(57)【要約】  皮膚美白活性を持つペプチド及びその用途に係り、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、ペプチドを含む皮膚美白用化粧料組成物、ペプチドを含む過色素浸着性疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物、及びこれを用いた皮膚美白方法または過色素浸着性疾患の予防、改善、または治療方法を提供する。
2022500346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択されるいずれか一つの保護基と結合されたものである請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドのＣ−末端は、アミノ基（−ＮＨ２）及びアジド（−ＮＨＮＨ２）からなる群から選択されるいずれか一つの保護基と結合されたものである請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、下記のような特性から選択されるいずれか一つ以上を示すものである請求項１に記載のペプチド：
（ａ）メラニン生成の抑制、
（ｂ）チロシナーゼ活性の抑制、及び
（ｃ）Ｒａｂ２７ａ、メラノフィリン（Ｍｌｐｈ）、ミオシン ＶＡ、ＭＩＴＦ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、チロシナーゼ、またはＴＲＰ１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）発現の抑制。
【請求項５】
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む皮膚美白用化粧料組成物。
【請求項６】
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む、過色素浸着性疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記過色素浸着性疾患は、シミ、そばかす、肝班、くすみ、老人性色素斑、または日光黒色腫である請求項６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
請求項１ないし４のうちいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として含む化粧料組成物を、個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚美白方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白活性を持つペプチド及びその用途に関する。 
【背景技術】
【０００２】
皮膚色を決定する因子としては、基本的に人種と地域、性別、年齢による差を除けば、シミ、そばかす、および紫外線露出による日焼けがあり、その他にも全体的な色素沈着、にきび、傷、角質の分布状態と血液の循環、ストレス、および健康状態などがある。前記の因子のうち色素沈着は、皮膚の色を決定する主要な因子として知られている。
【０００３】
皮膚の色に影響を与える色素としては、メラニン、メラノイド、カロチン、ヘモグロビン、およびカロチノイドなどがあり、皮膚、毛髪及び目の多様な色がこれら色素によって決定される。これらのうち皮膚の色を決定する最も重要な色素はメラニンであって、具体的に、メラニンの量及び分布によって色が決定される。メラニンは、皮膚表皮の下にメラニン形成細胞と呼ばれる細胞で生成され、皮膚の新陳代謝によって角質表面に移動して離れる。皮膚の色にかかわらず、メラニン形成細胞の数はほとんど同一であるが、但し、メラニンの生成量及び種類、分布が異なるため、皮膚の色に差がある。
【０００４】
皮膚でチロシンがチロシナーゼという人体酵素によってドーパ（ＤＯＰＡ）に転換され、続く一連の酸化過程を通じて最終的に黒褐色の重合体であるメラニンが生成される。メラニンが必要以上に多く生じれば、シミやそばかす、ほくろなどの過色素沈着症を引き起こして美容上に良くない結果をもたらす。一方、最近レジャー人口の増加によって外部で活動することを楽しむ人々が多くなりつつ、紫外線によるメラニン色素沈着を防ごうとする要求が増えている実情である。
【０００５】
このような技術的背景下で、メラニン形成細胞の活性阻害、チロシナーゼの活性阻害などのメカニズムを通じて、過度なメラニン生成を阻む美白剤の開発についての多角的な研究が進められているが（韓国公開特許第１０−２０１９−００５００５８号）、まだ不備な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
美白効能を持つ新規のペプチドを提供する。
【０００７】
前記ペプチドを含む化粧料組成物を提供する。
【０００８】
前記ペプチドを含む薬剤学的組成物を提供する。
【０００９】
前記ペプチドを用いた過色素浸着性疾患の予防、改善、または治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００１１】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは当業界で公知の化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）； Ｓｔｅｗａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ．ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造される。
【００１２】
前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、物学的に有効な活性を持つものである。前記生物学的に有効な活性は、（ａ）メラニン生成の抑制、（ｂ）チロシナーゼ活性の抑制、及び（ｃ）ＭＲａｂ２７ａ、メラノフィリン（Ｍｌｐｈ）、ミオシン ＶＡ、ＭＩＴＦ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、チロシナーゼ、またはＴＲＰ１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）発現の抑制などの特性から選択されるいずれか一つ以上を示すものである。よって、前記ペプチドは、皮膚美白または過色素浸着性疾患の予防、改善、または治療のための用途で用いられる。
