(57)【要約】本発明は、血管疾患、好ましくは末梢血管疾患を治療するためのカゼインキナーゼ１阻害剤の使用、および対応する治療方法に関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管疾患および／または心血管疾患の予防および／または治療に使用するためのカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤。
【請求項２】
前記血管疾患または前記心血管疾患が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血および高血圧症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項３】
前記血管疾患または前記心血管疾患が、心不全、くも膜下出血および高血圧症からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項３】
前記ＣＫ１阻害剤がＣＫ１δおよび／またはＣＫ１εに対して選択的である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項４】
前記ＣＫ１阻害剤が、ＰＦ−６７０４６２、ＰＦ−４８００５６７およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項５】
前記ＣＫ１阻害剤がＰＦ−６７０４６２である、請求項４に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項６】
前記ＣＫ１阻害剤がＰＦ−４８００５６７である、請求項４に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項７】
前記ＣＫ１阻害剤が１日１回、２回または３回患者に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項８】
前記ＣＫ１阻害剤が、対象の休息段階に少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画に従って対象に投与される、請求項７に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項９】
前記ＣＫ１阻害剤が、休息段階または休息段階の−２時間から＋２時間、好ましくは休息段階の−１時間から＋１時間において、少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画に従って対象に投与される、請求項８に記載の使用のためのＣＫ１阻害剤。
【請求項１０】
有効量の少なくとも１つのＣＫ１阻害剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含んで行うことによる、血管疾患および／または心血管疾患の予防および／または治療のための方法。
【請求項１１】
前記血管疾患または前記心血管疾患が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血および高血圧症からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管疾患または前記心血管疾患が、心不全、くも膜下出血および高血圧症からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＫ１阻害剤がＣＫ１δおよび／またはＣＫ１εに対して選択的である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＫ１阻害剤が、ＰＦ−６７０４６２、ＰＦ−４８００５６７およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＫ１阻害剤がＰＦ−６７０４６２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＫ１阻害剤がＰＦ−４８００５６７である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＫ１阻害剤が１日１回、２回または３回前記患者に投与される、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＫ１阻害剤が、前記患者の休息段階に少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画に従って対象に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＫ１阻害剤が、休息段階または休息段階の−２時間から約＋２時間において、少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画に従って前記患者に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＫ１阻害剤が、休息段階の約−１時間から約＋１時間において、少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画に従って前記患者に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が哺乳動物、好ましくはヒトである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管疾患、好ましくは末梢血管疾患および心血管疾患を治療するためのカゼインキナーゼ１阻害剤の使用に関する。本発明は、また、対応する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基礎的および臨床的な心血管研究への多額の投資にもかかわらず、心血管疾患は依然として世界で最も悲惨かつ困難な健康問題であり、毎年１７，５００，０００人以上の死者を出す原因となっている（非感染性疾患による死亡者数の４７％に相当）。心血管疾患の管理にかかる世界的なコストは、２０３０年までに１兆４００億ドルに上り、この健康問題は世界経済にとって深刻な脅威となるであろう。
