(57)【要約】【課題】本発明は、飼育動物に給餌するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】ある実施形態において、微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含む組成物を、動物のフード及び／又は飲料水と接触させる。好ましくは、増殖副生成物は、バイオサーファクタントである。利点を挙げると、本発明は、例えば、動物の免疫系を増進し、消化健康を促進し、動物に栄養を提供し、歯／口腔の健康を促進することによって、飼育動物の健康と良好な状態を促進することである。さらに、本発明を用いて、ペットフードの保存期間を延ばし、有害な微生物によるフードの汚染を防止することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物がフード及び／又は飲料水を摂取する前に、バイオサーファクタント生成微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含む組成物を、前記動物のフード及び／又は飲料水と接触させる、飼育動物に給餌する方法。
【請求項２】
前記増殖副生成物は、バイオサーファクタントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオサーファクタントは、ソホロ脂質、ラムノ脂質、マンノシルエリスリトール脂質、セロビオース脂質及びトレハロース脂質から選択される糖脂質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオサーファクタントは、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アルスロファクチン及びリケニシンから選択されるリポペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオサーファクタントは、リン脂質である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオサーファクタントは、脂肪酸エステルである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオサーファクタントは、粗形態であり、前記粗形態は、バイオサーファクタント生成微生物が培養された発酵ブロス中の前記バイオサーファクタントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記粗形態のバイオサーファクタントは、それを生成する微生物と共に、又はそれなしで使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、予め製造された動物のフードと混合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記予め製造された動物のフードは、生のフード、調理済みドライフード、又は調理済みウェットフードである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、生の動物のフード、調理済みドライフード又は調理済みウェットフードの製造に使用される原料成分と混合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物のフードは、前記動物の健康及び良好な状態を促進するための栄養素を含み、前記動物の消化管への前記栄養素のバイオアベイラビリティが増進される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
バイオサーファクタント生成微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含む組成物をペットフードと接触させる、ペットフードの保存期間を延ばす方法。
【請求項１４】
フード媒介病原体によるペットフードの異物の混入が防止される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
バイオサーファクタント生成微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含み、前記増殖副生成物がバイオサーファクタントである、飼育動物に給餌するための組成物。
【請求項１６】
前記バイオサーファクタントは、ソホロ脂質、ラムノ脂質、マンノシルエリスリトール脂質、セロビオース脂質及びトレハロース脂質から選択される糖脂質である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記バイオサーファクタントは、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アルスロファクチン及びリケニシンから選択されるリポペプチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記バイオサーファクタントは、リン脂質である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記バイオサーファクタントは、脂肪酸エステルである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記バイオサーファクタントは、粗形態であり、前記粗形態は、バイオサーファクタント生成微生物が培養された発酵ブロス中の前記バイオサーファクタントを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粗形態のバイオサーファクタントを、それを生成する微生物なしで含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
水をさらに含み、前記水は、動物の飲料水である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
予め製造された生、ウェット又はドライペットフードをさらに含み、前記予め製造されたペットフードは、加工及び／又は調理された状態であり、動物による消費の準備ができた状態である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記微生物及び／又は増殖副生成物は、前記予め製造されたフードと混合される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記微生物及び／又は増殖副生成物は、ドライ動物性フードキブル、ペレット、トリーツ又はビスケット上にコーティングを形成する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
調理済みペットフードを製造するための原料をさらに含み、前記原料は、ドライ又はウェットペットフード製品を製造するために、前記微生物及び／又は増殖副生成物と共に調理された状態である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
動物の健康のための１つ以上の栄養素をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記１つ以上の栄養素は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、及び微量ミネラルの選択された供給源である、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１８年９月２８日出願の米国仮出願第６２／７３８，４６２号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
動物を飼育する場合、家畜であっても交友動物であっても、動物の健康と幸せはその食事に因るところが大きい。ペットは、例えば、種類、品種、サイズ、年齢、及び健康状態に応じて、様々な栄養を必要とするが、ペットの食餌は、基本的に必要な栄養を供給し、動物にとって味が良く、容易に消化可能で、動物がフードから最大の健康上の利益を得ることができるものでなければならない。
【０００３】
犬猫のような家庭動物用フードは、典型的には、フード製造施設で製造され、その後、包装され、各種卸売及び小売流通チャネルを介して動物オーナーに流通される。フードの種類としては、例えば、ドライキブル、ウェットフード、セミモイストフード、冷凍フード、フリーズドライフード、ビスケット、ケーキ又はトリーツを挙げることができる。
【０００４】
理想的なペットフードは、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、及び必須脂肪酸を含む、幅広い他の生体利用可能な成分と共に、消化可能なタンパク質源を含有しなければならない。しかしながら、ドライフードでは、これらの栄養素の多くは、キブル及びペレットを製造するために使用される押出プロセスのために、最適量に満たない。ドライ食材とウェット食材との混合物を混合して生地を形成し、これを非常に高い圧力及び高温下で調理する。次いで、生地は、特別な形状の穴を通って押し出され、ペレットが形成される。押出成形中に加えられる高熱が、最終フード製品中の多くの貴重な栄養素の熱分解を引き起こす恐れがある。
【０００５】
さらに、多くのタイプのペットフードでは、その配合がフードの保存期間を延ばし、異物の混入を防止するために、必然的に防腐剤を含有する。防腐剤なしでは、ペットフードは急速に腐敗し、消費されると病気を引き起こすことがある。市販のドッグフードを保存するには多くの方法があり、その多くは、例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エトキシキン、プロピレングリコール、第三ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、及びメタ重亜硫酸ナトリウム等の人工防腐剤化合物の使用を含み、その多くは癌に関連している。
【０００６】
