(57)【要約】本発明は、アルコールを生産する方法であって、糖の流体を発酵反応器（２）に導入して、糖の流体に対してイソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトンに豊富な発酵麦汁を生じさせ、発酵反応器（２）は、クロストリジウム属に属する種によって生じかつポリウレタン発泡材を含んでいる固体担体（９）上に担持されているバイオマスを含んでいる、方法に関する。本発明は、前記バイオマスを前記固体担体（９）上に担持されて含んでいる発酵反応器（２）にも関する。
2022502053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールを生産するための方法であって、糖の流体を発酵反応器（２）に導入して糖の流体に相対してイソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトンに豊富な発酵マストを生じさせ、発酵反応器（２）は、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスを含んでおり、該バイオマスは、ポリウレタン発泡材を含む固体担体（９）上に担持されている、方法。
【請求項２】
ポリウレタン発泡材は、等価球の径が０．１〜５ｍｍである体積空洞；および／または空気中で測定される嵩密度１０〜９０ｇ／Ｌを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖の流体を発酵反応器（２）に連続的に導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発酵反応器（２）の体積に相対した糖の流体の希釈率（Ｄ）；０．０４ｈ−１〜１ｈ−１で発酵を行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスは、種クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・チロブチリカム、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム、クロストリジウム・ブチリカムから選択される種に属する細菌を含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスは、クロストリジウム・ベイジェリンキの種に属しイソプロパノールを天然に生じさせる遺伝的に改変された細菌および／またはイソプロパノールの生産のために遺伝的に改変されたクロストリジウム・アセトブチリカムを含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスを、補助タンク（７）中の固体担体（９）上に固定し、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスを担持している固体担体（９）を発酵反応器（２）に導入する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスを固体担体上にバイオフィルムの形態で固定する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
固体担体（９）を発酵反応器（２）に１個または複数個のブロックの形態および／または複数個のポリウレタン発泡材の立方体、平行六面体または任意の他の三次元形態を含んでいるネットまたは格子コンテナ（１０）の形態で導入する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
固体担体（９）は、実質的に、ストレートの円形シリンダの形態にあり、発酵反応器（２）の内径未満または実質的にそれに等しい径を有している、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
固体担体（９）は、流動床または固定床を発酵反応器（２）内に形成する、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
固体担体（９）を発酵反応器（２）内に置いて、発酵反応器（２）の反応培地の表面と同一の高さにする、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
発酵マストの生産を嫌気発酵によって行う、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
２８℃〜４０℃の温度、および／または約０．１ＭＰａ〜０．１５ＭＰａの圧力で、かつ／または最低２５０時間の期間にわたって発酵を行う、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
イソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトンを生産するのに適しているクロストリジウム属に属する種によって生じるバイオマスをポリウレタン発泡材を含んでいる固体担体（９）上に担持されて含んでいる発酵反応器（２）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の説明は、糖の流体の発酵によりアルコールを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エネルギー移行の挑戦に応じるために、かなりの研究が、「グリーン」方法を開発するために行われているところであり、石油の精製および／または石油化学に対して代替の方法で化学産業へのアクセスを供給している。
【０００３】
発酵方法に由来するアルコール（例えば、イソプロパノールおよびｎ−ブタノール）は、石油化学誘導体の最も将来有望な代替の中にある。ＡＢＥ（Acetone-Butanol-Ethanol：アセトン−ブタノール−エタノール）の発酵は、クロストリジウム属に属する微生物によって行われるものであり、このような発酵は、（２０世紀初頭に）産業化された最古の発酵の一つであり、それ故に、広範囲にわたって研究されてきたものである。より最近には、ＩＢＥ（Isopropanol-Butanol-Ethanol：イソプロパノール−ブタノール−エタノール）の発酵は、イソプロパノール、ブタノールおよびエタノールの混合物を生じさせ、かつ、これもクロストリジウム属に属する微生物によって行われるものであり、このような発酵は、数多くの研究の主題であった。
【０００４】
このタイプの方法において採用される発酵アプローチに関しては、０．１〜０．７ｇ／Ｌ・ｈの範囲の、このタイプの方法について発揮される低い生産性にも拘わらず、バッチ生成がＡＢＥおよびＩＢＥの発酵のための定法にとどまっている（例えば、非特許文献１および２参照）。しかしながら、これらの生産性はあまりに低いままに留まっており、経済的に実行可能な産業方法を想定することができない。
【０００５】
均質反応器における懸濁中の細胞による連続的な方法が想定されてもよい。しかしながら、生産性はまた比較的低く、容易には顕著に増大させられ得ない。主要な技術的課題の一つは、発酵培地中の細胞の濃度であり、これは、この方法において適用される希釈率によって主に制御される。この率は、発酵槽における細胞の「洗い落とし（wash-out）」を回避するために高くあることができない。これらの理由のために、近年において、微生物のバイオマスの高い保持の方に向けられた方法に強い興味が示された。２種の手段が存在する：「細胞の固定化（immobilization of the cells）」およびフィルタ膜による保持による細胞「再循環（recycling）」。
【０００６】
連続的方法のための２種の固定化技術：固体担体上の吸着および閉じ込め（confinement）がしばしば引用され、この２種の技術は、ＡＢＥの生産についての文献において研究されてきた。
