(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、とりわけ、第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のTNF阻害剤またはIL-6阻害剤を相乗的な量で含むその医薬組成物及びその方法である。相乗的な組み合わせは、(a)疾患または疾患の1つまたは複数の症状の改善、または(b)疾患または疾患の1つまたは複数の症状の発症の遅延をもたらす。
2022501388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のTNF阻害剤を含む医薬組成物であって、ここで、該第2の量が、TNF阻害剤の治療有効レベル未満である、医薬組成物。
【請求項２】
前記第2の量が、前記TNF阻害剤の治療有効レベルの少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％未満である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記TNF阻害剤の治療有効レベルが、(a)疾患、または疾患の1つまたは複数の症状の改善、または(b)疾患、または疾患の1つまたは複数の症状の発症の遅延の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％、または少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍の増加によって測定される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記TNF阻害剤が、エタネルセプト(EnbrelTMまたはBenepaliTM)、アダリムマブ(HumiraTM)、インフリキシマブ(RemicadeTM)、ゴリムマブ(SimponiTM)、セルトリズマブまたはセルトリズマブペゴル(CimziaTM)、またはそれらの後発生物製剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記第2の量が、エタネルセプトまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが、50 mgである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第2の量が、アダリムマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが、40 mgである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記第2の量が、インフリキシマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが3 mg/kgである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記第2の量が、ゴリムマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが50 mgである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記第2の量が、セルトリズマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが400 mgである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第1の量が、前記PTPRS抗クラスタリング剤の治療有効レベル未満である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のIL-6阻害剤を含む医薬組成物であって、ここで、該第2の量が、IL-6阻害剤の治療有効レベル未満である、医薬組成物。
【請求項１２】
前記第2の量が、前記IL-6阻害剤の治療有効レベルの少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％未満である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記IL-6阻害剤の治療有効レベルが、(a)疾患、または疾患の1つまたは複数の症状の改善、または(b)疾患、または疾患の1つまたは複数の症状の発症の遅延の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％、または少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍の増加によって測定される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記IL-6阻害剤が、トシリズマブ(AtlizumabTM)またはサリルマブ(KevzaraTM)を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第2の量が、トシリズマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが、4 mg/kg IVである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記第2の量が、トシリズマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが、162 mg SCである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記第2の量が、サリルマブまたはその後発生物製剤を含み、その治療有効レベルが、100 mgである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記第1の量が、前記PTPRS抗クラスタリング剤の治療有効レベル未満である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
PTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤を含む医薬組成物であって、ここで、該PTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤が、併用相乗量で存在する、医薬組成物。
【請求項２０】
前記TNF阻害剤が、エタネルセプト(EnbrelTMまたはBenepaliTM)、アダリムマブ(HumiraTM)、インフリキシマブ(RemicadeTM)、ゴリムマブ(SimponiTM)、セルトリズマブまたはセルトリズマブペゴル(CimziaTM)、またはそれらの後発生物製剤を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
PTPRS抗クラスタリング剤及びIL-6阻害剤を含む医薬組成物であって、ここで、該PTPRS抗クラスタリング剤及びIL-6阻害剤が、併用相乗量で存在する、医薬組成物。
【請求項２２】
前記IL-6阻害剤が、トシリズマブ(AtlizumabTM)またはサリルマブ(KevzaraTM)を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン1(Ig1)及び免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)の一方または両方を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン1(Ig1)または免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、Ig1及び2を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、Ig1及び2に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、Fc-Ig1及び2を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、Fc-Ig1及び2に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:4のIg1アミノ酸残基30〜127または配列番号:8のアミノ酸残基30〜127を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE(配列番号:1)または配列番号:5に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:1または配列番号:5に示されるアミノ酸配列に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:4のIg2アミノ酸残基128〜231または配列番号:8のアミノ酸残基128〜244を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:4のアミノ酸残基128〜231または配列番号:8のアミノ酸残基128〜244に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA(配列番号:2)または配列番号:6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:2または配列番号:6に示されるアミノ酸配列に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:4のIg3アミノ酸残基232〜321または配列番号:8のアミノ酸残基245〜334を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:4のアミノ酸残基232〜321または配列番号：8のアミノ酸残基245〜334に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTDVKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA(配列番号:3)または配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む、請求項36記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、配列番号:3または配列番号:7のアミノ酸残基に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、ヘパラン硫酸に結合する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、膜貫通ドメインを欠いている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、細胞内ドメインを欠いている、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれかの医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者における自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項４４】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、コンドロイチン硫酸ではない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫疾患が、関節炎である、請求項４３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記自己免疫疾患が、リウマチ性関節炎である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記自己免疫疾患が、強皮症またはクローン病である、請求項４３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜４２のいずれかの医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者における線維芽細胞の活性を低下させる方法。
【請求項４９】
前記PTPRS抗クラスタリング剤が、コンドロイチン硫酸ではない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記線維芽細胞の活性が、線維芽細胞遊走を含む、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記線維芽細胞の活性が、コラーゲン産生、グリコサミノグリカン産生、網状及び弾性線維産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生、糖タンパク質産生、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記線維芽細胞の活性が、細胞外マトリックス産生を含む、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記線維芽細胞が、滑膜線維芽細胞、真皮線維芽細胞、及び間質性線維芽細胞からなる群から選択される、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記線維芽細胞が、滑膜線維芽細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験者が、線維芽細胞媒介性疾患を患っている、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記線維芽細胞媒介性疾患が、線維症である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記線維症が、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、心筋内線維症、心房線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、腹膜後線維症、腎性全身性線維症、皮膚線維症、または関節線維症である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記線維芽細胞媒介性疾患が、線維芽細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記線維芽細胞媒介性自己免疫疾患が、クローン病、関節炎、リウマチ性関節炎、及び強皮症からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１〜４２のいずれかに記載の有効量の医薬組成物を被験者に投与することを含み、該投与が、被験者における細胞外マトリックスを調節する、被験者における細胞外マトリックスを調節する方法。
【請求項６１】
前記細胞外マトリックスの調節が、該細胞外マトリックスの１つまたは複数の成分の調節を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞外マトリックス成分が、プロテオグリカン、多糖、または繊維を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞外マトリックス成分が、プロテオグリカンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記プロテオグリカンが、ヘパラン硫酸である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験者が、細胞外マトリックス疾患を患っている、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞外マトリックス疾患が、アテローム性動脈硬化症、癌、アミロイド疾患、炎症状態、及び発達障害からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アミロイド疾患が、アルツハイマー病または炎症関連AAアミロイドーシスである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記炎症状態が、変形性関節症、全身性強皮症、または狼瘡である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記第1の量及び第2の量が、同時に投与される、請求項４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記第1の量及び第2の量が、別々に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第1の量が第１時点に投与され、前記第2の量が第2時点に投与され、または、前記第1の量が第2時点に投与され、前記第2の量が第1時点に投与される、請求項４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第2時点が、前記第1時点から約120、90、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または１日以内である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第1の量または第2の量が、BIDまたはQIDで投与される、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本願は、2018年9月19日に出願された米国仮出願第62/733,545号の優先権を主張する。該出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【政府援助の研究開発による発明に対する権利に関する声明】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01 AR066053の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
（ASCIIテキストファイルとして提出された配列リスト、表、またはコンピュータプログラムリストの付録への参照）
【０００３】
ファイル048513-510001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.txtに書き込まれた配列リスト(2019年9月19日に作成、76,475バイト、マシンフォーマットIBM-PC、MS Windowsオペレーティングシステム)は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００４】
米国では、約5〜8％の人が自己免疫疾患に苦しんでいる。研究者は80種以上の異なる自己免疫疾患を特定し、さらに多くの疾患が自己免疫の要素を持っているのではないかと疑っている。関節リウマチ(RA)だけでも、米国では約250万人が苦しんでいる。RAは関節や骨に影響を及ぼすが、様々な臓器や生体系にも影響を与える可能性がある。
【０００５】
線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は、関節リウマチ(RA)の炎症と関節破壊を媒介する重要な役割を果たす。免疫抑制を増加させることなく疾患を制御するのを助けるために免疫調節剤と組み合わせて使用されうる新世代の抗RA療法の可能な標的として、この細胞型への注目度が高まっている。FLSの動作は、相互接続された複数のシグナル伝達経路によって制御される。これらの経路のいくつかは、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)と脱リン酸化酵素(PTP)のバランスのとれた作用の結果である、チロシン残基上のタンパク質の可逆的リン酸化を伴う。PTKは、FLSの成長と侵襲性の媒介物である。PTPは、タンパク質のリン酸化チロシン残基からリン酸基を除去することによって作用する。受容体タンパク質チロシン脱リン酸化酵素(RPTPまたはPTPR)は、一般に可変長の細胞外ドメインとそれに続く膜貫通領域及びC末端触媒細胞質ドメインを有するPTPである。
【０００６】
免疫抑制性疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)が利用可能であるにもかかわらず、多くの関節リウマチ(RA)患者は依然として軽快できていない。線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は、RA中に浸潤性になる非免疫学的関節裏層細胞である。DMARDと組み合わせてFLSを標的とする非免疫抑制剤は、感染のリスクを高めることなくRAの制御を改善する可能性がある。最近、我々はRPTPσデコイ生物製剤(RPTPσ-Ig1及び2)を使用して受容体タンパク質チロシン脱リン酸化酵素シグマ(RPTPσ)とプロテオグリカンシンデカン-4の間の相互作用を破壊すると、FLS軟骨浸潤が減少することを報告した。
【０００７】
RA等の慢性炎症状態の現在の治療法には、腫瘍壊死因子-α(TNF)またはインターロイキン-6(IL-6)阻害剤の投与が含まれる。しかし、そのような治療法には重大な副作用があり、その有効性の改善があり得る。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、とりわけ、第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のTNF阻害剤を含む医薬組成物であり、ここで、該第2の量は、TNF阻害剤の治療有効レベル未満である。いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤の治療有効レベルは、(ａ)疾患または疾患の１つ以上の症状の改善、または(ｂ)疾患の発症または疾患の１つ以上の症状の発生の遅延によって決定される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、エタネルセプトである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、50 mg未満のエタネルセプトである。いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、アダリムマブである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、40 mg未満のアダリムマブである。いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、インフリキシマブである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、3 mg/kg未満のインフリキシマブである。いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、ゴリムマブである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、50 mg未満のゴリムマブである。いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、セルトリズマブまたはセルトリズマブペゴルである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、200 mg未満のセルトリズマブまたはセルトリズマブペゴルである。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、前記第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のIL-6阻害剤を含む医薬組成物であり、ここで、該第2の量は、IL-6阻害剤の治療有効レベル未満である。いくつかの実施形態では、前記IL-6阻害剤は、トシリズマブまたはアトリズマブである。いくつかの実施形態では、前記薬物は静脈内注入により投与され、前記第2の量は、4 mg/kg未満のトシリズマブまたはアトリズマブである。いくつかの実施形態では、前記薬物はSCで投与され、前記第2の量は、162 mg未満のトシリズマブまたはアトリズマブである。いくつかの実施形態では、前記IL-6阻害剤は、サリルマブまたはケブザラである。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、100 mg未満のサリルマブまたはケブザラである。
【００１１】
本明細書で提供されるのは、上記の医薬組成物のいずれかであり、ここで、前記第1の量は、前記PTPRS抗クラスタリング剤の治療有効レベル未満である。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン１(Ig1)及び免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)の一方または両方を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、膜貫通ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、細胞内ドメインを欠いている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、併用相乗量で存在する、第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤と第2の量のTNFまたはIL-6阻害剤との上記の組み合わせのいずれか１つの医薬組成物。
【００１３】
本明細書に提供されるのは、上記のPTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤またはPTPRS抗クラスタリング剤及びIL-6阻害剤の任意の組み合わせの医薬組成物を被験者に投与することによる、被験者における自己免疫疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸ではない。前記自己免疫疾患は、関節炎であってもよく、また関節リウマチであってもよい。前記自己免疫疾患は、強皮症またはクローン病であってもよい。前記方法は、前記医薬組成物の投薬スケジュールを含むことができる。
【００１４】
本明細書で提供されるのは、上記薬物の組み合わせのいずれかを投与することによる、被験者における線維芽細胞の活性を低下させる方法である。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸ではない。前記線維芽細胞の活性は、線維芽細胞遊走であってもよい。前記線維芽細胞の活性は、コラーゲン産生、グリコサミノグリカン産生、網状及び弾性線維産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生、糖タンパク質産生、またはそれらの組み合わせであってもよい。前記線維芽細胞の活性は、細胞外マトリックスの産生であってもよい。前記線維芽細胞は、滑膜線維芽細胞、真皮線維芽細胞、または間質性線維芽細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、前記被験者は、線維芽細胞媒介性疾患を患っている。該線維芽細胞媒介性疾患は、線維症であってもよい。該線維症は、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、心筋内線維症、心房線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、腹膜後線維症、腎性全身性線維症、皮膚線維症、または関節線維症であってもよい。前記線維芽細胞媒介性疾患は、線維芽細胞媒介性自己免疫疾患であってもよい。該線維芽細胞媒介性自己免疫疾患は、クローン病、関節炎、リウマチ性関節炎、または強皮症であってもよい。
【００１５】
本明細書に提供されるのは、上記に開示された任意の有効量の医薬組成物を被験者に投与することによる、被験者における細胞外マトリックスを調節する方法である。ここで、前記投与は、被験者における細胞外マトリックスを調節する。細胞外マトリックスの調節は、細胞外マトリックスの１つまたは複数の成分の調節であってもよい。前記被験者は、細胞外マトリックス疾患を患っている可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図1は、RA及び変形性関節症(OA)FLSにおける(RPTPσをコードする)PTPRS発現を示している。図1Aは、TNFの有無にかかわらず、RA(n=3)及びOA(n=3)FLSにおける相対的PTPRS発現を示している。図1Bは、RA及びOA(n=3)における相対的PTPRS発現プールを示している。
【００１７】
図2は、マウスFLSにおけるTNF誘導性RPTPσ発現を示している。マウスFLSを24時間血清飢餓状態にした後、50 ng/mlのTNFで刺激するか、24時間刺激しなかった。図2Aは、TNF刺激の有無にかかわらず、RA FLS RPTPσタンパク質発現を示すウエスタンブロットを示している。図2Bは、TNF刺激の有無にかかわらず、マウスFLS RPTPσ mRNA相対的発現を示している。
【００１８】
図3は、Ig1及び2His-及びFc-構築物のリンカー領域のアミノ酸配列を示している。
【００１９】
図4は、TNFまたはPTPRS Fc-Ig1及び2(Ig1&1)の非存在下または存在下での血清飢餓FLS(n=3)単層でのFc-Ig1及び2構築物1を単独または組み合わせて用いたスクラッチアッセイの結果を示している。図4Aは、創傷時(0時間)、または創傷後12、24、または48時間で、TNFまたはIg1及び2の存在下または非存在下で、単独でまたは組み合わせて、RA1757における創傷幅(任意単位)を示している。図4Bは、創傷時(0時間)、または創傷後12、24、または48時間で、TNFまたはIg1及び2の存在下または非存在下で、単独でまたは組み合わせて、RA1775における創傷幅(任意単位で)を示している。図4Cは、創傷時(0時間)、または創傷後12、24、または48時間で、TNFまたはIg1及び2の存在下または非存在下で、単独でまたは組み合わせて、RA1402における創傷幅(任意単位)を示している。図4Dは、創傷時(0時間)、または創傷後12、24、または48時間で、TNFまたはIg1及び2の存在下または非存在下で、単独でまたは組み合わせて、RA FLSにおける創傷幅(任意単位)を示している。二元配置分散分析(ANOVA, ****, P<0.0001)を用いてデータを分析した。
【００２０】
図5は、関節炎のK/BxN血清転移誘発関節炎(STIA)マウスからの単球またはマクロファージにおけるRPTPσ発現を示している。図5Aは、古典的(Ly6C+CD43-)、中間的(Ly6C+CD43+)、または非古典的(Ly6C-CD43+)循環単球(血中単球)におけるRPTPσ発現を示している。形質細胞様樹状細胞(pDC)におけるRPTPσ発現は、比較のために示している。図5Bは、(Ly6C+CD43-)、中間(Ly6C+CD43+)、または非古典的(Ly6C-CD43+)関節マクロファージ(足首マクロファージ)におけるRPTPσ発現を示している。高レベルのRPTPσを発現することが知られている形質細胞様樹状細胞(pDC)におけるRPTPσ発現は、比較のために示している。
【００２１】
図6は、RPTPσ-ノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)マウス(Hisタグ付きIg1及び2構築物を使用)の骨髄で再構成したマウスのSTIAが、STIAモデルのIg1及び2に対して同じ応答性を示したことを示している。図6Aは、Ig1及び2または媒体の注射を受けた後、0、2、4、6、及び8日目にIg1及び2「使用中」構築物で処置されたWTまたはRPTPσ-KO STIAマウスのいずれかの臨床スコアを示している。図6Bは、Ig1及び2または媒体の注射を受けた後、0、2、4、6、及び8日目にIg1及び2「使用中」構築物で処置されたWTまたはRPTPσ-KO STIAマウスのいずれかの足首の厚さ(mm)の変化を示している。平均+/- s.e.m.が示されている。二元配置分散分析(ANOVA, **, P<0.01)を用いてデータを分析した。
【００２２】
図7は、「使用中」のFc-Ig1及び2が、単剤療法として、またはTNF阻害剤mEtanercept(p75mTNFr:Fc)と組み合わせて、コラーゲン誘発関節炎(CIA)を回復させるのに有効であったこと、また、Ig1及び2とmEtanerceptの組み合わせがTNF阻害剤単独よりも有意に高い有効性を示したことを示している。平均+ s.e.m.が示されている。
【００２３】
図8は、TNF阻害剤mEtanercept(p75mTNFr:Fc)の滴定が、治療有効レベル(２mg/kg)未満の効果及びCIAマウスの関節ホモジネートにおけるPTPRSの誘導を示したことを示している。図8Aは、0日目に一次免疫され、21日目に追加免疫されたマウスの臨床スコアの変化を示している。平均+ s.e.m.が示されている。図8Bは、媒体、または異なる投与量のmEtanerceptで処置されたマウスの足首におけるPTPRSの相対的発現を示している。
【００２４】
図9は、Fc-Ig1及び2「構築物1」またはエタネルセプトを単独または組み合わせで処置されたマウスの関節炎の臨床スコアを示している。
【００２５】
図10は、Fc-Ig1及び2「構築物1」で処置されたマウスにおける不完全フロイント免疫賦活剤(IFA)の1回目及び2回目の投与後の抗コラーゲン抗体レベルを示している。
【００２６】
図11は、CIAにおけるFc-Ig1及び2とmEtanerceptの間の治療上の相乗効果を示している。図11Aは、実験の漫画式要約と、Fc-Ig1及び2、及びmEtanerceptの別々にそして併用治療した後の経時的臨床スコアを示している。図11Bは、本実験終了時の、図11Aのマウスの血清中の抗II型コラーゲンIgG抗体のレベルを示している。図11Cは、図11Aに示されるように処置されたマウスにおける滑膜炎の組織病理学的スコアを示している。図11Dは、図11Aに示されるように処置されたマウスにおける骨糜爛の組織病理学的スコアを示している。図11Eは、図11Aに示されるように処置されたマウスにおける軟骨枯渇の組織病理学的スコアを示している。図11B〜Eでは、グラフは、二元配置分散分析(図11A対媒体群)または一元配置分散分析(図11C〜E)による平均値±s.e.m.、* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001、**** P<0.0001を示している。
【００２７】
図12は、RA患者の滑膜組織から単離されたRA FLSからのRNA-seqデータを示している。
【００２８】