ペットは、例えば、感染症、消化器問題、栄養欠乏症、歯／口腔の健康病理、及び炎症を含む、ヒトが罹るのと同じ多くの一般的な病気に罹る。過剰カロリー、低栄養素含量、及び化学防腐剤を有する高度に加工されたフードの消費は、これらの健康問題、並びに肥満、関節炎、糖尿病及び癌の一因となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０４４９５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの病気の多くは、バランスのとれた食事を通して、間接的又は直接的に解決することができる。従って、ペット及び他の家畜に給餌するための改善された組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、例えば、イヌ、ネコや家畜等に給餌する際の微生物及び／又は増殖副生成物の使用に関する。利点を挙げると、本発明の組成物及び方法は、例えば、動物の消化（ＧＩ）管を通る栄養素のバイオアベイラビリティ及び吸収の増大、消化器の健康の増進、消化管及び／又は口腔の感染予防及び／又は制御、歯の健康の増進、並びにペットフードの腐敗及び／又は汚染の予防を含む、多くの利点を提供することができる。さらに、本発明の組成物は、天然由来であり、環境に優しく、ペットフードの嗜好性を損なわないものである。
【００１０】
好ましい実施形態において、本発明は、ペットに給餌するための組成物であって、１つ以上の有益な微生物及び／又は１つ以上の微生物増殖副生成物を含む組成物を提供する。存在する場合、組成物中の微生物は、活性又は不活性形態であり得る。いくつかの実施形態において、微生物は増殖副生成物から分離される。好ましい実施形態において、有益な微生物は、非病原性真菌、酵母及び／又は細菌である。
【００１１】
一実施形態において、組成物は、１つ以上の酵母及び／又はその１つ以上の増殖副生成物を含む。酵母は、例えば、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces spp（例えば、S.cerevisiae及び／又はS.boulardii）、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、Monascus purpureus、及び／又はAcremonium chrysogenumとすることができる。酵母は、活性又は不活性細胞又は胞子の形態、並びに乾燥細胞塊及び／又は休眠細胞（例えば、酵母加水分解物）の形態とすることができる。
【００１２】
特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の真菌及び／又はその１つ以上の増殖副生成物を含む。真菌は、例えば、Pleurotus spp.の真菌、例えばP.ostreatus（ヒラタケ）、Lentinula spp.の真菌、例えばL.edodes（シイタケキノコ）、及び／又はTrichoderma spp.の真菌、例えばT.virideとすることができる。真菌は、活性又は不活性細胞、菌糸体、胞子及び／又は子実体の形態とすることができる。果実体は、存在する場合、例えば、細断及び／又はブレンドして、顆粒及び／又は粉末形態にすることができる。
【００１３】
一実施形態において、組成物は、１つ以上の追加の有益な微生物、例えば、１つ以上のBacillus spp.の細菌を含む。特定の実施形態において、Bacillus spp.は、B.amyloliquefaciens、B.subtilis及び／又はB.licheniformisである。
【００１４】
好ましい実施形態において、微生物由来の組成物は、微生物増殖副生成物を含む。組成物は、微生物及び／又は増殖副生成物が生成された発酵培地を含むことができる。
【００１５】
一実施形態において、増殖副生成物は、それが生成された発酵培地から精製されている。あるいは、一実施形態において、増殖副生成物は、粗形態で利用される。粗形態は、例えば、目的の増殖副生成物を生成する微生物の培養から生じる液体上清の形態をとることができる。
【００１６】
増殖副生成物はまた、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、溶剤及び／又は他の代謝生成物を含む、細胞増殖の結果として生成される代謝生成物又は他の生化学物質を含むことができる。
【００１７】
特定の実施形態において、液体発酵ブロス及びバイオサーファクタント生成微生物の浸漬培養から生じる細胞を含有する微生物培養物の形態で、バイオサーファクタントを組成物に添加することができる。特定の実施形態において、バイオサーファクタントがソホロ脂質であるとき、この「培養形態」のバイオサーファクタントは、Starmerella bombicolaの酵母細胞、ソホロ脂質、及び他の酵母増殖副生成物をその中に含む発酵ブロスを含むことができる。酵母細胞は、それらがペットフードと接触したり、ペットフードに処方される時点で活性であっても不活性であってもよい。より低濃度のソホロ脂質が望ましい場合、S.bombicolaの培養物を生じるソホロ脂質部分を除去することができ、例えば、１〜４ｇ／Ｌの残留ソホロ脂質、及び、場合により、酵母細胞及び他の増殖副生成物を有する残留液体を、本方法において利用することができる。他のバイオサーファクタントの使用が望まれるとき、他のバイオサーファクタントを生成することができる任意の他の微生物を利用する同様の生成物が想定される。
【００１８】
一実施形態において、本組成物は、動物のフードを補い、動物の健康（health）及び／又は良好な状態（well-being）を促進するための１つ以上の物質及び／又は栄養素、例えば、アミノ酸（必須アミノ酸を含む）、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、並びに微量ミネラル、例えば、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ及びケイ素の供給源を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物の微生物は、これらの物質を生成及び／又は提供する。
【００１９】
一実施形態において、組成物は、ケルプ（kelp）抽出物、干し草、アルファルファ、わら、サイレージ、穀物及び／又はマメ科植物等のプレバイオティクスの１つ又は複数の供給源を含む。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明による組成物は、例えば、酵母細胞壁の有利な特性のために、例えば、精製された微生物代謝生成物単独よりも優れる。これらの特性には、高濃度のマンノプロテイン及び酵母細胞壁の外表面の一部としての生体高分ベータグルカンが含まれる。これらの化合物は例えば、有効な乳化剤として働くことができる。さらに、組成物は、培養物中の残留バイオサーファクタント、並びに溶剤、酸、ビタミン、ミネラル、酵素及びタンパク質等の他の代謝生成物及び／又は細胞成分をさらに含むことができる。従って、組成物は、多くの他の用途の中でも、界面活性剤として作用し、抗菌性及び／又は表面／界面張力低下特性を有することができる。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明は、動物がフード及び／又は水を摂取する前に、微生物及び／又はその増殖副生成物を含む組成物を、動物のフード及び／又は飲料水と接触させる、飼育動物に給餌する方法を提供する。利点を挙げると、本方法は、動物に栄養素を提供し、動物の消化器（ＧＩ）、歯及び免疫の健康を増進するのに有用である。
【００２２】
一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥製品のいずれかとして使用される。一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥形態のいずれかで、動物のフードに、又は動物の飲料水に導入される。一実施形態において、組成物は、チュートイ又はボーンに添加される。
【００２３】
一実施形態において、組成物は、標準的な生のペットフード、及び／又は調理済みウェット及び／又はドライペットフードの製造に利用されるフード原料に添加される。利点を挙げると、これはペットフードの保存期間を延ばし、望ましくない微生物によるペットフードの異物の混入を防ぐことができる。
【００２４】
一実施形態において、組成物は、例えば、ドライキブル、トリーツ、ビスケット、又はペレットの製造に利用される成分に添加される。栄養補助キブルは、一ピース当たり一定濃度の微生物由来の組成物を含むことができる。他の実施形態において、組成物は、ピースの表面コーティングとして利用することができる。ドライキブルを製造するには、当技術分野で公知の方法を使用することができる。特定の好ましい実施形態において、「低温」ペレット化プロセス、又は高熱もしくは蒸気を使用しないプロセスが使用される。
【００２５】
利点を挙げると、例えば、組成物中にバイオサーファクタントが存在するために、本方法は、動物の消化管の上皮細胞を介する栄養吸収を増大させることができる。さらに、組成物の抗微生物特性により、本方法は、動物の免疫健康を増進し、抗生物質の必要性を減少させ、消化器感染を減少させ、口臭、う蝕及び歯周病等の歯科／口腔の病変を減少させることができる。さらに、本発明の方法は、有害な化学防腐剤を必要とせずに、ペットフードの保存期間を延ばし、及び／又は望ましくない微生物による汚染を防止することを補助することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、例えば、イヌ、ネコ、家畜等の飼育動物に給餌するための組成物及び方法を提供する。利点を挙げると、本発明の組成物及び方法は、例えば、動物の消化（ＧＩ）管を通る栄養素のバイオアベイラビリティ及び吸収の増大、消化器の健康の増進、消化管及び／又は口腔の感染の予防及び／又は制御、歯の健康の増進、並びにペットフードの腐敗及び／又は汚染の予防を含む、多くの利点を提供することができる。さらに、本発明は、天然由来で、環境に優しく、ペットフードの嗜好性を損なわない組成物を利用する。
