【事件の表示】
　特許第３３０２３５８号「改質生物学的材料」の請求項１ないし３４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３０２３５８号の請求項１ないし３４に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第３３０２３５８号の発明についての出願は、１９９０年１０月１２日（パリ条約による優先権主張１９８９年１０月１２日イギリス、１９９０年８月６日イギリス）に国際出願され、平成１４年４月２６日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、尾関ラン子より特許異議の申立がなされ、平成１５年３月１３日付けで取消の理由の通知がなされ、延長された応答指定期間内である平成１５年９月２４日に特許権者より意見書が提出されるとともに訂正請求がなされ、その間、異議申立人より平成１５年９月２日付で上申書が提出され、その後、特許権者から平成１５年１１月２７日付で、また、異議申立人から平成１５年１２月２９日付で、それぞれ上申書が提出され、その後、平成１６年８月１７日付で再度、取消の理由の通知がなされ、延長された応答指定期間内である平成１７年２月２８日に特許権者より意見書が提出されたものである。　
　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
　特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
　特許請求の範囲の請求項１「【請求項１】　非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、医薬に使用するための前記細胞または組織。」を、「【請求項１】　非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、
そして前記相同的補体制限因子は、前記移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている、
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否　
　訂正後の請求項１は、訂正前の請求項１の構成要件である「相同的補体制限因子」が「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている」ものであることを特定したものである。そして、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明には、「ＨＣＲＦ（相同的補体制限因子）をドナー組織上の細胞膜に結合させるように、ＨＣＲＦを供給することが一般に非常に便利である。…この目的を達成するための最も好ましいルートは、ドナー組織がレシピエントに移植されたときにレシピエント中で活性な１種以上のＨＣＲＦをコードする核酸を含み、表現する点で、ドナー組織がトランスジェニックであることである。」（特許掲載公報１３欄４２〜４９行）と記載されている。そして、「トランスジェニック」とは遺伝子が導入されたことを表す用語であるから、「トランスジェニック」な組織とは遺伝子が導入された組織を意味するものと認められる。　
　そうすると、上記訂正は、訂正前の請求項１の構成要件である「相同的補体制限因子」を、特許明細書に記載された事項の範囲内において、「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている」ものに限定したものであるから、特許請求の範囲を減縮するものに該当し、新規事項を追加するものではない。　
　また、上記訂正は実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
　
３．特許異議申立についての判断　
（１）本件発明　
　上述の訂正が認められるから、本件請求項１〜３４に係る発明（以下、それぞれ本件発明１〜３４という。）は、訂正された特許明細書の特許請求の範囲の請求項１〜３４に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。　
【請求項１】　ドナー種の移植可能な動物細胞または組織であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、そして前記相同的補体制限因子は、前記移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている、医薬に使用するための前記細胞または組織。　
【請求項２】　移植治療に使用するための、請求項１に記載の細胞または組織。　
【請求項３】　組織が器官である、請求項１または２に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項４】　器官が心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓または甲状腺である、請求項３に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項５】　組織が、血液細胞もしくは造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、または内分泌器官由来の細胞を含む、請求項１または２に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項６】　古典的経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に、ＨＣＲＦが関与する、請求項１−５のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項７】　ＨＣＲＦが天然のＨＣＲＦである、請求項１−６のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項８】　ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する、請求項６に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項９】　ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項８に記載の使用のための細胞または組織：因子Ｉ（以前、Ｃ３ｂ不活性化因子またはＫＡＦとしても知られる）；因子Ｈ；Ｃ４結合タンパク質；ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）；膜共因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６としても知られ、当初はｇｐ４５−７０として記載され、そして、さらにｇｐ６６／５６としても知られる）；ＣＲ１（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体またはＣＤ３５としても知られる）；および／またはＣＲ２（ＣＤ２１、Ｃ３．ｄｇ受容体、３ｄ／ＥＢＶ受容体およびｐ１４０としても知られる）。　
【請求項１０】　ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する、請求項１−９のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１１】　ＨＣＲＦがＣ８および／またはＣ９における補体活性化を制御する、請求項６に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１２】　ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項１１に記載の使用のための細胞または組織：Ｃ８ｂｐ（ＨＲＦまたはＭＩＰとしても知られる）；Ｐ−１８（ＨＲＦ−２０、ＣＤ５９またはＭＩＲＬとしても知られる）；またはＳＰ４０．４０。　
【請求項１３】　ＨＣＲＦが膜結合している、請求項１−１２のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１４】　ＨＣＲＦが、ドナー組織上の細胞膜と融合されるように提供される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１５】　ドナー組織が、レシピエントに移植された場合に、レシピエント種中で用いられ得る１つまたはそれ以上のＨＣＲＦをコードする核酸を有しそして発現する、という点においてトランスジェニックである、請求項１４に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１６】　レシピエント種がヒトである、請求項１−１５のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１７】　ドナー種がブタである、請求項１−１６のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。　
【請求項１８】　移植可能な組織または移植可能な細胞を有するトランスジェニック動物であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子（ＨＣＲＦｓ）をコードする核酸を含みかつ発現するものであり、そして、トランジェニック動物はレシピエント種に対して不調和な種である、前記動物。　
【請求項１９】　組織が器官である、請求項１８に記載の動物。　
【請求項２０】　器官が心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓または甲状腺である、請求項１９に記載の動物。　
【請求項２１】　組織が、血液細胞もしくは造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、または内分泌器官由来の細胞を含む、請求項１８に記載の動物。　
【請求項２２】　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが、古典的経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に関与する、請求項１８−２１のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項２３】　ＨＣＲＦが天然のＨＣＲＦである、請求項１８−２２のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項２４】　ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する、請求項２２に記載の動物。　
【請求項２５】　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項２４に記載の動物：因子Ｉ（以前、Ｃ３ｂ不活性化因子またはＫＡＦとしても知られる）；因子Ｈ；Ｃ４結合タンパク質；ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）；膜共因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６としても知られ、当初はｇｐ４５−７０として記載され、そして、さらにｇｐ６６／５６としても知られる）；ＣＲ１（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体またはＣＤ３５としても知られる）；および／またはＣＲ２（ＣＤ２１、Ｃ３．ｄｇ受容体、３ｄ／ＥＢＶ受容体およびｐ１４０としても知られる）。　
【請求項２６】　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する、請求項１８−２５のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項２７】　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦがＣ８および／またはＣ９における補体活性化を制御する、請求項２２に記載の動物。　
【請求項２８】　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項２７に記載の動物：Ｃ８ｂｐ（ＨＲＦまたはＭＩＰとしても知られる）；Ｐ−１８（ＨＲＦ−２０、ＣＤ５９またはＭＩＲＬとしても知られる）；またはＳＰ４０．４０。　
【請求項２９】　ＨＣＲＦが膜結合している、請求項１８−２８のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項３０】　レシピエント種がヒトである、請求項１８−２９のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項３１】　ドナー種がブタである、請求項１８−３０のいずれか１項に記載の動物。　
【請求項３２】　請求項１８−３１のいずれか１項に記載の動物に由来する移植可能な動物細胞または組織。　
【請求項３３】　培養動物細胞または当該細胞を含む培養組織であって、当該細胞は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、前記細胞または組織。　
【請求項３４】　トランスジェニック動物を作成する方法であって、適合しない種の少なくとも１種類の同的補体制限因子をコードするＤＮＡ、並びにトランスジェニック動物の少なくともいくつかの細胞においてコードＤＮＡが発現されるのを可能にするような１種またはそれ以上の配列を、動物の遺伝子物質に導入する、ことを含む前記方法。　
　
（２）特許異議申立の理由の概要　
　異議申立人　尾関ラン子は、下記の甲第１、２号証及び参考資料１〜６を提出し、上記訂正前の本件請求項に係る発明について、請求項１〜３４に係る発明は甲第１号証及び甲第２号証刊行物に記載された発明並びに慣用技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また、本件明細書の記載には不備があり、請求項１〜５、１３、１５〜２１、２９〜３１及び３４に係る発明についての特許は特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであるから、本件請求項１〜３４に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
　　　　　　　　　　　　　　　　　記　
甲第１号証：ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ　Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，８２５−８３０，１９８８　
甲第２号証：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８８，６３，５８５−５９０　
参考資料１：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２２（３）、１０６３−１０６４，１９９０　
参考資料２：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｖｏｌ．ＸＸＸＩＩ，Ｎｏ．６，４１９−４３２，１９９０　
参考資料３：ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ　Ｖｏｌ．３１，２２６−２２７、１９８１　
参考資料４：ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ　Ｖｏｌ．６６，１４０１−１４０６，Ｎｏ．１１，１９９８　
参考資料５：Ｇｅｎｅ　１８６（１９９７）８３−８６　
参考資料６：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３８．２２１−２３０（１９９６）　
　
（３）当審が通知した取消理由　
（３−１）当審は、平成１５年３月１３日付で、上記異議申し立ての理由と同旨の理由（ただし、特許法第３６条第３項および第４項については、全請求項（請求項１〜３４）を対象とする）を取消理由として通知した。　
（３−２）当審は、また、特許権者による上記訂正請求の後、平成１６年８月１７日付で、新たな取消理由の通知を行った。その概要は、以下のとおりである。　
「１．訂正後の本件発明１〜１７および３３は、下記の刊行物１〜３に記載された発明並びに本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。　
　　　　　　　　　　　　　　　　　記　
刊行物１．ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ　Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，８２５−８３０，１９８８（異議申立人が提出した甲第１号証）　
刊行物２．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８８，６３，５８５−５９０（異議申立人が提出した甲第２号証）　
刊行物３．臨床免疫、第２１巻、第９号、第１４８７−１４９２頁、１９８９年９月２５日発行（異議申立人が提出した平成１５年９月２日付上申書に添付された参考資料Ａ）　
　
２．本件明細書の記載は不備であり、訂正後の本件発明１〜３２および３４についての特許は特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。」　
　
（４）当審が引用した刊行物に記載された事項　
刊行物１：ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ　Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，８２５−８３０，１９８８
　「不調和異種移植片の拒絶反応機構」と題する論文であり、　
（ｉ）８２５頁の要約欄に、　
「
不調和異種移植片拒絶反応の機構が、モルモット−ラット間の心臓移植モデルを用いて、研究された。
血清中の補体力価は、拒絶反応の際に、Ｃ４およびＣ２の消費を伴うことのないＣ３の有意の減少を示した。このことは、第２経路を介して補体が活性化されたことを示唆している。
インビトロでの実験は、ラットの補体が第２経路を介してモルモットの赤血球（Ｅｇｐ）を攻撃することを示した。これらの発見は、このモルモット−ラット間の不調和異種移植片モデルにおける拒絶反応が第２経路を介する補体の第一次的活性化により引き起こされたことを示している。
（ｉｉ）８２５頁右欄１〜２４行に、　
「
異種移植は、調和移植と不調和移植とに分けられる。調和移植片は、不調和移植片よりも長く生存する。
不調和移植片は自然あるいは獲得抗体およびそれに続く古典経路を介する補体の活性化により拒絶されるということが、一般に受け入れられている。
　しかしながら、抗体と古典的補体成分がこのタイプの拒絶反応に関与することの明らかな証拠は示されていない。更に、
近年の補体学の進歩は、補体系が抗体の仲介なしに外来物を認識し、これと反応することを明らかにした。この補体活性化の抗体非依存性の経路は、代替的な第２経路として特性付けされる。異種移植片が第２経路の活性化によって拒絶され得るものかどうかは、試験されたことがない。この研究で、我々は、２つのドナー・レシピエント種の組み合わせ（モルモット対非処理ラット、ハムスター対予め感作されたラット）における心臓移植を用いて、超急性拒絶反応の機構を調べた。
（ｉｉｉ）８２６頁〜の「結果」の項に、　
「不調和異種移植のインビトロ・モデルとしてのラット血清によるＥｇｐの溶解（図３）
　
ラットによるモルモットの組織の補体依存性細胞溶解を分析するために、インビトロの研究が、Ｅｇｐを標的細胞として用い、また、４種類のラット血清を用いて行われた。
インビトロにおける研究においても、モルモットの細胞が、古典経路を介してではなく、自然抗体の関与なしで活性化される第２経路を介して、ラットの血清中の補体により溶解することが示された。
（ｉｖ）８２８頁〜の「検討」の項に、　
「
