(57)【要約】  本発明は、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を使用する、認知障害などの脳障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、レヴィー小体型認知症などの認知障害を含む脳障害の治療的処置および／または診断のための方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、アルツハイマー病を含む認知障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から生体試料を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表７〜１２に列挙されるｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法。
【請求項２】
ｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、６つのｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００４５３６４、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２３、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９１、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２２、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９２、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー６」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルが、神経認知検査、神経イメージング法および／またはＣＳＦバイオマーカーなどの認知障害の検出にとって好適な別のバイオマーカーと組み合わせて検出される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
認知機能の喪失もしくは障害または認知症に罹患する対象における認知障害の発症または進行をモニタリングするための請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、ならびに
（ｄ）前記同定された認知障害に従って治療的処置を設計すること
を含む、前記方法。
【請求項６】
認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に罹患する対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症と関連する認知障害を診断すること、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた結果に、治療的処置を適合させること
を含む、前記方法。
【請求項７】
認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に罹患する対象に治療戦略を適合させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を診断またはモニタリングする工程、および
（ｂ）その結果として患者の治療戦略を改変する工程
を含む、前記方法。
【請求項８】
生体試料が、血液、血漿、血清、唾液、涙液、尿または脳脊髄液から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
認知障害もしくは任意の認知症型が診断される（健康な対照に対する差異）か、または特定の型の認知症が、限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型の軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ、レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ、パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ、血管性認知症、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む他の型の認知症に対して診断される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
限定されるものではないが、ＡＤを含む認知障害を診断および／またはモニタリングするためのキットであって、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定のための少なくとも１つの試薬を含む、キット。
【請求項１１】
少なくとも１つの試薬が、目的のｌｎｃＲＮＡと相補的な特異的オリゴヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
６８のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００５０５３９、ＴＣＯＮＳ＿０００６２５５５、ＴＣＯＮＳ＿０００２４９１６、ＴＣＯＮＳ＿０００５９１９８、ＴＣＯＮＳ＿０００６６４６２、ＴＣＯＮＳ＿０００３３６５３、ＬＩＮＣ−ＰＩＮＴ：１６、ｌｎｃ−ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１−１２：１、ｌｎｃ−ＧＡＢＢＲ１−１：２、ｌｎｃ−ＰＭＭ２−６：２、ＭＡＬＡＴ１：２３、ＭＡＬＡＴ１：４８、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：６、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：３、ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡに特異的な核酸を含む、次世代シーケンシングのための標的シーケンシングパネル。
【請求項１３】
軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、脳疾患、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）およびアルツハイマー病または別の認知障害の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡであって、処置が、対象に、脳および／または末梢中のｌｎｃＲＮＡの発現をモジュレートする（誘導する、または阻害する）有効量の医薬品を投与することを含み、ｌｎｃＲＮＡが、以下のｌｎｃＲＮＡシグナチャー：
（ｉ）２１のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００５０５３９、ＴＣＯＮＳ＿０００６２５５５、ＴＣＯＮＳ＿０００２４９１６、ＴＣＯＮＳ＿０００５９１９８、ＴＣＯＮＳ＿０００６６４６２、ＴＣＯＮＳ＿０００３３６５３、ＴＣＯＮＳ＿０００４０８７８、ＴＣＯＮＳ＿０００００６３４、ＴＣＯＮＳ＿０００５０１７８、ＴＣＯＮＳ＿０００５５４９６、ＴＣＯＮＳ＿０００３３７３６、ＴＣＯＮＳ＿０００２３３０９、ＴＣＯＮＳ＿０００２７７６５、ＴＣＯＮＳ＿０００６２６０２、ＴＣＯＮＳ＿００００５３２５、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９７４、ＴＣＯＮＳ＿０００２３２４０、ＴＣＯＮＳ＿０００２３４０１、ＴＣＯＮＳ＿０００６６３５８、ＴＣＯＮＳ＿０００６２３０６、ＴＣＯＮＳ＿０００２７４３８）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１２」）；
（ｉｉ）１０のｌｎｃＲＮＡ（ＬＩＮＣ−ＰＩＮＴ：１６、ｌｎｃ−ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１−１２：１、ｌｎｃ−ＧＡＢＢＲ１−１：２、ｌｎｃ−ＰＭＭ２−６：２、ＭＡＬＡＴ１：２３、ＭＡＬＡＴ１：４８、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：６、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：３、ＭＡＬＡＴ１：１１、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１３」）；
（ｉｉｉ）１７のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２２、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２３、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９４、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２１、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９０、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２４、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９１、ＴＣＯＮＳ＿０００１２０５９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９２、ＴＣＯＮＳ＿０００１２０６０、ＴＣＯＮＳ＿０００５００１４、ｌｎｃ−ＥＮＣ１−５：１、ｌｎｃ−ＳＮＡＰ２５−３：１、ｌｎｃ−ＨＭＧＡ１−２：４、ＰＥＧ３−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＵＮＣ８０−１：１）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１４」）；
（ｉｖ）１７のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＮＥＫ６−２：１、ｌｎｃ−ＰＭＭ２−６：４、ＵＧＤＨ−ＡＳ１：１０、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＥＩＦ１ＡＤ−１：１、ｌｎｃ−ＦＡＮＣＬ−４：１、ｌｎｃ−ＦＡＡＰ１００−２：１、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９７４、ｌｎｃ−ＦＥＭ１Ｂ−４：１、ｌｎｃ−ＧＮＡ１４−３：１、ｌｎｃ−ＰＩＮＫ１−２：１、ｌｎｃ−ＰＲＳＳ２７−４：２４、ｌｎｃ−ＳＬＣ２５Ａ３−７：１、ｌｎｃ−ＦＥＭ１Ｂ−４：１、ＮＯＲＡＤ：２、ＮＯＲＡＤ：８、ＣＡＣＴＩＮ−ＡＳ１：５）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４２」）の１つから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである、ｌｎｃＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，２１０号の利益および優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヒト医薬の分野、具体的には、脳障害、特に、軽度認知障害、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症および前頭側頭型認知症を伴うものを含む認知障害の診断および治療に関する。本発明は、血漿もしくは血液などの末梢循環体液中の長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）中に存在し、および／または脳組織および／もしくは全血中で発現され、脳障害のための治療標的である、認知障害などの脳障害のためのバイオマーカー、またはこのバイオマーカーを使用して、認知障害、特に、アルツハイマー病などの脳障害を診断するための、またはその発症もしくは進行をモニタリングするための非侵襲的方法に関する。本発明はさらに、このバイオマーカーおよび患者に由来する末梢体液または全血を使用する、診断目的のため、ならびに／または臨床試験における患者の階層化および／もしくは治療戦略の効能のモニタリングを含む、他のヒト医薬適用のための、関連するキット、方法、プロトコールおよび伝達可能な形態の情報に関する。本発明はさらに、脳疾患、特に、認知障害を有する患者において変化した、その処置のための診断または治療候補である脳特異的ｌｎｃＲＮＡにある。本発明はかくして、患者のクオリティオブライフに対する強い影響ならびに医療制度および経済に対する有意な影響を有するであろう。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の進行的喪失を特徴とする慢性神経変性疾患である。軽度認知障害（ＭＣＩ）が大きな最初の症状であり、軽度、中等度および重度ＡＤステージに進行的に進展する。早発型ＡＤは、３０代から６０代半ばの間に生じ、ＡＤを有する全ての人々の１０％未満であり、ＡＰＰまたはＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＡＤを有する多くの人々は、６０代半ば以降に症状が発生する遅発型を有する。遅発型ＡＤの原因は、未だ完全には理解されていないが、多くの実証された遺伝的危険因子は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子アレルε４である。早発の家族型であるにしろ、散在型であるにしろ、全てのＡＤ形態は、病理学的には２つの典型的な特質、アミロイド斑におけるアミロイドベータペプチド（Ａβ）（ＡＰＰ遺伝子によってコードされるＡＰＰタンパク質の代謝物）の細胞外沈着および脳中の神経原線維変化における高リン酸化タウタンパク質（ＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる）の細胞内沈着を特徴とし、進行性神経変性と関連する（Marcus et al. J Neurogenet. 2011; 25(4):127-33；Gotz et al, Br J Pharmacol. 2012; 165(5):1246-59）。
【０００４】
ＡＤは、最も一般的な形態の認知症である。現在、世界で約４６８０万人がＡＤまたは他の型の認知症と共に生きている。高齢者集団に関しては、この数は２０５０年までに１億３１５０万人に増加すると見積もられている（World Alzheimer Report, 2015）。そのため、ＡＤは、先進国と新興国との両方において、罹患した個人およびその家族ならびに医療および福祉財源上の経済的および社会的費用に対して、ますます重大な負担になっている。
【０００５】
レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）およびパーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）は、両方ともレヴィー小体型認知症と呼ばれるが、６５歳より上の患者において２番目に最も一般的な型の変性認知症であり、その脳病理学的特質は、神経喪失を伴う、α−シヌクレイン神経封入体（レヴィー小体およびレヴィーニューライト）である（Lancet. 2015 Oct 24;386(10004):1683-97）。３つの遺伝子、ＡＰＯＥ、ＳＮＣＡおよびＧＢＡにおける変異体は、レヴィー小体型認知症のリスクの増大と関連するとされているが、多くの場合、その原因は未知である。
【０００６】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、全年齢群において３番目に最も一般的な認知症であり、４５〜６４歳群においては１番目または２番目（ＡＤに次ぐ）に多い認知症である。最も一般的な形態は、行動障害型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＤ）として知られ、人格、行動、および判断力の変化を特徴とする（その初期段階において）。「前頭側頭型障害」の傘下にある他の障害としては、ピック病、原発性進行性失語症、原発性非能弁的失語症、意味認知症、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）症候群、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を伴うＦＴＤが挙げられる。
【０００７】
ＦＴＤスペクトラム障害の古典的な臨床表現型間には重複している臨床特徴があり、かくして、臨床診断像を複雑にしている。ＦＴＤスペクトラム障害はまた、タウタンパク質の神経封入およびアストロサイト封入、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）、ならびに稀に肉腫において融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）と共に、前頭側頭葉変性の知見と共通の基礎となる分子病理を共有する。ｂｖＦＴＤおよびＰＰＡ＿ｌａｎｇｕａｇｅ変異体は、タウ、ＴＤＰ−４３またはＦＵＳプロテイノパチーと関連し、ＰＳＰ症候群はタウプロテイノパチーと関連することが多い。ＣＢＤ症候群の病理は、ＣＢＤまたはＰＳＰの形態のタウオパチーを含むが、ベータ−アミロイドパチー／タウオパチー（ＡＤの典型）、プリオノパチー、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーおよびアルファ−シヌクレイノパチーも含む。ＦＴＤを有する４０％もの患者が、この疾患の家族歴を有する。全症例の１０％〜２０％が、３つの遺伝子：Ｃ９ｏｒｆ７２（Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質をコードする）、ＧＲＮ（プログラヌリンをコードする）およびＭＡＰＴ（タウをコードする）における、またはその近くでの突然変異に起因していた。より稀な他の原因となる遺伝子突然変異が、家族性ＦＴＤにおいて同定されている：ＴＤＰプロテイノパチーに起因するＦＴＤの症例については、ＶＣＰ、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＢＫ１およびＣＣＮＦ遺伝子、タウ陰性、ＴＤＰ陰性、ユビキチン陽性の病理に起因するＦＴＤの症例については、ＣＨＭＰ２ＢおよびＦＵＳ（Lancet. 2015 Oct 24;386(10004):1672-82；Desmarais P, et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2019;90:412-423）。
【０００８】
現在、ＡＤについても、他の非ＡＤ認知症型のいずれかについても治癒はない。これらの疾患については対症療法が存在し、全て、神経伝達物質の混乱を相殺しようとするものである。いくつかの新しい潜在的な疾患修飾治療剤候補が現在、ＡＤにおける臨床試験において試験されているが、まだ認可されたものはない。２００２年から２０１２年まで、対症療法剤（３６．６％）、疾患修飾低分子（３５．１％）および疾患修飾免疫療法（１８％）に関する２８９の第２相および第３相のＡＤ臨床試験の９９．６％が失敗した（Cummings et al., Expert Rev Clin Pharmacol. 2014;7(2):161-5）。ＡＤ薬開発のための成功率を改善するためにＡＤ分野の世界の専門家および製薬業界によって提唱された戦略は、ａ）神経変性が始まる前の疾患プロセスの早期に介入すること、ｂ）非侵襲的であり、対象集団の階層化および臨床試験における薬物効能の長期的モニタリングにとって好適な、早期診断のための正確なバイオマーカーを同定および開発することである。
【０００９】
ＡＤの病理学的特徴は、死後の組織病理学的分析において定義される。脳における両方の型の病変（アミロイド斑および神経原線維変化）の存在は依然として、ＡＤの確定診断にとって絶対に必要な特徴である。
【００１０】
この疾患の現在の診断は依然として不確実であり（Dubois et al Lancet Neurol. 2014;13(6):614-29）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用する構造イメージングおよび／またはフルオロデオキシグルコースＦ１８（１８Ｆ−ＦＤＧ）のポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用するグルコース代謝などの、臨床および神経心理検査と神経イメージングの総合的な組合せに基づくものであり、その精度は、方法および疾患の重症度段階に応じて７０％〜８５％未満である（Frisoni et al., Nat Rev Neurol. 2010; 6(2): 67-77； Tahmasian et al., J Nucl Med. 2016 ;57(3):410-5）。
