(57)【要約】  本発明は、ＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片及びその使用を提供する。前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延し、ＰＴＸ３の検出セット及びその検出方法、及びＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延する医薬組成物及びその使用に適用できる。【選択図】図２
2022500503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる非変性アミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列と、
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載される核酸配列がコードする核酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に記載される核酸配列がコードする核酸配列を有する軽鎖可変領域配列と、
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３４又は３５に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６又は３７に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列と、
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３８又は３９に記載される核酸配列がコードする核酸配列を有する重鎖可変領域配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４０又は４１に記載される核酸配列がコードする核酸配列を有する軽鎖可変領域配列と、
を含むことを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体又はその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、マウス由来抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体又はその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗原結合断片は、単鎖可変領域断片、単鎖可変領域断片二量体〔（ｓｃＦｖ）２〕、単鎖可変領域断片三量体〔（ｓｃＦｖ）３〕、可変領域断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ナノ抗体又はこれらの任意の組み合わせであることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、複合、結合、糖化、タグ付け（ｔａｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）又はこれらの任意の組み合わせによって修飾されることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、抗体−薬物複合体又はその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、三重機能性モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型又はＩｇＥ型に属することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型に属し、且つ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを有することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１アイソタイプを有することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、不活性な抗体に属することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニスト抗体に属することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ペントラキシン関連タンパク質受容体と１種又は複数種のＰＴＸ３のＣ末端の特定の配列との結合を特異的に抑制又は遅延することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２５】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数種のＰＴＸ３の活性を抑制又は遅延することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３受容体と１種又は複数種のＰＴＸ３との相互作用、ＰＴＸ３によるシグナル伝達又はこれらの任意の組み合わせを特異的に抑制又は遅延することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２７】
請求項１から請求項２６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むＰＴＸ３の検出セットであって、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる非変性アミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とするＰＴＸ３の検出セット。
【請求項２８】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる非変性アミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項２９】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列からなる群から選ばれる非変性アミノ酸配列と特異的に結合することを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項３０】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項３１】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項３２】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項３３】
前記非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７に記載のＰＴＸ３の検出セット。
【請求項３４】
請求項２７から請求項３３のいずれか１項に記載のＰＴＸ３の検出セットによりＰＴＸ３を検出するインビトロでのＰＴＸ３の検出方法であって、
前記ＰＴＸ３の検出セットに含まれるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の分析感度は、０．００１６ｐＭ以上であることを特徴とするインビトロでのＰＴＸ３の検出方法。
【請求項３５】
有効投与量を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３６】
活性薬物成分をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記有効投与量は、体重１キロあたり２ｍｇから１０ｍｇであることを特徴とする請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記有効投与量は、５ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記有効投与量は、６ｍｇ／ｋｇ体重から９ｍｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
ペントラキシン関連タンパク質（ＰＴＸ３）とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用であって、
前記医薬組成物は、請求項３４から請求項３８のいずれか１項に記載の医薬組成物であり、且つ、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、前記のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するための有効投与量を有することを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４１】
前記疾患又は前記症状は、上皮細胞癌、腺癌、神経膠芽腫及び線維化を含むことを特徴とする請求項４０に記載のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４２】
前記上皮細胞癌は、肺癌、乳癌及び鼻咽頭癌を含むことを特徴とする請求項４１に記載のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４３】
前記腺癌は、大腸癌を含むことを特徴とする請求項４１に記載のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４４】
前記線維化の前記疾患又は前記症状からの影響を受ける臓器は、肺、肝、腎及び皮膚からなる群から選ばれることを特徴とする請求項４１に記載のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４５】
前記医薬組成物は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、同所性注射、経口投与又は口鼻吸入によって投予されることを特徴とする請求項４０に記載のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項４６】
腫瘍細胞に有効投与量の請求項３５から請求項３９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することにより前記腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するステップを含むことを特徴とするインビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法。
【請求項４７】
前記腫瘍細胞の由来は、神経膠芽腫、上皮細胞癌及び腺癌を含むことを特徴とする請求項４６に記載のインビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法。
【請求項４８】
前記上皮細胞癌は、肺癌、乳癌及び鼻咽頭癌を含むことを特徴とする請求項４７に記載のインビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法。
【請求項４９】
前記腺癌は、大腸癌を含むことを特徴とする請求項４７に記載のインビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法。
【請求項５０】
前記活性は、増殖、癌幹細胞性、移行、侵襲、転移、腫瘍体積又は薬剤耐性を含むことを特徴とする請求項４６に記載のインビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法。
【請求項５１】
前記線維化疾患及び／又は前記線維化症状からの影響を受ける臓器に有効投与量の請求項３５から請求項３９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することにより前記臓器の前記線維化疾患及び／又は前記線維化症状を抑制又は遅延するステップを含むことを特徴とするインビトロで線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するための方法。
【請求項５２】
前記臓器は、肺、肝、腎及び皮膚からなる群から選ばれることを特徴とする請求項５１に記載のインビトロで線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体及びその使用に関し、特に、ＰＴＸ３のＣ末端の特定の配列とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、並びにそれを使用した検出試薬、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌細胞は、腫瘍の周辺の微小環境を刺激して各種の炎症性因子、白血球、血管過剰増殖及びプロテアーゼなどを産生させ、癌の慢性炎症反応も癌細胞の成長、転移と侵襲に関連することが知られているが、その形成の原因及び詳細なメカニズムは、まだ多くの不明な点がある。
【０００３】
腫瘍の微小環境は、炎症反応に関連するほか、他の研究でも、腫瘍の微小環境は、腫瘍の転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）や化学療法耐性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）にも密接に関連することが指摘されている。腫瘍の微小環境は、多種の基質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）とその他の異なる形態の細胞とから構成され、腫瘍を保護するだけでなく、腫瘍細胞が免疫細胞から逃げて抵抗することを可能にし、これにより、腫瘍細胞の薬剤耐性をもたらす。
【０００４】
腫瘍の周辺の基質組織中の線維芽細胞及びマクロファージは、ＣＥＢＰＤによって活性化されると、分泌型因子であるペントラキシン関連タンパク質３（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３；ＰＴＸ３）の産生を誘発する。ＰＴＸ３は、血管新生を促進する活性を有するとともに、鼻咽頭癌細胞の移行及び組織への侵入（侵襲ともいう）の能力を向上させることができる。また、過去の研究では、癌の周辺組織の細胞においてＣＥＢＰＤが活性化されて、癌の転移を促進し、さらに化学療法において薬剤耐性癌細胞の産生を促進させる可能性があり、これらの薬剤耐性癌細胞は、より速く成長し、且つより容易に転移することも実証されている。
【０００５】
現在、シス−ジアンミンジクロロ白金（ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）；ＣＤＤＰ；商品名：シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ））、太平洋パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；商品名：Ｔａｘｏｌ）、５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ；５−ＦＵ）などの低分子抗癌剤が市販されているが、最近の研究では、上記の低分子抗癌剤は、癌細胞でのＣＥＢＰＤの発現だけでなく、マクロファージ及び線維芽細胞でのＣＥＢＰＤの発現を活性化することができ、逆に癌細胞に薬剤耐性を生じさせて急速に転移させて、癌の治療効果が悪いことが見出された。
【０００６】
ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状は、上記の癌の以外、線維化疾患及び／又は線維化症状にも関する。
【０００７】
そこで、癌及び線維化に対する既存の薬物の治療効果が悪いなどの問題を克服するために、生物サンプル中のＰＴＸ３の含有量を検出するＰＴＸ３と特異的に結合する抗体を開発することは、至急のことである。
【発明の概要】
【０００８】
このため、本発明の一実施形態は、１種又は複数種のペントラキシン関連タンパク質（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＴＸ３）のＣ末端の特定の配列と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供することである。
【０００９】
本発明の他の一実施形態は、特定の配列の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供することである。
【００１０】
本発明の別の一実施形態は、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むＰＴＸ３の検出セットを提供することである。
【００１１】
本発明の更なる一実施形態は、上記のセットによりＰＴＸ３を検出するインビトロでのＰＴＸ３の検出方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の一実施形態は、有効投与量を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含み、且つ、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を有効成分とする医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる他の一実施形態は、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用であって、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、活性成分であり、且つ、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するための有効投与量を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる一実施形態は、腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するために、腫瘍細胞に有効投与量を有する上記の医薬組成物を投与するステップを含む、インビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の一実施形態は、臓器の線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するために、線維化疾患及び／又は線維化症状からの影響を受ける臓器に有効投与量の上記の医薬組成物を投与するステップを含む、インビトロで線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するための方法を提供する。
【００１６】
本発明の上記の実施形態によれば、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することができる。
【００１７】
一実施例において、上記の非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のいずれかに記載されるアミノ酸配列又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。他の実施例において、上記の非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のいずれかに記載されるアミノ酸配列又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の他の実施形態によれば、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。ここで、重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に記載されるアミノ酸配列であってもよく、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に記載されるアミノ酸配列であってもよい。
【００１９】
いくつかの実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列であってもよく、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列であってもよい。
