(57)【要約】  本発明は、薬剤の分野、特に、線維症の診断及び治療の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＤ１４６及びそれをバイオマーカーとした線維症の診断において、また線維症の治療において治療標的として使用することに関する。本発明はまた、対象において線維症の素因を検出する組成物及び方法、対象において繊維症を診断、予後予測及び／又はモニターする組成物及び方法に関する。さらに、対象における線維症の予防又は治療において使用するための、ＣＤ１４６阻害剤と、ＣＤ１４６阻害剤を含む組成物と、組成物キット及び診断又は治療状況におけるその使用とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓又は腎線維症の素因検出、診断及び／若しくは予後予測又はモニターにおいてバイオマーカーとして使用するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質。
【請求項２】
対象の線維症の素因検出、診断及び／若しくは予後予測又はモニターにおいてバイオマーカーとして使用するための配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質。
【請求項３】
インビトロ又はエクスビボで、対象の心臓又は腎線維症の素因検出若しくは診断及び／又は予後予測を行う方法であって、
当該方法は、前記対象の生体サンプルにおいて前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを決定するステップを含み、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される方法。
【請求項４】
前記方法は、
前記対象の生体サンプルにおいて前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを決定するステップであって、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるステップｉ）と、
ステップｉ）において決定された前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
ステップｉ）において決定された前記レベルが前記基準値よりも高い場合、前記対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると結論づける、又はステップｉ）で決定された前記レベルが前記基準値より低い場合、前記患者が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インビトロ又はエクスビボで、対象において線維症の素因検出若しくは診断及び／又は予後予測を行う方法であって、
当該方法は、前記配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は前記配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップを含む方法。
【請求項６】
前記方法は、
前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを、前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、
ステップｉ）で決定した前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
前記対象が線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも高い場合、結論づける、又は前記患者が線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも低い場合、結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、
前記Ｉ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、
ステップｉ）で決定した前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
前記対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも低い場合、結論づける、又は前記患者が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも高い場合、結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インビトロ又はエクスビボで、心臓又は腎線維症を、対象においてモニターする方法であって、
前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップであって、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される決定ステップを含み、
可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが前記対象の生体サンプルにおいて遅い時点で、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが低いことは、線維症の減少を示し、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、モニター方法。
【請求項９】
インビトロ又はエクスビボで、対象の線維症をモニターする方法であって、配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップを含み、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが前記対象の生体サンプルにおいて遅い時点において、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが低いことは、線維症の減少を示し、等しいヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、モニター方法。
【請求項１０】
インビトロ又はエクスビボで、対象の線維症をモニターする方法であって、配列番号９の前記Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップを含み、前記対象の生体サンプルにおける可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが、遅い時点において、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、低いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが高いことは、線維症の減少を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、モニター方法。
【請求項１１】
対象、典型的には線維症の素因がある、線維症の影響を受けている若しくは予後不良の線維症を有すると請求項３又は４に記載の方法により特定された対象、又は未進行の線維症若しくは線維症の増加を有すると請求項８に記載の方法により特定された対象における心臓及び／又は腎線維症の予防若しくは治療において使用するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤。
【請求項１２】
対象、典型的には線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良の線維症を有すると請求項５又は６に記載の方法により特定された対象又は未進行の線維症若しくは線維症の増加を有すると請求項９に記載の方法により特定された対象における線維症の予防若しくは治療に使用するための配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤。
【請求項１３】
前記阻害剤は、抗体、アプタマー、ポリペプチド、有機小分子及び核酸から選択される、請求項１１に記載の可溶型ＣＤ１４６阻害剤若しくは請求項１２に記載のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６阻害剤。
【請求項１４】
前記阻害剤は、抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体、好ましくは可溶型ＣＤ１４６に選択的に結合するモノクローナル抗体である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の可溶型ＣＤ１４６阻害剤。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤と、対象における心臓及び／又は腎線維症の予防又は治療において使用するための薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項１６】
配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤と、対象における線維症の予防又は治療に使用するための薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項２に記載の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質若しくは前記Ｉ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項３又は４に記載のインビトロ又はエクスビボで心臓又は腎線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項５から７のいずれかに記載のインビトロ又はエクスビボで線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項８に記載のインビトロ又はエクスビボで心臓又は腎線維症をモニターする方法、請求項９又は１０に記載のインビトロ又はエクスビボで線維症をモニターする方法、請求項１１、１３又は１４に記載の前記可溶型ＣＤ１４６阻害剤、請求項１２、１３又は１４に記載の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６阻害剤、又は請求項１５又は１６に記載の組成物であって、前記対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである、可溶型ＣＤ１４６タンパク質、線維症の素因の検出若しくは診断及び／又は予後予測方法、心臓又は腎線維症のモニター方法、線維症のモニター方法、又は可溶型ＣＤ１４６阻害剤又は組成物。
【請求項１８】
請求項２に記載のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又はＩ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項５から７に記載のインビトロ又はエクスビボで線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項９又は１０に記載のインビトロ又はエクスビボで線維症をモニターする方法、請求項１２、１３又は１４に記載のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６阻害剤、又は請求項１６に記載の組成物であって、線維症は肺線維症である、可溶型ＣＤ１４６タンパク質、線維症の素因の検出若しくは診断及び／又は予後予測方法、線維症のモニター方法、又は可溶型ＣＤ１４６阻害剤又は組成物。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質を含む組成物、又は配列番号９の前記Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質、及び対象、好ましくはヒトにおける皮膚線維症及び／又は肺線維症の予防又は治療に使用するための薬学的に許容されるキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、薬剤の分野、特に、線維症の診断及び治療の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＤ１４６と、それをバイオマーカーとして線維症の診断において使用すること及び治療ターゲットとして線維症の治療において使用することに関する。本発明はまた、対象において線維症の素因を検出する組成物及び方法、対象において繊維症を診断、予後予測及び／又はモニターする組成物及び方法に関する。さらに、対象における線維症の予防又は治療において使用するための、ＣＤ１４６阻害剤と、ＣＤ１４６阻害剤を含む組成物と、組成物キット及び診断又は治療状況におけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、修復又は反応過程において器官又は組織に過度の繊維性結合組織が形成されるものである。生理学的に、線維症は、結合組織を沈着させるように作用し、当該結合組織は、下に横たわる器官又は組織の構造及び機能を消し去ってしまいかねない。細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質の病的な蓄積と規定されることから、線維症は、影響を受けた組織に瘢痕を残し厚くする結果となる。それは、本質において、正常な器官の機能を妨げる、過剰となった創傷治癒応答である。組織は、益々硬化し、その機能性を失ってしまう。
【０００３】
線維症は、瘢痕過程と類似しており、その両方に、コラーゲン及びグリコサミノグリカンを含め、結合組織を下に横たえる繊維芽細胞が刺激されることを伴う。その過程は、マクロファージ等の免疫細胞が、線維芽細胞を刺激する可溶型因子を放出すると開始される。最も特徴的な線維化促進メディエータは、トランスフォーミング増殖因子βであり、当該増殖因子βは、マクロファージと、間質と呼ばれる表面の間の任意の損傷を受けた組織とにより放出される。線維症の他の既知の可溶型メディエータには、ＣＴＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）が含まれる。自己免疫疾患もまた、線維症に至る恐れがある。組織修復のこの過程は、複雑であり、ＥＣＭ合成及び分解の厳格な制御が、正常な組織構造の維持を保証する。しかしながら、過程全体は、必要であるものの、組織創傷が深刻であるか若しくは繰り返されている場合又は創傷治癒の応答自体が調節解除されようとしている場合、徐々に不可逆的な繊維化応答に至る可能性がある。
【０００４】
線維症は、身体内の器官及び多くの組織に、典型的には、炎症又は損傷の結果として、起こり得るものであり、例として、心臓（心房線維症、心内膜心筋線維症、梗塞、特に、陳旧性心筋梗塞）、腎臓（腎線維症）、肝臓（肝硬変、胆道閉鎖症）、肺（進行性塊状線維症）、脳（神経膠瘢痕）、動脈（動脈硬化）、膝又は肩等の関節（関節線維症）、腸（クローン病）、手、指（デュピュイトラン拘縮）、皮膚（ケロイド、腎性全身性線維症）、縦隔の軟組織（縦隔線維症）、骨髄の軟組織（後腹膜線維症）、骨髄（骨髄繊維症）等が含まれる。
【０００５】
糸球体疾患は、腎線維症及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）に、徐々に又は急速に至る可能性がある。急速進行性又は半月体形成性糸球体腎炎（ＧＮ）は、腎糸球体損傷と半月体の発現を伴う顕著な炎症の結果として末期の腎不全に急速に進行し得るまれな腎臓病の一群である（Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ，Ｐ，２００７）。その他の腎臓の区画が、影響を受け、腎臓の間質性線維症に至る炎症を示す管形成間質を含む。このような構造的な病変の機能的帰結は、腎機能の急速な悪化である（Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ  ２０１３）。いくつかの研究でさえ、実験的ＧＮの前臨床モデルにおいて概ね、病態生理学的進歩があったとすれば、炎症過程と、その結果として生じる線維症の両方において、当該疾患の制御及び進行における分子的洞察が、なお制限されており、現在の治療は、依然として部分的にしか有効ではない。
【０００６】
心臓線維症は、心筋梗塞、ある種の心筋症又は高血圧等の心疾患のある種の形態に応答して同時に発現する創傷治癒過程である。細胞外基質タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンＩ及びＩＩＩ）の沈着が増加するという特徴があり、これには、基質の分解に関与するメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現の減少を伴う（Ｔａｌｍａｎ及びＲｕｓｋｏａｈｏ，２０１６）。この組織の蓄積は、収縮及び弛緩の能力のみならず内在的な心臓の電気活動を引き起こす能力まで失わせる障害を受けた心臓の硬直増進及びコンプライアンス低下の原因となる。このようなすべての変化は、心臓に機能不全を発現した患者が、長い時間をかけて、心停止に至ることになる（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ他，２０１０）。
【０００７】
心臓線維症は、心筋内の位置によって２種類に分類される。
−心筋細胞の間の間質空間内への線維症の進行に相当する「反応／間質性」線維症このタイプの線維症は、さらに詳細には、老化と関連して説明される（Ｃｈｅｎ及びＦｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，２０１０，Ｍａｙｓ他，１９９１）。実際、多くの研究が、心臓の老化が、肥大化につながる心筋細胞の総数の減少と心筋のコラーゲン沈着の有意な増加と関連付けられることを示してきた。このような変化は、収縮機能は保ちながらも拡張障害をもたらす心臓のコンプライアンスの低下の原因となる（Ｂｉｅｒｎａｃｋａ及びＦｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，２０１１）。
−「修復性繊維症（ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」は、心筋梗塞等の心疾患に応答した瘢痕組織形成を指す（Ｗｅｂｅｒ，１９８９）。
【０００８】
現在のところ、心臓線維症の有害な過程を制御するのに有効な治療法は殆どない。よって、この過程を阻止又逆進させる新しい治療法の探求が、主な公衆衛生の課題である。
【０００９】
線維症を伴う病変の頻度は、高齢化と、心血管憎悪のリスク因子（糖尿病、肥満及び高血圧）により有意に高い。これまで、特定のバイオマーカーを線維症の検出に利用することはできなかった。線維症を定量化する唯一の方法は、生検である。同様に、線維症の治療に利用可能な治療方法はなく、特に、繊維化過程を逆進させることができる治療方法はない。
【００１０】
線維症を診断しモニターする又は患者に線維症を発現するリスクがあるか否かを判定する簡易で信頼できる特異性のある試験は、なお不足し、患者の健康を保つ又は改善することを意図した予防及び治療戦略を迅速に立てることは高い価値のあることである。これが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｌａｉｓ，  Ｓ．，  Ａｌｌｉｏｌｉ，  Ｎ．，  Ｐｕｊａｄｅｓ，  Ｃ．，  Ｄｕｂａｎｄ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｖａｉｎｉｏ，  Ｏ．，  Ｉｍｈｏｆ，  Ｂ．Ａ．，  Ｄｕｎｏｎ，  Ｄ．  ＨＥＭＣＡＭ／ＣＤ１４６  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ１１４：１８４７−１８５９  （２００１）
【非特許文献２】Ａｎｆｏｓｓｏ，  Ｆ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｓａｂａｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  Ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ＣＤ１４６  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７６：１５６４−１５６９  （２００１）
【非特許文献３】Ｓｏｌｏｖｅｙ，  Ａ．Ｎ．，  Ｇｕｉ，  Ｌ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｅｎｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．，  Ｂｒｏｗｎｅ，  Ｐ．Ｖ，  Ｈｅｂｂｅｌ，  Ｒ．Ｐ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐ１Ｈ１２．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．１３８：３２２−３１  （２００１）
【非特許文献４】Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ８：３１９−３２７  （１９９８）；
【非特許文献５】Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ａｎｆｏｓｓｏ，  Ｆ．，  Ｍａｓｓｅ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｃｒａｍｅｒ，  Ｅ．，  Ｓａｂａｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｌｅ  Ｂｉｖｉｃ，  Ａ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１４６  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｃｏｈｅｓｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ９８：３６７７−３６８４  （２００１）
【非特許文献６】Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ，  Ｍ．，  Ｄｅｓｐｏｉｘ，  Ｎ．，  Ｋｅｂｉｒ，  Ａ．，  Ｈａｒｈｏｕｒｉ，  Ｋ．，  Ａｒｓａｎｔｏ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｅｓｐｉｎｏｓａ，  Ｌ．，  Ｐｅｒｒｉｎ，  Ｐ．，  Ｒｏｂｅｒｔ，  Ｓ．，  Ｖｅｌｙ，  Ｆ．，  Ｓａｂａｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｌｅ  Ｂｉｖｉｃ，  Ａ．，  Ｋａｐｌａｎｓｋｉ，  Ｇ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  ＣＤ１４６  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ２９：７４６−７５３  （２００９）
【非特許文献７】Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｍｏａｌ，  Ｖ．，  Ａｎｆｏｓｓｏ，  Ｆ．，  Ｄａｎｉｅｌ，  Ｌ．，  Ｂｒｕｎｅｔ，  Ｐ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４６，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ，  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ．  ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．９０：９１５−９２０  （２００３）
【非特許文献８】Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｒｅｕｍａｕｘ，  Ｄ．，  Ｇｅｂｏｅｓ，  Ｋ．，  Ｃｏｌｏｍｂｅｌ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ，  Ｍ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｄｕｔｈｉｌｌｅｕｌ，  Ｐ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１４６，  ａ  ｎｅｗ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ１２：１６−２１  （２００６）
【非特許文献９】Ｂｅｃｋｅｒｓ  Ｍ，  Ｇｌａｄｉｓ−Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｍ，  Ｈａｍａｎｎ  Ｗ，  Ｓｃｈｍｕｔｚｌｅｒ  Ｗ，  Ｚｗａｄｌｏ−Ｋｌａｒｗａｓｓｅｒ  Ｇ．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｒｉｏ−ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ  ａｓ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ  Ｏｆｆ  Ｊ  Ｅｕｒ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｓ  Ｓｏｃ  Ａｌ．  １９９７；４６：２９-３０．
【非特許文献１０】Ｂｉｅｒｎａｃｋａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，  Ｎ．Ｇ．  （２０１１）．  Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｇｉｎｇ  Ｄｉｓ．  ２，  １５８-１７３．
【非特許文献１１】Ｂｏｎｅｂｅｒｇ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｉｌｌｇｅｓ，  Ｈ．，  Ｌｅｇｌｅｒ，  Ｄ．Ｆ．，  Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｇ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４６  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＣＤ１４６  ｉｎ  ａ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ，  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ７８：３２５−３３１  （２００９）
【非特許文献１２】Ｃｈａｄｂａｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｒ．Ｃ．  Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｌａｎｃｅｔ．  ３６５：１７９７−１８０６  （２００５）
【非特許文献１３】Ｃｈａｎ，  Ｂ．，  Ｓｉｎｈａ，  Ｓ．，  Ｃｈｏ，  Ｄ．，  Ｒａｍｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｒ．，  Ｓｕｋｈａｔｍｅ，  Ｖ．Ｐ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＣＤ１４６  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ２３２：２３２−２４４  （２００５）
【非特許文献１４】Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，  Ｒ．Ｒ．，  Ｈｅｒｒｏｎ，  Ｔ．，  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｒ．，  Ｓｈｏｒｅ，  Ｄ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｐ．，  Ｓｅｔｈｉａ，  Ｂ．，  Ｃｈｕａ，  Ｆ．，  Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｋｅｎｔｉｓｈ，  Ｊ．Ｃ．  （２０１０）．  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  Ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｓｔｏｌｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１，  ９７９-９８８．
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ，  Ｎ．Ｇ．  （２０１０）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｇｉｎｇ．  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．  Ｒｅｖ．  １５，  ４１５-４２２．
【非特許文献１６】Ｃｏｈｅｎ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｌｉｎｄｅｎｍｅｙｅｒ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ  ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｂｙｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｂｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ３：ｅ２９３７  （２００８）
【非特許文献１７】Ｄａｎｉｅｌ，  Ｌ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｍｏａｌ，  Ｖ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．，  Ｂｅｒｌａｎｄ，  Ｙ．，  Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒ，  Ｄ．  Ｔｕｂｕｌａｒ  ＣＤ１４６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ９９：ｅ１０５−１１１  （２００５）
【非特許文献１８】Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｂ，  Ｂａｓｉｒｅ  Ａ，  Ｇｅｎｔｉｌｅ  Ｃ，  Ｓａｂａｔｉｅｒ  Ｆ，  Ｍｏｎｓｏｎｉｓ  Ｆ，  Ｄｅｓｏｕｃｈｅｓ  Ｃ，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  Ｕｚａｎ  Ｇ，  Ｓａｍｐｏｌ  Ｊ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４６＋  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．  ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．  ２００５；９４：１２７０-１２７９．
【非特許文献１９】Ｄｅｓｐｏｉｘ  Ｎ，  Ｗａｌｚｅｒ  Ｔ，  Ｊｏｕｖｅ  Ｎ，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  Ｂａｒｄｉｎ  Ｎ，  Ｐａｕｌ  Ｐ，  Ｌｙｏｎｎｅｔ  Ｌ，  Ｖｉｖｉｅｒ  Ｅ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ，  Ｖｅｌｙ  Ｆ．  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１４６／ＭＣＡＭ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８；  ３８：  ２８５５−６４
【非特許文献２０】Ｄｊｕｄｊａｊ，  Ｓ．，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ，  Ｃ．，  Ｒａｆｆｅｔｓｅｄｅｒ，  Ｕ．，  Ｇｕｅｒｒｏｔ，  Ｄ．，  Ｄｕｓｓａｕｌｅ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｂｏｏｒ，  Ｐ．，  Ｋｅｒｒｏｃｈ，  Ｍ．，  Ｈａｎｓｓｅｎ，  Ｌ．，  Ｂｒａｎｄｔ，  Ｓ．，  Ｄｉｔｔｒｉｃｈ，  Ａ．，  Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ，  Ｔ．，  Ｆｌｏｅｇｅ，  Ｊ．，  Ｚｈｕ，  Ｃ．，  Ｌｉｎｄｅｎｍｅｙｅｒ，  Ｍ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｍｅｒｔｅｎｓ，  Ｐ．Ｒ．  Ｎｏｔｃｈ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２２８：２８６−２９９  （２０１２）
【非特許文献２１】Ｄｕａｎ，  Ｈ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｓ．，  Ｌｕｏ，  Ｙ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｌ．，  Ｇｒａｍａｇｌｉａ，  Ｉ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｕ，  Ｄ．，  Ｚｅｎｇ，  Ｑ．，  Ｆａｎ，  Ｋ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  Ｑｉｎ，  Ｚ．，  Ｃｏｕｒａｕｄ，  Ｐ．Ｏ．，  Ｒｏｍｅｒｏ，  Ｉ．Ａ．，  Ｗｅｋｓｌｅｒ，  Ｂ．，  Ｙａｎ，  Ｘ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＣＤ１４６  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＮＳ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ３：１６８７  （２０１３）
【非特許文献２２】Ｅｌ  Ｍａｃｈｈｏｕｒ  Ｆ，  Ｋｅｕｙｌｉａｎ  Ｚ，  Ｋａｖｖａｄａｓ  Ｐ，  Ｄｕｓｓａｕｌｅ  ＪＣ，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｃ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ３  ｉｎ  Ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｌ；２６（７）：１５６１−７５．  ｄｏｉ：  １０．１６８１／ＡＳＮ．２０１３０９０９６８．  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ２４．
【非特許文献２３】Ｆｉｒｅ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１  （１９９８）
【非特許文献２４】Ｆｕ  Ｙ，  Ｄｕ  Ｙ，  Ｍｏｈａｎ  Ｃ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉ−ＧＢＭ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；１２４：１０９−１１８．
【非特許文献２５】Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．，  Ｐｏｎｃｅｌｅｔ，  Ｐ．，  Ｌａｕｒｅｎｔ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｍａｓｓｏｔ，  Ｏ．，  Ａｒｎｏｕｘ，  Ｄ．，  Ｌｅｑｕｅｕｘ，  Ｎ．，  Ａｍｂｒｏｓｉ，  Ｐ．，  Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ，  Ｃ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  Ｓ−Ｅｎｄｏ  １  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １３９：６５−７５．  （１９９１）
【非特許文献２６】Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  “Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ”  （３ｒｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ２００６），  ｐｐ．  ５３５−５６５
【非特許文献２７】Ｇｕｄｅｙ  ＳＫ，  Ｓｕｎｄａｒ  Ｒ，  Ｍｕ  Ｙ，  Ｗａｌｌｅｎｉｕｓ  Ａ，  Ｚａｎｇ  Ｇ，  Ｂｅｒｇｈ  Ａ，  Ｈｅｌｄｉｎ  Ｃ−Ｈ，  Ｌａｎｄｓｔｒoｍ  Ｍ．  ＴＲＡＦ６  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＴＧＦβ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １．  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０１４；７：ｒａ２．
【非特許文献２８】Ｇｕｅｚｇｕｅｚ，  Ｂ．，  Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，  Ｐ．，  Ｌａｍｅｒａｎｔ，  Ｎ．，  Ｋｉｅｄａ，  Ｃ．，  Ｊａｆｆｒｅｄｏ，  Ｔ．，  Ｄｕｎｏｎ，  Ｄ．  Ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＭＣＡＭ）／ＣＤ１４６  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：  ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７９：６６７３−６６８５  （２００７）
【非特許文献２９】Ｇｕｙｏｔ  Ｍ，  Ｐａｇｅｓ  Ｇ．  ＶＥＧＦ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ−  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＮＪ．  ２０１５；１３３２：３-２３．
【非特許文献３０】Ｈａｌｔ  ＫＪ，  Ｐａｒｓｓｉｎｅｎ  ＨＥ，  Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ＳＭ，  Ｓａａｒｅｌａ  Ｕ，  Ｓｉｍｓ−Ｌｕｃａｓ  Ｓ，  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  Ｐ，  Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ  Ｊ，  Ｑｕａｇｇｉｎ  Ｓ，  Ｓｋｏｖｏｒｏｄｋｉｎ  ＩＮ，  Ｖａｉｎｉｏ  ＳＪ．  ＣＤ１４６（＋）  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ２０１６  Ａｕｇ；９０（２）：３１１−３２４．
【非特許文献３１】Ｊ．  Ｅ．  Ｈａｍｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｃｌｏｎｅ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：４０１０−４０１４  （１９８８）；
