(57)【要約】  変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体、そのコード配列、その調製方法、およびそれを含有するウイルス様粒子が提供され、タンパク質またはその変異体およびそのウイルス様粒子は、少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９、またはＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６）に対する中和抗体を誘導することができる。医薬組成物またはワクチンを調製するための上記のタンパク質およびウイルス様粒子の使用もまた提供され、医薬組成物またはワクチンは、少なくとも２つの型のＨＰＶの感染、および感染によって引き起こされる、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマなどの疾患を予防するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体であって、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、以下の変異：
（１）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化；および（２）（ａ）、（２）（ｂ）、（２）（ｃ）または（２）（ｄ）：
（２）（ａ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｂ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｃ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｄ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、
で定義された変異
を有し、
前記変異体が、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失によってのみ、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と異なり、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９）に対する中和抗体の産生を誘導する能力を保持し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ａ）で定義された前記変異を有し、任意選択で、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｂ）で定義された前記変異を有し、任意選択で、（３）（ｃ）で定義された変異をさらに有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｃ）で定義された前記変異を有し、任意選択で、（３）（ａ）または（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｄ）で定義された前記変異を有し、任意選択で、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
（３）（ａ）、（３）（ｂ）、または（３）（ｃ）で定義された前記変異は以下のとおり：
（３）（ａ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｂ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｃ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換
であり；
好ましくは、前記第２の型の野生型ＨＰＶが、ＨＰＶ６９であり；好ましくは、（２）（ａ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（２）（ｂ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（２）（ｃ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（２）（ｄ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記第３の型の野生型ＨＰＶが、ＨＰＶ２６であり；好ましくは、（３）（ａ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（３）（ｂ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（３）（ｃ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基であり；例えば、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で９個のアミノ酸が短縮化されており；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質が、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、配列番号４、５、６または７に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、配列番号２３、２７、２８、４１または４５に記載のアミノ酸配列を有する、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体をコードする単離された核酸であって、
好ましくは、前記単離された核酸が、配列番号１２、１３、１４または１５に記載のヌクレオチド配列を有し；
好ましくは、前記単離された核酸が、配列番号３２、３６、３７、４９または５３に記載のヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸および／または請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を含むか、またはそれらからなるＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体、または請求項２に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、または請求項４に記載の宿主細胞、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子、を含む組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子、および任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチンであって、
好ましくは、前記ＨＰＶウイルス様粒子が、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在し；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、およびＨＰＶ２６感染からなる群から選択される少なくとも１つの感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、医薬組成物またはワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を調製する方法であって、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を宿主細胞内で発現させ、次に前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を回収することを含み、
好ましくは、前記宿主細胞が大腸菌であり；
好ましくは、前記方法が、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を大腸菌において発現させ、次に、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を得るステップと；好ましくは、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を、クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって、前記大腸菌の前記溶解物上清から回収するステップとを含む、方法。
【請求項９】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項１０】
ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための方法であって、予防的有効量の請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子または請求項７に記載の医薬組成物もしくはワクチンを対象に投与することを含み、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、およびＨＰＶ２６感染からなる群から選択される少なくとも１つの感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、およびＨＰＶ２６感染からなる群から選択される少なくとも１つの感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、使用。
【請求項１２】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための、請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子であって、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、およびＨＰＶ２６感染からなる群から選択される少なくとも１つの感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体またはＨＰＶウイルス様粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月２６日出願の中国出願第２０１８１１１２２８２２．１号からの優先権の利益に基づき、およびそれを主張しており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本出願は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関連している。特に、本発明は、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質（またはその変異体）、それをコードする配列、それを調製するための方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、タンパク質（またはその変異体）およびウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９、またはＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９およびＨＰＶ２６）に対する中和抗体の産生を誘導することができ、したがって、前記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、および前記感染によって引き起こされる、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマなどの疾患を予防するために使用することができる。本発明はさらに、前記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、および前記感染によって引き起こされる、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマなどの疾患を予防するための、医薬組成物またはワクチンの製造におけるタンパク質およびウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主に皮膚および粘膜に疣贅を引き起こす。ＨＰＶ型は、腫瘍形成との関連性に応じて、高リスク型と低リスク型とに分けられる。それらの中でも、高リスクＨＰＶ型による感染は、女性の子宮頸がんを含む生殖器がんの主な原因であり；低リスクＨＰＶ型は、主に尖圭コンジローマを引き起こすことが実証されている。ＨＰＶ感染を予防および制御するための最も有効な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸がんを引き起こす高リスクＨＰＶ型に対するワクチンをワクチン接種することである。
【０００４】
ＨＰＶの主要なキャプシドタンパク質Ｌ１は、自己組織化して中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）になるという特徴がある。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要なキャプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成される対称二十面体構造を有する（Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．およびＰ．Ｈ．Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ．１９８７年。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６１（９）：２７９３−９頁）。ＨＰＶ  ＶＬＰは、構造の点で天然ＨＰＶと非常に類似しており、天然ウイルスの中和エピトープのほとんどを保持し、高力価中和抗体の産生を誘導することができる（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．，Ｆ．Ｂｏｏｙら、１９９２年Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９巻（２４）：１２１８０〜４頁）。
【０００５】
既存の研究は、ＨＰＶ  ＶＬＰが、主に同じＨＰＶ型に対する中和抗体の産生を誘導し、同じＨＰＶ型に対する防御免疫をもたらし、少数の高度に相同なＨＰＶ型間で低い交差防御効果しかないことを示している（Ｓａｒａ  Ｌ．Ｂｉｓｓｅｔｔ，Ｇｉａｄａ  Ｍａｔｔｉｕｚｚｏら、２０１４年  Ｖａｃｃｉｎｅ．３２巻：６５４８〜６５５５頁）。したがって、既存のＨＰＶワクチンにおいて、防御範囲は非常に限定されている。一般に、あるＨＰＶ型のＶＬＰは、同じＨＰＶ型による感染を予防するためにのみ使用することができる。この場合、ＨＰＶワクチンの防御範囲を広げる必要がある場合、唯一の方法は、ワクチンにおいてより多くのＨＰＶ型のＶＬＰを加えることである。現在、Ｍｅｒｃｋ製のＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ＨＰＶ１６、１８、６、および１１に対する４価ワクチン）およびＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、および５８に対する９価ワクチン）を含む市販のＨＰＶワクチン、ならびにＧＳＫ製のＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ＨＰＶ１６および１８に対する二価ワクチン）は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰを組み合わせることにより調製されている。しかし、そのような解決策はＨＰＶワクチンの製造コストを大幅に増加させ、免疫量の増加により安全性の問題を引き起こす場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野では、複数のＨＰＶ型による感染、および子宮頸がんおよび尖圭コンジローマなどの感染によって引き起こされる疾患を、より経済的かつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶ型に対する防御中和抗体の産生を誘導することができるＨＰＶウイルス様粒子を開発することが急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の内容
本出願は、少なくとも部分的に、発明者の驚くべき発見に基づいている、すなわち、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）５１型のＬ１タンパク質の特定のセグメントを、第２のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９など）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置換した後、このようにして得られた変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、生物においてＨＰＶ５１および第２のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９など）に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その防御効果は、ＨＰＶ５１  ＶＬＰと第２のＨＰＶ型のＶＬＰとの混合物の防御効果と同等であり、ＨＰＶ５１に対するその防御効果は、ＨＰＶ５１  ＶＬＰ単独の防御効果と同等であり、第２のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９など）に対する防御効果は、第２のＨＰＶ型単独のＶＬＰの防御効果と同等である。
【０００８】
