(57)【要約】ＰＤ１遺伝子標的部位に特異的な操作されたヌクレアーゼであって、ＰＤ１遺伝子標的部位に対するオンターゲット特異性が増加するように、切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはその相同体）および／またはＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡ）中に変異を含む、ヌクレアーゼが本明細書に記載される。本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの主鎖）の１つもしくは複数に変異を含む、および／またはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインに１つもしくは複数の変異を含む、高度に特異的なＰＤ１ヌクレアーゼ、すなわち人工ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を提供する。
2022500052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮであって、前記ＺＦＮまたは前記ＴＡＬＥＮが、第１のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮおよび第２のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを含み、各ＺＦＮが、前記ＰＤ１遺伝子中の標的部位に結合するＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含み、各ＴＡＬＥＮが、前記ＰＤ１遺伝子中の標的部位に結合するＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＺＦＮまたは前記ＴＡＬＥＮの前記ＦｏｋＩ切断ドメインの少なくとも１つが、前記ＦｏｋＩ切断ドメイン中における、野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた４１６、４１８、４２２、４７６、４７９、４８１、５２５、５２７または５３１の１つまたは複数における置換変異をさらに含む、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ。
【請求項２】
少なくとも１つの前記ＦｏｋＩ切断ドメイン中における前記置換変異が、以下：Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄおよび／またはＱ５３１Ｒの通りである、請求項１に記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ。
【請求項３】
前記ＦｏｋＩ切断ドメイン中における前記置換変異が、以下：Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５ＴまたはＫ５２５Ｖの通りである、前記請求項のいずれかに記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ。
【請求項４】
前記第１のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮおよび／あるいは前記第２のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮが、前記置換変異を含む、前記請求項のいずれかに記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ。
【請求項５】
前記第１のＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する１２９４２と名付けられたＺＦＰを含み、前記第２のＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する２５０２９と名付けられたＺＦＰを含む、前記請求項のいずれかに記載のＺＦＮ。
【請求項６】
前記請求項のいずれかに記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記請求項のいずれかに記載の、１つもしくは複数のＺＦＮ、１つもしくは複数のＴＡＬＥＮおよび／または１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
【請求項８】
哺乳動物細胞におけるＰＤ１遺伝子を切断するための方法であって、前記ＰＤ１遺伝子が切断されるように、前記細胞中で前記請求項のいずれかに記載の１つまたは複数のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法。
【請求項９】
前記細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させるステップをさらに含み、前記ＰＤ１遺伝子の切断が、前記ドナーポリペプチドと前記ＰＤ１遺伝子との間の相同組換えを促進する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記請求項のいずれかに記載の単離された細胞または方法から産生された、遺伝子改変された細胞の単離された集団であって、ＰＤ１遺伝子が、ヌクレアーゼによって特異的に改変されている、単離された集団。
【請求項１１】
ＰＤ１の遺伝子改変のオンターゲットのオフターゲットに対する比率が、２００より大きい、遺伝子改変された細胞の単離された集団。
【請求項１２】
前記請求項のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞の単離された集団に由来する部分的にまたは完全に分化した細胞。
【請求項１３】
１つまたは複数の追加の遺伝子改変をさらに含み、必要に応じて、Ｔ細胞受容体遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子および／もしくはＣＴＬＡ−４遺伝子などのＰＤ１以外の１つもしくは複数の遺伝子の不活性化、ならびに／またはＣＡＲ導入遺伝子などの導入遺伝子の組み込みを含む、前記請求項のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞の単離された集団。
【請求項１４】
がんの処置に使用するための、前記請求項のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または細胞の単離された集団を含む組成物。
【請求項１５】
対象における疾患または障害を処置する方法であって、ＰＤ１遺伝子を切断するステップ、前記請求項のいずれかに記載の１つもしくは複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは細胞の単離された集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記疾患または前記障害が、がんまたは自己免疫障害である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１８日に出願された米国仮出願第６２／７３２，６７４号の利益を主張し、その開示は、これによりその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究で行われた発明への権利の陳述
該当なし。
［０００２．１］配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年９月９日に作成され、８３２５０１８１４０ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１５，７９２バイトのサイズである。
【０００３】
技術分野
本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学および相同組換えの分野にある。
【背景技術】
【０００４】
人工ヌクレアーゼ、例えば操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとも称される操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として公知のＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：２５８−２６１）は、切断ドメインと会合するかまたはそれに作動可能に連結したＤＮＡ結合ドメイン（ヌクレオチドまたはポリペプチド）を含み、ゲノム配列の標的化された変更に使用されてきた。例えば、ヌクレアーゼは、外因性配列を挿入する、１つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化する、遺伝子発現パターンが変更された生物（例えば、作物）および細胞系を作り出すことなどに使用されてきた。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号を参照されたい。例えば、ヌクレアーゼの対（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ−Ｆｏｋ融合体）は、ゲノム配列を切断するのに使用することができる。対の各メンバーは、一般的に、ヌクレアーゼの１つまたは複数の切断ドメイン（またはハーフドメイン）に連結された操作された（天然に存在しない）ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ結合タンパク質がその標的部位に結合すると、そのＤＮＡ結合タンパク質に連結されている切断ドメインは、二量体化とそれに続くゲノムの切断を起こすことができるように配置される。
【０００５】
ＤＮＡ切断の特異性を強化する（オフターゲット切断を低減する）ためのいくつかの戦略が記載されている。これらのアプローチの詳細は、機能的な特色およびそれが適用されたヌクレアーゼの制限の点で異なっていた。全てのタンパク質系（例えばＴＡＬＥＮ（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１１）、ＺＦＮ（Ｋｉｍ  １９９６）、およびメガヌクレアーゼ（Ｇｒｉｚｏｔ  ２００９））について、特異性を改善するための簡単で直接的なアプローチは、塩基を感知する界面を再操作することであった（Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１５；Ｒｅｂａｒ  １９９４；Ｊａｒｊｏｕｒ  ２００９）。他のより一般的な戦略としては、意図しないヌクレアーゼ種の形成を抑制するために二量体化の対称性を壊すこと（Ｍｉｌｌｅｒ  ２００７）、ならびに非特異的なＤＮＡの接触を除去すること（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ２０１４）が含まれた。より短い標的を特色とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の場合、いくつかの研究は、複雑なゲノムにおける固有の位置指定（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）に伴う制限を是正するために切断に必要な認識事象を拡張することに焦点を当ててきた（Ｒａｎ  ２０１３、Ｔｓａｉ  ２０１４、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ２０１４ａ、Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ  ２０１５）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの塩基を感知する界面を操作する機会は、標的認識におけるワトソン−クリック相互作用の優勢な役割を考慮すると、比較的制限されてきたが、近年の研究は、ＰＡＭ界面および合成ガイドを調べ始めている（Ｙｉｎ  ２０１８；Ｒｙａｎ  ２０１８）。Ｃａｓ９の特異性は、非特異的な接触の除去を介しても改善されているが（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ２０１６；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ２０１６；Ｃｈｅｎ  ２０１７）、得られたバリアントの少なくともサブセットについて活性の低減という犠牲を伴っている（Ｋｕｌｃｓａｒ  ２０１７；ＤｅＷｉｔｔ  ２０１６；Ｚｈａｎｇ  ２０１７）。最終的に、２つの近年の研究は、オンターゲットでの優先性がより大きいＣａｓ９バリアントを同定するのに選択ベースのアプローチを使用している（Ｈｕ  ２０１８；Ｃａｓｉｎｉ  ２０１８）。これらのアプローチはそれぞれ、親の開始フレームワークに比べて特異性が改善された試薬をもたらした。
【０００６】
これらの戦略の共通の特色は、ほぼ最初の標的結合にのみ焦点を当てて、解釈および論理的根拠を得ようとしていることであった。まれな例外を除いて、各々は、公然と、または暗黙のうちに、標的結合を、ＤＮＡ切断特異性を決定する唯一のものとして扱ってきたことから、結果として下流のステップを再操作することによって切断の優先性を改善する潜在性は、ほとんどが調査されないままである。これは、酵素の特異性を強化するための動態のモジュレーションは生物学にわたって前例があり、ならびにゲノム編集プロセスのための触媒の必要条件が最小限であることを考慮すると、特異性を改善するための重要な未開発の面をもたらすと考えられる（成功した編集は、細胞１つ当たりちょうど１つの切断事象を必要とし得る）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の近年の研究は、中間体構造の特徴付け（Ｓｉｎｇｈ  ２０１６、Ｊｉａｎｇ  ２０１６、Ｊｉａｎｇ  ２０１７）および切断プロセスの動力学（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ２０１５、Ｄａｇｄａｓ  ２０１７、Ｒａｐｅｒ  ２０１８）を始めているが、これらの洞察を利用する努力は、これまでのところささやかであり、高度に改変された細胞における固有の特異性は実証されていない（Ｃｈｅｎ  ２０１７）。さらに、動態に焦点を当てたフレームワークは、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮなどのヌクレアーゼに適用されておらず、それらのより長い標的は、動態の最適化が特に有益であり得る、オンターゲット部位とオフターゲット部位との間の本来的により広いエネルギーギャップをもたらす。
【０００７】
米国公報第２０１８００８７０７２号は、切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）および／またはＺＦＰ主鎖に変異を含む高度に特異的なヌクレアーゼ、ならびにこのような高度に特異的なヌクレアーゼを作製および使用する方法を開示している。
プログラム死受容体（ＰＤ１、ＰＤＣＤ１としても公知）は、（１）リンパ節における抗原特異的なＴ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することによる；および（２）調節性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）におけるアポトーシスを低減することによる２つのメカニズムを介して自己免疫からガードする免疫チェックポイントである。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３６：２１９−４２；  Ｆｉｆｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２１７：４５−５９。ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１をブロックする薬物の新しいクラスであり、これは、腫瘍を攻撃するために免疫系を活性化し、様々な種類のがんを処置するのに使用される。例えば、Ｊｅｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５２（３）：３５７−３７１を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１０）２３６：２１９〜４２
【非特許文献２】Ｆｉｆｅら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１１）１２１７：４５〜５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、非常に低いオフターゲット切断活性を示すかまたはオフターゲット切断活性を示さないＰＤ１に標的化された改善されたヌクレアーゼの必要が依然としてある。
本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン領域（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥの主鎖）の１つもしくは複数に変異を含む、および／またはＦｏｋＩヌクレアーゼ切断ドメインもしくは切断ハーフドメインに１つもしくは複数の変異を含む、高度に特異的なＰＤ１ヌクレアーゼ、すなわち人工ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を提供する。
【００１１】
したがって、一態様では、ＰＤ１に標的化された操作された（人工）ヌクレアーゼであって、ＰＤ１中の標的部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）、およびこれらの変異体が由来する親の（例えば、野生型）切断ドメインと比較して１つまたは複数の変異を含む少なくとも１つの切断ハーフドメインを含む、ヌクレアーゼが本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＺＦＮの対を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、左および右の（または第１および第２の）ＺＦＮとも称され、対の各ＺＦＮは、ＺＦＰ  ＰＤ１  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）を含む。ある特定の態様では、ＰＤ１ヌクレアーゼは、１２９４２（配列番号３）および２５０２９（配列番号５）と名付けられたＺＦＰ、ならびにその中に１つまたは複数の変異を含有するＦｏｋＩ切断ドメインを含むＺＦＮである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、添付の表および図面のいずれかに示される変異の１つまたは複数であり、これらの変異体の、互いの、および他の変異体（例えば二量体化および／または触媒ドメイン変異体、ならびにニッカーゼ変異）との任意の組合せを含む。本明細書に記載される変異としては、これらに限定されないが、切断ドメインの電荷を変化させる変異、例えば正電荷を有する残基から正電荷を有さない残基への変異（例えば、ＫおよびＲ残基の変異（例えば、Ｓへ変異している）；Ｎ残基の変異（例えば、Ｄへの）、およびＱ残基の変異（例えば、Ｅへの）；ＤＮＡ主鎖に近いと予測される残基への変異（例えば、（−５）位、（−３）位など）；ならびに／または他の残基における変異（例えば、二量体化ドメインにおけるもの）が挙げられる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩ相同体由来であり、３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４１６、４１８、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４７２、４７３、４７６、４７８、４７９、４８０、４８１、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２３、５２５、５２７、５２９、５３４、５５９、５６９、５７０、および／または５７１の１つまたは複数を含むアミノ酸残基４１４〜４２６、４４３〜４５０、４６７〜４８８、５０１〜５０２、および／または５２１〜５３１の１つまたは複数に変異を含む。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ対の左のＺＦＮが、変異を含む。他の実施形態では、ＺＦＮ対の右のＺＦＮが、変異を含む。他の実施形態では、ＺＦＮの右および左のＺＦＮの両方が、変異を含む。変異は、対応する位置でＦｏｋＩに相同な天然の制限酵素中に見出される残基への変異を含み得る。ある特定の実施形態では、変異は、置換、例えば、任意の異なるアミノ酸、例えばアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）またはスレオニン（Ｔ）での野生型残基の置換である。変異体の任意の組合せが企図され、その例としては、これらに限定されないが、添付の表および図面に示されるものが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＦｏｋＩヌクレアーゼ（切断）ドメインは、４１６、４１８、４２２、４７６、４７９、４８１、５２５および／または５３１の１つまたは複数に（単独で、または他の変異、例えばＥＬＤ、ＫＫＲなどと組み合わせて）、好ましくは４１６、４２２、４７６、４８１、および／または５２５に、さらにより好ましくは４１６、４８１および／または５２５に、変異を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの少なくとも１つのＦｏｋＩドメインは、（ｉ）例えば、４１６位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｅ、Ｆ、またはＮ残基で置換されている）、４１８位における（例えば、野生型Ｓ残基が、ＤまたはＥ残基で置換されている）、４２２位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｈ残基で置換されている）、４７６位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＴ残基で置換されている）、４８１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｄ、ＥまたはＨ残基で置換されている）、５２５位における（例えば、野生型Ｋ残基が、Ａ、Ｓ、ＴまたはＶ残基で置換されている）、５２７位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ残基で置換されている）、または５３１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｒ残基で置換されている）単一の変異；あるいは（ｉｉ）４１６位（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｅ、Ｆ、またはＮ残基で置換されている）、４１８位（例えば、野生型Ｓ残基が、ＤまたはＥ残基で置換されている）、４２２位（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｈ残基で置換されている）、４７６位（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＴ残基で置換されている）、４８１位（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｄ、ＥまたはＨ残基で置換されている）、５２５位（例えば、野生型Ｋ残基が、Ａ、Ｓ、ＴまたはＶ残基で置換されている）、５２７位（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ残基で置換されている）、または５３１位（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｒ残基で置換されている）の１つにおける変異と、１つまたは複数の追加の残基の変異（例えば、二量体化変異、例えばＥＬＤ、ＫＫＲなど）との組合せを含む。例えば、図１〜３を参照されたい。ある特定の実施形態では、変異は、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄ、および／またはＱ５３１Ｒ変異からなる群より選択される単一の変異を含む。置換変異の非限定的な例は、図１〜３に示される。ヌクレアーゼ対の一方または両方の成分のヌクレアーゼ（切断）ドメインはまた、４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および５５９位における１つまたは複数の変異を含んでいてもよく、これらに限定されないが、ＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳが挙げられる。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい。