【０００３】
高血圧は、すべての心血管疾患の第一の危険因子であり、心臓発作、心不全（ＨＦ）、脳卒中および腎不全のリスクを高める。３人に１人が高血圧であると言われている。しかし、高血圧には兆候や症状がほとんどないため、ほとんどの場合は診断されないままである。我々は、なぜ人々が高血圧になるのかわかっておらず、高血圧の症例の１０％しか説明できない。高血圧を理解することは、心血管疾患の予防と治療の鍵となる。
【０００４】
微小血管研究では、健康と病気における最小血管（毛細血管前の細動脈と毛細血管後の細静脈）の構造と機能を研究している。抵抗動脈は、平均動脈圧（ＭＡＰ）と組織灌流の両方を調節する心血管系内の「ホットスポット」であり、全末梢抵抗（ＴＰＲ）の大部分を発生させる原因となっている。従って、抵抗動脈の構造と機能が変化すると（例えば、病気や加齢によって）、直ちに組織灌流とＭＡＰに影響を与える。抵抗動脈は、心血管の健全性を改善するための未開発の機会である。健康と病気における微小血管機能の構造的および分子的基盤を理解することで、さまざまな新しい治療戦略が解き明かされるであろう。
【０００５】
微小血管系を標的とする現在の治療法は、臓器機能を改善することができず、重大な副作用を伴うことなく効果的な用量に決定することが困難であるため、標準以下である。一例として、ＨＦの筋原性緊張の増大はＴＰＲを上昇させ、心室トポグラフィーおよび心機能に有害な長期的影響を誘発する「後負荷ミスマッチ」を誘発する。実際、後負荷の短時間の増大でさえ、著しい梗塞拡大を誘発する。その結果、ＨＦの心臓後負荷を軽減するいくつかの戦略が評価されてきたが、大した成果は得られていない。心臓後負荷を軽減することは心臓に良い影響を与えるかもしれないが、血管拡張剤（一酸化窒素など）は、筋原性応答をなくし、ＴＰＲや血圧を危険なほど低下させるリスクがある。
【０００６】
筋原性応答と全身の血行動態への影響：１９０２年、ウィリアム・ベイリス卿は、経壁圧の上昇により、抵抗動脈が「虫（ワーム）のようにねじったり、よじったりして動く」（すなわち、収縮する）ことを発見した１。この観察結果は、後に筋原性応答２−５と呼ばれ、灌流圧の変化に対する血管径の動的な調整を表している。その名前の語源（ｍｙｏ＝筋肉、ｇｅｎｉｃ＝発生）が示すように、筋原性応答は血管壁の平滑筋層に由来し６−８、解剖学的には、筋原性応答は毛細血管前の小動脈および細動脈の特性といえる（すなわち、小径の「抵抗動脈」は大径の導管動脈とは機能的に異なる）。
【０００７】
全身レベルでは、オームの法則は、抵抗動脈の筋原性応答がＴＰＲとＭＡＰに大きな影響を与えるであろうことを示している９，１０。これは、抵抗動脈が、心筋症１１、ＨＦ１２，１３、糖尿病１４，１５および高血圧症１６を含む組織灌流および／または全身血液動態の変化を特徴とするいくつかの疾患プロセスにおける「機能的なホットスポット」として位置づけられる。生体内では、骨格筋の抵抗動脈がＴＰＲを顕著に調節する。これは、この血管床が身体最大の循環ネットワークを形成しているからである１７。
【０００８】
筋原性応答の制御因子としてのＴＮＦ逆シグナル伝達：骨格筋の抵抗動脈を対象とする本発明者らの独創的な研究１８において、本発明者らは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、より具体的には膜結合型（ｍＴＮＦ）が、非病的な環境下で骨格筋の抵抗動脈の筋原性応答を駆動する構成的メカノセンサーであることを示した。したがって、平滑筋細胞内のＴＮＦ遺伝子を急性的に欠失させるか、エタネルセプトでＴＮＦを除去すると、骨格筋の抵抗動脈の筋原性応答が減弱し、その結果、全身血圧が低下する。注目すべきは、骨格筋の動脈の筋原性応答に対するエタネルセプトの抑制効果が、ヒトを含む５つの異なる種にわたって保存されていることである。機構的には、ｍＴＮＦは血管平滑筋細胞にかかる機械的負荷をアウトサイドインシグナル（すなわち、ＴＮＦを介した「逆シグナル」）に変換し、確立された細胞内の筋原性シグナル要素（例えば、ＥＲＫ１／２やスフィンゴシンキナーゼ１）に結合する。この非標準のｍＴＮＦ逆シグナル機構は、骨格筋の抵抗動脈に特有のものと思われる１８。
【０００９】
カゼインキナーゼ１はＴＮＦ逆シグナル伝達のモジュレーターである：ＴＮＦの細胞質ドメインは、識別可能な酵素機能を持たないため、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）などの関連タンパク質を介してシグナルを伝達する。驚くべきことに、進化圧は、いくつかの種にわたってＴＮＦのＣＫ１リン酸化部位を保存しており、それが重要な機能を果たしていることが示唆されている１９。この点に関して、ＴＮＦのリン酸化は「活性スイッチ」として機能し、ＴＮＦ逆シグナル伝達機能を調節するための柔軟な機構をもたらしている。
【００１０】
ＣＫ１は、７つの普遍的に発現する単量体セリン／スレオニンプロテインキナーゼのファミリーである２０。すべてのＣＫ１アイソフォームは、高度に保存されたキナーゼドメインを持っているが、触媒作用のないＮ−およびＣ−末端ドメインは大きく異なっている２１，２２。これらのドメインは、インビボでのキナーゼ活性、キナーゼの局在性および基質特異性の制御に重要な役割を果たしている２１−２３。ＣＫ１ファミリーのアイソフォームは、インビトロでは似たような基質特異性を示すので２４、インビボでのそれらの異なる生物学的機能（例えば、染色体分離、紡錘体形成、概日リズム、核内移行、Ｗｎｔ経路シグナルおよび細胞生存／アポトーシス）は、ほとんどすべて局在、ドッキング配列および相互作用の相手の違いから生じている２２。
【００１１】