【０００７】
第１の固体担体上の吸着の場合において、固体表面上への微生物の物理的吸着は静電力、ファンデルワールス力を介してまたは細菌細胞膜と担体との間の共有結合によって行われる。微生物のバイオフィルムと発酵溶液との間に物理的な障壁はないので、吸着、細胞の脱離および固体担体の復活の度合いの間の種々の平衡が固体担体、実施および操作条件に応じて達成されてよい。固定された細胞は微生物自体によって排泄されたポリサッカライド（ＥＰＳ： “Extracellular Polymeric Substances”：細胞外ポリマー物質）により典型的に取り囲まれ、細胞が懸濁中にある場合にのみ種々の成長および生物活性体制を有することが留意されるべきである（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００８】
複数種の固体担体が試験されかつ有利であることが、木炭（例えば、非特許文献４参照）、れんが（例えば、非特許文献５参照）、および製紙パルプ（例えば、非特許文献６参照）を含めて、ＡＢＥタイプの発酵についての文献により分かった。他方、このような固体担体は、合成のものではなく、発酵方法の再現性という大きな課題を生じる。
【０００９】
カプセル封入（閉じ込めによる固定化）の場合、微生物は、多孔性マトリクスの内側に導入されて、外部培地へのそれらの拡散が回避される一方で同時に、基質のための物質および栄養物、さらには反応生成物の移動が許容される。カプセル封入閉じ込め技術を用いた担体の例は、アルギン酸塩ビーズ（例えば、非特許文献７参照）、およびｋ−カラゲナン（例えば、非特許文献８参照）を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jones D. T.、Woods D. R.著、「Acetone-Butanol Fermentation Revisited」、Microbiol. Rew.、1986年、50巻、第4号、p.484-524またはTable 16.6
【非特許文献２】Lopez-Contreras A.ら著、「Bioalcohol Production: Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass」、chapter book 16、2010
【非特許文献３】Halan B.、Buehler K.、Schmid A.著、「Biofilms as living catalysts in continuous chemical syntheses Trends in Biotechnol.」、2012、第30巻、第9号、p.453-465
【非特許文献４】Qureshi N.、Maddox I. S.著、「Continuous solvent production from whey permeate using cells of Clostridium acetobutylicum immobilized by adsorption onto bonechar」、Enzyme Microb. Technol.、1987、第9巻、p.668-371
【非特許文献５】Qureshi N.、Schripsema J.、Lienhardt J.、Blaschek H. P.著、「Continuous solvent production by Clostridium beijerinckii BA101 immobilized by adsorption onto brick」、World Journal of Microbiology & Biotechnology、2000年、第16巻、p.377-382
【非特許文献６】Survase S. A.、van Heiningen A.、Granstroem T.著、「Continuous bio-catalytic conversion of sugar mixture to acetone-butanol-ethanol by immobilized Clostridium acetobutylicum DSM 792」、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2012年、第93巻、p.2309-2316
【非特許文献７】Mollah A. H.、Stuckey D. C.著、「Maximizing the production of acetone-butanol in alginate bead fluidized bed reactor using Clostridium acetobutylicum」、J. Chem. Tech. Biotechnol.、1993年、第56巻、p.83-89
【非特許文献８】Godia F.、Howard I.、Scott D.、Davison B. H.著、「Use of immobilized microbial membrane fragments to remove oxygen and favor the acetone-butanol fermentation」、Biotechnol. Prog.、1990、p.210-213
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明の説明の第１の対象は、水力学の希釈率が活性バイオマスの希釈率とは異なっている反応器におけるＩＢＥＡ（Isopropanol-Butanol-Ethanol-Acetone）タイプの発酵のための方法を提供することにある。この目標を達成するために、吸着によって細菌バイオマスをバイオフィルムの形態で発酵反応器内に少なくとも部分的に定着させることができ、体積ベースの生産性を改善する方法が以下に記載される。
【００１２】
第１の局面によると、上記の対象、さらには他の利点が、アルコールを生産する方法であって、糖の流体を発酵反応器に導入して糖の流体に相対してイソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトンに豊富な発酵マストを生産し、発酵反応器は、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスをポリウレタン発泡材を含んでいる固体担体上に担持されて（すなわち固定されて）含んでいる方法によって得られる。
【００１３】
１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも０．２ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも０．２ｇ／Ｌのブタノール、少なくとも０．２ｇ／Ｌのエタノールおよび少なくとも０．２ｇ／Ｌのアセトンの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも０．２ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも０．２ｇ／Ｌのブタノール、０．２ｇ／Ｌ未満のエタノールおよび少なくとも０．２ｇ／Ｌのアセトンの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも０．２ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも０．２ｇ／Ｌのブタノール、０．２ｇ／Ｌ未満のエタノールおよび０．