【事件の表示】
　特願２０１５−５１４３７８「組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用する異種タンパク質発現方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２５年１２月　５日国際公開、ＷＯ２０１３／１７８３４４、平成２７年　８月１３日国内公表、特表２０１５−５２３０６５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、２０１３年（平成２５年）５月２４日（パリ条約による優先権主張　外国庁受理２０１２年５月３０日、欧州特許庁、２０１２年５月３０日、米国）を国際出願日とする出願であって、平成２８年５月１７日付けの拒絶理由の通知に対し、同年１１月２４日に意見書及び手続補正書が提出されたが、平成２９年４月１４日付けで拒絶査定がされたところ、同年８月２５日に拒絶査定不服審判の請求がなされると同時に手続補正書が提出されたものである。
　
第２　平成２９年８月２５日にされた手続補正についての補正の却下の決定
［補正の却下の決定の結論］
　平成２９年８月２５日にされた手続補正（以下、「本件補正」という。）を却下する。
　
［理由］
１　本件補正について（補正の内容）
（１）本件補正後の特許請求の範囲の記載
　本件補正により、特許請求の範囲の請求項１の記載は、次のとおり補正された（下線部は、補正箇所である。）。
「【請求項１】エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のための、再生医療に使用するためにより未分化状態の細胞へ細胞を再プログラミングするための、又は特異的に分化した細胞状態の細胞へ細胞をプログラミングするための、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、
当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、
　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードして
おり、
　
ここで細胞の再プログラミング因子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに／又はここで該プログラミング因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せからなる群から選択され、
　
ここで治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、
　
（２）本件補正前の特許請求の範囲の記載
　本件補正前の、平成２８年１１月２４日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１の記載は次のとおりである。
「【請求項１】エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のための、再生医療に使用するためにより未分化状態の細胞へ細胞を再プログラミングするための、又は特異的に分化した細胞状態の細胞へ細胞をプログラミングするための、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに
　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている、ベクター。」
　
２　補正の適否
　本件補正は、本件補正前の請求項１に記載された発明を特定するために必要な事項である「変異」について、「当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、」のとおり限定を付加するものであり、また、本件補正前の請求項１に記載された発明を特定するために必要な事項である「細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質」について、「ここで細胞の再プログラミング因子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに／又はここで該プログラミング因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せからなる群から選択され、　ここで治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、」のとおり限定を付加するものであって、補正前の請求項１に記載された発明と補正後の請求項１に記載された発明の産業上の利用分野及び解決しようとする課題が同一であるから、特許法第１７条の２第５項第２号の特許請求の範囲の減縮を目的とするものに該当する。
　そこで、本件補正後の請求項１に記載された発明（以下、「本件補正発明」という。）が、同条第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に適合するか（特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか）について、以下、検討する。
　
（１）本件補正発明
　本件補正発明は、上記１（１）に記載したとおりのものである。
　
（２）引用文献の記載事項
　原査定の拒絶理由で引用文献１として引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物である特表２００８−５２９５０８号公報（以下、「引用文献１」という。）には、以下の事項が記載されている（下線は合議体による。）。
　
ア　「【請求項１】二次
転写能力を欠損することなく複製能力の欠損を生じる、遺伝子
Ｐのうち少なくとも１つに突然変異を有するウイルスゲノムを含有している組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルス
【請求項２】パラミクソウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
センダイウイルス
【請求項４】突然変異を遺伝子Ｐ中に有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項５】突然変異は、遺伝子Ｐにコードされるタンパク質のＮ末端部分配列に関することを特徴とする、請求項４に記載のウイルス。
【請求項６】突然変異は、
（ａ）
遺伝子Ｐにコードされるタンパク質のアミノ酸２〜７７又は
（ｂ）
複製能力を欠損するために十分な（ａ）の部分配列
の欠失を含む
【請求項７】ウイルスゲノムは、
異種遺伝子産物をコードする配列を少なくとも１つ含有している
【請求項８】異種遺伝子産物は、タンパク質、リボザイム、アンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ分子であることを特徴とする、請求項７に記載のウイルス。
【請求項９】
異種遺伝子産物は、
抗原又は治療タンパク質である
・・・・・・・・・・・・
【請求項１７】請求項１から１４までのいずれか１項に記載の組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノム又は／及びアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子。
・・・・・・・・・・・・
【請求項２８】次の工程：
（ａ）遺伝子Ｎ、Ｌ及びＰのうち少なくとも１つに、二次
転写能力を欠損することなく、ウイルスゲノム複製能力の欠損を生じる
（ｂ）ウイルスの増殖が行われる条件下に細胞を培養する工程
を含む請求項１から１４までのいずれか１項に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの増殖方法。
