(57)【要約】【課題】α−シヌクレインの立体配座特異的エピトープ、それに対する抗体、およびそれに関連する方法を提供する。【解決手段】本開示は、α−シヌクレインの立体配座エピトープ、それに対する抗体、ならびに免疫原およびそれに特異的な抗体を作製および使用する方法に関する。特に、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の少なくとも３つのアミノ酸を含む環状化合物に対して産生された抗体は、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインを選択的に認識し、α−シヌクレインの伝播および毒性を阻害することができる。【選択図】図６Ｈ
2022502369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、任意にＥＫＴ、ＫＴＫ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）の少なくとも３つの残基を含むα−Ｓｙｎペプチド、ＴＥＱ、およびリンカーを含む、環状化合物であって、前記リンカーが、ペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基に共有結合している、環状化合物。
【請求項２】
前記α−Ｓｙｎペプチドが、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）から選択される、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項３】
前記α−Ｓｙｎペプチドが、ＫＥＱであるか、またはＫＥＱを含む、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項４】
前記α−Ｓｙｎペプチドが、ＥＫＴＫ（配列番号２）およびＴＫＥＱ（配列番号４）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の環状化合物。
【請求項５】
前記リンカーが、１〜８個のアミノ酸および／もしくは１つ以上の官能化可能な部分を含むか、またはそれらからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の環状化合物。
【請求項６】
リンカーアミノ酸が、ＡおよびＧから選択され、かつ／または前記官能化可能な部分が、Ｃである、請求項５に記載の環状化合物。
【請求項７】
前記リンカーが、ＧＧＣＧＧ（配列番号１３）、ＧＣＧＧＧＧ（配列番号１２）、ＧＧＧＣＧＧ（配列番号１５）、もしくはＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号１６）を含むか、またはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の環状化合物。
【請求項８】
前記リンカーが、１つ以上のＰＥＧ分子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の環状化合物。
【請求項９】
前記環状化合物が、表２〜４のいずれか１つに列挙された化合物から選択され、任意に前記環状化合物が、シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧ）（配列番号５７）、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧ）（配列番号４７）、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧ）（配列番号４８）、シクロ（ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号１０）、およびシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）から選択される、請求項１に記載の環状化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の環状化合物を含む、免疫原。
【請求項１１】
前記環状化合物が、担体タンパク質もしくは免疫原性増強剤に結合し、かつ／または多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）である、請求項１０に記載の免疫原。
【請求項１２】
前記担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるか、または前記免疫原性増強剤が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項１１に記載の免疫原。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の環状化合物中の前記α−Ｓｙｎペプチド、またはミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド中の前記α−Ｓｙｎペプチド中のエピトープに結合する抗体であって、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の免疫原または前記免疫原を含む組成物を使用して任意に産生される、抗体。
【請求項１４】
前記抗体を産生するために使用される前記組成物が、アジュバントを含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記エピトープが、立体配座エピトープであり、前記抗体が、対応する線状化合物および／または未変性α−Ｓｙｎポリペプチドと比較して、請求項１〜９のいずれか一項に記載の環状化合物に選択的に結合する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記エピトープが、立体配座エピトープであり、前記抗体が、未変性α−Ｓｙｎポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎ中の前記α−Ｓｙｎペプチドに選択的に結合する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記α−Ｓｙｎペプチドが、ＥＫＴ、ＫＴＫ、もしくはＫＥＱを含むか、またはそれからなる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記α−Ｓｙｎペプチドおよび／またはエピトープが、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、対応する線状化合物および／または未変性α−Ｓｙｎポリペプチドと比較して、前記環状化合物に対して少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍より選択的である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、未変性α−Ｓｙｎポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに選択的に結合する、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、未変性α−Ｓｙｎポリペプチドと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに対して少なくとも２倍、３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍より選択的である、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのうちの１つ以上の前記アミノ酸配列が、以下に記載のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４から選択される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号６１〜６６のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号６７〜７２のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２６】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号７３〜７８のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２７】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号７９〜８１、７６、７７、および８４のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２８】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、７６、７７、および８４のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２９】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号９１〜９４、７１、および９６、またはそれぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、７７、および１８４のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項３０】
前記重鎖可変領域が、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、もしくは１９０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ配列が維持されている、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、もしくは１９１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ配列が維持されている、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の抗体、および検出可能な標識または粒子、任意に磁性粒子などの部分を含む、免疫複合体。
【請求項３４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の環状化合物もしくは免疫原の前記アミノ酸残基をコードするか、または請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の抗体もしくは請求項３３に記載の免疫複合体をコードする核酸配列を含む、核酸。
【請求項３５】
前記核酸配列が、重鎖可変領域をコードする配列を含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲのうちの１つ以上の前記アミノ酸配列が、以下に記載されるもの、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４；および／またはから選択される、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ配列番号６１〜６６、それぞれ配列番号６７〜７２、それぞれ配列番号７３〜７８、それぞれ配列番号７９〜８１、７６、７７、および８４、それぞれ配列番号７９、８０、８１、７６、７７、および８４、それぞれ配列番号９１〜９４、７１、および９６、またはそれぞれ配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、７７、および１８４のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸が、重鎖可変領域をコードする核酸を含み、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＣＤＲのうちの１つ以上の前記アミノ酸配列が、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２７、もしくは１８５；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２８、もしくは１８６；または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、もしくは１８７によってコードされる、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３８】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ、配列番号９７〜９９を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ、配列番号１０３〜１０５を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４０】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ、配列番号１０９〜１１１を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４１】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ、配列番号１１５〜１１７を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４２】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ、配列番号１１５、１１６、および１２３を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４３】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ配列番号１２７〜１２９またはそれぞれ配列番号１８５、１８６、および１８７を有する核酸配列によってコードされる、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４４】
前記核酸配列が、軽鎖可変領域をコードし、前記軽鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのうちの１つ以上の前記アミノ酸配列が、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１００、１０６、１１２、１３０、もしくは１８８；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１０１、１０７、もしくは１１３；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１３２、もしくは１８９によってコードされる、請求項３４に記載の核酸。
【請求項４５】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１００〜１０２を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４６】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１０６〜１０８を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４７】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１１２〜１１４を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４８】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１１２、１１３、および１２０を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４９】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１１２、１１３、および１２０を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項５０】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ配列番号１３０、１０７、および１３２またはそれぞれ配列番号１８８、１１３、および１８９を有する核酸配列によってコードされる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項５１】
前記核酸が、ｉ）重鎖可変領域をコードする第１の核酸分子であって、前記重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、第１の核酸分子と、ｉｉ）相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードする第２の核酸分子と、を含み、前記ＣＤＲのうちの１つ以上の前記アミノ酸配列が、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２７、もしくは１８５；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２８、もしくは１８６；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、もしくは１８７；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１００、１０６、１１２、１３０、もしくは１８８；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１０１、１０７、もしくは１１３；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１３２、もしくは１８９によってコードされる、請求項３４に記載の核酸。
【請求項５２】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号９７〜１０２を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５３】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１０３〜１０８を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５４】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１０９〜１１４を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５５】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１１５〜１１７、１１２、１１３、および１２０を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５６】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ、配列番号１１５、１１６、１２３、１１２、１１３、および１２０を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５７】
前記相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ配列番号１２７〜１３０、１０７、および１３２、またはそれぞれ配列番号１８５〜１８８、１１３、および１８９を有する核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５８】
前記重鎖可変領域が、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、および１９２のうちのいずれか１つを含む核酸配列；前記ＣＤＲ領域の前記アミノ酸配列が維持されている前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つをコードするか、または配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列によってコードされ、前記ＣＤＲアミノ酸配列が維持されている、請求項３７〜４３および５１〜５７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、および１９３のうちのいずれか１つを含む核酸配列；前記ＣＤＲ領域の前記アミノ酸配列が維持されている前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つをコードするか、または配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列によってコードされ、前記ＣＤＲアミノ酸配列が維持されている、請求項４４〜５７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６０】
請求項３５〜５９のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項６１】
配列番号１５７〜１６４、１６９〜１７７、および１７９から任意に選択されるシグナル配列をさらに含む、請求項６０に記載のベクター。
【請求項６２】
請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の抗体を発現する、組換え細胞。
【請求項６３】
前記組換え細胞が、哺乳動物細胞、任意にハイブリドーマ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項６２に記載の組換え細胞。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の環状化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、ベクター、または組換え細胞を含み、任意に請求項１〜６３のいずれか一項に記載の環状化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、ベクター、もしくは組換え細胞のうちの１つ以上、任意に２つ以上、または３つ以上を含む、組成物。
【請求項６５】
請求項１〜６４のいずれか一項に記載の環状化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、ベクター、組換え細胞、または組成物を、任意に１つ以上の試薬、粒子、またはプレートとともに含む、キット。
【請求項６６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の環状化合物もしくは免疫原、または前記環状化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与することと、抗体および／または投与される前記環状化合物もしくは免疫原に特異的な抗体を発現する細胞を単離することと、任意に、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに選択的に結合する１つ以上の抗体を選択および／または単離することと、を含む、請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法。
【請求項６７】
試験試料が、ミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチドを含むかどうかを決定するためのアッセイであって、前記方法が、
ａ．抗体：ミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチド複合体を形成することを許容する条件下で、前記試験試料を、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の抗体または前記抗体を含む前記免疫複合体、任意に請求項２４に記載の免疫複合体と接触させることと、
ｂ．任意の抗体：ミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチド複合体の存在を検出および／または定量化することと、を含み、
検出可能な複合体の前記存在が、前記試験試料がミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチドを含み得ることを示している、アッセイ。
【請求項６８】
抗体：ミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチド複合体の量が、定量化され、かつ／または対照と比較される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記試験試料が、血液および／または血清および／または血漿および／または脳組織抽出物および／またはＣＳＦを含む、請求項６７または６８に記載のアッセイ。
【請求項７０】
前記試験試料が、ヒト試料である、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７１】
前記複合体を検出することが、前記複合体をｐａｎ  α−Ｓｙｎ抗体と接触させることを含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７２】
前記アッセイが、後続の試験試料中の抗体：ミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチド複合体の前記存在を検出および／または定量化することと、任意に前記試験試料と比較することと、をさらに含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７３】
前記対象が、α−シヌクレイノパチーの治療を受けている、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７４】
前記対象が、α−シヌクレイノパチーの治療を受けていない、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７５】
前記試験試料と接触した前記抗体が、粒子、任意に磁性ビーズにコンジュゲートされている、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７６】
前記複合体を前記検出することまたは前記複合体を定量化することが、前記複合体を標識されたｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体と接触させることを含む、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７７】
対象がα−シヌクレイノパチーを有するかどうかを診断する方法における使用のための、請求項６７〜７６のいずれか一項に記載のアッセイであって、
ａ．前記対象の試験試料中のミスフォールドしたα−シヌクレインの量を検出することと、
ｂ．前記ミスフォールドしたα−シヌクレインの量を対照と比較することであって、前記対照が、対照試料の集団に見られるｃｕｔ−ｏｒｒまたは範囲である、比較することと、を含み、
前記ミスフォールドしたα−シヌクレインの量が、正常な対照試料に見られるレベルもしくは範囲よりも高いか、または前記シヌクレイノパチーを有する対象からの対照試料に見られる範囲内にある場合、前記対象が、α−シヌクレイノパチーを有する可能性がある、アッセイ。
【請求項７８】
前記α−シヌクレイノパチーが、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体病（ＬＢＤ）、または多系統萎縮症から選択される、請求項７７に記載のアッセイ。
【請求項７９】
ミスフォールドしたα−ｓｙｎ毒性を阻害する方法であって、細胞集団またはそれを必要とする対象に、有効量の請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体もしくは免疫複合体、または前記抗体もしくは免疫複合体を含む組成物を投与することを含み、前記抗体が、モノマー、未変性テトラマー、および／または不溶性フィブリルα−シヌクレイン種と比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎに選択的に結合する、方法。
【請求項８０】
前記組成物が、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体および／または免疫複合体を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
有効量の請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の抗体、請求項３３に記載の免疫複合体、または請求項３４に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記抗体が、モノマー、未変性テトラマー、および／または不溶性フィブリルα−シヌクレイン種と比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインに選択的に結合する、α−シヌクレイノパチーを有する対象を治療するための、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記α−シヌクレイノパチーが、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体病（ＬＢＤ）、または多系統萎縮症から選択される、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願はＰＣＴ出願であり、２０１８年１０月７日に出願された米国仮出願第６２／７４２，４０８号、２０１８年１２月１７日に出願された米国仮出願第６２／７８０，５９９号、２０１９年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／８２０，７０１号、および２０１９年６月２０日に出願された米国仮出願第６２／８６４，０６０号からの優先権を主張し、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎまたはα−シヌクレインとも称される）エピトープおよびそれに対する抗体、より具体的には、疾患関連α−シヌクレインにおいて選択的にアクセス可能な立体配座α−シヌクレインエピトープ、ならびに関連する抗体組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
α−シヌクレイン（α−ｓｙｎまたはα−シヌクレイン）は、主にニューロンのシナプス前終末に見られる１４０アミノ酸タンパク質であり、シナプス小胞をクラスター化することによって、シナプス前終末におけるシナプス小胞の供給を維持する際に、およびドーパミンの放出を調節する際に機能的役割を果たすと考えられている［ｅＬｉｆｅ  ２０１３；２：ｅ００５９２  ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００５９２］。シヌクレインの少なくとも３つのアイソフォームは、選択的スプライシングによって産生される。タンパク質の最も一般的な形態は、１４０アミノ酸の完全長タンパク質である。他のアイソフォームは、エクソン３の喪失により残基４１〜５４を欠くα−ｓｙｎ−１２６、およびエクソン５の喪失により残基１０３〜１３０を欠くα−ｓｙｎ−１１２である。
【０００４】
溶液中のモノマーα−シヌクレインは、単一の安定した３Ｄ構造を欠く、本質的に無秩序なタンパク質であると考えられている。α−ｓｙｎのＮ末端残基１〜６０は両親媒性であり、コンセンサス配列ＫＴＫＥＧＶ（配列番号６）を含む４つの１１残基の繰り返しを含む。この配列は、アポリポタンパク質結合ドメインと同様の構造的αヘリックス傾向を有する。残基６１〜９５は、非アミロイド−β成分またはＮＡＣ領域と称される中央の疎水性領域を構成し、タンパク質凝集に関与することが知られている［ＰＮＡＳ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，１９９３  ９０（２３）１１２８２−１１２８６；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．９０．２３．１１２８２］。残基９６〜１４０は、明確な構造的傾向のない、非常に酸性かつプロリンに富む領域を構成する。
【０００５】
溶液中のα−ｓｙｎモノマーは、本質的に無秩序である。膜に結合したモノマーは、部分的ヘリックス構造を有する［Ｕｌｍｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ｂａｘ，Ａ．，Ｃｏｌｅ，Ｎ．Ｂ．，Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｒ．Ｌ（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０  ９５９５−９６０３、Ｒａｏ，Ｊ．Ｎ．，Ｊａｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｅｇｄｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｌａｎｇｅｎ，Ｒ．，Ｕｌｍｅｒ，Ｔ．Ｓ．（２０１０）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２  ８６５７−８６６８］。膜に結合したα−ｓｙｎモノマーは、膜に湾曲を誘導する［Ｖａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ｖ２８５，ｎｏ．４２，ｐｐ３２４８６−３２４９３，（２０１０）ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０．１３９５７６］。α−シヌクレインは、凝集に抵抗する安定してフォールドしたテトラマー中に存在し得るか［ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０３２４］、または少なくともＣＮＳ中にモノマーとして存在し得る（Ｆａｕｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．３１８９４９）。
【０００６】
最近、パーキンソン病のような疾患が、テトラマー化できない変異体α−ｓｙｎを発現するマウスにおいて発症することが示された（Ｎｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１８）。
【０００７】
パーキンソン病、レビー小体型認知症、および多系統萎縮症（総称してシヌクレイノパチーとして知られる）と関連付けられる病的状態では、α−シヌクレインが凝集して、レビー小体およびレビー神経突起に特徴的な不溶性フィブリルを形成する。α−シヌクレインは、レビー小体フィブリルの主要な構造成分である。α−シヌクレインの病理はまた、アルツハイマー病の散発性症例および家族性症例の両方に見られる［ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１−００２−０５９６−７］。α−Ｓｙｎの遺伝子における点突然変異は、Ａ５３Ｔ、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ｈ５０Ｑ、およびＧ５１Ｄを含む、遺伝性パーキンソン病と関連付けられる。α−ＳｙｎをコードするＳＮＣＡ遺伝子のゲノム重複および三重化による過剰発現もまた、パーキンソン病を引き起こすようである。
【０００８】
シナプス前部に位置するα−シヌクレインの病理学的凝集体は、シナプス機能障害の原因であると考えられる［ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１−０１０−０７１１−０］。したがって、α−シヌクレインの凝集を阻害する小分子化合物は、シヌクレイノパチーを治療するための戦略として開発された［ＲＥＦ  ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｉ０６００７４９］。
【０００９】
α−シヌクレイン免疫染色レビー小体のホスホ−Ｓ１２９を特異的に認識する抗体は、Ｓ１２９がシヌクレイノパチー病変において選択的かつ広範囲にリン酸化されることを示す。
【００１０】
抗体は、α−シヌクレインおよび記載されるそれに関連する免疫原に対して産生されている。
【００１１】
米国特許公開第ＵＳ２０１６／０２４４５１５Ａ１号は、ヒト抗α−シヌクレイン抗体について説明している。
【００１２】
米国特許公開第ＵＳ２０１５／０２３２５２４Ａ１号は、α−シヌクレインＢ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトープを含む少なくとも２つの領域を有する１つ以上の免疫原を含む組成物を開示している。
【００１３】