加えて、上記の置換に基づいて、ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の別の特定のセグメントを、第３のＨＰＶ型（ＨＰＶ２６など）のＬ１タンパク質の対応するセグメントでさらに置換することができ、このようにして得られた二重置換を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ５１、第２のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９など）、および第３のＨＰＶ型（ＨＰＶ２６など）に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その防御効果は、ＨＰＶ５１  ＶＬＰ、第２のＨＰＶ型のＶＬＰ、および第３のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物の防御効果と同等である。
【０００９】
したがって、一態様では、本出願は、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を提供し、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および（２）（ａ）、（２）（ｂ）、（２）（ｃ）または（２）（ｄ）：
（２）（ａ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｂ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｃ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｄ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、で定義された変異
を有し、
変異体は、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失によってのみ、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と異なり、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９）に対する中和抗体の産生を誘導する能力を保持する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ａ）で定義された変異を有し、任意選択で、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｂ）で定義された変異を有し、任意選択で、（３）（ｃ）で定義された変異をさらに有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｃ）で定義された変異を有し、任意選択で、（３）（ａ）または（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｄ）で定義された変異を有し、任意選択で、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有する。
【００１４】
（３）（ａ）、（３）（ｂ）、または（３）（ｃ）で定義された変異は以下のとおり：
（３）（ａ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｂ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｃ）野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で９個のアミノ酸が短縮化されている。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ６９である。いくつかの実施形態では、（２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、（２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、（２）（ｃ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、（２）（ｄ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ２６である。いくつかの実施形態では、（３）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、（３）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、（３）（ｃ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基は、配列番号１７に記載の配列を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基は、配列番号１８に記載の配列を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基は、配列番号１９に記載の配列を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基は、配列番号２０に記載の配列を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の３５０〜３６２位のアミノ酸残基は、配列番号２１に記載の配列を有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基は、配列番号５６に記載の配列を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基は、配列番号５７に記載の配列を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基は、配列番号５８に記載の配列を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基は、配列番号５９に記載の配列を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の３４８〜３６０位のアミノ酸残基は、配列番号６０に記載の配列を有する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、配列番号４、５、６または７に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、配列番号２３、２７、２８、４１または４５に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
別の態様では、本出願は、上記のように、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様では、本出願は、単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本出願による単離された核酸は、配列番号１２、１３、１４または１５に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本出願による単離された核酸は、配列番号３２、３６、３７、４９または５３に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００３５】
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは、当技術分野で周知であり、クローニングベクターおよび発現ベクターを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００３６】
別の態様では、本出願はさらに、上記のように単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞、ならびに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（哺乳動物細胞など、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本出願による宿主細胞はまた、２９３Ｔ細胞などの細胞株であり得る。
【００３７】
別の態様では、本出願は、本出願による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を含むか、またはそれらからなるＨＰＶウイルス様粒子に関する。
【００３８】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３９】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４１】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５０】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、９個のアミノ酸の短縮化、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基による置換、および野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基による置換、を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号４、５、６または７に記載の配列を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号２３、２７、２８、４１または４５に記載の配列を有する変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００５８】
別の態様では、本出願はさらに、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、またはＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本出願による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００５９】
別の態様では、本出願はさらに、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子、および任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチンに関する。本出願による医薬組成物またはワクチンは、ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ感染によって引き起こされる、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマなどの疾患を予防するために使用することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、およびＨＰＶ２６感染からなる群から選択される少なくとも１つの感染）である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６１】
本出願による医薬組成物またはワクチンは、当技術分野で周知の方法によって、例えば、これらに限定されないが、経口または注射によって投与することができる。本出願において、特に好ましい投与経路は注射である。
【００６２】
いくつかの好ましい実施形態では、本出願による医薬組成物またはワクチンは、単位剤形の形態で投与される。例えば、本出願を限定するものではないが、各単位投与量には５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇのＨＰＶウイルス様粒子が含まれる。
【００６３】
別の態様では、本出願は、上記の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を調製する方法であって、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を宿主細胞内で発現させ、次いで宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を回収することを含む、方法に関する。
【００６４】
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を大腸菌において発現させ、次いで、大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を得るステップを含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を、クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって、大腸菌の溶解物上清から回収する。
【００６５】
別の態様では、本出願は、ワクチンを調製するための方法であって、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と組み合わせることを含む、方法に関する。
【００６６】
別の態様では、本出願は、ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための方法であって、予防的有効量の本出願によるＨＰＶウイルス様粒子または医薬組成物もしくはワクチンを対象に投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、および／またはＨＰＶ２６感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患としては、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマが挙げられるが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
【００６７】
別の態様では、本出願はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、本出願による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体またはＨＰＶウイルス様粒子の使用に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、および／またはＨＰＶ２６感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患としては、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
別の態様では、本出願はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための、本出願による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体またはＨＰＶウイルス様粒子に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、および／またはＨＰＶ２６感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患としては、子宮頸がんおよび尖圭コンジローマが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本出願における用語の定義
本出願において、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されている定型的な操作である。一方、本出願をよりよく理解するために、関連する用語の定義および説明を以下に示す。
【００７０】
本出願によれば、「第２の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ５１以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本出願では、第２の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ６９である。
【００７１】
本出願によれば、「第３の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ５１および第２の型の野生型ＨＰＶ以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本出願では、第３の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ２６である。
【００７２】
本出願によれば、「対応する位置」という表現は、配列が最適にアラインメントされている場合、すなわち、配列が最も高いパーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされている場合に比較される配列の同等の位置を指す。
【００７３】
本出願によれば、「野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス５１型（ＨＰＶ５１）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において周知であり、公開データベース（ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＣＶ８８６３１．１、ＡＬＪ３２９３０．１、ＣＲＨ６９９０３．１およびＡＪＳ１０５４０．１など）中に見出すことができる。
【００７４】
