(57)【要約】本願では、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合することができるアプタマー；ＩｇＧタンパク質と共にＩｇＧ結合アプタマーを含む組成物；及び、それらを作り出す方法、及び、使用する方法を説明する。本願では、アプタマーに結合したタンパク質を放出する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６、１０〜１６、１８〜３４、３６〜４７、４８〜５７、６５〜６９、７１〜７４、７８、７９〜８４、８８〜９３、９６〜９８、１００〜１０２、及び、１０４〜１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含むアプタマーであって、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記アプタマー。
【請求項２】
配列番号４５、４６、及び、４７から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含むアプタマーであって、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記アプタマー。
【請求項３】
配列番号６９、７４、及び、７８から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含むアプタマーであって、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記アプタマー。
【請求項４】
配列番号１０６の核酸塩基配列、または、それに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含むアプタマーであって、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記アプタマー。
【請求項５】
前記アプタマーが、５０ｎＭを超える、または、１００ｎＭを超える、または、１５０ｎＭを超える、または、２００ｎＭを超える、または、２５０ｎＭを超える、または、３００ｎＭを超える親和性で、ＩｇＧに結合する、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記アプタマーが、８ｎＭ未満、または、７ｎＭ未満、または、６ｎＭ未満、または、５ｎＭ未満、または、４ｎＭ未満、または、３ｎＭ未満、または、２ｎＭ未満、または、１ｎＭ未満の親和性で、ＩｇＧに結合する、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項７】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンを、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択する、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項８】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンを、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、及び、５−（Ｎ−２−）ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）から選択する、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列の５’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列の３’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列の５’末端、及び、３’末端は、独立して、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１、２、３、または、４に記載のアプタマー。
【請求項１２】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項２または４に記載のアプタマー。
【請求項１３】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）である、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項１４】
前記アプタマーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４から選択するＩｇＧタンパク質に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１５】
前記アプタマーが、ヒトＩｇＧタンパク質、サルＩｇＧタンパク質、マウスＩｇＧタンパク質、ウシＩｇＧタンパク質、ヤギＩｇＧタンパク質、ヒツジＩｇＧタンパク質、及び、ウサギＩｇＧタンパク質から選択するＩｇＧタンパク質に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１６】
前記アプタマーが、長さが、少なくとも２７〜１００個のヌクレオチド（または、長さが、２７から、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または、１００個のヌクレオチド）である、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオシド間の結合が、ホスホロチオエートである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１９】
ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物であって、配列番号１〜６、１０〜１６、１８〜３４、３６〜４７、４８〜５７、６５〜６９、７１〜７４、７８、７９〜８４、８８〜９３、９６〜９８、１００〜１０２、及び、１０４〜１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記組成物。
【請求項２０】
ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物であって、配列番号４５、４６、及び、４７からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記組成物。
【請求項２１】
ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物であって、配列番号６９、７４、及び、７８からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記組成物。
【請求項２２】
ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物であって、配列番号１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、前記組成物。
【請求項２３】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンを、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択する、請求項１９、２０、２１、または、２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、及び、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）から選択する、請求項１９、２０、２１、または、２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列の５’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１９、２０、２１、または、２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列の３’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１９、２０、２１、または、２２に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列の５’末端、及び、３’末端は、独立して、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む、請求項１９、２０、２１、または、２２に記載の組成物。
【請求項２８】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項２０、または、２２に記載の組成物。
【請求項２９】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記アプタマーが、長さが、少なくとも２７〜１００個のヌクレオチド（または、長さが、２７から、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または、１００個のヌクレオチド）である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記アプタマーの核酸塩基配列での１つ以上のＰが、ウラシルである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項３２】
前記アプタマーの核酸塩基配列でのそれぞれのＰが、リンカーを介して、ピリミジン塩基のＣ−５位に共有結合しているナフチル置換基を含むＣ−５修飾ピリミジンである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項３３】
前記リンカーを、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカー、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する、請求項３２に記載のアプタマー。
【請求項３４】
前記アプタマーの１つ以上のＰ位置がウラシルである、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記アプタマーの核酸塩基配列でのそれぞれのＰが、リンカーを介して、ピリミジン塩基のＣ−５位に共有結合しているナフチル置換基を含むＣ−５修飾ピリミジンである、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記リンカーを、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカー、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
試料からＩｇＧタンパク質を精製する方法であって：
ａ）前記試料を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアプタマーとインキュベーションして、ＩｇＧタンパク質−アプタマー複合体を生成する；及び
ｂ）前記複合体からＩｇＧタンパク質を溶出する、ことを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記溶出を、ベンズアミジン、アルキルイミダゾリウム誘導体、または、それらの組み合わせの存在下で実施する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アルキルイミダゾリウム誘導体を、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、及び、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリドからなる群から選択する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
試料からＩｇＧタンパク質を精製する方法であって：
ａ）前記試料を、ＩｇＧタンパク質に対して親和性を有するアプタマーとインキュベーションして、ＩｇＧタンパク質−アプタマー複合体を生成する；及び
ｂ）ベンズアミジン、アルキルイミダゾリウム誘導体、または、それらの組み合わせの存在下で、前記複合体からＩｇＧタンパク質を溶出する、ことを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記アルキルイミダゾリウム誘導体が、共鳴構造：
【化１】
2022502069.tif 000031
式中、Ｒを、非置換アルキル、アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、前記共鳴構造を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒを、非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒを、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記アルキルイミダゾリウム誘導体を、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、及び、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリドからなる群から選択する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記アプタマーが、配列番号１〜６、１０〜１６、１８〜３４、３６〜４７、４８〜５７、６５〜６９、７１〜７４、７８、７９〜８４、８８〜９３、９６〜９８、１００〜１０２、及び、１０４〜１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含むアプタマーであって、前記アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記アプタマーの核酸塩基配列での１つ以上のＰが、ウラシルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アプタマーの核酸塩基配列でのそれぞれのＰが、リンカーを介して、ピリミジン塩基のＣ−５位に共有結合しているナフチル置換基を含むＣ−５修飾ピリミジンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記リンカーを、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカー、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
試料からタンパク質を精製する方法であって：
ａ）前記試料を、前記タンパク質に結合することができるアプタマーとインキュベーションして、タンパク質−アプタマー複合体を生成する；及び
ｂ）ベンズアミジン、アルキルイミダゾリウム誘導体、または、それらの組み合わせの存在下で、前記複合体からタンパク質を溶出する、ことを含む、前記方法。
【請求項５０】
前記アルキルイミダゾリウム誘導体が、共鳴構造：
【化２】
2022502069.tif 000032