【００１３】
前記ペプチドは、化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸水性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、減少した抗原性を獲得するために、ペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端、または両末端に保護基が結合してもいる。前記安定性は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から前記ペプチドを保護する生体内の安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も含む。前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、ブトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択されるいずれか一つの保護基と結合される。前記ペプチドのＣ−末端は、アミノ基（−ＮＨ２）、三級アルキル基、及びアジド（−ＮＨＮＨ２）からなる群から選択されるいずれか一つの保護基と結合される。また、前記ペプチドは選択的に、標的化配列、タグ、標識された残基、半減期またはペプチド安定性を高めるための特定の目的で製造されたアミノ酸配列もさらに含む。
【００１４】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む化粧料組成物、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む薬剤学的組成物、及び化粧料または薬剤学的組成物を製造するか、または化粧料または薬剤学的組成物として使うための配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドの用途を提供する。
【００１５】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
【００１６】
前記ペプチドは、前述した通りである。
【００１７】
用語「皮膚美白」は、メラニン色素の合成を阻害することで皮膚トーンを明るくするだけではなく、紫外線、ホルモンまたは遺伝に起因した皮膚の色素過多沈着を改善することを意味する。前記皮膚の色素過多沈着は、そばかす、シミ、肝斑、くすみ、老人性色素斑、または褐色の斑点などを含む。
【００１８】
従来の機能性ペプチドは、有効な生物学的活性にもかかわらず、ペプチド自体のサイズのため、標的組織または細胞に効果的に流入されないか、または半減期が短くて短期間に体内で消滅するという短所を示す。一方、一様相による皮膚美白用化粧料組成物は、１０個以下のアミノ酸からなるペプチドを有効成分として含み、これによって、有効成分の皮膚浸透率などが非常に優秀であり、例えば、局所的に皮膚に塗布する場合、有効な皮膚美白効果を得る。
【００１９】
用語「改善」は、状態の緩和または治療に係るパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させるすべての行為を意味する。
【００２０】
前記化粧料組成物は、前記ペプチドの化粧品学的有効量、及び／または化粧品学的に許容される担体を含む。用語「化粧品学的有効量」は、前記化粧料組成物の皮膚美白効能を達成するのに十分な量を意味する。化粧品学的有効量は、目的とする皮膚美白効果が現われるほどに、当業者が通常的な常識に基づいて定める。前記ペプチド及び化粧品学的に許容される担体の重量比は、例えば、５００：１ないし１：５００であり、一例として、前記重量比は、４５０：１ないし１：４５０、４００：１ないし１：４００、３５０：１ないし１：３５０、３００：１ないし１：３００、２５０：１ないし１：２５０、２００：１ないし１：２００、１５０：１ないし１：１５０、１００：１ないし１：１００、８０：１ないし１：８０、６０：１ないし１：６０、４０：１ないし１：４０、２０：１ないし１：２０、１０：１ないし１：１０、８：１ないし１：８、６：１ないし１：６、４：１ないし１：４、または２：１ないし１：２であるが、これに制限されるものではない。
【００２１】
前記化粧料組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型にも製造され、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含むクレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤型化されるが、これに制限されるものではない。例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォータ、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造される。
【００２２】
前記化粧料組成物の剤型がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。
【００２３】
前記化粧料組成物の剤型がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、例えば、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの推進体を含む。
【００２４】
前記化粧料組成物の剤型が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルを含む。
【００２５】
前記化粧料組成物の剤型が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エチルアルコールまたはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁液剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが用いられる。