２ｇ／Ｌ未満のアセトンの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも１ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも２ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも２ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも４ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも３ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも６ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも４ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも８ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも１０ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも２０ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、糖の流体に相対して、少なくとも１５ｇ／Ｌのイソプロパノール、少なくとも３０ｇ／Ｌのブタノールの供給を含む。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも０．４ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比は、できる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも３ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも６ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも９ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも１２ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも３０ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。１種または複数種の実施形態によると、発酵マストは、少なくとも６０ｇ／Ｌのイソプロパノール＋ブタノールの供給を含み、イソプロパノール／（イソプロパノール＋ブタノール）の比はできる限り０〜１の範囲（例えば０．０１〜０．９９）にわたる。
【００１４】
第１の局面による生産方法により、微生物のより良好な安定性を維持することがさらに可能になる（例えば性能品質の経時維持）。さらに、発酵培地中の所定の含有率以上において、発酵生成物、特にアルコール（例えばブタノール）は、微生物上に阻害効果を有することが知られているが、第１の局面による生産方法により、培地中に存在する生物活性に関するこれらの阻害生成物のマイナス効果を少なくとも部分的に低減させることが可能となる。
【００１５】
１種または複数種の実施形態によると、糖の流体は、発酵反応器に連続的に導入される。
【００１６】
１種または複数種の実施形態によると、ポリウレタン発泡材は、以下の特徴のうちの少なくとも一方を含む：
−  等価球の径が０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．２５ｍｍ〜１．１ｍｍ、好ましくは０．５５〜０．９９ｍｍである体積空洞（すなわち細孔または小室）、および
−  １０〜９０ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜８０ｇ／Ｌ、好ましくは１５〜４５ｇ／Ｌ、例えば２０〜４５ｇ／Ｌである、空気中で測定される嵩密度（すなわち、単位体積当たりの見かけ質量）。
【００１７】
１種または複数種の実施形態によると、発酵は、（発酵反応器の液体の体積に相対した転化されるべき供給原料の流量（糖の流体の液体の体積）の比として規定される）希釈率０．０４ｈ−１〜１ｈ−１、好ましくは０．０８ｈ−１〜０．５ｈ−１、例えば０．１２ｈ−１〜０．３ｈ−１で行われる。
【００１８】
１種または複数種の実施形態によると、発酵反応器は、発酵反応器の全体積に相対した見かけ体積で１０％〜９０％、好ましくは２０％〜５０％、好ましくは２０％〜４０％（例えば２５〜３０％）の固体担体を含む。
【００１９】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、反応培地中に少なくとも部分的に浸され、好ましくは全体的に浸される。１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、糖の流体の流れによる自然のまたは強制的な対流によって横断される（例えば、下降の、上昇のまたは放射状の流体循環であり、場合によっては、強制された対流における（例えば、ラシュトンタイプのラジアルターボミキサまたはアキシャルターボミキサまたは担体を通じた）循環。
【００２０】
１種または複数種の実施形態によると、発酵反応器は、上昇のまたは下降のまたは放射状の流体循環を有し場合によってはガスの対向流旋回を有する反応器である。
【００２１】
１種または複数種の実施形態によると、バイオマスは、クロストリジウム属に属しかつＩＢＥＡタイプの混合物を生じさせることができる微生物（例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・チロブチリカム、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（C. saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム・ブチリカム（C. butylicum）および他のクロストリジウム菌種）によって生産され（かつ／またはこれを含む）。採用される微生物は、遺伝的に改変されてもされてなくてもよい。より全体的には、「溶媒生産」クロストリジウム種の大部分が用いられてよい。好適に採用される種は、Ｃ．ベイジェリンキまたはＣ．アセトブチリカムの種に属するものである。それらは遺伝的に改変された種であってもなくてもよい。遺伝的に改変された種は、遺伝子材料（ＤＮＡ）が初期の種に相対して改変された種に対応する。遺伝的改変は、当業者に周知である遺伝的ツールを用いてなされる（参照：Pyne et al. Biotech Adv. 2014 32(3):623-41およびWasels et al. J. Microbiol. Methods 2017 140:5-11）。遺伝的改変は、イソプロパノール／ブタノール／エタノールの生産のためのその性能品質またはイソプロパノールまたはｎ−ブタノールの方への選択性を改変するためのそれの容量を改善するために採用される種の実際上のゲノム内容の改変に対応してよい。遺伝的改変は、本方法において用いられるクロストリジウム種の性能品質またはイソプロパノールまたはｎ−ブタノールのほうへの選択性を改善するための１種（または複数種）の遺伝材料の統合に対応してもよい。用語「遺伝材料（genetic material）」は、遺伝的に改変された種のゲノムに統合された１種または複数種の遺伝要素（プロモータ、遺伝子、ターミネータ、レギュレート構造等）を含有しているＤＮＡフラグメントを意味する（参照：クロストリジウム・アセトブチリカムに関するWalther & Francois Biotechnology Advances 34 (2016) 984-996によるレビュー）。１種または複数種の実施形態によると、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスは、遺伝的に改変されてもされてなくてもよいクロストリジウム・ベイジェリンキおよび／またはクロストリジウム・アセトブチリカムの種に属する細菌を含む。
【００２２】
