(57)【要約】  本発明は、グルタミン合成酵素の投与による脂肪肝疾患の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝疾患ならびに肝炎、線維症、肝硬変およびがんを含む関連する肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのグルタミン合成酵素（ＧＳ）。
【請求項２】
ＧＳが、肝臓の脂肪沈着を低減もしくは排除する、および／または肝細胞もしくは組織の線維症を好転させる、請求項１に記載の脂肪肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳ。
【請求項３】
ＧＳがタンパク質である、またはＧＳタンパク質をコードする核酸分子として提供される、請求項１または請求項２に記載の対象における脂肪肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳ。
【請求項４】
ＧＳが、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳ。
【請求項５】
対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するための、ＧＳと組み合わせて使用するためのアンモニア低下剤。
【請求項６】
脂肪肝疾患が後天性脂肪肝疾患、例えばＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、線維症、急性肝不全、肝硬変または肝臓がんである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の、脂肪肝疾患を治療もしくは予防する方法において使用するためのＧＳ、または対象における脂肪肝疾患の治療もしくは予防において使用するためのＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項７】
脂肪肝疾患が遺伝子由来である、好ましくは脂肪肝疾患が尿素サイクル異常症（ＵＣＤ）、有機酸血症（ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃａｄｅｍｉａ）および／またはグルタミン合成酵素欠損が原因で生じる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、脂肪肝疾患を治療もしくは予防する方法において使用するためのＧＳ、または対象における脂肪肝疾患の治療もしくは予防において使用するためのＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項８】
対象が、好ましくは尿素サイクル異常症（ＵＣＤ）から生じる、遺伝子由来である脂肪肝疾患を有する、および／または糖原貯蔵障害もしくはクリスチャン・ウェーバー病から選択される遺伝性障害を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するための、アンモニア低下剤と組み合わせてもよいＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項９】
対象が、糖尿病、肥満、栄養失調、過剰なアルコール摂取、および薬物使用からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１０】
ＧＳがタンパク質であり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、もしくはその酵素的に活性な断片である；またはＧＳが、ＧＳタンパク質をコードする核酸分子もしくはその生物学的に活性な断片もしくは変異体であり、発現ベクターで提供される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳ。
【請求項１１】
ＧＳタンパク質が、例えばタンパク質、ペプチド、非タンパク質ポリマーまたはアフィニティータグから選択される部分に連結され、好ましくは部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１２】
ＰＥＧが、タンパク質のＮ末端でＧＳタンパク質に連結され、好ましくはＧＳタンパク質が、ペプチドリンカーまたは化学結合を介して部分に連結されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１３】
ＧＳタンパク質が、共有結合を介して部分に連結されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１４】
ＧＳタンパク質が、対象への全身投与、好ましくは皮下または静脈内投与に適した形態である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１５】
ＧＳが、タンパク質の多量体型を含む調製物として提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１６】
ＧＳタンパク質が単量体型で提供される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１７】
アンモニア低下剤が、窒素捕捉剤（例えば、フェニル酢酸ナトリウム）、イオン交換樹脂（例えばＲｅｌｙｐｓａ）、アンモニア吸収体（リポソームベースのアンモニア吸収体のような、例えばＶｅｒｓａｎｔｉｓ）、アンモニアを除去する操作されたマイクロバイオーム（例えばＳｙｎｌｏｇｉｃ）、または抗生物質（例えば、リファキシミン）およびラクツロースの使用などの腸アンモニア解毒方法からなる群から選択される、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１８】
アンモニア低下剤が窒素捕捉剤であり、窒素捕捉剤が、フェニル酢酸の薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容されるプロドラッグ、フェニル酪酸の薬学的に許容される塩、その薬学的に許容されるプロドラッグ、グリセロールフェニル酪酸、その薬学的に許容されるプロドラッグ、安息香酸の薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容されるプロドラッグ、およびアンモニア結合樹脂からなる群から選択される、請求項１６に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組みわせたアンモニア低下剤。
【請求項１９】
フェニル酢酸の薬学的に許容される塩がフェニル酢酸ナトリウムである、請求項１８に記載の対象における脂肪肝疾患の治療または予防において使用するためのＧＳ、またはＧＳと組み合わせた窒素捕捉剤。
【請求項２０】
対象における脂肪肝疾患を治療もしくは予防する方法において使用するための、ＧＳおよびアンモニア低下剤またはそのアミノ酸もしくは尿素サイクル中間体もしくはその類似体を含むキット。
【請求項２１】
アンモニア低下剤が、窒素捕捉剤、イオン交換樹脂（例えばＲｅｌａｐｓａ）、アンモニア吸収体（リポソームベースのアンモニア吸収体のような、例えばＶｅｒｓａｎｔｉｓ）、アンモニアを除去する操作されたマイクロバイオーム（例えばＳｙｎｌｏｇｉｃ）、リファキシミンおよびラクツロースからなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
窒素捕捉剤が、請求項１８に定義された通りである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
脂肪肝疾患が、請求項６〜８に定義された通りである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
ＧＳが、請求項３または９〜１３のいずれか１項に定義された通りである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
肝臓の脂肪沈着および／または線維症の低減または排除による対象における脂肪肝疾患を治療する方法であって、前記対象にＧＳを投与することを含む方法。
【請求項２６】
アンモニア低下剤を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象へのグルタミン合成酵素（ＧＳ）およびアンモニア低下剤の同時、連続またはその後の投与を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、脂肪肝疾患を有するまたは罹患しやすいと前もって診断されている、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＳが、請求項３または１０〜１６のいずれか１項に定義された通りである、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
脂肪肝疾患が、請求項６〜８のいずれか１項に定義された通りである、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
対象が、請求項９に定義された通りである、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
アンモニア低下剤が、請求項１７〜１９のいずれか１項に定義された通りである、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＳが組成物として提供される、脂肪肝疾患を治療する方法において使用するためのＧＳ。
【請求項３４】
組成物が医薬品またはサプリメントである、請求項３３に記載の方法において使用するためのＧＳ。
【請求項３５】
脂肪肝疾患の治療において使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクター、および脂肪肝疾患の治療において使用するために、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクターからなる群から選択される発現ベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝疾患の治療のためのグルタミン合成酵素の使用に関する。グルタミン合成酵素を含む医薬組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
健康な肝臓は、典型的には脂肪を含有しない、またはほとんど含有しない。初期段階のアルコール性および非アルコール性肝疾患はいずれも肝臓の脂肪沈着の出現を特徴とする。過剰なアルコール摂取に起因するアルコール関連肝臓疾患（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＲＬＤ）は、脂肪沈着の出現から未治療のままでいる場合、肝炎、および肝硬変へと重症度が増す。最も重症になると、ＡＲＬＤは肝臓がんに進行する場合がある。同様に、非アルコール関連脂肪肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）は、典型的には過体重または肥満の人の肝臓で脂肪が増大することで始まる。ＮＡＦＬＤもまた、肝臓の脂肪肝沈着から肝臓の線維症、瘢痕化および肝硬変まで数段階の重症度がある。現在、アルコール摂取量の変更ならびに食事および生活習慣の修正を除けば、脂肪肝疾患に対する治療はない。
【０００３】
脂肪肝疾患は、脂肪症または単純脂肪症と呼ばれることがある。脂肪の蓄積は炎症を伴う場合がある。これは、脂肪性肝炎として知られる状態であり、単純脂肪肝または単純脂肪症より進行性である。
【０００４】
ＮＡＦＬＤは代謝的要因に起因し得、そのいくつかは糖原病、ウェーバー・クリスチャン病等などの遺伝的原因を有し得る。他の原因としては、低栄養、栄養失調、ならびに化学療法および抗レトロウイルス療法を含む薬物または毒物の使用が挙げられる。
【０００５】
脂肪肝疾患の病態は、肝細胞の核の周囲に小さな脂肪空胞の出現によって代表される。空胞のサイズが大きくなるにつれて、核が細胞の周辺に押され、細胞は印環状の見た目を呈し得る。脂肪は組織を処理する間に溶解することから、空胞はしばしば空に見える。癒着している大きな空胞は、不可逆性と考えられる嚢胞を形成する場合がある。
【０００６】
状態の管理はまた、タンパク質および／または窒素摂取量ならびにカロリーの非経口摂取量の管理を含む、タンパク質摂取量を制限し、適正な栄養摂取量を確保するための食事コントロールも含み得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、状態の治療および管理の改善にもかかわらず、現在の療法は非特異的であり、状態の管理に必ずしもうまく成功していない。それ故に、脂肪肝疾患に対するさらなるまたは改善された療法が引き続き必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、このニーズに対処しようとするものであり、グルタミン合成酵素を使用して脂肪肝疾患を治療するという概念に基づく。
【０００９】
特に、本発明は、対象の肝臓の脂肪沈着量を低減して脂肪肝疾患を治療するのに使用するためのグルタミン合成酵素を提供する。グルタミン合成酵素は、遺伝子療法としての核酸分子として対象に提供されてもよい。あるいは、グルタミン合成酵素は、タンパク質療法として投与されてもよい。
【００１０】
グルタミン合成酵素（ＧＳ）は反応を触媒する：
グルタミン酸＋ＡＴＰ＋ＮＨ３→グルタミン＋ＡＤＰ＋リン酸。
【００１１】
本発明は、グルタミン合成酵素の投与が、肝細胞中の脂肪肝の症状を好転させるという驚くべき観察に基づく。具体的には、グルタミン合成酵素は、肝細胞の脂肪沈着を低減または排除する効果を有することが示された。
【００１２】
本発明はまた、グルタミン合成酵素の投与が、肝組織の線維症の進行を防ぐという驚くべき観察にも基づく。具体的には、グルタミン合成酵素は、肝組織の線維症を低減または排除する効果を有することが示された。
【００１３】
グルタミンは、腸透過性の維持および免疫機能を含む数多くの機能を有する重要なアミノ酸であり、腸透過性の維持および免疫機能は両方とも、ＮＡＦＬＤの治療におけるグルタミンシンターゼのこの予想外の観察された作用に寄与している可能性がある。
【００１４】
さらに、ＧＳおよびアンモニア低下剤（窒素捕捉剤、例えば、フェニル酢酸ナトリウムなどのフェニル酢酸の薬学的に許容される塩などの）の併用には相乗効果があり、肝臓の脂肪沈着を低減または排除するＧＳの能力をさらに高め得る。
【００１５】
したがって、１つの態様において本発明は、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するためのグルタミン合成酵素（ＧＳ）を提供する。ＧＳは、肝細胞または組織の脂肪沈着などの脂肪肝疾患の細胞影響を低減または改善し、それ故に肝組織の脂肪肝疾患、特に単純脂肪肝疾患の進行を好転させ、または予防する。したがって、本発明は、脂肪肝疾患ならびに肝炎、線維症、肝硬変およびがんを含む関連する肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳを提供する。
【００１６】
適切な実施形態において、ＧＳは、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するために提供され、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するために提供されてもよい。
【００１７】
別の態様において、本発明は、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するために、ＧＳと組み合わせて使用するためのアンモニア低下剤を提供する。
【００１８】
本発明の関連する態様はまた、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療のための組成物（例えば医薬組成物または栄養組成物、例えば医薬品またはサプリメント）の製造のためのＧＳの使用も提供する。
【００１９】
適切な実施形態において、組成物は、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するためのものであってもよい。
【００２０】
本発明のさらなる態様はまた、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療のためにＧＳと組み合わせて使用する組成物を製造するためのアンモニア低下剤の使用も提供する。
【００２１】
さらなる態様において本発明は、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用する組成物を製造するためのＧＳおよびアンモニア低下剤の使用を提供する。
【００２２】
さらなる態様において本発明は、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による対象における脂肪肝疾患を治療する方法であって、前記対象（より具体的には、それを必要とする対象）にＧＳを投与することを含む方法を提供する。適切な実施形態において、方法は、アンモニア低下剤を投与することをさらに含む。適切な実施形態において、方法は、前記対象へのグルタミン合成酵素（ＧＳ）およびアンモニア低下剤の同時、連続またはその後の投与を含んでもよい。本発明の方法は、脂肪肝疾患を有する対象を診断するステップを含んでもよい。本発明の方法は、脂肪肝疾患を有する対象を治療中および治療後にモニタリングすることを含んでもよい。
【００２３】
対象に対する肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するためのＧＳを含む組成物も提供される。
【００２４】
適切には、ＧＳを含む組成物は、医薬組成物または栄養組成物、例えば医薬品またはサプリメントであってもよい。適切には、組成物は、アンモニア低下剤をさらに含んでもよい。
【００２５】
本発明はまた、ＧＳおよびアンモニア低下剤を含む組成物に関する。
【００２６】
適切には組成物は、医薬組成物または栄養組成物であってもよい。適切には、組成物は、肝臓の脂肪沈着の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するためのものであってもよい。
【００２７】
別の態様において、本発明は、脂肪肝疾患の治療において使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクター、および脂肪肝疾患の治療において使用するために、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクターからなる群から選択される発現ベクターを含む細胞を提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクター、およびさらなる治療剤を含むキットを提供する。適切には、さらなる治療剤は、脂肪肝疾患に対して有効である薬剤であってもよい。適切には、脂肪肝疾患に対して有効である薬剤は、アンモニア低下剤またはそのアミノ酸もしくは尿素サイクル中間体である。キットは、脂肪肝疾患を治療する方法において使用するために提供されてもよい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、脂肪肝疾患の治療において個別、同時または連続使用するための組み合わせ調製物として、ＧＳおよびさらなる治療剤を含む生成物を提供する。適切には、さらなる治療剤は、脂肪肝疾患に対して有効である薬剤であってもよい。適切には高アンモニア血症に対して有効である薬剤は、アンモニア低下剤またはそのアミノ酸もしくは尿素サイクル中間体である。より適切には、さらなる治療剤は窒素捕捉剤である。