【００１１】
時には、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＤ関連バイオマーカーＡβ４２およびタウまたはリン酸化タウの検出が追加的に実施される（Sunderland et al., JAMA. 2003;289(16):2094-2103）が、ＣＳＦ検査は、侵襲的な手順であり、対象の入院を必要とすることも多い腰椎穿刺を必要とし、したがって、小さい割合の対象および遅すぎる段階のＡＤにおいてのみ使用される。
【００１２】
ＡＤおよび軽度認知障害（ＭＣＩ；最初の捉えにくい症状が現れる間の初期段階と定義される）の前臨床段階の早期検出、かくして、ＭＣＩのＡＤへの転換のリスクの早期検出および算出への適用のためには、長期的な確認診断検査が必須である。その制限（侵襲性）のため、ＣＳＦ検査は、症状が出現する前の前臨床ＡＤ段階における早期診断のバイオマーカーとして日常的には使用されず、長期的臨床試験において動員される同じ対象においていくつかの時点で反復的に実行されるコンパニオンバイオマーカーとして好適でもない。
【００１３】
最近では、特に、ＦＤＡおよび／またはＥＭＡによって認可されているＦ−１８フロルベタピルおよびＦ−１８フルテメタモールを含むポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）神経イメージングのためのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アミロイド−ベータ（Ａβ）リガンドのための放射性リガンドを用いる、ＡＤ病理にとって適切である特異的な神経イメージング法が開発されている（Choi et al., 2009 and Wong et al., 2010）。しかしながら、それらの実務は高価であり、非常に限定的であり（大都市の一部の病院でのみ利用可能であり、健康保険によって払い戻されないため、依然として主に臨床研究のためのものである）、その診断精度は依然としてさらなる理解のために研究中である。かくして、これらのＡβＰＥＴ神経イメージング法の使用は、依然として非常に限定的であり、大多数の患者は、富裕国においてさえ、そのような検査から利益を得られない。
【００１４】
薬物開発試験のために含まれるＡＤ患者集団のより良好な定義が必要である：Ａβリガンドを使用するＰＥＴイメージングは、ＡＤと診断された対象の最大３０％が、陰性のＡβスキャンを示し、正常な認知状態を示す対象の最大３５％が陽性のＡβスキャンを示すことを示した（Gaeel Chetelat et al, NeuroImage Clinical 2013; 2:356-65）。かくして、ＰＥＴのＡβスキャンは、大きい製薬会社による一部の臨床試験において所望のコホート中の対象の動員を誘導するために使用されている。軽度から中等度のＡＤが混ざった患者において試験した抗Ａβ抗体、例えば、ソラネズマブは、明らかな効能を示すことができなかった。ＣＳＦバイオマーカープロファイルに基づいて選択された軽度ＡＤ患者では、その結果は、最初の有望な効能を示した（Carlson et al., Alzheimers Dement (Amst). 2016; 2:75-85； Siemers et al., Alzheimers Dement. 2016;12(2):110-20）。しかしながら、ＣＳＦバイオマーカーの使用は、侵襲的であり、薬物開発のためのバイオマーカーとしてのその使用を劇的に制限する。例えば、それは、疾患の安定性および／または進行をモニタリングするための反復的使用にとって好適ではなく、日常的な臨床実務使用における疾患修飾治療薬候補の効能または予防戦略を長期臨床試験においてモニタリングするのに好適でもない。
【００１５】
全体として、現行の検査は、大きいＡＤ集団の診断のための使用のためのアクセシビリティの容易性（easy accessibility）および単純性を欠く、ならびに／または精度（感度および特異度）を欠く。これは、ＡＤのための信頼でき、迅速な診断検査を開発するための大きな障害およびボトルネックである。別の障害は、脊椎穿刺などの侵襲的な試料収集を必要としないバイオマーカーの同定である。細胞、動物モデル、前臨床モデル、およびヒト試験によって検証することができるそのような利用しやすい、高感度かつ特異的なバイオマーカーの欠如は、ＡＤのため、またはＡＤを誘発する、もしくはＡＤの進行に関与する病理学的プロセスに関する研究のための療法および薬物の開発を妨げる。
【００１６】
今日、効率的な予防的または疾患修飾性治療的処置、ならびに前臨床および初期ＭＣＩを含むＡＤの早期診断のため、および薬物開発における適用（臨床試験における患者の階層化および薬物効能の反復的モニタリング）のため、および認可されたら、新しい将来の療法の効能をモニタリングし、その投与量を調整するための正確で非侵襲的な末梢バイオマーカー検査に対する満たされない高い医学的要求が明らかに存在する。
【００１７】
同様に、ＤＬＢを含む非ＡＤ型認知症および多くのＦＴＤ関連神経変性障害については、効率的な予防的または疾患修飾性治療的処置に対する、ならびに特に、その初期型の診断のための正確で非侵襲的な末梢バイオマーカー検査に対する、満たされない高い医学的要求が存在する。
【００１８】
ｌｎｃＲＮＡは、典型的には、２００ヌクレオチドより長い転写物と定義され、ＲＮＡファミリーの中でも、ｌｎｃＲＮＡは最も組織特異的に発現されると考えられる。脳内では、ｌｎｃＲＮＡは、神経伝達およびシナプス可塑性を含む多様な機能を有するタンパク質のエピジェネティックな、転写および転写後レベルで遺伝子発現を調節することができる。最近の研究により、ＡＤの死後脳組織中でいくつかのｌｎｃＲＮＡ候補が同定された；一部のｌｎｃＲＮＡ候補は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験または動物モデルにおいて、神経毒性Ａβの形成、シナプス活性または神経ＤＮＡ修復を直接または間接に調節することが示された（概説については、Luo K and Chen Y, Clin Interv Aging 2016; 11: 867-872）。
【００１９】
本発明者らは、心臓組織または脳組織などの組織中で発現された、または高度に富化されたｌｎｃＲＮＡを、末梢循環中に放出させることができ、それらを様々な末梢試料中で古典的なＲＴ−ＰＣＲによって容易に定量できることを以前に示した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６５４９２）。ＲＴ−ＰＣＲに加えて、本発明者らは、末梢試料上で全ＲＮＡシーケンシングも実施し、血清、血漿およびＰａｘｇｅｎｅ−ＲＮＡチューブに収集された全血などの末梢試料中で有意な割合のｌｎｃＲＮＡを定量した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６５４９２）。
【００２０】
本発明に従って、脳疾患、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）およびアルツハイマー病または別の認知障害に特異的な新しいｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、最新技術と、Ｐａｘｇｅｎｅ全血チューブ、血清および血漿を含む、非侵襲的様式で収集された試料とを組み合わせる方法設定を使用して同定された。
【発明の概要】
【００２１】
本発明では、ヒト死後脳組織、特に、ＡＤ患者の側頭葉内側部および認知的にインタクトな健康な対照において、１０９１の新規脳ｌｎｃＲＮＡが初めて配列決定および同定された。健康な対照の脳と比較した場合に、ＡＤ患者の脳において示差的発現を示す新規脳ｌｎｃＲＮＡを含む脳ｌｎｃＲＮＡが同定された。さらに、既に配列決定されたもの、および新しく配列決定されたものを含む新しいｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、健康な対照と比較した場合に、Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ中に収集された全血およびＭＣＩ、ＡＤ、ＤＬＢまたはＦＴＤに罹患する患者の血液に由来する血漿を含む、非侵襲的な様式で収集された試料中で、ならびに試験した他の認知症型と比較した場合に、ＭＣＩおよび／または１つの認知症型（ＡＤもしくはＤＬＢもしくはＦＴＤ）を特異的に検出するパネル中で、示差的に発現されると同定された。さらに、新規な脳で富化されたｌｎｃＲＮＡを含む、脳で富化されたｌｎｃＲＮＡが同定された。これらの脳で富化されたｌｎｃＲＮＡは、末梢体液血漿および全血Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料中で検出可能な循環ｌｎｃＲＮＡを含む。
【００２２】
ある態様では、ＡＤ脳中での発現が欠損していると同定された新規ｌｎｃＲＮＡを含むｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡ分子増強治療手法としての開発のための新規治療候補であり、ＡＤ脳中で過剰発現されていると同定された新規脳ｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡ分子サイレンシング治療手法としての開発のための新規治療候補であり、両方とも脳障害、特に、アルツハイマー病および他の認知障害の処置のためのものである。
【００２３】
別の態様では、認知障害に罹患している患者において示差的に発現されると同定された、血漿および全血ｌｎｃＲＮＡパネルは、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢおよび／または別の認知障害もしくは認知症型を発症するリスクがある対象における、脳障害、特に、認知障害の予測および／または診断および／または鑑別診断のための潜在的な治療標的および／またはバイオマーカーである。
【００２４】
別の態様では、同定された脳で富化されたｌｎｃＲＮＡパネルは、限定されるものではないが、ＭＣＩ、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢなどの認知障害を含む脳障害のための治療および診断標的である。
【００２５】
新規ｌｎｃＲＮＡ、本発明者らがＢｒａｉｎＬｉｎｃと呼ぶ新しく同定された脳で富化されたｌｎｃＲＮＡパネル、脳および血漿（または脳および血液）に共通の同定されたｌｎｃＲＮＡを含む末梢体液中で示差的に発現されると同定された新しいｌｎｃＲＮＡパネルを、他の現存する技術を使用しては実現されなかったであろう、有意により高い感度、精密度および／または精度を示す革新的なＣｅｌｅｍｉｃｓの技術を使用して、患者の末梢試料中で定量することができる。Ｃｅｌｅｍｉｃｓによる多数のｌｎｃＲＮＡ標的のモニタリングならびにｑＰＣＲおよびＱｕａｎｔａｍａｔｒｉｘによる少数のｌｎｃＲＮＡの定量は、ＮＧＳおよびＨＴＧなどの他の現行の方法よりも好ましい方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、初期から中等度のアルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者および年齢を一致させた健康な対照に由来するヒト血清試料上でのｌｎｃＲＮＡ候補であるｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５およびｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１の発現レベルを示す。Ｙ軸：ＣＰＭ（１００万あたりのカウント数）で表した、ｌｎｃＲＮＡの濃度の平均＋／−平均の標準誤差。Ｘ軸：ＡＤ：アルツハイマー患者群、ＨＶ：健康な対照群。
【図２】図２は、比較のＶｏｌｃａｎｏプロットを示す。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、ＡＤ群対ＨＶ（健康な対照）群において示差的に発現される血清中の１００８のｌｎｃＲＮＡを示し、統計的有意性（ｐ＜０．０５）を線の上に示す。３３のｌｎｃＲＮＡは、０．０５未満のｐ値と、２以上または０．５以下の倍率変化との両方を示す。示差的に発現されるが、統計的有意性に達しないｌｎｃＲＮＡは、線の下に示される。
【図３】図３は、１９８６７のｌｎｃＲＮＡから選択された、上から１３位までの血清ｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図４】図４は、０．０５未満のｐ値および２以上もしくは０．５以下の倍率変化または０．８５以上もしくは０．１５以下のＡＵＣを示す９０のｌｎｃＲＮＡのうちの上から７位までの血清ｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図５】図５は、０．０５未満のｐ値および１．６以上もしくは０．６以下の倍率変化および０．８５以上もしくは０．１５以下のＡＵＣを示す９０のｌｎｃＲＮＡから選択された、上から１２位までの血清ｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図６】図６は、実施した７つの神経心理学的検査のうち、０．０５未満のｐ値ならびにＭＭＳＥおよび／またはＭｏＣＡを含む神経認知検査のスコアとの良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ）を示すｌｎｃＲＮＡから選択された、上から３位までの血清ｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図７】図７は、測定された１２０を超える構造のうち、０．０５未満のｐ値および神経イメージングスコア（側頭葉内側部領域、左および右海馬、左および右扁桃体、内嗅皮質などの認知および記憶にとって関連がある脳構造の体積）との良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ）を示す血清ｌｎｃＲＮＡから選択された、上から７位までのｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図８】図８は、０．０５未満のｐ値ならびにＣＳＦバイオマーカーＡβ４２およびタウ（総タウまたはリン酸化タウ）との良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ）を示すｌｎｃＲＮＡから選択された、上から１８位までの血清ｌｎｃＲＮＡ候補のシグナチャーの同定を可能にするランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングを示す。
【図９】図９は、血清ｌｎｃＲＮＡのレベルと、側頭葉内側部領域および海馬などの認知に関与する脳構造の体積測定神経イメージングスコアとの相関に関する結果の例を示す。
【図１０】図１０は、血清ｌｎｃＲＮＡと、ＣＳＦバイオマーカーＡβ４２またはタウとの相関に関する結果の例を示す。
【図１１】図１１は、脳および血漿ｌｎｃＲＮＡを同定するスキームを示す。
【図１２】図１２は、脳および血液（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ）ｌｎｃＲＮＡを同定するスキームを示す。
【図１３】図１３は、６人のアルツハイマー病患者と６人の健康な対照の対象（ＨＣ）とを比較する場合に、得られた血漿ｌｎｃＲＮＡのＶｏｌｃａｎｏプロットおよび血漿ｌｎｃＲＮＡ  ＬＲＲＣ１０−１：１のボックスプロットおよびそのＡＵＣ＝１を示すそのＲＯＣ曲線を示す。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、示差的に発現されるｌｎｃＲＮＡを示し、統計的有意性（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を線の上に示す。示差的に発現されるが、統計的有意性に達しなかったｌｎｃＲＮＡは、線の下に示される。
【図１４】図１４は、６人の健康な対照の対象と比較して６人のアルツハイマー病患者の血漿において循環血漿ｌｎｃＲＮＡとして、および示差的に発現される候補としても同定される、５人の健康な対照の対象の脳と比較して、５人のアルツハイマー病患者の脳において示差的に発現される３つの脳ｌｎｃＲＮＡの例を示す。
【図１５】図１５は、２つの全血ｌｎｃＲＮＡのボックスプロットを示す：ＭＣＩ群および認知症群（ＡＤ、ＤＬＢ、ＦＴＤ）において、健康な対照群と比較した場合、一方は過剰発現され、他方は過少発現される。
【図１６】図１６は、健康な対照群と比較して少なくとも１つの患者群において示差的に発現される２つの全血ｌｎｃＲＮＡのボックスプロットを示す。ｌｎｃＲＮＡ  ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３は、健康な対照と比較して全てのＭＣＩ患者において発現の減少を示す。ｌｎｃＲＮＡ  ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２は、ＭＣＩを有する多くの患者およびＡＤ患者において発現の増加を示す。
【図１７】図１７は、ＨＣ群と、他の全ての群とを識別する全血ｌｎｃＲＮＡのパネルの例を示し、その精度は９３．４％である。
【図１８】図１８は、選択されたｌｎｃＲＮＡを正確に定量するより良好な効率を示す標的シーケンシング手法を示す。例として、ＦＩＭＩＣＳの使用は、目的の配列の６０倍の富化を示し、分析がより困難な結果を与える全体的なシーケンシングにおける全配列の１％未満を占める。正規のＲＮＡ−Ｓｅｑ実験よりも高い精密度を可能にする１００倍のカバレッジを達成するのに必要なリードは、わずか８００万であった。
【図１９】図１９は、ＡＤおよび／または非ＡＤヒト対象の脳（カラム１、２）中で発現されるが、検査した臓器（カラム２〜１３）中では発現されないか、または弱く発現される多くの同定された脳で富化されたｌｎｃＲＮＡを示すヒートマップを示す。興味深いことに、これらの脳で富化されたｌｎｃＲＮＡのうち、一部は血漿中で発現されるように循環している脳で富化されたｌｎｃＲＮＡである。１：ＡＤ脳；２：非ＡＤ脳；３：肺；４：卵巣；５：結腸；６：前立腺；７：乳房；８：肝臓；９：膀胱；１０：腎臓；１１：皮膚；１２：心臓；１３：筋肉；１４：血漿。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示で開示される、本発明で初めて同定された１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡを含むｌｎｃＲＮＡは、限定されるものではないが、神経変性疾患、特に、アルツハイマー病および認知障害、抑鬱および不安などの神経精神障害、自閉症、多発性硬化症などの神経障害、運動ニューロン障害、脳卒中などの原発性および続発性脳障害の発症に関与するか、または全身障害、神経系を間接的に含む心血管代謝障害に関与してもよい。かくして、発現が変化したこれらのｌｎｃＲＮＡは、治療および診断適用のための新規標的である。ＡＤ脳において発現が変化していると同定された新規脳ｌｎｃＲＮＡは、脳障害、特に、アルツハイマー病および他の認知障害の処置のためのｌｎｃＲＮＡ分子サイレンシング治療手法としての開発のための新規治療候補であってもよい。
【００２８】
さらに、薬物候補または他の医薬品は、自閉症または他の症候群などの脳毒性を誘導し得る。本発明において同定されたｌｎｃＲＮＡを使用して、その毒性または効能を診断、予測またはモニタリングすることができる。
【００２９】
一態様では、本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、脳疾患、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）およびアルツハイマー病または別の認知障害の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡに関し、処置は、対象に、脳および／または末梢でのｌｎｃＲＮＡの発現をモジュレートする（誘導する、または阻害する）有効量の医薬品を投与することを含む。医薬品は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、組換えタンパク質、限定されるものではないが、ＡＶまたはＡＡＶ組換えベクターなどの組換えベクターにより駆動される治療剤、他のＲＮＡ関連治療手段を含む、低分子化学物質または生物学的医薬化合物などの特異的に設計された分子であってもよい。一部の実施形態では、医薬品は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に対象に投与される。一部の実施形態では、医薬品は、経口、静脈内または皮下または大脳内処置として対象に１回または反復的に投与される。