図13は、実験的マウス関節炎におけるFc-Ig1及び2の有効性を示している。図13Aは、マウスモデルでの治療による足首の厚さの減少を示している。図13Bは、111インジウム(111In)で標識されたFc-Ig1及び2を注射され、確立されたSTIAを有するマウスのX線写真を示している。図13Cは、X線写真のデンシトメトリー測定を示している。図13Dは、関節炎のCIAマウスへのFc-Ig1及び2、及びmEtanercept投与の効果を示している。図13Eは、抗コラーゲン抗体の産生に対するFc-Ig1及び2、及びmEtanerceptの効果を示している。図13F〜Gは、様々な臨床測定に対するFc-Ig1及び2投与の効果を示している。
【００２９】
図14は、様々な臨床測定に対するIg1及び2(His-Ig1及び2、及びFc-Ig1及び2)の効果を示している。図14Aは、致死的照射(>1000 Rad)及びCD45.2 WTまたはPTPRS KOマウスからの骨髄移植を受けたCD45.1遺伝子性マウスにおけるSTIAに対するIg1及び2の効果を示している。図14Bは、6〜7週齢から自発性関節炎を発症する関節炎K/BxN遺伝子組み換えマウスに対するIg1及び2を示している。図14Cは、マウスをSTIAに供する前の、pDC枯渇マウスに対するIg1及び2の効果を示している。図14Dは、CIAマウスの関節炎の足首における制御性T細胞(Treg)またはTh17細胞の蓄積または拡大に対するFc-Ig1及び2の効果を示している。図14Eは、同じ足首におけるMHCII+CD64+及びMHCII-CD64+マクロファージの数及び頻度に対するFc-Ig1及び2の効果を示している。図14Fは、抗コラーゲンIgG抗体の全体的な力価及び抗コラーゲンIgGサブクラスIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3の力価に対するFc-Ig1及び2の効果を示している。図14G〜Hは、それぞれ、Tfh細胞及びGC B細胞の頻度及び数に対するFc-Ig1及び2の効果を示している。図14I〜Jは、リンパ節におけるTh1、Th17またはTregの数に対するIg1及び2の効果を示している。
【００３０】
図15は、PTPRS発現に対するTNFの効果を示している。図15Aは、6つのヒストン修飾、オープンクロマチン(ATAC-seq)、RNA-seq、及びDNAメチル化を伴う、RA FLSにおけるのPTPRS遺伝子座のエピゲノムランドスケープを示している。図15Bは、RA FLSにおけるPTPRSに対するUSF2のsiRNA媒介ノックダウンの効果を示している。図15Cは、PTPRSのプロモーター領域に結合するUSF2のChIPアッセイを示している。図15Dは、USF2の存在下及び非存在下でのPTPRSルシフェラーゼレポーターアッセイを示している。
【００３１】
図16は、PTPRS発現に対するTNFの効果を示している。図16Aは、RAにおけるPTPRS発現に対するTNF増量の効果を示している。図16Bは、OAにおけるPTPRS発現に対するTNF増量の効果を示している。図16Cは、RAとOA FLSとの間のPTPRS発現の基礎レベルの比較を示している。
【００３２】
図17は、in vitro運動性アッセイを示している。図17Aは、TNFの非存在下での創傷面積の変化を示している。図17Bは、50 ng/ml TNFの存在下でので創傷面積の変化を示している。
【００３３】
図18は、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)の回復における、単剤として投与された、及び治療量以下の用量(2 mg/kg)のTNF阻害剤と組み合わせて投与された治療量以下(0.1及び0.25 mg)のIg1及び2の効果を示している。CIAマウスを、初回免疫化後44、46、及び48日目に腹腔内注射によって、ヒトIgG1 Fc対照、媒体(N=9)、2 mg/kgマウスエタネルセプト(mEtan、N=9)、0.5 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、0.25 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、0.1 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、2 mg/kg mEtan+0.1 mg Fc-Ig1及び2(コンボ、N=10)で処置した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。
【００３４】
図19は、IL-6の有無にかかわらず、RA FLSにおける相対的PTPRS発現を示している。
【００３５】
図20は、STIAマウスモデルにおける関節炎スコアに対するFc-Ig1及び2の効果を示している。上から下へ、14日目、及び各グラフについて、図20に示される線は、それぞれ以下を表す：媒体、0.05 mg Fc-Ig1及び2、0.1 mg Fc-Ig1及び2、0.25 mg Fc-1及び2、及び0.5 mg Fc-1及び2。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
本願は、PTPRS抗クラスタリング剤とTNF阻害剤またはIL-6阻害剤との、該薬剤または阻害剤単独の治療有効レベル未満の量での組み合わせを含む医薬組成物及びそれに関連する治療方法に関する。出願人は、PTPRS抗クラスタリング剤とTNF阻害剤の間またはPTPRS抗クラスタリング剤とIL-6阻害剤の間に驚くべき相乗効果があることを発見した。理論に拘束されたくないが、PTPRS抗クラスタリング剤は、少なくとも次の場合に使用できる：(1)部分応答者における免疫賦活剤として、または、(2)望ましくない感染症を経験している患者、または良好に制御されているが感染症のリスクを減らしたい患者のための免疫抑制節約剤として。
【００３７】
「被験者」、「患者」、「個人」等の用語は、限定することを意図するものではなく、一般に交換することができる。即ち、「患者」と記載される個人は、必ずしも特定の疾病にかかっているわけではなく、単に医学的助言を求めているだけでもよい。
【００３８】
「対照」または「標準対照」は、試験試料、測定値、または値と比較するための参照、通常は既知の参照として機能する試料、測定値、または値を指す。例えば、試験試料は、所与の疾患(例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、癌、感染症、免疫疾患、またはその他の疾患)を患っていることが疑われる患者から採取され、既知の正常な(疾患のない)個人(例えば、標準対照被験者)と比較され得る。標準対照は、特定の疾患(即ち、標準対照集団)を持たない同様の個人(例えば、標準対照被験者、同様の医学的背景、同じ年齢、体重等の健康な個人)の母集団から収集された平均測定値または値を表すこともできる。標準対照の値は、同じ個人から、例えば、発病前に患者から以前に得られた試料からも得ることができる。当業者に認識されるように、任意の数のパラメーター(例えば、RNAレベル、タンパク質レベル、特定の細胞タイプ、特定の体液、特定の組織、滑液細胞、滑液、滑膜組織、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞等)を評価するために標準対照を設計することができる。
【００３９】
当業者は、どの標準対照が所与の状況において最も適切であるかを理解し、標準対照の値との比較に基づいてデータを分析できるであろう。標準対照は、データの有意性(統計的有意性等)を決定するためにも役立つ。例えば、標準対照における所与のパラメーターの値が大きく変動すれば、試験試料の変動は重要とは見なされないであろう。
【００４０】
「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。用量は、各投与で個人に与えられる有効成分の量を指す。用量は、特定の治療法の通常の用量の範囲、投与の頻度、個人のサイズと耐性、状態の重症度、副作用のリスク、及び投与経路を含む多くの要因によって異なる。当業者は、上記の要因に応じて、または治療の進行に基づいて、用量を変更できることを認識するであろう。「剤形」という用語は、医薬品または医薬組成物の特定のフォーマットを指し、投与経路に依存する。例えば、剤形は、例えば吸入器用に、噴霧用の液体形態であってもよく、例えば経口用に、錠剤または液体であってもよく、また、例えば注射用に、生理食塩水溶液であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療する」及び「予防する」という用語は、発症の遅延、症状の頻度または重症度の低下、症状の改善、患者の快適さまたは機能(例えば、関節機能)の改善、病状の重症度の低下等を指してもよい。治療効果は、特定の治療を受けていない個人または個人のプール、または治療の中止前または中止後の同じ患者と比較することができる。「予防する」という用語は、一般に、患者における所与の疾患(例えば、自己免疫、炎症性自己免疫、癌、感染性、免疫、または他の疾患)または疾患症状の発生の減少を指す。上に示したように、予防は、完全な(検出可能な症状がない)または部分的であってもよい。その結果、治療しない場合に発生する可能性よりも少ない症状が観察される。
【００４２】
本明細書で使用される「治療有効用量または量」とは、それが投与される効果(例えば、疾患の治療または予防)をもたらす用量を意味する。正確な用量及び処方は、治療目的に依存し、既知の技術(例えば、Liebermanの「医薬品剤形」(vol.1-3、1992);Lloydの「医薬品配合の芸術、科学及び技術」(1999);Remingtonの「科学と薬局の実践」第20版、Gennaro編集(2003)；及びPickarの「投与量の計算」(1999)を参照)を用いて当業者によって確認可能である。例えば、治療有効量は、所与のパラメーターについて、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％の増加または減少を示す。治療効果は、「-倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療有効用量は、標準対照に対して少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれ以上の効果を有してもよい。治療有効用量または量は、疾患の1つまたは複数の症状を改善してもよい。治療有効用量または量は、それが投与される効果が疾患を発症するリスクのある人を治療する場合、該疾患または疾患の1つまたは複数の症状の発症を予防または遅延させてもよい。
【００４３】
「診断」という用語は、疾患(例えば、自己免疫、炎症性自己免疫、癌、感染性、免疫、または他の疾患)が被験者に存在する相対的確率を指す。同様に、「予後」という用語は、ある病状に関して、特定の将来の結果が被験者において起こり得る相対的確率を指す。例えば、本発明の文脈において、予後は、ある個人がある疾患(例えば、自己免疫、炎症性自己免疫、癌、感染性、免疫、または他の疾患)を発症する可能性、または該疾患の発生可能な重症度(例えば、疾患の期間)を指すことができる。医療診断の分野の技術者の誰もが理解するように、これらの用語は絶対的なものではない。
【００４４】
本明細書で使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」またはこれらの文法的同等物は、互いに共有結合している少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のDNA、RNA、及びそれらの類似体(誘導体)を含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さが約5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上のヌクレオチドから、長さが約100個のヌクレオチドまでである。核酸及びポリヌクレオチドは、より長い長さ、例えば、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等を含む任意の長さのポリマーである。特定の実施形態では、本明細書の核酸は、ホスホジエステル結合を含有する。他の実施形態では、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミダイト結合(Ecksteinの「オリゴヌクレオチド及び類似体：実践方法」、オクスフォード大学を参照)、及びペプチド核酸の骨格及び結合を含む、代替の骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。他の核酸類似体には、陽性骨格、非イオン性骨格、及び米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、ならびにSanghui&Cook編集の「アンチセンス研究における炭水化物修飾」の第6及び7章(ASCシンポジウムシリーズ580)に記載の非リボース骨格を有するものが含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。リボース-リン酸骨格の修飾は、様々な理由で、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために、またはバイオチップ上のプローブとして行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を調製することができるが、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、または天然に存在する核酸と類似体の混合物を調製してもよい。
【００４５】
特定の核酸配列には、「スプライス変異体」も含まれる。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異体によってコードされる任意のタンパク質を包含する。「スプライス変異体」は、その名前が示すように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、異なる(代替の)核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、最初の核酸転写物をスプライシングすることができる。スプライス変異体の生成メカニズムは様々であるが、エクソンの選択的スプライシングが含まれる。リードスルー転写によって同じ核酸に由来する代替ポリペプチドもまた、該定義に含まれる。スプライス生成物の組換え型を含む、スプライシング反応の生成物は全て該定義に含まれる。カリウムチャネルスプライス変異体の例は、Leicherら, J. Biol. Chem. 273(52):35095-35101(1998)に記載されている。
【００４６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されているDNA配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合、隣接しており、読み取り段階にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。リンクは、便利な制限部位での結紮によって行われる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。
【００４７】
本明細書で使用される「プローブ」または「プライマー」という用語は、試料への特異的ハイブリダイゼーションを検出することができる１つまたは複数の核酸断片であると定義される。プローブまたはプライマーは、使用する特定の技術に応じて、任意の長さにすることができる。例えば、PCRプライマーは、一般に、長さが10〜40個のヌクレオチドの間であるが、例えば、サザンブロットのための核酸プローブは、100個のヌクレオチドを超える長さであってもよい。プローブは、標的または試料へのその結合を検出することができるように、以下に記載されるように非標識または標識され得る。プローブは、染色体の１つまたは複数の特定の(事前に選択された)部分、例えば、１つまたは複数のクローン、単離された染色体全体または染色体断片、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物のコレクションからの核酸の供給源から産生することができる。標的要素に固定された核酸の長さ及び複雑さは、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要因を調整して、所与のハイブリダイゼーション手順に最適なハイブリダイゼーションとシグナル産生を提供し、異なる遺伝子またはゲノム位置間で必要な解像度を提供することができる。
【００４８】
前記プローブはまた、アレイのように、固体表面(例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、溶融シリカスライド)に固定された単離された核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、前記プローブは、例えば、WO96/17958に記載されるような核酸のアレイの一員であってもよい。高密度アレイを製作できる技術も該目的に使用できる(例えば、Fodor (1991) Science 767-773、Johnston (1998) Curr.Biol.8：R171-R174、Schummer (1997) Biotechniques 23：1087-1092、Kern (1997) Biotechniques 23：120-124、及び米国特許第5,143,854号を参照)。
【００４９】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、リンカーまたは化学結合、または非共有的に、イオン、ファンデルワールス、静電、または水素結合のいずれかを介してラベルに共有結合し、プローブに結合したラベルの存在を検出することによって、該プローブの存在を検出できるようにするものである。あるいは、高親和性相互作用を使用する方法は、結合パートナーの対の一方が他方、例えばビオチン、ストレプトアビジンに結合する場合に同じ結果を達成し得る。
【００５０】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」または配列「同一性」の百分率という用語は、BLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて以下に説明するデフォルトのパラメーターで測定された時、または手動による整列や目視検査(例えば、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等のNCBIウェブサイトを参照)で測定された時に、同一であるか、または、特定の百分率値(即ち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の対応を得るために比較及び整列された場合、約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上高い同一性)で同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つ以上の配列またはサブ配列を指す。その場合、そのような配列は「実質的に同一」であると言う。該定義は、試験配列の補完を指すか、または適用されてもよい。該定義には、欠失及び/または追加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含まれる。採用されたアルゴリズムは、ギャップ等を説明することができる。
【００５１】
配列比較の場合、通常、1つの配列が参照配列として機能し、試験配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列がコンピューターに入力され、任意選択でサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、または代替パラメーターを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【００５２】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、2つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続した位置の参照配列と比較されうる20〜600、通常は約50〜約200、より通常は約100〜約150からなる群から選択されるいくつかの隣接する位置のいずれか1つのセグメントへの参照を含む。比較するための配列の整列の方法は、当技術分野で周知されている。比較するための配列の最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970) の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)によって、または手動による整列や目視検査(例えば、「分子生物学の現在のプロトコル」Ausubelら編集、1995年付録を参照)によって行うことができる。
【００５３】
配列同一性及び配列類似性の百分率を測定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、それぞれAltschulら, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1977) 及びAltschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されているBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。
【００５４】
「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という句は、他のヌクレオチド配列(例えば、全細胞またはライブラリーDNAまたはRNA)よりも、例えば、より厳密な条件下で、より高い親和性を有する特定のヌクレオチド配列のみへの分子結合、二重化、またはハイブリダイズを指す。
【００５５】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」という句は、典型的には核酸の複雑な混合物において、核酸がその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は、配列に依存し、状況によって異なる。より長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドについては、Tijssenの「生化学及び分子生物学における技術-核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイゼーション原理の総説及び核酸アッセイの戦略」(1993)を参照できる。一般に、厳密なハイブリダイゼーション条件は、定義されたイオン強度pHでの特定の配列の熱融点(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択される。前記Tmは、標的に相補的なプローブの50％が平衡(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは、プローブの50％が平衡状態で占有される)で標的配列にハイブリダイズする温度(定義されたイオン強度、pH、及び核酸濃度の下で)である。厳密なハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することでも達成できる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、次のようになりうる：50％ホルムアミド、5x SSC、及び1％SDS、42℃でのインキュベート、または5x SSC、1％SDS、65℃でのインキュベート、0.2x SSC中の洗浄、及び65℃での0.1％SDS。例示的な「中程度の厳密なハイブリダイゼーション条件」には、40％ホルムアミド、1 M NaCl、37℃での1％SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、及び45℃で1x SSC中の洗浄が含まれる。ポジティブハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、同様の厳密な条件を提供できることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための他のガイドラインは、多くの参考文献で提供されている。例えば、John Wiley & Sonsの「分子生物学における現在のプロトコル」（Ausubelら編集）。
【００５６】
コードするポリペプチドが実質的に同一である場合、核酸は、実質的に同一であってもよい。これは、例えば、遺伝暗号で許可されている最大のコドン縮重を使用して核酸のコピーが作成された場合に起きる。このような場合、該核酸は、通常、中程度の厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００５７】
「阻害性核酸」は、標的核酸(例えば、PTPRSに翻訳可能なmRNA)に結合し、該標的核酸(例えば、DNAからのmRNA)の転写を減少させ、または、該標的核酸(例えば、mRNA)の翻訳を減少させるか、転写物のスプライシングを改変する(例えば、一本鎖モルホリノオリゴ)ことができる核酸(例えば、DNA、RNA、ヌクレオチド類似体のポリマー)である。「モルホリノオリゴ」は、あるいは「モルホリノ核酸」と呼ばれてもよいが、当技術分野で一般に知られているモルホリンを含有する核酸(例えば、ホスホルアミデートモルホリノオリゴ、または「PMO」)を指す。Marcos.P.の「生化学的及び生物物理学的研究通信」358(2007)521-527を参照されたい。いくつかの実施形態では、「阻害性核酸」は、標的核酸(例えば、RPTPシグマに翻訳可能なmRNA)に結合し(例えば、ハイブリダイズする)、標的核酸の翻訳を減少させることができる核酸である。該標的核酸は、阻害性核酸が結合する(例えば、ハイブリダイズする)1つまたは複数の標的核酸配列であるか、またはそれらを含む。従って、阻害性核酸は、典型的には、標的核酸配列において標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる配列(本明細書では「アンチセンス核酸配列」とも呼ばれる)であるか、またはそれを含む。阻害性核酸の例は、アンチセンス核酸である。阻害性核酸の別の例は、siRNAまたはRNAi(それらの誘導体またはヌクレオチド類似体等の前駆体を含む)である。さらなる例には、shRNA、miRNA、shmiRNA、またはそれらの誘導体または前駆体の一部が含まれる。いくつかの実施形態では、前記阻害性核酸は、一本鎖である。他の実施形態では、前記阻害性核酸は、二本鎖である。
【００５８】
「アンチセンス核酸」は、mRNA分子(例： 標的mRNA分子)(例えば、Weintraub、Scientific American、262：40(1990)を参照)等の特定の標的核酸(例えば、標的核酸配列)の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である核酸(例えば、DNA、RNAまたはそれらの類似体)であり、例えば、アンチセンス、siRNA、shRNA、shmiRNA、miRNA(マイクロRNA)である。従って、アンチセンス核酸は、標的核酸(例えば、標的mRNA)にハイブリダイズする(例えば、選択的にハイブリダイズする)ことができる。いくつかの実施形態では、前記アンチセンス核酸は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸配列(例えば、mRNA)にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、前記アンチセンス核酸は、中程度の厳密なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸(例えば、mRNA)にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、及びアノマー糖リン酸、骨格が修飾されたヌクレオチド等の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。「抗PTPRSアンチセンス核酸」は、PTPRSの少なくとも一部をコードする、mRNA分子等の標的核酸配列の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であるアンチセンス核酸である。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴである。いくつかの実施形態では、モルホリノオリゴは、当技術分野で知られているように、一本鎖アンチセンス核酸である。いくつかの実施形態では、モルホリノオリゴは、標的のタンパク質発現を減少させ、標的mRNAの翻訳を減少させ、標的mRNAの翻訳開始を減少させ、または転写物のスプライシングを改変する。いくつかの実施形態では、前記モルホリノオリゴは、細胞透過性部分(例えば、ペプチド)に抱合されている。アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖核酸であってもよい。
【００５９】
細胞内では、前記アンチセンス核酸が、標的mRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成してもよい。前記アンチセンス核酸は、細胞が二本鎖のmRNAを翻訳しないため、mRNAの翻訳を妨害する。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当技術分野で周知されている(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172：289,(1988))。DNAに直接結合するアンチセンス分子を使用してもよい。
【００６０】
注射、吸入、または経口摂取を含む、当技術分野で知られている任意の適切な手段を用いて、抑制性核酸を被験者に送達することができる。別の適切な送達システムは、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステム等のコロイド分散システムである。本発明のコロイド系の例はリポソームである。リポソームは、in vitro及びin vivoでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。リポソーム内のRNA及びDNAを含む核酸は、生物学的に活性な形態で細胞に送達されることができる(Fraleyら、Trends Biochem. Sci., 6：77, 1981)。リポソームは、当技術分野で知られている任意の手段を使用して、特定の細胞型または組織を標的にすることができる。阻害性核酸(例えば、アンチセンス核酸、モルホリノオリゴ)は、細胞透過性送達システム(例えば、細胞透過性ペプチド)を用いて、細胞に送達されることができる。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、ウイルスベクターまたはウイルスを用いて、特定の細胞または組織に送達される。
【００６１】
「siRNA」は、二本鎖RNAを形成する核酸を指し、二本鎖RNAは、siRNAが遺伝子と同じ細胞または標的遺伝子に存在する(例えば、発現される)場合に、遺伝子または標的遺伝子の発現を低減または阻害する能力を有する。前記siRNAは、典型的には長さが約5〜約100個のヌクレオチドであり、より典型的には長さが約10〜約50個のヌクレオチドであり、より典型的には長さが約15〜約30個のヌクレオチドであり、最も典型的には長さが約20〜30個の塩基ヌクレオチド、または約20〜25個の、または約24〜29個のヌクレオチドであり、例えば、長さが20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチドである。siRNA分子とそれらを産生する方法は、例えば、Bass, 2001, Nature, 411, 428-429、Elbashirら, 2001, Nature, 411, 494-498、WO 00/44895、WO 01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409、及びWO 00/44914に記載されている。dsRNAまたはsiRNA(例えば、ヘアピン二重鎖として)を転写するDNA分子もRNAiを提供する。dsRNAを転写するためのDNA分子は、米国特許第6,573,099号、米国特許出願公開第2002/0160393号及び2003/0027783号、ならびにTuschl及びBorkhardt, Molecular Interventions, 2:158(2002)に開示されている。
【００６２】
siRNAを直接投与することも、siRNA発現ベクターを用いて異なる設計基準を持つRNAiを誘導することもできる。ベクターは、短いスペーサー配列で区切られ、転写を終了するのに役立つTの文字列で終わる2つの逆方向反復配列を挿入できる。
【００６３】
核酸配列を含む適切なベクターの構築は、当技術分野でよく理解されている標準連結及び制限技術を使用する(Maniatisらの「分子クローニング：実験マニュアル」、Cold Spring Harbour Laboratory、New York(1982)を参照)。単離されたプラスミド、DNA配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、切断され、調整され、そして所望の形態で再連結される。
【００６４】
「生体試料」または「試料」は、被験者または患者から得られた、またはそれらから誘導された材料を指す。生体試料には、生検や剖検試料等の組織の切片及び組織学的目的で採取された凍結切片が含まれる。このような試料には、血液や血液画分または生成物(例えば、血清、血漿、血小板、赤血球等)、喀痰、組織、培養細胞(例えば、初代培養、外植片、及び形質転換細胞)、便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、T細胞等の体液が含まれる。生体試料は、通常、真核生物から得られる。例えば、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）、牛、犬、ネコ、げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ）、または鳥、爬虫類、または魚等。
【００６５】
