(57)【要約】本発明は、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含むハイブリッドキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにその使用方法を対象とする。方法は、対象において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減し、抗腫瘍活性を増加させ、かつがんを処置するための、使用を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、ＡＯＮ。
【請求項２】
少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、前記ＡＯＮが２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである、請求項１に記載のＡＯＮ。
【請求項３】
前記２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドが、式１〜１６のいずれかにしたがって配置されている、請求項２に記載のＡＯＮ。
【請求項４】
前記２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドが、式６にしたがって配置されている、請求項３に記載のＡＯＮ。
【請求項５】
前記２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結が、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合（５’Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−３Ｏ−、５’Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’−Ｏ−、および５’Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’Ｓ−）、ホスホロジチオエート結合、Ｒｐ−ホスホロチオエート結合、Ｓｐ−ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−５’および３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−５’）、メチルホスホネート結合、３’−チオホルムアセタール結合、（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）、アミド結合（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’）、ホスホロアミデート基、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載のＡＯＮ。
【請求項６】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、
約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド
を含む、請求項２に記載のＡＯＮ。
【請求項７】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項３に記載のＡＯＮ。
【請求項８】
少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、医薬組成物。
【請求項９】
前記ＡＯＮが、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、かつ前記ＡＯＮが２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、
約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド
を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞においてＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
前記細胞を、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と接触させる工程を含み、
前記ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつ
前記ＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含み、
それにより、Ｆｏｘｐ３の発現レベルを低減する、方法。
【請求項１３】
前記細胞が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔｒｅｇが細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＯＮが、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、かつ前記ＡＯＮが２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
それを必要とする対象において抗腫瘍免疫を増加させる方法であって、
前記対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、
前記ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつ
前記ＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含み、
それにより、抗腫瘍免疫を増加させる、方法。
【請求項１８】
前記ＡＯＮが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔｒｅｇが細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＯＮがＴｒｅｇのアポトーシスを誘導する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＯＮが免疫細胞の活性を増加させ、それにより、抗腫瘍免疫を増加させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫細胞が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＯＮが、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、かつ前記ＡＯＮが２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
前記対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、
前記ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつ
前記ＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含み、
それにより、前記がんを処置する、方法。
【請求項２６】
前記ＡＯＮがＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＯＮが、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、かつ前記ＡＯＮが２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが前記対象において抗腫瘍免疫を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させかつ／または免疫細胞の活性を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＯＮが、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
免疫療法剤および／または化学療法剤を投与する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫療法剤および／または化学療法剤が、チェックポイント阻害剤、ワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブまたはペムブロリズマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫療法剤および／または化学療法剤が、前記ＡＯＮの前記投与の前に、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
放射線療法を施す工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記放射線療法が、前記ＡＯＮの前記投与の前に、前記投与と同時に、または前記投与の後に施される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんが、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、黒色腫、および膠芽腫からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが肺がんである、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２６日に出願された米国特許出願第６２／７３７，０６１号、および２０１８年９月２８日に出願された米国特許出願第６２／７３９，００１号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権の恩典を主張し、両方の内容全体は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
添付の配列表中の資料は、参照により本出願に組み込まれる。ＡＵＭｌｌ９０＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の添付の配列表テキストファイルは、＿＿に作成され、＿＿ｋｂである。ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピューター上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用してアクセス可能である。
【０００３】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金５Ｒ０１ＣＡ１７７８５２および５Ｒ０１ＡＩ１２３２４１の下での政府の支援により為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００４】
発明の分野
本発明は、概して、ハイブリッドキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、より特には、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減し、抗腫瘍活性を増加させ、およびがんを処置するための、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景情報
がんは、著しい罹病率および死亡率に繋がる、抑制のない細胞増殖および転移により特徴付けられる不均一状態である。男性および女性の両方におけるがん関連死の４分の１超が肺がんからのものであり、これは２０１８年に米国において１５４，０５０人であると推定される。肺がんの全てのステージについての現行の５年生存率は、外科的介入、放射線、化学療法、および他の処置の進歩にもかかわらず、１８．６％である。
【０００６】
この高い死亡率の理由の１つは、免疫系による破壊を逃れる腫瘍の能力である。腫瘍内微小環境へのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤の成功はアウトカムを向上させることが示されているが、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）による浸潤は、様々な種類のがんにおいて負の臨床アウトカムと相関することが示されている。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔエフェクター細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および樹状細胞による抗腫瘍活性を活発に抑制する。これは、身体ががん性細胞および／または腫瘍を攻撃することを妨げるため、予後を悪化させる。Ｔｒｅｇの機能および免疫抑制はＦＯＸＰ３に依存性であり、現在これらの細胞を標的とする有効なやり方は存在しない。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯまたはＡＯＮ）と呼ばれる一本鎖合成オリゴヌクレオチドは、核酸治療の１つの手段である。それらは、標的ＲＮＡの配列を認識し、遺伝子サイレンシングを達成することができる。これが起こるいくつかの潜在的な機序があり、その１つは、標的ＲＮＡがＡＯＮに結合した際の標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の切断である。従来のＡＯＮは創薬および前臨床研究において有効であったが、クリニックへのそれらの移行は、標的アクセシビリティ、オフターゲティング効果、乏しい安定性、および標的細胞への乏しい送達を含む多数の課題により行き詰まっている。
【０００８】
殊に肺がんにおいて、Ｔｒｅｇ免疫抑制を低減し、抗腫瘍免疫を促進する、次世代ＡＯＮ化学を使用する新たな治療法に対する満たされていない必要性が現在存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含むハイブリッドキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減し、抗腫瘍活性を増加させ、およびがんを処置するために使用され得るという独創的な発見に基づく。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、ＡＯＮを提供する。
【００１１】
様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドは、式１〜１６のいずれかにしたがって配置されている。一態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドは、式６にしたがって配置されている。ある特定の態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合（５’Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−３Ｏ−、５’Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’−Ｏ−、および５’Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’Ｓ−）、ホスホロジチオエート結合、Ｒｐ−ホスホロチオエート結合、Ｓｐ−ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−５’および３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−５’）、メチルホスホネート結合、３’−チオホルムアセタール結合、（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）、アミド結合（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’）、ホスホロアミデート基、またはこれらの組合せである。
【００１２】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含む。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、医薬組成物を提供する。
【００１４】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含む。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００１５】
追加の実施形態では、本発明は、細胞においてＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、細胞を、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と接触させる工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。
【００１６】
一態様では、細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。様々な態様では、Ｔｒｅｇは細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する。
【００１７】
他の態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において抗腫瘍免疫を増加させる方法であって、対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。
