【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月21日(2010.9.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ペルオキシダーゼを基本とするアッセイを行う方法であって、
ペルオキシダーゼ酵素と、下記の化合物：
2002538806.tif 000001

からなる群より選ばれる可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質化合物とを反応させる工程であって、
該基質化合物は、該ペルオキシダーゼ酵素との反応後に不溶性生成物を形成し、
該不溶性生成物は、照射されたときに活性化形態へと転換する
ことを特徴とする工程、
該不溶性生成物に光を照射することにより、該不溶性生成物を活性化形態へと転換する工程、
該活性化形態にある不溶性生成物に第１の波長の光を照射する工程であって、該照射により、該活性化形態にある不溶性生成物が、該第１の波長よりも長い第２の波長の蛍光を発するようにする工程、及び
該第２の波長を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】  前記ペルオキシダーゼ酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記基質化合物の濃度が約１×１０-4Ｍ〜５×１０-2Ｍの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記基質化合物の濃度が約１×１０-3Ｍ〜１×１０-2Ｍの範囲にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】  前記不溶性生成物に光を照射することにより、該不溶性生成物を活性化する工程が、該不溶性生成物に約３４０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長を有する光を照射する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  前記光が約３５０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】  式：
2002538806.tif 000002
で示される構造を有する化合物。
【請求項８】  式：
2002538806.tif 000003
で示される構造を有する化合物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
発明の開示
本発明は、永久性の高度に蛍光性のペルオキシダーゼを基本とするアッセイ法であって、ペルオキシダーゼと可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させ、不溶性の蛍光性生成物を形成する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
別の態様において本発明は、所望の物質を含むかもしれないサンプル中で前記所望の物質の存在又は不存在を検出するためのペルオキシダーゼを基本とするアッセイであって、ペルオキシダーゼ酵素と可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させて、ペルオキシダーゼ活性により不溶性の蛍光性生成物を形成する工程を含むことを特徴とする方法に向けられる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
実験データ
実施例１  ｐ−ヒドロキシフェニル含有ＨＲＰ基質を用いた、組織切片における蛍光の検出
パラフィン包埋マウス腸切片を脱パラフィン化（deparaffinize）し、非特異的結合部位をＰＢＳブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−ＢＢ）（０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２、１．０％ウシ血清アルブミン、０．２％脱脂粉乳及び０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の３０分間の処理によりブロックした。濃度１０μｇ／ｍｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートコムギ胚芽アグルチニン（Sigma, St. Louis, MO）のＰＢＳ−ＢＢ溶液を、切片と共に、室温下で１時間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）及びＴｒｉｓ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、３分間の洗浄を３回）中で洗浄した。０．００３％のＨ2Ｏ2を含むＮ−（５−ヒドロキシペンチル）−３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンアミド（ＨＨＰＡ）の１ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を、切片へ、室温下で１０分間添加した。次いで切片をＴｒｉｓ（３分間の洗浄を３回）中で洗浄し、Ｔｒｉｓ：グリセロール（１：１）を用いてマウントし、カバーガラスで覆った。切片を、エピフルオレセンス（epifluorescence）及び下記の励起／発光特性（３６０ｎｍ／＞４００ｎｍ（青−白色の蛍光）、４９０ｎｍ／５２０ｎｍ（緑色蛍光）及び５５０ｎｍ／５７０ｎｍ（赤色蛍光））を有するフィルターセットを備えたZeiss Axioskop 顕微鏡で観察した。切片を、Zeiss MC100 カメラシステムで撮影した。
