【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年2月19日(2010.2.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類の多能性の幹細胞から、分化した神経細胞集団を生成する方法であって、
（ａ）霊長類の多能性の幹細胞の培養を増殖させるステップと、
（ｂ）前記多能性の幹細胞を培養して、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択するステップと、
（ｃ）ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチするための前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別するステップと、
（ｄ）ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方を含む分化培地でネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を培養することで、Ｎ−アセチル・システインの存在下で前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて分化した神経細胞集団を生成するステップと、
を含む、分化神経細胞集団を生成するための方法。
【請求項２】
前記多能性の幹細胞が、レーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性の幹細胞がヒト胚幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト胚幹細胞がレーザー・アブレーション法を用いて得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分化した神経細胞集団が６０％のドーパミン作動性神経細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分化した神経細胞集団が３０％のセロトニン作動性神経細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分化した神経細胞集団が２５％のオリゴデンドロサイトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の前記多能性の幹細胞を培養して胚様体を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記胚様体を培養して、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、多能性の幹細胞を無血清培地で培養することによって選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記無血清培地がＩＴＳＦｎ無血清合成培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、前記胚様体を無血清培地で培養することで、選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記無血清培地がＩＴＳＦｎ無血清合成培地である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経前駆細胞が、９５％のネスチン陽性細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）によって、ＮＣＡＭ陽性細胞についてエンリッチをおこなうために、ステップ（ｃ）の前記ネスチン陽性神経前駆細胞を選別する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ネスチン陽性神経前駆細胞が、５０〜６０％のＮＣＡＭ陽性細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性神経前駆細胞を増殖培地で増殖させることを、さらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ラミニン、プトレッシン、プロゲステロン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が６〜１０日間にわたって前記増殖培地で増殖する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１種類以上の集団を倍加させるために、前記細胞を培養し、そして連続的に継代する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が液体窒素中で凍結保存される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記分化培地が、ウシ胎仔血清、Ｂ２７、アスコルビン酸、およびＮ−アセチル・システインが補充された神経基本培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記分化培地が、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル・システイン、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューチュリン、ソニック・ヘッジホッグ・タンパク質（ＳＨＨ）、および線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）からなる群から選択される１種類以上の分化剤を、さらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化培地で３０〜５０日間にわたり増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
神経前駆細胞からドーパミン作動性神経細胞を生成する方法であって、
ネスチンに陽性の細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチし、前記ネスチン陽性細胞をＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方、およびＮ−アセチル・システインの存在下で培養することで前記ネスチン陽性細胞を分化させて、ドーパミン作動性神経細胞を生成する、ドーパミン作動性神経細胞生成方法。
【請求項３０】
Ｎ−アセチル・システインの存在下で４０％の前記ネスチン陽性細胞がドーパミン作動性神経細胞に分化する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＮＣＡＭに陽性の細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチすることを、さらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させてドーパミン作動性神経細胞を生成する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
