(57)【要約】本発明は、体細胞核移植（SCNT）によって生成された任意の胚の細胞を含む細胞内で生理学的なX染色体不活性化（XCI）を再現するための組成物および方法を特徴とする。1つの局面において、本発明は、SCNTにより生成された胚において生理学的なX染色体不活性化を発生させる方法であって、SCNTを通じて生成された胚に、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドまたは該デメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを注射する工程を含む方法を特徴とする。本明細書には、H3K27me3特異的デメチラーゼをコードする遺伝子の発現を増加させるまたはヒトH3K27me3特異的デメチラーゼの活性を増加させる剤を含む方法、組成物およびキットが開示される。2022501012.tif 000014
2022501012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞核移植（SCNT）により生成された胚において生理学的なX染色体不活性化を発生させるための方法であって、SCNTを通じて生成された胚に、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドまたは該デメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを注射する工程を含む、方法。
【請求項２】
H3K27me3特異的デメチラーゼをコードするmRNAが胚に注射される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
約1000〜2000 ng/μLのmRNAが胚に注射される、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
1800 ng/μLのmRNAが胚に注射される、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
X染色体が体細胞由来のドナー核に存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
ドナー核が卵母細胞または胚性幹細胞に移植される、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、H3K27me3特異的デメチラーゼの酵素活性フラグメントをコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが哺乳類発現ベクター中に存在する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類発現ベクターが、プロモーターにより指示される、H3K27me3特異的デメチラーゼの構成性または誘導性発現を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
注射されるポリペプチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
X連鎖遺伝子の発現を減少させる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
X染色体刷り込みを回避する遺伝子の発現を有意に変化させない、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
常染色体の遺伝子発現を有意に変化させない、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約35〜60％を上回る、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約50％を上回る、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
胚が初期胚盤胞ステージの胚である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
胚が成体体細胞由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
体細胞がヒト対象から得られる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
胚由来の細胞を培養して、ヒト対象への移植に適した組織を得る工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1に記載の方法により生成される、胚盤胞。
【請求項２２】
請求項20に記載の方法により生成される、細胞または組織。
【請求項２３】
請求項1に記載の胚盤胞を宿主の子宮に着床させることにより生成される、クローン生物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
げっ歯類を含む特定の獣亜綱哺乳類（therian mammals）の雌において、2つのX染色体の一方は、遺伝子量補償を達成するために不活性化される。発生の間に、X染色体不活性化（XCI）は、刷り込みまたは無作為様式で起こり得る。刷り込みXCI（imprinted XCI）において、父性X染色体（Xp）は、着床前発生の間に選択的に不活性化される。刷り込みXCIは胚外細胞系統においても維持されるが、それは後期胚盤胞の前エピブラスト細胞系統において失われる。着床直後（peri-implantation）のステージにおいて、エピブラスト細胞は無作為XCIを起こし、Xpまたは母性X染色体（Xm）のいずれかをサイレンシングする。これまでの研究は、刷り込みおよび無作為の両XCIにおけるX連鎖長鎖非コードRNAであるXistの重要な役割を示している。Xist RNAは、インシス（in cis）でX染色体を覆い不活性化することによりXCIに関与する。
【０００２】
着床前発生の間にXpを選択的にサイレンシングするために、Xistは、長きにわたって考察されているが未だ判明していない機構により、Xmに刷り込まれる。核移植アプローチを用いたこれまでの研究は、Xistのゲノム刷り込みが卵形成の間に確立することを示唆している。しかし、DNAメチルトランスフェラーゼ母性ノックアウト胚の分析は、卵母細胞DNAのメチル化がXist刷り込みに必須でないことを明らかにした。最近の研究は、単為生殖（PG）胚におけるH3K9me3デメチラーゼであるKdm4bの過剰発現がXistを部分的に抑制解除することを示し、これにより刷り込みXistサイレンシングにおけるH3K9me3の関与が示唆された。しかし、PG胚が1つの母性対立遺伝子の非生理学的なXist抑制解除を起こすという事実は、H3K9me3欠失PG胚において観察される抑制解除効果が生理学的に関連しているのかどうかという疑問を生じさせる。最近、母性H3K27me3がDNAメチル化非依存的常染色体遺伝子刷り込みにおける刷り込み印として機能することが発見された。
【０００３】
そのような観察は、体細胞由来のドナー核が除核卵母細胞に移植される治療的および生殖的クローン化に関連する。このプロセスは、体細胞核移植（SCNT）と呼ばれ、体細胞と除核卵母細胞の融合、除核卵母細胞への核の注射、または任意の他の方法により達成され得る。現在のところ、SCNTの約1パーセントしか、生きた胚の生成に成功しない。このSCNTの低い成功率は、刷り込みの欠陥に関連する。したがって、SCNTの成功率を高めるためおよび刷り込みの欠陥を修復するための、新規の組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載されるように、本発明は、SCNTによって生成された任意の胚の細胞を含む細胞内で生理学的なX染色体不活性化（XCI）を再現するための組成物および方法を特徴とする。
【０００５】
1つの局面において、本発明は、体細胞核移植（SCNT）により生成された胚において生理学的なX染色体不活性化を発生させるための方法であって、SCNTを通じて生成された胚に、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドまたは該デメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを注射する工程を含む方法を特徴とする。1つの態様において、H3K27me3特異的デメチラーゼをコードするmRNAが胚に注射される。別の態様において、前記ポリヌクレオチドはKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドをコードする。別の態様において、約1000〜約2000 ng/μLのmRNAが胚に注射される。別の態様において、1800 ng/μLのmRNAが胚に注射される。別の態様において、X染色体が体細胞由来のドナー核に存在する。別の態様において、ドナー核は卵母細胞または胚性幹細胞に移植される。別の態様において、前記ポリヌクレオチドは、H3K27me3特異的デメチラーゼの酵素活性フラグメントをコードする。別の態様において、前記ポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクター中に存在する。別の態様において、哺乳類発現ベクターは、プロモーターにより指示されるH3K27me3特異的デメチラーゼの構成性または誘導性発現を含む。別の態様において、注射されるポリペプチドはKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cである。別の態様において、前記方法は、X連鎖遺伝子の発現を減少させる。別の態様において、前記方法は、X染色体刷り込みを回避する遺伝子の発現を有意に変化させない。別の態様において、前記方法は、常染色体の遺伝子発現を有意に変化させない。別の態様において、X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスは約35〜60％を上回る。別の態様において、X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスは約50％を上回る。他の態様において、胚は初期胚盤胞ステージの胚または成体体細胞由来である。別の態様において、体細胞はヒト対象から得られる。別の態様において、前記方法は、胚由来の細胞を培養してヒト対象への移植に適した組織を得る工程をさらに含む。
【０００６】
別の局面において、本発明は、前記方法により生成される胚盤胞を特徴とする。
【０００７】
別の局面において、本発明は、前記方法により生成される細胞または組織を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、前記局面の胚盤胞を宿主の子宮に着床させることにより生成されるクローン生物を特徴とする。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１０】
定義
それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における当業者によって一般に理解されている意味を有する。以下の参考例は、本発明において使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、それ以外のことが示されていない限り、以下でそれらに割り当てられる意味を有する。
【００１１】
「H3K27me3特異的デメチラーゼ」は、トリメチル化H3 'Lys-27を特異的に脱メチル化するタンパク質を意味する。例示的なデメチラーゼは、Kdm6a、Kdm6bおよびKdm6cを含む。
【００１２】
「KDM6Aポリペプチド」（リシン特異的デメチラーゼ6A、ヒストンデメチラーゼUTXとも呼ばれる）は、NCBI参照配列：O15550.2で提供される配列またはそのフラグメントに対して少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有し、かつデメチラーゼ活性を有するタンパク質を意味する。例示的なKDM6Aアミノ酸配列を、以下に提供する。
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【００１３】
「KDM6Aポリヌクレオチド」は、KDM6Aポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なKDM6Aポリヌクレオチド配列は、NM_001291415.1で提供される。
【００１４】
「KDM6Bポリペプチド」（リシン特異的デメチラーゼ6、JmjCドメイン含有タンパク質3とも呼ばれる）は、NCBI参照配列：O15054.4で提供される配列またはそのフラグメントに対して少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有し、かつデメチラーゼ活性を有するタンパク質を意味する。例示的なKDM6Bアミノ酸配列を、以下に提供する。
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【００１５】
「KDM6Bポリヌクレオチド」は、KDM6Bポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なKDM6Bポリヌクレオチド配列は、NM_001080424.2で提供され、それを以下に再掲載する。
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【００１６】
「KDM6Cポリペプチド」（ヒストンデメチラーゼUTY、Y染色体上で遍在的に転写されるTPRタンパク質とも呼ばれる）は、NCBI参照配列：O14607.2で提供される配列またはそのフラグメントに対して少なくとも約85％のアミノ酸同一性を有し、かつデメチラーゼ活性を有するタンパク質を意味する。例示的なKDM6Cアミノ酸配列を、以下に提供する。
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【００１７】
「KDM6Cポリヌクレオチド」は、KDM6Cポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なKDM6Aポリヌクレオチド配列は、NM_001258249.1で提供され、その配列を以下に再掲載する。
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【００１８】
「リシン27トリメチル化ヒストンH3（H3K27me3）」は、ヒストンH3タンパク質サブユニット上のリシン27のトリメチル化を意味する。H3K27me3修飾は通常、遺伝子抑制に関連する。
【００１９】
「剤」は、ペプチド、核酸分子または小化合物を意味する。
【００２０】
「対立遺伝子」は、染色体上の同じ位置で見いだされる遺伝子の2つまたはそれ以上の代替形態のうちの一方を意味する。
【００２１】
「変更（alteration）」は、標準的な当技術分野で公知の方法、例えば本明細書に記載されるものによって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における変化（change）（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、変更は、発現レベルの10％の変化、好ましくは発現レベルの25％の変化、より好ましくは40％の変化、最も好ましくは50％またはそれ以上の変化を含む。
【００２２】
「改善」は、疾患の進展または進行の減少、抑制、減衰、軽減、停止または安定化を意味する。
【００２３】
「胞胚」という用語は、本明細書で使用される場合、卵割腔と呼ばれる体液で満たされた空洞を囲む細胞の中空の球体からなる胚発生における初期ステージを表す。胞胚という用語は、ときどき、胚盤胞と言い換え可能に使用される。
【００２４】