式中、Ｒを、非置換アルキル、アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、前記共鳴構造を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｒを、非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
Ｒを、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記アルキルイミダゾリウム誘導体を、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、及び、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリドからなる群から選択する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記アプタマーが、少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジンを含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ヌクレオシドを含む前記Ｃ−５修飾ピリミジンを、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アプタマーが、検出可能な標識を含む、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記アプタマーが、固体支持体に結合している、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記アプタマーが、固体支持体に捕捉することが可能な結合ペアのメンバーを含む、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記アプタマーを、ビオチン化している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記固体支持体が、ストレプトアビジンを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質を、免疫グロブリンタンパク質、免疫グロブリンタンパク質のドメイン、抗体のＦｃ領域、抗体のＦａｂ領域、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥ、及び、ＩｇＧとＩｇＭから選択する、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１０月１５日に出願した米国仮出願第６２／７４５，５０３号、及び、２０１８年１０月２６日に出願した米国仮出願第６２／７５０，９５８号の優先権の利益を主張するものであり、それら出願の各々を、あらゆる目的で、それらの全内容を、参照により、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する配列表を含む。２０１９年１０月２日に作成した当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が２０１９−１０−１５＿０１ｌ３７−００２５−００ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが７５キロバイトである。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般的に、核酸の分野、より具体的には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）タンパク質に結合することができるアプタマー；ＩｇＧ結合アプタマーを含む組成物；及び、これらを作り出す方法、及び、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、無数の用途で利用されており、例えば、個別の治療法、ウエスタンブロット、蛍光顕微鏡法、及び、フローサイトメトリーでの検出方法に使用するモノクローナル抗体とＦｃ融合タンパク質などで利用されている。現在のところ、一般的に使用されているアフィニティークロマトグラフィー精製法である、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティーを使用して、ＩｇＧの精製が行われている。
【０００５】
アフィニティー精製のために抗体またはＦｃ融合タンパク質を捕捉するために、あるいは、その他の用途において抗体を検出するために、アプタマー試薬を使用することは好都合である。アプタマーは、タンパク質Ａと抗体に関する理想的な代替物を提供しており、そして、低分子量、換言すれば、結合標的モル数／グラムが大きい；安定性が大きい（温度とｐＨ条件の許容範囲、及び、非理想的な条件からの回復可能性を兼ね備えている）；特別な冷却を必要とせずに長期の貯蔵寿命が可能である；抗体が関係する問題を招きかねない凝集特性を持ち合わせていない；費用効果が高く、かつ、再現性のある生産が可能である；標的に対する特異性と親和性を大きくする可能性がある；及び、簡単に修飾ができるので、特定の標的または標的のクラスに対して「調整可能」である、などの幾つかの重要な利点を有する。本開示は、ＩｇＧ含有タンパク質に対して結合特異性を有するアプタマーを提供することで、そのような要望に応えるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一部の実施形態では、ＩｇＧ含有タンパク質に対する結合特異性を有するアプタマーを提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、アプタマーは、配列番号１〜６、１０〜１６、１８〜３４、３６〜４７、４８〜５７、６５〜６９、７１〜７４、７８、７９〜８４、８８〜９３、９６〜９８、１００〜１０２、及び、１０４〜１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、アプタマーは、配列番号４５、４６、及び、４７から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、アプタマーは、配列番号６９、７４、及び、７８から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、アプタマーは、配列番号１０６の核酸塩基配列、または、それに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。
【０００８】
一部の実施形態では、アプタマーは、５０ｎＭを超える、または、１００ｎＭを超える、または、１５０ｎＭを超える、または、２００ｎＭを超える、または、２５０ｎＭを超える、または、３００ｎＭを超える親和性で、ＩｇＧに結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、８ｎＭ未満、または、７ｎＭ未満、または、６ｎＭ未満、または、５ｎＭ未満、または、４ｎＭ未満、または、３ｎＭ未満、または、２ｎＭ未満、または、１ｎＭ未満の親和性で、ＩｇＧに結合する。
【０００９】
一部の実施形態では、アプタマーを、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択するヌクレオシドを含むＣ−５修飾ピリミジンを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、アプタマーは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、及び、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）から選択するヌクレオシドを含むＣ−５修飾ピリミジンを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、アプタマーのヌクレオチド配列の５’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。一部の実施形態では、アプタマーのヌクレオチド配列の３’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の５’末端、及び、３’末端は、独立して、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。
【００１２】
一部の実施形態では、アプタマーは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）であるヌクレオシドを含むＣ−５修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）であるヌクレオシドを含むＣ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーを提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、アプタマーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４から選択するＩｇＧタンパク質に結合する。一部の実施形態では、アプタマーは、ヒトＩｇＧタンパク質、サルＩｇＧタンパク質、マウスＩｇＧタンパク質、ウシＩｇＧタンパク質、ヤギＩｇＧタンパク質、ヒツジＩｇＧタンパク質、及び、ウサギＩｇＧタンパク質から選択するＩｇＧタンパク質に結合する。
【００１４】
一部の実施形態では、アプタマーは、長さが、少なくとも２７〜１００個のヌクレオチド（または、長さが、２７から、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または、１００個のヌクレオチド）である。
【００１５】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含むアプタマーを提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオシド間の結合が、ホスホロチオエートであるアプタマーを提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物を提供しており、当該アプタマーは、配列番号１〜６、１０〜１６、１８〜３４、３６〜４７、４８〜５７、６５〜６９、７１〜７４、７８、７９〜８４、８８〜９３、９６〜９８、１００〜１０２、及び、１０４〜１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物を提供しており、当該アプタマーは、配列番号４５、４６、及び、４７からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物を提供しており、当該アプタマーは、配列番号６９、７４、及び、７８からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それらに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質と、アプタマーとを含む組成物を提供しており、当該アプタマーは、配列番号１０６からなる群から選択する核酸塩基配列、または、それに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の同一性を有する核酸塩基配列を含み、当該アプタマーの核酸塩基配列でのＰを、独立して、それぞれの存在に関して、ピリミジン、及び、Ｃ−５修飾ピリミジンからなる群から選択する。一部の実施形態では、組成物を提供しており、アプタマーのＣ−５修飾ピリミジンを含むヌクレオシドを、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択する。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｃ−５修飾ピリミジンを、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、及び、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）から選択する。
【００１８】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーのヌクレオチド配列の５’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーのヌクレオチド配列の３’末端が、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、ヌクレオチド配列の５’末端、及び、３’末端は、独立して、１〜５０個のヌクレオチド（または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０個のヌクレオチド）をさらに含む。
【００１９】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーのＣ−５修飾ピリミジンを含むヌクレオシドは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、ヌクレオシドを含むＣ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）である。
【００２０】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーは、長さが、少なくとも２７〜１００個のヌクレオチド（または、長さが、２７から、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または、１００個のヌクレオチド）である。
【００２１】
一部の実施形態では、アプタマーを提供しており、当該アプタマーの核酸塩基配列での１つ以上のＰは、ウラシルである。一部の実施形態では、当該アプタマーの核酸塩基配列でのそれぞれのＰは、リンカーを介してピリミジン塩基のＣ−５位に共有結合したナフチル置換基を含むＣ−５修飾ピリミジンである。一部の実施形態では、リンカーを、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカー、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する。
【００２２】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーの１つ以上のＰ位置は、ウラシルである。
【００２３】
一部の実施形態では、ＩｇＧタンパク質とアプタマーを含む組成物を提供しており、当該アプタマーの核酸塩基配列でのそれぞれのＰは、リンカーを介してピリミジン塩基のＣ−５位に共有結合したナフチル置換基を含むＣ−５修飾ピリミジンである。一部の実施形態では、リンカーを、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカー、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する。
【００２４】