【００１９】
一態様では、ＡＯＮは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させる。一部の態様では、Ｔｒｅｇは細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する。様々な態様では、ＡＯＮはＴｒｅｇのアポトーシスを誘導する。別の態様では、ＡＯＮは免疫細胞の活性を増加させる。ある特定の態様では、免疫細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。
【００２０】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。
【００２２】
様々な態様では、ＡＯＮはＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する。一部の態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００２３】
様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、対象において抗腫瘍免疫を増加させる。一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させかつ／または免疫細胞の活性を増加させる。
【００２４】
ある特定の態様では、ＡＯＮは、薬学的に許容される担体をさらに含む。他の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤がさらに投与される。ある特定の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤は、チェックポイント阻害剤、ワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブもしくはペムブロリズマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、アベルマブ、もしくはデュルバルマブ）、またはこれらの組合せである。他の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤は、ＡＯＮの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。ある特定の態様では、放射線療法がさらに施される。ある特定の態様では、放射線療法は、ＡＯＮの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に施される。
【００２５】
ある特定の態様では、がんは、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、黒色腫、または膠芽腫である。一態様では、がんは肺がんである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】脾臓細胞の細胞集団中のＦｏｘｐ３発現細胞の数を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。スクランブル：対照ＦＡＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド；Ｆｏｘｐ３−１〜９：Ｆｏｘｐ３を標的とする９つの異なるＦＡＮＡオリゴヌクレオチド；２．５ｕＭおよび５ｕＭ：Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡの濃度；フルオロ：陰性対照、細胞の自家蛍光。
【図２】精製されたＴｒｅｇ細胞集団中のＦｏｘｐ３発現細胞の数を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。スクランブル：対照ＦＡＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド；Ｆｏｘｐ３−１〜９：Ｆｏｘｐ３を標的とする９つの異なるＦＡＮＡオリゴヌクレオチド；２．５ｕＭおよび５ｕＭ：Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡの濃度。
【図３】Ｆｏｘｐ３発現細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。
【図４】脾臓、リンパ節、および血液細胞によるＡＰＣ標識ＦＡＮＡのインビボ細胞内取込みを示すフローサイトメトリードットプロットを示す。ＩＶ：静脈内。
【図５】脾臓、リンパ節、および血液の非Ｔｒｅｇ  Ｆｏｘｐ３＋細胞による標識ＦＡＮＡのインビボ細胞内取込みを示すフローサイトメトリードットプロットを示す。ＩＶ：静脈内。
【図６】脾臓、リンパ節、および血液のＴｒｅｇ細胞による標識ＦＡＮＡのインビボ細胞内取込みを示すフローサイトメトリードットプロットを示す。ＩＶ：静脈内。
【図７】Ｆｏｘｐ３発現細胞によるＦＡＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを示す共焦点顕微鏡画像を示す。Ｎ：核、＊：ＦＡＮＡ；矢じり：Ｆｏｘｐ３。
【図８】ウエスタンブロットにより測定されたＦｏｘｐ３のタンパク質発現レベルに対するＦｏｘｐ３−ＦＡＮＡのインビトロ効果を示す。図８ＡはＦｏｘｐ３発現を示すイムノブロットであり、図８ＢはＦｏｘｐ３定量化を示す。
【図９】ウエスタンブロットにより測定されたＦｏｘｐ３のタンパク質発現レベルに対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す。Ｂ６：非処理対照。図９ＡはＦｏｘｐ３発現を示すイムノブロットであり、図９ＢはＦｏｘｐ３定量化を示す。
【図１０】Ｔｒｅｇ免疫抑制アッセイを示すヒストグラムを示す。
【図１１】Ｔｒｅｇ抑制機能に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。＊：対照と比較して有意な差異。
【図１２】ウエスタンブロットにより測定されたＦｏｘｐ３のタンパク質発現レベルに対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す。図１２ＡはＦｏｘｐ３発現を示すイムノブロットであり、図１２ＢはＦｏｘｐ３定量化を示す。
【図１３】腫瘍成長に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す成長曲線を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、マウスにおけるＴＣ１肺腫瘍の成長へのＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６のインビボ効果を示す。図１４Ａは、対照およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）処置マウスにおける腫瘍体積を示す成長曲線を示し、図１４Ｂは、腫瘍成長に対するＦｏｘｐ３  ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）のインビボ効果を示す個々の成長曲線を示し、図１４ＣはＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋細胞の数を示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５】フローサイトメトリーにより測定された腫瘍内Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す。図１５Ａはフローサイトメトリードットプロットを示し、図１５ＢはＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋腫瘍内細胞の定量化を示す。
【図１６】フローサイトメトリーにより測定された脾臓内Ｆｏｘｐ３＋細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す。図１６Ａはフローサイトメトリードットプロットを示し、図１６ＢはＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋脾臓内細胞の定量化を示す。
【図１７】０．１または０．５μＭのＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を用いた処理後のＦｏｘｐ３のインビトロノックダウンを示すイムノブロットを示す。
【図１８】マウス脾臓細胞中のＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの集団に対する９つの異なるＦＡＮＡのインビトロ効果を示すフローサイトメトリードットプロットを示す。２．５または５μＭのＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを使用。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｂは、Ｔｒｅｇ抑制機能に対するＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂのインビトロ効果を示す。図１９Ａは、Ｔｒｅｇ増殖を示すヒストグラムを示し、図１９Ｂは分裂細胞の定量化を示す。
【図１９Ｂ】同上。
【図２０】腫瘍担持マウスの灌流リンパ節におけるＦｏｘｐ３発現に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示すイムノブロットを示す。
【図２１】マウスにおける肺腫瘍成長におけるＦｏｘｐ３  ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）のインビボ効果を示す。図２１Ａは経時的な腫瘍成長を示し、図２１Ｂは、実験の終わりにおける定量化を示すグラフバーである。
【図２２】肺がんのマウスモデルにおける抗腫瘍免疫に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果を示す。ＬＮ：リンパ節；ＳＰ：脾臓、Ｔ：腫瘍。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含むハイブリッドキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減するため、抗腫瘍活性を増加させるため、およびがんを処置するために使用され得るという独創的な発見に基づく。
【００２８】
本発明の組成物および方法を記載する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されず、そのような組成物、方法、および条件は変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される学術用語は特定の実施形態を記載する目的のものに過ぎず、限定的であることは意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されることもまた理解されるべきである。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の参照物を含む。そのため、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本開示を読んだ当業者に明らかとなる本明細書に記載の種類の１つまたは複数の方法、および／またはステップを含む、などである。
【００３０】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個々に指し示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、改変およびバリエーションは本開示の精神および範囲内に包含されることが理解される。好ましい方法および材料がこれより記載される。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、ＡＯＮを提供する。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、修飾糖を含有する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を指す。ＡＯＮは、ワトソン−クリック塩基対合を介して核酸配列を認識し、転写前または後の遺伝子サイレンシングを引き起こす一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＡＯＮはその標的ｍＲＮＡに結合し、ＲＮａｓｅ  Ｈにより認識されるデュプレックスを形成し、そしてそれが、ｍＲＮＡの切断、翻訳機構の立体的遮断、または必要なＲＮＡ相互作用の防止を誘導する。
【００３４】
糖修飾オリゴヌクレオチドは当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第８，１７８，３４８号、ならびに米国特許出願第２００５／０２３３４５５号、同第２００９／０１５４６７号、および同２００５／０１４２５３５号を参照）。これらのヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列とデュプレックスを形成し、そのため遺伝子発現を阻害することができる。いくつかの種類のアナログが記載されてきており、ＲＮａｓｅＨがそれに対して強い親和性を有するより安定な複合体を形成して、より効率的な遺伝子サイレンシングを結果としてもたらすことができる臨床的に関連する分子を設計することを目的として、アナログでは、酵素安定性、デュプレックス形成能力、またはＲＮａｓｅＨ動員のモジュレートの方策として、例えば、糖、糖骨格、またはヌクレオチド間連結における変化が評価された。
【００３５】
アナログのうち、それらをＲＮａｓｅＨに対してより好適な基質とするためにホスホジエステルおよびホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｔａｔｅ）オリゴヌクレオチドを含む混合骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）；ペントフラノース（ｐｅｎｔｏｆｕｒａｓｅ）の代わりにヘキソピラノースを含有するオリゴヌクレオチド、例えば、非環式骨格を含み、概して、増加した酵素安定性を有するが低減したデュプレックス形成能力を有する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ならびに本明細書において使用され、本明細書においてさらに後述されるようなアラビノヌクレオシドが記載され、合成されてきた。
【００３６】
追加的に、非修飾ヌクレオシドと交互の修飾ヌクレオシドを含むキメラオリゴヌクレオチドもまた記載されており、細胞および生物における遺伝子発現に対するそれらの強い影響力について公知である。
【００３７】
リボース糖部分、ホスホジエステル骨格、および塩基の修飾を含む、ヌクレオチド安定性を向上させるための化学的戦略が公知である。特に、ホスホジエステル骨格は多くの場合にホスホロチオエート（ＰＳ）骨格で置き換えられる。ＰＳ骨格は、骨格中の非ブリッジ形成原子の１つが硫黄で置き換えられた場合に作られる。例えば、リボース糖の２’位に対して為された修飾は、本明細書において使用されるような２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ）修飾ヌクレオチドなどのアラビノヌクレオシドを結果としてもたらす。
【００３８】
フォークヘッドボックスＰ３またはスクルフィン（ｓｃｕｒｆｉｎ）としても公知のＦｏｘｐ３は、免疫系応答に関与するタンパク質である。ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーとして、Ｆｏｘｐ３は、制御性Ｔ細胞の発生および機能における調節経路のマスター調節因子として機能するようである。詳細な制御機序は未だ確立されていないが、ＦＯＸタンパク質は転写調節因子のフォークヘッド／ウイングド−ヘリックスファミリーに属し、転写の間の類似したＤＮＡ結合相互作用を介して制御を発揮することが推定されている。制御性Ｔ細胞モデルシステムにおいて、ＦＯＸＰ３転写因子は、制御性Ｔ細胞機能に関与する遺伝子のためのプロモーターを占有し、Ｔ細胞受容体の刺激後に鍵となる遺伝子の転写を抑止し得る。
【００３９】
Ｆｏｘｐ３は、ＣＤ２５またはＣＤ４５ＲＢなどの他のより低い特異性のマーカーによっても同定される、Ｔ細胞および適応／誘導性制御性Ｔ細胞（ａ／ｉＴｒｅｇ）の系列である天然制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の特異的なマーカーである。動物研究において、Ｆｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇは、免疫寛容、殊に自己寛容の伝達において不可欠である。
【００４０】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本発明の修飾ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、修飾ＡＯＮは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明の修飾ＡＯＮは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドを含む。
【００４２】