６０％の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞が、ドーパミン作動性神経細胞に分化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
神経前駆細胞からセロトニン作動性神経細胞を生成する方法であって、
ネスチンおよびＮＣＡＭに陽性である細胞として、前記神経前駆細胞をエンリッチすること、ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞をＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方の存在下で培養することで前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、セロトニン作動性神経細胞を生成する、セロトニン作動性神経細胞生成方法。
【請求項３５】
３０％の前記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞がセロトニン作動性神経細胞に分化する、請求項３４に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
次に、上記ネスチン陽性神経前駆細胞を保存して、適当な免疫学的技術、例えば免疫標識および蛍光選別（ソーティング）、例えば磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）、固相吸着、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、細胞表面マーカーに対するフロー免疫細胞化学、またはフロー・サイトメトリー・アッセイによって、ＮＣＡＭ陽性細胞をエンリッチすることが可能である。好ましい実施形態によれば、これらの方法は、少なくとも約４０〜７０％のＮＣＡＭ陽性細胞、より好ましくは約５０〜６０％のＮＣＡＭ陽性細胞、および最も好ましくは約８０〜９９％のＮＣＡＭ陽性細胞を含むネスチン陽性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、上記方法は、さらに、増殖培地中でネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性神経前駆細胞を、好ましくは６〜１０日にわたって、増殖させるステップ（ｃ）を含む。好ましくは、上記増殖培地は、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ラミニン、プトレッシン、プロゲステロン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群から選択される１種類以上の可溶性因子を含む。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
上記ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性神経前駆細胞を、１種類以上の集団を倍加させるために、好ましくは、培養および連続的に継代する。これらの細胞もまた、液体窒素で凍結保存する。ＮＣＡＭ陽性神経前駆細胞を、好ましくは、上記方法のステップ（ｄ）に記載したように、３０〜５０日間にわたって分化培地中で増殖させる。好ましい実施形態では、上記分化培地が、ウシ胎仔血清、Ｂ２７、アスコルビン酸、およびＮ−アセチル・システインが補充された神経基本培地を含む。別の好ましい実施形態では、上記分化培地は、ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいは両方を、さらに含む。好ましくは、上記分化培地は、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル・システイン、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューチュリン、ソニック・ヘッジホッグ・タンパク質（ＳＨＨ）、および線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）からなる群から選択される１種類以上の分化剤を、さらに含む。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
本発明の開示は、神経前駆細胞からドーパミン作動性神経細胞を生成する方法を提供するもので、該方法は、ネスチンに陽性の細胞として上記神経前駆細胞をエンリッチし、ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいはそれら両方の存在下で、細胞を培養することで、ドーパミン作動性神経細胞を生成するために、上記ネスチン陽性細胞を分化させることを含む。好ましくは、少なくとも４０〜９９％のネスチン陽性細胞が、それらの方法を用いてドーパミン作動性神経細胞に分化する。別の実施形態では、これらの方法は、さらに、ＮＣＡＭに陽性の細胞として、上記神経前駆細胞をエンリッチし、これらのネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を好ましくは分化させてドーパミン作動性神経細胞（例えば、少なくとも６０〜９９％の細胞をドーパミン作動性神経細胞に分化させる）を生成する。本発明の開示はまた、神経前駆細胞から神経を生成する方法を提供するもので、該方法は、神経前駆細胞を、ネスチンおよびＮＣＡＭに陽性の細胞にエンリッチし、ネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞を分化させて、ＴＧＦ−β３またはインターロイキン−１βあるいはそれら両方の存在下で細胞を培養することで、セロトニン作動性神経細胞を生成する。好ましくは、これらの方法を用いて、約３０〜９９％のネスチン陽性ＮＣＡＭ陽性細胞がセロトニン作動性神経細胞に分化する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
