(57)【要約】本開示は、ブタ−ヒトハイブリッド胸腺組織を作製すること、及び異種移植における寛容を誘導するために該ハイブリッド胸腺組織を使用することに関する。該ハイブリッド胸腺組織は、レシピエントにおいて免疫適格性を回復又は誘導し、かつレシピエントにおいて成熟機能性Ｔ細胞にＴ細胞前駆細胞を発達させる胸腺依存性を回復又は促進するために使用することもできる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞及び第２の哺乳動物種からの胸腺組織を含む単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項２】
前記第２種がブタである、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項３】
前記ブタがミニブタである、請求項２に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項４】
前記第１種が霊長類又はヒトである、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項５】
前記第２の哺乳動物種からの胸腺組織が胎児胸腺組織又は新生児胸腺組織である、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項６】
前記胸腺上皮細胞が、第１の哺乳動物種胸腺から得られる、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項７】
前記胸腺上皮細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞から作製される、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項８】
前記胸腺上皮細胞が、ＨＬＡ対立遺伝子を第１の哺乳動物種と共有する胚性幹細胞から作製される、請求項７に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項９】
前記胚性幹細胞が、ＨＬＡ対立遺伝子を前記第１の哺乳動物種と共有するように遺伝子操作される、請求項７に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項１０】
前記ハイブリッド胸腺組織が、前記第１種からの胸腺上皮細胞を前記第２種からの前記胸腺組織に導入することによって作製される、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項１１】
前記ハイブリッド胸腺組織が、前記第１種からの胸腺上皮細胞を前記第２種からの胸腺組織へ注入することによって作製される、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項１２】
前記ハイブリッド胸腺組織が、以下の工程：
（ｉ）前記第２種からの胸腺組織を２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で処理する工程；及び
（ｉｉ）前記第１種からの胸腺上皮細胞を前記２ＤＧ処理した胸腺組織に導入する工程
を含む方法によって作製される、請求項１に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）において、前記胸腺上皮細胞が、前記２−ＤＧ処理した胸腺組織に注入される前にマトリゲルに懸濁される、請求項１２に記載の単離したハイブリッド胸腺組織。
【請求項１４】
ハイブリッド胸腺組織を作製するための方法であって、
（ｉ）２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で第２の哺乳動物種からの胸腺組織を処理する工程；及び
（ｉｉ）第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞を前記２ＤＧ処理した胸腺組織に導入する工程
を含む方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）において、前記胸腺上皮細胞が、２−ＤＧ処理した胸腺組織に注入される前にマトリゲルに懸濁される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２種がブタである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ブタがミニブタである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１種が霊長類又はヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記胸腺組織が、胎児胸腺組織又は新生児胸腺組織である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記胸腺上皮細胞が、前記第１の哺乳動物種の胸腺から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記胸腺上皮細胞が、前記第１の哺乳動物種の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は前記第１の哺乳動物種の胚性幹細胞から作製される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記胸腺上皮細胞が、前記第１の哺乳動物種とＨＬＡ対立遺伝子を共有する胚性幹細胞から作製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚性幹細胞が、前記第１の哺乳動物種とＨＬＡ対立遺伝子を共有するように遺伝子操作される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ハイブリッド胸腺組織が、前記第１種からの胸腺上皮細胞を前記第２種からの胸腺組織に導入することによって作製される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ハイブリッド胸腺組織が、前記第１種からの胸腺上皮細胞を、前記第２種からの胸腺組織に注入することによって作製される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
第１種のレシピエント哺乳動物において第２種のドナー哺乳動物から得られる移植片に対する寛容を誘導する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のハイブリッド胸腺組織を前記レシピエント哺乳動物に導入する工程；及び
（ｂ）前記レシピエント哺乳動物において前記ドナー哺乳動物からの移植片を移植する工程
を含む方法。
【請求項２７】
第１種のレシピエント哺乳動物において免疫適格性を回復又は誘導する方法であって、請求項１に記載のハイブリッド胸腺組織を前記レシピエント哺乳動物に導入する工程を含む方法。
【請求項２８】
第１種のレシピエント哺乳動物において成熟機能性Ｔ細胞にＴ細胞前駆細胞を発達させる胸腺依存性を回復又は促進する方法であって、請求項１に記載のハイブリッド胸腺組織を前記レシピエント哺乳動物に導入することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
他の出願への相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年９月２０日出願の米国特許出願第６２／７３４，０１９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の利益に関する声明
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられたＡＩ０８４９０３、ＡＩ０４５８９７、及びＡＩ１０６６９７の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本開示は、ブタ−ヒトハイブリッド胸腺を作製すること、及び異種移植における寛容を誘導するためにそのハイブリッド胸腺を使用することに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
同種ドナーの深刻な不足は、現在行われている臓器移植の数を制限している。この供給−需要の相違は、他の種からの臓器（異種移植片）の使用によって修正され得る。非ヒト霊長類の使用に関連付けられる倫理的問題及び非実用性を考慮して、ブタはヒトに最も適切なドナー種であると考えられる。臓器の大きさ及びヒトとの生理学的類似性に加えて、ブタを迅速に育て、同系繁殖させる能力は、ヒトへの移植ドナーとして機能する能力を向上させることができる遺伝子改変に特に適している（Ｓａｃｈｓ，Ｐａｔｈ．Ｂｉｏｌ．４２：２１７−２１９，１９９４；Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，４補遺．６：４３−５０，２００４）。
【０００５】
最近の進歩にもかかわらず、異種移植片に対する免疫応答は強力であり、それらの臨床的使用を制限している。非特異的免疫抑制療法と組み合わせた移植は、高い初期移植片寛容と関連付けられるが、臨床臓器移植の成功に対する主な制限は、大部分が移植の慢性拒絶反応による後期移植片喪失であった。さらに、免疫抑制療法は、有害な副作用をもたらすか、又は感染の危険性を増加させる場合が多い。このように、異種移植片に対する免疫応答を制御する方法は、それらの適用性を大幅に改善する。
【０００６】
Ｇａｌ遺伝子を欠く遺伝子操作されたブタは、抗Ｇａｌα１−３Ｇａｌ（Ｇａｌ）天然抗体による非ヒト霊長類における共通拒絶を回避する。Ｃｏｏｐｅｒ Ｄ．異種間の臓器移植の簡単な歴史（Ａ ｂｒｉｅｆ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．Ｐｒｏｃ（Ｂａｙｌ Ｕｎｉｖ Ｍｅｄ Ｃｅｎｔ）．２０１２  Ｊａｎ；２５（１）：４９−５７。この進歩にもかかわらず、Ｔ細胞依存性抗体は、拒絶を引き起こす他のブタ特異性を認識することができる。Ｙａｎｇ ＹＧ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ.  異種移植：現在の状態及び将来の展望（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ）  Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｊｕｌ；７（７）：５１９−３１。Ｔ細胞抑制延長ブタ異種移植片は非ヒト霊長類において生存するが、そのような処置は非常に毒性がある。Ｙａｍａｄａ Ｋ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ，Ｓａｃｈｓ ＤＨ．  異種移植における寛容（Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１７ Ｄｅｃ；２２（６）：５２２−５２８。
【０００７】
Ｔ細胞抑制に対する別の手法は寛容誘導である。異種移植片寛容手法には、混合キメラ誘導及びブタ胸腺移植が含まれる。
【０００８】
混合キメラは、レシピエント中のＴ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のレベルでドナーに対する寛容を誘導することができる。Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ Ａ．，Ｙａｍａｄａ Ｋ．及びＳｙｋｅｓ Ｍ．，異種移植片：免疫学的障害物及び寛容に向けての進歩（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｈｕｒｄｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ） Ｒｅｖ．２０１４；２５８（１）：２４１−２５８．Ｓａｃｈｓ  Ｄ．Ｈ．，Ｋａｗａｉ  Ｔ．及びＳｙｋｅｓ Ｍ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２０１４；４：ａ０１５５２９。
【０００９】
胸腺異種移植はまた、堅牢な寛容を誘導することができる。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ Ｈ，Ｏｎｏｅ Ｔ，Ｄａｈｍａｎｉ Ａ，Ｌｉ ＨＷ，Ｈｏｌｚｌ Ｍ，Ｙａｍａｄａ Ｋ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．ブタ胸腺異種移植片中で発達するヒトＴ細胞の異種移植片寛容及び免疫機能（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｉｎ Ｐｉｇ Ｔｈｙｍｕｓ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）  Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４  Ａｐｒ  １；１９２（７）：３４４２−５０。ブタ胸腺移植片は、インビトロでドナーブタに特異的に応答しないマウスにおいて多様かつ機能的なヒトＴ細胞レパートリーを生成することができる。Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｉ，Ｆｕｄａｂａ  Ｙ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ａ，Ｙａｎｇ  Ｙ，及びＳｙｋｅｓ  Ｍ．ブタとヒトの異種胸腺移植片中で生成されるヒトＴ細胞レパートリーの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｉｎ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｕｓ  ｇｒａｆｔｓ）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００８  Ａｕｇ  ２７；８６（４）：６０１−６１０．Ｎｉｋｏｌｉｃ Ｂ．，Ｊ．Ｐ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｔ．Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｊ．Ｓ．Ａｒｎ，Ｄ．Ｈ．Ｓａｃｈｓ，Ｍ．Ｓｙｋｅｓ。ブタ胸腺移植片における正常な発達及びブタドナーＭＨＣに対するヒトＴ細胞の特異的寛容（Ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｏｎｏｒ ＭＨＣ）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ  １５；１６２：３４０２−３４０７。Ｈａｂｉｒｏ  Ｋ，Ｓｙｋｅｓ  Ｍ，Ｙａｎg ＹＧ  ヒト免疫系が確立されたマウスにおける胸腺移植を介したブタ異種抗原に対するヒトＴ細胞寛容の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｉｇ  ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｖｉａ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）  Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００９  Ｊｕｎ；９（６）：１３２４−９。ブタからヒヒモデルへのこの手法の拡張は、非ヒト霊長類におけるブタ腎臓異種移植片生存の持続を達成した。Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｙａｚａｗａ  Ｋ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ａ，Ｉｗａｎａｇａ  Ｔ，Ｈｉｓａｓｈｉ  Ｙ，Ｎｕｈｎ  Ｍ，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ  Ｐ，Ｎｏｂｏｒｉ  Ｓ，Ｖａｇｅｆｉ  ＰＡ，Ｐａｔｉｅｎｃｅ  Ｃ，Ｆｉｓｈｍａｎ  Ｊ，Ｃｏｏｐｅｒ  ＤＫ，Ｈａｗｌｅｙ  ＲＪ，Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ＨＪ，Ａｗｗａｄ Ｍ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ，Ｓａｃｈｓ ＤＨ  α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウトドナー及び血管付き胸腺組織の共移植の使用によるヒヒにおけるブタ腎異種移植片生存の顕著な延長（Ｍａｒｋｅｄ  ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｎａｌ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｂａｂｏｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌｐｈａ１，３−ｇ���ｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｄｏｎｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ｔｈｙｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００５ Ｊａｎ；１１（１）：３２−４。