「天然に存在するヌクレオチド」または「非修飾ヌクレオチド」は、通常存在する糖（Ｄ−リボースおよびＤ−２−デオキシリボース）ならびにヌクレアーゼによって容易に分解されるホスホジエステル骨格を含有する。本明細書において使用される場合、非修飾ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドと称される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「２’−ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ」または「２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮ」、または「Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡ」などは、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡの部分を標的とするＡＯＮを指す。２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現の部分を標的とするように設計される。２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、アンチセンスオリゴヌクレオチドへの少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの組込みの結果としてもたらされる。本明細書に記載の修飾合成オリゴヌクレオチドは、２’−ＦＡＮＡ修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、そのため２’−ＦＡＮＡオリゴヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮまたは２’−ＦＡＮＡ  ＡＳＯ）である。これらの修飾合成オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格を含むことができる。それらはまた、本開示において後に考察される他の骨格修飾を含むことができる。２’−ＦＡＮＡヌクレオチドの組込みは、高い安定性、特異性、および標的に対する親和性を付与する。２’−ＦＡＮＡ  ＡＳＯはまた、自己送達が可能であり、それにより送達剤の必要性が無くなる。送達剤の欠如は、様々なモデルにおいて毒性を低減する。そのため、一部の実施形態では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮの少なくとも部分は、Ｆｏｘｐ３遺伝子に対応するｍＲＮＡ配列の部分に相補的である。２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡの全体または部分を標的としてそれに結合するように設計されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の実施形態による２’−ＦＡＮＡ修飾配列を含む合成ＡＯＮは、Ｆｏｘｐ３の発現を阻害する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の２’ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮは、ｍＲＮＡの部分に結合してＲＮａｓｅ  Ｈによる切断を誘発することによりＦｏｘｐ３細胞の発現を阻害する。
【００４４】
２’ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの化学および構築は、他の場所において詳細に記載されている（例えば、それぞれが参照により本明細書に具体的に全体が組み込まれる米国特許第８，２７８，１０３号および同第９，９０２，９５３号を参照）。本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮおよびそれらを使用する方法は、当該技術分野において公知の任意のＦＡＮＡ化学を想定する。一部の実施形態では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ホスフェートを含むヌクレオシド間連結を含み、それにより、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、糖修飾ヌクレオシドおよび／または２’−デオキシヌクレオシドは、ホスフェートを含み、それにより、糖修飾ヌクレオチドおよび／または２’−デオキシヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ホスホロチオエートを含むヌクレオシド間連結を含む。一部の実施形態では、ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホロチオエート、Ｒｐ−ホスホロチオエート、Ｓｐ−ホスホロチオエートから選択される。一部の実施形態では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、（ａ）ホスホジエステル、（ｂ）ホスホトリエステル、（ｃ）ホスホロチオエート、（ｄ）ホスホロジチオエート、（ｅ）Ｒｐ−ホスホロチオエート、（ｆ）Ｓｐ−ホスホロチオエート、（ｇ）ボラノホスフェート、（ｈ）メチレン（メチルイミノ）（３’ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ５’）、（ｉ）３’−チオホルムアセタール（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）、（ｊ）アミド（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’）、（ｋ）メチルホスホネート、（ｌ）ホスホロアミデート（３’−ＯＰ（Ｏ２）−Ｎ５’）、および（ｍ）（ａ）〜（ｌ）の任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のヌクレオチド間連結を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、糖修飾ヌクレオチド（例えば、アラビノヌクレオチドアナログ［例えば、２’−ＦＡＮＡ］）および２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の交互のセグメントまたは単位を含む２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが利用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、糖修飾ヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドセグメントのそれぞれを少なくとも２つ含み、それにより、全体として少なくとも４つの交互のセグメントを有する。各交互のセグメントまたは単位は、独立して、１つまたは複数のヌクレオチドを含有してもよい。一部の実施形態では、各交互のセグメントまたは単位は、独立して、１または２つのヌクレオチドを含有してもよい。一部の実施形態では、セグメントはそれぞれ１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、セグメントはそれぞれ２つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のヌクレオチドは、２、３、４、５または６つのヌクレオチドからなるものであってもよい。２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、奇数または偶数の交互のセグメントまたは単位を含有してもよく、糖修飾ヌクレオチド残基またはＤＮＡ残基を含有するセグメントで開始および／または終了してもよい。そのため、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、以下：
Ａ１−Ｄ１−Ａ２−Ｄ２−Ａ３−Ｄ３  ．．．  Ａｚ−Ｄｚ
のように表されてもよく、ここで、Ａ１、Ａ２などのそれぞれは、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）の糖修飾ヌクレオチド残基（例えば、２’−ＦＡＮＡ）の単位を表し、Ｄ１、Ｄ２などのそれぞれは、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）のＤＮＡ残基の単位を表す。各単位内の残基の数は、同じであるか、または単位毎に可変であってもよい。オリゴヌクレオチドは、奇数または偶数の単位を有してもよい。オリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド含有単位（例えば、２’−ＦＡＮＡ含有単位）またはＤＮＡ含有単位のいずれかで開始（すなわち、その５’末端にある）してもよい。オリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド含有単位またはＤＮＡ含有単位のいずれかで終了（すなわち、その３’末端にある）してもよい。単位の総数は、わずか４（すなわち、各種類について少なくとも２つ）であってもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、アラビノヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドの交互のセグメントまたは単位を含み、セグメントまたは単位は、それぞれ独立して、少なくとも１つのアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、セグメントは、それぞれ独立して、１〜２個のアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、セグメントは、それぞれ独立して、２〜５または３〜４個のアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、アラビノヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドの交互のセグメントまたは単位を含み、セグメントまたは単位はそれぞれ、１つのアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、セグメントは、それぞれ独立して、約３つのアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、アラビノヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドの交互のセグメントまたは単位を含み、セグメントまたは単位はそれぞれ、１つのアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、アラビノヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドの交互のセグメントまたは単位を含み、前記セグメントまたは単位はそれぞれ、２つのアラビノヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドをそれぞれ含む。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、
ａ）（Ａｘ−Ｄｙ）ｎ                          Ｉ
ｂ）（Ｄｙ−Ａｘ）ｎ                          ＩＩ
ｃ）（Ａｘ−Ｄｙ）ｍ−Ａｘ−Ｄｙ−Ａｘ        ＩＩＩ
ｄ）（Ｄｙ−Ａｘ）ｍ−Ｄｙ−Ａｘ−Ｄｙ        ＩＶ
からなる群から選択される構造を有し、ここで、ｍ、ｘおよびｙのそれぞれは、それぞれ独立して、１以上の整数であり、ｎは、２以上の数であり、Ａは糖修飾ヌクレオチドであり、Ｄは２’−デオキシリボヌクレオチドである。
【００４８】
例えば、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝１、ｙ＝１およびｎ＝１０である構造Ｉを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000002
を有する。
【００４９】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝１、ｙ＝１およびｎ＝１０である構造ＩＩを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000003
を有する。
【００５０】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝１、ｙ＝１およびｎ＝９である構造ＩＩＩを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000004
を有する。
【００５１】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝１、ｙ＝１およびｎ＝９である構造ＩＶを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000005
を有する。
【００５２】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝２、ｙ＝２およびｎ＝５である構造Ｉを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000006
を有する。
【００５３】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝２、ｙ＝２およびｎ＝５である構造ＩＩを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000007
を有する。
【００５４】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝２、ｙ＝２およびｍ＝４である構造ＩＩＩを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000008
を有する。
【００５５】
別の例では、本明細書に開示される２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ｘ＝２、ｙ＝２およびｍ＝４である構造ＩＶを有し、それにより、構造：
2022502062.tif 000009
を有する。
【００５６】
様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドは、式１〜１６のいずれかにしたがって配置されている。一態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドは、式６にしたがって配置されている。
【００５７】
修飾２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮ配列は、配列中のヌクレオチドの全てについてまたは部分のみについて修飾糖部分を含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＯＮは、配列中の全てで修飾糖部分ヌクレオチドを有してもよい。一部の実施形態では、ＡＯＮは、１〜６０ヌクレオチドの長さであってもよい。一部の実施形態では、ＡＯＮは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０より多くの非修飾ヌクレオチドを有してもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非修飾ヌクレオチドは、修飾糖部分を有するヌクレオチドのストリングの間でＡＯＮ中に位置する。例えば、修飾ＡＯＮは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはより多くの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドのストリング、続いて少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはより多くの非修飾ヌクレオチドのストリング、続いて少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはより多くの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの別のストリングを有してもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが２’ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドにより隣接される場合、非修飾ヌクレオチドセクションは「ヌクレオチドギャップ配列」と称され得る。ギャップ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０より多くの非修飾ヌクレオチドからなるものであってもよい。一部の実施形態では、ＡＯＮは、単一のギャップ配列を有してもよく、または同じ分子中に複数のヌクレオチドギャップ配列を有してもよい。非修飾ヌクレオチドギャップ配列の各側における２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドのストリングは、同じまたは異なる長さであり得る。例えば、ＡＯＮは、８つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド、続いて７つの非修飾ヌクレオチド、続いて２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの数が第１の修飾ストリングと同じまたは異なる２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの第２のストリングを有してもよい。ある特定の実施形態では、ＡＯＮは、非修飾ヌクレオチドのギャップ配列に隣接している２’−ＦＡＮＡ糖修飾ヌクレオチド配列からなる。例えば、ＡＯＮは、１〜１０ヌクレオチドの長さの２’−ＦＡＮＡ修飾配列、次に１〜１０ヌクレオチドの長さの非修飾ヌクレオチド配列、続いて１〜１０ヌクレオチドの長さの別の２’−ＦＡＮＡ修飾配列を含み、修飾および非修飾ヌクレオチドのこのパターンが任意選択的に繰り返される。表１は、２１の長さのオリゴヌクレオチド中の非修飾ヌクレオチドおよび２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの例示的な配置を示す。
