(57)【要約】  肝臓オルガノイドを使用するバイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬ」または「肝臓補助装置」）が、本明細書に開示される。開示されるシステムは、それを必要とする個人、特に肝機能障害を有する個人に治療効果を提供するために使用することができる。システムは、インビボまたはエクスビボの構成要素を含んでもよく、開示されるシステムを使用して個人に肝機能が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓オルガノイドおよび肝臓オルガノイド支持体を含むバイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬ」または「肝臓補助装置」）であって、前記肝臓オルガノイドは、前記肝臓オルガノイド支持体に付着または含有される、バイオ人工肝臓システム。
【請求項２】
前記バイオ人工肝臓システムは、エクスビボで肝臓代謝機能を提供する、請求項１に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項３】
前記バイオ人工肝臓システムは、インビボで肝臓代謝機能を提供する、請求項１または２に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項４】
前記肝臓オルガノイドは、生体液から一方向に胆汁を取り込み、好ましくは、前記生体液は血液または血漿の一方または両方である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項５】
前記生体液は血液であり、前記バイオ人工肝臓システムはインビボで移植される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項６】
前記バイオ人工肝臓システムは、約１０％未満の肝臓スフェロイド、もしくは約５％未満の肝臓スフェロイド、もしくは約１％未満の肝臓スフェロイドを有するか、または肝臓スフェロイドを実質的に含まない肝臓オルガノイド集団を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項７】
前記肝臓オルガノイドは管腔を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項８】
前記肝臓オルガノイドは、前駆細胞、好ましくは胚性幹細胞および多能性幹細胞の一方または両方に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項９】
前記肝臓オルガノイドは、少なくとも３０日、または少なくとも４５日、または少なくとも５０日、または少なくとも６０日、または６０日を超えて胆汁クリアランス機能を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１０】
前記肝臓オルガノイドが一方向に胆汁酸を取り込むことができるまで、基底膜マトリックスで培養される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１１】
前記肝臓オルガノイド支持体は、前記肝臓オルガノイドを所望の構成に維持することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１２】
前記肝臓オルガノイド支持体は、肝臓オルガノイドを収容するように構成されたリザーバーチャンバーを備える、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１３】
前記肝臓オルガノイド支持体は、双方向の流体の流れを可能にするように膜に動作可能に接続される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１４】
前記肝臓オルガノイド支持体は、一方向の流体の流れを可能にするように膜に動作可能に接続される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１５】
前記バイオ人工肝臓サポートは、血液分離カートリッジ、チャコールカラム、樹脂カラム、および透析膜のうちの１つ以上を含むアルブミン透析システムと併せて使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１６】
前記肝臓オルガノイド支持体はチャンバーまたはリザーバーを備え、前記肝臓オルガノイドはその中で自由流動性であり、好ましくは、前記肝臓オルガノイドは、約５００ｍＬの体積中に約１０６〜１０１０、または約１０７〜１０９の濃度である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１７】
前記肝臓オルガノイド支持体は、懸濁液中に前記肝臓オルガノイドを含むチャンバーを備え、前記肝臓オルガノイド懸濁液を混合することができる機構をさらに備える、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１８】
前記肝臓オルガノイド支持体は、透過性媒体によって分離された２つの流体経路を備え、前記２つの流体経路間の連通は前記透過性媒体を横切り、透前記過性媒体は肝臓オルガノイドを含み、前記肝臓オルガノイドは前記透過性媒体と関連している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項１９】
前記透過性媒体は中空糸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項２０】
前記肝臓オルガノイド支持体は臨床グレードであり、前記肝臓オルガノイド支持体は非免疫原性である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項２１】
前記バイオ人工肝臓システムは、透析システムとさらに組み合わされて、それを必要とする個人に提供される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のバイオ人工肝臓システム。
【請求項２２】
肝不全を有する個人を治療する方法であって、前記個人を請求項１〜２１のいずれかに記載のバイオ人工肝臓システムで治療することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年９月２７日に出願された"Ｌｉｖｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ"と題された米国仮出願第６２／７３７，２６１号の優先権および利益を主張するものであり、その内容は、その全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
肝不全で集中治療室に入院するほとんどの患者は生存することができない。８０〜９０％もの高い死亡率が報告されている。これまでのところ、利用可能な唯一の治療法は肝移植である。しかしながら、移植用の肝臓が直ちに利用できない場合、または特定の状況において、患者が移植の対象とならない場合がある。
【０００３】
急性肝不全および慢性肝疾患（肝細胞癌および肝硬変等）等の肝疾患を治療するために、肝細胞移植、肝臓サポートシステム、および３Ｄ臓器プリンティングを含む様々なアプローチが提案されている。現在、肝細胞は、それを必要とする患者の肝機能障害を補助するために体外装置において使用される肝臓細胞の最も有望な供給源である。しかしながら、これまでに肝細胞の使用は不十分であることが証明されている：肝細胞は、肝機能を補助するために既存の装置と一緒に使用すると寿命が短く、それによってそのような細胞型の有用性が制限される。生物学に基づく細胞システムの欠如は、そのようなシステムのより広い臨床応用を遅らせ、肝臓サポートシステムを提供するための改善された方法の必要性を生み出した。
【０００４】
様々なタイプの肝臓サポートシステムが提案または説明されているが、生物学的構成要素を含む装置が現在不足している。本開示は、当該技術分野における前述の必要性の１つ以上に対応する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に開示されるのは、それを必要とする個人、特に肝機能障害を有する個人の肝機能障害に対して肝臓オルガノイドを使用し得るバイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬ」または「肝臓補助装置」）である。開示されるシステムは、それを必要とする個人、特に肝機能障害を有する個人に治療効果を提供するために使用することができる。システムは、インビボまたはエクスビボの構成要素を含んでもよく、肝臓オルガノイドを含む開示されるシステムにより、個人において損なわれた肝機能が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
