(57)【要約】本明細書に開示される導入遺伝子構築物は、（ｉ）前記第１のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の活性が、外因性誘導剤の存在下で生殖細胞の死を引き起こす、および（ｉｉ）前記構築物を標的とする第２のヌクレオチド配列を含む。 鳥類の生殖細胞に対して、同じものを使用する方法、およびそのような方法によって提供されるトランスジェニック鳥類。
2022502064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むトランスジーン構築物：（ｉ）第１のヌクレオチド配列であって、前記第１のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の活性が、外因性誘導剤の存在下で生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）の死を引き起こす、第１のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）前記構築物を鳥類生殖細胞へと標的化する第２のヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記第１のヌクレオチド配列が、アポトーシス誘導ドメインを含み、かつ、前記外因性誘導剤が、前記アポトーシスドメインを活性化して生殖細胞のアポトーシスを引き起こすことが可能な二量体化剤である、請求項１に記載のトランスジーン構築物。
【請求項３】
前記第１のヌクレオチド配列が、アポトーシス誘導酵素をコードする、請求項１または請求項２に記載のトランスジーン構築物。
【請求項４】
前記外因性誘導剤が、ＡＰ２０１８７リガンドＦＫ１０１２、ＡＰ１５０１、またはＡＰ１９０３からなる群から選択される、請求項３に記載のトランスジーン構築物。
【請求項５】
前記外因性誘導剤が、二量体化安定薬である、請求項２または請求項３に記載のトランスジーン構築物。
【請求項６】
前記第１のヌクレオチド配列が、非細胞毒性プロドラッグを前記生殖細胞を殺傷する細胞毒性剤へと変換することが可能な酵素をコードし、任意で、前記外因性誘導剤が、前記生殖細胞を殺傷する細胞毒性剤へと前記酵素によって変換されるプロドラッグである、請求項１に記載のトランスジーン構築物。
【請求項７】
前記アポトーシス誘導酵素が、カスパーゼであり、任意で、前記カスパーゼが、哺乳動物カスパーゼ９、ｉカスパーゼ９、またはニワトリ化カスパーゼａｖｉカスパーゼ９から選択される、請求項３に記載のトランスジーン構築物。
【請求項８】
前記第２のヌクレオチド配列が、ＤＡＺＬ、ＤＤＸ４、ＤＭＲＴ１、ＭＩＲ３８３、ＴＤＲＤ１５、ＴＤＲＤ５、ＦＫＢ６、ＧＡＳＺ、ＤＭＲＴＢ１、ＴＤＲＤ９、ＧＴＳＦ１、ＭＯＶ１０Ｌ１、ＳＴＫ３１、ＲＮＦ１７、ＦＤＦＴ１、ＧＮＧ１０、ＤＤＸ４３、ＫＣＮＨ７、ＳＯＸ２１、ＴＵＢＡ１Ｂ、およびＰＮＬＤＣ１からなる鳥類生殖細胞において特異的に発現される遺伝子の群から選択される遺伝子座、またはＭＳＴＲＧ．９８４６（２：４０７８９４８０−４０８４８１９０）、ＭＳＴＲＧ．１０４５７（２：７１８８０７８５−７１９９１４８５）、ＭＳＴＲＧ．１７０１７（３：８５４５３００９−８５４６２０２９）からなるグループから選択されたＲＮＡコード遺伝子を標的化する、前出請求項のいずれか一項に記載のトランスジェニック構築物。
【請求項９】
前記第２のヌクレオチド配列が、ＤＡＺＬを標的化する、前出請求項のいずれか一項に記載のトランスジェニック構築物。
【請求項１０】
前記第１のヌクレオチド配列が、カスパーゼをコードし、かつ、前記第２のヌクレオチド配列が、遺伝的ＤＡＺＬ座を標的化する、請求項１に記載のトランスジーン構築物。
【請求項１１】
前記第２のヌクレオチド配列が、鳥類生殖細胞においてのみ発現される遺伝子座の中への相同組換えによって、前記構築物を生殖細胞へと標的化する、前出請求項のいずれか一項に記載のトランスジェニック構築物。
【請求項１２】
前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介して生殖細胞を標的とし、前記構築物が、生殖細胞特異的配列を標的化するガイドＲＮＡを含む、前出請求項のいずれか一項に記載のトランスジェニック構築物。
【請求項１３】
鳥類の生殖質を改変する方法であって、前記方法が、トランスジーン構築物を前記鳥類の受精卵または培養生殖細胞の中へ投与すること、および前記トランスジーン構築物を含むか、または前記トランスジーン構築物を含む生殖細胞で注射された前記卵をインキュベートすることを含み、前記トランスジーン構築物が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトランスジーン構築物であり、かつ、前記トランスジーン構築物が、前記胚の生殖細胞の中へ組み込まれている、鳥類の生殖質を改変する方法。
【請求項１４】
前記方法が、代理宿主鳥類を産生する方法であり、前記方法が、前記外因性誘導剤を投与し、それにより前記生殖細胞の死を引き起こすステップを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、生殖細胞をドナー鳥類から前記受精卵の中へ移植し、孵化するまでインキュベートして、移植された生殖細胞の遺伝的同一性を有する子孫鳥類を生成するステップをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記子孫鳥類からの雄および雌子孫を交配して、移植された生殖細胞の遺伝的同一性を有する生殖細胞を持つ１つ以上のさらなる世代の子孫鳥類を産生することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のトランスジーン構築物を含むか、または請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法によって産生されるトランスジェニック鳥類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子改変されたおよび／または野生型の鳥、例えばニワトリを生殖型細胞（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）から生成する方法、およびそのような方法を使用して生成された鳥に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
単離された生殖型細胞からの鳥の品種の生産は、現在、大部分が非効率的および困難なプロセスである。遺伝子改変鳥の生成に関連する特定の問題は、遺伝子改変を含む生殖型細胞の鳥の子孫への安定した伝達およびそれに続くそのような鳥の生成である。特に、従来の方法を使用する場合、生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）伝達は、遺伝子改変されていてもされていなくてもよいドナー生殖細胞と内因性生殖細胞との間の機能的配偶子の形成における競合の結果として、特に非効率的である。
【０００３】
二倍体生殖細胞は１羽の鳥から宿主鳥に移植することができるが、その後に形成される配偶子から産生される子孫の割合は変動し、子孫のいくつかまたはすべてが内因性（宿主鳥）生殖細胞に由来する配偶子から形成される（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔ  Ｄｅｖ  ２２（８）：  １２３７−１２４６；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ９０（１）：  １５）。内因性（宿主）生殖細胞は、照射またはブスルファン等の化学療法試薬を使用して破壊することができるが、これらの毒性試薬は、内因性生殖細胞のみならず動物体も殺傷し得る。Ｔａｇａｍｉは、化学処理を使用して、不妊の代理宿主ニワトリを生成した（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ８３（１）：１３０−７）。本発明者らおよびＮａｋａｍｕｒａは、ガンマ線照射を使用して内因性生殖細胞を殺傷した（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ５（１１）：  ｅ１５５１８；  Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，  （２０１２）  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ５８（４）：  ４３２−４３７）。