【００５９】
（表１）２１−ｍｅｒ  ２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮ内の例示的な２’−ＦＡＮＡヌクレオシドの配置
2022502062.tif 000010
【００６０】
表１に示される式は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、３１〜１３８、１１〜１９  １３９〜１９２に示される任意の配列、またはその部分に適用されてもよく、式中、Ｘは、ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）を表し、太字かつ下線を引いたヌクレオチドは２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドを表す。
【００６１】
ある特定の態様では、２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロチオエート結合（５’Ｏ−Ｐ（Ｓ）Ｏ−３Ｏ−、５’Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’−Ｏ−、および５’Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｏ−３’Ｓ−）、ホスホロジチオエート結合、Ｒｐ−ホスホロチオエート結合、Ｓｐ−ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、メチレン結合（メチルイミノ）、アミド結合（３’−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−５’および３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−５’）、メチルホスホネート結合、３’−チオホルムアセタール結合、（３’Ｓ−ＣＨ２−Ｏ５’）、アミド結合（３’ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−５’）、ホスホロアミデート基、またはこれらの組合せである。
【００６２】
一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含む。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、表２からの任意の配列、またはこれらに対して相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００６３】
本発明の２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２の少なくとも５つの連続的なヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２（表２）のヌクレオチド配列、またはこれらのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つを含む。本開示の目的のために、同じ位置にチミンまたはウラシルを有する分子は、以下の配列の同等物であるとみなされる。一部の実施形態では、修飾合成２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２のうちのいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
（表２）２’−ＦＡＮＡオリゴヌクレオチド配列
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2022502062.tif 000025
［ＦＡＮＡ  Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ］：ＦＡＮＡ修飾塩基；Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ：非修飾ＤＮＡ塩基；＊―ホスホロチオエート連結
【００６５】
本明細書に記載の実施形態による修飾ＡＯＮの非限定的な例は、表１中の式に記載の任意の配置におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｌｌ−１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２の配列のいずれかを含むことができるがそれに限定されない。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、医薬組成物を提供する。
【００６７】
「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の原料成分と適合性であり、かつそのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。例えば、担体、希釈剤、もしくは賦形剤、またはその組成物は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさないし、それが含有される医薬組成物の他の成分のいずれとも望ましくない方式で相互作用しないものであってもよい。
【００６８】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、約０〜約２０個のデオキシリボヌクレオチド残基を含む配列に隣接している、５’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび３’末端における約０〜約２０個の２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含む。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００６９】
追加の実施形態では、本発明は、細胞においてＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、細胞を、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）と接触させる工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「少なくとも１つ」は、所望の効果を増加させかつ／または増進するための１つまたは複数の２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮの投与を指す。そのような効果に達するために、効果を相乗的とすることを目的として、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮが同じ対象に投与され得る。「複数の２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮ」とも称される少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、求めるアウトカム、対象の身体的状態、または投与スケジュールに影響し得る任意の他のパラメーター、例えば、進展もしくは進行もしくは疾患状態に依存して、１回に１つ、１回に数個、または１回に全てで投与され得る。
【００７１】
一態様では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＡＯＮが細胞と接触させられる。
【００７２】
合成ＡＯＮは、細胞によるＡＯＮの接触および取込みを許容する任意の好適なやり方で送達することができ、それは送達ビヒクルもトランスフェクション剤も必要とせずに為され得る。一部の実施形態では、送達方法は、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションが挙げられるがそれに限定されないトランスフェクション技術を含む。他の実施形態では、送達方法はジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）である。細胞は、トランスフェクション剤もしくは送達ビヒクルまたは他のトランスフェクション方法と共に、ＡＯＮと接触させることができる。トランスフェクション試薬および方法の非限定的な例としては、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ナノ粒子送達（例えば、ＰＥＧコーティングナノ粒子）、陽イオン性脂質および／またはポリマー、双性イオン性脂質および／またはポリマー、中性脂質および／またはポリマーが挙げられる。特有の例としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ試薬、ＤＯＰＣ中性リポソーム、シクロデキストリン含有ポリマーＣＡＬ１０１、および脂質ナノ粒子が挙げられる。
【００７３】
一実施形態では、細胞は、インビトロで培養された細胞の集団のものである。別の実施形態では、細胞は、生きた宿主または対象中の集団の部分である。例えば、ＡＯＮは、細胞のＦＯＸＰ３遺伝子発現をサイレンシングする目的のためにインビボ環境において細胞に送達されてもよい。追加的に、ＡＯＮは、問題となる細胞種に対するその効果を研究するために培養細胞に送達されてもよい。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する」は、細胞をＡＯＮと接触させる前の発現レベルより低い、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現レベルにおける任意の変化を指す。「Ｆｏｘｐ３の発現レベル」という語句は、タンパク質およびｍＲＮＡの両方の発現レベルを区別なく指すことが意図される。
【００７５】
一態様では、細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【００７６】
「Ｔｒｅｇ」という用語は、「制御性Ｔ細胞」または「サプレッサーＴ細胞」と交換可能に使用される。それは、当該技術分野における一般的意味を有し、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を予防するＴヘルパー細胞のサブセットを指す。Ｔｒｅｇは、免疫抑制細胞であり、一般に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方調節する。Ｔｒｅｇは、バイオマーカーＣＤ４、ＦＯＸＰ３、およびＣＤ２５を発現し、ナイーブＣＤ４細胞と同じ系列に由来すると考えられている。
【００７７】
免疫系は、自己と非自己を識別できなければならない。自己／非自己の識別が失敗した場合、免疫系は、身体の細胞および組織を破壊して自己免疫疾患を引き起こし得るか、またはがん細胞などの異常な細胞を破壊せずに抗腫瘍免疫抑制に繋がり得る。
【００７８】
制御性Ｔ細胞は、活発に免疫系の活性化を抑制し、病的自己反応性、すなわち、自己免疫疾患を予防する。制御性Ｔ細胞が免疫系内で果たす不可欠な役割は、制御性Ｔ細胞における遺伝子欠損の結果としてもたらされる重篤な自己免疫症候群の他、免疫系ががん細胞を破壊することを妨げる過剰な制御性Ｔ細胞活性の観察により、立証されている。実際に、Ｔｒｅｇは、がんを有する個体において上方調節される傾向があり、多くの腫瘍の部位に動員されるようである。ヒトおよび動物モデルの両方における研究は、腫瘍内微小環境中のＴｒｅｇの数が多いことは予後不良の指標となり、Ｔｒｅｇは腫瘍免疫を抑制して、がん細胞の増殖を制御する身体の先天的な能力を邪魔すると考えられることを示している。
【００７９】
制御性Ｔ細胞はグランザイムＢを産生することができ、そしてそれは、エフェクターＴ細胞のアポトーシスを誘導することができる。制御性Ｔ細胞による抑制の別の主要な機序は、分子ＣＴＬＡ−４の作用による、エフェクターＴ細胞の表面に発現されるＣＤ２８受容体を通じた共刺激の予防を通じたものである。
【００８０】
様々な態様では、Ｔｒｅｇは細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する。
【００８１】
「分子マーカー」という語句は、「細胞マーカー」、「細胞表面マーカー」、または「細胞表面タンパク質」という語句と代替的に使用され、細胞の表面に発現され、かつ例えば、１つの細胞種を別の細胞種から区別するために使用され得る任意のタンパク質を指す。
【００８２】
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造的バリアント、およびペプチド結合を介して連結された合成の天然に存在しないそのアナログ、関連する天然に存在する構造的バリアント、および合成の天然に存在しないそのアナログを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成装置を使用して合成され得る。「タンパク質」という用語は、典型的に１００アミノ酸を超える、大きいポリペプチドを典型的に指す。「ペプチド」という用語は、典型的に１００アミノ酸未満の、短いポリペプチドを典型的に指す。
【００８３】
他の態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において抗腫瘍免疫を増加させる方法であって、対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。一態様では、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＡＯＮが対象に投与される。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「抗腫瘍免疫」は、抗腫瘍効果を有する、すなわち、腫瘍／がん細胞を標的として、身体ががんと闘うことを助ける、免疫応答を指す。抗腫瘍免疫は、先天免疫および獲得免疫の両方に依拠する。
【００８６】
「免疫応答」という用語は、抗原への統合された身体応答を指し、好ましくは、細胞性免疫応答または細胞性の他に液性免疫応答を指す。免疫応答は、保護的／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）／予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）および／または治療的であってもよい。
【００８７】
細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することにより中心的役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、がん細胞などの疾患細胞を殺傷し、さらなる疾患細胞の産生を防ぐ。液性応答はＢ細胞すなわちＢリンパ球に関し、これらは、適応免疫系のリンパ球の種類であり、免疫監視のために重要である。Ｂ細胞抗原特異的受容体は、抗原プロセシングを一切必要とせずに病原体全体を認識するＢ細胞表面上の抗体分子である。Ｂ細胞の各系列は異なる抗体を発現するため、Ｂ細胞抗原受容体の完全なセットは、個体が生成できる全ての抗体を表す。
【００８８】
本発明のＡＯＮは、Ｔｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現の部分を標的としてＴｒｅｇ機能を減少させかつ抗腫瘍免疫を増加させるように設計される。抗腫瘍免疫のこの増加は、患者の処置を補助し得る。そのため、一部の実施形態では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮの少なくとも部分は、Ｆｏｘｐ３遺伝子に対応するｍＲＮＡ配列の部分に相補的である。２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡの全体または部分を標的としてそれに結合するように設計されてもよい。
【００８９】
「対象」という用語は、本明細書において使用される場合、主題の方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者により認められるように、対象は動物であってもよい。そのため、他の動物、例えば、脊椎動物、例えば、齧歯動物（マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、農用動物、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリなど、ならびに霊長動物（サル、チンパンジー、オランウータンおよびゴリラを含む）は、対象の定義内に含まれる。
【００９０】
「投与」およびまたは「投与する」という用語は、所望のアウトカムを達成するために治療有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に提供することを意味するものと理解されるべきである。