一部の実施形態では、試料からＩｇＧタンパク質を精製する方法を提供しており、当該方法は：ａ）当該試料を、ＩｇＧに結合することができるアプタマーとインキュベーションして、ＩｇＧタンパク質−アプタマー複合体を生成する；及び、ｂ）当該複合体からＩｇＧタンパク質を溶出する、ことを含む。一部の実施形態では、溶出を、ベンズアミジン、アルキルイミダゾリウム誘導体、または、それらの組み合わせの存在下で実施する。一部の実施形態では、アルキルイミダゾリウム誘導体が、共鳴構造：
【化１】
2022502069.tif 000003
式中、Ｒを、非置換アルキル、アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、構造を有する。一部の実施形態では、Ｒを、非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する。一部の実施形態では、Ｒを、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する。一部の実施形態では、アルキルイミダゾリウム誘導体を、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、及び、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリドからなる群から選択する。
【００２５】
一部の実施形態では、試料からタンパク質を精製する方法を提供しており、当該方法は：ａ）当該試料を、タンパク質に結合することができるアプタマーとインキュベーションして、タンパク質−アプタマー複合体を生成する；及び、ｂ）当該複合体からタンパク質を溶出する、ことを含む。一部の実施形態では、溶出を、ベンズアミジン、アルキルイミダゾリウム誘導体、または、それらの組み合わせの存在下で実施する。一部の実施形態では、アルキルイミダゾリウム誘導体が、共鳴構造：
【化２】
2022502069.tif 000004
式中、Ｒを、非置換アルキル、アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する、構造を有する。一部の実施形態では、Ｒを、非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する。一部の実施形態では、Ｒを、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び、ベンジルからなる群から選択する。一部の実施形態では、アルキルイミダゾリウム誘導体を、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、及び、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリドからなる群から選択する。
【００２６】
一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質−アプタマー複合体から溶出した後も、活性を保持している。
【００２７】
一部の実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、Ｃ−５修飾ピリミジンを含むヌクレオシドを、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、からなる群から選択する。
【００２８】
一部の実施形態では、アプタマーは、検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、アプタマーを、固体支持体に結合している。一部の実施形態では、アプタマーは、固体支持体に捕捉することが可能な結合ペアのメンバーを含む。一部の実施形態では、アプタマーを、ビオチン化している。一部の実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、タンパク質は免疫グロブリンタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質のドメインである。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体のＦｃ領域、または、抗体のＦａｂ領域である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＥ、及び、ＩｇＧ、または、ＩｇＭである。
【００３０】
本発明の前出の、及び、その他の目的、特徴、及び、利点は、添付した図面を参照しながら説明を進める以下の詳細な説明によって理解が深まることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】アプタマーに組み込み得る特定の例示的な５位の修飾ウリシル、及び、シトシン。
【図２】ウラシル、または、ウリジンの５位に存在し得る特定の例示的な修飾、及び、特定の例示的な修飾ウリジン。Ｃ−５修飾の化学構造として、修飾を、ウラシルまたはウリジンの５位に結合させる例示的なアミド結合がある。そこで示した５位部分として、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ、及び、ＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４−メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）、及び、ヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）がある。
【図３】シトシン、または、シチジンの５位に存在し得る特定の例示的な修飾、及び、特定の例示的な修飾シチジン。Ｃ−５修飾の化学構造として、修飾を、シトシンまたはシチジンの５位に結合させる例示的なアミド結合がある。そこで示した５位部分として、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ、及び、ＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び、２ＮＥ）、及び、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）がある。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
用語、及び、方法
特に断りが無い限り、技術用語を、慣例的な使い方で使用する。分子生物学での共通用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが出版したＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．が出版したＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及び、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．が出版したＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に認め得る。
【００３３】
本開示での様々な実施形態の確認を容易ならしめるために、特定の用語に関する説明を、以下に提供する：
【００３４】
アプタマー：本明細書で使用する用語「アプタマー」、「核酸リガンド」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、「修飾アプタマー」、及び、「クローン」は、互換可能であり、標的に対して望ましい作用を示す自然界には存在しない核酸のことを指す。望ましい作用として、標的に対して結合させること、標的を触媒的に変化させること、標的または標的の機能的活性を修飾または改変させるような方法で標的と反応させること、（自殺阻害剤で認められるような）標的に対して共有結合させること、及び、標的と別の分子との間の反応を促すことなどがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
一部の実施形態では、この作用は、標的分子に対する特異的な結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン／クリック塩基対形成、または、三重螺旋形成とは独立したメカニズムを介してアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子に結合する公知の生理学的機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーとして、核酸の候補混合物から同定する核酸があり、当該アプタマーは、当該標的のリガンドであり、同核酸を：（ａ）候補混合物と標的とを接触させて、候補混合物でのその他の核酸と比較して、標的に対して大きな親和性を示す核酸を、候補混合物の残余から分配可能にする；（ｂ）候補混合物の残余から親和性が大きな核酸を分配する；及び、（ｃ）親和性が大きな核酸を増幅して、リガンドに富んだ核酸の混合物を生成し、それにより、標的分子のアプタマーを同定する、ことを含む方法で同定する。親和性の相互作用は、程度の問題であると認識されている；しかしながら、この関連では、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」とは、一般的に、アプタマーが、混合物または試料でのその他の非標的成分に結合するよりも遙かに大きな度合いの親和性で、その標的に結合することを意味している。「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、または、「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する１つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、あらゆる適切な数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、そのような分子の複数のセットのことを指す。異なるアプタマーは、同数、または、異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡとし得るものであり、また、一本鎖、二本鎖、または、二本鎖または三本鎖領域を含み得る。一部の実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載した、または、当該技術分野で公知のＳＥＬＥＸプロセスを使用して調製する。
【００３６】
Ｃ−５修飾ピリミジン：本明細書で使用する用語「Ｃ−５修飾ピリミジン」とは、Ｃ−５位に修飾を有するピリミジンのことを指し、図１〜３に例示した部分があるが、これらに限定されない。Ｃ−５修飾ピリミジンの例として、米国特許第５，７１９，２７３号、及び、第５，９４５，５２７号に記載されているものがあるが、これらに限定されない。Ｃ−５修飾を含むヌクレオシドの例として：本明細書で例示した、ベンジルカルボキシアミド（あるいは、ベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいは、ナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいは、トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、フェネチルカルボキシアミド（あるいは、フェネチルアミノカルボニル）（Ｐｅ）、チオフェニルメチルカルボキシアミド（あるいは、チオフェニルメチルアミノカルボニル）（Ｔｈ）、及び、イソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選択する置換基によるデオキシウリジンのＣ−５位の置換があるが、これらに限定されない。
【００３７】
また、Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾は、２’−位の糖修飾、環外アミンでの修飾、及び、４−チオウリジンの置換などのその他のヌクレオシド修飾を、単独で、または、あらゆる組み合わせで、組み合わせ得る。
【００３８】
特定の代表的なＣ−５修飾ピリミジンとして：５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、または、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）がある。
【００３９】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成の前後のいずれかに修飾することができる。オリゴヌクレオチドでのヌクレオチドの配列に、１つ以上の非ヌクレオチド成分を割り込ませ得る。修飾オリゴヌクレオチドは、重合後に、例えば、あらゆる好適な標識化成分とのコンジュケーションなどで、さらに修飾し得る。
【００４０】
本明細書で使用する用語「少なくとも１つのピリミジン」とは、核酸の修飾を指す場合、核酸での１つの、幾つかの、または、全てのピリミジンのことを指し、核酸でのいずれか、または、全ての存在するＣ、Ｔ、または、Ｕのいずれか、または、全てを修飾し得る、または、修飾し得ないことを示す。
【００４１】
ＩｇＧアプタマー：本明細書で使用するＩｇＧアプタマーとは、ＩｇＧタンパク質に結合することができるアプタマーのことを指しており、総ＩｇＧ、１つ以上の個々のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４）、ＩｇＧ  Ｆｃ領域、及び、抗体との関連でペアを形成し得るカッパ軽鎖定常領域、または、ラムダ軽鎖定常領域などの軽鎖定常領域とペアにしたＩｇＧ対などがある。ＩｇＧアプタマーは、これらのサブクラス、及び／または、領域のそれぞれに対して特異性を示し得る、あるいは、サブクラス、及び／または、領域のすべて、または、サブセットに対して結合し得る。
【００４２】
コンセンサス配列：本明細書で使用するコンセンサス配列は、配列アラインメントの対象となる一連の核酸配列のそれぞれの位置で最も頻繁に認められるヌクレオチドを表す核酸塩基配列のことを指す。
【００４３】
阻害する：本明細書で使用する阻害するとの用語は、ペプチドまたはポリペプチドが、測定可能な活性もしくは生物活性を、もはや持たない程度にまで、ペプチドまたはポリペプチドの発現を妨げる、または、抑制すること；または、ペプチドまたはポリペプチドが、測定可能な活性もしくは生物活性を、もはやもたない程度にまで、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を抑制する、及び／または、その活性を抑制する、または、ブロックする、ことを意味する。
【００４４】
調節する：本明細書で使用する調節するとの用語は、ペプチド、タンパク質、または、ポリペプチドの発現レベルを、リファレンス発現レベルと比較して、その発現レベルを増減させて変更すること、及び／または、ペプチド、タンパク質、または、ポリペプチドの安定性、及び／または、活性を、リファレンス安定性、及び／または、活性レベルと比較して、その安定性、及び／または、活性レベルを増減させて変更させる、ことを意味する。
【００４５】
医薬として許容可能な塩：本明細書で使用する化合物（例えば、アプタマー）の医薬として許容可能な塩または塩とは、イオン結合を含有しており、一般的には、化合物と、個体への投与に好適な酸または塩基のいずれかを反応させて作り出す産物のことを指す。医薬として許容可能な塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び、酒石酸塩などの酸付加塩；Ｌｉ、Ｎａ、Ｋなどのアルカリ金属カチオン、ＭｇまたはＣａなどのアルカリ土類金属塩、または、有機アミン塩などがあるが、これらに限定されない。
