【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月8日(2010.9.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  (ａ)  サンプルを、電気化学ルミネセンス標識を含み、そして相補的な第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子と混合し、
(ｂ)  工程（ａ）からのサンプルとハイブリダイズした核酸または核酸分子とを、サンプル中に存在するヘリカーゼが第一および第二の核酸または核酸分子を解離できる条件下にインキュベートし、
(ｃ)  解離した第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで
(ｄ)  捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測定すること
からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を検出する電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項２】  ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである請求項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項３】  病原体ヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである請求項２記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項４】  工程（ｂ）と（ｃ）の間に、
(ｉ)  解離した核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子と、第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートし、
(ii)  工程（ｉ）からのハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体とともにインキュベートすること
からなる請求項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項５】  捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである請求項４記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項６】  捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項４記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項７】  捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである請求項６記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項８】  電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである請求項１記載の電気化学ルミネセンスアッセイ法。
【請求項９】  (ａ)  サンプルをヘリカーゼ、および電気化学ルミネセンス標識を含み、そして相補的な第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または
核酸分子と混合して混合物を形成させ、
(ｂ)  工程（ａ）からの混合物を、ヘリカーゼがサンプルの不存在下に第一および第二の核酸または核酸分子を解離できる条件下にインキュベートし、
(ｃ)  解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで
(ｄ)  捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測定すること
からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を調節する物質を検出する方法。
【請求項１０】  物質はヘリカーゼ活性のインヒビターである請求項９記載の方法。
【請求項１１】  ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである請求項９記載の方法。
【請求項１２】  病原体ヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】  工程（ｂ）と（ｃ）の間に
(ｉ)  解離した核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子と、第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートし、
(ii)  工程（ｉ）からのハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体とともにインキュベートすること
からなる請求項９記載の方法。
【請求項１４】  捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】  捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項１３記載の方法。
【請求項１６】  捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】  電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである請求項９記載の方法。
【請求項１８】  （ａ）電気化学ルミネセンス標識を含む第一の核酸または核酸分子、（ｂ）第一の核酸または核酸分子に相補的な第二の核酸または核酸分子および（ｃ）ヘリカーゼからなる、ヘリカーゼ活性の電気化学ルミネセンスによる検出のためのキット。
