(57)【要約】本発明は、細胞のトランスクリプトームを記録するための方法に関し、この方法は、試験細胞を提供する工程であって、該試験細胞は、逆転写酵素ポリペプチド及びＣａｓ１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列、Ｃａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列であって、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列と、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む第３の導入遺伝子核酸配列であって、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、第３の導入遺伝子核酸配列と、を含む、前記工程と、前記試験細胞を前記第１の導入遺伝子配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される条件に曝露する工程であって、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成される前記ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体はＲＮＡ分子からプロトスペーサーを獲得し、及びスペーサーを前記第３導入遺伝子核酸配列に統合し、改変された第３の導入遺伝子核酸配列を生成する、前記工程と、前記試験細胞から前記改変された第３の導入遺伝子核酸配列を単離し、単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を得る工程と、単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を配列決定する工程と、を含む。【選択図】図１ａ
2022500032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の転写産物を記録するための、特にトランスクリプトームを記録するための方法であって、前記方法は、
−  試験細胞を提供する工程であって、該試験細胞は、
逆転写酵素ポリペプチド及びＣａｓ１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列、並びにＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列であって、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列と、
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む第３の導入遺伝子核酸配列であって、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、前記第３の導入遺伝子核酸配列と、
を含む工程と、
−  曝露工程において、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される条件下に前記試験細胞を曝露する工程であって、ここで前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成される前記ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体は、
１つ以上の核酸分子、より具体的には１つ以上のＲＮＡ分子から、少なくとも１つのプロトスペーサー、特に２つ以上のプロトスペーサーを獲得し、及び
前記プロトスペーサーをスペーサーとして前記第３の導入遺伝子核酸配列内に統合する、前記工程と、
少なくとも１つの統合されたスペーサーを含む改変された第３の導入遺伝子核酸配列を生成する工程と、
−  前記改変された第３の導入遺伝子核酸配列を前記試験細胞から単離して、単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を得る工程と、
−  前記単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を配列決定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第３の導入遺伝子核酸配列がＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含み、前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列が、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成される前記ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３の導入遺伝子核酸配列は、さらなるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験細胞がさらに、
−  センサーをコードする第４の導入遺伝子核酸配列を含み、前記センサーは、分析対象分子と接触すると活性化され、活性化センサーを生成し、前記活性化センサーは、細胞内の記録遺伝子の発現を誘導し、並びに、
前記曝露工程において、前記分析対象分子が存在する場合、前記活性化センサーは、細胞内の記録遺伝子の発現を誘導し、前記記録遺伝子に由来するＲＮＡは、スペーサーとして獲得される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び／又は前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列が、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ）のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体、又はそれに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって特異的に認識可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試験細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第３の導入遺伝子核酸配列が、ベクター、特に発現ベクター内に含まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列が前記ベクター内に含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される、前記条件が、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の過剰発現をもたらす、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される、前記条件が、
−  前記試験細胞を誘導物質化合物、特にＩＰＴＧ、ラクトース、アラビノース、ラムノース又はアンヒドロテトラサイクリンと接触させることを含み、又は
−  嫌気性条件を含み、及び前記誘導性プロモーターは嫌気性誘導性プロモーターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
−  前記第３の導入遺伝子核酸配列は、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部にエンドヌクレアーゼ認識部位配列を含み、及び前記エンドヌクレアーゼ認識部位配列は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能であり、ここで、特に前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及び前記制限部位配列は２０ｂｐｓ〜０ｂｐｓで区切られており、及び前記部位特異的エンドヌクレアーゼは、特にＩＩＳ型又はＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼ、特にＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ、又はＢｐｕＳＩであり、
−  前記単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列は、前記配列決定の前に前記特定のエンドヌクレアーゼと接触され、ここで、前記（全長）ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（前記エンドヌクレアーゼ部位に隣接する）は、短縮ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列に切断される、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列決定が、ＰＣＲプライマーの使用を含み、前記ＰＣＲプライマーが、全長ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列の一部に本質的に相補的であるが、前記改変された第３の核酸配列内の前記エンドヌクレアーゼ切断から生じる前記短縮ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートに完全に相補的ではない核酸配列を含み、前記全長ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、少なくとも１つのスペーサー獲得事象に起因するか、又はそれによって形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
逆転写酵素ポリペプチド及びＣａｓ１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする前記第１の導入遺伝子核酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択される配列、又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％もしくは≧９９％同一の配列を含む、又は本質的にそれからなり、及び該コードされるポリペプチドは配列番号７によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃａｓ２ポリペプチドをコードする前記第２の導入遺伝子核酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２から選択される配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、もしくは３２と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％もしくは≧９９％同一の配列を含む、又は本質的にそれからなり、及び該コードされるポリペプチドは配列番号８によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列がともに、配列番号３４の配列、又は配列番号３４と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％もしくは≧９９％同一の配列を含む、又は本質的にそれからなり、及び該コードされるポリペプチドは配列番号３４によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む前記第３の導入遺伝子核酸配列が、配列番号３５〜１０３から選択される配列を含む、又は本質的にそれからなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）を含む、単離された核酸分子であって、
前記単離された核酸分子は、さらなるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列を含まない、前記単離された核酸分子。
【請求項１８】
ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含む、請求項１７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列が１０ｂｐ〜０ｂｐ離れている、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部にエンドヌクレアーゼ認識部位配列をさらに含み、前記エンドヌクレアーゼ認識部位配列が部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に部位特異的制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能であり、及び、特に前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及び前記制限部位配列は、２０ｂｐｓ〜０ｂｐｓ、特に１０ｂｐｓ〜０ｂｐｓ離れている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記部位特異的エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型又はＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼ、特に、ＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ又はＢｐｕＳＩである、請求項２０に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び／又は前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列が、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ）のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体、又はそれに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって特異的に認識可能である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
以下の配列要素、
−  逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の核酸配列、並びにＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の核酸配列であって、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列と、
−  ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ配列であって、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、前記ＣＲＩＳＰＲアレイ配列と、
を含む発現ベクター。
【請求項２４】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイ配列が、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含み、前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列が１０ｂｐ〜０ｂｐ離れている、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイ配列が、前記ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能な、さらなるＣＲＩＳＰＲリピート配列を含まない、請求項２３又は２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部にエンドヌクレアーゼ認識部位配列をさらに含み、前記エンドヌクレアーゼ認識部位配列が部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に部位特異的制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能であり、並びに前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及び前記制限部位配列は、１０ｂｐｓ〜０ｂｐｓ離れている、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記部位特異的エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型又はＩＩＧ型制限エンドヌクレアーゼ、特に、ＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ、又はＢｐｕＳＩである、請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
前記ＣＲＩＳＰＲリーダー配列、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ）に由来する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記誘導性プロモーター配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で作動可能であり、及び特にＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｐｔｅｔプロモーター、ＰＣプロモーター及びＰＢＡＤプロモーターから選択される、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてコドン最適化されている、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
−  逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列と、
−  Ｃａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列と、ここで前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、１つの誘導性プロモーター配列の転写制御下にあり、
−  請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の導入遺伝子核酸分子と、
を含む細胞であって、
ここで、前記第１の導入遺伝子核酸配列、前記第２の導入遺伝子核酸配列及び前記導入遺伝子核酸分子は、
−  請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の発現ベクターに含まれる、又は
−  前記細胞のゲノム内に統合されている、前記細胞。
【請求項３２】
さらに、
−  第４の導入遺伝子産物をコードする第４の導入遺伝子核酸配列であって、前記第４の導入遺伝子産物は、細胞内の記録遺伝子の発現を調節することができ、前記記録遺伝子の発現の調節は、分析対象分子の存在又は不在に依存する、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記第４の導入遺伝子産物が、目的の分子と接触すると活性化されて活性化センサーを生じるセンサーであり、前記活性化センサーが細胞内の記録遺伝子の発現を誘導する、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
患者の食事を監視するための、又は患者の疾患、特に患者の消化器又は胃腸の障害の診断のための方法であって、前記方法は、
−  前記患者から収集された糞便試料から請求項３１〜３３に記載の細胞を収集する工程であって、前記細胞は、前記患者に前もって経口的に適用される、前記細胞を収集する工程と
−  前記細胞から導入遺伝子核酸配列を単離して、単離された導入遺伝子核酸配列を得る工程と、
−  前記単離された導入遺伝子核酸配列を配列決定する工程と、を含み、
それにより、胃腸管の環境で生成された前記細胞の１つ又は複数の転写物を記録する、
前記方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法を実施するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のトランスクリプトームにおける変化を記録するための方法及び手段に関する。
【０００２】
この出願は、２０１８年９月１１日に出願された欧州特許出願番号ＥＰ１８１９３８８１．２の優先権に対する権利を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
生物学の中心的な課題は、細胞の分子成分がどのように機能し、統合して複雑な細胞の挙動を可能にするかを理解することである。この課題によって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び代謝物のレベルでの詳細な細胞内観察を容易にする非常に高度な技術の創造がますます加速されてきた。特に、ＲＮＡ配列決定技術は、複数又は単一の細胞内のトランスクリプトームの定量化を可能にし、これまでになく詳細に細胞の挙動、状態、及びタイプの分子署名を明らかにする。これらのテクノロジーの力にもかかわらず、それらは破壊的な方法を必要とし、したがって、観察は時間内のいくつかのスナップショットに制限されるか、又は非同期の細胞過程を選択する。これに対する挑発的な解決策の１つは、転写情報のコード化、保存、及び回復を可能にする合成記憶デバイスを細胞内に導入することである。
【０００４】
細菌の適応免疫システムＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、理想的な分子レコーダーを体現している。プラスミド又はウイルス感染の分子記憶は、ダイレクトリピート（ＤＲ）によって区切られた短い核酸セグメント（スペーサー）の形でＣＲＩＳＰＲアレイ内に保存される。新しい記憶は、Ｃａｓ１とＣａｓ２の作用によって獲得され、これらは、ＣＲＩＳＰＲアレイ内の古いスペーサーの前方（リーダー配列の隣又はリーダー配列の近位）に新しいスペーサーを複合的に統合し、それによって分子事象の一時的な記憶を提供する。大腸菌からのプロトタイプＴＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ獲得システムは、細菌集団内の定義された刺激の任意の情報と定量化可能な記録を保存するために最近活用された（非特許文献１〜３）。これらのシステムは、ＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得を分子レコーダーとして使用する可能性を優雅に示しているが、今のところ、化学合成されたヌクレオチドをエレクトロポレーションする必要性、又は以前の技術と同様に、誘導性プロモーターの利用可能性によって制限されている。さらに、これらのシステムは、ＲＮＡではなくＤＮＡに由来するスペーサーを獲得するため、細胞の転写履歴を包括的に反映しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】シップマンら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３５３（６２９８），（２０１６），ａａｆ１１７５
【非特許文献２】シップマンら，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５４７，（２０１７），３４６−３４９
【非特許文献３】シェスら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｏ０９５８，（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この背景に基づいて、本発明の目的は、細胞を破壊することなく、生細胞内のＲＮＡの発現パターンにおける変化を記録するための方法及び手段を提供することである。この目的は、本明細書の特許請求の範囲の主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
用語と定義
ＣＲＩＳＰＲという用語は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）の略語である。
【０００８】
本明細書の文脈において、スペーサーという用語は、ＣＲＩＳＰＲアレイ内に挿入されるポリヌクレオチドに関する。Ｃａｓ１及びＣａｓ２の複合体は、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のＤＮＡを切断し、その位置にスペーサーを統合する。スペーサーは、ダイレクトリピート配列の上流に統合されている。
【０００９】
本明細書の文脈において、ＣＲＩＳＰＲアレイという用語は、獲得されたスペーサーがＣａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって挿入又は統合される核酸配列を指す。
【００１０】
本明細書の文脈において、プロトスペーサーという用語は、スペーサーとしてＣＲＩＳＰＲアレイに統合される前のスペーサーの前駆体に関する。プロトスペーサーが一本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡは最初にＣＲＩＳＰＲアレイ内に統合され、次にＤＮＡに逆転写されます。
【００１１】
本明細書の文脈において、導入遺伝子又は遺伝子導入のという用語は、配列が導入遺伝子配列であるものに関して、宿主生物とは異なる生物に部分的又は完全に由来する遺伝子又はコードする配列に関連する。
【００１２】
本明細書の文脈において、コドン最適化という用語は、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、ヌクレオチド配列の変更に関連する。すべての生物には特定のコドン使用法があり、宿主生物に関してコドンを最適化することにより、発現の効率が高められ得る。
【００１３】
本明細書の文脈において、過剰発現という用語は、人工的に導入された遺伝子の発現に関連し、これは、宿主生物のハウスホールド遺伝子などの構成的に発現される遺伝子の発現よりも高く、特に２倍高く、より特に５倍高く、さらに特に１０倍高い。
【００１４】
本明細書の文脈において、トランスクリプトームという用語は、宿主又は試験細胞内のすべてのＲＮＡのセット、特に宿主又は試験細胞内のすべてのｍＲＮＡのセットに関連する。
【００１５】
本明細書の文脈において、リーダー配列という用語は、ＣＲＩＳＰＲアレイ又は遺伝子座の最初又は最後のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列の直前又は直後に位置する核酸配列に関する。
【００１６】
本明細書の文脈において、配列同一性及び配列同一性のパーセンテージという用語は、２つの整列された配列を位置ごとに比較することによって決定される配列比較の結果を表す単一の定量的パラメーターを指す。比較のための配列の整列の方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の整列は、スミス及びウォーターマン，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムによって、ニードルマン及びワンチ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアラインメントアルゴリズムによって、ピアソン及びリップマン，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の相似法の検索によって、又は、これらに限定されないがＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含む、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって、行うことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。
【００１７】
アミノ酸配列を比較するための１つの例は、以下のデフォルト設定、ワードサイズ：３；クエリ範囲内の最大一致数：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；構成調整：条件付き構成スコアマトリックス調整、を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである。核酸配列を比較するためのそのような例の１つは、以下のデフォルト設定、ワードサイズ：２８；クエリ範囲内の最大一致数：０；一致／不一致スコア：１．−２；ギャップコスト：線形、を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである。特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、タンパク質及び核酸それぞれの比較のための上記で特定されたデフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴプログラム一組（アルツシュルら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を使用して得られた値を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】ＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得による転写記録を示す。ａ）ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現は、細胞内ＲＮＡの獲得につながり、ＤＮＡ内に保存された転写イベントの分子記憶を提供する。