しかしながら、ドナー生殖細胞から産生された子孫の数は処理後に増加したが、すべての子孫がドナー生殖細胞に由来するわけではなく、処理により多くの宿主ニワトリが殺傷された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロドラッグの存在下で生殖細胞を殺傷する遺伝子産物（ニトロレダクターゼ、Ｎｔｒ）を生殖細胞で発現する不妊の哺乳動物および魚のトランスジェニック系統が、作製されてきた。ｉＣ９（誘導カスパーゼ９）遺伝子は、ヒトおよびマウス中で幹細胞を殺傷し、トランスジェニックマウスの内皮細胞を殺傷するために使用されてきた。そのような技術は、哺乳動物および鳥に適用されたときに生殖細胞改変技術を使用して得られた異なる結果を考えると、鳥に直接移転可能であるとは期待されないであろう。例えば、本発明者らの以前の仕事は、遺伝子編集技術を介したＤＤＸ４遺伝子中の遺伝子変異を介して、生殖細胞を持たない雌ニワトリを産生した。（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１７）。本発明者らは、変異体Ｄｄｘ４遺伝子を持つ雄哺乳動物が不妊である一方で、変異体Ｄｄｘ４を有する雌哺乳動物が正常な稔性を有するので、雌ニワトリが不妊であることを期待しなかった。生殖細胞改変技術は、したがって、哺乳動物の中と鳥の中では非常に異なる効果を有し得る。不妊性はまた、内因性生殖型細胞が発生の最中にいつ死ぬかにも依存する。鳥では、ＤＤＸ４不妊雌は孵化までの生殖型細胞を含み、遺伝子改変された宿主胚の中へ注入されたドナー生殖細胞と競合し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、先行技術の問題の多くに対処する。本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子工学を使用して生殖細胞で組換えタンパク質を発現させることにより、例えば特定のプロドラッグまたはインデューサーへの曝露時に、宿主ニワトリの他の細胞を殺傷することなく、要求に応じて宿主生殖細胞を選択的に殺傷し、ドナー生殖細胞の非常に効率的な統合が達成され得ることを示した。異なる鳥種からの遺伝資源（生殖細胞）をこの宿主鳥に転移することができ、子孫の遺伝学は転移された材料から得られる（図１）。
【０００６】
不妊哺乳動物および魚のトランスジェニック系統がその発現遺伝子産物を作製したが、鳥および哺乳動物種におけるタンパク質の活性および機能の違い、ならびに鳥および哺乳動物種間の遺伝子機能および活性の差は、哺乳動物で利用される技術が期待されないことを意味する。魚は鳥に移すことができるので、細胞改変技術は鳥と哺乳動物では非常に異なる効果をもたらし得る。不妊性は、内因性生殖細胞が発生中にいつ死滅するかにも依存する（遺伝子またはタンパク質の活性の時間的性質）。鳥では多くの異なる遺伝子座をアッセイして、適切な発生段階でトランスジーンを発現するかどうか、つまり、胚発生中に生殖細胞を１００％除去することができるかどうかを判断する必要がある。
【０００７】
よって、本発明の第１の態様は、前記鳥の生殖細胞にトランスジーンを含むトランスジェニック鳥を提供し、ここで、前記トランスジーンによってコードされるタンパク質の活性は、外因性誘導剤を介して誘導可能であり、誘導されると、前記タンパク質の活性が誘導され、前記生殖細胞の死を引き起こす。
【０００８】
本発明の第２の態様は、以下を含むトランスジーン構築物を提供する：（ｉ）第１のヌクレオチド配列であって、前記第１のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の活性が、外因性誘導剤の存在下で生殖細胞（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）の死を引き起こす、第１のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）前記構築物を鳥類生殖細胞へと標的化する第２のヌクレオチド配列。
【０００９】
第３の態様は、鳥類の生殖質を改変する方法を提供し、前記方法は、トランスジーン構築物を前記鳥類の受精卵に投与し、前記卵子をインキュベートすることを含み、前記トランスジーン構築物は、本発明の第２の態様のトランスジーン構築物であり、トランスジーン構築物は、前記胚の生殖細胞に組み込まれる。
【００１０】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様のトランスジーン構築物を含むか、または本発明の第３の態様による方法によって産生されるトランスジェニック鳥類を提供する。
【００１１】
本発明において、鳥類は、任意の適切な鳥であり得る。例えば、鳥類は、ガリフォルム（ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）、アセリフォルム（ａｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）、スズメ目（ｐａｓｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）、ツル目（ｇｒｕｉｆｏｒｍｅｓ）、ストルチオニフォルム（Ｓｔｒｕｔｈｉｏｎｉｆｏｒｍｅｓ）、レイフォルム（ｒｈｅｉｆｏｒｍｅｓ）、カスアリフォルム（ｃａｓｕａｒｉｆｏｒｍｅｓ）、アピエリギフォルム（ａｐｙｅｒｙｇｉｆｏｒｍｅｓ）、オチディフォルム（ｏｔｉｄｉｆｏｒｍｅｓ）、コロンビフォルム（ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）、スフェニシフォルム（ｓｐｈｅｎｉｓｃｉｆｏｒｍｅｓ）、カタルチフォルム（ｃａｔｈａｒｔｉｆｏｒｍｅｓ）、タカ目（ａｃｃｉｐｉｔｒｉｆｏｒｍｅｓ）、チドリ目（ｓｔｒｉｇｉｆｏｒｍｅｓ）、オウム目（ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）、ハヤブサ目（ｃｈａｒａｄｒｉｉｆｏｒｍｅｓ）またはハヤブサ目（ｆａｌｃｏｎｉｆｏｒｍｅｓ）のオーダーであり得る。適切には、鳥類は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、ライチョウ、ホロホロチョウ、ハト、ダチョウ、エミュー、鳴き鳥、オウム、フィンチ、スズメ、ペンギン、またはハヤブサである。一実施形態では、鳥類は、ニワトリである。
【００１２】
本発明において、本発明のトランスジーン構築物および本発明で使用するためのトランスジーン構築物は、生殖細胞を標的化する。一実施形態では、生殖細胞は原始生殖細胞である。別の実施形態では、生殖細胞は成体生殖細胞である。好ましくは、前記構築物は、始原生殖細胞または胚の性腺または成鳥の精巣および卵巣の生殖細胞において優先的に発現される鳥類ゲノムの遺伝子座を標的化する。好ましくは、遺伝子座は、始原生殖細胞または胚または成鳥の性腺の生殖細胞でのみ発現される。一実施形態では、トランスジーン構築物は、鳥において、生殖細胞でのみ発現される以下の遺伝子座の１つを標的化する：ＤＡＺＬ、ＤＤＸ４、ＤＭＲＴ１、ＭＩＲ３８３、ＴＤＲＤ１５、ＴＤＲＤ５、ＦＫＢ６、ＧＡＳＺ、ＤＭＲＴＢ１、ＴＤＲＤ９、ＧＴＳＦ１、ＭＯＶ１０Ｌ１、ＳＴＫ３１、ＲＮＦ１７、ＦＤＦＴ１、ＧＮＧ１０、ＤＤＸ４３、ＫＣＮＨ７、ＳＯＸ２１  ＴＵＢＡ１Ｂ、またはＰＮＬＤＣ１。別の実施形態において、前記構築物は、以下のＲＮＡをコードする遺伝子のうちの１つ以上を標的化する：ＭＳＴＲＧ．９８４６  （２：４０７８９４８０−４０８４８１９０）、ＭＳＴＲＧ．１０４５７（２：７１８８０７８５−７１９９１４８５）、ＭＳＴＲＧ．１７０１７  （３：  ８５４５３００９−８５４６２０２９）。適切には、トランスジーン構築物は、以下の遺伝子座ＤＡＺＬ、ＲＮＦ１７、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＳＴＫ３１、ＦＤＦＴ１、ｇｇａ−ｍｉｒ−６６１１のいずれかを標的化する。有利なことに、トランスジーンは、ニワトリＰＧＣで最も高度に発現される遺伝子座を標的としている。有利なことに、トランスジーンは、特定の鳥類のＰＧＣ、例えば、ガチョウ、アヒル等で最も高度に発現される遺伝子座を標的化する。
【００１３】