【００２７】
＜代表的な定義＞
本明細書中で使用される、「バイオフィルム」は細菌等の微生物の複雑な凝集体であり、細胞は、細胞外多糖マトリックスを介して互いに及び／又は表面に接着する。バイオフィルム中の細胞は、液体培地中で浮遊又は泳動することができる単一細胞で同じ生物のプランクトン細胞とは生理学的に異なる。
【００２８】
本明細書中で使用される、害虫又は他の望ましくない生物に関して使用される用語「制御」は、害虫又は他の生物を殺傷、無能にする、もしくは固定する、あるいは害虫又は他の生物が実質的に害を引き起こすことができなくなるようにすることまで包含する。
【００２９】
本明細書で使用される、「飼育（domesticated）」動物とは、ヒトにより、影響を受け、繁殖され、飼い慣らされ、持続的な頭数の生成により制御された種の動物であり、その結果、動物とヒトとの間に共生的な関係が存在する。飼育動物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、サル、鳥、げっ歯類、その他小哺乳類、は虫類等の、保護及び／又は交友のためにヒトによって飼育され、世話される動物を含む「ペット」である。飼育動物は、フード、ファイバー、及び労働等の商品を生産するために農業又は工業環境で飼育される動物を含む「家畜」でもあり得る。家畜という用語に含まれる動物の種類としては、アルパカ、ラマ、肉牛及び乳牛、バイソン、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラバ、アッセイ、ラクダ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、及びハトが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される、微生物発酵において「採取された（harvested）」とは、微生物由来の組成物の一部又は全部を増殖容器から除去することを指す。
【００３１】
本明細書中で使用される、「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば、小分子（例えば、後述するもの）等の有機化合物、又は他の化合物は、天然に関連付けられた細胞物質等の他の化合物を実質的に含まない。例えば、精製又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、その天然に存在する状態で、それに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製又は単離されたポリペプチドは、その天然に存在する状態でそれに隣接するアミノ酸又は配列を含まない。精製又は単離された微生物株は、天然に存在する環境から除去される。従って、単離された株は例えば、生物学的に純粋な培養物として、又は担体と会合した胞子（又は株の他の形態）として存在し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、精製化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％である。好ましくは、調製物は、目的の化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。例えば、精製化合物は、所望の化合物の少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、又は１００重量％（ｗ/ｗ）である。純度は、任意の適宜標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。
【００３３】
「代謝生成物」とは、代謝によって生成される任意の物質（例えば、増殖副生成物）又は特定の代謝プロセスに関与するのに必要な物質をいう。代謝生成物は、代謝の出発物質、中間体、又は最終生成物である有機化合物とすることができる。代謝生成物の例としては、酵素、毒素、酸、溶剤、アルコール、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、ポリマー、及び界面活性剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書中で使用される、「微生物由来の組成物」とは、微生物又は他の細胞培養物の培養の結果として生成された成分を含む組成物を意味する。従って、微生物由来の組成物は、微生物自体及び／又は微生物増殖の副生成物を含む。微生物は、栄養状態、胞子形態、菌糸形態、任意の他の形態の微生物繁殖体、又はこれらの混合物であり得る。微生物は、プランクトンであっても、バイオフィルムの形態であっても、又は両方の混合物であってもよい。増殖副生成物は、例えば、代謝生成物（例えば、バイオサーファクタント）、細胞膜成分、発現タンパク質、及び／又は他の細胞成分であり得る。微生物は、無傷であっても溶解されていてもよい。細胞は、全く存在しないか、又は、例えば、組成物の少なくとも１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12、１×１０13ＣＦＵ／ｍｌ以上の濃度で存在してもよい。
【００３５】
本発明はさらに、所望の結果を達成するために実際に適用される生成物である「微生物由来の生成物」を提供する。微生物由来の生成物は単に、微生物培養プロセスから採取された微生物由来の組成物である。あるいは、微生物由来の生成物は、添加されたさらなる成分を含み得る。追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、担体（例えば、水又は塩溶液）、さらなる微生物増殖を支持するために添加された栄養素、非栄養増殖促進剤、及び／又は微生物及び／又はそれが適用される環境中の組成物の追跡を容易にする薬剤を含むことができる。微生物由来の生成物はまた、微生物由来の組成物の混合物を含むことができる。微生物由来の生成物はまた、これらに限定されるものではないが、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等のような、何らかの方法で処理された微生物由来の組成物の１つ以上の成分を含んでもよい。
【００３６】
本明細書中で使用される、状態又は発生を「予防する」とは、１つ以上の予防手段の適用により、その発症又は進行を遅延させる手段である。場合によっては、予防は絶対的ではなく、状況又は発生が依然として起こり得ることを意味するが、予防措置がない場合よりも遅らせたり、及び／又は重篤度を低くすることができる。
【００３７】
本明細書で示される範囲は、その範囲内の全ての値について省略されたものであると理解される。例えば、１〜５０の範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、組み合わせ、又は下位範囲が含まれると理解される。同様に、１〜５０の範囲には、例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９などの、上述の整数の間に介在するすべての小数値が含まれると理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から広がる「ネストされた下位範囲」が特に考えられる。例えば、１〜５０の例示的な範囲のネスト化された下位範囲は、一方向からだと１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、他方向からだと５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される、「減少」は負の変化を意味し、「増加」は正の変化を意味する。ここで、正又は負の変化は、少なくとも０．２５％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
【００３９】
「含有する」と同義である「含む」という移行語句は、包括的又は非限定的であり、追加の、非記載の要素又は方法ステップを排除しない。対照的に、「からなる」という移行語句は、請求項に指定されていない要素、ステップ、又は成分を排除する。「から実質的になる」という移行語句は、請求項の範囲を、特定の材料又はステップ、及び請求項に記載された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。「含む」という用語の使用には、記載された構成要素「からなる」及び「実質的になる」実施形態も意図される。
【００４０】
特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「又は」は、包括的と理解される。特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「１つ」、「その」は、単数又は複数であると理解される。
【００４１】
特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される、用語「約」は当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。
【００４２】
本明細書に記載される可変体のいずれかの定義における化学基の列挙の再引用は、いずれかの１個の基又は列挙された基の組み合わせとしてその可変体の定義を含む。本明細書における変数又は態様のための実施形態の記載は、その実施形態を、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせて含む。
【００４３】
本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
＜微生物由来の組成物＞
好ましい実施形態において、本発明は、飼育動物に給餌するための組成物であって、微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含む組成物を提供する。存在する場合、組成物中の微生物は、活性又は不活性形態であり得る。いくつかの実施形態において、微生物は培養後にそれらの増殖副生成物から分離される。