「割球」という用語は、本明細書を通じて、着床前の胚から得られる少なくとも1つの割球（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ等）を表すために使用される。「2つまたはそれ以上の割球のクラスター」という用語は、「割球由来派生物（blastomere-derived outgrowth）」と言い換え可能に使用され、割球のインビトロ培養の間に生成される細胞を表す。例えば、割球がSCNT胚から得られ、初期培養が行われた後、それは通常、少なくとも1回分裂して2つまたはそれ以上の割球のクラスター（割球由来派生物としても公知）を生じる。このクラスターはさらに、胚性または胎児性細胞と共に培養され得る。究極的に、割球由来派生物は、分裂を続けるであろう。これらの構造から、この培養法の過程でES細胞、全能性幹（TS）細胞および部分分化細胞型が発生するであろう。
【００２５】
「クローン化された（またはクローン化する）」という用語は、本明細書で使用される場合、別の個体単位と同一の遺伝子セットを有する新たな個体単位を生成するための遺伝子操作技術を表す。本発明において、「クローン化された」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞、胚性細胞、胎児性細胞、および／または動物細胞が別の細胞、胚性細胞、胎児性細胞、分化細胞および／または動物細胞の核DNA配列と実質的に類似または同一の核DNA配列を有することを表す。「実質的に類似」および「同一」という用語は、本明細書に記載されている。クローン化されたSCNT胚は、核移植から生じ得る、あるいは、クローン化されたSCNT胚は、少なくとも1つの再クローン化工程を含むクローン化プロセスから生じ得る。
【００２６】
本願において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（containing）」および「有する」等は、米国特許法におけるそれらにしたがう意味を有し得、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得；「から本質的になる」または「本質的になる」も同様に米国特許法にしたがう意味を有し、この用語は開放型であり、言及されているその基本的または新規の特徴が言及されている以外のものの存在によって変化しない限り、言及されている以外のものの存在を許容するが、先行技術の態様は除外する。
【００２７】
「検出」は、検出される分析物の存在、非存在または量の特定を表す。
【００２８】
「疾患」は、細胞、組織または臓器の正常な機能または発生にダメージを与えるまたはそれらを妨げる任意の状態または障害を意味する。障害の例は、胚におけるX染色体刷り込みの故障を伴う欠陥（例えば、発生上の欠陥、生命力の喪失）を含む。
【００２９】
「DNA」は、デオキシリボ核酸を意味する。様々な態様において、DNAという用語は、ゲノムDNA、組み換えDNAまたはcDNAを表す。特定の態様において、DNAは、「標的領域」を含む。本明細書で想定されているDNAライブラリは、ゲノムDNAライブラリ、およびRNAから構築されるcDNAライブラリ、例えばRNA発現ライブラリを含む。様々な態様において、DNAライブラリは、1つまたは複数のさらなるDNA配列および／またはタグを含む。
【００３０】
「有効量」は、細胞を生理学的に正常な状態に回復させるために必要な剤の量を意味する。1つの態様において、剤の有効量は、刷り込み欠陥を修復するためにおよび生理学的に正常な刷り込み表現型を細胞に与えるために必要な量である。1つの態様において、Kdm6b mRNAの注射は、異常なおよび／または望ましくないX染色体不活性化を伴う刷り込み欠陥を修復するのに十分である。疾患の治療的処置のために本発明を実施する上で使用される活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重および全般的健康によって異なる。最終的に、担当の医師または獣医が、適切な量および投与計画を決定するであろう。そのような量は、「有効」量として参照される。
【００３１】
「胚」は、  を意味する。
【００３２】
「フラグメント」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％を含む。フラグメントは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000ヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００３３】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その本来の状態で見いだされるそれに通常付随する成分が様々な程度取り除かれた物質を表す。「単離する」は、元の供給源または環境からの一定程度の分離を意味する。「精製する」は、単離よりも高度な分離の程度を意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、何らかの不純物がそのタンパク質の生物学的特性に実質的に影響するまたは他の悪い結果をもたらすことがないよう他の物質を実質的に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、細胞物質、ウイルス物質、組み換えDNA技術によって生成された場合は培養培地、または化学合成された場合は化学前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない場合に、精製されている。純度および均質度は典型的に、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質の場合、異なる修飾は、個別に分離され得る異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【００３４】
「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子の由来となった生物の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、DNA）を意味する。したがってこの用語は、例えば、ベクターに、自律複製プラスミドもしくはウイルスに、もしくは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた、または他の配列から独立した個別分子（例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるcDNAもしくはゲノムもしくはcDNAフラグメント）として存在する組み換えDNAを含む。加えて、この用語は、DNA分子から転写されたRNA分子、および追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えDNAを含む。
【００３５】
「単離されたポリペプチド」は、自然状態でそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、重量で少なくとも60％が自然状態でそれに付随するタンパク質および天然有機分子を含まない場合に、単離されている。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％が、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって、またはそのタンパク質を化学的に合成することによって取得され得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定され得る。
【００３６】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内のすべての値の簡略表記であることが理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50を含む群の任意の値、値の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
【００３７】
「減少する」は、少なくとも10％、25％、50％、75％または100％の負の変更を意味する。
【００３８】
「参照」は、標準または対照条件を意味する。
【００３９】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたは全体、例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドもしくは約300ヌクレオチドまたはその付近もしくはその間の任意の整数である。
【００４０】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と100％同一であることを必要としないが、典型的に、実質的な同一性を示すであろう。内因性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と100％同一であることを必要としないが、典型的に、実質的な同一性を示すであろう。内因性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」は、様々なストリンジェンシーの条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）またはその一部分との間で二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照のこと）。
【００４１】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750 mM未満のNaClおよび約75 mM未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500 mM未満のNaClおよび約50 mM未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250 mM未満のNaClおよび約25 mM未満のクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で行われ得、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％のホルムアミドの存在下で行われ得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。追加パラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、およびキャリアDNAの含有または非含有の変更は、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウムおよび1％ SDS中、30℃で行われる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1％ SDS、35％ホルムアミドおよび100μg/ml変性処理済サケ精液DNA（ssDNA）中、37℃で行われる。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1％ SDS、50％ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中、42℃で行われる。これらの条件に関する有用なバリエーションは、当業者に直ちに明らかになるであろう。
【００４２】
ほとんどの場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーごとに異なる。洗浄ストリンジェンシーの条件は、塩濃度によっておよび温度によって定義され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによってまたは温度を上昇させることによって上昇し得る。例えば、洗浄工程におけるストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約30 mM未満のNaClおよび約3 mM未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約15 mM未満のNaClおよび約1.5 mM未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄工程におけるストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい態様において、洗浄工程は、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％ SDS中、25℃で行われる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％ SDS中、42℃で行われる。より好ましい態様において、洗浄工程は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％ SDS中、68℃で行われる。これらの条件に関するさらなるバリエーションは、当業者に直ちに明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis（Science 196:180, 1977）；Grunstein and Hogness（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975）；Ausubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001）；Berger and Kimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York）；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００４３】
「体細胞核移植」または「SCNT」は、除核卵母細胞への体細胞由来のドナー核の移植を意味する。このプロセスは、生殖的または治療的のいずれかのクローン化において使用され得、体細胞と除核卵母細胞の融合、除核卵母細胞への核の注射または任意の他の方法によって達成され得る。
【００４４】
体細胞の核は遺伝情報を提供し、卵母細胞は胚の発生に必要な栄養および他のエネルギー生成物質を提供する。融合が起こると、細胞は全能性になり、最終的に胚盤胞に発生し、この時点で内部細胞塊が単離される。
【００４５】
「核移植」という用語は、本明細書で使用される場合、除核卵母細胞と体細胞の細胞核遺伝物質または核を人為的に組み合わせることによって同一の特徴および特質を獲得する遺伝子操作技術を表す。いくつかの態様において、核移植手順は、ドナー体細胞由来の核または核遺伝物質を除核卵または卵母細胞（核／前核を取り除いた卵または卵母細胞）に移植するものである。ドナー核は、体細胞から取得され得る。
【００４６】
「核遺伝物質」という用語は、その個体についての情報をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含む核内で見いだされる構造物および／または分子を表す。核遺伝物質は、染色体およびクロマチンを含む。この用語はまた、細胞分裂、例えば親細胞から娘細胞への細胞分裂により生成される核遺伝物質（例えば、染色体）も表す。核遺伝物質は、ミトコンドリアDNAを含まない。
【００４７】
「SCNT胚」という用語は、体細胞の核または核遺伝物質と融合された除核卵母細胞の細胞またはその全能性子孫を表す。SCNT胚は胚盤胞に発生し、着床後から生きた子孫に発生し得る。SCNT胚は、1細胞胚、2細胞胚、4細胞胚または胚盤胞になる前の任意のステージの胚であり得る。
【００４８】
「ドナーヒト細胞」または「ドナーヒト体細胞」という用語は、核アクセプターまたはレシピエントとしてのレシピエント卵母細胞に移植されるヒト細胞の体細胞または核を表す。
【００４９】
「体細胞」という用語は、生殖性の細胞または生殖性の細胞前駆体でない植物または動物細胞を表す。いくつかの態様において、分化した細胞は、生殖細胞ではない。体細胞は、多能性または全能性細胞に関連しない。いくつかの態様において、体細胞は、胚に存在せずまたは胚から得られず、かつインビトロでのそのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する「非胚性体細胞」である。いくつかの態様において、体細胞は、胚もしくは胎児でない生物中に存在するもしくは胚もしくは胎児でない生物から得られるまたはインビトロでのそのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する「成体体細胞」である。
