(57)【要約】  本発明が開示する細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグは、それぞれが内側および外側を有する頂壁フィルムおよび底壁フィルムであって、丈夫な溶接継ぎ目によって（任意選択で１つまたは複数の側壁フィルムによって）互いに対して内側と内側の間を密閉されて、丈夫な溶接継ぎ目によって区切られた容積を伴うバッグを形成する、頂壁フィルムおよび底壁フィルムと、頂壁フィルムおよび／または底壁フィルムを通る、流体の導入および回収のための１つまたは複数のポートと、前記頂壁フィルムの内側と前記底壁フィルムの内側を接合して、バッグの容積を複数の培養隔室に分割する、１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目と、脆弱な溶接継ぎ目の各々に隣接して頂壁フィルムおよび底壁フィルムに貼付された１つまたは複数の把持手段であって、特定の脆弱な溶接継ぎ目に隣接した頂壁フィルムおよび底壁フィルム上の把持手段を引き離すことによって特定の脆弱な溶接継ぎ目を壊すように適合された１つまたは複数の把持手段とを備える。
2022501022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグ（１）であって、
それぞれが内側および外側を有する頂壁フィルム（２）および底壁フィルム（４）であって、丈夫な溶接継ぎ目（１２）によって（任意選択で１つまたは複数の側壁フィルムによって）互いに対して内側と内側の間を密閉されて、前記丈夫な溶接継ぎ目によって区切られた容積（８）を伴うバッグを形成する、頂壁フィルム（２）および底壁フィルム（４）と、
前記容積に対する流体の導入および回収のための１つまたは複数のポート（１４）と、
前記頂壁フィルムの前記内側と前記底壁フィルムの前記内側を接合して前記容積を複数の培養隔室（１８）に分割する１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目（１６）と、
前記脆弱な溶接継ぎ目の各々に隣接して前記頂壁フィルムおよび前記底壁フィルムに貼付された１つまたは複数の把持手段（２０）であって、特定の脆弱な溶接継ぎ目に隣接した前記頂壁フィルムおよび前記底壁フィルム上の前記把持手段を引き離すことによって前記特定の脆弱な溶接継ぎ目を壊すように適合された１つまたは複数の把持手段（２０）と
を備える、可撓性プラスチックバッグ（１）。
【請求項２】
前記把持手段が、フィルムのループ、フィルムのタブ、フック、把持バー、取っ手、頂フィルムまたは底フィルムのポートまたは折り目、のうちの１つまたは複数を備える、請求項１に記載のバッグ。
【請求項３】
少なくとも３つの培養隔室を備える、請求項１または２に記載のバッグ。
【請求項４】
前記頂壁フィルムおよび前記底壁フィルムが、丈夫な溶接継ぎ目によって、それらの縁端に沿って互いに直接密閉されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項５】
少なくとも１つの培養隔室における少なくとも１つの特性を測定するように適合された１つまたは複数のセンサ（５０）をさらに備える、請求項１から４のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項６】
前記センサのうちの少なくとも１つが生細胞密度センサである、請求項５に記載のバッグ。
【請求項７】
撹拌のために、揺動テーブルプラットフォームなどの動くテーブルプラットフォーム（５２）に取り付けられるように適合された、請求項１から６のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項８】
放射線滅菌などによって滅菌してから供給される、請求項１から７のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項９】
前記培養隔室のうちの少なくとも１つの中に細胞培養液を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項１０】
脆弱な溶接継ぎ目によって区切られた１つまたは複数の培養媒体隔室をさらに備える、請求項１から９のいずれか一項に記載のバッグ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の可撓性プラスチックバッグ（１）を備えるバイオリアクタであって、前記バッグの撹拌のために、動くテーブルプラットフォーム（５２）に取り付けられている、バイオリアクタ。
【請求項１２】
前記動くテーブルプラットフォームが揺動テーブルプラットフォームである、請求項１１に記載のバイオリアクタ。
【請求項１３】
前記底壁フィルムに取り付けられた少なくとも１つの把持手段（２０）が前記動くテーブルプラットフォームに取り付けられている、請求項１１または１２に記載のバイオリアクタ。
【請求項１４】
特定の脆弱な溶接継ぎ目を開くために、前記頂壁フィルムの前記外側に取り付けられた把持手段を引っ張ることができる継ぎ目オープナ（５６）をさらに備える、請求項１３に記載のバイオリアクタ。
【請求項１５】
前記継ぎ目オープナが、前記特定の脆弱な溶接継ぎ目が完全に開くまで引っ張り、次いで、引っ張るのをやめて、バッグのいかなる損傷も防止するように構成されている、請求項１４に記載のバイオリアクタ。
【請求項１６】
前記継ぎ目オープナがセンサ（５０）に接続されており、前記センサから信号を受け取ったとき前記脆弱な継ぎ目を開くように適合されている、請求項１４または１５に記載のバイオリアクタ。
【請求項１７】