【請求項２９】請求項１から１４までのいずれか１項に記載の組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルス、請求項１５に記載のヌクレオカプシド又は請求項１６に記載のウイルスゲノムを作用物質として、ならびに場合により製剤学的に通常の担体又は／及び助剤を含有していることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３０】ワクチンとして使用するための請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】単価又は多価ワクチンとしての請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】ウイルス感染に対するワクチンとしての、例えば、病原性マイナス鎖ＲＮＡウイルスでの感染に対するワクチンとしての、請求項３０又は３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】抗腫瘍治療に使用するための請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３４】リスクのある患者で使用するための請求項２９から３３までのいずれか１項に記載の医薬組成物。」（特許請求の範囲）
　
イ　「【００２４】
本発明による組換えマイナス鎖ＲＮＡ−ウイルスは、遺伝子
Ｐのうち少なくとも１つに突然変異を有する
突然変異は、遺伝子
Ｐのうち１つの中での欠失、置換又は／及び挿入であることができ、これらはウイルスの複製欠損を引き起こすが、しかし、転写能力を壊すことはない
【００２５】本発明の有利な１実施態様では、
組換えウイルスは、遺伝子Ｐ中、そのうちでも特に遺伝子ＰのＮ−末端部分配列中に突然変異を有する
この突然変異は、アミノ酸２〜７７の領域内で複製能力の欠損を導く突然変異であるのが特に有利であり、例えば、（ａ）遺伝子Ｐによりコードされたタンパク質のアミノ酸２〜７７又は（ｂ）（ａ）の部分配列の複製能力を欠損するために十分である部分配列の欠失である
　
ウ　「【００２７】突然変異の他に、
本発明により組換えウイルスは、
少なくとも１つの異種遺伝子産物コード配列を含む
異種遺伝子産物は、
抗原（これに対して免疫応答が発生する）、又は治療タンパク質
異種遺伝子産物は、
腫瘍抗原又は自己抗原であるのが有利である
エ　「【００３２】本発明のもう１つの対象は、本発明による組換えマイナス鎖ＲＮＡ−ウイルスゲノム又はその前駆体、又はウイルス−アンチゲノム又はその前駆体をコードする１本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、ｃＤＮＡ分子である。これに関連して、”前駆体”という用語はＤＮＡ分子が異種遺伝子産物コード配列を有さず、単にこのような配列を挿入するためのクローニング部位を有することを意味する。クローニング部位は、１つの制限切断部位、例えば、ＤＮＡ中の特異的又は非特異的な制限切断部位、又は幾つかの連続した制限切断部位、有利には特異的な制限切断部位を有するマルチプルなクローニング部位である。ウイルスゲノム又は／及び相補配列をコードするＤＮＡ分子は、有利には適切な発現調節配列と作動的に連結した形で存在する。
【００３３】
ＤＮＡ分子は、有利にはベクター
　
オ　「【００４４】本発明のもう１つの対象は、先に挙げたような複製欠損性でかつ転写可能な組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルス、又はそのヌクレオカプシドを作用物質として、ならびに場合により製剤的に通常の担体又は／及び助剤として含有している医薬組成物である。医薬組成物は、人類医学及び獣医学で使用するために適切である。これらは特にワクチンとして、又は抗腫瘍治療用に使用でき、特に子供、老人又は／及び損傷もしくは衰弱した免疫系を有する人のようにリスクのある患者で使用するためのワクチンとして使用できる。この場合に医薬組成物は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスをその元のウイルスエンベロープ中に含有できる。」（【００４４】）
　
カ　「【００６８】３．
複製欠損センダイウイルス−ベクター
　それぞれタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬの遺伝子が欠失した複製欠損センダイウイルスをコードするｃＤＮＡ構築物ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＮ、−ΔＰ及び−ΔＬを製造した。このために、ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｓｉｘを維持しながら、それぞれ遺伝子Ｎ、Ｐ又はＬの読取り枠を欠失しなくてはならず、その際、非コード転写カセットは適切な位置で保持されたままでなくてはならなかった（図８Ａ）。
【００６９】欠失したＯＲＦの代わりに制限切断部位の挿入により、各ｃＤＮＡ構築物ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＮ、−ΔＰ及び−ΔＬ中に後で使用するために、もう１つの機能的転写カセットを提供することにした。必要な場合には、この中にもう１つの導入遺伝子を挿入できる。
【００７０】複製欠損ＳｅＶＶの更なる変異体として、Ｎ−末端の短くなったＰタンパク質をコードし、
アミノ酸２〜７７が欠損している欠失突然変異体ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７を製造した
【００７１】ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＮ、−ΔＰ及び−ΔＬのクローニングは全て同じ原則に従って実施した。ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰのクローニングは、実例を挙げて以下のパラグラフで詳細に説明することにする。これに関連して、ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＮと−ΔＬのクローニングにおける違いだけを表にまとめた。
【００７２】３．１　ｃＤＮＡ構築物ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰとｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７のクローニング
　Ｐ−タンパク質のＯＲＦを、複製可能なウイルスｐＳｅＶ−ｅＧＦＰのｃＤＮＡ構築物から取り除き、複製欠損ベクターをコードする新たなｃＤＮＡ　ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰを製造した。Ｐ−ＯＲＦの代わりに、ＸｈｏＩ−制限切断部位を組込んだ。
【００７３】ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰのクローニングに関して、ＰＣＲ　ΔＰ　ＩとＰＣＲ　ΔＰ　ＩＩという名称の２個のＰＣＲ−断片を製造し、引き続き融合した。両方のＰＣＲ−反応のための鋳型としてｐＳｅＶ−ｅＧＦＰを使用した。断片ＰＣＲΔＰ　Ｉ（１２７２　ｂｐ）では、フォワード−プライマーΔＰ　Ｉ（＝Ｎ−５７８；表３）により、特異的ＳｐｈＩ−部位の前のＮ　ＯＲＦの領域内で、鋳型とのハイブリダイゼーションが達成された。リバース−プライマーΔＰ　Ｉ（＋）は、Ｐ遺伝子の５’−ＮＴＲ領域内でＰのＡＴＧ−コードの前まで鋳型とハイブリダイズされ、かつそこで制限切断部位ＸｈｏＩが挿入された。
