(57)【要約】本明細書において、バリアントCD80ポリペプチド、バリアントCD80ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。該免疫調節タンパク質は、多種多様な腫瘍学的状態に治療的有用性を提供する。そのようなタンパク質を作製および使用するための組成物および方法を提供する。2022501361.tif 000141
2022501361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてがんを処置する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)がんを有する対象に、PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;ならびに
(b)該対象に治療有効量の抗がん剤を投与する段階。
【請求項２】
抗がん剤が、免疫チェックポイント阻害剤または化学療法剤である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
抗がん剤が、白金系化学療法剤である化学療法剤である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
化学療法剤がオキシラプラチンである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
抗がん剤がCTLA-4の免疫チェックポイント阻害剤であり、任意で、該チェックポイント阻害剤が、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはその抗原結合断片である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
抗がん剤がPD-1の免疫チェックポイント阻害剤(PD-1阻害剤)であり、任意で、PD-1阻害剤が抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項８】
対象においてがんを処置する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)がんを有する対象に、PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;ならびに
(b)対象に治療有効量のPD-1阻害剤を投与する段階であって、PD-1阻害剤が、プログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊する、段階。
【請求項９】
前記リガンドが、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PD-1阻害剤が、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
PD-1阻害剤が、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項7〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合部分が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680(AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される、請求項7〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
PD-1阻害剤が、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含む、請求項7〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
PD-1阻害剤がAMP-224である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
PD-1阻害剤の投与の開始が、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始と同時または順次に実施される、請求項7〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
PD-1阻害剤の投与の開始が、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始の後である、請求項7〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
抗PD-1抗体の投与の開始が、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質の最終用量の投与の後である、請求項7〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
バリアントCD80融合タンパク質が、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含み、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質が、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、方法。
【請求項２２】
バリアントCD80融合タンパク質が非経口投与される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
バリアントCD80融合タンパク質が皮下投与される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
バリアントCD80融合タンパク質が静脈内投与される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
バリアントCD80融合タンパク質が、ボーラス注射である注射によって投与される、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
治療有効量が、各々両端の値を含めて、約0.5mg/kg〜約140mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.5mg/kg〜約20mg/kg、約0.5mg/kg〜約18mg/kg、約0.5mg/kg〜約12mg/kg、約0.5mg/kg〜約10mg/kg、約0.5mg/kg〜約6mg/kg、約0.5mg/kg〜約3mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約18mg/kg、約1mg/kg〜約12mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約6mg/kg、約1mg/kg〜約3mg/kg、約3mg/kg〜約40mg/kg、約3mg/kg〜約30mg/kg、約3mg/kg〜約20mg/kg、約3mg/kg〜約18mg/kg、約3mg/kg〜約12mg/kg、約3mg/kg〜約10mg/kg、約3mg/kg〜約6mg/kg、約6mg/kg〜約40mg/kg、約6mg/kg〜約30mg/kg、約6mg/kg〜約20mg/kg、約6mg/kg〜約18mg/kg、約6mg/kg〜約12mg/kg、約6mg/kg〜約10mg/kg、約10mg/kg〜約40mg/kg、約10mg/kg〜約30mg/kg、約10mg/kg〜約20mg/kg、約10mg/kg〜約18mg/kg、約10mg/kg〜約12mg/kg、約12mg/kg〜約40mg/kg、約12mg/kg〜約30mg/kg、約12mg/kg〜約20mg/kg、約12mg/kg〜約18mg/kg、約18mg/kg〜約40mg/kg、約18mg/kg〜約30mg/kg、約18mg/kg〜約20mg/kg、約20mg/kg〜約40mg/kg、約20mg/kg〜約30mg/kg、または約30mg/kg〜約40mg/kgである、請求項20〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
治療有効量が、両端の値を含めて、約3.0mg/kg〜18mg/kgである、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
治療有効量が、両端の値を含めて、約6mg/kg〜約20mg/kgである、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
治療有効量が、両端の値を含めて、約1mg/kg〜約10mg/kgである、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
治療有効量が、両端の値を含めて、約2.0mg/kg〜約6.0mg/kgである、請求項20〜26および29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
バリアントCD80融合タンパク質が、腫瘍内投与される、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を腫瘍内投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
【請求項３３】
バリアントCD80融合タンパク質が、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
治療有効量が、両端の値を含めて、約0.1mg/kg〜約1mg/kgである、請求項19〜25および31〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
治療有効量が、約0.2mg/kg〜約0.6mg/kgである、請求項19〜25および31〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
治療有効量が、単回用量で投与される、請求項20〜31および33〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
治療有効量が、6回以下の複数回用量で投与され、6回以下の複数回用量が、2回の用量、3回の用量、4回の用量、5回の用量または6回の用量である、請求項20〜31および33〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
治療有効量が、4回の用量で投与される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
治療有効量が、3回の用量で投与される、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
治療有効量が、2回の用量で投与される、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
6回以下の複数回用量の各々が、毎週、2週間毎、3週間毎または4週間毎に投与される、請求項37〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
各々の複数回用量の間隔が約1週間である、請求項37〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
単回用量または6回以下の複数回用量の各々が、個々に、約0.5mg/kg〜約10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与される、請求項20〜26および36〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
【請求項４５】
Q1W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量が、約1mg/kg〜約3mg/kgである、請求項43または44記載の方法。
【請求項４６】
前記投与が、1週間を超える期間にわたる、請求項43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
単回用量または6回以下の複数回用量が、個々に、約1.0mg/kg〜約40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与される、請求項20〜26および36〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
【請求項４９】
Q3W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量が、約3.0mg/kg〜約10mg/kgである、請求項46または請求項47記載の方法。
【請求項５０】
バリアントCD80融合タンパク質が、非経口投与、任意で、皮下投与される、請求項44〜46、48および49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
バリアントCD80融合タンパク質が、ボーラス注射である注射によって投与される、請求項44〜46および48〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
治療有効量が、6週間以下の期間で投与される、請求項20〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
治療有効量が、4週間以下または約4週間の期間で投与される、請求項20〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
各々の複数回用量が等しい量である、請求項20〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
投与する段階の前に、PD-L1もしくはCD28について表面陽性、および/またはCD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性の細胞を含む、腫瘍を有する対象を、処置のために選択する、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
CD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性、および/またはCD28について表面陽性の細胞を含む、腫瘍を有するとして選択された対象に、バリアントCD80融合タンパク質を投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
【請求項５７】
CD80またはCD86について表面陰性の細胞が、腫瘍細胞または抗原提示細胞を含む、請求項55または請求項56記載の方法。
【請求項５８】
CD28について表面陽性の細胞が、腫瘍浸潤Tリンパ球を含む、請求項55または請求項56記載の方法。
【請求項５９】
対象が、PD-L1について表面陽性の細胞を含む腫瘍を有するとしてさらに選択されている、請求項55〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
PD-L1について表面陽性の細胞が、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞、任意で、腫瘍浸潤Tリンパ球である、請求項55または請求項59記載の方法。
【請求項６１】
対象の腫瘍中の腫瘍浸潤Tリンパ球の存在または密度に基づき免疫スコア(immunoscore)を決定する段階をさらに含む、請求項55〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
免疫スコアが低い場合、対象が処置のために選択される、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
バリアントCD80融合タンパク質が、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、請求項1〜62のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
バリアントCD80融合タンパク質が、PD-L1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す、請求項1〜63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
バリアントCD80融合タンパク質が、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、請求項1〜64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
結合親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、請求項63〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項1〜66のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項1〜67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項1〜68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、請求項1〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、請求項1〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89Nを含む、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含む、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93Eを含む、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
非改変CD80がヒトCD80である、請求項1〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、請求項1〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、請求項78または請求項79記載の方法。
【請求項８１】
バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、請求項1〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項1〜83のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項1〜84のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
バリアントCD80細胞外ドメインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、請求項1〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
多量体化ドメインがFc領域である、請求項1〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、請求項87または請求項88記載の方法。
【請求項９０】
Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcがヒトIgG1のものである、請求項87または請求項88記載の方法。
【請求項９１】
Fc領域が、アミノ酸置換N297Gを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
Fc領域が、アミノ酸置換R292C/N297G/V302Cを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、請求項90記載の方法。
【請求項９３】
Fc領域が、アミノ酸置換L234A/L235E/G237Aを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、請求項90記載の方法。
【請求項９４】
Fc領域が、アミノ酸置換C220Sをさらに含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、請求項87〜93のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
Fc領域がK447delを含み、この残基がKabatのEUインデックスに従って番号付けされる、請求項87〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
バリアントCD80融合タンパク質が、CTLA-4の活性をアンタゴナイズする、請求項1〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
バリアントCD80融合タンパク質が、PD-1/PD-L1相互作用を遮断する、請求項1〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
バリアントCD80融合タンパク質が、CD28に結合して、CD28アゴニズムを媒介する、請求項1〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
CD28アゴニズムがPD-L1依存性である、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
対象がヒトである、請求項1〜99のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
(a)PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、該バリアントCD80融合タンパク質;ならびに
(b)抗がん剤
を含む、キット。
【請求項１０２】
抗がん剤が、免疫チェックポイント阻害剤または化学療法剤である、請求項101記載のキット。
【請求項１０３】
抗がん剤が、白金系化学療法剤である化学療法剤である、請求項101または請求項102記載のキット。
【請求項１０４】
化学療法剤がオキシラプラチンである、請求項103記載のキット。
【請求項１０５】
抗がん剤がCTLA-4の免疫チェックポイント阻害剤であり、任意で、該チェックポイント阻害剤が抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片である、請求項101または請求項102記載のキット。
【請求項１０６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはその抗原結合断片である、請求項105記載のキット。
【請求項１０７】
抗がん剤が、PD-1の免疫チェックポイント阻害剤(PD-1阻害剤)であり、任意で、PD-1阻害剤が抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である、請求項101または請求項102記載のキット。
【請求項１０８】
(a)PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、該バリアントCD80融合タンパク質;ならびに
(b)プログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊するPD-1阻害剤
を含む、キット。
【請求項１０９】
前記リガンドが、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である、請求項108記載のキット。
【請求項１１０】
PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する、請求項107〜109のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１１】
PD-1阻害剤が、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない、請求項107〜110のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１２】
PD-1阻害剤が、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である、請求項107または108記載のキット。
【請求項１１３】
PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項107〜112のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１４】
前記抗体または抗原結合部分が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680(AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される、請求項107または請求項113記載のキット。
【請求項１１５】
PD-1阻害剤が、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含む、請求項107〜112のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１６】
PD-1阻害剤がAMP-224である、請求項115記載のキット。
【請求項１１７】
バリアントCD80融合タンパク質が、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、請求項107〜116のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１８】
バリアントCD80融合タンパク質が、PD-1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す、請求項107〜117のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１９】
バリアントCD80融合タンパク質が、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、請求項107〜118のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２０】
結合親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、請求項107〜119のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２１】
1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項107〜120のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２２】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項107〜121のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２３】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項107〜122のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２４】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、請求項107〜123のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２５】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、請求項107〜124のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２６】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、請求項107〜125のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２７】
非改変CD80がヒトCD80である、請求項107〜126のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２８】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、請求項107〜127のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２９】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、請求項128記載のキット。
【請求項１３０】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、請求項129記載のキット。
【請求項１３１】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、請求項129または請求項130記載のキット。
【請求項１３２】
バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、請求項101〜131のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３３】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、請求項101〜132のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３４】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である、請求項101〜133のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３５】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項101〜134のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３６】
バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項101〜135のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３７】
バリアントCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、請求項101〜136のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３８】
多量体化ドメインがFc領域である、請求項101〜137のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３９】
Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、請求項138記載のキット。
【請求項１４０】
Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、請求項138または請求項139記載のキット。
【請求項１４１】
Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcがヒトIgG1のものである、請求項138〜140のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４２】
請求項101〜141のいずれか一項記載のキットおよび使用説明書を含む、製造物品。
【請求項１４３】
前記説明書が、請求項1〜20、22〜31および34〜100のいずれか一項記載の方法に従う、バリアントCD80 Fc融合タンパク質またはPD-1阻害剤の投与のための情報を提供する、請求項142記載の製造物品。
【請求項１４４】
融合タンパク質の2つのコピーを含む多価CD80ポリペプチドであって、該融合タンパク質が、以下を含む、該多価CD80ポリペプチド：
(1)IgVドメインまたはその特異的結合断片を含む少なくとも2つのバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分(vCD80)であって、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、vCD80、および
(2)Fc領域ポリペプチド。
【請求項１４５】
前記ポリペプチドが四価である、請求項144記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１４６】
前記融合タンパク質が、構造:(vCD80)-リンカー-Fc-リンカー-(vCD80)を含む、請求項144または請求項145記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１４７】
前記融合タンパク質が、構造:(vCD80)-リンカー-(vCD80)-リンカー-Fcを含む、請求項144または請求項145記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１４８】
vCD80が、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、請求項144〜147のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１４９】
vCD80が、PD-L1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分と比較して、PD-L1との増加した結合を示す、請求項144〜148のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５０】
親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、請求項148または請求項149記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５１】
1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項144〜150のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５２】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項144〜151のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５３】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項144〜152のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５４】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、請求項144〜153のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５５】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、請求項144〜154のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５６】
1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、請求項144〜155のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５７】
非改変CD80がヒトCD80である、請求項144〜156のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５８】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、請求項144〜157のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１５９】
非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、請求項158記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６０】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、請求項159記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６１】
非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、請求項159または請求項160記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６２】
vCD80が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、請求項144〜161のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６３】
vCD80が、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、請求項144〜162のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６４】
vCD80が、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を有する、請求項144〜163のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６５】
vCD80が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項144〜164のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６６】
vCD80が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、請求項144〜165のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６７】
vCD80が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、請求項144〜166のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６８】
Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、請求項144〜167のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１６９】
Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、請求項144〜168のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７０】
Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して、低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcが、ヒトIgG1のものである、請求項144〜168のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７１】
各vCD80が同じである、請求項144〜170のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７２】
リンカーが柔軟なリンカーである、請求項144〜171のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７３】
リンカーがペプチドリンカーである、請求項144〜172のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７４】
リンカーが、GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)または3×GGGGS(SEQ ID NO:1504)である、請求項173記載の多価CD80ポリペプチド。
【請求項１７５】
請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドの融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１７６】
請求項175記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１７７】
発現ベクターである、請求項176記載のベクター。
【請求項１７８】
請求項175記載の核酸または請求項176もしくは請求項177記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７９】
請求項175記載の核酸または請求項176もしくは請求項177記載のベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドの産生方法。
【請求項１８０】
前記多価CD80ポリペプチドを含むタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む、請求項179記載の方法。
【請求項１８１】
請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドを含む、操作された細胞。
【請求項１８２】
前記多価CD80ポリペプチドが、分泌シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結された核酸分子によってコードされる融合タンパク質を含む、請求項181記載の操作された細胞。
【請求項１８３】
前記多価CD80ポリペプチドが、発現された場合に、操作された細胞から分泌されることができる、請求項181または請求項182記載の操作された細胞。
【請求項１８４】
請求項175記載の核酸分子または請求項176もしくは177記載のベクターを含む、操作された細胞。
【請求項１８５】
前記核酸分子が、前記融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結された分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項184記載の操作された細胞。
【請求項１８６】
前記核酸分子が、多価CD80ポリペプチドの融合タンパク質をコードし、多価CD80ポリペプチドが、発現された場合に、操作された細胞から分泌されることができる、請求項184または請求項185記載の操作された細胞。
【請求項１８７】
前記シグナルペプチドが非天然のシグナル配列である、請求項182および184〜186のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１８８】
前記シグナルペプチドが、IgGκシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、CD33シグナルペプチドまたはVHシグナルペプチドである、請求項182および184〜186のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１８９】
前記核酸分子が、前記融合タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、請求項182〜188のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１９０】
前記プロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、請求項189記載の操作された細胞。
【請求項１９１】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項189記載の操作された細胞。
【請求項１９２】
前記プロモーターが、T細胞活性化シグナル伝達に応答するエレメントに応答し、任意で、前記プロモーターが、NFATについての結合部位またはNF-κBについての結合部位を含む、請求項189または請求項191記載の操作された細胞。
【請求項１９３】
免疫細胞、任意で、抗原提示細胞(APC)またはリンパ球である、請求項181〜192のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１９４】
前記細胞が、T細胞、B細胞またはNK細胞であるリンパ球であり、任意で、該リンパ球が、CD4+またはCD8+であるT細胞である、請求項181〜193のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１９５】
前記細胞が、対象から得られた初代細胞であり、任意で、対象がヒト対象である、請求項181〜193のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１９６】
キメラ抗原受容体(CAR)または操作されたT細胞受容体(TCR)をさらに含む、請求項181〜195のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項１９７】
請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１９８】
請求項181〜196のいずれか一項記載の操作された細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１９９】
(i)SEQ ID NO:1に記載の残基に対応する野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230として記載されるアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアント細胞外ドメイン、および
(ii)エフェクター活性を有するFc領域
を含む、バリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCD28のエクトドメインに特異的に結合し、かつヒトPD-L1のエクトドメインに結合しないか、またはPD-L1のエクトドメインに対する野生型ヒトCD80の細胞外ドメインと類似の結合親和性でPD-L1のエクトドメインに結合する、該バリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２００】
バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCTLA-4のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCTLA-4のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す、請求項199記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０１】
バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCD28のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCD28のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す、請求項199または請求項200記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０２】
野生型ヒトCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、請求項199〜201のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０３】
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、請求項199〜202のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０４】
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、アミノ酸改変L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130AまたはT120S/T130Aを含む、請求項199〜203のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０５】
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される置換、またはその保存的アミノ酸置換より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換を含む、請求項199〜202のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０６】
前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、請求項199〜202および205のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０７】
Fc領域が免疫グロブリンG1(IgG1)のものである、請求項199〜206のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質。
【請求項２０８】
請求項199〜207のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項２０９】
任意で発現ベクターである、請求項208記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１０】
請求項208記載の核酸または請求項209記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１１】
請求項208記載の核酸または請求項209記載のベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、請求項199〜210のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質の産生方法であって、任意で、バリアントCD80融合タンパク質を含むタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む、産生方法。
【請求項２１２】
請求項199〜207のいずれか一項記載のバリアントCD80融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項２１３】
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項197、198、および212のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２１４】
無菌である、請求項197、198、212、および213のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２１５】
容器の中に請求項197、198、および212〜214のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む製造物品であって、任意で、容器がバイアルである、製造物品。
【請求項２１６】
容器が密封されている、請求項215記載の製造物品。
【請求項２１７】
請求項197、198、および212〜214のいずれか一項記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
【請求項２１８】
請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドを対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
【請求項２１９】
請求項181〜196のいずれか一項記載の操作された細胞を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
【請求項２２０】
前記操作された細胞が、対象に対して自家である、請求項219記載の方法。
【請求項２２１】
免疫応答を調節することが、対象において疾患または状態を処置する、請求項217〜220のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２２】
疾患または状態が、腫瘍またはがんである、請求項221記載の方法。
【請求項２２３】
請求項197、198、および212〜214のいずれか一項記載の薬学的組成物を対象に投与する段階、請求項144〜174のいずれか一項記載の多価CD80ポリペプチドを対象に投与する段階、または請求項181〜196のいずれか一項記載の操作された細胞を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「METHODS AND USES OF VARIANT CD80 FUSION PROTEINS AND RELATED CONSTRUCTS」という名称の2018年9月19日に出願された米国仮特許出願第62/733,625号;「VARIANT CD80 FUSION PROTEINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS」という名称の2018年9月19日に出願された米国仮特許出願第62/733,623号;および「METHODS AND USES OF VARIANT CD80 FUSION PROTEINS AND RELATED CONSTRUCTS」という名称の2019年3月13日に出願された米国仮特許出願第62/818,058号の恩典を主張するものであり、それらの各々の内容は、参照によりその全体が組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、2019年9月18日に作成された761612003040SeqList.txtという表題の2,178,803バイトサイズのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、がんの処置における免疫応答を調節するための治療用組成物およびそれを使用する方法に関する。いくつかの局面では、本開示は、コグネイト結合パートナーに対する変化した結合、例えば結合親和性または選択性、例えばCD28、PD-L1、および/またはCTLA-4に対する増加した親和性を示すCD80の特定のバリアントに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
抗原提示細胞(APC)または標的細胞とリンパ球とによって、およびそれらの細胞間で形成される免疫学的シナプス(IS)で起こるプロセスに介入することによる免疫応答の調節に関して、医学的関心が高まっている。機構的には、ISの細胞表面タンパク質は、複数のタンパク質標的と、それらが結合する単一タンパク質との、協調的でありかつ同時に起こることが多い相互作用を伴うことができる。IS相互作用は、2つの細胞の接合部と密接に関連して起こり、この構造体中の単一タンパク質が、同じ細胞上のタンパク質(シス)および関連細胞上のタンパク質(トランス)の両方と、恐らく同時に相互作用することができる。ISを調節できる治療薬は知られているが、改善された治療薬が必要である。そのようなニーズを満たす、細胞上で発現可能な可溶性タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含む免疫調節タンパク質が提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、がんを有する対象に、PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階であって、バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;ならびに対象に治療有効量の抗がん剤を投与する段階を含む。
【０００６】
いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤または化学療法剤である。いくつかの態様では、抗がん剤は、白金系化学療法剤である化学療法剤である。いくつかの態様では、化学療法剤はオキシラプラチンである。いくつかの態様では、抗がん剤は、CTLA-4の免疫チェックポイント阻害剤であり、任意で、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗がん剤は、PD-1の免疫チェックポイント阻害剤(PD-1阻害剤)であり、任意で、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である。
【０００７】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、がんを有する対象に、PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階であって、バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含有する、段階;ならびに対象に治療有効量のPD-1阻害剤を投与する段階であって、PD-1阻害剤が、プログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊する、段階を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、リガンドは、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に特異的に結合する。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの例では、抗体または抗原結合部分は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680(AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される。
【０００９】
いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含有する。いくつかの態様では、PD-1阻害剤はAMP-224である。
【００１０】
いくつかの態様では、PD-1阻害剤の投与の開始は、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始と同時または順次に実施される。いくつかの例では、PD-1阻害剤の投与の開始は、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始の後である。いくつかの態様では、抗PD-1抗体の投与の開始は、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質の最終用量の投与の後である。任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質は、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される。
【００１１】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階を含み、バリアントCD80融合タンパク質は、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含有し、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質が、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される。
【００１２】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質、例えばバリアントCD80 Fc融合体は、非経口投与される。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質、例えばバリアントCD80 Fc融合体は、皮下投与される。いくつかの態様では、バリアントCD80 Fc融合タンパク質は、静脈内投与される。いくつかの態様では、投与は、注射がボーラス注射である注射による。
【００１３】
提供される方法のいずれかの態様では、投与される治療有効量は、各々両端の値を含めて、約0.5mg/kg〜約40mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.5mg/kg〜約20mg/kg、約0.5mg/kg〜約18mg/kg、約0.5mg/kg〜約12mg/kg、約0.5mg/kg〜約10mg/kg、約0.5mg/kg〜約6mg/kg、約0.5mg/kg〜約3mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約18mg/kg、約1mg/kg〜約12mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約6mg/kg、約1mg/kg〜約3mg/kg、約3mg/kg〜約40mg/kg、約3mg/kg〜約30mg/kg、約3mg/kg〜約20mg/kg、約3mg/kg〜約18mg/kg、約3mg/kg〜約12mg/kg、約3mg/kg〜約10mg/kg、約3mg/kg〜約6mg/kg、約6mg/kg〜約40mg/kg、約6mg/kg〜約30mg/kg、約6mg/kg〜約20mg/kg、約6mg/kg〜約18mg/kg、約6mg/kg〜約12mg/kg、約6mg/kg〜約10mg/kg、約10mg/kg〜約40mg/kg、約10mg/kg〜約30mg/kg、約10mg/kg〜約20mg/kg、約10mg/kg〜約18mg/kg、約10mg/kg〜約12mg/kg、約12mg/kg〜約40mg/kg、約12mg/kg〜約30mg/kg、約12mg/kg〜約20mg/kg、約12mg/kg〜約18mg/kg、約18mg/kg〜約40mg/kg、約18mg/kg〜約30mg/kg、約18mg/kg〜約20mg/kg、約20mg/kg〜約40mg/kg、約20mg/kg〜約30mg/kg、または約30mg/kg〜約40mg/kgである。いくつかの態様では、治療有効量は、両端の値を含めて、約3.0mg/kg〜18mg/kgである。いくつかの態様では、治療有効量は、両端の値を含めて、約6mg/kg〜約20mg/kgである。
【００１４】
任意のこのような態様のいくつかでは、治療有効量は、両端の値を含めて、約1mg/kg〜約10mg/kgである。いくつかの態様では、治療有効量は、両端の値を含めて、約2.0mg/kg〜約6.0mg/kgである。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質、例えばバリアントCD80 Fc融合体は、腫瘍内投与される。
【００１５】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を腫瘍内投与する段階を含み、バリアントCD80融合タンパク質は、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質は、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、両端の値を含めて、約0.1mg/kg〜約1mg/kgである。いくつかの例では、治療有効量は、約0.2mg/kg〜約0.6mg/kgである。いくつかの態様では、治療有効量は、単回用量で投与される。
【００１６】
任意のそのような提供される態様のいくつかでは、治療有効量は、6回以下の複数回用量で投与され、6回以下の複数回用量は、2回の用量、3回の用量、4回の用量、5回の用量または6回の用量である。いくつかの態様では、治療有効量は、4回の用量で投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、3回の用量で投与される。いくつかの例では、治療有効量は、2回の用量で投与される。
【００１７】
いくつかの態様では、複数回用量の各用量は、毎週、2週間毎、3週間毎または4週間毎に投与される。いくつかの態様では、6回以下の複数回用量の各々は、毎週、2週間毎、3週間毎または4週間毎に投与される。いくつかの局面では、各々の複数回用量の間隔は、約1週間である。
【００１８】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、単回用量または複数回用量の各々、例えば6回以下の複数回用量の各々は、約0.5mg/kg〜約10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与される。
【００１９】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供され、該方法は、がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与する段階を含み、バリアントCD80融合タンパク質は、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、Q1W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量は、約1mg/kg〜約3mg/kgである。
【００２１】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、単回用量または複数回用量の各々、例えば6回以下の複数回用量の各々は、約1.0mg/kg〜約40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与される。
【００２２】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供され、該方法は、がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与する段階を含み、バリアントCD80融合タンパク質は、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、Q3W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量は、Q3Wの約3.0mg/kg〜約10mg/kgである。
【００２４】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質は、非経口投与、任意で、皮下投与される。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、ボーラス注射である注射によって投与される。
【００２５】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、投与は、1週間を超える期間にわたる。いくつかの例では、治療有効量は、6週間以下の期間で投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、4週間以下または約4週間の期間で投与される。ある態様では、各々の複数回用量が等しい量である。
【００２６】
任意のこのような態様のいくつかでは、該方法は、投与する段階の前に、PD-L1もしくはCD28について表面陽性および/またはCD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性の細胞を含む、腫瘍を有する対象を、処置のために選択する。いくつかの態様では、PD-L1について表面陽性である細胞を含む腫瘍を有する対象が、処置のために選択される。いくつかの態様では、CD28について表面陽性である細胞を含む腫瘍を有する対象が、処置のために選択される。いくつかの態様では、CD80について表面陰性である細胞を含む腫瘍を有する対象が、処置のために選択される。いくつかの態様では、CD86について表面陰性である細胞を含む腫瘍を有する対象が、処置のために選択される。特定の局面では、そのような細胞は腫瘍細胞である。特定の局面では、そのような細胞は、腫瘍浸潤免疫細胞、例えば腫瘍浸潤Tリンパ球である。
【００２７】
対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供され、該方法は、バリアントCD80融合タンパク質を、CD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性、および/またはCD28について表面陽性の細胞を含有する腫瘍を有するとして選択された対象に投与する段階を含み、バリアントCD80融合タンパク質は、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含有し、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【００２８】
いくつかの態様では、CD80またはCD86について表面陰性の細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞を含有する。いくつかの態様では、CD28について表面陽性の細胞は、腫瘍浸潤Tリンパ球を含有する。いくつかの例では、対象は、PD-L1について表面陽性の細胞を含む腫瘍を有するとしてさらに選択されている。いくつかの態様では、PD-L1について表面陽性の細胞は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞、任意で、腫瘍浸潤Tリンパ球である。
【００２９】
いくつかの態様では、該方法は、対象の腫瘍中の腫瘍浸潤Tリンパ球の存在または密度に基づき免疫スコア(immunoscore)を決定する段階を含む。いくつかの態様では、免疫スコアが低い場合、対象が処置のために選択される。任意のこのような態様のいくつかでは、対象は、少なくとも1つの結合パートナーに特異的に結合する試薬を使用する免疫組織化学(IHC)によって選択される。
【００３０】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーの増加した結合を示す。いくつかの例では、バリアントCD80融合タンパク質は、結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合をさらに示す。任意のこのような態様のいくつかでは、結合、例えば親和性は、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合、例えば親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【００３１】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す。いくつかの例では、バリアントCD80融合タンパク質は、結合パートナーPD-L1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合をさらに示す。任意のこのような態様のいくつかでは、結合親和性は、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【００３２】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの例では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。
【００３３】
いくつかの例では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含有する。
【００３４】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89Nを含有する。
【００３５】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含有する。
【００３６】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93Eを含有する。
【００３７】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含有する。
【００３８】
任意のこのような態様のいくつかでは、非改変CD80はヒトCD80である。
【００３９】
任意のこのような態様のいくつかでは、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含有するか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である。
【００４０】
いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるか、またはそれを含有する、細胞外ドメイン部分である。いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、IgVドメインを含有するが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない。いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない細胞外ドメイン部分である。
【００４１】
いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。
【００４２】
任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含有する。任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含有する。いくつかのこのような態様では、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【００４３】
任意のこのような態様のいくつかでは、多量体化ドメインはFc領域である。いくつかの態様では、Fc領域は、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである。いくつかの態様では、Fc領域は、1つまたは複数のエフェクター機能を示す。いくつかの態様では、Fc領域は、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、野生型Fc領域と比較して低下した、例えば野生型ヒトFcと比較して低下した、1つまたは複数のエフェクター機能を示すバリアントFc領域は、ヒトIgG1のものである。
【００４４】
いくつかの態様では、Fc領域は、アミノ酸置換N297Gを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、Fc領域は、アミノ酸置換R292C/N297G/V302Cを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、Fc領域は、アミノ酸置換L234A/L235E/G237Aを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、Fc領域は、アミノ酸置換C220Sをさらに含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、Fc領域は、K447delを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。
【００４５】
任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質は、CTLA-4の活性をアンタゴナイズする。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、PD-1/PD-L1相互作用を遮断する。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28に結合して、CD28アゴニズムを媒介する。いくつかの態様では、CD28アゴニズムは、PD-L1依存性である。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【００４６】
