(57)【要約】  標的植物において遺伝子Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性を確立する、回復させる、または増加させる方法が、本発明の該抵抗性を調整する遺伝子の特定および準備により可能になる。具体的には、抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性は、本発明の遺伝子の存在に依存する。該抵抗性を与えることに関与する遺伝子、および前述した本発明の実施形態は、追加の用途、たとえば新しい抵抗性栽培品種の開発を目的としたｃｉｓ遺伝的またはｔｒａｎｓ遺伝的アプローチにおける抵抗性改変遺伝子アレルの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性に関与する前記ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４４のコーディングＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｄ）アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加により、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）配列番号４４のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるコーディングＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記コードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、配列番号４５に示す位置７２にプロリン（Ｐ）を、または配列番号４５に示す位置１８６にバリン（Ｖ）を有するか、
前記コーディングＤＮＡ配列の核酸は、配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、配列番号４４に示す位置２１４にシトシン（ｃ）を、または配列番号４４に示す位置５５６にグアニン（ｇ）を有し、
好ましくは、前記ポリペプチドが、配列番号８、１２、１６、または２０のアミノ酸配列を有するか、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、または１９であるか、前記コーディングＤＮＡ配列が、配列番号７、１１、１５、または１９のヌクレオチド配列である、
核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子と特異的にハイブリダイズし、かつポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を阻害する前記ポリペプチドの非機能的アレルをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドは、前記ヌクレオチド配列における１つまたは複数の変異によって少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）、配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）、および／または配列番号４５に示す位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されており、好ましくは位置２５のプロリン（Ｐ）がアラニン（Ａ）で置換され、位置７２のプロリン（Ｐ）がスレオニン（Ｔ）で置換され、かつ／または位置１８６のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されている、ヌクレオチド配列；ならびに／あるいは
（ｂ）配列番号３のコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列であって、アミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異によって少なくとも１つの核酸置換を含み、好ましくは配列番号４４に示す位置７３〜７５、配列番号４４に示す位置２１４〜２１６、および／または配列番号４４に示す位置５５６〜５５８で、１つまたは複数のヌクレオチドが置換されており、好ましくは位置７３のシトシン（ｃ）がグアニン（ｇ）で置換され、位置２１４のシトシン（ｃ）がアデニン（ａ）で置換され、かつ／または位置５５６のグアニン（ｇ）がアデニン（ａ）で置換されている、ヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を好ましくは含む、核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸分子にコードされる、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または２記載の核酸分子を含むベクターまたは発現カセットであって、好ましくは前記核酸分子が非相同調節エレメントに機能的に連結されている、ベクターまたは発現カセット。
【請求項５】
請求項１もしくは２記載の核酸分子、請求項３記載のポリペプチド、または請求項４記載のベクターもしくは発現カセットを含む、細胞。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含むか、請求項４に定められる請求項１記載の核酸分子を導入遺伝子として含むベクターまたは発現カセットを含む、植物またはその一部分であって、好ましくは前記植物が、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に追加で含む、植物またはその一部分。
【請求項７】
請求項６記載の植物の種子または子孫であって、請求項１記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含み、好ましくは、前記種子は技術処理されており、前記技術処理が、
（ａ）研磨、
（ｂ）粉衣、好ましくはペレット化、
（ｃ）外殻形成、および
（ｄ）着色
からなる群より選択される、種子または子孫。
【請求項８】
少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対であって、
（ｉ）請求項２に定められるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする；
（ｉｉ）請求項１に定められるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする；
（ｉｉｉ）ビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）において、請求項２記載の核酸分子と、かつ／または請求項２記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２と同時分離するビータ・ウルガリスゲノム内の領域と、特異的にハイブリダイズする；ならびに／あるいは
（ｉｖ）ビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）において、請求項１記載の核酸分子と、かつ／または請求項１記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２と同時分離するビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）ゲノム内の領域と、特異的にハイブリダイズする、
好ましくは配列番号２４〜４０からなる群より選択される、
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対。
【請求項９】
ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を付与する、回復させる、または増加させる方法であって、
（ｉ）請求項１記載の核酸分子を、相同性指向性修復または相同組換えにより、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼに促進されて、ビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに統合または遺伝子移入する、かつ任意選択により、前記植物細胞から植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ｉｉ）特にＢＮＹＶＶ感染後、好ましくは、ネイティブプロモーターの修飾により、または前記ネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す非相同プロモーターと前記核酸分子との融合により、前記植物において請求項１記載の核酸分子の発現を増加させる、ステップ；あるいは
（ｉｉｉ）請求項３に定められる請求項１記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの機能的アレルの活性および／または安定性を、請求項１記載のヌクレオチド配列の修飾により増加させる、ステップ；
（ｉｖ）請求項１記載の核酸分子または請求項４に定められる請求項１記載の核酸分子を含むベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換させる、かつ任意選択により、前記形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ｖ）請求項２記載の核酸分子を含む植物または植物細胞の変異を誘発する、ならびに請求項１記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの機能的アレルが回復しており、かつ／または非機能ポリペプチドの発現が失われている植物または植物細胞それぞれを選別／選択する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸分子を含むＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する方法であって、
（Ｉ）ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含む、ビータ属の植物またはビータ属の植物細胞を準備する、ステップ；ならびに
（ＩＩａ）請求項１記載の核酸分子または請求項４に定められる請求項１記載の核酸分子を含むベクターもしくは発現カセットで（Ｉ）の植物細胞を形質転換させる、ステップ；および
（ＩＩｂ）前記形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ＩＩＩａ）部位特異的ヌクレアーゼまたはニッカーゼを、および任意選択により修復マトリックスまたは部位特異的塩基エディターを、前記植物細胞に導入するステップであって、前記部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノムの所定の場所に少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断または少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を発生させることができ、前記修復マトリックスは、請求項１記載の核酸分子を含み、あるいは前記部位特異的塩基エディターは、細胞のゲノムの所定の場所に少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断を発生させることができ、かつ少なくとも１つの核酸塩基を変換することができる、ステップ；および
（ＩＩＩｂ）任意選択により、
ａ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
ｂ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の組み合わせ
から選択される、任意選択により相同性指向性修復または相同組換えによる、所定の場所でのゲノムの修飾を可能にする条件で、（ＩＩＩａ）からの細胞を培養するステップであって、
前記核酸分子が前記植物のゲノムに統合される、ステップ；および
（ＩＩＩｃ）（ＩＩＩｂ）で改変された細胞から植物を再生させる、ステップであって；
好ましくは前記所定の場所は、請求項２記載の核酸分子に存在するか、請求項２記載の核酸分子から多くても１万塩基対だけ上流または下流に離れた位置である、ステップ；あるいは
（ＩＶａ）（Ｉ）の植物を請求項６記載の植物と交雑させる、ステップ；および
（ＩＶｂ）ＢＮＹＶＶを媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に、および請求項１記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含む植物を、特定する、かつ選択するステップであって、前記抵抗性遺伝子Ｒｚ２および／または請求項１記載の核酸分子は、前記植物のゲノムにホモ接合として存在する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定する方法であって、前記植物は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が前記植物のゲノムに存在していればそれを示す能力があり、
（ｉ）前記植物、またはその一部分もしくはその種子における、請求項１記載の核酸分子の存在および／もしくは発現を、または請求項３に定められる請求項１記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（ｉｉ）請求項１記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、またはその１つもしくは複数の同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出することであって、好ましくは請求項１記載の核酸分子のヌクレオチド配列における前記少なくとも１つのマーカー座位の前記検出は、請求項８記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の使用を含み、前記１つまたは複数の同時分離領域は、ビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）の第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ａ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｂ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている、検出すること；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出に基づき、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、請求項１記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定すること、および任意選択により選択すること
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項２記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定する方法であって、
（ｉ）前記植物、またはその一部分もしくはその種子における、請求項２記載の核酸分子の存在および／もしくは発現を、または請求項３に定められる請求項２記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（ｉｉ）請求項２記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、またはその１つもしくは複数の同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出することであって、好ましくは請求項２記載の核酸分子のヌクレオチド配列における前記少なくとも１つのマーカー座位の前記検出は、請求項８記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の使用を含み、前記１つまたは複数の同時分離領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ａ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｂ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている、検出すること；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出に基づき、請求項２記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定すること、および任意選択により選択すること
を含む、方法。
【請求項１３】
（Ａ）前記植物、またはその一部分もしくはその種子における、遺伝子Ｒｚ２の存在および／もしくは発現を、または遺伝子Ｒｚ２にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（Ｂ）遺伝子Ｒｚ２における、または遺伝子Ｒｚ２と同時分離する、好ましくは請求項１記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む染色体範囲と同時分離する１つもしくは複数の領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出すること；
を追加で含み、
請求項１１の（ｉｉｉ）で、特定された、かつ任意選択により選択された植物、またはその一部分もしくはその種子は、請求項１１の（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出ならびに（Ｂ）の検出に基づき、請求項１記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む、
請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物を栽培する方法であって、
（ｉ）請求項６記載の植物の苗を植えること、または請求項７記載の種子をまくこと、および
（ｉｉ）前記苗または前記種子から植物を育成すること、および
（ｉｉｉ）任意選択により、生長した植物からビート根を収穫すること
を含み、
栽培植物のＢＮＹＶＶ侵襲に対抗する、方法。
【請求項１５】
ＢＮＹＶＶ抵抗性植物、好ましくはビータ・ウルガリス（Beta vulgaris）種の植物、より好ましくはビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．ウルガリス、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．コンディティバ、またはビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．クラッサ／アルバの植物を生産するための、請求項１もしくは２記載の核酸分子、請求項３記載のポリペプチド、および／または請求項４記載のベクターもしくは発現カセットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性に関与する該ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにポリペプチドが発現する植物において該ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する該ポリペプチドの非機能的アレルをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本発明の核酸分子にコードされる対応するポリペプチドに関する。さらに、本発明は、核酸分子またはその一部分のいずれか１つを内在遺伝子または導入遺伝子として含む、植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、または植物の種子もしくは子孫に関する。さらに、本発明は、抵抗性遺伝子Ｒｚ２を含むビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させる方法、ならびにＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する、または特定する、かつなるべくは選択する方法も包含する。本発明は、栽培植物のＢＮＹＶＶ侵襲に対抗するビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法、ならびに本発明の核酸分子のいずれか１つと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも包含する。
【０００２】
発明の背景
叢根病は、経済的重要性が極めて高いテンサイの全世界的な病害であり、５０％以上の減収を引き起こすこともある。「ｒｏｏｔ  ｍａｄｎｅｓｓ」とも呼ばれるこの病害の原因は、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）であり、土壌菌ポリミキサ・ビタエにより伝染する。ＢＮＹＶＶに感染すると、細根および側根が叢生し、根の本体の形成が著しく低下し、糖分含有率も低下する。感染植物は、水分吸収率の低下を示し、したがって干ばつのストレスを受けやすくなる。感染が植物全体に伝播すると、葉脈が黄色になり、葉に壊死部や黄斑が生じる。ほかのウイルス性病害と同様、この病害を治す制御は不可能なので、損害を防ぐには抵抗性品種を栽培するしかない。現在、叢根病に対し、Ｒｚ１（「Ｈｏｌｌｙ」としても知られる）、Ｒｚ２、およびＲｚ３という主要な３つの遺伝子が研究調査されている。
【０００３】
同定され、国際特許出願公開第２０１４／２０２０４４号明細書に記載されている抵抗性遺伝子Ｒｚ２は、ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４２に由来し、テンサイのいくつかの品種で発現すると、叢根病に対し、Ｒｚ１と比べて高い抵抗性を与えることが知られている。さらに、ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４１に由来するＲｚ３が同定されたことが知られており、これはおそらくは同一のまたは非常によく似たＲｚ２のアレルバリアントである。
【０００４】
ところが、テンサイの新品種を開発する過程では、Ｒｚ２またはＲｚ３の抵抗性アレルが存在していても、何らかの遺伝的背景により、抵抗性の弱化または喪失がもたらされることが観測されている。今のところ、観測されているこの効果につながる分子遺伝学的背景について、何もわかっていない。しかし、Ｒｚ２またはＲｚ３それぞれに媒介される抵抗性効果をあらゆる遺伝的背景において用いられるように、ビータ属の育種家の間では観測されている抵抗性の低下または喪失を予防する需要が高い。
【０００５】
具体的には、目的は、観測されている抵抗性の低下または喪失の背後にある機構を突き止めること、そしてそれを使って、Ｒｚ２およびＲｚ３それぞれに基づき叢根病に対し安定した抵抗性を示すテンサイの系統を確立することである。本発明では、この目的は、請求項および本明細書に記述される実施形態によって実現される。
【０００６】
発明の概要
本発明は、植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性に関与するポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにポリペプチドが発現する  において該ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する該ポリペプチドの非機能的アレルをコードする核酸分子に関する。それによって、核酸分子のいずれか１つにコードされるポリペプチドが該植物において生産される。
【０００７】
さらに、本発明は、核酸分子またはその一部分のいずれか１つを内在的または遺伝子導入的に含む、植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、または植物の種子もしくは子孫に関する。特定の任意選択の実施形態では、本質的に生物学的プロセスにより得られた植物およびそれらの構成要素は除外される。
【０００８】
抵抗性遺伝子Ｒｚ２を含むビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させる方法、ならびにＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する、または特定する、かつなるべくは選択する方法も、同様に本発明に包含される。本発明は、栽培植物のＢＮＹＶＶ侵襲に対抗するビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法、ならびに本発明の核酸分子のいずれか１つと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも、包含する。
【０００９】
本発明はしたがって、以下のポイント［１］〜［２９］に挙げられる、かつ実施例および図に例示される、実施形態に関する。
【００１０】
［１］ポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性に関与する該ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４４のコーディングＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｄ）アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加により、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）配列番号４４のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるコーディングＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、配列番号４５に示す位置７２にプロリン（Ｐ）を、および／または配列番号４５に示す位置１８６にバリン（Ｖ）を有するか、
コーディングＤＮＡ配列の核酸は、配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、配列番号４４に示す位置２１４にシトシン（ｃ）を、および／または配列番号４４に示す位置５５６にグアニン（ｇ）を有する、
核酸分子。
【００１１】
［２］ポリペプチドが、配列番号８、１２、１６、または２０のアミノ酸配列を有するか、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、または１９であるか、コーディングＤＮＡ配列が、配列番号７、１１、１５、または１９のヌクレオチド配列である、［１］記載の核酸分子。
【００１２】
［３］［１］または［２］記載の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、かつポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する該ポリペプチドの非機能的アレルをコードする核酸分子であって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、該ヌクレオチド配列における１つまたは複数の変異によって少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）、配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）、および／または配列番号４５に示す位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されている、ヌクレオチド配列；ならびに／あるいは
（ｂ）配列番号３のコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列であって、アミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異によって少なくとも１つの核酸置換を含み、好ましくは配列番号４４に示す位置７３〜７５、配列番号４４に示す位置２１４〜２１６、および／または配列番号４４に示す位置５５６〜５５８で、１つまたは複数のヌクレオチドが置換されている、ヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を好ましくは含む、核酸分子。
【００１３】
［４］コードされるポリペプチドが、
（ｉ）配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）の代わりにアラニン（Ａ）を、
（ｉｉ）配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）の代わりにスレオニン（Ｔ）を、および／または
（ｉｉｉ）配列番号４５に示す位置１８６のバリン（Ｖ）の代わりにイソロイシン（Ｉ）を
有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、［３］記載の核酸分子。
【００１４】
［５］
（ｉ）配列番号４４に示す位置７３のシトシン（ｃ）の代わりにグアニン（ｇ）を、
（ｉｉ）配列番号４４に示す位置２１４のシトシン（ｃ）の代わりにアデニン（ａ）を、および／または