【００３０】
一部の実施形態では、脳疾患の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡは、本発明において初めて同定された少なくとも１つの新規ｌｎｃＲＮＡである（表７に列挙される１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡ）。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、９２２のｌｎｃＲＮＡ（表７に列挙される０．９未満の倍率変化を示す４３０のｌｎｃＲＮＡおよび１．１を超える倍率変化を示す４９２のｌｎｃＲＮＡ）から選択される少なくとも１つの新規ｌｎｃＲＮＡである。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、本開示において「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１２」と称される、下記群から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。
【００３１】
【表１】
2022501016.tif 000002
【００３２】
一部の実施形態では、脳疾患の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡは、脳において配列決定され、健康な対照の脳と比較して、アルツハイマー病または認知症の脳において示差的に欠損するか、または過剰発現されることが本発明によって同定される少なくとも１つのＬＩＮＣｉｐｅｄｉａに基づくｌｎｃＲＮＡである。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、表８に列挙される、ＡＤ脳における発現レベルが低下した６８１のｌｎｃＲＮＡおよびＡＤ脳において過剰発現される５２１のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、本開示において「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１３」と称される、下記群から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。
【００３３】
【表２】
2022501016.tif 000003
【００３４】
別の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、本開示において「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４２」と称される、下記群から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。
【００３５】
【表３】
2022501016.tif 000004
【００３６】
一部の実施形態では、脳疾患の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡは、脳において検出可能であるが、末梢臓器生検：肺、卵巣、結腸、前立腺、乳房、肝臓、膀胱、腎臓、皮膚、心臓、筋肉においては発現されないか、または少なくとも２倍少なく発現されると同定された少なくとも１つの脳で富化されたｌｎｃＲＮＡである。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、表１２に列挙される８６０のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、本開示において「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１４」と称される、下記群から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。
【００３７】
【表４】
2022501016.tif 000005
【００３８】
一部の実施形態では、脳疾患の処置における使用のためのｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡである。ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２は、本開示の以下で定義される。
【００３９】
ある態様では、本発明は、脳疾患、特に、軽度認知障害（ＭＣＩ）およびアルツハイマー病もしくは別の認知障害の診断における使用のための、または脳障害型、特に、限定されるものではないが、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症および前頭側頭型認知症を含む認知症型の診断および鑑別診断のためのｌｎｃＲＮＡシグナチャーに関する。健康な対照と比較した場合に、Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ中に収集された全血およびＭＣＩ、ＡＤ、ＤＬＢおよび／またはＦＴＤに罹患する患者の血液に由来する血漿を含む、非侵襲的な様式で収集された試料中で、ならびに試験した他の認知症型と比較した場合に、ＭＣＩおよび１つの認知症型（ＡＤもしくはＤＬＢもしくはＦＴＤ）を特異的に検出するパネル中で、示差的に発現される、既に配列決定されたｌｎｃＲＮＡおよび新しく配列決定されたｌｎｃＲＮＡを含むｌｎｃＲＮＡシグナチャーを使用することができる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、下記群から選択される。
【００４０】
【表５−１】
2022501016.tif 000006
【表５−２】
2022501016.tif 000007
【表５−３】
2022501016.tif 000008
【００４１】
上記の４２のｌｎｃＲＮＡシグナチャーを、本開示に開示される全ての方法または使用において使用することができる。
【００４２】
ある態様では、本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症および／またはレヴィー小体型認知症などの認知障害を含む、脳障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から生体試料を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表７〜１２に列挙されるｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血清または血漿である。
【００４４】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー６＋表９と表１２の両方に列挙される８つのｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡまたは表１０もしくは表１１と表１２の両方に列挙される５５のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４１」）を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、血漿中に循環する新規の脳で富化されたｌｎｃＲＮＡを含む血漿試料で循環する脳で富化されたｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、６つのｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００４５３６４、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２３、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９１、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０２２、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９２、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー６」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー６であるか、またはそれを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含む、またはそれからなる（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４０」）。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２であるか、またはそれを含む。
【００４６】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーであるか、またはそれを含む。
【００４７】
ある態様では、本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症および／またはレヴィー小体型認知症などの認知障害を含む、脳障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から、血漿である生体試料を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー３８」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００４８】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。
【００４９】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、６つのｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５）「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー３」から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー３であるか、またはそれを含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、１１のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９）「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４」から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４であるか、またはそれを含む。
【００５１】
ある態様では、本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症および／またはレヴィー小体型認知症などの認知障害を含む、脳障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から、全血である生体試料を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー３９」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００５２】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、４３のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー５」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー５であるか、またはそれを含む。
【００５４】
ある態様では、本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するか、または発症するリスクがある対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症および／またはレヴィー小体型認知症などの認知障害を含む、脳障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から、２つ以上の生体試料（血漿と全血との両方など）を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４０」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００５５】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。一部の実施形態では、２つ以上の生体試料は、血漿および全血である。
【００５６】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２であるか、またはそれを含む。
【００５７】
ある態様では、本発明はまた、診断しようとする認知機能の喪失もしくは障害または認知症の亜型などの脳障害に罹患している対象における、限定されるものではないが、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症および前頭側頭型認知症を含む脳障害型、特に、認知症型の診断および鑑別診断のための方法であって、
（ａ）対象から、２つ以上の生体試料（血漿と全血との両方など）を単離すること；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４０」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較すること
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００５８】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。一部の実施形態では、生体試料は、血漿または全血である。
【００５９】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２であるか、またはそれを含む。
【００６０】
ある態様では、本発明は、認知機能の喪失もしくは障害または認知症などの脳障害に罹患している対象における、限定されるものではないが、軽度認知障害、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症、前頭側頭型認知症などの認知障害を含む脳障害の発症または進行をモニタリングするための方法であって、下記工程：
（ａ）対象から生体試料を単離する工程；
（ｂ）前記対象に由来する生体試料中で、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４０」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出する工程；
（ｃ）試料中でのｌｎｃＲＮＡの発現レベルと、参照中での発現レベルとを比較する工程
を含み、
参照中でのレベルと比較した試料中での発現レベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法に関する。
【００６１】
一部の実施形態では、方法は、工程（ｃ）の後に、認知障害などの前記同定された脳障害に従う治療的処置を設計する工程をさらに含む。一部の実施形態では、生体試料は、血漿または全血である。
【００６２】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２であるか、またはそれを含む。
【００６３】
生体試料は、体液、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液もしくは脳脊髄液または臓器組織から得られた対象の小部分であってもよい。好適には、生体試料は、血漿または血清または全血（Ｐａｘｇｅｎｅ−ＲＮＡチューブ）である。
【００６４】
脳障害とは、例えば、認知症型、神経変性疾患、神経もしくは神経精神障害などの認知障害または脳疾患一覧の下記例に由来する脳を含む全身障害を意味する。
【００６５】
認知症の型および亜型は、数多くあり、例えば、
アルツハイマー病（ＡＤ）およびＡＤ型のＭＣＩ
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ
進行性核上麻痺（ＰＳＰ）
大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）
レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ
パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ
血管性認知症および関連ＭＣＩ
脳卒中関連ＭＣＩおよび認知症
他の認知症型、が挙げられる。
【００６６】
認知障害を伴う神経変性障害ならびに神経および神経精神障害は、疾患進行の初期に、またはより後の段階で生じることが多い：
パーキンソン病
ハンチントン病
自閉症
筋萎縮性側索硬化症
運動ニューロン疾患
多発性硬化症
ニューロパチー
大鬱病性障害
不安。
【００６７】
脳障害を伴う全身障害ならびに糖尿病などの代謝障害、卒中などの心血管障害、自己免疫および炎症障害を含む、脳認知障害などの脳の健康に対する負の影響。
【００６８】
認知障害または認知症を含む脳障害の診断について：
「参照」は、例えば、脳障害または認知障害の症状および異常な神経イメージング知見を有しない、および本発明の方法を用いて診断しようとする患者と年齢が一致している、正常で健康な対象に由来する試料などの、好適な対照試料であってもよい。参照は、障害もしくは疾患症状の証明の前または脳障害または認知機能もしくは認知症の障害もしくは喪失の診断の前の同じ対象に由来する試料であってもよい。参照は、標準化された試料、例えば、脳障害または認知障害の症状および異常な神経イメージング知見を有しない健康な対象のいくつかの試料に由来する材料またはデータを含む試料であってもよい。
【００６９】
特定の認知症型またはその軽度認知障害（ＭＣＩ）と他の認知症型およびそのＭＣＩの治療、診断または鑑別診断について：
脳障害および亜型は数多く、認知症の型および亜型を示す認知障害を含む：
【００７０】
認知症の型および亜型は、数多くあり、例えば、
アルツハイマー病（ＡＤ）およびＡＤ型のＭＣＩ
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ
進行性核上麻痺（ＰＳＰ）
大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）
レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ
パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ
血管性認知症および関連ＭＣＩ
脳卒中関連ＭＣＩおよび認知症
他の認知症型、が挙げられる。
【００７１】
認知障害を伴う神経変性障害ならびに神経および神経精神障害は、疾患進行の初期に、またはより後の段階で生じることが多い：
パーキンソン病
ハンチントン病
筋萎縮性側索硬化症
自閉症多発性硬化症
運動ニューロン疾患
ニューロパチー
大鬱病性障害
不安。
【００７２】
脳障害を伴う全身障害ならびに糖尿病などの代謝障害、卒中などの心血管障害、自己免疫および炎症障害を含む、脳認知障害などの脳の健康に対する負の影響。
【００７３】
１つの脳障害の鑑別診断については、参照試料は、同じクラスの障害の別の脳障害に罹患する患者に由来する試料（例えば、認知症亜型の鑑別診断については、参照試料は、他の型の認知症に罹患する患者に由来する試料であってもよい）、および／または別の疾患に罹患してもよいが、標的脳障害と類似する症状は有しない対象に由来する試料上で得られた参照値（例えば、認知症の鑑別診断については、参照試料は認知障害または認知症を有しない患者に由来してもよい）であってもよい。
【００７４】
