【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の部分および第２の部分を含む標的核酸の検出方法であって、
（ａ）標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）前記標的核酸をプローブと接触させることを含み、
ここで、前記プローブは前記標的核酸の第１の部分と相補的な第１の部分を含み、前記プローブは前記標的核酸の第２の部分と実質的に相補的な第２の部分を含むものであり、
コントロールと比較した前記標的核酸へのプローブ結合レベルが前記試料中に存在する標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。
【請求項２】
前記試料が第１の部分および第２の部分を含む同胞核酸（ｓｉｂｌｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）をさらに含み、
前記標的核酸の第１の部分および前記同胞核酸の第１の部分は実質的に同一であり、
前記同胞核酸の第１の部分は前記プローブの第１の部分と実質的に相補的であり、
前記同胞核酸の第２の部分は前記プローブの第２の部分と実質的に相補的である
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸がｃＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸が増幅される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅が行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フォワードプライマーが配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが標識を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識がフルオロフォアを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識がさらにクエンチャー分子を含み、前記フルオロフォアがプローブ上の前記クエンチャー分子の遠位に存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が生体試料である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、血液、血液画分、尿、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、羊水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患または健康状態の検出方法であって、
（ａ）標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）請求項１に記載の方法により前記試料中の前記標的核酸のレベルを測定することを含み、
コントロールと比較した前記標的核酸のレベルの差異が疾患または健康状態の指標である
当該検出方法。
【請求項１６】
前記試料が生体試料を含み、該生体試料が血液、血液画分、尿、羊水、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病が癌である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
複数の標的核酸の検出方法であって、
各標的核酸が第１の部分および第２の部分を含み、
（ａ）複数の標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）前記標的核酸を複数のプローブと接触させることを含み、
各プローブが前記標的核酸のうちの１つの第１の部分と相補的な第１の部分を含み、各プローブが前記標的核酸のうちの１つの第２の部分と実質的に相補的な第２の部分を含むものであり、
コントロールと比較した各標的核酸への各プローブの結合レベルが前記試料中に存在する各標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。
【請求項１９】
前記試料がさらに複数の同胞核酸を含み、各同胞核酸が第１の部分および第２の部分を含み、前記プローブの第１の部分が前記同胞核酸の第１の部分と実質的に相補的である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が個人から単離されたＤＮＡであり、前記試料中に存在する各標的核酸のレベルが前記個人の遺伝子型の指標となる請求項１８に記載の方法を含む遺伝子型同定方法。
【請求項２１】
被験者から得られる体液試料中のマイクロＲＮＡ発現同定方法であって、
（ａ）試料からマイクロＲＮＡを含むＲＮＡを提供すること；
（ｂ）ポリアデニル化ＲＮＡの逆転写産物を生成すること；および
（ｃ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むポリメラーゼ連鎖反応により工程（ｂ）の逆転写産物を増幅すること
を含む当該同定方法。
【請求項２２】
前記体液試料が、血液、血清、尿、羊水、腹水、唾液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、滲出液、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物および精液からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブがさらにマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記フォワードプライマーが配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブが配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項２１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
表７および表８Ａ、Ｂに記載される結果は、本明細書で記載するプローブまたはオリゴｄＴプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、配列においてたった１つのヌクレオチドだけ異なる標的核酸を差次的に検出可能であることを示している。
表８Ｂ  異なる位置にミスマッチを含むオリゴｄＴプライマーを用いたＬｅｔ−７ファミリーメンバーの検出
【表１０】
2010500867.tif 000001
【表１１】
2010500867.tif 000002
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
反対に、ｃＤＮＡアダプター配列に対して１つのミスマッチを有するが、ｍｉＲ−１００に対してはミスマッチを有していないプローブは、ｍｉＲ−９９に対して検出されたＣTと比べて約５サイクル低いＣTでｍｉＲ−１００を認識した。本発明の方法の高い特異性は、非常に類似度の高いｍｉＲＮＡを混合した場合でも維持される（表９）。
表９  ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１００の検出
【表１２】
2010500867.tif 000003
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
表１６Ａ−Ｂは、ヒトの唾液、胸水および胸部分泌物中においても異なるマイクロＲＮＡを特異的に検出可能であったことを示す。表１６には、ヒトの唾液、胸水および胸部分泌物から種々のマイクロＲＮＡ標的配列を抽出、単離および検出することが可能なことが初めて示されている。
表１６Ａ  ヒトの唾液中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１９】
2010500867.tif 000004
表１６Ｂ  胸水および胸部分泌物中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表２０】
2010500867.tif 000005