【００３０】
別の態様において、本発明は、肝臓の線維症の低減または排除による後期脂肪肝疾患の治療において使用するためのグルタミン合成酵素（ＧＳ）を提供する。したがって、ＧＳは、脂肪肝疾患、特に進行期または後期脂肪肝疾患および肝硬変の進行を好転させ、または予防する。したがって、本発明は、肝臓の線維症の低減または排除により肝炎、線維症、肝硬変およびがんを含む後期脂肪肝疾患を治療または予防する方法において使用するためのＧＳを提供する。
【００３１】
適切な実施形態において、組成物は、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するためのものであってもよい。
【００３２】
別の態様において、本発明は、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するために、ＧＳと組み合わせて使用するためのアンモニア低下剤を提供する。
【００３３】
本発明の関連する態様はまた、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療のための組成物（例えば医薬組成物または栄養組成物、例えば医薬品またはサプリメント）の製造のためのＧＳの使用を提供する。
【００３４】
適切な実施形態において、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療のために、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するための組成物（例えば医薬組成物または栄養組成物、例えば医薬品またはサプリメント）の製造のためのＧＳの使用が提供されてもよい。組成物は、ＧＳおよびアンモニア低下剤の併用、同時、個別または連続投与用であってもよい。
【００３５】
本発明のさらなる態様はまた、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療のために、ＧＳと組み合わせて使用するための組成物の製造のためのアンモニア低下剤の使用も提供する。
【００３６】
さらなる態様において本発明は、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するための組成物の製造のためのＧＳおよびアンモニア低下剤の使用を提供する。
【００３７】
さらなる態様において本発明は、肝臓の線維症の低減または排除による対象における脂肪肝疾患を治療する方法であって、前記対象（より具体的には、それを必要とする対象）にＧＳを投与することを含む方法を提供する。適切な実施形態において、方法は、アンモニア低下剤を投与することをさらに含む。適切な実施形態において、方法は、前記対象へのグルタミン合成酵素（ＧＳ）およびアンモニア低下剤の同時、連続またはその後の投与を含んでもよい。本発明の方法は、脂肪肝疾患を有する対象を診断するステップを含んでもよい。本発明の方法は、脂肪肝疾患を有する対象を治療中および治療後にモニタリングすることを含んでもよい。
【００３８】
肝臓の線維症の低減または排除による対象に対する脂肪肝疾患の治療において使用するためのＧＳを含む組成物も提供される。
【００３９】
適切には、ＧＳを含む組成物は、医薬組成物または栄養組成物、例えば医薬品またはサプリメントであってもよい。適切には、組成物は、アンモニア低下剤をさらに含んでもよい。
【００４０】
本発明はまた、ＧＳおよびアンモニア低下剤を含む組成物にも関する。
【００４１】
適切には組成物は、医薬組成物または栄養組成物であってもよい。適切には、組成物は、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するためのものであってもよい。
【００４２】
別の態様において、本発明は、脂肪肝疾患の治療において使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクター、および肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において使用するために、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するための、グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする発現ベクターからなる群から選択される発現ベクターを含む細胞を提供する。
【００４３】
別の態様において、本明細書に定義されるキットは、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患を治療する方法において使用するために提供されてもよい。
【００４４】
別の態様において、本発明は、肝臓の線維症の低減または排除による脂肪肝疾患の治療において個別、同時または連続使用するための組み合わせ調製物として、ＧＳおよびさらなる治療剤を含む生成物を提供する。適切には、さらなる治療剤は、脂肪肝疾患に対して有効である薬剤であってもよい。適切には高アンモニア血症に対して有効である薬剤は、アンモニア低下剤またはそのアミノ酸もしくは尿素サイクル中間体である。より適切には、さらなる治療剤は窒素捕捉剤である。
【００４５】
本発明は、後天性または遺伝性脂肪肝疾患を有する対象の治療に使用されてもよい。対象は、尿素サイクル異常症（ＵＣＤ）に関連する遺伝性（ｇｅｎｅｔｉｃ）（遺伝（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ））脂肪肝疾患を有し得る。対象は、尿素サイクル酵素または輸送体の欠損による遺伝性障害を有し得る。したがって、本発明は、脂肪肝疾患を有する対象の治療に関し、対象はＵＣＤ、または他の遺伝的高アンモニア血症（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、好ましくはオルニチントランスカルバミラーゼの欠損（すなわち、タンパク質の異常な発現をもたらすオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子の変異または遺伝子異常）を有する。ＵＣＤまたは他の遺伝的高アンモニア血症を有する対象は、脂肪肝疾患の症状、例えば肝細胞の脂肪沈着または肝組織の線維症を示し得る。対象は、糖原貯蔵障害またはクリスチャン・ウェーバー病（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｗｅｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）などの、脂肪肝疾患に関連する遺伝性障害を有し得る。対象は、後天性脂肪肝疾患を有し得、ならびに糖尿病、肥満、栄養失調、過剰なアルコール摂取、および薬物使用からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有し得る。対象は上述の状態の１つを有し得、脂肪肝疾患を発症するリスクがあると診断される。
【００４６】
本明細書に記載される本発明はまた、対象から除去された肝組織を、例えばエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）治療方法で治療することにも関する。
【００４７】
用語「ＧＳ」は、ＧＳタンパク質、またはＧＳタンパク質もしくはその活性断片をコードする核酸配列のどちらかを含み得る。本明細書ではＧＳは、その範囲内にタンパク質または核酸配列の任意の生物学的に活性な断片または変異体を含む。用語「ＧＳタンパク質」は、あるいは、「グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性を有するタンパク質」として表現することができる。用語「タンパク質」は、ペプチドおよびポリペプチド、ならびにタンパク質またはポリペプチド断片を含む任意のタンパク質性分子を含むように本明細書で広く使用される。以下により詳細に記載されるように、ＧＳタンパク質は、これが天然に現れる場合の（例えば、天然のまたは野生型ＧＳ）完全長のＧＳ酵素でなくても、または該ＧＳ酵素に対応しなくてもよく、切断されたまたは他の変異体が含まれる。また、含まれるのは、同様に以下により詳細に記載されるように、ＧＳタンパク質と他の分子とのコンジュゲート、または融合体である。
【００４８】
用語「脂肪肝疾患」は、脂肪沈着が肝細胞に存在するいずれかの状態を含む。そのような状態としては、ＡＲＬＤおよびＮＡＦＬＤを含む遺伝性または後天性脂肪肝疾患（脂肪症）、ならびに肝臓の炎症（ＮＡＳＨを含む脂肪性肝炎）、肝炎（アルコール性および非アルコール性）、肝硬変、線維症、および肝臓がんなどの脂肪肝疾患に由来する状態が挙げられる。本発明の態様は、肝臓の脂肪沈着を低減もしくは排除する、および／または肝臓の線維症もしくは瘢痕化を完全にもしくは部分的に好転させるのに使用することができる。本発明の態様はまた、脂肪肝疾患の進行を阻害または好転させる、例えば、単純脂肪肝から脂肪性肝炎（ＮＡＳＨを含む）、線維症、肝硬変、または肝臓がんへの疾患の進行を遅延または予防するのに使用することもできる。本発明の態様は、疾患の症状の好転、例えば脂肪肝および／または線維症の症状の好転による疾患の治療または予防に関する。したがって、本発明の態様は、肝臓の脂肪沈着および／または瘢痕化の低減または排除に関する。したがって、本発明の態様は、脂肪肝疾患ならびに肝炎、線維症、肝硬変およびがんを含む関連する肝疾患の治療または予防に関する。
【００４９】
脂肪肝疾患では、アンモニアレベルの上昇が観察され得る。故に、＞４０、６０もしくは７０もしくは８０μｍｏｌ／Ｌまたはそれ以上、例えば４１、４２、４５、５０、５５、６０、７０もしくは８０μｍｏｌ／Ｌまたはそれ以上の血漿（または血中）アンモニア濃度が観察され得る。例えば、正常なアニオンギャップおよび正常な血漿グルコース濃度と関連する＞１００μｍｏｌ／Ｌ、および特に１５０μｍｏｌ／Ｌ以上の血漿アンモニア濃度は、例えば尿素サイクル酵素（ＵＣＥ）の発現および／または活性の変化による脂肪肝疾患と関連している場合またはしていない場合がある。
【００５０】
脂肪肝疾患は、イメージング法、例えば超音波、ＣＴスキャン、またはＭＲＩ；当技術分野で周知のおよび使用される手法による、正常レベルより高いアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどの肝臓酵素に関する血液検査（例えば、血漿または血清または任意の血液由来試料の）；染色による肝組織のコラーゲン比例面積（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ  ａｒｅａ）の測定、または肝臓もしくは肝組織の脂肪沈着もしくは線維症もしくは瘢痕化などの症状を検出するための肝生検を使用して検出することができる。そのような決定および分析は、臨床評価、例えば肝機能検査等と組み合わせることができる。家族歴の調査ならびに／または分子遺伝学的検査および／もしく評価もまた行われ得る。したがって、本発明は、脂肪肝疾患、高アンモニア血症の症状、または脂肪肝（例えばＵＣＤ）もしくは高アンモニア血症をもたらす遺伝性障害について対象を診断するステップを含んでもよい。本発明の他の態様では、対象は、脂肪肝疾患を有する、または脂肪肝（例えばＵＣＤ）をもたらす遺伝性障害、もしくは脂肪肝疾患のより高リスクをもたらす状態、例えば糖尿病、肥満、栄養失調、過剰なアルコール摂取、もしくは薬物使用を有すると診断された者である。
【００５１】
本明細書では、内部名称ＡＭ−５３５はグルタミン合成酵素を指す。ＡＭ−５３５は、１つまたは複数のＮ末端リンカーを有する、およびポリ（ｈｉｓ）タグを有してもよいヒトＧＳを含み得る。ＡＭ−５３５は、ＧＳのペグ化バージョンを含んでもよい。ＡＭ−５３５は、実施例にさらに記載される。本明細書で使用される場合、本発明による使用のためのグルタミン合成酵素またはＧＳタンパク質への言及は、ヒトＧＳおよびヒト以外の動物（マウス、ウシ、ウサギ、ラット、サル、チンパンジー、およびイヌ等などの）由来、または例えば菌類、植物もしくは細菌を含む他の供給源由来のＧＳ、ならびに酵素的に活性な変異体を含む、酵素的に活性なＧＳの全ての形態への言及を含む。代表的なＧＳタンパク質としては、故に、配列番号１もしくは２もしくは４（それぞれヒトＧＳ、前駆体、成熟Ｎ末端タグ化型）に記載されたＧＳポリペプチド、または配列番号６［ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株３０ＳＣ由来のＧＳ］もしくは配列番号７［トウモロコシ、ゼア・マイス（Ｚｅａ  Ｍａｙｓ）由来のＧＳ］に記載されたＧＳポリペプチド、またはその酵素的に活性な断片と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するものが挙げられる。例えば、ＧＳへの言及はまた、Ｎおよび／もしくはＣ末端切断ポリペプチドまたはアミノ酸修飾タンパク質（例えば、アデニル化などの翻訳後修飾、またはタンパク質の構造もしくは活性に影響を与え得るアミノ酸多型などの他の修飾）も含み得る。ＧＳへの言及はまた、タンパク質の多量体も含み得る。用語「ＧＳタンパク質」は、故に、全ての天然型のＧＳ酵素またはポリペプチド、ならびにＧＳ酵素活性を保持する１つまたは複数のアミノ酸置換、付加（挿入および伸長を含む）または欠失を有する合成的に誘導および修飾されたポリペプチドを含む、その酵素的に活性な断片または変異体を含む。
【００５２】
ＧＳは、故に、酵素分類ＥＣ６．３．１．２の範囲内にある任意の酵素であってもよく、または該酵素に由来してもよい。ＧＳは、ＧＳ活性を有する任意のポリペプチドまたはペプチドであってもよい。ＧＳ活性は、例えば上記に示された反応スキームに従って、グルタミン酸およびアンモニアをグルタミンに変換する能力として定義することができる。ＧＳ活性は、当技術分野で公知のおよび文献に記載されたアッセイまたはテスト（例えば機能的活性アッセイ）を用いて評価または決定することができる。例えば、ＧＳ酵素活性アッセイは、Listrom et al, Biochem. J. 1997, 328, 159-163に記載されている。ＧＳ活性のアッセイはまた、以下の実施例にも記載されている（実施例２および４参照）。
【００５３】
ヒトＧＳは、３７３個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号１に示された）として発現される。これは、発現された場合の完全「前駆体」タンパク質に相当し、該タンパク質は、次いでアミノ酸２〜３７３を有する成熟型にさらにプロセシングされる（配列番号２に示された３７２個のアミノ酸の成熟タンパク質をインビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）もたらすようにＮ末端メチオニンのみが除去されている。配列番号３に記載された例示的なポリヌクレオチドは、配列番号１のポリペプチドをコードするｃＤＮＡに相当する。配列番号４は、以下の実施例で調製および使用されるように、Ｎ末端  Ｈｉｓタグおよびリンカー配列を備えた配列番号１のＧＳポリペプチドを含む、修飾されたヒトＧＳタンパク質に相当する。配列番号５は、以下の実施例で使用されるように、細菌における発現のためにコドン最適化された配列番号４のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
ヒトＧＳは、十分に特徴付けられている（例えばListrom et al., 1997、上記参照）。植物および細菌を含む他の生物由来のＧＳ酵素もまた同定されており、そのような他のＧＳ酵素の核酸およびアミノ酸配列は当技術分野で周知であり、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ヌクレオチド（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）およびタンパク質（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）データベースなどの自由に利用可能なデータベースで提供されている。植物または細菌のＧＳ酵素とヒトＧＳの間の配列同一性は低くなり得るが、構造的および機能的類似性は高い。したがって、植物もしくは細菌のＧＳ、もしくは実際に他の生物由来のＧＳ、またはそのアミノ酸配列変異体が使用され得る。代表的な例として、配列番号６は、ヒトＧＳと２３．８％の配列同一性およびラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）のＧＳと６１．９％の配列同一性を有する、ラクトバチルス・アシドフィルス株３０ＳＣ由来のＧＳのアミノ酸配列を記載し、ならびに配列番号７は、ヒトＧＳと５５．７％の配列同一性を有する、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）［トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、ゼア・マイス］由来のＧＳのアミノ酸配列を記載する。
【００５５】
ＧＳは、一般的に、複数（すなわち、２つ以上）の単量体サブユニットを含む多量体として生じる。例えば、上記に提供されたＧＳアミノ酸配列は、そのような単量体サブユニットに相当する。ヒトＧＳは、五量体または十量体（５または１０個のサブユニット）として最も高頻度で報告されている。本明細書で使用される場合、ＧＳは、単量体および／または多量体として提供され得る。多量体は、２つ以上の単量体サブユニット、例えば２〜２０個、２〜１６個、２〜１５個、２〜１４個または２〜１２個のサブユニットを含み得る。組換えＧＳは、五量体、十量体、もしくは他の多量体、または活性単量体として存在し得る。
【００５６】
本明細書で提供される方法において使用されるＧＳタンパク質は、得られたＧＳが酵素活性を示すことを条件として、組換え方法、タンパク質単離および精製方法、ならびに化学合成方法などの当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。したがって、ＧＳは、組換えＧＳ、組織から単離された天然のＧＳ、または化学的に合成されたＧＳであってもよい。
【００５７】