米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２９５４６５Ａ１号は、脳内のαシヌクレインのレベルの上昇を診断するための抗αシヌクレイン抗体の使用について説明している。
【００１４】
オリゴマーα−シヌクレインは、ニューロン死を引き起こすタンパク質の形態であり得る［Ｂｒｏｗｎ  ＤＲ  ２０１０，ＤＯＩ：１０．１００２／ｉｕｂ．３１６］。α−Ｓｙｎは、パーキンソン病患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で検出されている。前フィブリル状中間体として形成されると考えられているオリゴマーは、α−Ｓｙｎの優先的に毒性のある成分であり得る［Ｋａｒｐｉｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｅｍｂｏｊ．２００９．２５７］。β構造が損なわれた前フィブリル状α−シヌクレインバリアントは、パーキンソン病モデルの神経毒性を増加させる［ＥＭＢＯ  Ｊ．２８，３２５６−３２６８；Ｏｕｔｅｉｒｏ．．ＭｃＬｅａｎ，（２００８）］。有毒なオリゴマーα−シヌクレイン種の形成は、生細胞の細胞内で起こり得る［ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３，ｅ１８６７；Ｄａｎｚｅｒ．．Ｋｏｓｔｋａ，（２００７）］。異なる種のα−シヌクレインオリゴマーは、カルシウムの流入および播種を誘導する［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，９２２０−９２３２］。
【００１５】
オリゴマーは、明確な構造を持たず、立体配座的に可塑性であり、官能性モノマーまたはテトラマーの濃度よりはるかに低い濃度で存在する。ミスフォールドしたオリゴマーα−ｓｙｎの濃度が低いため、この標的は捕らえにくくなる。健康なα−ｓｙｎを標的とする抗体または薬物は、細胞に有害であり得る。
【００１６】
オリゴマーα−シヌクレインに対する抗体を産生する試みが報告されている。米国特許公開第ＵＳ２０１６／０１９９５２２Ａ１号は、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）またはα、β不飽和アルケナル４−オキソ−２−ノネナール（ＯＮＥ）で修飾された可溶性プロトフィブリル／オリゴマーヒトα−シヌクレインの調製物を使用して抗体を産生することを報告している。ヒト試料に対するそれらの有用性の証拠は提供されなかった。
【００１７】
細胞内レビー小体を伴うニューロンの生存は、細胞質内α−Ｓｙｎ凝集体の存在がすべての細胞に対してひどく毒性ではないことを示唆している［Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉｅｔ．ａｌ（１９９７）Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８３９−８４０］。
【００１８】
完全長のヒトα−シヌクレインのフィブリル構造は、固体ＮＭＲ（ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａ）によって得られた［ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．３１９４，Ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ＮＭＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｂｒｉｌ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｕｍａｎ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，Ｔｕｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ＳＭＢ  ２０１６］。
【００１９】
モノマーα−Ｓｙｎおよび／または不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎよりもミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインに優先的または選択的に結合する抗体が望ましい。
【発明の概要】
【００２０】
本明細書に記載されているのは、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインの立体配座エピトープである。
【００２１】
態様は、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の３つ以上の残基を含み、かつ／またはそれらからなり、任意に、残基ＥＫＴＫ（配列番号２）もしくはその一部、残基ＫＴＫＥ（配列番号３）もしくはその一部、または残基ＴＫＥＱ（配列番号４）もしくはその一部を含み、かつ／またはそれらからなる、α−シヌクレインペプチドを含む環状化合物を含み、その一部は、少なくとも３つのアミノ酸を含む。
【００２２】
環状化合物に組み込まれたα−シヌクレインペプチドは、立体配座エピトープであり、免疫原として使用することができる。エピトープは、α−シヌクレインのミスフォールドしたオリゴマー種において選択的に曝露され、例えば、未変性でフォールドしたα−シヌクレインモノマーおよび／または未変性テトラマーでは利用できないか、またはあまり利用できない。
【００２３】
別の態様は、対応する線状化合物および／または未変性α−Ｓｙｎおよび／または不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎと比較して、本明細書に記載の環状化合物のα−Ｓｙｎペプチド中および／またはミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレイン中のエピトープに特異的に結合する抗体を含む。抗体は、本明細書に記載の免疫原または免疫原を含む組成物を使用して産生することができる。
【００２４】
エピトープは、立体配座エピトープであり、例えば、エピトープは、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎで選択的に提示されるか、またはアクセス可能である。α−Ｓｙｎペプチドは、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の３つ以上の残基、任意に４つ以上の残基、５つ以上の残基、もしくは６つの残基であり得るか、または具体的にＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、もしくはＫＴＫＥＱ（配列番号９）であり得る。
【００２５】
実施形態では、抗体は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４から選択される。
【００２６】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６７、ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６８、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６９、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７０、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７１、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号７２。
【００２７】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号７３、ＣＤＲ−Ｈ２  配列番号７４、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号７５、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７６、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７７、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号７８。
【００２８】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号７９、ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号８０、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号８１、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７６、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７７、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号８４。
【００２９】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号７９、ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号８０、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号８１、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号７６、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７７、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号８４。
【００３０】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号９１、ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号９２、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号９３、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号９４、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７１、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号９６。
【００３１】
実施形態では、ＣＤＲは、次のとおりである。
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１８０、ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１８１、ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号１８２、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１８３、ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号７７、およびＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１８４。
【００３２】
さらなる態様は、本明細書に記載の核酸を含む。
【００３３】
さらなる態様は、本明細書に記載の核酸を含むベクターである。
【００３４】
別の態様は、本明細書に記載の抗体、核酸、またはベクターを産生する組換え細胞を含む。さらなる態様は、本明細書に記載の成分（例えば、環状化合物、抗体、核酸、ベクター、組換え細胞など、およびそれらの組み合わせ）を含む組成物を含む。
【００３５】
別の態様は、試験試料がミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎを含むかどうかを検出するためのアッセイを提供し、
ａ．試験試料を、抗体：ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド複合体を産生することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体または免疫複合体と接触させることと、
ｂ．任意の複合体の存在または不在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試験試料がミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドを含み得ることを示している。
【００３６】
検出されたミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎは、例えば、未変性α−Ｓｙｎと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドにおいて選択的にアクセス可能な本明細書に記載の立体配座エピトープを含み、例えば、エピトープは、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎにおいて選択的に提示され得るかまたはアクセス可能であり得る。
【００３７】
さらなる態様は、細胞集団またはそれを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の抗体、免疫複合体、または組成物を投与することを含む、ミスフォールドしたα−シヌクレイン毒性を阻害する方法を含む。
【００３８】
さらに別の態様は、本明細書に記載の前述のうちのいずれかの抗体、免疫複合体もしくは組成物、または組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む、α−シヌクレイノパチーを治療する方法である。これらの抗体は、例えば本明細書に示されるように、モノマー、テトラマー（例えば生理学的もしくは未変性種）および／または不溶性フィブリルα−シヌクレイン種と比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインおよび／または可溶性α−シヌクレインフィブリル（例えば、毒性のミスフォールドした種）に選択的に結合する。
【００３９】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示しながら単なる例示として与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
ここで、本開示の様々な実施形態を、以下の図面に関連して説明する。
【００４１】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、予測されるエピトープを表すグラフである。図１Ａは、溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）に基づいて、配列の関数として予測される曝露の可能性を示す。図１Ａのグラフは、エピトープを選択するための基準としてＳＡＳＡの増加（ΔＳＡＳＡ）を使用した、応力フィブリル構造ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａから生じるエピトープ予測を表す。ＥＫＴＫ（配列番号２）（残基５７〜６０）およびＴＫＥＱ（配列番号４）（残基５９〜６２）エピトープは、ＰＤＢ構造２Ｎ０Ａの予測として出現する（図１Ａ）。図１Ｂは、エピトープ選択の基準として未変性接触の喪失を使用した、構造ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａから生じるエピトープ予測を示す。ＥＫＴＫエピトープ（配列番号２）は、このメトリックを使用した予測として出現する。図１Ｃは、ＳＡＳＡの増加（ΔＳＡＳＡ）、エピトープの動力学の増加を表す原子位置の二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）の増加、および未変性接触の数の減少（Δ接触）を含む、いくつかのメトリックによって行われたエピトープ予測を示す。これらの３つの異なるメトリックは、エピトープＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、およびそれらの部分配列を予測する。すなわち、フィブリル構造内の１つ以上の鎖について、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）は、上記の３つの基準すべてを満たすが、隣接する領域は、この要件を満たしていない。
【図２Ａ】非偏向フィブリル（ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａ）との関連で、α−Ｓｙｎのモノマーの立体配座のレンダリングを示す。この構造は、１００ｍＭのＮａＣｌを含むα−Ｓｙｎの５つの鎖の平衡シミュレーションから取得される。残基Ｋ５８およびＫ６０は、この構造的アンサンブルでほぼ平行である。Ｋ６０のＨε３原子（弱く正に帯電している、Ｑ＝０．０５）とＱ６２のＮε２（負に帯電している、Ｑ＝−０．６４）との間には密接な接触がある。
【図２Ｂ】偏向フィブリルアンサンブルにおけるα−Ｓｙｎのモノマーの構造のスナップショットを示す。このアンサンブルでは、残基Ｋ５８およびＫ６０は平行ではなくなり、Ｋ６０とＱ６２との間の接触は存在しなくなる。これは、Ｋ６０およびＱ６２が、非偏向フィブリルと比較して、偏向または「応力」フィブリルおよびα−Ｓｙｎのオリゴマー種での結合によりアクセス可能であり得ることを示唆する。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、α−シヌクレインの異なる立体配座の模式図を示す。パネルＡは、非偏向フィブリル（ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａ）との関連で、ＥＫＴＫ（配列番号２）のスナップショットを示す。この図はまた、この配列領域のＳＡＳＡを示し、エピトープが大部分埋まっているため、ＳＡＳＡは最小限である。パネルＢは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）のアンサンブルの重心構造を示す。環状ペプチドの側鎖は、フィブリルの側鎖と比較して増加したＳＡＳＡを示す。パネルＣは、単離された未変性モノマーアンサンブルの重心構造におけるエピトープの両方のインスタンスの側鎖配向を示す。Ｔ５９およびＫ６０の配向は、Ｋ５８と比較して、環状ペプチドアンサンブルよりも単離されたモノマーアンサンブルにおいて有意に異なる。エピトープの立体配座は、環状ペプチドアンサンブルの立体配座の大部分とは異なる。
【図４】パネルＡは、非偏向フィブリル（ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａ）との関連で、ＴＫＥＱ（配列番号４）のスナップショットを示す。この図はまた、この配列領域のＳＡＳＡを示し、エピトープが大部分埋まっているため、ＳＡＳＡは最小限である。パネルＢは、環状ペプチドシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）のアンサンブルの重心構造を示す。環状ペプチドの側鎖は、フィブリルの側鎖と比較して増加したＳＡＳＡを示す。パネルＣは、単離された未変性モノマーアンサンブルの重心構造におけるエピトープの側鎖配向を示す。側鎖の配向は、単離されたモノマーアンサンブルでは、環状ペプチドアンサンブルの対応する側鎖の配向とは著しく異なる。
【図５】パネルＡは、フィブリルアンサンブル、応力／偏向フィブリルアンサンブル、および環状ペプチドアンサンブルシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）中のＥＫＴＫ（配列番号２）エピトープのアンサンブル平均溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）をプロットする。残基は、非偏向フィブリル、偏向フィブリル、および環状ペプチド間の表面曝露の単調な増加を示す。パネルＢは、非偏向フィブリルアンサンブル、応力／偏向フィブリルアンサンブル、および環状ペプチドアンサンブルシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）中のＴＫＥＱ（配列番号４）エピトープのアンサンブル平均溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）をプロットする。残基Ｔ５９、Ｅ６１、およびＱ６２は、非偏向フィブリルと環状ペプチドとの間の表面曝露の最大の増加を示す。非偏向フィブリルから偏向フィブリルへのＳＡＳＡの増加は、エピトープ全体でほぼ均一である。エピトープＴＫＥＱ（配列番号４）およびＥＫＴＫ（配列番号２）のＳＡＳＡの増加はまた、図５および図１のパネルＡ、Ｃに示されている。パネルＣは、ＲＭＳＤのヒストグラムを環状ペプチド足場ｃｙｌｃｏ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）の環状ペプチド平衡分布の重心にプロットする。ほとんどの立体配座は、重心立体配座と非常によく似ており、分布は、約１．３オングストロームでピークになる。また、モノマーアンサンブルおよびフィブリルアンサンブルの重心立体配座のエピトープの立体配座に対応するＲＭＳＤも示されている。最後に、αヘリックス、ミセル結合α−シヌクレイン、１ＸＱ８、および２ＫＫＷのＰＤＢ構造の立体配座におけるエピトープのＲＭＳＤが示されている。これらの立体配座は、ほとんどの環状立体配座とは異なる。
【図６】図６Ａ〜Ｈは、一連のグラフである。図６Ａは、ＳＰＲによるα−シヌクレインモノマーへの抗体の結合を示す一連のグラフである。ｐａｎ抗体４Ｄ６では強い結合が見られ、凝集したα−シヌクレインに有利なＳｙｎ−Ｆ１では低レベルの結合が見られ、試験抗体では結合は見られない。図６Ｂは、ＳＰＲによるαシヌクレインオリゴマーへの抗体の結合を示す一連のグラフである。図６Ｃは、サンドイッチＳＰＲによるαシヌクレインオリゴマーへの抗体の結合を示す一連のグラフである。図６Ｄは、α−シヌクレインオリゴマーへの結合を示す一連のグラフである。図６Ｅは、可溶性ＬＢＤ脳抽出物に対する抗体結合応答を示す一連のグラフである。図６Ｆは、ＨＭＷおよびＬＭＷ可溶性ＬＢＤ脳画分における抗体結合を示す一連のグラフである。各条件の最初の暗いバーは、ＨＭＷ（約１４０〜７００ｋＤａ）であり、２番目の明るいバーは、ＬＭＷ（約８〜７０ｋＤａ）である。図６Ｇは、小さな可溶性フィブリルとの抗体の交差反応性結合の程度を示すグラフである。図６Ｈは、本開示の試験抗体とｐａｎ抗体４Ｄ６との結合プロファイルの比較を示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜Ｆは、一連のドットブロットである。図７ＧおよびＨは、一連のグラフである。図７Ｇは、正常脳に対するレビー小体型認知症（ＤＬＢ）脳における倍率反応性をプロットしたグラフである。図７Ｈは、脳試料中のαシヌクレインの総量を示すグラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｈは、様々な試験抗体により阻害されるα−ｓｙｎ毒性を示すグラフおよび画像である。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、一連のグラフである。図９Ａは、ＳＰＲによる合成α−ｓｙｎオリゴマーへの抗体選択的結合を示すが、モノマーまたは生理学的テトラマーへの抗体選択的結合を示さないグラフである。図９Ｂは、α−ｓｙｎオリゴマーおよび超音波処理されたフィブリルへの抗体選択的結合を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｅは、α−ｓｙｎ試験抗体が、ＩＨＣおよび免疫蛍光染色によって、高密度のレビー小体上のα−ｓｙｎの小さな凝集体を優先的に染色することを示す画像である。図１０Ｆ〜Ｋは、α−ｓｙｎ試験抗体が、ＩＨＣによる正常脳の検出可能な染色を引き起こさないことを示す画像である。
【図１１】抗体２Ｅ９の代表的なＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、一連のグラフである。図１２Ａは、ＤＬＢ可溶性脳抽出物に結合する試験抗体を示すグラフである。図１２Ｂは、可溶性ＤＬＢ抽出物に結合する試験抗体がエピトープ特異的であることを示すグラフである。
【図１３】図１３Ａ〜Ｉは、試験抗体がＰＦＦにより誘導されたα−シヌクレイン凝集体の形成を低減することを示すグラフおよび画像である。
【図１４】図１４Ａ〜Ｈは、試験抗体が内因性α−シヌクレインのＰＦＦにより誘導された凝集およびリン酸化を低減することを示すグラフおよび画像である。
【図１５】図１５Ａ〜Ｂは、グラフであり、図１５Ａは、試験抗体がα−シヌクレイン凝集のインビトロ伝播を阻害することを示すグラフであり、図１５Ｂは、立体配座エピトープを含むα−ｓｙｎペプチドを含む環状ペプチドが、既形成フィブリルの播種活性を複製するのに十分であり、試験抗体２Ｅ９によって中和されることを示すグラフである。
【図１６】図１６ＡおよびＢは、多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者からの脳抽出物に対する試験抗体の結合応答を示す棒グラフである。図１６Ｃは、脳抽出物のプリオン濃縮画分に対する試験抗体の結合応答を示す棒グラフである。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、試験抗体１２Ｇ１の結合プロファイルを示す一連のグラフである。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、試験抗体９Ｄ８の結合プロファイルを示す一連のグラフである。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、試験抗体１０Ｄ５の結合プロファイルを示す一連のグラフである。
【図２０】生体試料中のミスフォールドしたオリゴマーα−ｓｙｎの定量化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
立体配座特異的抗体の生成が達成された。
【００４３】
未変性タンパク質領域に対して産生された抗体は、変性オリゴマー種などのミスフォールドしたタンパク質に対して選択的でない傾向があり、したがって、ミスフォールドしたタンパク質だけでなく未変性機能性タンパク質にも結合する可能性があり得る。
【００４４】
本明細書に記載されるように、α−Ｓｙｎのミスフォールドしたオリゴマー形態に対して選択的であり得る抗体を開発するために、本発明者らは、フィブリルとの関連で破壊されやすく、したがってミスフォールドのための触媒基質として作用し得るミスフォールドしたタンパク質オリゴマーの表面に曝露され得る、α−Ｓｙｎ配列の領域を同定しようとした。
【００４５】
実施例に記載されるように、標準化した力場を持つ分子動力学を使用した計算シミュレーションが用いられた。フィブリル構造の実験的に検証された構造モデルは、分子動力学を使用して部分的にアンフォールドされる報告された立体配座から全体的に偏向され、異常な細胞環境での外部チャレンジで無秩序になりやすい隣接する一次配列の領域を生成した。
【００４６】
これらの弱く安定した領域は、変性オリゴマーなどのミスフォールドした病原性種に選択的に曝露される可能性があると仮定した。
【００４７】
実施例に記載されるように、本発明者らは、立体配座エピトープを同定した。本発明者らは、より高い曝露表面積、フィブリルに存在する接触相互作用の喪失、および／または単離されたモノマーアンサンブルに対して二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）によって容易に整列しなかったが、偏向した部分的に無秩序なフィブリルアンサンブルに対してより有利に整列するであろう立体配座などのいくつかの基準を満たすことによって、推定選択的エピトープを模倣するように同定されたエピトープを含む環状化合物を設計した。実施例にさらに示されるように、これらの環状化合物を含む免疫原を使用して産生されたモノクローナル抗体は、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインに優先的に結合し、α−シヌクレイン誘導神経毒性を阻害する抗体を産生した。
【００４８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「α−シヌクレイン」または「α−シヌクレイン」または「α−ｓｙｎ」と交互に称される「α−Ｓｙｎ」という用語は、野生型配列α−Ｓｙｎおよび変異型、モノマーα−Ｓｙｎ、ならびにそれらの凝集体、例えばすべての種、特にヒトα−Ｓｙｎ（すなわちｈｕα−Ｓｙｎ）からのα−Ｓｙｎのミスフォールドしたオリゴマーおよび可溶性フィブリル型などを含む、すべての形態のα−Ｓｙｎを意味する。ヒトα−Ｓｙｎは、典型的には、１４０アミノ酸残基のタンパク質であり、アミノ酸配列（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３７８４０）およびヌクレオチド配列（例えば、受託番号ＨＧＮＣ：１１１３８）は、以前に特徴付けられている。
【００４９】
本明細書で使用される「野生型」は、ヒトにおいて非変異体または天然型タンパク質の一次アミノ酸配列を指す。
【００５０】
本明細書で使用される「未変性α−シヌクレインポリペプチド」または「未変性α−Ｓｙｎ」は、膜または細胞質ゾルに関連するかどうかにかかわらず、α−シヌクレインモノマー、ならびにテトラマーなどの正常細胞に見られる他のマルチマーを指し、例えば、本明細書に記載されるように、ＰＤＢフィブリル（２Ｎ０Ａ）からの鎖のうちの１つを使用する場合に予測され得る。未変性α−シヌクレインポリペプチドは、例えば、シヌクレイノパチーに罹患していない脳において、ｐａｎ抗体を使用して検出することができる。
【００５１】
未変性α−Ｓｙｎテトラマーのモデル［ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１３２６０１０８］は、上記のエピトープの残基、具体的にはＫ６０〜Ｅ５７の間、およびＫ３４〜Ｅ５７の間の鎖間塩橋を含む相互作用によって安定化されることを示す。同様に、Ｑ６２は、最大の常磁性緩和効果の中で示され、テトラマーと単離されたモノマーにおいて強く相互作用していることを示す。これらの相互作用は、天然型の未変性テトラマー形態のエピトープの隔離をもたらす可能性があり、その結果、エピトープを標的とする抗体が、変性種（例えば、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレイン）に対して選択される。
【００５２】
本明細書で使用される「構造化フィブリル」、「非応力フィブリル」、または「非偏向フィブリル」は、α−シヌクレインのフィブリルについて熱平衡で観察されると予想される立体配座を指し、例えば、ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａは、その代表的な例である。
【００５３】
本明細書で使用される「ミスフォールドしたオリゴマー」、「変性オリゴマー」は、マルチサブユニットポリペプチドまたはポリペプチド凝集の二次および三次構造を指し、オリゴマーポリペプチドまたはその中のサブユニットが、未変性モノマーおよび／またはテトラマーによって典型的に採用されるものとは異なる立体配座を（例えば、１つ以上の位置で）採用したことを示す。ミスフォールドは、アミノ酸の欠失、置換、または付加などのタンパク質中の突然変異によって引き起こされ得るが、野生型配列タンパク質はまた、疾患においてミスフォールドされ、例えば、微小環境条件の変化、またはフィブリル形成（例えば不溶性フィブリル）への経路上もしくは経路外にあり得るオリゴマー形成の結果として、疾患特異的または選択的エピトープを曝露することもできる。したがって、本明細書においてポリペプチドを指す場合の「ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド」、「ミスフォールドしたα−Ｓｙｎ」、または「ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎ」は、発生期にフォールドしたモノマーα−Ｓｙｎおよび／または未変性でフォールドしたテトラマーα−シヌクレインとは異なる立体配座を示す、α−Ｓｙｎポリペプチドオリゴマーを指し、例えば、変性オリゴマー、可溶性フィブリル、プロトフィブリル、およびフィブリル断片が含まれる。可溶性フィブリルには、例えば、１００，０００ｘｇで１時間超遠心分離にかけられた試料の上清に見られるａ−ｓｙｎフィブリル種が含まれる。可溶性フィブリルは、断片を産生するフィブリルを超音波処理することによって産生され得る。例えば、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎは、フィブリル構造の一部を含む、部分的に秩序化された立体配座、ならびにモノマー、テトラマー、および／またはフィブリルα−Ｓｙｎのいずれかではなく交互の立体配座を有するアミノ酸のポリマーセグメントを含む、部分的に無秩序な立体配座を含み得る。本明細書に示されるミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインは、結合のために選択的に提示されるかまたはアクセス可能な立体配座エピトープを含み、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレイン中のエピトープ配列は、例えば、側鎖の配向または二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）によって測定される、単離されたモノマーとの関連で対応する配列とは立体配座的に異なり得る。ミスフォールドしたα−シヌクレインは、未変性モノマーおよび／もしくはテトラマーなどのミスフォールドしていないタンパク質立体配座中、またはレビー小体沈着物に見られるものなどの不溶性フィブリル中でＥ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、および／またはＱ６２が占めるのではなく、代替立体配座中の残基Ｅ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、またはＱ６２のうちの少なくとも１つを含み得る。可溶性α−シヌクレインフィブリルは、より小さなフィブリルまたは断片、例えば、実施例に記載されるように超音波処理され、溶液中にあるフィブリル、ならびに不溶性フィブリルを含むレビー小体には存在しない疾患関連のより小さなフィブリルを指す。
【００５４】
「変異体α−Ｓｙｎ」という用語は、α−Ｓｙｎの形態、特に、家族性パーキンソン病の例に特徴的な置換など、例えばアミノ酸置換をもたらす遺伝子突然変異の結果として生じるα−Ｓｙｎの内因性形態を指す。
【００５５】
「ＥＫＴＫ（配列番号２）」という用語は、配列番号２に示されるように、アミノ酸配列：グルタミン酸、リジン、スレオニン、リジンを意味する。「ＴＫＥＱ（配列番号４）」という用語は、配列番号４に示されるように、アミノ酸配列：スレオニン、リジン、グルタミン酸、グルタミンを意味する。同様に、ＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＫＴＫＥＱ（配列番号９）は、一文字アミノ酸コードによって同定されるアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列の参照は、α−Ｓｙｎの配列または単離されたペプチド、例えば環状化合物のエピトープ部分のアミノ酸配列を指し得る。配列ＥＫＴＫ（配列番号２）およびＴＫＥＱ（配列番号４）は、それぞれ、α−Ｓｙｎアミノ酸一次配列（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３７８４０）の残基５７〜６０および残基５９〜６２からなる。
【００５６】
本明細書で使用される「ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）中のエピトープ」という用語は、抗体によって特異的に結合されるその任意の部分を指す。例えば、抗体は、エピトープ中のいくつかの残基の組み合わせの側鎖および／または骨格に特異的に結合し得、Ｅ５７、および／もしくはＥ６１、および／もしくはＫ５８、および／もしくはＫ６０、および／もしくはＱ６２、および／もしくはＴ５９のうちのいくつか、またはこれらの残基の特定の部分、または前述のうちのいずれかの組み合わせを含む。エピトープは、立体配座エピトープであり得る。