【００１０】
しかしながら、残りの制限には、効率的に外来抗原を認識することができない最適以下のレシピエントの免疫機能；最適以下の生存、ホメオスタシス及び自己反応性Ｔ細胞の非効率的な除去；並びに自己免疫を防止するための調節性Ｔ細胞の正の選択の欠如が含まれる。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、第２種のドナー哺乳動物から得られる移植片に対する寛容を第１種のレシピエント哺乳動物において誘導する方法であって、
（ａ）第２種からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入する工程；及び
（ｂ）レシピエント哺乳動物にドナー哺乳動物からの移植片を移植する工程
を含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いくつかの実施形態では、胸腺機能は、工程（ａ）を実行する前にレシピエント哺乳動物に本質的に存在しない。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物は霊長類であり、いくつかの実施形態では、それはヒトである。いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物はブタであり、いくつかの実施形態では、それはミニブタである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物からの胸腺組織は胎児胸腺組織である。いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物からの胸腺組織は新生児胸腺組織である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の胸腺から得られる。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物種由来の胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有する胚性幹細胞から生成される。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有するように遺伝子操作される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、工程（ａ）においてレシピエント哺乳動物に移植される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）は、工程（ｂ）の前又はそれと同時に実施される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、レシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞をドナー哺乳動物からの胸腺組織に導入することによって生成される。いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、第１種のレシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞を第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織に注入することによって生成される。いくつかの実施形態では、本方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をレシピエント哺乳動物に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、移植片は、細胞、組織又は臓器を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、以下の工程：
（ｉ）第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織を２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で処理する工程；及び
（ｉｉ）第１種のレシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞を２ＤＧ処理された胸腺組織に導入する工程
を含む方法によって生成される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１種からの胸腺上皮細胞は、２ＤＧ処理された胸腺組織に注入される前にマトリゲルに懸濁される。
【００１９】
本開示はまた、第１種のレシピエント哺乳動物において免疫適格性を回復又は誘導する方法であって、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織を第１種のレシピエント哺乳動物に導入する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本開示はまた、第１種のレシピエント哺乳動物において成熟機能性Ｔ細胞に発達させるＴ細胞前駆細胞の胸腺依存性を回復又は促進する方法であって、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織を第１種のレシピエント哺乳動物に導入することを含む。
【００２１】
これらの方法のいくつかの実施形態では、胸腺機能は、導入工程の前にレシピエント哺乳動物に本質的に存在しない。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物は、導入工程の前に胸腺摘出手術をされる。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物は免疫障害を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物はブタであり、いくつかの実施形態では、ブタはミニブタである。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物は霊長類である。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物はヒトである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物からの胸腺組織は胎児胸腺組織である。いくつかの実施形態では、ドナー哺乳動物からの胸腺組織は新生児胸腺組織である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の胸腺から得られる。いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有する胚性幹細胞から生成される。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有するように遺伝子操作される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織はレシピエント哺乳動物に移植される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、第１種からの胸腺上皮細胞を第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織に導入することによって生成される。いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織に第１種からの胸腺上皮細胞を注入することによって生成される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド胸腺組織は、以下の工程：
（ｉ）第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織を２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で処理する工程；及び
（ｉｉ）第１種からの胸腺上皮細胞を２ＤＧ処理された胸腺組織に導入する工程
を含む方法によって生成される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、第１種由来の胸腺上皮細胞は、２ＤＧ処理された胸腺組織に注入される前にマトリゲルに懸濁される。
【００２９】
本開示はまた、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞及び第２の哺乳動物種からの胸腺組織を含む単離されたハイブリッド胸腺組織、並びにハイブリッド胸腺組織を作製する方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、第２の哺乳動物種はブタであり、いくつかの実施形態では、ブタはミニブタである。いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物種は霊長類である。いくつかの実施形態では、レシピエント哺乳動物はヒトである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第２の哺乳動物種からの胸腺組織は胎児胸腺組織である。いくつかの実施形態では、第２の哺乳動物種からの胸腺組織は新生児胸腺組織である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、第１の哺乳動物種からの胸腺から得られる。いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞は、胎児胸腺組織から得られる。いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞は新生児胸腺組織から得られる。いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、第１の哺乳動物種からの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。いくつかの実施形態では、胸腺上皮細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子を第１の哺乳動物種と共有する胚性幹細胞から生成される。いくつかの実施形態では、胚性幹細胞は、第１の哺乳動物種とＨＬＡ対立遺伝子を共有するように遺伝子操作される。
【００３３】
本開示はまた、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞及び第２の哺乳動物種からの胸腺組織を含む単離されたハイブリッド胸腺組織、並びにハイブリッド胸腺組織を作製する方法であって、
（ｉ）２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で第２の哺乳動物種からの胸腺組織を処理する工程；及び
（ｉｉ）第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞を２ＤＧ処理された胸腺組織に導入する工程
を含む方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞は、２ＤＧ処理された胸腺組織に注入される前にマトリゲルに懸濁される。
【００３５】
本発明を説明するために、本発明のある実施形態を図面に示す。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒト／ブタのハイブリッド胸腺の作製。移植後１２〜２０週の時点で、ハイブリッドブタ／ヒト胸腺及びヒトＣＤ３４＋細胞を用いて作製したヒト化マウスを安楽死させ、移植された胸腺を摘出し、切片化し、染色して、２光子共焦点顕微鏡法を用いてヒトＴＥＣを検出した。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、注入していない（図１Ａ）、ヒト胎児胸腺間質細胞（妊娠２０週齢）を注入した（図１Ｂ）、及び小児ヒト胸腺間質細胞（４ヶ月齢の胸腺由来）を注入した（図１Ｃ）移植ブタ胸腺の画像を示す。ＢとＣの矢印は、ブタ胸腺内のヒトＴＥＣを表すＣＫ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を指す。図１Ａ〜図１Ｃに示す切片全体の定量分析を図１Ｄに示す。ヒト胎児及び小児の胸腺及びブタ胸腺の追加対照も定量分析に含めた。分析は、胸腺切片全体における全てのＣＫ１４＋細胞内のＣＫ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の局在化の計算を可能にするｌｍａｒｉｓＣｏｌｏｃソフトウェアによって実施した。バーの頂部に示される番号は、ＣＫ１４＋細胞の中のＣＫ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の割合である。図１Ｅ及び１Ｆは、１７歳の小児胸腺をリベラーゼで消化した後、ｈｕＣＤ４５枯渇ヒト胸腺細胞から３−Ｄマトリゲル培養系で３週間培養し、増殖させたヒト胸腺間葉系細胞（ＴＭＣ）（図１Ｅ）及びＴＥＣ（図１Ｆ）の代表的な画像を示す。図１Ｇ及び１Ｈは、それぞれ、増殖させたＴＭＣ及びＴＥＣの代表的なフローサイトメトリー特性を示す。ＣＤ１０５−ＣＤ３２６＋はＴＥＣと考えられるが、ＣＤ１０５＋ＣＤ３２６−細胞はＴＭＣであると考えられる。
【図２】ＣＫ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を、ヒト胸腺間質細胞（胎児胸腺由来）（ＴＥＣ）をブタ胸腺に注入することによって生成されたハイブリッド胸腺において検出した。図２Ａ：ヒトＴＥＣ注射なし。図２Ｂ：ヒトＴＥＣ注入。図２Ｃ：２−ＤＧ処理したブタ胸腺＋ヒト胎児ＴＥＣ注入。
【図３】図３は、ハイブリッド胸腺を生成する際に使用するための方法の開発を示す結果。図３Ａは、ブタ胎児胸腺フラグメントへの細胞の注入後に放出された細胞の数を示すフローサイトメトリーの結果を示す。ＰＢＭＣ細胞をマトリゲルに再懸濁して、注射後にブタ胸腺から漏出しないようにした。解凍したブタ胎児胸腺フラグメントに細胞を注射するために、３つの異なる方法を使用した。方法Ａ：小片をＶ底９６ウェルプレートのウェル内に置き、ハミルトン注射器を使用する注入。方法Ｂ：ＰＥ５０管を用いる注入。方法Ｃ：マトリゲルが凝固するまで、鉗子で小片をウェルの外側に保持しながらハミルトン注射器を使用する注入。放出された細胞の数をフローサイトメトリーによって決定し、注入し、ＣＦＳＥ染色されたＰＢＭＣを追跡した。図３Ｂ及び３Ｃは、ブタ胸腺フラグメント中の胸腺細胞をエクソビボで激減させるための種々の試薬の結果を示す。図３Ｂは、各試薬で処理した細胞に対する総生細胞数（頂部パネル）と、各試薬について処理した細胞についての生細胞の割合（底部パネル）のグラフである。図３Ｃは、残存する二重陽性のＣＤ４とＣＤ８の生細胞（ＤＰ）又は読み出し情報として使用される間質細胞を含有する二重陰性（ＤＮ）細胞上の単一陽性（ＳＰ）ＣＤ４（ＳＰ−ＣＤ４）又はＳＰ−ＣＤ８細胞の比率のグラフである。１００ｎＭの２ＤＧで１２時間処理すると、最も低い比率になるので、間質細胞を保存しながら胸腺細胞を除去するための最良の戦略であった。
