【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月14日(2010.9.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移の速度を高めて前記酵素の活性又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を検出する方法であって、当該方法が、
ａ）マンガン塩を含む反応緩衝液中での末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応から前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移を実施して、マンガン不在下における反応速度を上回るように前記反応の速度を高めること
を含んでおり、前記酵素が鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼである、方法。
【請求項２】
マンガン塩の濃度が０．０１ｍＭ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マンガン以外に他の金属塩も末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸と共に存在する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
遊離金属イオン濃度を調節するための金属イオン緩衝剤の存在下で前記反応を実施することをさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオン緩衝剤がジカルボン酸である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドポリリン酸が、次式のものである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【化１】
2006524040.tif 000001
式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である。
【請求項７】
核酸配列の存在を検出する方法であって、
ａ）請求項１記載の方法に従って末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の利用速度を高めるためマンガン塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を実施する工程であって、前記ポリメラーゼ反応が、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させて、標識ポリリン酸を生成させることを含む工程と、
ｂ）前記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生成させる工程と、
ｃ）前記検出可能な種の存在を検出する工程と
を含む、方法
【請求項８】
段階（ａ）がさらにホスファターゼ存在下で前記ポリメラーゼ反応を実施することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）がさらに、区別できる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で前記ポリメラーゼ反応を実施することを含む、請求項７又は請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な種で得られるスペクトルを公知のスペクトルと比較することによって前記核酸配列を定量化する段階をさらに含む、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
核酸配列中の単一ヌクレオチドを同定する方法であって、
ａ）請求項７記載のポリメラーゼ反応を実施する工程と、
ｂ）取り込まれたヌクレオシドを同定する工程と
を含む、方法。
【請求項１２】
前記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の１種以上が４個以上のリン酸基を含む、請求項７記載の核酸配列存在検出方法。
【請求項１３】
前記末端リン酸標識ヌクレオチドが次の式Ｉで表される、請求項７記載の方法。
【化２】
2006524040.tif 000002
式中、
Ｐ＝リン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、
Ｙは、酸素又はイオウ原子であり、
Ｂは、窒素含有複素環塩基であり、
Ｓは、非環式部分、環式炭素部分又は糖部分であり、
Ｐ−Ｌは、リン酸を除去すると独立して検出可能となるリン酸化標識であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、又はホスホルアミデート結合を形成するのに適した水酸基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能標識である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移の速度を高めて前記酵素の活性又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を検出する方法を提供し、前記方法は、マンガン塩を含む反応緩衝液中において末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からの前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移を実行させ、それによって、もし他の二価金属塩が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガンが存在していない状況下における反応速度を上回るように、反応速度を高めることを含む。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
用語「金属イオン緩衝剤」とは、Ｍｎ2+のような溶液中遊離金属イオンの濃度を制御する物質を意味する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
本発明は、酵素反応において末端リン酸標識ヌクレオチドとともにマンガン塩を使用し、たとえ他の金属塩が存在するにしてもマンガン不在下で観察される酵素による利用を上回るように酵素によるそれらの利用を高める方法を提供する。いくつかの酵素は、それらの活性のために二価金属イオンを補因子として使用することが公知である。多くの場合、これらの金属イオンは、他の金属イオンにより置換できるが、しかしこの置換の結果、酵素活性が低下することになる。本発明者らは、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸ではこれが真実ではなく、異なる金属イオンたとえばこの場合マンガンを添加すると、実際に、ヌクレオシド一リン酸転移を触媒する酵素によるそれらの利用速度が高まることを見出した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