PD-L1と特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、該バリアントCD80融合タンパク質;ならびに抗がん剤を含有するキットが、本明細書に提供される。
【００４７】
いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤または化学療法剤である。いくつかの態様では、抗がん剤は、白金系化学療法剤である化学療法剤である。いくつかの態様では、化学療法剤はオキシラプラチンである。いくつかの態様では、抗がん剤は、CTLA-4の免疫チェックポイント阻害剤であり、任意で、チェックポイント阻害剤は抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗がん剤は、PD-1の免疫チェックポイント阻害剤(PD-1阻害剤)であり、任意で、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である。
【００４８】
PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含有する、該バリアントCD80融合タンパク質;ならびにプログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊するPD-1阻害剤を含有する、キットが、本明細書に提供される。
【００４９】
いくつかの態様では、リガンドは、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に特異的に結合する。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である。いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００５０】
任意のこのような態様のいくつかでは、抗体または抗原結合部分は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680 (AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される。
【００５１】
いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含有する。いくつかの態様では、PD-1阻害剤はAMP-224である。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、PD-1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す。
【００５２】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合をさらに示す。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す。いくつかの態様では、結合、例えば親和性は、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【００５３】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。
【００５４】
提供される態様のいずれかのいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含有する。
【００５５】
任意のこのような態様のいくつかでは、非改変CD80はヒトCD80である。いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含有するか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である。
【００５６】
いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるか、またはそれを含有する、細胞外ドメイン部分である。いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、IgVドメインを含有するが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない。
【００５７】
いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分は、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない細胞外ドメイン部分である。
【００５８】
いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。
【００５９】
いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含有する。いくつかのこのような態様では、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【００６０】
任意のそのような提供される態様のいくつかでは、多量体化ドメインはFc領域である。いくつかの態様では、Fc領域は免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである。いくつかの態様では、Fc領域は、1つまたは複数のエフェクター機能を示す。いくつかの態様では、Fc領域は、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有するバリアントFc領域であり、バリアントFc領域は、野生型Fc領域と比較して低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcはヒトIgG1のものである。
【００６１】
このような態様のいずれかのキットおよび使用説明書を含有する製造物品が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、説明書は、提供される方法のいずれかに従う、バリアントCD80融合タンパク質、例えばバリアントCD80 Fc融合タンパク質またはPD-1阻害剤の投与のための情報を提供する。
【００６２】
以下を含む融合タンパク質の2つのコピーを含有する多価CD80ポリペプチドが、本明細書に提供される：
IgVドメインまたはその特異的結合断片を含む少なくとも2つのバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分(vCD80)であって、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含有する、vCD80、および
Fcポリペプチド。
【００６３】
いくつかの態様では、ポリペプチドは四価である。いくつかの態様では、融合タンパク質は、構造:(vCD80)-リンカー-Fc-リンカー-(vCD80)を含有する。いくつかの態様では、融合タンパク質は、構造:(vCD80)-リンカー-(vCD80)-リンカー-Fcを含有する。
【００６４】
いくつかの態様では、vCD80は、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分を含むvCD80と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す。いくつかの態様では、vCD80は、PD-L1に対する非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分と比較して、PD-L1との増加した結合を示す。いくつかの態様では、vCD80は、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含むvCD80と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す。いくつかの態様では、結合、例えば親和性は、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【００６５】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。
【００６６】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。
【００６７】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含有する。
【００６８】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含有する。いくつかの態様では、非改変CD80はヒトCD80である。
【００６９】
いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含有するか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である。いくつかの例では、非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分は、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるか、またはそれを含有する、細胞外ドメイン部分である。
【００７０】
いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、IgVドメインを含有するが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない。いくつかの態様では、非改変CD80の細胞外ドメイン部分は、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される。いくつかの例では、vCD80は、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含有しない細胞外ドメイン部分である。
【００７１】
任意のこのような態様のいくつかでは、vCD80は、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含有する。いくつかの態様では、vCD80は、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を有する。いくつかの態様では、vCD80は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を含有し、任意で、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、vCD80は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個以下のアミノ酸改変を含有し、任意で、アミノ酸改変はアミノ酸置換である。いくつかの態様では、vCD80は、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【００７２】
いくつかの態様では、多量体化ドメインはFc領域である。いくつかの態様では、Fc領域は、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである。いくつかの態様では、Fc領域は、1つまたは複数のエフェクター機能を示す。いくつかの態様では、Fc領域は、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、バリアントFc領域は、野生型Fc領域と比較して、低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcはヒトIgG1のものである。
【００７３】
任意のこのような態様のいくつかでは、各vCD80は同じである。いくつかの態様では、リンカーは柔軟なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、
2022501361.tif 000003
である。
【００７４】
任意のこのような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書に提供される。
【００７５】
任意のこのような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドの融合タンパク質をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。
【００７６】
このような態様のいずれかの核酸を含有するベクターが、本明細書に提供される。いくつかの態様では、ベクターは発現ベクターである。
【００７７】
このような態様のいずれかの核酸またはベクターを含有する宿主細胞が、本明細書に提供される。
【００７８】
このような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドの産生方法が、本明細書に提供され、該方法は、このような態様のいずれかの核酸またはこのような態様のいずれかのベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む。いくつかの態様では、該方法は、多価CD80ポリペプチドを含有するタンパク質を単離または精製する段階を含む。
【００７９】
このような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドを含む操作された細胞が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、多価CD80ポリペプチドは、分泌シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結された核酸分子によってコードされる融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、多価CD80ポリペプチドは、発現された場合に、操作された細胞から分泌されることができる。
【００８０】
このような態様のいずれかの核酸分子またはベクターを含む操作された細胞が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、核酸分子は、融合タンパク質をコードする配列に機能的に連結された分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、多価CD80ポリペプチドの融合タンパク質をコードし、多価CD80ポリペプチドは、発現された場合に、操作された細胞から分泌されることができる。いくつかの態様では、シグナルペプチドは非天然のシグナル配列である。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、IgGκシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、CD33シグナルペプチドまたはVHシグナルペプチドである。
【００８１】
いくつかの態様では、核酸分子は、融合タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む。いくつかの態様では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答するエレメントに応答し、任意で、プロモーターは、NFATについての結合部位またはNF-κBについての結合部位を含む。
【００８２】
いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞、任意で、抗原提示細胞(APC)またはリンパ球である。いくつかの態様では、細胞は、T細胞、B細胞またはNK細胞であるリンパ球であり、任意で、リンパ球は、CD4+またはCD8+であるT細胞である。いくつかの態様では、細胞は、対象から得られた初代細胞であり、任意で、対象はヒト対象である。
【００８３】
いくつかの態様では、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)または操作されたT細胞受容体(TCR)をさらに含む。
【００８４】
このような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドを含有する薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【００８５】
このような態様のいずれかの操作された細胞を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【００８６】
(i)SEQ ID NO:1に記載の残基に対応する野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230として記載されるアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアント細胞外ドメイン、および(ii)エフェクター活性を有するFc領域を含む、バリアントCD80融合タンパク質が、本明細書に提供され、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCD28のエクトドメインに特異的に結合し、かつヒトPD-L1のエクトドメインに結合しないか、またはPD-L1のエクトドメインに対する野生型ヒトCD80の細胞外ドメインと類似の結合親和性でPD-L1のエクトドメインに結合する。
【００８７】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCTLA-4のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCTLA-4のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCD28のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCD28のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す。
【００８８】
いくつかの態様では、野生型ヒトCD80細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸改変L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130AまたはT120S/T130Aを含む。
【００８９】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される置換、またはその保存的アミノ酸置換より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む。
【００９０】
いくつかの態様では、Fc領域は、免疫グロブリンG1(IgG1)のものである。
【００９１】
このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。
【００９２】
このような態様のいずれかの核酸を含むベクターが、本明細書に提供され、任意で、ベクターは発現ベクターである。
【００９３】
このような態様のいずれかの核酸またはベクターを含む宿主細胞が、本明細書に提供される。
【００９４】
このような態様のいずれかの核酸またはベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質の産生方法が本明細書に提供され、任意で、該方法は、バリアントCD80融合タンパク質を含むタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む。
【００９５】
このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。
【００９６】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含有する。いくつかの態様では、薬学的組成物は無菌である。
【００９７】
容器の中にこのような態様のいずれかの薬学的組成物を含有する製造物品が、本明細書に提供され、いくつかの態様では、任意で、容器はバイアルである。いくつかの態様では、容器は密封されている。
【００９８】
このような態様の薬学的組成物を対象に、またはこのような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドを対象に、投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、免疫応答をモデル化することが対象において疾患または状態を処置することを含む。
【００９９】
このような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドを対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法が、本明細書に提供される。
【０１００】
このような態様のいずれかの操作された細胞を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、操作された細胞は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、免疫応答を調節することは、対象において疾患または状態を処置する。いくつかの態様では、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。
【０１０１】
このような態様のいずれかの薬学的組成物を対象に、またはこのような態様のいずれかの多価CD80ポリペプチドを対象に、投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。
【０１０２】
このような態様のいずれかの薬学的組成物、多価CD80ポリペプチド、または操作された細胞を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。
【０１０３】
野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230として記載されるアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアント細胞外ドメイン、およびエフェクター活性を有するFc領域を含有するバリアントCD80融合タンパク質が、本明細書に提供され、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCD28のエクトドメインに特異的に結合し、かつヒトPD-L1のエクトドメインに結合しないか、またはPD-L1のエクトドメインに対する野生型ヒトCD80の細胞外ドメインと類似の結合親和性でPD-L1のエクトドメインに結合する。
【０１０４】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCTLA-4のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCTLA-4のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す。任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインは、ヒトCD28のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCD28のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、親和性は、約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上増加する、または1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上を上回って増加する。
【０１０５】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、混合リンパ球反応における免疫学的活性を増加させ、任意で、増加した免疫学的活性は、混合リンパ球反応におけるIFN-γまたはインターロイキン2の増加した産生を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、抗原提示細胞と共にインキュベートされたT細胞レポーターアッセイで評価した場合の免疫学的活性を増加させる。いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質は、Tリンパ球のCD28媒介性共刺激を増加させる。いくつかの局面では、増加は、約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上である、または1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上よりも大きい。
【０１０６】
任意のこのような態様のいくつかでは、野生型ヒトCD80細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。いくつかの態様では、野生型ヒトCD80細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの例では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含有する。
【０１０８】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸改変L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130AまたはT120S/T130Aを含有する。
【０１０９】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸置換A91G/I118V/T120S/T130Aを含有する。いくつかの例では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸置換S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130Aを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸置換E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93Rを含有する。いくつかの例では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される置換、またはその保存的アミノ酸置換より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。
【０１１０】
任意のこのような態様のいくつかでは、1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含有する。
【０１１１】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含有する。いくつかの局面では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸置換を有する。いくつかの例では、バリアントCD80細胞外ドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１２】
任意のこのような態様のいくつかでは、Fc領域は、免疫グロブリンG1(IgG1)のものである。いくつかの例では、Fc領域は、アミノ酸置換C220Sを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。いくつかの態様では、Fc領域は、K447delを含有し、残基は、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる。
【０１１３】
いくつかの局面では、Fc領域は、SEQ ID NO:1502、1510、1517または1527に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害、プログラム細胞死および細胞食作用の中より選択される。任意のこのような態様のいくつかでは、バリアントCD80融合タンパク質は二量体である。
【０１１４】
このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。
【０１１５】
このような態様のいずれかの核酸を含有するベクターが、本明細書に提供される。いくつかの態様では、ベクターは発現ベクターである。
【０１１６】
このような態様のいずれかの核酸またはこのような態様のいずれかのベクターを含有する宿主細胞が、本明細書に提供される。
【０１１７】
このような態様のいずれかの核酸またはベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質の産生方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、該方法は、バリアントCD80融合タンパク質を含有するタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む。
【０１１８】
このような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を含有する薬学的組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含有する。いくつかの態様では、薬学的組成物は無菌である。
【０１１９】
容器の中にこのような態様のいずれかの薬学的組成物を含有する製造物品が、本明細書に提供され、任意で、容器はバイアルである。いくつかの態様では、容器は密封されている。
【０１２０】
このような態様のいずれかの薬学的組成物を対象に、またはこのような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法が、本明細書に提供される。いくつかの局面では、免疫応答を調節することは、対象において疾患または状態を処置する。いくつかの例では、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。
【０１２１】
このような態様のいずれかの薬学的組成物を対象に、またはこのような態様のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法が、本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】図1Aは、FcにコンジュゲートされたCD80バリアントIgSFドメイン（vIgD）の活性の例示的な概略図であって、CD80-FcがPD-1/PD-L1阻害活性を遮断する概略図を描写する。示すように、CD80 vIgD-FcがPD-L1に結合することによって、PD-L1のその同族結合パートナーPD-1への結合をアンタゴナイズし、PD-1阻害性シグナル伝達を遮断し、TCRシグナル伝達閾値を低下させ、そして、T細胞活性化を促進する。
【図１Ｂ】図1Bは、FcにコンジュゲートされたバリアントIgSFドメイン（vIgD）の活性の例示的な概略図であって、CD80-FcがPD-L1依存性CD28アゴニスト活性をもたらす概略図を描写する。示すように、腫瘍細胞の表面上に発現されるPD-L1へのCD80-Fcの結合は、腫瘍細胞上のPD-L1とT細胞の表面上に発現される阻害性PD-1受容体との会合を防止することができる。加えて、CD80-Fcは、T細胞の表面上の共刺激性CD28受容体に結合するのに利用可能であり、それによって、TCRシグナルのCD28共刺激を介してT細胞活性化を促進しながらT細胞を腫瘍に局在させる。
【図２Ａ】図2Aは、Fcに融合されたバリアントIgSFドメイン（vIgD）（vIgD-Fc）の活性の例示的な概略図であって、vIgDがCD80のIgSFドメインのバリアントである概略図を描写する。示すように、CD80の可溶性vIgDは、その同族結合パートナーと相互作用して、CD80とCTLA-4との相互作用を遮断し、それによって、CTLA-4阻害性受容体を遮断し、場合によって、T細胞がエフェクター表現型へと分化することを可能にする。
【図２Ｂ】図2Bは、FcにコンジュゲートされたCD80バリアントIgSFドメイン（vIgD）の活性の例示的な概略図であって、CD80-FcがCTLA-4阻害活性を遮断する概略図を描写する。示すように、T細胞（例えば、Treg細胞およびTeff細胞）の表面上に発現されるCTLA-4にCD80 vIgD-Fcが結合することによって、CTLA-4の、B7として表示されるその同族結合パートナーCD80（B7-1）およびCD86（B7-2）への結合をアンタゴナイズして、CTLA-4阻害性シグナル伝達を遮断し、TCRシグナル伝達閾値を低下させ、そして、T細胞活性化を促進する。
【図３】図3は、第1のCD80 vIgDおよび第2のCD80 vIgDを含有する多価分子の様々な例示的な形状を描写する。示すように、第1のCD80 vIgDおよび第2のCD80 vIgDは、独立して、Fc領域のN末端またはC末端に直接的または間接的に連結される。ホモ二量体Fc分子を生成させるために、Fc領域は、細胞における個々のFc領域の共発現によって、適合したFc領域とホモ二量体を形成可能であるものである。ヘテロ二量体Fc分子を生成させるために、個々のFc領域は、個々のFc領域が細胞において共発現されたときにホモ二量体と比較してヘテロ二量体の形成が優先されるように、変異（例えば、CH3ドメインにおける「ノブ-イントゥ-ホール（knob-into-hole）」変異）を含有する。いくつかの態様では、第1のCD80 vIgDおよび第2のCD80 vIgDは、同じであるか異なる。示される形状は、その同族結合パートナーの1つまたは複数に対して二価、四価または六価であるタンパク質をもたらす。
【図４】図4は、細胞表面に発現されたPD-L1リガンド、CD28リガンドおよびCTL44リガンドへの例示的なCD80 IgV-Fcバリアントの結合を描写する。
【図５】図5は、例示的なCD80 IgV-Fcバリアントによって誘導された、Jurkat/IL-2レポーター株における用量依存性のPD-L1依存性CD28共刺激を描写する。
【図６】図6は、例示的なCD80 IgV-Fcバリアントによって誘導された、PD-L1依存性共刺激後のヒト初代T細胞サイトカイン産生を描写する。
【図７】図7は、例示的なCD80 IgV-Fc候補の、PD-L1に結合して、蛍光コンジュゲートされたPD-1結合を遮断する能力を描写する。
【図８】図8は、PD-1/PD-L1相互作用とその後の機能的活性である例示的なバリアントCD80-Fcバリアントの拮抗活性を描写する。
【図９】図9は、野生型IgG1 Fc（WT Fc）または不活性IgG1 Fc（不活性Fc）に融合された例示的なバリアントCD80ポリペプチドのインビボ抗腫瘍活性を描写する。
【図１０】図10は、不活性Fc対照；例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）50μg、100μgもしくは500μg；または抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）100μgで処置した後のマウスモデルにおける腫瘍体積の中央値（左パネル）および平均値（右パネル）を描写する。動物はすべて、8日目、10日目および12日目に処置した（左パネルおよび右パネルの各々の左の3つの矢印）。最初に不活性Fc対照を受けた動物のみが、その後、26日目、28日目および31日目に、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc 100μgも受けた（左パネルおよび右パネルの各々の右の3つの矢印）。
【図１１】図11は、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）50μg、100μgおよび500μgならびに抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）100μgでインビボ処置した後のhPD-L1MC38腫瘍溶解物におけるIFNγの濃度を描写する。
【図１２】図12は、複数の例示的なCD80 IgV-Fc（不活性）バリアントおよび抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）で処置した後のマウスモデルにおける腫瘍体積の中央値（左パネル）および平均値（右パネル）を描写する。
【図１３】図13は、例示的なCD80 IgV-Fc（不活性）バリアントおよび抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）による処置後腫瘍消失が示されたマウスにおける、huPD-L1/MC38腫瘍細胞を再負荷した後の腫瘍体積の中央値（左パネル）および平均値（右パネル）を描写する。
【図１４】図14は、CD45陰性（CD45 neg.；CD45-）生存腫瘍細胞の単一細胞懸濁液に対するフローサイトメトリーによる、結合している陰性対照Fc、CD80バリアント-Fcおよび抗PD-L1抗体の検出を描写する。
【図１５】図15は、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）および抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）で処置した後のマウスモデルにおける腫瘍体積の中央値（上部パネル）および平均値（下部パネル）を描写する。
【図１６】図16Aおよび16Bは、陰性対照Fc、CD80バリアント-Fcおよび抗PD-L1抗体で処置したマウスの腫瘍流入領域リンパ節（図16A）および腫瘍（図16B）における、フローサイトメトリーによって検出されたCD8細胞の割合を描写する。図16Cは、陰性対照Fc、CD80 IgV-Fcおよびヒト抗PD-L1抗体でインビボ処置したCD45陰性腫瘍上の抗ヒトFcで検出された試薬の割合を表す。
【図１７】図17は、形質導入されていない親MC38に対してではなく、huPD-L1で形質導入されたMC38腫瘍細胞に対して特異的な、CD80 IgV-Fcバリアントのインビトロ細胞傷害活性を描写しており、このことは、huPDL1特異的殺傷を実証している。
【図１８】図18および19は、初代ヒトT細胞（図18）および初代ヒト単球（図19）へのCD80 IgV-Fcバリアントの結合を描写する。
【図１９】図18および19は、初代ヒトT細胞（図18）および初代ヒト単球（図19）へのCD80 IgV-Fcバリアントの結合を描写する。
【図２０】図20は、酵素相補性アッセイを使用した、PD-1に対するPD-L1媒介性SHP-2動員のCD80 IgV-Fcバリアントアンタゴニズムを描写する。
【図２１】図21は、CD80/CTLA-4結合のCD80 IgV-Fcバリアントアンタゴニズムを描写する。
【図２２Ａ】図22Aは、例示的な試験バリアントCD80 IgV-Fcの単独および抗マウスPD-1モノクローナル抗体との併用の、同系マウス黒色腫モデルにおける抗腫瘍活性の評価からの腫瘍体積中央値を示す。
【図２２Ｂ】図22Bは、TGIによって測定された抗腫瘍活性を示す。
【図２３】図23は、例示的な試験バリアントCD80 IgV-Fc単独および抗PD-1抗体との併用の組み合わせによるT細胞応答の評価におけるIL-2産生を示す。
【図２４−１】図24Aは、バリアントCD80 IgV-FcのIP（腹腔内注射）またはIT（腫瘍内注射）による処置からの抗腫瘍活性の評価からの腫瘍体積中央値を示す。
【図２４−２】図24Bは、バリアントCD80 IgV-FcでIP（腹腔内注射）またはIT（腫瘍内注射）処置したマウスからのCD45-陰性細胞サブセットの中でhuIgGを使用して検出された細胞の百分率を示す。*、**、****は、それぞれ、p<0.05、0.001、0.0001（一元配置分散分析によるFc対照群に対する）。図24Cは、バリアントCD80 IgV-FcでIP（腹腔内注射）またはIT（腫瘍内注射）処置したマウスからのPD-L1+CD45-細胞サブセットの中でhuIgGを使用して検出された細胞の百分率を示す。*、****は、それぞれ、p<0.05、0.0001（一元配置分散分析によるFc対照群に対する）。
【図２５】図25は、バリアントCD80 IgV-FcでIP（腹腔内注射）またはIT（腫瘍内注射）処置したマウスからの腫瘍における総細胞の中のp15e四量体+CD8+ T細胞の評価割合を示す。*、***は、それぞれ、p<0.05または0.001（一元配置分散分析によるFc対照群に対する）。
【図２６】図26A〜26Bは、例示的な多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質によるPD-L1/PD-1およびCTLA-4/CD80相互作用の遮断の評価からの結果を示す。
【図２７】図27は、例示的な多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質によるサイトメガロウイルス（CMV）抗原特異的T細胞応答の評価におけるIL-2産生を示す。
【図２８Ａ】図28Aは、用量群に対する対照マウス（非腫瘍担持）の経日的な観察された血清濃度（円）および予測血清濃度（マウスPKモデル；実線）を示す。
【図２８Ｂ】図28Bは、マウスPKモデルに対する適合度を示す。左上の散布図は、血清濃度の測定値を予測値に対して集団レベルで比較する。右上の散布図は、血清濃度の測定値を予測値に対して個別レベルで比較する。両プロットにおいて、点線は、単位元を表す。左下および右下のプロットは、集団予測および時間に対する重み付き残差の分布を示す。
【図２９Ａ】図29A〜29Fは、マウス腫瘍モデル（ヒトPD-L1を発現するマウス結腸腺がんMC38細胞）におけるモデル予測血清濃度値（中央値および信頼区間（CI））を観察された血清濃度値と比較して示しており、この場合の動物は処置されている。CD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）で処置したマウス群についてのデータおよび予測を以下の投与量について示す：100μgの単回用量（図29A；中央値およびCI 80％）、33μgの1回量を7日毎（Q7D）に合計3回の用量（図29B；中央値およびCI 90％）、100μgの単回用量（図29C；中央値およびCI 90％）、500μgの単回用量（図29D；中央値およびCI 90％）、1500μgの単回用量（図29E；中央値およびCI 90％）、および167μgの1回量を3日毎（Q3D）に合計3回の用量（図29F；中央値およびCI 90％）。処置はすべて、腹腔内（IP）投与された。
【図２９Ｂ】図29Aの説明を参照のこと。
【図２９Ｃ】図29Aの説明を参照のこと。
【図２９Ｄ】図29Aの説明を参照のこと。
【図２９Ｅ】図29Aの説明を参照のこと。
【図２９Ｆ】図29Aの説明を参照のこと。
【図３０Ａ】図30Aは、用量群に対するカニクイザルの経日的な観察された血清濃度（円）および予測血清濃度（サルPKモデル；実線）を示す。
【図３０Ｂ】図30Bは、サルPKモデルに対する適合度を示す。左上の散布図は、血清濃度の測定値を予測値に対して集団レベルで比較する。右上の散布図は、血清濃度の測定値を予測値に対して個別レベルで比較する。両プロットにおいて、点線は、単位元を表す。左下および右下のプロットは、集団予測および時間に対する重み付き残差の分布を示す。
【図３１Ａ】図31A〜31Bは、hPD-L1-MC38腫瘍担持マウスにおける観察された腫瘍体積（三角形および線適合）および予測腫瘍体積（マウスPDモデル；実線；PRED）を経日的に異なる処置群で示す。図31Aは、腫瘍担持マウスが、未処置であった（CTRL）、例示的な試験CD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）33μgを7日毎に合計3回の用量（Q7D×3）受けた、またはCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）100μgの単回用量を受けた、研究#1処置群を示す。図31Bは、腫瘍担持マウスが、未処置であった（CTRL）、CD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）100μgの単回用量を受けた、CD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）167μgを3日毎に合計3回の用量（Q3D×3）受けた、CD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）500μgの単回用量を受けた、または試験CD80バリアント1500μgの単回用量を受けた、研究#2を示す。
【図３１Ｂ】図31Aの説明を参照のこと。
【図３２Ａ】図32Aは、一用量のCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）が異なる濃度で週1回（Q1W）投与された（静脈内注射（IV)）ヒトにおける予測標的（CD28）飽和を示す。
【図３２Ｂ】図32Bは、一用量のCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）が異なる濃度で週1回（Q1W）ヒトに投与（IV）されるレジメン下の薬物の予測ヒト血清濃度レベルを示す。
【図３２Ｃ】図32Cは、一用量のCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）が異なる濃度で三週間毎に1回（Q3W）ヒトに投与（IV）されるレジメン下の薬物の予測ヒト血清濃度レベルを示す。
【図３３】図33は、CD80 IgV-Fcバリアント、オキサリプラチンまたは両方の組み合わせで処置した後のhuPD-L1+MC38腫瘍担持マウスについての腫瘍体積の変化を示す。
【図３４】図34は、CD80 IgV-Fcバリアント、CTLA-4に対する抗マウスチェックポイント抗体または両方の組み合わせで処置した後のhuPD-L1+MC38腫瘍担持マウスについての腫瘍体積の変化を示す。
【図３５】図35は、CD80 IgV-FcバリアントのCD80 IgVドメインと野生型PD-L1との間の結合面の結晶構造を示す。
【図３６】図36Aは、CD80 IgV-Fcバリアント、抗CD28遮断抗体または両方の組み合わせで処置した後のhuPD-L1+MC38腫瘍担持マウスについての腫瘍体積の変化を示す。図36Bは、CD80 IgV-Fcバリアント、抗PD-L1遮断抗体または両方の組み合わせで処置した後のhuPD-L1+MC38腫瘍担持マウスについての腫瘍体積の変化を示す。
【図３７】図37は、SIPで形質導入されたドナーPan T細胞から収集された上清中の経時的なCD80 IgV-Fc分泌型免疫調節タンパク質（SIP）濃度レベルを示す。
【図３８】図38は、Jurkat/IL-2レポーター株における例示的なCD80 IgV-Fc SIPによって誘導された用量依存性CD28共刺激を示す。
【図３９】図39は、PD-L1発現人工抗原提示細胞へのCD80 IgV-Fc SIP結合を示す。
【図４０】図40は、例示的なCD80 ECD-Fcバリアントによって誘導された、Jurkat/IL-2レポーター株における用量依存性のFcR依存性CD28アゴニズムを描写する。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
詳細な説明
本明細書では、少なくとも1つの標的リガンドコグネイト結合パートナー(カウンター構造体リガンドタンパク質とも呼ばれる)に対する変化した結合活性または親和性を示すCD80およびその特異的結合断片のバリアントまたは変異体であるか、またはそれらを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変または野生型CD80ポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加)を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変または野生型CD80ポリペプチドと比較して、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、非改変または野生型CD80ポリペプチドのIgSFドメイン(例えば、IgV)の中にある。
【０１２４】
本明細書では、CD80の細胞外ドメインのバリアントまたは変異体、および多量体化ドメインを含有する融合タンパク質である免疫調節タンパク質もまた、提供される。いくつかの局面では、提供されるバリアントCD80融合タンパク質は、少なくとも1つの標的リガンドコグネイト結合パートナー(カウンター構造体リガンドタンパク質とも呼ばれる)との変化した結合活性または親和性を付与する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば置換)を有するCD80細胞外ドメインポリペプチドを含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変または野生型CD80ポリペプチドの細胞外ドメインと比較して、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加)を含有する。これらのバリアントCD80を作製および使用する方法もまた、提供される。
【０１２５】
いくつかの態様では、変化した結合活性、例えば、結合親和性および/または結合選択性、例えば、増加または減少した結合親和性または選択性は、少なくとも1つの結合パートナータンパク質CD28、PD-L1、またはCTLA-4に対するものである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CD28、PD-L1、またはCTLA-4のうちの1つまたは複数との変化した、例えば増加または減少した、結合活性または親和性を示す。
【０１２６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない、非改変または野生型CD80と比較して、CD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つまたは複数との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CD28との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、PD-L1との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CTLA-4との増加した結合親和性を示す。
【０１２７】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CD28およびPD-L1の一方または両方との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CD28およびCTLA-4の一方または両方との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、PD-L1およびCTLA-4の一方または両方との増加した結合親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80と比較して、CD28、PD-L1およびCTLA-4との増加した結合親和性を示す。
【０１２８】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4との結合についての1つまたは複数の改変を含有しない非改変または野生型CD80の選択性と比較して、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4との結合について増加した選択性を示す。いくつかの態様では、比率は、1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍、15.0倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍もしくはそれ以上を上回って、または約1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍、15.0倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍もしくはそれ以上を上回って増加する。
【０１２９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドおよび免疫調節タンパク質は、免疫学的免疫応答を調節する、例えば免疫応答を増加させる。いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達分子との相互作用を介してT細胞の活性化、拡大増殖、分化、および生存を調節する。概して、抗原特異的T細胞の活性化には、一般的に2つの異なるシグナルが必要である。第1のシグナルは、抗原提示細胞(APC)上に存在する主要組織適合複合体(MHC)関連抗原とT細胞受容体(TCR)の相互作用によって提供される。第2のシグナルは、TCR会合に対する共刺激、例えばCD28共刺激シグナルであり、T細胞のアポトーシスまたはアネルギーを避けるために必要である。
【０１３０】
いくつかの態様では、通常の生理的条件下では、T細胞媒介性免疫応答は、T細胞受容体(TCR)による抗原認識によって開始され、共刺激シグナルおよび阻害性シグナル(例えば、免疫チェックポイントタンパク質)のバランスによって調節される。免疫系は、免疫チェックポイントに依存して自己免疫を防ぎ(すなわち、自己寛容)、免疫応答時、例えば病原性感染に対する攻撃時に過度の損傷から組織を保護する。しかしながら、場合によっては、これらの免疫調節タンパク質は、免疫系から逃避するためのメカニズムとして、腫瘍を含む疾患および状態で調節不全になる可能性がある。
【０１３１】
いくつかの態様では、公知のT細胞共刺激受容体の中にはCD28があり、これは、APC上に両方とも存在するリガンドB7-1(CD80)およびB7-2(CD86)のT細胞共刺激受容体である。他ならぬこれらのリガンドは、CD28よりも高い親和性で阻害性T細胞受容体CTLA4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)にも結合できる；CTLA4への結合は、免疫応答を下方調節するように作用する。いくつかの態様では、CD80は、プログラム死リガンド1(PD-L1)に結合することができる。CD80は、PD-L1との親和性がCD28との親和性と類似している。PD-L1は、阻害性免疫受容体、プログラム死1(PD-1)の2つのリガンドの1つである。PD-L1とPD-1の相互作用は、T細胞の不活性化を促進し、T細胞の活性を下方調節することにより、免疫学的活性を負に調節する。T細胞上のPD-1発現は、T細胞の過剰活性を防ぐ戦略として、T細胞が活性化された後に誘導され得る。多くの腫瘍細胞は表面にPD-L1を発現し、潜在的にPD-1/PD-L1相互作用、および腫瘍に対するT細胞応答の阻害をもたらす。CD80のPD-L1への結合は、PD-L1とPD-1との間の相互作用を遮断でき、これにより、例えば腫瘍部位でのT細胞応答の阻害を防ぎ、免疫応答を効果的に増強または高める。いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、B7/CTLA-4の結合をアンタゴナイズし、CTLA-4阻害性シグナル伝達を防止し、TCRシグナル伝達閾値を低下させ、これにより、T細胞活性化および免疫応答を促進することができる。
【０１３２】
いくつかの態様では、CD80は、CD28受容体との結合に役立つ場合があり、T細胞応答の誘導に関与する場合がある。いくつかの態様では、CD80は、PD-L1に結合して、PD-L1とPD-1との相互作用を遮断し、T細胞応答の阻害を防ぐ場合があり、またはCTLA-4に結合してCTLA-4阻害性シグナル伝達を防ぐ場合がある。したがって、場合によっては、CD80と、PD-L1、CD28、および/またはCTLA-4との相互作用により、重複した効果および補完的な効果を得ることができる。いくつかの態様では、CD28およびPD-L1は、免疫応答のモデリングにおいて補完的な役割を果たす場合がある。
【０１３３】
いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、阻害性受容体CTLA-4、PD-L1/PD-1負の調節複合体および/または共刺激受容体CD28によって誘導またはこれらと関連する免疫学的活性を調節する(例えば、増加または減少させる)。例えば、いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、局所T細胞上のCD28受容体と結合し、それを共刺激し、これにより、免疫応答を促進する。いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、図1Aに示すように腫瘍細胞またはAPC上のPD-L1と結合することができ、これにより、PD-L1とPD-1阻害性受容体との相互作用を遮断し、これにより、さもなければPD-L1/PD-1相互作用から得られたであろう負の調節シグナル伝達を防ぐ。いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、図2Aに示すようにCTLA-4阻害性受容体と結合し、それとAPC上に発現されたCD80との相互作用を遮断し、これにより、CD80結合CTLA-4受容体の負の調節シグナル伝達を防ぐ。いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、PD-L1/PD-1相互作用を遮断しながら、局在化したT細胞上のCD28受容体と結合およびそれを共刺激し、これにより、免疫応答を促進することができる(図1B)。いくつかの特定の態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、CTLA-4阻害性受容体とも結合し、それとCD80との相互作用を遮断し、CD80結合CTLA-4受容体の負の調節シグナル伝達を防ぐ。
【０１３４】
したがって、いくつかの態様では、提供されるポリペプチドは、CD28および/またはPD-L1の両方、および場合によりCTLA-4と、独立した結合親和性を有し、これにより、受容体による共刺激の補完効果をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。これらのバリアントCD80を作製および使用する方法もまた、提供される。
【０１３５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28および/またはCTLA-4と、例えばヒトCD28またはヒトCTLA-4に、特異的に結合する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の改変を含有しない、非改変または野生型CD80と比較して、CD28またはCTLA-4の一方または両方との、変化した、例えば増加した、結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型ヒトCD80細胞外ドメインポリペプチドと比較して、CTLA-4、例えばヒトCTLA-4との、増加した結合を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型ヒトCD80細胞外ドメインポリペプチドと比較して、CD28、例えばヒトCD28との、増加した結合を示す。
【０１３６】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、可溶性である。結合パートナーに対するバリアントCD80の同じ増加した結合および活性に基づいて、バリアントポリペプチドを様々な構成でフォーマットし、状況に応じて免疫応答をアンタゴナイズまたはこれをアゴナイズする能力は、治療用途に柔軟性をもたらす。例えば、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4に対する親和性が増加した可溶性フォーマットの強化CD80タンパク質の送達は、活性化刺激、例えば、CD3および/もしくはCD28共刺激シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために起こり得る細胞内の阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のシグナル伝達をアンタゴナイズすることができる。場合によっては、この結果、免疫応答は増加することができる。
【０１３７】
加えて、ある種のフォーマットは、場合によっては、CD28アゴニズムも媒介することができる。提供される態様の中に、CD28を介して共刺激シグナルを調節する、例えばこれをアゴナイズする態様がある。
【０１３８】
場合によっては、CD28アゴニズムは、PD-L1との増加した結合を示すある種のバリアントCD80ポリペプチドによって媒介され、これによりCD28との相互作用のための免疫シナプス表面へのバリアントCD80分子のつなぎまたは架橋を促し、これにより共刺激シグナルをもたらすことにより、T細胞の活性化を促す。PD-L1依存性CD28共刺激と本明細書で呼ばれるこの活性は、いくつかの局面では、バリアントCD80ポリペプチドが非競合的様式でおよび/またはバリアントCD80ポリペプチドの二量体フォーマットを提供することによって、PD-L1およびCD80の両方と結合する能力による(例えば図1Bを参照)。場合によっては、このようなPD-L1依存性共刺激は、エフェクター機能を備えるFcを必要とせず、エフェクターなしのまたは不活性なFc分子を含有する、Fc融合タンパク質によって媒介されることができる。いくつかの局面では、これに加えてまたはこれに代えて、つなぎまたは架橋も、バリアントCD80ポリペプチドがエフェクター機能を保持または示す免疫グロブリンの野生型Fc領域との融合タンパク質として提供される場合、Fc受容体を介して達成することができ、本明細書ではFc受容体依存性CD28共刺激と呼ばれる。
【０１３９】
いくつかの態様では、エフェクター活性を有する免疫グロブリンFcを備える融合タンパク質としてフォーマットされた場合、CD80ポリペプチドのバリアント完全細胞外ドメインのある種のフォーマットは、CD28アゴニズムを媒介できることが、本明細書で見出されている。このような例では、Fc結合を介するFcRとのバリアントCD80融合体の結合は、T細胞上のCD28との会合のために分子を免疫シナプスに局在化するまたはつなぐ場合がある。いくつかの局面では、そのような活性は、CD80ポリペプチドがプログラム死リガンド1(PD-L1)に結合しない態様で特に有効であることが考えられている。CD80はPD-L1に結合できることが報告されている。ある種のバリアント、および野生型CD80の完全細胞外ドメインを備えてフォーマットされたようなある種のフォーマットのバリアントは、実質的により低いPD-L1結合を示すか、またはPD-L1と結合しないことが見出されている。いくつかの態様では、PD-L1に結合しない分子は、結合アッセイ、例えばフローサイトメトリーに基づくアッセイで検出した場合、PD-L1とバックグラウンド結合またはバックグラウンド結合をわずかだけ上回る結合を示す。
【０１４０】
いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、CD28に増加した結合を示す。いくつかの態様では、CD28との増加した結合は、CD28共刺激シグナル伝達の増加を招くことができ、それにより、T細胞活性化および免疫応答を促進する。いくつかの局面では、CD28共刺激シグナル伝達の増加は、FcRに結合することができるエフェクターFcに依存する。対照的に、PD-L1と結合するCD80バリアントは、エフェクター機能を有するFcを必要としないフォーマット、例えばFc融合タンパク質がエフェクターなし、または不活性なFc分子であるフォーマットの、PD-L1依存性CD28アゴニズムを示すことができる。
【０１４１】
いくつかの局面では、Fc受容体を、例えばそのエフェクター活性を介して、架橋することは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)媒介性エフェクター機能を開始することができ、これにより、CTLA-4発現細胞(例えばCTLA-4発現制御性T細胞)またはPD-L1発現細胞(例えば、PD-L1hi腫瘍)などのコグネイト結合パートナーを発現している標的細胞の枯渇をもたらす。
【０１４２】
いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態はまた、B7/CTLA-4結合をアンタゴナイズし、CTLA-4阻害性シグナル伝達を防止し、TCRシグナル伝達閾値を低下させ、これにより、T細胞活性化および免疫応答を促進することができる(図2B)。いくつかの態様では、提供されるCD80ポリペプチド、例えば、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの可溶性形態は、図2Aおよび2Bに示すように、CTLA-4阻害性受容体と結合し、APC上に発現されるCD80とそれとの相互作用を遮断し、これにより、CD80結合CTLA-4受容体の負の調節シグナル伝達を防止する。
【０１４３】
いくつかの態様では、バリアントCD80融合タンパク質などの提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、阻害性受容体CTLA-4、および/または共刺激受容体CD28により誘導されるまたはそれと関連する免疫学的活性を調節する、例えば増加させる。
【０１４４】
これらの受容体の活性の増強または抑制は、がんの処置に臨床的意義を有する。しかしながら、場合によっては、両方の受容体の共刺激効果に介入してそれを変化させる治療法は、空間配向要件に加えて免疫学的シナプスの範囲によって課されるサイズ制限によって制約される。いくつかの局面では、抗体薬を含む既存の治療薬は、これらの相互作用の調節に関与する複数の標的タンパク質と同時に相互作用できない場合がある。加えて、場合によっては、既存の治療薬は、免疫応答をアンタゴナイズするだけで、アゴナイズする能力を持たない場合がある。加えて、これら2つの受容体の一方または他方を独立して標的とする薬物間の薬物動態の違いが、処置の過程を通してそのような薬物の組み合わせの所望の血中濃度を適切に維持するのに困難をもたらす可能性がある。提供されるバリアントCD80ポリペプチドおよび免疫調節タンパク質、および記載される他のフォーマットは、そのような問題に対処する。
【０１４５】
本明細書で言及される特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む全ての刊行物は、特許、特許出願、科学論文またはデータベースを含む個々の刊行物が参照により組み入れられると具体的にかつ個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載の定義に反する、またはそうでなく矛盾する場合、本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先される。
【０１４６】
本明細書において使用されるセクションの見出しは、単に構成を目的としたものであって、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４７】
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての専門用語、表記、ならびに他の技術および科学用語または術語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有することを意図する。場合によっては、通常理解されている意味を有する用語は、明確化のためおよび/またはすぐに参照できるように本明細書において定義され、そして本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも一般的に当技術分野において理解されているものと大きな差異をなすと解釈されるべきではない。
【０１４８】
本明細書を通して使用される用語は、特定の事例において別段限定されない限り、以下のとおり定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈上、別段の明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語、頭字語、ならびに略語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。別段の指示のない限り、化学名および生化学名の略称および記号は、IUPAC-IUB命名法による。別段の指示のない限り、全ての数値範囲は、その範囲を規定する値だけでなくその間の全ての整数値も含む。
【０１４９】
「親和性が改変された」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの文脈において使用される場合、親の野生型または非改変の(すなわち、非親和性改変)IgSF対照ドメインと比較して、そのコグネイト結合パートナー(あるいは「カウンター構造体」)のうちの少なくとも1つに対する結合親和性または結合活性が増加または減少するように変化したアミノ酸配列(対応する野生型の親または非改変IgSFドメインと比べて)を有する哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを意味する。この文脈では、親和性改変CD80 IgSFドメインが含まれる。いくつかの態様では、親和性改変IgSFドメインは、野生型または非改変IgSFドメイン中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸差異、例えばアミノ酸置換を含有することができる。結合親和性または結合活性の増加または減少は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005)。Linsley et al., Immunity, Vol 1(9: 793-801 (1994)も参照されたい。タンパク質のそのコグネイト結合パートナーに対する結合親和性または結合活性の増加は、野生型IgSFドメイン対照よりも少なくとも10％大きい値となり、いくつかの態様では、野生型IgSFドメイン対照値よりも少なくとも20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％、または10000％大きい値となる。タンパク質のそのコグネイト結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する結合親和性または結合活性の減少は、対照の90％以下であるが野生型IgSFドメイン対照値の10％以上の値となり、いくつかの態様では、野生型IgSFドメイン対照値の80％、70％、60％、50％、40％、30％、または20％以下であるが10％以上の値となる。親和性改変タンパク質は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。「親和性改変IgSFドメイン」という用語は、親和性改変IgSFドメインが作製された、いかなる特定の出発組成物または方法のいかなる条件も課すものと解釈されるべきではない。したがって、本発明の親和性改変IgSFドメインは、任意の特定の親和性改変プロセスによって、次いで親和性改変IgSFドメインへと変換された野生型IgSFドメインに限定されない。親和性改変IgSFドメインポリペプチドは、例えば、野生型哺乳動物IgSFドメイン配列情報から開始して生成され、次いで、そのコグネイト結合パートナーとの結合性についてインシリコでモデル化され、そして最後に組換えまたは化学合成されて、主題の親和性改変IgSFドメイン組成物を得ることができる。しかし別の一例では、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、親和性改変IgSFドメインは、産物を意味するが、必ずしもいずれかの所与のプロセスによって産生される産物を意味するわけではない。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む多種多様な技術が用いられる場合がある。
【０１５０】
本明細書における「抗体」という用語は、もっとも広い意味で使用され、無傷の抗体を含むポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに単鎖可変断片(scFv)、および単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ)断片を含む、断片抗原結合(Fab)断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG(rIgG)断片、単鎖抗体断片を含む機能的(抗原結合)抗体断片を含む。該用語は、遺伝子操作されたおよび/またはその他の方法で改変された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば、二重特異性、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデム型ジ-scFv、タンデム型トリ-scFvを包含する。特に述べないかぎり、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解すべきである。該用語はまた、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷または完全長抗体を包含する。
【０１５１】
抗体に関連する「抗体断片」または「抗原結合断片」は、無傷抗体が結合する抗原と結合する、無傷抗体の一部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含むが、それに限定されるわけではない。抗体断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化のみならず、組換え宿主細胞による産生を含むがそれに限定されるわけではない様々な技術によって作製することができる。いくつかの態様では、抗体は、組換え産生された断片、例えば天然に存在しない配置を含む断片、例えば合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって接続した2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有する断片、および/または天然に存在する無傷抗体の酵素消化によって産生され得ない断片である。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「結合親和性」および「結合活性」という用語は、特異的結合条件下でのタンパク質のそのカウンター構造体に対する特異的結合親和性および特異的結合活性をそれぞれ意味する。生化学動態において、結合活性は、CD80と、そのカウンター構造体PD-L1、CD28、および/またはCTLA-4との間などの個別の非共有結合相互作用の複数の親和性の積算強度を指す。このように、結合活性は、単一の相互作用の強度を説明する親和性とは異なる。親和性改変CD80 IgSFドメインを含有するバリアントCD80のそのカウンター構造体との結合親和性の増加または減弱は、非改変CD80、例えば天然または野生型IgSFドメイン、例えばIgVドメインを含有する非改変CD80の結合親和性と比べて決定される。結合親和性または結合活性を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol. 5: 443-453 (2005)を参照されたい。いくつかの態様では、親和性改変IgSFドメインを含有するようなバリアントCD80は、フローサイトメトリーにより測定した場合、実施例6に記載されるような結合アッセイで非改変CD80対照よりも少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％大きい平均蛍光強度(MFI)値をもたらす結合親和性でCD28、PD-L1および/またはCTLA-4に特異的に結合する。
【０１５３】