【図４】図４は、ハイブリッド胸腺を調製し、ハイブリッド胸腺をレシピエントマウスに移植するための実験計画を示す。
【図５】図５は、２ＤＧで処理し、ヒト胸腺間質細胞を注入した胎児ブタ胸腺（グラフ上に円で表される）、２ＤＧで処理せず、ヒト胸腺間質細胞を注入した胎児ブタ胸腺（グラフ上に四角形で表される）、及び２ＤＧで処理し、ヒト胸腺間質細胞を注射しなかった胎児ブタ胸腺（グラフ上に三角形で表される）のいずれかのハイブリッド胸腺移植後のヒト免疫細胞再構成のレベルのグラフを示す。図５Ａは、白血球中のｈＣＤ４５＋の割合を示す。図５Ｂは、ｈＣＤ４５＋中のＣＤ３＋細胞の割合を示す。図５Ｃは、血液１μｌ当たりのｈＣＤ４５＋細胞数を示す。図５Ｄは、血液１μｌあたりのｈＣＤ３＋細胞数を示す。図５Ｅは、ｈＣＤ３＋中のＣＤ４＋細胞の割合を示す。図５Ｆは、血液１μｌあたりのｈＣＤ４＋細胞数を示す。図５Ｇは、ｈＣＤ４５＋中のＣＤ１９＋細胞の割合を示す。図５Ｈは、ｈＣＤ４５＋中のＣＤ１４＋細胞の割合を示す。図５Ｉは、血液１μｌあたりのｈＣＤ１９＋細胞数を示す。図５Ｊは、血液１μｌあたりのｈＣＤ１４＋細胞数を示す。図５Ｋは、ｈＣＤ３＋中の未処理細胞の割合を示す。図５Ｌは、ｈＣＤ３＋中のエフェクターメモリ細胞の割合を示す。
【図６】図６は、移植した胸腺内にある注射し、ブタＴＥＣと混合したヒトＴＥＣの検出の画像を示す。ヒト化マウスに移植した未注入ブタ胸腺を左に示し、ヒト化マウスに移植したハイブリッド胸腺は右上に示す。
【図７】図７は、ハイブリッド胸腺を有するマウスの末梢Ｔ細胞がヒトＴＥＣドナーに部分的に寛容であることを示唆するインビトロＴ細胞増殖結果のグラフを示す。図７Ａは、ブタ樹状細胞に対する種々の移植した胸腺を有するマウスのＴ細胞増殖応答を示す。図７Ｂは、ヒトブタ樹状細胞に対する種々の移植した胸腺を有するマウスのＴ細胞増殖応答を示す。ヒト胸腺間質細胞を注射していない胎児ブタ胸腺を円で表し、ヒト胸腺間質細胞を注射し、２ＤＧで処理しなかった胎児ブタ胸腺を四角形で表し、２−ＤＧで処理したヒト胸腺間質細胞を注入した胎児ブタ胸腺を三角形で表す。
【図８】図８は、ヒト胸腺（ＨＵ／ＨＵマウス）において発達するＴ細胞と比較して、ブタ胸腺（ＳＷ／ＨＵマウス）で発達するヒトＴ細胞の中のヒト組織特異的自己抗原（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＴＲＡ）（ＭＡＲＴ−１、ＮＹＥＳＯ１及び膵島抗原ＩＡ−２）に対する応答の増加を示す。図８Ａは、マウスモデルの概略図である。図８Ｂは、ヒトＨＳＣドナーＤＣによって提示されるヒトＴＲＡ（ＩＡ−２、ＭＡＲＴ−１及びＮＹＥＳＯ１）に対するマウスからのヒト末梢Ｔ細胞（移植後１８週）の増殖応答を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト胸腺（ＨＵ／ＨＵマウス）において発達するものと比較して、ブタ胸腺（ＳＷ／ＨＵマウス）で発達するヒトＴｒｅｇ及びＣＤ８  Ｔ細胞の生存がより低いことを示す。図９は、ＳＷ／ＨＵマウスと比較して、ＨＵ／ＨＵマウスにおける移植した胸腺細胞における種々の細胞、及びＳＷ／ＨＵマウスと比較したＨＵ／ＨＵマウスにおける脾臓／リンパ節における種々の細胞を示すグラフである。ＨＵ／ＨＵマウス番号は丸で示され、ＳＷ／ＨＵマウス番号は正方形として示されている。図９Ａは、移植した胸腺における胸腺細胞の総数を示す。図９Ｂは、移植した胸腺における胸腺細胞サブセットの割合を示す。図９Ｃは、移植した胸腺におけるＳＰ−ＣＤ４＋内のＴｒｅｇの割合を示す。図９Ｄは、移植した胸腺におけるＫｉ６７＋細胞の割合を示す。図９Ｅは、移植した胸腺におけるＣＤ４５ＲＯ＋細胞の割合を示す。図９Ｆは、移植した胸腺におけるＣＴＬＡ−４＋細胞の割合を示す。図９Ｇは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）における総細胞数を示す。図９Ｈは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるｈＣＤ４５＋細胞の割合を示す。図９Ｉは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるｈＣＤ４５＋内のＴ細胞の割合を示す。図９Ｊは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＴ細胞内のＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。図９Ｋは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＣＤ４＋内のＴｒｅｇの割合を示す。図９Ｌは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）における未処理細胞の割合を示す。図９Ｍは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＥＭ細胞の割合を示す。図９Ｎは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の割合を示す。図９Ｏは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＫｉ６７＋細胞の割合を示す。図９Ｐは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるｈＣＤ４５ＲＯ＋の割合を示す。図９Ｑは、マウスの各サブセット中の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）におけるＣＴＬＡ−４＋の割合を示す。
【図１０】図１０は、「ハイブリッド胸腺」におけるヒトＴＥＣの長期（２０週超）の持続性を示す。図１０Ａは、ヒトＴＥＣを注入していないものを含む移植したブタ胸腺（ＳＷ／ＴＨＹ、頂部左パネル）、ヒト胎児ＴＥＣを注入したブタ胸腺（ＳＷ／胎児ｈｕ−ＴＥＳ ＴＨＹ、頂部右パネル）、ヒト小児ＴＥＣを注入したブタ胸腺（ＳＷ／小児ｈｕ−ＴＥＣ ＴＨＹ、底部左パネル）、及びヒトｈＰＳＣを注入したブタ胸腺（ＳＷ／ｈＰＳＣ−ＴＥＣ ＴＨＹ、底部右パネル）の画像である。図１０Ｂは、注入していないＳＷ ＴＨＹ移植片（左上）ではなく、ｈＰＳＣ−ＴＥＣ前駆体（底部左パネル）を注入したヒト胸腺（頂部右）及びＳＷ移植片においてのみＥＰＣＡＭ＋、ＣＤ１０５陰性ｈｕ−ＴＥＣの存在を示す種々の長期胸腺移植片からの消化した間質中のゲーティングされたＣＤ４５陰性細胞の代表的なフローサイトメトリー染色である。図１０Ｃは、注入していないＳＷ胸腺に対する、ヒトＥＳ−ＴＥＣを注入したＳＷ胸腺を投与した複数のマウスからのＣＤ４５−ＨＬＡ−ＡＢＣ＋ＥｐＣＡＭ＋（注入したヒトＴＥＣ）の割合の定量のグラフである。
【図１１】図１１は、ブタ胸腺へのｈＥＳ−ＴＥＣの注入が、Ｔ細胞の発達の増強及び末梢のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を促進することを示す。１〜２×１０５のｈＥＳ−ＴＥＣを注入した（緑色バー）、又は注射していない（透明バー）ブタ胸腺を、２×１０５個のヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋細胞を静脈内注入した胸腺切除ＮＳＧマウスの腎カプセルの下に移植した。胸腺移植片からの脾細胞及び胸腺細胞を移植後１８〜２２週の時点で、フローサイトメトリーによって分析した。図１１Ａは、各群のマウスにおけるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の絶対数のグラフである。図１１Ｂは、各群のマウスにおけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数のグラフである。図１１Ｃは、各群のマウスにおけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数のグラフである。図１１Ｄは、各群のマウスにおける脾臓の単核細胞におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞として定義された最近の胸腺移出ＣＤ３１＋ＣＤ４＋未処理細胞の絶対数のグラフである。図１１Ｅは、ＨｕＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯの発現について染色されたマウスの各グループにおける胸腺細胞中の示された細胞の数のグラフである。胸腺細胞を、ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＣＤ１４−細胞としてゲーティングした。全ヒトＣＤ４５細胞、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋、単一陽性ＣＤ４＋ＣＤ８−及びＣＤ４−ＣＤ８＋としてゲーティングした胸腺移植片の半分からの胸腺細胞の絶対数が示されている。ＳＰ ＣＤ４及びＣＤ８細胞を、より成熟したＣＤ４５ＲＡ＋胸腺細胞と比較して未成熟ＣＤ４５ＲＯ＋にさらにサブゲーティングした。平均＋ＳＥＭを、２つの独立した実験を代表するｈＥＳ−ＴＥＣ（ｎ＝６、正方形）及びブタ胸腺単独（ｎ＝５、三角形）を注入したブタ胸腺について示す。６×１０５（ＳｗＴＨＹ及びＳｗＴＨＹ＋ＴＥＣからの各々ｎ＝１）細胞よりも少ない胸腺移植片を分析から除外した。マン・ホイットニー検定を用いて、ＳｗＴＨＹ  ｈＥＳ−ＴＥＣを注入したグループとＳｗＴＨＹのみを注入したグループを比較してｐ値を決定し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＋ｐ＝０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細説明
略語
ＳＷ−ブタ
ＨＵ−ヒト
ＴＥＣ−胸腺上皮細胞
ＴＭＣ−胸腺間葉細胞
ＷＢＣ−白血球
ＤＰ−二重陽性細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋の両方）
ＳＰ−単一陽性細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれか）
ｔｒｅｇ−調節性Ｔ細胞
ＬＮ−リンパ節
ＴＲＡ−組織特異的自己抗原
２ＤＧ−２Ｄグルコ−ス
ＭＡＣＳ−磁気活性化細胞選別
ＨＳＣ−ヒト造血細胞
【００３８】
本開示は、作製されたヒトＴ細胞レパートリーの最適な免疫機能を有するブタ抗原に対する免疫寛容を達成するために、ヒト／ブタハイブリッド胸腺を作製する方法を提供する。本方法は、ブタ胸腺におけるヒトＴ細胞の機能及び自己寛容を改善する一方で、ブタ異種移植片に対する寛容を発達させることによって、単一ブタ胸腺を使用する場合に遭遇する制限を克服する。
【００３９】
本方法は、患者特異的胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）を含むハイブリッドブタ−ヒト胸腺を作製する。患者特異的ＴＥＣは、患者の胸腺から直接得られるか、患者特異的誘導多能性幹細胞から作製されるか、又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子を患者と自然又は人工的に共有する胚性幹細胞から作製されるかのいずれかであり得る。患者特異的ＴＥＣは、正の選択に関与することができ、その結果、末梢におけるレシピエントＨＬＡ分子によって提示される外来抗原をより容易に認識するＴ細胞が得られる。さらに、多くの組織特異的抗原（ＴＳＡ）は、ヒトとブタの間で異なるので、胸腺でヒトＴＳＡを作るためにヒトＴＥＣを加えると、自己免疫からの保護を確実にする助けとなる。このように、ブタ胸腺の代わりにハイブリッド胸腺を使用すると、作製されたヒトＴ細胞レパートリーの機能及び自己寛容を改善し、異種移植片寛容の誘導を可能にし得る。
【００４０】
本発明のハイブリッド胸腺／胸腺組織（例えば、ハイブリッドブタ−ヒト胸腺／胸腺組織）はまた、適切な胸腺機能を欠くか、又はＴ細胞免疫不全（例えば、成人における老化胸腺）を有する患者における免疫再構成のために使用され得る。ハイブリッド胸腺／胸腺組織（例えば、ハイブリッドブタ−ヒト胸腺／胸腺組織）の適用は、薬理学及び薬物スクリーニング、医学的異種移植寛容試験及び調製、並びに移植又は免疫障害治療中に使用される免疫原性（例えば、ｍＡｂ）を引き起こすことができる治療分子に対する寛容誘導のための異種モデルを含む。
【００４１】
本明細書で使用する場合、ハイブリッド胸腺組織は、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織を指し、第１種のレシピエント哺乳動物からの胸腺上皮細胞を含む。
【００４２】
一実施形態では、ヒト（例えば、患者特異的）胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）を含むブタ胸腺／胸腺組織（例えば、胎児胸腺／胸腺組織）がヒトの胸腺／胸腺組織（例えば、患者の胸腺／胸腺組織）から得られるハイブリッド胸腺／胸腺組織が構築される。別の実施形態では、ヒト（例えば、患者特異的）ＴＥＣを含むブタ胸腺／胸腺組織（例えば、胎児胸腺／胸腺組織）が、ヒト（例えば、患者特異的）誘導多能性幹細胞から作製されたハイブリッド胸腺／胸腺組織が構築される。さらに別の実施形態では、ヒトＴＥＣを含むブタ胸腺／胸腺組織（例えば、胎児胸腺／胸腺組織）が、ＨＬＡ対立遺伝子を患者と自然に共有するか、又はそうするように操作された胚性幹細胞から作製されるハイブリッド胸腺／胸腺組織が構築される。
【００４３】
ブタ胸腺移植片へのヒトＴＥＣの包含は、抗原認識に対する機能的効果を有することができる。
【００４４】
本開示は、第１種のレシピエント哺乳動物において、第２種のドナー哺乳動物から得られた移植片に対する寛容を誘導する方法を提供する。本方法は、以下の工程：（ａ）第２種からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入する工程；及び（ｂ）レシピエント哺乳動物にドナー哺乳動物からの移植片を移植する工程、を含み得る。ドナーは、ミニブタを含むブタであってよい。レシピエントはヒトであってよい。
【００４５】
本開示はまた、作製された霊長類Ｔ細胞レパートリーの最適な免疫機能を有するブタ抗原に対する免疫寛容を達成するために、霊長類−ブタハイブリッド胸腺／胸腺組織を作製する方法を提供する。本開示の一実施形態は、ブタにおいてヒヒとのハイブリッド胸腺／胸腺組織を提供する。
【００４６】
ハイブリッド胸腺／胸腺組織は、主に血管付き胸腺ローブ又は複合胸腺−腎臓移植片として移植され得る。
【００４７】
ハイブリッド胸腺／胸腺組織は、レシピエントに筋肉内移植され得る。ハイブリッド胸腺／胸腺組織は、レシピエントにおける４頭筋のみに又は追加の移植部位（例えば、腎カプセル及び網）のいずれかに移植され得る。Ｗｕら，ブタからヒヒモデルにおける異種間胸腺移植（Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ Ｔｈｙｍｕｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ａ Ｐｉｇ−ｔｏ−ｂａｂｏｏｎ Ｍｏｄｅｌ），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００３，７５（３）：２８２−２９１。
【００４８】
異種移植のレシピエントは、第１の哺乳動物種の哺乳動物である。異種移植のドナーは、第２の哺乳動物種の哺乳動物を指す。ドナー哺乳動物は、異種移植のための細胞、組織、及び／又は臓器のドナーである。