本出願では、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列について言及される場合、それは、配列番号１に記載の配列を参照することによって説明される。例えば、「野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１に記載のポリペプチドの５２〜６０位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、野生型ＨＰＶ５１が種々の単離菌を含み得、種々の単離菌間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異がある場合があることを理解している。さらに、当業者は、配列に差異がある場合があるが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ５１単離菌間で非常に高い同一性を有し（一般に、９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。したがって、本出願では、「野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ５１単離菌のＬ１タンパク質（番号ＡＣＶ８８６３１．１、ＡＬＪ３２９３０．１、ＣＲＨ６９９０３．１、およびＡＪＳ１０５４０．１に記載のＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質など）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号１の配列断片だけでなく、種々のＨＰＶ５１単離菌のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、「野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１の５２〜６０位のアミノ酸残基、および種々のＨＰＶ５１単離菌のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００７５】
本出願によれば、「野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス６９型（ＨＰＶ６９）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において周知であり、公開データベース（ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＨＶ８３６５４．１、ＡＬＪ３２８４４．１、およびＡＬＪ３２８２８．１など）中に見出すことができる。
【００７６】
本出願では、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列について言及される場合、それは、配列番号２に記載の配列を参照することによって説明される。例えば、「野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２に記載のポリペプチドの５２〜６０位のアミノ酸残基を指し；「野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２に記載のポリペプチドの１７０〜１８３位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、野生型ＨＰＶ６９が種々の単離菌を含み得、種々の単離菌間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異がある場合があることを理解している。さらに、当業者は、配列に差異がある場合があるが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ６９単離菌間で非常に高い同一性を有し（一般に、９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。したがって、本出願では、「野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号２に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ６９単離菌のＬ１タンパク質（ＡＨＶ８３６５４．１、ＡＬＪ３２８４４．１、およびＡＬＪ３２８２８．１に記載のＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質など）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号２の配列断片だけでなく、種々のＨＰＶ６９単離菌のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、「野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２の５２〜６０位のアミノ酸残基および種々のＨＰＶ６９単離菌のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００７７】
本出願によれば、「野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス２６型（ＨＰＶ２６）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において周知であり、公開データベース（ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＮＰ０４１７８７．１、ＡＨＹ９６０４６．１、およびＡＨＹ９６０５３．１など）中に見出すことができる。
【００７８】
本出願では、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列について言及される場合、それは、配列番号２２に記載の配列を参照することによって説明される。例えば、「野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２２に記載のポリペプチドの５１〜６０位のアミノ酸残基を指し；「野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２２に記載のポリペプチドの１７３〜１８１位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、野生型ＨＰＶ２６が種々の単離菌を含み得、種々の単離菌間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異がある場合があることを理解している。さらに、当業者は、配列に差異がある場合があるが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ２６単離菌間で非常に高い同一性を有し（一般に、９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。したがって、本出願では、「野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号２２に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ２６単離菌のＬ１タンパク質（ＮＰ０４１７８７．１、ＡＨＹ９６０４６．１およびＡＨＹ９６０５３．１に記載のＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質など）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号２２の配列断片だけでなく、種々のＨＰＶ２６単離菌のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、「野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２２の５１〜６０位のアミノ酸残基および種々のＨＰＶ２６単離菌のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００７９】
本出願によれば、「対応する配列断片」または「対応する断片」という表現は、配列が最適にアラインメントされている場合、すなわち、配列が最も高いパーセンテージの同一性を得るようにアラインメントされている場合に比較される配列の同等の位置に配置されている断片を指す。
【００８０】
本出願によれば、「Ｎ末端でのＸ個のアミノ酸の短縮化」または「Ｎ末端でＸアミノ酸が短縮化された」という表現は、あるタンパク質のＮ末端での１〜Ｘ位のアミノ酸残基の、（タンパク質翻訳を開始するための）開始コドンによってコードされたメチオニン残基による置換を指す。例えば、Ｎ末端で９個のアミノ酸が短縮化されたＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端の１〜９位のアミノ酸残基を、開始コドンによってコードされるメチオニン残基により置換した結果生じるタンパク質を指す。
【００８１】
本出願によれば、「変異体」という用語は、本出願による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号５または６に記載のタンパク質）と比較して、そのアミノ酸配列が１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加または欠失を有するか、または少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、本発明による変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の機能を保持するタンパク質を指す。本出願では、「変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９）に対する中和抗体の産生を誘導する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の類似性の尺度を指す。一般に、配列は、最大の一致を得るようにアラインメントされた。「同一性」は、当技術分野において周知の意味を有し、公開されたアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によって計算することができる。
【００８２】
本出願によれば、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列がある特定の部位に塩基またはアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれがある特定の部位にアデニンを有する、または２つのポリペプチドのそれぞれがある特定の部位にリシンを有する）、２つの分子はその部位において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較の部位の総数に対する２つの配列が共有する同一の部位の数の関数×１００である。例えば、２つの配列の１０部位のうち６部位が一致する場合、これら２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは５０％の同一性を共有する（６部位のうち３部位が一致している）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性が生じる方法で実施する。そのようなアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁、１９７０年）に基づいて、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを使用することによって実施することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）を使用し、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ重み１、２、３、４、５、または６を用いて、決定することができる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利に影響を与えたり、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性を変化させたりしないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的または機能的に類似の残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性など、を有する）により置換される置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、およびトリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、およびメチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（スレオニン、バリン、およびイソロイシンなど）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）、が含まれる。したがって、一般に、保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２巻（１０）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照のこと、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８４】
本出願によれば、「大腸菌発現系」という用語は、大腸菌（株）およびベクターからなる発現系を指し、大腸菌（株）は、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）を含むがこれらに限定されない市販の株に由来する。
【００８５】
本出願によれば、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸担体ツールを指す。ベクターにより、その中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現が可能になる場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって、宿主細胞で発現する担持された遺伝物質要素を有することができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
本出願によれば、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、当技術分野において周知であり、対象および活性成分に薬理学的および／または生理学的に適合性のある担体および／または賦形剤であって（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度増強剤が含まれるが、これらに限定されない、担体および／または賦形剤を指す。例えば、ｐＨ調整剤には、リン酸緩衝液が含まれるが、これに限定されない；界面活性剤には、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が含まれるが、これらに限定されない；アジュバントには、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、およびフロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）が含まれるが、これらに限定されない；ならびにイオン強度増強剤には、ＮａＣｌが含まれるが、これに限定されない。
【００８７】
本出願によれば、「有効量」という用語は、意図された目的を有効に達成することができる量を指す。例えば、疾患（ＨＰＶ感染など）の予防に有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、または遅延させるのに有効な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００８８】
本出願によれば、「クロマトグラフィー」という用語は、イオン交換クロマトグラフィー（カチオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収性クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、およびアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
本出願によれば、「溶解物上清」という用語は、宿主細胞（大腸菌など）を溶解緩衝液中で破壊し、次に、破壊された宿主細胞を含有する溶解溶液から不溶性物質を除去するステップによって生成される溶液を指す。トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などを含むがこれらに限定されない種々の溶解緩衝液が、当技術分野において周知である。加えて、宿主細胞の破壊は、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出、リゾチーム処理などを含むがこれらに限定されない当業者に周知の方法によって達成することができる。濾過および遠心分離を含むがこれらに限定されない、不溶性物質を除去するための方法もまた、当業者に周知である。
【発明の効果】
【００９０】
本出願の有益な効果
研究によると、ＨＰＶ５１と他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９および／またはＨＰＶ２６など）との間には、ある特定の交差防御が存在するが、そのような交差防御は非常に低く、一般に１％未満、さらには同じＨＰＶ型のＶＬＰの保護レベルの１０００分の１である。したがって、ＨＰＶ５１ワクチンでワクチン接種された対象は、他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９および／またはＨＰＶ２６など）に感染するリスクが依然として高い。
【００９１】