「生検」とは、診断または予後評価のために組織の試料を除去する過程及び組織標本自体を指す。当技術分野で知られている任意の生検技術を、本発明の診断方法及び予後診断方法に適用できる。適用される生検技術は、他の要因の中でもとりわけ、評価される組織の種類(即ち、前立腺、リンパ節、肝臓、骨髄、血球、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、T細胞等)に依存する。代表的な生検技術には、切除生検、切開生検、針生検、外科生検、及び骨髄生検が含まれる。生検技術は、例えば、「Harrisonの内科原則」（Kasperら編集、第16版、2005年）の第70章及び第V部全体で議論されている。
【００６６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６７】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸及び後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びO-ホスホセリン）である。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を持つ化合物を指し、即ち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）である。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持っているが、天然アミノ酸と同じように機能する化合物を指す。
【００６８】
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている3文字の記号、またはIUPAC-0IUB生化学命名委員会が推奨する1文字の記号のいずれかで参照できる。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている1文字のコードで参照できる。
【００６９】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一配列の核酸を指す。遺伝暗号の縮退のために、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、GCUは、全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、コードされたポリペプチドを改変することなく、コドンを記載された対応するコドンのいずれかに改変できる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の一種の「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載している。当業者は、核酸中の各コドン(通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUG、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一の分子を産生できることを認識するだろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関して記載された各配列において暗示的である。
【００７０】
当業者は認識するように、アミノ酸配列に関しては、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはアミノ酸のごく一部を改変、追加、または削除する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、削除、または追加は、該改変により、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換される「保存的に修飾された変異体」である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に追加され、それらを除外しない。
【００７１】
次の8つのグループには、それぞれ、相互に保存的に置換されたアミノ酸が含まれている：1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、スレオニン(T);及び8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton、Proteins(1984)を参照)。
【００７２】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(例えば、ELISAで一般的に使用されるもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン及びタンパク質、または、例えば、放射性標識をペプチドまたは標的ペプチドと特異的に反応する抗体に組み込むことによって検出可能にすることができる他の実体が含まれる。抗体を前記標識に抱合させるための当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。例えば、Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diegoに記載されている方法を使用する。
【００７３】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが実験室の方法によって修飾されているか、またはその結果であることを示す。従って、例えば、組換えタンパク質には、実験方法によって産生されたタンパク質が含まれる。組換えタンパク質は、タンパク質の天然(非組換え)形態内に見られないアミノ酸残基を含み得るか、または修飾された、例えば標識されたアミノ酸残基を含み得る。
【００７４】
核酸の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、該核酸が、本質的に互いに同じ関係に見出されない2つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、前記核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能的核酸、例えば、ある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域を作製するように配置された無関係の遺伝子からの2つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、該タンパク質が、本質的に互いに同じ関係に見出されない2つ以上のサブ配列を含むこと(例えば、融合タンパク質)を示す。
【００７５】
ポリペプチドは、別の分子に化学的に結合することができる。本明細書で使用される場合、「バイオ抱合」及び「バイオ抱合リンカー」という用語は、「バイオ抱合反応基」または「バイオ抱合反応性部分」の原子または分子間の結果として生じる対合を指す。該対合は、直接的または間接的であってもよい。例えば、本明細書で提供される第1バイオ抱合反応基(例えば、-NH2、-C(O)OH、-N-ヒドロキシスクシンイミド、または-マレイミド)と第2バイオ抱合反応基(例えば、スルフヒドリル、硫黄含有アミノ酸、アミン、アミノ酸を含むアミン側鎖、またはカルボン酸塩)との間の抱合は、例えば、共有結合またはリンカー(例えば、第2リンカーの第1リンカー)によって直接的であってもよく、または、例えば、非共有結合(例えば、静電相互作用(例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合)、ファンデルワールス相互作用(例えば、双極子-双極子、双極子誘導双極子、ロンドン分散)、リングスタッキング(パイ効果)、疎水性相互作用等) によって間接的であってもよい。実施形態では、バイオ抱合体またはバイオ抱合体リンカーは、バイオ抱合化学(即ち、2つバイオ抱合反応基の対合)を使用して形成される。これは、求核置換(例えば、アミン及びアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応)、親電子置換(例えば、エナミン反応)及び炭素-炭素及び炭素-ヘテロ原子の多重結合への付加(例えば、マイケル反応、ディールスアルダー付加)を含むが、これらに限定されない。これら及び他の有用な反応は、例えば、Marchの「最新有機化学」第3版, John Wiley&Sons, New York,1985、Hermansonの「バイオ抱合の技術」, Academic Press, San Diago,1996、及びFeeneyらの「タンパク質修飾;化学シリーズの進歩」, Vol.198,アメリカ化学会, Washington D.C.,1982で議論されている。実施形態では、第１バイオ抱合反応基(例えば、マレイミド部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、スルフヒドリル)に共有結合している。実施形態では、第1バイオ抱合反応基(例えば、ハロアセチル部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、スルフヒドリル)に共有結合している。実施形態では、第1バイオ抱合反応基(例えば、ピリジル部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、スルフヒドリル)に共有結合している。実施形態では、第1バイオ抱合反応基(例えば、-N-ヒドロキシスクシンイミド部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、アミン)に共有結合している。実施形態では、第1バイオ抱合反応基(例えば、マレイミド部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、スルフヒドリル)に共有結合している。実施形態では、第1バイオ抱合反応基(例えば、−スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド部分)は、第2バイオ抱合反応基(例えば、アミン)に共有結合している。
【００７６】
本明細書で使用される「結合する」及び「結合した」という用語は、その平易で通常の意味に従って使用され、原子または分子間の対合を指す。該対合は、直接的または間接的であってもよい。例えば、結合した原子または分子は、例えば、共有結合またはリンカー(例えば、第1リンカーまたは第2リンカー)によって直接的であってもよく、または、例えば、非共有結合 (例えば、静電相互作用(例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合)、ファンデルワールス相互作用(例えば、双極子-双極子、双極子誘導双極子、ロンドン分散)、リングスタッキング(パイ効果)、疎水性相互作用等)によって間接的であってもよい。
【００７７】
「抗体」は、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ミュー定常領域遺伝子、及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類される。これらは、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEをそれぞれ定義する。通常、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性と親和性において最も重要である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体の断片は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダ等を含む異なる生物に由来してもよい。本発明の抗体は、該抗体の所望の機能(例えば、グリコシル化、発現、抗原認識、エフェクター機能、抗原結合、特異性等)を改良または調節するために1つまたは複数のアミノ酸位置で修飾または変異された抗体を含んでもよい。
【００７８】
例示的な免疫グロブリン(抗体)構造的単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一のペアで構成され、各ペアは1つの「軽い」鎖(約25 kD)と1つの「重い」鎖(約50〜70 kD)を持つ。各鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。
【００７９】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化によって生成されるいくつかのよく特徴付けられた断片として存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化して、F(ab)’2を生成する。これは、それ自体がジスルフィド結合によってVH-CH1に結合した軽鎖であるFabの二量体である。該F(ab)’2は、穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断し、それによってF(ab)’2二量体をFab’単量体に変換する。該Fab単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を備えたFabである(基礎免疫学,第3版, Paul編集,1993を参照)。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されているが、当業者は、化学的な方法にまたは組換えDNA方法論でそのような断片を新たに合成できることを理解するであろう。従って、本明細書で使用される抗体という用語は、抗体全体の修飾によって生成され、または組換えDNA方法論(例えば、一本鎖Fv)を使用して新たに合成された抗体断片、または、単量体またはファージディスプレイライブラリー(例えば、McCaffertyら、Nature 348：552-554(1990)を参照)を使用して同定されたものも含む。
【００８０】
本発明の適切な抗体（例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体）を調製するために、また、本発明に従って使用するために、当技術分野で知られている多くの技術(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256：495-497(1975)、Kozborらの「最新免疫学」4：72(1983)、Coleらの「モノクローナル抗体及びがん治療」（pp.77-96）、Alan R. Liss,Inc.(1985)、Coliganの「免疫学における現在のプロトコル」(1991)、Harlow & Laneの「抗体、実験マニュアル」(1988)、及びGodingの「モノクローナル抗体：原則と実践」(第2版,1986))を使用することができる。目的抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローン化することができる。例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローン化することができ、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーは、ハイブリドーマまたは形質細胞からも製作できる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する(例えば、Kuby,Immunology(第3版1997)を参照)。一本鎖抗体または組換え抗体を産生するための技術(米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号)を、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するように適合させることができる。また、遺伝子組み換えマウス、または他の哺乳動物等の他の生物を使用して、ヒト化またはヒト抗体を発現させることができる(例えば、米国特許第5,545,807、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、Marksら, Bio/Technology 10:779-783 (1992)、Lonbergら, Nature 368:856-859(1994)、Morrison, Nature 368:812-13(1994)、Fishwildら, Nature Biotechnology 14:845-51(1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)、及び Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照)。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択した抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーFab断片を同定することができる(例えば、McCafferty ら,Nature 348：552-554(1990)、Marksら,Biotechnology 10：779-783(1992)を参照)。抗体は二重特異性にすることもでき、即ち、2つの異なる抗原を認識できる(例えば、WO 93/08829、Trauneckerら,EMBO J.10：3655-3659(1991)、及びSureshら, Methods in Enzymology 121：210(1986)を参照)。抗体はまた、ヘテロ抱合体であってもよい。例えば、2つの共有結合した抗体、または免疫毒素(例えば、米国特許第4,676,980号、WO 91/00360、WO 92/200373、及びEP 03089を参照)。
【００８１】
非ヒト抗体をヒト化または霊長化するための方法は、当技術分野でよく知られている(例えば、米国特許第4,816,567号、第5,530,101号、第5,859,205号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、第5,777,085号、第6,180,370号、第6,210,671号、及び第6,329,511号、WO 87/02671、EP特許出願0173494、 Jonesら(1986)Nature 321：522、及びVerhoyenら, (1988) Science 239：1534)。ヒト化抗体は、例えば、WinterとMilstein,(1991) Nature 349：293にさらに記載されている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と呼ばれ、通常、移入可変ドメインから取得される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のCDRまたはCDR配列に置き換えることにより、Winterらの方法(例えば, Morrisonら, PNAS USA, 81:6851-6855(1984)、Jonesら, Nature 321:522-525(1986)、Riechmannら, Nature 332:323-327 (1988)、MorrisonとOi, Adv. Immunol.,44:65-92 (1988)、Verhoeyenら, Science 239:1534-1536(1988)、及び Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)、Padlan, Molec.Immun.,28:489-498 (1991)、Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217(1994)を参照)に従って本質的に実行することができる。従って、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基及びおそらくいくつかのFR残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第1の配列及び所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第2の配列セットを含むポリヌクレオチドは、合成的に、または適切なcDNA及びゲノムDNAセグメントを組み合わせて生成することができる。ヒト定常領域DNA配列は、様々なヒト細胞から周知の手順に従って単離することができる。
【００８２】
「キメラ抗体」は、一種の抗体分子であり、(ａ)その定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、それにより、抗原結合部位(可変領域)が、異なるクラスまたは変更されたクラスの定数領域、エフェクター機能及び/または種、または、キメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等）にリンクされている。または(b)前記可変領域またはその一部が、異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、または交換されている。本発明の好ましい抗体及び本発明に従って使用するための好ましい抗体には、ヒト化及び／またはキメラモノクローナル抗体が含まれる。
【００８３】
治療薬を抗体に抱合させるための技術は、周知されている(例えば、 Arnon らの「モノクローナル抗体及び癌治療における薬物の免疫標的化のためのモノクローナル抗体」,Reisfeld ら編集, pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、 Hellstromらの「制御されたドラッグデリバリーにおけるドラッグデリバリーのための抗体」(第2版)、Robinson ら編集, pp.623-53 Marcel Dekker, Inc. 1987)、Thorpeの「癌治療における細胞毒性剤の抗体担体：モノクローナル抗体の総説」1984:生物学的及び臨床応用、Pincheraら編集, pp.475-506 (1985)、 及び Thorpeらの「抗体毒素抱合体の調製及び細胞毒性」,Immunol.Rev., 62:119-58 (1982)を参照)。
【００８４】
抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「特異的に(または選択的に)免疫反応する」という句は、タンパク質またはペプチドを指す場合、多くの場合ではタンパク質や他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を測定できる結合反応を指す。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10倍〜100倍を超えて特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択された抗体が必要である。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とは免疫反応性ではないポリクローナル抗体のみを取得するように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成することができる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている。特定の免疫反応性を測定するために使用できるイムノアッセイのフォーマット及び条件の説明については、例えば、Harlow & Laneの「抗体の使用、実験マニュアル」(1998)を参照されたい。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、「生理学的に許容される」及び「薬理学的に許容される」と同義的に使用される。医薬組成物は、一般に、貯蔵中の緩衝及び保存のための薬剤を含み、投与経路に応じて、適切な送達のための緩衝液及び担体を含むことができる。
【００８６】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和された形態は、溶媒和されていない形態と同等であり、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形態またはアモルファス形態で存在してもよい。一般に、全ての物理的形態は、本発明によって企図される使用と同等であり、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００８７】
「PTPR」、「RPTP」または「rPTP」(全ての用語が等しい)は、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素として自然界に見られる受容体タンパク質チロシン脱リン酸化酵素を指す。
【００８８】
「PTPRS」は、プロテインチロシン脱リン酸化酵素(PTP)ファミリーの一員であるプロテインチロシン脱リン酸化酵素受容体タイプS(またはシグマ)を指す。PTPRSのアミノ酸配列は、例えば、UniProtKB/Swiss-Prot受入番号Q13332及びBOV2N1、ならびに配列番号:4に見出すことができる。PTPRSの核酸配列は、例えば、GenBank受入番号NC_000019.9に見出すことができる。PTPRSは、細胞内ドメイン(例えば、配列番号:8のアミノ酸残基1304〜1948または配列番号:4のアミノ酸残基1279〜1907)、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号:8のアミノ酸残基1283〜1303または配列番号:4のアミノ酸残基1258〜1278）、及び細胞外ドメイン(例えば、配列番号:9または配列番号:10)を含む。膜貫通ドメインという用語は、膜に埋め込まれ、任意選択で膜にまたがるタンパク質またはポリペプチドの部分を指す。細胞内ドメインという用語は、細胞の細胞質にまで及ぶタンパク質またはポリペプチドの部分を指す。細胞外ドメインという用語は、細胞外環境にまで及ぶタンパク質またはポリペプチドの部分を指す。PTPRSの細胞外ドメインには、免疫グロブリン様ドメイン1(Ig1)、免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)、及び免疫グロブリン様ドメイン3(Ig3)が含まれる。Ig1のアミノ酸配列には、配列番号:4のアミノ酸残基30〜127、配列番号:8のアミノ酸残基30〜127、またはアミノ酸配列EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE(配列番号:1)、または配列番号:5のアミノ酸配列が含まれる。Ig2のアミノ酸配列には、配列番号:4のアミノ酸残基128〜231、配列番号:8のアミノ酸残基128〜244、またはアミノ酸配列DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA(配列番号:2)、または配列番号:6のアミノ酸配列が含まれる。Ig3のアミノ酸配列には、配列番号:4のアミノ酸残基232〜321、または配列番号:8のアミノ酸残基245〜334またはアミノ酸配列PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTDVKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA(配列番号:3)、または配列番号:7のアミノ酸配列が含まれる。
【００８９】
「RPTPのタンパク質レベル」は、そのタンパク質形態(その前駆体RNA形態とは区別される)におけるRPTPの(相対的または絶対的な)量を指す。RPTPのタンパク質は、全長タンパク質(例えば、遺伝子の完全なコード領域から翻訳されたタンパク質。これには翻訳後修飾も含まれる場合がある)、全長タンパク質の機能的断片(例えば、アッセイで活性または機能を有する全長タンパク質のサブドメイン)、または全長タンパク質の任意のペプチドまたはオリゴペプチドであってもよいRPTPのタンパク質断片を含んでもよい。
【００９０】
「RPTPのRNAレベル」は、RPTPを形成するために翻訳され得る存在するRNAの(相対的または絶対的な)量を指す。RPTPのRNAは、全長RPTPを形成するのに十分な全長RNAであってもよい。RPTPのRNAはまた、全長RNAの断片であってもよい。これにより、全長RPTPの断片を形成する。全長RNAの断片は、RPTPの機能的断片を形成してもよい。いくつかの実施形態では、RPTPのRNAは、RPTP遺伝子の全てのスプライス変異体を含む。PTPRSのスプライス変異体は、Pulido R、Serra-Pages C らの「膜貫通型タンパク質チロシン脱リン酸化酵素のLAR/PTPデルタ/PTPシグマサブファミリー：複数のヒトLAR、PTPデルタ、及びPTPシグマアイソフォームは組織特異的に発現し、LAR相互作用タンパク質LIP.1と関連している。」Proc Natl Acad Sci USA. 1995、Dec 5; 92(25)：11686-90に提供されている。
【００９１】
「自己免疫治療薬」は、治療有効用量または量で被験者に投与されたときに自己免疫疾患を治療または予防する分子(例えば、抗体、核酸、阻害性核酸、合成化学品、化学低分子)である。いくつかの実施形態では、自己免疫治療薬は、RPTP結合剤である。
【００９２】
腫瘍壊死因子(TNF、カケキシン、カケクチン、腫瘍壊死因子α、TNF-α、またはTNFα)は、全身性炎症に関与する細胞シグナル伝達タンパク質(サイトカイン)であり、急性期反応を構成するサイトカインの1つである。これは、CD4 +リンパ球、NK細胞、好中球、肥満細胞、好酸球、ニューロン等、他の多くの細胞タイプによって産生される可能性があるが、主に活性化マクロファージによって産生される。TNFは、TNFスーパーファミリーの一員であり、相同なTNFドメインを持つ様々な膜貫通タンパク質で構成されている。
【００９３】
インターロイキン(ILs)は、白血球(leukocyte)によって発現されることが最初に見られたサイトカインのグループ(分泌タンパク質及びシグナル分子)である。ILは、構造的特徴の区別に基づいて4つの主要なグループに分類できる。しかし、それらのアミノ酸配列の類似性はかなり低い(通常15〜25％の同一性)。ヒトゲノムは、50を超えるインターロイキンと関連タンパク質をコードしている。免疫系の機能は、主にインターロイキンに依存しており、それらの多くのまれな欠陥が報告されており、全て自己免疫疾患または免疫不全を特徴としている。インターロイキンの大部分は、ヘルパーCD4 Tリンパ球、単球、マクロファージ、及び内皮細胞を介して合成される。それらは、Tリンパ球とBリンパ球、及び造血細胞の発達と分化を促進する。
【００９４】
インターロイキン6(IL-6)は、炎症誘発性サイトカインと抗炎症性ミオカインの両方として機能するインターロイキンである。ヒトでは、IL-6遺伝子によってコードされている。また、骨芽細胞は、IL-6を分泌して破骨細胞の形成を刺激する。多くの血管の中膜の平滑筋細胞も、炎症誘発性サイトカインとしてIL-6を産生する。抗炎症性ミオカインとしてのIL-6の役割は、TNF-αとIL-1に対する阻害効果、及びIL-1raとIL-10の活性化によって媒介される。
【００９５】
本明細書で定義されるように、タンパク質−阻害剤相互作用に関する「阻害」、「阻害する」、「阻害している」等の用語は、阻害剤の非存在下でのタンパク質の活性または機能と比較して、タンパク質の活性または機能に悪影響(例えば、減少させる) を与えることを意味する。実施形態では、阻害は、阻害剤の非存在下でのタンパク質の濃度またはレベルと比較して、タンパク質の濃度またはレベルに負の影響を与える(例えば、減少させる)ことを意味する。実施形態では、阻害は、疾患または疾患の症状の軽減を指す。実施形態では、阻害は、特定のタンパク質標的の活性の低下を指す。従って、阻害には、少なくとも部分的に、刺激を部分的または完全に遮断すること、活性化を減少、防止、または遅延させること、またはシグナル伝達または酵素活性またはタンパク質の量を不活性化、脱感作、または減少させることが含まれる。実施形態では、阻害は、直接相互作用に起因する標的タンパク質の活性低下を指す(例えば、阻害剤は標的タンパク質に結合する)。実施形態では、阻害は、間接的相互作用からの標的タンパク質の活性低下を指す(例えば、阻害剤は、標的タンパク質を活性化するタンパク質に結合し、それにより、標的タンパク質の活性化を妨げる)。理論に拘束されたくないが、いくつかの実施形態では、前記阻害剤は、タンパク質をその正しい作用部位から、及び／またはその基質の近くから除去するか、またはタンパク質をその正しい作用部位に導くことによって作用する。
【００９６】
「阻害剤」、「抑制因子」または「拮抗剤」または「ダウンレギュレーター」という用語は、交換可能に、所与の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を検出可能に低下させることができる物質を指す。拮抗剤は、拮抗剤の非存在下での対照と比較して、発現または活性を10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上減少させることができる。特定の例において、発現または活性は、拮抗剤の非存在下での発現または活性よりも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、またはそれよりも低い。
【００９７】
インターロイキン6(IL-6)は、炎症誘発性サイトカインと抗炎症性ミオカインの両方として機能するインターロイキンである。IL-6は、リガンド結合IL-6Rα鎖(CD126)とシグナル伝達成分gp130(CD130とも呼ばれる)からなる細胞表面I型サイトカイン受容体複合体を介してシグナルを伝達する。CD130は、白血病抑制因子(LIF)、毛様体神経向性因子、オンコスタチンM、IL-11、及びカルジオトロフィン-1を含むいくつかのサイトカインの一般的なシグナル伝達物質であり、ほとんどの組織でほぼ遍在的に発現している。IL-6阻害剤をIL-6またはその受容体に誘導することができる。
【００９８】
トシリズマブ、またはアトリズマブは、主に関節リウマチ(RA)及び全身性若年性特発性関節炎(小児の重症型関節炎)の治療のための免疫抑制薬である。トシリズマブは、インターロイキン6受容体(IL-6R)に対するヒト化モノクローナル抗体である。この薬は、1つまたは複数の疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)に対して不十分な反応を示した、中等度から重度の活動性関節リウマチ(RA)の成人患者に処方される。有効量：IVによるRAの治療では、成人での投与量は、4週間に1回の60分間の単回点滴として4 mg/kg IVであり、その後、臨床反応に基づいて、4週間に1回の60分間の単回点滴として8 mg/kgIVに増加する。肝酵素の上昇、好中球減少症、血小板減少症等、特定の用量に関連する検査値の変化を管理するには、8 mg/kgから4 mg/kgへの減少が推奨される。推奨される最大用量は、1回の注入あたり800 mgである。SCによるRAの治療では、100 kg未満の患者では、162 mgを隔週で皮下投与し、その後、臨床反応に基づいて毎週に増加する。100 kg以上の患者の場合、毎週162 mgを皮下投与する。特定の用量関連の検査値の変化(例えば、肝酵素の上昇、好中球減少症、血小板減少症)の場合、用量の中断または毎週から隔週への投与頻度の減少が推奨される。