【００７４】断片ＰＣＲΔＰ　ＩＩは１９３８　ｂｐから成り、ここでも鋳型としてｐＳｅＶを使用した。フォワード−プライマーΔＰ　ＩＩをＰ配列の５’−ＮＴＲの一部とハイブリダイズし、かつＸｈｏＩ−切断部位につなげた。ＰＣＲ　ΔＰ　ＩＩ（＋）のリバース−プライマーは、特異的Ｅｃｏ４７　ＩＩＩ部位の後ろのＦ遺伝子のＯＲＦ内で結合し、さらに１つの人工的なＭｌｕＩ−部位を有した。
【００７５】２のＰＣＲ−断片ΔＰＩとΔＰ　ＩＩをＸｈｏＩ−部位により組合せた。Ｎ　ＯＲＦの部分配列、組込まれたＸｈｏＩ−制限切断部位を有する非コードＰ−転写カセット、ＭならびにＦ　ＯＲＦの四分の一から成る融合産物を制限酵素ＳｐｈＩ及びＭｉｕＩで切断し、中間クローニングし、かつ配列が正しいことが証明された。正しい配列を有するサブクローンから、３００６　ｂｐの大きなＳｐｈＩ―Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片を切断し、これは同じ処理をしたベクターｐＳｅＶ−ｅＧＦＰ中にライゲーションした。配列検査後に相応のｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰクローン（ゲノムウイルスｃＤＮＡ）を複製欠損ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの製造用に準備した（図９）。
【００７６】欠失突然変異体ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７をクローニングするために、２個の変異誘発プライマーを用いるＰＣＲを使用した。フォワードプライマー”ＸｈｏＩ　ＰΔ２−７７”は、ＸｈｏＩ−部位を有し、ＡＴＧ−開始コドンならびにＰタンパク質のアミノ酸７８〜８６のコドンが続いていた。リバースプライマー”ＰΔ２−７７（＋）ＸｈｏＩ”は、Ｐタンパク質の最後の１０コドンとＸｈｏＩ−部位を有した。アミノ酸７６個だけ短くなったＰタンパク質のＮ末端の読取り枠は、鋳型ｐＳｅＶから出発してｒｕｌｅ　ｏｆ　ｓｉｘを維持しながらＰＣＲにより製造した。２つのクローニング工程により、ＸｈｏＩで切断された１４８８ｂｐの大きな断片を元のＰ−ＯＲＦの位置でｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの非コード転写カセット中に挿入した。配列検査後にゲノムｃＤＮＡクローンも複製欠損ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の製造用に準備した（図９）。
【００７７】Ｐ　ＯＲＦ中のコドン２〜７７の欠失は、非構造タンパク質の場合にＶ及びＷタンパク質でもＮ−末端が短くなる結果となり、かつＣ−ファミリーまたＣ’だけ（同様に切断された）によりコードされたままであった；タンパク質Ｃ、Ｙ１及びＹ２は、欠失した開始コドンゆえに、もはや短くなったｍＲＮＡから翻訳されることができなかった。」（【００６８】〜【００７７】）
　
キ　「【０１１１】６．変性ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰｃＤＮＡ構築物の製造
　標的細胞中でＰ遺伝子欠失ＳｅＶＶの転写能力を場合によっては改善するために、元のＰ−読取り枠の位置で、Ｎ末端がアミノ酸７６個だけ短くなった形のＰタンパク質をコードする、もう１つの組換え構築物を製造した（”ｐＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７”；項目３．１と図８Ｂ参照）。
【０１１２】ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７粒子の産生とそれらの増殖は、項目４．１及び５．４と同様に行った。
【０１１３】６．１　Ｈ２９ヘルパー細胞中でのＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の成長挙動
　ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染したＨ２９ヘルパー細胞中では、Ｎ末端がアミノ酸７６個たけ短くなったウイルスコードＰΔ２−７７タンパク質を細胞性コードＰタンパク質と一緒に合成した。
【０１１４】ウイルス複製に対する短くなったＰタンパク質ＰΔ２−７７の発現の影響を調べるために、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの成長速度で記載した方法と同様に、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７、ＳｅＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰ又はコントロールウイルスＳｅＶ−ｅＧＦＰでＨ２９細胞の感染（ＭＯＩ＝３）を実施した。個々の調製物の上澄みを１２０時間にわたり、後代ウイルス滴定量の細胞感染価試験により、ｅＧＦＰ発現細胞の数について測定した。
【０１１５】ＳｅＶ−ｅＧＦＰ感染Ｈ２９細胞（陽性コントロール）から、１２０時間の期間内に平均して８０個のウイルス粒子が遊離されたが、その際にＨ２９細胞によるＰタンパク質のトランス相補化は、この場合には必要ではなかった。ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７は、ＳｅＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰのようにほぼ同じ効率でＨ２９トランス相補化系において増殖できた：感染したＨ２９細胞から１２０時間後に約２０×１０６個のウイルス粒子がＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰ又はＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７から遊離され、これはＨ２９細胞１つ当たり、Ｐ突然変異体の遊離ウイルス粒子約４０個の数に相当した。」（【０１１１】〜【０１１５】）
　
ク　「【０１１６】７．ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰとＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の遺伝子発現の比較ならびに感染した標的細胞中でのタンパク質合成の定量化
　感染した標的細胞中でベクターＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７がＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰと比べて強い導入遺伝子発現を示すかどうかを調べるために、レポーター遺伝子ｅＧＦＰならびにＨＮタンパク質のウイルスコード発現を詳細にキャラクタリゼーションした。
【０１１７】５×１０５個のベロ細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させ（ＭＯＩ＝１）、その際、ｐ．ｉ．２日目に、約７０％蛍光ベロ細胞が観察できた（記載なし）。このことは、これらのウイルスベクター変異体の殆どのＲＮＰ−複合体が標的細胞中で測定可能な転写を誘発できることを意味する。
【０１１８】７．１　ＦＡＣＳ−分析によるｅＧＦＰ発現の定量化
　レポーター遺伝子ｅＧＦＰがＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７中に挿入された転写カセットは、後で医学分野で使用する際に病原体、例えば、所望のウイルスの抗原をコードするべきである。これらの抗原発現は、患者において保存的免疫応答を引き起こすために十分でなくてはならない。