【図１ｂ】ＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得による転写記録を示す。ｂ）ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）及びＣＲＩＳＰＲ獲得を介したＲＮＡの記録及びそれに続くディープ配列決定（Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ）の比較。ＲＮＡ−ｓｅｑは、単一の時点で細胞集団のトランスクリプトームを捕捉し、細胞イベントの一時的なスナップショットを提供する。対照的に、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは以前の転写イベントに関する情報をＣＲＩＳＰＲアレイに永続的に保存し、時間の経過とともに発生した転写イベントを再構築するための分子記録を提供する。
【図２ａ−ｂ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ａ）Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ実験ワークフロー（図７）の概略図。ｂ）大腸菌ゲノム（スケールバー２５０ｋｂ）及び代表的な遺伝子座（スケールバー１００ｂｐ）に整列したスペーサーのカバレッジ。同一の整列は、独立した生物学的試料で獲得された再発スペーサーを表す（ｎ＝１４）。センス／アンチセンス配向ラベルはＲＮＡに関するものである。
【図２ｃ−ｅ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ａ）Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ実験ワークフロー（図７）の概略図。ｂ）大腸菌ゲノム（スケールバー２５０ｋｂ）及び代表的な遺伝子座（スケールバー１００ｂｐ）に整列したスペーサーのカバレッジ。同一の整列は、独立した生物学的試料で獲得された再発スペーサーを表す（ｎ＝１４）。センス／アンチセンス配向ラベルはＲＮＡに関するものである。ｃ）ゲノム整列スペーサーの長さ分布。ｄ）ゲノム整列スペーサーのＧＣ含量分布。点線は５０％のＧＣ含量を表す。ｅ）スペーサーの５’（左）又は３’（右）末端のヌクレオチド確率、及びそれぞれの隣接配列。スペーサー（青）と隣接（灰色）ヌクレオチドが示されている。データは、ｎ＝１４の独立した生物学的試料間でマージされたスペーサーを表す。ｃ−ｅの値は、ｎ＝１４の独立した生物学的試料のゲノムアライメントスペーサーの平均パーセント±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図２ｆ−ｇ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ｆ）転写産物に沿った整列スペーサーの遺伝子本体カバレッジ。相対位置は、隣接するゲノム領域のコード配列長＋／−３００ｂｐのパーセンタイルを表す。値は、ｎ＝１４の独立した生物学的試料の平均正規化カバレッジ±標準偏差である。
【図３ａ−ｃ】本発明のシステムＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、存在量に応じてＲＮＡから直接スペーサーを獲得することを示す。ａ）ｔｄイントロンを含むコンストラクト及びｔｄイントロンスプライスジャンクションに整列する代表的なスペーサーの概略図。ｂ）ｔｄイントロンスプライスジャンクションに由来するスペーサーの定量化。値は、ｎ＝３の独立した生物学的試料の１００万回の読み取りあたりの平均ｔｄイントロンスペーサー±ｓ．ｅ．ｍ．である。生の配列決定数の合計を下に示す。ｃ）ＭＳ２記録を描いた実験ワークフロー。
【図３ｄ−ｆ】本発明のシステムＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、存在量に応じてＲＮＡから直接スペーサーを獲得することを示す。ｄ）ＭＳ２由来のＲＮＡスペーサーの定量。値は、ｎ＝３（ＭＳ２なし）及び４（ＭＳ２）の生物学的に独立した試料の１００万回の読み取りあたりの平均ＭＳ２整列スペーサー±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｅ）ＭＳ２ゲノムに整列するスペーサーのカバレッジ。データは、試料間でマージされた整列を表す。センス又はアンチセンス配向は、（＋）鎖ＭＳ２ＲＮＡに関して与えられ、スケールバー２００ｂｐである。ｆ）任意の配列の転写記録の概略図と定量化。値は、ｎ＝１０の独立した生物学的試料の平均相対スペーサー数±ｓ．ｅ．ｍ．である。構成的に発現されたＫａｎＲ選択マーカーを対照として使用した。
【図３ｇ】本発明のシステムＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、存在量に応じてＲＮＡから直接スペーサーを獲得することを示す。ｇ）直交転写記録の概略図と定量化。値は、ｎ＝１０（処理済み）及び９（未処理）の独立した生物学的試料の平均相対スペーサー数±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図４ａ】複雑な細胞挙動のトランスクリプトームスケールの記録及び分析を示す。ａ）Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑを比較するためのワークフロー。
【図４ｂ−ｃ】複雑な細胞挙動のトランスクリプトームスケールの記録及び分析を示す。ｂ）ピアソン相関を使用して実行された、未処理（灰色）及び酸化ストレス処理（緑色）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング、ｎ＝１２（未処理）及びｎ＝１１（処理済み）の独立した生物学的試料。ｃ）ピアソン相関を使用して実行された未処理（灰色のボックス）及び酸ストレス処理（オレンジ色のボックス）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング、ｎ＝１０の独立した生物学的試料。
【図４ｄ−ｅ】複雑な細胞挙動のトランスクリプトームスケールの記録及び分析を示す。ｄ）未処理（灰色）及び酸化ストレス処理（緑色）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡ、ｎ＝１２（未処理）及びｎ＝１１（処理）の独立した生物学的試料。ｅ）未処理（灰色）及び酸ストレス処理（オレンジ）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡ、ｎ＝１０の独立した生物学的試料。
【図４ｆ−ｇ】複雑な細胞挙動のトランスクリプトームスケールの記録及び分析を示す。ｆ）酸化ストレス下で差次的に発現する特徴的な遺伝子のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング。ｇ）酸ストレス下で差次的に発現する特徴的な遺伝子のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング。
【図５ａ−ｂ】用量依存的及び一過性の除草剤曝露を記録するためのセンチネル細胞を示す。ａ）ピアソン相関を使用して実行された未処理（灰色）、１０ｍＭパラコート処理（赤）及び１ｍＭパラコート処理（緑）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング、ｎ＝１５の独立した生物学的試料。ｂ）未処理（灰色）、１０ｍＭパラコート処理（赤）及び１ｍＭパラコート処理（緑）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡ、ｎ＝１５の独立した生物学的試料。
【図５ｃ】用量依存的及び一過性の除草剤曝露を記録するためのセンチネル細胞を示す。ｃ）特徴的な差次的発現遺伝子のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのクラスタリング。
【図５ｄ】用量依存的及び一過性の除草剤曝露を記録するためのセンチネル細胞を示す。ｄ）一過性のパラコート曝露時にＲｅｃｏｒｄｓ−Ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑを比較するためのワークフロー。
【図５ｅ−ｆ】用量依存的及び一過性の除草剤曝露を記録するためのセンチネル細胞を示す。ｅ）非曝露（灰色）、一過性のパラコート曝露（ターコイズ）及び常にパラコート曝露（赤）の大腸菌集団からのＲＮＡ−ｓｅｑデータのＰＣＡ、ｎ＝６の独立した生物学的試料。ｆ）非曝露（灰色）、一過性のパラコート曝露（ターコイズ）及び常にパラコート曝露（赤）の大腸菌集団からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡ、ｎ＝６の独立した生物学的試料。
【図６ａ−ｂ】ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログの検索及びスクリーニングを示す。ａ）１２１個のＲＴ−Ｃａｓ１オルソログの同定、リーダー−ＤＲ−ｓｐａｃｅｒ１−ＤＲ−ｓｐａｃｅｒ２−ＤＲを含む最小のＣＲＩＳＰＲアレイを保持するプラスミドからの大腸菌での過剰発現、それに続く拡張ＣＲＩＳＰＲアレイのディープ配列決定、及び同定されたスペーサーの分析及び特性評価を伴う実験ワークフロー。ｂ）機能テスト用に選択された１４の異なるＲＴ−Ｃａｓ１タンパク質の比較。左側に示されているのは、宿主種に続いてＭＵＳＣＬＥ複数配列決定整列のＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ遺伝距離を使用して構築された近隣結合系統樹である。大きな「不明なドメイン」は緑色で、Ｃａｓ６相同性ドメインはピンクで、ＲＴドメインは紫色で、Ｃａｓ１は黄色で強調表示されている。
【図６ｃ−ｄ】ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログの検索及びスクリーニングを示す。ｃ）異なる誘導培地での大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）での一晩の増殖及びＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の誘導後の新たに獲得したスペーサーの検出頻度。示されているのは、ｎ＝１の生物学的試料の１００万回の配列読み取りあたりのスペーサーカウントの合計である。ｄ）Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）アレイ１から対応する過剰発現プラスミドに配列決定された２００個のスペーサーの代表的な整列。ｅ）Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）アレイ２から対応する過剰発現プラスミドに配列決定された２００個のスペーサーの代表的な整列。
【図７ａ】ＳＥＮＥＣＡワークフローと様々な培養条件でのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ効率の評価を示す。ａ）ＳＥＮＥＣＡは、リーダー配列とそれに続く単一のＤＲ及び制限酵素ＦａｑＩの認識配列からなる最小のＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドに依拠する。（左）親アレイと（右）拡張アレイのＳＥＮＥＣＡワークフローが示されています。ゴールデンゲート反応において、ＦａｑＩがＤＲ（Ｉ／ＩＩ）内で切断し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７  ３’アダプター（ＩＩＩ）にライゲーションするための粘着末端を導入する。親アレイについては、これにより、単一の切り捨てられたＤＲ（ＩＶａ）が生じる。拡張されたアレイについては、これにより、短縮されたＤＲだけでなく、無傷のＤＲ及びスペーサー（ＩＶｂ）が生じる。全長ＤＲ及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７  ３’アダプターに結合するプライマーを使用したＰＣＲにより、親アレイ（Ｖａ）が線形増幅され、拡張アレイ（Ｖｂ）が指数関数的に増幅される。
【図７ｂ−ｅ】ＳＥＮＥＣＡワークフローと様々な培養条件でのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ効率の評価を示す。ｂ）ＩＰＴＧ誘導の有無にかかわらず、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２をコードするプラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から得られた配列読み取り。ｃ）大腸菌ＢＬ２１ＡＩであること以外はｂ）と同じ。ｄ）大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、大腸菌のＫ１２亜株であること以外はｂ）と同じ。ｅ）新しく獲得したスペーサーを含む誘導試料からの配列決定読み取りの割合の比較。
【図７ｆ−ｇ】ＳＥＮＥＣＡワークフローと様々な培養条件でのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ効率の評価を示す。ｆ）ＯＤ６００が０．４、０．８、又は飽和状態の培養物から得られた１００万配列決定読み取りあたりのスペーサー。ｇ）ＯＤ６００が０．４、０．８、又は飽和状態の培養物から得られた１００万配列決定読み取りあたり２つのスペーサーを備えたＣＲＩＳＰＲアレイ。ｂ−ｇの値は、ｎ＝３の独立した生物学的試料の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図８】ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログ及びＣＲＩＳＰＲアレイの方向性のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑベース選別を示す。ａ）Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ分析のためのＣＲＩＳＰＲアレイ及び方向性の選択を示すＦ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の概略図。各遺伝子座内のＣＲＩＳＰＲアレイが特定され、対応するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２コード配列をコードするプラスミドにクローン化された。アレイは、１５０ｂｐのリーダーを使用して、順方向と逆方向の両方の可能な方向でテストされた。ゲノムデータが不十分な場合、アレイは一方向性でのみテストされました。ｂ）ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログ及びＣＲＩＳＰＲアレイの方向性のｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ読み出し。各アレイの順方向（ｆｗ）及び逆方向補数（ｒｃ）の獲得効率は、それぞれ青及びオレンジでプロットされている。値は、ｎ＝１の生物学的試料の１００万回の配列決定読み取りあたりのゲノム整列スペーサーである。
【図９ａ−ｂ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性及びＳＥＮＥＣＡと従来のスペーサー獲得の読み出しの比較を示す。ａ）図２ｆと同様に調製された、ｎ＝１４の独立した生物学的試料間でマージされたプラスミド整列スペーサーを使用して決定されたヌクレオチド確率。ｂ）すべてのスペーサー又は転写産物の本体の内部（「遺伝子本体の内部」）で獲得されたスペーサーについてのスペーサーＧＣ含有量のヒストグラム。値は、ｎ＝３の独立した生物学的試料のゲノムア整列スペーサーの平均パーセント±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図９ｃ−ｅ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性及びＳＥＮＥＣＡと従来のスペーサー獲得の読み出しの比較を示す。ｃ）コーディング遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに整列するスペーサーの割合。センス又はアンチセンス配向標識は、図２ｃと同様に調製されたＲＮＡに関するものでる。ｄ）図２ｄと同様に調製されたゲノム整列スペーサーの長さ分布。ｅ）ゲノム整列スペーサーのＧＣ含量分布。点線は、図２ｅと同様に調製されたバランスの取れた（５０％）ＧＣ含量を表す。ｃ−ｇの値は、５７９８個のスペーサーを含む、ｎ＝１のプールされた試料のゲノム整列スペーサーの平均パーセントである。
【図９ｆ−ｇ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性及びＳＥＮＥＣＡと従来のスペーサー獲得の読み出しの比較を示す。ｆ）図２ｆと同様に調製された、従来の獲得読み出しのヌクレオチド確率。ｇ）図２ｆと同様に調製された、ＳＥＮＥＣＡ獲得読み出しのヌクレオチド確率。遺伝子本体カバレッジ。各遺伝子について、スペーサーカバレッジが決定され、比較のためにパーセンタイルに変換された。値は平均正規化カバレッジである。ｎ＝１プールされた試料、５７９８個のスペーサーを含む。ｃ−ｇの値は、５７９８個のスペーサーを含む、ｎ＝１のプールされた試料のゲノム整列スペーサーの平均パーセントである。
【図９ｈ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性及びＳＥＮＥＣＡと従来のスペーサー獲得の読み出しの比較を示す。遺伝子本体カバレッジ。各遺伝子について、スペーサーカバレッジが決定され、比較のためにパーセンタイルに変換された。値は平均正規化カバレッジである。ｎ＝１プールされた試料、５７９８個のスペーサーを含む。
【図１０ａ−ｃ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ａ）ＲＮＡ由来のスペーサーを検出するための、ｔｄイントロンスプライスジャンクションを使用してＲＮＡに対するＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の特異性を決定するための実験ワークフロー。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は独立した培養物から抽出され、ｔｄイントロン挿入部位の標的ディープ配列決定に供された。ｂ）ｔｄイントロンスプライスジャンクションの定量化。スプライスジャンクションはＲＮＡ由来のスペーサーに特異的であり、大腸菌ゲノムの代替ＲＴによって生成されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡコピーに特異的ではない。値は、ｎ＝３の独立した生物学的試料の１００万配列決定読み取りあたりの平均ｔｄイントロンスプライスジャンクション数±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。ｃ）ＲＮＡウイルスからのＣＲＩＳＰＲ獲得を示す、プラスミド、大腸菌ゲノム、及びＭＳ２ゲノムに整列されたスペーサーの数。各参照に整列しているスペーサーの総数とパーセントが表される。値は、複製全体のＭＳ２整列スペーサーの合計を表し、ｎ＝２の生物学的試料からのｎ＝６４の技術的複製、２２００万のスペーサーを表す。
【図１０ｄ−ｅ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ｄ）過剰発現プラスミド、大腸菌、ＭＳ２ゲノムに整列するｃ）のＭＳ２アラインスペーサーの数。ＭＳ２整列スペーサーがＭＳ２ゲノムに特異的であることを示している。続いて各参照に整列するＭＳ２整列スペーサーの総数とパーセントが示されており、ｎ＝２の生物学的試料からのｎ＝６４の技術的複製であり、２，２００万のスペーサーを表す。ｅ）ＭＳ２ゲノムの特徴に一致するスペーサーの総数であり、ｎ＝２の生物学的試料からのｎ＝６４の技術的複製、２，２００万のスペーサーを表す。
【図１０ｆ】ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって獲得されたスペーサーの特性を示す。ｆ）ＭＳ２及びＥ．ｃｏｌｉゲノムからの転写産物数の散布図。各ドットは、ｎ＝４の独立した生物学的試料の各転写産物の平均スペーサー数を表す。水平の黒いバーは、すべての転写産物にわたる平均ゲノム整列スペーサー数±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１１ａ】ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用した任意のＲＮＡ配列記録の定量分析を示す。ａ）ｓｆＧＦＰ又はＲｌｕｃに整列する図３ｆのスペーサーのカバレッジ。矢印及び点線は転写開始部位（ＴＳＳ）を反映し、黒い八角形は転写ターミネーターを示す。各ヌクレオチド位置について、ｎ＝１０の独立した生物学的試料の１００万回の配列決定読み取りあたりのスペーサーカバレッジの合計が示されている。
【図１１ｂ−ｅ】ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用した任意のＲＮＡ配列記録の定量分析を示す。ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたｓｆＧＦＰｍＲＮＡの絶対定量。図３ｆの試料。値は、ｎ＝１０の独立した生物学的試料の１６ＳｒＲＮＡコピー数で正規化された６×１０９細胞あたりの平均コピー数±ｓ．ｅ．ｍ．である。ｃ）Ｒｌｕｃについてであること以外、ｂと同様。ｄ）図３ｆの絶対ｓｆＧＦＰｍＲＮＡコピー数及び転写産物整列スペーサーの数の相関関係を示す散布図。線形回帰適合、決定係数（Ｒ２）、及びピアソン線形相関係数（Ｐ）、ｎ＝１０の独立した生物学的試料。ｅ）Ｒｌｕｃについてであること以外、ｄと同様。
【図１１ｆ−ｈ】ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用した任意のＲＮＡ配列記録の定量分析を示す。ｆ）任意のｓｆＧＦＰ配列及び内因性転写産物のスペーサー数の比較。各ドットは各転写産物の平均スペーサー数を表し、水平の黒いバーは、平均ゲノム整列スペーサー数±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を表す。ｇ）記録されたスペーサーの数が異なる場合のｓｆＧＦＰ整列スペーサー及びインデューサー濃度の間の用量反応関係。これらのデータは、ｓｆＧＦＰ整列スペーサーの平均数±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を表す。ｈ）３ＯＣ６−ＨＳＬ誘導後のＦｌｕｃ転写産物にマッピングされるスペーサーの相対スペーサー数。値は、ｎ＝６の独立した生物学的試料の１００万回の配列決定読み取りあたりのスペーサーの正規化された平均数±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１１ｉ−ｊ】ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用した任意のＲＮＡ配列記録の定量分析を示す。ｉ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＦｌｕｃｍＲＮＡの絶対定量。データは、図３ｇと同じ細菌培養から得られました。値は、６ＳｒＲＮＡコピー数で正規化された、６×１０９細胞あたりの平均コピー数±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１０の独立した生物学的試料である。ｊ）Ｒｌｕｃについてであること以外、ｇと同じである。
【図１２ａ】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが累積的に高度に発現する遺伝子を明らかにすることを示す。ａ）ｂ及びｃに示されているｎ＝３の独立した生物学的複製間のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ相関を示す散布図。線形回帰適合、決定係数（Ｒ２）、及びピアソン線形相関係数（Ｐ）が各比較について示されている。データはｌｏｇ２で正規化された転写産物の定量カウントを表す。
【図１２ｂ】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが累積的に高度に発現する遺伝子を明らかにすることを示す。ｂ）スペーサーは、高度に発現する遺伝子から優先的に獲得される。ＲＮＡ−ｓｅｑベースの遺伝子発現値の減少に応じたプラスミド及び大腸菌遺伝子（上）又は大腸菌遺伝子のみ（下）のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑスペーサー数。モンテカルロ境界は、転写バイアスのないシミュレーションされたスペーサーを反映している。平均累積正規化スペーサー数、及びモンテカルロ境界が、ｎ＝３の独立した生物学的試料で示されている。
【図１２ｃ−ｄ】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが累積的に高度に発現する遺伝子を明らかにすることを示す。ｃ）ＲＮＡ−ｓｅｑ固定相スナップショット及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ転写記録の間の相関の評価。ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは、一晩ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現するように誘導された定常期増殖中の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の同じ集団で実行された。すべて（左上）、定常期（右上）、対数期（左下）、及びプラスミド媒介（右下）の遺伝子間の相関関係が示されている。線形回帰適合、決定係数（Ｒ２）、及びピアソン線形相関係数（Ｐ）が各比較について示されている。データは、ｎ＝３の独立した生物学的試料のリピート全体で平均されたｌｏｇ２正規化転写産物定量化数を表す。ｄ）長期培養におけるＬｏｇでのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び定常期遺伝子の相関。これらのデータは、ｎ＝３の独立した生物学的試料を入力として、様々な大腸菌培養時点を使用して、定常期又は対数期の遺伝子セットについてｂについて説明したように計算されたＲ２値を表す。
【図１２ｅ】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが累積的に高度に発現する遺伝子を明らかにすることを示すｅ）遺伝子発現レベルを正規化した場合としない場合の転写産物整列スペーサー数の比較。各ドットは、ｎ＝３の独立した生物学的試料を使用した転写産物あたりの平均正規化カウント数を表す。水平の黒いバーは、平均ゲノム整列スペーサー数±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１３−１】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及びＰＣＡを使用して複雑な細胞の挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。ａ）図４に示す酸ストレス応答データセットを使用して、ＰＣＡは、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータに対して実行された。このデータは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが元のデータの７％（３１４スペーサー又は６．１×１０６大腸菌細胞に対応）で酸ストレス応答試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類していることを示している。
【図１３−２】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及びＰＣＡを使用して複雑な細胞の挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。ａ）図４に示す酸ストレス応答データセットを使用して、ＰＣＡは、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータに対して実行された。このデータは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが元のデータの７％（３１４スペーサー又は６．１×１０６大腸菌細胞に対応）で酸ストレス応答試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類していることを示している。