【００９９】
サリルマブ、またはケブザラは、インターロイキン6受容体に対するヒトモノクローナル抗体であり、1つまたは複数の疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)に失敗した18歳以上の患者において、中等度から重度の活動性関節リウマチの症状を軽減し、構造的損傷の進行を遅らせる。有効量：成人の関節リウマチの投与量は、1日1回皮下に100 mgである。
【０１００】
腫瘍壊死因子(TNF、カケキシン、またはカケクチン;腫瘍壊死因子αまたはTNFα)は、全身性炎症に関与する細胞シグナル伝達タンパク質(サイトカイン)であり、急性期反応を構成するサイトカインの1つである。CD4 +リンパ球、NK細胞、好中球、肥満細胞、好酸球、ニューロン等、他の多くの細胞タイプによって産生される可能性があるが、主に活性化マクロファージによって産生される。TNFはTNFスーパーファミリーの一員であり、相同なTNFドメインを持つ様々な膜貫通タンパク質で構成されている。TNFは、TNFR1(TNF受容体タイプ1; CD120a; p55/60)及びTNFR2(TNF受容体タイプ2; CD120b; p75/80)の2つの受容体に結合できる。TNFR1は55-kDaであり、TNFR2は75-kDaである。TNFR1は、ほとんどの組織で発現し、膜結合型と可溶性三量体の両方のTNFによって完全に活性化されるが、TNFR2は、通常免疫系の細胞に見られ、膜結合型のTNFホモ三量体に応答する。TNFは、炎症反応を促進し、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、乾癬、化膿性汗腺炎、難治性喘息等の自己免疫疾患に関連する多くの臨床的問題を引き起こす。
【０１０１】
TNF阻害剤は、上記の状態を治療するために使用することができる。この阻害は、TNFαに直接結合するインフリキシマブ(レミケード)、アダリムマブ(ヒュミラ)、セルトリズマブペゴル(シムジア)等のモノクローナル抗体、またはTNFRよりも高い親和性でTNFαに結合するエタネルセプト(エンブレル)等のデコイ循環受容体融合タンパク質を使用して達成できる。
【０１０２】
エタネルセプト(またはエンブレル)、またはその後発生物製剤(例えば、ベネパリ)は、TNF阻害剤として作用して腫瘍壊死因子(TNF)に干渉することにより自己免疫疾患を治療するバイオ医薬品である。エタネルセプトは、TNF-αを阻害することにより、関節リウマチ、若年性特発性関節炎及び乾癬性関節炎、尋常性乾癬及び強直性脊椎炎の治療に使用される。エタネルセプトは、組換えDNAによって生成される融合タンパク質である。 これは、TNF受容体をIgG1抗体の定常末端に融合させる。これは、分子量150 kDaの大きな分子であり、TNFに結合し、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ等の自己免疫疾患を含むヒト及び他の動物の過剰な炎症を伴う障害、及び潜在的に過剰なTNFαによって媒介される他の様々な障害におけるその役割を低下させる。成人関節リウマチにおける有効量：週1回皮下50 mgまたは週2回皮下25 mg。
【０１０３】
アダリムマブ、またはフミラ、またはその後発生物製剤は、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、化膿性汗腺炎、ブドウ膜炎、及び若年性特発性関節炎の治療に使用されるTNFαに対するモノクローナル抗体である。アダリムマブは、腫瘍壊死因子-α(TNFα)を不活性化させることによって機能する疾患修飾性抗リウマチ薬及びモノクローナル抗体である。成人関節リウマチにおける有効量：隔週で40 mgを皮下投与；メトトレキサートを併用していないRA患者の一部は、頻度を増やして毎週40 mgでもよい。
【０１０４】
インフリキシマブ、またはレミケード、またはその後発生物製剤は、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、ベーチェット病等の多くの自己免疫疾患の治療に使用されるTNFαに対するモノクローナル抗体である。成人関節リウマチにおける投与量：0、2、及び6週間でIV誘導レジメンとして3 mg/kgを投与し、その後8週間ごとにIV維持レジメンとして3 mg/kgを投与；不完全な反応を示す患者の場合、最大10 mg/kg IVまで用量を調整し、または4週間ごとに治療を検討してもよい。
【０１０５】
ゴリムマブ、またはシンポニ、またはその後発生物製剤は、免疫抑制薬として使用され、シンポニのブランド名で販売されているTNFαに対するヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の治療薬として使用されている。皮下投与での有効量：月1回50 mg；IVでの有効投与量：0及び4週目で30分間にわたって2 mg/kg、その後は8週間ごと。
【０１０６】
セルトリズマブ、セルトリズマブペゴル、またはシムジア、またはその後発生物製剤は、クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の治療に使用されるTNFαに対するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である。有効量、初期用量：0、2、及び4週目に400 mgを皮下注射し(200 mgを2回皮下注射)、その後隔週で200 mgを皮下注射する。維持量：臨床反応が得られた患者では、4週間ごとに400 mgを皮下投与する。注射部位を回転させる。皮膚に圧痛がある場合、または傷ついた、赤くなった、または硬い部位の皮膚には注射を行わないこと。400 mgの投与量が必要な場合(200 mgを2回皮下注射)、大腿部または腹部の別々の部位に注射すべきである。
【０１０７】
「RPTP結合剤」は、RPTP、RPTPに翻訳可能なRNA、またはRPTPに翻訳可能なRNAに転写可能なDNAに結合する(例えば、優先的に結合する)分子である。分子が優先的に結合する場合、その結合は、生物または細胞に存在する他の高分子生体分子と比較して優先的である。化合物は、例えば、優先的結合が1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10000倍、100,000倍、1,000,000倍大きいである場合、生物または細胞に存在する他の高分子生体分子と比較して優先的に結合する。
【０１０８】
薬剤は、RPTPに結合する(例えば、優先的に結合する)ことによって、RPTP、RPTPをコードする核酸(例えば、RNAまたはDNA)、またはRPTPのタンパク質、RPTPまたはRPTPのタンパク質をコードする核酸(例えば、RNAまたはDNA)を「標的化」することができる。任意選択で、該RPTPはPTPRSである。薬剤は、例えば、標的分子への結合が同様の形態の他の分子への結合よりも大きい場合に、分子に優先的に結合する。いくつかの実施形態では、該優先的結合は、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10000倍、100,000倍、1,000,000倍大きいである。いくつかの実施形態では、結合アッセイまたは実験(例えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、放射性または非放射性標識、免疫沈降、活性アッセイ等)が、単一のRPTPS、単一のRPTPの核酸(RNAまたはDNA等)、または単一のRPTPのタンパク質との相互作用のみまたは主に相互作用を明らかにする場合、薬剤は、RPTP、RPTPの核酸(RNAやDNA等)、またはRPTPのタンパク質を標的化する。薬剤はまた、RPTP、RPTPの核酸（例えば、RNAまたはDNA）、またはRPTPのタンパク質に結合することによって、薬剤が存在しない場合と比較して細胞または生物中のRPTPの量を減少または増加させることによって、またはRPTPと生理学的または天然のリガンドとの間の相互作用を減少させることによって、RPTP、RPTPの核酸（例えば、RNAまたはDNA）、またはRPTPSのタンパク質を「標的化」することができる。本明細書で提供されるガイダンスを使用して、当業者は、薬剤が細胞または生物中のRPTPの量を減少させるか増加させるかを容易に決定することができる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、状態、疾患または障害、または状態、疾患または障害に関連する症状を「治療する」またはその「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチを指す。有益なまたは望ましい臨床結果は、1つまたは複数の症状または状態の緩和または改善、状態、障害または疾病程度の減少、状態、障害または疾病状態の安定化、状態、障害または疾病発症の予防、状態、障害または疾病蔓延の防止、状態、障害または疾患進行の遅延または緩徐、状態、障害または疾病発症の遅延または緩徐、状態、障害または病状の改善または緩和、それらの部分的または全体的な寛解を含むことができるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療しない場合に予想されるよりも被験者の生存延長を意味することができる。「治療」はまた、状態、障害または疾患の進行を阻害し、状態、障害または疾患の進行を一時的に遅らせることを意味することができるが、場合によっては、状態、障害または疾患の進行を永久に停止させることを含む。本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、または「治療している」という用語は、タンパク質分解酵素の発現を特徴とする疾患または状態の１つまたは複数の症状またはタンパク質分解酵素の発現を特徴とする疾患または状態の症状の影響を低減する方法を指す。従って、本開示の方法において、治療は、確立された疾患、状態、または疾患または状態の症状の重症度の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％の軽減を指すことができる。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、被験者における疾患の１つまたは複数の症状が10％減少した場合の治療であると見なされる。従って、前記減少は、天然レベルまたは対照レベルと比較して、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、または10％〜100％の間の任意の百分率の減少であってもよい。治療は、必ずしも疾患、状態、または疾患または状態の症状の治癒または完全な切除を指すとは限らないことが理解される。さらに、本明細書で使用される場合、減少、低減、または阻害への言及には、対照レベルと比較して10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上の変化が含まれ、そのような用語には、完全な排除が含まれる場合があるが、必ずしも含まれるとは限らない。関節炎等の疾病の症状には、滑膜炎、骨糜爛、軟骨枯渇等がある。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「PTPRS抗クラスタリング剤」等の用語は、PTPRSタンパク質の二量体化、オリゴマー化、またはクラスター化のレベルの低下を引き起こすことができる薬剤(例えば、低分子、抗体を含むタンパク質等)を指す。いかなる理論にも拘束されたくないが、HSによるPTPRSのクラスター化は、不活性な二量体または他のオリゴマー形態を生じさせる可能性があると考えられている。従って、PTPRS抗クラスタリング剤の作用は、PTPRSのクラスター化された(例えば、二量体化またはオリゴマー化された)形態と比較して活性を取り戻す単量体PTPRSをもたらす。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、本明細書に記載されるように、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む非酵素的組換えタンパク質である。任意選択で、該非酵素的組換えタンパク質は、PTPRSの細胞外ドメインである。特定の理論に拘束されることなく、PTPRSの細胞外ドメインまたはその一部がPTPRSをHSから置換する。これは、PTPRSを活性化し、ベータカテニン及び他の基質(滑膜細胞のエズリン等)の脱リン酸化、及び下流のFLS浸潤性及び炎症誘発性作用の阻害につながる可能性がある。これは、ここで提供される実施例とデータによってサポートされている。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗PRPRS抗体またはその断片である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗PTPRSアプタマーである。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗ヘパラン硫酸抗体またはその断片である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗ヘパラン硫酸アプタマーである。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸ではない。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸模倣物、またはコンドロイチン硫酸と同じまたは同様の作用機序を有する薬剤ではない。他の実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸模倣物である。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「非酵素的組換えタンパク質」という用語は、酵素活性を有さない組換えタンパク質(例えば、該タンパク質が生物学的触媒として機能しない)を指す。従って、いくつかの実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、該PTPRSの細胞外ドメイン部分のみを含み、該PTPRSの酵素的部分を含まない。実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、該PTPRSの細胞外ドメイン部分のみを含み、該PTPRSの酵素的部分または該PTPRSの膜貫通部分を含まない。いくつかの実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、一緒に連結されたPTPRSの2つ以上の細胞外ドメインを含む(例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも5個、少なくとも10個、約2〜50または100個、約3〜50または100個のアミノ酸、または約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100個のアミノ酸のアミノ酸リンカーによって連結され、ここで、該アミノ酸配列は、PTPRSリガンド結合の細胞外ドメインを妨害しないように設計されている)。「PTPRSの細胞外ドメイン」という用語は、PTPRSの細胞外ドメインのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含むことができる。従って、前記非酵素的組換えタンパク質は、該PTPRSの細胞外ドメインの一部を含むことができる。例えば、該タンパク質は、PTPRSの1つまたは複数の免疫グロブリン様ドメイン（例えば、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:6及び／または配列番号:7、またはそれらのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体）を含む。前記PTPRSの細胞外ドメインは、典型的には、ヘパラン硫酸等のPTPRSリガンドに結合する(例えば、特異的に結合する)ことができる。任意選択で、前記PTPRSの細胞外ドメインは、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン１(Ig1)、免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)、及び免疫グロブリン様ドメイン3(Ig3)のうちの１つまたは複数、またはそれらのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。任意選択で、前記PTPRSの細胞外ドメインは、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン1(Ig1)及び免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)の一方または両方、またはそれらのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。
【０１１２】
任意選択で、前記タンパク質は、配列番号:4のIg1アミノ酸残基39〜124、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。任意選択で、前記タンパク質は、EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE(配列番号:1)、または配列番号:5として示されるアミノ酸配列、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。
【０１１３】
任意選択で、前記タンパク質は、配列番号:4のIg2アミノ酸残基152〜233、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。任意選択で、前記タンパク質は、DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA(配列番号2)、または配列番号:6として示されるアミノ酸配列、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。
【０１１４】
任意選択で、前記タンパク質は、配列番号:4のIg3アミノ酸残基259〜327、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。任意選択で、前記タンパク質は、PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTDVKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA(配列番号:3)、または配列番号:7として示されるアミノ酸配列、またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインまたはその一部のアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、膜貫通ドメインを欠き、かつ／または細胞内ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインまたはその一部のアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、膜貫通ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、PTPRSの細胞外ドメインまたはその一部のアミノ酸配列を含む非酵素的組換えタンパク質は、細胞内ドメインを欠いている。
【０１１６】
任意選択で、提供されるPTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する(例えば、特異的に結合する)。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRSタンパク質のオリゴマー化またはクラスタリングを防ぎ、例えば、PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRSタンパク質の二量体化を防ぐ。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRS活性を調整し、例えば、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRSの脱リン酸化酵素活性を増加させる。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、脱リン酸化酵素をその基質またはその作用部位から除去する。
【０１１７】
本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される薬剤を含む組成物である。本明細書で提供されるのは、PTPRS抗クラスタリング剤、TNF阻害剤、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書で提供されるのは、PTPRS抗クラスタリング剤、IL-6阻害剤、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。提供される組成物は、追加の薬剤を含むことができる。前記提供される組成物は、任意選択で、in vitroまたはin vivoでの製剤及び投与に適している。任意選択で、該組成物は、１つまたは複数の提供される薬剤及び薬学的に許容される担体を含む。適切な担体及びそれらの製剤は、Remington：「薬学と実践」, 第21版, David B. Troy編集, Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的にまたは他の方法で望ましい材料を意味し、即ち、該材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、それが含まれる医薬組成物の他の成分と有害な方法で相互作用したりすることなく、被験者に投与される。被験者に投与される場合、該担体は、有効成分の分解を最小限に抑え、該被験者における有害な副作用を最小限にするように任意に選択される。
【０１１８】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤は、併用相乗量で投与される。本明細書で使用される「併用相乗量」は、相乗効果(即ち、相加効果よりも大きい効果)をもたらす第1の量(例えば、PTPRS抗クラスタリング剤の量)及び第2の量(例えば、TNFまたはIL-6阻害剤の量)の合計を指す。従って、本明細書で互換的に使用される「相乗作用」、「相乗性」、「相乗的な」、「併用相乗量」、及び「相乗的な治療効果」という用語は、併用で投与された化合物の測定された効果を指し、ここで、該測定された効果は、単剤として単独で投与された各化合物の個々の効果の合計よりも大きい。
【０１１９】
実施形態では、相乗量は、TNFまたはIL-6阻害剤とは別に使用される場合、PTPRS抗クラスタリング剤の量の約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％であってもよい。実施形態では、相乗量は、PTPRS抗クラスタリング剤とは別に使用される場合、TNFまたはIL-6阻害剤の量の約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％であってもよい。
【０１２０】
前記相乗効果は、PTPRS抗クラスタリング活性低下効果及び/またはTNFまたはIL-6活性低下効果であってもよい。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤とTNFまたはIL-6阻害剤との相乗効果は、個別に単独で使用した場合、PTPRS抗クラスタリング剤の減少、またはTNFまたはIL-6の減少の合計よりも、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、 2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％大きな減少(例えば、PTPRS抗クラスタリング活性の低下またはTNFまたはIL-6活性の低下)をもたらす可能性がある。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤とTNFまたはIL-6阻害剤との相乗効果は、個別に単独で使用した場合、PTPRS抗クラスタリング剤の抑制の合計またはTNFまたはIL-6阻害剤よりもPTPRS抗クラスタリング及び/またはTNFまたはIL-6活性に対し、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％大きい阻害をもたらす可能性がある。
【０１２１】
前記PTPRS抗クラスタリング剤とTNFまたはIL-6阻害剤は、随伴に(例えば、混合物として)、別々に、しかし同時に(例えば、別々の静脈内ラインを介して)、または連続して(例えば、１つの薬剤が最初に投与され、続いて第2の薬剤が投与される)のいずれかで組み合わせて投与され得る。従って、組み合わせという用語は、前記PTPRS抗クラスタリング剤とTNFまたはIL-6阻害剤の随伴的、同時的、または連続的な投与を指すために使用される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤が連続に投与される場合、該PTPRS抗クラスタリング剤は第1時点で投与され、そして、前記TNFまたはIL-6阻害剤は第2時点で投与される。ここで、該第1時点は、該第2時点に先行する。該治療のコースは、被験者の特定の特徴及び選択された治療のタイプに応じて、個別に決定するのが最善である。本明細書に開示されるもの等の治療は、1日1回、1日2回、隔週1回、月1回、または治療上有効である任意の適用可能な基準で被験者に投与することができる。該治療は、単独で、または本明細書に開示されるかまたは当技術分野で知られている他の治療と組み合わせて投与することができる。追加の治療として、最初の治療と同時に、異なる時間に、または完全に異なる治療スケジュールで投与することができる(例えば、最初の治療は毎日であり、追加の治療は毎週である)。従って、実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤は、同時にまたは連続して投与される。
【０１２２】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、第1時点で投与され、そして、前記TNFまたはIL-6阻害剤は、第2時点で投与される。該第1時点が前記第2時点に先行する。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約120、90、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、11、9、8、7、6、5、4、3、2または1日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約120日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約90日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約60日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約50日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約40日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約30日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約20日以内である。
【０１２３】
実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約19日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約18日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約17日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約16日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約15日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約14日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約13日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約12日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約11日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約10日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約9日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約7日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約6日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約5日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約4日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約3日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約2日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約１日以内である。
【０１２４】
実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8、10、または12日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約10日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約12日以内である。実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤及びPTPRS抗クラスタリング剤は、前記第2時点で同時的に投与される。実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤及びPTPRS抗クラスタリング剤は、前記第2時点で随伴的に投与される。実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤は、前記第2時点で投与され、PTPRS抗クラスタリング剤は、該第2時点で投与されない。
【０１２５】
実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤は第1時点で投与され、そして、前記PTPRS抗クラスタリング剤は第2時点で投与される。ここで、該第1時点が前記第2時点に先行する。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約120、90、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約120日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約90日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約60日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約50日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約40日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約30日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約20日以内である。
【０１２６】
実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約19日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約18日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約17日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約16日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約15日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約14日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約13日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約12日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約11日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約10日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約9日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約7日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約6日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約5日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約4日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約3日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約2日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約1日以内である。
