(57)【要約】  対象から生体試料を収集する工程と；対象の生体試料中の少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化ステータスを決定する工程と；生体試料中のメチル化ステータスを確立されている閾値と比較し、対象がせん妄を患う可能性が高いかどうか決定する工程とにより対象の感受性を決定する方法が開示される。特定の態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＴＮＦアルファ、ＢＮＤＦ、ＧＤＮＦ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１およびＩＲＦ８から選択される遺伝子中に位置する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
せん妄に対する対象の感受性を決定する方法であって、
ａ．対象から生体試料を収集する工程と；
ｂ．対象の生体試料中の少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化ステータスを決定する工程と；
ｃ．生体試料中のメチル化ステータスを確立されている閾値と比較し、対象がせん妄を患う可能性が高いかどうか決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＴＮＦアルファ、ＢＮＤＦ、ＧＤＮＦ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１およびＩＲＦ８から選択される遺伝子中の位置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体の位置０５７３３１３５を含み、メチル化の検出が、対象がせん妄に感受性であることを示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＧＤＮＦ遺伝子内の５番染色体のｃｇ０２３２８２３９を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１、およびｃｇ０４４２５６２４から選択され、脱メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体のｃｇ２１２９５７２９を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体のｃｇ１０５１８９１１を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＩＲＦ８遺伝子内の１６番染色体のｃｇ４０１５７９４を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
メチル化されている１つまたは複数のＣｐＧ配列とメチル化されていない１つまたは複数のＣｐＧ配列の比を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象の少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化ステータスを決定することによってせん妄に対する対象の感受性を決定するためのキットであって、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出するキット。
【請求項１１】
ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、少なくとも１つの第２の核酸プライマーが、非メチル化ＣｐＧ配列を検出する、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、１つまたは複数の合成または非天然のヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
少なくとも１つの第１の核酸プライマーが結合している固体基材をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
基材が、ポリマー、ガラス、半導体、紙、金属、ゲルまたはヒドロゲルである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
固体基材が、マイクロアレイまたはマイクロ流体カードである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１７】
ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体のｃｇ２１２９５７２９でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、メチル化の検出が、せん妄に対する感受性の増大を示す、請求項１０に記載のキット。
【請求項１８】
ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１およびｃｇ４４２５６２４から選択されるＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、メチル化の検出が、せん妄に対する感受性の減少を示す、請求項１０に記載のキット。
【請求項１９】
ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体のｃｇ１０５１８９１１でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、メチル化の検出が、せん妄に対する感受性の増大を示す、請求項１０に記載のキット。
【請求項２０】
対象がせん妄を起こすか否か決定するためのコンピュータ実装される方法であって、
ａ．使用者について自己報告データを得る工程と；
ｂ．１つまたは複数の予測計算を実行して、使用者の予測される多部位ＣｐＧ配列メチル化比、予測される閾値メチル化ステータスおよび予測されるせん妄を決定する工程と；
ｃ．使用者について測定された多部位ＣｐＧ配列非メチル化レベルおよび測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化ステータスを提供する工程と；
ｄ．自己報告データ、１つまたは複数の予測計算、測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化および非メチル化レベルならびに測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化比に基づいて予測スコアを生成する工程と；
ｅ．予測スコアに基づいてせん妄の予測されるレベルを出力する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]本出願は、２０１９年９月１４日に出願され、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｒｉｕｍ  Ｒｉｓｋ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という表題の米国特許仮出願第６２／７３１，５９９号の優先権を主張し、その出願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[002]本開示は、エピジェネティックバイオマーカーデータを使用して患者のせん妄の危険性を検出するデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[003]本開示は、エピジェネティックバイオマーカーを利用して患者におけるせん妄の危険性を検出するためのデバイスおよび方法に関する。
[004]高齢患者においてせん妄は、一般的であり、危険を伴う。主要な危険因子には、加齢および感染または手術などの外因性傷害がある。動物モデルにおいて、加齢は、外因性傷害に応答してミクログリアからの炎症誘発性サイトカイン放出を増強する。エピジェネティック機構であるＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍ）は、遺伝子発現を調節し、年齢とともに変化する。高齢個体は、傷害に応じたサイトカインの増大に影響するメチル化変化を有する場合があるが、加齢が、サイトカイン遺伝子のＤＮＡｍに影響を及ぼす程度は十分に理解されていない。
【０００４】
[005]患者、特に、感染または手術などの傷害後の高齢患者においてせん妄の危険性を正確に予測し、検出するための費用効率が高く、簡単な方法およびデバイスに対する必要性が当業者に存在する。開示される発明は、医師に早期の介入決定を行うための情報を提供する。より早期にせん妄またはせん妄の高い可能性を検出することができれば、社会的費用はより低くなり、患者に必要とされる医療の量も減少する。本発明による入院期間の大幅な減少は、患者、医師および保健納付者のいずれかに肯定的影響を与えることになる。
【０００５】
[006]複数の実施形態が開示されるが、本開示のなお他の実施形態は、開示される装置、システムおよび方法の例示的な実施形態を示し、記載する以下の詳細な説明から当業者に明らかになろう。理解されるであろうが、開示される装置、システムおよび方法は、すべて本開示の精神と範囲から逸脱することなく、様々な明らかな態様において修飾することができる。したがって、図面および詳細な説明は、事実上例示的であり、制限的ではないと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[007]せん妄に対する対象の危険性および／または感受性を検出するための様々なデバイスならびに方法が、本明細書に開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[008]特定の実装形態において、せん妄に対する対象の感受性を決定する方法であって、対象から生体試料を収集する工程と；対象の生体試料中の少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化ステータスを決定する工程と；生体試料中のメチル化ステータスを確立されている閾値と比較し、対象がせん妄を患う可能性が高いかどうか決定する工程とを含む方法が開示される。
【０００８】
[009]特定の態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＴＮＦアルファ、ＢＮＤＦ、ＧＤＮＦ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１およびＩＲＦ８から選択される遺伝子中に位置する。さらなる態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５を含み、メチル化の検出は、対象がせん妄に感受性であることを示す。さらに他の態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＧＤＮＦ遺伝子内の５番染色体のｃｇ０２３２８２３９を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す。なおさらなる態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１およびｃｇ０４４２５６２４から選択され、脱メチル化の検出は、せん妄を起こす可能性の増大を示す。さらに他の態様において、少なくとも１つのＣｐＧ配列は、ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体のｃｇ２１２９５７２９を含み、メチル化の検出は、せん妄を起こす可能性の増大を示す。少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体のｃｇ１０５１８９１１を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す方法。少なくとも１つのＣｐＧ配列が、ＩＲＦ８遺伝子内の１６番染色体のｃｇ４０１５７９４を含み、メチル化の検出が、せん妄を起こす可能性を示す方法。メチル化されている１つまたは複数のＣｐＧ配列とメチル化されていない１つまたは複数のＣｐＧ配列の比を決定する工程をさらに含む方法。記載された技術の実装形態は、ハードウェア、方法もしくは工程、またはコンピュータ利用可能な媒体上のコンピューターソフトウェアを含み得る。
【０００９】
[010]対象の少なくとも１つのＣｐＧ配列のメチル化ステータスを決定することによってせん妄に対する対象の感受性を決定するためのキットが、本明細書にさらに開示され、キットは、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出する。
【００１０】