【図１４−１】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び差次的発現した特徴的な遺伝子分析を使用して複雑な細胞挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。図４ｅ、ｆ、ｇに示す酸ストレス応答データセットを使用して、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータについて、差次的に発現された特徴的な遺伝子が同定された。プロットは、階層的にクラスター化された特徴的な遺伝子ヒートマップを示している。このデータは、元のデータの１０％（４４８スペーサー又は８．８×１０６大腸菌細胞に対応）で、特徴的な遺伝子が試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類できることを示している。
【図１４−２】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び差次的発現した特徴的な遺伝子分析を使用して複雑な細胞挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。図４ｅ、ｆ、ｇに示す酸ストレス応答データセットを使用して、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータについて、差次的に発現された特徴的な遺伝子が同定された。プロットは、階層的にクラスター化された特徴的な遺伝子ヒートマップを示している。このデータは、元のデータの１０％（４４８スペーサー又は８．８×１０６大腸菌細胞に対応）で、特徴的な遺伝子が試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類できることを示している。
【図１４−３】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び差次的発現した特徴的な遺伝子分析を使用して複雑な細胞挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。図４ｅ、ｆ、ｇに示す酸ストレス応答データセットを使用して、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータについて、差次的に発現された特徴的な遺伝子が同定された。プロットは、階層的にクラスター化された特徴的な遺伝子ヒートマップを示している。このデータは、元のデータの１０％（４４８スペーサー又は８．８×１０６大腸菌細胞に対応）で、特徴的な遺伝子が試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類できることを示している。
【図１４−４】Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び差次的発現した特徴的な遺伝子分析を使用して複雑な細胞挙動を評価するために必要な最小細胞数を決定することを示す。図４ｅ、ｆ、ｇに示す酸ストレス応答データセットを使用して、データセット全体だけでなく漸進的かつ無作為にダウンサンプリングされたデータについて、差次的に発現された特徴的な遺伝子が同定された。プロットは、階層的にクラスター化された特徴的な遺伝子ヒートマップを示している。このデータは、元のデータの１０％（４４８スペーサー又は８．８×１０６大腸菌細胞に対応）で、特徴的な遺伝子が試料、ｎ＝１０の独立した生物学的試料を適切に分類できることを示している。
【図１５ａ−ｂ】ＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得効率の最適化及び一過性除草剤曝露をコード化するためのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ互換センチネル細胞に対応する特徴的な遺伝子の検出を示す。ａ）指定されたＩＰＴＧ濃度下で元のコード配列（ＣＤＳ）（水色）又は最適化されたＣＤＳ（紺色）を使用してＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２コード化プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から得られたプラスミド及びゲノム整列スペーサー。ｂ）ＰＴ７ｌａｃ、ＰｔｅｔＡ、又はＰｒｈａＢプロモーターのいずれかの転写制御下で最適化されたコード配列を使用して、それぞれＩＰＴＧ、ａＴｃ、又はＲｈａｍｎｏｓｅの示された濃度で誘導されたＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２コード化プラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）から得られたプラスミド及びゲノム整列スペーサー。
【図１５ｃ】ＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得効率の最適化及び一過性除草剤曝露をコード化するためのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ互換センチネル細胞に対応する特徴的な遺伝子の検出を示す。ｃ）特徴的な差次的（累積的）発現の遺伝子のＲＮＡ−ｓｅｑ累積的発現プロファイルの教師なし階層的クラスタリング。特徴的な遺伝子は、ＤＥＳｅｑ２、ｅｄｇｅＲ、及びｂａｙＳｅｑ、ｎ＝６の独立した生物学的試料によって同定された上位２０の最も差次的に発現される遺伝子間の結合を表す。
【図１５ｄ】ＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得効率の最適化及び一過性除草剤曝露をコード化するためのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ互換センチネル細胞に対応する特徴的な遺伝子の検出を示す。ｄ）特徴的な差次的（累積的）発現遺伝子のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ累積的発現プロファイルの教師なし階層的クラスタリング。特徴的な遺伝子は、ＤＥＳｅｑ２、ｅｄｇｅＲ、及びｂａｙＳｅｑ、ｎ＝６の独立した生物学的試料によって同定された上位２０の最も差次的に発現される遺伝子間の結合を表す。ａ、ｂのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３の独立した生物学的試料である。
【図１６】マウス腸内の一般的なＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑワークフローの概略図を示す。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＭＧ１６５５細胞は、誘導性プロモーター（この場合はＰｔｅｔＡ）の転写制御下で、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２をコードするプラスミドで形質転換される。さらに、ベクターはＦｓＣＲＩＳＰＲアレイのＳＥＮＥＣＡ互換バージョンをエンコードする。大腸菌細胞は、形質転換後、最初に固体培養で増殖され、次に個々のコロニーから液体培養で増殖される。続いて、無菌マウスに大腸菌細胞を強制経口投与し、抗生物質（ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２プラスミドの耐性マーカーと一致）及びＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現の誘導物質（この場合はアンヒドロテトラサイクリン）を添加することにより、プラスミドの維持とＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現を確保する。大腸菌細胞は無菌マウスの腸にコロニーを形成し、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、細胞が腸を通過する間にスペーサーをプラスミド由来のＣＲＩＳＰＲアレイに記録する。次に、動物の糞便又は腸の内容物から様々な部位で大腸菌細胞を収集する。プラスミドＤＮＡは大腸菌から抽出され、ＳＥＮＥＣＡに供した後、ディープ配列決定を行って、記録されたスペーサーを獲得し、腸内環境を推測する。
【図１７】ＳＥＮＥＣＡによって検出されたスペーサーの獲得及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いたマウスの強制経口投与後のディープ配列決定を示す。アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）は、示された濃度で飲料水を介して供給された。スペーサーの獲得は、ａＴｃ濃度の増加とともに増加した。
【図１８】ＳＥＮＥＣＡによって検出されたスペーサーの獲得及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いたマウスの強制経口投与後のディープ配列決定を示す。アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）は、示された濃度で飲料水を介して供給された。複数のスペーサーの獲得は、ａＴｃ濃度の増加とともに増加した。
【図１９】ＳＥＮＥＣＡによって検出されたスペーサーの獲得及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いたマウスの強制経口投与後のディープ配列決定を示す。プラスミドＤＮＡは、小腸、盲腸、結腸、糞便の大腸菌細胞から分離された。スペーサーの獲得は、腸のすべてのテストされた解剖学的セクションで発生する。
【図２０】ＳＥＮＥＣＡによって検出されたスペーサーの獲得及び大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いたマウスの強制経口投与後のディープ配列決定を示す。プラスミドＤＮＡは、２、５及び９日目に動物の糞便からの大腸菌細胞から分離され、スペーサーの獲得は時間とともに増加することが示されました。
【図２１】図１６に概説されているように、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を強制経口投与され、及び水（Ｈ２Ｏ）又は大腸炎を誘発する１、２、又は３％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）飲料水のいずれかで処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡを示す。
【図２２】図１６に概説されているように、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を強制経口投与され、及び固形飼料又はデンプンベースの飼料を与えられたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡを示す。
【図２３】図１６に概説されているように、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を強制経口投与され、及び水（Ｈ２Ｏ）又は大腸炎を誘発する１、２、又は３％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）飲料水のいずれかで処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータの上位の差次的発現遺伝子についての教師なし階層的クラスタリングを示すヒートマップを示す。（Ｈ２Ｏ）又は１、２、又は３％（ｗ／ｖ）大腸炎は、飲料水中にデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を誘発します。分散安定化形質転換（ｖｓｔ）形質転換ゲノム整列スペーサーカウントが使用された。
【図２４】図１６に概説されているように、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を強制経口投与され、及び固形飼料又はデンプンベースの飼料を与えられたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータの上位の差次的発現遺伝子についての教師なし階層的クラスタリングを示すヒートマップを示す。分散安定化形質転換（ｖｓｔ）形質転換ゲノム整列スペーサーカウントが使用された。
【図２５】図１６に概説されているように、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を発現する大腸菌ＭＧ１６５５細胞を強制経口投与され、固形飼料、デンプン、又は脂肪ベースの飼料を与えられたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータのＰＣＡプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、細胞の転写産物、特にトランスクリプトームを記録するための方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
−  試験細胞を提供する工程であって、試験細胞は、
逆転写酵素ポリペプチド及びＣａｓ１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列、及びＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列であって、ここで第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列は、誘導性又は構成的プロモーター配列の転写制御下にある、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列と、
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む第３の導入遺伝子核酸配列であって、ここで、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、第１の導入遺伝子核酸配列と第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、第３の導入遺伝子核酸配列と
を含む工程、
−  第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される条件下に試験細胞を曝露する工程であって、ここで、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体は、
１つ以上の核酸分子、特に１つ以上の細胞内核酸分子、より特に１つ以上のＲＮＡ分子から、少なくとも１つのプロトスペーサー、特に２つ以上のプロトスペーサーを獲得し、及び前記プロトスペーサーをスペーサーとして前記第３の導入遺伝子核酸配列内に統合する、工程、
−  改変された第３の導入遺伝子核酸配列を試験細胞から単離して、単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を生成する工程、並びに
−  単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列を配列決定する工程。
【００２０】
プロトスペーサーの獲得は、それ自体が核酸分子、特にＲＮＡ分子と結合するＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２が複合体を形成することよって行われる。第１及び第２の導入遺伝子核酸配列によってコードされるＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２は、特にＲＮＡからプロトスペーサーを獲得し、それらをＣＲＩＳＰＲアレイ内に統合して逆転写することができる、安定した機能的な複合体を形成する。したがって、プロトスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のＤＮＡの断片であるスペーサーに変換される。これらのスペーサーは、トランスクリプトームに由来するプロトスペーサーの配列を解明するために、単離及び配列決定され得る。
【００２１】
あるいは、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列は、構成的プロモーター又は低酸素若しくは嫌気性条件などの栄養要求条件下で発現されるプロモーターの転写制御下にあり得る。
【００２２】
第１及び第２の導入遺伝子核酸配列によってコードされるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって獲得されるプロトスペーサーは、宿主細胞の内因性核酸又は導入遺伝子核酸配列、又は水平遺伝子転移からの外因性核酸、又は宿主細胞に導入された外因性合成核酸に由来し得る。
【００２３】
特定の実施形態では、前記試験細胞は、さらに、
−  センサーをコードする第４の導入遺伝子核酸配列を含み、ここで、前記センサーは、分析対象分子と接触すると活性化され、活性化センサーを生成し、前記活性化センサーは、細胞内の記録遺伝子の発現を誘導し、
そして、前記曝露工程において、前記分析対象分子が存在する場合、前記活性化センサーは、細胞内の記録遺伝子の発現を誘導し、そして前記記録遺伝子に由来するＲＮＡは、スペーサーとして獲得される。
【００２４】
したがって、特定の実施形態において、宿主細胞は、誘導性プロモーター配列又は構成的プロモーター配列の転写制御下にある第４の導入遺伝子核酸配列をさらに含む。誘導性又は構成的プロモーター配列は、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現を制御する誘導性又は構成的プロモーター配列と等しいか、又は異なっていてもよい。好ましくは、第４の導入遺伝子核酸配列は、合成プロモーター配列の転写制御下にある。
【００２５】
有利には、特定の任意の配列は、特定の刺激（例えば、誘導化合物）を示すプロトスペーサーとして発現及び獲得されてもよい。例えば、大腸菌細胞は、胃腸管に存在するヒトの疾患のバイオマーカーについての特定の受容体を発現するように設計されている。本発明の方法による大腸菌の記録は、センサーによって実行される下流の細胞内事象（導入遺伝子のような任意の配列の発現など）を記録する。これにより、記録する大腸菌細胞に複数の診断センサーを備えることができる。センサーの上に転写記録を追加すると、病気の種類や状態をさらに区別するのに助けとなる。適切なバイオマーカーの非限定的な例には、ｓｆＧＦＰ、Ｒｌｕｃ、Ｆｌｕｃを含む。さらに、適切なバイオマーカーの非限定的な例には、任意の配列、すなわち、例えば、ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって優先的に統合されるように最適化され、バイオマーカーと一意的に対になるＤＮＡヌクレオチドの任意の組成が含まれる。
【００２６】
特に、試験細胞は、特に環境又は条件に応じて、原核細胞又は真核細胞であってもよく、これらの影響は、試験細胞の転写について決定されなければならない。
【００２７】
特定の実施形態において、第３の導入遺伝子核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含み、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列は、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である。特に、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列及びＣＲＩＳＰＲリーダー配列は互いにすぐ近くにあり、例えば１０〜０ｂｐ以下で区切られる。
【００２８】
ダイレクトリピート配列及びリーダー配列は、両方の可能な位置づけであらわされてもよい。したがって、ダイレクトリピート配列及び任意選択でリーダー配列を含む第３の導入遺伝子核酸配列は、第３の導入遺伝子核酸が試験細胞のゲノム内に統合されているか、第３の導入遺伝子核酸はベクター内に含まれるかどうかに関係なく、宿主生物のＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上にあり得る。
【００２９】
特定の実施形態において、第３の導入遺伝子核酸配列は、さらなるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列を含まない。
【００３０】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び／又はＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）（特に、ＢＡ−９１種又はＳＫ−０２種）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）（特にＤＳＭ３９８６）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）（特にＳ１４株）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）（特に亜種フェタス）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）（特にＴ８４１２）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）（特にＤＳＭ  ２０７５）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）（特に４Ｂ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）（特に６９Ｂ４）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（特にＰＣＣ７１１６）のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体、又はそれに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である。
【００３１】
特に、上記の種のいずれか１つに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、上記の種のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％のアミノ酸又は核酸配列同一性を有する機能的同等のポリペプチド（ＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２）も包含する。同様に、上記の種のいずれか１つに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２もまた、同一のアミノ酸配列であるが、コドン最適化されたＲＴ−Ｃａｓ１及び／又はＣａｓ２をコードする核酸配列を有するポリペプチドを包含する。
【００３２】
特定の実施形態において、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列は、それぞれ配列番号１〜３４によって特徴付けられる核酸配列、又は配列番号１〜３４のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する機能的同等物をコードする核酸配列の１つを含むか、又は本質的にそれらからなる。
【００３３】
特定の実施形態において、第３の導入遺伝子核酸配列は、配列番号３５〜１０３を特徴とする核酸配列、又は配列番号３５〜１０３のいずれかと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する機能的同等物をコードする核酸配列、を含むか、又は本質的にそれらからなる。
【００３４】
特定の実施形態では、試験細胞は大腸菌細胞である。特定の実施形態において、試験細胞は、大腸菌Ｋ１２株又は大腸菌Ｂ株である。特定の実施形態では、試験細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ＡＩ、ノバブルー（ＮｏｖａＢｌｕｅ）（ＤＥ３）、ＢＷ２５１１３、Ｓｔｂｌ３、ＭＧ１６５５、ＪＭ８３、Ｔｏｐ１０、ニッスル（Ｎｉｓｓｌｅ）１９１７、及びＮＧＦ−１のリストから選択される大腸菌株である。
【００３５】
特定の実施形態において、第３の導入遺伝子核酸配列は、ベクター内に含まれる。特定の実施形態において、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、ベクター、特に発現ベクター内に含まれる。
【００３６】
あるいは、第３の導入遺伝子核酸配列（ＣＲＩＳＰＲアレイ）及び／又は第１及び第２の導入遺伝子核酸配列（ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２）は試験細胞のゲノム内に統合され得る。
【００３７】
特定の実施形態において、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される条件は、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の過剰発現をもたらす。
【００３８】
特定の実施形態において、第１の導入遺伝子核酸配列及び第２の導入遺伝子核酸配列の発現が誘導される条件は、
−  試験細胞を誘導物質化合物と接触させることを含み、かつ、前記誘導性プロモーターは、誘導物質化合物によって誘導可能なプロモーターであり、又は
−  嫌気性条件を含み、かつ、前記誘導性プロモーターは嫌気性誘導性プロモーターである。
【００３９】
特定の実施形態において、誘導物質化合物は、ＩＰＴＧ、ラクトース、アラビノース、ラムノース又はアンヒドロテトラサイクリンである。
【００４０】
腸の酸素不足（嫌気性）環境でのみ活性があり、体外の酸素が豊富な環境では活性がないプロモーターが使用される場合、そのプロモーターは嫌気性誘導性プロモーターと呼ばれる。
【００４１】
あるいは、誘導性プロモーターは、試験細胞を取り巻く環境の変化によって、又は変化した環境、例えば温度、ｐＨ値、炎症、微量栄養素、多量栄養素、又は発生する低酸素又は嫌気性条件などによって誘導され得る。
【００４２】
特定の実施形態において、第３の導入遺伝子核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部にエンドヌクレアーゼ認識部位配列を含み、エンドヌクレアーゼ認識部位配列は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に部位特異的制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能である。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及び制限部位配列は、１０ｂｐｓ〜０ｂｐｓ離れている。特定の実施形態では、部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、特にＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ、又はＢｐｕＳＩである。
【００４３】
特定の実施形態において、単離された改変された第３の導入遺伝子核酸配列は、配列決定の前に特定のエンドヌクレアーゼと接触され、ここで、前記エンドヌクレアーゼ部位に隣接する全長ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートは、短縮ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列に切断される。
【００４４】
有利なことに、部位特異的制限エンドヌクレアーゼは、リーダー配列から最も離れたダイレクトリピート配列を切り詰める。ダイレクトリピート配列はスペーサーの獲得時に複製されるため、少なくとも１つの獲得されたスペーサーを含む変更された第３の導入遺伝子核酸配列は、上記の名称の部位特異的エンドヌクレアーゼで消化した後でも、完全長のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートを含むが、変更されていない第３導入遺伝子核酸（獲得したスペーサーなし）は、部位特異的エンドヌクレアーゼで消化した後、短縮されたＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列のみを含む。
【００４５】
特定の実施形態において、配列決定は、ＰＣＲプライマーの使用を含み、ＰＣＲプライマーは、改変された第３の核酸配列内の完全長ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列に本質的に相補的である核酸配列を含み、ここで、全長ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、少なくとも１つのスペーサー獲得事象、特に前記部位特異的制限エンドヌクレアーゼでの消化時に切断される前記制限部位配列の部分に起因するか、又はそれによって形成される。
【００４６】
上記の好ましいＰＣＲプライマーはこの領域に結合するが、獲得したスペーサーがない未改変の第３の導入遺伝子核酸配列内の短縮ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートには結合しない。したがって、短縮された単一ＤＲのみを有するアレイ（つまり、新しく獲得されたスペーサーがない）は、プライマー結合配列がなく、そして指数関数的に増幅されない。したがって、部位特異的制限エンドヌクレアーゼ部位及び好ましいプライマーは、有利に新しいスペーサーを有するアレイを優先的に増幅することを可能にする。
【００４７】