１種または複数種の実施形態によると、糖の流体は、リグノセルロースから得られたＣ５および／またはＣ６の糖、および／または糖生産植物から得られた糖（例えばグルコース、フルクトースおよびスクロース）、および／またはでんぷん質植物から得られた糖（例えばデキストリン、マルトースおよび他のオリゴマー、さらにはでんぷん）の水溶液を含む。１種または複数種の実施形態によると、水溶液は、２０〜８００ｇ／Ｌ（例えば２０〜５００ｇ／Ｌ）の糖を含む。
【００２３】
１種または複数種の実施形態によると、糖の流体はバイオマス供給原料から生じさせられる。１種または複数種の実施形態によると、バイオマス供給原料は再生可能資源の処理を起源とする。１種または複数種の実施形態によると、再生可能資源は、リグノセルロースバイオマス（例えば木質の基材、例えば針葉樹の植物および落葉植物（例えば針葉樹の植物、例えばトウヒまたはマツ、または落葉植物、例えばユーカリ））、農業副産物（例えばわら）またはリグノセルロースの廃棄物を生じさせる産業（農業食品および紙の産業）からの副産物、および／または専用栽培の植物（例えばススキ属、パニクル・ウィルガツム（スイッチグラス））、および／または糖生産植物、例えば、テンサイ、サトウキビ、キクイモおよび／またはでんぷん性植物（例えばトウモロコシおよびコムギ）および／または塊茎（例えばキャッサバ、キクイモおよびジャガイモ）を含む。１種または複数種の実施形態によると、再生可能資源は生成物または残渣のリグノセルロース性のバイオマスおよびリグノセルロース性材料変換生成物も含む。
【００２４】
１種または複数種の実施形態によると、バイオマス供給原料は、バイオマス供給原料の全重量に相対して約３５重量％〜５０重量％のセルロース、２０重量％〜３０重量％のヘミセルロースおよび１５重量％〜２５重量％のリグニンを含む。
【００２５】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスの固体担体上の（例えば吸着による）固定化の前および／または後に発酵反応器の内側に置かれる。
【００２６】
１種または複数種の実施形態によると、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスは、補助タンク中の固体担体上に固定され、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスを支持している固体担体（以降において細菌バイオマスとも称する）は、発酵反応器に導入される。発酵反応器に相対して迅速なループ（「in stream」：インストリーム」）で機能する補助タンクの内側に細菌バイオマスを固定することが可能である。本発明の説明の方法においてバッチ工程を、例えば４〜５時間の期間にわたって、例えば糖の流体を発酵反応器に連続的に導入する前に実行することがとりわけ可能である。１種または複数種の実施形態によると、固体担体を含有する／水中に沈める反応培地は、反応体積の全体積に相対して０．５体積％〜２０体積％、好ましくは１体積％〜２０体積％の程度（例えば１０体積％）の細菌バイオマス接種溶液（例えば実質的に最大の増殖率にある細胞を有するもの）による接種を経る。１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、前記「バッチ」工程の間に接種溶液中に少なくとも部分的に浸され、好ましくは全体的に浸される。１種または複数種の実施形態によると、細菌バイオマスは、固体担体上にバイオフィルムの形態（すなわち、（有機または無機の）固体表面に付着されるかまたはフロックまたは集合体を、離隔した方法で、とりわけ自己造粒によって固体表面上に形成する微生物の群）で固定される。
【００２７】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、１個または複数個のブロックの形態で発酵反応器に導入される。１種または複数種の実施形態によると、固体担体（例えば単一のブロックの形態にある固体担体）は、実質的にストレートの円形シリンダの形態にあり、発酵反応器の内径未満のまたは実質的に等しい径を有している。１種または複数種の実施形態によると、ブロックは、発酵反応器の内径に実質的に等しい径を有する。ブロックおよび発酵反応器は、ここではストレートの円形シリンダとして記載されているが、ブロックおよび発酵反応器はあらゆる形状のものであってよいことが理解される。１種または複数種の実施形態によると、ブロックは、発酵反応器の主軸（垂直）に相対して中心が同一とされるかまたは中心が異なるものとされているか、または、発酵反応器の放射壁に接している。
【００２８】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、発酵反応器にネットまたは格子コンテナの形態で導入され、これは、複数のポリウレタン発泡材の立方体、平行六面体または任意の他の三次元形状（チップ）を含んでおり、例えば、それの少なくとも１つの寸法は、少なくとも３ｍｍである。１種または複数種の実施形態によると、ネットまたは格子コンテナはストレートの円形シリンダであり、発酵反応器の内径未満またはそれに実質的に等しい径を有している。１種または複数種の実施形態によると、ネットまたは格子コンテナは、発酵反応器の内径に実質的に等しい径を有する。ネット、格子コンテナおよび発酵反応器は、ここではストレートの円形シリンダとして記載されているが、ネット、格子コンテナおよび発酵反応器はあらゆる形状もものであってよいことが理解される。
【００２９】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、流動床または固定床を発酵反応器中に形成する。１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、少なくとも部分的に、好ましくは全体的に鉄格子（grate）によって浸されて維持される流動床を形成する。
【００３０】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は（例えば機械的に）撹拌される。１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、ネットまたは格子コンテナの内側に固定され、中心が同一とされ、例えば撹拌の軸と中心が同一とされる（例えばロビンソン−マホニータイプの反応器の使用）。
【００３１】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体（例えばブロック（１個または複数個）、ネットまたは格子コンテナ）は、反応培地の表面と同一の高さとされるように発酵反応器内に置かれる。１種または複数種の実施形態によると、糖の流体は、ブロック（１個または複数個）、ネットまたは格子の上方または下方に直接的に導入される。
【００３２】
１種または複数種の実施形態によると、発酵は、嫌気発酵（例えば厳密嫌気発酵）であり、例えば、不活性ガスの供給下に（例えば窒素下に）行われる。
【００３３】
１種または複数種の実施形態によると、発酵は、２８℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃（例えば３６℃）の温度で、かつ／または、約０．１ＭＰａ〜０．１５ＭＰａ（すなわち大気圧＋水頭（water heads））の圧力で行われる。
【００３４】
１種または複数種の実施形態によると、発酵は、少なくとも２５０時間、好ましくは少なくとも５００時間の時間にわたってあらゆる上限（例えば５０００時間）なく連続的に行われる。
【００３５】
第２の局面によると、上述の主題、さらには他の利点は、クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマスをポリウレタン発泡材を含んでいる固体担体（９）上に担持されて含んでいる発酵反応器（２）によって得られる。