鳥類間の始原生殖細胞のＲＮＡトランスクリプトームの比較は、ほとんどの鳥種の生殖細胞で高レベルで発現される遺伝子を決定した。この分析により、ＤＡＺＬはほとんどの鳥種で最も高く、ＧＴＳＦ１はガチョウで２番目に高く、ＴＤＲＤ９はアヒルの生殖細胞で２番目に高いことが見いだされた。したがって、異なるゲノム位置は、特定の鳥種でよりよく機能し得る。図２１は、それぞれチキン、アヒル、ガチョウの発現レベルを示す。
【００１４】
適切には、トランスジーンは、鳥類の成長および生殖周期の正しい時間に発現する遺伝子座を標的とし、鳥類および鳥類の生殖系の発達を可能にするが、ドナーおよび宿主生殖細胞の競合を最小限に抑える。例えば、実施形態において、本発明者らは、提供される発現の時間的性質のために、ＤＤＸ４不妊雌は、ドナー生殖細胞と競合することができる孵化までの生殖細胞を含むと決定した。生殖細胞は孵化後にのみ死滅した。理解されるように、外因性薬剤が適用されるまで発現を可能にする能力、外因性薬剤の提供を通じて発現を調節する能力、および発現の時間的性質を考慮する能力は、宿主中の生殖遺伝子の単純なノックアウトよりも有利なシステムを提供し得る。
【００１５】
適切には、細胞死除去遺伝子およびそれが標的とされる遺伝子座は、必要に応じて、胚発生中に生殖細胞を除去するために選択され得る。
【００１６】
細胞死除去トランスジーンは、胚発生中に生殖細胞の大部分を除去するのに十分に活性でなければならない。ＤＤＸ４は、ニワトリの遺伝子座としてｄａｚｌの２番目の選択肢として選択され得る。理解されるように、増加したアポトーシス活性を有する細胞切除トランスジーンを提供することは、ニトロレダクターゼを使用して示された切除の欠陥を克服することができた。たとえば、ｉＣａｓｐａｓｅ９の強化された活性により、ＤＤＸ４遺伝子座の使用が可能になる。当業者によって理解されるように、スクリーニングアッセイを使用して、切除または潜在的な切除を提供するタンパク質（カスパーゼ９またはニトロレダクターゼまたは任意の他の細胞死誘導遺伝子）のアミノ酸変化を同定することができ、そのようなものを作製するために使用されるスクリーニング機能的に有用なレベルで／効率を高めて生殖細胞の切除を提供するのに十分に活性またはより活性なタンパク質。その後、そのようなタンパク質は、リストされた生殖細胞特異的遺伝子座のいずれかに導入され得た。
【００１７】
実施形態では、カスパーゼ９遺伝子（哺乳動物アミノ酸バージョンまたはニワトリアミノ酸バージョン（ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９）は、宿主細胞の切除を与えるのに特に有利であることが見出された。実施例に記載されているように、ニワトリ細胞のＤＤＸ４遺伝子座に導入されたときに細胞培養で提供されたとき、ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９はすべての生殖細胞を切除しないと決定された。
【００１８】
適切には、哺乳動物のアミノ酸カスパーゼ９トランスジーンは、ＤＡＺＬ遺伝子座を標的化する場合に生殖細胞を切除するために提供され得る。適切には、切除は、実質的に純粋なドナー子孫、例えば、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９９％超、１００％を提供する。適切には、ｉＣａｓｐａｓｅ９はニワトリの不妊切除に利用沿い得る。ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子は、ニワトリに完全な不妊切除を提供することが決定された（図２３）。
【００１９】
特定の実施形態において、トランスジーンは、鳥類のＤＡＺＬ遺伝子座、特に鳥類のＤＡＺＬ遺伝子座のｃ末端を標的化するｃＤＮＡであり得る。本発明者らは、ＤＡＺＬが始原生殖細胞において高レベルで発現され、したがって細胞の選択的切除を可能にするだけでなく、切除を提供するのに十分な毒性タンパク質の発現も提供することを決定した。さらに、本発明者らは、遺伝子座によって提供される発現レベルに加えて、発現のタイミング（発現の時間的性質）が重要であると決定した。  ＤＡＺＬは、鳥類の胚の始原生殖細胞で初期に発現する。したがって、ＤＡＺＬの一時的な発現は、毒性タンパク質またはアポトーシス誘導タンパク質の発現に使用するのにも有利である。適切には、ＤＡＺＬの制御下にあるｉＣａｓｐａｓｅ９が特に有利である。例えば、本発明者らは、ｉＣａｓｐａｓｅ９トランスジーンがニワトリのＤＡＺＬ遺伝子座でうまく機能することを決定した。
【００２０】
遺伝子座の破壊が十分である可能性があるノックアウトの使用とは対照的に、毒性タンパク質またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、カスパーゼ）の発現を検討する場合、構築物を提供する発現レベルおよび発現のタイミングが重要であると考えられる。トランスジーンによって生成される切除の程度は、トランスジーンの遺伝的位置によって変化し得、例えば、遺伝子の５’末端に挿入されるか、遺伝子の３’末端に挿入されるか、または発現が駆動される独立したトランスジーンとして鳥の生殖細胞でのみ発現する遺伝子の調節領域によって。
【００２１】
一実施形態では、本発明のトランスジーン構築物および本発明で使用するためのトランスジーン構築物は、組換えタンパク質が内因性遺伝子と等しいレベルで発現されるように、ｃＤＮＡおよび２ＡまたはＩＲＥＳ配列を含む。例えば、組換えタンパク質が内因性遺伝子と等しいレベルで発現されるように、２Ａペプチド配列をｃＤＮＡに連結することができる。
【００２２】
一実施形態では、鳥において、生殖細胞または生殖細胞でのみ発現される遺伝子座からのヌクレオチド配列（ＤＡＺＬおよびＤＤＸ４を含むそのような遺伝子座の例は上に示される）、ここで、前記ヌクレオチド配列は、調節領域および最初のコーディングメチオニンまでの最初のエクソンは、ｃＤＮＡにリンクされている。ＤＮＡのこの領域は、組換えタンパク質を生殖細胞、例えばトランスポゾンで特異的に発現する任意の適切な方法で鳥に導入し得る。
【００２３】
本発明のおよび本発明で使用するためのＤＡＺＬおよびＤＤＸ４修復テンプレートの例を図１５、１６、１７および１８に示す。そのような修復テンプレートは、本発明のさらに独立した態様を構成する。
【００２４】
本発明の方法において、トランスジーン構築物を生殖細胞に標的化するために、任意の適切な手段を使用することができる。適切には、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／ｃｆｐベースのシステム等のＣＲＩＳＰＲベースのシステムを使用して、トランスジーンを生殖細胞に標的化することができる。このようなシステムでは、ガイドＲＮＡが構築物を生殖細胞に指向し得る。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の第２の態様のトランスジェニック構築物と、生殖細胞において特異的に転写される遺伝子座に構築物を標的化するためのＣａｓ９等の部位特異的ヌクレアーゼとを含むキットが提供される。
【００２６】
トランスジーン構築物を生殖細胞に標的化するためのＣＲＩＳＰＲベースのシステムの代替の実施形態において、トランスポゾンベースのシステムを使用して、トランスジーン構築物を生殖細胞に標的化することができる。そのようなシステムにおいて、標的化は、トランスポゾン内に、（ｉ）前記第１のヌクレオチド配列と共に生殖細胞において優先的に発現される、好ましくは排他的に発現される遺伝子からの調節領域を組み込むことによって達成され得る。例えば、そのようなトランスポゾンは、ＤＤＸ４またはＤＡＺＬからの調節領域、カスパーゼ９遺伝子および二量体化ドメイン（適切にはＤＡＺＬおよびイカスパーゼ９）を含み得る。最初のヌクレオチド配列は、生殖細胞でのみ発現すると予想されます。したがって、外因性誘導剤の適用時に、生殖細胞のみが殺されると予想される。
【００２７】
本発明の第２の態様のトランスジーン構築物は、鳥類の生殖質を改変するために使用され得る。トランスジーン構築物を生殖細胞に標的化し、誘導剤を投与することにより、トランスジーンは、内因性生殖細胞を選択的に殺傷することができるように活性化される。適切には、生殖細胞のトランスジーンの活性化は、生殖細胞数を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％まで減少させる。通常の値から１００％に。適切には、このプロセスは、内因性の生殖細胞を欠く鳥を提供する。