[011]特定の態様において、キットは、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、少なくとも１つの第２の核酸プライマーは、非メチル化ＣｐＧ配列を検出する。さらなる態様において、少なくとも１つの第１の核酸プライマーは、１つまたは複数の合成または非天然のヌクレオチドを含む。なおさらなる態様において、キットは、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが結合している固体基材をさらに含む。さらに他の態様において、基材は、ポリマー、ガラス、半導体、紙、金属、ゲルまたはヒドロゲルである。いっそうさらなる態様において、固体基材は、マイクロアレイまたはマイクロ流体カードである。さらなる態様によると、キットは検出可能な標識をさらに含む。なおさらなる態様において、キットは、ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体のｃｇ２１２９５７２９でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーをさらに含み、メチル化の検出は、せん妄に対する感受性の増大を示す。さらに他の態様において、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１およびｃｇ４４２５６２４から選択されるＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーならびにメチル化の検出は、せん妄に対する感受性の減少を示す。なおさらなる態様において、キットは、ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体のｃｇ１０５１８９１１でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第２の核酸プライマーを含み、メチル化の検出は、せん妄に対する感受性の増大を示す。
【００１１】
[012]使用者について自己報告データを得る工程と；１つまたは複数の予測計算を実行して、使用者の予測される多部位ＣｐＧ配列メチル化比、予測される閾値メチル化ステータスおよび予測されるせん妄を決定する工程と；使用者について測定された多部位ＣｐＧ配列非メチル化レベルおよび測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化ステータスを提供する工程と；自己報告データ、１つまたは複数の予測計算、測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化および非メチル化レベルならびに測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化比に基づいて予測スコアを生成する工程と；予測スコアに基づいてせん妄の予測されるレベルを出力する工程とによって対象がせん妄を起こすか否かを決定するためのコンピュータ実装される方法が本明細書にさらに開示される。他の実装形態は、対応するコンピュータシステム、装置および１つまたは複数のコンピュータ記憶デバイス上に記録されているコンピュータプログラムを含み、それぞれは、本方法の動作を実行するために構成される。
【００１２】
[013]複数の実施形態が開示されるが、本発明のなお他の実施形態は、本発明の例示的な実施形態を示し、記載する以下の詳細な説明から当業者に明らかになろう。理解されるように、本発明は、すべて本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な明らかな態様において修飾することができる。したがって、図面および詳細な説明は、事実上例示的であり、制限的ではないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[014]ＴＮＦアルファ遺伝子中の上位２つのＣｐＧ部位のうちの１つ、ｃｇｃｇ１０６５０８２１を図示する相関表であり、年齢と血液試料のＤＮＡメチル化との関係を例示する。
【図２】[015]ＴＮＦアルファ遺伝子中の上位２つのＣｐＧ部位のうちの１つ、ｃｇｃｇ０１５６９０８３を図示する相関表であり、年齢と血液試料のＤＮＡメチル化との関係を例示する。
【図３】[016]年齢と血液中のＴＮＦアルファ発現との関係を例示する相関表である。
【図４】[017]年齢とＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＩＬ−８遺伝子におけるＤＮＡメチル化との相関を図示する着色した表である。
【図５Ａ】[018]せん妄事例および非せん妄事例に対して年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のｃｇ０１３６０６２７における血液ＤＮＡメチル化に関する相関表である。
【図５Ｂ】[019]せん妄事例および非せん妄事例に対して年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のｃｇ２３３８４７０８における血液ＤＮＡメチル化に関する相関表である。
【図５Ｃ】[020]せん妄事例および非せん妄事例に対して年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のｃｇ２０４７７２５９における血液ＤＮＡメチル化に関する相関表である。
【図５Ｄ】[021]せん妄事例および非せん妄事例に対して年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のｃｇ０６８２５４７８における血液ＤＮＡメチル化に関する相関表である。
【図６】[022]せん妄事例と非せん妄事例とで比較した、年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のＣｐＧ  ２４個における血液ＤＮＡメチル化との相関を図示する着色した表である。
【図７】[023]６名の患者の年齢とグリア細胞、ニューロン試料および血液試料中のＴＮＦアルファ遺伝子中のＣｐＧ  ２４個におけるＤＮＡメチル化との相関を示す着色した表である。
【図８Ａ】[024]年齢に伴うＤＮＡｍ変化を示すデータを示す図である。脳ＩＬ−６  ｃｇ２３７３１３０４  ＤＮＡｍにおける変化と年齢は有意に相関した。
【図８Ｂ】[025]年齢に伴うＤＮＡｍ変化を示すデータを示す図である。血液ＩＬ−６  ｃｇ２３７３１３０４  ＤＮＡｍにおける変化は、加齢に伴う脳と類似の傾向を示した。
【図８Ｃ】[026]年齢に伴うＤＮＡｍ変化を示すデータを示す図である。血液および脳ＩＬ−６  ｃｇ２３７３１３０４における変化は、有意に相関した。
【図９】[027]ＧＴＰコホートから得られた血液試料の年齢とＤＮＡｍレベルの相関を示す図である。
【図１０】[028]ＧＴＰコホートから得られた血液試料の年齢とＴＮＦアルファ発現レベルの相関を示す図である。
【図１１】[029]せん妄事例および非せん妄対照の人口統計学的データを示す図である。
【図１２】[030]せん妄事例対非せん妄対照間で比較した、年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のＣｐＧ  ２４個における血液ＤＮＡｍとの相関を示す図である。
【図１３】[031]個々のＣｐＧ差異の分布および対応する対数変換されたｐ値（ｎ＝８７）に対するボルケーノプロットを示す図である。
【図１４】[032]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧの上位２０個を示す図である。
【図１５】[033]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の上位２０経路の結果を示す図である。
【図１６】[034]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＫＥＧＧ分析の上位２０経路の結果を示す図である。
【図１７−１】[035]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の有意な経路の結果を示す図である。
【図１７−２】[035]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の有意な経路の結果を示す図である。
【図１７−３】[035]せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の有意な経路の結果を示す図である。
【図１８】[036]せん妄（ｎ＝４３）対対照（ｎ＝４４）における暦年齢とＤＮＡｍ年齢との相関を示す図である。
【図１９】[037]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２０Ａ】[038]年齢と上位２つのＣｐＧにおけるベータ値との相関を示す図である。
【図２０Ｂ】[039]年齢と上位２つのＣｐＧにおけるベータ値との相関を示す図である。
【図２１−１】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２１−２】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２１−３】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２１−４】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２１−５】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２１−６】[040]年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２２−１】[041]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２２−２】[041]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２３−１】[042]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２３−２】[042]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２３−３】[042]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２３−４】[042]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２３−５】[042]年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関を示す着色した表である。
【図２４−１】[043]ＥＯＤコホートにおけるせん妄事例対非せん妄対照間で比較した年齢とＢＤＮＦ遺伝子中のＣｐＧ  ８３個における血液ＤＮＡｍとの相関を示す着色した表である。
【図２４−２】[043]ＥＯＤコホートにおけるせん妄事例対非せん妄対照間で比較した年齢とＢＤＮＦ遺伝子中のＣｐＧ  ８３個における血液ＤＮＡｍとの相関を示す着色した表である。
【図２４−３】[043]ＥＯＤコホートにおけるせん妄事例対非せん妄対照間で比較した年齢とＢＤＮＦ遺伝子中のＣｐＧ  ８３個における血液ＤＮＡｍとの相関を示す着色した表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[044]範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書に表され得る。そのような範囲が表される場合、さらなる態様は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用して、特定の値が、さらなる態様を形成することが理解されよう。範囲のそれぞれの終点が、他の終点と関連して、および他の終点とは独立して両方で有意であることはさらに理解されよう。本明細書においていくつかの値が開示され、各値はまた、値自体に加えて「約」特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。また、２つの特定の単位間の各単位が開示されることも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４も開示される。
【００１５】
[045]本明細書では、用語「対象」は、投与の標的、例えば、動物のことを指す。したがって、本明細書に開示される方法の対象は、哺乳動物、魚、トリ、爬虫類または両生類などの脊椎動物であり得る。別法として、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯動物であり得る。用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、雄か雌かに関わらず、成体および新生対象ならびに胎児が網羅されることを意図する。一態様において、対象は哺乳動物である。患者とは、疾患または障害に苦しむ対象のことを指す。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【００１６】
[046]本明細書では、用語「処置」とは、疾患、病的状態もしくは障害を治療、寛解、安定化または防止することを意図した患者の医学的管理のことを指す。この用語は、積極的な処置、すなわち、疾患、病的状態または障害の改善のために特に行われる処置を含み、さらに、原因処置、すなわち関連する疾患、病的状態または障害の原因の除去のために行われる処置を含む。加えて、この用語は、緩和処置、すなわち、疾患、病的状態または障害の治療よりもむしろ徴候の軽減のために設計された処置；予防的処置、すなわち、関連する疾患、病的状態もしくは障害の発症を最小化するまたは部分的もしくは完全に阻害するために行われる処置；および支持的処置、すなわち、関連する疾患、病的状態または障害の改善のために行われる別の特定の療法を補うために利用される処置を含む。様々な態様において、用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含めた患者のあらゆる処置も網羅し：（ｉ）疾患の素因があり得るが、疾患を有するとまだ診断されていない患者において疾患が起こることを防止する；（ｉｉ）疾患を阻害する、すなわち、発症を抑制する；または（ｉｉｉ）疾患を軽減する、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。一態様において、患者は霊長類などの哺乳動物であり、さらなる態様において、患者はヒトである。