【００２０】
他の実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３４又は３５に記載されるアミノ酸配列であってもよく、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６又は３７に記載されるアミノ酸配列であってもよい。
【００２１】
他の実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３８又は３９に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列であってもよく、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４０又は４１に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列であってもよい。
【００２２】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体又はその抗原結合断片である。一例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、マウス由来抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体又はその抗原結合断片である。
【００２３】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、単鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）、単鎖可変領域断片二量体〔（ｓｃＦｖ）２〕、単鎖可変領域断片三量体〔（ｓｃＦｖ）３〕、可変領域断片（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００２４】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、結合、糖化、タグ付け（ｔａｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）又はこれらの任意の組み合わせによって修飾される。
【００２５】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）又はその抗原結合断片である。
【００２６】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；  ＢｓＡｂ）又はその抗原結合断片である。
【００２７】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、三重機能性モノクローナル抗体（ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合断片である。
【００２８】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型又はＩｇＥ型に属する。他の一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型に属し、且つ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを有する。
【００２９】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、不活性な抗体又はアンタゴニスト抗体に属する。
【００３０】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３受容体が１種又は複数種のＰＴＸ３のＣ末端の特定の配列との結合の識別を特異的に抑制又は遅延するものである。いくつかの例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数種のＰＴＸ３の活性を抑制又は遅延するものである。他の一例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３受容体と１種又は複数種のＰＴＸ３との相互作用、ＰＴＸ３によるシグナル伝達又はこれらの任意の組み合わせを特異的に抑制又は遅延するものである。
【００３１】
本発明の別の一実施形態によれば、上記のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含むＰＴＸ３の検出セットを提供する。ここで、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、非変性アミノ酸配列と特異的に結合することができ、且つ、この非変性アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の更なる他の一実施形態によれば、上記のＰＴＸ３の検出セットによりＰＴＸ３を検出するインビトロでのＰＴＸ３の検出方法を提供する。ここで、ＰＴＸ３の検出セットに含まれるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の分析感度は、例えば、０．００１６ｐＭ以上であってもよい。
【００３３】
本発明の他の実施形態によれば、有効投与量を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含み、且つ、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を有効成分とする医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の一実施例によれば、上記の医薬組成物は、活性薬物成分をさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、ペントラキシン関連タンパク質（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＴＸ３）とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延する医薬組成物を調製するためのモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。一実施例において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、活性成分であり、且つ、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するための有効投与量を有する。
【００３６】
本発明の一実施例によれば、上記の医薬組成物は、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するために用いられる。ここで、疾患又は症状は、上皮細胞癌、腺癌、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ；ＧＢＭ）及び線維化を含んでもよい。いくつかの例において、上皮細胞癌は、肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）及び鼻咽頭癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＮＰＣ）を含んでもよい。前記腺癌は、例えば、大腸癌であってもよい。
【００３７】
本発明の一実施例によれば、上記の線維化疾患又は症状からの影響を受ける臓器は、肺、肝、腎及び皮膚を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、上記の医薬組成物は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓ．ｃ．）注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ、ｉ．ｐ．）注射、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）注射、経口投与又は口鼻吸入によって投予されてもよい。
【００３９】
本発明の他の実施形態によれば、腫瘍細胞に有効投与量の上記の医薬組成物を投与することにより腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するステップを含む、インビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法を提供する。
【００４０】
本発明の他の実施形態によれば、腫瘍細胞に有効投与量の上記の医薬組成物を投与することにより腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するステップを含む、インビトロで腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延するための方法を提供する。
【００４１】
本発明の他の実施形態によれば、線維化疾患及び／又は線維化症状からの影響を受ける臓器に有効投与量の上記の医薬組成物を投与することにより前記臓器の線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するステップを含む、インビトロで線維化疾患及び／又は線維化症状を抑制又は遅延するための方法を提供する。
【００４２】
本発明に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の適用は、特定のＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片によりＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延し、インビトロでのＰＴＸ３の検出セット及びインビトロでＰＴＸ３の含有量を検出する方法だけでなく、ＰＴＸ３受容体のＰＴＸ３に対する識別に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延する医薬組成物及びその使用にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力を示す曲線図である。
【図２】本発明の他の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力を示す曲線図である。
【図３】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体と異なる断片のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合のエピトープマッピングを示す図である。
【図４】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体と異なる断片のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合のエピトープマッピングを示す図である。
【図５】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体と異種のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合の結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体がＰＴＸ３組換えタンパク質とＰＴＸ３受容体との結合を阻害する競争的抑制を示す図である。
【図７Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図７Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図８Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図８Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図９Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図９Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図１０Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの移行細胞の数の結果を示す図である。
【図１０Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図１０Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの細胞塊の数の結果を示す図である。
【図１１Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図１１Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図１２Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図１２Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図１３Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の移行細胞の数の結果を示す図である。
【図１３Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の侵襲細胞の数の結果を示す図である。
【図１４Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図１４Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された肺癌細胞株Ａ５４９の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又は市販の抗体により抑制された鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１の細胞塊の数の結果を示す図である。
【図１５Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１の腫瘍体積の結果を示す図である。
【図１５Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１の腫瘍の転移の結果を示す図である。
【図１６Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体により抑制されたマウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積の結果を示す図である。
【図１６Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はアイソタイプ対照抗体により抑制されたマウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍の転移の結果を示す図である。
【図１７Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合に抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積を示す画像である。
【図１７Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合に抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積の変化の折れ線グラフである。
【図１７Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合に抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積の変化の折れ線グラフである。
【図１８Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合におけるマウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１を評価する実験フローを示す模式図である。
【図１８Ｂ】本発明の他の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合における、マウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を示す画像である。
【図１８Ｃ】本発明の他の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合における、マウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積の折れ線グラフである。
【図１８Ｄ】本発明の他の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合における、マウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１のマウスの生存率を示す図である。
【図１９Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植の大腸癌細胞株ＭＣ３８の実験フローを示す模式図である。
【図１９Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植の大腸癌細胞株ＭＣ３８の腫瘍体積を示す折れ線グラフである。
【図２０Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植のヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの腫瘍体積を示す折れ線グラフである。
【図２０Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植のヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧのマウスの生存率を示す図である。
【図２１Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による急性肝線維化マウスへの改善効果を評価する実験フローを示す模式図である。
【図２１Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による急性肝線維化マウス体内のヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）で染色された肝左葉の組織切片を示す図である。
【図２１Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による急性肝線維化マウス体内の肝壊死領域の割合を示す図である。
【図２１Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による急性肝線維化マウス体内の肝臓重量／体重比を示す図である。
【図２２Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による慢性肝線維化マウスへの改善効果を評価する実験フローを示す模式図である。
【図２２Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による慢性肝線維化マウス体内のピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色された肝左葉の組織切片を示す図である。
【図２２Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による慢性肝線維化マウス体内の肝線維化領域の割合を示す図である。
【図２２Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による慢性肝線維化マウス体内の肝臓重量／体重比を示す図である。
