(57)【要約】  本発明は概して、ヒト造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる方法に関する。該方法は特に、成熟NK細胞が分化方法のごく初期に得られ、これらのNK細胞が増大したCD16発現及び抗体依存性細胞傷害（ADCC）を示すことを特徴とする（図11）。本発明の方法は、T-Box expressed in T cells（T-BET）及びEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せから選択される少なくとも1つの転写因子をHSCにトランスフェクト及び／又は形質導入することを特に包含する。【選択図】図11
2022502091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる方法であって、
a）単離HSCを準備する工程と、
b）工程a）の前記細胞をトロンボポエチン（TPO）、幹細胞因子（SCF）及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）を含有する培地中で培養する工程と、
c）工程b）の前記細胞に、T-Box expressed in T cells（T-BET）若しくはEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子をトランスフェクト及び／又は形質導入する工程と、
d）工程c）から得られる細胞をIL-2又はIL-15、好ましくはIL-15を含むリストから選択される少なくとも1つのサイトカインを含有する培地中で培養する工程と、
を含み、前記成熟NK細胞を工程d）の開始後3日目から得ることができる、方法。
【請求項２】
前記成熟NK細胞のCD16発現が非トランスフェクト若しくは非形質導入対照細胞、又は対照トランスフェクト若しくは対照形質導入細胞と比較して増大している、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記成熟NK細胞が少なくともステージ4である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程b）の前記培地が、血清を含む完全イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM培地）である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記TPOが約1 ng/ml〜約100 ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記SCFが約5 ng/ml〜約500 ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記FLT3-Lが約5 ng/ml〜約500 ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程d）の前記培地がFLT3-L、SCF、IL-3又はIL-7を含むリストから選択されるサイトカインを更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記IL-2及び／又はIL-15が約0.5ng/ml〜約50 ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程d）が不活性化間質細胞株を用いた、例えばEL08.1D2細胞又はOP9細胞を用いた共培養工程である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程c）において、前記細胞に前記少なくとも1つの転写因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターを形質導入する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
T-Box expressed in T cells（T-BET）、Eomesodermin（EOMES）、又はEomesodermin（EOMES）とT-Boxexpressed in T cells（T-BET）との組合せがトランスフェクト及び／又は形質導入されていることを特徴とするHSC細胞。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる分化NK細胞。
【請求項１４】
前記NK細胞のCD16発現が非トランスフェクト若しくは非形質導入対照細胞、又は対照トランスフェクト若しくは対照形質導入細胞と比較して増大している、請求項13に記載の分化NK細胞。
【請求項１５】
癌を有する被験体における抗体依存性細胞傷害の誘導に使用される、請求項12又は13に記載の分化NK細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる方法に関する。該方法は特に、成熟NK細胞が分化方法のごく初期に得られるのに加え、増強された抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性を有することを特徴とする（図11）。本発明の方法は、HSCにT-Boxexpressed in T cells（T-BET）及びEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せから選択される少なくとも1つの転写因子をトランスフェクト及び／又は形質導入することを特に包含する。
【背景技術】
【０００２】
自然リンパ球（Innate lymphoid cells；ILC）は、自然免疫系に属する新規のリンパ系細胞サブファミリーである。種々のILCが発生的に関連し、リンパ球形態、抗原受容体の遺伝子依存性再構成の欠如、並びに骨髄及び樹状細胞表現型マーカーの欠損を特徴とする。ILCは、ヘルパーT細胞サブセットと同様、異なる表現型、サイトカイン分泌プロファイル及び必須転写因子に応じて3つの異なる群に分けることができる[1,2]。
【０００３】
プロトタイプILCとみなされるナチュラルキラー（NK）細胞は、重要な細胞傷害性細胞である[1]。NK細胞は、パーフォリン及びグランザイムBを含有する細胞溶解性顆粒の放出による活性化後に広範な抗腫瘍及び抗微生物保護を与える。細胞障害効果に加え、NK細胞は、IFN-γを含むサイトカインの産生による免疫修飾にも寄与する[3,4]。NK細胞は、他のリンパ球と同様、共通のリンパ始原細胞段階を経て分化する、骨髄中のCD34+造血幹細胞（HSC）に由来する。二次リンパ組織では、細胞が順次ステージ1（CD34+CD45RA+CD117-CD94-）pro-NK細胞、続いてステージ2又はpre-NK細胞（CD34+CD45RA+CD117+CD94-）へと発生するヒトNK細胞発生が進められる。ステージ1及びステージ2細胞は、T細胞、樹状細胞及びNK細胞発生能を有することから多能性である。ステージ3細胞（CD34-CD117+CD94-CD16-）は、もはやT細胞及び樹状細胞へと発生することができないことから単分化能（committed）NK細胞前駆細胞である。ステージ4（CD34-CD56brightCD94+CD16-）及びステージ5（CD34-CD56dimCD94+CD16+）は、成熟NK細胞である[5,6]。NK細胞及びILCの分化及び成熟は、転写因子によって厳密に調節される複雑な分子プロセスである。多くの必須因子が、転写因子欠損マウスの生成及びアベイラビリティのためにマウスILC分化の転写制御において同定されている[7]。マウスとは対照的に、ヒトNK及びILC分化における転写因子の役割に関する現在の知識は、極めて限定されている。
【０００４】
T-bet及びEomesodermin（Eomes）は、2つのT-box転写因子である。T-betは、造血細胞においてのみ発現されるTbx21遺伝子によってコードされるタンパク質である。Eomesは、脊椎動物胚発生においても重要な役割を果たし、T-betと相同性を有する。T-betは、IFN-γ産生及び細胞毒性を含むT細胞エフェクター機能に必須の主要制御因子として知られる。さらに、T-bet及びEomesは、マウスNK細胞及びILCの分化、維持及び機能において重要な役割を果たす[8]。T-bet欠損マウス及びEomesflox/floxVav-Cre+マウスは、主に未熟表現型を有するNK細胞の数の減少を示す[9,11]。T-bet及びEomesの両方を欠いたマウスは、完全にNK細胞を発生することができない[11]。これらのノックアウトマウスモデルにより、T-bet及びEomesの両方がNK細胞発生及び末端NK細胞成熟に不可欠であることが示される。さらに、T-bet及びEomesは、成熟NK細胞表現型の維持に必要とされ、これは成熟NK細胞におけるT-bet/Eomesの欠失の誘導後の成熟度マーカーの喪失によって強調される[10]。NK細胞とは別に、ILCの特定のサブセットがそれらの発生についてT-bet及び／又はEomesに依存する。CD127+ILC1及び自然細胞傷害性受容体（NCR）+ILC3は、T-betを発現するが、Eomesを欠く。Eomesflox/floxVav-Cre+マウスは、NK細胞数が減少しているが、ILC1を維持する。対照的に、T-bet欠損マウスは、NK細胞がより少ないが、ILC1を完全に欠いている。T-bet及びEomesの両方を欠いたマウスは、ILC1の完全な欠如を示す。また、NCR+ILC3は、T-bet欠損マウスの腸で発生しない[9〜12]。
【０００５】
NK細胞は、それらの抗腫瘍役割のために、癌免疫療法に有望な作用物質として大いに研究されている。種々のNK細胞ベースの治療戦略の1つは、癌患者へのHSCの養子移入である。もう1つは、HSCを初めにin vitroで成熟NK細胞に分化させ、次いでこれを増加させて移植に十分なNK細胞数を得ることである。癌療法ではNK細胞を用いた種々のアプローチが既に臨床で用いられているが、依然として再発につながる幾つかの大きな制限がある。種々のマウス腫瘍モデルにおける養子移入成熟NK細胞の分析から、細胞毒性及びIFN-γ産生の減少をもたらす移入したNK細胞の枯渇が明らかになった[13]。重要なことには、このNK細胞表現型の枯渇は、転写因子T-BET及びEOMESの下方調節に起因する可能性がある[13]。近年、T-BET及びEOMES発現の低下が白血病患者におけるHSC移植後のNK細胞機能障害にも関与することが研究により証明された。T-BET及びEOMES発現の低下は、HSC移植後早期に既に観察される。NK細胞におけるこれらの転写因子の下方調節は、非再発死亡率の上昇と関連する[14]。ヒトNK細胞の分化に関する胸腺細胞選択関連HMGボックスタンパク質（TOX）の役割は、Yun et al.によって[15]、また特許文献1において研究されている。Vong et al.（2014）は、胸腺細胞選択関連HMGボックスタンパク質ファミリーの別の成員、すなわちTOX2がヒトNK細胞の正常な成熟に必要とされ、T-BET発現に直接関連することを開示している[16]。T-BETを過剰発現するCAR-T細胞は、特許文献2において、またGacerez and Sentmanによって開示されている[17]。
【０００６】