【００４９】
本開示は、第１種のレシピエント哺乳動物において第２種のドナー哺乳動物から得られた移植片に対する寛容を誘導する方法であって、（ａ）第２種からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入する工程、及び（ｂ）レシピエント哺乳動物においてドナー哺乳動物からの移植片を移植する工程、を含む方法を提供する。工程（ａ）は、工程（ｂ）の前又はそれと同時に実施されてよい。
【００５０】
本開示はまた、第１種のレシピエント哺乳動物において免疫適格性を回復又は誘導する方法であって、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入する工程を含む方法を提供する。
【００５１】
第１種のレシピエント哺乳動物において成熟機能性Ｔ細胞に発達させるＴ細胞前駆細胞の胸腺依存性を回復又は促進する方法であって、第２種のドナー哺乳動物からの胸腺組織であり、第１種からの胸腺上皮細胞を含むハイブリッド胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入することを含む方法も、本開示に包含される。
【００５２】
一実施形態では、胸腺機能は、ハイブリッド胸腺組織が導入される前にレシピエント哺乳動物に本質的に存在しない。別の実施形態では、レシピエント哺乳動物は、ハイブリッド胸腺組織が導入される前に胸腺切除される。さらに別の実施形態では、レシピエント哺乳動物は免疫障害を有する。
【００５３】
第２種は、ミニブタなどのブタであり得る。
【００５４】
第１種は、非ヒト霊長類又はヒトなどの霊長類であり得る。
【００５５】
一実施形態では、レシピエント哺乳動物はヒトであり、ドナー哺乳動物はミニブタである。
【００５６】
第２種からの胸腺組織は、胎児胸腺組織、又は新生児胸腺組織であり得る。
【００５７】
第１種からの胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の胸腺から取得され得る。第１種からの胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から作製され得る。第１種からの胸腺上皮細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有する胚性幹細胞から作製され得る。例えば、胚性幹細胞は、レシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を自然に共有し得るか、又はレシピエント哺乳動物とＨＬＡ対立遺伝子を共有するように遺伝子操作される。
【００５８】
一実施形態では、ハイブリッド胸腺組織はレシピエント哺乳動物に移植される。例えば、ハイブリッド胸腺組織は、主に血管付き胸腺ローブ又は複合胸腺−腎臓移植片として移植され得る。
【００５９】
ハイブリッド胸腺組織は、第１種からの胸腺上皮細胞を第２種からの胸腺組織に導入することによって作製され得る。ハイブリッド胸腺組織は、第１種からの胸腺上皮細胞を第２種からの胸腺組織に注入することによって作製され得る。
【００６０】
ハイブリッド胸腺組織は、以下の工程：（ｉ）２−デオキシグルコース（２ＤＧ）で第２種からの胸腺組織を処理する工程；及び（ｉｉ）第１種からの胸腺上皮細胞を２ＤＧ処理した胸腺組織に導入する工程、を含む方法によって作製され得る。工程（ｉｉ）において、胸腺上皮細胞は、２ＤＧ処理された胸腺組織に注入される前に、マトリゲルなどの生体材料中に懸濁され得る。
【００６１】
胸腺上皮細胞は、第２種からの胸腺組織に注入される前に、生体材料（例えば、マトリゲル）に懸濁され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、第２種からの胸腺組織に導入される前に、第１種からの胸腺上皮細胞は、生物材料と組み合わされ得る（例えば、懸濁され得る）。生体材料は、ゾル−ゲル、タンパク質を含むヒドロゲル、マトリゲル、細胞で人工的に構築された足場、及びそれらの組み合わせであり得る。生体材料の非限定的な例には、ポリエチレン−イミン及びデキストラン硫酸塩、ポリ（ビニルシロキサン）コポリマーポリエチレンイミン、ホスホリルコリン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリヒドロキシ吉草酸及びコポリマー、ポリヒドロキシブチレート及びコポリマー、ポリジオキサノン、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリエステル、コラーゲン、ゼラチン、セルロースポリマー、キトサン、アルギン酸塩、フィブロネクチン、細胞外マトリックスタンパク質、ビンクリン、寒天、アガロース、ヒアルロン酸、マトリゲル及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００６３】
本方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をレシピエント哺乳動物に投与することをさらに含み得る。
【００６４】
移植片は、細胞、組織又は臓器を含み得る。一実施形態では、移植片は造血幹細胞を含む。別の実施形態では、移植片は骨髄を含む。さらに別の実施形態では、移植片は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、肺、腸、皮膚、小腸、気管、角膜、又はそれらの組み合わせを含む。
【００６５】
本開示は、第１の哺乳動物種からの胸腺上皮細胞及び第２の哺乳動物種からの胸腺組織を含む単離されたハイブリッド胸腺組織を提供する。
【００６６】
免疫適格性で、Ｔ細胞枯渇及び胸腺切除したレシピエントへのブタ胸腺の移植を含む、非常に異なる異種ドナーの中心的なＴ細胞寛容を達成するための別の手法が開発されてきた。これらの研究は、マウスで開始され、顕著で特異的なインビトロでの非応答性及びドナー特異的皮膚移植片生存の延長を実証した（Ｌｅｅ ＬＡ，Ｇｒｉｔｓｃｈ ＨＡ，Ｓｅｒｇｉｏ ＪＪら、不一致の異種移植障壁を越えた特異的寛容（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｃｒｏｓｓ ａ ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ）．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９４；９１：１０８６４−１０８６７．Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｓｗｅｎｓｏｎ  Ｋ，Ｓｅｒｇｉｏ  ＪＪ，Ａｒｎ ＪＳ，Ｓａｃｈｓ ＤＨ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ  不一致の異種障壁を越えた皮膚移植片寛容（Ｓｋｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｃｒｏｓｓ  ａ  ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｂａｒｒｉｅｒ）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９９６；２：１２１１−１２１６）。マウスモデルは、異種胸腺移植片におけるＴ細胞再構成によって付与された寛容及び免疫機能のメカニズムの広範な研究を可能にした。胸腺内クローンの欠失は、異種ドナー及びレシピエントに対する新たに開発された胸腺細胞を寛容化する主要なメカニズムである（Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｓｅｒｇｉｏ  ＪＪ，Ｓｗｅｎｓｏｎ  ＫＡ，Ａｒｎ  ＪＳ，Ｓａｃｈｓ  ＤＨ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．ブタ胸腺移植片におけるブタＭＨＣによる機能性マウスＣＤ４細胞の正の選択及び負の選択（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｏｒｃｉｎｅ ＭＨＣ ｉｎ ｐｉｇ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；１５９：２１００−２１０７．Ｚｈａｏ Ｙ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂａｒｂｏｓａ ＪＩ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ａ，Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｋ，Ｓａｃｈｓ ＤＨ，Ｓｙｋｅｓ  Ｍ．）。宿主反応性Ｔ細胞の効率的な胸腺内負の選択にもかかわらず、自己免疫疾患が、ブタ胸腺移植無胸腺症マウスにおいて発達し得る：自己免疫を抑制する調節メカニズムの失敗の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００２；７５：１８３２−１８４０）。追加研究は、残留マウス抗ブタ応答の抑制におけるブタ胸腺移植片中で発達するＴｒｅｇに関係していた。Ｚｈａｏら  胸腺切除マウスに新生児ブタ胸腺と移植することによる特定のブタ皮膚移植片寛容の誘導（Ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｉｇ  ｓｋｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｐｉｇ  ｔｈｙｍｕｓ  ｉｎ  ｔｈｙｍｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  ２０００；  ６９：１４４７−１４５１.  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂａｒｂｏｓａら  別の位置に新生児ブタ組織を移植することによるＣＤ４再構成の増強は、ドナー特異的寛容及び既存の異種反応性Ｔ細胞の抑制に関連している（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＤ４ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００１；７２：１２２３−１２３１。陽性及び負の選択マウスＭＨＣ対立遺伝子が以前に同定された異なるＭＨＣハプロタイプ及びＴＣＲのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックレシピエントマウスを用いると、ブタ胸腺移植片における正の選択が、マウス造血細胞からの寄与なく、ブタ胸腺ＭＨＣによって排他的に媒介されたが、負の選択はブタとマウスの両方のＭＨＣによって媒介され、ドナーブタ胸腺移植片中の両方の種からのクラスＩＩ ＭＨＣ＋ＡＰＣの存在と一致していることが実証された。Ｚｈａｏ Ｙ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂａｒｂｏｓａ ＪＩ，Ｚｈａｏ Ｇ，Ｓｈａｆｆｅｒ Ｊ，Ａｒｎ ＪＳ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．非常に異なる異種ブタＭＨＣによって正の選択されたトランスジェニックＴＣＲを有するマウスＴ細胞の成熟及び機能（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｃ ＴＣＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｐａｒａｔｅ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｐｏｒｃｉｎｅ ＭＨＣ） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００；４７：２１７−２２８。Ｚｈａｏ Ｙ，Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｋ，Ｓｅｒｇｉｏ ＪＪ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．  ブタＭＨＣは、ブタ胸腺移植片におけるマウスＭＨＣ制限ＴＣＲを有するマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の正の選択を媒介する（Ｐｉｇ ＭＨＣ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ａ ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＴＣＲ ｉｎ ｐｉｇ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８；１６１：１３２０−１３２６。正の選択におけるマウスＭＨＣ関与の欠如並びにブタ胸腺及びマウスレシピエントの完全なＭＨＣ相違にもかかわらず、これらのＴ細胞は、マウスＭＨＣ分子によって提示されるタンパク質抗原での免疫化に応答することができ、最も重要なことには、クリアランスがＣＤ４＋Ｔ細胞に依存している日和見病原体からマウスを保護することができた。ＺｈａｏらＴ細胞が枯渇した胸腺切除マウスにおける胎児ブタ胸腺移植片による免疫回復（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｅｔａｌ  ｐｉｇ  ｔｈｙｍｕｓ  ｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ，ｔｈｙｍｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｍｉｃｅ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５８：１６４１−１６４９。これらの結果は、多様なＴ細胞レパートリーが異種胸腺移植片において選択された場合に、レシピエントＭＨＣ上の外来抗原の認識のための十分な交差反応性が起こり得ることを実証するものとして解釈される。
【００６７】
寛容のためのブタ胸腺移植法は、ヒトＴ細胞が正常に発達することができ、ブタ胸腺移植片中のブタ異種抗原に集中的に寛容化されるという原理証明を提供するために、ヒト化マウスモデルに拡張されてきた。Ｎｉｋｏｌｉｃ  Ｂ，Ｇａｒｄｎｅｒ ＪＰ，Ｓｃａｄｄｅｎ ＤＴ，Ａｒｎ ＪＳ，Ｓａｃｈｓ ＤＨ，Ｓｙｋｅｓ Ｍ．  ブタ胸腺移植片における正常な発達及びブタドナーＭＨＣに対するヒトＴ細胞の特異的寛容（Ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｈｙｍｕｓ ｇｒａｆｔｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｏｎｏｒ ＭＨＣ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ.  １９９９；１６２：３４０２−３４０７．Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ＨＯ，Ｔ．；Ｄａｈｍａｎｉ，Ａ．；Ｌｉ，Ｈ．；Ｈｏｌｚｌ，Ｍ．；Ｙａｍａｄａ，Ｋ．；Ｓｙｋｅｓ，Ｍ．ブタ胸腺異種移植におけるヒトＴ細胞の異種移植片寛容及び免疫機能（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｉｎ  ｐｉｇ  ｔｈｙｍｕｓ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；１９２（７）：３４４２−３４５０。ブタ胸腺移植片で発達する胸腺と末梢の両方のヒトＴ細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における第３のグループのブタ及び同種ヒトに対する無傷の応答を有するドナーブタに対して特異的な非応答性を示す。これらのＴ細胞はまた、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）ドナー及びＭＬＲ中のマウスレシピエントに対して応答性を示さず、両方とも胸腺異種移植片において検出されるヒトドナーＡＰＣ及びマウスＡＰＣの負の選択への寄与を反映する。Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら ヒト免疫応答性の個別化されたインビボ分析のためのモデル（Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ） Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；４（１２５）：１２５ｒａ１３０。重要なことに、ブタ胸腺移植片中で発達するヒトＴ細胞についてドナー特異的な皮膚移植片寛容が観察される。