【００１７】
[047]ＣｐＧアイランドは、ＣｐＧ配列の頻度が他の領域より高いＤＮＡの短い区間である。用語ＣｐＧにおける「ｐ」は、シトシン（「Ｃ」）およびグアニン（「Ｇ」）がホスホジエステル結合によって接続されていることを示す。ＣｐＧアイランドは、ハウスキーピング遺伝子および多くの調節される遺伝子のプロモーターの周りにしばしば位置する。これらの場所で、ＣｐＧ配列は、活性な遺伝子においてはメチル化されていない。それに対し、不活性遺伝子においてＣｐＧ配列は、通常メチル化されてその遺伝子の発現を抑制している。
【００１８】
[048]ＣｐＧアイランドのメチル化は、そのようなメチル化を決定するのに適切な任意の方法を使用して当業者によって決定され得る。例えば、当業者は、バイサルファイト反応に基づく方法を使用してそのようなメチル化を決定することができる。
【００１９】
[049]ＴＮＦアルファ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１、ＩＲＦ８  ＩＬ−１ベータ、Ｉｌ−２、ＩＬ−６および／またはＩＬ−８遺伝子に特異的な少なくとも１つのプローブを含む、対象がせん妄に対する素因を有するかもしくはせん妄を有する可能性があるか（例えば感受性）決定するためのスクリーニングキットが開示される。特定の実施形態において、キットは、固体基材をさらに含み、各プローブは、固有の箇所において基材に結合している。特定の実施形態において、プローブは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＮＦアルファ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１および／またはＩＲＦ８のＣｐＧ残基でメチル化を検出する。特定の実施形態において、基材は、ポリマー、ガラス、半導体、紙、金属、ゲルまたはヒドロゲルである。特定の実施形態において、キットは、少なくとも１つの対照プローブをさらに含み、少なくとも１つの対照プローブは、固有の箇所において基材に結合している。特定の実施形態において、固体基材は、マイクロアレイまたはマイクロ流体カードである。特定の実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチドプローブまたは核酸誘導体プローブである。
【００２０】
[050]本開示は、バイサルファイト処理ＤＮＡを使用して、末梢血細胞においてＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化ステータスもしくはその誘導体を決定することによって対象が、せん妄を有するまたは発症する可能性が有るかどうか決定する診断方法を提供し、ＣｐＧ配列のメチル化ステータスは、せん妄と関連する。特定の実施形態において、本方法は、複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化ステータスを決定する。そのような複数性は、少なくとも１００など１〜１００００の任意の整数であり得る。
【００２１】
[051]メチル化ステータスがせん妄に対する感受性と関連する任意の１つまたは複数のＣｐＧ配列を本明細書における方法および／またはキットにおいて使用して、予測値（例えば、せん妄を発症する可能性を表す）を決定することができる。ＣｐＧ配列には、表３に挙げたものがあるが、これに限定されない。せん妄に対する感受性と関連するとして本明細書に開示される他の任意のＣｐＧ配列が、さらに含まれる。特にせん妄感受性を決定することに対して、より多くのＣｐＧ配列（すなわち、メチル化ステータスがせん妄感受性と関連しているＣｐＧ配列）が評価されるほど、予測値がより正確になることは理解されよう。
【００２２】
【表１】
2022500087.tif 000002
【００２３】
[052]特定の実施形態において、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１またはｃｇ０４４２５６２４から選択されるＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、非メチル化ＣｐＧ配列を検出し、脱メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するためのキットが開示される。特定のさらなる実施形態において、キットは、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体のｃｇ２６７２９３８０、ｃｇ１０６５０８２１、またはｃｇ０４４２５６２４でＣｐＧ配列の上流もしくは下流に結合する第２および／もしくは第３のプライマーをさらに含む。
【００２４】
[053]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体の３１５４３６５５、３１５４３６８６または３１５４３５６５から選択される位置でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーであり、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、脱メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となるプライマーを含む。特定のさらなる実施形態において、キットは、ＴＮＦアルファ遺伝子内の６番染色体の位置３１５４３６５５、３１５４３６８６または３１５４３５６５でＣｐＧジヌクレオチドの上流もしくは下流に結合する第２および／もしくは第３のプライマーをさらに含む。
【００２５】
[054]特定の実施形態において、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体のｃｇ０５７３３１３５でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出し、メチル化がせん妄に対する感受性の指標となる、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するためのキットが開示される。
【００２６】
[055]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＢＤＮＦ遺伝子内の１１番染色体の位置２７７４０８７６でＣｐＧジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーは、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００２７】
[056]特定の実施形態において、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するための開示されたキットは、ＧＤＮＦ遺伝子内の５番染色体のｃｇ０２３２８２３９でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００２８】
[057]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＧＤＮＦ遺伝子内の５番染色体の位置３７８３７４６３でＣｐＧジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００２９】
[058]特定の実施形態において、ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体のｃｇ２１２９５７２９でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するためのキットが開示される。
【００３０】
[059]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＬＤＬＲＡＤ４遺伝子内の１８番染色体の位置３７８３７４６３でＣｐＧジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００３１】
[060]特定の実施形態において、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するための開示は、ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体のｃｇ１０５１８９１１でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００３２】
[061]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＤＡＰＫ１遺伝子内の９番染色体の位置９０１７２０４６でＣｐＧジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００３３】
[062]特定の実施形態において、ＩＲＦ８遺伝子内の１６番染色体のｃｇ０４０１５７９４でＣｐＧ配列を含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的な少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧ配列を検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる、対象がせん妄に対する素因を有するかまたはせん妄を有する可能性があるか決定するためのキットが開示される。
【００３４】
[063]特定の実装形態において、開示されるキットは、ＩＲＦ８遺伝子内の１６番染色体の位置８５９４７８６６でＣｐＧジヌクレオチドを含むバイサルファイト変換された核酸配列に対して相補的である少なくとも８ヌクレオチド長の少なくとも１つの第１の核酸プライマーを含み、少なくとも１つの第１の核酸プライマーが、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを検出し、メチル化が、せん妄に対する感受性の指標となる。
【００３５】
[064]特定の実施形態において、開示される方法は、ＰＣＲ（重合連鎖反応）アッセイによって実行される。一部の事例において、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイの形態を取ることになる。これらＰＣＲアッセイの特定の実施形態において、キットは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＬＤＬＲＡＤ４、ＤＡＰＫ１および／またはＩＲＦ８座の領域を特異的に増幅する２つのプライマーならびに増幅された領域を選択的に認識する遺伝子特異的プローブを含有してもよい。合わせて、プライマーおよび遺伝子特異的プローブは、プライマー−プローブセットと呼ばれる。ＰＣＲ反応の所与の時点またはＰＣＲ反応の全体を通じて増幅された区分にハイブリダイズする遺伝子特異的プローブの量を測定することにより、当業者は、反応開始時にもともと存在していた核酸の量を推測することができる。一部の例において、ハイブリダイズしたプローブの量は、蛍光分光測光法によって測定される。プライマー−プローブセットの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、．．．９９９７、９９９８、９９９９、１００００個など、１〜１００００個の任意の整数のプローブであり得る。一キットにおいて、プローブのすべては、単一の反応ウェルまたは複数の反応ウェル中に物理的に置かれてもよい。プローブは、乾燥または液体の形態でもよい。それらは、単一反応または一連の反応に使用されてもよい。特定の実施形態において、プローブはオリゴヌクレオチドプローブである。特定の実施形態において、プローブは核酸誘導体プローブである。
【００３６】
[065]本発明の特定の実施形態は、単離されたまたは実質的に精製された核酸組成物を包含する。本発明の文脈において、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子は、天然の環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではないＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子である。単離されたＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子は、精製された形態で存在してもよく、または例えばトランスジェニック宿主細胞内など非天然の環境中に存在してもよい。例えば、「単離された」または「精製された」核酸分子が、組換え技術によって作製された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学的に合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。一実施形態において、「単離された」核酸は、核酸が得られる生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００３７】
[066]「天然に存在する」は、人工的に作製されたものとは異なる天然に見い出され得る組成物について記載するために使用される。例えば、生物中に存在するヌクレオチド配列は天然に存在しており、その配列は、天然の供給源から単離され得、研究室内で人によって意図的に修飾されていない。
【００３８】