【００２８】
適切には、誘導されたときのトランスジーンは、インビトロで培養されたときに生殖細胞を死滅させるのに十分なレベルの外因性誘導剤の存在下で発現され得る。
【００２９】
内因性生殖細胞の殺傷後または殺傷中、例えば、アポトーシス誘導ドメインからコードされたタンパク質の活性化、またはプロドラッグのトランスジーンからコードされた酵素による細胞毒性代謝物への変換、生殖細胞を欠く鳥類（宿主鳥）は、細胞（移植細胞）、例えば生殖細胞を提供され得る。同じまたは異なる鳥類の別の鳥類からの細胞。宿主鳥は移植された細胞の遺伝学で子孫を産生する。適切には、このプロセスは、生殖細胞をドナー鳥から代理鳥に移植するステップを含み得る。
【００３０】
適切には、トランスジーンからコードされたタンパク質の活性の誘導は、ドナー細胞の移植の前に停止され得る。
【００３１】
適切には、ドナー鳥から移植された細胞は、凍結細胞に由来し得る。
【００３２】
理解されるように、ドナー鳥から代理宿主に移植された生殖細胞は、トランスジーンの効果のために代理宿主に存在した内因性生殖細胞と競合する可能性が高くなるであろう。
【００３３】
適切には、移植された細胞は、遺伝子編集された生殖細胞であり得る。適切には、遺伝子編集された生殖細胞は、宿主鳥類のものと同じまたは異なる鳥類種に由来し得る。
【００３４】
適切には、このプロセスは、移植された細胞のゲノムを鳥類に提供するステップを含み得る。適切には、代理宿主鳥類を使用して、その鳥類種または別の鳥類種からの遺伝子編集生殖細胞から、複数の、例えば群れの遺伝子編集鳥類を生産することができる。
【００３５】
本発明の一態様では、代理宿主鳥類を作製する方法が提供され、前記方法は、トランスジーン構築物を鳥類の受精卵に挿入し、前記卵を孵化するまでインキュベートすることを含み、前記トランスジーン構築物は、前記胚の生殖細胞に組み込まれ、どのトランスジーン構築物から発現されたタンパク質が、外因性誘導剤の存在下で前記生殖細胞の死を引き起こす。本方法は、前記トランスジーン構築物を、前記胚の生殖細胞だけでなく、前記胚から生じる鳥からその後に産生されるすべての子孫の生殖細胞にも組み込むことを可能にする。
【００３６】
適切には、本方法は、外因性誘導剤で産生された代理宿主を処理して、前記内因性生殖細胞の死を引き起こすことをさらに含み得る。適切には、本方法は、外因性生殖細胞を前記代理宿主に移植することをさらに含む。
【００３７】
適切には、本方法は、前記代理宿主鳥の１つまたは複数からの雄および雌の子孫を交配して、移植された生殖細胞の遺伝的特徴を有する生殖細胞を有する子孫鳥を産生することをさらに含む。移植された生殖細胞からの子孫の検出は、標準的なゲノムシーケンシング技術によって特定することができる。
【００３８】
代理宿主鳥は、細胞、特に他の鳥類からの生殖細胞の移植に使用することができる。生殖細胞は、始原生殖細胞、胚性生殖細胞、ゴノサイトであり得る。生殖細胞は、成人の精巣または卵巣の移植を介して移植し得る。代理宿主鳥は、移植された細胞の遺伝学で子孫を産生する。
【００３９】
代理宿主鳥は、生殖細胞の形で保存された凍結遺伝物質から鳥種を復活させるために使用し得る。復活した鳥の種は、凍結した生殖細胞のゲノムを有するであろう。
【００４０】
次に、本発明の実施形態を、例としてのみ、添付の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、不妊宿主への生殖細胞移植の図を示す。
【図２】図２は、ＮＤＸ４遺伝子座へのＮＴＲおよびｉカスパーゼ９（ｉＣ９）の標的化を示す概略図を示す。ＤＤＸ４遺伝子座へ標的化されたＮＴＲ修復テンプレートとＤＤＸ４遺伝子座へ標的化されたｉｃ９修復テンプレートを示す。
【図３】図３は、ＤＡＺＬ遺伝子座へのＮＴＲおよびｉカスパーゼ９（ｉＣ９）の標的化を示す概略図を示す。ＤＡＺＬ遺伝子座へ標的化されたＮＴＲ修復テンプレートおよびＤＡＺＬ遺伝子座へ標的化されたｉｃ９修復テンプレートを示す。
【図４】図４は、ＤＡＺＬ遺伝子座を標的化するＰＧＣが、ＤＤＸ４遺伝子座を標的化する細胞の約４倍の量のＧＦＰを発現することを示す。Ｄａｚｌ遺伝子座を標的化するＧＦＰを含むＰＧＣが、Ｄｄｘ４遺伝子座を標的化するＧＦＰを含むＰＧＣよりも３．８倍高いＧＦＰ蛍光を発現することを示す。Ａは、ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー分析を示す。Ｂは、標的化ＰＧＣの顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、５００個のＰＧＣ（コントロール、ＣＡＧ−ＮＴＲまたはＤａｚｌ−ＮＴＲ）を、ニトロレダクターゼプロドラッグＣＢ１９５４の存在下または非存在下で培養したことを示す（プロドラッグの各濃度でｎ＝２）。１０日後、各ウェルの総細胞数をカウントした。３つの独立した実験からの各データポイントのＮ＝６。
【図６】図６は、５００個のＰＧＣ（ｄａｚｌ−ＧＦＰ、ｄａｚｌ−ヒト−カスパーゼ、またはｄａｚｌ−ニワトリ−カスパーゼ）を、二量体化分子Ｂ／Ｂの存在下または非存在下で培養したことを示す。１０日後、各ウェルの総細胞数をカウントした。３つの独立した実験からの各データポイントのＮ＝６。
【図７】図７は、Ｂ／Ｂ処理は、注入されたＤＡＺＬ−ｉＣａｓｐ９ターゲットＰＧＣを除去することを示す。ステージＨＨ１６の胚に、ＣＲＩＳＰＲ試薬をトランスフェクトしてｄａｚｌ遺伝子座に誘導性カスパーゼ遺伝子とＧＦＰを挿入する３５００  ＰＧＣと、トランスポゾンをトランスフェクトしてＴｄＴｏｍａｔｏ発現用のカセットをゲノムにランダムに挿入する３５００ＰＧＣを注入した。注入後、胚に５０μｌの１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを、２５ｎＭの二量体薬剤Ｂ／Ｂの有無にかかわらず投与した。発達の８日目に、性腺を解剖し、蛍光下で観察した。画像は、各治療の３つの独立した注射を表す。
【図８】図８は、７つのｉカスパーゼ９およびａｖｉカスパーゼ９をターゲットにしたＧ１の子孫を示す。ＤＡＺＬ  ｉカスパーゼ９、Ｄａｚｌ  ａｖｉカスパーゼ９（ニワトリ）を、雌の野生型ニワトリと交配させたＤＤＸ４ヘテロ接合体の雄からの受精卵に注入した。３０００個のＰＧＣをウィンドウ処理されたステージ１６ＨＨ胚に注入し、卵を密封して孵化するまでインキュベートした。これらの初代のニワトリの繁殖は、標的トランスジーンを含む７つのトランスジェニックＧ１子孫を生成した。ここに示されている陽性の子孫は、番号４２、４、１８である。Ａは、カスパーゼ９特異的プライマーを使用したＰＣＲを示す；ＭＷ、分子量マーカー、Ａ、ａｖｉカスパーゼ９を含むターゲットＰＧＣ、Ｂ、ｉカスパーゼ９を含むターゲットＰＧＣ。Ｂは、ＧＦＰに特異的なプライマーを用いたＰＣＲを示す。
【図９】図９は、６日目と１０日目のｉＣａｓｐａｓ９およびａｖｉカスパーゼ９Ｇ２胚におけるＧＦＰ発現を示す。ｉカスパーゼ９およびａｖｉカスパーゼ９遺伝子に対してＰＣＲ陽性であるＧ２胚を、ＧＦＰ蛍光について画像化した。
【図１０】図１０は、ＧＦＰの発現が、１０日目のｉＣａｓｐａｓ９およびａｖｉカスパーゼ９Ｇ２胚で生殖細胞に特異的であることを示す。左パネル；Ｂ／Ｂを注入したｉカスパーゼ９およびａｖｉカスパーゼ９胚のＧＦＰ蛍光。右のパネル：ＤＤＸ４タンパク質の免疫蛍光（赤）。
【図１１】図１１は、Ｂ／Ｂで処理されたｉカスパーゼ９およびａｖｉカスパーゼ９Ｇ２胚が、生殖細胞を有しないことを示す。Ｂ／Ｂをステージ１６のニワトリ胚の背側大動脈に注入した（２．５日目）。胚をインキュベートし、１０日目にＧＦＰ蛍光とＤＤＸ４発現を試験した。左パネル；Ｂ／Ｂを注入したｉカスパーゼ９およびａｖｉカスパーゼ９胚のＧＦＰ蛍光。右パネル：ＤＤＸ４タンパク質の免疫蛍光（赤）。
【図１２】図１２は、ａｖｉカスパーゼ９トランスジェニック胚のＢ／Ｂ薬物治療が、宿主の生殖細胞を除去し、移植されたドナー細胞が宿主の性腺に存在することを可能にすることを示す。ＤＡＺＬ遺伝子座を標的化するａｖｉカスパーゼ９トランスジーンを含むステージＨＨ１６胚に、トランスポゾンをトランスフェクトした２００個のドナーＰＧＣを注入して、ＴｄＴｏｍａｔｏ発現用のカセットをゲノムにランダムに挿入した。注入された細胞は、０．５ｍＭ（最終濃度）のＢ／Ｂ二量体化薬を含む１μｌの溶液中にあった。注入後、卵に１５μＭ（最終濃度）のＢ／Ｂ二量体薬剤を含む５０μｌの１ｘ  Ｐｅｎ  ／  Ｓｔｒｅｐを投与し、８日間インキュベートした。発生の１０日目に、性腺を解剖し、蛍光下で観察した。  ａｖｉカスパーゼ９二量体化薬物で処理された胚のすべての生殖細胞はＴｄＴｏｍａｔｏドナー細胞由来であり、内因性（宿主）生殖細胞は検出されなかった。