【００５０】
「卵母細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、減数分裂の第2中期に達した成熟卵母細胞を表す。卵母細胞はまた、生殖に関与する雌性配偶子または生殖細胞を表すために使用され、一般に卵とも呼ばれる。成熟卵は、単一の母性染色体のセット（23本、ヒト霊長類においてはＸ）を有し、第2中期で休止する。
【００５１】
「ハイブリッド卵母細胞」は、第1のヒト卵母細胞（「レシピエント」と呼ばれる）由来の細胞質を有するが、そのレシピエント卵母細胞の核遺伝物質を有さず、「ドナー」と呼ばれる別のヒト細胞由来の核遺伝物質を有する除核卵母細胞を表す。いくつかの態様において、ハイブリッド卵母細胞はまた、レシピエント卵母細胞由来ではなく、（核遺伝物質と同じドナー細胞であり得る、または異なるドナー由来、例えばドナー卵母細胞由来であり得る）ドナー細胞由来であるミトコンドリアDNA（mtDNA）を含み得る。
【００５２】
「除核卵母細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、その核が取り除かれたヒト卵母細胞を表す。
【００５３】
「除核」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の核物質を取り除き、細胞質のみを残すプロセスを表す。卵に適用される場合、除核は、核膜によって囲まれていない、母性染色体の除去を表す。「除核卵母細胞」という用語は、核物質または核が取り除かれた卵母細胞を表す。
【００５４】
「レシピエントヒト卵母細胞」は、本明細書で使用される場合、その本来の核を取り除いた後に、ヒト核ドナー細胞から核を受け取るヒト卵母細胞を表す。
【００５５】
「融合」という用語は、本明細書で使用される場合、核ドナー細胞とレシピエント卵母細胞の脂質膜の結合を表す。例えば、脂質膜は、細胞の原形質膜または核膜であり得る。融合は、それらが相互に隣接して配置されている場合または核ドナー細胞がレシピエント卵母細胞の囲卵腔に配置されている場合、核ドナー細胞とレシピエント卵母細胞の間への電気刺激の適用により起こり得る。
【００５６】
「生きた子孫」という用語は、本明細書で使用される場合、子宮外（ex utero）で生存することができる動物を意味する。好ましくは、それは、1秒間、1分間、1日、1週間、1ヶ月間、6ヶ月間または1年超にわたって生存することができる動物である。動物は、生存のために子宮内（in utero）環境を必要としないものであり得る。
【００５７】
「出生前」という用語は、誕生前に存在することまたは起こることを表す。同様に、「出生後」という用語は、誕生後に存在することまたは起こることを表す。
【００５８】
「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書で使用される場合、別の生物由来の遺伝物質を実験的に移植し、宿主が移植された遺伝子の遺伝的特性をその染色体組成に取り込んだ生物を表す。
【００５９】
「着床させる」という用語は、本明細書に開示されるSCNT胚を参照して本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるSCNT胚で代理雌動物を妊娠させることを表す。この技術は、当業者に周知である。例えば、Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairymanを参照のこと。胚は、子宮内で発生することが可能であり得る、あるいは、胎児は、分娩前に子宮環境から取り出され得る。
【００６０】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば農業的に重要な哺乳類（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）または希少もしくは絶滅危惧哺乳類（例えば、パンダ）を含むがこれらに限定されない哺乳類を意味する。
【００６１】
「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列の任意の1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列の任意の1つ）に対して少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を表す。好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸で、少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％さらには99％同一である。
【００６２】
配列同一性は、典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または修飾に対して相同度を割り当てることによって同一または類似の配列を照合する。保存的置換は、典型的に、以下のグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一度の決定に関する例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムは、近い関係性の配列を示すe-3〜e-100の間のプロバビリティスコアで使用され得る。
【００６３】
「体細胞核移植」または「SCNT」は、除核卵母細胞への体細胞由来のドナー核の移植を意味する。このプロセスは、生殖的または治療的のいずれかのクローン化において使用され得、体細胞と除核卵母細胞の融合、除核卵母細胞への核の注射または任意の他の方法によって達成され得る。
【００６４】
体細胞の核は遺伝情報を提供し、卵母細胞は胚の発生に必要な栄養および他のエネルギー生成物質を提供する。融合が起こると、細胞は全能性になり、最終的に胚盤胞に発生し、この時点で内部細胞塊が単離される。
【００６５】
「核移植」という用語は、本明細書で使用される場合、除核卵母細胞と体細胞の細胞核遺伝物質または核を人為的に組み合わせることによって同一の特徴および特質を獲得する遺伝子操作技術を表す。いくつかの態様において、核移植手順は、ドナー体細胞由来の核または核遺伝物質を除核卵または卵母細胞（核／前核を取り除いた卵または卵母細胞）に移植するものである。ドナー核は、体細胞から取得され得る。
【００６６】
「核遺伝物質」という用語は、その個体についての情報をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含む核内で見いだされる構造物および／または分子を表す。核遺伝物質は、染色体およびクロマチンを含む。この用語はまた、細胞分裂、例えば親細胞から娘細胞への細胞分裂により生成される核遺伝物質（例えば、染色体）も表す。核遺伝物質は、ミトコンドリアDNAを含まない。
【００６７】
「SCNT胚」という用語は、体細胞の核または核遺伝物質と融合された除核卵母細胞の細胞またはその全能性子孫を表す。SCNT胚は胚盤胞に発生し、着床後から生きた子孫に発生し得る。SCNT胚は、1細胞胚、2細胞胚、4細胞胚または胚盤胞になる前の任意のステージの胚であり得る。
【００６８】
「ドナーヒト細胞」または「ドナーヒト体細胞」という用語は、核アクセプターまたはレシピエントとしてのレシピエント卵母細胞に移植されるヒト細胞の体細胞または核を表す。
【００６９】
「体細胞」という用語は、生殖性の細胞または生殖性の細胞前駆体でない動物細胞を表す。いくつかの態様において、分化した細胞は、生殖細胞ではない。体細胞は、多能性または全能性細胞に関連しない。いくつかの態様において、体細胞は、胚に存在せずまたは胚から得られず、かつインビトロでのそのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する「非胚性体細胞」である。いくつかの態様において、体細胞は、胚もしくは胎児でない生物中に存在するもしくは胚もしくは胎児でない生物から得られるまたはインビトロでのそのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する「成体体細胞」である。
【００７０】
「卵母細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、減数分裂の第2中期に達した成熟卵母細胞を表す。卵母細胞はまた、生殖に関与する雌性配偶子または生殖細胞を表すために使用され、一般に卵とも呼ばれる。成熟卵は、単一の母性染色体のセット（23本、ヒト霊長類においてはＸ）を有し、第2中期で休止する。
【００７１】
「ハイブリッド卵母細胞」は、第1のヒト卵母細胞（「レシピエント」と呼ばれる）由来の細胞質を有するが、そのレシピエント卵母細胞の核遺伝物質を有さず、「ドナー」と呼ばれる別のヒト細胞由来の核遺伝物質を有する除核卵母細胞を表す。いくつかの態様において、ハイブリッド卵母細胞はまた、レシピエント卵母細胞由来ではなく、（核遺伝物質と同じドナー細胞であり得る、または異なるドナー由来、例えばドナー卵母細胞由来であり得る）ドナー細胞由来であるミトコンドリアDNA（mtDNA）を含み得る。
【００７２】
「除核卵母細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、その核が取り除かれたヒト卵母細胞を表す。
【００７３】
「除核」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の核物質を取り除き、細胞質のみを残すプロセスを表す。卵に適用される場合、除核は、核膜によって囲まれていない、母性染色体の除去を表す。
【００７４】
「レシピエントヒト卵母細胞」は、本明細書で使用される場合、その本来の核を取り除いた後に、ヒト核ドナー細胞から核を受け取るヒト卵母細胞を表す。
【００７５】
「融合」という用語は、本明細書で使用される場合、核ドナー細胞とレシピエント卵母細胞の脂質膜の結合を表す。例えば、脂質膜は、細胞の原形質膜または核膜であり得る。融合は、それらが相互に隣接して配置されている場合または核ドナー細胞がレシピエント卵母細胞の囲卵腔に配置されている場合、核ドナー細胞とレシピエント卵母細胞の間への電気刺激の適用により起こり得る。
【００７６】
「生きた子孫」という用語は、本明細書で使用される場合、子宮外で生存することができる動物を意味する。好ましくは、それは、1または数時間、1日、1週間、1ヶ月間、6ヶ月間または1年超にわたって生存することができる動物である。動物は、生存のために子宮内環境を必要としないものであり得る。
【００７７】
「出生前」という用語は、誕生前に存在することまたは起こることを表す。同様に、「出生後」という用語は、誕生後に存在することまたは起こることを表す。
【００７８】
「胚盤胞」という用語は、本明細書で使用される場合、約30〜150細胞の、有胎盤哺乳類内の着床前（マウスにおいては受精から約3日後、ヒトにおいては受精から約5日後）の胚を表す。胚盤胞ステージは、桑実胚ステージの後に続き、その特有の形態により区別され得る。胚盤胞は、細胞の層（栄養外胚葉）、体液で満たされた空洞（胞胚腔または胚盤胞腔）および内部の細胞のクラスター（内部細胞塊またはICM）から構成される球体からなる。未分化細胞からなるICMは、胚盤胞が子宮内に着床した場合、胎児に成長するものを生じる。これらの同じICM細胞は、培養下で成長させた場合、胚性幹細胞株を生じ得る。着床の際、マウス胚盤胞は、約70個の栄養膜細胞および30個のICM細胞から構成される。
【００７９】
「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書で使用される場合、別の生物由来の遺伝物質を実験的に移植し、宿主が移植された遺伝子の遺伝的特性をその染色体組成に取り込んだ生物を表す。
【００８０】
「着床させる」という用語は、本明細書に開示されるSCNT胚を参照して本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるSCNT胚で代理雌動物を妊娠させることを表す。この技術は、当業者に周知である。例えば、Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairymanを参照のこと。胚は、子宮内で発生することが可能であり得る、あるいは、胎児は、分娩前に子宮環境から取り出され得る。
【００８１】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば農業的に重要な哺乳類（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）または希少もしくは絶滅危惧哺乳類（例えば、パンダ）を含むがこれらに限定されない哺乳類を意味する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「処置する（treat）」、「処置する（treating）」、「処置」等の用語は、障害および／またはそれに付随する症状の軽減または改善を表す。それを排除するものではないが、障害または状態の処置は、その障害、状態またはそれらに付随する症状を完全に消滅させることを必要としないことが理解されるであろう。1つの態様において、「処置する」という用語は、SCNT胚における刷り込み欠陥の処置を表す。
【００８３】
個別に言及されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または、もしくは」という用語は、包含的であると理解される。個別に言及されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「a」、「an」および「the」という用語は、単数または複数であると理解される。
【００８４】
個別に言及されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または、もしくは」という用語は、包含的であると理解される。個別に言及されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「a」、「an」および「the」という用語は、単数または複数（すなわち、少なくとも1つ）であると理解される。例として、「要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００８５】
個別に言及されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における普通許容度の範囲内、例えば、平均の2標準偏差内と理解される。約は、示されている値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％内と理解され得る。そうでないことが文脈から明らかでない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。
【００８６】
本明細書の可変基の定義において化学基のリストが示されている場合、その可変基が、任意の単一の基または列挙されている基の組み合わせとして定義されていることが含まれる。本明細書において可変基または局面の態様が示されている場合、任意の単一の態様としてのその態様または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わされたその態様が含まれる。