配列番号１に記載されたポリペプチドなどのＧＳポリペプチドを修飾して、本明細書で提供される方法において使用するための酵素的に活性なＧＳ変異体を生成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、当業者は、基質結合、または活性部位に関与する位置での修飾は、これらの重要な領域の外側の位置での修飾より耐用性が低い可能性があることを理解するであろう。任意のＧＳポリペプチドは、当技術分野で記載されているものなどの当技術分野で周知の方法を使用してテストすることができる。
【００５８】
ＧＳポリペプチドは、１つまたは複数のリンカーおよび／またはタグ配列に作動可能に連結されてもよい。リンカー配列は、適切には１〜３０個のアミノ酸、より適切には１〜２０個のアミノ酸、より適切には１〜１０個のアミノ酸の適切な任意のペプチド配列であってもよい。最も適切なリンカー配列は、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸長であってもよい。適切には、リンカー配列は、柔軟性を提供するグリシンおよび／またはセリン残基を含んでもよい。最も適切なリンカーは、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳであってもよい。ＧＳは、２つ以上のリンカーに作動可能に連結されてもよく、それらは同じであってもよく、または異なっていてもよい。適切には、１つまたは複数のリンカーは、ポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結（別のペプチド配列を介して直接的、または間接的に）されてもよい。２つ以上のリンカーが提供される場合、いずれか１つのリンカー配列は別のリンカーに作動可能に直接連結され、または介在配列を介して別のベクターに間接的に連結され得る。タグ配列は、適切にはタンパク質の単離のためのマトリックスに結合する、任意のペプチド配列であってもよい。適切なタグは当技術分野で公知であり、利用可能である。適切なタグとしては、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＳｔｒｅｐタグおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。ポリ（ｈｉｓ）タグは、ＨＨＨＨＨＨ、または任意の適切な数のＨｉｓ残基であってもよい。適切な実施形態において、本発明で使用されるＧＳ配列は、以下の立体配座：リンカー−タグ−リンカー−ＧＳで提供することができる。最も適切には、リンカーは、上記に定義された通りであってもよく、より適切にはＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳであってもよい。タグは、上記に定義された通りであってもよく、最も適切にはポリ（ｈｉｓ）タグであってもよい。最も適切には、ＧＳ配列は、ＧＧＧＳ−ポリ（ｈｉｓ）−ＧＧＧＧＳ−ＧＳとして提供されてもよい。適切には、ＧＳ配列は、ＧＧＧＳ−ポリ（ｈｉｓ）−ＧＧＧＧＳ−ヒトＧＳとして提供される。適切には、ヒトＧＳは配列番号１である。本明細書に定義されるＧＳタンパク質ならびに任意のリンカーおよび／またはタグ配列をコードする核酸配列もまた提供される。そのような核酸配列は、本明細書に記載されているベクターで提供されてもよい。
【００５９】
ＧＳが核酸分子として提供される場合、ＧＳは、ＧＳをコードする完全長天然配列、例えば、配列番号２に示される配列であってもよく、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体であってもよい。用語「生物学的に活性な」は、グルタミン酸をグルタミンに変換する能力を示すグルタミン合成酵素（配列番号１）をコードする核酸の断片または変異体を指す。配列番号１に記載のタンパク質は、配列番号２に記載の核酸配列によってコードされる。ＧＳまたはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする核酸分子は、ベクターで提供されてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
【００６０】
ベクターは、グルタミン合成酵素の生物学的に活性な断片または変異体をコードする配列番号２の断片または変異体を含み得る。
【００６１】
適切な実施形態において、ベクターは、アンモニア低下剤をさらにコードする。
【００６２】
用語「変異体」は、本明細書で使用される場合、配列番号１のポリペプチドの一次構造の変更を含むポリペプチドを指す。適切には、変異体は、配列番号１のポリペプチドと７０％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと８０％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと９０％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと９５％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと９６％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと９７％以上の同一性；配列番号１のポリペプチドと９８％以上の同一性；またはさらには配列番号１のポリペプチドと９９％以上の同一性を共有してもよい。変異体は、配列番号１に記載の配列に関して、配列番号１のポリペプチドと１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、またはさらには３０％以上異なっていてもよい。
【００６３】
用語「断片」は、本明細書で使用される場合、配列番号１のポリペプチドの一次構造の長さの変更を含むポリペプチドを指す。適切な断片は、配列番号１の完全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。実際に、適切な変異体は、配列番号１の少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。
【００６４】
適切な実施形態において、発現ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であってよい。例として、適切なウイルス性発現ベクターは、パラミクソウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、およびヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来し得る。他の適切なウイルスベクターは、当業者に公知であろう。
【００６５】
適切な非ウイルス性発現ベクターは、無機粒子発現ベクター（リン酸カルシウム、シリカ、および金などの）、脂質ベースの粒子発現ベクター（例えば、カチオン性脂質、脂質ナノエマルション、および固体脂質ナノ粒子）およびポリマーベースの粒子発現ベクター［例えば、ペプチド、ポリエチレンイミン、キトサン、およびデンドリマー（ｄｅｎｄｉｍｅｒｓ）］からなる群から選択されてもよい。他の適切な非ウイルス性発現ベクターは、当業者に公知であろう。
【００６６】
該用語はまた、それ自体ではＧＳ活性を示さないが、対象に投与すると活性なＧＳに変換され得る形態の、ＧＳタンパク質のプロドラッグも含む。
【００６７】
故に、本明細書で使用される場合、ＧＳタンパク質またはポリペプチドに関して「酵素的に活性な」は、グルタミンへのグルタミン酸およびアンモニアの変換を触媒することができるＧＳタンパク質またはポリペプチドを指す。典型的には、酵素的に活性なＧＳタンパク質またはポリペプチドは、配列番号１、２、４、６または７に記載されたＧＳポリペプチドの酵素活性の少なくともまたは約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を示す。
【００６８】
用語「対象」は本明細書で使用される場合、任意のヒトまたはヒト以外の動物を含み、例えばヒト、霊長類、家畜動物（例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験室テスト動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオン動物（例えばイヌ、ネコ）および捕獲野生動物（例えばキツネ、カンガルー、シカ）を含む、特に哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたは実験室テスト動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、状態もしくは症状を治すもしくは改善する、状態もしくは疾患の確立を予防する、またはさもなければ、状態もしくは疾患もしくは他の望ましくない症状の進行をいかなる方法であろうと予防する、妨げる、遅らせる、低減するもしくは好転させる、あらゆる使用を指す。具体的には、本発明では「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、肝臓の脂肪沈着を低減または排除して脂肪肝疾患の症状を完全にもしくは部分的に好転させることを意味する。このようにして、肝臓に存在するトリグリセリドの空胞は縮小し、または排除される。炎症、線維症または瘢痕化などの肝臓疾患の進行性症状もまた、完全にもしくは部分的に好転させることができる。故に用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」等は、その最も広い文脈で考えられるべきである。例えば、治療は、患者が完全に回復するまで治療されることを必ずしも含意するわけではないが、患者もしくは対象の状態、または疾患もしくは状態の症状の任意の向上または改善を含む。故に例えば、後天性ではなく遺伝性脂肪肝疾患の場合、本発明による治療は、根底にある遺伝性障害は当然ながら治療しないが、脂肪肝疾患の結果として生じる臨床状態を治療する。複数の症状を示すまたは複数の症状を特徴とする状態では、治療または予防は、前記症状の全てを必ずしも治す、改善する、予防する、妨げる、遅らせる、低減するまたは好転させるわけではないが、前記症状の１つまたは複数を治す、改善する、予防する、妨げる、遅らせる、低減するまたは好転させる可能性がある。適切な実施形態において、本発明による「治療」は、肝臓における脂肪レベルの、例えば正常または健康なレベルへの低減、例えば、脂肪が存在しない、または極めて最小限の脂肪空胞が存在する；脂肪嚢胞の非存在；正常であり、変位していない細胞核、線維症なしまたは最小／健康なレベルの線維症をもたらす。故に、治療は、正常または健康な肝臓脂肪レベルの回復を含む。治療はまた、肝組織の線維症の低減または排除も含み得る。
【００７０】
適切な実施形態において、本発明による「治療」は、対象の組織におけるグルタミン合成酵素レベルおよび／または活性の増加を含み得る。そのような増加は、任意の適切な組織（例えば肝臓）においてであってもよい。グルタミン合成酵素レベルおよび／または活性の増加は、例えば、対象におけるグルタミンのレベル、グルタミン酸のレベルを測定すること、および／またはグルタミンのレベルとグルタミン酸のレベルの比を決定することにより決定することができる。増加は、例えば脂肪肝疾患がＵＣＥの低減を伴う、正常または健康なレベルであってもよい。正常または健康なグルタミンおよび／またはグルタミン酸のレベルは、これらが測定される試料に応じて異なり得ることが理解されるであろう。また、正常または健康なグルタミンおよび／またはグルタミン酸のレベルは、対象特異的であり、対象の体重、食生活、性別および年齢などの要因に依存し得ることも理解されるであろう。正常または健康なグルタミンおよび／またはグルタミン酸のレベルは、当業者に公知であろう。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標または症状の重症度の低下を指す。特定の実施形態において、改善は、状態または疾患の１つまたは複数の指標の進行における遅延または減速を含む。指標の重症度は、当業者に公知の主観的または客観的尺度によって決定することができる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、肝臓の脂肪沈着「と関連する」疾患または状態の文脈で使用されるときの用語「と関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」は、疾患または状態が、アンモニアレベルの上昇の結果生じ得る、アンモニアレベルの上昇をもたらし得る、アンモニアレベルの上昇を特徴とし得る、またはさもなければアンモニアレベルの上昇と関連し得ることを意味する。故に、疾患または状態と脂肪肝の関連は、直接的または間接的であってもよく、時間的に離れていてもよい。
【００７３】
同様に、グルタミン合成酵素レベルおよび／またはグルタミン合成酵素活性を決定するための適当な試料としては、グルタミン合成酵素、グルタミンおよび／またはグルタミン酸が存在し得る任意の適当なまたは望ましい試料が挙げられる。これらは、任意の適当なまたは望ましい組織試料または体液試料であってもよい。適切な組織の例は、肝臓および／または筋肉組織である。好都合には、試料は、任意の体液試料であってもよく、典型的には血液または任意の血液由来試料、例えば血漿または血清等となろうが、任意の他の体液、例えば尿、脳脊髄液、または糞便もしくは組織試料等、例えば生検試料または洗浄液（ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）もしくは洗浄液（ｗａｓｈｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ）試料等であってもよい。これは、当然ながら、治療される等の状態のまさにその性質に依存し得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、望ましい効果を提供するための、文脈に応じてＧＳおよび／またはアンモニア低下剤の、非毒性であるが十分な量または用量をその意味の範囲内で含む。該タンパク質および／またはアンモニア低下剤の有効量は異なり得ることが理解されるであろう。例示的な治療有効量は、本明細書の他の部分に明記されている。
【００７５】
必要とされる正確な量または用量は、治療される種、対象の年齢および全身状態、治療される状態の重症度、投与される特定のＧＳ、および投与様式等などの要因に応じて対象ごとに異なるであろう。故に、正確な「有効量」を明記することは適当ではない。しかし、任意の所与のケースについて、適当な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００７６】
実際に、本発明の驚くべき特徴は、５または１０サブユニット多量体という文献の報告に反して、ヒトＧＳを、単量体型も含む複数の異なるタイプの多量体の混合物として発現するおよび／または得ることができることである。単量体型は、活性であることが示されている。故に、本発明によれば、ＧＳは、単量体としておよび／または多量体として使用することができ、多量体は、単一の多量体型として、または単量体を含んでも含まなくてもよい異なる多量体型の混合物として提供することができる。以下の例で報告されるように、４個以上、例えば４〜１０個、例えば５〜８個の多量体型が得られ得る。多量体のサイズは、２〜２０個のサブユニットであり得る。
【００７７】
以下の実施例は、グルタミンへのグルタミン酸およびアンモニアの変換を触媒するＧＳポリペプチドの能力を評価するためのものである。
【００７８】
いくつかの例では、本明細書で本発明により使用されるＧＳタンパク質は、当技術分野で周知の原核生物または真核生物発現系を用いて作製される組換えＧＳである。例示的な原核生物発現系としては、以下に限定されるものではないが、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現系が挙げられ、例示的な真核生物発現系には、以下に限定されるものではないが、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞発現系が挙げられる。
【００７９】
ＧＳをコードする核酸は、以下に限定されるものではないが、肝臓ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよび合成ヌクレオチド合成を含む任意の適切な方法によって得ることができる。増幅のためのプライマーは、上記に記載されたものなどの公知のＧＳ配列に基づき設計することができる。ＧＳの核酸およびアミノ酸配列は当技術分野で周知であり、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ヌクレオチド（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）およびタンパク質（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）データベースなどの自由に利用可能なデータベースで提供されている。
【００８０】
配列番号３に記載された配列を有する核酸などのＧＳポリペプチドをコードする核酸は、最適な発現系に適した発現ベクターにクローニングすることができる。いくつかの例では、核酸は、特定の系での発現にコドン最適化される。例えば、ＧＳポリペプチドをコードする核酸は、エシェリキア・コリでの発現にコドン最適化されてもよい。エシェリキア・コリでの発現のためのＧＳをコードする例示的なコドン最適化核酸は、配列番号５に記載されており、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号４に記載された）を介して結合されたＨｉｓタグを含むＧＳポリペプチドをコードする。
【００８１】
典型的にはＧＳをコードする核酸は、異種の核酸分子の発現を促進する制御配列に作動可能に連結された発現ベクターにクローニングされる。ＧＳの発現に適した多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に公知である。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響される。そのような選択は、当業者の技術のレベルの十分に範囲内である。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび適宜エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含むことができる。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかの場合では、細胞中のベクターのコピー数を増幅するのに複製起点が使用され得る。
【００８２】
ＧＳポリペプチドはまた、タンパク質融合体として発現することもできる。例えば、融合体は、追加の機能性をポリペプチドに加えるように生成されてもよい。融合タンパク質の例としては、以下に限定されるものではないが、ＧＳおよび精製のためのアフィニティータグ（例えばＨｉｓタグ、例えばｈｉｓ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、ＨＡまたはＧＳＴタグ）、リーダー配列（ｐｅｌＢリーダー配列などの）、タンパク質分泌を指示する配列、またはＧＳを安定化および／もしくは可溶化するタンパク質（例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、またはインビボ半減期を増加させるタンパク質（例えば、アルブミンもしくはＦｃドメイン、またはそれらの断片）を含有する融合体が挙げられる。