【００１３】
したがって、本明細書には、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮであって、前記ＺＦＮまたは前記ＴＡＬＥＮが、第１および第２の（左および右とも称される）ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを含み、各ＺＦＮが、前記ＰＤ１遺伝子中の標的部位に結合するＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含み、各ＴＡＬＥＮが、前記ＰＤ１遺伝子中の標的部位に結合するＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよびＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＺＦＮまたは前記ＴＡＬＥＮの前記ＦｏｋＩ切断ドメインの少なくとも１つが、前記ＦｏｋＩ切断ドメイン中における、野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされた４１６、４１８、４２２、４７６、４７９、４８１、５２５、５２７または５３１の１つまたは複数における置換変異をさらに含む、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮが記載される。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｏｋＩ切断ドメイン中における置換変異は、以下：Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄおよび／またはＱ５３１Ｒの通りである。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｏｋＩ切断ドメイン中における置換変異は、以下：Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５ＴまたはＫ５２５Ｖの通りである、前記請求項のいずれかに記載のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する第１のＺＦＰ、および配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する第２のＺＦＰを含む。
【００１４】
本明細書に記載される人工ヌクレアーゼは、ＤＮＡ主鎖上のリン酸と非特異的に相互作用することができる、標的配列のヌクレオチドを認識する残基の外側のＤＮＡ結合ドメイン内の１つまたは複数のアミノ酸への変異（例えば、「ＺＦＰ主鎖」（ＤＮＡ認識へリックス領域の外側）へのまたは「ＴＡＬＥ主鎖」（ＲＶＤの外側）への１つまたは複数の変異）をさらに含んでいてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ヌクレオチドの標的特異性に必要ではないＺＦＰ主鎖におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を、中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合へリックスに対して（−５）、（−９）位および／または（−１４）位で行われる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）における１つまたは複数の変異を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質のフィンガーのうち１、２、３、４、５または６つが、１つまたは複数の主鎖変異（例えば、フィンガーのうち１、２、３、４、５または６つにおける（−５））を含む。さらなる実施形態では、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質における１つまたは複数のジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に変異を含んでいてもよい。一部の実施形態では、（−５）、（−９）および／または（−１４）におけるアミノ酸（例えばアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に変異している。一部の実施形態では、−５位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変更されている。他の実施形態では、（−９）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられている。さらなる実施形態では、（−１４）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられている。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに変異を含んでいてもよく、（−５）、（−９）および／または（−１４）位におけるアミノ酸は、１つまたは複数のフィンガー（例えば、ＺＦＰの６つのフィンガーのうちの３つのフィンガー、４つのフィンガー、５つのフィンガー）において、任意の組合せで、上で列挙したアミノ酸のいずれかに変更されている。
【００１５】
本明細書に記載される変異（単独または任意の組合せで）は、特異性が増加したＰＤ１ヌクレアーゼを提供する。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインまたは融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。したがって、１つまたは複数のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。
【００１７】
さらに別の態様では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ、ポリペプチド（例えば、融合分子または融合ポリペプチド）および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞、例えば、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＮ、１つもしくは複数のＴＡＬＥＮおよび／または１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞（または細胞の集団）も提供される。本明細書に記載の単離された細胞または方法から産生された、遺伝子改変された細胞の単離された集団であって、ＰＤ１遺伝子が、ヌクレアーゼによって特異的に改変されている、単離された集団も提供される。ある特定の実施形態では、ＰＤ１の遺伝子改変のオンターゲットのオフターゲットに対する比率が、細胞の単離された集団において２００より大きい。本明細書に記載の遺伝子改変された細胞の単離された集団に由来する部分的にまたは完全に分化した細胞も記載される。本明細書に記載の遺伝子改変された細胞の単離された集団は、１つまたは複数の追加の遺伝子改変をさらに含んでもよく、必要に応じて、Ｔ細胞受容体遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子および／もしくはＣＴＬＡ−４遺伝子などのＰＤ１以外の１つもしくは複数の遺伝子の不活性化、ならびに／またはＣＡＲ導入遺伝子などの導入遺伝子の組み込みを含む。
【００１８】
一実施形態では、細胞は、融合ポリペプチドの対を含み、一方または両方の融合ポリペプチドは、本明細書に記載される１つまたは複数の変異に加えて、残基、例えば米国特許第８，９６２，２８１号に記載されているような操作された切断ハーフドメインにおいて１つまたは複数の追加の変異を含む。
【００１９】
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドによって改変された細胞も本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞は、ヌクレアーゼ媒介性の導入遺伝子挿入、またはヌクレアーゼ媒介性のＰＤ１遺伝子ノックアウトを含む。改変された細胞、および改変された細胞由来の任意の細胞は、必ずしも一過性にとどまらずに本発明のヌクレアーゼを含むとは限らないが、このようなヌクレアーゼによって媒介されるゲノム改変は依然として存在する。
【００２０】
さらに別の態様では、ＰＤ１遺伝子の標的化された切断のための方法；細胞中で相同組換えを起こさせる方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が提供される。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、またはそれらの組合せで実施してもよい。方法は、本明細書に記載される融合ポリペプチドの対（すなわち、一方または両方の融合ポリペプチドが本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインを含む融合ポリペプチドの対）を発現させることによって、細胞クロマチンを、細胞中の所定の目的の領域で切断することを含む。ある特定の実施形態では、オフターゲット部位（例えば、非ＰＤ１遺伝子）を超えるオンターゲット部位（例えば、ＰＤ１遺伝子）についての標的化された切断優先は、本明細書に記載される変異を有さない切断ドメインを含むヌクレアーゼと比較して、５０％〜６０％（またはそれらの間の任意の値）、６０％〜７０％（またはそれらの間の任意の値）、７０％〜８０％（またはそれらの間の任意の値）、８０％〜９０％（またはそれらの間の任意の値）、９０％〜２００％（またはそれらの間の任意の値）、または２００％を超える任意の値を含む、少なくとも５０〜２００％（またはそれらの間の任意の値）またはそれよりも多く増加する。同様に、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、オフターゲット部位切断は、これらに限定されないが、１〜５０倍（またはそれらの間の任意の値）を含む、１〜１００倍またはそれよりも多い倍数まで低減される。他の態様では、本明細書に記載される対を形成したＰＤ１ヌクレアーゼの成分（左および右）は、任意の比率で別々に投与される。一部の実施形態では、左および右の成分は、等しい量で投与される。一部の実施形態では、細胞と接触させるために、操作されたヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインパートナーが使用され、この場合、複合体の各パートナーは、１：１の比率で、または１：１以外の他のパートナーに対する比率で付与される。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインパートナーは、細胞と接触するのに使用され、複合体の各パートナーは、１対１以外の他のパートナーに対する比率になる。一部の実施形態では、２つのパートナー（ハーフ切断ドメイン）の比率は、１：１の比率であるか、または１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０または１：２０の比率、またはそれらの間の任意の値になる。他の実施形態では、２つのパートナーの比率は、１：３０よりも大きい。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１と異なるように選択された比率で配置される。一部の態様では、各パートナーは、ｍＲＮＡとして細胞に送達されるか、またはウイルスまたは非ウイルスベクターで送達され、各パートナーをコードする等しいまたは等しくない量のｍＲＮＡまたはベクターが送達される。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼ複合体の各パートナーは、単一のウイルスまたは非ウイルスベクターに含まれていてもよいが、両方のパートナーが等しく発現されるか、または一方のパートナーが他方よりも大きいまたは小さい値で発現されるように計画的に発現され、最終的に１対１以外の切断ハーフドメインの比率で細胞に送達される。一部の実施形態では、各切断ハーフドメインは、異なる発現効率を有する異なるプロモーターを使用して発現される。他の実施形態では、２つの切断ドメインは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に送達され、両方とも、同じオープンリーディングフレームから発現されるが、２つのパートナーをコードする遺伝子は、２つのパートナーの比率が１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０の比率、またはそれらの間の任意の値になるように３’パートナーをより低い割合で発現させる配列（例えば自己切断２Ａ配列またはＩＲＥＳ）によって分離される。他の実施形態では、２つのパートナーは、等しい比、または１：１と異なるように選択された比率で配置される。
【００２１】
例えば標的化された変異を導入するために内因性ＰＤ１遺伝子を変更する方法も提供される。ある特定の実施形態では、ＰＤ１遺伝子を遺伝子的に修飾する方法は、細胞に、１つまたは複数の標的化されたヌクレアーゼ（所定の部位で細胞クロマチン中に二本鎖切断を作り出すため）、および切断の領域における細胞クロマチンのヌクレオチド配列への相同性を有するドナーポリヌクレオチドを導入することを含む。細胞のＤＮＡ修復プロセスは、二本鎖切断の存在によって活性化され、ドナーポリヌクレオチドは、切断の修復のための鋳型として使用され、結果として細胞クロマチンへのドナーのヌクレオチド配列の全部または一部の導入が起こる。したがって、細胞クロマチン中のＰＤ１配列は、変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。
【００２２】
標的化された変更としては、これらに限定されないが、点変異（すなわち、単一の塩基対の異なる塩基対への変換）、置換（すなわち、複数の塩基対の、同一な長さの異なる配列への変換）、１つまたは複数の塩基対の（ｏｒ）挿入、１つまたは複数の塩基対の欠失、および上述の配列変更の任意の組合せが挙げられる。変更はまた、コードされたアミノ酸が変更されるように、コード配列の一部である塩基対の変換を含んでいてもよい。
【００２３】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状または環状であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。これは、裸の核酸として、１つもしくは複数の送達剤（例えば、リポソーム、ナノ粒子、ポロキサマー）との複合体として、またはウイルス送達ビヒクル、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などに含有されて送達されてもよい。ドナー配列は、１０〜５，０００ヌクレオチドの長さの範囲（またはそれらの間のヌクレオチドの任意の整数値）またはそれよりも長くてもよい。一部の実施形態では、ドナーは、標的化された切断部位との相同性を有する領域に挟まれた全長遺伝子を含む。一部の実施形態では、ドナーは、相同な領域を欠いており、相同性と無関係のメカニズム（すなわちＮＨＥＪ）を介して標的遺伝子座に組み込まれている。他の実施形態では、ドナーは、細胞での使用のために（すなわち遺伝子修正のために）相同な領域に挟まれた核酸のより小さい一片を含む。一部の実施形態では、ドナーは、機能的または構造的な成分、例えばｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどをコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／またはその発現をモジュレートする調節エレメントをコードする配列を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／またはその発現をモジュレートする目的の調節タンパク質（例えばＺＦＰ  ＴＦ、ＴＡＬＥ  ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ）である。
【００２４】
さらに別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、融合分子）および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞も提供される。一実施形態では、細胞は、それぞれ本明細書で開示される切断ドメインを含む融合分子の対を含む。本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して産生された遺伝子改変された細胞（例えば、Ｔ細胞）の単離された集団であって、ＰＤ１遺伝子が、ヌクレアーゼによって特異的に改変されている（他の遺伝子と比較して）、単離された集団も本明細書で提供される。これらの細胞では、これらの細胞におけるＰＤ１遺伝子は、ヌクレアーゼによって遺伝子改変されているが（例えば、挿入および／または欠失（「インデル」）によって変異されている）、これらのヌクレアーゼを使用して作製されたＰＤ１遺伝子の外側の遺伝子改変は、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異を有さないＰＤ１ヌクレアーゼと比較して、これらに限定されないが、１〜５０分の１（またはそれらの間の任意の値）を含め、１〜１００分の１またはそれより低く低減される。ある特定の実施形態では、細胞の単離された集団におけるヌクレアーゼによって行われた遺伝子改変の１％未満（例えば、０．５％未満）が、ＰＤ１遺伝子の外側にある。ある特定の態様では、ヌクレアーゼによって産生された集団の細胞の少なくとも４０％が、ＰＤ１への改変（インデル）を含み、一方で細胞の０．０５％未満が、ヌクレアーゼによって行われたオフターゲット（非ＰＤ１）遺伝子改変を含む。よりさらなる実施形態では、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して産生された遺伝子改変された細胞の単離された集団は、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異を有さないＰＤ１標的化ヌクレアーゼを使用した遺伝子改変のオン／オフの比率と比較して、より大きい遺伝子改変の相対的なオン／オフ（ＰＤ１／非ＰＤ１）の比率を有し、添付の図面で示されるように、必要に応じて本発明のヌクレアーゼによって行われた細胞におけるオン／オフ遺伝子改変の比率は、１００もしくはそれより高い、または１５０もしくはそれより高い、または２００もしくはそれより高い。細胞としては、培養細胞、生物中の細胞、ならびに処置後に細胞および／またはその子孫が生物に戻される場合、処置のために生物から取り出された細胞が挙げられる。細胞クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であってもよい。
【００２５】
本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または細胞の単離された集団を含む組成物は、がんなどの疾患または障害の処置における使用に関して特許請求される。対象における疾患または障害（例えば、がん）を処置する方法であって、ＰＤ１遺伝子を切断するステップ、本明細書に記載される１つもしくは複数のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは細胞の単離された集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法も提供される。
【００２６】
別の態様では、本明細書に記載される融合タンパク質、または１つもしくは複数のジンクフィンガータンパク質、本明細書に記載される切断ドメインおよび／もしくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；補助的な試薬；ならびに必要に応じて指示および好適な容器を含むキットが本明細書に記載される。キットはまた、１つもしくは複数のヌクレアーゼまたはこのようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００２７】
これらのおよび他の態様は、全体として開示を考慮すれば当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、示されたＰＤ１  ＺＦＮ対に関するＦｏｋＩバリアントのスクリーニングデータの結果を示す。図１Ａは、示されたバリアントの結果を示す。対における各ＺＦＮに対して５００ｎｇのｍＲＮＡの用量を用いて単一の複製から値を決定した。「ｗｔ」は、以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対を示す（例えば、１２９４２／２５０２９）。「ｗｔ１／２」は、２５０ｎｇの各ＺＦＮ単量体の用量で試験された以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対を示す。相対値は、「ｗｔ」試料に対して３つの反復測定の平均の割合としての％インデルを示す。左の２つの列の値は、以前に報告された右のＺＦＮと組み合わせた左のＺＦＮにおける示されたＦｏｋＩを用いて決定された。中央の列の値は、示されたＦｏｋＩバリアントが右のＺＦＮにあり、左のＺＦＮが改変されていないことを除いて、類似していた。最も右の列の値は、左および右のＺＦＮの両方における示されたＦｏｋＩバリアントを用いて決定された。図１Ｂは、示された通りそのＦｏｋＩドメイン内に単一残基置換を有するＰＤ１  ＺＦＮ二量体のバリアントのオンターゲット活性を示す。「半分用量」の親試料は、送達のために２５０ｎｇのＲＮＡを使用した。相対的なシグナル強度を強調するために、表の値は、灰色のヒートマップ中に埋め込まれる。矢印は、経過観察研究でさらに特徴付けられた高いレベルのオンターゲット活性の完全な保持を示すバリアントを強調する。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、示されたＰＤ１  ＺＦＮ対に関するＦｏｋＩバリアントのスクリーニングデータの結果を示す。図１Ａは、示されたバリアントの結果を示す。対における各ＺＦＮに対して５００ｎｇのｍＲＮＡの用量を用いて単一の複製から値を決定した。「ｗｔ」は、以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対を示す（例えば、１２９４２／２５０２９）。「ｗｔ１／２」は、２５０ｎｇの各ＺＦＮ単量体の用量で試験された以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対を示す。相対値は、「ｗｔ」試料に対して３つの反復測定の平均の割合としての％インデルを示す。左の２つの列の値は、以前に報告された右のＺＦＮと組み合わせた左のＺＦＮにおける示されたＦｏｋＩを用いて決定された。中央の列の値は、示されたＦｏｋＩバリアントが右のＺＦＮにあり、左のＺＦＮが改変されていないことを除いて、類似していた。最も右の列の値は、左および右のＺＦＮの両方における示されたＦｏｋＩバリアントを用いて決定された。図１Ｂは、示された通りそのＦｏｋＩドメイン内に単一残基置換を有するＰＤ１  ＺＦＮ二量体のバリアントのオンターゲット活性を示す。「半分用量」の親試料は、送達のために２５０ｎｇのＲＮＡを使用した。相対的なシグナル強度を強調するために、表の値は、灰色のヒートマップ中に埋め込まれる。矢印は、経過観察研究でさらに特徴付けられた高いレベルのオンターゲット活性の完全な保持を示すバリアントを強調する。