【００６８】
マウスモデルの結果に基づいて、胸腺異種移植手法は、大型動物のブタとヒヒの種の組合せにまで拡張されてきた。ヒヒの腎カプセルの下に配置したブタ胸腺フラグメントを使用する初期の研究により、対照と比較して、ある程度のＴ細胞回復、インビトロでのドナー特異的低応答性及びドナー皮膚移植片の生存延長が実証された。しかし、移植され、血管新生されたブタ胸腺組織の量は非常に制限されていた。Ｗｕら、ブタ−ヒヒモデルにおける異種胸腺移植（Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｉｇ−ｔｏ−ｂａｂｏｏｎ  ｍｏｄｅｌ）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００３；７５（３）：２８２−２９１。よりロバストな胸腺機能を達成するために、かつ上記のマウスデータからみて、ブタ胸腺中で発達するドナー特異的Ｔｒｅｇは、移植前処置によって激減しない既存のＴ細胞を抑制するために必要とされることが期待され、その後の研究は、同種ブタ腎臓移植モデルにおける寛容誘導に有効性が既に示されている主に血管付きブタ胸腺を利用した。Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ａ，Ｕｔｓｕｇｉ  Ｒ，ら  ミニブタでの胸腺移植。ＩＩ。胸腺切除レシピエントへの複合胸腺腎移植による寛容の誘導（Ｔｈｙｍｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｎａｔｕｒｅ  ｓｗｉｎｅ）  ＩＩ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｔｈｙｍｏｋｉｄｎｅｙｓ  ｔｏ  ｔｈｙｍｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：３０７９−３０８６。ブタの腎カプセル下に自己胸腺フラグメントを配置することにより、数ヶ月前にドナーブタ中で調製された複合型「胸腺腎」移植片の一部として、又はヒヒにおけるブタ胸腺ローブの直接的な血管吻合によって胸腺を移植した。Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｙａｚａｗａ  Ｋ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ａら。α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウトドナー及び血管新生胸腺組織の共移植の使用によるヒヒでのブタ腎異種移植片生存の顕著な延長（Ｍａｒｋｅｄ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｎａｌ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｌｐｈａ１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｄｏｎｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｔｈｙｍｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５；１１（１）：３２−３４。両方の手法は、初めて、ヒヒにおけるＧａｌＴノックアウトブタ腎臓の長期生存をもたらした。Ｔａｓａｋｉら，リツキシマブ治療はブタからヒヒの異種腎臓移植に続くタンパク質尿の早期発症を防止する（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｉｇ−ｔｏ−ｂａｂｏｏｎ ｘｅｎｏ−ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ．２０１４；２５（４）：７３７−７４４。この治療を受けている動物の生存は、抗ＣＤ４０Ｌの血栓性合併症によって、かつ最小変化の疾患様糸球体症のためにタンパク質尿によって制限されており、これは、それぞれ非血栓性抗ＣＤ４０の使用によって、かつリツキシマブとＣＴＬＡ  ４Ｉｇを投与することによって回避することができる。Ｙａｍａｄａら，異種移植：潜在的な腎臓レシピエントを有する我々はどこにいる？最近の進歩及び可能性のある将来の臨床試験（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： Ｗｈｅｒｅ Ａｒｅ Ｗｅ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｋｉｄｎｅｙ Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ？ Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ）  Ｃｕｒｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｐ．２０１７；４（２）：１０１−１０９。
【００６９】
ブタ胸腺腎移植片を移植されるヒヒは、ブタ胸腺移植片におけるデノボレシピエント（ヒヒ）胸腺リンパ球形成、Ｅｌｉｓｐｏｔ及びＭＬＲアッセイにおける末梢及びドナー特異的非応答性における最近の胸腺移出の出現、並びに非Ｇａｌ天然抗体の低下の証拠を示した。Ｔａｎａｂｅら  同種及び異種移植後の移植臓器の成長における内因性（移植片）対外因性（宿主）因子の役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ （Ｇｒａｆｔ） Ｖｅｒｓｕｓ Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ（Ｈｏｓｔ）Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ Ｏｒｇａｎｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ａｎｄ Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ），Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１７  Ｊｕｌ；１７（７）：１７７８−１７９０。後者はブタ腎臓による吸収を反映し得るが、最小のＩｇＭ結合がこれらの異種移植片で検出され、補体固定又は顕著な病理はなかった。そのため、このモデルで得られた結果は、霊長類における寛容を誘導するために複合胸腺腎異種移植片の可能性を実証する。
【００７０】
異種のブタ胸腺におけるヒトＴ細胞レパートリーの作製の制限は、移植片を保護するのに有用であるが、宿主に感染する微生物病原体に対する保護を最適化せず、従来のＴ細胞をあまり選択せず、ヒト組織特異的自己抗原（ＴＲＡ）を認識するＴｒｅｇを積極的に選択することに失敗するブタＭＨＣ上の微生物抗原の優先的認識を含む。実際、ヒト化マウスにおける研究では、ヒトＴ細胞がヒト胸腺移植片よりむしろブタで発達した場合に、免疫化に続いてヒトＡＰＣによって提示されるペプチドに対する応答の低下が示された。
【００７１】
この制限を克服するための手法は、胸腺切除標本から得られるか、又は幹細胞から作製されたレシピエント胸腺上皮細胞がブタ胸腺組織に注入される、「ハイブリッド胸腺」の作製を含む。生後胸腺ドナーからのハイブリッド胸腺が作製され、そのハイブリッド胸腺はヒトＴ細胞間でヒトＴＲＡに対する寛容を促進する。
【００７２】
ブタ胸腺移植片は、正常で多様なマウス又はヒトのＴ細胞レパートリーの発達を支持することが示されており、これらのＴ細胞は異種のブタドナーに特異的に寛容であることが示されている。しかし、周囲のレシピエントＨＬＡ分子によって提示される外来抗原の認識は、最適以下である。そのため、免疫機能は最適ではない可能性がある。本明細書に示されるように、これは、これらのＴＥＣが正の選択に関与するので、ブタ−ヒトハイブリッド胸腺移植片中にレシピエントＴＥＣを提供することによって克服することができ、その結果、末梢におけるレシピエントＨＬＡ分子によって提示される外来抗原をより容易に認識することができるＴ細胞が得られる。ブタ胸腺移植片の場合には、周囲にそれらの「正の選択」リガンドがないＴ細胞の生存、ホメオスタシス及び機能は、最適以下である。正の選択のリガンドは、胸腺細胞が複合体を認識する低親和性Ｔ細胞受容体を有する場合に、プログラム細胞死から胸腺細胞をレスキューするＴＥＣ上のＭＨＣ／ペプチド複合体である。ブタ−ヒトハイブリッド胸腺におけるレシピエントＴＥＣを提供することにより、末梢でレシピエント細胞上に同じリガンドがあるＴ細胞の正の選択が可能になり、正常な生存、ホメオスタシス及び機能が付与される。ブタ胸腺移植片の場合、ＴＥＣは、別の方法で周囲の非常に特異的な組織においてのみ発現する抗原（すなわち、組織特異的抗原、ＴＳＡ）を産生する。ＴＥＣによるＴＳＡのこの発現の２つの重要な結果は、ａ）レパートリーからのこれらの自己反応性Ｔ細胞を激減させるための、それらを強力に認識する胸腺細胞のクローン欠失、ｂ）周囲の自己免疫を防止するための安全ネットを加えるための、それらを認識する調節性Ｔ細胞の正の選択である。多くのＴＳＡは、ヒトとブタの間で異なるので、ブタ−ヒトハイブリッド胸腺移植片中にヒトＴＳＡを作製するためにヒトＴＥＣを添加することは、自己免疫からの保護を確実にするのに役立つであろう。
【００７３】
要約すると、単一ブタ胸腺の代わりにハイブリッド胸腺を使用することにより、ブタの胸腺において作製されるヒトＴ細胞レパートリーの機能及び自己寛容を改善することができる一方で、ブタに対する寛容を発達させることができる。
【００７４】
一実施形態では、レシピエントは胸腺切除される。別の実施形態では、レシピエントは胸腺切除されない。さらに別の実施形態では、レシピエントは、年齢により胸腺形成の速度が遅い。さらに別の実施形態では、レシピエントは老化した胸腺を有する。
【００７５】
本発明のハイブリッド胸腺／胸腺組織を用いた胸腺異種移植は、混合キメラ誘導と組み合わせてもよいし、組み合わせなくてもよい。例えば、胸腺異種移植が、耐久性のある混合ブタ−ヒトキメラ化と混合キメラ誘導と組み合わされた場合には、ブタとヒトの両方のＡＰＣが、天然のヒト胸腺及びブタ胸腺異種移植片中に存在し、造血細胞上で発現するブタ又はヒトのいずれかの抗原を認識する胸腺細胞の一生の負の選択を確実にする。さらに、ブタ又はヒトのＴＲＡを認識する従来のＴ細胞は、関連する種の胸腺で欠失しており、反対の種の胸腺での発達に起因する欠失回避は、他の胸腺で発達するＴＲＡ特異的Ｔｒｅｇによって適切に抑制される。混合ブタキメラ化は、未知の異種標的を認識する天然抗体の寛容を保証し、ＮＫ細胞も同様に寛容化される。
【００７６】
異種移植を実施する能力が、臓器異種移植片の前に寛容プロトコル（例えば、混合キメラ誘導）の適用を選択的に可能にするので、異種移植は、故人のドナーからの同種移植よりも容易に寛容誘導に役立つ。一実施形態では、本方法は、最初にレシピエントの免疫系を寛容化することを含み、寛容が達成され、その後、免疫抑制なしに、又は免疫抑制の短縮コースで臓器移植を実行することを確証する。
【００７７】
本開示は、第２種の哺乳動物、例えば、ブタから得られた移植片に対する寛容を第１種（例えば、ヒトなどの霊長類）のレシピエント哺乳動物において誘導する方法を提供する。本方法は、移植片の移植前又は移植と同時に、ハイブリッド胸腺／胸腺組織をレシピエント哺乳動物に導入すること、及び（任意に）移植片をレシピエントに移植することを含む。ハイブリッド胸腺／胸腺組織は、Ｔ細胞レベルで免疫寛容を誘導することにより、その後の移植片のためのレシピエントを整える。
【００７８】
本開示は、レシピエントにおける異種移植片寛容を誘導するための方法であって、ハイブリッド胸腺／胸腺組織をレシピエントに導入する工程を含む方法を提供する。
【００７９】
一実施形態では、ハイブリッド胸腺／胸腺組織を移植された無胸腺のＴ細胞枯渇レシピエントの宿主Ｔ細胞は、ハイブリッド胸腺／胸腺組織において成熟することができる。移植したハイブリッド胸腺／胸腺組織において成熟する宿主Ｔ細胞は、免疫適格性である。
【００８０】
本開示は、Ｔ細胞前駆体を産生することができるが、胸腺機能不全であるため、正常な免疫応答に十分な数の成熟機能性Ｔ細胞を産生することができない、宿主又はレシピエント、例えば、霊長類宿主又はレシピエントにおいて免疫適格性を回復又は誘導する（又は機能性成熟Ｔ細胞に成熟又は発達させるＴ細胞前駆細胞の胸腺依存性を回復又は促進する）方法を提供する。本方法は、移植したハイブリッド胸腺／胸腺組織において宿主Ｔ細胞が成熟することができるように、ハイブリッド胸腺／胸腺組織をレシピエントに導入する工程を含む。
【００８１】
一実施形態では、レシピエント／宿主は、霊長類、例えば、ヒトであり、ドナーはブタ、例えば、ミニブタである。
【００８２】
本方法は、ハイブリッド胸腺／胸腺組織の受け入れを容易にするか、そうでなければ方法を最適化する他の工程を含むことができる。ある実施形態では、胎児又は新生児肝臓又は脾臓組織などの肝臓又は脾臓組織を胸腺組織と共に移植し、ドナー造血細胞、例えば、臍帯血幹細胞又は胎児若しくは新生児の肝臓又は脾臓の細胞をレシピエントに投与し、例えば、胎児肝細胞の懸濁液を腹腔内又は静脈内に投与する。レシピエントは、ハイブリッド胸腺／胸腺組織が導入される前又はその時点などに胸腺切除され得る。
【００８３】
ある実施形態では、本方法は、胸腺組織のＮＫ媒介拒絶を防止するために、（好ましくは、レシピエントに胸腺組織を導入する前又はその時に）例えば、レシピエントのＮＫ細胞に結合することができる抗体をレシピエントに導入することによってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を激減させるか、不活性化又は阻害すること；（好ましくは、胸腺組織をレシピエントに導入する前又はその時に）例えば、レシピエントのＴ細胞に結合することができる抗体をレシピエントに導入することによって宿主Ｔ細胞機能を激減させるか、不活性化又は阻害すること；（好ましくは、胸腺組織をレシピエントに導入する前又はその時に）例えば、レシピエントのＣＤ４又はＣＤ４＋細胞に結合することができる抗体をレシピエントに導入することによって宿主ＣＤ４＋細胞機能を激減させるか、不活性化又は阻害することを含む。
【００８４】
ある実施形態は、レシピエントの骨髄を激減させるか又は部分的に激減させるために、（好ましくは、胸腺組織又は造血幹細胞の移植の前に）例えば、レシピエント哺乳動物への低用量、例えば、約１００〜４００ラドの照射、全身照射、骨髄抑制薬の投与、又は抗体を不活化又は激減させる造血幹細胞の投与のうちの１以上によって造血空間を作製する工程を含む。
【００８５】
ある実施形態は、（好ましくは胸腺組織又は造血幹細胞の移植の前に）例えば、約７００ラドの胸腺照射を宿主に照射すること、抗Ｔ細胞抗体、例えば、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体の１以上の用量をレシピエントに投与すること、又は短期間、免疫抑制剤をレシピエントに投与することのうちの１以上によって胸腺Ｔ細胞を不活化することを含む。
【００８６】