【００５７】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、配列中のアミノ酸（またはそのサブセット）が、抗体または結合断片、例えば本明細書に記載の抗体または結合断片によって特異的に認識される、抗原中のアミノ酸の配列を意味する。エピトープは、１つ以上の抗原決定基を含み得る。例えば、立体配座エピトープに対応する単離されたペプチドに対して生成された抗体は、該エピトープ配列の一部またはすべてを認識する。
【００５８】
本明細書で使用される「ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎで選択的に提示されるかまたはアクセス可能なエピトープ」という用語は、マルチマー、オリゴマー、または凝集形態であるかどうかにかかわらず、パーキンソン病およびレビー小体型認知症（例えば、ミスフォールドしたα−Ｓｙｎに関連する疾患）などのシヌクレイノパチーに存在するものとして、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド上で選択的に提示されるかまたはアクセス可能であるが、通常インビボで見られるα−Ｓｙｎの初期モノマーペプチドまたはテトラマー形態の分子表面上では提示されないかまたはアクセス可能でない、立体配座エピトープを指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸の配列またはタンパク質の種において特定の三次元構造を有するその抗原決定基を指し、少なくとも三次元構造の態様が存在するか、または単離されたモノマー（未変性）もしくは他の未変性構造などの別の種と比較して、抗体結合によりアクセス可能である。立体配座エピトープに特異的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープのアミノ酸のうちの１つ以上の空間的配置を認識する。例えば、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の立体配座エピトープは、抗体によって選択的に、例えば別の立体配座、任意にα−Ｓｙｎモノマーもしくは不溶性フィブリルまたは例えば、対応する線状ペプチドもしくはその一部を使用して産生された抗体における対応する領域と比較して、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍以上の選択性によって認識されるＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の１つ以上のアミノ酸またはその一部の立体配座を指し得る。
【００６０】
本明細書における「環状ペプチド」への言及は、完全にタンパク質性の環状化合物（例えば、リンカーが２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸である）を指し得る。実施例において決定された環状ペプチドについて記載された特性は、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、環状化合物）に組み込むことができることが理解される。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、天然型アミノ酸のすべて、ならびに修飾されたＬ−アミノ酸を含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含むことができる。例えば、アミノ酸は、水素の代わりに重水素、窒素−１４の代わりに窒素−１５、および炭素−１２の代わりに炭素−１３、および他の同様の変化を含むことができる。
【００６２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖、単一ドメイン、ヒト化および他のキメラ抗体、ならびにそれらの結合断片を含むことを意図している。抗体は、組換え源に由来し、かつ／またはトランスジェニック動物で産生され得る。実施形態における抗体は、重鎖可変領域、または重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２、および重鎖相補性決定領域３を含む重鎖、ならびに軽鎖可変領域、または軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２、および軽鎖相補性決定領域３を含む軽鎖を含む。また、生化学的技法を使用して産生され得るか、またはライブラリーから単離され得るヒト抗体も含まれている。ヒト化またはキメラ抗体は、１つ以上のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。本開示の抗体または複数の抗体への言及は、例えば、本明細書に記載の免疫原を使用して産生され、かつ／または本明細書に記載のエピトープ、例えば、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＥＫＴＫ（配列番号２）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、または例えばエピトープ、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレイン、および／もしくは該エピトープ配列のうちの１つを含む環状化合物との関連でその一部に対して選択的である、本明細書に記載の抗体または複数の抗体を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「重鎖相補性決定領域」という用語は、抗体分子の重鎖可変領域内の超可変性の領域を指す。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端まで、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｈ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）と呼ばれる３つの相補性決定領域を有する。
【００６４】
本明細書で使用される「重鎖可変領域」という用語は、重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２、および重鎖相補性決定領域３を含む重鎖の可変ドメインを指す。１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドは、例えば、ＣＤＲ配列の外側で、修飾される、例えば、保存的置換で置き換えることができる。可変領域は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、続いてＣＤＲ１、続いてフレームワーク領域２（ＦＲ２）、続いてＣＤＲ２、続いてフレームワーク領域３（ＦＲ３）、続いてＣＤＲ３、続いてフレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む。
【００６５】
本明細書で使用される「軽鎖相補性決定領域」という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域内の超可変性の領域を指す。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端まで、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２、および軽鎖相補性決定領域３と呼ばれる３つの相補性決定領域を有する。
【００６６】
本明細書で使用される「軽鎖可変領域」という用語は、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２、および軽鎖相補性決定領域３を含む軽鎖の可変ドメインを指す。可変領域は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、続いてＣＤＲ１、続いてフレームワーク領域２（ＦＲ２）、続いてＣＤＲ２、続いてフレームワーク領域３（ＦＲ３）、続いてＣＤＲ３、続いてフレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む。
【００６７】
「単離された抗体」という語句は、抗体を産生する供給源、例えば、動物、ハイブリドーマ、または他の細胞株（抗体を産生する組換え細胞など）から除去された、インビボまたはインビトロで産生される抗体を指す。単離された抗体は、任意に「精製」され、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の純度を意味する。
【００６８】
無傷または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含み、抗原に結合するか、または無傷の抗体と競合する、抗体または抗体鎖の一部または部分に対する本明細書で使用される「結合断片」という用語。例示的な結合断片には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらのマルチマーが含まれる。断片は、無傷または完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理によって得ることができる。断片はまた、組換え手段によって得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ′）２断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたＦ（ａｂ′）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を低減し、Ｆａｂ′断片を産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成につながり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ′、およびＦ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、および他の断片もまた、組換え発現技法によって構築され得る。
【００６９】
抗体が、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）またはＴＫＥＱ（配列番号４）などのエピトープに結合すると言われる場合、その抗体が、指定された残基またはその一部、例えば少なくとも１つの残基または少なくとも２つの残基を含むポリペプチドまたは化合物に特異的に結合することを意味する。そのような抗体は、必ずしもＥＫＴＫ（配列番号２）またはＴＫＥＱ（配列番号４）のすべての残基に接触するわけではなく、該エピトープ内のすべての単一アミノ酸置換または欠失は、必ずしも結合親和性に有意に影響するか、または等しく影響するわけではない。
【００７０】
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、ペプチド配列、本明細書に記載のペプチドまたは化合物に付加または導入することができ、直接または間接的に検出可能なシグナルを産生することができる、蛍光タンパク質などの部分を指す。例えば、標識は、放射線不透過性の陽電子放出放射性核種（例えば、ＰＥＴイメージングにおける使用のため）、または３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光（フルオロフォア）もしくは化学発光（クロモフォア）化合物；アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば、二次抗体を使用して間接的に検出可能であり得る。
【００７１】
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが、標的Ｚよりも標的Ｙに対してより強く（Ｋｏｎ）、かつ／またはより小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で結合し、この文脈では、抗体Ｘが、Ｚよりも標的Ｙに対してより高い親和性を有する、抗体結合の程度を指す。同様に、本明細書における「より低い親和性」という用語は、抗体Ｘが、標的Ｚよりも標的Ｙに対してより弱く、かつ／またはより大きい解離定数で結合し、この文脈では、抗体Ｘが、Ｚよりも標的Ｙに対してより低い親和性を有する、抗体結合の程度を指す。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性は、ＫＡ＝１／ＫＤとして表すことができ、ＫＤは、ｋｏｎ／ｋｏｆｆに等しい。ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値は、表面プラズモン共鳴を使用して測定され得る（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを使用して測定可能）。
【００７２】
また、本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、リンパ球および免疫原の抗原性部分に対して向けられた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
【００７３】
本明細書で使用される「免疫原」は、免疫応答を誘起し、かつ／または抗体の産生を引き起こし、例えば、多抗原性ペプチドとしてコンジュゲートされ、かつ／またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強剤に融合された、本明細書に記載の環状ペプチドを含み得る物質を意味する。本明細書に記載のコンジュゲートに加えて、同定されたエピトープ、例えば、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、またはＫＴＫＥ（配列番号３）に対する交差反応性抗体を誘発する免疫原性ペプチド模倣体。有用な免疫原として機能するために、α−Ｓｙｎペプチドは、望ましくは、Ｅ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、および／またはＱ６２を含む、最少で約３、４、５、６、または７個のα−Ｓｙｎ残基を組み込む。
【００７４】
例えば、α−ｓｙｎリン酸化を阻害する本開示の抗体との関連で本明細書で使用される「阻害すること」という用語は、抗体の存在下でのα−ｓｙｎリン酸化の量を、抗体の不在下と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％低減することを意味する。
【００７５】
環状化合物に関する「対応する線状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学部分を含むか、またはそれらからなるが線状（非環化）形態である化合物、任意にペプチドを指す。
【００７６】
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然型塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然型モノマーまたはその一部を含む、修飾または置換された配列を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む天然型塩基を含み得る。配列はまた、修飾された塩基を含み得る。そのような修飾された塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補性核酸配列、ならびにコドン最適化または同義のコドン同等物を含む。本明細書で使用される「単離された核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない核酸、または化学的に合成される場合は化学前駆体、もしくは他の化学物質を指す。単離された核酸はまた、核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５′および３′末端に位置する配列）を実質的に含まない。
【００７７】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、例えば、該核酸分子が原核生物および／もしくは真核生物細胞に導入され、かつ／またはゲノムに組み込まれることを可能にする核酸分子の任意の中間体ビヒクルを含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベースのベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどを含む。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体外遺伝物質、通常は環状ＤＮＡ二重鎖の構築物を指し、これは、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる。
【００７８】
「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ発現ベクターを導入して組換え細胞を産生することができる細胞を指す。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、ならびに任意のタイプの微生物、酵母、真菌、昆虫、または哺乳動物宿主細胞であり得る。哺乳類の宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。
【００７９】
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、または賦形剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
【００８０】
本明細書で使用される「投与される」という用語は、治療有効量の本開示の化合物または組成物の、細胞または対象への投与を意味する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「有効量」という語句は、所望の結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を意味する。対象に投与される場合、有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重などの要因によって異なり得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。
【００８２】
本明細書で使用され、当該技術分野でよく理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは望ましい臨床結果には、１つ以上の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡大の防止、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解（部分的または全体的）、検出の可否が含まれ得るが、これらに限定されない。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存率と比較して、生存率を延長することも意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」は、予防的治療も含む。例えば、初期段階のＰＤを有する対象は、進行を防ぐために治療することができる。そのような対象は、進行を防ぐために、本明細書に記載の化合物、抗体、免疫原、免疫複合体または組成物で治療することができる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、抗体に関して「特異的に結合する」とは、抗体が、構造的または立体配座的に異なる抗原および／または修飾もしくは突然変異した配列を有する抗原よりも高い親和性でその標的抗原に結合することを意味する。例えば、多価抗体は、少なくとも５ｅ−５、少なくとも１ｅ−６、少なくとも１ｅ−７、少なくとも１ｅ−８、または少なくとも１ｅ−９のＫＤでその標的に結合する。少なくとも１ｅ−７より大きい親和性が好ましい。１つの可変ドメインを含むＦａｂ断片などの抗原結合断片は、例えば、断片化されていない抗体との多価相互作用よりも１０倍または１００倍低い親和性／結合力でその標的に結合し得る。
【００８４】
α−Ｓｙｎの形態に優先的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的」または「選択的に結合する」という用語（例えば、単離された未変性モノマーまたは未変性テトラマーおよび／または不溶性フィブリル状α−シヌクレインと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーおよび小さな可溶性フィブリルなどのミスフォールドした立体配座）は、結合タンパク質が、少なくとも２倍、３倍、または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍以上の親和性でその形態に結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、ミスフォールドしたオリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態と比較して少なくとも３倍などのより高い親和性で特定の形態のα−Ｓｙｎに優先的に結合する。
【００８５】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、化学部分、好ましくは免疫原性が低いかまたは非免疫原性であり、ペプチドＮ末端および／またはＣ末端に結合される、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、任意にＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）エピトープペプチドの少なくとも３つのアミノ酸を含む、α−ＳｙｎペプチドＮ末端および／またはＣ末端に直接または間接的に共有結合できることを意味する。リンカー端部は、例えば、接合して環状化合物を産生することができる。リンカーは、１つ以上のシステイン残基などの１つ以上の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して、担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原増強剤に連結することができる。リンカーを含む環状化合物は、ペプチド自体よりも長さが長い。すなわち、（例えば、３つのアミノ酸残基の）リンカーを有するペプチドを環化すると、リンカーを有しないペプチドよりも大きな閉じた円が作製される。リンカーは、アミノ酸ＧおよびＡなどの非免疫原性部分、またはＰＥＧの繰り返しを含み得るが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、本明細書で使用される場合、別の原子群または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの群または原子間の化学的相互作用を形成する原子群または単一原子を指す「官能基」を有する化学実体を指す。システインの場合、官能基は、反応してジスルフィド結合を形成することができる、−ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えば、ＣＣＣであり得る。別の原子群との反応は、例えば、約１ｅ−１４のＫｄを有し得るビオチン−ストレプトアビジン結合の場合のように、共有結合または強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、少なくとも１ｅ−９、少なくとも１ｅ−１０、少なくとも１ｅ−１１、少なくとも１ｅ−１２、少なくとも１ｅ−１３、または少なくとも１ｅ−１４のＫｄとの相互作用を意味する。
【００８７】
タンパク質および／または他の薬剤は、免疫原性を助けるために、またはインビトロ研究においてプローブとして作用するために、環状化合物に結合され得る。この目的のために、反応することができる（例えば、共有結合または非共有結合であるが強い結合を作製する）任意の官能化可能な部分を使用することができる。特定の一実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上の非対合システインとジスルフィド結合を形成するように反応するシステイン残基であり、これは、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強剤、またはインビトロ免疫ブロットもしくは免疫組織化学的アッセイに使用されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。
【００８８】
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含む動物界のすべてのメンバーを含む。
【００８９】
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含み（ｃｏｎｔａｉｎ）得る。
【００９０】
本開示の範囲の理解において、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」およびその派生語という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を指定し、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、および／またはステップの存在を除外する、制限的用語であることが意図される。
【００９１】
本明細書におけるエンドポイントによる数値範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数値および分数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が含まれる）。また、そのすべての数値および分数は、「約」という用語によって修飾されると推定されることも理解されたい。さらに、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことを理解されたい。「約」という用語は、参照されている数値のプラスマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【００９２】
さらに、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが好適である本明細書で記載される他の実施形態に適用可能であるように意図される。例えば、以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義されている。そのように定義された各態様は、反対に明らかに示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
【００９３】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形には、文脈で明らかに別段の指示がない限り、複数形の参照が含まれる。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含むことができる。
【００９４】
ＩＩ．エピトープおよびエピトープ化合物
本発明者らは、それぞれ、立体配座エピトープであり得るアミノ酸５７〜６０、５８〜６１、および５９〜６２において、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）を含むα−Ｓｙｎタンパク質の配列を同定したため、例えば、ＥＫＴＫ（配列番号２）およびＴＫＥＱ（配列番号４）またはそれらの各々の一部が、α−Ｓｙｎのミスフォールドしたオリゴマー種における抗体結合に選択的にアクセス可能であり得る。
【００９５】
モノマー、フィブリル、および／または偏向α−Ｓｙｎフィブリルアンサンブルで同定されたエピトープ間で同定された１つ以上の立体配座の違いに基づいて、本発明者らは、抗体を産生するための立体配座が制限された化合物および免疫原を設計した。
【００９６】
実施例に示されるように、該免疫原を使用して産生された抗体は、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎを検出または標的化するのに有用である。
【００９７】
実施例に記載されるように、環状ペプチドシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）、シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）、シクロ（ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号１０）、およびシクロ（ＣＧＧＧＧＴＫＥＱＧＧ）（配列番号１１）などの環状化合物を同定して、モノマーおよび／または不溶性フィブリル種と比較して、α−Ｓｙｎのミスフォールドしたオリゴマー種における対応するエピトープの立体配座の違いを捕捉した。例えば、環状１０−ｍｅｒシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）におけるアミノ酸のＲＭＳＤ構造アラインメントは、モノマーアンサンブルにおける対応する量とは有意に異なることが見出された。これは、環状化合物が、発生期のモノマーα−Ｓｙｎおよび／または不溶性フィブリルに提示される配列とは立体配座的に異なる立体配座エピトープを提供する可能性があることを示唆している。
【００９８】
したがって、本開示は、α−Ｓｙｎ、例えばペプチドＥＫＴＫ（配列番号２）、およびＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）またはそれらの一部、例えばα−Ｓｙｎ上のアミノ酸残基５７〜５８に対応するＥＫおよびα−Ｓｙｎ上のアミノ酸６０〜６２に対応するＫＥＱにおける立体配座エピトープを同定する。実施例に示されるように、ＥＫＴＫ（配列番号２）およびＴＫＥＱ（配列番号４）は、α−Ｓｙｎにおいて無秩序になりやすい領域として同定された。残基ＥＫＴＫ（配列番号２）およびＴＫＥＱ（配列番号４）は、実施例に記載されるような集団座標法を使用する予測において出現した。
【００９９】
態様は、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、任意にＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）の少なくとも３つのアミノ酸、および／またはＫＥＱなどの前述のうちのいずれかの一部を含むα−Ｓｙｎペプチドを含む化合物を含む。実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドは、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、ＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、またはＫＴＫＥＱ（配列番号９）から選択される。
【０１００】
α−Ｓｙｎペプチドはまた、１、２、または３つのＣ末端アミノ酸残基とともに、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）（または１、２、もしくは３つのＮ末端アミノ酸残基のＥＫＴもしくはＥＫＴＫ（配列番号２）などのその内部配列、および／または）に対するＮ末端および／またはＣ末端のいずれかのα−Ｓｙｎに追加の１、２、または３アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドの最大長は、９アミノ酸、８アミノ酸、または７アミノ酸である。
【０１０１】
実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドは、ＫＥＱ、ＴＫＥＱ（配列番号４）、ＫＴＫＥＱ（配列番号９）、またはＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。
【０１０２】
実施形態では、化合物は、リンカーをさらに含む。リンカーは、１つ以上の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８アミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子、ならびに／あるいはそれらの組み合わせを含むことができる。実施形態では、リンカーアミノ酸は、ＧおよびＡなどの非免疫原性または低免疫原性アミノ酸残基から選択され、例えば、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ−ＰＥＧ（ＰＥＧ２とも称される）−ＧＧなどであり得る。例えば、化合物を薬剤もしくは検出可能なタグ、またはＢＳＡなどの担体、またはＫＬＨなどの免疫原性増強剤に結合するために、官能基を有する１つ以上の官能化可能な部分、例えばアミノ酸を含めることができる。官能化可能な部分は、システインなどのアミノ酸であり得る。実施形態では、リンカーは、最大で１、２、３、４、５、６、７、または８アミノ酸を含む。
【０１０３】
実施形態では、リンカーは、ＧＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＧＣ、ＧＣＧ、またはＰＥＧ２−ＣＧを含む。別の実施形態では、リンカーは、ＧＣＧＧＧＧ（配列番号１２）、ＧＧＣＧＧ（配列番号１３）、ＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＧＧＣＧＧ（配列番号１５）、またはＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号１６）を含む。他のリンカーを表２〜４に提供する（α−Ｓｙｎペプチドを含む構築物で提示される）。
【０１０４】
化合物のタンパク質性部分（もしくはリンカーもタンパク質性である化合物）は、固相合成または均質溶液中での合成などのタンパク質の化学でよく知られている技法を使用する化学合成によって調製することができる。
【０１０５】
化合物は線状であり得、例えば、対応する環状化合物に優先的に結合する抗体を選択するために使用され得る。好ましくは、化合物は、環状化合物などの立体配座化合物である。実施例に示されるように、これは、α−Ｓｙｎペプチドを含む環状ペプチドを使用して達成することができる。
【０１０６】
したがって、態様は、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、任意にＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）の少なくとも３つのアミノ酸を含むα−Ｓｙｎペプチド、ならびに／または前述のうちのいずれかの一部およびリンカーを含む環状化合物を提供し、ここでリンカーは、α−Ｓｙｎペプチドに直接または間接的に共有結合している。実施例に示されるように、環状ペプチドの残基は、モノマーまたはフィブリルアンサンブルの対応する残基と比較して、代替の立体配座にある。実施形態では、環状化合物は、本明細書に記載のα−Ｓｙｎペプチドおよびリンカーを含む。実施形態では、環状化合物は、ＥＫＴ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）、および最大６個のα−Ｓｙｎ残基（例えば、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）に対するＮ末端および／またはＣ末端の１または２アミノ酸）、ならびにリンカーを含み、ここでリンカーは、α−ＳｙｎペプチドのペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基に直接または間接的に共有結合される。環状ペプチドの残基の曝露は、モノマーおよび／またはフィブリルアンサンブル、ならびに細胞のモノマーおよび不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎにおいて、対応する残基とは異なり得る。例えば、環状化合物では、Ｅ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、またはＱ６２のうちの少なくとも１つは、モノマーアンサンブルで占められている立体配座よりも多くの表面曝露を有する。
【０１０７】
ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＥＫＴ、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、ＫＴＫＥＱ（配列番号９）、ＫＥＱまたはＴＫＥＱ（配列番号４）を含むペプチドが、ＥＫＴＫ（配列番号２）またはＴＫＥＱ（配列番号４）のＮ末端および／またはＣ末端であるα−Ｓｙｎに見られる１、２、または３つの追加の残基を含み、環化化合物中のリンカーは、α−Ｓｙｎ追加の残基のＮ末端および／またはＣ末端に共有結合している。同様に、α−Ｓｙｎペプチドが、ＥＫＴＫ（配列番号２）である場合、リンカーは、残基ＥおよびＫに共有結合し、α−Ｓｙｎペプチドが、ＴＫＥＱ（配列番号４）である場合、リンカーは、残基ＴおよびＱに共有結合し、α−Ｓｙｎペプチドが、ＫＴＫＥＱ（配列番号９）である場合、リンカーは、残基ＫおよびＱに共有結合している。
【０１０８】