【００２９】
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、複数用量で試験したＰＤ１  ＺＦＮ対に対する示されたＦｏｋＩバリアントのオンターゲット（「ＰＤ１」）およびオフターゲット（「ＯＴ１」、「ＯＴ２」および「ＯＴ３」）切断活性（％インデル）を示す表である。図２Ａは、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ（およびＧＦＰ対照）に関する結果を示す。図２Ｂは、図２Ａに示されるデータのサブセット（Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４６Ｎ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５ＴおよびＫ５２５Ｖ）を示す。値は、３つの生物学的複製物の平均である。「ｗｔ」は、以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対（１２９４２／２５０２９）を示す。他の試料に関して、左の列に示されたＦｏｋＩバリアントは、左および右のＺＦＮの両方に使用された。第２の列には、対中の各ＺＦＮのｍＲＮＡ用量が示される。またオンターゲット部位とオフターゲット部位との間の相対的な切断活性も示される（最後の列は「オン／オフ」）。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、複数用量で試験したＰＤ１  ＺＦＮ対に対する示されたＦｏｋＩバリアントのオンターゲット（「ＰＤ１」）およびオフターゲット（「ＯＴ１」、「ＯＴ２」および「ＯＴ３」）切断活性（％インデル）を示す表である。図２Ａは、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ（およびＧＦＰ対照）に関する結果を示す。図２Ｂは、図２Ａに示されるデータのサブセット（Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４６Ｎ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５ＴおよびＫ５２５Ｖ）を示す。値は、３つの生物学的複製物の平均である。「ｗｔ」は、以前に報告されたＰＤ１  ＺＦＮ対（１２９４２／２５０２９）を示す。他の試料に関して、左の列に示されたＦｏｋＩバリアントは、左および右のＺＦＮの両方に使用された。第２の列には、対中の各ＺＦＮのｍＲＮＡ用量が示される。またオンターゲット部位とオフターゲット部位との間の相対的な切断活性も示される（最後の列は「オン／オフ」）。
【００３０】
【図３】図３は、そのＦｏｋＩドメイン内に単一残基置換を有するＰＤ１  ＺＦＮ二量体のバリアントのオンターゲットおよびオフターゲット活性を示す。各バリアントを、両方のＺＦＮが示された置換を有する二量体として試験した（列１の「親」は、示されたＦｏｋＩ変異を行う以前の対（例えば、１２９４２／２５０２９）を示す。各ＺＦＮ単量体（列２）に対して示された量のｍＲＮＡを使用したヌクレオフェクションを介して、ＺＦＮをヒトＫ５６２細胞に送達し、それに続いて３日目にゲノムＤＮＡを単離し、意図した標的におけるインデルに関してディープシーケンシング分析を行った。列３は、意図した標的で測定された％インデルを提供し、列４〜６は、以前に公知の３つのオフターゲット部位における％インデルを示す。値は、３つの生物学的複製物の平均である。列７は、オフターゲットインデルの合計を列挙し、列８は、オンターゲット：オフターゲットのインデルの比率（＝列３／列７）を示す。
【００３１】
【図４】図４は、示された投薬量でのオンおよびオフターゲット部位における示されたＴＡＬＥＮ対（ＣＣＲ５に標的化された）を使用した切断の結果を示す。各バリアントを、両方のＴＡＬＥＮが示された置換を有する二量体として試験した（列１の「親」は、示されたＦｏｋＩ変異を有さないＣＣＲ５  ＴＡＬＥＮ対を示す）。各ＺＦＮ単量体（列２）に対して示された量のｍＲＮＡを使用したヌクレオフェクションを介して、ＴＡＬＥＮをヒトＫ５６２細胞に送達し、それに続いて３日目にゲノムＤＮＡを単離し、意図した標的におけるインデルに関してディープシーケンシング分析を行った。列３は、意図した標的で測定された％インデルを提供し、列４〜６は、以前に公知の３つのオフターゲット部位における％インデルを示す。値は、３つの生物学的複製物の平均である。列７は、オフターゲットインデルの合計を列挙し、列８は、オンターゲット：オフターゲットのインデルの比率（＝列３／列７）を示す。相対的なシグナル強度を強調することを助けるために、表の値は、灰色のヒートマップ中に埋め込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
オフターゲット切断を差次的に減少させることにより、ＰＤ１遺伝子のオンターゲットの操作されたヌクレアーゼ切断の特異性を増加させるための方法および組成物が本明細書で開示される。
【００３３】
総論
方法の実施、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、別段の指定がない限り、当業界の技術範囲内ものとして、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７および定期のアップデート；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，  ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  ３０４，  ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”  （Ｐ．Ｍ．  Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ，  ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  １１９，  ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  （Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  ｅｄ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  １９９９を参照されたい。
【００３４】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、直鎖状または環状のコンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されないものとする。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート主鎖）を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。
【００３５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３６】
「結合」は、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、必ずしも結合相互作用の全ての成分が配列特異的であること（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触）を必要としない。このような相互作用は、一般的に１０−６Ｍ−１またはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。「非特異的な結合」は、オンターゲット配列に依存しない目的の任意の分子（例えば操作されたヌクレアーゼ）と高分子（例えばＤＮＡ）との間に生じる非共有結合の相互作用を指す。
【００３７】
「結合タンパク質」は、非共有結合によって別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／またはそれは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つよりも多くのタイプの結合活性を有していてもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ系の場合、ＲＮＡガイドは、ヌクレアーゼの成分（Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）にとって異種であり、両方とも操作することができる。
【００３８】
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。このようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きいタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、一方で他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）であり、一方で他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのガイドＲＮＡ成分（例えばＣａｓ９またはＣｆｐ１）である。
【００３９】
「ＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、配列特異的な方式で、例えば１つもしくは複数のジンクフィンガーを介して、またはそれぞれジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬＥにおける１つもしくは複数のＲＶＤとの相互作用を介してＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。
【００４０】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、配列特異的な方式で、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介してＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、二量体化して標的遺伝子を切断する１つのＺＦＮ、ならびにＺＦＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
【００４１】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのそのコグネート標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。用語「ＴＡＬＥＮ」は、二量体化して標的遺伝子を切断する１つのＴＡＬＥＮ、ならびにＴＡＬＥＮの対（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
【００４２】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、例えば天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）を介して、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「反復可変二残基」またはＲＶＤ領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。それゆえに、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準に起因する天然に存在しないタンパク質である。設計に関する合理的な基準としては、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計および結合データのデータベース保存情報における情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムが挙げられる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照されたい；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【００４３】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に見出されず、それらの産生は主として、実験的なプロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的設計またはハイブリッド選択に起因する。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８；ＵＳ５，９２５，５２３；ＵＳ６，００７，９８８；ＵＳ６，０１３，４５３；ＵＳ６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００４４】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えば、Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、同上；Ｇ．  Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １１１，  ６５２を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む必要な全ての成分である。
【００４５】
「組換え」は、これらに限定されないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による捕捉および相同組換えを含む、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。この開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、このような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすことから、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々な形で公知である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、このような移入は、切断した標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、ならびに／またはドナーを使用して標的および／もしくは関連プロセスの一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」を含み得る。このような特殊化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに取り込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
【００４６】
本開示のある特定の方法において、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物（例えばドナー）の組み込みを媒介する。必要に応じて、構築物は、切断の領域中のヌクレオチド配列への相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれてもよく、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介して、切断の修復のための鋳型として使用され、結果として、発現カセットの場合と同様にヌクレオチド配列の全部または一部の細胞クロマチンへの導入が起こる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更されてもよく、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列に変換されてもよい。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置き換え（すなわち、情報としての意味での配列の置き換え）を表すと理解することができ、必ずしも１つのポリヌクレオチドの別のものによる物理的または化学的な置き換えを必要としない。
【００４７】
本明細書に記載される方法および組成物（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼを使用して作製された細胞など）のいずれかでは、追加の操作されたヌクレアーゼは、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断に使用することができる。
【００４８】
細胞クロマチン中の目的の領域における配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。このような相同組換えは、切断の領域に相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
【００４９】
本明細書に記載される方法および組成物（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼを使用して作製された細胞など）のいずれかでは、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同だが同一ではない配列を含有していてもよく、それにより相同組換えを刺激して、目的の領域中の同一ではない配列を挿入する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば１００個の連続する塩基対にわたりドナーとゲノム配列との間で１つのみヌクレオチドが異なる場合、ドナーとゲノム配列との相同性は９９％よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、新しい配列が目的の領域に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有していてもよい。これらの場合では、非相同配列は、一般的に、目的の領域中の配列に相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）の配列、または１，０００個よりも大きい任意の数の塩基対に挟まれる。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組換えメカニズムによってゲノムに挿入される。
【００５０】
本明細書に記載される方法のいずれかは、ドナー配列の標的化組込みによる、または標的配列の切断とそれに続く目的の遺伝子の発現を破壊するエラープローンＮＨＥＪ媒介性修復を介する、細胞中の１つまたは複数の標的配列の、部分的または完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を含む細胞系も提供される。
【００５１】
さらに、本明細書に記載される標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性配列を組み込むのにも使用できる。外因性核酸配列は、例えば、１つもしくは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコードもしくは非コード配列、ならびに１つもしくは複数の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいてもよい。加えて、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生することができる。
【００５２】
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、ＤＮＡ分子の共有結合の主鎖の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、これらに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含む様々な方法によって開始させることができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、標的とされた二本鎖ＤＮＡ切断のために、融合ポリペプチドが使用される。
【００５３】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と共に切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」は、同義的に使用されて、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。用語「切断ドメイン」は、用語「切断ハーフドメイン」と同義的に使用される。用語「ＦｏｋＩ切断ドメイン」は、本明細書に示されるＦｏｋＩ配列および任意のＦｏｋＩ相同体を含む。
【００５４】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）との絶対ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。
【００５５】
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の、またはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１００，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２０００〜２０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは、約５〜１５ｋｂの間（またはそれらの間の任意の値）のものであってもよい。
【００５６】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、その核型によって特徴付けられることが多く、核型は、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含んでいてもよい。
【００５７】
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない、複製能のある核酸、核タンパク質複合体または核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド、ミニサークルおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。本明細書に記載される肝臓特異的な構築物は、エピソームにより維持されてもよく、あるいは、細胞に安定して組み込まれていてもよい。
【００５８】
「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入できる分子である。「細胞中に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞にとって外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞にとって外因性分子である。外因性分子は、例えば、正常に機能しない内因性分子の機能するバージョン、または正常に機能する内因性分子の正常に機能しないバージョンを含んでいてもよい。
【００５９】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されたなどの小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖などの高分子、上記の分子の任意の改変された誘導体、または上記の分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であってもよい。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、これらは、一本鎖または二本鎖であってもよく、直鎖状、分岐状または環状であってもよく、任意の長さのものであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
