(57)【要約】  試料（１２）のラマンスペクトル特徴（５２）を測定するための方法および装置（１０）が開示され、試料から、例えば周囲光（１４）の入射に起因して、または可変蛍光に起因して、可変強度のバックグラウンド光も受け取られる。検出ピクセル（４２）および記憶ピクセル（４４）が、ＣＣＤデバイス（４０）上に規定される。レーザプローブ光（２２）が試料に向けられる。第１の間隔および第２の間隔の反復サイクルにおいて、各第１の間隔において、バックグラウンド光が検出ピクセルにおいて受け取られ、各第２の間隔において、バックグラウンド光および散乱レーザプローブ光の両方が検出ピクセルにおいて受け取られる。第１の間隔および第２の間隔の各々からの蓄積信号が、それぞれ第２の間隔および第１の間隔中、記憶ピクセルに保持される。他の態様では、レーザプローブ光は、第１の間隔および第２の間隔の両方の最中に試料に向けられるが、各間隔において異なる波長を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
周囲光が入射する試料のラマンスペクトル特徴を測定する方法であって、
複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）上に、検出ピクセル、および検出ピクセルとは別個の記憶ピクセルを規定することと、
前記試料にレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源を提供することと、
前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系を提供することと、
露光期間の持続時間にわたって、少なくとも、前記検出ピクセルにおいて第１のバックグラウンドスペクトル信号を蓄積するために、少なくとも、レーザプローブ光ではなく、前記試料からのバックグラウンド光が前記検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、前記検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と前記試料からラマン散乱されるレーザプローブ光の両方が前記検出ピクセルにおいて受け取られる第２の間隔とから成るサイクルを繰り返すことと、
前記第１の間隔中に、前記第１のバックグラウンドスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積し、一方、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することと、
前記第２の間隔中に、前記第２のラマンスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積し、一方、前記蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することとを含み、
前記試料からの前記バックグラウンド光は前記試料によって散乱される周囲光を含む、方法。
【請求項２】
前記レーザプローブ光が、各第２の間隔中に前記試料に入射し、各第１の間隔中に前記試料に存在しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レーザ光源は、各第１の間隔中ではなく、各前記第２の間隔中にのみ前記レーザプローブ光を放射するように動作する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料のラマンスペクトル特徴を測定する方法であって、
複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）上に、検出ピクセルおよび検出ピクセルとは別個の記憶ピクセルを規定することと、
前記試料に複数の異なる波長のレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源を提供することと、
前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系を提供することと、
露光期間の持続時間にわたって、少なくとも、前記検出ピクセルにおいて第１のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と、前記試料によって散乱される第１の波長のレーザプローブ光の両方が前記検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、前記検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と前記試料によって散乱される、前記第１の波長とは異なる第２の波長のレーザプローブ光の両方が前記検出ピクセルにおいて受け取られる第２の間隔とから成るサイクルを繰り返すことと、
前記第１の間隔中に、前記第１のラマンスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積し、一方、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することと、
前記第２の間隔中に、前記第２のラマンスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積し、一方、前記蓄積された第１のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することとを含む、方法。
【請求項５】
前記サイクルは、少なくとも、前記検出ピクセルにおいて第３のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と、前記試料によって散乱される第３の波長のレーザプローブ光との両方が、前記検出ピクセルにおいて受け取られる第３の間隔をさらに含み、前記方法は、
前記第１の間隔および前記第２の間隔中に、前記蓄積された第３のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することと、
前記第３の間隔中に、前記蓄積された第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶しながら、前記第３のラマンスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積することとをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サイクルは、少なくとも、前記検出ピクセルにおいてさらなるバックグラウンドスペクトル信号を蓄積するために、前記試料によって散乱されるレーザプローブ光ではなく、前記試料からのバックグラウンド光が、前記検出ピクセルにおいて受け取られるさらなる間隔をさらに含み、前記方法は、
前記第１の間隔および前記第２の間隔中に、前記蓄積されたさらなるバックグラウンドスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶することと、
前記さらなる間隔中に、前記蓄積された第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号を前記記憶ピクセルに記憶しながら、前記さらなるバックグラウンドスペクトル信号を前記検出ピクセルにさらに蓄積することとをさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
散乱レーザプローブ光が前記試料からも受け取られる間隔中に受け取られる前記試料からの前記バックグラウンド光が、前記試料の蛍光を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料の前記蛍光が、前記試料に入射する前記レーザプローブ光に応答して放射される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料からの前記バックグラウンド光が、前記試料に入射し、前記試料によって散乱される周囲光を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記露光期間の後に、前記露光期間中に蓄積された前記スペクトル信号を前記ＣＣＤから読み出すことと、
１つまたは複数の前記露光期間から読み出される蓄積されたスペクトル信号を使用して、前記バックグラウンド光の信号を除去するように補償された、補償ラマンスペクトル信号を計算することとをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数の露光期間からの前記補償ラマンスペクトル信号から前記試料の化学的特性を決定することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記収集光学系は、前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルにわたってスペクトル的に分散させるように構成された分光計を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が手持ち式デバイスによって実行される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記反復サイクルが、基準試料によって散乱されるレーザプローブ光が、基準スペクトル信号の蓄積のために前記検出ピクセルにおいて受け取られるさらなる間隔をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＣＤの前記ピクセルの電荷内容を行シフトすることによって、前記スペクトル信号が前記検出ピクセルと前記記憶ピクセルとの間で移動される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記記憶ピクセルは、前記検出ピクセルの対向する両側に配置された記憶ピクセルの少なくとも第１のグループおよび第２のグループを含み、前記第１のグループは、前記蓄積された第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号の記憶に使用され、前記第２のグループは、前記蓄積された第２のラマン信号の記憶に使用される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記記憶ピクセルは、前記検出ピクセルの対向する両側に配置された記憶ピクセルの少なくとも第１のグループおよび第２のグループを含み、
第１の露光期間中、前記第１のグループが、前記蓄積された第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号の記憶に使用され、前記第２のグループが、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号の記憶に使用され、
第２の露光期間中、前記第１のグループが、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号の記憶に使用され、前記第２のグループが、前記蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号の記憶のために使用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の露光期間および前記第２の露光期間の各々の終わりに前記ＣＣＤから前記蓄積された第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を読み取ることと、
両方の露光期間からの前記蓄積された第１のスペクトル信号をともに組み合わせることと、
両方の露光期間からの前記蓄積された第２のスペクトル信号をともに組み合わせることと、
両方の露光期間からの組み合わされた前記第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を使用して、前記バックグラウンド光の信号を除去するために補償されている、補償ラマンスペクトル信号を計算することとを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記記憶ピクセルは、前記検出ピクセルの行またはブロックの間にインターリーブされたピクセルの行またはブロックを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記収集光学系が、前記試料から散乱した光が前記記憶ピクセルにおいて受け取られるのを阻止するように構成されたマスキングを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記露光期間が、少なくとも１０または少なくとも１００の、前記第１の間隔および前記第２の間隔の各々を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記露光期間は、少なくとも１秒の持続時間を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記レーザ光源は、前記レーザプローブ光を前記試料の表面上の照明領域に向けるように構成され、前記収集光学系は、前記検出ピクセルにおいて受け取るために前記試料表面上の収集領域から散乱される光を収集するように構成され、前記収集領域は、前記照明領域から空間的にオフセットされている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
複数の露光期間の各々の最中に、第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号の両方を蓄積することを含み、前記照明領域と収集領域との間の空間オフセットは前記露光期間の各々について異なる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
各オフセットの前記スペクトル信号を前記試料内の異なる深さまたは深さ分布と関連付けることによって、前記試料の１つまたは複数の表面下領域の化学的特性を決定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
可変周囲光の条件下で試料のラマンスペクトル特徴を検出するための装置であって、
複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）であって、前記ピクセルが検出ピクセルおよび記憶ピクセルを含む、電荷結合素子と、
前記試料にレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源と、
前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系と、
前記検出ピクセルにおいて第１のバックグラウンドスペクトル信号を蓄積するために、レーザプローブ光ではなく、前記試料からのバックグラウンド光が前記検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第１の間隔と、前記検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と前記試料から散乱されるレーザプローブ光の両方が前記検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第２の間隔とがインターリーブされている露光期間を実施するように構成されているコントローラであって、
結果、各第１の間隔中に、前記第１のバックグラウンドスペクトル信号が前記検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号が前記記憶ピクセルに記憶され、かつ
結果、各第２の間隔中に、前記第２のラマンスペクトル信号が前記検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、前記蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号が前記記憶ピクセルに記憶される、コントローラとを備え、
前記試料からの前記バックグラウンド光は前記試料によって散乱される周囲光を含む、装置。
【請求項２７】
前記レーザプローブ光が、各第２の間隔中に前記試料に入射し、各第１の間隔中に前記試料に存在しないように構成されている、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記レーザ光源が、前記第１の間隔中ではなく、前記第２の間隔中に前記レーザプローブ光を放射するように構成されている、請求項２６または２７に記載の装置。
【請求項２９】
試料のラマンスペクトル特徴を検出するための装置であって、
複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）であって、前記ピクセルが検出ピクセルおよび記憶ピクセルを含む、電荷結合素子と、
前記試料に第１の波長または第２の波長のいずれかのレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源と、
前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系と、
前記検出ピクセルにおいて第１のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と、前記試料によって散乱される前記第１の波長のレーザプローブ光が前記検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第１の間隔と、前記検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、前記試料からのバックグラウンド光と前記試料によって散乱される前記第２の波長のレーザプローブ光の両方が前記検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第２の間隔とがインターリーブされている露光期間を実施するように構成されているコントローラであって、