【０１１９】標的細胞を感染した各ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７ヌクレオカプシドが検出可能な導入遺伝子発現を行えることを証明するために、同じ数のＨ２９とベロ細胞を同量のウイルス粒子に感染させ、かつＦＡＣＳ（蛍光活化細胞選別）分析によりＦＡＣＳ−フローサイトメターを使用しながら、ｅＧＦＰ発現Ｈ２９細胞もしくはベロ細胞の数を比較した。全細胞数に対する感染細胞の蛍光シグナルをプロットすることにより、データをコンピューターヒストグラム法により評価した。
【０１２０】２．５×１０５個のベロ細胞又はＨ２９細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７又はＰ遺伝子欠失ウイルスＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰ（ＭＯＩ＝１）に感染させた。プローブのＦＡＣＳ分析は、感染の２４時間後に行った。感染細胞をＰＢＳ中に取り、かつフローサイトメトリーにより蛍光細胞の数を計算した。結果は、蛍光ベロ細胞とＨ２９細胞の割合［％］として図１１に挙げられている。
【０１２１】Ｈ２９ヘルパー細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰに感染させた２４時間後に、ｅＧＦＰ−発現Ｈ２９細胞の８６％がＦＡＣＳ分析により検出できた。ここで、Ｐタンパク質の細胞性合成は、新たなＰ：Ｌ−複合体の形成、ひいては新たなｍＲＮＡの産生を促進した。このことは、感染細胞中でｅＧＦＰ−タンパク質の合成を生じた。これに対してベロ細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰに感染させた場合には、ｐ．ｉ．２４時間目でも、それ以降の時点でも更なる試験調製物中でｅＧＦＰ−タンパク質の発現は検出できなかった。ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰヌクレオカプシドによりトランスフェクトしたＰ：Ｌ−複合体は、ＭＯＩ＝１で感染させた場合には感染したベロ細胞中で検出可能な発現を引き起こすことができなかった。
【０１２２】これに対してＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染した２４時間後に、ＦＡＣＳ分析により８０％弱のｅＧＦＰ発現Ｈ２９細胞及び同じく７５％のｅＧＦＰ発現ベロ細胞を同定できた。Ｈ２９細胞の感染の際に、ｅＧＦＰｍＲＮＡの転写をＰタンパク質の細胞合成により、ひいては新たなＰ：Ｌ−複合体により促進できる。ベロ細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させた際に、Ｎ末端が短くなったＰタンパク質ＰΔ２−７７の新たな合成により転写が強くなった。
【０１２３】この結果から、転写能力のあるＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の数により重要な確証が得られた：Ｈ２９細胞とベロ細胞はＭＯＩ＝１で感染した。理論的に生じる細胞の多重感染は、両方の調製物中で統計的に同様に殆ど可能性がなかった。ｐ．ｉ．２４時間目では、８０％弱のｅＧＦＰ−発現Ｈ２９細胞と、約７５％のｅＧＦＰ−発現ベロ細胞が同定された。これにより、Ｐヘルパー細胞中で導入遺伝子発現が可能な短いＰ変異体ＰΔ２−７７１を有する各ＲＮＰ−複合体は、感染した標的細胞中でも同様に導入遺伝子発現をもたらすという推論を導き出すことができた。これに対してＰ　ＯＲＦの完全欠失がある変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰは、この特性を満たさなかった。
【０１２４】７．２　感染した標的細胞中で発現したＨＮ−タンパク質の機能試験
　血球吸着（ＨＡＤ）試験を用いて、個々の感染細胞においてヒト赤血球の結合の効果及びウイルスＨＮ−タンパク質の露出の効果を検出した（図１２）。
【０１２５】５×１０５個のベロ細胞を低いＭＯＩ＝０．５でＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７に感染させた。これに対して、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの場合に個々の蛍光細胞を総じて観察できるようにするために、１０倍高いＭＯＩ＝５でベロ細胞を感染させなくてはならなかった。吸着１時間後に、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ含有の培地交換を行った。引き続き、細胞を３３℃で数日インキュベートした。両方のベクター変異体の導入遺伝子発現は、まずｅＧＦＰ−蛍光により再び追跡した。ｐ．ｉ．５日目と９日目に、ＨＡＤ−試験系列を実施し、ヒト赤血球の形成を手かがりにウイルスＨＮタンパク質の露出を分析した。
【０１２６】ＭＯＩ＝５のＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの場合に、統計的にベロ細胞の９９．３％が感染したにもかかわらず、顕微鏡で０．０１％のｅＧＦＰ−陽性細胞だけが観察できるに過ぎなかった（図１２左上）。これに対して、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７では、ＭＯＩ＝５の場合に緑色蛍光が期待通りに細胞の４０％で見られた（図１２左下）。
【０１２７】ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰに感染した２日後には、半分のｅＧＦＰ−陽性細胞（感染した５×１０５のうち２５個）は、赤血球がその表面上に結合できた（図１２上中央）。更なるインキュベーションと再度ＨＡＤ試験の後には、感染細胞上で赤血球吸着は何も起こらなかった。２番目の複製欠損ＳｅＶＶ変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７では、はるかに改善された結果が得られた：感染５日後に、感染細胞（ＭＯＩ＝０．５）の約４０％は、赤血球がその表面に結合できた（図１２下中央）。この場合に、個々の細胞では、１０〜７０個の複合赤血球の様々な結合活性が観察できた。従って、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染した細胞（ｐ．ｉ．５日目）はＨＮタンパク質が細胞表面上に露出でき、機能的ＨＡＤ−試験は陽性として評価できることが示された。同時に、様々な量の結合赤血球を手がかりに、感染細胞中でＨＮ−タンパク質の効果的発現を算出できた。
【０１２８】感染細胞を３３℃でさらにインキュベートし、その際、ＨＮ−タンパク質のノイラミニダーゼ活性が感染細胞に結合した赤血球の剥離を生じた。前記細胞を洗浄して剥離した赤血球を取り除き、かつさらに３３℃で４日間インキュベートした。ｐ．ｉ．９日目に、さらにＨＡＤ−試験を実施した。今度は約３０％のＨＡＤ−陽性ベロ細胞だけが検出された。この場合に結合した赤血球の数は、細胞１つ当たり赤血球５〜２０個に減った。
【０１２９】またｐ．ｉ．９日目では、複製欠損変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７により依然として十分な機能性ＨＮが合成された。これに対して、Ｐ　ＯＲＦの完全欠失がある変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰは、この特性を満たさなかった。
【０１３０】７．３　ウェスタンブロット分析によるｅＧＦＰ発現の定量化