特定の実施形態において、逆転写酵素ポリペプチド及びＣａｓ１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする前記第１の導入遺伝子核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、及び３１から選択される配列、又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、又は３１と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％、又は≧９９％同一の配列を含む又は本質的にそれからなり、及びそのコードされるポリペプチドは配列番号７によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能を有する。
【００４８】
特定の実施形態において、Ｃａｓ２ポリペプチドをコードする前記第２の導入遺伝子核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２から選択される配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％、又は≧９９％同一の配列を含む又は本質的にそれからなり、及びそのコードされるポリペプチドは配列番号８によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能を有する。
【００４９】
特定の実施形態において、前記第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、ともに、配列番号３４の配列、又は、配列番号３４と少なくとも８５％同一、特に≧９０％、≧９３％、≧９５％、≧９８％又は≧９９％同一の配列を含む又は本質的にそれからなり、及びそのコードされるポリペプチドは配列番号３４によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能を有する。
【００５０】
配列番号３４は、核酸分子又は合成オペロンをコードする複数遺伝子として説明することができ、第１及び第２のポリペプチドの両方が同じプロモーターの転写制御下にある。第１及び第２のポリペプチドの異なるタンパク質コード配列は、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）で区切られており、２つの異なるタンパク質産物が生じる。
【００５１】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む前記第３の導入遺伝子核酸配列は、配列番号３５〜１０３から選択される配列を含む、又は本質的にそれからなる。
【００５２】
本発明の第２の態様は、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む単離された核酸分子に関し、
単離された核酸分子は、さらなるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列を含まない。
【００５３】
特定の実施形態において、単離された核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列は、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列の上流又は下流であり得る。特に、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列とＣＲＩＳＰＲリーダー配列は互いにすぐ近くにあり、例えば１０ｂｐ〜０ｂｐ以下離れている。
【００５４】
特定の実施形態において、単離された核酸分子は、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部にエンドヌクレアーゼ認識部位配列をさらに含み、エンドヌクレアーゼ認識部位配列は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に部位特異的制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能である。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及びエンドヌクレアーゼ認識部位配列は、１０ｂｐ〜０ｂｐ離れている。
【００５５】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び／又はＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）（特に、ＢＡ−９１種又はＳＫ−０２種）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）（特にＤＳＭ３９８６）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）（特にＳ１４株）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）（特に亜種フェタス）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）（特にＴ８４１２）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）（特にＤＳＭ２０７５）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）（特に４Ｂ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）（特に６９Ｂ４）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（特にＰＣＣ７１１６）のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体、又はそれに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である。
【００５６】
特定の実施形態において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、特にＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ、又はＢｐｕＳＩである。
【００５７】
特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３５〜１０３によって特徴付けられる核酸配列、又は、配列番号３５〜１０３のひとつと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する機能的同等物をコードする核酸配列、を含む又は本質的にそれらからなる。
【００５８】
本発明の第３の態様は、以下の配列要素：
−  逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の核酸配列、及びＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の核酸配列であって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある、前記第１の核酸配列及び第２の核酸配列と、
−  ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ配列であって、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列が、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列と、
を含む発現ベクターに関する。
【００５９】
特定の実施形態において、発現ベクターは、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列によってコードされるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって認識可能なさらなるＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列を含まない。
【００６０】
特定の実施形態において、発現ベクターは、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列をさらに含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能であり、特に、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及びＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は１０ｂｐ〜０ｂｐ離れている。
【００６１】
特定の実施形態において、発現ベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートの下流又は内部のエンドヌクレアーゼ認識部位配列をさらに含む。特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼ認識部位配列は、部位特異的エンドヌクレアーゼ、特に部位特異的制限エンドヌクレアーゼによって特異的に認識可能である。特定の実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート及び前記制限部位配列は、１０ｂｐｓ〜０ｂｐｓ離れている。
【００６２】
特定の実施形態では、前記部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、特にＦａｑＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＦｉｎＩ、又はＢｐｕＳＩである。
【００６３】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリーダー配列及び／又はＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）（特に、ＢＡ−９１種又はＳＫ−０２種）、ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）（特にＤＳＭ３９８６）、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｅｓ）（特にＳ１４株）、カンピロバクター フェタス（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）（特に亜種フェタス）、テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）（特にＴ８４１２）、ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）（特にＤＳＭ２０７５）、アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）（特に４Ｂ）、セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）（特に６９Ｂ４）、マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）、トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｌｙｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、もしくはリヴラリア種（特にＰＣＣ７１１６）のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体、又はそれに由来するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である。
【００６４】
特定の実施形態において、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列は、それぞれ配列番号１〜３４によって特徴付けられる核酸配列の１つ、又は、配列番号１〜３４のひとつと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する機能的同等物をコードする核酸配列、を含む又は本質的にそれらからなる。
【００６５】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイ配列は、配列番号３５〜１０３によって特徴づけられる核酸配列の１つ、又は、配列番号３５〜１０３のひとつと少なくとも７０％、８０％、８５％９０％、９５％又は９８％の同一性を有する機能的同等物をコードする核酸配列、を含む又は本質的にそれらからなる。
【００６６】
特定の実施形態において、前記誘導性プロモーター配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作動可能であり、そして特に、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｐｔｅｔプロモーター、ＰＣプロモーター又はＰＢＡＤプロモーターから選択される。
【００６７】
特定の実施形態において、第１及び第２の導入遺伝子核酸配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化されている。
【００６８】
本発明の第４の態様は、第３の態様による発現ベクターを含む細胞又は
−  逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列、及びＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列を含み、第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下であり、及び
−  上記の態様又はその任意の実施形態による導入遺伝子核酸分子を含む細胞に関し、
ここで、第１の導入遺伝子核酸配列、第２の導入遺伝子及び導入遺伝子核酸分子は、
−  第３の態様による発現ベクターに含まれる、又は
−  前記細胞のゲノム内に統合されている。
【００６９】
特定の実施形態では、細胞はさらに、
−  第４の導入遺伝子産物、特にポリペプチドセンサーまたは核酸センサーをコードする第４の導入遺伝子核酸配列を含み、前記第４の導入遺伝子産物は、細胞内の記録遺伝子の発現を（直接的または間接的に）調節することができ、そのような前記記録遺伝子の発現の調節は、分析対象分子の存在又は非存在に依存しており、
ここで、目的の前記分子は、環境内又は前記細胞内の任意の分子、特に小分子から選択され、
そして、前記記録遺伝子は、活性化されたセンサーが存在しない条件下では発現されない。
【００７０】
本発明の文脈における小分子は、８００Ｄａ未満の分子量を有する分子である。
【００７１】
特定の実施形態において、前記第４の導入遺伝子産物は、目的の分子と接触すると活性化されて活性化センサーを生じるセンサーであり、前記活性化センサーは、細胞内の記録遺伝子の発現を（直接的又は間接的に）誘導する。
【００７２】
遺伝子発現の直接調節は、第４の導入遺伝子産物が直接的に発現を誘導することができる転写因子である場合に達成される。
【００７３】
遺伝子発現の間接的な調節は、第４の導入遺伝子産物が受容体である場合に達成され、受容体は、活性化されると、遺伝子発現の調節につながるシグナルカスケードを開始する。
【００７４】
本発明の第５の態様は、患者の食事を監視するための方法、又は患者の疾患、特に患者の消化器疾患又は胃腸疾患の診断のための方法に関し、その方法は、
−  前記患者から収集された糞便試料から細胞を収集する工程であって、ここで、細胞は、
逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の核酸配列、並びにＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の核酸配列であって、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある、第１の核酸配列及び第２の核酸配列と、
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含む導入遺伝子核酸分子であって、ここで、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、導入遺伝子核酸分子と、を含み、
又は細胞は
逆転写酵素及びＣａｓ１ポリペプチドの融合タンパク質をコードする第１の導入遺伝子核酸配列、並びにＣａｓ２ポリペプチドをコードする第２の導入遺伝子核酸配列であって、第１の導入遺伝子核酸配列及び前記第２の導入遺伝子核酸配列は、誘導性プロモーター配列の転写制御下にある、第１の核酸配列及び第２の核酸配列と、
ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含む導入遺伝子核酸分子であって、ここで、ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列の発現産物によって形成されるＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって特異的に認識可能である、導入遺伝子核酸分子と、を含み、
ここで、第１の導入遺伝子核酸配列、第２の導入遺伝子及び導入遺伝子核酸分子は、前記細胞のゲノム内に統合されており、
ここで、前記細胞は、以前に前記患者に経口投与されており、誘導性プロモーター配列は、前記患者の胃腸管で活性である、工程と
−  前記細胞から導入遺伝子核酸配列を単離して、単離された導入遺伝子核酸配列を生成する工程と、
−  前記単離された導入遺伝子核酸配列の配列決定する工程と、を含み、
それにより、胃腸管の環境で生成された前記細胞の１つ以上の転写産物を記録する。
【００７５】
患者の胃腸管における誘導性プロモーター配列の活性は、低酸素又は嫌気性条件下で発現を特異的に誘導するプロモーターを使用することによって、又はアンヒトロテトラサイクリンなどの誘導化合物を患者に投与することによって達成される。
【００７６】
有利なことに、試験細胞は、胃腸管内の細胞外環境を説明する情報を捕捉するためのセンチネル細胞として利用され得る。その目的のために、上記のＣＲＩＳＰＲ機構を含む試験細胞は、患者に投与され得る。胃腸環境の状態又は変化に起因する試験細胞のトランスクリプトームの変化は、本発明の方法で決定され得る。その後、試験細胞は、糞便又は胃腸内容物から収集され得、そこに含まれるＣＲＩＳＰＲアレイ（第３の導入遺伝子核酸配列）は配列決定されて、試験細胞のトランスクリプトームの変化を明らかにし、胃腸管内の細胞外環境の代理測定として機能する。
【００７７】
細菌細胞、例えば大腸菌細胞は、環境に応じてトランスクリプトームを変化させることが知られている。特定の食事の下で、又は特定の消化器又は胃腸の病気で、胃腸管内のセンチネル試験細胞は、胃腸管内の細胞外環境を反映するトランスクリプトームの変化を捕捉する。試験細胞のトランスクリプトームの変化は、例えば、微量栄養素、多量栄養素、胆汁酸、炎症マーカー、自己調節分子、及び細菌によって自然に感知されるその他の分子を含む多数の細胞外シグナルによって誘発される可能性がある。さらに、試験細胞は、例えば、腸の炎症のマーカーであるテトラチオネートと硝酸塩／亜硝酸塩を含む、関心のある特定の腸分子のためのバイオセンサーを備えることができる。本発明者らは、例えば酸化ストレス、酸ストレス又は除草剤曝露における培養で増殖した大腸菌におけるこれらのトランスクリプトーム変化は、プロトスペーサーとして作用し、ＣＲＩＳＰＲ機構によって捕捉される転写産物から本発明の方法で観察され得ることを示した。さらに、本発明者らは、マウス、例えば異なる飼料を与えられたマウスまたは大腸炎のマウスモデルの腸管内の大腸菌におけるこれらのトランスクリプトーム変化は、プロトスペーサーとして作用し、ＣＲＩＳＰＲ機構によって捕捉される転写産物から本発明の方法で観察され得ることを示した。胃腸管内では、センチネル細胞内の第１及び第２の転写産物の発現が起こり、ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２タンパク質複合体の集合につながる。この複合体は、大腸菌細胞内のＲＮＡをＣＲＩＳＰＲアレイ内に統合する。ＲＮＡはＤＮＡに変換され、配列決定のためにＣＲＩＳＰＲアレイ内に保存される。このようにして、消化管内の大腸菌細胞のトランスクリプトームの間接的な観察が可能であり、消化管内の細胞外環境の代理測定を提供する。
【００７８】
本発明の第６の態様は、第５の態様の方法を実施するための装置に関する。
【実施例】
【００７９】
本発明者らは、ＲＮＡからの直接のＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得は、生細胞内のＣＲＩＳＰＲアレイに転写記録を保存に利用できると仮説を立てた。したがって、いくつかのオーソロガスＲＴ−Ｃａｓ１を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが特徴づけられた。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において異種的にＲＮＡスペーサーを獲得し得るために、フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）由来のものを同定した。Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）ＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２（ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２）を利用し、トランスクリプトームスケールの分子記録を細胞集団内に可能にする方法であるＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを開発した。転写事象は、ＲＮＡの存在量に従って記録され、ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲアレイに保存され、継続的及び一時的な複雑な細胞の挙動を記述するために利用され得る。
【００８０】
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によるＣＲＩＳＰＲスペーサーの獲得
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における異種発現時にＲＮＡから直接スペーサーを獲得する能力を有するＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２ＣＲＩＳＰＲ獲得複合体を同定することに着手した。本発明者らは、１２１個のＲＴ−Ｃａｓ１オルソログを同定し（表１）、機能的特徴づけのために１４個の代表を選択した（図６ａ、ｂ）。本発明者らは、それらの予測されたＣＲＩＳＰＲアレイをさらに含むプラスミドから、対応するＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質を過剰発現させた（図６ａ）。以前に確立されたスペーサー獲得アッセイを使用して、本発明者らは、Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）のオルソログが積極的に新しいスペーサーを獲得したことを発見した（図６ｃ）。内因性Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）遺伝子座は２つのＣＲＩＳＰＲアレイを含んでおり、発明者らは、過剰発現プラスミドだけでなく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムに由来する新規スペーサーがいずれかの中に獲得されたことを観察した（図６ｃ−ｅ）。
【００８１】
拡張されたＣＲＩＳＰＲアレイの選択的増幅
以前に確立されたスペーサー獲得アッセイを使用して、本発明者らは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の１００万のディープ配列決定読み取りあたり約１３００の新たに獲得されたスペーサーを得た（図６ｃ）。新規スペーサーの検出を改善するために、本発明者らは、新しいスペーサーを獲得したＣＲＩＳＰＲアレイを選択的に増幅するための方法である、拡張ＣＲＩＳＰＲアレイの選択的増幅（ＳＥＮＥＣＡ）を開発した（図２ａ、図７ａ）。典型的なＳＥＮＥＣＡ支援Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ実験は、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一晩培養から抽出された〜１８０ｎｇのプラスミドＤＮＡの入力を使用し、１００万の配列決定読み取りごとにプラスミド又はホストゲノムに整列する合計９５０，０００個のスペーサーを生成する。（図２ａ、図７ｂ−ｅ）。これは、最近の報告と比較して数千倍の改善を示す。Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用して、本発明者らは、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及び増殖期を通して、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２のインビボ活性を容易に実証した（図７ｂ−ｇ）。
【００８２】
次に、発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを採用して、ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログの最初の選択を再選別した（図７ｂ）。さらに、本発明者らは、先天的なこれらを予測することに関連する課題を克服するために、両方の可能な方向でそれらの内因性遺伝子座に存在するすべての潜在的なＣＲＩＳＰＲアレイを含めた（図８ａ）。従来の読み出しと比較してＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの感度が向上しているため、本発明者らは、ＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現時に、オルソログの大部分について新たに獲得したスペーサーを容易に検出した（図８ｂ）。ほんのわずかだけのオルソログはＣＲＩＳＰＲアレイの好ましい方向性（つまり、上流のリーダー配列に対する特異性）を示した。従来の読み出しと一致して、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、スペーサー獲得効率の点で他のすべてのオルソログを上回り、さらなる特性評価のために選択された。Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑで採用されている概念は、スペーサー獲得効率が低いために手に負えない他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムでのスペーサー獲得を特徴づけるためにも適用され得る。
【００８３】
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２スペーサー獲得の特徴
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の特性をよりよく理解するために、本発明者らは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の集団に対してＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを実行することにより、新たに獲得したスペーサーを広範囲に特徴づけた（図２ａ）。本発明者らは、ゲノム整列スペーサーが特定の「アンチセンス」配向で優先的に獲得され、それによってスペーサーが元のＲＮＡに相補的であることを観察した（図２ｂ、ｃ）。スペーサーの長さの中央値は３９ｂｐで、分布はより長い長さに偏っていた（図２ｄ）。ＧＣ含量の中央値は３６％であり、ＡＴリッチスペーサーへの強いバイアスを示している（図２ｅ）。前述のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムと一致して、発明者らは、プラスミド（図９ａ）又はゲノム（図２ｆ）のいずれかから獲得した新たに適応したスペーサー内又は隣接する配列優先性を発見せず、これは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を示さないことを意味する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへのスペーサー整列を観察している間、発明者らは、多くのカバレッジピークが遺伝子の末端の近くに位置していることに気づいた（図２ｂ）。この観察と一致して、本発明者らは、ゲノム全体のレベルで、ほとんどのスペーサーが遺伝子の５’末端及びより少ない程度で３’末端に由来することを発見した（図２ｇ）。この発見は、ＡＴリッチスペーサーへの明らかなバイアスが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲＮＡ末端のＡＴリッチによって引き起こされる可能性を高めたが、ＡＴリッチスペーサーへのバイアスは、遺伝子本体内に由来するスペーサーのみを考慮した場合に持続した（図８ｂ）。本発明者らは、ＳＥＮＥＣＡを従来のスペーサー読み出しと直接比較して、ＳＥＮＥＣＡが追加のバイアスを導入するかどうかを究明したが、大きな違いは見られなかった（図９ｃ−ｈ）。まとめると、これらの結果は、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２がＲＮＡ分子の末端など、遺伝子の始まり又は終わりに関連する配列に基づいてＡＴリッチスペーサーを選択するプロセスを反映している。