本出願は、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質およびそれによって形成されたＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ５１および他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６９および／またはＨＰＶ２６など）に対して有意な交差防御を提供することができる。特に、同じ免疫量で、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子は、生物において少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９、またはＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６）に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その効果は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ５１  ＶＬＰとＨＰＶ６９  ＶＬＰとの混合物、またはＨＰＶ５１  ＶＬＰ、ＨＰＶ６９  ＶＬＰ、およびＨＰＶ２６  ＶＬＰの混合物）の効果と同等である。したがって、本出願によるＨＰＶウイルス様粒子を使用して、少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９、またはＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６）による感染、ならびに感染に関連する疾患を同時に予防することができ、ＨＰＶウイルス様粒子は、非常に有益な技術的効果がある。これには、ＨＰＶワクチンの防御範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの製造コストを削減するという点で特に大きな利点がある。
【００９２】
本出願の実施形態は、図面および実施例を参照することによってさらに詳細に説明される。しかし、当業者は、以下の図面および実施例が、本出願の範囲を定義するのではなく、本出願を説明することのみを目的としていることを理解するであろう。以下の図面および好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本出願の種々の目的および利点は、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１Ａ】実施例１における精製された変異タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１：タンパク質分子量マーカー；レーン２：ＨＰＶ５１Ｎ９（Ｎ末端で９アミノ酸が短縮化されたＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質）；レーン３：ＨＰＶ６９Ｎ０（完全長野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質）；レーン４：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１（配列番号４に記載の変異タンパク質）；レーン５：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２（配列番号５に記載の変異タンパク質）；レーン６：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３（配列番号６に記載の変異タンパク質）；レーン７：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４（配列番号７に記載の変異タンパク質）；レーン８：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５（配列番号８に記載の変異タンパク質）。結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５が約９０％の純度に達したことを示した。
【図１Ｂ】実施例１における精製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が約８０〜９０％の比較的高い純度に達したことを示した。
【図１Ｃ】実施例１における精製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が約８０〜９０％の比較的高い純度に達したことを示した。
【図１Ｄ】実施例１における精製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が約８０〜９０％の比較的高い純度に達したことを示した。
【図２Ａ】ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用することによって決定された、実施例１で調製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５のウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：タンパク質分子量マーカー；レーン２：ＨＰＶ５１Ｎ９（Ｎ末端で９アミノ酸が短縮化されたＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質）；レーン３：ＨＰＶ６９Ｎ０（完全長野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質）；レーン４：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１；レーン５：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２；レーン６：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３；レーン７：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４；レーン８：Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５。結果は、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５を、広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識することができることを示した。
【図２Ｂ】ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用することによって決定された、実施例１で調製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のウエスタンブロッティングの結果を示す。結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識できることを示した。
【図２Ｃ】ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用することによって決定された、実施例１で調製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のウエスタンブロッティングの結果を示す。結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識できることを示した。
【図２Ｄ】ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用することによって決定された、実施例１で調製された変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５のウエスタンブロッティングの結果を示す。結果は、クロマトグラフィー精製後、変異タンパク質が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識できることを示した。
【図３】モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析された、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４またはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５を含む試料の結果を示す。結果は、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、またはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが約１３〜１４分に現れ、これはＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰのピークと同等であることを示していた。これは、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５が、組織化してすべて均一なサイズのＶＬＰになることができることを示していた。
【図４】モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析された、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３またはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５、を含む試料の結果を示す。結果は、これらの変異ＶＬＰの最初のタンパク質ピークが約１３〜１４分に現れ、これはＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰのピークと同等であることを示していた。これは、これらの変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５が、組織化してすべて均一なサイズのＶＬＰになることができることを示していた。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４またはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５によって形成されたＶＬＰは、不均一なサイズであった。
【図５】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１４８Ｓ、１３５Ｓ、１１７Ｓ、および１３１Ｓであることを示していた。これは、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４はすべて、組織化してサイズおよび形態の点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、１２３Ｓ）に類似したウイルス様粒子になることができることを示していた。
【図６】変異Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１４８Ｓ、１３０Ｓ、１３１Ｓ、１３０Ｓ、１３５Ｓ、１４０Ｓ、１３５Ｓ、１４４Ｓ、１３３Ｓ、１３１Ｓ、１６１Ｓ、１４０Ｓ、１３７Ｓ、１３２Ｓ、１２６Ｓ、および４８Ｓであり、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰは均一性が低く、２つの異なるサイズを有していることを示していた。
【図７】種々のＶＬＰ試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１００，０００×の倍率で撮影、バー＝０．１μｍ）を示しており、Ａは、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｂは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｃは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｄは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｅは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｆは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｇは、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示している。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰが，ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰと類似しており、これらの変異タンパク質が、組織化して半径約２５ｎｍのＶＬＰになることができることを示していた。
【図８】種々のＶＬＰ試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１００，０００×の倍率で撮影、バー＝０．１μｍ）を示しており、Ａは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｂは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｃは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示しており；Ｄは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示している。結果は、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４を除いて、他の変異タンパク質が、組織化して半径約２５ｎｍのＶＬＰになることができることを示していた。
【図９】ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの識別結果を示しており、Ａは、モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析したＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの結果を示しており；Ｂは、ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示しており；Ｃは、ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰのＴＥＭ写真を示している。
【図１０Ａ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１０Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１０Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【図１０Ｂ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１０Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１０Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【図１１Ａ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１１Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１１Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【図１１Ｂ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１１Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１１Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【図１２Ａ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１２Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１２Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【図１２Ｂ】Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰでマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図１２Ａ：アルミニウムアジュバント群１（５．０μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図１２Ｂ：アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
配列情報
本出願に関連する配列の一部を、以下の表１に提供する。
【００９５】
【表１−１】
2022502057.tif 000002
【００９６】
【表１−２】
2022502057.tif 000003
【００９７】
【表１−３】
2022502057.tif 000004
【００９８】
【表１−４】
2022502057.tif 000005
【００９９】
配列１（配列番号１）：
MALWRTNDSKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列２（配列番号２）：