本発明はまた、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に罹患している対象において、限定されるものではないが、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、レヴィー小体型認知症などの認知障害を含む脳障害を診断し、その発症または進行をモニタリングする方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記対象の生体試料を使用して認知障害などの脳障害の存在を決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させる工程
を含む、方法に関する。
【００７５】
本発明はまた、臨床症状を検出するための利用可能な方法（ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡおよび認知障害に関する他の神経認知検査）を使用する場合に、見かけの、および／または測定可能な症状を示さないが、症状に先行して本発明のバイオマーカーの異常な変化を示す対象において、限定されるものではないが、初期のＭＣＩおよび非常に軽度なアルツハイマー病などの認知障害を含む脳障害を診断する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記対象の生体試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させる工程
を含む、方法に関する。
【００７６】
本発明はまた、限定されるものではないが、ＡｐｏＥ遺伝子アレル、心血管、代謝、炎症バイオマーカーを含む遺伝子型などの、危険因子と共に、本発明のバイオマーカーを測定することによって、対象における、限定されるものではないが、初期ＭＣＩおよび非常に軽度のアルツハイマー病などの認知障害を含む脳障害の将来改善される診断方法であって、
（ａ）上記の危険因子の１つと共に本発明による方法を使用して前記対象の生体試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させること
を含む、方法に関する。
【００７７】
本発明はさらに、ＭＲＩおよび／またはＣＴスキャンとしての神経イメージング方法によって、見かけ上の、および／または測定可能な異常を示さない対象における、限定されるものではないが、初期ＭＣＩおよび初期段階のアルツハイマー病または前頭側頭型認知症またはレヴィー小体型認知症などの認知障害を含む脳障害を予測診断する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記対象の生体試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させる工程
を含む、方法に関する。
【００７８】
本発明はさらに、限定されるものではないが、アミロイドまたはタウまたはドーパミン作動性もしくはシヌクレイン作動性ＰＥＴスキャンなどの、分子神経イメージング方法によって、見かけ上の、および／または測定可能な異常を示さない対象における、限定されるものではないが、初期ＭＣＩおよび初期段階のアルツハイマー病または前頭側頭型認知症またはレヴィー小体型認知症を含む認知障害を予測診断する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記対象の生体試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させる工程
を含む、方法に関する。
【００７９】
本発明はさらに、分子神経イメージング方法を含む神経イメージング方法と共に、本発明のバイオマーカーの組合せを使用して、対象における、限定されるものではないが、初期ＭＣＩおよび初期段階のアルツハイマー病または前頭側頭型認知症またはレヴィー小体型認知症を含む認知障害を診断する、または鑑別診断する、またはモニタリングする方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記対象の生体試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に応じて治療的処置を適合させる工程
を含む、方法に関する。
【００８０】
本発明はまた、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に罹患する対象を処置するための方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して、前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症と関連する認知障害を診断すること、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた結果に、治療的処置を適合させること
を含む、方法に関する。
【００８１】
認知障害の治療的処置の例は、
−脳障害の処置のために既に認可されている薬物
・例えば、コリンエステラーゼ阻害剤、ドネペジル、リバスチグミンもしくはガランタミン、またはＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、メマンチン、または例えば、ドネペジルとメマンチンとの組合せのうち、アルツハイマー病の処置のために既に認可された薬物、および／または
−臨床開発中の治療候補もしくは組合せ
・例えば、抗アミロイド分野でアルツハイマー病患者において現在試験されているもの、例えば、ベータセクレターゼ阻害剤および抗ベータアミロイドモノクローナル抗体、および抗タウ手法、または抗タウ分野で現在試験されているもの、例えば、タウリン酸化状態を調節するキナーゼもしくはホスファターゼのモジュレーターおよび抗タウ抗体、神経変性、酸化的ストレス、オートファジー、ミトコンドリア機能障害および免疫−炎症の分子経路をモジュレートする薬物および薬物候補、および／または
−本発明から誘導される新規治療手法
の投与を含んでもよい。
【００８２】
ある態様では、本発明はまた、表９に列挙される４１０のｌｎｃＲＮＡ、表１０に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび表１１に列挙される１３６のｌｎｃＲＮＡ（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー４０」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定のための少なくとも１つの試薬を含む、限定されるものではないが、ＭＣＩ、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢなどの認知障害を含む脳障害を診断および／またはモニタリングするためのキットも提供する。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルは、５４のｌｎｃＲＮＡ（ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー２であるか、またはそれを含む。
【００８３】
本発明のキットは、本発明のｌｎｃＲＮＡシグナチャーの測定の実施を可能にし、キットは、上に示されたｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを測定するための少なくとも１つの試薬を含む。
【００８４】
「試薬」とはまた、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定を具体的に可能にする試薬、すなわち、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡの発現レベルの特異的決定について具体的に意図される試薬も意味する。例としては、例えば、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡに特異的な増幅プライマー対（フォワードおよびリワード（ｒｅｗａｒｄ））および／またはプローブが挙げられる。この定義は、他の任意のｌｎｃＲＮＡの発現レベルの決定のために使用される一般的な試薬を含まない。
【００８５】
一部の実施形態では、限定されるものではないが、ＭＣＩ、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢなどの認知障害を含む脳障害を診断および／またはモニタリングするためのキットは、目的のｌｎｃＲＮＡに特異的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブと、プローブ−標的核酸複合体を精製するための試薬とを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、目的のｌｎｃＲＮＡの領域と相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、ＤＮＡである。ｌｎｃＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブの長さは、３０〜８０ヌクレオチド、例えば、４０〜７０、４０〜６０、または約５０ヌクレオチドであってもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチン化されており、プローブ−標的複合体を精製するための試薬は、ストレプトアビジン被覆基質、例えば、ストレプトアビジン被覆磁気粒子、例えば、Ｔ１ストレプトアビジン被覆磁気ビーズである。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態は、６８のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００５０５３９、ＴＣＯＮＳ＿０００６２５５５、ＴＣＯＮＳ＿０００２４９１６、ＴＣＯＮＳ＿０００５９１９８、ＴＣＯＮＳ＿０００６６４６２、ＴＣＯＮＳ＿０００３３６５３、ＬＩＮＣ−ＰＩＮＴ：１６、ｌｎｃ−ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１−１２：１、ｌｎｃ−ＧＡＢＢＲ１−１：２、ｌｎｃ−ＰＭＭ２−６：２、ＭＡＬＡＴ１：２３、ＭＡＬＡＴ１：４８、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：６、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：３、ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）（「ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１」）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡに特異的な核酸を含む、次世代シーケンシングのための標的シーケンシングパネルに関する。一部の実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーから選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーを含むか、またはそれからなる。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１であるか、またはそれを含む。
【００８７】
本発明はまた、限定されるものではないが、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症、前頭側頭型認知症などの認知障害を含む脳障害の処置のための臨床試験において試験される新しい治療戦略（薬物候補）の開発のための方法であって、（ａ）後に臨床試験に動員されるであろう、かくして、試験が、この試験される新しい薬物候補から利益を得ない患者亜集団患者の動員を回避しながら、試験される治療戦略から利益を得る患者集団を処置するための可能性を増強するであろう、患者の選択のための処置を開始する前に、および／または（ｂ）新しい試験される薬物候補を用いた処置が始まったら、試験される治療戦略の効能を含む応答をモニタリングするために、使用することができる、方法の適用にも関する。
【００８８】
さらなる態様では、本発明はまた、検出の方法に関する。例えば、本発明は、１つまたは複数のｌｎｃＲＮＡの検出のための方法を企図する。一態様では、方法は、
（ａ）対象から生体試料を単離すること；
（ｂ）６８のｌｎｃＲＮＡ（ＴＣＯＮＳ＿０００５０５３９、ＴＣＯＮＳ＿０００６２５５５、ＴＣＯＮＳ＿０００２４９１６、ＴＣＯＮＳ＿０００５９１９８、ＴＣＯＮＳ＿０００６６４６２、ＴＣＯＮＳ＿０００３３６５３、ＬＩＮＣ−ＰＩＮＴ：１６、ｌｎｃ−ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１−１２：１、ｌｎｃ−ＧＡＢＢＲ１−１：２、ｌｎｃ−ＰＭＭ２−６：２、ＭＡＬＡＴ１：２３、ＭＡＬＡＴ１：４８、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：６、ｌｎｃ−ＬＴＢＰ３−２：３、ｌｎｃ−ＡＮＡＰＣ１１−２：８、ｌｎｃ−ＣＬＬＵ１−２：６、ｌｎｃ−ＫＬＨＬ３６−２：２、ｌｎｃ−ＬＲＲＣ１０−１：１、ｌｎｃ−ＲＭＤＮ２−３：２４、ｌｎｃ−ＳＭＮ２−４：２、ｌｎｃ−ＳＰＲＹＤ３−１：１７、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ｌｎｃ−ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１：５、ＴＣＯＮＳ＿０００１９７９８、ＴＳＰＯＡＰ１−ＡＳ１：３９、ＴＣＯＮＳ＿０００３５０９３、ｌｎｃ−ＯＣＭ−３：４、ｌｎｃ−ＫＩＦ１４−１：２、ＰＣＢＰ１−ＡＳ１：３０２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：１、ＮＥＡＴ１：２２、ｌｎｃ−ＣＡ６−８：２、ＳＴＡＲＤ７−ＡＳ１：５、ｌｎｃ−ＩＬ３１ＲＡ−１：１、ｌｎｃ−ＡＮＫＲＤ３６−１：４、ｌｎｃ−ＡＴＰ６ＡＰ２−１３：１、ｌｎｃ−ＳＯＣＳ６−１０：１、ｌｎｃ−ＣＤＩＰＴ−２：１、ｌｎｃ−ＵＳＰ４７−２：１、ＲＢＭ２６−ＡＳ１：１、ＭＩＲ１８１Ａ２ＨＧ：１、ＴＴＣ２１Ｂ−ＡＳ１：２、ＬＥＦ１−ＡＳ１：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：１、ｌｎｃ−ＺＣＣＨＣ１３−４：１、ｌｎｃ−ＮＥＭＦ−１：４、ＴＣＯＮＳ＿０００１１９９４、ｌｎｃ−ＥＶＸ１−１５：１、ｌｎｃ−ＲＥＣ８−２：１、ＯＩＰ５−ＡＳ１：３６、ＭＹＬＫ−ＡＳ１：１３、ｌｎｃ−ＰＣＰ４Ｌ１−３：２、ｌｎｃ−ＣＧＲＥＦ１−２：１、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ−１１：１、ＰＳＭＢ８−ＡＳ１：１４、ｌｎｃ−ＳＴＸ１０−２：１、ｌｎｃ−ＴＣＦＬ５−６：１、ｌｎｃ−ＵＱＣＣ３−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ５１６−１４：１、ｌｎｃ−ＰＤＧＦＡ−６：２、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−１６：１、ｌｎｃ−ＳＡＭＤ１１−１２：４、ｌｎｃ−ＡＤＡＤ１−３：１、ｌｎｃ−ＳＬＣ３５Ｅ３−８：２、ｌｎｃ−ＮＩＤ１−４：４、ＦＴＸ：１９、ＴＣＯＮＳ＿０００１７３７２、ｌｎｃ−ＧＲＡＰ−１：２）から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなるｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の発現レベルを検出すること
を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーから選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１〜４２から選択されるｌｎｃＲＮＡシグナチャーであるか、またはそれを含む。好ましい実施形態では、ｌｎｃＲＮＡシグナチャーは、ｌｎｃＲＮＡシグナチャー１であるか、またはそれを含む。
【００９０】
ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを、当業者には公知の任意の技術によって決定することができる。特に、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、それぞれのｌｎｃＲＮＡの核酸転写物の量を測定することによって決定される。核酸転写物の量を、当業者には公知の任意の技術によって測定することができる。測定を、抽出されたＲＮＡ試料上で、または当業者には周知の技術によって抽出されたＲＮＡから調製された逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）上で直接的に実行することができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料から、核酸転写物の量を、核酸マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、ＦＩＭＡＰ定量化、および標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む、当業者には公知の任意の技術を使用して測定することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、シーケンシング、例えば、次世代シーケンシングを使用して決定される。シーケンシングを、逆転写酵素を使用して、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後に実行するか、またはＲＮＡ分子を直接配列決定することができる。本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない、特定の実施形態では、次世代シーケンシングを使用する発現レベルの測定を、以下のように実施することができる。簡単に述べると、ＲＮＡを、試料（例えば、血液試料）から抽出する。ｒＲＮＡを除去した後、ＲＮＡ試料をｃＤＮＡに逆転写する。鎖の特異性を確保するために、アクチノマイシンＤの存在下でＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素およびランダムプライマーを使用して、最初に一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含む第２鎖マーキングミックスを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換する。得られる平滑末端ｃＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズを使用して精製する。３’末端アデニル化工程の後、アダプターをｃＤＮＡに結合させる。そのように得られたｃＤＮＡ（シーケンシングライブラリー）を、ＰＣＲによって増幅することができる。シーケンシングライブラリーを、当業者には公知の任意の次世代シーケンシング技術によって配列決定することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、例えば、シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）による、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルの測定を、測定の前に目的のｌｎｃＲＮＡに対応する核酸（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を捕捉し、富化することによって容易にする。本明細書で使用される場合、富化とは、目的の核酸を選択的に精製することにより、初期試料と比較して試料中の目的の核酸のパーセンテージを増加させることを指す。目的のｌｎｃＲＮＡに対応する核酸の富化を、抽出されたＲＮＡ試料または抽出されたＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ試料上で実行することができる。一部の実施形態では、目的のｌｎｃＲＮＡに対応する核酸を、プローブ−標的核酸複合体を形成するためのプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料を、目的のｌｎｃＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、目的のｌｎｃＲＮＡの領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）にハイブリダイズさせることによって捕捉および富化する。プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであってもよい。ｌｎｃＲＮＡに特異的なプローブの長さは、３０〜８０ヌクレオチド、例えば、４０〜７０、４０〜６０、または約５０ヌクレオチドであってもよい。プローブ−標的核酸複合体を、当業者には公知の任意の技術によって精製することができる。好ましい実施形態では、プローブをビオチン化する。ビオチン化されたプローブ−標的核酸複合体を、ストレプトアビジン被覆基質、例えば、ストレプトアビジン被覆磁気粒子、例えば、Ｔ１ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用することによって精製することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを、定量的ＰＣＲを使用して決定することができる。定量的、またはリアルタイムＰＣＲは当業者には周知で容易に利用可能な技術であり、正確な説明を要しない。本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない、特定の実施形態では、定量的ＰＣＲを使用する発現プロファイルの決定を、以下のように実施することができる。簡単に述べると、リアルタイムＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行する。６μｌのｃＤＮＡを、７．５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．７５μｌのプローブとプライマーとの２０倍混合物および０．７５μｌの水を含有する９μｌのＰＣＲ混合物に添加する。反応は、５０℃で２分、次いで、９５℃で１０分の１回の初期工程、および９５℃で１５秒および６０℃で１分を含む４０サイクルの増幅からなる。反応およびデータ獲得を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施することができる。試料中の鋳型転写物分子の数を、指数期における増幅サイクル（サイクル閾値またはＣＱまたはＣＴ）を記録することによって決定し、その時点で、バックグラウンド蛍光を超える蛍光シグナルを検出することができる。かくして、鋳型転写物分子の開始数は、ＣＴと逆相関する。
