【手続補正書】
【提出日】平成21年11月13日(2009.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲルの作製方法であって、該方法は、
ペプチドを含む溶液を提供する工程であって、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、工程と、
該溶液の１つ以上の特徴を変化させる工程であって、ここでヒドロゲルが形成される工程とを包含する、方法。
【請求項２】
前記特徴が、イオン強度、温度、特定のイオンの濃度、およびｐＨからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変化させる工程が、前記溶液を電磁放射と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変化させる工程が、前記溶液のｐＨを変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶液の１つ以上の特徴を変化させる工程により、塩濃度が約２０ｍＭ〜約４００ｍＭになる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記塩がＮａＣｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液のｐＨがｐＨ９未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液のｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液のｐＨが約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液のｐＨが約ｐＨ７．４である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドを含む、ヒドロゲルであって、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、ヒドロゲル。
【請求項１２】
さらに塩を含む、請求項１１に記載のヒドロゲル。
【請求項１３】
前記塩がＮａＣｌである、請求項１２に記載のヒドロゲル。
【請求項１４】
ヒドロゲルの作製のための、溶液の形態の組成物であって、該組成物は、ペプチドを含み、該溶液は、動物に注入された後に該動物内でヒドロゲルを形成し、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、組成物。
【請求項１５】
前記動物が哺乳動物である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記動物がヒトである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記溶液が、１つ以上の治療因子をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療因子が、低分子、ペプチド、タンパク質、および細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
治療因子を必要とする動物に治療因子を送達するための、溶液の形態の組成物であって、該組成物は、該治療因子および１つ以上のペプチドを含み、該溶液は、動物内に投与された後に該動物内でヒドロゲルを形成し、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、組成物。
【請求項２０】
前記動物が哺乳動物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記動物がヒトである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記治療因子が、低分子、ペプチド、タンパク質、および細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
治療因子を必要とする動物に治療因子を送達するための、ヒドロゲルの形態の組成物であって、該組成物は、該治療因子および１つ以上のペプチドを含み、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、組成物。
【請求項２４】
前記動物が哺乳動物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記動物がヒトである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記治療因子が、低分子、ペプチド、タンパク質、および細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
動物の創傷を処置するための、溶液の形態の組成物であって、該組成物は、ペプチドを含み、該溶液は、該創傷と接触するとヒドロゲルを形成し、該ペプチドが配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含む、組成物。
【請求項２８】
前記溶液が治療因子を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記動物が哺乳動物である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記動物がヒトである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記治療因子が、低分子、ペプチド、タンパク質、および細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
細胞を増殖させる方法であって、
細胞を含むヒドロゲルを形成する工程であって、該ヒドロゲルは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、工程と、
細胞生存に適切な条件下で該細胞を維持する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ヒドロゲルを形成する工程が、ペプチドを含む溶液の１つ以上の特徴を調整することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記調整される特徴が、ｐＨ、イオン強度、特定のイオンの濃度からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記調整される特徴がイオン強度である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記調整される特徴がＣａ２＋イオン濃度である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が動物細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が組換え体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記目的のタンパク質が抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が幹細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