前記センサが生細胞密度センサであり、前記継ぎ目オープナが、所定の生細胞密度が一旦達成されたとき前記脆弱な継ぎ目を開くように適合されている、請求項１６に記載のバイオリアクタ。
【請求項１８】
ａ）  それぞれが内側および外側を有する頂壁フィルム（２）および底壁フィルム（４）であって、丈夫な溶接継ぎ目（１２）によって（任意選択で１つまたは複数の側壁フィルムによって）互いに対して内側と内側の間を密閉されて、前記丈夫な溶接継ぎ目によって区切られた容積（８）を伴うバッグを形成する、頂壁フィルム（２）および底壁フィルム（４）と、前記容積に対する流体の導入および回収のための１つまたは複数のポート（１４）と、前記頂壁フィルムの前記内側と前記底壁フィルムの前記内側を接合して前記容積を複数の培養隔室（１８）に分割する１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目（１６）とを備える細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグ（１）を用意するステップと、
ｂ）  前記培養隔室のうちの少なくとも１つの中に培養基および細胞を導入するステップと、
ｃ）  前記培養隔室の中の前記細胞を培養して細胞培養液をもたらすステップと、
ｄ）  前記２つの培養隔室を、より大きい培養隔室へと結合するように、前記培養隔室と隣接した培養隔室との間の脆弱な溶接継ぎ目を、前記脆弱な溶接継ぎ目に対して基本的に垂直な方向に、前記頂壁フィルムおよび前記底壁フィルムを前記脆弱な溶接継ぎ目にわたって引き離すことによって壊すステップと、
ｅ）  前記より大きい培養隔室の中で前記細胞を培養するステップと
を含む、細胞の培養のための方法。
【請求項１９】
ステップａ）が、請求項１から９のいずれか一項に記載の可撓性プラスチックバッグを用意するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｄ）が、前記脆弱な溶接継ぎ目に隣接した前記頂壁フィルムおよび前記底壁フィルム上の把持手段（２０）を引き離すステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｃ）が、センサ（５０）で前記細胞培養液の特性を測定して、前記特性が所定の値を達成したときステップｄ）を開始するステップを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記特性が前記細胞培養液の生細胞密度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
制御ユニット（６６）が前記センサおよび継ぎ目オープナ（５６）に対して通信可能に結合されており、前記制御ユニットが、前記特性が前記所定の値を一旦達成したとき前記継ぎ目オープナを活性化してステップｄ）を実行させるようにプログラムされている、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養のためのバイオリアクタに関し、より詳細には、種系列増殖または細胞療法のための細胞の増殖などの細胞培養の多段増殖に適切な可撓性バッグのバイオリアクタに関する。本発明は、可撓性バッグのバイオリアクタにおける細胞培養を拡大する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養を、小さい細胞バンクサンプルからより大きい製造バッチへとスケールアップするとき、通常は、個別のバイオリアクタを使用して数ステップを要する。培養のこの順序は、しばしば種系列と呼ばれ、多くの場合、細胞密度を、＞１０５細胞／ｍｌ程度のある特定の最適なウィンドウの範囲内に維持するために必要とされる。小さい凍結保存されたバイアルサンプルから数ｍ３までスケールアップするバイオ医薬品の大規模生産では、種系列は、６ステップまで包含することができ、数週間かかることがある。これはまた、１つのバイオリアクタから別のバイオリアクタへの培養液の無菌の移植は、ＬＡＦベンチまたは無菌のクリーンルームの中で移植する必要があるという点において複雑な処置である。これらの条件下でさえ、高価値の大量培養にとって致命的な結果をもたらしかねない、偶発的な感染に関するある特定のリスクもある。同様の懸念は、たとえば幹細胞または遺伝子組み換えされた免疫細胞といった、臨床の細胞療法で使用される細胞の増殖にも当てはまる。
【０００３】
細胞培養液用の使い捨て容器に向かう一般的傾向に伴って、種系列において可撓性バッグのバイオリアクタを使用する傾向が増している。しかしながら、１つの小さいバッグを空にして、より大きいバッグの中へ内容物を移す必要性が依然として残っており、これはいくらかの汚染のリスクを伴う作業集中的な動作である。バッグ断面の全体にわたってバッグの一部をクランプして分離し、次いでクランプを解除する（ＷＯ２００８１５３４０１）か、または折りたたんだバッグから始めて、次いでバッグを広げる（米国特許出願公開第２０１０００５５７６４号）ことにより、可撓性バッグの培養容積を徐々に増加させることが示されている。しかしながら、これらの解決策では使用済隔室と未使用隔室の間の密閉が優れず、培養液が未使用の隔室の中に漏出し、不適当な条件下で成長した細胞から放出された物質によって細胞培養液が汚染される原因となる。これらの方法は、バッグに対する機械的損傷のリスクもかなり包含しており、結果としてバッグが破断するリスクを伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００８／１５３４０１
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０００５５７６４号