ここで、T-BET又はEOMESのいずれかのレトロウイルス構成的過剰発現構築物を用いてin vitroで臍帯血HSCからのヒトNK細胞成熟を加速する方法を明らかにする。対照形質導入HSCは、成熟機能的NK細胞に分化するために14日間〜21日間の培養期間を必要とするが、T-BET又はEOMES形質導入HSCでは、NK細胞が培養の3日目に既に現れる。これらの早期発生NK細胞は、完全に成熟した表現型を有し、特異的細胞毒性及びIFN-γ産生に関しても高度に機能的である。重要なことには、NK細胞は、増強されたADCC活性も示す。HSCのT-BET又はEOMES形質導入時のADCC活性の増強を伴うこのNK細胞分化及びNK細胞の成熟の加速は、NK細胞ベースの養子細胞療法を最適化する新規のツールをもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2012/046940号
【特許文献２】国際公開第2017/190100号
【発明の概要】
【０００８】
第1の態様では、本発明は、造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させるex vivoでの方法であって、
a）単離HSCを準備する工程と、
b）工程a）の細胞をトロンボポエチン（TPO）、幹細胞因子（SCF）及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）を含有する培地中で培養する工程と、
c）工程b）の細胞に、T-Boxexpressed in T cells（T-BET）若しくはEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子をトランスフェクト及び／又は形質導入する工程と、
d）工程c）から得られる細胞をIL-2又はIL-15、好ましくはIL-15を含むリストから選択される少なくとも1つのサイトカインを含有する培地中で培養する工程と、
を含み、成熟NK細胞を工程d）の開始後3日目から、特に4日目又は5日目から得ることができる、方法を提供する。
【０００９】
本発明の具体的な実施の形態では、上記成熟NK細胞は、少なくともステージ4、特にステージ4及びステージ5 NK細胞である。トランスフェクション又は形質導入の少なくとも5日後からステージ4 NK細胞が存在し、及び／又は得ることができる。トランスフェクション又は形質導入の少なくとも9日後からステージ5 NK細胞が存在し、及び／又は得ることができる。
【００１０】
別の特定の実施の形態では、工程b）の上記培地は、特に約1%〜20%ウシ胎児血清（FCS）を含む完全イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM培地）である。
【００１１】
本発明のまた更なる実施の形態では、上記TPOは、約1 ng/ml〜約100 ng/ml、好ましくは約20 ng/mlの濃度で存在する。
【００１２】
また更なる実施の形態では、上記SCFは、約5 ng/ml〜約500 ng/ml、好ましくは約100 ng/mlの濃度で存在する。
【００１３】
別の実施の形態では、上記FLT3-Lは、約5 ng/ml〜約500ng/ml、好ましくは約100 ng/mlの濃度で存在する。
【００１４】
本発明のまた更なる実施の形態では、工程d）の培地は、FLT3-L、SCF、IL-3又はIL-7を含むリストから選択されるサイトカインを更に含む。
【００１５】
別の特定の実施の形態では、IL-2及び／又はIL-15は、約0.5 ng/ml〜約50 ng/ml、好ましくは約10 ng/mlの濃度で存在する。
【００１６】
更なる実施の形態では、本発明の方法の工程d）は、（不活性化）フィーダー細胞株、特に間質細胞株を用いた、例えばEL08.1D2細胞又はOP9細胞を用いた共培養工程である。
【００１７】
本発明の方法の更なる実施の形態では、工程c）において、細胞に少なくとも1つの転写因子をコードする核酸を含む（レトロウイルス）ベクターを形質導入する。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、T-Box expressedin T cells（T-BET）、Eomesodermin（EOMES）、又はT-BETとEOMESとの組合せを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子がトランスフェクト及び／又は形質導入されていることを特徴とするHSC細胞を提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明による方法を用いて得られる分化NK細胞、より詳細には、NK細胞のCD16発現が非トランスフェクト若しくは非形質導入対照細胞、又は対照トランスフェクト若しくは対照形質導入細胞と比較して増大している分化NK細胞を提供する。
【００２０】
本発明はまた、癌を有する被験体における抗体依存性細胞傷害の誘導に使用される、本明細書に開示される分化NK細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】HSCにおけるT-BET/EOMESの過剰発現がNK細胞始原細胞の強い減少をもたらすことを示す図である。臍帯血由来HSCにおけるT-BET、EOMES又は対照過剰発現ベクターの形質導入後にCD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、NK細胞／ILC3分化培地中にてEL08-ID2間質細胞の存在下で培養した。（A）T-BET及びEOMESの発現を、T-BET及びEOMES過剰発現並びに対照（ctrl）培養物において指定の時点でフローサイトメトリーを用いて決定した。eGFP+CD45+ゲーティング細胞の代表的なヒストグラムを示す（点線＝fluorescence minus one（FMO）対照）。T-BET及びEOMES発現の平均蛍光強度（MFI）を平均±SEM（n=5〜9）として棒グラフで示す。（B）対照及び過剰発現培養物を3日目にフローサイトメトリーによって分析し、HSC（CD34+CD45RA-）、ステージ1（CD34+CD45RA+CD117-）、ステージ2（CD34+CD45RA+CD117+）細胞、及びステージ3（CD34-CD117+CD94-）細胞を含むeGFP+CD45+ゲーティング細胞におけるNK細胞前駆細胞の存在を評価した。代表的なドットプロットを示す。矢印はゲーティング戦略を示す。ゲートの数値はパーセンテージを示す。種々のNK細胞ステージの絶対細胞数を平均±SEM（n=5又は6）として棒グラフに示す。*及び**は、それぞれ0.05未満及び0.01未満のp値を表す。
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図２−１】HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時のヒトNK細胞発生の加速を示す図である。臍帯血由来HSCにおけるT-BET、EOMES又は対照過剰発現ベクターの形質導入後に、CD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、NK細胞／ILC3分化培地中にてEL08-ID2間質細胞の存在下で培養した。培養物を指定の時点でフローサイトメトリーによって分析した。（A）eGFP+CD45+CD11a+ゲーティング細胞の代表的なドットプロットを示す。右上の象限の細胞は、全成熟NK細胞集団（CD56+CD94+）である。数値はパーセンテージを示す。（B）ゲーティングした全NK細胞（eGFP+CD45+CD11a+CD56+CD94+）の代表的なドットプロットを示す。ステージ4（CD56+CD16-）及びステージ5（CD56+CD16+）NK細胞を識別することができる。（C）異なる時点でのステージ4及びステージ5 NK細胞の絶対細胞数を平均±SEM（n=6〜10）として示す。（D）異なる時点での全NK細胞集団（eGFP+CD45+CD11a+CD56+CD94+）に対するステージ5 NK細胞（CD56+CD16+）のパーセンテージを平均±SEM（n=6〜9）として示す。*及び**は、それぞれ0.05未満及び0.01未満のp値を表す。
【図２−２】同上
【図２−３】同上
【図２−４】同上
【図３−１】T-BET及びEOMES過剰発現時のヒトNK細胞発生が間質フィーダー細胞の非存在下でも加速することを示す図である。臍帯血由来HSCにおけるT-BET、EOMES又は対照過剰発現ベクターの形質導入後に、CD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、NK細胞／ILC3分化培地中にてEL08-ID2間質細胞の非存在下で培養した。培養物を指定の時点でフローサイトメトリーによって分析した。（A）eGFP+CD45+CD11a+ゲーティング細胞の代表的なドットプロットを示す。右上の象限の細胞は、全成熟NK細胞集団（CD56+CD94+）である。数値はパーセンテージを示す。（B）ゲーティングした全NK細胞（eGFP+CD45+CD11a+CD56+CD94+）の代表的なドットプロットを示す。ステージ4（CD56+CD16-）及びステージ5（CD56+CD16+）NK細胞を識別することができる。（C）異なる時点でのステージ4及びステージ5 NK細胞の絶対細胞数を平均±SEM（n=2）として示す。
【図３−２】同上
【図４】HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時のNK細胞分化がIL-15に依存したままであることを示す図である。臍帯血由来HSCにおけるT-BET、EOMES又は対照過剰発現ベクターの形質導入後に、CD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、IL-15がサイトカインミックス中に含まれないNK細胞／ILC3分化培地中にてEL08-ID2間質細胞の存在下で培養した。培養物を指定の時点でフローサイトメトリーによって分析した。パーセンテージを各象限に示すeGFP+CD45+CD11a+ゲーティング細胞の代表的なドットプロット。NK細胞（CD56+CD94+）は、IL-15の非存在下では、HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時に発生しない。
【図５−１】HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現がILC3分化を阻害し、T、NKT又はB細胞分化を誘導しないことを示す図である。臍帯血由来HSCにおけるT-BET、EOMES又は対照過剰発現ベクターの形質導入後に、CD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、NK細胞／ILC3分化培地中で培養した。培養物を指定の時点でフローサイトメトリーによって分析した。（A）eGFP+CD45+CD11a-CD94-CD117+ゲーティング細胞の代表的なドットプロットを示す。右上の象限の細胞は、ILC3細胞（NKp44+RORγt+）である。棒グラフは、ILC3の絶対細胞数を平均±SEM（n=6又は7）として表す。*は、0.05未満のp値を表す。（B）T-BET及びEOMES過剰発現培養物及び対照培養物の両方で他のリンパ球集団の存在を14日目に決定した。eGFP+CD45+ゲーティング細胞の代表的なドットプロットをT細胞（CD56-CD3+）、NKT細胞（CD56+CD3+）及びB細胞（CD56-CD19+）について示す。数値は対応するパーセンテージを示す。
【図５−２】同上