【００８７】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される任意の他の組成物および方法の1つまたは複数と組み合わされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図1A〜1Dは、H3K9me3の異所的除去が母性Xist発現を誘導しなかったことを示す。図1Aは、抗H3K9me3抗体で染色された受精卵の代表的画像を示す。（M）母性前核；（P）父性前核。棒グラフは、母性前核の相対的H3K9me3シグナル強度を示す。注射なしの受精卵の平均シグナル強度を1.0に設定した。試験した胚の総数は、8（注射なし）、9（1000 ng/μL Kdm4b）および9（2600 ng/μL Kdm4b）であった。エラーバーは、標準誤差（SE）を示す。（***）P<0.001；（*）P<0.05、両側スチューデントt検定。図1Bは、Kdm4bを注射した4細胞胚におけるXist RNA FISH（マジェンダ色）の代表的画像を示す。各胚の性を、Rnf12座に対する同時DNA FISH（灰色）により評価した。矢印は割球を示しており、これは下パネルで拡大表示されている。図1Cは、雄胚における示された数のXist RNAクラウドおよびスポットを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雄胚の数は、6（注射なし）、5（1000 ng/μL Kdm4b）および12（2600 ng/μL Kdm4b）であった。図1Dは、雌胚における示された数のXist RNAクラウドおよびスポットを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雄胚の数は、6（注射なし）、6（1000 ng/μL Kdm4b）および8（2600 ng/μL Kdm4b）であった。
【図１Ｂ】図1Aの説明を参照されたい。
【図１Ｃ】図1Aの説明を参照されたい。
【図１Ｄ】図1Aの説明を参照されたい。
【図２Ａ】図2A〜2Cは、卵母細胞および着床前の胚において母性H3K27me3がXistを被覆したことを示す。図2Aは、Xist座におけるH3K27me3 ChIP-seq（Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079）、DNase I-seq（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）およびDNAメチル化レベル（Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440）のゲノムブラウザビューを示す。（Oo）MII卵母細胞；（Sp）精液；（7d）7日齢の雌から採取された成長中の卵母細胞；（14d）14日齢の雌から採取された成長中の卵母細胞；（GV）十分に成長したGVステージの卵母細胞。図2Bは、Xist座における1細胞、2細胞、および胚盤胞の胚ならびにE6.5エピブラストの対立遺伝子H3K27me3のゲノムブラウザビューを示す。強調表示された四角は、H3K27me3の豊富さの母性対立遺伝子バイアスが胚盤胞の胚において保持されているコンピュータにより決定された領域を示す。（Mat）母性対立遺伝子；（Pat）父性対立遺伝子。H3K27me3 ChIP-seqデータセットは、Zheng et al.（2016; Mol Cell 63: 1066-1079）に記載されている。図2Cは、胚盤胞の胚におけるXist座の高解像度ビューを示す。母性対立遺伝子バイアスがかかったH3K27me3ドメインが影付き表示されている。
【図２Ｂ】図2Aの説明を参照されたい。
【図２Ｃ】図2Aの説明を参照されたい。
【図３Ａ】図3A〜3Eは、H3K27me3の消失が母性Xist発現を誘導したことを示す。図3Aは、抗H3K27me3抗体で染色された受精卵の代表的画像を示す。（M）母性前核、（P）父性前核。棒グラフは、母性前核の相対的H3K27me3シグナル強度を示す。Kdm6bMUTを注射した受精卵の平均シグナルを1.0に設定した。試験した胚の総数は、15（Kdm6bMUT）および13（Kdm6bWT）であった。エラーバーは、標準誤差（SE）を示す。（***）P<0.001、両側スチューデントt検定。図3Bは、Kdm6bWTを注射した桑実胚の胚における母性H3K27me3 ChIP-seqシグナルの消失を示すXist座のゲノムブラウザビューである。（Mat）母性対立遺伝子；（Pat）父性対立遺伝子。図3Cは、Kdm6bを注射した4細胞胚におけるXist RNA FISH（薄灰色）の代表的画像を示す。各胚の性を、Rnf12座に対する同時DNA FISH（灰色）により評価した。図3Dは、雄4細胞胚における示された数のXist RNAクラウドおよびスポットを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雄胚の数は、8（Kdm6bMUT）および15（Kdm6bWT）であった。図3Eは、雌4細胞胚における示された数のXist RNAクラウドおよびスポットを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雄胚の数は、8（Kdm6bMUT）および12（Kdm6bWT）であった。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照されたい。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照されたい。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照されたい。
【図３Ｅ】図3Aの説明を参照されたい。
【図４Ａ】図4A〜4Eは、H3K27me3の消失が母性X染色体不活性化（XCI）を誘導したことを示す。図4Aは、Kdm6WTを通じた母性Xist発現により引き起こされる母性XCIを示す図である。図4Bは、Kdm6bを注射した桑実胚の胚におけるXist RNA FISH（薄灰色）の代表的画像を示す。各胚の性を、Rnf12座に対する同時DNA FISH（灰色）により評価した。図4Cは、雄の桑実胚の胚における示された数のXist RNAクラウドを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雄胚の数は、19（Kdm6bMUT）および35（Kdm6bWT）であった。図4Dは、雌の桑実胚の胚における示された数のXist RNAクラウドを有する割球の比を示すグラフを示す。各バーは、個々の胚を表す。試験した雌胚の数は、34（Kdm6bMUT）および35（Kdm6bWT）であった。図4Eは、Kdm6bMUT注射胚盤胞とKdm6bWT注射胚盤胞の間の個々の母性染色体における遺伝子の相対発現を示す箱ひげ図を示す。十分なSNPリード（SNPリード＞10、RPM［百万あたりのリード数］＞0.5）を有する遺伝子を分析した。箱内の中央の線は、中央値を示す。箱の縁およびひげは、それぞれ、25/75および2.5/97.5パーセンタイルを示す。（***）P<0.001、マン・ホイットニー・ウィルコクソン検定。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照されたい。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照されたい。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照されたい。
【図４Ｅ】図4Aの説明を参照されたい。
【図５】図5Aおよび5Bは、着床前の胚において異所性Kdm6bWT mRNA注射がH3K27me3を減少させたことを示す。これらの結果は、図3A〜3Eに示されている結果に関連する。図5Aは、H3K27me3抗体で免疫染色されたKdm6bを注射された4細胞および桑実胚の胚の代表的画像を示す。Kdm6b mRNAを受精卵に注射した。胚を、受精から46（4細胞）および78（桑実胚）時間後に固定した。図5Bは、相対的H3K27me3シグナル強度を示すグラフである。複数の割球のシグナル強度を測定し、これを平均して単一の胚の値を得た。Kdm6bMUT胚の平均シグナルを1.0に設定した。試験した胚の総数は、4細胞については9（Kdm6bMUT）および9（Kdm6bWT）、ならびに桑実胚については19（Kdm6bMUT）および22（Kdm6bWT）であった。エラーバーは、標準誤差（SE）を示す。***、p<0.001、* p<0.05（両側スチューデントt検定）。
【図６Ａ】図6A〜6Fは、胚性幹細胞（ESC）およびKdm6bを注射した桑実胚の胚におけるH3K27me3 ULI-NChIPの検証を示す。これらの結果は、図3A〜3Eの結果に関連する。図6Aは、ENCODEプロジェクトにおいてマウスESCで検出されたH3K27me3ピークと500または2,000のESCを用いて我々の手で検出したH3K27me3ピークの間の相関を示す散布図である。図6Bは、公開されたデータセット（Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562）のH3K27me3ピークとKdm6bMUTを注射した桑実胚の胚のH3K27me3ピークの間の相関を示す散布図を示す。図6Cは、公開されたデータセット（Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562）のH3K27me3ピークとKdm6bMUTを注射した桑実胚の胚のH3K27me3ピークの間の相関を示すベン図を示す。図6Dは、公開されたデータセットとKdm6bMUTを注射した桑実胚の胚におけるほぼ同一のH3K27me3の豊富さを示す代表的な遺伝子座のゲノムブラウザビューを示す。図6Eは、Kdm6bMUTを注射した桑実胚の胚およびKdm6bWTを注射した桑実胚の胚において検出されたH3K27me3ピークの数を示すグラフである。図6Fは、Kdm6bWTを注射した胚におけるH3K27me3ドメインの消失を示すXist座のゲノムブラウザビューを示す。父方対立遺伝子は、これらのトラックで識別されなかった。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照されたい。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照されたい。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照されたい。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照されたい。
【図６Ｆ】図6Aの説明を参照されたい。
【図７】図7は、Kdm6bを注射した胚におけるRnf12のRT-qPCR分析を示すグラフである。データを18Sに対して正規化し、その後にKdm6bMUT胚の値を1.0に設定した。エラーバーは、3つの生物学的複製物の標準誤差（SE）を示す。各実験は、グループあたり18〜24個の胚のプールを使用した。Rnf12はKdm6bWTを注射した胚において上方調節ではなく下方調節されることが注目される。学説により拘束されるものではないが、Rnf12が非エスケープX連鎖遺伝子であることを考慮すれば（Borensztein et al. 2017. Nat Struct Mol Biol 24: 226-233）、これは、母性XCIが、Kdm6bWTを注射した胚において4細胞ステージという早期に発生したことに起因するものと考えられる。
【図８Ａ】図8A〜8Dは、Kdm6bWTを注射した胚盤胞の胚における母性X染色体不活性化を示す。これらの結果は、図4A〜4Eに示される結果に関連する。図8Aは、RNA-seqサンプルの生物学的複製物の間の相関を示す散布図である。図8Bは、Kdm6bを注射した胚盤胞における個々の染色体の母性対立遺伝子発現比［Mat/(Mat+Pat)］を示す箱ひげ図である。箱内の中央の線は、中央値を示す。箱の縁およびひげは、それぞれ、25/75および2.5/97.5パーセンタイルを示す。Kdm6bMUT：薄灰色、左バー；Kdm6bWT：濃灰色、右バー；p値＜2.2e-16。図8Cは、Kdm6bWTを注射した胚盤胞の胚とKdm6bMUTを注射した胚盤胞の胚の間のX連鎖遺伝子の相対発現レベルを示すグラフである。母性対立遺伝子の発現レベルを分析した。各点は、十分なSNPリード（RPM>0.5）を示す個々の遺伝子を表す。図8Cは、図8Dに示される、既知のエスケープ遺伝子（escapee）を除いた遺伝子を示す。図8Dは、Kdm6bWTを注射した胚盤胞の胚とKdm6bMUTを注射した胚盤胞の胚の間のX連鎖遺伝子の相対発現レベルを示すグラフである。母性対立遺伝子の発現レベルを分析した。各点は、十分なSNPリード（RPM>0.5）を示す個々の遺伝子を表す。図8Dは、既知のエスケープ遺伝子である遺伝子を示す。左から右に：Rbm3、Suv39h1、Tbc1d25、Atp6ap2、Araf、Ndufb11、Nkap、Lamp2、Utp14a、Idh3g、Eif2s3x、Xist、Kdm5c、Sms、Pdha1、Syap1およびMsl3。
【図８Ｂ】図8Aの説明を参照されたい。
【図８Ｃ】図8Aの説明を参照されたい。
【図８Ｄ】図8Aの説明を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
発明の詳細な説明
本発明は、体細胞核移植（SCNT）によって生成された任意の胚の細胞を含む細胞において生理学的なX染色体不活性化を再現するための組成物および方法を特徴とする。
【００９０】
Kdm6bは、H3K27me3特異的デメチラーゼである。本発明は、少なくとも一部、Kdm6bを通じた母性X染色体不活性化が生理学的な染色体不活性化を再現するという発見に基づいている。
【００９１】
X染色体不活性化
発生の間に、X染色体不活性化（XCI）は、刷り込みまたは無作為様式で起こる。刷り込みXCIにおいて、父性X染色体（Xp）は、着床前発生の間に選択的に不活性化される。無作為XCIは、エピブラストにおいて起こり、それはXpまたは母性X染色体（Xm）のいずれかをサイレンシングする。Xistは、刷り込みおよび無作為の両XCIにおいて機能するX連鎖長鎖非コードRNAである。Xistは、卵形成の間にXmに刷り込まれる。Xist RNAは、インシスでX染色体を覆い不活性化することによりXCIに関与する。
【００９２】
H3K27me3特異的デメチラーゼ
1つの局面において、本発明は、ヒトSCNTの効率を向上させる方法であって、ドナーヒト体細胞、レシピエントヒト卵母細胞、ハイブリッド卵母細胞（例えば、融合もしくは活性化前のドナー遺伝物質を含むヒト除核卵母細胞）またはヒトSCNT胚（すなわち、ドナー核と除核卵母細胞の融合後）の核または細胞質を、生理学的なX染色体不活性化を再現することができるH3K27me3特異的デメチラーゼ（Kdm6a、Kdm6b、Kdm6c等）と接触させる工程を含む方法を提供する。本明細書で議論されるように、本発明者らは、H3K27me3特異的デメチラーゼが、父性X染色体不活性化に対して母性X染色体不活性化を正常化し、それによってヒトSCNTの効率を向上させるために使用できることを発見した。
【００９３】
H3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子
1つの局面において、本発明は、ヒトSCNTの効率を向上させる方法であって、ドナーヒト体細胞、レシピエントヒト卵母細胞、ハイブリッド卵母細胞（例えば、融合もしくは活性化前のドナー遺伝物質を含むヒト除核卵母細胞）またはヒトSCNT胚（すなわち、ドナー核と除核卵母細胞の融合後）の核または細胞質を、H3K27me3特異的デメチラーゼ（Kdm6a、Kdm6b、Kdm6c等）を活性化する剤と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００９４】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法、組成物およびキットにおいて有用なH3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子は、H3K27me3特異的デメチラーゼをコードする遺伝子の発現を増加させるまたはヒトH3K27me3特異的デメチラーゼ、例えば、ヒトKdm6a、Kdm6b、Kdm6c等の活性を増加させる剤である。
【００９５】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法、組成物およびキットにおいて有用なH3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子は、Kdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドをコードする核酸剤である。