【図１３】図１３は、ヒトｉカスパーゼ９トランスジーン用に合成されたＤＮＡを示す。
【図１４】図１４は、ニワトリｉカスパーゼ９トランスジーン用に合成されたＤＮＡを示す。
【図１５】図１５は、ニワトリ最適化ニトロレダクターゼ遺伝子を含むＤＤＸ修復テンプレートのＤＮＡ配列を示す。
【図１６】図１６は、ニワトリａｖｉカスパーゼ９を含むＤＡＺＬ修復テンプレートのＤＮＡ配列を示す。
【図１７】図１７は、ヒトｉカスパーゼ９を含むＤＡＺＬ修復テンプレートのＤＮＡ配列を示す。
【図１８】図１８は、ヒトｉカスパーゼ９を含むＤＤＸ４修復テンプレートのＤＮＡ配列を示す。
【図１９】図１９は、ニワトリ最適化ニトロレダクターゼ遺伝子のＤＮＡを示す。この表の一番上の行は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｔｒおよびコドン最適化Ｎｔｒ配列に存在する各アミノ酸の１文字アミノ酸コードを示す。２行目はＥ．ｃｏｌｉ  Ｎｔｒ配列の塩基配列を示し、表の３行目はニワトリのＮｔｒ遺伝子を最適化するときに実行された変更を強調している。強調表示された列は、３ＡＡＳＮｔｒ構築物を生成するために実行された３つの変異がどこにあるかを示す：コドン４１のスレオニンがグルタミン（ＣＡＧ）に変異している。コドン位置７１のアスパラギンがセリン（ＡＧＣ）に変異し、コドン位置１２４のフェニルアラニンはスレオニン（ＡＣＣ）に変異している。
【図２０】図２０は、他のニワトリ胚組織および多能性細胞と比較したニワトリ始原生殖細胞のＲＮＡトランスクリプトームの表を例示し、生殖細胞でのみ、これらの胚段階で高レベルで発現する遺伝子を特定している。ＥＳＣは、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＧＫＸは、産卵期のニワトリ胚からの細胞、非多能性は、６６の成体ニワトリ非多能性組織および細胞株をまとめたものである。
【図２１】図２１は、鳥類ＰＧＣにおける生殖細胞特異的遺伝子の発現を示す。グラフは、ニワトリ、ガチョウ、アヒルのＰＧＣにおける宝石細胞特異的遺伝子の相対的な遺伝子発現を示す。正規化された式の値の平均が、ＤＥＳｅｑ２パッケージから取得される。これらの式の値は、すべてのサンプルの読み取りの総数に正規化されている。  ＴＤＲＤ９およびＴＵＢＡ１Ｂの発現は、アヒルＰＧＣでより高い発現が記録され、ＧＡＳＺとＲＮＦ１７はガチョウＰＧＣで高度に発現され、残りの遺伝子はニワトリＰＧＣでより高く発現される。
【図２２】図２２は、５００個のＰＧＣ（ｄａｚｌ−ＧＦＰ、ｄａｚｌ−ｉカスパーゼ、ｄａｚｌ−ａｖｉカスパーゼ、ｄｄｘ４−ｉカスパーゼ９）を、二量体化分子Ｂ  ／  Ｂの存在下または非存在下で培養したことを示す。１０日後、各ウェルの総細胞数をカウントした。各データポイントについてＮ＝２。
【図２３】図２３は、孵化して繁殖させて純粋な子孫を産むｉカスパーゼ９代理宿主エンビロに注入された黒い皮を剥いたウコッケイニワトリドナーＰＧＣを使用したカスパーゼ９宿主切除の使用を例示する。Ａ）Ｄａｚｌ−ｉカスパーゼ９サロゲートからの子孫（胚）はＧＦＰトランスジーンを含まなかったため、ほとんどの宿主生殖細胞は子孫を生成しなかった（内因性生殖細胞からの子孫の５０％は、切除されなかった場合はＧＦＰ  ＋である必要がある）Ｄａｚｌ−ａｖｉカスパーゼ９サロゲートからの２つの子孫は、ＧＦＰトランスジーンを含み、子孫の一部が内因性生殖細胞に由来することを示す。（Ａ〜Ｃ）子孫（胚およびヒヨコ）の皮膚は黒色で、ドナー生殖細胞に由来することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（発明の詳細な説明）
ＦＫ結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ＦＫＢＰ１２は、受容体のイムノフィリンファミリーに属し、そのアミノ酸配列は、哺乳動物とニワトリとの間で高度に保存されている（Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ：  Ｍｏｌ．  Ｉｎｔｅｇ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３６（２）：３９１−３９９）。これは、免疫抑制薬ＦＫ５０６のサイトゾル受容体であり、タンパク質二量体化を介して細胞シグナリングの選択的制御の標的となる。
【００４３】
二量体ＦＫＢＰ１２バリアントであるＦＫ１０１２は、細胞内タンパク質の二量体化またはオリゴマー化を介して細胞シグナリングの制御を媒介するために、Ｓｐｅｎｃｅｒおよび同僚によって合成されてきた（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−１０２４）。後に、ＦＫＢＰ１２中の特異性結合ポケットは、嵩高いフェニルアラニンをより小さなバリン残基で置換すること（ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ）によって創生された。再設計されたＦＫ１０１２リガンドは、ＡＰ１９０３および密接に関連するＡＰ２０１８７が挙げられ、ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖに対する親和性および選択性が高く、内因性ＦＫＢＰとの相互作用が最小限であるとして、考案された（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５（１８）：１０４３７−１０４４２；  Ｎoｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９（７）：４４４−５１）。
【００４４】
カスパーゼタンパク質、２、３、４、７、８、９  または１０は、プログラム細胞死を誘導することが知られている天然発生タンパク質である。カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）は、二量体化すると活性化し、細胞アポトーシスを引き起こする。Ｃａｓｐ９は、その二量体化ドメイン（ＣＡＲＤ）をトランケートして除去することができる。ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ二量体化ドメインをＣａｓｐ９に融合することにより、リガンド導入時に細胞アブレーションを選択的に誘導することができる。このシステムは、誘導可能カスパーゼ９（ｉＣａｓ９（ｉＣ９））システムと呼ばれる。ＡＰ２０１８７はＢ／Ｂホモ二量体薬として販売されている。これは、細胞アブレーションを誘導するシステムを提供するために利用されてきた。融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を排除するために使用されてきている（Ｃａｒｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２（７）：６２７−３９）。また、マウス、Ｘｅｎｏｐｕｓ、およびゼブラフィッシュ中でｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を除去するためにも使用されている（Ｍａｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（１２）：１２３４−１２３９；  Ｐａｊｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１（７）：７９７−８０３；  Ｈａｍｍ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５０（２）：８８５−９２；  Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０１６）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４３（２２）：４２７９−４２８７；  Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  （２０１７）  Ｎａｔｕｒｅ  １１；  ５４５（７６５３）：１８７−１９２）。
【実施例】
【００４５】
（例１）