当業者は、以下に記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、決して本発明の教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０００７】
【図１】オルガノイド増殖培地を用いたｉＰＳＣからのオルガノイド生成および改善された細胞増殖の例示的なプロトコル、ならびにｉＰＳＣから形成されたオルガノイドにおける様々な遺伝子の発現を示す。
【図２】オルガノイド増殖培地を用いた初代試料からのオルガノイド生成を示す。
【図３】一細胞からのオルガノイドの遺伝子発現解析を示す。
【図４】Ｍａｔｒｉｇｅｌ包埋法およびマイクロウェルメッシュ法を用いたｉＰＳＣからのオルガノイド形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【０００９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者などに知られている１つ以上の用量およびその均等物への言及を含む。
【００１０】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００１１】
「個人」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、治療、観察、および／または実験の対象である動物を指すために互換的に使用される。一般に、この用語はヒト患者を指すが、方法および組成物は、他の哺乳動物等の非ヒト対象に等しく適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、この用語はヒトを指す。さらなる実施形態において、この用語は小児を指す場合がある。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）という用語は、胚性および胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子および精子細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数分割によって生産される細胞も全能性である。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、体のほぼ全ての細胞型、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、着床前胚盤胞の内部細胞塊細胞の子孫であり得るか、または特定の遺伝子の発現を強制することによって、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞の誘導によって得られてもよい。多能性幹細胞は、任意の適切な供給源に由来し得る。多能性幹細胞の供給源の例は、ヒト、げっ歯類、ブタ、およびウシを含む哺乳動物の供給源を含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、一般にｉＰＳ細胞とも省略され、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、通常、非多能性幹細胞、例えば成体体細胞から人工的に得られた一種の多能性幹細胞を指す。いくつかの実施形態において、特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞等の非多能性細胞内へのトランスフェクションによって、ｉＰＳＣが得られる。トランスフェクションは、典型的には、レトロウイルス等のウイルスベクターを介して行われる。トランスフェクトされる遺伝子には、マスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることは示唆される。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、通常、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用される場合、ｉＰＳＣには、第１世代のｉＰＳＣ、マウスにおける第２世代のｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを用いて多能性幹細胞にヒト線維芽細胞を形質転換するためにレトロウイルス系が使用される。別の実施形態において、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換するためにレンチウイルス系が使用される。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ−３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを生成するために非ウイルスベースの技術が用いられる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚および肝臓細胞のＤＮＡ内に輸送し、胚性幹細胞と同一の細胞をもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自身の遺伝子を標的の宿主と組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの実施形態において、非常に低い効率ではあるが、いずれのウイルストランスフェクション系も全く使用せずに、プラスミドを介して再プログラミングを達成することができる。他の実施形態において、タンパク質の直接送達を用いてｉＰＳＣを生成し、そのようにしてウイルスまたは遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態において、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによって多能性誘導遺伝子の発現を増加させることもできる。いくつかの実施形態において、例示的なｉＰＳ細胞株は、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ４−３、ｉＰＳ−ＤＦ６−９、ｉＰＳ（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ）、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）、およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、一般にＥＳ細胞とも略され、多能性であり、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊から派生される細胞を指す。本開示の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞を包含するために広義で使用される場合がある。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、それを通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、１つ以上の専門化された細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（または全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））幹細胞、多能性幹細胞（誘導性または非誘導性）、複能性幹細胞、寡能性幹細胞、および単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞を、胚、乳児、小児、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。
【００１７】
人工肝臓サポートシステムは、腎臓透析システムの概念と同様に、機能障害のある肝臓または機能していない肝臓によって除去されない蓄積された毒素を濾過および吸着することによって、急性または慢性肝不全を治療することができる。肝臓サポートシステムは、アルブミン透析または血漿分離および濾過によって血液を精製するために使用することができ、水溶性物質だけでなく、ビリルビン、胆汁酸、芳香族アミノ酸の代謝物、中鎖脂肪酸および／またはサイトカイン等の親油性のアルブミン結合物質も除去するために使用することができる。人工肝臓は、肝臓毒素をある程度除去し得るが、尿素生成、タンパク質合成、糖新生、酵素的解毒、および免疫調節等の肝臓の代謝機能を実行する能力を欠いている。
【００１８】