【００９６】
いくつかの態様において、剤は、Kdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cまたはヒトKdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cをコードする対応する野生型配列と比較して同程度もしくはそれ以上にヒトSCNTの効率を向上させる、それらに対して少なくとも80％の配列同一性（もしくは少なくとも約85％、もしくは少なくとも約90％、もしくは少なくとも約95％、もしくは少なくとも約98％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性）を有するそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくはホモログもしくは変種を含むがこれらに限定されないヒトH3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子をコードする核酸配列を含む。
【００９７】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において使用されるH3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子は、ヒトKdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cポリペプチド、またはそのようなヒトKdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cポリペプチドの変種もしくは生物学的活性フラグメントから選択される。当業者は本明細書に開示される方法および組成物において使用されるヒトKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドの適切なヒトホモログおよびそのようなヒトホモログをコードする核酸を特定することができることが、本発明に包含される。いくつかの態様において、H3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子は、ベクター、例えばウイルスベクターから発現されるH3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドをコードする核酸剤である。
【００９８】
代替の態様において、本発明における使用のために包含されるH3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子は、Kdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cまたはそれらの機能的フラグメントをコードする合成性修飾RNA（modRNA）である。合成性修飾RNA（modRNA）は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国出願US2012/03228640；US2009/0286852およびUS2013/0111615ならびに米国特許第8,278,036号；同第8,691,966号；同第8,748,089号；同第8,835,108号に記載されている。いくつかの態様において、合成性修飾RNA分子はベクターにおいて発現されず、合成性修飾RNA分子は裸の合成性修飾RNA分子であり得る。いくつかの態様において、組成物は、脂質複合体中に存在する少なくとも1つの合成性修飾RNA分子を含み得る。
【００９９】
いくつかの態様において、合成性修飾RNA分子は、少なくとも2つの修飾ヌクレオシドを含む、例えば、少なくとも2つの修飾ヌクレオチドは、5-メチルシチジン（5mC）、N6-メチルアデノシン（m6A）、3,2'-O-ジメチルウリジン（m4U）、2-チオウリジン（s2U）、2'フルオロウリジン、プソイドウリジン、2'-O-メチルウリジン（Um）、2'デオキシウリジン（2' dU）、4-チオウリジン（s4U）、5-メチルウリジン（m5U）、2'-O-メチルアデノシン（m6A）、N6,2'-O-ジメチルアデノシン（m6Am）、N6,N6,2'-O-トリメチルアデノシン（m62Am）、2'-O-メチルシチジン（Cm）、7-メチルグアノシン（m7G）、2'-O-メチルグアノシン（Gm）、N2,7-ジメチルグアノシン（m2,7G）、N2,N2,7-トリメチルグアノシン（m2,2,7G）およびイノシン（I）からなる群より選択される。いくつかの態様において、合成性修飾RNA分子はさらに、5'キャップ、例えば、5'キャップアナログ、例えば、5'ジグアノシンキャップを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法および組成物において使用される合成性修飾RNA分子は、5'三リン酸を含まない。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法および組成物において使用される合成性修飾RNA分子はさらに、ポリ（A)テイル、コザック配列、3'非翻訳領域、5'非翻訳領域またはそれらの任意の組み合わせを含み、いくつかの態様において、合成性修飾RNA分子は、任意で、アルカリホスファターゼで処理され得る。
【０１００】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの導入にあたっては、核酸構築物を細胞に導入するための、本質的に任意の方法が使用され得る。物理的な核酸導入方法は、構築物を含む溶液の注射、構築物により覆われた粒子による銃照射、核酸の溶液への細胞、組織サンプルもしくは生物の浸漬、または構築物の存在下での細胞膜の電気穿孔を含む。ウイルス粒子にパッケージされたウイルス構築物は、細胞への発現構築物の効率的導入およびコードされるタンパク質の翻訳の両方を達成するために使用され得る。細胞への核酸の導入のための当技術分野で公知の他の方法、例えば、脂質を通じた担体輸送、化合物を通じた輸送、例えばリン酸カルシウム等も使用され得る。
【０１０１】
細胞内での発現のために、DNAベクター、例えば、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターを含むプラスミドベクターが、使用され得る。いくつかの態様において、コードされるタンパク質の発現は、誘導性プロモーターまたは条件付き発現システムによって制御される。本発明との関係で有用なプロモーターの例は、テトラサイクリン誘導性プロモーター（TRE-tightを含む）、IPTG誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子システム、およびリバーステトラサイクリントランス活性化因子（rtTA）システムである。細胞または組織特異的プロモーターであり得る構成性プロモーターも使用され得る。多くのプロモーターは、すべての細胞および組織型において発現されるよう、ユビキタスである。特定の態様は、インビトロおよびインビボ研究において最も効率的な条件付き遺伝子発現システムの1つであるテトラサイクリン応答性プロモーターを使用する。
【０１０２】
体細胞核移植
体細胞核移植（SCNT）は、例えば、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）の生殖的クローン化のためにまたは細胞置換療法のために所望の組織を生成する治療的クローン化のために使用され得る技術である。残念ながら、クローン動物は、不適切なX染色体不活性化に起因する特定の欠陥に悩まされている。本発明は、インビトロ受精により生成された、すなわち、SCNTを用いて生成された胚に生理学的なX染色体不活性化を回復させることによりこれらの欠陥に対処する。
【０１０３】
体細胞核移植は、核ドナー細胞を入手し、ついでこの核ドナー細胞を除核レシピエントシ細胞、最も好ましくは除核卵母細胞に融合して核移植胚を形成し、この胚を活性化させ、最後にこの胚を培養するまたはこの胚をホスト母体に移すことを含む。核移植時に、1つの細胞由来の核DNAの全長相補鎖が除核細胞に導入される。核移植方法は、当業者に周知である。例えば、各々、すべての図、表および図面を含むその全体が参照により本明細書に組み入れられる、1991年2月19に発行された、「Multiplying Bovine Embryos」を表題とする、Prather et al.に対する米国特許第4,994,384号；1991年10月15日に発行された、「Bovine Nuclear Transplantation」を表題とする、Masseyに対する米国特許第5,057,420号；1999年11月30日に発行された、「Production of Chimeric Bovine or Porcine Animals Using Cultured Inner Cell Mass Cells」を表題とする、Stice et al.に対する米国特許第5,994,619号；2000年1月19日に発行された、「Quiescent Cell Populations For Nuclear Transfer」を表題とする、それぞれ、Campbell et al.およびWilmut et al.に対する、英国特許第GB 2,318,578号、同第GB 2,331,751号；2000年1月4日に発行された、「Method of Cloning Bovines Using Reprogrammed Non-Embryonic Bovine Cells」を表題とする、Strelchenko et al.に対する米国特許第6,011,197号；ならびに「Method of Cloning Porcine Animals」を表題とする米国出願番号09/753,323（代理人管理番号030653.0026.CIP1、2000年12月28日出願）を参照のこと。核移植は、透明帯に包囲されていない卵母細胞を用いることによって達成され得る。
【０１０４】
核移植手順において、核ドナー細胞またはその核は、レシピエント細胞に導入される。レシピエント細胞は、好ましくは卵母細胞であり、好ましくは除核される。しかし、本発明は、一部、卵母細胞の核が卵母細胞から物理的に抽出されない核移植に関連する。細胞分裂の間にドナー細胞由来の核DNAを複製する核移植胚を確立することが可能である。例えば、Wagoner et al., 1996, "Functional enucleation of bovine oocytes: effects of centrifugation and ultraviolet light," Theriogenology 46: 279-284を参照のこと。加えて、核移植は、1つの核ドナーと2つ以上の除核卵母細胞を組み合わせることによって達成され得る。また、核移植は、1つの核ドナー、1つまたは複数の除核卵母細胞および1つまたは複数の除核卵母細胞の細胞質を組み合わせることによって達成され得る。得られる核ドナー細胞およびレシピエント細胞の組み合わせは、「ハイブリッド細胞」と称され得る。
【０１０５】
「核ドナー」という用語は、本明細書で使用される場合、卵母細胞に移され得る核DNAを有する任意の細胞またはその核を表す。核ドナーは、細胞から単離された核であり得る。細胞から核を単離し、その核を核ドナーとして利用するための複数の技術が当業者に利用可能である。例えば、各々、すべての図、表および図面を含むその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,664,097号、同第6,011,197号および同第6,107,543号を参照のこと。あらゆるタイプの細胞が、核ドナーとして利用され得る。核ドナー細胞の例は、インビトロまたはインビボでの2つの配偶子の結合から得られる胚から単離された培養および非培養細胞；培養された胚性細胞（例えば、前胚盤胞細胞および内部細胞塊細胞）から得られる胚性幹細胞（ES細胞）；胚から単離された内部細胞塊細胞から得られる培養および非培養細胞；培養および非培養前胚盤胞細胞；培養および非培養胎児細胞；培養および非培養成体細胞；培養および非培養始原生殖細胞；培養および非培養生殖細胞（例えば、胚性生殖細胞）；動物から単離された培養および非培養体細胞；培養および非培養卵丘細胞；培養および非培養羊膜細胞；培養および非培養胎児線維芽細胞；培養および非培養生殖降起細胞；培養および非培養分化細胞；同調集団の培養および非培養細胞；非同調集団の培養および非培養細胞；培養および非培養血清飢餓細胞；培養および非培養永久細胞；ならびに培養および非培養全能性細胞を含むがこれらに限定されない。例えば、各々、すべての図、図面および表を含むその全体が参照により本明細書に組み入れられる、Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321-1329；Shim et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 1089-1095；Tsung et al., 1995, Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28: 173-189；およびWheeler, 1994, Reprod. Fertil. Dev. 6: 563-568を参照のこと。加えて、核ドナーは、事前に凍結または凍結保存された細胞であり得る。
【０１０６】
核移植のプロセスにより生成されるハイブリッド細胞は、例えば、生殖的クローン化においてまたは再生的クローン化において使用され得る。
【０１０７】
SCNT実験は、成体分化体細胞由来の核が全能性状態に再プログラムされ得ることを示した。したがって、本明細書に開示される方法を用いて生成されるSCNT胚は、全能性または胚性幹細胞または幹様細胞および細胞コロニーの生成に適したインビトロ培養培地中で培養され得る。胚の培養および維持に適した培養培地は当技術分野で周知である。ウシ胚の培養および維持に使用され得る公知の培地の例は、ハムF-10 + 10%ウシ胎仔血清（FCS）、組織培養培地199（TCM-199）+ 10%ウシ胎仔血清、タイロード・アルブミン・乳酸塩・ピルビン酸塩（TALP）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、イーグルおよびウィッテン培地を含む。卵母細胞の収集および成熟に使用される最も一般的な培地の1つは、TCM-199およびウシ胎仔血清、新生児血清、発情期ウシ血清、子羊血清または去勢牛血清を含む1〜20％の血清添加物である。好ましい維持培地は、Earl塩、10％ウシ胎仔血清、0.2 Maピルビン酸塩および50μg/ml硫酸ゲンタマイシンを含むTCM-199を含む。上記のいずれにおいても、様々な細胞型、例えば、果粒膜細胞、卵管細胞、BRL細胞および子宮細胞ならびにSTO細胞との共培養が行われ得る。
【０１０８】
特に、子宮内膜の上皮細胞は、着床前および着床期の間に白血病阻止因子（LIF）を分泌する。したがって、いくつかの態様において、培養培地へのLIFの添加は、SCNT由来胚のインビトロ発生を増進することを含む。胚性または幹様細胞培養におけるLIFの使用は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,712,156号に記載されている。
【０１０９】
別の維持培地は、参照により本明細書に組み入れられるRosenkrans, Jr. et al.に対する米国特許第5,096,822号に記載されている。CR1と命名されたこの胚培地は、胚を支援するのに必要な栄養物質を含む。CR1は、1.0 mM〜10 mM、好ましくは1.0 mM〜5.0 mMの範囲の量のL乳酸ヘミカルシウムを含む。L乳酸ヘミカルシウムは、ヘミカルシウム塩が組み込まれたL乳酸である。また、培養下でヒト胚性幹細胞を維持するのに適した培養培地は、Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)およびProc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848 (1995)で議論されている。