（ｉｉｉ）配列番号４４に示す位置５５６のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を、
有するＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、［３］または［４］記載の核酸分子。
【００１５】
［６］
（ｉ）配列番号４４に示す位置７２のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を、および／または
（ｉｉ）配列番号４４に示す位置１１１のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を、
追加で有するコーディングＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、［３］〜［５］のいずれか１つ記載の核酸分子。
【００１６】
［７］［１］もしくは［２］または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子にコードされるポリペプチド。
【００１７】
［８］［１］もしくは［２］または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子を含むベクターまたは発現カセットであって、好ましくは［１］もしくは［２］または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子は非相同調節エレメントに機能的に連結されており、好ましくは、該調節エレメントはプロモーターである、ベクターまたは発現カセット。
【００１８】
［９］［１］もしくは［２］または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子、［７］記載のポリペプチド、あるいは［８］記載のベクターまたは発現カセットを含む、細胞。
【００１９】
［１０］［１］または［２］記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含むか、［８］に定められる［１］または［２］記載の核酸分子を導入遺伝子として含むベクターまたは発現カセットを含む、植物またはその一部分。
【００２０】
［１１］ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に、追加で含むことを特徴とする、［１０］記載の植物またはその一部分。
【００２１】
［１２］［１０］または［１１］記載の植物の種子または子孫であって、［１］または［２］記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含むか、［８］記載のベクターまたは発現カセットを含む、種子または子孫。
【００２２】
［１３］技術処理されており、その技術処理が、
（ａ）研磨、
（ｂ）粉衣、好ましくはペレット化、
（ｃ）外殻形成、および
（ｄ）着色
からなる群より選択される、［１２］記載の種子。
【００２３】
［１４］少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、かつ特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対であって、
（ｉ）［３］〜［６］のいずれか１つに定められるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするが、［１］または［２］に定められるヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない；
（ｉｉ）［１］または［２］に定められるヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするが、［３］〜［６］のいずれか１つに定められるヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない；
（ｉｉｉ）ビータ・ウルガリスにおいて［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子と、かつ／または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２と同時分離するビータ・ウルガリスゲノム内の領域と、特異的にハイブリダイズする；ならびに／あるいは
（ｉｖ）ビータ・ウルガリスにおいて［１］もしくは［２］記載の核酸分子と、かつ／または［１］もしくは［２］記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２と同時分離するビータ・ウルガリスゲノム内の領域と、特異的にハイブリダイズする、
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対。
【００２４】
［１５］配列番号２４〜４０からなる群より選択される、［１４］記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対。
【００２５】
［１６］ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させる方法であって、
（ｉ）［１］または［２］記載の核酸分子を、相同性指向性修復または相同組換えにより、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼに促進されて、ビータ・ウルガリス種の植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに統合または遺伝子移入する、かつ任意選択により、該植物細胞から植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ｉｉ）特にＢＮＹＶＶ感染後、好ましくは、ネイティブプロモーターの修飾により、または該ネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す非相同プロモーターと該核酸分子との融合により、該植物において［１］または［２］記載の核酸分子の発現を増加させる、ステップ；あるいは
（ｉｉｉ）［７］に定められる［１］または［２］記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの機能的アレルの活性および／または安定性を、［１］または［２］記載のヌクレオチド配列の修飾により増加させる、ステップ；
（ｉｖ）［１］もしくは［２］記載の核酸分子または［８］に定められる［１］もしくは［２］記載の核酸分子を含むベクターもしくは発現カセットで植物細胞を形質転換させる、かつ任意選択により、該形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ｖ）［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子を含む植物または植物細胞の変異を誘発する、ならびに［１］もしくは［２］記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの機能的アレルが回復しており、かつ／または非機能ポリペプチドの発現が失われている植物または植物細胞それぞれを選別／選択する、ステップ
を含む、方法。
【００２６】
［１７］［１０］に定められる［１］または［２］記載の核酸分子を含むＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する方法であって、
（Ｉ）ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含む、ビータ属の植物またはビータ属の植物細胞を準備する、ステップ；ならびに
（ＩＩａ）［１］もしくは［２］記載の核酸分子または［８］に定められる［１］もしくは［２］記載の核酸分子を含むベクターもしくは発現カセットで（Ｉ）の植物細胞を形質転換させる、ステップ；および
（ＩＩｂ）該形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ＩＩＩａ）部位特異的ヌクレアーゼまたはニッカーゼを、および任意選択により修復マトリックスまたは部位特異的塩基エディターを、該植物細胞に導入するステップであって、該部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノムの所定の場所に少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断または少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を発生させることができ、該修復マトリックスは、［１］または［２］記載の核酸分子を含み、あるいは該部位特異的塩基エディターは、細胞のゲノムの所定の場所に少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断を発生させることができ、かつ少なくとも１つの核酸塩基を変換することができる、ステップ；および
（ＩＩＩｂ）任意選択により、
ａ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
ｂ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；
ｄ）ａ）〜ｃ）の任意の組み合わせ
から選択される、任意選択により相同性指向性修復または相同組換えによる、所定の場所でのゲノムの修飾を可能にする条件で、（ＩＩＩａ）からの細胞を培養するステップであって、
該核酸分子が該植物のゲノムに統合される、ステップ；および
（ＩＩＩｃ）（ＩＩＩｂ）で改変された細胞から植物を再生させる、ステップ；あるいは
（ＩＶａ）（Ｉ）の植物を［１０］〜［１２］記載のいずれか１つの植物と交雑させる、ステップ；および
（ＩＶｂ）ＢＮＹＶＶを媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に、および［１］または［２］記載の核酸分子を内在的または遺伝子導入的に含む植物を、特定する、かつ選択するステップであって、抵抗性遺伝子Ｒｚ２および／または［１］もしくは［２］記載の核酸分子は、該植物のゲノムにホモ接合として存在する、ステップ
を含む、方法。
【００２７】
［１８］該所定の場所が、［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子に存在するか、［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子から多くても１万塩基対だけ上流または下流に離れた位置であることを特徴とする、［１７］記載の方法。
【００２８】
［１９］［１］または［２］記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定する方法であって、該植物は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が該植物のゲノムに存在していればそれを示す能力があり、
（ｉ）該植物、またはその一部分もしくはその種子における、［１］もしくは［２］記載の核酸分子の存在および／もしくは発現を、または［７］に定められる［１］もしくは［２］の核酸分子にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（ｉｉ）［１］もしくは［２］記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、またはその１つもしくは複数の同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出すること；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出に基づき、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、［１］または［２］記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定すること、および任意選択により選択すること
を含む、方法。
【００２９】
［２０］［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定する方法であって、
（ｉ）該植物、またはその一部分もしくはその種子における、［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子の存在および／もしくは発現を、または［７］に定められる［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（ｉｉ）［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、またはその１つもしくは複数の同時分離領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出すること；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出に基づき、［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子を含むビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定すること、および任意選択により選択すること
を含む、方法。
【００３０】
［２１］［１］もしくは［２］記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子のヌクレオチド配列における、少なくとも１つのマーカー座位の検出は、請求項１４または１５記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の使用を含み、該１つまたは複数の同時分離領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ１００２ｓ０２（配列番号３４）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ２４９９ｓ０１（配列番号３５）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓｘｉ０６９８ｓ０１（配列番号３６）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｖ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）、ならびに／または
（ｖ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｖｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８００ｓ０１（配列番号３２）、ならびに／または
（ｖｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ４９１３ｘｘｘ（配列番号３１）、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５７８２ｓ０１（配列番号３０）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている、［１９］または［２０］記載の方法。
【００３１】
［２２］
（Ａ）該植物、またはその一部分もしくはその種子における、遺伝子Ｒｚ２の存在および／もしくは発現を、または遺伝子Ｒｚ２にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは
（Ｂ）遺伝子Ｒｚ２における、または遺伝子Ｒｚ２と同時分離する、好ましくは［１］もしくは［２］の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む染色体範囲と同時分離する１つもしくは複数の領域における、少なくとも１つのマーカー座位を検出すること；
を追加で含み、
［１９］の（ｉｉｉ）で、特定された、かつ任意選択により選択された植物、またはその一部分もしくはその種子は、［１９］の（ｉ）および／または（ｉｉ）の検出ならびに（Ｂ）の検出に基づき、［１］または［２］記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む、
［１９］または［２１］記載の方法。
【００３２】
［２３］遺伝子Ｒｚ２のヌクレオチド配列における該少なくとも１つのマーカー座位が、マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）により検出可能であり、遺伝子Ｒｚ２と同時分離する１つまたは複数の領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号３３）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている、［２２］の方法。
【００３３】
［２４］［１］または［２］記載の核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む染色体範囲と同時分離する１つまたは複数の領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ１００２ｓ０２（配列番号３４）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ２４９９ｓ０１（配列番号３５）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓｘｉ０６９８ｓ０１（配列番号３６）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｖ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている、［２２］記載の方法。
【００３４】
［２５］Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、またはＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力が損傷している、ビータ・ウルガリス種の植物を特定および／または選択するための、［１４］または［１５］記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の使用。
【００３５】
［２６］ビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法であって、
（ｉ）［１０］もしくは［１１］記載の植物の苗を植えること、または［１２］もしくは［１３］記載の種子をまくこと、および
（ｉｉ）該苗または該種子から植物を育成すること、および
（ｉｉｉ）任意選択により、生長した植物からビート根を収穫すること
を含み、
栽培植物のＢＮＹＶＶ侵襲に対抗する、方法。
【００３６】
［２７］Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する核酸分子を特定するための、［１］もしくは［２］記載の核酸分子または［３］〜［６］記載のいずれか１つの核酸分子、［７］記載のポリペプチド、［８］記載のベクターまたは発現カセット、および／あるいは［９］記載の細胞の使用。
【００３７】
［２８］ＢＮＹＶＶ抵抗性植物、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物、より好ましくはビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．ウルガリス、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．コンディティバ、またはビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．クラッサ／アルバの植物を生産するための、［１］もしくは［２］記載の核酸分子または［３］〜［６］のいずれか１つ記載の核酸分子、［７］記載のポリペプチド、および／あるいは［８］記載のベクターまたは発現カセットの使用。
【００３８】
［２９］遺伝子Ｒｚ２または抵抗性遺伝子Ｒｚ２が、
ａ）配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２１のＤＮＡ配列のコード配列を含む、ヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドから、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列のアミノ酸置換、欠失および／または付加により誘導されたポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、
ｄ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、あるいは
ｅ）少なくとも配列番号２２のアミノ酸位置１６８〜２２７および少なくとも配列番号２２のアミノ酸位置５９１〜６１３および少なくとも配列番号２２のアミノ酸位置１０１３〜１０７２をコードするか、少なくとも配列番号２３のアミノ酸位置１８２〜２４１、少なくとも配列番号２３のアミノ酸位置６０５〜６２７、および少なくとも配列番号２３のヌクレオチド配列のアミノ酸位置１０２７〜１０８６をコードする、ヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子である、［１］〜［６］記載の核酸分子、［１１］記載の植物またはその一部分、［１４］または［１５］記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対、［１６］〜［１９］および［２２］〜［２４］のいずれか１つ記載の方法、ならびに［２５］および［２７］記載の使用。
【００３９】
［３０］ステップ（ｉ）および／またはステップ（ｉｉ）の検出が、ＰＣＲ、好ましくは競合アレル特異的ＰＣＲ（ＫＡＳＰ）に基づき、任意選択により標識プライマーが適用される、［１９］の方法。
【００４０】
［３１］ステップ（ｉ）および／またはステップ（ｉｉ）の検出が、ＰＣＲ、好ましくは競合アレル特異的ＰＣＲ（ＫＡＳＰ）に基づき、任意選択により標識プライマーが適用される、［２０］記載の方法。
【００４１】
［３２］（ｉ）の植えることが、好ましくは種蒔き機、作付け機、および播種機からなる群より選択される、機械的デバイスによりなされる、［２６］記載の方法。
【００４２】
［３３］（ｉｉｉ）の収穫が、収穫機、好ましくはテンサイ収穫機であり得る、機械的デバイスによりなされる、［２６］または［３２］記載の方法。
【００４３】
［３４］植物の葉が、（ｉｉｉ）の収穫の間に機械的に除去され、該機械的な除去は、好ましくは［３３］に定められる収穫機によりなされる、［２６］、［３２］、または［３３］記載の方法。
【００４４】
［３５］追加のステップ
（ｉｖ）該収穫したビート根から砂糖、好ましくはショ糖を抽出すること
を含む、［２６］、［３２］、［３３］、または［３４］記載の方法。
【００４５】
［３６］オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対が標識されている、好ましくは蛍光標識されている、より好ましくはＦＡＭまたはＨＥＸにより蛍光標識されている、［２５］記載の使用、または［１４］もしくは［１５］記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド対。
【００４６】
［３７］［９］記載の細胞または［１０］もしくは［１１］記載の植物もしくはその一部分の、細胞抽出物。
【００４７】
［３８］［１］記載の核酸分子を含む、［３７］記載の細胞抽出物。
【００４８】
［３９］ショ糖を含む、［３７］または［３８］記載の細胞抽出物。
【００４９】
［４０］ショ糖濃度が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、もっとも好ましくは１０％〜２０％であって、該濃度は質量濃度［ｇ／ｄｌ］として与えられる、［３７］、［３８］、または［３９］記載の細胞抽出物。
【００５０】
［４１］特定された植物またはその種子が、［２６］、［３２］、［３３］、または［３４］記載の方法で用いられる、［１９］または［２０］記載の方法。
【００５１】
［４２］タンパク質が、配列番号４５の配列内に１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を含む、［７］記載のポリペプチド。
【００５２】
［４３］自然界では発生しない、人工化合物である、［７］記載のポリペプチド。
【００５３】
［４４］［１］の核酸分子を特定するための分子マーカーを生産する方法であって、
ａ）配列番号５４と配列番号５５との配列アラインメントを準備する、ステップ
ｂ）配列番号５４と配列番号５５との少なくとも１つの多型を特定する、ステップ
ｃ）ｂ）で特定された多型の検出に適したもう１つの分子マーカーを開発する、ステップ
を含む、方法。
【００５４】
［４５］該少なくとも１つの多型は、一塩基多型である、［４４］記載の方法。
【００５５】
［４６］［１］記載の核酸分子を特定するための、または［１］記載の核酸分子を含む植物を特定するための、配列番号５４のヌクレオチド配列上の分子マーカーの使用。
【００５６】
まず、本願で用いるいくつかの用語について、以下に詳細に説明する。
【００５７】
ヌクレオチド配列の長さの特定化に関し、「およそ」という用語は、＋／−２００塩基対の、好ましくは＋／−１００塩基対の、特に好ましくは＋／−５０塩基対の偏差を意味する。
【００５８】
「ビータ属の植物」は、アマランス科（アマランサケアエ）に属する。これらの植物のナンバリングには、ビータ・マクロカルパ、ビータ・ウルガリス、ビータ・ロマトゴナ、ビータ・マクロリザ、ビータ・コロリフロラ、ビータ・トリギイナ、およびビータ・ナナといった植物種がある。ビータ・ウルガリス種の植物は、具体的には、植物亜種のビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスである。たとえば、これらのナンバリングには、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスｖａｒ．アルティッシマ（狭義のテンサイ）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．ウルガリス（フダンソウ）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．コンディティバ（ビートルート／レッドビート）、ビータ・ウルガリスｓｓｐ．ウルガリスｖａｒ．クラッサ／アルバ（飼料用ビート）がある。
【００５９】
ヌクレオチド配列の「機能断片」は、その機能断片が由来する完全なヌクレオチド配列の機能性と同一であるかそれに匹敵する機能性を有する、ヌクレオチド配列のセグメントを意味する。したがって、機能断片は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたり全ヌクレオチド配列と同一または相同であるヌクレオチド配列を有し得る。それはまた、９０〜１００％の範囲を明示的に包含する。さらに、ヌクレオチド配列の「機能断片」はまた、たとえば転写後のまたは転写時の遺伝子サイレンシングの過程で、全ヌクレオチド配列の機能性を改変する、ヌクレオチド配列のセグメントを意味し得る。したがって、ヌクレオチド配列の機能断片は、全ヌクレオチド配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の、好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、または１４０の、特に好ましくは少なくとも１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の連続するヌクレオチドを含み得る。それはまた、２１〜５０ヌクレオチドの範囲を明示的に包含する。
【００６０】
タンパク質の「機能部分」は、タンパク質のセグメント、または該タンパク質をコードするアミノ酸配列のセクションを意味し、該セグメントは、植物細胞において完全なタンパク質のものと同一であるか匹敵する機能を発揮し得る。タンパク質の機能部分は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたり、該機能部分が由来するタンパク質と同一の、あるいは保存的および半保存的アミノ酸交換を考慮すれば類似の、アミノ酸配列を有する。
【００６１】
「非相同」という用語は、導入されるポリヌクレオチドが、同種または異種の、異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来すること、あるいは原核生物または真核生物の宿主細胞と相同ではあるが、異なる遺伝的環境に置かれたため、自然界に存在し得る対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。非相同ポリヌクレオチドは、対応する内在遺伝子に加えて存在していてもよい。
【００６２】
本発明の意味では、「ホモログ」は、系統発生起源が同じタンパク質と理解され、「アナログ」は、同じ機能を発揮するが、異なる系統発生起源を有するタンパク質と理解され、「オーソログ」は、同じ機能を発揮する異種に由来するタンパク質と理解され、「パラログ」は、ある種において重複により現れたタンパク質と理解され、このコピーは、同じタンパク質機能を保持するか、その発現鋳型を変えるが機能は変えないか、そのタンパク質機能を変えるか、元の遺伝子機能を両コピー間で分割する。
【００６３】