【００８４】
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２はＲＮＡから直接スペーサーを獲得する
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２がＲＮＡから直接スペーサーを獲得するかどうかを決定するために、本発明者らは自己スプライシングｔｄグループＩイントロンを利用した。このイントロンは機能的なリボザイムであり、プレｍＲＮＡからのそれ自体の切除を触媒し、ＤＮＡレベルでは存在しない特徴的なスプライス接合部をもたらす。本発明者らは、スペーサーによって高度にサンプリングされた遺伝子、すなわちｃｓｐＡ、ｒｐｏＳ及びａｒｇＲに基づいて３つのイントロン中断構築物を構築した（図３ａ）。これらの構築物を発現させた後、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを行うと、本発明者らは、スプライス接合部にまたがる独特のスペーサーを観察した（図３ａ、ｂ）。スプライス接合部を含むスペーサーが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での非特異的ＲＴ活性によって生成された拡張相補ＤＮＡコピーから獲得された可能性を排除するために、本発明者らは、ｔｄイントロン構築物発現培養物から抽出されたゲノムＤＮＡに対して標的ディープ配列決定を行い（図１０ａ）、スプライス接合部はＤＮＡレベルで存在しなかった（図１０ａ、ｂ）。重要なことに、これらの結果は、ＤＮＡからのスペーサー獲得の可能性を排除するものではない。まとめると、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種ＲＮＡからＣＲＩＳＰＲスペーサーを獲得するのを容易にする。
【００８５】
この発見をさらに検証するために、本発明者らはエンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＭＳ２を利用した。ＭＳ２ファージは、ライフサイクル中にセンス及びアンチセンス一本鎖ＲＮＡの両方として存在するが、ＤＮＡ中間体はない。ＭＳ２ファージは、細胞侵入のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞にはないＦ線毛を必要とすることを考えると、発明者らは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）に目を向けた。ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現細胞にＭＳ２ファージを感染させると、本発明者らは、ＭＳ２ゲノム全体からサンプリングされた新規のＭＳ２整列スペーサーを容易に観察することができた（図３ｃ−ｅ、図１０ｃ−ｆ）。ＭＳ２整列スペーサーはプラスミド又は宿主ゲノムと配列類似性を共有せず、それらの特異性を確認した（図１０ｄ）。要約すると、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２は、外来ＲＮＡから直接スペーサーを獲得することを可能にし、それによって侵入するウイルスの分子記憶を提供する。
【００８６】
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用した任意のトランスクリプトの記録
転写事象を定量的に記録するためのＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の可能性を評価するために、本発明者らは、誘導性発現システムを利用して、スペーサーがＲＮＡ存在量に従って獲得されているかどうかを直接決定した。対応するコンストラクトは、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導性ＰｔｅｔＡプロモーターの転写制御下にあるスーパーフォルダー（ｓｕｐｅｒ−ｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）又はレニラルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）遺伝子を含んだ。本発明者らは、これらをレベルのａＴｃレベルを増加させて培養された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、その後、それぞれｑＲＴ−ＰＣＲ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑのために全ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの両方を収集した（図３ｆ）。本発明者らは、ｓｆＧＦＰ又はＲｌｕｃの誘導が増加すると、それぞれのコード配列に整列するスペーサーのカバレッジが用量依存的に一致して増加することを観察した（図１１ａ）。本発明者らは、この応答を定量化し、スペーサー数及び絶対ｍＲＮＡコピー数（図１１ｂ−ｅ）だけでなく培地中のａＴｃ濃度（図３ｆ）との間の線形関係（Ｒ２値０．９７）を観測した。さらに、ｓｆＧＦＰ整列スペーサーは、ゲノム整列スペーサーを背景にほぼ１桁で検出され（図１１ｆ、ｇ）、これは、ＰｔｅｔＡなどの強力な合成誘導性プロモーターの使用と一致している。重要なことに、構成的に発現されたＫａｎＲ遺伝子に整列するスペーサーはａＴｃ濃度に依存していなかった（図３ｆ）。
【００８７】
これらの発見をさらに一般化するために、本発明者らは、３−オキソヘキサノイル−ホモセリンラクトン（３ＯＣ６−ＨＳＬ）誘導性ＰＬｕｘＲプロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子を配置する、第２の誘導性発現系を評価した。誘導により、Ｆｌｕｃ整列スペーサーが４倍に増加した（図１１ｈ）。さらに、ａＴｃ誘導性ＰｔｅｔＡ及び３ＯＣ６−ＨＳＬ誘導性ＰＬｕｘＲ転写システムの両方を組み合わせが、並行した２つの独立した刺激の直交記録を可能にした図３ｇ、図１１ｉ、ｊ）。これは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは一見すると誘導可能な発現システムと互換性があり、それによって生細胞の集団内で定義された刺激の複数の直交セットの記録を可能にすることを示唆している。まとめると、これらの結果は、ＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲスペーサーの獲得により、累積転写産物量の定量化可能な記録を生成できること、及び転写記録が標準的な分子法及びシーケンス法を使用して効率的に獲得されることを示している。
【００８８】
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは累積的に高度に発現する遺伝子を示す
ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２が存在量依存的にＲＮＡから直接スペーサーを獲得したことを考慮して、本発明者らは、これが累積細胞トランスクリプトームの定量化を可能にできるかどうかを調査した。本発明者らは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を過剰発現するＲＮＡ−ｓｅｑ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及び全ＲＮＡの両方のプラスミドＤＮＡを回収した（図４ａ）。最初に、発明者らは、生物学的複製間のＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの再現性を確認し（ピアソン相関＝０．９９６〜０．９９９及びＲ２＝０．５６０〜０．６１８）（図１２ａ）、次にスペーサー獲得に対する遺伝子発現の影響を評価した。ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２スペーサーは、高度に転写された遺伝子に対して強いバイアスを示し（拡張データ図１２ａ）、さまざまな成長段階でトランスクリプトーム全体のＲＮＡ−ｓｅｑベースの遺伝子発現値と相関した（図１２ｂ−ｄ）。特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓサブタイプは、プラスミド由来のスペーサーを優先的に獲得するための能動メカニズムを持っているが、発明者らは、これらの遺伝子の高い発現レベルを考慮した後、同じものは観察しなかった（図１２ｅ）。まとめると、スペーサーは高度に転写された遺伝子から体系的に獲得され、累積的な転写発現を表す。
【００８９】
トランスクリプトームスケールの記録は細胞の挙動を明らかにする
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用して複雑な細胞の挙動を記録及び説明できるかどうかを判断するために、発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における十分に研究された酸化ストレス及び酸ストレス応答に目を向けた。本発明者らは、酸化及び酸ストレスで刺激されたＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現培養物に対してＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを実行し、教師なし階層的クラスタリングだけでなく主成分分析（ＰＣＡ）を使用して累積発現数を分析した。どちらのアプローチも処理条件の区別に成功し、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが異なる分子履歴を捕捉したことを示唆している（図４ｂ−ｅ）。累積的に差次的に発現される遺伝子を同定するために、本発明者らは、ＲＮＡ配列決定のために開発された標準的な差次的発現（ＤＥ）分析ツールを利用した。個々のツールの特定のバイアス及び前提を克服するために、発明者らは、３つの補完的なツール、すなわちＤＥＳｅｑ２、ｅｄｇｅＲ、及びｂａｙＳｅｑを利用した。各ツールでＤＥ遺伝子を特定した後、本発明者らは、各分析からの上位２０のＤＥ遺伝子の結合に基づいて、各刺激の特徴的な遺伝子のセットを生成し、それらを階層的にクラスター化し、それらの発現値とともにプロットした（図４ｆ、ｇ）。特徴的な遺伝子の中で、発明者らは、各刺激に対する細胞応答を支配すると予想されるいくつかを特定した。本発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑによって複雑な細胞挙動を評価するために必要な最小細胞数を調査し、８．８×１０６細胞が処置条件を適切に分類するのに十分であることを発見した（図１３、１４）。要約すると、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲアレイ内に保存されたＲＮＡ由来のスペーサーを利用して、複雑な細胞挙動の根底にある転写応答を再構築し得るという概念を支持している。
【００９０】
センチネル細胞は一過性の除草剤曝露をコード化する
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを利用してセンチネル細胞を生成できるかどうかを判断するために、発明者らは除草剤パラコートを利用し、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが用量依存的かつ一過性の曝露を捕捉できるかどうかを判断した。パラコートは、微生物でスーパーオキシドアニオンを生成する静菌性除草剤であり、人間への急性毒性と自殺事件での使用により、多くの国で禁止されている。
【００９１】
改良されたＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現コンストラクト（図１５ａ、ｂ）を使用して、発明者らは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増加する濃度のパラコートに曝露し、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑによって転写記憶を検索した。さまざまな処理条件での累積遺伝子発現の定量化により、教師なし階層的クラスタリング及びＰＣＡの両方を使用して、試料が適切な曝露グループに容易に分類されることが示された（図５ａ、ｂ）。さらに、特徴的な遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の用量反応性及び標準的なパラコート曝露遺伝子を捕捉した（図５ｃ）。例えば、本発明者らは、特徴的な遺伝子内で、パラコートによって引き起こされる活性酸素種（ＲＯＳ）の除去を容易にすることが以前に示されたアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼの２つのサブユニットをコードするａｈｐＣ及びａｈｐＦを発見した。さらに、本発明者らは、システイン代謝に関与するｃｙｓ−レギュロンの遺伝子のセット、すなわち、ＣｙｓＣ、ｃｙｓＪ及びｃｙｓＫを同定し、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるパラコート耐性を促進することが以前に示された。
【００９２】
次に、本発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが生理学的範囲で一過性のパラコート曝露を捕捉することもできるかどうかを決定した。パラクアットで培養物を一時的に刺激した後（図５ｄ）、本発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑデータセットの累積遺伝子発現及び遺伝子発現をそれぞれ定量化した。次に、本発明者らは、２つの方法がＰＣＡによる一過性のパラコート曝露を捕捉することができ（図５ｅ、ｆ）、及び差次的に発現された特徴的な遺伝子クラスタリング（図１５ｃ、ｄ）が可能であるかどうかを評価した。これらの分析は、ＲＮＡ−ｓｅｑではなくＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが一時的なパラコート曝露を捕捉できたことを示している（図５ｅ、ｆ及び図１５ｃ、ｄ）。まとめると、これらの結果は、パラコート曝露の記憶がＲＮＡ−ｓｅｑによって評価されると細胞トランスクリプトーム内で失われたが、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑによって調査されるようにセンチネル細胞のＣＲＩＳＰＲアレイのＤＮＡ内に保存された分子記憶内に保存されることを示している。
【００９３】
マウスの腸環境を記録するセンチネル細胞
微生物は、多様な微量栄養素が利用できる腸のニッチを含む、多様な環境に適応して生き残るために進化してきた。これらの微生物の遺伝子発現パターンは、それらが生息する細胞外環境を反映しているため、共生及び病原性微生物の維持だけでなく、コロニー形成を可能にする栄養素に関する重要な情報を提供する可能性がある。これは、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に因果関係がある腸内毒素症、及び食事において不足している糖やアミノ酸は、動物モデルや人間の乳児で矯正的であることが実証されている栄養失調に対処しようとする臨床的介入を考案及びテストするための明確な入り口を提供する可能性がある。残念ながら、微生物の遺伝子発現は一過性であり、時間の経過とともに、微生物がヒトの腸を通過する間、一定に保たれない。その結果、腸のニッチにおける微生物の遺伝子発現パターンは、非常に侵襲的な試料収集を通じてのみアクセス可能である。本発明者らによって提示されたＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ技術は、哺乳類の腸を通過するときに環境を絶えず記録するセンチネル細胞を作成することにより、これらの制限に対処することができる。したがって、糞便源からこれらのセンチネル細胞を収集し、個別化された医療の基礎を形成することにより、非侵襲的な方法でヒトの腸の健康及び腸内細菌叢の摂動を監視する大きな可能性を秘めている。さらに、メタゲノムデータと組み合わせて、複数のセンチネル微生物からのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータは、腸の変化との関連で微生物−微生物及び宿主−微生物の相互作用の変化を監視するのに役立つ可能性がある。
【００９４】
本発明者らは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の様々な株が、ネズミの腸を通過するときに転写記録者（すなわち、センチネル細胞）として機能する可能性を調査した。この目的のために、本発明者らは、強制経口投与により、アンヒドロテトラサイクリン誘導性ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現カセットをコードするＢＬ２１（ＤＥ３）又はＭＧ１６５５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を用いてノトバイオートＣ５７ＢＬ／６マウスを単コロニー化した。ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現は、記録プラスミドの維持を確実にするために、カナマイシンと一緒に動物の飲料水を介してアンヒドロテトラサイクリンを投与することにより、非侵襲的に誘導された。続いて、これらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、マウスの糞便からだけでなく、実験のエンドポイントで異なる腸の区画から縦方向にサンプリングされた。プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定に続いて、発明者らは新たに獲得したスペーサーを単離することができた（図１６）。
【００９５】
実験を通じて、発明者らは、飲料水中のａＴｃの濃度を上げると、新しいスペーサーの記録が増加し、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現が強くなることを示した（図１７及び図１８）。さらに、スペーサーは、小腸から盲腸及びマウスの結腸に蓄積するスペーサーによって明らかなように、胃腸管全体に記録された（図１９）。最後に、発明者らは、糞便試料から得られたスペーサーの数が時間とともに増加することを実証し、細菌が腸にしっかりとコロニーを形成し、実験を通して新しいスペーサーを継続的に獲得したことを示した（図２０）。
【００９６】
次に、本発明者らは、マウス腸内の異なる微小環境及び病状を検出するためのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの可能性を評価した。一例では、本発明者らは、１％、２％又は３％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を動物の飲料水に投与することによって大腸炎を誘発した。対応するデータは、処理された動物の糞便から分離された細胞に対してＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを実行することによって、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して３つの処理条件を分類するために使用され得る（図２１）。
【００９７】
同様に、別の実験では、発明者らは、動物にデンプン又は固形飼料ベースの飼料を与えたかどうかを正確に区別することができた（図２２）。ともに、これらの実験は、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑベースのセンチネル細胞が治療条件を層別化するだけでなく、管腔環境の明確な特徴を明らかにすることができ、したがって診断デバイスとして役立つ可能性があることを示している。
【００９８】
これは、それぞれのＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータセットで差次的発現解析を実行して、さまざまな処理条件に応じて差次的に発現した正確な遺伝子を特定することでさらに強化された（図２３及び図２４）。大腸炎の実験で、発明者らは亜硝酸塩の減少の兆候を観察した。おそらく宿主の炎症性ＮＯＳのアップレギュレーションの結果である。また、示差食実験において、本発明者らは、デンプン食を与えられたマウスで糖酸異化遺伝子が誘導されたのに対し、Ｅｎｔｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路及びメチルグリオキサールシャント遺伝子は、おそらく植物細胞壁配糖体の利用可能性のために、固形飼料で誘導されたことを観測した。
【００９９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５細胞を使用した追加の実験で、本発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが、この場合、固形飼料、デンプン、及び脂肪に基づいて３つの異なる飼料を容易に区別できることを確認した（図２５）。
【０１００】
討論
ここで、本発明者らは、トランスクリプトームスケールの事象をＤＮＡにコード化し、細胞集団の累積の遺伝子発現を評価する技術であるＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑについて説明する。本発明者らは、特定の複雑な転写情報を記録することによってその可能性を実証している。まず、既存のスペーサー読み出し方法を改善するために、発明者らはＳＥＮＥＣＡを開発し、それは最近の報告と比較してスペーサー検出効率の数千倍の改善をもたらし、それによってＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の詳細な特性評価及び分子レコーダーとしてのその応用を可能にした。本発明者らの結果は、ＲＮＡ由来のスペーサーが、ＰＡＭのないＡＴリッチ領域からの豊富な転写産物の末端から優先的に獲得され、トランスクリプトームスケールで広くサンプリングされ、累積の転写産物発現の並列定量化を可能にすることを示唆している。
【０１０１】
一連の実験において、本発明者らは、任意の配列の誘導を増加させると、スペーサーが直交性で用量依存的に獲得され、細胞内の絶対ｍＲＮＡコピー数と高度に相関することを示し、したがって、分子記録が予測可能な方法で初期刺激を忠実に要約することを実証する。これはまた、ますます多重化され直交分子記録デバイスへの道を開く。複雑な細胞の挙動を誘導すると、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは、分子事象の意味のあるトランスクリプトームスケールの記録を提供し、これは、特定の刺激のみを記録する現在の分子記録技術の能力を超えている。最後に、本発明者らは、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを使用して、静菌性除草剤パラコートに対する複雑な細胞応答の用量依存的特徴を解明し、ＲＮＡ−ｓｅｑではなくＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑが一過性のパラコート刺激を記録できることを実証する。
【０１０２】
追加の研究が、より少ない細胞内でより豊富で動的な発現及び系統情報をエンコードするために、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの能力を大幅に改するであろうが、発明者の原理実証実験は、後で細胞の集団から複雑な分子履歴を再構築するための、トランスクリプトームスケールの事象をＤＮＡに永続的に記録する強力なツールを導入している。本発明者らは、記録された転写履歴が、根底にある遺伝子発現の変化を反映しており、したがって、生物学的又は疾患プロセスを調査するために使用できることを示している。長期的には、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得成分を他の細胞型に導入して、特定の細胞挙動、細胞状態及び型を生じさせる事象の分子配列及び系統経路を記録できると想定している。
【０１０３】
方法
オルソログ発見パイプライン
アルトロスピラ プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）ＲＴ−Ｃａｓ１（ＷＰ＿００６６２０４９８）のタンパク質配列をシード配列として使用し、ＨＭＭＥＲ  ｖ３．１ｂ２（１Ｅ−０５のＥ値カットオフ）を使用して、すべてのＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列に対してＪＡＣＫＨＭＭＥＲ検索を実行った。その後、Ｃａｓ１及びＲＴドメインの両方を持つタンパク質が、ＨＭＭＳＣＡＮ（１Ｅ−０５のＥ値カットオフ）を使用して同定された。候補タンパク質のゲノム配列情報が獲得され、ＣＲＩＳＰＲｄｅｔｅｃｔ  ｖ２．０、ＣＲＩＳＰＲｏｎｅ、及びＨＭＭＳＣＡＮを使用して、ＲＴ−Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣＲＩＳＰＲアレイの存在をさらに検査した。１２１の候補タンパク質から、１４のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が選択され、続いてＭＵＳＣＬＥ  ｖ３．８．３１を使用して整列され、候補ドメイン及び触媒残基が特定された。遺伝的距離はＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ法を使用して計算され、系統樹は最近傍法を使用して構築された。
【０１０４】
菌株及び培養条件
この研究で使用した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株は、クローニング目的のＳｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び、獲得アッセイ用のＫ１２株として、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。すべての菌株は、新鮮なコロニーから直接、ＺｙｍｏＢｒｏｔｈ中１９℃で増殖させ、Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＆  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってコンピテントを作成した。形質転換後、細胞を３７℃で、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１％グルコース（ｗ／ｖ）を含む溶原性ブロス（ＬＢ）（Ｄｉｆｃｏ）１．５％寒天プレート上で増殖させ、Ｔ７ｌａｃシステムからのバックグラウンド発現を低減した。プラスミド単離のための液体培養物は、１％グルコース（ｗ／ｖ）を含むＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌトリプトン、４ｍＬ／Ｌグリセロール、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４）で増殖した。
【０１０５】
ゴールデンゲート互換のｐＥＴ３０過剰発現ベクターの生成
クローニングのためのすべての標準ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実行され、オリゴヌクレオチド及びｇＢｌｏｃｋは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから注文された。プライマーは表６に列挙される。ｐＥＴ３０ｂ（＋）（Ｍａｒｋｕｓ  Ｊｅｓｃｈｅｋからの親切な贈り物）は、バックボーンに存在する５つの不要なＢｂｓＩ制限部位を削除するために、プライマーＦＳ＿１５１／ＦＳ＿１５２、ＦＳ＿１５３／ＦＳ＿１５４、ＦＳ＿１５５／ＦＳ＿１５６、ＦＳ＿１５７／ＦＳ＿１５８、ＦＳ＿１５９／ＦＳ＿１６０をそれぞれ使用して、５つのフラグメントとしてＰＣＲ増幅された。得られたＰＣＲフラグメントは、２ｘＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して集められ、ｐＦＳ＿００１２を生成した。続いて、オリゴＦＳ＿３８０及びＦＳ＿３８１はアニーリングされ、Ｔ７ターミネーターをコードする二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを生成し、ＸｈｏＩ／ＣｓｉＩを使用してｐＦＳ＿００１２にクローニングされ、ｐＦＳ＿００１３、２つのゴールデンゲートクローニングサイトを含むｐＥＴ３０由来の過剰発現ベクターを生成し、ＲＴ−Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、および対応するＣＲＩＳＰＲアレイの並列クローニングを容易にした。Ｒこの研究でテストされたすべてのＲＴ−Ｃａｓ１及びＣａｓ２オルソログのヌクレオチド配列とそれに対応するＣＲＩＳＰＲアレイは、配列の下に列挙されている。
【０１０６】