現在利用可能な非生物学的肝臓サポートシステムは、解毒の役割を果たすように設計されているだけであり、肝臓の合成および代謝機能は提供しない。対照的に、バイオ人工システムは、一般に、これらの追加の役割を実行することができる生細胞を含む。これまで、線維芽細胞または肝スフェロイドがそのようなシステムに使用されてきたが（例えば、Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１５  Ａｕｇｕｓｔ；６３（２）：３８８−３９８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１５．０３．０２１、ブタモデルにおけるスフェロイドリザーバーバイオ人工肝臓を開示）、肝スフェロイドまたは初代肝細胞の機能は非常に一時的に持続する。肝スフェロイドまたは初代肝細胞の機能が非常に限定されているため（典型的には２４時間未満）、これらのシステムの有用性は限られている。不死化肝細胞株はより長く生存し得るが、胆汁酸クリアランスおよびアンモニウム代謝等の重要な肝機能を欠いているため、そのような必要がある患者の肝臓サポートには理想的ではない。
【００１９】
本明細書に記載のバイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬまたは「肝臓補助装置」）は、肝臓オルガノイド技術を利用し、当該技術分野における前述の必要性の１つ以上、特に、既存のバイオ人工システムにおける肝細胞および／またはスフェロイドの機能不全に対応するのに有用である。開示されるシステムおよび方法は、管腔（または「キャビテーション」）構造を有する肝臓オルガノイドを使用し、これはさらに、それを必要とする個人に重要な肝機能を提供することができる。本明細書に記載の肝臓オルガノイドを使用するシステムは、開示される肝臓オルガノイドが、線維芽細胞およびスフェロイドの２４時間の生存よりもはるかに長い６０日以上の持続性を有するという点で、スフェロイドまたは線維芽細胞を使用するシステムの欠陥にさらに対応する。これらの肝臓オルガノイドは、線維芽細胞および／またはスフェロイドには存在しない特徴である、肝臓に固有の胆汁クリアランス機能および代謝機能を提供することができる。
【００２０】
開示される肝臓サポートシステムは、非生物学的またはバイオ人工肝臓サポートシステムとして分類される体外装置を含んでもよく、それを必要とする個人の肝機能をサポートするために使用することができる。開示される肝臓サポートシステムは、それを必要とする患者における肝機能をサポートするかまたは実質的に置き換える使用を含み得る。例えば、開示される肝臓サポートシステムは、急性、慢性、および／または末期の慢性肝不全を有する個人の肝機能を補助するために使用され得る。システムはそのような個人に限定されないが、個人が肝機能障害を有しないが、急性または慢性の状態にかかわらず、肝機能の増強が望ましい状態のためにさらなるサポートを必要とする使用をさらに含んでもよい。
【００２１】
一態様において、バイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬ」または「肝臓補助装置」）が開示される。ＢＡＬは、肝臓オルガノイドおよび肝臓オルガノイド支持体を含んでもよく、肝臓オルガノイドは、前記肝臓オルガノイド支持体に付着または含有され得る。一態様において、バイオ人工肝臓システムは、エクスビボで肝臓代謝機能を提供することができ、具体的には、システムは少なくとも部分的または実質的に体外に位置する。一態様において、バイオ人工肝臓システムは、インビボで肝臓代謝機能を提供することができ、具体的には、システムは少なくとも部分的または実質的に体内に位置する、一態様において、システムで使用される肝臓オルガノイドは、肝臓オルガノイドが生体液から一方向に胆汁を取り込むことができることを特徴とし得る。生体液は、例えば、血液もしくは血漿、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様において、生体液は血液であり得、バイオ人工肝臓システムは、システムが移植された個人に肝機能を提供するためにインビボで移植され得る。
【００２２】
特定の状況では、スフェロイドがシステム内の肝臓オルガノイド集団に存在する場合があることを理解されたい。しかしながら、一態様において、肝臓オルガノイドと肝臓スフェロイドとの比は１：１を超え、その結果、スフェロイド／オルガノイド集団の大部分はオルガノイドを含む。例えば、バイオ人工肝臓システムは、約１０％未満の肝臓スフェロイド、もしくは約５％未満の肝臓スフェロイド、もしくは約１％未満の肝臓スフェロイドを有するか、または肝臓スフェロイドを実質的に含まない肝臓オルガノイド／肝臓スフェロイド集団を含み得る。
【００２３】
開示されるシステムにおいて有用な開示される肝臓オルガノイドは、前駆細胞、例えば、胚性幹細胞および／または多能性幹細胞に由来し得る。肝臓オルガノイドは、その機能によって特徴付けられ得る。特に、肝臓オルガノイドは、少なくとも３０日、または少なくとも４５日、または少なくとも５０日、または少なくとも６０日、または６０日を超えて持続する胆汁クリアランス機能を有し得る。
【００２４】
肝臓サポートシステム
肝臓オルガノイドが収容／付着／含有されるサポートシステムは、様々な異なる形態をとることができ、これらの特徴の変更は当業者の技能の範囲内である。例えば、一態様において、サポートシステムは、複数の肝臓オルガノイドを収容するように構成されたリザーバーチャンバーを備えてもよい。サポートシステムは、双方向または一方向の流体の流れを可能にするために、膜に動作可能に接続され得る。他の態様において、サポートシステムは、血液分離カートリッジ、チャコールカラム、樹脂カラム、および透析膜のうちの１つ以上を含むアルブミン透析システムと併せて使用することができる。サポートシステムは、チャンバーまたはリザーバーを備えてもよく、前記肝臓オルガノイドはその中で自由流動性であり、前記肝臓オルガノイドは、約５００ｍＬの体積中に約１０６〜１０１０、または約１０７〜１０９の濃度で存在し得る。一態様において、肝臓オルガノイドの濃度は、約５００ｍＬの体積中に、約１×１０６６〜約５×１０６６、または約３×１０６６であってもよい。サポートシステムは、懸濁液中に肝臓オルガノイドを含むチャンバーを備えてもよく、前記肝臓オルガノイド懸濁液を混合することができる機構をさらに備えてもよい。肝臓オルガノイドサポートシステムは、透過性媒体によって分離された２つの流体経路を備えてもよく、２つの流体経路間の連通は透過性媒体を横切り、透過性媒体は肝臓オルガノイドを含み、肝臓オルガノイドは前記透過性媒体と関連している。一態様において、透過性媒体は、中空糸を含み得る。一態様において、サポートシステムは、臨床グレードの材料（すなわち、生物学的材料と反応しない材料）を含んでもよく、全体的または部分的に非免疫原性材料を含み得る。
【００２５】
さらなる態様において、肝不全を有する個人を治療する方法が開示される。特定の態様において、方法は、本明細書に開示されるバイオ人工肝臓システムを用いて、（生物学的機能が損なわれているかどうかにかかわらず）それを必要とする個人を治療することを含み得る。治療は、医療の専門家によって決定された期間で行うことができるが、一般に、それを必要とする個人に好ましい治療反応を提供するのに十分な期間である。一態様において、サポートシステムは、透析システムと組み合わせて個人に提供され得る。
【００２６】
肝臓オルガノイド
開示される方法およびバイオ人工肝臓システムでの使用に適した肝臓オルガノイドが本明細書に記載される。一態様において、本開示に有用な肝臓オルガノイドは、肝臓組織によって発現されることが知られている特定の遺伝子の発現によって特徴付けられ得る。例えば、肝臓オルガノイドは、ＰＲＯＸ１、ＲＢＰ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＢＣＣ１１、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ５、ＡＬＢ、ＦＢＧ、ＭＲＰ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ６８、ＣＤ３４、ＣＤ３１から選択される１つ以上の遺伝子を発現し得ることを特徴とし得る。さらなる態様において、肝臓オルガノイドは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、およびチトクロームＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、ＨＮＦ４ａ、Ｅ−カドヘリン、ＤＡＰＩ、およびＥｐｃａｍ等の特定のタンパク質を発現し得る。そのような発現は、例えば、発生中の肝臓オルガノイドの４０日目〜５０日目に起こり得る。前述の遺伝子／タンパク質の発現レベルは、ヒト肝臓細胞、例えば、成人の肝臓細胞に観察されるものと類似している場合がある。一態様において、肝臓オルガノイドは、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｍＬの１ｘｅ６細胞／２４時間の総肝臓タンパク質発現を有することを特徴とし得る。
【００２７】