【００４６】
医薬組成物：本明細書で使用する医薬組成物とは、個体への投与に好適な形態のアプタマー含む製剤のことを指す。医薬組成物は、一般的には、その意図する投与経路に適合するように製剤する。投与経路の例として、経口、及び、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、及び、直腸投与があるが、これらに限定されない。
【００４７】
ＳＥＬＥＸ：本明細書で使用する用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ法」は、本明細書では、互換可能に使用しており、一般的に（１）所望の様式で、例えば、タンパク質に対して大きな親和性で結合する様式で標的分子と相互作用するアプタマーの選択と、（２）選択したそれら核酸の増幅との組み合わせのことを指す。ＳＥＬＥＸプロセスは、特定の標的、または、バイオマーカーに対して親和性が大きなアプタマーを同定するために使用することができる。
【００４８】
配列同一性：本明細書で使用する配列同一性とは、２つ以上の核酸配列の間において、それらの配列が共有する同一ヌクレオチド位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入する必要があるギャップの数、それに、それぞれのギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較、及び、２つ以上の配列の間でのパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、及び、ギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムなどを、それらのデフォルトパラメーターで使用して達成することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴでのＢＬＡＳＴＮも参照されたい）。配列比較のために、一般的には、１つの配列が、試験配列を比較するリファレンス配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列とリファレンス配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムを、指定プログラムパラメーターに基づいてリファレンス配列と比較して、試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を算出する。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及び、ＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターでの実行、または、目視検査（一般的には、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅが出版したＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）を参照されたい）によって、実施することができる。本明細書で使用するアプタマーなどの核酸のパーセント同一性とは、その配列が、リファレンスヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、約９５％同一である場合、核酸配列が、リファレンス核酸配列のそれぞれ１００個のヌクレオチド当たり最大で５つの点変異を含み得ることを除けば、核酸配列がリファレンス配列と同一である、ことを意図している。換言すれば、核酸配列が、リファレンス核酸配列と少なくとも約９５％が同一である所望の核酸配列を得るためには、リファレンス配列でのヌクレオチドの最大で５％を欠失する、または、別のヌクレオチドで置換する、または、リファレンスでのヌクレオチド総数の最大で５％に相当する数のヌクレオチドを、リファレン���配列に挿入する（本明細書では挿入と称する）。所望の配列を生成するためのリファレンス配列でのこれらの変異は、リファレンス配列のヌクレオチドの間で個々に、または、リファレンス配列内で１つ以上の隣接する群で散在させて、リファレンスヌクレオチド配列の５’末端または３’末端位置、または、これらの末端位置の間のいずれかの箇所に存在させ得る。
【００４９】
ＳＯＭＡｍｅｒ：本明細書で使用するＳＯＭＡｍｅｒ、または、緩慢なオフ速度修飾アプタマーの用語は、改善したオフ速度特性を有するアプタマーのことを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、参照により、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」である米国特許第７，９４７，４４７号明細書に記載されている改善したＳＥＬＥＸ方法で選択することができる。一部の実施形態では、緩慢なオフ速度アプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーなど）は、≧２分、≧４分、≧５分、≧８分、≧１０分、≧１５分≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または、≧２４０分のオフ速度（ｔ１／２）を有する。
【００５０】
スペーサー配列：本明細書で使用するスペーサー配列とは、アプタマーの核酸配列の５’末端、３’末端、５’及び３’末端の両方、及び／または、ヌクレオチドの間で共有結合した小分子（複数可）からなる、あらゆる配列のことを指す。例示的なスペーサー配列として、ポリエチレングリコール、炭化水素鎖、及び、アプタマー結合活性を維持しながら、コンセンサス領域を接続する分子共有結合足場を提供するその他のポリマー、または、コポリマーがあるが、これらに限定されない。特定の態様では、スペーサー配列は、末端３’または５’ヒドロキシル、２’炭素などの標準的な結合、または、ピリミジンのＣ５位、または、プリンのＣ８位などの塩基修飾を介して、アプタマーに共有結合し得る。
【００５１】
標的分子：本明細書で使用する標的分子（または、標的）とは、核酸が所望の方法で作用する（例えば、標的に対して結合する、標的を触媒的に変化させる、標的または標的の機能的活性を修飾または改変させるような方法での標的との反応させる、（自殺阻害剤で認められるような）標的に対して共有結合すること、及び、標的と別の分子との間の反応を促す）ことができる、あらゆる化合物または分子のことを指す。標的分子の例として、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、増殖因子、細胞、組織、及び、前述したいずれかのあらゆる断片または部分があるが、これらに限定されない。事実上、あらゆる化学的または生物学的エフェクターが、適切な標的となり得る。あらゆるサイズの分子を、標的として使用することができる。また、標的と核酸との間の相互作用の可能性または強度を高めるために、標的を、特定の方法で改変することもできる。また、特定の化合物または分子のあらゆる些細な変化、例えば、タンパク質の事例では、そのアミノ酸配列の変化、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識成分とのコンジュケーションなど、分子の同一性を実質的に改変しないその他の操作または修飾も標的は含み得る。「標的分子」または「標的」とは、１つのタイプまたは種の分子、または、アプタマーに結合することができる多分子構造の一連のコピーである。「標的分子」または「標的」とは、そのような分子の複数のセットのことを指す。
【００５２】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び、「ｔｈｅ」は、特に断りが無い限り、複数の事項をも指す。本明細書で使用する「ａ」及び「ａｎ」は、列挙した「１つ以上」の構成要素を指す、ことを理解されたい。「ＡまたはＢを含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」とは、Ａ、または、Ｂ、または、Ａ及びＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドについて与える、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び、すべての分子量または分子量値は、概算であり、そして、説明のために提供をしている、ことを理解されたい。
【００５３】
本明細書で提供する範囲は、その範囲内のすべての値の省略表現である、ことを理解されたい。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、５０のあらゆる数、それらの数の組み合わせ、または、部分範囲（ならびに、特に断りが無い限り、その分数）を含む、ものと理解されたい。あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または、整数範囲は、特に断りが無い限り、列挙する範囲内のあらゆる整数値、ならびに、適切であれば、その分数値（整数の１０分の１、及び、１００分の１など）を含む、ものと理解されたい。また、あらゆる物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズ、または、厚みなどに関する、本明細書で列挙するあらゆる数値範囲も、特に断りが無い限り、列挙した範囲内のいずれの整数も含む、ものと理解されたい。本明細書で使用する用語「約」は、特に断りが無い限り、示した範囲、値、または、構造の±２０％のことを意味する。本明細書で使用する用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、及び、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、オープンエンド形式であり、そして、同義語として使用する。
【００５４】
本明細書に記載したものと類似する、または、同等の方法、及び、材料を、本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法、及び、材料を、以下に説明する。本明細書で引用するすべての刊行物、特許出願、特許、及び、その他の参考文献は、参照により、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。矛盾がある場合には、用語の説明を含めて、本明細書を優先する。加えて、材料、方法、及び、実施例は例示目的のものにすぎず、限定は意図していない。
【００５５】
ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸは、一般的には、核酸の候補混合物を調製すること、当該候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、当該親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、当該核酸を当該親和性複合体から分離及び単離すること、当該核酸を精製すること、及び、特異的アプタマー配列を同定すること、を含む。このプロセスは、選択したアプタマーの親和性をさらに改良するために複数回行い得る。このプロセスは、プロセスにおいて１回以上の時点において、増幅ステップを含み得る。例えば、発明の名称が「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用することができる。例えば、発明の名称が「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
【００５６】
ＳＥＬＥＸプロセスは、改善した特性、例えば、改善したインビボ安定性、または、改善した送達特性などをアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する親和性の大きなアプタマーを同定するために使用することができる。このような修飾の例として、リボース位置、及び／または、リン酸位置、及び／または、塩基位置での化学的置換がある。ＳＥＬＥＸプロセスで同定する修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、発明の名称が「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」である米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、そこでは、ピリミジンの５’位、及び、２’位で化学的に修飾したヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載がされている。前出の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾した１つ以上のヌクレオチドを含有する優れた特異性を有するアプタマーについて記載している。拡大した物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリー、ならびに、ＳＥＬＥＸ、及び、ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸでのそれらの使用について記載している、発明の名称が「ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」である米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照されたい。
【００５７】
また、ＳＥＬＥＸは、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。標的分子に結合することができるアプタマーを生成するための改善したＳＥＬＥＸ方法を記載しており、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」である米国特許出願公開第２００９０００４６６７号を参照されたい。前出の通り、これらの緩慢なオフ速度アプタマーは、「ＳＯＭＡｍｅｒ」としても公知である。解離速度がさらに小さいアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ、及び、光アプタマー、または、ＳＯＭＡｍｅｒを、それらの標的分子のそれぞれから作り出す方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸−標的複合体を形成させること、及び、緩慢なオフ速度濃縮プロセスを実効することを含み、解離速度が大きな核酸−標的複合体が解離して再形成することはないが、解離速度が小さい複合体はインタクトなままである。加えて、この方法は、候補核酸混合物の生産で修飾ヌクレオチドを使用して、改善したオフ速度性能を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを生成する、ことを含む。
【００５８】