ある実施形態は、天然抗体、例えば、デオキシスペルガリンを激減させるか又は不活性化する薬物の投与、抗ＩｇＭ抗体の投与、又は宿主の血液からの天然抗体の吸着のうちの１以上によって、例えば、ドナー抗原と宿主血液を接触させることによって、例えば、ドナー種からのドナー臓器、例えば、腎臓又は肝臓の血液潅流によって天然抗体を激減させるか、又は別の方法で不活性化することを含む。
【００８７】
他の方法は、レシピエントによる移植片の受容を促進するために、本明細書に開示される方法と組み合わせてよい。例えば、胸腺組織に対する寛容はまた、ドナー抗原、例えば、ドナーＭＨＣ遺伝子を発現する核酸をレシピエントの細胞、例えば、造血幹細胞に挿入し、遺伝子操作された細胞をレシピエントに導入することによって誘導することもできる。例えば、ヒトレシピエント幹細胞は、ブタＭＨＣ遺伝子、例えば、ブタクラスＩ若しくはクラスＩＩのＭＨＣ遺伝子、又はクラスＩとクラスＩＩ遺伝子の両方を発現するように操作することができ、その細胞は、ハイブリッド胸腺組織を受容するヒトレシピエントに移植される。レシピエント霊長類、例えば、ヒトに挿入されると、ドナーＭＨＣ遺伝子の発現は、ドナー抗原へのその後の曝露に対する寛容をもたらし、そのため、胸腺組織に対する寛容を誘導することができる。
【００８８】
例えば、造血幹細胞の移植によって寛容を誘導する方法は、本明細書に開示される方法と組み合わせることもできる。
【００８９】
胸腺組織の受容を促進するために、寛容を誘導する他の方法を使用してもよい。例えば、短期の高用量の免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンを投与することによって誘導することができるヘルパーＴ細胞の抑制は、寛容を誘導することが見出された。これらの方法では、ヘルパーＴ細胞は、移植片の移植の直後に比較的短い期間抑制され、慢性免疫抑制を必要としないか、又は含まない。
【００９０】
例えば、サイトカイン活性のレベルを変化させるか、又は移植片対レシピエント病を阻害することによって、寛容を促進するか、又はドナー組織の受容を促進する他の方法も、本発明の方法と組み合わせて使用してよい。
【００９１】
別の態様では、本開示は、ドナー哺乳動物からの移植片を受容するレシピエント哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトにおけるＴ細胞の活性、好ましくは、胸腺又はリンパ節Ｔ細胞の活性を減少又は阻害する方法を提供する。本方法は、移植片に対する寛容を誘導すること、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンをＴ細胞、好ましくは胸腺又はリンパ節Ｔ細胞を不活性化するのに十分である短い期間、レシピエントに投与することを含む。
【００９２】
本明細書で使用する「胸腺機能欠損」は、Ｔ細胞の成熟を支持する個々の胸腺の能力が、正常個体と比較して損なわれる状態を指す。胸腺欠損状態には、胸腺又は胸腺の機能が本質的に存在しないものが含まれる。
【００９３】
本明細書で使用する「寛容」は、そうでなければ、例えば、レシピエントへの非自己ＭＨＣ抗原の導入に応答して生じる、例えば、ドナー抗原に対する免疫応答を開始する移植レシピエントの能力の阻害又は減少を指す。寛容は、体液性、細胞性、又は体液性と細胞性応答の両方を含むことができる。寛容の概念には、完全な寛容と部分的な寛容の両方が含まれる。言い換えると、本明細書で使用されるように、寛容には、例えば、ドナー抗原に対する免疫応答を開始する移植レシピエントの能力の任意の程度の阻害が含まれる。
【００９４】
本明細書で使用する「造血幹細胞」は、成熟骨髄及び／又はリンパ系細胞に発達することができる細胞を指す。好ましくは、造血幹細胞は、骨髄及び／又はリンパ系統の長期再集団を可能にする。レシピエント又はドナーの臍帯血由来の幹細胞を本開示の方法に使用することができる。
【００９５】
本明細書で使用する「ミニブタ」は、完全に又は部分的に同系交配されたミニブタを指す。
【００９６】
本明細書で使用する「移植片」は、身体部分、臓器、組織、細胞、又はその一部を指す。
【００９７】
本明細書で使用する「間質組織」は、その機能的要素又は実質が区別されるように、臓器の支持組織又はマトリックスを指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、免疫能力の回復、誘導、又は促進は、（１）レシピエント成熟機能性Ｔ細胞の数を増加させるか、もしくはレシピエントにおいて成熟した成熟機能性ドナーＴ細胞を提供することのいずれか又はその両方によって、レシピエントにおける成熟機能性Ｔ細胞の数を増加させること（本開示の方法による処置を行わない場合に見られるものを超える）；又は（２）例えば、リコール抗原に対する皮膚の応答を開始する能力によって測定されるように、レシピエントの免疫応答性を改善すること、又は例えば、インビトロ試験により測定されるように、例えば、抗原に対する増殖応答の改善、例えば、破傷風抗原若しくは同種抗原に対する応答の改善によって、レシピエントのＴ細胞の応答性を改善することのうちの一方又は両方を意味する。
【００９９】
本明細書で使用するように、成熟Ｔ細胞に成熟するＴ細胞前駆細胞の胸腺依存性を回復又は誘導することは、レシピエントにおけるレシピエント起源の機能性成熟Ｔ細胞の数を増加させるか、又はＴ細胞が成熟し得るドナー胸腺組織を提供することによって、レシピエントに成熟機能性ドナーＴ細胞を提供することのいずれか又はその両方を意味する。この増加は、部分的であり、成熟機能性Ｔ細胞のレベルを本質的に正常な免疫応答になるレベルにしない増加、又は部分的、例えば、レシピエントの成熟機能性Ｔ細胞のレベルを本質的に正常な免疫応答になるレベルにすることができない増加であり得る。
【０１００】
ある実施形態では、臓器移植又は胸腺置換のいずれかのためのレシピエントの調製は、以下の工程のいずれか又は全てを含む。これらは、以下の順番で実施してよい。
【０１０１】
最初に、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物を、レシピエントに静脈内注射する。抗体調製物は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。排除されない場合には、成熟Ｔ細胞は、胸腺移植と感作後の異種移植片臓器の両方の拒絶を促進する可能性がある。ＡＴＧ調製物はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を排除する。ＮＫ細胞は、おそらく移植した臓器には影響を及ぼさないが、新たに導入された胸腺組織を拒絶するように直ちに作用する可能性がある。ブタＡＴＧのそれまでの調製物は、ウマ由来のＡＴＧよりも低い力価であったが、任意の哺乳動物宿主から得られた抗ヒトＡＴＧ、例えば、ブタで生成されたＡＴＧも使用することができる。ＡＴＧは抗ＮＫモノクローナル抗体よりも優れており、後者は一般に全ての宿主ＮＫ細胞に溶解しないが、ＡＴＧにおけるポリクローナル混合物は全ての宿主ＮＫ細胞を溶解することができる。しかし、抗ＮＫモノクローナル抗体を使用することができる。比較的重度の免疫無防備状態の個体では、この工程は必要ではない。宿主（又はドナー）Ｔ細胞が異種胸腺において成熟するにつれて、それらは胸腺組織に寛容になるであろう。あるいは、宿主免疫系が漸進的に回復するにつれて、胸腺組織に対する寛容を誘導するために宿主を治療することが望ましい場合がある。
【０１０２】
最適には、レシピエントの胸腺を切除することができる。胸腺切除されたレシピエントにおいて、レシピエントＴ細胞は、レシピエント胸腺で分化する機会をもたないが、ハイブリッド胸腺組織では分化しなければならない。場合によって、貧血を回避するために、レシピエントを脾臓摘出することが必要となり得る。
【０１０３】
第２に、レシピエントには低用量の放射線を投与することができる。この工程は骨髄移植において有益であると考えられているが（新たに注入された骨髄細胞のための造血空間を作成することによって）、骨髄移植を伴わない胸腺移植片ではあまり重要ではない。しかし、亜致死量、例えば、ほぼ１００に等しい、又は１００超で約４００未満のラドの用量、全身放射、及び７００ラドの局所胸腺放射を使用することができる。
【０１０４】
第３に、天然抗体をレシピエントの血液から吸着させることができる。抗体の除去は、レシピエントの血液をドナー又はドナー種の抗原に暴露することによって、例えば、レシピエントの天然抗体を吸着するためのドナー種の肝臓の血液潅流によって達成することができる。予め形成された天然抗体（ｎＡｂ）は、移植片拒絶の主な薬剤である。天然抗体は異種の内皮細胞に結合し、主にＩｇＭクラスである。これらの抗体は、異種ドナーの抗原に対する任意の既知の以前の暴露とは無関係である。これらの天然抗体を生成するＢ細胞は、Ｔ細胞に依存しない傾向があり、通常、発達中にこれらの抗原に曝露することによって自己抗原に対して寛容化される。再び、この工程は、少なくとも最初は、比較的重度の免疫無防備状態の患者には必要ではないかもしれない。
【０１０５】
ハイブリッド胸腺組織はレシピエントに移植される。胎児又は新生児の肝臓又は脾臓組織を含めることができる。
【０１０６】
これらの手順の１つ又は全てを含む任意の組合せは、移植した胸腺組織又は別の異種臓器の生存を援助し得る。
【０１０７】
本開示の方法は、異種移植片に対する寛容を付与するために使用することができ、例えば、移植ドナーが非ヒト動物、例えば、ブタ、例えば、ミニブタであり、移植レシピエントは霊長類、例えば、ヒトである。
【０１０８】
異種移植片のドナー及び寛容誘導胸腺組織を供給する個体は、同一の個体であってもよく、又は可能な限り密接に関連していてもよい。例えば、高度に又は完全に同系交配されたドナーのコロニーからの異種移植片を導き出すことが好ましい。
【０１０９】
第２の哺乳動物種（すなわち、ドナー）は、ブタ種（例えば、ミニブタ種）又は非ヒト霊長類種などの非ヒト哺乳動物種であり得る。第１の哺乳動物種の非限定的な例には、ブタ、齧歯類、非ヒト霊長類、ウシ、ヤギ、及びウマが含まれる。
【０１１０】
一実施形態では、第２の哺乳動物種（すなわち、ドナー）は、少なくとも部分的に同系交配されたミニブタである（例えば、ブタはブタ白血球抗原（ＳＬＡ）遺伝子座でホモ接合であり、かつ／又は全ての他の遺伝子座の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上でホモ接合である）。遺伝子工学は、完全に又は部分的に同系交配されたブタ（例えば、ミニブタ、トランスジェニックブタなど）に行うことができる。例えば、同系交配されたマサチューセッツ総合病院（ＭＧＨ）のミニブタを本発明の方法に使用してよい。これらには、４０年間にわたって同系交配され、全ての遺伝子座においてホモ接合性であるＭＧＨミニブタが含まれる。一実施形態では、同系交配ＳＬＡｄｄミニブタを使用してよい。Ｍｅｚｒｉｃｈら及びＳａｃｈｓ，組織適合性ミニブタ：同系交配大動物モデル（ＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｓｗｉｎｅ：  Ａｎ  ｉｎｂｒｅｄ  ｌａｒｇｅ−ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００３；７５：９０４−９０７。米国立ブタ資源及び研究センター（ＮＳＲＲＣ，ＲＡＤＩＬ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＯ）のブタを本発明の方法で使用してもよい。
【０１１１】
第１の哺乳動物種（すなわち、レシピエント）は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、又はカニクイザル）などの霊長類、又はヒトであり得る。一実施形態では、第２の種はヒトである。
【０１１２】
様々な実施形態では、ドナー（第２種）及びレシピエント（第１種）は、異なる種のものである。例えば、ドナーは非ヒト動物、例えば、ミニブタであり、レシピエントはヒトである。
【０１１３】
第２の哺乳動物種のそのようなドナー動物からの移植片を、第１の哺乳動物種（例えば、ヒト）のレシピエント哺乳動物に移植する方法も本開示に包含される。
【０１１４】
本トランスジェニックドナー動物の細胞、組織、臓器又は体液は、移植（例えば、異種移植）のために使用され得る。移植用ドナー動物から採取された移植片には、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、肺移植、腸、皮膚、甲状腺、骨髄、小腸、気管、角膜、肢、骨、内分泌腺、血管、結合組織、前駆幹細胞、血球、造血細胞、膵島、脳細胞並びに内分泌及び他の臓器からの細胞、体液、並びにそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１１５】
細胞は任意の種類の細胞であり得る。ある実施形態では、細胞は、造血細胞（例えば、造血幹細胞、リンパ球、骨髄細胞）、膵臓細胞（例えば、β膵島細胞）、腎臓細胞、心臓細胞、又は肝細胞である。
【０１１６】
ドナー動物の骨髄細胞（ＢＭＣ）、又は造血幹細胞（例えば、胎児肝臓懸濁液又は動員された末梢血幹細胞）をレシピエントに注入してよい。
【０１１７】
本方法はまた、以下の治療：Ｔ細胞を阻害するか、補体を阻止するか、さもなければ移植片に対するレシピエントの免疫応答を下方制御する治療のうちの１以上を含んでよい。
【０１１８】
移植片の寛容を促進し、かつ／又は免疫認識を減少させる治療には、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）、抗体（例えば、ポリクローナル抗胸腺細胞抗血清（ＡＴＧ）などの抗Ｔ細胞抗体、及び／又はＬｏＣＤ２ｂなどのモノクローナル抗ヒトＴ細胞抗体）、照射、及び混合キメラを誘導する方法の使用が含まれる。米国特許第６，９１１，２２０号、同第６，３０６，６５１号、同第６，４１２，４９２号、同第６，５１４，５１３号、同第６，５５８，６６３号、及び同第６，２９６，８４６号。Ｋｕｗａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１１（１）：２９−３１，２００５．  Ｙａｍａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１（１）：３２−３４，２００５。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、レシピエントは、胸腺切除され、かつ／又は脾臓摘出される。胸腺照射を用いることができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、レシピエントは、低用量の放射線（例えば、１００ラド〜４００ラドの全身照射の致死量以下の線量）を投与される。局所胸腺放射も使用してよい。
【０１２１】
レシピエントは、コブラ毒素因子などの補体を激減させる薬剤で治療することができる。
【０１２２】
天然抗体は、臓器灌流、及び／又は寛容誘導性骨髄の移植によって排除することができる。天然抗体は、ドナー種の肝臓の血液潅流によってレシピエントの血液から吸収することができる。移植に使用される細胞、組織、又は臓器は、それらが宿主の天然抗体によって認識されないように遺伝的に改変され得る（例えば、細胞は、ａ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損である）。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、ヒト抗ヒトＣＤ１５４ｍＡｂ、ミコフェノール酸モフェチル、及び／又はメチルプレドニゾロンでの治療を含む。本方法はまた、抗炎症剤（例えば、プロスタサイクリン、ドーパミン、ガンシクロビル、レボフロキサシン、シメチジン、ヘパリン、アンチトロンビン、エリスロポエチン、及びアスピリン）などの支持療法に有用な薬剤を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ドナー間質組織が投与される。
【０１２５】
免疫抑制薬剤とも呼ばれる免疫抑制剤は、体液性若しくは細胞性免疫系又は補体系の成分などの免疫系の１以上の態様の機能又は活性を低下させる任意の化合物であり得る。