ヒドロゲルを含むセンサであって、該ヒドロゲルは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、センサ。
【請求項４７】
前記ヒドロゲルの１つ以上の特徴が、該ヒドロゲルが目的の分析物と接触した場合に変化する、請求項４６に記載のセンサ。
【請求項４８】
前記変化した特徴が剛性である、請求項４７に記載のセンサ。
【請求項４９】
前記変化した特徴が光学的性質である、請求項４７に記載のセンサ。
【請求項５０】
環境条件を検出する方法であって、該方法は
ヒドロゲルを含むセンサを該環境条件を代表するサンプルと接触させる工程と、
該ヒドロゲルの１つ以上の特徴を決定する工程と
を包含し、該ヒドロゲルは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、方法。
【請求項５１】
前記ヒドロゲルの１つ以上の特徴が、該ヒドロゲルが目的の分析物と接触した場合に変化する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記変化した特徴が剛性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記変化した特徴が光学的性質である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒドロゲルの特徴と、異なる時間に決定した該ヒドロゲルの同一の特徴とを比較する工程をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
目的の分子を精製する方法であって、該方法は、
目的の分子および１つ以上の夾雑物を含む溶液を、目的の分子がヒドロゲルによって保持される条件下でヒドロゲルに接触させる工程と、
該ヒドロゲルから該目的の分子を回収する工程と
を包含し、該ヒドロゲルは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、方法。
【請求項５６】
前記目的の分子がタンパク質である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記目的の分子が抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記目的の分子が治療因子である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
目的の分子を精製する方法であって、該方法は
目的の分子および１つ以上の夾雑物を含む溶液を、少なくとも１つの夾雑物がヒドロゲルによって保持される条件下でヒドロゲルに接触させる工程と、
該目的の分子を回収する工程と
を包含し、該ヒドロゲルは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、方法。
【請求項６０】
前記目的の分子がタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記目的の分子が抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記目的の分子が治療因子である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
ヒドロゲル内に細胞をカプセル化する方法であって、該方法は、
ペプチドを含む溶液および細胞を含む溶液を提供する工程であって、該ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドを含む、工程と
該ペプチドを含む溶液の特徴が、ヒドロゲルが形成されるように変更される条件下で、該溶液を合わせる工程と
を包含する、方法。
【請求項６４】
前記変更される特徴が、ｐＨ、イオン強度および特定のイオンの濃度からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記変更される特徴がイオン強度である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記変更される特徴が、Ｃａ２＋イオン濃度である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が動物細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞が組換え体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記目的のタンパク質が抗体である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が幹細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞がヒト幹細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチドおよび細胞を含むヒドロゲルであって、該細胞が、該ヒドロゲル全体に均一に分布している、ヒドロゲル。
【請求項７８】
前記ペプチドは、配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶ−ＮＨ２からなる、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項７９】
前記細胞が動物細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８１】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８２】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８３】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８４】
前記細胞が組換え体である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８５】
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８６】
前記目的のタンパク質が抗体である、請求項８５に記載のヒドロゲル。
【請求項８７】
前記細胞が幹細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８８】
前記細胞がヒト幹細胞である、請求項７７に記載のヒドロゲル。
【請求項８９】
配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶを含むペプチド。
【請求項９０】
配列ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶ−ＮＨ２からなる、請求項８９に記載のペプチド。
【請求項９１】
請求項９０に記載のペプチドを含む、ヒドロゲル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【化１】
2009523118.tif 000001