「生物学的半減期」という用語は、ある物質(例えば、本発明のバリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節ポリペプチド)が、その薬理学的または生理学的活性または濃度の半分を喪失するのに要する時間を指す。生物学的半減期は、物質の消失、排泄、分解(例えば、酵素的)、または体の特定の臓器もしくは組織における吸収および濃縮によって影響されることができる。いくつかの態様では、生物学的半減期は、物質の血漿中濃度がその定常状態レベルの半分に達するのに要する時間(「血漿半減期」)を決定することによって評価することができる。本発明のポリペプチドを誘導体化してその生物学的半減期を延長するために使用することができるコンジュゲートは、当技術分野において公知であり、非限定的に、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、XTEN(伸長組換えペプチド；WO2013130683を参照のこと)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、脂質(アシル化)、およびポリ-Pro-Ala-Ser(PAS)、ポリグルタミン酸(グルタミル化)を含む。
【０１５４】
抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤に関連して「結合を遮断する」という用語およびその文法上の変形は、このような阻害剤がPD-1とPD-L1またはPD-L2などのPD-1リガンドとの相互作用を阻害または破壊または低減する能力を指す。このような阻害は、例えば、PD-1上の重複した結合部位、および/またはリガンド親和性を変える抗体によって誘導されるPD-1のコンフォメーション変化などが原因のリガンド結合への直接干渉を含む、任意のメカニズムにより起こる場合がある。
【０１５５】
「がん」という用語は、異常に高いレベルの増殖および成長を示す細胞群を指すために本明細書において使用される。がんは、良性(良性腫瘍とも呼ばれる)、前悪性、または悪性の場合がある。がん細胞は、固形がん細胞または白血病がん細胞の場合がある。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、それに限定されるわけではない。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、下垂体がん、食道がん、星状細胞腫、軟部組織肉腫、非小細胞肺がん(扁平上皮細胞非小細胞肺がんを含む)、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、腎細胞がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん(hepatic carcinoma)、脳がん、子宮内膜がん、精巣がん、胆管がん(cholangiocarcinoma)、胆嚢がん、胃がん、黒色腫、および様々な種類の頭頸部がん(頭頸部扁平上皮がんを含む)が挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「CAR」という用語は、少なくともエクトドメイン、膜貫通、およびエンドドメインを含有する、哺乳動物細胞上に発現された人工(すなわち、人造)膜貫通タンパク質を指す。CARタンパク質は、任意で、エクトドメインを膜貫通ドメインに共有結合的に連結する「スペーサー」を含む。スペーサーは、多くの場合、ペプチド結合を介してエクトドメインを膜貫通ドメインに連結するポリペプチドである。CARは、典型的には、哺乳動物リンパ球上に発現する。いくつかの態様では、CARは、T細胞または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの哺乳動物細胞上に発現する。T細胞上に発現するCARは、本明細書において「CAR T細胞」または「CAR-T」と称される。ある態様では、CAR-Tは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞である。例えば養子細胞移入において臨床的に使用される場合、患者の腫瘍に対する抗原結合特異性を有するCAR-Tは、典型的には、患者から得られる天然T細胞上に発現するように操作されている。CARを発現する操作されたT細胞は、次いで注入により患者に戻される。したがって、CAR-Tは、多くの場合、自家CAR-Tではあるが、同種CAR-Tも本発明の範囲内に含まれる。CARのエクトドメインは、生理的条件下で標的抗原(例えば、腫瘍特異的抗原)と特異的に結合する抗原結合領域(例えば、抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv))を含有する。特異的に結合すると、一連の生化学的事象(すなわち、シグナルトランスダクション)は、CAR-Tの免疫学的活性の調節をもたらす。したがって、例えば、CAR-Tの抗原結合領域によるその標的抗原への特異的結合によって、細胞傷害性、増殖、またはサイトカイン産生の変化によって反映されるように、T細胞活性の免疫学的活性の変化を導くことができる。いくつかの態様では、CAR-T活性化によるシグナルトランスダクションは、天然の哺乳動物T細胞におけるシグナルトランスダクションに関与するCD3ζ鎖(「CD3-z」)によって達成される。CAR-Tは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節するために複数のシグナル伝達ドメイン(例えば、CD28、41BB、またはOX40)をさらに含有することができる。CD3-zは、T細胞受容体シグナルトランスダクションに関与する免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)として知られている保存されたモチーフを含有する。
【０１５７】
「総合して」または「総合的」という用語は、インビトロアッセイにおいて2つ以上のバリアントCD80ポリペプチドの存在によって誘導されるサイトカイン産生に関して使用される場合、個々のバリアントCD80ポリペプチドによって誘導されるサイトカイン産生に関係なく、サイトカイン発現レベル全体を意味する。いくつかの態様では、アッセイされるサイトカインは、例えば実施例7に記載されるインビトロ初代T細胞アッセイにおけるIFN-γである。
【０１５８】
「コグネイト結合パートナー」という用語(「カウンター構造体」と互換的に使用される)は、ポリペプチド(例えば、バリアントCD80のIgSFドメイン)に関して、言及されているポリペプチドが特異的結合条件下で特異的に結合する少なくとも1つの分子(典型的には、天然の哺乳動物タンパク質)を指す。いくつかの局面では、親和性改変IgSFドメインを含有するバリアントCD80は、対応する天然または野生型CD80のカウンター構造体に特異的に結合するが、増加または減弱化した親和性で結合する。特異的結合条件下で認識されてそのコグネイト受容体に特異的に結合するリガンドの一種は、その受容体のカウンター構造体またはコグネイト結合パートナーの一例である。「細胞表面コグネイト結合パートナー」は、哺乳動物細胞表面上に発現するコグネイト結合パートナーである。「細胞表面分子種」は、免疫学的シナプス(IS)を形成する細胞(例えば、哺乳動物細胞)上に発現するおよび該細胞によって発現する、免疫学的シナプスのリガンドのコグネイト結合パートナーである。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」、「コンジュゲーション」またはそれらの文法上の変形は、当技術分野において公知の任意の接続または連結法によって、2つ以上の化合物を一緒に接続または連結して、別の化合物の形成をもたらすことを指す。それはまた、2つ以上の化合物を一緒に接続または連結することによって生成される化合物を指すこともできる。例えば、1つまたは複数の化学部分またはポリペプチドに直接的または間接的に連結されたバリアントCD80ポリペプチドが、例示的なコンジュゲートである。そのようなコンジュゲートは、融合タンパク質、化学的コンジュゲートによって産生されるもの、および任意の他の方法によって産生されるものを含む。
【０１６０】
「競合的結合」という用語は、本明細書において使用される場合、あるタンパク質が、少なくとも2つのコグネイト結合パートナーに特異的に結合することができるが、1つのコグネイト結合パートナーの特異的結合が第2のコグネイト結合パートナーの同時結合を阻害する(例えば、防止するまたは妨げる)ことを意味する。したがって、場合によっては、あるタンパク質は、2つのコグネイト結合パートナーと同時に結合することはできない。一般的に、競合結合剤は、特異的結合のための同じまたは重複した結合部位を含有するが、これは必須要件ではない。いくつかの態様では、競合的結合は、第2のコグネイト結合パートナーの特異的結合に起因して、そのコグネイト結合パートナーの1つへのタンパク質の特異的結合の測定可能な(部分的または完全な)阻害を引き起こす。ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)アッセイなどの競合的結合を定量する多種多様な方法が公知である。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、組成物は、細胞を含む、2つ以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１６２】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書において使用される場合、あるアミノ酸残基が類似の化学特性(例えば、電荷または疎水性)を備える側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている、アミノ酸置換を意味する。類似の化学特性を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、1)脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、3)アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、4)芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、5)塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、6)酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに、7)硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換の群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
【０１６３】
タンパク質の位置に関して「〜に対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、例えば配列表に記載の、開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置に「対応する」という記述は、構造配列アラインメントに基づいてまたは標準的なアラインメントアルゴリズム(例えば、GAPアルゴリズム)を使用して、開示された配列とのアラインメントによって特定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。例えば、本明細書に記載される構造アラインメント法による、SEQ ID NO:2(ECDドメイン)に記載された、またはSEQ ID NO:76、150もしくは1245(IgVドメイン)に記載された、野生型CD80の配列との参照配列のアライメントによって、対応する残基を決定することができる。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を、ガイドとして使用して、対応する残基を特定することができる。
【０１６４】
「低下(減少)させる」または「減弱(化)する」または「抑制する」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の低下(減少)を意味する。低下(減少)は、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％であることができる。
【０１６５】
「誘導体」または「誘導体化されている」という用語は、その治療効果を保持または増強させながら、生物学的半減期、バイオアベイラビリティ、免疫原性、溶解性、毒性、効力、または有効性などの特性を変化させるために、タンパク質を直接または間接的に組成物に共有結合的に連結させることによる、タンパク質の改変を指す。本発明の免疫調節ポリペプチドの誘導体は、本発明の範囲内であり、例えば、グリコシル化、PEG化、脂質化、またはFc融合によって作製することができる。
【０１６６】
本明細書において使用される場合、検出は、タンパク質の可視化(目視または機器による)を可能にする方法が含まれる。タンパク質は、そのタンパク質に特異的な抗体を使用して可視化できる。タンパク質の検出はまた、検出可能な標識を含むタグとタンパク質の融合によって、または検出可能な標識を含む二次抗体などの、該タンパク質に特異的な第2の試薬との接触によっても促すことができる。
【０１６７】
本明細書において使用される場合、ドメイン(典型的には、3以上、一般的に5または7以上のアミノ酸、例えば10〜200のアミノ酸残基の配列)は、分子の他の部分と構造的および/または機能的に異なりかつ特定可能な分子(例えば、タンパク質またはコーディング核酸)の一部分を指す。例えば、ドメインは、1つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立してフォールド構造を形成することができ、および/または結合活性などの機能活性によって認識される、ポリペプチド鎖の部分を含む。タンパク質は、1つ、または1つよりも多い別個のドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連ファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性、例えばモチーフに対する相同性によって、特定、定義、または識別することができる。別の例では、ドメインは、その機能(例えば、コグネイト結合パートナーなどの生体分子と相互作用する能力)によって識別することができる。ドメインは、独立して生物学的機能または活性を示すことができ、その結果、ドメインは、独立してまたは別の分子に融合して活動(例えば、結合)することができる。ドメインは、線状アミノ酸配列または非線状アミノ酸配列であることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、公知であり、かつ、当業者によって特定することができる。本明細書における例示のため、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは十分に当技術分野の技能の範囲内であると理解される。必要であれば、ドメインを特定するために適切なソフトウェアを用いることができる。
【０１６８】
「エクトドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、膜タンパク質(例えば、膜貫通型タンパク質)の、小胞膜の外側にある領域を指す。エクトドメインは、多くの場合、リガンドまたは細胞表面受容体に、例えば当該リガンドまたは当該細胞表面受容体に特異的に結合する結合ドメインを介して、特異的に結合する結合ドメインを含有する。細胞の膜貫通型タンパク質のエクトドメインは、代替的に細胞外ドメインと称される。
【０１６９】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、単独(すなわち、単剤療法として)または追加の治療剤との組み合わせのいずれかでエクスビボ(患者由来の細胞との接触による)またはインビボ(患者への投与による)で投与された場合、例えば疾患の症状および/または病因を改善または消失させることによって、疾患進行の統計的に有意な減少をもたらす、本発明の治療用組成物(タンパク質組成物または細胞組成物を含む)の量および/または濃度を指す。有効量は、疾患または障害と関連する少なくとも1つの症状もしくは生物学的応答もしくは影響を緩和する、低下させる、もしくは軽減する、疾患もしくは障害の進行を防止する、または患者の身体機能を改善する、量であり得る。ある態様では、患者は、哺乳動物、例えば非ヒト霊長類またはヒト患者である。
【０１７０】
「エンドドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、いくつかの膜タンパク質(例えば、膜貫通型タンパク質)において見いだされる、細胞表面膜によって画定される内部空間内に延びる領域を指す。哺乳動物細胞では、エンドドメインは、膜タンパク質の細胞質領域である。細胞では、エンドドメインは、細胞内構成成分と相互作用し、かつシグナルトランスダクションにおいて役割を果たすことができ、したがって、場合によっては、細胞内シグナル伝達ドメインであることができる。細胞の膜貫通型タンパク質のエンドドメインは、代替的に細胞質ドメインと称され、これは、場合によっては、細胞質シグナル伝達ドメインであることができる。
【０１７１】
「増強された」または「増加(向上)した」という用語は、本明細書において哺乳動物リンパ球の免疫学的活性の増加の文脈で使用される場合、リンパ球の1つまたは複数の活性の増加を意味する。活性の増加は、例えば統計的に有意な量などでの、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性のうちの1つまたは複数の増加であることができる。いくつかの態様では、増加した免疫学的活性への言及は、インターフェロンγ(IFN-γ)産生を、例えば統計的に有意な量、増加させることを意味する。いくつかの態様では、免疫学的活性を、混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいて評価することができる。MLRアッセイを実行する方法は、当技術分野において公知である。Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56。リンパ球の活性を評価する他の方法は、本明細書に記載される任意のアッセイを含め、当技術分野において公知である。ある態様では、増強は、非ゼロ対照値よりも少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％大きい増加であることができる。
【０１７２】
「操作された細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入(例えば、組換えDNA法またはウイルス形質導入法)によって遺伝子改変された哺乳動物細胞を指す。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞、例えばリンパ球(例えば、T細胞、B細胞、NK細胞)または抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)である。細胞は、患者由来の初代細胞であることができ、または細胞株であることができる。いくつかの態様では、本発明の操作された細胞は、バリアントCD80ポリペプチドが特異的に結合するCD28、PD-L1、および/もしくはCTLA-4を発現するT細胞、またはPD-L1を発現するAPCの免疫学的活性を調節するように操作された本発明のバリアントCD80を含有する。
【０１７３】
「操作されたT細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入(例えば、組換えDNA法またはウイルス形質導入法)によって遺伝子改変されたT細胞(例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞(あるいは、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL)、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、またはγδT細胞)を指す。
【０１７４】
「操作されたT細胞受容体」または「操作されたTCR」という用語は、選択され、クローニングされ、および/またはその後T細胞の集団(多くの場合、養子免疫療法に使用される)に導入される、主要組織適合複合体(MHC)/ペプチド標的抗原と所望の親和性で特異的に結合するように操作されたT細胞受容体(TCR)を指す。操作されたTCRとは対照的に、CARは、MHC非依存的に標的抗原と結合するように操作される。
【０１７５】
「〜上に発現する」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞(例えば哺乳動物細胞)の表面に発現するタンパク質に関して使用される。したがって、当該タンパク質は膜タンパク質として発現する。いくつかの態様では、発現する当該タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。いくつかの態様では、当該タンパク質は、小分子部分(例えば、薬物または検出可能標識)にコンジュゲートされる。細胞の表面に発現するタンパク質は、哺乳動物細胞上に発現する細胞表面タンパク質(例えば細胞表面受容体)を含むことができる。
【０１７６】
「半減期延長部分」という用語は、ポリペプチド融合体または化学的コンジュゲートの部分であって、そのように該部分にコンジュゲートされていないタンパク質の半減期と比較して、哺乳動物血清中に循環するタンパク質の半減期を延長する部分を指す。いくつかの態様では、半減期は、1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、もしくは6.0倍より長く、または約1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、もしくは6.0倍より長く延長される。いくつかの態様では、半減期は、半減期延長部分を有しないタンパク質と比較して、インビボ投与後、6時間超、12時間超、24時間超、48時間超、72時間超、96時間超、または1週間超延長される。半減期は、タンパク質がその濃度、量、または活性の半分を喪失するのに要する時間を指す。半減期は、例えば、ELISAアッセイまたは活性アッセイを使用することによって決定することができる。例示的な半減期延長部分には、Fcドメイン、多量体化ドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、XTEN(伸長組換えペプチド；WO2013130683を参照のこと)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、脂質(アシル化)、およびポリ-Pro-Ala-Ser(PAS)、およびポリグルタミン酸(グルタミル化)が含まれる。
【０１７７】
「免疫学的シナプス」または「免疫シナプス」という用語は、本明細書において使用される場合、MHC I(主要組織適合複合体)またはMHC IIを発現する哺乳動物細胞(例えば、抗原提示細胞または腫瘍細胞)と、哺乳動物リンパ球(例えば、エフェクターT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞)との間の界面を意味する。
【０１７８】
免疫グロブリン分子のFc(結晶性断片)領域またはドメイン(Fcポリペプチドとも呼ばれる)は、主に免疫グロブリン重鎖の定常領域に相当し、抗体のエフェクター機能を含む様々な機能を担っている。Fcドメインは、免疫グロブリン分子のヒンジドメインの一部または全てとCH2ドメインおよびCH3ドメインとを含有する。Fcドメインは、1つまたは複数のジスルフィド結合によって接続された2つのポリペプチド鎖の二量体を形成することができる。例示的な二量体化ポリペプチドを図3に示す。いくつかの態様では、Fcは、エフェクター機能を促す活性が低減された(例えば、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上を上回って低減された)バリアントFcである。いくつかの態様では、Fc領域中のアミノ酸置換への参照は、特定のSEQ ID NOに基づいて記載されない限りは、EU番号付けシステムによる。EU番号付けは公知であり、最近更新されたIMGT Scientific Chart(IMGT(登録商標)、すなわちinternational ImMunoGeneTics information system(登録商標)、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(作成日：2001年5月17日、最終更新日：2013年1月10日)およびKabat, E. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242 (1991)に報告されているEUインデックスに従う。
【０１７９】
免疫グロブリンFc融合体(「Fc融合体」)、例えば免疫調節Fc融合タンパク質は、免疫グロブリンのFc領域に機能的に連結された1つまたは複数のポリペプチド(または1つもしくは複数の小分子)を含む分子である。Fc融合体は、例えば抗体のFc領域(薬物動態を促す)およびバリアントCD80ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドまたは小分子(融合パートナー)に間接的または直接的に連結され得る。様々なリンカーが当技術分野において公知であり、任意でこれを使用して、Fcを融合パートナーに連結させてFc融合体を生成することができる。同一種のFc融合体を、二量体化してFc融合ホモ二量体を形成することができ、または非同一種を使用してFc融合ヘテロ二量体を形成することができる。いくつかの態様では、Fcは、哺乳動物Fc、例えばネズミ、ウサギまたはヒトFcである。
【０１８０】
「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターによってコードされているタンパク質を発現させるために使用できる細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌(E. coli)であることができ、または真核生物、例えば単細胞真核生物(例えば酵母または他の真菌類)、植物細胞(例えば、タバコまたはトマト植物細胞)、動物細胞(例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞)、またはハイブリドーマであることができる。宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはそれらの誘導体、例えば無血清培地中で成長するVeggie CHO、DG44、Expi CHO、もしくはCHOZNおよび関連細胞株またはDHFR欠損したCHO系統DX-B11が挙げられる。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞)であることができる。
【０１８１】
「免疫グロブリン」という用語(「Ig」と略記される)は、本明細書において使用される場合、5種のヒトクラスの抗体、すなわちIgA(サブクラスIgA1およびIgA2を含む)、IgD、IgE、IgG(サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む)、およびIgMのいずれかを含む哺乳動物免疫グロブリンタンパク質を指す。該用語はまた、完全または部分的合成(例えば、組換えまたは化学合成)であろうと天然に産生されようと完全長未満である免疫グロブリン、例えば抗原結合断片(Fab)、VHおよびVLを含有する可変断片(Fv)、1つの鎖として一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片(scFv)、ならびに他の抗体V領域断片、例えば、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFvダイアボディ、Fc、およびFdポリペプチド断片を含む。ホモ二重特異性およびヘテロ二重特異性の二重特異性抗体は、該用語の意味の範囲内に含まれる。
【０１８２】
「免疫グロブリンスーパーファミリー」または「IgSF」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞の、認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の群を意味する。分子は、免疫グロブリン(すなわち、抗体)と共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして類別され、これらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを保有する。IgSFのメンバーは、免疫系の、細胞表面抗原受容体、共受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある種のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋タンパク質を含む。これらは、通常、免疫系における役割と関連する。免疫学的シナプス中のタンパク質は、IgSFのメンバーであることが多い。IgSFはまた、機能のような共通の特性に基づいて「サブファミリー」に分類することができる。このようなサブファミリーは、典型的には、4〜30のIgSFメンバーからなる。
【０１８３】
「IgSFドメイン」または「免疫グロブリンドメイン」または「Igドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、IgSFタンパク質の構造ドメインを指す。Igドメインは、免疫グロブリン分子に因んで命名されている。これらは、約70〜110アミノ酸を含有し、それらのサイズおよび機能に従って類別される。Igドメインは、逆平行β鎖の2つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する特徴的なIgフォールドを保有する。サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸間の相互作用ならびにBおよびF鎖中のシステイン残基間で形成される高度に保存されているジスルフィド結合が、Igフォールドを安定化させる。Igドメインの一端は、抗体のそれらのリガンドに対する特異性にとって重要な相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。Ig様ドメインは、IgV、IgC1、IgC2、またはIgIとして(クラスに)分類することができる。ほとんどのIgドメインは、可変(IgV)ドメインまたは定常(IgC)ドメインのいずれかである。9つのβ鎖を有するIgVドメインは、一般的に7つのβ鎖を有するIgCドメインより長い。IgSFのいくつかのメンバーのIgドメインは、アミノ酸配列がIgVドメインと似ているが、IgCドメインとサイズが類似している。これらは、IgC2ドメインと呼ばれ、一方で、標準的なIgCドメインは、IgC1ドメインと呼ばれる。T細胞受容体(TCR)鎖は、細胞外部分に2つのIgドメイン(1つはN末端におけるIgVドメインおよび1つは細胞膜に隣接するIgC1ドメイン)を含有する。CD80は、2つのIgドメイン、すなわちIgVおよびIgCを含有する。
【０１８４】
「IgSF種」という用語は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を有するIgSFメンバータンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)メンバーは、そのIgSFメンバーに属する全てのIgSF種に固有の同一性を定義している。このように、各IgSFファミリーメンバーは、他のIgSFファミリーメンバーから固有であり、したがって、特定のIgSFファミリーメンバーの各種は、別のIgSFファミリーメンバー種から固有である。それにもかかわらず、同じIgSF種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で生じ得る。加えて、遺伝子多型が原因の単一のIgSF種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因のIgSF種の野生型短縮形態と同様、単一のIgSF種内の別の形態の相違を成す。「細胞表面IgSF種」は、細胞(一般的に哺乳動物細胞)の表面に発現するIgSF種である。
【０１８５】
「免疫学的活性」という用語は、本明細書においてT細胞のような哺乳動物リンパ球の文脈で使用される場合、1つまたは複数の細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生(例えば、インターフェロン-γ)、またはT細胞傷害性活性を指す。場合によっては、免疫学的活性は、ケモカインまたはインターロイキンのようなサイトカインのそれらの発現を意味することができる。免疫学的活性の増強または抑制を決定するためのアッセイは、培養上清中のインターフェロン-γサイトカインレベルを測定するMLR(混合リンパ球反応)アッセイ(Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56)、SEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB(staphylococcal enterotoxin B))T細胞刺激アッセイ(Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56)、および抗CD3 T細胞刺激アッセイ(Li and Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104)を含む。T細胞活性化は、IFN-γサイトカインの分泌と関連するため、これらのインビトロのヒトT細胞アッセイからの培養上清中のIFN-γレベルの検出は、市販のELISAキットを使用してアッセイすることができる(Wu et al, Immunol Lett 2008 Apr 15; 117(1): 57-62)。免疫応答の誘導は、静止リンパ球と比べて免疫学的活性の増加をもたらす。本明細書において提供されるとおりの免疫調節タンパク質(例えば、親和性改変IgSFドメインを含有するバリアントCD80ポリペプチド)は、初代T細胞アッセイにおいて、野生型IgSFメンバーまたはIgSFドメイン対照と比べてIFN-γ(インターフェロン-γ)発現を、いくつかの態様において増加させることができ、または、その他の態様において減少させることができる。当業者は、IFN-γ発現の増加を決定するために使用される初代T細胞アッセイのフォーマットが、IFN-γ発現の減少についてアッセイするために用いられるフォーマットと異なることを認識しているであろう。初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を減少させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性改変IgSFドメインの能力についてアッセイする際に、実施例6に記載されるように混合リンパ球反応(MLR)アッセイを使用することができる。好都合なことに、本発明の可溶性形態の親和性改変IgSFドメインを用いて、IFN-γ発現をアンタゴナイズすることによりその発現を減少させるその能力を、同じく実施例6に記載されるようにMLRで決定することができる。あるいは、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性改変IgSFドメインの能力についてアッセイする際に、共固定化アッセイを使用することができる。共固定化アッセイでは、T細胞受容体シグナル(いくつかの態様において、抗CD3抗体によって提供される)を共固定化された親和性改変IgSFドメイン、例えばバリアントCD80と併用して、野生型IgSFドメイン対照と比べてIFN-γ発現を増加させる能力を決定する。バリアントCD80膜貫通型免疫調節タンパク質の活性を評価することを含む、操作された細胞の免疫学的活性をアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、非限定的に、抗原刺激後にT細胞を拡大増殖させる能力、再刺激の非存在下でT細胞の拡大増殖を持続する能力、および適切な動物モデルにおける抗がん活性を含む。アッセイはまた、標準的な51Cr放出アッセイ(例えば、Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464を参照のこと)またはフローベース細胞傷害性アッセイ、またはインピーダンスベース細胞傷��性アッセイ(Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198)を含む、細胞傷害性を評価するアッセイを含む。
【０１８６】
「免疫調節ポリペプチド」または「免疫調節タンパク質」は、免疫学的活性を調節するポリペプチドまたはタンパク質分子である。免疫応答の「調節」または「調節すること」とは、免疫学的活性の増加または低減のいずれかを意味する。免疫調節タンパク質は、単一のポリペプチド鎖であるか、または(例えば、鎖間ジスルフィド結合によって)互いに共有結合された少なくとも2つのポリペプチド鎖の多量体(二量体またはより高次の多量体)であることができる。したがって、単量体、二量体、およびより高次の多量体ポリペプチドは、その定義された用語の範囲内である。多量体ポリペプチドは、(同一ポリペプチド鎖の)ホモ多量体または(非同一ポリペプチド鎖の)ヘテロ多量体であることができる。免疫調節タンパク質は、バリアントCD80ポリペプチドを含むことができる。
【０１８７】
「増加(向上)させる」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量、増加(向上)させることを意味する。増加(向上)は、非ゼロ対照値よりも少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、またはそれ以上であることができる。
【０１８８】
CD80の「アイソフォーム」は、アミノ酸配列が異なる、複数の天然に存在するCD80ポリペプチドのうちの1つである。アイソフォームは、単一の遺伝子によって発現されるRNA転写物のスプライスバリアントの産物であることができ、または遺伝子重複から生じ得るような機能的に類似のタンパク質を生成する高度に類似するが異なる遺伝子の発現産物であることができる。本明細書において使用される場合、CD80の「アイソフォーム」という用語はまた、CD80遺伝子の異なるアレルの産物も指す。
【０１８９】
本明細書において使用される場合、「キット」は、再構成、活性化、および送達、投与、診断のための機器/デバイス、および生物学的活性または特性の評価のためを含むが、それに限定されるわけではない、成分の組み合わせ、例えば、本明細書における組成物と別の品目との組み合わせを指す。キットは、任意で、使用説明書を含む。
【０１９０】
「標識」という用語は、検出可能シグナルを提供するために直接もしくは間接的に結合もしくは連結できる、または検出可能シグナルを改変するために第2の標識と相互作用できる、化合物または組成物を指す。標識は、標識されたポリペプチドを生成するために、ポリペプチドに直接または間接的にコンジュゲートすることができる。標識は、それ自体、検出可能(例えば、放射性同位体標識または蛍光標識)であることができる、または酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物組成物の化学変化を触媒することができる。標識の非限定的な例としては、蛍光発生部分、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが挙げられる。
【０１９１】
「リンパ球」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系における白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)(細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する)、T細胞(細胞媒介性の細胞傷害性適応免疫に関する)、およびB細胞(体液性の抗体による適応免疫に関する)を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球(ILC)もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
【０１９２】
場合によっては、患者または個体と互換的に使用される「対象」という用語は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。「哺乳動物」という用語は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも1つへの言及を含む。
【０１９３】
「哺乳動物」または「患者」という用語は、具体的に、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも1つへの言及を含む。
【０１９４】
「膜タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、生理的条件下で脂質二重層に直接または間接的に結合しているタンパク質を意味する。膜を形成する脂質二重層は、生体膜、例えば真核生物(例えば、哺乳動物)の細胞膜または人工の(すなわち、人造の)膜、例えばリポソーム上に見いだされる膜であることができる。脂質二重層への膜タンパク質の結合は、共有結合によるか、または非共有結合的相互作用(例えば、疎水性相互作用もしくは静電相互作用)によるものであることができる。膜タンパク質は、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であることができる。表在性膜タンパク質である膜タンパク質は、脂質二重層に非共有結合するか、または内在性膜タンパク質に非共有結合する。表在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で表在性膜タンパク質が脂質二重層と会合するおよび/または脂質二重層から解離することができるように、脂質二重層への一時的な結合を形成する。表在性膜タンパク質とは対照的に、内在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で内在性膜タンパク質が脂質二重層への結合から解離しないように、膜の脂質二重層への事実上恒久的な結合を形成する。膜タンパク質は、脂質二重層の一層によって膜への結合を形成することができる(モノトピック型)か、または膜の両方の層によって結合することができる(ポリトピック型)。1つの脂質二重層とだけ相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性モノトピック型タンパク質」である。脂質二重層の両方と相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性ポリトピック型タンパク質」であり、あるいは、本明細書において「膜貫通型タンパク質」と称される。
【０１９５】
「調節すること」または「調節する」という用語は、本明細書において免疫応答(例えば哺乳動物の免疫応答)の文脈で使用される場合、本発明のバリアントCD80を含む免疫調節ポリペプチドの投与の結果として起こる、既存のまたは潜在的な免疫応答の任意の変化(例えば、増加または減少)を指す。したがって、調節は、バリアントCD80を含む免疫調節タンパク質の投与の非存在下で起こるまたは存在する免疫応答と比較した、免疫応答の変化(例えば、増加または減少)を指す。そのような調節は、免疫細胞の免疫学的活性の度合いまたは程度の任意の誘導、活性化、抑制、または変化を含む。免疫細胞は、B細胞、T細胞、NK(ナチュラルキラー)細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)、および非プロフェッショナル抗原提示細胞、ならびに炎症細胞(好中球、マクロファージ、単球、好酸球、および好塩基球)を含む。調節は、既存の免疫応答、発生段階にある免疫応答、潜在的な免疫応答に、または免疫応答を誘導する、調節する、それに影響を及ぼす、もしくは応答する能力に付与される任意の変化を含む。調節は、免疫応答の一部としての、免疫細胞における遺伝子、タンパク質および/または他の分子の発現および/または機能の任意の変化を含む。免疫応答の調節または免疫学的活性の調節は、例えば、以下を含む：免疫細胞の消失、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の誘導または生成；免疫細胞における不応答状態(すなわち、アネルギー)の誘導；免疫細胞の活性または機能を増強または抑制すること(これらの細胞によって発現されるタンパク質のパターンを変化させることを非限定的に含む)。例としては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、もしくは他の細胞表面受容体などの特定の分子クラスの産生および/もしくは分泌の変化、またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが挙げられる。調節は、例えば、初代T細胞アッセイにおける野生型または非改変CD80対照と比べたIFN-γ(インターフェロンγ)発現の変化によって評価することができる(Zhao and Ji, Exp Cell Res. 2016 Jan1; 340(1): 132-138を参照のこと)。調節は、例えば、野生型CD80膜貫通型タンパク質によって操作された細胞と比べた、操作された細胞の免疫学的活性の変化、例えば操作された細胞の細胞傷害性活性の変化または操作された細胞のサイトカイン分泌の変化によって、評価することができる。
【０１９６】
「多量体化ドメイン」という用語は、それぞれが同じまたは異なる多量体化ドメインであることができる相補的多量体化ドメイン(例えば、第1の多量体化ドメインおよび第2の多量体化ドメイン)を含有する、ポリペプチド分子と1つまたは複数の追加のポリペプチド分子との安定した相互作用を促進するアミノ酸配列を指す。相補的多量体化ドメイン間の相互作用、例えば、第1の多量体化ドメインと第2の多量体化ドメイン間の相互作用は、安定なタンパク質-タンパク質相互作用を形成して、ポリペプチド分子と追加のポリペプチド分子との多量体を産生する。場合によっては、多量体化ドメインは同じであり、それ自体と相互作用して2つのポリペプチド鎖間に安定したタンパク質-タンパク質相互作用を形成する。一般的に、ポリペプチドは、多量体化ドメインに直接的または間接的に接続される。例示的な多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列またはその部分、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、および適合性のあるタンパク質-タンパク質相互作用ドメインを含む。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、IgG(IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプを含む)、IgA、IgE、IgDおよびIgMならびにそれらの改変形態由来の、Fcドメインまたはその部分であることができる。
【０１９７】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の核酸残基(例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)のポリマーを指す。特に限定されない限り、該用語は、公知の天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸、およびそれと類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で代謝される核酸を包含する。別段の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列(「参照配列」)だけでなく、保存的に改変されたそれらのバリアント(例えば、縮重コドン置換)および相補的ヌクレオチド配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される場合がある。核酸またはポリヌクレオチドという用語は、遺伝子によってコードされているcDNAまたはmRNAを包含する。
【０１９８】
「分子種」という用語は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を備えたタンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)メンバーは、同一のまたは実質的に同一の分子種の集合体を規定する。したがって、例えば、ヒトCD80はIgSFメンバーであり、各ヒトCD80分子はCD80の一分子種である。同じ分子種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。加えて、遺伝子多型が原因の単一の分子種内の小さな配列差異は、単一の分子種内の別の形態の相違を成し、例えばタンパク質分解的切断が原因の単一の分子種の野生型短縮形態も同様である。「細胞表面分子種」は、哺乳動物細胞の表面に発現する分子種である。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方のみ、またはもう一方のみに存在する(しかし両方ではない)、2つ以上の異なるタンパク質種は、互いに「シス」または「シス配置」にあると言われる。第1のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第1の細胞のみに存在し、第2のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第2の細胞のみに存在する、2つの異なるタンパク質種は、「トランス」または「トランス配置」にあると言われる。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞の両方に存在する、2つの異なるタンパク質種は、これらの細胞上でシスおよびトランスの両配置にある。
【０１９９】
「非競合的結合」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくとも2つのコグネイト結合パートナーに同時に特異的に結合するタンパク質の能力を意味する。したがって、タンパク質は、少なくとも2つの異なるコグネイト結合パートナーに同時に結合することができるが、結合相互作用は、同じ期間である必要はないため、場合によっては、タンパク質は、コグネイト結合パートナーの1つにのみ特異的に結合される。いくつかの態様では、結合は、特定の結合条件下で起こる。いくつかの態様では、同時結合は、1つのコグネイト結合パートナーの結合が第2のコグネイト結合パートナーとの同時結合を実質的に阻害しないようなものである。いくつかの態様では、非競合的結合は、タンパク質上のその結合部位への第2のコグネイト結合パートナーの結合が、タンパク質上のその結合部位への第1のコグネイト結合パートナーの結合に置き換わらないことを意味する。非競合的結合を評価する方法は、Perez de La Lastra et al., Immunology, 1999 Apr: 96(4): 663-670に記載されている方法など、当技術分野において周知である。場合によっては、非競合的相互作用において、第1のコグネイト結合パートナーは、第2のコグネイト結合パートナーの相互作用部位と重複しない相互作用部位で、第2のコグネイト結合パートナーの結合が第1のコグネイト結合パートナーの結合と直接干渉しないように、特異的に結合する。したがって、第2のコグネイト結合パートナーの結合によるコグネイト結合パートナーの結合へのいかなる影響も、第1のコグネイト結合パートナーの結合との直接的な干渉以外の機序を介するものである。例えば、酵素-基質相互作用においては、非競合的阻害剤は、酵素の活性部位以外の部位に結合する。非競合的結合は、第2のコグネイト結合パートナーが、第1のコグネイト結合パートナーの結合と重複しない相互作用部位で特異的に結合するが、第1の相互作用部位が第1のコグネイト結合パートナーに占有されているときだけ第2の相互作用部位に結合する、非競合的な結合相互作用を包含する。
【０２００】
「添付文書」という用語は、慣例上、治療薬の市販用パッケージ中に含まれる説明書であって、適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌および/またはそのような治療薬の使用に関する警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
【０２０１】
「薬学的組成物」という用語は、哺乳動物対象、多くの場合ヒトにおける、薬学的用途に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性作用物質(例えば、バリアントCD80を含む免疫調節ポリペプチドまたはバリアントCD80膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞)、および担体、賦形剤、または希釈剤を含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、それぞれ、典型的には、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤である。
【０２０２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、かつ、ペプチド結合を介して連結されている2つ以上のアミノ酸の分子鎖を指す。該用語は、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。該用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。該用語はまた、合成することができるか、または公知のタンパク質操作技術を使用して組換え発現することができる、1つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸の分子も含む。加えて、タンパク質は誘導体化することができる。
【０２０３】
「初代T細胞アッセイ」という用語は、本明細書において使用される場合、インターフェロン-γ(「IFN-γ」)発現を測定するためのインビトロアッセイを指す。実施例6に記載されるアッセイのような多種多様なこのような初代T細胞アッセイが当技術分野において公知である。好ましい態様では、使用されるアッセイは、抗CD3共固定化アッセイである。このアッセイでは、初代T細胞が、追加の組換えタンパク質と共にまたはそれなしで固定された抗CD3によって刺激される。ある時点(通常24〜72時間)で培養上清を採取する。別の態様では、使用されるアッセイは混合リンパ球反応(MLR)である。このアッセイでは、初代T細胞が、同種他家APCで刺激される。ある時点(通常24〜72時間)で培養上清を採取する。標準的なELISA技術によって培養上清中のヒトIFN-γレベルを測定する。市販のキットが供給業者から入手可能であり、製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。
【０２０４】
「精製された」という用語は、核酸(例えば、本発明の免疫調節タンパク質をコードする)に適用される場合、一般的に、当技術分野において周知の分析技術によって決定した他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを意味する(例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフ溶出液、および/または密度勾配遠心分離に供した媒体中で、別個のバンドを形成する)。例えば、電気泳動ゲル中で本質的に1つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。精製された本発明の核酸またはタンパク質は、少なくとも約50％純粋、通常、少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％またはそれ以上純粋(例えば、重量パーセントまたはモルベース)である。
【０２０５】
「組換え」という用語は、物質(例えば、核酸またはポリペプチド)がヒトの介入によって人工的に(すなわち、非天然に)変えられていることを示す。該変化は、その天然の環境もしくは状態内のまたはそこから取り出された物質に対して実施することができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、親和性改変、DNAシャッフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組み換えることによって作製されるものである。「組換えDNA分子」は、このような分子生物学的技術によって一緒に接続されたDNAのセグメントから構成される。「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、組換えDNA分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有するおよび/または発現する細胞であるか、または別様に遺伝子操作(例えば、組換えタンパク質(例えば、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質)をコードする核酸分子を細胞に導入することによって)により変化された細胞である。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列アレイからなる。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルス中の遺伝子を含む多種多様な真核生物源から単離されている(類似した制御エレメント、すなわちプロモーターはまた原核生物中にも見いだされる)。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどのような細胞タイプが使用されるべきかによる。「機能的な組み合わせにある」、「機能的な順序にある」および「機能的に連結された」という用語は、本明細書において使用される場合、所与の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子が産生される様式または配向での核酸配列の連結を指す。
【０２０６】
「組換え発現ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、所望のコード配列とその機能的に連結されたコード配列の特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸配列とを含有するDNA分子を指す。原核生物において発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意でオペレーター配列、リボソーム結合部位、および場合によっては他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、細胞からの融合タンパク質のより簡易な単離のため、発現された融合タンパク質が組換え宿主細胞によって分泌されることができるように、分泌シグナルペプチド配列がまた、任意で、組換えタンパク質(例えば、組換え融合タンパク質)のコード配列に機能的に連結された組換え発現ベクターによってコードされることができる。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ベクターの中には、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターがある。
【０２０７】
「選択性」という用語は、あるコグネイト結合パートナーなどのある基質の特異的結合に関して、対象タンパク質またはポリペプチドの、当該対象タンパク質の異なるコグネイト結合パートナーなどの別の基質に対する特異的結合と比較した、優先度を指す。選択性は、対象タンパク質と第1の基質(例えば第1のコグネイト結合パートナー)との結合活性(例えば、結合親和性)(例えば、Kd1)と、同じ対象タンパク質と第2のコグネイト結合パートナーとの結合活性(例えば、結合親和性)(例えば、Kd2)との比率として反映することができる。
【０２０８】
「配列同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子またはタンパク質間の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列同一性を指す。「配列同一性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度およびヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質の配列同一性は、配列を整列したときの各配列中の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸の配列同一性は、配列を整列したときの各配列中の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のための配列のアラインメントのための方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法には、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAが挙げられる。BLASTアルゴリズムは、配列同一性パーセントを計算し、2つの配列間の類似性の統計解析を実施する。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(NCBI)のウェブサイトを通じて公的に利用可能である。
【０２０９】
「可溶性」という用語は、タンパク質に関して本明細書において使用される場合、タンパク質が膜タンパク質ではないことを意味する。概して、可溶性タンパク質は、1つもしくは複数のIgSFドメインまたはその特異的結合断片を含有するIgSFファミリーメンバー受容体の細胞外ドメインまたはその一部分のみを含有するが、膜貫通ドメインを含有しない。場合によっては、Fcドメインへ直接またはリンカーを介して間接的に連結または結合させることによってタンパク質の溶解性を改善することができ、これは、場合によっては、タンパク質の安定性および/または半減期も改善することができる。いくつかの局面では、可溶性タンパク質は、Fc融合タンパク質である。
【０２１０】
「種」という用語は、ポリペプチドまたは核酸に関して本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の配列を有する分子の集団を意味する。同じ種のポリペプチド間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。アミノ末端またはカルボキシ末端において完全長種とわずか1、2、または3アミノ酸残基以下異なる(または差異をコードする)わずかに短縮されたポリペプチド配列は、単一種の配列であるとみなされる。そのような微小不均一性は、製造されたタンパク質の共通の特徴である。
【０２１１】
「特異的結合断片」という用語は、本明細書において完全長野生型哺乳動物CD80ポリペプチドまたはそのIgVもしくはIgCドメインに関して使用される場合、IgVおよび/またはIgCドメインの部分配列を有し、インビトロおよび/またはインビボで哺乳動物CD28、哺乳動物PD-L1および/または哺乳動物CTLA-4(例えば、ヒトまたはネズミCD28、PD-L1および/またはCTLA-4)に特異的に結合する、ポリペプチドを意味する。いくつかの態様では、CD80 IgVまたはCD80 IgCの特異的結合断片は、完全長野生型配列の配列長の少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％である。バリアントCD80を形成するために、特異的結合断片の配列を変化させることができる。
【０２１２】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書において使用される場合、その親和性または結合活性が、十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集合体に対する同じタンパク質の平均親和性または結合活性の少なくとも5倍大きく、しかし任意で少なくとも10、20、30、40、50、100、250または500倍大きく、またはさらに少なくとも1000倍大きくなるように、特異的結合条件下で、標的タンパク質に結合するタンパク質の能力を意味する。特異的に結合するタンパク質は、単一の標的分子のみに結合する必要はなく、標的と非標的(例えば、パラログまたはオーソログ)との間の構造形態の類似性に起因して非標的分子に特異的に結合する場合がある。当業者は、異なる動物種において同じ機能を有する分子(すなわち、オーソログ)への特異的結合または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する非標的分子(例えば、パラログ)への特異的結合が起こり得、かつ、固有の非標的(例えば、ランダムポリペプチド)の統計的に妥当な集合と比べて決定される結合の特異性を損なうことはないことを認識しているであろう。したがって、本発明のポリペプチドは、交差反応性により、1つよりも多い別個の標的分子種に特異的に結合し得る。固相ELISAイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴(例えば、Biacore)測定を使用して、2つのタンパク質間の特異的結合を決定することができる。一般的に、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-5M未満、多くの場合1×10-12Mの低さの解離定数(Kd)を有する。本開示のある種の態様では、2つの結合タンパク質間の相互作用は、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mまたは1×10-11Mの解離定数を有する。
【０２１３】
ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞に関して、「表面発現する」または「表面発現」という用語は、当該ポリペプチドが膜タンパク質として発現することを意味する。いくつかの態様では、膜タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。
【０２１４】
「合成の」は、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して本明細書において使用される場合、組換え法および/または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
【０２１５】
「ターゲティング部分」という用語は、本明細書において使用される場合、バリアントCD80を含むポリペプチドに共有結合もしくは非共有結合されるか、またはそれを物理的にカプセル化する組成物を指す。ターゲティング部分は、細胞表面受容体(例えば、B7ファミリーメンバーPD-L1)、または腫瘍抗原(例えば、腫瘍特異的抗原(TSA)もしくは腫瘍関連抗原(TAA)、例えばB7-H6)のような所望のカウンター構造体に対して特異的結合親和性を有する。典型的には、所望のカウンター構造体は、特定の組織または細胞タイプ上に局在化される。ターゲティング部分は、抗体、抗原結合断片(Fab)、VHおよびVLを含有する可変断片(Fv)、1つの鎖として一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片(scFv)、ならびに他の抗体V領域断片、例えばFab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFvダイアボディ、ナノボディ、可溶性受容体、受容体リガンド、親和性成熟された受容体またはリガンド、ならびに小分子(500ダルトン未満の)組成物(例えば、特異的結合受容体組成物)を含む。ターゲティング部分はまた、本発明のポリペプチドをカプセル化するリポソームの脂質膜に共有結合または非共有結合させることもできる。
【０２１６】
「膜貫通型タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、脂質二重層を実質的にまたは完全に貫通する膜タンパク質を意味し、該脂質二重層は、例えば、哺乳動物細胞などの生体膜中に、またはリポソームなどの人工構築物中に見いだされる。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層に統合され、その統合が生理的条件下で熱力学的に安定である、膜貫通ドメイン(「膜貫通ドメイン」)を含む。膜貫通ドメインは、一般的に、水性環境(例えば、サイトゾル、細胞外液)と相互作用するタンパク質の領域と比較してその疎水性が高いことに基づいてそれらのアミノ酸配列から、任意の数の市販のバイオインフォマティクスソフトウェアアプリケーションにより予測可能である。膜貫通ドメインは多くの場合、膜を貫通する疎水性αヘリックスである。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層の両方の層を1回または複数回通過することができる。本明細書に記載の提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通型タンパク質に含まれる。膜貫通ドメインに加えて、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインおよびいくつかの態様ではエンドドメインをさらに含む。
【０２１７】
疾患または障害の「治療すること」、「治療」または「治療法」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の治療用組成物(例えば、免疫調節タンパク質を含有する)を、単独で、または本明細書に記載される別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することによる臨床または診断症状のいずれかの低減、停止、または消失によって証明される、疾患または障害の進行を遅延、中断、または後退させることを意味する。がんの文脈において本明細書で使用される場合、がんの「治療」、がんを「阻害する」、がんを「阻害すること」またはがんの「阻害」という用語は、非限定的にResponse Evaluation Criteria for Solid Tumors(RECIST)のような標準的な基準によって測定した場合の、腫瘍成長速度の統計的に有意な低下、腫瘍成長の停止、または腫瘍のサイズ、質量、代謝活性もしくは体積の低下、または無増悪生存期間(PFS)もしくは全生存期間(OS)の統計的に有意な増加のうちの少なくとも1つを指す。疾患もしくは障害を「予防すること」、疾患もしくは障害の「予防(prophylaxis)」または疾患もしくは障害の「予防(prevention)」は、本発明の文脈において使用される場合、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するか、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるための、免疫調節ポリペプチドを単独または別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することを指す。
【０２１８】
「腫瘍特異的抗原」または「TSA」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に主に存在するが一般的に哺乳動物対象の正常細胞上には見いだされないカウンター構造体を指す。腫瘍特異的抗原は腫瘍細胞のみに存在する必要はないが、腫瘍特異的抗原を有する特定の哺乳動物の細胞の割合が十分に高いか、または腫瘍の表面の腫瘍特異的抗原のレベルが十分に高いため、それにより抗腫瘍治療薬(例えば、本発明の免疫調節ポリペプチド)でターゲティングでき、そして腫瘍の影響から哺乳動物を予防または治療することを提供する。いくつかの態様では、腫瘍を有する哺乳動物由来の細胞の統計的無作為標本では、TSAを提示する細胞の少なくとも50％ががん性である。他の態様では、TSAを提示する細胞の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％ががん性である。
【０２１９】
「バリアント」(また「改変された」または「変異体」)という用語は、バリアントCD80に関して使用される場合、ヒトの介入によって作製されたCD80、例えば哺乳動物(例えば、ヒトまたはネズミ)CD80を意味する。バリアントCD80は、非改変または野生型CD80と比べて、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントCD80は、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせにより野生型CD80アイソフォーム配列と異なるポリペプチドである。本明細書における目的のために、バリアントCD80は少なくとも1つの親和性改変ドメインを含有し、それにより1つまたは複数のアミノ酸差異がIgSFドメイン(例えば、IgVドメイン)に生じる。バリアントCD80は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸差異、例えばアミノ酸置換を含有することができる。バリアントCD80ポリペプチドは、一般的に、対応する野生型または非改変CD80、例えばSEQ ID NO:1の配列、その成熟配列またはその細胞外ドメインもしくはIgSFドメインを含有するそれらの一部分と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO:76、またはSEQ ID NO:150、またはSEQ ID NO:1245に記載の配列を含む、対応する野生型または非改変CD80と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示す。
【０２２０】
天然には存在しないアミノ酸および天然に存在するアミノ酸が、許容される置換または付加の範囲内に含まれる。バリアントCD80は、任意の特定の作製方法に限定されることはなく、例えばデノボ化学合成、デノボ組換えDNA技術、またはそれらの組み合わせを含む。本発明のバリアントCD80は、哺乳動物種のCD28、PD-L1および/またはCTLA-4のうちの少なくとも1つまたは複数に特異的に結合する。いくつかの態様では、変化したアミノ酸配列は、非改変または野生型CD80タンパク質と比較して、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4との変化した(すなわち、増加または減少した)結合親和性または結合活性をもたらす。結合親和性または結合活性の増加または減少は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5：443-453 (2005)。また、Linsley et al., Immunity, Vol 1(9): 793-801 (1994)も参照されたい。CD28、PD-L1および/またはCTLA-4へのバリアントCD80の結合親和性または結合活性の増加は、非改変または野生型CD80よりも少なくとも5％大きい値であることができ、いくつかの態様では、非改変または野生型CD80対照値よりも少なくとも10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％大きい値であることができる。CD28、PD-L1および/またはCTLA-4とのCD80の結合親和性または結合活性の減少は、非改変または野生型CD80対照値の95％以下の値までであり、いくつかの態様では、非改変または野生型CD80対照値の結合親和性または結合活性の80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％以下または、検出不可能の値までである。バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。バリアントCD80ポリペプチドの文脈における「バリアント」という用語は、バリアントCD80が作製される任意の特定の出発組成物または方法のいかなる条件も課すものと解釈されるべきではない。バリアントCD80は、例えば、野生型哺乳動物CD80配列情報から開始して生成され、次いでCD28、PD-L1および/またはCTLA-4への結合についてインシリコでモデル化され、そして最後に組換えまたは化学合成されて、バリアントCD80を得ることができる。しかし別の一例では、バリアントCD80は、非改変または野生型CD80の部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、バリアントCD80は、組成物を意味するが、必ずしも任意の所与のプロセスによって産生される産物である必要はない。組換え法、化学合成、またはそれらの組み合わせを含む多種多様な技術が用いられる場合がある。