【００４５】
微生物は、例えば、細菌、酵母及び／又は真菌であり得る。これらの微生物は、天然の微生物であってもよく、又は遺伝的に改変された微生物であってもよい。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換され得る。微生物はまた、所望の株の突然変異体であってもよい。本明細書中で使用される、「突然変異体」は基準微生物の株、遺伝的変異体又はサブタイプを意味し、ここで、その突然変異体は基準微生物と比較して、１以上の遺伝的変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、重複、フレームシフト突然変異又は反復拡大）を有する。変異体を生成するための手順は、微生物学的技術分野において周知である。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
【００４６】
有益な微生物は、例えば、細菌、酵母及び／又は真菌である。これらの微生物は、天然、又は遺伝的に改変された微生物であってもよい。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換され得る。微生物はまた、所望の株の突然変異体であってもよい。本明細書中で使用される、「突然変異体」は、基準微生物の株、遺伝的変異体又はサブタイプを意味し、ここで、その突然変異体は、基準微生物と比較して、１以上の遺伝的変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、重複、フレームシフト突然変異又は反復拡大）を有する。変異体を生成するための手順は、微生物学的技術分野において周知である。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
【００４７】
一実施形態において、有益な微生物は、酵母及び／又は真菌である。本発明による使用に適した酵母及び真菌種として、Acaulospora、Acremonium chrysogenum、Aspergillus、Aureobasidium（例えば、A.pullulans）、Blakeslea、Candida（例えば、C.albicans、C.apicola、C.batistae、C.bombicola、C.floricola、C.kuoi、C.riodocensis、C.nodaensis、C.stellate）、Cryptococcus、Debaryomyces（例えば、D.hansenii）、Entomophthora、Hanseniaspora（例えば、H.uvarum）、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces（例えば、K.phaffii）、Lentinula spp.（例えば、L.edodes）、Meyerozyma（例えば、M.guilliermondii）、Monascus purpureus、Mortierella、Mucor（例えば、M.piriformis）、Penicillium、Phythium、Phycomyces、Pichia（例えば、P.anomala、P.guilliermondii、P.occidentalis、P.kudriavzevii）、Pleurotus（例えば、P.ostreatus、P.sajorcaju、P.cystidiosus、P.cornucopiae、P.pulmonarius、P.tuberregium、P.citrinopileatus及びP.flabellatus）、Pseudozyma（例えば、P.aphidis）、Rhizopus、Rhodotorula（例えば、R.bogoriensis）、Saccharomyces（例えば、S.cerevisiae、S.boulardii、S.torula）、Starmerella（例えば、S.bombicola）、Torulopsis、Thraustochytrium、Trichoderma（例えば、T.reesei、T.harzianum、T.viride）、Ustilago（例えば、U.maydis）、Wickerhamiella（例えば、W.domericqiae）、Wickerhamomyces（例えば、W.anomalus）、Williopsis（例えば、W.mrakii）、Zygosaccharomyces（例えば、Z.bailii）等が挙げられる。
【００４８】
一実施形態において、酵母が例えば、Wickerhamomyces anomalus、Saccharomyces spp.の酵母（例えば、S.cerevisiae及び／又はS.boulardii）、Starmerella bombicola、Meyerozyma guilliermondii、Pichia occidentalis、及び／又はPseudozyma aphidisである。酵母は、活性又は不活性細胞又は胞子の形態、並びに乾燥細胞塊及び／又は休眠細胞（例えば、酵母加水分解物）の形態である。
【００４９】
特定の具体的な実施形態において、微生物は、Starmerella bombicolaであり、これは、ソホロ脂質バイオサーファクタントの有効な生成体である。いくつかの実施形態において、ソホロ脂質が酸性（線状）形態のソホロ脂質とラクトン形態のソホロ脂質との混合物として生成される。
【００５０】
特定の実施形態において、微生物は、ソホロ脂質バイオサーファクタントの効果的なプロデューサーであるWickerhamomyces anomalusである。W.anomalusはまた、摂取された食物からのリンの改善された消化及びバイオアベイラビリティのために有用な酵素であるフィターゼ、並びに動物に害を及ぼすことなく病原性微生物を制御するために有用なキラー毒素（例えば、エキソ−β−１，３−グルカナーゼ）を生成する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、酵母細胞バイオマスの存在は、多数のタンパク質（乾燥細胞バイオマスの５０％までを含有する）、脂質及び炭素源、並びにミネラル及びビタミンの全スペクトル（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（ＰＰ）、Ｂ５、Ｂ７（Ｈ）、Ｂ６、Ｅ）をさらに提供する。
【００５２】
特定の実施形態において、組成物は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を含む有益な細菌を含む。細菌は、例えば、Agrobacterium（例えば、A.radiobacter）、Azotobacter（A.vinelandii、A.chroococcum）、Azospirillum（例えば、A.brasiliensis）、Bacillus（例えば、B.amyloliquifaciens、B.firmus、B.laterosporus、B.licheniformis、B.megaterium、Bacillus mucilaginosus、B.subtilis）、Frateuria（例えば、F.aurantia）、Microbacterium（例えば、M.laevaniformans）、Pantoea（例えば、P.agglomerans）、Pseudomonas（例えば、P.aeruginosa、P.chlororaphis、Pchlororaphis subsp.aureofaciens（Kluyver）、P.putida）、Rhizobium spp、Rhodospirillum（例えば、R.rubrum）及び/又はSphingomonas（例えば、S.paucimobilis）である。
【００５３】
一実施形態において、組成物は、胞子及び／又は乾燥細胞塊の形態の１つ又は複数のBacillus spp.の細菌を含む。特定の実施形態において、Bacillus spp.は、B.amyloliquefaciens、B.subtilis及び／又はB.licheniformisである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、B.amyloliquefaciensは、体重を増加させ、飼料摂取効率を増加させ、成長ホルモン（例えば、ＧＨ／ＩＧＨ−１）レベルを増加させるために、プロバイオティクスとして作用する。さらに、B.amyloliquefaciensは、他の有益な微生物（例えば、短鎖脂肪酸の生成者）の成長を促進し、一方、例えば、抗菌性リポペプチドバイオサーファクタントを生成することによって、動物の腸内の潜在的な病原性微生物の量を減少させることができる。いくつかの実施形態において、４×１０10ＣＦＵ／日の用量のB.amyloliquefaciensが、本発明の組成物の一部として動物に投与される。
【００５５】
一実施形態において、微生物は、B.subtilisの株、例えば、B.subtilis var.locusesＢ１又はＢ２等であり、例えば、サーファクチンやその他のリポペプチドバイオサーファクタントの有効な生成体である。本明細書は、本明細書に開示された教示と一致する程度まで、国際公開第２０１７／０４４９５３号（特許文献１）を参照により組み込むものである。
【００５６】
例えば、糖脂質、リポペプチド、マンノプロテイン、ベータグルカン、酵素、及び抗メタン生成可能な、及び／又は生体乳化可能な及び表面／界面張力低下特性を有する他の代謝生成物を大量に蓄積することができる株を含む他の微生物株を、本発明に従って使用することができる。
【００５７】
１つの具体的な実施形態において、組成物は、組成物中に存在する微生物のそれぞれの種の約１×１０6〜約１×１０13、約１×１０7〜約１×１０12、約１×１０8〜約１×１０11、又は約１×１０9〜約１×１０10ＣＦＵ／ｍｌを含む。
【００５８】
一実施形態において、組成物は、総体積で約１〜１００％、約１０〜９０％、又は約２０〜７５％の微生物を含む。
【００５９】