結果、前記第１の間隔中に、前記第１のラマンスペクトル信号が前記検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、前記蓄積された第２のラマンスペクトル信号が前記記憶ピクセルに記憶され、かつ
結果、前記第２の間隔中に、前記第２のラマンスペクトル信号が前記検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、前記蓄積された第１のラマンスペクトル信号が前記記憶ピクセルに記憶される、コントローラとを備える、装置。
【請求項３０】
前記試料からの前記バックグラウンド光が、前記試料の蛍光を含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記試料の前記蛍光が、前記試料に入射する前記レーザプローブ光に応答して放射される、請求項２９または３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記試料からの前記バックグラウンド光が、前記試料に入射し、前記試料によって散乱される周囲光を含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
前記レーザ光源が、前記第１の間隔中に前記第１の波長のレーザプローブ光を放射し、前記第２の間隔中に前記第２の波長のレーザプローブ光を放射するように構成されている、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
前記露光期間の後に、前記露光期間中に蓄積された前記第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号および前記第２のラマンスペクトル信号を前記ＣＣＤから受け取り、前記第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号から前記バックグラウンド光の信号を除去するために補償されている、補償ラマンスペクトル信号を計算するように構成された分析器をさらに備える、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
前記分析器は、前記補償ラマンスペクトル信号から決定された前記試料の化学的特性を出力するように構成される、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記収集光学系は、前記試料から散乱される光を前記検出ピクセルにわたってスペクトル的に分散させるように構成された分光計を含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の装置を備える手持ち式分析デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の１つまたは複数のラマンスペクトル特徴を測定するための方法および装置に関する。例えば、本発明の実施形態は、例えば実験室から離れて使用するために、試料に対してラマン分光法を実行するための手持ち式装置での実施に有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
前書き
ラマン分光法は、様々な試料の化学組成を決定するために使用することができる強力な分析方法である。この技法は、ほんの数例を挙げると、材料特性評価、爆発物検出、食品分析、医薬品分析、医療診断、法医学、文化遺産、および、宇宙探査ミッションにおける地球外試料調査を含む広範囲の用途を有する。実験室の制御された環境において正確かつ効果的なラマンスペクトル分析を提供するための技法が十分に開発されている。
【０００３】
しかしながら、実験室外のより実用的な適用分野において、ラマンスペクトル分析および試料の特性評価のためのロバストな機器を提供することは、一般な他の散乱および発光タイプならびに光子信号と比較したラマン散乱の非常に低い断面積を所与として、材料の十分に迅速な検出をどのように提供するか、十分に軽量で携帯可能であるがロバストなデバイスをどのように提供するか、振動および汚染などの有害な環境影響をどのように回避するかなどの、多くの課題を提示する。
【０００４】
試料のラマン分光法はまた、試料の蛍光、特にラマンスペクトル特徴の検出に使用されるのと同じ試料のレーザ光照明によって励起される蛍光によって悪影響を受ける可能性がある。
【０００５】
本発明は、関連する従来技術の課題および制限に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、ラマンスペクトル信号の非常に弱い性質に起因して、ラマンスペクトル分析が、ラマン散乱信号を容易に圧倒し得る周囲光干渉を非常に受けやすいことに注目した。そのような周囲光は、試料のラマンスペクトル特徴を決定するために特に意図されていない試料に当たる光、例えば、直接的または間接的な太陽光、ならびに室内および机の照明などの人工光源として特徴付けることができる。特に、そのような周囲光は、試料を特徴付けるラマンスペクトル特徴を検出する目的で試料に向けられたレーザプローブ光を含まず、例えば、試料に入射する他のすべての光を含み得る。
【０００７】
したがって、通常の実験室環境外でのラマン分光法の適用は、さらなるバックグラウンドの移動／変動（例えば、移動する物体が落とす影、機器または人員の動き、光スペクトル強度の変動などに起因する）を受ける可能性もある望ましくない光源（人工光または日光など）によって損なわれる可能性がある。
【０００８】
周囲光は、試料と機器プローブヘッドとの間の接触領域を物理的に覆うことによって、ラマン機器に入るのを防ぐことができることが多い。しかし、これは、特にロバストでユーザフレンドリな携帯型ラマン分析器が必要な場合、常に実用的または実現可能ではない。ゲーティングと組み合わせた短パルスレーザの使用などの解決策を使用して周囲光からの干渉を克服することが可能であり得るが、この技法はピーク出力が高いことを意味し、敏感な試料を損傷する可能性があり、この手法に固有の機器の複雑さはまた、妥当なコストで小型の軽量（例えば、手持ち式）デバイスを製造するという目標を妨げる可能性がある。
【０００９】
別の手法は、３００ｎｍ未満の紫外線スペクトル範囲のレーザプローブ光を使用することであり得る。これは、太陽放射が大気オゾン吸収に起因してこの領域で遮断されるためであるが、これはＵＶ放射による試料劣化をもたらす可能性があり、太陽光以外の周囲光の他の光源が依然として問題であり得る。ＵＶ領域のこの使用はまた、このスペクトル領域では達成できないことが多いマトリックスの非吸光度に依存する、内深部の濁った試料を調べるための空間オフセットラマン分光法（ＳＯＲＳ）または透過ラマン分光法などのいくつかの特別なラマンモダリティの使用を制限する可能性もある。
【００１０】
試料に入射する周囲光の影響は、入射周囲光の強度および／またはスペクトル含有量が変化するとき、特にこれらの変化がラマンスペクトルの単一の露光または取得期間と同じ時間スケールにあるか、またはより迅速である場合、補償がより困難である可能性が高い。
【００１１】
したがって、本発明者らは、ＣＣＤチップ上の電荷保持を伴う電荷結合素子（ＣＣＤ）における電荷シフト動作を使用した高速光学ロックイン検出に基づく技法を使用して、レーザプローブ光および周囲光による同時の照明と、周囲光照明のみの両方から得られるスペクトルの準同時取得を使用して、周囲光の急速かつ不規則な変動の有害な影響に対処しようと努めてきた。
【００１２】
記載されている技法はまた、ラマンスペクトル特徴を測定するのにかかる時間中に試料によって放出される蛍光レベルの変動を補償するのを助けるために使用され得る。そのような変動は、例えば、蛍光信号が経時的に相当に減少する光退色に起因し得る。そのような光退色は、特に、ラマンスペクトル特徴を取得するために使用されるレーザビームによる照明に起因して起こり得る。そのような光退色、例えば試料中の他の分子との接触時の励起状態フルオロフォアの不活性化には、様々なメカニズムが関与し得る。
【００１３】
記録された各スペクトルに必要な読み出しおよびアナログ−デジタル変換ステップ、ならびに典型的な低いラマン信号強度に起因して、従来のＣＣＤベースの検出器には、動作速度を実質的に約１０Ｈｚ未満に制限する基本的な技術的限界がある。したがって、所望のラマンスペクトル特徴を含むレーザプローブ光から生じるスペクトルと、周囲光のみから生じるスペクトルとの迅速な交互検出を可能にするために、本発明は、ＣＣＤ電荷シフト技法を利用することを模索する。この手法では、取得を減速させ、データに追加の（読み出し）ノイズを導入するＣＣＤ読み出しおよびデジタル化ステップは、ラマンおよびバックグラウンドスペクトル信号の蓄積の多数（例えば数千）サイクル後に１回だけ実行される。簡潔には、はるかにより長い全露光期間の１サイクルにわたって、ＣＣＤの特定の領域が、試料から散乱されるレーザプローブ光および周囲光の両方を含む収集光に露光される。
【００１４】
同じサイクル内で、蓄積された電荷は、ＣＣＤチップ上の電荷全体を一定行数ｎだけ一方向にシフトすることによって非照明領域（例えば、アクティブ照明領域の上方）にシフトされ、この時点で、ＣＣＤチップ上の以前に照明された領域は、試料の前のレーザ励起源をオフにするかまたは遮断することによってのみ取得された周囲光の寄与にさらされる。次いで、サイクルは、電荷全体をｎ行だけもう一度逆にシフトすることによって継続し、これは、アクティブ照明領域に戻る、ラマン信号を有する以前に取得された電荷を提示し、以前に取得されたバックグラウンドが、例えばアクティブ照明領域の下など、別の非照明領域に伝播される間に、別のラマン露光を開始する。次いで、このサイクルは、例えば、固定もしくは所定の期間であり得るか、または読み取るのに十分な電荷が蓄積されるか、またはＣＣＤ飽和レベルに近づくまでであり得る、露光期間の持続時間にわたって繰り返される。
【００１５】
単一の露光期間のサイクル内のＣＣＤからのデジタル化または他の読み出しが一切なく、ＣＣＤチップ上での上下の電荷移動のみが関与することに起因して、電荷シフト期間は、キロヘルツ範囲の周波数で促進することができ、露光期間全体を通してＣＣＤピクセル内に蓄積し続ける可能性がある、シフトされる電荷に対するノイズペナルティは実質的にない。このようにして、多くの、例えば数千サイクルの間に蓄積された電荷は、改善された高い信号対雑音比を有するスペクトルの検索を可能にする。ＣＣＤからのスペクトル信号の最終的な読み出しは、その段階での電荷信号の高さを考慮すると、無視できると考えることができるスペクトルに読み出しノイズを１回だけ導入する。
【００１６】
上記の技法は、サイクルが、第１の波長のレーザ励起に起因する電荷の蓄積、その電荷の非照明領域へのシフト、およびその後の第２の波長のレーザ励起に起因する電荷の蓄積を含む場合にも実施することができ、両方の場合において、試料は周囲光にもさらされており、２つの異なる励起波長によるスペクトルは、その後、周囲光の寄与を大きく除去するプロセスにおいて組み合わされる。
【００１７】
特に、本発明は、特に、そのバックグラウンド光が可変である、例えば、強度および／またはスペクトル含有量に関して、ならびにおそらく偏光特性に関しても可変であると予測される場合に、バックグラウンド光もそこから受け取られる試料のラマンスペクトル特徴を測定する方法を提供する。検出ピクセルおよび記憶ピクセルが、複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）上に画定され、レーザプローブ光を試料に向けるように構成されたレーザ光源が提供される。試料からの光を検出ピクセルに向けるように構成された収集光学系も提供される。例えば、試料からの光および収集光学系によって収集される光は、試料に入射する周囲光の成分を含むことができ、これらの成分は入射後、弾性および非弾性散乱メカニズムの両方、拡散および鏡面反射、ならびに試料の表面における散乱とその下での散乱の両方を含む、多種多様な方法で散乱される。
【００１８】
試料からの光は加えて、またはその代わりに、例えばラマンスペクトル特徴を決定する目的で試料に向けられたレーザプローブ光による励起後に試料から放出される蛍光の成分などの他の成分を含み得る。そのような蛍光は、例えば光退色などのプロセスに起因して可変であり得、そのような変動の補償は、本発明が周囲光の変動を補償することができるのと同じように、本発明を使用して達成することができる。
【００１９】
第１の態様では、方法は、露光期間の持続時間にわたって、少なくとも、第１のバックグラウンドスペクトル信号の検出ピクセルにおける蓄積のためにレーザプローブ光ではなく試料からのバックグラウンド光が検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、試料からのバックグラウンド光および試料によって散乱されるレーザプローブ光の両方、特に試料によってラマン散乱されているそのような光が検出ピクセルにおける第２のラマンスペクトル信号の蓄積のために検出ピクセルにおいて受け取られる第２の間隔とから成るサイクルを繰り返すことを含む。特に、試料からのバックグラウンド光は、試料によって散乱される周囲光であり得、またはそれを含み得るが、特に試料において弾性的または非弾性的に散乱されているレーザプローブ光の要素を含まないと考えることができる。
【００２０】
第１の間隔中、第１のバックグラウンドスペクトル信号は、周囲光の入射に起因して検出ピクセルに蓄積され、一方、蓄積された第２のラマンスペクトル信号は、上記記憶ピクセルに記憶される。第２の間隔中、第２のラマンスペクトル信号は、バックグラウンド光およびレーザプローブ光の両方の入射に起因して検出ピクセルに蓄積され、一方、蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号は上記記憶ピクセルに記憶される。したがって、蓄積された第２のラマン分光信号は、第２の間隔中に検出ピクセルにおいて受け取られる散乱レーザプローブ光およびバックグラウンド光の両方からの寄与を含み、一方、蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号は、バックグラウンドからの寄与のみを含む。
【００２１】
第１の態様では、少なくとも第１の間隔中、レーザ光源がオフにされるか、又はプローブ光が試料に到達することが遮断されるが、レーザプローブ光の波長は、露光期間中、一定に保たれる。
【００２２】
第２の態様では、レーザプローブ光の２つ以上の波長が使用され、特に、各第１の間隔中に第１の波長が使用され、各第２の間隔中に第１の波長とは異なる第２の波長が使用される。これらの第１の波長および第２の波長は大峰の、単一の露光期間にわたって一定に保持されるべきであり、典型的にはまた、複数の露光期間にわたって一定に保持されてもよい。
【００２３】
第２の態様では、方法は、露光期間の持続時間にわたって、少なくとも、第１のラマンスペクトル信号の検出ピクセルにおける蓄積のために、試料からのバックグラウンド光と、試料によってその後散乱される第１の波長のレーザプローブ光、特に試料によってラマン散乱されているそのような光が検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、第２のラマンスペクトル信号の検出ピクセルにおける蓄積のために、試料からのバックグラウンド光と、試料によってその後散乱される、第１の波長とは異なる第２の波長のレーザプローブ光、特に試料によってラマン散乱されているそのような光が検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、第２のラマンスペクトル信号の検出ピクセルにおける蓄積のために、試料からのバックグラウンド光および試料によって散乱されるレーザプローブ光の両方、特に試料によってラマン散乱されているそのような光が検出ピクセルにおいて受け取られる第２の間隔とから成るサイクルを繰り返すことを含む。
【００２４】
特に、試料からのバックグラウンド光は、試料によって散乱される周囲光であってもよく、もしくはそれを含んでもよく、および／または試料の蛍光であってもよく、もしくはそれを含んでもよい。しかしながら、バックグラウンド光は、特に試料において弾性的または非弾性的に散乱されているレーザプローブ光の要素を含まないと考えることができる。例えば、試料のそのような蛍光は、試料に入射するレーザプローブ光によって少なくとも部分的に励起され得、特に同じレーザ光による試料の光退色に起因して経時的に強度が低下し得る。
【００２５】
第１の間隔中、第１のラマンスペクトル信号は、検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、蓄積された第２のラマンスペクトル信号は、上記記憶ピクセルに記憶される。第２の間隔中、第２のラマンスペクトル信号は、検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、蓄積された第１のラマンスペクトル信号は、上記記憶ピクセルに記憶される。
【００２６】
上記の態様のいずれにおいても、露光期間の後、露光期間中に蓄積された第１の（バックグラウンドまたはラマン）スペクトル信号および第２の（ラマン）スペクトル信号は、例えばデジタル化、電子増倍、空間平均またはビニング、および必要に応じて他の技法を含め、ＣＣＤから読み取ることができる。
【００２７】
次いで、１つまたは複数のそのような露光期間からの読み取られた第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を使用して、バックグラウンド光に起因する信号が大部分除去された補償ラマンスペクトル信号を計算することができる。次いで、試料においてまたは試料中に存在する１つまたは複数の化学種の同定および／または濃度などの、試料の１つまたは複数の化学的特性を、１つまたは複数の露光期間からの補償ラマンスペクトル信号から決定することができる。
【００２８】
補償スペクトル信号は、利用可能なスペクトル信号から様々な方法で計算することができる。第１の態様では、第１のバックグラウンドスペクトル信号を第２のラマンスペクトル信号から単に減算することができる。第２の態様では、補償スペクトル信号の計算がより複雑になり得るが、いくつかの適切な技法が以下、例えば米国特許第８，５７０，５０７号明細書に記載されている。