本開示に有用な肝臓オルガノイドはまた、それらの構造によっても特徴付けられ得る。肝臓オルガノイドは、内在化された微絨毛および間葉系細胞をさらに含む管腔構造を含み得る。肝臓オルガノイドの管腔構造は、極性肝細胞および基底膜によって囲まれている場合がある。肝臓オルガノイドは、機能的な星状細胞および機能的なクッパー細胞を含み得る。一態様において、肝臓オルガノイドは、例えば、ＣＹ２Ｃ９＊２変異体等の薬物代謝チトクローム変異体を含む細胞を含み得る。肝臓オルガノイドは、ＵＳ２０１６／０１７７２７０に記載されるような血管系を含み得る。一態様において、肝臓オルガノイドは、肝臓オルガノイドが炎症性細胞、例えば、Ｔ細胞または他の炎症性分泌タンパク質を含まないことを特徴とし得る。
【００２８】
本開示に有用な肝臓オルガノイドはまた、それらの機能によっても特徴付けられ得る。例えば、肝臓オルガノイドは、以下のうちの１つ以上を有することを特徴とし得る：胆汁産生能、胆汁輸送活性、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｈ発現、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間の補体因子Ｂ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ３発現；少なくとも１０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のＣ４発現、少なくとも１，０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のフィブリノーゲン産生、および少なくとも１，０００ｎｇ／ｍＬ／１ｘｅ６細胞／２４時間のアルブミン産生。一態様において、肝臓オルガノイドは、生体液から一方向に胆汁を取り込むことができ、好ましくは、前記生体液は、血液または血漿から選択される。３Ｄ凝集肝臓細胞が報告されているが、開示される組成物は、アルブミン産生等の非常に高い機能活性（ｉＰＳＣ由来肝細胞を使用する従来の最高標準モデルと比較して最大１０倍の増加）を有し、内部管腔構造に起因して改善された酸素および／または栄養供給を可能にし、それによってはるかに長い培養（場合によっては、少なくとも６０日超）が可能となる。一態様において、本明細書で使用される肝臓オルガノイドは、少なくとも３０日、または少なくとも４５日、または少なくとも５０日、または少なくとも６０日、または６０日を超える胆汁クリアランス機能を有する。
【００２９】
開示される肝臓オルガノイドは、当該技術分野で既知の方法を使用して、前駆細胞、好ましくは多能性幹細胞に由来し得る。本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に記載の方法において使用することができる任意の細胞を包含し、それによって１つ以上の前駆細胞がそれ自体を再生する能力または１つ以上の特殊化細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）の処理に供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（または全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））幹細胞、多能性幹細胞（誘導性または非誘導性）、複能性幹細胞、寡能性幹細胞、および単能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、胚、乳児、小児、または成人由来であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理に供される体細胞であり得る。さらに、異なる細胞株からの前駆細胞の混合物、正常細胞と遺伝子改変細胞の混合物、または２つ以上の種または組織源からの細胞の混合物が、肝不全の患者を治療するために使用することができる。細胞は、限定されないが、当該技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲ法を含む、自発的、化学的、またはウイルス的方法を使用して遺伝子改変することができる。遺伝子改変細胞は、不死性、同種異系性の低下、または肝細胞機能の分化等の特徴を示す可能性がある。
【００３０】
一態様において、肝臓オルガノイドは、前記肝臓オルガノイドが胆汁酸を一方向に取り込む能力を増強するのに十分な期間、基底膜マトリックスで培養され得る。培養された肝臓オルガノイドは、次いで、バイオ人工肝臓システムに移植され得る。開示されるシステムのための開示される肝臓オルガノイドを製造する際に、肝臓オルガノイドが胆汁酸を一方向に取り込むことができるまで、開示される肝臓オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の基底膜マトリックスで培養することが有利であり得る。
【００３１】
肝臓オルガノイドの作製方法
肝臓オルガノイドを製造する方法は、出願人によって記載されている。例えば、Ｔａｋｅｂｅに対するＷＯ２０１８／０８５６１５Ａ１、"Ｌｉｖｅｒ  ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ"を参照されたい。一態様において、ｉＰＳＣ細胞から肝臓オルガノイドの形成を誘導する方法が開示されている。この方法は、ａ）後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約３日間、ｉＰＳＣ細胞由来の胚体内胚葉（ＤＥ）を、ＦＧＦ経路活性化剤およびＧＳＫ３阻害剤と接触させるステップと、ｂ）肝臓オルガノイドを形成するのに十分な期間、好ましくは約１〜約５日間、好ましくは約４日間、ステップａで得られた後部前腸スフェロイドをレチノイン酸（ＲＡ）の存在下でインキュベートするステップと、を含み得る。肝臓オルガノイドは、当該技術分野で既知の方法に従って、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２７５８５に開示される方法を使用して、作製することができる。特に、一態様において、ｉＰＳＣ由来の前腸は、オルガノイド形成の前に、例えば、約−８０℃の凍結条件に供され得る。一態様において、ｉＰＳＣ由来の前腸は、（細胞クラスターとは対照的に）単一細胞として凍結条件に供され得る。
【００３２】
出願人によって、凍結した単一細胞から形成された場合に、オルガノイド形成効率が改善されることが実証されている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２７５８５を参照されたい。そのような方法は、本明細書に開示される肝臓サポートシステムとともに使用され得る。例えば、出願人は、ｉＰＳＣ由来の前腸細胞から肝臓オルガノイドを得る凍結法を発明した。凍結融解の結果として、単一細胞の単離細胞の生存率はクラスター条件細胞よりも有意に高かった。具体的には、ｉＰＳＣ由来の前腸細胞を凍結することにより、単離された単一細胞からのより効率的なオルガノイド形成が可能になる。そのような方法は、本明細書に記載の肝臓オルガノイドおよび／またはシステムの製造を改善するために、本開示とともに使用され得る。
【００３３】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する成長因子のファミリーである。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面関連ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用がＦＧＦシグナル伝達に不可欠であることが示されている。適切なＦＧＦ経路活性化剤は、当業者によって容易に理解されるであろう。例示的なＦＧＦ経路活性化剤として、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群から選択される１つ以上の分子が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、これらの経路を活性化するために、ＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡが用いられてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＤＥ培養物は、１０ｎｇ／ｍｌ以上、２０ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、７５ｎｇ／ｍｌ以上、１００ｎｇ／ｍｌ以上、１２０ｎｇ／ｍｌ以上、１５０ｎｇ／ｍｌ以上、２００ｎｇ／ｍｌ以上、５００ｎｇ／ｍｌ以上、１，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１，２００ｎｇ／ｍｌ以上、１，５００ｎｇ／ｍｌ以上、２，０００ｎｇ／ｍｌ以上、５，０００ｎｇ／ｍｌ以上、７，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、または１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の、本明細書に記載されるＦＧＦシグナル伝達経路の１つ以上の分子で処理される。いくつかの実施形態において、シグナル伝達分子の濃度は、処理全体を通して一定に維持される。他の実施形態において、シグナル伝達経路の分子の濃度は、処理の過程で変化する。いくつかの実施形態において、本発明によるシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭおよびウシ胎児セリン（ＦＢＳ）を含む培地に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上の濃度であり得る。当業者は、本明細書に記載のレジメンが、限定されないがＦＧＦシグナル伝達経路における任意の分子を含む、本明細書に記載のシグナル伝達経路の任意の既知の分子に、単独でまたは組み合わせて、適用可能であることを理解するであろう。