MALWRTSDSKVYLPPTPVSRVVSTDEYVTRTGIYYYAGSSRLLTLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAYQYRVFRVHLPDPNKFGLPDPQLYNPETERLVWACVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKLDDTENSHLATANADTDNRDNVCVDNKQTQLCIIGCTPPLGEHWGVGTVCKNAQSQVQRGDCPPLELISSVIEDGDMIDTGFGAMDFTALQATKCDVPLDINQSICKYPDYLKMSADTYGNSMFFFLRREQLFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMVTSDAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTCVDTTRSTNLTISTVSAQSASATFKPSDYKQFIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTDVMAYIHTMNSTILENWNFGLTLPPTASLEDAYRFIKNSATTCQRDAPAQPKEDPFSKLKFWDVDLKEKFSIDLDQFPLGRKFMLQAGIQRRPKLGTKRPASSLSASSSSTTRKKRKLTK
配列３（配列番号３）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列４（配列番号４）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列５（配列番号５）：
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配列６（配列番号６）：
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配列７（配列番号７）：
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配列８（配列番号８）：
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配列９（配列番号９）：
ATGGCCCTGTGGAGGACCAACGACAGCAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１０（配列番号１０）：
ATGGCTCTGTGGCGTACCTCTGACTCTAAAGTTTACCTGCCGCCGACCCCGGTTTCTCGTGTTGTTTCTACCGACGAATACGTTACCCGTACCGGTATCTACTACTACGCTGGTTCTTCTCGTCTGCTGACCCTGGGTCACCCGTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGGTCTCTGCTTACCAGTACCGGGTATTCCGTGTCCACCTGCCGGACCCGAACAAATTCGGTCTGCCGGACCCGCAGCTGTACAATCCAGAAACCGAACGTCTGGTTTGGGCTTGCGTTGGTGTCGAGGTCGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAACAGACCCAGCTGTGCATCATCGGTTGCACCCCGCCGCTGGGTGAACACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAACTGATCTCTTCTGTTATCGAAGACGGTGACATGATCGACACCGGTTTCGGTGCTATGGACTTCACCGCTCTGCAGGCTACCAAATGCGACGTTCCGCTGGACATCAACCAGTCTATCTGCAAATACCCCGACTACCTGAAAATGTCTGCTGACACCTACGGTAACTCTATGTTCTTCTTCCTGCGTCGTGAACAGCTGTTCGCTCGTCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCTACCCCGTCTGGTTCTATGGTTACATCCGACGCTCAGCTGTTCAACAAACCGTACTGGCTGCAGCGTGCTCAGGGTCACAACAACGGTATCTGCTGGGGTAACCAGCTGTTCGTTACCTGCGTTGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACCGTTTCTGCTCAGTCTGCTTCTGCTACCTTCAAACCGTCTGACTACAAACAATTTATCCGTCACGGTGAAGAATACGAACTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAAATCACCCTGACCACCGACGTTATGGCTTACATCCACACCATGAACTCTACCATCCTGGAAAACTGGAACTTCGGTCTGACCCTGCCGCCGACCGCTTCTCTGGAAGACGCTTACCGTTTCATCAAAAACTCTGCTACCACCTGCCAGCGTGACGCTCCGGCTCAGCCGAAAGAAGACCCGTTCTCTAAACTGAAATTCTGGGACGTTGACCTGAAAGAAAAATTCTCTATCGACCTGGACCAGTTCCCGCTGGGTCGTAAATTCATGCTGCAGGCTGGTATCCAGCGTCGTCCGAAACTGGGTACCAAACGTCCGGCTTCTTCTCTGTCTGCTTCTTCTTCTTCTACCACCCGTAAAAAACGTAAACTGACCAAATAA
配列１１（配列番号１１）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１２（配列番号１２）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGGTCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１３（配列番号１３）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１４（配列番号１４）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１５（配列番号１５）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１６（配列番号１６）：
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTCAGTCTGCTTCTGCTACCTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列１７（配列番号１７）：
IPKSGSTAE
配列１８（配列番号１８）：
LDDTENSHLATANADTDNRDNVC
配列１９（配列番号１９）：
VGTVCKNAQSQVQR
配列２０（配列番号２０）：
FFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTS
配列２１（配列番号２１）：
SAQSASATFKPSD
配列２２（配列番号２２）：
MALWRTSDSKVYLPPTPVSRVVNTDEYVTRTGIYYYAGSSRLLTLGHPYFSIPKTGQKAEIPKVSAYQYRVFRVHLPDPNKFGLPDPQLYNPDTERLVWACVGVEVGRGQPLGIGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNVSVDNKQTQLCIIGCTPPLGEHWGIGTICKNTQTQRGDCPPLELISSIIEDGDMIDTGFGAMDFTALQATKSDVPIDISQSTCKYPDYLKMSADTYGNSMFFFLRREQLFARHFYNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTSSIYSATPSGSMVTSDAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTCVDTTRSTNLTISTLSAASASTPFKPSDYKQFIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTDVMAYIHLMNASILEDWNFGLTLPPTASLEDAYRFIKNSATTCQRNAPPVPKEDPFQKFKFWDVDLKEKFSIDLDQFPLGRKFMLQAGIQRRPKLGTKRPLSSTSSSTKRKKRKLTK
配列２３（配列番号２３）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGIGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNVSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列２４（配列番号２４）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTICKNTQTQRGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列２５（配列番号２５）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFYNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTSSIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列２６（配列番号２６）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTASAASASTPFKPSDFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列２７（配列番号２７）：
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配列２８（配列番号２８）：
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配列２９（配列番号２９）：
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配列３０（配列番号３０）：
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配列３１（配列番号３１）：
配列番号２２をコードするＤＮＡ配列
ATGGCTCTGTGGCGTACCTCTGACTCTAAAGTTTACCTGCCGCCGACCCCGGTTTCTCGTGTTGTTAACACCGACGAATACGTTACCCGTACCGGTATCTACTACTACGCTGGTTCTTCTCGTCTGCTGACCCTGGGTCACCCGTACTTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAGTTTCTGCTTACCAGTACCGTGTTTTCCGTGTTCACCTGCCGGACCCGAACAAATTCGGTCTGCCGGACCCGCAGCTGTACAACCCGGACACCGAACGTCTGGTTTGGGCTTGCGTTGGTGTTGAAGTTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGTTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTCTGTTGACAACAAACAGACCCAGCTGTGCATCATCGGTTGCACCCCGCCGCTGGGTGAACACTGGGGTATCGGTACCATCTGCAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAACTGATCTCTTCTATCATCGAAGACGGTGACATGATCGACACCGGTTTCGGTGCTATGGACTTCACCGCTCTGCAGGCTACCAAATCTGACGTTCCGATCGACATCTCTCAGTCTACCTGCAAATACCCGGACTACCTGAAAATGTCTGCTGACACCTACGGTAACTCTATGTTCTTCTTCCTGCGTCGTGAACAGCTGTTCGCTCGTCACTTCTACAACAAAGCTGGTGCTGTTGGTGACGCTATCCCGACCACCCTGTACATCAAAGGTGCTGAATCTGGTCGTGAACCGCCGACCTCTTCTATCTACTCTGCTACCCCGTCTGGTTCTATGGTTACCTCTGACGCTCAGCTGTTCAACAAACCGTACTGGCTGCAGCGTGCTCAGGGTCACAACAACGGTATCTGCTGGGGTAACCAGCTGTTCGTTACCTGCGTTGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACCCTGTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCGTCTGACTACAAACAGTTCATCCGTCACGGTGAAGAATACGAACTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAAATCACCCTGACCACCGACGTTATGGCTTACATCCACCTGATGAACGCTTCTATCCTGGAAGACTGGAACTTCGGTCTGACCCTGCCGCCGACCGCTTCTCTGGAAGACGCTTACCGTTTCATCAAAAACTCTGCTACCACCTGCCAGCGTAACGCTCCGCCGGTTCCGAAAGAAGACCCGTTCCAGAAATTCAAATTCTGGGACGTTGACCTGAAAGAAAAATTCTCTATCGACCTGGACCAGTTCCCGCTGGGTCGTAAATTCATGCTGCAGGCTGGTATCCAGCGTCGTCCGAAACTGGGTACCAAACGTCCGCTGTCTTCTACCTCTTCTTCTACCAAACGTAAAAAACGTAAACTGACCAAATAA
配列３２（配列番号３２）：
配列番号２３をコードするＤＮＡ配列
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配列３３（配列番号３３）：
配列番号２４をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGGTCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTGCAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列３４（配列番号３４）：
配列番号２５をコードするＤＮＡ配列
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配列３５（配列番号３５）：
配列番号２６をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGGTCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列３６（配列番号３６）：
配列番号２７をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAGTTTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列３７（配列番号３７）：
配列番号２８をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGTTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTCTGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列３８（配列番号３８）：
配列番号２９をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTACAACAAAGCTGGTGCTGTTGGTGACGCTATCCCGACCACCCTGTACATCAAAGGTGCTGAATCTGGTCGTGAACCGCCGACCTCTTCTATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列３９（配列番号３９）：
配列番号３０をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列４０（配列番号４０）：
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配列４１（配列番号４１）：
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配列４２（配列番号４２）：
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配列４３（配列番号４３）：
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配列４４（配列番号４４）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFSIPKTGQKAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列４５（配列番号４５）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGIGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNVSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列４６（配列番号４６）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTICKNTQTQRGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列４７（配列番号４７）：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTASAASASTPFKPSDFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK
配列４８（配列番号４８）：
配列番号４０をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAGTTTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列４９（配列番号４９）：
配列番号４１をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTGCAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５０（配列番号５０）：
配列番号４２をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTACAACAAAGCTGGTGCTGTTGGTGACGCTATCCCGACCACCCTGTACATCAAAGGTGCTGAATCTGGTCGTGAACCGCCGACCTCTTCTATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５１（配列番号５１）：
配列番号４３をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５２（配列番号５２）：
配列番号４４をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAGTTTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５３（配列番号５３）：
配列番号４５をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGCTACCGTTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTCTGTTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５４（配列番号５４）：
配列番号４６をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTGCAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５５（配列番号５５）：
配列番号４７をコードするＤＮＡ配列
ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCACATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
配列５６（配列番号５６）：
SIPKTGQKAE
配列５７（配列番号５７）：
IGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNV
配列５８（配列番号５８）：
ICKNTQTQR
配列５９（配列番号５９）：
FYNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTSS
配列６０（配列番号６０）：
SAASASTPFKPSD
本出願を実行するための特定の様式
本出願は、以下の実施例を参照することによってさらに説明され、ここで、実施例は、本出願を限定するのではなく、本出願を説明する目的でのみ使用される。
【０１００】
特に指示がない限り、本出願で使用される分子生物学的実験方法および免疫学的アッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５年に記載されている方法に従って実質的に実施され；制限酵素を、製造者が推奨する条件下で使用する。当業者は、実施例が本出願を説明するために使用されるが、本出願の保護範囲を限定することを意図するものではないことを理解している。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の発現および精製
発現ベクターの構築
ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ＤＧ、Ｙｏｕｎｇ  Ｌ、Ｃｈｕａｎｇ  ＲＹ、Ｖｅｎｔｅｒ  ＪＣ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＣＡ、Ｓｍｉｔｈ  ＨＯ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９年；６：３４３−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１８）を使用して、ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質からの特定のセグメントおよび／またはＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質からの特定のセグメントを含む変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。簡単に説明すると、変異を含む短い断片と変異を含まない長い断片とを、最初にＰＣＲによって得て、次にギブソンアセンブリシステムを使用して２つの断片をライゲーションして環を形成した。
【０１０２】
使用した最初の鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５１Ｎ９Ｃ（Ｎ末端で９個のアミノ酸が短縮化されたＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質をコードし、表２では５１Ｌ１Ｎ９と略記されている）、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６９Ｎ０Ｃ（完全長ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質をコードし、表２では６９Ｌ１Ｎ０と略記されている）、およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ２６Ｎ０Ｃ（完全長ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質をコードし、表２では２６Ｌ１Ｎ０と略記されている）で構成されていた。各ＰＣＲの鋳型およびプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下のとおりである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、所定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；および７２℃で１０分間の最終伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下のとおりである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、所定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；および７２℃で１０分間の最終伸長。アニーリングの温度および時間を、表２に列挙した。使用したＰＣＲプライマーの配列を、表３に列挙した。増幅産物を電気泳動にかけ、ＤＮＡ抽出キット（ＢＥＹＯＴＩＭＥ、カタログ番号Ｄ００３３）を使用して目的の断片を回収し、その濃度を決定した。増幅によって得られた短い断片と長い断片とを、２：１のモル比（総量３μＬ）で混合し、次に３μＬの２×ギブソンアセンブリマスターミックス（ＮＥＢから購入、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有）を加え、５０℃で１時間反応させた。
【０１０３】
組織化した生成物（６μＬ）を使用して、塩化カルシウム法で調製した４０μＬのコンピテント大腸菌  ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を形質転換した。形質転換した大腸菌を、カナマイシン（最終濃度２５μｇ／ｍＬ、以下同様）を含有する固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、以下同様）に拡散させ、単一コロニーがはっきりと観察されるまで、３７℃で１０〜１２時間静置培養に供した。単一コロニーを採取して、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含有する）を含有するチューブに播種し、３７℃にて１０時間、２２０ｒｐｍで振とうしながら培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを使用してプラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、および５５であり、それらのコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５、６、７、８、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、および４７（対応するタンパク質は、それぞれＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５、と指定された）であることを示していた。
【０１０４】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の３５０〜３６２位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１０５】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１０６】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１０７】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１０８】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の３４８〜３６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１０９】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１０】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１１】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１２】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の３４８〜３６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１３】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１４】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１５】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１６】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の３４８〜３６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１７】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１８】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１１９】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１２０】
変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５は、ＨＰＶ５１Ｎ９とは、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基により置換されており、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の３４８〜３６０位のアミノ酸残基により置換されている点が異なっている。
【０１２１】
【表２−１】
2022502057.tif 000006
【０１２２】
【表２−２】
2022502057.tif 000007
【０１２３】
【表２−３】
2022502057.tif 000008
【０１２４】
【表３−１】
2022502057.tif 000009
【０１２５】
【表３−２】
2022502057.tif 000010
【０１２６】
【表３−３】
2022502057.tif 000011
【０１２７】
【表３−４】
2022502057.tif 000012
【０１２８】
大規模な変異タンパク質の発現
組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５、それぞれを含む大腸菌溶液を、−７０℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ液体培地中に播種し、２００ｒｐｍで３７℃にて約８時間インキュベートした。次に、培養物を、カナマイシンを含有する５００ｍＬのＬＢ培地に移し（１ｍｌの細菌溶液を移した）、さらにインキュベートした。細菌濃度が約０．６のＯＤ６００に達したら、培養温度を２５℃に下げ、５００μＬのＩＰＴＧを各培養ボトルに加えた。インキュベーションをさらに８時間行った。培養終了後、遠心分離により細菌を回収した。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５タンパク質を発現する細菌を、それぞれ得た。
【０１２９】
変異タンパク質を発現する細菌の破壊
上記で得られた細菌を、１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭのＮａＣｌ）に対する１ｇの細菌の比率で再懸濁した。超音波装置を３０分間使用して細菌を破壊した。破壊された細菌を含有する溶解液を、１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離し、上清（すなわち、破壊された細菌の上清）を得た。
【０１３０】
変異タンパク質のクロマトグラフィー精製
機器：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが製造したＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００分取液体クロマトグラフィーシステム（すなわち、元のＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏ．）
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）、ＣＨＴ−ＩＩ（Ｂｉｏ−ＲＡＤから購入）、およびＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）
以下の溶出プロトコルで使用される異なる濃度のＮａＣｌを含有する緩衝液を、緩衝液Ａと緩衝液Ｂをある特定の比率で混合することによって調製した。
【０１３１】
緩衝液：緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ）；および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ）。
【０１３２】
試料：上記で得られた、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３をそれぞれ含有する破壊された細菌の上清。
【０１３３】
溶出プロトコル：
（１）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによる破壊された細菌の上清のカチオン交換精製：試料をカラム上に充填し、次に不所望のタンパク質を４００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（８０％  緩衝液Ａ＋２０％  緩衝液Ｂ）で溶出し、続いて、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（６０％  緩衝液Ａ＋４０％  緩衝液Ｂ）により目的のタンパク質を溶出し、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画分を回収した；
（２）ステップ（１）で得られた溶出画分のＣＨＴＩＩ（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：ステップ（１）で得られた溶出画分を希釈して、ＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに下げた；試料をカラム上に充填し、次に不所望のタンパク質を５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（７５％  緩衝液Ａ＋２５％  緩衝液Ｂ）で溶出し、続いて、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（５０％  緩衝液Ａ＋５０％  緩衝液Ｂ）により目的のタンパク質を溶出し、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画分を回収した；
（３）ステップ（２）で得られた溶出画分のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：試料をカラム上に充填し、次に不所望のタンパク質を１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出し、続いて、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（９０％  緩衝液Ａ＋１０％  緩衝液Ｂ）により目的のタンパク質を溶出し、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液により溶出した画分を回収した。