【００９１】
一態様では、ＡＯＮは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させる。一部の態様では、Ｔｒｅｇは細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を発現する。様々な態様では、ＡＯＮはＴｒｅｇのアポトーシスを誘導する。
【００９２】
別の態様では、ＡＯＮは免疫細胞の活性を増加させる。ある特定の態様では、免疫細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはこれらの組合せである。
【００９３】
本発明の文脈における「免疫応答性細胞」、「免疫細胞」、または「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応の間にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫細胞」は、好ましくは、抗原、または、抗原もしくは抗原に由来する抗原ペプチドの提示により特徴付けられる細胞に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、抗体を分泌し、がん性細胞を認識し、かつ任意選択的にそのような細胞を排除する。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。
【００９４】
様々な態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに対して相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００９５】
さらに別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を投与する工程を含み、ＡＯＮがＦｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合し、かつＡＯＮが少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチド）を含む、方法を提供する。一態様では２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＡＯＮが対象に投与される。
【００９６】
「処置」という用語は、「治療方法」という用語と本明細書において交換可能に使用され、１）診断された状態または障害を治癒し、減速させ、その症状を減じ、かつ／またはその進行を停止させる治療的処置または手段、および２）予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置を必要とする者としては、特定の医学的障害を既に有している個体の他に、障害を最終的に獲得する可能性がある個体（すなわち、予防的手段を必要としている個体）を挙げることができる。疾患を「処置する」ことは、該用語が本明細書において使用される場合、疾患または障害の頻度を低減すること、疾患または障害の１つまたは複数の症状が対象により経験される頻度を低減することを意味する。
【００９７】
「治療有効量」、「有効用量」、「治療有効用量」、または「有効量」などの用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医により求められている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する主題化合物の量を指す。一般に、応答は、患者における症状の寛解または所望の生物学的アウトカムのいずれかである。そのような量は、化合物が投与される対象への有益な効果に十分なものであるべきである。有効量は、本明細書に記載されるように決定され得る。本明細書において使用される場合、「治療有効量」は、細胞が投与される対象に有益な効果を提供するために十分な細胞の量である。
【００９８】
「投与」およびまたは「投与する」という用語は、処置を必要とする対象に治療有効量の医薬組成物を提供することを意味することが理解されるべきである。投与経路は特に限定されず、経口、静脈内、筋肉内、注入、髄腔内、皮内、皮下、舌下、頬側、直腸、膣、眼、耳経路、鼻、吸入、噴霧化、皮膚、外用、経皮、腹腔内または腫瘍内投与を含むことができる。
【００９９】
「がん」という用語は、がん（悪性腫瘍）を良性腫瘍から区別する、他の部位（二次的部位、転移）に浸潤および拡大する可能性を有する１つの部位（原発部位）において開始する異常な制御されない細胞増殖により特徴付けられる疾患群を指す。実質的に全ての臓器は罹患の可能性があり、ヒトが罹患し得る１００より多くの種類のがんに繋がっている。がんは、多くの原因からもたらされ得、該原因としては、遺伝的素因、ウイルス感染、電離放射線への曝露、環境上の汚染物質への曝露、タバコおよびもしくはアルコールの使用、肥満症、質の悪い食事、身体活動の欠如、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。「がん細胞」または「腫瘍細胞」、および文法的等価物は、腫瘍集団の大部分を構成する非腫瘍原性細胞、および腫瘍原性幹細胞（がん幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前がん病変に由来する細胞の総集団を指す。
【０１００】
例示的ながんとしては、急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児；急性骨髄性白血病、成人；副腎皮質がん；副腎皮質がん、小児；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍；肛門がん；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児大脳；胆管がん、肝臓外；膀胱がん；膀胱がん、小児；骨がん、骨肉腫／悪性繊維性組織球腫；脳幹部神経膠腫、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹部神経膠腫、小児；脳腫瘍、小脳星状細胞腫、小児；脳腫瘍、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児；脳腫瘍、上衣腫、小児；脳腫瘍、髄芽腫、小児；脳腫瘍、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；脳腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、小児；脳腫瘍、小児（その他）；乳がん；乳がんおよび妊娠；乳がん、小児；乳がん、男性；気管支腺腫／カルチノイド、小児：カルチノイド腫瘍、小児；カルチノイド腫瘍、胃腸；がん腫、副腎皮質；がん腫、膵島細胞；原発未知のがん腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫、小児；大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児；子宮頸がん；小児がん；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；腱鞘の明細胞肉腫；結腸がん；結腸直腸がん、小児；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；子宮内膜がん；上衣腫、小児；上皮がん、卵巣；食道がん；食道がん、小児；ユーイングファミリー腫瘍；頭蓋外生殖細胞腫瘍、小児；性腺外生殖細胞腫瘍；肝臓外胆管がん；眼がん、眼内黒色腫；眼がん、網膜芽腫；胆嚢がん；胃（ＧａｓｔｒｉｃまたはＳｔｏｍａｃｈ）がん；胃（ＧａｓｔｒｉｃまたはＳｔｏｍａｃｈ）がん、小児；胃腸カルチノイド腫瘍；生殖細胞腫瘍、頭蓋外、小児；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫．小児脳幹部；神経膠腫．小児視覚路および視床下部；有毛細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん、成人（原発性）；肝細胞（肝臓）がん、小児（原発性）；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児；妊娠の間のホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視覚路神経膠腫、小児；眼内黒色腫；膵島細胞がん（内分泌性膵臓）；カポジ肉腫；腎臓がん；喉頭がん；喉頭がん、小児；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、有毛細胞；唇および口腔がん；肝臓がん、成人（原発性）；肝臓がん、小児（原発性）；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児急性；リンパ球性白血病、慢性；リンパ腫、ＡＩＤＳ関連；リンパ腫、中枢神経系（原発性）；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン；小児期；リンパ腫、妊娠の間のホジキン；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児；リンパ腫、妊娠の間の非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム；男性乳がん；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児；悪性胸腺腫；髄芽腫、小児；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞がん；中皮腫、悪性；原発不明の転移性扁平頸部がん；多発性内分泌腺腫症候群、小児；多発性骨髄腫／血漿細胞新生物；菌状息肉症；脊髄形成異常症候群；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；鼻咽頭がん、小児；神経芽腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児；妊娠の間の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺がん；口腔がん、小児；口腔および口唇がん；口咽頭がん；骨の骨肉腫／悪性繊維性組織球腫；卵巣がん、小児；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓がん；膵臓がん、小児、膵臓がん、膵島細胞；副鼻腔および鼻腔がん；副甲状腺がん；陰茎がん；褐色細胞腫；松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；下垂体腫瘍；血漿細胞新生物／多発性骨髄腫；肺胸膜芽細胞腫；妊娠および乳がん；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓がん、成人；原発性肝臓がん、小児；前立腺がん；直腸がん；腎臓細胞（腎臓）がん；腎臓細胞がん、小児；腎盂および尿管、移行細胞がん；網膜芽腫；横紋筋肉腫、小児；唾液腺がん；唾液腺がん、小児；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫（骨の骨肉腫Ｖ悪性繊維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児；肉腫、軟組織、成人；肉腫、軟組織、小児；セザリー症候群；皮膚がん；皮膚がん、小児；皮膚がん（黒色腫）；皮膚がん、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟組織肉腫、成人；軟組織肉腫、小児；原発不明の扁平頸部がん、転移性；胃（ＳｔｏｍａｃｈまたはＧａｓｔｒｉｃ）がん；胃（ＳｔｏｍａｃｈまたはＧａｓｔｒｉｃ）がん、小児；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；精巣がん；胸腺腫、小児；胸腺腫、悪性；甲状腺がん；甲状腺がん、小児；腎盂および尿管の移行細胞がん；栄養膜腫瘍、妊娠；原発未知のがん、小児；小児の希少がん；尿管および腎盂、移行細胞がん；尿道がん；子宮肉腫；膣がん；視覚路および視床下部神経膠腫、小児；外陰がん；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍が挙げられるがそれに限定されない。
【０１０１】
ある特定の態様では、がんは、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、黒色腫、または膠芽腫である。
【０１０２】
一態様では、がんは肺がんである。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「肺がん」は、進行の全てのステージにおける全ての種類の肺がんを含み、肺がん；転移性肺がん；非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の３つの主な形態、すなわち、肺腺がん、扁平細胞がん、および大細胞がん；小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、ならびに中皮腫を包含するがそれに限定されないことが意味される。
【０１０４】
様々な態様では、ＡＯＮはＦｏｘｐ３遺伝子の発現レベルを低減する。一部の態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’−ＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１つの非修飾デオキシリボヌクレオチドを含むハイブリッドキメラＡＯＮであり、ＡＯＮは２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮである。一態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１〜１３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９〜１９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜３０２、またはこれらに相補的な配列の、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【０１０５】
様々な態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、対象において抗腫瘍免疫を増加させる。一部の態様では、２’−ＦＡＮＡ  ＡＯＮは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少させかつ／または免疫細胞の活性を増加させる。
【０１０６】
ある特定の態様では、ＡＯＮは、薬学的に許容される担体をさらに含む。他の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤がさらに投与される。
【０１０７】