　細胞の全タンパク質の一連の希釈系列を用いてウェスタンブロット分析により、複製可能なＳｅＶ−ｅＧＦＰと比較して、複製欠損ＳｅＶ−ベクターのｅＧＦＰ発現の半定量的評価を実施した。
【０１３１】５×１０５個のベロ細胞をＳｅＶ−ｅＧＦＰ又はＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させた（ＭＯＩ＝３）。ｐ．ｉ．２４時間目に、細胞の溶解を行った；細胞抽出物を一連の希釈系列（１：２）で２０μｇから２．５μｇの全体量までＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で解かした。タンパク質をＰＶＤＦ膜上にトランスフェクトし、かつ初めにウイルスコードｅＧＦＰ−タンパク質（２６ｋＤａ）をウェスタンブロット分析により検出した（図１３）。
【０１３２】蛍光タンパク質ｅＧＦＰは、ウェスタンブロット分析を用いて、ＳｅＶ−ｅＧＦＰ及びＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７感染ベロ細胞中の両方で検出できた。ｅＧＦＰシグナルの強さの比較により、複製欠損ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７から算出した発現が複製可能なＳｅＶ−ｅＧＦＰに比べて約１６倍減少したと言うことができる。
【０１３３】この場合に１６倍の減少は僅かであり、かつ変性Ｐタンパク質であるにもかかわらず、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７は極めて効果的な二次転写をもたらしたと言うことができる。
【０１３４】７．４　ウェスタンブロット分析によるＨＮ−発現の評価
　ＳｅＶ　ＨＮ−タンパク質はｅＧＦＰタンパク質とは異なり膜貫通型の表面タンパク質であり、かつ重要な抗原決定因子である。ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７感染細胞中でＨＮ−タンパク質の発現強さを相対的に定量化することにより、ＳｅＶ　ＨＮ−抗原の発現の強さについて証言が可能である。
【０１３５】細胞の全タンパク質の一連の希釈系列を用いてウェスタンブロット分析により、複製可能なＳｅＶ−ｅＧＦＰと比較して、複製欠損ＳｅＶ−ベクターのＨＮ発現の半定量的評価を実施した。ベロ細胞５×１０５個ごとに、２つの平行調製物中で、ＳｅＶ−ｅＧＦＰ又はＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７（ＭＯＩ＝１）に感染させ、かつ２４時間もしくは４８時間インキュベートした。この後に、細胞の溶解を行った；細胞抽出物を一連の希釈系列（１：２）で１６μｇから２μｇの全体量までＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で溶かした。タンパク質をＰＶＤＦ膜上にトランスフェクトし、かつウイルスコードＨＮ−タンパク質（６０ｋＤａ）を単クローンＨＮ抗体を用いて検出した（図１４）。
【０１３６】ＨＮタンパク質は、ＳｅＶ−ｅＧＦＰ感染ベロ細胞の場合に両方のインキュベーション時間の後に全てのレーン中（１６〜２μｇ全タンパク質；左右のレーン２〜５番目）で効果的に検出できた。ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の場合には、ＨＮタンパク質のバンドが１６μｇ及び８μｇの全タンパク質を有するレーン（レーン７、８）でも目視できたが、弱い強さであった。ＳｅＶ−ｅＧＦＰ−に対するＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７感染ベロ細胞中でのＨＮ発現の相対的定量化は、１６及び８μｇの全タンパク質対２μｇの全タンパク質の比較により行い（左右のレーン７と８、対レーン５）、かつインキュベーション時間とは無関係にＰ欠失変異体の８〜１６倍のＨＮ発現の推定した減少を可能にした。これは、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７感染標的細胞中で比較的に高い転写率を生じ、ひいては一般にウイルス複製欠損ベクターの高い導入遺伝子発現を生じさせることができる。
【０１３７】両方の測定値（ｅＧＦＰタンパク質とＨＮタンパク質）を含めて、平均して１０倍の発現の減少から始めることができる。」（【０１１６】〜【０１３７】）
　
ケ　「【０１３８】８．標的細胞中でのＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の複製欠損
　ベロ細胞を複製可能なＳｅＶ−ｅＧＦＰに感染させた場合には、これに続いて２日で初めに感染した強い蛍光細胞の周辺に、１０００個までの更なる蛍光細胞から成るスポットが生じた。ベロ細胞中でＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の複製欠損を立証するために、ベロ細胞の自然な分裂速度を考慮して、初めに感染した標的細胞の周辺で緑色蛍光細胞が生じないことを確認することにした。ベロ細胞は平均して２４時間ごとに分裂した。ベロ細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させた場合には、約２４時間後に検出可能なｅＧＦＰ−発現が見られた。さらにインキュベーションフェーズの２４時間後にも、これらの初めに感染した蛍光ベロ細胞から、自然分裂により幾つかの場合に２つの（弱い）蛍光娘細胞が生じた。この観察結果は、１０１〜１０４個のウイルス粒子が感染した標的細胞から生じたウイルス増殖とは関係がなく、よって隣接する細胞を感染できる。他方で、感染細胞の自然な分裂速度は、細胞分裂の数が増すにつれて減少したｅＧＦＰ−発現強さに影響を与えた。この観察結果は、ウイルスベクターＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７がゲノム複製欠損であるということ、すなわち、新たなゲノムが何も合成されていないことを示している。感染細胞の幾つかの連続した細胞分裂が、最後には停止するまで蛍光強さの連続的な減少を生じる場合には、ウイルス増殖は排除されることになる。
【０１３９】標的細胞中でＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の複製欠損を最終的に持続させるために、最後の試験を実施した：
　Ｔ７５−フラスコを〜２０×１０６個のベロ細胞で覆った。これらの細胞はインキュベーションフェーズを開始するために既に高密度で播かれていたので、その結果もはや強い分裂活性はなかった。これらのベロ細胞をＭＯＩ＝０．００１でＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させた。１時間のインキュベーション時間の後、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（少ない分裂活性）による培地交換を行い、かつベロ細胞を３３℃でインキュベートした（Ｐ１）。ｐ．ｉ．２日目では、選択したＭＯＩに相応して、初めに個々に存在する数千の感染蛍光ベロ細胞が観察できた。高い細胞密度ゆえに、それに続く４日のインキュベーションで、殆ど細胞分裂しなかった。すなわち、初めの感染細胞の数は、蛍光により一定のままで検出された。この時間内にウイルス粒子が形成された場合には、これに隣接する細胞を感染させることができた。このことは、蛍光の増大により反映されていた。８日後にも、周辺細胞の欠損した新たな感染ゆえにウイルスベクターの伝播を排除できた。細胞に新たな培地を与えるために、上澄液を取り出し、かつベロ細胞を新たな培地で覆った。インキュベーション開始から１２日後に、培地の底からベロ細胞が剥がれた。全体の試験期間の間に、ウイルスベクターの複製は増大する蛍光細胞の形で観察することができなかった。従って、隣接するベロ細胞における一次感染細胞によるＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７の伝播を新規ウイルスゲノムならびにウイルス粒子の産生により排除できた。よって、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７を複製欠損ウイルスベクターと称するべきである。