【０１２６】
免疫抑制剤の非限定的な例には、（１）プリン合成阻害剤（イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤、例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸、及びミコフェノール酸モフェチルなど）、ピリミジン合成阻害剤（例えば、レフルノミド及びテリフルノミド）、及びアンチフォレート（例えば、メトトレキサート）などの抗代謝産物；（２）タクロリムス、シクロスポリンＡ、ピメクロリムス、及びボクロスポロスポリン（ｖｏｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）などのカルシニューリン阻害剤；（３）サリドマイド及びレナリドミドなどのＴＮＦ−α阻害剤；（４）アナキンラなどのＩＬ−１受容体拮抗薬；（５）ラパマイシン（シロリムス）、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、及びバイオリムスＡ９などのラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳動物標的；（６）プレドニゾンなどのコルチコステロイド；及び（７）いくつかの細胞又は血清の標的（抗リンパ球グロブリン及び抗胸腺細胞グロブリンを含む）のいずれか１つに対する抗体が含まれる。
【０１２７】
非限定的で例示的な細胞標的及びそれらのそれぞれの阻害剤化合物は、補体成分５（例えば、エクリズマブ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、アフェリモマブ及びゴリムマブ）；ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ）；ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）；ＢＡＹＸ（例えば、ネレリモマブ）；インターフェロン（例えば、ファラリモマブ）；ＩＬ−６（例えば、エルシリモマブ）；ＩＬ−１２及びＩＬ−１３（例えば、レブリキズマブ及びウステキヌマブ）；ＣＤ３（例えば、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ）；ＣＤ４（例えば、クレノリキシマブ、ケリキシマブ及びザノリムマブ）；ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ）；ＣＤ１８（例えば、エルリズマブ）；ＣＤ２０（例えば、アフツズマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ）；ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）；ＣＤ４０（例えば、テネリキシマブ、トラリズマブ）；ＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチン（例えば、アセリズマブ）；ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ）；ＣＤ１４７／バシギン（例えば、ガビリモマブ）；ＣＤ１５４（例えば、ルプリズマブ）；ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）；ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）；ＣＡＴ（例えば、ベルチリムマブ、レルデリムマブ、メテリムマブ）；インテグリン（例えば、ナタリズマブ）；ＩＬ−６受容体（例えば、トシリズマブ）；ＬＦＡ−１（例えば、オデュリモマブ）；及びＩＬ−２受容体／ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ）を含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
レシピエントの天然抗体は、臓器灌流、及び／又は寛容誘導性骨髄移植によって排除され得る。
【０１２９】
一実施形態では、レシピエントは、静脈内に注射されたウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物（例えば、約２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、５０ｍｇ／ｋｇで、例えば、移植３、２、１日前に）治療される。抗体調製物は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。ＡＴＧ調製物はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を排除する。任意の哺乳動物宿主から得られた抗ヒトＡＴＧも使用することができる。加えて、さらなるＴ細胞枯渇が指示された場合に、レシピエントは、ＬｏＣＤ２ｂ（Ｉｍｍｅｒｇｅ  ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）などのモノクローナル抗ヒトＴ細胞抗体で治療され得る。骨髄移植のために、レシピエントに低用量の放射線を投与することができる。場合によっては、レシピエントは、コブラ毒素因子などの補体を激減させる薬剤で治療することができる（例えば、１日前に）。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、維持療法（例えば、移植の直前に開始し、少なくとも移植後数日間継続する）には、ヒト抗ヒトＣＤ１５４ｍＡｂによる治療が含まれる。ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を、全血レベルを維持するために投与することができる。メチルプレドニゾロンを、移植の日から始めて、その後、次の３〜４週間にわたって徐々に減らすように投与してもよい。
【０１３１】
支持療法（例えば、０〜１４日目）に有用な種々の薬剤には、プロスタサイクリン、ドーパミン、ガンシクロビル、レボフロキサシン、シメチジン、ヘパリン、アンチトロンビン、エリスロポエチン、及びアスピリンなどの抗炎症剤が含まれる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ドナー間質組織が投与される。それは、胎児肝臓、胸腺、及び／又は胎児脾臓から得てもよく、例えば、腎カプセル中でレシピエントに移植してもよい。胸腺組織は、血管再生のために自己腎カプセルの下に埋め込むことによって移植用に調製することができる。異なる種の障壁を越える幹細胞生着及び造血は、ドナー種からの造血間質環境を提供することによって増強され得る。間質マトリックスは、造血細胞とそれらの間質環境との間の相互作用に必要な、造血成長因子、接着分子、及びそれらのリガンドなどの種特異的因子を供給する。
【０１３３】
肝臓は胎児における造血の主要な部位であるので、胎児肝臓はまた、造血幹細胞の源として骨髄に対する代替物として機能することができる。各臓器は、宿主に移植したそれぞれの未分化幹細胞の分化を支持することができる臓器特異的間質マトリックスを含む。埋め込みの代替又は補助として、胎児肝細胞を流体懸濁液中に投与することができる。
【０１３４】
骨髄細胞（ＢＭＣ）、又はドナーの造血幹細胞の別の供給源、例えば、胎児肝臓懸濁液をレシピエントに注入することができる。ドナーＢＭＣには、レシピエントの適切な部位があり、残りの宿主細胞と連続して成長し、増殖し、キメラリンパ球造血集団を形成する。この過程により、新たに形成するＢ細胞（及びそれらが生成する抗体）は、ドナー抗原に曝露され、その結果、移植片は自己として認識されるであろう。ドナーに対する寛容はまた、造血幹細胞、例えば、ＢＭＣの生着が達成された動物におけるＴ細胞レベルで観察される。異種ドナーの使用は、同じ動物から、又は遺伝的に適合した動物からの骨髄細胞及び臓器を使用する実現性を可能にする。
【０１３５】
実施例
本発明は、以下の実験の詳細からより良く理解されるであろう。しかし、当業者は、説明した特定の方法及び結果が、その後に続く特許請求の範囲により完全に記載されているように、本発明の単なる例示であることを容易に理解するであろう。
【０１３６】
実施例１−最適な免疫機能を有するブタ抗原に対する免疫寛容性を達成するためのヒト／ブタハイブリッド胸腺の作製
異種移植片に対する強力な免疫応答は、過剰な毒性を伴わずに、従来の免疫抑制で制御することが困難である。胸腺移植は、異種移植のためのＴ細胞寛容を誘導する有望な手法である。ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）及びブタ（ＳＷ）胸腺移植片を用いて作製されたヒト化マウスは、両方の種に寛容であることが以前に示されている。しかし、この手法には依然としていくつかの課題がある。第１に、ブタ胸腺におけるＳＷ ＭＨＣ上で選択されたＴ細胞は、周囲のヒトＭＨＣ（ＨＬＡ）によって提示される抗原を最適に認識しない可能性がある。第２に、ＳＷ胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）はヒト組織特異的自己抗原（ＴＲＡ）を提示しないので、負の選択が損なわれ、またヒトＴＲＡに特異的なＴｒｅｇが欠如している可能性がある。これらの問題は、本明細書に記載のヒト／ブタハイブリッド胸腺を作製することによって克服された。
【０１３７】
方法
ヒト／ブタのハイブリッド胸腺細胞を作製するために、胸腺間質細胞を、ヒト胎児（妊娠２０週齢）及び小児（４ヶ月齢）の胸腺のリベラーゼでの消化により単離し、続いて、ヒトＣＤ４５＋細胞を磁気で取り除く。ヒトＣＤ４５細胞をマトリゲルに再懸濁し、解糖を抑制する２−デオキシグルコースで処理し、凍結／解凍した胎児ＳＷ胸腺組織に注入し、胎児ＳＷ胸腺におけるブタ胸腺細胞の数を低下させた（図２Ａ〜Ｃ）。
【０１３８】
次いで、これらの注入されたＳＷ胸腺を、照射したＮＯＤ ｓｃｉｄ共通γ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスに移植し、続いて、同じｈｕＴＥＣドナー又は同種ドナーからのヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋ＨＳＣを注入した。移植後１２〜２０週の時点で、移植した胸腺を摘出し、切片化し、染色して、２光子共焦点顕微鏡を用いてヒトＴＥＣを検出した（図１Ａ〜１Ｄ）。成人の胸腺におけるＴＥＣの数は胸腺の萎縮により減少するので、１７歳のドナーからの胸腺由来のｈｕＴＥＣ及び胸腺間葉細胞（ＴＭＣ）を、２Ｄマトリゲルマトリックス上で増殖させ、細胞を胎児ブタ胸腺組織に注入し、続いて、ヒト化マウスに移植した（図１Ｅ〜１Ｈ）。
【０１３９】
結果
ｈｕＴＥＣ注入されたＳＷ胸腺は、ヒト化マウスにおいて機能的であり、ヒト胸腺形成を支持した。サイトケラチン（ＣＫ）１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞及びＣＫ８＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞並びにＣＫ８＋ＣＫ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞は、ヒト胎児と小児のドナーの両方によって作製されたハイブリッド胸腺において検出された。これらのＴＥＣは広く分布しており、ブタＴＥＣと混合されていた（図１Ａ〜１Ｄ）。１７歳の胸腺ＥｐＣＡＭ＋ＴＥＣを、１回の継代で５倍増殖させた。インビトロ増殖させたヒトＴＥＣ及び間葉細胞を用いて作製したハイブリッド胸腺は、ヒトＴＥＣを含んでいた（図１Ｅ〜１Ｈ）。
【０１４０】
結論
ヒト胸腺間質細胞のブタ胸腺への注入は、ヒト／ブタハイブリッド胸腺を作製するための有効な手法である。古い胸腺からのヒトＴＥＣは、本明細書に記載のプロトコルを用いてインビトロで増殖させることができ、ブタ移植片において長期間検出可能であった。
【０１４１】
実施例２−ハイブリッド胸腺を作製する方法の開発
注入方法
細胞をマトリゲルに再懸濁し、注入後にブタ胸腺から漏出するのを防止した。原則として、この実験では、ヒト胸腺上皮細胞の代わりにヒトＰＢＭＣを使用した。最初に、１０００万個のヒトＰＢＭＣを、追跡色素としてＣＦＳＥ（２．５μＭ）で染色した。ＣＦＳＥ染色したＰＢＭＣ（８百万個の細胞）を氷上で１４０μｌのマトリゲルに再懸濁し、１μｌあたり５０，０００個の細胞の細胞濃度にした。解凍したブタ胎児胸腺フラグメントに細胞を注入する３つの異なる方法：
方法Ａ：小片をＶ底９６ウェルプレート（５〜８μｌ）のウェルの中に置いて、ハミルトン注射器を使用する注入；
方法Ｂ：ＰＥ５０管（２０μｌ）を用いる注入
方法Ｃ：小片をマトリゲルが凝固するまで鉗子でウェルの外側に保持した状態で、ハミルトン注射器を用いる注入（４〜６μｌ）。
【０１４２】
全ての注入片を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む９６ウェルプレートの異なるウェルに移した。３時間後、小片をリベラーゼで消化した。放出した細胞の数をフローサイトメトリーによって決定し、ＣＦＳＥ染色した注入ＰＢＭＣを追跡した。図３Ａに示すように、全３つの注入方法について、注入した細胞の少なくとも一部を回収した。
【０１４３】
要約すると、注入前にマトリゲルに細胞を再懸濁すると、ブタ胸腺組織中に注入細胞が保持された。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌され、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ  ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより生成及び市販されているゲル状タンパク質混合物の商品名である。
【０１４４】
ヒト胸腺間質細胞の拒絶を防止するためにブタ胸腺細胞を激減させる方法
抗ブタＣＤ３免疫毒素及び補体媒介毒性（補体＋抗ブタＣＤ２の供給源としてのウサギ血清）を含むブタ胸腺フラグメント中の胸腺細胞をエクソビボで激減させるための異なる戦略がある。しかし、これらの２つの戦略は有効ではなかった。前者の戦略は、ブタ胸腺細胞におけるアポトーシスをより高い濃度で誘導し、ＳＰ及びＤＰ Ｔ細胞並びに非Ｔ細胞を死滅させ、胸腺における生存胸腺細胞の大きな集団を残す。後者の戦略は、胸腺フラグメント中のブタ胸腺細胞をエクソビボで激減させるのに効果的ではなかった。結果は示さず。
【０１４５】
これらの結果を考慮して、以下の方法を用いて、ブタ胸腺細胞をエクソビボで激減させるために、以下の試薬を試験した：
０日目：ブタ胸腺片を解凍し、以下のうちの１つと（３つ組で）インキュベートする：
ａ）シクロスポリンＡ
ｂ）ヒドロコルチゾン
ｃ）ノッチ阻害剤（γセクレターゼ阻害剤＝ＧＳｉ）
ｄ）ＡＢＴ−７３７
ｅ）２デオキシグアノシン
ｆ）２Ｄグルコース
ｇ）未処理
異なる時点で組織を消化し、死細胞及びアポトーシス細胞の割合について試験した。図３Ｂ参照。
【０１４６】
２−デオキシグルコース（２ＤＧ、１００ｍＭ）を用いる１２時間のエクソビボ調節は、間質細胞を生きたままにしながら胸腺細胞を激減させるための最良の手法であった。間質細胞を含む、二重陰性（ＤＮ）細胞に対する残りの生きている二重陽性ＣＤ４及びＣＤ８細胞（ＤＰ）又は単一陽性（ＳＰ）ＣＤ４（ＳＰ−ＣＤ４）又はＳＰ−ＣＤ８細胞の比率を、読み出し情報として使用した。１００ｎＭの２ＤＧでの１２時間の処理は、最も低い比率になり、従って、間質細胞を保存しながら胸腺細胞を除去するための最良の戦略であった。図３Ｃ参照。
【０１４７】
ハイブリッド胸腺の作製
ヒト胸腺間質細胞の注入のために、ブタ胸腺細胞を激減させるための２−ＤＧ処理及びハミルトン注射器を使用して（上述の方法Ｃ）、ハイブリッド胸腺を作製し、インビボで試験した。具体的には、胎児ブタ胸腺の２つのバイアルを解凍した。可能な限り多くの胸腺細胞を放出するために上下にピペッティングした後、小片の半分を１００ｍＭの２ＤＧで１２時間処理し、残りの半分は未処理のままにした。
【０１４８】