「免疫モジュレーター」または「免疫療法剤」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫系をモジュレートする任意の治療剤を指す。免疫モジュレーターの例としては、エイコサノイド、サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、ケモカイン、チェックポイント調節剤、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、およびインターフェロンが挙げられる。免疫モジュレーターの特有の例としては、ＰＧＩ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−ε、ＩＮＦ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ、ＣＤ２０、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ１、ＰＤ１Ｌ２、ＩＣＯＳ、イミキモド、ＣＤ２００、ＣＤ５２、ＬＴα、ＬＴαβ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＦａｓＬ、Ｏｘ４０Ｌ、Ａｐｒｉｌ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ４０Ｌ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＡＰＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＬＴβＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、Ｆａｓ、Ｏｘ４０、ＡＩＴＲ、ＤＲ３、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＢＡＦＦＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、Ｆｎｌ４、ＣＤ４０、ＥＤＡＲ  ＸＥＤＡＲ、ＤＲ６、ＤｃＲ３、ＮＧＦＲ−ｐ７５、およびＴａｊが挙げられる。免疫モジュレーターの他の例としては、特有の抗体、例えば、アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ）（トシリズマブ）、シムジア（Ｃｉｍｚｉａ）（ＣＤＰ８７０）、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（エタネルセプト（ｅｎｔｅｒａｃｅｐｔ））、キネレット（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、アバタセプト（オレンシア（Ｏｒｅｎｃｉａ））、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（インフリキシマブ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（リツキシマブ（ｒｉｔｕｚｉｍａｂ））、シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ）（ゴリムマブ）、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、レシジェン（ＲｅｃｉＧｅｎ）、プレグリディ（Ｐｌｅｇｒｉｄｙ）、ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、ノバントロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ）、タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）（ナタリズマブ）、ジレニア（Ｇｉｌｅｎｙａ）（フィンゴリモド）、オーバジオ（Ａｕｂａｇｉｏ）（テリフルノミド）、ＢＧ１２、テクフィデラ（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）、レムトラーダ（Ｌｅｍｔｒａｄａ）（アレムツズマブ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｍａｂ）、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（セツキシマブ）、マツズマブ、ＩＭＣ−ＩＩＦ  ８、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、デノスマブ、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（ベバシズマブ）、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（アダリムマブ）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（トラスツズマブ）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（インフリキシマブ）、リツキシマブ、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（パリビズマブ）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｘｏｇａｍｉｃｉｎ））、ラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）（エファリズマブ）、タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）（ナタリズマブ）、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）（ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ））、ニュートロスペック（ＮｅｕｔｒｏＳｐｅｃ）（テクネチウム（９９ｍＴｃ）ファノレソマブ）、トシリズマブ、プロスタシント（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ）（インジウム−ＩＩＩ標識カプロマブペンデチド）、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（イットリウム９０にコンジュゲートしたイブリツモマブチウキセタン（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８））、ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（オマリズマブ）、マブセラ（ＭａｂＴｈｅｒａ）（リツキシマブ）、レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（アブシキシマブ）、マブキャンパス（ＭａｂＣａｍｐａｔｈ）（アレムツズマブ）、シムレクト（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）（バシリキシマブ）、ロイコスキャン（ＬｅｕｋｏＳｃａｎ）（スレソマブ）、ＣＥＡ−スキャン（ＣＥＡ−Ｓｃａｎ）（アルシツモマブ）、ベルルマ（Ｖｅｒｌｕｍａ）（ノフェツモマブ）、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）（エドレコロマブ）、アレムツズマブ、ＣＤＰ  ８７０、ナタリズマブ、ジオトリフ（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）（アファチニブ）、リンパルザ（Ｌｙｎｐａｒｚａ）（オラパリブ）、パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）（ペルツズマブ）、オプジーボ（Ｏｔｄｉｖｏ）（ニボルマブ）、ボシュリフ（Ｂｏｓｕｌｉｆ）（ボスチニブ）、カボメティクス（Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ）（カボザンチニブ）、オギブリ（Ｏｇｉｖｒｉ）（トラスツズマブ−ｄｋｓｔ）、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（スニチニブリンゴ酸塩）、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（ブレンツキシマブベドチン）、アレセンサ（Ａｌｅｃｅｎｓａ）（アレクチニブ）、カルクエンス（Ｃａｌｑｕｅｎｃｅ）（アカラブルチニブ）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（シロルーセル）、ベージニオ（Ｖｅｒｚｅｎｉｏ）（アベマシクリブ）、キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（ペムブロリズマブ）、アリコパ（Ａｌｉｑｏｐａ）（コパンリシブ）、ネルリンクス（Ｎｅｒｌｙｎｘ）（ネラチニブ）、イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）（デュルバルマブ）、ダラザレックス（Ｄａｒｚａｌｅｘ）（ダラツムマブ）、テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（アテゾリズマブ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンチオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）（イミフィンジ）、イピリムマブ（Ｉｐｌｉｍｕｍａｂ）（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ））、およびタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ）が挙げられる。
【０１０８】
「化学療法剤」という用語は、本明細書において使用される場合、がんを処置するために使用される抗新生物効果を有する任意の治療剤を指す。化学療法剤および抗新生物剤は周知の細胞傷害剤であり、（ｉ）ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、およびビノレルビン）、タキサン（カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、およびテセタキセル）、エポチロン（イキサベピロン）、およびポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）を含む、抗微小管剤；（ｉｉ）抗葉酸剤（アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、およびラルチトレキセド）、およびデオキシヌクレオシドアナログ（アザシチジン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、デシタビン、ドキシフルリジン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリン、ネララビン、ペントスタチン、テガフール、およびチオグアニン）を含む、代謝拮抗剤；（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩ阻害剤（ベロテカン、カンプトテシン、コシテカン、ギマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ルルトテカン、シラテカン、トポテカン、およびルビテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アクラルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｍ）、メルバロン、ミトキサントロン、ノボビオシン、ピラルビシン、テニポシド、バルルビシン、およびゾルビシン）を含む、トポイソメラーゼ阻害剤；（ｉｖ）ナイトロジェンマスタード（ベンダムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、リン酸エストラムスチン、イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、メルファラン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラムスチン）、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、フォテムスチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、ニムスチン、ラニムスチン  セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、およびストレプトゾトシン）、白金ベースのもの（シスプラチン、カルボプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンおよびサトラプラチン）、アジリジン（カルボコン、チオテパ、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）、ジアジコン（ＡＺＱ）、トリアジクオンおよびトリエチレンメラミン）、アルキルスルホネート（ブスルファン、マンノスルファン、およびトレオスルファン）、非古典的アルキル化剤（ヒドラジン、プロカルバジン、トリアゼン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ミトブロニトール、およびピポブロマン）、テトラジン（ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミド）を含む、アルキル化剤；（ｖ）ドキソルビシンおよびダウノルビシンを含む、アントラサイクリン剤が挙げられる。これらの化合物の誘導体としては、エピルビシンおよびイダルビシン；ピラルビシン、アクラルビシン、およびミトキサントロン、ブレオマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびアクチノマイシン；（ｖｉ）ＦＩ阻害剤（チピファ���ニブ）、ＣＤＫ阻害剤（アベマシクリブ、アルボシジブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、およびセリシクリブ）、ＰｒＩ阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、およびイキサゾミブ）、ＰｈＩ阻害剤（アナグレリド）、ＩＭＰＤＩ阻害剤（チアゾフリン）、ＬＩ阻害剤（マソプロコール）、ＰＡＲＰ阻害剤（ニラパリブ、オラパリブ、ルカパリブ）、ＨＤＡＣ阻害剤（ベリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、ボリノスタット）、およびＰＩＫＩ阻害剤（イデラリシブ）を含む、酵素阻害剤；（ｖｉｉ）ＥＲＡ受容体アンタゴニスト（アトラセンタン）、レチノイドＸ受容体アンタゴニスト（ベキサロテン）、性ステロイド受容体アンタゴニスト（テストラクトン）を含む、受容体アンタゴニスト剤；（ｖｉｉｉ）アムサクリン、トラベクテジン、レチノイド（アリトレチノイン  トレチノイン）  三酸化ヒ素、アスパラギン枯渇剤（アスパラギナーゼ／ペガスパルガーゼ）、セレコキシブ、デメコルシン  エレスクロモール、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシンメペサクシネート（Ｏｍａｃｅｔａｘｉｎｅ  ｍｅｐｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、およびエリブリンを含む、未分類の剤が挙げられる。
【０１０９】
ある特定の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤は、チェックポイント阻害剤、ワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブもしくはペムブロリズマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、アベルマブ、もしくはデュルバルマブ）、またはこれらの組合せである。
【０１１０】
「チェックポイント阻害剤」は、免疫系機能に影響する免疫チェックポイントを使用するがん処置用の療法を指す。免疫チェックポイントは、刺激性または阻害性であり得る。腫瘍は、免疫系の攻撃から自身を保護するためにこれらのチェックポイントを使用することができる。チェックポイント療法は、阻害チェックポイントを遮断して、免疫系機能を回復させることができる。チェックポイントタンパク質としては、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤＣＤ１、ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても公知）およびそのリガンド、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、Ａ２ＡＲ（アデノシンＡ２Ａ受容体）、Ｂ７−Ｈ３（またはＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（またはＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター、またはＣＤ２７２）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）、ならびにＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）が挙げられる。
【０１１１】
ＰＤ−１およびＣＤ２７９（分化クラスター２７９）としても公知のプログラム細胞死タンパク質１は、Ｔ細胞炎症活性を抑制することによる免疫系の下方調節および自己寛容の促進において重要な役割を果たす細胞表面受容体である。ＰＤ−１は免疫チェックポイントであり、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に制御性Ｔ細胞（抗炎症性の抑制性Ｔ細胞）においてアポトーシスを低減するという二重の機序を通じて自己免疫から保護する。ニボルマブおよびペムブロリズマブは、がん処置のためにＦＤＡにより承認されている２つの商品化された抗ＰＤ−１抗体である。
【０１１２】
ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達でＴ細胞およびＢ細胞上で上方調節される一方、休止マウスにおいて、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡは、心臓、肺、胸腺、脾臓、および腎臓中に検出され得る。ＰＤ−Ｌ１は、ＩＦＮ−γを用いる処理で、ＰＡ１骨髄腫、Ｐ８１５肥満症細胞腫、およびＢ１６黒色腫を含むほぼ全てのマウス腫瘍細胞株上に発現される。ＰＤ−Ｌ２発現はより制限されており、主にＤＣおよび少数の腫瘍系統により発現される。アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブは、がん処置のためにＦＤＡにより承認されている３つの商品化された抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１１３】
「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対する活性の獲得免疫を提供する生物学的調製物を指す。ワクチンは、典型的には、疾患惹起因子に似た作用物質を含有し、多くの場合に、作用物質、その毒素、またはその表面タンパク質の弱体化または殺傷形態から作られる。ワクチンは、その作用物質を脅威として認識し、それを破壊し、さらに将来的にそれを認識して破壊するように、免疫系を刺激する。ワクチンは、予防的または治療的（例えば、がんワクチン）であり得る。「がんワクチン」という用語は、がんおよび／または腫瘍成長に対する処置を提供し、それを阻害しかつ／またはそれに対する免疫を伝える、接種材料または接種材料の部分として使用が可能な任意の調製物を指す。ワクチンは、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、またはＲＮＡワクチンであってもよい。