【００３５】
適切なＧＳＫ３阻害剤は、当業者によって容易に理解されるであろう。例示的なＧＳＫ３阻害剤として、限定されないが、例えば、ＧＳＫ３βを阻害するカイロン／ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。当業者は、開示される方法を実行するのに適したＧＳＫ３阻害剤を認識するであろう。ＧＳＫ３阻害剤は、約１μＭ〜約１００μＭ、または約２μＭ〜約５０μＭ、または約３μＭ〜約２５μＭの量で投与され得る。当業者は、適切な量および期間を容易に理解するであろう。Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤は、開示されるＧＳＫ３阻害剤にとって代わることができる。そのような置換は当該技術分野において理解されており、当業者による日常的な実験によって容易に決定することができる。
【００３６】
一態様において、幹細胞は、哺乳動物またはヒトのｉＰＳＣであり得る。前述のように、前腸スフェロイドは、例えば、商品名Ｍａｔｒｉｇｅｌとして販売されている市販の基底膜マトリックス等の基底膜マトリックスに包埋され得る。
【００３７】
バイオ人工肝臓システム
一態様において、バイオ人工肝臓システムは、それを必要とする個人に肝臓代謝機能を提供することができ、前記肝臓代謝機能は、バイオ人工肝臓システムを使用して提供され、バイオ人工肝臓システムは、少なくとも部分的に、それを必要とする個人に対してエクスビボに位置する。一態様において、バイオ人工肝臓システムは、それを必要とする個人に肝臓代謝機能を提供することができ、前記バイオ人工肝臓システムは、少なくとも部分的に、それを必要とする個人に対してインビボに位置する。そのような機能は、例えば、肝臓補助装置と併せて記載される肝臓オルガノイドを組み込むことによって実行され得る。肝臓補助装置当該技術分野で既知の任意の装置の形態をとることができる。例えば、バイオ人工肝臓システム（肝臓補助装置）は、例えば、ＵＳ９６５０６０９、ＵＳ２０１２／０００９０８６、ＷＯ１９９２／００７６１５Ａ１、ＵＳ２００３／０２２８６８５Ａ１に記載されているもの等、様々な異なる形態をとることができ、生物学的機能が、少なくとも部分的に、肝臓オルガノイド組成物によって提供される、例えば、肝臓補助装置は、本明細書に記載の肝臓オルガノイド組成物を含むバイオリアクターを含んでもよく、肝臓オルガノイドは、細胞区画および／または細胞リザーバー内に位置し、任意選択的に追加の細胞型および／またはスフェロイドが補充される。肝細胞、または肝臓に存在する他の細胞、例えば、内皮細胞、伊東細胞、クッパー細胞、および線維芽細胞等も、肝臓オルガノイドに加えてシステムに含めることができる。肝細胞とこれらまたは他のタイプの細胞の１つ以上との共培養も、バイオ人工肝臓システム／肝臓補助装置において使用することができる。
【００３８】
記載される肝臓オルガノイドシステムと併せて使用することができるシステムのさらなる例として、分子吸着剤再循環システム、すなわち「ＭＡＲＳ」システム（Ｇａｍｂｒｏ  Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯ）、血漿分離吸着および透析システム（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ、Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、シングルパスアルブミン透析（ＳＰＡＤ）、および選択的血漿濾過療法（ＳＥＰＥＴ）が挙げられる。他のシステムとして、シングルパスアルブミン透析（ＳＰＡＤ）、治療的血漿交換（ＴＰＥ）（血液から患者の血漿を対外で分離および除去し、血液細胞を補充液とともに患者に返還することを含む）、Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＥＬＡＤ）、ＡＭＣ−ＢＡＬ装置、Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＳＲＢＡＬ）、Ｈｅｐａ  Ｗａｓｈ、Ｌｉ−ＡＬＳ、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ−Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｉｃｅ（ＵＣＬ−ＬＤＤ）が挙げられる。
【００３９】
一態様において、開示される肝臓オルガノイドと併せて使用されるシステムは、ＭＡＲＳ装置である。ＭＡＲＳは二重回路システムから構成され、一方の回路はヘモダイアフィルターを有し、もう一方の回路はアルブミン結合毒素の受容体としてのアルブミンを有し、これにより、水溶性分子と親油性分子の両方を除去することができる。分画された血漿分離および吸着システム（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）も二重回路システムであり、アルブミン透過性のポリスルホン膜によって隔てられた血液回路および血漿回路から構成される。血漿画分は、陰イオン交換体および中性樹脂を含む吸収剤に移行し、そこでアルブミン結合毒素が直接精製される一方で、血液回路は、水溶性毒素を除去するために高フラックス透析に供される。
【００４０】
一態様において、肝臓オルガノイドは、血漿灌流のために設計された中空糸の３Ｄネットワークに配置することができる。肝臓オルガノイドは、例えば、最も広く使用されているＢＡＬ装置であるＨｅｐａｔＡｓｓｉｓｔ（商標）システム（Ａｌｌｉｑｕａ  Ｉｎｃ．、Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）（患者の血漿が微孔性膜を横切る肝臓オルガノイドに遭遇するように、肝臓オルガノイドを透析カートリッジと併せて使用する）とともに使用されてもよい。
【００４１】
一態様において、オルガノイドは、Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＥＬＡＤ（登録商標）；Ｖｉｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに使用することができ、肝臓オルガノイドは肝臓酵素活性を提供し得る。本明細書に記載の肝臓オルガノイドとともに使用することができる他の設計は、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのバイオ人工肝臓「ＡＭＣ−ＢＡＬ」（Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびＭＥＬＳ（Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｒｉｔｅ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。
【００４２】
一態様において、肝臓オルガノイドは、Ｅｘｃｏｒｐｅ  Ｍｅｉｃａｌ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によるＢｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＬＳＳ（商標））とともに使用することができ、単一の中空カートリッジ内の初代ブタ肝細胞を（全体または一部）本明細書に記載の肝臓オルガノイドと置き換えることができる
【００４３】
前述のシステムは、ＭｃＫｅｎｚｉｅらの"Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，"Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２（２００８）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