【００２９】
第１の態様では、例えば、各第１の間隔中ではなく、各第２の間隔中にのみ上記レーザプローブ光を放射するようにレーザ光源を動作させることによって、レーザプローブ光は、各第２の間隔中に試料に入射し、各第１の間隔中は試料に存在しないようにすることができる。さらに、バックグラウンドスペクトル信号の汚染の可能性を低減するために、レーザ光源がレーザ光を放射しないときに第２の間隔内にガード期間を設けることができる。
【００３０】
第２の態様の場合、レーザ光源は、第１の間隔中に第１の波長のみを放射し、第２の間隔中に第２の波長のみを放射するように動作することができる。少なくとも２つの異なる波長で動作する単一のレーザが使用されてもよく、または各々が異なる波長で動作する複数のレーザがレーザ光源に含まれてもよい。
【００３１】
第２の態様のいくつかの実施態様では、第３のバックグラウンドスペクトル信号を蓄積するように、試料からのバックグラウンド光のみが検出器ピクセルにおいて受け取られる第３の間隔をサイクルに含めることができる。これらの第３のスペクトル信号は、第１の間隔および第２の間隔中に記憶ピクセルに記憶される。露光期間の終わりに、３つのスペクトル信号がすべて読み出される。次いで、補償ラマンスペクトル信号からの（最初の２つの間隔に対する蛍光信号を含み得る）バックグラウンド光信号の除去をさらに改善するために、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号、ならびに第３のバックグラウンドスペクトル信号の３つすべてを使用して、補償スペクトル信号が計算される。
【００３２】
各露光期間は、例えば、少なくとも１０、または少なくとも１００、または少なくとも１０００の、第１の間隔および第２の間隔の各々、ならびに同じく使用される場合には第３の間隔およびさらなる間隔を含んでもよい。第１の間隔および第２の間隔（ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなる間隔）の組み合わせがサイクルである場合、そのようなサイクルは、例えば３００Ｈｚ〜３ｋＨｚの周波数で繰り返すことができる。第１の間隔および第２の間隔の長さおよび分布は、露光期間の各サイクルにおいて同じであってもよいが、これは必須ではなく、異なる間隔が露光期間内に十分にインターリーブされて、所与のまたは予測されるレベルの変動を有するバックグラウンド光に対してラマンスペクトル信号を十分に補償するために、異なる間隔と間隔との間に必要なレベルのインターリーブを提供する限り、規則的または不規則な様々な長さおよび組み合わせが使用されてもよい。
【００３３】
露光期間の持続時間は、十分なレベルの正確度で試料の標的特性を決定するのに十分な信号対雑音比のラマンスペクトル信号を取得するのに必要とされる予測時間に従って選択または予め選択されてもよく、装置内で予め設定されてもよく、または例えば標的性能レベルを満たすために必要に応じて装置によって決定されてもよい。典型的には、各露光期間は、少なくとも０．１秒、または少なくとも１秒の持続時間を有してもよい。
【００３４】
収集光学系は、試料から散乱される光を検出ピクセルにわたってスペクトル的に分散させ、それによって空間的に分散したスペクトルを形成するように構成された分光計を含むことができる。
【００３５】
記載されている方法の一部またはすべては、手持ち式デバイスによって実行されてもよい。例えば、プローブ光の生成、送達および収集、ならびにスペクトル信号の取得のみを実行するための手持ち式デバイスが提供されてもよく、これらの信号はその後、さらなる分析および表示のために別のデバイスまたはコンピュータシステムに渡され、または手持ち式デバイスはまた、スペクトルの分析およびスペクトルから決定された試料の特性の表示を提供してもよい。
【００３６】
反復サイクルは、例えば、基準試料によって散乱されているレーザプローブ光を含む、異なる特性を有する収集光が、基準スペクトル信号などのさらなるまたは他のスペクトル信号の蓄積のために検出ピクセルにおいて受け取られるさらなる間隔をさらに含むことができる。これにより、例えば基準スペクトル信号を用いたスペクトル差分技法を用いて、ラマンスペクトル信号をより正確に分析することが可能になり得る。
【００３７】
ＣＣＤのピクセルの電荷内容を行シフトすることによって、スペクトル信号を検出ピクセルと記憶ピクセルとの間で移動させることができる。本明細書において行を参照する場合、これは、拡張アレイの次元に垂直な次元に沿って全体としてシフトすることができるＣＣＤ上のピクセルの１次元アレイを参照することを意図しており、これは通常、特定のＣＣＤタイプの文脈において「行」として、または他の何らかの用語によって参照される。垂直方向の寸法はまた、典型的には、読み出し動作においてＣＣＤピクセルが読み出される寸法であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。
【００３８】
記憶ピクセルは、連続ブロックとしても提供され得る検出ピクセルの対向する両側に配置された記憶ピクセルの、例えば連続ブロックなどの少なくとも第１のグループおよび第２のグループによって提供されてもよく、第１のグループは、蓄積された第１のバックグラウンドまたはラマン信号の記憶に使用され、第２のグループは、蓄積された第２のラマンスペクトル信号の記憶に使用される。第３のスペクトル信号またはさらなるスペクトル信号のために、さらなる記憶ピクセルグループを提供することができる。
【００３９】
記憶ピクセルが、検出ピクセルの対向する両側に配置された記憶ピクセルの少なくとも第１のグループおよび第２のグループを含む場合、方法は以下を含むことができる。すなわち、第１の露光期間中、第１のグループが、蓄積された第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号の記憶に使用され、第２のグループが、蓄積された第２のラマンスペクトル信号の記憶に使用され、第２の露光期間中、第１のグループが、蓄積された第２のラマンスペクトル信号の記憶に使用され、第２のグループが、蓄積された第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号の記憶のために使用される。このようにして、記憶ピクセルの２つのブロック間、または２つのブロックの内外へのスペクトル信号の移動間の非対称性は、例えば第１の露光期間および第２の露光期間の結果を組み合わせることによって、後続の分析においてより容易に補償することができる。そのような非対称性の１つの原因は、収集光の検出ピクセルへの非対称投影であり得る。
【００４０】
この目的のために、本方法はまた、第１の露光期間および第２の露光期間の各々の終わりにＣＣＤから蓄積された第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を読み取ることと、両方の露光期間からの蓄積された第１のスペクトル信号をともに組み合わせることと、両方の露光期間からの蓄積された第２のスペクトル信号をともに組み合わせることと、両方の露光期間からの組み合わされた第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を使用して補償ラマンスペクトル信号を計算することとを含むことができる。
【００４１】
記憶ピクセルは、検出ピクセルの行または行ブロックの間にインターリーブされたピクセルの行またはブロックまたは行を含むことができる。このようなインターリーブは、間隔と間隔との間にＣＣＤ上でスペクトル信号を行シフトさせる必要がある距離を低減することができ、必要な記憶ピクセル空間の量を低減することができるが、試料から散乱される光が記憶ピクセルにおいて受け取られるのを阻止するように配置構成されたマスキングを提供する必要性につながる可能性がある。
【００４２】
レーザ光源は、試料の表面上の照明領域にレーザプローブ光を向けるように構成されてもよく、収集光学系は、試料表面上の収集領域から散乱した光を誘導するように配置構成されてもよい。これらの照明領域および収集領域のいずれかまたは両方は、固定されていても可動であってもよい。いくつかの実施形態では、収集領域は、照明領域から空間的にオフセットされてもよく、いくつかの実施形態では、オフセットは、例えば、試料の１つまたは複数の表面下特性を、場合により試料への深さの関数として決定するように、空間オフセットラマン分光法を実行するために制御されてもよい。試料表面上の照明領域および収集領域のいずれかまたは両方は、連続的であってもよく、または複数の分離された部分領域から構成されてもよい。入口領域および収集領域は、典型的には円形または楕円形であってもよいが、それらは様々な他の形状および構成をとってもよい。
【００４３】
特に、本方法は、複数の露光期間の各々の最中に、第１のバックグラウンドまたはラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号の両方を蓄積するが、露光期間の各々について異なる上記照明領域と収集領域との間の空間オフセットを使用することを含むことができる。次いで、各オフセットについての第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号を試料内の異なる深さまたは深さ分布と関連付けることによって、試料の１つまたは複数の表面下領域について、１つまたは複数の補償ラマンスペクトル特徴またはそれらのスペクトル特徴に関連する１つまたは複数の化学的特性を決定することができる。
【００４４】
本発明はまた、記載された方法の様々な態様に対応し、当該態様を実施するように構成された装置を提供する。例えば、上記の第１の態様に関連して、本発明は、例えば可変周囲光の条件下でバックグラウンド光も受け取られる試料のラマンスペクトル特徴を検出するための装置であって、複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）であって、ピクセルが検出ピクセルおよび記憶ピクセルを含む、電荷結合素子と、試料にレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源と、試料から散乱される光を検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系と、検出ピクセルにおいて第１のバックグラウンドスペクトル信号を蓄積するために、レーザプローブ光ではなく、試料からのバックグラウンド光が検出ピクセルにおいて受け取られる第１の間隔と、検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、試料からのバックグラウンド光と試料から散乱されるレーザプローブ光の両方が検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第２の間隔とがインターリーブされている露光期間を実施するように構成されているコントローラであって、結果、各第１の間隔中に、第１のバックグラウンドスペクトル信号が検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、蓄積された第２のラマンスペクトル信号が上記記憶ピクセルに記憶され、かつ、結果、各第２の間隔中に、第２のラマンスペクトル信号が検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、蓄積された第１のバックグラウンドスペクトル信号が上記記憶ピクセルに記憶される、コントローラとを備える、装置を提供する。特に、試料からのバックグラウンド光は、試料によって散乱される周囲光であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００４５】
特に、この第１の態様では、レーザ光源は、第１の間隔中ではなく、第２の間隔中にレーザプローブ光を放射することができる。
【００４６】
上記の第２の態様に関連して、本発明は、例えば可変周囲光および／または可変蛍光の条件下でバックグラウンド光が受け取られる試料のラマンスペクトル特徴を検出するための装置であって、複数のピクセルを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）であって、ピクセルが検出ピクセルおよび記憶ピクセルを含む、電荷結合素子と、試料に第１の波長または第２の波長のいずれかのレーザプローブ光を向けるように構成されているレーザ光源と、試料から散乱される光を検出ピクセルに向けるように構成されている収集光学系と、検出ピクセルにおいて第１のラマンスペクトル信号を蓄積するために、試料からのバックグラウンド光と、試料によって散乱される第１の波長のレーザプローブ光の両方が検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第１の間隔と、検出ピクセルにおいて第２のラマンスペクトル信号を蓄積するために、試料からのバックグラウンド光と試料によって散乱される第２の波長のレーザプローブ光の両方が検出ピクセルにおいて受け取られる複数の第２の間隔とがインターリーブされている露光期間を実施するように構成されているコントローラとを備える、装置を提供する。
【００４７】
特に、試料からのバックグラウンド光は、試料によって散乱される周囲光であってもよく、もしくはそれを含んでもよく、および／または試料の蛍光であってもよく、もしくはそれを含んでもよい。例えば、試料のそのような蛍光は、試料に入射するレーザプローブ光によって少なくとも部分的に引き起こされ得、結果もたらされる試料の光退色に起因して経時的に強度が低下し得る。
【００４８】
この第２の態様では、装置は、第１の間隔中に、第１のラマンスペクトル信号が検出ピクセルにさらに蓄積され、一方、蓄積された第２のラマンスペクトル信号が上記記憶ピクセルに記憶されるように、かつ、第２の間隔中に、第２のラマンスペクトル信号が検出ピクセルに蓄積され、一方、蓄積された第１のラマンスペクトル信号が記憶ピクセルに記憶されるように構成される。
【００４９】
この第２の態様では、レーザ光源は、第１の間隔中に第１の波長のレーザプローブ光を放射し、第２の間隔中に第２の波長のレーザプローブ光を放射することができる。これは、例えば、単一の切り替え可能な波長レーザ、または各々が異なる波長を放射するように構成された複数のレーザを使用して実施することができる。
【００５０】
いずれの態様においても、装置は、露光期間の後に、露光期間中に蓄積された第１のスペクトル信号および第２のスペクトル信号をＣＣＤから受け取り、バックグラウンド光に起因する信号の一部または本質的にすべてを除去するように補償された補償ラマンスペクトル信号を、蓄積されたスペクトル信号から計算するように構成された分析器をさらに備えることができる。そのような分析器は、補償ラマンスペクトル信号から決定された試料の特性を出力するように構成され得る。
【００５１】
特に、装置は、例えば空港、工場、野外などの環境で働くセキュリティ、軍事、工業、または他の人員による使用に適した手持ち式または携帯型デバイスであってもよい。
【００５２】
収集光学系は、試料から散乱される光を検出ピクセルにわたってスペクトル的に分散させるように構成された分光計を含むことができる。
【００５３】
試料材料としてポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を使用する実験では、本発明の実施形態は、周囲光バックグラウンドの不規則な変動に対処する優れた能力を示し、特に狭く強いスペクトル寄与を有する周囲光源の場合に優れた能力を示した。ライブラリベースのスペクトルマッチングは、再構築スペクトルのより高い品質に加えて、本発明の実施形態が個々のスペクトル再構築のより大きい再現性からも利益を得ることを実証した。
【００５４】
測定時間の利点（後述する実験では「従来の」読み出しよりも最大６０％速い）およびデータ量の利点（実験では最大１８倍小さいファイルサイズ）は、記載されている技法のさらなる利点である。これらの実験では、ＰＴＦＥを試験試料として使用し、追加の蛍光または白熱光照明による８３０ｎｍ励起においてラマンスペクトルを記録した。結果は、本発明を具現化する（また、１０００Ｈｚで切り替わる第１の間隔および第２の間隔を用いてこれらの実験において動作する）動作モードが、ラマンスペクトルからの動的に変化する周囲光の寄与の除去について、「従来の」モード（実際には１０Ｈｚ以下の単一モード露光期間に限定される）よりも明らかな利点を有することを実証した。ライブラリベースのスペクトルマッチングは、特にスペクトル的に狭い線および空間的に不均一な発光プロファイルを有する干渉光に対して、「電荷シフト」モードを使用して個々のスペクトルについて優れた再構築性能および改善された再現性を明らかにした。
【００５５】
したがって、記載された装置および方法は、従来のＣＣＤ動作の基本的な技術的限界を克服し、通常の実験室環境外の動的に変化する照明条件下で適用されるモバイルラマンシステムに特に有利である。
【００５６】
図面の簡単な説明
次に、本発明の実施形態が、例としてのみ、添付の図面を参照しながら説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】可変周囲光などの試料から受け取られる可変バックグラウンド光、および／または光退色に起因して露光期間にわたって減少する試料の蛍光の条件下で試料のラマンスペクトル特徴を検出するための装置の概略図である。
【図２ａ】図１の装置の動作におけるＣＣＤピクセルの行グループ間のバックグラウンドスペクトル信号Ｂおよびラマンスペクトル信号Ｒの行シフトを示す図である。
【図２ｂ】図２ａと同様であるが、２つの異なるレーザプローブ光波長を使用して蓄積される第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２が、ＣＣＤピクセルの行から離れたグループ間で行シフトされる場合の図である。
【図３】図２ａまたは図２ｂに示す動作のタイミング図である。
【図４】バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号を対称対において含む一対のＣＣＤ画像を示す図である。