この研究の目的は、３０分以内に起こる異種移植片拒絶反応の機構を明らかにすることであった。このような超急速な態様で起こる速かな拒絶反応（超急性拒絶反応と呼ばれる）は、レシピエントがドナーに対する抗体により予め感作されたときや、不調和異種移植片移植されたときに、観察されていた。
いくつかの報文が、アスピリンなどの抗血小板剤ではなく、ＣＶＦによる前処理が不調和異種移植片の生存を長引かせたことを示した。ＣＶＦ前処理による移植片生存の長期化は、われわれの超急性拒絶反応モデルにおいても、他のモデルと同様に、示された。
我々は、心臓異種移植の超急性拒絶反応の２つのモデル（不調和モデルおよび予め感作された調和モデル）を確立した。これらのモデルにおける拒絶反応に起因する血清中の補体レベルの変化が、補体活性化の経路を識別するために研究された。
調和心臓異種移植片を受けた予め感作されたラットの血清中において、Ｃ４およびＣ３の有意の減少が検出された。
Ｃ４およびＣ２の減少は、抗体に依存する方式で生ずる古典的補体経路の活性化を示た。
不調和心臓を受けた非感作ラットにおいては、Ｃ３のみが減少した。Ｃ４およびＣ２の消費を伴わないＣ３の減少は、抗体とは独立した第２補体経路の活性化の典型的プロフィール
これらの結果は、ＣＶＦがＣ４およびＣ２に何ら影響を与えることなくＣ３を枯渇させるという事実と相俟って、不調和心臓移植片の超急性拒絶反応が主にＣ３の活性化と関係していることを示している。
Ｃ３の活性化は、主に第２経路を介して生じたものと考えられる。
不調和異種移植モデルから得られた結果は、抗体が全く関与しない、第２補体経路のみによる活性化が超急性の態様で移植片の拒絶反応を引き起こすという結論に導く。
　自然抗体と第２経路の間には相関関係があることが報告されてきた。第２経路は、あるタイプの抗体によっても活性化することができる。しかしながら、もしも自然抗体の検出できないほどの量が数分以内に生じる速やかな反応を引き起こすことができるのだとしたら、驚くべきことであろう。更にまた、移植片の右心室血中においてＣ４およびＣ２が枯渇しなかったことは、抗体が欠けていたことを示唆する。右心室血中のＣ３の減少は、異種移植片が直接補体を活性化することを示している。　
　我々は、また、ある種の細胞免疫が超急性拒絶反応に寄与しているかどうかを調べた。拒絶反応を受けた心臓移植片の組織学的分析は、細胞の浸潤を示さなかった。細胞の浸潤が数分以内に生じることはないようである。更に、
他の人々により記述された結果によれば、シクロスポリンおよびアスピリンは、異種移植片の生存を長引かせるのに効果的ではない。
　
インビトロ系を用い、我々は、ラットの血清がモルモットの細胞を損傷するかどうか調べ、レシピエントの補体が移植された異種移植片を攻撃することを見いだした。ラットの血清はたやすくＥｇｐを溶解させ、また、当該溶解は第２経路のみを介して生じる。これらの結果は、我々のインビボにおける結果と一致する。
　補体活性化による拒絶反応の機構は、以下のように生じるのかもしれない。Ｃ３の活性化形態であるＣ３ｂが付着すると、それに続く成分が活性化され、結果として細胞溶解を生じる膜攻撃複合体を形成することとなる。
もしも当該細胞が補体の攻撃から保護されるならば、付着したＣ３ｂは血漿中あるいは当該細胞の表面に存在する補体制御蛋白により速やかに不活性化されるに違いない。しかしながら、異種移植片の拒絶反応においては、付着したレシピエントのＣ３ｂが活性を有したまま移植片の細胞表面に残存している。
もし仮にラットのＣ３ｂがモルモットの制御蛋白に適合するものであったなら、移植片に付着したＣ３ｂは効果的に不活性化され、引き続く第２経路の活性化は生じなかったであろう。それゆえ、移植片におけるＣ３の消費の原因となるかもしれない一つの機構は、ラットＣ３ｂがモルモットの制御蛋白と適合しないことである。補体とその制御蛋白の間の種特異的な反応についてのさらなる研究が、上述の仮説を吟味するために必要である。
（上記引用箇所における下線は、合議体によるものである。）　
刊行物２：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８８，６３，５８５−５９０
　「ヒト赤血球のＣ８−結合蛋白質：補体攻撃相の構成要素との相互関係」と題する論文であり、「Ｃ８−結合蛋白質は、ヒト赤血球の固有な膜蛋白質であり、種特異的に補体（Ｃ５ｂ−９）を介する細胞溶解を抑制する。この研究では、我々はヒト赤血球から単離したＣ８ｂｐをヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に会合させた。ヒトＣ５ｂ−９による溶血に対し通常感受性であるＳＲＢＣは、溶血に対して非感受性となった。」（５８５頁サマリー欄１〜４行）、「ヒツジ赤血球は通常、ヒト補体によって溶血する。しかし、Ｃ８ｂｐを会合させた後では、Ｃ５ｂ−９による溶解は抑制された。一方、ヒトＣ５ｂ−７や、モルモット、又はウサギＣ８、Ｃ９による溶血には影響しなかった。」（５８９頁ディスカッション欄２〜５行）、「反応メカニズムに関係なく、Ｃ８ｂｐは膜の重要な制御蛋白質のようであり、同種の補体による溶血に対して赤血球を保護している。」（５８９頁ディスカッション欄末尾３〜１行）と記載されている。　
刊行物３：臨床免疫、第２１巻、第９号、第１４８７−１４９２頁、１９８９年９月２５日発行
　「補体ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ形成阻止膜糖蛋白」と題する論文であり、　
　「補的（注．補体の誤りと認められる。）の反応系には、ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙおよびａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙの活性化反応系が存在しているが、共にＣ５を分解するＣ５ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅを形成しＣ５ａとＣ５ｂに分解する。その結果形成されたＣ５ｂは、Ｃ６と反応してＣ５ｂ６なる２分子複合体を形成することになるが、このＣ５ｂ６は、次に続く補体成分であるＣ７が反応してＣ５ｂ６７なる３分子複合体になると物理化学的特性が急変し、極めて疎水性の高い多分子複合体となる。従って、Ｃ５ｂ６７は細胞膜等の脂質二重層膜に疎水結合で吸着することになる。膜に吸着したＣ５ｂ６７には、更にＣ８及びＣ９が順次反応して、二重層膜を貫通する多分子複合体を形成し、細胞膜障害を引き起こす。この多分子複合体Ｃ５ｂ６７８９は、細胞膜障害を引き起こす複合体ということからｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＭＡＣ）と呼ぶことが多い。このＭＡＣの作用によって殺菌反応や細胞溶解反応が引き起こされる。しかし、Ｃ５ｂ６は安定な２分子複合体であり、しかもＣ５ｂが生成された、すなわち、Ｃ５がＣ５ａとＣ５ｂに分解された局所に留まることなく、Ｃ７と会合して疎水性に変換するまでは体液中を自由に拡散することができる。…従って、例え補体反応が病原細菌等の侵入異物に対して起こったとしても、Ｃ５ｂ６はＣ７との反応に手間取るようなことがあれば、侵入異物から離れた場所でＣ５ｂ６７を形成することになる。このような場合には、Ｃ５ｂ６７が吸着する細胞膜は、その近傍に居合わせた自己細胞ということになる。自己細胞に吸着したＣ５ｂ６７にそのままＣ８及びＣ９が反応すれば、補体反応による自己障害が引き起こされてしまう。即ち、病原細菌等に対する補体反応は同時に自己組織の障害を伴わざるを得ないことになる。しかし、このような自己障害を防ぐために、細胞膜上には自己補体のＭＡＣ形成を阻害する制御因子が備わっており、上記のような不要な自己組織障害が起こらない仕組みになっていることが明らかとなってきた。」（１４８７頁の「はじめに」の項）と、細胞一般の細胞膜上に備わっている、自己補体のＭＡＣ形成を阻害する制御因子について記載され、　
　そのような制御因子として、ヒト赤血球から１Ｆ５Ａｇを得たこと（１４９０頁右欄等）、そして、当該１Ｆ５Ａｇについて、「精製１Ｆ５Ａｇをモルモット赤血球（ＧＰＥ）に添加すると、効率よく膜に吸着する。この１Ｆ５Ａｇを吸着したＧＰＥ（ＧＰＥ−１Ｆ５）は、ヒト補体に対して極めて抵抗性になることが確かめられた．ＧＰＥにＣ５ｂ６７を反応させたＧＰＥ−Ｃ５ｂ６７をつくると、これはヒトＣ８及びＣ９で容易に溶血反応を起こす。そこで、Ｃ８を作用させる前後で１Ｆ５Ａｇを作用させ、どの段階で抑制効果を現すか調べたところ、Ｃ８を反応させた後から１Ｆ５Ａｇを吸着させても抑制効果を示すことが分かった。」（１４９１頁左欄下２０〜１０行）と、モルモット赤血球の細胞膜上にこれを会合させると、ヒト補体による細胞溶解が抑制されたことが記載されている。　
　
（５）当審の判断　
（５−１）特許法第２９条第２項について　
（５−１−１）本件発明１について　
　本件発明１は、「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、そして前記相同的補体制限因子は、前記移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている、医薬に使用するための前記細胞または組織。」というものである。そして、本件発明１の「医薬に使用するための細胞または組織」における「医薬」とは、移植治療に用いる生物学的材料を意味していることは明らかである。　
　これに対し、本件優先日前に頒布された刊行物１には、上述のとおり、「不調和異種移植片拒絶反応の機構が、モルモット−ラット間の心臓移植モデルを用いて、研究された。」こと、当該モデルにおける血清中の補体レベルの変化を調べた結果、「不調和心臓を受けた非感作ラットにおいては、Ｃ３のみが減少した。」こと、そして「Ｃ４およびＣ２の消費を伴わないＣ３の減少は、抗体とは独立した第２補体経路の活性化の典型的プロフィールである。」ことが記載され、これらのことから、「不調和異種移植モデルから得られた結果は、抗体が全く関与しない、第２補体経路のみによる活性化が超急性の態様で移植片の拒絶反応を引き起こすという結論に導く」ものであると考察されたことが記載されている。刊行物１には、上記モデルにより不調和異種移植片拒絶反応の機構を研究した背景について明記はされていないが、例えば、特許権者が引用する参考資料１８（Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ＆Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ．１４２（１）：２９−３２，１９７６）にも「異種移植は、異なる動物種の間での移植と定義される。遠い関係にある動物の臨床上の使用は、様々な状況において有用であろう。動物は、移植のための高価でない器官を提供するであろう。動物の器官は、病んだヒトの器官の機能を支持するために使用されるであろう。…遠い関係にある種間の器官の使用を制限する要素は、数分あるいは数時間以内に生じる器官の拒絶反応である超急性異種移植片拒絶の現象である。」（２９頁左欄１〜１５行）と記載されているように、当時既に異種移植による移植治療における超急性拒絶反応が問題とされていたことから、刊行物１が頒布された当時の技術状況を踏まえれば、刊行物１の上記研究は、「非ヒトのドナー種の動物細胞または組織」を「ドナー種に対して不調和な種であるレシピエント種に対する移植治療に用いる生物学的材料として使用する」ことを究極の目的として、不調和異種移植において生じる超急性拒絶反応の機構を研究したものととらえることができる。　
　そこで、本件発明１と刊行物１に記載された上記異種移植に関する技術的事項を対比すると、両者は、「非ヒトのドナー種の動物細胞または組織であって、ドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、移植に用いる生物学的材料として使用するための前記細胞または組織」に関するものである点で一致するが、本件発明１が「当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、前記相同的補体制限因子は、前記動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている」ことによって、移植治療の際の超過敏拒絶を抑制し、もって、当該動物細胞または組織を「移植治療」の目的で「移植可能な」ものとするものであるのに対し、刊行物１には、そのような遺伝操作について記載されておらず、ドナー種の細胞または組織をレシピエント種の相同的補体制限因子と会合させることによりレシピエント種への移植の際の超急性拒絶反応を抑制することについては記載されていない点で、相違する（なお、本件特許明細書で使用されている、異種移植における「超過敏」拒絶という用語は、この用語に関連して刊行物１が引用されている（特許掲載公報８欄２０〜４３行）ことからも明らかに、刊行物１における、異種移植に伴う「超急性」拒絶反応と同一のことを指しているものと認められるので、本異議決定では以後統一してこれを「超急性拒絶反応」と表記する。）。　
　しかしながら、刊行物１には、上述のとおり、「…モルモット−ラット間の不調和異種移植片モデルにおける拒絶反応は、第２経路を介する補体の第１次的活性化により引き起こされる。」、「不調和異種移植モデルから得られた結果は、抗体が全く関与しない、第２補体経路のみによる活性化が超急性の態様で移植片の拒絶反応を引き起こすという結論に導く。」、「補体活性化による拒絶反応の機構は、以下のように生じるのかもしれない。Ｃ３の活性化形態であるＣ３ｂが付着すると、それに続く成分が活性化され、結果として細胞溶解を生じる膜攻撃複合体を形成することとなる。もしも当該細胞が補体の攻撃から保護されるならば、付着したＣ３ｂは血漿中あるいは当該細胞の表面に存在する補体制御蛋白により速やかに不活性化されるに違いない。しかしながら、異種移植片の拒絶反応においては、付着したレシピエントのＣ３ｂが活性を有したまま移植片の細胞表面に残存している。というのは、Ｃ３ｂは、それを介してラットＣ３がモルモットの移植片により消費されたところの第２経路を活性化するために必須のものであるからである。もし仮にラットのＣ３ｂがモルモットの制御蛋白に適合するものであったなら、移植片に付着したＣ３ｂは効果的に不活性化され、引き続く第２経路の活性化は生じなかったであろう。それゆえ、移植片におけるＣ３の消費の原因となるかもしれない一つの機構は、ラットＣ３ｂがモルモットの制御蛋白と適合しないことである。補体とその制御蛋白の間の種特異的な反応についてのさらなる研究が、上述の仮説を吟味するために必要である。」と、不調和種間の異種移植における超急性拒絶反応が、第二経路を介して活性化されたレシピエント種の補体による移植されたドナー組織に対する攻撃により起こること、ドナー組織の細胞表面にレシピエントのＣ３ｂに適合する補体制御蛋白が存在すれば、Ｃ３ｂは効果的に不活性化され、引き続く第２経路の補体活性化は生じず、レシピエント種の補体によるドナー種の組織に対する攻撃は起こらないであろうこと、従って、モルモットーラット間の異種移植における超急性拒絶反応の原因の一つは、ラット（レシピエント）のＣ３ｂ（補体）とモルモット（ドナー）の補体制御蛋白の不適合であろうことが強く示唆されている。　
　刊行物１のこれらの記載は、異種移植に伴う超急性拒絶反応は、ドナー細胞の細胞表面上にレシピエントのＣ３ｂに適合する補体制御蛋白質が存在すれば、Ｃ３ｂを急速に不活性化し、引き続く第２経路の補体の活性化を妨げることにより、抑制し得る可能性があることを示唆するものである。そして、本件特許明細書にもその旨が記載されている（特許掲載公報１０欄９行〜１３欄２５行）とおり、本件優先日には、Ｃ３以降の、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成を経て細胞溶解に至る補体活性化経路、および当該経路に関与するＣ５〜Ｃ９、その活性型であるＣ５ａ、Ｃ５ｂ等の補体成分は当業者によく知られ、また、これに対する補体制御蛋白質である相同的補体制限因子も、ＭＣＰ、ＤＡＦ等、Ｃ３段階に干渉するもののみならず、Ｃ８段階においてブロックするものなど、多数のものが知られており、刊行物１の上記記載は、Ｃ３ｂを不活性化し得る補体制御蛋白質のみならず、ドナー細胞の細胞表面上に上記Ｃ３以降のレシピエントの第２経路の補体活性化を遮断し得る相同的補体制限因子が存在すれば、異種移植に伴う超急性拒絶反応を抑制し得る可能性があることをも示唆するものといえる。　
　そして、本件優先日前に頒布された刊行物２には、上述のとおり、ヒツジの赤血球にヒトの相同的補体制限因子であるＣ８ｂｐを会合させることにより、ヒトの補体Ｃ５ｂ−９によるヒツジの赤血球細胞への攻撃を抑制できたと記載され、また、同じく本件優先権主張日前に頒布された刊行物３には、上述のとおり、補体活性化によるＭＡＣ形成に基づく細胞障害のメカニズムが説明され、また、「Ｃ５ｂ６は安定な２分子複合体であり、しかもＣ５ｂが生成された、すなわち、Ｃ５がＣ５ａとＣ５ｂに分解された局所に留まることなく、Ｃ７と会合して疎水性に変換するまでは体液中を自由に拡散することができる。…従って、例え補体反応が病原細菌等の侵入異物に対して起こったとしても、Ｃ５ｂ６はＣ７との反応に手間取るようなことがあれば、侵入異物から離れた場所でＣ５ｂ６７を形成することになる。このような場合には、Ｃ５ｂ６７が吸着する細胞膜は、その近傍に居合わせた自己細胞ということになる。自己細胞に吸着したＣ５ｂ６７にそのままＣ８及びＣ９が反応すれば、補体反応による自己障害が引き起こされてしまう。即ち、病原細菌等に対する補体反応は同時に自己組織の障害を伴わざるを得ないことになる。しかし、このような自己障害を防ぐために、細胞膜上には自己補体のＭＡＣ形成を阻害する制御因子が備わっており、上記のような不要な自己組織障害が起こらない仕組みになっていることが明らかとなってきた。」（１４８７頁の「はじめに」の項）と、細胞一般の細胞膜上に備わっている自己補体のＭＡＣ形成を阻害する制御因子により、自己組織障害が起こらないメカニズムについて説明されるとともに、そのような制御因子として、ヒト赤血球から１Ｆ５Ａｇを得たこと（１４９０頁右欄等）、そして、当該１Ｆ５Ａｇについて、「精製１Ｆ５Ａｇをモルモット赤血球（ＧＰＥ）に添加すると、効率よく膜に吸着する。この１Ｆ５Ａｇを吸着したＧＰＥ（ＧＰＥ−１Ｆ５）は、ヒト補体に対して極めて抵抗性になることが確かめられた．ＧＰＥにＣ５ｂ６７を反応させたＧＰＥ−Ｃ５ｂ６７をつくると、これはヒトＣ８及びＣ９で容易に溶血反応を起こす。そこで、Ｃ８を作用させる前後で１Ｆ５Ａｇを作用させ、どの段階で抑制効果を現すか調べたところ、Ｃ８を反応させた後から１Ｆ５Ａｇを吸着させても抑制効果を示すことが分かった。」（１４９１頁左欄下２０〜１０行）と、モルモット赤血球の細胞膜上にこれを会合させると、ヒト補体による細胞溶解が抑制されたことが記載されており、当該刊行物には、ヒト由来の補体制限因子である１Ｆ５Ａｇを異種の細胞の細胞膜上に会合させると、ヒト補体の活性化が実際に抑制されることが示されているといえる。　
　してみると、不調和異種移植に用いるドナー細胞、組織に、レシピエント種の第二経路における補体活性化カスケードのいずれかの段階を抑制するレシピエント種の相同的補体制限因子を会合させることにより、ドナー細胞、組織をレシピエントに移植した際のレシピエントの補体による攻撃を抑制し、もって超急性拒絶反応を抑制することは、刊行物１、２および３の教示に基づき、当業者が容易に想起し得たことと認められる。　
　そして、そもそも相同的補体制限因子は、生体の組織を構成する細胞が自己の補体による攻撃を防ぐために、自ら産生し、細胞表面に結合させたり、周囲環境に放出するものであることを考慮すれば、ドナー種の細胞または組織とレシピエント種の相同的補体制限因子とを会合させる態様として、ドナー種の組織を構成する細胞に対しレシピエント種の相同的補体制限因子をコードする遺伝子により形質転換するなどの遺伝操作をすることにより、ドナー種の細胞によりレシピエント種の相同的補体制限因子を発現させ、細胞表面に結合した形などで産生させる態様は、むしろ当業者がまず真っ先に想起するはずのものである。　