【００３６】
１種または複数種の実施形態によると、発酵反応器の出口において得られた発酵マストの少なくとも一部は、発酵反応器の入口に再循環させられる。全体的な滞留時間とは無関係で線速度を達成することがとりわけ可能である。
【００３７】
上記言及の方法の実施形態、さらには前記方法の他の特徴および利点は、非制限の例証の目的のために純粋に与えられた以下に続く説明を、以下の図面を参照しながら読む際により明らかにされることになる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（図面のリスト）
図１は、本発明の説明の実施形態によるアルコールを生産する方法の模式図である。
【００３９】
図２は、本発明の説明の実施形態による径が発酵反応器の内径に実質的に等しい固体担体の模式図である。
【００４０】
図３は、本発明の説明の実施形態による発酵反応器と中心が同一の、中心が異なる、または発酵反応器の壁に接している固体担体の模式図である。
【００４１】
図４は、本発明の説明の実施形態による固体担体の模式図であり、ポリウレタン発泡材から作製された要素をネットまたは格子コンテナ中に閉じ込められて含んでいる。
【００４２】
図５は、本発明の説明の実施形態による発酵反応器中に浸される含有される流動床を形成している固体担体の模式図である。
【００４３】
図６は、本発明の説明の実施形態によるアルコールを生産するための方法の模式図であり、発酵仕上げ工程も含んでいる。
【００４４】
図７は、課された希釈率に応じた参照方法のＩＢＥＡの体積生産性における変化を示している。
【００４５】
（実施形態の説明）
第１の局面による方法および第２の局面による反応器の実施形態が今ここで詳細に記載されることになる。以下の詳細な説明において、多くの具体的な詳細が提示されて、本方法のより綿密な含蓄が提供される。しかしながら、本方法は、これらの具体的な詳細なく行われ得ることが当業者にとって明白であるだろう。他の場合において、周知の特徴は、本説明を不必要にわかりにくくすることを回避するために詳細には記載されない。
【００４６】
以下の点で、用語「含む（comprise）」は、「include」および「contain」と同義であり（これと同一のことを意味する）、含めてまたはオープンであり、他の不特定の要素を除外しない。さらに、本発明の説明において、用語「おおよそ（approximately）」、「実質的に（substantially）」、「本質的に（essentially）」および「約（about）」は、所与の値の１０％より大きいおよび／またはより小さい差（margin）と同義である（これと同じことを意味する）。
【００４７】
（糖の流体）
１種または複数種の実施形態によると、糖の流体は、リグノセルロースから得られたＣ５および／またはＣ６の糖、および／または糖生産植物から得られた糖（例えばグルコース、フルクトースおよびスクロース）、および／またはでんぷん性の植物から得られた糖（例えばデキストリン、マルトースおよび他のオリゴマー、さらにはでんぷん）の水溶液を含む。１種または複数種の実施形態によると、Ｃ５および／またはＣ６の糖の水溶液は再生可能資源の処理を起源とする。１種または複数種の実施形態によると、再生可能資源は、リグノセルロース性のバイオマスタイプのものであり、とりわけ、木質の基材（例えば針葉樹の植物および落葉植物）、農業副産物（例えばわら）またはリグノセルロースの廃棄物を生じさせる産業（農業食品および紙の産業）からの副産物を含んでよい。再生可能資源は、糖生産植物、例えばテンサイ、サトウキビ、またはでんぷん性植物、例えばトウモロコシおよびコムギを起源としてもよい。Ｃ５および／またはＣ６の糖の水溶液は、種々の再生可能資源の混合物を起源としてもよい。
【００４８】
（クロストリジウム属に属する種によって生じたバイオマス）
細菌のバイオマスは、主として、バイオフィルムの形態で固体担体上に吸着される。好ましくは、細菌は、種クロストリジウム・ベイジェリンキおよび／またはクロストリジウム・アセトブチリカムに属する種である。本方法において用いられる細菌は、遺伝的に改変されてもされてなくてもよくかつイソプロパノールを自然に生じさせる種および／またはアセトンを自然に生じさせかつイソプロパノールを生じさせるように遺伝的に改変されたクロストリジウム種であってよい。
【００４９】
（固体担体）
固体担体は、ポリウレタン発泡材を含む。ポリウレタン発泡材が特に有利であるのは、それがＩＢＥＡタイプの混合物の生産へのアクセスを可能にするだけではなく、細菌バイオマスの固定によって連続タイプの生産へのアクセスも可能にするからである。具体的には、本出願人は、ポリウレタン発泡材は、十分に実質的な方法で（すなわち、細胞の洗い落としを引き起こす希釈率を超えて）クロストリジウム属の細菌を定着させることができ、これにより、ＩＢＥＡタイプの混合物を連続的に生じさせることが可能となることを立証した。さらに、ポリウレタン発泡材は、反応器中の浸漬による固定に適している。
【００５０】
１種または複数種の実施形態によると、ポリウレタン発泡材は、以下を有している：
−  体積空洞（すなわち細孔または小室）；その等価球の径は０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．２５ｍｍ〜１．１ｍｍ、好ましくは０．５５〜０．９９ｍｍである：および／または
−  空気中で測定される嵩密度（すなわち、単位体積当たりの見かけ質量）：１０〜９０ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜８０ｇ／Ｌ、好ましくは１５〜４５ｇ／Ｌ、例えば２０〜４５ｇ／Ｌまたは２５〜４５ｇ／Ｌ。
【００５１】
（細孔径を測定するための方法の説明：X線断層写真術）
体積空洞の等価球の径は、とりわけ、サンプル（例えば７ｍｍ×７ｍｍ×１５ｍｍ）のＸ線マイクロスキャナ（例えばHR 70kV 200 microA Point 焦点媒体チューブ（focal medium tube）：Varian pixel検出器：６ミクロン；捕捉時間：２時間）による分析および発泡材の典型的な体積の復元（例えば復元される体積５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍであり、ボクセルサイズは６ミクロンである）（球状の小室を仮定する）によって得られてよい。
【００５２】
径の測定は、Ｘ線マイクロスキャナにより捕捉される３Ｄ体積からのAvizoソフトウェアによる３Ｄ画像分析によってなされた。小室は、画像分析によって人為的に閉じられて、体積、次いでその径が推定された。所与の小室の径は、同一の体積の球のものに見立てられる。画像分析の種々の工程は、以下の通りである：
−  画像を二値化する（黒＝小室および白＝壁）；
−  Avizo上のｘｙ集水地域法（catchment basin method）によって「小室」を２Ｄ区画化する；
−  Avizo上の３Ｄ集水地域法によって小室を３Ｄ区画化する；
−  縁部の小室（不完全な小室）を除去する；
−  復元された小室の体積を測定する；
−  小室の径（同一体積の等価球の径）を推定する；
−  比較のために小室のサイズ分配を行う。
【００５３】
（方法）
図１は、リグノセルロース性のバイオマスタイプの基質からアルコール混合物を生産するためのスキームを示す。
【００５４】
図１に関連して、Ｃ５および／またはＣ６の糖を例えば含んでいる糖の流体は、ライン（１）を介して発酵反応器（２）に導入され、発酵工程を経る。
【００５５】
発酵反応器（２）において、糖の流体は、ポリウレタン発泡材を含んでいる固体担体上に担持された細菌性バイオマスと接触しているように置かれる。それ故に、発酵可能な糖（例えばＣ５および／またはＣ６の糖）は、微生物によってアルコールおよび／または溶媒に変換され、（第１の）発酵マスト（または酒液またはワイン）が生じ、これは、糖の流体に相対してイソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトンにとりわけ富んでいる。