このアッセイの変形は、アプタマーが、それらの標的分子と共有結合する、または、「光架橋する」ことを可能ならしめる光反応性官能基を含むアプタマーを用いる。例えば、発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称する。例えば、発明の名称がいずれも「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び、米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい；また、例えば、発明の名称が「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーが、それらの標的分子と結合する機会を得た後に、光アプタマーを光活性化し、そして、固体支持体を洗浄してあらゆる非特異的結合分子を除去する。光アプタマーに結合する標的分子は、光アプタマーでの光活性化官能基（複数可）が作り出す共有結合であるため、通常は除去されないので、徹底した洗浄条件を使用し得る。
【００５９】
これらのアッセイ形式の両方で、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒは、試料と接触させる前に、固体支持体に固定する。しかしながら、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定は、最適なアッセイを提供し得ない。例えば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを予め固定すると、固体支持体表面でのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒと標的分子との混合が非効率的となりかねず、おそらくは、このことが、反応時間の長期化を招き、それ故に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒと、それらの標的分子との効率的な結合を可能ならしめるためのインキュベーション時間を長くする。さらに、光アプタマーまたはｐｈｏｔｏＳＯＭＡｍｅｒを、アッセイにおいて、かつ、固体支持体として利用する材料に応じて使用する場合、固体支持体は、光アプタマーまたはｐｈｏｔｏＳＯＭＡｍｅｒと、それらの標的分子との間に共有結合を形成するために使用する光を、散乱させる、または、吸収する傾向を示し得る。さらに、使用する方法に応じて、標的分子を、それらのアプタマーまたはｐｈｏｔｏＳＯＭＡｍｅｒに結合させて検出することは、固体支持体の表面が、使用するあらゆる標識薬剤にも曝露されて、これらの影響を受ける場合もあり得るので、対象を不正確なものにしかねない。最後に、固体支持体でのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定は、一般的には、試料に対するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの曝露前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ調製ステップ（すなわち、固定）を含んでおり、そして、この調製ステップは、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの活性または官能性に影響を及ぼし得る。
【００６０】
ＳＯＭＡｍｅｒが、溶液において、その標的を捕捉し、次いで、ＳＯＭＡｍｅｒ−標的混合物の特定の成分を検出前に除去する、ことが可能になるようにデザインした分離ステップを用いるＳＯＭＡｍｅｒアッセイも記載されている（発明の名称が、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｓｔ  Ｓａｍｐｌｅｓ」である米国特許出願公開第２００９００４２２０６号を参照されたい）。ここで記載しているＳＯＭＡｍｅｒアッセイ方法は、核酸（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を検出及び定量することで、試験試料での非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量を可能にする。ここで記載している方法は、非核酸標的を検出及び定量する核酸代用物（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を作り出し、それにより、増幅を含む多種多様な核酸技術を、タンパク質標的など、より広範囲な所望の標的に適用することを可能ならしめる。
【００６１】
標的をペプチドとしたＳＥＬＥＸプロセスの実施形態は、発明の名称が「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」である米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。この事例では、標的は、ＩｇＧタンパク質である。
【００６２】
化学修飾アプタマー
アプタマーは、その特性及び特徴を改善する修飾ヌクレオチドを含み得る。このような改善の例として、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または、送達特性の改善があるが、これらに限定されない。
【００６３】
そのような修飾の例として、ヌクレオチドのリボース位置、及び／または、リン酸位置、及び／または、塩基位置での化学的置換がある。ＳＥＬＥＸプロセスで同定する修飾ヌクレオチドを含むアプタマーは、発明の名称が「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」である米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、そこでは、ピリミジンの５’位、及び、２’位で化学的に修飾したヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載されている。前出の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾した１つ以上のヌクレオチドを含有している、優れた特異性を有するアプタマーを記載している。発明の名称が、「ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」であり、改善した物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリーと、ＳＥＬＥＸ及びｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸでのそれらの使用について記載している米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照されたい。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、または、デオキシリボヌクレオチド、または、その修飾形態、ならびに、その類似体のことを指す。ヌクレオチドとして、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、及び、それらの誘導体、及び、類似体）、ならびに、ピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及び、それらの誘導体、及び、類似体）を含む種がある。本明細書で使用する用語「シチジン」とは、特に断りが無い限り、一般的には、シトシン塩基を含む、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または、修飾リボヌクレオシドを指すために使用する。用語「シチジン」として、２’−フルオロ、２’−メトキシなどの２’−修飾シチジンがある。同様に、「修飾シチジン」、または、特定の修飾シチジンとは、特に断りが無い限り、修飾シトシン塩基を含む、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または、修飾リボヌクレオシド（２’−フルオロ、２’−メトキシなど）のことも指す。用語「ウリジン」とは、特に断りが無い限り、一般的には、ウラシル塩基を含む、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または、修飾リボヌクレオシドを指すために使用する。用語「ウリジン」は、２’−フルオロ、２’−メトキシなどの２’−修飾ウリジンを含む。同様に、「修飾ウリジン」、または、特定の修飾ウリジンは、特に断りが無い限り、修飾ウラシル塩基を含む、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または、修飾リボヌクレオシド（２’−フルオロ、２’−メトキシなど）のことも指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「５−位修飾シチジン」、または、「Ｃ−５修飾シチジン」とは、シトシン塩基のＣ−５位置に修飾を有するシチジンのことを指す。本明細書で使用する用語「Ｃ−５修飾カルボキサミドシチジン」、または、「シチジン−５−カルボキサミド」とは、シトシン塩基のＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾を有するシチジンのことを指すものであり、本明細書で例示した部分（ＲＸ１）があるが、これらに限定されない。例示的なＣ−５修飾カルボキサミドシチジンとして、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＢｎｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＥｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＰｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮａｐｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮａｐｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮＥｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮＥｄＣ」と称する、そして、図３に示している）；及び、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＴｙｒｄＣと称する、そして、図３に示している）があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃ−５修飾シチジン、例えば、それらの三リン酸形態は、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）でオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。
【００６６】
また、本明細書に記載したＣ−５修飾シチジンの化学修飾は、単独で、または、あらゆる組み合わせで、２’位の糖修飾、環外アミンでの修飾、及び、４−チオシチジンの置換などと組み合わせることができる。
【００６７】
本明細書で使用する用語「５−位修飾シトシン」または「Ｃ−５修飾シトシン」とは、シトシンのＣ−５位置に修飾を有するシトシン塩基のことを指す。本明細書で使用する用語「Ｃ−５修飾カルボキサミドシトシン」、または、「シトシン−５−カルボキサミド」とは、シトシンのＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾を有するシトシン塩基のことを指すものであり、本明細書で例示した部分（ＲＸ１）があるが、これらに限定されない。例示的なＣ−５修飾カルボキサミドシトシンとして、図３に示す修飾シトシンがあるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で使用する用語「Ｃ−５修飾ウリジン」、または、「５−位修飾ウリジン」とは、ウラシル塩基のＣ−５位置で修飾したウリジンまたはデオキシウリジンのことを指す。一部の実施形態では、ウリジン、または、デオキシウリジンは、例えば、図２に示したように、ウラシル塩基のＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾を有する。一部の実施形態では、Ｃ−５修飾ウリジン、例えば、それらの三リン酸形態は、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）でオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。例示的な５−位修飾ウリジンとして：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンがあるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「修飾する」、「修飾した」、「修飾」、及び、そのあらゆる変化形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用する場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及び／または、Ｃなど）の少なくとも１つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体、または、エステルであることを意味する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドよりも大きなヌクレアーゼ耐性を有する。さらなる修飾として、主鎖修飾、メチル化、珍しい塩基対の組み合わせ、例えば、イソ塩基のイソシチジンと、イソグアニジンなどがある。修飾として、キャッピングなどの３’及び５’修飾もある。その他の修飾として、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾、及び、荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、そして、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）による修飾などがある。さらに、通常は、ヌクレオチドの糖に存在するヒドロキシル基のいずれでも、ホスホネート基、または、リン酸基で置換し得る；標準的な保護基で保護し得る；または、さらなるヌクレオチド、または、固体支持体へのさらなる連結を調製するために活性化し得る。５’末端、及び、３’末端のＯＨ基は、リン酸化し得るものであり、または、アミン、約１〜約２０の炭素原子の有機キャッピング基部分、一部の実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または、その他の親水性もしくは疎水性生体ポリマー、または、合成ポリマーで置換し得る。
【００７０】