【特許文献３】ＥＰ２，２２６，０５８Ａ１
【特許文献４】米国特許第４，５１９，４９９号
【特許文献５】米国特許第８，１８０，５７５号
【特許文献６】ＷＯ２０１０／０１０３１３Ａ２
【特許文献７】米国特許第６，１９０，９１３号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５００６３２４７号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００８０１６０５９７号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９０２３３３３４号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１６０２１５２４９号
【特許文献１２】米国特許第６，１９０，９１３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｖ  Ｓｉｎｇｈ：  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（１〜３）、１４９〜１５８頁（１９９９年）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｃｋｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、２０１３年、２９巻、Ｎｏ．  ３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それゆえに、細胞培養液を１つの可撓性培養隔室から別の隔室へ無菌条件下で移す安全で好都合なやり方が必要である。種系列処置を自動化する必要性がさらに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、培養液をむき出しのまま容器間で移植することなく培養容積の好都合な増加を可能にする可撓性バッグを提供するものであり、したがって汚染のリスクを軽減する。これを達成する、細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグは、
−  それぞれが内側および外側を有する頂壁フィルムおよび底壁フィルムであって、丈夫な溶接継ぎ目によって（任意選択で１つまたは複数の側壁フィルムによって）互いに対して内側と内側の間を密閉されて、丈夫な溶接継ぎ目によって区切られた容積を伴うバッグを形成する、頂壁フィルムおよび底壁フィルムと、
−  頂壁フィルムおよび／または底壁フィルムを通して流体を導入したり回収したりするための１つまたは複数のポートと、
−  頂壁フィルムの内側と底壁フィルムの内側を接合して、容積を複数の培養隔室に分割する、１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目と、
−  脆弱な溶接継ぎ目の各々に隣接して頂壁フィルムおよび底壁フィルムに貼付された１つまたは複数の把持手段であって、特定の脆弱な溶接継ぎ目に隣接する頂壁フィルム上の把持手段と底壁フィルム上の把持手段を引き離すことによって特定の脆弱な溶接継ぎ目を壊すように適合された１つまたは複数の把持手段とを備える。
【０００８】
利点の１つには、培養隔室間の継ぎ目が容易に壊れて、より大きい培養隔室を形成することがある。さらなる利点には、継ぎ目を自動的に壊すことができ、オペレータ時間が最小限になり得、バッグおよび機器の必要量が減少し得ることがある。
【０００９】
本発明の第２の態様は、上記で論じられたような、撹拌するように動く（たとえば揺動する）プラットフォーム上の１つまたは複数の可撓性バッグを用いるバイオリアクタを提供するものであり、これによって、培養液をむき出しのまま容器間で移植することなく、培養容積の好都合な増加が可能になる。これは特許請求の範囲において定義されるようなバイオリアクタを用いて達成される。
【００１０】
本発明の第３の態様は、培養液をむき出しのまま容器間で移植することなく、培養容積を増加させる培養方法を提供するものである。これは特許請求の範囲において定義されるような方法を用いて達成される。
【００１１】
本発明のさらなる適切な実施形態が従属請求項に記述されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】２つの脆弱な溶接継ぎ目によって互いに区切られた３つの接続可能な培養隔室を有するバッグを用いる本発明の一実施形態を示す図（上面図）である。バッグは揺動テーブル上に取り付けられている。
【図２】図１のバッグの一連の側面図である。ａ）脆弱な溶接継ぎ目はどちらも完全な状態のままであり、ｂ）脆弱な溶接継ぎ目が１つ開かれており、ｃ）脆弱な溶接継ぎ目が両方とも開かれている。
【図３】ａ）斜め方向の脆弱な溶接継ぎ目およびｂ）同心の脆弱な溶接継ぎ目を有する、バッグの代替形態機構を示す図（上面図）である。
【図４】フィルムのループ把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図５】フィルムのタブ把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図６】粘着テープ把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図７】ポートブリッジ把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図８】単一ポート把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図９】把持取っ手を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図１０】フィルムの折りたたみ把持手段を詳細に示す図（脆弱な溶接継ぎ目を横切った側面図）である。