【０１４０】結論：
　先に挙げた結果は、標的を定めたポリメラーゼ複合体の成分の遺伝子操作により、ウイルスコード遺伝子を転写できるが、ウイルスゲノムをもはや複製しない複製欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスを製造できたということを示している。
【０１４１】センダイウイルスの場合には、ポリメラーゼ補助因子リンタンパク質の遺伝子が完全に欠損しているか（”ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰ”）又はアミノ酸２〜７７のコドンが取り除かれていた（”ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７”）特殊な２つの変異体をさらに詳しく試験した。２つのＳｅＶベクターは、Ｐタンパク質をトランスの形で提供しない細胞（いわゆる標的細胞）中で複製欠損であるが、しかしその遺伝子発現性が著しく異なる。
【０１４２】ＭＯＩ＝５のＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの場合には、統計的にベロ細胞の０．７％だけが感染せずに残った（９９．３％は少なくとも１つのＲＮＰ複合体を含有した）にもかかわらず、顕微鏡では０．０１％だけのｅＧＦＰ−陽性細胞が観察できた。このことから、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ΔＰの１５以上のＲＮＰが１つの感染した標的細胞中に同時に存在する場合に、目視可能な導入遺伝子発現を生じることが計算により結論付けられた。
【０１４３】このＰ遺伝子欠損ＳｅＶＶは、類似した狂犬病ΔＰ変異体のように似た弱い発現を示した（上記Ｓｈｏｊｉ等）。両方のベクターは感染した標的細胞中で、ウイルス粒子から持ち込まれたポリメラーゼ複合体により一次転写できるだけである。しかしベクターの治療用途には、コードした導入遺伝子もしくは抗原の強い発現が望ましい。この条件は、複製欠損変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７を用いて満たすことができ、これは複製可能なＳｅＶ　と比べて、平均して１０倍少ない発現能力を標的細胞中でもたらす。ベクターゲノム中、Ｎ末端が短くなったＰタンパク質の遺伝子の存在により、一次転写だけではなく、二次転写も可能である。これは、新たに生じるベクターコードＰΔ２−７７タンパク質を含有する変性ポリメラーゼ複合体により成就するが、これらはポリメラーゼの複製様式は促進しない。
【０１４４】感染した標的細胞中のタンパク質合成の定量化により、複製欠損ウイルスベクターＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７が、ウイルスコード遺伝子の効果的な転写と発現を実行できることが証明された。この場合に、３’近位の導入遺伝子（ｅＧＦＰ）が効果的に合成されるだけではなく、ゲノム位置６に存在するＨＮ−遺伝子も感染の少なくとも９日後に転写され、かつタンパク質が感染した標的細胞において機能的に露出した。」（【０１３８】〜【０１４４】）
　
コ　「【０１４５】９．複製欠損ＲＮＡ−ワクチンによるマウスモデル中で誘発した免疫応答の測定
　特にＰ遺伝子中の欠失（”ＰΔ２−７７”）により、新たなゲノムの合成を可能にしない変性ウイルスポリメラーゼ複合体を生じることが示された。同時に、このような複製欠損ウイルスに感染した後に、標的細胞中で媒介されたウイルス遺伝子発現は、複製可能なウイルスでの感染と比べて約１０倍低かった。
【０１４６】ワクチンベクターとして複製欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスの十分なイムノゲンの特性を検出するために、２組の異種ウイルスの抗原もしくは抗原決定基（ヒトパラインフルエンザウイルスＴｙｐ　３、ｈＰＩＶ３及び呼吸系発疹ウイルス、ＲＳＶ）をウイルスゲノム中に挿入した：このために、元の表面タンパク質ＦとＨＮの遺伝子がキメラＦタンパク質とＨＮタンパク質ＳｅＶ／ｈＰＩＶ３をコードする遺伝子と置換されている複製欠陥ＳｅＶ　ＰΔ２−７７を構築した。キメラのＦタンパク質は、５５８個のアミノ酸を有し、かつｈＰＩＶ３の細胞外ドメイン（アミノ酸４９３個）、ＳｅＶの膜間ドメイン（アミノ酸２３個）及びＳｅＶの細胞質ドメイン（アミノ酸４２個）から成る。キメラのＨＮタンパク質は、５７９個のアミノ酸を有し、かつＳｅＶの細胞質ドメイン（アミノ酸３５個）、ＳｅＶの膜間ドメイン（アミノ酸２５個）ならびにｈＰＩＶの細胞外ドメイン（アミノ酸５１９個）から成る。キメラのＦタンパク質とキメラＨＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列プロトコールでは配列番号２７及び２８と称した。
【０１４７】ウイルスゲノム中へのキメラ遺伝子の挿入により、新たな抗原性が作られると同時にそれらの産生の際にウイルス粒子の効率的な組立てが保障された。
【０１４８】２つのウイルス遺伝子の間に組込まれた更なる発現カセット中で、ＲＳＶの表面タンパク質Ｆのコード化を行った。これにより、構築物が二価ワクチンに広げられた。
【０１４９】これらの新規ワクチンを動物モデルでテストした。Ｂａｌｂ／Ｃマウスのグループを３週間の間隔で、２種の異なるウイルスプレパレーション（グループＡもしくはＣ、それぞれ１０４感染単位）で３回鼻腔内免疫し、コントロール群（Ｂ）はワクチンの代わりにＰＢＳを含有させた。３回目の免疫化の後に、粘膜免疫応答の分析のために鼻洗浄液（ＮＷ）を獲得し、ならびに気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、かつ体液性免疫応答を分析するために血清を単離した。ｈＰＩＶ３ならびにＲＳＶに対して特異的に誘発された免疫グロブリンＩｇＡとＩｇＧの量をＥＬＩＳＡにより測定した。複製欠損ワクチンプロトタイプは、ｈＰＩＶ３に対して特異的なＩｇＡ抗体の著しい誘発を引き起こし（図１５Ａ）、抗ＲＳＶ　ＩｇＡ抗体の誘発は僅かであった（表示無し）。体液性免疫応答の誘発は、両方のウイルスの表面抗原に対して、特異的ＩｇＧの量が２倍異なる比較可能な滴定量をもたらした（図１５Ｂ）。抗ｈＰＩＶ３−ＩｇＧの更なる分析は、誘発された抗体が中和特性（滴定量１／６４）を有することを示した。これに対して、予想通りに、コンロトールグループでは何の特異的ＩｇＡもしくはＩｇＧ誘発も確認できなかった。
【０１５０】本発明によるワクチンは、体液性ウイルス抗原に対して特異的粘膜応答と体液免疫応答を誘発できた。更なる実験は、リンパ球免疫マウスがインターフェロンγを産生したのに対して、ＩＬ−５は検出できなかったことを示した。この調査結果は、二価の複製欠損ＲＮＡワクチンが長い持続的免疫性にとって必要条件であるＴ細胞免疫応答を引き起こせることを示している。
【０１５１】結論
　抗原のコード配列中に２組の異種ウイルスを挿入した変性ベクターで実験動物を感染させた後、中和抗体の誘発が検出された。このことは、新しいタイプのワクチンを開発するための複製欠陥マイナス鎖ＲＮＡウイルスの可能性を示している。」（【０１４５】〜【０１５１】）