【００６０】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に通常存在しない、細胞または染色体に導入される感染性のウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソームを含んでいてもよい。外因性分子の細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。また外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子であってもよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する。例えば、ヒト核酸配列は、元々はマウスまたはハムスター由来の細胞系に導入されてもよい。外因性分子の植物細胞への導入のための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介性形質転換、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃（例えば、「遺伝子銃」を使用する）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられる。
【００６１】
それに対して、「内因性」分子は、特定の細胞中に、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞器官、または天然に存在するエピソームの核酸を含み得る。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
【００６２】
用語「外因性核酸の生成物」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド生成物の両方、例えば、転写産物（ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００６３】
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が好ましくは共有結合によって連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってもよく、異なる化学的タイプの分子であってもよい。融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとの融合体）、切断ドメインと作用的に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）の融合体、および融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。
【００６４】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。また、細胞におけるタンパク質の発現に、トランススプライシング、ポリペプチドの切断およびポリペプチドのライゲーションが含まれていてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、この開示の他所で提示される。
【００６５】
「遺伝子」は、本開示の目的に関して、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかは問わない。したがって、遺伝子としては、必ずしもこれらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。
【００６６】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。
【００６７】
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的であっても、完全であってもよい。
【００６８】
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望ましい、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性のウイルスゲノム中に存在していてもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの転写されなかった領域内であってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さくてもよく、もしくは最長２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
【００６９】
「セーフハーバー」遺伝子座は、宿主細胞に対していかなる有害効果もなく遺伝子を挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。最も有益なものは、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接遺伝子からの任意のリードスルー発現によって撹乱されないセーフハーバー遺伝子座である。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国公報第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。
【００７０】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしもそうでなくてもよいが、好ましくは慣例的なアッセイで容易に測定されるタンパク質生成物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに強化された細胞成長および／または遺伝子増幅（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を媒介するタンパク質をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニターするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結し得るレポーターをコードする配列を含む。
【００７１】
「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば幹細胞（多能性および複能性）などが挙げられる。
【００７２】
用語「作用的な連結」および「作用的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した」（または「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した」）は、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つで発揮される機能を媒介し得る可能性をもたらすように成分が配列されている２つまたはそれよりも多くの成分（例えば配列エレメント）の並置に関連して、同義的に使用される。例証として、プロモーターなどの転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、転写調節配列は、コード配列に作用的に連結している。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作用的に連結しているが、必ずしもそれと直接隣接していなくてもよい。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないとしても、コード配列に作用的に連結した転写調節配列である。
【００７３】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的な断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を依然として保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的な断片は、対応するネイティブの分子よりも多くの、それよりも少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有していてもよい。核酸またはタンパク質の機能を決定するための方法（例えば、コード化機能、別の核酸にハイブリダイズする能力、酵素活性のアッセイ）は、当業界において周知である。
【００７４】
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能な、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込み型ベクターを含む。
【００７５】
用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され、哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象としては、障害を有する対象が挙げられる。
【００７６】
用語「処置すること」および「処置」は、本明細書で使用される場合、症状の重症度および／または頻度における低減、症状および／または根本的な原因の消失、症状および／またはその根本的な原因の出現の防止、ならびに損傷の改善または回復を指す。がん、単一遺伝子疾患および移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。
【００７７】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めたタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて様々な長さの）は、ヌクレオソームコア間に伸長する。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核および真核両方の全てのタイプの細胞核タンパク質を包含することが意図される。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームのクロマチンの両方を含む。
【００７８】
「接近可能な領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子が結合することができる細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされていないものであると考えられる。接近可能な領域の他と異なる構造は、化学的および酵素プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出できることが多い。
【００７９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在するという条件で結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。「意図した」または「オンターゲット」配列は、結合分子が結合することが意図される配列であり、「意図しない」または「オフターゲット」配列は、意図した標的ではない、結合分子が結合する任意の配列を含む。
【００８０】
ＤＮＡ結合分子／ドメイン
目的の任意の遺伝子または遺伝子座における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合分子／ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。任意のＤＮＡ結合分子／ドメインを本明細書で開示される組成物および方法において使用することができ、これらに限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分（ガイドまたはｓｇＲＮＡ）、またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。
【００８１】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。例えば、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許公報第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【００８２】
ある特定の実施形態では、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／００６０２３０号（例えば、表１）で開示されるＤＮＡ結合ドメインは、ＰＤ１遺伝子中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質を含む。好適なＺＦＰの非限定的な例としては、米国特許第８，５６３，３１４号の表２および３に示される認識へリックス領域を有する１２９４２および２５０２９と名付けられたＺＦＰが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３または配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００８３】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、その場合、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【００８４】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００８５】
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に、好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の強化は、例えば米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
【００８６】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６で詳細に記載されている。
【００８７】
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。
【００８８】
通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのある特定のものは、４、５または６つあるいはそれより多くのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；一方で６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。
【００８９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８；  Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される変異切断ドメインとともに使用されたジンクフィンガータンパク質は、主鎖領域（例えば、−１〜６に番号付けされる７アミノ酸の認識へリックス領域の外側の領域）に、例えば−１４、−９および／または−５位の１つまたは複数において、１つまたは複数の変異（置換、欠失、および／または挿入）を含む。１つまたは複数のこれらの位置における野生型残基は、欠失していても、任意のアミノ酸残基で置き換えられていても、および／または１つもしくは複数の（ｏｎ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）追加の残基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、−５位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変更されている。他の実施形態では、（−９）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられている。さらなる実施形態では、（−１４）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられている。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに変異を含んでいてもよく、１つまたは複数のフィンガーにおける（−５）、（−９）および／または（−１４）位におけるアミノ酸は、任意の組合せの上で列挙したアミノ酸のいずれかに変更されており、例えば、ジンクフィンガータンパク質の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのフィンガーへの主鎖変異（例えば、（−５）変異）である。
【００９１】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体である、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１を参照）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３（１３）：４３７９−４３８４；米国特許公報第２０１１０３０１０７３号および同第２０１１０１４５９４０号を参照）由来のものに類似した転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）由来の操作されたドメインを含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌は、重要な穀物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５個よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中型ドメインを含有し、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説に関して、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照）。加えて、植物病原性細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ  ４株ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同な、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子が見出されている（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５塩基対の欠失により異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００９２】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。繰り返しの配列は、およそ１０２塩基対を含み、反復は、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ、同上）。反復の多型は通常、１２および１３位に位置し、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列における連続するヌクレオチドの同一性と、１２および１３位における高度可変二残基（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性と間に１対１の対応が存在すると考えられる（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照）。実験的に、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識に関する天然コードは、１２および１３位におけるＨＤ配列（反復可変二残基またはＲＶＤ）により、シトシン（Ｃ）への結合が起こり、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合すると決定された。これらのＤＮＡ結合反復が、新しい組合せおよび多数の反復を有するタンパク質に組み立てられて、植物細胞において新しい配列と相互作用し、非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子が作製された（Ｂｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ、同上）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、非定型的なＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含むＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）が得られたいる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００９３】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ：１−１３，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照）。
【００９４】
よりさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置するかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖切断を作り出すことができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１−８  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこともあり得る。任意のＴＡＬＥＮを、１つまたは複数のメガ−ＴＡＬＥを有する追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）と組み合わせて使用してもよい。
【００９５】
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡに結合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許公報第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号を参照されたい。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １：ｅ６０）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【００９６】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、同上；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ、同上を参照）。真核生物において、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは、小さい（１９〜３１ｎｔの）ＲＮＡに結合する。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さいＲＮＡと標的との間でワトソン−クリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、エンドヌクレアーゼとして標的ＲＮＡを切断する（Ｖｏｇｅｌ  （２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４：９７２−９７３）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さい一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（しばしばウイルス）ＤＮＡを検出および除去するように機能する可能性がある（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １９，  ４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ５１，  ５９４；Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、同上）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。