「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖核酸分子が最大限相補的な核酸鎖に結合する、すなわちそれと塩基対を形成するプロセスと理解すべきである。ハイブリダイゼーションの標準的な方法は、たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に記載されている。それは好ましくは、核酸分子の塩基の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％、特に好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、最大限相補的な核酸鎖と塩基対を形成することと理解される。そのようなアニーリングの可能性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにかかっている。「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション条件に関する。塩基対形成をより難しくする場合は高ストリンジェンシーが存在し、塩基対形成をより容易にする場合は低ストリンジェンシーが存在する。たとえば、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、塩濃度またはイオン強度および温度に左右される。一般に、ストリンジェンシーは、加温および／または塩含有率の低下により増加させることができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションが主として相同核酸分子間でのみ生じる条件と理解すべきである。したがって「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、実際の核酸の付加に通用する条件のみならず、後の洗浄ステップにも通用する条件に関する。たとえば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、主として、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子だけがハイブリダイズする条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、たとえば、４ｘＳＳＣ中６５℃でのハイブリダイゼーション、および後続の０．１ｘＳＳＣ中６５℃でのおよそ全１時間の反復洗浄である。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件で実施される。
【００６４】
二本鎖ＤＮＡの形態の核酸に関連して、「相補的」ヌクレオチド配列は、第１のＤＮＡ鎖に対し相補的な第２のＤＮＡ鎖が、塩基対形成のルールにしたがい第１の鎖の塩基に対応するヌクレオチドを有することを意味する。相補配列は、好ましくは相手方配列と完全に相補的であり、したがって好ましくは同じ長さを有する。
【００６５】
「単離核酸分子」は、その自然のまたは元の環境から抽出された核酸分子と理解される。この用語は、合成生産された核酸分子も包含する。「単離ポリペプチド」は、その自然のまたは元の環境から抽出されたポリペプチドと理解される。この用語は、合成生産されたポリペプチドも包含する。
【００６６】
「分子マーカー」は、植物集団における多型の核酸であり、リファレンスまたは定位ポイントとして用いられる。組換え事象の検出用マーカーは、植物集団内の差異または多型の観察に適したものである。そのようなマーカーは、したがって、さまざまな同座対立遺伝子状態（アレル）を検出し、かつそれらを区別することができる。「分子マーカー」という用語はまた、ゲノム配列、たとえばプローブまたはプライマーとして用いられる核酸と、相補的であるか、少なくともほぼ相補的であるか、相同である、ヌクレオチド配列に関する。こうしたＤＮＡレベルの差異が、マーカーとして見出されることになり、それらはたとえば、ポリヌクレオチド配列の差異、たとえばＳＳＲ（単純反復配列）、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）、ＦＬＰ（断片長多型）、またはＳＮＰ（一塩基多型）の差異である。マーカーは、ゲノム核酸または発現した核酸、たとえばスプライスＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＥＳＴに由来してもよく、また、プローブまたはプライマー対として用いられる核酸に関連してもよく、したがって、ＰＣＲベースの方法を用いる配列断片の増幅に適している。（ある集団の部分間の）遺伝的多型を説明するマーカーを、従来技術の定着した方法を用いて検出してもよい（An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, Griffiths, Miller, Suzuki, et al., 2000）。それにはたとえば、ＤＮＡシーケンシング、ＰＣＲベースの配列特異性増幅、ＲＦＬＰの検証、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）によるポリヌクレオチド多型の検証、増幅した植物ゲノム可変配列の検出、３ＳＲ（自家持続配列複製）の検出、ＳＳＲの検出、ＳＮＰの検出、ＲＦＬＰの検出、またはＡＦＬＰ（増幅断片長多型）の検出が含まれる。さらに、ＥＳＴ（発現配列タグ）およびＥＳＴ配列に由来するＳＳＲマーカーおよびＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ）を検出する方法も公知である。文脈によっては、本明細書における「マーカー」という用語は、特定のマーカー（たとえばＳＮＰ）が見つかり得る、ある種のゲノムの特定の染色体位置を意味することもある。
【００６７】
マーカーとしては、１つまたは複数の検出分子と接続され得る合成オリゴヌクレオチドも挙げられ、ここで検出分子は、検証方法の範囲内で、検出反応またはシグナル生成に用いられ得る。合成オリゴヌクレオチドとしては、標識プライマーも挙げられる。標識プライマーとしては、蛍光標識プライマーが挙げられる。蛍光標識プライマーは、ＦＡＭまたはＨＥＸにより標識されている場合がある。合成オリゴヌクレオチドおよび標識プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、ならびに競合アレル特異的ＰＣＲで用いられ得る。合成オリゴヌクレオチドおよび標識プライマーは、人工化合物であり、自然界では発生せず、自然界からは単離できない。そのような化合物の生産について、以下でさらに説明する。
【００６８】
「プロモーター」は、典型的にはコード領域の上流にある、翻訳されない制御ＤＮＡ配列であり、ＲＮＡポリメラーゼの結合点を含有し、ＤＮＡの転写を開始する。プロモーターは、遺伝子発現のレギュレーター遺伝子として作用するほかのエレメント（たとえばｃｉｓ調節エレメント）をさらに含有する。「コアまたはミニマルプロモーター」は、転写開始に必要な基本エレメント（たとえばＴＡＴＡ  ｂｏｘおよび／またはイニシエーター）を有するプロモーターである。
【００６９】
「病原体」は、植物と相互作用して、該植物の１つまたは複数の器官の病徴をもたらす生物を意味する。こうした病原体には、たとえば、動物、菌、微生物、またはウイルス生物もしくは卵菌が含まれる。
【００７０】
「病原体感染」は、病原体が植物宿主組織と相互作用する最初の時点と理解すべきである。この意味で、「侵襲」は、病原体と宿主との接触の発生を意味する。たとえば、ウイルス病原体ＢＮＹＶＶは、土壌菌ポリミキサ・ビタエにより伝染する。ポリミキサは土壌中で何十年も生存できる胞子を作る。このウイルスはこれらの胞子中でも生存する。これらの永久胞子が遊走子を生じると、これらを介してウイルスは植物宿主組織の細胞内へと発芽することができ、そして宿主と相互作用することができる（Esser (2000) Kryptogamen 1: Cyanobakterien Algen Pilze Flechten Praktikum und Lehrbuch. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 3rd edition）。
【００７１】
植物「器官」は、たとえば、葉、芽、茎、根、胚軸、枝芽、分裂組織、胚、葯、胚珠、種子、または果実を意味する。「植物部分」としては、限定ではないが、花粉のほか、芽または主軸、葉、花、花房、根、果実、および種子が挙げられる。「植物部分」という用語は、複数の器官の集合、たとえば花もしくは種子、または器官の一部、たとえば植物の芽の断面も意味する。植物「組織」は、たとえば、カルス組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、芽組織、根組織、植物腫瘍組織、または生殖組織、ならびに形成層、柔組織、維束管組織、厚膜組織、および表皮である。とはいえ、組織はこのリストに限定されない。たとえば、植物「細胞」は、たとえば細胞壁を有する単離細胞もしくはそれらの凝集体、または原形質体と理解される。
【００７２】
ＢＮＹＶＶを例とする抵抗性のレベルは、ビータ属の植物における「評価スコア」の決定により、質的に定義され得る（ビータ属の植物、たとえばテンサイの評価スコアのスキームは、従来技術、Mechelke (1997)から公知である）。
【００７３】
本発明に関連して、「制御配列」という用語は、特異性および／または発現強度に影響するヌクレオチド配列に関し、たとえば制御配列は所定の組織特異性を与える。そのような制御配列は、ミニマルプロモーターの転写開始点の上流に、しかしその下流にも、たとえば転写されるが翻訳はされないリーダー配列に、またはイントロン内に、あり得る。
【００７４】
「抵抗性」という用語は、広義に理解すべきであり、病害発生の遅延から完全ブロックまでの範囲の防護を意味する。重要な病原体の一例が、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）である。本発明の抵抗性植物細胞または本発明の抵抗性植物は、好ましくはＢＮＹＶＶに対する抵抗性を獲得する。ある病原体に対する抵抗性は、同病原体がもたらす病害への抵抗性と同等に扱われ、たとえば、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性は、「ｒｏｏｔ  ｍａｄｎｅｓｓ」（叢根病）に対する抵抗性でもある。
【００７５】
同定され、国際特許出願公開第２０１４／２０２０４４号明細書に記載されている抵抗性遺伝子「Ｒｚ２」は、ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４２に由来し、テンサイのいくつかの品種で発現すると、叢根病に対し抵抗性を与えることが知られている。さらに、ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４１に由来するＲｚ３が同定されたことが知られており、これは同一の可能性が高いまたは非常によく似たＲｚ２のアレルバリアントである。したがって、遺伝子Ｒｚ２およびＲｚ３、ならびにそれぞれのタンパク質は、実質的に同一であり、名称「Ｒｚ２」と「Ｒｚ３」とは交換可能に用いられ得る。
【００７６】
「レモリン」は、可変Ｎ末端領域および保存Ｃ末端ドメインを含む、植物特異的タンパク質の科であり、宿主−微生物相互作用を含め、さまざまな生物的および非生物的ストレスの役割を果たしている。本発明は、機能レモリンタンパク質、すなわちこのタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の確立に関与するレモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子と、非機能レモリンタンパク質、すなわちこのタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害するレモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子とを区別する。この文脈では、「〜に関与する」という用語には、抵抗性遺伝子Ｒｚ２を追加で含む植物においてＢＮＹＶＶ抵抗性、特に高レベルのＢＮＹＶＶ抵抗性を確立するのに不可欠であることだけでなく、増加させることが含まれる。「非機能」という用語は、遺伝子Ｒｚ２と組み合わせても抵抗性を与えることができないことに関し用いられる。
【００７７】
したがって、本発明の「機能型」、「機能（レモリン）タンパク質」、「機能（レモリン）ポリペプチド」、「機能（レモリン）バリアント」、「機能（レモリン）アレル」、「機能（レモリン）遺伝子」、および「機能核酸分子」という用語は本発明では交換可能に用いられ、本発明の「非機能型」、「非機能（レモリン）タンパク質」、「非機能（レモリン）ポリペプチド」、「非機能（レモリン）バリアント」、「非機能（レモリン）アレル」、「非機能（レモリン）遺伝子」、および「非機能核酸分子」という用語もまた同様である。
【００７８】
「遺伝子導入植物」は、そのゲノムに少なくとも１つのポリヌクレオチドが統合されている植物に関する。したがってそれは非相同ポリヌクレオチドであり得る。このポリヌクレオチドは、好ましくは安定して統合されており、それはこの統合されたポリヌクレオチドが、該植物において安定して保存され、発現し、そして安定して子孫へと受け継がれる場合もあることを意味する。植物のゲノムへのポリヌクレオチドの安定導入は、その前の親世代の植物のゲノムへの統合も含み、該ポリヌクレオチドはその後も安定して受け継がれ得る。「非相同」という用語は、導入されるポリヌクレオチドが、同種または異種の、異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来すること、あるいは原核生物または真核生物の宿主細胞と相同ではあるが、たとえば異なる遺伝的環境に置かれたため、自然界に存在し得る対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。非相同ポリヌクレオチドは、対応する内在遺伝子に加えて存在していてもよい。
【００７９】
「産業的製糖の原材料」は、テンサイからの糖分抽出に特化した製糖設備に供給され得る植物材料を意味する。そのような原材料は、典型的には、収穫したテンサイのビート本体（主根）である。抽出プロセスに確実に適合するよう、ビート本体は十分な質量、体積、および円錐形を有する必要があり、そうすれば原材料を機械的に裁断して細片化（ビート切片）することができる。これらのビート切片は、糖分抽出のための表面積を最大限にし、また、高効率に抽出できるようにナトリウム、カリウム、および窒素の含有率が低くなくてはならない。抽出後、残ったビートパルプを圧縮し、乾燥させ、動物の飼料として用いる。
【００８０】
「ショ糖濃度」は、根の生重量に対するパーセンテージとして表される。
【００８１】
「単胚」は、植物一個体に生長する種子を意味し、多胚（poligermまたはmultigerm）種子（「シードボール」とも呼ばれる）は複数の植物体に生長する。
【００８２】
「抽苔」は、テンサイが種子を生産して繁殖しようと有花茎（または茎）を自然に作ることである。テンサイの抽苔を誘発するのは春化、すなわち、たとえば越冬中に生じ得る寒さストレスである。しかし、抽苔プロセスおよびその後の結実によりビート本体のショ糖含有率が低下するので、商用育成されるテンサイは抽苔前に収穫される。
【００８３】
「競合アレル特異的ＰＣＲ」または「ＫＡＳＰ」は、ポリメラーゼ連鎖反応の、蛍光ベースのホモジニアス・ジェノタイピング変化形態である。これは、アレル特異的オリゴ伸長およびシグナル生成の蛍光共鳴エネルギー移動に基づく。この化学反応を、ゲノムＤＮＡ内の特定の核酸配列の検出に用いることができる。通常は、蛍光標識プライマーがＰＣＲに用いられる。ＦＡＭおよびＨＥＸは、蛍光タグとして用いられ得る。
【００８４】
特許出願中の（pending）配列および図を参照しながら、本発明の設計および実施形態を、例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）のＴＧＢ１タンパク質と、Ｒｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質と、（Ａ）レモリンタンパク質の機能バリアントまたは（Ｂ）レモリンタンパク質の非機能バリアントとの間に起こり得る相互作用モードを描いたモデルの図である。バリアント（Ａ）においては、ＴＧＢ１タンパク質がこの機能レモリンタンパク質に結合してそれを修飾し、それを抵抗性アレルのＲｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質により検出できるので、抵抗性反応が開始される。バリアント（Ｂ）においては、Ｒｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質はＴＧＢ１に修飾された非機能レモリンタンパク質を検出できないので、抵抗性反応は開始しない。
【図２】非機能レモリンタンパク質、すなわちタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害するレモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子（ハプロタイプ１、Ｈａｐ１−ＯＲＦ）のコーディングＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列と、機能レモリンタンパク質、すなわちタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の確立に関与するレモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子の４ハプロタイプ（Ｈａｐ２−ＯＲＦ、Ｈａｐ３−ＯＲＦ、Ｈａｐ４−ＯＲＦ、およびＨａｐ５−ＯＲＦ）のｃＤＮＡ配列との配列アラインメントの図である。多型をグレーでハイライトしている。
【図３】非機能レモリンタンパク質、すなわちタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害するレモリンタンパク質（Ｈａｐ１）と、４つの機能レモリンタンパク質、すなわちタンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の確立に関与するレモリンタンパク質（Ｈａｐ２、Ｈａｐ３、Ｈａｐ４、およびＨａｐ５）とのタンパク質配列アラインメントの図である。多型をグレーでハイライトしている。
【図４】Ｒｚ２の抵抗性アレルを含む、かつ追加でレモリンの機能的アレル（ＲＥＭ（ｆ））またはレモリンの非機能的アレル（ＲＥＭ（ｎ−ｆ））のいずれかを含む、テンサイの葉組織における、ＢＮＹＶＶ由来のＴＧＢ１遺伝子の発現後の細胞死反応を比較する、トランジェントアッセイの概略図である。実験の詳細は実施例２で説明する。
【図５】Ｒｚ２の抵抗性アレルおよびレモリンの機能的アレル（ＲＥＭ（ｆ））を含むテンサイの葉組織における、レモリンの非機能的アレル（ＲＥＭ（ｎ−ｆ））、レモリンの機能的アレル（ＲＥＭ（ｆ））、または空ベクター対照のいずれかと組み合わせたＢＮＹＶＶ由来のＴＧＢ１遺伝子の発現後の細胞死反応を比較する、トランジェントアッセイの概略図である。実験の詳細は実施例２で説明する。
【図６】Ｒｚ２の抵抗性アレルもレモリンの機能的アレル（ＲＥＭ（ｆ））も含まないテンサイの葉組織における、レモリンの非機能的アレル（ＲＥＭ（ｎ−ｆ））またはレモリンの機能的アレル（ＲＥＭ（ｆ））のいずれかと組み合わせたＢＮＹＶＶ由来のＴＧＢ１遺伝子およびＲｚ２の抵抗性アレル発現後の細胞死反応を比較する、トランジェントアッセイの概略図である。実験の詳細は実施例２で説明する。
【図７】レモリン遺伝子および遺伝子Ｒｚ２の位置、ならびにさまざまなマーカー位置を示す、ビータ・ウルガリスの第３染色体の概略図である。レモリンは第３染色体の長腕上で遺伝子Ｒｚ２から約０．７５ｃＭ遠位に位置する。左：レモリンに対し遠位の、およびＲｚ２に対し近位のマーカー位置であって、マーカー支援育種（ＭＡＳ）に用いることができる隣接領域を画定する。右：レモリン遺伝子内、遺伝子Ｒｚ２内、ならびに両遺伝子間の領域に結合しているマーカー。
【図８】組換え体における抵抗性遺伝子Ｒｚ２とレモリン遺伝子との異なるアレル組み合わせの存在に関し区分される２７３０個体の植物集団のマーカーベースの分析の視覚的説明図であって、Ａは非機能レモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子の存在を示し、Ｂは機能レモリンタンパク質をコードするレモリン遺伝子の存在を示す。Ｈは、非機能レモリンアレルの遺伝型はヘテロ接合であることを表す。
【図９】アグロバクテリウム・ツメファシエンス浸潤後のニコチアナ・ベンタミアナの葉の図である。白く囲んだ部分は浸潤された領域であり、各領域は異なるベクターの組み合わせで浸潤されている。ベクターの組み合わせについては対応する例で詳しく説明する。
【図１０】形質転換後のテンサイ葉片におけるルシフェラーゼ活性の測定を示す図である。異なるコンストラクトを準備した：１：空ベクター；２：Ｒｚ２＿Ｃ４８＋空ベクター；３：ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１＋空ベクター；４：Ｒｚ２＿Ｃ４８＋ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１；５：Ｒｚ２＿Ｃ４８＿Ｄ４９１Ｖ（自己活性化バリアント）；６：ｐ７０Ｓ−１６５−１７６＿Ｄ８０Ｎ（自己活性化ＣＣドメイン、陽性対照）。
【００８６】
発明の詳細な説明
Ｒｚ２の抵抗性アレルが存在していても、テンサイの品種によっては、Ｒｚ２に媒介されるビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）に対する抵抗性が弱化するか完全に喪失する、という観測されている効果の背後にある機構を明らかにするために、そして得られた知識を育種プロセスの改善に用いるために、大々的な交雑実験のほかに分子生物学的実験を実施し、機能型であれば植物におけるＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の確立に重要または大切であり、非機能型であれば該抵抗性の抑制をもたらすタンパク質をコードする遺伝子の遺伝ファインマッピング、特定、単離、および特徴決定が含まれた。
【００８７】
両方のアレルバリアント、すなわち一方は機能タンパク質をコードし、他方は非機能タンパク質をコードするバリアントの特定は、Ｒｚ２の抵抗性を備えたＢＮＹＶＶ抵抗性品種の育種と高い関連性がある。一方では、非機能的アレルを抵抗性Ｒｚ２アレルから分離できることは、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の低下または喪失を示す以外は育種および耕種の良好な特性を有するテンサイ系統を、ＢＮＹＶＶ抵抗性テンサイ品種の育種に使用するために、重要である。また他方で、植物におけるＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性の発生の背後にある機構を理解すること、すなわち機能的アレルを特定することは、ＢＮＹＶＶに対し抵抗性である植物を効率よく生成するために、特に興味深い。
【００８８】
したがって、本発明は、全体として、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。この文脈では、「〜に関与する」という用語には、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性、特に高レベルのＢＮＹＶＶ抵抗性を確立するのに不可欠であることだけでなく、増加させることが含まれる。したがって、本発明の核酸分子およびコードされるポリペプチドはそれぞれ、該ポリペプチドが発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する。好ましくは、本発明の核酸分子は、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を増加させるか、対応するポリヌクレオチドが発現する植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を確立するのに不可欠である。わかりやすくするために、この核酸分子を本発明の「機能型」、「機能バリアント」、「機能的アレル」、「機能遺伝子」、または「機能核酸分子」と呼ぶ。
【００８９】
好ましくは、本発明の核酸分子は、ビータ属に、好ましくはビータ・ウルガリス種に、より好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスに属する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する。
【００９０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、かつポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する該ポリペプチドの非機能的アレル、すなわち非機能バリアントをコードする、核酸分子に関する。わかりやすくするために、この核酸分子を本発明の「非機能型」、「非機能バリアント」、「非機能的アレル」、「非機能遺伝子」、または「非機能核酸分子」と呼ぶ。
【００９１】
具体的には、本発明の非機能核酸分子は、対応するポリヌクレオチドが発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を低下させるか抑制することができる。好ましくは、該植物は、ビータ属に、好ましくはビータ・ウルガリス種に、より好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスに属する。
【００９２】
抵抗性遺伝子Ｒｚ２は、過去に同定され、国際特許出願公開第２０１４／２０２０４４号明細書に記載されており、ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４２に由来し、テンサイのいくつかの品種で発現すると、叢根病に対し抵抗性を与えることが知られている。対応する核酸配列が、国際公開第２０１４／２０２０４４号明細書に開示されており、参照により本明細書に援用される。ビータ・マリティマのアクセッションＷＢ４１に由来するＲｚ３が同定されており、これはおそらくＲｚ２のアレルバージョンである。したがって、遺伝子Ｒｚ２とＲｚ３とは実質的に同一であり、理論に縛られるわけではないが、本発明の核酸分子は、Ｒｚ３に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性にも関与する、またはそれを妨害すると考えるのが妥当であろう。
【００９３】
本発明の核酸分子の特定および遺伝的位置の特定を、実施例１に詳述するように実施した。まず、非機能的アレルの特定および位置特定に焦点を当てた。遺伝マッピングにより、非機能的アレルがＲｚ２座位の付近に位置特定されることが示された。ところがこの領域に含まれる遺伝子数が尚も多すぎて、具体的な候補を挙げることができなかった。特に困難だったのは、非機能的アレルと抵抗性遺伝子Ｒｚ２との遺伝的連関／連鎖が近いことであった。それが別の染色体上に、または遺伝子Ｒｚ２からもっと遠い距離にあれば、その効果はＱＴＬマッピングで別個の効果として見られたであろう。このように、一般的な育種プロセスを用いた場合、Ｒｚ２の抵抗性アレルが存在するにもかかわらず遺伝型がなぜ叢根病に罹りやすいのか、説明することはできなかった。
【００９４】
遺伝マッピングと並行して、複遺伝子性育種材料の分子マーカーのパターンを分析した。マーカーｓ３ｅ５７９８ｓ０１（表５参照）は、リプレッサー効果の位置決めに関し、最高のエビデンスを示した。この領域のリファレンス配列の分析によると、マーカーｓ３ｅ５７９８ｓ０１は、注釈付き遺伝子モデル（ｇ２３２３８．ｔ１）にある。この遺伝子は、レモリンドメイン（Ｃ末端領域）を含有しており、原形質膜に発現する。レモリンは、可変Ｎ末端領域および保存Ｃ末端ドメインを含む、植物特異的タンパク質の科であり、宿主−微生物相互作用を含め、さまざまな生物的および非生物的ストレスにおいて役割を果たしている。しかしそれらの機能は、これまで完全には理解されていない。
【００９５】
文献によると、レモリンは、原形質連絡（ＰＤ）を通るウイルス伝播の役割を果たし得、特にウイルス移動の負のレギュレーターとして作用し得る（Raffaele et al., Plant Cell (2009), 21(5), 1541-1555; Perraki et al., FEMS Letters (2014), 588(9), 1699-1705）。一般に、ＰＤは細胞間の接続を提供し、１〜６０ｋＤの分子の共原形質体輸送を可能にする。ウイルスはＰＤを通って移動して、局所に伝播する感染および共原形質体の師部ローディングを達成し、それによって浸透性感染を開始する。
【００９６】
より詳細には、Raffaele et al. 2009が、レモリンがジャガイモで、ジャガイモウイルスＸの細胞間の移動を妨害し、ウイルス移動タンパク質ＴＧＢｐ１（Triple Gene Block 1 タンパク質）に直接結合することを報告している。レモリンが過少蓄積している植物では、感染植物の葉で有意なウイルス蓄積増加が観測されており、感染病巣は野生型植物のものよりも有意に大きかった。それと合致するように、レモリンを過剰発現している植物では、ウイルス蓄積の低下、およびより小さい感染病巣が観測された。このように、レモリンは、ウイルス伝播に対しアンタゴニスト効果を有すると思われる。この文脈で、Perraki et al. 2014が、レモリン遺伝子がジャガイモにおいて、ジャガイモウイルスＸ  ＴＧＢｐ１がＰＤ透過性を増加させる能力を制限することを示している。