【００８３】
原核生物、特にエシェリキア・コリは、大量のＧＳを作製するための系を提供する。エシェリキア・コリの形質転換は、当業者に周知の簡単で迅速な手法である。エシェリキア・コリの発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現の誘導、および宿主細胞に対してある程度の毒性を示すタンパク質の発現に有用な誘導性プロモーターを含有することができる。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ならびに温度制御λＰＬプロモーターが挙げられる。
【００８４】
他の例では、ＧＳを作製するのにバキュロウイルス発現系などの真核生物発現系が使用される。典型的には、発現ベクターは、高レベル発現のためのバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系としては、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロウイルス、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来するＳｆ９、シューダレチア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮｌ）などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のためには、ＧＳのヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。
【００８５】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母もまた、ＧＳの発現宿主として使用することができる。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換することができる。典型的には、ＧＡＬｌ、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５などの誘導性プロモーターが、遺伝子発現を制御するのに使用される。酵母発現ベクターは、形質転換ＤＮＡを選択および維持するためのＬＥＵ２、ＴＲＰｌ、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３などの選択可能なマーカーを含むことが多い。
【００８６】
哺乳動物発現系もまた、ＧＳを発現するのに使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ導入、ならびに電気穿孔およびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳動物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザックコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。そのようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復を含むことが多い。哺乳動物発現に利用可能な例示的な細胞株としては、以下に限定されるものではないが、ＢＨＫ、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳＯ（非分泌）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞などのマウス、ラット、ヒト、サル、ならびにニワトリおよびハムスター細胞が挙げられる。
【００８７】
発現後、ＧＳは、以下に限定されるものではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ画分およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む、当業者に公知の任意の方法を用いて精製することができる。アフィニティー精製法は、調製の効率および純度を向上するのに使用され得る。例えば、ＧＳを結合する抗体および他の分子がアフィニティー精製において使用され得る。上記で論じたように、発現コンストラクトは、ｈｉｓ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧもしくはＨＡタグまたはＧＳＴ部分などのアフィニティータグをＧＳに加えるように操作されてもよく、次いで、それぞれＮｉ樹脂、ｍｙｃ抗体、ＨＡ抗体、ＦＬＡＧ抗体またはグルタチオン樹脂を用いてアフィニティー精製されてもよい。適切には、ポリ９×ｈｉｓタグが使用され得る。より適切には、６×ｈｉｓタグが使用される。純度は、ＳＤＳページおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのゲル電気泳動および染色および分光光度法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。
【００８８】
本発明による使用のために、アフィニティータグ（例えばｈｉｓタグ等）が除去されてもよいが、これは必ずしも必要ではなく、ＧＳポリペプチドは結合されたタグと共に使用されてもよい。
【００８９】
タグまたは他の融合パートナーは、当技術分野で周知の原理に従って、任意の適切なリンカーであり得るリンカーを介してＧＳに結合されてもよい。そのようなリンカーは、典型的にはおよび好都合には、短い（例えば２〜１０、２〜８または２−６ｍｅｒ）ペプチドであってもよい。例としてリンカーＧＧＳＧ、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳが挙げられ得るが、任意の適切なアミノ酸から成っていてもよい。アミノ酸リンカーは、組換え手段によって融合タンパク質の調製を可能にするが、非アミノ酸ベースのリンカーもまた、やはり当技術分野で周知のおよび文献に記載されている原理および手法に従って使用され得る。リンカーは、切断可能（例えば酵素的に）または非切断可能であってもよい。
【００９０】
ＧＳポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖として、あるいはさらなる部分または化学基もしくは物質に結合またはコンジュゲートすることにより修飾される修飾ポリペプチドとして調製することができる。例示的な修飾としては、以下に限定されるものではないが、ペグ化、アルブミン化（ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｏｎ）または他の公知の修飾が挙げられる。例えば、いくつかの例では、記載された方法において使用するためのＧＳポリペプチドは、当技術分野で周知の標準的な方法を用いてペグ化される。これは、例えば、循環中のＧＳタンパク質の半減期を増加させるのに役立ち得る。故に、本発明の好ましい実施形態においてＧＳタンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または多糖もしくはオリゴ糖などのポリマーとのコンジュゲートとして提供されてもよい。ＰＥＧとのコンジュゲートが特に好ましい。上記に示されているように、そのようなコンジュゲートの調製は、当技術分野で周知であり、文献に記載されている。故に、コンジュゲーを調製するのに、例えば１００ダルトン〜１００ｋＤ、ただしより頻繁には５ｋＤ〜１００ｋＤ、例えば１２または１５ｋＤ〜６０または８０ｋＤ、例えば１５〜５０、１５〜４０、または１５〜３０ｋＤなどの様々なサイズのＰＥＧが使用され得る。さらに、ＰＥＧは、ＧＳタンパク質に様々な方法で結合または連結することができ、１つを超えるＰＥＧが１つ１つのタンパク質に結合され得る。ＰＥＧは、上記の融合タンパク質に関して直接的または間接的に、例えば記載されているリンカーを介して、もしくはリンカー機能を提供し得る任意の分子基もしくは化学基によって連結することができる。故に、ＰＥＧは、ＮまたはＣ末端の一方または両方、あるいはＧＳ分子の内部、例えばＧＳタンパク質分子の１つもしくは複数のリジン残基のアミノ基、または該タンパク質分子の任意の他の化学的部分もしくは残基で連結することができる。ＰＥＧなどのポリマーをタンパク質に結合またはコンジュゲートする方法は、当技術分野で周知であり、文献に記載されている（例えば、Roberts et al. 2012, Advanced Drug Delivery Reviews, 64 (supplement) 116-127およびVeronese 2001, Biomaterials 22, 405-417参照）。以下の実施例に提示されるデータは、ＰＥＧをＮ末端に連結して調製されたＰＥＧコンジュゲートが、例えば様々なコンジュゲートを投与された動物由来の肝臓溶解物の活性アッセイにおいて、特に有効であることを示している。したがって、ＧＳタンパク質のＮ末端に連結されたＰＥＧを含むＰＥＧコンジュゲートは、本発明の１つの好ましい実施形態となる。ＧＳタンパク質は、単量体および／または多量体型でペグ化されてもよい。故に、便宜上、単量体型および様々な多量体型の両方のＧＳを含む調製物がペグ化に供されてもよい。
【００９１】
ＧＳは、対象に投与するための医薬組成物として製剤化することができる。ＧＳは、選択された量のＧＳを１つまたは複数の生理学的または薬学的に許容される担体または賦形剤と混合して、任意の従来の様式で製剤化することができる。
【００９２】
したがって、本発明のさらなる態様は、肝臓の脂肪沈着の低減による脂肪肝疾患の治療用である、ＧＳおよび１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ＧＳは、本明細書に記載されている核酸分子、またはタンパク質として提供されてもよい。
【００９３】
担体または賦形剤の選択は投与専門医の技術の範囲内であり、投与様式などのいくつかのパラメーターに依存し得る。いくつかの例では、ＧＳタンパク質は液体として提供される。他の例では、ＧＳタンパク質は、乾燥（ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）または凍結乾燥形態などの乾燥（ｄｒｉｅｄ）形態で提供される。そのような乾燥形態は、水、緩衝液、生理食塩水または他の適切な溶液などの適切な溶液の添加により、投与の前に再水和することができる。ＧＳが核酸として提供される場合、ＧＳは、任意の適切な組成物で提供されてもよく、肝臓に直接投与するために注射可能であってもよい。本明細書で提供されるＧＳは、直接投与用に製剤化されてもよく、または希釈もしくは他の変更のために製剤化されてもよい。したがって、ＧＳは、単回（または単位）投与形態または複数回投与形態で製剤化することができる。単回投与形態の例としては、アンプルおよびシリンジが挙げられる。複数回投与形態の例としては、複数の単位用量を含有するバイアルおよびボトルが挙げられる。
【００９４】
製剤中のＧＳの濃度は、投与すると、少なくとも肝細胞内の脂肪の非存在または実質的な非存在という点で肝臓が正常または健康に見えるように、肝臓の脂肪沈着を低減または排除するのに有効なＧＳの量をデリバリーするのに有効である。ＧＳの濃度および量は、対象における基質レベル、および投与様式を含むいくつかの要因に依存し、経験的に決定することができる。本明細書で提供される組成物中のＧＳの例示的な濃度としては、以下に限定されるものではないが、（約）０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００もしくは５０００ｍｇ／ｍＬ  ＧＳまたはそれ以上の濃度が挙げられる。
【００９５】
ＧＳ組成物を製剤化するために、１つの実施形態においてＧＳの重量画分が、望ましい濃度で選択された媒体に溶解、懸濁、分散され、またはさもなければ混合される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルションおよび他のそのような混合物であり、以下に限定されるものではないが、溶液、懸濁液、ペースト、ゲル、エアロゾル、スプレー、または全身投与に適した任意の他の製剤を含む、非水性または水性混合物として製剤化することができる。
【００９６】
一般に、ＧＳ組成物は、規制機関からの承認を考慮して調製され、またはさもなければ動物およびヒトでの使用に関して一般に認識されている薬局方に従って調製される。ＧＳ組成物は、希釈剤、賦形剤、または媒体などの担体を含んでもよい。そのような薬学的担体は、水および油などの滅菌液体であってもよい。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のための液体担体として使用することができる。組成物は、活性な成分と一緒に、希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えば、デンプン、天然ゴム、例えばアカシアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当業者に公知の他のそのような結合剤を含有することができる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが挙げられる。ＧＳ組成物はまた、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤を含有することもできる。適切な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００９７】
組織標的化リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として適切である場合がある。これらは、当業者に公知の方法により調製することができる。リポソームデリバリーとしてはまた、コラーゲンゲルおよびフィブロネクチンで修飾されたリポソームなどの医薬マトリックスを含む徐放性製剤も挙げられ得る。
【００９８】
医薬組成物だけでなく、ＧＳはまた、他の手段、例えば、食事サプリメントなどの栄養組成物、例えば非経口栄養組成物で製剤化または投与することもできる（例えば、単独でまたは他のサプリメント成分と一緒に）。適切には、栄養サプリメントは、アンモニアに解毒作用をもたらすのに十分なＧＳが腸に達するような投与レジメンで提供されてもよい。ＧＳは、ポリペプチド（例えば精製された酵素）として、または発現宿主細胞もしくは生物の一部としてそのような食品に含まれてもよい。故に、例えば微生物（例えば、酵母または細菌または真菌）宿主細胞または植物（植物細胞を含む）が、ＧＳを発現するように操作されてもよく、それ自体、例えば細胞全体または抽出物もしくは他の処理物（酵素活性を保持することができる）として投与されてもよく、または栄養組成物に組み込まれてもよい。故に、例えば、ヒトまたはヒト以外の動物の消費に適した細菌または酵母細胞が、ＧＳを発現するように操作されてもよい（すなわち、ＧＳをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の導入によって）。あるいは、植物が類似の（ａｎａｌａｇｏｕｓ）様式で操作されてもよく、適当な植物の部分等（例えば種、葉、塊茎等）が投与に提供されてもよい。どの微生物（例えば酵母、細菌、藻または真菌）がヒトまたは他の動物の消費に適しているかは当技術分野で公知であり、多くのそのような生物が、今日、例えば生菌製剤で使用されている。任意のそのような生菌生物または製剤は、例えば、ビフィドバクテリウムまたはラクトバチルス属種（例えばラクトバチルス・アシドフィルス）等などの乳酸菌に基づき使用され得る。故に、本発明によればそのような生物または調製物は、ＧＩ管用に製剤化されてもよく、および例えば注射もしくは注入、または浣腸もしくは直腸投与等によって、ＧＩ管に直接投与されてもよい。対象に投与されるＧＳの正確な量または用量は、ＧＳの活性、投与経路、治療される疾患または状態、投薬回数、ならびに対象の体重、年齢および全身状態などの他の検討事項に依存する。特定の投薬量および投与プロトコルは経験的に決定することができ、または例えば、動物モデルでの試験から推定することができる。ＧＳの例示的な治療有効用量としては、以下に限定されるものではないが、１日につき（約）１ｍｇ／ｋｇ〜（約）１０００ｍｇ／ｋｇ体重、または１日につき（約）１０ｍｇ／ｋｇ〜（約）１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む、１日につき（約）０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日につき（約）１００００ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。故に、例えば、対象は、１日につき体重１ｋｇあたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、もしくは２００００ｍｇまたはそれ以上のＧＳを投与されてもよい。
【００９９】
ＧＳは、全身投与されることが本発明の特徴である。したがって、ＧＳは、ＧＳを全身にデリバリーする任意の方法および経路によって投与することができる。特定の実施形態においてＧＳは、非経口的に投与されてもよい。当業者は、各投与経路に適した様式で案出された、以下に限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または腹腔内投与を含む、およびそれらのいずれか２つ以上の任意の組み合わせによる、投与またはデリバリーの適当な方法を容易に理解し、選択することができるであろう。いくつかの例では、本明細書に記載されているＧＳ、またはＧＳ組成物もしくは生成物は、皮下投与されてもよい。他の例では、本明細書に記載されているＧＳ、またはＧＳ組成物もしくは生成物は、静脈内投与されてもよい。例えば、ＧＳ組成物は、静脈内ボーラスなどの注射または注入よって静脈内投与することができる。
【０１００】
全身投与は経口であってもよい。経口投与とは、経口デリバリーによることを意味する。したがって、非経口は、ＧＳが口を介した摂取によって投与されないことを意味する。ＧＳタンパク質を腸、またはより一般には胃腸（ＧＩ）管にデリバリーする他の投与手段が挙げられ得る（例えば直腸に、または浣腸、もしくはＧＩ管への直接投与によって）。さらなる実施形態において本発明は、筋肉、特に骨格筋への投与を含まない。故に、そのような実施形態において投与は、筋肉を対象にしない、すなわち非筋肉指向型療法（ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）である。
【０１０１】