【００９４】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを、核酸マイクロアレイの使用によって決定することができる。核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラスまたはミクロスフェアサイズのビーズであってもよい基質に結合させた異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカもしくはシリカに基づく材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースから構成されていてもよい。プローブは、ｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」）などの核酸であってもよい。標的核酸試料の発現プロファイルを決定するために、前記試料を標識し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合させたプローブ配列と相補的である標的核酸間での複合体の形成をもたらす。次いで、標識されたハイブリダイズされた複合体の存在を検出する。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が、当業者にとって利用可能である。
【００９５】
一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルをＦＩＭＡＰ定量化によって決定することができる。簡単に述べると、ｌｎｃＲＮＡを、化学的に改変されたｑＰＣＲと同じ配列を有するプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。フォワードプライマーを５’でリン酸化し、リバースプライマーを５’でビオチン化する。ＰＣＲ産物を、エキソヌクレアーゼで消化して、リン酸化された鎖を除去し、ビオチン化されたものだけを保持する。ビオチン化されたＰＣＲ産物を、目的のＲＮＡと相補的なオリゴで被覆されたコードされたシリカマイクロディスク（標的オリゴあたり１つのコード）と共にインキュベートし、ハイブリダイズした産物を、蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートの添加によって示す。ｌｎｃＲＮＡの発現レベルを、蛍光シグナルを測定することによって決定する。
【００９６】
さらなる態様では、検出方法は、１つまたは複数のｌｎｃＲＮＡを測定または検出するための試薬の使用を企図する。「試薬」とは、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定を具体的に可能にする試薬、すなわち、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡの発現レベルの特異的決定について具体的に意図される試薬を意味する。例としては、例えば、増幅プライマー対（フォワードおよびリワード（ｒｅｗａｒｄ））および／またはｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡが挙げられる。この定義は、他の任意のｌｎｃＲＮＡの発現レベルの決定のために使用される一般的な試薬を含まない。
【００９７】
さらなる態様では、検出方法は、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液から選択される、生体試料から１つまたは複数のｌｎｃＲＮＡを検出することを含む。一部の実施形態では、生体試料は、血液である。
【００９８】
認知障害、特に、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症、例えば、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢを発症する、または有するリスクがある対象を「処置すること」またはその「処置」とは、障害または疾患の少なくとも１つの症状が治癒する、軽減される、治療される、または改善されるように、それを必要とする対象にレジメンを投与すること、またはレジメンの投与を意味する。本発明によれば、診断結果に応じて、対象は、適合させた治療的処置にかけられ、さらにモニタリングされる。本発明のｌｎｃＲＮＡシグナチャーに基づく対象のモニタリングは、治療的処置をさらに適合させる、または改変する、例えば、薬物の量を増加させる、薬物の組合せを投与して相乗効果を得る、または薬物を、有効量の別の薬物で置き換えることを可能にする。
【００９９】
本発明はまた、本発明による認知機能の障害もしくは喪失または認知症などの進行性脳機能の（インビトロ）診断またはモニタリングための方法を使用して診断および／またはモニタリングされた、認知障害などの脳障害に罹患している対象における治療戦略の改変に関する。
【０１００】
本発明によれば、本発明のｌｎｃＲＮＡを、限定されるものではないが、ＭＣＩ、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢを含む認知障害を診断するために現在使用されている１つまたは複数のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。そのようなバイオマーカーの例としては、限定されるものではないが、米国特許第９，３７７，４７２号、米国特許第７，８９７，７８６号、および米国特許第６，７０３，２１２号、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７３９０５／ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７３９０５（それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたバイオマーカーが挙げられる。本発明のｌｎｃＲＮＡと、１つまたは複数の公知のバイオマーカーとを組み合わせる本発明の方法は、診断、または鑑別診断の精度の増強；およびより効率的で上手くいく薬物開発、例えば、臨床試験への動員前の患者の階層化に関する精度の増強および認可された療法または開発中の新規薬物の効能のモニタリングを可能にすることができる。
【０１０１】
本発明によれば、本発明のｌｎｃＲＮＡを、限定されるものではないが、ＡＤ、ＦＴＤ、ＤＬＢを含む認知障害を診断するために、および／または鑑別診断目的で現在使用されている１つまたは複数の検査と組み合わせて使用することができる。そのような検査の例としては、限定されるものではないが、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡ、ＦＣＳＲＴ検査などの神経心理学的検査、ならびに神経イメージング方法、特に、アミロイド、タウ、アルファ−シヌクレインまたは脳においてプロテイノパチーを可視化するための他の分子に特異的なリガンドを使用する体積測定ＭＲＩおよび分子神経イメージングＰＥＴ法が挙げられる。本発明のｌｎｃＲＮＡと、１つまたは複数の公知のバイオマーカーとを組み合わせる本発明の方法は、診断、または鑑別診断の精度の増強；およびより効率的で上手くいく薬物開発、例えば、臨床試験への動員前の患者の階層化に関する精度の増強および認可された療法または開発中の新規薬物の効能のモニタリングを可能にすることができる。
【０１０２】
本発明によれば、脳中の、本発明によって初めて同定されたｌｎｃＲＮＡの発現および／または量を正規化することにある新規治療手法を、本発明によって同定されたそのような新規ｌｎｃＲＮＡの発現または量の変化を特徴とする脳障害の処置（単独での、または現行の療法および新規の他の療法と組み合わせた）として使用することができる。
【０１０３】
本発明によれば、血漿、血清、血液または別の体液中の、同定された脳で富化されたｌｎｃＲＮＡ、同定された循環ｌｎｃＲＮＡを、本発明によって同定されたそのような循環ｌｎｃＲＮＡの発現または量の変化を特徴とする脳障害のための新規治療的処置の設計および開発のため、ならびに診断適用のために使用することができる。
【０１０４】
本発明によれば、脳または末梢体液中の、認知障害（ＭＣＩ、ＡＤ、ＤＬＢおよび／またはＦＴＤ）などの脳障害中で示差的に発現される本発明によって同定された変化したｌｎｃＲＮＡを、脳または末梢体液中で示差的に発現される本発明によって同定されたそのようなｌｎｃＲＮＡの発現または量の変化を特徴とする脳障害のための新規治療的処置の設計および開発ならびに診断適用のために使用することができる。
【０１０５】
ＡＤおよびＡＤ型の軽度認知障害（ＭＣＩ）の発症に特異的に関与するｌｎｃＲＮＡシグナチャーを同定するために、ＡＤまたはＡＤ型のＭＣＩを有する患者群および脳イメージングの異常を示さない認知的にインタクトな健康な対照群を含む、異なる群に由来する試料中の合計１２７８０２のｌｎｃＲＮＡをスクリーニングした。続いて、全試料中のｌｎｃＲＮＡプロファイリングにおいて、１９８６７のｌｎｃＲＮＡが閾値を超えて検出された。異なる群の試料中で測定されたｌｎｃＲＮＡ発現レベルの比較により、神経認知および神経心理学的検査ならびに神経イメージング検査ならびに脳脊髄液バイオマーカー：ベータ−アミロイドペプチド１−４２（Ａβ４２）およびタウ（総タウおよび／またはリン酸化タウ）に基づいて、臨床現場の神経学部門において、ＡＤまたはＡＤ型の認知障害を有すると診断された患者群の試料中の発現レベルと比較した、対照群の試料中で示差的に発現されたｌｎｃＲＮＡを、ｌｎｃＲＮＡバイオマーカー候補と同定した。
【０１０６】
両側Ｗｅｌｃｈのｔ検定および／または２群間のＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、発現レベルを分析した。有意な示差的発現を、ｐ＜０．０５と同定した。倍率変化およびＡＵＣ（曲線下面積）を、それぞれのｌｎｃＲＮＡについて、およびそれぞれの試験条件について算出する。
【０１０７】
示差的発現を１．６以上（もしくは０．６以下）の倍率変化および／または０．８０以上（もしくは０．２０未満）のＡＵＣに基づいて決定した場合の血清ｌｎｃＲＮＡ候補も選択し、表２および表３に示す。
【０１０８】
ランダムフォレストアルゴリズム（Breimann 2001、Breiman and Cutler 2001）を使用してモデルを構築し、それも使用して上位のｌｎｃＲＮＡを選択した。上から２〜２０位のｌｎｃＲＮＡの組合せに基づく予測モデルは、８０％以上の精度で疾患を予測することができる。
【０１０９】
配列決定された１２７８０２の血清ｌｎｃＲＮＡのうち、統計的分析のためにその閾値発現レベルに基づいて１９８６７のｌｎｃＲＮＡを選択した。ＡＤ患者と、健康な対照集団との比較により、１００８のｌｎｃＲＮＡが統計的有意性（ｐ値＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）をもって示差的に発現されることが示された（表１）。これらの１００８のｌｎｃＲＮＡの配列は、本出願に含まれる配列表に示される。
【０１１０】
【表６−１】
2022501016.tif 000009
【表６−２】
2022501016.tif 000010
【表６−３】
2022501016.tif 000011
【表６−４】
2022501016.tif 000012
【表６−５】
2022501016.tif 000013
【表６−６】
2022501016.tif 000014
【表６−７】
2022501016.tif 000015
【表６−８】
2022501016.tif 000016
【表６−９】
2022501016.tif 000017
【表６−１０】
2022501016.tif 000018
【表６−１１】
2022501016.tif 000019
【表６−１２】
2022501016.tif 000020
【表６−１３】
2022501016.tif 000021
【０１１１】
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）をもって示差的に発現される１００８の血清ｌｎｃＲＮＡのうち、３３のｌｎｃＲＮＡが、２以上または０．５未満の倍率変化を示し、これを表２に示す。
【０１１２】
【表７】
2022501016.tif 000022
【０１１３】
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）をもって示差的に発現される１００８の血清ｌｎｃＲＮＡのうち、６０のｌｎｃＲＮＡが、０．８５以上のＡＵＣを示し、これを表３に示す。
【０１１４】
【表８】
2022501016.tif 000023
【０１１５】
分析された合計１９８６７の血清ｌｎｃＲＮＡを使用する場合、ＡＤ患者と健康対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが、以下の１３のｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの１３のｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．９９３、精度＝９５．８％、感度＝１００％および特異度＝９１．７％で２つの集団（軽度ＡＤ患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１１６】
【表９】
2022501016.tif 000024
【０１１７】
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）をもって示差的に発現される１００８の血清ｌｎｃＲＮＡのうち、２を超える（もしくは０．５未満の）倍率変化または０．８５以上（もしくは０．１５以下）のＡＵＣを示す９０のｌｎｃＲＮＡを、ランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングのために使用した。その結果は、以下の上から７位までの候補が、１００％のＡＵＣ値ならびに１００％の精度、１００％の感度および１００％の特異度で、ＡＤ群とＨＶ群との完全な識別を可能にしたことを示す。
【０１１８】
【表１０】
2022501016.tif 000025
【０１１９】
１．６以上の倍率変化および０．８５以上のＡＵＣを有するｌｎｃＲＮＡの一覧を考慮する別のフィルターを適用する場合、ランダムフォレストアルゴリズムの使用は、モデルを構築するために以下の上から１２位までの血清ｌｎｃＲＮＡを選択することを可能にし、これは、依然として優れたＡＵＣ＝０．９７９、９５．８％の優れた精度、９１．７％の感度および１００％の特異度でＡＤ集団とＨＶ集団とを識別することを可能にした。
【０１２０】
【表１１】
2022501016.tif 000026
【０１２１】
さらに、最良の血清ｌｎｃＲＮＡ候補を選択するために、ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健康な対照集団における統計的に有意な示差的発現と、実施した７つの神経心理学的検査のうちのＭＭＳＥおよび／またはＭＯＣＡを含む神経認知検査のスコアとの良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｒ係数）との両方を有するｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットに適用した（表４）：その結果は、以下の上から３位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーが、ＡＵＣ＝０．９５３、９１．７％の精度、９１．７％の感度および９１．７％の特異度で、ＡＤ患者と健康な対照集団との優れた識別を可能にしたことを示す。
【０１２２】
【表１２】
2022501016.tif 000027
【０１２３】
【表１３】
2022501016.tif 000028
【０１２４】
ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健康な対照集団における統計的に有意な示差的発現と、神経イメージングスコア（測定した１２０を超える構造のうち、側頭葉内側領域、左および右海馬、左および右扁桃体、内嗅皮質などの認知および記憶に関連がある脳構造の体積）との良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ）との両方を有する表５からの血清ｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットにも適用した：その結果は、以下の上から７位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーが、ＡＵＣ＝０．９９３、精度＝９５．８％、感度＝９１．７％および特異度＝１００％で、ＡＤ患者と健康な対照集団との優れた識別を可能にしたことを示す。
【０１２５】
【表１４】
2022501016.tif 000029
【０１２６】
【表１５−１】
2022501016.tif 000030
【表１５−２】
2022501016.tif 000031
【０１２７】
ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健康な対照集団における統計的に有意な示差的発現と、ＡＤ病理と高く関連するＣＳＦバイオマーカー：Ａβ４２、タウまたはリン酸化タウのレベルとの良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ）との両方を有する表６からの血清ｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットにも適用した：その結果は、以下の上から１８位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーが、ＡＵＣ＝０．９７２、精度＝０．９１７、感度＝０．８３および特異度＝１で、ＡＤ患者と健康な対照集団との優れた識別を可能にしたことを示す。
【０１２８】
【表１６】
2022501016.tif 000032
【０１２９】
【表１７】
2022501016.tif 000033
【０１３０】
治療適用のための、脳障害、特に、ＭＣＩ、ＡＤにおいて特異的に関与するさらなる脳ｌｎｃＲＮＡを同定するために、ＡＤ患者（典型的なＡＤ病変：アミロイド斑および神経原線維変化を組織病理学的に示す組織）および非認知症の健康な対照（ＨＣ）の対象（ＡＤおよび他の病変を含まない組織）に由来する死後脳側頭葉内側部からなる凍結組織試料を、新規ｌｎｃＲＮＡならびに注釈付きヒトｌｎｃＲＮＡ転写物配列および構造に関するデータベースであるＬＮＣｉｐｅｄｉａに基づく１２７８０２のｌｎｃＲＮＡのディープシーケンシングおよび定量化の実験において使用した。