[067]対象が、せん妄を起こすか否か決定するためのコンピュータ実装される方法がさらに開示され、本方法は、使用者について自己報告データを得る工程と；１つまたは複数の予測計算を実行して、使用者の予測される多部位ＣｐＧ配列メチル化比、予測される閾値メチル化ステータスおよび予測されるせん妄を決定する工程と；使用者について測定された多部位ＣｐＧ配列非メチル化レベルおよび測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化ステータスを提供する工程と；自己報告データ、１つまたは複数の予測計算、測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化および非メチル化レベルならびに測定された多部位ＣｐＧ配列メチル化比に基づいて予測スコアを生成する工程と；予測スコアに基づいてせん妄の予測されるレベルを出力する工程とを含む。
【００３９】
[068]本明細書において引用される刊行物および特許のすべては、個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれるために具体的かつ個別に指示されるかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されている関連する方法および／または材料を開示ならびに記載するために参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は、本出願日前のその開示のためのものであり、本発明が、先行発明によりこれら刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきでない。さらに、提供される公開日は、それぞれ独立に確認される必要があり得る実際の公開日と異なる場合がある。
【実施例】
【００４０】
[069]以下の例は、本明細書において請求される化合物、組成物、製品、デバイスおよび／または方法が、どのように作られ、評価されるかという特定の例の完全な開示および説明を当分野の技術者に提供するために記載されるものであり、本発明の単なる例示であることを目的とし、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを目的としない。しかしながら、当業者は、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行い、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなお得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【００４１】
実施例１
[070]サイトカイン遺伝子におけるＤＮＡｍパターンが、加齢と相関するかどうか試験するために、ＧＴＰ対象２６５名（年齢範囲１８〜６５歳）の血液試料に基づくデータセットを最初に使用した。
【００４２】
[071]図１は、患者が高齢になるにつれてｒ＝−０．４１およびｐ値、２．８５×Ｅ−１２でＤＮＡｍの減少の証拠を提供するＴＮＦアルファのｃｇ１０６５０８２１部位を例示する。図２は、ｒ＝−０．３８９およびｐ値、５．２１×Ｅ−１１のｃｇ０１５６９０８３における類似の結果を例示する。さらに、図３は、年齢と血液中のＴＮＦアルファ発現レベルとの相関を示す。結果は、ｒ＝０．３７およびｐ値、３．８４×Ｅ−７であった。相関表は、加齢に伴うＤＮＡｍ変化およびサイトカイン遺伝子の発現の増大が、せん妄の危険性の指標に関するエピジェネティックマーカーとして使用され得るという主張を示し、支持する。
【００４３】
[072]図１〜図４に示すように、最も高い相関は、ｃｇ１０６５０８２１であった（ｒ＝−０．４１；ｐ値、２．８５×Ｅ−１２）（図１〜図４）。ＴＮＦアルファ中のＣｐＧ全２７個は、少なくとも名目上有意であり、そのうちの８個はゲノム規模の有意レベルで有意であった（ｐ＜５×Ｅ−８）（図３）。さらに、これらサイトカイン発現レベルの試験により、血液中のＴＮＦアルファ発現が、加齢と有意な正の関連性を有することが確認された（ｒ＝０．３７、ｐ＝３．８４×Ｅ−７）（図３）。
【００４４】
[073]図４は、年齢と血液試料のＤＮＡｍレベルとで関連を呈したＣｐＧ  ２８個に対するロー値およびｐ値を提供する。大多数のＣｐＧは、ＴＮＦアルファ遺伝子由来であった。他の遺伝子由来のＣｐＧを表中で、灰色で強調する。
【００４５】
[074]図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、ＴＮＦアルファ場所ｃｇ０１３６０６２７、ｃｇ２３３８４７０８、ｃｇ２０４７７２５９、ｃｇ０６８２５４７８におけるせん妄有りおよび無し患者の経時的なＤＮＡｍパターンの証拠を提供する。表中、赤色はせん妄有り患者を示し、青色データポイントはせん妄無し患者を示す。４つすべてが、統計的に有意な値ａ＝０．０５でせん妄有りの患者とせん妄無しの患者の固有のパターンを示す。
【００４６】
[075]図６は、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄに示したものと同じ相関だが、ＣｐＧ  ２４個について示す表である。赤色のロー値セルは、ＤＮＡｍと年齢との逆相関を示し、青色は正相関を示す。非せん妄患者においてＣｐＧのおよそ半分は正相関を有し、半分は逆相関を有する。せん妄患者において試験したＣｐＧのうち２つ以外のすべては、年齢とＤＮＡｍの間に逆相関をもたらした。
【００４７】
[076]図７は、年齢とグリア細胞試料、ニューロン細胞および血液細胞試料中のＴＮＦアルファ遺伝子のＣｐＧ  ２４個におけるＤＮＡｍとの相関を図示する。前述の如く、赤色セルは年齢とＤＮＡｍ間の逆相関を示し、青色セルは正相関を示す。この実例は、グリア細胞のＤＮＡメチル化が、サイトカイン遺伝子において加齢とともに変化するという主張に対する支持を提供する。
【００４８】
[077]特定の実施形態によれば、ＴＮＦアルファ遺伝子は、医師が情報に基づいて決定を行うのに必要な予測情報を提供する。血液試料などの生体試料が収集され、増幅された後、その試料は配列決定され、分析され得る。分析は、ＴＮＦアルファ遺伝子内の複数のＣｐＧ部位を網羅する。複数のＣｐＧ部位を利用することにより偽陽性の可能性が低下する。
【００４９】
[078]本実施例において、異なる２つのコホートの試料を使用して、加齢とサイトカイン遺伝子のＤＮＡｍとの関連を調べた。一方のコホートは、脳外科手術的に切除された脳組織および血液試料が同時に収集された医学的に難治性のてんかん患者の組であった［脳外科手術コホート（ＮＳＧ）］。加えて、ＤＮＡｍを含む血液試料および発現データを、Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＧＴＰ）の対象２６５名の独立した、大きなコホートから使用した（Ｓｍｉｔｈら、２０１１年）。
方法および材料
ＮＳＧコホートの研究対象および試料収集
[079]研究参加者および試料収集工程のより詳細な概要については、これまでに記載されている（Ｂｒａｕｎら、２０１７年；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、２０１７年）。簡潔には、２０１４年３月〜２０１７年４月にアイオワ大学病院・クリニックで脳外科手術を受けた医学的に難治性のてんかん対象２１名を本研究に募集した。本研究は、アイオワ大学のヒト対象研究施設内倫理委員会によって承認された。書面による同意書を得、全血試料をＥＤＴＡ管に、唾液をＯｒａｇｅｎｅ  ＤＩＳＣＯＶＥＲ（商標）キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．ＯＧＲ−５００）で、および口腔組織をスワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ、２５−１５０６  １ＰＦ  ＴＴ  ＭＣ）で収集した。切除した脳組織試料を直ちに貯蔵し、ドライアイス上に移し、各脳領域の一部を病理検査に送った。すべての試料を−８０℃で貯蔵した。一般に、血液試料は、手術室において手術終了時に採取され、唾液および口腔スワブは、手術後２日以内に収集された。ＦＡＣＳを、前述のとおり実行した（Ｂｒａｕｎら、２０１７年；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、２０１７年）。
試料処理およびエピジェネティクスプラットフォーム
[080]メチロームアッセイを前述のとおり実行した。簡潔には、唾液、口腔および全血からのゲノムＤＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＭＣＤ８５２０１）で単離した。ＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００２）を使用してバイサルファイト変換した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＷＧ−３１７−１００２）を使用して、対象２１名の脳、血液、唾液および口腔試料のＤＮＡｍを分析した。生データを、ＲパッケージＲｎＢｅａｄｓおよびＭｉｎｆｉを使用して処理し（Ａｒｙｅｅら、２０１４年；Ｆｏｒｔｉｎら、２０１７年）；これにより差異的メチル化分析に加えて、品質管理検査、データ選別およびデータの標準化が可能になる（Ａｒｙｅｅら、２０１４年；Ａｓｓｅｎｏｖら、２０１４年；Ｆｏｒｔｉｎら、２０１７年）。
統計的分析
[081]すべての統計的分析を、Ｒで実行した（Ｔｅａｍ、２０１７年）。ＤＮＡｍ相関を、各組織に対する平均メチル化を使用してピアソンの相関により算出した。サイトカイン遺伝子の相関を、アレイ上に存在するそれら遺伝子のＣｐＧと実行した。加齢とＤＮＡｍとの相関の程度を、試験したサイトカイン遺伝子における各ＣｐＧについて算出した。相関係数およびその有意レベルを、Ｒパッケージｌｉｍｍａを使用してスピアマンの検定により算出した（Ｓｍｙｔｈら、２００５年）。
ＧＴＰコホートのデータ
[082]Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔの詳細な試料収集は、Ｓｍｉｔｈら（２０１１年）に見ることができる（Ｓｍｉｔｈら、２０１１年）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＤＮＡｍデータを、以前に記載されているパイプラインによって処理した（Ｒａｔａｎａｔｈａｒａｔｈｏｒｎら、２０１７年）。簡潔には、Ｉｎｆｉｎｉｕｍプロトコールを、対照プローブの目視検査による各ステップで評価し、その後バックグラウンド標準化したベータ値、メチル化シグナル、非メチル化シグナルおよび検出ｐ値をＲに転送した（ＩｈａｋａおよびＧｅｎｔｌｅｍａｎ、１９９６年）。ＲパッケージＣｐＧａｓｓｏｃに基づいて、低強度試料（プローブ検出コールレート＜９０％および全体の中央値の半分または２０００任意単位より小さい平均強度値）および検出ｐ値＞０．００１のプローブを除去した（Ｂａｒｆｉｅｌｄら、２０１２年）。性染色体にクロスハイブリダイゼーションするプローブも除去した（Ｃｈｅｎら、２０１３年）。１型および２型プローブをベータ混合分位数標準化で標準化し、その後ＣｏｍＢａｔ手順を２回行って性別およびＰＴＳＤのステータスを管理しながらチップ効果、次いで位置効果を除去した（Ｌｅｅｋら、２０１２年；Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆら、２０１３年）。分析前に、β値をＭ値にログ変換した（Ｄｕら、２０１０年）。
【００５０】
[083]遺伝子発現分析の場合、ＲＮＡを、すべての参加者について午前８時３０分頃にＴｅｍｐｕｓ管に収集した全血から抽出した。すべての試料は、Ｂｙｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）６を有した。プローブが、試料の５％において検出ｐ値＜０．０１を有した場合、プローブは十分に発現したと見なした。合計１５８７７個のプローブがこれらの基準を満たした。アレイをｌｏｇ２変換し、Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄを使用して標準化した（Ｍｅｃｈａｍら、２０１０年）。
結果
患者人口動態
ＮＳＧ研究
[084]ＮＳＧ対象２１名の脳および周辺組織試料を分析した、中でも７名が女性であり、平均年齢は３１歳（ＳＤ±１６．４）であった。切除し、分析した脳領域は、側頭皮質（患者１１名）、前頭皮質（患者４名）、海馬（患者４名）および後頭骨エリア（患者２名）を含んだ。蛍光活性化細胞分別法（ＦＡＣＳ）を脳組織に対して実行して、ニューロンマーカーについて陽性の細胞を分離し、分析に充分なＤＮＡ量のニューロン陽性（ニューロン）試料６個およびニューロン陰性（グリア）試料１３個を得た。
ＧＴＰ研究
[085]ＧＴＰコホートに関する詳細な情報については、これまでに記載されている（Ｓｍｉｔｈら、２０１１年）。簡潔には、利用可能なＤＮＡｍおよび発現データを含む合計試料サイズは２６５個であり、７１％は女性であり、収集時の平均年齢は４２歳（ＳＤ±１２）であった。試料の９４パーセントをアフリカ系アメリカ人個体から受け取り、５％を白色人種の個体から受け取った。
ＮＳＧ脳および血液試料のＤＮＡメチル化