すべてのＣＫ１アイソフォームは構成的に活性であり、したがって、「セカンドメッセンジャー非依存性キナーゼ」に分類される。標準的に、ＣＫ１は「プライミングされた」（予めリン酸化された）コンセンサス配列Ｓ（Ｐ）−Ｘ−Ｘ−Ｓをリン酸化する。ここで、“Ｓ（Ｐ）”は“プライミング”されたホスホセリンを表し、“Ｘ”は任意のアミノ酸を表し、“Ｓ”はＣＫ１がリン酸化する標的のセリンを表す２０。効率的な基質認識にはリン酸化されたセリン残基が必要であるため、ＣＫ１は他のキナーゼとともに基質をリン酸化することが多く２０、これは階層的リン酸化機構と一致している２５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の技術的課題は、末梢血管系の筋原性応答を改善するための新規投与計画を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、「末梢血管系における筋原性応答を改善する」という用語は、以下に詳しく説明するように、特にそれぞれの病状や状態（特に特定の病気や状態に関連して、それぞれ筋原性応答が悪化する）において、筋原性応答の改善を意味する。健康な対象と比較して、末梢血管系における筋原性応答が悪化していることを示す対象の末梢血管系における筋原性応答は、前記筋原性応答が正常化されているか、または少なくとも正常化された値の方向に変化している。
【００１４】
上記の技術的課題の解決策は、特許請求の範囲、本明細書および添付の図に開示されている本発明の実施形態によって提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、筋原性反応性の個別部分を調節するメカニズムを選択的に標的とすることにより、ＴＰＲを低減する優れた手段を発見した。筋原性応答の血管床特異的調節は、正常な生理学的調節機構を完全に維持したまま、臓器の血流と機能を改善することができる。
【００１６】
本発明によれば、血管平滑筋のＣＫ１発現活性を変化させる化合物は、ｍＴＮＦ逆シグナル伝達と筋原性応答に影響を与え、そしてその結果として、全末梢抵抗、組織血流、および全身血圧に影響を与える。筋原性反応性の変化は多くの疾患（例、心不全、くも膜下出血、糖尿病、脳卒中、敗血症）の特徴であるため、微小血管のＣＫ１活性／発現を標的とすることは、多様な疾患における微小血管の筋原性応答および全身血行動態を改善できる可能性がある。
【００１７】
より具体的には、本発明は、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤の使用、すなわち、１つまたは複数のＣＫ１阻害剤を、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などのような血管および／または心血管の疾患（ＣＶＤｓ）の予防および／または治療のために使用することができる。
【００１８】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、ＣＫ１の発現および／または活性を低下させる化合物である。
【００１９】
本発明で使用するための好ましいＣＫ１阻害剤は、ＣＫ１アイソフォームδ（ＣＫ１δ、他の例では「ＣＫ１Ｄ」とも呼ばれる）および／またはε（ＣＫ１ε、他の例では「ＣＫ１Ｅ」とも呼ばれる）に選択的な阻害剤である。本発明のある実施形態では、ＣＫ１阻害剤は、ＣＫ１εよりもＣＫ１δに対してより強い阻害効果を有する場合が好ましい。本発明で使用するのに特に適したＣＫ１阻害剤は、ＷＯ２０１４／０２３２７１に開示されているＣＫ１阻害剤であり、より好ましくは、ＣＫ１阻害剤Ｄ４４７６、ＰＦ６７０４６２、ＩＣ２６１およびＰＦ４８００５６７である。本発明で使用するのに非常に好ましいＣＫ１阻害剤は、ＰＦ−６７０４６２およびＰＦ−４８００５６７であり、これらは組み合わせて使用することもできる。本発明との関連で他の有用なＣＫ１阻害剤は、Ｓａｌａｄｏらによって開示されたＣＫ１δ選択的阻害剤（2014 J. Med. Chem. 2014, 57, 2755-2772、特にその図１、表１および図２に示すものであり、化合物Ｍ３−１５が最も好ましい。本発明は、薬学的に許容される塩、溶媒和物、そのようなエステル類のエステル塩、ならびに、必要とする患者への投与時に、本発明で使用するＣＫ１阻害剤またはその代謝物もしくは残基を直接的または間接的に提供することができる任意の他の付加物または誘導体の使用にも向けられていることを理解されたい。
【００２０】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者におけるＣＫ１の発現／活性を阻害し、末梢抵抗動脈の血管平滑筋細胞におけるｍＴＮＦの逆シグナル伝達を抑制する。
【００２１】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者における心不全のような疾患において、平滑筋のＥｒｋ１／２のリン酸化やスフィンゴシン−１−リン酸のシグナル伝達を抑制する。
【００２２】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者におけるＣＫ１の発現／活性を阻害し、末梢の筋原性反応性を低下させる。
【００２３】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者における全末梢抵抗を減少させる。
【００２４】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者における全身血圧を下げる。
【００２５】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤は、特に冠動脈疾患（ＣＡＤ）（狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている））、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心拍異常、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓症、静脈血栓症、くも膜下出血、高血圧症（心不全、くも膜下出血および高血圧症が特に好ましい）などの血管および心血管の疾患（ＣＶＤｓ）などのような疾患に苦しむ患者における骨格筋、腸間膜、腎臓、および冠循環中の血流を増加させる。