　そして、本件優先日前には、例えば、本件特許明細書でも引用されている、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，５６４９−５６５３（１９８８）に記載されている手法等、動物細胞を形質転換し、異種の蛋白を発現させ、細胞外に分泌させたり、膜蛋白として細胞表面に発現させる手法が具体的に知られており、これらの細胞系について、異種の相同的補体制限因子を細胞表面などに発現することは、当該手法等を用いることにより適宜になし得たことと認められる。もっとも、本件特許明細書に具体的に相同的補体制限因子の発現とその補体抑制効果を確認した実施例が記載されているのは、ＣＨＯ細胞、マウス３Ｔ３繊維芽細胞などの、確立された培養細胞系だけであり、これらの細胞系はそれ自体は移植に用いられるものではないが、組織培養が可能なドナー種の細胞であれば、これと同様の手法で当該細胞を形質転換し、適宜組織培養することによって、移植可能な細胞または組織を得ようと発想する程度のことは容易に想到できる範囲を超えるものではない。　
　そして、本件特許明細書に記載された培養細胞系での実施例における実験結果は、当業者が十分予測し得る程度のものである。　
　そうすると、本件発明１のうち、組織培養が可能な細胞または組織については、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて、当業者が容易に想到し得たものとするのが相当である。　
　なお、本件発明１には、トランスジェニック動物を作成し、当該動物から移植可能な細胞または組織を採集する態様も含まれるが、そのような態様については、後に（５−２）で詳述するとおり、当業者が当該態様を容易に実施することができる程度に本件特許明細書の発明の詳細な説明が記載されていないという不備がある。　
（５−１−１−２）特許権者の主張について　
（５−１−１−２−１）特許権者は、当審の上述の第２回目の取消理由通知に対する平成１７年２月２８日付の意見書において、「本件発明前は、移植の現場においてはレシピエント種を修飾するのが常識であり、ドナー種を修飾するという本件特許発明のアイデアは当該技術分野において極めて画期的であった。」、「異種移植拒絶を解消するためにレシピエント種ではなく「ドナー種」を不調和なＨＣＲＦで遺伝子工学的に修飾すること、そして当該細胞を医薬として使用する、という本件特許発明の本質的な技術的特徴が、いずれの刊行物にも一切、記載も示唆もされていない。」旨を主張し、「極めて複雑な異種移植における拒絶反応について、仮にいくらかの知見が得られているとしても、その仕組みを解明し本質的問題を解決することは、本件特許発明前の既知の知識を単に組み合わせただけでは、決してなし得なかったのである。」と主張する。　
　しかしながら、異種移植における拒絶反応はドナー種とレシピエント種の何らかの不適合によるものであるはずであるから、これを解消するためにドナー種に何らかの修飾をすることは、レシピエント種を修飾することと並んで、ごく自然な発想であり、また、刊行物１には、本件明細書に、異種移植片拒絶を回避または軽減するために現在、実験的に採られている手段として第一に挙げられているシクロスポリンによるレシピエント免疫系の抑制処理（本件特許公報第８欄４４〜５０行）について、「シクロスポリン…は、異種移植片の生存を長引かせるのに効果的ではない。」と、あまり有効ではないことも記載されており、刊行物１には、異種移植片拒絶を回避または軽減するための新たな手法を開発する動機付けが示されてもいるといえる。　
　そして、刊行物１には、上述のとおり、不調和異種移植片に対する拒絶反応が第２経路を介した補体の活性化により引き起こされることを示す実験結果が記載され、これに基づき、補体活性化による拒絶反応の機構はＣ３の活性化とそれに続く成分の活性化により膜攻撃複合体が形成されることによるのであろうこと、そして、ドナーの補体制御蛋白がレシピエントの補体と適合するものであったなら、このような補体の活性化は生じなかったであろうことが考察されている。　
　一方、本件明細書にも「適当なＨＣＲＦ（相同的補体制限因子）のための遺伝子の、全てではないが、多くはＲＣＡ（補体活性化のレギュレーター）座に存在し、この座は染色体１の帯ｑ３２に位置づけられる［レイ−キャンポス等、ジェイ．イクスプ．メド．１６７、６６４−６６９（１９８８）］。ＨＣＲＰの命名と位置に関しては若干の混乱があるが、因子Ｃ４ＢＰ、ＣＲ１、ＤＡＦおよび因子Ｈはレイ−キャンプス等（上記引用文中）によって、および彼らの以前の研究［ジェイ．イクスプ．メド．１６６、２４６−２５２（１９８７）］において確認されている。膜補因子蛋白質（ＭＣＰ）は研究者によってはＣ４結合蛋白質（Ｃ４ＢＰ）と同義語として扱われており、これら２因子が関係するまたは同じであることが考えられる。」（特許公報第１１欄３０〜４２行）と記載され、また、特許権者が提出した参考文献２２（Ｎａｔｕｒｅ，３２５（６１０４）：ｐ．５４５−９，１９８７）に「ＤＡＦ補体ＤＮＡの分析によって、ＤＡＦメッセンジャーＲＮＡの２つのクラスを明らかにした。」と記載され、同じく参考文献２３（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８（１）：ｐ．１８１−９４，１９８８）に、「ヒト単球ｃＤＮＡライブラリーからクローンが同定された。…推定された完全長ＭＣＰタンパク質は、３４アミノ酸シグナルペプチド及び３５０アミノ酸成熟タンパク質からなる。」と記載されているように、１９８９年の本願優先日当時までには、「補体カスケードの作用をその溶解活性を減ずるまたは阻止するように調節する物質」である相同的補体制限因子について、その機能や、分子構造、それをコードする遺伝子などについて解明が進みつつあり、本件の実施例において用いられているＤＡＦ、ＭＣＰの遺伝子なども公知であり、また、例えば本願明細書にも引用されている、ＤＡＦの変異体に関する１９８７年に公開されたヨーロッパ特許公開２４４２６７号明細書（特許公報１５欄３６〜３９行）にも、「意外にも、本発明者は、ＤＡＦｍＲＮＡの細胞プロセッシングの研究中に、膜結合形のＤＡＦ（ｍＤＡＦ）のみがインビボにおける発現系ではないことを見いだした。」（対応するファミリーの特開昭６３−１０２６９９号公報５頁左上欄１４〜１７行）、「ＤＡＦの発現にとって好適な宿主細胞は多核細胞生物から導かれた細胞の培養物である。…有用な哺乳類のセルラインには例えば、ＶＥＲＯ細胞，Ｈｅｌｌａ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞…の各セルラインが含まれる。」（同１２頁右下欄下３行〜１３頁左上欄下２行）、「ｍＤＡＦは、メドフらの方法を用いて、形質転換細胞の膜から回収される。」（同１３頁右上欄下１行〜左下欄２行）と記載されているように、それらがインビボにおいて主に膜結合形で発現すること、また、その遺伝子で哺乳動物細胞のセルラインを形質転換させると主に膜蛋白として発現することも、当業者によく知られていたものといえる。　
　そして、刊行物２、３には、上述のとおり、ヒツジやモルモットの赤血球にヒトの補体制限因子を会合させると、ヒト補体によるこれらの細胞溶解が抑制されたと記載され、異種の細胞に補体制限因子を会合させることにより、これに対し相同的な補体による細胞溶解が実際に抑制されることが示されている。　
　本件優先日当時のこれらの技術常識および刊行物２、３による知見を踏まえれば、不調和な種間の異種移植における超急性拒絶反応を抑制するために、当該移植に用いるドナー種の動物細胞または組織に対し、レシピエント種において補体の完全活性化を抑制し得る相同的補体制限因子を遺伝子操作によって導入し、ドナー種の細胞表面において当該相同的補体制限因子を発現させることは、刊行物１に記載された技術的事項に基づいて当業者が容易に想起し得たことというべきである。　
　そして、本件特許発明に関し本件特許権者が本件出願時点までに実際に行ったのは、本件特許明細書によれば、（ｉ）ヒト細胞ライン（Ｔ５）およびヒト−マウス・ハイブリドーマ細胞ライン（Ｂ１０）にはヒトＤＡＦが発現し、これらの細胞はインビトロにおいて抗体の存在下、ヒト補体を添加しても溶解しないことを確かめたこと（実施例７）、（ｉｉ）形質転換によりＭＣＰあるいはＤＡＦの遺伝子を導入した哺乳動物細胞ラインの培養細胞が、インビトロにおいて抗体の存在下、ヒト補体による細胞溶解を免れたことを確かめたこと（実施例８〜１０）、および、（ｉｉｉ）尾細胞のＤＮＡがＭＣＰあるいはＤＡＦのヒト標識ｃＤＮＡプローブに陽性のトランスジェニックマウスを得たこと（実施例１１〜１４）だけであるが、これらのうち（ｉ）と（ｉｉ）は、形質転換により哺乳動物細胞ラインの細胞表面においてヒトの相同的補体制限因子が発現するという上記ヨーロッパ特許公開明細書にも記載されている事実と、刊行物２、３に記載された上記事項から、当業者が容易に予測し得る範囲のことに過ぎない。また、（ｉｉｉ）についても、下記の（５−２）において詳述するように、本件優先日の技術常識に基づいて当業者が容易に予測し得る範囲のことである。　
　本件特許明細書に記載されたこれらの実験結果から、移植治療に使用し得るドナー細胞や組織についても、これを形質転換することにより同種の効果が得られることはある程度期待されるとしても、本件明細書において、移植治療に使用し得るドナー細胞や組織を遺伝操作し、それにより不調和なレシピエントに対し異種移植を行った際に実際にインビボにおいて超急性拒絶を受けない細胞や組織が得られたことが確認されていない以上、請求人が主張するように「極めて複雑な」ものであることが想定された異種移植における拒絶反応の本質的問題が、本件出願時に本件発明において解決されたとまではいえないものであり、本件発明が従来技術から予測し難い格別の効果を奏するものとはいえない。　
（５−１−１−２−２）特許権者は、また、上記意見書において、「移植の拒絶反応において補体が関与していることが知られたのは本件の優先日よりもずっと以前のことである。」と、１９７６年に頒布された特許権者提出の上述の参考資料１８を引用して主張し、「仮に「移植の拒絶反応において補体が関与することが知られていれば、ドナー種の細胞によりレシピエント種の相同的補体制限因子を発現させ、細胞表面に結合した形などで産生させる態様は、当業者がまず真っ先に想起するはずである」とすれば、なぜ、１３年間も本件特許発明を想到できなかったのか、合理的な理由がない限り理解できない。」と主張する。　
　しかしながら、移植の拒絶反応において補体が関与することが知られていても、補体系の完結を妨げる相同的補体制限因子について、それをコードする遺伝子などの知識が不十分であれば、ドナー種の細胞によりレシピエント種の相同的補体制限因子を発現させる態様が実現できないのは明らかである。そして、本願実施例で採用されているＤＡＦやＭＣＰなどの相同的補体制限因子について、その遺伝子などの詳細が明らかになったのは、上述のとおり本願優先日の数年前にすぎないのであるから、特許権者の上記主張は妥当なものとはいえない。　
　
（５−１−２）本件発明２〜１７について　
（５−１−２−１）本件発明２〜５　
　本件発明２〜５は、本件発明１の「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織」について、「移植治療に使用するための」ものであること、「組織が器官」であること、「器官が心臓、肺…」であること、「組織が血液細胞…の細胞を含む」ものであることを、それぞれ特定するものである。　
　移植治療が移植可能な動物細胞または組織の主要な用途であることは明らかであり、心臓等の器官や血液細胞等の細胞が移植治療の対象となることも明らかであるから、ドナー種のこれらの細胞、組織のうち、組織培養が可能なものについては、遺伝操作された移植可能な細胞、組織を得ることは、本件発明１と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たことである。　
（５−１−２−２）本件発明６〜１５　
　本件発明６〜１５は、本件発明１の「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織」について、「古典経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に、ＨＣＲＦ（相同的補体制限因子）が関与する」ものであること、「ＨＣＲＦが天然のものである」こと、「ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する」ものであること、「ＨＣＲＦが、ＤＡＦ、ＭＣＰ…であるか、またはその活性を有するものである」こと、「ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する」ものであること、「ＨＣＲＦがＣ８及び／またはＣ９における補体活性化を制御する」ものであること、「ＨＣＲＦが、Ｃ８ｂｐ…であるか、またはその活性を有するものである」こと、「ＨＣＲＦが膜結合している」こと、「ＨＣＲＦが、ドナー組織上の細胞膜と融合されるように提供される」ものであること、「ドナー組織が、レシピエントに移植された場合に、レシピエント種中で用いられ得る１つまたはそれ以上のＨＣＲＦをコードする核酸を有しそして発現する、という点においてトランスジェニックである」ものであることを、それぞれ特定するものである。　
　補体カスケードにおいて、Ｃ３が関与する以降の過程は、古典経路と第二経路の双方に共通であり、ＤＡＦ、ＭＣＰ、Ｃ８ｂｐ等がこれらの過程に関与するＨＣＲＦであり、その中には染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在するものがあること、また、それらの多くは細胞膜に結合するなどして細胞膜上に存在することもよく知られており、これらの多くについては配列等の情報も公知である。そして、古典経路と第二経路のいずれに基づく拒絶反応についてもこれを抑止するためには、これらの経路の双方に共通のＣ３が関与する以降の過程を抑制することが適していることも明らかである。　
　したがって、組織培養が可能なドナー種の細胞について、ＨＣＲＦとしてこれらのものを用いようと想起する程度のことは、本件発明１と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たことである。　
　そして、本件特許明細書には、これらの多くについて具体的実施例がなく、これらの効果が従来技術から予測できる範囲を超える格別のものということもできない。　
（５−１−２−３）本件発明１６、１７　
　本件発明１６、１７は、本件発明１の「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織」について、「レシピエント種がヒトである」こと、また、「ドナー種がブタである」ことを、それぞれ特定するものである。　
　異種移植は、通常ヒトをレシピエントとして行われることが多く、また、ブタはドナー種としてよく用いられるものである。そして、ヒトのＨＣＲＦとして、本件クレームに含まれる多数のものの配列が知られているから、これを用いて組織培養が可能なブタの細胞を形質転換し、移植可能な細胞または組織を得ようと想起する程度のことは、本件発明１と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得ることである。　
　そして、本件特許明細書には、これらについて具体的実施例がなく、これらの効果が従来技術から予測できる範囲を超える格別のものということもできない。　
　
（５−１−３）本件発明３３について　
　本件発明３３は、「培養動物細胞または当該細胞を含む培養組織であって、当該細胞は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、前記細胞または組織。」というものである。　
　本件特許明細書には、本件発明の移植可能な培養細胞及び組織について、具体的な名称が何も記載されていないので、どのような細胞、組織を意図しているのか明らかではないが、組織培養が可能なドナー種の細胞であれば、本件発明１について上述したとおり、これに対してレシピエント種の相同的補体制限因子をコードする遺伝子により形質転換するなどの遺伝操作を行い、ドナー種の細胞によりレシピエント種の相同的補体制限因子を発現させ、細胞表面に結合した形などで産生させることにより、ドナー細胞、組織をレシピエントに移植した際のレシピエントの補体による攻撃を防止し、もって超急性拒絶反応を抑制することは、当業者が容易に想到し得たことと認められる。　
　また、本件発明３３は、相同的補体制限因子の会合の態様を本件発明１のようにドナー種の細胞の遺伝操作によるものに限定してはおらず、例えば刊行物２、３に記載されているような、レシピエント種の相同的補体制限因子をドナー種の細胞に吸着させる態様をも含むものであるが、このような態様についても、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先権主張日当時の技術水準に基づいて当業者が容易に想到し得たものである。　
　したがって、本件発明３３は、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものと認められる。　
　
（５−１−４）特許法第２９条第２項について、まとめ　
　以上のとおりであるから、本件発明１〜１７および３３は、本件優先日前に頒布された刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。　
　
（５−２）特許法第３６条第３項について　
（５−２−１）本件発明１〜１７について　
　本件発明１〜１７の「非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織」には、例えば本件発明４のように心臓等の器官も含まれるものであることからみて、本件発明１〜１７は、上記細胞または組織を、そのような細胞または組織を有するトランスジェニック動物から採集する態様をも含むものと認められる。　
　しかしながら、以下の（５−２−２）に詳述するように、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、「移植可能な組織または移植可能な細胞を有するトランスジェニック動物であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子（ＨＣＲＦｓ）をコードする核酸を含みかつ発現するものであり、そして、トランジェニック動物はレシピエント種に対して不調和な種である、前記動物。」を容易に得ることができる程度に記載されているものと認められない。　
　したがって、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、本件発明１〜１７の上記態様について当業者が容易に実施できる程度に記載されていない。　
　
（５−２−２）本件発明１８について　
　本件発明１８は、「移植可能な組織または移植可能な細胞を有するトランスジェニック動物であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子（ＨＣＲＦｓ）をコードする核酸を含みかつ発現するものであり、そして、トランジェニック動物はレシピエント種に対して不調和な種である、前記動物。」というものである。　
　本件発明１について上述したとおり、ドナー種の組織を構成する細胞に対してレシピエント種の相同的補体制限因子をコードする遺伝子により形質転換するなどの遺伝操作を行い、ドナー種の細胞によりレシピエント種の相同的補体制限因子を発現させ、細胞表面に結合した形などで産生させることにより、ドナー細胞、組織をレシピエントに移植した際のレシピエントの補体による攻撃を防止し、もって超急性拒絶反応を抑制することは、当業者が容易に想起し得たことと認められる。　
　そして、本件優先日当時には、数種類の哺乳動物について、ＥＳ細胞などの個体に生育させることができる細胞を形質転換し、生体に成育させ、交配を繰り返すことによりトランスジェニック動物を得、当該トランスジェニック動物において目的蛋白を適切に発現させることができた成功事例が複数例知られていたことは、特許権者も主張するとおりであるから、ドナー種のＥＳ細胞などについてもこれらに用いられた手法のいずれかを適用して、レシピエント種の相同的補体制限因子を適切に発現するドナー組織を得るためのトランスジェニック動物を作成しようと試みる動機付けがあることまでは認められる。　
