【手続補正書】
【提出日】平成22年3月4日(2010.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物を含む組成物であって、前記構築物が
（ａ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記発現可能なヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するプロモーターヌクレオチド配列と、発現可能なヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターヌクレオチド配列は前記発現可能なヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；
（ｃ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列；又は
（ｄ）複数のｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロンを含む前記組成物。
【請求項２】
前記構築物が（ａ）及び（ｂ）の両者を含み、（ａ）及び（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が相互に異なるか、又は
前記構築物が（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードし、（ｂ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が前記Ｏ−ＲＳをコードするか、又は
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ  ｔＲＮＡ遺伝子から選択されるか、又は
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導されるか、又は
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列が複数の１種以上のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンであるか、又は
（ａ）の前記発現可能なヌクレオチド配列がｔＲＮＡをコードする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項４】
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含むか、又は
（ｄ）の前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なるか、又は
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含むか、又は
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導されるか、又は
（ｄ）の前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系であって、前記系が
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを含む前記翻訳系。
【請求項６】
前記核酸構築物が
（ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡを含むか又はコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡは前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ｉｉｉ）複数の前記Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を含む請求項５に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子が大腸菌ｐｒｏＫ、ｐｒｏＬ及びｐｒｏＭ  ｔＲＮＡ遺伝子から選択されるか、又は
前記大腸菌プロリンｔＲＮＡプロモーター及びターミネーター配列が夫々配列番号３２（プロモーター）及び３３（ターミネーター）に記載の大腸菌ｐｒｏＫのプロモーター及びターミネーター配列から誘導されるか、又は
前記ポリシストロン性オペロンが複数の同一の異種ポリヌクレオチドリンカーを含むか、又は
前記ポリシストロン性オペロンが複数の異種ポリヌクレオチドリンカーを含み、異種ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも２個が相互に異なるか、又は
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが５’末端チミジンヌクレオチド、３’末端アデノシンヌクレオチド、又は５’末端チミジンヌクレオチドと３’末端アデノシンヌクレオチドの両者を含むか、又は
前記異種ポリヌクレオチドリンカーがｖａｌＵとｖａｌＸ；ｉｌｅＴとａｌａＴ；ｓｅｒＶとａｒｇＶ；ｖａｌＶとｖａｌＷ；ｇｌｙＴとｔｈｒＴ；ｍｅｔＴとｌｅｕＷ；ｇｌｎＷとｍｅｔＵ；ｈｉｓＲとｌｅｕＴ；ｇｌｎＵとｇｌｎＷ；ｌｅｕＰとｌｅｕＶ；ｇｌｎＶとｇｌｎＸ；ａｌａＷとａｌａＸ；ｉｌｅＵとａｌａＵ；ｉｌｅＶとａｌａＶ；ｍｅｔＵとｇｌｎＶ；ｇｌｙＷとｃｙｓＴ；ａｒｇＸとｈｉｓＲ；及びａｒｇＹとａｒｇＺから選択される内在大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子間に位置する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導されるか、又は
前記異種ポリヌクレオチドリンカーが配列番号１４（ｖａｌＵ／ｖａｌＸリンカー）又は１５（ｉｌｅＴ／ａｌａＴリンカー）のヌクレオチド配列から誘導される請求項６に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記Ｏ−ｔＲＮＡが１種以上の古細菌ｔＲＮＡから誘導されるか、又は
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がＯ−ｔＲＮＡをコードする複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンであるか、又は
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））のヌクレオチド配列を含むか、又は
Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１（ＭｊｔＲＮＡ−Ｔｙｒ（ＣＵＡ））の複数のヌクレオチド配列を含むポリシストロン性オペロンであるか、又は
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるか、又は
前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるか、又は
前記Ｏ−ＲＳが配列番号２に記載の野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（野生型Ｍｊ−ｔＲＮＡＴｙｒＲＳ）のアミノ酸配列に対してアミノ酸２８６位又は２８６位に類似する位置にアスパラギン酸→アルギニン置換をもつ請求項５に記載の翻訳系。
【請求項９】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む宿主細胞を含む請求項５に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞であるか、又は
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項１２】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドを宿主細胞で作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｖ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含む宿主細胞を準備し、
（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前記核酸構築物が
（Ｉ）大腸菌プロリンｔＲＮＡ遺伝子から誘導されるプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列（ここで、前記プロモーター及びターミネーター配列はいずれも前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列は前記プロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して異種である）；
（ＩＩ）配列番号１３のヌクレオチド配列をもつ改変型大腸菌ｇｌｎＳプロモーターに対応するヌクレオチド配列（ここで、前記改変型大腸菌ｇｌｎＳヌクレオチド配列は前記Ｏ−ＲＳをコードする前記ヌクレオチド配列と機能的に連結されている）；並びに
（ＩＩＩ）複数のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を含み、少なくとも１個のＯ−ｔＲＮＡ遺伝子が天然ｔＲＮＡオペロンに由来する天然ポリヌクレオチドリンカーから誘導される異種ポリヌクレオチドリンカーにより少なくとも１個の隣接Ｏ−ｔＲＮＡ遺伝子から分離されているポリシストロン性オペロン
の少なくとも１種を集合的に含むようにこれらを準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。
【請求項１３】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの発現用翻訳系の作製方法であって、
（ａ）非天然アミノ酸と；
（ｂ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｃ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが発現されると、ポリヌクレオチドにおけるセレクターコドンの位置がポリペプチドを生産するようにポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置を制御するように構成された前記ポリヌクレオチドを準備する段階を含む前記方法。
【請求項１４】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ該当ポリペプチドの作製方法であって、
（ａ）（ｉ）非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と；
（ｉｉｉ）前記該当ポリペプチドをコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含み、セレクターコドンの位置が該当ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の特定位置に相関するポリヌクレオチドと；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む宿主細胞を含む翻訳系を準備する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記宿主細胞で前記ポリペプチドの翻訳中に前記ポリペプチドの前記特定位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ前記該当ポリペプチドを作製する段階を含む前記方法。