【００２６】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤の効果は筋原性緊張に限定されており、カテコールアミンで誘発された血管収縮は、心不全、くも膜下出血、高血圧などの疾患では影響を受けない。
【００２７】
本発明によれば、ＣＫ１阻害剤の効果は末梢および冠循環に限定されており、脳血管の血行動態は、上述のような疾患、特に心不全、くも膜下出血、高血圧などでは影響を受けない。
【００２８】
本発明はまた、上述したような血管および／または心血管の疾患の予防および／または治療に使用するためのＣＫ１阻害剤、好ましくは上でより詳細に概説したようなものから選択されるＣＫ１阻害剤にも向けられている。
【００２９】
本発明はさらに、有効量の少なくとも１つのＣＫ１阻害剤、好ましくは上記でより詳細に概説したものから選択された少なくとも１つのＣＫ１阻害剤を、それを必要とする患者、好ましくは哺乳動物の患者、特にヒトの患者に投与することを含む、上述の血管および／または心血管の疾患の予防および／または治療するための方法に向けられている。
【００３０】
本発明では、ＣＫ１δ／ε選択的阻害の効果が頭打ちになることが示されており、ＣＫ１を最大限に阻害しても、筋原性血管収縮を部分的にしか軽減できないと結論づけられている。この論評を受けて、本発明者らは、ＣＫ１阻害剤を用いた本発明の治療に適した例示的な条件として、心不全（ＨＦ）におけるＣＫ１阻害の有効性を確認するための追加実験を行った。
【００３１】
本発明によれば、１つまたは複数のＣＫ１阻害剤は、それの／それらの遊離形態で使用することができる。他の実施形態では、本発明で使用されるようなＣＫ１阻害剤（複数可）（すなわち、少なくとも１つのＣＫ１阻害剤）は、典型的には、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体および／または溶媒と組み合わせて、前記少なくとも１つのＣＫ１阻害剤を含む医薬組成物中に存在する。
【００３２】
本発明の方法および使用において適用されるＣＫ１阻害剤の有効量、すなわち、特定の患者または生物に対する特定の有効量レベルは、治療される障害および障害の重症度を含む様々な要因；採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食習慣；採用される特定の化合物の投与時間、投与経路および排泄率；治療期間；採用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬剤、および医療技術でよく知られている同様の要因を含む様々な要因に依存する。
【００３３】
本発明に関連して好ましい投与量は、特に本明細書で言及されているような好ましい化合物、より具体的にはＰＦ−４８００５６７およびＰＦ−６７０４６２を参照すると、体重１ｋｇ当たり約１〜約３００ｍｇ（以下、「ｍｇ／ｋｇ」という）、好ましくは約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約２０〜約７０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、例えば３０ｍｇ／ｋｇである。用量は、１日２回、３回など、１回またはそれ以上投与してもよい。好ましくは、１日１回または２回の投与が行われる。好ましいのは、１つまたは複数のＣＫ１阻害剤の投与が１日１回行われることである。
【００３４】
心血管事故の多くは、休息段階、つまり人間の患者が心配する夜間に起こることが知られている。したがって、少なくとも１つのＣＫ１阻害剤は、治療を受ける対象の休息段階に少なくとも１つのＣＫ１の最大の薬理学的効果を提供する投与計画で投与されることが好ましく、より好ましくは休息段階またはその前後である。「休息段階またはその前後」とは、好ましくは休息段階の約−２時間から約＋２時間であり、より好ましくは休息段階の約−１時間から約＋１時間であり、さらに好ましくは休息段階の約−０．５時間から約＋０．５時間である。当業者にとって、少なくとも１つのＣＫ１阻害剤の最大の薬理学的効果を提供する投与計画は、選択されたＣＫ１阻害剤に依存することは明らかである。例えば、活性化合物の比較的速い分解を示すＣＫ１阻害剤は、患者の休息段階の３、４、５、または６時間前などの休息段階の前の適切な時間（すなわち、ヒトの患者の就寝時間の前）に１日１回投与することができる。選択したＣＫ１阻害剤が遅い分解を示す化合物である代替の実施形態では、ＣＫ１阻害剤は、その阻害剤の最大効果、典型的には、治療を受ける患者の休息段階、好ましくは休息段階またはその前後（好ましくは上記の定義に従う）において最大の生物学的利用濃度が得られることを保証する制御放出組成物を通じて投与することができる。休息段階に上述の最大の効果を得るための適切な医薬組成物および／または用量および投与計画（例えば、本明細書で詳細に説明した特定のＣＫ１阻害剤）は、当業者に知られている。
【００３５】
ＣＫ１阻害剤の投与経路は特に重要ではなく、選択される経路は、個々のＣＫ１阻害剤化合物または適用される化合物および治療される対象に依存する。好ましくは、ＣＫ１阻害剤（複数可）は、経口または静脈内投与などの全身投与で投与されるが、経口投与が特に好ましい。
【００３６】
「患者」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それぞれ動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトを意味する。
【００３７】
本発明に従って使用するための少なくとも１つのＣＫ１阻害剤（好ましくは上記したような医薬組成物の形で）は、脳血管の状態を治療するのに有効な任意の量および任意の投与経路を用いて投与することができる。本発明によれば、「治療する」または「治療」という用語は、状態の重症度が、未治療の状態と比較して少なくとも進行しないこと、好ましくは状態の重症度が進行しないこと、より好ましくは状態の重症度が軽減されること、さらに好ましくは状態の重症度が大幅に軽減されること、そして、理想的には、状態が実質的に治癒することを意味すると理解される。好ましくは、本発明による状態の重症度が少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％減少し、状態の完全な治癒が本発明の治療の最も好ましい結果である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】（Ａ）治療前、ＨＦ（ｎ＝６）のマウスから分離された精巣挙筋の動脈の筋原性緊張は、シャムコントロール（ｎ＝８）から分離された動脈と比較して増大していた。