【非特許文献３２】Ｈａｒｈｏｕｒｉ，  Ｋ．，  Ｋｅｂｉｒ，  Ａ．，  Ｇｕｉｌｌｅｔ，  Ｂ．，  Ｆｏｕｃａｕｌｔ−Ｂｅｒｔａｕｄ，  Ａ．，  Ｖｏｙｔｅｎｋｏ，  Ｓ．，  Ｐｉｅｒｃｅｃｃｈｉ−Ｍａｒｔｉ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，  Ｃ．，  Ｌａｍｙ，  Ｅ．，  Ｖｅｌｙ，  Ｆ．，  Ｐｉｓａｎｏ，  Ｐ．，  Ｏｕａｆｉｋ，  Ｌ．，  Ｓａｂａｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ，  Ｍ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４６  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｉｎｄ−ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ．  １１５：３８４３−３８５１  （２０１０）
【非特許文献３３】Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９８；  Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７  （１９７５）
【非特許文献３４】Ｈｅｎｉｑｕｅ  Ｃ，  Ｂｏｌｌｅｅ  Ｇ，  Ｌｅｎｏｉｒ  Ｏ，  Ｄｈａｕｎ  Ｎ，  Ｃａｍｕｓ  Ｍ，  Ｃｈｉｐｏｎｔ  Ａ，  Ｆｌｏｓｓｅａｕ  Ｋ，  Ｍａｎｄｅｔ  Ｃ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｋａｒｒａｓ  Ａ，  Ｔｈｅｒｖｅｔ  Ｅ，  Ｂｒｕｎｅｖａｌ  Ｐ，  Ｎｏｃｈｙ  Ｄ，  Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ，  Ｔｈａｒａｕｘ  ＰＬ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ２  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｐｏｄｏｃｙｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ  ＧＮ．Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  ２０１６  Ｊａｎ；２７（１）：１７２−８８．  ｄｏｉ：  １０．１６８１／ＡＳＮ．２０１４１１１０８０．  Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｍａｙ  ２１．
【非特許文献３５】Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣ１２  Ｃｅｌｌｓ，”  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ８：２９５−３０８  （１９９８）
【非特許文献３６】Ｊｏｕｖｅ，  Ｎ．，  Ｂａｃｈｅｌｉｅｒ，  Ｒ．，  Ｄｅｓｐｏｉｘ，  Ｎ．，  Ｂｌｉｎ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｍａｔｉｎｚａｄｅｈ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｐｏｉｔｅｖｉｎ，  Ｓ．，  Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ，  Ｍ．，  Ｆａｌｌａｇｕｅ，  Ｋ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ，  Ｍ．，  Ｖｅｌｙ，  Ｆ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．，  Ｌｅｒｏｙｅｒ，  Ａ．Ｓ．  ＣＤ１４６  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＦＡＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１３７：５０−６０  （２０１５）
【非特許文献３７】Ｊｕｓｓｉｌａ  Ｌ，  Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ．  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００２；８２：６７３-７００．
【非特許文献３８】Ｋｅｂｉｒ，  Ａ．，  Ｈａｒｈｏｕｒｉ，  Ｋ．，  Ｇｕｉｌｌｅｔ，  Ｂ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｗ．，  Ｆｏｕｃａｕｌｔ−Ｂｅｒｔａｕｄ，  Ａ．，  Ｌａｍｙ，  Ｅ．，  Ｋａｓｐｉ，  Ｅ．，  Ｅｌｇａｎｆｏｕｄ，  Ｎ．，  Ｖｅｌｙ，  Ｆ．，  Ｓａｂａｔｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｓａｍｐｏｌ，  Ｊ．，  Ｐｉｓａｎｏ，  Ｐ．，  Ｋｒｕｉｔｈｏｆ，  Ｅ．Ｋ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ，  Ｍ．ＣＤ１４６  ｓｈｏｒｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １０７：６６−７５  （２０１０）
【非特許文献３９】Ｋａｒｋａｒ  ＡＭ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｊ，  Ｐｕｓｅｙ  ＣＤ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００１；１６：５１８−５２４．
【非特許文献４０】Ｋａｓｐｉ  Ｅ，  Ｈｅｉｍ  Ｘ，  Ｇｒａｎｅｌ  Ｂ，  Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｂ，  Ｓｔａｌｉｎ  Ｊ，  Ｎｏｌｌｅｔ  Ｍ，  Ｂｅｒｔａｕｄ−Ｆｏｕｃａｕｌｔ  Ａ，  Ｒｏｂａｇｌｉａ−Ｓｃｈｌｕｐｐ  Ａ，  Ｒｏｌｌ  Ｐ，  Ｃａｕ  Ｐ，  Ｌｅｒｏｙｅｒ  Ａ，  Ｂａｃｈｅｌｉｅｒ  Ｒ，  Ｂｅｎｙａｍｉｎｅ  Ａ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  Ｂａｒｄｉｎ  Ｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１４６  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｃｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７；
【非特許文献４１】Ｋａｖｖａｄａｓ  Ｐ，  Ａｂｅｄ  Ａ，  Ｐｏｕｌａｉｎ  Ｃ，  Ａｕｔｈｉｅｒ  Ｆ，  Ｌａｂｅｊｏｆ  ＬＰ，  Ｃａｌｍｏｎｔ  Ａ，  Ａｆｉｅｒｉ  Ｃ，  Ｐｒａｋｏｕｒａ  Ｎ，  Ｄｕｓｓａｕｌｅ  ＪＣ，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｃ，  Ｃｈａｄｊｉｃｈｒｉｓｔｏｓ  ＣＥ．  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ４３  Ｂｌｕｎｔｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＧＮ．Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  ２０１７  Ｊｕｎ  ３０．  ｐｉｉ：  ＡＳＮ．２０１６１１１２１１．  ｄｏｉ：  １０．１６８１／ＡＳＮ．２０１６１１１２１１．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献４２】Ｋｅｒｒｏｃｈ  Ｍ，  Ｇｕｅｒｒｏｔ  Ｄ，  Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｐｌａｃｉｅｒ  Ｓ，  Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ，  Ｊｏｕａｎｎｅａｕ  Ｃ，  Ｒｏｎｄｅａｕ  Ｅ，  Ｒｏｎｃｏ  Ｐ，  Ｂｏｆｆａ  ＪＪ，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｃ，  ＤｕｓｓａｕｌｅＪＣ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０１２  Ｏｃｔ；２６（１０）：４０７９−９１．  ｄｏｉ：  １０．１０９６／ｆｊ．１１−１９４９０２．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｌ  ２．
【非特許文献４３】Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ＆  Ｒ．  Ｗ．  Ｃａｒｔｈｅｗ，  “Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｓＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ｔｈａｔ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２  Ａｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｎｇｌｅｓｓ  Ｐａｔｈｗａｙ，”  ＣｅＪ  ９５：１０１７−１０２６  （１９９８）；
【非特許文献４４】Ｋｉｔｃｈｉｎｇ  ＡＲ，  Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ  ＳＲ，  Ｔｉｐｐｉｎｇ  ＰＧ．  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  １９９９；１０：７５２−７５９．
【非特許文献４５】Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６：  ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ−−４０  ｙｅａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５；２３：１−２１
【非特許文献４６】Ｋｏｒｆｆ  Ｔ，  Ｋｉｍｍｉｎａ  Ｓ，  Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ  Ｇ，  Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ＨＧ．  Ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ３−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ：  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ＶＥＧＦ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  Ｏｆｆ  Ｐｕｂｌ  Ｆｅｄ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；１５：４４７-４５７．
【非特許文献４７】Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２  （１９８３）；  ａｎｄ  Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ．  ７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １９８５
【非特許文献４８】ＬｅＢｌｅｕ，  Ｖ．Ｓ．，  Ｔａｄｕｒｉ，  Ｇ．，  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｊ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｙ．，  Ｃｏｏｋｅ，  Ｖ．Ｇ．，  Ｗｏｄａ，  Ｃ．，  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｋａｌｌｕｒｉ，  Ｒ．  Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９：１０４７−１０５３  （２０１３）
【非特許文献４９】Ｌｅ  Ｈｉｒ  Ｍ，  Ｈａａｓ  Ｃ，  Ｍａｒｉｎｏ  Ｍ，  Ｒｙｆｆｅｌ  Ｂ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９８；７８：１６２５−１６３１
【非特許文献５０】Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．Ｋ．，  Ｚｅｎｇ，  Ｘｉａｏ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｗｕ  Ｙ．，  Ｏｕｙａｎｇ，  Ｙ．Ｘ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．，  Ｌｉ，  Ｙ．Ｃ．，  Ｌｉｎ，  Ｈ．Ｙ．，  Ｗｅｉ，  Ｘ．Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．Ｑ．，  Ｋｒｕｙｔ，  Ｆ．Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．Ｊ．  ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＥＲα  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＡＫＴ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ３８６：６５−７６  （２０１７）
【非特許文献５１】Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｗ．  Ｎｅｌｌｅｎ，  ｅｄｓ．，  “Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９９７）
【非特許文献５２】Ｌｕｑｕｅ  Ｙ，  Ｃａｔｈｅｌｉｎ  Ｄ，  Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｘｕ  Ｘ，  Ｓｏｈｉｅｒ  Ｊ，  Ｐｌａｃｉｅｒ  Ｓ，  Ｘｕ−Ｄｕｂｏｉｓ  ＹＣ，  Ｌｏｕｉｓ  Ｋ，  Ｈｅｒｔｉｇ  Ａ，  Ｂｏｒｉｅｓ  ＪＣ，  Ｖａｓｓｅｕｒ  Ｆ，  Ｃａｍｐａｇｎｅ  Ｆ，  Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ  ＪＰ，  Ｖｏｓｓｈｅｎｒｉｃｈ  Ｃ，  Ｒｏｎｄｅａｕ  Ｅ，  Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ．  Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇａｍｍａ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  Ｂ−  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ２０１７  Ｍａｙ；９１（５）：１１４６−１１５８．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｋｉｎｔ．２０１６．１０．０３７．  Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｊａｎ  １９．
【非特許文献５３】Ｍａｒｃｕｓ−  Ｓｅｋｕｒａ，  “Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７２：２８９−２９５  （１９８８）；
【非特許文献５４】Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ，  Ｐ．Ｗ．  Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  ＳｅｍｉｎＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ２９：３１５−３１６  （２００７）
【非特許文献５５】Ｍａｙｓ，  Ｐ．Ｋ．，  ＭｃＡｎｕｌｔｙ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｃａｍｐａ，  Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌａｕｒｅｎｔ，  Ｇ．Ｊ．  （１９９１）．  Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２７６，  ３０７-３１３．
【非特許文献５６】Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ，  Ｃａｔｈｅｌｉｎ  Ｄ，  Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｒａｆａｔ  Ｃ，  Ｌｕｑｕｅ  Ｙ，  Ｓｏｈｉｅｒ  Ｊ，  Ｎｏｃｈｙ  Ｄ，  Ｇａｒｃｏｎ  Ｌ，  Ｃａｌｌａｒｄ  Ｐ，  Ｊｏｕａｎｎｅａｕ  Ｃ，  Ｖｅｒｐｏｎｔ  ＭＣ，  Ｔｈａｒａｕｘ  ＰＬ，  Ｈｅｒｔｉｇ  Ａ，  Ｒｏｎｄｅａｕ  Ｅ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１４  Ｓｅｐ；１８４（９）：２４３８−４９．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１４．０５．０２０．  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｊｕｌ  ６．
【非特許文献５７】Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ，  Ｋｅｌｌｅｒ  ＡＣ，  Ｍｉｃｈｅｌ  ＭＬ，  Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｒａｆａｔ  Ｃ，  Ｌｅｔａｖｅｒｎｉｅｒ  Ｅ，  Ｔｉｌｌｅｔ  Ｙ，  Ｒｏｎｄｅａｕ  Ｅ，  Ｌｅｉｔｅ−ｄｅ−Ｍｏｒａｅｓ  ＭＣ．  Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ａｎｔｉ−ＧＢＭ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  ２００９  Ｊｕｎ；２０（６）：１２８２−９２．  ｄｏｉ：  １０．１６８１／ＡＳＮ．２００８０４０４３３．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｍａｙ  ２１．
【非特許文献５８】Ｍｏｅｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｓｍｅｅｔｓ，  Ｂ．  Ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＲＰＧＮ：  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｒｉｅｔａｌ  ｃｅｌｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２８：４８９−４９２（２０１３）
【非特許文献５９】Ｐａｓｑｕｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．，  Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｌ．，  Ｌｅ  Ｍａｒｔｅｌｏｔ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂｏｈｅｃ，  Ｃ．，  Ｒｏｃｈｅ，  Ｓ．，  Ｍｏｔｔｉｅｒ，  Ｄ．，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆ．  Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４６  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｕｎｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｌｏｓｓ．  Ａ  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔ？  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ９４：１２８０−１２８４  （２００５）
【非特許文献６０】Ｐｒａｋｏｕｒａ  Ｎ，  Ｋａｖｖａｄａｓ  Ｐ，  Ｋｏｒｍａｎｎ  Ｒ，  Ｄｕｓｓａｕｌｅ  ＪＣ，  Ｃｈａｄｊｉｃｈｒｉｓｔｏｓ  ＣＥ，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ  ＣＮＦκＢ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−β３  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｒｅｎａｌ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ＧＮ．．  Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  ２０１７  Ｍａｙ；２８（５）：１４７５−１４９０．  ｄｏｉ：  １０．１６８１／ＡＳＮ．２０１６０７０７０９．  Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｄｅｃ  ５．
【非特許文献６１】Ｒｏｃｋｅｙ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｊ．Ａ．  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−−ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｏｒｇａｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｆａｉｌｕｒｅ．ＮＥｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７２：１１３８−１１４９  （２０１５）
【非特許文献６２】Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ  Ａ，  Ｗａｄａ  Ｔ，  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｋ，  Ｔｅｓｃｈ  Ｇ，  Ｋｅｌｌｅｙ  ＶＲ．  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ＭＲＬ−Ｆａｓ（ｌｐｒ）  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８；１６１：４９４−５０３．
【非特許文献６３】Ｓｔａｌｉｎ  Ｊ，  Ｈａｒｈｏｕｒｉ  Ｋ，  Ｈｕｂｅｒｔ  Ｌ，  Ｓｕｂｒｉｎｉ  Ｃ，  Ｌａｆｉｔｔｅ  Ｄ，  Ｌｉｓｓｉｔｚｋｙ  Ｊ−Ｃ，  Ｅｌｇａｎｆｏｕｄ  Ｎ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ，  Ｆｏｕｃａｕｌｔ−Ｂｅｒｔａｕｄ  Ａ，  Ｋａｓｐｉ  Ｅ，  Ｓａｂａｔｉｅｒ  Ｆ，  Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ  Ｍ，  Ｂａｒｄｉｎ  Ｎ，  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ｌ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ，  Ｂｌｏｔ−  Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ｓＭＣＡＭ／ｓＣＤ１４６）  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１３；２８８：８９９１-９０００．
【非特許文献６４】Ｓｔａｌｉｎ  Ｊ，  Ｎｏｌｌｅｔ  Ｍ，  Ｇａｒｉｇｕｅ  Ｐ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｓ，  Ｖｉｖａｎｃｏｓ  Ｌ，  Ｅｓｓａａｄｉ  Ａ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ，  Ｂａｃｈｅｌｉｅｒ  Ｒ，  Ｆｏｕｃａｕｌｔ−Ｂｅｒｔａｕｄ  Ａ，  Ｆｕｇａｚｚａ  Ｌ，  Ｌｅｒｏｙｅｒ  ＡＳ，  Ｂａｒｄｉｎ  Ｎ，  Ｇｕｉｌｌｅｔ  Ｂ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ１４６  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ１４６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２０１６；３５：５４８９-５５００．
【非特許文献６５】Ｔａｉｒａ，  Ｅ．，  Ｎａｇｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｔａｎｉｕｒａ，  Ｈ．，  Ｔａｋａｈａ，  Ｎ．，  Ｋｉｍ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｋｕｏ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｂ．Ｓ．，  Ｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｈ．，  Ｍｉｋｉ，  Ｎ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｇｉｃｅｒｉｎ，  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７０：２８６８１−２８６８７  （１９９５）
【非特許文献６６】Ｔａｎｇ  ＷＷ，  Ｆｅｎｇ  Ｌ，  Ｖａｎｎｉｃｅ  ＪＬ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉ−ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４；９３：２７３−２７９．
【非特許文献６７】Ｔｏｕｂａｓ  Ｊ，  Ｂｅｃｋ  Ｓ，  Ｐａｇｅａｕｄ  ＡＬ，  Ｈｕｂｙ  ＡＣ，  Ｍａｅｌ−Ａｉｎｉｎ  Ｍ，  Ｄｕｓｓａｕｌｅ  ＪＣ，  Ｃｈａｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｃ，  ＣｈａｄｊｉｃｈｒｉｓｔｏｓＣＥ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１１  Ｊｕｌ；３０１（１）：Ｆ２４−３２．  ｄｏｉ：  １０．１１５２／ａｊｐｒｅｎａｌ．００２５５．２０１０．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｒ  ２３
【非特許文献６８】Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄ．  Ｒ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （３ｒｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ２００１
【非特許文献６９】Ｔａｌｍａｎ，  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｋｏａｈｏ，  Ｈ．  （２０１６）．  Ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ-ｆｒｏｍ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ３６５，  ５６３-５８１．
【非特許文献７０】Ｔｅｌｌｉｅｒ  Ｅ，  Ｃａｎａｕｌｔ  Ｍ，  Ｐｏｇｇｉ  Ｍ，  Ｂｏｎａｒｄｏ  Ｂ，  Ｎｉｃｏｌａｙ  Ａ，  Ａｌｅｓｓｉ  Ｍ−Ｃ，  Ｎａｌｂｏｎｅ  Ｇ，  Ｐｅｉｒｅｔｔｉ  Ｆ．  ＨＤＬｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＡＤＡＭ１７−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００８；２１４：６８７-６９３．
【非特許文献７１】Ｖａｉｎｉｏ，  Ｏ．，  Ｄｕｎｏｎ，  Ｄ．，  Ａｉｓｓｉ，  Ｆ．，  Ｄａｎｇｙ，  Ｊ．Ｐ．，  ＭｃＮａｇｎｙ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｉｍｈｏｆ，  Ｂ．Ａ．  ＨＥＭＣＡＭ，  ａｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｃ−ｋｉｔ＋  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ１３５：１６５５−１６６８  （１９９６）
【非特許文献７２】Ｗａｎｇ  Ｎ，  Ｆａｎ  Ｙ，  Ｎｉ  Ｐ，  Ｗａｎｇ  Ｆ，  Ｇａｏ  Ｘ，  Ｘｕｅ  Ｑ，  Ｔａｎｇ  Ｌ．  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ１４６  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２００８  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２１（６）：９３１−４０．
【非特許文献７３】Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｐｉｔｕｌｅｓｃｕ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｔ．Ｓ．，  Ｂｏｃｈｅｎｅｋ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，  Ａ．，  Ａｄａｍｓ，  Ｓ．，  Ｄａｖｙ，  Ａ．，  Ｄｅｕｔｓｃｈ，  Ｕ．，  Ｌｕｔｈｉ，  Ｕ．，  Ｂａｒｂｅｒｉｓ，  Ａ．，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｌ．Ｅ．，  Ｍａｋｉｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｎｏｂｅｓ，  Ｃ．Ｄ．，  Ａｄａｍｓ，  Ｒ．Ｈ．  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ４６５：４８３−８６６  （２０１０）
【非特許文献７４】Ｗｉａｎｎｉ＆  Ｍ．  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−  Ｇｏｅｔｚ，  “Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：７０−７５  （２０００）
【非特許文献７５】Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．Ｔ．  （１９８９）．  Ｃａｒｄｉａｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｔｈｅ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １３，  １６３７-１６５２．
【非特許文献７６】Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  ＲＰ，  Ｊｅｖｎｉｋａｒ  ＡＭ，  Ｔａｋｅｉ  Ｆ，  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＬＨ，  Ｋｅｌｌｅｙ  ＶＥ．  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  （ＩＣＡＭ−１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９０；１３６：４４１−４５０．
【非特許文献７７】Ｘｕ  Ｊ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ｃｕｌｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２８：Ｕｎｉｔ  ２８．１．
【非特許文献７８】Ｙａｎ，  Ｘ．，  Ｌｉｎ，  Ｙ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｙｕａｎ，  Ｍ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉ，  Ｐ．，  Ｘｉａ，  Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｌｕｏ，  Ｄ．，  Ｌｉｕ，  Ｑ．，  Ｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｂａｄｅｒ，  Ｂ．Ｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ１４６  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＡＡ９８，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｂｌｏｏｄ１０２：１８４−１９１  （２００３）
【非特許文献７９】Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｐｏｔｅｎｔａ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｋａｌｌｕｒｉ，  Ｒ．  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｅｍｅｒｇｅ  ｖｉａ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  ＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．  １９：２２８２−２２８７  （２００８）
【非特許文献８０】Ｚｅｎｇ，  Ｑ．，  Ｌｉ，  Ｗ．，  Ｌｕ，  Ｄ．，  Ｗｕ，  Ｚ．，  Ｄｕａｎ，  Ｈ．，  Ｌｕｏ，  Ｙ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｊ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  Ｆｕ，  Ｌ．，  Ｙａｎ，  Ｘ．  ＣＤ１４６，  ａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒ，  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０９：１１２７−１１３２  （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らが、本明細書において、初めて、ＣＤ１４６を、線維症の診断において特に興味深いバイオマーカーであること及び線維症の治療において有利な治療ターゲット又は治療ツールであることを明確にするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＣＤ１４６タンパク質、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）タンパク質、又は配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質、又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質であって、典型的にはバイオマーカーとして、対象の線維症、特に心臓、腎臓、皮膚及び／若しくは肺の線維症の素因の検出、診断及び／若しくは予後予測において又はモニターにおいて使用するための可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）タンパク質を、本明細書に記述する。
【００１４】
本明細書にさらに記述するのは、インビトロ、エクスビボ又はインビボによる、対象における線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚若しくは肺線維症の、対象に対する素因検出若しくは診断及び／又は予後予測をする方法である。本方法は、典型的には、対象の生体サンプルにおいてＣＤ１４６タンパク質の発現レベル、典型的には、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベル、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベル、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベル又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを決定するステップを、含む。
【００１５】
本明細書にさらに記述するのは、インビトロ、エクスビボ又はインビボによる、対象における線維症、好ましくは、心臓又は腎線維症をモニターする方法である。本方法は、典型的には、対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点でＣＤ１４６タンパク質の発現レベル、特に、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを決定することを含み、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択され、可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルが、対象の生体サンプルにおいて遅い時点において、対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、対象における線維症の増加を示し、一方で、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが低いことは、線維症の減少を示し、等しい可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルは、線維症が対象において進行していないことを示す。
【００１６】
本明細書にさらに記述するのは、インビトロ、インビボ又はエクスビボで、対象の線維症、特に、皮膚又は肺線維症をモニターする方法であって、当該方法は、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定することを含み、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが、対象の生体サンプルにおいて、遅い時点で、対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが低いことは、線維症の減少を示し、等しいヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルは、線維症が対象において進行していないことを示す。
【００１７】