【００２６】
前記化粧料組成物の剤型が界面−活性剤含有のクレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられる。
【００２７】
前記化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分以外に、化粧料組成物に通常的に用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常的な補助剤を含む。
【００２８】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む過色素浸着性の予防または治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００２９】
前記ペプチドは、前述した通りである。
【００３０】
用語「予防」は、前記組成物の投与で疾病の発病を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。用語「治療」は、疾病を患うか、または発病の危険がある個体に、前記個体の状態（例えば、一つ以上の症状）の改善、疾病進行の遅延、症状発生の遅延または症状進行の鈍化などを含む効果を提供する任意の形態の治療を意味する。よって、前記「治療」及び「予防」は、症状の治癒または完全な除去を意味するように意図されない。
【００３１】
前記「過色素浸着性疾患」は、皮膚にメラニン色素が過多に生成されて皮膚に浸着する疾患、すなわち、過色素浸着症状が現われる疾患をいう。前記過色素浸着性疾患は、例えば、シミ、そばかす、肝班、くすみ、老人性色素斑、または日光黒色腫である。
【００３２】
前記薬剤学的組成物は、前記ペプチドの薬剤学的有効量、及び／または薬剤学的に許容される担体を含む。
【００３３】
用語「薬剤学的有効量」は、前記薬剤学的組成物の過色素浸着性疾患の予防または治療効能を達成するのに十分な量を意味する。
【００３４】
前記ペプチド及び薬剤学的に許容される担体の重量比は、例えば、５００：１ないし１：５００であり、一例として、前記重量比は、４５０：１ないし１：４５０、４００：１ないし１：４００、３５０：１ないし１：３５０、３００：１ないし１：３００、２５０：１ないし１：２５０、２００：１ないし１：２００、１５０：１ないし１：１５０、１００：１ないし１：１００、８０：１ないし１：８０、６０：１ないし１：６０、４０：１ないし１：４０、２０：１ないし１：２０、１０：１ないし１：１０、８：１ないし１：８、６：１ないし１：６、４：１ないし１：４、または２：１ないし１：２であるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。好適な、薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００３６】
前記薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などをさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００３７】
前記薬剤学的組成物は、経口または非経口、望ましくは、非経口で投与でき、非経口投与である場合には、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与できるが、これに限定されるものではない。 
【００３８】
前記薬剤学的組成物の投与量は、１日当り０．０００１ないし１０００ｕｇ（マイクログラム、０．００１ないし１０００ｕｇ、０．０１ないし１０００ｕｇ、０．１ないし１０００ｕｇ、または１．０ないし１０００ｕｇであるが、これに制限されるものではない。前記投与は、１日１回ないし４回、２回ないし３回、または２回施す。また、本願の投与は、４週以上、８週以上、４週ないし１２週、または８週ないし１２週施す。前記投与は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によって多様に処方される。
【００３９】
前記薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することで、単位容量の形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造される。
【００４０】
前記剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤及び／または安定化剤をさらに含む。
【００４１】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む化粧料組成物を、個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚美白方法を提供する。
【００４２】
前記ペプチド、皮膚美白、及び化粧料組成物は前述した通りである。
【００４３】
用語「塗布する」は、「適用する」及び「投与する」と相互交換的に使われ、一実施形態による組成物の所望の部位での少なくとも部分的局所化をもたらすこと、または投与経路によって個体内に一様相による組成物を配置することである。
【００４４】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む薬剤学的組成物を個体に投与する段階を含む、過色素浸着性疾患の予防、改善、または治療方法を提供する。
【００４５】
前記ペプチド、薬剤学的組成物、過色素浸着性疾患の予防、改善、及び治療は、前述した通りである。
【００４６】
前記「個体」は、疾病の治療を要する対象を意味し、さらに具体的には、ヒトまたはヒトではない霊長類、マウス、犬、猫、馬、及び牛などの哺乳類を意味する。
【００４７】
他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む皮膚美白用食品組成物を提供する。 
【００４８】
前記ペプチド及び皮膚美白は、前述した通りである。