ＧＳはまた、他の治療剤または活性剤、特に、脂肪肝疾患を治療（例えば改善）し得る第２のまたはさらなる治療剤と併用してまたは組み合わせて投与することもできる。第２のまたはさらなる薬剤は、典型的には、窒素捕捉剤（またはアンモニア捕捉剤）または置換アミノ酸もしくは尿素サイクル中間体、またはその類似体などのアンモニア低下剤である。そのような薬剤は、それ故に、アミノ酸、例えばアルギニン、グルタミン酸、シトルリンおよび／もしくはオルニチン、ならびに／またはＮ−アセチルグルタミン酸および／もしくは類似体分子カルバミルグルタミン酸［Ｃａｒｂａｇｌｕ（登録商標）］を含み得る。より適切には、第２のまたはさらなる薬剤は、アンモニア低下剤、より適切には窒素捕捉剤である。そのような実施形態は、本発明の特定の態様をもたらす。
【０１０２】
用語「アンモニア低下剤」は、アンモニアを例えば治療される対象の血液から除去する、および／またはアンモニア産生を低減もしくは阻害する化合物を指す。アンモニア低下剤はまた、アンモニア捕捉剤と呼ぶこともできる。アンモニア低下剤は、アンモニアの血中濃度を低減する薬剤であってもよい。アンモニア低下剤は、アンモニアの排出を増加させる、または対象におけるその産生を低減する薬剤または化合物であってもよい。アンモニアの排出は、アンモニアに結合し、排出される化合物を提供することによって増加され得る。アンモニア低下剤は小分子であってもよい。アンモニア低下剤は、窒素捕捉剤、イオン交換樹脂（例えばＲｅｌｙｐｓａ）、アンモニア吸収体（リポソームベースのアンモニア吸収体のような、例えばＶｅｒｓａｎｔｉｓ）、アンモニアを除去する操作されたマイクロバイオーム（例えばＳｙｎｌｏｇｉｃ）、リファキシミンおよびラクツロースからなる群から選択されてもよい。
【０１０３】
用語「窒素捕捉剤」は、本明細書で使用される場合、アンモニアを除去することにより対象における窒素および／またはアンモニアのレベルを低減する化合物または薬剤を指す。適切には、窒素捕捉剤は、アンモニアの血中濃度を低下させる。用語アンモニア捕捉剤および窒素捕捉剤は、当業者に理解されている。適切な実施形態において窒素捕捉剤は、フェニルアセチルグルタミンに代謝され、次いで尿中に排泄される得ることにより、対象における窒素および／またはアンモニアの量（適切には血中濃度）を低減する。
【０１０４】
適切な実施形態において、窒素捕捉剤は、フェニル酢酸の薬学的に許容される塩（本明細書ではフェニル酢酸塩とも呼ばれる）、フェニル酪酸の薬学的に許容される塩（本明細書ではフェニル酪酸塩とも呼ばれる）、グリセロールフェニル酪酸、安息香酸の薬学的に許容される塩、その薬学的に許容されるプロドラッグ、およびアンモニア結合樹脂からなる群から選択されてもよい。他の窒素捕捉剤は当業者に周知であろう。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、例えば、十分に塩基性であるフェニル酢酸の酸付加塩、例えば、無機酸または有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、シトリックメタンスルホネート（ｃｉｔｒｉｃ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）またはマレイン酸との例えば酸付加塩を含む。さらに、十分に酸性であるフェニル酢酸の適切な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩もしくはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩もしくはマグネシウム塩、アンモニウム塩または薬学的に許容されるカチオンを提供する有機塩基との塩、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩である。
【０１０６】
適切な実施形態において、フェニル酢酸の薬学的に許容される塩は、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酢酸カリウム、オルニチンフェニル酢酸塩からなる群から選択されてもよい。
【０１０７】
適切な実施形態において、フェニル酪酸の薬学的に許容される塩は、フェニル酪酸ナトリウムおよびフェニル酢酸カリウムからなる群から選択されてもよい。
【０１０８】
適切な実施形態において、安息香酸の薬学的に許容される塩は、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸カリウムからなる群から選択されてもよい。
【０１０９】
アンモニア低下剤は、例えば水和形態などの、溶媒和形態および非溶媒和形態で存在してもよいことが理解されるものとする。本発明の文脈において包含されるのは、全てのそのような溶媒和形態および非溶媒和形態であることが理解されるべきである。
【０１１０】
用語「プロドラッグ」は、本明細書で使用される場合、化学的または生物学的部分によってアンモニア低下剤（窒素捕捉剤などの）より活性が低下されているが、アンモニア低下剤に代謝される、またはインビボで加水分解を受けてアンモニア低下剤を形成する薬剤を指す。
【０１１１】
特に、循環からグルタミンを除去するように作用する（ＧＳの作用によって形成されるグルタミン）、フェニル酢酸またはフェニル酪酸化合物などの薬剤が好ましい。アンモニア低下剤などの第２のまたはさらなる薬剤は、同じ製剤もしくは組成物中、または別個の組成物もしくは製剤中でを含め、ＧＳタンパク質と個別、連続的または同時に投与されてもよい。
【０１１２】
第２のまたはさらなる薬剤は、経口を含む同じ投与経路または異なる投与経路によって投与されてもよい。故に、１つの例示的な実施形態において、第２のまたはアンモニア低下剤などのさらなる薬剤は、経口的に、または他の全身的手段によって投与されてもよく、ＧＳは、非経口全身的手段によって投与されてもよい。
【０１１３】
窒素捕捉剤（フェニル酢酸ナトリウム、オルニチンフェニル酢酸塩、フェニル酪酸ナトリウム、または安息香酸ナトリウムを含む）などのアンモニア低下剤は、例えば急性管理のために静脈内注入によって、および／または例えば長期維持のために経口的に投与されてもよい。ｉ．ｖ．注入は末梢であってもよいが、中心ｉ．ｖ．注入が好ましい。同様に、アルギニンなどのアミノ酸は、経口的に、またはｉ．ｖ．、例えば中心ｉ．ｖ．注入によって投与されてもよい。
【０１１４】
そのようなキットは、脂肪肝疾患の治療において使用するために提供され得る。キットの構成要素は、当該薬剤を１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に含む別個の医薬組成物として提供されてもよい。本発明の組成物は、１回または１回を超えて投与することができる。１回を超えて投与される場合、組成物は一定の間隔でまたは必要に応じて、例えば臨床医によって決定されたように投与することができる。一定の間隔としては、例えば、ほぼ毎日、毎週、隔週、毎月、または任意の他の間隔が挙げられ得る。治療プロトコルの選択は、当業者の技術のレベルの十分に範囲内である。例えば、プロトコルは、動物モデルでの試験に基づき決定され得る。他の例では、血液中のアンモニアレベルが  所定のレベルを上回る場合、組成物の反復用量が対象に投与されてもよい。
【０１１５】
本発明による、ＧＳタンパク質と組み合わせたＧＳタンパク質の使用、またはアンモニア低下剤の使用は、遺伝子療法が適切もしくは適当でない対象、例えば小児、または遺伝子療法に不応性である対象の治療に有利である。そのような不応性の対象としては、例えば、遺伝子療法のデリバリーに使用されるウイルスベクターに以前に曝露されている者、またはこれに免疫反応を示している者が挙げられ得る。
【０１１６】
有利には、治療剤としてのタンパク質の使用は、より高用量の活性タンパク質を対象にデリバリーし、対象およびニーズに従って用量を調整できるようにする。さらに、遺伝子療法と比較して、タンパク質療法は、はるかに速い応答を可能にし、故に緊急の使用によりに適している。
【０１１７】
すでに述べたように、本発明の１つの態様は、脂肪肝疾患の治療において使用するために、ＧＳタンパク質と組み合わせて使用するためのアンモニア低下剤を含む医薬組成物に関する。アンモニア低下剤は、対象に投与するための医薬組成物として製剤化することができる。アンモニア低下剤は、選択された量の窒素捕捉剤を、１つまたは複数の生理学的または薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することにより、任意の従来の様式で製剤化することができる。適切には、組成物は、非経口全身投与用、または経口投与用であってもよい。医薬組成物はまた、ＧＳタンパク質を含むこともできることが理解されるであろう。そのような実施形態において、組成物は非経口全身投与用に製剤化されるであろう。
【０１１８】
担体または賦形剤の選択は投与専門医の技術の範囲内であり、投与様式などのいくつかのパラメーターに依存し得る。いくつかの例ではアンモニア低下剤は、液体として提供される。他の例では、アンモニア低下剤は、乾燥形態で提供される。そのような乾燥形態は、水、緩衝液、生理食塩水または他の適切な溶液などの適切な溶液の添加により、投与の前に再水和することができる。アンモニア低下剤は、直接投与用に製剤化されてもよく、または希釈もしくは他の変更のために製剤化されてもよい。したがって、アンモニア低下剤は、単回（または単位）投与形態または複数回投与形態で製剤化することができる。単回投与形態の例としては、アンプルおよびシリンジが挙げられる。複数回投与形態の例としては、複数の単位用量を含有するバイアルおよびボトルが挙げられる。
【０１１９】
製剤中のアンモニア低下剤の濃度は、投与すると窒素および／もしくはアンモニウムを循環から除去し、またはアンモニア産生を低減もしくは阻害するのに有効なアンモニア低下剤の量をデリバリーするのに有効である。濃度および量は、対象における基質レベル、および投与様式を含むいくつかの要因に依存し、経験的に決定することができる。本明細書で提供される組成物中のアンモニア低下剤の例示的な濃度としては、以下に限定されるものではないが、（約）０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００もしくは５０００ｍｇ／ｍＬアンモニア低下剤またはそれ以上の濃度が挙げられる。
【０１２０】
アンモニア低下剤組成物を製剤化するために、１つの実施形態においてアンモニア低下剤の重量画分が、望ましい濃度で選択された媒体に溶解、懸濁、分散され、またはさもなければ混合される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルションおよび他のそのような混合物であり、以下に限定されるものではないが、溶液、懸濁液、ペースト、ゲル、エアロゾル、スプレー、または全身投与に適した任意の他の製剤を含む、非水性または水性混合物として製剤化することができる。
【０１２１】
一般に、アンモニア低下剤は、規制機関からの承認を考慮して調製され、またはさもなければ動物およびヒトでの使用に関して一般に認識されている薬局方に従って調製される。組成物は、希釈剤、賦形剤、または媒体などの担体を含んでもよい。そのような薬学的担体は、水および油などの滅菌液体であってもよい。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射可能な溶液のための液体担体として使用することができる。組成物は、活性な成分と一緒に、希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えば、デンプン、天然ゴム、例えばアカシアゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当業者に公知の他のそのような結合剤を含有することができる。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが挙げられる。フェニル酢酸、またはその薬学的に許容される塩組成物はまた、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤も含有することができる。適切な薬学的担体の他の例は、当業者に公知であろう。
【０１２２】
アンモニア低下剤は、化合物を身体にデリバリーする任意の方法および経路によって投与することができる。特定の実施形態において、アンモニア低下剤は、非経口的に投与することができる。当業者は、各投与経路に適した様式で製剤化された、以下に限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮内、経皮、皮下、または腹腔内投与を含む、およびそれらのいずれか２つ以上の任意の組み合わせによる、投与またはデリバリーの適当な方法を容易に理解し、選択することができるであろう。
【０１２３】
医薬組成物だけでなく、アンモニア低下剤はまた、他の手段、例えば、食事サプリメントなどの栄養組成物、例えば非経口栄養組成物で製剤化または投与することもできる（例えば、単独でまたは他のサプリメント成分と一緒に）。適切には、そのような組成物は、経口または非経口投与用であってもよい。
【０１２４】
すでに述べたように、アンモニア低下剤は、ＧＳと組み合わせて投与するためのものである。アンモニア低下剤は、同じ製剤もしくは組成物中、または別個の組成物もしくは製剤中でを含め、ＧＳと個別、連続的または同時に投与されてもよいことが理解されるであろう。故に、１つの例示的な実施形態においてアンモニア低下剤は、経口的に、または他の全身的手段によって投与されてもよく、ＧＳは、非経口全身的手段によって投与されてもよい。
【０１２５】
アンモニア低下剤の例示的な治療有効用量としては、以下に限定されるものではないが、１日につき（約）１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、または１日につき約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重を含む、１日につき約１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日につき（約）２０００ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。故に、例えば、対象は、１日につき体重１ｋｇあたり１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、もしくは２０００ｍｇまたはそれ以上のアンモニア低下剤を投与されてもよい。アンモニア低下剤の他の例示的な治療有効用量としては、以下に限定されるものではないが、約１ｇ／日〜約５０ｇ／日が挙げられる。故に、例えば、対象は、１日につき１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、もしくは５０グラム、またはそれ以上のアンモニア低下剤を投与されてもよい。有効用量は、アンモニア低下剤に応じて異なり得ることが理解されるであろう。ＧＳ組成物、および／またはアンモニア低下剤を含む組成物もしくはアンモニア低下剤ではないさらなる薬剤を含む組成物は、所望であれば、１つまたは複数の単位投与形態を含有することができる、針付きシリンジ、またはバイアルおよび針付きシリンジなどの、パッケージ、キットまたはディスペンサ装置で提示されてもよい。キットまたはディスペンサ装置は、投与説明書が添付されていてもよい。ＧＳ組成物およびアンモニア低下剤を含む組成物が別個である実施形態において、キットは、ＧＳ組成物およびアンモニア低下剤を含む組成物を含み得る。適切には、そのような実施形態において、キットは、ＧＳ組成物、および窒素捕捉剤を含み得る。適切には、そのような実施形態において、キットは、ＧＳ組成物、およびフェニル酢酸塩、例えばフェニル酢酸ナトリウムを含む組成物を含み得る。組成物は、包装材料、組成物、および組成物が脂肪肝疾患または脂肪肝疾患と関連する疾患もしくは状態を治療するために、対象に投与するためのものであることを示すラベルを含有する製品としてパッケージすることができる。
【０１２６】
適切な全身投与方法は、当業者に公知であろう。例として、全身投与は、静脈内または皮下経路などの非経口投与経路によって達成されてもよい。「全身投与」は、発現ベクター産物（グルタミン合成酵素またはその生物学的に活性な断片などの）を患者の複数の部位内で発現できるようにすることが理解されるであろう。本発明の文脈において、全身投与は筋肉内投与を含まない。
【０１２７】
（文脈が他に要求する場合を除いて）脂肪肝疾患（ｆａｔｔｙ  ｏｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）の治療において使用するためのＧＳ、アンモニア低下剤と組み合わせて使用するためのＧＳタンパク質、ＧＳと組み合わせて使用するためのアンモニア低下剤、それらの使用、治療方法、組成物、キットおよび生成物に関して記載された実施形態は、本発明の残りの態様に概ね適用可能であることが理解されるであろう。
【０１２８】
本発明は、以下の非限定的実施例および図を参照してこれよりさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、実施例１で調製されるヒトＧＳタンパク質の２０ｋＤａ  Ｎ末端アルデヒドＰＥＧコンジュゲートのＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。グラフは、多量体が画分８および９、ならびに単量体が画分１０に溶出されたことを示す。
【図２】図２は、様々なＧＳ候補：非コンジュゲートＧＳ（ｗｔ  ＧＳ）および陰性対照と対比したＰＥＧコンジュゲート変異体（ＧＳ１、ＧＳ２、ＧＳ３、ＧＳ４）のインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）ＧＳ活性の比較を示す。グルタミン合成酵素活性が、Acosta et al., 2009, World J. Gastroenterol.,15(23）, 2893-2899のアッセイに従ってＯＤ５７０ｎｍとして示されている。ＧＳ１  −  （Ｎ末端アルデヒド単量体）；ＧＳ２  −  Ｎｏｆ−２０（商標）；ＧＳ３  −  Ｎｏｆ−３０（商標）、ＧＳ４  −  Ｎ末端アルデヒド単量体。
【図３】図３は、（Ａ）ベースライン、（Ｂ）投与後２４時間、および（Ｃ）投与後７２時間時点の様々なコンジュゲートのオス、野生型（ｗｔ）ＣＤ１マウスの投与前および投与後の血漿に関するＰＥＧ  ＥＬＩＳＡ結果を示す。（１  −  Ｎ末端アルデヒドコンジュゲートＧＳ単量体；２  −  Ｎｏｆ−２０（商標）ＧＳコンジュゲート多量体；３  −  Ｎｏｆ−３０（商標）コンジュゲートＧＳ多量体；４  −  Ｎ末端アルデヒドコンジュゲートＰＥＧ多量体）。
【図４】図４は、実施例３に記載されている、２．５ｍｇ／ｋｇ、投与後３日の投与されたｗｔ  ＣＤ１マウスにおける肝臓溶解物中のＧＳ活性（ＯＤ５３５ｎｍ）結果を示す。
【図５】図５Ａは、肝臓ＧＳ活性アッセイ結果を示す。図５Ｂは、血漿ＧＳ活性アッセイ結果を示す。肝臓および血漿ＧＳ活性はいずれも、ＧＳタンパク質、およびＧＳタンパク質と窒素捕捉剤で治療された胆管結紮（ＢＤＬ）ラットでアッセイされた。