（誘導可能カスパーゼ９（ｉＣ９）トランスジーンによるニワトリゲノムの改変を介したニワトリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）の選択的アブレーション。）
（ｉＣａｓｐ９−トランスフェクト化ＰＧＣを産生するために使用されるＤＮＡ構築物の調製）
誘導可能Ｃａｓｐ９をＰＧＣ中で特異的に発現させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、ＰＧＣ中で特異的に発現する以下の遺伝子座中の配列挿入を媒介した：
・ＤＤＸ４：ＲＮＡヘリカーゼであるニワトリｖａｓａホモログは、ＤＤＸ４遺伝子座によって生殖細胞中で特異的に発現する。ＤＤＸ４開始コドン（ＡＴＧ）での外因性遺伝子の標的化挿入を行って、対応するタンパク質の生殖細胞特異的発現を達成した。
・ＤＡＺＬ：ＤＡＺＬ遺伝子座は、ＲＮＡ結合タンパク質ＤＡＺＬの発現を駆動する。  ＤＡＺＬ発現もまた、生殖細胞特異的であり、ＤＤＸ４発現より少なくとも１０倍高いと測定されてきている（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）。外因性ｃＤＮＡのＤＡＺＬ遺伝子座の終止コドン（ＴＧＡ）での標的化挿入を使用して、対応するタンパク質の生殖細胞特異的発現を達成した。
標的化戦略の概略図を、図２および図３に示す。
【００４６】
（誘導可能カスパーゼ９）
Ｓｐｅｎｃｅｒラボによって寄託されたプラスミドｐＭＳＣＶ−Ｆ−ｄｅｌ  Ｃａｓｐ９．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１５５６７／）（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）  Ｂｌｏｏｄ  １０５（１１）：４２４７−５４）は、トランケートされたヒトＣａｓｐ９に融合されたＦＫＢＰ１２Ｆ３６ＶのｃＤＮＡ配列（その二量体化ドメインが除去されて基礎活性が低下するようにトランケートされた）と、Ｃａｓｐ９のＣ末端に融合されたＨＡタグを含有する。このＤＮＡ配列を本明細書でｉＣａｓｐ９と呼ぶ。
【００４７】
ｉＣａｓｐ９配列を、後続するＰ２Ａ配列と、隣接するＢａｍＨ１制限部位と、コドン交換によって除去された配列内ＢａｍＨ１部位とで化学的に合成した。ＢａｍＨ１部位隣接ｉＣａｓｐ９配列（ｈｕｍａｎ＿ｉＣａｓｐ９）をｐＭＡベクターで合成した。
【００４８】
また、ヒトｉＣａｓｐ９のＣａｓｐ９ドメイン（ＮＰ＿００１２２０．２のアミノ酸１３５〜４１７）をニワトリＣａｓｐ９タンパク質配列の相同アミノ酸領域（ＸＰ＿４２４５８０．６のアミノ酸１６９〜４５０）と交換してｃｈｉｃｋｅｎ＿ｉＣａｓｐ９配列を産生した。ニワトリｉＣａｓｐ９配列を、前出するＰ２Ａ配列と、隣接するＢａｍＨ１制限部位と、コドン交換によって除去された配列内ＢａｍＨ１部位とで化学的に合成した。ＢａｍＨ１部位隣接ｉＣａｓｐ９配列（ｃｈｉｃｋｅｎ＿ｉＣａｓｐ９）をｐＭＡベクターで合成した。このＤＮＡ配列を本明細書でａｖｉＣａｓｐ９と呼ぶ。
【００４９】
（ニトロレダクターゼトランスジーン）
ニトロレダクターゼ遺伝子は特定の細菌種に存在し、特定の化合物のニトロ基を細胞毒性代謝物に還元する。Ｅ．ｃｏｌｉ由来ニトロレダクターゼ遺伝子を、ニワトリ発現のためにコドン最適化した。プロドラッグ基質ＣＢ１９５４の存在下でより高い比活性を生成することが示された３つのアミノ酸置換（図１９を参照）を行った。
【００５０】
（ＤＤＸ４−ＧＦＰ修復テンプレート）
ＤＤＸ４修復テンプレートを最初に、複数のオーバーラップする二本鎖ＤＮＡフラグメントのライゲーションを可能にするＧｉｂｓｏｎクローニングを使用して構築した。このプラスミドのフラグメントをＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプライマー）によってまたは制限消化（ＮＥＢ酵素）によって調製した。２Ａリボソームスキップ配列が、融合タンパク質の翻訳を避けるために遺伝子間に含んでいた。これらの２Ａペプチドを、アミノ末端にて、配列が追加の２Ａ結合遺伝子の挿入を可能にするためにＢａｍＨ１制限切断部位を含むＧＳＧリンカーと共に設計した。
【００５１】
メインフラグメントを、アンピシリン耐性およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）カセットを含むｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクター由来の配列を使用して調製した。  ３ｋｂｐ  ｐＧＥＭ−Ｔ配列と、ＤＤＸ４（左標的化アーム）の開始コドンまでの３ｋｂｐの相同性とを、以前に構築されたＤＤＸ４標的化グベクター（ＨＯＭＯＬ  ｐＧＥＭ−Ｔ左アームおよび右アームｄｄｘ４＋ＧＦＰｐｕｒｏｐｏｌｙＡ）から、Ｘｃｍ１およびＮｃｏ１を使用して６ｋｂｐフラグメントを切り出し、ゲル精製を使用してクリーンアップして、取得した。
【００５２】
ＤＤＸ４開始コドンからの１．５ｋｂｐの相同性からなる右標的化アームを、ニワトリＰＧＣ（Ｙ２細胞、ＮＡＲＦから得られた卵に由来）から調製されたゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲによって合成した。この反応のためのフォワードプライマー（ＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＴＡＣＣＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣ、７５  ｂｐ）配列番号７は、修復テンプレートがＣａｓ９タンパク質によって切断されないように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化部位でのＴ２Ａリボソームスキップおよびコドンスワップのための部分配列を含有していた。この反応のためのリバースプライマー（ＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴＧＧ、４７  ｂｐ）配列番号８は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター配列への２０  ｂｐのオーバーハングと、オーバーハング後にＸｃｍ１切断部位を再挿入したヌクレオチドとを含有していた。
【００５３】
ＤＤＸ４修復テンプレートのための最終フラグメント（８００ｂｐ）は、以前に構築したＤＤＸ４標的化ベクターであるＨＯＭＯＬ  ｐＧＥＭ−Ｔ左腕および右腕ｄｄｘ４＋ＧＦＰｐｕｒｏｐｏｌｙＡからＰＣＲによって再度合成されたｅＧＦＰの配列を含有していた。この反応のためのフォワードプライマー（ＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ、４１ｂｐ）は、左標的化アームへの２０  ｂｐのオーバーハングと、オーバーハング後にＮｃｏ１切断部位を再挿入したヌクレオチドとを含有していた。この反応のためのリバースプライマー（ＧＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ、７６ｂｐ）配列番号１０は、残りのＴ２Ａ配列プラス右腕フラグメントの部分Ｔ２Ａ配列の２０ｂｐのオーバーハングを含有していた。
【００５４】
フラグメントをライゲーションするために、１００  ｎｇのメインフラグメントと等モル量の他のフラグメントの混合物を、Ｇｉｂｓｏｎ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｅｎｚｙｍｅ（ＮＥＢ）と５０℃で１時間インキュベートした。ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテントセルを２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した。形質転換細胞から調製したミニプレップを制限消化により検証し、マキシプレップを調製した。
【００５５】
ＤＡＺＬ修復テンプレートを、最初にＧｉｂｓｏｎクローニングを使用して、ＰＣＲ（ＩＤＴプライマー）によって、または制限消化（ＮＥＢ酵素）によって調製したプラスミドのためのフラグメントと一緒に構築した。ＩＤＴは、この作業に必要であった＞１００ｂｐ長のプライマーを合成することができる。修復テンプレートをまた、その産物がプロドラッグの導入時に細胞を選択的に切除するために使用することができるニワトリ最適化ＮＴＲ遺伝子を含むように構築した。