【００４９】
前記食品組成物に含有されている有効成分としてのペプチドの含量は、食品の形態、所望の用途などによって適当に非制限的に選択され、例えば、全体食品重量の０．０１ないし１５重量％で添加できる。さらに、例えば、健康飲み物組成物は、１００ｍｌを基準として０．０２ないし１０ｇ、望ましくは０．３ないし１ｇの割合で添加できる。
【発明の効果】
【００５０】
一様相によるペプチドによれば、メラニンの生成及びチロシナーゼ活性を有意的に抑制するだけではなく、メラニン生成関連因子の発現を抑制することで、優れた皮膚美白効果を示し、過色素浸着性疾患の予防、改善、または治療に適用できる。よって、一様相によるペプチドは、皮膚美白用組成物または過色素浸着性疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物の有効成分として活用される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをＢ１６Ｆ１０細胞に添加した後、メラニンの生成減少を確認した結果を示す図面である。
【図２】前記ペプチドをＢ１６Ｆ１０細胞に添加した後、チロシナーゼの活性減少を確認した結果を示す図面である。
【図３】前記ペプチドをＢ１６Ｆ１０細胞に添加した後、メラニン生成関連遺伝子であるＲａｂ２７ａ、Ｍｌｐｈ、ミオシンＶＡ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びＴＲＰ１の発現抑制を確認した結果を示す図面である。
【図４】前記ペプチドをＢ１６Ｆ１０細胞に添加した後、メラニン生成関連タンパク質であるＭｌｐｈ、Ｒａｂ２７ａ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、及びＭＩＴＦの発現抑制を確認した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞ ペプチドの合成
自動ペプチド合成器（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）を用いて、下記の表１に記載の配列番号１のアミノ酸配列を持つペプチドを合成し、Ｃ１８逆相の高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、アメリカ）を用いて、これらの合成されたペプチドを純水分離した。カラムは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ Ｃ１８（２．１ｍｍＸ１００ｍｍ，１．７ｕｍ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ、アメリカ）を用いた。
【００５４】
【表１】
2022500346.tif 000003
【００５５】
＜実施例２＞ 合成されたペプチドの美白効能（１）メラニン生成抑制効果の確認
マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０細胞を６−ウェルプレートに、５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で接種した後、これを１６時間培養した。次いで、培養培地を、２％（ｖ／ｖ）血清の含まれている培地に入れ替えた後、これに、メラニンの生成を促進するために、２００ｎｇ／ｍｌのα−ＭＳＨ（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅｓ）を添加し、これと共に、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドそれぞれを１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または２００μＭで添加した後、これを７２時間培養した。次いで、培養された細胞を１ＮのＮａＯＨで溶解させた後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。一方、対照群として、未処理群（Ｃｏｎ）を使い、陰性対照群として、α−ＭＳＨのみを添加した群、陽性対照群として、皮膚美白剤として知られている２００μＭまたは５００μＭのアルブチン及びα−ＭＳＨを添加した群を使った。
【００５６】
４５０ｎｍでの吸光度から、Ｂ１６Ｆ１０細胞が生成したメラニンの含量（％）を算出した。算出されたメラニン含量（％）を図１に示した。図１に示したように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの添加によって、濃度依存的にメラニンの生成が減少したということが分かった。
【００５７】
（２）チロシナーゼ活性抑制効果の確認
配列番号１のペプチドの、メラニン生成の核心酵素のチロシナーゼに対する活性抑制効果を確認した。
【００５８】
具体的に、マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０細胞を６−ウェルプレートに、５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で接種した後、これを１６時間培養した。次いで、培養培地を、２％（ｖ／ｖ）血清の含まれている培地に入れ替えた後、これに、２００ｎｇ／ｍｌのα−ＭＳＨを添加した。これと共に、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドそれぞれを１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、または１６０μＭで添加した後、これを７２時間培養した。氷の上に前記６−ウェルプレートを位置させ、冷たいＰＢＳで洗浄した。次いで、１％（ｖ／ｖ） Tｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が含有されている０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８、溶解緩衝液）を添加して、細胞を溶解させた。次いで、前記ウェルプレートに存在する細胞をスクレーパで掻いて１．５ｍｌチューブに集めた。回収した細胞は攪拌し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を得た。次いで、上澄み液内のタンパク質を定量して、一定量のタンパク質が含まれるように調整した後、これに緩衝液を添加し、総９０μLの試料を９６−ウェルプレート上に分注した。また、前記プレートで、実験試料、Ｂｌａｎｋ試料、陽性対照群の試料は、下記の表２に示したように用意した。