【図５ａ】バックグラウンドスペクトル信号Ｂおよびラマンスペクトル信号Ｒ（または同様にＲ１およびＲ２、上記の図２ａを参照）がＣＣＤピクセル内でインターリーブおよびシフトされ得る方法を示す図である。
【図５ｂ】バックグラウンドスペクトル信号Ｂおよびラマンスペクトル信号Ｒ（または同様にＲ１およびＲ２、上記の図２ａを参照）がＣＣＤピクセル内でインターリーブおよびシフトされ得る方法を示す図である。
【図６】ＣＣＤ上でインターリーブされたスペクトル信号Ｆの第３のセットの実施態様を示す図である。
【図７ａ】本発明の態様を実施して空間オフセットラマン分光法を提供する方法を示す図である。
【図７ｂ】本発明の態様を実施して空間オフセットラマン分光法を提供する方法を示す図である。
【図８】図１の配置構成が実装され得る方法をより詳細に示す図である。
【図９ａ】５０、１００および５００ミリ秒の露光期間におけるＣＣＤの様々な「従来の」動作モード、ならびに本発明の「電荷シフト」技法（Ｃ−Ｓ）の使用についての、ＰＴＦＥ試料のラマン信号対周囲光強度比に対するＨＱＩスペクトルマッチング品質指標（横座標）を示す図であって、周囲光の変化が最小の「静的」条件の結果を示し、周囲光はコンパクト蛍光管によって提供されている、図である。
【図９ｂ】５０、１００および５００ミリ秒の露光期間におけるＣＣＤの様々な「従来の」動作モード、ならびに本発明の「電荷シフト」技法（Ｃ−Ｓ）の使用についての、ＰＴＦＥ試料のラマン信号対周囲光強度比に対するＨＱＩスペクトルマッチング品質指標（横座標）を示す図であって、周囲光の「動的」な、相当により可変である条件の結果を示し、周囲光はコンパクト蛍光管によって提供されている、図である。
【図１０ａ】図９ａの結果に対応する結果を提供するが、周囲光は白熱電球によって提供される図である。
【図１０ｂ】図９ｂの結果に対応する結果を提供するが、周囲光は白熱電球によって提供される図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
実施形態の詳細な説明
ここで図１を参照すると、試料からの可変バックグラウンド光の条件下で試料１２のラマンスペクトル特徴を検出するための装置１０が概略的に示されている。実施形態は、可変周囲光１４を補償する課題に関して主に説明されているが、実施形態は、試料から受け取られるバックグラウンド光が試料の蛍光などの異なるまたは追加の可変成分を含む状況にも適用可能である。そのような蛍光は、例えば、露光期間にわたる試料の光退色に起因して減少し得る。
【００５９】
したがって、試料から散乱される、または試料から受け取られる周囲光が参照される場合、これは、より一般的には、ラマン散乱成分がラマンスペクトル特徴、したがって試料の特性を決定するために特に重要であるレーザ光の弾性および非弾性散乱成分に加えて、試料から受け取られるバックグラウンド光と考えることができる。
【００６０】
試料に到達する周囲光は、太陽などの様々な自然光源、および／または白熱灯、蛍光灯、およびＬＥＤ照明などの様々な人工光源から生じる可能性があり、例えば、装置の周囲の人および物体の動き、装置および／または試料の動き、空にわたる雲の動き、照明のオンおよびオフ、または他の様態での強度およびスペクトル出力の変化などに起因して可変であり得る。周囲光が試料に到達しない場合でも、可変レベルの蛍光が試料によって放出され得る。
【００６１】
試料を損傷する可能性がある過剰なレーザ光照明強度を回避しながら、試料の１つまたは複数の化学的特性を決定するために試料１２から十分なラマン散乱光を取得するには、典型的には少なくとも０．１秒、より典型的には数秒〜数十秒の露光期間を必要とする場合があり、いずれにせよ、より長い露光時間は一般に、そのような特性の決定のより高い正確度をもたらす。試料からすべての周囲光１４を除外することが容易または好都合ではない状況では、そのような露光時間にわたる周囲光の強度および／またはスペクトル含有量の有意な変動は、試料から散乱される光におけるラマンスペクトル特徴の正確な測定をより困難にし得る。周囲光が試料から除外される場合であっても、そのような露光時間にわたる試料の蛍光の有意な変動は、試料から散乱される光におけるラマンスペクトル特徴の正確な測定をより困難にし得る。
【００６２】
このような問題は、装置１０が全体として手持ち式もしくは携帯型もしくは内蔵型のデバイスである場合、または装置１０のプローブ部分１６が手持ち式であり、例えば光ファイバ接続によって装置の残りの部分に機能的に接続されている場合に特に生じ得る。そのような装置は、例えば、空港、倉庫において、爆発物、毒または他の危険物質が疑われる場合などのセキュリティまたは軍事状況において、セキュリティまたは税関または法執行官または軍人によってなどに特に有用であり得る。
【００６３】
装置１０は、レーザプローブ光２２を生成し、試料１２の表面上の１つまたは複数の照明点または領域２４に向けるレーザ光源２０を備える。次いで、収集光学系３０が、試料１２の表面の１つまたは複数の収集領域３４から散乱される収集光３２を受け取る。この収集光３２は、その光の弾性散乱部分およびラマン散乱部分を含むレーザプローブ光２２の要素と、周囲光１４の要素、特に試料から散乱されているそのような要素の両方を含む。
【００６４】
レーザ光源２０は、典型的には、１つまたは複数のレーザ２６と、レーザの出力を様々な方法で調整し、調整された出力を試料１２に向けて導くために使用することができる光源光学系２８とを備えることができる。１つまたは複数のレーザ２６は、典型的には、電磁スペクトルの近赤外領域、例えば約８００ｎｍの波長でレーザプローブ光のビームを放射する近赤外レーザによって提供されてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、単一のレーザ波長のみが必要であり、これは単一のレーザ２６によって好都合に提供することができる。いくつかの他の実施形態では、レーザ光の複数の波長が必要であり、これは、例えば、制御可能な波長出力を有する単一のレーザ２６によって、または異なる波長で出力するように構成された複数のレーザ２６、２６’によって提供することができる。
【００６６】
光源光学系２８は、ビームを調整するための１つまたは複数の適切なバンドパスフィルタおよび他の構成要素と、試料表面上の照明領域（複数可）２４に入射するようにレーザプローブ光２２を導くように配置構成された１つまたは複数の光ファイバおよび／またはレンズとを含むことができる。装置１０が手持ち式または同様のプローブ部分１６を含む場合、そのような光ファイバを使用して、レーザプローブ光２２をプローブ部分１６に搬送し、その後、試料の照明領域２４に送達することができる。
【００６７】
第１の態様では、レーザ光源２０は、第１の動作時間間隔中ではなく、第２の動作時間間隔中に、レーザプローブ光２２が試料に入射し、散乱して収集光３２の一部を形成するようにコントローラ６０によって制御され、これらの間隔は以下でより詳細に説明される。これは、典型的には、例えば、レーザへの入力電流をそれぞれレーザ閾値電流を上回るまたは下回るように変化させることによって、第１の間隔中ではなく第２の間隔中にレーザプローブ光２２を生成するようにレーザ２６を制御することによって達成され得る。図１では、これはレーザ変調信号６２によって制御されるものとして示されている。しかしながら、例えば、機械的または光学的構成を使用してレーザ２６の出力をシャッタすること、レーザプローブ光２２を、収集光学系３０による収集がほとんどまたはまったく行われない試料上の異なる位置などの他の場所に向け直すことなどを含む、他の技法が代わりにまたは加えて使用されてもよい。
【００６８】
第２の態様では、レーザ光源２０は、動作の第１の間隔および第２の間隔中にレーザプローブ光２２が試料に入射し、散乱して収集光３２の一部を形成するようにコントローラ６０によって制御されるが、異なる波長のレーザプローブ光が、第１の間隔および第２の間隔の各々において試料に向けられる。
【００６９】
収集光学系３０は、試料の表面上の１つまたは複数の収集領域３４から光３２を収集し、収集光を電荷結合素子（ＣＣＤ）４０の形態のピクセル化撮像光検出器の検出ピクセル４２に導くように構成される。検出ピクセルに向けられるこの収集光は、第２の間隔中は散乱レーザプローブ光２２を含むが、第１の間隔中は含まない。
【００７０】
収集光学系３０は、典型的には、適切な光ファイバおよび／またはレンズなどの、試料の収集領域３４から光を受け取り、検出および測定されるラマン散乱波長範囲内にない光を除外するために１つまたは複数のエッジフィルタを使用することなどによって任意の必要なスペクトルフィルタリングを実行するように構成された受信光学系３６を含むことができる。装置１０が手持ち式または同様のプローブ部分１６を含む場合、受信光学系３６の光ファイバを使用して、収集光３２をプローブ部分１６から搬送し、その後、ＣＣＤ４０の検出ピクセルに送達することができる。
【００７１】
収集光３２は、ラマンピークおよび／またはラインなどのラマンスペクトル特徴を含むスペクトルを形成するために、または収集光のスペクトル特徴をこれらのピクセルにわたって分布させるために、収集光３０を検出ピクセルにわたって分散させるように構成された分光計３８を介してＣＣＤ  ４０の検出ピクセル４２に送達され得る。分光計３８は、例えば、ホログラフィック透過格子などの１つまたは複数のスペクトル分散格子もしくは屈折要素、またはＫａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ＳｙｓｔｅｍｓのＨｏｌｏｓｐｅｃデバイスなどのより複雑な分光計構成要素を備えてもよい。いくつかの実施形態では、スペクトルフィルタリング技法を分散分光計３８に加えて、またはその代わりに使用して、スペクトル特徴を検出ピクセル全体に分布させることができる。
【００７２】
いくつかの構成および動作モードでは、最大量のレーザプローブ光２２が収集光３２に散乱されるように、照明領域（複数可）２４および収集領域（複数可）３４が正確に一致するか、または可能な限り一致して完全に重なり合うことが望ましい場合がある。しかしながら、手持ち式またはポータブル装置として提供される場合は装置１０の全体が、または装置の手持ち式プローブ１６が、典型的には、試料の近位に保持するが、試料から離間することによる使用のために構成される場合があり、これは、この正確または密接な位置合わせを困難にする傾向がある。この目的のために、例えば、試料に接触または押圧される装置またはプローブから延在するコーンまたはフレームなどの機械的位置決め要素、または適切なガイドを提供する可視光スポットなどの光学的構成によって、試料表面上の照明領域および収集領域の位置合わせを制御するのを助けるために、装置、デバイスまたはプローブの一部として、１つまたは複数の位置合わせ機構１７を設けることができる。照明領域２４および収集領域３４は、形状がほぼ円形または楕円形であってもよいが、環、複数の分離された部分領域から形成される領域などの他の形状が使用されてもよい。いくつかの構成では、以下でより詳細に説明するように、ＳＯＲＳ技法を使用して試料の１つまたは複数の表面下領域の特性を決定するために、照明領域および収集領域を空間オフセットによって意図的に離間させることができる。複数のそのようなオフセットの各々を用いてスペクトル測定を繰り返すことによって、そのようなオフセットの各々からのラマンスペクトル信号を、例えば国際公開第２００６／０６１５６６号パンフレットに論じられているように、試料内の異なる深さまたは深さ分布に関連付けることができる。
【００７３】
いくつかの態様では、各第１の間隔中、実質的に周囲光寄与のみが収集光３２に見られ、各第２の間隔中、収集光３２はまた、試料１２において散乱されるレーザプローブ光２２からの寄与も含むように、レーザ光源２０を制御するためにコントローラ６０が使用されることは上記で言及した。第１の間隔および第２の間隔のタイミングはまた、例えば図１に示すように、対応する外部トリガ信号６４によってＣＣＤ  ４０に伝達される。
【００７４】
蓄積信号の少なくとも第１および第２の別個のセットが、ＣＣＤのピクセル内に保持される。バックグラウンドスペクトル信号５０として参照される第１の蓄積信号セットは、各第１の間隔の開始のために検出ピクセル４２にロードされ、その結果、第１の間隔中、それらのピクセルの電荷は、周囲光の寄与を含むがレーザプローブ光の寄与を含まない収集光３２の入射に起因して蓄積し、したがって、ピクセル電荷によって表されるこれらのバックグラウンドスペクトル信号５０は、各第１の間隔中に蓄積する。ラマンスペクトル信号５２として参照される第２の蓄積信号セットは、各第２の間隔の開始のために検出ピクセル４２にロードされ、その結果、各第２の間隔中、それらのピクセルの電荷は、周囲光の寄与を含むがレーザプローブ光の寄与を含まない収集光３２の入射に起因して増大し、したがって、累積電荷によって表されるこれらのラマンスペクトル信号５２も蓄積する。
【００７５】
検出ピクセルにロードされていないとき、スペクトル信号５０、５２のセットはＣＣＤの他のピクセルに記憶され、これらは一般に記憶ピクセル４４として参照される。ＣＣＤピクセルのアレイ内のこれらの記憶ピクセルの位置についての詳細および様々なオプションは、以下で説明される。第１の間隔および第２の間隔の各々の間で、検出ピクセルと記憶ピクセルとの間のバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号の転送は、ＣＣＤピクセルの行シフトを使用して達成することができ、それによって、以下により詳細に説明するように、ピクセルの行全体がＣＣＤピクセルアレイを上下に移動する。ピクセルグループのこの移動は、コントローラ６０が第１の間隔および第２の間隔のタイミングを示すのに応答して、ＣＣＤの制御回路４６の適切なプログラミングおよび／または制御によって達成することができる。
【００７６】
他の態様では、第１の波長のレーザ光および周囲光が第１の間隔中に試料に入射し、第２の波長のレーザ光および周囲光が第２の間隔中に試料に入射し、その場合、蓄積し記憶されたスペクトル信号の２つのセットが、バックグラウンドおよびラマン信号の代わりにそれぞれの第１のラマン信号および第２のラマン信号として参照され得る。試料から受け取られる他のバックグラウンド光、特に、例えば光退色に起因して測定または露光期間の持続時間にわたって変化する可能性が高い蛍光を補償するために、周囲光が試料から除外される場合でも、同様の技法を使用することができる。
【００７７】
記憶ピクセル４４は、好都合には、図１に示されるように、各記憶ブロックと同じピクセルアレイサイズのピクセルのブロックとしても提供される検出ピクセルの行のそれぞれ上方および下方の、各々が同じピクセルアレイサイズの２つのブロックにおいて提供されてもよいが、例えば図２ａ〜図６の説明において以下でさらに説明されるように他の配置構成が使用されてもよい。
【００７８】
いくつかの構成では、収集光２２が記憶ピクセルに入射しないことを保証するために、マスキング４５が必要とされ得る。そのようなマスキング４５は、収集光学系３０内の、または収集光学系とＣＣＤ４０との間のマスク構成要素によって提供され得る。代替的にまたは付加的に、マスキング４５は、例えば、記憶ピクセルにわたってＣＣＤに１つまたは複数の不透明層（メタライゼーションなど）を追加することによって、ＣＣＤ上に直接実装することができる。図１に示す記憶ピクセルの配置構成では、記憶ピクセルは検出ピクセル４２のブロックとは別個の連続したピクセルブロックに設けられるため、これは必要でない場合があるが、例えば検出ピクセル行と記憶ピクセル行とが単独でまたはより小さいブロックでインターリーブされる他の配置構成では、そのようなマスキング４５が必要であり得る。
【００７９】
露光期間の終わりに、ＣＣＤの読み出し回路４８が使用されて、露光期間の第１の間隔にわたって蓄積された第１のスペクトル信号５０（バックグラウンドまたは第１のラマンスペクトル信号）（図１ではＢとしてのみ示されているが、Ｒ１という用語は第１のラマンスペクトル信号に使用することができる）と、露光期間の第２の間隔にわたって蓄積された第２のスペクトル信号５２（ラマンまたは第２のラマンスペクトル信号）（図１ではＲとして示されているが、Ｒ２という用語は第２のラマンスペクトル信号に使用することができる）の両方が読み出される。これは、コントローラ６０からの読み出しトリガ信号６６に応答してもよく、または、読み出し動作の開始を示すためにコントローラ６０に読み出しトリガ信号６６を送信する代わりに、ＣＣＤによってＣＣＤ内で内部的にトリガされてもよい。
【００８０】
次いで、読み出されたスペクトル信号は、これらの信号を様々な方法で使用することができる分析器６１に送られる。次いで、ＣＣＤの様々なピクセルがリセットされ得、新しいバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号（または第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号）が以前と同じように蓄積されるさらなる露光期間が開始され得る。分析器は、汎用コンピュータシステムまたは本明細書に記載の分析目的のために特別に構成されたコンピュータシステムであってもよい１つまたは複数のコンピュータシステムによって提供されてもよい。そのようなコンピュータシステムは、典型的には、少なくとも１つのマイクロプロセッサと、適切なデータ入力および出力機能と、記載された分析態様を実行するために１つまたは複数のコンピュータシステム上で実行するためのコンピュータプログラム命令を記憶するメモリとを備えることができる。この目的のために、様々なスペクトル信号を表すデータを分析器に渡し、コンピュータプログラム命令を使用して処理するためにメモリに記憶することができる。補償スペクトル信号および／またはスペクトル信号から導出された試料の化学的特性などの分析の結果を、メモリに記憶することができ、および／または、例えば分析器の視覚的表示の表示によって、例えばデータネットワークを介して他のコンピュータシステムに渡されることによって、取り外し可能コンピュータ可読媒体に記憶されることによってなど、様々な方法で、出力することができる。
【００８１】