　
　上記記載事項ア〜エ及びカ〜ケから、引用文献１には、「組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種遺伝子産物コード配列を含み、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７又はその部分配列の欠失である、並びに
　ここで該少なくとも１種の異種遺伝子産物コード配列は、腫瘍抗原又は治療タンパク質をコードしている、
ベクター。」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
（３）引用発明との対比
ア　本件補正発明１、２及び３について
　本件補正発明を、「エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のための、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、並びに　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、治療的タンパク質をコードしており、　ここで治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、ベクター。」に係る発明（以下、「本件補正発明１」という。）、「再生医療に使用するためにより未分化状態の細胞へ細胞を再プログラミングするための、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、並びに　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子をコードしており、　ここで細胞の再プログラミング因子が、Ｎａｎ��ｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ベクター」に係る発明（以下、「本件補正発明２」という。）、「特異的に分化した細胞状態の細胞へ細胞をプログラミングするための、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、並びに　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、プログラミング因子をコードしており、　ここで該プログラミング因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ベクター」に係る発明（以下、「本件補正発明３」という。）に分け、そのうちの本件補正発明１について、以下、検討する。
　
イ　本件補正発明１と引用発明とを対比する。
　引用発明の「異種遺伝子産物コード配列」は、本件補正発明１の「異種核酸配列」に相当し、引用発明の「センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７又はその部分配列の欠失」は、本件補正発明１の「センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、１個又は複数のアミノ酸の欠失」に相当する。
　したがって、本件補正発明１と引用発明は、「組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターであって、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、少なくとも１種の異種核酸配列を含み、
　ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、並びに
　ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、治療的タンパク質をコードしている、
ベクター。」である点で一致し、両者は以下の点でのみ相違する。
　
相違点：本件補正発明１は、エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のためのものであり、異種核酸配列によりコードされる治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択されるものであるのに対し、引用発明は、用途について特定されておらず、異種核酸配列によりコードされるタンパク質が、腫瘍抗原又は治療タンパク質であり、治療タンパク質について特定のタンパク質が記載されていない点。
　
（４）判断
　以下、相違点について検討する。
　癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌抗原をコードする遺伝子を含む、センダイウイルスベクターなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを、エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のために使用することは、本願優先日前周知技術である（国際公開第０３／０２９４７５号の第４４頁第１８行〜第２５行、第５５頁第１１行〜第２４行、第６７頁第４行〜第６行、国際公開第２００５／０４２７３７号の［００８５］、［００９２］、国際公開第２００５／０６７９８１号［００１０］、［００６７］参照）から、引用発明において、腫瘍抗原として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌抗原を用い、エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のために使用することは、当業者が容易に想到し得ることである。
　また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインをコードする遺伝子を含む、センダイウイルスベクターなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを、エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のために使用することは、本願優先日前周知技術である（国際公開第２００５／０４２７３７号［００８５］、［００９５］、国際公開第２００５／０６７９８１号［００１０］、［００１３］、国際公開第２００８／１３６４３８号［００２１］、［００８０］〜［００８１］参照）から、引用発明において、治療タンパク質として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを用い、エクスビボ若しくはインビボでの遺伝子治療のために使用することは、当業者が容易に想到し得ることである。
　そして、引用文献１には、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２〜７７の欠失により、ウイルスの転写能を欠損することなく、複製能を欠損させることができ、患者の治療に使用できることが記載されており（上記記載事項イ、オ、ク〜コ）、また、「複製欠損ウイルスベクターＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７が、ウイルスコード遺伝子の効果的な転写と発現を実行できることが証明された。この場合に、３’近位の導入遺伝子（ｅＧＦＰ）が効果的に合成されるだけではなく、ゲノム位置６に存在するＨＮ−遺伝子も感染の少なくとも９日後に転写され、かつタンパク質が感染した標的細胞において機能的に露出した」ことが記載されている（上記記載事項ケ）から、本件補正発明１の「改善された安全性プロファイルを示し、且つ十分に長い期間にわたり異種核酸配列を効率的に発現することが可能である」という効果は、引用文献１の記載から予測できる範囲内のものであり格別顕著なものということはできない。