【図１１】脆弱な溶接継ぎ目を開くための２つの継ぎ目オープナの実施形態を示す図（側面図）である。
【図１２】バッグを伴う揺動テーブルのバイオリアクタを示す図（側面図）である。
【図１３】脆弱な溶接継ぎ目に沿った概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用されるような「丈夫な溶接継ぎ目」という用語は、フィルムの損傷なく引き離すことが不可能であるか、または引き離すのに約８０Ｎを超える力が必要な、２つのプラスチック製フィルムまたはラミネートを接合する溶接継ぎ目を意味する。
【００１４】
本明細書で使用されるような「脆弱な溶接継ぎ目」という用語は、約５Ｎ〜約８０Ｎなどの中程度の力を使用して、フィルムの損傷なく引き離すことができる、２つのプラスチック製フィルムまたはラミネートを接合する溶接継ぎ目を意味する。そのような継ぎ目はまた、破裂したり時期尚早の漏出をもたらしたりすることなく、正常細胞の培養中に生じる力に耐えることができる。
【００１５】
本明細書で使用されるような「ポート」という用語は、バッグに対して流体を出し入れするためのバッグの開口を意味する。ポートは、一般的には、バッグフィルムに取り付けるための内部取付け器具（たとえばディスク）と、管類または外部デバイスに取り付けるための外部取付け器具とを備える。外部取付け器具は、たとえば、ホースバーブまたは他の管類コネクタ、１本の管類、スパイクまたは注射器針によって貫通するための膜などとすることができる。
【００１６】
本発明は、図１〜図１０によって示される第１の態様において、細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグ１を開示するものである。このバッグは以下のａ）〜ｄ）を備える。
【００１７】
ａ）  それぞれ内側（バッグの容積８に面する）および外側（外部に面する）を有する頂壁フィルム２および底壁フィルム４。これらのフィルムは、丈夫な溶接継ぎ目１２によって互いに対して内側と内側の間を密閉されて、容積を伴うバッグを形成し、容積８は、頂壁フィルムの内側と底壁フィルムの内側の両方に面し、丈夫な溶接継ぎ目と、頂壁フィルムおよび底壁フィルムとによって区切られる。丈夫な溶接継ぎ目は、頂壁フィルムの縁端および底壁フィルムの縁端に沿って適切に配置され得る。頂壁フィルムと底壁フィルムは、望ましくは互いに対して直接溶接され得るが、容積を伴うバッグを形成するように、１つまたは複数の側壁フィルムによって密閉されてもよい。フィルムは均一なフィルムまたはラミネートでよく、たとえばポリエチレンおよび／またはエチレン酢酸ビニル共重合体などのポリオレフィンばかりでなく、たとえばエチレンビニルアルコール系重合体および／またはたとえばポリアミドの耐引裂性層といったバリア層を含み得る。フィルム／ラミネートの厚さは、たとえば１００〜３５０マイクロメートルなど、５０〜４００マイクロメートルでよい。フィルム／ラミネートの材料は、適切には低レベルの溶出性物質／抽出可能物質を伴うＵＳＰ  ＶＩ品質のものであり得、細胞培養用途における適合性を求めて選択され得る。細胞培養液用のそのようなフィルム／ラミネートの例は、Ｆｏｒｔｅｍ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＢｉｏｃｌｅａｒ  １０ラミネートおよびＢｉｏｃｌｅａｒ  １１ラミネートを含む。
【００１８】
ｂ）  頂壁フィルムおよび／または底壁フィルムを通る、流体の導入および回収のための１つまたは複数のポート１４。少なくとも１つの培養隔室は、以下のｃ）で論じられるように、ガス入口およびガス出口を適切に備える。これらの入口および出口は、培養液の感染／汚染を防止するための細菌フィルタ（図示せず）を装備してよく、たとえば培養液に空気／酸素を供給して二酸化炭素などのガス状の代謝生成物を除去するために使用される。培養隔室は、サンプリング出口と、培養基用の入口と、たとえば温度、細胞密度、ｐＨおよび／またはたとえば酸素もしくは代謝生成物の濃度用のセンサとのうちの１つまたは複数も備え得る。少なくとも第１の培養隔室は、特定の培養プロトコルに必要なポート／センサを有するべきである。これらは、次いで、第１の培養隔室に対してさらなる培養隔室が追加されるときにもアクセス可能になる。しかしながら、隔室の容積がある特定のレベルを超えて増加するときには、より大きい規模において必要とされるより高い流速に適合するように、たとえばより大きい管類直径のさらなるポートを有するのが有利であり得る。
【００１９】
ｃ）  頂壁フィルムと底壁フィルムの内側を接合し、容積を少なくとも３つの培養隔室などの複数の培養隔室１８に分割する１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目１６。次いで、それぞれの培養隔室が、頂壁フィルムおよび底壁フィルム、１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目によって、また、任意選択で１つまたは複数の丈夫な溶接継ぎ目によって、区切られる。使用中に、バッグは、培養隔室のうちの少なくとも１つの中に細胞培養液を含んでよく、脆弱な溶接継ぎ目は、壊れていないときには別の培養隔室への培養液のいかなる漏出も防止する。脆弱な溶接継ぎ目は、たとえばＥＰ２，２２６，０５８Ａ１または米国特許第４，５１９，４９９号に開示されているような弱い溶接でよく、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。