【００９７】
最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するもの（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、同上）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を用いて１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片のいずれかと会合する。このＴｔＡｇｏが結合した「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、ＤＮＡの第三者の分子においてワトソン−クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように導くのに機能する。これらのガイドＤＮＡにおける配列の情報により標的ＤＮＡが確認されると、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このようなメカニズムは、その標的ＤＮＡに結合した状態のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても裏付けられる（Ｇ．  Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ、同上）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ、同上）。
【００９８】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質上にロードすることができる（Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、同上）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって指示されるため、外因性の、研究者によって特定されたガイドＤＮＡと共に形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、それゆえに、相補的な、研究者によって特定された標的ＤＮＡにＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を導く。このように、ＤＮＡ中に標的化された二本鎖切断を作り出すことができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオーソロガスなＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された切断を可能にする。このような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断に関して、哺乳動物細胞での発現に最適化されたＴｔＡｇｏコドンのバージョンの使用が好ましい場合がある。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が、細胞透過性ペプチドに融合されている場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましい場合がある。さらに、３７℃で改善された活性を有するように変異誘発を介して変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）は、ＤＮＡ切断（ｂｒｅａｋ）の利用のために当業界において標準的な技術を使用する、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む一連の結果に影響を与えるのに使用することができる。
【００９９】
したがって、任意のＤＮＡ結合分子／ドメインを使用することができる。
【０１００】
融合分子
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの成分、例えば単一ガイドＲＮＡ）および異種調節（機能性）ドメイン（またはその機能的な断片）を含む融合分子も提供される。共通のドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、発癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子および調節因子；ＤＮＡ再構成酵素ならびにその関連因子および調節因子；クロマチン関連タンパク質およびその調節因子（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡを改変する酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにその関連因子および調節因子が挙げられる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細についての、米国特許公報第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号および同第２００７／０２１８５２８号。
【０１０１】
活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１，  ５９５２−５９６２  （１９９７）を参照）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３７３−３８３  （１９９８）を参照）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ  ＆  Ｂａｒｉｋ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：５６１０−５６１８  （１９９８）およびＤｏｙｌｅ  ＆  Ｈｕｎｔ，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２  （１９９７））；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：３−２８  （１９９８））、または人工キメラ機能性ドメイン、例えばＶＰ６４（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １８，  ６４３９−６４４７）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １１，  ４９６１−４９６８  （１９９２））、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２３：２５５−２７５；Ｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ  （１９９９）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｐｏｌ．  ４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６９：３−１２；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２５：２７７−２８３；およびＬｅｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ９：４９９−５０４を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５，−６，−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｇｅｎｅ  ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：８７−９９；Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：２９８−３０９；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２：１−８；Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１：���３−４４；およびＨｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。
【０１０２】
ＤＮＡ結合ドメインと機能性ドメインとの融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）の形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが、機能性ドメインとして好適であることは、当業者には明らかである。活性化複合体および／または活性化している活性（例えば、ヒストンのアセチル化など）を標的遺伝子に補充することが可能な本質的にあらゆる分子が、融合タンパク質の活性化しているドメインとして有用である。融合分子における機能性ドメインとしての使用に好適な、インシュレータードメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチン再構築タンパク質、例えばＩＳＷＩを含有するドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、米国特許公報第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号ならびにＷＯ０２／４４３７６に記載されている。
【０１０３】
例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５：３３８−３４２を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Ｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：３０５−３２１；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２２：１９−２７を参照されたい。
【０１０４】
融合分子は、当業者に周知のクローニングおよび生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、必要に応じて、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原由来のものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）も含む。融合タンパク質（およびそれをコードする核酸）は、融合体の成分のなかでも翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。
【０１０５】
一方の機能性ドメイン（またはその機能的な断片）のポリペプチド成分と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との融合体は、当業者に公知の生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のカタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合体を作製するための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：３９３０−３９３５。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡは、機能性ドメインと会合して、活性な転写調節因子およびヌクレアーゼを形成する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、標的部位は、細胞クロマチンの接近可能な領域中に存在する。接近可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および同第７，９２３，５４２号に記載されるようにして決定することができる。細胞クロマチンの接近可能な領域中に標的部位が存在しない場合、１つまたは複数の接近可能な領域は、米国特許第７，７８５，７９２号および同第８，０７１，３７０号に記載されるようにして生成することができる。追加の実施形態では、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が接近可能な領域中にあるかないかに関係なく、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することが可能である。このタイプの「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核内因子３（ＨＮＦ３）に見出される（Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４８：２６１−２７０；Ｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６０：７１９−７３１；およびＣｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：２４４−２５４）。
【０１０７】
融合分子は、当業者に公知の通りに薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８５；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１０８】
融合分子の機能的な成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると遺伝子の転写に影響を与えることが可能な多種多様の成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能的な成分としては、これらに限定されないが、様々な転写因子ドメイン、例えば活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーを挙げることができる。
【０１０９】
追加の例示的な機能性ドメインは、例えば、米国特許第６，５３４，２６１号および同第６，９３３，１１３号に開示されている。
【０１１０】
外因性の小分子またはリガンドによって調節される機能性ドメインも、選択することができる。例えば、機能性ドメインが外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下におけるその活性なコンフォメーションのみを想定しているＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を用いてもよい（例えばＵＳ２００９０１３６４６５を参照）。したがって、ＺＦＰは、調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結することができ、その結果得られるＺＦＰ−ＴＦの活性は、外部のリガンドによって制御される。
【０１１１】
ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。そのようなものとして、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づく。例えば、目的に合わせたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（２０）：ｅ１７８；Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５５：４４３−４５８。加えて、ＺＦＰの操作も記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第７，１６３，８２４号；および同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
【０１１２】
加えて、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥをヌクレアーゼドメインに融合して、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ、すなわち、その操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識し、ＤＮＡ結合部位の近傍でヌクレアーゼ活性によるＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的な実体が作り出されている。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。ごく最近、このようなヌクレアーゼは、様々な生物におけるゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公報ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
【０１１３】
したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、広範囲に適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでいてもよく、あるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、コグネート結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように変更されてもよい。
【０１１４】
本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれかでは、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびＴＡＬＥＮとも称されるヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含んでいてもよい。使用者が選択する標的配列とのロバストな部位特異的な相互作用のためにこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ：１−１３，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこ
ともあり得る。
【０１１５】
よりさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに位置しているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用できるか、または二本鎖切断を作り出すことができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１−８  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照）。任意のＴＡＬＥＮを、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガ−ＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））または他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用することができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその切断活性を示す部分を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般的に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号６として開示された「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーにグループ分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８；  Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。
【０１１７】
主としてＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号６として開示された「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）由来の天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的なゲノム改変を促進するのに使用されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同な遺伝子（Ｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｏｎ．  ２５５：８８−９３）または認識配列が導入された前もって操作されたゲノム（Ｒｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４：８０９６−１０６；Ｃｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３），  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  １３３：９５６−６５；Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０；Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２），  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：１５６８−８１；Ｇｏｕｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６），  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ８（５）：６１６−６２２）のいずれかの改変に限定されていた。したがって、医学的に、または生物工学的に関連する部位において新規の結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作する試みが行われてきた（Ｐｏｒｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：９６７−７３；Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４２：３１−４１；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許公報第２００７０１１７１２８号；同第２００６０２０６９４９号；同第２００６０１５３８２６号；同第２００６００７８５５２号；および同第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の、天然に存在する、または操作されたＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結していてもよく、および／またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは、異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結していてもよい。
【０１１８】
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子における標的部位に結合するように操作されたＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）、および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載される制限および／またはメガヌクレアーゼ由来）を含む。
【０１１９】