【００５６】
標的化テンプレートの主なフラグメントは、上記のＤＤＸ４−ＧＦＰ修復テンプレートからＸｃｍ１およびＮｏｔ１を使用してＤＮＡを切り出した３ｋｂｐ  ｐＧＥＭ−Ｔ配列であった。
【００５７】
ニワトリＰＧＣ（Ｙ２細胞）から調製したゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲにより、ＤＡＺＬ終止コドンまで（ただしこれを含まない）１．５ｋｂｐの相同性からなる左標的化アームを合成した。この反応のフォワードプライマー
（ＴＣＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＴ、６７  ｂｐ）配列番号１１は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター配列への２５  ｂｐのオーバーハング、並びにオーバーハングの後にＮｏｔ１切断部位を再挿入したヌクレオチドを含んでいた。この反応のリバースプライマー（ＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴ、４８ｂｐ）配列番号１２は、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列への２５ｂｐのオーバーハングを含んでいた。
【００５８】
第３のフラグメント（６００ｂｐ）は、Ｐ２Ａのための配列、続いてＮＴＲを含み、ＮＴＲは、ＤＤＸ４−ＧＦＰ−ＮＴＲ修復テンプレートからＢａｍＨ１を使用して切断され、次いで、ＤＤＸ４−ＧＦＰ修復テンプレートを使用して構築された（ＢａｍＨ１で線形化され、Ｐ２Ａ−ＮＴＲシーケンスを含んでいたインサートでライゲーションされた）。
【００５９】
第４のフラグメント（８００ｂｐ）は、ＤＤＸ４−ＧＦＰ修復テンプレートからＰＣＲによって合成された、ｅＧＦＰのための配列を含んでいた。この反応のためのフォワードプライマー
（ＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ、１０７ｂｐ）配列番号１３は、ＮＴＲ遺伝子への２５ｂｐのオーバーハングおよびＴ２Ａリボソームスキップのための配列を含んでいた。この反応のためのリバースプライマー（ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ、２２ｂｐ）配列番号１４は、オーバーハングを含んでいなかった。
【００６０】
ＤＡＺＬ−ＧＦＰ標的化テンプレートのための第５かつ最終のフラグメントは、ニワトリＰＧＣ（Ｙ２細胞）から調製したゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲによって合成された、ＤＡＺＬ終止コドンからの（およびそれを含む）１．５ｋｂｐの相同性からなる右標的化アームであった。この反応のためのフォワードプライマー（ＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＡＴ、９４ｂｐ）配列番号１５は、ｅＧＦＰ遺伝子の中への２５ｂｐのオーバーハング、および対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドのＰＡＭ部位の変異を含んでいた。この反応のためのリバースプライマー（ＣＴＣＴＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＧＴ、５５ｂｐ）配列番号１６は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター配列への２５ｂｐのオーバーハング、並びにオーバーハングの後にＸｃｍ１切断部位を再挿入したヌクレオチドを含んでいた。
【００６１】
フラグメントをライゲーションするために、１００ｎｇのメインフラグメントと等モル量の他のフラグメントの混合物を、Ｇｉｂｓｏｎ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ酵素（ＮＥＢ）と一緒に５０℃で２時間インキュベートした。ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテントセルを２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した。形質転換細胞から調製したミニプレップを制限消化により照合し、マキシプレップを調製した。
【００６２】
ＢａｍＨ１を使用して、ＤＡＺＬ−ＧＦＰ修復テンプレートからニワトリに最適化されたＮＴＲ配列を切り出した。ヒトおよびニワトリの２Ａ−ｉＣａｓｐ９配列（ｉＣａｓｐ９およびａｖｉＣａｓｐ９）は、それぞれのｐＭＡベクターからＢａｍＨ１を使用して切り取り、Ｔ７ライゲーションによって開化ＤＡＺＬ−ＧＦＰ修復テンプレート中へ挿入した。ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄコンピテントセルを２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した。形質転換細胞から調製したミニプレップを制限消化により照合し、マキシプレップをＤＡＺＬ−ａｖｉＣａｓｐ９−ＧＦＰ（ニワトリ）修復テンプレートおよびＤＡＺＬ−ｉＣａｓｐ９−ＧＦＰ（ヒト）修復テンプレート用に調製した。
【００６３】
ＤＡＺＬ遺伝子座停止コドンから１５０ｂｐ以内のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列は、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで入手可能なＣＲＩＳＰＲデザインツールを使用してクエリした。上位５つのスコアリングガイド（ガイド配列の最初の２つの塩基がＧＧに置き換えられている）のフォワードおよびリバースオリゴ（ＩＤＴ）を、Ｂｂｓ１粘着末端で合成した。オリゴをＰＣＲでアニーリングし、消化／ライゲーションＰＣＲミックスを使用して、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／６２９８８／）にライゲーションした。コンピテントセルを２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換し、形質転換したコロニーからマキシプレップを調製した。ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９マキシプレッププラスミド（＃１〜５）は、ガイド挿入切断部位（Ｂｐｉ１）から４００ｂｐ下流のＰＸ４５９プラスミドに相補的なフォワードオリゴおよびリバースプライマーを使用したＰＣＲにより照合した。
【００６４】
すべてのＤＮＡ配列を図１３〜１９に示す。
【００６５】
（トランスフェクションプロセス）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、約１５０，０００個のＰＧＣに１μｇのＤＡＺＬ−ｉＣａｓｐ９−ＧＦＰ修復テンプレート（ニワトリまたはヒト）および１μｇのＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−４または−５をトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液中で５時間後、ＰＧＣをペレット化し、完全（ＦＡＯＴ）培地に再懸濁した。２４時間後、ＰＧＣに新鮮な培地を与え、ピューロマイシンの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液２μｌを各ウェルに添加した（最終濃度０．０４μｇ／ｍｌ）。ＰＧＣをピューロマイシンとともに４８時間インキュベートし、１回洗浄し、新鮮な培地に再懸濁した。細胞を１〜２週間培養して、２００，０００〜４００，０００細胞の集団に到達させた後、ＦＡＣＳを使用して選別し、正常に修飾された（ＧＦＰ陽性）細胞を収集した。ＧＦＰ陽性細胞は、ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−４またはＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−５のいずれかでトランスフェクトされたＰＧＣから得られたが、ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−５でトランスフェクトされたＰＧＣのみをニワトリの作製に使用した。