一実施形態において、本組成物の１つ以上の微生物増殖副生成物は、バイオサーファクタントである。バイオサーファクタントは、微生物によって生成される構造的に多様な群の界面活性物質で、生分解性であり、再生可能な基質上の選択された生物を使用して効率的に生成される。バイオサーファクタントは、全て両親媒性物質であり、極性（親水性）部分と非極性（疎水性）基の２つの部分からなる。それらの両親媒性構造のために、バイオサーファクタントは、疎水性の水不溶性物質の表面積を増加させ、そのような物質の水バイオアベイラビリティを増加させ、細菌細胞表面の特性を変化させる。
【００６０】
バイオサーファクタントは、界面に蓄積して、界面張力を減少させ、溶液中に凝集ミセル構造を形成させる。安全で有効な微生物バイオサーファクタントは、液体、固体、及び気体の分子間の表面及び界面張力を減少させる。バイオサーファクタントは、細孔を形成し、生体膜を不安定化する能力によって、抗菌剤、抗真菌剤、及び溶血剤として使用できる。低毒性及び生分解性の特性と組み合わせて、バイオサーファクタントは、ペットフード及びペットフードサプリメントにおける使用に有利である。
【００６１】
バイオサーファクタントには、例えば、糖脂質、リポペプチド、フラボ脂質、リン脂質、脂肪酸エステル、リポタンパク質、リポ多糖−タンパク質複合体、及び多糖−タンパク質−脂肪酸複合体が含まれる。バイオサーファクタント分子の一般的な親油性部分は、脂肪酸の炭化水素鎖であり、一方、親水性部分は、中性脂質のエステル又はアルコール基によって、脂肪酸又はアミノ酸（又はペプチド）のカルボキシレート基によって、フラボ脂質の場合には有機酸によって、又は糖脂質の場合には炭水化物によって形成される。
【００６２】
微生物バイオサーファクタントは、増殖培地中の炭化水素源（例えば、油、糖、グリセロール等）の存在に応答して、細菌、真菌、及び酵母等の様々な微生物によって生成される。バイオサーファクタントは、当技術分野で知られている発酵プロセスによって得ることができる。
【００６３】
一実施形態において、バイオサーファクタントは、糖脂質（例えば、ソホロ脂質、ラムノ脂質、マンノシルエリスリトール脂質、セロビオース脂質及びトレハロース脂質）、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アルスロファクチン及びリケニシン）、リン脂質（例えば、カルジオリピン）又は脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸メチルエステル及び／又は脂肪酸エチルエステル）である。
【００６４】
一実施形態において、組成物は、合成又は生物学的に生成されたアミノ酸を含む。特定の実施形態において、アミノ酸はバリンである。バリンは、Wickerhamomyces anomalus及びSaccharomyces spp.が生成するアミノ酸で、家畜の成長と健康を助け、飼料中のタンパク源のより完全な形質転換を可能にする。一実施形態において、組成物は、それを生成する酵母の有無にかかわらず、精製された形態のバリンを含む。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、微生物及び／又は増殖副生成物が生成された発酵培地を含むことができる。利点を挙げると、特定の実施形態において、これは例えば、高濃度のマンノプロテイン及び酵母細胞壁の外表面の一部としての生体高分子ベータグルカンのために、組成物を、例えば、精製された微生物代謝生成物単独よりも優れたものにすることができる。これらの化合物は、例えば、有効な乳化剤として作用する。さらに、組成物は、培養物中の残留バイオサーファクタント、溶剤、酸、ビタミン、ミネラル、酵素及びタンパク質等の他の代謝生成物及び／又は細胞成分をさらに含むことができる。従って、組成物は、多くの他の用途の中でも、界面活性剤として作用して、抗菌性及び表面／界面張力低下特性を有することができる。
【００６６】
一実施形態において、バイオサーファクタントは、それが生成された発酵培地から精製されている。あるいは、一実施形態においてバイオサーファクタントは、粗形態で利用される。粗形態のバイオサーファクタントは、例えば、バイオサーファクタント生成微生物の培養から生じる発酵ブロス中のバイオサーファクタント沈殿物を含む液体混合物の形態をとることができる。この粗形態のバイオサーファクタント溶液は、約０．００１％〜９９％、約２５％〜約７５％、約３０％〜約７０％、約３５％〜約６５％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、又は約５０％の純粋なバイオサーファクタントを含むことができる。
【００６７】
特定の実施形態において、バイオサーファクタントは、液体発酵ブロス及びバイオサーファクタント生成微生物の浸漬培養から生じる細胞を含有する微生物培養物の形態で組成物に添加することができる。特定の実施形態において、バイオサーファクタントがソホロ脂質である場合、この「培養形態」のバイオサーファクタントは、Starmerella bombicolaの酵母細胞、ソホロ脂質（ＳＬＰ）、及び他の酵母増殖副生成物をその中に含む発酵ブロスを含むことができる。酵母細胞は、動物のフードと接触させるか、又は動物のフードと処方する時点で活性又は不活性であり得る。より低い濃度のＳＬＰが望まれる場合、S.bombicolaの培養物を生じるＳＬＰ部分を除去し、そして例えば、１〜４ｇ／Ｌの残留ＳＬＰ及び任意で酵母細胞及び他の増殖副生成物を有する残留液体を、本発明の方法において利用することができる。別のバイオサーファクタントの使用が望まれる場合、他のバイオサーファクタントを生成することができる任意の他の微生物を利用する同様の生成物が想定される。
【００６８】
一実施形態において、組成物は、水をさらに含むことができる。例えば、微生物及び／又は増殖副生成物を、例えば、飼料添加物及び／又はサプリメントとして動物の飲料水と混合することができる。
【００６９】
一実施形態において、組成物は、予め製造された生の又は調理済みウェット又はドライペット又は動物のフードをさらに含むことができ、この場合、予め製造されたフードは、動物による消費の準備ができる状態に加工されている。例えば、微生物及び／又は増殖副生成物は、予め製造された生の又は調理済みフード上に注がれ、及び／又は混合されてもよく、又は微生物及び／又は増殖副生成物は、ドライ動物フードピース、例えばキブル、ペレット、トリーツ及び／又はビスケットの外側上のコーティングとして作用してもよい。
【００７０】
一実施形態において、組成物は、調理済みペット及び動物のフードを製造するための原料をさらに含むことができ、原料は、微生物及び／又は増殖副生成物と共に、調理及び／又は加工されて、強化されたドライ又はウェットペットフード製品を製造する。
【００７１】
一実施形態において、本組成物は、動物の食餌を補足し、及び／又は動物の健康及び／又は良好な状態を促進するための追加の栄養素、例えば、アミノ酸（必須アミノ酸を含む）源、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、微量ミネラル、例えば、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ及びケイ素を含む。
【００７２】
好ましい組成物は、ビタミン及び／又はミネラルを任意の組み合わせで含む。本発明の組成物において使用するビタミンは、例えば、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール及びパラアミノ安息香酸を含むことができる。鉱物は、例えば、カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、セレン及び亜鉛の塩を含むことができる。他の成分としては抗酸化剤、ベータグルカン、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、カロテノイド、及び他の多くが挙げられ得るが、これらに限定されない。典型的なビタミン及びミネラルは、例えば、推奨される毎日の量（ＲＤＡ）で、毎日消費が推奨されるものであるが、正確な量は変えることができる。組成物は、好ましくはＲＤＡビタミン、ミネラル及び微量ミネラルの複合体、並びに確立されたＲＤＡはないが、動物健康生理学において有益な役割を有する栄養素を含む。
【００７３】
＜微生物及び／又は微生物増殖副生成物の生成＞
本発明は、微生物の培養及び微生物代謝生成物及び／又は微生物増殖の他の副生成物の製造のための方法を利用する。本発明はさらに、微生物の培養及び所望の規模での微生物代謝生成物の生成に適した培養プロセスを利用する。これらの培養プロセスには、浸漬培養／発酵、固相発酵（ＳＳＦ）、及び変形、ハイブリッド、及び／又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書中で使用される、「発酵」は、制御された条件下での細胞の培養又は増殖をいう。増殖は、好気性又は嫌気性である。好ましい実施形態において、微生物は、ＳＳＦ及び／又はその変性版を使用して増殖される。
【００７５】
一実施形態において、本発明は、バイオマス（例えば、生細胞物質）、細胞外代謝生成物、残留栄養素、及び／又は細胞内成分を生成するための材料及び方法を提供する。
【００７６】
本発明に従って使用される微生物増殖容器は、工業的使用のための任意の発酵槽又は培養反応器である。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有してもよく、又はｐＨ、酸素、圧力、温度、湿度、微生物密度及び／又は代謝生成物濃度等の培養プロセスにおける重要な因子を測定するために機能制御／センサに接続されてもよい。
【００７７】
さらなる実施形態において、容器は、容器内の微生物の増殖（例えば、細胞数及び増殖相の測定）をモニターすることもできる。あるいは、毎日のサンプルを容器から取り出し、希釈プレーティング技術等の当技術分野で公知の技術による計数に供してもよい。希釈プレーティングは、サンプル中の生物の数を推定するために使用される単純な技術である。この技術はまた、異なる環境又は処置を比較することができる指標を提供することができる。
