【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年8月9日(2010.8.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、特に、蛍光染料で染色または標識されているタンパク質および核酸などの有機分子において、蛍光を増強する方法に関する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
蛍光を発する化合物は、多くの用途を有し、発生率および観測波長が異なるため、蛍光が吸収に比べて本質的により感度の良い生物学的応用に特に適していることが知られている。蛍光は、全細胞、細胞成分、および細胞機能の検出に用いることができる。例えば、多くの診断および分析技法は、サンプルを検出できるようにそれらを蛍光タグ付けする必要がある。このことは、細胞、組織、タンパク質、抗体、酵素、薬物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、または天然もしくは合成ポリマーなどの多種多様な材料と相互作用する蛍光染料またはプローブを用い、蛍光コンジュゲートを作成することによって達成される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
合成蛍光プローブについては、観察すべき生化学反応に対する特異性を付与するためにリガンドがよく使用され、蛍光染料は、相互作用を検出または定量する手段を提供する。このような応用例には、とりわけ、タンパク質の検出（例えば、ゲル中、表面上または水溶液）、細胞トラッキング、酵素活性の評価および核酸または他の生体高分子の染色が含まれる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
生物学的研究の多くの分野では、赤色蛍光化合物が広範に使用されている。テキサスレッド、テトラメチルローダミンまたは赤色発光ＢＯＤＩＰＹ染料を含むこれらの多くは、５４２ｎｍなどの緑色波長における励起を必要とする。このことは、多くの応用例、特にアルゴンイオンレーザーが励起に使用される応用例におけるそれらの用途を制限している。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
タンパク質の染色には、多くの方法が利用可能である。これらの方法は、非蛍光化合物、または蛍光化合物を利用することができる。最も一般的に使用されている方法は、非蛍光性であるクーマシーブルー（ブラッドフォード分析）を利用している。蛍光をベースとしたタンパク質検出法は、タンパク質と複合体を形成し、非蛍光方法に比べて本質的により感度の良い蛍光染料を利用している。タンパク質の蛍光染色は、従来の銀染色またはクーマシー染色を上回る多くの利点を有する。そのような利点には、より高い感度、より低いバックグラウンド干渉およびより大きなダイナミックレンジが含まれる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０１／８１３５１は、フロ［３，２−ｇ］［２］ベンゾピラン−２，９（９ａＨ）ジオンのコアをベースとした蛍光染料化合物について記載している。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
蛍光染料は、電気泳動の分野で特に有用である。電気泳動は、電場による印加後のゲルマトリックス中における荷電分子の相対的移動度を利用することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質などの荷電生体高分子の分離を可能にする。電場中で各分子が移動する距離は、分子の電荷、形状および重量によって異なる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
当技術分野では多くの蛍光染料が知られているが、シグナル強度、シグナル対バックグラウンド比および蛍光染料の感度を改善することが依然として必要である。さらに、電気泳動のゲルマトリックス上で形成される蛍光複合体の安定性を改善することが必要である。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
本発明は、蛍光染料の蛍光を増強し、ストークスシフトの増加（すなわち、励起波長と発光波長との間における通常の差のさらなる増加）をもたらし、蛍光染料／有機分子複合体の安定性を改善して溶液中またはゲルマトリックス上に蓄積されたサンプルの蛍光強度を高め、かつ／または寿命を伸ばす方法を提供する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
本明細書で使用する用語「蛍光を増強すること」は通常、蛍光染料からの蛍光発光を増加させることを意味する。この増加は、染料の通常の発光波長においてであっても、異なる波長においてであってもよい。このことは、蛍光強度の増加、シグナル対バックグラウンド比の増加または蛍光染料の検出感度限界の向上（すなわち、より高い感度）によって明らかにすることができるであろう。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
本明細書で使用する用語「ストークスシフト」は、蛍光染料の励起波長から発光波長におけるよく知られたシフトの現象を指す。このシフトは、より高波長に向かう（すなわち、赤色シフト）。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
本明細書で使用する用語「アザフィロン蛍光染料」は、ポリケチド生合成経路から得られるか、得られる可能性のある任意の蛍光染料を意味する。ポリケチド生合成経路から得られる可能性のある染料の例は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０１／８１３５１に記載されている。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
さらに、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、用語「蛍光染料」は、蛍光染料化合物、ならびに蛍光染料化合物がタンパク質または核酸などの有機分子と会合するか、コンジュゲートする場合に形成される蛍光複合体またはコンジュゲートを指す。蛍光複合体またはコンジュゲートは、非共有結合性および／または共有結合性相互作用によって有機分子について形成させることができるであろう。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
本発明者は、塩基、特に窒素含有塩基の存在が、特定の蛍光染料、特にアザフィロン蛍光染料の通常の発光波長に緑色蛍光から赤色蛍光へのシフトを引き起こすことを発見した。このストークスシフトが有利なのは、典型的なアルゴンイオンレーザーの励起波長（４８８ｎｍ）からさらに蛍光染料の発光波長を移動するからである。長いストークスシフトの蛍光染料が重要な生化学試薬であるのは、それらの蛍光発光が、励起光源からの干渉を最小限にして検出でき、励起プロファイルと発光プロファイルの重なりが少ないために自己消光がより低い傾向にあるからである。さらに、長いストークスシフトの染料は、多くの生体サンプル中に存在する短いストークスシフトのフルオロフォアの存在に起因する自己蛍光からの干渉が少ない傾向がある。通常、長いストークスシフトを有することが知られている蛍光染料は高分子量分子であり、不十分な透過性およびタンパク質分解により蛍光標識としての応用例は厳しく限定されている。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