【図２３Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による腎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【図２３Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による腎線維芽細胞の細胞結節の細胞染色画像である。
【図２３Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による腎線維芽細胞の吸光度測定の結果を示す柱状図である。
【図２４Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＵＵＯマウスの腎線維化の実験フローを示す模式図である。
【図２４Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＵＵＯマウスの腎臓の組織切片の染色画像である。
【図２４Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＵＵＯマウスの腎線維化の実験フローを示す模式図である。
【図２４Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＵＵＯマウスの腎臓の組織切片の染色画像である。
【図２５Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による肺線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【図２５Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による肺線維芽細胞の移行細胞の数の柱状図である。
【図２５Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による肺線維芽細胞の細胞結節の細胞染色画像である。
【図２５Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による肺線維芽細胞の吸光度測定の結果を示す柱状図である。
【図２６Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの実験フローを示す模式図（図２６Ａ）である。
【図２６Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの体重変化を示す曲線図である。
【図２６Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの肺の外観及び組織切片を示す画像である。
【図２６Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの肺の外観及び組織切片を示す画像である。
【図２７Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの実験フローを示す模式図である。
【図２７Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの体重変化を示す曲線図である。
【図２７Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの肺の外観及び組織切片を示す画像である。
【図２７Ｄ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの肺の外観及び組織切片を示す画像である。
【図２８Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による胚胎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【図２８Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による胚胎線維芽細胞の細胞結節を示す細胞染色画像である。
【図２８Ｃ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による胚胎線維芽細胞の吸光度測定の結果を示す柱状図である。
【図２９Ａ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による異なる処理をされた肝線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【図２９Ｂ】本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による異なる処理をされた肝線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をもっと明らかにするために、以下、図面を参照して詳細に説明する。
【００４５】
上記のように、本発明は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片によりペントラキシン関連タンパク質（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＴＸ３）とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びその使用を提供し、ＰＴＸ３の検出セット及びその検出方法、及びＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延する医薬組成物及びその使用に適用できる。
【００４６】
本発明でいうモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体のＣ末端の特定の配列との結合を特異的に抑制又は遅延するために、特定の配列の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含んでもよい。
【００４７】
言い換えれば、一実施例において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＰＴＸ３のＣ末端アミノ酸配列と特異的に結合することができ、その配列の範囲が限定されず、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載される非変性アミノ酸配列が挙げられるが、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することが好ましく、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及び１１に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することがより好ましく、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することがさらに好ましい。上記の実施例において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列は、ヒトＰＴＸ３組換えタンパク質の非変性アミノ酸配列の２００番目から２３６番目のアミノ酸に対応する。他の一例において、上記のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列は、ヒトＰＴＸ３組換えタンパク質の非変性アミノ酸配列の２００番目から２２０番目のアミノ酸に対応する。別の一例において、前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列は、ヒトＰＴＸ３組換えタンパク質の非変性アミノ酸配列の２０３番目から２１７番目のアミノ酸に対応する。
【００４８】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載されるアミノ酸配列を有する。重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＲＩＤＰＡＮＸ１Ｘ２ＴＫＹＤＰＸ３ＦＱＧであってもよい。ここで、Ｘ１は、Ｇ又はＤを表し、Ｘ２は、Ｄ又はＮを表し、Ｘ３は、Ｋ又はＭを表し、その具体的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１９又は２０に記載されている。重鎖可変領域のＣＤＲ３の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に記載されるアミノ酸配列を有する。軽鎖可変領域のＣＤＲ１の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に記載されるアミノ酸配列を有する。軽鎖可変領域のＣＤＲ２の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に記載されるアミノ酸配列を有する。軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＨＱＸ４ＱＲＳＰＬＴであってもよい。ここで、Ｘ４は、Ｆ又はＹを表し、その具体的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２４又は２５に記載されている。
【００４９】
他の実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有してもよいが、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有してもよい。
【００５０】
他の実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３４又は３５に記載されるアミノ酸配列を有してもよいが、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３６又は３７に記載されるアミノ酸配列を有してもよい。
【００５１】
他の実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３８又は３９に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有してもよいが、軽鎖可変領域配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４０又は４１に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有してもよい。
【００５２】
いくつかの実施例において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、その種類が限定されず、例えば、キメラ抗体又はその抗原結合断片であってもよい。他の例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、マウス由来抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト化抗体又はその抗原結合断片であってもよい。
【００５３】
いくつかの実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の構造は限定されず、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）の構造の安定性との兼ね合いで、完全な抗体構造又は単純化された抗体構造であってもよく、例えば、単鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）、単鎖可変領域二量体〔（ｓｃＦｖ）２〕、単鎖可変領域三量体〔（ｓｃＦｖ）３〕、可変領域断片（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｆｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ナノ抗体〔ｎａｎｏｂｏｄｙ、シングルドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）又は重鎖抗体（ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ともいう〕又はこれらの任意の組み合わせであり、これにより、組換え抗体の工程が簡略化される。上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍細胞の融合又は組換え遺伝子の発現などによって調製されてもよく、これは、当業者によく知られているものであり、ここでは詳細な説明を省略する。
【００５４】
いくつかの実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、実際の需要に応じて、さらに複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、結合、糖化、タグ付け（ｔａｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）又はこれらの任意の組み合わせによって修飾されてもよい。例えば、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、さらに薬物と抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）又はその抗原結合断片を形成することができる。他の例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、特定のシグナルペプチドと結合して、特定の部位、例えば、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）に入ることもできる。
【００５５】
いくつかの実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＢｓＡｂ）、三重機能性モノクローナル抗体（ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合断片であってもよい。
【００５６】
本発明の一実施例によれば、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、結合、糖化、タグ付け（ｔａｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）又はこれらの任意の組み合わせによって修飾される。
【００５７】
本発明の一実施例によれば、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）又はその抗原結合断片である。
【００５８】
本発明の一実施例によれば、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＢｓＡｂ）又はその抗原結合断片である。
【００５９】
本発明の一実施例によれば、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、三重機能性モノクローナル抗体（ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合断片である。
【００６０】
一実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型又はＩｇＥ型に属することができる。１つの具体的な実施例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ型に属し、且つ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを有する。一例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１アイソタイプを有し、例えば、ＩｇＧ１ｋアイソタイプを有する。いくつかの具体的な例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、不活性な抗体又はアンタゴニスト抗体に属する。いくつかの具体的な例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数種のＰＴＸ３の活性を特異的に抑制又は遅延することができる。他のいくつかの具体的な例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３受容体と１種又は複数種のＰＴＸ３との相互作用、ＰＴＸ３によるシグナル伝達又はこれらの任意の組み合わせを特異的に抑制又は遅延することができる。
【００６１】
応用する場合、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＰＴＸ３の検出セット及び方法に適用でき、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することにより、生体サンプル中のＰＴＸ３を検出する分析感度を向上させる。本発明でいう生体サンプルの形態は、例えば、細胞、組織、血液、尿液、リンパ液、組織液、体液などを含んでもよいが、これらに限定されない。上記のＰＴＸ３の検出セットは、例えば、フローサイトメータ、酵素結合免疫吸着測定（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）検出試薬セット、バイオチップなどの種々の既存の検出用コンポーネント／機器に適用でき又は、例えば、直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）、競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色及びウエスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）などの既存の検出用方法に適用できる。１つの具体的な例において、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の分析感度（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、検出下限値（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬＬＯＤ）ということもでき、一般的に、０．００１６ｐＭ以上である。
【００６２】
上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、有効成分として医薬組成物に添加されてもよい。一実施例において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体を選択的に含んでもよい。本発明でいう「薬学的に許容される担体」とは、それ自体が活性成分ではなく、活性成分を個体に送達するための担体、希釈剤、アジュバント及び／又は媒体、又は、組成物の処理又は貯蔵性を改善するために上記の組成物に添加される添加剤、又は、医薬組成物に適した組成物の投与量単位の形成及び容易な投与を許可又は補助するための賦形剤又はいかなる物質を指す。前記薬学的に許容される担体は、活性成分の薬理学的活性を破壊してはならず、且つ、十分な治療投与量の活性成分を送達する時に無毒でなければならない。
【００６３】