【図６−１】HSCにおいてT-BET/EOMES過剰発現時に発生するNK細胞が表現型的かつ形態的に成熟していることを示す図である。HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時のNK細胞の分化を更に特性評価するために、フローサイトメトリーを用いて種々の成熟NK細胞マーカーの発現を決定した。（A）3日目及び7日目のT-BET又はEOMES過剰発現NK細胞による、また14日目の対照形質導入NK細胞による指定のNK細胞マーカーの発現を示す代表的なヒストグラム。（B）指定のNK細胞マーカーのMFI又はパーセンテージを平均±SEM（n=5〜9）として示す。*、**又は***は、それぞれ0.05未満、0.01未満又は0.001未満のp値を表す。（C）NK細胞をT-BET及びEOMES過剰発現培養物では3日目及び7日目、また対照培養物では19日目に選別した。選別した細胞をライトギムザ染色し、顕微鏡下で分析した。矢印は、細胞質中の細胞傷害性顆粒を示す。顆粒NK細胞のパーセンテージを棒グラフで示す。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図７−１】HSCにおけるT-BET/EOMES過剰発現時に生成したNK細胞が機能的に成熟していることを示す図である。（A）21日目のT-BET及びEOMES過剰発現NK細胞及び対照NK細胞を選別し、51Cr標識K562標的細胞と4時間共培養した。異なるエフェクター：標的（E:T）比の特異的溶解のパーセンテージを示す（平均±SEM）（n=6〜9）。（B）21日目のT-BET/EOMES過剰発現及び対照培養物の両方の細胞をK562標的細胞で2時間刺激した後、ゲーティングNK細胞におけるCD107a発現をフローサイトメトリーによって決定した。NK細胞におけるCD107a発現のパーセンテージを棒グラフに平均±SEM（n=9）として示す。（C）21日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物及び対照培養物の細胞をPMA／イオノマイシン、IL-12/IL-18又はIL-12/IL-18/IL-15で24時間刺激した後、ゲーティングNK細胞におけるIFN-γ及びTNF-α産生をフローサイトメトリーによって測定した。IFN-γ及びTNF-α産生NK細胞のパーセンテージを棒グラフに平均±SEM（n=6）として示す。（B及びC）*は0.05未満のp値を表す。
【図７−２】同上
【図８】HSCにおいてEOMES過剰発現時に発生するNK細胞が抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性の増大を示すことを示す図である。（A）21日目の培養物のT-BET及びEOMES過剰発現NK細胞及び対照NK細胞を選別し、リツキシマブ（RTX）の存在下又は非存在下で51Cr標識Raji標的細胞と共培養した。異なるE:T比に応じた特異的溶解のパーセンテージを棒グラフに平均±SEM（n=15）として示す。（B）21日目のT-BET/EOMESの両方の過剰発現培養物及び対照培養物の細胞をK562、又はRTXの存在下若しくは非存在下のRaji標的細胞で2時間刺激した。ゲーティングNK細胞におけるCD107a発現のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定し、棒グラフに平均±SEM（n=6）として示す。（A及びB）*、**又は***は、それぞれ0.05未満、0.01未満又は0.001未満のp値を表す。
【図９】T-BET及びEOMES過剰発現がHSCのトランスクリプトームに影響を及ぼすことを示す図である。0日目のHSC（CD34+Lin-eGFP+）をT-BET及びEOMES過剰発現及び対照培養物から選別し、RNAシークエンシングを行った（n=5）。（A）ボルケーノプロットによりT-BET又はEOMES過剰発現培養物対対照培養物のHSCにおける遺伝子発現を示す。青色及び赤色のドットは、それぞれ有意に下方又は上方調節される転写産物を表す（FDR<0.05）。選択した差次的に発現される転写因子を示す。（B）GSEA分析を、T-BET又はEOMES過剰発現対対照培養物のHSCにおいて差次的に発現される遺伝子に対し、NKdim細胞特異的遺伝子セットにおいて発現される上位500個の遺伝子を用いて行った。NES＝正規化濃縮スコア。
【図１０−１】HSCにおけるID2、TOX及びETS-1過剰発現がヒトNK細胞分化を加速しないことを示す図である。ID2、TOX、ETS-1又は対照ベクターを臍帯血由来HSCに形質導入した。CD34+Lin-eGFP+前駆細胞を選別し、NK細胞／ILC3分化培地中で培養した。培養物を指定の時点でフローサイトメトリーによって分析した。（A）指定の細胞集団の絶対細胞数（平均±SEM）をID2及びTOX過剰発現培養物について示し、対照培養物と比較する。（B）指定の条件についてのNK細胞の絶対細胞数（平均±SEM）。p27は内因性ETS-1のシグナル伝達を阻害する優性阻害アイソフォームであり、p51は完全長アイソフォームである。*は0.05未満のp値を表す。
【図１０−２】同上
【図１１】グラフィカルアブストラクト（Graphical abstract）である。臍帯血由来HSCにヒト転写因子T-BET又はEOMESをコードするcDNAを形質導入し、NK細胞分化培地中でin vitro培養する。HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現は、NK細胞成熟の劇的な加速をもたらし、NK細胞がCD16（FcγRIII）発現及び抗体依存性細胞傷害（ADCC）の増大を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で使用される数量を特定していない単数形（"a","an", and "the"）は、文脈により明確に他に指示されない限り、単数及び複数の両方の指示物を含む。本明細書で使用される「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含まれる（comprised of）」という用語は、「含んでいる、挙げられている（including）」、「含む、挙げられる（includes）」又は「含有している（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンド（open-ended）であり、追加的な、列挙されていないメンバー、要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書で使用される「約」という用語は、パラメーター、量、時間的期間等の測定可能な値を指す場合、具体的な値の及びその値からの変量を包含し、かかる変量が開示される発明を実施するのに適切である限り、±20％以下、好ましくは±10％以下、より好ましくは±5％以下の変量を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値は、その値自体も具体的に、また好ましくは、開示されることも、理解されなければならない。一群のメンバーの1以上又は少なくとも1つのメンバーといった「1以上」又は「少なくとも1つ」という用語が、更なる例示によりそれ自体明確であるが、とりわけこの用語は、例えば、上記メンバーの任意の1つ、又は上記メンバーの任意の3超、4超、5超、6超、若しくは7超等、また上記メンバーの全てに及ぶ上記メンバーの任意の2以上に対する言及を包含する。別段の定めがない限り、技術用語及び科学用語を含む本発明の開示に使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。更なる指示により、用語の定義は、本発明の教示をよりよく理解するために含まれる。
【００２３】
第1の態様では、本発明は、造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる方法であって、
a）単離HSCを準備する工程と、
b）工程a）の細胞をトロンボポエチン（TPO）、幹細胞因子（SCF）及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）を含有する培地中で培養する工程と、
c）工程b）の細胞に、T-Boxexpressed in T cells（T-BET）若しくはEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子をトランスフェクト及び／又は形質導入する工程と、
d）工程c）から得られる細胞をIL-2又はIL-15、好ましくはIL-15を含むリストから選択される少なくとも1つのサイトカインを含有する培地中で培養する工程と、
を含み、成熟NK細胞を工程d）の開始後3日目から得ることができる、方法を提供する。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、造血幹細胞（HSC）を成熟ナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる方法であって、
a）単離HSCを準備する工程と、
b）工程a）の細胞をトロンボポエチン（TPO）、幹細胞因子（SCF）及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）を含有する培地中で培養する工程と、
c）工程b）の細胞に、T-Boxexpressed in T cells（T-BET）若しくはEomesodermin（EOMES）、又はそれらの組合せを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子をトランスフェクト及び／又は形質導入する工程と、
d）工程c）から得られる細胞を、FLT3L、SCF、IL-3及びIL-7を含有し、IL-2又はIL-15、好ましくはIL-15を含むリストから選択される少なくとも1つのサイトカインを更に含む培地中で培養する工程と、
を含み、成熟NK細胞を工程d）の開始後3日目から得ることができる、方法を提供する。
【００２５】
具体的な実施形態では、ヒトHSCを臍帯血から精製し、FLT3L、SCF及びTPOの存在下で2日間前培養して増殖を誘導し、これにより形質導入効率を高める。その後、細胞にTBET及びEOMESのいずれかのコードcDNAを含有するLZRSウイルスのレトロウイルス上清で形質導入する。このウイルス構築物は、形質導入の1日後又は2日後にフローサイトメトリー選別することによる形質導入細胞の選択を可能にするEGFPレポーター遺伝子も含有する。レトロウイルス形質導入は、宿主細胞のDNAへの組込み、及びフローサイトメトリー分析によって測定されるようなコード化タンパク質の構成的過剰発現（対照形質導入細胞と比較して（有意に）高いコード化タンパク質の発現（平均蛍光強度（MFI）として示される）、又はタンパク質発現の基礎レベルを超える場合）をもたらす。陰性対照ベクターは、EGFPのみを含有する。次いで、形質導入細胞をFLT3L、SCF、IL-3、IL-7及びIL-15の存在下にてEL08-ID2間質細胞株で培養する。この条件では、HSCから始まるNK細胞分化が可能である。
【００２６】
本発明の文脈では、「造血幹細胞（HSC）」という用語は、造血と呼ばれるプロセスにおいて血球を生じる幹細胞を意味する。本発明のHSCは、実施例の部に更に説明されるような任意の好適なサンプル、例えば臍帯血、又は代替的には胎盤、胎盤血、胎盤灌流液（placental perfusate）、末梢血、骨髄、胸腺、脾臓若しくは肝臓から得る／単離することができる。HSCについての細胞集団の濃縮は例えば、CD34がHSCマーカーであることが知られていることから、CD34発現に基づく細胞選別によって行うことができる。本明細書で提供される方法に使用される造血細胞は、単一の個体、例えば単一の胎盤、又は複数の個体から得ることができ、例えばプールすることができる。造血細胞が複数の個体から得られ／単離され、プールされる場合、造血細胞は、同じ組織供給源から得ることができる。このため、様々な実施形態では、プールした造血細胞は、全て胎盤、例えば胎盤灌流液由来、全て胎盤血由来、全て臍帯血由来、全て末梢血由来等である。