【図１Ｂ】（Ｂ）５５０ｎＭ  ＰＦ６７０４６２によるインビトロでの治療（３０分）後、両方のグループの筋原性緊張は同じレベルまで減衰した。したがって、ＨＦを介した筋原性緊張の増大は排除され（すなわち、治療後の曲線が重なる）、新しい緊張レベルは、シャムコントロールと比較してわずかに低下しただけである。
【図２Ａ】ｍＴＮＦの細胞質部分が逆シグナル伝達を制御することを示している。
【図２Ｂ】ｍＴＮＦの細胞質部分が逆シグナル伝達を制御することを示している。
【図３Ａ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｂ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｃ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｄ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｅ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｆ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｇ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｈ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｉ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図３Ｊ】カゼインキナーゼ１がｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ａ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｂ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｃ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｄ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｅ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｆ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｇ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図４Ｈ】カゼインキナーゼ１デルタが筋原性応答を制御していることを示している。
【図５Ａ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｂ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｃ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｄ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｅ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｆ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｇ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図５Ｈ】ＣＫ１Ｄが筋原性応答の概日振動を制御していることを示している。
【図６Ａ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｂ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｃ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｄ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｅ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｆ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｇ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｈ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｉ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【図６Ｊ】ＣＫ１Ｄ阻害が、ＨＦの微小血管機能障害と心機能が改善することを示している。
【実施例】
【００３９】
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。
【００４０】
実施例１：ＣＫ１の阻害はインビトロおよびインビボでの筋原性応答を低下させる。
【００４１】
図１を参照すると、微小血管の平滑筋細胞をマウスの腸間膜動脈から培養し、標準的なウエスタンブロッティングによりＥＲＫ１／２のリン酸化を評価した。マウス精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈を圧力ミオグラフィーによって評価した。ｍＴＮＦ逆シグナル伝達は、本質的に活性なＴＮＦタイプＩ受容体の構築物であるｓＴＮＦＲ１−Ｆｃによって誘導された。