【０１１０】
いくつかの態様において、フィーダー細胞は、マウス胚性線維芽細胞を含む。適切な線維芽細胞フィーダー層を調製する手段は、以下の実施例に記載されており、これは十分に技術常識内である。
【０１１１】
胚盤胞ステージのSCNT胚（またはその等価物）からES細胞（例えば、NT-ESCまたはhNT-ESC）を誘導する方法は、当技術分野で周知である。そのような技術は、SCNT胚からES細胞（例えば、hNT-ESC）を誘導するために使用され得、hNT-ESCを生成するために使用されるSCNT胚は、KDM4デメチラーゼファミリーのメンバーおよび／またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤SUV39h1/SUV39h2で処置されなかったSCNTと比較して、体細胞ドナー細胞から提供された核遺伝物質において減少したレベルのH3K9me3を有する。hNT-ESCは、発生のより早期のステージの間にクローンSCNT胚から取得され得る。
【０１１２】
特定の態様においては、本明細書に開示される方法、組成物およびキットを用いて生成されるSCNT胚から生成される割球が、全能性細胞を得るためにガラスピペットを用いて分離され得る。いくつかの態様において、分離は、0.25％トリプシンの存在下で行われ得る（Collas and Robl, 43 BIOL. REPROD. 877-84, 1992; Stice and Robl, 39 BIOL. REPROD. 657-664, 1988; Kanka et al., 43 MOL. REPROD. DEV. 135-44, 1996）。
【０１１３】
特定の態様において、SCNT胚から得られる胚盤胞または胚盤胞様クラスターは、胚性幹細胞株、例えば、核移植ESC（ntESC）細胞株を得るために使用され得る。そのような株は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるThomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)およびThomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7544-7848 (1995)によって報告された培養方法にしたがい、取得され得る。
【０１１４】
多能性胚性幹細胞はまた、出生への胚の正常な発生を妨げることなく、SCNT胚から取り出された単一の割球から生成され得る。その開示の全体が参照により組み入れられる、2004年11月4日に出願された米国出願番号60/624,827；2005年3月14日に出願された同60/662,489；2005年6月3日に出願された同60/687,158；2005年10月3日に出願された同60/723,066；2005年10月14日に出願された同60/726,775；2005年11月4日に出願された同11/267,555；2005年11月4日に出願されたPCT出願番号PCT/US05/39776を参照のこと；各々の全開示が参照により組み入れられるChung et al., Nature, Oct. 16, 2005 （出版前に電子的に公開されている）およびChung et al., Nature V. 439, pp. 216-219 (2006)も参照のこと。そのような例において、SCNT胚は、多能性幹細胞の生成のために破壊されない。
【０１１５】
本発明の1つの局面において、この方法は、研究におけるおよび治療におけるSCNT胚由来の細胞の利用を含む。そのような多能性幹細胞（PSC）または全能性幹細胞（TSC）は、皮膚、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腎臓、肝臓、血液および血液形成、血管前駆および血管内皮、膵臓ベータ、神経、グリア、網膜、内耳濾胞（inner ear follicle）、腸、肺細胞を含むがこれらに限定されない身体のあらゆる細胞に分化し得る。
【０１１６】
本発明の別の態様において、SCNT胚、または胚盤胞、またはSCNT胚から得られる多能性もしくは全能性細胞（例えば、NT-ESC）は、他の治療的に有用な細胞、例えば、網膜色素上皮、造血前駆細胞および血管芽前駆細胞ならびに外胚葉、中胚葉および内胚葉の多くの他の有用な細胞型を生成するよう、1つまたは複数の分化誘導因子に暴露され得る。そのような誘導因子は、サイトカイン、例えば、インターロイキン・アルファA、インターフェロン・アルファA/D、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・ガンマ、インターフェロン・ガンマ誘導タンパク質10、インターロイキン1〜17、ケラチノサイト成長因子、レプチン、白血病阻止因子、マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージ炎症タンパク質1アルファ、1ベータ、2、3アルファ、3ベータおよび単球走化性タンパク質1〜3、6カイン（6kine）、アクチビンA、アンフィレグリン、アンギオレギン、B内皮細胞成長因子、ベータセルリン、脳由来神経栄養因子、C10、カルディオトロフィン1、毛様体神経栄養因子、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、エオタキシン、上皮成長因子、上皮好中球活性化ペプチド78、エリスロポエチン、エストロゲン受容体アルファ、エストロゲン受容体ベータ、線維芽細胞成長因子（酸性および塩基性）、ヘパリン、FLT-3/FLK-2リガンド、グリア細胞株由来神経栄養因子、Gly-His-Lys、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、GROアルファ／MGSA、GROベータ、GROガンマ、HCC-1、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、ヘレグリン・アルファ、インスリン、インスリン成長因子結合タンパク質1、インスリン様成長因子結合タンパク質1、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子II、神経成長因子、神経栄養因子（neurotophin）3、4、オンコスタチンM、胎盤成長因子、プレイオトロフィン、ランテス（rantes）、幹細胞因子、間質細胞由来因子1B、トロンボポエチン（thromopoietin）、形質転換成長因子（アルファ、ベータ、1、2、3、4、5）、腫瘍壊死因子（アルファおよびベータ）、血管内皮成長因子、および骨形成タンパク質、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、例えば17B-エストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメデュリン、アルファ・メラノサイト刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコステロイド結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、卵胞刺激ホルモン、ガストリン1、グルカゴン、ゴナドトロピン、L-3,3',5'-トリヨードチロニン、黄体形成ホルモン、L-サイロキシン、メラトニン、MZ-4、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、PEC-60、下垂体成長ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セレクチン、性ホルモン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、サイロキシン結合グロブリンおよびバソプレッシンの発現を変更する酵素、細胞外マトリクス成分、例えば、フィブロネクチン、フィブロネクチンのタンパク質分解フラグメント、ラミニン、テネイシン、トロンボスポンジン、ならびにプロテオグリカン、例えば、アグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン（chontroitin）硫酸プロテオグリカンおよびシンデカンを含むがこれらに限定されない。他の誘導因子は、本発明の再プログラムされた細胞から得られる分化中の細胞に対して誘導性シグナルを提供するために使用される定義された組織由来の細胞または細胞から得られる成分を含む。そのような誘導性細胞、例えば特定病原体除去（SPF）胚性または成体細胞は、ヒト、非ヒト哺乳類または鳥類から取得され得る。
【０１１７】
割球の培養。1つの態様において、SCNT胚は、割球を生成するために使用され得、本明細書に開示される方法によって生成されたSCNT胚から、当該SCNT胚を破壊することなくまたはそれらの生存能を有意に変更することなく個々の割球を単離するために、着床前遺伝子診断（PGD）において現在使用されているそれらに関連するインビトロ技術を利用することができる。本明細書に示されているように、多能性胚性幹（hES）細胞および細胞株は、本明細書に開示されるSCNT胚から、出生へのその胚の発生を妨げることなく取り出された単一の割球から生成され得る。
【０１１８】
「Dolly」というヒツジのクローン化に関するWilmut et al.（Wilmut, et al, Nature 385, 810 (1997)）の発見は、hESCの入手に関するThomson et al.（Thomson et al., Science 282, 1145 (1998)）の発見と共に、患者自身の核から生成されるSCNT胚またはSCNTにより改変された細胞塊由来の患者特異的hESCの樹立に基づく再生細胞移植に対する大きな熱意を生み出した。自家移植を通じて免疫拒絶を回避することを目的とするこの戦略は、おそらく、SCNTの最も強力な臨床上の理論的根拠である。同様に、複合病特異的SCNT-hESCの入手は、疾患メカニズムの発見を加速させ得る。細胞移植については、個々のマウス自身のSCNT由来mESCを用いたマウスSCIDおよびPDモデルの先進的処置が活気づいている（Rideout et al, Cell 109, 17 (2002); Barberi, Nat. Biotechnol. 21, 1200 (2003)）。最終的に、幅広い組織適合性を有するSCNT由来幹細胞のバンクを設立する能力が、現在行われている新しい卵母細胞の供給に対する要求を減らすであろう。
【０１１９】
本発明の特定の態様において、SCNT胚から得られる多能性または全能性細胞（例えば、hNT-ESC）は、任意で分化され得、組織内に導入され得、通常それらはそこで、治療利用性を示すように滞在する。例えば、SCNT胚から得られる多能性または全能性細胞は、組織に導入され得る。特定の他の態様において、SCNT胚から得られる多能性または全能性細胞は、全身的に、または治療的利用性が望まれる部位から離れた場所から導入され得る。そのような態様において、SCNT胚から得られる多能性または全能性細胞は、離れた場所から作用し得または所望の部位にホーミングし得る。
【０１２０】
本発明の特定の態様において、SCNT胚から得られるクローン細胞、多能性または全能性細胞は、他の多能性幹細胞の分化を誘導する上で利用され得る。胚の遺伝子発現パターンを維持しつつインビトロで増殖することができる単一細胞由来の細胞集団の生成は、他の多能性幹細胞の分化を誘導する上で有用である。細胞・細胞誘導は、早期の胚において分化を方向づける一般的手段である。脊髄神経細胞、心細胞、膵臓ベータ細胞および造血系決定細胞（definitive hematopoietic cells）を含む多くの潜在的に医学的に有用な細胞型は、通常の胚発生の間に誘導性シグナルの影響を受ける。胚の遺伝子発現パターンを維持しつつインビトロで増殖することができる単一細胞由来の細胞集団は、所望の細胞または組織型になるよう他の多能性幹細胞の分化を誘導する様々なインビトロ、インオボ（in ovo）またはインビボ培養条件で培養され得る。
【０１２１】
SCNT胚から得られる多能性または全能性細胞（例えば、ntESC）は、任意の所望の分化細胞型を得るために使用され得る。そのような分化細胞の治療利用はひとつではない。本明細書で議論されるように、ドナー細胞、またはレシピエント卵母細胞、ハイブリッド卵母細胞またはSCNT胚は、本明細書に開示される方法にしたがいH3K27me3特異的デメチラーゼにより処置され得る。
【０１２２】
あるいは、ドナー細胞は、障害を有する対象由来の成体体細胞であり得、生成されるSCNT胚は、疾患の動物モデルまたは疾患の細胞モデルを生成する分化条件下で培養され得る疾患特異的多能性もしくは全能性細胞を生成するために使用され得る。本発明の大きな利点は、SCNTの効率を向上させることにより、同質遺伝子または同系遺伝子のES細胞、特に人工多能性幹細胞でない（例えば、iPSCでない）多能性細胞の本質的に無限の供給元を提供することである。そのようなNT-ESCは部分的に多能性であることがなくかつウイルス性の導入遺伝子を有さずそれらの再プログラムを行うよう再プログラム因子を強制発現させることもないため、それらはiPSCを上回る利点を有し、移植に適する。
【０１２３】
いくつかの態様において、SCNTから生成されるNT-ESCは、SCNT胚から得られる患者特異的多能性細胞であり、ドナー細胞は、この多能性幹細胞またはその分化した子孫を用いて処置される対象から得られる。したがって、現在の移植方法に付随する大きな問題、すなわち、宿主対移植片または移植片対宿主拒絶が原因で起こり得る移植された組織の拒絶を回避するであろう。従来的に、拒絶は、拒絶抑制薬、例えばシクロスポリンの投与によって防止または減少される。しかし、そのような薬物は、大きな副作用、例えば、免疫抑制、発癌性を有し、また非常に高価である。本発明は、拒絶抑制薬、例えば、シクロスポリン、イムラン（imulan）、FK-506、グルココルチコイドおよびラパマイシンならびにそれらの誘導体の要求をなくすまたは少なくとも大きく減らすと考えられる。
【０１２４】
キット
本発明は、H3K27me3特異的デメチラーゼ活性化因子（例えば、Kdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cをコードするポリヌクレオチド、Kdm6a、Kdm6bもしくはKdm6cポリペプチド、またはそれらの酵素的に活性なフラグメント）を含むキットを提供する。
【０１２５】
いくつかの態様において、キットは、治療用または予防用の細胞組成物を含む滅菌容器を含み、そのような容器は箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、ポーチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または医薬を保持するのに適した他の材料から作製され得る。
【０１２６】
所望の場合、本発明の剤は、SCNTの効率を向上させるための当該剤の投与に関する説明書と共に提供される。説明書は、通常、生理学的なX染色体不活性化を向上させる組成物の使用についての情報を含む。他の態様において、説明書は、以下の少なくとも1つを含む：治療剤の説明；神経学的疾患もしくはその症状の処置もしくは予防のための投薬スケジュールおよび投与；事前措置；警告；適応；適応外（counter-indication）；過剰投与情報；副作用；動物薬理；臨床試験；ならびに／または参考情報。説明書は、（存在する場合）容器に直接、または容器に貼付するラベルとして、または容器内にもしくは容器と共に提供される別個のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして印刷され得る。
【０１２７】