【００２７】
本発明の文脈では、「分化する」という用語は、細胞が或る細胞型から別の細胞型へと変化するプロセスを意味する。本発明の方法を用いることで、かかる分化プロセスにおいてHSCを成熟ナチュラルキラー細胞へと変化させることができる。具体的には、本方法によるNK細胞の作製は、造血幹細胞の集団を増加させることを含む。細胞の増加の際に、造血細胞集団内の複数の造血幹細胞がNK細胞に分化する。
【００２８】
「ナチュラルキラー細胞」又は「NK細胞」は、自然免疫系に不可欠な細胞傷害性リンパ球の一種である。ヒトの身体では、NK細胞は、例えばウイルス感染細胞への迅速な応答をもたらし、腫瘍形成に応答する。in vitroでのNK細胞の分化は、転写因子によって調節される複雑なプロセスであり、多くの場合、非常に時間のかかるプロセスでもある。加えて、in vitro分化NK細胞のCD16発現は比較的低く、低い抗体依存性細胞傷害（ADCC）能をもたらす。本発明の方法は、成熟NK細胞を従来技術で既知の分化方法と比較してはるかに迅速に得ることができる（例えば、約3日間〜7日間対14日間〜21日間の培養後、特に3日間、4日間、5日間、6日間若しくは7日間の培養後、又は代替的には、例えば本明細書に記載される工程（c）のような細胞のトランスフェクション若しくは形質導入の5日後、6日後、7日後、8日後若しくは9日後）という点で、これらの問題に対する解決策を与える。加えて、このようにして得られるNK細胞は、約2倍〜10倍、特に約2倍〜5倍、より特には約2.5倍〜4.5倍高いCD16発現（対照細胞と比較して）を示し、ADCC活性の増大をもたらす。このため、このようにして得られるNK細胞は、抗癌療法又はNK細胞ベースの養子細胞療法等の人間医学に極めて適している。
【００２９】
したがって、本発明はCD16発現が非トランスフェクト若しくは非形質導入対照細胞、又は対照トランスフェクト若しくは対照形質導入細胞と比較して増大している、分化NK細胞も提供する。本発明は、癌を有する被験体における抗体依存性細胞傷害の誘導に使用される、本明細書で規定の分化NK細胞も提供する。
【００３０】
本発明の文脈では、「トロンボポエチン（thrombopoietin）（TPO）」は、巨核球の成長及び発生因子としても知られるタンパク質である。ヒトの身体では、TPOは肝臓及び腎臓によって産生され、血小板の産生を調節する。本発明の具体的な実施形態では、上記TPOは、培地（例えば工程bに使用される培地）中に約1 ng/ml〜約100 ng/ml、より具体的には約5 ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約10 ng/ml〜約30 ng/ml、特に約15 ng/ml、約20 ng/ml又は約25 ng/mlの濃度で存在する。
【００３１】
本発明の文脈では、KITリガンドとしても知られる「幹細胞因子（SCF）」は、造血において重要な役割を果たすサイトカインである。本文脈では、SCFは、HSCの自己再生及び維持に寄与する。本発明の具体的な実施形態では、上記SCFは、約5 ng/ml〜約500ng/ml、より具体的には約50 ng/ml〜約200ng/ml、より特には約90 ng/ml〜約110 ng/ml、特に約90 ng/ml、約100 ng/ml又は約110 ng/mlの濃度で培地（例えば工程bに使用される培地）中に存在する。SCFは、培養工程d）に使用される培地中で付加的なインターロイキンとして使用してもよく、この場合、SCFは約1 ng/ml〜約100ng/ml、より具体的には約5 ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約10 ng/ml〜約30 ng/ml、特に約15 ng/ml、約20 ng/ml又は約25 ng/mlの濃度で存在し得る。
【００３２】
本発明の文脈では、FMS様チロシンキナーゼ3リガンドとしても知られるFLT3リガンド（FLT-3-L）は、造血始原細胞を活性化することによって免疫細胞の数を増加させるサイトカイン及び成長因子として機能する内因性小分子である。本発明の具体的な実施形態では、上記FLT3-Lは、約5 ng/ml〜約500ng/ml、より具体的には約50 ng/ml〜約200ng/ml、より特には約90 ng/ml〜約110 ng/ml、特に約90 ng/ml、約100 ng/ml又は約110 ng/mlの濃度で培地（例えば工程bに使用される培地）中に存在する。FLT3-Lは、培養工程d）に使用される培地中で付加的なインターロイキンとして使用してもよく、この場合、FLT3-Lは約1 ng/ml〜約50ng/ml、より具体的には約5 ng/ml〜約25 ng/ml、より特には約5 ng/ml〜約15 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15ng/mlの濃度で存在し得る。
【００３３】
本発明の文脈では、「トランスフェクトする又はトランスフェクション」という用語は、ベクター（DNA又はRNA）又はmRNA分子等の裸の又は精製した核酸を真核細胞に意図的に導入するプロセスを意味する。「形質導入する又は形質導入」という用語は、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスベクターを用いることによるウイルス媒介遺伝子導入を用いたトランスフェクションプロセスの一種を意味する。本発明の文脈では、以下の実施例に更に詳述されるようなエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はRetroNectin媒介形質導入等のHSC細胞のトランスフェクション／形質導入の任意の好適な方法を用いることができる。
【００３４】
本発明の鍵は、成熟NK細胞への分化プロセスの時間を顕著に短縮し、更にはこのようにして得られるNK細胞におけるCD16発現を増大させ、ADCCの増大をもたらす、HSCにおけるT-BET及び／又はEomesodermin（EOMES）転写因子のトランスフェクション又は形質導入である。
【００３５】
T-BET（又は「T-Box expressed in T cells」）は、発生プロセスの調節に関与し、より具体的にはナイーブTリンパ球の発生を調節する転写因子である。実施例の部に詳述されるように、驚くべきことに、HSCにおけるT-BETの過剰発現（トランスフェクション／形質導入後）は、培養工程d）の3日後に既に成熟ステージ4及びステージ5NK細胞の絶対数の顕著な増加をもたらすことが見出された。本明細書に含まれるヒトT-BETタンパク質及び核酸配列は、NCBIアクセッション番号NM_013351.1（引用することにより本明細書の一部をなす）（核酸配列については配列番号1）によって特定される、対応するT-BET配列に実質的に同一の、すなわち少なくとも80%、85%、87%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の任意のホモログ又は人工配列である。本明細書で使用されるT-BETは、上述の特定のT-BETタンパク質の自然変異体も包含する。かかる変異体は、特定のT-BETタンパク質と少なくとも同じ必須の生物学的及び免疫学的特性を有する。
【００３６】
EOMES（又はeomesodermin）は、脊椎動物の発生プロセスの調節に関与する転写因子であり、より具体的には神経幹細胞及び他の関連細胞の調節を制御する。実施例の部に詳述されるように、驚くべきことに、EOMESの過剰発現（トランスフェクション／形質導入後）は、培養工程d）の3日後に既に成熟ステージ4及びステージ5NK細胞の絶対数の顕著な増加をもたらすことが見出された。加えて、このようにして得られるNK細胞は、ADCC活性の増大を示した。
【００３７】
上記の文脈では、本発明のNK細胞、より具体的にはEOMESを過剰発現するNK細胞は、治療用抗体と組み合わせた使用にとって特に興味深い。このため、NK細胞（養子）療法は、腫瘍抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体の注射と組み合わせることができる。かかる抗体は、癌免疫療法に使用されることが多い。NK細胞及び腫瘍抗原特異抗体療法を組み合わせることによって、腫瘍細胞がNK細胞によって効率的に標的化され、より良好な結果がもたらされる。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、抗体、特にモノクローナル抗体と組み合わせた、CD16の高発現を特徴とする本発明の成熟NK細胞を提供する。ex vivo分化NK細胞のCD16の発現の増強は、NK細胞の細胞傷害活性と、例えば悪性細胞に対する治療用抗体とを組み合わせる治療状況で利用され得る。
【００３９】
本明細書に含まれるヒトEOMESタンパク質及び核酸配列は、NCBIアクセッション番号NM_001278182.1（引用することにより本明細書の一部をなす）（核酸配列については配列番号2）によって特定される、対応するEOMES配列に実質的に同一の、すなわち少なくとも80%、85%、87%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一の任意のホモログ又は人工配列である。本明細書で使用されるEOMESは、上述の特定のEOMESタンパク質の自然変異体も包含する。かかる変異体は、特定のEOMESタンパク質と少なくとも同じ必須の生物学的及び免疫学的特性を有する。
【００４０】
本発明は、T-BET又はEOMESから選択される単一の転写因子の使用を開示するだけでなく、両方の転写因子の併用も包含する。T-BET及びEOMESの遺伝子標的が（部分的に）異なるため、両方の転写因子を組み合わせることは、相乗効果をもたらし得ることから有利であり得る。
【００４１】
本発明の転写因子は、任意の好適な方法を用いて本明細書で提供される細胞にトランスフェクト／形質導入することができる。トランスフェクション又は形質導入に用いられる方法は概して、当業者に既知であり、本発明を限定しない。具体的な実施形態では、上記細胞に、上記少なくとも1つの転写因子をコードする核酸を含むウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを形質導入する。代替的には、上記臍帯血HSCに、これらの転写因子をコードするmRNAをトランスフェクトすることができる。これにより一時的なTBET及びEOMESタンパク質転写がもたらされ、これは、mRNAの比較的短い半減期を考えると、短時間で失われる。
【００４２】