【００９７】
さらに、WetzelおよびVarrelmannの最近の刊行物（International Plant Immunity Symposium - 1st IRTG 2172 PRoTECT Symposium June 14th and 15th 2018, Goettingen, Germany）は、遺伝子Ｒｚ２が生産するタンパク質、すなわちＲｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質が、叢根病の原因ウイルスであるＢＮＹＶＶのＴＧＢｐ１タンパク質と相互作用し得ることを示唆している。ここでＲｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質とＢＮＹＶＶのＴＧＢｐ１タンパク質との間に欠けているリンクが、本発明で特定されるレモリンである可能性がある。このことから、図１Ａに示す、１つの可能な作用モードを導くことができる。こうして、１つの理論に縛られるものではないが、本発明のレモリン遺伝子は、ビータ・ウルガリスにおいて、上記と似た、または同じ機能を有する、すなわちＢＮＹＶＶ移動の負のレギュレーターとして作用する、と仮定される。
【００９８】
本発明で特定されるレモリン遺伝子の非機能的アレルは、非機能タンパク質であると思われる。１つの可能な作用モードを図１Ｂに示しており、ここで抵抗性アレルのＲｚ２  ＮＢＳ−ＬＲＲ受容体タンパク質は、このアレルのＢＮＹＶＶのＴＧＢ１タンパク質による修飾を検出できない。ゆえに、抵抗性反応は開始しない。
【００９９】
本発明で実施したさらなる実験によりこの仮説が裏付けられ、最初の結果は、Ｒｚ２の抵抗性アレルとレモリンの非機能的アレルとの組み合わせは、尚も叢根病に罹りやすい植物を生じるが、Ｒｚ２の抵抗性アレルおよびレモリンの機能的アレルを含む植物は、抵抗性を示すことを示した。実施例２を参照されたい。
【０１００】
非機能レモリンアレルの特定および分析から得られた知識を、その後、機能レモリンアレルの特定に用いた。具体的には、機能レモリン遺伝子の配列を特定するために、遺伝子Ｒｚ２が存在するにもかかわらず非機能レモリンアレルを含むがためにＢＮＹＶＶ抵抗性を示さないか抵抗性が低下しているテンサイ品種のゲノム配列の比較分析を、テンサイの追加の８０の遺伝型の配列を用いて実施した。
【０１０１】
全部で５つの異なるハプロタイプ（アレル）が見つかった。非機能レモリン遺伝子のハプロタイプ（ハプロタイプ１）と、その他の４つのハプロタイプ、すなわち機能レモリン遺伝子とは、３つのＫＡＳＰマーカー（ｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７；非機能的アレル：Ｇ）、ｓ３ｐ４３４９ｓ０１（配列番号２８；非機能的アレル：Ｔ）、ｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９；非機能的アレル：Ｔ））により区別することができた。表５を参照されたい。配列番号３に示す非機能的アレルのコード配列、すなわちオープン読み枠（ＯＲＦ）は、５つの小さいヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有し、それによって該ハプロタイプ（Ｈａｐ１）と、その他の４つのハプロタイプ（Ｈａｐ２〜５；配列番号７、１１、１５、および１９）とが区別される（図２）。したがって、Ｈａｐ１のコード配列（ＣＤＳ）は、位置７２のＧの代わりにＡを、位置７３のＣの代わりにＧを、位置１１１のＧの代わりにＡを、位置２１４のＣの代わりにＡを、位置５５６のＧの代わりにＡを有する。表１を参照されたい。配列番号４に示す非機能的アレルのタンパク質配列は、その他の４つのハプロタイプ（配列番号８、１２、１６、および２０）と、３つのアミノ酸が明白に異なる。表２を参照されたい。図３に示すように、非機能レモリン遺伝子にコードされる翻訳後の非機能ポリペプチドは、位置２５のＰｒｏの代わりにＡｌａを、位置７２のＰｒｏの代わりにＴｈｒを、位置１８６のＶａｌの代わりにＩｌｅを有する。表２も参照されたい。
【０１０２】
【表１】
2022500039.tif 000002
【０１０３】
【表２】
2022500039.tif 000003
【０１０４】
わかりやすくするために、ハプロタイプ２〜５のｃＤＮＡ配列を組み合わせてコンセンサス配列（配列番号４４）を、またハプロタイプ２〜５のアミノ酸配列を組み合わせて別のコンセンサス配列（配列番号４５）を作った。
【０１０５】
したがって、一実施形態では本発明は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するポリペプチドをコードする核酸分子に関し、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、配列番号４５に示す位置７２にプロリン（Ｐ）を、または配列番号４５に示す位置１８６にバリン（Ｖ）を有する。当然ながら、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、先述の位置の前述のアミノ酸を２つ、すなわち、配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、かつ位置７２にプロリン（Ｐ）を；配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、かつ位置１８６にバリン（Ｖ）を；または配列番号４５に示す位置７２にプロリン（Ｐ）を、かつ位置１８６にバリン（Ｖ）を有していてもよいし、先述の位置の前述のアミノ酸を３つ、すなわち配列番号４５に示す位置２５にプロリン（Ｐ）を、位置７２にプロリン（Ｐ）を、かつ位置１８６にバリン（Ｖ）を有していてもよい。
【０１０６】
該核酸分子のコーディングＤＮＡ配列を参照すると、コーディングＤＮＡ配列は、配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、配列番号４４に示す位置２１４にシトシン（ｃ）を、または配列番号４４に示す位置５５６にグアニン（ｇ）を有する。当然ながら、コーディングＤＮＡ配列は、先述の位置の前述のアミノ酸を２つ、すなわち、配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、かつ位置２１４にシトシン（ｃ）を；配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、かつ位置５５６にグアニン（ｇ）を；または配列番号４４に示す位置２１４にシトシン（ｃ）を、かつ位置５５６にグアニン（ｇ）を有していてもよいし、先述の位置の前述のアミノ酸を３つ、すなわち配列番号４４に示す位置７３にシトシン（ｃ）を、位置２１４にシトシン（ｃ）を、かつ位置５５６にグアニン（ｇ）を有していてもよい。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するポリペプチドをコードする核酸分子に関し、ポリペプチドは、配列番号８、１２、１６、もしくは２０のアミノ酸配列を有し、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、もしくは１９であり、またはコーディングＤＮＡ配列は、配列番号７、１１、１５、もしくは１９のヌクレオチド配列である。
【０１０８】
さらに、本発明のヌクレオチド配列に、単独でも組み合わせでも、ヌクレオチド配列を実際に変更する置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のほかの変更が導入され得るが、修飾されたヌクレオチド配列は当初の配列と同じ機能を実行し得る。このケースは、抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するアミノ酸配列のコード化に関する。
【０１０９】
さらなる実施形態では、本発明はしたがって、本発明のヌクレオチド配列にコードされるか本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を少なくとも１つ有する誘導されたアミノ酸配列は、コードされるポリペプチド／タンパク質の機能性が保存されており、ポリペプチドの誘導体を表す。単独でも組み合わせでも、ヌクレオチド配列を実際に変更するが、当初の配列と同じ機能を実行する置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のほかの変更は、したがって、従来技術で公知の従来の方法を用いて、たとえば部位特異的変異誘発、ＰＣＲに媒介される変異誘発、トランスポゾン変異誘発、ゲノム編集その他により、ヌクレオチド配列に導入することができる。
【０１１０】
あるアミノ酸を、同一または同等または類似の化学的／物理的特性を有する別のアミノ酸で置換することは、「保存的置換」または「半保存的置換」と呼ばれる。アミノ酸の物理的／化学的特性の例は、たとえば、疎水性または電荷である。どのアミノ酸置換が保存的置換または半保存的置換となるかは、当業者には公知である。さらに、当業者であれば、一般的なノウハウによって、どのアミノ酸欠失および付加であれば抵抗性タンパク質の機能性にとって無害であるか、そしてどの位置ならそれが可能であるか、認識し、識別し、そして検出することができる。当業者であれば、この機能レモリンタンパク質の場合、アミノ酸配列を修飾（１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加）するのに、特に保存ドメインの、たとえばレモリンドメインの機能性が、保存されなくてはならないこと、したがってこれらのドメインでは前記の修飾が限定的にしか可能でないことを、認識している。
【０１１１】
本発明はしたがって、本発明のヌクレオチド配列の機能断片を含む。したがって「断片」という用語には、前述のヌクレオチド配列と十分に類似したヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。「十分に類似した」という用語は、第１のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、第２のヌクレオチド配列または第２のアミノ酸配列に対し相対的に、十分なまたは最小限の数の同一または同等のヌクレオチドまたはアミノ酸の群を有することを意味する。
【０１１２】
アミノ酸配列に関しては、前述の方法による修飾後、やはり共通の構造ドメインを有し、かつ／または共通の機能活性をもっている。本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９１％、少なくともおよそ９２％、少なくともおよそ９３％、少なくともおよそ９４％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９６％、少なくともおよそ９７％、少なくともおよそ９８％、少なくともおよそ９９％、または少なくともおよそ１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、本明細書では、十分に類似していると定義される。このことはまた、９０％〜１００％の範囲を明示的に包含する。機能断片の場合は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、先に挙げた本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と同じ特性を概ね有していれば、十分な類似性が確立される。誘導体または誘導アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、直接または間接的に（たとえば増幅または複製ステップにより）、全長または少なくとも一部にわたり、本発明のヌクレオチド配列に対応する当初のヌクレオチド配列から生成される。
【０１１３】
したがって、本発明は、本発明のヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列と、または本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる、ヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
本発明はさらに、本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、かつポリペプチドが発現する植物において抵抗性遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害するポリペプチドの非機能的アレル、すなわち非機能レモリンバリアントをコードする、核酸分子に関する。わかりやすくするために、この核酸分子を本発明の「非機能型」、「非機能バリアント」、「非機能的アレル」、または「非機能遺伝子」、または「非機能核酸分子」と呼ぶ。
【０１１５】
実施例２の特にアッセイ２に示すように、非機能ポリペプチド（レモリン）アレルは、該ポリペプチドの機能的アレルよりも優性と思われる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、［３］の核酸分子にコードされる非機能ポリペプチドは、［１］または［２］の核酸分子にコードされる機能的アレルのポリペプチドよりも優性である。優性とは、植物のヘテロ接合状態、たとえば植物がポリペプチドの非機能的アレルおよび機能的アレルを含む場合、非機能的アレルが抵抗性の発生を阻害するか妨げ、その結果としてその植物が、ＢＮＹＶＶ感染および該ウイルスの植物内伝播のそれぞれを被りやすいことを意味する。
【０１１６】
具体的には、本発明の非機能核酸分子は、対応するポリヌクレオチドが発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を低下させるか抑制することができる。好ましくは、該植物は、ビータ属に、好ましくはビータ・ウルガリス種に、より好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスに属する。
【０１１７】
該非機能的アレルのヌクレオチドおよびアミノ酸コード配列は、それと、機能的アレル、すなわちポリペプチドが発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する本発明の核酸分子とを区別する、多型を特徴とする。原則的には、本発明の非機能遺伝子の配列および対応するポリペプチドはそれぞれ、上述したように本発明の核酸分子の配列に基づくが、上記ですでに定義したように非機能バリアントを生じる１つまたは複数の変異を含んでいる。当然ながら、非機能バリアントを生じる変異の可能性は豊富にあり、当業者であれば当然ながら、単一変異をいかにして導入するか、そして生じた遺伝子およびポリペプチドそれぞれが本当に不活性かどうかをいかにして試験するか、を知っている。好適な方法に関する詳細を、本明細書のほかの箇所に記載する。
【０１１８】
好ましい実施形態では、本発明の非機能核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、または配列番号４と少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９１％、少なくともおよそ９２％、少なくともおよそ９３％、少なくともおよそ９４％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９６％、少なくともおよそ９７％、少なくともおよそ９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるポリペプチドを、コードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドは、該ヌクレオチド配列における１つまたは複数の変異によって少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）、配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）、および／または配列番号４５に示す位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されている。当然ながら、該アミノ酸配列は、先述の位置の１つ、２つ、または３つにアミノ酸置換を有していてもよい。したがって、一実施形態では、配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）、位置７２のプロリン（Ｐ）、または位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されている。さらなる実施形態では、配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）および位置７２のプロリン（Ｐ）が、別のアミノ酸で置換されているか；配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）および位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されているか；配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）および位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されている。あるいは、配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）、位置７２のプロリン（Ｐ）、および位置１８６のバリン（Ｖ）が、別のアミノ酸で置換されている。
【０１１９】
好ましい実施形態では、本発明の非機能レモリンポリペプチドは、配列番号４５に示す位置２５のプロリン（Ｐ）の代わりにアラニン（Ａ）を、配列番号４５に示す位置７２のプロリン（Ｐ）の代わりにスレオニン（Ｔ）を、および／または配列番号４５に示す位置１８６のバリン（Ｖ）の代わりにイソロイシン（Ｉ）を有するアミノ酸配列を含む。当然ながら、該アミノ酸配列は、上記で説明した先述の位置の１つ、２つ、または３つ全部にアミノ酸置換を有していてもよい。
【０１２０】
コーディングＤＮＡ配列に関し、好ましい実施形態では、本発明の非機能レモリン遺伝子は、配列番号３のコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３のＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一であるコーディングＤＮＡ配列を含むか、配列番号３の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、アミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異によって少なくとも１つの核酸置換を含み、好ましくは配列番号４４に示す位置７３〜７５、配列番号４４に示す位置２１４〜２１６、および／または配列番号４４に示す位置５５６〜５５８で、１つまたは複数のヌクレオチドが置換されている。当然ながら、コーディングＤＮＡ配列は、置換ヌクレオチドを、先述の１つ、２つ、または３つ全部の位置に有していてもよい。したがって、一実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドが、配列番号４４に示す位置７３〜７５、位置２１４〜２１６、または位置５５６〜５５８で置換されている。さらなる実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドが配列番号４４に示す位置７３〜７５および位置２１４〜２１６で置換されているか；１つまたは複数のヌクレオチドが配列番号４４に示す位置７３〜７５および位置５５６〜５５８で置換されているか；１つまたは複数のヌクレオチドが配列番号４４に示す位置２１４〜２１６および位置５５６〜５５８で置換されている。あるいは、１つまたは複数のヌクレオチドが配列番号４４に示す位置７３〜７５、位置２１４〜２１６、および位置５５６〜５５８で置換されている。
【０１２１】
好ましい実施形態では、コーディングＤＮＡ配列は、配列番号４４に示す位置７３のシトシン（ｃ）の代わりにグアニン（ｇ）を、配列番号４４に示す位置２１４のシトシン（ｃ）の代わりにアデニン（ａ）を、および／または配列番号４４に示す位置５５６のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を有する。当然ながら、前述したように、コーディングＤＮＡ配列は、置換ヌクレオチドを先述の１つ、２つ、または３つ全部の位置に有していてもよい。
【０１２２】
任意選択により、コーディングＤＮＡ配列は、配列番号４４に示す位置７２のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を、および／または配列番号４４に示す位置１１１のグアニン（ｇ）の代わりにアデニン（ａ）を、追加で有する。
【０１２３】
とはいえ、機能レモリンアレルに関して上述したように、当業者であれば当然ながら、単独でも組み合わせでも、ヌクレオチド配列を実際に変更するが、当初の配列、ここではレモリン遺伝子の非機能バリアントをコードするヌクレオチド配列と、同じ機能を実行する、さらなる置換、欠失、挿入、付加、および／または任意のほかの変更が導入され得ることを知っている。
【０１２４】
病原体ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与えることに関与する核酸分子、および該抵抗性を妨害する対応する非機能バリアントを含め、本発明の核酸分子は、単離核酸分子であり得る。それは好ましくはＤＮＡであり、特に好ましくはｃＤＮＡ（コーディングＤＮＡ）である。機能レモリンタンパク質は、植物の病害の叢根病の原因となる病原体ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与えることに関与し、より好ましくは、タンパク質が発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する、すなわち該ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を増加させるか、該抵抗性を確立するのに不可欠である。非機能レモリンタンパク質は該抵抗性を妨害する。さらに、このポリペプチドはそれぞれ、特にビータ属の植物において、この病原体に対する抵抗性を与えることに関与し、また該抵抗性を妨害する。植物は、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物であり、特に好ましくは亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物であり、たとえばテンサイ、ビートルート、飼料用ビート、フダンソウ、およびセイヨウフダンソウの栽培品種が挙げられる。
【０１２５】
特に断らなければ、本発明の核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する核酸分子およびポリペプチドそれぞれ、すなわち機能レモリン遺伝子および機能レモリンポリペプチド／タンパク質が、ならびにＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する核酸分子およびポリペプチドそれぞれ、すなわち非機能レモリン遺伝子および非機能レモリンポリペプチド／タンパク質が含まれる。
【０１２６】
Ｒｚ２に媒介される抵抗性を改変するような、またはＲｚ２に媒介される抵抗性を改変できるポリペプチドをコードするような遺伝子は、従来技術からは知られていない。すでに上記で述べたように、従来より入手可能な市販の品種では、対応する植物にＲｚ２の抵抗性アレルが存在していても、何らかの遺伝的背景により、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性の弱化または喪失がもたらされることが観測されている。この効果を担う遺伝子、すなわちレモリン遺伝子の非機能バリアントの特定によって、好適なマーカーの生成が可能になり、今やその独特のハプロタイプにより非機能レモリンアレルの診断が可能である。さらに、遺伝子Ｒｚ２およびレモリン遺伝子の遺伝的および物理的位置の正確な知識によって、これらの遺伝子間の組換え体の特定がはじめて可能になり、したがって非機能レモリン遺伝子とＲｚ２の抵抗性アレルとを分けられる。レモリンおよびＲｚ２に、またはそれらの間にマーカーがある新たな交雑種において、交雑パートナーの機能的アレルを示す組換え体を選択することができる。さらに、機能レモリンアレルの特定によって、抵抗性遺伝子Ｒｚ２を有しているのに、レモリンの非機能バリアントが存在することによって、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を失っている植物、たとえば高収量品種に、同遺伝子を組み入れることが可能になる。
【０１２７】
したがって、該植物に、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を、任意選択により非機能レモリン遺伝子の除去と、たとえばその発現のいっさいの阻害または非機能レモリン遺伝子の変異と併せて組み入れて、機能バリアントを確立することにより、今や、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性が回復した高収量品種を非常に早く開発することが可能である。したがって、本発明の枠組みでは、遺伝子Ｒｚ２および本発明の機能レモリン遺伝子に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を有する、テンサイ植物、フダンソウ植物、レッドビートまたはビートルート植物、飼料用ビート植物が、はじめて提供され、したがって本発明に包含される。列挙の植物はすべて農業栽培に適した、本発明の抵抗性を有する栽培植物、作物、または植物なので、本発明の一部である。特に、食料、砂糖の原材料または製造原料として利用可能な地下貯蔵器官を含むような、かつ本発明の抵抗性を含むような作物は、本発明の一部であり、本発明のさらなる態様である。貯蔵器官は、たとえば糖分を含有するテンサイのビート本体、消費可能なレッドビートのビート本体、または餌になる飼料用ビートのビート本体であり得る。地下貯蔵器官は、完全に生長した植物の５０％超を占める場合があり、テンサイの場合は７０％超にもなり得る。さらに、こうした植物の種子または播種材料も本発明の一部である。種子または播種材料は、以下にさらに記載するように技術処理され得る。
【０１２８】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子、すなわちＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する核酸分子および該抵抗性を妨害する核酸分子それぞれの配列を含む、組換えおよび／または非相同ＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子は、さらに、好ましくは制御配列を含む。したがって該ＤＮＡ分子は、この制御配列と機能的に連結され得、またはこの制御配列の影響下にあり得る。この制御配列は、好ましくはプロモーター配列および／またはほかの転写もしくは翻訳制御エレメントの、たとえばｃｉｓエレメントの配列である。本発明の核酸分子を含む遺伝子の発現を制御するこの制御配列は、好ましくは、病原体感染の結果として発現を与えるか調整することができる配列である。このプロモーターは、好ましくは、特に植物の根におけるＤＮＡ配列の発現を制御することができる。制御配列は、発現する配列に対し非相同であってもよい。そのようなアプローチには、発現する配列の発現率、発現が生じる組織、および発現が生じる時点を当業者が調節しやすくなり得るという利点があり、当業者はそれぞれの使用事例に最適な制御配列を選択する。非相同ＤＮＡ配列は、好ましくは、植物の病原体防御の構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む（例：抵抗性遺伝子（Ｒ遺伝子）、あるいはシグナル伝達に関与するキナーゼもしくはホスファターゼなどの酵素およびＧタンパク質をコードする、または病原性エフェクター（弱毒性遺伝子（ａｖｒ）として公知のもの）をコードする遺伝子）。非相同ＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ配列の１つであってもよい。非相同ＤＮＡ配列はまた、植物の病原体防御のさらなる構成要素を追加でコードし得る。したがって、非相同ＤＮＡ配列は、その転写後に多シストロン性ｍＲＮＡが生じるように設計され得る。
【０１２９】