【００６６】
ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−４は、次のガイド配列を含む：ＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡ配列番号１７。このガイドのＰＡＭ部位は、ゲノムのリバース鎖上で、ＤＡＺＬ遺伝子座終止コドンの４４ｂｐ上流である。
【００６７】
ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−５は、ガイド配列として以下を含む：ＧＧＣＴＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＧＴ配列番号１８。このガイドのＰＡＭ部位は、ゲノムのリバース鎖上で、ＤＡＺＬ遺伝子座終止コドンの４６ｂｐ下流である。ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−５のガイドのＰＡＭサイト配列は、最終的なＤＡＺＬ−ｉＣａｓｐ９−ＧＦＰ修復テンプレートの相同性アーム中に変異導入したが、ＤＡＺＬ−ＰＸ４５９−４のガイドのＰＡＭサイト配列は変異導入していなかったことに注意すべきである。
【００６８】
ＰＧＣを３週間培養して、ＧＦＰ発現構築物で安定して標的化された細胞を選択した。ｄｄｘ４＿ＧＦＰおよびｄａｚｌ＿ＧＦＰをターゲットとする雌ＰＧＣを、ＧＦＰ蛍光用にゲートされたＦＡＣＳ−ＡＲＩＡを使用したフローサイトメトリーによって精製した。精製した細胞は、ＧＦＰ蛍光のレベルを定量化するためにフローサイトメトリーによって分析された培養物の数で拡大した。ＤＡＺＬ遺伝子座を標的としたＧＦＰを含む細胞は、ＤＤＸ４遺伝子座を標的としたＧＦＰを含む細胞より３．７５倍蛍光が高かった（図４）。
【００６９】
ＤＤＸ−Ｎｔｒ、ＤＤＸ−ｉｃａｓｐａｓｅ９、ＤＡＺＬ−Ｎｔｒ、ＤＡＺＬ−ｉｃａｓｐａｓｅ９（ヒト）、Ｄａｚｌ−ｉｃａｓｐａｓｅ９（ニワトリ）を標的とした雌のＰＧＣを同様の方法で精製した。
【００７０】
標的ニトロレダクターゼ遺伝子を含むＰＧＣを、プロドラッグＣＢ１９５４で処理した。ＰＧＣは、薬物にさらされたときに死滅した。ｄａｚｌ遺伝子座を標的化するＮＴＲを含む細胞は、対照細胞と比較して細胞数が減少した（図５）。
【００７１】
標的化されたｉカスパーゼ９遺伝子を含むＰＧＣを、Ｂ／Ｂ二量体化化合物で処理した。対照の非標的ＰＧＣは、薬物で治療した場合、ＰＧＣの数が減少していなかった。ｄａｚｌ遺伝子座を標的化するヒトおよびニワトリのカスパーゼ９遺伝子を含む細胞では、ＰＧＣ数が大幅に減少した（図６）。ｄｄｘ４遺伝子座を標的化するｉＣａｓｐａｓｅ９を含む細胞は、ＰＧＣ数がわずかに少なかった。これらの細胞を対照の赤色蛍光ＰＧＣと混合し、ニワトリ胚に注入した。ニワトリ胚をＢ／Ｂ二量体化合物で処理した。赤いＰＧＣおよびコントロールＧＦＰ  ＰＧＣのみが胚中に見られた。Ｄａｚｌ  ｉｃａｓｐａｓｅ９  ＰＧＣが殺傷された（図７）。
【００７２】
（Ｄａｚｌｉｃａｓｐａｓｅ９を標的としたニワトリの産生）
Ｄａｚｌ  ｉＣａｓｐａｓｅ９（ヒト）またはＤａｚｌ  ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９（ニワトリ）または両方を混合して、雌の野生型ニワトリと交配したＤＤＸ４ヘテロ接合体（Ｚ−Ｚ）雄の受精卵に注入した。３０００個のＰＧＣをウィンドウ処理されたステージ１６ＨＨ胚に注入し、卵を密封して孵化するまでインキュベートした。初代（Ｚ−Ｗ）の雌の孵化したニワトリの繁殖は、標的トランスジーンを含むトランスジェニック子孫を生み出した（図８）。
【００７３】
（Ｂ／Ｂ二量体化試薬を使用したＤａｚｌ−ｉＣａｓｐａｓｅ９およびＤａｚｌ−ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９を標的化したニワトリおよび生殖細胞の除去の分析）
Ｇ１  Ｄａｚｌ−ｉｃａｓｐａｓｅ９およびＤａｚｌ−ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９ニワトリを性的に成熟するまで飼育し、野生型鶏と交配させた。交配からの受精卵（Ｇ２胚）を培養し、性腺でのＧＦＰ発現を試験した。Ｄａｚｌ−ｉｃａｓｐａｓｅ９およびＤａｚｌ−ａｖｉｃａｓｐａｓｅ９の両方のＧ２胚の性腺の生殖細胞は、性腺中にＧＦＰ＋細胞を含んでいた（図９）。凍結切片および生殖細胞マーカーであるＤＤＸ４に対する抗体による免疫染色により、ＧＦＰ発現細胞が生殖細胞であることが示された（図１０）。Ｇ２胚を、生殖細胞の除去についてテストした。１．０μｌの０．１ｍＭ  Ｂ／Ｂ二量体化試薬（タカラバイオ社）を２．５日目（ステージ１６ハミルトン＆ハンバーガー（ＨＨ））のニワトリ胚の血流に注入した。胚を８日間インキュベートし、ＰＣＲスクリーニングしてｉＣａｓｐａｓｅ９胚を同定し、性腺でのＧＦＰ発現を試験した。薬物処理されたＧ２Ｄａｚｌ−ｉＣａｓｐａｓｅ９およびＤａｚｌ−ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９胚は、目に見えるＧＦＰ発現を有しない（図１１）。生殖細胞マーカーであるＤＤＸ４に対する抗体による凍結切片および免疫染色は、Ｄａｚｌ−ｉｃａｓｐａｓｅ９およびＤａｚｌ−ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９胚の性腺に識別可能なＤＤＸ４陽性またはＧＦＰ＋細胞がほとんど存在しないことを示す（図１１）。外因性（ドナー）ＰＧＣが不妊された宿主にコロニーを形成できることを示すために、Ｄａｚｌ−ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９Ｇ２胚にドナー赤色蛍光生殖細胞とＢ／Ｂ薬を注入した。胚を８日間培養し、蛍光細胞と生殖細胞を試験した。ａｖｉＣａｓｐａｓｅ９  Ｇ２胚は、性腺にドナー生殖細胞のみが存在し、内因性（宿主）生殖細胞は検出されなかった。（図１２）。
【００７４】
（トランスジェニックニワトリの生殖細胞の除去）
ｉＣａｓｐａｓｅ９トランスジーンを、ＰＧＣのＤＤＸ４またはＤＡＺＬ遺伝子座のいずれかを標的化させ、細胞を二量体化薬に曝露した。ＤＡＺＬ遺伝子座に挿入されたトランスジーンを含む細胞は、阻害／殺傷されたと判断された。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、胚段階での発現レベルが生殖細胞を切除するために重要であると考える。
【００７５】
この詳細を図２２に示す。
【００７６】
ＰＧＣのＤＡＺＬ遺伝子座を標的化するカスパーゼ９の発現を利用して、宿主生殖細胞の切除およびドナー鶏品種からの子孫の生産を、黒色皮膚を剥いたウコッケイニワトリ品種のニワトリドナーＰＧＣを使用して試験した。カスパーゼ宿主胚に注入されたドナーＰＧＣを試験し、その後、性的に成熟して繁殖させた。図２３に示すように、ウコッケイＰＧＣを注入し、Ｂ／Ｂ薬で処理した、Ｄａｚｌ−Ｃａｓｐａｓｅ９宿主の子孫は、ドナー生殖細胞に由来することを示す黒色皮膚を有することが見いだされた。
【００７７】
より詳細には、この実施形態では、黒色皮膚のウコッケイＰＧＣをＢ／Ｂ二量体化薬物と混合し、卵中にある間にＤａｚｌ−カスパーゼ宿主胚に注入した。卵を密封し、胚を孵化させ、性的に成熟したときに互いに交配させた。
【００７８】
内因性ＧＦＰ＋カスパーゼ９宿主ＰＧＣに由来する場合、子孫の５０％がＧＦＰ陽性であるはずである。Ｄａｚｌ−ａｖｉカスパーゼ９宿主の子孫のいくつかはＧＦＰ＋であり、Ｄａｚｌ−ｉカスパーゼ９の子孫はいずれもＧＦＰ＋ではなかった（表２３Ａに示されている）。
【００７９】
さらに、Ｄａｚｌ−カスパーゼ宿主からの胚の子孫は、ドナーのウコッケイＰＧＣの黒色皮膚表現型を示した（図２３Ｂに示されている）。そして、ドナーのウコッケイＰＧＣの黒色皮膚表現型を示すＤａｚｌ−カスパーゼ宿主から、子孫が孵化した（図２３Ｃに示されている）。
【００８０】
本発明は、特定の例を参照して特に示され、説明されてきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、その中で形態および詳細の種々の変更を行うことができることが当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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