別のアプローチは、例えばレトロウイルスベクター（例えばLZRS）において対照の転写因子と突然変異エストロゲン受容体（ERT2）との融合タンパク質を生成する構築物を使用することによって、誘導レトロウイルスベクターを生成することである。融合タンパク質には、2A配列、及び形質導入細胞と非形質導入細胞との区別を可能にする高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）レポーター遺伝子が続く。レトロウイルス形質導入後に、CD34+Lineage-（CD3/14/19/56）eGFP+臍帯血HSCを選別し、分化培地に入れて、NK細胞発生に対する形質導入転写因子の影響を研究することができる。形質導入転写因子／ERT2融合タンパク質は、構成的に発現されるが、熱ショックタンパク質に結合することで細胞質性、ひいては不活性なままである。タモキシフェンの添加により熱ショックタンパク質が解離し、転写因子が核に移行することで、転写因子が活性化する。転写因子は、培養の初めから活性化することができ、この活性化は、その後、任意の時点でタモキシフェンを培養培地から除去することによって停止させることができる。
【００４３】
転写／形質導入工程後に、それにより得られる細胞を、少なくとも1つのサイトカインを含有する培地中で培養する。具体的な実施形態では、上記サイトカインは、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン（interleukin）-7（IL-7）、インターロイキン-2（IL-2）及び／又はインターロイキン-15（IL-15）である。好ましい実施形態では、少なくとも1つのサイトカインは、IL-15である。
【００４４】
本発明の文脈では、「インターロイキン-3」（IL-3）は、骨髄系前駆細胞へのHSCの分化を刺激するインターロイキンである。IL-7に加えて、IL-3は、リンパ球前駆細胞へのHSCの分化を刺激する。本発明の具体的な実施形態では、上記IL-3は、培地（例えば工程dの培地）中に約5 ng/ml〜約500ng/ml、より具体的には約0.5 ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約1 ng/ml〜約20 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15ng/ml、代替的には約0.5 ng/ml〜約25 ng/ml、より具体的には約1 ng/ml〜約15 ng/ml、より特には約1 ng/ml〜約10 ng/ml、特に約10 ng/ml、約5 ng/ml又は約15ng/mlの濃度で存在する。
【００４５】
本発明の文脈では、「インターロイキン-7」（IL-7）は、リンパ前駆細胞へのHSCの分化を刺激するインターロイキンである。さらに、IL-7は、成熟NK細胞の生存及び増加の調節において重要な役割を果たす。本発明の具体的な実施形態では、上記IL-7は、培地（例えば工程dの培地）中に約5 ng/ml〜約500 ng/ml、より具体的には約0.5ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約1 ng/ml〜約20 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15 ng/ml、代替的には約1 ng/ml〜約100 ng/ml、より具体的には約5 ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約10 ng/ml〜約30 ng/ml、特に約15 ng/ml、約20 ng/ml又は約25 ng/mlの濃度で存在する。
【００４６】
本発明の文脈では、「IL-2」又は「インターロイキン-2」は、微生物感染に対する身体の自然な応答の一部を形成する上で免疫に関与する白血球の活性を調節する、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種である。本発明の具体的な実施形態では、上記IL-2は、培地（例えば工程dの培地）中に約5 ng/ml〜約500 ng/ml、より具体的には約0.5ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約1 ng/ml〜約20 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15 ng/mlの濃度で存在する。
【００４７】
本発明の文脈では、「IL-15」又は「インターロイキン-15」は、IL-2と構造的に類似するサイトカインの一種である。IL-15は、ウイルスの感染後に単核食細胞によって分泌され、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。本発明の具体的な実施形態では、上記IL-15は、培地（例えば工程dの培地）中に約5 ng/ml〜約500 ng/ml、より具体的には約0.5ng/ml〜約50 ng/ml、より特には約1 ng/ml〜約20 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15 ng/ml、代替的には約1 ng/ml〜約50 ng/ml、より具体的には約5 ng/ml〜約25 ng/ml、より特には約5 ng/ml〜約15 ng/ml、特に約5 ng/ml、約10 ng/ml又は約15ng/mlの濃度で存在する。
【００４８】
本発明の文脈では、本発明のNK細胞のステージ（例えば成熟度）は、一般に知られている方法による、特にフローサイトメトリー分析を用いた、NK細胞の細胞表面上に存在する表現型NK細胞マーカー（CD56、CD94、CD16）の評価によって決定される。ステージ4又はステージ5 NK細胞が培養物中に存在する瞬間から、これらの細胞は、成熟NK細胞集団とみなされる（例えば、培養物中の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%又はそれ以上の細胞が、それぞれの表現型NK細胞マーカーを有する）。ステージ4及びステージ5 NK細胞は、それぞれCD56+CD94+CD16-及びCD56+CD94+CD16+表現型によって決定される。
【００４９】
好ましい実施形態では、「成熟」NK細胞は、少なくともステージ4、特にステージ4及びステージ5、より特にはステージ5である。
【００５０】
培養に用いられる方法及び培地（例えば工程b又はdの方法及び培地）は、単離HSCの培養に好適な任意の方法及び培地であり得る。特に、上記培地は、IMDM培地（イスコフ改変ダルベッコ培地）である。任意に、上記培地は、約1%〜20%（例えば約5%、10%、15%）の血清、特にウシ胎児血清又はヒトAB血清を含む。
【００５１】
工程d）の培地は、FLT3-L、SCF、IL-3、IL-7及びIL-15からなるリストから選択されるサイトカインを更に含有し得る。
【００５２】
さらに、培養工程d）は、任意の好適な共培養細胞株又はフィーダー細胞株、例えば不活性化間質細胞株、より具体的にはEL08.1D2細胞（すなわちマウス胎児肝臓間質細胞株）又はOP9細胞（すなわちマウス骨髄間質細胞株）を用いた共培養工程であり得る。EL08.1D2フィーダー細胞上でHSCから分化したNK細胞が、OP9フィーダー細胞上で分化したNK細胞と比較してより高レベルのKIR及びCD16を発現し、NK細胞成熟の増大を示すことが見出された。
【００５３】
更なる態様では、本発明は、T-Box expressed in T cells（T-BET）及びEomesodermin（EOMES）、又はその組合せ、特にEOMESを含むリストから選択される少なくとも1つの転写因子がトランスフェクト及び／又は形質導入されている、又はトランスフェクト及び／又は形質導入されたことを特徴とするHSC細胞又はNK細胞も提供する。T-BET及び／又はEOMESをコードするcDNAを含有するレトロウイルスベクター（例えばLZRSウイルス）が形質導入されたHSC又はNK細胞が更に含まれる。具体的な実施形態では、本発明は、EOMESがトランスフェクト及び／又は形質導入されたHSC、例えばEOMESをコードするcDNAを含有するレトロウイルスベクター（例えばLZRSウイルス）が形質導入されたHSCを提供する。
【００５４】
最後に、本発明は、本発明の方法を用いて得られた分化NK細胞を提供する。
【００５５】
本発明は、医療用途、例えば免疫療法及び／又は癌治療における上記NK細胞の方法及び使用も含む。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例を、開示される主題による方法、組成物、及び結果を説明するために以下に示す。これらの実施例は、本明細書に開示される主題の全ての態様を含むものとは解釈されずに、代表的な方法、組成物、及び結果を説明するものと解釈される。
【００５７】
1.  材料及び方法
臍帯血からのCD34+HSCの単離
臍帯血（UCB）は、ゲント大学病院（Ghent，Belgium）の臍帯血バンクから入手した。本研究における臍帯血の使用は、医学健康科学部（Faculty of Medicine and Health Sciences）の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に準拠してインフォームドコンセントが得られた。単核細胞をLymphoprep密度勾配遠心分離によって得た。続いて、CD34+HSCを、磁気活性化細胞選別（MACS；Direct CD34+ HSC MicroBeadKit，Miltenyi Biotech，Leiden，The Netherlands）を用い、製造業者の指針に従って単核細胞から濃縮した。CD34+HSCの純度は、フィコエリトリン（phycoerythrin）（PE）とコンジュゲートした抗CD34抗体で細胞を標識することによって決定した。90%を超える純度がLSRII Flow Cytometer（BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.A）によって確認された。新たに単離されたCD34+HSCをウシ胎児血清（FCS）＋10%DMSO中で凍結し、使用するまで液体窒素中で保管した。
【００５８】
過剰発現ベクターのレトロウイルス産生
過剰発現構築物の分子クローニング
ヒトT-BET及びEOMES cDNAは、SourceBioScience（Nottingham，UK）から購入した（T-BET cDNA：IRATp970D0558D配列は、NM_013351.1と同一である；EOMES cDNA：IRAKp961A1269Q配列は、NM_001278182.1と同一である）。BamHI及びXho-Iの制限部位を、Phusion（商標） High Fidelity PCR（New England Biolabs Inc；Ipswich，MA，U.S.A）を用いたPCRによって、自己設計プライマー：
Fw-Tbet：AAGTTGGATCCACCATGGGCATCGTGGAGCCGGGTTG（配列番号3）、
Rev-Tbet：AAAGTTCTCGAGTCAGTTGGGAAAATAGTTATAAAACTGTCCTTCAGCTTCC（配列番号4）、
Fw-Eomes：AAAGTTGGATCCACCATGCAGTTAGGGGAGCAGCTC（配列番号5）、
Rev-Eomes：AAAGTTCTCGAGTTAGGGAGTTGTGTAAAAAGCATAATACCC（配列番号6）を用いてcDNAに付加した。
【００５９】
ヒトID2及びTOX cDNAは、OriGeneTechnologies（Rockville，MD，U.S.A）から購入した（ID2 cDNA：SC118791、NM_002166.4と同一の配列；TOX cDNA：SC114879、NM_014729.2と同一の配列）。BamHI、EcoRI及びNgoMIVの制限部位を上記のようにcDNAに付加した。自己設計プライマー：
Fw-ToxEcoRI：ATCTCAGAATTCAGTGAAATGGACGTAAGATTTTATCC（配列番号7）