より意義深いのは、本発明において、ストークスシフト、および／またはストークスシフトの増加が、シグナル強度の増加を伴うこともあり、これがより高いシグナル対バックグラウンド比（すなわち、非特異的バックグラウンド蛍光の低下）および／または蛍光染料の検出感度限界の向上につながる。したがって、塩基の存在は、知られている蛍光技法、特に有機分子を検出するための蛍光染色技法を著しく改善する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
蛍光染料は、式（Ｉａ）で表される化合物、またはその異性体であることが好ましい。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
染料は、異性体を含む式（Ｉｂ）で表される化合物を有することが好ましい。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
エピコッコノンおよびエピコッコノン含有染料混合物ならびに抽出物が好ましい。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
一実施形態において、上述の方法は、有機分子を染色および／または標識する方法であって、有機分子と蛍光染料との間で蛍光複合体を形成することを含み、蛍光複合体は、塩基の存在下で形成され、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基で処理される方法の一部である。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
別の実施形態において、上述の方法は、塩基および／または界面活性剤の存在下で有機分子と蛍光染料との間で蛍光複合体を形成し、かつ／または蛍光複合体は、その形成後に塩基および／または界面活性剤で処理されることを含む。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
有機分子は、蛍光染料によって染色または標識することを必要とする任意の分子であってよい。しかしながら、有機分子は通常、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチドまたは核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）であり、酵素、細胞受容体、増殖因子、抗体などの別の複雑な分子に含まれていてもいなくても、あるいは組織、器官または細胞の一部であってもなくてもよい。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
電気泳動後に有機分子および／またはゲルマトリックスを塩基で処理することも本発明の中に企図されている。例えば、電気泳動後のゲルを、蛍光染料で処理する前または後に塩基で洗浄してもよい。電気泳動後の洗浄を脂肪族アミン（Ｃ４〜Ｃ２０一級アミン）またはアンモニアを用いて行うことが好ましいのは、これらの塩基が、ゲル中で分離されたタンパク質を取り囲むＳＤＳミセルに分配する傾向があるためである。通常、ゲルは、適切な濃度の塩基性溶液で２×１０分の洗浄を受けるが、洗浄回数および洗浄時間は、使用する塩基、ゲルプレートのサイズ、塩基の濃度などによって異なる。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
また、本発明は、タンパク質を可動化および検出する方法であって、
（ａ）タンパク質の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｂ）タンパク質をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｃ）上述のように可動化タンパク質と蛍光染料の間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｄ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ、
を含み、蛍光複合体は、塩基および／または界面活性剤の存在下で形成される方法を提供する。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
さらに、本発明は、核酸を可動化および検出する方法であって、
（ａ）核酸の溶液をマトリックスに塗布するステップ、
（ｂ）核酸をマトリックス上で可動化するステップ、
（ｃ）上述のように可動化核酸と蛍光染料の間で蛍光複合体を形成するステップ、及び、
（ｄ）そのようにして形成された蛍光複合体を検出するステップ、
を含み、蛍光複合体は、塩基および／または界面活性剤の存在下で形成される方法を提供する。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
また、本発明は、上述のような蛍光染料を上述のような塩基および／または界面活性剤と混合することによって得られる蛍光化合物または複合体を提供する。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
また、本発明は、上述のような蛍光染料、上述のような塩基および／または界面活性剤を含む組成物を提供する。組成物には、タンパク質および／または核酸などの有機分子がさらに含まれていてもよい。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
また、本発明は、上述のような蛍光染料、上述のような塩基および／または界面活性剤を備えるキットを提供する。キットには、タンパク質および／または核酸などの有機分子がさらに含まれていてもよい。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１０】
ゲル染色
材料および方法
製造業者の使用説明書（ＮｕＰＡＧＥ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ、Ａｕｇｕｓｔ  ２６  ２００２．ＩＭ−１００１）に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １０ウエル１２％ポリアクリルアミドゲルを調製し泳動した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ＳＤＳ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔタンパク質マーカーを調製し、５０ｍＭジチオスレイトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｅｇｅｎｔｓ  Ｐａｒｋ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｙ、ＶＩＣ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｃａｔ．ＮＰ０００７）で２倍希釈した。サンプルを７０℃で１０分間加熱した。１×ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｃａｔ  Ｍ２９３３）緩衝液を用いてゲルを分離させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ（Ｃａｔ．ＮＰ０００５；５００μＬ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｘ−ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅ−Ｌｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌの陰極室に加え、追跡用染料がゲルの基部に達するまで２００Ｖ一定でゲルを泳動した。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
これらの結果は、核酸の検出および定量を改善する際の染料の有用性および界面活性剤および／または塩基および／または酸の用途を示している。