本明細書にさらに記述するのは、インビトロ、エクスビボ又はインビボで、対象の線維症、特に、皮膚又は肺線維症をモニターする方法であって、配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定することを含み、対象の生体サンプルにおける可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが、遅い時点において、対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、低いことは、対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが高いことは、線維症の減少を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが高いことは、線維症の減少を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが等しいことは、線維症が対象において進行していないことを示す。
【００１８】
さらに本明細書に記述するのは、ＣＤ１４６阻害剤、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質であって、対象、典型的には本明細書に記述した方法により、線維症に対する素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維症増大を有する又は予後不良の線維症を有するものとして特定された対象において、線維症、特に、心臓及び／又は腎線維症の予防又は治療に使用する可溶型ＣＤ１４６タンパク質である。
【００１９】
さらに本明細書に記述するのは、ＣＤ１４６阻害剤、特に、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤であって、対象、典型的には、本明細書に記述した方法により、線維症に対する素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維症増大を有する又は予後不良の線維症を有するものとして特定された対象において、線維症、特に、皮膚又は肺線維症の予防又は治療に使用するための可溶型ＣＤ１４６タンパク質である。
【００２０】
本明細書にさらに記述するのは、ＣＤ１４６阻害剤、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質阻害剤又は配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤を、インビトロ又はエクスビボで、その必要がある対象における線維症、特に、心臓及び／又は腎線維症を予防又は治療するために（使用する）組成物を調製するために使用することである。
【００２１】
本発明者らは、本明細書において、ＣＤ１４６阻害剤、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるＣＤ１４６インヒビタータンパク質の阻害剤又は配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤、及び対象における線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／又は肺線維症の予防又は治療において使用するための薬学的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
【００２２】
本明細書にさらに記述するのは、ＣＤ１４６タンパク質、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質、及び対象、好ましくはヒトにおける皮膚線維症及び／又は肺線維症予防又は治療に使用するための薬学的に許容されるキャリアを含む組成物である。
【００２３】
発明者らはまた、本明細書において、抗体及びフラグメントであって、ＣＤ１４６タンパク質、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質に向けられる抗体及びフラグメントを記述する。本明細書に新たに記述する好ましい抗体又はそのフラグメントは、配列番号９４、配列番号９５及び配列番号９６の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９７、配列ＦＡＳ及び配列番号９８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列とを含む。本明細書に新たに記述する別の抗体は、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９０、配列ＦＡＳ及び配列番号９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列とを含む抗体又はそのフラグメントである。
【００２４】
本発明者らは、さらに、本明細書において、線維症、特に、心臓又は腎線維症を対象において診断する方法を記述する。本方法は、典型的には、対象の生体サンプルにおいて、典型的には対象の血清において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるＣＤ１４６、好ましくはｓＣＤ１４６タンパク質の量を、検出する、好ましくは定量するステップを含む。このような方法には、典型的には、本明細書に記述するように、ＣＤ１４６タンパク質、好ましくはｓＣＤ１４６タンパク質を結合する抗体を使用することを含む。
【００２５】
本発明者らはまた、本明細書に、線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／又は肺線維症を、その必要のある対象において、典型的には、本明細書に記述した方法により、線維症に対する素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維症増大を有する又は予後不良の線維症を有するものとして特定された対象において、治療する方法を記述する。本方法は、典型的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるＣＤ１４６阻害剤、特に、可溶型ＣＤ１４６インヒビタータンパク質の阻害剤若しくは配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６インヒビタータンパク質の阻害剤、又はこのようなＣＤ１４６阻害剤を含む組成物を、典型的にはその有効量、前記対象に投与するステップを含む。
【００２６】
インビトロエクスビボ又はインビボで、薬剤、典型的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるＣＤ１４６阻害剤、特に、可溶型ＣＤ１４６インヒビタータンパク質の阻害剤若しくは配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６インヒビタータンパク質の阻害剤、又は線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／又は肺線維症を治療する組成物の有効性をモニターする方法も、記述する。本方法は、対象からの第１の生体サンプルにおけるＣＤ１４６、典型的には可溶型ＣＤ１４６の発現を、線維症の任意の治療前に、線維症治療のための薬剤又は組成物に曝された同一の対象の第２の生体サンプルにおけるＣＤ１４６、典型的には可溶型ＣＤ１４６の発現と比較するステップを典型的に含む。
【００２７】
別の態様において、本開示は、本明細書に記述の生成物、典型的にはタンパク質、（可溶型）ＣＤ１４６の阻害剤又は組成物の任意の１つ以上を含むキットを提供する。典型的には、キットは、開示の方法によるタンパク質、阻害剤又は組成物を用いる説明書も含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＣＤ１４６がマウスにおける実験ＧＮにおいて誘発されていることを示す。ＣＤ１４６は、ＮＴＳ（脱補体化した腎毒性血清）をマウスに投与後４日目から１５日目にかけて徐々に損傷を受けた腎臓内において、非常によく上方制御され、損傷を受けた糸球体内に主に局在する（Ａ）。この上方制御は、ウェスタンブロット（Ｂ、Ｃ）により確認された。＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１，＊＊＊，Ｐ＜０．００１。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図２】図２は、ＣＤ１４６ノックアウトマウスが、ＮＴＳ誘発糸球体腎炎から保護されていることを示す。体重が、疾患の誘発後、マウスにおいて増加している（Ａ）。腎臓機能を蛋白尿により評価し、クレアチニン（Ｂ）、血中尿素窒素（Ｃ）タンパク質グラム／ｍｍｏｌで表した。全３つのパラメータが、ＣＤ１４６ノックアウトマウスにおいて疾患が緩やかに進行することを明らかにしている。腎臓スライスのマッソントリクローム染色は、腎臓の構造が、ＣＤ１４６ノックアウトにおいて、糸球体の半月体（Ｅ）及び尿細管拡張（Ｆ）の発現が少なくなることから、保護されていることを示す。半月体は、細胞性半月体を呈する糸球体の百分率（％）として表される。＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図３】図３は、ＣＤ１４６ノックアウトマウスの腎臓炎症及び線維症の発現が低下していることを示す。Ｉ１−１β（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）及びＩＣＡＭ−１（Ｃ）用のＱＰＣＲが、ＮＴＳ−ＧＮの誘発後１５日のＣＤ１４６ＫＯマウスの腎臓における炎症応答が制限されることを示した。Ｆ４／８０（Ｄ，Ｅ）及びＣＤ３（Ｆ，Ｇ）のための免疫組織化学的検査では、それぞれ、ＣＤ１４６ＫＯマウスにおける単球及びリンパ球の接着が制限されることが確認された。同時点において、ＴＧＦβ（Ｈ）、コラーゲンＩＩＩ（Ｉ）及びシリウスレッド染色（Ｊ）の定量化用のＱＰＣＲが、ＣＤ１４６ＫＯマウスにおける線維化応答が制限されることを示した。＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１，＊＊＊，Ｐ＜０．００１。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図４】図４は、ＣＤ１４６が、ＮＴＳ投与後糸球体内皮細胞において強く誘発されていることを示す。内皮細胞（ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１）（Ａ）、ポドサイト（Ｎｅｓｔｉｎ）（Ｂ）、壁側（Ｃｌａｕｄｉｎ−１）（Ｃ）及び糸球体間質細胞（α−ＳＭＡ）（Ｄ）等の糸球体構成要素のＣＤ１４６及び種々のマーカーのための二重免疫フルオレセイン腎臓皮質スライスが、ＣＤ１４６発現が主に糸球体内皮細胞において誘発されることを示した。顕微鏡画像の拡大像：×４００。
【図５】図５は、ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスの生成を示す。ＣＤ１４６−ｆｌｏｘマウスを、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性化用レポーターとして蛍光性タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１を発現するＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ６（ＣＡＧ−ＺｓＧｒｅｅｎ１）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交配させた。それから、ＣＤ１４６遺伝子が内皮細胞特異的に欠失するマウスを、Ｒａｌｆ  Ａｄａｍｓにより確立されたＣｄｈ５（ＰＡＣ）−ＣｒｅＥＲＴ２マウス系統とＣＤ１４６ｆｌｏｘ−Ｚｓ  Ｇｒｅｅｎ動物をさらに交配させることにより、生成した（Ａ）。ＣＤ１４６遺伝子の欠失は、トウモロコシ油で希釈され（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、１ｍｇタモキシフェン／注入）連続３日投与されるタモキシフェンの腹腔内注入により誘発された。ＣＤ１４６用免疫蛍光では、血管内皮からの欠失が確認された（Ｂ）。よって、ＣＤ１４６ｍＲＮＡ発現も、ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスの腎臓において減少した（Ｃ）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＃，Ｐ＝０．０５（ＮＴＳ対ＣＴＬ）。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図６】図６は、ＣＤ１４６の内皮特異的欠失によって、ＮＴＳ−ＧＮの誘発後、腎臓機能及び構造が保護されたことを示す。ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスでは、ＮＴＳに誘発された体重（Ａ）、蛋白尿（Ｂ）及びＢＵＮ（Ｃ）の増加が、すべて鈍化した。さらに、腎臓皮質スライスにおけるマッソントリクローム染色（Ｄ）は、糸球体半月体（Ｅ）及び尿細管拡張（Ｆ）が、ＮＴＳ注入後１５日で減少したことを明らかにしている。＊，Ｐ  ＜  ０．０５；＊＊，Ｐ  ＜  ０．０１（ＮＴＳ対ＣＤｌ４６−ＥＣ−ｄｅｌ）；＃，Ｐ  ＜  ０．０５；＃＃，Ｐ  ＜  ０．０１（ＮＴＳ対ＣＴＬ−ＰＢＳ）。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図７】図７は、ＣＤ１４６内皮特異的欠失によって、マウスが、炎症及び腎臓間質性線維症から保護されたことを示す。Ｆ４／８０染色は、単球の浸潤がＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスにおいてＮＴＳ注入後１５日で鈍化したこと（Ａ）を示している。よって、ＶＣＡＭ−１（Ｂ）及びＭＣＰ−１（Ｃ）用のＱＰＣＲは、この炎症マーカーの上方制御が鈍化したことを示している。さらに、ＴＧＦ−β１（Ｄ）及びＣｏｌｌａ１（Ｅ）用のＱＰＣＲは、同様の結果を示した。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１。顕微鏡画像の拡大像：×２００。
【図８】図８は、ヒトの糸球体疾患におけるＣＤ１４６転写物の発現を示す。糖尿病性腎症（ＤＮ）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＤ）、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、膜性腎症（ＭＧＮ）、ループス腎炎（ＳＬＥ）、急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ）の患者の単離された糸球体から得た遺伝子発現データと、対照（移植前の移植組織の生検）。ＣＤ１４６発現は、対照と比較して糸球体症において有意にまた差次的に制御された。
【図９】図９は、心筋梗塞（Ａ）及び筋線維芽細胞を生じさせる細胞集団（Ｂ）により心臓線維症が誘発される段階を示す。
【図１０】図１０は、心筋梗塞のモデルを示す。左下行冠動脈は、永久結紮されている（Ａ及びＢ）。動物は、種々の検査を行うために術後２１日で絶命させる（Ｃ）。
【図１１】図１１は、免疫組織学的原理及び方法を示す。目的のタンパク質の間接的な免疫検出を、単一のシグナル増幅システムを用いて行う。本方法では、組織に存在する目的のタンパク質を、一次抗体を用いて検出する。この抗体のハイブリダイゼーションを、ビオチン分子に結合した二次抗体により検出する。酵素、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したアビジン−ビオチン複合体を追加することによって、特定の基質（ジアミノベンジジン）の沈着後、標的抗原を検出することができる。反応は、光学顕微鏡により観察可能な安定した褐色の沈殿物を生成する（表１及び表２）。
【図１２】図１２は、ウェスタンブロットの原理を示す。
【図１３】図１３は、「ＭＩ」（又は「ＩＭ」）動物における心臓線維症域（Ａ及びＢ）の場所とＣＤ１４６ＲＮＡ発現（Ｃ）（ｎ＝３）を示す。梗塞性／線維性域又は領域（「ＩＺ」若しくは「ＩＡ」又は「ＦＺ」若しくは「ＦＡ」）が、結紮下の左心室心尖部に位置する。境界域又は領域（「ＢＺ」又は「ＢＡ」）が、梗塞性域の直近に位置し、遠位／遠隔域又は領域（「ＤＺ」若しくは「ＤＡ」又は「ＲＺ」若しくは「ＲＡ」）が、結紮域の上方に位置する。心臓線維症（Ｂ、６０Ｘ対物）が、梗塞性域（赤色矢印）に位置し、境界域（青色矢印）に増殖している。
【図１４】図１４は、心筋梗塞モデルにおけるＣＤ１４６／ｓＣＤ１４６の発現（ｎ＝３）を示す。（Ａ）ＣＤ１４６の免疫検出：ＣＤ１４６の免疫検出は、ｓｈａｍ動物と比較してＭＩ動物の心室壁における標識が増えたことを示す。線維症域は、周辺の心筋細胞が標識されているのに対して（「ＢＡ」）、標識されていない（「ＩＡ」）。一部の画像は、他のものを６０Ｘ対物で撮影しているのに対し、２０Ｘで撮影している。（Ｂ）ＣＤ１４６ＥＬＩＳＡ（ｎ=２）：ＣＤ１４６濃度を２ｓｈａｍマウス及び２ＭＩマウスの血清において決定した。結果をｎｇ／ｍｌで示す。
【図１５】図１５は、加齢性線維症のモデルにおけるＣＤ１４６発現（ｎ＝３）を示す。２４月齢の動物（ｅ、ｆ）の心筋切片のシリウスレッド染色（ｅ）及びＣＤ１４６免疫検出（ｆ）。
【図１６】図１６は、老化を通じた心臓線維症におけるＣＤ１４６の役割を示す。心臓線維症のシリウスレッド染色（ａ、ｂ：４０Ｘ対物）及び２４月齢の雌のコラーゲン（ｃ）（ｎ＝３）（ｐ＝０．０００１）が占める領域の画分の定量化。Ａ−コラーゲンＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ定量化（ｄ）（ｎ＝１）。Ｂ−細胞膜の染色及び心筋細胞サイズの定量化（ｎ＝３）（ｐ＜０．０００１）。
【図１７】図１７は、筋線維芽細胞の表現型の獲得におけるＣＤ１４６ｓの役割を示す。ＣＤ１４６ｓを用いた刺激中に、ＴＧＦ−βを用いて観察した場合に匹敵する増加を示した細胞増殖の研究（Ａ）（ｐ＜０．０５）。筋線維芽細胞マーカーＳＭＡの発現が、ＲＮＡ解析（Ｂ）及びタンパク質解析（Ｃ）中ＣＤ１４６（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いて４８時間刺激後に増加し、アクチン線維が、ＴＧＦ−βを用いた刺激と同等に長くなっている（Ｄ）（２０Ｘ対物）。フィブロネクチン及びタイプＩのコラーゲンの発現（Ｅ）はまた、ＴＧＦ−βを用いた刺激後同等に増加した。ＣＤ１４６は、ＲＮＡレベルでＴＧＦ−βの発現における増加を誘発する（Ｆ）。
【図１８】図１８は、抗ｓＣＤ１４６抗体を各種回数用いた、腎不全及び線維症を伴うＵＵＯ（一側性尿管閉塞）のマウスの治療モデルを示す。８〜１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに右尿管の結紮を受けさせた。右尿管は、正中線腹部切開により露出させ、腎盂の下１ｃｍで５．０絹の結紮糸で完全に閉塞させた。手術後、７動物の４つの群を作った。動物の１つの群に、対照として用い、静脈内に溶媒を用いて１、４、７及び１０日に治療を受けさせた。動物の１つの群に、手術後１、４及び１０日に、抗ｓＣＤ１４６抗体を静脈内に１マウスあたり１０マイクログラム用いて治療を受けさせた。別の動物の群に、同一のプロトコルで、ただし、術後７日及び１０日のみに治療を受けさせた。最後に、動物の最後の群に、術後１、４、７及び１０日に、対照ＩｇＧを用いて、動物ごとに１０マイクログラムＩＶ治療を受けさせた。
【図１９】図１９は、腎線維症における抗ｓＣＤ１４６の治療効果を示す。手術後１４日で、動物は、絶命させ、腎臓を免疫組織化学的検査のために除去した。実験用腎臓又は対側腎臓におけるサイラスレッドで、線維症が推定された。結果は、線維症が、実験用腎臓において、対側腎臓と比較すると、増加したことを示す。ＩｇＧを用いた治療は、線維症を緩和しなかった。対照的に、１〜１４日又は７〜１４日の抗ｓＣＤ１４６抗体を用いた治療は、有意に線維症を減退させた。
【図２０】図２０は、アルファ−ＳＭＡ発現における抗ｓＣＤ１４６抗体の治療効果を示す。手術後１４日で、動物は、絶命させ、腎臓を除去した。アルファ−ＳＭＡ発現は、実験用腎臓又は対側腎臓に特異的抗体を用いた免疫組織化学的検査により決定した。結果は、アルファ−ＳＭＡが、実験用腎臓において、対側腎臓と比較すると、増加したことを示す。ＩｇＧを用いた治療は、アルファ−ＳＭＡ発現を緩和しなかった。対照的に、１〜１４日又は７〜１４日の抗ｓＣＤ１４６抗体を用いた治療は、アルファ−ＳＭＡ発現を有意に減退させた。
【図２１】図２１は、内皮細胞内の可溶型ＣＤ１４６ｓの分泌物におけるプロテイナーゼ阻害剤の効果を示す。Ａ：可溶型ＣＤ１４６（ＣＤ１４６ｓ）の分泌物を、ＥＣＦＣにおいて、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦｂ、５０ｎｇ／ｍｌのネトリン、５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ５ａ及び５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを用いた２４ｈの治療に応答して、決定した。Ｂ：汎阻害剤ＧＭ６００１の効果を、ＥＣＦＣ細胞中のＣＤ１４６ｓ分泌物においてＥＬＩＳＡ法により試験した。実験を、対照条件で、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを用いた２４時間の治療後、行った。インサートは、ＴＮＦ治療が、治療の２４時間からＣＤ１４６ｓを有意に増加させることを示す。ＧＭ６００１の用量依存効果は、１μＭと５０μＭとの間で発揮された。結果は、５実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｃ：フューリンコンバターゼ阻害剤の効果（ＩＦ）を、５０μＭｏｎのＣＤ１４６ｓ分泌物で、対照条件において、ＴＮＦ２０ｎｇ／ｍｌを用いた２４ｈの治療後に、試験した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｄ：ＴＩＭＰ−１、−２及び−３（１μｇ／ｍｌ）の効果を、ＣＤ１４６分泌物において、対照条件で、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを用いた治療後に、試験した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，実験対対照。
【図２２】図２２は、ＡＤＡＭ１０が、ＥＣＦＣ（ヒト内皮コロニー形成細胞）における長いアイソフォームのＣＤ１４６のシェディングに関与することを示す。Ａ：ＥＣＦＣは、ｓｉＲＮＡが標的とする短い（ｓｈＣＤ１４６）又は長い（ＩｇＣＤ１４６）アイソフォームのＣＤ１４６と制御ｓｉＲＮＡとを用いて、遺伝子導入された。可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）分泌物を決定した。結果は、各種４実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｂ：ＥＣＦＣが、ｓｉＲＮＡが標的とするＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ２、ＡＤＡＭ１０又はＴａｃｅと、制御ｓｉＲＮＡとを用いて遺伝子導入された（Ｃ）。可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）分泌物を決定した。１つの条件において、細胞を、ＧＭ６００１を１０μＭ用いて治療した。結果は、各種５実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｃ：ＡＤＡＭ１０を、基本条件で培養されたＥＣＦＣ中で免疫沈降させた。長い（ＩｇＣＤ１４６）及び短い（ｓｈＣＤ１４６）アイソフォームのＣＤ１４６を、ウェスタンブロットにより特異的抗体を用いて検出した。結果は、各種３実験の代表である。Ｄ：ＥＣＦＣに、ｓｉＲＮＡが標的とするＡＤＡＭ１０又はＴａｃｅと、制御ｓｉＲＮＡとを用いて遺伝子導入した（Ｃ）。半透フィルター上に増殖したＥＣＦＣ単層の透過率を、デキストラン−ＦＩＴＣを用いて決定した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｅ：ＥＣＦＣに、ＡＤＡＭ１０（ｐ−ＡＤＡＭ１０）又はＴａｃｅ（ｐ−Ｔａｃｅ）をコードしたプラスミドベクター及び対照プラスミドベクターを遺伝子導入した。半透フィルター上に増殖したＥＣＦＣ単層の透過率を、デキストラン−ＦＩＴＣを用いて決定した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，実験対対照。
【図２３】図２３は、Ｔａｃｅが、ＥＣＦＣにおいて短いアイソフォームのＣＤ１４６のシェディングに関与することを示す。Ａ：ＥＣＦＣに、ｓｉＲＮＡが標的とする短い（ｓｈＣＤ１４６）又は長い（ＩｇＣＤ１４６）アイソフォームのＣＤ１４６と対照ｓｉＲＮＡとを用いて、遺伝子導入し、可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）分泌物を、基本条件で、ＴＮＦ２０ｎｇ／ｍｌを用いて２４ｈ治療した細胞において決定した。結果は、各種５実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｂ：２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦを用いて２４ｈ治療したＥＣＦＣに、Ｔａｃｅ、ＡＤＡＭ１０、ＭＴ１−ＭＭＰを標的とするｓｉＲＮＡと、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃ）とを遺伝子導入し、可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）分泌物を決定した。結果は、各種３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。
【図２４】図２４は、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６アイソフォームの特徴を示す図である。Ａ：Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６アイソフォームの、ｓｈｅｄフォームと比較した概略図。アミノ酸に相違が示された。Ｂ：Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６アイソフォームのｍＲＮＡ発現を、ＥＣＦＣ及びＨＵＶＥＣにおいて解析し、短いアイソフォーム及び長いアイソフォームのＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現と比較した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｃ：Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６アイソフォームのｍＲＮＡ発現を、細胞を２４ｈ、シェディングされたリコンビナント可溶型ＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ２０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦベータ５ｎｇ／ｍｌ及びネトリン５０ｎｇ／ｍｌで治療した後、ｑＰＣＲによりＥＣＦＣにおいて解析した。細胞はまた、ＷＮＴ５ａ  ２０ｎｇ／ｍｌで１５分間、ＷＮＴ３ａ  ５０ｎｇ／ｍｌで１ｈ、治療した。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥＭである。＊：Ｐ＜０．０５、実験対対照。
【図２５】図２５は、血管形成におけるＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６の効果を示す図である。Ａ：ＥＣＦＣの増殖における、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６を標的とするｓｉＲＮＡの効果を示す図である。実験をＧＭ６００１  １０μＭの存在下で行った。結果は、各種４実験の平均値であり、１つの実験における代表的な写真を示す。Ｂ：プラスミドトランスフェクションにより実現されたＩ１０−ｓＣＤ１４６（ｐ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６）及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６（ｐ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６）の過剰発現及びシェディングされたｓＣＤ１４６（ｐ−ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６）の、ＥＣＦＣの増殖における効果。実験をＧＭ６００１  １０μＭの存在下で行った。Ｃ：リコンビナントタンパク質Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びシェディングされたｓＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍｌのＥＣＦＣの増殖における効果。実験をＧＭ６００１  １０μＭの存在下で行った。結果は、各種４実験の平均値である。Ｄ：卵黄嚢膜アッセイを、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６  ２５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌの存在下で行い、対照と比較した。各種４実験の代表的写真を示す。Ｅ：ＥＣＦＣで実現されたスフェロイド実験における、リコンビナントタンパク質Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、を制御するＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びシェディングされたｓＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍｌの出芽数、枝分かれ部位及び累積出芽長の効果を示す図である。結果を、ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌ及びＥＧＭ２−ＭＶ完全培地と比較した。実験の平均値及び代表的な写真を示す。結果は、各種４実験の平均値である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、実験対対照。
【図２６】図２６は、マウスの虚血性後肢モデルにおけるリコンビナントＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６の局所注入の効果を示す。Ａ：虚血性マウスを、ＰＢＳ又はｒｈ−ｓＣＤ１４６／ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６／ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６若しくはＶＥＧＦ２μｇで治療した。血液灌流速度をレーザードップラー法によりモニターした。結果は、各種６実験の、それぞれの群における平均値であり、対照後肢の％として表している。＊，＊＊，＊＊＊：Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１，Ｉ１０−ｓＣＤ１４６対ＰＢＳ；＄＄，＄＄＄：Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１，Ｉ５−ｌ３−ｓＣＤ１４６対ＰＢＳ；＃＃，＃＃＃：  Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１，ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６対ＰＢＳ；£：Ｐ＜０．０５，ＶＥＧＦ対ＰＢＳ。Ｂ：対照（ＰＢＳ）及び手術後２８日のｓｈｅｄ  ｒｈ−ｓＣＤ１４６／ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６／ｒｈ−Ｉ５−ｌ３−ｓＣＤ１４６治療動物からの後肢筋肉部分における血管検査。血管を、イソレクチンＢ４，＊＊，  ＊＊＊：  Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．００１，実験対対象。＄：Ｐ＜０．０５，  Ｉ１０−ｓＣＤ１４６対Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６で、標識した。Ｃ：Ｄ２８における対照（ＰＢＳ）の血管造影写真及びシェディングされたｓＣＤ１４６／Ｉ１０−ｓＣＤ１４６／Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６で治療した動物。写真は、それぞれの群の６動物の代表的なものである。血管密度の平均値を、肢の各種部分（腓腹、大腿）及び脚全体における右脚対左脚として表した。＊，＊＊：Ｐ＜０．０１，Ｐ<０．００１，腓腹における実験対ＰＢＳ、＄：Ｐ＜０．０５，大腿における実験対ＰＢＳ、＃，＃＃：Ｐ０．０５，Ｐ＜０．０１，脚全体における実験対ＰＢＳ。
【図２７】図２７は、全身性硬化症におけるＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６アイソフォームの発現及び効果を示す。Ａ：シェディングされたｓＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６濃度を、全身性硬化症の２２名の患者において、適合する対照と比較して決定した。Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６もまた、肺線維症のＳＳｃ患者と非肺線維症のＳＳｃ患者とにおいて比較した（挿入図、それぞれｎ＝１０及びｎ＝１２）。Ｂ：基準のＷｎｔシグナルの活性化（ｂ−カテニン／ＴＣＦ転写活性、ルシフェラーゼアッセイ）を、ＣＤ１４６ＫＯ及びＷＴマウスからのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）において推定した。ＭＥＦを、ブレオマイシンで又はブレオマイシンなしでシェディングされたｓＣＤ１４６の存在下又は不存在下で治療した。結果は、５つの独立した実験の平均値＋／−ＳＥＭである。Ｃ：皮膚の厚さを、ブレオマイシンの皮下注射により、全身性硬化症を誘発したＣＤ１４６ＫＯマウスモデルにおいて、評価した。シェディングされたｓＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６の効果を、推定し、４〜５の各種動物の平均値を示した。代表的な写真も示す。Ｄ：皮膚の面を、各種の、ブレオマイシンで治療した、シェディングされたｓＣＤ１４６で治療した又は治療しなかった、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６を注入した又は注入しなかったＣＤ１４６ＫＯマウスにおいて示す。Ｅ：シェディングされたｓＣＤ１４６／Ｉ１０−ｓＣＤ１４６／Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６を用いて又は用いずに治療した動物の皮膚の血管検査。血管は、イソレクチンＢ４で標識している。結果は、４〜５の動物における各種３実験の代表である。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，実験対対照。
【図２８】図２８は、正常な組織におけるＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６アイソフォームの発現を示す図である。Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現を、種々の器官において組織アレイにより調べた。結果は、リンパ節における発現の関数として規準化した。
【図２９】図２９は、ＣＤ１４６及び可溶型ＣＤ１４６の分泌物の発現におけるＵＵＯ（片側尿管結紮）の効果を示す。Ａ：ＣＤ１４６の発現は、腎臓切片において観察され、ＵＵＯを有する腎臓及び対側の腎臓において定量化した。定量化を示す。Ｂ：可溶型ＣＤ１４６をＥＬＩＳＡ法で、偽手術されたＵＵＯ動物において定量化した。結果は、７動物の平均である。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，ＵＵＯ対対側。
【図３０】図３０は、コラーゲン及びフィブロネクチン発現における抗体治療の効果を示す。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ及びフィブロネクチンのタンパク質発現において、ＵＵＯの効果が観察された。抗体を用いた治療の効果も、対照ＩｇＧを用いた治療と比較して観察された。結果は、それぞれの群における７動物の平均値である。＊＊＊＊：Ｐ＜０．００１，ビヒクル対対側§§§§：Ｐ＜０．００１，ｍＡｂ対ビヒクル＊＊＊：Ｐ＜０．０１  ビヒクル又は対照  ＩｇＧ対対側§§§：Ｐ＜０．０１  ｍＡｂ対ビヒクル
【図３１】図３１は、ａ−ＳＭＡ発現における抗体治療の効果を示す。免疫組織化学によりａ−ＳＭＡの発現におけるＵＵＯの効果が観察された。抗体を用いた治療の効果も、対照ＩｇＧを用いた治療と比較して観察された。結果は、それぞれの群における７動物の平均値である。＊＊＊：Ｐ＜０．００１，ビヒクル対対側§§§：Ｐ＜０．０１  ｍＡｂ対ビヒクル
【図３２】図３２は、ヒト腎臓線維芽細胞の初代培養におけるａ−ＳＭＡ発現及びビメンチンｍＲＮＡ発現における抗ｓＣＤ１４６ｍＡｂの効果を示す。ｓＣＤ１４６（５０ｎｇ／ｍｌ）の効果は、ヒト線維芽細胞からの初代培養において調べた。抗ｓＣＤ１４６  ｍＡｂ  ５００ｎｇ／ｍｌ、単独で（Ａｃ）又はｓＣＤ１４６とともに投与した場合の効果。結果は、３実験の平均値＋／−ＳＥであり、フォールド変化対治療なしの対照条件として表している。＊：Ｐ＜０．０５、ｓＣＤ１４６対対照＄：Ｐ＜０．０５、ｓＣＤ１４６＋Ａｃ対ｓＣＤ１４６
【図３３】図３３は、腎臓の特徴におけるアデニン食餌の効果を示す。Ａ：動物を、アデニンで治療し（アデニン）、又はアデニンなしに治療し（対照）、アデニン食餌の終了後２週間で絶命させた。線維症を腎臓にシリウスレッド染色後検出した。代表的な写真を示す。Ｂ：ＴＧＦｂ、コラーゲンａ１及びアルファＳＭＡのｍＲＮＡ発現を、対照腎臓と、アデニン食餌直後の腎臓と（Ｅｎｄ）、アデニン食餌の終了後１週間（ｗｅｅｋ１）と、アデニン食餌の終了後２週間（ｗｅｅｋ２）と、アデニン食餌の終了後３週間（ｗｅｅｋ３）とにおいて解析した。結果を、対照群からの変動として表している。Ｃ：アルファＳＭＡのタンパク質発現を、対照腎臓と、アデニン食餌直後の腎臓と（Ｅｎｄ）、アデニン食餌の終了後１週間（ｗｅｅｋ１）と、アデニン食餌の終了後２週間（ｗｅｅｋ２）と、アデニン食餌の終了後３週間（ｗｅｅｋ３）とにおいて解析した。結果を、対照群に相対するものとして表している。Ｄ：ＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現を、対照腎臓と、アデニン食餌直後の腎臓と（Ｅｎｄ）、アデニン食餌の終了後１週間（ｗｅｅｋ１）と、アデニン食餌の終了後２週間（ｗｅｅｋ２）と、アデニン食餌の終了後３週間（ｗｅｅｋ３）とにおいて解析した。結果を、対照群からの変動として表している。
【図３４】図３４は、抗ｓＣＤ１４６抗体の、アデニンで治療したマウスの腎臓の線維症における効果を示す。Ａ：アデニンで治療した動物に、ＰＢＳ、対照ＩｇＧ又は抗ｓＣＤ１４６  ｍＡｂを注入した。線維症を、腎臓において食餌の終了後２週間でシリウスレッド染色後検出した。代表的な写真を示す。Ｂ：線維症領域の定量化を、すべての表面上の線維症領域の％として表している。結果は、それぞれの郡の４動物から少なくとも５切片の＋／−ＳＥ平均として表している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ＣＤ１４６は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質である。内皮透過率、炎症及び血管形成に関与していることが知られている。
【００３０】