【０１３１】
合計で１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡが、ＡＤおよび／またはＨＣ脳において同定された。続いて、これらの新規の１０９１のｌｎｃＲＮＡを、配列決定された１２７８０２のｌｎｃＲＮＡの一覧に加え、合計で１２８，８９４のｌｎｃＲＮＡを脳中での全ての実験においてプロファイリングした。１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡを、表７に示す。
【０１３２】
【表１８−１】
2022501016.tif 000034
【表１８−２】
2022501016.tif 000035
【表１８−３】
2022501016.tif 000036
【表１８−４】
2022501016.tif 000037
【表１８−５】
2022501016.tif 000038
【表１８−６】
2022501016.tif 000039
【表１８−７】
2022501016.tif 000040
【表１８−８】
2022501016.tif 000041
【表１８−９】
2022501016.tif 000042
【表１８−１０】
2022501016.tif 000043
【表１８−１１】
2022501016.tif 000044
【表１８−１２】
2022501016.tif 000045
【０１３３】
１０９１の新規脳ｌｎｃＲＮＡ（表７）のうち、４９２のｌｎｃＲＮＡが、１．１を超える倍率変化を示し、４３１のｌｎｃＲＮＡが、０．９未満の倍率変化を示し、脳障害、特に、ＭＣＩおよびアルツハイマー病などの認知障害の処置のための、それぞれ、脳内のそのようなｌｎｃＲＮＡをサイレンシングするため、または増強するための潜在的な新規治療候補である。
【０１３４】
１０９１の新規脳ｌｎｃＲＮＡのうち、末梢副作用を示さない、または限られた末梢副作用しか示さない、治療適用のための使用のための一部の好ましい新規ｌｎｃＲＮＡ候補は、例えば、脳においては０．５以下または２以上の倍率変化および０．０５未満のｐ値を示し、末梢組織および血液などの末梢体液においては発現が低いか、または発現を示さない新規脳ｌｎｃＲＮＡである。
【０１３５】
ＡＤおよび対照の脳における本発明によって配列決定されたＬＩＮＣｉｐｅｄｉａに由来する、および５ＣＰＭ（中央値）を超える発現を有する１０１２２の新規およびｌｎｃＲＮＡの合計数のうち、ＡＤ脳をＨＣ脳と比較する場合に、統計的に有意な示差的発現を全て示した、４２の新規ｌｎｃＲＮＡを含む１２０２のｌｎｃＲＮＡが同定された。これらの１２０２のｌｎｃＲＮＡを表８に列挙し、これらは認知障害、特に、ＭＣＩおよびアルツハイマー病の処置のための治療候補である。
【０１３６】
【表１９−１】
2022501016.tif 000046
【表１９−２】
2022501016.tif 000047
【表１９−３】
2022501016.tif 000048
【表１９−４】
2022501016.tif 000049
【表１９−５】
2022501016.tif 000050
【表１９−６】
2022501016.tif 000051
【表１９−７】
2022501016.tif 000052
【表１９−８】
2022501016.tif 000053
【表１９−９】
2022501016.tif 000054
【表１９−１０】
2022501016.tif 000055
【表１９−１１】
2022501016.tif 000056
【表１９−１２】
2022501016.tif 000057
【表１９−１３】
2022501016.tif 000058
【０１３７】
２８の新規ｌｎｃＲＮＡを含む３８６のｌｎｃＲＮＡは、（ｉ）死後の脳における高い発現（ＣＰＭ＞２５）、（ｉｉ）ＡＤ脳対ＨＣ脳における有意な示差的発現、ならびに（ｉｉｉ）生存しているＡＤ患者または健康な対照の血漿および血液（Ｐａｘｇｅｎｅ）における非発現または低発現（ＣＰＭ＜５）を示した。これらの３８６のｌｎｃＲＮＡを、表７および表８に列挙し、そのプロファイルを含有させる。
【０１３８】
診断および治療適用のために、限定されるものではないが、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および／またはレヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）などの認知障害を含む脳障害の発症に特異的に関与する末梢体液、血液および血漿ｌｎｃＲＮＡシグナチャー中の循環ｌｎｃＲＮＡを同定するために、１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡおよびＬＮＣｉｐｅｄｉａに基づく１２７８０２のｌｎｃＲＮＡを含む合計１２８，８９３のｌｎｃＲＮＡを、ＡＤ症例および非認知症の症例に由来する脳ならびにＭＣＩを有する患者群、軽度ＡＤを有する患者群、中等度から重度のＡＤを有する患者群、ＤＬＢを有する患者群およびＦＴＤを有する患者群を含む、異なる対象群に由来する血漿および／または全血試料においてスクリーニングおよびプロファイリングし、ならびに正常な神経認知スコアを有し、脳イメージングの異常を示さない認知的にインタクトな健康な対照の対照参照群をスクリーニングした。
【０１３９】
続いて、全試料中の１２８，８９４のｌｎｃＲＮＡのうち、脳試料中の５３７４７のｌｎｃＲＮＡ、血漿試料中の３５６１８のｌｎｃＲＮＡ、全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）試料中の７１１３２のｌｎｃＲＮＡを、実験に含まれた試料のうち、ある試料中で少なくとも１カウントのレベルで検出した。さらに、少なくとも１つの試験した対象群に由来する試料の５０％において５ＣＰＭを超える発現レベルのさらなる閾値を適用して、以下の数のｌｎｃＲＮＡを統計的分析のために保持した：１０１２２の脳ｌｎｃＲＮＡ、３７７４の血漿ｌｎｃＲＮＡおよび９３６７の全血ｌｎｃＲＮＡ。
【０１４０】
それぞれのｌｎｃＲＮＡについて、両側Ｗｅｌｃｈのｔ検定および／またはＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、２群（例えば、ＡＤ群と健康な対照群）間の発現レベルを比較することによって、示差的発現レベルを決定した。有意な示差的発現を、ｐ＜０．０５と同定した。４１０のｌｎｃＲＮＡが、統計的有意性（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）および０．８０未満または１．２０を超える倍率変化をもって、ＡＤ血漿対ＨＣ血漿中で示差的に発現された。表９は、４１０の血漿ｌｎｃＲＮＡを示す。
【０１４１】
【表２０−１】
2022501016.tif 000059
【表２０−２】
2022501016.tif 000060
【表２０−３】
2022501016.tif 000061
【表２０−４】
2022501016.tif 000062
【表２０−５】
2022501016.tif 000063
【表２０−６】
2022501016.tif 000064
【０１４２】
２８４７のｌｎｃＲＮＡが、健康な対照群と比較して、ＭＣＩ群または軽度ＡＤ群または中等度から重度のＡＤ群またはこれらのＡＤ群の両方またはＦＴＤ群またはＤＬＢ群の全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）中で示差的に発現され、統計的有意性（ｐ値＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）および０．８０以下または１．２０以上の倍率変化を有していた。これらのｌｎｃＲＮＡは、健康な対照群と比較した場合、少なくとも１つの疾患群について統計的有意性をもって示差的発現を示した（ｐ値＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）。２８４７のｌｎｃＲＮＡを、表１０に示す。
【０１４３】
【表２１−１】
2022501016.tif 000065
【表２１−２】
2022501016.tif 000066
【表２１−３】
2022501016.tif 000067
【表２１−４】
2022501016.tif 000068
【表２１−５】
2022501016.tif 000069
【表２１−６】
2022501016.tif 000070
【表２１−７】
2022501016.tif 000071
【表２１−８】
2022501016.tif 000072
【表２１−９】
2022501016.tif 000073
【表２１−１０】
2022501016.tif 000074
【表２１−１１】
2022501016.tif 000075
【表２１−１２】
2022501016.tif 000076
【表２１−１３】
2022501016.tif 000077
【表２１−１４】
2022501016.tif 000078
【表２１−１５】
2022501016.tif 000079
【表２１−１６】
2022501016.tif 000080
【表２１−１７】
2022501016.tif 000081
【表２１−１８】
2022501016.tif 000082
【表２１−１９】
2022501016.tif 000083
【表２１−２０】
2022501016.tif 000084
【表２１−２１】
2022501016.tif 000085
【表２１−２２】
2022501016.tif 000086
【表２１−２３】
2022501016.tif 000087
【表２１−２４】
2022501016.tif 000088
【表２１−２５】
2022501016.tif 000089
【表２１−２６】
2022501016.tif 000090
【表２１−２７】
2022501016.tif 000091
【表２１−２８】
2022501016.tif 000092
【表２１−２９】
2022501016.tif 000093
【表２１−３０】
2022501016.tif 000094
【表２１−３１】
2022501016.tif 000095
【表２１−３２】
2022501016.tif 000096
【表２１−３３】
2022501016.tif 000097
【表２１−３４】
2022501016.tif 000098
【表２１−３５】
2022501016.tif 000099
【表２１−３６】
2022501016.tif 000100
【表２１−３７】
2022501016.tif 000101
【表２１−３８】
2022501016.tif 000102
【表２１−３９】
2022501016.tif 000103
【表２１−４０】
2022501016.tif 000104
【表２１−４１】
2022501016.tif 000105
【表２１−４２】
2022501016.tif 000106
【表２１−４３】
2022501016.tif 000107
【表２１−４４】
2022501016.tif 000108
【表２１−４５】
2022501016.tif 000109
【表２１−４６】
2022501016.tif 000110
【表２１−４７】
2022501016.tif 000111
【表２１−４８】
2022501016.tif 000112
【表２１−４９】
2022501016.tif 000113
【表２１−５０】
2022501016.tif 000114
【表２１−５１】
2022501016.tif 000115
【表２１−５２】
2022501016.tif 000116
【表２１−５３】
2022501016.tif 000117
【表２１−５４】
2022501016.tif 000118
【表２１−５５】
2022501016.tif 000119
【表２１−５６】
2022501016.tif 000120
【表２１−５７】
2022501016.tif 000121
【表２１−５８】
2022501016.tif 000122
【表２１−５９】
2022501016.tif 000123
【表２１−６０】
2022501016.tif 000124
【表２１−６１】
2022501016.tif 000125
【表２１−６２】
2022501016.tif 000126
【０１４４】
ＡＤ患者において示差的に発現されるｌｎｃＲＮＡをさらに同定するために、ＡＤ患者における全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）を、非ＡＤ対象群と比較した。１３６のｌｎｃＲＮＡが、非ＡＤ対象群（ＤＬＢ＋ＦＴＤ群またはＤＬＢ＋ＦＴＤ＋ＨＣ群のいずれか）と比較した場合、ＡＤ患者群（軽度ＡＤ＋中等度から重度のＡＤ群）の全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）中で示差的に発現され、統計的有意性（ｐ値＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）および０．８０以下または１．２０以上の倍率変化を有していた。１３６のｌｎｃＲＮＡを、表１１に示す。
【０１４５】
【表２２−１】
2022501016.tif 000127
【表２２−２】
2022501016.tif 000128
【表２２−３】
2022501016.tif 000129
【０１４６】
脳で富化されたｌｎｃＲＮＡ：ＡＤおよび対照の脳において本発明によって配列決定され、５ＣＰＭ（中央値）未満の発現レベルを有する１０１２２のｌｎｃＲＮＡのうち、８６０のｌｎｃＲＮＡが、末梢臓器である肺、卵巣、結腸、前立腺、乳房、肝臓、膀胱、腎臓、皮膚、心臓、筋肉と比較して、脳において２倍高い発現レベルを示した。８６０のｌｎｃＲＮＡを、表１２に示す。
【０１４７】
【表２３−１】
2022501016.tif 000130
【表２３−２】
2022501016.tif 000131
【表２３−３】
2022501016.tif 000132
【表２３−４】
2022501016.tif 000133
【表２３−５】
2022501016.tif 000134
【表２３−６】
2022501016.tif 000135
【表２３−７】
2022501016.tif 000136
【表２３−８】
2022501016.tif 000137
【表２３−９】
2022501016.tif 000138
【０１４８】
本発明で同定された３１のｌｎｃＲＮＡと、神経認知ＭＭＳＥ（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）検査または脳脊髄液ＣＳＦバイオマーカーＡベータおよびタウまたはリン酸化タウまたは年齢との相関を試験した。結果を、表１３に示す。
【０１４９】
【表２４】
2022501016.tif 000139
【０１５０】
ＡＮＫＲＤ３６−１−４を除く、試験した全てのｌｎｃＲＮＡにおいて、年齢との相関は、一般化された線形モデルによって年齢で調整した後、対象群について依然として有意なままであったが、これは、対象群と比較した場合、選択されたｌｎｃＲＮＡの示差的発現が、単に年齢効果に起因するものではなく、疾患効果にも起因し、それぞれの認知症型のための診断および／または治療適用にとってのそれらの適切性を強調することを示している。
【０１５１】
ｌｎｃＲＮＡの最良の候補をさらに選択するために、それぞれのｌｎｃＲＮＡおよびそれぞれの試験した条件について、倍率変化（ＦＣ）およびＡＵＣを算出した。２群を比較する場合、１．２を超える（もしくは０．８未満の）ＦＣなどの適切な倍率変化（ＦＣ）および／または０．６５を超える（もしくは０．３５未満の）ＡＵＣなどの適切なＡＵＣに基づいて示差的発現が決定された場合、ｌｎｃＲＮＡ候補を選択した。ランダムフォレストアルゴリズム（Breimann 2001、Breiman and Cutler 2001）を使用してモデルを構築し、上位のｌｎｃＲＮＡも選択した。少なくとも２つのｌｎｃＲＮＡを含む上位候補の一覧の組合せに基づく予測モデルは、６５％以上かつ最大１００％の精度で疾患を予測することができる。
【０１５２】
全血試料中で測定可能であり、表１１に記載される０．８以上（または０．２以下）のＡＵＣを有する合計８４４のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、軽度認知障害（ＭＣＩ）患者と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の２つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの２つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝１、精度＝１００％、感度＝１００％および特異度＝１００％で２つの集団（軽度認知障害患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１５３】
【表２５】
2022501016.tif 000140
【０１５４】
全血中で測定可能であり、表１１に記載される０．７以上（または０．３以下）のＡＵＣを有する合計５００のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、ＡＤ患者と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の７つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの７つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．９５４、精度＝９１％、感度＝９０％および特異度＝９１％で２つの集団（軽度ＡＤ患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１５５】
【表２６】
2022501016.tif 000141
【０１５６】
全血中で測定可能であり、表１１に記載される０．６５以上（または０．３５以下）のＡＵＣを有する合計６０５のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、中等度から重度のＡＤ患者と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の６つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの６つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．９２２、精度＝８３％、感度＝７０％および特異度＝９１％で２つの集団（中等度から重度のＡＤ患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１５７】
【表２７】
2022501016.tif 000142
【０１５８】
全血中で測定可能であり、表１１に記載される０．６５以上（または０．３５以下）のＡＵＣを有する合計１１２４のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、全てのＡＤ患者（軽度＋中等度から重度）と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の７つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの７つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．９５４、精度＝９１％、感度＝８８％および特異度＝９２％で２つの集団（ＡＤ患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１５９】
【表２８】
2022501016.tif 000143
【０１６０】
全血中で測定可能であり、表１１に記載される０．８以上（または０．２以下）のＡＵＣを有する合計１３５２のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、レヴィー小体型認知症患者と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の２つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの２つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝１、精度＝１００％、感度＝１００％および特異度＝１００％で２つの集団（レヴィー小体型認知症患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１６１】