一態様において、本明細書に記載の肝臓オルガノイドは、２０１４年６月１７日に出願されたＮｙｂｅｒｇに対するＵＳ９，６５０，６０９、２０１０年３月１２日に出願されたＮｙｂｅｒｇに対するＵＳ２０１２／０００９０８６、１９９２年５月１４日に公開されたＳｈａｔｆｏｒｄらに対するＰＣＴ／ＵＳ９１／０７９５２に記載される装置とともに使用することができ、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、肝機能を補助する線維芽細胞または他の細胞型が記載されている場合、本明細書に記載の肝臓オルガノイドを代用することができる。
【００４５】
一般に、開示されるシステムは、肝臓オルガノイド（「複数のオルガノイド」を含む）を肝臓オルガノイド支持体と併せて使用することができ、その組み合わせは、肝機能を補助するためにバイオ人工肝臓サポートシステムにおいて用いられる。「肝臓オルガノイド支持体」とは、肝臓オルガノイド（複数可）が肝臓機能を補助するのに十分な生体液に接触することを可能にする様式で肝臓オルガノイドを付着、含有、または何らかの方法で配向させることができる任意の基質または容器を意味し、上記に言及されるシステムのいずれかに記載されるようなカートリッジもしくは中空糸の形態、または肝臓サポートシステムの一部として肝臓オルガノイドを提供するための基質として機能する代替形態である。肝臓オルガノイド支持体の例は、限定されないが、ＵＳ２０１１／０２１８５１２号に記載されるような中空糸、カートリッジを含み、円筒形、実質的に平面な形状、またはそれらの任意の変形等の任意の所望の形状をとることができる。一態様において、肝臓オルガノイド支持体は、肝臓オルガノイド（複数可）を所望の構成に維持する。肝臓オルガノイド支持体は、一態様において、肝臓オルガノイドを収容するように構成されたリザーバーチャンバーを備え得る。肝臓オルガノイド支持体は、特定の態様において、双方向の流体の流れを可能にするように膜に動作可能に接続され得、かつ／または一方向の流体の流れを可能にするように膜に動作可能に接続され得る。
【００４６】
一態様において、本明細書に記載のバイオ人工肝臓システムは、血液分離カートリッジ、チャコールカラム、樹脂カラム、および透析膜のうちの１つ以上を含むアルブミン透析システムと併せて使用することができる。
【００４７】
一態様において、肝臓オルガノイド支持体は、肝臓オルガノイドがチャンバー内で自由流動または移動することができるチャンバーまたはリザーバーを備え得る。肝臓オルガノイド支持体は、懸濁液中に肝臓オルガノイドを含むチャンバーを備えてもよく、前記肝臓オルガノイド懸濁液を混合することができる機構をさらに備えてもよい。
【００４８】
一態様において、肝臓オルガノイド支持体は、透過性媒体によって分離された２つの流体経路を備えてもよく、２つの流体経路間の連通は透過性媒体を横切り、透過性媒体は肝臓オルガノイドを含み、肝臓オルガノイドは前記透過性媒体と関連している。一態様において、透過性媒体は、２０１２年１１月２６日に出願されたＦｌｉｅｇらに対するＵＳ２０１５／０２７３１２７Ａ１に記載されているような中空糸を含み得る。一態様において、肝臓オルガノイド支持体は、臨床グレードであり、非免疫原性であり得る。
【００４９】
一態様において、バイオ人工肝臓システムは、肝臓オルガノイドおよび生体材料を含み得る。生体材料はヒドロゲルであり得る。一態様において、生体材料は、コラーゲン、アルギン酸、フィブリン、ゼラチン、アルギン酸−フィブリンヒドロゲル、コラーゲン−フィブリノーゲンヒドロゲル、コラーゲン−アルギン酸ヒドロゲル、フィブロゲン−アルギン酸ヒドロゲル、コラーゲン−アルギン酸−フィブリン（ＣＡＦ）ヒドロゲル、およびそれらの組み合わせから選択され得る。開示されるシステムとともに使用できる例示的な材料については、例えば、Ｍｏｎｔａｌｂａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ／ａｌｇｉｎａｔｅ／ｆｉｂｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９１，１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１８，Ｐａｇｅｓ  ２３６−２４６を参照されたい。
【００５０】
オルガノイド増殖培地
一態様において、肝臓オルガノイドの増殖に、および／または肝臓装置システム内で使用するために使用される培地は、以下を含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含み得る：Ｂ２７（例えば、約１〜５％、または約２％のＢ２７）、Ｎ２サプリメント（例えば、約０．１〜約５％、または約１％のＮ２サプリメント）、Ｇ  ｕｌｔａｍａｚ（例えば、約０．１％から約１０％、または約１％のＧｕｌｔａｍａｚ）、ＨＥＰＥＳ（例えば、約０．１％〜約１０％、または約１％のＨＥＰＥＳ）、アスコルビン酸（例えば、約５〜約１００ｕｇ／ｍＬのアスコルビン酸、または約５０ｕｇ／ｍＬのアスコルビン酸）、ＦＧＦ２（例えば、約１〜約１００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２）、ＶＥＧＦ（例えば、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦ）、ＥＦＧ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｍ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ）、ＣＨＩＲ９９０２１または他のＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、約１〜５０μＭのＣＨＩＲ９９０２１、または約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）、およびＡ８３−０１（例えば、約０．０１〜約１μＭ、または約０．５μＭのＡ８３−０１）。一態様において、オルガノイド増殖培地は、上記の量の約半分から上記の量の約２倍まで、または上記の量の約４分の１から上記の量の約３倍までの量の上記の成分の各々であり得る。
【００５１】
治療方法
一態様において、本明細書に記載されるようなバイオ人工肝臓システム（「ＢＡＬ」または「肝臓補助装置」、本明細書において互換的に使用される）を、任意選択的に、透析システムとさらに組み合わせて、それを必要とする個人に提供するステップを含む、肝機能障害、例えば肝不全を有する個人を治療する方法が開示される。「肝不全」という用語は、肝臓が、正常な生理学の一部として正常な合成および代謝機能を実行できないことを指す。したがって、肝不全は、例えば、アルブミンの不十分な解毒につながり、その後、アルブミンの結合能力が枯渇し、そうでなければアルブミンに結合した毒素、例えば、非結合ビリルビンが濃縮される。治療は、例えば、>１０ｍｇ／ｄＬのビリルビン濃度で示される。しかしながら、肝透析治療が必要であることが示されるが、ビリルビンレベルの上昇を特徴としない肝障害が存在する。使用される「肝不全」という表現に関連する障害は、限定されないが、肝腎症候群、非代償性慢性肝疾患、急性肝不全、肝移植後の移植片機能不全、肝手術後の肝不全、続発性肝不全、多臓器不全、外因性中毒または胆汁うっ滞における難治性掻痒症等を含む。
【実施例】
【００５２】
肝臓オルガノイドの調製方法
肝臓オルガノイドへの分化ＤＥを肝臓オルガノイドに分化させるために、「Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ法」、「Ｍａｔｒｉｇｅｌサンドイッチ法」、および「Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用しない方法」の３つの方法を用いることができ、各々について以下に述べる。
【００５３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ法：７〜８日目に、播種した細胞を含む胚体内胚葉オルガノイドを穏やかにピペッティングして皿から剥離した。単離したスフェロイドを８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、皿上で１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋した。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で５〜１５分間置いた。Ｍａｔｒｉｇｅｌが固化した後、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、Ｂ２７、Ｎ２、およびレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２μＭを１〜５日間添加した。培地を一日おきに交換した。ＲＡ処理後、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋されたオルガノイドを、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）、および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で維持し、培地を３日ごとに交換した。２０〜３０日目頃に、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋されたオルガノイドを、任意の分析のためにスクラッチングおよび穏やかなピペッティングにより単離した。