Rev-ToxNgoMIV：AAAGTTGCCGGCTCAAGTAAGGTACAGTGCTTTGTCC（配列番号8）
Fw-Id2BamHI：CTATCAGGATCCGTCAGCATGAAAGCCTTCAGTC（配列番号9）
Rev-Id2NgoMIV：AAAGTTGCCGGCTCAGCCACACAGTGCTTTGC（配列番号10）
【００６０】
ヒトETS-1 p51又はp27をコードするcDNAを、それぞれpLEXhEts1p51HAtag及びpCDNA3hEts1p27ベクターからサブクローニングした（L. A. Garrett-Sinha（ニューヨーク州立大学、Buffalo，NY，U.S.A.）の厚意により提供及び[21]）。
【００６１】
種々の転写因子のcDNAをLZRS-IRES-eGFPレトロウイルスベクターにライゲートした（元のLZRSプラスミド：TM Kinsella, GP Nolan (1996) [18]）。空のLZRS-IRES-eGFPベクターを対照として使用した。ウイルスベクターをシークエンシングし（GATC Biotech，Ebersberg，Germany）、構築物の正確なDNA配列を確認した。
【００６２】
レトロウイルス産生
対照、T-BET、EOMES、TOX、ID2及びETS-1レトロウイルス構築物を、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A）を用いてPhoenix A細胞にトランスフェクトし、10%FCS、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン（Life technologies，Carlsbad，CA，U.S.A）及び2 μg/mlピューロマイシンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中で維持した。レトロウイルスをトランスフェクション後2日目、6日目及び14日目に採取し、使用するまで-80℃で保管した。
【００６３】
in vitroでのNK細胞分化培地
EL08.1D2細胞の培養
マウス胎生肝細胞株EL08.1D2を0.1%ゼラチンコーティングプレート上、33℃で100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2 mMグルタミン及び10 μM β−メルカプトエタノールを添加した50%Myelocult M5300培地（Stem Cell Technologies，Grenoble，France）、35%α-MEM、15%FCS中で維持した。EL08.1D2細胞を、10 μg/mlマイトマイシンCを2時間〜3時間にわたって培養培地に添加することによって不活性化した。これにより、これらの細胞の細胞増殖を完全に阻止した。その後、トリプシン−EDTAを用いて採取する前に細胞を十分にすすいだ。培養の14日目及び21日目にHSCを添加するか又は分化NK細胞／ILC3を移動する少なくとも24時間前に、細胞を0.1%ゼラチンコーティング組織培養処理24ウェルプレート上に50000細胞／ウェルの密度でプレーティングした。
【００６４】
HSCのレトロウイルス形質導入及びNK細胞分化
単離臍帯血由来CD34+HSCを、-4日目〜-2日目に10% FCS（全てLifeTechnologiesから）を含有し、トロンボポエチン（TPO）（20 ng/ml）、幹細胞因子（SCF）（100 ng/ml）（全てPeprotechから）及びFMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）（100 ng/ml、R&D Systems）を添加した完全IMDM中で培養した。続いて、これらの細胞を採取し、RetroNectin（Takara Bio，Saint-Germain-en-Laye，France）コーティングプレートに移し、ウイルス上清を添加した。ウイルス添加後に付加的なサイトカインを添加し、濃度を一定に保った。プレートを950 g及び32℃で90分間遠心分離した。0日目に、lineage-（CD3/CD14/CD19/CD56）CD34+eGFP+HSCを、FACS ARIA IIIセルソーター（BD Biosciences，San Jose，CA，U.S.A.）を用いて選別した。選別したHSCを100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2 mMグルタミン、10 mMピルビン酸ナトリウム（全てLife Technologiesから）、20%熱不活性化ヒトAB血清（Merck，Darmstadt，Germany）、24μM β−メルカプトエタノール、20 μg/mLアスコルビン酸及び50 ng/mL亜セレン酸ナトリウム（全てSigma-Aldrichから）を添加したダルベッコ変法イーグル培地＋ハムF-12培地（比率2:1）中でマイトマイシン処理EL08.1D2細胞と共培養した。以下のサイトカインを添加した：IL-3（5 ng/mL、第1週のみ）、IL-7（20 ng/mL）、IL-15（10 ng/mL）（全てR&D Systemsから）、SCF（20 ng/mL）及びFlt3-L（10 ng/mL）。代替的には、T-BET及びEOMES形質導入時のNK細胞分化におけるIL-15の必要性を試験するために、IL-15をサイトカインミックス中に含めなかった。7日目にサイトカインを含む同量の新鮮培地の添加によって培養培地をリフレッシュした。14日目に非接着性細胞を採取し、新たなマイトマイシン処理EL08.1D2フィーダー細胞に移した。
【００６５】
フローサイトメトリー
NK細胞分化共培養物を、フローサイトメトリー（LSRIIフローサイトメーター、BD Biosciences）を用いて異なる時点で検査した。データをFACSDivaバージョン6.1.2ソフトウェア（BD Biosciences）及び／又はFlowJo_V10（Ashland，OR，U.S.A）によって分析した。
【００６６】
機能アッセイ
IFN-γ及びTNF-αの産生
フローサイトメトリーによる細胞内IFN-γ及びTNF-α検出のために、21日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物又は21日目の対照形質導入細胞からの105個の細胞を、10 ng/ml IL-15（Miltenyi Biotec，Leiden，The Netherlands）を用いて又は用いずに、50 ng/ml酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）及び1 μg/mlイオノマイシン（どちらもSigmaAldrich，Sant Louis，MO，U.S.Aから）、又は10 ng/ml IL-12（PeproTech，London，U.K.）及び10ng/ml IL-18（R&D Systems，MN，U.S.A.）で24時間刺激した。最後の4時間にブレフェルジンA（BD GolgiPlug，1/1000，BD Biosciences）を添加した。その後、NK細胞マーカー表面染色を行い、続いてCytofix/Cytopermキット（BD Biosciences）及びIFN-γ/TNF-α染色を用いて固定及び透過処理した。細胞内IFN-γ又はTNF-αの存在を、ゲーティングしたNK細胞上でフローサイトメトリーによって分析した。
【００６７】
細胞毒性アッセイ
細胞特異的死滅を決定するために、51クロム放出アッセイを行った。したがって、106個のK562標的細胞を100 μCi Na251CrO4（Perkin Elmer，Waltham，MA，U.S.A）によって37℃で1.5時間標識した。eGFP+CD45+CD11a+CD56+CD94+NK細胞を21日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物又は対照形質導入培養物から選別し、V字底96ウェルプレート内の103個／ウェルの51Cr標識K562細胞に段階希釈で添加した。エフェクター細胞を標的細胞に三連で添加した。4時間後に上清を採取し、発光カウンター（Wallac Microbeta Trilux，Perkin Elmer）を用いて放射能を測定した。特異的溶解のパーセンテージを、式：［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×100を用いて算出した。
【００６８】
CD20発現ヒトバーキットリンパ腫細胞株であるRajiに対するADCCを、上記のような51クロム放出アッセイを用いて三連で測定した。標的細胞を、0 μg/ml又は10 μg/mlのいずれかのリツキシマブ（抗CD20抗体）（Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland、ゲント大学病院薬剤部（Belgium）の厚意により提供）を含有する培地中でエフェクター細胞に1:1のエフェクター：標的比で添加し、4時間インキュベートした。特異的溶解を、上記のような式を用いて算出した。
【００６９】
CD107a脱顆粒アッセイ
脱顆粒の尺度である細胞膜上でのCD107a発現の分析のために、21日目のT-BET又はEOMES過剰発現培養物及び対照形質導入細胞からの105個の細胞を、105個のK562又はRaji標的細胞に0 μg/ml又は10 μg/mlのリツキシマブと共に添加し、2時間共培養した。その後、細胞を採取し、NK細胞表面マーカー及びCD107aについて染色した。ゲーティングしたNK細胞におけるCD107a脱顆粒を、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【００７０】
細胞遠心分離（Cytospins）
細胞形態の微視的評価のために、eGFP+CD45+CD11a+CD56+CD94+NK細胞を3日目若しくは7日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物、又は19日目の対照形質導入培養物から選別した。細胞遠心分離を行い（Shandon Cytospin（商標） 4，Thermo Scientific，Cheshire，UK）、ライトギムザ染色し、微視的評価した。細胞傷害性顆粒を含有する細胞のパーセンテージを手動で計数した。
【００７１】
ライブラリー調製及びRNAシークエンシング
RNA抽出（RNeasy micro kit，Qiagen，Hilden，Germany）後に、全抽出RNAの濃度及び品質を、それぞれ「Quant-it ribogreen RNAアッセイ」（Life Technologies，Grand Island，NY，U.S.A）及びRNA 6000ナノチップ（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，U.S.A）を用いて確認した。続いて、70 ngのRNAを使用して、Illuminaシークエンシングライブラリー調製を、QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kits（Lexogen，Vienna，Austria）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。ライブラリーをIlluminaのプロトコル「Sequencing Library qPCRQuantification protocol guide」、2011年2月バージョンに従い、qPCRによって定量化した。High sensitivity DNAチップ（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，U.S.A.）を用いてライブラリーのサイズ分布及び品質を制御した。75 bpのシングルリードを生成するハイスループットIllumina NextSeq500フローセルでシークエンシングを行った。1サンプル当たり平均で5.3×106±1.7×105個のリードが生成された。初めに、cutadaptバージョン1.11を用いてこれらのリードをトリミングし、「QuantSEQ FWD」アダプター配列を除去した。トリミングしたリードを、STARバージョン2.5.3aを用いてホモ・サピエンス（Homo sapiens）GRCh38.90参照ゲノムに対してマッピングした。RSEMソフトウェアバージョン1.2.31を用いて、カウントテーブルを作成した。