　しかしながら、本件特許明細書に、ドナー種のトランスジェニック動物について、具体的に実施例が記載されているのは、マウスの受精卵に対しＳＦＦＶ．ｎｅｏをベクターとしてヒトＭＣＰあるいはヒトＤＡＦのｃＤＮＡをミクロ注入により導入し、当該受精卵から得られたマウス及びその仔マウスの尾細胞をヒトＭＣＰあるいはヒトＤＡＦのｃＤＮＡをプローブとしてＤＮＡ分析した結果、これらのマウスの中には陽性反応を示すものがあったということだけであり、当該細胞においてヒトＭＣＰ、ヒトＤＡＦの発現を確認していないから（実施例１０〜１４）、本件特許明細書には、トランスジェニック動物において、レシピエント種の相同的補体制限因子を遺伝操作により導入し、当該因子を適切に発現させることについては、実施例が記載されているとはいえない。そして、実施例１０〜１４は、プローブとの反応性を見ただけであるから、これらのマウスにヒトＭＣＰ、ヒトＤＡＦの全長ＤＮＡが存在するかどうかさえ定かとはいえず、このような手法により、実際に、必要な細胞、組織においてレシピエント種の相同的補体制限因子を適切に発現し、もって当該細胞、組織を不調和異種移植に用いることができるようなトランスジェニック動物が得られたか、否かは、定かではない。　
　そして、必要な細胞、組織においてレシピエント種の相同的補体制限因子を適切に発現するトランスジェニック動物を得るには、単に当該遺伝子を導入し、遺伝できるようにさせるだけでは足りず、例えば、分化、発生などに際し、不要時に発現すれば、成育に悪影響が生じることも想定でき、反対に必要時に十分発現しなければ、十分な補体抑制効果を得ることができないから、各組織に応じた適切なプロモーターの選択など、当該遺伝子を適時に適切に発現させるための工夫等が必要と考えられる。事実、異議申立人が引用する参考資料４〜６によれば、本件出願後、数年が経過した１９９８年の時点においても、トランスジェニック動物によりＭＣＰを適切に発現することが困難であったものと認められる。また、特許権者が引用する参考資料７〜１５および１７によれば、レシピエント種の相同的補体制限因子を適切に発現するトランスジェニック動物が得られたのは、いずれも、本件出願後数年を経た後のことであり、しかも、それに用いた手法は、本件特許明細書に記載された上記手法とは異なるものである。　
　これらのことを踏まえれば、本件出願時には、所望するトランスジェニック動物を確実に得ることができるような技術水準にあったとはいえず、レシピエント種の相同的補体制限因子をドナー種の動物に導入し、当該因子を適切に発現させるための具体的な手法、条件等について記載されていない本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているということはできないとするのが相当と認められる。　
　これにつき、特許権者の提出した参考資料１６（Ｋｕｒｔ  Ｂｕｅｒｋｉ氏による供述宣誓書）において、宣誓者は、特許明細書に記載されたＳＦＦＶ．ｎｅｏをベクターとする手法を用いれば、他の組み換え蛋白に関する成功例からみて、本件においても相同的補体制限因子を適切に発現するトランスジェニック動物が得られるであろうこと、また、特許権者が提出した参考資料８、１１、１２、１７においてヒトＤＡＦを発現するトランスジェニック・ブタを得るために用いられているミニジーンを組み込む手法に関連しては、このようなミニジーンを組み込む手法は他の組み換え蛋白を発現するトランスジェニック動物を得る手法として本件優先日当時すでに公知であった旨を述べている。　
　しかしながら、特許権者は、本件明細書の実施例１０〜１４の手法により不調和なレシピエント種に移植可能な細胞または組織を有するトランスジェニック動物が実際に得られることを示しておらず、また、参考資料８、１１、１２、１７は本件出願の４〜８年後の１９９４年〜１９９８年に頒布されたものであり、当該資料において採用されている手法自体は他の蛋白質について本件優先日当時公知であったとしても、そのことは、本件優先日当時に知られていた他の蛋白質についての成功事例に用いられた手法のうちの一つを用いてヒトＤＡＦを発現するトランスジェニック・ブタが得られたことを示すに留まるものであり、本件発明に適用すべきものとしてそのような手法が本件明細書に記載されているわけでもないから、当業者が本件明細書の記載に基づき本件発明１８を容易に実施することができることの根拠にはならない。また、ヒトの補体制限因子を適切に発現するトランスジェニック動物が本件出願後に実際に得られたとしても、本件出願時に所望するトランスジェニック動物を確実に得ることができるような技術水準にあったとはいえない以上、そのことをもって、本件出願時に、そのようなトランスジェニック動物の作成が確実に成功すると期待できるということにはならない。　
　なお、仮に、本件の遺伝操作について格別の工夫は必要なく、本件優先日当時に知られていた他の蛋白質についての成功事例に用いられた任意の手法を単に適用することにより、本件発明１８のトランスジェニック動物が得られるのであれば、ドナー種の細胞等にレシピエント種の相同的補体制限因子を遺伝操作によって導入することにより当該ドナー種の細胞等を不調和なレシピエント種に移植可能なものとすることを発想すること自体は（５−１−１）において本願発明１について上述したとおり刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものであるから、本件発明１８もまた、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
　
（５−２−３）本件発明１９〜３２について　
（５−２−３−１）本件発明１９〜２１　
　本件発明１９〜２１は、本件発明１８の「移植可能な組織または細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物」について、「組織が器官」であること、「器官が心臓、肺…」であること、「組織が血液細胞…の細胞を含む」ものであることを、それぞれ特定するものである。　
　上述のとおり、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているということができないから、このような動物が得られることを前提とする本件発明１９〜２１についても、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が当該発明を容易に実施することができる程度に記載されているということができない。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているといえるのであれば、移植治療が移植可能な動物細胞または組織の主要な用途であることは明らかであり、心臓等の器官や血液細胞等の細胞が移植治療の対象となることも明らかであるから、本件発明１８について、これらの事項を特定する本件発明１９〜２１は、本件発明１８と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
（５−２−３−２）本件発明２２〜２９　
　本件発明２２〜２９は、本件発明１８の「移植可能な組織または細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物」について、「レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが、古典経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に関与する」ものであること、「ＨＣＲＦが天然のものである」こと、「ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する」ものであること、「レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが、ＤＡＦ、ＭＣＰ…であるか、またはその活性を有するものである」こと、「レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する」ものであること、「レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦがＣ８及び／またはＣ９における補体活性化を制御する」ものであること、「レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが、Ｃ８ｂｐ…であるか、またはその活性を有するものである」こと、「ＨＣＲＦが膜結合している」ことを、それぞれ特定するものである。　
　上述のとおり、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているということができないから、このような動物が得られることを前提とする本件発明２２〜２９についても、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が当該発明を容易に実施することができる程度に記載されているということができない。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているといえるのであれば、（５−１−２−２）において本件発明６〜１５について上述したとおり、補体カスケードにおいて、Ｃ３が関与する以降の過程は、古典経路と第二経路の双方に共通であり、ＤＡＦ、ＭＣＰ、Ｃ８ｂｐ等がこれらの過程に関与するＨＣＲＦであり、その中には染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在するものがあること、また、それらの多くは細胞膜に結合するなどして細胞膜上に存在することもよく知られており、これらの多くについては配列等の情報も公知であり、そして、古典経路と第二経路のいずれに基づく拒絶反応についてもこれを抑止するためには、これらの経路の双方に共通のＣ３が関与する以降の過程を抑制することが適していることも明らかであるから、本件発明１８において移植可能な組織または細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物が有するべき、レシピエント種において使用できるＨＣＲＦとして、これらのものを用いることを特定する本件発明１９〜２１は、本件発明１８と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たことといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
（５−２−３−３）本件発明３０、３１　
　本件発明３０、３１は、本件発明１８の「移植可能な組織または細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物」について、移植の「レシピエント種がヒトである」こと、また、移植の「ドナー種がブタである」ことを、それぞれ特定するものである。　
　上述のとおり、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているということができないから、このような動物が得られることを前提とする本件発明３０、３１についても、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が当該発明を容易に実施することができる程度に記載されているということができない。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているといえるのであれば、（５−１−２−３）において本件発明１６、１７について上述したとおり、異種移植は、通常ヒトをレシピエントとして行われることが多く、また、ブタはドナー種としてよく用いられるものであり、そして、ヒトのＨＣＲＦについては、本件クレームに含まれる多数のものについて配列等の情報が知られているから、本件発明１８においてヒトの相同的補体制限因子の遺伝子を用いて移植可能な組織または細胞を有するトランスジェニック豚を得ることを特定する本件発明１９〜２１は、本件発明１８と同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たことといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
（５−２−３−４）本件発明３２　
　本件発明３２は、本件発明１８〜３１のいずれかに係る動物に由来する移植可能な動物細胞または組織というものである。　
　上述のとおり、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているということができないから、このような動物が得られることを前提とする本件発明３２についても、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が当該発明を容易に実施することができる程度に記載されているということができない。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８を容易に実施することができる程度に記載されているといえるのであれば、「移植可能な組織または細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物」に係る本件発明１８〜３１は、上述のとおり、刊行物１〜３に記載された発明に基づいて当業者が容易に想到し得るものであるから、これらの動物由来の「移植可能な組織または細胞」についての本件発明３２も、これらと同様に、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得るものといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
　
（５−２−４）本件発明３４について　
　本件発明３４は、「トランスジェニック動物を作成する方法であって、適合しない種の少なくとも１種類の同的補体制限因子をコードするＤＮＡ、並びにトランスジェニック動物の少なくともいくつかの細胞においてコードＤＮＡが発現されるのを可能にするような１種またはそれ以上の配列を、動物の遺伝子物質に導入する、ことを含む前記方法。」というものである。　
　上述のとおり、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が本件発明１８に係るトランスジェニック動物を容易に作成することができる程度に記載されているということができないから、このような動物を作成する方法に係る本件発明３４についても、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が当該発明を容易に実施することができる程度に記載されているということができない。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８に係るトランスジェニック動物を容易に作成することができる程度に記載されているといえるのであれば、本件発明３４は、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
　
（５−２−５）特許法第３６条第３項について、まとめ　
　以上のとおりであるから、本件発明１〜３２および３４についての特許は特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。　
　なお、仮に、本件特許明細書の発明の詳細な説明が、当業者が本件発明１８に係るトランスジェニック動物を容易に作成することができる程度に記載されているといえるのであれば、本件発明１〜１７のトランスジェニック動物を前提とする態様、ならびに本件発明１８〜３２および３４は、刊行物１〜３に記載された発明および本件優先日当時の技術常識に基づいて当業者が容易に想到し得たものといえ、その特許は平成１５年３月１３日付で通知した先の取消理由により取り消すべきものである。　
　
（６）むすび　
　以上のとおりであるから、本件発明１〜１７および３３の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、特許法第１１３条第２号に該当し、また、本件発明１〜３２および３４についての特許は特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、特許法第１１３条第４項に該当するので、本件発明１〜３４の特許は、取り消すべきものである。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
改質生物学的材料
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　非ヒトのドナー種の移植可能な動物細胞または組織であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、
そして前記相同的補体制限因子は、前記移植可能な動物細胞または組織に遺伝操作によって導入されている、
　【請求項２】
　移植治療に使用するための、請求項１に記載の細胞または組織。
　【請求項３】
　組織が器官である、請求項１または２に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項４】
　器官が心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓または甲状腺である、請求項３に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項５】
　組織が、血液細胞もしくは造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、または内分泌器官由来の細胞を含む、請求項１または２に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項６】
　古典的経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に、ＨＣＲＦが関与する、請求項１−５のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項７】
　ＨＣＲＦが天然のＨＣＲＦである、請求項１−６のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項８】
　ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する、請求項６に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項９】
　ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項８に記載の使用のための細胞または組織：
　因子Ｉ（以前、Ｃ３ｂ不活性化因子またはＫＡＦとしても知られる）；
　因子Ｈ；
　Ｃ４結合タンパク質；
　ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）；
　膜共因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６としても知られ、当初はｇｐ４５−７０として記載され、そして、さらにｇｐ６６／５６としても知られる）；
　ＣＲ１（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体またはＣＤ３５としても知られる）；および／または
　ＣＲ２（ＣＤ２１、Ｃ３．ｄｇ受容体、３ｄ／ＥＢＶ受容体およびｐ１４０としても知られる）。
　【請求項１０】
　ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する、請求項１−９のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１１】
　ＨＣＲＦがＣ８および／またはＣ９における補体活性化を制御する、請求項６に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１２】
　ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項１１に記載の使用のための細胞または組織：
　Ｃ８ｂｐ（ＨＲＦまたはＭＩＰとしても知られる）；
　Ｐ−１８（ＨＲＦ−２０、ＣＤ５９またはＭＩＲＬとしても知られる）；または
　ＳＰ４０．４０。
　【請求項１３】
　ＨＣＲＦが膜結合している、請求項１−１２のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１４】
　ＨＣＲＦが、ドナー組織上の細胞膜と融合されるように提供される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１５】
　ドナー組織が、レシピエントに移植された場合に、レシピエント種中で用いられ得る１つまたはそれ以上のＨＣＲＦをコードする核酸を有しそして発現する、という点においてトランスジェニックである、請求項１４に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１６】
　レシピエント種がヒトである、請求項１−１５のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１７】
　ドナー種がブタである、請求項１−１６のいずれか１項に記載の使用のための細胞または組織。
　【請求項１８】
　移植可能な組織または移植可能な細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物であって、当該細胞または組織は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子（ＨＣＲＦｓ）をコードする核酸を含みかつ発現するものであり、そして、トランジェニック動物はレシピエント種に対して不調和な種である、前記動物。
　【請求項１９】
　組織が器官である、請求項１８に記載の動物。
　【請求項２０】
　器官が心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓または甲状腺である、請求項１９に記載の動物。
　【請求項２１】
　組織が、血液細胞もしくは造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、または内分泌器官由来の細胞を含む、請求項１８に記載の動物。
　【請求項２２】
　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが、古典的経路と第二経路の双方に共通の補体活性化カスケードの部分に関与する、請求項１８−２１のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項２３】
　ＨＣＲＦが天然のＨＣＲＦである、請求項１８−２２のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項２４】
　ＨＣＲＦがＣ３における補体活性化を制御する、請求項２２に記載の動物。
　【請求項２５】
　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項２４に記載の動物：
　因子Ｉ（以前、Ｃ３ｂ不活性化因子またはＫＡＦとしても知られる）；
　因子Ｈ；
　Ｃ４結合タンパク質；
　ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）；
　膜共因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６としても知られ、当初はｇｐ４５−７０として記載され、そして、さらに９Ｐ６６／５６としても知られる）；
　ＣＲ１（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体またはＣＤ３５としても知られる）；および／または
　ＣＲ２（ＣＤ２１、Ｃ３．ｄｇ受容体、３ｄ／ＥＢＶ受容体およびｐ１４０としても知られる）。
　【請求項２６】
　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが天然ＨＣＲＦの活性を有し、当該天然ＨＣＲＦの遺伝子は、染色体１のバンドｑ３２に位置するＲＣＡ（補体活性化の制御因子）座に存在する、請求項１８−２５のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項２７】
　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦがＣ８および／またはＣ９における補体活性化を制御する、請求項２２に記載の動物。
　【請求項２８】
　レシピエントに存在する場合には、ＨＣＲＦが以下のものであるか、またはその活性を有するものである、請求項２７に記載の動物：
　Ｃ８ｂｐ（ＨＲＦまたはＭＩＰとしても知られる）；
　Ｐ−１８（ＨＲＦ−２０、ＣＤ５９またはＭＩＲＬとしても知られる）；または
　ＳＰ４０．４０。
　【請求項２９】
　ＨＣＲＦが膜結合している、請求項１８−２８のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項３０】
　レシピエント種がヒトである、請求項１８−２９のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項３１】
　ドナー種がブタである、請求項１８−３０のいずれか１項に記載の動物。
　【請求項３２】
　請求項１８−３１のいずれか１項に記載の動物に由来する移植可能な動物細胞または組織。
　【請求項３３】
　非ヒトの培養動物細胞または当該細胞を含む培養組織であって、当該細胞は、補体の完全活性化を抑制するためにレシピエント種において使用できる１種またはそれ以上の相同的補体制限因子と会合しており、そしてドナー種はレシピエント種に対して不調和な種である、前記細胞または組織。
　【請求項３４】
　非ヒトのトランスジェニック動物を作成する方法であって、適合しない種の少なくとも１種類の同的補体制限因子をコードするＤＮＡ、並びにトランスジェニック動物の少なくともいくつかの細胞においてコードＤＮＡが発現されるのを可能にするような１種またはそれ以上の配列を、動物の遺伝子物質に導入する、ことを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は、移植に用いるための生物学的に適合する材料及びこのような材料の製造法と使用法に関する。
　欠損した又は不完全な動物（特にヒト）の器官を含めた組織の補充はこの４０年間にわたって臨床医学における一般的な療法になっている。これらの補充療法は、例えばデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）によって商標ＤＡＣＲＯＮで販売されているポリエチレンテレフタレートの不完全血管の修復への使用から、閉塞動脈をバイパスするため及び一人の人から他の人への心臓移植のための自家移植片としての伏在静脈の使用までの範囲である。
　器官移植は、比較的安い費用での高い成功率の達成を可能にする近代的な免疫抑制剤によって、著しい発展を遂げている。器官移植の要望は急激に増大している。現在、世界で年間２０，０００件を越える器官移植が行われている。しかし、これは現在の判断基準によって評価したニーズの約１５％を表すにすぎない。あらゆる種類のドナー器官の供給／需要比は既存供給源から満たされることはできない。このことは心臓移植の需要によって最も良く説明されると思われる。１９６７年のバーナード（Ｂａｒｎａｒｄ）による最初の心臓移植はかなり新聞で報道された。１年以内に、１０１件の心臓移植が２２カ国において異なる６４手術チームによって実施された。得られた芳しくない結果には幻滅が伴い、１９７０年代初期には世界で年間３０件に満たない移植が実施されたにすぎない。しかし、シクロスポリン免疫抑制剤の導入は心臓移植に大変革をもたらし、現在では大抵のセンターが１年間移植組織の８０％を越える心臓移植成功率（及び患者生存率）を期待することができる。専門技術が獲得されるにつれて、この生存率がさらに上昇することが妥当に期待される。この処置の成功は、当然、需要をさらに高め、医学専門家と一般大衆は心臓移植が実際に死に代わる手段であることをますます知るようになり、ますます多くの患者がこの処置を望むようになる。現在、年間２，０００件を越える心臓移植が実施されている。
　今日では、心臓移植における最大の死亡危険性は適当なドナー器官が入手可能に成るのを待つ間である。人工心臓はこれらの患者に短期間のサポート装置を提供するが、より多くの心臓移植センターとより大きいドナー供給とが長期間望まれている。心臓移植から恩恵を受ける個人の考えられる数は決して科学的には確認されていないが、心臓移植のニーズの発表された推定値は選択基準、受容者の年齢、疾患等に依存して大ざっぱに年間１００万人につき５０〜２５０人の範囲であった。実際の数字が如何なるものであっても、現在のドナー供給のオプションが要求を満たすことができないことは、極めて明らかである。腎臓移植と肝臓移植に関しても同様な考察をすることができ、膵臓又はランゲルハンス島の移植が糖尿病治療のための広く受け入れられる治療方法に成るならば、この組織の不足も重要な関心事になると思われる。
　現在の移植療法には他の欠点も存在する。特に、多くの器官のドナー自体が移植される器官以外の器官への損傷によって死亡した、何らかの事故（例えば、交通事故）の犠牲者であるために、ドナー器官が移植への使用に適するとは必ずしも限らず、また移植されるべき器官への付加的損傷又は付随する問題が存在することもある。
　さらに、ドナーからの器官の予想できない入手性のために、移植手術は予め上演時間を定められた手術を含むルーチン手術として予定することがしばしばできない。あまりにも頻繁に、手術チームと病院管理者はドナー器官が確認された瞬間に反応し、労働時間外の時間に働かなければならず、それによって経営上及び個人的な困難さが増大している。
　心臓、肝臓及び肺の移植の場合には、拒絶が生ずるならば、別の適当なドナーが偶然にも短時間内に入手可能にならないかぎり、再移植は通常不可能である。
　上記の医学的困難さを別として、現在の移植の実際は社会的困難さを含む場合がある。第一に、可能なドナーから器官を取り出すことに対する宗教的異議が、特に生まれ変わりを信じる文化において存在する。特に国によっては同意が必要である場合に、死者から器官を取り出すことに対して生ずる倫理的及び社会的困難さが当然存在する。最後に、生活腎臓ドナーの商取引の出現は、特に第三世界の国において、懸念を生じており、このような取引を抑制又は減ずることが社会的に望ましい。
　その欠点に関して上述したような、通常の移植手術は特定の種の１動物（一般にヒト）から同じ種の他の動物への移植を含む。このような移植は同種移植と呼ばれる。上述したような、通常の同種移植組織供給に関する困難さのために、移植に異種移植組織を用いることの可能性に注目が集中している。異種移植は細胞及び器官を含めた組織の、種間の障壁を越えての、移植に一般に用いられる包括的な用語である。
　治療的補充スケジュールにおける異種移植組織の成功した使用の幾つかの例が既に存在する。例えば、最近では大動脈弁置換へのブタ組織の使用、重度火傷患者のカバーへのブタ皮膚及び置換静脈移植片としてのウシ臍静脈の使用が実証されている。しかし、これらの異種移植片の全てが共通して１問題を有している：すなわち、これらは機械的な置換を形成するにすぎない。使用組織は生物学的に非機能的である。これに対する理由は、ヒトに存在する免疫プロセスが直ちに（数分間又は数時間内に）大抵の種からの組織の細胞的完全性を破壊するからである。このような異種移植片は不調和異種移植片として知られる。
　この破壊の残忍性は系統発生的に関連する。従って、ヒトに密接に関係する霊長類であるチンパンジーからの組織は同種移植片と殆ど同様にヒトの中で生き残ることができる；このような異種移植片は調和異種移植片として知られる。
　調和異種移植片は同種移植片に伴う困難さに対する答えを与えると考えられるが、実際には事実は恐らくこの通りではない。チンパンジーはヒトよりも非常に小さく、チンパンジー器官は一般に、ヒトにおいて機能するほど充分に大きくはない。腎臓の場合には、このことは欠陥ヒト腎臓の置換に２個のチンパンジー腎臓を移植することによって解決されるが、腎臓と心臓に関しては、これは明らかに不可能である。さらに、チンパンジーは本来緩慢に繁殖し、捕らわれ状態では繁殖が不充分であるので、実験動物としてのチンパンジーの需要［特に、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の研究の現在の領域では］は、依然として需要が供給を上回っていることを意味する。さらに、異種移植片ドナーとしての他の霊長類の使用の公衆による受け入れには若干の社会的困難さが存在する。
　それ故、不調和異種移植片が再び注目されている。不調和異種移植片がこのように迅速に失敗する理由はドナー種の未確認抗原に対するレシピエント種における「自然生成」抗体の存在であると一般に考えられている［ションズ（Ｓｈｏｎｓ）等のヨーロプ．サージ．レス．（Ｅｕｒｏｐ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．）５　２６〜３６（１９７３）］。抗体はドナー種からの免疫学的チャレンジを受けていない個人に存在することが発見されているので、「自然生成」と呼ばれる。
　器官移植片の−超過敏な抗体−仲介拒絶として知られる−急激な拒絶は充分に知られている。腎臓移植（同種移植）がルーチン治療になった１９６０年代初期には、移植腎臓が時には、手術のまだ進行中に、レシピエントによって拒絶されることが観察された。移植手術中に、ドナーとレシピエントとの血管が一緒に縫合された直後に、腎臓は一般に赤色になり、稠度が硬くなる。このような移植はしばしば、殆ど直ちに尿を生ずる。患者がまだ手術台上であるときに移植片が破壊される拒絶の形態（超過敏拒絶）では、移植後の最初の数分間かそこらで破壊プロセスが開始する。これが生ずると、腎臓は青みを帯び、不調和になり、うっ血する。器官の稠度も変化する。一般に、移植片は浮腫状になり、尿産生は生じず、新たに移植された腎臓は直ちに摘出される。レシピエント中に予め形成された循環抗体とドナー腎臓中の抗原との間の体液仲介免疫反応が関係することは明らかになっている。同種移植における免疫反応を避ける唯一つの方法は、レシピエント中にドナー細胞に対する抗体が存在しないことを、移植前にチェックすることである。このような抗体検査（交差適合試験）の知識が増大するにつれて、レシピエント中の抗体がドナー中の高原に対して反応するという一般化が事実ではなく、同種の固体間の移植に関する場合に、超過敏な移植片破壊がＴ−温暖陽性交差−適合として知られる特定の種類の抗体の存在に限定され、これらの抗体が殆ど確実にＩｇＧサブクラスに属することが明らかになっている。さらに、これらの抗体の存在は以前の輸血の結果として又は妊娠の結果として又は、最も一般的には、失敗した以前の移植の結果としての既存免疫化処置に常に由来する。
　超過敏異種移植片拒絶の機構は、上述したように、超過敏同種移植片拒絶の機構と大体同じであると主として考えられている。異種移植片拒絶の機構に関する文献は約８３年間に遡って、広範囲である。この期間中、抗体が関与しない異種移植片拒絶機構を示唆したと思われるのは３刊行物にすぎない。補体活性化の代替え経路が異種移植片拒絶（このような用語を必ずしも用いていないが）に関与することが示唆されている。この示唆はシリング（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ）等による論文［サージェリー，ジネコロジー　アンド　オブステトリクス（Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）１４２　２９−３２（１９７６）］に初めて出現した。この示唆は１９８８年と１９８９年に（同じデータを２回発表）、ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ）等によって再びなされた［トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）４６（６）８２５−８３０（１９８８）とトランスプランテーション　プロシーディング（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ）２１（１）５２０−５２１（１９８９）］。しかし、これらの実験は両方とも同じ誤りを有していたため、結果は決定的ではなかった。選択されたモデルは異種移植片モデルであると著者によって主張されているが、交差種抗体が存在しなかった。しかし、現在では、交差種抗体の検出に用いられた検定法が不充分であること、及びこれらの論文に引用された推論が不充分なデータに基づくものであったことが考えられる。
　異種移植片拒絶を回避又は軽減するために現在、実験的に採られている大抵の手段は、例えばシクロスポリンＡ及びその他の免疫抑制剤によって、プラズマフェレーゼによって、抗体のコブラ毒因子、ブドウ球菌属蛋白質Ａ吸収による処理等によって、主として非特異的基準で、レシピエント免疫系に化学療法的に干渉することを含む。このアプローチは当然、同種移植片を支持する化学療法の結果として生じたものである。
　本発明は根本的に異なるアプローチを用いる：すなわち、レシピエント免疫系の非特異的干渉の代わりに、本発明はレシピエント免疫系のある一定の要素によって自己と見なされるドナー移植片の効果を有する物質の同時投与を可能にする。特に好ましい実施態様では、ドナー組織自体を改質して、ある点においてレシピエントに対して免疫的に自己（ｓｅｌｆ）であると思われるようにする。
　超過敏異種移植片拒絶が必ずしも抗体−仲介でないことも発見されている。このことは２つの観察に起因する。第一に、抗体の不存在下、補体の存在下で超過敏拒絶が観察される；第二に、抗体の存在下、補体の不存在下で超過敏拒絶が観察されない。
　本発明は、補体活性化が、適当な抗体分子の結合によって助成される又は助成されないのいずれであっても、異種移植片の超過敏破壊において顕著であるという発見に基づく。代替え経路の補体活性化は多様な細胞産生物によって誘導されうる。これらの産生物は例えば細菌又は異種移植片のような外部からの侵入細胞に限定されず、多くの細胞上に存在する。従って、原則として、個体の多くの細胞が代替え経路の補体を活性化して、大規模な自己免疫破壊を生ずる。これが起こらないことは、血清中及び細胞上に自然に存在する、多くの補体不調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）蛋白質の存在による。これらの分子［ここでは「相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）補体制限因子と呼ぶ」は古典経路又は自己細胞産生物による代替え経路のいずれかによって自己補体の完全活性化を阻止して、自己（ｓｅｌｆ）の自己免疫破壊を防止する。このような分子の機能は発作性夜間血色素尿症において科学的精密さで説明される。この疾患では、上記分子の少なくとも１つの膜アンカー（ａｎｃｈｏｒ）（腐食促進因子）が存在しない。従って、蛋白質が赤血球細胞膜内に保留されず、細胞から離れ、補体の代替え経路を活性化し、その後溶解して、発作性夜間血色素尿症を生ずる。
　本発明の第１態様によると、レシピエントとは異なる種であり、レシピエントに対して不調和種であるドナー種に由来する動物組織をレシピエントに移植する方法を提供する、この方法は組織をレシピエントに移植し、移植組織と共に、レシピエント種において補体完全活性化を阻止するために活性である１種以上の相同的補体制限因子を供給することを含む。
　本明細書で用いる「組織」なる用語は、器官（特に、心臓、肺、肝臓と腎臓、膵臓及び甲状腺のような重要な内部器官）、角膜、皮膚、血管、その他の結合組織、血液細胞と造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞、内分泌腺及びその他の器官からの細胞を含めた細胞並びに体液（例えばＰＰＦ）（これらの全てが１つの種から他の種への移植の候補でありうる）を含む。移植可能な生物学的な材料を意味する。