【請求項１９】  第一の核酸または核酸分子は第二の核酸または核酸分子にハイブリダイズする請求項１８記載のキット。
【請求項２０】  さらに第一の核酸または核酸分子に相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子から構成される請求項１８記載のキット。
【請求項２１】  さらに捕獲受容体を含む請求項２０記載のキット。
【請求項２２】  捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にある請求項２１記載のキット。
【請求項２３】  捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである請求項２２記載のキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
したがって第一の実施態様においては、本発明は
(ａ) サンプルを、電気化学ルミネセンス標識を含み、そして相補的な第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子と混合し、
(ｂ) 工程（ａ）からのサンプルとハイブリダイズした核酸または核酸分子とサンプル中に存在するヘリカーゼが第一および第二の核酸または核酸分子を解離する条件下にインキュベートし、
(ｃ) 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで
(ｄ) 捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測定すること
からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を検出する電気化学ルミネセンスアッセイ法を提供する。
ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである。好ましくはヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲するためには任意の方法が採用される。好ましい一連の工程においては、上記工程（ｂ）と（ｃ）の間に、解離された第一の核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子と第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートする。ついで、ハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体によって捕獲する。捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にあってもよい。好ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである。好ましい電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
他の実施態様においては、本発明は、
(ａ) サンプルを、ヘリカーゼおよび電気化学ルミネセンス標識を含み、そして相補的な第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子と混合して混合物を形成させ、
(ｂ) 工程（ａ）からの混合物を、ヘリカーゼがサンプルの不存在下に第一および第二の核酸または核酸分子を解離できる条件下にインキュベートし、
(ｃ) 解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲し、ついで
(ｄ) 捕獲された第一の核酸または核酸分子からの電気化学ルミネセンスを測定すること
からなるサンプル中のヘリカーゼ活性を調節する物質を検出する方法を提供する。
好ましい実施態様においては、物質はヘリカーゼ活性のインヒビターである。ヘリカーゼはヒトヘリカーゼまたは病原体ヘリカーゼである。好ましくは、ヘリカーゼは真菌、ウイルス、細菌または寄生体のヘリカーゼである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲するためには任意の方法が採用される。好ましい一連の工程においては、上記工程（ｂ）と（ｃ）の間に、解離された核酸または核酸分子を、第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子と第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートする。ついでハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体によって捕獲する。捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にあってもよい。好ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである。好ましい電気化学ルミネセンス標識はルテニウムキレートである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
さらに他の実施態様においては、本発明はヘリカーゼ活性の電気化学ルミネセンス検出のためのキットを提供する。このようなキットは、
(ａ) 電気化学ルミネセンス標識を含む第一の核酸または核酸分子、
(ｂ) 第一の核酸または核酸分子に相補的な第二の核酸または核酸分子および
(ｃ) 電気化学ルミネセンス検出を促進するのに適当なヘリカーゼおよび／または磁性ビーズからなる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