本明細書で使用する用語「疎水性基」及び「疎水性部分」は、本明細書では互換的に使用しており、そして、非荷電、及び／または、小さな双極子を有する、及び／または、基または部分が水から反発する傾向がある、あらゆる基または部分のことを指す。これらの基または部分は、例えば、芳香族炭化水素、または、平面構造芳香族炭化水素を含み得る。疎水性を決定する方法、または、分子（または、基、または、部分）が疎水性であるか否を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、経験的に導き出した方法、ならびに、計算方法がある。例示的な方法は、Ｚｈｕ  Ｃｈｏｎｇｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｖｉａ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎｇｌｅ  ｏｆ  ａ  ｗａｔｅｒ  ｎａｎｏｄｒｏｐｌｅｔ  ｏｎ  ｐｌａｎａｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １１３（４６）  ｐｇｓ．  １２９４６−１２９５１に記載されている。本明細書に開示したように、例示的な疎水性部分として、図１のグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ、及び、ＸＶＩがあるが、これらに限定されない。さらに例示的な疎水性部分として、図２の部分がある（例えば、Ｂｎ、Ｎａｐ、ＰＥ、ＰＰ、ｉＢｕ、２Ｎａｐ、Ｔｒｙ、ＮＥ、ＭＢｎ、ＢＦ、ＢＴ、Ｔｒｐ）。
【００７１】
本明細書で使用する用語「タンパク質」は、「ペプチド」、及び、「ポリペプチド」と同義に使用する。「精製した」ポリペプチド、タンパク質、または、ペプチドは、アミノ酸配列を取得する細胞、組織、または、無細胞源由来の細胞物質、または、その他の汚染タンパク質を実質的に含まず、または、化学的に合成する場合は、化学前駆体、または、その他の化学物質を実質的に含まない。
【００７２】
本明細書で使用する用語「核酸」とは、ＤＮＡ、及び／または、ＲＮＡ、及び／または、それらの類似体を含むあらゆる核酸配列のことを指しており、そして、一本鎖、二本鎖、及び、多本鎖の形態を含む。本明細書で使用する用語「核酸」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」、及び、「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを指すために互換的に使用しており、そして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及び、これらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド、及び、ポリヌクレオチドの修飾があり、あらゆる位置でのヌクレオチド単位に対する様々な物質または部分の付着を含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び、「核酸」として、二本鎖、または、一本鎖分子、ならびに、三重螺旋分子がある。核酸、オリゴヌクレオチド、及び、ポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広範な用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及び、ポリヌクレオチドの用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及び、ポリヌクレオチドが、アプタマーに限定されることはない。
【００７３】
また、ポリヌクレオチドは、一般的に、当該技術分野において公知のリボース、または、デオキシリボース糖類の類似形態も含んでおり、同類似形態として、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−フルオロ、２’−ＮＨ２、または、２’−アジド、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、または、リキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び、脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドなどがある。本明細書に記載した通り、１つ以上のホスホジエステル連結を、代替連結基で置換し得る。これらの代替連結基として、リン酸塩を、ホスホロチオエート、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲＸ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）ＲＸ、Ｐ（Ｏ）ＯＲＸ’、ＣＯ、または、ＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換する実施形態があり、式中、それぞれのＲＸまたはＲＸ’は、独立して、Ｈである、または、エーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、または、アラルジルを任意に含む置換した、または、置換していないアルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である。ポリヌクレオチドでのすべての連結を、同一にする必要はない。糖類、プリン、及び、ピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド主鎖などの代替主鎖構造にすることができるので、最終産物をデザインする上で有利になる。
【００７４】
存在する場合、ポリマーを構築する前後に、ヌクレオチド構造に対して修飾を施すことができる。ヌクレオチドの配列を、非ヌクレオチド成分で分断することができる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュケーションなどで、重合後にさらに修飾することができる。
【００７５】
本明細書で核酸の修飾を指す場合に使用する用語「少なくとも１つのヌクレオチド」とは、核酸での１つ、幾つか、または、すべてのヌクレオチドのことを指し、核酸でのＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、または、Ｕの修飾の有無は問わない。
【００７６】
本明細書で使用する単一タイプの５−位修飾ピリミジン、または、Ｃ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーという用語は、「単一修飾アプタマー」、「単一修飾塩基」を有するアプタマー、「単一塩基修飾」を有するアプタマー、または、「修飾した単一塩基」のことを指しており、これらを、すべて互換可能に使用する。アプタマーのライブラリー、または、アプタマーライブラリーも、同じ術語を使用し得る。
【００７７】
本明細書で使用する２つの異なるタイプの５−位修飾ピリミジン（または、Ｃ−５修飾ピリミジン）を含むアプタマーという用語は、「二重修飾アプタマー」、「２つの修飾塩基」を有するアプタマー、「２つの塩基修飾」を有するアプタマー、または、「修飾した２つの塩基」、「二重に修飾した塩基」を有するアプタマーのことを指しており、これらを、すべて互換可能に使用する。アプタマーのライブラリー、または、アプタマーライブラリーも、同じ術語を使用し得る。したがって、一部の実施形態では、アプタマーは、２つの異なる５−位修飾ピリミジンを含んでおり、２つの異なる５−位修飾ピリミジンを含むヌクレオシドを、ＮａｐｄＣとＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣとＰＰｄＵ、ＮａｐｄＣとＭＯＥｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｈｒｄＵ、ＰＰｄＣとＰＰｄＵ、ＰＰｄＣとＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣとＭＯＥｄＵ、ＰＰｄＣとＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣとＴｈｒｄＵ、ＮａｐｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣとＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＮａｐｄＵ、及び、２ＮａｐｄＣと２ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＰＰｄＵ、２ＮａｐｄＣとＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣとＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣとＴｒｐｄＵ、ＰＰｄＣとＴｙｒｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵ、ＴｒｙｄＣと２ＮａｐｄＵ、ＴｙｒｄＣとＰＰｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｒｐｄＵ、ＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵ、及び、ＴｙｒｄＣとＴｙｒｄＵから選択する。一部の実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの修飾ウリジン、及び／または、チミジンと、少なくとも１つの修飾シチジンを含み、少なくとも１つの修飾ウリジン、及び／または、チミジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及び、ベンゾフラニル部分から選択する部分で５位を修飾しており、そして、少なくとも１つの修飾シチジンは、ナフチル部分、チロシル部分、及び、ベンジル部分から選択する部分で５位を修飾している。特定の実施形態では、この部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及び、スルホンリンカーから選択する基を含むリンカーを介して、延期の５位に共有結合する。
【００７８】
特定の実施形態では、アプタマーは、第１の５−位修飾ピリミジン、及び、第２の５−位修飾ピリミジンを含み、第１の５−位修飾ピリミジンは、第１の５−位修飾ピリミジンの５位にトリオシル部分を含み、そして、第２の５−位修飾ピリミジンは、第２の５−位修飾ピリミジンの５位にナフチル部分またはベンジル部分を含む。関連する実施形態では、第１の５−位修飾ピリミジンは、ウラシルである。関連する実施形態では、第２の５−位修飾ピリミジンは、シトシンである。関連する実施形態では、アプタマーの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％のウラシルを、５位で修飾している。関連する実施形態では、アプタマーの少なくとも１０％、１５％，２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％、または、１００％のシトシンを、５位で修飾している。
【００７９】
例示的なＮａｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【化３】
2022502069.tif 000005
【００８０】
例示的な２ＮａｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【化４】
2022502069.tif 000006
【００８１】
例示的なＰＰｄＵ構造（５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【化５】
2022502069.tif 000007
【００８２】
例示的なＴｒｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（３−インドール−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【化６】
2022502069.tif 000008
【００８３】
例示的な２ＮＥｄＵ構造５−［Ｎ−（２−ナフチル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【化７】
2022502069.tif 000009
【００８４】
ＩｇＧを検出する方法
一部の実施形態では、試料に含まれるＩｇＧを検出する方法を提供しており、同方法は、試料を、本明細書に記載したアプタマーと接触させることを含む。一部の実施形態では、ＩｇＧを検出または定量する方法を提供しており、同方法は、ＩｇＧを含む試料、または、ＩｇＧを含むものと推測される試料を、本明細書に記載したアプタマーと接触させることを含む。一部の実施形態では、試料に含まれるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／または、ＩｇＧ４を互いに区別する方法を提供しており、同方法は、試料を、本明細書に記載したアプタマーと接触させることを含む。一部の実施形態では、当該方法は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で、試料を、本明細書に記載したＩｇＧアプタマーと接触させることを含む。ＩｇＧアプタマーが結合したＩｇＧの検出、及び／または、定量は、当該技術分野での方法、及び／または、本明細書に記載した方法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、ＩｇＧアプタマーは、検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、ＩｇＧアプタマーを、固体支持体に結合する、または、固体支持体に捕捉し得る結合ペアのメンバーを含む（例えば、ビオチン化アプタマーは、ストレプトアビジンを含む固体支持体に結合し得る）。
【００８５】
ＩｇＧアプタマー組成物を含むキット
本開示は、本明細書に記載したＩｇＧアプタマーのいずれかを含むキットを提供する。このようなキットは、例えば、（１）少なくとも１つのＩｇＧアプタマー；及び、（２）少なくとも１つの固体支持体を含むことができる。さらなるキットの要素として、任意に、例えば：（１）あらゆる安定剤、緩衝剤など、及び、（２）キット要素を保持、及び／または、混合するための少なくとも１つの容器、バイアル、または、類似の機器を含むことができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、特定の機能、及び／または、実施形態を説明するために提供している。これらの実施例に起因して、そこに記載した特定の特徴または実施形態の開示に限定するものと解釈すべきではない。
【００８７】
実施例１：
ＩｇＧに結合するアプタマーを同定するための２つの手法を使用した。まず、（ＩｇＧ）Ｆｃ融合タンパク質をもたらす既存のアプタマー配列を、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合するアプタマーについてスクリーニングした。ＩｇＧバインダーを探し出すために、異なるＦｃ融合タンパク質に結合するアプタマーのＳＥＬＥＸを使用して同定したアプタマー配列を整列させて、アプタマー配列データベース全体で共通の配列パターンを同定した。個々の標的タンパク質のそれぞれに共通の配列パターンは、一般的には、異なるタンパク質標的が、異なるアプタマー配列をもたらすので、Ｆｃ  ＩｇＧバインダーである可能性がある（すなわち、配列の共通性は、Ｆｃ  ＩｇＧ融合領域の存在に起因する可能性が大きい）。
【００８８】
関連する第２の手法では、公知のＦｃ  ＩｇＧバインダーを使用して、ＳｏｍａＬｏｇｉｃアプタマー配列データベースを検索し、一般的な配列、または、配列モチーフを同定した。
