【手続補正書】
【提出日】平成22年6月14日(2010.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、
(a) 少なくとも一つのポリＧが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Ｉに準備する工程、このとき該溶液Ｉはアルカリ性ｐＨを含み、該ｐＨは好ましくは８〜１３、より好ましくは１２であり、
(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、
(i)   温度Ｉに溶液Ｉの温度を調節する、 該温度Ｉは４〜７０℃、好ましくは４５〜７０℃、より好ましくはおよそ５０℃、そして最も好ましくは５０℃であり、
(ii)  該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を１１０％より上に含むまで、該温度Ｉにて該溶液Ｉ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iii) 温度ＩＩに該溶液Ｉの温度を調整する、該温度ＩＩは０〜７０℃、好ましくは温度Ｉ未満であり、さらに好ましくは温度ＩＩが０〜２５℃、最も好ましくは０〜２℃であり、
(c) ｐＨ５〜８に該溶液ＩのｐＨを調整する工程、このとき溶液ＩのｐＨの調整は好ましくはｐＨが６〜７になるまで行い、そして、
(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、
(i)  ｐＨ５〜８であり、少なくとも２０ｍＭの陽イオンを含む溶液ＩＩに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、該溶液ＩＩは好ましくは２００〜２７５ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭの該陽イオンを含み、
(ii)  温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、 該温度ＩＩＩは５０〜９９℃、好ましくは８０〜９０℃、より好ましくはおよそ８５℃、最も好ましくは８５℃であり、
(iii) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iv)  温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整する、該温度ＩＶは５０℃未満であり、該温度ＩＶは好ましくは０〜２５℃、より好ましくは０〜２℃である、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記溶液Ｉの温度を温度ＩＩに調節する工程が、少なくとも３．６℃／分の温度勾配で行われ、及び／又は、該溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調節する工程が、少なくとも３．６℃／分の温度勾配で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液Ｉが、アルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム、最も好ましくは水酸化ナトリウムを含み、このとき、前記水酸化物の濃度が、１０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくはおよそ２５ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記陽イオンがＮａ＋又はＫ＋であり、このとき好ましくは前記陽イオンがＮａ＋である、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液Ｉの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、５０μＭ〜２ｍＭ、最も好ましくは２６０μＭであり、及び／又は、前記溶液ＩＩの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、５０μＭ〜２ｍＭ、好ましくは１００〜３００μＭ、最も好ましくは１７５μＭである、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
温度ＩＩＩにて溶液ＩＩ中で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程が、前記オリゴヌクレオチドが８０〜９５％、好ましくは８０〜９０％、より好ましくは８３〜９０％、より好ましくは８５〜９０％、そして、最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含むまで行われる、請求項１から５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、その５'末端に少なくとも３、最大１５のグアノシン体とその３'末端に少なくとも３、最大の１５グアノシン体を含み、好ましくはパリンドローム配列を含み、さらに好ましくは該パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号：１)であり、よりさらに好ましくは、
(a) 「Ｇ４−４」GGGGGACGATCGTCGGGG (配列番号：２)、
(b) 「Ｇ５−５」GGGGGGACGATCGTCGGGGG (配列番号：３)、
(c) 「Ｇ６−６」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号：４)、
(d) 「Ｇ７−７」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号：５)、
(e) 「Ｇ８−８」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号：６)、
(f) 「Ｇ９−９」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号：７)、
(g) 「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号：８)、
(h) 「Ｇ１１」GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (配列番号：９)
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号：８)を有する、請求項１から７のいずれか一に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチド組成物であって、該ヌクレオチド組成物が請求項１から８のいずれか一に記載の方法によって入手可能であり、好ましくは該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％、より好ましくは８０〜９０％、より好ましくは８３〜９０％、より好ましくは８５〜９０％、そして最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含み、さらにより好ましくは、該オリゴヌクレオチドが、核酸配列「Ｇ８−８」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号：６)又は「Ｇ１０」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号：８)を有し、最も好ましくは前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号：８)を有する、ヌクレオチド組成物。