脆弱な溶接継ぎ目は、たとえば２つの隣接した培養隔室間の全体の境界決定を構成することができる。脆弱な溶接継ぎ目は、図１および図３ａ）に示されるように２つの丈夫な溶接継ぎ目の間に延在してよいが、図３ｂ）のように閉ループを形成することもできる。培養隔室は、第１の培養隔室１８ａ、第２の培養隔室１８ｂおよび任意選択の第３の培養隔室１８ｃ、さらなる任意選択の第４の培養隔室１８ｄであり得る。第２の培養隔室は第１の培養隔室よりも大きくてよく、たとえば第１の培養隔室の容積の少なくとも２００％、１２０〜１０００％または２５０〜３００％など、少なくとも１２０％の容積を有する。第３の培養隔室は第２の培養隔室よりも大きくてよく、たとえば第２の培養隔室の容積の少なくとも２００％、１２０〜１０００％または２５０〜３００％など、少なくとも１２０％の容積、ならびに／あるいは第１の培養隔室の容積の少なくとも４００％または１４０〜１００００％など、少なくとも１４０％の容積を有する。これによって、第１の培養隔室から第２の培養隔室へ、次いで第３の培養隔室へとスケールアップする、安全で好都合な３ステップが可能になる。脆弱な溶接継ぎ目がすべて壊れると、バッグの全体の容積が１つの培養隔室を形成することになり、次いで、これが頂フィルムおよび底フィルムならびに丈夫な溶接継ぎ目によって区切られる。培養隔室の配置は、たとえば図１のような直線状、図３ａ）のような斜め方向、または図３ｂ）のような同心であり得るが、他の配置も可能である。バッグは、たとえば、脆弱な溶接継ぎ目によって区切られた、合計で４つ、５つまたはそれ以上のさらなる培養隔室を備え得る。一例として、バッグは、それぞれ２００ｍｌ、５００ｍｌ、１．５ｌ、５ｌおよび１５ｌの容積を有する５つの培養隔室を備え得る。さらに、バッグは、脆弱な溶接継ぎ目によって区切られた１つまたは複数の培養媒体隔室を備え得る。この場合、脆弱な溶接継ぎ目は、必要なときに培養媒体隔室から培養隔室の中へ新規の培養基の流入を可能にするために開かれ得る。培養媒体隔室は、バッグの配送に際して培養媒体で前もって満たされてよく、または作業者によって適切な培養媒体で満たされてもよい。
【００２０】
ｄ）  頂壁フィルムおよび底壁フィルムの外側に貼付された（または内側に貼付されて、把持手段の一部が、外側からつかむことができるようにフィルムの開口を通って突き出る）１つまたは複数の把持手段２０であって、脆弱な溶接継ぎ目の各々に隣接し、特定の脆弱な溶接継ぎ目に隣接する頂壁フィルム上の把持手段と底壁フィルム上の把持手段を引き離すことによって特定の脆弱な溶接継ぎ目を壊すように適合された１つまたは複数の把持手段２０。把持手段は、フィルムのループ２２、フィルムのタブ２４、フック、把持バー、取っ手２６、タブ３０またはループを有する細長い粘着テープ２８、チューブ３４を接続された１対のポート３２、単一ポート３６ならびに頂フィルム／底フィルムの折り目３８のうちの１つまたは複数を備え得る。把持手段は、互いに対面する頂フィルムと底フィルムの位置において対になって配置され得る。これらの実施形態のさらなる詳細は以下のように論じられる。
−  フィルムのループ２２が溶接によってバッグ外表面に密閉されており、ユーザはループの下をつかんで引っ張ることができる（図４）。
−  フィルムが溶接によってバッグ外表面に密閉されている（図５）。これは上記の実施形態に類似であるが、必ずしもループの形態ではない。簡単なプルタブ２４がフィルムに密閉されるかまたはフィルムの一部を形成すれば十分であり得る。タブはまた、フックまたは機械的継ぎ目オープナの類似の構成要素の取付けのためのタブ／フィルムを通って空けられた１つまたは複数の穴を有することができる。
−  プルタブにおいて密閉するのではなく、脆弱な継ぎ目の近くにつかめる面３０を生成するために粘着テープ２８または類似のものが使用され得る（図６）。脆弱な継ぎ目の上に細長いテープを付ければ、ユーザはテープ自体を引っ張って継ぎ目を開くことができる。
−  テープに類似して、脆弱な継ぎ目をはがす適正な手段をもたらすために、脆弱な継ぎ目の近くのバッグに把持取っ手２６が取り付けられ得る（図９）。この取っ手は、溶接または接着接合によって取り付けられ得る。
−  脆弱な継ぎ目の両側の近くにポート３２（たとえば逆刺のついたポート）を溶接することによって「ポートブリッジ」が生成され得る（図７）。脆弱な継ぎ目にわたる取っ手を生成するために、２つのポートがチューブ３４によって接続され得る。
−  ポートブリッジに類似であるが、１つのポート３６（たとえば開口がないかまたは塞がった開口を有するブラインドポート）が脆弱な継ぎ目の近くのフィルムに溶接されていれば、これをつかんで（たとえば管類またはポート上の取っ手／フック構造を用いて）継ぎ目をはがすことができる（図８）。
−  バッグを製造するとき、ユーザがつまみ取り得る「余分な」フィルムを計画的に生成する（図１０）。たとえば、バッグの幅が０．５メートルであれば、この０．５ｍの継ぎ目を生成するために０．６ｍのフィルムを使用する。余分な０．１ｍのフィルム３８にはしわが寄り、ユーザは、これをつかんではがして開くことができるはずである。上記で論じられたように、把持手段は溶接または接着接合によって取り付けられ得る。溶接は、フィルムを通って移動する異物が付加される可能性がないという点で有利であり得る。しかしながら、また、細胞毒性成分を移動させない接着剤が使用される場合または把持手段が培養の直前に取り付けられる場合には、接着接合も可能である。
【００２１】