前記適用される薬学的に許容される担体は、医薬組成物の調製をよく知っている一般的な知識者によく知られており、且つ、緩衝剤、希釈剤、崩壊剤、接着剤、粘着剤、湿潤剤、ポリマー、滑沢剤、スリップ剤、不快な味や臭いを遮蔽又は除去するために添加される物質、染料、芳香剤及び組成物の外観を改善するために添加される物質を含むが、これらに限定されない。前記薬学的に許容される担体の具体例として、クエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、炭酸水素塩緩衝剤、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、炭酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、アラビアガム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マンニトール、ソルビトール、乳糖、ショ糖、澱粉、ゼラチン、セルロース類物質（例えば、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル）、低融点ワックス、カカオ脂、アミノ酸、尿素、アルコール類、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化ナトリウム又はその他の塩、リポソーム、グリセリン又は粉末、ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及びポリエチレングリコールなど）及びその他の薬学的に許容される物質を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明でいうＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状への抑制又は遅延は、上皮細胞癌、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ；ＧＢＭ）、腺癌及び線維化を含んでもよいが、これらに限定されない。前記上皮細胞癌として、例えば、肺癌、乳癌及び鼻咽頭癌が挙げられる。前記腺癌として、例えば、大腸癌が挙げられる。前記線維化疾患又は症状からの影響を受ける臓器として、肺、肝（例えば、急性肝線維化、慢性肝線維化）、腎及び皮膚等を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００６５】
応用する場合、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、目的細胞又は被験者に有効投与量の上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片又は上記の医薬組成物を投与することにより、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するために用いることができる。マウスを例とすると、本発明でいう「有効投与量」とは、体重１キロあたり２ｍｇから１０ｍｇのＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を投与し、この投与量で週に１回投与することを指す。他の一例において、前述のＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の有効投与量は、例えば、５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であることが好ましいが、６ｍｇ／ｋｇ体重〜９ｍｇ／ｋｇ体重であることがより好ましい。他の対象に適用される場合、生体の等価性に応じて適切な有効投与量に換算することができる。なお、ＰＴＸ３モノクローナル抗体の有効投与量が２ｍｇ／ｋｇ体重未満である場合、所定の時間内にＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を効果的に減少又は抑制又は遅延することができない。
【００６６】
腫瘍について、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、癌幹細胞性（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）、移行（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、腫瘍体積又は薬剤耐性（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）などの腫瘍細胞の活性を抑制又は遅延することができる。
【００６７】
本発明でいう線維化は、臓器や組織における過剰な繊維組織、例えば、繊維性結合組織の形成、又は、炎症、修復、反応の過程における繊維組織の形成として定義される。上記の繊維組織は、反応性、良性又は病理学的状態であってもよい。生理学的には、線維化は、繊維組織の過剰沈着の病理学的状態及び傷口の癒合過程における結合組織の沈着過程を記述するために用いられる。例えば、傷口から形成された瘢痕や、単一の種類の細胞から形成された線維腫や、線維組織から過剰に沈着した病理学的状態が挙げられる。線維化疾患又は症状からの影響を受ける臓器について、上記のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、急性肝線維化、慢性肝線維化などの線維化に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延することができる。
【００６８】
上記の医薬組成物は、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、同所性注射（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、経口投与、口鼻吸入などによって投与されることにより、内在性ＰＴＸ３の活性を特異的に抑制し、さらに癌細胞の活性を抑制又は遅延することができる。具体的に、インビトロでの細胞実験によって、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片及びそれを含む医薬組成物を所定の時間、例えば、４週間から１１週間使用することにより、癌細胞の活性を抑制又は遅延できることが実証された。
【００６９】
以下、いくつかの実施例により本発明の応用を説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の構想及び範囲を逸脱しない限り、様々な変更及び修飾を行うことができる。
【００７０】
実施例１．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の調製
この実施例は、従来の腫瘍融合法又は組換えタンパク質発現法により、ＰＴＸ３組換えタンパク質のＣ末端アミノ酸配列を特異的に識別するＰＴＸ３モノクローナル抗体を調製した。
【００７１】
簡単に言えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に記載される非変性アミノ酸配列のＰＴＸ３組換えタンパク質を免疫原とし、１匹あたり５０μｇの投与量でＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、２週間後、さらに１匹あたり５０μｇの投与量で免疫を２週間に１回、合計４回強化した。次に、活性化した脾細胞と骨髄癌細胞とを融合させた後、融合腫瘍細胞株を産生させた。
【００７２】
上記の融合腫瘍細胞株から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列の組換えタンパク質に対する結合親和力が高い融合腫瘍細胞株をスクリーニングし、得られた融合腫瘍細胞株から産生されたＰＴＸ３モノクローナル抗体は、配列識別番号ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載される非変性アミノ酸配列と特異的に結合することができる。
【００７３】
上記で得られた融合腫瘍細胞株の培養上清液を収集して市販のカラムによりＰＴＸ３モノクローナル抗体（臻威バイオテクノロジー社）を精製した後、偉喬バイオメディカル社によって重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のアミノ酸配列及びそれに対応する核酸配列を分析した。重鎖可変領域の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に記載されるアミノ酸配列を有してもよく、軽鎖可変領域の配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に記載されるアミノ酸配列を有してもよい。重鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に記載されるアミノ酸配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有する。軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｓ：３６に記載されるアミノ酸配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に記載される核酸配列がコードするアミノ酸配列を有する。
【００７４】
また、上記のＰＴＸ３モノクローナル抗体を市販のモノクローナル抗体アイソタイピングキットで分析したところ、その抗体のアイソタイプがＩｇＧ１ｋであることが確認された。
【００７５】
実施例２．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の親和力の評価
この実施例は、従来のＥＬＩＳＡキットによりＰＴＸ３組換えタンパク質と実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体との親和力を評価した。
【００７６】
まず、５μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に記載される非変性アミノ酸配列）又はウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ；コントロール群として）を９６ウェル細胞培養プレート（製品コード：９０１８、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに塗布し、４℃で一晩反応させた。その後、ブロッキング溶液（３％脱脂粉乳を含むリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ））をウェル内に入れ、室温（４℃〜４０℃）で１時間のブロック反応を行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを湿潤洗浄し、さらに一次抗体を加えて室温（４℃〜４０℃）で１時間反応させた。ここで、一次抗体は、段階希釈した実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体（濃度２．４４×１０−４μｇ／ｍＬ〜１．００μｇ／ｍＬ）であった。その後、ＰＢＳで洗浄して各ウェル内の結合していないＰＴＸ３モノクローナル抗体を除去し、且つ、二次抗体を加えて室温（４℃〜４０℃）で反応させた。その後、各ウェルにテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）を加えて一定の時間反応させた後、０．１Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を加えて１０分間反応させて、反応を停止させた。ここで、二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｈｏｒｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）と結合した抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧ−ＨＲＰ）であった。次に、市販のＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その結果を図１に示した。各値は、３回繰り返した。上記の二次抗体の反応時間は、メーカーのマニュアルに従って行い、当業者によく知られているものであるので、ここでは詳細な説明を省略する。
【００７７】
図１を参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力を示す曲線図であり、ここで、符号「●」付きの曲線は、ＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力の曲線を表し、符号「■」付きの曲線は、ＢＳＡのＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力の曲線を表す。
【００７８】
図１の結果から分かるように、４６倍と高く希釈した（抗体濃度が０．２４４ｎｇ／ｍＬ又は０．００１６ｐＭに相当する）後のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、依然としてＰＴＸ３組換えタンパク質に対して良好な親和力を保持する。
【００７９】
また、上記のＥＬＩＳＡキットによって、本発明の一実施例のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３組換えタンパク質に対して高い親和力を有することも証明された。まず、１０μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に記載される非変性アミノ酸配列、ｐＨ７．２のＰＢＳに溶解した）を９６ウェル細胞培養プレート（製品コードが上記と同じである）の各ウェルに塗布し、４℃で一晩反応させた。その後、ブロッキング溶液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ）をウェル内に入れ、室温（４℃〜４０℃）で１時間のブロック反応を行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを湿潤洗浄し、さらに一次抗体を加えて室温（４℃〜４０℃）で１時間反応させた。ここで、一次抗体は、段階希釈した実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体（濃度０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）であった。その後、ＰＢＳＴで各ウェルを数回湿潤洗浄して、各ウェル内の結合していないＰＴＸ３モノクローナル抗体を除去し、且つ、二次抗体を加えて室温（４℃〜４０℃）で反応させた。ここで、二次抗体は、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧ−ＨＲＰ）である。その後、各ウェルにＴＭＢを加えて一定の時間反応させた後、０．１Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を加えて１０分間反応させて、反応を停止させた。次に、市販のＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）で４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その結果を図２に示した。各値は、４回繰り返した。上記の二次抗体の反応時間は、当業者によく知られているものであるので、ここでは詳細な説明を省略する。
【００８０】
図２を参照すると、本発明の他の実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３組換えタンパク質に対する親和力を示す曲線図である。
【００８１】
図２の結果から分かるように、ＰＴＸ３組換えタンパク質（即ち、抗原）に対するＰＴＸ３モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）は、８５ｐＭであり、ＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３組換えタンパク質に対して高い親和力を有するので、ＰＴＸ３の検出セットに適用できる。
【００８２】
また、他の実験において、ＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３組換えタンパク質の２００番目から３５９番目のアミノ酸（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に記載される非変性アミノ酸配列；図示せず）又は２００番目から２３６番目のアミノ酸（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載される非変性アミノ酸配列；図３に示すように）と特異的に結合することができる。
【００８３】
実施例３．ＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３との結合領域の評価
１．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング領域の評価
この実施例は、従来のＥＬＩＳＡキットによりＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ）領域を評価した。
【００８４】
この実施例は、２００μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１２、１６、１７に記載される非変性アミノ酸配列、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、ｐＨ８．３）又はＢＳＡ（コントロール群として）を９６ウェル細胞培養プレートのウェル内に塗布し、４℃で一晩反応させた以外は、実施例１と同様に、ＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３に対する小さな結合領域を評価した。次に、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）をウェル内に入れ、室温（４℃〜４０℃）で１時間のブロック反応を行った。ブロッキング溶液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを湿潤洗浄し、さらに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体（濃度１２５ｎｇ／ｍＬ）を加えて室温（４℃〜４０℃）で２時間反応させた。その後、ＰＢＳで洗浄して各ウェル内の結合していないＰＴＸ３モノクローナル抗体を除去し、且つ、二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ、１：５０００で希釈した）を加えて室温（４℃〜４０℃）で１時間反応させた。その後、各ウェルにＴＭＢを加えて一定の時間反応させた後、０．１Ｍ硫酸を加えて１０分間反応させて、反応を停止させ、且つ、市販のＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その結果を図３に示した。各値は、３回繰り返した。
【００８５】
図３を参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体と異なる断片のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合のエピトープマッピングを示す図である。ここで、ＲＩ３７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、ＫＴ４４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、ＧＩ４０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、符号「＊＊＊」は、コントロール群（即ち、ＢＳＡ群）に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【００８６】
図３の結果から分かるように、ＰＴＸ３モノクローナル抗体のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片に対する親和力は、他の断片よりも高く、且つ、統計的有意性がある。
【００８７】
図４を参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体と異なる断片のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合のエピトープマッピングを示す図である。ここで、横軸は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１０に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表す。
【００８８】