【０１２７】
実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8、10、または12日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約8日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約10日以内である。実施形態では、前記第2時点は、前記第1時点から約12日以内である。実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤及びPTPRS抗クラスタリング剤は、前記第2時点で同時的に投与される。実施形態では、前記TNFまたはIL-6阻害剤及びPTPRS抗クラスタリング剤は、前記第2時点で随伴的に投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は前記第2時点で投与され、前記TNFまたはIL-6阻害剤は該第2時点では投与されない。
【０１２８】
本明細書で提供される方法によれば、被験者は、本明細書で提供される有効量の2つ以上の薬剤(例えば、PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤)を投与される。「有効量」は、記載された目的(例えば、それが投与される効果を達成すること、疾患(例えば、RA)を治療する、PTPRS活性を誘導すること、及び疾患または状態の１つ以上の症状を軽減すること)を達成するのに十分な量である。「有効量」の例は、疾患(例えば、癌)の１つまたは複数の症状の治療、予防、または軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも呼ばれることがある。1つまたは複数の症状の「軽減」(及びその文法上の同等物)は、症状の重症度または頻度の減少、または症状の排除を意味する。所与のクラスの医薬品の適切な投与量に関するガイダンスは、文献に記載されている。例えば、所与のパラメーターに対して、治療有効量は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％の増加または減少を示す。有効性は、「倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療有効量は、対照に対して少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれ以上の効果を有し得る。正確な量は、治療の目的に依存し、当業者は既知の技術(例えば、Liebermanの「医薬品剤形」(vol.1-3, 1992)、Lloydの「医薬品配合の芸術、科学、技術」(1999)、Pickarの「投与量の計算」(1999)、及びRemingtonの「薬学と実践」第20版、2003、Gennaro編集、Lippincott、Williams & Wilkinsを参照)を用いて確認可能である。
【０１２９】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、または300 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約0.5 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約5 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約10 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約20 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約30 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約40 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約50 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約60 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約70 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約80 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約90 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約100 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約200 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約300 mg/kgの量で投与される。承知されるように、前記量が「mg/kg」と呼ばれる場合、その量は、前記PTPRS抗クラスタリング剤を投与されている被験者の体重１キログラムあたりのミリグラム数である。
【０１３０】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約0.5 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg/kg 、200 mg/kg、または300 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kg〜2 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kg〜3 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kg〜4 mg/kgの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約1 mg/kg〜5 mg/kgの量で投与される。
【０１３１】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約10 mg BID、20 mg BID、30 mg BID、40 mg BID、50 mg BID、60 mg BID、70 mg BID、80 mg BID、90 mg BID、100 mg BID、110 mg BID、120 mg BID、130 mg BID、140 mg BID、150 mg BID、160 mg BID、170 mg BID、180 mg BID、190 mg BID、200 mg BID、210 mg BID、220 mg BID、230 mg BID、240 mg BID、250 mg BID、260 mg BID、270 mg BID、280 mg BID、290 mg BID、または300 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約10 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約20 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約30 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約40 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約50 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約60 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約70 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約80 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約90 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約100 mg BIDの量で投与される。承知されるように、前記量は「bis in die」を表す「BID」と呼ばれる場合、その量は1日2回投与される。
【０１３２】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約110 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約120 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約130 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約140 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約150 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約160 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約170 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約180 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約190 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約200 mg BIDの量で投与される。承知されるように、前記量は「bis in die」を表す「BID」と呼ばれる場合、その量は1日2回投与される。
【０１３３】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約210 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約220 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約230 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約240 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約250 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約260 mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約270mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約280mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約290mg BIDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約300 mg BIDの量で投与される。承知されるように、前記量は「bis in die」を表す「BID」と呼ばれる場合、その量は1日2回投与される。
【０１３４】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約10 mg QD、20 mg QD、30 mg QD、40 mg QD、50 mg QD、60 mg QD、70 mg QD、80 mg QD、90 mg QD、100 mg QD、110 mg QD、120 mg QD、130 mg QD、140 mg QD、150 mg QD、160 mg QD、170 mg QD、180 mg QD、190 mg QD、200 mg QD、210 mg QD、220 mg QD、230 mg QD、240 mg QD、250 mg QD、260 mg QD、270 mg QD、280 mg QD、290 mg QD、または300 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約10 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約20 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約30 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約40 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約50 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約60 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約70 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約80 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約90 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約100 mg QDの量で投与される。承知されるように、前記量は「quaque die」を表す「QD」と呼ばれる場合、その量は1日1回投与される。
【０１３５】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約110 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約120 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約130 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約140 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約150 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約160 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約170 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約180 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約190 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約200 mg QDの量で投与される。承知されるように、前記量は「quaque die」を表す「QD」と呼ばれる場合、その量は1日1回投与される。
【０１３６】
実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約210 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約220 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約230 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約240 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約250 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約260 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約270 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約280 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約290 mg QDの量で投与される。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、約300 mg QDの量で投与される。承知されるように、前記量は「quaque die」を表す「QD」と呼ばれる場合、その量は1日1回投与される。
【０１３７】
前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を、患者の生涯にわたって、1年間、1ヶ月間、または1週間、本明細書に提供される量で投与してもよい。前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を、毎日、毎週、または毎月、本明細書に提供される量で投与してもよい。前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を、28日連続して本明細書に提供される量で投与してもよい。前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を、14日間連続して本明細書に提供される量で投与してもよい。実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤は、BIDまたはQDで投与される。さらなる実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を365、28、または14日連続して同時に投与する。他のさらなる実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤及びTNFまたはIL-6阻害剤を14日間連続して同時に投与する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤またはTNFまたはIL-6阻害剤を毎週または毎月投与する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、エタネルセプト(エンブレル)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は50 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、50 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、アダリムマブ(ヒュミラ)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は40 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、40 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、インフリキシマブ(レミケード)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は3 mg/kg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、3 mg/kg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、ゴリムマブ(シンポニ)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は50 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、50 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、前記TNF阻害剤は、セルトリズマブ、セルトリズマブペゴル(シムジア)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は200 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、200 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。
【０１４４】
本明細書で提供されるのは、第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤及び第2の量のIL-6阻害剤を含む医薬組成物である。ここで、前記第2の量は、前記IL-6阻害剤の治療有効レベル未満である。前記第2の量は、前記IL-6阻害剤の治療有効レベルよりも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％低くすることができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、前記IL-6阻害剤は、トシリズマブ(アトリズマブ)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、該薬物は、静脈内注入で投与され、前記第2の量は4 mg/kg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、4 mg/kg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。いくつかの実施形態では、該薬物は、SCで投与され、前記第2の量は162 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、SCで投与され、162 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。SCによるRAの治療では、100 kg未満の患者では、162 mgを隔週で皮下投与し、その後、臨床反応に基づいて毎週に増加する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、前記IL-6阻害剤は、サリルマブ(ケブザラ)またはその後発生物製剤である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は100 mg未満である。いくつかの実施形態では、前記第2の量は、100 mg未満の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％である。SCによるRAの治療では、100 kg未満の患者では、100 mgを1日1回皮下投与する。
【０１４７】
本明細書で提供されるのは、上記の医薬組成物のいずれかである。ここで、前記第1の量は、前記PTPRS抗クラスタリング剤の治療有効レベル未満である。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRS免疫グロブリン様ドメイン１(Ig1)及び免疫グロブリン様ドメイン2(Ig2)の一方または両方を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、配列番号:4のIg1アミノ酸残基30〜127または配列番号:8のアミノ酸残基30〜127を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE (配列番号:1)または配列番号:5に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、配列番号:4のIg2アミノ酸残基128〜231または配列番号:8のアミノ酸残基128〜244を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA (配列番号:2)または配列番号:6に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、配列番号:4のIg3アミノ酸残基232〜321または配列番号:8のアミノ酸残基245〜334を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTDVKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA (配列番号:3)または配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤のアミノ酸配列は、上記の配列に対して約60％、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の同一性を有し得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、膜貫通ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、細胞内ドメインを欠いている。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、併用相乗量で存在する、第1の量のPTPRS抗クラスタリング剤と第2の量のTNFまたはIL-6阻害剤との上記の組み合わせのいずれか１つの医薬組成物である。
【０１５０】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的毒性のない酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本願の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を、適切にまたは適切な不活性溶媒のいずれかで、十分な量の所望の塩基と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩が含まれる。本願の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、適切にまたは適切な不活性溶媒のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等のような無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデリック、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的毒性のない有機酸に由来する塩が含まれる。アルギネート等のアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツノール酸等の有機酸の塩も含まれる(例えば、Bergeら、Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977)を参照)。当業者に知られている他の薬学的に許容される担体は、本願の組成物に適している。
【０１５１】
投与用の組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解された、本明細書に記載の薬剤を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水等を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質が含まれていない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術で滅菌することができる。これらの組成物は、pH調整剤、緩衝剤、及び毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の生理学的条件に近似するために必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。これらの製剤中の活性剤の濃度は大きく変動しうる。これは、主に体液量、粘度、体重等に基づいて、選択された特定の投与方法及び被験者のニーズに基づいて選択される。
【０１５２】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、ならびに油で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これらの製剤には微生物の増殖を防ぐための防腐剤が含まれている場合がある。
【０１５３】
医薬組成物は、鼻腔内または吸入可能な溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤を介して送達することができる。鼻腔溶液は、滴またはスプレーで鼻腔に投与されるように設計された水溶液であってもよい。鼻腔溶液は、多くの点で鼻分泌物と類似するように調製することができる。従って、鼻腔溶液は通常等張であり、pH 5.5〜6.5を維持するためにわずかに緩衝されていない。さらに、眼科用製剤で使用されるものと同様の抗菌防腐剤及び任意選択で適切な薬物安定剤を製剤に含めることができる。様々な市販の鼻用製剤が知られており、例えば、抗生物質及び抗ヒスタミン剤を含むことができる。
【０１５４】
経口製剤は、例えば、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとる。いくつかの実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を含むか、またはそれらは、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは食品に直接組み込まれ得る。経口治療投与の場合、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハー等の形態で使用され得る。そのような組成物及び調製物は、少なくとも0.1％の活性化合物を含むべきである。組成物及び調製物の百分率は、当然変化させることができ、都合よく、単位重量の約2〜約75%、または好ましくは25〜60%であってもよい。そのような組成物における活性化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。
【０１５５】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。水溶液、特に滅菌水性媒体は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。例えば、1回の投与量を1 mlの等張NaCl溶液に溶解し、1000 mlの皮下注射液に加えるか、所要の注入部位に注射することができる。
【０１５６】
無菌の注射可能な溶液は、活性化合物または構築物を必要な量で適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術を使用して、無菌の注射可能な溶液を再構成するための無菌の粉末を調製することができる。直接注入のためのより多くの、または高度に濃縮された溶液の調製もまた企図される。DMSOは、非常に迅速に浸透するための溶媒として使用でき、高濃度の活性剤を小さな領域に送達する。
【０１５７】
化合物の製剤は、アンプルやバイアル等の単位用量または複数用量の密封容器で提供することができる。従って、組成物は単位剤形であってもよい。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量に細分される。従って、組成物は、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形には、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
組成物は、当技術分野で知られている手順で、投与後に迅速に、持続に、または遅延放出を提供するように製剤化できる。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい場合がある。提供される組成物で使用するのに適した製剤は、Remington：「薬学と実践」, 第21版, David B. Troy編集, Lippicott Williams & Wilkins(2005)に記載されている。
【０１５９】
本明細書で提供されるのは、提供される組成物の１つまたは複数及び使用説明書を含むキットである。任意選択で、該キットは、PTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤またはIL-6阻害剤を含む有効量の組成物の１つまたは複数の用量を含む。任意選択で、該キットは、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体または誘導体を含む非酵素的組換えタンパク質を含む。任意選択で、該キットは、PTPRSの細胞外ドメインの1つまたは複数の部分を含む。任意選択で、前記組成物またはタンパク質は、容器(例えば、バイアルまたはパケット)に存在する。任意選択で、該キットは、炎症性及び／または自己免疫疾患の１つまたは複数の症状を治療または予防するための１つまたは複数の追加の薬剤を含む。任意選択で、該キットは、例えば、注射器、針、管、カテーテル、パッチ等の組成物を投与する手段を含む。該キットはまた、使用前に滅菌及び／または希釈を必要とする製剤及び／または材料を含んでもよい。
【０１６０】
本明細書に記載の組成物及び薬剤は、予防的及び治療的処置の両方に有用である。予防的使用のために、本明細書に記載の治療有効量の薬剤が、早期発症の前または最中に(例えば、自己免疫疾患の最初の徴候及び症状の際に)被験者に投与される。治療的処置は、疾患の診断または発症後に、本明細書に記載の治療有効量の薬剤を被験者に投与することを含む。
【０１６１】