把持手段を用いると、小さい領域４８に力を集中して、脆弱な溶接継ぎ目１６の両側４０、４２を、継ぎ目の長手方向軸４６に対して基本的に垂直な方向４４に引き離すことができる（図１３）。これは、継ぎ目を引きちぎる超過圧力を生成するために、たとえば培養隔室を圧縮することによって継ぎ目を開こうとするよりもはるかに簡単である。Ｂｉｏｃｌｅａｒ  １０およびＢｉｏｃｌｅａｒ  １１フィルム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、溶接温度を１８０℃で一定に保ち、８０ｐｓｉの圧力で実験を行った。丈夫な溶接継ぎ目は１４秒の溶接時間で得られ、溶接時間を１秒に短縮すると脆弱な溶接継ぎ目が達成された。これらの脆弱な溶接継ぎ目は、隔室を圧縮して破裂させるのではなく、垂直に引っ張ることによって開くことができた。さらに、特定の対の把持手段を引き離すことにより、他の脆弱な継ぎ目の損傷のリスクや、結果として生じる、隣接した培養隔室への付随的な漏出なしで、意図された脆弱な継ぎ目のみを開くことができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、バッグは、少なくとも１つの培養隔室の少なくとも１つの特性を測定するように適合された１つまたは複数のセンサ５０をさらに備える。バッグは、生細胞密度（ＶＣＤ）センサを適切に備え得る。これは、たとえば米国特許第８，１８０，５７５号またはＷＯ２０１０／０１０３１３Ａ２に記述されているようなたとえばインラインのバイオマスセンサであり得、これらは参照によって全体が本明細書に組み込まれる。市販のＶＣＤセンサの例は、Ｉｎｃｙｔｅ（商標）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびＦｕｔｕｒａ（商標）（Ａｂｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、バッグは、撹拌のために揺動するかまたは動くテーブル５２のプラットフォームに、直接、またはテーブルに除去可能に取り付けられたトレイによって、取り付けられるように適合されている。テーブルは、たとえばテーブルよりもいくぶん下に設置されて、軸５４のまわりで前後に揺動することができる。この目的のために適切な揺動テーブルプラットフォームは、たとえば米国特許第６，１９０，９１３号に記述され、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓからＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）として市販されており、この特許は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。単一の軸のまわりで揺動するのとは別のモードで動くテーブルプラットフォームが、たとえば米国特許出願公開第２００５００６３２４７号（縦に枢動可能なフラップを有するテーブル）、米国特許出願公開第２００８０１６０５９７号（２つの平行な軸のまわりの動き）、米国特許出願公開第２００９０２３３３３４号（軌道を回る動き）および米国特許出願公開第２０１６０２１５２４９号（旋回する動き）に開示されており、それらはすべて、参照によって全体が本明細書に組み込まれる。これらのモードはバッグとともに使用することも可能である。バッグがテーブルまたはトレイに取り付けられていれば、底壁フィルム上の把持手段２０はテーブル／トレイに取り付けられ得る。次いで、脆弱な溶接継ぎ目が、手動または機械的継ぎ目オープナ５６により、頂壁フィルム上の把持手段を引っ張ることによって簡単に開かれ得る。把持手段は、（雄）把持手段を、テーブル／トレイの対応する（雌）受け器またはソケットの中へ挿入することにより、テーブル／トレイに取り付けられ得る。受け器／ソケットは、バッグに損傷を与えるリスクのあるいかなる突出部分もないように、テーブル／トレイの中に適切に組み込まれ得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、バッグは、放射線滅菌またはスチーミング／加圧減菌などによって滅菌してから供給される。放射線滅菌は、たとえばガンマ線または電子ビームを照射することによって達成され得る。適切には、すべての液体接点材料は、放射安定性になるように、また照射の後に低レベルの溶出性物質を与えるように選択される。すべての材料が、たとえばＵＳＰ  ＶＩ品質のものであり得る。
【００２５】
本発明は、図１および図１２によって示された第２の態様において、上記で論じられたような、バッグの撹拌のために動く／揺動するテーブル５２のプラットフォームに取り付けられた可撓性プラスチックバッグ１を備えるバイオリアクタを開示するものである。バッグは、動く／揺動するテーブルに直接取り付けられ得、または、テーブルに対して除去可能に取り付けられたトレイを介して取り付けられ得る。取付けは、たとえばバッグ終端のポケットの中に挿入されてトレイ／テーブルに対してクランプされた剛体のロッド５１を用いて達成され得る。適切には、前記底壁フィルムの外側に取り付けられた少なくとも１つの把持手段２０が、次いで、上記で論じられたような動く／揺動するテーブルプラットフォームに取り付けられ得る。揺動テーブルプラットフォームは、少なくとも１つの軸５４のまわりで前後に揺動するように、適切に適合され得る。トレイ／テーブル用の揺動機構および支持体５５は、米国特許第６，１９０，９１３号およびＶ  Ｓｉｎｇｈ：  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（１〜３）、１４９〜１５８頁（１９９９年）に詳細に記述されている。バイオリアクタは、培養隔室のうちの少なくとも１つの中に細胞培養液をさらに含み得る。テーブル／トレイは、バッグと直接接触した温度制御（加熱）面を装備し得る。テーブル／トレイは、少なくとも１つのバッグと電気的に接触するセンサコネクタをさらに装備し得る。培養隔室のうちの少なくとも１つは、ガス入口および細菌フィルタを介してガス供給に接続されてよい。