「不調和種」とは、それからのレシピエントへの（一般に血管新生した）異種移植片が通常超過敏拒絶、すなわち、数日間ではなく、数分間もしくは数時間内の拒絶を生ずる種である［カルネ（Ｃａｌｎｅ）、トランスプラント　プロク．（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ．）２：５５０、１９７０］。このような超過敏拒絶は当該技術分野に熟練した人に周知であり、移植後２４時間足らずに、６時間足らずに或いは１時間足らずにさえも生ずる。
　補体とその活性化は現在周知であり、ロイット（Ｒｏｉｔｔ）のエッセンシャル　イムノロジー（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第５版、１９８４）、ブラックウェル　サイエンティフィック出版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オックスフォードに述べられている。補体（Ｃ’）に帰せられる活性は配列中で作用する９蛋白質成分（Ｃ１〜Ｃ９）の作用に依存し、この中の最初の成分はＣ１ｑ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓと呼ばれる３主要サブフラクションから成る。補体は古典経路又は代替え経路によって活性化される、この両経路を次に簡単に説明する。
　古典経路では、抗体がＣ１に結合し、これのＣ１ｓがエステラーゼ活性を得て、活性化をもたらし、最初にＣ４の、次にＣ２の膜又は免疫複合体上の部位に移る。この複合体は「Ｃ３コンバーターゼ」活性を有し、溶液中でＣ３を分解して、全く異なる機能を有する小ペプチドフラグメントＣ３ａと残留分子Ｃ３ｂを生ずる。Ｃ３ａはアナフィラトキシン活性を有し、補体増幅カスゲートにもはや関係しない。Ｃ３ｂは膜に結合し、抗原−抗体−Ｃ３ｂ複合体の免疫粘着を生じ、このようにして次の食作用を促進する。
　代替え経路では、Ｃ３コンバーターゼ活性はＣ３ｂＢによって発揮され、Ｃ３ｂＢの活性化は外因性作用剤、特に例えば抗体に関係なく作用するエンドトキシンのような微生物多糖類によって誘発されうる。コンバーターゼはＣ３ｂと因子Ｂとの複合体に対する因子Ｄの作用によって形成される。これは有効なフィードバック回路を形成し、この経路でＣ３分解生成物（Ｃ３ｂ）が開裂酵素のより多くの形成を助ける。
　古典経路と代替え経路の両方では、Ｃ３ｂレベルがＣ３ｂイナクチベーター（因子Ｉ）によって維持される。Ｃ３ｂは容易に因子Ｆと結合して、複合体を形成し、これは因子Ｉによって分解されて、その溶血性と免疫粘着性とを失う。
　古典経路と代替え経路はＣ３段階後は共通する。Ｃ５は分解されて、Ｃ５ａとＣ５ｂフラグメントを生ずる。Ｃ５ａはアナフィラトキシン活性を有し、多形の走化性を生ずる。Ｃ５ｂはＣ６及びＣ７と複合体として結合して、膜上に熱安定性部位を形成し、膜は最終成分Ｃ８とＣ９とを補充して、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する。これは膜に挿入されて、膜から突出する環状構造体であり、電解質と水とに対して完全に透過性であるトランスメンブランチャンネルを形成する。内部のコロイド浸透圧が高いために、ナトリウムイオンと水の正味流入が生じて、細胞溶解をもたらす。
　本発明に有用な相同的補体制限因子（ＨＣＲＦ）は一般に、補体活性化カスケートの如何なる部分にも干渉することができる。ＨＣＲＦは古典経路を構成する部分に単独で干渉することができる、又は代替え経路を構成する部分に単独で干渉することができる、或いはさらに一般的には古典経路と代替え経路の両方に共通する部分に干渉することができる。ＨＣＲＦレギュレーターが経路の共通部分に干渉することが好ましい。ＨＣＲＦは天然ＨＣＲＦに同じでありうる、又は単純に適当な機能を有する。組換え体ＤＮＡテクノロジーによって製造されたもの及び製造された変異体を含めた合成及び半合成ＨＣＲＦは、ＨＣＲＦなる用語に含まれる。
　上述したように、相同的補体制限因子は補体カスケードの作用をその溶解活性を減ずる又は阻止するように調節する物質であり；これらは動物体が自己免疫反応を避けるように組織を自己として標識するために用いられる。本発明では、ＨＣＲＦが膜に結合する又は血清中に遊離するのいずれでも原則として可能であるが、実際にはＨＣＲＦが異種移植組織の細胞に膜結合することが好ましい。このようにして、ＨＣＲＦが移植組織に「会合する」ことが容易である。好ましいＨＣＲＦには、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体（ＣＲ１）、Ｃ３ｄｇ受容体（ＣＲ２）、腐食促進因子（ＤＡＦ）、Ｃ３ｂイナクチベーター及び膜補因子蛋白質（ＭＣＰ）を含む推定膜因子がある。推定血清ＨＣＲＦは因子Ｆ、腐食促進因子（ＤＡＦ）及びＣ４結合蛋白質（Ｃ４ｂｐ）を含む。これらのＨＣＲＦは全て、Ｃ３段階における干渉によって補体活性を負調節する。Ｃ８においてブロックする相同的制限因子（ＨＲＦ）も推定膜因子である。
　適当なＨＣＲＦのための遺伝子の、全てではないが、多くはＲＣＡ（補体活性化のレギュレーター）座に存在し、この座は染色体１の帯ｑ３２に位置づけられる［レイ−キャンポス（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｏｓ）等、ジェイ．イクスプ．メド．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）
１６７
　ＨＣＲＦの命名と位置に関しては若干の混乱があるが、因子Ｃ４ＢＰ、ＣＲ１、ＤＡＦ及び因子Ｈはレイ−キャンプス（Ｒｅｙ−Ｃａｍｐｕｓ）等（上記引用文中）によって、及び彼らの以前の研究［ジェイ．イクスプ．メド．
１６６
　ＨＣＲＦに関する他の参考文献を下記に挙げる：因子Ｉ（以前にＣ３ｂアナクチベーター又はＫＡＦとしても知られる）：タムラ（Ｔａｍｕｒａ）とネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、ジェイ．イムノル．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）
９９
　因子Ｈ：パングバーン（Ｐａｎｇｂｕｒｎ）等、ジェイ．イクスプ．メド．
１４６
１４８
　ＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られる）：ニコルソン−ウェラー（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅｌｌｅｒ）等、ジェイ・イムノル．
１２９
１６６
　ＣＲ１（ＣＤ３５としても知られる）：メドフ（Ｍｅｄｏｆ）等、ジェイ．イクスプ．メド．
１５６
１２９
　ＣＲ２（ＣＤ２１、３ｄ／ＥＢＶ受容体及びｐ１４０として知られる）：イイダ（Ｉｉｄａ）等、ジェイ．イクスプ．メド．
１５８
８１
　ＲＣＡ蛋白質の一部の組織分布は次の通りである：ＣＲＩ：膜（限定）：赤血球；単球；大抵のＢ細胞と一部のＴ細胞；多形核白血球；濾胞−樹状細胞；糸球体有足細胞；
　ＣＲ２：膜（限定）：大抵のＢ細胞；濾過−樹状細胞；一部の上皮細胞及び若干のＴ細胞ライン；
　ＭＣＲ：膜（広範囲）；全ての末梢血液細胞（赤血球以外）；上皮細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞系統；栄養芽層及び精子；
　ＤＡＦ：膜（広範囲）：全ての末梢血液細胞；上皮細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞系統；栄養芽層及び精子；
　Ｃ４ｂｐ：血漿：肝臓合成；及びＨ：血漿：肝臓合成；繊維芽細胞及び単球細胞ライン。
　その使用も本発明によって考えられる膜侵襲複合体のレベルでの相同的制限に関係する蛋白質に関して、下記６５ｋＤａ（又はそこら）の蛋白質が同じであるという蛋白質配列としての一般的同意（但しまだ証拠はない）が存在する：Ｃ８結合蛋白質［ジェネルマルク（Ｓｃｈｏｅｎｅｒｍａｒｋ）等、ジェイ．イムノル．
１３６
　相同的制限因子（ＨＲＦ）［ツアルマン（Ｚａｌｍａｎ）等、イムノロジー８３、６９７５（１９８６）］；及びＭＡＣ阻害蛋白質（ＭＩＰ）［ワットス（Ｗａｔｔｓ）等、（１９８８）］。
　Ｃ８ｂｐ／ＨＲＦ／ＭＩＰ蛋白質は、ＣＤ５９及びＤＡＦと同様に糖脂質アンカーによって細胞表面に付着する：これらの蛋白質は発作性夜間血色素尿症には機能的に存在しないことが知られている。
　１８−２０ｋＤａ蛋白質もＭＡＣレベルに関係する。下記は同じであると考えられる（但し同じでないこともありうる）：ｐ−１８［スギタ（Ｓｕｇｉｔａ）等、ジェイ．バイオケム，（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
１０４
　ＨＲＦ−２０［オカダ（Ｏｋａｄａ）等、イントル．イムノル．（Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）
１
　ＣＯ５９［ダビース（Ｄａｖｉｅｓ）等、ジェイ．イクスプ．メド．（１９８９年９月）；及び反応性溶解の膜インヒビター（ＭＩＲＬ）［ホロギン（Ｈｏｌｏｇｕｉｎ）等、ジェイ．クリン．インベスト．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）
８４
　これらの蛋白質の推定存在（ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の証拠はＣＤ５９とＨＲＦ−２０との蛋白質及び／又はｃＤＮＡ塩基配列が同じであると判明していることである：おそらく、これらはｐ−１８／ＭＩＲＬとも同じであると考えられる。ＣＤ５９／ＨＲｆ−２０塩基配列と、Ｔ−細胞活性化に関係するネズミＬＹ−６抗原の塩基配列との幾らかの相同関係が存在することを注目すべきである［グロンクス（Ｇｒｏｎｘ）等、ジェイ．イムノル．
１４２
　ＳＰ−４０．４０もＭＡＣ調節に関係する［キブスバウム（Ｋｉｖｓｚｂａｕｍ）等、ＥＭＢＯ　
８
　ＨＣＲＦがＣ３段階で補体活性化に干渉することが好ましい。ＭＣＰとＤＡＦの両方はＣ３活性化の代替え経路での有効フィードバック回路をブロックし、これらは好ましいＨＣＲＦを構成する。
　ＨＣＲＦは移植組織と共に供給される。このことは、移植組織が自己として標識されるが、例えば侵入細菌のような他の外来物はこのように有意には標識されないようなやり方で、ＨＣＲＦが投与されることを意味する。単純に非経口的に、但し移植組織に対して局所的に、１種以上の適当なＨＣＲＦを投与することが可能である。しかし、実際には、これは好ましくない、この理由はＨＣＲＦを移植組織に充分に局在化することが困難であり、移植が行われた後にＨＣＲＦをレシピエントに反復投与しなければならないという他の困難さがあるからである；しかし、これは専門医による薬剤学的投与系の使用によって克服することができた。
　ＨＣＲＦをドナー組織上の細胞膜に結合させるように、ＨＣＲＦを供給することが一般に非常に便利である。適当な表現を生ずる、移植組織の良好な感染症が生ずることがあるが、この目的を達成するための最も好ましいルートは、ドナー組織がレシピエントに移植されたときにレシピエント種中で活性な１種以上のＨＣＲＦをコードする核酸を含み、表現する点で、ドナー組織がトランスジェニックであることである。このようなトランスジェニック組織はＨＣＲＦを無限に表現し続ける。ＨＣＲＦは発生的にレシピエント種に又はこれより好ましくなくは、調和異種移植片が可能であるような密接に関連する種に由来しうる。
　原則として、トランスジェニックドナー組織は細胞培養から得られるが、ドナー組織がトランスゲニック動物から得られることが好ましい。トランスゲニック動物は少なくとも被移植組織において、優先的に、ＨＣＲＦを表現する筈である（又は表現することが可能である）。しかし、ＨＣＲＦを何らかの結合剤（例えば、ハイブリッドモノクローナル抗体）によって［ミルスタインとクエロ（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ＆Ｃｕｅｌｌｏ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
３０５
　レシピエント種は主としてヒトであるが、排他的ではない。経済及び倫理が許す場合には他の種も可能であるので、他の霊長類が適当なレシピエントである。
　ドナー種はレシピエント種とは異なり、レシピエント種の生理学を考慮した場合に、移植のために適当な組織を提供しうる、如何なる適当な種でもありうる。ヒトレシピエントに対しては、ブタドナーが適切であると考えられるが、他の種が適切である場合もある。
　本発明の第２態様によると、予定レシピエント種において補体の完全活性化を阻止するために活性な１種以上の相同的補体制限因子と会合した、レシピエント種に対して不調和種であるドナー種の移植可能な動物細胞又は組織を提供する。
　本発明の第３態様では、少なくとも１種の不調和種への移植時に又はこれの免疫系への曝露時に異種移植片拒絶を生じないような、移植可能な組織を有するトランスジェニック動物を提供する。不調和種は、動物からの異種移植片を通常、超過敏に拒絶する種である。
　それ故、本発明はレシピエント種に対して不調和種であるドナー種に由来する動物組織及びレシピエント種において活性な１種以上の相同的補体制限因子のレシピエント種へ移植可能な組織製造への使用を含む。
　本発明の第４態様では、他の種の相同的補体制限因子を表現しうる細胞を有するトランスジェニック動物を提供する。相同的補体制限因子はトランスジェニック動物の種に対して不調和である種において一般に活性である。細胞は、本発明の第１態様に関連して述べたような選択性で、１種の特定組織の細胞であるか、又は２種以上もしくは全ての組織の細胞であり、この場合には動物は２つ以上の組織のドナーになりうる。このようなトランスジェニック動物は非形質転換（非増殖性の意味で）細胞の集合（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と見なされる。
　本発明の第５態様によると、動物細胞に関して不調和である種において活性な、１種以上の相同的補体制限因子を表現しうる非形質転換動物細胞を提供する。本発明の第６実施態様では、少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮＡと、コーディングＤＮＡの非形質転換動物細胞による表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを含む組換え体ＤＮＡを提供する。動物細胞は発生的にこの構成体を含むトランスジェニック動物の細胞でありうる。代替え手段として、細胞は培養器官又は例えばランゲルハンス島のような他の器官でありうる。
　本発明の第７態様では、動物の遺伝材料に加えてトランスジェニック動物を製造するために適した遺伝的構成体を提供する、この構成体は少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮＡと、この構成体を発生的に含むトランスジェニック動物の少なくとも幾つかの細胞におけるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを含む。このような遺伝的構成体はＹＡＣとして知られる微小染色体の形状でありうる。上記のように、相同的補体制限因子は一般に、トランスジェニック動物の種に対して不調和である種において活性である。
　本発明の第８態様では、動物の遺伝材料に少なくとも１種の相同的補体制限因子をコードするＤＮＡと、トランスジェニック動物の少なくとも幾つかの細胞におけるコーディングＤＮＡの表現を可能にする１つ以上の塩基配列とを加えることを含む、トランスジェニック動物の製造方法を提供する。
　トランスジェニック動物の製造方法は一般にますます普及しており、行われる詳細な工程は当該技術分野で現在通常用いられているような工程である。例えば、国際特許第Ａ８８００２３９号はトランスジェニック動物の構成に原則として必要な工程を開示する。
　トランスジェニック動物の細胞中への構成体の実際の編入方法はミクロ注射による、精子仲介編入又は他の適当な方法による。予備的な遺伝操作を一般的に好ましい原核生物において実施されうる。
　ＨＣＲＦをコードするＤＮＡはｃＤＮＡ形で入手可能であるか、又は通常のクローニング方法を用いて演繹される。腐食促進因子（ＤＡＦ）をコードするＤＮＡは恐らく最も良く特性化されたＤＮＡであり、メドフ等によって述べられている［ＰＮＡＳ、
８４
　ＤＡＦの遺伝学とＤＡＦをコードするｃＤＮＡの既知塩基配列とをさらに良く特性化するために、ＤＡＦは好ましい相同的補体制限因子を構成する。
　本発明の第２〜第７態様の他の好ましい特徴は第１態様の特徴に必要な変更を加えたものである。
　【実施例】
　本発明を次に下記実施例によって説明する。実施例においては図面を参照する：
実施例１
　
抗種抗体の不存在下で異種移植片拒絶が生ずる
　一般に、動物は免疫グロブリンの循環なしには存在しえない。免疫グロブリンは抗原刺激に反応してリンパ球によって産生する。しかし、新生仔期の初期には、受動的に移入された母親の免疫グロブリンがこの自己産生抗体の一時的代替え物として作用する。この受動的に移入された免疫グロブリンは、早期に免疫経験をする子に対して保護を与える。哺乳動物では、母親の免疫グロブリンのこの受動的移入は通常、経胎盤的に及び初乳を介して生ずる。しかし、幾つかの種では、胎盤の構造は母親の抗体がこの経路によって移入されないような構造である。ブタはこのような種の１つである。母親の抗体の全ては初乳から得られる。従って、新しく生まれた吸乳前のブタは、原則として、免疫グロブリンを含まない。大型の白ブタを誕生時に入手し、吸乳させずに熱水で暖めた木製ケージに入れた。各分娩（ｆａｒｒｏｗｉｎｇ）からの２匹のブタを各実験に用いた。これらのブタは誕生時に約１ｋｇの体重であった。
　約３００ｇ体重のニュージーランド白ウサギの乳仔をドナーとして用いた。これらのドナーはヒプノールとジアゼパムによって麻酔し、胸部を開き、１９ゲージ針を用いて大静脈に挿管した。低温（＋４℃）カルジオプレギア（トーマスＮｏ．２）を心臓が拍動を停止し、カルジオプレギアによって潅流されるまで注入した。注射器によって直接低温カルジオプレギアを外部から注入して冷却も行った。次に、ウサギ心臓を標準外科方法を用いて摘出し、＋４℃のカルジオプレギア溶液中に必要になるまで保存した。ウサギ心臓は虚血性損失を非常に受けやすいことが分かっているので、これらの予防処置が必要であると判明している。
　レシピエントのブタは最初にハロタン／０２吸入によって麻酔した。次に、静脈内バタフライ（２３ゲージ）針を乳房静脈に挿入し、静脈内ケタミンによって麻酔を維持した。ブタは同時に生理食塩水の静注によって水和状態に維持した。血清とＥＤＴＡ血液サンプルを移植前に抽出した。
　ウサギ心臓をヘロン（Ｈｅｒｏｎ）方法に従ってブタの頚部に移植した［アクタ．パトル．ミクロバイオル．スキャンド．（Ａｃｔａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｓｃａｎｄ．）
７９
　ＥＣＧ結果は図１Ａ〜１Ｅに示す。図１Ａに示すトレースは移植直後の正常心臓拍動を示す。機能不全（ｆａｉｌｕｒｅ）は約２０分後に開始し（図１Ｂ）、１時間以内に（図１Ｄ）、心臓拍動は検出されなくなり、超過敏拒絶を実証した。
　それ故、この実施例は不調和異種移植片の超過敏拒絶が抗体の不存在下でも起こることを実証する。
実施例２
　
実施例１で用いた新生仔は抗種抗体を有さない
　ウサギ抗ブタＩｇＧをダビース（Ｄａｖｉｅｓ）とハワード（Ｈｏｗａｒｄ）によって改良された（発表されず）、グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）等、バイオケミカル　ジャーナル、
８９
　下記物質をポリスチレン管（ＬＰ２　６ｃｍＸ１ｃｍ）中に迅速に連続的に加える：
　蛋白質（１ｍｇ／ｍｌ濃度）２５−５０μｌ
　Ｎａ１２５Ｉ（１００ｍＣｉ／ｍｌ）３−４μｌ
　クロラミン−Ｔ（＊４ｍｇ／５ｍｌ；０．５Ｍ）１０μｌ
　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