本発明はさらに、本発明の核酸分子にコードされ得るポリペプチドならびにその機能的および／または免疫学的活性断片に、ならびに該ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する抗体に関する。ポリペプチドは、特に好ましくは、配列番号４、８、１２、１６、および２０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。タンパク質、ポリペプチド、および断片の組換え生産について、当業者は熟知している（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, またはWingfield, P. T., 2008, Production of Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science, 52:5.0:5.0.1‐5.0.4）。当業者は、本発明のタンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、公知の方法により生産することができる（E. Harlow et al., editor, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)）。モノクローナル抗体の生産も、タンパク質検出法において同じく有用なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の生産も、さまざまな従来の方法により実施することができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118, New York: Academic Press (1983)）。そして抗体を発現ｃＤＮＡライブラリーの選別に用いて、免疫学的選別により同一、相同、または非相同遺伝子を特定することができ（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, またはAusubel et al., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology.” John Wiley & Sons）、あるいはウエスタンブロット分析に用いることができる。
【０１３０】
具体的には、本発明は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは選択的に検出するが、該抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは本質的に検出しない、抗体に関する。具体的には、対応する非機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは、機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドの２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上、検出されない。別の実施形態では、本発明は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは選択的に検出するが、該抵抗性に関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは本質的に検出しない、抗体に関する。具体的には、対応する機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドは、非機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドの２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上、検出されない。
【０１３１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、自然界では発生しない合成ポリペプチドであることを特徴とする。
【０１３２】
さらに、本発明の抗体を、たとえば免疫組織化学法で利用できるように、そして抗体呈色を誘起するために、蛍光色素と連結することができる。蛍光色素はフルオロクロムであり得る。本発明の抗体は、ほかのシグナリング分子と連結されて存在していてもよい。これらとしては、たとえばビオチン、放射性同位体、アルカリホスファターゼなどのレポーター酵素、またはオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
【０１３３】
本発明の追加の主題は、植物において、なるべくは調節エレメントの制御下で、特に機能調節エレメントの制御下で、本発明の核酸分子または組換えＤＮＡ分子を含むベクターまたは発現カセット、ならびに陰性および／または陽性選択マーカーである。したがって、ベクターの主鎖は本発明の核酸分子に対し非相同であり、つまりそのようなベクターは自然界では発生せず、自然界からは単離できない。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、または発現ベクター、形質転換ベクター、シャトルベクター、もしくはクローニングベクターであり；二本鎖でも一本鎖でも、直線状でも環状でもよく；あるいはゲノム統合によりまたは染色体外で、原核生物または真核生物を形質転換することができる。発現ベクターまたは発現カセット内の本発明の核酸分子またはＤＮＡ分子は、好ましくは、原核生物または真核生物の細胞における転写および任意選択により、発現を可能にする１つまたは複数の制御配列と機能的に連結されている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。これらの制御配列は、好ましくはプロモーターまたはターミネーターであり、特に転写開始出発点、リボソーム結合位置、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止位置、および／またはポリアデニル化シグナルである。たとえば、核酸分子はここで好適なプロモーターおよび／またはターミネーターの制御下にある。好適なプロモーターは、構成的プロモーター（例：「カリフラワーモザイクウイルス」由来の３５Ｓプロモーター（Odell et al., Nature 313 (1985), 810 - 812）；病原体により誘起可能なプロモーターが特に好適である（例：パセリ由来のＰＲ１プロモーター（Rushton et al., EMBO J. 15 (1996), 5,690‐5,700））であり得る。病原体により誘起可能な特に好適なプロモーターは、自然界では発生しない合成またはキメラプロモーターであり、複数エレメントで構成され、ミニマルプロモーターを含有し、かつ少なくとも１つのｃｉｓ調節エレメントをミニマルプロモーターの上流に有しており、該少なくとも１つのｃｉｓ調節エレメントは特定の転写因子の結合位置となる。キメラプロモーターは、所望の要件にしたがい設計され、異なる因子により誘起されたり抑制されたりする。そのようなプロモーターの例は、国際公開第００／２９５９２号、同第２００７／１４７３９５号、および同第２０１３／０９１６１２号に記載されている。たとえば、好適なターミネーターは、ｎｏｓターミネーターである（Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573）。好適なプロモーターおよびターミネーターは、ネイティブプロモーターおよびネイティブターミネーターであってもよい。ベクターまたは発現カセットは、所望のベクターまたはＤＮＡ分子／核酸分子の移動を検出するために、またこれらを含有する個体を選択するために、従来のインジケーター／レポーター遺伝子または抵抗性遺伝子を追加で含有するが、それは遺伝子の発現によって直接検出することが大抵は非常に難しいためである。
【０１３４】
インジケーター／レポーター遺伝子の例は、たとえばルシフェラーゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子である。これらはさらに、遺伝子のプロモーターの活性および／または制御の試験も可能にする。特に植物の形質転換に関する抵抗性遺伝子の例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。追加の陽性選択マーカーは、非形質転換植物よりも形質転換植物に選択の利点を、特に養分の利点を与える、たとえばマンノース−６−ホスファートイソメラーゼまたはキシロースイソメラーゼなどの酵素であり得る。とはいえ、当業者に公知の追加のインジケーター／レポーター遺伝子または抵抗性遺伝子を除外するわけではない。好ましい実施形態では、ベクターは植物ベクターである。さらに、発現カセットは、植物ゲノムに統合されて存在していてもよい。
【０１３５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のベクター、組換えＤＮＡ分子、および／または核酸分子を含む、細胞に関する。細胞は、本発明の意味では、原核生物（たとえば微生物）の細胞または真核生物の細胞（たとえば植物細胞または酵母細胞）であり得る。細胞は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスもしくはアグロバクテリウム・リゾゲネスなどのアグロバクテリウム、エシェリキア・コリ細胞、または植物細胞であり；植物細胞は、特に好ましくはビータ属の植物の、ビータ・ウルガリス種の、または亜種ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスの細胞である。細胞は、培養物として存在する場合もある。したがって本発明は、そのような細胞を含有する細胞培養物もカバーする。細胞培養物は、好ましくは、別の細胞型を含まない純粋または単離培養物である。
【０１３６】
本発明の核酸分子、組換えＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターもしくは発現カセットを、アグロバクテリウムに導入することができる、コンジュゲーションまたは電気穿孔などの多くの方法も、本発明の核酸分子、ＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターを植物細胞に導入することができる、多様な形質転換法（微粒子銃形質転換、アグロバクテリウム媒介性形質転換）などの方法も、どちらも当業者には公知である（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。
【０１３７】
さらに、本発明は、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含有する植物に、好ましくはビータ・ウルガリス種ｓｕｂｓｐ．ウルガリスの植物またはその一部分に関する。本発明の核酸分子は、植物のゲノムに導入されても、遺伝子移入されてもよい。一実施形態では、本発明の核酸分子は植物にとっては外来性であり、すなわち非相同核酸分子である。
【０１３８】
したがって、本発明の植物は、本発明の核酸分子を導入遺伝子または内在遺伝子（endogene）として含むことができ、あるいは該核酸分子を導入遺伝子として含む本発明のベクターまたは発現カセットを含むことができる。さらに、本発明の植物は、本発明のベクターおよび核酸分子それぞれを内包する本発明の細胞を含むことができる。好ましい実施形態では、本発明の植物は、本発明の核酸分子に関しヘテロ接合性であるか好ましくはホモ接合性である。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の植物は、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を、内在的または遺伝子導入的にさらに含む。したがって、本発明の枠組みでは、遺伝子Ｒｚ２および本発明の機能レモリン遺伝子に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を有するテンサイ植物、フダンソウ植物、レッドビートまたはビートルート植物、飼料用ビート植物が、はじめて提供される。
【０１４０】
本発明の植物の一部分はしたがって、細胞、組織、器官、または複数の細胞、組織、もしくは器官の組み合わせであり得る。複数の器官の組み合わせは、たとえば花または種子である。遺伝子Ｒｚ２および本発明の機能レモリン遺伝子を含む本発明の植物は、遺伝子Ｒｚ２を含むが本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含有しない、かつ／またはＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわちレモリンの非機能バリアントを含有する、対応する植物（対照植物）よりも、ＢＮＹＶＶに対する高い抵抗性を好ましくは示す。対照植物は、理想的には、遺伝子導入植物と同一の遺伝型を有し、かつ同一の条件で栽培されているが、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性に関与する本発明の核酸分子を含有せず、かつ／またはＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子を含有する。
【０１４１】
本発明の核酸分子を含有する本発明の植物細胞または植物もしくはその一部分、特にビータ属の植物は、本発明の核酸分子を含有しないか、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子を含有する対応する植物細胞または植物もしくはその一部分よりも、病原体、特にＢＮＹＶＶに対する高い抵抗性を好ましくは示す。
【０１４２】
遺伝子導入植物細胞または植物もしくはその一部分の場合、これは、本発明の核酸分子またはＤＮＡ分子、すなわち機能レモリン遺伝子を、本発明の導入遺伝子またはベクターまたは発現カセットとして含む。そのような遺伝子導入植物細胞または植物もしくはその一部分は、たとえば、該核酸分子、ＤＮＡ分子、または対応するベクターもしくは発現カセットで、好ましくは安定的に形質転換されているものである。好ましい実施形態では、核酸分子は、植物細胞における転写および任意選択により、発現を可能にする１つまたは複数の制御配列と、機能的に連結されている。そして該核酸分子および制御配列でできている構造全体が、導入遺伝子となる。そのような制御配列は、たとえばプロモーターまたはターミネーターである。植物に適用される数々の機能プロモーターおよびターミネーターが当業者には公知である。
【０１４３】
本発明は、本発明の細胞の液胞、およびその中に貯蔵される中身の物質も含む。
【０１４４】
さらに、本発明はまた、細胞からの、好ましくは植物細胞からの、特に好ましくはビータ・ウルガリスの細胞からの、特に好ましくはテンサイ、フダンソウ、またはビートルートのうちの１つの作物の細胞からの、抽出物に関する。細胞抽出物から植物を再生させることはできない。
【０１４５】
本発明の核酸、すなわち機能レモリン遺伝子を含有する植物ゲノムも、同様に本発明に包含される。植物ゲノムから植物を再生させることはできない。砂糖（ショ糖）を生産するための、または汁液、好ましくはビートルートの汁液を生産するための、細胞抽出物の使用も本発明に包含される。本発明の細胞およびその液胞に含有される糖分、具体的にはショ糖も、同様に本発明に包含される。
【０１４６】
本発明の追加の態様は、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含有する種子を含む、種子ストックである。該核酸分子は、遺伝子導入的または内在的に存在し得る。種子ストックおよび種子は、技術処理されていてもよい。したがって本発明は、技術処理済み種子ストックおよび技術処理済み種子も含む。技術処理済み種子ストックのさまざまな実施形態を以下に詳しく説明するが、種子ストックという用語には種子も含まれる。技術処理済み種子ストックは、研磨された形態で存在し得る。それによって種子の最外層が除去されているので、種子はより丸い形をなす。最適に均一化された形状は種子ストック粒の均一な散布をもたらすので、それは播種に役立つ。技術処理済み種子ストックには、ペレット種子ストックもさらに包含される。それによって種子ストックはペレット塊に埋め込まれ、該ペレット塊はそれが含有する種子ストックを保護し、そしてより大きい塊になるので、ペレット種子ストックは風流に対しより高い抵抗能を示し、したがってより風に吹き飛ばされにくくなり、それと同時に播種時のより精密な位置決めが可能になる。本発明の好ましい実施形態では、販売用のバッチまたはユニットのペレット種子ストック粒はすべて、本質的に同形状および同質量を有する。直径および質量は、５％の偏差が可能である。しかし、好ましくは、偏差は１％を超えない。主構成要素の１つとして、ペレット塊は、たとえば鉱物を、たとえば粘土、ベントナイト、カオリン、腐植土および／または泥炭などを含有し得る。ポリアクリルアミドのような接着性材料を添加してもよい。追加の可能な構成要素が、米国特許第４，０６７，１４１号明細書に言及されている。さらに、ペレット塊は、実際の栽培にプラスに影響する追加の化学剤を含有し得る。ここではこれらは肥料に数えられる物質であってもよい。これらとしては、窒素、リン、およびカリウム（多量養素）のうちの１つまたは複数の元素を豊富に含む化合物が挙げられる。したがって、肥料成分には、たとえば硝酸性窒素、アンモニウム窒素、硝酸マグネシウム、硝酸アンモニウムカルシウム、モノアンモニウムホスファート、モノカリウムホスファート、および硝酸カリウムが含まれ得る。さらに、ペレット塊は、殺菌剤、殺虫剤、および／または摂食阻害剤を含有し得る。殺菌剤は、チラムおよび／またはヒメキサゾールおよび／またはその他の殺菌剤であり得る。殺虫剤は、ネオニコチノイド群の物質であり得る。ネオニコチノイド群の物質は、好ましくはイミダクロプリド（ＡＴＣＣｏｄｅ：ＱＰ５３ＡＸ１７）および／またはクロチアニジン（ＣＡＳナンバー２１０８８０−９２−５）である。さらに、殺虫剤は、シフルトリン（ＣＡＳナンバー６８３５９−３７−５）、ベータ−シフルトリン、またはテフルトリンであってもよい。粉衣またはペレット塊に含まれる化合物は、植物に吸収され、浸透性効果を示し、それによって植物全体の好適な保護を提供することは、特筆に値する。１つまたは複数の病虫害防除剤を含むペレット種子から得られた植物は、したがって、自然に生息する植物とは異なり、生物的ストレス条件下でより良い性能を示す。この文脈では、本発明は、ペレット塊と本発明の種子との混合物も包含する。さらに、本発明は、本発明のペレット種子を生産する方法も包含し、該方法は、
ａ）本発明の核酸、すなわち機能レモリン遺伝子を含む、テンサイ植物の種子を準備する、ステップ
ｂ）該テンサイ植物の種子をペレット塊に埋め込む、ステップ、および
ｃ）該ペレット塊を乾燥させるステップであって、該種子は任意選択によりプライムもしくは予発芽種子であってもよく、または該種子はステップｂ）の間にプライム処理されていてもよい、ステップ
を含む。
【０１４７】
ペレット種子ストックは、粉衣種子ストックの具体的な実施形態である。この文脈では、技術処理済み種子ストックは、粉衣種子ストックも包含する。とはいえ本発明はペレット種子ストックに限定されず、むしろどのような形態の粉衣種子ストックにも応用することができる。本発明はしたがって、粉衣種子ストックにも関し、ペレット種子ストックも含むがそれに限定されない。したがって、乾式粉衣、湿式粉衣、および懸濁粉衣も包含される。それによって粉衣は少なくとも１つの色素（着色剤）も含み得、したがって粉衣種子ストックと非粉衣種子ストックとを即座に見分けることができるうえに、播種後の環境における良好な視認性も保証される。粉衣はピリング塊の文脈で記載される農薬も含有し得る。本発明はしたがって、少なくとも１つの殺虫剤などの摂食阻害剤および／または少なくとも１つの殺菌剤が粉衣に含まれるような、粉衣種子ストックを含む。任意選択により、いわゆる電気（electonical）粉衣（電気エネルギーの印加による粉衣）が適用され得る。とはいえ、電気粉衣はこの用語の厳密な意味での粉衣ではない。
【０１４８】
技術処理済み種子ストックの追加の形態は、外殻形成された種子ストックである。コーティング処理された種子ストックと同じく、コーティングとして知られるものもこの文脈で語られる。ペレット種子ストックとの違いは、種子粒が元の形状を保っていることであり、この方法は特に経済的である。この方法は、たとえば欧州特許出願公開第０３３４２５８号明細書に記載されている。技術処理済み種子ストックの追加の形態は、出芽またはプライム種子ストックである。出芽種子ストックは予発芽処理により前処理されており、プライム種子ストックはプライミング（「発芽処理」）により前処理されている。予発芽およびプライム種子ストックには、発芽までの時間が短いという利点がある。それと同時に、播種後に発芽する時点がよりしっかりと同期する。それによって、栽培の間、そして特に収穫の間、より良い農業工学プロセシングが可能になるほか、収量も増加する。予発芽処理では、種子ストックの種皮から幼根が出るまで種子ストックを発芽させ、次いでプロセスを停止する。プライミングでは、種子ストックの種皮から幼根が出る前にプロセスを停止する。予発芽種子ストックと比べて、プライミングに供した種子ストックのほうが、再乾燥のストレスに感受性が低く、そのような再乾燥後も予発芽種子ストックと比べて貯蔵寿命が長く、そのため予発芽種子ストックには一般に再乾燥を勧めない。この文脈では、事前に技術処理された種子ストックには、プライムおよび再乾燥種子ストックも含まれる。予発芽処理のプロセスは、米国特許第４，９０５，４１１号明細書に説明されている。プライミングのさまざまな実施形態が、欧州特許出願公開第０６８６３４０号明細書に説明されている。それに加えて、１つのプロセスで種子ストックを同時に丸めてプライム処理することも可能である。この方法は、欧州特許第２００２７０２号明細書に記載されている。ペレット処理もされているプライム種子ストックが、本発明に包含される。
【０１４９】
技術処理済み種子ストックは、追加で、上記に説明した１つまたは複数の除草剤の抵抗性も備え得る。それによって、事前に除草剤で処理されたため雑草が生えない畑に技術処理済み種子ストックを散布することができるので、さらに改良された農業工学的栽培が可能になる。
【０１５０】
それに加えて、本発明は、本発明の種子ストックまたは本発明の種子と上記で定義した粉衣塊とを含有する混合物も包含する。したがって粉衣塊は、好ましくは上記で定義したようなペレット塊として具現化される。
【０１５１】
本発明の種子ストックの貯蔵については、貯蔵条件は、好ましくは、種子ストックの安定性または貯蔵寿命に負の影響を与えないように選ばれる。ここで湿度の変動は特に不利な効果を有し得る。本発明の一部は、撥水性と通気性とを兼ね備えた袋または容器で種子ストックを貯蔵する方法である。そのような袋または容器は、カートン箱または包装材として設計され得る。そのようなカートン箱または包装材は、内部のベーパーバリアを任意選択により有し得る。カートン箱または包装材が二重カートン箱として設計される場合、その安定性が増加する。本発明の種子ストックまたは本発明の技術処理済み種子ストックを含む容器、袋、カートン箱、または包装材も、同様に本発明の一部である。本発明の種子ストックまたは本発明の技術処理済み種子ストックをそのような袋、容器、包装材、またはカートン箱に貯蔵することも、同様に本発明の一部である。
【０１５２】
一実施形態では、本発明の植物は、ハイブリッド植物またはダブルハプロイド植物である。ハイブリッド植物もダブルハプロイド植物も自然界では発生せず、自然界からは単離できない。本発明の植物のさらなる実施形態では、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子が、ヘテロ接合型として、またはより好ましくはホモ接合型として存在する。本発明は、該核酸分子または対応するポリペプチドを含有するハイブリッド種子およびダブルハプロイド種子も包含する。
【０１５３】
本発明のさらなる実施形態は、植物、好ましくはビータ・ウルガリス種の植物を含み、該植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性がさらに増加していることを特徴とする。このことは、たとえば「遺伝子スタッキング」により実現され得、すなわちこの用量効果により抵抗性が増加する。そのために、ＢＮＹＶＶ抵抗性を与える遺伝子Ｒｚ２、およびＲｚ２に媒介される抵抗性に関与する本発明の核酸分子を含有する本発明の植物を、少なくとも後者で、あるいは前述の遺伝子両方で、過剰に形質転換させて、該植物における該遺伝子の転写量を増加させる。抵抗性遺伝子Ｒｚ２を含むビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させるさらなる可能性を、以下に記載する。
【０１５４】
本発明の追加の実施形態は、発芽から１０、１１、１２、１３、１４、または１５カ月以内にテンサイ植物の抽苔が生じることがなく、ビート本体の生長はこの期間のうちに終わるので、抽苔前に収穫可能な、テンサイ植物もしくはその一部分、またはそのような植物のペレット種子に関する。
【０１５５】
本発明の一実施形態では、テンサイ植物もしくはその一部分、またはそのような植物のペレット種子が、完全に生長した植物の全質量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％にもなる質量を有するビート本体の生長を可能にするゲノムを有する。
【０１５６】
本発明の別の実施形態では、テンサイ植物もしくはその一部分、またはそのような植物のペレット種子は、光合成により、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、３５０ｇ、４００ｇ、４５０ｇ、または５００ｇの最小質量、および１０００ｇ、１１００ｇ、１２００ｇ、１３００ｇ、１４００ｇ、１５００ｇ、１６００ｇ、１７００ｇ、１８００ｇ、１９００ｇ、または２０００ｇもの最大質量を有するビート本体の生長を可能にするゲノムを有する。
【０１５７】
本発明の追加の実施形態は、テンサイ植物もしくはその一部分、またはそのような植物のペレット種子に関し、該テンサイ植物のゲノムは、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％ものショ糖濃度を有するビート本体の生長を可能にする。
【０１５８】
本発明は、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させる方法をさらに包含する。該抵抗性を与える、回復させる、または増加させるための、考えられる方法を以下に挙げるが、それらに限定されない。
【０１５９】
ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与えること、増加させること、および／または回復させることは、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を、ビータ・ウルガリス種の植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに統合することによって、ならびに該植物細胞から可能な植物の再生によって、行うことができる。統合は、有性交雑、たとえばＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ属の植物と、任意選択により抵抗性遺伝子Ｒｚ２と組み合わせた、本発明の機能レモリン遺伝子を含む植物とを交雑させ、そして選択することによって、および相同性指向性修復または相同組換えによって、行われ得る。言及した後者の２つの方法は、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼに支援され、該ヌクレアーゼは、限定ではないが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、もしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、ＦｏｋＩもしくはそのバリアントなどの制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または二部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼから選択され得る。
【０１６０】
ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、増加させる、かつ／または回復させる別の方法は、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子で、対応する組換えＤＮＡ分子で、または本発明のベクターもしくは発現カセットで、植物細胞を形質転換させること、および形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させることにより、行われ得る。
【０１６１】
一般に、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子にコードされるポリペプチドの活性および／または安定性、ならびに対応する核酸分子の発現は、機能レモリン遺伝子および／またはそのネイティブプロモーターの核酸配列の修飾により増加し得る。
【０１６２】
そのような修飾を生じる変異は、生物内で生じさせてもよいし、単離状態の対応する核酸を化学的に修飾して所望の効果を得てもよい。後者のアプローチの利点は、化合物をより精密に編集できることである。
【０１６３】
上記の実施形態［１］もしくは［２］記載の核酸分子の変異バージョンおよび／またはネイティブプロモーターの変異バージョンを含む生物を生産する方法は、
（Ｉ）核酸分子および／またはプロモーターを含む生物または細胞を準備する、ステップ；
（ＩＩ）該生物もしくは該細胞の変異率または該生物もしくは該細胞の変異誘発が増加する、ステップ；
（ＩＩＩ）変異の結果としてＢＮＹＶＶに対する抵抗性の変化もしくは抵抗性レベルの変化を示す生物の表現型を選択する、または該核酸分子および／もしくは該プロモーターにステップ（ＩＩ）で形成された変異を含む生物もしくは細胞の遺伝型を選択する、ステップ；ならびに、任意選択により
（ＩＶ）ステップ（ＩＩＩ）で得られた細胞から生物を再生させる、ステップ
を含む。
【０１６４】