【００２６】
ある特定の実施形態では、バイオリアクタは、特定の脆弱な溶接継ぎ目を開くように頂壁フィルムの外側に取り付けられた把持手段２０を引っ張ることができる継ぎ目オープナ５６をさらに備える。継ぎ目オープナは、たとえばセンサ５０に接続されて、センサから信号を受け取ったとき脆弱な継ぎ目を開くように適合され得る。詳細には、センサが生細胞密度センサであれば、継ぎ目オープナは、所定の生細胞密度が一旦達成されると、脆弱な継ぎ目を開くように適合され得る。継ぎ目オープナは、頂壁フィルム上の把持手段と係合して、脆弱な溶接継ぎ目を継ぎ目に対して基本的に垂直な方向に引いて開くように構成される。継ぎ目オープナは、たとえばソレノイドアクチュエータ、垂直に移動可能なワイヤ、片持ち梁、バー、またはロッドなどに取り付けられた、フックまたはクランプであり得る。動きは、モータまたはピストンによって、任意選択でたとえば片持ち梁、バー、ワイヤ／プーリー機構によって、与えられ得る。図１１には、ａ）テーブル／トレイに取り付けられたアクチュエータ６０によって上昇する片持ち梁５８、およびｂ）２つの個々にアドレスできるアクチュエータ６４を有するオーバーヘッドビーム６２といった２つの説明に役立つ実例が示されている。図１１に示されるように、バッグが備え得るセンサ５０が制御ユニット６６に対して信号によって接続されており、制御ユニット６６は、センサから所定の信号レベルを一旦受け取ると、継ぎ目オープナ／アクチュエータ５６、６０、６４を作動させるように適合されている。継ぎ目オープナ／アクチュエータは、脆弱な溶接継ぎ目が完全に開いたことを表す力または位置が一旦達成されると、引っ張る動きを停止するように適合された力または位置のセンサをさらに備え得る。
【００２７】
本発明は、第３の態様において細胞の培養のための方法を開示するものである。この方法は、以下のステップａ）〜ｅ）を含む。
【００２８】
ａ）  細胞の培養のための可撓性プラスチックバッグ１を用意するステップであって、可撓性プラスチックバッグ１が、それぞれが内側および外側を有する頂壁フィルム２および底壁フィルム４であって、丈夫な溶接継ぎ目１２によって（任意選択で１つまたは複数の側壁フィルムによって）互いに対して内側と内側の間を密閉されて、丈夫な溶接継ぎ目によって区切られた容積８を伴うバッグを形成する、頂壁フィルムおよび底壁フィルムと、頂壁フィルムおよび／または底壁フィルムを通る、流体の導入および回収のための１つまたは複数のポート１４と、前記頂壁フィルムの内側と前記底壁フィルムの内側を接合して容積を複数の培養隔室１８に分割する１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目１６とを備える、ステップ。
【００２９】
ｂ）  第１の培養隔室１８ａの中に培養基および細胞を導入するステップ。
【００３０】
ｃ）  第１の培養隔室の中の細胞を培養して細胞培養液をもたらすステップ。
【００３１】
ｄ）  第１の培養隔室１８ａと第２の培養隔室１８ｂを、より大きい培養隔室へと結合するように、第１の培養隔室と隣接した第２の培養隔室１８ｂとの間の脆弱な溶接継ぎ目１６を、脆弱な溶接継ぎ目１６の長手方向軸４６に対して基本的に垂直な方向４４に、頂壁フィルムと底壁フィルムを脆弱な溶接継ぎ目にわたって引き離すことによって壊すステップ。適切には、脆弱な溶接継ぎ目は、継ぎ目の開かれていない残余の部分の背後に何らかの停滞部が残るのを防止するために完全に開かれる。機械的継ぎ目オープナが使用される場合には、これは、完全に開いたことを指示する所定の力のレベルまたはオープナ位置が達成されるまで引っ張るステップを包含することができる。次いで、バッグのいかなる損傷も防止するために、引っ張る動きが停止され得る。
【００３２】
ｅ）  より大きい培養隔室の中で細胞を培養するステップ。
【００３３】
この方法は、任意選択で、以下のステップｆ）およびｇ）をさらに含み得る。
【００３４】
ｆ）  第１の培養隔室と第２の培養隔室と第３の培養隔室を、最終的な培養隔室へと結合するように、より大きい培養隔室と隣接した第３の培養隔室１８ｃとの間の脆弱な溶接継ぎ目を、脆弱な溶接継ぎ目に対して基本的に垂直な方向に、頂壁フィルムと底壁フィルムを脆弱な溶接継ぎ目にわたって引き離すことによって壊すステップ。ステップｄ）および／またはｆ）において引っ張る方向４４は、たとえば脆弱な溶接継ぎ目の長手方向軸４６（継ぎ目が湾曲している場合には局部的な長手方向軸）に対して７５〜９０度または８０〜９０度など、６０〜９０度の角度αであり得る。たとえば４つまたは５つといったより多くの培養隔室を１つの最終的な培養隔室へと接合することも、もちろん可能である。
【００３５】
ｇ）  最終的な培養隔室の中で細胞を培養するステップ。
【００３６】