【００７８】
一実施形態において、本方法は、窒素源を用いて培養を補助することを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素樹脂、及び／又は塩化アンモニウムとすることができる。これらの窒素源は、単独で、又は２種以上の組み合わせで使用することができる。
【００７９】
本方法は、増殖培養物を酸素化することができる。一実施形態によれば、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入するために、空気を遅く流す。浸漬発酵の場合、酸素化空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラー、及び液体中への酸素の溶解のために液体に気泡を供給するための空気スパージャーを含む機構を介して日々充填される周囲空気であってもよい。
【００８０】
本方法は、培養物に炭素源を補充することをさらに含むことができる。炭素源は、典型的には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、及び／又はマルトース等の炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、及び／又はピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、及び／又はグリセロール等のアルコール、大豆油、カノーラ油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、及び／又はアマニ油等の脂肪及び油である。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
一実施形態において、微生物の成長因子及び微量栄養素が培地に含まれる。これは、それらが必要とするビタミンの全てを生成することができない微生物を増殖させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトのような微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含まれ得る。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、及び微量元素の供給源は、例えば、トウモロコシ粉等の穀粉又は粉の形成で、又は酵母エキス、ジャガイモエキス、牛エキス、大豆エキス、バナナ皮エキス等のエキスの形態で、又は精製された形態で含まれる。アミノ酸、例えば、タンパク質の生合成に有用なアミノ酸もまた含まれる。
【００８２】
一実施形態において、無機塩も含まれ得る。使用可能な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、及び／又は炭酸ナトリウムである。これらの無機塩は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８３】
一実施形態において、微生物の増殖速度を高める物質を意味する、１つ又は複数の生体刺激剤を含めることもできる。生体刺激剤は、種特異的であるか、又は種々の種の増殖速度を増大し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、培養方法は、培養プロセスの前及び／又は間に、培地中に追加の酸及び／又は抗菌剤を添加することをさらに含んでもよい。抗菌剤又は抗生物質は、培養物を汚染から保護するために使用される。
【００８５】
さらに、消泡剤を添加して、浸漬培養の間にガスが生成されるときに泡の形成及び／又は蓄積を防止することもできる。
【００８６】
混合物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。緩衝液、及び炭酸塩及びリン酸塩等のｐＨ調節剤を使用して、ｐＨを好ましい値付近に安定化させることができる。金属イオンが高濃度で存在する場合、媒体中にキレート化剤を使用することが必要である。
【００８７】
微生物は、プランクトン形態で、又はバイオフィルムとして増殖させることができる。バイオフィルムの場合、容器は、その中に微生物をバイオフィルム状態で増殖させることができる基質を有することができる。システムはまた、例えば、バイオフィルム増殖特性を促進及び／又は改善する刺激（せん断力応力等）を付加する能力を有していてもよい。
【００８８】
一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは１５〜６０℃、より好ましくは２５〜５０℃で実施される。さらなる実施形態において、培養は、一定温度で連続的に実施されてもよい。他の実施形態において、変化する温度で培養がなされてもよい。
【００８９】
一実施形態において、方法及び培養プロセスで使用される装置は無菌である。反応器／容器のような培養装置は、滅菌ユニット、例えば、オートクレーブから分離されてもよいが、それに接続されてもよい。培養装置はまた、接種を開始する前に、インサイチュで滅菌する滅菌ユニットを有していてもよい。空気は、当技術分野で公知の方法によって滅菌することができる。例えば、周囲空気は、容器内に導入される前に、少なくとも１つのフィルタを通過することができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌されてもよく、又は、任意で、熱を全く加えなくてもよく、望ましくない細菌増殖を制御するために、低水分活性及び低ｐＨを用いてもよい。
【００９０】
一実施形態において、本発明はさらに、増殖及び代謝生成物生成に適切な条件下で本発明の微生物株を培養し、任意で、代謝生成物を精製して、例えば、バイオサーファクタント、酵素、タンパク質、エタノール、乳酸、ベータグルカン、ペプチド、代謝中間体、多価不飽和脂肪酸、及び脂質等の微生物代謝生成物を生成するための方法を提供する。本方法によって生成される代謝生成物含量は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。
【００９１】
発酵培地のバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／Ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／Ｌである。細胞濃度は、例えば、最終生成物のグラム当たり、少なくとも１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12 又は１×１０13 細胞であり得る。
【００９２】
目的の微生物によって生成される微生物増殖副生成物は、微生物中に保持されるか、又は増殖培地中に分泌される。培地は、微生物増殖副生成物の活性を安定化する化合物を含有していてもよい。
【００９３】
微生物の培養及び微生物副生成物の生成のための方法及び装置は、バッチ、準連続処理、又は連続処理で実施することができる。
【００９４】
一実施形態において、微生物培養組成物の全ては、培養の完了時に（例えば、所望の細胞密度、又は特定の代謝生成物の密度を達成した時に）除去される。このバッチ手順では、全く新しいバッチが第１のバッチの採取時に開始される。
【００９５】
他の実施形態において、発酵生成物の一部のみが、任意の時点で除去される。この実施形態において、生存細胞、胞子、分生子、菌糸及び／又は菌糸を有するバイオマスは新しい培養バッチのための接種物として容器内に残る。除去される組成物は、無細胞培地であり得るか、又は細胞、胞子、もしくは他の生殖繁殖体、及び／又はそれらの組み合わせを含み得る。このようにして、準連続システムが生成される。
【００９６】
利点を挙げると、本方法は、複雑な設備や高いエネルギー消費を必要としない。目的の微生物は、現場で小規模又は大規模に培養され、培地と混合したままでも利用できる。
【００９７】
＜微生物由来生成物の調製＞
本発明は、飼育動物に給餌する際に使用するための微生物由来の生成物を提供する。本発明の微生物由来の生成物は、微生物及び／又は微生物によって生成される微生物代謝生成物及び／又は任意の残留栄養素を含有する発酵培地である。発酵生成物は、抽出又は精製することなく直接使用することができる。所望であれば、抽出及び精製は、文献に記載されている標準的な抽出及び／又は精製方法又は技術を用いて容易に行うことができる。
【００９８】
一実施形態において、「スター３＋」と呼ばれる酵母発酵生成物を、固相発酵の変形形態を使用して、キラー酵母、Wickerhamomyces anomalusの培養を介して得ることができる。培養物は、酵母が付着及び増殖し得る十分な表面積を有する基質（例えば、米、大豆、ヒヨコマメ、パスタ、オートミール又は豆）上で増殖される。酵母細胞が全体的に増殖する発酵培地全体は、例えば、２５〜３０℃で３〜５日間培養した後に採取することができる。培養物を基質とブレンドし、粉砕及び／又は微粉化し、任意に乾燥させることができる。これは、スター３＋生成物を含む。約１×１０8 〜１×１０12、又は約１×１０10ＣＦＵ／グラムを含む組成物は、他の成分と混合する前に、例えば５００〜１，０００倍に希釈することができる。
【００９９】
他の実施形態において、酵母発酵生成物は、浸漬発酵を使用して得られ、ここで、酵母発酵生成物は、細胞及び任意の酵母増殖副生成物を含む液体ブロスを含む。汚染細菌増殖を防ぐために、必要な炭素源、窒素源、ミネラル源、及び任意で抗菌物質を含有する液体培地を使用することができる。培養物は、追加の炭素源、特に、飽和油（例えば、１５％キャノーラ油、又は使用済み調理用植物油）を用いて増殖させることができる。典型的には、ｐＨは５．０〜５．５で始まり、次いで３．０〜３．５に低下し、そこで安定化される。例えば、２５〜３０℃で２４〜７２時間培養した後に採取することができる、細胞及び酵母増殖副生成物を有する発酵ブロスは、この代替形態のスター３＋生成物を含む。
【０１００】