生物は植物であり得る。好ましくは植物は、ビータ・ウルガリスである。しかし、微生物としての単細胞生物を使用することもできる。微生物はＥ．コリであり得る。生物が植物であれば、方法をインビトロだけでなくインビボで適用することができる。生物が植物であって、方法をインビトロで適用する場合、植物の細胞培養物が確立され得、そして変異率または変異誘発の増加がこの細胞培養物において生じ得る。変異率の増加には、たとえば５−ブロモウラシルもしくはエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）のような変異誘発剤の使用、または電離放射線もしくはＵＶ光のような物理的変異原の使用が包含される。変異誘発には、標的化変異誘発も包含される。標的化変異誘発は、（以下でさらに説明する）遺伝子編集などの精密な方法により達成され得る。細胞から生物を再生させることは、細胞生物学のさまざまな標準的な参考文献で説明されている。植物の再生は、たとえば標準的な参考文献、Plant biotechnology: comprehensive biotechnology, second supplement（Michael W. Fowler, Graham Warren, Murray Moo-Young ‐ Pergamon Press - 1992）で説明されている。細胞培養物からのビータ・ウルガリスの再生が、Lindsey & Gallois (1990)に記述されている。
【０１６５】
これらの参照文献には、いかにして植物細胞の培養物を確立するかも記載されている。核酸分子およびプロモーターそれぞれの変異バージョンは、好ましくは、変異により増加した本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子の発現率を特徴とする。そのような効果は、いくつかの変異の存在にも依拠し得る。たとえば、プロモーターまたは核酸分子に２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を導入することができる。
【０１６６】
したがって、変異の導入により、もっと抵抗性を与えるタンパク質が細胞内で組み立てられ得、または該タンパク質はより良い効果を有する。それによって、未改変の本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含む対照植物と比べて、抵抗性がたとえば少なくとも１、２、３、４、５パーセントまたはそれ以上増加し得る。この増加は、以下でさらに説明するようにして測定され得る。さらに、１つまたは複数の変異による抵抗性は、少なくとも１評価スコアだけ増加し得る。評価スコアの決定については、本明細書のほかの箇所で説明する。さらに、Ｒｚ２に媒介される抵抗性を改変するタンパク質は、変異の結果として、効果の変化を与えることができ、また場合によっては、当初の抵抗性機構に適応してしまったような病原体に対する効果を示すこともできる。この文脈では、本発明は、そのような本発明の核酸の変異バリアントおよび本発明のタンパク質の変異バリアントも包含する。好ましくは、本発明は、自然界では発生せず、自然界からは単離できないようなバリアントも包含し、病原体にそのようなバリアントに適応する機会を与えない。上記の変異バージョンの核酸分子を含む生物を生産する方法は、１つまたは複数の変異によってさらに増加した抵抗性を有する生物またはそれぞれの植物を特定するさらなるステップを、さらに含み得る。抵抗性の増加が生じたかどうかは、本明細書で説明する評価スコアにより、あるいは抵抗性レベルの測定により、決定することができる。
【０１６７】
すでに述べたように、変異バージョンの核酸分子またはプロモーターを含む生物を生産する上述の方法のほか、単離状態の上記の核酸を化学修飾して所望の効果を得ることも可能である。この目的のために、以下の方法が提供される：
化学修飾された上記の実施形態［１］もしくは［２］記載の核酸分子および／または化学修飾されたプロモーターを生産する方法であって、
（Ｉ）上述の核酸分子を単離形態で準備する、ステップ；
（ＩＩ）
（ＩＩａ）変異誘発、
（ＩＩｂ）遺伝子編集、
（ＩＩｃ）制限およびライゲーションそれぞれ、挿入、または欠失
の各ステップのうちの１つにより、該核酸分子または該プロモーターを化学修飾する、ステップ
を含む。
【０１６８】
さらに、化学修飾は、本明細書のほかの箇所で、アレルバリアントの文脈で記載されるようなアプローチにより生じさせることができる。上のステップ（ＩＩ）での遺伝子編集は、「ゲノム編集」という用語と等価である。任意選択により、化学修飾された核酸分子または化学修飾されたプロモーターを続けて細胞に導入してもよいし、安定的に統合してもよい。そのような細胞のおかげで、化学修飾された核酸分子および修飾されたプロモーターは細胞増殖の文脈で増えることができる。次いでこれらを大量に単離することができ、そして発現分析を実施することができる。発現分析は、化学修飾がプロモーターに関する場合は特に好適である。細胞を採取し、そして化学修飾された抵抗性タンパク質を単離して、化学的に分析することができる。化学修飾された核酸分子または修飾されたプロモーターを含む細胞が植物細胞である場合、この細胞から完全体の植物が再生され得る。本段落に記載するこれらのアプローチは、核酸分子の修飾体および／またはプロモーターの修飾体を生産する上記の方法に続いて実施することができ、得られたバリアントも本発明の一部である。さらに、化学修飾された核酸分子または修飾されたプロモーターを含む植物も、本発明の一部である。したがって、本発明は、この方法により得られた植物にも関する。さらに、本発明は、この方法により得られた化学修飾された核酸分子に、およびコードされるポリペプチドにも関する。これらの化合物は、元の（修飾されていない）化合物の最適化バージョンであり得、さらに上で説明したように、得られる抵抗性レベルが少なくとも１、２、３、４、５パーセントもしくはそれ以上増加し得、または少なくとも１評価スコアだけ増加し得る。この点で、化学修飾された核酸分子を生産する方法は、核酸分子を最適化する方法でもある。最適化の方法は、未修正バリアントと比べて植物において抵抗性の増加をもたらす、核酸分子の修飾バリアントを特定する追加のステップをさらに含み得る。
【０１６９】
一実施形態では、該ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を増加させることは、植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を改変する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子の発現を増加させることにより実施され得る。それはネイティブプロモーターの修飾によって生じ得、該修飾は、好ましくは、遺伝子編集、または部位特異的ヌクレアーゼおよび任意選択により修復モデルに媒介される部位特異的変異誘発により生じ得る。そのようなヌクレアーゼの例はすでに上記で言及した。本発明の核酸分子の発現の増加は、核酸分子と非相同プロモーターとの融合によっても生じ得、特にＢＮＹＶＶ感染後に、ネイティブプロモーターと比べて高い活性を示す。融合は、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復モデルによっても生じ得るが、二本鎖切断の直後の挿入によっても生じ得る。
【０１７０】
上記ですでに述べたように、ＢＮＹＶＶ抵抗性を増加させる方法は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の修飾により本発明のポリペプチドの活性および／または安定性を増加させることにより実施することもでき、当業者に公知の技法により実施され得る。このアプローチを以下でさらに詳しく説明する。
【０１７１】
標的植物のゲノムへの本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子の導入、または該核酸分子の発現および対応するタンパク質の安定性／活性を増加させる該核酸分子の修飾のいずれかを扱った前述のアプローチはすべて、任意選択により、非機能レモリンアレルの発現の阻害と組み合わせて実施することができる。
【０１７２】
あるいは、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与える、回復させる、または増加させる方法が、ＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリンアレルを含む植物または植物細胞の変異誘発、ならびに機能レモリンアレルにコードされるポリペプチドの機能的アレルが回復しているかつ／または非機能ポリペプチドの発現が失われている植物または植物細胞の選別および任意選択により選択により、実施され得る。このことは、非機能レモリン遺伝子の核酸配列のランダムまたは特異的変異誘発により実施され得る。感受性アレルと抵抗性アレルとを区別する多型の例を表１および２に示す。
【０１７３】
たとえば、非機能的アレルは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による遺伝子変異により修飾することができ、とりわけ後者は、例として国際公開第２０１４／１４４１５５号（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いる植物ゲノム工学）およびOsakabe & Osakabe, Plant Cell Physiol., 56 (2015), 389-400に記載されている。これは、ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeted Induced Local Lesions in Genomes）と呼ばれる方法の使用によっても実現でき、たとえば独国特許出願公開第１０２０１３１０１６１７号明細書には、感受性遺伝子においてどうやって点変異を起こさせるかが記載されており、続いて好適な変異、すなわち抵抗性を与える変異を示す植物、たとえばイエローモザイクウイルス抵抗性のオオムギが選択される。独国特許出願公開第１０２０１３１０１６１７号明細書の４、８、および１２ページの段落［００１４］、［００２６］、および［００３８］を参照されたい。ＴＩＬＬＩＮＧ法は、Henikoff et al.の発表文献（Henikoff et al., Plant Physiol. 135, 2004, 630-636）にも詳細に記載されている。
【０１７４】
所定の標的部位での切断を可能にするために、標的化変異誘発の酵素は、好ましくは結合／認識ドメインおよび切断ドメインを含む。二本鎖切断または一本鎖切断を誘起する能力がある具体的な酵素には、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ＤＳＢＩ（二本鎖切断誘起）酵素またはＳＳＢＩ（一本鎖切断誘起）酵素）、ならびにそのバリアントがあり、もうヌクレアーゼ機能またはニッカーゼ機能は含んでいないが別の酵素との併用でもっぱら認識分子として働く分子もそれに含まれる。近年、多くの好適なヌクレアーゼ、特に目的別のエンドヌクレアーゼが開発されており、これにはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、たとえばナトロノバクテリウム・グレゴリイ由来のアルゴノートヌクレアーゼ、およびClustered Regularly lnterspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ）系の一部としてのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、たとえば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃｓｍ１、ＣａｓＸ、またはＣａｓＹヌクレアーゼが含まれる。したがって、本発明の好ましい態様では、ゲノム工学構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼから選択される、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼから選択される、ＤＳＢ誘起酵素またはＳＳＢ誘起酵素またはそれらのバリアントを含む。
【０１７５】
希少切断（rare-cleaving）エンドヌクレアーゼは、好ましくは約１４〜７０の連続ヌクレオチドの認識部位を有する、したがってほとんどの植物ゲノムのようなより大きいゲノムにおいても切断頻度が非常に低い、ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素である。ホーミングエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼとも呼ばれ、そのような希少切断エンドヌクレアーゼのファミリーの一員である。それらは独立遺伝子または介在配列であるイントロンによりコードされ得、顕著な構造的および機能的特性を示して、より古典的な制限酵素、ふつうは微生物制限修飾ＴｙｐｅＩＩ系と、区別される。それらの認識部位は、ほとんどの制限酵素認識部位の特徴的なダイアド対称性と異なる、一般非対称性を有する。イントロンまたはインテインにコードされるいくつかのホーミングエンドヌクレアーゼが、それらのそれぞれの遺伝要素の、アレル無イントロンまたは無インテイン部位へのホーミングを促進することがわかっている。無イントロンまたは無インテインアレルにおいて部位特異的二本鎖切断を生じることにより、これらのヌクレアーゼは組換え誘導末端を作り、それが、コード配列を複製しイントロンまたは介在配列のＤＮＡレベルの挿入をもたらす、遺伝子変換プロセスに携わる。ほかの希少切断メガヌクレアーゼおよびそれらのそれぞれの認識部位のリストが、国際公開第０３／００４６５９号の表１に提供されている（１７〜２０ページ）（参照により本明細書に援用される）。
【０１７６】
さらに、基本的には選んだ標的ヌクレオチド配列をどれでも認識する、カスタマイズされた希少切断エンドヌクレアーゼを設計する方法が利用可能である。簡単に説明すると、特定のヌクレオチド配列を認識するように設計されたジンクフィンガードメインと、Ｆｏｋｌなどの天然制限酵素由来の非特異的ＤＮＡ切断ドメインとのハイブリッドを用いて、キメラ制限酵素を調製することができる。そのような方法は、たとえば国際公開第０３／０８０８０９号、同第９４／１８３１３号、または同第９５／０９２３３号、およびIsalan et al. (2001). A rapid, generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1 promoter. Nature biotechnology, 19(7): 656; Liu et al. (1997). Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(11): 5525-5530に記載されている。
【０１７７】
カスタム設計のエンドヌクレアーゼの別の例としてはＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、これらはヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩまたはそのバリアント）の触媒ドメインに融合させた微生物の属ザントモナスに由来する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に基づく。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ結合特異性は、タンデムに並んだ３４／３５アミノ酸リピート単位の反復可変二残基（ＲＶＤ）により定められ、１つのＲＶＤが標的ＤＮＡにおける１つのヌクレオチドを特異的に認識する。リピート単位は、基本的に任意の標的配列を認識するように組み立てることができ、ヌクレアーゼの触媒ドメインに融合させて、配列特異的エンドヌクレアーゼを作ることができる（たとえばBoch et al. (2009). Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326(5959), 1509-1512; Moscou & Bogdanove (2009). A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science, 326(5959), 1501-1501；および国際公開第２０１０／０７９４３０号、同第２０１１／０７２２４６号、同第２０１１／１５４３９３号、同第２０１１／１４６１２１号、同第２０１２／００１５２７号、同第２０１２／０９３８３３号、同第２０１２／１０４７２９号、同第２０１２／１３８９２７号、同第２０１２／１３８９３９号を参照）。国際公開第２０１２／１３８９２７号にはさらに、さまざまな触媒ドメインを有するモノマー（小型）ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬＥ、ならびにそれらの組み合わせが記載されている。
【０１７８】
最近、新型のカスタマイズ可能なエンドヌクレアーゼ系が記述された。いわゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。ＣＲＩＳＰＲ系とは、その自然環境において、少なくとも１つの小さな一個の非コードＲＮＡと、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣｐｆ１ヌクレアーゼもしくはＣｓｍ１ヌクレアーゼのような別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの組み合わせを含む、分子複合体のことであり（Zetsche et al., “Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”, Cell, 163, pp. 1-13, October 2015；米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号明細書）、特異的ＤＮＡ二本鎖切断を生産することができる。現在ＣＲＩＳＰＲ系は、５つのタイプのＣＲＩＳＰＲ系を含む、２つのクラスに分類され、たとえばタイプＩＩ系はＣａｓ９をエフェクターとして用い、タイプＶ系はＣｐｆ１をエフェクター分子として用いる（Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015）。人工のＣＲＩＳＰＲ系では、合成非コードＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および／または任意選択により、ニッカーゼとして作用するように修飾されているかヌクレアーゼ機能をいっさいもたない、修飾されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの機能を合わせた少なくとも１つの合成または人工ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと組み合わせて用いることができる（Makarova et al., 2015,前掲）。天然ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により媒介される免疫応答は、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を必要とし、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性化を制御するこのガイドＲＮＡの成熟は、これまでに特徴決定されているさまざまなＣＲＩＳＰＲ系の間で大きく異なる。まず、スペーサーとしても知られる侵入ＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ座位の近位端の２つの隣接するリピート領域の間に統合される。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ系は、妨害ステップの主要酵素としてのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、この系はｃｒＲＮＡおよびトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方をガイドモチーフとして含有する。これらがハイブリダイズして二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成し、それがＲＮＡｓｅＩＩＩに認識され、そして切断されて、成熟ｃｒＲＮＡを形成することができる。するとこれらはＣａｓ分子と結合して、このヌクレアーゼを特異的に標的核酸領域に向ける。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域およびＣａｓ相互作用領域の両方を含み得るので、特定の標的核酸や所望のＣａｓヌクレアーゼとは関係なく、特別設計することができる。
【０１７９】
さらなる安全機構として、標的核酸領域にはＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）が存在すべきであり、これらはＤＮＡ配列であって、Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体に認識されるＤＮＡの直後に続く。ストレプトコッカス・ピオゲネスに由来するＣａｓ９のＰＡＭ配列が、「ＮＧＧ」または「ＮＡＧ」と記述されている（標準ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）（Jinek et al, “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, Science 2012, 337: 816-821）。スタフィロコッカス・アウレウスに由来するＣａｓ９のＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」または「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」である。さらなるバリアントＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が知られている。かくして、ナイセリア・メニンギタイディスＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを切断する。ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを切断する。最近、さらなるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣが、カンピロバクターのＣＲＩＳＰＲ系に関し記述された（国際公開第２０１６／０２１９７３号）。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについては、ｔｒａｃｒＲＮＡをもたないＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９系に一般に認識されるＧリッチＰＡＭよりも、短いＴリッチＰＡＭに続く標的ＤＮＡを効率よく認識し切断したことが記述されている（Zetsche et al.,前掲）。さらに、修飾されたＣＲＩＳＰＲポリペプチドを用いることで、特異的一本鎖切断を得ることができる。Ｃａｓニッカーゼとさまざまな組換えｇＲＮＡとの併用は、ダブルＤＮＡニッキングにより高度に特異的なＤＮＡ二本鎖切断を誘起することもできる。さらに、２つのｇＲＮＡを用いることで、ＤＮＡ結合の特異性を、したがってＤＮＡ切断を、最適化することができる。当初は微生物に関して記述されたＣａｓＸおよびＣａｓＹエフェクターのようなさらなるＣＲＩＳＰＲエフェクターも利用可能になり、ゲノム工学用途に使用できるさらなるエフェクターとなっている（Burstein et al., “New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”, Nature, 2017, 542, 237-241）。
【０１８０】
ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素の切断部位は、切断が誘起されるＤＮＡ上またはＲＮＡ上の正確な場所に関する。切断部位は、ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素の認識部位に含まれても含まれなくてもよく（重複してもしなくてもよく）、したがってＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素の切断部位は、その認識部位に、またはその付近にある、と言われる。結合部位と呼ばれることもあるＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素の認識部位は、ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素に（特異的に）認識されるヌクレオチド配列であり、その結合特異性を決定する。たとえば、ＴＡＬＥＮまたはＺＮＦモノマーは、それらのＲＶＤリピートまたはＺＦリピートそれぞれにより決定される認識部位を有するが、その切断部位はそのヌクレアーゼドメイン（たとえばＦｏｋＩ）により決定され、ふつうは認識部位の外側にある。ダイマーのＴＡＬＥＮおよびＺＦＮの場合、切断部位はそれぞれのモノマーの２つの認識／結合部位の間にあり、切断が生じるこの介在ＤＮＡまたはＲＮＡ領域は、スペーサー領域と呼ばれる。
【０１８１】
当業者であれば、特定の認識部位を認識し、そして切断部位または予め選択された／所定の部位の近傍でＤＳＢまたはＳＳＢを誘起するＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素を選ぶことも、そのようなＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素を遺伝子工学処理することも可能であろう。あるいは、任意の従来の形質転換法を用いて、またはゲノム内にＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素認識部位を有する生物との交雑により、ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素認識部位を標的ゲノムに導入してもよく、その後、そのＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素の切断部位に、またはその近傍に任意の所望の核酸を導入してもよい。
【０１８２】
本明細書で用いられる場合、「二本鎖ＤＮＡ切断誘起酵素」、「二本鎖切断を誘起する酵素」、または「ＤＳＢＩ酵素」は、「認識部位」または「所定の部位」または「所定の場所」と呼ばれる特定のヌクレオチド配列で二本鎖ＤＮＡ切断を誘起する能力がある酵素である。したがって、「一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ切断誘起酵素」、「一本鎖切断を誘起する酵素」、または「ＳＳＢＩ酵素」は、「認識部位」または「所定の部位」または「所定の場所」と呼ばれる特定のヌクレオチド配列で一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ切断を誘起することができる酵素である。
【０１８３】
本明細書で用いられる場合、「修復核酸分子」または「修復マトリックス」は、切断部位のまたはその近傍の予め選択された部位で、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ修飾の鋳型として使用される、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。本明細書で用いられる場合、「ゲノムＤＮＡ修飾の鋳型としての使用」は、修復核酸分子が、予め選択された部位に隣接する標的ゲノムにおける隣接領域と対応する相同領域間の相同組換えにより、予め選択された部位で複製されること、または該部位に統合されることを意味し、任意選択により（たとえば隣接領域が１つしかない場合は）修復核酸分子の２つの末端のうちの１つでの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と組み合わされる。
【０１８４】
本明細書で用いられる場合、「ゲノムの修飾」は、ゲノムが少なくとも１つのヌクレオチドにおいて、または少なくとも１つのエピジェネティック編集により、変更されていることを意味する。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合、「予め選択された部位」、「所定の部位」、または「既定の部位」は、その場所での１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、置換、および／または欠失が望ましい、ゲノム（たとえば核ゲノムまたは葉緑体ゲノム）内の特定のヌクレオチド配列を指す。
【０１８６】
さまざまな実施形態では、本発明の少なくとも１つの塩基エディターが、少なくとも１つの部位特異的ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素複合体に、または少なくとも１つの修飾された部位特異的ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素複合体に、または任意選択により、該少なくとも１つの部位特異的ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素複合体の構成要素に、一時的または恒久的に連結している。この連結は、共有結合および／または非共有結合であり得る。本明細書に開示される、任意の塩基エディターまたは部位特異的ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素複合体、またはそれらの触媒活性断片、あるいは塩基エディター複合体または部位特異的ＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素複合体の任意の構成要素が、細胞に核酸断片として導入され得、該核酸断片は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質エフェクターであるかそれをコードすることができ、あるいはＤＮＡ、ＲＮＡ、および／もしくはタンパク質として、またはそれらの任意の組み合わせとして、導入され得る。