【０２２１】
「野生型」または「自然」または「天然」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸分子、タンパク質(例えば、CD80)、IgSFメンバー、宿主細胞などの生体物質に関して用いられ、自然界で見いだされかつヒトの介入によって改変されていないものを指す。
【０２２２】
本明細書において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈上、別段の明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味する。本明細書に記載される複数の局面および差異は、複数の局面および差異「からなる」および/または「から本質的になる」を含むことが理解されている。
【０２２３】
本開示を通して、請求される主題の様々な局面は、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔化のためであり、請求される主題の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきでないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値をすべて具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、ある値域が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、およびその規定範囲内の任意の他の規定値または介在値が、請求される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、独立的にそのより小さな範囲内に含まれる場合があり、これらもまた、規定範囲における任意の具体的に除外される限界値に従って、請求される主題内に包含される。規定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それら含まれた限界値の一方または両方を除外する範囲もまた、請求される主題内に含まれる。このことは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【０２２４】
「約」という用語は、本明細書に使用される場合、当業者にとって難なく分かる、各値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそのものに向けられた態様を含む(および記載する)。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。
【０２２５】
本明細書に使用される場合、「任意の」または「任意で」は、続いて記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないこと、ならびに記載が該事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、置換されてもよい基は、該基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。
【０２２６】
本明細書に使用される場合、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物についての略称は、別段の指示のない限り、その一般的な使用、認められた略称、または生化学命名法に関するIUPAC-IUB委員会((1972) Biochem. 11 : 1726を参照されたい)に従う。
【０２２７】
I.  バリアントCD80 IGSFドメイン融合タンパク質
1つまたは複数のCD80結合パートナーに対して変化した(増加または減少した)結合活性または親和性を示すバリアントCD80ポリペプチドを含有する融合タンパク質が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、CD80結合パートナーは、CD28、PD-L1、またはCTLA-4である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数のCD80結合パートナーに対して変化した(例えば増加した)結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、2つ以上のCD80結合パートナーに対して変化した(例えば増加した)結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、2つ以上のCD80結合パートナーは、CD28、PD-L1、またはCTLA-4のうちの2つ以上である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、3つのCD80結合パートナーに対して変化した(例えば増加した)結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、CD80結合パートナーは、CD28、PD-L1、およびCTLA-4である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型もしくは非改変CD80ポリペプチド、またはIgDを含有する野生型もしくは非改変CD80の一部分、またはその特異的結合断片と比べて、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメイン(IgD)に1つまたは複数のアミノ酸改変、例えば1つまたは複数の置換(あるいは、「変異」または「交換」)、欠失または付加を含有する。したがって、提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)がIgDにある、バリアントIgD(以下「vIgD」と呼ばれる)であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80は可溶性であり、膜貫通ドメインを欠如する。
【０２２８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインおよびIgCドメインを含むIgDを含有する細胞外ドメインを含有する。いくつかの態様では、IgDは、細胞外ドメイン(ECD)全体を含むことができる。いくつかの態様では、IgDは、IgVドメインもしくはIgC(例えば、IgC2)ドメイン、またはIgVドメインもしくはIgC(例えば、IgC2)ドメインの特異的結合断片、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、IgDは、IgVのみ、細胞外ドメイン(ECD)全体を含むIgVとIgCとの組み合わせ、またはCD80のIgドメインの任意の組み合わせであることができる。表1は、CD80のIgVまたはIgC領域に対応する例示的な残基を提供する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、置換)がIgVドメインまたはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片にある、IgVドメインまたはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸改変(例えば、置換)がIgVドメインまたはその特異的結合断片にある、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含有する。いくつかの態様では、変化した結合活性または親和性によって、変化したIgVドメインまたはIgCドメインは、親和性改変IgSFドメインである。
【０２２９】
（表１）CD80ドメインおよび配列
2022501361.tif 000004
【０２３０】
いくつかの態様では、バリアントは、非改変CD80配列の配列と比べて、もう1つのIgSFドメインが改変されている。いくつかの態様では、非改変CD80配列は、野生型CD80である。いくつかの態様では、非改変または野生型CD80は、天然CD80またはそのオーソログの配列を有する。いくつかの態様では、非改変CD80は、1つまたは複数のIgSFドメインを含有するCD80の細胞外ドメイン(ECD)またはその一部分であるか、またはそれを含む(表1を参照のこと)。例えば、非改変CD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸35〜135、SEQ ID NO:1のアミノ酸35〜138(SEQ ID NO:1245を参照)、またはSEQ ID NO:1のアミノ酸35〜141として記載されるIgVドメインであるか、またはそれを含む。場合によっては、非改変CD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸145〜230またはSEQ ID NO:1のアミノ酸142〜232として記載されるIgCドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、非改変または野生型CD80ポリペプチドの細胞外ドメインは、IgVドメインおよび1つまたは複数のIgCドメインを含む。しかしながら、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインと1つまたは複数のIgCドメインとの両方を含む必要はない。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むか、または本質的にそれからなる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgCドメインまたはその特異的結合断片を含むか、または本質的にそれからなる。いくつかの態様では、バリアントCD80は、可溶性であり、かつ膜貫通ドメインを欠く。いくつかの態様では、バリアントCD80はさらに、膜貫通ドメインを含み、場合によっては細胞質ドメインも含む。
【０２３１】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、哺乳動物CD80ポリペプチド、例えば、非限定的にヒト、マウス、カニクイザル、またはラットCD80ポリペプチドである。いくつかの態様では、野生型または非改変CD80配列は、ヒトである。
【０２３２】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、(i)SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列もしくはシグナル配列を欠くその成熟形態を有するか、(ii)SEQ ID NO:1と少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示すアミノ酸配列もしくはその成熟形態を有するか、または(iii)IgVドメインもしくはIgCドメインもしくはその特異的結合断片を含有する(i)もしくは(ii)の一部分である。
【０２３３】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、CD80の細胞外ドメインまたはその一部分であるか、またはそれを含む。例えば、いくつかの態様では、非改変または野生型CD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型CD80ポリペプチドは、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸の配列を含むことができるか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができるか、または(iii)IgVドメインもしくはIgCドメインを含む(i)もしくは(ii)の特異的結合断片である。いくつかの態様では、CD80の野生型または非改変細胞外ドメインは、CTLA-4、PD-L1またはCD28のうちの1つまたは複数などの、1つまたは複数のCD80結合タンパク質と結合することができる。
【０２３４】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、IgVドメインもしくはIgCドメイン、またはその特異的結合断片を含有する。いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドのIgVドメインは、SEQ ID NO:76、150、もしくは1245に記載のアミノ酸配列またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型CD80ポリペプチドのIgVドメインは、(i)SEQ ID NO:76、150、もしくは1245に記載のアミノ酸配列を含有することができるか、 (ii)SEQ ID NO:76、150、もしくは1245と少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有することができるか、または(iii)(i)もしくは(ii)の特異的結合断片である。いくつかの態様では、野生型または非改変IgVドメインは、CTLA-4、PD-L1またはCD28のうちの1つまたは複数などの、1つまたは複数のCD80結合タンパク質と結合することができる。
【０２３５】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドのIgCドメインは、SEQ ID NO:1の残基145〜230、154〜232、もしくは142〜232として記載されるアミノ酸配列、またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型CD80ポリペプチドのIgCドメインは、(i)SEQ ID NO:1の残基145〜230、154〜232、もしくは142〜232として記載されるアミノ酸配列を含有することができるか、または(ii)SEQ ID NO:1の残基145〜230、154〜232、もしくは142〜232と少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有することができるか、または(iii)(i)もしくは(ii)の特異的結合断片である。いくつかの態様では、野生型または非改変IgCドメインは、1つまたは複数のCD80結合タンパク質と結合することができる。
【０２３６】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、CD80の特異的結合断片、例えばIgVドメインまたはIgCドメインの特異的結合断片を含有する。いくつかの態様では、特異的結合断片は、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4と結合することができる。特異的結合断片は、少なくとも50アミノ酸、例えば少なくとも60、70、80、90、100、または110アミノ酸のアミノ酸長を有することができる。いくつかの態様では、IgVドメインの特異的結合断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸35〜135、35〜138、37〜138または35〜141として記載されるIgVドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様では、IgCドメインの特異的結合断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸145〜230、154〜232、または142〜232として記載されるIgCドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含む。
【０２３７】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインを含むECDドメインまたはその一部分を含む、バリアントCD80ポリペプチドを含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインまたはIgCドメインのうちの少なくとも1つが1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する、IgVドメインもしくはIgCドメイン、またはIgVドメインの特異的結合断片もしくはIgCドメインの特異的結合断片を含むことができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインおよびIgCドメイン、またはIgVドメインの特異的結合断片およびIgCドメインの特異的結合断片を含むことができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、完全長IgVドメインを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、完全長IgCドメインを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgCドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、完全長IgVドメインおよび完全長IgCドメインを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、完全長IgVドメイン、およびIgCドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインの特異的結合断片および完全長IgCドメインを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインの特異的結合断片およびIgCドメインの特異的結合断片を含む。
【０２３８】
このような態様のいずれかでは、バリアントCD80ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、CD80ポリペプチドドメインのいずれか1つまたは複数に位置することができる。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、バリアントCD80ポリペプチドの細胞外ドメインに位置する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、IgVドメインまたはIgVドメインの特異的結合断片に位置する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、IgCドメインまたはIgCドメインの特異的結合断片に位置する。
【０２３９】
概して、ポリペプチドの様々な属性の各々(例えば、結合パートナーに対するCD80の親和性、ポリペプチド鎖当たりの変異の数、連結ポリペプチド鎖の数、バリアントCD80当たりのアミノ酸変化の数および性質など)が、個別に開示される。しかしながら、当業者に明らかであるとおり、任意の特定のポリペプチドが、これらの独立した属性の組み合わせを含むことができる。IgSFドメインのドメイン構成を説明するために使用されるSEQ ID NOとして記載される特定の配列への言及を含むアミノ酸への言及は、例示を目的としており、提供される態様の範囲を限定するつもりはないことが理解されている。ポリペプチド、およびそのドメインの説明は、類似の分子との相同性分析およびアラインメントに基づいて理論的に導出されることが理解されている。したがって、正確な遺伝子座は変動することができ、必ずしもタンパク質毎に同じとは限らない。よって、特定のIgSFドメイン(例えば、特定のIgVドメインまたはIgCドメイン)は、いくつか(例えば、1、2、3、または4個)のアミノ酸分長いかまたは短いことができる。
【０２４０】
さらに、以下で考察されるような本発明の各種態様は、上に開示したとおりに定義された用語の意味の範囲内で頻繁に提供される。したがって、特定の定義において記載される態様は、定義された用語が本明細書に記載の様々な局面および属性の考察において利用される場合、参照により組み入れられると解釈されるべきである。したがって、見出し、様々な局面および態様の提示の順序、ならびに各々独立した属性の別々の開示は、本開示の範囲への限定のつもりではない。
【０２４１】
A.  バリアントCD80ポリペプチド
野生型または非改変CD80ポリペプチドに含有されるIgSFドメインと比べて、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片を含有する、バリアントCD80 IgSFドメイン融合ポリペプチドが、本明細書において提供され、その結果、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、1つまたは複数のコグネイト結合パートナー、CD28、PD-L1またはCTLA-4に対して変化した(増加または減少した)結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば固相ELISAイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴(Biacore)アッセイによって測定した場合に、野生型または非改変CD80ポリペプチド対照配列のものとは異なる、CD28、PD-L1またはCTLA-4に対する結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28および/またはCTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、PD-L1に対して減少した結合親和性を有する。CD28、PD-L1および/またはCTLA-4は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質またはネズミタンパク質であることができる。
【０２４２】
CD28、PD-L1および/またはCTLA-4に対する、変化した(例えば、増加した)結合活性または親和性は、野生型または非改変IgSFドメインのIgSFドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸改変によって付与される。野生型または非改変CD80配列は、本明細書に記載のバリアントCD80ポリペプチドを生成するために、必ずしも出発組成物として使用される必要はない。したがって、「置換」という用語の使用は、提供される態様がバリアントCD80ポリペプチドの特定の作製法に限定されることを暗示するものではない。バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、デノボペプチド合成によって作製することができ、したがって、置換のためにコードするコドンを変えるという意味で、必ずしも「置換」を必要とするわけではない。この原則はまた、アミノ酸残基の「付加」および「欠失」という用語にもおよび、これも同じく特定の作製法を暗示するものではない。バリアントCD80ポリペプチドが設計または作製される手段は、いかなる特定の方法にも限定されない。しかしながら、いくつかの態様では、野生型または非改変CD80をコードする核酸が、実施例に開示された方法または当業者に公知の他の方法に従って、野生型または非改変CD80遺伝物質から変異誘発され、所望の特異的結合親和性および/またはIFN-γ発現もしくは他の機能的活性の誘導についてスクリーニングされる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、任意の数の公的に利用可能なデータベースで利用可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、次いで、その後スクリーニングされる。国立生物工学情報センターは、そのような情報を提供し、そのウェブサイトは、前述したようにUniProtKBデータベースと同じくインターネットを介して公的にアクセス可能である。
【０２４３】
特に明記しない限り、本開示を通して示すとおり、アミノ酸改変は、以下の、SEQ ID NO:2に記載の非改変ECD配列の位置の番号付け、または適用可能な場合は、SEQ ID NO:76、150、または1245に記載の非改変IgV配列の位置の番号付けに対応するアミノ酸位置番号によって、指定される:
2022501361.tif 000005
【０２４４】
CD80ポリペプチド(そのIgSFドメインを含有するその一部分(例えば、IgV)を含む)における改変(例えば、アミノ酸置換)の対応する位置を、例えば、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:150またはSEQ ID NO:1245を有する参照配列のアラインメントによって特定することは、当業者のレベルの範囲内である。本開示全体での改変の記載において、アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変(例えば、野生型)アミノ酸が番号の前に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸置換が番号の後に列挙される。改変が該位置の欠失である場合は「del」と表示され、改変が該位置における挿入である場合は「ins」と表示される。場合によっては、アミノ酸位置が中央に示されて挿入が列挙され、対応する非改変(例えば、野生型)アミノ酸が番号の前および後に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸挿入が非改変(例えば、野生型)アミノ酸の後に列挙される。
【０２４５】
本明細書に提供される特定の態様では、アミノ酸改変(例えば、置換)は、野生型CD80の完全細胞外ドメイン中にある。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に記載の例示的な野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230に対応するアミノ酸残基を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に記載の例示的な野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230に対応する細胞外ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、野生型CD80の細胞外ドメインは、SEQ ID NO:2に記載されている。いくつかの態様では、細胞外ドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有するバリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０２４６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80配列に1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、野生型または非改変CD80配列のエクトドメイン(細胞外ドメイン)、例えば細胞外ドメインにあることができる。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、IgVドメインまたはその特異的結合断片にある。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)は、IgCドメインまたはその特異的結合断片にある。バリアントCD80ポリペプチドのいくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)のいくつかは、IgVドメインまたはその特異的結合断片にあり、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)のいくつかは、IgCドメインまたはその特異的結合断片にある。
【０２４７】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。改変(例えば、置換)は、IgVドメインまたはIgCドメインにあることができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgVドメインまたはその特異的結合断片に最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgCドメインまたはその特異的結合断片に最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドまたはその特異的結合断片(例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245のアミノ酸配列)と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
【０２４８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して4、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、102、103、104、107、108、109、110、114、115、116、117、118、120、121、122、126、127、128、129、130、133、137、140、142、143、144、148、149、152、154、160、162、164、168、169、174、175、177、178、182、183、185、178、185、188、190、192、193、または199位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、このようなバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28、PD-L1、またはCTLA-4のうちの1つまたは複数に対して変化した結合親和性を示す。例えば、いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28、PD-L1、および/またはCTLA-4に対して増加した結合親和性を示す。
【０２４９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000006
より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【０２５０】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えば置換は、
2022501361.tif 000007
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である。
【０２５１】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して7、23、26、34、49、51、55、57、58、71、73、78、79、82、および/または84位に対応する、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して7、23、26、34、49、51、55、57、58、71、73、78、79、82、または84位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、前述の位置のいずれか2つ以上、例えば該位置の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個またはそれ以上に改変、例えばアミノ酸置換を有する。
【０２５２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
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の中より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【０２５３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変
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2022501361.tif 000018
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を含む。
【０２５４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して7、13、15、16、20、22、23、24、25、26、27、30、31、33、34、35、36、38、41、42、43、46、47、48、51、53、54、55、57、58、61、62、65、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、84、85、86、87、88、92、94、95、および/または97位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して7、23、26、30、34、35、46、51、55、57、58、65、71、73、78、79、82、または84位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、前述の位置のうちのいずれか2つ以上に、例えば該位置の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上に、改変、例えば、アミノ酸置換を有する。
【０２５５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
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の中より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E7D、E23D、E23G、A26E、A26P、A26S、A26T、I30F、I30T、I30V、K34E、E35D、E35G、D46E、D46V、P51A、N55D、N55I、T57A、T57I、I58V、L65P、A71D、A71G、R73S、G78A、T79A、T79I、T79L、T79P、C82R、V84A、V84I、L85Qより選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、前述のアミノ酸置換のいずれか1つまたは複数、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、またはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、1つのみの前述のアミノ酸置換を含む非改変または野生型CD80ポリペプチドと比較して、1つのみのアミノ酸差異を含む。
【０２５６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、非改変CD80またはその特異的結合断片に、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して12、18、29、31、37、38、41、43、44、47、61、67、68、69、70、72、77、83、88、89、90、91または93位に対応する、1つまたは複数の追加のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、A12T、A12V、H18L、H18Y、R29H、Y31H、K37E、M38T、T41A、M43I、S44P、M47L、M47T、I67T、V68A、V68M、I69T、L70P、L70R、L70Q、L72P、E77G、V83A、V83I、E88D、K89E、K89N、D90G、D90N、A91T、K93Rの中より選択される1つまたは複数の追加のアミノ酸置換を有する。
【０２５７】
保存的アミノ酸置換は、野生型または非改変アミノ酸以外の、置換されたアミノ酸と同じクラスのアミノ酸に属する任意のアミノ酸である。アミノ酸のクラスは、脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン)、ヒドロキシルまたは硫黄含有(セリン、システイン、スレオニン、およびメチオニン)、環状(プロリン)、芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)、塩基性(ヒスチジン、リジン、およびアルギニン)、および酸性/アミド(アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン)である。したがって、例えば、A26E置換の保存的アミノ酸置換には、A26D、A26N、およびA26Qアミノ酸置換が含まれる。
【０２５８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aの中からの2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aの中からの3つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を有する。
【０２５９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸置換
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を有するか、またはそれを含む。
【０２６０】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸置換A91G/I118V/T120S/T130Aを有するか、またはそれを含む。
【０２６１】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸置換S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130Aを有するか、またはそれを含む。
【０２６２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸置換E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93Rを有するか、またはそれを含む。
【０２６３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸置換I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130Aを有するか、またはそれを含む。
【０２６４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して18位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換H18Yまたはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、26、35、46、47、68、71、85または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85QまたはD90Gの1つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/A26E、H18Y/E35D、H18Y/D46E、H18Y/D46V、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/V68M、H18Y/A71G、H18Y/L85Q、H18Y/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従ってさらなるアミノ酸改変を提供することができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２６５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して26位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換A26E、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、35、46、47、68、71、85または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85QまたはD90Gの1つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/A26E、A26E/E35D、A26E/D46E、A26E/D46V、A26E/M47I、A26E/M47L、A26E/V68M、A26E/A71G、A26E/L85Q、A26E/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２６６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して35位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換E35D、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、46、47、68、71、85または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85QもしくはD90Gの1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/E35D、A26E/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/V68M、E35D/A71G、E35D/L85Q、E35D/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して46位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換D46EもしくはD46V、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、47、68、71、85または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、M47I、M47L、V68M、A71G、L85QまたはD90Gの1つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/D46E、A26E/D46E、E35D/D46E、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/V68M、D46E/A71G、D46E/L85Q、D46E/D90Gを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/D46V、A26E/D46V、E35D/D46V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/V68M、D46V/A71G、D46V/L85Q、D46V/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２６７】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して47位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換M47IまたはM47L、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、46、68、71、85または90の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、V68M、A71G、L85QもしくはD90Gの1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/M47I、A26E/M47I、E35D/M47I、M47I/D46E、M47I/D46V、M47I/V68M、M47I/A71G、M47I/L85QまたはM47I/D90Gを含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/M47L、A26E/M47L、E35D/M47L、M47L/D46E、M47L/D46V、M47L/V68M、M47L/A71G、M47L/L85QまたはM47L/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２６８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して68位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換V68M、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、46、47、71、85または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、A71G、L85QまたはD90Gの1つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/V68M、A26E/V68M、E35D/V68M、D46E/V68M、D46V/D68M、M47I/V68M、M47L/V68M、V68M/A71G、V68M/L85Q、V68M/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２６９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して71位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換A71G、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、46、47、68、85または90の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、L85QもしくはD90Gの1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/A71G、A26E/A71G、E35D/A71G、D46E/A71G、D46V/D68M、M47I/A71G、M47L/A71G、V68M/A71G、A71G/L85Q、A71G/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２７０】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して85位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換L85Q、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、46、47、68、71または90の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71GもしくはD90Gの1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/L85Q、A26E/L85Q、E35D/L85Q、D46E/L85Q、D46V/D68M、M47I/L85Q、M47L/L85Q、V68M/L85Q、A71G/L85Q、L85Q/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２７１】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して90位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換D90G、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、18、26、35、46、47、68、71または85の1つまたは複数の位置に、1つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71GもしくはL85Qの1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変H18Y/D90G、A26E/D90G、E35D/D90G、D46E/D90G、D46V/D68M、M47I/D90G、M47L/D90G、V68M/D90G、A71G/D90G、L85Q/D90Gを含む。バリアントCD80ポリペプチドは、提供される態様に従って、本明細書に記載されるいずれかなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表2は、記載される例示的なアミノ酸改変およびバリアントCD80ポリペプチドについて記載する。
【０２７２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して18、26、35、46、47、48、68、70、71、85、88、89、90、または93位に対応する位置に非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、N48K、V68M、L70M、A71G、L85Q、E88D、K89N、D90G、K93Eまたはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、アミノ酸改変E35D/M47I/L70M、E35D/M47L E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、またはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む。
【０２７３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、H18Y/M47I/T57I/A71G、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85QまたはH18Y/A71D/L72P/E88Vのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:41、59、66、115、133、140、189、207または214に記載のポリペプチドではない。
【０２７４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、A26E/E35D/M47L/L85Qのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:73、147または221に記載のポリペプチドではない。
【０２７５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、E35D/A71D、E35D/M47I、E35D/T57I/L70Q/A71D、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D.E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E35D/M43I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、V22L/E35D/M43L/A71G/D76H、A26E/E35D/M47L/L85Q、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94Wのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:19、20、28、29、37、46、47、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、64、68、69、70、73、75、93、94、102、103、111、120、121、124、125、126、127、128、129、130、132、133、134、138、142、143、144、147、149、167、168、176、177、185、194、195、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、212、216、217、218、221、または223に記載のポリペプチドではない。
【０２７６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、E35D/D46V/L85Q、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95VまたはD46E/A71Dのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:55、69、74、129、143、148、203、217または222に記載のポリペプチドではない。
【０２７７】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、E35D/M47I、M47L/V68A、M47I/E88D、H18Y/M47I/T57I/A71G、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D/M47I/L70M、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、E35D/M47L、A26E/E35D/M47L/L85Qのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:19、20、29、33、38、41、49、51、56、60、73、93、94、103、107、112、115、123、125、130、134、147、167、168、177、181、186、189、197、199、204、208、221に記載のポリペプチドではない。
【０２７８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、A26E/E35D/M47L/L85Qのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:62、136、210に記載のポリペプチドではない。
【０２７９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、H18Y/M47I/T57I/A71GまたはV22L/E35D/M43L/A71G/D76Hのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:41、70、115、144、189または218に記載のポリペプチドではない。
【０２８０】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドはSEQ ID NO:2、76または150に記載の非改変CD80ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85QまたはA26E/E35D/M47L/L85Qのみである。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:54、55、58、59、73、128、129、132、133、147、202、203、206、207または221に記載のポリペプチドではない。
【０２８１】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35DおよびM47Lに対応する位置に、非改変CD80またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35DおよびM47Iに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35DおよびA71Gに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35DおよびM47Vに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35DおよびV68Mに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、H18YおよびE35Dに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、少なくとも3つのアミノ酸改変を含み、該少なくとも3つの改変には、SEQ ID NO:2に記載の位置の番号付けを参照して18、26、35、46、47、68、71、85または90位に対応する3つ以上の位置での改変が含まれる。いくつかの態様では、少なくとも3つのアミノ酸改変は、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q、またはD90G、またはその保存的アミノ酸置換に対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35D/M47L/V68Mに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35D/M47V/V68Mに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、E35D/M47L/L85Qに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、H18Y/E35D/M47Iに対応するアミノ酸改変を、非改変CD80またはその特異的結合断片に含む。
【０２８７】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙された置換(変異)のいずれかを含む。表2はまた、野生型CD80または例示的なバリアントCD80ポリペプチドの細胞外ドメイン(ECD)またはIgVドメインについてSEQ ID NOを参照することにより例示的な配列を提供する。示されるように、所与のドメインに対応する正確な遺伝子座または残基は、ドメインの特定または分類に使用される方法などに応じて異なることができる。さらに、場合によっては、所与のドメイン(例えば、IgV)の隣接するN末端および/またはC末端アミノ酸も、例えば発現されたときにドメインの適切なフォールディングを確実にするために、バリアントIgSFポリペプチドの配列に含めることができる。したがって、表2におけるSEQ ID NOの例示は、限定するものと解釈されるべきではないことが理解されている。例えば、バリアントCD80ポリペプチドの特定のドメイン(例えば、IgVドメイン)は、それぞれのSEQ ID NOに記載のアミノ酸配列よりもいくつかのアミノ酸分長いかまたは短く、例えば1〜10アミノ酸、例えば、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸分長いかまたは短いことができる。
【０２８８】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙された細胞外ドメイン(ECD)配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:3〜75、224〜319、512〜722、1145〜1175、1299〜1365、1383〜1444、1447〜1500、1537または1541のうちのいずれか1つ)を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙された細胞外ドメイン(ECD)配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:3〜75、224〜319、512〜722、1145〜1175、1299〜1365、1383〜1444、1447〜1500、1537または1541のうちのいずれか1つ)と少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、例えば少なくとも96％の同一性、97％の同一性、98％の同一性、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、野生型または非改変CD80には存在しないアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙された細胞外ドメイン(ECD)配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:3〜75、224〜319、512〜722、1145〜1175、1299〜1365、1383〜1444、1447〜1500、1537または1541のうちのいずれか1つ)の特異的結合断片を含み、野生型または非改変CD80には存在しないアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙されたIgV配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:77〜149、151〜223、320〜511、723〜1144、1176〜1237、1256〜1298、1366〜1368、1370〜1380、1381〜1382、1445〜1446、1538、1540、1542または1544のうちのいずれか1つ)を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙されたIgV配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:77〜149、151〜223、320〜511、723〜1144、1176〜1237、1256〜1298、1366〜1368、1370〜1380、1381〜1382、1445〜1446、1538、1540、1542または1544のうちのいずれか1つ)と少なくとも90％の同一性、少なくとも91％の同一性、少なくとも92％の同一性、少なくとも93％の同一性、少なくとも94％の同一性、少なくとも95％の同一性、例えば少なくとも96％の同一性、97％の同一性、98％の同一性、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、野生型または非改変CD80には存在しないアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、表2に列挙されたIgV配列のうちのいずれか(すなわち、SEQ ID NO:77〜149、151〜223、320〜511、723〜1144、1176〜1237、1256〜1298,1366〜1368、1370〜1380、1381〜1382、1445〜1446、1538、1540、1542または1544のうちのいずれか1つ)の特異的結合断片を含み、野生型または非改変CD80には存在しないアミノ酸改変(例えば、置換)を含有する。
【０２８９】
表2はまた、野生型CD80または例示的なバリアントCD80ポリペプチドの細胞外ドメイン(ECD)またはIgVドメインについてSEQ ID NOを参照することにより例示的な配列を提供する。示されるように、所与のドメインに対応する正確な遺伝子座または残基は、ドメインの特定または分類に使用される方法などに応じて異なることができる。さらに、場合によっては、所与のドメイン(例えば、ECD)の隣接するN末端および/またはC末端アミノ酸も、例えば発現されたときにドメインの適切なフォールディングを確実にするために、バリアントIgSFポリペプチドの配列に含めることができる。したがって、表2におけるSEQ ID NOの例示は、限定するものと解釈されるべきではないことが理解されている。例えば、バリアントCD80ポリペプチドの特定のドメイン(例えば、IgVドメイン)は、それぞれのSEQ ID NOに記載のアミノ酸配列よりもいくつかのアミノ酸分長いかまたは短く、例えば1〜10アミノ酸、例えば、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸分長いかまたは短いことができる。
【０２９０】
（表２）例示的なバリアントCD80ポリペプチド
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【０２９１】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸改変は、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、バリアントCD80ポリペプチドが、1つまたは複数の結合パートナー、CTLA-4、PD-L1、またはCD28に対して変化した(増加または減少した)結合活性または親和性を示すように、野生型または非改変CD80ポリペプチドに含有されるIgSFドメインと比べて親和性改変された少なくとも1つのIgSFドメイン(例えば、IgVまたはIgC)またはその特異的結合断片を産生する。親和性改変された少なくとも1つのIgSFドメイン(例えば、IgVまたはIgC)またはその特異的結合断片を含有する、提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、1つまたは複数のコグネイト結合パートナー、CTLA-4、PD-L1、またはCD28に対して変化した(増加または減少した)結合活性または親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば固相ELISAイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴(Biacore)アッセイによって決定した場合に、野生型または非改変CD80ポリペプチド対照配列のものとは異なる、CD28、PD-L1、またはCTLA-4に対する結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、CTLA-4および/またはCD28に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1に対して減少した結合親和性を有する。CD28、PD-L1および/またはCTLA-4は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質またはネズミタンパク質であることができる。
【０２９２】
結合パートナーのそれぞれに対する結合親和性は独立しており、すなわち、いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つ、または3つに対する変化した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つ、または3つに対する増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つ、もしくは3つに対して増加した結合親和性、ならびに/またはCD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つ、もしくは3つに対して減少した結合親和性を有する。
【０２９３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。
【０２９４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1に対して増加した結合親和性およびCD28に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4に対して増加した結合親和性およびPD-L1に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28に対して増加した結合親和性およびCTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28、PD-L1、およびCTLA-4に対して増加した結合親和性を有する。
【０２９５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1に対して減少した結合親和性を有する。
【０２９６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4およびCD28に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4に対して増加した結合親和性およびCD28に対して減少した結合親和性を有する。このような態様のいずれかでは、バリアントCD80ポリペプチドは、PD-L1に対して減少した結合親和性を有し、かつ/またはPD-L1に結合しないか、もしくは実質的に結合しない。
【０２９７】
いくつかの態様では、CD28、PD-L1、および/またはCTLA-4との増加したまたはより大きい結合親和性を有するバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチド対照と比べて、CD28、PD-L1、および/またはCTLA-4結合パートナーに対する結合親和性の少なくとも約5％、例えば少なくとも約10％、15％、20％、25％、35％、または50％の増加を有する。いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べた結合親和性の増加は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、またはそれ以上よりも大きい。このような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０２９８】
いくつかの態様では、コグネイト結合パートナーとの減少または低下した結合親和性を有するバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチド対照と比べて、結合パートナーに対する結合親和性の少なくとも5％、例えば少なくとも約10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上の減少を有する。いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べた結合親和性の減少は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍または50倍よりも大きい。このような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０２９９】
いくつかの態様では、前述の態様のいずれかのCD28、PD-L1、および/またはCTLA-4との平衡解離定数(Kd)は、少なくとも1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mもしくは1×10-11M、もしくは1×10-12Mもしくはそれ未満、または約1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10Mもしくは1×10-11M、もしくは1×10-12Mもしくはそれ未満であることができる。
【０３００】
結合パートナーとの変化した(例えば増加または減少した)結合を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例は、IgVおよびIgCドメインを含有する完全細胞外ドメイン中に変異が含有されるものを含めて、実施例に記載されている。コグネイト結合パートナーとの結合についての例示的な結合活性は、平均蛍光強度(MFI)に基づくフローサイトメトリーに基づくアッセイおよび対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドへの結合の比較に示される。そのようなバリアントポリペプチドの中に、コグネイト結合パートナー、例えば記載されたようなCD28、CTLA-4および/またはPD-L1に対して増加または減少を示すポリペプチドがある。
【０３０１】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドに含有されるIgSFドメインと比べて少なくとも1つの親和性改変IgSFドメイン(例えば、IgVまたはIgC)またはその特異的結合断片を含有する、提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、1つまたは複数の結合パートナーに結合した際に野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、細胞内シグナルに応答してサイトカインを放出することができるT細胞などのシグナル伝達可能な細胞の表面に発現したCD28、PD-L1、および/またはCTLA-4などの、1つまたは複数の機能的結合パートナーによって誘導される変化した(増加する/刺激するまたは減少する/阻害する)シグナル伝達を示す。いくつかの態様では、変化したシグナル伝達は、特定のバリアントおよび/または野生型もしくは非改変CD80ポリペプチドとのインキュベーション後に、例えばサイトカイン放出(例えばIL-2放出またはIFN-γ放出)を測定するアッセイによって決定される場合に、例えば、同じフォーマットの(例えば可溶性の)、野生型または非改変CD80ポリペプチド対照配列によってもたらされるものとは異なる。例示的なアッセイが実施例8〜9に記載されている。例示的なアッセイでは、サイトカイン放出は、サイトカイン放出細胞の表面に発現する機能的結合パートナーのシグナル伝達活性の合計の関数である。
【０３０２】
CTLA-4は阻害性シグナル伝達を誘導するため、増加したCTLA-4シグナル伝達により、いくつかの例示的なアッセイでサイトカイン放出の減少がもたらされる。逆に、減少したCTLA-4シグナル伝達により、減少した阻害性シグナルがもたらされ、これによりサイトカイン放出は減少せず、いくつかのアッセイでは増加したサイトカイン放出がもたらされることができる。CD28シグナル伝達はサイトカイン放出を刺激するため、増加したCD28シグナル伝達により、例示的なアッセイで増加したサイトカイン放出をもたらす。逆に、減少したCD28シグナル伝達により、例示的なアッセイで減少したサイトカイン放出がもたらされる。PD-L1は阻害性シグナル伝達を誘導するため、PD-1と結合した場合、増加したPD-L1シグナル伝達により、いくつかの例示的なアッセイでサイトカイン放出の減少がもたらされる。逆に、PD-L1シグナル伝達の減少により、減少した阻害性シグナル伝達がもたらされるが、これによりサイトカイン放出は減少せず、いくつかのアッセイで増加したサイトカイン放出がもたらされることができる。
【０３０３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28媒介性シグナル伝達を増加させる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1、および/またはCTLA-4媒介性シグナル伝達を減少させる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28媒介性シグナル伝達を増加させ、PD-L1、および/またはCTLA-4媒介性シグナル伝達を減少させる。
【０３０４】
コグネイト結合パートナーのそれぞれに対する結合親和性は独立しており、したがって、いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つ、もしくは3つにより誘導されるシグナル伝達を増加させることができ、かつ/またはCD28、PD-L1、およびCTLA-4のうちの1つ、2つもしくは3つにより誘導されるシグナル伝達を減少させることができる。
【０３０５】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、結合した際に、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CD28により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの態様では、バリアントCD80は、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1/PD-1により誘導されるシグナル伝達を減少させる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチド、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4により誘導されるシグナル伝達を減少させる。
【０３０６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、CTLA-4によって誘導されるシグナル伝達を減少させ、CD28によって誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて、PD-L1によって誘導されるシグナル伝達を減少させ、CD28によって誘導されるシグナル伝達を増加させる。
【０３０７】