したがって、本発明は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸からの酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移の速度を高めて前記酵素の活性又は前記末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を検出する方法を提供し、前記方法は、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸反応からのマンガン塩を含む反応緩衝液中における前記酵素触媒ヌクレオシド一リン酸転移を実行させ、それによって、もしたとえ他の二価金属塩が前記緩衝液中に存在しているにしてもマンガン不在下における前記反応速度を上回るように前記反応速度を高めることを含む。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する方法に関し、従来のアッセイを用いて、核酸ポリメラーゼ活性によりＲＮＡ又はＤＮＡ合成をモニタリングする。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３′水酸基へのヌクレオシド一リン酸の転移により、オリゴヌクレオチドを合成する。この反応を進める力となっているのは、無水物結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾がポリメラーゼ反応で機能するその能力を完全に破壊することはないという知見を利用している。前記のオリゴヌクレオチド合成反応では、ヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基においてのみの直接変化を伴い、末端リン酸位におけるヌクレオチドの修飾により核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重となっている。しかし、これらの末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸は、ポリメラーゼにとって非常に貧弱な基質である。本発明者らは、それらの基質性を、マンガン塩を添加することによって実質的に高めることができることを見出した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
本発明が提供する方法は、デオキシヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、環式炭素ヌクレオシドポリリン酸、又は電気化学的標識、質量タグ、又は比色色素、化学発光標識又は末端リン酸に結合した蛍光標識を有する非環式ヌクレオシドポリリン酸アナログが含まれる。核酸ポリメラーゼがこのアナログを基質として利用する時、酵素活性化可能な標識が、ホスホリル転移の無機ポリリン酸副産物上に存在するであろう。ホスホリル転移のポリリン酸産物をホスファターゼにより切断すると、それに結合した標識に検出可能な変化が生じる。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼが修飾された末端ホスホリル基を有するヌクレオチドを認識できる一方、本発明者らは、この出発物質がホスファターゼのテンプレートではないと決定したことに注意されたい。下記の図は、本発明の方法に最も関連する分子を示しており、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副産物及び酵素活性化標識を示している。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
本文に示した核酸配列存在を検出する方法の１態様において、前記工程は、ａ）Ｍｎ塩存在下で核酸ポリメラーゼ反応を起こさせ末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の利用速度を高めること、ここで、前記反応が末端リン酸標識ヌクレオチドを反応させること及び前記ポリメラーゼ反応の結果標識ポリリン酸が産生し、ｂ）前記標識ポリリン酸を前記リン酸エステルの加水分解に適したホスファターゼと反応させ、検出可能な種を産生させること、及びｃ）適切な手段により前記検出可能種の存在を検出することを含む。本態様において、核酸ポリメラーゼ反応に使用したテンプレート（「鋳型」ともいう。）は、ヘテロポリマー又はホモポリマーのテンプレートであることができる。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、本明細書全体において、成長するヌクレオチド鎖へのヌクレオシド一リン酸の取り込み後同時に放出された標識ポリリン酸が、それ自体として分離してもしなくても検出できるか、又はホスファターゼと反応させ検出可能な種を産生させることを意味する。他のヌクレオチドも本反応に含めることができ、それらは、実質的にホスファターゼに対して非反応性であり、例えば、検出可能種を生成しない部分により末端リン酸でブロックされたヌクレオチドがある。この特定の態様における検出のための核酸には、ＲＮＡ、天然又は合成オリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体ＤＮＡが含まれる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸を含む末端リン酸標識ヌクレオチドを含む態様において、ホスホリル転移の標識ポリリン酸副産物がホスファターゼ処理を行わずに検出できることも本発明の範囲内であることに注意されたい。たとえば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニンは、蛍光マーカークエンチングの原因となることが公知である。したがって、末端リン酸標識ヌクレオチドにおいて、前記標識は前記塩基によって部分的に消失することもある。前記ヌクレオシド一リン酸が取り込まれると、標識ポリリン酸副産物を、その蛍光増強により検出することもできる。これとは別に、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出により同定する前に、前記の標識ポリリン酸産物をクロマトグラフィで物理的に分離することも可能である。さらに、質量分析を用いて質量差により前記産物を検出することもできるであろう。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
別のアッセイ様式では、ポリメラーゼ反応を１種を超える末端リン酸標識ヌクレオチド存在下で実施できるが、このヌクレオチドのそれぞれは、独自に検出可能な種を産生可能である。たとえば、前記アッセイには、酵素的に無機ポリリン酸から放出されるとホスホリル転移の副産物が第１波長で光を放出する第１標識に結合した第１ヌクレオチド（例えばアデノシンポリリン酸）と第２波長で光を放出する第２標識に結合した第２ヌクレオチド（例えばグアノシンポリリン酸）が含まれる。望ましいのは、前記第１及び第２波長における発光が、実質的にほとんどあるいは全く重ならないことである。ヌクレオチド配列情報に基づく複数の同時アッセイがその後、前記ポリリン酸から放出された特定標識に基づいて誘導できることも、本発明の範囲内である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４６】
図１に示したように、ガンマ標識ｄｄＧＴＰを含む反応について、色素発光は、プライマー：テンプレート１によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、ｄＣであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル転移のピロリン酸生成物を切断すると、ＣＦ3−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー：テンプレート２では、得られなかった。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４９】
図２に示したように、ガンマ標識ｄｄＡＴＰを含む反応について、色素発光は、プライマー：テンプレート２によってのみ検出されたが、テンプレート中の次のヌクレオチドは、ｄＴであった。エビアルカリホスファターゼによりホスホリル転移のピロリン酸生成物を切断すると、ＣＮ−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸検出を可能とする。検出可能な色素発光は、プライマー：テンプレート１により得られなかった。