図４の結果から分かるように、ＰＴＸ３モノクローナル抗体のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２〜４に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片に対する親和力は、他の断片よりはるかに高い。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２〜４に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片は、ＰＴＸ３の２０３番目から２１７番目のアミノ酸、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列に対応し、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２〜４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に記載されるアミノ酸配列の範囲内にあることを表す。
【００８９】
２．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング領域の差異の評価
この実施例は、実施例３と同様に、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（製品コード：ａｂ９０８０６；ａｂｃａｍ  ｐｌｃ．，Ｕ．Ｋ．）とＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング領域を評価し、その結果を図５に示した。各値は、３回繰り返した。
【００９０】
図５を参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体と異なる断片のＰＴＸ３組換えタンパク質との結合のエピトープマッピングを示す図である。ここで、ＰＴＸ３／ＦＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、ＲＩ３７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、ＫＴ４４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、ＧＩ４０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に記載されるＰＴＸ３組換えタンパク質断片を表し、符号「＊＊＊」は、コントロール群（ＢＳＡ群）に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【００９１】
図５の結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）のＰＴＸ３／ＦＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）に対する親和力は、いずれも高いが、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＲＩ３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のＰＴＸ３組換えタンパク質断片に対する親和力は、市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）よりも高く、且つ、統計的有意性があり、ＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）がＰＴＸ３との結合のエピトープマッピング領域に対して差異があることが示された。 
【００９２】
実施例４．インビトロでのＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合への影響の評価
ＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３受容体の結合領域又はその近傍領域と競争的に結合することにより、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合の機会を特異的に抑制又は遅延することができる。この実施例は、ＣＤ４４をＰＴＸ３受容体の一例とし、競争的結合試験によりＰＴＸ３モノクローナル抗体がＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を競争的に抑制する効果を評価した。
【００９３】
本実施例によって、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３を中和して、それがＰＴＸ３受容体（例えば、ＣＤ４４）の結合領域又はその近傍領域と結合できないようにさせることが実証された。
【００９４】
簡単に言えば、この実施例で使用された競争的結合分析法は、１０μｇ／ｍＬのＰＴＸ３受容体〔例えば、ＣＤ４４のＮ末端組換えタンパク質（ＣＤ４４のＮ末端の１〜２２０番目のアミノ酸残基の配列、ＰＢＳに溶解し、ｐＨ  ７．２；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，北京、中国））を９６ウェル細胞培養プレートのウェル内に塗布し、４℃で一晩反応させた以外は、実施例１と同様である。次に、ブロッキング溶液（３％脱脂粉乳を含むＰＢＳ）をウェル内に入れ、室温（４℃〜４０℃）で１時間のブロック反応を行った。
【００９５】
競争的結合試験を行った場合、ＨＲＰと結合したＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に記載される非変性アミノ酸配列、ＨＲＰ−ＰＴＸ３、濃度５μｇ／ｍＬ）と異なる濃度の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体（濃度１μｇ／ｍＬ又は２μｇ／ｍＬ）を室温（４℃〜４０℃）で１時間予備反応させて、予備反応生成物を形成した。
【００９６】
ブロッキング溶液を除去した後、各ウェルをＰＢＳで湿潤洗浄し、さらに上記の予備反応生成物を加えて室温（４℃〜４０℃）で２時間の反応を行った。次に、ＰＢＳで洗浄して各ウェル内の結合していない予備反応生成物を除去し、各ウェルにＴＭＢを加えて一定の時間反応させた後、０．１Ｍ硫酸を加えて１０分間反応させて、反応を停止させ、且つ、市販のＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その結果を図６に示した。各値は、４回繰り返した。
【００９７】
図６を参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体がＰＴＸ３組換えタンパク質とＰＴＸ３受容体との結合を阻害する競争的抑制を示す図である。ここで、縦軸は、競争的抑制率（％）を表し、横軸の下方の符号「＋」又は「−」は、結合反応を行った場合の特定の成分の添加の有無を表し、図６の左側の１番目のバーは、コントロール群（即ち、ＰＴＸ３モノクローナル抗体を加えないＰＴＸ３組換えタンパク質の群）を表し、符号「＊＊＊」は、コントロール群に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【００９８】
図６の結果から分かるように、図６の左側の１番目のバーのＰＴＸ３モノクローナル抗体を加えない値を０％の競争的抑制率とし、ＰＴＸ３モノクローナル抗体とＰＴＸ３組換えタンパク質とを予備反応させてからＣＤ４４受容体と反応させる場合、得られた競争的抑制率（％）は、ＰＴＸ３モノクローナル抗体の濃度に対して投与量依存性関係を示し、且つ、統計的有意性があり、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３を中和して、それがＣＤ４４結合区域又はその近傍領域と結合できないようにさせることを示す。 
【００９９】
実施例５．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の活性への影響の評価
乳癌、肺癌、鼻咽頭癌、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ；ＧＢＭ）は、悪性腫瘍であり、且つ、上記の癌細胞は、移行（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）及び癌幹細胞性（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）などの活性を有する。この実施例は、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、登録番号：ＢＣＲＣ  ６０４２５、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６；トリプルネガティブ乳癌細胞株、以下、単に「ＭＢ２３１」と称する）、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（登録番号：ＢＣＲＣ  ６００７４；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）、ヒト鼻咽頭癌細胞株ＨＯＮＥ１（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９０Ｊａｎ  １５；４５（１）：８３−９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．９５２４−９５２８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９８９）、ヒトＧＢＭ癌細胞Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  登録番号：ＨＴＢ−１４；ＢＣＲＣ  登録番号：６０３６０）等を使用して、下記の試験により実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の活性への影響を評価した。 
【０１００】
１．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の移行への影響の評価
移行実験を行った場合、上記の癌細胞を１×１０５個細胞／ウェルの細胞密度で、２４ウェルのボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）の上層（底部のウェルの径８μｍ）に接種して、３時間培養した。次に、上層の細胞培養液を血清を含まない細胞培養液に交換し、且つ、下層の血清を含まない細胞培地に０．２μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に記載される非変性アミノ酸配列）、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３モノクローナル抗体又は０．４μｇ／ｍＬのコントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）を加えた。
【０１０１】
１６時間培養した後、上層内側の細胞を綿棒で掻き取り、上層の底部外側に移行した細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、且つ、蛍光顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で、上層の底部外側に移動した細胞の数を算出し、その結果を図７Ａ、図８Ａ、図９Ａ及び図１０Ａに示した。
【０１０２】
図７Ａ、図８Ａ、図９Ａ及び図１０Ａを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図７Ａ）、肺癌細胞Ａ５４９（図８Ａ）、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図９Ａ）及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１０Ａ）の移行細胞の数を示す柱状図である。上記の実施例のデータは、いずれも各時点及び各サンプルの３回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によりすべての値を分析した。上記の実施例の符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１０３】
図７Ａ、図８Ａ、図９Ａ及び図１０Ａの結果から分かるように、ＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの移行細胞の数を顕著に抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１０４】
２．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の侵襲への影響の評価
侵襲実験を行った場合、２４ウェルのボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）の上層（底部のウェルの径８μｍ）の底面を予め基底膜マトリックス（ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）で塗布した後、上記の癌細胞を１×１０５個細胞／ウェルの細胞密度で２４ウェルのボイデンチャンバーの上層に接種して、３時間培養した。次に、上層の細胞培養液を血清を含まない細胞培養液に交換し、且つ、下層の血清を含まない細胞培地に０．２μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載される非変性アミノ酸配列）、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３モノクローナル抗体又は０．４μｇ／ｍＬのコントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）を加えた。
【０１０５】
１６時間培養した後、上層内側の細胞を綿棒で掻き取り、上層の底部外側に移行した細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、且つ、蛍光顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で、上層の底部外側に移動した細胞の数を算出し、その結果を図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂ及び図１０Ｂに示した。
【０１０６】
図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂ及び図１０Ｂを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図７Ｂ）、肺癌細胞Ａ５４９（図８Ｂ）、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図９Ｂ）及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１０Ｂ）の侵襲細胞の数を示す柱状図である。ここで、符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１０７】
図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂ及び図１０Ｂの結果から分かるように、ＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの侵襲細胞の数を顕著に抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１０８】
３．ＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の移行への影響の評価
上記の癌細胞は、癌幹細胞性（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有し、ＰＴＸ３組換えタンパク質を添加することにより、前記癌細胞は、細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）を形成することができる。
【０１０９】
細胞塊の実験を行った場合、上記の癌細胞を０．２μｇ／ｍＬのＰＴＸ３組換えタンパク質、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３モノクローナル抗体又は０．４μｇ／ｍＬのコントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）を含む１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養液〔１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、５０〜１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び５０〜１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む〕に加え、且つ、３７℃で湿度を保つ濃度５％の二酸化炭素で培養し、これは、当業者に知られているものであるので、詳細な説明を省略する。
【０１１０】
そして、上記の異なる処理がされた癌細胞を５×１０３個細胞／ウェルの細胞密度で超低接着表面多孔質培養皿（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に接種し、血清を含まない（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）細胞培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）［Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ；Ａｂｃａｍ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む］で共培養を行った。２週間培養した後、細胞塊の数を光学顕微鏡で観察し、その結果を図７Ｃ、図８Ｃ、図９Ｃ及び図１０Ｃに示した。
【０１１１】
図７Ｃ、図８Ｃ、図９Ｃ及び図１０Ｃを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図７Ｃ）、肺癌細胞Ａ５４９（図８Ｃ）、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図９Ｃ）及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１０Ｃ）の細胞塊の数を示す柱状図である。ここで、符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１１２】
図７Ｃ、図８Ｃ、図９Ｃ及び図１０Ｃの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９、鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１及び神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの細胞塊の数を顕著に抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１１３】
４．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体の癌細胞の活性への影響の評価
この実施例は、実施例２と同様に、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（製品コード：ａｂ９０８０６；ａｂｃａｍ  ｐｌｃ．，Ｕ．Ｋ．）による癌細胞の活性への抑制効果を評価し、その結果を図１１Ａ〜図１４Ｃに示した。
【０１１４】