特に、分析器６１は、単一の露光期間からであるか、または複数の露光期間の組み合わせからであるかにかかわらず、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号Ｂ、Ｒ、または第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２を使用して様々なデータ分析プロセスを実行することができる。特に、周囲光の寄与が大きく除去された補償ラマンスペクトル信号Ｒ’は、例えば、ラマン信号からのバックグラウンド信号の直接のまたはスケーリングされた減算、または他の技法によって、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号から計算することができる。同様に、第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２から補償ラマンスペクトル信号Ｒ’を計算するために、様々な技法を使用することができる。
【００８２】
第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２が蓄積されて出力される場合、これらは、試料の化学的特性から生じる対応するスペクトル特徴を含むが、レーザプローブ光の第１の異なる波長と第２の異なる波長との間の波長の差によって互いに波長がシフトされている。これらの目的には、わずか数十分の一またはわずか数百分の一ナノメートルの異なるレーザプローブ光波長間の波長差で十分であり得る。
【００８３】
次いで、分析器は、補償ラマンスペクトル信号を決定するために、第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２を組み合わせるか、または比較することができる（また、後述するように利用可能であれば、さらなるバックグラウンドスペクトル信号Ｂも使用する）。試料からの蛍光のスペクトルおよび強度は、レーザプローブ光の第１の波長と第２の波長との間で必要とされる波長のわずかな差によって本質的に影響を受けないため、この技法は、補償ラマンスペクトル信号から蛍光を大きく除去することを可能にするという利点も有する。この技法はまた、補償ラマンスペクトル信号から任意の周囲光のスペクトル信号を大きく除去することができる。なぜなら、第１のラマン信号および第２のラマン信号の各々に存在する任意の周囲光信号は本質的に同じであり、したがって、信号間の唯一の系統的な差は、第１の間隔および第２の間隔の間の異なるレーザプローブ光波長に起因するためである。
【００８４】
周囲光が試料から受け取られるか否かにかかわらず、第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２をこのように組み合わせることはまた、露光期間にわたって試料から受け取られる蛍光の変動を補償するのを助ける効果を有することに留意されたい。したがって、この技法は、装置および方法において周囲光が試料から大部分または完全に除外される場合を含む、光退色および同様の効果を補償したラマンスペクトル信号を提供するために使用することができる。
【００８５】
試料の１つまたは複数の特徴、特に化学的特徴Ｃは、例えば、様々な化学種のラマンシグネチャにおいて予測される特定のスペクトルピークまたはラインの大きさを確立することによって、補償ラマンスペクトル信号Ｒ’から導き出すことができる。そのような化学的特徴は、例えば、試料中の化学種の同一性および／または濃度を含み得る。
【００８６】
上述したように、ＣＣＤがその後読み出される前に、ラマンスペクトル信号およびバックグラウンドスペクトル信号の検出をＣＣＤの露光期間にわたって複数回インターリーブすることによって、バックグラウンドスペクトル信号がラマンスペクトル信号に対する周囲光の寄与をより正確に反映することができるように、各それぞれの間隔の長さを最適化することがより容易になる。同様に、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号がそれぞれ第１の間隔および第２の間隔の各々に蓄積される場合、それぞれの間隔は、周囲光（および／または試料蛍光）の同じ寄与をより正確に反映することができる。さらに、どちらの場合も、ＣＣＤからの読み出し動作の回数も大幅に低減され、それによって読み出しノイズのレベルも低減される。
【００８７】
スペクトル、スペクトル特徴強度もしくは大きさ、および補償ラマンスペクトル信号Ｒ’の他の態様などのデータ、ならびに／または、例えば濃度を提供するかもしくは特定の種の存在を示す試料の特定の化学的特性Ｃを記述するデータは、装置１０のディスプレイ６５を使用して提示され得るか、または装置１０に、例えば固定または取り外し可能なデータ記憶媒体に記憶され得るか、またはネットワークを介して接続されているか、もしくは装置１０により直接的に接続されているかにかかわらず、他のコンピュータ（図１には示されていない）などの他のデータ処理機器に出力され得る。
【００８８】
露光期間にわたって、多数の第１の間隔および第２の間隔、例えば、各々の少なくとも１０、各々の少なくとも１００、または各々の少なくとも１０００が存在してもよく、例えば、第１の間隔および第２の間隔は反復サイクルで交互になってもよい。文字ＢおよびＲが、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号が蓄積される間隔を表す場合、そのようなサイクルは、［Ｂ，Ｒ］と書くことができる。しかしながら、１回の露光期間において各間隔の数が厳密に同じである必要はなく（例えば、厳密に交互であっても１つずつ異なる数であることが一般的であり得る）、後述するように、第１の間隔および第２の間隔がさらに存在する場合、多少異なる数が使用されてもよい。同じことが、第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２が蓄積される間隔を有する他の態様にも当てはまる。
【００８９】
典型的には、第１の間隔および第２の間隔はすべて同じ持続時間であってもよく、例えば各々が約１ミリ秒続くことができるが、第１の間隔は必要に応じて第２の間隔とは異なる長さであってもよい。例えば、約１ｋＨｚの周波数を有するＣＣＤへの外部トリガ信号６４を使用することができる。バックグラウンド（または第１のラマン）スペクトル信号５０またはラマン（または第２のラマン）スペクトル信号５２のいずれかが検出ピクセル４２と記憶ピクセル４４との間でいずれかの方向にシフトされる行シフト期間の持続時間は、様々な要因に依存するが、第１の間隔または第２の間隔の持続時間と比較して有意であり得る。例えば、ＣＣＤが１ＭＨｚのレートで隣接するピクセル行間でデータをシフトすることができ、検出ピクセルが８０行のブロックを形成する場合、任意の２つの間隔間の行シフト期間は約０．０８ミリ秒になる。この期間が、外部トリガ入力の後続の反復の間に利用可能な１ミリ秒の期間から差し引かれる場合、第１の間隔および第２の間隔の各々について約０．９ミリ秒しか利用できない。
【００９０】
図１の配置構成では、第１の間隔と第２の間隔との間の行シフト期間にＣＣＤのシャッタリングは実施されず、その結果、収集光３２はそれらの時間中に検出ピクセルに入射し続ける。行シフト期間中にレーザプローブ光２２が検出ピクセルに入射し、それによってバックグラウンドスペクトル信号を汚染する危険性を回避するために、レーザプローブ光２２が試料に向けられない第２の間隔の開始および終了時に十分な時間バッファを、例えば、それらのバッファ期間にわたってレーザ２４をオフまたはシャッタリングすることによって、確保することが好ましい。適切なバッファ期間は、例えば、各第２の間隔の開始および終了において約５０ミリ秒であり得る。これを念頭に置くと、多くの場合、例えばそのようなバッファ期間中など、各第２の間隔の少なくとも一部にわたって、レーザプローブ光が検出ピクセルに入射しないことは明らかである。
【００９１】
機械的、光学的、または電子的シャッタリング機構が使用されて、収集光３２が第２の間隔中を除いて検出器ピクセルに到達することが妨げられる場合、そのようなバッファ期間は大幅に回避され得る。そのようなシャッタリングはまた、必要に応じて、行シフト期間中に収集光が検出器期間に到達するのを防止するために使用することができる。
【００９２】
上述したように、図１の装置を使用して、周囲光１４などのバックグラウンドを表すバックグラウンドスペクトル信号５０、および収集光３２内で受け取られるものとしてのレーザプローブ光２２およびバックグラウンド／周囲光１４の両方を表すラマンスペクトル信号５２、または代替的に上述したような第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号を蓄積することができるが、１つまたは複数のさらなるスペクトル信号を、繰り返しサイクルの１つまたは複数のさらなる間隔にわたって蓄積することもできる。そのような場合、通常、２つ以上のそのようなスペクトル信号が記憶ピクセルに保持され、一方、１つのスペクトル信号が検出ピクセルに保持される。
【００９３】
そのような構成の一例は、露光期間が繰り返される第３の間隔を含み、各第３の間隔中に、レーザプローブ光２２が試料１２ではなく基準試料によって収集光３２に散乱される場合である。これは、基準試料を装置１０に組み込み、レーザ光源２０および／または収集光学系３０を適切に適合させることによって、または例えば可動または回転ステージを使用して試料および基準試料をプローブ光の内外に繰り返し交換することによって実施することができる。次いで、得られた蓄積基準スペクトル信号Ｆを、ラマンスペクトル信号５２と基準スペクトル信号との比較によって差分スペクトル信号の決定において分析器６１によって使用するために、ＣＣＤによって露光期間の終わりに出力することができ、ラマンスペクトル信号および／または差分スペクトル信号は、バックグラウンドスペクトル信号を使用してバックグラウンド光または周囲光の影響を補償される。このようにして、試料からのスペクトル信号と参照試料からのスペクトル信号との間の差を表すラマン差分スペクトル信号を決定することができ、上述のようにバックグラウンド光または周囲光に対する補償を提供することもできる。
【００９４】
第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号が第１の間隔および第２の間隔内で収集される他の構成では、第３の間隔は、上記のバックグラウンドスペクトル信号の収集と同様の方法で、試料から散乱されるバックグラウンド光または周囲光のみを収集することを含み、レーザプローブ光はその第３の期間に試料に入射しない。
【００９５】
このように３つ以上の異なる間隔を使用して、露光期間の終わりに出力するためにＣＣＤで３つ以上の異なるスペクトル信号を測定する場合、３つ以上の異なる間隔の繰り返しサイクルに対して様々な選択肢が存在する。間隔が各々、それらの間隔中に蓄積されたバックグラウンド、ラマンおよび基準スペクトル信号に対応する文字Ｂ、Ｒ、Ｆによって表される場合、サイクルは、反復される［Ｂ、Ｒ、Ｆ、Ｒ］、［Ｂ、Ｒ、Ｆ、Ｂ、Ｒ、Ｆ］  および様々な他の順列を含むことができるが、必ずしもサイクル内に同じ数の各間隔を有する必要はなく、間隔の長さは異なってもよく、さらにサイクルごとに異なってもよいことに留意されたい。
【００９６】
この場合の第１の間隔、第２の間隔および第３の間隔が、それらの間隔中に蓄積されたバックグラウンド、第１のラマンおよび第２のラマンスペクトル信号に対応する文字Ｂ、Ｒ１、Ｒ２によって表される場合、サイクルは、反復される［Ｂ、Ｒ１、Ｒ２］、［Ｂ、Ｒ１、Ｂ、Ｒ２］および様々な他の順列を含むことができるが、必ずしもサイクル内に同じ数の各間隔を有する必要はなく、間隔の長さは異なってもよく、さらにサイクルごとに異なってもよいことに留意されたい。
【００９７】
上記の例では、第３の信号Ｒ３および任意選択的にさらなる信号（Ｒ４等）を得る目的で、第３のおよび任意選択的にさらなる異なるレーザプローブ光波長を使用することができる。補償ラマンスペクトル信号の計算において、ラマンスペクトル信号の各々がともに組み合わされ、任意選択的に１つまたは複数のバックグラウンドスペクトル信号と組み合わされる。そのような場合、サイクルは、［Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３］、［Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３］、［Ｂ、Ｒ１、Ｂ、Ｒ２、Ｂ、Ｒ３］、［Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４］、または様々な他の順列などの反復間隔を含むことができ、スペクトル信号の各々は、対応する間隔にわたって検出ピクセルに蓄積され、他の時間には記憶ピクセルに記憶される。
【００９８】
単一のレーザ２６を動作させて、必要な２つ以上の異なる波長のレーザプローブ光を提供することができ、またはこの目的のために複数のレーザ２６をプローブ光源２０に含めることができる。
【００９９】
例えば、その内容がこの特定の目的および他のすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５７０，５０７号に記載されているように、補償ラマンスペクトル信号を決定するために、第１のラマンスペクトル信号、第２のラマンスペクトル信号および場合によりさらなるラマンスペクトル信号を組み合わせ、任意選択的にバックグラウンドスペクトル信号とともに組み合わせるために、様々な数学的技法および分析技法を使用することができる。例えば、１つの選択肢は、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号のスケーリングされた減算を行うことであり、多くの場合、この手順は、得られる導関数様の補償ラマンスペクトル信号が十分な品質であり、さらなるデータ分析を受けることができるため、許容される。いくつかの状況下では、スペクトル品質を改善するために、例えば信号対ノイズ比に関して、導関数様の補償ラマンスペクトル信号から再構築スペクトルを計算することが必要な場合がある。これは、例えば、その内容がこの特定の目的および他のすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｏｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．２００５，５９，８４８−８５１に論じられているように、差分ラマンスペクトル信号の単純な積分手順によって達成することができる。
【０１００】
特定の用途に応じて、補償ラマンスペクトル信号の再構築のためのより高度なアルゴリズムも必要とされ得る。一例として、国際公開第２０１１／０３３０１７号パンフレット（その内容がこの特定の目的および他のすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）は、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号が強度値に関して互いに関連して標準化されるような手順を記載している。続いて、第１の差分スペクトル信号が計算され、第２の差分スペクトル信号が計算され、第１の差分スペクトル信号が第１の変換スペクトル信号に変換され、第２の差分スペクトル信号が第２の変換スペクトル信号に変換され、最後に、第１の変換スペクトル信号と第２の変換スペクトル信号とを加算することによって、補償ラマンスペクトル信号が計算される。
【０１０１】
十分な感度を有する適切なＣＣＤデバイス４０は、典型的には、ノイズを低減するために、例えばペルチェ素子または液体窒素を使用して低温に冷却することができ、典型的には、行および列方向に数百から数千ピクセルの寸法を有するピクセルアレイを有することができる。次いで、検出器ピクセル４６は、典型的には、数十行のピクセル、例えば８０行、典型的には全行長（例えば１０００ピクセル）を含むことができるが、より短い行のピクセルを使用することもできる。次に、上述したように、収集光学系が使用されて、収集光３２が検出ピクセルの行に沿った方向にスペクトル的に分散される。検出器ピクセル内にないときにスペクトル信号を記憶するために、典型的には、記憶ピクセルの少なくとも１つの対応するサブセットがそのようなスペクトル信号ごとに必要とされ、各サブセットは典型的には、寸法および幾何学的形状において検出ピクセルに対応する。したがって、検出ピクセルが８０ピクセルの全長行によって提供される場合、記憶ピクセルは、８０ピクセルの全長行の２つの対応する領域を提供する必要がある。
【０１０２】
各スペクトル信号がＣＣＤピクセルの複数の行に記憶される場合、これらの行は、分析器６１に転送される前にＣＣＤ自体で平均化または合計され得る。これは、典型的には、ピクセル電荷のデジタル化の前に行われる。スペクトル分解能を効果的に低減するが、平均化によってノイズ特性を改善するために、必要に応じて、行に沿った隣接ピクセルの同様の合成も実行することができる。代替的に、そのようなピクセルの加算、平均化、または他の合成、特に複数の行の合成は、分析器において実行されてもよい。
【０１０３】
図１では、検出ピクセルおよび記憶ピクセルの幾何学的形状は、第１のブロックおよび第２のブロックによって提供されるものとして示されており、記憶ピクセル４４の複数の連続した行の各々は、検出ピクセルの連続した行のブロックの上下にある。図２ａは、第１の間隔および第２の間隔のサイクルが露光期間中に繰り返されるときに、バックグラウンドスペクトル信号およびラマンスペクトル信号がこれら３つの等しいサイズのピクセルブロック間でどのように移動され得るかを示す。
【０１０４】
レーザプローブ光が対応して２つの異なる波長（バックグラウンドスペクトル信号Ｂおよびラマンスペクトル信号Ｒの代わりにラマンスペクトル信号Ｒ１、Ｒ２）を有する間隔中に、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号の代わりに、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号が、上述のように蓄積される場合に、同じ原理および詳細が適用される。これは、図２ｂの対応するパネル（ｉ）〜（ｉｖ）に示されており、図２ａの検出ピクセル４２に入射する「周囲」および「周囲＋プローブ」光が、「周囲＋プローブλ１」および「周囲＋プローブλ２」に置き換えられている。