上で詳細に記載したように、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、その場合、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ反復単位の１つまたは複数のアミノ酸配列に関連付けられる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１２０】
標的部位の選択；ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号で詳細に記載されている。
【０１２１】
加えて、これらのおよび他の参考文献で開示されたように、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、例えば、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さのリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結されていてもよい。６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。米国特許第８，７７２，４５３号も参照されたい。
【０１２２】
したがって、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合ドメインおよび任意のヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含んでいてもよい。上述したように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーまたはＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン、およびヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン由来の切断ドメイン、および異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して異種であってもよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来となり得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的な断片）の１つまたは複数は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【０１２３】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする上記したような任意のヌクレアーゼまたはその部分由来であってもよい。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよく、各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的な断片）由来であってもよい。加えて、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、２つの融合タンパク質のそれらそれぞれの標的部位への結合によって、切断ハーフドメインが例えば二量体化により機能的な切断ドメインを形成することが可能な空間的な配向で互いに切断ハーフドメインが配列されるように互いに配置される。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５〜１０ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド間をあけている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入していてもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれよりも多く）。一般的に、切断部位は、標的部位間にある。
【０１２４】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、結合部位で、またはその近傍でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋＩは、一方の鎖においてその認識部位から９ヌクレオチドで、および他方の鎖においてその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていてもされていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１２５】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質において使用されたＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された二本鎖切断および／または標的化された細胞配列の置き換えのために、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された切断および標的化された配列変更のパラメーターは、この開示の他所で提供される。
【０１２６】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化して（例えば、二量体化して）機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
【０１２７】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、本明細書にその全体が組み込まれる国際公報ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加の制限酵素は、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらは、本開示により企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ由来の切断ドメインを含む。全長ＦｏｋＩを以下に示す。本明細書に記載されるヌクレアーゼで使用される切断ドメインは、イタリックとアンダーラインで示され（全長タンパク質の３８４〜５７９位）、ホロタンパク質配列は、後述される（配列番号１）：
【化１】
2022500052.tif 000003
【０１２９】
ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、アミノ酸残基の１つまたは複数における変異を含んでいてもよい。変異は、（異なる残基での野生型アミノ酸残基の）置換、（１つまたは複数のアミノ酸残基の）挿入および／または（１つまたは複数のアミノ酸残基の）欠失を含む。ある特定の実施形態では、残基４１４〜４２６、４４３〜４５０、４６７〜４８８、５０１〜５０２、および／または５２１〜５３１（上記の全長配列に対して番号付けした）の１つまたは複数が、変異しており、これは、これらの残基が、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：７７８−７８４に記載されるその標的部位に結合したＺＦＮの分子モデルにおいてＤＮＡ主鎖の近くに位置しているためである。ある特定の実施形態では、４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５位における１つまたは複数の残基が変異している。ある特定の実施形態では、変異は、任意の異なる残基、例えばアラニン（Ａ）残基、システイン（Ｃ）残基、アスパラギン酸（Ｄ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、グリシン（Ｇ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基またはスレオニン（Ｔ）残基での野生型残基の置換を含む。他の実施形態では、４１６、４１８、４２２、４４６、４４８、４７６、４７９、４８０、４８１、５２５、５２７および／または５３１位の１つまたは複数における野生型残基が、例えば、これらに限定されないが、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄおよび／またはＱ５３１Ｒを含む他の任意の残基で置き換えられている。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、これらの全ての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号；ならびに米国特許公開第２０１１０２０１０５５号に記載されるような、ホモ二量体化を最小化または防止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位におけるアミノ酸残基（全長ＦｏｋＩ配列に対して番号付けした）は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。変異は、ＦｏｋＩに相同な天然制限酵素に見出される残基への変異を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５位における変異は、正電荷を有するアミノ酸の、荷電を有さない、または負電荷を有するアミノ酸での置き換えを含む。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、１つまたは複数のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６および４８６に変異を含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；同第８，９６１，２８１号および同第８，６２３，６１８号；米国特許公報第２００８０１３１９６２号および同第２０１２００４０３９８号に記載されるような、絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインを含む。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）（本明細書に示される野生型ＦｏｋＩに対して番号付けした）を含む、融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされたアミノ酸残基４９０、５３８および５３７に変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＫＫＫ」または「ＫＫＲ」）を含む、融合タンパク質を提供する（参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．８，９６２，２８１を参照）。例えば、これらの開示があらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「シャーキー（Ｓｈａｒｋｅｙ）」および／または「シャーキーの」変異を含む（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ，  （２０１０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００（１）：９６−１０７を参照）。
【０１３２】
別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の変異に加えて、野生型ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩ相同体に対して番号付けされたアミノ酸残基４９０、および５３８に変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＫＫ」）を含む、融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５位における１つまたは複数の変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられているポリペプチド（「ＥＬ」）を含む、融合タンパク質を提供する（参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．８，０３４，５９８を参照）。
【０１３３】
一態様では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、ＦｏｋＩ触媒ドメインにおける３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４０２、４１６、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４７、４４８、４６９、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２５、５２９、５３４、５５９、５６９、５７０、５７１位の１つまたは複数における野生型アミノ酸残基が変異しているポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。添付の表および図のいずれかで示される１つまたは複数の変異を含むヌクレアーゼドメインが提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の変異は、野生型アミノ酸を、正電荷を有する残基から中性残基または負電荷を有する残基に変更する。これらの実施形態のいずれかでは、記載された変異体はまた、１つまたは複数の追加の変異を含むＦｏｋＩドメインに作製されてもよい。好ましい実施形態では、これらの追加の変異は、二量体化ドメイン中、例えば４１８、４３２、４４１、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および／または５５９位にあってもよい。変異の非限定的な例としては、任意の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩの相同体）の、３９３、３９４、３９８、４１６、４２１、４２２、４４２、４４４、４７２、４７３、４７８、４８０、５２５または５３０位における野生型残基の、任意のアミノ酸残基での変異（例えば、置換）（例えば、Ｋ３９３Ｘ、Ｋ３９４Ｘ、Ｒ３９８Ｘ、Ｒ４１６Ｓ、Ｄ４２１Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｋ４４４Ｘ、Ｓ４７２Ｘ、Ｇ４７３Ｘ、Ｓ４７２、Ｐ４７８Ｘ、Ｇ４８０Ｘ、Ｋ５２５Ｘ、およびＡ５３０Ｘ、ここで最初の残基は、野生型を表し、Ｘは、野生型残基が置換される任意のアミノ酸を指す）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｘは、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＤまたはＮである。他の例示的な変異としては、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４４６Ｄ、Ｓ４４６Ｒ、Ｋ４４８Ａ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｎ、Ｑ４８１Ｅ、Ａ５３０Ｅ、および／またはＡ５３０Ｋが挙げられ、アミノ酸残基は、全長ＦｏｋＩ野生型切断ドメインおよびその相同体に対して番号付けされている。ある特定の実施形態では、組合せは、４１６および４２２、４１６位における変異、およびＫ４４８Ａ、Ｋ４４８ＡおよびＩ４７９Ｑ、Ｋ４４８ＡおよびＱ４８１Ａ、ならびに／またはＫ４４８Ａ、および５２５位における変異を含んでいてもよい。一実施形態では、４１６位における野生型残基は、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられていてもよく（Ｒ４１６Ｅ）、４２２位における野生型残基は、Ｈｉｓ（Ｈ）残基で置き換えられ（Ｒ４２２Ｈ）、５２５位における野生型残基は、Ａｌａ（Ａ）残基で置き換えられている。本明細書に記載される切断ドメインは、これらに限定されないが、４３２、４４１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２７、５３７、５３８および／または５５９位におけるものを含む追加の変異、例えば二量体化ドメイン変異体（例えば、ＥＬＤ、ＫＫＲ）および／またはニッカーゼ変異体（触媒ドメインへの変異）をさらに含んでいてもよい。本明細書に記載される変異を有する切断ハーフドメインは、当業界で公知のようにヘテロ二量体を形成する。
【０１３４】
したがって、ＰＤ１遺伝子を切断するヌクレアーゼが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、左および右のＺＦＮのＺＦＮヌクレアーゼ対を含むＺＦＮであり、左および右のＺＦＮはそれぞれ、切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）およびＰＤ１結合ＺＦＰを含み、左および右のＺＦＮの切断ドメインは二量体化し、ＰＤ１遺伝子は切断される。ある特定の態様では、ＰＤ１結合ＺＦＰは、１２９４２および２５０２９と名付けられたＺＦＰを含み、その完全アミノ酸配列は、以下に示される（配列番号３および配列番号５）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、左および右のＴＡＬＥＮのＴＡＬＥＮヌクレアーゼ対を含むＴＡＬＥＮであり、左および右のＴＡＬＥＮはそれぞれ、切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）およびＰＤ１結合ＴＡＬ−エフェクタードメインを含み、左および右のＴＡＬＥＮの切断ドメインは二量体化し、ＰＤ１遺伝子は切断される。
【０１３５】
対のＰＤ１遺伝子に結合するＺＦＮの一方または両方は、ＦｏｋＩ切断ドメイン中における、野生型ＦｏｋＩ（配列番号１）に対して番号付けされた４１６、４１８、４２２、４７６、４７９、４８１、５２５および／または５３１の少なくとも１つまたは複数の、好ましくは４１６、４２２、４７６、４８１、および／または５２５、さらにより好ましくは４１６、４８１および／または５２５に、１つまたは複数の変異をさらに含む。ヌクレアーゼ対の一方または両方の成分のヌクレアーゼ（切断）ドメインはまた、４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８および／または５５９位における１つまたは複数の変異を含んでいてもよく、これらに限定されないが、ＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳが挙げられる。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＰＤ１ヌクレアーゼ対の一方または両方は、例えば４１６位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｅ、Ｆ、またはＮ残基で置換されている）、４１８位における（例えば、野生型Ｓ残基が、ＤまたはＥ残基で置換されている）、４２２位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｈ残基で置換されている）、４７６位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＴ残基で置換されている）、４８１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｄ、ＥまたはＨ残基で置換されている）、５２５位における（例えば、野生型Ｋ残基が、Ａ、Ｓ、ＴまたはＶ残基で置換されている）、５２７位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ残基で置換されている）、または５３１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｒ残基で置換されている）単一の変異を含む。例えば、図１〜３を参照されたい。ある特定の実施形態では、変異は、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄ、Ｑ５３１Ｒ変異からなる群より選択される単一の変異を含む。置換変異の非限定的な例は、図１〜３に示される。よりさらなる実施形態では、ヌクレアーゼ対（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）の両方のヌクレアーゼの１つまたは複数は、例えば４１６位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｅ、Ｆ、またはＮ残基で置換されている）、４１８位における（例えば、野生型Ｓ残基が、ＤまたはＥ残基で置換されている）、４２２位における（例えば、野生型Ｒ残基が、Ｈ残基で置換されている）、４７６位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＴ残基で置換されている）、４８１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｄ、ＥまたはＨ残基で置換されている）、５２５位における（例えば、野生型Ｋ残基が、Ａ、Ｓ、ＴまたはＶ残基で置換されている）、５２７位における（例えば、野生型Ｎ残基が、Ｄ残基で置換されている）、または５３１位における（例えば、野生型Ｑ残基が、Ｒ残基で置換されている）単一の変異を、単一の変異以外の追加の変異、例えばＥＬＥ、ＥＬＤ、ＫＫＲなどの変異と共に含む。したがって、ヌクレアーゼ対の一方または両方のメンバーは、本明細書に記載される１つまたは複数の変異を含む。
【０１３６】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて核酸標的部位で組み立てられてもよい（例えば米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照）。このようなスプリット酵素の成分は、別々の発現構築物で発現させてもよく、または例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって個々の成分が離れている１つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１３７】
ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、例えば米国特許第９，５０６，１２０号および同第８，５６３，３１４号に記載されたような酵母ベースの染色体系で、使用前に、活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １：ｅ６０）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１３９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次ステップで標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡをｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズさせ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介させる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに、次に、標的認識のための追加の必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に向ける。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ：（ｉ）「適合」と呼ばれるプロセスにおける将来的な攻撃を防止するための外来のＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、それに続く（ｉｉｉ）外来の核酸でのＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関連し、例えば外来のＤＮＡの挿入などの機能における役割を担う。