オルソログ選別用のＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２過剰発現ベクターのゴールデンゲートアセンブリ
ＲＴ−Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣＲＩＳＰＲアレイ配列は、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから注文された。推定ＣＲＩＳＰＲアレイは、リーダー配列及びそれに続くＤＲ−ネガティブスペーサー１−ＤＲ−ネガティブスペーサー２−ＤＲからなる配列として注文された。さらに、各フラグメントは、ｐＦＳ＿００１３へのゴールデンゲートアセンブリを容易にするオーバーハングを生成するＢｂｓＩ制限サイトに隣接していた。簡単に説明すると、フラグメントあたり４０ｆｍｏｌ（ＲＴ−Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、対応するＣＲＩＳＰＲアレイ、ｐＦＳ＿００１３アクセプターベクター）、１μＬ  ＡＴＰ／ＤＴＴミックス（各１０ｍＭ）、０．２５μＬ  Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、０．７５μＬ  ＢｐｉＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰＣＲグレードＨ２Ｏを含む最大１０μＬの１μＬバッファーグリーンは、３７℃で３分間、１６℃で５分間、続いて８０℃で１０分間の９９サイクルに供された。続いて、この混合物の５μＬは、５０μＬのＳｔｂｌ３細胞に形質転換され、ＳＯＣ培地で３７℃、１０００ｒｐｍで３０分間回収した後、プレートに広げた。
【０１０７】
スペーサーの獲得
獲得アッセイは、１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が供給された３ｍＬのＴＢ培地を含む細菌培養チューブで、並びにＢＬ２１（ＤＥ３）ゴールド及びＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）について、３７℃、３００ｒｐｍで実施された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＡＩの場合、Ｌ−（＋）−アラビノース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２％（ｗ／ｖ）まで添加された。各培養物は、形質転換し、及び３７℃で一晩増殖させると４℃で１４日以内に保存された細菌の２つのコロニーと接種された。培養物が飽和状態に達したとき（通常、接種後１２〜１４時間）、２ｍＬの細菌培養物は回収され、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドは標準のプラスミドＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐ手順で分離され、ディープ配列決定ライブラリの調製用テンプレートとして扱った。
【０１０８】
ディープ配列決定による従来の獲得読み出しのためのＣＲＩＳＰＲアレイの増幅
リーダー隣接スペーサーは、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２ＸＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用して、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイのリーダー配列にフォワードプライマー結合、最初の自然スペーサーにリバースプライマー結合で個々のＣＲＩＳＰＲアレイのプライマー設計及び結合部位については、それぞれプライマー設計ノート１及び表２）、ＰＣＲ反応１μＬあたり３ｎｇのプラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅された。各生物学的複製について、１０μＬの１２の個別のＰＣＲ反応が、１５秒の延長時間で１６サイクル実行された。次に、同じ生物学的試料に属する個々の１０μＬ反応がプールされ、自家製ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してＰＣＲ対ビーズ比１：１．５（ｖ／ｖ）で残留プライマーは除去し、６０μＬのバッファーＴＥでＰＣＲ産物を溶出した。続いて、生物学的試料あたり５００ｎｇの最初のラウンドＰＣＲ産物は３％ＬＡＢアガロースゲルで流され（３００Ｖ、５５分、実行中に氷水浴でゲルチャンバーを冷却）、２１１〜３００ｂｐでのゲルスライスのブラインド切除によって精製し、拡張されていないアレイのＰＣＲ産物に対応する顕著なＤＮＡバンド（つまり、新規スペーサーの獲得なし）を回避する。次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲルスライスからアンプリコンが精製され、２２μＬのバッファーＥＢに溶出された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプター及びインデックスは、２ラウンド目のＰＣＲで追加され、ディープ配列決定及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＨＴインデックスに対応する（Ｎ）８バーコードを付された試料にバーコード化におけるフローセルへ（プライマー設計及びインデックスについては、それぞれプライマー設計ノート２及び表３）ＰＣＲ産物の結合用のＰ５及びＰ７ハンドルを取り付けたユニバーサルセカンドラウンドディープ配列決定プライマーを使用した２０μＬＰＣＲ反応のテンプレートとして６μＬのゲル精製入力ＤＮＡを使用した。この２回目のＰＣＲの後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して産物は精製され、２２μＬのバッファーＥＢで溶出された。次に、試料はプールされ、上記と同じパラメーターを使用して別のラウンドのゲル精製に供され、今回は２８０〜３５０ｂｐの範囲の生成物を切り出した。
【０１０９】
拡張Ｃｒｉｓｐｒアレイの選択的増幅（ＳＥＮＥＣＡ）
ＦｓＣＲＩＳＰＲＡｒｒａｙ２は、ＦＳ＿８７１／ＦＳ＿９０４を使用してｐＦＳ＿１６０から増幅され、リーダー配列及び単一のＤＲ、それに続く下部鎖上のＦａｑＩ制限部位（ＣＴＴＣＡＧ）で構成される最小のＦｓＣＲＩＳＰＲアレイを生成し、標準の記録プラスミドとしてプラスミドｐＦＳ＿０２３５を生成した。このプラスミドは、化学コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）ゴールドバクテリア又はＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換され、上記のようにスペーサーを獲得した。Ｑｕａｎｔ−ＩＴＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出及び定量したプラスミドはＴｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏマイクロプレートリーダーで読み出された後、ゴールデンゲート反応でプラスミドＤＮＡはＳＥＮＥＣＡアダプターライゲーションに供された。オリゴヌクレオチドＦＳ＿０９６３／ＦＳ＿０９６４は、９５℃で５分間加熱され、０．１２℃／で２０℃／秒に冷却されることにより、アニーリングされた（１００μＭオリゴ各２．５μＬ、５μＬ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ）、４０μＬ  ＰＣＲグレードＨ２Ｏ）。アニーリングされたオリゴはＴＥバッファーで１：１００に希釈された。次に、４０ｆｍｏｌのプラスミドＤＮＡ（ｐＦＳ＿０２３５の場合は１８０．３ｎｇ）、０．２５μＬのＴ７リガーゼ（酵素）、１μＬのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＦａｑＩ  ０．５μＬの２０ｘＳＡＭ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ（すべてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アニーリングされて希釈された１μＬのオリゴヌクレオチドＦＳ＿０９６３／ＦＳ＿０９６４の総量１０μＬは、３分３７℃、３分２０℃、続いて５５℃で１５分の９９サイクルに供された。ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２ＸＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）（フォワードプライマー：ＦＳ＿０９６８からＦＳ＿０９７４、リバースプライマー：ＦＳ＿０９１１）を使用して、最初のラウンドのディープ配列決定ＰＣＲが実行された。各生体試料について、１０．３８μＬのアダプターライゲーションプラスミドＤＮＡを含む１つの３０μＬ反応は実行され（９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で２０秒間、続いて７２℃で５分間を２２サイクル）、プールされ、ＰＣＲとビーズとの比率が１：１．６（ｖ／ｖ）の磁気ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製され、２５μＬのＴＥバッファー（プライマー設計についてはプライマー設計ノート３で詳細を確認）にＰＣＲ産物を回収する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプター及びインデックスは、２０μＬ反応における入力として５μＬの最初のラウンドＰＣＲ産物を使用する（プライマー設計及びインデックスについては、それぞれプライマー設計ノート２及び表３）２回目のＰＣＲ（９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で５分間を８サイクル）で追加された。試料はプールされ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して脱塩され、Ｅ−Ｇｅｌ  ＥＸアガロースゲル２％（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でサイズを選択され、レーンあたり２００〜５００ｎｇのＤＮＡをロードし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを使用して抽出さ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォームで、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（１５０サイクル）又はＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｍｉｄ／Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｖ２キット（１５０サイクル）（両方ともＩｌｕｍｉｎａ）をそれぞれ使用してディープ配列決定に供された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォーム用ＫＡＰＡライブラリ定量化キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用したｑＰＣＲで測定した場合、ライブラリは１．４〜１．６ｐＭの濃度でロードされた。ＰｈｉＸは５〜１０％で含まれていた。
【０１１０】
ＳＥＮＥＣＡベースのオルソログ選別
ＳＥＮＥＣＡベースのＣＲＩＳＰＲアレイの方向性スクリーニングについて、１５０ｎｔの標準リーダー長とそれに続く単一のＤＲを想定して、推定ＣＲＩＳＰＲアレイはゲノム配列から抽出された。ＳＥＮＥＣＡに必要なＦａｑＩ制限部位は、ＤＲの下流に追加され、配列は、増幅とクローニングのためのユニバーサルアダプターが隣接された。これらの機能を含む最終的なアレイ配列決定は、配列２に示され、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから線形ＤＮＡフラグメントとして注文された。これらは、プライマーＦＳ＿１４０６／ＦＳ＿１４０７を使用してＰＣＲ増幅され、ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用して、それぞれのＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２オルソログを含むＣｓｉＩ／ＮｏｔＩ消化プラスミドにクローニングされた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換すると、これらのコンストラクトはＴＢ培地で標準的なスペーサー獲得アッセイに供された。プラスミドＤＮＡは抽出され、ＳＥＮＥＣＡアダプターライゲーションが行れた。この実験でテストされた各ＣＲＩＳＰＲアレイでアニーリングするそれぞれのオリゴを表４に示す。アダプターライゲーションに続いて、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２ＸＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、テンプレートとしての２０μＬＳＥＮＥＣＡアダプターライゲーション全体を含む単一の１４０μＬの第１ラウンドＰＣＲ反応がオルソログごとに調製された。テストされた各ＣＲＩＳＰＲアレイのそれぞれのＤＲに固有の最初のラウンドのＰＣＲプライマーは表５に示す。１４０μＬのＰＣＲ反応は、９６ウェルプレートの列に沿って１１μＬの１２の反応に分割された。このプレートをグラジエントＰＣＲ（エッペンドルフマスターサイクラーグラジエントで５３〜６８℃）にかけた。この手順が選択されたのは、ＳＥＮＥＣＡが、ＤＲマッチングプライマーが獲得事象の結果として生じる完全なＤＲにのみ結合し、一意のアニーリング温度で切り捨てられた親ＤＲには結合しないという事実を利用しているためである。ＰＣＲ反応を分割し、温度勾配をかけることにより、事前の知識がなくても、１２の反応の少なくとも１つが、拡張されたＣＲＩＳＰＲアレイの選択的増幅が起こるアニーリング温度にさらされることが保証される。ＰＣＲが３０サイクル実行された後、温度勾配に沿って実行された１２の反応は再度プールされ、１．８５ｘＡｍｐｕｒｅビーズを使用して精製され、２５μＬのＴＥバッファーで溶出された。この溶出液の５μＬは、上記のように６５℃のアニーリング温度で１２サイクルの標準的な２０μＬの２回目のＰＣＲのテンプレートとして使用された。続いて、２．２ｘＡｍｐｕｒｅビーズを使用してＰＣＲ産物を精製し、２２μＬのＴＥバッファーに溶出し、標準のＳＥＮＥＣＡプロトコル（Ｅ−Ｇｅｌ  Ｅｘ  ２％、続いてゲル抽出）で説明されているようにサイズを選択され、ディープ配列決定に供された。
【０１１１】
ディープ配列決定
オルソログ選抜のためのＣＲＩＳＰＲアレイの小規模ターゲットディープ配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームでＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｖ３  ３００サイクルキット又はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ＰＥ２００サイクルキットＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉｇｈＳｅｑ２５００を使用して実行された。ＳＥＮＥＣＡを使用して準備されたスペーサーライブラリのディープ配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームでＮｅｘｔＳｅｑ５５０／５５０高出力キットｖ２１５０サイクル、又はＭｉＳｅｑでＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３  １５０サイクルを使用して配列決定された。
【０１１２】
データ分析パイプライン
ＦＡＳＴＱファイルは、ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ  ＳＥ  ＬＥＡＤＩＮＧ：３  ＴＲＡＩＬＩＮＧ：３  ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５  ＭＩＮＬＥＮ：７５）を使用して品質フィルタリング及びトリミングされ、その後ＦＡＳＴＸ−Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｖ０．０．１４（ｆａｓｔｑ−ｔｏ−ｆａｓｔａ）（ｈｔｔｐ：／／ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ／）を使用してＦＡＳＴＡファイルに変換された。ｐｙｔｈｏｎ２．７で記述されたカスタムスクリプトを使用して、スペーサーはｍ２つの１０ｎｔ  ＤＲセグメント間の２０〜６６ヌクレオチド配列の識別に基づいて識別され、１番目と２番目のＤＲセグメントでそれぞれ２つと３つのミスマッチが可能になった。複数のスペーサーを備えたアレイは、完全なＤＲ配列の存在に基づいて識別され、３つのミスマッチが許容された。与えられた試料からの独特なスペーサー（＞１ミスマッチ）だけがさらに処理された。スペーサーは、ｂｏｗｔｉｅ２（ｂｏｗｔｉｅ２−−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌ）を使用してプラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列を含むマージされたリファレンスゲノムに整列された［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｌ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（ＮＣ＿０１２９４７．１）ゲノム、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＮＣ＿０００９１３．３）］。ＭＳ２に挑む実験では、ＭＳ２配列［ＭＳ２（ＮＣ＿００１４１７．２）］もマージされたリファレンスゲノムに含まれていた。同一の整列はｓａｍｔｏｏｌｓｖ１．３を使用して折りたたまれ、整列はＧｅｎｅｉｏｕｓｖ１０．２．３で視覚化された。読み取り数及び整列機能に関する基本的な統計は、標準のｂａｓｈコマンドを使用して計算され、Ｐｒｉｓｍ７．０ｄを使用してコンパイル及び視覚化された。遺伝子本体のパーセンタイルは、ＲＳｅＱＣ（ｇｅｎｅＢｏｄｙ＿ｃｏｖｅｒａｇｅ．ｐｙ  ｖ２．６．４）を使用して計算された。ヌクレオチドの確率は、ｗｅｂｌｏｇｏ  ｗｅｂｔｏｏｌｖ２．８．２を使用して決定及び視覚化された。シミュレーションされたスペーサーデータセットは、ＢＥＤｔｏｏｌｓ  ｖ２．２５（ｂｅｄｔｏｏｌｓ  ｒａｎｄｏｍ−ｎ５００  −ｌ３８）を使用して作成された。ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの転写産物の定量化は、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ  ｖ１．５．０を使用して実行された。Ｍａｔｌａｂ  ｖ９．１．０で記述されたカスタムスクリプトを使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ転写産物数は、１００万あたりの転写産物（ＴＰＭ）を使用して正規化され、累積スペーサー合計、線形回帰適合、決定係数（Ｒ２）、及びピアソン線形相関係数の計算に使用された。
【０１１３】
酸化又は酸ストレス処理に対応するＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータセットは、Ｒｖ３．４．４で記述されたカスタムスクリプトを使用して分析された。簡単に言えば、複製全体で５カウント未満の転写産物は廃棄された。完全なリンケージ（入力として生の転写産物数を使用）を使用したピアソン線形相関の教師なし階層クラスタリングを表すヒートマップは、デフォルト設定で「ｈｅａｔｍａｐ．２」、「ｈｃｌｕｓｔ」、及び「ｃｏｒ」コマンドを使用して作成された。主成分分析（ＰＣＡ）は、デフォルト設定で「ｐｒｃｏｍｐ」コマンドを使用して、５０個の最も可変的な（標準偏差）遺伝子のｌｏｇ２変換データ（生カウントとゼロを許容する１つの疑似カウント）に対して実行された。Ｒ内のＤＥｓｅｑ２ｖ１．１４．１、ｅｄｇｅＲｖ３．１６．５、及びｂａｙＳｅｑｖ２．８．０カプセル化を使用して、差次的発現分析（生の数と１つの疑似数を入力として使用）を実行された。特徴的な差次的発現遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを表すヒートマップは、デフォルト設定で「ｐｈｅａｔｍａｐ」コマンドを使用して作成された。
【０１１４】
コードの可用性
説明されているデータ分析に使用されるカスタムスクリプトは、Ｐｌａｔｔ  ＬａｂのＷｅｂサイト（ｐｌａｔｔ．ｅｔｈｚ．ｃｈ）で入手できる。
【０１１５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のＲＮＡＳｅｑ
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）からのＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ補足プロトコル：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用した細菌からのトータルＲＮＡの精製に従って、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現の誘導下で一晩増殖させた後に行われた。適切な量の投入培養（５×１０８細胞に対応）を達成するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＯｎｅＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定したＯＤ６００が０．２〜０．６になるように、一晩培養の段階希釈液が調製された。酸洗浄したガラスビーズ（Ｇ１２７７−１０Ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細菌が溶解された。追加のオンカラムＤＮａｓｅ消化は、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して実行された。ＤＮＡフリーＲＮＡは、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるために、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｂａｓｅｌに提出され、その後、ＮｅｘｔＳｅｑ５００／５５０高出力ｖ２キット（１５０サイクル）を使用したＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームでライブラリの準備及び配列決定した。
【０１１６】
ｔｄイントロン
ｇＢｌｏｃｋ  ＦＳ＿ｇＢｌｏｃｋ＿ｔｄ＿ｉｎｔｒｏｎ＿ａｃｃｅｐｔｏｒ（配列３）は、ＳｐｈＩ／ＳｇｒＡＩを使用してｐＦＳ＿０２３５にクローンニンングされ、ｐＦＳ＿０２３８を生成した。このｇＢｌｏｃｋは、ＢＢａ＿Ｊ２３１０４プロモーター、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のリボソーム結合部位、及び効率的なスプライシングを促進する隣接領域を含むｔｄイントロン配列をコードしていた。さらに、ＢｂｓＩを介したゴールデンゲートクローニングサイトがｔｄイントロン配列の下流及び上流に配置され、上記のように単一のワンポット反応で上流及び下流のエクソン配列をシームレスに組み立てることができた。本発明者らは、転写産物の５’末端がＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって優先的に獲得されることに以前に気づいたため、本発明者らは、それぞれの転写産物の最初の２３〜３１ヌクレオチド内にｔｄイントロンを導入した。本発明者らは、３つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ｃｓｐＡ、ｒｐｏＳ、ａｒｇＲ（それぞれ、コールドショックタンパク質ＣｓｐＡ、ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子ＲｐｏＳ及びアルギニンリプレッサー）のイントロン中断配列を作成した。これらは、先行するＳＥＮＥＣＡ実験でＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２複合体によって十分にサンプリングされたという事実に基づいて選択された。隣接するエクソン配列を４〜６の位置で変異させて、ｔｄイントロンスプライシング用に最適化された配列を生成し、これは、スプライシングされた転写産物と内因性の転写産物又はＤＮＡを明確に区別するのにも役立った。
【０１１７】
したがって、本発明者らは、転写産物のフラグメントがｔｄイントロンの５’でクローン化され、ゴールデンゲートアセンブリの前にそれらをアニーリングするための相補的オリゴヌクレオチドを整え、一方、イントロンの３’でクローン化されるフラグメントは、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって増幅された。オリゴヌクレオチドは、ＣｓｐＡのＦＳ＿１０５４／１０５５（イントロンの５’、アニーリング）及びＦＳ＿１０５６／１０５７（イントロンの３’、ＰＣＲ）：ＲｐｏＳの場合はＦＳ＿１０３８／１０３９及びＦＳ＿１０４０／１０４１；ＡｒｇＲの場合はＦＳ＿１０４６／１０４７及びＦＳ＿１０４８／１０４９であった。本発明者らは、それぞれの遺伝子の配列をｔｄイントロン隣接部位の配列に変異させても終止コドンが生成されないことを確実にした。ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２過剰発現コンストラクトを含むｔｄイントロンは、標準的な獲得アッセイに続いて、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定に供された。ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してｔｄ−ＡｒｇＲ形質転換培養物からｇＤＮＡを抽出することにより、ＦｓＣＲＩＳＰＲアレイの外側のＤＮＡにｔｄイントロンスプライス部位が存在することがテストされた。ｔｄイントロン挿入部位を含むライブラリは、フォワードプライマーＦＳ＿１１５４からＦＳ＿１１５７及びリバースプライマーＦＳ＿１１５８からＦＳ＿１１６１を使用して、上記のものと同様の２ラウンドＰＣＲ戦略法を使用して増幅された（表６）。最初のＰＣＲは、５７℃のアニーリング温度と２０秒の伸長で１５サイクル行った。２回目のＰＣＲは、６３℃のアニーリング温度と２０秒の伸長で８サイクル行った。
【０１１８】
ＭＳ２ファージによる感染
ＭＳ２ファージによる感染の場合、記録プラスミドｐＦＳ＿０２３５はＦ’に形質転換され、及びＭＳ２感受性のＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）コンピテントセル（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換された。翌朝、１００μＭのＩＰＴＧを含む１５ｍＬのＴＢが１０個のコロニーと接種され、オービタルシェーカーで３７℃、１５０ｒｐｍでＯＤ６００が０．２４になるまで増殖した。次に、ＭｇＳＯ４は５ｍＭの最終濃度まで添加された。３ｍＬのアリコートが細菌培養チューブに分割され、２００μＬの高力価ＭＳ２ファージ懸濁液で感染され、振とうせずに室温で１時間インキュベートされ、ＭＳ２によって感染させた。次に、培養管はオービタルシェーカーに移され、３０℃、８０ｒｐｍで一晩インキュベートされた。ＭＳ２ファージの存在下で３７℃ではなく３０℃で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を増殖させると、生産的なＭＳ２による細胞の溶解が防止される。翌朝、振とうは１５０ｒｐｍに上られた。もう１日後（感染後〜４１時間）、培養物は遠心分離によってペレット化され、プラスミドＤＮＡが抽出され、ＳＥＮＥＣＡに供し、続けてディープ配列決定に供された。
【０１１９】
ｓｆＧＦＰ及びＲｌｕｃ転写産物の合成記録