【０１０５】
図２ａのパネル（ｉ）では、検出ピクセル４２の中央ブロック（実線の輪郭で示されている）が示されており、記憶ピクセルの第１のブロック４４’および第２のブロック４４’’（太い破線の輪郭で示されている）が、ＣＣＤピクセルグリッド上の中央ブロックの上下に配置されている。各ブロックは、例えば、高さが約８０個の隣接するピクセル行および長さが約１０００個の隣接するピクセルとすることができる。検出ピクセルまたは記憶ピクセルのいずれとしても使用されない１つまたは複数の行のガード領域４７を、例えば、収集光３２が記憶ピクセルに入射しないようにより良好にガードするために、各ブロックの間に設けることができる。
【０１０６】
パネル（ｉ）では、蓄積バックグラウンドスペクトル信号Ｂが検出ピクセル４２内に保持され、その結果、バックグラウンドスペクトル信号は、収集光３２内の試料から散乱されるスペクトル的に分散された周囲光からの照明下で蓄積するが、散乱レーザプローブ光からの寄与はない。ラマンスペクトル信号Ｒは、収集光３２から照明されていない記憶ピクセル４４’’の下段ブロックに保持される。したがって、図２ａは、上述の第１の間隔に対応する。
【０１０７】
図２ａのパネル（ｉｉ）は、ラマンスペクトル信号が検出ピクセル４２へと行シフトアップされており、バックグラウンドスペクトル信号が記憶ピクセル４４’の上段ブロックへとシフトアップされている後続の行シフト期間を示している。この行シフト期間の終わりに、パネル（ｉｉｉ）に示すように第２の間隔が始まり、結果、ラマンスペクトル信号が、第２の間隔の少なくとも一部について、試料から散乱されるレーザプローブ光２２ならびにバックグラウンド光または周囲光を含む、スペクトル的に分散された収集光３２の照明下で検出ピクセル４２に蓄積する。
【０１０８】
パネル（ｉｖ）では、第２の間隔の終了後に、ラマンスペクトル信号が記憶ピクセル４４’’の下段ブロックにシフトバックされ、バックグラウンドスペクトル信号が検出ピクセル４２にシフトダウンされ、その結果、第１の間隔および第２の間隔の次のサイクルが開始され得ることが分かる。
【０１０９】
図２ａのパネル（ｉ）〜（ｉｖ）では、スペクトル信号は、それらが様々な時点で記憶されているピクセルブロックよりもわずかに小さいブロックとして示されているが、これは、様々な構成要素が図においてより明確に見えるように、明確化のためのものに過ぎない。
【０１１０】
図３は、図２ａまたは図２ｂの事象が図中の左から右へ経時的にどのように進展するかを示すタイミング図である。以下の説明は、図２ａのタイミングに焦点を当てているが、これが図２ｂのプロセスのタイミングにどのように変換されるかは容易に理解することができる。間隔のサイクルのタイミングを指示または制御する信号が、例えば図１に関連して上述した外部トリガ信号６４とすることができるＥＸＴ−Ｔとして、図の上部に示されている。図の左側では、このトリガ信号のピークが、図２ａのパネル（ｉｖ）に示されているような第１の行シフト期間８０−１の開始を引き起こすかまたは指示し、バックグラウンドスペクトル信号が検出器ピクセルに行シフトされ、その後、第１の間隔Ｉ１のインスタンスが開始する。この第１の間隔の終わりは、ラマンスペクトル信号が検出器ピクセルに行シフトされ、第２の間隔Ｉ２のインスタンスが始まる第２の行シフト期間８０−２の開始を引き起こすかまたは示す、ＥＸＴ−Ｔ信号の第２のピークによってトリガされるかまたは示される。このサイクルが露光期間中に複数回繰り返され、その後、第１の間隔および第２の間隔中にそれぞれ蓄積されたバックグラウンドスペクトル信号およびラマンスペクトル信号の各々がＣＣＤから読み取られる。
【０１１１】
何らかのさらなるシャッタ機構がなくとも、検出ピクセル４２は、行シフト期間中にバックグラウンド光または周囲光によって依然として照らされ、分散された収集光３２を検出ピクセル上に完全に均一に（例えば、何らかの「スマイル（ｓｍｉｌｅ）」パターンまたは他の歪みなしに）投影することは困難であり得るため、蓄積されたスペクトル信号は、いずれのスペクトル信号が上に記憶され、いずれのスペクトル信号が検出ピクセルブロックの下に記憶されるかに起因するアーチファクトによってある程度影響を受ける可能性がある。したがって、装置の出力に対するこの非対称性の影響を低減するために、バックグラウンドスペクトル信号などの１セットの信号が検出ピクセルの上方に記憶される図２ａまたは図２ｂに示すサイクルなどのサイクルからなる各露光期間が、同様のサイクルからなるが、バックグラウンドスペクトル信号などの同じセットの信号が検出ピクセルの下方に記憶される露光期間によって平衡され得る。
【０１１２】
したがって、図４は、２つの異なる露光期間の終わりにＣＣＤから読み取られたデータを示す。上段パネルは、上段ブロックＢが蓄積されたバックグラウンドスペクトル信号を含み、下段ブロックＲが蓄積されたラマンスペクトル信号を含むピクセルからなる読み出された「画像」９０−１を示し、一方、下段パネルは、上段ブロックＲが蓄積されたラマンスペクトル信号を含み、下段ブロックＢが蓄積されたバックグラウンドスペクトル信号を含むピクセルからなる読み出された「画像」９０−２を示す。
【０１１３】
図４の９０−１および９０−２に対応する交互の露光期間をインターリーブすることは有利であり得、その結果、隣接するそのようなデータセットを対にして組み合わせることができ、上記アーチファクトをより良好に低減することができるが、いずれの場合も、より一般的には、バックグラウンドおよびラマン信号を記憶するために交互の位置を使用する等しいかまたは同様の数の露光期間が、データのさらなる分析において、例えばバックグラウンドスペクトル信号を使用するラマンスペクトル信号の補償において組み合わされるかまたは使用されるべきである。
【０１１４】
図４に示され、上記で論じられた技法は、図に示されるようなバックグラウンドスペクトル信号Ｂおよびラマンスペクトル信号Ｒの代わりに、上記で論じられたような２つの異なる波長のレーザプローブ光を使用して第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２が蓄積される場合に等しく適用される。
【０１１５】
図５ａおよび図５ｂは、検出ピクセルおよび記憶ピクセルを配置構成するための代替方式を示す。この配置構成では、記憶ピクセルの対応するブロックとインターリーブされた検出ピクセル４２の複数のブロックが存在し、各ブロックは図２および図４の例よりも少ない行を有する。各ブロックは、高さが１ピクセル行ほど小さくてもよく、または高さが数十ピクセル以上まで大きくてもよい。通常、記憶ピクセルの各ブロックは、ピクセルに関して各検出ブロックと同じサイズである。次に、図５ａは、検出ピクセル４２の各ブロックがスペクトル的に分散された収集光３２の照明下での蓄積のためのバックグラウンドスペクトル信号Ｂを含み、各記憶ブロック４４が照明されていないラマンスペクトル信号Ｒを含む第１の間隔を表す。
【０１１６】
図５ｂは、検出ピクセルの各ブロック内のバックグラウンドスペクトル信号Ｂが下方の記憶ブロック４４まで行シフトされ、記憶ピクセルの各ブロック内のラマンスペクトル信号Ｒが下方の検出ブロック４２まで行シフトされる、第１の間隔の終わりにおける行シフト期間を表す。次いで、ラマンスペクトル信号の蓄積のために第２の間隔が行われ、その後、図５ｂの方向とは逆方向に、または任意選択的に同じ方向にさらにシフトして、図５ａに示すように後続の第１の間隔の開始に戻る。連続する間隔間のシフトシーケンスは、バイナリアップ−ダウン−アップ−ダウン方式、または代替的に、アップ−アップ−ダウン−ダウンなどの同じ方向の連続シフトを含む異なる方式に従うことができるが、これは、記憶および検出のためにより多くのピクセルブロックを使用する傾向がある。
【０１１７】
図５ａおよび図５ｂに示される配置構成は、第１のラマン信号Ｒ１および第２のラマン信号Ｒ２が、示されるようなバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号の代わりに、２つの異なる波長のレーザプローブ光を使用して検出ピクセルに蓄積される場合にも適用される。
【０１１８】
検出ピクセルのブロックと記憶ピクセルのブロックとがインターリーブされる配置構成では、記憶ピクセルが収集光による照明から保護されることを確実にするために、より洗練されたまたはより精細なマスキング４５（図１参照）が必要とされ得る。ガード領域４７内のピクセルの数も同様の目的のために適合されてもよい。上述したように、そのようなマスキング４５は、ＣＣＤデバイス上もしくはＣＣＤデバイス内、または装置内の他の場所に直接実装された層をマスキングすることによって実装することができる。
【０１１９】
検出ピクセルまたは記憶ピクセルのインターリーブされた各ブロックの高さが１ピクセル行のみである場合、これは距離、したがって後続の間隔間の行シフト期間を完了するのに必要な時間を最小化する。しかしながら、１行または数行のみのブロックを実装すると、記憶ピクセルの適切なマスキングを実装することがより困難になる可能性があり、その結果、高さが数ピクセル、例えば高さが１０ピクセルのブロックがより便利になる可能性がある。他方、図１、図２ａおよび図２ｂに示すように検出ピクセルの単一のブロックのみが使用される場合、これは、収集光を特にそのブロックに集中させることができ、インターリーブされた検出ピクセルブロックおよび記憶ピクセルブロックにわたって拡散される場合よりも効率的に使用することができるという利点を有する。
【０１２０】
１つまたは複数のさらなる間隔を使用して、３セット以上のスペクトル信号（バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号、または異なる波長のレーザプローブ光からの第１のラマン信号および第２のラマン信号）を装置によって蓄積することができることを上述した。上述した一例は、サイクルの各第３の間隔において、レーザプローブ光２２が、試料１２ではなく基準試料によって収集光３２に散乱されることである。結果として得られる蓄積された基準スペクトル信号Ｆは、その後、ＣＣＤによって露光期間の終わりに出力することができる。図６は、そのような第３の間隔またはさらなる間隔および対応するスペクトル信号が実装され得る１つの方法を示す。図５に示すような検出器ピクセルおよび記憶ピクセルのインターリーブされた単一ブロックの代わりに、図６は、検出器ピクセルのブロックの各対の間でインターリーブされた記憶ピクセルの２つのブロックを示す。
【０１２１】
これらのブロックの行シフトの適切なシーケンスにより、３セットのスペクトル信号Ｂ、Ｆ、Ｒの各々は、各サイクルの対応する間隔中に検出ピクセル４２内に存在するときに蓄積することができ、一方、他の間隔中は記憶ブロック４４’、４４’’に保持される。例えば、ここでの適切なシフトシーケンスは、「−ダウン−ダウン−アップ＋アップ−ダウン−ダウン−アップ＋アップ−」とすることができ、「アップ＋アップ」は、その行シフト期間においてスペクトル信号が通常の距離の２倍、すなわち２ブロックの距離だけシフトされることを示す。
【０１２２】
図１および図２ａ〜図２ｄに示す線に沿った検出器ピクセルの単一ブロックを使用して、検出器ピクセルのブロックの上方および／または下方に記憶ピクセルの１つまたは複数のさらなるブロックを追加することによって、３セット以上のスペクトル信号を実装することもできる。
【０１２３】
例えば２つの異なる波長のレーザプローブ光を使用して蓄積された第１のラマンスペクトル信号Ｒ１および第２のラマンスペクトル信号Ｒ２を伴うバックグラウンドスペクトル信号Ｂなど、３つ（またはそれ以上）の異なる信号の他の組み合わせが蓄積される場合にも、図６の配置構成が適用される。別の例は、バックグラウンドスペクトル信号がないが、第１のラマンスペクトル信号Ｒ１、第２のラマンスペクトル信号Ｒ２および第３のラマンスペクトル信号Ｒ１が、３つの異なる波長のレーザプローブ光を使用して蓄積される場合である。
【０１２４】
以下でより詳細に説明するように、ＳＯＲＳ技法を使用して試料の１つまたは複数の表面下領域の特性を決定するために、図１に示した照明領域２４および収集領域３４を空間オフセットによって意図的に離間させることができることは上記で言及した。各々が異なるそのようなオフセットを有する複数の露光期間を使用することによって、そのようなオフセットの各々からのラマンスペクトル信号を、例えば国際公開第２００６／０６１５６６号パンフレットに論じられているように、試料内の異なる深さまたは深さ分布に関連付けることができる。このような技法は、試料１２が拡散散乱しており、レーザプローブ光２２が試料の表面を貫通して、例えば少なくとも数ミリメートルの相当の距離にわたって拡散散乱することができる場合に特に関連性がある。
【０１２５】
弾性散乱である散乱の割合と比較して、非弾性ラマン散乱である拡散散乱試料１２内のレーザプローブ光２２の散乱の割合は、通常、非常に小さく、通常は何桁もの差がある。その結果、プローブ光のほとんどの光子は、拡散散乱試料中でラマン散乱されない。しかしながら、試料内でラマン散乱されるプローブ光の各光子も、その後に多数回弾性散乱され、試料を通る光子のランダムウォークを引き起こす。照明領域２４と収集領域３４との間の試料の表面下体積を通るこのランダムウォークの平均経路は、これらの領域間の空間オフセットに依存する。空間オフセットが大きい場合、経路の平均深さは試料内でより深くなることが分かる。
【０１２６】
この原理を使用して、ラマン散乱が生じる深さの分布を制御するために、照明領域と収集領域との間の間隔を装置１０によって制御または調整することができる。この技法は、空間オフセットラマン分光法（ＳＯＲＳ）として参照され、国際公開第２００６／０６１５６５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０６１５６６号パンフレットに詳細に論じられており、その内容は、試料内の特定の深さおよび深さプロファイルにおいて試料の特性がどのように決定され得るかを例示するためを含む、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
異なる空間オフセットからのラマンスペクトル特徴または関連情報を組み合わせて、１つまたは複数の深さまたは１つまたは複数の深さプロファイルについて選択された試料の特性を導出することができるいくつかの方法が、上記の特許文献に記載されているが、例えば、ある深さ、深さプロファイル、または複数のそのような深さもしくは深さプロファイルにおける試料特性を導出するために、１つまたは複数のより大きいオフセットのスペクトル特徴から、オフセットが小さいまたはオフセットがないスペクトル特徴が減算される単純な減算方式、または、複数のオフセットにおける検出されたスペクトル特徴間の統計的関係が使用される主成分分析などのより複雑な多変量分析を含むことができる。
【０１２８】
したがって、空間オフセットラマン分光法の原理によれば、照明および収集領域は様々なサイズおよび形状であってもよく、任意の特定の空間オフセットについて、これらの領域は各々、試料の表面上の単一の連続したまたは複数の個別のセグメントによって形成されてもよい。そのような領域のいくつかの例を図７ａおよび図７ｂに示す。
【０１２９】
図７ａでは、照明領域２４が固定位置に設けられ、複数の収集領域３４ａ〜３４ｅが単一の照明領域からの空間オフセットを増加させて設けられている。任意選択的に、図示された収集領域３４ａのうちの１つは、ゼロオフセットまたはヌル間隔を形成するように、照明領域２４と一致するか、または重なり合う。このゼロオフセットは、より大きい信号から導出される信号を補償するために、試料の表面を表す信号を好都合に提供することができる。これは、例えば、１つまたは複数のより大きい間隔について検出されたラマン特徴から、ヌル間隔について検出されたラマン特徴を減算することによって行うことができる。
【０１３０】
図７ａの配置構成を例として使用すると、照明領域と集光領域との間の任意の数の空間オフセット、例えば、１つから最大１０以上までのオフセットを使用することができ、ラマン特徴は、典型的には、各オフセットについて別個の露光時間間隔中に検出されることが分かる。図７ａでは、照明領域は試料に対して固定されたままであり、収集領域は移動されるが、収集領域の代わりに、または収集領域に加えて照明領域を移動させることができる。図７ａの領域は、本質的に円形または楕円形の形状であり、典型的には送達および収集光学系の実装の都合によって決定され、様々な他の形状が使用されてもよい。図７ａでは、収集領域３４ｂ〜３４ｅのいずれも照明領域と重複しないが、ある程度の重複は許容され得る。
【０１３１】
図７ｂでは、中央収集領域３４が周囲の照明領域２４ａ内にある同心配置が使用されており、これは連続したまたは破断した環の形態であり得る。これは、照明領域が比較的大きく、したがって試料の損傷を回避するためにより低い照明強度を使用して提供することができるという利点を有する。次いで、同心照明領域２４ａおよび２４ｂによって示されるように、照明領域の半径を変えることによって複数の空間オフセットを提供することができる。
【０１３２】
プローブ光の十分な散乱を提供して、試料の深さに由来するラマンスペクトル特徴を検出することができるようにするために、試料は、拡散散乱しもしくは濁っているか、または強く拡散し得る。そのような散乱の程度は試料に依存し、プローブ光の光子の伝播方向がランダム化される長さである輸送長に関して定義され得る。当業者は、拡散散乱の輸送長ｌ＊が、以下の式によって平均自由経路に関連すると解釈され得ることを知っている。
【０１３３】
ｌ＊＝ｌ／（１−ｇ）
式中、ｇは非対称係数（多数の散乱事象にわたる散乱角の平均）であり、ｌは平均自由経路である。本発明による使用に適したいくつかの試料の拡散散乱輸送長は、約１００μｍ〜数ｍｍ程度であり得る。
【０１３４】