一実施形態において、酵母発酵生成物は、バイオサーファクタント生成酵母、Starmerella bombicolaの浸漬培養を介して得ることができる。この酵母は、糖脂質バイオサーファクタント、例えばソホロ脂質（ＳＬＰ）の有効なプロデューサーである。２５℃で５日間培養した後の発酵ブロスは、酵母細胞懸濁液を含むことができ、例えば、１５０ｇ／Ｌ以上のＳＬＰを含むことができる。組成物中のバイオサーファクタントがより少ないことが望ましい場合には、この酵母発酵生成物は、さらに改変することができる。例えば、S.bombicolaの発酵は、ＳＬＰの識別可能な層への沈殿を生じる。このＳＬＰ層は除去することができ、１〜４ｇ／Ｌの残留ＳＬＰを依然として含有することができる残留液体及びバイオマスを、本組成物において利用することができる。
【０１０１】
微生物由来の生成物中の微生物は、活性又は不活性形態である。さらに、微生物を組成物から除去し、残留培養物を利用することができる。微生物由来の生成物は、さらなる安定化、保存、及び貯蔵なしに使用することができる。利点を挙げると、これらの微生物由来の生成物の直接使用は、微生物の高い生存率を保ち、異物や望ましくない微生物による汚染の可能性を低減し、微生物増殖の副生成物の活性を維持する。
【０１０２】
微生物増殖から生じる微生物及び／又は培地（例えば、ブロス又は固体基質）は増殖容器から除去され、そして例えば、即時使用のための配管を介して移される。
【０１０３】
一実施形態において、微生物由来の生成物は、単に微生物の増殖副生成物である。例えば、微生物によって生成されたバイオサーファクタントは、例えば、液体ブロス中に約０．００１％〜９９％の純粋なバイオサーファクタントを含む、粗形態の浸漬発酵容器から収集することができる。
【０１０４】
他の実施形態において、微生物由来の生成物（微生物、培地、又は微生物及び培地）は、例えば、意図される用途、意図される適用方法、発酵容器のサイズ、及び微生物増殖施設から使用場所への任意の運搬モードを考慮に入れて、適切なサイズの容器に入れることができる。従って、微生物由来の組成物が配置される容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上であってもよい。他の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン、又はそれより大きい。
【０１０５】
例えば、酵母発酵生成物を増殖容器から採取され、採取された生成物は容器に入れられ、及び／又は配管で運ばれる（又は使用のために輸送される）際、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる施設で製造された他の微生物由来の組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物増殖のための栄養素、追跡剤、溶剤、殺生物剤、他の微生物及び意図された使用に特有の他の成分である。
【０１０６】
本発明による配合に含有される他の適切な添加剤には、そのような配合に慣例的に使用される物質が含まれる。このような添加剤の例には、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、緩衝剤、溶解性制御剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤及び紫外線防止剤が含まれる。
【０１０７】
一実施形態において、生成物は、有機酸及びアミノ酸又はそれらの塩を含む緩衝剤をさらに含んでもよい。適切な緩衝剤には、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタラート、グルカル酸塩、タルトロナート、グルタミン酸塩、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びそれらの混合物が含まれる。リン酸及び亜リン酸又はそれらの塩も使用することができる。合成緩衝液を使用することは適切であるが、上記に列挙した有機及びアミノ酸又はそれらの塩等の天然緩衝液を使用することが好ましい。
【０１０８】
さらなる実施形態において、ｐＨ調整剤は、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸又は混合物を含む。
【０１０９】
一実施形態において、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、重リン酸ナトリウム等の塩の水性調製物等の追加の成分を配合に含めることができる。
【０１１０】
利点を挙げると、本発明に従って、微生物由来の生成物は、微生物が増殖したブロスを含む。生成物は、例えば、少なくとも、１重量％、５重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％、７５重量％、又は１００重量％のブロスである。生成物中のバイオマスの量は、例えば、その間の全てのパーセンテージを含めて０重量％〜１００重量％のいずれかである。
【０１１１】
任意で、生成物は、使用前に貯蔵することができる。貯蔵時間は短い方が好ましい。従って、貯蔵時間は、６０日未満、４５日未満、３０日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、３日未満、２日未満、１日未満、又は１２時間未満である。好ましい実施形態において、生細胞が生成物中に存在する場合、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃未満等の低温で貯蔵され、一方、バイオサーファクタント組成物は、典型的には周囲温度で貯蔵することができる。
【０１１２】
＜動物への給餌方法＞
好ましい実施形態において、本発明は、動物がフード及び／又は水を摂取する前に、微生物及び／又はその増殖副生成物を、動物のフード及び／又は飲料水と接触させることを含む飼育動物に給餌するための方法を提供する。利点を挙げると、本方法は、動物に栄養素を提供し、動物の消化器（ＧＩ）の健康、歯／口腔健康、及び免疫健康を増進するのに有用である。さらに、本組成物は、ペットフードの保存期間を延ばし、望ましくない微生物によるペットフードへの異物の混入を防止することによって、防腐剤として役立つ。
【０１１３】
一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥生成物のいずれかとして使用される。一実施形態において、組成物は、液体又は乾燥形態のいずれかで、動物のフードに、又は動物の飲料水に導入される。一実施形態において、組成物は、チュートイ又はボーンに添加される。
【０１１４】
一実施形態において、組成物は、肉製品、穀物、野菜、果物、及び他の香味料、添加物、及び／又は栄養源等の、生の動物のフード、ウェットフード、及び／又はドライフードを製造する際に利用される標準的なフード原料に添加される。次いで、ペット及び／又は動物飼料を製造するための標準的な手順に従って、原料及び組成物を調理及び／又は加工することができる。
【０１１５】
本明細書で使用される、「生のフード」は、未調理で消費されることを意味するペットフードを指す。例えば、生のドッグフードは、多くの場合、未調理の肉、全骨又は骨粉、果物、野菜、卵及び／又は乳製品を含む。
【０１１６】
本明細書で使用される、「ドライフード」は、ウェットフードと同様の組成であるが、典型的には、約５％〜約１５％又は２０％ｗ／ｖの範囲の限定された水分含量（典型的には小サイズから中サイズの個々のピース、例えば、キブル、トリーツ、ビスケット、又はペレットの形態である）を含むペットフードを指す。一実施形態において、組成物は、約５％〜約２０％ｗ／ｖの水分含量を有する。ドライフード製品は、種々の水分含量の種々のフードを含み、比較的貯蔵安定性があり、微生物又は真菌による劣化又は汚染に対して抵抗性がある。
【０１１７】
一実施形態において、組成物を、ドライフードを製造する際に利用される原料に添加することができる。補充されたドライフードピースは、一ピース当たり一貫した濃度の微生物由来の組成物を含むことができる。他の実施形態において、組成物は、ドライフードピース上の表面コーティングとして利用することができる。加圧粉砕、押出、及び／又はペレット化を含む、ドライフードを製造するための当技術分野で公知の方法を使用することができる。
【０１１８】
例示的な実施形態において、ドライフードは、例えば、スクリュー押出によって調製されてもよく、スクリュー押出は、非常に短時間で、原料を調理し、成形し、特定のキブル形状及びサイズへ切断することを含む。成分は、均質な発泡性生地に混合され、押出機内で調理され、圧力及び高熱下でダイに強制的に通されてもよい。調理後、キブルを冷やし、その後、任意で、コーティングを噴霧する。このコーティングは、例えば、例えば、鶏又はウサギ由来の肝臓又は腸等の動物組織の液体又は粉末加水分解形成を含む、液体脂又は消化物、及び／又は栄養油を含む。他の実施形態において、キブルは、真空エンロービング技術を使用してコーティングされ、キブルは真空に曝され、次いで、コーティング材料に曝され、その後、真空の解除によって、キブル内部のコーティング材料が吹き付けられる。次いで、熱風乾燥を用いて、総水分含量を１０％以下に減少させることができる。
【０１１９】
一実施形態において、ドライフードは、「低温」ペレット化プロセス、又は高熱もしくは蒸気を使用しないプロセスを使用して製造される。本方法は、例えば、本発明の組成物中の重要な成分及び／又は栄養素を変性又は分解するリスクなしに成分を一緒に保持するために、粘性及び凝集特性を有する液体バインダーを使用することができる。
【０１２０】
例示的な実施形態において、缶詰（ウェット）フードは、例えば、肉及び野菜、ゲル化剤、肉汁、ビタミン、ミネラル及び水を含む原料をブレンドすることによって調製されてもよい。次に、混合物を製造ライン上の缶に供給し、蓋をし、充填した缶を約１３０℃の温度で約５０〜１００分間滅菌する。本明細書で使用される「ウェットフード」は、典型的には、缶又はホイルバッグで販売され、典型的に、約７０％〜約９０％ｗ／ｖの範囲の水分含量を有するペットフードを指す。