図１１Ａ、図１２Ａ及び図１３Ａを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図１１Ａ）、肺癌細胞Ａ５４９（図１２Ａ）及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図１３Ａ）の移行細胞の数を示す柱状図である。ここで、符号「＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０５）を表し、符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１１５】
図１１Ａ、図１２Ａ及び図１３Ａの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１の移行細胞の数を顕著に抑制又は遅延することができるが、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体による癌細胞の移行細胞の数への抑制又は遅延効果は、市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）よりも顕著に高く、且つ、統計的有意性がある。
【０１１６】
図１１Ｂ、図１２Ｂ及び図１３Ｂを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図１１Ｂ）、肺癌細胞Ａ５４９（図１２Ｂ）及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図１３Ｂ）の侵襲細胞の数を示す柱状図である。ここで、符号「＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０５）を表し、符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１１７】
図１１Ｂ、図１２Ｂ及び図１３Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１の侵襲細胞の数を顕著に抑制又は遅延することができるが、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体による癌細胞の侵襲細胞の数への抑制又は遅延効果は、市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）よりも顕著に高く、且つ、統計的有意性がある。
【０１１８】
図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃを参照すると、それぞれ本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体により抑制された乳癌細胞ＭＢ２３１（図１４Ａ）、肺癌細胞Ａ５４９（図１４Ｂ）及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１（図１４Ｃ）の細胞塊の数を示す柱状図である。ここで、符号「＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．０１）を表し、符号「＊＊＊」は、統計的有意性があるデータ（Ｐ＜０．００１）を表す。
【０１１９】
図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体及び市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）は、コントロール群の抗体ＩｇＧ１ｋに比べて、乳癌細胞ＭＢ２３１、肺癌細胞Ａ５４９及び鼻咽頭癌細胞ＨＯＮＥ１の細胞塊の数を顕著に抑制又は遅延することができるが、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体による細胞塊の数への抑制又は遅延効果は、依然として市販のＰＴＸ３モノクローナル抗体（ａｂ９０８０６）よりも顕著に高く、且つ、統計的有意性がある。 
【０１２０】
実施例６．ＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの腫瘍の成長及び転移への影響の評価
１．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの同所性異種移植乳癌腫瘍の成長及び転移への抑制効果の評価
この実施例は、上記のヒト癌細胞株を免疫不全マウスの乳腺脂肪パッドに同所性注射し、腫瘍を形成した後、さらに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体を投与することにより、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体による腫瘍への抑制又は遅延効果を評価した。
【０１２１】
まず、乳癌細胞ＭＢ２３１−Ｌｕｃ２〔ＭＢ２３１がヒト乳癌細胞であり、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）α及びＥＲβが発現しない；Ｌｕｃ２がルシフェラーゼを発現する遺伝子である）をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（楽斯科バイオテクノロジー社から購入）の乳腺脂肪パッドに同所性接種した。腫瘍の平均体積が８０ｍｍ３に達した後、実験用マウスに実施例１のＰＴＸ３抗体（８ｍｇ／ｋｇ体重）又はコントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ、８ｍｇ／ｋｇ体重）を週に１回投与し、その結果を図１５Ａ〜図１５Ｂに示した。図１５Ｂは、乳癌細胞ＭＢ２３１−Ｌｕｃ２を接種した後の１１週目のインビボイメージング結果を示し、ここで、インビボイメージングは、市販のインビボ蛍光イメージング（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅｓ）システム〔例えば、非侵襲的３Ｄ生体分子イメージングシステム（ＩＶＩＳ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ〕により腫瘍の大きさを観察し、発光画像領域は、マウス体内に乳癌細胞ＭＢ２３１−Ｌｕｃ２から形成された腫瘍を有することを表す。その後、すべてのマウスを犠牲にして、マウス体内の腫瘍の大きさを測量し、且つ、下記の式（Ｉ）に基づいて腫瘍体積を算出した。
【０１２２】
Ｖ＝（ｗ×ｌ２）×０．５２  （Ｉ）
式（Ｉ）中、ｌは、腫瘍の長さを表し、ｗは、腫瘍の幅を示す。
【０１２３】
図１５Ａ〜図１５Ｂを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１の腫瘍体積（図１５Ａ）及び腫瘍の転移（図１５Ｂ）の結果を示す図である。図１５Ａのデータは、各時点及び各サンプルの６回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、符号「＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０５）があることを表す。
【０１２４】
図１５Ａ及び図１５Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、同所性異種移植乳癌細胞ＭＢ２３１の腫瘍体積及び腫瘍の転移を顕著に抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１２５】
２．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの同所性同種移植乳癌腫瘍の成長及び転移への抑制効果の評価
この実施例は、上記のマウス癌細胞株を免疫系が正常なマウスの乳腺脂肪パッドに同所性注射し、腫瘍を形成してから、マウスのトリプルネガティブ乳癌（ｔｒｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ；ＴＮＢＣ）のモデルを樹立した後、さらに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体を投与することにより、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の腫瘍への抑制効果を評価した。
【０１２６】
まず、１×１０６乳癌細胞４Ｔ１（４Ｔ１がマウス乳癌細胞株であり、Ｌｕｃ２遺伝子含有ベクターをトランスフェクションし、ＥＲβが発現するが、ＥＲαが発現しなく、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５３９ＴＭ）を同所性同種移植されるものとして、野生型ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６〜８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）の乳腺脂肪パッドに同所性接種した。腫瘍の平均体積が５０ｍｍ３に達した後、実験用マウスに実施例１のＰＴＸ３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）又はコントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ、１０ｍｇ／ｋｇ体重）を週に１回投与した。インビボ蛍光イメージングシステムにより腫瘍の大きさ及び転移を観察した。その後、すべてのマウスを犠牲にして、マウス体内の腫瘍の大きさを測量し、且つ、上記の式（Ｉ）に基づいて腫瘍体積を算出した。
【０１２７】
図１６Ａ〜図１６Ｂを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積（図１６Ａ）及び腫瘍の転移（図１６Ｂ）への抑制の結果を示す図である。図１６Ｂは、乳癌細胞４Ｔ１を接種した後の５週目のインビボイメージング結果を示し、その中の発光画像領域は、マウス体内に乳癌細胞４Ｔ１から形成された腫瘍を有することを表し、且つ、図１６Ａのデータは、各時点及び各サンプルの６回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、符号「＊＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０１）があることを表す。
【０１２８】
図１６Ａ及び図１６Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び腫瘍の転移を顕著に抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１２９】
３．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体と抗癌剤との併用によるインビボでの同所性同種移植乳癌腫瘍の成長への抑制効果の評価（Ｉ）
この実施例は、上記のマウス乳癌細胞株４Ｔ１をＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス（６〜８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）の乳腺脂肪パッドに同所性接種した以外は、実施例６の第２点と同様に評価した。腫瘍の平均体積が５０ｍｍ３に達した後、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体〔２．５ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋともいう）、５．０ｍｇ／ｋｇ体重又は１０．０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＸ３Ａｂ、臻威バイオテクノロジー社］、コントロール群の抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ｋ、製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）を投与し又はパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ又はＰａｃｌｉｔａｘｅｌともいい、３０．０ｍｇ／ｋｇ体重）と併用し、腹腔内注射によりマウスに週に１回、合計６週間投与した。６週目に、マウスを犠牲にした後、インビボ蛍光イメージングシステムにより腫瘍の大きさ及び転移を観察した。
【０１３０】
６週間後、市販のインビボ蛍光イメージング（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅｓ）システム〔例えば、非侵襲的３Ｄ生体分子イメージングシステム（ＩＶＩＳ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ〕により腫瘍の大きさを観察し、その結果を図１７Ａに示し、その中の発光画像領域は、マウス体内に乳癌細胞４Ｔ１から形成された腫瘍を有することを表す。上記のシステムによりマウス体内の腫瘍の大きさ及び転移を測定し、且つ、上記の式（Ｉ）に基づいて腫瘍体積を算出し、その結果を図１７Ｂ〜図１７Ｃに示した。
【０１３１】
図１７Ａ〜図１７Ｃを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合に抑制されたマウスの同所性異種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を示す画像（図１７Ａ）及び腫瘍体積の変化の折れ線グラフ（図１７Ｂ〜図１７Ｃ）である。図１７Ｂ〜図１７Ｃのデータは、各時点及び各サンプルの６回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、ここで、符号「＊＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０１）があることを表す。
【０１３２】
図１７Ａ〜図１７Ｃの結果から分かるように、図１７Ａ及図１７Ｂに示すように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体又はパクリタキセルは、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を抑制又は遅延できる。しかし、図１７Ａ及図１７Ｂに示すように、マウスに対して、ＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合、同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を抑制又は遅延することができ、且つ、この両者の併用効果は、単独処理による総合的効果をはるかに超える。以上の差異は、いずれも統計的有意性がある。 
【０１３３】
４．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体を抗癌剤と併用する場合におけるインビボでの同所性同種移植乳癌腫瘍の成長への抑制効果の評価（ＩＩ）
この実施例は、図１８Ａの実験フローの模式図に従って、実施例６の第３点と同様に評価を行い、その結果を図１８Ｂ〜図１８Ｄに示した。
【０１３４】
図１８Ｂ〜図１８Ｄを参照すると、それぞれ本発明の他の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合又は併用しない場合における、マウスの同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を示す画像（図１８Ｂ）、腫瘍体積の折れ線グラフ（１８Ｃ）及びマウスの生存率（図１８Ｄ）である。図１８Ｃ〜図１８Ｄのデータは、各時点及び各サンプルの６回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、ここで、符号「＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０５）があることを表し、符号「＊＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０１）があることを表す。
【０１３５】
図１８Ｂ〜図１８Ｄの結果から分かるように、１８Ｂ及び図１８Ｃに示すように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体又はパクリタキセルは、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積及び転移を抑制又は遅延できる。しかし、１８Ｂ及び図１８Ｃに示すように、マウスに対して、ＰＴＸ３モノクローナル抗体をパクリタキセルと併用する場合、同所性同種移植乳癌細胞４Ｔ１の腫瘍体積を抑制又は遅延するとともに、マウスの生存率を８０％以上に向上させることができ、且つ、この両者の併用効果は、単独処理による総合的効果をはるかに超える。以上の差異は、いずれも統計的有意性があった。 
【０１３６】
５．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの同種異体移植大腸癌腫瘍の成長への抑制効果の評価
この実施例は、上記のマウスの大腸癌細胞株ＭＣ３８をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（６〜８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）に皮下（ｓ．ｃ．）注射した以外は、図１９Ａの実験フローの模式図に従って実施例６の第３点と同様に評価した。ＭＣ３８細胞を注射した後の７日目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によりマウスに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体〔１０．０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＸ３Ａｂ、臻威バイオテクノロジー社〕又はコントロール群の抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ｋ、製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）を週に１回、合計３回投与した。週にインビボ蛍光イメージングシステムにより腫瘍の大きさを観察した。２３日目に、すべてのマウスを犠牲にして、マウス体内の腫瘍の大きさを測量し、且つ、上記の式（Ｉ）に基づいて腫瘍体積を算出した。
【０１３７】
図１９Ｂを参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植の大腸癌細胞株ＭＣ３８の腫瘍体積の結果を示す図である。図１９Ｂのデータは、各時点及び各サンプルの４回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、ここで、符号「＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．０５）があり、符号「＊＊＊」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【０１３８】
図１９Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、大腸癌細胞株ＭＣ３８の腫瘍体積を抑制又は遅延することができ、且つ、この差異は統計的有意性がある。 
【０１３９】
６．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの異種移植神経膠芽腫の成長への抑制効果の評価
この実施例は、上記のヒト神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ；ＧＢＭ）細胞株Ｕ８７ＭＧをＮＯＤ−ＳＣＩＤ雄マウス（６〜８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）に皮下（ｓ．ｃ．）注射した以外は、実施例６の第３点と同様に評価した。Ｕ８７ＭＧ細胞を注射した後の２０日目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によりマウスに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体〔１０．０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＸ３Ａｂ、臻威バイオテクノロジー社〕又はコントロール群の抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ｋ、製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）を週に１回、合計４週間投与した。２０日後、腫瘍の大きさを測量し、且つ、上記の式（Ｉ）に基づいて腫瘍体積を算出した。