いくつかの態様では、CD28により誘導されるシグナル伝達を刺激または増加させるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドにより誘導されるシグナルの少なくとも105％、110％、120％、150％、200％、300％、400％または500％、またはそれ以上であるシグナルを生成する。いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べたCD28媒介性シグナル伝達の増加は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、またはそれ以上よりも大きい。このような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０３０８】
いくつかの態様では、CTLA-4またはPD-1/PD-L1によって誘導される阻害性シグナル伝達を阻害するまたは減少させるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドによって誘導されるシグナルの90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、またはそれ未満であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、CTLA-4および/もしくはPD-L1により誘導される阻害性シグナル伝達に影響を与え、かつ/またはCD28によるシグナル伝達に影響を与えるバリアントCD80ポリペプチドは、対応する野生型または非改変CD80ポリペプチドによりもたらされるPD-L1、CTLA−4およびCD28シグナル伝達の合計より大きいPD-L1、CTLA−4およびCD28シグナル伝達の合計をもたらす。このような態様では、PD-L1、CTLA−4およびCD28シグナル伝達の合計は、対応する野生型または非改変CD80ポリペプチドによりもたらされたシグナルの少なくとも105％、110％、120％、150％、200％、300％、400％または500％、またはそれ以上である。このような例では、対応する野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０３１０】
1つまたは複数の機能的結合パートナー、例えばCD28、PD-L1、および/またはCTLA-4との相互作用の後に誘導された、変化した(例えば、増加または減少した)シグナル伝達を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例が、実施例に記載されている。提供されるCD80バリアントポリペプチドの中に、IgVおよびIgCドメインを含有する完全細胞外ドメイン中に変異が含有されるものが含まれる。対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドとの比較を含めて、T細胞レポーターJurkat細胞株におけるレポーターの蛍光変化に基づくレポーターに基づくアッセイで例示的な機能的活性が示される。このようなバリアントポリペプチドの中に、記載のようなCD28共刺激またはアゴニズムの増加を示すポリペプチドがある。
【０３１１】
1.  CD28
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較してCD28のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、CD28のエクトドメインとの増加した親和性は、CD28のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、または200倍を上回って増加している。
【０３１２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメインおよびCTLA-4のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメインおよびPD-L1のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメイン、PD-L1のエクトドメインおよびCTLA-4のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、CD28ならびにCTLA-4およびPD-L1の一方または両方のエクトドメインに対する増加した親和性は、CTLA-4またはPD-L1のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、独立して1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【０３１３】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメインおよびCTLA-4のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメインおよびPD-L1のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28のエクトドメイン、CTLA-4のエクトドメイン、およびPD-L1のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、CD28のエクトドメインとの増加した親和性は、CD28のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または60倍を上回って増加している。
【０３１４】
CD28への変化した(例えば、増加した結合を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例は、実施例に記載されている。CD28との結合についての例示的な結合活性は、平均蛍光強度(MFI)に基づくフローサイトメトリーに基づくアッセイおよび対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドとの結合の比較に示される。このようなバリアントポリペプチドの中に、記載のようなCD28、例えば、ヒトCD28に対して増加した結合を示すポリペプチドがある。さらに、1つまたは複数の機能的結合パートナー、例えばCD28との相互作用の後に誘導された、変化した(例えば、増加した)シグナル伝達を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例が、実施例に記載されている。いくつかの局面では、対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドとの比較を含めて、混合リンパ球反応および/またはT細胞レポーターJurkat細胞株におけるレポーターの蛍光変化に基づくレポーターに基づくアッセイで例示的な機能的活性が示される。このようなバリアントポリペプチドの中に、記載のようなCD28共刺激またはアゴニズムの増加を示すポリペプチドがある。
【０３１５】
これらの態様のうちのいくつかでは、このようなバリアントポリペプチドの非限定的な例の中に、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28に対して増加した結合親和性を示し、SEQ ID NO:2、76、150、または1245の12、13、18、20、22、23、24、26、27、31、35、41、42、43、46、47、54、55、57、58、61、62、67、68、69、70、71、72、79、83、84、85、88、90、93、94、および/または95位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する、バリアントCD80ポリペプチドが含まれる。これらの態様のいくつかでは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CD28に対して増加した結合親和性を示すバリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2、76、150、または1245の23、26、35、46、55、57、58、71、79、および/または84位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。
【０３１６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000040
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000041
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【０３１７】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、
2022501361.tif 000042
2022501361.tif 000043
である。
【０３１８】
2.  PD-L1
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1との増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えばSEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1のエクトドメインに対する増加した親和性を示す。いくつかの態様では、PD-L1のエクトドメインとの増加した親和性は、PD-L1のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、または450倍を上回って増加している。
【０３１９】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えばSEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1のエクトドメインに対する増加した親和性、およびCTLA-4のエクトドメインに対する増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えばSEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1のエクトドメインに対する増加した親和性、およびCD28のエクトドメインに対する増加した親和性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、例えばSEQ ID NO:2、76、150、または1245に記載の配列を含む、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1のエクトドメインに対する増加した親和性、およびCD28のエクトドメインに対する増加した親和性、およびCTLA-4のエクトドメインに対する増加した親和性を示す。いくつかの態様では、PD-L1のエクトドメインとの増加した親和性は、PD-L1のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍または60倍を上回って増加している。
【０３２０】
PD-L1との変化した(例えば、増加した)結合を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例は、実施例に記載されている。PD-L1との結合についての例示的な結合活性は、平均蛍光強度(MFI)に基づくフローサイトメトリーに基づくアッセイおよび対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドへの結合の比較に示される。このようなバリアントポリペプチドの中に、記載のようなPD-L1、例えば、ヒトPD-L1に対して増加した結合を示すポリペプチドがある。さらに、1つまたは複数の機能的結合パートナー、例えばPD-L1との相互作用の後に誘導された、変化した(例えば、増加した)シグナル伝達を有するCD80バリアントポリペプチドの非限定的な例が、実施例に記載されている。いくつかの局面では、対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドとの比較を含めて、混合リンパ球反応および/またはT細胞レポーターJurkat細胞株におけるレポーターの蛍光変化に基づくレポーターに基づくアッセイで例示的な機能的活性が示される。このようなバリアントポリペプチドの中に、記載のようなPD-L1依存性のCD28共刺激またはアゴニズムの増加を示すポリペプチドがある。
【０３２１】
これらの態様のうちのいくつかでは、このようなバリアントポリペプチドの非限定的な例の中に、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1に対して増加した結合親和性を示し、SEQ ID NO:2、76、150、または1245の7、12、13、15、16、18、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、51、53、54、55、57、58、61、62、63、65、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、および/または97位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する、バリアントCD80ポリペプチドが含まれる。これらの態様のいくつかでは、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1に対して増加した結合親和性を示すバリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO:2、76、150、または1245の7、23、26、30、34、35、46、51、55、57、58、65、71、73、78、79、82、および/または84位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を有する。
【０３２２】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000044
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000045
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【０３２３】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、
2022501361.tif 000046
2022501361.tif 000047
2022501361.tif 000048
2022501361.tif 000049
である。
【０３２４】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較してPD-L1のエクトドメインに対して増加した親和性を示す、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、PD-L1およびPD-1の結合からの減少した阻害性シグナルをもたらす。いくつかの態様では、PD-L1およびPD-1により誘導される阻害性シグナル伝達を阻害するかまたは減少させるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドの存在下でPD-L1/PD-1シグナルの90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、またはそれ未満であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、置換)を含有しないこと以外は、バリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０３２５】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、PD-L1のエクトドメインに対して増加した親和性を示す、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、PD-L1依存性のCD28共刺激を示すことができるか、またはPD-L1依存性のCD28共刺激活性をもたらすことができる。バリアントCD80ポリペプチドがPD-L1依存性のCD28共刺激活性を媒介するかまたはもたらすいくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドの親和性は、PD-L1のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、または450倍増加する。
【０３２６】
いくつかの態様では、PD-L1依存性のCD28共刺激活性を示すか、媒介するか、またはもたらす、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80と比較してCD28のエクトドメインとの結合を保持する。例えば、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、CD28のエクトドメインとの親和性の少なくとも2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、または少なくとも約2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％を保持することができる。
【０３２７】
いくつかの態様では、PD-L1依存性のCD28共刺激活性を示すか、媒介するか、またはもたらす、本明細書に提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、CD28のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、CD28のエクトドメインとの増加した親和性を示す。例えば、バリアントCD80ポリペプチドは、CD28のエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、または200倍を上回って増加している、CD28のエクトドメインとの増加した親和性を示すことができる。
【０３２８】
3. CTLA-4
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO：2、76、150または1245に示される配列を含む野生型または非改変CD80ポリペプチドなどの野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較して、CTLA-4のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの態様では、CTLA-4のエクトドメインへの増加した親和性は、非改変CD80のCTLA-4のエクトドメインに対する結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍または60倍を上回って増加している。
【０３２９】
CTLA-4への結合が変更された（例えば、増加した）CD80バリアントポリペプチドの非限定例は、実施例に記載される。CTLA-4に結合するための例示的な結合活性は、フローサイトメトリーベースのアッセイにおいて、平均蛍光強度（MFI）および対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドへの結合の比較に基づいて示される。中でも、そのようなバリアントポリペプチドは、記載のようなCTLA-4（例えば、ヒトCTLA-4）に対して結合の増加を示すポリペプチドである。さらに、1つまたは複数の機能的結合パートナー、例えばCTLA-4との相互作用後に誘導されたシグナル伝達が変更された（例えば、増加した）CD80バリアントポリペプチドの非限定例は、実施例に記載される。例示的な機能的活性は、いくつかの局面では、混合リンパ球反応および/またはレポーターベースアッセイにおいて、対応する非改変または野生型CD80ポリペプチドとの比較を含めたT細胞レポーターJurkat細胞株におけるレポーターの蛍光の変化に基づいて示される。
【０３３０】
中でも、そのようなバリアントポリペプチドの非限定例は、これらの態様のいくつかにおいて、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較してCTLA-4に対して増加した結合親和性を示すバリアントCD80ポリペプチドであって、SEQ ID NO：2、76、150または1245の7、12、13、16、18、20、22、23、24、26、27、30、33、35、37、38、41、42、43、44、46、47、48、52、53、54、57、58、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、77、79、81、83、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95および/または97位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する、該バリアントCD80ポリペプチドを含む。これらの態様のいくつかにおいて、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較してCTLA-4に対して増加した結合親和性を示すバリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO：2、76、150または1245の7、23、26、30、35、46、57、58、71、73、79および/または84位に対応する1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。
【０３３１】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000050
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、
2022501361.tif 000051
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
【０３３２】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、
2022501361.tif 000052
2022501361.tif 000053
2022501361.tif 000054
である。
【０３３３】
いくつかの態様では、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比較してCTLA-4のエクトドメインに対して増加した親和性を示す本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、CTLA-4阻害性受容体からの減少した阻害性シグナルをもたらす。いくつかの態様では、本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドは、CD80とCTLA-4との相互作用を遮断し、それによって、CTLA-4阻害性受容体を遮断する。いくつかの態様では、阻害性受容体CTLA-4の活性を阻害または減少させるバリアントCD80ポリペプチドは、野生型または非改変CD80ポリペプチドの存在下でCTLA-4阻害性シグナルの90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％またはそれ未満のシグナルを生じるだろう。そのような例では、野生型または非改変CD80ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しない以外はバリアントCD80ポリペプチドと同じ配列を有する。
【０３３４】
B. 多量体化ドメイン
vIgDを含有する本明細書において提供されるバリアントCD80を含むバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、可溶性タンパク質として多種多様な方法でフォーマットすることができる。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、多量体化ドメインを含有する。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、Fc領域である。いくつかの特定の局面では、Fc領域は、FcRに結合するおよび/または1つもしくは複数のエフェクター活性を媒介することが可能なエフェクターFcである。他の特定の局面では、Fc領域は、エフェクター活性を低下させるかFcをFcエフェクター機能に対して不活性にするように1つまたは複数のアミノ酸置換によって改変されているFcである。
【０３３５】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、その結合パートナー、例えば、CD28の活性をアゴナイズまたは刺激する。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムは、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。場合によって、バリアントCD80ポリペプチドを含むバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質が、その結合パートナー、例えば、CTLA-4および/またはPD-L1の活性をアンタゴナイズするかそれを遮断するために提供される。いくつかの態様では、CTLA-4またはPD-L1/PD-1のアンタゴニズムは、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムは、PD-L1のCD80結合に依存するかそれによって増強され得る。そのようなCD28のPD-L1依存性アゴニズムは、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。当業者は、1つまたは複数の特異的結合パートナーをアンタゴナイズまたはアゴナイズするなどのために、特定のフォーマットの活性を容易に決定することができる。そのような活性を評価するための例示的な方法は、実施例を含め、本明細書において提供される。
【０３３６】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、可溶性タンパク質である。当業者は、細胞表面タンパク質が典型的には細胞内、膜貫通および細胞外ドメイン（ECD）を有すること、ならびに、細胞外ドメインまたは免疫学的に活性なその部分配列を使用してそのようなタンパク質の可溶性形態を作製することができることを認識するであろう。したがって、いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様では、バリアントCD80を含有する免疫調節タンパク質は、細胞内（細胞質）ドメインまたは細胞内ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、アミノ酸改変を含有するIgVドメインおよび/またはIgC（例えば、IgC2）ドメイン（1つまたは複数）またはその特異的結合断片を含有するECDドメインまたはその一部を含有するvIgD部分を唯一含有する。
【０３３７】
いくつかの局面では、多量体化ドメイン（例えば、Fc鎖）に融合されたCD80のvIgDを含むバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質が提供される。当業者は、細胞表面タンパク質が典型的には細胞内、膜貫通および細胞外ドメイン（ECD）を有すること、ならびに、細胞外ドメインまたは免疫学的に活性なその部分配列を使用してそのようなタンパク質の可溶性形態を作製することができることを認識するだろう。したがって、いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様では、バリアントCD80を含有する免疫調節タンパク質は、細胞内（細胞質）ドメインまたは細胞内ドメインの一部を欠いている。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、アミノ酸改変を含有するIgVドメインおよび/またはIgC（例えば、IgC2）ドメイン（1つまたは複数）またはその特異的結合断片を含有するECDドメインまたはその一部を含有するvIgD部分を唯一含有する。
【０３３８】
いくつかの態様では、バリアントCD80を含むバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、本発明の1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、本発明のポリペプチドは、正確に、1つ、2つ、3つ、4つ、5つのバリアントCD80配列を含むだろう。いくつかの態様では、バリアントCD80配列の少なくとも2つは、同一のバリアントCD80配列である。
【０３３９】
いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、CD80の2つ以上のvIgD配列を含む。いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、CD80の3つ以上のvIgD配列を含む。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、その結合パートナーへの多価結合を示す。例えば、場合によって、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、その結合パートナーへの二価、三価、四価、五価または六価の結合を示す。いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、二価である。いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、四価である。
【０３４０】
いくつかの態様では、ポリペプチド鎖内の複数のバリアントCD80ポリペプチドは、互いに同一（すなわち、同じ種）であるか、非同一（すなわち、異なる種）のバリアントCD80配列であることができる。単一ポリペプチド鎖の態様に加えて、いくつかの態様では、本発明のポリペプチドの2つ、3つ、4つまたはより多くを、共有結合または非共有結合によって互いに付着させることができる。したがって、単量体、二量体およびより高次（例えば、3、4、5またはより高次）の多量体タンパク質が本明細書において提供される。例えば、いくつかの態様では、正確に2つの本発明のポリペプチドを共有結合または非共有結合によって互いに付着させて、二量体を形成することができる。いくつかの態様では、付着は、鎖間システインジスルフィド結合を介してなされる。本発明の2つ以上のポリペプチドを含む組成物は、同一種もしくは実質的に同一種のポリペプチド（例えば、ホモ二量体）または非同一種のポリペプチド（例えば、ヘテロ二量体）のものであることができる。本発明の複数の連結されたポリペプチドを有する組成物は、上述したように、各ポリペプチド鎖において本発明の1つまたは複数の同一または非同一のバリアントCD80ポリペプチドを有することができる。
【０３４１】
いくつかの態様では、免疫調節タンパク質は、直接的またはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに連結されているバリアントCD80ポリペプチドを含有する。例えば、本明細書において提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体または五量体）分子としてフォーマットすることができる。いくつかの局面では、多量体化ドメインは、分子の半減期を延長させる。2つ以上のバリアントCD80ポリペプチドの相互作用は、直接的または間接的のいずれかの、安定な構造を形成するためにそれら自体相互作用できる任意の部分または他のポリペプチドへのそれらの連結によって容易になることができる。例えば、別個のコードされたバリアントCD80ポリペプチド鎖は、多量体化によって接続させることができ、それによって、ポリペプチドの多量体化が多量体化ドメインによって媒介される。典型的には、多量体化ドメインは、第1のバリアントCD80ポリペプチドと第2のバリアントCD80ポリペプチドとの間で安定なタンパク質-タンパク質相互作用の形成を提供する。
【０３４２】
ホモまたはヘテロ多量体ポリペプチドは、別個のバリアントCD80ポリペプチドの共発現から生成させることができる。第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。特定の態様では、第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドは、ホモ二量体では同じであり、各々、同じ多量体化ドメインに連結される。他の態様では、ヘテロ二量体は、異なる第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドを連結させることによって形成することができる。そのような態様のいくつかにおいて、第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進可能な異なる多量体化ドメインに連結される。
【０３４３】
いくつかの態様では、多量体化ドメインは、安定なタンパク質-タンパク質相互作用を形成可能ないずれかを含む。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列（例えば、Fcドメイン；例えば、国際特許公開番号WO 93/10151およびWO 2005/063816 US；米国公開番号2006/0024298；米国特許第5,457,035号を参照のこと)；ロイシンジッパー（例えば、核形質転換タンパク質fosおよびjunもしくはがん原遺伝子c-myc由来、または窒素の一般制御（General Control of Nitrogen）（GCN4）由来）（例えば、Busch and Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40；Gentz et al., (1989) Science, 243:1695-1699を参照のこと）；疎水性領域；親水性領域；または、ホモもしくはヘテロ多量体のキメラ分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用することができる。加えて、多量体化ドメインは、例えば、米国特許第5,731,168号；国際特許公開番号WO 98/50431およびWO 2005/063816；Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617-621に記載されているなど、ホールを含むアミノ酸配列に相補的な突起部を含むアミノ酸配列を含むことができる。そのような多量体化領域は、立体相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなくキメラ単量体の混合物からのホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進するように、操作することができる。一般に、突起部は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起部と同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第2のポリペプチドの界面上に任意で作製される。例示的な多量体化ドメインを以下に説明する。
【０３４４】
バリアントCD80ポリペプチドは、いずれの場所でもよいが、典型的にはそのN末端またはC末端を介して、多量体化ドメインのN末端またはC末端に接続して、キメラポリペプチドを形成することができる。連結は、直接的であっても、リンカーを介して間接的であってもよい。キメラポリペプチドは、融合タンパク質であることができるか、または共有もしくは非共有相互作用などを通じた化学的連結によって形成することができる。例えば、多量体化ドメインを含有するキメラポリペプチドを調製する際に、バリアントCD80ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸を、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に、直接的または間接的または任意でリンカードメインを介して機能的に連結することができる。場合によって、構築物は、バリアントCD80ポリペプチドのC末端が多量体化ドメインのN末端に接続されているキメラタンパク質をコードする。一部の場合では、構築物は、バリアントCD80ポリペプチドのN末端が多量体化ドメインのC末端に接続されているキメラタンパク質をコードすることができる。
【０３４５】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、多量体化によって接続された、例えば、二量体、三量体、四量体または五量体分子として接続された、2つ以上のポリペプチドを含む。その形状のいくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドを含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、多量体化ドメインに融合される。いくつかの例では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖を含む）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、タンパク質の二量体化、三量体化、四量体化または五量体化を促進するアミノ酸の配列と融合される。
【０３４６】
いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、タンパク質の五量体化を促進するアミノ酸の配列と融合される。いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）アセンブリドメインの一部に融合される（Voulgaraki et al., Immunology (2005) 115(3):337-346）。いくつかの例では、COMPは、SEQ ID NO：1524に示されるようなアミノ酸配列（例えば、完全長COMPのアミノ酸29-72、Uniprotアクセッション番号P49747）またはSEQ ID NO：1524に対して85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列であるかそれを含有する。
【０３４７】
いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、タンパク質の四量体化を促進するアミノ酸の配列と融合される。いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（VASP）四量体化ドメインに融合される（Bachmann et al., J Biol Chem (1999) 274(33):23549-23557）。いくつかの態様では、VASPは、SEQ ID NO：1525に示されるようなアミノ酸配列（例えば、完全長VASPのアミノ酸343-375；Uniprotアクセッション番号P50552）またはSEQ ID NO：1525に対して85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列であるかそれを含有する。
【０３４８】
いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、タンパク質の三量体化を促進するアミノ酸の配列と融合される。いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチド（例えば、別個のコードされたポリペプチド鎖）を含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、ZymoZipper（ZZ）12.6ドメインに融合される。いくつかの態様では、ZZドメインは、SEQ ID NO：1526に示されるようなアミノ酸配列（米国特許第7,655,439号を参照のこと）またはSEQ ID NO：1526に対して85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列であるかそれを含有する。
【０３４９】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、四価である。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、2コピーのバリアントCD80 IgSfドメインを含有する。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、バリアントCD80 IgSfドメイン成分、リンカー成分、および多量体化ドメイン成分を様々な順序および組み合わせで含む。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、以下を次の順序で含む：バリアントCD80 IgSFドメイン-リンカー-多量体化ドメイン-リンカー-バリアントCD80 IgSfドメイン。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、以下を次の順序で含む：バリアントCD80 IgSFドメイン-リンカー-バリアントCD80 IgSfドメイン-リンカー-多量体化ドメイン。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、以下を次の順序で含む：多量体化ドメイン-リンカー-バリアントCD80 IgSFドメイン-バリアントCD80 IgSfドメイン。例示的なバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、図3に示される。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質はさらに、第3のCD80 vIgDを含有することができる。いくつかの態様では、CD80 vIgDは、独立して、Fc領域のN末端もしくはC末端にまたは別のCD80 vIgDのN末端もしくはC末端に、直接的または間接的に連結される。
【０３５０】
ポリペプチド多量体は、同じまたは異なるバリアントCD80ポリペプチドの2つを直接的または間接的に多量体化ドメインに直接的または間接的に連結させることによって作製された複数（2つなど）のキメラタンパク質を含有する。いくつかの例では、多量体化ドメインがポリペプチドである場合、バリアントCD80ポリペプチドおよび多量体化ドメインをコードする遺伝子融合体が適切な発現ベクターに挿入される。得られたキメラまたは融合タンパク質を、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において発現させることができ、アセンブルして多量体となることが可能になり、この場合、多量体化ドメインは相互作用して多価ポリペプチドを形成する。バリアントCD80ポリペプチドへの多量体化ドメインの化学的連結は、ヘテロ二官能性リンカーを使用して行うことができる。
【０３５１】
融合タンパク質などの得られたキメラポリペプチド、およびそれから形成された多量体は、例えば、プロテインAまたはプロテインGカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによるなどの、任意の好適な方法によって精製することができる。異なるポリペプチドをコードする2つの核酸分子が細胞に形質転換される場合、ホモおよびヘテロ二量体の形成が起こる。ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成が優先されるように、発現するための条件を調整することができる。
【０３５２】
いくつかの態様では、多量体化ドメインは、免疫グロブリン由来のFcドメインまたはその部分である。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、免疫グロブリンFcに付着された1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドを含む（CD80 vIgD-Fc融合体とも呼ばれる「バリアントCD80-Fc融合体」などの「免疫調節Fc融合体」をもたらす）。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドの付着は、FcのN末端である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドの付着は、FcのC末端である。いくつかの態様では、2つ以上のCD80バリアントポリペプチド（同じまたは異なる）は、独立して、N末端およびC末端で付着される。
【０３５３】
いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドは、いずれの場所でもよいが、典型的にはそのN末端またはC末端を介して、多量体化ドメインのN末端またはC末端に接続して、キメラポリペプチドを形成することができる。連結は、直接的であっても、リンカーを介して間接的であってもよい。また、キメラポリペプチドは、融合タンパク質であることができるか、または共有もしくは非共有相互作用などを通じた化学的連結によって形成することができる。例えば、多量体化ドメインを含有するキメラポリペプチドを調製する際に、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドをコードする核酸を、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に、直接的または間接的または任意でリンカードメインを介して機能的に連結することができる。場合によって、構築物は、バリアントCD80ポリペプチドのC末端が多量体化ドメインのN末端に接続されているキメラタンパク質をコードする。一部の場合では、構築物は、バリアントCD80ポリペプチドのN末端が多量体化ドメインのN末端またはC末端に接続されているキメラタンパク質をコードすることができる。
【０３５４】
いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドは、多量体化ドメインのN末端に配置される。いくつかの態様では、2つのバリアントCD80ポリペプチドは、多量体化ドメインのN末端に配置される。いくつかの態様では、1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドは、多量体化ドメインのC末端に配置される。いくつかの態様では、2つのバリアントCD80ポリペプチドは、多量体化ドメインのC末端に配置される。
【０３５５】
いくつかの態様では、多量体化ドメインの各々は、キメラポリペプチドを形成するために2つ以上のバリアントCD80ポリペプチドに連結される。場合によって、構築物は、第1のバリアントCD80ポリペプチドのC末端が第2のバリアントCD80ポリペプチドのN末端に接続され、第2のバリアントCD80ポリペプチドのC末端が多量体化ドメインのN末端に接続されているキメラタンパク質をコードする。いくつかの態様では、構築物は、多量体化ドメインのC末端が第1のバリアントCD80ポリペプチドのN末端に接続され、第1のバリアントCD80ポリペプチドのC末端が第2のバリアントCD80ポリペプチドのN末端に接続されているキメラタンパク質をコードする。いくつかの態様では、構築物は、第1のバリアントCD80ポリペプチドのC末端が多量体化ドメインのN末端に接続され、多量体化ドメインのC末端が第2のバリアントCD80ポリペプチドのN末端に接続されているキメラタンパク質をコードする。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、免疫グロブリン由来のFcドメインまたはその部分である。
【０３５６】
いくつかの態様では、第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドは、同じである。いくつかの態様では、第1と第2のバリアントCD80ポリペプチドは、異なる。いくつかの態様では、キメラポリペプチドはさらに、記載されるポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに接続された第3のCD80ポリペプチドを含有する。
【０３５７】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、多量体化によって接続された、例えば、二量体、三量体、四量体または五量体分子として接続された、2つ以上のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、記載されているような1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドを含有するキメラポリペプチドの形状を有する。
【０３５８】
いくつかの態様では、Fcは、ネズミ科またはヒトのFcである。いくつかの態様では、Fcは、哺乳動物またはヒトのIgGl、lgG2、lgG3またはlgG4 Fc領域である。いくつかの態様では、Fcは、ヒトIgG1などのIgG1に由来する。いくつかの態様では、Fcは、SEQ ID NO：1502、1510もしくは1518に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：1502、1510もしくは1518に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０３５９】
いくつかの態様では、Fc領域は、その通常の機能の1つまたは複数を変更する（例えば、低下させる）ための1つまたは複数の改変を含有する。一般に、Fc領域は、免疫グロブリンの主な機能である抗原結合能に加えて、補体依存性細胞傷害（CDC）および抗体依存性細胞傷害（ADCC）などのエフェクター機能に関与する。加えて、Fc領域に存在するFcRn配列は、インビボのFcRn受容体へのコンジュゲーションによりインビボ半減期を延長することによって、血清中のIgGレベルを調節する役割を果たす。いくつかの態様では、そのような機能は、提供されるFc融合タンパク質と共に使用するために、Fcにおいて低下または変更することができる。
【０３６０】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書において提供されるCD80-Fcバリアント融合体のFc領域に導入し、それによって、Fc領域バリアントを生成させてもよい。いくつかの態様では、Fc領域バリアントは、減少したエフェクター機能を有する。エフェクター機能を変更することができるFc配列に対する変化または変異の多くの例がある。例えば、WO 00/42072、WO2006019447、WO2012125850、WO2015/107026、US2016/0017041およびShields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)は、FcRへの結合が向上または減少した例示的なFcバリアントを記載している。これらの刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０３６１】
いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80-Fc融合体は、低下したエフェクター機能を示すFc領域を含み、これにより、インビボでのCD80-Fcバリアント融合体の半減期が重要であるが特定のエフェクター機能（CDCおよびADCCなど）が不要または有害である適用に対して望ましい候補となる。CDCおよび/またはADCC活性の低下/枯渇を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを実施することができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合アッセイを実施して、CD80-Fcバリアント融合体が、FcγR結合を欠いている（よって、ADCC活性を欠いている可能性が高い）がFcRn結合能を保持していることを確認することができる。ADCCを媒介するための初代細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表3にまとめられている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照のこと）およびHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.；およびCytoTox 96（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, Wis.）を参照のこと）。そのようなアッセイ用の有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞を含む。あるいは、または加えて、関心対象の分子のADCC活性を、インビボで、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価してもよい。また、CD80-Fcバリアント融合体がC1qに結合できず、よってCDC活性を欠いているかを確認するために、C1q結合アッセイを行ってもよい。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。当技術分野において公知の方法を使用してFcRn結合およびインビボクリアランス/半減期の決定を実施することもできる（例えば、Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照のこと）。
【０３６２】
エフェクター機能が低下したバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327および329（EU番号付けによる）の1つまたは複数の置換を有するものを含む（米国特許第6,737,056号）。そのようなFc変異体は、残基265および297がアラニンに置換されたいわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含め、アミノ酸位置265、269、270、297および327（EU番号付けによる）の2つ以上に置換を有するFc変異体を含む。
【０３６３】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質のFc領域は、位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325および329（EU番号付けによって示される）にあるアミノ酸のいずれか1つまたは複数が、天然Fc領域に比べて、異なるアミノ酸で置換されているFc領域を有する。そのようなFc領域の変更は、上記の変更に限定されず、例えば、Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691に記載されている、脱グリコシル化鎖（N297AおよびN297Q）、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1- E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、およびIgG4-L236Eなどの変更；WO 2008/092117に記載されているG236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328RおよびN325LL328Rなどの変更；位置233、234、235および237（EU番号付けによって示される）におけるアミノ酸挿入；ならびにWO 2000/042072に記載されている部位における変更を含む。
【０３６４】
FcRへの結合が向上または減少したある特定のFcバリアントが記載されている（例えば、米国特許第6,737,056号；WO 2004/056312、WO2006019447およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと）。
【０３６５】
いくつかの態様では、半減期を延長するおよび/または新生児Fc受容体（FcRn）への結合を向上させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域を含むバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質が提供される。半減期が延長したおよびFcRnへの結合が向上した抗体は、US2005/0014934A1（Hintonら）またはWO2015107026に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上させる1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。そのようなFcバリアントは、Fc領域の残基（EU番号付けによる）：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434の1つまたは複数に置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するもの（米国特許第7,371,826号）を含む。
【０３６６】
いくつかの態様では、CD80-Fcバリアント融合体のFc領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換E356DおよびM358L（EU番号付けによる）を含む。いくつかの態様では、CD80-Fcバリアント融合体のFc領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換C220S、C226Sおよび/またはC229S（EU番号付けによる）を含む。いくつかの態様では、CD80バリアント融合体のFc領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換R292CおよびV302Cを含む。また、Fc領域バリアントの他の例に関して、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO 94/29351も参照されたい。
【０３６７】
いくつかの態様では、野生型IgG1 Fcは、位置356および358（EU番号付けによる）に残基Glu（E）およびMet（M）を含有するアロタイプ（例えば、fアロタイプ）を有する、SEQ ID NO：1502に示されるFcであることができる。他の態様では、野生型IgG1 Fcは、例えばSEQ ID NO:1527に示されるような、位置356および358にAsp（D）およびLeu（L）を含有する残基など、ヒトG1m1アロタイプのアミノ酸を含有する。したがって、場合によって、本明細書において提供されるFcは、アロタイプG1 m1（例えば、アルファアロタイプ）の残基を再構成するためのアミノ酸置換E356DおよびM358Lを含有することができる。いくつかの局面では、野生型Fcは、エフェクター活性を低下させるかまたはFcをFcエフェクター機能に対して不活性にするように1つまたは複数のアミノ酸置換によって改変される。例示的なエフェクターレスまたは不活性変異は、本明細書に記載されるものを含む。中でも、本明細書において提供される構築物のFc中に含めることができるエフェクターレス変異は、L234A、L235EおよびG237A（EU番号付けによる）である。いくつかの態様では、野生型Fcはさらに、EU番号付けによる位置220（C220S）におけるシステイン残基からセリン残基への置換によるなど、1つまたは複数のシステイン残基の除去によって改変される。低下したエフェクター機能を有する例示的な不活性Fc領域は、SEQ ID NO：1508およびSEQ ID NO：1518に示され、これらは、それぞれ、SEQ ID NO：1502またはSEQ ID NO：1527に示されるアロタイプに基づく。いくつかの態様では、本明細書において提供される構築物中に使用されるFc領域はさらに、C末端リジン残基を欠くことができる。
【０３６８】
いくつかの態様では、例えば、米国特許第6,194,551号、WO 99/51642およびIdusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているような、減少したC1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）をもたらす変更が、Fc領域でなされる。
【０３６９】
いくつかの態様では、1つまたは複数のアミノ酸改変を含むバリアントFc領域を含むCD80-Fcバリアント融合体であって、バリアントFc領域がヒトIgG1などのIgG1に由来する、該CD80-Fcバリアント融合体が提供される。いくつかの態様では、バリアントFc領域は、SEQ ID NO：1502に示されるアミノ酸配列に由来する。いくつかの態様では、Fcは、SEQ ID NO：1502の番号付けによるN82G（EU番号付けによるN297Gに対応する）である少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、Fcはさらに、SEQ ID NO：1502の番号付けによるR77CまたはV87C（EU番号付けによるR292CまたはV302Cに対応する）である少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様では、バリアントFc領域はさらに、SEQ ID NO：1517に示されるFc領域など、SEQ ID NO：1502の番号付けによるC5S（EU番号付けによるC220Sに対応する）アミノ酸改変を含む。例えば、いくつかの態様では、バリアントFc領域は、以下のアミノ酸改変：EU番号付けによるV297Gおよび以下のアミノ酸改変C220S、R292CまたはV302Cの1つまたは複数（SEQ ID NO：1502に基づいて、N82Gおよび以下のアミノ酸改変C5S、R77CまたはV87Cの1つまたは複数に対応する）を含み、例えば、Fc領域は、SEQ ID NO：1507に示される配列を含む。いくつかの態様では、バリアントFc領域は、アミノ酸改変C220S、L234A、L235EまたはG237Aの1つまたは複数を含み、例えば、Fc領域は、SEQ ID NO：1508に示される配列を含む。いくつかの態様では、バリアントFc領域は、アミノ酸改変C220S、L235P、L234V、L235A、G236delまたはS267Kの1つまたは複数を含み、例えば、Fc領域は、SEQ ID NO：1509に示される配列を含む。いくつかの態様では、バリアントFcは、アミノ酸改変C220S、L234A、L235E、G237A、E356DまたはM358Lの1つまたは複数を含み、例えば、Fc領域は、SEQ ID NO：1513に示される配列を含む。
【０３７０】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるCD80-Fcバリアント融合体は、上記セクションI.Aに示される説明に従うバリアントCD80ポリペプチドを含有する。いくつかの態様では、バリアントFc領域に連結された記載されるバリアントCD80ポリペプチドのいずれか1つを含むCD80-Fcバリアント融合体であって、バリアントFc領域が変異R292C、N297GおよびV302C（SEQ ID NO：1502に示される野生型ヒトIgG1 Fcに基づいてR77C、N82GおよびV87Cに対応する）を含有するヒトIgG1 Fcではない、該CD80-Fcバリアント融合体が提供される。いくつかの態様では、Fc領域またはバリアントFc領域に連結されたバリアントCD80ポリペプチドのいずれか1つを含むCD80-Fcバリアント融合体であって、バリアントCD80ポリペプチドが3つのアラニンからなるリンカーでFcに連結されていない、該CD80-Fcバリアント融合体が提供される。
【０３７１】
いくつかの態様では、Fc領域は、SEQ ID NO：1502に示される野生型または非改変Fcの位置232に対応するC末端リジンを欠いている（EU番号付けによるK447delに対応する）。いくつかの局面では、そのようなFc領域は、1つまたは複数の追加の改変、例えば、アミノ酸置換（例えば、記載されるようないずれか）を追加で含むことができる。そのようなFc領域の例は、SEQ ID NO：1508〜1510、1513、または1519〜1521に示される。
【０３７２】
いくつかの態様では、バリアントFc領域を含むCD80-Fcバリアント融合体であって、バリアントFcが、SEQ ID NO：1513、1508〜1510、1517もしくは1519〜1521のいずれかに示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO：1513、1508〜1510、1517もしくは1519〜1521のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、該CD80-Fcバリアント融合体が提供される。
【０３７３】
いくつかの態様では、Fcは、ヒトIgG2などのIgG2に由来する。いくつかの態様では、Fcは、SEQ ID NO：1503に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：1503に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０３７４】
いくつかの態様では、Fcは、SEQ ID NO：1515に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：1515に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様では、IgG4 Fcは、ヒトIgG4のCH3ドメインがヒトIgG1のCH3ドメインで置換されており、かつ、阻害された凝集体形成を示す安定化されたFc、ヒトIgG4のCH3およびCH2ドメインがヒトIgG1のCH3およびCH2ドメインでそれぞれ置換されている抗体、またはヒトIgG4のKabatらによって提案されたEU指数で示される位置409にあるアルギニンがリジンで置換されており、かつ、阻害された凝集体形成を示す抗体である（例えば、米国特許第8,911,726号を参照のこと）。いくつかの態様では、Fcは、Fabアーム交換によって治療用抗体と内因性IgG4との間の組換えを防止すると示されているS228P変異を含有するIgG4である（例えば、Labrijin et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27(8): 767-71を参照のこと）。いくつかの態様では、Fcは、SEQ ID NO：1516に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO：1516に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０３７５】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、リンカーを介するなどしてFc配列に間接的に連結される。いくつかの態様では、1つまたは複数の「ペプチドリンカー」は、バリアントCD80ポリペプチドとFcドメインとを連結する。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸残基またはより大きな長さであることができる。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を有するが、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1アミノ酸残基長以下である。いくつかの態様では、リンカーは、柔軟なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで)：GGGGS（「4GS」または「G4S」；SEQ ID NO：1523）または4GSリンカーの多量体、例えば、SEQ ID NO：1505（2×GGGGS；(G4S)2）もしくはSEQ ID NO：1504（3×GGGGS；(G4S)3）に示されるような2、3、4もしくは5つの4GSリンカーの繰り返しである。いくつかの態様では、リンカーは、一連のアラニン残基を単独で、または別のペプチドリンカー（4GSリンカーまたはその多量体など）に加えて含むことができる。いくつかの態様では、各連におけるアラニン残基の数は、2、3、4、5または6つのアラニンである。いくつかの態様では、リンカーは、3つのアラニン（AAA）である。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、リンカーを介してFc配列に間接的に連結され、この場合のリンカーは、3つのアラニンから構成されない。いくつかの例では、リンカーは、その後に3つのアラニンが続く2×GGGGS
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である。いくつかの態様では、リンカーはさらに、クローニングによっておよび/または制限部位から導入されたアミノ酸を含むことができ、例えば、リンカーは、制限部位BAMHIの使用によって導入されるようなアミノ酸GS（一文字アミノ酸コードで）を含むことができる。例えば、いくつかの態様では、リンカー（一文字アミノ酸コードで）は、GSGGGGS（SEQ ID NO:1522）、GS(G4S)3（SEQ ID NO：1243）、またはGS(G4S)5（SEQ ID NO：1244）である。いくつかの態様では、リンカーは、剛性リンカーである。例えば、リンカーは、α-ヘリックスリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで）：EAAAKまたはEAAAKリンカーの多量体、例えば、SEQ ID NO：1241（1×EAAAK）、SEQ ID NO：1242（3×EAAAK）もしくはSEQ ID NO：1251（5×EAAAK）に示されるような、2つ、3つ、4つもしくは5つのEAAAKリンカーの繰り返しである。場合によって、バリアントCD80を含む免疫調節ポリペプチドは、ペプチドリンカーの様々な組み合わせを含む。
【０３７６】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質のバリアントCD80ポリペプチドは、Fc配列に直接的に連結される。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、ヒンジ領域の全部または一部を追加的に欠いた不活性FcなどのFcに直接的に連結される。ヒンジ領域の一部（6つのアミノ酸）を欠いている例示的なFcは、SEQ ID NO：1240に示される。いくつかの態様では、CD80ポリペプチドがFc配列に直接的に連結される場合、CD80ポリペプチドは、C末端で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15またはより多くのアミノ酸だけ短縮することができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドは、IgV領域をIgC領域に接続する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはより多くのアミノ酸が除去されるように短縮される。例えば、バリアントCD80ポリペプチドは、SEQ ID NO：1245に示される例示的な野生型CD80骨格に改変を含有することができる。
【０３７７】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質（例えば、バリアントCD80-Fc融合タンパク質）は、Fcドメインに連結された2つのバリアントCD80 Fcポリペプチドによって形成される二量体である。いくつかの具体的な態様では、同一種または実質的に同一種（3つ以下のN末端またはC末端アミノ酸配列の差異を可能にする）のCD80-Fcバリアント融合ポリペプチドは、ホモ二量体を作製するために二量体化されるであろう。いくつかの態様では、二量体は、2つのバリアントCD80 Fcポリペプチドが同じであるホモ二量体である。あるいは、異なる種のCD80-Fcバリアント融合ポリペプチドを二量体化して、ヘテロ二量体を生成させることができる。したがって、いくつかの態様では、二量体は、2つのバリアントCD80 Fcポリペプチドが異なるヘテロ二量体である。
【０３７８】
また、バリアントCD80-Fc融合タンパク質をコードする核酸分子も提供される。いくつかの態様では、Fc融合タンパク質の産生のために、バリアントCD80-Fc融合タンパク質をコードする核酸分子は、適切な発現ベクターに挿入される。得られたバリアントCD80-Fc融合タンパク質を、発現で形質転換された宿主細胞において発現させることができ、そこで、Fc部分間に形成された鎖間ジスルフィド結合によってFcドメイン間のアセンブリが起こり、二価のバリアントCD80-Fc融合タンパク質などの二量体が生成される。
【０３７９】
得られたFc融合タンパク質は、プロテインAまたはプロテインGカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製することができる。ヘテロ二量体の生成のために、追加の精製工程が必要となり得る。例えば、異なるバリアントCD80ポリペプチドをコードする2つの核酸が細胞に形質転換される場合、Fc-ドメインを担持するバリアントCD80分子はジスルフィド連結されたホモ二量体としても発現されるであろうから、ヘテロ二量体の形成は、生化学的に達成されなければならない。したがって、ホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊に有利であるが鎖内ジスルフィドには影響しない条件下で減少させることができる。場合によって、異なるバリアント-CD80 Fc単量体を等モル量で混合し、酸化させてホモ二量体とヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフ技術によって分離される。あるいは、以下に記載するノブ-イントゥ-ホール法を使用してバリアントCD80ポリペプチドを含有するFc融合体分子を遺伝子操作および発現させることによって、このタイプのヘテロ二量体の形成を偏らせることができる。
【０３８０】
C. 分泌型免疫調節タンパク質（SIP）および操作された細胞
本明細書において提供されるのは、免疫調節バリアントCD80ポリペプチドのいずれかを発現する操作された細胞（あるいは「操作された細胞」）である。いくつかの態様では、発現される免疫調節バリアントCD80ポリペプチドは、細胞から発現および分泌される（本明細書において以降「分泌型免疫調節タンパク質」またはSIPとも呼ばれる）。
【０３８１】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなアミノ酸変異のいずれか1つまたは複数を含有するCD80バリアント免疫調節ポリペプチドは、細胞から発現される際などに分泌可能である。そのようなバリアントCD80免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様では、細胞から分泌されるCD80バリアント免疫調節タンパク質は、記載されるようないずれかなどのバリアントCD80ポリペプチドが直接的または間接的にFc領域またはドメインに連結または融合されたCD80-Fc融合タンパク質である。場合によって、野生型Fc（例えば、IgG1）がエフェクター活性を低下させるための1つまたは複数のアミノ酸変異を含有する記載されるFc領域のいずれかなど、Fc領域は、不活性であるおよび/またはエフェクター活性を示さない。場合によって、Fc領域は、免疫グロブリン（例えば、IgG1）の野生型Fcであり、かつ/または、エフェクター活性を示す。
【０３８２】
特定の態様では、バリアントCD80免疫調節タンパク質は、本明細書に記載されるか提供されるようないずれかなどのCD80多価ポリペプチドである。
【０３８３】
いくつかの態様では、バリアントCD80免疫調節タンパク質は、ドメインを細胞外に出すシグナルペプチド、例えば、抗体シグナルペプチドまたは他の有効なシグナル配列を含む。免疫調節タンパク質がシグナルペプチドを含み、操作された細胞によって発現されるとき、シグナルペプチドは、免疫調節タンパク質が操作された細胞によって分泌されるようにする。一般に、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドの一部は、分泌と共に免疫調節タンパク質から切断される。免疫調節タンパク質は、核酸（発現ベクターの部分であることができる）によってコードされることができる。いくつかの態様では、免疫調節タンパク質は、細胞（免疫細胞、例えば、初代免疫細胞など）によって発現および分泌される。