提供されるタンパク質、薬剤及び組成物は、例えばリウマチ性関節炎等の関節炎を含む自己免疫疾患を発症している、または発症するリスクがある被験者の治療に使用するためのものである。任意選択で、前記タンパク質、薬剤、及び組成物は、細胞外マトリックス疾患及び／または線維芽細胞媒介性疾患を発症している、または発症するリスクがある被験者の治療に使用するためのものである。本明細書で使用される場合、「細胞外マトリックス疾患」という用語は、細胞外マトリックス(ECM)または細胞外マトリックスの１つまたは複数の成分に関連する状態、障害または疾患を指す。該細胞外マトリックスは、細胞内コミュニケーションを含むが、これに限定されない他の生物学的機能に関与することに加えて、細胞に構造的支持を提供する。細胞外マトリックスの成分には、プロテオグリカン(例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びケラチン硫酸)、非プロテオグリカン多糖類(例えば、ヒアルロン酸)、繊維、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンが含まれるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、成長因子やサイトカイン等のシグナル伝達分子の貯蔵庫としても機能する。細胞外マトリックス疾患には、ECMの1つまたは複数の機能の調節不全(例えば、細胞内コミュニケーション及び/または運動の調節不全)またはECMの1つまたは複数の成分の調節不全(例えば、ECMの1つまたは複数の成分の活性及び/または産生の増加または減少)に関連する疾患が含まれる。細胞外マトリックス疾患には、ECMの分解及びリモデリングの変化に関連する疾患、及びECMにおける免疫複合体及び他の免疫産物等の薬剤の蓄積の変化(例えば、増加または減少)に関連する疾患も含まれる。細胞外マトリックス疾患には、アテローム性動脈硬化症、癌、アミロイド疾患、糸球体疾患、メサンギウム疾患、炎症状態、及び発達障害が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「線維芽細胞媒介性疾患」という用語は、線維芽細胞の活性または運動に関連する状態、障害、または疾患を指す。線維芽細胞は、ECMとコラーゲンの合成に関与する細胞の一種であり、結合組織の主要な細胞型である。線維芽細胞のタイプには、滑膜線維芽細胞、真皮線維芽細胞、及び間質性線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない。線維芽細胞の主な機能は、ECMの成分を継続的に分泌することにより、結合組織の完全性を維持することである。線維芽細胞媒介性疾患には、線維芽細胞の活性及び／または運動の変化に関連する疾患が含まれる。従って、例えば、線維芽細胞媒介性疾患には、線維芽細胞遊走の変化または線維芽細胞の活性の変化に関連する疾患が含まれる。線維芽細胞の活性には、コラーゲン産生、グリコサミノグリカン産生、網状及び弾性線維産生、サイトカイン産生、及び糖タンパク質産生が含まれるが、これらに限定されない。従って、線維芽細胞媒介性疾患には、コラーゲン、グリコサミノグリカン、網状及び弾性線維、サイトカイン、及び糖タンパク質のうちの1つまたは複数の線維芽細胞による産生の変化に関連する疾患が含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「炎症性疾患」という用語は、異常な炎症(例えば、疾患を患っていない健康な人等の対照と比較して増加したレベルの炎症)を特徴とする疾患または状態を指す。炎症性疾患の例には、自己免疫疾患、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、若年性発症糖尿病、1型糖尿病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、乾癬、シェーグレン症候群、血管炎、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、魚鱗癬、グレーブス眼症、炎症性腸疾患、アジソン病、白斑、喘息、アレルギー性喘息、尋常性ざ瘡、セリアック病、慢性前立腺炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流障害、虚血再灌流障害、脳卒中、サルコイドーシス、移植片拒絶、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化症、強皮症、及びアトピー性皮膚炎が含まれる。
【０１６３】
本明細書に提供されるのは、被験者におけるPTPRS活性を調節する方法である。該方法は、有効量のPTPRS抗クラスタリング剤を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、被験者におけるPTPRS活性を調節する。また、それを必要とする被験者における自己免疫疾患または自己免疫疾患または障害を治療、予防、及び／または改善する方法も提供される。具体的には、被験者の自己免疫疾患を治療する方法が提供される。該方法は、上記のように、治療有効量のPTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤またはIL-6阻害剤を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、被験者における自己免疫疾患を治療する。被験者の自己免疫疾患を治療する方法も提供される。該方法は、PTPRS脱リン酸化酵素活性を増加させる治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、被験者における自己免疫疾患を治療する。自己免疫疾患または障害には、炎症性自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。任意選択で、自己免疫疾患は、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、強皮症、全身性強皮症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、若年発症糖尿病、1型糖尿病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、乾癬、シェーグレン症候群、血管炎、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、グレーブス眼症、炎症性腸疾患、アジソン病、白斑、喘息、またはアレルギー性喘息である。任意選択で、自己免疫疾患は、関節炎、クローン病、強皮症、または関節リウマチである。任意選択で、前記化合物は、上記のようなPTPRS抗クラスタリング剤及びTNF阻害剤またはIL-6阻害剤である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸ではない。任意選択で、前記抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸模倣物、またはコンドロイチン硫酸と同じまたは同様の作用機序を有する薬剤ではない。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗PTPRS抗体またはその断片、抗ヘパラン硫酸抗体、またはコンドロイチン硫酸模倣物である。任意選択で、全体を通して記載されるように、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、PTPRSの細胞外ドメインのアミノ酸配列またはそのサブ配列、一部、相同体、変異体、または誘導体を含む非酵素的組換えタンパク質であってもよい。
【０１６４】
この方法は、有効量の提供される薬剤及び組成物を投与することを含み、有効量の組成物を投与することは、被験者における自己免疫疾患を治療または予防する。本明細書に開示される組成物の投与は、全身投与または局所投与であってもよい。例えば、炎症性自己免疫障害を有する被験者を治療することは、経口または注射可能な形態の医薬組成物を毎日またはそうでなければ定期的なスケジュールで投与することを含み得る。任意選択で、前記薬剤及び組成物は、投与用に製剤化され、滑液への送達のために、及び／または線維芽細胞様滑膜細胞への送達のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、該治療は、任意選択で、例えば、炎症性自己免疫疾患の症状が現れたときにのみ行われる。
【０１６５】
被験者における線維芽細胞の活性を低下させる方法も提供される。該方法は、治療有効量のPTPRS抗クラスタリング剤を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、被験者における線維芽細胞の活性を低下させる。任意選択で、前記抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸模倣物、またはコンドロイチン硫酸と同じまたは同様の作用機序を有する薬剤ではない。いくつかの実施形態では、前記抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸模倣物である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、本明細書で提供される非酵素的組換えタンパク質である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗PTPRS抗体またはその断片、または抗ヘパラン硫酸抗体またはその断片である。任意選択で、前記線維芽細胞の活性は、線維芽細胞遊走を含む。任意選択で、前記線維芽細胞の活性は、コラーゲン産生、グリコサミノグリカン産生、網状及び弾性線維産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生、糖タンパク質産生、またはそれらの組み合わせを含む。任意選択で、前記線維芽細胞の活性は、細胞外マトリックス産生を含む。線維芽細胞には、滑膜線維芽細胞、真皮線維芽細胞、及び間質性線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない。任意選択で、前記線維芽細胞は、滑膜線維芽細胞である。
【０１６６】
いくつかの場合では、前記被験者は、線維芽細胞媒介性疾患を患っている。従って、被験者における線維芽細胞媒介性疾患を治療する方法が提供される。該方法は、治療有効量のPTPRS抗クラスタリング剤を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、該被験者における線維芽細胞媒介性疾患を治療する。任意選択で、前記抗クラスタリング剤は、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸模倣物、またはコンドロイチン硫酸と同じまたは同様の作用機序を有する薬剤ではない。いくつかの実施形態では、前記抗クラスタリング剤は、コンドロイチン模倣物である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、本明細書で提供される非酵素的組換えタンパク質である。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、ヘパラン硫酸に結合する。任意選択で、前記PTPRS抗クラスタリング剤は、抗PTPRS抗体またはその断片、あるいは抗ヘパラン硫酸抗体またはその断片である。線維芽細胞媒介性疾患には、線維症及び線維芽細胞媒介性自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。該線維症は、例えば、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、心筋内線維症、心房線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、腹膜後線維症、腎性全身性線維症、皮膚線維症、または関節線維症であってもよい。前記線維芽細胞媒介性自己免疫疾患は、例えば、クローン病、関節炎、関節リウマチ、及び強皮症であってもよい。
【０１６７】
本明細書で提供されるのは、被験者の細胞外マトリックスを調節する方法である。該方法は、本明細書で提供される有効量の非酵素的組換えタンパク質を被験者に投与することを含む。ここで、投与は、被験者の細胞外マトリックスを調節する。任意選択で、該方法は、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸模倣物、またはコンドロイチン硫酸と同じまたは同様の作用機序を有する薬剤の投与を含まない。細胞外マトリックスの調節には、例えば、細胞外マトリックスの１つまたは複数の成分の調節が含まれる。任意選択で、前記細胞外マトリックス成分は、プロテオグリカン、多糖または繊維からなる群から選択される。任意選択で、前記細胞外マトリックス成分は、プロテオグリカン、例えば、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸である。任意選択で、前記細胞外マトリックス成分は、ヘパラン硫酸である。任意選択で、前記被験者は、細胞外マトリックス疾患を患っている。細胞外マトリックス疾患は既知であり、これらに限定されないが、アテローム性動脈硬化症、癌、アミロイド疾患、炎症状態、及び発達障害が含まれる。任意選択で、前記細胞外マトリックス疾患は、変形性関節症である。任意選択で、前記アミロイド疾患は、アルツハイマー病または炎症関連AAアミロイドーシスである。任意選択で、前記炎症状態は、全身性硬化症または狼瘡である。
【０１６８】
炎症状態、自己免疫疾患、線維芽細胞媒介性疾患、または細胞外マトリックス疾患を患っている被験者の治療を含む本明細書で提供される方法は、炎症状態または自己免疫疾患を治療または予防する１つまたは複数の追加の薬剤の投与を含み得る。例えば、提供される方法は、１つまたは複数の抗炎症剤の投与及び有効量をさらに含むことができる。提供される方法で使用するのに適した追加の薬剤には、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、疾患修飾性抗リウマチ薬、コルチコステロイド、及びビタミンD類似体が含まれるが、これらに限定されない。関節リウマチを治療または予防するための例示的な疾患修飾性抗リウマチ薬には、アザチオプリン、シクロスポリンA、D-ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキサート(MTX)、ミノサイクリン、スルファサラジン(SSZ)、及びシクロホスファミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
薬剤または組成物の組み合わせは、随伴に(例えば、混合物として)、別々に、しかし同時に(例えば、別々の静脈内ラインを介して)または連続して(例えば、１つの薬剤が最初に投与され、続いて第2の薬剤が投与される)のいずれかで投与され得る。従って、組み合わせという用語は、2つ以上の薬剤または組成物の随伴的、同時的、または連続的な投与を指すために使用される。該治療のコースは、被験者の特定の特徴及び選択された治療のタイプに応じて、個別に決定するのが最善である。本明細書に開示されるもの等の治療は、1日1回、1日2回、隔週1回、月1回、または治療上有効である任意の適用可能な基準で被験者に投与することができる。該治療は、単独で、または本明細書に開示されるかまたは当技術分野で知られている他の治療と組み合わせて投与することができる。追加の治療として、最初の治療と同時に、異なる時間に、または完全に異なる治療スケジュールで投与することができる(例えば、最初の治療は毎日であり、追加の治療は毎週である)。
【０１７０】
本明細書で提供される方法によれば、被験者は、有効量の本明細書で提供される１つまたは複数の薬剤の有効量を投与される。有効量と有効投与量という用語は同じ意味で使用される。有効量という用語は、所望の生理学的反応(例えば、炎症の軽減)を生み出すために必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効な量及びスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投与のための投薬量範囲は、疾患または障害の１つまたは複数の症状が影響を受ける(例えば、軽減または遅延する)所望の効果を生み出すのに十分な大きさの範囲である。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の実質的な有害な副作用を引き起こすほど大きくてはならない。一般的に、投与量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患または障害の程度、投与経路、または、他の薬物がレジメンに含まれているかどうかによって変動し、また、当業者によって決定できる。禁忌が発生した場合は、個々の医師が投与量を調整できる。投与量は、変動する可能性があり、1日または数日間、毎日1回または複数回の投与で投与することができる。所与のクラスの医薬品の適切な投与量に関するガイダンスは、文献に記載されている。例えば、所与のパラメーターについて、有効量は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、または少なくとも100％の増加または減少を示す。有効性は、「倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療有効量は、対照に対して少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれ以上の効果を有し得る。正確な用量及び製剤は治療目的に依存し、当業者は既知の技術（例えば、Liebermanの「医薬品剤形」(vol.1-3、1992);Lloydの「医薬品配合の芸術、科学及び技術」(1999);Remingtonの「科学と薬局の実践」第20版、Gennaro編集(2003)；及びPickarの「投与量の計算」(1999)を参照)を用いて確認可能である。
【０１７１】
任意選択で、提供された治療方法または被験者におけるPTPRS活性または機能をさらに調節する方法は、被験者から生体試料を取得し、被験者が対照と比較してPTPRSのRNAレベルまたはタンパク質レベルの変化を有するかどうか、被験者が炎症状態、自己免疫疾患、線維芽細胞媒介性疾患または細胞外マトリックス疾患を発症するかまたは発症するリスクがあることを示す変更されたRNAレベルまたは変更されたタンパク質レベルを測定することを含む。任意選択で、該変更されたレベルは、対照と比較して高いレベルである。対照試料または対照値は、試験試料と比較するための参照(通常は既知の参照)として機能する試料を指す。例えば、自己免疫疾患を患っていることが疑われる患者から試験試料を採取し、自己免疫疾患を患っていることが知られている被験者または既知の正常な(非疾患)被験者からの試料と比較することができる。対照は、同様の個人の母集団（例えば、自己免疫疾患の患者や、同様の医学的背景、同じ年齢、体重等の健康な人）から収集された平均値を表すこともできる。対照値はまた、同じ個人から、例えば、以前に得られた試料から、疾患の前に、または治療の前に得ることができる。
【０１７２】
従って、提供されるのは、被験者が炎症状態、自己免疫疾患、線維芽細胞媒介性疾患または細胞外マトリックス疾患を発症するかまたは発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であり、該方法は、被験者から生体試料を取得すること、及び被験者がPTPRSまたはそのアイソフォームのRNAレベルまたはタンパク質レベルが上昇しているかどうかを決定することを含む。RNAレベルの上昇またはタンパク質レベルの上昇は、被験者が自己免疫疾患、炎症性疾患、線維芽細胞媒介性疾患、または細胞外マトリックス疾患を発症しているか、発症するリスクがあることを示す。任意選択で、該提供される方法は、自己免疫疾患を患っている被験者を選択することをさらに含む。任意選択で、該自己免疫疾患は、炎症性自己免疫疾患、例えば、関節炎またはリウマチ性関節炎である。本明細書で使用される場合、生体試料には、細胞、組織、及び体液が含まれるが、これらに限定されない。PTPRS RNAまたはタンパク質の有無、またはレベルを評価するために使用される体液には、全血、血漿、尿、血清、涙、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、水性または硝子体液、初乳、喀痰、羊水、唾液、気管支肺胞洗浄液試料、発汗、漏出液、滲出液、及び滑液が含まれるが、これらに限定されない。任意選択で、前記生体試料は、関節組織または体液に由来する。任意選択で、該提供される方法は、単離された細胞試料を形成する関節組織または体液から細胞を単離することをさらに含む。そのような単離された細胞試料は、滑膜細胞、線維芽細胞、造血細胞、マクロファージ、白血球、T細胞またはそれらの組み合わせを含み得る。任意選択で、前記滑膜細胞は、線維芽細胞様滑膜細胞またはマクロファージ様滑膜細胞である。任意選択で、前記単離された細胞試料は、線維芽細胞様滑膜細胞を含む。
【０１７３】
核酸及びタンパク質、ならびにそのような分子間の相互作用を検出及び同定するための方法は、当技術分野の技術の範囲内に汎用される分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を含む。そのような技術は文献(例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis,「分子クローニング：実験マニュアル」, 第2版, 1989、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.,「動物細胞培養」, R.I. Freshney編集, 1986を参照)に完全に説明されている。
【０１７４】
RNAを検出する方法は、核酸検出アッセイとほぼ累積的であり、例えば、ノーザンブロット、RT-PCR、アレイ(マイクロアレイを含む)、及び配列決定(高処理配列決定法を含む)が含まれる。いくつかの実施形態では、逆転写酵素反応が実施され、次いで、標的配列が、標準的なPCRを使用して増幅される。定量的PCR(qPCR)またはリアルタイムPCR(RT-PCR)は、対照と比較した場合、相対的発現レベルを測定するのに役立つ。定量的PCR技術及びプラットフォームは当技術分野で知られており、市販されている(例えば、qpersymposium.comで入手可能なqPCRシンポジウムのウェブサイトを参照)。核酸アレイは、核酸発現の検出にも有用である。カスタマイズ可能なアレイは、Affymetrix等から入手できる。任意選択で、RNAを検出するための方法は、配列決定法を含む。RNA配列決定は、既知であり、これらに限定されないが、Illumina, Inc., (La Jolla, CA)またはLife Technologies (Carlsbad, CA)が提供するプラットフォームを含む様々なプラットフォームで実行できる。例えば、Wangら, Nat Rev Genet. 10(1)：57-63(2009)及びMartin, Nat Rev Genet. 12(10)：671-82(2011)を参照。
【０１７５】
タンパク質レベルまたは濃度は、ウエスタンブロッティング、ELISA、ELISPOT、免疫沈降、免疫蛍光(FACS等)、免疫組織化学、免疫細胞化学等のタンパク質を定量化するための当技術分野における標準的な方法、ならびに細胞内または細胞によって産生されるタンパク質を定量するために現在知られているまたは後に開発される任意の他の方法によって測定することができる。
【０１７６】
開示されているのは、開示された方法及び組成物に使用できる、組み合わせて使用できる、調製に使用できる、または製品である材料、組成物、及び成分である。これら及び他の材料は、本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々の及び集合的な組み合わせ及び順列の特定の参照は明示的に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、ある方法が開示及び議論され、その方法を含むいくつかの分子に対して行うことができるいくつかの修正が議論される場合、方法のありとあらゆる組み合わせ及び順列、ならびに可能な修正は、特にその逆が示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも具体的に企図され、開示されている。この概念は、開示された組成物を使用する方法の工程を含むがこれらに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。従って、理解されるべきこととして、実行できる様々な追加工程がある場合、これらの追加工程のそれぞれは、開示された方法の任意な特定の方法の工程または方法の工程の組み合わせで実行でき、そのような各組み合わせまたは組み合わせのサブセットは、具体的に企図され、開示されたと見なすべきである。
【０１７７】
本明細書で引用されている刊行物及びそれらが引用されている材料は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
いくつかの実施形態が説明されてきた。しかし、様々な改変がなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は、本特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【０１７９】
実施例1.材料と方法
【０１８０】
ポリペプチド
【０１８１】
実験に以下のポリペプチドを使用した。
【０１８２】
「使用中」(配列番号:16)：
EEPPRFIREPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIDFDESSGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITIHAKLTVLREDQLPPGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRTSGGGSLVPRGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０１８３】
「構築物１」(配列番号:17)：
ETGEEPPRFIREPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIDFDESSGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITIHAKLTVLREDQLPPGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRTSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０１８４】
「Hisタグ付き」(配列番号:18)：
ETGEEPPRFIREPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIDFDESSGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITIHAKLTVLREDQLPPGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRGTKHHHHHH
【０１８５】
ヒト滑膜組織及びFLSの調製
【０１８６】
FLSは、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)の臨床トランスレーショナル研究所(CTRI)バイオリポジトリー、及び昭和大学リウマチ学部から入手した。(52)に記載されているように、滑膜切除術を受けた異なるRA患者からの廃棄された滑膜組織から以前に各株を得た。RAの診断は、1987年に改訂された米国リウマチ学会の基準(53)に準拠した。FLSを採取し、プロトコル＃140175の下でUCSD Institutional Review Board (IRB)に承認された実験に使用し、またはプロトコル＃CB-120-0614の下でLa Jolla Institute for Allergy and Immunology IRBに承認された実験に使用した。全ての患者は、地元のIRBに承認された同意書に署名した。
【０１８７】
10％ウシ胎児血清(FBS; Omega Scientific)、2 mM L-グルタミン、50 μg/mlゲンタマイシン、100ユニット/mlペニシリン、及び100 μg/mlストレプトマイシン(Life Technologies)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning)で、37℃で5％CO2を含む加湿雰囲気中にFLSを培養した。全ての実験で、FLSを継代4〜10の間で使用し、特に記載がない限り、実験前に0.1％FBS(血清飢餓培地)中で細胞を24〜48時間同期させた。
【０１８８】
ヒト皮膚線維芽細胞
【０１８９】
健常人ドナーからの皮膚線維芽細胞株(NHDF)は、記載されているように(54)、国立疾病研究交流(NDRI)から得られた皮膚標本から分離した。FLSと同じ完全DMEM培地及び条件でNHDFを培養した。全ての実験で、NHDFを継代3〜8の間で使用し、分析または機能アッセイの前に0.1％FBSを含む血清飢餓培地中で細胞を24時間同期させた。
【０１９０】
マウスFLS株の調製
【０１９１】
8週齢のBALB/cマウスから肘、膝、足首の関節を分離した。細かく刻んだ組織を穏やかに攪拌しながら、0.5 mg/mlコラゲナーゼIVのRPMI-1640溶液中、37℃で2時間温浸し、そして、10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、50 μg/mlゲンタマイシン、100ユニット/mlペニシリン、及び100 μg/mlストレプトマイシンを含むFLS培地(DMEM)中、37℃で、加湿された5％CO2雰囲気中で、4日間培養した。特に記載がない限り、マウスFLSを継代4〜10の間で使用し、実験前に0.1％FBS(血清飢餓培地)中で一晩同期させた。
【０１９２】
FLS遊走アッセイ
【０１９３】
0.1％FBSを含むDMEM中で集密的なFLSを24時間血清飢餓状態にし、トリプシン温浸で採取し、直径6.5 mm；孔径8 μmのTranswellポリカーボネート培養挿入物(Costar)の上部チャンバーに100 μlの0.5％BSAを含む無血清DMEMに5x104細胞で播種した。10％FBSを含む600 μlのDMEMの24ウェルプレートに挿入物を配置した。該アッセイプレートをFc-Ig1及び2の存在下/非存在下で37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした後、該Transwell挿入物を取り外し、上部チャンバーを綿棒で静かに拭き、非遊走細胞を除去した。Transwell膜をメタノール中に5分間固定し、0.2％クリスタルバイオレットの2％エタノール溶液中に30分間染色した。Motic AE2000顕微鏡を10Xで使用し、細胞を可視化した。ImageJソフトウェア(NIH、バージョン1.8.0_201)を使用し、4つの重複しない視野をカウントし、細胞を定量した。TNF存在下での遊走については、RA FLSを24時間血清飢餓状態にした後、TNF(50 ng/mL)でさらに24時間前処理した。その後、遊走アッセイと同様に細胞を播種した。遊走アッセイ中に、TNF(50 ng/mL)もFc-Ig1及び2と組み合わせて添加した。
【０１９４】
FLS浸潤アッセイ
【０１９５】
浸潤アッセイでは、遊走アッセイと同様に細胞を播種した。ただし、CorningTM BioCoat Matrigel Invasion Transwellチャンバー(Corning)を使用した。アッセイプレートを48時間インキュベートした後、遊走アッセイについて記載したように染色し、可視化した。
【０１９６】
創傷治癒アッセイ
【０１９７】
RA FLSを集密になるまで6ウェルプレートの中で増殖させ、0.1％FBSを含むDMEM中で24時間血清飢餓状態にした。細胞を1 mlのチップで引っ掻き、20または40 nMのFc-Ig1及び2、または媒体対照の存在下で、1％FBSを含むDMEM中でインキュベートした。創傷直後(0時間)及び24時間後に、ソフトウェアToupView 3.7を備えたMotic AE2000顕微鏡を4Xで用いて、4枚の創傷画像を撮影した。ImageJ(NIH、バージョン1.8.0_201)ソフトウェアを用いて創傷面積を計算し、24時間後の創傷面積を0時間の面積に規準化した。
【０１９８】
免疫ブロッティング
【０１９９】
細胞を、1 mMフェニルメタンスルホニルフルオリド、1Xタンパク質分解酵素阻害剤カクテル(Roche)、及びPhosStop(Sigma-Aldrich)を含むTNE緩衝液(50 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、5 mM EDTA [pH 8.0])で溶解した。Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)を用いて、細胞溶解物のタンパク質濃度を測定した。ヤギポリクローナル抗ヒトPTPRS抗体(R&D Systems)及びウサギ抗GAPDH抗体(Cell Signaling)を用いて、免疫ブロッティングを実施した。
【０２００】
シンデカン-4の検出には、ヘパラナーゼI(60 ng/mL)、II(88 ng/mL)、及びIII(90 ng/mL)の組み合わせでRA及びOA FLS株を37℃で1時間処理し、その後細胞をPBSで洗浄し、1X RIPA溶解緩衝液(Cell Signaling Technologies)に溶解した。組換えP.ヘパラヌスヘパラナーゼII及びIII、及び組換えF.ヘパラナムヘパラナーゼIはR&D Systems社から入手した。ヤギポリクローナル抗シンデカン-4抗体(R&D Systems)を用いてシンデカン-4を検出した。
【０２０１】
定量的リアルタイムRT-PCR(qPCR)
【０２０２】
RNeasyキット(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。qRT-PCR用のSuperScript（登録商標）IIIファーストストランド合成SuperMix(Life Technologies)を用いてcDNAを合成した。Bio-Rad CFX384リアルタイムPCR検出システム上で、プライマーアッセイ及びSYBR（登録商標）Green qPCR Mastermix（SABiosciences/Qiagen）を用いて、qPCRを実行した。プライマーアッセイの効率は90％を超えることがメーカーによって保証されていた。各反応を技術的に三通りで測定した。ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)の発現レベルに対して、データを規準化した。結果は、DDCq法での対照試料における発現レベルと比較した変化倍率、またはGAPDHの発現と比較した変化倍率として表される。
【０２０３】
マウス
【０２０４】
全ての動物実験は、La Jolla Institute for Allergy and Immunology 及び UCSD(＃S16098)での、施設内動物管理使用委員会が承認したプロトコル(＃AP140-NB4-0610)に従って実施した。BALB/cバックグラウンドのPTPRSノックアウト(KO)マウスは、(55)で以前に説明されているように作成した。DBA1/J(JAX 000670、DBA1/J)、BALB/c(JAX 000651、BALB/cJ)、及びCD45.1 BALB/c(JAX 006584、CByJ.SJL(B6)-Ptprca/J)は、Jackson Laboratoriesから入手した。C57BL/6バックグラウンドのKRNマウスは、ハーバード大学のChristophe Benoist博士からの寛大な贈り物であった。NODマウスは、Taconicから入手した。