【００５９】
【表２】
2022500346.tif 000004
【００６０】
次いで、それぞれの試料に２０μＬの１０ｍＭＬ−ＤＯＰＡを添加した後、３７℃で１時間培養した後、４７５ｎｍでの吸光度を測定した。一方、対照群として、未処理群（Ｃｏｎ）を使い、陰性対照群として、α−ＭＳＨのみを添加した群、陽性対照群として、皮膚美白剤として知られている２００μＭまたは５００μＭのアルブチン及びα−ＭＳＨを添加した群を使った。算出されたチロシナーゼ活性（倍数）を、図２に示した。図２に示したように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの添加によって、チロシナーゼ活性が抑制されたということが分かった。
【００６１】
（３）メラニン生成関連遺伝子の発現抑制効果の確認
配列番号１のペプチドのメラニン生成関連遺伝子の発現が抑制されるかどうかを確認した。
【００６２】
具体的に、マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０細胞を６−ウェルプレートに、５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で接種した後、これを１６時間培養した。次いで、培養培地を、２％（ｖ／ｖ）血清の含まれている培地に入れ替えた後、これに、２００ｎｇ／ｍｌのα−ＭＳＨを添加した。これと共に、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドそれぞれを１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、または１６０μＭで添加した後、これを７２時間培養した。前記培養された細胞からｍＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ＆ＰＣＲ ｐｒｅ−ｍｉx（Ｉｎｔｒｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を使って、前記抽出されたｍＲＮＡを逆転写させることでそれぞれのｃＤＮＡを合成した。次いで、前記ｃＤＮＡとＲａｂ２７ａ、Ｍｌｐｈ（メラノフィリン）、ミオシンＶＡ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、またはＴＲＰ１増幅用プライマー対を使って、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った。一方、対照群、陰性対照群及び陽性対照群は、実施例２．（１）と同じ群を使い、本実施例で使ったプライマーの核酸配列は、下記表３の通りである。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
ＰＣＲ増幅結果から算出された発現変化を、図３に示した。図３に示したように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの添加によって、メラニン生成関連遺伝子であるＲａｂ２７ａ、Ｍｌｐｈ、ミオシンＶＡ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びＴＲＰ１の発現が抑制されたということが分かった。
【００６５】
（４）メラニン生成関連タンパク質の発現抑制効果の確認 
配列番号１のペプチドのメラニン生成関連タンパク質の発現が抑制されるかどうかを確認した。
【００６６】
具体的に、マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１０細胞を６−ウェルプレートに、５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で接種した後、これを１６時間培養した。次いで、培養培地を、２％（ｖ／ｖ）血清の含まれている培地に入れ替えた後、これに、２００ｎｇ／ｍｌのα−ＭＳＨを添加した。これと共に、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドそれぞれを１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭ、または１６０μＭで添加した後、これを７２時間培養した。次いで、培養された細胞を溶解した後、Ｍｌｐｈ、Ｒａｂ２７ａ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、またはＭＩＴＦに対する抗体（いずれもｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を使って、免疫ブロットを行った。一方、対照群、陰性対照群及び陽性対照群は、実施例２．（１）と同じ群を使った。
【００６７】
免疫ブロット結果から算出された発現変化を、図４に示した。図４に示したように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの添加によって、メラニン生成関連タンパク質であるＭｌｐｈ、Ｒａｂ２７ａ、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、及びＭＩＴＦの発現が抑制されたということが分かった。 
【００６８】
前記実験結果を総合すれば、一実施形態による配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、皮膚の美白効能を持つということが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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