【００５６】
発酵反応器（２）における発酵工程は、２８℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃の温度で行われてよく、その結果、発酵マストは、ＩＢＥＡタイプの発酵反応生成物、例えばイソプロパノールを含み、次いで、ライン（３）を介して排出される。
【００５７】
発酵マストは、ライン（３）を介して、発酵マストから興味の化合物を分離・抽出するための分離ユニット（４）（任意）に導入され、前記化合物は、ライン（５）を介して取り出される。蒸留かすとして一般に知られる分離残渣は、ライン（６）を介して分離ユニット（４）から取り出される。蒸留かすは、一般的には、水と、さらには任意の液体または先行の工程の間に転化または抽出されなかった固体生成物とからなる。分離ユニット（４）は、１回または複数回の蒸留、および場合による固形物および／または懸濁中物質の分離を、例えば、遠心分離、デカンテーションおよび／またはろ過によって実施してよい。
【００５８】
従来技術に存在している複数基の発酵反応器の実施または技術が、細菌性バイオマスを固体担体上の吸着によって固定するために適しており、発酵反応器（２）の内側または補助タンクにおいて「インストリーム」態様で実施が行われようとどうであろうとそのようにすることができる。例えば、細菌性バイオマスは、直接的に発酵反応器（２）においてまたは間接的に発酵反応器（２）に相対して「インストリーム」態様で例えば機能している補助タンク（７）（任意）において固体担体上に固定されてよい。このように細菌性バイオマスを負荷された固体担体は、その後、例えばライン（８）を介してまたは任意の他の手段を介して発酵反応器に導入されてよい。
【００５９】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は流動床または固定床を形成する。
【００６０】
流動床の場合、液体の流れは、（発酵マストの密度は一般的にはポリウレタン発泡材の密度より高いので）直接的にポリウレタン発泡材の床上に下方方向で確立されてよい。１種または複数種の実施形態によると、糖の流体の液体表面速度は、最小流動化速度より大きい。１種または複数種の実施形態によると、糖の流体の液体表面速度は、発酵の過程で起きる密度差における変化に応じて改変される（例えば増大させられる）。例えば、バイオフィルムが固体担体上に形をなすにつれて徐々に、固体担体の密度は変動する（例えば増大する）に至ってよく、進化的水力学体制が生じる（例えば発酵の開始時および発酵の終了時の異なる任意の再循環率）。
【００６１】
固定床の場合、ポリウレタン発泡材粒子の解放されたまたは構造化された積み重ねを含んでいる固体担体が想定されてよく、機械的な撹拌が伴うかまたは伴わない（例えばカラムの内側）。
【００６２】
１種または複数種の実施形態によると、発酵培地は、上昇流または下降流として固体床を通過する。例えば、下降液体流通の場合、ガスの向流展開を可能にするシステムが提供されてよい。１種または複数種の実施形態によると、例えば、機械的撹拌が発酵反応器（２）の中心において適用される場合に放射流通が発酵反応器（２）（例えばラシュトンタイプの放射ターボミキサ）中に想定されてもよい。１種または複数種の実施形態によると、固体は、撹拌の軸に対して中心が同一であるバスケットの内側に固定され、とりわけ、反応培地のスピードおよび前記培地の周囲に課された流体力学を制御することが可能となる（例えばロビンソン−マホニータイプの反応器）。
【００６３】
（固体担体の浸漬および使用）
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、部分的にまたは全体的に浸漬され、とりわけ、バイオフィルムの形成が増加させられかつ性能が改善される。
【００６４】
１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、単一のブロックの形態で、例えば、発酵反応器（２）の内径未満または実質的に等しい径を有するシリンダの形態で導入される。１種または複数種の実施形態によると、図２に示されるように、固体担体（９）の径は発酵反応器（２）の内径に実質的に等しい。それ故に、ブロックは、フィルタ培地に対応してよく、このフィルタ培地の内側で、バイオフィルムは成長する。糖の流体に同伴される場合のある不溶材料の供給を制御することは場合によってはより困難であるが、図１に提示されるような発酵反応器（２）を用いる方法の性能品質は、最も高い中にある。他方、図２に示されるような固体担体（９）は、より下方のレベルのところで、フリーの液相中にわずかにプラスの圧力を起こす可能性がある。発酵の間にガスの放出が相当あるならば、ガスポケットが、固体担体の下に形をなしてもよく、固体担体（９）の内側の優先的な通過がガスの放出の間に生じさせられてよいことが留意されるべきである。
【００６５】
１種または複数種の実施形態によると、図３に示されるように、固体担体（９）のブロックは、発酵反応器（２）と中心が同一とされるか、これと中心が異なっているものとされるかまたは発酵反応器（２）の壁に接しているものとされてよい。有利には、固体担体（９）は、本方法の入口または出口における液体の流通を決して、とりわけ、連続的に行われる場合に中断させることはない。さらに、不溶材料、例えば、大部分のシリアルに由来する不溶材料の考えられる存在は、何らの問題も持ち出さない。ライン（１）を介して到着する糖の流体の流れは、例えばそれらが発酵反応器（２）の反応培地の表面と同一の高さとされる場合に固体担体（９）のブロックのレベルで導入されてもよい。有利には、固体担体が糖の流体の入口のレベルで反応培地の表面と同一の高さとされる場合、培地は、局所的にアルコール中にとぼしく濃縮され、細菌の増殖が促進される。
【００６６】
一体構造の固体担体（９）を用いることは要求されないことが理解される。１種または複数種の実施形態によると、固体担体は、ネットまたは格子コンテナ（１０）を含み、これは、立方体または平行六面体または大小のサイズの任意の形状の他の三次元の要素（例えば多面体）（例えば少なくとも１つの寸法が３ｍｍ〜１０ｍ、例えば２ｃｍ〜１ｍ）を含んでおり、図４に示されるように、この要素は、ポリウレタン発泡材から構成される。１種または複数種の実施形態によると、ネットまたは格子コンテナ（１０）は、シリンダを形成し、その径は、発酵反応器（２）の内径未満であるかまたはこれに実質的に等しい。１種または複数種の実施形態によると、ネットまたは格子コンテナ（１０）が有している径は、発酵反応器（２）の内径に実質的に等しい。
【００６７】
ガスの放出が固体担体（９）を上昇させる傾向を有するということが生じてよい。他方、有孔板、簡単なネットまたは鉄格子（１１）（図５参照）は、固体担体を、例えば移動中に、発酵反応器（２）中に維持するのに十分であってよい。
【００６８】
図２〜５の実施形態において、発酵反応器（２）は、上昇の流体流通を有している。他方、糖の流体の流通の方向は下降であってよいことが理解される。流通の方向は（発酵反応器の外側から眺められて）全体的に上昇または下降でありおよび発酵反応器（２）の内側で放射方向であってよいことも理解される。
【００６９】
（仕上げ工程）