[086]ＮＳＧ研究（Ｂｒａｕｎら、２０１７年；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、２０１７年）のデータセットを最初に使用して、サイトカイン遺伝子におけるＤＮＡｍパターンが脳の加齢と相関しているかどうか見た。脳外科手術の間に切除した脳組織において対象（年齢範囲５〜６２歳）の全体でＤＮＡｍレベルと年齢との関連を見た。炎症誘発性サイトカイン遺伝子、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＴＮＦアルファを選択して、どれが合計５２個のＣｐＧを含むか試験した。６つのＣｐＧが、名目有意性（ｐ＜０．０５）で加齢と相関した。２０試験のうち１つが単独で偶然に有意ならば、５２個のＣｐＧのうち２．６個が偶然に有意であると予想した。上位のヒットは、ＩＬ−６（ｃｇ２３７３１３０４）であり、ロー値、−０．７３およびｐ値、０．０００６０を有した（図８ａ）。これは、多重試験に対する補正後でも０．０５／５２＝０．０００９６のレベルで有意であった。次いで血液においてこの特別なＣｐＧおよびＤＮＡｍ傾向を見、ローは、−０．４２でありｐ値は、０．０７５であることが判明した（図８ｂ）。このＣｐＧにおいて脳と血液間のＤＮＡｍの相関も有意であった（ロー＝０．６５；ｐ値＝０．００２６）（図８ｃ）。
ＧＴＰコホート、合計２６５名の対象の血液試料のＤＮＡメチル化および発現
[087]ＮＳＧ予備分析と類似して、ＧＴＰコホートにおいてＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦアルファのＤＮＡｍと加齢との関連を調査しようと試みた。データセットはＣｐＧ  ７４個を含み、中でもＣｐＧ  １４個においてＤＮＡｍレベルは名目有意性（ｐ＜０．０５）で加齢と関連した。名目レベルで加齢と有意に関連したＣｐＧは３８個あり、ＴＮＦアルファで主に示された。実際のところ、ＴＮＦアルファ中のＣｐＧ全２７個は、少なくとも名目上有意であった（図７）。８個のＣｐＧが、ゲノム規模の有意レベルで有意であり（ｐ＜５×Ｅ−８）、すべてＴＮＦアルファであった（図７）。上位のヒットは、ｃｇ１０６５０８２１であった（ｒ＝−０．４１；ｐ値、２．８５×Ｅ−１２）（図６、図９）。さらに、これらサイトカインの発現レベルを、利用可能な発現データがある対象２１５名のサブグループに対して試験した場合、予想された通りＴＮＦアルファ発現が、加齢と有意に正に関連した（ｒ＝０．３７、ｐ＝３．８４×Ｅ−７）（図１０）。
血液およびＦＡＣＳ分別された脳の再現した、ＤＮＡメチル化ＮＳＧ試料
[088]ＧＴＰ上位の所見が、ＮＳＧ研究においても示されるかどうか決定しようと試みた。上位４つのヒットのうちの３つ（ｃｇ１０６５０８２１、ｃｇ０８５５３３２７およびｃｇ２６７２９３８０、すべてＴＮＦアルファ由来、図７においてオレンジ色で強調した）が、血液（Ｎ＝２１）において名目有意性で加齢と相関し、結果として独立したコホートが発見を再現した。
【００５１】
[089]次に、ＧＴＰコホートにおけるＴＮＦアルファのＤＮＡｍと加齢とのこれら関連が、ＮＳＧ脳組織において同じように存在するかどうか試験した。各組織型（全脳、ニューロン陽性、ニューロン陰性および血液）由来試料を有する公平な対象６名のデータを使用して、ＴＮＦアルファ遺伝子において試験したＣｐＧ全２４個で年齢とＤＮＡｍとの相関の傾向をより良く比較した。全脳組織とＦＡＣＳ分別したニューロン陽性（ニューロン）細胞の両方にいかなる傾向も同定されなかったが、ＦＡＣＳ分別したニューロン陰性（グリア）細胞において加齢との名目上有意な関連が、ｃｇ０４４７２６８５およびｃｇ２６７３６３４１で見られ（ｐ＝０．０１７、図６、図７において淡青色の強調）、類似の傾向が、次の上位４つのＣｐＧ部位において見られた（図６、図７において濃青色の強調）。
【００５２】
[090]全２４個のＣｐＧは、グリア（ロー＝−１〜−０．３）、全脳（ロー＝−０．９〜０）および血液（ロー＝−１〜０）において逆相関を示したが、ニューロン陽性細胞は、負から正までの様々な範囲のロー値を示した（ロー＝−０．７〜１）（図７）。これは、加齢と関連するＤＮＡｍの傾向におけるグリアとニューロン細胞型との不一致、およびグリアと血液との傾向の類似性を示す。ただし、注目すべきことは、試料サイズが非常に小さく、統計的に有意な傾向を検出する能力が限定されている可能性がある。
考察
[091]２１個の試料のＮＳＧデータは、ヒト脳において、炎症誘発性サイトカイン遺伝子（ＩＬ−６）のプロモーター領域における１つのＣｐＧのＤＮＡｍレベルが、年齢と共に低下し、その低下がＩＬ−６発現の増大と潜在的に関連する可能性があることを示した。また、ＩＬ−６におけるこのＣｐＧのＤＮＡｍレベルは脳と血液とで相関しており、血液中でＤＮＡｍは加齢と類似の傾向を示す。これらの発見は、このＩＬ−６  ＣｐＧの血液ＤＮＡｍが、脳における年齢と相関する変化のエピジェネティックバイオマーカーの有用性を有することを示唆する。実際のところ、ＩＬ−６における単一のＣｐＧでの低いＤＮＡｍが、ヒト対象から得られた血液の発現の増加と関連することを示す報告もある（Ｎｉｌｅら、２００８年）。
【００５３】
[092]ＧＴＰコホートにおける独立したコホートからのデータは、血液試料の複数のＣｐＧにおける加齢に伴って低下する年齢関連ＤＮＡｍを明らかにした。そのパターンは、ＮＳＧコホートと大いに整合性がある。上位シグナルは、ゲノム規模で有意なｐ値、２．８５×Ｅ−１２を示した。試験したＣｐＧ部位７４個の多重比較補正に対して調整すると、図７に挙げた通りＣｐＧ  ２８個が０．０５／７４＝０．０００６８で有意であった（ＧＴＰのＣｐＧ  ２４個）。血液ＤＮＡｍのこれら発見の大多数は、ＴＮＦアルファにおけるものであり、加齢に伴う低下を示し、これは文献と整合性がある（Ｇｏｗｅｒｓら、２０１１年）。さらに、ＴＮＦアルファの発現は、ＤＮＡｍと年齢との逆相関に基づいて予想された通り加齢と正相関した。これに反して、このコホートのＴＮＦアルファ以外の他の炎症誘発性サイトカインの発現は、加齢と相関しなかった。これは、人体が安定な状態にある場合に他のサイトカインが特定の範囲に安定化されることを示す可能性がある。しかしながら、加齢に伴うアンダーラインＤＮＡｍ変化のため、個体は、外因性傷害に曝露されると発現を増強しやすくなり、特定の閾値を超えるとせん妄の危険性に一層さらされる可能性がある。実際のところ、ＴＮＦアルファレベルの直接測定とせん妄との関係は、議論の余地があった。せん妄患者において、複数の研究が、ＴＮＦアルファは有意なままではないと報告した（ｄｅ  Ｒｏｏｉｊら、２００７年；Ｃｉｎａｒら、２０１４年；Ｂｒｕｍら、２０１５年）。注目すべきことに、これら報告におけるせん妄事例の試料サイズは１００例未満（それぞれ６４事例、１５事例および１７事例）であり、したがって結果は力不足であった可能性がある。また、外因性傷害のレベルの制御は、制御が困難な交絡因子であり得る。これらの矛盾するデータは、サイトカインレベル自体はせん妄の危険性の信頼できるバイオマーカーとして作用しない可能性があり、ＤＮＡｍは、せん妄に対するより良いアンダーライン危険因子を潜在的に提供する可能性があることを示唆している。
【００５４】
[093]ＧＴＰのＴＮＦアルファの結果をＮＳＧコホートにおいてさらに調べた。血液においてＴＮＦアルファ内のほとんどすべてのＣｐＧにおけるＤＮＡｍが、高齢になるのに伴って低下することが示された。さらに、ＦＡＣＳ分別したニューロン陰性組織中のＴＮＦアルファＣｐＧにおけるＤＮＡｍは、加齢と類似の低下を示した。１つのＣｐＧ（ｃｇ１５９８９６０８）は、１３事例の限られた試料サイズでも、加齢と名目上有意に関連することが判明した。このＣｐＧも、ｐ値、５．３４×Ｅ−５でＧＴＰコホート中の血液試料の加齢と有意に関連した。ＮＳＧデータを、全脳、グリア、ニューロンおよび血液からの試料を有する対象６名の間で比較した場合、グリア、全脳および血液組織においてＴＮＦアルファのＣｐＧ  ２４個の大部分に逆相関が見られたが、ニューロン陽性細胞はより広範囲の相関を示した。グリアおよび血液におけるＴＮＦアルファのこの類似傾向は、グリア細胞（ミクログリアを含む）および血液細胞（単球を含む）が、炎症誘発性サイトカイン遺伝子において加齢と関連して類似のＤＮＡｍ変化を有する可能性があるという仮説を支持する。
【００５５】
[094]加齢に伴って低下するＤＮＡｍにおいて見た傾向が、ＤＮＡｍは加齢に伴って一般に低下しがちであるという事実によることはあり得る；しかしながら、異なる組織は加齢傾向が異なったので、これはその発見が一般化されなかったことを示す。したがって、炎症誘発性サイトカイン遺伝子におけるＤＮＡｍレベルの年齢に伴う低下は、神経細胞と比較して、グリアおよび血液細胞においてより支配的であることはあり得る。
【００５６】
[095]ここで示されるデータは、血液および脳組織、特にグリア細胞における加齢に伴うサイトカイン遺伝子のＤＮＡｍ関連変化の証拠を提供する。せん妄に感受性である個体が、これら遺伝子においてＤＮＡｍの悪化または異常調節された変化を有することは起こり得るので、本研究は、せん妄におけるエピジェネティック変化の仮説をさらに試験するための基礎を提供する。この目的のために、せん妄有りおよび無し対象から試料を収集して、ゲノム規模でＤＮＡｍ差異を試験する研究を開始した。
【００５７】
[096]せん妄と関連するエピジェネティックバイオマーカーの同定は、内科および外科の現在の診療を潜在的に改善する可能性がある。例えば、可能であれば、せん妄の危険性が高いと同定される患者は、危険性が小さくなるまで手術を延期してもよく、または予防措置を利用して手術後に患者を詳しく監視し、それにより危険な予後を最小化できよう。これにより、病院の限られた資源をより効率的に配置することが可能になる。
【００５８】
[097]要約すると、せん妄病態生理学においてサイトカイン遺伝子に対するＤＮＡｍの役割に関する仮説を提案する。特に、加齢に伴って炎症誘発性サイトカイン遺伝子におけるＤＮＡｍの低下があり、この低下は、感染症または手術などの外因性傷害に特に応答してその遺伝子をより発現されやすくする可能性があると仮定する。したがって、サイトカインレベルの増加による炎症応答は、潜在的にせん妄を引き起こす可能性がある。この実施例は、ＴＮＦアルファおよびＩＬ−６  ＣｐＧにおけるＤＮＡｍが、脳と血液組織の両方において加齢と逆相関していることを示した。ＴＮＦアルファの場合、ニューロン組織とは対照的にグリアおよび血液が加齢に伴って類似のＤＮＡｍ傾向を示した。重要なことに、本研究はサイトカイン遺伝子におけるＤＮＡｍレベルが加齢と関連することを示すが、外因性傷害後にせん妄を発症しない老齢個体と対比してせん妄に感受性である老齢個体が、異なるメチル化を有するかどうか決定する必要がある。
【００５９】
実施例２
[098]加齢および炎症が、せん妄の鍵となる危険因子であるという事実を踏まえて、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍ）がヒト寿命にわたって動的に変化し、エピジェネティック機構がサイトカインを含めた遺伝子の発現を制御するという事実に重点を置いた。したがって、加齢およびせん妄感受性に特異的なエピジェネティック修飾がミクログリアにおいて起こり；類似の修飾が血液において起こり；これらエピジェネティック変化が外因性傷害に対する反応を増強し、サイトカイン発現およびせん妄感受性を増大させると仮定した。実際のところ、発表されているどの研究も、ヒトにおけるＤＮＡｍとせん妄との関係を、特にゲノム規模でのＤＮＡｍ調査で評価していない。
【００６０】
[099]この実施例において、せん妄の有る入院患者および無い入院患者の血液中のＤＮＡｍステータスを比較して、患者から常法通り得られる血液試料においてせん妄に対して臨床的に有用なエピジェネティックバイオマーカーを同定した。３つの理由：１）血液中の単球の機能は、ミクログリアと類似しており、両方とも外因性刺激に応じてサイトカインを放出する、２）同時点で収集される同じ個体の血液中のＤＮＡｍレベルに対する生きた脳組織（脳外科手術中に切除される）におけるＤＮＡｍレベルの比較が、ゲノム規模で高レベルの相関を示した、および３）これまでのデータが、グリアおよび血液中の炎症誘発性サイトカイン遺伝子ＴＮＦアルファのＤＮＡｍにおいて類似の年齢に伴う低下を示した、のため血液を使用した。これら目的を達成するために、せん妄患者とせん妄の無い対照とで血液中のＤＮＡｍ差異を調査する本研究を行った。
【００６１】
[0100]包括的にするために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＥＰＩＣアレイを使用するゲノム規模での手法を利用した。せん妄の有る群および無い群の間で炎症誘発性サイトカイン遺伝子、ＴＮＦアルファと年齢との相関を最初に試験した。ネットワーク分析も行った。最後に、２群間でＤＮＡｍ年齢を比較した。
方法
研究対象および試料収集
[0101]研究参加者が、別々に進行中のせん妄研究に登録されていた場合、それら参加者を共同登録した。研究参加者の募集工程のより詳細な概要は、これまでに記載されてきた。簡潔には、２０１７年１１月〜２０１８年１０月にアイオワ大学病院・クリニックで対象９２名をこのエピジェネティクス研究のために募集した。本研究は、アイオワ大学のヒト対象研究施設内倫理委員会によって承認された。
せん妄ステータス定義
[0102]研究参加者の表現型判定のより詳細な概要については、これまでに記載されてきた。簡潔には、入院記録を再検討し、Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ（ＣＡＭ−ＩＣＵ）、Ｄｅｌｉｒｉｕｍ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ改訂９８（ＤＲＳ−Ｒ−９８）およびＤｅｌｉｒｉｕｍ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＤＯＳＳ）を実施することによってせん妄の存在について潜在的研究参加者をスクリーニングした。せん妄カテゴリーの最終的な決定は、訓練された精神科医による詳細なカルテの再検討によって行われた（Ｇ．Ｓ．）。