したがって、この目的のために、図１〜図６に関して上述した装置および方法を、照明領域と集光領域との間の１つまたは複数の空間オフセットとともに使用することができる。そのようなオフセットは、典型的には、約１ｍｍ〜約５０ｍｍ、より典型的には約３ｍｍ〜約２０ｍｍに及ぶことができ、試料内の深さにおける試料の特性を決定するために、約１ｍｍ〜約３０ｍｍ、より典型的には約２ｍｍ〜約１５ｍｍに及ぶことができる。本発明の実施形態は、例えば照明領域と集光領域との間の単一の空間オフセットを使用して、ただ１つの深さまたは深さプロファイルにおいてそのような特性を決定するように構成されてもよく、または複数の深さまたは深さプロファイルの各々においてそのような特性を決定するように構成されてもよい。実施形態はまた、試料の表面における特性を決定するためにゼロまたはヌルオフセットを使用してもよい。
【０１３５】
図１、図７ａおよび図７ｂは、大部分が平面であるか、または中程度にしか湾曲していない表面上で隣接しているか、近位にあるか、または離間している照明領域および収集領域を示す。このような配置構成は、試料に貫入し、表面下領域内でラマン散乱を受けた後、レーザプローブ光の光子が収集光学系による収集のために試料の表面に後方散乱されるため、後方散乱構成として説明することができる。しかしながら、照明領域および収集領域はまた、例えば９０度離れた領域、またはさらには１８０度離れた領域、または任意の他の角度または角度範囲の法線を有するなど、実質的に異なる表面法線を有する、同一平面から遠い表面の部分上にあってもよい。
【０１３６】
例えば、照明領域および収集領域は、試料の両側に配置されてもよく、または本発明によってその特性が決定されている表面下体積が照明領域と収集領域との間に直接存在するように配置されてもよく、そのような配置は、透過構成として説明することができる。試料の材料が照明領域と収集領域との間に直接存在する透過配置構成は、試料が小さい場合、例えば、強く散乱する試料の場合、直径または厚さが約５ｍｍ〜約５０ｍｍ程度しかない場合に特に重要であり得るが、より透明な試料の場合、照明領域と収集領域との間のより大きい直径または間隔を使用することができる。
【０１３７】
試料の表面下領域のｐＨを決定するために本発明の実施形態で使用することができる透過幾何学形状およびそのような配置構成の他の詳細のさらなる説明は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１３５６６号パンフレットを含む従来技術に見出すことができ、本発明で使用するために、および他のすべての目的のために適切な透過幾何形状をどのように配置するかを示す。
【０１３８】
図８は、上記の装置および方法が実施され得る方法のいくつかの方法をより詳細に示しているが、明確にするために、ＣＣＤから出力されるスペクトル信号またはその後の分析の詳細はこの図には示されていない。この図は、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号が露光期間の第１の間隔および第２の間隔中にどのように蓄積され得るかを示しているが、第１のラマンスペクトル信号および第２のラマンスペクトル信号が代わりに第１の間隔および第２の間隔中にそれぞれ蓄積されるように容易に適合され得、異なる第１の波長および第２の波長のレーザプローブ光がそれぞれ第１の間隔および第２の間隔において試料に入射する。
【０１３９】
レーザ光源２０において、レーザ２６は、８３０ｎｍのコリメートビームを放射するマイクロシステムダイオードレーザモジュール（Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ−Ｂｒａｕｎ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｈｏｃｈｓｔｆｒｅｑｕｅｎｚｔｅｃｈｎｉｋ、ベルリン、ドイツ）によって提供される。光源光学系では、直線偏光レーザ光は、２つのバンドパスフィルタ１２２（Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｉｎｃ．）を通過し、次いで１／４波長板１２４によって円偏光に変換される。以下に説明する実験では円偏光を使用したが、これは検出モードに特に影響せず、直線偏光または任意の他の安定した偏光状態でも同等に良好な結果が得られた。レーザモジュールの温度は、コントローラ６０の温度コントローラ１６２（５２４０  ＴＥＣＳｏｕｒｃｅ，Ａｒｒｏｙｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって２５℃に調整され、注入電流は、同じくコントローラ６０の一部を形成するレーザドライバ１６４（４２２０−ＤＲ  ＬａｓｅｒＳｏｕｒｃｅ，Ａｒｒｏｙｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって制御される。
【０１４０】
光源光学系では、次いで、焦点距離が５０ｍｍのレンズ１２６が、レーザ放射を試料１２上に集束させる。以下に記載される実験において、試料は、２２０μｍ厚のＰＴＦＥ層によって提供された。
【０１４１】
試料１２から後方散乱されるレーザ放射は、焦点距離１００ｍｍのアクロマートレンズ１３２によって収集光学系３０に収集される。続いて、２つのラマンエッジフィルタ１３４（Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｉｎｃ．）が、弾性散乱および反ストークス寄与を排除しながら、ラマンストークスシフト成分のみを透過させる。焦点距離が６０ｍｍのアクロマートレンズ１３６が、光を円形状−線形状変換ファイババンドル１３７（ＢＦＬ２００ＬＳ０２，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に集束させ、次いで、ファイババンドルは、検出された光を、−７０℃まで熱電的に冷却され、Ａｎｄｏｒ「Ｓｏｌｉｓ」ソフトウェア（バージョン４．２８．３００５２．０、Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を実行するＰＣによって制御される、電荷シフトＣＣＤ  ４０（ＤＵ４２０Ａ−ＢＲ−ＤＤ−９ＵＷ，Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を取り付けられた分光計１３８（Ｈｏｌｏｓｐｅｃ  １．８ｉ，Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に転送する。ＣＣＤは、ハードウェアの変更を伴わない標準的な分光ＣＣＤであった。上記のようなＣＣＤにおける行シフトモード動作は、「Ｓｏｌｉｓ」ソフトウェアのカスタマイズによって容易になった。
【０１４２】
レーザ源光学系２０および収集光学系３０の両方が、黒色アルミニウム箔カバー（ＢＫＦ１２，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して周囲光から遮蔽された。
【０１４３】
レーザプローブ光２２の放出を露光期間の間隔サイクルおよびその後のデータ読み出しと同期させるために、第１のデジタル遅延発生器１６６（ＤＧ６４５，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の出力ポートの一方がＣＣＤの外部トリガ入力６４に接続され、一方で、もう一方がレーザドライバ１６４の変調入力に接続される。ＣＣＤのシャッタ出力６６は、第２のデジタル遅延発生器１６８（Ｍｏｄｅｌ  ５５５，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の入力に接続されている。第２の遅延発生器の出力は、第１のデジタル遅延発生器１６６の「抑止」入力に接続されて、第１の間隔または最終データ読み出し段階ではなく、第２の間隔中にのみレーザ発光を可能にする。
【０１４４】
露光期間中、この例では１ｋＨｚの周波数を有する外部トリガ信号が、記憶ピクセル４４として使用されるＣＣＤピクセルの第１のブロックから、検出ピクセル４２として使用されるＣＣＤピクセルの第２のブロックへのバックグラウンドスペクトル信号（第１のサイクルでは空またはヌル）の行シフト、および検出ピクセル４２から記憶ピクセル４４の第２のブロックへのラマンスペクトル信号（露光期間の第１のサイクルの開始時には空またはヌル）の行シフトをトリガする（図２ｄを参照）。検出ピクセル４２のブロックは、その後に続く第１の間隔中、周囲光の寄与によって照明される（図２ａを参照）。したがって、結果として生じる電荷の蓄積は、バックグラウンドスペクトル信号の蓄積に対応する。各記憶ブロックは、例えば約８０行だけ検出ピクセルのブロック４２からオフセットすることができ、各記憶ブロックは、例えば上記の図２ａ〜図２ｄに示すように、検出ピクセルのブロックから反対方向にオフセットされる。
【０１４５】
後続のトリガ信号を受信すると、記憶ピクセルの第２のブロックから検出ピクセルへのラマンスペクトル信号の、および記憶ピクセルの第１のブロックへのバックグラウンドスペクトル信号の反対方向への行シフトがトリガされ、第２の間隔がトリガされ（図２ｂも参照）、ラマンスペクトル信号は、次いで、電荷の蓄積を介して、両方の周囲光条件、および第２の間隔の少なくとも一部にわたって試料から散乱されるレーザプローブ光２２による照明を介して、検出ピクセル４２に蓄積する（図２ｃを参照）。
【０１４６】
電荷シフトならびに第１の間隔および第２の間隔のこのサイクルは、多数回、例えば、後述する例では約２５００回繰り返され、これは約５秒の総露光時間（間隔間の電荷シフト期間を含む）に対応する。
【０１４７】
露光期間の終わりに、バックグラウンドおよびラマンスペクトル信号を表すＣＣＤチップ上の蓄積電荷（例えば、１６ピクセルの垂直ビニングが適用されるイメージングモードで動作する）が読み出され、デジタル化される。検出ピクセルのブロックの照明条件は、レーザプローブ光２２の有無のいずれかであり得るため、記憶ピクセルには２つの異なる幾何形状が存在し、バックグラウンドスペクトル信号またはラマンスペクトル信号のいずれかが、ＣＣＤピクセルアレイの読み出し側から遠い記憶ブロックに記憶される。図４に関する関連する説明を再び参照すると、これらは「ａ」（最終画像の下側領域のレーザ発光−図４の上部を参照）および「ｂ」（最終画像の上側領域のレーザ発光−図４の下部を参照）として参照することができる。以下に説明する実験例では、スペクトル信号は常に「ａ」および「ｂ」幾何形状の露光期間の対において記録され、２つの露光期間の組み合わせの合計取得時間は１０秒となった。
【０１４８】
以下に説明する実験例では、レーザドライバ１６４は、レーザ発振閾値（「レーザオフ」状態に対応する）を下回る５６０ｍＡの注入電流に設定され、５００Ｈｚの周波数において第１のデジタル遅延発生器によって変調され、すなわち、ラマンスペクトル信号が検出ピクセル内にある露光期間の第２の間隔中にのみ発射される。１Ｖの変調電圧を印加すると、６６０ｍＡの「レーザオン」状態のレーザ注入電流が得られ、５２ｍＷの試料位置における光パワーが得られる。（バックグラウンドスペクトル信号への信号混合をもたらす）行シフト期間中のレーザ放出を回避するために、６８０μｓのＣＣＤトリガ信号とレーザパルス出力との間のパルス遅延を適用した。レーザパルス幅は、後続のパルスが到達するまでの利用可能な時間（すなわち、１ミリ秒）によって制限され、３１９μｓに設定された。
【０１４９】
ＣＣＤ  ４０によって必要とされる外部トリガ信号６４は、第１のデジタル遅延発生器によって提供される。対応するパルス出力は、「抑止」機能の影響を受けず、したがって、１ｋＨｚの選択された周波数でＣＣＤの「ＥＸＴ  ＴＲＩＧ」入力に連続パルス列を送達することに留意されたい。第１の間隔および第２の間隔の複数サイクルの露光期間がＳｏｌｉｓソフトウェアにおいて開始されると、ＣＣＤ「シャッタ」出力６６はトリガ信号を第２のデジタル遅延発生器１６８の入力に送る。この遅延発生器は、そのようなトリガ信号が受け取られないとき、すなわちレーザが「オフ」状態にあるときに、第１の遅延発生器１６６のレーザ出力の「抑止」機能を起動するようにＴＴＬハイ構成に設定されている。ＣＣＤからトリガ信号６６を受信すると、第２の遅延発生器１６８は、選択された持続時間（例えば５秒）のパルスを出力して、第１の遅延発生器１６６の「抑止」機能を無効にし、その結果、その特定の持続時間にわたってレーザ出力を有効にする。第１の間隔および第２の間隔の予め設定されたサイクル数に達し（Ｓｏｌｉｓソフトウェアにおいて予め設定される）、次いで、ＣＣＤがバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号の読み出し段階を経ると、シーケンス全体が完了する。
【０１５０】
この読み出し段階中、ＣＣＤは、例えば１６ピクセルのグループにおいて垂直に（列に沿って）ビニングするようにプログラムすることができる。検出ピクセルのブロックならびに記憶ピクセルの第１のブロックおよび第２のブロックの各々が６４ピクセルの高さを有する場合、これは、４行のバックグラウンドスペクトル信号および４行のラマンスペクトル信号のＣＣＤからの出力をもたらす（ともにビニングされた１６ピクセルのサブブロック毎に１つ）。
【０１５１】
第１の間隔および第２の間隔の複数のサイクルによる説明した露光期間を使用した図７の装置の動作（ここでは「電荷シフトモード」として参照される）からの実験結果を比較するために、装置を比較のためのより「従来の」モードでも動作させた。この従来のモードでは、５０ｍｓ、１００ｍｓおよび５００ｍｓの露光期間が使用された。電荷シフトおよび従来のモードの両方において照明条件を一致させるために、２つの調整ステップが実行された。まず、従来の読み出しモードにおいて適切な露光期間の数を選択することによって、全取得時間中に検出ピクセルに当たる周囲光の総量を一致させた。第二に、所与の数の総露光期間について、個々の露光期間中に試料に衝突するレーザ光子の総数を、適切なレーザパルス幅を選択することによって一致させた。
【０１５２】
従来モード動作の読み出し段階中のＣＣＤの照明を回避するために、レーザパルスのタイミングを各露光期間の中心になるように調整した。すなわち、ＣＣＤトリガパルスに対する適切なレーザパルス遅延を選択した。電荷シフトモードの読み出し条件を模倣するために、各々が列方向に１６ピクセルを含む４つのトラックを使用してマルチトラックモードにおいてバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号を取得した。さらに、各々がバックグラウンド、次いで「レーザオン」および「レーザオフ」状態に対応するラマンスペクトル信号を有する一連のサイクルを記録するために、ＣＣＤは、第１の遅延発生器１６６によって外部からトリガされた。
【０１５３】
試料に到達する周囲光は、太陽などの様々な自然光源、および／または白熱灯、蛍光灯、およびＬＥＤ照明などの様々な人工光源から生じる可能性があり、例えば、装置の周囲の人および物体の動き、装置および／または試料の動き、空にわたる雲の動き、照明のオンおよびオフ、または他の様態での出力の変化などによって影響され得る。記載された装置および方法を実証する目的で、３５Ｗハロゲン電球（広帯域光源として）または小型蛍光灯管（狭帯域光源として）のいずれかを使用して、試料領域を直接照明した。その低い強度に起因して、コンパクトな蛍光管（いくつかの狭い輝線を有する）から放出された光は、試料領域の直接照明に加えてミラーを使用して試料表面に向かって反射されている。上記の図８に関連して記載されたＰＴＦＥ試料に注目して、両方の周囲光の強度は、７３４ｃｍ−１の主なＰＴＦＥラマンバンドと最も強い周囲光信号との比が０．００８〜０．０２６の範囲内になるように設定された。「静的照明条件」では、周囲光はさらなる物理的干渉なしに使用されたが、「動的照明条件」では、光強度は、人員、測定領域の周りの他の物体または光源自体の動きを粗く模倣して、対応する光源の真下でオペレータの手を振ることによって変調された。「従来」および「電荷シフト」動作モードの光源の両方について、「静的」および「動的」照明下で、６反復の実験セットを、各実験中に記録されたバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号の１０個の個々のセットを用いて行った。
【０１５４】
「従来モード」では、ＣＣＤピクセル行８１〜１４４に対応する４つの個々のトラック上で取得されたスペクトル信号を平均し、動力学系列の両方の場合（「レーザオン」／「レーザオフ」）の個々のスペクトルを累積して、平均スペクトルをもたらした、すなわち一方はＰＴＦＥラマン信号および周囲光信号を含み、他方は周囲光の寄与のみを含む。次いで、２つのスペクトルの各々からの最小値を差し引いた後、周囲光源の最も強い特徴、すなわち、蛍光についての１０９８ｃｍ−１における鋭い信号の頂点（３つのデータ点の平均）または白熱光についての９４７ｃｍ−１〜９７３ｃｍ−１の広い発光プロファイルの頂点（１５個のデータ点の平均）に正規化した。最後に、２つの対応するスペクトル間の差を取った。
【０１５５】
「電荷シフト」スペクトル信号は、「従来の」読み出しにおけるスペクトル信号と同様の方法で処理された。しかしながら、ここでは、上部（ピクセル行８１〜１４４）および下部（ピクセル行１〜６４）の領域内で取得された強度が初期ステップにおいて平均化され、差分計算（上部領域−下部領域）の後に、「ａ」スペクトルから「ｂ」スペクトルを減算することによる最終的な再構築ステップが追加された。
【０１５６】
ＰＴＦＥテープの基準スペクトルを得るために、すべての周囲光をオフにし、１０秒の積分時間を使用して２つの高い信号対ノイズ比のスペクトルを記録し、１０個の個々のスペクトルを各々平均した。続いて、「レーザオフ」状態に対応するスペクトル（５６０ｍＡ注入電流）が、「レーザオフ」状態に対応するスペクトル（６６０ｍＡ注入電流）から直接減算された。
【０１５７】
ＰＴＦＥラマン信号および周囲光の両方からの寄与を有するスペクトルから、特徴的なスペクトル特徴の強度を決定した。７３４ｃｍ−１におけるＣ−ＦおよびＣ−Ｃ対称伸縮バンドのＰＴＦＥラマンバンド強度を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、ワシントン州レドモンド）を使用してバンドの左右５点の平均強度によって決定されるベースラインより上のピーク中心における３点の強度の平均として計算した。蛍光の周囲光強度を、１０９８ｃｍ−１の最も強い輝線を使用する以外は同じ方法で決定した。白熱灯の場合、広い発光の最大強度は、７０ｃｍ−１〜９８ｃｍ−１の領域内の平均強度から９４７ｃｍ−１〜９７３ｃｍ−１の範囲内のバックグラウンドの平均強度を差し引くことによって計算された。回収されたスペクトルのＰＴＦＥ信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を計算するために、ＰＴＦＥまたは蛍光輝線のいずれからの信号も含まない８１０ｃｍ−１〜８６０ｃｍ−１のスペクトル範囲内のバックグラウンドノイズ値を決定した。