図６において指し示されるように、本アルコール生産方法は、「フィニッシャー」として知られている仕上げ反応器（１２）を実施してよい（任意）。１種または複数種の実施形態によると、発酵反応器（２）からライン（３）を介して抜き出された発酵マストは仕上げ反応器（１２）に導入される。仕上げ反応器（１２）は発酵反応器（２）から抜き出された発酵マストと相対してＩＢＥＡに豊富な第２の発酵マストを生じさせるのに適したものである。次いで、第２の発酵マストは、仕上げ反応器（１２）から抜き出され、ライン（６）を介して排出され、発酵マストから興味の化合物を分離・抽出するための分離ユニット（４）（任意）に導入され、前記化合物は、ライン（５）を介して取り出される。仕上げ反応器（１２）は、好ましくはＰＵ発泡材を有しないものである。フィニッシャーは、好ましくは均一であり、延長した滞留時間を可能にすることによって、クロストリジウム種のＩＢＥＡ力価ポテンシャルを最適に利用し、かつ、種の必要性に一致した量の炭素ベースの基質を加えるという目的を有している。仕上げ反応器（１２）により、とりわけ、サッカライドの消耗を保証することが可能となる。
【００７０】
１種または複数種の実施形態によると、アルコール生産方法は、第１および／または第２の発酵マスト中に存在する生成ＩＢＥＡ化合物の一部回収の工程を含む。ＩＢＥＡ化合物を抽出するこの工程は、発酵反応器（２）および／または仕上げ反応器（１２）に送られる加圧ガスによりストリッピングして水相中に存在するアルコールを同伴させる工程を含む。
【００７１】
１種または複数種の実施形態によると、ストリッピングガスは、発酵によって直接的に生じかつ使用の前に（当業者に知られた方法を介して）前もって格納されたガスである。ストリッピングガスは、典型的には、二酸化炭素および場合による水素を含む。ガスによりストリッピングするこの工程により、有利には、発酵の間に培地中に存在するアルコールの含有率を制御してアルコール含有率が臨界値に達した時に生じた微生物の阻害を制限することが可能となる。１種または複数種の実施形態によると、ガスによりストリッピングする工程は、連続的またはバッチ式のいずれかで行われてよい。発酵槽の体積に相対する発酵ガスの流量は、例えば０．５〜２．５Ｌ／Ｌ／ｍｉｎ、好ましくは０．７〜１．１Ｌ／Ｌ／ｍｉｎである。
【００７２】
１種または複数種の実施形態によると、回収方法が行われてもよく、その結果、ガスによりストリッピングする工程は、水不溶性の有機溶媒を含有しているフィニッシャー（１２）において行われ、この溶媒は、上澄み有機相を発酵マスト上に形成する。さらに、溶媒は、微生物と生体適合性であるように選ばれることになる。
【００７３】
それ故にストリッピングガスは発酵マストに注入され、上澄み有機相に生じたアルコールを同伴し、アルコールの一部は、ストリッピングガスが前記有機相を通過する時に有機相に移される。
【００７４】
（実施例）
（参照例：懸濁液中の細胞の連続的な試験）
懸濁液中の細胞による連続的な試験を実験的に行う。全体積５Ｌを有するバイオリアクタに発酵培地１．８Ｌを充填する。当初のグルコースを６０ｇ／Ｌに設定し、接種は、０．２Ｌである。すなわち、接種率は、試験の開始から（厳密な）嫌気条件を保証するという目的のために１時間にわたって窒素によりパージした後に、最大の増殖率にある細胞を有する発酵培地の全体積に相対して１０体積％である。予備的なバッチ工程（４〜５時間）の間窒素によるパージを維持する。採用された微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３である。温度および機械的撹拌を、試験の開始から、それぞれ、３６℃および６０ｒｐｍに設定する；圧力は、実質的に大気圧＋バイオリアクタの水頭である。２工程で試験を行う：
−  第１のバッチ工程（継続期間４〜８時間）；遅延時間および対数増殖の開始に対応する（発酵ガスの発生と同時に起こる）；および
−  第２の連続様式の工程；異なる希釈率を課す。
【００７５】
滞留時間の少なくとも３倍（好ましくは少なくとも５倍）のに対応する時間期間を、安定化の目的のためにそれぞれの新しい公称値をパスするために許容する。次に、発酵マストのグルコースおよび主要な代謝物（すなわち、イソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトン）を分析する。
【００７６】
図７は、バイオリアクタ中で課された希釈率Ｄ（ｈ−１）に応じたＩＢＥＡの体積生産性ｒ（ｇ／Ｌ・ｈ）における変化を示す。希釈率Ｄは、反応器に入る体積流量を反応器の体積で除算したものとして定義される。懸濁液中の微生物による方法の場合、このパラメータは、流体および微生物についての滞留時間の逆関数として同時に考慮されてよい。その結果として、細胞の洗い落としは、所定の希釈率の上に現れ、これにより、体積生産性の喪失に至る。この場合、臨界の希釈率は、０．０４〜０．０６ｈ−１であり、その時に、ＩＢＥＡの最大の生産性は、約０．４５ｇ／Ｌ・ｈの値に達する。
【００７７】
（実施例１：本発明の説明に合致する；ポリウレタン発泡材によるバッチ様式での試験）
バッチ様式での方法を実験的に行う：異なる物理的および構造的な特徴を有するポリウレタン発泡材タイプの固体担体（発泡材１、発泡材２）による２回の発酵、およびコントロールの発酵（懸濁液中の細胞）。これらの２種の発泡材の主要な特徴を下記の表１に提示する。
【００７８】
【表１】
2022502053.tif 000003
【００７９】
複数基のバイオリアクタに発酵培地２０ｍＬを充填する。この発酵培地、酸素の非存在を保証するように嫌気条件下に前もって置いていたものである。バイオリアクタの全体積に相対して４０％の体積（見かけ体積）の固体を、各バイオリアクタに導入する。初期グルコースを９０ｇ／Ｌに設定し、播種密度は、最大限の増殖率にある細胞により１０％（液体体積）（すべての発酵について同一の接種）である。採用された微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３である。バイオリアクタをすべて嫌気ジャー中に設定温度（３６℃）に１２日の設定期間にわたって置く。圧力は、実質的に大気圧＋バイオリアクタの水頭である。次に、最終の発酵マストを分析し、同様にバイオフィルムを担持する固体を分析する。実験の再現性を保証するように各操作条件を３通り行う。
【００８０】
ポリウレタン発泡材タイプの固体の存在は、グルコースの必然の過消費（下記の表２参照）およびＩＢＥＡの最終の力価に関していくつかの効果を有する。
【００８１】
【表２】
2022502053.tif 000004
【００８２】
力価は、一定と考えられる発酵収率および各試験上のグルコース消費から定量される。それ故に、発泡材１および発泡材２によるバッチ発酵は、それぞれ、１７．５ｇ／Ｌおよび１５．２ｇ／ＬのＩＢＥＡを生じさせ、力価は、両方の場合において、コントロールの発酵により得られたもの（１３．３ｇ／ＬのＩＢＥＡ）より大きい。
【００８３】
（実施例２：本発明の説明に合致する：ポリウレタン発砲材による連続的な試験）
本方法を本発明の説明の実施形態により、異なる物理的および構造的な特徴を有しているポリウレタン発泡材タイプの固体担体（発泡材１、発泡材２）上の固定による連続的な様式で２回の発酵を用いて実験的に行う。これらの２種の発泡材の主要な特徴を表１に提示する。解放された様式で、３ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍのサイズの立方体により充填を行う。
【００８４】
１１２ｍＬのガラスカラム（寸法：内径＝３２ｍｍ、Ｈ＝１３．９ｃｍ）に固体担体を、カラムの全内部体積に相対してカラム中５０％の体積割合に導入する。第２の発酵フラスコの再循環ループ中にカラムを置き、このフラスコの発酵培地の体積は８０ｍＬに達する。酸素の非存在を保証するために窒素によりパージすることによって嫌気条件下に前もって発酵システム全体を置いた。供給原料タンク中のグルコースを９０ｇ／Ｌに設定し、固体担体は、発酵培地の全体積に相対して最大限の増殖率にある細胞により１０体積％の接種率を経る。採用された微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３である。システムの温度を設定し（３６℃）、撹拌は行わない。圧力は、実質的に大気圧＋ガラスカラムの水頭である。２工程で試験を行う：