特に神経細胞型の分化を促進する適当な分化剤として、限定されるものではないが、プロゲステロン、プトレッシン、ラミニン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ニューチュリン、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ノギン、フォリスタチン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、任意の型の線維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−４、ＦＧＦ−８、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））、増殖および分化因子５（ＧＤＦ−５）、ニューロトロフィン・ファミリーのメンバー（神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）））、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β−３（ＴＧＦβ３）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）（グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）、ミドカイン、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、ドーパミン、ならびにｇｐ１３０と複合体を形成する受容体に対するリガンド（例えば、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、およびＩＬ−６）が挙げられる。分化栄養培地は、神経細胞（例えばＮ２およびＢ２７添加物（Ｇｉｂｃｏ））の維持培養を助ける添加物を含んでもよい。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
ヒトＥＳ細胞を培養することで増殖させ、定期的にＥＳ細胞を継代して分化を阻害した。ＥＳ細胞を、最初に該細胞をＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないダルベッコのリン酸緩衝液で１０秒間洗い、つぎに該細胞を０．０５％トリプシンで５秒処理することで、継代をおこなった。５秒後、トリプシンのアッセイを血清含有ＥＳ培地によって阻害した。つぎに、細胞をスクラップして破壊し、小さなクラスターにした。クラスターを２枚の０．１％ゼラチン被覆１００ｍｍペトリ皿（上記したように、ＬＩＦおよびｂＦＧＦを含むＥＳ培地に含まれる支持細胞によって被覆）に植え付けした。細胞を４〜６日間、増殖させた。
（３）胚様体の生成
未分化ヒトＥＳ細胞を増殖して増やした後、該細胞を培養して胚様体を形成した。最初に、ＥＳ細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離した後、スクラップして細胞を小さなクラスターに破壊した。次に、これらのクラスターを約１ｘ１０５細胞／ｍｌで、支持細胞が無い細菌学的皿上に植え付けた。使用した細菌学的皿は、付着を阻む非粘着性の表面を有することから、ＥＳ細胞の分化および胚様体形成を刺激する。これらの細胞をＬＩＦおよびｂＦＧＦを含まないＥＳ培地での懸濁培養として培養した。これらの細胞を培養するために使用したＥＳ培地は、高グルコースのＤＭＥＭまたはノックアウトＤＭＥＭであり、１０〜２０％ＦＣＳまたはノックアウト血清置換、同様に他のサプリメント（例えば、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン酸、および抗体）で補われている。ｂＦＧＦはいっさいＥＳ培地に加えられていない。胚様体を４〜８日間増殖させた。この時間のあいだ、ＥＳ培地は、沈殿法により２日毎に変えられた。この沈殿法は、凝集体の懸濁液を遠心管に移し、凝集体を遠心管の底に沈殿させ、培地を吸引し、さらにそれを新鮮な培地に置き換えた。新鮮な培地に含まれる凝集体をつぎに培養皿に移した。４〜８日後、胚様体を回収し、低速で遠心し、さらにＥＳ細胞培地に再懸濁した。約２０〜３０の胚様体を、ＬＩＦ無しの０．１％ゲラチン含有ＥＳ培地で被覆された組織培養プレート上に植え付け、さらに２４時間インキュベートした。
（４）ネスチン陽性神経前駆体の選択および増殖
２４時間後、ネスチン陽性細胞（神経前駆細胞）を、ＥＳ培地の代わりにＩＴＳＦｎ（ネスチン選択）無血清合成培地を用いることで、選択した。ＩＴＳＦｎ培地は、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）からなり、増殖因子インスリン（５〜２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、亜セレン酸ナトリウム（１０〜５０ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリン（１〜１０ｇｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）、およびフィブロネクチン（１〜５μｇ／ｍｌ）で補った。
この培地はネスチン陽性細胞の選択を可能とし、２日毎に補充しているＩＴＳＦｎ培地で、６〜１０日間、通常８〜９日日にわたって実行した。選択が完了した後、上記神経前駆細胞を、免疫蛍光技術を用いてネスチン発現について特徴づけた。その結果、約９５％の細胞がネスチンを発現した（図１Ａ）。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
チェンバー・スライドを蛍光顕微鏡下で観察して、免疫陽性領域の評価をおこなった。この免疫蛍光分析は、かなりの割合の分化型細胞で、神経細胞特異的マーカーＮＣＡＭ（図３、ＭＡＰ−２（図４Ａ）、およびβチューブリン（図４Ｂ）に対して免疫活性であったことを示した。これらのキー抗原の発現は、分化培地中でのインキュベーション時間の増加をもたらした。免疫蛍光分析はまた、より少ない割合の細胞がセロトニン（図７）、同様に星状細胞に存在する非神経性のマーカーであるグリア線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）と、オリゴデンドロサイト（図６）に存在するＧＡＢＡおよびグルタメートとを発現することを証明した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
最初に、細胞を開示された方法の異なる段階で回収した。未分化ＥＳ細胞、胚様体、ネスチン陽性神経前駆細胞、ＮＣＡＭ陽性細胞、および分化細胞は、神経基本培地で分化の７、２２、および３７日後に単離した。回収前に、神経基本培地で分化する細胞を、１５分間にわたり、５６ｍＭのＫＣｌを添加したＨＢＳＳによって最初に刺激し、ドーパミン分泌を誘発した。ほぼ、５ｘ１０６細胞をトリプシン処理し、遠沈殿法によってペレット化した。次に、細胞を抗酸化剤（０．２ｇ／ｌのメタ重亜硫酸ナトリウム）を含む冷１Ｎ過塩素酸で超音波処理し、４℃で２０分間遠心（１５，０００ｒｐｍ／分）した。上澄みを抽出し、以降に続くＲＰ−ＨＰＣＬによる細胞内ドーパミン濃度の測定のために、−７０℃で保存した。ドーパミン化のレベルを、細胞可溶化物と培養上澄み（最終培地変化後４８時間）とによって測定した。培養上澄みは、直ちに７．５％オルトリン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムで安定化させた。