実施形態では、環状化合物は、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）を含むかまたはそれからなるペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に結合される。
【０１０９】
実施形態では、交互立体配座は、残基Ｅ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、またはＱ６２のうちの１つ以上について、より溶媒に曝された立体配座である。
【０１１０】
一実施形態では、環状化合物は、環状ペプチドである。別の実施形態では、環状ペプチドは、配列番号５、７、および１０〜６０のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、環状ペプチドは、ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧの配列（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、環状ペプチドは、ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧの配列（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、環状ペプチドは、ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧの配列（配列番号１０）を含むか、またはそれからなる。
【０１１１】
環状ペプチドおよび対応する線状ペプチドは、例えば、α−Ｓｙｎペプチドおよび官能化可能な部分に対するリンカー残基の位置を同定することによって参照することができる。例えば、ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ（配列番号５）は、４，２構築物と称され得、ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ（配列番号７）は、１，４構築物と称され得、ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧは、３，２構築物と称され得る。
【０１１２】
環化ペプチドを作製するための方法は、当該技術分野で知られており、ＳＳ環化またはアミド環化（頭−尾、または骨格環化）を含む。方法については、実施例のセクションでさらに説明する。例えば、そのＮ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基を有するペプチド、例えば、ＣＧＧＥＫＴＫＧＧＣ（配列番号１７）は、ＳＳ環化によって反応して、環状ペプチドを産生することができる。環状化合物は、環化前に、α−Ｓｙｎペプチド、任意にＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、または関連エピトープを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合したリンカーを有する線状分子として合成することができる。あるいは、リンカーの一部は、Ｎ末端に共有結合し、一部は、環化前にＣ末端に共有結合される。いずれの場合も、線状化合物は、例えば、頭−尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化される。
【０１１３】
実施例に記載されるように、環状化合物は、同定され、合成され、免疫原を調製するために使用され、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎに選択的な抗体を産生するために使用される立体配座エピトープとの関連性について評価された。本明細書に記載のエピトープＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、および／またはその一部は、α−Ｓｙｎのミスフォールドした伝播株における潜在的な標的であり得、本明細書に示されるような立体配座エピトープを認識する抗体は、ミスフォールドした種を検出し、そのような伝播株を阻害するのに有用である。上記のように、α−Ｓｙｎペプチドを含む環状化合物は、抗体を産生する免疫原として使用することができる。
【０１１４】
したがって、別の態様は、本明細書に記載される立体配座化合物、任意に環状ペプチドなどの環状化合物を含む免疫原を含む。実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強剤、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはオボアルブミンなどの担体を含む。免疫原性増強剤は、アミド結合を介するなどして直接、または化学リンカーを介して間接的に化合物に結合させることができる。あるいは、免疫原は、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であり得る。
【０１１５】
免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｔｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ  ２００７に記載の方法を使用して、制限されたα−Ｓｙｎエピトープペプチドを含む環状化合物を、ＫＬＨなどの免疫原性増強剤またはＢＳＡなどの担体にコンジュゲートすることによって産生することができる。実施形態では、実施例３および４に記載の方法が使用される。
【０１１６】
ＩＩＩ．抗体
本明細書に記載の化合物、特に、α−ＳｙｎペプチドＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号３）などのＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）の任意の３つのアミノ酸残基を含む環状化合物を使用して、対応する線状化合物と比較してα−Ｓｙｎペプチドを含む化合物に選択的に結合する、ならびに／またはモノマーおよび／もしくはα−Ｓｙｎ不溶性フィブリルと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎを含むミスフォールドした形態のα−Ｓｙｎのα−Ｓｙｎペプチド中のエピトープにも結合する抗体を産生することができる。実施例に示されるように、環状化合物は、非偏向フィブリル状α−Ｓｙｎとは異なり、部分的にアンフォールドしたフィブリル状α−Ｓｙｎ（偏向α−Ｓｙｎ）に類似する１つ以上の空間立体配座を示す。さらに、該化合物を使用して産生された抗体は、環状ペプチドに選択的であり、また、未変性種と比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−ｓｙｎなどのミスフォールドしたα−ｓｙｎに選択的に結合することが示され、それらがミスフォールドしたα−Ｓｙｎにおけるこれらの残基の立体配座を優先的に認識することを示す。例えば、実施例に示されるように、産生された抗体は、モノマーおよび不溶性フィブリル種と比較して、ミスフォールドしたオリゴマー種に優先的に結合する。
【０１１７】
同様に、例えば、ＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、もしくはＫＴＫＥＱ（配列番号９）を含む環状化合物、および／または本明細書に記載の他の関連エピトープ配列を使用して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎとの関連で、例えばＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、ＥＫＴＫＥ（配列番号８）、またはＫＴＫＥＱ（配列番号９）などに選択的に結合する抗体を産生することができる。
【０１１８】
したがって、態様は、α−Ｓｙｎペプチド中のエピトープに結合する抗体を含み、α−Ｓｙｎペプチドは、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、またはその関連エピトープ、例えば少なくとも３つもしくは少なくとも４つのアミノ酸を含むその一部を含むか、またはそれからなる。実施形態では、ＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、ＫＥＱ、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）から選択されるα−Ｓｙｎペプチド。
【０１１９】
実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープである。
【０１２０】
α−Ｓｙｎペプチドは、環状化合物および／またはミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎなどのミスフォールドしたα−Ｓｙｎにあり得る。実施形態では、抗体は、対応する線状化合物と比較して、α−Ｓｙｎペプチドを含む環状化合物に選択的に結合する。別の実施形態では、抗体は、モノマーまたは不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎと比較して、オリゴマーα−Ｓｙｎなどのミスフォールドしたα−Ｓｙｎ中のα−Ｓｙｎペプチドに選択的に結合する。
【０１２１】
実施形態では、抗体は、単離される。
【０１２２】
実施形態では、抗体は、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎなどのミスフォールドした形態と比較して、単離された未変性モノマーα−Ｓｙｎに選択的に結合しない。選択的結合を含む結合は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して、例えば、本明細書に記載されるように測定することができる。
【０１２３】
したがって、さらなる態様は、該α−Ｓｙｎペプチドを含む環状化合物、またはミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎのα−Ｓｙｎペプチド中の立体配座エピトープに特異的または選択的に結合する抗体であり、α−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープは、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、またはＥＫＴ、ＫＴＫ、ＴＫＥ、もしくはＫＥＱなどのその一部を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープは、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）である。一実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープは、ＥＫＴＫ（配列番号２）である。別の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープは、ＫＴＫＥ（配列番号３）である。さらに別の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープは、ＴＫＥＱ（配列番号４）である。
【０１２４】
実施形態では、エピトープは、抗体への結合に主に関与する少なくとも２つの連続するアミノ酸残基を含むか、またはそれらからなり、少なくとも２つの連続するアミノ酸は、対応してＥＫＴＫ（配列番号２）、またはＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）内に埋め込まれたＥＫ、またはＫＴ、またはＴＫ、またはＫＥ、またはＥＱである。
【０１２５】
別の実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープであり、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）からなる。実施形態では、抗体は、対応する線状化合物と比較して、環状ペプチド中のＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）、任意にシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧ）配列番号４８、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）配列番号４９、シクロ（ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）配列番号１０、またはシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）配列番号５に選択的に結合する。
【０１２６】
実施形態では、抗体は、環状化合物中のα−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープに選択的に結合し、α−Ｓｙｎペプチドは、対応する線状ペプチドおよび／またはモノマーもしくは不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎと比較して、任意にシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）または表２〜４に記載されている他の環状ペプチド配列との関連で、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。例えば、実施形態では、抗体は、環状化合物中のＴＫＥＱ（配列番号４）、任意にシクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）などの環状ペプチドに選択的に結合し、任意に本明細書に記載の方法を使用して、例えばＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって測定して、対応する線状ペプチドおよび／またはモノマーもしくは不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎ中のＴＫＥＱ（配列番号４）と比較して、環状立体配座中のＴＫＥＱ（配列番号４）に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍より選択的なより優れた選択性（例えば、結合親和性）を有する。
【０１２７】
実施形態では、抗体は、未変性α−Ｓｙｎと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド中のα−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープに選択的に結合する。実施形態では、選択性は、モノマーまたは不溶性フィブリル状α−Ｓｙｎよりもミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに対して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍より選択的である。
【０１２８】
実施形態では、抗体は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４から選択される。
【０１２９】
実施形態では、抗体は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、ＣＤＲ３のアミノ酸列は、配列番号６３、６９、７５、８１、９３、または１８２から選択され、抗体は、未変性α−Ｓｙｎと比較して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎ中の本明細書に記載のα−Ｓｙｎペプチドまたはエピトープに選択的に結合する。
【０１３０】
一実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号６１〜６６のアミノ酸配列から選択される。
【０１３１】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、および６６のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１３２】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号６７〜７２のアミノ酸配列から選択される。
【０１３３】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、および７２のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１３４】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号７３〜７８のアミノ酸配列から選択される。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号７３、７４、７５、７６、７７、および７８のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１３６】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号７６〜７７、７９〜８１、および８４のアミノ酸配列から選択される。
【０１３７】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号７６〜７７、７９、８０、８１、および８４のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１３８】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号７９〜８１、７６〜７７、および８４のアミノ酸配列から選択される。
【０１３９】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号７９、８０、８１、７６、７７、および８４のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１４０】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号７１、９１〜９４、および９６のアミノ酸配列から選択される。
【０１４１】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号９１、９２、９３、９４、７１、および９６のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１４２】
別の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、７７、および１８４のアミノ酸配列から選択される。
【０１４３】
特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号１８０、１８１、１８２、１８３、７７、および１８４のアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０１４４】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は維持されている。
【０１４５】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１３３のアミノ酸配列、または配列番号１３３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３５のアミノ酸配列、または配列番号１３５に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３７のアミノ酸配列、または配列番号１３７に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３９のアミノ酸配列、または配列番号１３９に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１４１のアミノ酸配列、または配列番号１４１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１４３のアミノ酸配列、または配列番号１４３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号１９０のアミノ酸配列、または配列番号１９０に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。
【０１４６】
実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ配列は維持されている。
【０１４７】
別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１３４のアミノ酸配列、または配列番号１３４のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１３６のアミノ酸配列、または配列番号１３６のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１３８のアミノ酸配列、または配列番号１３８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１４０のアミノ酸配列、または配列番号１４０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１４２のアミノ酸配列、または配列番号１４２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１４４のアミノ酸配列、または配列番号１４４のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１９１のアミノ酸配列、または配列番号１９１のいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１３３のアミノ酸配列、または配列番号１３３および配列番号１３４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１３４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１３５のアミノ酸配列、または配列番号１３５および配列番号１３６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１３６に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１３７のアミノ酸配列、または配列番号１３７および配列番号１３８に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１３８に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１３９のアミノ酸配列、または配列番号１３９および配列番号１４０に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４０に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４１のアミノ酸配列、または配列番号１４１および配列番号１４２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４３のアミノ酸配列、または配列番号１４３および配列番号１４４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１４４に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１９０のアミノ酸配列、または配列番号１９０および配列番号１９１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１９１に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１４９】
以下の表１３および１４は、ＩｇＢＬＡＳＴに従って決定される、抗体クローン２Ｅ９、９Ｄ８、１２Ｇ１、３Ｃ１１、１２Ｂ１２、１０Ｄ５、および１１Ｂ６の各々の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびにそれぞれ重鎖および軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を示している。表１４の重鎖および軽鎖のＣＤＲは、太字で示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤＲセット、重鎖および／または軽鎖の可変領域は、そこに記載されているとおりである。他の実施形態では、抗体または核酸は、そこに記載される配列を含む。
【０１５０】
実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびポリクローナル抗体からなる群から選択される。
【０１５１】
実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１５２】
実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
【０１５３】
実施形態では、抗体は、一本鎖抗体であり、任意にヒト化一本鎖抗体である。
【０１５４】
実施形態では、抗体は、Ｆａｂ断片、任意にヒト化Ｆａｂ断片などの結合断片である。
【０１５５】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、本明細書に記載の免疫原で免疫付与した対象から採取し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞と融合させて、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生成することができる。そのような技法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法）、ならびにヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０−６７（１９８６））、および組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９））は、当該技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は、所望のエピトープと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【０１５６】
特定の抗原または分子に対して反応性のある特定の抗体または抗体断片はまた、細胞表面成分を有する細菌で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１：５４４−５４６（１９８９）、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照）。
【０１５７】
非ヒト種からの抗体のヒト化は、文献に十分に記載されている。例えば、ＥＰ−Ｂ１０２３９４００およびＣａｒｔｅｒ＆Ｍｅｒｃｈａｎｔ  １９９７（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８，４４９−４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手される（例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ，Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ．）。
【０１５８】
ヒト化形態のげっ歯類抗体は、ＣＤＲグラフト化によって容易に生成される（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）。このアプローチでは、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を構成する６つのＣＤＲループが、対応するヒトフレームワーク領域に連結されている。フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を与える可能性があるため、ＣＤＲグラフトは、しばしば親和性が低減された抗体を生成する（Ｆｏｏｔｅ＆Ｗｉｎｔｅｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２４：４８７−４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するために、特定のフレームワーク残基を部位特異的変異誘発または他の組換え技法によって置き換えることがしばしば必要であり、抗原結合部位のコンピューターモデリングによって支援され得る（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８−２９７６，１９９４）。
【０１５９】
ヒト化形態の抗体は、任意に、再表面化することによって得られる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２３５：９５９−９７３，１９９４）。このアプローチでは、げっ歯類抗体の表面残基のみがヒト化される。
【０１６０】
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略によって同定され得る（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３，１９９４）。１つのアプローチでは、特定の抗原に対して向けられたげっ歯類抗体の重鎖がクローン化され、繊維状ファージ上のＦａｂ断片として表示するためにヒト軽鎖のレパートリーと対合される。ファージは、抗原に結合することによって選択される。その後、選択されたヒト軽鎖は、ファージ上に表示するためにヒト重鎖のレパートリーと対合され、ファージは、抗原に結合することによって再び選択される。その結果、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂ断片が得られる。別のアプローチでは、メンバーがそれらの外面に異なるヒト抗体断片（ＦａｂまたはＦｖ）を表示する、ファージのライブラリーが産生される（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７）。所望の特異性を有するファージディスプレイ抗体は、特定の抗原に対する親和性濃縮によって選択される。いずれかのアプローチから同定されたヒトＦａｂまたはＦｖ断片は、哺乳動物細胞におけるヒト抗体としての発現のために再クローン化され得る。
【０１６１】
ヒト抗体は、任意にトランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、および同第５，７７０，４２９号）。このアプローチでは、キメラまたは生殖細胞変異体マウスの重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子が欠失される。その後、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、そのような変異体マウスに移す。得られたトランスジェニックマウスは、抗原チャレンジ時にヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができる。
【０１６２】
ヒト化またはヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択される。ヒト化またはヒト抗体は、１つ以上のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。さらに、これらの抗体は、典型的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖなどの抗原結合断片および単一ドメイン抗体断片として、または重鎖および軽鎖がリンカーによって連結されている一本鎖抗体として産生される。また、ヒトまたはヒト化抗体は、モノマーまたはポリマーの形態で存在し得る。ヒト化抗体は、任意に、１つの非ヒト鎖および１つのヒト化鎖（すなわち、１つのヒト化重鎖または軽鎖）を含む。
【０１６３】
さらに、本明細書に記載のエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリーは、疾患特異的エピトープに特異的な抗体断片を同定するために、本開示の疾患特異的エピトープを使用することによって任意にスクリーニングされる。同定された抗体断片を任意に使用して、本開示の異なる実施形態で有用である様々な組換え抗体を産生する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えば、Ｘｏｍａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を通じて市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野で周知である。
【０１６４】
別の態様は、本明細書に開示される抗体および検出可能な標識または粒子などの部分を含む免疫複合体である。
【０１６５】
検出可能な標識は、例えば、蛍光タンパク質などの抗体（例えば、融合部分）に融合されたポリペプチド、または任意に切断可能なＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグなどの精製タグであり得る。例えば、検出可能な標識は、ストレプトアビジン、または蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃｙ５）であり得る。
【０１６６】
検出可能な標識はまた、陽電子放出放射性核種であり得る。他の検出可能な標識は、本明細書の他の場所に記載されている。
【０１６７】
粒子は、例えば、抗体がコンジュゲートされる磁性ビーズなどの磁性粒子、金粒子、樹脂、またはアガロースであり得る。本明細書に記載の１つ以上の異なる抗体を、粒子にコンジュゲートさせることができる。抗体は、例えば、アミン、カルボキシル、またはマレイミド官能基を介した共有結合によって粒子にコンジュゲートさせることができる。
【０１６８】
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物または免疫原のアミノ酸残基をコードする核酸である。
【０１６９】
さらなる態様は、本明細書に記載の抗体または免疫複合体、例えば、任意にベクターに含まれる一本鎖、単一ドメイン、および／またはヒト化抗体などをコードする核酸である。核酸配列は、例えば、標準的なＲＴ−ＰＣＲを使用してそこから生成されたｃＤＮＡを使用するハイブリドーマによって発現される免疫グロブリン遺伝子転写物を配列決定し、例えば標準的な色素ターミネーターキャピラリー配列決定を使用して配列決定することによって決定することができる。
【０１７０】
核酸はまた、例えば少なくとも１０ヌクレオチドを含む、ＣＤＲなどのその任意の部分をコードすることができる。核酸はまた、本明細書に記載の１つ以上の配列を増幅するためのプライマーであり得る。
【０１７１】
核酸は、シグナル配列などの他の構成要素を含み得る。
【０１７２】
実施形態では、抗体をコードする核酸は、重鎖可変領域をコードする核酸配列を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載されるもの、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４から選択される。
【０１７３】
実施形態では、抗体をコードする核酸は、重鎖可変領域をコードする核酸配列を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、配列番号６３、６９、７５、８１、９３、および１８２から選択される。
【０１７４】
実施形態では、抗体をコードする核酸は、重鎖可変領域をコードする核酸配列を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２７、もしくは１８５；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２８、もしくは１８６；または
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、または１８７によってコードされる。
【０１７５】