【０１２１】
一実施形態において、組成物は、噴霧乾燥バイオマス製品として調製されてもよい。バイオマスは、遠心分離、濾過、分離、デカンティング、分離とデカンティングの組み合わせ、限外濾過又は精密濾過等の公知の方法によって分離することができる。
【０１２２】
一実施形態において、組成物は、高い栄養含量を有する。結果として、この組成物は、完全動物飼料組成物の全ての一部として使用される。一実施形態において、飼料組成物は、飼料の１５％〜飼料の１００％の範囲の本組成物を含む。
【０１２３】
本発明の組成物は、脂肪、脂肪酸、脂質、例えば、リン脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、及び微量ミネラル、例えば鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ及びケイ素のうちの少なくとも１つ以上に富んでいてもよい。
【０１２４】
さらに、組成物の抗菌特性のために、本方法は、抗生物質の必要性を低減しながら、動物の免疫健康を増進することができる。一実施形態において、本方法は、その中の感染性微生物を制御することによって、消化管における感染の発生又は重症度を減少させることができる。他の実施形態において、本方法は、口腔の状態の発生又は重症度を低減することができる。例えば、本発明の組成物の経口摂取によって、口臭及び虫歯を引き起こす口腔内の微生物の制御を行うことができ、歯周病の発生を遅延及び／又は最小限に抑えることができる。
【０１２５】
さらに、一実施形態において、本方法は、有害な化学防腐剤を必要とせずに、ペットフードの保存期間を延ばし、及び／又はフード媒介病原体等の望ましくない微生物による汚染を防止することを補助することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物を、栄養補助フードとして使用することができ、別のペットフード組成物と同時投与することができる。栄養補助フードは、肉汁、飲料水、飲料、ヨーグルト、粉末、顆粒、ペースト、懸濁液、チュー、モルセル、液体溶液、トリーツ、スナック、ペレット、ピル、カプセル、錠剤、サシェ、又は任意の他の適切な送達形態等の任意の適切な形態を有することができる。栄養補助フードは、本微生物由来の組成物、並びにビタミン、ミネラル、プロバイオティクス、プレバイオティクス、及び抗酸化剤等の任意の化合物を含むことができる。いくつかの実施形態において、栄養補助フードは、動物への投与前に、ペットフード組成物又は水又は他の希釈剤と混合されてもよい。
【０１２７】
利点を挙げると、例えば、本発明の組成物中のバイオサーファクタントの存在のために、本方法は、例えば、ペットフード又は栄養補助フード中に存在する栄養素及び／又は水のバイオアベイラビリティを増加させることによって、動物の消化管の上皮細胞を介した栄養及び／又は水の吸収を増進することができる。
【０１２８】
一実施形態において、栄養素は、脂肪及び／又はアミノ酸である。脂肪は、エネルギー（特に心筋及び骨格筋）の脂肪酸源として働き、アミノ酸は、タンパク質の構成単位として働く。脂肪はまた、ビタミン吸収を補助する。例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫは、脂溶性であるか、又は脂肪と一緒に消化され、吸収され、そして輸送されるだけである。炭水化物、典型的には、植物起源の炭水化物（例えば、小麦、ひまわり粉、トウモロコシグルテン、大豆粉）もまた、ペットフード製品に含まれることが多いが、炭水化物はタンパク質又は脂肪よりもペットにとって優れたエネルギー源ではない。
【０１２９】
脂肪は、典型的には、魚粉（少量の魚油を含有する）及び魚油をペットフード製品に組み込むことによって提供される。ペットフード製品に使用することができる抽出油には、魚油（例えば、油性魚メンハーデン、アンチョビー、ニシン、カペリン及びタラ肝臓由来）、及び植物油（例えば、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ種子及び亜麻種子由来）が含まれる。典型的に、魚油は長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸、ＥＰＡ及びＤＨＡを含有するため、好ましい油であり、対照的に、植物油はＥＰＡ及び／又はＤＨＡの供給源を提供しない。典型的なペットフード製品は、ペットフード製品の重量パーセントとして測定して、約１５〜３０％の油（例えば、魚、植物等）を含む。
【０１３０】
一実施形態において、栄養素はタンパク質である。ペットフード製品に供給されるタンパク質は、植物又は動物起源である。例えば、動物起源のタンパク質は、海洋動物（例えば、魚油、ペットタンパク質、オキアミ粉、ムラサキガイ粉、エビピール、イカ粉、イカ油等）又は陸生動物（例えば、血液粉、卵粉末、肝臓、腎臓、肉及び骨粉、カイコ、サナギ粉、ホエー粉末等）に由来する。植物起源のタンパク質には、大豆粉、トウモロコシグルテン粉、小麦グルテン、綿実粉、キャノーラ粉、ヒマワリ粉、米等が含まれ得る。
【０１３１】
一実施形態において、栄養素は、ビタミン又は微量ミネラルである。ビタミンには、例えば、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール及びパラアミノ安息香酸が含まれる。鉱物は、例えば、カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、セレン及び亜鉛の塩を含むことができる。他の成分としては抗酸化剤、ベータグルカン、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、カロテノイド、及び他の多くが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明の方法によれば、微生物由来の組成物の投与は、分娩から動物の成体寿命までの範囲の期間にわたる食事療法の一部として実施することができる。特定の実施形態において、動物は、若い又は成長中の動物である。いくつかの実施形態において、動物は老化している動物である。他の実施形態において、投与は、例えば、動物がその予想又は予定寿命の約３０％、４０％、５０％、６０％、又は８０％を超える寿命に達したときは、定期的又は長めに設定した定期的に開始する。
【０１３３】
本明細書に記載の組成物は、動物のフード及び／又は飲料水を介して、本発明の１つ以上の目的を達成するのに必要な時間、動物に投与され、例えば、（例えば、感染の制御を介して）動物の免疫健康を促進及び／又は増進し、動物の消化健康を促進及び／又は増進し、動物に栄養を提供し、動物の水分補給を増進し、（例えば、虫歯、口臭、及び歯周病を引き起こす細菌の制御を介して）歯の健康及び／又は口腔の健康を促進し、そして全体として、動物の生活の質を改善し、健康及び健康を増進する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、動物のフード及び／又は飲料水と、定期的に、例えば、食事毎に、又は１日１回の食事毎に接触される。
【０１３４】
＜実施例＞
本発明及びその多くの利点は、例示として与えられる以下の実施例からより良く理解される。以下の実施例は、本発明の方法、用途、実施形態及び変形のいくつかを例示するものである。本発明を限定するものと見なされるべきではない。本発明に関して、多数の変更及び修正を行うことができる。
【０１３５】
［実施例１：ソホロ脂質の製造］
発酵温度は、培養される微生物及び／又は微生物増殖副生成物に応じて、一般的に約２２〜２８℃の間である。Starmerella bombicolaについては、約２５℃の温度が理想的である。
【０１３６】
ｐＨは、培養される微生物及び／又は微生物増殖副生成物に応じて、約２．０〜約７．０、好ましくは約３．０〜約６．５とする。さらに、汚染の可能性を低減するために、培養プロセスは、第１のｐＨ範囲で開始し、次いで、第１のｐＨ範囲よりも高いか又は低いかのいずれかの第２のｐＨ範囲に調整することができる。
【０１３７】
これらの培養条件下で、バイオマス、バイオサーファクタント及び他の代謝生成物の工業的に有用な生成は、わずか２４時間の発酵後に達成される。発酵が完了すると、増殖副生成物及び／又は残った培養物は、次いで、反応器から回収され、そして種々の産業上の目的のために適用される。
【０１３８】
反応器を再び滅菌し、同じ微生物由来の製品又は異なる微生物由来の製品のいずれかを発酵させるために再使用することができる。例えば、反応器は、ＳＬＰの生成のためにStarmerella bombicolaを培養するのに使用され、本方法に従って滅菌され、次いで、再びＳＬＰを生成するために使用されるか、又はＭＥＬの生成のためにPseudozyma aphidisを培養するために使用される。
【０１３９】
本発明のシステムは工業的規模で、生成培養物の異物の混入なしに、ソホロ脂質（ＳＬＰ）を生成するために使用することができる。
【０１４０】
一実施形態において、反応器にStarmerella bombicolaの酵母を接種する。培養培地は、炭素源、脂質、窒素源を含み、２００ｐｐｍまでの純粋なソホロ脂質を補充することができる。
【０１４１】
酵母及び培養培地を、好気性条件下で、バイオマスの初期蓄積に十分な期間（典型的には約２４時間〜約４８時間）、ｐＨ３．０〜３．５でインキュベートする。温度を２２℃〜２８℃に保ち、溶存酸素濃度を１５％〜３０％（１００％周囲空気の）内に保つ。初期バイオマス蓄積が達成されたら、ｐＨを５．５に調整し、プロセスを続ける。
【０１４２】
培養物がｐＨ３．５まで酸性化されるたら、発酵プロセスを継続し、培地中にＳＬＰの十分な蓄積が達成されるまで、ｐＨをこのレベルで安定に保つ。ＳＬＰは、培地中に褐色半透明から不透明の沈殿物層を形成する。次いで、ＳＬＰを発酵培地から回収し、残りの酵母発酵生成物を別々に採取することができる。
【国際調査報告】
2022502402.tif 000002
2022502402.tif 000003
2022502402.tif 000004