【図６】図６は、投与および非投与ＯＴＣマウスの染色された（ヘマトキシリンおよびエオシンで）肝臓生検を示す。組換えヒトＧＳタンパク質投与マウスは、非投与マウスと比べて正常な肝臓構造を示す。
【図７】図７は、実施例６に記載されている対照およびＧＳ投与マウスのアンモニアレベルを示す。
【図８】図８は、実施例６に記載されているＧＳ（ＡＭ  ５３５）投与ＭＣＤマウスにおけるデジタルＦＰＡ分析による、対照における肝切片の脂肪割合（％）を示す。
【図９】図９は、実施例７による、グラフ形式のＨＦＨＣラットＣＰＡ（コラーゲン比例面積）の結果を示す。
【図１０】図１０は、実施例７による、シリウスレッド染色を用いたＧＳ酵素（ＡＭ−５３５）の週２回投与の７週間後の線維症に対する影響を示す；正常な非ＨＦＨＣ食動物と同じＣＰＡレベルを示している。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３０】
実施例１
ＧＳタンパク質およびＧＳタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの作製および精製
ヒトグルタミン合成酵素（ＧＳ）の作製：ヒトＧＳの遺伝子（ＨｉｓタグおよびリンカーＧＧＧＧＳをＧＳのＮ末端にコードする５’配列を含み、細菌における発現のためにコドン最適化された配列番号５）を含有するｐＥＴ３０ａ＋ベクターを、エシェリキア・コリ発現系で使用した。プラスミド構築後、ＧＳの発現の評価を広範な誘導（ＩＰＴＧ）および発現温度で行った。ヒトＧＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されたコンストラクトで可溶性に発現した。溶解緩衝液（５０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、１０％グリセロール、０．１％トリトンＸ−１００、１００ｕｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、３単位のＤＮＡｓｅ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ）を使用して細胞から可溶性タンパク質を抽出した。可溶性タンパク質は、遠心分離後に抽出した。発現試験後、最良の条件をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で見出し、培養し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで２５℃、１６時間誘導した。試した他の条件には、多様なＩＰＴＧ誘導（０．０１Ｍ〜０．１Ｍ  ＩＰＴＧ）の使用、様々なインキュベーション温度（１６℃〜３７℃にわたる）、および４〜１６時間の誘導インキュベーション時間が含まれた。
【０１３１】
発現ＧＳの精製：発現タンパク質の最初の精製工程は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズによるＨｉｓタグ精製、２０ｍＭイミダゾールによる洗浄、および３００ｍＭイミダゾールによる溶出を含んだ。
【０１３２】
タンパク質ＰＥＧコンジュゲーション：ＧＳタンパク質を、還元条件下で（２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムの使用により）Ｎ末端アルデヒド２０ｋＤａ  ｐｅｇに１６時間コンジュゲートした（Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ’ｓ  ２０ｋＤａ  Ｎ末端Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ＰＥＧ）。
【０１３３】
最終精製：コンジュゲートしたタンパク質を、ＳＥＣクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６またはＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（図１参照）を使用した。多量体は画分８±９で見出された。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２の画分１０は（低濃度の）多量体を含んだ。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６では、多量体が画分８＋９、単量体が画分１２／１３で見出された。
【０１３４】
トレハロースおよびスクロースを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＧＳの最終製剤を調製した。
【０１３５】
実施例２
ＧＳ調製物の活性
Ehrenfeld et al., 1963, J. Biol. Chem. 238(11)、3711-3716に記載された元のアッセイから修正されたAcosta et al., 2009のアッセイ（上記参照）を用いて、実施例１に従って調製した様々なＧＳ調製物およびＰＥＧコンジュゲートをＧＳ活性についてテストした。
【０１３６】
１００ｕｇの精製タンパク質試料を、以下の反応緩衝液に添加した：１５０μＬストック溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液［ｐＨ７．１］、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、β−メルカプトエタノール、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、グルタミン酸、およびｐＨ７．２に調整した２００ｍｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミン）。チューブを３７℃で１５分間インキュベートした。０．６ｍＬ  ［２×濃度］塩化第二鉄試薬（０．３７ｍｏｌ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、０．６７ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌおよび０．２０ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸）を添加して反応を停止した。試料を氷上に５分間置いた。沈殿したタンパク質を１０，０００ｇで遠心分離によって除去し、上清の吸光度を試薬ブランクに対して５３５〜５７０ｎｍで読み取った。結果を図２に示す。Ｔｒｉｎ１  −  （Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ’ｓから入手した２０ｋＤサイズのＮ末端アルデヒド単量体ＰＥＧ）；Ｔｒｉｎ２  −  ＮＯＦ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した、単官能性直鎖状２０ｋＤ  ＰＥＧ、ＮＨＳ活性エステルとＧＳタンパク質にコンジュゲートされたＮｏｆ−２０コンジュゲートＧＳ）；Ｔｒｉｎ３  −  ＮＯＦ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した、単官能性直鎖状３０ｋＤ  ＰＥＧ、ＮＨＳ活性エステルとＧＳタンパク質にコンジュゲートされたＮｏｆ−３０）；Ｔｒｉｎ４  −  Ｎ末端アルデヒド、ＧＳ多量体）。他のコンジュゲートの活性は類似していたが、Ｔｒｉｎ４（Ｎ末端アルデヒド多量体）は最良の活性を示し、ｗｔ  ＧＳ（非コンジュゲート）と比べて活性プロファイルは酷似していた。
【０１３７】
実施例３
ＧＳタンパク質のマウスへの投与  −  ＧＳタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの血漿レベルに対する効果
オスの野生型（ｗｔ）ＣＤ１マウスに、実施例１に記載されているように調製した様々なＧＳタンパク質およびＰＥＧコンジュゲート（Ｔｒｉｎ１  −  Ｎ末端アルデヒドコンジュゲートＧＳ単量体；Ｔｒｉｎ２  −  Ｎｏｆ−２０  ＧＳコンジュゲート多量体；Ｔｒｉｎ  ３  −  Ｎｏｆ−３０コンジュゲートＧＳ多量体；Ｔｒｉｎ４  −  Ｎ末端アルデヒドコンジュゲートＰＥＧ多量体）の皮下（ｓ．ｃ）投与により２．５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＥＬＩＳＡを、製造者によって概説されたプロトコルに従って行った（Ａｂｃａｍ  ＰＥＧ  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ１３３０６５）。図３に示されている血漿ＥＬＩＳＡの結果は、予想通り、非コンジュゲートｗｔ  ＧＳに関して、全ての時点で極めて低いかまたは検出不可能なレベルを示している。２４時間後、いくつかの候補は血漿中で高レベルであることが見出されたが、投与後７２時間後、Ｔｒｉｎ−ＧＳ  ４（Ｎ末端アルデヒドコンジュゲートＰＥＧ  ＧＳ多量体）は、最も高い存在を示した。各群Ｎ＝２匹。故に、この実験は、ＧＳタンパク質の全身投与が、高い循環レベルのＧＳ  ＰＥＧコンジュゲートを、および特に治療的に有効または活性となり得るレベルで得るのに成功裏に使用され得ることを示している。
【０１３８】
実施例４
ＧＳタンパク質のマウスへの投与  −  肝臓溶解物のＧＳ活性レベル
活性アッセイは、５００μｇの肝臓溶解物（実施例３の実験からの殺処分したマウス由来）を必要に応じて各反応に添加したこと以外は、実施例２に記載されているように行った。結果を図４に示す。投与後３日の肝臓溶解物におけるＧＳ活性結果は、優れた候補はＮ末端アルデヒドコンジュゲートＰＥＧ  ＧＳ多量体であり、媒体（生理食塩水投与）対照と比べたベースラインを上回る有意な活性を示す唯一の候補であったことを示すものである。各群Ｎ＝２匹。
【０１３９】
実施例５
尿素サイクル異常症（ＯＴＣ欠損症）のＯｔｃｓｐｆ−ａｓｈマウスモデルを使用して、ＧＳおよびＧＳ＋ＳＰの効果を示した。使用したマウスの詳細は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｓｔｒａｉｎ／００１８１１（Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎ  ａ／Ａ−Ｏｔｃｓｐｆ−ａｓｈ／Ｊ）に見出すことができる。マウスに通常の食事を与える。年齢は約１０週〜２３週とばらつきがあり、群をよくマッチさせた。全ての動物は、オスのヘミ接合性である（ＯＴＣはＸ連鎖性であるため、オスのＸ染色体にのみ存在し、それ故にマウスはノックアウトである）。
【０１４０】
Ｎ末端ＧＧＧＳリンカー、およびＧＧＧＧＳリンカーを含む非ペグ化（ｎｏｎ−ｐｅｇｌｙａｔｅｄ）ヒトＧＳを使用した。これは、図６にＡＭ５３５として言及されている。全ての群［媒体、ＧＳおよびＧＳ＋ＳＰ；ＧＳ＝グルタミン合成酵素、ＧＳ＋ＳＰ＝グルタミン合成酵素＋フェニル酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｅｎｌｙａｃｅｔａｔｅ）］を次のように治療した：
実験は火曜日から翌週の水曜日まで（８日）行った。
ＳＰは１日２回、３５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．投与した；ＧＳは最初の４日間、全ての治療群に投与し（１日１回、４０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．）、次いで２日間［週末］中断し、４０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．でＧＳをさらに３日間投与した。
【０１４１】
マウスを８日目に殺処分し、血液を抽出し、血漿について遠沈し、この血漿をアンモニア定量化に使用した（以下の方法参照）。
【０１４２】
文献に記載された標準的な方法を用いて遺伝子型判定を行う。
【０１４３】
材料および方法
全ての実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って改訂された１９８６年動物（科学的処置）法に従って行った。全ての動物は、「実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」（国立衛生研究所刊行物８６−２３；１９８５年改訂）に概説された基準に従って人道的なケアを受けた。これらの実験に使用した全ての動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ケント、ＵＫ）から入手したオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（実験開始時の体重、２５０ｇ）であり、５群に分けた：胆管結紮動物＋アンモニア＋生理食塩水血清（ＢＤＬ＋ＨＡ＋ＳＳ、ｎ＝６）、胆管結紮動物＋アンモニア＋フェニル酢酸ナトリウム（ＢＤＬ＋ＨＡ＋ＳＰ、ｎ＝６）、胆管結紮動物＋アンモニア＋フェニル酢酸ナトリウム＋グルタミン合成酵素（ＢＤＬ＋ＨＡ＋ＳＰ＋ＧＳ、ｎ＝５）、胆管結紮動物＋アンモニア＋グルタミン合成酵素（ＢＤＬ＋ＨＡ＋ＧＳ、ｎ＝６）、偽手術を受けた動物＋グルタミン合成酵素（ＳＨＡＭ＋ＧＳ、ｎ＝５）。ＳＰおよびＧＳを含む治療を「ＣＯＭＢＯ」と呼ぶ場合がある。
【０１４４】
胆管結紮手術
全身麻酔下（誘導に１００％酸素中５％イソフルラン、維持に空気中２％イソフルラン）、慢性肝傷害を誘導するためにラットは胆管の三重結紮を受け（小開腹手術方法）、手術２８日間後に試験された。正中開腹手術を麻酔下で行った。ＢＤＬ群では、総胆管を単離し、３−０絹糸で三重に結紮し、結紮部間で切開した。偽手術群は、結紮部間での切開なしに同じ手順を行った。ＢＤＬ後、全ての動物は体重が増加し続け、偽手術対照と同程度であった。両群の全死亡率は１０％未満であり、手術の３６時間以内に発生した。
【０１４５】
非肝硬変高アンモニア血症条件
２３匹のラットに高アンモニア血症（ＨＡ）食を投与した。約１００ｇのストックに使用したアミノ酸レシピは、１５ｇロイシン、７．７ｇフェニルアラニン、７ｇグルタミン酸、１０ｇアラニン、４．４ｇプロリン、５．８ｇスレオニン、１１ｇアスパラギン酸、５ｇセリン、４．８ｇグリシン、３．３ｇアルギニン、９．６ｇリジン、８．４ｇヒスチジン、３ｇチロシン、１．５ｇトリプトファン、および１０．６ｇバリンであった。この混合（標準的なげっ歯動物の食事粉末と１：５混合した）の２５ｇは毎日新たに調製し、ラットは５日間これに自由にアクセスできた。レシピは、全身の高アンモニア血症をもたらすことが知られている［２］、［１］消化管出血の効果を模倣したげっ歯動物ヘモグロビンのアミノ酸組成に近似していた。
【０１４６】
フェニル酢酸ナトリウム条件
１１匹のラットにフェニル酢酸ナトリウム（ＳＰ）食を投与した。５日間、１日０．３ｇ／ｋｇを食事粉末と混合し、毎日新たに調製した。
【０１４７】
グルタミン合成酵素条件
１６匹のラットに、ＧＳを２日に１回（１日目および３日目）腹腔内注射した。注射した総容量は、１８〜２２ｍｇ／ｋｇのＧＳを可能にする３ｍｌ  ｉ．ｐ．であった。
【０１４８】
結果
ＧＳタンパク質のマウスへの投与  −  肝臓および血液中のＧＳ活性レベル
活性アッセイは、上記の材料および方法セクションに記載されているように行った。結果を図５ＡおよびＢに示す。５日目に測定したラット肝臓の結果は、ＳＨＡＭ＋ＧＳ群で最もＧＳ活性が良いことを示している。さらに、ＧＳおよびＧＳ＋ＳＰ治療は、ＢＤＬを受けたマウスの肝臓のＧＳ活性を増加させることが図５Ａから分かる。血液で測定した場合、結果は、ＢＤＬ＋ＧＳ群で最もＧＳ活性が良いことを示している。さらに、図５Ｂから、血液中のＧＳ活性が経時的に、投与後２４時間および４８時間でさえ一貫して（ｃｏｎｓｉｓｔａｎｔ）いることが分かる。
【０１４９】
ＯＴＣマウス肝臓のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
染色方法は、アルミニウムイオンおよび酸化ヘマトキシリンから形成された複合体であるヘマラムの適用を伴う。これは細胞の核を青く染める。核染色に続いてエオシンＹの水性またはアルコール性溶液で対比染色を行う。対比染色は、好酸性の他の構造を赤、ピンクおよびオレンジの様々な色に染める。ヘマラムによる核の染色はＤＮＡの存在を必要とせず、恐らくは、ヒストンなどのアルギニンリッチ塩基性核タンパク質への色素−金属複合体の結合によるものである。エオシンは、フルオレセインに対する臭素の作用から生じる蛍光赤色色素である。エオシンは、顕微鏡下の実験のために細胞質を染色するのに使用することができる。エオシンで容易に染まる構造は、好酸性と呼ばれる。エオシンは、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色においてヘマトキシリンとの対比染色として最もよく使用される。エオシンは、赤血球を赤色に強く染色する。エオシンは酸性色素であり、細胞の塩基性部分、すなわち細胞質に現れる。
【０１５０】
Ｈ＆Ｅで染色した肝臓標本は、それ故に典型的には青い核を示し、細胞質および細胞外マトリックスは異なる色のピンクとなる。本発明者らは、Ｈ＆Ｅ染色後４０×光学顕微鏡を使用して写真を撮影し、投与群対非投与群を適宜比較した。このプロトコルでは、組織は動物実験から採取し、パラフィンで保存し、ミクロトームで薄切し（約４〜９μｍ切片）、スライドに置き、染色および／またはＩＨＣ分析に備えた。
溶液／緩衝液
＞９８％キシレン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｕｒｅ  ＳＬＲ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｘ／０２００／１７）
＞９８％プロパノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ９５１６）
Ｈ２Ｏ（蒸留）
ヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＭＨＳ１）
エオシンＹ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ４００９）
【０１５１】
この実験に関して、マウス（ＯＴＣ半接合性オス）に組換えヒトＧＳタンパク質を４０ｍｇ／ｋｇで８日間、腹腔内に投与し（以前に記載）、殺処分後、肝臓を回収した。この試験の目的：１．組換えヒトＧＳ（ＡＭ−５３５）、２．対照／媒体のためにマウス肝臓を２群に分けた。両群のマウス肝臓をＨ＆Ｅ染色を含む基礎病態について調べた。
【０１５２】
６つの酵素関連尿素サイクル異常症全てにおいて、脂肪症（ｓｔｅａｔｏｔｉｓ）／脂肪肝様疾患が認められている[Bigot et al. 2017 ‘Liver involvement in urea cycle disorders:a review of the literature]。尿素サイクルは、ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪肝疾患）で調節不全となることが示されている[Chiara et al 2018 ‘Urea cycle dysregulation in nonalcoholic fatty liver disease].