膜型ＣＤ１４６は、管内径又は解剖学的領域に拘わらず、血管樹のすべての内皮細胞において検出される接着性タンパク質である（Ｂａｒｄｉｎ，  Ｎ．  ２００１、Ｇｅｏｒｇｅｓ  Ｆ  １９９１）。主に、細胞間接合部に限局し、相互の内皮細胞の接着及び細胞間透過率のみならず（Ａｎｆｏｓｓｏ，Ｆ．，２００１、Ｓｏｌｏｖｅｙ，Ａ．Ｎ．，２００１、Ｊｏｕｖｅ，Ｎ．，２０１５）、単球血管外移動（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ．，２００９）及び血管形成（Ｃｈａｎ，Ｂ．，２００５、Ｈａｒｈｏｕｒｉ，Ｋ．，２０１０、Ｙａｎ，Ｘ．，２００３、Ｈａｌｔ  Ｊ  ＫＩ，２０１６）も制御する。ＣＤ１４６は、各種アイソフォーム、細胞骨格へのアンカリングを媒介し得るＰＤＺ結合モチーフと推定されるものを有する短いアイソフォームと（Ｋｅｂｉｒ，Ａ．，Ｓ．２００１、Ｔａｉｒａ，Ｅ．，１９９５、Ｖａｉｎｉｏ，Ｏ．，１９９６）、エンドサイトーシスモチーフと推定されるものを有する長いアイソフォームと（Ｇｕｅｚｇｕｅｚ，Ｂ．，２００７）と、メタロプロテアーゼによる膜型ＣＤ１４６のシェディングの結果としての可溶型フォーム（ｓＣＤ１４６）（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ．，２００３、Ｂｏｎｅｂｅｒｇ，Ｅ．Ｍ．，２００９）として存在する。ｓＣＤ１４６は、ヒト血清中に検出可能であり、そのレベルは、炎症性腸疾患（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ．，２００６）、異常妊娠（Ｐａｓｑｕｉｅｒ，Ｅ．，２００５）又は慢性腎不全（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ．，２００３）等の異なる病態において調節される。
【００３１】
本発明者らは、本明細書において、初めて、ＣＤ１４６の短い膜アイソフォーム及び長い膜アイソフォームが、ＴＮＦα変換酵素及びＡＤＡＭ１０プロテイナーゼによりシェディングされることを立証している。その上、ＲＮＡ配列決定実験が、２つの代替ｓＣＤ１４６によるスプライスバリアントの存在を明らかにし、本明細書では、「Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６」（又はＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６）及び「Ｉ１０ーｓＣＤ１４６」（又はＩ１０可溶型ＣＤ１４６）として特定した。
【００３２】
その上、本発明者らは、ＣＤ１４６、典型的には、ｓＣＤ１４６が、バイオマーカーとして線維症の診断に又は線維症治療において治療ツールとして、有利に使用可能であることを、発見し、初めて本明細書に記述する。
【００３３】
ＣＤ１４６は、特に、対象において、線維症、特に心臓、腎臓、皮膚及び／又は肺線維症の素因検出、診断及び／又は予後予測又はモニターにおける使用に有利である。
【００３４】
本発明との関連において、本明細書の以下にさらに記述するように、ＣＤ１４６は、典型的には、ＣＤ１４６タンパク質、例えば、膜型ＣＤ１４６又は可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）であり、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるｓＣＤ１４６タンパク質、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質から選択されるＣＤ１４６タンパク質である。
【００３５】
さらに、正確には、本発明者らは、初めて、可溶型ＣＤ１４６、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるｓＣＤ１４６タンパク質が、心臓及び腎線維症をもたらすことに関与しており、したがって、心臓及び腎線維症のバイオマーカーであることを立証した。本発明者らは、ｓＣＤ１４６が、線維症の原因である細胞、すなわち、線維芽細胞及び内皮細胞を刺激することを示した。本発明者らの実験は、特に、深刻な腎線維症誘導の２つのモデル（糸球体基底膜血清により誘導されるモデル及び一側性の尿管閉塞のモデル）において、ＣＤ１４６が非常に増加し、ｓＣＤ１４６の濃度が循環する血液中で上昇し、線維症における効果は、ＣＤ１４６に対してＫＯマウスを使用したとき、大きく低下することを立証している。本発明者らはまた、ＣＤ１４６及びｓＣＤ１４６が、マウスの心筋梗塞モデルで増加し、ＫＯ動物におけるＣＤ１４６に対する線維症の量が、心筋梗塞後対照動物と比較して減少し、同時に、高齢マウスでは、野生型（ＷＴ）マウスと比較したＫＯ  ＣＤ１４６マウスにおける心臓線維症の発現が減少したことを立証した。
【００３６】
本発明者らはまた、可溶型ＣＤ１４６、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるｓＣＤ１４６タンパク質が、心臓及び肺において線維化促進活性を有し、したがって、心臓及び／又は腎線維症を治療するための治療ターゲットであることも立証した。線維症という現象は、よって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤、特に、このようなｓＣＤ１４６タンパク質を対象としたモノクローナル抗体の存在で予防又は逆進させることができる。
【００３７】
他方で、本発明者らは、可溶型ＣＤ１４６、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるｓＣＤ１４６タンパク質が、皮膚及び肺において抗線維化活性を有し、したがって、対象における皮膚線維症及び／又は肺線維症の予防又は治療に使用することができることを、立証した。
【００３８】
本発明者らは、配列番号８の新たに特定されたアイソフォームＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質と、配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質とが、ともに線維症の、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症のバイオマーカーであることも立証した。しかしながら、このような２つのアイソフォームは、同じようには変動しない。その一方で、Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６は、線維症において上方制御され、Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６は、下方制御される。Ｉ５−１３は、線維症、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症を治療するための治療ターゲットであり、Ｉ１０は、線維症、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症の予防又は治療用の治療ツールとして使用可能である。
【００３９】
本明細書において上に示したように、線維症は、心筋梗塞等の虚血性イベントの後に、免疫疾患と関連して、また老化が進む間にも起こる場合がある。
【００４０】
「対象」という用語は、任意の試験可能な対象を指し、典型的には患者を指し示す。好ましくは、対象が、哺乳動物であり、さらに好ましくは人間である。本発明は、個人と集団全体と両方に用いることができる。対象は、年齢又は性別を問わず試験を受けられる。
【００４１】
「ヒトの長い（ｌｏｎｇ）ＣＤ１４６タンパク質」又は「長いＣＤ１４６」は、主に内皮細胞の膜に存在し、本明細書に記述した配列番号１０に対応するアミノ酸配列を有するヒトタンパク質、ペプチド又はアミノ酸分子を指す。
【００４２】
「ヒトの短い（ｓｈｏｒｔ）ＣＤ１４６タンパク質」又は「短いＣＤ１４６」は、主に内皮細胞の膜に存在し、本明細書に記述した配列番号１１に対応するアミノ酸配列を有するヒトタンパク質、ペプチド又はアミノ酸分子を指す。
【００４３】
「ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質」又は「可溶型ＣＤ１４６」又は「ｓＣＤｌ４６」は、典型的には、ヒトタンパク質、ペプチド又はアミノ酸分子を指す。このようなｓＣＤｌ４６タンパク質は、典型的には、ヒト血清中に存在する。本発明に係る特定のヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択されるアミノ酸配列を含むか又はその中にある。
【００４４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の中において、配列番号７が、対象が動物、特にヒトである、本発明との関連において使用可能な好ましいヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質である。
【００４５】
本発明に係る典型的なｓＣＤ１４６タンパク質は、すでに説明したように、診断との関連においてバイオマーカーとして、また治療ターゲットとして、治療的又は予防的／予防処置との関連において治療ツールとして使用可能なタンパク質である。
【００４６】
本説明は、さらに、本明細書に記述の本発明のタンパク質をそれぞれコードする核酸分子を記述する。
【００４７】
このような核酸分子は、典型的には生物活性ヒトＣＤ１４６タンパク質、特に、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡであるか、又はそのリコンビナントフォームを準備するために使用することができる。
【００４８】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、線維症、典型的には任意の線維性ヒト疾患に至る、その結果もたらされる又はそれと関連付けられる任意の病態、疾患、障害又は機能障害の状態を軽減、進行緩和させるか又は治癒（逆進）させることのできる治療的及び予防的若しくは予防治療又は方法の両方を指す。このような疾患の例として、心房線維症、心内膜心筋線維症、梗塞、特に、陳旧性心筋梗塞、腎線維症、硬変、胆道閉鎖症、進行性塊状線維症、神経膠瘢痕、動脈硬化度、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、腎性全身性線維症、縦隔線維症、後腹膜線維症、骨髄繊維症、全身性硬化症等がある。
【００４９】
このような「治療」は、典型的には、その必要があることが明確になった本明細書に既述の対象、典型的には動物の対象、好ましくはヒトの対象に向けたものである。対象として考えられるのは、線維症に至る、その結果もたらされる又はそれと関連付けられる病態、疾患、障害又は機能障害の状態にある対象、又はこのような病理、疾患、障害、機能障害の状態を「発現するリスクがある」と考えられる対象、すなわち、発現するリスクがあることが疑われる対象であって、そのような対象において、このようなことは予防されるべきである。
【００５０】
例えば、患者は、線維症、又は線維症に至る、その結果もたらされる又はそれと関連付けられる本明細書に記述の病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態の１つを発現する素因がある（若しくは素因があると疑われる）対象であり得る。対象は、例えば、心臓線維症（例えば、心房線維症、心内膜心筋線維症若しくは梗塞）又は腎線維症を患っている又は「発現するリスクがある」とみなされる対象である。
【００５１】
対象は、無症状であるか又はこのような病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態の早期の兆候若しくは進行した兆候を示し得る。
【００５２】
典型的な対象は、線維症の素因がある、線維症による影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維症の増進がある、線維症予後不良であると、本明細書に記述の方法のおかげで特定された対象である。
【００５３】
本明細書に記述の別の特定の目的は、対象、典型的には動物、好ましくはヒトにおいて、線維症、特に、心臓及び／若しくは腎線維症に対する素因の検出（検出すること）、その診断及び／若しくは予後推測（診断及び／若しくは予後予測をすること）又はモニター（モニターすること）において、典型的にはバイオマーカーとして使用するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質である。
【００５４】
好ましいヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質が、配列番号７に含まれる又はある。
【００５５】
本明細書に記述のさらに特定の目的は、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質を、対象において、線維症、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症の素因の検出、その診断及び／若しくは予後予測又はモニターをする際バイオマーカーとして使用することである。
【００５６】
本明細書に記述の別の特定の目的は、配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質を、対象において、線維症、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症に対する素因の検出、その診断及び／若しくは予後予測又はモニターをする際バイオマーカーとして使用することである。
【００５７】
対象、典型的には動物、好ましくはヒトにおいて、線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／又は肺線維症に対する素因の検出若しくは診断及び／又は予後予測を、インビトロ、エクスビボ又はインビボで行う方法を、特に、本明細書に記述する。心臓及び／又は腎線維症に関連する好ましい態様において、このような方法において使用されるＣＤ１４６は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される。
【００５８】
皮膚及び／又は肺線維症に関連する別の好ましい態様において、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質において使用されるｓＣＤ１４６は、配列番号のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質である。
【００５９】
「診断」又は「診断する」という用語は、対象における、本明細書において定めた病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態、典型的には、線維症の検出若しくは特定、又はこのような病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態の評価（定量し、比較すること）を指す。
【００６０】
特定の態様において、本発明の診断方法は、ＣＤ１４６、典型的にはｓＣＤ１４６タンパク質の存在の決定及び／又は対象の生体サンプル中に存在するＣＤ１４６、典型的にはｓＣＤ１４６タンパク質量の測定と、好ましくは、基準値との量の比較とを含む。
【００６１】
「予測（prediction）」又は「予測する（predicting）」という用語は、対象が、本明細書において定めた病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態を発現する素因の評価を指す。
【００６２】
「診断」又は「診断する」という用語は、本明細書で定めた病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態の対象において、治療の有無に拘わらず、進行（経過）の評価又はモニター、典型的には、このような疾患若しくは障害の悪化と関連する有害な作用の予測、又は、逆に、対象の健康改善の予測を指す。
【００６３】
本発明の診断方法は、ＣＤ１４６、典型的には、ＣＤ１４６タンパク質等の、早期の前駆症状期及び後期を含む種々の段階において測定した量又はレベルを、対象からの１つ又は複数の生体サンプルにおいてモニターし、定量し、比較する１つ又は複数のステップを含み得る。
【００６４】
予後予測は、最も適切な治療を明確にするために、典型的には、線維症の進行の評価（予測）と対象の特徴とを含む。
【００６５】
本明細書に記述の方法は、典型的には、対象の生体サンプルにおいて、ＣＤ１４６、特に、ｓＣＤ１４６の存在を実証するステップ、換言すれば、ＣＤ１４６タンパク質の発現を決定するステップと、好ましくは、ＣＤ１４６の発現（ＣＤ１４６量の測定）レベルを決定するステップとを含む。
【００６６】
特に、本明細書に記述のヒトＣＤ１４６タンパク質の任意のもの、典型的にはヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質を、対象、典型的には動物、好ましくはヒトにおいて、線維症又は線維症関連の疾患、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／若しくは肺線維症の存在を示し得るバイオマーカーとして使用することができる。
【００６７】
特定の態様において、対象において線維症を診断及び／又は予後予測する方法は、可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを対象の生体サンプルにおいて決定するステップであって、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択するステップｉ）と、ステップｉ）で決定された発現レベルを基準値、例えば、所定の基準値と比較するステップｉｉ）と、ステップｉ）において決定されたレベルが基準値よりも高いと、当該対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると結論づける、又はステップｉ）において決定されたレベルが基準値よりも低いと、患者は、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む。
【００６８】
別の特定の態様において、対象において線維症に対する素因を検出する又はその診断及び／若しくは予後予測をする方法は、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質及び配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを対象の生体サンプルにおいて決定するステップを含む。
【００６９】
一態様においてさらに正確には、本方法は、Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、ステップｉ）において決定された発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、ステップｉ）で決定されたレベルが基準値よりも高いと、対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると結論づける、又はステップｉ）で決定されたレベルが基準値よりも低いと、患者が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む。
【００７０】
別の態様において、本方法は、Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを、対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、ステップｉ）において決定された発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、ステップｉ）において決定されたレベルが基準値より低いと、対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると結論づける、又はステップｉ）において決定されたレベルが基準値より高いと、対象が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると結論づけるステップｉｉｉ）とを含む。
【００７１】
「基準値」、「対照値」、「カットオフ値」という用語は、基準集団の、典型的には健康な対象、すなわち、病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態ではない対象の生体サンプルを用いて得られた値（測定レベル、量又は濃度）の平均に対応する基底値（Ｂａｓａｌ  Ｖａｌｕｅ）を指す場合がある。
【００７２】
基準値はまた、統計学的又は識別値、すなわち、健康な対照集団と、既知の病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態を有する集団との両方においてパラメータを測定することにより決定された値であり得る。識別値は、パラメータ値と、健康な対照集団と患者集団との既知の臨床データとの間の関係の解析に基づいた所定の特異性及び／又は所定の感受性を有する疾患集団を特定する。このように決定された識別値は、今後の個人の試験における同一の実験条件について有効である。例えば、基準値は、Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質については３００ｎｇ／ｍｌ、Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質については５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００７３】
本明細書に記述の特定の方法は、線維症、特に、心臓又は腎線維症を、対象において、インビトロ、エクスビボ又はインビボでモニターする方法である。本方法は、典型的には、対象の生体サンプルにおいて、２回以上、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベル又は可溶型ＣＤ１４６タンパク質の量の存在を決定すること及び測定することを含み、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択され、早期の時点において対象の生体サンプルにおいて得られた基準値と比較した、後期の時点における対象の生体サンプルにおけるＣＤ１４６タンパク質の（欠如の後に続く）存在又は発現レベルの上昇が、対象において線維症の増進又は線維症の悪化を示す一方、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルの低下は、線維化の減退を示し、等しい可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルは、対象において、線維化が安定している又は換言すれば進行していないことを示す。
【００７４】
本明細書に記述の別の特定の方法は、インビトロ、インビボ又はエクスビボによる対象における線維症のモニター方法であって、当該方法は、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを、対象の生体サンプルにおいて２回以上決定することを含み、対象の生体サンプルにおける可溶型ＣＤ１４６タンパク質の後期の時点での発現レベルが、対象の生体サンプルにおいて早期の時点で得られた基準値と比較して高いことは、対象における線維症の増進を示し、これに対して、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルの方が低いことは、線維化の減退を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質が等しいことは、線維症が対象において進行していないことを示す。
【００７５】
本明細書に記述の別の特定の方法は、インビトロ、インビボ又はエクスビボによる対象における線維症のモニター方法であって、当該方法は、配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを対象の生体サンプルにおいて２回以上決定することを含み、対象の生体サンプルにおける可溶型ＣＤ１４６タンパク質の後期の時点での発現レベルが、対象の生体サンプルにおいて早期の時点で得られた基準値と比較して低いことは、対象における線維症の増進を示し、その一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが高いことは、線維症の減退を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が対象において進行していないことを示す。
【００７６】
線維症の進行を評価するために又は治療の効率を調節するために、治療下で若しくは任意の治療の前に患者を試験し、同一の患者を治療下で（典型的には治療を何も妨げない状態で）数日、数週間若しくは数か月後に試験することは、有用となり得る。このような状況において、第２の試験の結果（測定値）を第１の試験結果と比較した。
【００７７】
「基準値を上回る」又は「基準値より高い」ＣＤ１４６の発現量／レベルは、例えば、少なくとも２つの標準偏差の、有意な統計学的増加を意味し得る。
【００７８】
「生体サンプル」という用語は、対象、特に、動物の対象、典型的にはヒトからの任意の生体サンプルを含む。生体サンプルは、組織生検、例えば、心臓生検、又は生物学的液体サンプルであってよい。
【００７９】
本発明との関連において使用可能な生体サンプルの典型的な例は、血漿、血液、血清、尿、脳脊髄液及び唾液のサンプルから選択可能である。好ましくは、生体サンプルは、血漿、血液、又は血清サンプルであり、さらにより好ましくは、血清サンプルである。生体サンプルは、好ましくは希釈されたサンプルであり、希釈は、典型的には、１／２５、１／５０、１／１００、１／２００又は１／４００、好ましくは１／２５である。
【００８０】
特に、考えられるＣＤ１４６タンパク質の血清中濃度は、線維症の素因の検出、診断、予後予測又はモニター方法において高値を示す場合がある。実際、測定値は、対象の健康状態と関連付けられる標準的な値と比較することができる。特に、考えられるフォームのＣＤ１４６、典型的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるｓＣＤ１４６又は配列番号９のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の過剰発現は、線維症の存在を示す可能性がある。
【００８１】
好ましくは、ＣＤ１４６、特に、ｓＣＤ１４６の存在の決定及び量の測定は、対象の生体サンプルが、適切な抗ＣＤ１４６抗体と直接接触する１ステップ法により又は生体サンプルの予備的治療を伴う方法によりイムノアッセイにおいて決定される。
【００８２】
ＣＤ１４６、特に、ｓＣＤ１４６に結合し、それを対象の生体サンプル中において特定する／定量することができる抗体が、当該技術において知られている。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、好ましくは、ＣＤ１４６、特に（膜型ＣＤ１４６に対して）ｓＣＤ１４６に選択的に結合するモノクローナル抗体である。
【００８３】
ｓＣＤ１４６に選択的に結合する特定の抗体は、（膜型ＣＤ１４６に対して）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む又は同配列番号にあるタンパク質、好ましくは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む又は同配列番号にあるタンパク質に選択的に結合する抗体から選択することができる。
【００８４】
有利には、本発明に係る（膜型ＣＤ１４６に対して）ｓＣＤ１４６に選択的に結合する抗体は、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９０、配列ＱＶＳ及び配列番号９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列とを含む。
配列番号８７は、以下のアミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＨＦに対応する。
配列番号８８は、以下のアミノ酸配列：ＩＦＰＧＳＧＤＴに対応する。
配列番号８９は、以下のアミノ酸配列：ＡＲＴＷＡＹに対応する。
配列番号９０は、以下のアミノ酸配列：ＱＳＬＬＹＳＤＧＫＴＹに対応する。
配列番号９１は、以下のアミノ酸配列：ＡＱＴＴＨＦＰＬＴに対応する。
【００８５】
特定の態様において、本発明に係る抗体又はそのフラグメントは、配列番号９３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号９２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）とを備える。
【００８６】
有利には、本発明に係る（膜型ＣＤ１４６に対して）ｓＣＤ１４６に選択的に結合する抗体は、配列番号９４、配列番号９５及び配列番号９６の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９７、配列ＦＡＳ及び配列番号９８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列とを含む。
配列番号９４は、以下のアミノ酸配列：ＧＦＴＦＳＤＹＧに対応する。
配列番号９５は、以下のアミノ酸配列：ＩＹＹＤＳＳＫＭに対応する。
配列番号９６は、以下のアミノ酸配列：ＡＡＦＱＦＤＹに対応する。
配列番号９７は、以下のアミノ酸配列：ＱＧＩＳＴＳに対応する。
配列番号９８は、以下のアミノ酸配列：ＱＱＳＹＮＬＰＹＴに対応する。
【００８７】
特定の態様において、本発明に係る抗体又はそのフラグメントは、配列番号１００を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号９９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）とを備える。
【００８８】
本明細書に記述の抗体の任意のものは、組成物に、典型的には診断用組成物に組込み可能であって、さらに、薬学的に許容されるキャリア又は担体を、当業者により容易に決定されるそれぞれの適切な用量でさらに含む。
【００８９】
ＣＤ１４６に結合する抗体は、典型的には、有効量、組成物に使用され又は組成物に存在する。発現「有効量」は、ＣＤ１４６、特にｓＣＤ１４６を、対象又は対象の生体サンプルにおいて検出及び／又は測定するのに十分な抗ＣＤ１４６抗体の量又は濃度を指す。
【００９０】
動物、典型的にはヒトにおいて診断関連で使用するための抗ＣＤ１４６抗体典型的な有効量は、約１μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌとの間であり、好ましくは、約１μｇ／ｍｌと約２．５μｇ／ｍｌとの間、又は約２．５μｇ／ｍｌと約５μｇ／ｍｌとの間である。
【００９１】
イムノアッセイは、当該技術において周知の方法により、固相又は均一相において、１つ又は２つのステップにおいて、競合法等により、行うことができる。
より好ましくは、前記イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＦＥＩＡ、ウェスタンブロット、ドットブロット、ビーズ・ベース・アッセイ、抗原アレイ及び放射免疫測定法から選択される。
【００９２】
ＥＬＩＳＡにおいて、抗原は、固体表面に固定化され、酵素に連結する抗体と複合体を形成するようにしなければならない。検出は、呈色生成物を生成するように基質とともに恒温放置を経て結合した酵素の活性を評価することにより行われる。
【００９３】
ＦＥＩＡにおいて、呈色生成物は、蛍光性である。
【００９４】
放射免疫測定法において、最終生成物は、放射性である。
【００９５】
ドットブロットプロトコルを用いたタンパク質の検出は、ウェスタンブロットと、両方の方法によって当該タンパク質の特定および解析が可能となる点で、類似する。ドットブロットの手法は、従来のウェスタンブロット技法とは、タンパク質サンプルに電気泳動を用いた分離をしないことにより、異なる。サンプルのタンパク質は、その代わりに、膜に点在させて、抗体プローブでハイブリダイズする。ビーズ・ベース・アッセイ又は抗原アレイは、研究者が、生物学的サンプル及び環境サンプルにおいて複数の分析対象を同時に測定する新しいアプローチである。
【００９６】
半定量測定が、例えば、数値を正規化し比を求めるように通常コントロールを用いた、又は（任意の単位で表される）キャリブレーターとしてのポジティブコントロールを用いた既述の方法のそれぞれで、得られる。
【００９７】
検出は、固体の担体、例えば、１つのフォーム又は各種フォームのＣＤ１４６を検出及び／又は定量化するために、複数の抗体を整然と配列するように配置するものであるマイクロプラーク（ｍｉｃｒｏｐｌａｑｕｅ）、又は固体粒子、試験管等において、行ってよい。
【００９８】
抗体が、可溶型ＣＤ１４６タンパク質を結合した抗体、例えば、（膜型ＣＤ１４６に対して）可溶型ＣＤ１４６タンパク質を選択的に結合した抗体である、特に、配列番号７を含む又はそれからなる可溶型ＣＤ１４６タンパク質である特定の態様において、試験対象の血清中の前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが基準レベルと比較して高いことは、線維症又は線維症の増進、特に、心臓及び／又は腎線維症又は線維化の増進を示す。
【００９９】
抗体が、配列番号８を含む又はそれからなるＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質を結合する抗体である別の特定の態様において、試験対象の生体サンプル中の、典型的には血清中の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが、基準レベルと比較して上昇したことは、線維症又は線維症の増進、特に皮膚線維症及び／若しくは肺線維症又はそれらの線維症の増進を示す。
【０１００】
抗体が、配列番号９を含む又はそれからなるＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質を結合する抗体である別の特定の態様において、試験対象の生体サンプル、典型的には血清中の前記Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが、基準レベルと比較して上昇したことは、線維症の減退、特に、皮膚線維症及び／又は肺線維症の減退を示す。
【０１０１】
本発明者らはまた、対象における線維症、特に、心臓又は腎線維症を診断する方法を本明細書に記述する。この方法は、典型的には、対象の血清中において、ＣＤ１４６、好ましくはｓＣＤ１４６の量を検出、好ましくは測定／定量するステップを含む。このような方法には、典型的には、本明細書に記述するように、ＣＤ１４６タンパク質、好ましくはｓＣＤ１４６タンパク質を結合する抗体を使用する必要がある。
【０１０２】
本発明者らはまた、本明細書に、対象、典型的には、本明細書に記述の方法により、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維化が増進している又は線維症の予後不良であると特定されている対象における線維症、特に、心臓及び／若しくは腎線維症、任意の病態、疾患、障害若しくは機能不全状態の予防又は治療に使用するためのＣＤ１４６阻害剤、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤又はこのようなＣＤ１４６阻害剤を含む組成物を記述する。
【０１０３】
本発明者らはまた、本明細書に、対象、典型的には、本明細書に記述の方法により、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維化が増進している又は線維症の予後不良であると特定されている対象において、線維症、特に、皮膚線維症及び／若しくは肺線維症、特に、全身性硬化症と関連付けられる肺線維症、又は線維症に至る、線維症から生じる又は線維症と関連付けられる任意の病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態の予防又は治療において使用するための配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質阻害剤又はこのようなＣＤ１４６阻害剤を含む組成物を記述する。
【０１０４】
線維症に至る、線維症から生じる又は線維症に関連付けられ、少なくとも１つの特定のフォームのＣＤ１４６、典型的には、ｓＣＤ１４６の、又はＣＤ１４６の受容体の過剰発現という特徴を有する、本明細書に記述の病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態は、有利には、ＣＤ１４６阻害剤により、好ましくは、ＣＤ１４６、好ましくはヒトＣＤ１４６に対して向けられる抗体、又はこのようなＣＤ１４６に対して向けられる他の任意のＣＤ１４６アンタゴニストにより、治療され、本明細書に記述のように、本発明者らは、実際に、このようなＣＤ１４６阻害剤が、一旦、対象に投与されると、線維症を予防し、停止させ、逆進させることさえ可能であることを発見した。
【０１０５】
特に、本説明は、インビトロ又はエクスビボで、組成物、典型的には医薬組成物を調製するための、線維症、特に、心臓、腎臓、皮膚及び／若しくは肺線維症又は線維症に至る、線維症から生じる若しくは線維症と関連付けられる任意の病態、疾患、障害若しくは機能障害の状態を、その必要がある対象において予防又は治療するためのＣＤ１４６阻害剤、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質阻害剤、配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質阻害剤又はこのようなＣＤ１４６阻害剤を含む組成物の使用に関する。
【０１０６】
典型的な態様において、ＣＤ１４６阻害剤は、抗体、アプタマー、ポリペプチド、有機小分子及び核酸から選択される。
【０１０７】
好ましい態様において、ＣＤ１４６阻害剤は、抗ＣＤ１４６抗体若しくはＣＤ１４６抗原結合分子、好ましくは、抗ｓＣＤ１４６抗体若しくはｓＣＤ１４６抗原結合分子、その機能的フラグメント（すなわち、ＣＤ１４６に結合可能なフラグメント）又はその誘導体である。
【０１０８】
「抗体」という用語は、最も広義に使用しており、所望の（例えば、線維症を阻害する）生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び抗体フラグメントに及ぶ。抗体フラグメントは、全長抗体の一部分、一般には、その抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、（例えば、ラクダ類の）単ドメイン抗体、サメＮＡＲ単ドメイン抗体、及び抗体フラグメントから形成される多特異性抗体がある。抗体フラグメントはまた、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ：登録商標）、ぺプボディ（ＰｅｐＢｏｄｉｅｓ）、抗体Ｔ細胞エピトープ融合体（Ｔｒｏｙｂｏｄｉｅｓ）又はペプチボディ（Ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）に限定はしないがそれらを含むＣＤＲ又は抗原結合ドメインを備える結合部分を指し得る。本発明による抗体は、ＩｇＧ抗体が典型的には好ましいが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ１、ＩｇＥ１、ＩｇＭ１又はＩｇＹ１任意のクラスであり得る。抗体は、ヒト、マウス（マウス又はラット）、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ウマ又はニワトリを含む、哺乳類又は鳥類起源であり得る。抗体は、任意のタイプの分子を抗体へ共有結合させることにより変化させることができる。例えば、限定するわけではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、細胞内リガンド若しくは他のタンパク質等に対する結合、当該技術において既知の他の改変によって、改変された抗体を含む。
【０１０９】
一般に、（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びハイブリドーマを含む）抗体を調製する技術及び抗体を用いて抗原を検出する技術は、例えば、当該技術、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９８；  Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７  （１９７５）；  Ｋｏｚｂｏｒ他，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２  （１９８３）；  ａｎｄ  Ｃｏｌｅ他，  ｐｐ．  ７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １９８５において周知である。