一態様においては、第一の核酸または核酸分子は既に第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズしている。本発明によるキットはさらに、第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子からなる。このような環境下には、キットは一般に捕獲リガンドを結合できる捕獲受容体を包含する。好ましい実施態様においては、捕獲受容体は磁性ビーズの表面上にあってもよい。好ましい実施態様においては、捕獲リガンドはビオチンであり、捕獲受容体はアビジンである。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
［図面の簡単な説明］
図１：大腸菌ＤnaＢヘリカーゼ活性の放射分析法による定量。
６０bpオリゴヌクレオチドを３′末端において32Ｐで標識した。ついで相補的な６０bpオリゴヌクレオチドを標識ヌクレオチドとハイブリダイズさせた。指示した様々な量のＤnaＢヘリカーゼを加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、サンプルをＰＡＧＥゲル上で分離し、オートラジオグラフィーで検出した。レーン８は煮沸サンプルを含有し、ssＤＮＡおよび dsＤＮＡの分離を示す。レーン９は標識 ssＤＮＡのみを含む。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
図４：ＳＰＡアッセイを用いたＤnaＢヘリカーゼ活性の棒グラフ。
図５：Ｅｕ−放射標識オリゴヌクレオチドおよびローダミン標識相補的オリゴヌクレオチドを用いたヘリカーゼ活性の定量のための時間リゾールビング蛍光消光アッセイの模式図。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
ヘリカーゼは広範囲の様々な細胞機能たとえば成長に必要であり、標的疾患は１または２種以上の特異的なヘリカーゼの活性を調節することによる疾患または疾患の進行が阻害される疾患のみに限定される。たとえば標的疾患にはウイルス、細菌および真菌感染、代謝性疾患、遺伝的疾患、細胞の成長および調節機能不全たとえば新生物、炎症、過敏症等が包含される。標的疾患は、植物とくに穀類または動物とくに家畜、愛玩動物およびヒトの疾患であってもよい。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」の語は一般的に、相補的な核酸にハイブリダイズできる少なくとも18ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは32Ｐ−ヌクレオチド（単数または複数）によって標識することが可能で、それにはビオチンまたはルテニウムキレートのような標識が共有結合によって接合されている。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザー上で合成的に調製される。したがって、天然に存在しないホスホエステルアナログの結合たとえばチオエステル結合等を有するオリゴヌクレオチドが製造できる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
「アビジン」には、ビオチンに高い親和性で結合できる任意のタンパク質およびポリペプチドが包含される。ストレプトアビジンがこのようなアビジンの例である。
「ヘリカーゼ」は相補的な核酸または核酸分子の二重鎖を解く（または非ハイブリダイズする）能力を有する任意のタンパク質またはポリペプチドである。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
ヘリカーゼアッセイ
本発明によって特定される方法は、電気化学ルミネセンス標識を含み、そして相補的な第二の核酸または核酸分子とハイブリダイズする第一の核酸または核酸分子の混合物の形成を包含する。ハイブリダイズした第一および第二の核酸または核酸分子は、標的化されるヘリカーゼに依存して、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、線状または環状である。さらに、他の核酸もしくは核酸分子または構造類縁体も、それらが標的化ヘリカーゼ活性に対する活性な基質を提供する限り置換できる。核酸または核酸分子はアッセイ条件および要求に服する任意の長さとすることができる。たとえば、ヘリカーゼ基質特異性を保証し、非特異的な再生を最小限にするためには、第一および第二の核酸または核酸分子間に最小の相補性領域、通常は少なくとも約12，さらに通常には少なくとも約18，好ましくは約24の連続した塩基対が要求される。鎖の間にはサイズの差があってもよい。サイズはアッセイを容易にし、統計的に有意な結果を提供するように選択され、多くの場合、サイズは少なくとも１または２以上のオーダーの大きさで異なる。一般的に至適な長さは経験的に容易に決定することができる。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
核酸または核酸分子は、標的化ヘリカーゼ（単数または複数）に対して慣用の基質を提供する任意の配列とすることができる。核酸または核酸分子は少なくとも１種の核酸または核酸分子の全体の長さにわたって相補的であるか、または相補性領域の非相補性５′および／または３′領域があってもよい。これらの非相補性５′および／または３′領域の導入はある種のヘリカーゼの良好な基質を生成する分子フォークを提供する。一般に慣用の複製ベクター（たとえばファージまたはその制限フラグメント）は核酸または核酸分子の安価なソースを提供する。アッセイは一般にＤＮＡ結合タンパク質たとえばヒストンの存在に適合する。可能性のある様々な基質、たとえば様々なサイズ、配列、タンパク質複合性を有する二重鎖核酸を包含することは、基質感受性ヘリカーゼの検出の可能性を改良するために有利なことが多い。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