【００４２】
微小血管の平滑筋細胞において、ｓＴＮＦＲ１−ＦｃはＥＲＫ１／２のリン酸化を増加させる。ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃによって誘導されるＥＲＫ１／２のリン酸化は、汎ＣＫ１阻害剤であるＣＫＩ−７および特定のＣＫＩδ阻害剤であるＰＦ−６７０４６２の両方によって消失する。これらの所見は、精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈で確かめられた。ＣＫＩ−７をインビトロで適用すると、ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃによって誘発されるｍＴＮＦ逆シグナル伝達が抑制され、筋原性応答が低下する。ＣＫ１の阻害は、ＴＮＦ−／−動脈の筋原性応答に影響を与えなかった。インビトロでは、ＰＦ−６７０４６２も筋原性応答を低下させ、インビボで適用したときには、ＰＦ−６７０６２は単離された精巣挙筋の動脈の筋原性応答を低下させた。重要なことは、上記のいずれの処置もアゴニストで誘発された血管収縮に影響を与えなかったことである。
【００４３】
実施例２：ｍＴＮＦの細胞質部分が逆シグナル伝達を制御する。
【００４４】
図２を参照すると、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞を２４時間かけて一過性にトランスフェクトし、ＴＮＦ抗体のアダリムマブ（ＨｕｍｉｒａＴＭ）で５分間刺激した。ｍＴＮＦ逆シグナル伝達は、ウエスタンブロットによって評価されたＥＲＫ１／２のリン酸化によって示される。ＨＥＫ細胞が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）プラスミド構築物を発現しない限り、ｍＴＮＦの逆シグナル伝達は刺激されない（ＮＴ＝非形質導入）；ＴＮＦの細胞内領域（アミノ酸２〜２５）を切断すると逆シグナル伝達（Ｔｒｕｎｃ  ＴＮＦ）が消失する。重要なのは、ｍＴＮＦの細胞質尾部には、Ｔｒｕｎｃ  ＴＮＦで除去されるカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）認識部位（Ｓ（Ｐ）−Ｘ−Ｘ−Ｓ）が含まれており、ｍＴＮＦ逆シグナル伝達においてＣＫ１の結合のために必要であることを示している。
【００４５】
図２中の＊は、対応のないスチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５（ｎ＝６〜１２の生物学的複製）を示している。
【００４６】
実施例３：カゼインキナーゼ１はｍＴＮＦを介した筋原性応答を制御する。
【００４７】
図３を参照すると、マウス精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈を単離し、圧力ミオグラフィーのためにカニューレを挿入した。経壁圧の段階的な増加（２０ｍｍＨｇステップで２０〜１００ｍｍＨｇ）は筋原性血管収縮を生じさせる。（図３ａ）汎カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）阻害剤であるＣＫＩ−７（インビトロで１０μＭ）は筋原性応答を低下させる。（図３ｂ）フェニレフリンによって誘発された血管収縮は損なわれずに残っているため、ＣＫＩ−７によって血管の健全性が損なわれることはない。（図３ｃ）ＣＫＩ−７は、筋原性応答の用量依存的な低下を生じさせる（ｎ＝４〜６血管）。（図３ｄ）ＣＫＩ−７はＴＮＦシグナル伝達がない場合（すなわち、ＴＮＦノックアウト動脈、ＴＮＦ  ＫＯ）には効果がない。（図３ｅ）ＴＮＦ  ＫＯ動脈におけるフェニレフリンで誘発された血管収縮は、ＣＫＩ−７の影響を受けない。（図３ｆ）ｍＴＮＦ刺激融合タンパク質ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍＬ）の急性投与は、ＣＫＩ−７によって阻止される血管収縮を刺激する。このことは、ｍＴＮＦ逆シグナル伝達には機能的なＣＫ１が必要であることを示している。（図３ｇ）すべての血管は、実験前は健全であり、フェニレフリン（ＰＥ）に対する強い血管収縮によって示されている。（ｈ）単離した精巣挙筋の抵抗動脈に圧力ミオグラフィーと、それに続けてＥＲＫ１／２リン酸化のためのウエスタンブロットと、ｍＴＮＦ逆シグナル伝達の分子読み出しとを行った。ｓＴＮＦＲ１−Ｆｃは、ＣＫＩ−７によって阻害されるＥＲＫ１／２リン酸化を促進した。（ｉ）代表的なウエスタンブロットである。（ｊ）腸間膜血管の平滑筋細胞は、ＣＫＩ−７（１μＭ）によって阻害されるｓＴＮＦＲＩ−Ｆｃに応答して強固なＥＲＫ１／２リン酸化を示す。
【００４８】
（図３ａ、ｂ、ｄ、ｅ）図３ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅ中の＊は、対応のないスチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示している。（図３ｃ、ｆ〜ｇ）図３ｃ、ｆおよびｇ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定による未処理のコントロールの応答と比較したものである。＊は一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示すとともにコントロール（Ｃｏｎ）と比較したものであり、＋はボンフェローニ事後検定でＴＮＦＲ１−Ｆｃのみ（０ｍｏｌ／Ｌ  ＣＫＩ−７）と比較してＰ＜０．０５を示す。生物学的複製の数は、図３の括弧内に示されている。
【００４９】
実施例４：カゼインキナーゼ１デルタは筋原性応答を制御する。
【００５０】