例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号９７〜９９の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１０３〜１０５の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１０９〜１１１の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１１５〜１１７の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１１５〜１１６、および１２３の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１２７〜１２９から選択される核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ、配列番号１８５〜１８７の核酸配列によってコードされ得る。
【０１７６】
別の実施形態では、抗体をコードする核酸は、軽鎖可変領域をコードする核酸を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１００、１０６、１１２、１１５、１３０、もしくは１８８；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１０１、１０７、もしくは１１３；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１３２、もしくは１８９によってコードされる。
【０１７７】
例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１００〜１０２の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１０６〜１０８の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１２〜１１４の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１２〜１１３、および１２０の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１２〜１１３、および１２０の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１０７、１３０、および１３２の核酸配列によってコードされ得る。例えば、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１８８、１１３、および１８９の核酸配列によってコードされ得る。
【０１７８】
実施形態では、核酸は、抗体をコードし、ｉ）重鎖可変領域をコードする第１の核酸分子であって、重鎖可変領域が、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、第１の核酸分子と、ｉｉ）相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードする第２の核酸分子と、を含み、該ＣＤＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、以下に記載の核酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２７、もしくは１８５；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２８、もしくは１８６；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、もしくは１８７；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号１００、１０６、１１２、１３０、もしくは１８８；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号１０１、１０７、もしくは１１３；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１３２、もしくは１８９によってコードされる。
【０１７９】
第１の核酸分子および第２の核酸分子は、発現カセットとして融合され得るか、または別個の発現カセットとしてベクターに含まれ得る。
【０１８０】
核酸は、本明細書に記載のＣＤＲセットを含むことができる。
【０１８１】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、および１０２によってコードされる。
【０１８２】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、および１０８によってコードされる。
【０１８３】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４によってコードされる。
【０１８４】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１５、１１６、１１７、１１２、１１３、および１２０によってコードされる。
【０１８５】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１１５、１１６、１２３、１１２、１１３、および１２０によってコードされる。
【０１８６】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１２７、１２８、１２９、１３０、１０７、および１３２によってコードされる。
【０１８７】
特定の実施形態では、ＣＤＲ  ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３は、それぞれ、配列番号１８５〜１８８、１１３、および１８９によってコードされる。
【０１８８】
別の実施形態では、抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、および１９２のうちのいずれか１つを含む核酸配列；ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が維持されている前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つをコードするか、または配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、および１９０のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列によってコードされ、ＣＤＲアミノ酸配列は維持されている。
【０１８９】
さらなる実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、および１９３のうちのいずれか１つを含む核酸配列；ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が維持されている前述のうちのいずれかに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列；配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つをコードするか、または配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、および１９１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列によってコードされ、ＣＤＲ配列は維持されている。
【０１９０】
実施形態では、核酸は、単離された核酸である。
【０１９１】
ベクターは、抗体を産生するか、または本明細書に記載のペプチド配列を発現するのに適したベクターを含む、任意のベクターであり得る。
【０１９２】
核酸分子は、タンパク質の発現を確実にする適切な発現ベクターに既知の方法で組み込まれ得る。可能な発現ベクターには、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、使用される宿主細胞と互換性がある必要がある。発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に適しており、これは、発現ベクターが、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子を含むことを意味する。例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、別々のベクターに挿入され得る。例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、同じ発現ベクターに挿入され得る。
【０１９３】
実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列をコードする核酸配列のうちの１つ以上を含むか、または本明細書に記載の任意の核酸、例えば、配列番号９７〜１１７、１２０、１２３、１２７〜１３０、１３２、１４５〜１５６、および１８５〜１８９のうちの１つ以上を含む。
【０１９４】
実施形態では、ベクターは、例えば、遺伝子療法による一本鎖抗体を発現するのに適している。ベクターは、例えば、神経特異的プロモーターなどを使用して、神経組織における特異的発現に適合させることができる。実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。そのようなベクターを使用して、インビボで抗体を送達することができる。
【０１９５】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む様々な供給源に由来し得る。
【０１９６】
そのような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択した宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列などの他の配列を発現ベクターに組み込むことができる。
【０１９７】
実施形態では、調節配列は、神経組織および／または細胞における発現を指示または増加させる。
【０１９８】
実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０１９９】
組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載の抗体またはエピトープペプチドを発現するためのベクターで形質転換、感染、またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。
【０２００】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性の増加を提供する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする発現カセットを含み得、組換えペプチドの溶解度を高め、例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、親和性精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えペプチドの精製を助ける。さらに、タンパク質分解切断部位を、標的組換えタンパク質に添加して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離するのを可能にすることができる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれ、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを組換えタンパク質に融合する。
【０２０１】
例えば、インビトロおよびインビボの両方でニューロンおよび神経組織に遺伝子を移入するためのシステムには、ウイルス、特に単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびレンチウイルスを含むレトロウイルスに基づくベクターが含まれる。遺伝子送達の代替アプローチには、ネイキッドプラスミドＤＮＡおよびリポソーム−ＤＮＡ複合体の使用が含まれる。別のアプローチは、ＤＮＡがポリカチオン凝縮され、脂質が捕捉され、脳内遺伝子送達によって脳に導入されるＡＡＶプラスミドの使用である（Ｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．米国出願第２００２／０７６３９４号）。
【０２０２】
実施形態では、ベクターは、シグナル配列（細胞内抗体発現を可能にする）を含む核酸配列を含む。フォールディングおよびジスルフィド形成を伴う適切な外在化を可能にし、分泌され、ダイマー化され、処理されたタンパク質として所望の抗体を作製することを可能にする分泌可能な鎖前駆体の発現に適した任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナル配列は、配列番号１５７〜１６４、１６９〜１７７、および１７９のうちのいずれか１つから選択される。
【０２０３】
実施形態では、ベクターは、シグナル配列が欠失された核酸配列、任意に表１５にあるものを含む。
【０２０４】
別の態様では、本明細書に記載の抗体を発現する細胞も提供される。
【０２０５】
実施形態では、細胞は、ハイブリドーマなどの融合細胞である。
【０２０６】
実施形態では、細胞は、組換え細胞である。実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、任意にＣＨＯ細胞である。
【０２０７】
組換え細胞は、ポリペプチドを産生するのに適した、例えば、抗体および／またはその結合断片を産生するのに適した任意の細胞を使用して生成することができる。
【０２０８】
好適な宿主細胞には、多種多様な原核生物および真核生物の宿主細胞が含まれる。例えば、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞などの細菌細胞で発現され得る。
【０２０９】
より具体的には、組換え抗体産生細胞を産生するのに適した細菌宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の様々な種、ならびに当業者に周知の他の多くの細菌種が含まれる。好適な細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞で機能するプロモーター、１つ以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモーターが含まれる。代表的な選択可能マーカーには、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの様々な抗生物質耐性マーカーが含まれる。好適な発現ベクターには、λ誘導体などのバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２などのプラスミド、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
好適な酵母および真菌宿主細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の様々な種が含まれるが、これらに限定されない。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅにおいて発現するためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコルは、当業者に周知である。
【０２１１】
好適な哺乳類細胞には、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＮＳ−１細胞、およびこれらの系統の任意の誘導体が含まれる。
【０２１２】
実施形態では、組換え抗体を産生するために使用される哺乳類細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３細胞、またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から選択される。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞株は、２９３細胞株に由来し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ  ２９３発現システム、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム、または他の発現システムで使用することができる。
【０２１３】
哺乳動物細胞における発現を指示するための好適な発現ベクターは、一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０などのウイルス材料に由来する）、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。
【０２１４】
好適な昆虫細胞には、ＢｏｍｂｙｘまたはＳｐｏｄｏｔｅｒａ種からの細胞および細胞株が含まれる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズおよびｐＶＬシリーズが含まれる。
【０２１５】
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性の増加を提供する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする遺伝子を含み得、組換えペプチドの溶解度を高め、例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、親和性精製におけるリガンドとして作用することにより、標的組換えペプチドの精製を助ける。さらに、タンパク質分解切断部位を、標的組換えタンパク質に添加して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離するのを可能にすることができる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれ、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを組換えタンパク質に融合する。
【０２１６】
実施形態では、抗体またはその結合断片の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。誘導性非融合発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｐＥＴ  １１ｄが含まれる。
【０２１７】
組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子の例は、特定の薬物、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその部分、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分、好ましくはＩｇＧに対する耐性を付与するＧ４１８およびハイグロマイシンなどのタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によって監視される。選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性形質転換細胞などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードしている場合、Ｇ４１８で選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現を視覚化およびアッセイすること、特に、発現および表現型に対する突然変異の影響を決定することが可能になる。選択可能なマーカーは、目的の核酸とは別のベクターに導入できることが理解されるであろう。他の選択可能なマーカーには、目的の核酸と同時形質導入され得るＧＦＰなどの蛍光タンパク質が含まれる。
【０２１８】
ＩＶ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物、免疫原、免疫複合体、抗体、核酸、ベクター、および／または細胞を含む組成物である。組成物は、本明細書に記載の成分の２つ以上、３つ以上、または任意の組み合わせを含む。例えば、組成物は、２つ以上の抗体、２つ以上の免疫複合体、２つ以上の免疫原などを含み得る。
【０２１９】
実施形態では、組成物は、希釈剤を含む。
【０２２０】
抗体および／または細胞を含むポリペプチドに適した希釈剤には、生理食塩水、ｐＨ緩衝液およびグリセロール溶液、またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結するのに適した他の溶液が含まれるが、これらに限定されない。核酸に適した希釈剤には、水、生理食塩水、およびエタノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む。実施形態では、組成物は、例えば本明細書に記載の方法のための、例えばシヌクレイノパチーを有するか、またはミスフォールドしたα−シヌクレイン毒性を阻害する必要がある対象を治療するための薬学的組成物である。
【０２２２】
１つ以上の抗体は、本明細書に記載の状態または疾患に対して、組み合わせて、または他の治療とともに投与することができる。
【０２２３】
本明細書に記載の組成物は、有効量の活性物質が薬学的に許容されるビヒクルと混合して組み合わされるように、任意にワクチンとして対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製するための、それ自体既知の方法によって調製することができる。
【０２２４】
本明細書に記載の化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。
【０２２５】
例えば、使用できるアジュバントには、内因性アジュバント（リポ多糖など）が含まれ、通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化した細菌の成分である。外因性アジュバントは、典型的には、抗原に非共有結合し、宿主の免疫応答を増強するように配合される免疫調節剤である。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、およびリン酸アルミニウム（総称して一般的にミョウバンと称される）は、アジュバントとして日常的に使用されている。広範囲の外因性アジュバントは、免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。これらには、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｓ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）などのサポニン、または膜タンパク質抗原（免疫刺激複合体）に複合体化されたＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）ならびにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどの、それから生成された粒子、鉱物油、死滅したマイコバクテリア、および鉱物油を含むプルロニックポリマー、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカリド（ＬＰＳ）などの細菌産生物、ならびに脂質Ａ、およびリポソームが含まれる。
【０２２６】
実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。水中油型エマルジョンとしては、スクアレン、ピーナッツオイル、ＭＦ５９（ＷＯ  ９０／１４３８７）、ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が挙げられる。水中油型エマルジョンは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１′−２′ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）セラミド（ＴＭ））、または他の細菌細胞壁成分などの免疫刺激剤とともに使用され得る。
【０２２７】
アジュバントは、単一の組成物として免疫原とともに投与することができる。あるいは、アジュバントは、免疫原の投与の前、同時、および／または後に投与され得る。
【０２２８】
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体および希釈剤を含む。実施形態では、組成物は、無菌組成物である。
【０２２９】
薬学的組成物には、限定されないが、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性の滅菌注入可能な溶液もしくは懸濁液が含まれ、これらは、組成物を意図されたレシピエントの組織または血液と実質的に適合性にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および溶質をさらに含み得る。そのような組成物中に存在し得る他の成分には、例えば、水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が含まれる。即時注入溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤、または濃縮溶液もしくは懸濁液から調製することができる。組成物は、例えば、限定されないが、患者への投与前に滅菌水または生理食塩水または他の薬学的に許容される希釈剤で再構成される凍結乾燥粉末として供給され得る。
【０２３０】
薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。好適な薬学的に許容される担体には、薬学的組成物の生物活性の有効性を妨害しない、本質的に化学的に不活性かつ非毒性の組成物が含まれる。好適な薬学的担体の例には、水、食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物は、患者に直接投与するための形態を提供するために、好適な量の担体と一緒に、治療有効量の化合物を含む必要がある。
【０２３１】
「本明細書で使用される化合物」という用語は、例えば、ペプチド、免疫原、抗体、免疫複合体などを指すことができる。
【０２３２】
別の態様は、本明細書に記載の抗体およびα−ｓｙｎ（例えば、ミスフォールドしたα−ｓｙｎオリゴマーまたは可溶性フィブリル）を含む抗体複合体を含む。複合体は、溶液中であり得る。
【０２３３】
Ｖ．キット
さらなる態様は、ｉ）抗体もしくは免疫複合体、ｉｉ）核酸もしくはベクター、ｉｉｉ）ペプチド、環状化合物、もしくは免疫原、ｉｖ）組成物、および／またはｖ）例えば滅菌バイアルまたは他のハウジングなどのバイアルに含まれる、本明細書に記載の組換え細胞、ならびに任意に参照剤および／またはその使用説明書を含むキットに関する。
【０２３４】
キットは、本明細書に記載の抗体と、ビーズなどの粒子、イムノアッセイ用のマルチウェルプレートなどのプレート、または他のマトリックスを含むことができる。抗体は、それにコンジュゲートされ得るか、１つ以上のカップリング試薬とは別に提供され得る。
【０２３５】
キットは、試験試料調製溶液もしくは希釈溶液、複合体形成溶液、または非結合抗体を洗浄するための洗浄溶液、１つ以上の検出試薬もしくはカップリングなどの１つ以上の試薬を含むことができる。
【０２３６】
試薬は、本明細書に記載の試薬、例えば、実施例に記載されている試薬であり得る。
【０２３７】
キットは、例えば、本明細書に記載の方法または複数の方法で使用するためのものであり得る。
【０２３８】
本明細書に記載の化合物、免疫原、抗体、免疫複合体、核酸、ベクター、細胞組成物、およびキットは、ミスフォールドしたα−ｓｙｎ毒性を阻害するため、シヌクレイノパチーを治療するため、または本明細書に記載の他の方法もしくはアッセイに使用することができる。それらはまた、ミスフォールドしたα−ｓｙｎ毒性を阻害するため、シヌクレイノパチーを治療するための薬剤の製造において、または本明細書に記載される他の方法もしくはアッセイで使用され得る。
【０２３９】
ＶＩ．方法およびアッセイ
本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、抗体、および免疫複合体を作製するための方法が含まれる。
【０２４０】
特に、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、ＴＫＥＱ（配列番号４）、または関連エピトープの立体配座エピトープに対して選択的な抗体を作製する方法が提供される。
【０２４１】
一実施形態では、この方法は、本明細書に記載の環状化合物もしくは免疫原、または環状化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与された環状化合物または免疫原に特異的な抗体および／または細胞を単離することと、任意にミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに選択的に結合する１つ以上の抗体を単離することと、を含む。
【０２４２】
上記のように、本明細書に記載される抗体は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、該ＣＤＲのうちのアミノ酸配列は、以下に記載のアミノ酸配列、
ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号６１、６７、７３、７９、９１、もしくは１８０；
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号６２、６８、７４、８０、９２、もしくは１８１；
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号６３、６９、７５、８１、９３、もしくは１８２；
ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号６４、７０、７６、９４、もしくは１８３；
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号６５、７１、もしくは７７；または
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号６６、７２、７８、８４、９６、もしくは１８４から選択される。
【０２４３】
抗体は、本明細書に記載のＣＤＲセットまたは可変領域のうちのいずれかを含むことができる。
【０２４４】
別の実施形態では、産生された抗体は、単離および精製される。
【０２４５】
別の実施形態では、単離および精製された抗体は、親和性成熟されている。親和性成熟は、例えば、ＣＤＲ配列のバリアントを含むファージライブラリーを使用して、プラスチックプレートに吸着された抗原を用いて、最初の選択について記載されるように実施することができる。
【０２４６】
当業者は、いくつかの方法を使用して、ミスフォールドしたオリゴマーα−シヌクレインに対して特異的な結合親和性を有する抗体を産生できることを理解するであろう。使用できる方法は、ファージディスプレイ法である。
【０２４７】
さらなる態様は、試験試料が、例えば、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎを含むかどうかを検出するためのアッセイを提供し、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、または関連する立体配座エピトープは、残基Ｅ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、またはＱ６２のうちの少なくとも１つを含み、ミスフォールドしていないタンパク質立体配座（例えば、未変性モノマーおよびテトラマー）または不溶性フィブリル中のＥ５７、Ｋ５８、Ｔ５９、Ｋ６０、Ｅ６１、および／またはＱ６２が占めるよりも別の立体配座にある。
【０２４８】
実施形態では、アッセイは、
ａ．試験試料を、抗体：ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチド複合体を産生することを許容する条件下で、本明細書に記載の抗体と接触させることと、
ｂ．任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試験試料がミスフォールドしたα−Ｓｙｎポリペプチドを含み得ることを示している。
【０２４９】
別の実施形態では、アッセイは、
ａ．抗体−抗原複合体を産生することを許容する条件下で、該対象の試験試料を本明細書に記載の抗体または免疫複合体と接触させることと、
ｂ．試験試料中の抗体−抗原複合体の量を定量化することと、
ｃ．試験試料中の抗体−抗原複合体の量を対照と比較することと、を含む。
例えば、対照との比較は、試験試料が、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎなどのミスフォールドしたα−Ｓｙｎを含むかどうかを示すことができる。
【０２５０】
実施形態では、試験試料は、脳組織またはその抽出物、唾液、および／またはＣＳＦを含む。実施形態では、試験試料は、ヒト対象から得られる。
【０２５１】
対照は、疾患を有するかまたは有しないとして知られている対照集団に由来する範囲またはカットオフ値であり得る。アッセイには、負の対照または正の対照（組換えミスフォールドしたオリゴマーα−ｓｙｎまたは環状ペプチドなど）を含めることもできる。
【０２５２】
例えば、負の対照試料をアッセイに含めて、アッセイのバックグラウンド値を提供することができる。試験試料で得られた結果は、対照集団（例えば、対照）で得られた値と比較することができる。対照は、例えば、年齢が一致し、試験試料が得られた対象のシヌクレイノパチーを有していない、または有するとして知られている対照対象から決定された範囲またはカットオフ値であり得る。疾患の進行を監視することを含む方法において、１つ以上の以前のレベルと比較することもできる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、試験試料は、α−シヌクレイン遺伝子に遺伝子突然変異を含む対象に由来する。
【０２５４】
別の実施形態では、試験試料は、シヌクレイノパチー、任意にパーキンソン病、レビー小体型認知症、または多系統萎縮症を患っている、または患っている疑いのある対象に由来する。
【０２５５】
フローサイトメトリー、ドットブロット、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、および免疫沈降、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫細胞化学、および他の検出プラットフォーム（例えば、ＳＩＭＯＡ、ＭＳＤなど）のイムノアッセイを含む、本明細書に記載の抗体を使用して、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドが試験試料中に存在するかどうかを決定するために、多くの方法を使用することができる。
【０２５６】
いくつかの方法を使用した試験試料中のミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎの検出は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む、シヌクレイノパチーの診断および治療の追跡に使用することができた。例えば、１〜１０００ｐｇ／ｍＬの試料の範囲で検出できるアッセイが有用であり得る。例えば、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ」（ＳＭＣＴＭ）は、超高感度であり、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎなどの少量のバイオマーカーの検出に適している。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎ−抗体または本明細書に記載の抗体でコーティングされた磁性ビーズなどの粒子を含む免疫複合体は、試験試料からα−Ｓｙｎを捕捉するために使用される。本明細書に記載の抗体は、モノマー種と比較して毒素産生性オリゴマー種に選択的に結合するため、この方法は、生理学的に豊富なモノマーによる干渉を制限する。測定ステップは、捕捉されたミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎを、例えば他の場所に記載された検出可能な標識のうちのいずれかなどの標識を含むｐａｎ  α−Ｓｙｎ抗体で検出し、続いて、その標識からのシグナルの定量化のために結合した検出器抗体を溶出することを含み得る。決定されたシグナルは、試料中のミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドの量に比例するため、その量は、標準曲線から計算することができる。通常の対照試料で得られた範囲またはカットオフ値との比較は、診断目的に使用することができ、縦方向の測定を使用して、治療の有効性を評価することができる。このアプローチの実現可能性は、可溶性ＭＳＡ脳抽出物を使用して確立されている（実施例１９）。