【０１５８】
スペクトル再構築の定量的評価のために、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，８３，４０６１−４０６７（その内容がこの特定の目的および他のすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に論じられているようなヒット品質指標（ＨＱＩ）を、個々の再構築スペクトルとＰＴＦＥ参照スペクトルとの間のスペクトル類似性の指標として使用した。特に動的照明条件下では不可避である周囲光強度レベルの潜在的変動を説明するために、図９ａ、図９ｂ、図１０ａおよび図１０ｂにおいてＰＴＦＥ信号対周囲光強度比に対してＨＱＩがプロットされている。
【０１５９】
「従来の」モードの場合、スペクトル再構築は単純に、「レーザオン」スペクトルからの「レーザオフ」スペクトルのスケーリングされた減算によって実行された。しかしながら、「電荷シフト」モードの場合、記録された２つの別個のトラック、すなわち、ラマンスペクトル信号（周囲光を含む）およびバックグラウンドスペクトル信号（周囲光のみ）のスケーリングされた減算は、蛍光輝線の顕著な残差を残した。残差のスペクトルパターンは一次導関数の形に似ており、電荷シフトプロセス中に周囲光輝線のシフトが存在し得ることを示している。この効果は、平面格子が直線入射スリットの湾曲画像をもたらす撮像分光器に固有の周知の「スマイル」パターンに関して理解することができる。
【０１６０】
「従来の」モードでは、ＣＣＤピクセル電荷が一方向にのみ、すなわち、実際の読み出し段階（露光あたり約９０ミリ秒の持続時間）中にのみシフトされるため、これは問題であるようには見えない。したがって、レーザのオンオフにかかわらず記録された連続スペクトルは、まったく同じ量の歪みを経験し、個々の寄与は減算中に相殺される。しかしながら、「電荷シフト」モードでは、露光段階中に電荷が両方向にシフトされ、比較的多数の８０のシフトされた行に起因して、「スマイル」効果によって引き起こされる歪みを完全に補償することができない。１１００ｃｍ−１付近の最大残留強度は、上部トラックスペクトルおよび下部トラックスペクトルにおける蛍光輝線の元の強度の６％未満にしかならないため、効果は相対的に小さいことに留意されたい。
【０１６１】
それにもかかわらず、図４に関して上述した技法を使用することは、この歪みを克服するのに役立つ。開始トリガ信号によって決定されるように、ＰＴＦＥ試料に由来するラマン散乱光は、「電荷シフト」モードにおいて上部トラック（「ａ」スペクトル）または下部トラック（「ｂ」スペクトル）のいずれかにおいてイメージングされた。どちらの場合も上部トラックから下部トラックを減算する結果として、「ａ」差については正のラマン強度が得られ、一方、「ｂ」差については負のラマン強度が得られた。スペクトル歪みは両方の場合で等しいため、両方の差スペクトルを互いから減算することによって効果的に除去され、再構築ＰＴＦＥスペクトルが得られる。ここで説明する実験では、再構築スペクトルと参照スペクトルとの比較は、残留歪みが非常にわずかしか残されていない、得られたスペクトルの高品質を強調している。
【０１６２】
「静的」照明条件下での平均再構築スペクトルは、「従来の」および「電荷シフト」モードにおいて非常に類似したパターンを示した。蛍光干渉はすべての場合で効果的に除去され、以前の非常に強い輝線からのわずかな寄与しか残っておらず、（標準偏差によって示されるように）再構築スペクトルの良好な再現性が達成された。しかしながら、再構築スペクトルのＳ／Ｎ比に関して、従来の読み出しモードと電荷シフトモードとの個々の取得時間の間に明確な差があった。ほぼ平坦なバックグラウンドの上に主に鋭く強い輝線を有する干渉光源の場合、この効果は、個々の取得の数に依存する読み出しノイズに関して説明することができる。「電荷シフト」モードでは、２つの読み出しのみが行われたが、読み出しサイクルの数は、「従来」モードにおいて５００、１００および５０ミリ秒のサブ取得時間に対して、それぞれ１８、７４および１２２である。５００ミリ秒の取得時間では、取得回数が比較的少ないことに起因して、取得されたＳ／Ｎ比が「電荷シフト」モードと同一であるため、蓄積された読み出しノイズの有害な影響は消失する。
【０１６３】
「動的」照明条件下では、再構築スペクトルの標準偏差は、「電荷シフト」モードと比較して「従来の」読み出しモードではるかに大きかった。特に、１００ミリ秒のサブ取得時間の場合、蛍光輝線の残差が顕著であった。さらなる試験は、この観察が、スペクトル放出プロファイルの空間的変動をもたらす蛍光灯の比較的大きい活性面（各々１０ｍｍの直径および９４ｍｍの長さを有する２つの別個のＵ字形放電管）に起因することを示した。動的照明条件下で光源と実験設備との間で手を動かすと、収集光学系は異なる時点においてわずかに異なるスペクトル分布を捕捉した。手の動きがＣＣＤ読み出し周波数と同期していなかったため、スペクトル歪みは、運動学的系列の隣接するスペクトルに均一に分布していない。その結果、スペクトル再構築プロセスは、これらの歪みを効果的に除去することができなかった。適用された手を振る周波数では、５０ミリ秒および５００ミリ秒のサブ取得時間がより良好な再構築性能をもたらしたが、これは異なる変調周波数には当てはまらない場合があることに留意されたい。この基本的な問題を克服する唯一の方法は、露光期間の第１の間隔と第２の間隔との間でバックグラウンドレベルの高速変動を均等に効果的に分配し、結果、後続のスペクトル再構築がこれらの外乱を効率的に除去することができるようにする、例えば１ｋＨｚの周波数で動作する「電荷シフト」モードの能力である。ＣＣＤに当たる蛍光の絶対強度がより低いことに起因して、Ｓ／Ｎ比はすべての場合で増加するが、依然として「静的」照明条件で既に観察されるものと同じ傾向を示す。
【０１６４】
「従来の」および「電荷シフト」モードでの回収されたスペクトルの定量的評価のために、ＰＴＦＥ対蛍光強度比が、図９ａおよび図９ｂにおいて、ヒット品質指数（ＨＱＩ）に対してプロットされており、完全なスペクトル一致は１のＨＱＩに対応する。
【０１６５】
図９ａの「静的」照明条件下では、「従来の」モードと「電荷シフト」モードとの間で再構築性能に大きい差はなく、非常に良好な再構築が達成される。しかしながら、「従来の」読み出しについては、サブ取得時間を増加させてより良好な再構築を行う傾向がある。５００ミリ秒において記録された一連の１８個の個々のスペクトルから再構築スペクトルは、最良の性能を示し、同等のＰＴＦＥ信号対周囲光強度比において、「電荷シフト」モードから再構築されるスペクトルと実質的に同一である。ほぼ平坦なベースラインを有する蛍光放出によってスペクトルに付加されるショットノイズの量は著しくないため、この効果は、より短いサブ取得時間にわたる累積読み出しノイズの量の増加に関して理解することができる。不変のバックグラウンドについて予測されるように、１．７〜７．５  Ｈｚの範囲の周波数における「従来の」モードは、これらの静的寄与を効果的に排除することができる。
【０１６６】
しかしながら、図９ｂは、「動的」照明の場合、「電荷シフト」モードが周囲光干渉の急速に変化する変調に対処するのに優れており、最良の再構築（最高のＨＱＩ）および最良の再現性（１０個のスペクトルの各セット内の最低の標準偏差）をもたらすことを示している。「従来の」条件下で１００ミリ秒の露光時間において記録された２つのスペクトルの再構築は非常に悪い結果をもたらしており、提示を明確にするためにこれらの外れ値が除去されていることに留意されたい。結果は、（個々の取得間の不可避の読み出し段階に起因して）１０Ｈｚ未満の周波数に制限される「従来の」モードが、周囲光干渉の不規則な変調／変動に効率的かつ再現可能に対処することができないことを実証している。材料の同定に関して、確認目的で使用される典型的な最小ＨＱＩは０．９５である（上記のＲｏｄｒｉｇｕｅｚ他を参照されたい）。この閾値を適用すると、調査中のＰＴＦＥ試料の正分類率は、５０、１００および５００ミリ秒のサブ取得時間を有する「従来の」モードでは、それぞれ５７％、６８％および８２％であった。対照的に、「電荷シフト」モードの優れたスペクトル再構築性能は、１００％の正分類率をもたらした、すなわち、試料は６０例中６０例でＰＴＦＥとして同定された。
【０１６７】
２つのモード間の１つの主な違いは、従来のモードでは、再構築性能が、調査されたすべてのサブ取得時間について「静的」から「動的」照明条件に減少し（１．０〜３．２％の減少）、一方、電荷シフトモードの場合は反対である（０．８％増加）ことである。さらに、スペクトル再構築の再現性は、「従来の」モードでは５０、１００および５００ミリ秒のサブ取得時間に対してそれぞれ４．３、１２．２および５．４倍低下し、一方、「電荷シフト」モードでは変化が観察されない。この挙動は、２つの反作用する効果によって説明することができる。「静的」照明では、測定中の蓄積蛍光強度はより高い（しかし、安定している）が、「動的」照明条件下では、様々な（しかし、全体的に低い）量の周囲光が取り込まれる。「電荷シフト」モード（この場合、１ｋＨｚで動作する）は、変調されたバックグラウンドを扱う優れた能力を有するため、絶対蛍光強度が小さいほど、「動的」照明条件下でのスペクトル再構築が良好になる。対照的に、「従来の」モードは、バックグラウンド変動をうまく処理することができないため、この場合、より低い絶対強度の利点を利用することができず、再構成性能の低下および変動の増加をもたらす。
【０１６８】
白熱光源は、記録されたスペクトルに有意なバックグラウンドを追加する広く強いスペクトル放出を有していた。その結果、「静的」照明条件下での再構成スペクトルは、同等のピーク強度の蛍光と比較して約１桁低いＳ／Ｎ比を示している。この場合の蛍光とは対照的に、「従来」モードでは、サブ取得時間に関してＳ／Ｎ比について観察可能な傾向はなかった。白熱灯のスペクトル特性のために、スペクトルに含まれる光子ショットノイズの量は、蓄積された読み出しノイズよりもはるかに大きく、したがって主要なノイズ源と考えることができる。
【０１６９】
「動的」照明条件下では、光強度の変調によって導入されるスペクトル歪みがさらなる変動源として寄与する。「従来の」モードでは、この効果により、様々なバックグラウンドに対処するこの構成の能力が限られているため、静的照明に対して低波数領域および高波数領域（すなわち、スペクトル再構築のために正規化が実行される領域の外側）において標準偏差が増加した。しかしながら、「電荷シフト」モードの場合、そのタイプの変動を効果的に排除する能力は、「静的」照明条件と比較して全体的な光強度が減少したため、標準偏差を大幅に減少させた。微細なピクセル対ピクセルノイズによって支配されるＳ／Ｎ比に関して、様々な動作モード間で観察可能な差はなかった。しかしながら、全体的な白熱光の強度が低下し、結果としてショットノイズの寄与が低下したため、絶対値は「静的」照明条件と比較して約１．４〜１．６倍増加した。
【０１７０】
図１０ａは、「静的」照明条件下でのＰＴＦＥ信号対白熱光強度比を示す。この構成では、すべての再構築スペクトルは誤差範囲内で同一であり、選択されたサブ取得時間のいずれにおいても「電荷シフト」モードが「従来の」モードと比較して同等に良好に機能することを強調している。スペクトル内に大量のショットノイズが存在することに起因して、蛍光干渉（ＨＱＩ＝０．９４〜０．９８）と比較して、ＨＱＩの絶対値は明らかに減少する（ＨＱＩ＝０．４０〜０．５５）。
【０１７１】
「動的」照明条件の下では、「電荷シフト」法は、図１０ｂに見られるように、この場合に最良のスペクトル再構築および最低の変動をもたらす変動バックグラウンドを効率的に除去することができることを実証する。選択されたサブ取得時間とは無関係に、「従来の」モードのスペクトル再構築性能は劣っており、スペクトル再構築後に依然として残留歪みが存在するため、より大きい変動を示す。特に、「電荷シフト」モードスペクトルでは、達成されるＨＱＩ信号とＰＴＦＥ信号対白熱光強度比との間に正比例関係があることが明らかになる。この効果は、ショットノイズの寄与が低減される場合により良好なスペクトル整合を実現することができるときに期待される。
【０１７２】
蛍光光源によって導入されるスペクトル的に狭い歪みとは対照的に、白熱光によって引き起こされる再構築スペクトルの変動は、信号バックグラウンドのスペクトル的に広い変調と考えることができる。したがって、「従来の」モードでは、７次多項式フィッティング（ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）  Ｒ２０１３  ａ）によってスペクトル的に緩やかに変化するベースラインを除去する試みがなされている。続いて、補正されたスペクトルのスペクトル再構築性能をＨＱＩによって評価した。歪んだスペクトル（「動的」照明下で「従来の」モードで記録された）のスペクトル再構築は、「電荷シフト」モードと比較して性能および再現性の低下を示すが、この差は多項式ベースライン補正後に消失する。このアプローチは、（この場合はＰＴＦＥとしての）鋭い十分に分離されたラマンバンドを有する試料については成功しているようであるが、より困難な検体、例えば生体組織の場合、多項式フィッティングによってスペクトルに重要なアーチファクトを付加するリスクがあることに留意されたい。
【０１７３】
表１は、電荷シフトモードにおける１回の露光期間に対応する、１回の取得に必要なファイルサイズおよび測定時間に関する「従来の」モードと「電荷移動」モードとの比較を示す。周囲光強度の高速変動に対処するために、利用可能な最も速いＣＣＤ変調周波数を使用することが有益であり得る。「従来の」モードでは、これは５０ミリ秒のサブ取得時間について７．５Ｈｚであり、一方、「電荷シフト」モードでは、１ｋＨｚの達成可能な周波数は２桁速く、したがって明確な利点を提供する。周囲光干渉の除去は、通常の実験室環境外、すなわち携帯機器が適用される場所で特に必要とされるため、データ記憶容量が制限される可能性があるときに生成されるデータ量にも注意が必要である。
【０１７４】
【表１】
2022502660.tif 000003
【０１７５】
表１に示されているように、ＣＣＤから読み取られたバックグラウンドおよびラマンスペクトル信号を合わせたデータファイルのサイズは、ＣＣＤに当たる周囲光の総量に応じて変化する。全体として、ＣＣＤソフトウェアから得られる「従来の」モードの元のファイルサイズは、「電荷シフト」モードと比較して最大１８倍（７．５Ｈｚ動作の場合）大きい。白熱光を例にとると、５０個のスペクトルの合計ファイルサイズは、周波数７．５Ｈｚの「従来」モードでは１５３．４ＭＢになるが、「電荷シフト」モードでは９．０ＭＢしかならない。したがって、「従来の」モードの主な制限は、周囲光の高速変動を動的モードでのみ補償でき、これには、動的系列の各単一のサブ取得を読み出して記憶する必要があることである。ほとんどの場合、個々のサブ取得へのアクセスは必要とされないため、「電荷シフト」技法は、データをスペクトル再構築に必要な量に制限することによって、この点で有益である。
【０１７６】
最後に、生成されるデータ量だけでなく、測定を完了するのに必要な時間も重要な要素である。表１から、「電荷シフト」モードと比較して、従来のモードは、５０ミリ秒、１００ミリ秒、および５００ミリ秒について、それぞれ６３％、３７％、および６％遅いことが分かる。５０個のスペクトルの取得を再び例にとると、これは７．５Ｈｚで「従来の」モードでは１３：３５分かかるが、「電荷シフト」技法を使用すると８：２０分しかかからない。測定時間は、「従来の」モードでより低い周波数を適用することによって短縮することができるが、これは、周囲光の高速変動をこれ以上効果的に計上することができないことを犠牲にする。
【０１７７】
本発明の特定の実施形態および用途を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な修正および変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【０１７８】
例えば、記載された技法は、例えば互いに１／１０〜１／２秒程度離れた間隔であり得る複数の連続した時間フレームにおける試料に関する補償ラマンスペクトル信号を決定することによって、時間分解ラマン分光法を実施するために使用され得る。記載された技法は、ラマンイメージング、または個々のラマンバンドなどのラマンスペクトル特徴が画像平面にわたって検出される広視野ラマンイメージングにも使用することができる。
【図１】
2022502660.tif 000004
【図２ａ】
2022502660.tif 000005
【図２ｂ】
2022502660.tif 000006
【図３】
2022502660.tif 000007
【図４】
2022502660.tif 000008
【図５（ａ）】
2022502660.tif 000009
【図５（ｂ）】
2022502660.tif 000010
【図６】
2022502660.tif 000011
【図７ａ】
2022502660.tif 000012
【図７ｂ】
2022502660.tif 000013
【図８】
2022502660.tif 000014
【図９ａ】
2022502660.tif 000015
【図９ｂ】
2022502660.tif 000016
【図１０ａ】
2022502660.tif 000017
【図１０ｂ】
2022502660.tif 000018
【国際調査報告】
2022502660.tif 000019
2022502660.tif 000020
2022502660.tif 000021
2022502660.tif 000022
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