【０１４０】
図２０Ａ及び図２０Ｂを参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体又はコントロール群の抗体により抑制されたマウスへの移植のヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧの腫瘍体積を示す折れ線グラフ（図２０Ａ）及びマウスの生存率を示す図（図２０Ｂ）である。図２０Ａのデータは、各時点及び各サンプルの３回又は４回繰り返し実験のデータから正負の平均標準偏差として取得されたものであり、ここで、符号「ｐ＝０．０００８」は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に対して統計的有意性があることを表す。
【０１４１】
図２０Ａ及び図２０Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、異種移植神経膠芽腫細胞Ｕ８７ＭＧの腫瘍体積を抑制又は遅延するとともに（図２０Ａ）、マウスの生存率を７５％に向上させることができる（図２０Ｂ）。以上の差異は、いずれも統計的有意性があった。 
【０１４２】
実施例７．ＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの線維化への遅延又は逆転効果の評価
１．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの急性肝線維化の肝壊死への逆転効果の評価
この実施例は、図２１Ａの実験フローの模式図に従って行い、義守大学の義大病院動物センターのガイドラインに基づいて設計されている。まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）に体重１ｍＬ／ｋｇのテトラクロロメタン（ＣＣｌ４とオリーブオイルとを１：１の体積比で混合したもの）を筋肉内注射した。テトラクロロメタンによる急性肝線維化は、１２時間以内に肝細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を引き起こした。次に、テトラクロロメタンを注射した後の４時間及び２８時間目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体〔１０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＸ３Ａｂ、臻威バイオテクノロジー社〕又はコントロール群の抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ｋ、製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）をマウスに投与した。２日目に、すべてのマウスを犠牲にし、肝組織切片の変化、肝壊死領域の占める割合及び肝臓重量／体重比を観察し、その結果を図２１Ｂから図２１Ｄに示した。
【０１４３】
図２１Ｂ〜図２１Ｄを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による急性肝線維化マウス体内のヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）で染色された肝左葉の組織切片（図２１Ｂ、拡大倍率：２０倍、肝細胞アポトーシスの様子を観察する）、肝壊死領域の割合（図２１Ｃ）及び肝臓重量／体重比（図２１Ｄ）を示す図である。図２１Ｃは、市販の画像分析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｗ．Ｓ．Ｒａｓｂａｎｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）の自動的な閾値検出機能により合計スキャン領域における肝壊死領域の占める割合を測量した。
【０１４４】
図２１Ｂ〜図２１Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、テトラクロロメタンによる急性肝線維化の細胞アポトーシス（図２１Ｂ）及び壊死（図２１Ｃ）を遅延するとともに、マウスの急性肝線維化による肝臓重量の増加の程度（図２１Ｄ）を遅延することができる（図２１Ｄ）。以上の差異は、いずれも統計的有意性があった。 
【０１４５】
２．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のインビボでの慢性肝線維化の肝壊死への逆転効果の評価
この実施例は、図２２Ａの実験フローの模式図に従って行い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（８週齢、楽斯科バイオテクノロジー社から購入）に体重１ｍＬ／ｋｇのテトラクロロメタン（ＣＣｌ４とオリーブオイルとを１：１の体積比で混合したもの）を週に２回、合計８週間筋肉内注射した以外は、実施例７の第１点と同様に設計されている。次に、テトラクロロメタンを注射した後の３〜８週目に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によりマウスに実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体〔１０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＴＸ３Ａｂ、臻威バイオテクノロジー社〕又はコントロール群の抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＩｇＧ１ｋ、製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）を週に１回投与した。８週目の終わりに、すべてのマウスを犠牲にし、肝組織切片の変化、肝壊死領域の占める割合及び肝臓重量／体重比を観察し、その結果を図２２Ｂ〜図２２Ｄに示した。
【０１４６】
図２１Ｂ〜図２１Ｄを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による慢性肝線維化マウス体内のピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）で染色された肝左葉の組織切片（図２２Ｂ、拡大倍率：２０倍、肝線維化の様子を観察する）、肝線維化領域の割合（図２２Ｃ）及び肝臓重量／体重比（図２２Ｄ）を示す図である。図２２Ｃは、市販の画像分析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｗ．Ｓ．Ｒａｓｂａｎｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）の自動的な閾値検出機能により合計スキャン領域における肝壊死領域の占める割合を測量した。
【０１４７】
図２２Ｂ〜図２２Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、テトラクロロメタンによる慢性肝線維化（図２２Ｂ）及び領域の割合（図２２Ｃ）を遅延するとともに、マウスの慢性肝線維化による肝臓重量の増加の程度を遅延することができる（図２２Ｄ）。以上の差異は、いずれも統計的有意性があった。 
【０１４８】
４．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の腎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現への影響の評価
この実施例は、ラット腎線維芽細胞株（ＮＲＫ４９Ｆ、登録番号：ＢＣＲＣ  ６００８４，ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７０ＴＭ）を使用して、下記の試験により実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の腎線維化への影響を評価した。
【０１４９】
まず、腎線維芽細胞株ＮＲＫ４９Ｆ細胞をダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（１２８００−０８２，Ｇｉｂｃｏ）（１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む）に培養した。
【０１５０】
ＮＲＫ４９Ｆ細胞を０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で処理した後、さらに２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３で６時間処理した。次に、改良型放射性免疫沈降アッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，ＲＩＰＡ）緩衝液〔ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、１ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ）を含む〕でＮＲＫ４９Ｆ細胞を溶解した。その後、特定の抗体を用いてウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ、製品コードＴ６１９９、Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、製品コード１５６１３−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）の発現を検出し、且つ、α−チューブリンの発現量をローディング・コントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）群として、その結果を図２３Ａに示した。
【０１５１】
また、ＮＲＫ４９Ｆ細胞を２４ウェル細胞培養プレートに接種し、０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３で２４時間処理した。次に、−２０℃でＮＲＫ４９Ｆ細胞をメタノールで一晩固定した。翌日、室温でピクロシリウスレッド溶液（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、製品コードａｂ２４６８３２、Ａｂｃａｍ）で２０分間染色した後、酢酸で２回湿潤洗浄した。光学顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で、細胞結節の数を判定した。その後、これらの細胞を０．１Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、市販のＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図２３Ｂ及び図２３Ｃに示した。
【０１５２】
図２３Ａ〜図２３Ｃを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるマウス腎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果（図２３Ａ）、細胞結節の細胞染色画像（図２３Ｂ）及びその柱状図（図２３Ｃ）である。符号「＊＊＊」は、コントロール群に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【０１５３】
図２３Ａ〜図２３Ｃの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、腎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を低下させ（図２３Ａ）、細胞結節の数を減少させることができ（図２３Ｂ、図２３Ｃ）、且つ、その差異が統計的有意性があった。 
【０１５４】
５．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の片側尿管閉塞（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ＵＵＯ）動物モデルでの腎線維化への遅延効果の評価
この実施例は、それぞれ図２４Ａ及び図２４Ｃの実験フローの模式図に従って評価した。まず、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ品種の雄マウス（楽斯科バイオテクノロジー社から購入）を採取した。次に、マウスの左側の切り口で片側尿管閉塞（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ＵＵＯ）手術を行った。左腎を取り出して尿管（ｕｒｅｔｅｒ）を露出させて、縫合糸（４−Ｏ  Ｓｉｌｋ）で尿管を縫合した。その後、手術縫合器で傷口を縫合した。そして、術後０日目及び７日目（前処理、例えば、図２４Ａ及び図２４Ｂ）又は術後７日目（後処理、例えば、図２４Ｃ及び図２４Ｄ）に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で処理し、術後１４日目にマウスを安楽死させた。半分の腎臓をホルマリンで固定して、パラフィンに包埋した。組織切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｅｏｓｉｎ、ＨＥ）又はピクロシリウスレッド溶液（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、製品コードａｂ２４６８３２、Ａｂｃａｍ）で染色した後、カバーガラスを載せて密封し、２０倍の拡大倍率で画像を観察し、その結果を図２４Ｂ及び図２４Ｄに示し、図中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【０１５５】
図２４Ｂ及び図２４Ｄを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＵＵＯマウスの腎臓の組織切片の染色画像を示す。
【０１５６】
図２４Ｂ及び図２４Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、確かにＵＵＯ動物の腎線維化を遅延できる。 
【０１５７】
６．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＰＴＸ３処理後の肺線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現及び移行への影響の評価
この実施例は、ヒト肺線維芽細胞株（ＨＦＬ１、登録番号：ＢＣＲＣ  ６０２９９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１５３ＴＭ）を使用して、下記の試験により実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の肺線維化への影響を評価した。
【０１５８】
まず、ＨＦＬ１細胞をハムＦ−１２Ｋ（Ｆ１２Ｋ）培地〔Ｋａｉｇｈｎ改良〕（２１１２７−０２２，Ｇｉｂｃｏ）（１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む）に培養した。
【０１５９】
ＨＦＬ１細胞を０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で処理した後、さらに２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３で６時間処理した。次に、改良型ＲＩＰＡ緩衝液でＨＦＬ１細胞を溶解した。その後、特定の抗体を用いてウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ、製品コードＴ６１９９、Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、製品コード１５６１３−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ、製品コード１４６９５−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）及びα−平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ、製品コードＧＴＸ  １００９０４、ＧｅｎｅＴｅｘ）の発現を検出し、且つ、α−チューブリンの発現量をローディング・コントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）群として、その結果を図２５Ａに示した。
【０１６０】
また、ＨＦＬ１細胞を２４ウェル細胞培養プレート〔ウェルの径が８μｍの挿入型培養皿（３５３０９７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む〕に接種し、下層の培養用ウェルに０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３の有無で処理した。１６時間培養した後、挿入型培養皿内の細胞を綿棒で掻き取った。挿入型培養皿の底部から移行した挿入型培養皿のポリカーボネートフィルムの下面に貼り付けた細胞をＤＡＰＩで染色し、且つ、蛍光顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で細胞の数を判定し、その結果を図２５Ｂに示した。
【０１６１】
ＨＦＬ１細胞を２４ウェル細胞培養プレートに接種し、０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３の有無で２４時間処理した。次に、−２０℃でＨＦＬ１細胞をメタノールで一晩固定した。翌日、室温でピクロシリウスレッド溶液（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、製品コードａｂ２４６８３２、Ａｂｃａｍ）で２０分間染色した後、酢酸で２回湿潤洗浄した。光学顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で、細胞結節の数を判定した。その後、これらの細胞を０．１Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、市販のＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図２５Ｃ及び図２５Ｄに示した。
【０１６２】
図２５Ａ〜図２５Ｄを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による肺線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果（図２５Ａ）、移行細胞の数の柱状図（図２５Ｂ）、細胞結節の細胞染色画像（図２５Ｃ）及びその柱状図（図２５Ｄ）を示す。符号「＊＊＊」は、コントロール群に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【０１６３】
図２５Ａ〜図２５Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、ＰＴＸ３処理後の肺線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現、移行及び細胞結節の数を遅延できる。 
【０１６４】
７．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＩＰＦマウスモデルのブレオマイシン誘発肺線維化への影響の評価（Ｉ）
この実施例は、図２６Ａの実験フローの模式図に従って行った。まず、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ品種の雄マウス（楽斯科バイオテクノロジー社から購入）を採取した。ＰＢＳ又は２ｍｇ／ｋｇのブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、ＢＬＭ、製品コードａｐ３０２、Ｚｎｚｏ）をマウスに気管内投与（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｌｙ  ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ，Ｉ．Ｔ．）して線維化を誘発した。線維化を誘発した後、１４日目、２１日目に、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）をマウスに投与し、２８日目に安楽死させた。