【０１８７】
塩基エディターは、標的化塩基修飾、すなわち関心対象の点変異をもたらす関心対象の塩基の変換を媒介する能力を有する、タンパク質またはその断片である。好ましくは、本発明の文脈の少なくとも１つの塩基エディターは、少なくとも１つのＤＳＢＩ／ＳＳＢＩ酵素に、または任意選択により少なくとも１つのＤＳＢＩ／ＳＳＢＩの構成要素に、一時的または恒久的に融合している。該融合は、共有結合および／または非共有結合であり得る。複数の発表文献が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはシチジンデアミナーゼドメイン、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集触媒ポリペプチド（ＡＰＯＢＥＣ１）、たとえばラット由来のＡＰＯＢＥＣに連結された非機能ヌクレアーゼを用いての、主にシチジン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への標的化塩基変換を示している。シトシン（Ｃ）の脱アミノ化は、シチジンデアミナーゼに触媒されて、ウラシル（Ｕ）を生じ、これはチミン（Ｔ）の塩基対形成特性を有する。ほとんどの既知のシチジンデアミナーゼがＲＮＡ上で働き、ＤＮＡを許容することが知られているわずかな例は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを必要とする。ｄＣａｓ９−標的ＤＮＡ複合体に関する諸研究によると、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ‘Ｒループ’複合体の形成後、置換されたＤＮＡ鎖の少なくとも９つのヌクレオチド（ｎｔ）が対形成していない（Jore et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18, 529-536 (2011)）。実際、Ｃａｓ９−Ｒループ複合体の構造では、置換されたＤＮＡ鎖上のプロトスペーサーの最初の１１ｎｔは乱れており、それらの移動が高度には制限されていないことを示す。非鋳型鎖のシトシンにおいてＣａｓ９ニッカーゼに誘起される変異は、細胞内シトシンデアミナーゼ酵素によるアクセシビリティから生じた可能性も考えられる。ＲループにおけるこのｓｓＤＮＡ区間のサブセットは、ｄＣａｓ９に係留されたシチジンデアミナーゼがＤＮＡにおいてプログラム可能なＣからＵへの直接の変換をもたらすための有効な基質となり得ることが推論された（Komor et al.,前掲）。最近、Goudelli et al., Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature, 2017, 551(7681), 464で、ゲノムＤＮＡにおけるＡ・ＴからＧ・Ｃへの変換を媒介するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）が記述された。
【０１８８】
これらの方法は、好ましくは少なくとも１評価スコアの抵抗性の改良をもたらし、特に好ましくは少なくとも２、３、またはそれ以上の評価スコアの抵抗性の改良をもたらす。植物細胞の変異誘発およびその後の変異誘発植物細胞からの植物再生の後、または植物の変異誘発の後、表１および２に示すように、内在核酸分子に１つまたは複数の変異を示す植物を特定することができる。この文脈で、すでに言及した本発明の植物は、抵抗性が少なくとも１評価スコアだけ、好ましくは少なくとも２評価スコア以上、増加したことを特徴とし得る。あるいは、本発明の植物の抵抗性は、本発明の核酸を含まないかつ／またはその非機能バリアントを含む対照植物と比べて、たとえば少なくとも１、２、３、４、５パーセントまたはそれ以上増加し得る。この増加は、１枚の健康な葉に病原体単離物を接種し、その１５日後に侵襲表面を決定することで、測定され得る。侵襲表面の５％の低下は、抵抗性の５％の増加に相当する。測定を実施するためのさらなるパラメーターは、以下の実施形態「抵抗性試験」から導かれ得る。
【０１８９】
本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含むＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する方法は、代わりに、上述したように、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ属の植物またはビータ属の植物細胞を準備すること、該植物細胞を本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子で、または対応するベクターもしくは発現カセットで形質転換させること、および該形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生させること、を含む。
【０１９０】
代替実施形態では、ＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する方法は、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ属の植物またはビータ属の植物細胞を準備すること、部位特異的ヌクレアーゼまたはニッカーゼを、および任意選択により修復マトリックスまたは部位特異的塩基エディターを、該植物の細胞に導入すること、を含み、該部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノムに、好ましくはＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリンに、または該核酸分子の上流もしくは下流に、少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断または少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断を発生させることができ、該修復マトリックスは、ＢＮＹＶＶ抵抗性に関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含み、あるいは該部位特異的塩基エディターは、前述の場所の１つに少なくとも１つのＤＮＡ一本鎖切断を発生させることができ、かつ少なくとも１つの核酸塩基を変換することができる。好ましくは変換されるべき核酸塩基を、上の表１に挙げる。方法はさらに、任意選択により、生成した細胞を、前述の場所でのゲノムの修飾を可能にする条件で培養することを含み、該修飾は少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入であり得る。修飾は、任意選択により、相同性指向性修復または相同組換えにより生じ得、核酸分子が植物のゲノムに統合される。しかし、単一のヌクレオチドの置換は、塩基エディター、たとえばＣＲＩＳＰＲツールによっても生じ得るので、修復マトリックスは必ずしも必要ではない。さらに、修飾された植物細胞からの植物の再生が包含される。
【０１９１】
本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含むＢＮＹＶＶ抵抗性植物を生産する方法は、代わりに、ＢＮＹＶＶ抵抗性を媒介する抵抗性遺伝子Ｒｚ２を内在的または遺伝子導入的に含むビータ属の植物と、任意選択により抵抗性遺伝子Ｒｚ２と組み合わせた、本発明の機能レモリン遺伝子を含む植物とを交雑させること、そして抵抗性遺伝子Ｒｚ２、および本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を内在的にも遺伝子導入的にも含む植物を特定すること、および任意選択により選択することを含み、抵抗性遺伝子Ｒｚ２および／または該本発明の核酸分子は、該植物のゲノムにホモ接合として存在する。
【０１９２】
本発明は同様に、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含む、かつ遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を示す能力がある、ビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定する、かつなるべくは準備する方法に関し、該方法は、植物、またはその試料もしくは一部分もしくは種子における該核酸分子のまたはコードされるポリペプチドの存在および／または発現を検出するステップを含むことを特徴とする。したがって、該核酸分子の存在および発現のそれぞれは、該植物が、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を示す能力があることを示す。あるいは、該核酸分子の発現の不存在および不足のそれぞれは、ならびに／またはＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリン遺伝子の存在および／もしくは発現のそれぞれは、該植物が、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を示す能力がないか、該能力を損傷していることを示す。それに加えて、方法は、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含む、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、ビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくは種子を特定すること、および任意選択により選択することを含み得る。
【０１９３】
同様に、本発明は、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリン遺伝子を含む、ビータ・ウルガリス種の植物を特定する、かつ任意選択により選択する方法に関し、該方法は、植物、またはその試料もしくは一部分もしくは種子における該核酸分子のまたはコードされるポリペプチドの存在および／または発現を検出するステップを含むことを特徴とする。
【０１９４】
本発明の核酸分子の、または本発明のポリペプチドの存在および／または発現は、当業者には公知の標準的な方法、たとえばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはウエスタンブロットにより、試験することができる。
【０１９５】
ファインマッピングにより、ビータ・ウルガリスｓｕｂｓｐ．ウルガリスのゲノムにおけるレモリン遺伝子の位置が決定されており、遺伝子自体および周囲配列領域が特定されている。具体的には、レモリンは、第３染色体の長腕上で遺伝子Ｒｚ２から約０．７５ｃＭ遠位に位置している。このことは、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブまたは標的領域における遺伝マーカーの開発の根拠となり、機能レモリンアレルを含む植物と非機能レモリンアレルを含む植物とを区別することを可能にし、また遺伝子間の組換えの特定に用いることができる１つまたは複数の同時分離領域におけるマーカーの開発を可能にし、したがってリプレッサーアレルと抵抗性Ｒｚ２アレルとを見分けることを可能にする。両遺伝子の互いに対する遺伝的位置を図７に示す。
【０１９６】
ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、レモリン遺伝子の配列に由来し得、所望の生物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡバンクの選別に用いられ得る。プローブはまた、既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスにより特定済み相同遺伝子を増幅するのに、そしてレモリン遺伝子が生物に内在的に存在するかどうかもしくは成功裏に非相同的に導入されたかどうかチェックするのに、用いられ得る。
【０１９７】
ここで当業者は、通常のハイブリダイゼーション、クローニング、およびシーケンシング法を活用することができ、それらはたとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に挙げられている。また当業者であれば、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてレモリン遺伝子配列の増幅に用いることができる。特異的ハイブリダイゼーションを実現するために、そのようなプローブは、特異的であり、かつ少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有するべきである。核酸ハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays.” Elsevier, New York (1993);およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley lnterscience, New York (1995)に記載されている。
【０１９８】
したがって、一実施形態では、本発明は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするか、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするか、両方の核酸配列に相補的な核酸分子  、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００、または１０００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、好ましくはオリゴヌクレオチドの形態の、一対の核酸分子に関し、これはフォワードおよびリバースプライマーとして該核酸分子の１つに対し特異的な領域への付着に、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でのこれらの増幅に、好適である。
【０１９９】
本発明はしたがって、オリゴヌクレオチドとしてのマーカー、具体的にはプライマーオリゴヌクレオチドにも関する。これらは、少なくとも１５ヌクレオチド長であって、先に定義したヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、核酸分子を含む。
【０２００】
具体的には、本発明は、好ましくはオリゴヌクレオチドの形態であるか、該オリゴヌクレオチド対を収容するキットの形態である、一対の核酸分子を包含し、それは本発明の核酸分子に対し特異的な領域とのハイブリダイゼーションのフォワードおよびリバースプライマーとして、またポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でこれを増幅するのに好適であるか、ビータ・ウルガリスにおいてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子との、またはＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリン遺伝子との同時分離を示すビータ・ウルガリスのゲノム内の領域とのハイブリダイゼーションのフォワードおよびリバースプライマーとして好適である。あるいは、またはそれに加えて、該オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド対は、ビータ・ウルガリスにおいて機能レモリン遺伝子および遺伝子Ｒｚ２と、または非機能レモリン遺伝子および遺伝子Ｒｚ２と同時分離するビータ・ウルガリスのゲノム内の領域とのハイブリダイゼーションに、好適である。
【０２０１】
【表３】
2022500039.tif 000004
【０２０２】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対は、配列番号２４〜４０に示すものからなる群より選択される。具体的には、レモリンとＲｚ２との間に７４のマーカーが特定されており、そのうちの３つ：ｓ３ｅ５７８２ｓ０１（配列番号３０；非機能的アレル：Ｔ）、ｓ３ｅ４９１３ｘｘｘ（配列番号３１；非機能的アレル：Ｔ）、およびｓ３ｅ５８００ｓ０１（配列番号３２；非機能的アレル：Ｔ）を、図７に例示している。図７はまた、レモリンに対して遠位の、およびＲｚ２に対し近位のマーカー位置を示しており、これらは機能レモリンを導入する目的でマーカー支援育種（ＭＡＳ）に用いることができる隣接領域を画定する。これらのマーカー、ならびにそれらのそれぞれの遺伝的および物理的位置を表３〜５に示す。
【０２０３】
【表４】
2022500039.tif 000005
【０２０４】
【表５】
2022500039.tif 000006
【０２０５】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドを、たとえば対応する波長の光による励起下で蛍光シグナルを発するように、蛍光色素と結合させることができる。蛍光色素はフルオロクロムであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドを、シグナル発生に好適なほかの化合物と連結する場合もある。そのようなオリゴヌクレオチドは自然界では発生せず、自然界から単離することもできない。以下を実行して、そのような有標オリゴヌクレオチドを生産する、すなわちＤＮＡを生体直交的に有標化することができる。そのために、インビボまたはインビトロでＤＮＡをヌクレオシドアナログで有標化してから、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応によりフルオロフォアと連結することができる。これに加えて、ＤＮＡに化学的にフルオロフォアを与えることもできる。オリゴヌクレオチドをホスホラミダイト合成によりフルオロフォアで有標化して、たとえばＱＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、およびインサイチュハイブリダイゼーションで用いることができる。さらに、ＤＮＡは、蛍光ヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応の間に酵素的に生成してもよいし、リガーゼまたは末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて有標化してもよい。ＤＮＡは、ビオチン化および蛍光アビジンを介して間接的に検出することもできる。連結には、フルオロフォアとして、とりわけフルオレセイン、蛍光ランタニド、金ナノ粒子、カーボンナノチューブ、または量子ドットが用いられる。もっとも一般的に用いられる蛍光物質の１つが、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）である。したがって、オリゴヌクレオチド、および特にＦＡＭ有標をもつプライマーが、本発明に包含される。ＦＡＭは好ましくは６−ＦＡＭとして存在するが、所望の波長の発光および励起によっては、ほかのＦＡＭバリアント、たとえば５−ＦＡＭも使用され得る。追加の蛍光マーカーの例は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、ＡＴＴＯ、Ｄａｂｃｙｌ、ＨＥＸ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗである。使用分野にもよるが、オリゴヌクレオチドに塩基のまたは糖リン酸突起の修飾を施す場合もある。それらはとりわけ、アミノ−ｄＴ、アジド−ｄＴ、２−アミノプリン、５−Ｂｒ−ｄＣ、２’−デオキシイノシン（ＩＮＯ）、３’−デオキシ−Ａ、Ｃ、Ｇ、５−Ｍｅｔ−ｄＣ、５−ＯＨ−Ｍｅｔ−ｄＣＮ６−Ｍｅｔ−ｄＡ等である。
【０２０６】
したがって、本発明の特定法は、機能レモリン遺伝子と非機能レモリン遺伝子との、すなわちＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与する本発明の核酸分子の配列と該抵抗性を妨害する本発明の核酸分子のバリアントの配列との少なくとも１つの多型を、１つまたは複数の多型を検出する分子マーカーを用いて検出することにより、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を検出することも含む。そのような多型の例を表１に記載する。したがって、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子のヌクレオチド配列、または同時分離領域における少なくとも１つのマーカー座位の存在は、その植物にＲｚ２に媒介されるＢＹＮＶＶに対する抵抗性を示す能力があることを示す。あるいは、該核酸分子のヌクレオチド配列におけるマーカー座位の不存在、および／またはＢＮＹＶＶに対する抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリン遺伝子のヌクレオチド配列、もしくは同時分離領域における少なくとも１つのマーカー座位の存在は、その植物にＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を示す能力がないか、それが損傷していることを示す。それに加えて、方法は、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含む、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、ビータ・ウルガリス種の植物、またはその一部分もしくはその種子を特定すること、および任意選択により選択することを含み得る。
【０２０７】
同じ原理により、ＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリン遺伝子を含む植物を特定することができる。
【０２０８】
本発明の好ましい実施形態では、非機能レモリンバリアントが、それぞれ上記で定義したような核酸およびアミノ酸配列を含み、すなわちそれぞれ表１および２に示し、かつ図２および３に表すような特定の核酸およびアミノ酸配列を有する。本発明の方法の好ましい実施形態は、したがって、多型、具体的には診断多型を検出する分子マーカーを用いて、図２に示す多型の少なくとも１つを検出することを含む。この検出は、好ましくは、少なくとも１つの分子マーカーを１つの多型に、具体的には１つの診断多型に用いて行う。対応する多型の検出にどのマーカー技法を適用すべきか、そしてそのための分子マーカーをどうやって構築するか、当業者には公知である（Advances in Seed Science and Technology Vol. I, Vanangamudi et al., 2008を参照）。
【０２０９】
すでに上記で概説したように、本発明の特定法は、本発明の核酸分子と同時分離する領域において少なくとも１つのマーカー座位を検出するステップを含む。好ましくは、同時分離領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ１００２ｓ０２（配列番号３４）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ２４９９ｓ０１（配列番号３５）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓｘｉ０６９８ｓ０１（配列番号３６）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｖ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）、ならびに／または
（ｖ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｖｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８００ｓ０１（配列番号３２）、ならびに／または
（ｖｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ４９１３ｘｘｘ（配列番号３１）、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５７８２ｓ０１（配列番号３０）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている。
【０２１０】
図７にマーカーの場所を視覚化する。
【０２１１】
本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子を含む、かつ遺伝子Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在する場合はそれを示す能力がある、ビータ・ウルガリス種の植物の特定に用いられる本発明の方法は、植物、またはその一部分もしくはその種子における、遺伝子Ｒｚ２の存在および／もしくは発現を、または遺伝子Ｒｚ２にコードされるポリペプチドの存在を、検出すること；ならびに／あるいは遺伝子Ｒｚ２における、または遺伝子Ｒｚ２と同時分離する、好ましくは本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子および遺伝子Ｒｚ２を含む染色体範囲と同時分離する１つもしくは複数の領域における少なくとも１つのマーカー座位を検出することを、任意選択によりさらに含むことを特徴とする。したがって、特定された、かつ任意選択により選択された植物、またはその一部分もしくはその種子は、該核酸分子および遺伝子Ｒｚ２を含む。
【０２１２】
該方法の好ましい実施形態では、遺伝子Ｒｚ２のヌクレオチド配列における該少なくとも１つのマーカー座位が、マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）により検出可能であり、遺伝子Ｒｚ２と同時分離する１つまたは複数の領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓ３ｐ４３５１ｓ０１（配列番号２９）およびｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号３３）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている。
【０２１３】
該方法の代替の好ましい実施形態では、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子および遺伝子Ｒｚ２を含む染色体範囲と同時分離する１つまたは複数の領域は、ビータ・ウルガリスの第３染色体上のゲノム範囲であって、
（ｉ）マーカーｓ３ｅ５９８５ｓ０１（配列番号３３）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓ３ｅ２２４７ｘｘｘ（配列番号４０）により、
好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ１００２ｓ０２（配列番号３４）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｎ１０１７ｓ０２（配列番号３９）により、
より好ましくは、
（ｉ）マーカーｓｘｈ２４９９ｓ０１（配列番号３５）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉ）マーカーｓｘｉ０６９８ｓ０１（配列番号３６）およびｓ３ｐ４３４８ｓ０１（配列番号２７）、ならびに／または
（ｉｉｉ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｅ７３５７ｓ０１（配列番号３８）、ならびに／または
（ｉｖ）マーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）およびｓｘｈ８４８５ｓ０１（配列番号３７）により検出可能なマーカー座位を含み、かつそれらに隣接されている。
【０２１４】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対は、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力がある、またはＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性の能力が植物のゲノムに存在していればそれを示す能力が損傷している、ビータ・ウルガリス種の植物の特定および／または選択に用いられる。
【０２１５】
さらに、本発明は、検出に好適な本発明のオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むマーカーチップ（「ＤＮＡチップ」またはマイクロアレイ）にも関する。このマーカーチップは、本発明の１つまたは複数の検出法での使用に好適である。
【０２１６】
本発明は同様に、本発明のタンパク質を生産する方法に関する。この方法は、本発明の核酸分子、すなわち機能および非機能レモリン遺伝子それぞれを含有する細胞培養物を準備または培養すること、およびそれに続いて対応するタンパク質を発現させることを含む。
【０２１７】