【０１４０】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐで同定されており、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。機能的に保存されているにもかかわらず、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの態様において異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，  （２０１５）  Ｇｅｎｏｍ  Ｂｉｏ  １６：２５１を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との主要な差は、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを利用しないことであり、したがってｃｒＲＮＡのみを必要とする。ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチドの長さ（１９ヌクレオチドの反復および２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステムループを含有し、これが２次構造を保持する配列の変化を許容する。加えて、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が必要とする約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも著しく短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭの必要条件は、置き換えられた鎖における５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方が標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生じるが、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端化された切断を生じるのに、そのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用し、それに対してＣｐｆ１は、シードの外側に付着切断を生じるのに、ＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は、重要なシード領域から離れて付着切断を生じるため、ＮＨＥＪは、標的部位を破壊せず、それゆえに、Ｃｐｆ１は、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位を確実に切り続けることができる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的な誘導体」であってもよい。ネイティブ配列のポリペプチドの「機能的な誘導体」は、ネイティブ配列のポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的な誘導体」としては、これらに限定されないが、対応するネイティブ配列のポリペプチドと共通の生物学的活性をそれらが有するという条件で、ネイティブ配列の断片、ならびにネイティブ配列のポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的な誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合による改変体の両方、およびそれらの融合体、例えば誘導体Ｃａｓタンパク質を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の、変異体、融合体、共有結合による改変体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含み、これらは、細胞から得ることができる、または化学的に合成される、またはこれらの２つの手順の組合せによってであり得る。細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生する細胞、または天然にＣａｓタンパク質を産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、もしくは内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、天然にＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介した送達のための小さいＣａｓ９オーソログである（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１０，  ｐ．１８６）。
【０１４２】
ヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位において１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖の切断を生じることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば、米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（６）：５７７−５８２を参照されたい。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒活性ドメインと組み合わせて、ニッカーゼとして作用して、一本鎖の切断を生じることができる。それゆえに、２種のニッカーゼを組み合わせて使用して、特定の領域において二本鎖の切断を生じることができる。追加のニッカーゼも当業界、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４４（２）：ｅ１１．  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．  Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｏｃｔ  １９で公知である。
【０１４３】
本明細書に記載される１つまたは複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはポリヌクレオチドを含む細胞、ならびに本発明のヌクレアーゼを含む細胞から産生された遺伝子改変された細胞も本明細書で提供される。したがって、本発明は、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して産生された遺伝子改変された細胞（例えば、Ｔ細胞）の単離された集団であって、その細胞の集団において、ＰＤ１遺伝子が、ヌクレアーゼによって遺伝子改変されており（例えば、挿入および／または欠失（インデル）によって変異されている）、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異を含まないＰＤ１ヌクレアーゼと比較して特異性が増加している、細胞の集団を提供する。特異性は、様々な方法で決定することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、ヌクレアーゼによって行われたオンターゲット（ＰＤ１）遺伝子改変およびオフターゲット（非ＰＤ１）遺伝子改変を比較すること；オンおよびオフターゲット遺伝子改変間の倍率（またはパーセンテージ）の差を決定すること、ならびに／またはオフターゲット改変の実際のパーセンテージを決定すること（必要に応じてオンターゲット改変と比較して）が挙げられる。添付の図面も参照されたい。
【０１４４】
ある特定の態様では、ヌクレアーゼを使用して産生された遺伝子改変された細胞の単離された集団は、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異を有さないＰＤ１ヌクレアーゼを使用した遺伝子改変のオン／オフの比率よりも大きい相対的なオン／オフ（ＰＤ１／非ＰＤ１）の比率を有する。例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照されたい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼによって行われた細胞における遺伝子改変のオン／オフの比率は、１００より大きい、好ましくは１５０より大きい、さらにより好ましくは２００より大きい。したがって、これらの細胞におけるヌクレアーゼによって行われたＰＤ１遺伝子の外側にある遺伝子改変（オフターゲット変異）は、本明細書に記載されるＦｏｋＩ変異を有さないＰＤ１ヌクレアーゼと比較して、これらに限定されないが、１〜５０分の１（またはそれらの間の任意の値）を含め、１〜１００分の１またはそれより低く低減されていてもよい。ある特定の実施形態では、細胞の単離された集団におけるヌクレアーゼによって行われた遺伝子改変の１％未満（例えば、０．５％未満）が、ＰＤ１遺伝子の外側にある。よりさらなる態様では、本明細書に記載されるヌクレアーゼによって産生された細胞の集団の細胞の、少なくとも４０％（例えば、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％）が、ＰＤ１への改変（インデル）を含み、細胞の０．０５％未満が、ヌクレアーゼによって行われたオフターゲット（非ＰＤ１）遺伝子改変を含む。よりさらなる態様では、本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して産生された遺伝子改変された細胞の単離された集団は、１５０またはそれより大きい相対的なオン／オフ（ＰＤ１／非ＰＤ１）の比率を有する。したがって、ＰＤ１が特異的に変更されている、遺伝子改変された細胞が本明細書で提供される。本明細書に記載される遺伝子改変された細胞は、１つまたは複数の追加の遺伝子（ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＬＡ−４、セーフハーバー遺伝子）に行われた遺伝子改変（挿入および／または欠失）を含む、さらなる改変を含んでいてもよい。ＰＤ１遺伝子改変された細胞の単離された集団由来の部分的にまたは完全に分化した細胞も提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、ＣＡＲ導入遺伝子（ランダムに、またはヌクレアーゼ媒介性の組み込みを介し任意の遺伝子に組み込まれた）および／または１つもしくは複数の不活性化された遺伝子（例えば、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＣＴＬＡ−４）をさらに含むＴ細胞である。
【０１４５】
送達
本明細書に記載されるタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）、ポリヌクレオチドならびに／またはタンパク質および／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって、例えばタンパク質および／またはｍＲＮＡ成分の注射などによって、標的細胞に送達することができる。
【０１４６】
好適な細胞としては、これらに限定されないが、真核および原核の細胞および／または細胞系が挙げられる。このような細胞またはこのような細胞から生成した細胞系の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびに昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、または真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞系である。好適な細胞としては、幹細胞、例えば、一例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞も挙げられる。
【０１４７】
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインおよびこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質もまた、ＤＮＡ結合タンパク質（複数可）の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。加えて、追加の核酸（例えば、ドナー）も、これらのベクターを介して送達することができる。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、必要に応じて１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および／または追加の核酸を含んでいてもよいことが明らかである。したがって、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質および必要な場合に追加のＤＮＡが細胞に導入されるとき、それらは、同じベクターに、または異なるベクターに担持されてもよい。複数のベクターが使用される場合、各ベクターが、１つのまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および所望の場合、追加の核酸を含んでいてもよい。
【０１４９】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織中に操作されたＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入し、所望の場合、追加のヌクレオチド配列を共導入することができる。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質および／またはドナーをコードする）を細胞に投与することにも使用できる。ある特定の実施形態では、核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法での使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達の後にエピソームのまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３  （１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７  （１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６  （１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５  （１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０  （１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４  （１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６  （１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４  （１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ  （ｅｄｓ．）  （１９９５）；およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６  （１９９４）を参照されたい。
【０１５０】
核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強取り込み（ａｇｅｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。特に好ましくは、ＡＲＣＡ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ；アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそれらのバリアントである。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたい。
【０１５１】
追加の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられる（例えばＵＳ６００８３３６を参照）。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６、ＵＳ４，９４６，７８７；およびＵＳ４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）への送達であってもよい。
【０１５２】
標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えばイムノリピド（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体の調製は当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０  （１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２９１−２９７  （１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：３８２−３８９  （１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：６４７−６５４  （１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２  （１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２：４８１７−４８２０  （１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。
【０１５３】
追加の送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達され、抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞に持ち込まれる。細胞中に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）  ｐ．  ６４３を参照）。
【０１５４】
操作されたＤＮＡ結合タンパク質、および／または所望の場合、ドナー（例えばＣＡＲまたはＡＣＴＲ）をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化する、およびウイルスペイロードを核にトラフィッキングするための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよく（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、ウイルスベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処置してもよく、改変された細胞が患者に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。核酸の送達のための従来のウイルスベースの系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中での組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能であり、これは、挿入された導入遺伝子の長期にわたる発現をもたらすことが多い。加えて、高い形質導入効率が多くの様々な細胞型および標的組織で観察された。
【０１５５】
レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を取り入れ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するかまたは感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のためのパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復で構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次いで、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永続的な導入遺伝子発現を提供するのに使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくもの、およびそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２７３１−２７３９  （１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１６３５−１６４０  （１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．  １７６：５８−５９  （１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：２３７４−２３７８  （１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２２２４  （１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【０１５６】
一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法手順のために細胞を標的核酸で形質導入することにも使用される（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７  （１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１  （１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４：１３５１  （１９９４）を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−３２６０  （１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２−２０８１  （１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０  （１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：０３８２２−３８２８  （１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。
【０１５７】
臨床試験における遺伝子移入のために、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが現在利用可能であり、これらは、ヘルパー細胞系に挿入された遺伝子によって不完全なベクターを補完し、形質導入剤を生成することを含むアプローチを利用する。
【０１５８】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５  （１９９５）；Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １：１０１７−１０２  （１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８  （１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０  （１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージングしたベクターの場合、５０％またはそれよりも大きい形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４４（１）  ：１０−２０  （１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １：１１１−２  （１９９７））。