【０１１０】
その上、本発明にかかる抗体は、ペプチドタグ等マーカー配列に、精製を促進するために融合することができ、適切なタグは、ヘキサヒスチジンタグである。抗体は、診断又は治療薬に、当該技術において既知の方法により結合することもできる。このような結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の調製技術は、当該技術において周知である。このようなモノクローナル抗体、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体及び単鎖抗体の調製方法は、当該技術において既知である。特定の態様において、抗ＣＤ１４６抗体は、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質、好ましくは、配列番号７若しくは配列番号８のアミノ酸配列を含む若しくはそれにあるタンパク質又はそのエピトープを特異的に認識し／選択的にそれに結合する。
【０１１１】
この抗体は、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７の標的ＣＤ１４６タンパク質、特に、標的可溶型ＣＤ１４６タンパク質及び／又は配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質、好ましくは標的ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質の生物学的活性も中和する。好ましくは、モノクローナル抗体は、本明細書において定めた対象において線維症を縮小又は阻害させる。
【０１１２】
特定のモノクローナル抗体はまた、可溶型ＣＤ１４６受容体又はＣＤ１４６タンパク質受容体サブユニットの（標準的な発現と比較して）過剰な発現を減少又は抑制することができる。ヒトＣＤ１４６タンパク質、典型的にはヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質と、ＣＤ１４６若しくは可溶型ＣＤ１４６タンパク質受容体（又はＣＤ１４６タンパク質受容体サブユニット）とを結合する抗体は、本発明との関連において使用することも可能である。このような抗体を作製する方法が、当該技術において既知である（例えば、Ｄｅｓｐｏｉｘ  Ｎ，  Ｗａｌｚｅｒ  Ｔ，  Ｊｏｕｖｅ  Ｎ，  Ｂｌｏｔ−Ｃｈａｂａｕｄ  Ｍ，  Ｂａｒｄｉｎ  Ｎ，  Ｐａｕｌ  Ｐ，  Ｌｙｏｎｎｅｔ  Ｌ，  Ｖｉｖｉｅｒ  Ｅ，  Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ，  Ｖｅｌｙ  Ｆ．  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１４６／ＭＣＡＭ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８；３８：  ２８５５−６４を参照）。
【０１１３】
本発明との関連において使用可能であり（膜型ＣＤ１４６に対して）可溶型ＣＤ１４６を選択的に結合可能である、本発明者らが選択した好ましい抗体は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９０、配列ＱＶＳ及び配列番号９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列とを含む抗体、又は配列番号９４、配列番号９５及び配列番号９６の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列と、配列番号９７、配列ＦＡＳ及び配列番号９８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列と、を含む特異な抗体であり得る。
【０１１４】
特定の態様において、抗体は、配列番号９３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号９２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【０１１５】
別の特定の態様において、抗体は、配列番号１００を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号９９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【０１１６】
ＣＤ１４６阻害剤はまた、アプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を表すタイプの分子である。アプタマーは、任意のタイプの標的分子を、高い親和性及び特異性で、視覚的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．及びＧｏｌｄ  Ｌ．，１９９０に記述のように、ランダム配列ライブラリの試験管内選択法（ＳＥＬＥＸ法）により分離してよい。ランダム配列ライブラリは、ＤＮＡのコンビナトリアルケミストリー合成により得られる。このライブラリにおいて、それぞれのメンバーは、非反復配列から、最終的に化学的に改変された鎖状オリゴマーである。このタイプの分子のあり得る改変、用途及び利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ  Ｓ．Ｄ．，１９９９中で概説されている。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド方法によりコンビナトリアルライブラリーから選択される大腸菌チオレドキシンＡ等のプラットフォームタンパク質により示される、立体構造的に制限を受けた抗体可変領域からなる。
【０１１７】
別の態様において、ＣＤ１４６阻害剤は、アミノ酸残基を含むペプチド又はポリペプチド分子である。
【０１１８】
本明細書において使用される「アミノ酸残基」という用語は、（Ｌ）又は（Ｄ）配置の任意の天然／標準的なアミノ酸残基及び非天然／非標準的なアミノ酸残基を指し、アルファ又はアルファ二置換アミノ酸を含む。それは、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシンを指す。それには、βアラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、αアミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン（例えば、Ｌ-オルニチン（Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ））、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ｂｕｔｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ｂｕｔｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、Ｎ-メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニン、シクロブチルアラニン、シクロプロピルアラニン、シクロヘキシルグリシン、シクロペンチルグリシン、シクロブチルグリシン、シクロプロピルグリシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄ−又はＬ−）、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、セレノシステイン、ホモシステイン、ホモセリン（ＨｏＳｅｒ）、システイン酸、ε-アミノヘキサン酸、δアミノ吉草酸、２，３−ジアミノ酪酸（Ｄ−又はＬ−）等も、含まれる。このようなアミノ酸は、生化学／ペプチド化学の技術において周知である。
【０１１９】
本発明との関連において使用される、ペプチドを含む化合物は、ペプチド結合の少なくとも１つのペプチド結合のイソステリック修飾（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による置換を含んでよい。ペプチドを含む本発明の化合物は、ペプチドミメティクスであってよい。ペプチドミメティクス化は、典型的には、ペプチド等価体の極性、三次元サイズ及び機能性（生物活性）が保持されるという特徴を有し、ペプチド結合の１つ以上が、タンパク分解性のさらに安定な結合により、置換されていることを特徴とする。一般に、アミド結合（アミド結合サロゲート）と置き換わる結合が、アミド結合の特性の多く又はすべて、すなわち、コンフォメーション、立体容積、静電特性、水素結合用の電位等を保護する。典型的なペプチド結合の置換には、エステル、ポリアミン及びその誘導体、並びにアミノメチル及びケトメチレン等の置換アルカン及びアルケンが含まれる。例えば、ペプチドは、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス若しくはトランス）、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−又は−ＣＯＣＨ２−等の結合により置換される１つ以上のペプチド結合、−Ｎ−ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨＮＨ−、すなわち、側鎖が炭素原子の代わりに窒素原子に結合されるペプトイド結合を具えてよい。このようなペプチドミメティクスは、化学的安定性が高く、生化学的／薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率等）が高まり、かつ／又はペプチド等価体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）に対する抗原性が低下し得る。
【０１２０】
別の態様において、ＣＤ１４６阻害剤は、有機小分子である。
【０１２１】
「器官」という用語は、一般に製薬において使用される有機分子と同等のサイズの分子のことを指す。当該用語は、生体高分子を除外する（例えば、タンパク質、核酸等）。好ましい有機小分子は、大きさが、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでの範囲である。
【０１２２】
別の態様において、ＣＤ１４６阻害剤は、核酸である。
【０１２３】
ＣＤ１４６阻害剤は、典型的には、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、典型的には阻害剤ヌクレオチドとすることができる。これには、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び合成ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９との関連において使用可能なｇＲＮＡ）が含まれる。一部の好ましい実施形態において、ＣＤ１４６発現を標的とするｓｉＲＮＡが、用いられる。ｓｉＲＮＡ等の二本鎖ＲＮＡによる内在性遺伝子の機能及び発現に対する干渉が、種々の生物において示されてきた。例えば、Ａ．  Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１  ：８０６−８１１  （１９９８）；  Ｊ．  Ｒ．  Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ＆  Ｒ．  Ｗ．  Ｃａｒｔｈｅｗ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｓＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  ｔｈａｔ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２  Ａｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｎｇｌｅｓｓ  Ｐａｔｈｗａｙ，”  ＣｅＪ  ９５：１０１７−１０２６  （１９９８）；  Ｆ．  Ｗｉａｎｎｉ  ＆  Ｍ．  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−  Ｇｏｅｔｚ，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：７０−７５  （２０００）を参照。ｓｉＲＮＡは、自己相補的配列又は二本鎖配列を含むヘアピンループを含み得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には、１００以下の塩基対を有し、例えば、約３０ｂｐｓ以下であり得、当該技術において既知の、相補的ＤＮＡ鎖又は合成アプローチの使用を含むアプローチにより作製可能である。このような二本鎖ＲＮＡは、鋳型の両方向から読み出した単鎖ＲＮＡのインビトロ転写と、センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖をインビトロアニーリングすることにより、合成することができる。ＣＤ１４６を標的とする二本鎖ＲＮＡはまた、ｃＤＮＡベクターコンストラクトから合成することができ、その中で、ＣＤ１４６遺伝子（例えば、ヒトＣＤ１４６遺伝子）が、逆方向反復により分かれる逆方向にクローン化される。細胞遺伝子導入の後、ＲＮＡが転写され、相補的鎖の再アニーリングが続く。ＣＤ１４６遺伝子遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡが、細胞内に、適切なコンストラクトのトランスフェクションにより導入され得る。
【０１２４】
典型的には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが媒介するＲＮＡ干渉は、翻訳レベルにおいて媒介され、換言すると、このように干渉するＲＮＡ分子が、対応のｍＲＮＡ分子の翻訳を妨げ、その分解を招く。ＲＮＡ干渉はまた、転写レベルにおいても作用し、このように干渉するＲＮＡ分子に対応するゲノム領域の転写を妨害する場合がある。
【０１２５】
このように干渉するＲＮＡ分子の構造及び機能は、当該技術において周知であり、例えば、Ｒ．  Ｆ．  Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，“Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ”  （３ｒｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ２００６），  ｐｐ．  ５３５−５６５に記述されており、これを参照することにより本明細書に援用される。このようなアプローチのために、ベクター内へのクローン化及びトランスフェクション法もまた、当該技術において周知であり、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆  Ｄ．  Ｒ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （３ｒｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ２００１）に記述されており、これを参照することにより本明細書に援用される。
【０１２６】
二本鎖のＲＮＡに加えて、ＣＤ１４６を標的とする他の核酸剤もまた、本発明の実施、例えばアンチセンス核酸において採用することができる。アンチセンス核酸は、細胞内の特定の標的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。細胞内において、一本鎖アンチセンス分子は、そのｍＲＮＡにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。細胞は、ｍＲＮＡをこの二本鎖の形態に翻訳しない。したがって、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に干渉し、よって、遺伝子の発現がそのｍＲＮＡに転写される。アンチセンス方法は、インビトロで多くの遺伝子の発現を阻害するように使用されてきた。例えば、Ｃ  Ｊ．  Ｍａｒｃｕｓ−  Ｓｅｋｕｒａ，  “Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７２：２８９−２９５  （１９８８）；  Ｊ．  Ｅ．  Ｈａｍｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｅ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：４０１０−４０１４  （１９８８）；  Ｈ  Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−  １０  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ８：３１９−３２７  （１９９８）；  ａｎｄ  Ｗ．−Ｆ．  Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣ１２  Ｃｅｌｌｓ，”  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ８：２９５−３０８  （１９９８）を参照し、この参照により、全てが本明細書に援用される。アンチセンス技術は、さらに、Ｃ．  Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｗ．  Ｎｅｌｌｅｎ，  ｅｄｓ．，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９９７）に記述されており、この参照により本明細書に援用される。ヒト及び他の動物、特に哺乳動物からのＣＤ１４６ポリヌクレオチド配列が、当該技術にすでにある。既知の配列に基づいて、ＣＤ１４６を標的とする阻害性ヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）を、当該技術において周知の方法を用いて、容易に合成することができる。
【０１２７】
本発明に係る例示のｓｉＲＮＡは、２９ｂｐｓ、２５ｂｐｓ、２２ｂｐｓ、２１ｂｐｓ、２０ｂｐｓ、１５ｂｐｓ、１０ｂｐｓ、５ｂｐｓまでの塩基対又はこのような数の間の任意の整数の塩基対を有する場合がある。最適な阻害性ｓｉＲＮＡを設計するためのツールには、ＤＮＡｅｎｇｉｎｅ  Ｉｎｃ．（ワシントン州シアトル）及びＡｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．（テキサス州オースティン）から入手可能なものがある。
【０１２８】
本発明のアミノ酸分子は、その性能、及び／又は対象、通常、哺乳動物、好ましくはヒトにおける診断、治療又は予防的使用との生体適合性を改善するように設計することができる。それは、例えば、好ましくはヒトにおいて、各種タイプの組織、特に、病理学的組織、通常心臓又は腎臓組織を標的とするため、別のポリペプチドにグリコシル化、メチル化、アセチル化、リン酸化又は融合させることができる。
【０１２９】
本発明者らはまた、本明細書において、典型的には治療有効量のＣＤ１４６阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤、担体、ビヒクル又はキャリアとを含む組成物を提供する。
【０１３０】
組成物は、いくつかの異なるＣＤ１４６阻害剤、例えば、特定の剤形のＣＤ１４６向けの抗ＣＤ１４６抗体、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質及び配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質、並びに同一の又は異なる剤形のＣＤ１４６向けの異なる抗ＣＤ１４６抗体を含んでよい。
【０１３１】
本明細書に記述の抗体の任意のものが、さらに、薬学的に許容されるキャリア又は担体を、当業者により容易に決定されるそれぞれの適切な用量でさらに含む組成物に組み込まれてよい。
【０１３２】
組成物は、さらに、線維症予防又は治療を目的とした、ＣＤ１４６阻害剤ではない異なる追加の治療用化合物を含んでよい。
【０１３３】
特定の態様において、抗体、特に、本明細書に記述のヒト可溶型ＣＤ１４６に特に向けられた抗体を含む、本明細書に記述の組成物は、さらに、少なくとも１つの他の抗線維症因子をさらに含んでよい。本発明との関連において、抗線維症因子は、線維芽細胞の発現を阻害若しくは妨害する又は細胞外基質の沈着を阻害若しくは妨害する因子である。
【０１３４】
本発明との関連において使用可能な抗線維症因子は、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、リラキシン、グリタから選択されるザール及びｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ−２９又はｍｉＲ−１０１）から選択してよい。ＣＤ１４６阻害剤の「治療有効量」とは、その必要がある対象、典型的には哺乳動物、好ましくはヒトにおいて線維症の予防又は治療が可能な量である。哺乳動物、典型的にはヒトにおいて用いるための典型的な治療有効量は、約５ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇの間、例えば、約５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ又は約１０と１５ｍｇ／ｋｇとの間である。
【０１３５】
本発明との関連において使用可能な、薬学的に許容される添加物、担体、ビヒクル又はキャリアは、例えば、生理食塩水、任意選択的に、アイソジェニックなアルブミン等の安定化剤若しくは任意の他の安定化タンパク質、グリセロール等と組み合わせられるマンニトール２０％等の等張性緩衝液、及びポリブレン若しくはＤＥＡＥデキストラン等のアジュバントである。
【０１３６】
組成物は、典型的には、対象における線維症、特に、心臓及び／又は腎線維症の予防又は治療用である。
【０１３７】
配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤を含む、本明細書に記述の特定の組成物及び薬学的に許容されるキャリアは、対象における肺線維症、特に、全身性硬化症と関連付けられる肺線維症の防止又は治療用である。
【０１３８】
本明細書に記述の特定の組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質と、対象、好ましくはヒトにおける皮膚線維症及び／若しくは肺線維症、特に、全身性硬化症と関連付けられる肺線維症の予防又は治療において使用するための、薬学的に許容されるキャリアとを含む。
【０１３９】
本発明者らは、さらに、本明細書に、その必要のある対象、典型的には本明細書に記述の方法により線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている、未進行の線維症を有する、線維症が増進している又は線維症の予後不良であると特定されている対象における線維症、特に、心臓、皮膚、肺及び／又は腎線維症を予防又は治療する方法を記述する。本方法は、典型的には、ＣＤ１４６阻害剤、特に、ｓＣＤ１４６阻害剤若しくは特定のｓＣＤ１４６、又はこのようなＣＤ１４６阻害剤若しくはｓＣＤ１４６を含む組成物を、典型的にはその有効量前記対象に投与するステップを含む。
【０１４０】
特定の態様において、本方法は、対象に、抗体、典型的には本明細書に記述の抗ＣＤ１４６抗体、又はこのような抗体を含む組成物（典型的には医薬組成物）を、（有効量）投与するステップを含む。
【０１４１】
本明細書に記述の診断又は医薬組成物の用量は、当業者が、治療対象、投与経路、標的組織、（本明細書に開示の）生物学的活性化合物等に応じて調節してよい。
【０１４２】
種々のプロトコルが、抗ＣＤ１４６抗体、ＣＤ１４６阻害剤若しくは既述の任意の他の化合物の同時若しくは連続投与等の投与、単回若しくは反復投与等に用いられてよく、これは、当業者が調節してよい。
【０１４３】
本発明に係る生成物を含む診断又は医薬組成物は、患者、例えば、全身に、皮下に、脊髄内に、脳内に又は皮内の、所定の標的の病的組織又は領域に投与してよい。好ましい注入モードは、全身注入、特に、静脈内若しくは動脈内注入、又は皮下注入である。
【０１４４】
本明細書に記述のインビトロ、エクスビボ又はインビボで、薬剤、典型的にはＣＤ１４６阻害剤又は線維症、特に、心臓、皮膚、肺及び／又は腎線維症の治療のための組成物の有効性をモニターする方法である。この方法は、典型的には、ＣＤ１４６の発現を、線維症の任意の治療前の対象からの第１の生体サンプルと、線維症治療用薬剤又は組成物にさらされた同一の対象の第２の生体サンプルとにおいて比較するステップを含む。
【０１４５】
また、本明細書において、本明細書に記述の生成物の任意の１つ以上、典型的には有効又は治療量、典型的にはタンパク質、抗体、（可溶型）ＣＤ１４６の阻害剤若しくは組成物、このような生成物と、任意選択的に、その必要がある対象に生成物を投与するための手段若しくはデバイスと、任意選択的に、本明細書に記述の方法との関連において生成物を使用するための説明を提供するパンフレットとを含むキットが、提供される。
【０１４６】
好ましくはキットの中にある抗体は、典型的には、本明細書に記述のＣＤ１４６タンパク質の１つ、好ましくは本明細書に記述のｓＣＤ１４６のタンパク質の１つ向けである。それは、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１４７】
典型的には、キットはまた、開示の方法に係るタンパク質、抗体、阻害剤又は組成物を使用するための取扱説明書を含む。
【０１４８】
本発明のさらなる態様及び利点を、以下の実験の部において説明し、これは、本願の範囲を図示するものであって限定するものとみなすべきでない。本願において引用した全文献は、参照によって本明細書に援用される。
【０１４９】
実験の項
本明細書の以下に記述の実験は、特に、以下を示す。
−重度の腎線維症導入の２つのモデル（糸球体基底膜抗血清により誘発されたモデル及び片側尿管閉塞モデル）において、ＣＤ１４６は、糸球体毛細血管のレベルにおいて感知される程増加し、ｓＣＤ１４６の濃度は、循環する血液中で一層増加し、線維症への効果が、ＣＤ１４６用のＫＯマウスを用いたとき大きく低下し、その効果は、動物に抗−ｓＣＤ１４６抗体を注入したときに阻止されるか又は元に戻されてしまう。
−マウスにおける心筋梗塞モデルでは、ＣＤ１４６は、線維症の領域の周辺で増加し、ｓＣＤ１４６が増加する。
−ＣＤ１４６用ＫＯ動物では、線維症の量が、心筋梗塞後、対照動物と比較して、低下する。
−老齢マウスでは、心臓線維症の発現が、ＫＯ-ＣＤ１４６マウスで、野生マウスと比較して減少した。
−ｓＣＤ１４６は、腎臓及び心臓線維芽細胞の増殖をインビトロで増加させ、筋線維芽細胞への移行を誘発する。
−ｓＣＤ１４６は、腎臓及び心臓内皮細胞において内皮−間葉系移行をインビトロで誘発する。
−ｓＣＤ１４６は、線維症と頻繁に関連付けられるｍｉＲ２１をインビトロで有意に誘発する。
【０１５０】
この結果は、ｓＣＤ１４６が、線維症と関連付けられる種々の病態において、典型的には線維性ヒト疾患において、大量に分泌され、間質性線維症の発現に、線維芽細胞及び内皮細胞の両方を標的とすることによって、関与することを示す。その上、その現象は、動物を抗ｓＣＤ１４６抗体で治療すると妨げられる又は元に戻る。
【０１５１】
実施例１−ＣＤ１４６の内皮特異的欠失は、マウスにおいて実験用の糸球体腎炎から保護する
［材料及び方法］
（マウス系統）
ＣＤ１４６−ｆｌｏｘｅｄマウス及びＣＤ１４６−ＫＯマウスを、既述のように生成し、１０を超える世代間Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのバックグラウンドへ戻し交雑させた（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ，２００９）。ＣＤ１４６−ｆｌｏｘｅｄマウスを、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性化用レポーターとして蛍光性タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１を発現するＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ６（ＣＡＧ−ＺｓＧｒｅｅｎ１）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交配させた。それから、ＣＤ１４６遺伝子が内皮細胞特異的に欠失するマウスを、Ｒａｌｆ  Ａｄａｍｓ博士から譲渡されたＣｄｈ５（ＰＡＣ）−ＣｒｅＥＲＴ２マウス系統とＣＤ１４６ｆｌｏｘ−ＺｓＧｒｅｅｎ動物をさらに交配させることにより、生成した（Ｗａｎｇ，Ｙ  ２０１０）。ＣＤ１４６遺伝子の欠失は、トウモロコシ油で希釈され（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、１ｍｇタモキシフェン／注入）連続３日投与されるタモキシフェンの腹腔内注入により誘発された。ＣＤ１４６アレルの遺伝子型を同定するプライマーは、配列番号２２：５’−ＴＣＡＣＴＴＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’（ＣＤ１４６ＷＴ、ｆｌｏｘｅｄ及びＫＯアレルを検出するために使用される順方向プライマー）、配列番号２３：５’−ＣＣＴＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＡ−３’（ＣＤ１４６ＷＴ及びｆｌｏｘｅｄアレルを検出するために使用される逆方向プライマー）及び配列番号２４：５’−ＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡ−３’（ＣＤ１４６ＫＯアレルを検出するために使用される逆方向プライマー）のものである。
【０１５２】
（多様なヒト糸球体症におけるＣＤ１４６解析）
ヒト腎生検が、多施設治験においてＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｎａｌ  ｃＤＮＡ  Ｂａｎｋ-  Ｋｒｏｎｅｒ−Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｂａｎｋ，  ＥＲＣＢ）集められ、患者から、インフォームドコンセントの後、各地生命倫理委員会の承認を得られた。移植前移植組織バイオプシーを対照腎臓として使用した。すべてのＲＮＡを、既述のように、糸球体から単離し、逆転写させ、線形増幅させる（Ｄｊｕｄｊａｊ，Ｓ．，２０１２）。断片化、ハイブリダイゼーション、染色、イメージングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに従って実施した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）。単一プローブベースの解析ツールであるチップインスペクタ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、有意に変化したプローブに基づくトランスクリプトアノテーション、総強度正規化、マイクロアレイの有意性分析（Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｄ  ２００８）及びトランスクリプト同定を行った。事前に発現したＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｑＰＣＲによるヒトＣＤ１４６及びＧＡＰＤＨ検出を行った。ｍＲＮＡ発現を、標準曲線による定量化により解析した。
【０１５３】
（腎毒性の血清誘発糸球体腎炎）
脱補体化した腎毒性の血清（ＮＴＳ）を既述のように準備し（Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ  ２００９；Ｋｅｒｒｏｃｈ  Ｍ，２０１２）、体重１グラムあたり１７．５μｌの血清を、２日連続で経皮注入した（１日目及び２日目）。タイムコースプロトコルについて、月齢２か月のＣ５７Ｂ１６／Ｊ雌に、ＮＴＳを注入し、４、７及び１５日で組織採取のため絶命させた（それぞれのタイムポイントについてｎ＝６マウス）。６匹のマウスにＰＢＳを注入し、対照として用いた。
【０１５４】
ＣＤ１４６ＫＯプロトコルについて、月齢２か月のＣＤ１４６ＫＯ雌マウス及びその野生型の同腹仔のうちの一匹を使用した（１群あたり、ｎ＝１６）。それぞれの群から１０匹にＮＴＳを、６匹にＰＢＳを注入した。体重及び尿サンプルを０、４、８及び１５日で採取した。すべてのマウスを、１５日で絶命させ、血液及び組織サンプルを得た。
【０１５５】
ＣＤ１４６−ｆｌｏｘｅｄプロトコルについて、月齢１２か月の雌のマウスをタモキシフェンで治療した。６匹にＮＴＳを、４匹にＰＢＳを注入した。ＣＲＥリコンビナーゼ導入遺伝子を持たないＣＤ１４６−ｆｌｏｘｅｄ  ＺｓＧｒｅｅｎマウスを、タモキシフェンで治療し、対照として用いた（ＮＴＳについてはｎ＝６、ＰＢＳについてはｎ＝４）。体重及び尿サンプルを、０、４、８、１２及び１５日に採取した。マウスは、血液サンプルを得た後、１５日で絶命させた。
【０１５６】
動物実験についてのすべての手順は、欧州連合の実験動物の管理と使用に関する指針に従っており、フランス国立保健医学研究所の地域倫理委員会の承認を受けたものである。動物は、一定の温度で、水や食餌に自由に行き着ける中収容された。
【０１５７】
（組織学的及び機能的パラメータ）
それぞれの動物から片側の腎臓を、４％ホルマリン溶液に固定し、パラフィンに包埋した。４μｍの切片を、腎臓の損傷の組織学的評価のためマッソントリクローム染色で染色した。尿細管拡張を、以下の尺度を用いて半定量的に評価した。０：尿細管損傷なし、１：解析した細管の１〜２５％が損傷、２：解析した細管の２６〜５０％が損傷、３：解析した細管の５１〜７５％が損傷、４：解析した細管の７６％を超える細管が損傷。糸球体半月体を測定し、半月体を示す糸球体対糸球体の総数の％の数字として表した。スコアリングを、２名の別の研究者が、コードされたスライドにおいてマスク方式で行った。画像を、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８３フォトニック顕微鏡を用いて×２００倍率で得た。間質性線維症を、シリウスレッド染色されたパラフィン切片において×２００の倍率で、半定量的に評価した。次いで、線維症を、染色領域を画像領域の百分率として自動計算可能なバイナリ画像を形成することができるコンピュータベースの形態計測解析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、定量化した。ＢＵＮ及び蛋白尿レベルは、酵素方法（Ｋｏｎｅｌａｂａｕｔｏｍａｔｅｒ）を用いて測定され、クレアチニンがミリモル／リットル及びグラム／ミリモルでそれぞれ発現された。
【０１５８】
（免疫染色）
免疫組織化学的検査を、４μｍ厚さのパラフィンで包埋した組織切片に行った。組織は、クエン酸１０ｍＭで脱パラフィンし、９５℃でｐＨ６が、抗原検索のため使用された。切片を０.１％トリトン／ＰＢＳで透過処理した。Ｆ４／８０（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）及びＣＤ３（Ｄａｋｏ）に対する抗体を使用した。Ｆ４／８０及びＣＤ３陽性領域を、動物ごとに少なくとも１０枚の写真で２００×倍率で定量化し、市販品を入手可能な画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ；  Ｆｉｊｉ）を使用して、総組織領域の百分率として表した。免疫蛍光を、メタノールに固定した４μｍ厚さの凍結切片に行った。ＣＤ１４６（自家製ラット抗マウス）、ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ）、Ｃｌａｕｄｉｎ−１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎｅｓｔｉｎ  （ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｎｅｐｈｒｉｎ（Ａｂｃａｍ）抗ウサギ及びα−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）抗マウス抗体を使用した。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体を検出のために用いた。画像を、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８３フォトニック顕微鏡を用いて×４００倍率で得た。
【０１５９】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
総ＲＮＡを片側の腎臓からＴＲＩ試薬（ＭＲＣ）を用いて抽出した。ＲＮＡの質を、ＯＤ２６０：２８０比を測定することにより検証し、残留ゲノムＤＮＡを、ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により、３０分間３７℃で除去した。１ｍｇの総ＲＮＡが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭａｘｉｍａ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、製造業者の説明書に従って、ｃＤＮＡに転写された。リアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いたＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で、以下のプログラムの下、行った。９５℃で５分間と、９５℃で１５秒間及び６０℃で１５秒間を４５周期と、７２℃で１５秒間。定量的解析のため、実験遺伝子を、ＨＰＲＴ発現に対してＤＤＣＴ方法を用いて規準化した。解離曲線を解析して、単一産物が増幅したことを決定した。プライマー配列を表１に列記する。
【０１６０】
（ウェスタンブロット）
タンパク質を、ＲＩＰＡ溶解バッファ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて、腎臓組織から抽出した。ＣＤ１４６（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社）のためのウェスタンブロットを、既述のように標準的な技術を用いて行った（Ｂａｒｄｉｎ他、２００９）。ＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、ローディング・コントロールとして用いた。
【０１６１】
（統計解析）
値を平均値±ＳＥＭとして表している。データを、Ｓｔａｔｖｉｅｗソフトウェア・パッケージのプロテクト版フィッシャーの最小有意差法が後に続く１元配置分散分析を用いて解析を行った。エラーバーは、インビボデータに対して平均値±ＳＥＭ、インビトロデータに対して平均値±ＳＤを表す。Ｐ＜０．０５を伴う結果は、統計学的に有意とみなされたものである。
【０１６２】
【表１】
2022502410.tif 000002
【０１６３】
［結果］
（ＣＤ１４６は、損傷を受けた糸球体に誘発される）
糸球体疾病が進行する間にＣＤ１４６の発現を評価するために、発明者らは、受動的な腎毒性血清糸球体腎炎（ＮＴＳ−ＧＮ）を野生型マウスに誘発した。動物は、ＮＴＳ投与後４、７及び１５日で絶命させた。免疫蛍光は、健康な動物の糸球体に、ＣＤ１４６の弱い発現を示した（図１Ａ）。ＣＤ１４６の発現は、徐々に４日から１５日にかけて尿細管周囲の毛細血管及び損傷を受けた糸球体内において増加した。この上方制御は、腎臓組織のウェスタンブロットにより確認された（図１Ｂ及び図１Ｃ）。ＣＤ１４６ノックアウトマウスは、腎毒性血清誘発糸球体腎炎から保護された。
【０１６４】
ＧＮにおけるＣＤ１４６の役割を評価するために、ＣＤ１４６野生マウス及びＫＯマウスの両方にＮＴＳを注入した。マウスは、ＮＴＳ投与後１５日で絶命させた。ＮＴＳ−ＧＮは、予想通り、ＷＴ動物において疾患を誘発後、体重を増加させる結果となった（図２Ａ）。よって、腎臓の機能は、蛋白尿及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）が非常に増加したので、変化した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。逆に、ＣＤ１４６ＫＯマウスでは、体重及びＢＵＮ増加は鈍化した。さらに、蛋白尿の上昇は、このマウスでは有意に低くなった。マッソントリクローム染色による組織の病変の定量化は、ＮＴＳ注入がＣＤ１４６ＫＯマウスにおける損傷軽減を誘発することを示した（図２Ｄ）。実際、ＣＤ１４６ＫＯ動物における著しい構造上の保護は、野生動物と比較して、半月体形成及び尿細管拡張が有意な減少をすることにより、立証された（図２Ｅ及び図２Ｆ）。よって、ＣＤ１４６ＫＯ動物は、ＮＴＳ−ＧＮにより誘発される糸球体及び尿細管病変から保護され、これにより、腎臓の機能が保護され、蛋白尿が低減した。