さらに、本発明は、上述の方法により特定され、かつ適宜選択された、ＢＮＹＶＶ抵抗性植物またはその一部分にも関する。具体的には、本発明は、上述の本発明の方法の１つにより得られる、かつ好ましくは叢根病、すなわちＢＮＹＶＶ侵襲に対し抵抗性であり、かつＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与えることに関与する本発明の核酸分子、すなわち機能レモリン遺伝子の存在を特徴とする植物体を含む、植物集団に関する。この集団は、好ましくは、植物体を少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、特に好ましくは少なくとも５００、特に農作では好ましくは少なくとも１０００有する。該核酸分子を担持しない、ＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害する本発明の核酸分子、すなわち非機能レモリンを担持する、かつ／またはＢＮＹＶＶに罹りやすい植物体が該集団に占める比率は、好ましくは２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％、特に好ましくは存在するとしても５％未満である。
【０２１８】
ビータ属の新抵抗性植物系統の育種および開発の以下の利点も、本発明により実現され得る。配列情報、ならびに開示の遺伝子の機能バリアントと非機能バリアント、すなわちＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性に関与するアレルと該抵抗性を妨害するアレルとの区別を可能にする、特定された多型は、上述したように直に遺伝子における、ならびに上流および下流領域におけるマーカー開発を可能にし、そのことは、特に「リンケージドラッグ」のない最適化されたエリート系統の開発に関し、育種家にとって重要な改良となる。さらに、配列構造に関する知識を、たとえば相同のまたはオーソロガスな追加のレモリンまたはレモリン様遺伝子の特定に用いることができる。
【０２１９】
したがって、本発明は、ポリペプチドが発現する植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するポリペプチドまたは追加のタンパク質をコードする追加の核酸分子を特定する方法も包含する。当業者はそれによってデータベースを用いることができ、好適な検索プロファイルおよびコンピュータープログラムを利用して、相同配列を選別したり配列を比較したりすることができる。さらに、当業者自身が従来の分子生物学的技法によりレモリンタンパク質をコードする追加のＤＮＡ配列を派生させることができ、それらを本発明の範囲内で使用することができる。たとえば、本発明の核酸分子の配列から好適なハイブリダイゼーションプローブを派生させることができ、所望の生物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡバンクの選別に用いることができる。ここで当業者は、通常のハイブリダイゼーション、クローニング、およびシーケンシング法を活用することができ、それらはたとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に挙げられている。当業者はまた、既知の配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを合成することができ、そしてそれらをＲｚ２の抵抗性に関与する核酸分子、植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶに対する抵抗性に関与するポリペプチドもしくは追加のタンパク質をコードする核酸分子、またはほかのもしくは新規なレモリンアレルをコードする核酸分子の配列の増幅に用いることができる。
【０２２０】
一実施形態では、本発明はしたがって、ポリペプチドが発現するビータ・ウルガリス種の植物においてＢＮＹＶＶに対する抵抗性を与えることに関与するポリペプチドをコードする核酸分子を特定する方法を包含する。したがってこの方法は、ビータ・ウルガリス種の遺伝型における、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、配列データベースのアミノ酸配列との、または本発明のポリペプチドのアレルバリアントの配列との比較を含む。さらに、本発明の方法は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列またはアレルバリアントの特定、ならびに抵抗性遺伝子Ｒｚ２を含むビータ・ウルガリス種の植物における特定されたアミノ酸配列またはアレルバリアントをコードする核酸分子の導入；該植物における該核酸分子の発現；そして任意選択により、ＢＮＹＶＶに対する抵抗性のその後の検証も含む。
【０２２１】
前述したように、本発明の核酸分子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、または９８％も同一である、Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性に関与する追加のタンパク質、またはそれらのコード遺伝子、すなわちホモログ、アナログ、およびオーソログが、古典的なバイオインフォマティクスのアプローチ（データベース検索およびコンピュータープログラムによる相同配列の選別）により特定され得る。
【０２２２】
ホモログという用語はしたがって、（２つの異なる植物種に由来する）問題の遺伝子が本質的に同じ機能および共通の祖先をもつので、それらの核酸またはコードされるアミノ酸の配列は典型的には有意な同一性を示すことを意味する。しかし、有意味な対のアラインメントを生じるタンパク質配列がなくても、互いに相同な遺伝子は多数ある。これに対し、アナログという用語は、（同じく）同一のまたは類似の機能を有するが、同一構造から作られていない、すなわち共通の祖先をもたない遺伝子またはタンパク質を記述する。この場合、それらの核酸配列もしくはコードされるアミノ酸配列において、または最良の場合は特定の機能ドメインにおいて、有意な同一性が確立し得ないことが多い。
【０２２３】
ゲノムシーケンシングの文脈では、ホモログは、注釈でさらに細かく分類される。そのためにオーソロジーおよびパラロジーという用語が導入されている。オーソログは、種分化の現象を介してつながりのある遺伝子である。パラログは、重複の現象に起因する遺伝子である。
【０２２４】
遺伝子は、植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を与えることに関与する場合、本発明の意味では基本的にホモログ、アナログ、またはオーソログである。これを検証するために、すでに前述した、かつ当業者に公知の方法、たとえば、特定されたホモログまたはアナログまたはオーソログのＰＣＲによる増幅、発現ベクターにおけるクローニング、標的植物または植物細胞への導入、および抵抗性の確認が用いられる。
【０２２５】
本発明は、植物に耕種学的に有利な特性を与えることができるほかの遺伝要素と一緒に遺伝的または分子的スタックとして、本発明の核酸分子、すなわち機能レモリンアレルを使用することにも関する。それによって栽培植物の経済的価値は著しく増加し得、たとえば同じ遺伝的性質をもつが、該核酸分子を備えていないか本発明の核酸分子の非機能バリアントを含む植物と比べて、収量が増加する。具体的には、本発明は、特定されたレモリン遺伝子を、農業または園芸におけるビータ属の植物の栽培において、病原体ＢＮＹＶＶの侵襲を制御する方法で使用することに関し、たとえば、前述した方法の１つに補助されてのビータ属の植物の特定および選択、ならびに／またはそうして選択された植物もしくはその子孫の栽培を包含する。本発明はしたがって、ビータ・ウルガリス種の植物を栽培する方法を含み、第１のステップには、本発明のＢＮＹＶＶ抵抗性のビータ・ウルガリス種の植物の準備、または本発明の生産法に補助されてのビータ・ウルガリス種の植物の生産、または前述した本発明の特定法に補助されてのビータ・ウルガリス種の植物の特定および選択が含まれ、該準備には、本発明の対応する苗を植えること、または本発明の対応する種子をまくことが含まれ得；そして第２のステップには、第１のステップからの植物の栽培、または第１のステップからの植物の種子ストックの散布、または第１のステップからの植物の育成が含まれる。それによって栽培法は、栽培植物のＢＮＹＶＶ侵襲に対抗する。栽培法は、製糖法の一部であり得る。製糖法は、栽培法のステップに加えて、最後から２番目のステップとして、栽培植物を収穫すること、および最後のステップとして、前述の植物から砂糖を抽出することを含む。
【０２２６】
栽培法は、種子ストックの生産法の一部でもあり得る。種子ストックの生産法には、栽培法のステップに加えて、最後から２番目のステップとして、栽培植物の春化を、そして最後のステップとして、前述の植物からの種子の抽出を含む。
【０２２７】
抽出された種子は、任意選択により、ビータ・ウルガリス種のペレット種子ストックを得るために、ペレット化することができる。それはこの場合、ペレット種子ストックを生産する方法である。さらに、種子ストックの生産法は、ＢＮＹＶＶ抵抗性種子ストックを生産する方法として設計される場合がある。ＢＮＹＶＶ抵抗性種子ストックを生産する方法には、上述の種子ストックを生産する方法のステップに加えて、最後のステップとして、抽出された種子の少なくとも１つにおける、好ましくは抽出された種子の少なくとも０．１％または少なくとも１％における、本明細書に記載される方法による、本発明の核酸、すなわち機能レモリン遺伝子の検証が含まれる。検証は、特に好ましくは、種子の発芽可能性が保たれるように実施される。これは、検証に必要なＤＮＡを種子から抽出しても、種子の発芽可能性を消さない、という意味である。そのような場合、本発明の核酸の検証は、抽出された全種子に対し特に大きい比率で行われたかもしれない。たとえば、抽出された全種子の少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、特に好ましくは少なくとも４％に対し検証を行うことができる。
【０２２８】
本発明の植物、それらの細胞、または本発明の種子もしくは種子ストックは、追加の耕種学的に有利な特性を有する場合もあるし、それらを備えている場合もある。一例は、グリホサート、グリホシネート、またはＡＬＳ阻害剤などの除草剤に対する耐性または抵抗性である。グリホサートまたはＡＬＳ阻害除草剤に対する耐性が好ましい。グリホサート抵抗性の具体的な実施形態が、米国特許第７，３３５，８１６号明細書に開示されている。そのようなグリホサート抵抗性は、たとえば、ＮＣＩＭＢ（英国スコットランド、アバディーン）に寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４１１５８またはＮＣＩＭＢ  ４１１５９として保存されている種子ストックから入手可能である。そのような種子を、グリホサート耐性テンサイ植物を得るのに用いることができる。グリホサート抵抗性は、交雑によりビータ属のほかの種にも導入され得る。
【０２２９】
ＡＬＳ阻害除草剤抵抗性の具体的な実施形態が、国際公開第２０１２／０４９２６８号に開示されている。たとえば、そのようなＡＬＳ阻害除草剤抵抗性は、ＮＣＩＭＢ（英国、アバディーン）の寄託物、ＮＣＩＭＢ番号４１７０５から入手可能である。さらに、そのようなＡＬＳ阻害剤抵抗性は、ｔｉｌｌｉｎｇ法または部位特異的変異誘発により、たとえば遺伝子編集により、たとえばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮＳ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、もたらすことができる。数々の追加の除草剤およびそれらの応用可能性は、当業者には従来技術から公知である。当業者は従来技術を活用して、対応する耐性を植物において実現するには、どの遺伝要素をどのように用いるべきか、知識を得ることができる。
【０２３０】
耕種学的に有利な特性のさらなる例は、追加の病原体抵抗性、耐寒性、または霜耐性、ならびに水利用効率、窒素利用効率、および収量であって、該病原体はとりわけ昆虫、ウイルス、線虫、微生物、または菌であり得る。ここでも当業者は従来技術を活用して好適な遺伝要素を見つけることができる。
【０２３１】
本発明の植物に関し、さらに、本発明は、典型的には持続可能な原材料から生産される食材および動物の餌などの製品、好ましくは砂糖またはシロップ（モラセス）の生産における、その種子もしくは子孫に、またはその器官、植物部分、組織、もしくは細胞にも関し、モラセスは、産業用途にも、たとえばアルコール生産に、またはバイオテクノロジー製品を生産する生育培地としても使用され、化学産業の材料または物質、たとえば精製化学品、医薬もしくはその前駆体、診断用薬、化粧品、バイオエタノール、またはバイオガスの生産にも使用される。バイオガス工場で生体起源の原材料としてテンサイを使用する例が、独国特許出願公開第１０２０１２０２２１７８号明細書に記載されている。たとえば段落１０を参照されたい。
【０２３２】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の主題を制限することはない。特に断らないかぎり、標準的な分子生物学方法を用いている。たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, eds., Academic Press, London, 1987, およびWeir et al., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds., 1986を参照されたい。
【０２３３】
本発明の最重要配列の一部を以下に詳しく説明する：
配列番号２−非機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ１）のゲノム配列
配列番号３−非機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ１）のオープン読み枠
配列番号４−非機能レモリンポリペプチド（ハプロタイプ１）のアミノ酸配列
配列番号６−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ２）のゲノム配列
配列番号７−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ２）のオープン読み枠
配列番号８−機能レモリンポリペプチド（ハプロタイプ２）のアミノ酸配列
配列番号１０−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ３）のゲノム配列
配列番号１１−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ３）のオープン読み枠
配列番号１２−機能レモリンポリペプチド（ハプロタイプ３）のアミノ酸配列
配列番号１４−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ４）のゲノム配列
配列番号１５−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ４）のオープン読み枠
配列番号１６−機能レモリンポリペプチド（ハプロタイプ４）のアミノ酸配列
配列番号１８−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ５）のゲノム配列
配列番号１９−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ５）のオープン読み枠
配列番号２０−機能レモリンポリペプチド（ハプロタイプ５）のアミノ酸配列
配列番号５１−Ｒｚ２をコードするヌクレオチド配列
配列番号５２−Ｒｚ２バリアントＡのアミノ酸配列
配列番号５３−Ｒｚ２バリアントＢのアミノ酸配列
配列番号５４−機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ５）、隣接領域、およびＲｚ２を含むヌクレオチド配列
配列番号５５−非機能レモリン遺伝子（ｈａｐｌｏｔｙｐ１）、隣接領域、およびＲｚ２を含むヌクレオチド配列
【０２３４】
実施例
実施例１：Ｒｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性に関与する遺伝子、すなわち機能レモリン遺伝子、ならびに該抵抗性を妨害するバリアント、すなわち非機能レモリン遺伝子の特定および遺伝マッピング
対応するポリペプチドの発現後にビータ・ウルガリス種の植物においてＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性の抑制をもたらす非機能レモリン遺伝子の位置を特定するために、遺伝マッピングを実施した。そのために、Ｒｚ２の抵抗性アレルを含む２つのビータ・ウルガリス系統を交雑させ、ここで片方の親系統は非機能レモリン遺伝子を含んでおり、もう片方の親系統は叢根病に対し抵抗性であった。その後、子孫集団において、関心対象の遺伝子をＲｚ２の座位付近に遺伝的に特定することができた。ところがこの領域に含まれる遺伝子数が尚も多すぎて、具体的な候補を挙げることができなかった。
【０２３５】
遺伝マッピングと並行して、複遺伝子性育種材料の分子マーカーのパターンを分析した。遺伝子Ｒｚ２と非機能レモリン遺伝子含有予測座位との組換えを有する５つの遺伝型は自家受粉した。表現型の抵抗性データを子孫植物２０体から収集した。分散分析を実施してマーカーを決定した。マーカーｓ３ｅ５７９８ｓ０１（アレルＸ：Ａ、アレルＹ：Ｇ；プライマーアレルＸ（配列番号２４）、プライマーアレルＹ（配列番号２５））は、レモリン遺伝子の位置決めに関し、最高のエビデンスを示した。このマーカーの遺伝的位置は、遺伝マップの第３染色体上４０．９９５９８５０９ｃＭであった。基本のＳＮＰのリファレンス配列（ＳＢＫｖ７）上の物理的位置は、第３染色体上８，８８７，０００ｂｐであった。
【０２３６】
このように、このマーカーは抵抗性遺伝子ＲＺ２から、遺伝的にはわずか約０．７５ｃＭだけ離れたところに、物理的には約３８１ｋｂｐだけ離れたところにあり、たとえば第３染色体上の遺伝的位置４１．７４７１１３２ｃＭ（物理的位置：９，２６８，７０４ｂｐ）のマーカーｓ３ｅ５８５３ｓ０１（配列番号２６）により検出可能である。
【０２３７】
この領域のリファレンス配列の分析によると、マーカーｓ３ｅ５７９８ｓ０１（配列番号２４および２５）は注釈付き遺伝子モデル（ｇ２３２３８．ｔ１）にあり、この遺伝子はレモリンドメインを含有する（Ｃ末端領域）。
【０２３８】
さらに、関心対象の領域についてさらに解明するために、遺伝ファインマッピングを実施した。具体的には、Ｒｚ２（ＢＮＹＶＶ抵抗性）とレモリンとの異なるアレル組み合わせを示す組換え体を探した（非機能的アレルの存在−イエス（Ａ）／ノー（Ｂ）；図８）。このために、２７３０個体の区分される植物集団をマーカーにより分析した。遺伝子Ｒｚ２と特定されたレモリン遺伝子との間には、そのような組換え体を確実に特定するだけの十分な遺伝マーカーがある；図８を参照されたい。次に抵抗性試験で、これらの組換え体を追試した。後代の試験で、Ｈ位置（＝非機能的アレルのヘテロ接合）の遺伝型は１：２：１（Ａ：Ｈ：Ｂ）に分かれた。抵抗性試験でＡおよびＢの子孫をコントラストとして試験した。
【０２３９】
実施例２：レモリン遺伝子の機能検証
いくつかのバリアントの機能分析トランジェントアッセイを、好ましくは葉組織で実施する。これらは試験コンストラクトの一過性遺伝子発現（たとえばプラスミドであって、被験遺伝子は植物において活性なプロモーターの発現制御下にある）、およびその後の抵抗性反応誘発の代理としての高感受性応答（細胞死反応）の測定に基づく。試験コンストラクトの植物組織への移入は、たとえば、微粒子銃またはアグロバクテリウム浸潤による局所形質転換を用いる。細胞死反応は、視覚的に測定する（細胞崩壊、黄化、ＵＶ光下の蛍光）場合もあるし、同時形質転換レポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ）のレポーター遺伝子活性の測定による場合もある。レポーター遺伝子活性の低下は、細胞死活性の増加と相関がある。
【０２４０】
アッセイ１：Ｒｚ２の抵抗性アレルを含む２つの遺伝型におけるＴＧＢ１遺伝子発現後の細胞死反応の比較（図４）
試験した遺伝型は両方ともＲｚ２の抵抗性アレルを含有する。遺伝型１はレモリンの機能的アレルを含有し、遺伝型２はレモリンの非機能的アレルを含有する。ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）のＴＧＢ１遺伝子（配列番号４１、４２）またはたとえばビート土壌伝染性モザイクウイルス由来の相同ＴＧＢ１遺伝子（配列番号４３；WetzelおよびVarrelmann (2018)）をこの２つの遺伝型に移入した後、遺伝型１では細胞死反応が測定できる。遺伝型２では、対応する細胞死反応が生じないか、その発現は遺伝型１と比べて大幅に少ない。
【０２４１】
この試験は、Ｒｚ２およびレモリンの機能的アレルまたはアレル組み合わせの新たな遺伝型の選別に用いることもできる。それはＲｚ２に媒介されるＢＮＹＶＶ抵抗性を妨害するほかの遺伝子を有する遺伝型の選別にも、潜在的に好適である。
【０２４２】
アッセイ２：Ｒｚ２の抵抗性アレルを含む遺伝型におけるＴＧＢ１遺伝子およびレモリン遺伝子発現後の細胞死反応の比較（図５）
Ｒｚ２の抵抗性アレルおよびレモリンの機能的アレルを含む遺伝型をアッセイに用いる。この遺伝型で、ＴＧＢ１をレモリンの非機能的アレルと組み合わせて一過的に発現させる。比較のため、空ベクター対照と組み合わせたＴＧＢ１の一過性発現、またはレモリンの機能的アレルと組み合わせたＴＧＢ１の一過性発現を実施する。後者の２つの組み合わせでは、細胞死誘発が測定できる。それと比べて、ＴＧＢ１と非機能レモリンアレルとの組み合わせは、細胞死誘発の程度が少ないか、まったく存在しない。
【０２４３】
これらの結果は、非機能レモリンアレルがレモリンの機能的アレルよりも優性であることを示す。優性とは、ヘテロ接合状態（１組の染色体に非機能的アレルがあり、もう１組の染色体に機能レモリンアレルがある）であっても、それが完全な効果を顕現すること、すなわちいかなる場合も非機能的アレルが抵抗性の発生を阻害するか防止することを意味する。裏返せば、これは、機能レモリン遺伝子がホモ接合の場合にかぎり、Ｒｚ２が抵抗性を発生させることができることを意味する。
【０２４４】
アッセイ３：レモリンおよびＲｚ２のアレルと組み合わせたＴＧＢ１遺伝子発現後の細胞死反応の比較（図６）
ＴＧＢ１、Ｒｚ２、およびレモリンの機能または非機能的アレルの一過性発現は、Ｒｚ２をもたない遺伝型で、またはニコチアナ種などの代替試験系で行うことができる。機能レモリンを用いると、非機能レモリンの使用と比べて高い細胞死率が測定できる。
【０２４５】
この試験の変形を用いて、レモリンまたはＲｚ２のアレルのバリエーションと遺伝型を比較することもできる。検査対象のそれぞれの遺伝子を含む試験コンストラクトは一過性発現させず、その他の構成要素だけ一過性発現させる。細胞死反応の発現を、変数アレルの機能性の尺度として用いることができる。
【０２４６】
実施例３：ニコチアナ・ベンタミアナにおけるＲｚ２にコードされるポリペプチドとＴＧＢ１にコードされるポリペプチドとの相互作用の証明
Ｒｚ２のポリペプチドとＴＧＢ１のウイルスポリペプチドとの相互作用を証明するために、浸潤アプローチを選んだ。植物１個体につき葉を２枚浸潤させた。
【０２４７】
材料
１）コンストラクト
以下のコンストラクトを準備した：
【表６】
2022500039.tif 000007
【０２４８】
２）植物材料
植物材料として、発芽から４〜５週齢のニコチアナ・ベンタミアナの植物体を準備した。
【０２４９】
３）浸潤培地
以下のステップにより、１００ｍｌの浸潤培地を準備した：１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液を０．５Ｍ  ＭＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ５．６と、ならびに０．０５Ｍ  アセトシリンゴンと混合し、その後滅菌水を添加して最終体積１００ｍｌとなるよう調節した。
【０２５０】
方法ステップ
−上記リストのコンストラクトを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの培養物をいくつか準備した。それぞれ体積３ｍｌのＬＢ培地で培養した。上記のコンストラクトにコードされる抵抗性に応じて、リファンピシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、およびカナマイシンからなる群より選択される抗生物質を添加した。２８℃で一晩、１８０ｒｐｍのシェーカー上でインキュベーションを行った。
【０２５１】
−１８時間後、各培養物のＯＤ６００値を決定した。各液体培養物を室温で１５分、２５００ｇで遠心機にかけた。抗生物質なしでＬＢ培地にペレットを再懸濁させた。体積を、浸潤に望ましいＯＤ値：１となるよう調節した。
【０２５２】
−再懸濁後、培養物を、２８℃で１時間、１８０ｒｐｍのシェーカー上で再びインキュベートした。その後、培養物を上述したように遠心機にかけ、ペレットを浸潤培地に再懸濁した（この培地の組成は上述した）。Ｒｚ−２＿Ｃ４８＋空ベクター；Ｒｚ−２＿Ｃ４８＋ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１；空ベクター＋ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１の各組み合わせにつき、浸潤に望ましいＯＤ値：１：１となるよう体積を調節した。
【０２５３】
−微生物懸濁液を室温で２時間寝かせた。次に、これらの異なる微生物懸濁液を浸潤に適した関係：１：１で混合した。浸潤は、１ｍｌのインスリン注射器で葉の裏側に実施した。浸潤葉だけでなく浸潤部位にもタグを付けた。
【０２５４】
−浸潤後、植物を一晩室温で暗所に置いた。その後、浸潤植物を温度調節棚（climate cabinet）でのインキュベーションに供した。各日２２℃で１６時間光をあて、１９℃で８時間暗所に置いた。
【０２５５】
結果
結果を図９に示す。Ｒｚ２＿Ｃ４８＋空ベクターの組み合わせおよびＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１＋空ベクターの組み合わせは、浸潤部分の退色に至らないが、Ｒｚ２＿Ｃ４８＋ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１の組み合わせは、壊死により浸潤部分の退色に至る。壊死は、抵抗性反応が誘発されたことで、植物の防御機構が活性化したことを示す。
【０２５６】
実施例４：テンサイにおけるＲｚ２にコードされるポリペプチドとＴＧＢ１にコードされるポリペプチドとの相互作用の証明
テンサイ品種Ｄａｎｉｃｉａの葉片を、微粒子銃により、異なるコンストラクトの組み合わせで一過性形質転換させた。その後、タンパク質抽出物においてレポータータンパク質ルシフェラーゼの活性を決定した。Ｒｚ２＿Ｃ４８とＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１との組み合わせが、細胞死、およびルシフェラーゼレポータータンパク質の活性低下を伴う免疫応答を誘発することを示すことができた。Ｒｚ２＿Ｃ４８だけの形質転換、またはＢＮＹＶＶ−ＴＧＢ１だけの形質転換は、そのような反応を示さず、そうした単一構成要素では免疫応答を誘発するのに十分でない、と解釈される。ところがこれら両因子の組み合わせは相互作用を可能にし、抵抗性反応が開始する。結果を図１０に示す。
【０２５７】
実施例５：ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１とｇ２３２３８＿レモリンとのタンパク質相互作用の証明
二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）のプラスミドを準備した。これらのプラスミドは、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質の分断片とのタンパク質の融合をコードした。本発明者らは、ニコチアナ・ベンタミアナにおいて、レモリンの機能バリアントをコードするアレルを含むコンストラクトと組み合わせたＢＮＹＶＶ−ＴＧＢ１コンストラクトの共発現後、蛍光シグナルを観測することができた。この蛍光シグナルは、２つの個々のコンストラクトのどちらの発現後も観測されなかった。結果のデータは、レモリンの機能バリアントとウイルスタンパク質ＴＧＢ１との化学的相互作用を証明するものである。
【０２５８】
この実験は、ｇ２３２３８＿レモリンと、Ｒｚ２＿Ｃ４８抵抗性を活性化するウイルスタンパク質ＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１とのタンパク質間相互作用を示す。この結果は、ｇ２３２３８＿レモリンがＲｚ２＿Ｃ４８によるＢＮＹＶＶ＿ＴＧＢ１検出に関与することを裏付けるデータである。
【図１−１】
2022500039.tif 000008
【図１−２】
2022500039.tif 000009
【図２−１】
2022500039.tif 000010
【図２−２】
2022500039.tif 000011
【図２−３】
2022500039.tif 000012
【図３】
2022500039.tif 000013
【図４】
2022500039.tif 000014
【図５】
2022500039.tif 000015
【図６】
2022500039.tif 000016
【図７】
2022500039.tif 000017
【図８】
2022500039.tif 000018
【図９】
2022500039.tif 000019
【図１０】
2022500039.tif 000020
【配列表】
2022500039000001.app
【国際調査報告】
2022500039.tif 000021
2022500039.tif 000022
2022500039.tif 000023