【０１５３】
パラフィン組織ブロック（固定化およびパラフィン化）を、Ｌａｍｂ冷却台（モデルＴＣ−１０）で−１０℃で冷却状態にした。試料をミクロトームで薄切した。肝切片は４μｍ厚；腎臓は４μｍ；脳組織は８μｍで薄切した。薄切後、組織を加熱水槽（セ氏５５度に加熱）に数秒間入れ、次いでスライドに置いた（組織をスライドと共に水に浸してスライドに置く）。
１．脱パラフィン化組織：組織をキシレンに４５秒間「浸漬する（ｄｕｎｋ）」
２．キシレンを除去し、固定する：プロパノールに４５秒間「浸漬する」
３．ヘマトキシリン染色：５０〜１００ｍｍ２あたりヘマトキシリン染色１滴を滴下し、４５秒間待つ（通常、スライド１枚あたり約５滴が必要とされる）
４．ヘマトキシリン水洗：ヘマトキシリン残留物を温（３０℃）水（蒸留Ｈ２Ｏ推奨）で約４５秒間強くすすぐ
５．エオシン染色：エオシン染色２〜３滴を滴下し、３０秒間待つ
６．エオシン水洗：冷水（蒸留Ｈ２Ｏ）で１５秒間再びすすぐ
７．最終洗浄：プロパノールに４５秒間、次いでキシレンに４５秒間浸す
【０１５４】
結果
核は青に、細胞質はピンクから赤色になるはずである。
【０１５５】
示された組換えヒトＧＳ治療マウス（図６参照）は、正常な肝臓構造および細胞の完全性を示し、線維症はほとんどなく、全体的にかなり健康な肝臓であった。対照的に、対照（非投与）群のマウスは、脂肪症および脂肪肝様疾患を示唆する有意に少ない健康な肝臓を示した。
【０１５６】
肝細胞脂肪症は、細胞の周辺への核転位と並存する単一の大きな脂肪滴の存在（大滴性脂肪症）、または小さな脂肪滴および核変位なし（小滴性脂肪症）のどちらかによって同定することができる。前者はＮＡＦＬＤの典型であり、後者はＮＡＳＨの炎症と関連している。これらの結果は、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの両方がこのＯＴＣマウスモデルに関与し得ること、ならびに投与動物の肝臓の健康における明らかな、極めて著しい改善が見られ得ることを実証するものである（図６参照）。
【０１５７】
これらの結果は、ＧＳ療法は、脂肪肝、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）および関連する肝疾患障害を含む肝臓脂肪症を治療および好転させるための可能性のあるツールであることを示している。短期投与（８日間）では、ＡＭ−５３５投与（組換えＧＳ酵素）（ＯＴＣ半接合性）マウスの線維症様表現型は対照マウスと有意に異なっており、この短期間で脂肪肝型進行の好転および阻害が生じたことを示した。これは、ＧＳ療法が脂肪症および関連する疾患（ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨおよび線維症を含む）の治療および好転において有用であり得るという最初の、極めて強力な兆候である。
【０１５８】
実施例６
マウスＭＣＤ試験
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを誘導するのに最も広く使用される食餌は、メチオニン−コリン欠乏（ＭＣＤ）食である。標準的なＭＣＤ食は高含量のショ糖（エネルギーの４０％）も有しており、脂肪も適度に富んでいる（１０〜２０％）。これは極めて再現性のあるモデルである［５］。
【０１５９】
Ｎ末端ＧＧＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−ＧＧＧＧＳリンカー／タグ配列を含むペグ化ヒト組換えＧＳを使用した。このＧＳ（図７ではＡＭ５３５と言及されている）がこのモデルで有効かどうか、および脂肪を低減する可能性があり、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ適用の潜在的候補となり得るかどうかを調べるために試験を実施した。
【０１６０】
方法
マウスモデル背景、表現型：
マウス：Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ
性別：メス
体重：２５ｇ〜３０ｇ
年齢：＞７週
ＭＣＤ食投与量：
１日５ｇ／マウス１匹あたり＋必要に応じて薬物介入
ＭＣＤ食構成：
メチオニン／コリン欠乏食組成（量ｇ／ｋｇ食）：
ショ糖４５５．３ｇｍ
コーンスターチ２００．０ｇｍ
トウモロコシ油１００．０ｇｍ
Ａｌｐｈａｃｅｌ  Ｎｏｎ−Ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  Ｂｕｌｋ  ３０．０ｇｍ
ＡＩＮ  ７６  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘ  ３５．０ｇｍ
ＡＩＮ  ７６  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘ組成物（ｇｍ／ｋｇ）：
第二リン酸カルシウム５００．００ｇｍ
塩化ナトリウム７４．００ｇｍ
クエン酸三カリウム一水和物２２０．００ｇｍ
硫酸カリウム５２．００ｇｍ
酸化マグネシウム２４．００ｇｍ
炭酸マンガン（４３〜４８％  Ｍｎ）３．５０ｇｍ
クエン酸酸化鉄（１６〜１７％  Ｆｅ）６．００ｇｍ
炭酸亜鉛（７０％  ＺｎＯ）１．６０ｇｍ
炭酸第二銅（５３〜５５％  Ｃｕ）０．３０ｇｍ
ヨウ素酸カリウム０．０１ｇｍ
亜セレン酸ナトリウム０．０１ｇｍ
硫酸クロムカリウム０．５５ｇｍ
ショ糖、微粉末１１８．００ｇｍ−リン酸第二カルシウム３．０ｇｍ、Ｌ−アラニン３．５ｇｍ、Ｌ−アルギニン塩酸塩１２．１ｇｍ、Ｌ−アスパラギン一水和物６．０ｇｍ、Ｌ−アスパラギン酸３．５ｇｍ、Ｌ−シスチン３．５ｇｍ、Ｌ−グルタミン酸４０．０ｇｍ、グリシン２３．３ｇｍ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩４．５ｇｍ、Ｌ−イソロイシン８．２ｇｍ、Ｌ−ロイシン１１．１ｇｍ、Ｌ−リジン塩酸塩１８．０ｇｍ、Ｌ−フェニルアラニン７．５ｇｍ、Ｌ−プロリン３．５ｇｍ、Ｌ−セリン３．５ｇｍ、Ｌ−スレオニン８．２ｇｍ、Ｌ−トリプトファン１．８ｇｍ、Ｌ−チロシン５．０ｇｍ、Ｌ−バリン８．２ｇｍ、酢酸ＤＬ−アルファ−トコフェロール（２５０ｕ／ｇｍ）０．４８４ｇｍ、ビタミンＡパルミチン酸塩（２５０，０００ｕ／ｇｍ）０．０７９２ｇｍ、ビタミンＤ３（４００，０００ｕ／ｇｍ）０．００５５ｇｍ、エトキシキン０．０２ｇｍ、ビタミンミックス−ビオチン０．０００４ｇｍ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０６６１ｇｍ、葉酸０．００２ｇｍ、イノシトール０．１１０１ｇｍ、メナジオン０．０４９６ｇｍ、ナイアシン０．０９９１ｇｍ、ｐ−アミノ安息香酸０．１１０１ｇｍ、ピリドキシン塩酸塩０．０２２０ｇｍ、リボフラビン０．０２２ｇｍ、チアミン塩酸塩０．０２２ｇｍ、ビタミンＢ１２（０．１％  ｔｒｉｔ．）０．０２９７ｇｍ、アスコルビン酸１．０１６６ｇｍ、コーンスターチ３．４５０３ｇｍ
【０１６１】
方法／試験の概要：
ＭＣＤマウスを快適な状態にし、食餌を開始する前に少なくとも１週間、飼養施設に収容した。試験は個々の要件に応じて２．５〜４週間続いた。
【０１６２】
治療的介入は使用説明書に従って行った。血中アンモニアを殺処分時点で組織と一緒に採取し、組織検査を行った。このＭＣＤ試験は１８日間行い、上記に定義したように１週間に２回のＧＳをｉ．ｐ．に２５ｍｇ／ｋｇで与えた。合計で、マウスは上記に定義したようにＧＳの６回投与を受けた。臓器および血液を分析のために回収した。
【０１６３】
試験群：
−２×媒体対照（生理食塩水を注射）
−３×ＧＳ投与
【０１６４】
殺処分後分析：
１０ｕｌのマウス血液（新鮮）を使用して−製造者の使用説明書に従って、アンモニアをＡｍｍｏｎｉａ  Ｆｕｊｉチェッカーによって測定した。簡単には、１０ｕｌをカートリッジに適用し、Ｆｕｊｉ機械に挿入した。機械（ブロモフェノールブルーを含有する）は血液試料全体を加熱する。試料が加熱されると、ＮＨ３ガスが全血から放出され、ブロモフェノールブルーと混ざる。試料を次いでＦｕｊｉ  チェッカーによってＯＤ  ６００ｎＭで読み取ってアンモニアの推定値（マイクロモル／ｕＭ）を得、これがカートリッジの挿入２分後にコンソールのオペレーターに示される。
[https://www.fujifilm.com/products/medical/fdc/pdf/index/NH3-W_9903230-A4.pdf].