【０１６５】
ブレオマイシンをＣ５７ＢＬ／６マウスに気管内投与した後の７日目、１４日目、２１日目又は２８日目に、それぞれその体重を測量し、その後、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ（コントロール群）又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体を投与し、その結果を図２６Ｂに示した。
【０１６６】
マウスを安楽死させた後、ＰＢＳ（即ち、健康コントロール群）又は２ｍｇ／ｋｇのブレオマイシン（即ちＢＬＭ）を気管内投与した後の７日目、１４日目、２１日目又は２８日目にマウスの肺組織を肉眼で観察した。左肺葉に灌流した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定して、パラフィンに包埋した。組織切片をＨＥで染色した後、カバーガラスを載せて密封し、２０倍の拡大倍率で画像を観察し、その結果を図２６Ｃに示し、図中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【０１６７】
マウスを安楽死させた後、ブレオマイシンで線維化を誘発してから１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体を投与した後の２８日目にマウスの肺組織を肉眼で観察した。左肺葉に灌流した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定して、パラフィンに包埋した。組織切片をＨＥで染色した後、カバーガラスを載せて密封し、２０倍の拡大倍率で画像を観察し、その結果を図２６Ｄに示し、図中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【０１６８】
図２６Ｂ〜図２６Ｄを参照すると、それぞれ本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの体重変化を示す曲線図（図２６Ｂ）、肺の外観及び組織切片を示す画像（図２６Ｃ及び図２６Ｄ）である。
【０１６９】
図２６Ｂ〜図２６Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、肺線維化を誘発したマウス体内に肺線維化による体重の減少及び肺線維化の程度を逆転できる。 
【０１７０】
８．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＩＰＦマウスモデルのブレオマイシン誘発肺線維化への影響の評価（ＩＩ）
この実施例は、図２７Ａの実験フローの模式図に従って行った。まず、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ品種の雄マウス（楽斯科バイオテクノロジー社から購入）を採取した。ＰＢＳ又は２ｍｇ／ｋｇブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、ＢＬＭ、製品コードａｐ３０２、Ｚｎｚｏ）をマウスに気管内投与（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｌｙ  ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ、Ｉ．Ｔ．）して線維化を誘発した。線維化を誘発した後、２１日目に、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）をマウスに投与し、２８日目に安楽死させた。
【０１７１】
ブレオマイシンをＣ５７ＢＬ／６マウスに気管内投与した後の７日目、１４日目、２１日目又は２８日目に、それぞれその体重を測量し、その後、２１日目に、腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ（コントロール群）又は１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体を投与し、その結果を図２７Ｂに示した。
【０１７２】
マウスを安楽死させた後、ＰＢＳ（即ち、健康コントロール群）又は２ｍｇ／ｋｇのブレオマイシン（即ち、ＢＬＭ）を気管内投与した後の７日目、１４日目、２１日目又は２８日目にマウスの肺組織を肉眼で観察した。左肺葉に灌流した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定して、パラフィンに包埋した。組織切片をＨＥで染色した後、カバーガラスを載せて密封し、２０倍の拡大倍率で画像を観察し、その結果を図２７Ｃに示し、図中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【０１７３】
マウスを安楽死させた後、ブレオマイシンで線維化を誘発してから１０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ１ｋ又は１０  ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ３抗体を投与した２８日目のマウスの肺組織を肉眼で観察した。左肺葉に灌流した後、パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定して、パラフィンに包埋した。組織切片をＨＥで染色した後、カバーガラスを載せて密封し、２０倍の拡大倍率で画像を観察し、その結果を図２７Ｄに示し、図中のスケールバーは、１００μｍを表す。
【０１７４】
図２７Ｂ〜図２７Ｄを参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体によるＢＬＭ誘発肺線維化マウスの体重変化を示す曲線図（図２７Ｂ）、肺の外観及び組織切片を示す画像（図２７Ｃ及び図２７Ｄ）である。
【０１７５】
図２７Ｂ〜図２７Ｄの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、肺線維化を誘発したマウス体内に肺線維化による体重の減少及び肺線維化の程度を逆転できる。 
【０１７６】
９．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＮＩＨ−３Ｔ３胚胎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現への影響の評価
この実施例は、マウス胚胎線維芽細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３、登録番号：ＢＣＲＣ  ６０００８、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１６５８ＴＭ）を使用して、下記の試験により実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体の線維化への影響を評価した。
【０１７７】
まず、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ（１２８００−０８２，Ｇｉｂｃｏ）（１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む）に培養した。
【０１７８】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で処理した後、２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３で６時間処理した。次に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。その後、特定の抗体を用いてウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ、製品コードＴ６１９９、Ｓｉｇｍａ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ、製品コード１４６９５−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）及びα−平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ、製品コードＧＴＸ  １００９０４、ＧｅｎｅＴｅｘ）の発現を検出し、且つ、α−チューブリンの発現量をローディング・コントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）群とし、その結果を図２８Ａに示した。
【０１７９】
また、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２４ウェル細胞培養プレートに接種し、０．４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ（製品コード１０１０１、偉喬バイオメディカル社）、ＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）又は２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３の有無で２４時間処理した。その後、−２０℃でＮＩＨ−３Ｔ３細胞をメタノールで一晩固定した。翌日、室温でピクロシリウスレッド溶液（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、製品コードａｂ２４６８３２、Ａｂｃａｍ）で２０分間染色した後、酢酸で２回湿潤洗浄した。光学顕微鏡の拡大倍率が２００倍の視野で、細胞結節の数を判定した。その後、これらの細胞を０．１Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、市販のＥＬＩＳＡリーダーを用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測量し、その結果を図２８Ｂ及び図２８Ｃに示した。
【０１８０】
図２８Ａ〜図２８Ｃを参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体による胚胎線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果（図２８Ａ）、細胞結節を示す細胞染色画像（図２８Ｂ）及びその柱状図（図２８Ｃ）である。符号「＊＊＊」は、コントロール群に対して統計的有意性（ｐ＜０．００１）があることを表す。
【０１８１】
図２８Ａ〜図２８Ｃの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の線維化関連タンパク質の発現及び細胞結節の数を遅延できる。 
【０１８２】
１０．実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体のＦ２８肝線維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現への影響の評価
まず、ヒト癌関連線維芽細胞／肝細胞〔ｃａｎｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ／Ｆ２８（ＣＡＦ／Ｆ２８）ｃｅｌｌｓ〕をＤＭＥＭ（１２８００−０８２，Ｇｉｂｃｏ）（１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む）に培養した。
【０１８３】
ＣＡＦ／Ｆ２８細胞を放射線量８グレイ（Ｇｒａｙ，Ｇｙ）に暴露させた後、０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で６時間処理した。次に、改良型放射性免疫沈降アッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，ＲＩＰＡ）緩衝液〔ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、１ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍｇ／ｍｌ）を含む〕で細胞を溶解した。その後、特定の抗体を用いてウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ、製品コードＴ６１９９、Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、製品コード１５６１３−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ、製品コード１４６９５−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）及びα−平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ、製品コードＧＴＸ  １００９０４、ＧｅｎｅＴｅｘ）の発現を検出し、且つ、α−チューブリンの発現量をローディング・コントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）群として、その結果を図２９Ａに示した。
【０１８４】
また、ＣＡＦ／Ｆ２８細胞を０．４μｇ／ｍＬのＰＴＸ３抗体（臻威バイオテクノロジー社）で処理した後、２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３で６時間処理した。次に、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。その後、特定の抗体を用いてウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことにより、α−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ、製品コードＴ６１９９、Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、製品コード１５６１３−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ、製品コード１４６９５−１−ＡＰ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）及びα−平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ、製品コードＧＴＸ  １００９０４、ＧｅｎｅＴｅｘ）の発現を検出し、且つ、α−チューブリンの発現量をローディング・コントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）群とし、その結果を図２９Ｂに示した。
【０１８５】
図２９Ａ〜図２９Ｂを参照すると、本発明の一実施例に係るＰＴＸ３モノクローナル抗体の異なる処理をされた肝繊維芽細胞の線維化関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析結果である。
【０１８６】
図２９Ａ〜図２９Ｂの結果から分かるように、実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、コントロール群の抗体（ＩｇＧ１ｋ）に比べて、ＣＡＦ／Ｆ２８肝線維芽細胞の放射線照射やＰＴＸ３による線維化関連タンパク質の発現を遅延できる。
【０１８７】
上記のマウス実験は、成功大学の実験動物の管理と使用に関するガイドライン（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って行い、且つ、関連動物の使用プロトコルは、実験動物管理及び使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ）によって審査及び承認された。
【０１８８】
なお、本発明の実施例１のＰＴＸ３モノクローナル抗体は、ＰＴＸ３組換えタンパク質に対して良好な親和力及び感度を有し、生体サンプル中のＰＴＸ３含有量をインビトロで検出するためにＰＴＸ３の検出セット及び方法に適用できる。適用した生体サンプル、ＰＴＸ３を検出するための方法、セット、コンポーネント／機器などは、前述の通りであり、言うまでもない。次に、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びその使用は、親和力及び感度の高いＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を有効成分とし、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を効果的に抑制又は遅延することにより、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延し、様々な疾患を治療するための広域スペクトル薬とすることができる。
【０１８９】
つまり、本発明は、特定の配列のＰＴＸ３モノクローナル抗体、特定の分析モード又は特定の評価方式を例として、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びその使用を説明した。しかし、本発明は、これに限定されるものではなく、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びその使用は、本発明の構想及び範囲を逸脱しない限り、他の分析モード又は他の評価方式により行うこともできることは当業者にとって明らかである。
【０１９０】
以上の実施例から分かるように、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びその使用は、特定のＰＴＸ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を有効成分として、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合を特異的に抑制又は遅延し、ＰＴＸ３の検出セット及び方法に適用でき、且つ、ＰＴＸ３とＰＴＸ３受容体との結合に関連する疾患又は症状を抑制又は遅延するという利点を有する。
【０１９１】
本発明は、以上のようにいくつかの実施例を開示しているが、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者であれば、本発明の構想及び範囲を逸脱しない限り、様々な変更及び修飾を行うことができるので、本発明の保護範囲は、添付される請求の範囲によって限定される。
【図１】
2022500503.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
2022500503.tif 000049
【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
2022500503.tif 000063
【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
2022500503.tif 000067
【図２７Ａ】
2022500503.tif 000068
【図２７Ｂ】
2022500503.tif 000069
【図２７Ｃ】
2022500503.tif 000070
【図２７Ｄ】
2022500503.tif 000071
【図２８Ａ】
2022500503.tif 000072
【図２８Ｂ】
2022500503.tif 000073
【図２８Ｃ】
2022500503.tif 000074
【図２９Ａ】
2022500503.tif 000075
【図２９Ｂ】
2022500503.tif 000076
【配列表】
2022500503000001.app
【国際調査報告】
2022500503.tif 000077
2022500503.tif 000078
2022500503.tif 000079
2022500503.tif 000080