第一の核酸または核酸分子は検出可能な電気化学ルミネセンス標識を含む。電気化学ルミネセンスは電極に低電圧を適用した場合に発生する光であり、この際、標識の環化的酸化および還元反応が誘発される。このような環化的酸化／還元反応および光の発生が可能な任意の電気化学ルミネセンス標識が、本発明により使用できる。好ましい標識はトリス-(ビピリジン）のキレートに結合したルテニウム金属イオンである。ＤＮＡに対する特異的な電気化学ルミネセンス標識が開発されていて（Kentenら, 1991, Clin.Chem. 37: 1626; Kentonら, 1992, Clin. Chem. 38: 873; Origen(登録商標), Origen(登録商標)ホスホロアミダイトおよびＴＡＧホスホロアミダイト，IGEN Inc, Rockville, MD）、本発明に最も好ましい。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
本発明の方法では、本発明のアッセイ中に存在するヘリカーゼ活性により産生され解離した第一の核酸または核酸分子を捕獲する必要がある。解離された第一の核酸または核酸分子を捕獲するためには、任意の方法が採用される。好ましい一連の工程においては、解離された第一または第二の核酸または核酸分子を第一の核酸または核酸分子と相補的であり、そして捕獲リガンドを含む第三の核酸または核酸分子と、第一および第三の核酸または核酸分子がハイブリダイズできる条件下にインキュベートする。ついでハイブリダイズした第一および第三の核酸または核酸分子を捕獲リガンドと結合する捕獲受容体によって捕獲する。捕獲受容体は直接、電気化学ルミネセンス検出を促進するために磁性ビーズの表面上にあってもよい。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
本発明はとくに、ヘリカーゼ活性、とくにその阻害活性を調節する能力がある候補物質をスクリーニングするために適している。本発明は、候補物質のライブラリーの高いスループットでの薬物スクリーニングに適している。ライブラリー由来の候補物質には多くの化学的クラスが包含されるが、典型的にはそれらは有機化合物、好ましくは小有機化合物である。ライブラリーは合成および／または天然由来の化合物から構成される。たとえば、多くの方法が広範囲の有機化合物および生物分子のランダムなおよび指示された合成に、たとえばランダムなオリゴヌクレオチドの発現に利用される。また、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の型での天然の化合物のライブラリーも利用可能であり、容易に製造される。さらに、天然のおよび合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。加えて、既知の薬理学的物質は指示されたまたはランダムな化学修飾たとえばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等に付し、構造的な類縁体を製造することができる。物質は標準系列希釈標（standard serial dilution）または既知のモジュレーターからの類推によって決定された量で提供される。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
実施例１：旧来のヘリカーゼアッセイ
６０bpオリゴヌクレオチド（5′−TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA
GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配列番号：１）をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐで標識し、相補的な非標識６０bpオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした基質および様々な量のＤnaＢヘリカーゼ（Reha-Krantzら, J. Biol. Chem. 253 (1978): 4043-4050; LeBowitzら, J. Biol. Chem. 261 (1986): 4738-4748）を、アッセイ緩衝液（４００mM Ｈepes pH７.４, ５mM ＤＤＴ，２mg／mLのＢＳＡ,１２.５mM ＭｇＣｌ2 および６.２５mM ＡＴＰ）中に混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。０.５mM ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、ついで各反応液に２.５mgのプロテイナーゼＫを加えてＤnaＢヘリカーゼに結合した残ったオリゴヌクレオチドがあれば放出させた。ついでサンプルを１５％ＴＢＥゲルに通した。ＤＮＡ一本鎖および二重鎖をオートラジオグラフィーで識別した。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
ＳＰＡヘリカーゼアッセイキットは Amersham Life Science から購入した。アッセイは提供された指示書を以下に記載のようにわずかに改変して実施した。[3Ｈ] 標識オリゴヌクレオチドをＭ13一本鎖ＤＮＡ（Ｍ13ssＤＮＡ）鋳型にアニーリングさせて部分二重鎖基質を形成させる。ＤnaＢヘリカーゼおよび二重鎖基質をアッセイ緩衝液中に混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させる。ビオチン化された相補的オリゴヌクレオチドを、ついでＭ13ssＤＮＡから放出された放射標識オリゴヌクレオチドにアニーリングさせる。複合体は室温で１５分間インキュベートして、ストレプトアビジンでコートしたＳＰＡビーズにより捕獲し、放射性シグナルをカウントする。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