【０１６５】
肝臓を実施例５に記載されているＨ＆Ｅ染色により分析し、［６，７］に概説されている方法に従って脂肪計数をデジタルで行った（ｍＦＰＡ）。
【０１６６】
結果
アンモニアレベルｖｓ対照マウス
殺処分後すぐにアンモニアレベルを測定し、１０マイクロリットルの全血を各マウスから採取し、Ｆｕｊｉアンモニアチェッカーで分析を行った。アンモニアは、ＭＣＤ媒体対照マウスで有意に上昇し（約１００ｕＭで病原性と見なされる）、ＧＳ投与動物は、アンモニアの極めて低いベースライン（非病原性）レベル（平均約４０ｕＭ）まで下がった、アンモニアレベルの極めて大きな低下を示した（図７参照）。この低下は非常に有意であることが示された。
【０１６７】
Ｈ＆Ｅ染色および脂肪計数：
Ｈ＆Ｅ染色を、上記に記載された実施例５のプロトコルに従って行った。肝切片をその後デジタルで分析して、投与群ｖｓ対照群で脂肪を計数した。
【０１６８】
媒体対照動物と比べた場合、投与動物は脂肪が有意に低いことが独立したｍＦＰＡ脂肪計数から見て取ることができた（図８参照）。したがって、ＧＳはこのＭＣＤモデルにおいて肝臓の脂肪を有意に低減することが結論され得る。
【０１６９】
まとめ
ＧＳは、アンモニアのレベルを極めて有意に（アンモニアの病原性レベル（約１００ｕＭ）から、低い非病原性レベル（約４０ｕＭ）に）低下させることが見出された。これは、ＧＳが、アンモニアのレベルの極めて有意な低下を示した第３のモデルである。したがって、ＧＳは、高アンモニア血症関連状態（尿素サイクル異常症、肝性脳症および有機酸血症を含む）においてさらに追求する優れた候補である可能性がある。
【０１７０】
Ｈ＆Ｅ染色、およびその後の脂肪計数から、本発明者らは、組換えＧＳが脂肪レベルを有意に低下させることも示した。ＭＣＤおよびＯＴＣマウスモデルは両方とも、媒体対照と比べて低下した脂肪レベルを示した。
【０１７１】
実施例７
高脂肪高コレステロールラット
原理／背景
高脂肪高コレステロール（ＨＦＨＣ）ラットは、進行性ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪肝疾患）、脂肪性肝炎、線維症および最終的な肝硬変のモデルである［９−１１］。
【０１７２】
目的
１６週間モデルの最後の７週間、週２回、ｉ．ｐ．投与（約１０ｍｇ／ｋｇで）されたＡＭ−５３５がこのモデルの経過を変え、疾患進行および転帰を改善するかどうかを決定すること。
【０１７３】
試験の概要／方法
８週齢オスＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＵＫから入手した。ラットを収容し、試験前の少なくとも１週間にわたって快適な状態にした。オスＳＤラット２２０〜２５０ｇに高脂肪高コレステロール（１００ｇ）または固形飼料（１００ｇ）食を１６週間給餌し、腹腔内ＧＳ（Ｎ末端ＧＧＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−ＧＧＧＧＳリンカー／タグ配列を含むペグ化ヒト組換えＧＳ、ＡＭ−５３５とも呼ばれる）または媒体を９〜１６週目を含めて１週間に２回受け取るように無作為に割り付けた。殺処分後、心臓穿刺により血液を得、臓器を分析および病理検査のために回収した。
群：
・正常固形飼料食（＋媒体）ｎ＝４
・ＨＦＨＣ食（＋媒体［生理食塩水］）ｎ＝４
・ＨＦＨＣ食（＋ＧＳ）ｎ＝４
治療試験の動物合計ｎ＝１２
【０１７４】
高脂肪高コレステロール食組成
【０１７５】
【表１】
2022502048.tif 000002
【０１７６】
肝組織をパラフィンで保存し、ミクロトームで薄切し（約８μｍ切片）、スライドに置き、染色に備えた。シリウスレッド染色を行ってコラーゲンを検出した：この手法は、染料スルホン酸基とコラーゲン線維の塩基性基との強結合に基づく。
簡単には、染色プロトコルは次の通りである：
１．肝臓のパラフィン切片を脱蝋し、水和させた；２．ピクロシリウスレッド溶液（「Ｄｉｒｅｃｔ  ８０」、カタログ番号２６１０−１０−８）で１時間染色した；３．切片を強く振とうするか、または湿った濾紙でごく優しく吸い取った；４．１００％エタノールを３回交換して切片を脱水した；５．最後に、切片をキシレンで透徹し、ＤＰＸ封入剤でマウントし、撮像した。
【０１７７】
結果
【０１７８】
【表２】
2022502048.tif 000003
表１．血中アンモニアおよび質量。アンモニアはいずれの群でも上昇しないことに注意。肝臓：体重比平均も媒体群と比べて治療群で若干低かった（０．０４７ｖｓ０．０５１）が、これは統計的に有意ではなかった。
【０１７９】
血中アンモニア結果は、アンモニアに関して上昇した群は一つもなく（媒体ＨＦＨＣラットを含む）、媒体と比較した場合、肝臓：体重比のわずかな低下がＧＳ（ＡＭ−５３５）治療群ＨＦＨＣラットで見られたことを示した。
【０１８０】
肝臓病理検査コラーゲン比例面積（ＣＰＡ）結果
図９は、週２回投与の７週間後のＧＳはＣＰＡ（コラーゲン比例面積）が有意に低下し、正常食動物と同じＣＰＡレベルを示すことができたことを示している。
【０１８１】
分析は、ＨＦＨＣ  ＡＭ−５３５投与動物でＣＰＡ（コラーゲン比例面積）が有意に下がったことを示した（シリウスレッド染色肝切片）。コラーゲン比例面積（ＣＰＡ）測定は、総生検面積の割合としてコラーゲン沈着量を測定することにより、肝臓生検または切片（ヒト患者または動物の）の線維組織を定量化する［１１，１２］。ＣＰＡは、脂肪肝および肝硬変患者の臨床転帰を予測する［１３，１４］。
【０１８２】
線維症は、肝臓に異常に大量の瘢痕組織が形成されることである。線維症は、肝臓が損傷細胞を修復し置き換えようとするときに生じる。したがって、線維症は、後期脂肪肝疾患および肝硬変のマーカーである。
【０１８３】
まとめ
この特定の試験では、ＨＦＨＣラットに高脂肪、高コレステロール食を１６週間給餌した（またはナイーブ対照動物には正常食）。最後の７週間で、ＨＦＨＣ食ラットに媒体（生理食塩水）またはＧＳのどちらかを週２回、約１０ｍｇ／ｋｇで投与した。殺処分後、臨床血液パラメーターを測定した。ＧＳ  ＨＦＨＣラットを媒体ＨＦＨＣ対照と比較した場合、ほとんどの血液および質量パラメーターで類似したレベルが観察された。
【０１８４】
ＣＰＡが極めて高レベルで測定された媒体ＨＦＨＣ動物とは対照的に、ＧＳは、ＨＦＨＣ食に供されたラットにおいてＣＰＡを正常食レベルまで極めて有意に下げることができた。アンモニアはいずれの群でも上昇しなかったことから、ＨＦＨＣモデルは高アンモニア血症モデルではない。さらに、この酵素療法の極めて低い毒性および高い安全性プロファイルを特に考慮すると、投与を１０ｍｇ／ｋｇ、週２回から増やし得ることは実現可能である。ＧＳ投与は７週時点で開始した。９週時点で、ラットはすでに肝疾患を進行させていたであろうという事実に照らすと、これらのデータは特に興味深く、ＧＳが肝臓線維症に対する可能性のある治療であることを示している。
【０１８５】
（参考文献）
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配列：
配列番号１［完全ヒトタンパク質］
MTTSASSHLNKGIKQVYMSLPQGEKVQAMYIWIDGTGEGLRCKTRTLDSEPKCVEELPEWNFDGSSTLQSEGSNSDMYLVPAAMFRDPFRKDPNKLVLCEVFKYNRRPAETNLRHTCKRIMDMVSNQHPWFGMEQEYTLMGTDGHPFGWPSNGFPGPQGPYYCGVGADRAYGRDIVEAHYRACLYAGVKIAGTNAEVMPAQWEFQIGPCEGISMGDHLWVARFILHRVCEDFGVIATFDPKPIPGNWNGAGCHTNFSTKAMREENGLKYIEEAIEKLSKRHQYHIRAYDPKGGLDNARRLTGFHETSNINDFSAGVANRSASIRIPRTVGQEKKGYFEDRRPSANCDPFSVTEALIRTCLLNETGDEPFQYKN
配列２（インビボでの成熟タンパク質のためにメチオニンのみが切断されている）：
TTSASSHLNKGIKQVYMSLPQGEKVQAMYIWIDGTGEGLRCKTRTLDSEPKCVEELPEWNFDGSSTLQSEGSNSDMYLVPAAMFRDPFRKDPNKLVLCEVFKYNRRPAETNLRHTCKRIMDMVSNQHPWFGMEQEYTLMGTDGHPFGWPSNGFPGPQGPYYCGVGADRAYGRDIVEAHYRACLYAGVKIAGTNAEVMPAQWEFQIGPCEGISMGDHLWVARFILHRVCEDFGVIATFDPKPIPGNWNGAGCHTNFSTKAMREENGLKYIEEAIEKLSKRHQYHIRAYDPKGGLDNARRLTGFHETSNINDFSAGVANRSASIRIPRTVGQEKKGYFEDRRPSANCDPFSVTEALIRTCLLNETGDEPFQYKN
配列番号３  ｃＤＮＡ
CGAGAGTGGGAGAAGAGCGGAGCGTGTGAGCAGTACTGCGGCCTCCTCTCCTCTCCTAAC
CTGCTCTCGCGGCCTACCTTTACCCGCCCGCCTGCTCGGCGACCAGAACACCTTCCACCA
TGACCACCTCAGCAAGTTCCCACTTAAATAAAGGCATCAAGCAGGTGTACATGTCCCTGC
CTCAGGGTGAGAAAGTCCAGGCCATGTATATCTGGATCGATGGTACTGGAGAAGGACTGC
GCTGCAAGACCCGGACCCTGGACAGTGAGCCCAAGTGTGTGGAAGAGTTGCCTGAGTGGA
ATTTCGATGGCTCCAGTACTTTACAGTCTGAGGGTTCCAACAGTGACATGTATCTCGTGC
CTGCTGCCATGTTTCGGGACCCCTTCCGTAAGGACCCTAACAAGCTGGTGTTATGTGAAG
TTTTCAAGTACAATCGAAGGCCTGCAGAGACCAATTTGAGGCACACCTGTAAACGGATAA
TGGACATGGTGAGCAACCAGCACCCCTGGTTTGGCATGGAGCAGGAGTATACCCTCATGG
GGACAGATGGGCACCCCTTTGGTTGGCCTTCCAACGGCTTCCCAGGGCCCCAGGGTCCAT
ATTACTGTGGTGTGGGAGCAGACAGAGCCTATGGCAGGGACATCGTGGAGGCCCATTACC
GGGCCTGCTTGTATGCTGGAGTCAAGATTGCGGGGACTAATGCCGAGGTCATGCCTGCCC
AGTGGGAATTTCAGATTGGACCTTGTGAAGGAATCAGCATGGGAGATCATCTCTGGGTGG
CCCGTTTCATCTTGCATCGTGTGTGTGAAGACTTTGGAGTGATAGCAACCTTTGATCCTA
AGCCCATTCCTGGGAACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTCAGCACCAAGGCCA
TGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAGTACATCGAGGAGGCCATTGAGAAACTAAGCAAGCGGC
ACCAGTACCACATCCGTGCCTATGATCCCAAGGGAGGCCTGGACAATGCCCGACGTCTAA
CTGGATTCCATGAAACCTCCAACATCAACGACTTTTCTGGTGGTGTAGCCAATCGTAGCG
CCAGCATACGCATTCCCCGGACTGTTGGCCAGGAGAAGAAGGGTTACTTTGAAGATCGTC
GCCCCTCTGCCAACTGCGACCCCTTTTCGGTGACAGAAGCCCTCATCCGCACGTGTCTTC
TCAATGAAACCGGCGATGAGCCCTTCCAGTACAAAAATTAAGTGGACTAGACCTCCAGCT
GTTGAGCCCCTCCTAGTTCTTCATCCCACTCCAACTCTTCCCCCTCTCCCAGTTGTCCCG
ATTGTAACTCAAAGGGTGGAATATCAAGGTCGTTTTTTTTCATTCC
配列番号４：実施例１で使用した、細菌中で増殖させたＧＳタンパク質
MGSSHHHHHHGGGGSMTTSASSHLNKGIKQVYMSLPQGEKVQAMYIWIDGTGEGLRCKTRTLDSEPKCVEELPEWNFDGSSTLQSEGSNSDMYLVPAAMFRDPFRKDPNKLVLCEVFKYNRRPAETNLRHTCKRIMDMVSNQHPWFGMEQEYTLMGTDGHPFGWPSNGFPGPQGPYYCGVGADRAYGRDIVEAHYRACLYAGVKIAGTNAEVMPAQWEFQIGPCEGISMGDHLWVARFILHRVCEDFGVIATFDPKPIPGNWNGAGCHTNFSTKAMREENGLKYIEEAIEKLSKRHQYHIRAYDPKGGLDNARRLTGFHETSNINDFSAGVANRSASIRIPRTVGQEKKGYFEDRRPSANCDPFSVTEALIRTCLLNETG DEPFQYKN
配列番号５  ｃＤＮＡ（実施例１で使用した細菌の最適化ｃＤＮＡ）。
ATGGGCAGCAGCCACCACCATCACCACCACGGCGGCGGCGGTAGCATGACCACCTCGGCAAGCAGCCACCTGAATAAAGGCATCAAACAGGTGTATATGTCTCTGCCGCAGGGTGAAAAAGTTCAAGCCATGTACATTTGGATCGATGGCACCGGTGAAGGCCTGCGTTGCAAAACCCGCACGCTGGACTCAGAACCGAAATGTGTGGAAGAACTGCCGGAATGGAACTTTGATGGTAGCTCTACGCTGCAGTCGGAAGGCAGTAATTCCGACATGTATCTGGTTCCGGCGGCCATGTTTCGTGATCCGTTCCGCAAAGACCCGAACAAACTGGTGCTGTGCGAAGTTTTTAAATACAACCGTCGCCCGGCGGAAACCAATCTGCGTCATACGTGTAAACGCATTATGGATATGGTCAGCAACCAGCACCCGTGGTTCGGTATGGAACAAGAATATACCCTGATGGGTACGGATGGCCATCCGTTTGGTTGGCCGAGCAATGGTTTCCCGGGTCCGCAGGGTCCGTATTACTGCGGTGTCGGCGCAGATCGTGCTTACGGTCGCGACATTGTGGAAGCACACTATCGTGCTTGTCTGTACGCGGGTGTTAAAATCGCCGGCACCAATGCAGAAGTCATGCCGGCTCAGTGGGAATTTCAAATTGGCCCGTGCGAAGGTATCAGCATGGGCGATCATCTGTGGGTTGCTCGTTTCATCCTGCACCGCGTCTGTGAAGATTTTGGTGTGATTGCGACCTTCGACCCGAAACCGATCCCGGGCAACTGGAATGGTGCTGGCTGCCATACCAACTTTAGCACGAAAGCGATGCGTGAAGAAAATGGCCTGAAATACATCGAAGAAGCAATCGAAAAACTGTCTAAACGTCATCAGTATCACATTCGCGCCTACGATCCGAAAGGCGGTCTGGACAACGCACGTCGCCTGACCGGTTTTCACGAAACGAGCAACATCAATGATTTCTCTGCGGGCGTTGCCAATCGCTCAGCCTCGATTCGTATCCCGCGCACCGTCGGTCAAGAGAAAAAAGGCTATTTTGAAGATCGTCGCCCGAGTGCAAACTGTGACCCGTTCTCCGTGACGGAAGCCCTGATCCGCACCTGTCTGCTGAATGAAACCGGCGATGAACCGTTCCAATACAAAAAT
配列番号６［ラクトバチルス・アシドフィルス株３０ＳＣ  ＧＳ］
＞ｔｒ｜Ｆ０ＴＧ８７｜Ｆ０ＴＧ８７＿ＬＡＣＡ３グルタミン合成酵素ＯＳ＝ラクトバチルス・アシドフィルス（株３０ＳＣ）
MSKQYTTEEIRKEVADKDVRFLRLCFTDINGTEKAVEVPTSQLDKVLTNDIRFDGSSIDGFVRLEESDMVLYPDFSTWSVLPWGDEHGGKIGRLICSVHMTDGKPFAGDPRNNLKRVLGEMKEAGFDTFDIGFEMEFHLFKLDENGNWTTEVPDHASYFDMTSDDEGARCRREIVETLEEIGFEVEAAHHEVGDGQQEIDFRFDDALTTADRCQTFKMVARHIARKHGLFATFMAKPVEGQAGNGMHNNMSLFKNKHNVFYDKDGEFHLSNTALYFLNGILEHARAITAIGNPTVNSYKRLIPGFEAPVYIAWAAKNRSPLVRIPSAGEINTRLEMRSADPTANPYLLLAACLTAGLKGIKEQKMPMKPVEENIFEMTEEERAEHGIKPLPTTLHNAIKAFKEDDLIKSALGEHLTHSFIESKELEWSKYSQSVSDWERQRYMNW
配列番号７［ゼア・マイスＧＳ］［トウモロコシ（ｃｏｒｎ）／トウモロコシ（Ｍａｉｚｅ）ＧＳ］
＞ｔｒ｜Ｂ４Ｇ１Ｐ１｜Ｂ４Ｇ１Ｐ１＿ＭＡＩＺＥグルタミン合成酵素
MACLTDLVNLNLSDNTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLSGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDCYTPAGEPIPTNKRYNAAKIFSSPEVAAEEPWYGIEQEYTLLQKDTNWPLGWPIGGFPGPQGPYYCGIGAEKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISSGDQVWVARYILERITEIAGVVVTFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTESMRKEGGYEVIKAAIEKLKLRHREHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTIIWKP
【図１】
2022502048.tif 000004
【図２】
2022502048.tif 000005
【図３】
2022502048.tif 000006
【図４】
2022502048.tif 000007
【図５】
2022502048.tif 000008
【図６】
2022502048.tif 000009
【図７】
2022502048.tif 000010
【図８】
2022502048.tif 000011
【図９】
2022502048.tif 000012
【図１０】
2022502048.tif 000013
【配列表】
2022502048000001.app
【国際調査報告】
2022502048.tif 000014
2022502048.tif 000015
2022502048.tif 000016
2022502048.tif 000017