＊使用前に新たに製造しなければならない　上記成分を絶えず撹拌しながら３０秒間混合した。次に、下記成分を迅速に加えた：
　ＤＬ−チロシン（リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５　０．５ｍｌ中の飽和溶液）５０μｌ
　２％ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジド３００μｌ
　次に、標識された蛋白質を非反応ヨウ素から、ＰＢＳ／アジド中に作成したセファデックスＧ−２５中等級の小カラム８ｃｍｘ１．０ｃｍを用いて分離する。作成したＧ２５カラムに、ヨウ素化反応混合物を定量的に移入し、ＰＢＳ／アジドによって溶離した。６滴フラクションをポリスチレン管中に回収する。蛋白質と（１２５Ｉ）ヨウ化物との両ピークが溶離されるまで、カラムを溶離し、全フラクション中の放射能を測定する。
　蛋白質中に含まれる放射能は次のように算出する：蛋白質中の放射能カウント＝オリジナル総カウント−ヨウ化物ピーク中のカウント　放射性標識ＩｇＧ（今後「アイソトープ」と呼ぶ）は、下記のように、新生仔ブタ中の（ブタ）抗体の分析に用いる：
材料
　ＰＢｓ＋０．０１％アジド　−オックスオイド（Ｏｘｏｉｄ）
　ＰＢＳ／ＢＳＡ１％　−ＢＳＡ−シグマ（Ｓｉｇｍａ）
　アイソトープ　−１２−１８ｘ１０３カウント／分を有するウサギ抗ブタＩｇＧ全分子心臓不活性化血清（５６℃、３０分）
凝固防止血液サンプル
方法
　１．ＰＢＳ中ウサギ赤血球の１％懸濁液を製造し、試験管に１００μｌ量を加えた。赤血球をボタン状になるまで回転させ、上澄みを捨てる。
　２．成体ブタ（正の対照）、新生仔ブタ（試験サンプル）又はウサギ（負の対照）からのＰＢＳ／ＢＳＡ中に不活性化血清の連続希釈物を製造した。０．０２５ｍｌ量を赤血球ボタンに２通りに加えた。試験管を４℃において４時間インキュベートした。
　３．インキュベーション後に、試験管をＰＢＳ／ＢＳＡ中で３回洗浄し、アイソトープ０．０５ｍｌを各試験管に加え、一晩４℃においてインキュベートした。
　４．試験管を３回再洗浄し、ガンマーカウンターで１分間計数を実施した。
　５．結果を力価に対してカウント数／分としてプロットする。
　結果を図２に示す。ウサギ血清は負の対照として用い、成体（すなわち、吸乳）ブタを正の対照として用いた。吸乳前ブタ２のブタ抗体レベルは負の対照のレベルに匹敵する。
実施例３
　
異種移植片破壊への補体Ｃ３の関連性の実証
　バーゲル（Ｂｕｒｇｅｒ）等［ヨール．ジェイ．イムノル．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６，７−１１（１９８６）］によって述べられている系統からの補体欠損モルモットに実施例１のウサギ−ブタ異種移植片に関して述べた方法と本質的に同じ方法を用いて心臓を移植した。ラットはエーテル吸入によって麻酔し、心臓をカルジオプレギアによって冷却してから、既述したように摘出した。
　モルモットを静脈内ヴァリウムと筋肉内ヒプノールとによって麻酔した。心臓を既述したように、頚部に移植した。対照のモルモット、すなわち、正常補体レベルのモルモットに対しては、移植片拒絶が数分以内に生じ、頚部閉鎖を不必要にした。実験動物では、頚部を閉鎖し、心臓を１日２回触診によって監視した。術後数時間は正常ＥＣＧが観察され、超過敏拒絶が生じないことを示した。
実施例４
　Ａ．
ブタのリンパ球と腎臓細胞は代替え経路によってヒト補体を活性化する
　グラバー（Ｇｒａｂｅｒ）とウイリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）の方法［バイオチム．バイオフィズ．アクタ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．）１０，１９３（１９５３）］に従って、アガロースゲル１ヲ８ｘ８ｃｍガラスプレート上に注入した（図３）。ゲル混合物１０ｍｌが必要であり、これは２％アガロース５ｍｌとヴェロナール緩衝液（ＶＢ）５ｍｌから構成された。（ＶＢは７５ｍＭ　Ｎａバルビトン、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＮ３，ｐＨρ５である）。アガロースとＶＢは使用直前に６０℃において混合した。ゲルをレベルプラットフォーム上に注入し、冷却した。硬化したときに、ゲルは１％アガロースから成り、約１．５ｍｍの深さを有した。
　直径３ｍｍの孔３をゲルの１端部から約１ｃｍにカットした。各孔は被処理サンプル約８μｌを含有可能であった。サンプルは着色のための充分なブロムフェノールブルーの添加以外に特定の製剤を含まなかった。サンプルの塗布後に、ゲルを細心に電気泳動タンクのプラットフォームに乗せた。次に、ＶＢ（ランニング緩衝液）に浸した綿ガーゼで孔に密接するゲルの縁に沿って押圧し、別のガーゼでアガロースの対立縁を押圧した。（ガーゼの端が緩衝液タンク中に浸漬することが重要である）。次に、２５〜３０ｍＡの電流をアルブミン（ブロムフェノール結合によって目視可能）が正（陽極）ガーゼに達するまでゲルに通した。このプロセスは約２時間半〜３時間を要する。２種以上のゲルを同時に、平行して処理する場合には、印加電流はそれに応じて増加しなければならず、２種ゲルは５０ｍＡを要し、３種ゲルは７５ｍＡを要する、等である。
　ブロムフェノールブルーによって目視可能になった、アルブミンマーカー９の移動によって示唆される電気泳動終了時に、ゲルを電気泳動タンクから取り出した。
　Ｂ．
２次元交差免疫電気泳動
（Ａ）からの電気泳動蛋白質を含むストリップ１１（図４）をカットして、新しいガラスプレート１３の１端に置いた。可視化蛋白質に対する約１％抗血清を含む、２％アガロース：ＶＢの１：１混合物１５をプレート上に注入し、硬化させた。抗血清をアガロース／ＶＢＳ混合物に、これが約５０℃の温度に冷却されたときに加えた。
　次に、ロケットプレートを上述したように電気泳動させ、１次元ストリップを含むゲルの端部は綿ガーゼを介して負の電極（陰極）１７に結合し、反対端部は陽極１９に結合する。ゲルをゲルのサイズに依存する電流で一晩電気泳動させた；各８ｃｍ長さのゲルには１０ｍＡが必要であり、１６ｃｍ長さのゲルは２０ｍＡを必要とする、等である。
　蛋白質は１次元電気泳動によって分離し、定量され、２次元電気泳動によって可視化される、次に、可視化のための染色を説明する。
　Ｃ．
ゲルの潰しと染色
　このほうほうは通常の免疫電気泳動又はロケットと同じである。染色すべきゲルを、水で予め湿らせた、１層の繊維を含まないＰＯＳＴＬＩＰ（商標）ペーパー［アドラード　エバンス社（Ａｄｌａｒｄ　Ｅｖａｎｓ＆Ｃｏ．）］でカバーした。次に、これを６層の吸収性ペーパータオルでカバーした。この集積体を１時間かけて潰し、その後金水分を除去し、プロセスを繰り返した。
　第２回潰し後に、ゲルを温風下で乾燥させ、ＰＢＳ中に少なくとも１時間浸けて非沈降蛋白質を除去した。ゲルを再び乾燥させ、０．５％ｗ／ｖクーマシーブリリアントブルーＧ２５、４５％Ｈ２Ｏ、４５％メタノール、１０％酢酸の溶液中で１０分間染色した。
　ゲルを２０％メタノール、６％酢酸中で、下地が透明になるまで連続洗浄して、脱色した。最後に温風下で乾燥させた。
　図５は乾燥ゲルの再現である。ロケット１は正常ヒト血清（ＨＨＳ）５０μｌ＋１０ｍＭＥＧＴＡを含むＶＢＳ２５μｌを含む負の対照である。ＥＤＴＡはカルシウムを除去するキレーターである；カルシウムは古典経路補体活性化に重要であるので、ＥＤＴＡの存在は補体が代替え経路のみによって活性化されうることを保証する。左手（大きい）ピークはＣ３であり、右手（小さい）ピークはＣ３ｂｉ（活性化Ｃ３の分解生成物）である。それ故、対照では、少量のＣ３ｂｉは補体活性化がごく軽度であることを示す。
　ロケット２では、７５％ブタ赤血球（ｖ／ｖ）を緩衝液カクテルに加えた。Ｃ３ｂｉレベルの恐らく有意ではない僅かな増加が生じるので、これはブタ赤血球が、活性化するとしても、ごく僅かに代替え経路によってヒト補体を活性化することを示唆する。この低反応性の理由は明らかではない。
　ロケット３と４では、７５％ブタリンパ球（ｖ／ｖ）又は７５％ブタ腎臓細胞を、それぞれ緩衝液カクテルに加えた。各場合に、Ｃ３ｂｉレベルの適当な増加が生じる、ブタリンパ球によるヒト補体活性化を示唆する。
実施例５
　
ブタリンパ球はブタ補体の存在かでヒト抗体によって溶解しないが、ウサギ又はヒト補体の存在下では溶解する
　ブタ補体、ウサギ乳仔補体又はヒト補体のいずれかの存在下でのヒト血清−仲介細胞溶解を、クロム放出アッセイを用いて監視した。
材料
　リンパ球分離媒質　−フローラブス（Ｆｌｏｗｌａｂｓ）
　ＲＰＭＩ１６４０＋１０％不活性化ＦＣＳ
　ＰＢＳ（アジドなし）　−オクスオイド
　Ｖ孔プレート　−ステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）
　ウサギ乳仔補体リンパ球−血清−ｌａｂ−又はヒトもしくはブタ補体（ＲＰＭ１中で希釈１＋７）
　熱は血清を不活性化する（５６℃、３０分）
方法
　１．ＰＢＳ中で１：１に希釈した脱フィブリン化ブタ全血を同量のフィコールハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ）リンパ球分離媒質上に積層した。試験管を２０℃において３０分間１２００ｇで開店させた。
　２．界面に生じたブタリンパ球を取り出し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。ボタンをＲＰＭ１１６４０中に再懸濁させ、細胞カウントを２ｘ１０７／ｍｌに調節した。
　３．５１Ｃｒ２００μＣｉを細胞の２Ｘ１０７ペレットに加え、室温において１．５時間インキュベートした。
　４．標識細胞を５分間、９００ｇにおいて２回洗浄し、ＲＰＭ１中で最終細胞カウント１ｘ１０６／ｍｌを与えるように調節した。
　５．２通りの連続希釈物としての試験下の不活性化血清０．０５ｍｌ量を対照と共にプレートアウトした。希釈補体を０．０５ｍｌ量で該等孔に加え、次に標識細胞０．０５ｍｌを加えた。プレートをＣＯ２オーブン中で３０℃において１時間インキュベートする。
　６．インキュベーション後に、プレートを２０℃、９００ｇにおいて１５分間回転させて、細胞を沈降させた。上澄み１００μｌを標識試験管中に取り出し、ガンマーカウンターで１分間計数を実施した。
　７．結果を力価に対してオリジナル標識細胞のカウントの％としてプロットする。
対照
　完全放出対照（ＦＲＣ）　−　細胞５０μｌ＋Ｈ２Ｏ１００μｌ＋０．１％＋Ｔｗｅｅｎ
　負の対照　−細胞５０μｌ＋ＲＰＭＩ　１００μｌ
　補体対照（ＣＣ）　−細胞５０μｌ＋希釈補体５０μｌ＋ＲＰＭＩ　５０μｌ
結果
　結果は図６に示す。ブタリンパ球が非ブタ（すなわち、ウサギ又はヒト）補体の存在下でのみヒト血清によって溶解され、ブタ補体の存在下では溶解されないことが分かる。干渉は、ブタ細胞上に存在する１種以上の相同的補体制限因子がブタ補体の作用を上首尾に負調節するが、ヒト又はウサギ補体の作用を負調節しないことである。
実施例６
　この実施例の目的は抗体が超過敏拒絶を生じうることを実証することである。本出願が根拠とする概念は、超過敏拒絶が抗移植片抗体の不存在下で生ずるが機能的補体を必要とするという観察の結果として生じた。これは新規な観察であるので、抗体が異種移植片拒絶を生ずることを本式に実証する文献では実験が存在しない。自然生成抗体の存在下ではこれらの抗体が関係するのか否かを判断することが困難であり、このような実験の実施は容易ではない。この実施例では、調和異種移植片を適当な特異性を有する抗体の注入によって不調和異種移植片に変えることによって抗体の役割を実証した。この研究に用いたレシピエントはＰＶＧ種系統（ＲＴ１Ｃ）の雄ラット［バンチング　アンド　キングダム（Ｂａｎｔｉｎｇ　＆　Ｋｉｎｇｄｏｍ）、英国、オキソン、バイセスター］生後３〜６カ月、体重２５０−３００ｇであった。心臓ドナーはバンチング　アンド　キングダムから入手される、体重１００〜１５０ｇのシリア　ハムスターであった。心臓移植はヘロンの方法（実施例１における上記引用文献中）に従って実施した。ハムスターの心臓をラットの頚部に移植して、カフ（ｃｕｆｆ）方法によって大動脈を頚動脈に吻合し、肺動脈を頚静脈に吻合した。他の全ての心臓血管を結紮した。心臓は血管クランプの除去後数分間内に拍動を開始し、外部触診によって監視した。全ての手術はハロタンと酸素の吸入によって麻酔した動物に対して実施した。
　抗ハムスター溶解抗体レベルを下記のように測定した：１％ハムスター赤血球溶液５０μｌを連続的に予め希釈した試験血清５０μｌに加えた。ウサギ乳仔補体［セラ　ラブ（Ｓｅｒａ　Ｌａｂ）、クラウレイ　ダウン、サセックス］の１／７希釈物５０μｌを加えて、３７℃において１時間インキュベートした。補体固定希釈剤７５０μｌを加え、遠心分離した（ベックマン、ＭＩＣＲＯＦＵＧＥ、１３０００ｒｐｍ，４分間）、この後に上澄み中のＯＤ４１５を測定した。［ＭＩＣＲＯＦＵＧＥなる用語は商標である］。正の対照と負の対照はそれぞれ、細胞の１％溶液に加えるＣＦＤと蒸留水であった。ＯＤ４１５読取りの結果をＸ軸上の血清力価に対してプロットした。図７から明らかであるように、ラットへのハムスターの心臓の移植は非常に高い力価の溶解抗ハムスター抗体を産生するラットを生ずる。これらのラットの一部からの血清を標準カラムクロマトグラフィー方法を用いてセファデックスＧ２００「ファルマシア社（ＰｈａｒｍａｃｉａＧＢＬｔｄ．）、ロンドン］上のカラムクロマトグラフィーによってそれらの成分蛋白質フラクションに分離した［「生物学的材料の分離、精製及び特性化におけるセファデックスの使用（Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ＳＥＰＨＡＤＥＸ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、カーリング（Ｃｕｒｌｉｎｇ）著、イクスプ．イン．フィジカル．アンド　バイオケム（Ｅｘｐ．ｉｎ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｉｍ）３（１９７４）４１７−４８４（ジー．エイ．ケルカット（Ｇ．Ａ．Ｋｕｒｋｅｔ）編集、アカデミックプレス　ロンドンおよびニューヨーク、１９７０］。（ＳＥＦＡＤＥＸなる用語は商標である）。カラムから回収される各７ｍｌフラクションを、上述のように、溶解抗ハムスター抗体に関して分析した。図８は、これらの抗体が心臓移植の結果として誘導されたという事実にも拘わらず、抗種活性が殆ど排他的にＩｇＭフラクションに存在することを実証する。活性の検定後に、ＣＸ限外フィルター（ファルマシア）を用いて、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に濃縮して、使用するまで−７０℃に保存した。
　赤血球溶解とは対照的に、異種移植片を破壊するそれらの能力を試験するために、ハムスター心臓を特定の実験を受けたことないラットの頚部に移植した。ハムスター心臓の拍動が確認されるや否や、溶解抗ハムスター抗体を含む、ニート血清２ｍｌ又は精製免疫グロブリン０．５ｍｇのいずれかをラット静脈内に注入した。非分離血清とＩｇＧ０．５ｍｇの両方は１５分間以内にハムスター心臓移植片の破壊を一致して生じた。ＩｇＧ注入からの結果は移植片破壊を生ずる幾つかの標本の結果と不一致であったが、他の標本では移植片は拍動を続けた。Ｇ２００カラムからのアルブミンを対照として注入した場合には、心臓移植片は常に生残し、このモデルの標準時間（３日間）後に拒絶された。このことは移植片へのこの抗体の結合がその超過敏破壊を誘導しうることを実証する。
実施例７
　本出願に今まで述べたデータは、異種移植片破壊が代替え経路又は抗体仲介補体活性化（古典経路）のいずれかによる補体活性化に関連することを実証した。さらに、異種移植片ターゲットの表面上の補体レギュレーターは異種補体ではなく相同的補体による破壊から異種移植片を保護することができる。両補体活性化経路に共通した決定的な活性化工程は補体成分Ｃ３の開裂である。この開裂はＣ３コンバーターゼ、Ｃ４ｂ２ａ（古典経路Ｃ３コンバーターゼ）、又はコンバーターゼＣ３ｂＢｂ（代替え経路コンバーターゼ）によって生ずる。これらの酵素はＣ３−Ｃ３ｂを開裂し、Ｃ３ｂは次に代替え経路に関係して、さらに多くのＣ３コンバーターゼを形成する（フィードバック回路）。この結果、補体系は「異種」ターゲット上へのＣ３ｂ付着を迅速に増幅することができる。しかし、Ｃ３ｂの多くは異種ターゲットと充分に相互作用することができず、流体相中に留まり、ホストの細胞に無差別に結合しうる。これらの細胞を補体の無差別結合によるアタックから保護するために、流体相中の又は自己組織に結合した補体成分を活性化するために制御蛋白質が開発されている。Ｃ３制御に関係する糖蛋白質は発生的に全てが、ＲＣＡ（補体活性レギュレーター）座と呼ばれるヒト染色体１の１領域内に関係する。この例では、融合方法によりヒト染色体１を獲得し、それらの表面にＲＣＡ座の蛋白質を表現するマウス細胞が、異種移植片破壊のインビトロアッセイにおいて、あたかもヒト細胞であり、マウス細胞ではないかのごとく挙動することを実証する。
細胞ライン
　Ｔ５は、バード（Ｂｉｒｄ）等の方法によって製造された、イプスタイン　バル（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ）ウイルス形質転換扁桃Ｂ細胞ラインである［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２８９
　高分子量ゲノムＤＮＡはヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）とフリシャウフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）の方法を用いて製造した［メソドス　エンザイモル．（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５２　１８０−１８３（１９８７）］。要約すると、各細胞ラインからの１００ｘ１０６細胞をＴＮＥ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　１％サルコシル）５ｍｌによって溶解して、新鮮なプロテイナーゼＫ（１００マイクログラム／ｍｌ）によって処理した。標本をフェノール（水飽和及び０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８に対して平衡化）、フェノールクロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）及び次にクロロホルムイソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）によって抽出した。ＤＮＡをエタノール沈降によって得て、ＮａＣｌ中で１００ｍＭにしたＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）と４℃におけるＴＥ単独に対して透析した。単離ＤＮＡを０．５％アガロースゲル上で分析し、濃度を２６０ｎｍにおける光学密度によって測定した。各細胞ラインのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をサイキ（Ｓａｉｋｉ）等［サイエンス、２３９、４８７−４９１（１９８８）］が述べているように実施した。ゲノムＤＮＡ５００ｎｇ、各プライマー１．２ｎｇ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ［サーモス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｏｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓタイプ３］［カムビオ社（Ｃａｍｂｉｏ　Ｌｔｄ．）、英国、ケンブリッジ］を含む１００μｌ量中に、緩衝液を用いて酵素を供給した。ヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）［ベーリンガー　マンハイム　ジアグノスチックス　アンド　バイオケミカルス社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ．）、英国、サセックス］は各２ｍＭの濃度であった。ＤＮＡをプログラム可能なサーマルコントロラー（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）［ジネチック　リサーチ　インストルメンテイション社（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ．）、英国、サセックス、ダンモウ］を用いて、３０サイクルに増幅し、９３℃で１分間変性し、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間延伸（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）した。反応生成物１０μｌをＴｒｉｓ硼酸ＥＤＴＡ緩衝液中で処理される２％アガロースゲル上で直接分析した。生成物サイズはＨｉｎｃ　ＩＩ消化ファージＸ−１７４−ｒｆ　ＤＮＡ［ファルマシア　ＬＫＢバイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、スウェーデン、アプサラ］との比較によって測定した。