【０３８４】
したがって、いくつかの態様では、シグナルペプチドをさらに含むバリアントCD80免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様では、そのようなバリアントCD80ポリペプチドは、分泌のためのシグナル配列の機能的な制御下で、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子によってコードされる。いくつかの態様では、コードされた免疫調節タンパク質は、細胞から発現される際に分泌される。いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、シグナルペプチドをコードする分泌配列に機能的に接続されたバリアントCD80免疫調節タンパク質をコードする核酸分子である。
【０３８５】
シグナルペプチドは、細胞からの免疫調節タンパク質の分泌を合図する免疫調節タンパク質のN末端上の配列である。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、約5〜約40アミノ酸長（例えば、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、または約25〜約30、約30〜約35、または約35〜約40アミノ酸長）である。
【０３８６】
いくつかの態様では、シグナルペプチドは、対応する野生型CD80由来の天然シグナルペプチドである（表1を参照のこと）。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、非天然シグナルペプチドである。例えば、いくつかの態様では、非天然シグナルペプチドは、対応する野生型CD80由来の変異体天然シグナルペプチドであり、1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10またはより多く）の置換、挿入または欠失を含むことができる。いくつかの態様では、非天然シグナルペプチドは、野生型IgSFファミリーメンバーと同じIgSFファミリー由来のファミリーメンバーのシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、非天然シグナルペプチドは、野生型IgSFファミリーメンバーとは異なるIgSFファミリー由来のIgSFファミリーメンバー由来のシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、非IgSFタンパク質ファミリー由来のシグナルペプチドまたはその変異体、例えば、免疫グロブリン（IgG重鎖またはIgGカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン-2（IL-2）またはCD33など）、血清アルブミンタンパク質（例えば、HSAまたはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンまたはトリプシノーゲン）由来のシグナルペプチド、または細胞からタンパク質を効率的に分泌可能な他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドは、表3に記載されるいずれかを含む。
【０３８７】
（表３）例示的なシグナルペプチド
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【０３８８】
分泌可能バリアントCD80免疫調節タンパク質のいくつかの態様では、免疫調節タンパク質は、発現された際にシグナルペプチドを含み、シグナルペプチド（またはその一部）は、分泌時に免疫調節タンパク質から切断される。
【０３８９】
1. 操作された細胞
本明細書において提供されるのは、提供される免疫調節ポリペプチドのいずれかを発現する操作された細胞である。いくつかの態様では、操作された細胞は、免疫調節タンパク質を発現し、かつ、タンパク質の分泌に適した条件下で細胞から免疫調節タンパク質を分泌可能であるか分泌することができる。いくつかの態様では、免疫調節タンパク質は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、T細胞もしくはNK細胞などのリンパ球上、または骨髄細胞上に発現される。いくつかの態様では、操作された細胞は、抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様では、操作された細胞は、操作された哺乳動物T細胞または操作された哺乳動物抗原提示細胞（APC）である。いくつかの態様では、操作されたT細胞またはAPCは、ヒトまたはネズミ科の細胞である。
【０３９０】
いくつかの態様では、操作されたT細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞（あるいは、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL）、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、またはγδT細胞を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、操作されたT細胞は、CD4+またはCD8+である。MHCのシグナルに加えて、操作されたT細胞はまた、共刺激性シグナルを必要とする。いくつかの態様では、操作されたT細胞はまた、場合によって先に考察したような膜結合形態で発現されるバリアントCD80膜貫通免疫調節ポリペプチドによって提供される、阻害性シグナルによって調節されることもできる。
【０３９１】
いくつかの態様では、操作されたAPCは、例えば、マクロファージ、B細胞および樹状細胞などのMHC IIを発現するAPCだけでなく、細胞性と無細胞性（例えば、生分解性の高分子微粒子）の両方のaAPCを含めた人工APC（aAPC）も含む。人工APC（aAPC）は、これらが抗原をT細胞に提示するだけでなくそれらを活性化するという点でAPCと類似の様式で作用することができる、APCの合成バージョンである。抗原提示は、MHC（クラスIまたはクラスII）によって実施される。いくつかの態様では、aAPCなどの操作されたAPCにおいて、MHC上に負荷される抗原は、いくつかの態様では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。MHC上に負荷される抗原は、場合によってCTLA-4、CD28、PD-L1または本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドによって認識される他の分子を発現することができる、T細胞のT細胞受容体（TCR）によって認識される。aAPCを操作するために使用することができる材料は、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、酸化鉄、リポソーム、脂質二重層、セファロースおよびポリスチレンを含む。
【０３９２】
いくつかの態様では、細胞性aAPCは、養子細胞療法において使用される分泌型CD80免疫調節ポリペプチドまたはSIPおよびTCRアゴニストを含有するように操作することができる。いくつかの態様では、細胞性aAPCは、投与（例えば、患者への再導入のための）の前などに、ヒトT細胞のエクスビボ拡大増殖において使用されるSIPおよびTCRアゴニストを含有するように操作することができる。いくつかの局面では、aAPCは、例えば、OKT3および/またはUCHT1などの少なくとも1つの抗CD3抗体クローンの発現を含み得る。いくつかの局面では、aAPCは、不活性化（例えば、照射）されていてもよい。
【０３９３】
いくつかの態様では、分泌可能免疫調節タンパク質などの本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、抗原結合受容体、例えば、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）などの組換え受容体を発現する細胞において共発現されるか操作される。いくつかの態様では、操作されたT細胞などの操作された細胞は、がん、炎症性および自己免疫性障害、またはウイルス感染に関連する所望の抗原を認識する。具体的な態様では、抗原結合受容体は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含有する。いくつかの態様では、操作されたT細胞は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原などの抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、scFv）を含有するCAR（キメラ抗原受容体）T細胞である。いくつかの態様では、分泌型CD80免疫調節タンパク質またはsIPタンパク質は、操作されたT細胞受容体細胞または操作されたキメラ抗原受容体細胞によって発現される。そのような態様では、操作された細胞は、SIPおよびCARまたはTCRを共発現し、細胞からSIPを分泌する。
【０３９４】
キメラ抗原受容体（CAR）は、抗原結合ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通ドメイン、および抗原が結合した後にT細胞に活性化シグナルを誘導または媒介することが可能である細胞内シグナル伝達領域（エンドドメイン）を含む組換え受容体である。一部の例では、CAR発現細胞は、活性化ドメインおよび場合によって共刺激性ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分に連結された特定の腫瘍抗原に対して特異性を有する細胞外単鎖可変断片（scFv）を発現するように操作される。共刺激性ドメインは、例えば、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、誘導性T細胞共刺激因子（ICOS）に由来することができ、活性化ドメインは、例えば、CD3、例えばCD3ζ、ε、δ、γなどに由来することができる。ある特定の態様では、CARは、2つ、3つ、4つまたはより多くの共刺激性ドメインを持つように設計される。CAR scFvは、疾患または病状に関連する細胞上に発現される抗原、例えば、腫瘍抗原、例えばCD19などを標的とするように設計することができ、これは、限定されないがNHL、CLLおよび非T細胞ALLを含むすべての正常なB細胞およびB細胞悪性腫瘍を含めたB細胞系列の細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。例となるCAR+ T細胞療法および構築物は、米国特許公開番号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309および2014/0050708に記載されており、これらの参考文献は参照によりその全体が組み込まれる。
【０３９５】
いくつかの局面では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、例えば単鎖断片（scFv）である。いくつかの態様では、抗原は、腫瘍またはがん細胞上に発現される。例示的な抗原は、CD19である。例示的なCARは、SEQ ID NO：1565に示される抗CD19 scFvを含有するCARなどの抗CD19 CARである。いくつかの態様では、CARはさらに、スペーサー、膜貫通ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインなどのITAMシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域を含有する。いくつかの態様では、CARはさらに、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、スペーサーおよび膜貫通ドメインは、SEQ ID NO：1566、1567もしくは1568に示される例示的な配列またはSEQ ID NO:332、364、1997に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するなどのCD8に由来するヒンジおよび膜貫通ドメインである。いくつかの態様では、エンドドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、CD3-ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO：1569に示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO：1569に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、かつ、T細胞シグナル伝達の活性を保持する。いくつかの態様では、CARのエンドドメインはさらに、T細胞の免疫調節応答をさらに調節するための共刺激性シグナル伝達ドメインまたは領域を含むことができる。いくつかの態様では、共刺激性シグナル伝達ドメインは、CD28、ICOS、41BBまたはOX40の共刺激性領域であるかそれを含むか、または、前記の共刺激性領域に由来する。いくつかの態様では、共刺激性シグナル伝達ドメインは、CD28または4-1BBに由来し、SEQ ID NO：1570〜1573のいずれかに示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO：1570〜1573に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、かつ、T細胞共刺激性シグナル伝達の活性を保持する。
【０３９６】
いくつかの態様では、CARをコードする構築物はさらに、自己切断ペプチド配列によってCARから分離されている、マーカー、例えば、検出可能タンパク質などの第2のタンパク質をコードする。いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、F2A、T2A、E2AまたはP2A自己切断ペプチドである。T2A自己切断ペプチドの例示的な配列は、SEQ ID NO：1574、1575もしくは1576のいずれか1つまたはSEQ ID NO：1574、1575もしくは1576のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列に示される。いくつかの態様では、T2Aは、SEQ ID NO：1576に示されるヌクレオチドの配列またはSEQ ID NO：2008のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列によってコードされる。P2A自己切断ペプチドの例示的な配列は、SEQ ID NO：1577またはSEQ ID NO：1577に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列に示される。場合によって、核酸構築物は、1を超えるP2A自己切断ペプチド（P2A1およびP2A2など）をコードし、ヌクレオチド配列P2A1およびP2A2は各々、SEQ ID NO：1577に示されるP2Aをコードし、ヌクレオチド配列は、配列間の組換えを避けるため異なっていてもよい。
【０３９７】
いくつかの態様では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）または青色蛍光タンパク質（BFP）などの検出可能タンパク質である。蛍光タンパク質マーカーの例示的な配列は、SEQ ID NO：1578〜1582またはSEQ ID NO：1578〜1582に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列に示される。
【０３９８】
いくつかの態様では、CARは、SEQ ID NO：1583〜1590のいずれかに示されるアミノ酸の配列またはSEQ ID NO：1583〜1590のいずれか1つに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。いくつかの態様では、CARは、SEQ ID NO：1591もしくは1592に示されるヌクレオチドの配列またはSEQ ID NO：1591もしくは1592のいずれか1つに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列によってコードされる。
【０３９９】
別の態様では、操作されたT細胞は、組換えTCRまたは操作されたTCRを含むTCRを保有する。いくつかの態様では、TCRは、天然TCRであることができる。当業者は、一般に天然の哺乳動物T細胞受容体が、抗原特異的認識および結合に関与するαおよびβ鎖（またはγおよびδ鎖）を含むことを認識するであろう。いくつかの態様では、TCRは、改変されている操作されたTCRである。いくつかの態様では、操作されたT細胞のTCRは、APCによって提示される腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。いくつかの態様では、TCRは、WO 2015/009606に記載されているなどのHPV E6に特異的なTCRである。いくつかの態様では、TCRα鎖およびTCRβ鎖の配列は、コード核酸がP2AまたはT2Aリボソームスキップ配列などの自己切断ペプチドをコードする配列によって互いに分離されている、同じ発現ベクターの部分として構築することができる。
【０４００】
いくつかの態様では、分泌可能免疫調節ポリペプチドなどの免疫調節ポリペプチドを、操作されたT細胞または操作されたAPCなどの操作された細胞に、組換え宿主細胞に対して利用されているものなどの多種多様な戦略によって組み込むことができる。DNA構築物を初代T細胞に導入するための多種多様な方法は、当技術分野において公知である。いくつかの態様では、ウイルス形質導入またはプラスミドエレクトロポレーションが利用される。典型的な態様では、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、または発現ベクターは、発現された免疫調節タンパク質を分泌のために局在化させるシグナルペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明の分泌可能免疫調節タンパク質をコードする核酸は、宿主哺乳動物細胞における発現を可能にするレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターにサブクローニングされる。発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することができ、宿主細胞培養条件下で免疫調節タンパク質が分泌される。
【０４０１】
例示的な例では、初代T細胞をエクスビボで精製して（CD4細胞またはCD8細胞または両方）、抗CD3/抗CD28被覆ビーズなどの様々なTCR/CD28アゴニストからなる活性化プロトコルで刺激することができる。活性化プロセスの2日後または3日後、免疫調節ポリペプチドを含有する組換え発現ベクターを、当技術分野で標準的なレンチウイルスもしくはレトロウイルス形質導入プロトコルまたはプラスミドエレクトロポレーション戦略を通じて初代T細胞に安定に導入することができる。細胞を、例えば、天然親分子およびバリアントCD80を含むポリペプチドと交差反応する抗エピトープタグまたは抗体を使用したフローサイトメトリーによって、免疫調節ポリペプチド発現についてモニタリングすることができる。免疫調節ポリペプチドを発現するT細胞を、用途に応じて、抗エピトープタグ抗体を用いたソーティングを通じて濃縮することも、高発現または低発現のために濃縮することもできる。
【０４０２】
免疫調節ポリペプチド発現時に、操作されたT細胞を、多種多様な手段によって適切な機能についてアッセイすることができる。操作されたCARまたはTCRの共発現を検証して、操作されたT細胞のこの部分が免疫調節タンパク質の発現による影響をほとんど受けなかったことを示すことができる。検証したら、標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイ、増殖アッセイまたはサイトカインアッセイ（例えば、IFN-γ発現）を使用して、操作されたT細胞の機能を評価することができる。例示的な標準エンドポイントは、腫瘍株の溶解率、操作されたT細胞の増殖率、または培養上清中のIFN-γタンパク質発現率である。対照構築物に対して、統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、操作されたT細胞の増殖の増加、またはIFN-γ発現の増加をもたらす操作された構築物を選択することができる。追加的に、操作されていない、例えば、天然の初代T細胞または内因性T細胞を、同じインビトロアッセイに組み込んで、操作されたT細胞などの操作された細胞上に発現される免疫調節ポリペプチド構築物の、活性を調節する（場合によって、バイスタンダーである天然T細胞におけるエフェクター機能を活性化および生成することを含む）能力を測定することもできる。CD69、CD44またはCD62Lなどの活性化マーカーの増加した発現を内因性T細胞上でモニタリングすることもでき、増加した増殖および/またはサイトカイン産生は、操作されたT細胞によって発現される免疫調節タンパク質の所望の活性を示すこともできる。
【０４０３】
いくつかの態様では、類似のアッセイを使用して、CARまたはTCR単独を含有する操作されたT細胞の機能を、CARまたはTCRおよびSIP構築物を含有するものと比較することができる。典型的には、これらのインビトロアッセイは、様々な比率の操作されたT細胞と同族CARまたはTCR抗原を含有する「腫瘍」細胞株とを一緒に培養下でプレーティングすることによって実施される。標準エンドポイントは、腫瘍株の溶解率、操作されたT細胞の増殖率、または培養上清中のIFN-γ産生率である。同じTCRまたはCAR構築物単独に対して、統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、操作されたT細胞の増殖の増加、またはIFN-γ産生の増加をもたらした操作された免疫調節タンパク質を選択することができる。操作されたヒトT細胞を、マウスのT細胞、NK細胞およびB細胞を欠いているNSG系統のような免疫不全マウスにおいて分析することができる。CARまたはTCRが異種移植片上の標的カウンター構造体に結合しかつSIPの親和性修飾IgSFドメインと共発現される操作されたヒトT細胞を、異種移植片に比べて異なる細胞数および比率でインビボ養子移入することができる。例えば、ルシフェラーゼ/GFPベクターを含有するCD19+白血病腫瘍株の生着を、生物発光を通じてまたはエクスビボでフローサイトメトリーによってモニタリングすることができる。ある共通の態様では、異種移植片がネズミモデルに導入され、続いて数日後に操作されたT細胞が導入される。免疫調節タンパク質を含有する操作されたT細胞を、CARまたはTCR単独を含有する操作されたT細胞と比べて増加した生存、腫瘍クリアランス、または操作されたT細胞の拡大された数についてアッセイすることができる。インビトロアッセイと同様に、内因性の天然（すなわち、操作されていない）ヒトT細胞を共養子移入して、その集団において、より良好な生存または腫瘍クリアランスをもたらすエピトープ拡大の成功を予測することもできる。
【０４０４】
D. 核酸、ベクターおよびポリペプチドまたは細胞を産生させるための方法
本明細書において提供されるのは、本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の様々な提供される態様のいずれかをコードする、「核酸」と総称される単離された核酸または組換え核酸である。いくつかの態様では、後述されるすべてを含む本明細書において提供される核酸は、本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の組換え産生（例えば、発現）において有用である。本明細書において提供される核酸は、RNAの形態またはDNAの形態であることができ、mRNA、cRNA、組換えまたは合成RNAおよびDNA、ならびにcDNAを含むことができる。本明細書において提供される核酸は、典型的にはDNA分子であり、通常二本鎖DNA分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のいずれかを含む、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびハイブリッドDNA/RNA核酸またはそれらの組み合わせも提供される。
【０４０５】
また、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を産生する際に有用である組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞である。
【０４０６】
上に提供された態様のいずれかにおいて、本明細書において提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質をコードする核酸を、組換えDNAおよびクローニング技術を使用して細胞に導入することができる。このために、免疫調節ポリペプチドをコードする組換えDNA分子が調製される。そのようなDNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してDNAから切除することもできる。あるいは、ホスホロアミダイト法などの化学合成技術を使用してDNA分子を合成することもできる。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。一部の場合では、組換え核酸または合成核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通じて生成させてもよい。いくつかの態様では、少なくとも1つの親和性修飾されたIgSFドメインおよびいくつかの態様では多量体化ドメイン（例えば、Fcドメイン）を含有する1つまたは複数のバリアントCD80ポリペプチドをコードするDNAインサートを、提供される説明に従って生成させることができる。当業者に公知のように、このDNAインサートを適切な形質導入/トランスフェクションベクターにクローニングすることができる。また、核酸分子を含有する発現ベクターも提供される。
【０４０７】
いくつかの態様では、発現ベクターは、適切な細胞においてタンパク質の発現に適した条件下でバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を発現させることが可能である。いくつかの局面では、核酸分子または発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結された免疫調節タンパク質をコードするDNA分子を含む。DNA分子がベクターに挿入される前または後のいずれかに、この機能的連結を達成する方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。
【０４０８】
いくつかの態様では、発現を制御または調節するために、プロモーターまたはエンハンサーによってバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の発現が制御される。プロモーターは、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の部分に機能的に連結される。いくつかの態様では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（組織特異的な構成的に活性なプロモーターまたは他の構成的プロモーターなど）である。いくつかの態様では、プロモーターは、誘導物質（T細胞活性化シグナルなど）に応答性であり得る誘導性プロモーターである。
【０４０９】
いくつかの態様では、構成的プロモーターは、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例示的な構成的プロモーターは、サル空胞ウイルス40（SV40）プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ユビキチンC（UbC）プロモーター、およびEF-1α（EF1a）プロモーターを含む。いくつかの態様では、構成的プロモーターは、組織特異的である。例えば、いくつかの態様では、プロモーターは、免疫細胞、リンパ球またはT細胞などの特定の組織において免疫調節タンパク質の構成的発現を可能にする。例示的な組織特異的プロモーターは、例えば、フェトタンパク質、DF3、チロシナーゼ、CEA、界面活性タンパク質およびErbB2プロモーターを含め、米国特許第5,998,205号に記載されている。
【０４１０】
いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、転写の適切な誘導因子の有無を制御することによって核酸の発現が制御可能であるように、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例えば、プロモーターは、コードされたポリペプチドの調節された発現を可能にする、調節されたプロモーターおよび転写因子発現系、例えば、公開されているテトラサイクリン調節系または他の調節可能な系（例えば、公開されている国際PCT出願番号WO 01/30843を参照のこと）であることができる。例示的な調節可能なプロモーター系は、例えばClontech（Palo Alto, CA）から入手可能なTet-On（およびTet-Off）系である。このプロモーター系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンなど）によって制御される導入遺伝子の調節された発現を可能にする。他の調節可能なプロモーター系は公知である（例えば、ホルモン受容体由来のものなどのリガンド結合ドメインおよび転写調節ドメインを含有する遺伝子スイッチを説明している「Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches」という表題の公開されている米国出願番号2002-0168714を参照のこと）。
【０４１１】
いくつかの態様では、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。単なる一例として、いくつかの態様では、操作されたT細胞は、免疫調節タンパク質および免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結されたプロモーターをコードする発現ベクターを含む。操作されたT細胞は、例えば操作されたT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を通じたシグナル伝達によって活性化され、それによって、応答性プロモーターを通じた免疫調節タンパク質の発現および分泌を引き起こすことができる。
【０４１２】
いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、免疫調節タンパク質が活性化T細胞核内因子（NFAT）または活性化B細胞核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（NF-κB）に応答して発現されるように、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例えば、いくつかの態様では、誘導性プロモーターは、NFATまたはNF-κBに対する結合部位を含む。例えば、いくつかの態様では、プロモーターは、NFATもしくはNF-κBプロモーターまたはその機能的バリアントである。したがって、いくつかの態様では、核酸は、免疫調節タンパク質の毒性を低減または排除もしながら、免疫調節タンパク質の発現を制御することを可能にする。特に、本発明の核酸を含む操作された免疫細胞は、細胞（例えば、細胞によって発現されるT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR））が抗原によって特異的に刺激されたとき、および/または、細胞（例えば、細胞のカルシウムシグナル伝達経路）が、例えばホルボールミリスタートアセタート（PMA）/イオノマイシンによって非特異的に刺激されたときにのみ、免疫調節タンパク質を発現および分泌する。したがって、免疫調節タンパク質の発現および場合によって分泌を、それが必要なときおよび場合にのみ（例えば、感染症惹起物質、がんの存在下、または腫瘍部位で）起こるように制御することができ、それによって望ましくない免疫調節タンパク質相互作用を減少または回避することができる。
【０４１３】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質をコードする核酸は、NFATプロモーター、NF κBプロモーターまたはその機能的バリアントをコードする好適なヌクレオチド配列を含む。「NFATプロモーター」は、本明細書において使用される場合、最小プロモーターに連結された1つまたは複数のNFAT応答性エレメントを意味する。「NF κBプロモーター」は、最小プロモーターに連結された1つまたは複数のNF κB応答性エレメントのことを指す。いくつかの態様では、遺伝子の最小プロモーターは、最小ヒトIL-2プロモーターまたはCMVプロモーターである。NFAT応答性エレメントは、例えば、NFAT1、NFAT2、NFAT3、および/またはNFAT4応答性エレメントを含み得る。NFATプロモーター、NF κBプロモーターまたはその機能的バリアントは、任意の数の結合モチーフ、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、または最大で12個の結合モチーフを含み得る。
【０４１４】
DNA分子をその上に有する得られた組換え発現ベクターが、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる。いくつかの態様では、本明細書において提供される核酸はさらに、得られる可溶性免疫調節ポリペプチドが培養培地、宿主細胞または宿主細胞ペリプラズムから回収されるように、免疫調節ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された分泌またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様では、免疫調節ポリペプチドの膜発現が可能となるように、適切な発現制御シグナルが選択される。さらに、市販のキットおよび委託製造会社を利用して、本明細書において提供される操作された細胞または組換え宿主細胞を作製することもできる。
【０４１５】
いくつかの態様では、DNA分子をその上に有する得られた発現ベクターが、適切な細胞を形質転換、例えば形質導入するために使用される。導入は、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる。例示的な方法は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションを介することを含め、受容体をコードする核酸の移入のための方法を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入法によって細胞に移入される。
【０４１６】
哺乳動物T細胞またはAPCを含め多数の公的に入手可能でかつ周知の哺乳動物宿主細胞のいずれかを、ポリペプチドまたは操作された細胞を調製する際に使用することができる。細胞の選択は、当技術分野によって認識される多数の要因に依存する。これらは、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、DNA分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物安全性およびコストを含む。すべての細胞が特定のDNA配列の発現に等しく有効であるとは限らないという理解の下、これらの要因のバランスをとらなければならない。
【０４１７】
いくつかの態様では、宿主細胞は、酵母細胞などの多種多様な真核細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞もしくはHEK293細胞などの哺乳動物細胞であることができる。いくつかの態様では、宿主細胞は、懸濁細胞であり、ポリペプチドは、培養懸濁CHO細胞、例えば、CHO-S細胞などの培養懸濁液で操作または産生される。いくつかの例では、細胞株は、DG44およびDUXB11などのDHFRが欠損している（DHFR-）CHO細胞株である。いくつかの態様では、細胞は、グルタミンシンターゼ（GS）が欠損している、例えば、CHO-S細胞、CHOK1 SV細胞、およびCHOZN((R)）GS-/-細胞である。いくつかの態様では、懸濁CHO細胞などのCHO細胞は、CHO-S-2H2細胞、CHO-S-クローン14細胞、またはExpiCHO-S細胞であり得る。
【０４１８】
いくつかの態様では、宿主細胞は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞であることもできる。形質転換された組換え宿主は、ポリペプチドを発現する条件下で培養され、次いで精製されて、可溶性タンパク質が得られる。組換え宿主細胞を、所望のポリペプチドが発現されるような従来の発酵条件下で培養することができる。そのような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、本明細書において提供されるポリペプチドを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを含めた当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。所望の場合、成熟タンパク質の立体配置を完了する際にタンパク質のリフォールディング工程を使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程において利用することができる。
【０４１９】
いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞、例えば、操作された細胞を調製することと関連して上記したいずれかである。いくつかの態様では、そのような操作された細胞は、初代細胞である。いくつかの態様では、操作された細胞は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、操作された細胞は、対象に対して同種異系である。いくつかの態様では、操作された細胞は、白血球アフェレーシスなどによって対象から得られ、免疫調節ポリペプチド、例えば、膜貫通免疫調節ポリペプチドまたは分泌可能免疫調節ポリペプチドの発現のためにエクスビボで形質転換される。
【０４２０】
いくつかの態様では、組換えベクターは、プラスミドまたはコスミドである。本明細書に記載されるようにバリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するプラスミドまたはコスミドは、当技術分野において周知の標準的な技術を使用して容易に構築される。感染性物質の生成のために、ベクターまたはゲノムをプラスミド形態で構築することができ、これを次いで、パッケージングもしくは産生細胞株または宿主細菌へトランスフェクトすることができる。組換えベクターは、当技術分野において公知の組換え技術のいずれかを使用して生成させることができる。いくつかの態様では、ベクターは、原核生物の複製起点、ならびに/または、原核生物系における伝播および/もしくは選択のための薬剤耐性などの検出可能または選択可能マーカーを発現により付与する遺伝子を含むことができる。
【０４２１】
いくつかの態様では、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的な組換えウイルスベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびαウイルスベクターゲノムを含む。ウイルスベクターは、生ウイルスベクター、弱毒化ウイルスベクター、複製条件付きもしくは複製欠損ウイルスベクター、非病原性（欠陥）ウイルスベクター、複製能力のあるウイルスベクターであることができ、かつ/または、異種の遺伝子産物、例えば、本明細書において提供されるバリアント免疫調節ポリペプチドを発現するように改変される。ウイルスの生成のためのベクターはまた、ウイルスの弱毒化を変更するように改変することもでき、これは、転写または翻訳負荷を増減させる任意の方法を含む。
【０４２２】
使用できる例示的なウイルスベクターは、改変されたワクシニアウイルスベクター（例えば、Guerra et al., J. Virol. 80:985-98 (2006)；Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992)；Gheradi et al., J. Gen. Virol. 86:2925-36 (2005)；Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975)；Hu et al., J. Virol. 75: 10300-308 (2001)；米国特許第5,698,530号、第6,998,252号、第5,443,964号、第7,247,615号および第7,368,116号を参照のこと)；アデノウイルスベクターもしくはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（例えば、Molin et al., J. Virol. 72:8358-61 (1998)；Narumi et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998)；Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004)；米国特許第6,143,290号；第6,596,535号；第6,855,317号；第6,936,257号；第7,125,717号；第7,378,087号；第7,550,296号を参照のこと）；ネズミ白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、エコトロピックレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）および組み合わせに基づくものを含むレトロウイルスベクター（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-39 (1992)；Johann et al., J. Virol. 66: 1635-40 (1992)；Sommerfelt et al., Virology 176:58-59 (1990)；Wilson et al., J. Virol. 63:2374-78 (1989)；Miller et al., J. Virol. 65:2220-24 (1991)；Miller et al., Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990)；Kolberg, NIH Res. 4:43 1992；Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)を参照のこと）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）、HIV-2、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、馬伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）およびマエディ/ビスナウイルスに基づくものを含むレンチウイルスベクター（例えば、Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211 (2001)；Zufferey et al., J. Virol. 72: 9873, 1998；Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150, 1998；Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007；Engelman et al., J. Virol. 69: 2729, 1995；Nightingale et al., Mol. Therapy, 13: 1121, 2006；Brown et al., J. Virol. 73:9011 (1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams et al., J. Virol. 77: 11150, 2003；Powell et al., J. Virol. 70:5288, 1996を参照のこと）もしくはその任意のバリアント、および/または上記のウイルスのいずれかを生成するために使用することができるベクターを含む。いくつかの態様では、組換えベクターは、RNAウイルスの場合など、パッケージング細胞株において、ウイルスゲノムの発現を調節することができるプロモーターまたはエンハンサー配列などの調節配列を含むことができる（例えば、米国特許第5,385,839号および第5,168,062号を参照のこと)。
【０４２３】
いくつかの局面では、核酸または発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結された免疫調節タンパク質をコードする核酸配列を含む。免疫調節タンパク質をコードする核酸配列がベクターに挿入される前または後のいずれかに、この機能的連結に作用する方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。プロモーターを、免疫調節タンパク質をコードする核酸配列の部分に機能的に連結させることができる。いくつかの態様では、プロモーターは、標的細胞における構成的に活性なプロモーター（組織特異的な構成的に活性なプロモーターまたは他の構成的プロモーターなど）である。例えば、組換え発現ベクターはまた、リンパ組織特異的な転写調節エレメント（TRE）、例えば、Bリンパ球、Tリンパ球または樹状細胞に特異的なTREも含み得る。リンパ組織特異的TREは、当技術分野において公知である（例えば、Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043-53 (1992)；Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663-74 (1993)；Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993)を参照のこと）。いくつかの態様では、プロモーターは、誘導物質（T細胞活性化シグナルなど）に応答性であり得る誘導性プロモーターである。いくつかの態様では、対象における標的細胞、例えば、腫瘍細胞、免疫細胞および/またはAPCに送達される核酸を、上記の調節エレメントのいずれかに機能的に連結させることができる。
【０４２４】
いくつかの態様では、ベクターは、細菌ベクター、例えば、細菌プラスミドまたはコスミドである。いくつかの態様では、細菌ベクターは、標的細胞、例えば、腫瘍細胞、免疫細胞および/またはAPCに、プラスミドDNAの哺乳動物細胞への細菌媒介性移送（「バクトフェクション」とも称される）を介して送達される。いくつかの態様では、送達される細菌ベクターはまた、標的細胞における発現のための適切な発現制御配列、例えば、プロモーター配列および/もしくはエンハンサー配列、または上記の任意の調節もしくは制御配列のいずれかを含有する。いくつかの態様では、細菌ベクターは、感染性物質、例えば、細菌におけるコードされたバリアントポリペプチドの発現および/または分泌のための適切な発現制御配列を含有する。
【０４２５】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるポリペプチドは、合成法によって作製することもできる。固相合成は、小さなペプチドを作製する最も費用効果の高い方法であるので、個々のペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術は、保護基、リンカーおよび固相支持体の使用だけでなく、特定の保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用ならびに固相ペプチド合成の他の局面も含む。次いで、ペプチドを、本明細書において提供されるようなポリペプチドへとアセンブルすることができる。
【０４２６】
II. バリアントCD80 IGSFドメイン融合タンパク質の免疫調節活性を評価する方法
いくつかの態様では、本明細書において提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、T細胞活性化を調節する免疫調節活性を示す。いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、T細胞アッセイにおいて、野生型または非改変CD80対照と比べてIFN-γ発現を調節する。場合によって、IFN-γ発現の調節は、対照と比べてIFN-γ発現を増加させることができる。特異的結合およびIFN-γ発現を判定するためのアッセイは、当技術分野において周知であり、培養上清中のインターフェロン-ガンマサイトカインレベルを測定するMLR（混合リンパ球反応）アッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56）、SEB（ブドウ球菌エンテロトキシンB）T細胞刺激アッセイ（Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56）、および抗CD3 T細胞刺激アッセイ（Li and Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104）を含む。
【０４２７】
いくつかの態様では、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、いくつかの態様では、初代T細胞アッセイにおいて、野生型CD80対照と比べてIFN-γ（インターフェロン-γ）発現を変更（例えば、増加）させることができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、活性化刺激、例えば、CD3および/またはCD28共刺激性シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために生じ得る細胞における阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のアンタゴニストである。当業者は、IFN-γ発現の増減を判定するために使用される初代T細胞アッセイの異なるフォーマットが存在することを認識するであろう。
【０４２８】
初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を増加させるバリアントCD80の能力をアッセイする際に、混合リンパ球反応（MLR）アッセイを使用することができる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、CTLA-4阻害性受容体またはPD-L1の活性を遮断し、それによって、アッセイにおけるIFN-γの産生の増加によって観察されるように、アッセイにおいてMLR活性を増加させる。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、アゴニスト活性を示し、かつ/またはCTLA-4阻害性受容体の活性を遮断し、それによって、IFN-γ産生を増加させるなどMLR活性を増加させ得る。
【０４２９】
あるいは、初代T細胞アッセイにおいてIFN-γ発現を調節または増加させるバリアントCD80の能力をアッセイする際に、共固定化アッセイを使用することができる。共固定化アッセイでは、CD80非改変または野生型対照と比べてIFN-γ発現を増減させる能力を判定するために、TCRシグナル（いくつかの態様では、抗CD3抗体によって提供される）が、共固定化されたバリアントCD80と併用される。いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質、例えば、CD80-Fcは、共固定化アッセイにおいてIFN-γ産生を増加させる。
【０４３０】
いくつかの態様では、IFN-γ発現を増加させるバリアントCD80の能力をアッセイする際に、T細胞レポーターアッセイを使用することができる。いくつかの態様では、T細胞は、Jurkat T細胞株であるかJurkat T細胞株に由来する。レポーターアッセイでは、バリアントIgSFドメインポリペプチドの同族結合パートナーである阻害性受容体を過剰発現させるために、レポーター細胞株（例えば、Jurkatレポーター細胞）も生成される。例えば、バリアントCD80の場合、CTLA-4を過剰発現させるためにレポーター細胞株（例えば、Jurkatレポーター細胞）が生成される。他の例では、PD-L1を過剰発現させるためにレポーター細胞株（例えば、Jurkatレポーター細胞）が生成される。いくつかの態様では、レポーターT細胞はまた、レポーターに機能的に連結されたT細胞活性化に応答性の誘導性プロモーターを含有するレポーター構築物を含有する。いくつかの態様では、レポーターは、蛍光レポーターまたは発光レポーターである。いくつかの態様では、レポーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの態様では、プロモーターは、CD3シグナル伝達に応答性である。いくつかの態様では、プロモーターは、NFATプロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、共刺激性シグナル伝達、例えば、CD28共刺激性シグナル伝達に応答性である。いくつかの態様では、プロモーターは、IL-2プロモーターである。
【０４３１】
レポーターアッセイの局面では、レポーター細胞株は、阻害性受容体、例えば、CD80の野生型リガンドを発現する抗原提示細胞（APC）との共インキュベーションなどによって刺激される。いくつかの態様では、APCは、人工APCである。人工APCは、当業者に周知である。いくつかの態様では、人工APCは、K562細胞、CHO細胞または293細胞などの1つまたは複数の哺乳動物細胞株に由来する。いくつかの態様では、人工APCは、抗CD3抗体および場合によって共刺激性リガンドを発現するように操作される。いくつかの態様では、人工APCは、バリアントIgSFドメインポリペプチドの同族結合パートナーを過剰発現させるために生成される。例えば、バリアントCD80の場合、阻害性リガンドPD-L1を過剰発現させるためにレポーター細胞株（例えば、Jurkatレポーター細胞）が生成される。
【０４３２】
いくつかの態様では、Jurkatレポーター細胞は、バリアントIgSFドメイン分子または免疫調節タンパク質、例えば、バリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の存在下で、阻害性リガンドを過剰発現する人工APCと共インキュベートされる。いくつかの態様では、レポーター発現は、細胞の発光または蛍光を判定するなどしてモニタリングされる。いくつかの態様では、その阻害性受容体とリガンドとの間の正常な相互作用は、例えば、対照T細胞と阻害性受容体およびリガンドの相互作用が存在しないAPC（例えば、CD80を過剰発現しないAPC）との共インキュベーションによるレポーター発現などの対照と比べて、レポーターシグナルの抑制または減少をもたらす。本明細書において提供されるある特定の態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、例えばバリアントCD80-Fcとして可溶性形態で提供される場合、PD-L1依存性CD28共刺激などのCD28アゴニズムを媒介し、それによって、バリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の非存在に比べてレポーターシグナルの増加がもたらされる。場合によって、本明細書において提供されるようなバリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質のある特定のフォーマットは、阻害性受容体の遮断活性を提供し、それによって、バリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の非存在に比べてレポーター発現を増加させ得る。
【０４３３】
適切な対照の使用は当業者に公知であるが、前述の態様では、対照は、典型的には、バリアントCD80が由来するか発生する同じ哺乳動物種由来の天然CD80アイソフォームの野生型などの非改変CD80の使用を伴う。いくつかの態様では、野生型または天然CD80は、バリアントと同じ形態または対応する形態のものである。例えば、バリアントCD80がFcタンパク質に融合されたバリアントECDを含有する可溶性形態である場合、対照は、Fcタンパク質に融合されたCD80の野生型または天然ECDを含有する可溶性形態である。CD28、CTLA-4およびPD-L1のいずれか1つまたは複数に対する結合親和性が増加するか減少するかにかかわらず、バリアントCD80は、いくつかの態様では、T細胞アッセイにおいて、野生型CD80対照と比べてIFN-γ発現を増加させるであろう。
【０４３４】
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、野生型または非改変CD80対照と比べて、IFN-γ発現（すなわち、タンパク質発現）を少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはより多く増加させる。いくつかの態様では、野生型CD80対照は、野生型ネズミ科CD80配列のもの由来の配列において変更されたバリアントCD80に典型的に使用されるようなネズミ科CD80である。いくつかの態様では、野生型CD80対照は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：76またはSEQ ID NO：150またはSEQ ID NO：1245のアミノ酸の配列を含むCD80配列などの対応する野生型ヒトCD80配列のもの由来の配列において変更されたバリアントCD80に典型的に使用されるようなヒトCD80である。
【０４３５】
III. 薬学的製剤、投与、および製造物品またはキット
本明細書において提供されるのは、本明細書に記載されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質のいずれかを含有する組成物である。薬学的組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。例えば、薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を、改変、維持、または保存するための1つまたは複数の賦形剤を含有することができる。いくつかの局面では、当業者は、細胞を含有する薬学的組成物がタンパク質を含有する薬学的組成物と異なり得ることを理解する。
【０４３６】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、散剤、カプセル剤または錠剤などの固体である。例えば、薬学的組成物の成分は、凍結乾燥することができる。いくつかの態様では、固体の薬学的組成物は、投与の前に液体中で再構成されるか溶解される。
【０４３７】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、液体、例えば、水溶液（生理食塩水またはリンゲル液など）に溶解されたバリアントCD80ポリペプチドである。いくつかの態様では、薬学的組成物のpHは、約4.0〜約8.5の間（約4.0〜約5.0の間、約4.5〜約5.5の間、約5.0〜約6.0の間、約5.5〜約6.5の間、約6.0〜約7.0の間、約6.5〜約7.5の間、約7.0〜約8.0の間、または約7.5〜約8.5の間など）である。
【０４３８】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、充填剤、結合剤、コーティング剤、保存剤、滑沢剤、着香料、甘味剤、着色剤、溶剤、緩衝化剤、キレート剤、または安定剤を含む。薬学的に許容される充填剤の例は、セルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、マルトール、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプンを含む。薬学的に許容される結合剤の例は、ポリビニルピロリドン、デンプン、ラクトース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、スクロース、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、またはセルロースを含む。薬学的に許容されるコーティング剤の例は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン、またはゼラチンを含む。薬学的に許容される崩壊剤の例は、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、またはデンプングリコール酸ナトリウムを含む。薬学的に許容される滑沢剤の例は、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸を含む。薬学的に許容される保存剤の例は、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、またはソルビン酸を含む。薬学的に許容される甘味剤の例は、スクロース、サッカリン、アスパルテーム、またはソルビトールを含む。薬学的に許容される緩衝化剤の例は、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、または酒石酸塩を含む。
【０４３９】
いくつかの態様では、薬学的組成物はさらに、注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの、産物の制御放出または持続放出のための作用物質を含む。
【０４４０】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、滅菌されている。滅菌は、滅菌濾過膜に通す濾過、または照射によって達成してもよい。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に実行してもその後に実行してもよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で貯蔵しても溶液で貯蔵してもよい。加えて、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０４４１】
いくつかの態様では、組成物は、中性の緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖質；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでもよい。
【０４４２】
薬学的に許容される担体は、1つの組織、臓器または身体の一部から別の組織、臓器または身体の一部への関心対象の細胞の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルであり得る。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤もしくは封入材料、またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。担体の各成分は、製剤の他の有効成分と適合可能でなければならないという点で「薬学的に許容可能」でなければならない。それはまた、その治療効果を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性または任意の他の合併症のリスクを有するべきではないという意味で、直面し得るあらゆる組織、臓器または身体の一部との接触に好適でなければならない。
【０４４３】
IV. 治療的適用
本明細書において提供されるのは、本明細書に記載されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含有する提供される分子およびそれを含有する薬学的組成物を使用するための方法およびその使用である。そのような方法および使用は、ヒト患者などの対象における疾患または状態を処置することに関連することを含む、免疫応答を調節するための方法を含む。中でも、本明細書における使用方法およびその使用におけるそのような分子に含まれるのは、親和性改変されたIgSFドメイン（例えば、IgV）を含有するCD80バリアントポリペプチドの細胞外ドメインまたはその部分が多量体化ドメイン（例えば、Fcドメインまたは領域）に直接的または間接的に連結されたフォーマットである。
【０４４４】
特定の態様では、IgVおよびIgCドメインを含有する完全細胞外ドメインは、多量体化ドメイン、例えば、Fcドメインまたは領域に連結される。いくつかの態様では、そのような治療用物質は、バリアントCD80 IgV-Fv融合タンパク質などのバリアントCD80-Fc融合タンパク質である。
【０４４５】
記載されるような他の特定の態様では、Fcドメインまたは領域は、エフェクター活性を有する。いくつかの態様では、そのような治療用物質は、バリアントCD80 ECD-Fc融合タンパク質などのバリアントCD80-Fc融合タンパク質である。
【０４４６】
いくつかの局面では、そのような方法および使用は、例えば、分子またはそれを含有する組成物を、処置を必要とする疾患または状態を有する対象に投与することを伴う、治療的方法および使用を含む。本明細書に記載される薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）を、対象における腫瘍もしくはがん、ウイルス感染または細菌感染の処置などのために、多種多様な治療的適用において使用することができる。いくつかの態様では、疾患または状態は、がんである。いくつかの態様では、分子、細胞および/または組成物は、疾患または障害の処置を達成する有効量で投与される。使用は、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の、単独または記載されるような併用療法としての、そのような方法および処置における、ならびにそのような治療的方法を行うための医薬の調製における使用を含む。いくつかの態様では、本方法は、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質またはそれを含む組成物を、疾患または状態を有するかその疑いのある対象に投与することによって行われる。いくつかの態様では、本方法は、それによって、対象における疾患または状態または障害を処置する。
【０４４７】
いくつかの局面では、分子または組成物、薬学的組成物は、疾患を処置するために免疫応答を調節、例えば増加させることができる。いくつかの態様では、記載されるようなバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を用いて行われる方法は、対象における免疫応答を増加させる。中でも、提供される方法は、刺激性シグナルのシグナル伝達ならびに/またはPD-L1および/もしくはCTLA-4に対して増加した親和性をアゴナイズすることができ、活性化刺激、例えば、CD3および/またはCD28共刺激性シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために生じ得る細胞における阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のシグナル伝達をアンタゴナイズすることができる、CD28に対する親和性が増加したバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の送達を伴う方法である。場合によって、この結果は、免疫応答を増加させることであり得る。いくつかの態様では、Fc結合に依存するかそれによって増強され得るCD28のアゴニズムは、腫瘍またはがんの処置などのために、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムおよびPD-L1のアンタゴニズムは、腫瘍またはがんの処置などのために、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムおよびCTLA-4のアンタゴニズムは、腫瘍またはがんの処置などのために、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムならびにPD-L1およびCTLA-4のアンタゴニズムは、腫瘍またはがんの処置などのために、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。
【０４４８】
中でも、提供される方法は、いくつかの態様では、CTLA-4および/またはPD-L1に対して増加した親和性を有し、活性化刺激、例えば、CD3および/またはCD28共刺激性シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために生じ得る細胞における阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のシグナル伝達をアンタゴナイズすることができる、バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の送達を伴う方法である。ある特定の場合に、バリアントCD80 IgSF融合タンパク質は、腫瘍細胞またはAPC上のPD-L1に結合し、それによって、PD-L1とPD-1阻害性受容体の相互作用を遮断し、そうしなければPD-L1/PD-1相互作用から生じたであろう負の調節性シグナル伝達を阻止することが可能である。場合によって、この結果は、免疫応答を増加させることであり得る。他の態様では、提供されるバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、CD28に結合する活性を、場合によって増加した親和性と共に示す。いくつかの態様では、CD28への結合は、刺激性シグナルのシグナル伝達をアゴナイズすることができ、特にPD-L1へのCD80の同時結合に依存するかそれによって増強される。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムは、PD-L1依存性CD28共刺激によるものである。そのようなPD-L1依存性共刺激は、エフェクター機能を有するFcを必要とせず、エフェクターレスまたは不活性Fc分子を含有するFc融合タンパク質によって媒介されることができる。場合によって、そのようなバリアントCD80ポリペプチドはまた、局在化されたT細胞上のCD28受容体に結合およびそれを共刺激もしながらPD-L1/PD-1相互作用を遮断することによって、提供される治療的方法に関連した免疫応答の促進を促すこともできる。いくつかの態様では、CD28のアゴニズムおよび/またはCTLA-4もしくはPD-L1/PD-1のアンタゴニズムは、腫瘍またはがんの処置などのために、オンコロジーにおいて免疫性を促進するのに有用であり得る。
【０４４９】
いくつかの態様では、薬学的組成物を、哺乳動物のがん細胞（ヒトのがん細胞など）の成長を阻害するために使用することができる。がんを処置する方法は、本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかの有効量を、がんを有する対象に投与することを含むことができる。薬学的組成物の有効量を、がんの進行を阻害、停止または回復させるために投与することができる。ヒトのがん細胞をインビボまたはエクスビボで処置することができる。ヒト患者のエクスビボ処置では、がん細胞を含有する組織または体液が体外で処置され、その後、組織または体液が患者に再導入される。いくつかの態様では、がんは、ヒト患者において、治療用組成物の患者への投与によってインビボで処置される。したがって、本発明は、対照による処置と比べて、腫瘍の進行を阻害、停止または回復させるか、そうでなければ無増悪生存期間（すなわち、患者が増悪しないがんを患いながら生きている処置中および処置後の期間）または全生存期間（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、がんと診断後またはこれを処置後、一定期間生存する試験群または治療群の人々の割合）の統計的に有意な増加をもたらす、エクスビボおよびインビボ法を提供する。
【０４５０】
本明細書に記載される薬学的組成物および処置法によって処置できるがんは、黒色腫、膀胱がん、血液学的悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、肝臓がん、脳がん、腎臓がん、乳がん、膵臓がん（腺がん）、結腸直腸がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、脾臓がん、胸腺もしくは血液細胞のがん（すなわち、白血病）、前立腺がん、精巣がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん腫（gastric carcinoma）、筋骨格がん、頭頚部がん、消化管がん、生殖細胞がん、または内分泌および神経内分泌がんを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、がんは、ユーイング肉腫である。いくつかの態様では、がんは、黒色腫、肺がん、膀胱がん、および血液学的悪性腫瘍から選択される。いくつかの態様では、がんは、リンパ腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、子宮頸がん、神経芽細胞腫、または多発性骨髄腫である。いくつかの態様では、がんは、黒色腫、非小細胞肺がん（NSCLC）、腎細胞がん腫（RCC）、胃がん（gastric cancer）、膀胱がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、ホジキンリンパ腫、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん（HNSCC）、中皮腫、およびトリプルネガティブ乳がん（TNBC）から選択される。いくつかの態様では、がんは、黒色腫、胃がん、頭頸部扁平上皮がん（HNSCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、およびトリプルネガティブ乳がん（TNBC）から選択される。
【０４５１】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質などのバリアントCD80ポリペプチドを含む薬学的組成物を含む）は、単剤療法として（すなわち、単一の薬剤として）または併用療法として（すなわち、化学療法剤、がんワクチンまたは免疫チェックポイント阻害剤などの1つまたは複数の追加の抗がん剤と組み合わせて）投与される。
【０４５２】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質などのバリアントCD80ポリペプチドを含む薬学的組成物を含む）は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、CD25、PD-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28およびVISTAの中から選択される分子などの、PD-L1以外のチェックポイント分子に特異的に結合する作用物質を含むことができる。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体もしくは抗原結合断片、低分子またはポリペプチドである。いくつかの態様では、薬学的組成物は、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、抗CTLA-4抗体などのCTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。
【０４５３】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質などのバリアントCD80ポリペプチドを含む薬学的組成物を含む）は、放射線化学療法との併用療法として投与される。