【００８９】
両方の手法の結果を組み合わせて、共通の配列をさらに同定した。３つの配列パターンを同定し、そして、ＩｇＧに対する結合親和性についてさらに調査した。結合親和性に基づいて、３つのアプタマー配列を、ＩｇＧに対する結合親和性についてさらに分析し、そして、切断型の分析を行って、最小配列のＩｇＧバインダーを同定した。
【００９０】
実施例２：
５４０６−５６＿３；５３３４−８＿３、及び、１４１２５−１４４＿３アプタマーファミリーの全長５０−マー配列と、切断型配列に関するＩｇＧ結合親和性（または、解離定数；Ｋｄ）を決定し、そして、それぞれのアプタマーファミリーについて、ＩｇＧに結合することができる最小の配列長を同定するために当該結合親和性を使用した。
【００９１】
簡潔に説明すると、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、または、Ｚｏｒｂａｘビーズ分配のいずれかを使用して、それぞれのアプタマーの解離定数（Ｋｄ）を測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌアッセイに関しては、放射性標識アプタマーを、ＳＢ１７（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ）で、３分間かけて、９５℃にまで加熱し、そして、３７℃まで緩慢に冷却して再生した。約４０ｐＭのアプタマーを、様々な濃度の標的タンパク質（最終最高濃度は、５００ｎＭ、または、１００ｎＭのいずれか）を含むＳＢ１７と混合し、そして、３７℃でインキュベーションして、アプタマー−標的タンパク質複合体を形成した。それぞれの反応の１２分の１を、ナイロンメンブレンに転写し、そして、乾燥させて、それぞれの反応の総数を測定した。５５μｇのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、５５μＬの１０ｍＭ  ＤｘＳＯ４（デキストラン硫酸）を、それぞれの反応の残余の部分に加え、そして、３７℃で、５分間混合した。次いで、反応の３分の２を、真空下で、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＶ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して、タンパク質結合複合体を、非結合アプタマーから分離し、そして、１００μＬ  ＳＢ１７で洗浄した。ナイロンメンブレンとＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＶ  Ｐｌａｔｅｓをホスホロイメージ化し、そして、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ７０００  ＩＰを使用して、それぞれの試料の放射能の量を測定した。捕捉したアプタマーの割合を、タンパク質濃度の関数としてプロットし、そして、非線形曲線適合アルゴリズムを使用して、データから解離定数（または、Ｋｄ値）を決定した。ＩｇＧ１、２、３、及び、４；カッパ、及び、ＩｇＧ１マウスタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌビーズを使用して測定した。その他のすべてのタンパク質は、Ｚｏｒｂａｘビーズを使用して測定した。
【００９２】
Ｚｏｒｂａｘアッセイに関しては、放射性標識アプタマーを、ＳＢ１８で、３分間かけて、９５℃にまで加熱し、そして、３７℃まで緩慢に冷却して再生した。約４０ｐＭのアプタマーを、様々な濃度の標的タンパク質（最終最高濃度は、５００ｎＭ、または、１００ｎＭのいずれか）を含むＳＢ１８（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ）と混合し、そして、３７℃でインキュベーションして、アプタマー−標的タンパク質複合体を形成した。それぞれの反応の１２分の１を、ナイロンメンブレンに転写し、そして、乾燥させて、それぞれの反応の総数を測定した。２．２μｇのＺｏｒｂａｘビーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を加えた。次いで、反応の３分の２を、真空下で、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＶ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して、タンパク質結合複合体を、非結合アプタマーから分離し、そして、１８５μＬ  ＳＢ１８で洗浄した。ナイロンメンブレンとＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＶ  Ｐｌａｔｅｓをホスホロイメージ化し、そして、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ７０００  ＩＰを使用して、それぞれの試料の放射能の量を測定した。捕捉したアプタマーの割合を、タンパク質濃度の関数としてプロットし、そして、非線形曲線適合アルゴリズムを使用して、データから解離定数（または、Ｋｄ値）を決定した。
【００９３】
表１は、ＩｇＧの５４０６−５６＿３（５０−マー；配列番号１）アプタマーのＫｄ値、及び、５０−マーの５’末端、及び、３’末端切断型の分析を示している。表１に関して、それぞれの配列の「Ｐ」は、ＮａｐｄＵを表している。表１の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（５４０６−５６＿３）との重複を示すために整列させている。
【表１】
2022502069.tif 000010
【００９４】
表１のデータは、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び、１６のＫｄ値が、約２．５ｎＭ〜約７８ｎＭであり、アプタマーの特定の５’末端ヌクレオチドを除去し得るものであり、それとは別に、アプタマーの特定の３’末端ヌクレオチドを除去し得るものであり、そして、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持している、ことを示している。また、表１のデータは、５４０６−５６＿３の５’末端からの１２個超のヌクレオチド（配列番号７、８、及び、９を参照されたい）の除去、そして、５４０６−５６＿３の３末端からの１６個超のヌクレオチド（配列番号１７を参照されたい）の除去が、１０００ｎＭ超（または、＞１０００ｎＭ）のＫｄ値をもたらすことを示しており、このことは、解離定数アッセイでの「結合なし」（または、ＮＢ）の結果であると考えられる。
【００９５】
５４０６−５６＿３（配列番号１）アプタマーの５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドのＩｇＧ結合に対する寄与をさらに理解するために、５’、及び、３’末端ヌクレオチドの両方を除去して、さらなる切断型を作り出した。それぞれのアプタマーのＫｄ値を、表２に示す。表２に関して、それぞれの配列の「Ｐ」は、ＮａｐｄＵを表す。表２の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（５４０６−５６＿３）との重複を示すために整列させている。
【表２】
2022502069.tif 000011
2022502069.tif 000012
【００９６】
表２のデータは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、及び、４７のＫｄ値は、約２．７ｎＭ〜約６４ｎＭであり、このことは、アプタマーの５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドが除去し得るものであり、また、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持していることを示している。また、表２のデータは、２５−マーの配列（５４０６−５６＿５０；配列番号４７）が、ＩｇＧ（１８．８ｎＭのＫｄ値）に結合する上で十分である、ことも示している。以下の配列は、ＩｇＧに結合するのに十分な「コア」配列である（Ｐは、ＮａｐｄＵである）：
５’−ＰＡＣＧＡＰＰＰＰＣＡＧＰＰＧＧＡＰＣＣＡＧＰＡＣ−３’（配列番号４７）。
【００９７】
したがって、配列番号４７の５’末端、及び／または、３’末端にさらなるヌクレオチドを含むアプタマーは、表１及び２に記載したＫｄ値で示したように、ＩｇＧに結合する能力を保持していると考えられる。
【００９８】
ＩｇＧに結合する上で十分なさらなる「コア」配列（Ｐは、ＮａｐｄＵである）は：
５’−ＧＰＡＣＧＡＰＰＰＰＣＡＧＰＰＧＧＡＰＣＣＡＧＰＡＣ−３’（配列番号４６）；及び
５’−ＧＧＰＡＣＧＡＰＰＰＰＣＡＧＰＰＧＧＡＰＣＣＡＧＰＡＣ−３’（配列番号４５）である；
【００９９】
したがって、配列番号４５または４６の５’末端、及び／または、３’末端にさらなるヌクレオチドを含むアプタマーは、表１及び２に記載したＫｄ値で示したように、ＩｇＧに結合する能力を保持していると考えられる。
【０１００】
表３は、ＩｇＧに対する５３３４−８＿３（５０−マー；配列番号４８）アプタマーのＫｄ値、及び、５０−マーの５’末端、及び、３’末端切断型の分析を示している。表３では、それぞれの配列の「Ｐ」は、２ＮａｐｄＵを表す。表３の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（５３３４−８＿３）との重複を示すために整列させている。
【表３】
2022502069.tif 000013
【０１０１】
表３のデータは、配列番号４８、４９、５１、５１、５２、５３、５４、５５、５６、及び、５７のＫｄ値は、約５．３ｎＭ〜約２５ｎＭであり、このことは、アプタマーの特定の５’末端、及び、アプタマーの特定の３’末端ヌクレオチドが除去し得るものであり、また、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持していることを示している。また、表３のデータは、５３３４−８＿３の３末端から４個超のヌクレオチドを除去すると（配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、及び、６４を参照されたい）、Ｋｄ値が１０００ｎＭを超えることとなり（または、＞１０００ｎＭになる）、これは、解離定数アッセイの「結合なし」（または、ＮＢ）の結果であると考えられる。
【０１０２】
５３３４−８＿３（配列番号４８）アプタマーの５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドのＩｇＧ結合に対する寄与をさらに理解するために、５’、及び、３’末端ヌクレオチドの両方を除去して、さらなる切断型を作り出した。それぞれのアプタマーのＫｄ値を、表４に示す。表４に関して、それぞれの配列の「Ｐ」は、ＮａｐｄＵを表す。表４の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（５３３４−８＿３）との重複を示すために整列させている。
【表４】
2022502069.tif 000014
【０１０３】
表４のデータは、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３、７４、及び、７８のＫｄ値は、約４ｎＭ〜約２７９ｎＭであり、このことは、アプタマーの５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドが除去し得るものであり、また、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持していることを示している。また、表４のデータは、２７−マーの配列（５３３４−８＿２７；配列番号７１）が、ＩｇＧ（２７９ｎＭのＫｄ値）に結合する上で十分である、ことを示している。以下の配列は、ＩｇＧに結合する上で十分な「コア」配列である（Ｐは、２ＮａｐｄＵである）：
５’−ＧＧＰＰＡＣＣＰＰＧＰＡＧＧＣＧＡＰＰＡＰＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号７１）。
【０１０４】
したがって、一般的に、配列番号７１の５’末端、及び／または、３’末端にさらなるヌクレオチドを含むアプタマーは、表３及び４に記載したＫｄ値で示したように、ＩｇＧに結合する能力を保持している。
【０１０５】
さらに、表４のデータは、２８―マーの配列（５３３４−８＿３４；配列番号７８）が、ＩｇＧ（９．７１ｎＭのＫｄ値）に結合する上で十分である、ことを示している。以下の配列は、ＩｇＧに結合するのに十分な「コア」配列である（Ｐは、２ＮａｐｄＵである）：
５’−ＧＣＧＧＰＰＡＣＣＰＰＧＰＡＧＧＣＧＡＰＰＡＰＧＧＧＣＡ−３’（配列番号７８）。
【０１０６】
ＩｇＧに結合する上で十分なさらなる「コア」配列（Ｐは、２ＮａｐｄＵである）は：
５’−ＡＧＡＣＰＧＣＧＧＰＰＡＣＣＰＰＧＰＡＧＧＣＧＡＰＰＡＰＧＧＧ−３’（配列番号７４）；
５’−ＧＣＧＧＰＰＡＣＣＰＰＧＰＡＧＧＣＧＡＰＰＡＰＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号６９）；及び
５’−ＡＧＡＣＰＧＣＧＧＰＰＡＣＣＰＰＧＰＡＧＧＣＧＡＰＰＡＰＧＧＧＣ−３’（配列番号７３）である。
【０１０７】
したがって、配列番号６９、７３、７４、または、７８の５’末端、及び／または、３’末端にさらなるヌクレオチドを含むアプタマーは、表３及び４に記載したＫｄ値で示したように、ＩｇＧに結合する能力を保持していると考えられる。
【０１０８】
表５は、ＩｇＧに対する１４１２５−１４４＿３（５０−マー；配列番号７９）アプタマーのＫｄ値、及び、５０−マーの５’末端、及び、３’末端切断型の分析を示している。表５では、それぞれの配列の「Ｐ」は、ＮａｐｄＵを表す。表５の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（１４１２５−１４４＿３）との重複を示すために整列させている。
【表５】
2022502069.tif 000015
【０１０９】
表５のデータは、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、８８、８９、９０、９１、９２、及び、９３のＫｄ値は、約６．８ｎＭ〜約１７ｎＭであり、このことは、アプタマーの特定の５’末端ヌクレオチド、及び、アプタマーの特定の３’末端ヌクレオチドが除去し得るものであり、また、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持していることを示している。また、表５のデータは、５‘末端１４１２５−１４４−３（配列番号８５〜８７を参照されたい）から１１個超のヌクレオチドの除去、及び、３‘末端１４１２５−１４４−３（配列番号９４及び９５を参照されたい）からの１３個超のヌクレオチドの除去を行うと、Ｋｄ値が１０００ｎＭを超えることとなり（または、＞１０００ｎＭになる）、これは、解離定数アッセイの「結合なし」（または、ＮＢ）の結果であると考えられる。
【０１１０】