【０１１４】
免疫療法としては、がん細胞を特異的に認識および排除するように改変された、遺伝子操作されたＴ細胞の養子導入の使用が挙げられる。Ｔ細胞は、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を安定的に発現するように遺伝子改変され得る。ＣＡＲは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインからなるシグナル伝達エンドドメインを含む合成タンパク質である。抗原を発現する標的がん細胞と相互作用すると、キメラ抗原受容体は細胞内シグナル伝達を誘発して、それがＴ細胞活性化および腫瘍細胞に対する細胞傷害性免疫応答に繋がる。結合もする（ｔｈａｔ  ａｌｓｏ  ｂｉｎｄ）そのような療法が見出されており、再発性／難治性疾患に対して効率的であることが示されている。追加的に、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害活性を増進する共刺激受容体を含むように操作され得る。さらには、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍内微小環境中に目的のタンパク質を産生および送達するように操作され得る。
【０１１５】
他の態様では、免疫療法剤および／または化学療法剤は、ＡＯＮの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。
【０１１６】
ある特定の態様では、放射線療法がさらに施される。ある特定の態様では、放射線療法は、ＡＯＮの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に施される。
【０１１７】
いくつかのがん処置は、「併用療法」で、または「組み合わせて」使用され得る。「併用療法」および「組み合わせて」などの語句は、応答を増加させるために複数の医薬または処置を同時に使用することを指す。本発明のＡＯＮは、例えば、がんを処置するために使用される他の薬物または処置と組み合わせて使用され得る。特に、対象へのＡＯＮの投与は、例えば、化学療法、放射線、または治療的抗体の投与と組み合わせられ得る。そのような療法は、本発明のＡＯＮの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に施され得る。
【０１１８】
考察される応用のために想定される、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに結合する、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドを含むハイブリッドキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを考察する実施例が、以下に提示される。以下の実施例は、本発明の実施形態の実例をさらに示すために提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。それらは、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術が代替的に使用されてもよい。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
材料および方法
抗体およびフローサイトメトリー
商業的に入手可能なコンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をフローサイトメトリーのために使用した（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。抗Ｆｏｘｐ３  ｍＡｂはＦＪＫ−１６ｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であり、βアクチン抗体はウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であった。フローサイトメトリーはＣｙａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行い、ＦｌｏｗＪｏ  ８ソフトウェア（Ｔｒｅｅ−Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析した。ＣＤ４＋ＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞およびＣＤ４＋ＹＦＰ（Ｆｏｘｐ３−）細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＰｅｎｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用して年齢および性別をマッチさせたＦｏｘｐ３ＹＦＰ−ｃｒｅマウスから選別した。
【０１２０】
脾臓および末梢リンパ節を回収し、リンパ球の単一細胞懸濁液へと処理した。従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ、ＣＤ４＋ＣＤ２５−）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）細胞の単離のために磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した。細胞選別のために、リンパ球をＦｏｘｐ３ｃｒｅＹＦＰマウスから単離し、上記のようにＣＤ４発現に基づいて精製した。次に、ＣＤ４＋ＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞およびＣＤ４＋ＹＦＰ−細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＰｅｎｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を介して選別した。表面マーカーを使用して目的の細胞を分析し、Ｆｏｘｐ３染色について、表面マーカー染色細胞を固定し、透過処理を行い、Ｆｏｘｐ３特異的ｍＡｂを用いて標識した。全てのフローサイトメトリーデータは、Ｃｙａｎ（Ｄａｋｏ）の他にＣｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して捕捉し、ＦｌｏｗＪｏ  １０．ｌｒ５ソフトウェアを使用して解析した。データをプールし、最大のパーセント（最大の％）、すなわち各ビン中の細胞の数を最大数の細胞を含有するビン中の細胞の数で割ったものを表すオーバーレイデータの正規化としてヒストグラムで示した。
【０１２１】
Ｆｏｘｐ３発現を研究するためのＰｒｉｍｅＦｌｏｗアッセイ（Ｆｏｘｐ３＋細胞をＦｏｘｐ３−細胞から区別するため）
ＰｒｉｍｅＦｌｏｗは、フローサイトメトリーによるｍＲＮＡおよびタンパク質の同時の測定を可能とした。ＦＯＸＰ３  ｍＡｂと細胞とを、推奨される３０分の代わりに１時間インキュベートしたことを除いて、製造者の説明書にしたがってＰｒｉｍｅＦｌｏｗ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用した。
【０１２２】
Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ発現のためのｑＰＣＲ
プールされたリンパ節および脾臓試料から新たに単離された、またはＣＤ３／２８  ｍＡｂコーティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離および活性化されたＦｏｘｐ３＋  ＴｒｅｇまたはＦｏｘｐ３−  ＴＥ細胞からのＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して得た。ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの特異的プライマーを使用してｑＰＣＲを行い、遺伝子発現データを１８Ｓ  ＲＮＡに対して正規化した。
【０１２３】
Ｔｒｅｇ抑制アッセイ
ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  Ｔエフェクター（ＴＥ）およびＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（１３０−０９１−０４１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＦｏｘｐ３ＹＦＰ−ｃｒｅマウスから単離した。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識またはＣＦＳＥ標識Ｔｅｆｆ細胞（５×１０５）を、５×１０５個の照射同系Ｔ細胞枯渇脾臓細胞（１３０−０４９−１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および様々な比のＴｒｅｇの存在下でＣＤ３  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。７２時間後に、ＴＥ細胞の増殖をＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈またはＣＦＳＥ希釈の分析により決定した。
【０１２４】
簡潔に述べれば、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇを磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により単離し、ＣＦＳＥ標識ＨＤ  ＰＢＭＣと１：１〜１：１６のＴｒｅｇ／ＰＢＭＣ比で４日間インキュベートした。細胞を次に３．６ビーズ／細胞の比でＣＤ３  ｍＡｂコーティングマイクロビーズを用いて刺激した。抑制機能を曲線下面積としてカウントした。３つのＬＣ（腫瘍）および２つのＨＤ  Ｔｒｅｇを使用し、それら自身のＣＤ４＋  ＦＯＸＰ３−  Ｔｅｆｆ（ミックス中４０％〜ｌ００％のＴｒｅｇ）を用いて徐々に希釈し、抑制アッセイにおいて試験して、単離後にＦＯＸＰ３＋純度の減少と共にＴｒｅｇが抑制機能をどの程度喪失したかを決定した。これらのデータを回帰分析のために使用し、結果としてもたらされた等式を適用して、各単離されたＴｒｅｇ試料の正確なＦＯＸＰ３＋純度にしたがって抑制アッセイの結果を補正した。
【０１２５】
マウス投薬レジメン
３つの異なる種類のインビボ実験を行った。一部の実験では、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＦＡＮＡを用いて３回処置した。他の実験では、マウスを５０ｍｇ／ｋｇのＦＡＮＡを用いて１日毎に１週間処置した。さらなる一部の他の実験では、ＴＣ１腫瘍モデルを使用して、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＦＡＮＡを１日毎に２週間与えた。
【０１２６】
細胞株および腫瘍モデル
ＴＣ１細胞は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７を用いて不死化され、ｃ−Ｈａ−ＲＡＳがん遺伝子を用いて形質転換されたマウス肺上皮細胞に由来した。腫瘍研究のために、各マウスの右脇腹を剃毛し、皮下に１．２×１０６個のＴＣ１腫瘍細胞を注射した。腫瘍体積を式：（３．１４×長軸×短軸×短軸）／６により決定した。
【０１２７】
インビボＴＣ１腫瘍モデル実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にＴＣ１腫瘍細胞を接種し、マウスを７日目に３つの群（１０匹／群）に分けた。群１：スクランブル５０ｍｇ／ｋｇ；群２：ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５  ５０ｍｇ／ｋｇ；群３：ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６  ５０ｍｇ／ｋｇ。オリゴヌクレオチドをＰＢＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、０．１ｍｌ（１ｍｇ）を１４日間毎日腹腔内に与えた。腫瘍サイズをキャリパーを使用して測定し、腫瘍体積を週に２回算出し、実験の終わりに、腫瘍、灌流リンパ節および脾臓をさらなる分析のために回収した。
【０１２８】
実施例２
Ｆｏｘｐ３発現細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果の評価
Ｆｏｘｐ３発現細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果をフローサイトメトリーにより評価した。
【０１２９】
脾臓細胞をインビトロでＣＤ３  ｍＡｂおよび異なるＦＡＮＡ配列を用いて３日間処理した。図１に示されるように、対照スクランブルＦＡＮＡは、脾臓から単離された細胞集団中、ＦＡＮＡ濃度が２．５μＭである場合にＦｏｘｐ３発現細胞が１４．８％、５μＭではＦｏｘｐ３発現細胞が９．５７％であることを指し示した。Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡ配列を用いた処理は、Ｆｏｘｐ３発現細胞の数を低減した。例えば、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６を使用して、細胞のパーセンテージは、２．５μＭで４．６３％および５μＭで２．９７％にそれぞれ減少した。
【０１３０】
Ｔｒｅｇ細胞の精製された集団を、独立してインビトロで、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよびいくつかのＦＡＮＡ配列を用いて３日間処理した。図２に示されるように、対照スクランブルＦＡＮＡは、２．５μＭの用量の場合にＴｒｅｇの６７．５％、５μＭの用量においては６７％がＦｏｘｐ３発現細胞であることを指し示した。ＦＡＮＡを用いた処理の結果として、およびスクランブル対照配列と比較して、Ｆｏｘｐ３発現について陽性である細胞のパーセンテージにおける低減は、Ｆｏｘｐ３のサイレンシングを指し示すものであった。配列の多くはＦｏｘｐ３発現細胞の数を低下させた。
【０１３１】
Ｆｏｘｐ３発現細胞の数に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果をインビボでも評価した。マウスに３回の１０ｍｇ／ｋｇの用量（マウス３０ｇに３００μｇ）のＦＡＮＡを与え、最終用量の２４時間後に、関連するリンパ系組織を回収した。
【０１３２】
図３に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇの３回の用量は、インビボでＦｏｘｐ３発現細胞の数を控えめに低減した。この用量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍モデルにおいて使用された用量（５０ｍｇ／ｋｇ）よりはるかに低かったが、範囲を確立するために含めた。この用量においてＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６およびおそらくＦＡＮＡ−８は、ＹＦＰおよび／またはＦｏｘｐ３の検出の小量（２．６〜３％）の減少を示した。
【０１３３】
実施例３
ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの細胞内取込みの評価
ＦＡＮＡのインビボ取込みを、１０ｍｇ／ｋｇの蛍光（ＡＰＣ）標識スクランブル化オリゴヌクレオチドのマウスへの注射の２４時間後に評価した。細胞を脾臓、リンパ節、および血液から回収し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１３４】
細胞によるＣＤ８およびＡＰＣ発現を追跡することによりＣＤ８＋およびＣＤ８−細胞を分析した。図４に示されるように、ＦＡＮＡシグナルが３つ全ての位置のＣＤ８細胞において有意に検出され、ＣＤ８細胞のインビボトランスフェクションの成功、およびＣＤ８＋細胞によるＦＡＮＡのインビボ取込みを指し示した。
【０１３５】
Ｆｏｘｐ３タグ付け黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現するマウスモデルを使用して、非Ｔｒｅｇ細胞をＹＦＰ−（Ｆｏｘｐ３−）細胞として分析し、非Ｔｒｅｇ細胞による標識ＦＡＮＡの取込みを評価した。図５に示されるように、ＦＡＮＡシグナルは、Ｆｏｘｐ３を発現しない３つ全ての位置（脾臓、リンパ節、および血液）の細胞において有意に検出され、非Ｔｒｅｇ細胞によるＦＡＮＡ取込みを指し示した。
【０１３６】
Ｆｏｘｐ３タグ付けＹＦＰを発現するこの同じマウスモデルを使用して、Ｔｒｅｇ細胞をＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞として特に分析し、Ｔｒｅｇ細胞による標識ＦＡＮＡの取込みを評価した。図６に示されるように、ＦＡＮＡシグナルは、３つ全ての位置（脾臓、リンパ節、および血液）のＦｏｘｐ３発現（ＹＦＰ＋）細胞において有意に検出され、Ｔｒｅｇ細胞によるＦＡＮＡ取込みを指し示した。
【０１３７】