【０２５８】
実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴を使用して、立体配座特異的結合を評価することができる。
【０２５９】
さらなる態様は、化合物、免疫原、および／または本明細書に記載の化合物を含む組成物を対象に投与することと、任意に、投与された化合物または免疫原に特異的に結合する細胞および／または抗体を単離することとを含む、対象において免疫応答を誘導する方法を含む。抗体は、実施例に記載される１つ以上のアッセイを使用して試験することができる。
【０２６０】
本開示の抗体が、パーキンソン病ラットドーパミン作動性神経アッセイにおいてミスフォールドしたα−Ｓｙｎオリゴマーの毒性を阻害することができたことも、実施例において示されている。さらに、本明細書では、本開示の抗体が、パーキンソン病の海馬ニューロン培養モデルにおいて、小さな可溶性フィブリル（超音波処理された合成既形成フィブリル（ＰＦＦ））への曝露によって誘導されるα−シヌクレイン凝集およびリン酸化を防止できることも示される。例えば、実施例１１に示されるように、本開示の抗体は、内在化された合成α−ｓｙｎの量およびＰＦＦへの曝露によって誘導される病理学的リン酸化形態への内因性α−ｓｙｎの動員を低減することができた。
【０２６１】
最近では、家族性ＰＤ  Ｅ４６Ｋ突然変異および隣接するＫＴＫＥＧＶ配列に２つの相同Ｅ→Ｋ突然変異を発現するマウスが、テトラマーを破壊し、モノマーの数を増加させたことも示された（Ｎｕｂｅｒ  ２０１８）。これらのマウスで生理学的テトラマーを形成できないことは、パーキンソン病のような障害を引き起こした。
【０２６２】
したがって、別の態様は、有効量の抗体、免疫複合体、または本明細書に記載の抗体または免疫複合体を含む組成物を、細胞集団および／またはそれを必要とする対象に投与することを含む、ミスフォールドしたα−ｓｙｎ毒性および／または伝播を阻害する方法であり、抗体は、生理学的テトラマーではなく、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して決定される、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎに選択的に結合するか、または例えば、実施例に記載されるモデルアッセイなどのドーパミン作動性神経毒性アッセイにおいて評価されるように、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎ毒性を阻害する。
【０２６３】
細胞集団またはそれを必要とする対象における、ミスフォールドしたα−ｓｙｎ毒性を阻害するための、本明細書に記載の抗体または免疫複合体を含む有効量の抗体、免疫複合体、または組成物の使用も提供され、抗体は、ミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎおよび／または本明細書に記載の免疫原の文脈ではエピトープ配列に選択的に結合する。
【０２６４】
実施形態では、方法または使用は、ミスフォールドしたα−ｓｙｎの細胞間伝達を阻害するため、かつ／または内因性の凝集したリン酸化α−ｓｙｎの量を低減するためである。
【０２６５】
実施形態では、細胞集団は、神経細胞集団である。実施形態では、神経細胞集団は、パーキンソン病のインビトロモデルである。
【０２６６】
実施形態では、対象は、ヒトである。
【０２６７】
実施形態では、ヒトは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体病（ＬＢＤ、レビー小体型認知症もしくはＤＬＢとも称される）、または多系統萎縮症（ＭＳＡ）（総称してシヌクレイノパチーとして知られている）を有するか、または有することが疑われるか、または発症する可能性が高い。例えば、家族性ＰＤに関連する突然変異を担持する人は、ＰＤを発症する可能性が高いとみなされる。
【０２６８】
α−シヌクレイノパチーを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の本開示の抗体もしくは免疫複合体、または該抗体もしくは免疫複合体を含む組成物を投与することを含む方法も提供される。
【０２６９】
実施形態では、α−シヌクレイノパチーは、ＰＤ、ＬＢＤ、または多系統萎縮症（ＭＳＡ）である。α−シヌクレインはまた、アルツハイマー病（ＡＤ）にも関係している。したがって、さらなる態様は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の本開示の有効量の抗体もしくは免疫複合体、または任意に別のＡＤ治療と組み合わせて、該抗体もしくは免疫複合体を含む組成物を投与することを含む、対象を治療する方法である。別のＡＤ治療は、例えば、ＷＯ／２０１７／０７９８３３、ＷＯ／２０１７／０７９８３４、ＷＯ／２０１７／０７９８３１、ＷＯ／２０１７／０７９８３２、およびＷＯ／２０１７／０７９８３５のうちのいずれかに記載されている抗体であり得、各々が２０１６年９月１１日に提出され、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２７０】
抗体は、例えば、本明細書に記載の組成物に、例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて含まれ得、例えば、送達を改善するために小胞に配合され得る。抗体（例えば、２つ以上の抗体）および／または免疫複合体の組み合わせを使用することもできる。
【０２７１】
本明細書に記載の組成物、抗体、免疫原、および免疫複合体は、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、脳室内、髄腔内、眼窩内、眼科、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、または経口投与によって投与することができる。
【０２７２】
特定の実施形態では、組成物は、全身投与される。
【０２７３】
他の実施形態は、本明細書に記載の組成物、抗体、および免疫複合体と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との同時投与を企図している。
【０２７４】
特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０１２，０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されているように、血液脳関門の透過性を一時的に増加させることを目的とするものなど、血液脳関門を越えて本明細書に記載の組成物、抗体、および免疫複合体を投与するための方法も企図される。
【０２７５】
上記の開示は、一般に、本出願を説明している。以下の具体例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、単に説明を目的として説明されており、本出願の範囲を制限することを意図しない。状況が示唆または便宜をもたらす可能性があるため、形態の変化および同等物の代替が企図される。本明細書では特定の用語が用いられているが、そのような用語は、説明的な意味で意図されており、限定を目的とするものではない。
【０２７６】
以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０２７７】
実施例１
タンパク質（またはペプチド凝集体）に全体座標バイアスを課して、タンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドするように強制し、次いで部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）の最も可能性の高いアンフォールドした領域を予測する分子動力学ベースのシミュレーションを使用して、ミスフォールドしたα−シヌクレインに選択的または優先的に表示されるエピトープを同定した。バイアスシミュレーションを実施し、各残基に対応する溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の変化を測定した（検討中のタンパク質の初期フィブリル構造の変化と比較して）。ＳＡＳＡは、Ｈ２Ｏにアクセス可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの正の変化（検討中のタンパク質の初期構造の変化と比較して）は、関連する残基インデックスの領域でのアンフォールディングを示しているとみなすことができる。候補エピトープを同定するために、ＳＡＳＡに加えて、他の２つの方法を使用した。これらは、カットオフ長内の非水素原子によって定義されるフィブリル接触の喪失、および構造的アンサンブルの平均に関する偏差の程度を測定する二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）であり、ここで、いくつかのアミノ酸のＲＭＳＦの増加は、それらのアミノ酸の動力学の増加を示す。
【０２７８】
この方法は、α−Ｓｙｎフィブリル（ＰＤＢエントリー２Ｎ０Ａ）に適用された。
【０２７９】
α−Ｓｙｎフィブリルの１０鎖の構造が決定され、ＰＤＢエントリー２Ｎ０Ａとしてタンパク質データバンクに記載されている。ＰＤＢ  ２Ｎ０Ａ構造またはその一部をコンピューター上で平衡化して、平衡アンサンブルを取得でき、これは、α−Ｓｙｎのフィブリル構造内のエピトープのフィブリル立体配座のすべての測定に使用され、本明細書では不定に「構造化フィブリル」または「α−Ｓｙｎの非偏向フィブリル構造」、「α−Ｓｙｎのフィブリルアンサンブル」、「α−Ｓｙｎの平衡フィブリルアンサンブル」、または「α−Ｓｙｎフィブリル構造的アンサンブル」と称される。
【０２８０】
モノマーアンサンブルは、例えば、ＰＤＢフィブリル（２Ｎ０Ａ）からの鎖のうちの１つを開始構造としてとることによって得ることができる。次いで、ピボットアルゴリズムを使用して、構成に大きな立体配座変化を引き起こし、初期構成として使用される１５００の異なるアンフォールド構造を生成する。これらの１５００構造の各々について、３ｎｓの平衡化シミュレーションが実施され、各１ｎｓのスナップショット構成が収集され、モノマーアンサンブルに追加された（各初期条件に３つの平衡化スナップショット）。最終的な結果は、４５００構成のモノマーアンサンブルである。
【０２８１】
ＷＯ／２０１７／０７９８３６に記載される集団座標法、ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．Ｖｏｒｏｂｙｏｖ，ａｎｄ  Ａ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ：Ａ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＭＭ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１−６９０，２０１０、およびＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．Ｈｅｓｓ，ａｎｄ  Ｅ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＭＭ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎ  ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９−４６６，２０１０（両方が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＨＡＲＭＭ力場パラメーターを、溶媒としてのＴＩＰ３Ｐ水とともに使用して、この初期構造のシミュレーションを実施した。
【０２８２】
Ｉ．エピトープ予測
エピトープＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）は、例えば、図１Ａおよび図１Ｂに示されるような集団座標アプローチを使用して、ＰＤＢ構造２Ｎ０Ａから予測されるエピトープとして出現する。ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）エピトープは、増加したＳＡＳＡ、フィブリル接触の喪失、または増加したＲＭＳＦのいずれかを考慮すると、ＰＤＢ構造２Ｎ０Ａの予測として出現する（図１、パネルＣ）。アミノ酸足場（例えば、リンカーを含む）中にエピトープＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、またはＴＫＥＱ（配列番号４）を含む環状化合物を、実施例２に記載されるエピトープを提示するためのそれらの適合性について評価し、さらなる分析に使用した。
【０２８３】
本明細書で議論される図１〜５のプロットの場合、データは、前述のように、Ｃｈａｒｍｍ３６ｍ力場を使用した明示的溶媒（ＴＩＰ３Ｐ）での平衡シミュレーションから取得される。
【０２８４】
図２は、非偏向フィブリルとの関連でα−Ｓｙｎモノマーの立体配座を示す。この構造は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５つのα−Ｓｙｎ鎖の平衡シミュレーションから得られた重心立体配座である。残基Ｋ５８およびＫ６０は、この構造的アンサンブルでほぼ平行である。Ｋ６０のＨε３原子（弱く正に帯電している、Ｑ＝０．０５）とＱ６２のＮε２（負に帯電している、Ｑ＝−０．６４）との間には密接な接触がある。パネルＢは、偏向アンサンブル内のα−Ｓｙｎモノマーの構造のスナップショットを示す。このアンサンブルでは、残基Ｋ５８およびＫ６０は平行ではなくなり、Ｋ６０とＱ６２との間の接触は存在しなくなる。
【０２８５】
ＩＩ．溶媒−エピトープの曝露
図３パネルＡ〜Ｃは、非偏向フィブリルアンサンブル、同定された環状ペプチド、および配列ＥＫＴＫの単離された（未変性）モノマーの平衡アンサンブルの重心における各残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）を示すエピトープのスナップショットを示す。（配列番号２）。図４パネルＡ〜Ｃは、非応力フィブリルアンサンブル、環状ペプチドの平衡アンサンブル、および配列ＴＫＥＱ（配列番号４）の単離されたモノマーアンサンブル中の各残基の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）を示すスナップショットを示す。図１Ａおよび１Ｃは、偏向フィブリルアンサンブル中のＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、およびＴＫＥＱ（配列番号４）を含む、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）中の残基のＳＡＳＡが、非偏向フィブリルよりも増加することを示す。図５ＡおよびＢは、環状ペプチドのＳＡＳＡが、非偏向または偏向アンサンブルのＳＡＳＡよりも増加することを示し（ＴＫＥＱ（配列番号４）のＫ６０を除く）、より多くの表面が曝露されるため、抗体結合にアクセス可能であることを示す。ＴＫＥＱ（配列番号４）の場合、曝露の増加は、残基Ｅ６１およびＱ６２で最も顕著であり、非偏向アンサンブルよりもＳＡＳＡの最大の増加を示す。Ｅ６１の場合、環状フィブリルと非偏向フィブリルとの間のこの差は、１０１Å２であるが、Ｑ６２の場合、この差は、６７Å２である。Ｔ５９の場合、ＴＫＥＱ（配列番号４）の環状フィブリルと非偏向フィブリルとの間の差は、８０Å２であるが、ＥＫＴＫ（配列番号２）の場合、差は、６５Å２である。
【０２８６】
ＩＩＩ．線状またはフィブリル立体配座のいずれかのアンサンブルとは異なる環状ペプチド立体配座クラスターのアンサンブル。
図５Ｃは、ＲＭＳＤのヒストグラムを、環状ペプチド足場シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）の環状ペプチド平衡分布の重心にプロットする。ほとんどの立体配座は、重心立体配座と非常によく似ており、分布は、約１．３オングストロームでピークになる。また、未変性モノマーアンサンブルおよびフィブリルアンサンブルの重心立体配座のエピトープの立体配座に対応するＲＭＳＤも示されている。最後に、αヘリックス、ミセル結合α−シヌクレイン、１ＸＱ８、および２ＫＫＷのＰＤＢ構造の立体配座におけるエピトープのＲＭＳＤが示されている。この図は、これらの立体配座がほとんどの環状立体配座とは異なることを示す。環状ペプチドアンサンブルのエピトープ立体配座と、フィブリルアンサンブルまたは単離された未変性モノマーアンサンブルのいずれかにおけるその立体配座との間の非類似性は、ジェンセン−シャノン距離を使用することによって定量化することができる。この距離は、アンサンブルの任意の２つの対間の効果的分離を提供し、これは、２つのガウスアンサンブル間の効果的な分離としてリキャストすることができる。エピトープＥＫＴＫ（配列番号２）の環状ペプチド立体配座シクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）は、フィブリルのものとは異なり、これらのアンサンブルを表す２つのガウス分布間の有効距離は、７．８標準偏差になる。エピトープの多くの環状ペプチド立体配座もまた、単離された未変性モノマーアンサンブルのものとは異なり、これらのアンサンブルを表す２つのガウス分布間の有効距離は、３．１標準偏差になる。
【０２８７】
同様に、エピトープＴＫＥＱ（配列番号４）の環状ペプチド立体配座シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）は、フィブリルのものとは異なり、これらのアンサンブルを表す２つのガウス分布間の有効距離は、７．８標準偏差になる。エピトープの大部分の環状ペプチド立体配座もまた、単離された未変性モノマーアンサンブルのものとは異なり、これらのアンサンブルを表す２つのガウス分布間の有効距離は、５．２標準偏差になる。
【０２８８】
αヘリックス膜結合α−シヌクレイン（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＸＱ８および２ＫＫＷ）の立体配座もまた、例えば、ＴＫＥＱ（配列番号４）エピトープの図５Ｃに見られるように、環状ペプチドアンサンブルのほとんどの立体配座とは異なる。類似性の程度を、これらのＰＤＢ構造中のエピトープの埋め込み深さを環状ペプチドアンサンブルに計算することによって定量化した。埋め込みの深さが浅いということは、ＰＤＢ構造の外側にあるアンサンブルが少ないことを示し、したがって、より多くの割合の環状立体配座が、ＰＤＢ構造の立体配座とは異なる。ＥＫＴＫ（配列番号２）の場合、２ＫＫＷ中のエピトープの埋め込み深さは、２０％であり、１ＱＸ８中のエピトープの埋め込み深さは、３８％である。ＴＫＥＱ（配列番号４）の場合、２ＫＫＷ中のエピトープの埋め込み深さは、１６％であり、１ＱＸ８中のエピトープの埋め込み深さは、２２％である。これらの数値は、環状ペプチドアンサンブルの多くが、αヘリックス膜結合α−シヌクレイン中のエピトープの立体配座とは立体配座が異なることを示し、したがって、環状ペプチドに対して産生された抗体が、この未変性型のエピトープに結合する可能性は低い。
【０２８９】
実施例２
環状立体配座で同定されたエピトープを提示するために使用できる足場を評価した。以下の表２は、エピトープを、エピトープに対する可変数のグリシンアミノ酸Ｎ末端およびＣ末端に隣接させることによって得られた、ＥＫＴＫ（配列番号２）のいくつかの環状エピトープ足場を示す。適合性は、環状ペプチドのアンサンブルと、α−シヌクレインモノマー、β−シヌクレインモノマー、およびγ−シヌクレインモノマーの平衡アンサンブルと、応力（すなわち、偏向）フィブリルの平衡アンサンブルとの間のジェンソン−シャノン距離（Ｊｅｎｓｏｎ−Ｓｈａｎｎｏｎ−ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定することによって評価される。応力／偏向フィブリルとの類似性が望まれる一方で、モノマーアンサンブルとの非類似性もまた、インビボ機能への干渉を回避するために望まれる。これらの基準に基づいて好適であると予測される環状ペプチド足場を表２に示す。
【表１】
2022502369.tif 000003
【０２９０】
エピトープＫＴＫＥ（配列番号３）についても同様の分析を行った。好適な足場を表３に提供する。
【表２】
2022502369.tif 000004
【０２９１】
エピトープＴＫＥＱ（配列番号４）についても同様の分析を行った。好適な足場を表４に提供する。
【表３】
2022502369.tif 000005
【０２９２】
実施例３
立体配座的に制限されたエピトープを含む環状化合物の構築
立体配座的に制限されたエピトープ配列を含む化合物は、ＥＫＴＫＥＱ（配列番号１）、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）、またはＫＥＱなどのその一部、およびリンカー配列を含むか、またはそれらからなる線状ペプチドを作製することによって調製され、シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）またはシクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号４９）などの環状化合物を作製するように環化され得る。例えば、環状化合物は、線状ペプチドを頭から尾まで環化することによって作製することができる。
【０２９３】
例えば、ＥＫＴＫ（配列番号２）、ＫＴＫＥ（配列番号３）、もしくはＴＫＥＱ（配列番号４）などのエピトープに対応するペプチド、またはＫＥＱなどのその一部は、リンカーとともに合成され得るか、またはリンカーにコンジュゲートされ得、好ましくは、エピトープ配列のＣ末端および／またはＮ末端に１、２、３、または４アミノ酸および／またはＰＥＧユニットを含む。リンカーがアミノ酸配列で構成されている場合、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて使用して合成することができる。ＰＥＧ分子は、例えば、Ｈａｍｌｅｙ  ２０１４［Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４，１５（５），ｐｐ  １５４３−１５５９，ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ］およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２［Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  １１６−１２７、Ｍ．Ｊ．ＲｏｂｅｒｔｓＭ．Ｄ．ＢｅｎｔｌｅｙＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２５］（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカップリング化学を使用して、Ｎ末端にアミン基に結合され得る。化合物は、１）ペプチド結合を形成する（例えば、骨格を環化する）ためのペプチド＋リンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端、２）ペプチド＋リンカーに側鎖を有するアミノまたはカルボキシ末端、または３）ペプチド＋リンカーの２つの側鎖を共有結合することによって環化することができる。
【０２９４】
環状化合物の結合は、すべて通常のペプチド結合（ホモデティック環状ペプチド）であり得るか、またはエステル、エーテル、アミド、もしくはジスルフィド結合（ヘテロデティック環状ペプチド）などの他のタイプの結合を含み得る。
【０２９５】
ペプチドは、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または例えばシステインおよびホモシステインを含むペプチドの内部で、チオールまたはメルカプタン含有残基の酸化によって環化することができる。例えば、ペプチドに隣接する２つのシステイン残基が酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。用いることができる酸化試薬には、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化型グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、酢酸トリフルオロタリウム（ＩＩＩ）、または当業者に既知であり得、当業者に既知であるような方法で使用され得る他の酸化試薬が含まれる。
【０２９６】
環状ペプチド合成に関連する方法および組成物は、米国特許公開第２００９／０２１５１７２号に記載されている。米国特許公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許公開第２０１０／０１３７５５９号、および米国特許第７，５６９，５４１号は、環化の様々な方法を記載している。他の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９２４６６号、およびＡｎｄｒｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５：９１−１６９に記載されている。
【０２９７】
リンカーは、リンカーに隣接および／または挿入された１つ以上のシステイン残基を含むことができる。ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加された非天然システイン残基間にジスルフィド結合を作成することによって、環状立体配座に構造化することができる。
【０２９８】
環状ペプチドは、担体、任意にＢＳＡ部分、またはＫＬＨなどの免疫原性増強剤に連結することができる。
【０２９９】
実施例４
以下の線状および環状ペプチドを調製した。
【表４】
2022502369.tif 000006
【０３００】
ペプチド合成を、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施した。ペプチドは、２−クロロトリチルクロリド樹脂上での標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成と、それに続く樹脂からの切断によって合成された。エレクトロスプレーＭＳによってペプチド配列を確認し、ＨＰＬＣによって純度を評価して、少なくとも９５％の純度を確認した。環化を、頭−尾（Ｃ−Ｇ）アミド結合を介して実施した。非環化の線状ＣＧＨＨＱＫＧペプチドもまた、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって産生した。
【０３０１】
免疫原の構築
次いで、表１の環状化合物を、マレイミドベースのカップリング（ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を介してＫＬＨ（免疫付与用）またはＢＳＡ（スクリーニング用）にコンジュゲートした。
【０３０２】
実施例５
抗体の生成および選択
連結されたペプチドを、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＬＴＤ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）によって承認されたプロトコルに従って、マウスモノクローナル抗体の産生に使用した。
【０３０３】
免疫
簡単に説明すると、５０日齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ）に免疫付与した。抗原を含むがアジュバントを含まない一連の皮下水溶液注入を、１９日間にわたって行った。環状ペプチド−ＫＬＨの滅菌生理食塩水中の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液の注入あたり、マウスあたり１００μｇでマウスに免疫付与した。１９日目にすべてのマウスを安楽死させ、ハイブリドーマ細胞株を生成するためにリンパ球を採取した。
【０３０４】
融合／ハイブリドーマの開発
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  １５００）の存在下でマウスＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合細胞を、ＨＡＴ選択を使用して培養した。この方法は、半固体のメチルセルロースベースのＨＡＴ選択培地を使用して、ハイブリドーマの選択およびクローニングを１つのステップに組み合わせる。単一細胞由来のハイブリドーマを増殖させて、半固体培地上にモノクローナルコロニーを形成した。融合事象の１０日後、得られたハイブリドーマクローンを９６ウェル組織培養プレートに移し、対数増殖期中期に達するまで（５日）ＨＴ含有培地で増殖させた。
【０３０５】
ハイブリドーマ分析（スクリーニング）
ハイブリドーマからの組織培養上清を、抗原（環状ペプチド−ＢＳＡおよび線状ペプチド−ＢＳＡ）のスクリーニング時に間接ＥＬＩＳＡによって試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ二次を使用してＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方について調べ、ＴＭＢ基質を用いて発色させた。
【０３０６】
陽性培養物を、分泌を確認するために抗原をスクリーニングする際に、無関係な抗原（ヒトトランスフェリン）上で再試験した。クローンを抗体捕捉ＥＬＩＳＡによってアイソタイプ化して、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定し、同じエピトープを含む他の環状ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート上で間接ＥＬＩＳＡによって試験して、交差反応性を評価した。
【０３０７】
アイソタイプ化
ハイブリドーマ抗体を、抗体捕捉実験を使用してアイソタイプ化した。捕捉プレートを、１００ｕＬ／ウェルの炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）において、１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体で４℃で一晩コーティングした。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を、１００ｕｇ／ｍＬで添加した。二次抗体を、１：５，０００で添加した。ヤギ抗マウスＩｇＧγ−ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ−ＨＲＰを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルで、３７℃で１時間振とうしながら添加した。すべての洗浄ステップを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用して３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで添加し、暗所で発色させ、等量の１Ｍ  ＨＣｌで停止させた。
【０３０８】
結果
ＴＫＥＱ（配列番号４）構築物
シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）−ＫＬＨ（配列番号７）、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）−ＫＬＨ（配列番号４９）、およびシクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧ）−ＫＬＨ（配列番号４８）で免疫付与されたマウスは、線状構築物と比較して環状ペプチド（遊離またはＢＳＡに結合）に対して選択的なクローンを産生した。クローンを、環状ペプチド−ＢＳＡに対する反応性について、各クローンについて少なくとも３回試験し、同様の結果が得られた。
【表５−１】
2022502369.tif 000007
【表５−２】
2022502369.tif 000008
【表６】
2022502369.tif 000009
【表７−１】
2022502369.tif 000010
【表７−２】
2022502369.tif 000011
【０３０９】
ハイブリドーマ抗体はまた、表２〜４に示される異なるリンカーを含む環状ペプチドに選択的に結合する能力についても試験した。
【表８−１】
2022502369.tif 000012
【表８−２】
2022502369.tif 000013
【０３１０】
線状または無関係のペプチドＨＴ、ＢＳＡ、およびｘ−反応性自己（インシリコ分析からの潜在的に交差反応性のヒトタンパク質）と比較して、ハイブリドーマ抗体２Ｅ９が環状ペプチドに選択的に結合する結果を図１１に示す。また、α−ｓｙｎ、β−ｓｙｎ、およびγ−ｓｙｎモノマーに対する反応性の欠如も示されている。
【表９】
2022502369.tif 000014
【表１０−１】
2022502369.tif 000015
【表１０−２】
2022502369.tif 000016
【０３１１】
実施例６
ＥＫＴＫエピトープ（配列番号２）
同様に、線状または無関係のペプチドＨＴ、ＢＳＡ、およびヒト補体因子Ｈ（ＨＣＦＨ）と比較して、シクロ（ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号１０）に対して産生されたハイブリドーマ抗体の、遊離およびＢＳＡ結合環状ペプチドへの結合選択性を表１１に示す。ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ（配列番号５）の環状および線状ペプチドに対する反応性も示されている。
【表１１】
2022502369.tif 000017
【０３１２】
さらに、線状または無関係のペプチドＨＴ、ＢＳＡ、およびＨＣＦＨと比較して、シクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）に対して産生されたハイブリドーマ抗体の、遊離およびＢＳＡ結合環状ペプチドへの結合選択性を表１２に示す。ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ（配列番号１０）の環状および線状ペプチドに対する反応性も示されている。
【表１２】
2022502369.tif 000018
【０３１３】
マウス抗α−シヌクレインハイブリドーマは、間接ＥＬＩＳＡによってβ−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに対する反応性について交差試験した。
【０３１４】
ＥＬＩＳＡプレートを、０．１マイクログラム／ウェルのβ−シヌクレインまたはγ−シヌクレイン抗原を用いて、炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中１００ｍｉｃｒｏＬ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ中の３％スキムミルクパウダーを用いて、室温で１時間ブロックした。ハイブリドーマ抗体（１００ｍｉｃｒｏＬ／ウェル）を添加し、プレートを振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。１：５０００の二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧｙ−ＨＲＰ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１００ｍｉｃｒｏＬ／ウェルで、振とうしながら３７℃で１時間添加した。すべての洗浄ステップを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用して３０分間実施した。ＴＭＢ基質を、５０ｍｉｃｒｏＬ／ウェルで添加し、暗所で発色させ、等量の１Ｍ  ＨＣＬで停止させた。
【０３１５】
結果
シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）を使用して産生したハイブリドーマを試験した。β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの両方のカウントは、バックグラウンドと同様であった。
【０３１６】
同様に、シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧ）（配列番号４８）およびシクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号４９）に対して産生されたハイブリドーマを試験した。β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの両方のカウントは、バックグラウンドと同様であった。
【０３１７】
シクロ（ＣＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号１０）に対して産生された１０個のハイブリドーマを試験した。β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの両方のカウントは、バックグラウンドと同様であった。