図４を参照すると、マウス精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈を単離し、圧力ミオグラフィーのためにカニューレを挿入した。経壁圧の段階的な増加（２０ｍｍＨｇステップで２０〜１００ｍｍＨｇ）は筋原性血管収縮を生じさせる。（図４ａ）選択的ＣＫ１Ｅ阻害剤であるＰＦ−４８００５６７は筋原性応答を抑制する（インビトロで３０μＭ）。（図４ｂ）ＰＦ−４８００５６７は、ＩＣ５０（３２ｎＭ）を大きく上回る濃度ではあるが、用量依存的に筋原性応答を低下させた（各用量でｎ＝４〜５）ことから、この緊張における低下は、阻害剤のオフターゲット効果によるものではないかと考えられる。（図４ｃ）フェニレフリンで誘発された血管収縮は、ＰＦ−４８００５６７で治療された動脈で減少する。（図４ｄ）フェニレフリンで誘発された血管収縮の減少は、ベースラインの緊張への補正後も残っており、３０μＭ用量でのＰＦ−４８００５６７の非特異的阻害効果を示している。これらのデータを総合すると、ＣＫ１Ｅは筋原性応答を介している可能性が低いことを示している。なぜなら、反応の阻害はＩＣ５０より〜１０００倍高いＰＦ−４８００５６７の濃度でのみ起こり、ＰＦ−４８００５６７は一般的な血管の収縮性を阻害するからである（フェニレフリンに対する反応の鈍化で示される）。（図４ｅ）ＣＫ１Ｄ／Ｅ阻害剤であるＰＦ−６７０４６２は、筋原性応答を低下させる（インビトロで５５０ｎＭ）。この効果は、血管のインキュベーションバッファーを繰り返し交換することで元に戻せる。（図４ｆ）ＰＦ−６７０４６２は、公表されているＩＣ５０（７．７〜１４ｎＭ）に近い濃度で筋原性応答の用量依存的な低下を誘発していることから、緊張の低下がＣＫ１ＤまたはＣＫ１Ｅのいずれかに特異的である可能性が高いことを示唆している（それぞれの用量でｎ＝４〜５）。ＣＫ１Ｅ選択的阻害剤であるＰＦ−４８００５６７は、ＣＫ１Ｅの特異性の範囲をはるかに超えてのみ有効であったため、ＰＦ−６７０４６２のより強力な阻害効果はＣＫ１Ｄの標的化によるものであることが示唆される。（図４ｇ）ＣＫ１ＤはＴＮＦを介してシグナルを発し、ＰＦ−６７０４６２は野生型（ＷＴ）の動脈では筋原性応答を阻害するが、ＴＮＦノックアウト（ＴＮＦ−／−）マウスの動脈では阻害しない。（図４ｈ）フェニレフリンによって誘発された血管収縮はそのままなので、血管の健全性はＰＦ−６７０４６２によって損なわれない。
【００５１】
（図４ａ、ｃ、ｄ）図４ａ、ｃおよびｄ中の＊は、対応のないスチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示している。（図４ｂ、ｆ）図４ｂおよびｆ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定で０用量と比較したものである。（図４ｅ）図４ｅ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定でＰＦ−６７０４６２と比較したものである。（図４ｇ、ｈ）図４ｇおよびｈ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定によるＷＴ  ＰＦ−６７０４６２応答と比較したものである。生物学的複製の数は、図４の括弧内に示されている。
【００５２】
実施例５：ＣＫ１Ｄは筋原性応答の概日振動を制御する。
【００５３】
図５を参照すると、マウス精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈は、休息段階中期（ＺＴ７）または活動段階中期（ＺＴ１９）で単離され、圧力ミオグラフィーのためにカニューレを挿入した。経壁圧（６０〜１００ｍｍＨｇ）のワンステップの増加は、筋原性血管収縮を誘発する。（図５ａ）ＰＦ−６７０４６２（１０μＭ、インビトロ）は、休息段階（ＺＴ７）でのみ筋原性応答を低下させ、活動段階（ＺＴ１９）では低下させない。（図５ｂ）血管拡張はＰＦ−６７０４６２の投与によって影響を受けず、血管の初期緊張が圧力刺激の前から変わっていないことを示している。（図５ｃ）精巣挙筋の抵抗動脈は圧力ミオグラフィーを受け、続いてウエスタンブロッティングでＥＲＫ１／２のリン酸化を評価した。ＰＦ−６７０４６２は、休息段階（ＺＴ７）のＥＲＫ１／２のリン酸化を大幅に減少させる。（図５ｄ）代表的なウエスタンブロットである。（図５ｅ）血管の安静時の直径はＰＦ−６７０４６２の影響を受けない。（図５ｆ）ＰＦ−６７０４６２の投与前は、フェニレフリンに対する強力な血管収縮によって示されるように、血管の健康状態は損なわれていない。（図５ｇ）ＰＦ−６７０４６２の投与量に依存して休息段階中期（ＺＴ７）に筋原性緊張が低下し、活動段階中期（ＺＴ１９）には最下点に達した（用量あたりｎ＝４〜７血管）。（図５ｈ）強力にフェニレフリンで誘発された血管収縮によって示される血管の健全性は、ＰＦ−６７０４６２投与の影響を受けない。
【００５４】
（図５ａからｄ）図５ａ、ｂ、ｃおよびｄ中の＊は、同じ期間内の対応のないスチューデントのｔ検定（それぞれＺＴ７またはＺＴ１９）によるＰ＜０．０５を示している。（図５ｅ、ｆ）図５ｅおよびｆ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示している。（図５ｇ）図５ｇ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定で同じ期間内（それぞれＺＴ７またはＺＴ１９）で薬物なし（０μｍｏｌ／Ｌ）と比較したことを示している。（図５ｈ）図５ｈ中の＊は、対応のないスチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示している。生物学的複製の数は、図５の括弧内に示されている。
【００５５】
実施例６：ＣＫ１Ｄの阻害は、ＨＦにおける微小血管機能障害および心機能を改善する。
【００５６】
図６ａからｃを参照すると、マウスは、心筋梗塞（左前下行冠動脈の結紮）またはシャム手術を受けた。心筋梗塞後８週間で、マウスは心不全（ＨＦ）を発症した。精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈を単離し、圧力ミオグラフィーのためにカニューレを挿入した。経壁圧の段階的な増加（２０ｍｍＨｇステップで２０〜１００ｍｍＨｇ）はシャムグループよりもＨＦで有意に強い筋原性血管収縮を誘発した。（図６ａ）ＰＦ−６７０４６２（インビトロで５５０ｎＭ）による溶液槽処理は、ＨＦマウスの動脈の筋原性応答を正常化する（すなわち、筋原性応答のレベルはシャムの値と同様になる）。（図６ｂ）ＰＦ−６７０４６２は、シャム手術を受けたマウスの筋原性緊張に影響を与えない。（図６ｃ）フェニレフリンによって誘発された血管収縮が損なわれていないことから、血管はしっかりと機能していることが示されている。