培養隔室の中の培養は、当技術分野において周知の、たとえばＶ  Ｓｉｎｇｈ：  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（１〜３）、１４９〜１５８頁（１９９９年）、またはＣｌｉｎｃｋｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、２０１３年、２９巻、Ｎｏ．  ３に説明されている方法を使用すれば可能である。ガス入口を通して空気または他のガスが供給されてよく、過剰な空気／ガスは、ガス状の代謝生成物（たとえば二酸化炭素）とともにガス出口を通って放出され得る。第１の隔室における培養は、たとえば１．０×１０５、２．０×１０５、５．０×１０５または１．０×１０６の生細胞／ｍｌといった所定の生細胞密度（ＶＣＤ）が達成されるまで続けられてよい。所定のＶＣＤが達成されたとき、ステップｄ）およびさらなるステップが開始され得る。上記で論じられたように、ＶＣＤはインラインセンサで測定され得、または、たとえば細胞の生存染色キットを用い、Ｃｙｔｅｌｌ（商標）細胞画像化システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してオフラインまたはアットラインで測定され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ステップｇ）および／またはｅ）は、灌流モード、すなわち、培養液の少なくとも一部分をフィルタへ運搬し、濾液を除去してから細胞を培養液へ戻し、除去された濾液を新規の培養基と交換するモードによって行われてよい。これによってＶＣＤのさらなる増加が可能になる。
【００３８】
ステップａ）において、バッグは以前に論じられたような可撓性プラスチックバッグ１でよく、その場合には、ステップｄ）は、頂壁フィルムおよび底壁フィルム上の脆弱な溶接継ぎ目に隣接した把持手段２０を引き離すステップを含み得る。あるいは、バッグが有し得る１つまたは複数の脆弱な溶接継ぎ目が、頂壁フィルムの内側と底壁フィルムの内側を接合して容積を複数の培養隔室に分割し、頂フィルムおよび底フィルムの一方または両方に特定の把持手段はない。この場合、ステップｄ）は、１つまたは複数の真空吸引カップ、吸着床、粘着性プレート（たとえば両面テープで覆われたプレート）を用いて頂フィルムおよび／または底フィルムをつかむステップを包含することができ、または頂フィルムと底フィルムを引き離すステップに類似である。
【００３９】
ステップｃ）は、センサ５０で細胞培養液の特性を測定して、この特性が所定の値を達成したときステップｄ）を開始するステップを含み得る。適切には、この特性は細胞培養液の生細胞密度であり得る。この場合、バイオリアクタが備え得る制御ユニット６６（たとえばコンピュータまたはＰＬＣ）が、センサ５０および継ぎ目オープナ５６に接続されており、所定の値が達成されたかどうかを判定するようにプログラムされ、継ぎ目オープナを活性化してステップｄ）を実行させるように配置されている（図１１）。
【００４０】
この記述は、最善のモードを含めて本発明を開示するため、また、あらゆる当業者が、あらゆるデバイスまたはシステムを作製したり使用したりすること、およびあらゆる組み込まれた方法を実行することを含めて本発明を実施することを可能にするために、実例を使用している。本発明の特許の範囲は特許請求の範囲によって定義され、当業者に思い浮かぶ他の実例を含み得る。他のそのような実例は、特許請求の範囲の文字どおりの言語と異ならない構造要素を有する場合、または特許請求の範囲の文字どおりの言語との実体のない相違を有する等価構造要素を含んでいる場合には、特許請求の範囲に含まれるように意図されている。本文において言及されたすべての特許および特許出願は、全体が、参照によって、あたかも個々に組み込まれるかのように本明細書に組み込まれる。
【符号の説明】
【００４１】
１  可撓性プラスチックバッグ
２  頂壁フィルム
４  底壁フィルム
８  バッグの容積
１２  丈夫な溶接継ぎ目
１４  ポート
１６  脆弱な溶接継ぎ目
１８  培養隔室
１８ａ  第１の培養隔室
１８ｂ  第２の培養隔室
１８ｃ  第３の培養隔室
１８ｄ  第４の培養隔室
２０  把持手段
２２  フィルムのループ
２４  フィルムのタブ
２６  把持取っ手
２８  粘着テープ
３０  つかめる面
３２  ポート
３４  チューブ
３６  ポート
３８  フィルムの折り目
４０  脆弱な溶接継ぎ目１６の片側
４２  脆弱な溶接継ぎ目１６の片側
４４  継ぎ目の長手方向軸４６に対して基本的に垂直な方向
４６  継ぎ目の長手方向軸
４８  小さい領域
５０  センサ
５１  剛体のロッド
５２  動く／揺動するテーブル
５４  軸
５５  支持体
５６  機械的継ぎ目オープナ
５８  片持ち梁
６０  アクチュエータ
６２  オーバーヘッドビーム
６４  アクチュエータ
６６  制御ユニット
【図１】
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【図２ａ）】
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【図２ｂ）】
2022501022.tif 000005
【図２ｃ）】
2022501022.tif 000006
【図３ａ）】
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【図３ｂ）】
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【図４】
2022501022.tif 000009
【図５】
2022501022.tif 000010
【図６】
2022501022.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
2022501022.tif 000014
【図１０】
2022501022.tif 000015
【図１１ａ）】
2022501022.tif 000016
【図１１ｂ）】
2022501022.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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