翌日、ヒト胎児胸腺の６つのバイアルを解凍した。可能な限り多くの胸腺細胞として放出するために上下にピペッティングした後、リベラーゼを使用して、間質細胞を消化及び放出し、単細胞懸濁液を作製した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いてヒトＣＤ４５＋細胞を激減させた後、１０００万個の胸腺間質細胞を、１μｌ当たり６６，０００個の細胞濃度で、１５０μｌの冷マトリゲルに溶解した。約１０μｌの細胞（約６６０，０００胸腺間質細胞）を各胎児ブタ胸腺片に注入した（２ＤＧ処理及び未処理のいずれか）。この小片を、マトリゲルが固化するまで、室温で約２分間微細鉗子を用いて保持した。次いで、各片を、１０％ヒト血清を含む培地を含む９６ウェルプレートのウェルに移した。対照として、いくつかの小片にはヒト胸腺間質細胞を注入しなかった。インキュベーター内で１０分後、プレートを氷上のまま、免疫不全ＮＳＧマウスへの移植のためにマウス設備に移した。レシピエントマウスは、以前に胸腺切除されていたので、それらは天然のマウス胸腺を有さず、胸腺形成のための唯一の場所は移植した胸腺フラグメントであった。最初に、レシピエントＮＳＧマウスに照射し（１００ｃＧ）、続いてヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を注入した。次いで、各レシピエントマウスの腎カプセルの下に１つの胸腺片を移植した。
【０１４９】
実験計画は図４に示されている。
【０１５０】
移植後２〜３週間毎に、マウスから採血し、ヒト免疫細胞再構成のレベルを評価した。図５に示すように、２−ＤＧでのブタ胸腺フラグメントの処理は、移植した胸腺におけるヒト胸腺形成に影響を及ぼさなかった。
【０１５１】
移植後２０週の時点で、マウスを安楽死させ、移植した胸腺を摘出し、ＯＣＴで凍結させた。凍結切片化した後、スライドを、ヒトＨＬＡ−ＤＲ、サイトケラチン８（ＣＫ８、皮質胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）のマーカーとして））及びＣＫ１４（髄質ＴＥＣのマーカーとして）に対する抗体で染色した。ＣＫ抗体は、ヒトとブタの両方に対して交差反応性があるので、ＨＬＡ−ＤＲを用いて、ヒト及びブタのＴＥＣを分化させた。図６に示されるように、ブタＴＥＣと混合した注入ヒトＴＥＣを、移植した胸腺内で検出した。ＣＫについて陰性であったＨＬＡ−ＤＲ＋細胞は、骨髄から移植した胸腺へ移動するＨＳＣ由来の抗原提示細胞であった。
【０１５２】
インビトロＴ細胞増殖の結果は、ハイブリッド胸腺を有するマウスの末梢Ｔ細胞がヒトＴＥＣドナーに部分的に寛容であることを示唆した（図７Ｂ）。
【０１５３】
全てのマウスからのヒトＴ細胞は、ブタドナー樹状細胞（ＤＣ）に寛容であるが、ＳＬＡ−ＣＣの第３のグループのブタ樹状細胞（ＤＣ）には寛容ではなかった（図７Ａ）。
【０１５４】
全てのマウスからのヒトＴ細胞は、ヒトＨＳＣ−ドナーＤＣに寛容であった（図７Ｂ）。
【０１５５】
ブタ胸腺を有するマウスからのヒトＴ細胞は、ヒト胸腺ドナー−ＤＣ（ヒトＨＳＣと同種）とヒト同種−ＤＣの両方に応答して類似のレベルで増殖した。ハイブリッド胸腺を有するマウスからのヒトＴ細胞は、同種−ＤＣと比較して、ヒト胸腺ドナー−ＤＣに応答して減少したレベルで増殖した（図７Ｂ）。
【０１５６】
実施例３−ヒト胸腺（ＨＵ／ＨＵマウス）で発達する細胞と比較して、ブタ胸腺（ＳＷ／ＨＵマウス）で発達するヒトＴ細胞の中のヒト組織特異的自己抗原（ＴＲＡ）（ＭＡＲＴ−１、ＮＹＥＳＯ１及び膵島抗原ＩＡ−２）に対する応答性の増加
方法
ブタ胸腺で発達するヒトＴＲＡ特異的Ｔ細胞の負の選択の欠如の仮説を評価するために、同じヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋ＨＳＣと、自己のヒト胎児胸腺（ＨＵ／ＨＵ）又はブタ胎児胸腺（ＳＷ／ＨＵ）のいずれかを用いて、ヒト化マウスの２グループを作製した。図８Ａ参照。両方のグループにおいて、天然のマウス胸腺を摘出して、胸腺形成がヒト又はブタの胸腺のいずれにおいてのみ生じることを確実にした。移植後約２２週の時点で、マウスを安楽死させ、プールしたリンパ節（ＬＮ）及び脾細胞を、ＭＡＣＳを用いてマウスＣＤ４５＋細胞を激減させた。残りの細胞を、異なるヒトＴＲＡタンパク質と共に自己ＨＳＣ由来の樹状細胞と共培養して、これらのＴＲＡに応答するＴ細胞増殖を測定した。
【０１５７】
結果
図８Ｂに示すように、ＳＷ／ＨＵマウスにおけるヒト末梢Ｔ細胞は、自己ヒトＤＣによって提示されるヒトＴＲＡ（ＩＡ−２、ＭＡＲＴ−１及びＮＹＥＳＯ１）に対する増殖応答が有意に増加したことを示した。これらのＴＲＡのアミノ酸配列は、ヒトとブタとの間で有意に異なる。この知見は、ブタ胸腺におけるヒトＴＲＡ特異的Ｔ細胞の負の選択の欠如を支持し、ハイブリッド胸腺を使用する必要性を実証した。
【０１５８】
実施例４−ヒト胸腺（ＨＵ／ＨＵマウス）で発達する細胞と比較して、ブタ胸腺（ＳＷ／ＨＵマウス）で発達するヒトＴｒｅｇ及びＣＤ８Ｔ細胞のより低い生存率
方法
実施例３で作製したマウス（ＳＷ／ＨＵ及びＨＵ／ＨＵマウス）を移植後約２４週で安楽死させた。移植した胸腺及びプールした脾臓及びリンパ節（頸部、腋窩、上腕及び腸間膜ＬＮ）を収集した。胸腺細胞、脾細胞、及びＬＮ細胞を、物理的な力で（２つのスライドの間の胸腺組織を粉砕し、注射器プランジャーを使用して７０μｍのセルストレーナーを介して脾臓及びＬＮを粉砕すること）によって単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、脾細胞中のＲＢＣを溶解した。単離細胞を、血球計数器を用いて計数した。総細胞数を計数した後、各胸腺及びプールした脾臓及びＬＮからの０．２〜１００万個の細胞を、フローサイトメトリー分析のために図９に示す抗体で染色した。細胞をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリー機で読み取り、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。
【０１５９】
結果
脾臓及びＬＮ細胞並びに移植した胸腺細胞の数は、ＳＷ／ＨＵマウスと比較して、ＨＵ／ＨＵマウスにおいて有意に高かった（図９Ａと９Ｇ）。移植した胸腺におけるＤＰ（二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋）とＳＰ細胞（単一陽性のＳＰ−ＣＤ４又はＳＰ−ＣＤ８のいずれか）の比は、ＨＵ／ＨＵとＳＷ／ＨＵマウスとの間で類似していた（図９Ｂ）。機能的胸腺は、ＳＰ細胞よりもＤＰの比率が高くあるべきである。
【０１６０】
また、ＳＰ−ＣＤ４細胞におけるＴｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）の画分は類似していた（図９Ｃ）。増殖している（Ｋｉ６７＋）ＳＰ−ＣＤ４及びｔｒｅｇ細胞のレベルは、ＨＵ／ＨＵ胸腺と比較して、ＳＷ／ＨＵ胸腺で高かった（図９Ｄ及び９Ｆ）。また、ＳＷ／ＨＵ胸腺Ｔｒｅｇのより高い画分は、ＣＤ４５ＲＯを発現した（図９Ｅ）。
【０１６１】
胸腺におけるＳＰ−ＣＤ４細胞及びＳＰ−ＣＤ８細胞の類似のレベルとは対照的に、ＳＷ／ＨＵマウスは、Ｔ細胞間のＣＤ８細胞と、末梢中のＣＤ４細胞間のＴｒｅｇの割合がより低かった（脾臓及びリンパ節、図９Ｉ〜９Ｋ）。この知見は、これらの細胞サブセットの両方が、それらが生存するために選択されたものと同じＭＨＣと相互作用する必要があることを示した。ＳＷ／ＨＵマウスの抹消のＣＤ４とＣＤ８の細胞サブセットの両方におけるメモリ変換に無感作の率がより高いことが明らかであった（図９Ｌ及び９Ｍ）。末梢ＣＤ４、ＣＤ８及びＴｒｅｇ細胞内のＫｉ６７＋（増殖）（図９Ｏ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（活性化）（図９Ｎ）、ＣＤ４５ＲＯ＋（図９Ｐ）、及びＣＴＬＡ−４＋細胞（図９Ｑ）は、ＨＵ／ＨＵとＳＷ／ＨＵとの間で異なっていなかった。
【０１６２】
これらの結果から、さらに、ハイブリッド胸腺を使用する必要性が実証された。
【０１６３】
実施例５−胚性幹細胞由来のＴＥＣ（ＥＳ−ＴＥＣ）を有するハイブリッド胸腺の作製及びハイブリッド胸腺におけるヒトＴＥＣの長期持続性
方法
２×１０５ヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋細胞を静脈内に注入した胸腺切除免疫不全ＮＳＧ（Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／Ｉｌｒ２ｇ−／−）マウスの腎カプセルの下に移植する前に、ヒト胎児又は小児胸腺間質細胞（ｈｕ−ＴＥＣ）又はｈＰＳＣ−ＴＥＣ前駆体（１〜２×１０５ＴＥＣ）を、胎児ブタ胸腺組織（ＳＷ ＴＨＹ）に注入した。対照には、ヒトＴＥＣを注入していない胎児ブタ胸腺組織を移植した。
【０１６４】
移植後約２０週の時点で、移植した胸腺を摘出し、切片化し、染色して、２光子共焦点顕微鏡を用いてヒトＴＥＣを検出した。
【０１６５】
次いで、細胞を間質から放出し、細胞の数をフローサイトメトリーによって決定した。
【０１６６】
結果
図１０に示すように、「ハイブリッド胸腺」におけるヒトＴＥＣは長期（２０週超）の持続性があった。図１０Ａに示すように、ヒトＴＥＣを注入しなかったブタ胸腺を含む全ての移植片（上部左パネル）は、ヒトＨＳＣ由来のＨＬＡ−ＤＲ＋ＡＰＣ（緑）及びブタ／ヒトＣＫ１４＋ＴＥＣ（赤）を有する。しかし、ハイブリッド胸腺のみが、検出可能なＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＫ１４＋ヒトＴＥＣを有していた（黄色、矢印を参照）。
【０１６７】
長期胸腺移植片からの消化した間質中のゲーティングしたＣＤ４５陰性細胞のフローサイトメトリー染色は、注入していないＳＷ ＴＨＹ移植片ではなく（図１０Ｂ、上部左）、ヒト胸腺（図１０Ｂ、頂部右）と、ｈＰＳＣ−ＴＥＣ前駆体を注入したＳＷ移植片（図１０Ｂ、底部左パネル）においてのみＥＰＣＡＭ＋、ＣＤ１０５陰性ｈｕ−ＴＥＣの存在を示した。図１０Ｃ参照。
【０１６８】
実施例６−ｈＥＳ−ＴＥＣのブタ胸腺への注入は、Ｔ細胞の発達を促進し、末梢のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させた
方法
２×１０５個のヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋細胞を静脈内注入した胸腺切除免疫不全ＮＳＧ（Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／Ｉｌｒ２ｇ−／−）マウスの腎カプセルの下に移植する前に、ｈＥＳ−ＴＥＣ（１〜２×１０５ＴＥＣ）を胎児ブタ胸腺組織（ＳＷ ＴＨＹ）に注入した。対照には、ヒトＴＥＣを注入せずに胎児ブタ胸腺組織を移植した。
【０１６９】
胸腺移植片からの脾細胞及び胸腺細胞を、移植後１８〜２２週の時点でフローサイトメトリーによって分析した。
【０１７０】
結果
図１１Ａ〜Ｄに示されるように、ｈＥＳ−ＴＥＣを注入した胸腺移植片は、脾臓の単核細胞において、より高い絶対数のヒト脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞として定義される最近の胸腺移出ＣＤ３１＋ＣＤ４＋未処理細胞を有していた。
【０１７１】
最終分化の最終段階を評価するために、胸腺細胞をＨｕＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯの発現について染色した。図１１Ｅに示すように、ｈＥＳ−ＴＥＣを注入した胸腺移植片は、より高い数の全胸腺細胞、並びにより高い数のヒトＣＤ４５細胞、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋、単一陽性ＣＤ４＋ＣＤ８−、ＣＤ４−ＣＤ８＋及び未成熟ＣＤ４５ＲＯ＋を有していた。
【０１７２】
本発明の範囲は、具体的に、上記に示し、記載したものに限定されるものではない。当業者は、図示した材料、構成、構造及び寸法の例に適切な代替物があることを認識するであろう。特許及び種々の刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の記載中で引用され、説明されている。このような参考文献の引用及び説明は、単に本発明の記載を明らかにするために提供されており、その参考文献が本明細書に記載の本発明の先行技術であることを認めるものではない。本明細書で引用及び説明した全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されるものの変形、修正及び他の実施態様を思いつくであろう。本発明のある実施形態を示し、記載したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。上記の事項は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定するものではない。
【図１Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000003
【図１Ｃ−Ｄ】
2022501042.tif 000004
【図１Ｅ】
2022501042.tif 000005
【図１Ｆ】
2022501042.tif 000006
【図１Ｇ】
2022501042.tif 000007
【図１Ｈ】
2022501042.tif 000008
【図２Ａ】
2022501042.tif 000009
【図２Ｂ】
2022501042.tif 000010
【図２Ｃ】
2022501042.tif 000011
【図３Ａ−１】
2022501042.tif 000012
【図３Ａ−２】
2022501042.tif 000013
【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ】
2022501042.tif 000015
【図３Ｃ】
2022501042.tif 000016
【図４】
2022501042.tif 000017
【図５Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000018
【図５Ｃ−Ｄ】
2022501042.tif 000019
【図５Ｅ−Ｆ】
2022501042.tif 000020
【図５Ｇ−Ｈ】
2022501042.tif 000021
【図５Ｉ−Ｊ】
2022501042.tif 000022
【図５Ｋ−Ｌ】
2022501042.tif 000023
【図６】
2022501042.tif 000024
【図７Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000025
【図８Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000026
【図９Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000027
【図９Ｃ−Ｄ】
2022501042.tif 000028
【図９Ｅ−Ｆ】
2022501042.tif 000029
【図９Ｇ−Ｈ】
2022501042.tif 000030
【図９Ｉ−Ｊ】
2022501042.tif 000031
【図９Ｋ−Ｌ】
2022501042.tif 000032
【図９Ｍ−Ｎ】
2022501042.tif 000033
【図９Ｏ−Ｐ】
2022501042.tif 000034
【図９Ｑ】
2022501042.tif 000035
【図１０Ａ】
2022501042.tif 000036
【図１０Ｂ】
2022501042.tif 000037
【図１０Ｃ】
2022501042.tif 000038
【図１１Ａ−Ｂ】
2022501042.tif 000039
【図１１Ｃ−Ｄ】
2022501042.tif 000040
【図１１Ｅ】
2022501042.tif 000041
【国際調査報告】
2022501042.tif 000042
2022501042.tif 000043
2022501042.tif 000044