【００７２】
異なる処理群からのサンプルが共にクラスター化されているかを検証し、外れ値サンプルを検出するために、rlog変換カウントに対する主成分分析（PCA）を、R統計計算ソフトウェアを用いて行った。サンプル間の外れ値は検出されなかった。edgeRを用いて差次的遺伝子発現分析を行い、T-BET又はEOMES過剰発現時のHSCを対照HSCと比較した。差次的発現遺伝子をedgeR正確検定によって試験した。FDRが0.05未満の遺伝子を有意に差次的とみなした。
【００７３】
GSEAを、Broad InstituteのGSEAソフトウェアツールv2.2.2を用いて行った[19,20]。「GSEAPreranked」モジュールを、標準パラメーター及び1000順列を用いて実行した。
【００７４】
2.  結果
T-BET及びEOMES過剰発現時のヒトNK細胞発生の加速
ヒトNK細胞発生における転写因子T-BET及びEOMESの調節的役割を調査するために、T-BET及びEOMESの両方の過剰発現構築物を作製し、T-BET又はEOMESのヒトcDNAをLZRS-IRES-eGFPレトロウイルスベクターに別個にクローニングした。これらの過剰発現構築物を、-2日目に空の対照ベクターと並行してヒト臍帯血由来CD34+HSCに形質導入した。0日目に、形質導入HSCをlineage-（CD3/CD14/CD19/CD56）CD34+eGFP+細胞として選別し、これを続いてNK/ILC3培地中で分化させた。0日目から、eGFP+細胞におけるT-BET及びEOMESの過剰発現を一定の時点にてフローサイトメトリーによってタンパク質レベルで確認し、過剰発現が全培養期間を通して維持されることが示された（図1a）。3日目には、HSC、ステージ1及びステージ2 NK細胞始原細胞は、T-BET及びEOMES過剰発現培養物中に殆ど残っていなかったが、これらの集団は、対照形質導入培養物中に依然として明らかに存在していた。また、対照形質導入細胞と比較して少ないステージ3細胞がT-BET及びEOMES過剰発現で見られた（図1b）。際立って対照的に、ステージ4及びステージ5 NK細胞を含む成熟CD56+CD94+NK細胞が、T-BET及びEOMES過剰発現培養の3日目に既に存在していたが、対照形質導入細胞中では、NK細胞は14日目に初めて検出可能となった（図2a）。7日目に、成熟ステージ5 NK細胞であるCD56+CD94+CD16+NK細胞がT-BET及びEOMES過剰発現培養物中に存在していた。対照培養物中では、ステージ5 NK細胞は、21日目に初めて現れた（図2b及び図2c）。このため、T-BET及びEOMES過剰発現時には、ステージ4及びステージ5 NK細胞のパーセンテージ及び絶対数の両方が3日目、7日目及び14日目に有意に増加した（図2c及び図2d）。T-BET及びEOMES過剰発現により、対照形質導入NK細胞の11.9±4.9%と比較して、それぞれ全NK細胞の21.5±4.3%及び35.2±9.7%がCD16を培養の21日目に発現した。また、培養の21日目に、CD16発現強度は、対照NK細胞（MFI 3984±1971）と比較してEOMES過剰発現NK細胞において有意に高かった（平均蛍光強度（MFI）6266±2709）。T-BETを形質導入したNK細胞のCD16発現強度（MFI4066±1457）は、対照形質導入NK細胞とは有意に異ならなかった。
【００７５】
現在、NK細胞免疫療法に使用されるin vitro生成NK細胞は、通常は間質フィーダー細胞の非存在下で培養される。HSCにおけるT-BET又はEOMES過剰発現時のNK細胞分化の加速が無フィーダー系でも可能であるかを試験するために、形質導入HSCをNK細胞／ILC3分化培地においてEL08.1D2フィーダー細胞の非存在下で培養した。結果から、間質フィーダー細胞を含むNK細胞培養物と同様に、ステージ4 NK細胞がT-BET及びEOMESの両方の過剰発現培養物で培養の3日目から既に存在していたが、対照培養物中ではNK細胞が14日目に初めて検出可能であったことが示される（図3a及び図3c）。さらに、両方の過剰発現培養の7日目に成熟ステージ5 NK細胞が存在していたが、これらの成熟NK細胞は、対照形質導入細胞では14日目に初めて現れた（図3b及び図3c）。成熟ステージ4及びステージ5 NK細胞の絶対細胞数は、間質フィーダー細胞を含むNK細胞培養物と同様に、T-BET及びEOMES過剰発現時では3日目、7日目及び14日目に増加した（図3c）。まとめると、これらのデータから、フィーダー層の存在がHSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時のNK細胞成熟に影響を与えないことが示される。
【００７６】
HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現がNK細胞分化の極度の加速をもたらすことから、T-BET又はEOMES過剰発現が培養培地中のIL-15の必要性を覆す可能性があると推論した。IL-15は、NK細胞前駆細胞におけるIL-2Rβシグナル伝達を介したNK細胞発生及び分化に重要なサイトカインである。サイトカインミックス中にIL-15を含まない培養の結果から、対照形質導入HSCのようにT-BET又はEOMES形質導入HSCも3日目にNK細胞へと発生することができないことが示された。培養期間の14日目であっても、NK細胞は、T-BET又はEOMES過剰発現時にも、対照形質導入細胞でも発生しなかった（図4）。これは、HSCにおけるT-BET又はEOMES過剰発現がNK細胞分化中のIL-15の必要性を覆さないことを意味する。さらに、HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現により、IL2Rβ mRNAは、0日目にEOMES形質導入HSCにおいて対照形質導入HSCと比較して上方調節される（図9a）。累積的には、T-BET又はEOMES過剰発現時に初期前駆細胞がHSCからのNK細胞分化についてIL-15に依存したままであることが示される。
【００７７】
NK細胞の分化の加速及び増大とは対照的に、T-BET及びEOMES過剰発現時に対照と比較してはるかに少ないILC3が発生し（図5a）、ILC3発生がT-BET及びEOMES過剰発現によって強く阻害されることが示唆される。さらに、B細胞、T細胞又はNKT細胞は、対照又はT-BET及びEOMES過剰発現培養物において発生しなかった（図5b）。まとめると、T-BET又はEOMES形質導入HSCの分化は、これにより完全にNK細胞発生に偏り、ステージ4及びステージ5 NK細胞への分化は、劇的に加速する。
【００７８】
T-BET及びEOMES過剰発現時の早期発生NK細胞は、成熟NK細胞表現型を発現する
HSCのT-BET及びEOMES形質導入時の早期発生NK細胞を更に特性評価するために、それらの表現型を、成熟NK細胞マーカーのパネルを用いてフローサイトメトリーによって分析した。分化NK細胞が活性化NK細胞受容体を徐々に発現することから、NKG2D及びNKp46発現を評価した。NKG2Dは、EOMES過剰発現培養の3日目から、14日目の対照形質導入NK細胞と同等のレベルでNK細胞によって発現された（図6a及び図6b）。T-BET過剰発現時のNK細胞はまた、14日目の対照形質導入NK細胞と比較して低いレベルではあるが、培養の3日目にNKG2Dを発現した（図6a及び図6b）。NKG2Dと同様、T-BET過剰発現でのNK細胞によるNKp46発現は、遅延し、7日目に初めてより高レベルに達したが、EOMES過剰発現では、NKp46発現は、14日目の対照形質導入NK細胞と同等のレベルで3日目に発現され、7日目には対照形質導入NK細胞と比較して高いレベルで発現された（図6a及び図6b）。活性化NK細胞受容体とは別に、成熟NK細胞は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）も発現する。T-BET及びEOMES過剰発現時の3日目又は7日目に得られたNK細胞によるKIR発現の評価から、KIR発現が14日目の対照形質導入NK細胞と比較して極度に上方調節されることが示された（図6a及び図6b）。最後に、機能的NK細胞成熟を示す他のマーカーは、パーフォリン及びグランザイムBの細胞質発現であり、どちらも重要な細胞傷害性メディエーターである。3日目に、パーフォリン及びグランザイムBは、14日目の対照形質導入細胞と比較してT-BET及びEOMES過剰発現培養物の両方でNK細胞によって同様に発現された。7日目に、T-BET及びEOMESの両方の過剰発現NK細胞におけるパーフォリン発現は、上昇する傾向があったが、14日目の対照NK細胞と比較して有意に高い量には達しなかった（図6a及び図6b）。対照的に、EOMES過剰発現でのNK細胞によるグランザイムB発現は、培養の3日目に14日目の対照NK細胞と比較して有意に高かった（図6a及び図6b）。
【００７９】
パーフォリン及びグランザイムBタンパク質は、NK細胞の細胞傷害性顆粒に含有されることが知られている。したがって、3日目及び7日目の過剰発現培養物並びに19日目の対照培養物から選別したNK細胞の顕微鏡分析を行った。結果から、3日目及び7日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物からのNK細胞が、19日目の対照NK細胞と比較して同数の複数の細胞傷害性顆粒をそれらの細胞質中に有することが示される（図6c）。結論として、HSCにおけるT-BET又はEOMES過剰発現は、同様に細胞傷害性顆粒をそれらの細胞質中に含有する、完全な成熟表現型を有するヒトNK細胞の分化の加速をもたらす。
【００８０】
T-BET及びEOMES過剰発現時の早期発生NK細胞は、機能的に成熟している
成熟NK細胞の最も重要な機能は、悪性及びウイルス感染細胞の死滅である。HSCにおけるT-BET又はEOMES過剰発現時の早期発生NK細胞は、パーフォリン及びグランザイムBの両方を発現し、細胞質顆粒を含有することから、同様に細胞傷害能を有すると推論した。したがって、細胞傷害性アッセイを、ヒトNK細胞感受性K562細胞株を標的細胞として行った。結果から、21日目のT-BET及びEOMES過剰発現培養物からのNK細胞が21日目の対照NK細胞と同等の細胞毒性を媒介したことが示される（図7a）。標的細胞の溶解と細胞傷害性顆粒の脱顆粒とを相関させるためにCD107a発現を決定した。T-BET又はEOMES過剰発現培養物及び対照培養物からの21日目のNK細胞を、2時間の脱顆粒アッセイにおいてK562細胞でチャレンジした。T-BET及びEOMES過剰発現培養物からの両方のNK細胞におけるCD107a発現は、対照形質導入NK細胞と比較して有意に低かった（図7b）。
【００８１】