ＤnaＢヘリカーゼの滴定（図３）により至適な活性は０.１６μgのＤnaＢヘリカーゼによって得られることが指示される。０.１６μg未満のＤnaＢヘリカーゼを用いた場合はヘリカーゼ活性は低下し、二重鎖ＤＮＡを解くのに十分なヘリカーゼがないことが示唆される。しかしながら、０.１６μgを越えるＤnaＢヘリカーゼを各反応に使用しても、ヘリカーゼ活性は低下する。これは過剰なヘリカーゼが二重鎖ＤＮＡ基質から放出される一本鎖ＤＮＡに非特異的に結合して、これらの一本鎖ＤＮＡ産物の結合から、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドを防止することから生じると考えられる。至適アッセイ条件下には、このアッセイの最良のシグナル対ノイズは約１０倍である（図４）。煮沸変性した二重鎖基質から放出される産物より発生するシグナルによって測定すると、ＤnaＢヘリカーゼの活性は可能な最大活性の95％である。この方法は迅速であり、多数のサンプルを測定できる可能性を提供するが、高価なことおよび有意な放射性廃物の発生という欠点がある。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
実施例４：電気化学ルミネセンスヘリカーゼアッセイ
電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）ヘリカーゼアッセイは図７に示す。短いオリゴヌクレオチドをルテニウム金属キレートで標識し、Ｍ13一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせる。ヘリカーゼを添加すると標識オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡから解けて、ビオチンで標識した第二の相補的オリゴヌクレオチドへのアニーリングに使用できる。得られた複合体はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズにより捕獲される。ビーズ／複合体をフローセルを通して流し、磁場によって電極に捕獲させる。電極に電圧を適用し、ルテニウム標識に由来するＥＣＬシグナルを、電気化学ルミネセンス検出計たとえば Origen 分析計（IGEN Inc, Rockville, MD）を用いて測定する。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
６０bpオリゴヌクレオチド（5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配列番号：４）または３０bpオリゴヌクレオチド（5′-GTT AAA GGC CGC TTT TGC GGG ATC GTC ACC-3′；配列番号：５）をその５′末端でルテニウムで標識し（Kentenら, Clin.Chem. 1992, 38:873-879）、ＴＥ緩衝液（10ｍＭ Ｔris ＨＣｌ, １mM ＥＤＴＡ，pH７.４）に最終保存濃度２５pmole／μLで再懸濁
する。Ｍ13mp18ssＤＮＡを０.１８pmole／mLの濃度でＴＥ緩衝液に溶解する。等濃度のＭ13mp18ssＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション緩衝液（１０mM Ｔris ＨＣｌ, ０.３mMＮａＣｌ，３０mM クエン酸Ｎａ，pH８.５）中に混合する。この溶液を次に１００℃で２分間インキュベートし室温に冷却する。二重鎖基質（３０または６０オリゴヌクレオチドとアニーリングしたＭ13ssＤＮＡ）２５fmoleを大腸菌ＤnaＢヘリカーゼ２５ngをアッセイ緩衝液（４０mM Ｈepes pH７.４, ０.５mM ＤＴＴ，０.２mg／ml ＢＳＡ，８mM ＭｇＣｌ2 , ５mM ＡＴＰ）中に混合する。反応混合物を３７℃、４５分間インキュベートする。この反応液に０.５Ｍ ＥＤＴＡ中配列番号：４および５に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチド（5′-GGT GAC GAT CCC GCA AAA GCG GCC TTT AAC AGC-3′; 配列番号：６）１２５fmoleを加えて反応液を３７℃で１５分間インキュベートする。ビオチン化は Clontech からの Biotin-ON（登録商標）ホスホロアミデートキット（PT
1402-1）により、キットとともに提供された操作を用いて実施する。配列番号：６内の位置３２におけるアデニンがビオチン標識を受けた。最後に、総容量０.２５mLのＴＥ緩衝液中２０μgのストレプトアビジン磁性ビーズを加え、この溶液を撹拌しながら１５分間インキュベートする。ＥＣＬシグナルは、Origen 分析計（IGEN Inc, Rockville, MD）を用い、製造業者により指示された条件により記録する。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
大腸菌ＤnaＢヘリカーゼ活性の放射分析法による定量を示す。
【図２】
3Ｈ-放射標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを用いるヘリカーゼ活性の定量のためのシンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）の模式図である。
【図３】
様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた3Ｈ-基質の解離を示す。
【図４】
ＳＰＡアッセイを用いたＤnaＢヘリカーゼ活性の棒グラフである。
【図５】
Ｅｕ−放射標識オリゴヌクレオチドおよびローダミン標識相補的オリゴヌクレオチドを用いたヘリカーゼ活性の定量のための時間リゾールビング蛍光消光アッセイの模式図である。
【図６】
様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いたハイブリダイズ基質の解離を示す。
【図７】
ルテニウム標識オリゴヌクレオチドおよびＭ13ssＤＮＡを使用するヘリカーゼ活性の定量のための電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）アッセイの模式図である。
【図８】
様々な量のＤnaＢヘリカーゼを用いた未解離二重鎖基質により発生した電気化学ルミネセンスシグナルを示す。