【０３１８】
同様に、シクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）に対して産生されたハイブリドーマを試験した。β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの両方のカウントは、バックグラウンドと同様であった。
【０３１９】
実施例７
抗ミスフォールドしたα−Ｓｙｎ抗体の特徴付け
抗体は、表面プラズモン共鳴を使用して、未変性のモノマーα−Ｓｙｎポリペプチドおよびミスフォールドしたオリゴマーα−Ｓｙｎポリペプチドに結合するそれらの能力について試験した。
【０３２０】
生体試料の表面プラズモン共鳴分析。
均質化：ヒト神経組織試料を計量し、その後、新鮮な氷冷ＴＢＳ（５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（両方ともＳｉｇｍａ製）およびＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌａｖａｌ  ＱＣ  Ｃａｎａｄａ製のＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルで補足された）に浸漬し、組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるようにした。組織は、機械的プローブホモジナイザーを使用してこの緩衝液中で均質化される（３×３０秒のパルスで間に３０秒の休止があり、すべて氷上で実施される）。次いで、ＴＢＳ均質化した試料を、超遠心分離にかけた（７０，０００ｘｇで９０分間）。上清を収集し、等分して−８０℃で保存した。ＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して決定した。
【０３２１】
表面プラズモン共鳴分析：ＰＤおよびＬＢＤ患者からの神経組織試料を分析した。試験抗体、正の対照抗体（４Ｄ６）およびＩｇＧアイソタイプ対照を、センサーチップのフローセルに高密度（約１０，０００ＲＵ）（およそ９５００〜１３，０００ＲＵ）で固定した。希釈した試料を表面におよそ３００〜９００秒間連続して注入した後、緩衝液中で１５０秒間解離させ、表面を再生した。一部の実験では、４Ｄ６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、捕捉された物質を検出した。結合応答を、ＩｇＧ参照表面結合を差し引くことによって二重参照し、アッセイ緩衝液で正規化して、異なる試料群を比較した。
【０３２２】
試験抗体には、クローン：２Ｅ９、３Ｂ５、２Ｄ２、８Ｂ１２、９Ａ７が含まれていた。使用した対照抗体は、ｐａｎ−αＳｙｎ抗体（４Ｄ６）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。
【０３２３】
分析物には、ＳｙｎＡｇｉｎｇ  α−Ｓｙｎオリゴマーが含まれ、未分画レビー小体病（ＬＢＤ）（レビー小体型認知症（ＤＬＢ）とも称される）可溶性脳抽出物、高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（ＬＭＷ）ＬＢＤおよびＰＤ画分を分析した。
【０３２４】
未分画の可溶性脳抽出物を１：４に希釈し、ＨＭＷおよびＬＭＷ画分を１００ｕｇ／ｍＬ総タンパク質に希釈した。
【０３２５】
分析物を、固定化した抗体に１０ｕＬ／分で１５分間注入した。抗体４Ｄ６を、捕捉された分析物に１０ｕＬ／分で５分間注入した。
【０３２６】
結果
４Ｄ６（ｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体）は、ＳｙｎＡｇｉｎｇ  α−ｓｙｎオリゴマーへの強い結合を示した。試験クローン２Ｅ９は、ＳｙｎＡｇｉｎｇ  α−ｓｙｎオリゴマーへの強力な結合を示す。試験クローン２Ｄ２および８Ｂ１２は、より弱い結合を示す（図６Ｄ）。左パネルは、捕捉されたαシヌクレインの直接結合を示す。右パネルは、ｘ軸に沿って抗体によって捕捉され、ｐａｎ抗体４Ｄ６で検出されたαシヌクレインを示す。
【０３２７】
図６Ｅの右パネルに示されるように、試験抗体は、未分画の可溶性ＬＢＤ脳抽出物中で直接α−ｓｙｎに結合した。その後のｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体４Ｄ６による検出によって、試験抗体によって捕捉された物質にα−ｓｙｎが存在することが確認された（左パネル）。試験クローン２Ｅ９と、程度は少ないが、クローン２Ｄ２および８Ｂ１２は、脳抽出物の未分画（図６Ｅ）ならびにＬＭＷおよびＨＭＷ画分の両方でα−ｓｙｎに結合する（図６Ｆ）。
【０３２８】
試験クローンはまた、可溶性フィブリルの結合について評価した。別のＳＰＲ実行では、抗体を固定化し、可溶性の超音波処理されたフィブリル調製物を注入した。図６Ｇに示されるように、試験抗体の大部分は、小さな可溶性フィブリルとある程度の交差反応性を示した。
【０３２９】
図６Ｈは、試験クローン２Ｅ９とｐａｎ  α−ｓｙｎ  ４Ｄ６抗体の結合プロファイルを比較している。クローン２Ｅ９は、モノマーに結合せず、可溶性オリゴマーへの強力な結合および小さな可溶性フィブリルとの交差反応性を示す。
【０３３０】
実施例８
ミスフォールドしたα−シヌクレインオリゴマーへの結合
追加のＳＰＲ実験を、Ｗａｓｔａｃｈタンパク質をスポットしたＩＢＩＳ  ９６Ｘ  ＳＰＲバイオセンサーで実行した。試験ｍＡｂを、対照ｍＡｂ  Ｓｙｎ−Ｆ１および４Ｄ６とともに、標準のＮＨＳ／ＥＤＣ活性化を使用して、２００Ｍバイオセンサー表面にアミン結合した。対照Ｓｙｎ−Ｆ１および４Ｄ６を、各々４つの位置に固定化した。試験ｍＡｂを、各々２つの位置に固定化した。オリゴマーα−シヌクレインは、ＳｙｎＡｇｉｎｇ（Ｎａｎｃｙ  Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【０３３１】
ｒＰｅｐｔｉｄｅ（Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）から購入したαシヌクレインモノマーを、３倍濃度シリーズで最大５００ｕＭまで試験した。Ｓｙｎ−Ｆ１は、αモノマーへの弱い結合を示す。４Ｄ６（市販のｐａｎ  ｍＡｂ）は、αシヌクレインへのより高いレベルの結合を示した（図６Ａを参照）。試験抗体は、αシヌクレインモノマーへの結合を示さなかった（図６Ａ）。
【０３３２】
ＳｙｎＡｇｉｎｇ  α−シヌクレインオリゴマーを、６ｕＭまでの３倍滴定で試験した。Ｓｙｎａｇｉｎｇオリゴマーは、Ｓｙｎ−Ｆ１および４Ｄ６表面によく結合した。また、クローン２Ｅ９にもよく結合した（図６Ｂ）。
【０３３３】
試験ｍＡｂ  ２Ｅ９および対照４Ｄ６もまた、捕捉されたオリゴマーを有する表面上で１／１０希釈で試験した。２Ｅ９が最初に注入され、続いて４Ｄ６が次に注入された（矢印を参照）。２Ｅ９（シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）に対して産生された）は、それらにＳｙｎＡｇｉｎｇオリゴマーを有する表面に結合し、そうでない表面には結合しない。４Ｄ６もまた、ＳｙｎＡｇｉｎｇオリゴマーが存在する表面に結合し、存在しない表面には結合しない。図６を参照されたい。結合はまた、クローン３Ｂ５（シクロ（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）に対して産生された）、８Ｂ１２、９Ａ７（シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧ）（配列番号４８）に対して産生された）、および２Ｄ２（シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号４９）に対して産生された）でも検出された。
【０３３４】
図６Ｃは、他のクローンもＳｙｎＡｇｉｎｇオリゴマーに特異的に結合したことを示している。
【０３３５】
ＭＡＳＳ２機器（Ｓｉｅｒｒａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）を用いた別のＳＰＲ実行では、アミンカップリングを介して抗体をセンサーチップ上に直接固定化し、α−ｓｙｎ分析物をチップ上に注入して結合応答を測定した。試験したすべてのクローン、特に１Ｃ７、８Ｄ６、８Ｂ１２、９Ｄ８、１２Ｂ１２、２Ｄ２、および２Ｅ９は、モノマーまたは生理学的テトラマーにほとんどまたはまったく結合せずに、α−ｓｙｎオリゴマーに選択的に結合する（図９）。対照４Ｄ６は、すべての種のα−ｓｙｎと反応した。対照１（Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ、ヒトＩｇＧ、ＰＲＸ００２／ＲＧ７９３５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、ｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体と同様に動作し、すべての種に結合する。対照２（ＢＡＮ０８０５、ｍＡｂ４９／Ｇ、マウスＩｇＧ、α−ｓｙｎ抗体、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｂｓ）は、モノマーに対してある程度の反応性を持ってα−ｓｙｎオリゴマーに結合する。
【０３３６】
試験抗体２Ｅ９の結果は、他のα−ｓｙｎ指向性抗体と比較して図９Ｂに示される。対照抗体１および３（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のＮＩ−２０２．１２Ｆ４およびＰＲＸ００２）は、ｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体と同様に動作し、すべての種に結合する。対照抗体２（ｍＡｂ  ４９／Ｇ）は、主にα−ｓｙｎオリゴマーおよび超音波処理されたフィブリルに結合する。
【０３３７】
実施例９
レビー小体型認知症（ＬＢＤ）脳ホモジネートおよび対照脳ホモジネートを使用したドットブロットアッセイにおいても、いくつかの抗体を試験した。ＬＢＤ前頭皮質高速ペレットＴｒｉｔｏｎＸ抽出物（ＮＤＢＢ２２０＿ＨＰ−ＴＸ）および対照脳（「７２＿ＨＰ−ＴＸ」）を、Ｓｙｎ−Ｆ１凝集／フィブリル優先抗体（０．５μｇ／ｍＬ）、４Ｄ６  ｐａｎ  α−Ｓｙｎ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１μｇ／ｍＬ）、ならびに試験抗体２Ｅ９、１２Ｂ１２、３Ｃ１１、および２Ｄ６（４μｇ／ｍＬ）を使用して試験した。負荷を、β−アクチン（ａｂｍ、１μｇ／ｍＬ）の染色によって確認した。ニトロセルロース膜には、１０μｇの対照脳または１０μｇのＬＢＤ脳が点在していた。負荷参照として、１０μｇのβ−アクチンを点在させた。
【０３３８】
図７Ａに示されるように、Ｓｙｎ−Ｆ１は、対照脳と比較してＬＢＤに優先的に結合した。また図７Ａに示されているように、４Ｄ６は、ＬＢＤ脳および対照脳の両方に強力に結合する。ＬＢＤへの強い結合は、試験抗体２Ｅ９、１２Ｂ１２、３Ｃ１１、および２Ｄ６によって示された（図７Ｂ〜Ｅ）。βアクチン対照は、各ドットのタンパク質の量が同等であることを確認した（図７Ｆ）。
【０３３９】
対照脳抽出物と比較したＬＢＤの染色の相対量を、抗体Ｓｙｎ−Ｆ１、４Ｄ６、２Ｅ９、１２Ｂ１２、および３Ｃ１１について評価した。図７Ｇに示されるように、試験抗体は、ＬＢＤに１５〜２６倍優先的に結合した。これは、Ｓｙｎ−Ｆ１または４Ｄ６で見られたものよりも数倍高かった。対照およびＬＢＤ脳においてｐａｎ  α−ｓｙｎ抗体４Ｄ６によって検出されたα−Ｓｙｎの総量を図７Ｈに示す。
【０３４０】
実施例１０
パーキンソン病のラット初代ドーパミン作動性ニューロンモデルにおけるα−Ｓｙｎ毒性に対する抗体の神経保護効果
いくつかの抗体の神経保護効果を、インビトロパーキンソン病モデルを使用してα−ｓｙｎオリゴマーに曝露することによって損傷したラット初代ドーパミン作動性ニューロンでも試験した。
【０３４１】
方法
ラットドーパミン作動性ニューロンを、Ｓｃｈｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８によって記載されているように培養した。簡単に説明すると、懐胎１５日の妊娠した雌ラットを、頸椎脱臼によって絶命させ（Ｒａｔｓ  Ｗｉｓｔａｒ、Ｊａｎｖｉｅｒ）、胎児を子宮から取り出した。胚性中脳を取り出し、２％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ：ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ：Ｐ０６−０７１００、バッチ：７０５０２１８）および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ：Ｐ０６−１３９１１００、バッチ：Ｈ１７０８０７）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  １５（Ｌ１５、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ  Ｐ０４−２７０５５、バッチ：４５１１１１７）の氷冷培地に入れた。中脳を、トリプシン処理によって解離した。次いで、細胞を１０ｍＬピペットに３回通過させることによって機械的に解離した。細胞を、Ｂ２７  ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ：１７５０４，バッチ：１９５０３７６）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｒｅｆ：Ｐ０４−８０１００、バッチ：８４４０５１７）、および２％のＰＳで補足されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：１１５７０５５６、バッチ：１９４４３１２）、１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｅｆ：４５０−０２、バッチ：０８１７６１）、ならびに１ｎｇ／ｍＬのグリア細胞由来神経栄養因子ＧＤＮＦ（ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ：ＣＢ−１１１６００１、バッチ：Ｈ１７０８０６）からなる合成培養培地中に再懸濁した。トリパンブルー排除試験を使用して、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメーターで生細胞をカウントした。細胞を、９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リジンでプレコート；Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｒｅｆ：６５５９４０、バッチ：Ｅ１７０９３８Ｖ）に４００００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿空気（９５％）／ＣＯ２（５％）雰囲気中３７℃で培養した。
【０３４２】
培地の半分を、２日ごとに新鮮な培地と交換した。これらの条件では、培養の５日後、星状細胞が培養物に存在し、ニューロンの分化を可能にする増殖因子を放出する。
【０３４３】
α−シヌクレインの調製および細胞培養傷害
簡単に説明すると、α−ｓｙｎペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ｒｅｆ：Ｓ１００１−１、バッチ：０８０８１７ＡＳ）を、４μＭの合成培養培地中で再構成し、＋３７℃で３日間、暗所でゆっくりと振とうしてオリゴマーを生成した。同じ条件で対照培地を調製した。ＳｙｎＡｇｉｎｇからの第２のα−ｓｙｎオリゴマー調製物も試験した。培養の６日後、試験抗体およびα−ｓｙｎ毒素（オリゴマー）を室温で３０分間プレインキュベートした後、混合物を神経培養に添加した。培養培地を除去し、α−ｓｙｎオリゴマー調製物を添加した。試験化合物を、α−ｓｙｎ中毒の間に残した。以下の条件を試験した。
対照（ビヒクル）／４日間のビヒクル
α−シヌクレインオリゴマー／ビヒクル４日間の損傷
α−シヌクレインオリゴマー（０．５μＭ）＋２つの濃度での試験抗体（０．０５μＭおよび０．２５μＭ）
α−シヌクレインオリゴマー（０．５μＭ）＋ＢＤＮＦ  ５０ｎｇ／ｍＬ
試験抗体のみを最高濃度（０．２５μＭ）で評価した
【０３４４】
ドーパミン作動性ニューロンの生存を評価するために、１回の培養（条件ごとに６ウェル）を実施した。
【０３４５】
ＴＨ陽性ニューロンの総数
試験化合物の存在下または不在下で４日間中毒した後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  ６１４８、バッチ：ＳＺＢＥ２３９０Ｖ）の溶液によって室温で２０分間固定し、対照条件の細胞も同じ手順に従って同様に固定した。次いで、細胞を透過処理し、０．１％のサポニン（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ：Ｓ７９００、バッチ：ＢＣＢＪ８４１７Ｖ）および１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ；ｒｅｆ：Ｐ０４−３６５００、バッチ：２３００５１８）の溶液を用いて、非特異的部位を室温で１５分間ブロックした。細胞を、１％  ＦＣＳ、０．１％サポニンを含むニワトリ（ＴＨ、抗体−ａｂｃａｍ；ｒｅｆ：ａｂ７６４４２、バッチ：ＧＲ３１９０９１５）ＰＢＳ中で産生されたモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。ＴＨ染色されたドーパミン作動性ニューロンに対する抗体。
【０３４６】
抗体を、１％  ＦＣＳ、０．１％サポニンを含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（分子プローブ、ｒｅｆ：１３４１７２２７、バッチ：ＳＣ２３５９４１１Ａ）を用いて、室温で１時間曝露した。細胞の核を、同じ溶液中の蛍光マーカー（Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液、Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ：Ｂ１１５５、バッチ：０４６Ｍ４０４８Ｖ）によって標識した。
【０３４７】
各条件について、２０倍の倍率でＩｎＣｅｌｌ  ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ  ２２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェルあたり２０枚の写真を撮影した。各培養ウェルの画像を、同じ条件で撮影した。ＴＨ陽性ニューロンの細胞体の分析を、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。実験条件ごとに合計６つのデータが提供された。
【０３４８】
統計
データは、平均＋／−標準誤差平均（１培養、条件あたり６つのデータの）として表された。データのグローバル分析を、ダネットの検定に続いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実施した。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定される。
【０３４９】
結果
図８Ａに示されるように、ＳｙｎＡｇｉｎｇ  αシヌクレインオリゴマー調製物は、ドーパミン作動性ニューロンの生存率の大幅な減少を誘導した（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の５８．４３％）。同様の実験により、ニューロンの生存率が同様のレベルで減少した（例えば、対照の５６．０７％）。５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦは、ニューロンを細胞死から救出した（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の９７．１９％）。同様の実験において、ＢＤＮＦは、ニューロンを同様のレベル（例えば、対照の９９．４２％）で細胞死から救出した。
【０３５０】
２５０ｎＭの試験抗体１Ａ１２（シクロ（ＣＧＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号４９）に対して産生された）は、ドーパミン作動性ニューロンの生存に対して統計的に有意な効果を示す（ｐ＜０．０５、＊、対照の８３．１５％）。
【０３５１】
５０ｎＭの試験抗体３Ｃ１１および５０ｎＭの１２Ｂ１２は、統計的に有意な方法でオリゴマー誘導細胞死からドーパミン作動性ニューロンを救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、８９．６０％および＊、それぞれ対照の７９．７７％、図８Ａ）。
【０３５２】
２５０ｎＭの試験抗体２Ｄ６および２５０ｎＭの１１Ｂ６（両方ともシクロ（ＣＧＧＧＧＥＫＴＫＧＧ）（配列番号５）に対して産生された）は、統計的に有意な方法でオリゴマー誘導細胞死からドーパミン作動性ニューロンを救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、８３．８０％、および＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の８１．０１％）。
【０３５３】
抗体１Ａ１２、３Ｃ１１、１２Ｂ１２、２Ｄ６、および１１Ｂ６は、統計的に有意な方法で、ドーパミン作動性ニューロンをオリゴマー誘導細胞死から救出することができた。抗体２Ｅ９は、統計的有意性に近づいた。
【０３５４】
追加のクローンを用いた結果を図８Ｂに示す。図８Ｃ〜Ｇは、方法に記載されているドーパミン作動性ニューロン（ＴＨで染色）および核（Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液で染色）を示す、例示的な免疫組織化学画像である。図８Ｃは、対照の未処理ニューロンであり、ドーパミン作動性ニューロンプロセスを示す。図８Ｄは、α−シヌクレインオリゴマーで処理された細胞である。ニューロンプロセスは検出できない。ニューロンの喪失は、アプリケーションの抗体によって防止される。図８Ｅは、２Ｅ９抗体およびα−シヌクレインオリゴマーで処理された細胞である。図８Ｆは、１２Ｇ１抗体およびα−シヌクレインオリゴマーで処理された細胞であり、図８Ｇは、１２Ｂ１２抗体およびα−シヌクレインオリゴマーで処理された細胞であり、すべてドーパミン作動性ニューロンのオリゴマー毒性からの保護を示す。
【０３５５】
α−シヌクレインオリゴマー調製物は、繰り返された試験において、ドーパミン作動性ニューロンの生存の大幅な減少を誘導することが示された（ｐ＜０．０１、＊＊＊、対照の６２．９８〜６４．５０％）。さらに、５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦは、調製によって誘導された細胞死からニューロンを救出することができる（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の９６．３１〜１０３．７６％）。
【０３５６】
２５０ｎＭの試験抗体９Ｄ８および２５０ｎＭの１２Ｇ１は、統計的に有意な方法でドーパミン作動性ニューロン死を救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、９６．４７％および＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の９０．５９％）。
【０３５７】
試験抗体１２Ｂ１２（２５０ｎＭおよび５０ｎＭ）ならびに２５０ｎＭの抗体１０Ｄ５は、統計的に有意な方法でドーパミン作動性ニューロン死を救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、９２．６３％および＊、ｐ＜０．０５、９１．２４％、および＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の８８．９４％）。
【０３５８】
試験抗体８Ｂ１２（２５０ｎＭおよび５０ｎＭ）は、統計的に有意な方法でドーパミン作動性ニューロン死を救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、１０１．４４％および＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の９９．５２％）。
【０３５９】
２５０ｎＭの試験抗体７Ｆ６は、統計的に有意な方法でドーパミン作動性ニューロン死を救出することができる（＊＊、ｐ＜０．０１、それぞれ対照の９８．３９％）。
【０３６０】
実施例１１
パーキンソン病の海馬ニューロン培養モデルにおいて、既形成フィブリル（ＰＦＦ）を使用したα−シヌクレイン凝集体に対する抗体の効果。
超音波処理された合成既形成フィブリル（ＰＦＦ、小さな可溶性フィブリル）は、内因性α−ｓｙｎを動員し、インビトロおよびインビボでＬＢ／ＬＮ病理を誘導することが示され、病理学的α−ｓｙｎの伝播および細胞間伝達が、ＬＢ／ＬＮの漸進的拡散の機序として関与している（Ｃｏｓｔａｎｚｏ  ａｎｄ  Ｚｕｒｚｏｌｏ，２０１３、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２０１４）。
【０３６１】
ミスフォールドした疾患タンパク質の細胞間拡散は、それらの放出とそれに続く内在化を伴い得る。免疫療法は、細胞外空間で神経変性疾患を中和することによって、この神経変性疾患を治療することができる（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，２０１２、Ｊｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，２０１３）。
【０３６２】
合成α−ｓｙｎの内在化および病理学的リン酸化形態への内因性α−ｓｙｎの動員に対する試験抗体の効果もまた、海馬ニューロン培養においてＰＦＦを使用して試験した。
【０３６３】
方法
ラット海馬ニューロンは、Ｈａｒｒｉｓｏｎ（１９９０）によって説明されているように培養した。懐胎１７日目の妊娠した雌（Ｗｉｓｔａｒ，Ｊａｎｖｉｅｒ）を、頸椎脱臼によって絶命させた。海馬を、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚの氷冷培地（Ｌ１５、Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ，Ｐ０４−２７０５５、バッチ：４５１１１１７）中で各脳から迅速かつ無菌的に解剖し、続いて髄膜を取り除き、細かく刻んだ。次に、海馬組織をトリプシン処理（Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ  １Ｘ；ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ  Ｐ１０−０２３１００、バッチ８９７０３１８）によって、３７℃で２０分間消化した。ＤＮＡａｓｅ  ＩグレードＩＩ（０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ：Ｐ６０−３７７８０１００、バッチ：Ｈ１７０７０６）、および１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ：１０２７０−０９８、バッチ４２Ｇ２０６８Ｋ）を含むＤＭＥＭ（Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｆ  Ｐ０４−０３６００、バッチ：５１８１２１７）の添加によって、反応を停止させた。細胞を、１０ｍＬピペットを３回通過させることによって機械的に解離させた。次いで、細胞を５１５ｘｇで１０分間４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、２％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ  １７５０４−０４４、バッチ：１９６９９２６）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ  Ｐ０４−８０１００、バッチ：８４４０５１７）、２％のＰＳ溶液、および１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ：４５０−０２、バッチ：０２１８６１）で補足されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｎｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｒｅｆ  ２１１０３０４９、バッチ１９７９０８４）からなる合成培養培地中に再懸濁した。トリパンブルー排除試験を使用して、Ｎｅｕｂａｕｅｒサイトメーターで生細胞をカウントした。この状態では、３日間の培養後、海馬ニューロンの培養には、５％未満の星状細胞が含まれる。
【０３６４】
細胞を９６ウェルプレート（ウェルは、ポリ−Ｄ−リジン（Ｇｒｅｉｎｅｒ）でプレコートされている）に２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿空気（９５％）／ＣＯ２中（５％）雰囲気中３７℃で培養した。培地の半分を、２日ごとに新鮮な培地と交換した。７日間の培養後に培養物を使用した。
【０３６５】
α−シヌクレインの調製および細胞培養傷害
ヒトα−ｓｙｎペプチド（Ｐｒｏｔｅｏｓ）を、Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）による説明に従って調製した。ヒトα−ｓｙｎペプチドを解凍し、１２，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離して、任意の凝集した物質をペレット化した。ＰＦＦの生成には上清を使用した。濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整し、５００μＬを３７℃、１０００ＲＰＭで７日間振とうした。このステップで、ＰＦＦを分注し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０３６６】
α−ｓｙｎ  ＰＦＦ調製物を、７日間の培養後に一次海馬ニューロンに使用した。
【０３６７】
ＰＦＦを滅菌ＰＢＳ中で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、懸濁液を１０％の電力で０．５秒の６０パルスで超音波処理した。次いで、超音波処理したＰＦＦ溶液を、海馬ニューロン培地中で１μｇ／ｍＬに希釈し、ニューロン細胞培養に添加した。
【０３６８】
試験抗体およびα−ｓｙｎ毒素（超音波処理されたＰＦＦ）を、ニューロン培養に混合物を添加する前に、室温で３０分間一緒にプレインキュベートした。
【０３６９】
細胞を、試験化合物とともに同時にインキュベートした。以下の条件を行った。
対照（ビヒクル）／ビヒクル１４日間
α−シヌクレインＰＦＦ（１μｇ／ｍＬ、１４日間）
α−シヌクレインＰＦＦ（１μｇ／ｍＬ、１４日間）＋試験抗体（０．２５μＭおよび０．０５μＭ）
フィブリルを新たに添加することなく、培地を週１回交換した。
条件ごとに１つの培養および６つのウェルを行った。
【０３７０】
αシヌクレイン凝集体の評価
中毒の１４日後、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  ６１４８、バッチ：ＳＺＢＥ２３９０Ｖ）／４％スクロース（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｆ：Ｓ７９０３−２５０Ｇ、バッチ：ＢＣＢＶ９２０８）／１％  ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）の溶液によって、室温で１５分間固定した。次いで、細胞を透過処理し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｄｕｔｃｈｅｒ、Ｒｅｆ：Ｐ０６−１３９１１００、バッチ：Ｈ１６０８１０）および０．１％のｔｒｉｔｏｎを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、ｒｅｆ：Ｐ０４−３６５００、バッチ：６７６０９１８）の溶液によって、室温（ＲＴ）で１５分間ブロックした。
【０３７１】
ヒトα−シヌクレインの定量化のために、細胞を、
微小管関連タンパク質に対するニワトリ一次抗体（ＭＡＰ２、Ａｂｃａｍ、ｒｅｆ：ａｂ５３９２、バッチ：ＧＲ３２０９１４０−２）
１／５００のウサギ一次抗体抗α−シヌクレイン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ｒｅｆ  ７０１０８５、バッチ１９２０３７７−３）を含むブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ）中、４℃で一晩インキュベートした。
【０３７２】
内因性の病理学的α−シヌクレインの定量化のために、細胞を、
微小管関連タンパク質に対するニワトリ一次抗体（ＭＡＰ２、Ａｂｃａｍ、ｒｅｆ：ａｂ５３９２、バッチ：ＧＲ３２０９１４０−２）
１／５００のウサギ一次抗体抗リン酸化Ｓｅｒ１２９α−シヌクレイン（ａｂｃａｍ、ｒｅｆ  ａｂ５１２５３、バッチ：ＧＲ３２３２３４６−１）を含むブロッキング緩衝液中、４℃で一晩インキュベートした。
【０３７３】
これらの抗体を、ＰＢＳ  ３％ＢＳＡ中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３ヤギ抗ウサギＩｇＧ（分子プローブ、ｒｅｆ：Ａ２１０７０、バッチ：１７００３２６）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８ヤギ抗ニワトリ（分子プローブ、ｒｅｆ：Ａ１１００４１、バッチ：１７７６０４２）に室温で１時間曝露した。細胞の核を、同じ溶液中の蛍光マーカー（Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液、ＳＩＧＭＡ、ｒｅｆ：Ｂ１１５５、バッチ：０４６Ｍ４０４８Ｖ）によって標識した。
【０３７４】
各条件について、２０倍の倍率でＩｎＣｅｌｌ  ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ  ２２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウェルごとに複数の写真を撮影した。ＭＡＰ２陽性ニューロンおよびα−シヌクレイン凝集体の分析は、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒソフトウェア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。すべての値を、平均±ＳＥＭとして表した。統計分析を、様々な条件で行った。
【０３７５】
統計
データは、平均±ＳＥＭ（１培養、条件あたり６つのデータの）として表された。データのグローバル分析を、ダネットの検定に続いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実施した。有意水準は、ｐ＜０．０５に設定される。
【０３７６】
結果
ＰＦＦ調製物により損傷した海馬ニューロンのヒトαシヌクレイン凝集体に対する試験抗体の効果を図１３〜１４に示す。
【０３７７】
図１３Ａに示されるように、ＰＦＦ調製物は、ヒトαシヌクレイン凝集体の大幅かつ有意な増加を誘導する（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の２０３７６％）。
【０３７８】
抗体２Ｅ９（＊＊＊、ｐ＜０．００１、０．２５μＭで対照の１２１６８％；＊、ｐ＜０．０５  ０．０５μＭで対照の１５３８７％）、９Ｄ８（＊＊＊、ｐ＜０．００１、０．２５μＭで対照の９１８１％）、ならびに１２Ｇ１（＊＊＊、ｐ＜０．００１、０．２５μＭで対照の１１６９４％および０．０５μＭで対照の１３１５６％）は、統計的に有意な方法でヒトａ−シヌクレイン凝集体を減少させることができる。
【０３７９】
図１３Ｂに示されるように、ＰＦＦ調製物は、ヒトαシヌクレイン凝集体の大幅かつ有意な増加を誘導する（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の５３９４１％）。抗体１２Ｂ１２（＊、ｐ＜０．０５、０．２５μＭで対照の４０７１７％、および０．０５μＭで対照の４１００７％）、ならびに１Ａ１２（＊＊、ｐ＜０．０１、０．２５μＭで対照の３８６４１％、および＊＊＊、ｐ＜０．００１、０．０５μＭで対照の３００６４％）は、統計的に有意な方法でヒトα−ｓｙｎ凝集体を減少させることができる。
【０３８０】
図１３Ｃに示されるように、ＰＦＦ調製物は、ヒトαシヌクレイン凝集体の大幅かつ有意な増加を誘導する（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の４１５２８％）。