【０２０５】
関節炎モデル
【０２０６】
KRNマウスとNODマウスを交配させ、約6〜7週齢で関節炎を発症した子孫(自発的K/BxNマウス)を得た。関節炎のK/BxNマウスからの血清を、K/BxN血清転移誘発関節炎(STIA)モデル(35)で使用するためにプールした。STIAを誘発するために、6〜8週齢のマウスに100 μlの関節炎誘発性K/BxN血清を腹腔内(i.p.)注射した。血清注射の日から始めて隔日で、臨床スコアリング(以下に説明)及び足首の腫れの測定で関節炎の重症度を評価した。
【０２０７】
コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルを、(56)に記載されているように実行した。簡単に説明すると、8〜10週齢の雄のDBA/1Jを、50 μgの結核菌(H37Ra、ATCC 25177)(CFA、Sigma-Aldrich)を含むフロイントの免疫賦活剤に乳化した100 μgのニワトリII型コラーゲン(Condrex)で免疫した。28日後、不完全フロイント免疫賦活剤(IFA、Sigma-Aldrich)に乳化した100 μgのニワトリII型コラーゲンでマウスを追加免疫した。以下に説明するように臨床スコアリングによって関節炎を評価した。全てのモデルで、以前に説明されているように(57)、手首と足首における関節炎を臨床的にスコアリングした：0=正常; 1=最小限の紅斑と軽度の腫れ；2=中等度の紅斑と軽度の腫れ；3=顕著な紅斑と重度の腫れ、指はまだ関与せず；4=最大の紅斑と腫れ、指が関与する。
【０２０８】
His-Ig1及び2、Fc-Ig1及び2、及びmEtanerceptのinvivo投与
【０２０９】
組換えPTPRS 6xHisIg1及び2(ここではHis-Ig1及び2と呼ぶ)の調製は(21)に記載されている。ヒトIgG1-Fc融合Ig1及び2(ここではFc-Ig1及び2と呼ぶ)の調製は、LakePharma(米国)に委託した。マウスTNF遮断生物学的p75TNFR:Fc(mEtanercept)は、Amgen Extramural Research Alliance Programを通じてAmgenから入手した。トリス緩衝生理食塩水(TBS)または媒体対照(TBS)中のHis-Ig1及び2、120 mM NaClを含む20 mM Tris中のFc-Ig1及び2、またはヒトIgG1-Fc対照及びmEtanercepを、図の凡例に記載されているスケジュールに従って投与した。
【０２１０】
in vivo pDC枯渇
【０２１１】
500 μgの抗PDCA-1(InVivoMAb抗マウスCD317; BioXcell)またはIgGアイソタイプ対照(BioXcell)を2日間隔でi.p.または眼窩後方(r.o.)注射による2回投与でマウスにおけるpDCを枯渇した。
【０２１２】
血清抗コラーゲン抗体レベルの測定
【０２１３】
コラーゲンで免疫されたマウスの血清中の抗コラーゲン抗体レベルは、記載されているように(56)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定した。簡単に説明すると、低結合の96マルチウェルプレート(Costar)をII型ニワトリ胸骨コラーゲン(1 μg/ml; Sigma)でコーティングした。段階希釈された血清をインキュベートし、ビオチン化抗マウスIgG抗体(Jackson Laboratories)及び抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3抗体(Southern Biotech)を用いて、コラーゲンへのIgGの結合を検出した後、エクストラビジン-HRP(Sigma)とインキュベートし、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質で曝露した。Tecan Infinite M1000プレートリーダーを用いて、450 nmにおけるプレートの吸光度を読み取った。
【０２１４】
マウス関節炎関節の組織学的スコアリング
【０２１５】
後足全体を10％ホルマリン中に固定し、脱灰し、トリミングし、包埋した。組織ブロックから切片を作成し、H&E、サフラニン-Oまたはトルイジンブルー(HistoTox)で染色した。組織病理学的スコアリングは、(57)に記載されているように実施した。簡単に言えば、関節炎マウスの関節には、以下の基準に従って、H&E染色に基づいて、炎症について0〜4のスコアを割り当てた：0=正常; 1=関節周囲領域における炎症細胞の最小限の浸潤; 2=軽度の浸潤; 3=中程度の浸潤; 及び4=顕著な浸潤。関節炎マウスの関節には、以下の基準に従って、H&E染色に基づいて、骨吸収について0〜4のスコアを割り当てた：0=正常; 1=最小(吸収の小さな領域、低倍率では容易に判別できない);2=軽度(骨梁または皮質骨においてより多くの吸収領域、低倍率では容易に判別できない);3=中程度(骨梁及び皮質骨の明らかな吸収、皮質の全層欠損なし;いくつかの骨梁の喪失;低倍率で明らかな病変);及び4=顕著(皮質骨の全層欠損及び顕著な小柱骨喪失)。マトリックスのサフラニンOまたはトルイジンブルー染色の減少によって軟骨枯渇を識別し、0〜4のスケールでスコアリングした：0=軟骨破壊なし(サフラニンOによる完全染色)、1=局所的な軟骨糜爛; 2=より広範囲な軟骨糜爛; 3=重度の軟骨糜爛;及び4=軟骨全体の枯渇。盲検法で組織学的分析を実施した。Zeiss Axioscan.Z1(Zeiss)スライドスキャナーを用いて足首全体の画像を得て、Zenソフトウェア(Zeiss)を用いて分析した。
【０２１６】
マイクロコンピューター断層撮影(microCT)
【０２１７】
マウスの足首を10％中性緩衝ホルマリンに入れた。固定後、試料を70％エタノールに移した。スキャンする前に、骨をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に48時間移した。スキャンは、ボクセルサイズ9μm、50 kV/200 mA、0.5 mmアルミニウムフィルターを備えたSkyscan1176マイクロCT(Bruker)で実行した。露光時間は810 msであった。X線投影は、180°の走査角回転と4つの平均フレームの組み合わせで0.4°間隔で取得した。NRECONソフトウェア(Bruker)及びData Viewer(Bruker)を用いて投影画像を3D画像に再構成した。CTアナライザーソフトウェア(Bruker)を用いてデータを処理し、CT-VOXソフトウェア(Bruker)を用いて画像を作成した。骨糜爛は、(56)に記載されているように定量した。
【０２１８】
Fc-Ig1及び2 、及びmEtanerceptの放射性標識
【０２１９】
放射性標識を可能にするために、最初にDOTAで薬剤を機能化し、放射性原子を結合するためのキレート化部位を提供した。Fc-Ig1及び2をDOTA(Tetraxetan)に共有結合させるために、通常0.8 mgのタンパク質を合計1.3 mlのTris pH 7.3、150 mM NaClにおける0.5 mlヘパラン-アガロースビーズ(Sigma)に固定した。DOTA-NHSエステル(Macrocyclics)を0.77 mMの濃度で添加し、室温で30分間インキュベートした。同じ緩衝液で十分に洗浄した後、該タンパク質を750 mM NaCl、20 mM Tris pH 8.3で溶出し、サイズ排除クロマトグラフィー(Bio-Rad SEC 650)でさらに精製し、12〜15 mg/mlに濃縮した。mEtanerceptは、固体支持体への固定が必要ないことを除いて、同様の方法で修飾した。Native PAGEで該反応を定期的に監視した。
【０２２０】
該機能化の工程に続いて、該抱合体をインジウム-111とともに43℃で3時間インキュベートし、P10分離カラムで精製した。
【０２２１】
生体内分布
関節炎モデルで説明されているように、100 uLのK/BxN血清のIP注射によってSTIAを誘発した。血清注入の8日後に発生する関節炎のピーク時に、放射性標識タンパク質の注射及びその後の画像処理を開始した。
【０２２２】
注射及び画像処理の前に、全ての動物をイソフルランで麻酔した。各動物に、1匹あたり約170 uCiの用量で放射性標識剤を静脈内注射した。4匹の関節炎マウスに約170 uCiの111In標識Fc-Ig1及び2を注射し、2つの形態の対照と比較した：280 uCiの111In標識mEtanerceptを注射したさらに5匹の関節炎マウス、及び305 uCiの111In-labeled-Ig1及び2を注射した5匹の非関節炎マウス。注射直後、麻酔を継続しながら、γ-Imager平面ガンマイメージングシステム(Biospace Labs、Nesles la Vallee、フランス)の表面に各動物を緩く拘束した。動物を、背中を下に置き、足をイメージャの上部に緩くテープで固定し、111In照準器を所定の位置に置いた。注射後1時間、6時間、1日、3日、及び5日に各動物を10分間画像化した。各画像には、動物の隣に点光源として配置された、注入された線量の5％の標準も含まれていた。最終的な画像に続いて、マウスを屠殺し、血液、膀胱、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、脳、目、及び足の試料をプラスチック製のシンチレーションバイアルに採取し、秤量し、各バイアルの活性は、Gamma-9000ガンマカウンター(Beckman Coulter、Brea、CA)で測定した。GammaVisionソフトウェアで画像を分析し、Excelで計算し、SigmaPlotでグラフを作成した。関心領域(ROI)を、各時点で後足と標準の周りに描いた。合計数とROI領域を、ROIごとに記録し、Excelに出力した。そこで、全てのカウントが減衰について補正し、各ROIの合計カウントがROI面積で除算し、各足と標準の信号/面積の値を算出した。標準の全ての値を5％に規準化した。これにより、全ての足の値を生のカウントから注射された用量の百分率に変換できる補正係数が算出した。各時点での両方の後足の注射された用量の百分率を一緒に平均し、次に得られた値を各時点で全てのマウスにわたって平均し、プロットした。各臓器のガンマカウンター値を用いて、5日目の臓器摂取あたりの注射された用量の百分率を計算した。72 mL/kg血液の値を使用して、屠殺時に収集された少量から、各動物における血液の総量、従って総信号を計算した。臓器あたりのこれらの注射された用量の百分率の値も比較し、各マウス群にわたってプロットした。
【０２２３】
流動細胞計測法
【０２２４】
リンパ節と脾臓から単細胞懸濁液を調製した。マウスの血液から細胞を分離するために、眼窩後出血(生きている動物から)または心臓穿刺(安楽死させた動物から)を介し、2 mM EDTAのPBS溶液に血液を採取した。eBiosience RBC溶解緩衝液(Thermo Fisher)を使用し、脾臓及びマウスの血液から赤血球を溶解した。滑膜細胞を分離するために、足首関節を採取し、鈍い鉗子で引っ張ることによって脛骨と指を関節離断し、骨髄の汚染を防ぐために骨髄を洗い流した。関節をPBSでリンスし、Liberase TM(Roche)及びDNaseIで、37℃で60分間解離した。抗体染色の前に、細胞をFcブロック(BD Pharmingen)とプレインキュベートした。表面染色には、CD3(17A2)、CD19(6D5)、NK1.1(PK136)、CD11b(M1/70)、CD44(IM7)、Ly6G(1A8)、Ly6C(HK1.4)、CD45.1(A20)、MHCII(M5/114.15.2)、CD64(X54-5/7.1)、CD115(AFS98)に特異的な蛍光色素標識抗体をBiolegendから入手し、CD43(R2/60)、PD1(RMP1-30)、GL7(GL-7)、CD25(PC61.5)、B220(RA3-6B2)、CD317/BST2(eBio927)、CD62L(MEL-14)、CD45.2(104)、TCR-beta(H57-597)、CD8(53-6.7)、CD4(RM4-5)に特異的な蛍光色素標識抗体をeBioscience/Thermo Fisherから入手した。細胞内サイトカイン染色には、細胞を20 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA、Sigma Aldrich)、及び1 μmイオノマイシン(Sigma Aldrich)とともに、ブレフェルジンA(3 microg/mL、eBioscience/Thermo Fisher)の存在下、37℃で5時間インキュベートした。IC固定緩衝液(eBioscience/Thermo Fisher)及び透過化緩衝液(eBioscience/Thermo Fisher)を用いて、細胞内染色を行った。転写因子の細胞内染色には、FoxP3/転写因子染色緩衝液セット(eBioscience/ThermoFisher)を使用した。FoxP3(FJK-16s)、IL-17A(eBio17B7)、及びIFNgamma(XMG1.2)を認識する抗体はeBioscience/Thermo Fisherから入手し、BCL6はBD Bioscienceから入手した。eBioscience/ThermoFisherのFixable Viability色素で染色することにより、死細胞を分析から除外した。
【０２２５】
エベレストソフトウェアを搭載したZE5流動細胞計測器(Bio-Rad)でデータを取得した。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析を行った。細胞選別は、FACSAria III装置(BDBiosciences)で行った。フロー分析では、Mix-n-StainTM抗体標識化キット(Sigma-Aldrich)を用いて、抗マウスPTPRS(MEDIMABS)をAlexaFluor 647で標識化した。
【０２２６】
骨髄の再構成
【０２２７】
骨髄キメラを産生するために、雄のBALB/cByJ(CD45.1遺伝子性)マウスにRS 2000生物学的照射装置を用いて、550 Radを2回致死的に照射し、続いて雄のPTPRS WTまたはKO遺伝子性CD45.2ドナーマウスから骨髄を投与した。照射後8週間にK/BxN血清を投与し、関節炎を誘発した。7週間後、適切なCD45対立遺伝子(抗CD45.1及び抗CD45.2; eBioscience)を染色することにより、流動細胞計測法でキメラ現象を確認した。レシピエントマウスにおける生着割合は95％を超えていた。
【０２２８】
骨髄由来マクロファージのM1及びM2分極
【０２２９】
8〜12週齢のBALB/cマウスから骨髄細胞を分離した。10％FBS、25 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、100 units/mlペニシリン、100 microg/mlストレプトマイシンを含むIMDM培地の6ウェル培養プレートに全骨髄細胞を播種した(ウェルあたり2x106細胞)。非接着細胞をPBSで洗浄し、20 ng/mL M-CSFを含む新しいIMDM培地と交換することにより、24時間後に除去した。培地は3日ごとに交換した。細胞は合計7日間培養した。7日後、BMDMは刺激されないまま(M0)、または、M1分極のために100 ng/mL LPS(Sigma)及び50 ng/mL IFNgamma(Biolegend)またはM2分極のために10 ng/mL IL-4(Biolagend)または10 ng/mL IL-13(Biolegend)のいずれかで刺激した。24時間後にFc-Ig1及び2(20、40、及び80 nM)細胞を採取し、RNeasy Micro Kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。M1関連遺伝子Tnf、Il1b、Nos2、Il12b及びM2関連遺伝子Pparg、Arg1、Retnla及びMrc1の発現をqPCRで分析した。発現をGapdhの発現に規準化した。
【０２３０】
貪食アッセイ
【０２３１】
8〜12週齢のBALB/cマウスから骨髄細胞を単離し、12ウェルプレートで培養し(ウェルあたり1x106細胞)、上記のようにBMDM条件下で培養した。7日後、BMDMを刺激されないまま(M0条件)に、または上記のようにM1またはM2分極条件下に置いた。M1及びM2の分極中にFc-Ig1及び2(20、40、または80 nM)を追加した。24時間後、分極培地を、FBSを含まないIMDMに交換し、細胞をFc-Ig1及び2(20、40、または80 nM)または媒体対照のいずれかの存在下で1時間培養した。1時間後、製造元のプロトコルに従って、pHrodoTM Red E.ColiまたはpHrodoTM Green S. aureus BioParticlesTM (Invitrogen)のいずれかを細胞に添加した。細胞を30分間貪食させた後、細胞を洗浄し、TrypLE Express(Thermo Fisher)を用いてプレートから剥がし、Fixable Viability色素780(Thermo Fisher)で染色し、流動細胞計測法で分析した。氷上でBioparticlesとインキュベートした細胞を、貪食性の陰性対照として使用した。pH感受性色素pHrodoTMは、中性pHでは非蛍光性であるが、食胞に発生する酸性化により明るく蛍光を発す。
【０２３２】
CD4 T細胞分化アッセイ
【０２３３】
EasySepTMマウス未処理CD4+T細胞分離キット(Stem Cell Techonologies)を用いて、8〜12週齢のBALB/cまたはDBA/1Jマウスのプールされた脾臓及びリンパ節から未処理のCD4 T細胞を単離した。Fc-Ig1及び2(20、40、または80 nM)または媒体対照の存在下で、以下に説明する条件を用いて、単離された未処理のCD4T細胞をTh1、Th17、またはiTregのいずれかに分極された。
【０２３４】
Th1細胞の分化のために、可溶性抗CD28(37.51、Biolegend、0.5 microg/mL)、抗IL4(11B11、Biolegend、10 μg/mL)、組換えマウスIL-12(R&D Systems、25 ng/mL)、及び組換えマウスIL-2(R&D Systems、25 ng/mL)を含有する完全RPMI培地(10％FBS、100 units/mLペニシリン、100 microg/mLストレプトマイシン、1X非必須アミノ酸、25 mM HEPES、55 microMベータメルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン)中で、抗CD3(145-2C11、Biolegend、2 microg/ml)コーティングプレート上で1x105未処理CD4T細胞を培養した。Th17細胞の分化のために、可溶性抗CD28(37.51、1 μg/mL)、抗IFNgamma(XMG1.2、Biolegend、10 microg/mL)、抗IL4(11B11、10 μg/mL)、組換えヒトTGFbeta1(R&D Systems、5 ng/mL)、及び組換えマウスIL-6(Biolegend、50 ng/mL)を含有する完全RPMI培地中で、抗CD3(145-2C11、2 microg/ml)コーティングプレート上で1x105未処理CD4T細胞を培養した。iTregの分化のために、可溶性抗CD28(37.51、0.5 microg/mL)及び組換えヒトTGFbeta1(R&D Systems、5 ng/mL)を含有する完全RPMI培地中で、抗CD3(145-2C11、2 microg/ml)コーティングプレート上で1x105未処理CD4T細胞を培養した。細胞をTh分極条件下で5日間培養した。Th1及びTh17分化を確認するため、ブレフェルジンA(Thermo Fisher、3 microg/mL)の存在下でPMA(20 ng/mL)及びイオノマイシン(1 μM)で細胞を4時間刺激し、流動細胞計測法でIFNgamma及びIL-17Aの発現を分析した。iTreg分化を確認するため、FoxP3の発現について流動細胞計測法で細胞を分析した。分極条件なし(Th0)で培養された細胞を分極の対照として使用した。
【０２３５】
2番目の実験では、抗原提示細胞(APC)の存在下で未処理のCD4T細胞の分極を行った。BALB/cマウスから単離された1x105未処理のCD4T細胞を、Th1、Th17、またはiTreg分極条件下で、APCとして1x105照射BALB/c Rag2-KO脾細胞(3,500 rad)及び可溶性抗CD3(145-2C11、Biolegend、5 microg/ml)とともに培養した。上記と同じ分極条件を使用したが、照射されたAPCの存在により可溶性抗CD28を除去した。上記のように、Th1、Th17、及びiTregの分化を確認した。
【０２３６】
遺伝子導入及び二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ
【０２３７】
ATCCから入手したHEK293 T細胞で二重ルフィセラーゼアッセイを実施した。Opti-MEM中のプラスミド1マイクログラムあたり3対1の比率でポリエチレンイミン(PEI)を使用して、集密したHEK293 T細胞に遺伝子導入した。ヒトUSF2の過剰発現ベクターまたは空の対照ベクターは、VectorBuilder Inc.から入手した。USF2の結合部位を含む該PTPRSプロモーター領域(ヒトGRCh37/hg19位置にあるUCSCゲノムブラウザー：chr19：5,340,976-5,341,095)の120塩基対部分を含むルシフェラーゼプロモーター領域レポーターベクターは、VectorBuilder Inc.から入手した。遺伝子導入後、細胞を24時間インキュベートした。Promegaの二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、メーカーのプロトコルに従って、ルシフェラーゼ活性を評価した。レニラルシフェラーゼ活性を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性を規準化した。
【０２３８】
クロマチン免疫沈降
【０２３９】
RA FLSを集密になるまで培養し、24時間血清飢餓状態にし、組換えヒトTNFalpha(50 ng/mL)で6時間刺激するか、刺激しないままにした。次に、細胞を1％ホルムアルデヒドに室温で15分間固定した。超音波処理後、ウサギ抗USF2抗体(NBP2-56717、Novus Biologicals)を使用したPierceTM Magnetic ChIPアッセイキット(Thermo Fisher)で、製造元の取扱説明書に従って、4℃でクロマチンを一晩免疫沈降した。溶出したDNAをPTPRSプロモーター領域PCR及びqPCRに使用した。各条件の10％の入力が規準化に使用した。ヒトPTPRSプロモータープライマー、5'-TCTGCCCCGCTTCACATCG-3'(順方向)(配列番号:19)、及び5'-AGCCGCCACCACCACCACCA-3'(逆方向)(配列番号:20)をIDTから購入し、PowerUp SYBR Green PCRマスターミックス(Thermo Fisher)を備えたChIP qPCR、及びGC緩衝液を備えたOneTaq Hot Start Quick-Load 2Xマスターミックス(New England Biolabs Inc.)を用いたPCRに使用した。
【０２４０】
siRNAを介したノックダウン
【０２４１】
RA FLSを集密(70％)になるまで増殖させ、Human Dermal Fibroblast NucleofectorTMキット(Lonza)を用いて、製造元のプロトコルに従って、ヒトUSF2(Dharmacon)を標的とする1 microgのON-TARGETplus SMARTpoolsiRNAまたは1 microgのON-TARGETplus Non-targeting Pool siRNA(Dharmacon)を遺伝子導入した。簡単に説明すると、siRNAを含有する100 mLのヌクレオフェクター溶液に5x105 RA FLSを再懸濁し、AmaxaヌクレオフェクターIIでプログラムU-23を用いて電気泳動した。遺伝子導入された細胞を、6ウェルプレートで3つの個別のウェルに分割した。24時間後及び48時間後、RNA抽出のために細胞を回収し、USF2及びPTPRSの発現をqPCRで分析し、上記のようにGAPDHの発現に規準化した。対照siRNAで処置されたRA FLSにおける発現に対する発現の変化倍率をDDCT法で計算した。
【０２４２】
統計解析
【０２４３】
実施中の実験で生物学的に関連する差異を検出するのに十分な検出力を達成するために実施されたアッセイの経験に基づいて試料のサイズを選択した。図の凡例に示されているように、二元配置分散分析または一元配置分散分析(ANOVA)、Spearman相関、対応のないt検定、及びMann-Whitney U検定を任意選択で実行した。全ての統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実行した。Pが0.05未満であれば、比較は有意であると見なした。
【０２４４】
実施例2
【０２４５】
滑膜細胞を標的とした関節リウマチの併用療法
【０２４６】
関節リウマチ(RA)及び変形性関節症(OA)線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)において、PTPRS(RPTPσをコードする)発現に対するTNFの効果を研究した。FLSを継代4〜10の間で使用し、細胞を0.1％FBS(血清飢餓培地)の中で24〜48時間同期させた後、50 ng/ml TNFで24時間刺激した。RNeasyキット(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。qRT-PCR用のSuperScript（登録商標）IIIファーストストランド合成SuperMix(Life Technologies)を用いてcDNAを合成した。Bio-Rad CFX384リアルタイムPCR検出システムで、プライマーアッセイ及びSABiosciences/QiagenのSYBR（登録商標）Green qPCR Mastermixを用いてqPCRを実行した。プライマーアッセイの効率は90％を超えることがメーカーによって保証されていた。各反応を技術的に三通りで測定した。ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)の発現レベルに対して、データを規準化した。結果は、DDCq法での対照試料における発現レベルと比較した変化倍率として、またはGAPDHの発現と比較した変化倍率として表される。免疫ブロッティングでは、細胞を1 mMフェニルメタンスルホニルフルオリド、1Xタンパク質分解酵素阻害剤カクテル(Roche)、及びPhosStop(Sigma-Aldrich)を含有するTNE緩衝液(50 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、5 mM EDTA [pH 8.0])に溶解した。Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)を用いて細胞溶解物のタンパク質濃度を測定した。ヤギポリクローナル抗ヒトPTPRS抗体(R&D Systems)及びウサギ抗GAPDH抗体（Cell Signaling）を用いて免疫ブロッティング実施した。図1Aは、TNFの有無にかかわらず、RA(n=3)及びOA(n=3)FLSにおけるPTPRS発現を示す。図1Bは、RA及びOA(n=3)におけるPTPRS発現プールを示す。二元配置分散分析(ANOVA, n. P>0.05)を用いてデータを分析した。
【０２４７】
マウスFLSにおけるTNF誘導RPTPσ発現を研究した。マウスFLSを24時間血清飢餓状態にした後、50 ng/mlのTNFで刺激するか、24時間刺激しなかった。図2Aは、TNF刺激の有無にかかわらず、RA FLS RPTPσタンパク質発現を示す。
【０２４８】
8週齢のBALB/cマウスから肘、膝、足首の関節を分離した。細かく刻んだ組織を穏やかに攪拌しながら、0.5 mg/mlコラゲナーゼIVのRPMI-1640溶液中、37℃で2時間温浸し、そして、10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、50 μg/mlゲンタマイシン、100ユニット/mlペニシリン、及び100 μg/mlストレプトマイシンを含むFLS培地(DMEM)中で、37℃で、加湿された5％CO2雰囲気で、4日間培養した。マウスFLSを継代4〜10の間で使用し、50 ng/ml TNFで刺激する前、または24時間刺激しない前に、0.1％FBS(血清飢餓培地)中で一晩同期させた。RPTPσmRNA発現レベル(N=4)を上記のようにqPCRによって測定した。図2Bは、TNF刺激の有無にかかわらず、マウスFLS RPTPσ mRNAの相対的発現を示す。RPTPσmRNA発現レベル(n=4)をqPCRによって測定した。グラフは、ハウスキーピング遺伝子POLR2Aへの規準化後の平均+/-s.e.m.相対的発現を示す。両側Man-Whitney検定(*, P<0.05)を用いてデータを分析した。TNFの存在下でRPTPσ発現は、OAとRAFLSの両方で減少した。
【０２４９】
Fc-Ig1及び2の「使用中」構築物(TNSAGVRYSSPANLYVRTSGGGSLVPRGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF、配列番号:15)及びFc-Ig1及び2「構築物1」構築物(TNSAGVRYSSPANLYVRTSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF、配列番号:14)のリンカー配列。図3は、「使用中」のFc融合構築物(Doody KMらの「関節リウマチ治療のための標的脱リン酸化酵素依存性プロテオグリカンスイッチ」Sci Transl Med. 2015 May 20; 7(288)：288ra76)で利用されたHisタグ付き構築物のサブクローニングによって最初に産生された。）と「構築物1」(ここに示すほとんどの実施例で使用)との間のアミノ酸配列の相違を示す。「使用中」の構築物は、リンカーにタンパク質分解酵素切断部位(構築物のFcとIg1及び2部分の間の領域)を有し、これは新しい構築物1で除去された。下線が引かれた領域は、リンカー及び該融合タンパク質のFc部分内のジスルフィド結合を可能にする2つのシステイン(2つの構築物間で変更なし)を示す。
【０２５０】
Fc-Ig1及び2構築物1を用いて、スクラッチアッセイを実施した。RA FLSを6ウェルプレートで集密になるまで増殖させ、0.1％FBSを含むDMEM中で24時間血清飢餓状態にした。細胞を1 mlのチップで引っ掻き、20または40 nM Fc-Ig1及び2または媒体対照の存在下で、1％FBSを含むDMEM中でインキュベートした。創傷の直後(0時間)及び24時間後に、ソフトウェアToupView 3.7を備えたMotic AE2000顕微鏡を4Xで用いて、創傷の画像を撮影した。ImageJ(NIH、バージョン1.8.0_201)ソフトウェアを用いて、創傷面積を計算し、0、12、24、及び48時間後に、創傷面積を測定した。50 ng/ml TNF、40 nM PTPRS Ig1及び2を、50 ng/ml TNF+40 nM PTPRS Ig1及び2と比較した。図4Aは、上記のように、TNFまたはIg1及び2の単独または組み合わせの存在下または非存在下で、創傷時(0時間)または創傷後12、24、または48時間のRA 1757における(任意単位での)創傷を示す。図4Bは、上記のように、TNFまたはIg1及び2の単独または組み合わせの存在下または非存在下で、創傷時(0時間)または創傷後12、24、または48時間のRA 1775における(任意単位での)創傷を示す。図4Cは、上記のように、TNFまたはIg1及び2の単独または組み合わせの存在下または非存在下で、創傷時(0時間)または創傷後12、24、または48時間のRA 1402における(任意単位での)創傷を示す棒グラフである。図4Dは、プールされたデータを示す。二元配置分散分析(ANOVA, ****, P<0.0001)を用いてデータを分析した。
【０２５１】
これらの結果は、TNF刺激細胞がPTPRSの十分な発現を維持して、単剤療法におけるIg1及び2の有効性を確保することを示唆している。
【０２５２】
KRNマウスとNODマウスを交配し、約6〜7週齢で関節炎を発症した子孫(自発的K/BxNマウス)を得た。K/BxN血清転移誘発関節炎(STIA)モデル(35)で使用するために、関節炎のK/BxNマウスからの血清をプールした。STIAを誘発するために、6〜8週齢のマウスに100 μlの関節炎誘発性K/BxN血清を腹腔内(i.p.)注射した。以前に記載されたように(57)、手首と足首の臨床スコアリングによって関節炎の重症度を評価した：0=正常; 1=最小限の紅斑と軽度の腫れ; 2=中等度の紅斑と軽度の腫れ； 3=顕著な紅斑と重度の腫れ、指はまだ関与していない；及び 4=最大の紅斑と腫れ、指は関与している。血清注射の日から、足首の腫れを1日おきに測定。
【０２５３】
マウスの血液から細胞を分離するための流動細胞計測法では、眼窩後出血(生きている動物から)または心臓穿刺(安楽死させた動物から)を介して、2 mM EDTAのPBS溶液に血液を採取した。eBiosience RBC溶解緩衝液(Thermo Fisher)を使用し、脾臓及びマウスの血液から赤血球を溶解した。滑膜細胞を分離するために、足首関節を採取し、鈍い鉗子で引っ張ることによって脛骨と指を関節離断し、骨髄の汚染を防ぐために骨髄を洗い流した。関節をPBSでリンスし、Liberase TM(Roche)及びDNaseIで、37℃で60分間解離した。抗体染色の前に、細胞をFcブロック(BD Pharmingen)とプレインキュベートした。表面染色には、CD3(17A2)、CD19(6D5)、NK1.1(PK136)、CD11b(M1/70)、CD44(IM7)、Ly6G(1A8)、Ly6C(HK1.4)、CD45.1(A20)、MHCII(M5/114.15.2)、CD64(X54-5/7.1)、CD115(AFS98)に特異的な蛍光色素標識抗体をBiolegendから入手し、CD43(R2/60)、PD1(RMP1-30)、GL7(GL-7)、CD25(PC61.5)、B220(RA3-6B2)、CD317/BST2(eBio927)、CD62L(MEL-14)、CD45.2(104)、TCR-beta(H57-597)、CD8(53-6.7)、CD4(RM4-5)に特異的な蛍光色素標識抗体をeBioscience/Thermo Fisherから入手した。eBioscience/Thermo FisherのFixable Viability色素で染色することにより、死細胞を分析から除外した。エベレストソフトウェアを搭載したZE5流動細胞計測器(Bio-Rad)でデータを取得した。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析を行った。フロー分析では、Mix-n-StainTM抗体標識化キット(Sigma-Aldrich)を用いて、抗マウスPTPRS(MEDIMABS)をAlexaFluor 647で標識化した。