【０４５４】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質などのバリアントCD80ポリペプチドを含む薬学的組成物を含む）は、1つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて投与される。本明細書において提供される方法と組み合わせてもよい例示的な化学療法剤は、カペシタビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、エピルビシン、エリブリン、5-FU、ゲムシタビン、イリノテカン、イクサベピロン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、ABRAXANE（登録商標)（タンパク質結合パクリタキセル）、ペメトレキセド、ビノレルビン、およびビンクリスチンを含むが、それらに限定されない。
【０４５５】
いくつかの態様では、提供される併用療法を含む提供される方法は、対象における免疫応答を増強させる。いくつかの態様では、提供される併用療法を含む提供される方法は、対象におけるT細胞の活性化をもたらす。いくつかの態様では、提供される併用療法を含む提供される方法は、がんを患う対象における腫瘍サイズを減少させる。いくつかの態様では、提供される併用療法を含む提供される方法は、腫瘍についてサイズの減少または腫瘍の根絶をもたらすか達成することができる。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。
【０４５６】
併用療法を含む提供される治療的方法の有効性は、抗腫瘍治療薬を評価するための客観的応答基準を提供するガイドラインに従って評価することができる。そのようなガイドラインは、当業者に公知である。例えば、公表されているガイドラインは、世界保健機関（WHO）によって公表されているもの（World Health Organization, “WHO Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment,” (1979) WHO Offset Publication No. 48, Geneva pp. 1-45およびMiller et al., (1981) Cancer. 47:207-214を参照のこと）、および固形腫瘍の応答評価基準（RECIST)として公表されているもの（Eisenhauer et al, (2009) Eur J Cancer. 45(2):228-247）を含む。これらのガイドラインは、がん患者の腫瘍が、処置中に、改善（「応答」）したか、現状維持（「安定」）であったかまたは増悪（「進行」）したか規定するために提供される。腫瘍は、任意の再現性のある方法によって測定することができる。例えば、CT（コンピュータ断層撮影）またはMRI（核磁気共鳴画像法）をスライス厚が10mm以下の切断で、または5mmの連続再構成アルゴリズムを使用したスパイラルCTで使用して、腫瘍サイズを測定することができる。いくつかの例では、腫瘍は、胸部X線または超音波検査によって測定することができる。また、内視鏡検査または腹腔鏡検査を使用して腫瘍を測定することも可能である。
【０４５７】
本発明の治療用組成物の投与が、防御免疫応答を媒介するか媒介可能である免疫細胞を誘導、生成もしくは有効にする；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変化させる；またはこれらの効果の組み合わせによって、免疫学的活性を十分に調節するかどうかを判定するための多種多様な手段が公知である。免疫学的活性の調節の測定の例は、免疫細胞集団の有無の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学検査、組織学検査、電子顕微鏡、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する)；シグナルに応答して増殖または分裂する能力またはそれに対する抵抗性を含む免疫細胞の機能的能力の測定（抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノファ、PMA（ホルボール12-ミリスタート13-アセタート）、ペプチドまたはタンパク質抗原が負荷された抗原提示細胞で刺激した後の3H-チミジン取り込みに基づく、T細胞増殖アッセイおよびペプスキャン分析；B細胞増殖アッセイを使用するなど)；他の細胞を殺傷まは溶解する能力の測定（細胞傷害性T細胞アッセイなど)；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および他の細胞産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による)；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学的マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化、ポリペプチド切断およびタンパク質複合体の形成または解離のウェスタンブロット分析および免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用したDNA転写プロファイリング)；アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダリングを測定するためのゲル電気泳動、組織学検査；蛍光原カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析)；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、二次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー)；ならびに、例えば再発率または疾患重症度を測定することによる、臨床症状または転帰の測定（当業者に公知の臨床スコアを使用する）を含むが、それらに限定されない。
【０４５８】
A. 投薬および投与
いくつかの態様では、本明細書に記載される薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）が対象に投与される。一般に、薬学的組成物の投与量および投与経路は、対象のサイズおよび状態に応じて、標準的な薬務に従って決定される。例えば、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイまたはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタもしくはサルなどの動物モデルのいずれかで推定することができる。適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。正確な投与量は、対象が必要とする処置に関係する要因に照らして決定することができる。投与量および投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するように、または所望の効果を維持するように調整することができる。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の総体的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、薬物併用、反応感受性、ならびに治療への応答を含む。
【０４５９】
いくつかの態様では、対照動物および疾患動物モデル（例えば、がんモデル）において観察される薬物動態（PK）および薬力学（PD）プロファイルのモデリングおよびシミュレーションを使用して、患者への投薬を予測または決定することができる。例えば、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）からのPKデータを使用して、ヒトPKを推定することができる。同様に、マウスPKおよびPDデータを使用して、ヒトへの投薬を予測することができる。観察された動物データを使用して、ヒト用量応答をシミュレートするために使用できる計算モデルについて情報を受け取ることができる。いくつかの態様では、そのようなPKおよびPD動物データから、シグナル分布モデル（SDM；Lobo ED et al., AAPS PharmSci. 2002；4(4): E42）または細胞分布モデル（CDM；Yang J et al., AAPS J. 2010；12(1):1-10）などの形質導入モデルについて情報を受け取ることができ（例えば、実施例26を参照のこと）、これを使用してヒトへの投薬および応答を予測することができる。いくつかの態様では、SDMなどの形質導入モデルを使用して、ヒトへの投薬および投与を予測することができる。いくつかの態様では、SDMなどの形質導入モデルを使用して、本明細書に記載されるバリアントCD80融合タンパク質による処置を含む療法などのがん免疫療法を開発することができる。いくつかの態様では、モデルは、SDMである。いくつかの態様では、モデルは、CDMである。いくつかの態様では、SDMなどの形質導入モデルを使用して、腫瘍が成長も退行もしない最小薬物濃度を指す腫瘍静的濃度（TSC）を決定することができる。いくつかの態様では、TSCを、例えば単独でまたはPKデータと組み合わせて使用して、ヒトへの投薬を決定（例えば、予測）することができる。例えば、腫瘍成長阻害を誘導するために、ヒトへの投薬をより高くしても、予測TSCを超える薬物濃度をもたらすレジメンで送達してもよい。
【０４６０】
長時間作用型薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、3〜4日毎に、1週間毎、2週間毎、3週間毎、月1回などで投与してもよい。投薬頻度は、使用される製剤中の分子の薬物動態パラメータに依存するであろう。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投与量に達するまで投与される。それゆえ、組成物は、単回用量としてまたは複数回用量（同じまたは異なる濃度/投与量で）として経時的に、または持続注入として投与してもよい。適切な投与量のさらなる改良が日常的に行われる。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認してもよい。T細胞活性化もしくは増殖、サイトカイン合成もしくは産生（例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2の産生）、様々な活性化マーカー（例えば、CD25、IL-2受容体）の誘導、炎症、関節の腫脹もしくは圧痛、C-反応性タンパク質の血清レベル、抗コラーゲン抗体産生、および/またはT細胞依存性抗体応答を含め、治療効果についての多数のバイオマーカーまたは生理学的マーカーをモニタリングすることができる。
【０４６１】
典型的には、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲および状態における個々の差を考慮して、医師が決定することができる。いくつかの態様では、投与量をmg/kg（対象）に基づいて言及する際に、平均のヒト対象は、体重約70kg〜75kg、例えば70kgおよび体表面積（BSA）1.73m2を有するとみなされる。
【０４６２】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の投与量（治療有効量を達成するためなどの）は、単回用量または反復用量（複数の用量の投与を介するなどの）である。いくつかの態様では、用量は、対象に1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回以上与えられる。いくつかの態様では、約1回以上の用量（約2回以上の用量、約3回以上の用量、約4回以上の用量、約5回以上の用量、約6回以上の用量または約7回以上の用量など）が1週間に与えられる。いくつかの態様では、複数回用量が、数日、数週間、数ヶ月間または数年間にわたって与えられる。いくつかの態様では、一連の処置は、約1回以上の用量（約2回以上の用量、約3回以上の用量、約4回以上の用量、約5回以上の用量、約7回以上の用量、約10回以上の用量、約15回以上の用量、約25回以上の用量、約40回以上の用量、約50回以上の用量または約100回以上の用量など）である。
【０４６３】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の投与される用量は、対象の体重1kg当たりタンパク質約1μg以上（対象の体重1kg当たりタンパク質約2μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約5μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約10μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約25μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク約50μg質以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約100μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約250μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約500μg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約1mg以上、対象の体重1kg当たりタンパク質約2mg以上、または対象の体重1kg当たりタンパク質約5mg以上など）である。
【０４６４】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）は、経口、経皮（transdermally）、吸入による、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐剤による、皮下、皮内、経皮（transcutaneously）、噴霧による、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、髄腔内、腫瘍内または全身を含む、任意の経路を通じて対象に投与される。
【０４６５】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）は、非経口で投与される。本明細書において提供される例は、特に好適な投与経路が静脈内、皮下または腫瘍内投与を含むことを実証する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、ボーラス注射などの注射による投与に適した形態である。いくつかの態様では、薬学的組成物は、例えば静脈内注射による点滴に適した形態である。いくつかの態様では、注入期間は、30分間、40分間、50分間、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間、5時間もしくは6時間であるか、少なくとも30分間、40分間、50分間、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間、5時間もしくは6時間であるか、または約30分間、40分間、50分間、1時間、1.5時間、2時間、3時間、4時間、5時間もしくは6時間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜6時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜5時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜4時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜3時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜2時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、約30分間〜1時間の間である。いくつかの態様では、注入期間は、30分間であるか約30分間である。
【０４６６】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）は、がんを有することが公知であるかその疑いのある対象におけるがんを処置するために治療有効量で投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、約0.001mg/kg〜約100mg/kg（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、治療有効量は、約0.003mg/kg〜約80mg/kg（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、治療有効量は、約0.5mg/kg〜約60mg/kg（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、治療有効量は、約1mg/kg〜約60mg/kg（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、治療有効量は、約1mg/kg〜約40mg/kg（両端の値を含む）である。いくつかの態様では、治療有効量は、約1mg/kg〜約20mg/kg（両端の値を含む）である。
【０４６７】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）は、がんを有することが公知であるかその疑いのある対象におけるがんを処置するために治療有効量で投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、1mg/kg〜10mg/kgもしくは約1mg/kg〜10mg/kg（両端の値を含む）、例えば、1mg/kg〜8mg/kgもしくは約1mg/kg〜8mg/kg、1mg/kg〜6mg/kgもしくは約1mg/kg〜6mg/kg、1mg/kg〜4mg/kgもしくは約1mg/kg〜4mg/kg、1mg/kg〜2mg/kgもしくは約1mg/kg〜2mg/kg、2mg/kg〜10mg/kgもしくは約2mg/kg〜10mg/kg、2mg/kg〜8mg/kgもしくは約2mg/kg〜8mg/kg、2mg/kg〜6mg/kgもしくは約2mg/kg〜6mg/kg、2mg/kg〜4mg/kgもしくは約2mg/kg〜4mg/kg、4mg/kg〜10mg/kgもしくは約4mg/kg〜10mg/kg、4mg/kg〜8mg/kgもしくは約4mg/kg〜8mg/kg、4mg/kg〜6mg/kgもしくは約4mg/kg〜6mg/kg、6mg/kg〜10mg/kgもしくは約6mg/kg〜10mg/kg、6mg/kg〜8mg/kgもしくは約6mg/kg〜8mg/kg、または8mg/kg〜10mg/kgもしくは約8mg/kg〜10mg/kg（それぞれ両端の値を含む）の量である。
【０４６８】
いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも16％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも20％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも30％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも40％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも50％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも60％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも70％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも80％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも90％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも95％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。いくつかの態様では、治療有効量は、CD28受容体の少なくとも99％を飽和するために必要とされる量、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質の量である。
【０４６９】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）は、腫瘍内送達による投与に適した形態である。いくつかの局面では、腫瘍内送達のための投与量は、注射または他の非経口経路によって投与される量よりも少ない。
【０４７０】
いくつかの態様では、腫瘍内投与のための薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の治療有効量は、0.1mg/kg〜1mg/kgもしくは約0.1mg/kg〜1mg/kg（両端の値を含む）、例えば、0.1mg/kg〜0.8mg/kgもしくは約0.1mg/kg〜0.8mg/kg、0.1mg/kg〜0.6mg/kgもしくは約0.1mg/kg〜0.6mg/kg、0.1mg/kg〜0.4mg/kgもしくは約0.1mg/kg〜0.4mg/kg、0.1mg/kg〜0.2mg/kgもしくは約0.1mg/kg〜0.2mg/kg、0.2mg/kg〜1mg/kgもしくは約0.2mg/kg〜1mg/kg、0.2mg/kg〜0.8mg/kgもしくは約0.2mg/kg〜0.8mg/kg、0.2mg/kg〜0.6mg/kgもしくは約0.2mg/kg〜0.6mg/kg、0.2mg/kg〜0.4mg/kgもしくは約0.2mg/kg〜0.4mg/kg、0.4mg/kg〜1mg/kgもしくは約0.4mg/kg〜1mg/kg、0.4mg/kg〜0.8mg/kgもしくは約0.4mg/kg〜0.8mg/kg、0.4mg/kg〜0.6mg/kgもしくは約0.4mg/kg〜0.6mg/kg、0.6mg/kg〜1mg/kgもしくは約0.6mg/kg〜1mg/kg、0.6mg/kg〜0.8mg/kgもしくは約0.6mg/kg〜0.8mg/kg、または0.8mg/kg〜1mg/kgもしくは約0.8mg/kg〜1mg/kg（それぞれ両端の値を含む）の量である。
【０４７１】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の治療有効量は、単回用量として投与される。
【０４７２】
いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の治療有効量は、2回以上の用量、例えば、2回の用量、3回の用量、4回の用量、5回の用量または6回の用量などの複数回用量として投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）の治療有効量は、6回以下の複数回用量で投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物の治療有効量は、2回の用量として投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物の治療有効量は、3回の用量として投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物の治療有効量は、4回の用量として投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物の治療有効量は、5回の用量として投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物の治療有効量は、6回の用量として投与される。いくつかの態様では、複数回用量は、少なくとも1週間または少なくとも約1週間空けて投与される。いくつかの態様では、用量は、1週間に1回（QWまたはQ1W）、2週間毎に1回（Q2W）、3週間毎に1回（Q3W）または4週間毎に1回（Q4W）投与される。いくつかの態様では、各投与用量間の間隔は、1週間であるか約1週間である。いくつかの態様では、各投与用量間の間隔は、2週間であるか約2週間である。いくつかの態様では、各投与用量間の間隔は、3週間であるか約3週間である。いくつかの態様では、各投与用量間の間隔は、4週間であるか約4週間である。
【０４７３】
いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約0.001mg/kg〜約100mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約0.003mg/kg〜約80mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約0.5mg/kg〜約60mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約60mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約40mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約20mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約10mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約8mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約6mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg〜約3mg/kg（両端の値を含む）の量である。いくつかの態様では、用量、例えば、単回用量または複数回用量（例えば、6以下の複数回用量）の個々の用量の各々は、約1mg/kg、3mg/kgまたは10mg/kgの量である。
【０４７４】
いくつかの態様では、用量がQIWなど1週間に1回投与されるとき、1用量当たり投与される量は、約1mg/kg〜約3mg/kgである。いくつかの態様では、用量がQIWなど1週間に1回投与されるとき、1用量当たり投与される量は、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kgもしくは3mg/kgまたは前述のいずれかの値間の任意の値であるか、または約1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kgもしくは3mg/kgまたは前述のいずれかの値間の任意の値である。
【０４７５】
いくつかの態様では、用量がQ3Wなど3週間毎に1回投与されるとき、1用量当たり投与される量は、約3mg/kg〜約10mg/kgである。いくつかの態様では、用量がQ3Wなど3週間毎に1回投与されるとき、1用量当たり投与される量は、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kgもしくは10mg/kgまたはそれらの間の任意の値であるか、または約3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kgもしくは10mg/kgまたはそれらの間の任意の値である。
【０４７６】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような用量レジメンは、治療有効量を達成するように投与される。
【０４７７】
いくつかの態様では、複数回用量（例えば、6以下の1回量）の投与などについての投与の期間は、1週間、2週間、3週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間または6ヶ月間である。いくつかの態様では、複数回用量（例えば、6以下の1回量）の投与などについての投与の期間は、2ヶ月以内、例えば、6週間以内である。
【０４７８】
いくつかの態様では、2回の用量、3回の用量、4回の用量、5回の用量または6回の用量として投与されるなどの治療有効量は、1週間〜6週間の期間内など、6週間以内の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、6週間の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、5週間の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、4週間の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、3週間の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、2週間の期間内に投与される。いくつかの態様では、治療有効量は、1週間の期間内に投与される。
【０４７９】
当業者が所望の場合に投薬（例えば、複数回用量）を任意の時間まで継続できることが想定される。例えば、投薬は、腫瘍サイズの減少、疾患の兆候および/または症状の減少または改善などの望ましい疾患応答が達成されるまで継続してもよい。
【０４８０】
B. 併用療法
いくつかの態様では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する融合タンパク質またはその薬学的組成物を、1つまたは複数の追加の作用物質と共に投与することもできる。特定の態様では、1つまたは複数の追加の作用物質は、バリアントCD80ポリペプチドのその同族結合パートナー、例えば、CD28、CTLA-4およびPD-L1の1つまたは複数への結合に競合または遮断しない作用物質である。例えば、特定の態様では、本明細書において提供される方法において使用するための融合タンパク質のバリアントCD80ポリペプチドは、PD-L1に、例えば、野生型または非改変CD80ポリペプチドと比べて増加した親和性で結合し、追加の作用物質は、PD-L1に結合せず、かつ/または、PD-L1への結合に競合しないか、バリアントCD80ポリペプチドと同じまたは重複するPD-L1のエピトープを共有しない。
【０４８１】
いくつかの態様では、併用療法は、本明細書に記載されるいずれかなどの抗がん剤の治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、治療有効用量は、0.01mgまたは約0.01mgから1000mg、例えば、少なくとも0.01mg、0.1mg、1mg、10mg、1000mg、2000mg、3000mgまたはそれ以上の用量であることができる。いくつかの態様では、抗がん剤の治療有効用量は、0.01mg/kgまたは約0.01mg/kgから約50mg/kg、例えば、約0.1mg/kg〜約20mg/kg、約0.1〜約10mg/kg、約0.3〜約10mg/kg、約0.5mg/kg〜約5mg/kgまたは約0.5mg/kg〜約1mg/kgである。
【０４８２】
いくつかの態様では、抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤または化学療法剤）の用量は、その臨床投薬計画に従って継続または反復される。したがって、いくつかの態様では、提供される方法に従う投与の用量計画またはサイクルでは、バリアントCD80ポリペプチド（例えば、バリアントCD80-Fc融合タンパク質）を、1回だけ、例えば、記載されるような単回用量もしくは注入で、または数回用量で投与することができるが、抗がん剤の投与は、投与の投薬計画またはサイクル中、1回超、例えば、週3回、週2回、週1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回または月1回継続または反復される。いくつかの態様では、投与の投薬計画またはサイクルは、28日または4週間であるか約28日または4週間である。
【０４８３】
いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤を、0.01mgまたは約0.01mgから1000mgである量で、例えば、少なくとも0.01mg、0.1mg、1mg、10mg、1000mg、2000mg、3000mgまたはそれ以上の用量で投与することができる。例示的な態様では、免疫チェックポイント阻害剤を、約0.3mg/kg〜10mg/kg、または最大耐量、例えば少なくとも0.5mg/kg、もしくは少なくとも1mg/kg、もしくは少なくとも2mg/kg、もしくは少なくとも3mg/kg、もしくは少なくとも5mg/kg、もしくは少なくとも8mg/kgで投与してもよい。場合によって、用量を、単回用量としてまたは複数回用量で投与することができる。あるいは、約3mg/kgの第1の投与量、約5mg/kgの第2の投与量および約9mg/kgの第3の投与量を投与することを含め、漸増させた投与量レジメンによって免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよい。あるいは、漸増させた投与量レジメンは、免疫チェックポイント阻害剤の約5mg/kgの第1の投与量および約9mg/kgの第2の投与量を投与することを含む。別の段階的に漸増させた投与量レジメンは、免疫チェックポイント阻害剤の約3mg/kgの第1の投与量、約3mg/kgの第2の投与量、約5mg/kgの第3の投与量、約5mg/kgの第4の投与量および約9mg/kgの第5の投与量を投与することを含み得る。別の局面では、段階的に漸増させた投与量レジメンは、5mg/kgの第1の投与量、5mg/kgの第2の投与量および9mg/kgの第3の投与量を投与することを含み得る。いくつかの態様では、特定の投与量を1週間に2回、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回または月1回以上投与することができる。場合によって、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年以上反復するなど、反復可能なサイクル周期で投与量を投与することができる。
【０４８４】
いくつかの態様では、追加の作用物質は、PD-L1とその受容体PD-1との間の相互作用を遮断することが可能であり、それによって、そうしなければPD-L1/PD-1相互作用から生じたであろう負の調節シグナル伝達を遮断または阻止するための代替法またはアプローチを提供する、チェックポイント阻害剤である。
【０４８５】
いくつかの態様では、提供される併用療法によって達成されるそのような受容体/リガンド相互作用の標的化遮断は、相加的または相乗的な抗腫瘍活性を提供することができる。よって、いくつかの局面では、提供される併用療法は、対象または同状況の対象群の単剤療法としてのいずれかの分子単独による処置に比べて、処置成果または応答を向上させる。いくつかの局面では、提供される併用療法は、対象または同状況の対象群の単剤療法としてのいずれかの分子単独による処置に比べて、一つまたは他の分子のより少ない投与量で類似またはより大きい抗腫瘍効果を達成する。
【０４８６】
いくつかの態様では、追加の作用物質は、PD-1阻害剤である。PD-1は、1型膜タンパク質でありかつB7ファミリーのメンバーであるPD-L1およびPD-L2などのリガンドが結合可能である、阻害性受容体である。PD-1は、ヒトタンパク質および非ヒトタンパク質を含む。特に、PD-1抗原は、ヒトPD-1を含む（例えば、UniProtアクセッション番号Q15116.3を参照のこと）。いくつかの態様では、本明細書に記載される提供される併用において有用なPD-1阻害剤は、PD-1の活性または発現を阻害する、遮断する、無効にするまたはそれを妨害することが可能な任意の分子を含む。いくつかの局面では、PD-1阻害剤は、PD-1とそのリガンドPD-L1およびPD-L2の一方または両方との間の相互作用を崩壊させる。
【０４８７】
いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、低分子、核酸、タンパク質もしくはポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、ペプチボディ、ダイアボディ、またはミニボディである。一例として、PD-1阻害剤は、低分子化合物（例えば、約1000Da未満の分子量を有する化合物）である。低分子阻害剤の例は、PD-1の阻害剤である（例えば、Sasikumar et al., Biodrugs (2018) 10.1007/s40259-018-0303-4）。他の例として、本明細書に記載される併用における有用なPD-1阻害剤は、核酸およびポリペプチドを含む。PD-1阻害剤である限定されない例示的なペプチドは、AUR-012である。PD-1阻害剤は、米国特許出願公開番号2014/0294898に例示されているものなどのポリペプチド（例えば、大環状ポリペプチド）であることができる。他の例では、PD-1阻害剤は、PD-L1またはPD-L2の細胞外ドメインなどのPD-1リガンドの細胞外ドメインの組換え融合タンパク質を含むことができる。例えば、AMP-224（Amplimmune/GlaxoSmithKline）は、PD-L2の細胞外ドメインおよびヒトIgGのFc領域を含有し、PD-1に結合して、そのリガンドとの相互作用を遮断することができる。例えば、国際特許出願公開番号WO2010/027827およびWO2011/066342を参照されたい。
【０４８８】
例示的なPD-1の阻害剤は、CS1003（Cstone Pharmaceuticals）、AK103またはAK105（Akesio Biopharma, Hangzhou Hansi Biologics, Hanzhong Biologics）、HLX-10（Henlius Biotech）、LZM009（Livzon）、JTX-4014を含むが、それらに限定されない。
【０４８９】
いくつかの態様では、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの局面では、抗PD-1抗体または抗原結合断片は、以下の特徴の1つまたは複数を示すことができる：（a）例えばBiacoreバイオセンサーシステムを使用した表面プラズモン共鳴による決定でヒトPD-1に1×10-7M以下のKDで結合する；（b）ヒトCD28、CTLA-4またはICOSに実質的に結合しない；（c）混合リンパ球反応（MLR）アッセイにおいてT細胞増殖を増加させる；（d）MLRアッセイにおいてインターフェロン-ガンマ産生を増加させる；（e）MLRアッセイにおいてIL-2分泌を増加させる；（f）ヒトPD-1およびカニクイザルPD-1に結合する；（g）PD-L1および/またはPD-L2のPD-1への結合を阻害する；（h）抗原特異的メモリー応答を刺激する；（i）抗体応答を刺激する；および/あるいは（j）インビボでの腫瘍細胞成長を阻害する。
【０４９０】
場合によって、抗PD-1抗体は、キメラ抗体である。他の場合では、抗PD-1抗体は、ヒト化抗体である。さらなるの場合では、抗PD-1抗体は、キメラヒト化抗体である。抗PD-1抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であることができる。抗PD-1抗体または抗原結合断片の例は、公知であり、例えば、米国特許第6,808,710号、第7,488,802号、第7,943,743号、第8,008,449号、第8,168,757号および第8,354,509号、第8,779,105号、第8,735,553号；米国特許出願公開US20050180969、US20070166281、US20170290808、国際特許出願公開番号WO2008156712WO2012145493、WO2018156494、WO201891661、WO2014206107；治験登録番号NCT03474640；NCT03473743；NCT03311412；NCT02383212を参照されたい。いくつかの態様では、2つ以上のPD-1抗体が、本明細書に記載されるようなバリアントCD80融合タンパク質と組み合わせて投与される。
【０４９１】
例示的な抗PD-1抗体は、AGEN-2034（Agenus）、AM-0001、AK 103（Akeso Biopharma）、BAT-I306（Bio-Thera Solutions）、BGB-A317（Beigene）、BI-754091、セミプリマブ（REGN2810もしくはSAR439684)（Sanofi/Regeneron）、CBT-501、ENUM-244C8、GB-226、GLS-010（Gloria Pharmaceuticals; WuXi Biologics）、GX-D1、IBI308（Innovent Biologics）、JS001（Junshi Biosciences）、JNJ-63723283、MGA012（Macrogenics）、MEDI0680もしくはAMP514（AstraZeneca/MedImmune）、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ（Pfizer）、CT011もしくはMDV9300、PDR001（Pfizer）、組換えヒト化抗PD-1 mAb（Bio-Thera Solutions）、PD-1系二重特異性抗体（Beijing Hanmi Pharmaceutical）、PD-1モノクローナル抗体（Genor Biopharma）、REGN-2810、SHR-1210（Hengrui Medicine）、Sym021、SSI-361、TAB001、TSR-042またはその抗原結合断片を含むが、それらに限定されない。
【０４９２】
一態様では、抗PD-1 Abは、ニボルマブまたはその誘導体、例えばニボルマブのバリアントもしくは抗原結合断片である。ニボルマブ（Opdivo（商標）としても知られている；以前は、5C4、BMS-936558、MDX-1106またはONO-4538と命名されていた）は、PD-1リガンド（PD-L1およびPD-L2）との相互作用を選択的に阻止し、それによって抗腫瘍T細胞機能のダウンレギュレーションを遮断する、完全ヒトIgG4（S228P）PD-1免疫チェックポイント阻害抗体である（例えば、米国特許第8,008,449号；Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56を参照のこと）。
【０４９３】
別の態様では、抗PD-1抗体は、ペムブロリズマブまたはその誘導体、例えばペムブロリズマブのバリアントもしくは抗原結合断片である。ペムブロリズマブ（Keytruda（商標）、ランブロリズマブおよびMK-3475としても知られている）は、ヒト細胞表面受容体PD-1（プログラム死-1またはプログラム細胞死-1）に対して指向されるヒト化モノクローナルIgG4抗体である。ペムブロリズマブは、例えば、米国特許第8,900,587号、およびh409AIIと命名された抗体として国際特許公開番号WO2008156712に記載されている。
【０４９４】
さらなる態様では、抗PD-1抗体は、ピディリズマブ（hBAT-1またはCT-011とも呼ばれる）またはその誘導体、例えばピディリズマブのバリアントもしくは抗原結合断片である。ピディリズマブは、Bリンパ系細胞膜に対して産生され、T細胞およびNK細胞に基づく活性を誘発することが示されている、ネズミ科抗体（BAT）から生成されたヒト化IgGlKモノクローナル抗体である。ピディリズマブは、ヒトPD-1に結合する（例えば、US 2005/0180969におけるBAT-RKD/RHCと命名された抗体を参照のこと）。
【０４９５】
他の態様では、抗PD-1 Abは、MEDI0608（以前はAMP-514）であるか、またはその誘導体、例えばMEDI1068のバリアントもしくは抗原結合断片である。MEDI0608は、PD-1受容体に対するモノクローナル抗体である。MEDI0608は、例えば、米国特許第8,609,089B2号に記載されている。
【０４９６】
いくつかの態様では、追加の作用物質は、CTLA-4とその同族結合パートナーCD80またはCD86との間の相互作用を遮断可能であるチェックポイント阻害剤である。例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（Bristol-Myers Squibb）およびトレメリムマブ（Pfizer）を含む。
【０４９７】
いくつかの態様では、抗CTLA-4 Abは、イピリムマブ（MDX-010、MDX-101、MDX-CTLA-4、10D1またはYervoy（登録商標）とも呼ばれる）であるか、またはその誘導体、例えばイピリムマブのバリアントもしくは抗原結合断片である。イピリムマブは、CTLA-4に対する完全ヒト化IgG1モノクローナル抗体である。イピリムマブは、例えば、国際公開PCT出願番号WO2001014424またはEP特許EP1503794、米国公開特許出願番号米国特許出願公開番号US20020086014、US20150283234に記載されている。
【０４９８】
いくつかの態様では、抗CTLA-4 Abは、トレメリムマブ（CP-675、CP-675206、チシリムマブ、抗体クローン11.2.1とも呼ばれる）であるか、またはその誘導体、例えばトレメリムマブのバリアントまたは抗原結合断片である。トレメリムマブは、CTLA-4に対するモノクローナル抗体である。トレメリムマブは、例えば、米国特許第6,682,736号、第7,109,003号；第7,123,281号；第7,411,057号；第7,824,679号；第8,143,379号；第7,807,797号；および第8,491,895号に記載されている。
【０４９９】
本明細書に記載される併用療法において使用するための抗PD-1抗体などのチェックポイント阻害剤は、抗体、例えば、上記抗体のいずれかなどの抗PD-1抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片の例は、例えば、VL、VH、CLおよびCHIドメインを含有する一価断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（iii）VHおよびCH1ドメインを含有するFd断片；ならびに（iv）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインを含有するFv断片を含む。
【０５００】
いくつかの態様では、抗がん剤は、化学療法剤である。いくつかの態様では、抗がん剤は、アルキル化剤である。アルキル化剤は、核酸と共有結合を形成してDNA合成を阻害することによってDNAに直接損傷を与える化合物である。例示的なアルキル化剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびチオテパ、ならびにカルムスチンおよびロムスチンなどのニトロソウレアアルキル化剤を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、抗がん剤は、プラチナ剤である。プラチナ剤は、DNAに結合して架橋を引き起こし、最終的にアポトーシスをトリガーする。例示的なプラチナ剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチンおよびリポプラチンを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、抗がん剤は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、RNAおよびDNAの通常の構成要素と置き換わることによってDNAおよびRNA成長を妨害する。これらの作用物質は、細胞の染色体がコピーされているS期に細胞に損傷を与える。場合によって、代謝拮抗剤は、白血病、乳がん、卵巣がんおよび腸管がん、ならびに他のタイプのがんを処置するために使用することができる。例示的な代謝拮抗剤は、5-フルオロウラシル（5-FU）、6-メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、およびペメトレキセド（Alimta（登録商標））を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、抗がん剤は、抗腫瘍抗生物質である。抗腫瘍抗生物質は、がん細胞内のDNAを変更してそれらが成長および増殖しないように働く。アントラサイクリンは、DNA複製に関与する酵素を妨害する抗腫瘍抗生物質である。これらの薬物は、一般に、細胞周期のすべての段階で働く。これらは、多種多様ながんに広く使用することができる。例示的なアントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンを含むが、それらに限定されない。他の抗腫瘍抗生物質は、アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、マイトマイシン-C、およびミトキサントロンを含む。いくつかの態様では、抗がん剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。これらの薬物は、S期にコピーされ得るようにDNA鎖を分離するのを助けるトポイソメラーゼと呼ばれる酵素を妨害する。トポイソメラーゼ阻害剤は、特定の白血病、ならびに肺がん、卵巣がん、胃腸がんおよび他のがんを処置するために使用することができる。例示的なトポイソメラーゼ阻害剤は、ドキソルビシン、トポテカン、イリノテカン（CPT-11）、エトポシド（VP-16）、テニポシド、およびミトキサントロンを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、抗がん剤は、有糸分裂阻害剤である。有糸分裂阻害剤は、植物アルカロイドおよび天然植物性産物に由来する他の化合物であることが多い。これらは、細胞周期のM期において有糸分裂を停止させることにより働くが、場合によって、酵素が細胞再生に必要なタンパク質を作るのを妨げることによって、すべての段階で細胞に損傷を与���る可能性がある。例示的な有糸分裂阻害剤は、パクリタキセル（Taxol（登録商標））、ドセタキセル（Taxotere（登録商標））、イクサベピロン（Ixempra（登録商標））、ビンブラスチン（Velban（登録商標））、ビンクリスチン（Oncovin（登録商標））、ビノレルビン（Navelbine（登録商標））、およびエストラムスチン（Emcyt（登録商標））を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、抗がん剤は、オキサリプラチンなどの白金系化学療法剤である。オキサリプラチンは、DNA架橋剤として作用してDNA複製および転写を効率的に阻害し、その結果として細胞周期に非特異的な細胞傷害をもたらす、白金系薬物である。
【０５０１】
いくつかの態様では、白金系薬剤、例えばオキサリプラチンなどの化学療法剤は、約20mg/m2〜約150mg/m2、例えば、約40mg/m2〜約100mg/m2の範囲であることができる量、または50mg/m2もしくは約50mg/m2、55mg/m2もしくは約55mg/m2、60mg/m2もしくは約60mg/m2、65mg/m2もしくは約65mg/m2、70mg/m2もしくは約70mg/m2、75mg/m2もしくは約75mg/m2、80mg/m2もしくは約80mg/m2、85mg/m2もしくは約85mg/m2、90mg/m2もしくは約90mg/m2、または95mg/m2もしくは約95mg/m2、または前述のいずれかの値間の任意の値の量でヒト患者に投与される。いくつかの態様では、特定の投与量を、1週間に2回、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回または月1回以上投与することができる。場合によって、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年以上反復するなど、反復可能なサイクル周期で投与量を投与することができる。
【０５０２】
チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体またはその抗原結合断片などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤は、バリアントCD80ポリペプチドを含有する融合タンパク質またはその薬学的組成物の前に、それと同時もしくはほぼ同時に、それと連続的にまたは間欠的に投与することができる。例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤、例えば、抗PD-1抗体）などの抗がん剤とバリアントCD80ポリペプチド（例えば、バリアントCD80 IgV-FcなどのバリアントCD80-Fc）を含有する融合タンパク質を、一緒にまたは別々に同時投与することができる。いくつかの局面では、バリアントCD80ポリペプチドを含有する融合タンパク質は、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤）などの抗がん剤の前に投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤）などの抗がん剤は、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始後またはバリアントCD80融合タンパク質の治療有効量の最終用量の投与後2時間〜1週間以内に投与される。いくつかの局面では、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤）などの抗がん剤は、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始後またはバリアントCD80融合タンパク質の治療有効量の最終用量の投与後2時間〜144時間または約2時間〜144時間、例えば、2時間〜120時間もしくは約2時間〜120時間、2時間〜96時間もしくは約2時間〜96時間、2時間〜72時間もしくは約2時間〜72時間、2時間〜48時間もしくは約2時間〜48時間、2時間〜24時間もしくは約2時間〜24時間、2時間〜12時間もしくは約2時間〜12時間、12時間〜120時間もしくは約12時間〜120時間、12時間〜96時間もしくは約12時間〜96時間、12時間〜72時間もしくは約12時間〜72時間、12時間〜48時間もしくは約12時間〜48時間、12時間〜24時間もしくは約12時間〜24時間、24時間〜120時間もしくは約24時間〜120時間、24時間〜96時間もしくは約24時間〜96時間、24時間〜72時間もしくは約24時間〜72時間、24時間〜48時間もしくは約24時間〜48時間、48時間〜120時間もしくは約48時間〜120時間、48時間〜96時間もしくは約48時間〜96時間、48時間〜72時間もしくは約48時間〜72時間、72時間〜120時間もしくは約72時間〜120時間、72時間〜96時間もしくは約72時間〜96時間、または96時間〜120時間もしくは約96時間〜120時間に投与される。
【０５０３】
チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を必要に応じて対象に投与することができる。投与頻度の決定は、処置される病状、処置される対象の年齢、処置される病状の重症度、処置される対象の相対的な健康状態などを考慮して担当医などの当業者が行うことができる。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤、例えば、抗PD-1抗体）などの抗がん剤の有効量が、対象に1回または複数回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤の有効量が、対象に月1回、月1回未満、例えば、2ヶ月毎または3ヶ月毎に投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤の有効量が、月1回未満、例えば、3週間毎に1回、2週間毎に1回または1週間毎に1回投与される。場合によって、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤の有効量が、対象に少なくとも1回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、PD-1阻害剤、例えば、抗PD-1抗体）などの抗がん剤の有効量を、例えば少なくとも1ヶ月、少なくとも6ヶ月または少なくとも1年の期間にわたり、複数回投与してもよい。
【０５０４】
いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤の薬学的組成物は、提供される併用療法で、がんの治療（その予防を含む）に有用な量で投与される。治療有効量は、典型的には、処置される対象の重量、男女の身体もしくは健康状態、処置されるべき病状の広範さ、または処置される対象の年齢に左右される。一般に、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を、1用量当たり約10μg/kg（体重）〜約100mg/kg（体重）の範囲の量で投与してもよい。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を、1用量当たり約50μg/kg（体重）〜約5mg/kg（体重）の範囲の量で投与してもよい。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を、1用量当たり約100μg/kg（体重）〜約10mg/kg（体重）の範囲の量で投与してもよい。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を、1用量当たり約100μ/kg（体重）〜約20mg/kg（体重）の範囲の量で投与してもよい。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤）などの抗がん剤を、1用量当たり約0.5mg/kg（体重）〜約20mg/kg（体重）の範囲の量で投与してもよい。
【０５０５】
C. 処置のための対象
いくつかの態様では、提供される方法は、治療的適用の対象となる疾患または状態を有するか有する疑いのある対象を処置するための方法である。場合によって、処置のための対象は、治療に対する適合性を判定するまたは提供される態様のいずれかに従う処置（提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質のいずれかによる処置を含む）のための対象を特定もしくは選択するなどのために、1つまたは複数の特徴またはパラメータに基づいて処置の前に選択することができる。
【０５０６】
いくつかの態様では、提供される方法は、公知である、疑われるまたは提供される態様に従う処置の候補であり得る疾患または状態を有する患者の様々な生体試料に対する結合アッセイを利用した、診断法、予後判定法またはモニタリング法を含む。いくつかの態様では、本方法は、腫瘍または腫瘍細胞浸潤物上に発現されるか発現される可能性が高い1つまたは複数の細胞表面マーカーを検出することが可能な試薬を用いて行われる。いくつかの局面では、1つまたは複数の細胞マーカーは、腫瘍または腫瘍細胞浸潤物が治療的方法において利用されるべきバリアントCD80ポリペプチドの1つもしくは複数の結合パートナー（例えば、CD28、PD-L1および/またはCTLA-4）または競合細胞表面リガンド（例えば、CD80またはCD86）を発現するものを含む。いくつかの局面では、腫瘍浸潤Tリンパ球などのT細胞の細胞表面マーカーを検出することが可能である試薬、例えばCD3結合試薬が利用される。そのような試薬は、提供される分子もしくは薬学的組成物による処置から最も恩恵を受ける可能性の高い対象を選択するためおよび/または処置の有効性を予測するためのコンパニオン診断薬として使用することができる。
【０５０７】
いくつかの態様では、例えば疾患もしくは状態を処置するためおよび/または腫瘍もしくはがんを処置するための免疫応答を増加させるための方法における、提供されるバリアントCD80ポリペプチドまたはバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質のCTLA-4をアンタゴナイズするか遮断する、PD-L1/PD-1相互作用をアンタゴナイズするか遮断するおよび/またはPD-L1依存性CD28共刺激などのCD28アゴニズムを媒介する活性に基づく、対象を選択するためおよび/または提供される治療による処置の有効性を予測するための方法が提供される。
【０５０８】
いくつかの態様では、試薬は、細胞表面上の細胞表面マーカー（例えば、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、PD-L1またはCTLA-4）に特異的に結合する結合試薬である。いくつかの態様では、結合試薬は、抗体もしくは抗原結合断片、タンパク質リガンドもしくは結合パートナー、アプタマー、アフィマー、ペプチドまたはハプテンであることができる。いくつかの態様では、そのような試薬は、IgSFドメインであるかそれを含有するバリアントCD80ポリペプチドを含有する本明細書において提供される治療用物質または薬学的組成物による処置のための対象を選択または特定するためのコンパニオン診断薬として使用することができる。中でも、含まれるそのような治療用物質は、多量体化ドメイン（例えば、Fcドメインまたは領域）に直接的または間接的に連結された親和性改変されたIgSFドメイン（例えば、IgV）を含有するCD80バリアントポリペプチドの細胞外部分を含有する融合タンパク質である。いくつかの態様では、そのような治療用物質は、バリアントCD80-Fc融合タンパク質である。
【０５０９】
いくつかの態様では、提供される薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）を対象、例えば、がんを有することが公知であるかその疑いのある対象に投与する前に、本方法は、記載されるような細胞表面マーカーの存在もしくは非存在、または存在の程度の評価のために対象から生体試料を得ることを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を、細胞表面マーカー（例えば、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、PD-L1またはCTLA-4）のエクトドメインに特異的に結合することが可能な結合試薬（例えば、抗体）と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、生体試料は、間質細胞、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球を含む腫瘍組織試料である。
【０５１０】
いくつかの態様では、がんを有する疑いのある対象において、バリアントCD80ポリペプチドに対する競合細胞表面リガンドであるか、その可能性が高いかまたはそうあり得る細胞表面マーカーに対して表面陰性である細胞を検出することが望ましい。いくつかの局面では、競合細胞表面リガンドは、腫瘍内またはその周囲の細胞上に発現される場合に、CD28などのその結合パートナーの1つまたは複数へのバリアントCD80ポリペプチドの結合に競合し得るかその潜在性を有するリガンドである。例えば、CD80およびCD86は、抗原提示細胞（APC）または腫瘍細胞上に発現されるか発現され得る細胞表面マーカーであり、CD28に対する同族結合パートナーである。いくつかの態様では、提供される方法は、CD80またはCD86に結合することが可能な試薬を用いて行われる。提供される方法のいくつかの態様では、生体試料の細胞上でCD80もしくはCD86の検出可能な発現がない（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）、および/または、CD80もしくはCD86が生体試料の細胞の20％未満もしくは約20％未満で発現される、および/または、生体試料の細胞上のCD80もしくはCD86表面発現が細胞膜染色の低い強度を有するとしてスコア化もしくは特定される（例えば、0または1のスコア）場合に、生体試料は、CD80もしくはCD86に対して表面陰性の細胞、またはCD80もしくはCD86に対して比較的表面陰性である細胞を有するとして検出される。提供される方法のいくつかの態様では、生体試料の細胞の20％未満もしくは約20％未満、例えば、細胞の10％未満もしくは約10％未満、細胞の5％未満または約5％未満、細胞の2％未満もしくは約2％未満または細胞の1％未満もしくは約1％未満がCD80もしくはCD86に対して表面陽性である場合に、生体試料は、CD80またはCD86に対して比較的表面陰性である細胞を有するとして検出される。いくつかの態様では、生体試料が、CD80またはCD86の発現に対して表面陰性であるかCD80またはCD86の発現に対して比較的表面陰性である細胞を含むと判定または評価された場合、その対象が処置のために選択される。
【０５１１】
いくつかの態様では、結合試薬は、CD80（B7-1）またはCD86（B7-2）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。ヒトCD80またはヒトCD86を含むCD80またはCD86に特異的な抗体を含め、様々な試薬が公知である。診断薬試験において使用するためのまたは診断のためのキットの一部としての例示的な抗体を表4に提供する。
【０５１２】
（表４）診断薬試験において使用するための例示的な抗体
2022501361.tif 000057
【０５１３】
いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD80抗体EPR1157(2）と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD80抗体2D10と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD80抗体775と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD86抗体BU63と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD86抗体CDLA86と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD86抗体118と接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、提供される方法は、対象由来の生体試料を抗CD86抗体C86/2160Rと接触させること、および生体試料中またはその細胞上の結合した結合試薬の有無を検出することを含む。いくつかの態様では、生体試料は、間質細胞、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球を含む腫瘍組織試料である。
【０５１４】
いくつかの態様では、がんを有する疑いのある対象において、バリアントCD80ポリペプチドの結合パートナーであるかそれを含む細胞表面マーカーに対して表面陽性である細胞を検出することが望ましい。いくつかの局面では、結合パートナーは、場合によって腫瘍浸潤T細胞、抗原提示細胞または腫瘍細胞上に発現され得る、細胞表面CD28、PD-L1またはCTLA-4である。いくつかの態様では、細胞の少なくとも1％もしくは少なくとも約1％もしくは約1％、細胞の少なくとも5％もしくは少なくとも約5％もしくは約5％、細胞の少なくとも10％もしくは少なくとも約10％もしくは約10％、細胞の少なくとも20％もしくは少なくとも約20％もしくは約20％、細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％もしくは約40％、またはそれ以上において結合パートナーの検出可能な発現レベル（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）がある場合、生体試料は、細胞表面マーカー、例えばCD28、PD-L1またはCTLA-4に対して表面陽性の細胞が検出される。
【０５１５】
いくつかの態様では、細胞の少なくとも1％もしくは少なくとも約1％もしくは約1％、細胞の少なくとも5％もしくは少なくとも約5％もしくは約5％、細胞の少なくとも10％もしくは少なくとも約10％もしくは約10％、細胞の少なくとも20％もしくは少なくとも約20％もしくは約20％、細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％もしくは約40％、またはそれ以上において結合パートナーの検出可能な発現レベル（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）がある場合、腫瘍組織試料は、PD-L1に対して表面陽性の細胞が検出される。いくつかの態様では、細胞は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である。いくつかの態様では、細胞の少なくとも1％もしくは少なくとも約1％もしくは約1％、細胞の少なくとも5％もしくは少なくとも約5％もしくは約5％、細胞の少なくとも10％もしくは少なくとも約10％もしくは約10％、細胞の少なくとも20％もしくは少なくとも約20％もしくは約20％、細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％もしくは約40％、またはそれ以上において結合パートナーの検出可能な発現レベル（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）がある場合、腫瘍組織試料は、CD28に対して表面陽性の細胞が検出される。いくつかの態様では、細胞は、腫瘍浸潤免疫リンパ球である。いくつかの態様では、生体試料が、PD-L1の発現に対して表面陽性であるかPD-L1の発現に対して比較的表面陽性である細胞を含むと判定または評価された場合、その対象が処置のために選択される。
【０５１６】
いくつかの態様では、試薬は、腫瘍環境中に存在する腫瘍細胞または骨髄細胞の表面などの細胞表面上のPD-L1に特異的に結合するPD-L1結合試薬である。いくつかの態様では、結合試薬は、PD-L1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。細胞内または細胞外PD-L1を含めヒトPD-L1などのPD-L1を検出するための様々なコンパニオン診断試薬が公知である。例えば、Roach et al. (2016) Appl. Immunohistochem., Mol. Morphol., 24:392-397；Cogswell et al. (2017) Mol. Diagn. Ther. 21:85-93；国際公開特許出願番号WO2015/181343もしくはWO2017/085307、または米国公開特許出願番号US2016/0009805もしくはUS2017/0285037。抗PD-L1抗体の非限定例は、マウス抗PD-L1クローン22C3（Merck & Co.）、ウサギ抗PD-L1クローン28-8（Bristol-Myers Squibb）、ウサギ抗PD-L1クローンSP263またはSP142（Spring Biosciences）およびウサギ抗PD-L1抗体クローンE1L3Nを含むが、それらに限定されない。そのような結合試薬は、Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDxアッセイ、PD-L1 IHC 28-8 pharmDxアッセイ、Ventana PD-L1（SP263）アッセイ、またはVentana PD-L1（SP142）アッセイとして利用可能なものを含め、組織化学法において使用することができる。
【０５１７】
いくつかの態様では、細胞の少なくとも1％もしくは少なくとも約1％もしくは約1％、細胞の少なくとも5％もしくは少なくとも約5％もしくは約5％、細胞の少なくとも10％もしくは少なくとも約10％もしくは約10％、細胞の少なくとも20％もしくは少なくとも約20％もしくは約20％、細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％もしくは約40％、またはそれ以上において結合パートナーの検出可能な発現レベル（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）がある場合、腫瘍組織試料は、CD28に対して表面陽性の細胞が検出される。いくつかの態様では、細胞は、腫瘍浸潤Tリンパ球などの腫瘍浸潤免疫細胞である。いくつかの態様では、生体試料が、CD28の発現に対して表面陽性であるかCD28の発現に対して比較的表面陽性である細胞を含むと判定または評価された場合、その対象が処置のために選択される。いくつかの態様では、結合試薬は、CD28に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。ヒトCD28を含むCD28に特異的な抗体を含め、様々な試薬が公知である。抗CD28抗体の非限定例は、抗CD28抗体007（Sino Biologicals, 11524-R007）または抗CD28抗体C28/77（NovusBio, NBO2-32817）を含むが、それらに限定されない。
【０５１８】
いくつかの態様では、細胞の少なくとも1％もしくは少なくとも約1％もしくは約1％、細胞の少なくとも5％もしくは少なくとも約5％もしくは約5％、細胞の少なくとも10％もしくは少なくとも約10％もしくは約10％、細胞の少なくとも20％もしくは少なくとも約20％もしくは約20％、細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％もしくは約40％、またはそれ以上において結合パートナーの検出可能な発現レベル（例えば、結合試薬との接触および結合した結合試薬の検出後）がある場合、腫瘍組織試料は、CTLA-4に対して表面陽性の細胞が検出される。いくつかの態様では、細胞は、腫瘍浸潤Tリンパ球などの腫瘍浸潤免疫細胞である。いくつかの態様では、生体試料が、CTLA-4の発現に対して表面陽性であるかCTLA-4の発現に対して比較的表面陽性である細胞を含むと判定または評価された場合、その対象が処置のために選択される。いくつかの態様では、結合試薬は、CTLA-4に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。ヒトCTLA-4を含むCTLA-4に特異的な抗体を含め、様々な試薬が公知である。
【０５１９】
いくつかの態様では、本方法はさらに、免疫細胞浸潤物を評価するための免疫スコア（Immunoscore）または類似の方法を使用するなどして、がんを患うかまたはがんを有する疑いのある対象における免疫応答をスコア化するための方法を含むことができる。いくつかの局面では、そのような方法は、T細胞などの特定のリンパ球集団を特定または評価するための方法を含む。例えば、免疫スコアは、腫瘍浸潤リンパ球の定量化可能な尺度を含む。場合によって、本方法は、一般にT細胞に対するユニバーサルマーカーであるCD3に結合可能である結合試薬の使用を伴う。いくつかの局面では、CD45RO、CD8またはT細胞サブセットもしくはタイプの他のマーカーに基づくなどしてT細胞のタイプ、例えば制御性または細胞障害性T細胞を特定するために、さらなる分析を行ってもよい。場合によって、免疫スコアは、2つのリンパ球集団、細胞障害性T細胞（CD8）およびメモリーT細胞（CD45RO）の密度に基づく。他の免疫スコア様マーカーを利用することができる。場合によって、Tリンパ球の有無を分析するなどによって免疫応答をスコア化または評価する局面を、多重化法を使用して行うことができる。対象における生体試料中のある特定のTリンパ球集団の有無を分析するためなど、対象における免疫応答を分析または評価するための例示的な方法が公知である。例えば、Galon et al. (2012) Journal of Translational Medicine, 10:1；Galon et al. (2006) Science, 313:1960-1964；Galon et al. (2016) Journal of Translational Medicine, 14:273；Ascierto et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11:54；Kwak et al. (2016) Oncotarget, 7:81778-81790；米国特許出願公開US20160363593を参照されたい。さらに、記載されるような表面マーカーを評価または検出するための本明細書に記載される提供される方法のいずれかを、例えば免疫応答の有無またはTリンパ球の有無も評価またはスコア化するための方法において、一緒に多重化することができる。
【０５２０】