　
（５）審判請求人の主張
　審判請求人は、平成２９年１０月５日提出の手続補正書により補正された審判請求書において、「本願明細書の段落０１０４において、本願ウイルスベクターが長期間のタンパク質発現を呈し、ＧＦＰマーカー遺伝子からの蛍光が、少なくとも３０日の期間に渡り中度にしか減衰せず、３０日以降も顕著に高かったことが言及されています。　また、本願明細書の段落０１０９において、Ｎ−末端アミノ酸２〜７７を欠く切断型Ｐタンパク質を含むウイルスを用いた形質導入が、５日後も非常に高く、８日後であっても優位なｍＲＮＡ発現を呈したことが言及されています。　更に、本願明細書の段落０１１０において、Ｐタンパク質におけるアミノ酸２から７７の欠失を持つ複製−欠損ウイルスから観察された長期間の組換え遺伝子の発現が驚異的知見であったと言及されています。従来、ウイルスヌクレオキャプシドの半減期は約２４時間と報告されていたため、ウイルスは、より長期間の発現を要する遺伝子治療や細胞の（再）プログラミング等の用途に適さないと一般的に認識されていたことも言及されています。」と主張している。
　しかしながら、引用文献１には、「５×１０５個のベロ細胞をＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染させ（ＭＯＩ＝１）、その際、ｐ．ｉ．２日目に、約７０％蛍光ベロ細胞が観察できた（記載なし）。このことは、これらのウイルスベクター変異体の殆どのＲＮＰ−複合体が標的細胞中で測定可能な転写を誘発できることを意味する。」、「２番目の複製欠損ＳｅＶＶ変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７では、はるかに改善された結果が得られた：感染５日後に、感染細胞（ＭＯＩ＝０．５）の約４０％は、赤血球がその表面に結合できた（図１２下中央）。この場合に、個々の細胞では、１０〜７０個の複合赤血球の様々な結合活性が観察できた。従って、ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７に感染した細胞（ｐ．ｉ．５日目）はＨＮタンパク質が細胞表面上に露出でき、機能的ＨＡＤ−試験は陽性として評価できることが示された。・・・・・・・・・感染細胞を３３℃でさらにインキュベートし、その際、ＨＮ−タンパク質のノイラミニダーゼ活性が感染細胞に結合した赤血球の剥離を生じた。前記細胞を洗浄して剥離した赤血球を取り除き、かつさらに３３℃で４日間インキュベートした。ｐ．ｉ．９日目に、さらにＨＡＤ−試験を実施した。今度は約３０％のＨＡＤ−陽性ベロ細胞だけが検出された。・・・・・・・・・またｐ．ｉ．９日目では、複製欠損変異体ＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７により依然として十分な機能性ＨＮが合成された。」（以上、上記記載事項ク）、「感染した標的細胞中のタンパク質合成の定量化により、複製欠損ウイルスベクターＳｅＶＶ−ｅＧＦＰ−ＰΔ２−７７が、ウイルスコード遺伝子の効果的な転写と発現を実行できることが証明された。この場合に、３’近位の導入遺伝子（ｅＧＦＰ）が効果的に合成されるだけではなく、ゲノム位置６に存在するＨＮ−遺伝子も感染の少なくとも９日後に転写され、かつタンパク質が感染した標的細胞において機能的に露出した。」（上記記載事項ケ）と記載されており、少なくとも９日後における遺伝子の発現が確認されているから、引用文献１においても、「長期間の組換え遺伝子の発現」が観察されているものと認められるので、「従来、ウイルスヌクレオキャプシドの半減期は約２４時間と報告されていたため、ウイルスは、より長期間の発現を要する遺伝子治療や細胞の（再）プログラミング等の用途に適さないと一般的に認識されていた」との審判請求人の上記主張は採用できない。
　
（６）小括
　したがって、本件補正発明１は、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本件補正発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。
　
３　むすび
　よって、本件補正は、特許法第１７条の２第６項において準用する同法第１２６条第７項の規定に違反するので、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
第３　本願発明について
１　本願発明
　平成２９年８月２５日にされた手続補正は、上記のとおり却下されたので、本願の請求項１〜１１に係る発明は、平成２８年１１月２４日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１〜１１に記載された事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、その請求項１に記載された事項により特定される、上記第２［理由］１（２）に記載のとおりのものである。
　
２　原査定の拒絶理由
　原査定の拒絶理由は、本願の請求項１〜１１に係る発明は、本願の優先日前に頒布された下記の引用文献１に記載された発明及び周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない、というものである。
　
引用文献１：特表２００８−５２９５０８号公報
引用文献２：Experimental Hematology,2011,Vol.39,No.1, p.47-54
引用文献３：J.Biol.Chem.,2011,Vol.286,No.6, p.4760-4771
引用文献４：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,Vol.108,No.34,p.14234-14239
引用文献５：国際公開第２０１０／１３４５２６号
引用文献６：国際公開第２０１０／００８０５４号
　
３　引用文献の記載事項
　原査定の拒絶理由で引用された引用文献１及びその記載事項は、上記第２［理由］２（２）に記載したとおりである。
　
４　対比・判断
　本願発明は、上記第２［理由］２で検討した本件補正発明から、「当該変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７における、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７に対応するアミノ酸における、１個又は複数のアミノ酸の欠失である、」、「ここで細胞の再プログラミング因子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに／又はここで該プログラミング因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せからなる群から選択され、　ここで治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、」に係る限定事項を削除したものである。
　そうすると、本願発明の発明特定事項を全て含み、さらに他の事項を付加したものに相当する本件補正発明が、前記第２［理由］２（３）、（４）に記載したとおり、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願発明も、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
第４　むすび
　以上のとおり、本願発明は、引用文献１に記載された発明及び周知技術に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。