上記で詳細に引用したアミノ酸に加えて、任意の上記ペプチドの任意の位置をＸで示した（各Ｘは、独立して、当業者に公知の任意の天然もしくは非天然アミノ酸（ＬまたはＤ立体化学）またはアミノ酸の任意のアナログであり得る）。本出願では、Ｄ立体化学を、Ｄアミノ酸の前の上付き文字で示す（したがって、ＤＰはＤ−プロリンである）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、一般式ＶＫＶＫＶＫＶＫ（ＸＸＸＸ）ａＫＶＫＶＫＶ（ＸＸＸＸ）ｂＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２（配列番号５）に適合し得る。本発明のこの実施形態の特定の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【化２】
2009523118.tif 000002
上記で詳細に引用したアミノ酸に加えて、任意の上記ペプチドの任意の位置をＸで示した（各Ｘは、独立して、当業者に公知の任意の天然もしくは非天然アミノ酸（ＬまたはＤ立体化学）またはアミノ酸の任意のアナログであり得る）。好ましくは、各（ＸＸＸＸ）ａおよび（ＸＸＸＸ）ｂは、ターン（例えば、β−ターン）を形成することができる配列を含み得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【化３】
2009523118.tif 000003
ｍおよびｎはそれぞれ独立して１〜１００であってよく、ｍはｎと等しくても等しくなくてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
一定の水素結合と比較して分子間表面および側面疎水性接触の形成への寄与を変化させるために、ＭＡＸ１に基づいたペプチドを調製することができる。このようなペプチドは、同数の残基を有し得るが、折り畳まれたヘアピンの疎水性表面上に側鎖の疎水性が変化したアミノ酸を含む。したがって、折り畳みおよび自己集合の間に形成された可能な分子内および分子間水素結合の数は一定であるが、疎水性面の表面積が変化している。調製することができるペプチドの例には、以下の一般的配列のペプチドが含まれるが、これらに限定されない：ＸＫＸＫＸＫＸＫＶＤＰＰＴＫＸＫＸＫＸＫＸ−ＮＨ２（式中、Ｘ＝バリン（ＭＡＸ１）；Ｘ＝イソロイシン（ＭＡＸ３４）；およびＸ＝フェニルアラニン（ＭＡＸ３３））。分子モデリング（Ｉｎｓｉｇｈｔ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）は、これらのペプチドの表面積はＭＡＸ１＜ＭＡＸ３４＜ＭＡＸ３３の順で増加することを示す。表面積の変化は、ヒドロゲルの種々のパラメーターに影響を及ぼし、例えば、ＣＤによってモニタリングしたところ、各ペプチドが折畳まれて自己集合する温度（Ｔｇｅｌ）を減少させることができる（図９を参照のこと）。また、各ペプチドの流動学的性質は異なっていて良く、より疎水性の高いペプチドによりより強固なヒドロゲルを得ることができる。さらに、ヒドロゲル化速度が影響を受ける可能性があり、ペプチドの疎水性が高いほどより迅速にヒドロゲルが形成される。ヒドロゲル化速度を、流動学によって決定することができる（図１２を参照のこと）。Ｃｒｙｏ−ＴＥＭを使用して、これらのデザインの変化がヒドロゲルのナノスケールの構造に影響を与えるかどうかを決定することができ（例えば、疎水性表面積が増加するにつれて、自己集合状態の微小繊維間の接合数が増加し得る）、ＬＳＣＭを使用してマイクロスケールの構造の変化（例えば、ゲル多孔性の変化）を評価することができる。折り畳まれたペプチドの疎水性面から出ているアミノ酸残基の性質および数の変化および／または折り畳まれたペプチドの疎水性面から出ている機能的部分の性質および数の変化を使用して、形成されたヒドロゲルの材料特性を変化させることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【化Ａ】
2009523118.tif 000004
（ＭＡＸ１の配列を有するが、太字の位置にＮαブチル化リジン残基を含む）。当業者は、アミノ酸残基および／またはアミノ酸残基に付加した機能的部分の変化により、分子間水素結合の形成能力を調整された（増加または減少）他のペプチドを構築することができることを容易に認識する。ヒトアミリンの微小繊維への自己集合がＮ−ブチル残基を含むペプチドによって阻害されていることが公知である。ＣＤ分光法および流動学を使用して、これらのペプチドが種々の折り畳み条件下で折り畳まれてヒドロゲルに自己集合する能力を評価することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
１つの特定の実施形態では、４残基のターン（−ＶＤＰＰＴ−）を、−ＤＲＫＡＤＧＹＩＤＦＥＥ−と置換して、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＲＫＡＤＧＹＩＤＦＥＥＶＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２（配列番号１４）を得るＭＡＸ１の変異形が形成される。このペプチドは、金属の非存在下で不規則構造であるが、Ｃａ（ＩＩ）の結合後に迅速な折り畳みおよび自己集合が起こる。配列ＤＲＫＡＤＧＹＩＤＦＥＥは、トロポニンＣのＥＦハンドドメイン内に含まれるカルシウム結合ループに対応する。下線を引いた残基は、側鎖および主鎖カルボニルの両方を介してＣａ（ＩＩ）に結合してエクアトリアル位の１つを占める水を有する五角両錐形構造が得られる。重要なことには、この線形ペプチドが低ｍＭ  ＫｄでＣａ（ＩＩ）と結合することができ、この結合事象により構造が形成されることが示されている。トロポニンＣの結晶構造は、カルシウム結合ループのＮ末端およびＣ末端残基が約６Å以内であり、これらの末端残基が二面角を採用して逆平行シートの形成を促すことを示す。実際、このデザインしたペプチドを使用して、明示的溶媒（ｅｘｐｌｉｃｉｔ  ｓｏｌｖｅｎｔ）を使用したエネルギー最小化および力学的刺激を行い、この金属結合ループがＭＡＸ１の状況下でβ−ヘアピン構造の核となるように幾何学的に十分に適合していることが示された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
実施例２
間葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０ｔ１／２のカプセル化
２ｍｇのＨＰＬ８（ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＫＶ−ＮＨ２）を含むバイアルに、約２５℃で９０μＬの蒸留水を添加し、８チャンバー共焦点プレートに移し、そのときに、９０μＬの２×ＤＭＥＭを添加し、細胞のカプセル化に最適な均質な溶液を確実にするようにやさしくピペッティングした。直ちに、２０μＬのＤＭＥＭ（血清なし）中の１００，０００  細胞／ｍＬのストック溶液を、このＤＭＥＭ／ＨＰＬ８混合物に添加し、均質性を確実にするためにやさしく混合し、２０，０００細胞を含む１重量％ＨＰＬ８ヒドロゲルを生じた。このヒドロゲルを３７℃および５％ＣＯ２で１５分間インキュベートし、自己持続性（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）材料を確実にした。この時間の後、１０％ＦＢＳを含有する４００μＬのＤＭＥＭをヒドロゲルの頂部に添加し、栄養素を拡散させた（培地は、２４時間後に新しくした）。