インビトロＦＡＮＡ取込みを、共焦点顕微鏡法によっても評価した。図７に示されるように、標識ＦＡＮＡはＦｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇにおいて検出され、Ｔｒｅｇ細胞取込みを実証した。白矢じりにより標識されるようなＦｏｘｐ３、および黒の星により標識されるようなＦＡＮＡは、細胞の核（Ｎ）において検出された。核におけるＦｏｘｐ３およびＦＡＮＡの共局在性は、標的Ｆｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇ細胞によるＦＡＮＡの取込みの成功を指し示した。
【０１３８】
実施例４
Ｆｏｘｐ３タンパク質発現レベルに対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果の評価
Ｆｏｘｐ３タンパク質発現レベルに対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果をウエスタンブロットを介して評価して、Ｆｏｘｐ３発現をタンパク質レベルで阻害するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの能力を評価した。
【０１３９】
細胞を５μＭのいくつかのＦＡＮＡを用いて７２時間処理した後に、Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビトロ効果を評価した。図８Ａ〜Ｂに示されるように、Ｆｏｘｐ３発現は、Ｆｏｘｐ３発現を正規化するために使用されたローディングコントロールとしてのａ−チューブリン発現と共に測定された。ほとんどのＦＡＮＡは、スクランブル化対照と比較してＦｏｘｐ３の発現の低減を誘導した。
【０１４０】
Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビボ効果もまた評価した。Ｆｏｘｐ３を標的とするＦＡＮＡの１０ｍｇ／ｋｇの３用量を用いてマウスを処置した。最後の注射の２４時間後に細胞を回収した。図９Ａ〜Ｂに示されるように、Ｆｏｘｐ３タンパク質が測定され、それを対象としてのアクチンと比較した。ＦＡＮＡ  ５、６、８、および９は、スクランブル化ＦＡＮＡおよび対照と比較してＦｏｘｐ３発現を低減した。
【０１４１】
実施例５
Ｔｒｅｇ免疫抑制機能に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果の評価
Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制機能をフローサイトメトリーにより評価し、該評価では、Ｔエフェクター細胞に対するＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡ処理Ｔｒｅｇの効果をＴｒｅｇ免疫抑制アッセイにおいて測定した。
【０１４２】
Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡのインビトロ効果を５μＭのＦＡＮＡを用いたＴｒｅｇの処理後に評価した。様々な比のＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡ処理ＴｒｅｇおよびＴエフェクター細胞を次に評価し、Ｔエフェクターを免疫抑制するＴｒｅｇ細胞の能力をＴエフェクター細胞の数を評価することにより測定した。効率的なＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡを、Ｔエフェクター細胞のＴｒｅｇ免疫抑制を低減するそれらの能力により同定した。各列がＴエフェクター細胞（ＴＥ；正常な細胞傷害性免疫細胞である）に対するＴｒｅｇ細胞の比を指し示す図１０において、免疫活性化／増殖はＴｒｅｇにより抑制されるので、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージが試料中で増加した場合、ＴＥ細胞の増殖は減少することが予期された。スクランブル対照に示されるように、Ｔｒｅｇ関与がない場合、Ｔエフェクター細胞は増殖し、集団の９０．５％を構成した。Ｔｒｅｇ細胞数が増加し、初期集団が、同数のＴｒｅｇおよびＴＥ細胞（比１：１）により近くなるにつれて、ＴＥ細胞の増殖は減少し、３８．３％のみがＴＥ細胞を構成した。ＦＡＮＡを用いた細胞の処理、およびそれらの同じパーセンテージの評価は、Ｔｒｅｇ免疫抑制を防ぐことができるＦＡＮＡの同定を可能とした。ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６の両方は、強調されたパーセンテージにより見ることができるように、ＴｒｅｇによるＴエフェクター細胞の免疫抑制を防いだ。図１０において、増加する数のＴｒｅｇを系に加えた場合であっても、ＴｒｅｇをＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６を用いて処理した場合ＴＥの機能および活性は保存され、これはＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３のサイレンシングおよびそれらの抑制性作用の遮断のためであると推定された。
【０１４３】
実施例６
５０ｍｇ／ｋｇのＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの効果のインビボ評価
５０ｍｇ／ｋｇという高用量のＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドの効果を、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制機能に対する影響力、およびＦｏｘｐ３のタンパク質発現レベルに対する影響力などのいくつかのパラメーターを評価することによりインビボで評価した。
【０１４４】
マウスの腹腔内に１日１回７日間５０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（以前に提示したデータで確立された最も効率的なＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡのうちの２つ）を注射した。最後の注射の２４時間後に、脾臓およびリンパ節（ＬＮ）を収集し、Ｔｒｅｇを数え、評価した。
【０１４５】
Ｔエフェクター細胞を免疫抑制するＴｒｅｇの能力を、フローサイトメトリーによりＴエフェクター細胞の数を評価することにより測定した。ＴｒｅｇをＴｒｅｇ抑制アッセイに供し、該アッセイにおいて、増加する数のＴｒｅｇ細胞を正常な細胞傷害性免疫細胞、Ｔエフェクター（ＴＥ）細胞とインキュベートした。免疫活性化はＴｒｅｇにより抑制されるので、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージが試料中で増加するにつれて、ＴＥ細胞の増殖は減少することが予期された。図１１における対照の行に示されるように、Ｔｒｅｇ関与がない場合、ＴＥ細胞は増殖し、集団の９７．３％を構成した。Ｔｒｅｇ細胞が増加し、初期集団が、同数のＴｒｅｇおよびＴＥ細胞により近くなるにつれて、ＴＥ細胞の増殖は減少し、３５．４％のみがＴＥ細胞を構成した。特定の比のＴｒｅｇの存在を前提として、Ｔエフェクター細胞の測定されたパーセンテージは、対照試料中で生じるより高かったことから、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６を用いた細胞の処理は共に、Ｔエフェクター細胞のＴｒｅｇ媒介性の抑制を防ぐことが見出された（星を付したフローサイトメトリープロット）。この用量は有効であり、３回の１０ｍｇ／ｋｇの用量は有効性がより低かった。インビボでの５０ｍｇ／ｋｇの１日毎の用量は、Ｔｒｅｇ媒介性の免疫抑制を低減し、免疫系エフェクター機能を回復させた。
【０１４６】
さらに、図１２Ａ〜Ｂに示されるように、Ｆｏｘｐ３タンパク質を測定し、対照としてのベータ−アクチンと比較した。ウエスタンブロットにより、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６の両方は、スクランブル対照と比較してインビボでＦｏｘｐ３タンパク質発現を減少させたことが明らかになった。インビボでの５０ｍｇ／ｋｇのＦＡＮＡの１日毎の用量は、Ｆｏｘｐ３のタンパク質発現を低減した。
【０１４７】
実施例７
Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドを用いたＴＣ１マウスの処置のインビボ評価
選択されたＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡであるＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）の腫瘍成長に対する効果を、実施例１に記載されるようにＴＣ１腫瘍モデルを使用してインビボで評価した。さらに、腫瘍内および脾臓内Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇに対するＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６の効果をフローサイトメトリーにより評価した。
【０１４８】
ＴＣ１細胞を０日目にマウスに注射し、腫瘍を７日目まで成長させた。７日目に、マウス各１０匹の群を無作為に分け、スクランブル対照、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５、またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６の５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射を用いて１日毎に１４日間各マウスを処置した。各日に腫瘍サイズを測定し、プロットした。
【０１４９】
図１３に示されるように、２０日目に、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６は、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５およびスクランブル対照の両方と比較して腫瘍サイズを有意に低減できることが見出された。
【０１５０】
図１４Ａ〜Ｃにさらに詳述されるように、Ｆｏｘｐ３  ＡＳＯ療法は同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて成長するＴＣ１肺腫瘍の成長を損なわせたことが見出された。各線が異なるマウスを表す図１４Ｂに示されるように、腫瘍は１０匹のＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６処置マウスのうちの５匹において完全に退縮および消失し、その他のいくつかにおいて緩慢化したことが見出された。５０ｍｇ／ｋｇのＦＡＮＡの１日毎に２週間の用量は、インビボで腫瘍サイズをかなり低減し、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６は、１０匹の処置マウスのうちの５匹において完全な腫瘍退縮を誘導することができた。
【０１５１】
さらに、腫瘍内Ｆｏｘｐ３発現細胞の数をフローサイトメトリーにより測定した。実験の最終エンドポイント後、および動物の屠殺後に、腫瘍内細胞を回収し、分析した。図１５Ａ〜Ｂに示されるように、５０ｍｇ／ｋｇの用量のＦＡＮＡ、殊にＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６は、処置マウスの腫瘍中のＦｏｘｐ３発現細胞の数を低減することが見出され、このことは、Ｆｏｘｐ３ノックダウンが成功したことを実証し、そして、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６処置マウスの半分において腫瘍の排除に寄与した。
【０１５２】
追加的に、脾臓内Ｆｏｘｐ３発現細胞の数をフローサイトメトリーにより測定した。実験の最終エンドポイント後、および動物の屠殺後に、腫瘍内細胞を回収し、分析した。図１６Ａ〜Ｂに示されるように、５０ｍｇ／ｋｇの用量のＦＡＮＡは、処置マウスの脾臓中のＦｏｘｐ３発現細胞の数を低減することが見出され、このことは、Ｆｏｘｐ３ノックダウンが成功したことを実証した。
【０１５３】
実施例８
低用量のＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡ６−Ｂオリゴヌクレオチドを用いたＴＣ１マウスの処置のインビボ評価
選択されたＦｏｘｐ３  ＦＡＮＡの効果を、より低い用量のオリゴヌクレオチドを使用してインビトロおよびインビボで評価した。
【０１５４】
図１７に示されるように、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）はインビトロでＦｏｘｐ３ノックダウンを誘導するために効率的であることが実証された。さらに、２．５または５μＭのオリゴヌクレオチドで様々なＦＡＮＡを用いた処理後のＦｏｘｐ３＋脾臓細胞の数の評価を、ＣＤ３  ｍＡｂを用いて処理されたマウス脾臓細胞のフローサイトメトリーデータにより評価した。図１８に示されるように、抗Ｆｏｘｐ３  ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）はマウス脾臓細胞においてＦｏｘｐ３＋  ＴＲＥＧの集団を低減した。追加的に、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６を用いた細胞の処理後にＴｒｅｇ抑制機能をインビトロで評価した。図１９Ａ〜Ｂに示されるように、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−５またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６は、非処理細胞と比較して、これらオリゴヌクレオチドを用いて細胞を処理した場合（処理は１μＭの最終ＦＡＮＡ濃度を有した）にＣＤ３  ｍＡｂにより誘導される従来のＴ細胞の持続的な増殖により示されるように、マウスＴＲＥＧ抑制機能を損なわせた。
【０１５５】
より低い用量のＦＡＮＡオリゴヌクレオチドのインビボ分析を、実施例１に記載されるようにＴＣ１腫瘍モデルを使用して腫瘍担持マウスの灌流リンパ節において最初に評価した。ＴＣ１細胞を０日目にマウスに注射し、腫瘍を成長させた。マウス各４匹の２群を無作為に分け、各マウスをスクランブル対照、またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）の腹腔内注射を用いて１日毎に処置した。２１日目に、腫瘍担持マウスの灌流リンパ節を収集し、Ｆｏｘｐ３発現をウエスタンブロットにより評価した。図２０に示されるように、ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂは、スクランブル対照と比較して灌流リンパ節におけるＦｏｘｐ３発現の低減において効率的であった。
【０１５６】
さらに、腫瘍成長および抗腫瘍免疫に対するＦＡＮＡ  ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂの効果を、実施例１に記載されるようにＴＣ１腫瘍モデルを使用してインビボで評価した。ＴＣ１細胞を０日目にマウスに注射し、腫瘍を７日目まで成長させた。７日目に、マウス各８匹の群を無作為に分け、スクランブル対照、またはＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂの２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射を用いて１日毎に１４日間各マウスを処置した。各日に腫瘍サイズを測定し、プロットした。図２１Ａ〜Ｂに示されるように、２１日目に、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂは、スクランブル対照と比較して腫瘍サイズを有意に低減できることが見出され、Ｆｏｘｐ３  ＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂは肺腫瘍の成長を損なわせることを示した。
【０１５７】
ＣＤ４＋ＩＦＮ−ｇ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−２＋、ＣＤ８＋ＩＦＮ−ｇ＋、およびＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを、リンパ系組織中および腫瘍部位において評価した。図２２に示されるように、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＡＵＭ−ＦＡＮＡ−６Ｂは、リンパ系組織および腫瘍部位の両方においてＣＤ４＋ＩＦＮ−ｇ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−２＋、およびＣＤ８＋ＩＦＮ−ｇ＋  Ｔ細胞を有意に増加させることができることが見出され、また腫瘍内Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞を減少させることができることも見出され、Ｆｏｘｐ３  ＦＡＮＡ−６Ｂは抗腫瘍免疫を促進することを示した。
【０１５８】
本発明を上記の実施例を参照して記載したが、改変およびバリエーションは本発明の精神および範囲に包含されることが理解される。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2022502062.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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