Ｐｃａｔ−ｔｅｔＲ−ｔｅｒｍ＿ＰｔｅｔＯをコードするフラグメントはｐＬＰ１６７からプライマーＦＳ＿１１２３／ＦＳ＿１１２５（Ｌｕｚｉ  Ｐｅｓｔａｌｏｚｚｉからの親切な贈り物）で増幅され、ＢａｍＨＩ／ＡｇｅＩで消化され、ＡｇｅＩ／ＢｂｓＩで消化したｐＦＳ＿０２３８にクローニングされ（ｔｄイントロンコンストラクトのクローニングを参照）、ｐＦＳ＿０２７０を生成した。これには、ＰｔｅｔＡプロモーターのすぐ下流にＢｂｓＩを介したゴールデンゲートが含まれている。続いて、ｓｆＧＦＰはプライマーＦＳ＿１１３４／ＦＳ＿１１３５を使用してｐＬＰ１６７から増幅され、ＲｌｕｃはＢＢａ＿Ｊ５２００８（標準的な生物学的部分のレジストリ）のＦＳ＿１１３６／ＦＳ＿１１３７を使用して増幅された。両方のフラグメントは、ＢｂｓＩを介したゴールデンゲートアセンブリを使用してｐＦＳ＿０２７０にクローン化され、それぞれｐＦＳ＿０２７１（ｓｆＧＦＰ）及びｐＦＳ＿０２７２（Ｒｌｕｃ）を生成した。ＬｕｘＲプロモーター部分はｐＩＧ００４６のプライマーＦＳ＿１５８４／ＦＳ＿１５８５及びｐＩＧ００５９のＦＳ＿１５８６／ＦＳ＿１５８７（標準的な生物学的部分のレジストリ）で増幅され、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＡｇｅＩ消化されたｐＦＳ＿０２７０にクローニングされ、ｐＦＳ＿０３９９を作成した。オリゴＦＳ＿１５８８／ＦＳ＿１５８９をアニーリングし、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＦＳ＿０３９９にクローニングした。ｐＦＳ＿０４００を生成した。Ｆｌｕｃコード配列は、ＦＳ＿１６１８／ＦＳ＿１６１９を使用してＢｂａＩ７１２０１９（標準的な生物学的部分のレジストリ）から増幅され、ＢｓａＩで消化され、ＢｂｓＩで消化されたｐＦＳ＿０４００にクローン化され、ＲＮＡ記録実験で使用されるｐＦＳ＿０４１２が得られた。生物学的複製ごとに、５０ｍＬのＩＰＴＧ含有ＴＢ培地は、ｐＦＳ＿０２７１（ｓｆＧＦＰ）、ｐＦＳ＿０２７２（Ｒｌｕｃ）、及びｐＦＳ＿０４１２（Ｆｌｕｃ）で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の２２コロニーを接種された。ＯＤ６００が０．２５に達したとき、細胞は細菌培養チューブの３ｍＬのアリコートに分割され、ＰｔｅｔＡプロモーターの場合はａＴｃで、ＰＬｕｘＲプロモーターの場合はＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３ＯＣ６−ＨＳＬ）（Ｓｉｇｍａ）で誘導され、オービタルシェーカーで、３００ｒｐｍで１２〜１４時間培養した後、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定に供された。ｓｆＧＦＰ、Ｒｌｕｃ、及びＦｌｕｃに整列するスペーサーは、上記のように定量化された（「データ分析パイプライン」を参照）。配列決定読み取り１００万回あたりの一意的なスペーサーの検出数は正規化され、生物学的複製あたりのスペーサーの合計数を１００％と定義し、及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ７．０ｄを使用してプロットされた。ｐＦＳ＿０２７１及びｐＦＳ＿０２７２を使用したＲＮＡ記録について、同じ培養物からのＲＮＡ抽出は、ＲＮＡｓｎａｐ法を使用して行われ、続いて１．５μＬのＴＵＲＢＯＤＮａｓｅ��使用してＴＵＲＢＯＤＮＡフリーキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理し、ＤＮＡバックグラウンドを最小限に抑えた。逆転写は、テンプレートとして５００ｎｇのＲＮＡ試料でｑＳｃｒｉｐｔＤＮＡ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏ）を使用して行われた。ｃＤＮＡは１：４に希釈され、定量はＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システムでＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、２つの技術的複製で行われた。プライマー及びプローブの配列は表７に示す。絶対コピー数は検量線法を使用して計算され、１６ｓｒＲＮＡがハウスキーパーとして使用された。単一のＳＥＮＥＣＡ反応（６×１０９）の細胞数に対応するｍＲＮＡコピー数を決定するために、単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＢＮＩＤ１０２９９２）あたりの１８７００  １６ｓｒＲＮＡ転写産物の平均量に基づいて計算された。
【０１２０】
直交合成記録
Ｒｌｕｃコード配列はｐＦＳ＿０２７２からＦＳ＿１６２０／ＦＳ＿１１３７を使用して増幅され、ＢｂｓＩを介したゴールデンゲートアセンブリを使用してｐＦＳ＿０３９９にクローン化され、ｐＦＳ＿０４１３が生成された。Ｆｌｕｃコード配列は、ＦＳ＿１６２１／ＦＳ＿１６１９を使用してＢｂａ＿Ｉ７１２０１９（標準的な生物学的部分のレジストリ）から増幅され、ＢｂｓＩで消化され、ＢｓａＩで消化されたｐＦＳ＿０４１３にクローン化され、その後直交合成記録実験で使用されたｐＦＳ＿０４１４を得た。
【０１２１】
各生物学的複製について、１００μＭＩＰＴＧを含む５０ｍＬのＴＢ培地は、（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３ＯＣ６−ＨＳＬ）誘導性Ｆｌｕｃ及びａＴｃ誘導性Ｒｌｕｃをコードする配列を含むｐＦＳ＿０４１４で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の３３コロニーを接種された。ＯＤ６００が０．２５に達したら、細胞は細菌培養チューブで３ｍＬのアリコートに分割され、７５ｎｇ／ｍＬの無水テトラサイクリン塩酸塩（ａＴｃ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又は１０μＭの３ＯＣ６−ＨＳＬ（Ｓｉｇｍａ）又は両方の組み合わせで誘導した。オービタルシェーカーにおいて３００ｒｐｍで１２時間培養した後、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、ディープ配列決定、並びに同じ培養物からの並列ＲＮＡ抽出、逆転写及びｑＰＣＲ測定を行った。データは、単一の合成転写産物の記録について、上記のよう分析された。
【０１２２】
酸化ストレスに対する転写応答
生物学的複製ごとに、１００μＭＩＰＴＧを含む３６ｍＬのＩＰＴＧ含有ＴＢ培地は、前夜にｐＦＳ＿０２３５で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の２４コロニーを接種され（１コロニー／１．５ｍＬ）、２５０ｍＬバッフル付きシェーカーフラスコで０．２４〜０．２５のＯＤ６００に達するまで振とうした。次に、培養物は細菌培養チューブ（Ｇｒａｉｎｅｒ）に３ｍＬのアリコートに分割され、Ｈ２Ｏ２（３０％ｗ／ｗ溶液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で最終濃度１ｍＭ又は等量のｄｄＨ２Ｏになるように処理された。３００ｒｐｍで１２時間増殖を続けた後、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、ディープ配列決定のために２ｍＬの培養液を回収した。データは上記のように分析された（「データ分析パイプライン」参照）。
【０１２３】
酸ストレスに対する転写応答
ｐＨ制御された増殖のために、カリウム修飾溶原性ブロス（ＬＢ）（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、７．４５ｇ／Ｌ  ＫＣｌ）は１００ｍＭ  ＨＯＭＯＰＩＰＥＳ（ホモピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））で緩衝された。続いて、前述のようにＫＯＨ溶液を使用して、培地のｐＨは５．０（酸ストレス）又は７．０（中性）のいずれかに調整された。ｐＨを調整した５０ｍＬの生物学的複製ごとに、ＩＰＴＧ含有ＬＢ培地は、ｐＦＳ＿０２３５で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の３３コロニーに接種された（１コロニー／１．５ｍＬになる）。プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定のために、ＯＤ６００が０．３〜０．６の試料を収集した。データは上記のように分析された（「データ分析パイプライン」参照）。
【０１２４】
ａＴｃ誘導性ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現コンストラクトのクローニング
パラコートに対する転写応答を記録するために、ａＴｃ誘導性ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現コンストラクトが生成された。したがって、構成的プロモーター及びＰｔｅｔＡプロモーターによって駆動されるｔｅｔリプレッサーを含むフラグメントはＦＳ＿１５７４／１５７５を使用してｐＦＳ＿０２７１から増幅され、ＢｇｌＩ／ＳｐｈＩで消化し、さらにＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２のＮ末端はＦＳ＿１５７６／１５７７で増幅され、ＳｐｈＩ／ＢｇｌＩＩで消化された。これらの２つのフラグメントは、ＢｇｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＦＳ＿０２３５にクローン化され、ｐＦＳ＿０３９３が生成された。コドン最適化ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２配列はＧｅｎｓｃｒｉｐｔから獲得し、ＦＳ＿１６４１／１６４２を使用して増幅され、ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩを使用してｐＦＳ＿０３９３にクローニングされ、最初のＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２コード配列を置き換えてｐＦＳ＿０４５３（配列番号３３４）を生成した。
【０１２５】
１ｍＭ又は１０ｍＭ  パラコートに対する転写応答
パラコートジクロリド水和物（ＰＥＳＴＡＮＡＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は１ＭでｄｄＨ２Ｏに溶解された。各生物学的複製について、３０ｎｇ／ｍＬ  ａＴｃを含む７５ｍＬのＴＢ培地は、ｐＦＳ＿０３９３で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の５０コロニーを接種され、ＯＤ６００が０．２４〜０．２５に達するまでバッフル付きシェーカーフラスコで振とうされた。次に、培養物は細菌培養チューブに３ｍＬのアリコートに分割され、１ｍＭ及び１０ｍＭパラコートで処理され、さらに１１〜１２時間培養した後、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定のために２ｍＬの培養物を回収した。データは上記のように分析された（「データ分析パイプライン」を参照）。
【０１２６】
一過性のパラコート曝露に対する転写応答
各生物学的複製について、ｐＦＳ＿０４５３で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の２つのコロニーは、標準的な細菌培養チューブ内の３０ｎｇ／ｍＬａＴＣを含む３ｍＬのＴＢ培地に接種された。最初の１２時間は、すべての培養物はパラコートの非存在下（３００ｒｐｍ、３７℃）で培養された。次に、２ｍＬの培養液は吸引され、残りの１ｍＬはスピンダウン（２３００ｘｇ、１０分）され、上清は吸引され、細菌ペレットは３０ｎｇ／ｍＬのａＴｃを含む３ｍＬの新鮮なＴＢ培地に再懸濁された。一過性及び永久的な刺激条件の両方について、パラコートは１０ｍＭの最終濃度まで添加され、培養物は上記のようにさらに１２時間増殖した。次に、２ｍＬの培養物は除去され、残りの１ｍＬは上記のようにペレット化され、３０ｎｇ／ｍＬのａＴｃを含む３ｍＬの新鮮なＴＢ培地に再懸濁された。パラコートは１０ｍＭの恒久的な刺激条件に添加され、培養物は上記のようにさらに１２時間増殖させた。次に、プラスミドＤＮＡ抽出、ＳＥＮＥＣＡ、及びディープ配列決定のために２ｍＬの培養物が回収された。さらに、上記のＲＮＡＳｎａｐプロトコルによるＲＮＡ抽出のために１００μＬの培養液が回収された後、１．５μＬのＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅを使用してＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してリボソームＲＮＡを枯渇させた後、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリを調製し、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｖ２キット（７５サイクル）でディープ配列決定を行い、各ライブラリを４百万回以上の読み取りの深さで配列決定した。
【０１２７】
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ実験及び達成された記録効率のための細菌集団入力
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ実験は、３ｍＬの素晴らしいブロス（ＴＢ）培地で満たされた標準の１２ｍＬ培養チューブで行われ、そのうち２ｍＬはその後のプラスミドＤＮＡ抽出に使用された。初期の実験で、発明者らは、ＳＥＮＥＣＡへの入力として４０ｆｍｏｌ（１８０ｎｇのプラスミドＤＮＡ）を使用すると一貫した結果が得られ、試料をアーカイブし、必要に応じて同じ試料でいくつかの追加のＳＥＮＥＣＡ反応を実行するのに十分なプラスミドを残すことを決定した。
【０１２８】
したがって、典型的な実験で使用される細胞の数を文脈付けするために、４０ｆｍｏｌを考慮されることができる。図２ａに示されているコンストラクト（ｐＦＳ＿０２３５）のサイズは７２９３ｂｐであり、４０ｆｍｏｌのプラスミドＤＮＡがＳＥＮＥＣＡ反応の入力として使用された。式［ｄｓＤＮＡの質量（ｇ）＝ｄｓＤＮＡのモル（ｍｏｌ）ｘ（（ｄｓＤＮＡの長さ（ｂｐ）×６１７．９６ｇ／ｍｏｌ）＋３６．０４ｇ／ｍｏｌ）］を使用すると、これは１８０．３ｎｇのプラスミドＤＮＡの質量に相当する。これらの４０ｆｍｏｌのプラスミドＤＮＡは、２．４×１０１０プラスミドの総数に相当する（アボガドロの１モル数は６．０２２×１０２３粒子に等しく、これに４０×１０−１５を掛けて、使用される４０ｆｍｏｌを計算する）。ｐＥＴオリジンのコピー数を約２０とすると、ＳＥＮＥＣＡ反応ごとの標準入力として１．２×１０９個の細胞が使用される。
【０１２９】
ｐＦＳ＿０２３５の単一のＳＥＮＥＣＡ反応は、ＰＣＲ増幅にアダプターライゲーションプラスミドＤＮＡ全体を使用すると最終的に約６，１２６個のスペーサーを生成する（それぞれ１０μＬのアダプターライゲーションプラスミドＤＮＡを含む２つの３０μＬＰＣＲ反応）。ａＴｃ誘導性ＰｔｅｔＡプロモーター（ｐＦＳ＿０４５３）の転写制御下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２コード配列をコードする最適化ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現コンストラクトを使用すると、拡張データ図１０ａ、ｂ）効率が〜１０倍から６１，４６２スペーサー／ＳＥＮＥＣＡ反応向上する。したがって、４０ｆｍｏｌのプラスミドＤＮＡが獲得され、６１，４６２個のスペーサーが獲得された。これは、新しいスペーサーを獲得する３９０，４８５プラスミドの１つに相当する。ｐＥＴ３０ｂのコピー数を２０とすると、これは新しいスペーサーを獲得する１９，５２４個の細胞すべてにもたらす。
【０１３０】
特定の刺激を検出するために必要な細胞の数に基づいて、この計算を使用して、それぞれの記録の最小入力として使用される細胞の数を導き出すことができる。例えば、本発明者らは、任意の配列（ｓｆＧＦＰ）を評価するために必要とされるスペーサーの最小数を、８．８×１０６の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に対応する５００個のスペーサーと低く定義した（図１１ｇ）。
【０１３１】
同様に、本発明者らは、複雑な細胞挙動を検出するために必要なスペーサーの数を３１３（元のデータの７％）と推定した（図１３、１４）。これは、入力として使用される６．１×１０６個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に相当する。複雑な刺激を記録するために必要なスペーサーの総数は、定義された刺激（ｓｆＧＦＰ）を記録するために必要な数よりも少ないことがある。これは、複雑な場合、多くの異なる遺伝子にマッピングされるスペーサーが「使用可能な出力」に寄与するためである。定義された刺激のうち、必要な合計５００個のスペーサーのサブセットのみが単一の目的の遺伝子（ｓｆＧＦＰ）にマッピングされている。
【０１３２】
ＩＩＩ型対Ｉ型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
Ｆ．サッカリボランス（Ｆ．ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）のようなＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、一般に、典型的なＩ型システム（Ｅ．ｃｏｌｉＩ−Ｅ型のような）よりもスペーサーの獲得効率が数千倍低くなる。これには、新しいスペーサーを特定するために、複数回の複雑なサイズ選択手順とそれに続くディープ配列決定が必要である。同様に、拡張されたＣＲＩＳＰＲアレイからのＰＣＲ産物は、存在量がほとんどないため、ＤＮＡゲル（アガロース又はＰＡＧＥ）では検出できない。まとめると、従来のスペーサー読み出しは非常に効率的なスペーサー獲得システムに適用できるが、ＳＥＮＥＣＡの開発の動機となったほとんどのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの詳細な特性評価は不可能である。
【０１３３】
ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの相関関係の評価
本発明者らは、ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの間の直接的な相関関係を評価することに着手した（図１２ｂ、ｃ）。ただし、２つの手法の明確な性質、つまりＲＮＡ−ｓｅｑは時間内のスナップショットであり、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑは累積記録であるため、発明者らは、現在の転写産物量（ＲＮＡ−ｓｅｑ）が常にＣＲＩＳＰＲアレイ内での統合（Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑ）に先行することを期待し、したがって、特定の時点で弱い相関につながる。この潜在的な非同期性を調査するために、本発明者らは、定常増殖期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の同じ集団からＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑを実行し、すべての遺伝子、対数期遺伝子、定常期の遺伝子６３及びプラスミド媒介遺伝子のコンテキストで２つの間の相関を評価した。すべての遺伝子を考慮した場合（ピアソン相関＝０．６１、Ｒ２＝０．３７）、２つのデータセット間に弱い相関が観察されたが、対数相遺伝子のみを考慮した場合（ピアソン相関＝０．７２、Ｒ２＝０．５２）、はるかに強い相関が観察された。対照的に、定常期遺伝子のみを考慮した場合（ピアソン相関＝０．４９、Ｒ２＝０．２４）、相関は最も弱く、この場合、発明者らは、定常期成長に対応するスペーサーがまだ統合されていないと予想する。成長の１２、２４、及び３６時間後に得られたＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑデータセットで定常期又は対数期の遺伝子を使用してこの相関分析を実行すると、スペーサーレパートリーが定常期の遺伝子にシフトした一方で、対数期の遺伝子との相関が伸長成長中（図７ｆ、ｇ）に減少し、スペーサーの獲得が静止期でもまだアクティブであることを示していることが実際に明らかになった。さらに、成長期による影響が少ないと予想される強力な合成プロモーターの下で発現されるプラスミド媒介遺伝子は、最も高い相関を示す（ピアソン相関＝０．８４、Ｒ２＝０．７０）。まとめると、ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの違いは、両方の方法による転写産物測定のそれぞれの特徴を浮き彫りにする。つまり、ＲＮＡ−ｓｅｑは細胞採取時の細胞トランスクリプトームのスナップショットを表し、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑはＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２によって経時的に細胞集団でサンプリングされた累積トランスクリプトームを明らかする（図１ｂ）。
【０１３４】
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑによる複雑な細胞挙動の分析
本発明者らは、以下の問題に答えることに着手した。（ｉ）処理された条件及び処理されていない条件の間で大きく異なる転写スケールの記録であるか。（ｉｉ）データセット内の最も可変的な遺伝子が２つの集団を区別するか。（ｉｉｉ）標準的なＲＮＡ配列決定分析ツールは、累積的に差次的に発現された遺伝子を特定するか。（ｉｖ）初期刺激のコンテキストで有益な累積的に差次的に発現される遺伝子であるか。（ｖ）本発明者らは、細胞集団を、広範な、可変の、又は特徴的な応答に基づいて、治療された状態と治療されていない状態に偏りなく分類することができるか。
【０１３５】
問題（ｉ−ｉｖ）は本文で扱われているが、ここでは発明者が問題（ｖ）について詳しく説明する。特徴的な遺伝子の中で、発明者らは、各刺激に対する細胞応答を支配すると予想されるいくつかを特定した。例えば、本発明者らは、酸化ストレスの特徴的な遺伝子の中で、特徴的なＤＮＡ損傷修復タンパク質をコードするｄｐｓ（飢餓タンパク質中のＤＮＡ保護）を同定した。さらに、ｄｐｓは、酸化ストレスに応答して差次的に発現する遺伝子のトップであることが以前に示されている。さらに、本発明者らは、主に酸化ストレス条件下で作動して鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターの形成を助けるＳＵＦシステムの３つのメンバー（すなわち、ｓｕｆＡＢＣＤＳＥオペロン）を特定した。同様に、本発明者らは、酸ストレス特徴的な遺伝子３５の中で、ａｓｒ（酸ショックタンパク質前駆体）ならびにいくつかのシャペロン（例えば、ｄｎａＫ及びｉｂｐＢ）及びヒートショックタンパク質（例えば、ｇｒｐＥ及びｉｂｐＡ）を含む、酸ストレス応答の特徴的なメンバーを同定した。
【０１３６】
ＲＮＡ対ＤＮＡからのＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得
本発明者らは、ＲＮＡのみのｔｄイントロンスプライス接合部からのスペーサー獲得（図３ａ、ｂ及び図８ａ−ｂ）、ＲＮＡウイルスからのスペーサー獲得（図３ｃ−ｅ及び図１０ｃ−ｆ）及びＲＮＡ存在量に依存するスペーサー獲得（図３ｆ、ｇ、図１１ａ−ｅ及び図１２ｂ−ｄ）を含む、ＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲスペーサー獲得を示す複数の証拠を提示する。これらの観察結果は、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２がＲＮＡから直接スペーサーを獲得できることを強く示唆しているが、スペーサーがＤＮＡからも獲得されている可能性を排除するものではない。ＲＮＡ対ＤＮＡからのスペーサー獲得の違いは、ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２を介したスペーサー獲得の分子メカニズムを理解するための基本であるが、Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの解釈を混乱させるものではなく、それにより、獲得したスペーサーは、高度に転写された遺伝子に優先的に由来し、ゲノム全体のレベルでの遺伝子発現と相関し、及びＲＮＡの存在量と高度に相関する（図１２ｂ、ｃ）。
【０１３７】
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの利点
Ｒｅｃｏｒｄ−ｓｅｑの利点は、（ｉ）豊富さに依存するプロセスでＤＮＡ内のＲＮＡ種を捕捉して保存するために、オルソロガスＲＴ−Ｃａｓ１を含むＣＲＩＳＰＲ獲得システムを異種発現する能力、（ｉｉ）ＤＮＡに恒久的に保存されている分子履歴を効率的かつ拡張可能に読み出し、トランスクリプトームスケールの事象を再構築する能力、（ｉｉｉ）ウイルス感染又は誘導性発現システムの単一又は直交セットなどの特定の入力を記録するためのこの技術の適用、及び（ｉｖ）医療又はバイオテクノロジーアプリケーション用の「センチネル」細胞を作成するためのこのシステムの潜在的なアプリケーションを含む。特定の外部刺激を直接記録されない場合でも、細菌集団内で記録されたトランスクリプトームスケールの特徴的な分子は、意味のある生理学的状態を報告するのに十分であり得る。
【０１３８】
マウス実験
強制経口投与について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＭＧ１６５５）細胞はｐＦＳ＿０４５３（ＳＥＱＩＤＮＯ３３４）で形質転換され、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに画線され、３７℃で一晩（１２時間）増殖した。プラスミドｐＦＳ＿０４５３は、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター（ｐＴｅｔＡ）転写制御下にあるＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２及びＦｓＣＲＩＳＰＲアレイ２それに続くＳＥＮＥＣＡ読み出し用のＦａｑＩ制限部位をコードする。
【０１３９】
翌日の夕方、無菌条件下で５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む３ｍＬ  ＬＢ培地に単一コロニーは採取され、バクテリアシェーカー（２００〜３００ｒｐｍ）で、３７℃で一晩増殖した。この培養物が使用され、−８０℃で長期間保存するために５００μＬの細菌培養物を５００μＬの滅菌５０％（ｗ／ｖ）グリセロールと混合し、グリセロールストックを調製した。インビボ記録実験のために、一晩の液体培養物は、このグリセロールストックから直接、又は５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に細菌をストリークすることによるいずれかで接種され、単一の細菌コロニーを得た。
【０１４０】
ノトバイオートＣ５７ＢＬ／６マウスは、５００μＬのＰＢＳ中のｐＦＳ＿０４５３で形質転換した１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＭＧ１６５５細胞を強制経口投与された。プラスミドの持続性は、１００μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を飲料水に添加することで確保された。ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２の発現は、飲料水に１０〜３０μｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加することによって誘導された。
【０１４１】
ＤＳＳ実験について、強制経口投与の２４時間前に、カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びアンヒドロテトラサイクリン（３０μｇ／ｍＬ）が無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの飲料水に添加された。動物は無菌条件下で維持された。ｐＦＳ＿０４５３で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーは、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩増殖した。得られた培養物はペレット化され、１×ＰＢＳに再懸濁された。この細菌の再懸濁が使用され、１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を各動物に強制経口投与した。動物は、実験全体を通してカナマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンの両方を含む水で飼育された。糞便ペレットは、強制飼養の２４時間後に開始して１８日間収集された。実験の５日目から９日目まで、上記のようにカナマイシン及びアンヒドロテトラサイクリンを維持しながら、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（ＭＰＢｉｏ）が動物の飲料水に１％、２％、又は３％（ｗ／ｖ）添加された。動物は３匹の群が治療され、陰性対照動物は水を介してＤＳＳを受けなかった。
【０１４２】
実験は、プラスミドＤＮＡ抽出のために結腸及び盲腸の内容物も採取した１９日目に終了された。
【０１４３】
ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して、製造元の指示に従ってプラスミドＤＮＡは抽出され、増加したバイオマスを調整するために、バッファーＰ１、Ｐ２、及びＮ３に対してバッファーの量はそれぞれ５００、５００、及び７００μＬに増加された。プラスミドＤＮＡは１５０μＬのバッファーＥＢで溶出され、その後沈殿により濃縮された。したがって、１５μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０５μＬのイソプロパノールが各試料に添加された。試料は−２０℃で少なくとも２０分間インキュベートされた。核酸を沈殿させるための遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）に続いて、上清が除去され、遠心分離（２０，０００×ｇ、１５分、４℃）によってＤＮＡペレットは１５０μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄された。エタノールは吸引され、ＤＮＡペレットは５５℃で短時間乾燥され、ＤＮＡペレットは１５μＬのバッファーＥＢに再懸濁された。この溶出液から、７．５μＬがＳＥＮＥＣＡアダプターのライゲーションに使用され、ＳＥＮＥＣＡプロトコルの後続のすべてのステップを前述のように実行した。
【０１４４】
固形飼料及びでんぷんの飼料を比較する飼料実験について、実験前にすべての動物は固形飼料ベースの飼料（３３０７、Ｋｌｉｂａ  Ｎａｆａｇ）で維持された。実験の１日目に、５匹の動物は、固形飼料ベースの飼料で継続的に維持し、５匹の動物の２番目の群はデンプンベースの飼料（Ｄ１２４５０Ｊｉ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓＩｎｃ）に切り替えられた。実験の２日目に、アンヒドロテトラサイクリン及び硫酸カナマイシンが飲料水に添加された（それぞれ３０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）。実験の３日目に、すべての動物は、上記のようにｐＦＳ＿０４５３で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）を強制経口投与された。上記のようにプラスミドＤＮＡを抽出するために、実験の４日目から９日目まで糞便ペレットが収集された。さらに、１０日目に、動物は解剖され、上記のようにプラスミドＤＮＡ抽出のための盲腸及び結腸の内容物を得た。
【０１４５】
固形飼料、でんぷん、脂肪の飼料を比較する飼料実験について、実験前にすべての動物は固形飼料ベースの飼料（３３０７、Ｋｌｉｂａ  Ｎａｆａｇ）で維持された。実験の１日目に、固形飼料ベースの飼料（３３０７、Ｋｌｉｂａ  Ｎａｆａｇ）、デンプンベースの飼料（Ｄ１２４５０Ｊｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．）、又は脂肪ベースの飼料（脂肪強化食Ｄ１２４９２ｉ、Ｒｅｓｅａｒｃｈダイエット株式会社）のいずれかが与えられた。実験の２日目に、アンヒドロテトラサイクリン及び硫酸カナマイシンが飲料水に添加された（それぞれ３０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）。実験の３日目に、すべての動物は、上記のようにｐＦＳ＿０４５３で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５の１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）を強制経口投与された。上記のようにプラスミドＤＮＡを抽出するために、実験の４日目から１０日目まで糞便ペレットが収集された。さらに、１０日目に、動物は解剖され、上記のようにプラスミドＤＮＡ抽出のための盲腸及び結腸の内容物を得た。
【０１４６】
表１：ＲＴ−Ｃａｓ１オルソログ
ＨＭＭＥＲベースのタンパク質配列相同性検索によって同定されたＲＴ−Ｃａｓ１オルソログの宿主株及びタンパク質アクセッション番号
【０１４７】
【表１】
2022500032.tif 000003
2022500032.tif 000004
2022500032.tif 000005
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【０１４８】
表２：従来の獲得読み出しのための最初のラウンドＰＣＲプライマー
図６における従来の獲得の読み出しに関連する、ディープ配列決定のためのＣＲＩＳＰＲアレイを増幅するための最初のラウンドＰＣＲプライマーのプライマー結合部位。
【０１４９】
フォワードプライマー結合部位は各種の上のレーンに示され、リバースプライマー結合部位は下側レーンに示されている。最初のＰＣＲ用のアダプター配列を含むプライマーの設計は、この明細書の方法セクションのプライマー設計ノート１に詳しく説明されている。
【０１５０】
【表２】
2022500032.tif 000008
2022500032.tif 000009
【０１５１】
表３：ディープ配列決定のインデックス
この調査で使用されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑＨＴインデックスに対応する（Ｎ）８バーコード
【０１５２】
【表３】
2022500032.tif 000010
【０１５３】
表４：ＳＥＮＥＣＡアダプターオリゴ
それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイでソートされたＳＥＮＥＣＡ手順中のアダプターライゲーションのためのリバースオリゴ。図７および８に関連。ユニバーサルリバースオリゴＦＳ＿０９６３でアニーリングすると、アレイ固有のフォワードオリゴ（表下）は、ＳＥＮＥＣＡにおけるＦａｑＩ消化中に生成されたプラスミドオーバーハングと互換性のある４ｂｐオーバーハングを作成する。
【０１５４】
【表４】
2022500032.tif 000011
2022500032.tif 000012
2022500032.tif 000013
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【０１５５】
表５：ＳＥＮＥＣＡ獲得読み出し用の最初のラウンドＰＣＲプライマー
それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイによってソートされたＤＲ特異的ＳＥＮＥＣＡフォワード増幅プライマーのプライマー結合部位。図８に関連。ＳＥＮＥＣＡ  ＰＣＲ中、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイに対応するフォワードプライマーが選択され、ＦＳ＿０９１１はＩｌｌｕｍｉｎａアダプターに結合するユニバーサルリバースプライマーとして機能する。プライマー設計の詳細は、プライマー設計ノート１および２に記載されている。スタガリングは、ＣＲＩＳＰＲアレイの方向性選抜では、フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）アレイ２について説明されている通常の７つのフォワードプライマーに代えて、スタガー長が異なる２つのフォワードプライマー（ＮＮおよびＮＮＮ）のみを指図することで行われた。
【０１５６】
【表５】
2022500032.tif 000015
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2022500032.tif 000017
【０１５７】
表６：様々なプライマー
クローニングの目的で使用されるプライマー及びオリゴヌクレオチド。
【０１５８】
【表６】
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2022500032.tif 000020
【０１５９】
表７：ｑＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマー及びＴａｑＭａｎプローブ
【０１６０】
【表７】
2022500032.tif 000021
【０１６１】
配列１−ＲＴ−Ｃａｓ１ｓ、Ｃａｓ２ｓ、及びＣＲＩＳＰＲアレイ
個々のＲＴ−Ｃａｓ１、Ｃａｓ２オルソログのコドンマッピングされたＤＮＡ配列は、図６及び７における従来の適応読み出しのために予測されたＣＲＩＳＰＲアレイとともにＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔから注文された。
【０１６２】
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号１）
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株Ｃａｓ２（配列番号２）
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株アレイ  （配列番号１０２）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号３）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）Ｃａｓ２（配列番号４）                 
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）アレイ（配列番号１０３）
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号５）
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４Ｃａｓ２（配列番号６）                       
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４アレイ（配列番号３５）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号７）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）Ｃａｓ２（配列番号８）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）アレイ１（配列番号３６）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）アレイ２（配列番号３７）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号９）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種Ｃａｓ２（配列番号１０）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種アレイ（配列番号３８）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号１１）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）  Ｃａｓ２  （配列番号１２）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）アレイ  １  （配列番号３９）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）アレイ  ２  （配列番号４０）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）  ＢＡ−９１種
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）  ＢＡ−９１種  ＲＴ−Ｃａｓ１  （配列番号１３）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）  ＢＡ−９１種Ｃａｓ２（配列番号１４）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）  ＢＡ−９１種アレイ（配列番号４１）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）  ＤＳＭ ２０７５
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ ２０７５  ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号１５）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ ２０７５  Ｃａｓ２（配列番号１６）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ ２０７５アレイ（配列番号４２）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号１７）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アレイ（配列番号４３）
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂ
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂ  ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号１９）
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂ  Ｃａｓ２（配列番号２０）
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  （配列番号４４）
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  ２（配列番号４５）
ビブリオ シナロエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｉｎａｌｏｅｎｓｉｓ）Ｔ０８株
ビブリオ シナロエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｉｎａｌｏｅｎｓｉｓ）Ｔ０８株ＲＴ−Ｃａｓ１  （配列番号２１）
ビブリオ シナロエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｉｎａｌｏｅｎｓｉｓ）Ｔ０８株Ｃａｓ２（配列番号２２）
ビブリオ シナロエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｉｎａｌｏｅｎｓｉｓ）Ｔ０８株アレイ（配列番号４６）
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号２３）
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２Ｃａｓ２（配列番号２４）
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２アレイ  （配列番号４７）
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号２５）
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）Ｃａｓ２  （配列番号２６）
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）アレイ  （配列番号４８）
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号２７）
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｃａｓ２（配列番号２８）
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アレイ（配列番号４９）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種Ｃａｓ１（配列番号２９）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種ＲＴ（配列番号３３）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種Ｃａｓ２（配列番号３０）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ１（配列番号５０）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ２（配列番号５１）
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６ＲＴ−Ｃａｓ１（配列番号３１）
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６Ｃａｓ２（配列番号３２）
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ１（配列番号５２）
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ２（配列番号５３）
【０１６３】
配列２−ＣＲＩＳＰＲアレイ方向性選抜
それぞれのオルソログによってソートされた、図８ｂに関連するＣＲＩＳＰＲＡ方向性スクリーンの推定配列。すべての配列は、それぞれのＲＴ−Ｃａｓ１−Ｃａｓ２発現プラスミドへのギブソンアセンブリの隣接するアダプター部位とともに描かれている（ＲＣ＝逆相補体）
【０１６４】
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株アレイ１  （配列番号５４）
バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）Ｓ１４株４アレイ  １ＲＣ（配列番号５５）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）アレイ１（配列番号５６）
カンピロバクター フェタス  亜種フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ）アレイ１ＲＣ（配列番号５７）
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４アレイ１（配列番号５８）
セルロモノスポラ ボゴリエンシス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）６９Ｂ４アレイ１ＲＣ（配列番号５９）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
アレイ１（配列番号６０）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
アレイ１ＲＣ（配列番号６１）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
アレイ２（配列番号６２）
フシカテニバクター サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）
アレイ２ＲＣ（配列番号６３）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種アレイ１（配列番号６４）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＳＫ−０２種アレイ１ＲＣ（配列番号６５）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａアレイ１Ａ  （配列番号６６）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａアレイ１ＲＣ（配列番号６７）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａアレイ２Ａ  （配列番号６８）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａアレイ２ＲＣ  （配列番号６９）
マイクロモノスポラ ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａアレイ  ３Ａ  （配列番号７０）
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＢＡ−９１種
カンジダタス アキュムリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｃｃｕｍｌｉｂａｃｔｅｒ）ＢＡ−９１種アレイ１（配列番号７１）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ  ２０７５
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ  ２０７５アレイ１（配列番号７２）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ  ２０７５アレイ１ＲＣ（配列番号７３）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ  ２０７５アレイ２（配列番号７４）
デスルファクルス バーシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ  ２０７５アレイ２ＲＣ（配列番号７５）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａアレイ１（配列番号７６）
ウッズホレア マリティマ（Ｗｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａアレイ１ＲＣ（配列番号７７）  
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂ
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  １（配列番号７８）  
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  １ＲＣ（配列番号７９）  
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  ２Ａ（配列番号８０）  
アゾスピリルム リポフェルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）４Ｂアレイ  ２ＲＣ（配列番号８１）  
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２アレイ１（配列番号８２）  
テレジニバクター ターネラエ（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ）Ｔ８４１２アレイ１ＲＣ（配列番号８３）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）
アレイ１（配列番号８４）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）
アレイ１ＲＣ（配列番号８５）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）アレイ２（配列番号８６）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）アレイ２ＲＣ（配列番号８７）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）アレイ３（配列番号８８）  
トリポチルクス カンピロネモイド（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｉｒｘ ｃａｍｐｙｌｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）アレイ３ＲＣ（配列番号８９）  
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アレイ１（配列番号９０）  
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アレイ１ＲＣ（配列番号９１）  
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アレイ２（配列番号９２）  
オシラトリアル シアノバクテリウム（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アレイ  ２  ＲＣ  （配列番号９３）  
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ１（配列番号９４）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ１ＲＣ（配列番号９５）
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ２（配列番号９６）  
リヴラリアＰＣＣ ７１１６種アレイ２ＲＣ（配列番号９７）  
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ１（配列番号９８）  
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ１ＲＣ（配列番号９９）  
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ２（配列番号１００）  
ユーバクテリウム サブレウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ）ＤＳＭ  ３９８６アレイ  ２  ＲＣ  （配列番号１０１）  
【０１６５】
配列３−様々な配列
ｇＢｌｏｃｋ ＦＳ ｇＢｌｏｃｋ ｔｄイントロンアクセプター（配列番号１０４）
ヒトコドン最適化ＦｓＲＴ−Ｃａｓ１−Ｔ７ＲＢＳ−Ｃａｓ２（配列番号３４）
ｐＦＳ＿０４５３プラスミド（配列番号３３４）
【図１ａ】
2022500032.tif 000022
【図１ｂ】
2022500032.tif 000023
【図２ａ−ｂ】
2022500032.tif 000024
【図２ｃ−ｅ】
2022500032.tif 000025
【図２ｆ−ｇ】
2022500032.tif 000026
【図３ａ−ｃ】
2022500032.tif 000027
【図３ｄ−ｆ】
2022500032.tif 000028
【図３ｇ】
2022500032.tif 000029
【図４ａ】
2022500032.tif 000030
【図４ｂ−ｃ】
2022500032.tif 000031
【図４ｄ−ｅ】
2022500032.tif 000032
【図４ｆ−ｇ】
2022500032.tif 000033
【図５ａ−ｂ】
2022500032.tif 000034
【図５ｃ】
2022500032.tif 000035
【図５ｄ】
2022500032.tif 000036
【図５ｅ−ｆ】
2022500032.tif 000037
【図６ａ−ｂ】
2022500032.tif 000038
【図６ｃ−ｄ】
2022500032.tif 000039
【図７ａ】
2022500032.tif 000040
【図７ｂ−ｅ】
2022500032.tif 000041
【図７ｆ−ｇ】
2022500032.tif 000042
【図８】
2022500032.tif 000043
【図９ａ−ｂ】
2022500032.tif 000044
【図９ｃ−ｅ】
2022500032.tif 000045
【図９ｆ−ｇ】
2022500032.tif 000046
【図９ｈ】
2022500032.tif 000047
【図１０ａ−ｃ】
2022500032.tif 000048
【図１０ｄ−ｅ】
2022500032.tif 000049
【図１０ｆ】
2022500032.tif 000050
【図１１ａ】
2022500032.tif 000051
【図１１ｂ−ｅ】
2022500032.tif 000052
【図１１ｆ−ｈ】
2022500032.tif 000053
【図１１ｉ−ｊ】
2022500032.tif 000054
【図１２ａ】
2022500032.tif 000055
【図１２ｂ】
2022500032.tif 000056
【図１２ｃ−ｄ】
2022500032.tif 000057
【図１２ｅ】
2022500032.tif 000058
【図１３−１】
2022500032.tif 000059
【図１３−２】
2022500032.tif 000060
【図１４−１】
2022500032.tif 000061
【図１４−２】
2022500032.tif 000062
【図１４−３】
2022500032.tif 000063
【図１４−４】
2022500032.tif 000064
【図１５ａ−ｂ】
2022500032.tif 000065
【図１５ｃ】
2022500032.tif 000066
【図１５ｄ】
2022500032.tif 000067
【図１６】
2022500032.tif 000068
【図１７】
2022500032.tif 000069
【図１８】
2022500032.tif 000070
【図１９】
2022500032.tif 000071
【図２０】
2022500032.tif 000072
【図２１】
2022500032.tif 000073
【図２２】
2022500032.tif 000074
【図２３】
2022500032.tif 000075
【図２４】
2022500032.tif 000076
【図２５】
2022500032.tif 000077
【配列表】
2022500032000001.app
【国際調査報告】
2022500032.tif 000078
2022500032.tif 000079
2022500032.tif 000080
2022500032.tif 000081
2022500032.tif 000082