【０１６５】
（ＣＤ１４６ＫＯマウスＮＴＳ注入後炎症及び腎線維症が減少したことを示す）
ｑＰＣＲによる腎臓における炎症マーカーの評価は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡｓの誘発が、ＣＤ１４６ＫＯマウスではＮＴＳ注入後１５日で鈍化することを、示した（図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃ）。よって、Ｆ４／８０免疫染色は、ＣＤ１４６ＫＯマウスの腎皮質におけるマクロファージの浸潤の減少を示した（図３Ｄ及び図３Ｅ）。さらに、この動物は、ＣＤ３細胞浸潤が１５日で低減したことを示している（図３Ｆ及び図３Ｇ）。結果的に、腎線維症は、ＣＤ１４６欠乏マウスで制限された。実際、ＴＧＦ−β及びコラーゲンＩＩＩ等線維症マーカーのｍＲＮＡ発現は、ＣＤ１４６ＫＯマウスにおいて鈍化した（図３Ｈ及び図３Ｉ）。シリウスレッド染色の定量化によって、この動物における腎臓間質性線維症の低減が確認された（図３Ｊ）。全体的にみて、このデータは、ＣＤ１４６の欠如が、ＮＴＳ−ＧＮにおいて腎臓炎症及び腎臓間質性線維症を顕著に制限することを立証した。
【０１６６】
（ＣＤ１４６は、ＮＴＳ−ＧＮが進行する間に糸球体内皮において増加する）
侵襲後損傷を受けた糸球体においてＣＤ１４６を過剰発現する細胞のタイプを特定するために、発明者らは、糸球体成分に適切なマーカーを用いて、ＮＴＳ投与後７日で共局在実験を行った。ＣＤ１４６は、血管叢に基本条件で若干発現した（図１Ａ)。ＮＴＳ−ＧＮの誘発後、ＣＤ１４６の過剰発現は、主に、内皮マーカーＣＤ３１／ＰＥＣＡＭと共存した（図４Ａ）。対照的に、ＣＤ１４６は、ネスチンとの共存はなかったので、ポドサイトには検出されなかった（図４Ｂ）。壁細胞にも、ＣＤ１４６のクローディン１（図４Ｃ）との共存は検出しなかったので、検出されず、また糸球体間質細胞（図４Ｄ）にも検出されなかった。よって、本発明者らのデータは、ＣＤ１４６が、疾患の誘発後主に損傷を受けた糸球体内皮細胞内に高度に過剰発現したことを確認するものであった。
【０１６７】
（ＣＤ１４６内皮特異的欠失がマウスをＮＴＳ−ＧＮから保護する）
内皮ＣＤ１４６がＮＴＳ−ＧＮの進行において過剰発現する影響を推定するために、本発明者らは、ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウス系統を生成した。ＣＤ１４６は、タモキシフェン（ａｔａｍｏｘｉｆｅｎ）−誘導性  ＶＥ−カドヘリン  Ｃｒｅリコンビナーゼを内部に持つマウス（Ｗａｎｇ，Ｙ，２０１０）をＣＤ１４６ｆｌｏｘ―ＺｓＧｒｅｅｎマウスと交配することにより、特に血管内皮において欠失させられた（図５Ａ）。内皮細胞におけるＣＤ１４６欠失の特異性は、免疫蛍光法により、タモキシフェン注入後かつＮＴＳ投与後１５日で実証され（図５Ｂ）、さらにｑＰＣＲにより確認された（図５Ｃ）。ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスはまた、体重、蛋白尿及びＢＵＮの増加が制限されたことを示した（図６Ａ〜図６Ｃ）。この機能的な保護には、半月体の数として（図６Ｅ）腎臓構造の全体的な保存（図６Ｄ）が伴い、尿細管の損傷（図６Ｆ）は、ＮＴＳ−ＧＮ誘発後１５日でそれぞれの対照と比較して劇的に低減した。さらに、Ｆ４／８０免疫染色は、ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスの腎臓における単球の浸潤が低減したことを示した（図７Ａ）。よって、ｑＰＣＲ実験は、ＶＣＡＭ−１及びＭＣＰ１の上方制御が、完全に廃止されたことを示した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。その後、ＴＧＦ−β１及びコラーゲン１ｍＲＮＡの発現増加は、ＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウスにおいて、対照腎臓と比較して鈍化した（図７Ｄ及び図７Ｅ）。このデータは、ＣＤ１４６の内皮過剰発現が、マウスにおいて実験ＧＮの進行を促進することを立証する。
【０１６８】
（ＣＤ１４６転写物の数がヒト糸球体症において増加した）
ＣＤ１４６ｍＲＮＡ発現を、糖尿病性腎症（ＤＮ、ｎ＝７）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＤ、ｎ＝５）、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡ、ｎ＝２７）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ、ｎ＝１０）、膜性腎症（（ＭＧＮ、ｎ＝２１）、ループス腎炎（ＳＬＥ、ｎ＝３２）及び急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ、ｎ＝２３）に罹患した患者の腎臓生検から顕微解剖された糸球体において解析した。対照生検（ｎ＝６）と比較して、損傷を受けた糸球体は、ＣＤ１４６転写物の転写の明白な上方制御を示した（図８）。
【０１６９】
［考察］
種々の慢性炎症性疾患は、内皮間機能及び接合部の統合性の崩壊と関連付けられる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  ＲＰ，１９９０）。内皮接合部の組織化における欠損は、慢性腎臓疾患の進行中にも起こる。実際、いくつかの病因の腎症の患者からの生検において、発明者らは、内皮膜型ＣＤ１４６の高発現が、管内増殖、蛋白尿及び炎症と関連付けられていることを、これまでに報告してきた（Ｄａｎｉｅｌ  Ｌ，２００５）。さらに、ＣＤ１４６レベルの増加は、慢性腎不全進行中の腎臓の形態計測の変化と一致し、ＣＤ１４６により支持された接合部の機能が、この病理学的設定において変化する場合があることを示唆した。しかしながら、この過剰発現の病理学的な有意性は、不明瞭なままである。興味深いのは、本明細書に記述の実験において、ＣＤ１４６の発現が増加することは、その欠失が腎臓を免疫攻撃から保護し深刻な腎機能障害を妨げることから、腎臓疾患を促進するように見えることである。発明者らは、ＣＤ１４６が、糸球体腎炎の開始及び進行に対する新規の治療標的となることを立証した。
【０１７０】
本実験において、ＣＤ１４６は、腎臓微小循環、主に損傷した糸球体内において、疾患の初期段階から過剰発現する。ＣＤ１４６はまた、近位の細管内において後の時点で過剰発現することも分かった（図１Ａ）。発明者らの実験モデルでは、疾患の開始時点は、糸球体区画であり、ＣＤ１４６の過剰発現が、腎不全、蛋白尿及び体重増加を伴う糸球体及び尿細管間質の炎症の発現を促進した。ＣＤ１４６ＫＯマウスは、この変化から保護された。ＣＤ１４６は、マウスにおいて骨髄系細胞に発現することが報告された（Ｄｅｓｐｏｉｘ，Ｎ，２００８）。染色実験が、ＣＤ１４６が主に損傷した内皮に過剰発現することを示したので、発明者らは、内皮ＣＤ１４６の、ＮＴＳ−ＧＮ内における特定の役割を識別するために、ＣＤ１４６特異的内皮ＫＯを生成した。これにより、糸球体損傷のみならず間質性炎症も制御することにおける内皮細胞の主な役割が、明らかに立証される。この結果は、内皮ＣＤ１４６が、インビトロの単球経内皮泳動の制御に関係していることを立証する発明者らのこれまでの研究と一致している（Ｂａｒｄｉｎ，Ｎ，２００９）。実際、腫瘍壊死因子−αの刺激で、ＣＤ１４６の発現が、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の細胞接合部及び頂端膜両方で増加し、さらに内皮単層からの単球の遊出に寄与した。同様の結果が、さらに最近、多発性硬化症のマウスモデルにおいて報告され、同モデルでは、標的内皮ＣＤ１４６が、神経炎症を、リンパ球の血管外遊走を血液脳関門において制限することにより、低減させた（Ｄｕａｎ，Ｈ．；２０１３）。
【０１７１】
別の興味深い知見は、腎線維症がＣＤ１４６ＫＯ及びＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウス両方で鈍化したことである。この観察が、ヒトではまれな疾患である半月体ＧＮモデルにおいて報告されていても、腎線維症がすべての腎疾患の共通の進展変化の産物であることから、これが、特定の関心事であり、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の進行を高程度予測するものである（Ｒｏｃｋｅｙ，Ｄ．Ｃ  ２０１５）。発明者らは、内皮ＣＤ１４６が、内皮細胞の活性化に応答して、線維化過程の制御において重要な役割を果たすと考えている。内皮から中胚葉移行（Ｅｎｄｏ−ＭＴ）が、マウスの実験腎症の各種モデルにおいて、線維症の腎臓において活性化した線維芽細胞及び筋線維芽細胞の蓄積に寄与するよう提案されてきた（Ｚｅｉｓｂｅｒｇ，Ｅ．Ｍ．，２００８）。このことから、ＣＤ１４６の発現が低下するとＥｎｄｏ−ＭＴが低減することで、線維症の低減は部分的に説明がつく。しかしながら、さらに最近の研究では、腎線維症の発生に対するＥｎｄｏ−ＭＴプログラムの貢献度は中程度であることが立証された（ＬｅＢｌｅｕ，Ｖ．Ｓ．，２０１３）。別の仮説としては、ＣＤ１４６の役割が、他の組織における上皮から中胚葉への移行現象で説明されてきたように、転移の主要イベントである、細胞活性化を誘発する役割を果たしている可能性がある（Ｚｅｎｇ，Ｑ．，２０１２，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．Ｋ２０１７）。発明者らは、活性化された内皮細胞により放出された可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）が、線維芽細胞の増殖及び筋線維芽細胞表現型への移行を刺激して、腎臓細胞外基質の沈着及び線維症に至ると考えている。ＧＮは、世界的に、末期の腎臓疾患（ＥＳＲＤ）第２の最も頻度の高い原因として認識されている（Ｃｈａｄｂａｎ，Ｓ．Ｊ．，２００５）。積極的な免疫抑制治療法にも拘わらず、急速進行性腎炎は、ＣＫＤ及び頻繁にＥＳＲＤを伴う不可逆性の腎臓損傷に至る場合がある。糸球体損傷、尿細管間質性炎症及びＧＮにおける線維症を抑えるための治療標的の必要性を考えて、発明者らは、腎臓炎症性損傷におけるＣＤ１４６の役割を精査するために、ヒト糸球体症を伴ういくつかの特徴を有する強力な実験ツールを使用した。実際、糸球体抗原に対する免疫グロブリンが豊富なヒツジ血清の注入が、免疫系の細胞を腎臓へ浸潤させ、次に、深刻な糸球体損傷及び急速な腎機能欠失が続く（ＬｕｑｕｅＹ．，２０１７；Ｅｌ  Ｍａｃｈｈｏｕｒ  Ｆ．，２０ｌ５；Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ．，２０１４；Ｔｏｕｂａｓ  Ｊ．，２０１１；Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ．，２００９）。これは、マウスが疾患誘発後遅くとも４週で絶命していくので、急速進行性腎疾患のロバストモデルである（Ｋｅｒｒｏｃｈ  Ｍ．，２０１２；Ｋａｖｖａｄａｓ  ２０１７）。よって、このＧＮモデルの利点は、免疫性腎炎を引き起こす病原体のプロセスを短時間で明らかにするために使用可能であって、疾患の重症度を決定する可能性のあるいくつかの要因を特定できることである。これには、遺伝学的な罹患率と臨床治療の両方の展望から、重要な臨床上の意義がある（Ｆｕ  Ｙ，２００７）。実際、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、表面受容体、細胞外基質タンパク質等、いくつかのメディエータが、ＣＫＤにおける炎症反応を媒介する重大な役割を果たすことが示されてきた（Ｔａｎｇ  ＷＷ，１９９４；Ｌｅ  Ｈｉｒ  Ｍ．，１９９８；Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ  Ａ．，１９９８；Ｋｉｔｃｈｉｎｇ  ＡＲ，１９９９；Ｋａｒｋａｒ  ＡＭ，２００１；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．２００５；ＨｅｎｉｑｕｅＣ．，２０１６；Ｐｒａｋｏｕｒａ  Ｎ．，２０１７）。よって、発明者らの研究の主な知見は、ＣＤ１４６欠失が、ＣＤ１４６ＫＯ及びＣＤ１４６−ＥＣ−ｄｅｌマウス両方において疾患の進行が鈍化するので、このＧＮモデルにおいて有利であるということである。ＣＤ１４６に対する特異的阻害剤ツールの治療上の関心は、この接合分子が、別のタイプのＧＮに罹患する患者の生検において糸球体内で、健康な対照と比較すると、過剰発現することにより、強化される（図８）。発明者らの結果は、腎臓の内皮の、糸球体のみならず尿細管まですべての区画に向けて侵襲を制御する主な役割を支持するものである。発明者らは、内皮ＣＤ１４６が、ＧＮの進行において主な役割を果たすこと及びこの接合部分子が急性ＧＮの慢性腎臓病への進行を防止するよい治療戦略となることを立証した。
【０１７２】
発明者らはまた、インビボで、腎臓切片におけるＣＤ１４６の発現を免疫組織化学的検査により、また、ｓＣＤ１４６の分泌物をＵＵＯ（一側性の尿管閉塞）動物の血漿中でＥｌｉｓａ法により、偽手術された動物と比較して、定量化した（図２９）。結果は、ＣＤ１４６が、ＵＵＯを有する腎臓において、対側の腎臓と比較して有意に増加したこと、及びｓＣＤ１４６が、ＵＵＯ動物において、偽手術された動物と比較して有意に増加したことを示す。
【０１７３】
ＵＵＯの作用が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びフィブロネクチン発現に観察された。結果（図３０）は、ＵＵＯが、このようなタンパク質の発現を増加させたことを示す。興味深いことに、ＵＵＯの前又はＵＵＯ後１週間で、抗ｓＣＤ１４６抗体による治療を行うことによって、コラーゲン及びフィブロネクチンの発現が、対照ＩｇＧと比較して、減少し、このことは、抗体治療が、コラーゲン及びフィブロネクチンの沈着を妨げたことを示す。
【０１７４】
ＵＵＯの作用は、ａ−ＳＭＡの発現に観察された。結果（図３１）は、ＵＵＯが、ａ−ＳＭＡの発現を増加させたことを示す。興味深いことに、ＵＵＯの前又はＵＵＯの後１週間で、抗ｓＣＤ１４６抗体による治療を行うことによって、ａ−ＳＭＡの発現が、対照ＩｇＧと比較して、減少し、このことは、抗体治療が、フィブロネクチンの活性化を妨げたことを示す。
【０１７５】
抗ｓＣＤ１４６治療の効果を、（インビトロ）培地のヒト腎臓線維芽細胞中のａ−ＳＭＡ及びビメンチンのｍＲＮＡ発現において観察した。結果（図３２）は、抗ｓＣＤ１４６抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いた治療が、ｓＣＤ１４６が、ｓＣＤ１４６とともに観察されるａ−ＳＭＡ及びビメンチンｍＲＮＡの発現増加を誘発することを、阻害したことを示す。
【０１７６】
実施例２−心臓線維症の確立は心筋梗塞モデルにおけるＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの発現増加と関連づけられる
発明者らは、動物においてインビボで、心臓線維症の確立が、心筋梗塞モデルにおけるＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの発現増加と関連づけられることを示した。発明者らはまた、インビトロで、ＣＤ１４６ｓが、心臓線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を、ＴＧＦ−βのそれと同等の作用を伴って誘発したことを示す。したがって、ＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓは、心臓線維症を制限しかつ／又は元に戻すプロセスを目的とした新規の治療ターゲットとなる。
【０１７７】
［材料及び方法］
I  インビボ検査
ＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの役割を、心臓線維症の２つのマウスモデルを使って調べた。
−心筋梗塞により誘発される心臓線維症の第１のモデル
−高齢の動物における慢性心臓線維症の第２のモデル
【０１７８】
ａ）心筋梗塞により誘発される心臓線維症モデル
この第１のモデルは、Ｆｒａｎｃｅｓｃａ  Ｒｏｃｈａｉｓ博士（ＣＲ、フランス国立保健医学研究所、ＵＭＲ  Ｓ  ９１０）のチームとの協力で確立された。マウスに、ケタミン、キシラジン及びアトロピンの混合物の腹腔内注入により、麻酔を行う。それから、動物に、挿管し、人工呼吸下に置く。動物の胸部を切開し、心膜を開いて、左下行冠動脈を永久結紮する。心虚血を、左心室心尖部を結紮ポイントの下で漂白することにより視覚化する。動物の心膜を閉じて、動物を回復用ケージの中に配置する。心筋梗塞を有する動物の生存率は、平均して５０％である。
【０１７９】
すべての処置を、２グループに分けた１２週齢のＣ５７ＢＬ６雌に行う。
・Ｃ５７ＢＬ６−Ｓｈａｍマウス（ｎ＝３）：動物に、冠動脈を結紮することなく、開胸術を受ける前に麻酔をかけ、挿管する。
・Ｃ５７ＢＬ６＋ＭＩマウス（ｎ＝３）：動物に、心筋梗塞を含めるための完全な外科処置を施す。
【０１８０】
すべてのマウス（ＳＨＡＭ及びＭＩ）を２１日後に絶命させた。動物に、イソフルランで麻酔をかけ、体重を測り、心臓内の血液サンプルを、頚部転位により絶命させる前に引き出す。動物の心臓及び脛骨を取り除く。
【０１８１】
ｂ）慢性心臓線維症老化モデル
実験は、ＣＤ１４６を発現するＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）と比較してＣＤ１４６を発現しない、２４月齢雌の遺伝子導入Ｃ５７Ｂ１／６マウス（ＣＤ１４６−ＫＯ；ｎ＝５）に対して行う。絶命させた後、それぞれの動物の心臓を取り出す。心臓は、組織学的（ｎ＝３）及び免疫組織化学的解析のために調製するか又はＲＮＡ又はタンパク質抽出（ｎ＝１）を行うために、８０℃で急冷する。
【０１８２】
ｃ）心臓機能の検査
動物の心臓機能は、ＣＥＲＩＭＥＤで行われるドップラー心エコー（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓＶｅｖｏ２１００，５５０Ｄ  ｐｒｏｂｅ）を用いて評価する。測定は、Ｍモードで取り込んだ画像から、連続して長手方向（長軸線）、それから横断方向（短軸線）に行った。以下のパラメータ、拡張期容積、収縮期容積を、収縮期駆出画分を計算するため測定する。
【０１８３】
ｄ）組織学的検査及び免疫組織化学的検査
組織調製：採取した心臓を、低温のＰＢＳ溶液でリンスし、液体窒素でまず冷却されたイソペンタンでクライオ固定し、−８０℃で保管する。連続７μｍ厚さの切片を、４つの心室を組織学的切片において視覚化されるように、クライオスタットを用いて心臓の水平面で切る。
【０１８４】
シリウスレッド染色：切片を３分間ホルムアルデヒドで固定し（リン酸緩衝液で４％希釈、ｐＨ７．４）、シリウスレッドで染色する。切片をシリウスレッドで１時間浸漬した後、酢酸溶液（二重蒸留水に０．５％）で染色を分化させ、アルコールバスで脱水し、キシレンでクリアし、樹脂製の封入剤（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）で封入する。スライドをＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−４０顕微鏡で観察し、写真をＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ−２１カメラで撮影する。
【０１８５】
定量化を、ｌｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行う。血管構造を除去した後、コラーゲンが占めていた領域の画分（％）を、レッドに染色されたコラーゲンが占めていた領域を総組織領域と関連づけることにより、表す。
【０１８６】
全部で、３切片をそれぞれの動物について染色し（グループごとに４動物）、それぞれの動物の左心室のみ４視野（×２０）撮影したものを定量化する。
【０１８７】
（小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）を使用した心筋の細胞サイズの決定）
再水和後、組織切片を、４５分間、ＷＧＡ及びＤＡＰ１（１／５０００）を含む溶液中でインキュベートし、水性媒体中に封入する前にリンスする。スライドを蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で読み取る。撮影した画像を、ｌｍａｇｅＪソフトウェアを使用して解析する。３つの切片を、それぞれの動物（グループごとに３動物）について染色し、それぞれの動物の左心室のみ４視野（×２０）撮影したものを定量化する。細胞の領域は、核が中央に配置された細胞のサイズを測定することにより決定する。
【０１８８】
（免疫組織学）
切片を、解凍してから、１０分間冷却したアセトン中で固定する。一次抗体がマウス以外の種において生成された抗体である切片に対して、従来の免疫組織化学的な検査方法を用いた。それは、いくつかのステップからなる。
−内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックするステップ。切片を、メタノールで希釈した０．６％Ｈ２Ｏ２に１５分間インキュベートする。
−切片を、（５％ＰＢＳで）二次抗体を生成した種からの通常の血清とともに室温で２０分間インキュベートすることにある非特異的染色をブロックするステップ。
【０１８９】
切片を、一次抗体を含む溶液で、表２に特定した希釈及びインキュベーション時間、インキュベートする。
【０１９０】
【表２】
2022502410.tif 000003
【０１９１】
次に、切片を二次抗体溶液中でインキュベートする。すべての操作で、ビオチン化した抗体を使用する（表３）。
【０１９２】
【表３】
2022502410.tif 000004
【０１９３】
切片を、３０分間、事前調製したアビジン−ビオチン複合体を含む溶液（ベクター）と接触させて配置する。ペルオキシダーゼの検出を、ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）を用いて実行する。切片をヘマラム（Ｍａｙｅｒ）で対比染色してから、脱水し、封入する（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）。
【０１９４】
一次抗体がマウスに産生された抗体である切片に関して、市販のキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍ．）を使用して、マウスＩｇＧを、マウス組織においてマウスに産生された抗体の使用に関連したバックグラウンドノイズを低減させるために中和する。
【０１９５】
ｅ）分子生物学的解析
心臓を、氷の上に配置してから、心室腔に形成された凝血塊を除去するために開く。
【０１９６】
（組織のＲＮＡ抽出）
得られた基本組織（１００ｍｇ）を、ＱＩＡｚｏｌ  １ｍＬで吸収してから、３０秒間ポリトロンを用いて氷の上でホモジナイズする。クロロホルム２００μＬ容量をホモジネートに追加して、勢いよく振り、サンプルを１２０００ｇ１５分間遠心分離させる。上清を集め、ＲＮＡを、イソプロパノール５００μＬを追加することにより、沈殿させる。ＲＮＡを、４℃、１２０００ｇで、１０分間、遠心分離によりペレット化する。得られたＲＮＡペレットを、７５％エタノールを用いて洗浄してから、ＲＮＡ分解酵素なしの水２００μＬで吸収する。ＲＮＡの量を、２６０ｎｍで、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して測定する。
【０１９７】
（逆転写）
逆転写を、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、デオキシヌクレオチド三リン酸、オリゴ（ｄＴ）、ランダムプライマー及びＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を含む混合物が添加されるＨ２Ｏ １０μＬで吸収されたＲＮＡ５００ｎｇから、行う。
【０１９８】
混合物を、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔデバイス内で１０分間２５℃でインキュベートしてから、１２０分３７℃でインキュベートする。最終的に、反応は５分間８５℃で不活性となる。得られたｃＤＮＡは、すぐに−８０℃で凍結させる。
【０１９９】
（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ））
ＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行う。そのために、ｃＤＮＡ１０ｎｇを、対象の遺伝子を標的とする２５０ｎＭの左右プライマーと（表４）、Ｔａｑポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含む緩衝液１２．５μＬとを含む混合物に添加する。
【０２００】
【表４】
2022502410.tif 000005
【０２０１】
増幅を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）において行う。サンプルに、それぞれ、９５℃で５分間（変性）、９５℃で１０秒間（プライマーハイブリダイゼーション）、６０℃で３０秒間（重合）からなるサイクルに４０回かける。それぞれのサイクルの結果として蛍光を読み取る。Ｃｔ値を判定した後、研究中の遺伝子のそれぞれの相対的発現を決定する。
【０２０２】
ＩＩ．インビトロ検査
（心臓線維芽細胞のメンテナンス及び刺激）
ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｐａｃｋ  （ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）内で、雰囲気を制御して３７℃の環境で、増殖させる。ＨＣＦを、３〜７継代増殖させる。
【０２０３】
刺激をかけるために、線維芽細胞を３００００細胞／ｃｍ２の密度で完全培地に播種する。接着２４時間後、細胞培地を、増殖因子を含まない培地（最少培地）と４時間の間に交換する。
【０２０４】
次いで、この培地を、増殖研究のために、ＣＤ１４６ｓを２５、５０、７５又は１００ｎｇ／ｍＬ補充した又はＴＧＦ−βを２．５、５又は１０ｎｇ／ｍＬ補充した最少培地と交換する。
【０２０５】
（細胞増殖）
細胞増殖を、増殖キット（ＢｒｄＵ  Ａｓｓａｙ，  Ｒｏｃｈｅ）を使用して決定する。希釈溶液で１／１００希釈された抗ＢｒｄＵ抗体を、９０分間３７℃でインキュベートする。過剰な抗体を除去しリンスした後、抗ＢｒｄＵに特異的でペルオキシダーゼに結合した二次抗体を、３０分間室温でインキュベートしてから、除去する。検出を、酵素基質１００μＬを添加することにより行う。反応は、０．１ＭのＨ２ＳＯ４溶液５０μＬを添加することにより、停止する。染色強度、ＢｒｄＵ取り込みの割合を、４５０ｎｍで分光光度計において読み取る。結果を、細胞は含まないがＢｒｄＵを同量入れられた培養ウェルに観察されたバックグラウンドノイズを減算することにより、計算する。次いで、増殖の百分率をそれぞれの条件について計算する。それぞれの実験について、条件ごとに６ウェルについて得られた結果を平均化する。
【０２０６】
（ＲＮＡ発現）
総ｍＲＮＡを、精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ，  Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出してから、ＲＮａｓｅフリーの水３０μＬに溶出させる。ＲＮＡの量を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して、２６０ｎｍで測定する。ＲＮＡを、ＲＮＡ２００ｎｇを使用して、組織ＲＮＡと同一のプロトコルに従ってｃＤＮＡに変換する。遺伝子発現研究を、リアルタイムＰＣＲにより、ｃＤＮＡ１０ｎｇから行う（表４）。
【０２０７】
（タンパク質発現）
細胞を、４℃で、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  ＮＰ４０からなりプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、溶解する。得られた細胞可溶化物を、４℃で１５０００ｇを１０分間遠心分離させる。可溶化タンパク質を含む上清を集め、タンパク質の量を、サンプル調製中に使用した溶解緩衝液に希釈した１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液から調製したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の検量線を使用して、決定する。
【０２０８】
評価対象のサンプルと標準物質（２５μＬ）は、９６ウェルプレートに沈着させ、ＢＣＡ試薬２００μＬ（ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ）を添加する。吸収度を、５５０ｎｍで読み取り、対象のサンプルのタンパク質濃度を較正標準を使用して決定する。
【０２０９】
次いで、サンプルをウェスタンブロット実験において使用する。そのために、タンパク質３０μｇを含む一定分量を、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む４×Ｌａｅｍｍｌｉバッファで吸収してから、電気泳動ゲル剤（ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に沈着させる前に７５℃で１０分間加熱する。サンプルの泳動後に、タンパク質を、ニトロセルロースメンブレン（ｉＢｌｏｔ  ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にドライ式移行させる。メンブレンを４５分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）及び４％ＢＳＡを含むＴｒｉｓバッファを用いてブロッキングする。ＴＢＳ−Ｔで希釈された一次抗体（表５）を、４℃で１２時間ハイブリダイズしてから、３×１０分間ＴＢＳ−Ｔを用いてリンスする。ＨＲＰ結合二次抗体（ＴＢＳ−Ｔ）を１時間ハイブリダイズする。リンス後、ＨＲＰ活性を、化学発光基質（ＥＣＬ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出する。実験条件により発現に変化が及ばない標準化タンパク質（β−チューブリン）向けの抗体によって、定量を標準化してから、結果を半定量的に表すことができる（％対照）。放射光をカメラ（Ｇ：ＢＯＸ）で捕捉する。対象のタンパク質を、黒色のバンドとして白色の背景上に可視化する。こうして得られたシグナルを、デンシトメトリー（Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）により定量化する（表５）。
【０２１０】
【表５】
2022502410.tif 000006
【０２１１】
（免疫蛍光法）
細胞を、５分間、７０℃のエタノール中に４℃で固定してから、ＰＢＳでリンスする。５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液中でブロッキングして１時間後、１／５０希釈した一次抗体（抗α−ＳＭＡ、Ｄａｋｏ−０８５１）と、蛍光分子（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８）と結合された二次抗体（抗マウス抗体）とを、１．５時間インキュベートする。ＰＢＳによるリンスをそれぞれのステップの間に行う。細胞を、蛍光顕微鏡下で観察する前に、核染色を含む水性培地（ＰｒｏＬｏｎｇＭｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に封入する。
【０２１２】
［結果］
Ｉ．心臓線維症の２つのモデルにおけるＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓ発現の研究
本研究の第１の部分の目的は、心臓線維症の間のＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの発現を調査することであった。そのために、発明者らは、心筋梗塞により誘発された心臓線維症のモデルと、加齢動物に観察された慢性心臓線維症のモデルとに依拠した。
【０２１３】
ａ）心筋梗塞により誘発される心臓線維症
（心臓線維症の発現）
シリウスレッド染色（図１３Ｂ）が、動物の左心室周縁に位置する線維症ゾーンを明らかにしている。梗塞ゾーンに位置するこのコラーゲン沈着の最も高密度ゾーン（線維状ゾーン又は線維化ゾーン）は、心筋細胞をもはや含んでいない。この線維状ゾーンの周囲において、この沈着は、間質性であり、ＭＩ動物の左心室内の心筋細胞の間の境界ゾーン又は領域（「ＢＺ」又は「ＢＡ」）へ徐々に延びる。
【０２１４】
（ＣＤ１４６をコードするｍＲＮＡの発現）
ＣＤ１４６ＲＮＡ発現の解析（図１３Ｃ）を、ＲＴ−ＰＣＲにより、梗塞／線維化ゾーン（「ＩＺ」又は「ＦＺ」）の顕微解剖された組織から、このゾーンのすぐ近位（「ＢＺ」）、それから、このゾーンの遠位／遠隔（「ＤＺ」又は「ＲＺ」）へ行う。得られた結果を、ＳＨＡＭ動物の左心室から抽出したＲＮＡを用いて得られたものと比較する。結果は、全体的に見て、ＣＤ１４６発現が、ＭＩ動物の左心室において、ＳＨＡＭ個体と比較して増加したことを示している。心臓のそれぞれのゾーンの解析は、ＣＤ１４６発現が、特に、３倍、梗塞ゾーン（ＢＺ）のすぐ近位に位置する組織ゾーンにおいて、有意に増加したことを示す。
【０２１５】
（ＣＤ１４６の免疫検出）
ＳＨＡＭマウスにおいて、ＣＤ１４６の染色は、均等であり、心筋細胞の周縁に集中している（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。ＭＩマウスにおいて、ＣＤ１４６の発現は、線維症ゾーン内では少なく、このゾーンに存在する脈管構造となお関連づけられている（図１４、「ＩＡ」）。逆に、ＣＤ１４６の発現は、線維化領域（「ＦＡ」又は「ＢＡ」）の周りで非常に多い（図１４、「ＢＡ」）。この線維化周囲の染色は、組織スケールで観察されるもので、境界ゾーンでは染色が増大するとともに遠隔領域（「ＤＺ」又は「ＲＡ」）では顕著に減少して、ＣＤ１４６の発現に勾配が存在することを明らかにしている（図１４、「ＩＭ」）。高拡大率の観察は、線維症ゾーンの周縁では、ＣＤ１４６の発現が、心筋細胞の細胞質内に位置し（図１４、「ＢＡ」又は「ＢＺ」）、この心筋細胞の周縁に位置する細胞において実質的に増加することを示す。
【０２１６】
（ＣＤ１４６の血清アッセイ）
ＣＤ１４６の第１の血清アッセイ（図１４Ｂ）を、ＳＨＡＭマウス及びＭＩマウス（ｎ＝２）への心臓穿刺により得た血液サンプルから行った。得られた予備的結果は、可溶型ＣＤ１４６が、ＭＩ−誘発心臓線維症の動物において増加したことを示す。このような第１の結果は、動物の新しいコホートではまだ確認されていない。
【０２１７】
ｂ）心臓線維症老化モデル
（線維症の発現）
シリウスレッド染色（図１５、ｅ）は、高齢（２４月齢）マウスの心臓由来の切片の染色が、若齢マウス（３月齢）と比較して顕著に増加したことを示す。動物の老化には、脈管周囲及び間質内へのコラーゲンの沈着増加が伴う。
【０２１８】
（ＣＤ１４６の免疫検出）
加齢関連（２４月齢）心臓線維症モデルでは、ＣＤ１４６の発現（図１５、ｆ）は、１２週齢のＳＨＡＭ動物に対して、均質であり増加する。このＣＤ１４６の増加は、心筋細胞内とその周縁に位置する細胞内とにある。
【０２１９】
ＩＩ．心臓線維症発現におけるＣＤ１４６の役割
研究所において作製されたＣＤ１４６を発現しない動物（ＣＤ１４６−ＫＯ）を使用して、老化を通じた心臓線維症の発現におけるＣＤ１４６の役割を示す。この研究を、２年齢の雌のＣＤ１４６ＫＯ動物（ｎ＝４）と比較して、ＷＴ動物の群（ｎ＝４）に対して行った。
【０２２０】
（心臓線維症）
ＷＴ動物では、シリウスレッド染色によって、コラーゲンが心筋細胞の間へ蓄積して相互の隔離を起こすことが明らかである（図１６Ａ、ａ）。ＣＤ１４６ＫＯ動物からの組織学的切片の観察によって、コラーゲン沈着がずっと少なくなり、心筋細胞の個別化が存在しない結果となることが、明らかである（図１６Ａ、ｂ）。シリウスレッドの定量化（図１６Ａ、ｃ）は、ＣＤ１４６ＫＯ動物におけるコラーゲン沈着が、ＷＴ動物と比較しておよそ５０％減少することを確認するものである。この結果は、それぞれの実験群からの動物の心臓から、タイプＩのコラーゲンＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ解析することにより確認されている。
【０２２１】
（心筋細胞の大きさ）
ＷＧＡ染色（図１６Ｂ）によって、特に細胞膜を染色してから、組織内における細胞の大きさを決定することができる。発明者らの結果は、ＷＴ動物の左心室に位置する心筋細胞の方が、ＣＤ１４６ＫＯ動物のものより大きいことを示している（図１６Ｂ、ａ）。この観察はまた、染色された細胞の領域を定量化することにより確認されている（図１６Ｂ、ｂ）。したがって、ＷＴマウスでは、心筋細胞領域は、ＣＤ１４６ＫＯマウスにおいて定量化された領域の約２倍であり、この動物における心筋細胞肥大の顕著な低減を反映している。
【０２２２】
ＩＩＩ．筋線維芽細胞のフェノタイプの獲得におけるＣＤ１４６の役割
ＭＩ動物におけるＣＤ１４６ｓの増加と、ＣＤ１４６の欠如に関連付けられる心臓線維症における低減との観察によって、本発明者らは、ＣＤ１４６ｓの役割が、筋線維芽細胞に常在する心臓細胞（ｍｙｏＦＢ）の動員／分化にあると仮定することになった。発明者らは、よって、心臓線維芽細胞のｍｙｏＦＢへの分化の際のＣＤ１４６ｓの効果を試験した。
【０２２３】
そのために、発明者らは、ｍｙｏＦＢフェノタイプ（増殖、α−ＳＭＡの発現及び線維化マトリックスタンパク質）と関連付けられる発現マーカーに対するＣＤ１４６の効果を調査した。このすべての実験を、コントロールＴＧＦ−βとして、線維芽細胞をｍｙｏＦＢ内へ活性化させる既知の誘導因子を使用して行った。
【０２２４】
ａ）心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）の細胞増殖におけるＣＤ１４６ｓの効果
ＣＤ１４６の量が増加する効果を、心臓線維芽細胞の増殖において試験した（図１７Ａ）。得られた結果は、有意な、細胞増殖の用量依存的な増加を示す。ＣＤ１４６の最大の増殖促進効果が、ＣＤ１４６ｓ  ５０ｎｇ／ｍＬについて得られた。この量をその後の実験に対して用いた。このＣＤ１４６が誘発する増殖の増加は、細胞を、ＴＧＦ−β  ５ｎｇ／ｍＬにより刺激したときに観察したものと同等である。
【０２２５】
ｂ）ａ−ＳＭＡ発現におけるＣＤ１４６ｓの効果
α−ＳＭＡ発現の調節を、ＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍＬによりＨＣＦを４８時間刺激したことに応答して、調べた。
【０２２６】
ＲＮＡ発現レベルの半定量的解析は、ＣＤ１４６ｓが、α−ＳＭＡの有意な（ｎ＝４）２．５倍の過剰発現を誘発することを、示し、この細胞をＴＧＦ−β  ５ｎｇ／ｍＬにより刺激したときに観察された誘発に匹敵する（図１７Ｂ）。結果は、ウェスタンブロットにより行ったα−ＳＭＡタンパク質発現解析と相関する。よって、ＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍＬはまた、α−ＳＭＡタンパク質発現レベルの２．５倍の増加を誘発する（図１７Ｃ）。
【０２２７】
α−ＳＭＡ向けの抗体を使用して行った間接的免疫蛍光法は、ＣＤ１４６  ５０ｎｇ／ｍＬにより誘発されてα−ＳＭＡ発現がこのように増加することが、平滑筋のアクチンネットワークが確立されることと関連付けられ、平滑筋のアクチンネットワークは、ＨＣＦの細胞質に浸潤し、その組織化は、ＴＧＦ−βによる刺激に応答して観察されるα−ＳＭＡネットワークのものに匹敵することを、示す。
【０２２８】
ｃ）基質タンパク質の発現におけるＣＤ１４６ｓの効果