【０２５４】
図5Aに示すように、古典的(Ly6C+CD43-)、中間的(Ly6C+CD43+)、または非古典的(Ly6C-CD43+)循環単球(血中単球)のいずれも、RPTPσの有意な発現を示さなかった。比較のために、形質細胞様樹状細胞(pDC)におけるRPTPσの発現を示している。図5Bに示すように、古典的(Ly6C+CD43-)、中間的(Ly6C+CD43+)、または非古典的(Ly6C-CD43+)関節マクロファージ(足首マクロファージ)のいずれも、RPTPσの有意な発現を示さなかった。比較のために、高レベルのRPTPσを発現することが知られている形質細胞様樹状細胞(pDC)におけるRPTPσの発現を示している。
【０２５５】
in vivoでのFLS対放射線感受性骨髄由来細胞に対するIg1及び2の効果を分析するために、致死的照射(>1000 Rad)及びCD45.2WTまたはPTPRS KOマウスからの骨髄移植を受けたCD45.1遺伝子性マウスにおけるSTIAの減弱におけるIg1及び2の有効性を比較した(図6A及び6B)。骨髄キメラを産生するために、雄のBALB/cByJ(CD45.1遺伝子性)マウスにRS 2000生物学的照射装置を用いて、550 Radを2回致死的に照射し、続いて雄のPTPRS WTまたはKO遺伝子性CD45.2ドナーマウスから骨髄を投与した。関節炎を誘発するため、照射後8週間にK/BxN血清を投与した。7週間後、適切なCD45対立遺伝子(抗CD45.1及び抗CD45.2; eBioscience)を染色することにより、流動細胞計測法でキメラ現象を確認した。レシピエントマウスにおける生着割合は95％を超えていた。トリス緩衝生理食塩水(TBS)または媒体対照(TBS)中のHis-Ig1及び2を、結果の項に記載されているように投与した。KO(KO)対野生型(WT)マウス(Hisタグ付きIg1及び2「使用中」構築物を使用)は、STIAモデルでIg1及び2に対して同じ応答性を示した。骨髄再構成マウスに、血清移植後0、2、4、及び6日目に、500 μgのIg1及び2(群あたりn=3)または媒体(群あたりn=2)を眼窩後方(r.o.)に注射した。該実験の臨床スコアを図6Aに示す。図6Bは、足首の厚さの変化(mm単位)を示す。両方の図において、平均+/- s.e.m.が示されている。二元配置分散分析(ANOVA, **, P<0.01)を用いてデータを分析した。WTまたはKO骨髄で再構成されたマウスは、STIAを受けた後、同じ関節炎の重症度を示した。さらに、Ig1及び2は、2群のマウスで同一の抗関節炎作用を示した。照射後8週間にSTIAを開始した。マウスについて、媒体または0.5 mgのHis-Ig1及び2を1日おきに、合計4回の処置で、眼窩後方(r.o.)に注射した。WT BM対照群(n=4)、WT BM His-Ig1及び2群(n=5)、KO BM対照群(n=6)、KO BM His-Ig1及び2群(n=7)。** P<0.01、Mann Whitneyによる。
【０２５６】
適応免疫システムによって駆動され、RAの前臨床治療法の開発のゴールドスタンダードと見なされているマウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)の回復における、単剤療法としての治療用量とTNF阻害剤の治療用量との組み合わせの有効性を比較した。コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルを実行した。簡単に説明すると、8〜10週齢の雄のDBA/1Jを、50 μgの結核菌(H37Ra、ATCC 25177)(CFA、Sigma-Aldrich)を含むフロイントの免疫賦活剤に乳化した100 μgのニワトリII型コラーゲン(Condrex)で免疫した。28日後、不完全フロイント免疫賦活剤(IFA; Sigma-Aldrich)に乳化した100 μgのニワトリII型コラーゲンでマウスを追加免疫した。上記のように臨床スコアリングによって関節炎を評価した。
【０２５７】
組換えPTPRS 6xHisIg1及び2(ここではHis-Ig1及び2と呼ぶ)の調製は、Doody KMらの「関節リウマチ治療のための標的脱リン酸化酵素依存性プロテオグリカンスイッチ」, Sci Transl Med. 2015 May 20; 7(288)：288ra76に記載されている。ヒトIgG1-Fc融合Ig1及び2(ここではFc-Ig1及び2と呼ぶ)の調製は、LakePharma(米国)に委託した。マウスTNF遮断生物学的p75TNFR:Fc(mEtanercept)は、Amgen Extramural Research AllianceProgramを通じてAmgenから入手した。120 mM NaClを含む20 mM Tris中のFc-Ig1及び2、またはヒトIgG1-Fc対照及びmEtanerceptを、結果の項に記載されているスケジュールに従って投与した。効果的であることが示されている4 mg/kg用量のmEtanerceptを使用した。Fc-Ig1及び2と治療用量のmEtanerceptの組み合わせにより、臨床的関節炎の重症度が大幅に軽減された。群あたり6匹のマウスに、免疫後34、36、38日目に、それぞれIgG1Fc(Fcのみを含む対照)、媒体、0.5 mg Fc-Ig1及び2「使用中」+ 4 mg/kg mEtanercept、及び0.5 mg Fc-Ig1及び2を腹腔内注射した。臨床スコアリングによって2日ごとに関節炎を評価した。平均+ s.e.m.は示されている。図7は、Fc-Ig1及び2が単剤療法またはTNF阻害剤mEtanercept(p75mTNFr:Fc、エタネルセプトと同等のマウス)との組み合わせとしてコラーゲン誘発関節炎(CIA)を回復させるのに有効であり、Ig1及び2とmEtanerceptの治療用量の組み合わせがTNF阻害剤単独の治療用量よりも有意に高い有効性を示したことを示している。これらの実験では、マウスについて、0日目に一次免疫され、21日目に追加免疫された群あたり6匹のマウスに、免疫後34、36、及び38日目に、それぞれIgG1Fc(Fcのみを含む対照)、媒体、0.5mg Fc-Ig1及び2「使用中」+ 4 mg/kg mEtanercept、及び0.5 mg Fc-Ig1及び2を腹腔内注射した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。平均+ s.e.m.が示されている。
【０２５８】
CIAにおけるエタネルセプトの用量反応は、治療量以下の2 mg/kgのmEtanerceptがマウスの関節炎の関節におけるPTPRS発現を増強するのに十分であることを示した。免疫後34、36、及び38日目に、群あたり6匹のCIAマウスに、媒体またはmEtanercept(4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、及び0.5 mg/kg)をそれぞれ腹腔内注射した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。平均+ -s.e.m.が示されている。図8Aに、0日目に一次免疫され、21日目に追加免疫されたマウスの臨床スコアの変化が示されている。免疫後34、36、及び38日目に、群あたり6匹のCIAマウスに媒体またはmEtanercept(4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg、及び0.5 mg/kg)をそれぞれ腹腔内注射した。図8Bは、GAPDHの発現に規準化されたqPCRによる足首におけるPTPRS発現を示す。
【０２５９】
マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)の回復において、単剤療法として、及び治療量以下の用量(2 mg/kg)のTNF阻害剤と組み合わせて投与された治療量以下の用量(0.1及び0.25 mg)のIg1及び2の有効性を評価した。Fc-Ig1及び2の治療量以下の用量とmEtanerceptの治療量以下の用量の組み合わせは、臨床的な関節炎の重症度を驚くべき程に減少させた。免疫後44、46、及び48日目に、群あたり10匹のマウスに、IgG1-Fc(Fcのみを含む対照)、溶媒(上記を参照)、0.5 mg Fc-Ig1及び2、0.25 mg Fc-Ig1及び2、2 mg/kg mEtanercept、0.1 mg Fc-Ig1及び2、コンボ0.1 mg(0.1 mg Fc-Ig1及び2 + 2 mg/kg mEtanercept)をそれぞれ腹腔内注射した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。エタネルセプトにFc-Ig1及び2の併用または併用なしの滴定。図9に示されるように、Fc-Ig1及び2での処置は、CFA中のコラーゲン及びIFA中の追加免疫による免疫化後の抗体力価生成に影響を及ぼさなかった。該データは、Ig1及び2がマウスにおけるT細胞依存性B細胞抗体応答に影響を与えず、CIAにおけるIg1及び2の有効性が適応免疫応答の抑制によるものではないことを示している。該実験では、マウスについて0日目に一次免疫し、21日目に追加免疫した。免疫後44、46、及び48日目に、群あたり10匹のマウスに、IgG1-Fc(Fcのみを含む対照)、媒体、0.5 mg Fc-Ig1及び2、0.25 mg Fc-Ig1及び2、2 mg/kg mEtanercept、0.1 mg Fc-Ig1及び2、または0.1 mg Fc-Ig1及び2+2 mg/kg mEta(コンボ0.1 mg)のいずれかをそれぞれ腹腔内注射した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。
【０２６０】
Ig1及び2とTNF阻害剤の組み合わせ(例えば、エタネルセプトと同等のマウス)は、CIA、また、有効用量よりも低いレベルでのIg1及び2、及びTNF阻害剤との組み合わせ(図8及び9)の影響を受けたマウスにおいて、各薬剤単独(図7)と比較して有効性の増加をもたらし、相乗効果を実証している。
【０２６１】
CIA誘導のための二次抗コラーゲン免疫の一次周辺の治療用量(0.5 mg i.p.)のFc-Ig1及び2によるマウスの治療は、抗コラーゲン抗体の誘導に影響を与えない。あるコホートでは、マウスをCFA中のII型コラーゲンで免疫し、免疫の2日前から合計4回の注射で、2日ごとに0.5 mgのIg1及び2または媒体を腹腔内投与した。抗コラーゲン抗体力価を評価するために、処置の最後に血清を得た。別のコホートでは、マウスをCFA中のII型コラーゲンで免疫し、IFA中のコラーゲンで追加免疫した(21日目)。該追加免疫の2日前から合計4回の注射で、マウスに0.5 mgのIg1及び2または媒体を2日ごとに腹腔内投与した。抗コラーゲン抗体力価を評価するために、処置の最後に血清を得た。ELISAで血清抗コラーゲン抗体レベルを評価した。コラーゲンで免疫されたマウスの血清中の抗コラーゲン抗体レベルを、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)で測定した。簡単に説明すると、低結合の96マルチウェルプレート(Costar)をII型ニワトリ胸骨コラーゲン(1 μg/ml; Sigma)でコーティングした。段階希釈された血清をインキュベートし、ビオチン化抗マウスIgG抗体(Jackson Laboratories)及び抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体(Southern Biotech)を用いて、コラーゲンへのIgG結合を検出した後、エクストラビジン-HRP(Sigma)とインキュベートし、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質で曝露した。Tecan Infinite M1000プレートリーダーを用いて、450 nmにおけるプレートの吸光度を読み取った。図10に示すように、Fc-Ig1及び2による処置は、CFAでのコラージュ及びIFAでの追加免疫による免疫化後の抗体力価の産生に影響を与えなかった。該データは、Ig1及び2がマウスにおけるT細胞依存性B細胞抗体応答に影響を与えず、CIAにおけるIg1及び2の有効性が適応免疫応答の抑制によるものではないことを示した。
【０２６２】
従って、Ig1及び2の非免疫学的作用機序と一致して、これらの結果は、CIAのためにコラーゲンでマウスを免疫した後に産生された病原性抗体の力価がFc-Ig1及び2での処置によって影響を受けなかったことを示唆する。
【０２６３】
実施例3．滑膜細胞標的療法及びTNF免疫調節による関節炎の相乗的回復
【０２６４】
重度の関節炎(臨床スコアが8以上)のマウスを、単剤療法として重度の関節炎を回復に効果のないIg1及び2(0.1 mg)、及びmEtanercept(2 mg/kg)の用量で処置し、CIAにおけるFc-Ig1及び2、及びmEtanerceptの治療量以下の用量間の治療上の相乗効果を示した。上記のようにCIAを誘導し、スコアリングした。Fc-Ig1及び2、及びmEtanerceptを取得し、上記のように注射した。マウス関節炎の関節を組織学的スコアリングするために、後足全体を10％ホルマリン中に固定し、脱灰し、トリミングし、包埋した。組織ブロックから切片を作成し、H&E、サフラニン-Oまたはトルイジンブルー(HistoTox)で染色した。組織病理学的スコアリングは、上記のように実施した。簡単に言えば、関節炎のマウスの関節には、以下の基準に従って、H&E染色に基づいて、炎症について0〜4のスコアを割り当てた：0=正常; 1=関節周囲領域における炎症細胞の最小限の浸潤; 2=軽度の浸潤; 3=中程度の浸潤;及び4=顕著な浸潤。関節炎のマウスの関節には、以下の基準に従って、H&E染色に基づいて、骨吸収について0〜4のスコアを割り当てた：0=正常; 1=最小(吸収の小さな領域、低倍率では容易に判別できない); 2=軽度(骨梁または皮質骨においてより多くの吸収領域、低倍率では容易に判別できない); 3=中程度(骨梁及び皮質骨の明らかな吸収、皮質の全層欠損なし;いくつかの骨梁の喪失;低倍率で明らかな病変);及び4=顕著(皮質骨の全層欠損及び顕著な小柱骨喪失)。マトリックスのサフラニンOまたはトルイジンブルー染色の減少によって軟骨枯渇を識別し、0〜4のスケールでスコアリングした：0=軟骨破壊なし(サフラニンOによる完全染色); 1=局所的な軟骨糜爛; 2=より広範囲の軟骨糜爛; 3=重度の軟骨糜爛;及び4=軟骨全体の枯渇。盲検法で組織学的分析を実施した。Zeiss Axioscan.Z1(Zeiss)スライドスキャナーを用いて足首全体の画像を得て、Zenソフトウェア(Zeiss)を用いて分析した。
【０２６５】
治療量以下のIg1及び2とmEtanerceptの併用治療は、CIAの相乗的な回復をもたらす。100 μgのニワトリII型コラーゲンでの2回免疫(一次[d0]及び追加免疫[d28])によってDBA/1雄マウスにCIAを誘導した。媒体(PBS)、Fc-Ig1及び2(0.1 mg)、mEtanercept(2 mg/kg)、またはFc-Ig1及び2(0.1 mg)及びmEtanercept(2 mg/kg)の組み合わせで関節炎のマウスを48時間ごとに指定された期間処置した(図11A)N=8/群。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。(図11B)Ig1及び2とmEtanerceptの併用治療による関節炎の相乗的回復は、抗コラーゲン抗体の力価の低下とは関連しなかった。パネルは、ELISAを用いた実験の最後にAのマウスの血清における抗II型コラーゲンIgG抗体を示している。(図11C〜E)Ig1及び2とmEtanerceptの併用治療による関節炎の相乗的回復は、組織学的炎症と軟骨及び骨糜爛スコアの有意な改善と関連していた。注意されたいことに、Ig1及び2とmEtanerceptによる単剤療法では、臨床関節炎の回復の欠如と一致する組織学的スコアを改善できなかった。図は、図11Aのマウスの滑膜炎(図11C)の骨糜爛(図11D)及び軟骨枯渇(図11E)の組織病理学的評価を示している。グラフは平均+ -s.e.m.を示している。*P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001、**** P<0.0001、二次元配置分散分析(図11A、対溶媒群)または一元配置分散分析(図11C〜E)。
【０２６６】
実施例3.PTPRSは、RA滑膜裏層FLSに濃縮される。
【０２６７】
RAにおけるFLS指向療法の標的としてPTPRSをさらに確立するために、リウマチ滑膜におけるPTPRSの発現プロファイルを調べた。サブライニングRA FLS(CD34-THY1+(29))と比較した場合の滑膜裏層RA FLS(CD34-THY1-(29))におけるPTPRSの濃縮された発現を、RA患者の滑膜組織から単離されたRA FLSからのRNA-seqデータに示した(図12)。
【０２６８】
Fc-Ig1及び2は、関節炎の足に高い蓄積を示し、実験的関節炎を抑制する。
【０２６９】
次に、実験的マウス関節炎におけるFc-Ig1及び2の有効性を特徴づけることを試んだ。6xHis-Ig1及び2(Doody KMらの「関節リウマチ治療のための標的脱リン酸化酵素依存性プロテオグリカンスイッチ」Sci Transl Med. 2015 May 20; 7(288)：288ra76)で示されたものと同様に、我々は、Fc-Ig1及び2が非常に効果的であることを発見した(図13A)。STIAが確立されたマウスに、111-インジウム(111In)で標識されたFc-Ig1及び2を注射した。Fc-Ig1及び2の放射性標識は、タンパク質の機能に影響を与えなかった。対照として、111In標識mEtanerceptを使用し、非関節炎マウスに111In-Fc-Ig1及び2を注射した。図13B及びCに示されるように、Fc-Ig1及び2は、mEtanerceptと比較して、関節炎マウスの関節における有意な増加した蓄積を示した。マウスの脳と眼に111In-Fc-Ig1及び2の蓄積は観察されず、Fc-Ig1及び2が血液脳関門を越えないことを示唆している。
【０２７０】
CIAで有効であることが示されている4 mg/kgの用量での関節炎のCIAマウスへのFc-Ig1及び2の投与は、エタネルセプトのマウス相同体(マウスp75TNFR:Fc、ここではmEtanerceptと呼ぶ)による治療に匹敵する程に疾患重症度の有意な減少を引き起こした(図13D)。CIAにおけるFc-Ig1及び2の有効性は、抗コラーゲン抗体の産生の減少とは関連していなかった(図13E)。関節の組織病理学及びマイクロコンピューター断層撮影(microCT)分析によって評価されるように、Fc-Ig1及び2の投与はまた、軟骨損傷及び骨糜爛からマウスを保護した(図13F〜G)。まとめとして、これらの結果は、Ig1及び2が好ましい生体内分布プロファイルを持ち、自然免疫及び/または適応免疫系によって引き起こされる関節炎の複数のモデルにおいて治療効果を発揮することを示唆している。
【０２７１】
Ig1及び2は、自然免疫系を抑制せずに炎症性関節炎を軽減する。
【０２７２】
Ig1及び2の治療効果が、自然免疫系または獲得免疫系の抑制によって媒介されるかどうかを特徴づけることを試んだ。古典的(Ly6C+CD43-)、中間(Ly6C+CD43+)、または非古典的(Ly6C-CD43+)循環単球のいずれも、STIAマウスでPTPRSの検出可能な発現を示しなかった。さらに、PTPRSはMHCII+CD64+マクロファージには存在せず、STIAマウスの関節炎の足首から分離されたMHCII-CD64+マクロファージの小さなサブセットで、低レベルで発現していた。次に、in vivoでのFLS対放射線感受性骨髄由来細胞に対するIg1及び2の効果を分析するために、致死的照射(>1000 Rad)及びCD45.2 WTまたはPTPRS KOマウスからの骨髄移植を受けたCD45.1遺伝子性マウスにおけるSTIAの減弱におけるIg1及び2の有効性を比較した(図14A)。WTまたはKO骨髄で再構成されたマウスは、STIAを受けた後、同じ関節炎の重症度を示した。さらに、Ig1及び2は、2群のマウスで同一の抗関節炎作用を示した。自然免疫がIg1及び2の抗関節炎作用を媒介するかどうかの評価するために、高レベルのPTPRSを発現するpDCに目を向けた。pDCがin vivoでIg1及び2の抗関節炎作用に寄与するかどうかを評価するために、マウスをSTIAに供する前に、抗PDCA-1抗体を用いてpDCを枯渇させた(図14C)。pDC枯渇マウスと非枯渇マウスの間で関節炎の発症に相違は見られず、pDC枯渇マウスにおいてIg1及び2の抗関節炎効果は維持された。
【０２７３】
活性化されたマクロファージに対するIg1及び2の潜在的な影響をさらに除外するために、マクロファージの分極と細菌の貪食性も評価した。最初に、Fc-Ig1及び2を、骨髄由来マクロファージ(BMDM)のM1またはM2エフェクター表現型への分極中に添加した。両方のエフェクター表現型について、Fc-Ig1及び2の添加は、特徴的な転写因子またはサイトカインの増加に影響を与えなかった(図14A、B)。同様に、Fc-Ig1及び2は、M0、M1、またはM2マクロファージによる大腸菌または黄色ブドウ球菌の貪食性を変化させなかった(図14C-D)。これは、Ig1及び2が自然免疫細胞の機能を変化させないこと、及びマウス関節炎におけるその治療が自然免疫系の抑制によって媒介されないことを示唆している。
【０２７４】
CIAにおけるIg1及び2の治療効果は、適応免疫システムを媒介しない。
【０２７５】
Ig1及び2が適応免疫系への作用を通じて関節炎の発症に影響を与えるかどうかを評価するには、Ig1及び2を、6〜7週齢から自発性関節炎を発症する関節炎のK/BxN遺伝子組み換えマウスに投与した。Ig1及び2による処置の後、これらのマウスで自発性関節炎の有意な回復が観察された(図14B)。ただし、Ig1及び2で処置したK/BxNマウスの血清をWTレシピエントマウスに移してSTIAを誘導した場合、Ig1及び2で処置したK/BxNマウスと媒体で処置したK/BxNマウスの血清の関節炎誘発性に相違は見られなかった。従って、Ig1及び2による自発性K/BxN関節炎の回復は、関節炎誘発性抗体の力価の低下によって媒介されない。
【０２７６】
次に、マウスCIAを用いて、関節炎中の適応免疫系に対するFc-Ig1及び2の効果をさらに測定した。Fc-Ig1及び2の治療効果は、CIAマウスの関節炎の足首における制御性T細胞(Treg)またはTh17細胞の蓄積または拡大の変化とは関連していなかった(図14C〜D)。STIAデータと一致して、治療用量のFc-Ig1及び2による処置も、同じ足首のMHCII+CD64+及びMHCII-CD64+マクロファージの数または頻度を変化させなかった(図14E)。さらに、Fc-Ig1及び2の治療効果は、関節炎のCIAマウスの脾臓及びリンパ節における未処理の及びエフェクターCD4T細胞の増殖またはCD4T細胞エフェクター集団Th1またはTh17細胞の増殖の変化とは関連していなかった。同様に、CIAモデルでの病原性自己抗体の生成に重要な胚中心(GC)B細胞またはCD4 T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞数への影響は観察されなかった。最後に、Fc-Ig1及び2で処置した後、関節炎のCIAマウスでは、制御性T細胞(Treg)数、またはTregによるCTLA4の発現に変化はなかった。総合すると、これらの結果は、CIAにおけるFc-Ig1及び2の治療作用が、CD4エフェクター集団または胚中心B細胞への影響を媒介しないことを示唆している。
【０２７７】
Ig1及び2は、免疫化に対する適応応答を変化させない。
【０２７８】
Ig1及び2が免疫抑制DMARDの影響を受ける免疫化に対する免疫応答に影響を与える可能性があるかどうかを判断するには、次に、DBA1/Jマウスを、II型コラーゲンに対する一次免疫及び追加免疫中にFc-Ig1及び2で処置し、抗コラーゲンII型抗体の産生を追跡した。抗コラーゲンIgG抗体の全体的な力価(図14F)または抗コラーゲンIgGサブクラスIgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3の力価に対するFc-Ig1及び2の影響は観察されなかった。また、Tfh細胞またはGC B細胞の頻度と数に対するFc-Ig1及び2の影響も観察されなかった(図14G〜H)。総合すると、これらの結果は、Ig1及び2がII型コラーゲンによる免疫に対する体液性応答に影響を与えないことを示唆している。
【０２７９】
Ig1及び2は、CD4 T細胞の分極を変化させない。
【０２８０】
PTPRS-KO CD4 T細胞は、Th1細胞及びTh17細胞への分極の増強を示す。Ig1及び2がコラーゲン免疫中にCD4 T細胞分極に影響を与えるかどうかを判断するために、一次免疫及び追加免疫中にFc-Ig1及び2で処置したマウスのCD4T細胞集団を評価した。Fc-Ig1及び2処置マウスの脾臓及びリンパ節では、未処置の及びエフェクターCD4T細胞の集団の偏りは見られなかった。また、同じマウスのリンパ節(図14I〜J)または脾臓のいずれにおいても、Th1、Th17、またはTregの数の変化も観察されなかった。Fc-Ig1及び2または媒体のいずれかで処置されたマウスのリンパ節及び脾臓からのTregは、同様のレベルのCTLA4発現を示した。CD4 T細胞の分極に対するIg1及び2の影響をさらに分析するために、プレート結合抗体または抗原提示細胞(APC)によって刺激されたin vitro分極アッセイを実行した。in vivoで観察されたものと同様に、Ig1及び2は、APCの有無に関係なく、BALB/cまたはDBA1/Jマウスから分離されたCD4T細胞のTh1、Th17、またはTreg細胞への分極を変化させなかった。総合すると、これらの結果は、Ig1及び2がin vitroまたはin vivoでCD4 T細胞の分極に影響を与えないことを示唆し、Fc-Ig1及び2の治療効果が免疫抑制に媒介される可能性が低いという考えを支持する。
【０２８１】
TNFは、PI3K/GSK3b/USF2経路を介してRA FLSにおけるPTPRS発現を調節する。
【０２８２】
RA FLSのPTPRS遺伝子座のエピゲノムランドスケープをさらに評価すると、PTPRS遺伝子のエクソン1周辺のアクティブプロモーター(H3K4me3)、プライムエンハンサー(H3Kme1)、抑制マーク(H3K27me3)の両方のヒストンマークが特定された。ENCODEデータベースとUCSCヒトゲノムブラウザーを使用して、PTPRSのプロモーター領域において、GSK3b上流刺激因子(USF)-1及びUSF2の2つの下流標的の潜在的な結合部位を同定し、PTPRS発現の調節におけるこれら2つの転写因子の関与を示唆している(図15A)。これは、RNA-seqによって分析されたRA及びOA FLSにおけるPTPRSを伴うUSF1またはUSF2のいずれかの発現間の正の相関によってさらに裏付けられた。USF2のsiRNAを介したノックダウンを使用して、USF2が実際にRA FLSにおけるPTPRSの発現を促進することを発見した(図15B)。クロマチン免疫沈降(ChIP)を使用して、USF2が休止RA FLSにおけるPTPRSのプロモーター領域に結合し、そのような相互作用がTNFによる刺激後に有意に減少したことをさらに確認できた(図15C)。最後に、PTPRSプロモーター領域を含むルシフェラーゼレポーター構築物を使用して、USF2の過剰発現がPTPRSプロモーターの強力な活性化を引き起こすことを示す(図15D)。総合すると、これらの結果は、RA FLSにおけるPTPRSの発現が、PI3K/GSK3b/USF2経路を介してTNFによって調節されていることを示唆している。
【０２８３】
TNFがPTPRS発現を調節するかどうかを測定した。RA(N=13)及びOA(N=13) FLSを24時間血清飢餓状態にし、様々な濃度のTNFで12時間刺激した。
【０２８４】
図16A〜Bに示されるように、TNFによる刺激は、RNAレベルでのRA FLS及びOA FLSにおけるPTPRS発現の濃縮及び時間依存性の低減を引き起こしたが、RA及びOA FLS間のPTPRSの基礎mRNA発現の差は検出できなかった(図16C)。一元配置分散分析(ANOVA, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001))を用いてデータを分析した。
【０２８５】
PTPRSの発現はTNFによって低減されるが、in vitro運動性アッセイにおいて、TNFで処置されたRA FLSが、Ig1及び2に応答性を維持する。FLS(N=9)単層を血清飢餓状態にし、引っかき傷を負わせ、媒体、50 ng/mL TNF及び20 nM Ig1及び2の存在下で、1％FBSで刺激した。24時間で創傷幅を測定し、0時間での創傷幅に規準化した。二元配置分散分析(ANOVA, **P<0.01, ***P<0,001)を用いてデータを分析した。図17Aは、TNF非存在下での結果を示し、図17Bは、TNF刺激の存在下での結果を示す。
【０２８６】
マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)の回復において、単剤療法として、及び治療量以下(2 mg/kg)のTNF阻害剤と組み合わせて投与された治療量以下の用量(0.1及び0.25 mg)のIg1及び2の有効性を評価した。Fc-Ig1及び2の治療量以下の用量とmEtanerceptの治療量以下の用量の組み合わせは、臨床的関節炎の重症度の驚くべき減少をもたらした(図18)。雄のDBA/Jマウスの群を、0日目にII型コラーゲンに対して一次免疫し、28日目に追加免疫した。これらのマウスを、一次免疫後44、46及び48日目の腹腔内注射によって、ヒトIgG1 Fc対照(Fc-hIgG1、N=10)、媒体(N=9)、2 mg/kgマウスエタネルセプト(mEtan、N=9)、0.5 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、0.25 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、0.1 mg Fc-Ig1及び2(N=10)、2 mg/kg mEtan+0.1 mg Fc-Ig1及び2(コンボ、N=10)で処置した。2日ごとに臨床スコアリングにより関節炎を評価した。二元配置分散分析(ANOVA：*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001)を用いてデータを分析した。
【０２８７】
IL-6はRA FLSにおけるPTPRS発現を減少させる。RA FLS(n=4ライン)を24時間血清飢餓状態にした後、IL-6(25 ng/ml)で12時間刺激した。qPCRでPTPRSの発現を分析し、GAPDHに対して規準化した。刺激されていない(Un)細胞に対してRQを計算した(図19)。
【０２８８】
BALB/cマウスに100マイクロリットルの関節炎誘発性K/BxN血清を注射してSTIAを誘導し、次いで、0日目から１日おきに、示された量のFc-Ig1及び2を腹腔内注射した。2週間2日ごとに関節炎をスコアリングした。左のパネルは臨床スコアを示し、右のパネルはノギスで測定した足首の厚さを示している。平均+ -s.e.m.が示されている。*p<0.05、****p<0.0001。相違をANOVAによって測定した。これらの実験は、関節炎スコアに対するFc-Ig1及び2の効果を示している。
【図１Ａ】
2022501388.tif 000003
【図１Ｂ】
2022501388.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2022501388.tif 000006
【図３】
2022501388.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2022501388.tif 000009
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2022501388.tif 000013
【図６Ａ】
2022501388.tif 000014
【図６Ｂ】
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【図７】
2022501388.tif 000016
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2022501388.tif 000020
【図１１Ａ】
2022501388.tif 000021
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2022501388.tif 000024
【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2022501388.tif 000028
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
2022501388.tif 000031
【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
2022501388.tif 000033
【図１４Ａ】
2022501388.tif 000034
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
2022501388.tif 000042
【図１４Ｊ】
2022501388.tif 000043
【図１５Ａ−１５Ｂ】
2022501388.tif 000044
【図１５Ｃ−１５Ｄ】
2022501388.tif 000045
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
2022501388.tif 000049
【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2022501388000001.app
【国際調査報告】
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2022501388.tif 000055
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