そうでないことが示されていない限り、本発明の実施には、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術が用いられ、これらは十分に当業者の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); "Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology” "Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、そのため、本発明の製造および実施の際に考慮され得る。特定の態様において特に有用な技術は、以下の節で議論されるであろう。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療法をどのように策定し使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１２９】
実施例1：H3K9me3は両親性の胚におけるXistサイレンシングに不要である
Kdm4bを通じたH3K9me3の消失が両親性の胚においてXist抑制を誘導することができるかどうかを決定するため、Kdm4b mRNAをインビトロ受精させた胚に注射した。免疫染色分析は、Kdm4b mRNA注射が濃度依存的な様式で受精卵においてH3K9me3を効果的に除去したことを確認した（図1A）。Xist RNA発現を評価するため、4細胞胚においてRNA蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）分析を行った。雄胚と雌胚を区別するため、X染色体を、Rnf12座に特異的なプローブを用いるDNA FISHにより同時に標識した。そのため、雄または雌胚の各割球は、それぞれ、1つまたは2つのDNA FISHシグナルを有する。「注射なし」対照雄胚は、Xist RNAシグナルを示さず、雌胚の大部分は、1つのRNAクラウドまたはスポットシグナルを示した（図1B〜1D）。同様に、Kdm4b注射胚は、雄または雌胚のいずれにおいても母性Xist発現を誘導しなかった（図1B〜1D）。学説により拘束されるものではないが、これは、H3K9me3が生理学的な両親性条件下で母性Xistのサイレンシングに関して重要な役割を果たさないことを示している。
【０１３０】
実施例2：母性H3K27me3は卵母細胞および着床前の胚においてXistを被覆する
母性H3K27me3は刷り込み印として機能し得るので（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）、Xist刷り込みにおけるその潜在的関与を試験した。H3K27me3 ChIP-seq（高スループット配列決定と組み合わされたクロマチン免疫沈降［ChIP］）データセット（Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079）の分析は、Xistが、成熟卵母細胞において□450 kbに及び、卵母細胞成長の間に確立される広範なH3K27me3ドメインで被覆されていることを明らかにした（図2A）。卵母細胞DNase I配列決定（DNase I seq）（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）およびDNAメチローム（Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440）データセットの分析は、このH3K27me3ドメイン全体が低いクロマチンアクセス性および低いDNAメチル化を示すことを明らかにした（図2A）。学説により拘束されるものではないが、これは、DNAメチル化に非依存的なヘテロクロマチンドメインの形成を示唆している。受精後の胚のChIP-seqデータセット（Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079）の分析は、母性H3K27me3ドメインが着床前発生を通じて維持されているが、胚第6.5日（E6.5）のエピブラストにおいて失われることを明らかにした（図2B）。XistからZcchc13に及ぶがTsixプロモーターを含まない上流□200kb領域が、胚盤胞の胚においてH3K27me3の豊富さの対立遺伝子バイアスを維持していることが注目される（図2C)。これらのデータは、母性Xistサイレンシングにおける母性H3K27me3の潜在的役割を支持するものである。
【０１３１】
実施例3：母性H3K27me3は母性Xistサイレンシングを担っている
H3K27me3が母性Xistサイレンシングを担っているかどうかを試験するため、H3K27me3特異的デメチラーゼであるKdm6bをコードするmRNAを注射することによって受精卵においてH3K27me3を除去した（図3A）。陰性対照として、触媒ドメインに点変異を有する触媒性変異体Kdm6bMUTの注射により受精卵を調製した（図3A；Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。外因性Kdm6bの発現は一過的であるにもかかわらず、Kdm6bWT胚におけるH3K27me3レベルは、4細胞および桑実胚ステージのKdm6bMUT胚のそれよりも有意に低くなった（図5A〜5B）。
【０１３２】
Kdm6bWTを注射した胚のXist座においてH3K27me3が失われたことを確認するため、500〜2000個のマウス胚性幹細胞を用いて効果的に機能した（図6A）、超低インプットネイティブChIP-seq（ULI-NChIP）分析を行った（Brind’Amour et al. 2015. Nat Commun 6: 6033）。H3K27me3 ULI-NChIPを、Kdm6bWTまたはKdm6bMUTを注射した桑実胚の胚由来の□2000個の割球を用いて行った。データの質は、Kdm6bMUTを注射した胚を、公開されている桑実胚の胚のデータセットと比較することによって検証した（図6B〜6D；Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562）。Kdm6bWT注射胚におけるH3K27me3ピークの数は、Kdm6bMUT注射胚のそれよりもずっと少なかった（図6E）。重要なことに、Xist座は、Kdm6bWT胚においてドメイン全体を通じてH3K27me3の豊富さの顕著な減少を示している（図6F）。さらに、単一ヌクレオチド多型（SNP）情報の分析は、母性H3K27me3ドメインがKdm6bWT胚において失われたことを明らかにした（図3B）。
【０１３３】
Kdm6bWTを注射した4細胞胚において母性Xistが抑制されるかどうかを試験するため、RNA/DNA FISH分析を行った。RNA/DNA FISH分析は、Kdm6bWTを注射した雄の大部分がXist RNAクラウドまたはスポットを示したのに対して、Kdm6bMUTを注射した雄のすべてがシグナルを示さなかったことを明らかにした（図3C〜3D）。さらに、Kdm6bWTを注射した雌の大部分は、2つのXist RNAクラウドおよび／またはスポットを示したのに対して、Kdm6bMUTを注射した雌のほとんどが1つのクラウドを示した（図3C、3E）。これらの結果は、4細胞ステージにおいてXist座における母性H3K27me3の消失が母性Xist抑制を誘導したことを示している。
【０１３４】
実施例4. H3K27me3の消失は母性X染色体不活性化（XCI）を誘導する
母性Xist発現が桑実胚ステージまで継続するかどうかを試験するため（図4A)、RNA/DNA FISH分析を行った。注目すべきことに、Kdm6bWTを注射した雄および雌の胚の大部分が、それぞれ、1つおよび2つのRNAクラウドを示したの対して、Kdm6bMUTを注射した雄および雌の胚のほとんどが、それぞれ、ゼロおよび1つのRNAクラウドを示し（図4B〜4D）、これにより再活性化されたXistが維持されていることが示された。XistはRnf12の過剰発現によって上方調節され得る（Tan et al. 2016. Proc Natl Acad Sci 113: 3197-3202）が、RT-qPCR分析は、Kdm6bWT注射胚においてRnf12の上方調節の証拠を見いださず（図7）、Kdm6bWTを通じたXistの抑制がRnf12の過剰発現に起因する可能性が排除された。
【０１３５】
母性Xist発現が母性XCIをもたらすかどうかを決定するため（図4A）、早期胚盤胞ステージのハイブリッドマウス胚および生物学的複製物においてRNA配列決定（RNA-seq）分析を行った（図8A）。SNP情報の分析は、Xm連鎖遺伝子の試験を可能にし、Kdm6bWT注射胚において常染色体遺伝子ではなくXm連鎖遺伝子の発現レベルが有意に下方調節されたことが明らかされた（図4E）。同様に、X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアス［Mat/(Mat+Pat)］は、依然として＞50％であったが、Kdm6bWT注射胚において有意に低下した（図8B）。これらのデータは、Kdm6bWT注射胚において母性XCIが父性XCIよりも穏やかなレベルで起こることを示している。個々のX連鎖遺伝子のより詳しい試験は、Kdm6bWT注射胚においてほとんどの遺伝子が下方調節されたのに対して（図8C）、刷り込みXCIを回避することが公知の遺伝子（Borensztein et al. 2017. Nat Struct Mol Biol 24: 226-233）は不変であった（図8D）ことを確認した。学説により拘束されるものではないが、これは、Kdm6bを通じた母性XCIが生理学的なXCIを再現している可能性を示唆するものである。
【０１３６】
まとめると、本明細書に記載される結果は、H3K27me3がXistの刷り込み印として機能する証拠を提供する。Xist座における母性H3K27me3のドメインベースの調節は、魅力的な観察であり、かつ重要な疑問を抱かせる。例えば、H3K27me3ドメインの境界は卵形成の間にどのようにして規定されるのか？XistおよびZcchc13にまたがるこのドメインの前半部分（□200 kb）は胚盤胞の胚においてどのようにして母性対立遺伝子特異的なH3K27me3の豊富さを維持しているのか？注目すべきことに、この□200 kb領域は、トポロジー関連ドメイン（topological association domain）を形成するようであり（Giorgetti et al. 2014. Cell 157: 950-963）、このことは、クロマチン境界の調節におけるCTCF等のタンパク質の関与の可能性を暗示している。興味深いことに、このドメインは、その常染色体への挿入が刷り込みXCIを再現する導入遺伝子と高度に重複している（Okamoto et al. 2005. Nature 438: 369-373）。学説により拘束されるものではないが、このことは、この領域にポリコーム群複合体を誘引する中心的要素が存在し、卵形成の間の刷り込みの確立に寄与している可能性を示している。
【０１３７】
結論として、本研究はしたがって、H3K27me3依存的刷り込みされる遺伝子（Inoue et al. 2017）の新しいメンバーとしてXistを同定するだけでなく、XCIからXmを保護する上でのH3K27me3依存的ゲノム刷り込みの生物学的重要性を示している。
【０１３８】
上記の結果は、以下の材料および方法を用いて得た。
【０１３９】
マウス卵母細胞の採集
すべての動物研究を、Harvard Medical SchoolのInstitutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインにしたがい行った。卵母細胞採集およびインビトロ受精の手順は、以前に記載されている（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。この研究においてSNP分析のために使用したハイブリッド胚は、B6D2F1/J（BDF1）卵母細胞およびPWK精液（Jackson Laboratory、003715）のインビトロ受精により得た。
【０１４０】
mRNAの調製および注射
Kdm6b mRNAの構築および調製ならびに受精卵母細胞へのマイクロ注射は、以前に記載されている（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。Kdm4b構築物は、そのcDNA増幅産物をpcDNA3.1-Flag-poly(A)83プラスミドにクローン化することによって作成した。mRNAを、mMES-SAGE mMACHINE T7 Ultraキット（Life technologies）を用いて合成し、塩化リチウム沈降により精製し、ヌクレアーゼ非含有水に溶解させた。注射したKdm6bWTおよびKdm6bMUTのmRNAの濃度は1800ng/μLであり、Kdm4bのそれは1000または2600 ng/μLであった。
【０１４１】
FISH用のプローブ
Xist RNA用のプローブは、Nick翻訳試薬キット（Abbott Molecular, 07J00-001）をCy3-dCTP（GE Healthcare, PA53021）と共に用いることによって調製した。鋳型DNAは、全長マウスXist遺伝子をコードするプラスミド（Addgene, 26760）であった（Wutz and Jaenisch. 2000. Mol Cell 5: 695-705）。DNA FISH用のプローブは、同じキットをGreen-dUTP（Abbott Molecular, 02N32-050）と共に用いて調製した。鋳型DNAは、Rnf12座を含むBACクローン（RP23-36C20）であった（Fukuda et al. 2015. Development 142: 4049-4055）。蛍光プローブを、5μgのCot-1 DNA（Life technologies）、5μgのニシン精液DNA（Thermo Fisher Scientific）および2.5μgの酵母tRNA（Thermo Fisher Scientific, AM7119）と共にエタノール沈降させ、その後に20μLのホルムアミド（Thermo Fisher Scientific, 17899）に溶解させた。このプローブを4℃で保管した。使用する前に、プローブ（各々0.75μL）を0.75μLのCot-1 DNA/ホルムアミドおよび2.25μLの4xSSC/20％デキストラン（Millipore S4030）と混合した。このプローブ混合物を80℃で30分間加熱し、その後に37℃のインキュベーターに移した（「事前アニール済プローブ」）。
【０１４２】
ホールマウントRNA/DNA FISH
4細胞または桑実胚の胚を、46または78受精後時間（hpf）に、0.5％ Triton X-100を含むPBS中2％パラホルムアルデヒド（PFA）において室温で20分間固定した。0.1％ BSA/PBSによる3回の洗浄の後、胚を、0.02％ Triton X-100を含む0.1N HClにより4℃で15分間処理した。0.1％ BSA/2x SSCによる3回の洗浄の後、胚を、ガラス皿（Electron Microscopy Science, 705430-30）において10％、20％および50％ホルムアミド系列/2x SSC中でインキュベートし、そして30分間インキュベートした。このサンプルをミネラル油で覆い、80℃で30分間加熱し、ついで37℃で30分未満インキュベートした。ついでこの胚を4.5μLの「事前アニール済プローブ」中に移し、別のガラス皿においてミネラルオイルで覆い、37℃で24時間未満インキュベートした。胚を事前に42℃に温めておいた0.1％ BSA/2x SSCで洗浄し、最終滴下中で30分間維持し、DAPI（Vector Laboratories）を含むVectaShield中、ガラススライド上に配置した。蛍光を、レーザー走査共焦点顕微鏡（Zeiss, LSM800）下で検出した。
【０１４３】
ホールマウント免疫染色
免疫染色および定量の手順は、以前に記載されたものである（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。
【０１４４】
母性対立遺伝子バイアスがかかったH3K27me3ドメインの同定