ｍｙｏＦＢにより発現する基質タンパク質の２つをコードするＲＮＡの発現の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＣＤ１４６ｓが、フィブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの合成において（図１７Ｅ）、ＴＧＦ−βによる刺激への応答において観察されるものと同等の増加を誘発することを、示す。
【０２２９】
ｄ）ＴＧＦ−βの発現におけるＣＤ１４６ｓの効果
ＣＤ１４６ｓによるＨＣＦの刺激に応答して筋線維芽細胞のフェノタイプと関連付けられるマーカーの発現増加（図１７Ｆ）は、この効果がＴＧＦ−β発現の誘発の結果である可能性を、示唆している。本発明者らは、よって、この効果に必要な機構に関する研究を、ＣＤ１４６発現におけるＴＧＦ−βの効果を研究することにより、開始した。第１の結果（ｎ＝２）は、ＣＤ１４６ｓ  ５０ｎｇ／ｍＬが、ＣＤ１４６発現における２倍の増加を誘発することを示す。
【０２３０】
［考察］
心臓線維症は、心筋梗塞等又は老化を通じた特定の形態の心疾患に応答して自然に発現する創傷治癒プロセスである。現時点では、心臓線維症に対する有効な治療が不十分であり、このため、この目的が主な公衆衛生上の課題となっている。発明者らは、心臓線維症の発現におけるＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの役割を、その使用を治療ターゲットとして検討するために、研究した。発明者らは、（心筋梗塞及び老化）２つのマウスモデルではインビボで、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）ではインビトロで、ＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓが実際心臓線維症の発現に影響することを、示すことができた。
【０２３１】
発明者らの結果は、ＭＩ及び高齢の動物では、心臓線維症がＣＤ１４６の過剰発現と関連付けられることを、示す。ＭＩ動物では、心臓線維症は、心尖部に位置し左心室へ広がっているが、ＣＤ１４６の過剰発現が、梗塞ゾーンではなく、このゾーンから距離とともに減少していく発現勾配を有する近位ゾーンに起こることを伴う。組織のＣＤ１４６のこの過剰発現には、ＣＤ１４６ｓの分泌物における増加を伴う。ＣＤ１４６ｓが、本質的に、膜型ＣＤ１４６を劈開する機構により生成されること（Ｂａｒｄｉｎ他，２００３）が知られており、これによって、この２つの型において同時に増加することの説明がつく。
【０２３２】
さらに、発明者らは、心臓線維症の発現もまた、ＣＤ１４６の過剰発現と関連付けられることを、老化モデルにおいて観察することができた。実際に、その結果は、２４月齢マウスにおいて間質内のコラーゲン沈着の増加を示し、このことは、左心室にわたるＣＤ１４６発現の均質な増加と相関する。ＣＤ１４６−ＫＯ動物をこのモデルに使用することは、このような結果を、間質内のコラーゲン沈着が減少することを示すことにより、確認するものである。その上、ＣＤ１４６−ＫＯ動物では、ＳＨＡＭマウスに見られる心筋細胞肥大が、顕著に減少している。老化モデルでは、発明者らは、慢性心臓線維症の出現の際のＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの活動を確認している。
【０２３３】
心臓線維症は、確立されるのに時間を要するプロセスである。実際、修復性線維症（ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、一連の３つの相互依存的な段階、炎症段階、次に増殖段階、最後に成熟化段階で起こる。発明者らの結果は、ＣＤ１４６ｓが、細胞がｓＣＤ１４６で刺激されると細胞増殖が増加して、筋線維芽細胞の分化を誘発することを示す。さらに、この刺激は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化における既知の因子であるＴＧＦ−βによる刺激の間に得られたものと同一である。その上、ＣＤ１４６ｓは、ｍｙｏＦＢを特徴づけるマーカーであるα−ＳＭＡ、フィブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの発現の増加を誘発する。このような過剰発現はまた、ＴＧＦ−βによる刺激後に見受けられるものと同等である。このようなすべての結果は、ＣＤ１４６が、線維芽細胞のｍｙｏＦＢへの分化に関与していることを示す。
【０２３４】
発明者らの予備的結果はまた、ＣＤ１４６ｓが、ＴＧＦ−βを増加させることができることを示し、このことは、この２つの分子間の関係を示唆する。ＣＤ１４６ｓによる刺激後のＴＧＦ−β発現の研究によって、分子の潜在的機構の１つを理解し、ＴＧＦ−β及びＣＤ１４６ｓが相加又は相乗効果を有するか否かを判定することができるだろう。
【０２３５】
筋線維芽細胞を生じさせる他のプロセス、特に、内皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）プロセスによる内皮細胞の間葉細胞内への分化が、存在する。インビトロでの将来の研究は、よって、この細胞プロセスにおけるＣＤ１４６の効果を、内皮マーカー（ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ等）発現を間葉系マーカー（α−ＳＭＡ、ビメンチン、フィブロネクチン、タイプＩコラーゲン等）と比較して解析することにより、研究することになる。
【０２３６】
現時点で、心臓線維症を制御するための有効な治療は、不十分である。発明者らは、本明細書に、ＣＤ１４６／ＣＤ１４６ｓの活動が、その治療の標的となることを示している。可溶型ＣＤ１４６に特異的な抗体が、発明者らにより生成された。この抗体は、ブロッキング効果を有し、すなわちＣＤ１４６ｓの効果を抑制することができる。
【０２３７】
実施例３−可溶型ＣＤ１４６の各種血管形成促進バリアントが、シェディング及び代替スプライシングによって、内皮細胞により分泌される：線維症における特性及び関与
可溶型ＣＤ１４６は、生理機能及び病態に関与し、特に血管形成を制御するように、主な分子を構成する。したがって、発明者らは、１／ｓＣＤ１４６を内皮細胞内に生成する長いＣＤ１４６アイソフォーム及び短いＣＤ１４６アイソフォームのシェディング機構、２／ｓＣＤ１４６によるスプライスバリアントの潜在的存在、３／それらのそれぞれの機能、特に、血管形成及び線維症の制御及び４／全身性硬化症におけるそれらの関与を調査した。
【０２３８】
［方法］
（細胞）
内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）を、既述のように内皮ＥＧＭ−２  ＭＶ培地で培養した（Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｂ他，２００５）。ＨＵＶＥＣを既述のように得て、ＥＧＭ２培地で培養した（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）。ＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）を１３日から隔離した。ＣＤ１４６ＫＯ又はＷＴマウスからの胚を既述のように隔離し培養した（Ｘｕ  Ｊ．，２００５）。
【０２３９】
（細胞増殖アッセイ）
実験を既述のように行った（Ｓｔａｌｉｎ他，２０１３）。
【０２４０】
（回転楕円体における内皮細胞管形成）
回転楕円体実験の形成を既述のように行った（Ｋｏｒｆｆ  Ｔ．他，２００１）。
【０２４１】
（共免疫沈降実験）
実験を既述のように行った（Ｓｔａｌｉｎ他，２０１６）。
【０２４２】
（ｂ−カテニン／ＴＣＦ転写アッセイ）
ルシフェラーゼアッセイを既述のように行った（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）。
【０２４３】
（漿尿膜アッセイ）
ニワトリ胚アッセイ（ＣＡＭ）の漿尿膜を、既述のプロトコルを用いて行った（Ｂｅｃｋｅｒｓ他，１９９７）。
【０２４４】
（脂質ラフト調製）
脂質ラフトを、非イオン性界面活性剤で処理した細胞のショ糖密度勾配遠心分離により、既述のように隔離した（Ｔｅｌｌｉｅｒｅｉ他，２００６）。
【０２４５】
（全身性硬化症の動物モデル及び組織学的解析）
雌のＣＤ１４６ＫＯマウス（１１〜１６週）を、既述のように（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）、皮下ブレオマイシンで治療し、同腹仔のうちの一匹のＷＴマウスと比較した。
【０２４６】
マウス皮膚切片を４％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。皮膚の厚さを、既述のように（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）、Ｍｅｒｚ  ｇｒｉｄを使用した立体解析学的方法を用いて、定量した。
【０２４７】
（ｓｉＲＮＡ実験）
各種アイソフォームのｓＣＤ１４６を発現抑制させるように設計されたｓｉＲＮＡを生成した。コントロールｓｉＲＮＡもそれぞれの実験において使用した。ｓｉＲＮＡを内皮細胞に、製造業者（ＯＺ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が説明するようにＳｉｌｅｎｃｅ  ｍａｇｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎキットを使用して導入した。実験の関数として、タンパク質発現の約８０〜９５％が発現抑制される結果となる。各種ｓｉＲＮＡの配列を表６に示す。
【０２４８】
【表６】
2022502410.tif 000007
【０２４９】
（ＲＮＡ単離、逆転写及びリアルタイムＰＣＲ）
細胞ＲＮＡ全体を細胞から単離し、ｃＤＮＡ内へ逆転写し、結果として得られるｃＤＮＡをｑＰＣＲにかけた。順方向及び逆方向特異的プライマー配列を表７に示す。
【０２５０】
【表７】
2022502410.tif 000008
【０２５１】
（ウェスタンブロット解析）
メンブレンを特異的一次抗体（７Ａ４  １／３０００，アクチン１／５０００，Ｔａｃｅ及びＡＤＡＭ１０  １／１０００，Ｉ１Ｏ−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６  １／２５０）を用いて探索し、次に、二次抗体がペルオキシダーゼに結合する。ブロットが、ＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて現わされた。
【０２５２】
（定量的フローサイトメトリー）
各種アイソフォームのＣＤ１４６のメンブレン発現レベルを、抗体又はアイソタイプが適合したコントロール抗体を蛍光色素（１０μｇ／ｍｌ）に１時間４℃で結合することで、細胞を標識することにより決定した。洗浄後、サンプルをフローサイトメトリー（ＧａｌｌｉｏｓＴＭ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ）により解析した。それから、結果をＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｋａｌｕｚａ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により解析した。
【０２５３】
（プラスミドトランスフェクション実験及びクローン選択）
各種タンパク質をコードするプラスミドを、ＣＨＯ細胞に、Ｆｕｇｅｎキットを使用して製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明通り導入した。それから、安定したクローンをＧｅｎｅｔｉｃｉｎ及びＦＡＣＳを用いて選択し、ウェスタンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、最も高発現のクローンを特定した。
【０２５４】
（組織アレイ）
ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙｓ（ＯｒｉＧｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）を用いて、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６の発現を、４８の各種組織においてスクリーニングし、製造業者の指示に従った。
【０２５５】
（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６を、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＹ−ＱＵＡＮＴ  ｓＣＤｌ４６，Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ））を使用して評価した。プレートに、特異的マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１４６Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで表面を覆った。血清１０μＬを、それぞれのウェルに追加して、３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを５回洗浄し、特異的ＨＲＰ結合モノクローナル抗体（７Ａ４−ＨＲＰ，１ｍｇ／ｍｌ，Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）とともに、特異的希釈剤で１：１０００の希釈をして室温で３０分間インキュベートしてから、５回洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質２００μＬを室温で約２０分間インキュベートした。呈色反応は、その後、酸性溶液１００μＬを添加することにより停止させた。シグナルの強度は、サンプルに最初に含まれるｓＣＤ１４６の濃度と直接関連した。ｓＣＤ１４６のスプライシングされた２つのアイソフォーム（Ｉ５−１３ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６）を検出するため、同一のイムノアッセイを使用した（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ）。プロトコルを、二次抗体（検出抗体）についてのみ、ＨＲＰに結合する抗Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６又は抗Ｉ１０−ｓＣＤ１４６抗体と置き換わるように変更した。
【０２５６】
（内皮透過率の測定）
ＥＣＦＣを、２４−マルチウェル・ダブル・チャンバー・システム（Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）のメンブレンインサート上のウェル（孔１μｍ）ごと６０，０００細胞に、ｓｉＲＮＡトランスフェクションをした後又はせずに、播種した。次に、集密的内皮単層を、２４時間、ＥＧＭ−２培地で各種フォームのｓＣＤ１４６の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＦＩＴＣ−デキストラン（シグマ）を、細胞の頂端膜側において添加し、３７℃で１．５時間遊走可能とした。次に、基底外側のＦＩＴＣ−デキストランを、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定した。
【０２５７】
（免疫蛍光実験）
各種アイソフォームのＣＤ１４６及びＡＤＡＭ１０／Ｔａｃｅの局在を、カバーガラスに播種した細胞において調べた。細胞を、室温で１０分間パラホルムアルデヒドで固定してから、サポニン（０．２％）で透過処理し、それから、室温で３０分間抗ＣＤ１４６抗体（１／１００）及び抗Ｔａｃｅ（１／２００）又は抗ＡＤＡＭ１０（１／１００）抗体とインキュベートした。次に、細胞を、蛍光プローブと関連付けられる二次抗体とインキュベートした。一部の実験では、核をＤＡＰＩで染色した。次に、細胞を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ５１０）で調べた。
【０２５８】
虚血性マウスからの筋肉の切片において、血管形成を、イソレクチンＢ４（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，）（１／１００）で可視化した。組織切片を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ｓｐ５，Ｌｅｉｃａ，Ｎａｎｔｅｒｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により調べた。
【０２５９】
（組織学的解析）
ニワトリ胚アッセイの漿尿膜（ＣＡＭ）を、外科的に取り除き、１０％緩衝ホルムアルデヒドで１０時間固定し、段階的アルコールで脱水し、キシレンで洗浄し、パラフィン包埋した。５μｍ厚さの切片に、ＣＡＭの表面と平行な平面で切り、光学顕微鏡下で観察されるヘマトキシリン・エオシン染色により染色した。
【０２６０】
（マウス後肢虚血の誘発）
雌のマウスに、左大腿動脈全体を完全切除することにより、一側性後肢虚血を引き起こした。外科手術後、動物を、４つの治療群、虚血性内転筋にＰＢＳを２週間に１回２８日間注入した１つの対照群と、その対照群に各種リコンビナントヒト可溶型ＣＤ１４６（ｒｈ−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ１５−１３−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６）２μｇで治療した３つの実験群と、に分けた。
【０２６１】
（レーザードプラ血流解析）
虚血性の後肢血流対正常な後肢血流の比を、レーザードプラ血流解析器を使用して測定した。外科手術後の各種時点（１、３、７、１４、２１及び２８日）において、動物に対して、対象領域（脚及び足）を３回連続レーザー走査した。血流を、虚血性の後肢対正常な後肢の比として表した。
【０２６２】
（血管造影ＣＴ画像の研究）
動物を、ケタミン  キシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ）の混合物（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で深い麻酔にかけ、リピオドール（ｌｉｐｉｏｄｏｌｅ）２ｍｌを心臓内に灌流させた。ＣＴ  ３Ｄ画像を、以下の特徴、７０ｋＶｐエネルギー、露光時間３００ｍｓ及び７２０投影という特徴を有するマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（ｎａｎｏＰＥＴ／ＣＴ，Ｍｅｄｉｓｏ）を用いて得て、定量化した。
【０２６３】
（対象）
マルセイユ（フランス国）の内科に入院中の２４名のＳＳｃ患者からの血清を解析した。すべての患者が、２０１３  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ強皮症分類基準を満たしており、ルロイ他の基準にしたがって下位分類されていた。対照として、発明者らは、２４歳で、性別が一致した血液ドナーの血清を調査した。すべてのサンプルが、倫理的指令に関連して指定されたＢｉｏｂａｎｋ（ＤＣ  ２０１２−１７０４）からのものであり、使用前に−８０℃で保管された。
【０２６４】
（倫理委員会の承認）
動物実験は、ヨーロッパ議会の指令２０１０／６３／ＥＵに従ったものであり、動物実験委員会（エクス＝マルセイユ大学）により承認されている。上述の処置は、委員会承認の動物使用プロトコル（マルセイユ倫理委員会）下及び公認の研究者（Ｂ．Ｇｕｉｌｌｅｔ；ｎ°１３３２８）の監督下で、行われた。
【０２６５】
ヒトサンプルへの実験は、全身性硬化症の患者からの血漿に遡及的に行った。実験は、１９８３年に改訂された１９７５年ヘルシンキ宣言にしたがって行われ、関連機関の審査委員会により承認され、患者のインフォームドコンセントを得ている。Ｂ．Ｇｒａｎｅｌ及びＮ．Ｂａｒｄｉｎが、データを解析し、すべての著者が、一次臨床データを利用した。
【０２６６】
（ペプチド、プラスミド、抗体、阻害剤）
ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６（ｒｈ−ｓＣＤ１４６）に対応するリコンビナントヒト可溶型ＣＤ１４６を、Ｂｉｏｃｙｔｅｘより得た。ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６は、ＨＡペプチドをタグ結合させたタンパク質カラム（Ｔｒｉａｌ  Ｋｉｔ  ３３２０Ａ，ＭＢＬ）において精製により生成したものである。
【０２６７】
Ｔａｃｅをコードするプラスミドは、Ｄｒ  Ｆ．Ｐｅｉｒｅｔｔｉ，ＵＭＲ−Ｓ１０６２，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅからのものである。
【０２６８】
ＡＤＡＭ１０をコードするプラスミドは、Ｄｒ  Ｂ．Ｃｈａｒｒｅａｕ，ＵＭＲ−Ｓ１０６４，Ｎａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅからのものである。Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６に対するポリクローナル抗体は、Ｃｏｖａｌａｂ  ｃｏｍｐａｎｙが、２つのタンパク質［それぞれ、ＮＨ２−Ｃ−ＹＬＤＧＰＬＰＴＰＶＤＮＰＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０１）及びＮＨ２−Ｃ−ＲＤＱＶＴＰＳＧＶＶＦＫＬＦＤＫＫＰ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０２）］の特定の部位に対応するペプチドを注入することにより、生成したものである。ＡＤＡＭ−１７（ａｂ２０５１）、ＡＤＡＭ−１０（ＥＰＲ５６２２）、ＣＤ１４６（クローン７Ａ４）アンダクチン（ａｎｄａｃｔｉｎｅ）に対する抗体は、それぞれ、Ａｂｃａｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｏｃｙｔｅｘ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入したものである。
【０２６９】
ＧＭ６００１は、Ｓｅｌｌｅｃｋ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓからのものである。
【０２７０】
（統計解析）
データは、実験の示した数の平均値±ＳＥＭとして表した。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｌｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。有意差をマン=ホイットニーのＵ検定を用いて決定した。Ｐ値＜０．０５を有意であるとみなす。
【０２７１】
［結果］
（可溶型ＣＤ１４６の各種バリアントを、ＣＤ１４６の膜型アイソフォームのシェディングと、その代わりの内皮細胞におけるスプライシングとにより生成する）
可溶型ＣＤ１４６（ｓＣＤ１４６）の分泌物は、内皮細胞において、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ネトリン、ＴＧＦｂ、Ｗｎｔ５ａとして各種刺激に応答して、増加した（図２１Ａ）。ＴＮＦがより高効果に産生されると、発明者らは、ｓＣＤ１４６分泌物を、対照条件においてかつＴＮＦによる治療後に、解析した。実験を、汎マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤ＧＭ６００１の非存在又は存在状態で、シェディング及びスプライシングフォームの相対的寄与を推定するために、行った。結果は、ｓＣＤ１４６のＧＭ６００１依存部分が、全分泌物の７５％に対応することを示した。したがって、全分泌物の２５％が、ＧＭ６００１抵抗性の分泌物に対応する（図２１Ｂ）。
【０２７２】
発明者らは、同じタイプの実験を、フューリンコンバターゼ阻害剤（ＩＦ）の存在状態で行った。発明者らは、対照及びＴＮＦ条件の両方において、ＩＦが、ｓＣＤ１４６の分泌を阻害したことを観察した。当然ながら、両方の条件において、ＩＦ抵抗性分泌物の画分は同じだった（図２１Ｃ）。
【０２７３】
最後に、発明者らは、各種組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ）を、ｓＣＤ１４６分泌を阻害するために使用した（図２１Ｄ）。結果は、ＴＩＭＰ−１（１μｇ／ｍｌ）が、両方の条件でｓＣＤ１４６の分泌を低減させることができ、ＴＩＭＰ−３（１μｇ／ｍｌ）が、ｓＣＤ１４６分泌を、ＴＮＦで細胞を治療したときのみ、低減させることができることを示し、ＴＩＭＰ−２（１μｇ／ｍｌ）には効果がないことが観察された。
【０２７４】
まとめると、この実験は、１／シェディングの２つの各種機構が、短いｓＣＤ１４６及び長いｓＣＤ１４６から、ｓＣＤ１４６生成するのに関与すること、２／ＧＭ６００１に抵抗性のｓＣＤ１４６の分泌物の残りの画分（約２５％）が、ｓＣＤ１４６のバリアントの生成が一次転写物の選択的スプライシングにより発生することから、別の機構に依存し得ることを、示す。
【０２７５】
（長いＣＤ１４６アイソフォームは、可溶型ＣＤ１４６を、ＡＤＡＭ−１０依存性シェディングにより内皮細胞に生成する）
発明者らは、対照条件において、内皮細胞内のｓＣＤ１４６分泌における長い（ｌｇＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡ）及び短い（ｓｈＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡ）ＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡの影響を解析した。発明者らは、ｌｇＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡがｓＣＤ１４６分泌を約７５％低減させる一方で、ｓｈＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡに効果がないことを、観察した（図２２Ａ）。このことは、対照条件では、長いＣＤ１４６アイソフォームのみが、シェディングプロセスによりｓＣＤ１４６分泌に関与することを示す。対照条件においてｓＣＤ１４６分泌におけるＴＩＭＰの阻害効果（ＴＩＭＰ−１の効果）を考慮して、発明者らは、ＡＤＡＭ１０、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−２を標的とするｓｉＲＮＡの効果を試験した。Ｔａｃｅを標的とするｓｉＲＮＡの効果もまた、対照として試験した。結果（図２２Ｂ）は、ＡＤＡＭ１０  ｓｉＲＮＡのみが、ｓＣＤ１４６分泌を阻害することができ、その効果が、ＧＭ６００１の効果と同様であることを、示した。
【０２７６】
この結果を確認するために、発明者らは、免疫共沈降実験を行い、対照条件において、ｌｇＣＤ１４６が、ＡＤＡＭ１０と免疫共沈降し、ｓｈＣＤ１４６とＡＤＡＭ１０とは、免疫共沈降しなかったことを示した（図２２Ｃ）。免疫蛍光法によって、発明者らは、ｌｇＣＤ１４６が、内皮細胞の接合部と核周囲の領域との両方において、集密的ＥＣＦＣにおいて、ＡＤＡＭ１０と共存することを示した。それらはまた、集密的細胞の細胞内区画内において共存していた。ｌｇＣＤ１４６及びＡＤＡＭ１０の、集密的細胞内の細胞接合部における共存が、別の内皮細胞タイプ、ＨＵＶＥＣにおいて確認された。対照的に、ｓｈＣＤ１４６は、ＡＤＡＭ１０と、集密的細胞内で共存しなかった。
【０２７７】
長いフォーム及び短いフォームのＣＤ１４６が相互に相補的であるか否かを評価するために、発明者らは、ｌｇＣＤ１４６をｓｉＲＮＡで発現抑制し、その他のフォームにおける効果を観察した。ｌｇＣＤ１４６を発現抑制しても、ｓｈＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現は変化しなかった。このことは、内皮細胞における２つのアイソフォームの各種局在化を肯定する。発明者らはまた、２つのＣＤ１４６アイソフォームのｍＲＮＡ発現におけるＡＤＡＭ１０による発現抑制又は過剰発現の効果を解析した。ＡＤＡＭ１０による発現抑制又は過剰発現は、長いＣＤ１４６又は短いＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現を変化させなかった。
【０２７８】
ｌｇＣＤ１４６が、本質的に、接合部において発現するので、発明者らは、細胞のＡＤＡＭ１０による発現抑制及び過剰発現を、細胞透過率において、デキストラン透過率により決定されるように、試験した（図２２Ｅ及び図２２Ｆ）。結果は、ＡＤＡＭ１０  ｓｉＲＮＡ、又はＡＤＡＭ１０プラスミドによる細胞のトランスフェクションを用いたＥＣＦＣ治療が、デキストランへの透過率をそれぞれ増減させたことを示し、また、Ｔａｃｅ  ｓｉＲＮＡ又はＴａｃｅプラスミドによるトランスフェクションを用いた治療は、透過率を変化させなかったことを示す。ＣＤ１４６切断に依存しないＡＤＡＭ１０の潜在的寄与を評価するために、発明者らは、長いＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡの存在又は非存在状態において、内皮細胞におけるＡＤＡＭ１０過剰発現の効果を比較する透過率実験を行った。結果は、ＡＤＡＭ１０過剰発現及び長いＣＤ１４６のｓｉＲＮＡトランスフェクションが、内皮透過率を有意に増加させたことを示す。細胞に長いＣＤ１４６のｓｉＲＮＡ及び過剰発現したＡＤＡＭ１０をトランスフェクトすると、透過率における効果は、長いＣＤ１４６のｓｉＲＮＡが単独で存在する状態で観察されたときの効果と有意な差はなかった。このことは、ＡＤＡＭ１０が、このような細胞における透過率を制御するように、本質的に、長いＣＤ１４６に作用することを、示唆した。
【０２７９】
この結果を確認するために、発明者らは、（ＣＤ１４６を発現しない）ＣＨＯ細胞においてｌｇＣＤ１４６アイソフォームを、このアイソフォームを含むプラスミドをトランスフェクトさせることにより、発現させた。ｌｇＣＤ１４６を大量に発現する安定的なクローンを選択した。このクローンに対して、ＡＤＡＭ１０をコードしたプラスミドを、一過性トランスフェクトさせて、その効果をｓＣＤ１４６分泌物において観察した。結果は、ＡＤＡＭ１０が存在する状態で、ｓＣＤ１４６分泌が、有意に増加したことを示す。最後に、ＡＤＡＭ１０トランスフェクションの効果を、ｌｇＣＤ１４６（それぞれ、ＣＨＯ−ｌｇＣＤ１４６及びＣＨＯ−Ｃ）を安定トランスフェクトした又は安定トランスフェクトしなかったＣＨＯの透過率を観察した。結果は、ＣＨＯ−ｌｇＣＤ１４６の透過率が、ＡＤＡＭ１０が存在する状態で、有意に増加し、その一方で、ＣＨＯ−ＣにおけるＡＤＡＭ１０に効果がないことを、示した。
【０２８０】
まとめると、この実験は、内皮細胞において、接合部において発現する長いＣＤ１４６が、ＡＤＡＭ１０によりシェディングされて、ｓＣＤ１４６を生成することを示す。
【０２８１】
（短いＣＤ１４６アイソフォームは、内皮細胞においてＴａｃｅ依存型シェディングにより、可溶型ＣＤ１４６を生成する）
発明者らは、ＴＮＦ２０ｎｇ／ｍｌで治療して２４時間後のｓＣＤ１４６分泌における長い（ｌｇＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡ）及び短い（ｓｈＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡ）ＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡの影響を、対照条件と比較して解析した。発明者らは、対照条件において、ｌｇＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡのみが、ｓＣＤ１４６分泌を低減させたことを確認し（図２３Ａ）、ＴＮＦの下、ｌｇＣＤ１４６及びｓｈＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡ両方が、ｓＣＤ１４６分泌をそれぞれ約６０％及び２５％低減させたことを、観察した。発明者らは、よって、各種ｓｉＲＮＡを使用して、ｓｈＣＤ１４６シェディングにおいて必要なタンパク質分解酵素を特定した。ＴＮＦ下でｓＣＤ１４６分泌におけるＴＩＭＰの効果（ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−３による阻害）を考慮して、発明者らは、ＡＤＡＭ１０、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＴａｃｅを標的とするｓｉＲＮＡの効果を試験した。結果（図２３Ｂ）は、ＡＤＡＭ１０  ｓｉＲＮＡ及びＴａｃｅ  ｓｉＲＮＡが、同時に追加すると効果が追加されて、ｓＣＤ１４６分泌を阻害することができることを、示した。興味深いことに、ＡＤＡＭ１０及びＴａｃｅ  ｓｉＲＮＡは、ｓＣＤ１４６分泌を、ｌｇＣＤ１４６及びｓｈＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡの場合に観察されたように、６０％及び２５％それぞれ低減させた。この結果は、ｌｇＣＤ１４６がＡＤＡＭ１０によりシェディングされると、ｓｈＣＤ１４６が、Ｔａｃｅによりシェディングされ得ることを、示唆した。
【０２８２】
この仮説を確認するために、発明者らは、免疫共沈降実験を行い、ＴＮＦ下で、ｓｈＣＤ１４６がＴａｃｅと免疫共沈降し、その一方で、ｌｇＣＤ１４６がＡＤＡＭ１０と免疫共沈降したことを、示した。免疫蛍光法によって、発明者らは、ｓｈＣＤ１４６が、ＴＮＦ下ＥＣＦＣ細胞内においてＴａｃｅと共存することを、示した。集密的な細胞において、ｓｈＣＤ１４６は、膜で核内においてＴａｃｅと共存し、その一方で、非集密的細胞では、本質的に、遊走細胞の膜の襞において核の周りで共存する。対照的に、ｌｇＣＤ１４６は、Ｔａｃｅと、集密的細胞内で共存しなかった。長いＣＤ１４６アイソフォームについて示したように、ｓｈＣＤ１４６を発現抑制することは、ｌｇＣＤ１４６  ｍＲＮＡを変化させず、両方のアイソフォームが相互に相補的でなかったことを、示唆する。発明者らはまた、２つのＣＤ１４６アイソフォームのｍＲＮＡ発現に対してＴａｃｅが発現抑制する効果を解析した。Ｔａｃｅによる発現抑制は、長いＣＤ１４６又は短いＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現をいずれも変化させなかった。
【０２８３】
ｓｈＣＤ１４６は、最近、内皮細胞の脂質ラフトに存在することが記述され、またＴａｃｅも、この細胞画分内にあることが記述されたので、発明者らは、対照条件及びＴＮＦ下のＥＣＦＣの脂質ラフト画分を解析した。この実験において、ＧＭ６００１  １０μＭを、細胞に、分子のシェディングを回避するために追加した。結果は、対照条件では、ｓｈＣＤ１４６が脂質ラフトには観察されなかったことを示す。対照的に、ＴＮＦ下では、ｓｈＣＤ１４６及びＴａｃｅの両方が、この細胞画分に存在した。この結果を確認するために、発明者らは、ＣＨＯ細胞においてｓｈＣＤ１４６アイソフォームを、このフォームを含むプラスミドをトランスフェクトすることにより、発現させた。ｓｈＣＤ１４６を大量に発現する安定的なクローンを選択した。このクローンに、Ｔａｃｅをコードするプラスミドを一過性トランスフェクトさせ、その効果をｓＣＤ１４６の分泌において観察した。結果は、Ｔａｃｅが存在する状態で、ｓＣＤ１４６の分泌が、有意に増加したことを示す。  まとめると、この実験は、内皮細胞において、短いＣＤ１４６が、Ｔａｃｅによりシェディングされて、ｓＣＤ１４６を炎症条件（ＴＮＦ）において生成することを示す。
【０２８４】
（内皮細胞において選択的スプライシングにより生成される可溶型ＣＤ１４６の２つの新しいバリアントの特定）
発明者らは、ｓＣＤ１４６分泌物の画分が、ＧＭ６００１−非感受性であり、よって、膜型ＣＤ１４６のシェディングに依存しないことを観察したので（図２１を参照）、この画分が、一次転写物の選択的スプライシングにより生成された別の型のｓＣＤ１４６の生成によるものであろうと、仮定した。この仮定を試験するために、発明者らは、ＥＣＦＣ細胞においてＲＮＡ配列を行った。結果は、少なくとも２つの別のアイソフォームのｓＣＤ１４６の存在を示した。このアイソフォームの１つは、分子のイントロン１０（Ｉ１０−ｓＣＤ１４６アイソフォーム）を含んでいた。別の１つは、分子のイントロン５及び１３（Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６アイソフォーム）両方を含んでいた。図２４Ａは、この２つのアイソフォームの、ｓｈｅｄフォームと比較した概略図を示し、配列番号８／１９及び配列番号９／２０は、このアイソフォーム（それぞれ、Ｉ５−１３及びＩ１０）の配列を示す。
【０２８５】
発明者らは、ＥＣＦＣ及び他の内皮細胞、ＨＵＶＥＣにおけるＩ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６転写物の発現を実証した。結果は、両方の転写物がＥＣＦＣ及びＨＵＶＥＣに存在すること（図２４Ｂ）と、ＥＣＦＣへの免疫蛍光法及びＥＣＦＣ上清へのウェスタンブロットにより立証されるように、タンパク質として発現されることとを示す。発明者らは、２つのスプライスバリアントのｍＲＮＡ発現において膜ＣＤ１４６のシェディングに本当に影響する（図２１Ａを参照）各種刺激の効果を試験した。興味深いことに、それらは、差次的に調節されている。実際、Ｉ５−１３ｓＣＤ１４６は、ｍＲＮＡレベルでＴＮＦ及びＷｎｔ５ａにより上方制御され、ｓｈｅｄフォームのＣＤ１４６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦｂ、ネトリン及びＷｎｔ３ａによる変化は及ばなかった。対照的に、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６は、ｍＲＮＡレベルでこの各種因子により上方制御されなかった。Ｉ１０−ｓＣＤ１４６バリアントのｍＲＮＡレベルは、ＶＥＧＦ、ネトリン及びＷｎｔ３ａにより下方制御さえされた（図２４Ｃ）。
【０２８６】
この新しいスプライシングバリアントと、他のＣＤ１４６アイソフォームの発現との間の相互作用を評価するために、発明者らは、ｓｉＲＮＡ実験を行った。結果は、長いＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡも、短いＣＤ１４６  ｓｉＲＮＡもいずれも、ｍＲＮＡレベルにおいてＩ１０−ｓＣＤ１４６又はＩ５−１３−ｓＣＤ１４６の発現に影響しなかったことを、示す。同様に、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６又はＩ５−１３−ｓＣＤ１４６に対するｓｉＲＮＡは、短い又は長いＣＤ１４６  ｍＲＮＡ発現に変化を及ぼさなかった。最後に、リコンビナントＩ１０−ｓＣＤ１４６又はＩ５−１３−ｓＣＤ１４６タンパク質による内皮細胞の治療は、短いＣＤ１４６、長いＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６にｍＲＮＡレベルで変化を及ぼさなかった。このデータは、各種アイソフォームが、相互に相補的でないということを支持するものである。
【０２８７】
まとめると、この実験は、膜ＣＤ１４６アイソフォームのシェディングに加えて、ｓＣＤ１４６も、一次転写物の新たに２つのスプライスバリアントとして生成されることを、示す。
【０２８８】
（Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６アイソフォームの可溶型ＣＤ１４６は、インビトロ及びインビボで、血管形成促進効果を示す）
ＥＣＦＣが、エクスビボ血管形成研究用の有用なモデルを構成するので、発明者らは、ＥＣＦＣにおいて２つのスプライシングされたｓＣＤ１４６アイソフォーム（Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６）の効果を評価した。実験は、ＧＭ６００１が存在する状態で、膜ＣＤ１４６シェディングを妨げ、よってこの新たなアイソフォームの効果のみを観察するために、行われた。結果は、ｓｉＲＮＡが標的とするＩ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６が、ＥＣＦＣの増殖を阻害したこと（図２５Ａ）を、示した。両方のｓｉＲＮＡの効率を実証した。両方のアイソフォームをコードするプラスミドもまた、増殖へのその効果を調べるためにＥＣＦＣ内へトランスフェクトした。結果（図２５Ｂ）は、両方のプラスミドが、増殖を有意に増加させたことを示す。この２つのｓＣＤ１４６アイソフォームの血管形成の可能性もまた、リコンビナントタンパク質の生成後に評価した。リコンビナントＩ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６タンパク質（それぞれｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６）を産生し特徴を持たせた。その効果を、ＥＣＦＣの増殖において試験し、リコンビナントｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６フォーム（ｒｈ−ｓＣＤ１４６）のそれと比較した（図２５Ｃ）。