【００５４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップ法を使用した例
Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップを使用して、多数の機能的ＨＬＯを生成することができる。ヒトｉＰＳＣ株は、胚体内胚葉（ＤＥ）に分化させ、次いで後部前腸（ＰＦＧ）に分化させることができる。次に、分化細胞を５０〜７０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌドロップ（３Ｄ）に包埋することができる。肝細胞培養培地（ＨＣＭ）を使用した成熟段階の２週間後、各Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップは約１００のＨＬＯを生成する。これらのＨＬＯは、ＡＬＢ、ＡＦＰ、およびＲＢＰ４を高度に発現する（図４、パネルＡ）。ＨＬＯの産生をさらにスケールアップするために、マイクロウェルメッシュプレートを使用して均一なサイズのスフェロイドを生成することができる。これらのマイクロウェルメッシュプレートは、直径５００μｍ、深さ１００μｍのマイクロウェルを含み、多数のスフェロイドを効率的に形成することができる。次いで、ＨＣＭを含む回転壁容器バイオリアクター（ＲＷＶ）にスフェロイドを移すことができる。図４、パネルＢはオルガノイドの形成を示す。
【００５５】
例示的なプロトコルは以下の通りである：
ＰＦＧ単一細胞を６ウェルのＥＺＳＰＨＥＲＥ（商標）マイクロウェルメッシュプレートに播種する。（これは、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）、Ｅｌｐｌａｓｉａ等の他のマイクロウェルプレートで置き換えられてもよい。）２×１０＾６細胞／ウェルをＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ＋ＲＡ＋Ｒｏｃｋ阻害剤とともに播種する。プレートを１６０ｇで１分間穏やかに回転させる。プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに一晩入れる。
【００５６】
２日目には、球体が観察されるはずである。培地を上下に穏やかにピペッティングし、次いで１５ｍｌの試験管に球体を収集する。６ウェルプレートの各ウェルは、約２０００個の球体を生成することができる。プレート全体で、約１２０００個の球体が生成される。
【００５７】
球体と培地の混合物を、球体が全て底に沈殿するまで５分間ベンチ上に放置する。全ての培地を吸引する。培地を交換し、１０％のＭａｔｒｉｇｅｌと混合する。全ての球体および培地を回転壁容器バイオリアクター（ＲＷＶ）に移す（ＲＷＶまたは同等のシステムは、ＪＴＥＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ、ＳＡＴＡＫＥ、およびＡＢＬＥ等の複数の供給業者から市販されている）。５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートする。培地を３日ごとに交換する。１４日後に肝臓オルガノイドが形成される。
【００５８】
Ｍａｔｒｉｇｅｌサンドイッチ法：７〜８日目に、播種した細胞を含む胚体内胚葉オルガノイドを穏やかにピペッティングして皿から剥離した。単離したスフェロイドを８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。同時に、全ての添加剤を含む肝細胞培養培地を同じ体積の１００％Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。ＨＣＭとＭａｔｒｉｇｅｌの混合物を皿の底に播種してプレート上に厚いコーティングを形成し（０．３〜０．５ｃｍ）、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で１５〜３０分間置いた。Ｍａｔｒｉｇｅｌが固化した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合したスフェロイドをＭａｔｒｉｇｅｌで厚くコーティングされたプレートに播種した。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で５分間置いた。Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、Ｂ２７、Ｎ２、およびレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２μＭを１〜５日間添加した。培地を一日おきに交換した。ＲＡ処理後、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋されたオルガノイドを、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）、および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で維持し、培地を３日ごとに交換した。２０〜３０日目頃に、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋されたオルガノイドを、任意の分析のためにスクラッチングおよび穏やかなピペッティングにより単離した。
【００５９】
Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用しない方法：７〜８日目に、Ｂ  ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）レチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２μＭを含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）中で、播種した細胞を含む胚体内胚葉オルガノイドの平面培養を４日間継続した。培地を一日おきに交換した。４日間の平面培養後、オルガノイドが発芽し始めるのに対して、２Ｄ細胞は肝細胞に分化する。オルガノイドと肝細胞の両方は、１  ０日間、１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）、および２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む肝細胞培養培地（ＨＣＭ  Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）下で６０日にわたって維持することができる。オルガノイドアッセイの場合、浮遊オルガノイドを超低接着マルチウェルプレート（６ウェルプレート）に収集し、必要に応じてその後のアッセイに使用することができる。細胞分化のための培養物を５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中に３７℃で維持し、培地を３日ごとに交換した。
【００６０】
例：極性肝臓オルガノイドの生成および特徴付け