−  第１のバッチ工程（継続期間：４〜５時間）；「遅延時間（lag time）」および対数増殖の開始（発酵ガスの発生と同時に起こる）に対応する；および
−  第２の連続様式工程；異なる希釈率を課す。
【００８５】
滞留時間の少なくとも３倍に対応する時間の期間が、安定化の目的のためにそれぞれの新しい公称値をパスするために許容される。定期的に、最終の発酵マストを無菌条件下にカラムから集め、グルコースおよび主要な代謝物（すなわち、イソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトン）を分析する。
【００８６】
ポリウレタン発泡材タイプの固体担体の存在は、連続様式での発酵に関していくつかの効果を有している：下記の表３は、発酵の展開を、課された希釈率、グルコースの消費割合（％）、ＩＢＥＡの全含有量（ｇ／Ｌ）およびＩＢＥＡの体積生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）に応じて示している。懸濁液中の細胞の条件（参照例）に相対して、生産性における増大が観察されるのは、細胞が発泡材１（６倍）または発泡材２（３倍）上に固定されている場合である。
【００８７】
【表３】
2022502053.tif 000005
【００８８】
上記の実施形態および実施例が詳細に説明されているが、さらなる実施形態が想定されてよいことが理解される。例えば、本発明の説明による方法において用いられる細菌性バイオマスは、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３以外の種に対応してよい。同様に、本発明の説明によるポリウレタン発泡材は、表１に記載されたもの以外であってよい。さらに、課されたＩＢＥＡの含有率および体積生産性は、実施例において指し示されたもの以外の接種率、糖含有率、希釈率、温度、圧力、撹拌条件、継続期間等によって得られてよい。
【００８９】
本発明の説明において特に断らない限り、上記の全ての実施形態は、一緒に組み合わされてよいことは当業者にとって明白であるだろう。例えば、特に断らない限り、上記の実施形態の全ての特徴は、他の実施形態の他の特徴と組み合わされるかまたはそれらと置き換えられてよい。
【００９０】
（実施例３；本発明の説明に合致する：ポリウレタン発泡材による連続的試験）
本方法を本発明の説明の実施形態により、ポリウレタン発酵材タイプの固体担体上の固定化による連続様式で２回の発酵を用いて実験的に行う。解放様式で、１０ｍｍ×１０ｍｍ×７ｍｍのサイズの立方体による充填を行う。発泡材は、約１ｍｍのマクロ細孔サイズを有している。
【００９１】
２基の発酵槽は、作業体積２５０ｍＬを有するガラスカラムの形態にある。発酵槽の充填条件を表４に提示する。
【００９２】
【表４】
2022502053.tif 000006
【００９３】
反応器の入口と出口との間に再循環ループを置いて、発酵槽内の良好な均一性を維持する。液体の出口は、オーバーフローによって生じる。発酵システム全体を、窒素によりパージすることによって前もって嫌気条件下に置き、酸素の非存在を保証した。供給原料タンク中のグルコースの濃度を６０ｇ／Ｌに設定する。発酵槽に、発酵培地の全体積に相対して１０体積％に最大限の増殖率にある細胞により接種する。採用された微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３である。システムの温度を３４℃に設定し、再循環以外は撹拌を行わない。圧力は実質的に大気圧である。
【００９４】
２工程で試験を行う：
−  第１のバッチ工程（継続期間７時間）；「遅延時間」および対数増殖の開始（発酵ガスの発生と同時に起こる）に対応する；および
−  第２の連続様式の工程；異なる希釈率を課す。
【００９５】
第２の工程において、希釈率は、溶媒濃度に応じて連続的に増大する。定期的に、無菌条件下に発酵マストを集め、グルコースおよび主要な代謝物（すなわち、イソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトン）を分析する。ｐＨも測定する。
【００９６】
２基の発酵槽を９１２時間の期間にわたって運転する。希釈率は０．０２ｈ−１〜０．２３ｈ−１の範囲にわたる。２００時間の発酵の後、ＩＢＥＡの全含有量は８〜１６ｇ／Ｌの範囲にわたる。５００時間の前に、２基の反応器についてのＩＢＥＡの最大体積生産性は１．５ｇ／Ｌ・ｈである。試験全体についての最良の性能は、発酵槽（１）についてＩＢＥＡの最大体積生産性２．４４ｇ／Ｌ／ｈおよび発酵槽（２）についてＩＢＥＡの最大体積生産性２．２４ｇ／Ｌ／ｈを与える。
【００９７】
（実施例４（本発明の説明に合致する）：撹拌型反応器におけるポリウレタン発泡材による連続的な試験）
ポリウレタン発泡材タイプの担体上に固定された細胞により連続的な様式の試験を実験的に行う。全体積５Ｌを有するバイオリアクタに発酵培地２Ｌを充填する。初期のグルコースを６０ｇ／Ｌに設定し、接種は０．２Ｌである。すなわち、接種率は、試験の開始から（厳密な）嫌気条件を保証するという目的のために１時間にわたって窒素によりパージされた後で、最大限の増殖率にある細胞を有する発酵培地の全体積に相対して１０体積％である。予備的なバッチ工程の間（７時間）、窒素によりパージすることを維持する。採用された微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキＤＳＭ  ６４２３である。温度を３４℃に設定する。機械撹拌は６０〜１７０ｒｐｍの範囲にわたる。圧力は実質的には大気圧＋バイオリアクタの水頭である。
【００９８】
２工程で試験を行う：
−  第１のバッチ工程（継続期間７時間）；「遅延時間」および対数増殖の開始に対応する（発酵ガスの発生と同時に起こる）；および
−  第２の連続様式工程；異なる希釈率を課す。
【００９９】
第２の工程において、希釈率は溶媒の濃度に応じて連続的に増大する。定期的に、発酵マストを無菌条件下に集め、グルコースおよび主要な代謝物（すなわち、イソプロパノール、ブタノール、エタノールおよびアセトン）を分析する。ｐＨも測定する。
【０１００】
２基の発酵槽を約７６５時間の期間にわたって運転する。希釈率は０．０２ｈ−１〜０．２ｈ−１の範囲にわたる。１００時間後、ＩＢＥＡの全含有量は５〜１６ｇ／Ｌの範囲にわたる。この発酵について得られたＩＢＥＡの最大体積生産性は１．６ｇ／Ｌ・ｈである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の説明の実施形態によるアルコールを生産する方法の模式図である。
【図２】本発明の説明の実施形態による径が発酵反応器の内径に実質的に等しい固体担体の模式図である。
【図３】本発明の説明の実施形態による発酵反応器と中心が同一の、中心が異なる、または発酵反応器の壁に接している固体担体の模式図である。
【図４】本発明の説明の実施形態による固体担体の模式図であり、ポリウレタン発泡材から作製された要素をネットまたは格子コンテナ中に閉じ込められて含んでいる。
【図５】本発明の説明の実施形態による発酵反応器中に浸される含有される流動床を形成している固体担体の模式図である。
【図６】本発明の説明の実施形態によるアルコールを生産するための方法の模式図であり、発酵仕上げ工程も含んでいる。
【図７】課された希釈率に応じた参照方法のＩＢＥＡの体積生産性における変化を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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