【０２８９】
結果は、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びｒｈ−ｓＣＤ１４６が、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６の効果が低下するように見えたとしても、内皮細胞の増殖を増加させたことを示す。漿尿膜アッセイにおける血管形成も増加させた（図２５Ｄ）。発明者らは、３Ｄの毛細管形成の実験（球状体の実験）を３つのリコンビナントタンパク質を用いて行った。結果は、３つのリコンビナントタンパク質が、偽性毛細管を生成する能力を、出芽数及び累積出芽長さで測定されたように、増加したこと（図２５Ｅ）を、示す。繰り返しになるが、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６の効果は、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６又はＩ１０−ｓＣＤ１４６と比較すると、低下するように見える。各種フォームのｓＣＤ１４６の血管形成促進特性によって、発明者らは、後肢虚血マウスモデルにおける血管形成効果を調査することになった。虚血マウスを、週に２回、ｒｈ  ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＶＥＧＦ２μｇで、２８日間、局所的に治療し、血流は、レーザードップラー法により推定した。結果は、３つのフォームが、ＰＢＳで治療した動物と比較して、血流を増加させることができたことと、各種フォームのｓＣＤ１４６とともに観察された効果が、ＶＥＧＦとともに観察された効果よりもずっと高かったこととを示す（図２６Ａ）。興味深いことに、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６の効果は、有意な効果が、第１の注入後３日経ってすぐに観察されたので、他の分子によるものよりも早いように見えた。イソレクチンＢ４で筋肉を標識することは、血管形成が、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−ｓＣＤ１４６及びＶＥＧＦで治療した動物において、ＰＢＳで治療した対照動物と比較すると増加したことを、示した（図２６Ｂ）。最後に、血管造影画像は、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びｒｈ  −ｓＣＤ１４６で治療した脚における血管の数も、ＰＢＳで治療した脚と比較すると増加したこと（図２６Ｃ）も示した。定量化は、血管密度が、ｒｈ−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ１０−ｓＣＤ１４６、ｒｈ−Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＶＥＧＦで治療したとき、腓腹、大腿及び脚全体において有意に増加したことを、示す。すべての実験において、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６が、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６と比較して、高効果を示した。最後に、ＡＤＡＭ１０により長いＣＤ１４６アイソフォームをシェディングすることは、経内皮の透過率が増すことと関連付けられるので（図２２を参照）、発明者らは、新たなスプライスバリアントＩ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６が、この透過率を変化させ得るか否かを解析した。結果は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションも、このバリアントに対応するリコンビナントタンパク質による治療も、経内皮透過率へ変化を及ぼさなかったことを示す。
【０２９０】
まとめると、この結果は、両方のｓｈｅｄフォームのｓＣＤ１４６及びスプライスバリアントが、ＶＥＧＦとして、血管形成促進効果を示すことが、分かった。Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６は、さらに高い血管形成促進効果を、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６と比較して、示すように見える。
【０２９１】
（Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６は、線維症には差次的効果を示し、全身性硬化症においては差次的に調節される）
発明者らは、新たに特定したｓＣＤ１４６バリアントのｍＲＮＡレベルを、組織アレイを使用して解析した。結果を図２８に示す。一方では、多くの器官が、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６又はＩ１０−ｓＣＤ１４６を発現しなかったが、肺、リンパ節又は直腸は、２つのアイソフォームのｓＣＤ１４６を高発現した。興味深いことに、末梢血リンパ球は、高レベルのＩ５−１３−ｓＣＤ１４６を発現したが、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６は発現しなかった。Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６が、肺において高発現し、ＴＮＦ及びＷｎｔ５ａ／３ａにより差次的に調節されるので、発明者らは、全身性硬化症（ＳＳｃ）におけるこのアイソフォームの発現に焦点を絞ることに決めた。
【０２９２】
発明者らは、よって、ＳＳｃ患者の血清においてｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６の濃度を、対照患者と比較して、決定した（図２７Ａ）。結果は、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６が、ＳＳｃの患者において、有意に増加し、その一方で、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６は減少したことを示す。興味深いことに、発明者らは、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６濃度が、肺線維症の患者の血清において、肺疾患のない患者と比較すると、有意に高くなったことを観察した（挿入図）。
【０２９３】
発明者らが、最近、ＳＳｃの線維化に関与する標準Ｗｎｔ経路が、ｓＣＤ１４６により調節されることを、報告したが（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）、本発明者らは、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）でのｂ−カテニン／ＴＣＦ転写活性モデルにおける各種可溶型フォームの効果を解析した。発明者らは、まず、ＣＤ１４６ＫＯマウスからのＭＥＦが、野生マウスからのＭＥＦよりもブレオマイシンに感受性が高いことを示した（図２７Ｂ、左の部分）。よって、ＣＤ１４６ＫＯマウスからのＭＥＦを、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６の効果を解析するために使用した。結果（図２７Ｂ、右の部分）は、ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６が、ｂ−カテニン／ＴＣＦ転写活性を減少させ、その一方で、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６は、増加させることを示した。
【０２９４】
機構において、発明者らは、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症動物モデル（Ｋａｓｐｉ他，２０１７）を使用した。ブレオマイシンで治療した動物に、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６又はＩ１０−ｓＣＤ１４６を皮下注入した。それから、皮膚の厚さ、皮膚の面及び血管密度を解析した。結果は、ブレオマイシンによる治療が皮膚の厚さを増したことを示す。ｓＣＤ１４６又はＩ１０−ｓＣＤ１４６による治療は、この皮膚の厚さを、対照動物において観察された値へ低減させた。対照的に、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６の有意な効果はなかった（図２７Ｃ）。興味深いことに、皮膚の血管形成が低減したことが、肉眼レベルで、ブレオマイシンで治療した動物において観察された（図２７Ｄ）。ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６による治療は、顕微鏡レベルで観察される血管形成の増加につながり、その一方で、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６による治療では、そうならなかった。この結果を、イソレクチン−ｂ４で標識後確認した。血管密度は、ブレオマイシン治療した動物において低減し、この効果は、ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６により有意に後退した。対照的に、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６の効果はなかった（図２７Ｅ）。
【０２９５】
まとめると、この結果は、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６が、線維化促進性であり、肺線維症を伴うＳＳｃ患者の血清において非常に増加したことを、示す。対照的に、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６は、抗線維化であり、ＳＳｃの動物モデルにおける線維症を低減させることができる。
【０２９６】
［考察］
本研究において、発明者らは、複数のアイソフォームのｓＣＤ１４６が内皮細胞により分泌されることを立証し、発生機構を決定した。発明者らは、初めて、両方の膜ＣＤ１４６アイソフォームのシェディングに関与するタンパク質分解酵素を特定し、一次転写物の選択的スプライシング及び追加のｓＣＤ１４６タンパク質をコードすることにより生成される追加の２つのアイソフォームの存在を報告した。このアイソフォームは、血管形成及び線維症の制御に関連する各種特性を示す。１つの分子が各種フォームとして存在し得るという事実は、生理学及び／又は病理学においてその重要性を強調する。興味深いことに、各種スプライスバリアントが、多くのタンパク質、特に、別の血管形成高促進分子、ＶＥＧＦに対して、特定されてきた。よって、可溶型ＣＤ１４６はまた、多数のスプライシバリアントを有するタンパク質の大規模ファミリーを構成し得る。
【０２９７】
ｓｈｅｄフォームのＣＤ１４６に関して、発明者らは、膜ＣＤ１４６アイソフォームの機能として、２つの各種ＡＤＡＭにより生成されることを立証した。実際、長いフォームは、短いフォームがＴａｃｅによりシェディングされる一方、ＡＤＡＭ１０によりシェディングされる。興味深いことに、発明者らは、短いアイソフォームのＣＤ１４６が、プレセニリン１により細胞外部分のシェディングと、その後の細胞内部分のシェディングとにより完全にタンパク質分解処理され、細胞内ドメイン（ｓｈＣＤ１４６−ＩＣＤ）を生成することを、最近示した。対照的に、長いアイソフォームは、細胞外のシェディングのみを示した（Ｓｔａｌｉｎ他，２０１６）。発明者らは、短いＣＤ１４６アイソフォームが、このように、ｓｈＣＤ１４６−ＩＣＤの核内移行により、直接的な転写効果を示し得ることを示した。現在の研究において、発明者らは、ｓｈＣＤ１４６に関与するＡＤＡＭが、Ｔａｃｅであることを示す。興味深いことに、Ｔａｃｅ及びプレセニリン１は、タンパク質の連続的シェディングを発生させるのに関連することがよくある。よって、ノッチもまた、この２つの分子により処理され、ＮＩＣＤを転写効果で生成することにつながる（Ｇｕｄｅｙ他，２０１４）。
【０２９８】
ｓｈｅｄフォームのＣＤ１４６に加えて、発明者らの研究は、内皮細胞が少なくとも２つの他のフォームのｓＣＤ１４６を分泌可能であることを示す。この２つのアイソフォームは、選択的スプライシングにより生成される。発明者らがこの２つの新しいアイソフォームについて証明した第１の特性は、ｓｈｅｄフォームについて既述のように（Ｈａｒｈｏｕｒｉ  Ｋ．他，２０１０）、血管形成促進能力である。興味深いことに、血管形成効果は、虚血動物に分子の注入後３日経過してすぐに観察可能であるので、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６は、素早い効果を示したＩ５−１３−ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６よりも高い血管形成能力を示した。各種血管形成因子は、種々の血管形成能力を伴う各種アイソフォームとして存在することが、示されてきた。よって、主な血管形成分子ＶＥＧＦは、多様なアイソフォームを示す（Ｇｕｙｏｔ  Ｍ．他，２０１５）。このアイソフォームは、異なる細胞に発現し、血管形成／リンパ脈管新生に影響し得る各種受容体を示す（Ｊｕｓｓｉｌａ  Ｌ．他，２００２）。興味深いことに、各種アイソフォームはまた、同じ受容体を結合し、多種の細胞アウトカムを引き出す各種シグナル伝達及び輸送を誘発する（Ｆｅａｒｎｌｅｙ  ＧＷ他，２０１６）。ＶＥＧＦについて、少なくとも４つの各種受容体、ＶＥＧＦ  Ｒ１／２／３及びニューロピリン１が、特定されている。この受容体は、血管形成ばかりでなく、リンパ脈管新生にも関与する。さらなる研究が、各種ｓＣＤ１４６バリアントが各種受容体を結合するか否か及びリンパ脈管新生にも関与するか否かを判定するのに必要となるだろう。最近、血管形成促進及び抗血管形成アイソフォームのＶＥＧＦを記述した。これは、腫瘍では両方のタイプの分子が発現されるので、主な対象である。しかしながら、それらは、ベバシズマブのように抗ＶＥＧＦ分子により阻害され、治療効果を低減させる（Ｂｉｓｅｌｌｉ−Ｃｈｉｃｏｔｅ  ＰＭ他，２０１２）。発明者らは、最近、明細胞型腎細胞癌において、可溶型ＣＤ１４６が、スニチニブの有効性の予測マーカーを構成し、スニチニブへの抵抗機構の１つが、分子の莫大な増加に依存する可能性があることを示した（Ｄｕｆｉｅｓ  Ｍ．他，２０１８）。本研究において記述した別のスプライスバリアントは、血管新生促進性であるので、この現象における関与を解析する対象となるだろう。興味深いことに、発明者らは、２つの別のアイソフォームのｓＣＤ１４６もまた、線維症、特に、全身性硬化症（ＳＳｃ）の制御に関与することを、示した。ＳＳｃは、重篤な線維症及び調節不全の血管形成という特徴を有する。多くの因子における異常が、報告されてきた（Ｈｕｍｍｅｒｓ  ＬＫ他，２００９）。本研究において、発明者らは、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６スプライスバリアントが、Ｗｎｔ５ａ及びＴＮＦにより増加すること及びタンパク質がＳＳｃ患者の血清中で有意に増強され、その一方で、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６が、Ｗｎｔ３Ａ及びＶＥＧＦにより減少し、ＳＳｃにおいて減少することを、示した。患者の血清において観察された２つのアイソフォームの制御は、記述の、ＳＳｃ患者におけるＴＮＦ、Ｗｎｔ３ａ及びＶＥＧＦの増加と合致している。この結果は、ＳＳｃにおけるＣＤ１４６／ｓＣＤ１４６の関与を確認するものであるので重要であり、各種血管新生促進性フォームのｓＣＤ１４６が、病態において調節されることを示す。マウスにおいてブレオマイシンにより誘発されたＳＳｃのインビボモデルを用いると、発明者らは、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６が、皮膚の厚さにより決定されるようにＳＳｃを低減させることができ、その一方で、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６は、ＳＳｃを低減させなかったことを、示した。興味深いことに、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６は、この動物の真皮の血管密度を上昇させることができ、一方で、Ｉ５−１３ｓＣＤ１４６は、そうではなかった。よって、すべてのフォームが血管新生誘導性である一方で、ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６のみが、このモデルにおける新しい血管の生成を刺激することができた。このことは、各種フォームのｓＣＤ１４６が各種経路に関与することができること、及びその効果は病態学的条件に応じてバランスすることを示唆している。このように、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６はまた、ＭＥＦのインビトロモデルにおいてｂ−カテニン／ＴＣＦ転写活性を低減させることもでき、古典的Ｗｎｔ回路の下方制御による皮膚線維症における潜在的な減少を示唆する。これに対して、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６は、それを増加させた。この結果は、明らかに、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６が、ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６と比較して、各種受容体により作用し、各種シグナル伝達経路を起動させ得ることになる事実を支持するものである。まとめると、このデータは、Ｉ１０−ｓＣＤ１４６及びＩ５−１３−ｓＣＤ１４６が、ＳＳｃにおいて新たなバイオマーカーとなることを示す。特に、Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６が、肺線維症を伴うＳＳｃ患者において、肺線維症患者と比較して、有意に増加した事実は、病理の重症度マーカーとなることを示す。さらに、ｓｈｅｄ  ｓＣＤ１４６及びＩ１０−ｓＣＤ１４６は、線維症Ｉ５−１３−ｓＣＤ１４６に対して、ＳＳｃにおける治療効果を、血管新生を増加させ、線維症を低減させることにより、示す。結論として、この研究は、２つの膜アイソフォームＣＤ１４６のシェディングと関与する２つのプロテアーゼを特定し、選択的スプライシングにより生成された２つの追加のアイソフォームのｓＣＤ１４６を特定する。このすべてのバリアントは、ＶＥＧＦについて記述したように、血管新生促進特性を示し、血管新生促進分子の新たなファミリーを構成するように見える。これに対して、全身性硬化症の患者の血清において差次的に制御され、差次的な線維化特性を示す。
【０２９９】
実施例４−マウスのアデニン食餌により誘発された腎臓間質性線維症モデルにおける線維症発現へのｓＣＤ１４６の特異的抗体による阻害効果
発明者らは、アデニン食餌を使用することにより間質性線維症に関連付けられる慢性腎臓病を誘発した。これは、尿細管間質性線維症へ進行する結晶性腎症を誘発する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、８週齢であり、０．２５％のアデニン（Ａ０４  Ａｄｅ  ０．２５％、Ｓａｆｅ）を組み入れた食餌を１２日間与えた。対照マウスに、通常の食餌（Ａ０４、Ｓａｆｅ）を与えた。１２日後、食餌を停止し、動物を、食餌の終了後すぐに又は１週間、２週間若しくは３週間で使用した。
【０３００】
結果は、アデニン食餌の終了後２週間で、動物は、間質性の腎臓線維症を示し、その一方で、対照動物には線維症はなかった（図３３Ａ）。この線維症には、ｍＲＮＡレベルにおいて観察されるように、ＴＧＦｂ、コラーゲン１ａ及びａＳＭＡにおける増加が伴った（図３３Ｂ）。ａＳＭＡタンパク質もまた、有意に増加した（図３３Ｃ）。最後に、発明者らは、ＣＤ１４６のｍＲＮＡ発現における進行性の増加を、アデニン食餌の終了後有意な２週間及び３週間で、観察した（図３３Ｄ）。線維症の発現を予防するために、発明者らは、動物ＩＶを、抗ｓＣＤ１４６抗体１０μｇで、アデニン食餌の開始から１週間に２回治療し、食餌の終了後２週間で絶命させた。結果は、絶命時、対照動物も、対照ＩｇＧで治療した動物も、高度な線維症を発現したことを、示す。興味深いことに、抗ｓＣＤ１４６抗体で治療した動物は、間質性線維症が有意に減少することを示した（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。
【図１Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000009
【図１Ｃ】
2022502410.tif 000010
【図２Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000011
【図２Ｃ】
2022502410.tif 000012
【図２Ｄ】
2022502410.tif 000013
【図２Ｅ−Ｆ】
2022502410.tif 000014
【図３Ａ−Ｃ】
2022502410.tif 000015
【図３Ｄ−Ｅ】
2022502410.tif 000016
【図３Ｆ−Ｇ】
2022502410.tif 000017
【図３Ｈ−Ｊ】
2022502410.tif 000018
【図４Ａ−Ｄ】
2022502410.tif 000019
【図５Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000020
【図５Ｃ】
2022502410.tif 000021
【図６Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000022
【図６Ｃ−Ｄ】
2022502410.tif 000023
【図６Ｅ−Ｆ】
2022502410.tif 000024
【図７Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000025
【図７Ｃ−Ｄ】
2022502410.tif 000026
【図７Ｅ】
2022502410.tif 000027
【図８】
2022502410.tif 000028
【図９Ａ】
2022502410.tif 000029
【図９Ｂ】
2022502410.tif 000030
【図１０Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000031
【図１０Ｃ】
2022502410.tif 000032
【図１１】
2022502410.tif 000033
【図１２】
2022502410.tif 000034
【図１３Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000035
【図１３Ｃ】
2022502410.tif 000036
【図１４Ａ】
2022502410.tif 000037
【図１４Ｂ】
2022502410.tif 000038
【図１５】
2022502410.tif 000039
【図１６Ａ】
2022502410.tif 000040
【図１６Ｂ】
2022502410.tif 000041
【図１７Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000042
【図１７Ｃ−Ｄ】
2022502410.tif 000043
【図１７Ｅ−Ｆ】
2022502410.tif 000044
【図１８】
2022502410.tif 000045
【図１９】
2022502410.tif 000046
【図２０】
2022502410.tif 000047
【図２１Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000048
【図２１Ｃ−Ｄ】
2022502410.tif 000049
【図２２Ａ−Ｃ】
2022502410.tif 000050
【図２２Ｄ−Ｅ】
2022502410.tif 000051
【図２３Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000052
【図２４Ａ】
2022502410.tif 000053
【図２４Ｂ】
2022502410.tif 000054
【図２４Ｃ】
2022502410.tif 000055
【図２５Ａ−Ｃ】
2022502410.tif 000056
【図２５Ｄ−Ｅ】
2022502410.tif 000057
【図２６Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000058
【図２６Ｃ】
2022502410.tif 000059
【図２７Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000060
【図２７Ｃ】
2022502410.tif 000061
【図２７Ｄ−Ｅ】
2022502410.tif 000062
【図２８】
2022502410.tif 000063
【図２９Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000064
【図３０】
2022502410.tif 000065
【図３１Ａ】
2022502410.tif 000066
【図３１Ｂ】
2022502410.tif 000067
【図３２】
2022502410.tif 000068
【図３３Ａ−Ｄ】
2022502410.tif 000069
【図３４Ａ−Ｂ】
2022502410.tif 000070
【配列表】
2022502410000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月26日(2021.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓又は腎線維症の素因検出、診断及び／若しくは予後予測又はモニターにおいてバイオマーカーとして使用するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質。
【請求項２】
対象の線維症の素因検出、診断及び／若しくは予後予測又はモニターにおいてバイオマーカーとして使用するための配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質。
【請求項３】
インビトロ又はエクスビボで、対象の心臓又は腎線維症の素因検出若しくは診断及び／又は予後予測のためのデータを得る方法であって、
当該方法は、前記対象の生体サンプルにおいて前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを決定するステップを含み、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される、データを得る方法。
【請求項４】
前記方法は、
前記対象の生体サンプルにおいて前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを決定するステップであって、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるステップｉ）と、
ステップｉ）において決定された前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
ステップｉ）において決定された前記レベルが前記基準値よりも高い場合、前記対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると結論づける、又はステップｉ）で決定された前記レベルが前記基準値より低い場合、前記患者が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インビトロ又はエクスビボで、対象において線維症の素因検出若しくは診断及び／又は予後予測のためのデータを得る方法であって、
当該方法は、前記配列番号８のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又は前記配列番号９のＩ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップを含む、データを得る方法。
【請求項６】
前記方法は、
前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを、前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、
ステップｉ）で決定した前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
前記対象が線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも高い場合、結論づける、又は前記患者が線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも低い場合、結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、
前記Ｉ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて決定するステップｉ）と、
ステップｉ）で決定した前記発現レベルを基準値と比較するステップｉｉ）と、
前記対象が、線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも低い場合、結論づける、又は前記患者が、線維症の素因を有していない、線維症の影響を受けていない若しくは予後良好を有すると、ステップｉ）で決定した前記レベルが前記基準値よりも高い場合、結論づけるステップｉｉｉ）と、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インビトロ又はエクスビボで、心臓又は腎線維症を、対象においてモニターするためのデータを得る方法であって、
前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップであって、前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される決定ステップを含み、
可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが前記対象の生体サンプルにおいて遅い時点で、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが低いことは、線維症の減少を示し、可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、データを得る方法。
【請求項９】
インビトロ又はエクスビボで、対象の線維症をモニターするためのデータを得る方法であって、配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップを含み、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが前記対象の生体サンプルにおいて遅い時点において、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、高いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが低いことは、線維症の減少を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、データを得る方法。
【請求項１０】
インビトロ又はエクスビボで、対象の線維症をモニターするためのデータを得る方法であって、配列番号９の前記Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルを前記対象の生体サンプルにおいて２つ以上の時点で決定するステップを含み、可溶型ＣＤ１４６タンパク質の発現レベルが前記対象の生体サンプルにおいて遅い時点において、前記対象の生体サンプルにおいて早い時点で得た基準値と比較して、低いことは、前記対象における線維症の増加を示し、一方で、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質のレベルが高いことは、線維症の減少を示し、ヒト可溶型ＣＤ１４６タンパク質レベルが等しいことは、線維症が前記対象において進行していないことを示す、データを得る方法。
【請求項１１】
可溶型ＣＤ１４６に選択的に結合するモノクローナル抗体を、可溶型ＣＤ１４６タンパク質発現レベルを決定するために使用し、前記抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体は、
ａ）配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列、並びに配列番号９０、配列ＱＶＳ及び配列番号９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列、
ｂ）配列番号９３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号９２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
ｃ）配列番号９４、配列番号９５及び配列番号９６の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列、並びに配列番号９７、配列ＦＡＳ及び配列番号９８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列、又は、
ｄ）配列番号１００を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号９９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
を含む、請求項３〜１０のいずれかに記載のインビトロ又はエクスビボによる方法。
【請求項１２】
対象、典型的には線維症の素因がある、線維症の影響を受けている若しくは予後不良の線維症を有すると請求項３又は４に記載の方法により特定された対象、又は未進行の線維症若しくは線維症の増加を有すると請求項８に記載の方法により特定された対象における心臓及び／又は腎線維症の予防若しくは治療において使用するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤。
【請求項１３】
対象、典型的には線維症の素因を有する、線維症の影響を受けている若しくは予後不良の線維症を有すると請求項５又は６に記載の方法により特定された対象又は未進行の線維症若しくは線維症の増加を有すると請求項９に記載の方法により特定された対象における線維症の予防若しくは治療に使用するための配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤。
【請求項１４】
前記阻害剤は、抗体、アプタマー、ポリペプチド、有機小分子及び核酸から選択される、請求項１３に記載の可溶型ＣＤ１４６阻害剤若しくは請求項１２に記載のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６阻害剤。
【請求項１５】
前記阻害剤は、抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の可溶型ＣＤ１４６阻害剤。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ１４６モノクローナル抗体は、
ａ）配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列、並びに配列番号９０、配列ＱＶＳ及び配列番号９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列、
ｂ）配列番号９３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号９２を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
ｃ）配列番号９４、配列番号９５及び配列番号９６の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲポリペプチド配列、並びに配列番号９７、配列ＦＡＳ及び配列番号９８の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲポリペプチド配列、又は、
ｄ）配列番号１００を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号９９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
を含む、請求項１５に記載の可溶型ＣＤ１４６阻害剤。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤と、対象における心臓及び／又は腎線維症の予防又は治療において使用するための薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項１８】
配列番号８の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質の阻害剤と、対象における線維症の予防又は治療に使用するための薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の前記可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項２に記載の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質若しくは前記Ｉ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項３又は４に記載のインビトロ又はエクスビボで心臓又は腎線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項５から７のいずれかに記載のインビトロ又はエクスビボで線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項８に記載のインビトロ又はエクスビボで心臓又は腎線維症をモニターする方法、請求項９又は１０に記載のインビトロ又はエクスビボで線維症をモニターする方法、請求項１２、１４又は１５に記載の前記可溶型ＣＤ１４６阻害剤、請求項１３、１４又は１５に記載の前記Ｉ５−１３可溶型ＣＤ１４６阻害剤、又は請求項１７又は１８に記載の組成物であって、前記対象は哺乳動物である、可溶型ＣＤ１４６タンパク質、線維症の素因の検出若しくは診断及び／又は予後予測方法、心臓又は腎線維症のモニター方法、線維症のモニター方法、可溶型ＣＤ１４６阻害剤、又は組成物。
【請求項２０】
請求項２に記載のＩ５−１３可溶型ＣＤ１４６タンパク質又はＩ１０−可溶型ＣＤ１４６タンパク質、請求項５から７のいずれかに記載のインビトロ又はエクスビボで線維症の素因を検出する若しくは診断する及び／又は予後予測する方法、請求項９又は１０に記載のインビトロ又はエクスビボで線維症をモニターする方法、請求項１３、１４又は１５に記載のＩ５−１３可溶性ＣＤ１４６阻害剤、又は請求項１９に記載の組成物であって、線維症は肺線維症である、可溶型ＣＤ１４６タンパク質、線維症の素因の検出若しくは診断及び／又は予後予測方法、線維症のモニター方法、可溶型ＣＤ１４６阻害剤、又は組成物。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される可溶型ＣＤ１４６タンパク質を含む組成物、又は配列番号９の前記Ｉ１０可溶型ＣＤ１４６タンパク質、及び対象における皮膚線維症及び／又は肺線維症の予防又は治療に使用するための薬学的に許容されるキャリア。
【国際調査報告】
2022502410.tif 000071
2022502410.tif 000072
2022502410.tif 000073