１４１２５−１４４−３（配列番号７９）アプタマーの５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドのＩｇＧ結合に対する寄与をさらに理解するために、５’、及び、３’末端ヌクレオチドの両方を除去して、さらなる切断型を作り出した。それぞれのアプタマーのＫｄ値を、表６に示す。表６において、それぞれの配列の「Ｐ」は、ＮａｐｄＵを表す。表６の配列は、それぞれの切断型配列と、親の５０−マー配列（１４１２５−１４４−３）との重複を示すために整列させている。
【表６】
2022502069.tif 000016
【０１１１】
表６のデータは、配列番号７９、９６、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、及び、１０６のＫｄ値は、約３．５ｎＭ〜約１８ｎＭであり、このことは、アプタマーの特定の５’末端、及び、３’末端ヌクレオチドが除去し得るものであり、また、アプタマーが、ＩｇＧに対して結合する能力を保持していることを示している。また、表６のデータは、２８−マーの配列（１４１２５−１４４＿３０；配列番号１０６）が、ＩｇＧ（約８ｎＭのＫｄ値）に結合する上で十分である、ことを示している。以下の配列は、ＩｇＧに結合する上で十分な「コア」配列である（Ｐは、ＮａｐｄＵである）：
５’−ＰＧＧＣＧＡＡＣＰＣＣＣＰＧＡＡＰＧＣＰＣＰＰＧＰＣＰＰ−３’（配列番号１０６）。
【０１１２】
したがって、配列番号１０６の５’末端、及び／または、３’末端にさらなるヌクレオチドを含むアプタマーは、表５及び６に記載したＫｄ値で示したように、ＩｇＧに結合する能力を保持している。
【０１１３】
実施例３：
本実施例は、４つの異なるヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４）に対する５４０６−５６＿３；５４０６−５６＿４８；５３３４−８＿３；５３３４−８＿３４；１４１２５−１４４＿３、及び、１４１２５−１４４＿３０アプタマーの結合親和性を明らかにしており、それぞれを、カッパ軽鎖定常領域、または、Ｆｃ領域、及び、サル、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及び、ウサギのＩｇＧタンパク質とペアにしている。タンパク質に対するアプタマーの結合親和性（解離定数）を測定するために使用するプロトコルを、実施例２に記載している。
【０１１４】
選択したアプタマーの結合親和性を、総ＩｇＧ、ＩｇＧのサブクラス、及び、その他の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ）に対して、表７及び８に示している。表７は、ヒトＩｇＧ、及び、その他のクラスの結合親和性を示しており、一方で、表８は、ＩｇＧ、及び、ヒト以外の種（サル、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及び、ウサギ）に由来するその他のクラスの結合親和性を示している。
【表７】
2022502069.tif 000017
【表８】
2022502069.tif 000018
【０１１５】
実施例４：
本実施例は、ＩｇＧ−アプタマー親和性複合体からＩｇＧタンパク質を溶出するための条件と緩衝剤を明らかにする。
【０１１６】
本実施例において、タンパク質溶出を検出する方法は、９６ウェルプレートをベースとしたアッセイを使用した。ビオチン化抗ＩｇＧ−Ｆｃアプタマー（または、ＳＯＭＡｍｅｒ）を、１μｇ／ｍＬのアプタマー溶液を含むＨＢＳ／０．０１Ｔ、または、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔの１００μＬを、９６ウェルストレプトアビジンプレート（スーパーブロックブロッキング緩衝剤を入れてあるＳＡ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＢＣ）クリア９６ウェルプレート、Ｐｉｅｒｃｅ＃１５５００）のそれぞれのウェルに添加して捕捉した。（ＨＢＳ＝ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３；ＨＢＳＥ＝ＨＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７；ＨＢＳ／０．０１Ｔ、及び、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔは、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む））。３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝剤（ＨＢＳ／０．０１Ｔ、または、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔ）を加えてプレートを３回洗浄し、震盪して、４５０ｒｐｍで、１分間混合し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）、そして、手作業で空にした。
【０１１７】
次いで、プレートを、ＩｇＧ１と共にインキュベーションを行った。５ｕｇ／ｍＬ（ＨＢＳ／０．０１Ｔでの）タンパク質原体を、１００μＬ／ウェルで加え、そして、プレートを、震盪して、４５０ｒｐｍで、短くとも１時間、混合した。３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝剤（ＨＢＳ／０．０１Ｔ、または、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔ）を加えて、プレートを２回洗浄し、震盪して、５００ｒｐｍで、１分間混合し、そして、プレートを手作業で空にした。
【０１１８】
次に、アプタマー−タンパク質複合体を、溶出条件に供して、そして、洗浄をした。１００μＬ／ウェルの溶出緩衝剤（ＨＢＳ／０．０１Ｔ＋添加剤）を加え、震盪して、２分間、４５０ｒｐｍで混合し、そして、プレートを手作業で空にした。タンパク質の溶出を２回行い、そして、２回目の溶出では、添加する順序を逆にして、合計の溶出時間を均等にした。３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝剤（ＨＢＳ／０．０１Ｔ、または、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔ）を加えてプレートを３回洗浄し、震盪して、４５０ｒｐｍで、１分間混合し、そして、プレートを手作業で空にした。
【０１１９】
次いで、それぞれのウェルを、表面に残存しているＩｇＧ１のＦｃ領域に対して結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）プロテインＧに曝露した。試薬（ＨＲＰ−ｒｅｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ＬｉｆｅＴｅｃｈ  ＃１０１２２３）の１：１０００希釈物を含むＨＢＳ／０．０１Ｔを、１００μＬ／ウェルで使用した。プレートを震盪して、５００ｒｐｍで、４５〜６０分間混合した。プレートを、３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝剤で５回洗浄し（ＨＢＳ／０．０１Ｔ、または、ＨＢＳＥ／０．０１Ｔ）、震盪して、４５０ｒｐｍで、１分間混合し、そして、プレートを手作業で空にした。
【０１２０】
ＩｇＧ１の存在は、ＨＲＰとの相互作用で青色を呈する３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）加えて確認した。ＴＭＢ基質を、１００μＬ／ウェルで加えた。（ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  ＃３４０２１）。次いで、硫酸（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を、５０μＬ／ウェルで添加して、この反応を停止し、そして、黄色の発色を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）において４５０ｎｍの吸光度で検出した。この方式では、弱いシグナル、または、シグナルの不存在は、溶出条件が良好であることを示しているが、タンパク質が分解すると、偽陽性になることがある。
【０１２１】
溶出緩衝剤コントロールは、ＨＢＳ／Ｔ０．０ｌ％（ネガティブコントロール）、及び、１Ｍ  イミダゾール／２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ９（ポジティブコントロール）を含む１／２強度ＨＢＳ／Ｔ０．０ｌ％であった。
【表９】
2022502069.tif 000019
【表１０】
2022502069.tif 000020
2022502069.tif 000021
【０１２２】
ベンズアミジンとアルキルイミダゾリウム誘導体の両方での溶出性能に基づいて（表１１）、これらの化合物に関する試験をさらに行った。アルキルイミダゾリウム誘導体の共鳴構造など、これらの化合物の構造を以下に示す。ＨＢＳ／０．０ｌ％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７でのベンズアミジンと、アルキルイミダゾリウム誘導体との組み合わせを用いた、それぞれのアプタマー切断型の溶出を、以下の表１２に示す。溶出緩衝剤の濃度は、ベンズアミジン、イミダゾリウム誘導体、または、その両方において、３００ｍＭ〜４０ｍＭの範囲で、１．５倍ずつ希釈した。溶出時間は、２２℃で、１０分間であった。ポジティブコントロールは、１Ｍイミダゾール、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９であり、また、ネガティブコントロールは、ＨＢＳ０．０１％  Ｔｗｅｅｎ緩衝剤とした。
【化８】
2022502069.tif 000022
式中、Ｒを、非置換アルキル、アルケニル、及び、ベンジルから選択する。一部の実施形態では、Ｒを、非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、及び、ベンジルから選択する。一部の実施形態では、Ｒを、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び、ベンジルから選択する。
【表１１】
2022502069.tif 000023
2022502069.tif 000024
【表１２】
2022502069.tif 000025
2022502069.tif 000026
【０１２３】
表１２のデータは、それぞれのアプタマー切断型に関して、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（Ｈｅｘｙｌ、または、ＨＬＭ）と、ベンズアミジン（Ｂｅｎｚ）を含む緩衝剤が、濃度の関数として最も効果的な溶出液であり、また、ベンズアミジンとイミダゾリウム化合物の組み合わせは、いずれかの成分を単独で用いた場合よりも効果的である、ことを示している。これらのデータに基づいて、１−アリル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（ＡＬＭ）、１−ベンジル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（ＢＬＭ）、１−メチル−３−オクチルイミダゾリウムクロリド（ＭＯＭ）、及び、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（ＤＬＭ）などのイミダゾリウム誘導体について、さらに試験をした。表１３（図４〜１９）は、ストレプトアビジンプレートをベースとしたアッセイでの溶出に関する、新規のイミダゾリウム塩と、ベンズアミジンとの組み合わせを利用した、４つすべてのＩｇＧアプタマート選択型のデータを示している。
【表１３】
2022502069.tif 000027
2022502069.tif 000028
【０１２４】
表１３のデータは、表１２で認められたものと同様の傾向を示している。ベンズアミジンと組み合わせたＡＬＭとＢＬＭの両方が、化合物を単独で使用した場合よりも効果的であった。ＤＬＭとＭＯＭは、個別に、または、ベンズアミジンと組み合わせた場合でも、４０ｍＭにおいて効果的であった。この結果を受けて、これらの化合物を、さらに低濃度の範囲（４０ｍＭ〜１．２５ｍＭの範囲で、２倍ずつ希釈した）で試験した。表１４に、これらの結果を記載しており、そこでは、ＤＬＭを、１０ｍＭで溶出し、また、ＭＯＭを、４０ｍＭで溶出した。
【表１４】
2022502069.tif 000029
【０１２５】
実施例５：
本実施例では、アルキルイミダゾリウム誘導体と、ベンズアミジン製剤とで溶出したアプタマーのＩｇＧタンパク質に対する結合活性を測定する。これらの研究にあっては、アプタマー−２７４４と同定したアプタマーを使用した。アプタマー−２７４４−５７＿３７とは、１９個の５−位修飾ピリミジン（例えば、ＢｎｄＵ）を有しており、かつ、ヒト総ＩｇＧに対して７．５ｎＭの結合親和性を示す、４８−マーの配列である。
【０１２６】
アガロースビーズフォーマットアッセイを使用して、ＩｇＧタンパク質を捕捉し、次いで、機能活性試験のために溶出した。
【０１２７】
ビオチン標識Ｃ−５修飾アプタマーを、ストレプトアビジンビーズ（５０ｐｍｏｌアプタマー（加熱／冷却）に固定した。これらのビーズを、２０分間、インキュベーションして、２５℃で、８５０ｒｐｍで震盪させ、ＣＡＰＳで２回、そして、ＳＢ１７／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄した。５０ｐｍｏｌのＩｇＧ１全長タンパク質を、以下の配列（Ａ−Ｃ−ＢｎｄＵ−ＢｎｄＵ）７Ａ−Ｃを有する２０μＭのオリゴヌクレオチドに加えた。これらのビーズ、ＳＯＭＡｍｅｒ、及び、タンパク質を、２時間インキュベーションし、そして、８５０ｒｐｍ、２８℃で、震盪した。１０ｍＭのデキストラン硫酸を、５分間かけて加え、２５℃で、８００ｒｐｍ、で震盪し、そして、ＳＢ１７／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。溶出緩衝剤を加え、これらのビーズを、１２分間インキュベーションし、２５℃で、８００ｒｐｍで、震盪し、そして、１０００ｒｐｍで、１分間、遠心回転させた。
【０１２８】
取り出した直後に、Ｚｅｂａ  ９６ウェルスピンプレート（７Ｋ  ＭＷＣＯ、５５０μＬ）を使用して、溶出したタンパク質を、ＳＢ１７／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０緩衝剤へと緩衝剤交換を行い、次いで、溶出タンパク質を使用して、Ｚｏｒｂａｘアフィニティーアッセイを行った。約２ｐｍｏｌの溶出タンパク質を、０．１ｍＭ  ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ  ６４７で標識し、そして、ゲル上を泳動させた。緩衝剤で交換している間に損失が発生しないことを予め確認していたので、溶出タンパク質濃度を、検量線と比較して、相対バンド強度から概算した。データを、表１５にまとめている。ＩｇＧ１の全長に関しては、溶出条件が、タンパク質活性に有意な影響を与えることはなかったようである。
【表１５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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