【０３８１】
抗体３Ｃ１１（＊、ｐ＜０．０５、０．０５μＭで対照の２８８２９％）ならびに１１Ｂ６（＊＊＊、ｐ＜０．００１、０．２５μＭで対照の２３６９０％および＊＊、ｐ＜０．０１、０．０５μＭで対照の２４８９７％）は、統計的に有意な方法でヒトα−ｓｙｎ凝集体を減少させることができる。
【０３８２】
図１３Ｉに示されるように、既形成α−Ｓｙｎフィブリル（ＰＦＦ）の内在化に対する１０Ｄ５および１Ｃ７抗体の効果を、この実施例に記載されるプロトコルに従って試験した。両方の抗体は、ＰＦＦの取り込みおよび凝集の誘導を有意に減少させた。平均＋ＳＥＭの場合、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示し、＃は、ＰＦＦのみを示す。
【０３８３】
例示的な画像を図１３Ｄ〜Ｈに示す。図１３Ｄは、ニューロンマーカーＭＡＰ２について染色された対照細胞を示し、ニューロンの長いニューロンプロセスおよび細胞体を示している。核を、方法に記載されているように染色する。図１３Ｅは、α−シヌクレインＰＦＦで処理された細胞を示す。α−シヌクレインＰＦＦは、凝集体を示す明るい点状の染色として見える。図１３Ｆ〜Ｈは、α−シヌクレインＰＦＦを最初に試験抗体とインキュベートした場合の細胞を示す。凝集体は、目に見えて少ない。
【０３８４】
ヒトＰＦＦαシヌクレイン調製物に曝露された海馬ニューロンにおけるリン酸化内因性ラットαシヌクレイン凝集体の動員に対する試験抗体の効果を、図１４Ａおよび１４Ｂに示す。
【０３８５】
図１４Ａで観察されるように、ＰＦＦ調製物は、内因性リン酸化αシヌクレイン凝集体の大幅かつ有意な増加を誘導する（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の２１５．２６％）。
【０３８６】
０．０５μＭの抗体２Ｅ９（＊＊、ｐ＜０．０１、対照の１３１．１３％）、ならびに０．２５μＭおよび０．０５μＭの１２Ｇ１（＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の１４４．８１％および１４７．７７％）は、統計的に有意な方法で内因性リン酸化α−ｓｙｎ凝集体を減少させることができる。
【０３８７】
図１４Ｂで観察されるように、ＰＦＦ調製物は、内因性リン酸化αシヌクレイン凝集体の大幅かつ有意な増加を誘導する（ｐ＜０．００１、＊＊＊、対照の２２５．１８％）。
【０３８８】
０．２５μＭおよび０．０５μＭの抗体１２Ｂ１２は、内因性リン酸化α−ｓｙｎ凝集体を統計的に減少させることができる（＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の１４０．４４％および１４４．８８％）。
【０３８９】
０．０５μＭの抗体３Ｃ１１（＊、ｐ＜０．０５、対照の１５２．８９％）、および０．２５μＭの１１Ｂ６（＊、ｐ＜０．０５、それぞれ対照の１５６．７１％）は、内因性リン酸化α−ｓｙｎ凝集体を統計的に減少させることができる。
【０３９０】
図１４Ｈに示されるように、病理学的リン酸化形態への内因性α−Ｓｙｎの動員に対する１０Ｄ５および１Ｃ７抗体の効果を、この実施例に記載されるプロトコルに従って試験した。両方の抗体は、ＰＦＦの取り込みおよび凝集の誘導を有意に減少させた。平均＋ＳＥＭの場合、＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示し、＃は、ＰＦＦのみを示す。
【０３９１】
例示的な画像を図１４Ｃ〜Ｇに示す。図１４Ｃは、対照細胞を示す。図１４Ｄは、広範なリン酸化α−ｓｙｎ凝集体染色を示す、ＰＦＦ処理細胞を示している。ニューロン内のリン酸化された凝集体の例は、矢印で識別される。図１４Ｅ〜Ｇは、ＰＦＦを試験抗体とプレインキュベーションすると、内因性リン酸化α−ｓｙｎ凝集体染色が劇的に減少することを示す。
【０３９２】
試験された抗体２Ｅ９、１２Ｇ１、１２Ｂ１２、３Ｃ１１、および１１Ｂ６は、統計的に有意な方法で内因性リン酸化α−ｓｙｎ凝集体を低減することができる。
【０３９３】
実施例１２
ＬＢＤ脳および正常脳の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色および免疫蛍光法
レビー小体型認知症（ＬＢＤ）患者の脳前頭皮質の凍結切片を、４μｇ／ｍＬの濃度の試験抗体（２Ｅ９、１２Ｂ１２、もしくは３Ｃ１１）または対照抗体に曝露した。同様に、正常な個体の脳前頭皮質からの凍結切片を、１０μｇ／ｍＬの濃度の試験抗体（１２Ｂ１２、１２Ｇ１、３Ｃ１１、２Ｅ９、１１Ｂ６、および９Ｄ８）に曝露した。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＥＣＬ、１：１０００希釈）またはウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、１：５０００希釈）の添加によって検出した。次いで、ジアミノベジジン（ＤＡＢ）色原体試薬であるＨＲＰ酵素基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を切片に添加して、茶色をもたらした。細胞および細胞核を視覚化するために、切片をヘマトキシリンで対比染色した（青紫色の染色）。免疫蛍光法では、結合した抗体の検出は、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１：１０００の作業濃度でＤＡＰＩ対比染色により実施した。
【０３９４】
結果
ＩＨＣ染色は、図１０Ａ（２Ｅ９）および図１０Ｂ（１２Ｂ１２）および図１０Ｃ（３Ｃ１１）に示されるように、本開示によるα−ｓｙｎ抗体が高密度のレビー小体（不溶性フィブリル沈着物）よりも小さな凝集体に優先的に結合することを示している。図１０Ｄは、レビー小体のｐａｎ  α−ｓｙｎ  ４Ｄ６抗体染色を示し、図１０Ｅは、マウスＩｇＧ１対照を示す。図１０Ａ、Ｂ、およびＣの矢印は、試験抗体による小さな凝集体の染色を指しているが、図１０Ｄの矢印は、レビー小体がｐａｎ  αｓｙｎ抗体によって染色されていることを識別する。試験抗体は、レビー小体よりも小さな疾患を促進する凝集体に対してより高い選択性を示す。ＩＨＣで見られた結果と一致して、試験抗体の免疫蛍光染色も実施した（図１０Ａ左上のパネル）。
【０３９５】
ＩＨＣ染色はまた、試験抗体１２Ｂ１２、１２Ｇ１、３Ｃ１１、２Ｅ９、１１Ｂ６、および９Ｄ８がいずれも、図１０Ｆ（１２Ｂ１２）、図１０Ｇ（１２Ｇ１）、図１０Ｈ（３Ｃ１１）、図１０Ｉ（２Ｅ９）、図１０Ｊ（１１Ｂ６）、および図１０Ｋ（９Ｄ８）に示されるように、正常脳（１００倍の倍率）の検出可能な染色を生じなかったことを示す。
【０３９６】
実施例１３
特異性−リガンドブロッキング
可溶性ＤＬＢ脳抽出物中のα−ｓｙｎに対する試験抗体の結合特異性もまた、リガンドブロッキングアッセイで試験した。図１２Ａに示されるように、試験抗体は、ＤＬＢ脳抽出物に結合した。図１２Ｂに示されるように、ＤＬＢ抽出物への試験抗体の結合はエピトープ特異的であり、すなわち、抗体を産生するために使用されるエピトープ配列を含むペプチドへの曝露によって阻害される。Ｐａｎ  α−ｓｙｎ  ４Ｄ６、対照１（ヒトＩｇＧ、Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ、ＰＲＸ００２／ＲＧ７９３５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｌａｂｓ）および対照２（マウスＩｇＧ、ＢＡＮ０８０５、ｍＡｂ４９／Ｇ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｌａｂｓ）抗体は、異なるエピトープを認識するため、ＤＬＢ抽出物へのそれらの結合は、エピトープ配列を含む試験抗体ペプチドによってブロックされない。
【０３９７】
実施例１４
凝集したα−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）のプリオン様伝播は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）の進行の根底にある。α−Ｓｙｎオリゴマーおよび小さな可溶性フィブリルは、それぞれα−Ｓｙｎの神経毒性および伝播に関係している（Ｆｕｓｃｏ  ２０１７  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｏｉ  ２０１８  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）。通常のα−Ｓｙｎモノマーおよび生理学的テトラマーを節約しながら、これらの病原性種の標的を可能にするエピトープを同定した（Ｎｕｂｅｒ  ２０１８  Ｎｅｕｒｏｎ）。
【０３９８】
方法：集団座標（ＷＯ／２０１７／０７９８３６およびＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１８に記載に記載）を使用して、ａ−Ｓｙｎオリゴマー、およびより低い程度でフィブリル断片／プロトフィブリル上で曝露されるが、大きなフィブリル、生理学的テトラマー、またはα−Ｓｙｎモノマー上では曝露されないと予測された立体配座エピトープを同定した。立体配座エピトープを複製する環状ペプチド足場を使用して、マウスモノクローナル抗体を生成し、次いでこれをインビトロでの結合および生物活性の選択性についてスクリーニングした。
【０３９９】
結果：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、合成α−Ｓｙｎオリゴマーおよび可溶性超音波処理フィブリルへの選択的結合を示し、モノマーまたは生理学的テトラマーへの結合がほとんどまたはまったくない抗体候補を同定した。ＬＢＤ脳抽出物中の未変性α−Ｓｙｎ凝集体の認識は、ＳＰＲおよびドットブロットによって確認された。免疫組織化学により、レビー小体への最小限の結合が確認された。インビトロでは、抗体は、一次げっ歯類ニューロンをα−Ｓｙｎオリゴマーの毒性から保護し、α−Ｓｙｎ伝播に関与する機序、すなわち超音波処理された既形成フィブリルの取り込みおよびリン酸化α−Ｓｙｎ凝集体の誘導を阻害した。
【０４００】
結論：集団座標によるエピトープの「調整」により、病原性α−Ｓｙｎに対する保護活性を持つ選択的抗体の生成が可能になった。
【０４０１】
実施例１５
抗体配列決定
マウスハイブリドーマクローン２Ｅ９、９Ｄ８、１２Ｇ１、３Ｃ１１、１２Ｂ１２、１０Ｄ５、および１１Ｂ６の重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変領域を同定し、配列決定した。
【０４０２】
方法
全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを使用してｃＤＮＡに逆転写した。重鎖および軽鎖の抗体断片を、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）によって増幅した。増幅された抗体断片を、標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。コロニーＰＣＲを実施して、正しいサイズの挿入物を持つクローンをスクリーニングした。ハイブリドーマ細胞株ごとに、５つのクローンを選択し、重鎖および軽鎖の両方について配列決定した。各モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖配列を自信を持って決定するために、５つのクローンを用いて配列アラインメントを実施した。
【０４０３】
アミノ酸および核酸配列の分析
以下の表１３および１４は、ＩｇＢＬＡＳＴに従って決定される、抗体クローン２Ｅ９、９Ｄ８、１２Ｇ１、３Ｃ１１、１２Ｂ１２、１０Ｄ５、および１１Ｂ６の各々の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびにそれぞれ重鎖および軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を示している。表１４の重鎖および軽鎖のＣＤＲは、太字で示されている。
【表１３−１】
2022502369.tif 000019
【表１３−２】
2022502369.tif 000020
【表１４−１】
2022502369.tif 000021
【表１４−２】
2022502369.tif 000022
【表１４−３】
2022502369.tif 000023
【０４０４】
以下の表１５は、任意にアミノ末端で抗体鎖に連結され得るシグナル配列を示す。
【表１５】
2022502369.tif 000024
【０４０５】
ＣＤＲおよび抗体配列決定のコンセンサスの評価
ＶＨおよびＶＬ配列は、可変ＩｇＧ１重鎖および可変κ軽鎖の増幅抗体断片を含む５つのクローニングベクターの配列決定によって確認された。抗体２Ｅ９、９Ｄ８、１２Ｇ１、３Ｃ１１、１２Ｂ１２、１０Ｄ５、および１１Ｂ６の場合、５つの配列決定トレース全体で１００％のアラインメントが得られ、報告されたフレームワーク、ならびに重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が確実に保証される。報告された重鎖および軽鎖配列について、代替ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸は同定されなかった。
【０４０６】
実施例１６
α−Ｓｙｎ種の相対結合
精製された抗体２Ｅ９、１２Ｂ１２、および１２Ｇ１、ならびにＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した３つのα−ｓｙｎコンパレーター抗体）を、ＳＰＲ分析のためにセンサーチップ表面上に固定化した。およそ５０００ＲＵの各抗体を固定化した。α−ｓｙｎモノマー、テトラマー、または超音波処理された既形成フィブリル（可溶性フィブリル）の段階希釈物を抗体の上に注入した。結合相互作用を測定し、可溶性フィブリル：モノマーおよびテトラマー形態の相対結合を計算した。
【０４０７】
試験抗体の未変性モノマーおよびテトラマーに対する可溶性フィブリルへの抗体結合の比率を以下に示す。
【表１６】
2022502369.tif 000025
【０４０８】
３つのコンパレーター抗体とは異なり、試験抗体は、モノマーまたはテトラマー種のいずれかと比較して、可溶性フィブリルα−ｓｙｎに対して１０倍を超える結合を示した。
【０４０９】
実施例１７
α−シヌクレイン凝集のインビトロ伝播
α−シヌクレインモノマー（１００ｕＭ）を、凝集を引き起こすシードとして作用する１０ｎＭの可溶性ヒト既形成フィブリル（ｈｕＰＦＦ）とインキュベートした。
【０４１０】
図１５Ａに示されるように、単独でインキュベートされたモノマーは、試験された条件下で凝集しなかった。凝集は、チオフラビン−Ｔ（２５ｕＭ）によって結合されるβシートの形成を引き起こし、凝集の量に比例する蛍光シグナルを生じさせる。０．１ｎＭ（２Ｅ９：ｈｕＰＦＦの１：１００モル比）で添加された２Ｅ９抗体は、凝集の伝播を阻害した。
【０４１１】
環状ペプチドによる播種および２Ｅ９による阻害
α−Ｓｙｎ（ＰＦＦ）の超音波処理された既形成フィブリルは、凝集を引き起こすシードとして作用することが知られている。環状ペプチド（ＣＧＴＫＥＱＧＧＧＧ）（配列番号７）のみがＰＦＦの播種活性を複製する能力を、この実施例に記載のチオフラビン−Ｔアッセイを使用して試験した。凝集は、チオフラビン−Ｔ（２５ｕＭ）によって結合されるβシートの形成を引き起こし、凝集の量に比例する蛍光シグナルを産生する。
【０４１２】
α−Ｓｙｎモノマー（１００ｕＭ）を、シードとして１００ｎＭのＢＳＡ複合した環状ペプチド（配列番号７、抗体２Ｅ９を産生するために使用される環状ペプチド）、または対照として対応するＢＳＡコンジュゲート線状ペプチドとともにインキュベートした。図１５Ｂに示されるように、単独でまたは線状ペプチドの存在下でインキュベートされたモノマーは凝集しなかった。対照的に、環状ペプチドは、シードとして作用し、時間の経過とともにα−Ｓｙｎの進行性凝集を誘導することができる立体配座を有していた。０．１ｎＭで添加された２Ｅ９抗体は、凝集の伝播を阻害した（図１５Ｂ）。
【０４１３】
実施例１８
多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者からの脳抽出物への抗体の結合
アミンカップリングを介して、センサーチップ上に抗体を直接固定化した。ｐａｎ  α−シヌクレイン抗体（４Ｄ６）を正の対照として使用し、マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を負のアイソタイプ対照として使用した。５０歳の女性ＭＳＡ患者の小脳からの可溶性脳抽出物（２００ｕｇ／ｍＬ）を、固定化した抗体に８分間注入した後、５分間解離させた。解離段階への３０秒での結合応答（応答単位、ＲＵの観点から）を図１６Ａに示す。見られるように、試験抗体２Ｅ９、１２Ｇ１、１１Ｂ６、１２Ｂ１２、３Ｃ１１、９Ｄ８、および１０Ｄ５は、ｍＩｇＧ１で得られたバックグラウンド結合応答を超える結合応答を示し、結合応答は、対照ｐａｎ  α−ｓｙｎ（４Ｄ６）抗体で見られたものよりも大きかった。
【０４１４】
未分画のヒト可溶性ＭＳＡ脳抽出物への結合のＳＰＲ分析
多系統萎縮症（ＭＳＡ）の５０歳の女性の小脳からの未分画のヒト可溶性ＭＳＡ脳抽出物のＳＰＲ分析を、この実施例に記載されているように行った。試験抗体、正の対照抗体（ｐａｎ  α−Ｓｙｎ  ４Ｄ６）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓのコンパレーター抗α−Ｓｙｎ抗体（ｍＡｂ４９／Ｇ、ＮＩ−２０２．１２Ｆ４、ＰＲＸ００２）、およびマウスＩｇＧアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）を、高密度で（およそ１２，０００〜２０，０００ＲＵ）センサーチップのフローセル上で固定化した。２００ｕｇ／ｍＬに希釈した脳可溶性抽出物を、１０ｕＬ／分でおよそ８分間表面に注入した後、５分間解離させた（四重測定）。図１６Ｂに示されるように、すべての試験抗体およびコンパレーターは、ｍＩｇＧ１で得られたバックグラウンド結合応答を超える結合応答を示した。試験抗体の結合応答はまた、対照ｐａｎ  α−ｓｙｎ（４Ｄ６）抗体で見られたものよりも大きかった。ＮＩ−２０２．１２Ｆ４抗体は、Ｎ末端残基１〜１０に結合し、ＰＲＸ００２抗体は、残基１１８〜１２６に結合する。
【０４１５】
ヒトＭＳＡ脳抽出物からの「プリオン濃縮」画分への結合のＳＰＲ分析
ＭＳＡを有する５０歳の女性の小脳からの脳試料を、上記のように均質化した（実施例７）。次いで、ホモジネートを青柳ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅａａｔ８４６２，２０１９）によって説明されるように処理し、α−Ｓｙｎの自己伝播種を含む「プリオン濃縮画分」を単離した。簡単に説明すると、２％サルコシルおよび０．５％ベンゾナーゼをホモジネートに添加し、３７℃で２時間振とうしながらインキュベートした。次いで、リンタングステン酸（ＰＴＡ）を最終濃度２％で添加し、混合物を３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。次いで、材料を１６，１００ｘｇで３０分間遠心分離し、得られたペレットを２％サルコシルおよび２％  ＰＴＡに再懸濁し、３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした（残留サルコシル可溶性タンパク質を洗い流すため）。次いで、混合物を１６，１００ｘｇで３０分間遠心分離し、最終ペレットをＳＰＲ分析のためにＰＢＳに再懸濁した。
【０４１６】
試験抗体、正の対照抗体（ｐａｎ  α−Ｓｙｎ  ４Ｄ６）およびマウスＩｇＧアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）は、センサーチップのフローセルに高密度（およそ１８，０００〜２４，０００ＲＵ）で固定化した。再懸濁されたペレット材料（推定タンパク質濃度２５０〜３７５ｕｇ／ｍＬ）を１０ｕＬ／分でおよそ８分間表面に注入した後、およそ２００秒の解離期間（重複測定）を行った。結合応答を、ＩｇＧ参照表面結合を差し引くことによって二重参照し、アッセイ緩衝液で正規化した。結果を図１６Ｃに示す。すべての試験抗体は、ｍＩｇＧ１で得られたバックグラウンド結合応答を超える結合応答を示した。試験抗体の結合応答は、プリオンおよびプリオンに富む調製物に残っている任意の残りの汚染α−Ｓｙｎ種の両方に結合すると予想される対照ｐａｎ  α−ｓｙｎ（４Ｄ６）抗体で見られるものと同等またはそれ以上であった。
【０４１７】
実施例１９
生体試料中のミスフォールドしたα−ｓｙｎオリゴマーの測定
１２Ｇ１抗体を、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＭＣＴＭプラットフォームで使用した。標準曲線を生成するために、磁性粒子を１２．５ｕｇ／ｍＬの１２Ｇ１抗体でコーティングし、０〜１５６ｐｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のα−ｓｙｎオリゴマーに曝露した。次いで、捕捉されたα−Ｓｙｎを、１，５００ｎｇ／ｍＬの濃度で標識されたｐａｎ  α−Ｓｙｎ抗体（４Ｄ６）を使用して検出した。標準曲線は、異なるα−Ｓｙｎ濃度での溶出された検出抗体からのシグナル（応答単位）を示す。次いで、１２Ｇ１でコーティングされた磁性粒子を、同じプロトコルに従ってＭＳＡ脳抽出物（１，２７７ｕｇ／ｍＬ総タンパク質）に曝露した。得られたシグナルを使用して、標準曲線を使用して試料中に存在するα−Ｓｙｎオリゴマーの量を導出した。その量を、およそ１１３ｐｇ／ｍＬであると推定した（図２０）。
【０４１８】
実施例２０
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの「一分子カウント（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ）」（ＳＭＣＴＭ）プラットフォームを使用した選択性の分析
試験抗体１２Ｇ１（図１７Ａ〜Ｃ）、９Ｄ８（図１８Ａ〜Ｃ）、および１０Ｄ５（図１９Ａ〜Ｃ）のα−Ｓｙｎモノマー対オリゴマー対超音波処理フィブリルへの結合を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＭＣ（商標）プラットフォームで評価して、これらの種に対する抗体の定量下限（ＬＬｏＱ）および相対選択性を決定した。簡単に説明すると、磁性粒子を１２．５ｕｇ／ｍＬ（１２Ｇ１、１０Ｄ５）または２５ｕｇ／ｍＬ（９Ｄ８）の試験抗体でコーティングした。コーティングされた粒子を、モノマーの場合は最大１４００ｎｇ／ｍＬ、オリゴマーの場合は１０，０００ｐｇ／ｍＬ、可溶性の超音波処理されたフィブリルの場合は最大１，０００ｐｇ／ｍＬまでの広範囲のα−Ｓｙｎ濃度に曝露した。次いで、捕捉されたα−Ｓｙｎを、１，５００ｎｇ／ｍＬの濃度で標識されたｐａｎ  α−Ｓｙｎ抗体（４Ｄ６）を使用して検出した。結合曲線は、異なるα−Ｓｙｎ濃度に対する溶出された検出抗体からのシグナル（応答単位）を示す。ＬＬｏＱは、シグナルがバックグラウンドの２．５倍になる補間値として定義される。
【０４１９】
試験した３つの抗体はすべて、モノマーと比較して、α−Ｓｙｎオリゴマーおよびフィブリル（α−Ｓｙｎの病原性種）との反応性がはるかに高いことを示した。ＬＬｏＱ値に基づくと、オリゴマー対モノマーの倍率選択性は、９，３００〜３５，０００倍の範囲であり、可溶性フィブリル対モノマーの倍率選択性は、１１，２００〜１７５，０００倍の範囲であった。具体的には、オリゴマー対モノマーの１２Ｇ１倍率選択性は、３５，０００倍であり、フィブリル対モノマーの場合は１７５，００００倍であった（図１７Ａ〜Ｃ）。オリゴマー対モノマーの９Ｄ８倍率選択性は、９，３００倍であり、フィブリル対モノマーの場合は、９３，３００倍であった（図１８Ａ〜Ｃ）。オリゴマー対モノマーの１０Ｄ５倍率選択性は、９，３００倍であり、フィブリルの場合は１１，２００倍であった（図１９Ａ〜Ｃ）。
【０４２０】
実施例２１
ＳＰＲ親和性測定
様々なα−Ｓｙｎ種（モノマー、生理学的テトラマー、オリゴマー、および可溶性フィブリル）に対する抗体の結合パラメーターのＳＰＲ分析のために、抗体をセンサーチップのフローセルにおよそ２，０００〜４，５００ＲＵで固定化した。１，０００〜０．５ｎＭ（１２ポイント希釈系列）から２倍に希釈されたα−Ｓｙｎ分析物を表面に連続しておよそ４分間注入した後、緩衝液でおよそ５分間解離させて表面を再生した。結合パラメーターは、定常状態（モノマー、生理学的テトラマー）または速度論的（オリゴマー、超音波フィブリル）曲線近似およびラングミュア１：１結合モデルを使用して計算した。結果を表１７にまとめる。
【０４２１】
市販されている他のα−Ｓｙｎ抗体（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ、クローンＰＲＸ００２およびＮＩ−２０２．１２Ｆ４）と比較して、試験した抗体（２Ｅ９、１２Ｇ１、１２Ｂ１２）は、病原性α−Ｓｙｎ種に対してより高い選択性を示し、モノマーおよび生理学的テトラマーへの結合はごくわずかであったが、オリゴマーおよび超音波処理されたフィブリルに対する強い親和性を示した。
【表１７】
2022502369.tif 000026
【０４２２】
本出願は、現在好ましい例であると考えられるものを参照して説明されているが、本出願は、開示された例に限定されないことを理解されたい。逆に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な修正および同等の配置を網羅することを意図している。
【０４２３】
すべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願の各々が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表または他の場所で提供される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書で提供される各受託番号に関連する配列は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０４２４】
特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
参考文献
Ａｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１９）．Ａβ  ａｎｄ  ｔａｕ  ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｄｅｃｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，ｅａａｔ８４６２．
Ｓｃｈｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｚｕｄｄａｓ，Ａ．，Ｋｏｐｉｎ，Ｉ．Ｊ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｌ．，＆  ＤＩ  Ｐｏｒｚｉｏ，Ｕ．（１９８８）．１−Ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  １−ｍｅｔｈｙｌ−４−  ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５０，１９００−１９０７．
Ｃｏｓｔａｎｚｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｕｒｚｏｌｏ，Ｃ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４５２，１−１７．
Ｇｕｏ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．（２０１４）．Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０，１３０−１３８．
Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＮＬ．（１９９０）Ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｌｏｆｅｎ  ａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｅｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０  Ｍａｒ；４２２：４３３−４６．
Ｊｕｃｋｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ＬＣ．（２０１３）Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｓｅｐ  ５；５０１（７４６５）：４５−５１．
Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（２０１２）．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｐｒｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６，１５１１−１５１３．
Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ  Ｌ．，Ｌｕｋ  Ｋ．，Ｌｅｅ  Ｖ．（２０１４）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  Ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｓｅｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｔｏ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｌｅｗｙ  Ｎｅｕｒｉｔｅ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．９（９）：２１３５−２１４６．
Ｎｕｂｅｒ，Ｓｉｌｋｅ，Ｍｏｌｌｙ  Ｒａｊｓｏｍｂａｔｈ，Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｍｉｎａｋａｋｉ．．．Ｂａｒｂａｒａ  Ｃａｌｄａｒｏｎｅ，Ｕｌｆ  Ｄｅｔｔｍｅｒ，ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ  Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅ．Ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｕｓｅｓ  ａ  ＬＤＯＰＡ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｍｏｔｏｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｌｏｓｅｌｙ  Ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．ＮＥＵＲＯＮ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １０，２０１８．
Ｐｅｎｇ  ２０１８  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ＳＯＤ１  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ  Ｘｕｂｉａｏ  Ｐｅｎｇ，Ｎｅｉｌ  Ｒ．Ｃａｓｈｍａｎ，ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２０１８  １２２（４９），１１６６２−１１６７６．
【図１Ａ】
2022502369.tif 000027
【図１Ｂ】
2022502369.tif 000028
【図１Ｃ】
2022502369.tif 000029
【図１Ｄ】
2022502369.tif 000030
【図２Ａ】
2022502369.tif 000031
【図２Ｂ】
2022502369.tif 000032
【図３Ａ】
2022502369.tif 000033
【図３Ｂ】
2022502369.tif 000034
【図３Ｃ】
2022502369.tif 000035
【図４Ａ】
2022502369.tif 000036
【図４Ｂ】
2022502369.tif 000037
【図４Ｃ】
2022502369.tif 000038
【図５Ａ】
2022502369.tif 000039
【図５Ｂ】
2022502369.tif 000040
【図５Ｃ】
2022502369.tif 000041
【図６Ａ】
2022502369.tif 000042
【図６Ｂ】
2022502369.tif 000043
【図６Ｃ】
2022502369.tif 000044
【図６Ｄ】
2022502369.tif 000045
【図６Ｅ】
2022502369.tif 000046
【図６Ｆ】
2022502369.tif 000047
【図６Ｇ】
2022502369.tif 000048
【図６Ｈ】
2022502369.tif 000049
【図７Ａ】
2022502369.tif 000050
【図７Ｂ】
2022502369.tif 000051
【図７Ｃ】
2022502369.tif 000052
【図７Ｄ】
2022502369.tif 000053
【図７Ｅ】
2022502369.tif 000054
【図７Ｆ】
2022502369.tif 000055
【図７Ｇ】
2022502369.tif 000056
【図７Ｈ】
2022502369.tif 000057
【図８Ａ】
2022502369.tif 000058
【図８Ｂ】
2022502369.tif 000059
【図８Ｃ−Ｈ】
2022502369.tif 000060
【図９Ａ】
2022502369.tif 000061
【図９Ｂ】
2022502369.tif 000062
【図１０Ａ】
2022502369.tif 000063
【図１０Ｂ】
2022502369.tif 000064
【図１０Ｃ】
2022502369.tif 000065
【図１０Ｄ】
2022502369.tif 000066
【図１０Ｅ】
2022502369.tif 000067
【図１０Ｆ】
2022502369.tif 000068
【図１０Ｇ】
2022502369.tif 000069
【図１０Ｈ】
2022502369.tif 000070
【図１０Ｉ】
2022502369.tif 000071
【図１０Ｊ】
2022502369.tif 000072
【図１０Ｋ】
2022502369.tif 000073
【図１１】
2022502369.tif 000074
【図１２Ａ】
2022502369.tif 000075
【図１２Ｂ】
2022502369.tif 000076
【図１３Ａ】
2022502369.tif 000077
【図１３Ｂ】
2022502369.tif 000078
【図１３Ｃ】
2022502369.tif 000079
【図１３Ｄ−Ｈ】
2022502369.tif 000080
【図１３Ｉ】
2022502369.tif 000081
【図１４Ａ】
2022502369.tif 000082
【図１４Ｂ】
2022502369.tif 000083
【図１４Ｃ−Ｇ】
2022502369.tif 000084
【図１４Ｈ】
2022502369.tif 000085
【図１５Ａ】
2022502369.tif 000086
【図１５Ｂ】
2022502369.tif 000087
【図１６Ａ】
2022502369.tif 000088
【図１６Ｂ】
2022502369.tif 000089
【図１６Ｃ】
2022502369.tif 000090
【図１７Ａ】
2022502369.tif 000091
【図１７Ｂ】
2022502369.tif 000092
【図１７Ｃ】
2022502369.tif 000093
【図１８Ａ】
2022502369.tif 000094
【図１８Ｂ】
2022502369.tif 000095
【図１８Ｃ】
2022502369.tif 000096
【図１９Ａ】
2022502369.tif 000097
【図１９Ｂ】
2022502369.tif 000098
【図１９Ｃ】
2022502369.tif 000099
【図２０】
2022502369.tif 000100
【配列表】
2022502369000001.app
【国際調査報告】
2022502369.tif 000101
2022502369.tif 000102
2022502369.tif 000103
2022502369.tif 000104
2022502369.tif 000105
2022502369.tif 000106
2022502369.tif 000107
2022502369.tif 000108
2022502369.tif 000109