試料処理およびエピジェネティクスプラットフォーム
[0103]書面による同意書を得、全血試料をＥＤＴＡ管に収集した。すべての試料を、−８０℃で貯蔵した。メチロームアッセイを、前述のとおり実行した。簡潔には、全血からのゲノムＤＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＭＣＤ８５２０１）で単離した。ＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００２）を使用して、バイサルファイト変換した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＷＧ−３１７−１００２）を使用して、血液試料を含む対象９２名の試料９３個（１名の対象から２つの試料があった）のＤＮＡｍを分析した。生データを、ＲパッケージＣｈＡＭＰおよびＭｉｎｆｉを使用して処理した。ＣｈＡＭＰを使用して、試料が検出ｐ値＞０．１を有した場合、それを選別した（１試料）。プローブが、１）検出ｐ値＞０．０１を有した（４５４５８個のプローブ）、２）プローブ当たり少なくとも５％の試料において３つ未満のビーズを有した（８８６８個のプローブ）、３）非ＣｐＧプローブを有した（２７６１個のプローブ）、４）ＳＮＰ関連プローブを有した（９１７８８個のプローブ）、５）複数に存在するプローブを有した（１１個のプローブ）、および６）ＸまたはＹ染色体に位置した（１５８３６個のプローブ）場合、それらを選別した。選別後に、試料９２個およびプローブ７０１１９６個が残った。次いで、品質管理および探索分析を行った。密度プロットは３つの外れ値を示し、多次元尺度構成プロットは４つの外れ値を示した。そのうち２つは、実際に１名の対象由来の２つの試料の外れ値であった。他の２つは、密度プロットと同じであった。合計５個の試料を除去し、試料８７個を、ＣｈＡＭＰを使用して再処理した。プローブは、１）検出ｐ値＞０．０１を有した（１２９０３個のプローブ）、２）プローブ当たり少なくとも５％の試料において３つ未満のビーズを有した（８２８０個のプローブ）、３）非ＣｐＧプローブを有した（２９１１個のプローブ）、４）ＳＮＰ関連プローブを有した（９４４２５個のプローブ）、５）複数に存在するプローブを有した（１１個のプローブ）、および６）ＸまたはＹ染色体中に位置した（１６３５６個のプローブ）場合、それらを選別した。選別後、試料８７個およびプローブ７３１０３２個が残った。品質管理および探索分析において、密度プロットおよび多次元尺度構成プロットは外れ値を示さなかった。試料をベータ混合分位数拡大（ｂｅｔａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｄｉｌａｔｉｏｎ）で標準化した。バッチ効果を、パッケージＳＶＡに移植されているＣｏｍｂａｔ標準化方法を使用して補正した。
統計的分析
[0104]すべての統計的分析を、Ｒで実行した。サイトカイン遺伝子の相関を、アレイ上に存在するそれら遺伝子のＣｐＧと実行した。加齢とＤＮＡｍとの相関の程度を、試験したサイトカイン遺伝子における各ＣｐＧについて算出した。相関係数およびその有意レベルを、ピアソンの相関分析により算出した。分類別データをカイ二乗検定で算出した。ＤＮＡｍ年齢を、選別および品質管理工程後にオンラインＤＮＡｍＡｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｎａｍａｇｅ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／）を使用して算出した。ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、単球および顆粒球の細胞型割合も、オンラインのＤＮＡｍ  Ａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｎａｍａｇｅ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／）を使用し、先行研究に記載されている方法を使用することによって推定した。個々のＣｐＧのレベルでの差異的ＤＮＡメチル化を、ｌｉｍｍａ方法を使用するＲｎＢｅａｄｓによって分析した。年齢、性別および細胞型割合を共変量として含めた。ネットワーク分析を、ＲパッケージのｍｉｓｓＭｅｔｈｙｌを使用して、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）およびＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）富化分析に対してアレイ上の遺伝子当たりのプローブ数の違いを補正することにより行った。
結果
ＴＮＦアルファ遺伝子におけるせん妄事例対非せん妄対照の比較
[0105]選別後の試料８７個（せん妄４３個および非せん妄４４個、年齢範囲４２〜１０１歳）の全血試料を、ゲノム規模でのＤＮＡｍ分析用のＥＰＩＣアレイを使用して分析した。年齢、性別、ＤＮＡｍ年齢、ＣＤ８  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞およびＢ細胞においてせん妄事例と非せん妄対照の間に有意差はなかった（図１１）。中でも、最初に、図１２に示したＩｌｌｕｍｉｎａ  ＥＰＩＣアレイで試験したＴＮＦアルファ遺伝子中のＣｐＧ  ２４個について年齢とＤＮＡｍレベルとの相関を特に試験した。せん妄事例は、名目上有意（ｐ＜０．０５）なＣｐＧを８個示したが、非せん妄対照は名目上有意なＣｐＧを４個しか示さなかった。さらに、せん妄事例は、多重試験レベルに対する補正後に３つの有意なＣｐＧを示し（ｐ＜０．０５／２４＝０．００２０８）、一方で、非せん妄対照は、多重試験レベルに対する補正後にいかなる有意なＣｐＧも示さなかった。
ネットワーク分析
[0106]次に、せん妄事例と非せん妄対照間で、ゲノム規模でＤＮＡｍ差異を直接試験した。個々のＣｐＧ差異の分布および対応する対数変換されたｐ値に対するボルケーノプロットを、図１３に示す。せん妄事例と非せん妄対照の間で差異的にメチル化されているＣｐＧの上位２０個を図１４に示す。ゲノム規模での分析は、ゲノム規模での有意性（ｐ＝５．０７Ｅ−８）で、ｃｇ２１２９５７２９で上位ヒットを示した。このＣｐＧは、遺伝子ＬＤＬＲＡＤ４の近くに位置する。ネットワーク分析を、メチル化レベルの差異が５．０％より高く、ｐ値＜０．０００５（ｎ＝７５３）のＣｐＧを使用することによって行った。それら遺伝子を使用することにより、ネットワーク分析は、以下のＧＯ（図１５）およびＫＥＧＧ分析（図１６）による上位２０個の経路の結果を示した。ＧＯによる上位の経路は、免疫応答および骨髄性白血球活性化であり、ＫＥＧＧによる経路は、アルドステロン合成／分泌およびコリン作動性シナプスであった。図１７は、偽発見率（ＦＤＲ）調整済みｐ値＜０．０５のＫＥＧＧ分析の有意な経路も示す。
せん妄事例対非せん妄対照の比較：メチル化年齢
[0107]せん妄事例と非せん妄対照間でＤＮＡｍ年齢の差異をさらに試験した。ＤＮＡｍ年齢は、せん妄事例（ｒ＝０．７８、ｐ＜０．００１）および非せん妄対照（ｒ＝０．６７、ｐ＜０．００１）において暦年齢と有意な相関を示した。非せん妄対照におけるＤＮＡｍ年齢は、せん妄事例と比較して「より遅い加齢」を示した、しかし統計的有意差はなかった（図１８）。
考察
[0108]これは、せん妄の有る患者および無い患者の間のエピジェネティクスステータス、特にゲノム規模でのＤＮＡｍを比較する初の研究である。ここで提示したデータは、加齢に伴う炎症誘発性サイトカイン上のＤＮＡｍのレベル低下が、せん妄と関連する炎症の増加を引き起こし得るが、せん妄の無い患者においてはＤＮＡｍレベルが高いままであり、したがって炎症反応が抑制される可能性があり、患者がせん妄から保護されるという仮説と整合する。
【００６２】
[0109]本研究において、せん妄事例だけが、ＴＮＦアルファＤＮＡｍのレベル低下と年齢間の多重比較を調整したレベルで有意なＣｐＧを示した。この結果は、炎症誘発性遺伝子のＤＮＡｍレベルが、せん妄患者において加齢とともに低下するという仮説と整合性がある。せん妄患者の加齢に伴うＴＮＦアルファ遺伝子におけるＤＮＡｍレベルの下落は持続的であり得、このことが病院への入院を必要とする追加の医学的状態があるせん妄の発病を引き起こし得ると推測する。他方、せん妄の無い患者は、加齢に伴うＴＮＦアルファ遺伝子におけるＤＮＡｍレベルの下落がより少なく、したがって、このことがせん妄発症から患者を保護している可能性がある。この推測を確認するために、投薬状態の観点から可能な限り類似する患者集団を比較する大きな前向き研究を行う必要がある。手術にさらされる前に試料を収集できる外科患者を研究することが、そのような調査に理想的である。
【００６３】
[0110]ゲノム規模でのＤＮＡｍ分析から、ＬＤＬＲＡＤ４の遺伝子中にゲノム規模での有意なシグナルを１つ同定した。ＬＤＬＲＡＤ４、低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン含有４は、多くの細胞型の成長、分化、アポトーシス、運動、およびマトリックスタンパク質産生を調節するＴＧＦベータシグナル伝達の負の調節因子として機能する。ゲノム規模では有意でなかったが、上位ヒットＣｐＧのうちの１つは遺伝子ＤＡＰＫ１の近くにあった。ＤＡＰＫ１、細胞死関連プロテインキナーゼ１は、細胞死、自食および炎症を調節する機能を持つ。他の上位ヒットＣｐＧは、遺伝子ＩＲＦ８の近くにあった。ＩＲＦ８、インターフェロン調節因子８は、免疫応答、細胞成長および腫瘍形成をモジュレートする機能を持つ。
【００６４】
[0111]せん妄の病態生理学におけるこれら特異的遺伝子の潜在的役割についてはさらなる調査を必要とするが、ネットワーク分析は、ＧＯ分析から神経機能ならびに免疫応答、白血球活性化、好中球活性化、および免疫応答に関係する骨髄性細胞活性化を含めた炎症性／免疫工程に関連するいくつかの上位経路を同定した。コリン作動性シナプス、セロトニン作動性シナプスおよび白血球経内皮遊走を含めた、せん妄および神経機能に関連する多くの経路もＫＥＧＧ分析から同定された。コリン作動性シナプスは、上位ＫＥＧＧ経路の２番目であった。コリン作動系は、脳において最も重要な神経伝達物質系のうちの１つであり、アセチルコリン欠乏がせん妄と関連することは周知である。本研究の結果は、せん妄の潜在的病態生理学におけるコリン作動性機能の関連をさらに支持する。さらに、正の調節の経路ならびにインターロイキン１０産生の調節およびインターロイキン１７産生の正の調節は、ＧＯ分析から有意であった（ＦＤＲ調整したｐ値＜０．０５）。この結果は、せん妄の病態生理学における炎症誘発性サイトカインおよび神経炎症の役割も示唆しており、仮説と整合性がある。これらの発見は、せん妄病態生理学のこのエピジェネティック調査の有効性を支持し得る。
【００６５】
[0112]ＤＮＡｍ年齢が、せん妄事例と非せん妄対照の両方で暦年齢と有意に相関することを示した。しかしながら、非せん妄事例は、せん妄事例より実際の加齢に伴うＤＮＡｍ加齢の進行が比較的遅いことを示した。ＤＮＡｍ年齢は、エピジェネティック維持システムによる累積的な効果を測定し、死亡率を予測する。非せん妄対照は、ＤＮＡｍ加齢に対する防御機構を有する可能性があり、その機構がせん妄の発症も防止し得ると推測する。より大きい試料サイズの研究によって、ＤＮＡｍ加齢が、せん妄事例対対照間で実際に異なるかどうか試験することができる。
【００６６】
[0113]結論として、知見の及ぶ限りでは、これは、せん妄についての最初のエピジェネティクス研究である。ＤＮＡｍをゲノム規模で調査した。結果は、先行研究および仮説と整合性があった。上記のこれらの制約にもかかわらず、せん妄事例と非せん妄対照間で、遺伝子レベルとネットワークレベルの両方でエピジェネティックな差異の証拠を示した。この発見は、血液中のＤＮＡｍステータスが、せん妄に関する有用なエピジェネティックバイオマーカーになり得ることを示す。
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図の見出し
[0157]補足表１（図１１）せん妄事例および非せん妄対照の人口統計学的データ。略語：ＤＮＡｍ；ＤＮＡメチル化、ＣＤ８−Ｔ；ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４−Ｔ；ＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ；ナチュラルキラー細胞。
【００６７】
[0158]表１（図１２）せん妄事例対非せん妄対照間で比較した、年齢とＴＮＦアルファ遺伝子中のＣｐＧ  ２４個における血液ＤＮＡｍとの相関。注：ピンク色は、逆相関を強調し、青色は正相関を強調する。＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／２４）、†名目上有意（ｐ＜０．０５）。
【００６８】
[0159]図１（図１３）個々のＣｐＧ差異の分布および対応する対数変換されたｐ値（ｎ＝８７）に対するボルケーノプロット
[0160]補足表２（図１４）せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧの上位２０個
[0161]表２（図１５）せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の上位２０経路の結果。略語：ＧＯ；遺伝子オントロジー、ＦＤＲ；偽発見率。
【００６９】