以前に記載されたように（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、胚体内胚葉への分化を促進するためにＢＭＰおよびアクチビンＡを使用する。多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を生成するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。例示的な方法は、例えば、Ｗｅｌｌｓらに対するＵＳ９７１９０６８Ｂ２、"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ"、およびＷｅｌｌｓらに対するＵＳ２０１７／０２４０８６６Ａ１、"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ"に開示されている。いくつかの実施形態において、多能性細胞は桑実胚に由来する。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞には、胚性幹細胞を含むが、これに限定されない。胚性幹細胞を、胚の内部細胞塊または胚の性腺隆起から派生することができる。胚性幹細胞または生殖細胞は、ヒトを含む種々の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない種々の動物種から派生することができる。いくつかの実施形態において、ヒト胚性幹細胞を使用して胚体内胚葉を生成する。いくつかの実施形態において、ヒト胚性生殖細胞を使用して胚体内胚葉を生成する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣ細胞を使用して胚体内胚葉を生成する。本発明で使用することができるＤＥ細胞を得るまたは作製するためのさらなる方法は、限定されないが、Ｄ’Ａｍｏｕｒらに対する米国特許第７，５１０，８７６号、Ｆｉｓｋらに対する米国特許第７，３２６，５７２号、Ｋｕｂｏ１含まれ得る２００４，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：１６５１−１６６２、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５３４−１５４１、およびＡｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，"Ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＮＦ３／ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１３０１−１３１５に記載にされるものを含み、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
ＦＧＦ４、およびＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）は、前腸スフェロイドおよび発芽スフェロイドを誘導するために使用される。皿に播種した間葉系細胞を穏やかなピペッティングにより剥離した後、オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌに包埋する。胆汁輸送モデリングに適した極性オルガノイドを生成するために、オルガノイドをＲＡで処理する。オルガノイド生成法を最適化するために、ＲＡ処理を変更してもよい。アルブミン分泌のレベルに基づいて、４日間のＲＡの期間が典型的に用いられる。ＲＡ処理後約１０日で、上皮細胞で覆われた３００を超えるオルガノイドが成功裏に生成され得、管腔構造を有するオルガノイドの割合は約７０％である。得られたオルガノイドは上皮細胞においてアルブミン陽性であり、ＩＶ型コラーゲンは外表面に局在し、ＺＯ−１（閉鎖帯）で管腔内の内層を染色する。
【００６２】
得られたオルガノイド中の細胞では、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、胆管細胞の分化を制御する肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、および分化中のチトクロームＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）等の肝臓マーカー遺伝子の発現が大幅に増加する。細胞の約３０％は、間質細胞マーカーによって同定される非実質細胞であり（未発表の観察）、オルガノイドは、初代肝細胞よりもインビボの肝臓組織により類似したものとなる。
【００６３】
肝臓オルガノイドを使用した肝臓サポートシステムの例
オルガノイド（ＨＬＯ）は、３Ｄ回転バイオリアクター（（ＪＴＥＣシステムに限定されないが）ＪＴＥＣ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の特殊培地（付属製剤）で無期限に成長させることができる。最後に、約３×１０９ヒト肝細胞と同一のＨＬＯをリアクターから回収し、ＨＬＯ−ＢＡＬ処理に使用する。
【００６４】
ＢＡＬシステム
ＢＡＬシステムは、細胞回路および血液回路から構成される。ＢＡＬシステムの構成要素は、３つのローラーポンプ、ヘパリンポンプ、血漿フィルター（Ｓｏｒｉｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｔａｌｉａ、Ｍｉｒａｎｄｏｌａ，Ｉｔａｌｙ）、血漿成分分離器（Ｋａｗａｓｕｍｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、およびポリカーボネート製足場付きの多層平板バイオリアクターを含む。以前に報告されたように（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、血漿成分分離器内の膜は、優れた生体適合性を備えたエチレンビニルアルコール共重合体樹脂から作られている。膜の細孔径は１０ｎｍ（約２００ＫＤ）である。膜分子量カットオフは、ＩｇＧ、ＩｇＭの減少において高い性能を示し、その沈着により、重度の異種反応性の抗体応答を低下させるだけでなく、標的物質を効果的に除去することもできる（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００６５】
報告されているように（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、多層バイオリアクターは、中空カラムステントと、６５層の丸い平板のスタックとから構成されており、これらは全てポリカーボネート製である。隣接するプレート間のチャネル高さは、各プレートの下部に取り付けられたスペーサーで０．５ｍｍに維持される。ＨＬＯは、蠕動ポンプによってアイレットを介してバイオリアクター内に植え付けられる。バイオリアクターの高さは約１０ｃｍ、有効容積は４８０ｍｌである。新たに採取したｈｉＨｅｐ細胞をＨＭＭで輸送した。細胞がプレートの表面に付着し、ＢＡＬ処理のための準備が整うまで、バイオリアクター全体を３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
【００６６】
本明細書全体で与えられるすべての最大数値制限は、あたかもそのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように、すべてのより低い数値制限を含むことが理解されるべきである。本明細書全体で与えられるすべての最小数値制限は、あたかもそのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように、すべてのより高い数値制限を含む。本明細書全体で与えられるすべての数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に書かれているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべてのより狭い数値範囲を含む。
【００６７】
本明細書に開示される寸法および値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。代わりに、特記しない限り、そのような各寸法は、記載された値およびその値を含む機能的に均等の範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「２０ｍｍ」として開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味することが意図される。
【００６８】
相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書で引用されるすべての文書は、明示的に除外または他の方法で制限されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。任意の文書の引用は、それが本明細書に開示または請求される任意の発明に関する先行技術であること、またはそれが単独で、または他の参考文献との任意の組み合わせで、そのような発明を教示、示唆、または開示することを認めるものではない。さらに、本文書の用語の意味または定義が、参照により組み込まれる文書の同じ用語の意味または定義と矛盾する限りにおいて、本文書のその用語に割り当てられた意味または定義が優先するものとする。
【００６９】
本発明の特定の実施形態が例示および説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の他の変更および修正を行い得ることは、当業者には自明であろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更および修正を包含することが意図される。
【図１】
2022500058.tif 000002
【図２】
2022500058.tif 000003
【図３】
2022500058.tif 000004
【図４】
2022500058.tif 000005
【国際調査報告】
2022500058.tif 000006
2022500058.tif 000007