　培養Ｔ５、Ｂ１０及びＤＢ３を抗ＤＡＦ（腐食促進因子）モノクローナル抗体［キノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ）等、ジェイ．イクスプ．メド．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１６２、７５−９２（１９８５）］とフルオレセイン標識第２抗体とによって処理した。細胞（１ｘ１０６）をマウス抗ＤＡＦモノクローナル抗体１Ａ１０［１０％ＦＣＳ０．１％アジド中、ＩｇＧ２ａ　１０μｇ／ｍｌ］と反応させた。１Ａ１０［キノシタ等、ジェイ．イムノル、１３６、３３９０〜３３９５（１９８６）］は、米国　ニューヨーク、ニューヨーク大学メディカルセンターのエム　ダビツ（Ｍ．Ｄａｖｉｓ）博士から入手した。ブランク対照はバッファー単独であった。氷上で２時間インキュベートした後に細胞を３回洗浄し、１／１００ＦＩＴＣ結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩＧ（重鎖及び軽鎖、アフィニティ精製及びヒトＩＧ吸収）［タゴ　イムノケミカルス社（Ｔａｇｏ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．）米国、カリフォルニア州、ベーリンガム］を含む緩衝液１００μｌ中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。一部の細胞は染色対照としての第２抗体のみと共にインキュベートした。ＤＢ３はマウスＩｇＧ分泌細胞ラインであるので、ＤＢ３細胞を染色する場合に生ずる抗ＩｇＧ反応性を除去するために、等量のＤＢ３細胞によって予め吸収されたＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ２Ａ［１／４０、ザ　バインディング　サイト社（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｔｄ．）、英国、バーミンガム］又はヤギ抗マウスＩＧも用いた。全ての細胞を徹底的に洗浄し、緩衝液２００μｌ中に再懸濁させた。経口活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析のためのべクトン　ジキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣＳ−ＳＴＡＲ装置を用いてＤＡＦ陽性細胞を検出した［ＦＡＣＳ＝ＳＴＡＲなる表現は商標である］。
　ＰＣＲ方法を用いて、３種類の培養細胞ライン、Ｔ５（ヒト）、Ｂ１０（ヒト−マウス）及びＤＢ３（マウス−マウス）におけるヒト染色体１の存在を検出した。図９は、増幅後にＴ５とＢ１０の両方が４９５塩基対のバンドサイズを有するが、ＤＢ３（すなわち、マウス−マウス　ハイブリッド）は全くバンドを有さないことを示す。ＡＴ３プライマーを用いるＰＣＲ産物は５７２塩基対（対立遺伝子１）と４９６塩基対（対立遺伝子２）のサイズである２対立遺伝子から成ることが報告されている（ウー等、上記引用文献）。Ｔ５とＢ１０ゲノムＤＮＡ中に見い出されるバンドは対立遺伝子２に相当する。このことはヒト　マウス　ハイブリッド細胞ラインＢ１０はヒト染色体１を含有することを示す。
　ＤＡＦの存在のＦＡＣＳ分析は、ヒトＴ５細胞の過半量（８５．７％）は抗ＤＡＦモノクローナル抗体によって陽性に染色されることを示した。同様なレベル（８３．１％）の陽性細胞がマウス／ヒト　ハイブリッドＢ１０細胞中に発見された。マウス−マウス　ハイブリッドＤＢ３細胞は抗ＤＡＦ処理標本と非処理標本の両方に対して同じ染色パターンを示した。しかし、この抗マウスＩｇＧ反応性は、（１）ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ２ａを用いた場合に、又は（２）上記ヤギ抗マウスＩｇＧがＤＢ３細胞によって予め吸収された場合には除去された。この結果は、特異的抗ＤＡＦモノクローンナル抗体によって検出されるように、ヒト−マウス　ハイブリッド細胞ラインＢ１０が細胞膜表面上にヒトＤＡＦを表現することを実証する。表現レベルはヒト細胞ラインＴ５の表現レベルと同じである。マウス−マウス　ハイブリドーマ細胞ラインはヒトＤＡＦを表現しない。
　これらの細胞ラインに対して、上記実施例５で述べたように、クロム放出細胞毒性細胞溶解試験を実施した。図１０は、ブタ抗ヒト抗体をＴ５ヒト細胞ラインと共にインキュベートした場合に、ウサギ補体の添加が溶解を生ずるが、ヒト補体を添加した場合には、溶解が生じないことを示す。この理由は、当然、Ｔ５細胞ラインがヒトＨＣＲＦを有するからである。ヒト抗体をヒト細胞ラインに用いる場合には、ヒト補体又はウサギ補体のいずれによっても溶解は生じず、自己抗体が生じないことを示す。クロム放出方法は、ウサギ補体のヒト細胞による代替え経路活性化の有意なレベルの検出を可能にするほど長い、インキュベーション持続を可能にしない（図１１）。しかし、ヒト抗体をＤＢ３マウス−マウス　ハイブリドーマ細胞ラインと共にインキュベートする場合には（図１２）、細胞溶解はウサギ補体及びヒト補体の両方によって達成され、このことは実際にヒト補体がこのような方法で機能しうることを実証する。ヒト染色体を有し、少なくともＤＡＦを有することが分かっているＢ１０ヒト−マウス　ハイブリッドを用いる場合には、ウサギ補体は細胞ライン溶解を生じるが、ヒト補体は細胞ライン溶解を生ずることができない（図１３）。これの説明は、マウス−ヒト　ハイブリッド上に染色体１を有することによって表現されるヒトＨＣＲＦがヒト補体の活性を阻害することである。
実施例８
　前記実施例は、染色体１を有することが異種移植片細胞の破壊を阻止しうることを実証する。これはマウス細胞を異種移植片破壊から保護するのはＣＲＡ座であるという強い環境証拠であるが、この実施例では、非ヒト細胞ラインをヒトＭＣＰによってトランスフェクションし、ヒトもしくはウサギ補体に暴露させることの効果を実証する。
　ルブリン（Ｌｕｂｒｉｎ）等［ジェイ．イクスプ．メド．１６８　１８１−１９４（１９８８）］が詳述しているように、ｃＤＮＡはＭＣＰに対して産生する。トランスフェクトされた細胞ラインの構成はウールブリッジ（Ｕｈｌｂｒｉｇｇｅ）等が述べる方法［プログ．ナトル．アカド．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、８５、５６４９−５６５３（１９８８）］によって表現プラスミドＳＦＦＶ．ｎｅｏを用いて実施した。これはフレンド脾臓フォーカスを形成するウイルス５’長末端繰り返し配列（ＳＦＦＶ．ＬＴＲ）を含む［クラーク（Ｃｌａｒｋ）とマック（Ｍａｃｋ）、ヌクル．アシドス．レス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）１０、３３１５−３３３０（１９８２）及びプロク．ヌクル．アカド．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎｕｃｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）８０、５０３７−５０４１（１９８３）］。細胞ラインは米国、メリーランド州、ロックビルのアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション　１２３０１　パークラーン　ドライブから入手された。使用細胞ラインはＣＨＯ−ＫＩ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）とＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）であった。遺伝子の表現はＭＣＰに対するモノクローナル抗体［アンドリュウス（Ａｎｄｒｅｗｓ）等、アン．ハム．ジネト．（Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４９、３１−３９（１９８５）］と、ＦＡＣＳ分析とを用いて、既述したように、確認した。ある場合には、標準方法を用いてＦＡＣＳでの細胞分類（ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）によってＭＣＰの高レベル表現に関して細胞ラインを選択した。
　この実施例はＭＣＰによってＣＨＯ細胞をトランスフェクトする効果を説明する。これらの細胞ラインは単層として成長するので、細胞溶解はデ　ボノ（ｄｅ　Ｂｏｎｏ）等［イムノロジー３２、２２１−２２６（１９７７）］が述べているような、末端アデニン摂取アッセイによって評価した。要約すると、このアッセイは平底滅菌９６抗プレート中での補体及び抗体と共にの細胞培養物のインキュベーションを含むものであった。この実験インキュベーション期間の終了時に、細胞生存度を培養物が放射性アデニンを吸収する可能性によって評価する。生存細胞はアデニンを吸収するが、死亡細胞はアデニンを吸収しない；従って、生存細胞は高カウントを有し、死亡細胞は低カウントを有する。
　多くの形質転換細胞に共通して、ＣＨＯは自然生成抗体及び補体の代替え経路の作用に対して非感受性である。しかし、これらの細胞は、実施例６で述べたようにハムスター心臓異種移植片破壊を実証されたように生ずる抗体に対しては感受性である。ＣＨＯ細胞はハムスターから誘導されるので、これらの細胞はヒト及びウサギの両補体を含むＣＨＯ細胞を殺した（図１４）。ＣＨＯ細胞をヒトＭＣＰによってトランスフェクトする場合に、細胞はウサギ補体の存在下でのみ溶解しうる。ヒト補体はハムスター細胞表面上のヒトＭＣＰの存在によって阻害された（図１５）。細胞が殺されないことが実際にはＣ３コンバーターゼの欠損によることの証拠は、上記実施例４に述べたようなロケット免疫電気泳動によるＣＨＯ細胞インキュベーション後のヒトＣ３の分解の分析によって与えられる。理解されるように、補体制御のみのレベルを越えては分解が生じない（図１６）。
　上記データは非ヒト細胞の表面上の遺伝子工学補体負の調節蛋白質がこれらの細胞を、共通特徴としての補体のＣ３成分の開裂を必要とする、超過敏な異種移植片破壊機構から保護することを確証する。
実施例９
　実施例８の方法に従って、３Ｔ３マウス繊維芽細胞をＭＣＰをコードするｃＤＮＡ（ＭＣＰクローンＫ５．２３）によってトランスフェクトした。５１Ｃｒを実施例５に述べられているように細胞に加えた。次に細胞１量をヒト熱不活性化補体１量と、ヒト補体から抗マウス抗体を除去するためにマウス脾臓細胞によって４℃において予め吸収させたヒト補体１量と共にインキュベートした。この混合物と補体による連続希釈物とをプレートアウトした。クロム放出アッセイの一般的条件と特徴は実施例５に述べる通りである。クローンＫ５．２３の結果を図１７に示す、図１７は対照として逆配向で導入されるＭＣＰ（この場合には、転写されない）の効果をも示す。正確に転写されたＭＣＰ　ｃＤＮＡは比較的低レベルの５１Ｃｒ放出によって実証されるように、細胞を溶解から阻止するが、非転写ｃＤＮＡは比較的高いレベルの５１Ｃｒ放出によって実証されるように、有意な保護を与えない。
実施例１０
　上記実施例８に述べた結果と同様な結果がＤＡＦに対するｃＤＮＡによってトランスフェクトしたＬ１／２１０（マウス白血病細胞ライン）によって得られる。ルブリン（Ｌｕｂｌｉｎ）とアトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）［アン．レブ．イムノル．７、３５−５８（１９８９）］に述べられているようにＤＡＦに対して産生された。
実施例１１
　ＭＣＰに対するｃＤＮＡを調製し、上記実施例８におけるようにＳＦＦＶ．ｎｅｏに結合させた。
　このＤＮＡ標本を用いて、ビー．ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ）等が「マウス胚の操作、実験室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、コールド　スプリングハーバー　ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８６）に述べているように、トランスジェニックマウスを製造した。１０〜１５匹の（ＣＢＡＸＢ１０）ｆ１雌マウス、生後３−４週間、を、妊娠雌ウマからの血清ゴナドトロピン［フォリゴン（Ｆｏｌｌｉｇｏｎ）として商業的に供給］５単位の腹腔内注入と４８時間後のヒト妊婦尿からの絨毛膜ゴナドトロピン［コルロン（Ｃｈｏｒｕｌｏｎ）として商業的に供給］５単位の腹腔内注入とによって誘導して、排卵過剰にした。コルロン注入日に、これらの雌を（ＣＢＡＸＢ１０）Ｆ１雄と交尾させ、翌日膣プラグを有する雌を頚脱臼によって殺し、受精卵をそれらの卵管から単離した。
　このようにして単離された３００〜４００個の卵はノマルスキー（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）示差干渉コントラストオプチックス下で４００倍率において明確に目視可能な生殖核２個を含んだ。２個の生殖核の１つに０．５〜２ｎｇ／μｌの濃度範囲内のＭＣＰ　ｃＤＮＡトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含むＤＮＡ標本の約２０００コピーを注入した。
　このミクロ注入に耐えて生き残る卵を、前夜精管切除雄と交尾させ、偽妊娠した（ＣＢＡＸＢ１０）Ｆ１雌（すなわち、これらの雌は排卵し、これらの雌のホルモン状態は妊娠雌のホルモン状態であるが、これらの雌の卵細胞は受精していない）の卵管に再移植した。約２０個のミクロ注入卵をミクロ注入の同日に又は翌日の卵が２卵期であるときに麻酔下の各偽妊娠雌の卵管に移した。正常妊娠が後で生じ、１０匹の母親から１７匹のマウスが生まれた。仔のスクリーニングをスロットブロット及び／又はサザンブロットによって（実施例８参照）、及びＰＣＲ、尾皮膚細胞からのＤＮＡの分析によっても、トランスジーンを識別する３２Ｐ標識プローブ及びプライマーを用いて実施した。仔の１匹、雄はＭＣＰ　ＤＮＡ塩基配列に対してトランスジェニックであることが実証された。
実施例１２
　実施例１０に述べたような、ＤＡＦに対するｃＤＮＡをＭＣＰに対するｃＤＮＡの代わりに用いたこと以外は、実施例１１の方法を繰り返した。１０匹の母親から２３匹の仔が生まれた。これらの中の３匹（雌２匹、雄１匹）、ＤＡＦに対してトランスジェニックであり、サザンブロットによって示すように得られた。
実施例１３
　ヒトＭＣＰ　ｃＤＮＡトランスジーンを含む、実施例１１において得られた雄マウスを成熟するまで成長させ、（ＣＢＡＸＢ１０）Ｆ１雌と交尾させた。１１匹の仔が得られた。各仔からの尾細胞ＤＮＡを、プローブとして標識ヒトＭＣＰｃＤＮＡを用いて、スロット−ブロット分析によってスクリーニングして、トランスジーンが遺伝されたものであるか否かを決定した。結果は図１８の上部に示す。仔０、１、５、７、８及び１０は遺伝を受けたことが認められる。（４対照を用いた：ヒトＤＮＡ（Ｈ）；マウスＤＮＡ（Ｍ）；ヒトＭＣＰ標識ｃＤＮＡ　１０ｐｇと混合したマウスＤＮＡ及びヒトＭＣＰ標識ｃＤＮＡ　１０ｐｇと混合したマウスＤＮＡ）
実施例１４
　ヒトＤＡＦ　ｃＤＮＡトランスジーンを含む、実施例１２において得られた雄マウスを成熟するまで成長させ、（ＣＢＡＸＢ１０）Ｆ１雌と交尾させた。得られた各仔の尾細胞ＤＮＡを、プローブとして標識ヒトＭＣＰｃＤＮＡを用いて、スロット−ブロット分析によってスクリーニングして、トランスジーンが遺伝されたものであるか否かを決定した。結果は図１８の下部に示す。仔１３．３（雌）は遺伝を受けたことが認められる。（４対照を用い：ヒトＤＮＡ（Ｈ）；マウスＤＮＡ（Ｍ）；ヒトＤＡＦ標識ｃＤＮＡ　１０ｐｇと混合したマウスＤＮＡ及びヒトＡＤＦ標識ｃＤＮＡ　１００ｐｇと混合したマウスＤＮＡ）
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　図１Ａ〜１Ｅは実施例１によってブタ新生児へ移植したウサギ心臓の連続的ＥＣＧトレースを示す。
　【図２】
　図２は実施例１に用いたブタが有意な量の抗種抗体を有しないことを実証する、ラジオイムノアッセイの結果を示す。
　【図３】
　図３は実施例４に用いた、蛋白質電気泳動のある一定の段階を示す。
　【図４】
　図４は実施例４に用いた、二次元交差電気泳動のある一定の段階を示す。
　【図５】
　図５は実施例４から生ずる「２Ｄ−ロケット」を示す。
　【図６】
　図６は実施例５におけるクロム放出細胞溶解アッセイの結果を示す。
　【図７】
　図７は実施例６に述べるような、移植前（０日）及び移植後５、７及び９日目のハムスター心臓移植片のラットレシピエントからの溶解抗ハムスター抗体の力価を説明する。
　【図８】
　図８はＧ２００フラクションのＯＤをグラフによって示す。このヒストグラムは実施例６に述べるような、ハムスター心臓のラットレシピエントからの溶解抗ハムスター抗体の各フラクションにおける力価を説明する。
　【図９】
　図９は実施例７に述べるような、Ｔ５、ｂ１０及びＤＢ３細胞ラインから抽出されたＤＮＡのサザンブロットを示す。
　【図１０】
　図１０は実施例７に述べるように、ブタ抗ヒト抗体の存在下でヒト補体ではなく、ウサギ補体によってＴ５ヒト細胞ラインが溶解することを実証する、５１Ｃｒ放出図を示す。
　【図１１】
　図１１は実施例７に述べるように、ヒト抗体がヒト又はウサギ補体のいずれかを含むＴ５ヒト細胞ラインを溶解できないことを実証する、放出図を示す。
　【図１２】
　図１２は実施例７に述べるような、ウサギ補体又はヒト補体の存在下でのマウス−マウス　ハイブリドーマ（ＤＢ３）をヒト抗体が溶解しうることを実証する、５１Ｃｒ放出図を示す。
　【図１３】
　図１３は実施例７に述べるように、ヒト−マウス　ハイブリッド細胞ラインＢ１０がウサギ補体の存在下でヒト抗体によって溶解するが、ヒト補体の存在下ではヒト抗体によって溶解しないことを実証する、５１Ｃｒ放出を示す。
　【図１４】
　図１４はＣＨＯ細胞による３Ｈアデニンの摂取（カウント／分間）を示し、これらの細胞が、実施例８に述べるように、ヒト補体又はウサギ補体の存在下で免疫ラット血清によって殺されることを示す。
　【図１５】
　図１５はヒトＭＣＰをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞による３Ｈアデニンの摂取（カウント／分間）を示し、これらの細胞が、実施例８に述べるように、ウサギ補体の存在下で免疫ラット血清によって殺されるが、ヒト補体の存在下では免疫ラット血清によって殺されないことを示す。
　【図１６】
　図１６は、図１５に関して述べた環境下で、ヒト補体のＣ３成分が実施例８に述べるように、開裂されず、Ｃ３ｂを形成しないことを実証する「２Ｄロケット」を示す。
　【図１７】
　図１７は、ヒト補体の存在下で自然生成抗体による３Ｔ３マウス繊維芽細胞の溶解と、マウス細胞によるヒトＭＣＰの表現の保護効果とを実証する、５１Ｃｒ放出図を示す。
　【図１８】
　図１８は、プローブとして標識ＭＣＰ　ｃＤＮＡ（上部）又は標識ＤＡＦ　ｃＤＡを用いる第２世代トランスジェニックマウスのＤＮＡスロットブロット分析を示す。