[0162]表３（図１６）せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧを持つＫＥＧＧ分析の上位２０経路の結果。略語：ＫＥＧＧ；Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、ＦＤＲ；偽発見率。
【００７０】
[0163]補足表３（図１７）せん妄事例と非せん妄対照間で差異的にメチル化されているＣｐＧのＧＯ分析の有意な経路の結果。略語：ＫＥＧＧ；Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、ＦＤＲ；偽発見率。
【００７１】
[0164]図２（図１８）せん妄（ｎ＝４３）対対照（ｎ＝４４）における暦年齢とＤＮＡｍ年齢との相関。略語：ＤＮＡｍ；ＤＮＡメチル化
実施例３
[0165]せん妄は、高齢患者において一般的であるが、過小診断されており、処置されていない。せん妄の疫学および危険因子を特徴付けるために様々なスクリーニング方法が開発されてきた［例えば、Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ（ＣＡＭ）およびＣｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ（ＣＡＭ−ＩＣＵ）］。それら方法は、研究環境では優れた感度および特異性を有するが、「現実世界」の集中治療室の状況では最適状態に及ばない感度（３８〜４７％）であることが判明している。したがって、せん妄の危険性が高い高齢患者におけるせん妄のバイオマーカーの同定は、診断およびその後の介入に役立つ。上で、せん妄の病態生理学におけるエピジェネティクス、特に炎症誘発性サイトカイン遺伝子におけるＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍ）の潜在的役割を報告し、神経炎症の役割を強調した。しかし、せん妄の病態生理学的機序の複雑さおよび認知症患者におけるせん妄の公知の危険因子を考えると、年齢に相関する認知機能と強く関連する神経栄養因子など他の因子を同様に調べることが重要である。
【００７２】
[0166]認知機能と関連する様々な遺伝子のうち、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、神経可塑性、学習および記憶に寄与するシグナル伝達分子である。ＢＤＮＦの血清レベルの低下は、認知障害と関連する。ニューロンＰｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメインタンパク質４（ＮＰＡＳ４）のノックダウンモデルは、細胞死の増大を引き起こす。ノックダウンモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ調査は、光化学的に誘導した脳卒中後に病変サイズの増大および神経変性を示す。核受容体サブファミリー４Ａ２（ＮＲ４Ａ２）は、アルツハイマー病（ＡＤ）関連病態生理学を決定的に調節する。ＮＲ４Ａ２ノックダウンマウスモデルは、ＡＤ徴候／病理学（神経炎症／変性、プラーク蓄積）を悪化させる。ＦＤＡ認可済みのＮＲ４Ａ２モジュレーティング薬物の投与は、認知障害を有意に減少させ、プラークを減少させる。
【００７３】
[0167]加齢は、脳における遺伝子発現を大幅に改変し、そのような変化は、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍ）、ヒストン修飾およびマイクロＲＮＡ媒介転写制御を含めた様々なエピジェネティック修飾によって正確に調節される。実際に、ＤＮＡｍパターンは、ヒトの寿命を通して動的に変化することが示されており、加齢に関係するエピジェネティックな工程が詳細に研究されてきた。神経組織栄養遺伝子に関して、血液中のＢＤＮＦのＤＮＡｍは、これまでの研究において加齢と有意に相関している。しかしながら、どの研究も、せん妄における神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍの役割については調査してこなかった。我々の目的は、神経栄養因子においてＤＮＡｍを調べ、神経栄養因子のＤＮＡｍが加齢と相関するかどうか調査し、そのような傾向が脳と血液試料間で整合性があるかどうか、せん妄患者とせん妄の無い患者の間に何らかの差異があるか決定することである。
【００７４】
[0168]本研究において、３つの異なるコホート試料を分析してＤＮＡｍと年齢との相関を調べた。特に、加齢と神経組織栄養遺伝子のＣｐＧにおけるＤＮＡｍレベルとの関係を調査し、結果がこれらコホートにおいて再現され得るかどうか試験した。脳と血液両方の神経組織栄養遺伝子においてＤＮＡｍが加齢に伴って増大することは、神経栄養因子のより少ない発現を示唆しており、そのような変化は、せん妄患者においてより有意であると仮定した。
方法
Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＧＴＰ）コホートの試料
[0169]対象３８３名を、Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＧＴＰ）コホートから分析した。詳細な情報は、先行研究に見ることができる（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ、Ｂｒａｕｎ、ら、２０１８年）。ＤＮＡｍデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０を使用することによって処理した。利用したパイプラインについては、他で詳述した。
脳外科手術（ＮＳＧ）コホートの試料
[0170]対象２１名を、脳外科手術（ＮＳＧ）コホートから分析した。詳細な情報は、先行研究に記載された（Ｂｒａｕｎら、２０１９年）。簡潔には、２０１４年３月〜２０１７年４月にアイオワ大学病院・クリニックで脳外科手術を受けた難治性てんかんの対象が参加した。書面による同意書を参加者全員から得た。本研究は、アイオワ大学のヒト対象研究施設内倫理委員会によって承認された。全血をＥＤＴＡ管に、唾液をＯｒａｇｅｎｅ  ＤＩＳＣＯＶＥＲ（商標）キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ  Ｉｎｃ．ＯＧＲ−５００）で、および口腔組織をスワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ、２５−１５０６  １ＰＦ  ＴＴ  ＭＣ）で収集した。ゲノムＤＮＡを、唾液、口腔および全血からＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＭＣＤ８５２０１）で抽出した。次いで、ＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００２）でバイサルファイト変換した。ＤＮＡｍを、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＷＧ−３１７−１００２）で分析した。ＲパッケージＲｎＢｅａｄｓおよびＭｉｎｆｉを使用して、生データ、品質管理検査、データ選別、データの標準化および差異的メチル化分析を処理した。
せん妄のエピジェネティクス（ＥＯＤ）コホートの対象および試料
[0171]研究参加者が、別々に進行中のせん妄研究に登録されていた場合、対象９２名を参加させた。詳細な情報は、先行研究中に見ることができる（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、２０１９年；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ、Ｂｒａｕｎ、ら、２０１８年；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ、Ｃｈａｎ、ら、２０１８年）。簡潔には、２０１７年１１月〜２０１８年１０月にアイオワ大学病院・クリニックで対象は参加した。書面による同意書を参加者全員から得た。本研究は、アイオワ大学のヒト対象研究施設内倫理委員会によって承認された。
せん妄ステータスの定義
[0172]詳細な情報は、先行研究中に見ることができる（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ、Ｃｈａｎ、ら、２０１８年）。簡潔には、参加者を、入院記録、Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ（ＣＡＭ−ＩＣＵ）、Ｄｅｌｉｒｉｕｍ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ改訂９８（ＤＲＳ−Ｒ−９８）およびＤｅｌｉｒｉｕｍ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＤＯＳＳ）によってせん妄についてスクリーニングした。せん妄表現型判定の最終的な決定は、訓練された精神科医によって行われた。
試料処理
[0173]全血試料を、ＥＤＴＡ管で収集し、すべての試料を−８０℃で貯蔵した。メチロームアッセイを前述のとおり処理した。簡潔には、ゲノムＤＮＡを、全血からＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＭＣＤ８５２０１）で抽出した。次いで、ＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００２）でバイサルファイト変換した。
エピジェネティクスプラットフォーム
[0174]Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（商標）Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＷＧ−３１７−１００２）を使用して、血液試料を含む対象９２名からの試料９３個（１名の対象から２つの試料があった）のＤＮＡｍを分析した。ＲパッケージＣｈＡＭＰおよびｍｉｎｆｉを使用して、生データを処理した。ＣｈＡＭＰパッケージを用いて、試料が０．１より大きい検出ｐ値を有した場合、それを選別し（１試料存在した）、プローブが、１）０．０１より大きい検出ｐ値を有した（４５４５８個のプローブが存在した）、２）プローブ当たり、少なくとも５％の試料において３つ未満のビーズを有した（８８６８個のプローブが存在した）、３）非ＣｐＧプローブを有した（２７６１個のプローブが存在した）、４）ＳＮＰ関連プローブを有した（９１７８８個のプローブが存在した）、５）複数に存在するプローブを有した（１１個のプローブが存在した）、および６）ＸまたはＹ染色体中に位置した（１５８３６個のプローブが存在した）場合、それらを選別した。試料９２個およびプローブ７０１１９６個が、上記選別後に残った。品質管理および探索分析において、密度プロットは３つの外れ値を示し、多次元尺度構成プロットは４つの外れ値を示した（それらのうち２つは１名の対象由来であり、他の２つは密度プロットおよび多次元尺度構成プロットと同じであった）。全体として、試料５個を除去し、試料８７個をＣｈＡＭＰパッケージで再処理した。プローブが、１）０．０１より大きい検出ｐ値を有した（１２９０３個のプローブが存在した）、２）プローブ当たり、少なくとも５％の試料において３つ未満のビーズを有した（８２８０個のプローブが存在した）、３）非ＣｐＧプローブを有した（２９１１個のプローブが存在した）、４）ＳＮＰ関連プローブを有した（９４４２５個のプローブが存在した）、５）複数に存在するプローブを有した（１１個のプローブが存在した）、および６）ＸまたはＹ染色体中に位置した（１６３５６のプローブが存在した）場合、それらを選別した。選別後、試料８７個およびプローブ７３１０３２個が残った。品質管理および探索分析において、密度プロットおよび多次元尺度構成プロットは外れ値を示さなかった。試料をベータ混合分位数拡大で標準化した。バッチ効果を、パッケージＳＶＡに移植されているＣｏｍｂａｔ標準化方法で補正した。
統計分析
[0175]すべての統計分析を、Ｒで実行した（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、２０１９年）。年齢と各ＣｐＧにおける神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関を、ピアソンの相関分析によって試験した。ゲノム規模での有意レベルをｐ＜５×Ｅ−８、名目上有意なレベルをｐ＜０．０５として決定した。
結果
ＧＴＰコホート血液試料のＤＮＡメチル化および発現
[0176]神経組織栄養遺伝子におけるＤＮＡｍパターンが、加齢と相関するという本研究の根底にある概念を試験するために、対象３８３名（年齢平均＝４１．５０歳、年齢ＳＤ＝１２．９３歳、年齢範囲＝１８〜７７歳、女性Ｎ＝２７３名、人種＝アフリカ系アメリカ人３８０名、アメリカインディアン２名および他１名）の血液試料に基づくデータセットを最初に使用した。加齢と７つの神経組織栄養遺伝子；ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、活性調節細胞骨格関連タンパク質（ＡＲＣ）、Ｆｏｓプロトオンコジーン、ＡＰ−１転写因子サブユニット（ＦＯＳ）、ＮＰＡＳ４、核受容体サブファミリー４Ａ１（ＮＲ４Ａ１）およびＮＲ４Ａ２中のＣｐＧにおけるＤＮＡｍレベルとの関連を調査した。このデータセットは、それら遺伝子の全域に合計２２６個のＣｐＧを含み、その中でＣｐＧ  １０９個におけるＤＮＡｍレベルが、名目有意性（ｐ＜０．０５）で加齢と関連した。事実、ＣｐＧ  １６個が、ボンフェローニ補正したゲノム規模での有意性レベル（ｐ＜５×Ｅ−８）で有意であり、主にＢＤＮＦ（ＣｐＧ  ７個）およびＧＤＮＦ（ＣｐＧ  ４個）であった。上位のヒットは、ＧＤＮＦ中のｃｇ０２３２８２３９（ｐ＝１．５４×Ｅ−２０）であり、第２の上位はＢＤＮＦ中のｃｇ０５７３３１３５（ｐ＝４．４９×Ｅ−１５）であった（図１９、図２０Ａ、図２０Ｂ）。ｐ＜２×Ｅ−４（ＣｐＧ  ２２６個に対してボンフェローニ補正した、有意レベルｐ＜０．０５／２２６）のＣｐＧ上位５３個において、ＣｐＧ  ４９個（９２．５％）が加齢と正相関した（図２０）。年齢とＣｐＧ  ２２６個でのＤＮＡｍレベルとの相関を図２１に示した。しかしながら、血液試料におけるこれら遺伝子の発現レベルの試験は、発現は、加齢と有意な関連をもたないことを示した（データ不掲載）。