【表２９】
2022501016.tif 000144
【０１６２】
全血中で測定可能であり、表４に記載される０．８以上（または０．２以下）のＡＵＣを有する合計１０４１のｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、前頭側頭型認知症患者と健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の３つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの３つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝１、精度＝１００％、感度＝１００％および特異度＝１００％で２つの集団（前頭側頭型認知症患者および健康な対照集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１６３】
【表３０】
2022501016.tif 000145
【０１６４】
全血中で測定可能であり、表１１、表１２に記載される０．６５以上（または０．３５以下）のＡＵＣを有する合計６つのｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、全てのＡＤ患者集団とＮＡＤ（ＦＴＤ＋ＤＬＢ）患者集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の６つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの６つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．８０４、精度＝７９％、感度＝５６％および特異度＝９１％で２つの集団（ＡＤ集団および他の認知症型に罹患している集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１６５】
【表３１】
2022501016.tif 000146
【０１６６】
全血中で測定可能であり、表４に記載される０．６５以上（または０．３５以下）のＡＵＣを有する合計５つのｌｎｃＲＮＡを使用する場合に、全てのＡＤ患者集団とＤＬＢ、ＦＴＤ患者＋健康な対照集団とを識別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数に応じたＡＵＣが以下の５つのｌｎｃＲＮＡとプラトーに達することを示すことができた。これらの５つのｌｎｃＲＮＡを使用して、モデルを構築した。その結果は、このｌｎｃＲＮＡシグナチャーが、ＡＵＣ値＝０．８１１、精度＝７２％、感度＝６１％および特異度＝８１％で２つの集団（ＡＤ集団および他の認知症型に罹患しているか、または正常な認知状態を有する集団）間の識別を可能にしたことを示す。
【０１６７】
【表３２】
2022501016.tif 000147
【０１６８】
診断に関しては、鑑別診断のために、表１１、表１２に由来する少なくとも３つのｌｎｃＲＮＡを含み、それぞれの認知症型を特異的に検出することができる以下に列挙されるものなどの、いくつかの他のｌｎｃＲＮＡパネルを同定した。
【０１６９】
【表３３】
2022501016.tif 000148
【０１７０】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から１１位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、ＡＵＣ＝０．９６３、精度＝９３．４％、感度＝６５％および特異度＝９８．３％で、ＨＣ群と、他の全ての群（ＭＣＩ、全てのＡＤ、ＤＬＢ、ＦＴＤ）との優れた識別を可能にした。
【０１７１】
【表３４】
2022501016.tif 000149
【０１７２】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から７位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝９０．７％、感度＝９０％および特異度＝９１．２％で、ＨＣ群と、軽度ＡＤを有する患者との優れた識別を可能にした。
【０１７３】
【表３５】
2022501016.tif 000150
【０１７４】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から７位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝８３．３％、感度＝７０％および特異度＝９１．２％で、ＨＣ群と、中等度から重度のＡＤを有する患者との優れた識別を可能にした。
【０１７５】
【表３６】
2022501016.tif 000151
【０１７６】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から３位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝１００％、感度＝１００％および特異度＝１００％で、ＨＣ群と、レヴィー小体型認知症を有する患者との優れた識別を可能にした。
【０１７７】
【表３７】
2022501016.tif 000152
【０１７８】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から２位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝１００％、感度＝１００％および特異度＝１００％で、ＨＣ群と、前頭側頭型認知症を有する患者との優れた識別を可能にした。
【０１７９】
【表３８】
2022501016.tif 000153
【０１８０】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から５位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝７６．５％、感度＝５５．９％および特異度＝８６．８％で、ＡＤ患者（軽度ＡＤ患者および中等度から重度のＡＤを有する患者）と、非ＡＤ認知症群（ＦＴＤ＋ＤＬＢ）との優れた識別を可能にした。
【０１８１】
【表３９】
2022501016.tif 000154
【０１８２】
全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料）中で発現される以下の上から５位までのｌｎｃＲＮＡのシグナチャーは、精度＝８２．４％、感度＝６１．８％および特異度＝９２．６％で、ＡＤ患者（軽度ＡＤ患者および中等度から重度のＡＤを有する患者）と、非ＡＤ認知症群（ＦＴＤ＋ＤＬＢ）との優れた識別を可能にした。
【０１８３】
【表４０】
2022501016.tif 000155
【０１８４】
材料および方法
ヒト対象の脳、血清、血漿、全血または他の試料中のｌｎｃＲＮＡを同定するために、全ＲＮＡを最初に抽出し、リボソームＲＮＡの除去によってシーケンシングライブラリーを調製し（ＲｉｂｏＺｅｒｏ  ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製キット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）、２ｘ７５ｂｐのリード長を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００上で配列決定した。
【０１８５】
また、ｌｎｃＲＮＡを、特異的プライマーを使用するｑＰＣＲによって測定した。このために、全ＲＮＡを最初に抽出し、特異的プライマーを使用する逆転写およびリアルタイムＰＣＲを実施した。被覆されたマイクロディスク上のＰＣＲ産物の、検出プローブに結合した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づく特許権のあるプラットフォームである、ＦｉＭＡＰ（Ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ  ＱＭＡＰプラットフォームおよび新しい完全自動化バージョンのＱＭＸとも呼ばれる）を使用する。全ＲＮＡを抽出した後、ｌｎｃＲＮＡに対する特異的プライマーを使用するいくつかの標的の多重化を可能にする、逆転写およびＰＣＲ工程を行った。
【０１８６】
ｌｎｃＲＮＡを定量することができる多重化されたプラットフォームとしてのＦｉＭＡＰの効能を示すために、血漿試料を、ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、ＣｅｌｅｍｉｃｓおよびＦｉＭＡＰを使用して試験した。多くのｌｎｃＲＮＡが、入力ＲＮＡの希釈液がＱＭＡＰ上で濃度依存的様式で測定されるため、それらが良好に定量されること、およびｌｎｃＲＮＡ２０３２１について、参照ｑＰＣＲ法を使用する場合に、非常に同等の結果が得られることを示した。したがって、定量化を、それぞれのｌｎｃＲＮＡに特異的なコードされるマイクロディスクを使用するＦｉＭＡＰプラットフォーム上で実施した。
【０１８７】
患者集団および試料
脳組織生検：死後の脳側頭葉内側部組織試料および以下に記載される前向き研究に由来するもの以外の血液試料、ならびに末梢臓器生検：肺、卵巣、結腸、前立腺、乳房、肝臓、膀胱、腎臓、皮膚、心臓、筋肉は、多様な欧州の病院およびＦｉｒａｌｉｓのバイオバンクからのものであった。
【０１８８】
体液試料：体液試料は、国の倫理委員会によって受け入れられた欧州の病院のプロトコールに従って、および２０１５年１月２２日のＩＤ  ＲＣＢ：２０１５−Ａ００１１８−４１、２０１６年２月４日のＩＤ  ＲＣＢ：２０１６−Ａ２００２２７−４４などの下でＡｇｅｎｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  ｄｕ  Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ  ｅｔ  ｄｅｓ  Ｐｒｏｄｕｉｔｓ  ｄｅ  Ｓａｎｔｅ（ＡＮＳＭ）に登録されたＡｍｏｎｅｔａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに支援された前向き研究において動員された、健康なボランティア（ＨＶ）、Ｍｕｌｈｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅの「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ」（ＥＦＳ）でのドナー、および認知的にインタクトな健康な対照の対象および軽度認知障害または異なるステージのアルツハイマー病（ＡＤ）もしくは他の認知症型の患者に由来するものであった。全血試料を、Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ中に収集した。血清または血漿試料を、リチウム−ヘパリンチューブまたはＥＤＴＡチューブ中に収集した血液試料から調製し、ＣＳＦ、尿、唾液および涙液を、ポリプロピレンチューブを使用して収集した。
【０１８９】
本発明の表および図面に示される結果は、１０の死後脳試料（５のＡＤ、５のＨＣ）、２４の血清試料（１２のＡＤおよび１２のＨＣ）、１２の血漿試料（６のＡＤおよび６のＨＣ）ならびに以下の対象群に由来する１３９の試料中で得られたものである。
【０１９０】
【表４１】
2022501016.tif 000156
【０１９１】
ｌｎｃＲＮＡのための方法
試料のシーケンシング
リボ核酸（ＲＮＡ）抽出は、製造業者の指示書に従ってＮｏｒｇｅｎ  Ｓｅｒｕｍ／血漿抽出およびＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｕｔｅ  Ｋｉｔを使用して、１．５ｍｌの血清から開始して行う。シーケンシングライブラリーを、ヒト／マウス／ラットＲｉｂｏＺｅｒｏ  ｒＲＮＡ除去キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ、Ｃ）と組み合わせたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ鎖化全ＲＮＡライブラリー調製キットを使用して、抽出されたＲＮＡの全量から調製する。全ての工程を、断片化工程を用いずに、低効率プロトコールを用いて、および製造業者の指示書に従って実施する。簡単に述べると、細胞質リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をビオチン化標的特異的オリゴにハイブリダイズさせ、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して除去する。次いで、ｒＲＮＡを枯渇させたＲＮＡ試料を、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に逆転写する。鎖の特異性を確保するために、アクチノマイシンＤの存在下でＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムプライマーを使用して、最初に一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含む第２鎖マーキングミックスを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換する。得られる平滑末端ｃＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズを使用して精製する。３’末端アデニル化工程の後、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプターライゲーションを実施する。そのように得られたシングルインデックスライブラリーを、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して２回洗浄して、過剰のアダプターを除去し、ＰＣＲ（１５サイクル）によって富化する。ＰＣＲ産物を、最後のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ洗浄を用いて精製し、シーケンシングできるライブラリーを３０μｌの再懸濁緩衝剤中で溶出する。
【０１９２】
品質管理のために、１μｌの各ライブラリーを、製造業者の推奨に従って、ＤＮＡ１０００チップを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で泳動する。アダプター二量体の非存在をチェックし、平均ライブラリーサイズを領域表によって決定する。ライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ  ２．０上で定量する。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で予め決定されたライブラリーサイズを使用して、質量濃度からモル濃度を算出する。全てのライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００（２ｘ７５ｂｐ）を用いて配列決定する。
【０１９３】
バイオインフォマティック分析
ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｈｇ３８ゲノムに基づくｌｎｃＲＮＡ
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析を、Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ  ｂｕｉｌｄ  ６）を使用して実施する。Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗのアラインメント前のＱＡ／ＱＣモジュールを使用して、ＦＡＳＴＱファイルのリード品質を可視化する。全てのリードを検査する。生のＦＡＳＴＱファイルを、その品質スコア（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ）に応じて３’末端で調整する。使用されるパラメーターは、３０の最終最低品質レベルおよび５０の最小調整リード長である。整列されていないリードを、ホモ・サピエンスｈｇ３８ゲノムを使用してマッピングする。このマッピングを、ＳＴＡＲバージョン２．５．３ソフトウェア（Dobin A. et al., 2013, STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 15-21）を使用して行う。デフォルトパラメーターを使用する。Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗのアラインメント後のＱＣモジュールを使用して、位置あたりの平均塩基品質スコアならびにアラインメントあたりのマッピング品質を可視化した。マッピングされたリードを、Ｐａｒｔｅｋ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ／Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（Ｅ／Ｍ）アルゴリズム（Xing Y. et al, 2006. An expectation-maximization algorithm for probabilistic reconstructions of full-length isoforms from splice graphs. Nucleic Acids Res. 34, 3150-3160）を使用する定量化のための特許されたｌｎｃＲＮＡ注釈を含むＧＴＦファイルを使用して定量した。デフォルトパラメーターを使用する。中央値が遺伝子間領域中の中央リード密度より下である転写物を、分析の次の工程のために廃棄する。転写物数をＣＰＭ（百万あたりのカウント）によって正規化した。１群の試料の少なくとも半分において高い発現（ＣＰＭ≧５）を示す転写物のみを考慮する。
【０１９４】
新規ｌｎｃＲＮＡ探索
ＵＣｌｎｃＲＮＡパイプラインバージョン１．１．１（Sun Z. et al., Scientific Reports, 7(1): 14196, 2017）を使用することによって、新規探索を実施した。このパイプラインでは、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅバージョン１．３．４ｄ（Pertea M. et al., Nat Biotechnol, 33 (3): 290-295, 2015）を、再構築のために使用した。
【０１９５】
「ｃｕｆｆｃｏｍｐａｒｅ」プログラムバージョン２．２．１（C. Trapnell et al., ‘Nat Protoc, 7 (3): 562-578, 2012）を使用して、集合させた転写物を、参照注釈付きＧＴＦファイル（Ｇｅｎｃｏｄｅ  ２７およびＬＮＣｉｐｅｄｉａ  ５）と比較し、さらなる分析のために９つの試料に由来する全ての転写物を用いて新しいＧＴＦファイルを生成した。
【０１９６】
ｃｕｆｆｃｏｍｐａｒｅ、転写物長、エクソン数およびタンパク質コード能力によって生成されたＴｒａｎｓｆｒａｇクラスコード上でフィルタリングを行った。最初に、全て、新規ｌｎｃＲＮＡを潜在的に含み得る、コード「ｉ」、「ｊ」、「ｏ」、「ｕ」、「ｘ」および「．」を有する転写物を抽出した。「ｉ」カテゴリーは、例えば、既知の遺伝子のイントロン内にｌｎｃＲＮＡ全体を含有し得る。同様に、「ｊ」カテゴリーは、既知の遺伝子の長いノンコーディングアイソフォームであり得る。「ｏ」カテゴリーは、既知の転写物との全体的なエクソン重複を有する新規ｌｎｃＲＮＡを含み得る。「ｕ」カテゴリーは、長い遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）であり得る。「ｘ」カテゴリーは、参照遺伝子の反対の鎖上の新規ｌｎｃＲＮＡを含有し得る。「．」カテゴリーは、複数の分類を有する配列であってもよい。この後、２００ｎｔ以上の長さおよび少なくとも２個のエクソンを有する転写物のみを、次の工程のために保持した。ＣＰＡＴ（Coding-Potential Assessment Tool, L. Wang L., et al., Nucleic Acids Res, 41 (6): e74,2013）を、ノンコーディング能力の評価のために使用する。０．３未満のＣＰＡＴスコアを有する転写物を、ノンコーディングと考えた。新しいＧＴＦファイルを、選択された新規ｌｎｃＲＮＡの最終的な一覧を用いて生成した。
【０１９７】