【０１５９】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、不完全で非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入される細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特色である。（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３  （１９９８），  Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：７４８−５５  （１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０ならびにシュードタイプＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
【０１６０】
複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高い力価で産生し、いくつかの異なる細胞型に容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増える。Ａｄベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、非分裂性の分化細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉に見出されるものを含むなどの複数のタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を伴うものであった（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−９  （１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０  （１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：７  １０８３−１０８９  （１９９８）；Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２０５−１８  （１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５９７−６１３  （１９９７）；Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５０７−５１３  （１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−１０８９  （１９９８）が挙げられる。
【０１６１】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびそれに続く宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系も、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために相当量でパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスが感受性を示す熱処理によって低減することができる。
【０１６２】
多くの遺伝子療法適用において、遺伝子療法用ベクターが特定の組織タイプに対して高度な特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって所与の細胞型に対して特異性を有するように、ウイルスベクターを改変してもよい。リガンドは、目的の細胞型に存在することがわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１  （１９９５））は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞の対に拡張することができる。例えば、線状ファージは、実質的に全ての選択された細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作することができる。上の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利な特定の取り込み配列を含有するように操作することができる。
【０１６３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達方法は、上述した方法を含んでいてもよい。例えば、動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＣａｓをコードするｍＲＮＡまたは組換えＣａｓタンパク質は、ゲノム編集動物の１細胞期胚に、ガラス針を使用して直接注射することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞中でＣａｓおよびガイドＲＮＡを発現するために、典型的には、それらをコードするプラスミドは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを介して細胞にトランスフェクトされる。また組換えＣａｓタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたガイドＲＮＡと複合体化することもでき、Ｃａｓ−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質は、目的の細胞によって取り込まれる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２４（６）：１０１２）。治療目的で、ＣａｓおよびガイドＲＮＡは、ウイルスおよび非ウイルス技術の組合せによって送達することができる。例えば、ＣａｓをコードするｍＲＮＡは、ナノ粒子送達を介して送達してもよく、一方でガイドＲＮＡおよび任意の所望の導入遺伝子または修復鋳型は、ＡＡＶを介して送達される（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０１６）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（３）  ｐ．  ３２８）。
【０１６４】
遺伝子療法用ベクターは、典型的には、後述するように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所的適用による個々の患者への投与によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、ｅｘ  ｖｉｖｏで、個々の患者からの体外培養した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）またはユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞に送達することができ、続いて細胞は、通常ベクターを取り込んだ細胞の選択の後に、患者に再び埋め込まれる。
【０１６５】
診断、調査、移植または遺伝子療法のためのｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）は、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＤＮＡ結合タンパク質核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされ、再び対象生物（例えば、患者）に注入し戻される。ｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションに好適な様々な細胞型が当業者に周知である（例えば、どのように患者から細胞を単離および培養するかの考察に関して、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  （３ｒｄ  ｅｄ．  １９９４）およびそこで引用された文献を参照）。
【０１６６】
一実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのｅｘ  ｖｉｖｏの手順で、幹細胞が使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがｉｎ  ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化することができる、または哺乳動物（例えば細胞のドナー）に導入することができることであり、それらは骨髄に移植される。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が公知である（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１６９３−１７０２  （１９９２）を参照）。
【０１６７】
幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、望まれない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒細胞）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１６９３−１７０２  （１９９２）を参照）。
【０１６８】
一部の実施形態では、改変された幹細胞も使用することができる。例えば、アポトーシスに対する耐性が付与された神経幹細胞が、治療用組成物として使用することができ、幹細胞も本発明のＺＦＰ  ＴＦを含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、またはここでも例えばカスパーゼ−６特異的なＺＦＮを使用してカスパーゼにおいて破壊されているものによって、生じ得る。
【０１６９】
治療用ＤＮＡ結合タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与してもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションを含む、最終的な血液または組織細胞との接触に分子を導くのに通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する好適な方法は利用可能で、当業者に周知であり、特定の組成物を投与するのに１つよりも多くの経路を使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供できることが多い。
【０１７０】
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に導入遺伝子を導入するのに有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。
【０１７１】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２を参照されたい。
【０１７２】
薬学的に許容される担体は、部分的に、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、後述するように、利用可能な医薬組成物の多種多様の好適な製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８９を参照）。
【０１７３】
上述したように、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、任意のタイプのＴ細胞および幹細胞を含む、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含む任意のタイプの細胞で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞系は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、ならびに真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの細胞系の後代、変種および派生物も使用することができる。
【０１７４】
適用
疾患の処置および防止における操作されたＰＤ１ヌクレアーゼの使用は、いくつかの分野において有用であることが期待される。ＰＤ１は、これらに限定されないが、がんおよび自己免疫疾患を含む様々な疾患および障害に関与する。例えば、Ｃｈａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１０：７５−９７を参照されたい。例えば、ＰＤ１は、慢性的な抗原に応答してＴ細胞活性化とＴ細胞寛容とのバランスを調節することに関与することが示されている。ＨＩＶ１感染中、ＰＤ１の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞で増加することが見出されている。慢性的な抗原曝露の存在下でＴ細胞の機能不全が観察される場合、ＰＤ１の上方調節は、ＨＩＶ感染における場合と同様に、何らかの形でＴ細胞の疲弊（主要なエフェクター機能の進行性消失と定義される）と関連すると考えられる。ＰＤ１の上方調節はまた、慢性ウイルス感染の間に、これらと同じセットの細胞においてアポトーシスの増加にも関連し得る（Ｐｅｔｒｏｖａｓ  ｅｔ  ａｌ，  （２００９）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３（２）：１１２０−３２を参照）。ＰＤ１はまた、免疫監視からの腫瘍特異的な回避においても役割を果たし得る。ＰＤ１は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の両方において腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）で高度に発現されることが実証されている。ＰＤ１はまた、黒色腫浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）においても上方調節される（Ｄｏｔｔｉ  （２００９）  Ｂｌｏｏｄ  １１４  （８）：  １４５７−５８を参照）。腫瘍は、ＰＤ１リガンド（ＰＤＬ）を発現することが見出されており、これがＣＴＬにおけるＰＤ１の上方調節と組み合わされると、Ｔ細胞の機能性の喪失およびＣＴＬが有効な抗腫瘍応答を媒介することができないことにおける要因になり得る。したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、所望のＰＤ１標的部位（例えば、がんおよび自己免疫障害などの障害の処置のための）が主要な（または唯一の）切断場所になることを確実にするための、これらの新規のツールの特異性を増加させるのに役立つ。本明細書に記載されるオフターゲット切断を最小化または消去することは、全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの適用に関するこの技術の潜在性を増加させる。
【０１７５】
ＰＤ１のヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変は、これに限定されないががんを含む様々な遺伝学的および他の疾患の処置において有用である。例えば、遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ＣＡＲ＋細胞）は、がんのための治療用組成物を提供するために、本明細書に記載されるＰＤ１の遺伝子改変によってさらに改変することができる。
【０１７６】
上述したように、本明細書に記載される組成物および方法は、遺伝子改変、遺伝子修正、および遺伝子破壊に使用することができる。遺伝子改変の非限定的な例としては、相同組換え修復（ＨＤＲ）ベースの標的化た組込み；ＨＤＲベースの遺伝子修正；ＨＤＲベースの遺伝子改変；ＨＤＲベースの遺伝子破壊；ＮＨＥＪベースの遺伝子破壊ならびに／またはＨＤＲ、ＮＨＥＪ、および／もしくは一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）の組合せが挙げられる。一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、２つの相補的領域を露出させるための５’−３’エキソヌクレアーゼによるＤＳＢの切除による、同じ方向の２つの繰り返しの配列間の二本鎖切断の修復を指す。次いで２つのダイレクトリピートをコードする一本鎖が互いにアニールし、アニールした中間体は、一本鎖テール（いずれの配列にもアニールされていない一本鎖ＤＮＡの部分）が消化により除去されるようにプロセシングされ、ギャップがＤＮＡポリメラーゼによって満たされ、ＤＮＡ末端が再結合され得る。これは、ダイレクトリピート間に位置する配列の欠失をもたらす。
【０１７７】
組成物および方法は、体細胞療法にも使用することができ、それによってその生物学的な特性を強化するように改変された細胞のストックの産生を可能にする。このような細胞は、細胞のドナーの供給源およびレシピエントに対するその組織適合性と関係なく、様々な患者に注入することができる。
【０１７８】
記載された操作された切断ハーフドメインは、介在領域を欠失させるか、または２つの特定の遺伝子座を一度に変更するかのいずれかのための、複数の標的における同時の切断を必要とする遺伝子改変プロトコールにも使用することができる。２つの標的における切断は、４種のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの細胞発現を必要とし得、それにより、潜在的に、１０種の異なる活性なＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの組合せが生じ得る。このような適用の場合、野生型ヌクレアーゼドメインのためのこれらの新規のバリアントの置換は、望まれない組合せの活性を消失させ、オフターゲット切断の機会を低減し得る。ある特定の所望のＤＮＡ標的における切断がヌクレアーゼの対Ａ＋Ｂの活性を必要とし、第２の所望のＤＮＡ標的における同時の切断がヌクレアーゼの対Ｘ＋Ｙの活性を必要とする場合には、本明細書に記載される変異の使用は、ＡとＡ、ＡとＸ、ＡとＹなどの対形成を防止することができる。
引用された例示的な文献
【数１−１】
2022500052.tif 000004
【数１−２】
2022500052.tif 000005
【数１−３】
2022500052.tif 000006
【数１−４】
2022500052.tif 000007
【数１−５】
2022500052.tif 000008
【数１−６】
2022500052.tif 000009
【数１−７】
2022500052.tif 000010
【実施例】
【０１７９】
（実施例１：特定のＰＤ１特異的ヌクレアーゼの生成）
低いレベルのオフターゲット効果を有するＰＤ１特異的ヌクレアーゼを、米国特許公開第２０１８００８７０７２号に記載された通りに生成した。元の（親の）ＺＦＮは、米国特許第８，５６３，３１４号（例えば、表２および３）に記載されるように、ＺＦＰ１２９４２および２５０２９を含む。
【０１８０】
以下に親ＺＦＮ対のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（アミノ酸配列中、認識へリックス領域は下線で示し、標的化されたＦｏｋＩ残基は小文字で示し、分析のために選択されたＦｏｋＩ位置は太字と下線で示す）：
１２９４２（左のＰＤ１  ＺＦＮ）
核酸配列：
【化２】
2022500052.tif 000011
アミノ酸配列：
【化３】
2022500052.tif 000012
２５０２９（右のＰＤ１  ＺＦＮ）
核酸配列：
【化４】
2022500052.tif 000013
アミノ酸配列：
【化５】
2022500052.tif 000014
【０１８１】
これらのＰＤ１  ＺＦＮを使用して、２２種のＦｏｋＩバリアントのパネル（図１に列挙され、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄ、Ｑ５３１Ｒを含む）をスクリーニングした。そのＦｏｋＩドメイン内に単一残基置換を有するＰＤ１  ＺＦＮ二量体のバリアントのオンターゲット活性を分析した。各バリアントを、両方のＺＦＮが示された置換ＺＦＮを有する二量体として試験し、ｍＲＮＡヌクレオフェクション（５００ｎｇの各単量体）を介してヒトＫ５６２細胞に送達し、それに続いて３日目にゲノムＤＮＡを単離し、意図した標的におけるインデルに関してディープシーケンシング分析を行った。「半分用量」の親試料は、送達のために２５０ｎｇのＲＮＡを使用した。相対的なシグナル強度を強調するために、表の値に影を付けた。矢印は、高いレベルのオンターゲット活性の十分な保持を表す例示的なバリアントを強調する。
【０１８２】
Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５ＴおよびＫ５２５Ｖを含むオンターゲットスクリーニングから同定されたＦｏｋＩバリアントを、オンターゲットおよびオフターゲット部位の両方における、ならびに３つの最も高度に改変された以前に記載されたオフターゲットを含むオンターゲットおよびオフターゲット部位における活性に関してさらに特徴付けた（Ｂｅａｎｅ  ２０１５）。簡単に言えば、対の両方のＺＦＮにおいて同じＦｏｋＩバリアントを有するＺＦＮを、各ＺＦＮ単量体について、示された量のｍＲＮＡを使用したヌクレオフェクションを介してヒトＫ５６２細胞に送達した。３日目にゲノムＤＮＡを単離し、意図した標的およびオフターゲット部位におけるインデルに関してディープシーケンシング分析を決定した。
【０１８３】
図２Ａから図３で示されるように、オフターゲット活性は実質的に低減され（１０分の１から１００分の１）、最も選択的な置換（Ｑ４８１Ｄ）は、オンターゲット切断の優先性において＞２００倍の増加を示した（親二量体では７５％のＰＤ１インデル／６．４％のＯＴインデル、それに対して、バリアントでは８１％／０．０３％である図３を参照）。
【０１８４】
本明細書において示した通り、ＦｏｋＩドメインの改変を介して特異性が高度に強化されたＰＤ１  ＺＦＮを生成した。
【０１８５】
（実施例２：ＴＡＬＥＮ  ＦｏｋＩバリアント）
米国特許公開第２０１８００８７０７２号に記載されたように、ＴＡＬＥＮ対を設計し、試験した。使用されたＴＡＬＥＮ対（「試料」）は、全て米国特許第８，５８６，５２６号に記載されたように１０１０４１および１０１０４７のＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬ−エフェクターのＦｏｋＩバリアントであり、これらは、図４で示されるように含まれるＦｏｋＩバリアントに基づいて名称を変更した。
【０１８６】
図４で示されるように、Ｓ４４６Ｒ変異、Ｑ５５３１ＲまたはＱ４８１Ｈ変異を含む（二量体の一方または両方のＴＡＬＥＮ中に）ＴＡＬＥＮを含むいくつかのＦｏｋＩバリアント構築物がより活性であった。３０℃で、右のＴＡＬＥＮにおけるＦｏｋＩバリアントＱ５３１Ｒを使用すること、ならびに左および右のＴＡＬＥＮの両方におけるＦｏｋＩバリアントＱ４８１Ｈを使用することが、オフターゲット活性を、十分なオンターゲット活性を保持しながら４分の１より少なく減少させた。さらに、ほとんどのＴＡＬＥＮが、特異性において少なくとも２から８倍の増加を示した（相対的なオン／オフレベルによって測定した場合）。
【０１８７】
本明細書で述べられた全ての特許、特許出願および刊行物は、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
理解を明確にする目的のために図解と実施例によってある程度詳細に開示を提供したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく様々な変更や改変を実施することができることが当業者には明らかである。したがって、前述の記載および実施例は、限定として解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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