ＮＳＧ研究試料、脳におけるＤＮＡｍ
[0177]ＧＴＰコホート中のＤＮＡｍのこれら関連が、ＮＳＧコホート（Ｎ＝２１）中の脳組織にも存在するかどうか次に試験した。ＧＴＰコホート中の上位４つの遺伝子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＲ４Ａ２およびＮＰＡＳ４）に重点を置いた。ＢＤＮＦにおいて、１８個のＣｐＧが、名目有意性で加齢と正相関し（ｐ＜０．０５）、４個のＣｐＧが名目有意性で加齢と逆相関した（表２）。同様に、ＧＤＮＦにおいて１５個のＣｐＧが、名目有意性で加齢と正相関し、どのＣｐＧも名目有意性で加齢と逆相関せず、ＮＲ４Ａ２において２０個のＣｐＧが、名目有意性で加齢と正相関し、３個のＣｐＧが名目有意性で加齢と逆相関し、ＮＰＡＳ４において２個のＣｐＧが、名目有意性で加齢と正相関し、どのＣｐＧも名目有意性で加齢と逆相関しなかった。さらに、ＧＴＰ研究におけるＧＤＮＦのｃｇ０２３２８２３９での上位ヒットＣｐＧ（ｐ＝１．５４×Ｅ−２０）は、ＮＳＧ研究の脳組織においても多重試験有意レベルｐ＝１．２６×Ｅ−６（ＣｐＧ  ２０１個に対してボンフェローニ補正した、有意レベルｐ＜０．０５／２０１＝２．４９×Ｅ−４）で加齢と正相関した（図２２）。実際に、ＮＳＧ研究の脳組織における名目上有意（ｐ＜０．０５）なＣｐＧにおいて、ＢＤＮＦ中の３つのＣｐＧ、ＧＤＮＦ中の３つのＣｐＧ、ＮＲ４Ａ２中の３つのＣｐＧおよびＮＰＡＳ４中の２つのＣｐＧも、ＧＴＰ研究において名目上有意であった（図１９、図２２）。年齢と２０１個のＣｐＧにおけるＤＮＡｍレベルとの相関を図２３に示した。
ＥＯＤ研究試料におけるせん妄事例対非せん妄対照の比較
[0178]進行中の研究のせん妄事例と非せん妄対照間のＤＮＡｍ差異を次に直接試験した。せん妄４３名および非せん妄４４名の入院患者対象（年齢平均７０．２歳、ＳＤ  １０．２、範囲４２〜１０１歳）の全血試料を、ゲノム規模でのＤＮＡｍ分析のためにＥＰＩＣアレイを使用して分析した。その中で、年齢とＢＤＮＦ（図２４）、ＧＤＮＦ（図２１）およびＮＲ４Ａ２（図２３）遺伝子中のＣｐＧにおけるＤＮＡｍレベルとの相関を特に試験した。ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびＮＲ４Ａ２について非せん妄対照よりむしろせん妄事例において多くの名目上有意（ｐ＜０．０５）なＣｐＧが存在した。また、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびＮＰＡＳ４について非せん妄対照よりむしろせん妄事例において正相関するＣｐＧが存在した。さらに、ＢＤＮＦにおいてせん妄事例は、多重試験レベルに対する補正後に有意なＣｐＧを１つ示し（ｐ＜０．０５／１９２＝７．３５×Ｅ−４）（図２４）、一方で、非せん妄対照は、多重試験レベルに対する補正後にいかなる有意なＣｐＧも示さなかった。
考察
[0179]本研究において、ＧＴＰコホート血液試料のデータは、ＤＮＡｍパターンが、神経組織栄養遺伝子中の名目上有意なＣｐＧ部位において加齢とほとんど正相関を示すことを確認した。また、多重有意試験レベルにおいて、有意なＣｐＧのほぼすべてが加齢と正相関した。これらの結果は、神経栄養因子のＤＮＡｍレベルが加齢と相関することを示し、おそらく、神経栄養因子の発現が加齢に伴って低下し、障害のある認知を引き起こすことを示唆した。このコホートの血液における発現データは、年齢に関連する低下を示さなかったので、さらなる研究が、特に脳試料を使用してこの可能性を確認するために必要である。
【００７５】
[0180]ＮＳＧコホート脳試料のデータも、ほとんどすべてのＤＮＡｍパターンが、名目上有意な神経組織栄養遺伝子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＲ４Ａ２およびＮＰＡＳ４）において加齢と正相関を示すことを確認した。したがって、ＧＴＰ血液試料とＮＳＧ脳試料の両方において神経組織栄養遺伝子におけるＤＮＡｍが加齢に伴って増大するという同じ性向を確認することができた。さらに、血液試料を用いるＧＴＰ研究における上位ヒットＣｐＧは、脳試料を用いるＮＳＧ研究における多重有意試験レベルでも加齢と正相関した。これらの結果は、神経組織栄養遺伝子におけるＤＮＡｍパターンが、脳と血液組織において同一であり、仮説と整合性があることを示した。
【００７６】
[0181]ＥＯＤコホートの血液試料のデータにより、神経組織栄養遺伝子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＲ４Ａ２およびＮＰＡＳ４）中のＤＮＡｍレベルが、非せん妄対照よりむしろせん妄事例において加齢と正相関することが確認された。これは、高齢患者における神経組織栄養遺伝子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＲ４Ａ２およびＮＰＡＳ４）の高レベルのＤＮＡｍが、せん妄を引き起こす発現低下をもたらし得、一方で対照においてＤＮＡｍレベルが低いままであり、したがって神経栄養因子が高いままである場合、高齢患者はせん妄から保護され得るという仮説と整合性がある。
【００７７】
[0182]本研究において、せん妄患者を含む３つの独立したコホートにおいてＢＤＮＦのＤＮＡｍと加齢との有意な相関を示した。本研究は、発現変化と関連するデータを直接示さなかったが、ＢＤＮＦのＤＮＡｍの増大は、ＢＤＮＦの発現レベルの改変に少なくとも部分的に関与する可能性があると考えられる。本結果は、ＤＮＡｍが、加齢およびせん妄の危険性と関連する微妙な変化を捕捉する優れた方法であり得ることを示唆し得る。ＢＤＮＦにおける年齢に伴う低下に関連する認知症とせん妄の間でエピジェネティック機構を介する同じ経路が存在し得る。
【００７８】
[0183]これまでの研究で、ＴＮＦアルファ遺伝子のＤＮＡｍレベルが、ほぼすべてのＣｐＧで加齢と逆相関し、ＧＴＰコホートにおいてＴＮＦアルファ発現レベルが加齢と正相関することが示された。ＴＮＦアルファのＤＮＡｍレベルのこの結果は、ＮＳＧコホートにおいても示された。さらに、ＴＮＦアルファのＤＮＡｍレベルは、多重試験調整した有意レベルではせん妄事例においてのみ加齢と逆相関した（査読中）。したがって、神経炎症遺伝子、特にＴＮＦアルファは、せん妄の病態生理学において重要な役割を演じ得る。本研究において、神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍと加齢との関連性は、対照よりもむしろせん妄事例において示された。総合すれば、神経組織栄養および神経炎症工程のＤＮＡｍは共に相互作用しており、両方が高齢患者におけるせん妄の発症において重要な役割を演じている可能性があると推測する。
【００７９】
[0184]結論として、知見の及ぶ限りでは、これは、せん妄入院患者おける神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍと加齢との相関を報告する最初の研究である。上記のこれらの制約にもかかわらず、せん妄事例と非せん妄対照間でＢＤＮＦ遺伝子のエピジェネティックな差異の証拠を示した。この発見は、血液中のＢＤＮＦ遺伝子のＤＮＡｍステータスが、せん妄に関する有用なエピジェネティックバイオマーカーになり得ることを示す。
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図の見出しおよび注
[0238]図２０Ａおよび図２０Ｂ：年齢と上位２つのＣｐＧにおけるベータ値間の相関。略語：ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＧＤＮＦ；グリア細胞由来神経栄養因子。
【００８０】
[0239]表１（図１９）：年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関。注：青色は正相関を強調し、ピンク色は逆相関を強調する。＊＊ゲノム規模での有意レベルのボンフェローニ補正後に有意（ｐ＜５×Ｅ−８）、＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／２２６）。略語：ＡＰ−１転写因子サブユニット、ＡＲＣ；活性調節細胞骨格関連タンパク質、ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＦＯＳ；Ｆｏｓプロトオンコジーン、ＧＤＮＦ；グリア細胞由来神経栄養因子、ＧＴＰ；Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ＮＰＡＳ４；ニューロンＰｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメインタンパク質４、ＮＲ４Ａ１；核受容体サブファミリー４Ａ１、ＮＲ４Ａ２；核受容体サブファミリー４Ａ２。
【００８１】
[0240]表２（図２２）：年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子のＤＮＡｍレベルとの相関。注：青色は正相関を強調し、ピンク色は逆相関を強調する。＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／２０１）、†名目上有意（ｐ＜０．０５）。略語：ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＧＤＮＦ；グリア細胞由来神経栄養因子、ＮＰＡＳ４；ニューロンＰｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメインタンパク質４、ＮＲ４Ａ２；核受容体サブファミリー４Ａ２、ＮＳＧ；脳外科手術。
【００８２】
[0241]表３（図２４）：ＥＯＤコホートにおいてせん妄事例対非せん妄対照間で比較した年齢とＢＤＮＦ遺伝子中のＣｐＧ  ８３個における血液ＤＮＡｍとの相関。注：青色は正相関を強調し、ピンク色は逆相関を強調する。＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／１９２）、†名目上有意（ｐ＜０．０５）。略語：ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＤＮＡｍ；ＤＮＡメチル化、ＥＯＤ；せん妄のエピジェネティクス。
【００８３】
[0242]補足表１（図２１）：年齢とＧＴＰコホートから得られた血液試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２２６個のＤＮＡｍレベルとの相関。注：青色は正相関を強調し、ピンク色は逆相関を強調する。＊＊ゲノム規模での有意レベルのボンフェローニ補正後に有意（ｐ＜５×Ｅ−８）、＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／２２６）。略語：ＡＰ−１転写因子サブユニット、ＡＲＣ；活性調節細胞骨格関連タンパク質、ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＦＯＳ；Ｆｏｓプロトオンコジーン、ＧＤＮＦ；グリア細胞由来神経栄養因子、ＧＴＰ；Ｇｒａｄｙ  Ｔｒａｕｍａ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ＮＰＡＳ４；ニューロンＰｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメインタンパク質４、ＮＲ４Ａ１；核受容体サブファミリー４Ａ１、ＮＲ４Ａ２；核受容体サブファミリー４Ａ２。
【００８４】
[0243]補足表２（図２３）：年齢とＮＳＧコホートから得られた脳試料中の神経組織栄養遺伝子におけるＣｐＧ  ２０１個のＤＮＡｍレベルとの相関。注：青色は正相関を強調し、ピンク色は逆相関を強調する。＊多重試験レベルに対する補正後に有意（ｐ＜０．０５／２０１）、†名目上有意（ｐ＜０．０５）。略語：ＢＤＮＦ；脳由来神経栄養因子、ＧＤＮＦ；グリア細胞由来神経栄養因子、ＮＰＡＳ４；ニューロンＰｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍドメインタンパク質４、ＮＲ４Ａ２；核受容体サブファミリー４Ａ２、ＮＳＧ；脳外科手術。
【００８５】
[0244]本開示について好ましい実施形態を参照して記載してきたが、当技術に熟達した者は、開示した装置、システムおよび方法の精神と範囲から逸脱することなく形態および詳細に変更が行われ得ることを認識するであろう。
【図１】
2022500087.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
2022500087.tif 000012
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2022500087.tif 000047
2022500087.tif 000048