【請求項１０】
(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、 
(i)  このとき、該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのポリＧ伸展を含み、そして、
(ii) このとき、該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、
(c)  混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i)   前記コートタンパク質、このとき該混合物中の該コートタンパク質の濃度が好ましくは１〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌであり、及び／又は、さらに好ましくは該混合物中の該オリゴヌクレオチドの濃度が２５〜１００μＭ、より好ましくは６２．５μＭであり、
(ii)  前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、このとき該薬剤が、好ましくは尿素及びグアニジウムハイドロクロライドから選択される変性化化合物を含み、さらに好ましくは該変性化化合物が尿素であり、よりさらに好ましくは該混合物中の該尿素の濃度が０．２５〜７．２Ｍ、好ましくは１Ｍであり、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、このとき該混合物からの薬剤の除去が、好ましくは第一のバッファによる第一バッファ交換によって行われ、このとき該第一バッファは塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第一バッファ中の該塩化ナトリウムの濃度が０〜１Ｍ、好ましくは０〜５５０ｍＭ、より好ましくは０〜３５０ｍＭ、より好ましくは５０〜３５０ｍＭ、最も好ましくは２５０ｍＭであり、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。
【請求項１１】
(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) 請求項９に記載のヌクレオチド組成物を準備する工程、
(c)  混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i)   前記コートタンパク質、このとき該混合物中の該コートタンパク質の濃度が好ましくは１〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌであり、及び／又は、さらに好ましくは該混合物中の該オリゴヌクレオチドの濃度が２５〜１００μＭ、より好ましくは６２．５μＭであり、
(ii)  前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、このとき該薬剤が、好ましくは尿素及びグアニジウムハイドロクロライドから選択される変性化化合物を含み、さらに好ましくは該変性化化合物が尿素であり、よりさらに好ましくは該混合物中の該尿素の濃度が０．２５〜７．２Ｍ、好ましくは１Ｍであり、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、このとき該混合物からの薬剤の除去が、好ましくは第一のバッファによる第一バッファ交換によって行われ、このとき該第一バッファは塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第一バッファ中の該塩化ナトリウムの濃度が０〜１Ｍ、好ましくは０〜５５０ｍＭ、より好ましくは０〜３５０ｍＭ、より好ましくは５０〜３５０ｍＭ、最も好ましくは２５０ｍＭであり、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記コートタンパク質が、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパクないしはその断片を含むか、あるいは本質的にそれから成るか、あるいはそれからなり、好ましくは前記ＲＮＡバクテリオファージが、
(a) バクテリオファージＱβ、
(b) バクテリオファージＲ１７，
(c) バクテリオファージｆｒ、
(d) バクテリオファージＧＡ、
(d) バクテリオファージＳＰ、
(e) バクテリオファージＭＳ２、
(f) バクテリオファージＭ１１、
(g) バクテリオファージＭＸ１、
(h) バクテリオファージＮＬ９５、 
(i) バクテリオファージｆ２、
(j) バクテリオファージＰＰ７、及び
(k) バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡバクテリオファージがＱβであり、好ましくは前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドと前記コートタンパク質のモル比が、０．５〜１．２、最も好ましくは０．７である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記コートタンパク質が、
(a) 配列番号：１０(ＱβＣＰ)； 
(b) 配列番号：１０と配列番号：１１の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質)； 
(c) 配列番号：１２(Ｒ１７コートタンパク質)； 
(d) 配列番号：１３(ｆｒコートタンパク質)； 
(e) 配列番号：１４(ＧＡコートタンパク質)； 
(f) 配列番号：１５(ＳＰコートタンパク質)； 
(g) 配列番号：１５と配列番号：１６の混合物； 
(h) 配列番号：１７(ＭＳ２コートタンパク質)； 
(i) 配列番号：１８(Ｍ１１コートタンパク質)； 
(j) 配列番号：１９(ＭＸ１コートタンパク質)； 
(k) 配列番号：２０(ＮＬ９５コートタンパク質)； 
(l) 配列番号：２１(ｆ２コートタンパク質)；
(m) 配列番号：２２(ＰＰ７コートタンパク質)；及び、
(n) 配列番号：２３(ＡＰ２０５コートタンパク質)
からなる群から選択される配列を含むか、又は好ましくはこれからなる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質収率が少なくとも７５％であり、及び／又はオリゴヌクレオチド収率が少なくとも７５％である、請求項１０から１４のいずれか一に記載の方法。