成熟NK細胞の別の重要な機能は、IFN-γ及びTNF-αを含む炎症性サイトカインの産生であり、これにより他の免疫細胞に影響を与えることが可能である。したがって、過剰発現及び対照培養物の両方の21日目のNK細胞を、PMA及びイオノマイシン、又はIL-15を含む若しくは含まないIL-12、IL-18の組合せで刺激した。対照NK細胞に対するT-BET及びEOMES過剰発現NK細胞のIFN-γ産生は、PMA／イオノマイシンによる刺激後に同等であり、IL-12/IL-18又はIL-12/IL-18/IL-15刺激後により高かった（図7c）。対照的に、T-BET又はEOMES過剰発現NK細胞のTNF-α産生は、PMA／イオノマイシン及びIL-12/IL-18/IL-15条件の両方で対照形質導入NK細胞よりも有意に低かった（図7c）。HSCにおけるT-BET及びEOMES過剰発現時に得られるNK細胞が成熟表現型を有するだけでなく、細胞毒性及びIFN-γ産生の両方について機能的に成熟していると結論付けることができる。
【００８２】
EOMES過剰発現NK細胞は、増大したADCC活性を有する
抗体依存性細胞傷害（ADCC）は、エフェクター細胞の細胞表面上の活性化Fc受容体を架橋する標的細胞表面に対する結合抗体の存在により標的細胞が溶解する機構である。CD16（FcγRIII）は、NK細胞上で広範に発現され、ADCCによる死滅を誘導する主要な活性化Fc受容体である。パーセンテージ及び絶対細胞数の両方で有意により多いCD16+NK細胞が、対照培養物と比較してT-BET及びEOMES過剰発現培養物中で得られ（図2c及び図2d）、EOMES過剰発現培養物からのNK細胞も、CD16をより高強度で発現する。
【００８３】
したがって、T-BET及び／又はEOMES過剰発現NK細胞の治療可能性に関して、それらのADCC能を試験した。この目的で、CD20発現ヒトバーキットリンパ腫細胞株Rajiを、癌免疫療法に使用されるヒト化モノクローナル抗CD20抗体であるリツキシマブ（RTX）の存在下又は非存在下で標的として使用した。結果から、T-BET及びEOMES過剰発現並びに対照NK細胞の両方がADCCを示したが、EOMES過剰発現NK細胞のADCC能は、対照NK細胞と比較して有意に高かったことが示される（図8a）。これはCD107a脱顆粒分析によって確認された（図8b）。EOMES過剰発現と比較したT-BET過剰発現時のより低いパーセンテージのCD16+NK細胞及びそれらのより低いCD16発現強度は、T-BET過剰発現NK細胞におけるより強いADCC応答の欠如が説明され得る（図2d）。全体としてまとめると、本発明者らの結果から、EOMESを過剰発現するNK細胞がより高いADCCを示すことが示される。
【００８４】
T-BET及びEOMES過剰発現HSCのトランスクリプトームプロファイリングは、NK細胞特異的遺伝子の活性化を示す
対照形質導入HSCに対するT-BET又はEOMES形質導入HSCからのNK細胞の分化及び成熟の加速についての機械論的洞察を得るために、それらのトランスクリプトームをRNAシークエンシングによって決定した。T-BET及びEOMES過剰発現HSCでは、それぞれ572個及び1427個の差次的に発現される遺伝子（偽陽性率（FDR）＜0.05）が同定された。
【００８５】
T-BET又はEOMESを過剰発現するHSCは、どちらもHELIOS（IKZF2）、IRF8及びTOXを含むマウス及び／又はヒトNK細胞分化における役割が証明された転写因子のより高い発現を示した。ETS-1及びRUNX2のより高い発現は、EOMES過剰発現時にしか存在せず、HOBIT（ZNF683）は、T-BETを過剰発現するHSCにおいてのみより高く発現された。転写因子に加えて、パーフォリン（PRF1）、グランザイムB（GZMB）及びIL2RBも、EOMES形質導入HSCにおいてより高く発現された。予想されるように、CD34発現は、T-BET及びEOMES過剰発現HSCの両方で下方調節された（図9a）。
【００８６】
表1.  図9のボルケーノプロットで強調された差次的に発現される遺伝子
【表１】
2022502091.tif 000003
T-BET対Ctrl
遺伝子名
遺伝子記号
NCBI番号
log2倍率変化
グランザイムB
EOMES対Ctrl
パーフォリン
*下方調節
【００８７】
表2.  上位10個の下方調節される遺伝子
【表２】
2022502091.tif 000004
T-BET対Ctrl
遺伝子記号
NCBI番号
log2倍率変化
EOMES対Ctrl
FDRカットオフ＝5.00E-02
【００８８】
表3.  上位10個の上方調節される遺伝子
【表３】
2022502091.tif 000005
T-BET対Ctrl
遺伝子記号
NCBI番号
log2倍率変化
EOMES対Ctrl
FDRカットオフ＝5.00E-02
【００８９】
上記の表は、T-BET又はEOMES形質導入HSC対対照における上位10個の上方調節及び下方調節される遺伝子の概要を与える。表に挙げた遺伝子は、本発明の細胞と非形質導入／非トランスフェクト又は対照形質導入／対照トランスフェクト細胞との更なる区別に好適である。
【００９０】
重要なことには、遺伝子セット濃縮分析（GSEA）により、T-BET又はEOMES形質導入HSCがどちらも成熟CD56dimNK細胞特異的遺伝子の大きなセットの発現の増大を有することが更に明らかになった（図9b）。トランスクリプトームプロファイリングの結果は、NK細胞へのT-BET又はEOMES形質導入HSCの分化の加速に適合する。
【００９１】
ヒトHSCにおけるID2、TOX又はETS-1の過剰発現は、NK細胞分化を加速しない
幾つかの転写因子がNK細胞系列の特異化、分化及び／又は成熟において重要な役割を果たすことが示されている。ETSプロトオンコジーン1（ETS-1）及びDNA結合阻害因子2（ID2）は、どちらもNK細胞発生の初期段階を特定することが示されており、マウスにおけるNK細胞系列特異化の主要調節因子である[7]。さらに、ヒトHSCにおけるETS-1欠損は、invitroでのNK細胞分化の低下をもたらし、ヒトNK細胞発生におけるETS-1の重要な役割が明らかとなる[22]。成熟NK細胞の欠如が胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（TOX）を欠損したマウスにおいて報告されている[7]。この欠陥は、成熟NK細胞集団が減少するヒトのin vitro NK細胞培養物においても見られた[15]。
【００９２】
T-BET又はEOMES過剰発現で観察されるNK細胞分化及び成熟の加速が、NK細胞分化に関与する他の転写因子の過剰発現でも生じるかを分析するために、ID2、TOX及びETS-1の過剰発現の効果を試験した。HSCにおけるID2過剰発現は、対照形質導入細胞と比較してNK細胞成熟の有意差をもたらさなかった（図10a）。TOX過剰発現は、ステージ5 NK細胞分化に影響を及ぼさなかったが、ステージ4 NK細胞の生成を阻害した（図10a）。本発明者らの研究結果は、ヒトHSCにおけるTOX過剰発現時のNK細胞分化の増加を報告するYun S. et al.（15）の結果とは異なる。しかしながら、Yun S. et al.は、NK細胞パーセンテージの増加のみを示し、絶対NK細胞数は示されていない。生成したNK細胞上でのCD16発現も研究されなかった。
【００９３】
内因性ETS-1のシグナル伝達を阻害する優性阻害アイソフォームであるp27及び完全長アイソフォームであるp51のETS-1の2つのアイソフォームを付加的に過剰発現させた。p27過剰発現によりNK細胞分化が阻害され、このプロセスにおけるETS-1の重要な役割が示されたが、機能的に活性なp51アイソフォームの過剰発現は、NK細胞分化を増大させなかった（図10b）。
【符号の説明】
【００９４】
図面訳
図1
Stage  ステージ
Absolutecell number  絶対細胞数
図2
Absolutecell number  絶対細胞数
Stage  ステージ
Stage5 of total NK cells  全NK細胞に対するステージ5
図3
Absolutecell number  絶対細胞数
Stage  ステージ
図5
Absolutecell number  絶対細胞数
NKT cells  NKT細胞
Tcells  T細胞
Bcells  B細胞
図6
Perforin  パーフォリン
Percentageof NK cells  NK細胞のパーセンテージ
GranzymeB  グランザイムB
NKcells containing granules  顆粒を含有するNK細胞
図7
Specificlysis  特異的溶解
E:Tratio  E:T比
CD107aof NK cells  NK細胞のCD107a
Percentageof NK cells  NK細胞のパーセンテージ
図8
SpecificKilling  特異的死滅
CD107aof NK cells  NK細胞のCD107a
図9
T-BETvs. Ctrl  T-BET対Ctrl
log2fold change  log2倍率変化
EOMESvs. Ctrl  EOMES対Ctrl
NK-specificgenes in HSC from T-BET & EOMES overexpression cultures  T-BET及びEOMES過剰発現培養物のHSCにおけるNK特異的遺伝子
Geneset: top 500 genes expressed in NKdim cells  遺伝子セット：NKdim細胞において発現される上位500個の遺伝子
Dataset: HSC in T-BET overexpression vs. Ctrl cultures  データセット：T-BET過剰発現対対照培養物のHSC
EnrichmentScore  濃縮スコア
qvalue  q値
Dataset: HSC in EOMES overexpression vs. Ctrl cultures  データセット：EOMES過剰発現対対照培養物のHSC
図10
Day21  21日目
Absolutecell number  絶対細胞数
NKstage  NKステージ
Day28  28日目
NKcells  NK細胞
図11
OR  又は
NKcells  NK細胞
Highlights  重要点
ACCELERATEDNK CELL MATURATION  NK細胞成熟の加速
INCREASEDANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY（ADCC）  抗体依存性細胞傷害（ADCC）の増大
Tumor-specificAntibody  腫瘍特異的抗体
TumorAntigen  腫瘍抗原
参照文献
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【図１−１】
2022502091.tif 000006
【図１−２】
2022502091.tif 000007
【図１−３】
2022502091.tif 000008
【図２−１】
2022502091.tif 000009
【図２−２】
2022502091.tif 000010
【図２−３】
2022502091.tif 000011
【図２−４】
2022502091.tif 000012
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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