内部細胞塊（ICM）におけるH3K27me3 ChIP-seqについての100塩基対（bp）ビンのRPKM（百万のマップされたリードあたりの1キロ塩基あたりのリード数）値を含むBEDファイルは、GSE76687（Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079）から得た。BEDファイルは、2つの親対立遺伝子について母性または父性を含むRPKM値を表示し、対立遺伝子リード数を総リード数に対して正規化した。「bedtools makewindows」を使用して全mm9ゲノムにおいて1-kbビンを生成し、各ビンのRPKM値を「bedtools map」により計算した。すべてのビンを、1のシグナルカットオフおよび4の変化倍率カットオフを用いて「シグナルなし」、「両対立遺伝子」および「母性バイアスあり」の3つのカテゴリに分類した。スライディングウィンドウアプローチを用いて、「母性バイアスあり」のH3K27me3ビンに豊富なドメインを同定した。その基準は以下の通りであった：20 kbのウィンドウ内で、「母性バイアスあり」ビンの最小数が3であり、「母性バイアスあり」ビンのパーセンテージが「両対立遺伝子」ビンよりも高い。重複するウィンドウを「bedtools merge」により結合した。合計5986個のドメインがゲノム中で同定された。
【０１４５】
ULI-NChIP
78 hpfで、グループあたり□110個の桑実胚の胚を酸性タイロード溶液（Sigma-Aldrich）で軽く処理して透明帯を除去し、0.2％ BSA/PBSで洗浄し、1.5 mLチューブに移した。ULI-NChIPは、以下の点を変更しつつ以前に記載（Brind’Amour et al. 2015. Nat Commun 6: 6033）されたようにH3K27me3抗体（Diagenode, C15410069）を用いて行った。第1に、我々は、Agencourt Ampure XPに代えてBeckman SPRIselectビーズ（Beckman Coulter）を用いた。第2に、配列決定ライブラリを、Illumina用NEBNext Ultra II DNAライブラリ調製キット（New England Biolabs）を用いて調製した。第3に、PCR増幅を、Kapa Hifiホットスタートレディミックス（Kapa Biosystems）を用いて行った。最後に、サイズ選択を行わなかった。投入サンプルのために、クロマチン溶解産物の10％容積を取り、ライブラリ構築および配列決定に使用した。ライブラリの定量および配列決定は以前に記載されたものとした（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。
【０１４６】
ULI-NChIPのデータ分析
Kdm6bMUTサンプルとKdm6bWTサンプルの間の正規化のために、MAnorm（Shao et al. 2012. Genome Biol 13: R16）と同様の戦略を用いた。第1に、Kdm6bMUTサンプルとKdm6bWTサンプルの間で共通ピークを特定した。次に、すべてのサンプルを、共通ピーク内の各サンプルのRPKM値に基づき、最も高いカバレッジのサンプルに対して正規化した。SNP特異的リードは、ライブラリあたりの特有にマップされたリードの総数に対して正規化し、さらに、対立遺伝子あたりのSNP特異的リードの和に基づき最も高いカバレッジの対立遺伝子に対して正規化した。
【０１４７】
逆転写およびリアルタイムPCR分析
Kdm6b注射胚を、46 hpf（4細胞）、60 hpf（8細胞）および78 hpf（桑実胚）で採集した。逆転写およびリアルタイムPCR分析の手順は、この研究における逆転写用のランダムプライマーの使用を除いて以前に記載されたものとした（Inoue and Zhang. 2014. Nat Struct Mol Biol 21: 609-616）。リアルタイムPCRに使用したプライマー配列は、以下の通りであった。
2022501012.tif 000013
【０１４８】
RNA-seqおよびデータ分析
96 hpfの胚盤胞の胚を、酸性タイロード溶液で軽く処理し、0.2％ BSA/PBSにより洗浄し、-80℃でPCRチューブ内に保管した。グループあたり40〜46個の胚をプールし、RNA-seqに使用した。RNA-seqライブラリは、cDNA増幅後にNextera XT DNAライブラリ調製キット（Illumina）を使用したことを除いて以前に記載（Inoue et al. 2017）されたようにして調製した。
【０１４９】
統計的分析
統計的分析は、R（http://www.r-project.org）を用いて行った。ピアソンのR係数は、「cor」関数をデフォルトパラメータで用いて計算した。図8Bに関して、R関数「wilcox.test」を用いてマン・ホイットニーU検定を行った。
【０１５０】
コードの利用
カスタマイズされたパイプラインを使用してSNP情報に基づきそれらの親起源に対するハイブリッド胚の配列決定データのアラインメントを分割した。コードは、https://github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplitにおいて入手可能である。
【０１５１】
データの利用
本明細書で作成されたChIP-seqおよびRNA-seqデータセットは、アクセッション番号GSE103714の下でGene Expression Omnibusデータベースに登録されている。GV卵母細胞のWGBSデータセットは、http://www.nodai-genome.org/mouse.html?lang=enからダウンロードした（Kobayashi et al. 2012. PLoS Genet 8: e1002440）。H3K27me3 ChIP-seqデータセットは、GSE76687からダウンロードした（Zheng et al. 2016. Mol Cell 63: 1066-1079）。卵母細胞DNase I-seqデータセットは、GSE92605から得た（Inoue et al. 2017. Nature 547: 419-424）。ENCODEデータのBAMファイルおよびピークファイルは、https://www.encodeproject.org/files/ENCFF001KDTからダウンロードした。桑実胚の胚のH3K27me3 ChIP-seqデータセットは、GSE73952から得た（Liu et al. 2016. Nature 537: 558-562）。
【０１５２】
他の態様
前記記載から、本明細書に記載される発明に対してそれを様々な用途および条件に適応させるよう変更および改変がなされ得ることが明らかであろう。そのような態様もまた、添付の特許請求の範囲内である。
【０１５３】
本明細書の可変部分の定義において要素のリストが示されている場合、その可変部分が、任意の単一の要素または列挙されている要素の組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）として定義されていることが含まれる。本明細書において態様が示されている場合、任意の単一の態様としてのその態様または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わされたその態様が含まれる。
【０１５４】
本明細書で言及されているすべての特許、刊行物およびアクセッション番号は、各々個別の特許、刊行物およびアクセッション番号が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2022501012.tif 000015
【図１Ｂ】
2022501012.tif 000016
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2022501012.tif 000033
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2022501012.tif 000037
【図６Ｆ】
2022501012.tif 000038
【図７】
2022501012.tif 000039
【図８Ａ】
2022501012.tif 000040
【図８Ｂ】
2022501012.tif 000041
【図８Ｃ】
2022501012.tif 000042
【図８Ｄ】
2022501012.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月24日(2021.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2022501012000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年7月16日(2021.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞核移植（SCNT）により生成された非ヒト胚において生理学的なX染色体不活性化を発生させるための方法であって、SCNTを通じて生成された胚に、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドまたは該デメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを注射する工程を含む、方法。
【請求項２】
H3K27me3特異的デメチラーゼをコードするmRNAが胚に注射される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
約1000〜2000 ng/μLのmRNAが胚に注射される、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
1800 ng/μLのmRNAが胚に注射される、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
X染色体が体細胞由来の非ヒトドナー核に存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
ドナー核が非ヒト卵母細胞または胚性幹細胞に移植される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、H3K27me3特異的デメチラーゼの酵素活性フラグメントをコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが哺乳類発現ベクター中に存在する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類発現ベクターが、プロモーターにより指示される、H3K27me3特異的デメチラーゼの構成性または誘導性発現を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
注射されるポリペプチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
X連鎖遺伝子の発現を減少させる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
X染色体刷り込みを回避する遺伝子の発現を有意に変化させない、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
常染色体の遺伝子発現を有意に変化させない、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約35〜60％を上回る、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約50％を上回る、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
胚が初期胚盤胞ステージの胚である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
胚が成体体細胞由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
体細胞が非ヒト対象から得られる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
胚由来の細胞を培養して、非ヒト対象への移植に適した組織を得る工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1に記載の方法により生成される、非ヒト胚盤胞。
【請求項２２】
請求項20に記載の方法により生成される、細胞または組織。
【請求項２３】
請求項1に記載の胚盤胞を宿主の子宮に着床させることにより生成される、非ヒトクローン生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される任意の他の組成物および方法の1つまたは複数と組み合わされ得る。
[本発明1001]
体細胞核移植（SCNT）により生成された胚において生理学的なX染色体不活性化を発生させるための方法であって、SCNTを通じて生成された胚に、H3K27me3特異的デメチラーゼポリペプチドまたは該デメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを注射する工程を含む、方法。
[本発明1002]
H3K27me3特異的デメチラーゼをコードするmRNAが胚に注射される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ポリヌクレオチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cポリペプチドをコードする、本発明1001の方法。
[本発明1004]
約1000〜2000 ng/μLのmRNAが胚に注射される、本発明1002の方法。
[本発明1005]
1800 ng/μLのmRNAが胚に注射される、本発明1003の方法。
[本発明1006]
X染色体が体細胞由来のドナー核に存在する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ドナー核が卵母細胞または胚性幹細胞に移植される、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記ポリヌクレオチドが、H3K27me3特異的デメチラーゼの酵素活性フラグメントをコードする、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記ポリヌクレオチドが哺乳類発現ベクター中に存在する、本発明1008の方法。
[本発明1010]
哺乳類発現ベクターが、プロモーターにより指示される、H3K27me3特異的デメチラーゼの構成性または誘導性発現を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
注射されるポリペプチドがKdm6a、Kdm6bまたはKdm6cである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
X連鎖遺伝子の発現を減少させる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
X染色体刷り込みを回避する遺伝子の発現を有意に変化させない、本発明1001の方法。
[本発明1014]
常染色体の遺伝子発現を有意に変化させない、本発明1001の方法。
[本発明1015]
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約35〜60％を上回る、本発明1001の方法。
[本発明1016]
X連鎖遺伝子の母性対立遺伝子発現バイアスが約50％を上回る、本発明1001の方法。
[本発明1017]
胚が初期胚盤胞ステージの胚である、本発明1001の方法。
[本発明1018]
胚が成体体細胞由来である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
体細胞がヒト対象から得られる、本発明1018の方法。
[本発明1020]
胚由来の細胞を培養して、ヒト対象への移植に適した組織を得る工程をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
本発明1001の方法により生成される、胚盤胞。
[本発明1022]
本発明1020の方法により生成される、細胞または組織。
[本発明1023]
本発明1001の胚盤胞を宿主の子宮に着床させることにより生成される、クローン生物。
【国際調査報告】
2022501012.tif 000044