【０１３４】
ステップ（３）で得られた１５０μＬの溶出画分を、３０μＬの６×ローディングバッファー（１Ｌ中には３００ｍｌの１Ｍ  ＴＢ  ６．８、６００ｍｌの１００％  グリセロール、１２０ｇのＳＤＳ、６ｇのブロモフェノールブルー、および５０ｍｌのβ−メルカプトエタノールが含まれている）に加えた。得られた溶液を十分に混合し、８０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。次に、１０μｌの得られた試料を、１２０Ｖで１２０分間１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ；電気泳動バンドを、クマシーブリリアントブルーで染色した。電気泳動の結果を、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに示した。結果は、上記の精製ステップの後、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５タンパク質の純度が約９０％であることを示した。
【０１３５】
類似の方法により、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５１Ｎ９Ｃを使用して、ＨＰＶ５１Ｎ９タンパク質を調製および精製した；大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６９Ｌ１Ｎ０Ｃを使用して、ＨＰＶ６９Ｎ０タンパク質を調製および精製した；大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ２６Ｌ１Ｎ０Ｃを使用して、ＨＰＶ２６Ｎ０タンパク質を調製および精製した。
【０１３６】
変異タンパク質のウエスタンブロットアッセイ
上記の方法で精製したＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５タンパク質を、電気泳動にかけた。電気泳動後、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用してウエスタンブロットアッセイを実行し、その結果を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄに示した。結果は、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５が、広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得ることを示した。
【０１３７】
実施例２
ＨＰＶウイルス様粒子の組織化および粒子の形態学的検出
ＨＰＶウイルス様粒子の組織化
所定の容量（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５を、（１）２Ｌ  保存緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；（２）２Ｌ  再生緩衝液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；（３）２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌに、連続して透析した。透析を、３つの緩衝液のそれぞれで１２時間行った。
【０１３８】
類似の方法によって、ＨＰＶ５１Ｎ９、ＨＰＶ６９Ｎ０、およびＨＰＶ２６Ｎ０タンパク質を、それぞれＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰに組織化させた。
【０１３９】
モレキュラーシーブクロマトグラフィー分析
透析した試料を、１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析にかけ、使用された分析カラムは、ＴＳＫゲルＰＷ５０００×１７．８×３００ｍｍであった。ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの分析結果を図９に示し、他の試料の分析結果を、図３および４に示した。結果は、タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが約１３〜１４分に現れ、これはＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰのピークと同等であることを示していた。これは、変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５を除いて、他の変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５が、組織化してすべて均一なサイズのＶＬＰになることができることを示していた。変異タンパク質Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４またはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５によって形成されたＶＬＰは、不均一なサイズであった。
【０１４０】
沈降速度分析
沈降速度分析用の装置は、光学検査システムならびにＡｎ−５０ＴｉおよびＡｎ−６０Ｔｉローターを装備したＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ分析用超遠心機であった。ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数を、沈降速度法によって分析した。ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの分析結果を図９に示し、他の試料の分析結果を、図５および６に示した。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１４８Ｓ、１３５Ｓ、１１７Ｓ、１３１Ｓ、１４８Ｓ、１３０Ｓ、１３１Ｓ、１３０Ｓ、１３５Ｓ、１４０Ｓ、１３５Ｓ、１４４Ｓ、１３３Ｓ、１３１Ｓ、１６１Ｓ、１４０Ｓ、１３７Ｓ、１３２Ｓ、１２６Ｓ、および４８Ｓであり、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰは均一性が低く、２つの異なるサイズを有していることを示していた。
【０１４１】
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む１００μＬの試料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置は、ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．が提供する１００ｋＶの透過型電子顕微鏡（倍率１００，０００×）であった。簡単に説明すると、１３．５μＬの試料を、２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）でネガティブ染色し、カーボンコーティング銅グリッド上に固定して、ＴＥＭで観察した。ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰのＴＥＭ写真を図９に示し、他の試料のＴＥＭ写真を、図７および８に示した。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰを除いて、他のＶＬＰｓ  Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰはＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰと類似しており、半径が約２５ｎｍであることを示していた。
【０１４２】
実施例３
ウイルス様粒子でワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価１
この実験では、使用されたウイルス様粒子は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５  ＶＬＰであった。
【０１４３】
この実験では、ワクチン接種手順を、表４に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌型マウス）を２群に分けた、すなわち、アルミニウムアジュバント群１（５μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。各群を、さらに８つの部分群に分けた。対照部分群１および２には、それぞれＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独でおよびＨＰＶ６９Ｎ０ＶＬＰ単独でワクチン接種し、対照部分群３には、混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰとＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰとの混合物で、各ＶＬＰの所定の免疫量にて）ワクチン接種した。実験部分群１、２、３、４、および５には、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ５ＶＬＰでそれぞれ、ワクチン接種した。
【０１４４】
アルミニウムアジュバント群１〜２では、５匹のマウス／部分群に、それぞれ５μｇおよび１μｇの免疫量、ならびに１ｍＬの注射量で腹腔内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは、０週目に最初のワクチン接種を受け、次に２週目と４週目にそれぞれ追加免疫ワクチン接種を受けた。８週目に、眼窩出血を介して血液試料を収集し、血清中のＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示した。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。
【０１４５】
これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１およびＨＰＶ６９に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【０１４６】
【表４】
2022502057.tif 000013
【０１４７】
実施例４
ウイルス様粒子でワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価２
この実験では、使用されたウイルス様粒子は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰであった。
【０１４８】
この実験では、ワクチン接種手順を、表５に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌型マウス）を２群に分けた、すなわち、アルミニウムアジュバント群１（５μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。各群を、さらに１２の部分群に分けた。対照部分群１、２および３には、それぞれＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独で、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独で、およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独でワクチン接種し、対照部分群４には、混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰで（すなわち、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの混合物で、各ＶＬＰの所定の免疫量にて）、ワクチン接種した。実験部分群１、２、３、４、５、６、７および８には、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ４  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ５  ＶＬＰ、でそれぞれ、ワクチン接種した。
【０１４９】
アルミニウムアジュバント群１〜２では、５匹のマウス／部分群に、それぞれ５μｇおよび１μｇの免疫量、ならびに１ｍＬの注射量で腹腔内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは、０週目に最初のワクチン接種を受け、次に２週目と４週目にそれぞれ追加免疫ワクチン接種を受けた。８週目に、眼窩出血を介して血液試料を収集し、血清中のＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示した。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【０１５０】
【表５−１】
2022502057.tif 000014
【０１５１】
【表５−２】
2022502057.tif 000015
【０１５２】
実施例５
ウイルス様粒子でワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価３
この実験では、使用されたウイルス様粒子は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰであった。
【０１５３】
この実験では、ワクチン接種手順を、表６に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌型マウス）を２群に分けた、すなわち、アルミニウムアジュバント群１（５μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（１μｇの免疫量で、アルミニウムアジュバントを使用）。各群を、さらに１２の部分群に分けた。対照部分群１、２および３には、それぞれＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独で、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独で、およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独でワクチン接種し、対照部分群４には、混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰで（すなわち、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰの混合物で、各ＶＬＰの所定の免疫量にて）、ワクチン接種した。実験部分群１、２、３、４、５、６、７および８には、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ５ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ５  ＶＬＰでそれぞれ、ワクチン接種した。
【０１５４】
アルミニウムアジュバント群１〜２では、５匹のマウス／部分群に、それぞれ５μｇおよび１μｇの免疫量ならびに１ｍＬの注射量で腹腔内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスは、０週目に最初のワクチン接種を受け、次に２週目と４週目にそれぞれ追加免疫ワクチン接種を受けた。８週目に、眼窩出血を介して血液試料を収集し、血清中のＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図１２Ａおよび１２Ｂに示した。結果は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ５１に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示していた。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ６９に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ２６に対する高力価中和抗体の産生を誘導することもでき、それらの防御効果は、同じ用量でのＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独の防御効果および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量でのＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【０１５５】
【表６−１】
2022502057.tif 000016
【０１５６】
【表６−２】
2022502057.tif 000017
【０１５７】
実施例６
セロコンバージョンを誘導するためのウイルス様粒子のＥＤ５０の評価
この実験では、使用されたウイルス様粒子は、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰであった。
【０１５８】