【００５７】
図６ｄからｆを参照すると、未処理マウスにＰＦ−６７０４６２（３０〜５０ｍｇ／ｋｇを２００μＬの水に溶かして腹腔内に注射）または溶媒（２００μＬの水）を投与した。２４時間後、休息段階中期（ＺＴ７）に、精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈に圧力ミオグラフィーを行った。（図６ｄ）ＰＦ−６７０４６２の３０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの両方が筋原性応答を低下させることから、薬剤がインビボで機能することが示唆された。（図６ｅ）フェニレフリンで誘発された血管収縮はＰＦ−６７０４６２をインビボで適用しても変化しない。（図６ｆ）筋原性緊張の低下に伴い、ＰＦ−６７０４６２（３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の急性注射は平均動脈圧（ＭＡＰ）を低下させる（グループあたりｎ＝３）。
【００５８】
図６ｇからｊを参照すると、心筋梗塞またはシャム手術後のマウスに、ＰＦ−６７０４６２（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）または溶媒（ＤＭＳＯ）を７週間（５日間／週）慢性的に投与した。精巣挙筋の骨格筋の抵抗動脈を圧力ミオグラフィーのために単離した。（図６ｇ）精巣挙筋の抵抗動脈におけるＣＫ１ＤおよびＣＫ１ＥのｍＲＮＡ発現は、ＨＦとシャムとで差がなく（グループあたりｎ＝１８サンプル）、筋原性緊張の違いが翻訳後メカニズムによってもたらされることが示唆された。（図６ｈ）ＨＦで誘発された筋原性緊張の上昇は、ＰＦ−６７０４６２の慢性投与により正常化した。（図６ｉ）フェニレフリンで誘発された血管収縮は、慢性的にＰＦ−６７０４６２を投与することで損なわれない。ＰＦ−６７０４６２投与群におけるフェニレフリンの低濃度での緊張の低下は、安静時の筋原性緊張の変化によるものである。（図６ｊ）心エコー検査で評価された心臓からの血流の定量化である心拍出量は、慢性ＰＦ−６７０４６２投与で上昇する。
【００５９】
（図６ａ、ｂ、およびｇからｊ）図６ａ、ｂ、およびｇからｊ中の＊は、対応のないスチューデントのｔ検定によるＰ＜０．０５を示している。（図６ｃからｅ）図６ｃからｅ中の＊は、一元配置分散分析によるＰ＜０．０５を示し、ダネットの事後検定によるコントロールと比較している。生物学的複製の数は、図６の括弧内に示されている。
【００６０】
本発明は、ＣＫ１がｍＴＮＦ逆シグナル伝達、ひいては筋原性応答の制御因子として働くことを示している。アゴニストで誘発された血管収縮に影響を与えることなく筋原性応答を低下させるＣＫ１阻害剤の実証された能力は、微小血管の緊張が増加する疾患への臨床応用に大きな安全マージンを提供する。
【００６１】
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【図１Ａ】
2022500493.tif 000003
【図１Ｂ】
2022500493.tif 000004
【図２Ａ】
2022500493.tif 000005
【図２Ｂ】
2022500493.tif 000006
【図３Ａ】
2022500493.tif 000007
【図３Ｂ】
2022500493.tif 000008
【図３Ｃ】
2022500493.tif 000009
【図３Ｄ】
2022500493.tif 000010
【図３Ｅ】
2022500493.tif 000011
【図３Ｆ】
2022500493.tif 000012
【図３Ｇ】
2022500493.tif 000013
【図３Ｈ】
2022500493.tif 000014
【図３Ｉ】
2022500493.tif 000015
【図３Ｊ】
2022500493.tif 000016
【図４Ａ】
2022500493.tif 000017
【図４Ｂ】
2022500493.tif 000018
【図４Ｃ】
2022500493.tif 000019
【図４Ｄ】
2022500493.tif 000020
【図４Ｅ】
2022500493.tif 000021
【図４Ｆ】
2022500493.tif 000022
【図４Ｇ】
2022500493.tif 000023
【図４Ｈ】
2022500493.tif 000024
【図５Ａ】
2022500493.tif 000025
【図５Ｂ】
2022500493.tif 000026
【図５Ｃ】
2022500493.tif 000027
【図５Ｄ】
2022500493.tif 000028
【図５Ｅ】
2022500493.tif 000029
【図５Ｆ】
2022500493.tif 000030
【図５Ｇ】
2022500493.tif 000031
【図５Ｈ】
2022500493.tif 000032
【図６Ａ】
2022500493.tif 000033
【図６Ｂ】
2022500493.tif 000034
【図６Ｃ】
2022500493.tif 000035
【図６Ｄ】
2022500493.tif 000036
【図６Ｅ】
2022500493.tif 000037
【図６Ｆ】
2022500493.tif 000038
【図６Ｇ】
2022500493.tif 000039
【図６Ｈ】
2022500493.tif 000040
【図６Ｉ】
2022500493.tif 000041
【図６Ｊ】
2022500493.tif 000042
【国際調査報告】
2022500493.tif 000043
2022500493.tif 000044
2022500493.tif 000045