コムギ胚芽アグルチニンは、腸ムチン産生ゴブレット細胞に多量に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基に結合する。最初の顕微鏡試験は３６０ｎｍの励起で弱い蛍光シグナルを示したが（図１Ａ、青−白色フィルターセット）、標準の緑色（図１Ｃ）又は赤色（図１Ｅ）フィルターセットで観察したときシグナルはほとんどなかった。顕微鏡の領域（field）を３６０ｎｍで１分間照射し、前記の通りにして再試験した。３６０ｎｍ照射への短時間の曝露の後に蛍光シグナルが劇的かつ予想外に増加した。ゴブレット細胞に局在化する強い蛍光シグナルが、３つのフィルターセット：青−白色（図１Ｂ）、緑色（図１Ｄ）及び赤色（図１Ｆ）を用いて観察された。ＨＲＰをコンジュゲートしたコムギ胚芽アグルチニンとのインキュベートがない場合にはゴブレット細胞特異的シグナルは観察されなかった（データは示さず）。元の倍率は４００×であった。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
実施例２  ｐ−ヒドロキシフェニル含有ＨＲＰ基質を用いた改善された蛍光シグナル安定性
パラフィン包埋マウス脳切片を脱パラフィン化し、非特異的結合部位をＰＢＳ−ＢＢ中での３０分間の処理によりブロックした。微小管関連タンパク質−２に対するモノクローナル抗体（Sigma）をＰＢＳ−ＢＢで１：１００，０００に希釈し、切片と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＢで１：１０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA）と共に室温下で１時間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）中で洗浄し、ＴＳＡダイレクトフルオレセインキットを製造者の指示（NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA）にしたがい用いて又はＨＨＰＡ（ＴＳＡ増幅希釈物中の１ｍｇ／ｍｌ、１０分間）のいずれかを用いて微小管関連タンパク質−２免疫反応性を局在化させた。次いで切片をＴｒｉｓ（５分間の洗浄を３回）中で洗浄し、Ｔｒｉｓ：グリセロール（１：１）を用いてマウントし、カバーガラスで覆った。
フルオレセイン標識した切片を、４９０ｎｍ／５２０ｎｍに励起／発光ピークを有するフィルターセットを用いて観察した。ＨＨＰＡ標識切片を最初に３６０ｎｍで１分間照射して、沈殿した反応生成物を活性化し、次いで３６０ｎｍ／５２０ｎｍに励起／発光ピークを有するフィルターセットを用いて観察した。切片を連続的な励起の０及び１５分後に観察した。標準的な２秒の曝露を使用した顕微鏡写真を両方の時間時点において撮影し、経時の蛍光強度の変化を評価した。更に両方の時間時点において、ＡＳＡ設定１６００及びＭＣ１００カメラシステム（Zeiss）を使用した標準領域における顕微鏡写真的ドキュメンテーション（documentation）に必要な自動曝露時間を記録することにより、蛍光強度を半定量化した。この測定を使用して、短時間の曝露時間と明るい蛍光とを相関させ、長時間の曝露時間と暗い蛍光とを関連づけた。
ＴＳＡダイレクトフルオレセインと反応させた切片は、強い初期シグナル（図２Ａ）を示し、１５分間の連続的励起で劇的に衰えた（図２Ｂ）。規格ＡＳＡ１６００に必要な時間は０（１．８秒）から１５分（１２．０秒）で６倍以上に増加した。対照的に、ＨＨＰＡ反応スライドへの１５分間の連続的曝露は、蛍光強度の増加を起こした（図２Ｃ、時間０。図２Ｄ、１５分間の励起後。）。１５分間の一定の励起後、標準曝露時間は４．１秒から３．１秒へ減少した。ＨＨＰＡについての著しい蛍光安定性は予想外のものであり、これはほとんどのフルオロホア（fluorophore）を長時間の励起に曝露したときに観察されるシグナルの典型的な損失とは異なるものであった。元の倍率は６００×であった。
前記の図面、検討及び記載は、本発明及びこれのいくつかの態様の一般的原理を説明するものであり、本発明の実施についての限定を意味するものではない。なぜなら、多数の修飾及び改変が当業者にとって容易に明らかであるからである。全ての均等物を含む特許請求の範囲が本発明の範囲を規定する。