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌型マウス（８匹のマウス）に、単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントでワクチン接種し、実験群において、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ１−２６Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰまたはＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰ（０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇおよび０．０１１μｇの免疫量で）を使用し、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰを単独で、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰを単独で、ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰを単独で（０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、および０．０１１μｇの免疫量で）、または混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ、  ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ２６Ｎ１０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰに対して０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、および０．０１１μｇの免疫量で）を使用して；免疫容量は１ｍＬであった。加えて、ワクチンを希釈するために使用された希釈剤を、ブランク対照として使用した。各群において８匹のマウスにワクチン接種し、ワクチン接種後５週目に眼球から静脈血を収集した。血清中のＨＰＶに対する抗体を検出し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ＭＨ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ．１９３８年；２７巻：４９３〜７頁）により、セロコンバージョンを誘導する（すなわち、マウスにおける抗体の産生を誘導する）ためのＥＤ５０を、各試料について計算した。結果を表７に示した。
【０１５９】
【表７】
2022502057.tif 000018
【０１６０】
結果は、マウスへのワクチン接種の５週間後、マウスにおけるＨＰＶ５１に対する抗体の産生を誘導するためのＨ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰのＥＤ５０が、ＨＰＶ５１Ｎ９ＶＬＰ単独のＥＤ５０、および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰのＥＤ５０と同等であり、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独のＥＤ５０およびＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独のＥＤ５０よりも有意に優れていることを示し；ＨＰＶ６９に対する抗体の産生を誘導するためのそれらのＥＤ５０が、ＨＰＶ６９Ｎ０  ＶＬＰ単独のＥＤ５０、および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰのＥＤ５０と同等であり、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独のＥＤ５０よりも有意に優れていることを示し；ＨＰＶ２６に対する抗体の産生を誘導するためのそれらのＥＤ５０が、ＨＰＶ２６Ｎ０  ＶＬＰ単独のＥＤ５０、および混合ＨＰＶ５１／ＨＰＶ６９／ＨＰＶ２６  ＶＬＰのＥＤ５０と同等であり、ＨＰＶ５１Ｎ９  ＶＬＰ単独のＥＤ５０よりも有意に優れていることを示していた。これは、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ２−２６Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５１Ｎ９−６９Ｔ３−２６Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５１Ｎ９−６９Ｔ４−２６Ｓ２  ＶＬＰが、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、およびＨＰＶ２６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示していた。
【０１６１】
本出願の特定の実施形態が詳細に説明されてきたが、当業者は、本明細書に開示された教示に従って、それらに対して種々の修正および変更を行うことができ、そのような修正および変更は、本出願の範囲内であることを理解するであろう。本出願の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物によって与えられる。
【図１Ａ】
2022502057.tif 000019
【図１Ｂ】
2022502057.tif 000020
【図１Ｃ】
2022502057.tif 000021
【図１Ｄ】
2022502057.tif 000022
【図２Ａ】
2022502057.tif 000023
【図２Ｂ】
2022502057.tif 000024
【図２Ｃ】
2022502057.tif 000025
【図２Ｄ】
2022502057.tif 000026
【図３】
2022502057.tif 000027
【図４】
2022502057.tif 000028
【図５】
2022502057.tif 000029
【図６】
2022502057.tif 000030
【図７Ａ】
2022502057.tif 000031
【図７Ｂ】
2022502057.tif 000032
【図７Ｃ】
2022502057.tif 000033
【図７Ｄ】
2022502057.tif 000034
【図７Ｅ】
2022502057.tif 000035
【図７Ｆ】
2022502057.tif 000036
【図７Ｇ】
2022502057.tif 000037
【図８Ａ】
2022502057.tif 000038
【図８Ｂ】
2022502057.tif 000039
【図８Ｃ】
2022502057.tif 000040
【図８Ｄ】
2022502057.tif 000041
【図９】
2022502057.tif 000042
【図１０Ａ】
2022502057.tif 000043
【図１０Ｂ】
2022502057.tif 000044
【図１１Ａ】
2022502057.tif 000045
【図１１Ｂ】
2022502057.tif 000046
【図１２Ａ】
2022502057.tif 000047
【図１２Ｂ】
2022502057.tif 000048
【配列表】
2022502057000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月20日(2021.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体であって、野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、
（Ｉ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、以下の変異：
（１）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での、０〜１５個のアミノ酸の短縮化；および（２）（ａ）、（２）（ｂ）、（２）（ｃ）または（２）（ｄ）：
（２）（ａ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｂ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｃ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８１位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（２）（ｄ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８９位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、
で定義された変異、を有し、
あるいは、
（ＩＩ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ａ）で定義された前記変異を有し、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
あるいは、
（ＩＩＩ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｂ）で定義された前記変異を有し、（３）（ｃ）で定義された変異をさらに有し；
あるいは、
（ＩＶ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｃ）で定義された前記変異を有し、（３）（ａ）または（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
あるいは、
（Ｖ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、（１）および（２）（ｄ）で定義された前記変異を有し、（３）（ｂ）で定義された変異をさらに有し；
（３）（ａ）、（３）（ｂ）、または（３）（ｃ）で定義された前記変異は以下のとおり：
（３）（ａ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｂ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（３）（ｃ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換
であり；
前記変異体が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個のアミノ酸の置換、付加、または欠失によってのみ、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と異なり、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型に対する中和抗体の産生を誘導する能力を保持する、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体であって、以下の項目、すなわち
（ｉ）前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質と比較して、前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質のＮ末端で０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸が短縮化されている、
（ｉｉ）前記第２の型の野生型ＨＰＶが、ＨＰＶ６９である；
（ｉｉｉ）（２）（ａ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の５２〜６０位のアミノ酸残基である；
（ｉｖ）（２）（ｂ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１２５〜１４７位のアミノ酸残基である；
（ｖ）（２）（ｃ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８３位のアミノ酸残基である；
（ｖｉ）（２）（ｄ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ６９  Ｌ１タンパク質の２６１〜２９１位のアミノ酸残基である；
（ｖｉｉ）前記第３の型の野生型ＨＰＶが、ＨＰＶ２６である；
（ｖｉｉｉ）（３）（ａ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基である；
（ｉｘ）（３）（ｂ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１４６位のアミノ酸残基である；
（ｘ）（３）（ｃ）に記載の前記対応する位置の前記アミノ酸残基が、野生型ＨＰＶ２６  Ｌ１タンパク質の１７３〜１８１位のアミノ酸残基である；
（ｘｉ）前記野生型ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する；
（ｘｉｉ）前記第２の型の野生型ＨＰＶの前記Ｌ１タンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する；
（ｘｉｉｉ）前記第３の型の野生型ＨＰＶの前記Ｌ１タンパク質が、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する、
のうちの１つまたは複数を特徴とする、変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体。
【請求項３】
前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質が、配列番号４、５、６、７、２３、２７、２８、４１または４５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体をコードする単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１２、１３、１４、１５、３２、３６、３７、４９または５３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
請求項４または５に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項４または５に記載の単離された核酸および／または請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を含むか、またはそれらからなるＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体、または請求項４または５に記載の単離された核酸、または請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の宿主細胞、または請求項８に記載のＨＰＶウイルス様粒子、を含む組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載のＨＰＶウイルス様粒子、および任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチン。
【請求項１１】
前記ＨＰＶウイルス様粒子が、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する、請求項１０に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項１２】
前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染であり、および／または、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項１３】
前記ＨＰＶ感染が、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、ＨＰＶ２６感染、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物またはワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を調製する方法であって、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を宿主細胞内で発現させ、次に前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を回収することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、以下の項目、すなわち、
（ｉ）前記宿主細胞が大腸菌である；
（ｉｉ）前記方法が、前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を大腸菌において発現させ、次に、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質またはその変異体を得るステップを含む、
のうちの１つまたは複数を特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のＨＰＶウイルス様粒子を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ５１  Ｌ１タンパク質もしくはその変異体または請求項８に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための組成物またはワクチン。
【請求項１８】
前記ＨＰＶ感染が、１つまたは複数のＨＰＶ型による感染であり、および／または、前記ＨＰＶ感染によって引き起こされる前記疾患が、子宮頸がん、尖圭コンジローマ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物またはワクチン。
【請求項１９】
前記ＨＰＶ感染が、ＨＰＶ５１感染、ＨＰＶ６９感染、ＨＰＶ２６感染、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物またはワクチン。
【国際調査報告】
2022502057.tif 000049
2022502057.tif 000050
2022502057.tif 000051
2022502057.tif 000052
2022502057.tif 000053
2022502057.tif 000054
2022502057.tif 000055
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