ＧＳＥ４５３２６のＦａｓｔｑファイルを、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ［９］からダウンロードした。このデータセットは、１２の正常ヒト組織のＲＮＡ−ｓｅｑデータを含む。ペアエンドシーケンシングを、リボマイナス全ＲＮＡライブラリー上で実施した。リードのアラインメントを、以前に記載のように実施した。定量化を、Ｐａｒｔｅｋ  Ｅ／Ｍアルゴリズムを使用する新規ｌｎｃＲＮＡ注釈を用いて行った。
【０１９８】
統計分析および予測モデリング
示差的に発現されるｌｎｃＲＮＡを決定するために、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙパラメーター検定を使用する統計分析を実施して、２群の対象を比較する。０．０５以下のｐ値を有するｌｎｃＲＮＡを、示差的に発現されると考える。Ａｎｏｖａ検定を、２つを超える対象群の比較のために使用する。
【０１９９】
２つの分類に関する分類モデルを構築するために、ＲのＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙｓ（ＣＭＡ）パッケージ（Slawski M, Daumer M, Boulesteix AL. CMA: a comprehensive Bioconductor package for supervised classification with high dimensional data. BMC Bioinformatics 2008, 9:439）を、一個抜き交差検証と共に使用した。
【０２００】
この予測モデリングのために使用されるアルゴリズムは、（ａ）ランダムフォレスト、（ｂ）線形判別分析および（ｃ）ナイーブなＢａｙｅｓ（Breiman L. Random forests. Machine Learning, 45(1): 5-32, 2001）である。
【０２０１】
モデルにおけるＲＮＡ候補の順位を、１０個の候補選択の平均順位（ＣＶ倍率あたり）によって算出した。モデル（およびＲＮＡ選択法）あたりのＡＵＣを、モデルにおけるＲＮＡ数の関数としてプロットした。モデルあたりのＲＮＡの最適数を、グラフ的に決定した。ＲＯＣ曲線およびコンフュージョンマトリックスを生成して、本発明者らのモデルの予測性能を評価した。ＡＵＣ、精度、感度、特異度、正および負の予測値の値を報告する。
【０２０２】
ｌｎｃＲＮＡの定量化のためのさらなる方法
全ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、製造業者の指示書に従って、それぞれ、Ｐａｘｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａミニキット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ、Ｃａｎａｄａ）を使用して抽出した。ＲＮＡの品質を、ＲＮＡ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）と共にＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で検査した。ＲＮＡ量を、ＲＮＡ高感度キット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＱｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計上で測定した。
【０２０３】
ｃＤＮＡ合成
製造業者の指示書に従って高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、逆転写を実施した。
【０２０４】
ｑＰＣＲ定量化
ｌｎｃＲＮＡを、ｑＰＣＲの前に予め増幅させた。予備増幅反応物を、ｌｎｃＲＮＡに対応する０．１Ｘ（１００ｎＭ）のそれぞれのプライマー対を含むＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ予備増幅マスターミックスを使用して調製した。１６回の予備増幅サイクルを、供給業者によって公に宣言されたように実施した（５０℃で２分、９６℃で１０分、９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクル）。生体試料の定量的ＰＣＲを、ＴＥ緩衝剤中に１／２０に希釈された１μｌの予備増幅産物、５μｌの２ｘ  Ｓｏａｄｖａｎｃｅｄ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）および２５０ｎＭの各プライマーを含む全量１０μｌ中で行った。サイクリング条件は、９５℃で５〜１０分、次いで、９５℃で１０〜３０秒および６０℃で３０〜６０秒の４０サイクルであった。融解曲線分析（６０℃〜９９℃）を、温度プロファイル後に実施して、増幅における特異性を確保した。相対発現レベルを、ＣＦＸ  ｍａｅｓｔｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）を使用して、５対数尺度で実現した標準曲線に対して決定した。
【０２０５】
ＱＵＡＮＴＡＭＡＴＲＩＸ  ＦＩＭＡＰ定量化
また、目的のｌｎｃＲＮＡを、Ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ（Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）によって開発されたＦＩＭＡＰ／ＱＭＡＰプラットフォームを使用して定量した。簡単に述べると、ｌｎｃＲＮＡを、化学的に改変されたｑＰＣＲと同じ配列を有するプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。フォワードプライマーを５’でリン酸化し、リバースプライマーを５’でビオチン化した。多重化ＰＣＲ反応を、２μｌのｌｎｃＲＮＡ  ｃＤＮＡ、２５０ｎＭの各プライマーおよび１０μｌの２Ｘ  Ｏｎｅ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ２Ｘマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有する２０μｌの反応液中、以下の条件：９４℃で３０秒、９４℃で３０ｓ、６０℃で１分および６８℃で１分の２５サイクル、次いで、６８℃で５分の最終伸長を用いて、Ｂｉｏｒａｄ  Ｔ１００サーモサイクラー上で実施した。次いで、ＰＣＲ産物を、３７℃で３０分間、２５Ｕのラムダエキソヌクレアーゼで消化して、リン酸化された鎖を除去し、ビオチン化された鎖のみを保持した。そのように消化された産物を、目的のＲＮＡと相補的なオリゴで被覆したコードされたシリカマイクロディスクを使用してＱＭＡＰ上で定量した（標的オリゴあたり１個のコード）。簡単に述べると、ビオチン化されたＰＣＲ産物を、９６ウェルプレート中、被覆されたマイクロディスクと共にインキュベートし、ハイブリダイズされた産物を、洗浄工程後、蛍光ストレプトアビジンコンジュゲート、ＳＡＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加によって示した。プレートを、スポットあたり２つの画像：蛍光を定量するための１つの暗い画像およびマイクロディスクコードを読み取るための１つの明白色の画像を撮るＱＭＡＰ上で画像化した。次いで、それぞれの標的相対発現を、関連するマイクロディスクコードに従って蛍光シグナルを各標的に割り当てることによって、ＱＭＡＰソフトウェアによって算出する。
【０２０６】
また、ｌｎｃＲＮＡを、特異的プライマーを使用するｑＰＣＲによって測定した。このために、全ＲＮＡを最初に抽出し、特異的プライマーを使用する逆転写およびリアルタイムＰＣＲを実施した。被覆されたマイクロディスク上のＰＣＲ産物の、検出プローブに結合した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づく特許権のあるプラットフォームである、ＦｉＭＡＰ（Ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ  ＱＭＡＰプラットフォームおよび新しい完全自動化バージョンのＱＭＸとも呼ばれる）を使用する。全ＲＮＡを抽出した後、ｌｎｃＲＮＡに対する特異的プライマーを使用するいくつかの標的の多重化を可能にする、逆転写およびＰＣＲ工程を行った。
【０２０７】
ｌｎｃＲＮＡを定量することができる多重化されたプラットフォームとしてのＦｉＭＡＰの効能を示すために、血漿試料を、ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、ＣｅｌｅｍｉｃｓおよびＦｉＭＡＰを使用して試験した。多くのｌｎｃＲＮＡは、それらが、既知の参照ｌｎｃＲＮＡ２０３２１に関して参照ｑＰＣＲ法を使用する場合に、得られる非常に同等の結果を伴って、ＱＭＡＰ上で良好に定量され、ＱＭＡＰ上で用量依存的様式で測定される入力ＲＮＡ濃度に応じた希釈線形性と共に定量的であることを示した。
【０２０８】
それぞれのｌｎｃＲＮＡに特異的なコードされたマイクロディスクを使用するＦｉＭＡＰプラットフォーム上で実施された定量化は、多重化試験プラットフォームにとって適切なものであった。
【０２０９】
Ｃｅｌｅｍｉｃｓの説明
Ｃｅｌｅｍｉｃｓは、磁気ビーズと共に選択されたｌｎｃＲＮＡとハイブリダイズする１２０のヌクレオチドの捕捉プローブを使用する標的シーケンシング手法に基づく。捕捉工程は、上記のライブラリー調製後に実施される。簡単に述べると、１００ｎｇのライブラリーＤＮＡを、５．６μｌのブロックミックスと混合した３．４μｌの容量で使用する。次いで、７μＬの捕捉ライブラリーおよび１３μＬのハイブリダイゼーション緩衝剤を、９μｌのＤＮＡライブラリー調製物と混合し、６５℃で２４ｈインキュベートする。インキュベーション後、５０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍｙｏｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１を、２００μｌの洗浄緩衝剤＃１と混合し、ハイブリダイゼーション混合物に添加する。磁気条件下で上清を除去した後、５００μｌの洗浄緩衝剤＃２を添加し、分離機を使用して除去し、洗浄緩衝剤＃３で３〜６回洗浄した後、溶出のために３０μｌのヌクレアーゼ非含有水を添加する。次いで、ビーズ上で、捕捉されたＤＮＡ（１５μｌ）、ＰＣＲ捕捉後プライマー（５μｌ）、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（２５μｌ）およびヌクレアーゼ非含有水（５μｌ）を混合するＰＣＲを使用して１６サイクルにわたってライブラリーを増幅し、シーケンシングの前にＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して試料を精製する。全てのライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００（２ｘ７５ｂｐ）を用いて配列決定する。
【０２１０】
結果
ＬＮＣｉｐｅｄｉａ  ｖ５．２に基づく１２７，８０２の転写物のプロファイリングを、全ＲＮＡ−ｓｅｑ技術を使用して、アルツハイマー病に罹患している患者および認知的にインタクトな健康な対象に由来する血清試料上で実施した。上記の１２７，８０２の転写物のうち、１群の試料の少なくとも半分において１０ＣＰＭを超える発現レベルで１９８６７のｌｎｃＲＮＡが同定された。
【０２１１】
１９８６７の血清ｌｎｃＲＮＡのうち、アルツハイマー病の診断にとって有用な１００８のｌｎｃＲＮＡの一覧を、統計的有意性（ｐ値＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）に基づいて選択した。ランダムフォレストアルゴリズムを、分類化モデルのために使用した。これから、高い予測値を有する２〜２０のｌｎｃＲＮＡのいくつかのセットを同定した。選択された２〜２０のｌｎｃＲＮＡのセットは、０．７から最大で１までの範囲のＡＵＣ、０．７〜１の範囲の精度、感度および特異度を提供する。
【０２１２】
合計で１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡが、ディープシーケンシング実験から、５のＡＤ症例および１０のＨＣ例のヒト死亡後側頭葉内側部脳組織中での転写物再構築を使用してさらに同定された。これらの新規な１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡのプロファイリングを、全ＲＮＡｓｅｑ技術を使用して、ヒトＡＤ脳の群および健康な対照の脳の群に由来する同じ脳領域、側頭葉内側部上で実施した。これらの１０９１の新規脳転写物のうち、ＨＣ脳と比較してＡＤ脳において、２６が発現の欠損を示し、１６が過剰発現レベルを示した（Ｐ＜０．０５）。
【０２１３】
ＬＮＣｉｐｅｄｉａ  ｖ５．２に基づく１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡおよび１２７，８０２の転写物を含む合計１２８，８９３のプロファイリングを、５のＡＤ症例および５の健康な対照に由来する脳皮質（側頭葉内側部）上で、ならびに１２の対象、アルツハイマー病に罹患する６人の患者および６人の健康な対照に由来する血漿試料上で、ならびに５群：ＭＩＣ、軽度ＡＤ、中等度から重度のＡＤ、ＤＬＢまたはＦＴＤに罹患する患者および認知的にインタクトな健康な対照の対象に含まれる１３７人の対象に由来する全血（Ｐａｘｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ）試料上で全ＲＮＡ−ｓｅｑ技術を使用して実施した。
【０２１４】
全ての患者およびＨＣ群に由来するそれぞれの生体試料中で配列決定された１２８，８９３の転写物のうち、ｌｎｃＲＮＡを、その閾値発現レベル（試験した少なくとも１つの対象群の試料の少なくとも半分における５カウントパーミリオン（ＣＰＭ）を超える中央値）に基づいて同定した。１０１２２の脳ｌｎｃＲＮＡ、３７７４の血漿ｌｎｃＲＮＡおよび９３６７の全血ｌｎｃＲＮＡを、統計分析のために保持した。その結果、以下が示される：
【０２１５】
１−脳ｌｎｃＲＮＡパネル：脳において配列決定され、５ＣＰＭを超える発現レベルを有する１０１２２の脳ｌｎｃＲＮＡのうち：
−  本発明者らは、試験した全ての脳に関して、認知障害を含む脳障害のための新規治療および診断標的である、以前には記載されたことがない１０９１の新規ｌｎｃＲＮＡ（表７）の脳における発現を確認した。
−  本発明者らは、試験した全ての他の末梢臓器（肺、卵巣、結腸、前立腺、乳房、肝臓、膀胱、腎臓、皮膚、心臓、筋肉）と比較して、脳において少なくとも２倍高い発現レベルを示す８６０の脳で富化されたｌｎｃＲＮＡ（表１２）を同定した。これらの８６０のｌｎｃＲＮＡは、認知障害を含む脳障害のための新しい治療および／または診断標的である。
−  本発明者らは、ＡＤ脳とＨＣ脳とを比較した場合に、統計的に有意な示差的発現を示す、４２の新規ｌｎｃＲＮＡを含む１２０２のｌｎｃＲＮＡ（表８）を同定した：これらの１２０２のｌｎｃＲＮＡは、具体的に、認知障害、特に、アルツハイマー病のための治療および／または診断候補である。
【０２１６】
２−血漿ｌｎｃＲＮＡパネル：保持された３７１４の血漿ｌｎｃＲＮＡのうち、本発明者らは、ＡＤ血漿試料と、ＨＣ血漿試料とを比較する場合に、統計的に有意な示差的発現（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を示す４１０の血漿ｌｎｃＲＮＡ（表９）を同定した：これらの４１０のｌｎｃＲＮＡは、認知障害、特に、ＭＣＩおよびアルツハイマー病の診断および治療応答モニタリング適用にとって有用なバイオマーカーの新規パネルである。
【０２１７】
３−血液ｌｎｃＲＮＡパネル：保持された９３６７の血液ｌｎｃＲＮＡのうち、本発明者らは、試験した対象群（ＨＣ、ＭＣＩ、軽度ＡＤ、中等度から重度のＡＤ、全てＡＤ、ＤＬＢ、ＦＴＤ）の少なくとも１つにおいて統計的に有意な示差的発現を示す２９８２の血液ｌｎｃＲＮＡ（表１０、表１１）を同定した（全群を比較するＡｎｏｖａ検定を使用する場合のｐ値＜０．０５およびＨＣ群と試験した患者集団群の１つとを比較するためのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用する場合のｐ値＜０．０５）。さらに、本発明者らは、０．８未満または１．２を超える倍率変化および０．６５を超える、または０．３５未満のＡＵＣなどの追加基準を適用して、表１０および表１１に列挙される２８４７のｌｎｃＲＮＡおよび１３６のｌｎｃＲＮＡを選択した。
【０２１８】
これらの２９８２の血液ｌｎｃＲＮＡは、認知障害、特に、ＭＣＩおよびＭＣＩとしてのアルツハイマー病、軽度ＡＤ、中等度から重度のＡＤ、ＤＬＢおよびＦＴＤおよび他の認知障害の診断、鑑別診断および治療応答モニタリング適用にとって有用な新規バイオマーカーおよびバイオマーカーシグナチャーである。
【０２１９】
循環ｌｎｃＲＮＡパネル（脳に共通であり、末梢体液中に存在する）：脳において配列決定された１０１２２のｌｎｃＲＮＡのうち、体液中で循環ｌｎｃＲＮＡとして以下の数が同定された：
−  血漿中の２０９６の循環ｌｎｃＲＮＡ：これらの２０９６のｌｎｃＲＮＡのうち、４６のｌｎｃＲＮＡのパネルは、ＨＣ対象群と比較してＡＤ患者群の血漿試料中で示差的発現を示し、統計的有意性（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を示し、全てのＡＵＣ値が０．８を超えるか、または０．２未満であった。これらの４６の示差的に発現される循環ｌｎｃＲＮＡのうち、１７は、０．９を超えるＡＵＣ値を有し、４つの候補はＡＵＣ値＝１を有し、かくして、ＡＤ患者と、健康な対照の対象とを完全に識別する。
−  血液試料（Ｐａｘ  ＲＮＡチューブ）中で検出され、かくして、末梢体液中で測定可能なｌｎｃＲＮＡの新規パネルとして同定された４９０２のｌｎｃＲＮＡ。これらの４９０２のｌｎｃＲＮＡのうち、３１０のｌｎｃＲＮＡのパネルは、ＨＣ対象群と比較して試験した５の患者群（ＭＩＣ、軽度ＡＤ、中等度から重度のＡＤ、ＤＬＢまたはＦＴＤ患者）の少なくとも１つの血液試料中で統計学的有意性（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）をもって示差的発現を示し、認知障害の診断および治療適用のための良好な候補である。−血清中に循環する５０５４のｌｎｃＲＮＡ。これらの５０５４のｌｎｃＲＮＡのうち、４３のｌｎｃＲＮＡは、統計的有意性（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）をもって、健康な群と比較してＡＤ群の血清中で示差的に発現される。かくして、本発明はまた、循環ｌｎｃＲＮＡが変化する任意の脳障害の治療および診断適用に使用するための、本発明の方法を使用して検出される、血漿、血液、血清または他の任意の非侵襲的な末梢体液中に循環する任意の一般的な脳／血漿および／もしくは一般的な脳／血液および／もしくは脳／血清ｌｎｃＲＮＡならびに／または脳で富化されたｌｎｃＲＮＡに関する。
【０２２０】
特に、本発明は、脳障害、特に、認知障害の治療および診断適用に使用するための表１〜１２に列挙されたｌｎｃＲＮＡのパネルに関する。
【０２２１】
本開示に開示されたｌｎｃＲＮＡの配列は、本出願に含まれる配列表に示される。
【図１】
2022501016.tif 000157
【図２】
2022501016.tif 000158
【図３】
2022501016.tif 000159
【図４】
2022501016.tif 000160
【図５】
2022501016.tif 000161
【図６】
2022501016.tif 000162
【図７】
2022501016.tif 000163
【図８】
2022501016.tif 000164
【図９】
2022501016.tif 000165
【図１０】
2022501016.tif 000166
【図１１】
2022501016.tif 000167
【図１２】
2022501016.tif 000168
【図１３】
2022501016.tif 000169
【図１４】
2022501016.tif 000170
【図１５】
2022501016.tif 000171
【図１６】
2022501016.tif 000172
【図１７】
2022501016.tif 000173
【図１８】
2022501016.tif 000174
【図１９】
2022501016.tif 000175
【配列表】
2022501016000001.app
【国際調査報告】
2022501016.tif 000176
2022501016.tif 000177
2022501016.tif 000178
2022501016.tif 000179
2022501016.tif 000180