結合試薬を、検出のために検出可能標識に直接的または間接的にコンジュゲート、例えば融合させることができる。場合によって、結合試薬は、直接検出または試薬もしくは試薬の一部に結合する抗体および検出可能標識にカップリングされた抗体を介するなど第2の作用物質を介した検出のいずれかを可能にする部分に連結または付着される。例示的な検出可能標識は、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種および金属を含む。標識を検出するための方法は、当技術分野において周知である。そのような標識は、例えば、目視によって、蛍光スペクトロスコピーによって、反射率測定によって、フローサイトメトリーによって、X線によって、磁気共鳴画像法（MRI）および磁気共鳴スペクトロスコピー（MRS）などの多種多様な磁気共鳴方法によって検出することができる。検出の方法はまた、コンピュータ断層撮影（CT）、コンピュータ体軸断層撮影（CAT）、電子ビームコンピュータ断層撮影（EBCT）、高解像度コンピュータ断層撮影（HRCT）、下環状断層撮影、陽電子放出断層撮影（PET）、単光子放射型コンピュータ断層撮影（SPECT）、スパイラルコンピュータ断層撮影および超音波断層撮影を含めた多種多様な断層撮影法のいずれかを含む。例示的な検出可能標識は、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種および金属を含む。中でも、検出可能標識は、蛍光プローブまたは検出可能酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【０５２１】
結合試薬は、インビトロまたはインビボアッセイを含め当業者に公知の任意の結合アッセイを使用して、細胞表面マーカー、例えば、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、PD-L1またはCTLA-4を検出することができる。試料中の細胞表面マーカーの発現またはレベルを査定する、評価する、判定する、定量化するおよび/またはそれ以外の方法で特異的に検出するために使用できる例示的な結合アッセイは、固相結合アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA））、放射免疫アッセイ（RIA）、免疫放射定量アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ウェスタンブロットおよび組織化学法（免疫組織化学（IHC）または非抗体結合剤を使用した疑似免疫組織化学など）を含むが、それらに限定されない。ELISA法などの固相結合アッセイ法では、例えば、アッセイは、サンドイッチ形式であっても、競合的阻害形式であってもよい。他の例では、インビボ造影法を使用することができる。結合アッセイは、血漿、尿、腫瘍または疑いのある腫瘍組織（新鮮組織、凍結組織および固定またはパラフィン包埋組織を含む）、リンパ節または骨髄由来を含め、あらゆるタイプの患者の体液、細胞または組織試料から得られた試料に対して実施することができる。本明細書において提供される治療的方法に従う処置のための対象を選択する例示的な方法では、対象の処置の前に、試料、例えば腫瘍組織の採取が行われる。
【０５２２】
いくつかの態様では、結合アッセイは、組織または細胞試料中の結合パートナーの発現またはレベルを検出するための組織染色アッセイである。組織染色法は、細胞化学的または組織化学的方法、例えば、免疫組織化学（IHC）または非抗体結合剤を使用した組織化学（例えば、偽免疫組織化学）を含むが、それらに限定されない。そのような組織化学的方法は、腫瘍組織試料などの試料中の結合パートナーの量の定量的または半定量的検出を可能にする。そのような方法では、組織試料と、結合試薬、特に、検出可能に標識されたか検出することが可能である結合試薬とを、記載されるような組織または細胞に関連する細胞表面マーカーへの結合を可能にする条件下で接触させることができる。
【０５２３】
組織化学によって決定されるような本明細書において提供される方法において使用するための試料は、組織または細胞試料などの疾患または病状に関連する任意の生体試料であることができる。例えば、組織試料は、新鮮、凍結および/もしくは保存された臓器もしくは組織試料または生検または吸引物、または細胞を含む、固形組織であることができる。いくつかの例では、組織試料は、限定されないが乳がん、結腸がん、直腸がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、膀胱がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび肺がんの腫瘍を含む、原発腫瘍および転移腫瘍などの固形腫瘍から得られた組織または細胞である。特定の例では、試料は、末期がん、転移がん、未分化がん、卵巣がん、上皮内がん（ISC）、扁平上皮細胞がん（SCC）、前立腺がん、膵がん、非小細胞肺がん、乳がん、結腸がんであるがん由来の組織試料である。
【０５２４】
いくつかの局面では、腫瘍が固形腫瘍であるとき、腫瘍細胞の単離は、外科生検によって達成することができる。対象から腫瘍細胞を採取するために使用できる生検技術は、針生検、CT誘導針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検、皮膚生検、骨髄生検、および電気外科的ループ切除法（LEEP）を含むが、それらに限定されない。典型的には、100mg超である非壊死性の無菌生検または検体が得られるが、100mg未満、50mg以下、10mg以下もしくは5mg以下などより小さくてもよく；または、100mg超、200mg以上、もしくは500mg以上、1gm以上、2gm以上、3gm以上、4gm以上もしくは5gm以上などより大きくてもよい。アッセイのために抽出されるべき試料サイズは、限定されないが、実施されるべきアッセイの数、組織試料の健康、がんのタイプおよび対象の状態を含む多くの要因に左右され得る。腫瘍組織を無菌チューブまたは培養プレートなどの無菌容器に入れ、任意で適切な媒体に浸漬させることができる。
【０５２５】
いくつかの態様では、生検後に患者から得られた組織は、例えば、ホルマリン（ホルムアルデヒド）もしくはグルタルアルデヒドなどによって、またはアルコール浸漬によって固定される。組織化学的方法のために、腫瘍試料を、腫瘍組織の脱水およびパラフィン蝋または当業者に公知の他の固体支持体への包埋（Plenat et ah, (2001) Ann Pathol. January 21(l):29-47を参照のこと）、染色に適した切片への組織のスライス、ならびに、例えば有機溶媒による包埋用固体支持体の除去および保存組織の再水和を含む選択された組織化学的染色法に従って染色するための切片の処理など、公知の技術を使用して処理することができる。
【０５２６】
いくつかの態様では、組織化学法が利用される。場合によって、結合試薬は、直接的または間接的検出のために検出可能標識または他の部分に直接付着または連結される。例示的な検出可能試薬は、限定されないがビオチン、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質または酵素を含む。他の例では、結合試薬は、標識された結合パートナーまたは抗体を介して検出することができるペプチドまたはタンパク質にコンジュゲート、例えば融合される。いくつかの例では、結合パートナーは、結合試薬の1つまたは複数の領域（例えば、エピトープ）を認識する標識された抗体などの標識された第2の試薬を使用したHC法によって検出することができる。
【０５２７】
いくつかの態様では、組織化学法によって得られたなどの得られた染色検体は、染色のデジタル画像など、検出可能シグナルを可視化して画像を取得するためのシステムを使用してそれぞれ画像化される。画像取得のための方法は、当業者に周知である。例えば、試料が染色されたら、例えば、正立または倒立光学顕微鏡、走査共焦点顕微鏡、カメラ、走査またはトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡および赤外線撮像検出器など、任意の光学または非光学造影装置を使用して、染色またはバイオマーカー標識を検出することができる。いくつかの例では、画像は、デジタルで捕獲できる。次いで、得られた画像を、試料中の細胞表面マーカー、例えば、例えば、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、PD-L1またはCTLA-4の量を定量的または半定量的に決定するために使用することができる。免疫組織化学で使用するのに適した様々な自動化試料処理、走査および分析システムは、当技術分野において利用可能である。そのようなシステムは、自動化染色および顕微鏡的走査、コンピュータ化画像分析、連続切片比較（試料の配向およびサイズの変動を制御するために)、デジタル報告作成および試料の記録および追跡（組織切片が置かれるスライドなど）を含むことができる。免疫染色試料を含む細胞および組織上で定量的分析を実施するためにデジタル画像処理システムと従来の光学顕微鏡を組み合わせた細胞造影システムが市販されている。例えば、CAS-200システムを参照のこと（Becton, Dickinson & Co.）。特に、検出は、手動で行っても、コンピュータプロセッサおよびソフトウェアを含む画像処理技術によって行ってもよい。このようなソフトウェアを使用して、例えば、画像を、当業者に公知の手順を使用して、例えば、染色品質または染色強度を含む因子に基づき、構成、較正、標準化および/または検証することができる（例えば、公開された米国特許出願番号US20100136549を参照のこと）。
【０５２８】
いくつかの態様では、提供されるバリアントCD80ポリペプチドを含有する処置の前、その間および/またはその後に、診断試験が使用される。いくつかの態様では、提供される診断試験は、提供されるバリアントCD80ポリペプチドを含有する処置に対する応答を有する対象の可能性および/または程度を予測する。また、提供されるのは、腫瘍またはがんである疾患または病状を患う対象のための治療を選択するための方法である。
【０５２９】
V. キットおよび製造物品
また、本明細書において提供されるのは、本明細書に記載される薬学的組成物（バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を含む薬学的組成物を含む）を好適な包装に含む製造物品である。中でも、製造物品のための好適な包装は、1つまたは複数の容器、典型的には複数の容器、包装材料、ならびに1つまたは複数の容器および/または包装上またはそれに付随したラベルまたは添付文書（一般に、対象への組成物の投与についての説明書を含む）を含む。本明細書に記載される組成物のための包装に好適な容器は、当技術分野において公知であり、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、器（vessel）、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などを含む。これらの製造物品はさらに、滅菌および/または密封されてもよい。
【０５３０】
製造物品はさらに、1つまたは複数の識別情報および/または使用説明書を含む添付文書またはラベルを含んでもよい。いくつかの態様では、情報または説明書は、特定の状態もしくは疾患を処置するために、その内容物を使用することができるか使用しなければならならいこと、および/またはそのために説明書を提供することを示す。ラベルまたは添付文書は、製造物品の内容物が疾患または状態を処置するために使用されるべきであることを示してもよい。いくつかの態様では、ラベルまたは添付文書は、対象を、例えば、提供される方法の態様のいずれかに従って処置するための説明書を提供する。いくつかの態様では、説明書は、単位用量の1つまたは複数を対象に投与することを明記している。
【０５３１】
さらに提供されるのは、本明細書に記載される薬学的組成物（または製造物品）を含むキットであって、本明細書に記載される使用など組成物を使用する方法に関する説明書をさらに含んでもよい、キットである。本明細書に記載されるキットはまた、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび本明細書に記載される任意の方法を実施するための説明書を含む添付文書を含め、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０５３２】
VI. 例示的な態様
提供される態様に含まれるのは以下の通りである：
１．対象においてがんを処置する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)がんを有する対象に、PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、段階;ならびに
(b)対象に治療有効量のPD-1阻害剤を投与する段階であって、PD-1阻害剤が、プログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊する、段階。
２．前記リガンドが、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である、態様1の方法。
３．PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する、態様1または態様2の方法。
４．PD-1阻害剤が、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない、態様1または態様2の方法。
５．PD-1阻害剤が、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である、態様1〜4のいずれかの方法。
６．PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、態様1〜5のいずれかの方法。
７．前記抗体または抗原結合部分が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680(AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される、態様1〜6のいずれかの方法。
８．PD-1阻害剤が、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含む、態様1〜7のいずれかの方法。
９．PD-1阻害剤がAMP-224である、態様8の方法。
１０．PD-1阻害剤の投与の開始が、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始と同時または順次に実施される、態様1〜9のいずれかの方法。
１１．PD-1阻害剤の投与の開始が、バリアントCD80融合タンパク質の投与の開始の後である、態様1〜10のいずれかの方法。
１２．抗PD-1抗体の投与の開始が、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質の最終用量の投与の後である、態様1〜11のいずれかの方法。
１３．バリアントCD80融合タンパク質が、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、態様1〜12のいずれかの方法。
１４．がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含み、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質が、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、方法。
１５．バリアントCD80融合タンパク質が非経口投与される、態様1〜14のいずれかの方法。
１６．バリアントCD80融合タンパク質が皮下投与される、態様1〜15のいずれかの方法。
１７．バリアントCD80融合タンパク質が静脈内投与される、態様1〜15のいずれかの方法。
１８．バリアントCD80融合タンパク質が、ボーラス注射である注射によって投与される、態様1〜17のいずれかの方法。
１９．治療有効量が、各々両端の値を含めて、約0.5mg/kg〜約140mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.5mg/kg〜約20mg/kg、約0.5mg/kg〜約18mg/kg、約0.5mg/kg〜約12mg/kg、約0.5mg/kg〜約10mg/kg、約0.5mg/kg〜約6mg/kg、約0.5mg/kg〜約3mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約18mg/kg、約1mg/kg〜約12mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約1mg/kg〜約6mg/kg、約1mg/kg〜約3mg/kg、約3mg/kg〜約40mg/kg、約3mg/kg〜約30mg/kg、約3mg/kg〜約20mg/kg、約3mg/kg〜約18mg/kg、約3mg/kg〜約12mg/kg、約3mg/kg〜約10mg/kg、約3mg/kg〜約6mg/kg、約6mg/kg〜約40mg/kg、約6mg/kg〜約30mg/kg、約6mg/kg〜約20mg/kg、約6mg/kg〜約18mg/kg、約6mg/kg〜約12mg/kg、約6mg/kg〜約10mg/kg、約10mg/kg〜約40mg/kg、約10mg/kg〜約30mg/kg、約10mg/kg〜約20mg/kg、約10mg/kg〜約18mg/kg、約10mg/kg〜約12mg/kg、約12mg/kg〜約40mg/kg、約12mg/kg〜約30mg/kg、約12mg/kg〜約20mg/kg、約12mg/kg〜約18mg/kg、約18mg/kg〜約40mg/kg、約18mg/kg〜約30mg/kg、約18mg/kg〜約20mg/kg、約20mg/kg〜約40mg/kg、約20mg/kg〜約30mg/kg、または約30mg/kg〜約40mg/kgである、態様13〜18のいずれかの方法。
２０．治療有効量が、両端の値を含めて、約3.0mg/kg〜18mg/kgである、態様13〜19のいずれかの方法。
２１．治療有効量が、両端の値を含めて、約6mg/kg〜約20mg/kgである、態様13〜19のいずれかの方法。
２２．治療有効量が、両端の値を含めて、約1mg/kg〜約10mg/kgである、態様13〜19のいずれかの方法。
２３．治療有効量が、両端の値を含めて、約2.0mg/kg〜約6.0mg/kgである、態様13〜19および22のいずれかの方法。
２４．バリアントCD80融合タンパク質が、腫瘍内投与される、態様1〜23のいずれかの方法。
２５．がんを有する対象に、治療有効量のバリアントCD80融合タンパク質を腫瘍内投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
２６．バリアントCD80融合タンパク質が、治療有効量で、単回用量としてまたは6回以下の複数回用量で投与される、態様25の方法。
２７．治療有効量が、両端の値を含めて、約0.1mg/kg〜約1mg/kgである、態様1〜18および24〜26のいずれかの方法。
２８．治療有効量が、約0.2mg/kg〜約0.6mg/kgである、態様1〜18および24〜27のいずれかの方法。
２９．治療有効量が、単回用量で投与される、態様13〜24および26〜28のいずれかの方法。
３０．治療有効量が、6回以下の複数回用量で投与され、6回以下の複数回用量が、2回の用量、3回の用量、4回の用量、5回の用量または6回の用量である、態様13〜24および26〜28のいずれかの方法。
３１．治療有効量が、4回の用量で投与される、態様30の方法。
３２．治療有効量が、3回の用量で投与される、態様30の方法。
３３．治療有効量が、2回の用量で投与される、態様30の方法。
３４．6回以下の複数回用量の各々が、毎週、2週間毎、3週間毎または4週間毎に投与される、態様30〜33のいずれかの方法。
３５．各々の複数回用量の間隔が約1週間である、態様30〜33のいずれかの方法。
３６．単回用量または6回以下の複数回用量の各々が、個々に、約0.5mg/kg〜約10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与される、態様13〜19および29〜35のいずれかの方法。
３７．がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜10mg/kgの量で1週間に1回(Q1W)投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントCD80融合タンパク質が投与される、方法。
３８．Q1W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量が、約1mg/kg〜約3mg/kgである、態様36または37の方法。
３９．前記投与が、1週間を超える期間にわたる、態様36〜38のいずれかの方法。
４０．単回用量または6回以下の複数回用量が、個々に、約1.0mg/kg〜約40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与される、態様13〜19、29〜34のいずれかの方法。
４１．がんを有する対象に、バリアントCD80融合タンパク質を、両端の値を含めて約1.0mg/kg〜40mg/kgの量で3週間に1回(Q3W)投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
４２．Q3W投与されるバリアントCD80融合タンパク質の量が、約3.0mg/kg〜約10mg/kgである、態様39または態様40の方法。
４３．バリアントCD80融合タンパク質が、非経口投与、任意で、皮下投与される、態様37〜39、41および42のいずれかの方法。
４４．バリアントCD80融合タンパク質が、ボーラス注射である注射によって投与される、態様37〜39、41〜43のいずれかの方法。
４５．治療有効量が、6週間以下の期間で投与される、態様13〜44のいずれかの方法。
４６．治療有効量が、4週間以下または約4週間の期間で投与される、態様13〜44のいずれかの方法。
４７．各々の複数回用量が等しい量である、態様13〜44のいずれかの方法。
４８．投与する段階の前に、PD-L1もしくはCD28について表面陽性、および/またはCD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性の細胞を含む、腫瘍を有する対象を、処置のために選択する、態様1〜47のいずれかの方法。
４９．CD80もしくはCD86より選択される細胞表面リガンドについて表面陰性、および/またはCD28について表面陽性の細胞を含む、腫瘍を有するとして選択された対象に、バリアントCD80融合タンパク質を投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、方法。
５０．CD80またはCD86について表面陰性の細胞が、腫瘍細胞または抗原提示細胞を含む、態様48または態様49の方法。
５１．CD28について表面陽性の細胞が、腫瘍浸潤Tリンパ球を含む、態様48または態様49の方法。
５２．対象が、PD-L1について表面陽性の細胞を含む腫瘍を有するとしてさらに選択されている、態様48〜51のいずれかの方法。
５３．PD-L1について表面陽性の細胞が、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞、任意で、腫瘍浸潤Tリンパ球である、態様48または態様52の方法。
５４．対象の腫瘍中の腫瘍浸潤Tリンパ球の存在または密度に基づき免疫スコア(immunoscore)を決定する段階をさらに含む、態様48〜53のいずれかの方法。
５５．免疫スコアが低い場合、対象が処置のために選択される、態様54の方法。
５６．対象が、少なくとも1つの結合パートナーに特異的に結合する試薬を使用する免疫組織化学(IHC)によって選択される、態様48〜55のいずれかの方法。
５７．バリアントCD80融合タンパク質が、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、態様14〜56のいずれかの方法。
５８．バリアントCD80融合タンパク質が、結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、PD-L1との増加した結合を示す、態様14〜57のいずれかの方法。
５９．バリアントCD80融合タンパク質が、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、態様1〜13のいずれかの方法。
６０．結合親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、態様1〜59のいずれかの方法。
６１．1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様1〜60のいずれかの方法。
６２．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様1〜61のいずれかの方法。
６３．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様1〜62のいずれかの方法。
６４．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、態様1〜63のいずれかの方法。
６５．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、態様1〜64のいずれかの方法。
６６．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89Nを含む、態様1〜65のいずれかの方法。
６７．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含む、態様1〜65のいずれかの方法。
６８．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93Eを含む、態様1〜65のいずれかの方法。
６９．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、態様1〜65のいずれかの方法。
７０．非改変CD80がヒトCD80である、態様1〜69のいずれかの方法。
７１．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、態様1〜70のいずれかの方法。
７２．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、態様71の方法。
７３．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、態様72の方法。
７４．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、態様72または態様73の方法。
７５．バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、態様1〜74のいずれかの方法。
７６．バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、態様1〜75のいずれかの方法。
７７．バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である、態様1〜75のいずれかの方法。
７８．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様1〜77のいずれかの方法。
７９．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様1〜78のいずれかの方法。
８０．バリアントCD80細胞外ドメインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、態様1〜79のいずれかの方法。
８１．多量体化ドメインがFc領域である、態様1〜80のいずれかの方法。
８２．Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、態様81の方法。
８３．Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、態様81または態様82の方法。
８４．Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcがヒトIgG1のものである、態様81または態様82の方法。
８５．Fc領域が、アミノ酸置換N297Gを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様84の方法。
８６．Fc領域が、アミノ酸置換R292C/N297G/V302Cを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様84の方法。
８７．Fc領域が、アミノ酸置換L234A/L235E/G237Aを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様84の方法。
８８．Fc領域が、アミノ酸置換C220Sをさらに含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様81〜87のいずれかの方法。
８９．Fc領域がK447delを含み、この残基がKabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様81〜88のいずれかの方法。
９０．バリアントCD80融合タンパク質が、CTLA-4の活性をアンタゴナイズする、態様14〜89のいずれかの方法。
９１．バリアントCD80融合タンパク質が、PD-1/PD-L1相互作用を遮断する、態様14〜90のいずれかの方法。
９２．バリアントCD80融合タンパク質が、CD28に結合して、CD28アゴニズムを媒介する、態様14〜91のいずれかの方法。
９３．CD28アゴニズムがPD-L1依存性である、態様92の方法。
９４．対象がヒトである、態様1〜93のいずれかの方法。
９５．(a)PD-L1に特異的に結合するバリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質が、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分、および多量体化ドメインを含み、該バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、該バリアントCD80融合タンパク質;ならびに
(b)プログラム死-1(PD-1)とそのリガンドとの相互作用を破壊するPD-1阻害剤
を含む、キット。
９６．前記リガンドが、プログラム死リガンド-1(PD-L1)またはPD-L2である、態様95のキット。
９７．PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する、態様95または態様96のキット。
９８．PD-1阻害剤が、PD-L1との結合についてバリアントCD80融合タンパク質と競合しない、態様95〜97のいずれかのキット。
９９．PD-1阻害剤が、ペプチド、タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または小分子である、態様95のキット。
１００．PD-1阻害剤が、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、態様95〜99のいずれかのキット。
１０１．前記抗体または抗原結合部分が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、MEDI0680(AMP514)、PDR001、セミプリマブ(REGN2810)、ピディリズマブ(CT011)、またはその抗原結合部分より選択される、態様100のキット。
１０２．PD-1阻害剤が、PD-1に結合するPD-L2の細胞外ドメインまたはその一部分、およびFc領域を含む、態様95〜99のいずれかのキット。
１０３．PD-1阻害剤がAMP-224である、態様102のキット。
１０４．バリアントCD80融合タンパク質が、CD28およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含む融合タンパク質と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合をさらに示す、態様95〜103のいずれかのキット。
１０５．結合親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、態様95〜104のいずれかのキット。
１０６．1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様95〜105のいずれかのキット。
１０７．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様95〜106のいずれかのキット。
１０８．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様95〜107のいずれかのキット。
１０９．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、態様95〜108のいずれかのキット。
１１０．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、態様95〜109のいずれかのキット。
１１１．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、態様95〜110のいずれかのキット。
１１２．非改変CD80がヒトCD80である、態様95〜111のいずれかのキット。
１１３．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、態様95〜112のいずれかのキット。
１１４．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、態様113のキット。
１１５．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、態様114のキット。
１１６．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、態様114または態様115のキット。
１１７．バリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、態様95〜116のいずれかのキット。
１１８．バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、態様95〜117のいずれかのキット。
１１９．バリアントCD80細胞外ドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列である、態様95〜118のいずれかのキット。
１２０．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様95〜119のいずれかのキット。
１２１．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様95〜120のいずれかのキット。
１２２．バリアントCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、態様95〜121のいずれかのキット。
１２３．多量体化ドメインがFc領域である、態様1〜122のいずれかのキット。
１２４．Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、態様123のキット。
１２５．Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、態様123または態様124のキット。
１２６．Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcがヒトIgG1のものである、態様123〜125のいずれかのキット。
１２７．態様95〜126のいずれかのキットおよび使用説明書を含む、製造物品。
１２８．前記説明書が、態様1〜13、19〜24および27〜94のいずれかの方法に従う、バリアントCD80 Fc融合タンパク質またはPD-1阻害剤の投与のための情報を提供する、態様127の製造物品。
１２９．以下を含む融合タンパク質の2つのコピーを含む多価CD80ポリペプチド：
(1)IgVドメインまたはその特異的結合断片を含む少なくとも2つのバリアントCD80細胞外ドメインまたはその一部分(vCD80)であって、非改変CD80ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその一部分のアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸改変を含む、vCD80、および
(2)Fcポリペプチド。
１３０．前記ポリペプチドが四価である、態様129の多価CD80ポリペプチド。
１３１．前記融合タンパク質が、構造:(vCD80)-リンカー-Fc-リンカー-(vCD80)を含む、態様129または態様130の多価CD80ポリペプチド。
１３２．前記融合タンパク質が、構造:(vCD80)-リンカー-(vCD80)-リンカー-Fcを含む、態様129または態様130の多価CD80ポリペプチド。
１３３．vCD80が、CD28、PD-L1およびCTLA-4の中より選択される少なくとも1つの結合パートナーに対する非改変CD80の細胞外ドメインを含むvCD80と比較して、該少なくとも1つの結合パートナーとの増加した結合を示す、態様132の多価CD80ポリペプチド。
１３４．親和性が、結合パートナーのエクトドメインに対する非改変CD80の結合親和性と比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、または450倍を上回って増加している、態様133の多価CD80ポリペプチド。
１３５．1つまたは複数のアミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様129〜134のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１３６．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様129〜135のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１３７．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくD90Gの中より選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様129〜136のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１３８．1つまたは複数のアミノ酸改変が、SEQ ID NO:2の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、態様129〜137のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１３９．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、態様129〜138のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４０．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、態様129〜139のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４１．非改変CD80がヒトCD80である、態様129〜140のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４２．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、(i)SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を含むか、(ii)SEQ ID NO:2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか;または(iii)IgVドメインもしくはその特異的結合断片を含む(i)もしくは(ii)の一部分である、態様129〜141のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４３．非改変CD80の細胞外ドメインまたはその一部分が、IgVドメインまたはその特異的結合断片であるかまたはそれを含む細胞外ドメイン部分である、態様142の多価CD80ポリペプチド。
１４４．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、IgVドメインを含むが、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない、態様143の多価CD80ポリペプチド。
１４５．非改変CD80の細胞外ドメイン部分が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列として記載される、態様143または態様144の多価CD80ポリペプチド。
１４６．vCD80が、IgCドメインもIgCドメインの一部分も含まない細胞外ドメイン部分である、態様129〜145のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４７．vCD80が、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を含む、態様129〜146のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４８．vCD80が、1つまたは複数のアミノ酸置換が含有される、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列を有する、態様129〜147のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１４９．vCD80が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様129〜148のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５０．vCD80が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸改変を含み、任意で、該アミノ酸改変がアミノ酸置換である、態様129〜149のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５１．vCD80が、SEQ ID NO:2のアミノ酸35〜135(SEQ ID NO:76)またはSEQ ID NO:2の35〜141(SEQ ID NO:150)の配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、態様129〜150のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５２．多量体化ドメインがFc領域である、態様129〜151のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５３．Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)または免疫グロブリンG2(IgG2)タンパク質のものである、態様129〜152のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５４．Fc領域が、1つまたは複数のエフェクター機能を示す、態様152または態様153の多価CD80ポリペプチド。
１５５．Fc領域が、野生型Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントFc領域であり、該バリアントFc領域が、野生型Fc領域と比較して、低下した1つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトFcが、ヒトIgG1のものである、態様154または態様153の多価CD80ポリペプチド。
１５６．各vCD80が同じである、態様129〜155のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５７．リンカーが柔軟なリンカーである、態様129〜156のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５８．リンカーがペプチドリンカーである、態様129〜157のいずれかの多価CD80ポリペプチド。
１５９．リンカーが、GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)または3×GGGGS(SEQ ID NO:1504)である、態様158の多価CD80ポリペプチド。
１６０．態様129〜159のいずれかの多価CD80ポリペプチドをコードする、核酸分子。
１６１．態様160の核酸を含む、ベクター。
１６２．発現ベクターである、態様161のベクター。
１６３．態様160の核酸または態様161もしくは態様162のベクターを含む、宿主細胞。
１６４．態様160の核酸または態様161もしくは態様162のベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、態様129〜159のいずれかの多価CD80ポリペプチドの産生方法。
１６５．前記多価CD80ポリペプチドを含むタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む、態様164の方法。
１６６．態様129〜159のいずれかの多価CD80ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
１６７．薬学的に許容される賦形剤を含む、態様166の薬学的組成物。
１６８．薬学的組成物が無菌である、態様166または態様167の薬学的組成物。
１６９．容器の中に態様166〜168のいずれかの薬学的組成物を含む製造物品であって、任意で、容器がバイアルである、製造物品。
１７０．容器が密封されている、態様169の製造物品。
１７１．態様166〜168のいずれかの薬学的組成物を対象に、または態様129〜170のいずれかの多価CD80ポリペプチドを対象に、投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
１７２．免疫応答をモデル化することが、対象において疾患または状態を処置する、態様171のいずれかの方法。
１７３．疾患または状態が腫瘍またはがんである、態様172の方法。
１７４．態様166〜168のいずれかの薬学的組成物を対象に、または態様129〜171のいずれかの多価CD80ポリペプチドを対象に、投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法。
１７５．(i)SEQ ID NO:1に記載の残基に対応する野生型ヒトCD80細胞外ドメインのアミノ酸残基35〜230として記載されるアミノ酸配列中の1つまたは複数の位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアント細胞外ドメイン、および(ii)エフェクター活性を有するFc領域を含む、バリアントCD80融合タンパク質であって、該バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCD28のエクトドメインに特異的に結合し、かつヒトPD-L1のエクトドメインに結合しないか、またはPD-L1のエクトドメインに対する野生型ヒトCD80の細胞外ドメインと類似の結合親和性でPD-L1のエクトドメインに結合する、該バリアントCD80融合タンパク質。
１７６．バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCTLA-4のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCTLA-4のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す、態様175のバリアントCD80融合タンパク質。
１７７．バリアントCD80融合タンパク質の細胞外ドメインが、ヒトCD28のエクトドメインに対する野生型CD80の細胞外ドメインの結合親和性と比較して、ヒトCD28のエクトドメインとの増加した結合親和性を示す、態様175または態様176のバリアントCD80融合タンパク質。
１７８．親和性が、約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上増加する、または1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上を上回って増加する、態様176または態様177のバリアントCD80融合タンパク質。
１７９．バリアントCD80融合タンパク質が、混合リンパ球反応で評価した場合の免疫学的活性を増加させ、任意で、増加した免疫学的活性が、混合リンパ球反応におけるIFN-γもしくはインターロイキン2の増加した産生を含み;かつ/または
バリアントCD80融合タンパク質が、抗原提示細胞と共にインキュベートされたT細胞レポーターアッセイで評価した場合の免疫学的活性を増加させる、
態様175〜178のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８０．バリアントCD80融合タンパク質が、Tリンパ球のCD28媒介性共刺激を増加させる、態様175〜179のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８１．増加が、約1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上であるか、または1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍もしくはそれ以上よりも大きい、態様179または態様180のバリアントCD80融合タンパク質。
１８２．野生型ヒトCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、態様175〜181のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８３．野生型ヒトCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列を有する、態様175〜182のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８４．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様175〜183のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８５．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120SもしくはT130Aより選択される2つ以上のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を含む、態様175〜184のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８６．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、アミノ酸改変L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130AまたはT120S/T130Aを含む、態様184または態様185のバリアントCD80融合タンパク質。
１８７．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、アミノ酸置換A91G/I118V/T120S/T130Aを含む、態様175〜186のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８８．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、アミノ酸置換S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130Aを含む、態様175〜186のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１８９．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、アミノ酸置換E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93Rを含む、態様175〜186のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９０．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85QもしくはD90Gの中より選択される置換、またはその保存的アミノ酸置換より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様175〜183のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９１．前記1つまたは複数のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:2に記載の番号付けを参照して、アミノ酸置換H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68MまたはM47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85QまたはM47V/E85Qを含む、態様190のバリアントCD80融合タンパク質。
１９２．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68MまたはE35D/M47I/L70Mを含む、態様175〜183、190および191のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９３．1つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸置換E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93EまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dを含む、態様175〜183、および190〜192のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９４．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸置換を有する、態様175〜193のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９５．バリアントCD80細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13個以下のアミノ酸置換を含む、態様175〜194のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９６．バリアントCD80細胞外ドメインが、SEQ ID NO:2に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有する、態様175〜195のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９７．Fc領域が、免疫グロブリンG1(IgG1)のものである、態様175〜196のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９８．Fc領域が、アミノ酸置換C220Sを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様175〜197のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
１９９．Fc領域が、K447delを含み、この残基が、KabatのEUインデックスに従って番号付けされる、態様175〜198のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
２００．Fc領域が、SEQ ID NO:1502、1510、1517または1527に記載のアミノ酸配列を有する、態様175〜199のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
２０１．1つまたは複数のエフェクター機能が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害、プログラム細胞死および細胞食作用の中より選択される、態様175〜200のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
２０２．二量体である、態様175〜201のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質。
２０３．態様175〜202のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質をコードする核酸分子。
２０４．態様203の核酸を含むベクター。
２０５．発現ベクターである、態様204のベクター。
２０６．態様203の核酸または態様204もしくは態様205のベクターを含む宿主細胞。
２０７．態様203の核酸または態様204もしくは態様205のベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入する段階を含む、態様175〜202のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質の産生方法。
２０８．バリアントCD80融合タンパク質を含むタンパク質を単離または精製する段階をさらに含む、態様207の方法。
２０９．態様175〜202のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
２１０．薬学的に許容される賦形剤を含む、態様209の薬学的組成物。
２１１．無菌である、態様209または態様210の薬学的組成物。
２１２．容器の中に態様209〜211のいずれかの薬学的組成物を含む製造物品であって、任意で、容器がバイアルである、製造物品。
２１３．容器が密封されている、態様212の製造物品。
２１４．態様209〜211のいずれかの薬学的組成物を対象に、または態様175〜202のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を対象に、投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
２１５．免疫応答を調節することが、対象において疾患または状態を処置する、態様214のいずれかの方法。
２１６．疾患または状態が、腫瘍またはがんである、態様215の方法。
２１７．態様209〜211のいずれかの薬学的組成物を対象に、または態様175〜202のいずれかのバリアントCD80融合タンパク質を対象に、投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法。
【実施例】
【０５３３】
VII.実施例
以下の実施例は、例示目的のためだけに含まれるものであり、そして、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０５３４】
実施例1
IgSFドメインの変異体DNA構築物の作製
実施例1では、酵母ディスプレイライブラリとして酵母の表面上で翻訳および発現させるためのヒトCD80 IgSFドメインの変異体DNA構築物の作製について説明する。
【０５３５】
A.縮重ライブラリ
以下の、免疫グロブリン様V型（IgV）ドメインを含有するSEQ ID NO:150に記載されている野生型ヒトCD80配列に基づいて、構築物を作製した。
2022501361.tif 000058
【０５３６】
縮重コドンを用いた完全なまたは部分的なランダム化のために特定の残基を標的とするライブラリでは、URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/のアルゴリズムを使用して、様々なアミノ酸置換をコードさせるための特定の混合塩基セット等の縮重コドンを作製した。一般的には、URL: rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8LにおけるCTLA4に結合したCD80の結晶構造情報から変異させる位置を選択し、CTLA4に対する改善された結合物質を選択するためにCD80::CTLA4界面に基づいて標的ライブラリを設計した。例えば、構造情報を使用して、縮重コドンを用いた突然変異誘発のために接触または非接触の界面残基を同定した。この解析は、URL：spdbv.vital-it.chで利用可能な構造ビューアを用いて行った。
【０５３７】
ライブラリ設計の次の工程は、ヒト、マウス、ラット、およびサルのCD80配列をアライメントして、変異誘発のために選択した残基のうちのどれが保存されている残基であるかを同定することであった。この分析に基づいて、保存アミノ酸変化と野生型残基のみを指定する縮重コドンを用いて、保存されている標的残基を変異させた。保存されていない残基がより激しく変異したが、野生型の残基も含まれていた。標的タンパク質の過剰な変異誘発を避けるために、野生型残基をコードしている縮重コドンも配置した。同様の理由で、各ライブラリにつき最大20箇所までしか変異誘発の標的としなかった。変異解析では、側鎖がリガンド／カウンター構造（counter structure）の方を向いている、結合面から6Å以内にある接触および非接触の界面残基に注目した。
【０５３８】
標的ライブラリをコードしているDNAを作製するために、最長80ヌクレオチド長であり、そして、変異誘発の標的となる残基位置に縮重コドンを含有する重複オリゴをIntegrated DNA Technologies（Coralville, USA）に注文した。オリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解させ、等モル比で混合し、5分間で95℃まで加熱し、アニーリングさせるために室温までゆっくりと冷却した。次いで、IgVドメイン遺伝子配列の始まりと終わりにアニーリングするIgVドメイン特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR産物を作製した。次いで、BamHIおよびKpnIのクローニングサイトを超え、そして該クローニングサイトを含んでpBYDS03クローニングベクター（Life Technologies, USA）と40bp重複するIgVドメイン特異的オリゴヌクレオチドを用いて、前の工程で得られたPCR産物100ngを増幅し、全てのエレクトロポレーションのために合計で少なくとも12μgのDNAを作製した。両ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、OneTaq 2x PCRマスターミックス（New England Biolabs, USA）を使用した。PCR精製キット（Qiagen, Germany）を用いて2回目のPCRからの産物を精製し、そして、滅菌脱イオン水に再懸濁させた。あるいは、最長200bpの長さのUltramers（登録商標）（Integrated DNA Technologies）をメガプライマーPCR（URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）と組み合わせて使用して、複数の小さな重複プライマーを用いると容易には組み込むことができない縮重コドンのより大きなストレッチを作製した。メガプライマーPCRを用いて完全長産物を作製した後、酵母への相同組換えのために、pBYDS03クローニングバリアントとの40bpの重複領域を含有するDNAプライマーを用いて、変異体IgVドメインライブラリを再度PCR増幅した。
【０５３９】
ライブラリ挿入の準備として、pBYDS03ベクターをBamHIおよびKpnIの制限酵素（New England Biolabs, USA）で消化し、そして、大きなベクター断片をゲル精製し、滅菌脱イオン水に溶解させた。合計体積50μLの脱イオン水および滅菌水中で12μgのライブラリDNAインサートを4μgの線状化ベクターと混合することにより、次の工程のためのエレクトロポレーションレディ（electroporation-ready）DNAを作製した。標的ライブラリを作製するための別の方法は、縮重コドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いて標的IgVドメインの部位特異的変異誘発（Multisite kit, Agilent, USA）を行うことである。このアプローチを使用して、DNAの幾つかの特定のストレッチのみを変異誘発の標的とするサブライブラリを作製する。これらの場合には、選択工程に進む前にサブライブラリを混合する。一般的に、サブライブラリがわずか10E4〜10E5の範囲であったことを除いて、ライブラリサイズは10E7〜10E8クローンの範囲であった。
【０５４０】
B.ランダムライブラリ
また、SEQ ID NO:150に記載されているCD80のIgVドメインの変異体（IgVドメインを含有）を同定するために、ランダムライブラリを構築した。野生型CD80 IgVドメインをコードしているDNAを、酵母ディスプレイベクターpBYDS03のBamHIサイトとKpnIサイトとの間にクローニングし、次いで、同じ制限酵素を用いて放出させた。次いで、放出されたDNAをGenemorph II Kit（Agilent Genomics, USA）を用いて変異誘発させて、ライブラリのバリアントごとに平均3〜5個のアミノ酸変化を生じさせた。次いで、変異誘発されたDNAを2段階PCRで増幅し、標的ライブラリについて上記した通りさらに処理した。
【０５４１】
ビーズを用いた数ラウンドの選択および反復FACSが完了した後、エラープローンPCRを介してクローンのプールをさらに変異させた。このようにして、野生型IgVプラスミド配列をテンプレートとして使用するのではなく、選択のアウトプットDNAをテンプレートとして使用することを通して、上に概説した工程に従って第2世代の変異体ライブラリを作り出した。
【０５４２】
実施例2
DNAライブラリの酵母への導入
縮重およびランダムなCD80ライブラリDNAを酵母に導入するために、酵母株BJ5464（ATCC.org；ATCC番号208288）のエレクトロポレーションコンピテントセルを調製し、そして、本質的に記載されている通り（Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358）、上記の工程からのエレクトロポレーションレディDNAを用いてGene Pulser II（Biorad, USA）においてエレクトロポレーションを行った。唯一の例外は、改変プラスミドpBYDS03が保有するLEU2選択マーカーに適応させるために、形質転換細胞を非誘導最少選択性SCD-Leu培地で成長させたことであった。1リットルのSCD-Leu培地は、14.7グラムのクエン酸ナトリウム、4.29グラムのクエン酸一水和物、20グラムのデキストロース、6.7グラムの酵母ニトロゲンベース、および1.6グラムのロイシンを含まない酵母合成ドロップアウト培地用添加物からなる。0.22μmの真空濾過装置を用いて、使用前に培地を濾過滅菌した。
【０５４３】
新たに回収した細胞の希釈液をSCD-Leu寒天プレートにプレーティングし、次いで、プレート1枚あたり少なくとも50個のコロニーが生じたプレーティングからの単一コロニー数からライブラリサイズを推定することによって、ライブラリサイズを求めた。エレクトロポレーション行った培養液の残りを飽和するまで成長させ、この培養液からの細胞をもう一度同じ培地に1/100継代培養し、飽和するまで成長させて、形質転換されていない細胞の割合を最小限に抑え、そして、2つ以上のライブラリバリアントを含有する可能性のある細胞からプラスミドを分離することを可能にした。ライブラリの多様性を維持するために、計算されたライブラリサイズよりも少なくとも10倍多い細胞を含有する接種材料を用いてこの継代培養工程を行った。2回目の飽和した培養液からの細胞を、滅菌した25％（重量／体積）グリセロールを含有する新鮮培地に10E10/mLの密度になるように再懸濁させ、凍結させ、-80℃で保存した（凍結ライブラリストック）。
【０５４４】
実施例3
酵母選択
実施例3では、CD80の親和性が改変されたバリアントを発現している酵母細胞の選択について説明する。CTLA4のCD80への結合がCD28のCD80への結合をアンタゴナイズすることは十分に立証されている（Schwartz J.C. et al. Nature 410, 604-08, 2001）。CD28よりもCTLA4に選択的に結合するCD80変異体を同定するために、CD80変異体ライブラリからの細胞を、ポジティブおよびネガティブのFACS選別ならびに変異誘発の反復ラウンドに供した。
【０５４５】
推定ライブラリサイズの少なくとも10倍に相当する数の細胞を個々のライブラリストックから解凍し、非誘導SCD-Leu培地に1.0×10E6細胞/mLになるように懸濁させ、そして、一晩成長させた。翌日、ライブラリサイズの10倍に相当する数の細胞を2000RPMで2分間遠心分離し、そして、誘導SCDG-Leu培地に0.5×10E6細胞/mLになるように再懸濁させた。1リットルのSCDG-Leu誘導培地は、水に溶解させ、0.22μmの膜濾過装置で滅菌した、5.4グラムのNa2HPO4、8.56グラムのNaH2PO4・H2O、20グラムのガラクトース、2.0グラムのデキストロース、6.7グラムの酵母ニトロゲンベース、および1.6グラムのロイシンを含まない酵母合成ドロップアウト培地用添加物からなる。酵母の細胞表面におけるライブラリタンパク質の発現を誘導するために、誘導培地中において室温で1日間培養物を成長させた。
【０５４６】
同族リガンドがロードされたプロテインA磁気ビーズ（New England Biolabs, USA）を用いて細胞を2回選別して、非結合物質を低減し、そして、外因性組換えカウンター構造タンパク質に結合する能力を有する全てのCD80バリアントを濃縮した。その後、これに続いて、CTLA4-Fc（R&D Systems, USA）への結合の改善を示す酵母細胞の割合を高めるために、外因性カウンター構造タンパク質染色を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）を複数ラウンド行った。これらポジティブ選択をネガティブFACS選択と交互に行い、CD28-Fcに結合するCD80クローンを除去した。磁気ビーズ濃縮およびフローサイトメトリーによる選択は、本質的にMiller K.D., et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008に記載の通り実施した。
【０５４７】
CD80ライブラリでは、以下の通りの標的リガンドタンパク質を使用した：社内で生成したヒトrCTLA4-Fc、ヒトrCD28-Fc、およびヒトrPD-L1（R&D Systems, Minneapolis, USA）。磁気プロテインAビーズは、New England Biolabs, USAから入手した。二色フローサイトメトリー選別には、Bio-Rad S3e選別機を使用した。CD80のディスプレイレベルは、Alexafluor488で標識された抗赤血球凝集素（HA）抗体（Life Technologies, USA）でモニタリングした。Fc融合タンパク質、rCTLA4Fc、rPD-L1、またはrCD28Fcのリガンド結合は、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）を用いて検出した。前方散乱（FSC）／側方散乱（SSC）パラメータを使用してダブレット酵母をゲートアウトし、そして、選別ゲートは、FL1においてより制限されたタグ発現結合を有していた、FL2で検出されたより高いリガンド結合に基づいていた。
【０５４８】
フローサイトメトリー選別からの酵母のアウトプットを、より高度に特異的な結合親和性についてアッセイした。選別アウトプットの酵母を増殖させ、そして、それがコードしている特定のIgSF親和性改変ドメインバリアントを発現するように再誘導した。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親株、野生型酵母株、またはビーズアウトプット酵母集団等の任意の他の選択されたアウトプットと比較することができる。
【０５４９】
CD80については、各集団を抗HA（赤血球凝集素）タグの発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、rCTLA4Fc、rPD-L1、またはrCD28Fcの結合について、2回目のFACSアウトプット（F2）を親CD80酵母と比較した。
【０５５０】
選択されたバリアントCD80 IgVドメインを、融合タンパク質としてさらにフォーマット化し、そして、下記の通り結合および機能活性について試験した。
【０５５１】
実施例4
Fc融合体としての、そして、様々な免疫調節タンパク質タイプにおける選択アウトプットの再フォーマット化
実施例4では、実施例3で同定された選択アウトプットを、Fc分子に融合したCD80の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様V型（IgV）ドメインを含む免疫調節タンパク質（バリアントIgVドメイン-Fc融合分子）として再フォーマット化することについて説明する。
【０５５２】
最後のフローサイトメトリーCD80選別からのアウトプット細胞プールを、SCD-Leu培地でターミナル密度（terminal density）まで成長させた。各アウトプットからのプラスミドDNAを、酵母プラスミドDNA単離キット（Zymoresearch, USA）を用いて単離した。Fc融合体については、選択したFc融合ベクターへのクローニングに好適な制限酵素部位が付加されたPCRプライマーを用いて、プラスミドDNAプレップから変異体標的IgVドメインのコーディングDNAをバッチ増幅させた。制限酵素消化後、PCR産物をFc融合ベクターにライゲーションさせ、続いて、供給元の指示通り大腸菌（E. coli）株XL1 Blue（Agilent, USA）またはNEB5alpha（New England Biolabs）にヒートショック形質転換した。あるいは、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs）を用いてインビトロ組み換えを行うために両端にFc融合ベクターとの40bpの重複領域を含有するプライマーを用いてアウトプットをPCR増幅し、これを、その後、大腸菌株NEB5alphaへのヒートショック形質転換に使用した。Fc融合ベクターの例は、pFUSE-hIgG1-Fc2（InvivoGen, USA）である。
【０５５３】
形質転換反応物の希釈液を、100μg/mLカルベニシリン（Teknova, USA）を含有するLB寒天にプレーティングして、選択のために単一コロニーを単離した。次いで、各形質転換からの最大96個のコロニーを、96ウェルプレートにおいて、LB-カルベニシリンブロス（Teknovaカタログ番号L8112）中37℃で一晩飽和するまで成長させ、全てのクローンにおいて変異を同定するために、IgVドメインインサートのDNAシーケンシング用に各ウェルから少量のアリコートを提出した。DNAシーケンシングのためのサンプル調製は、サービス提供者（Genewiz; South Plainfield, NJ）が提供するプロトコルを用いて行った。DNAシーケンシングのためのサンプルを取り除いた後、最終的なグリセロール含量を25％にするために残りの培養液にグリセロールを添加し、将来マスタープレートとして使用するためにプレートを-20℃で保存した（下記参照）。あるいは、使い捨ての96ウェルレプリケーター（VWR, USA）を用いて、成長した液体培養物から固体寒天プレートにレプリカプレーティングすることによって、DNAシーケンシング用のサンプルを作製した。これらプレートを一晩インキュベーションして成長パッチを作製し、そして、Genewizによる指定通りにプレートをGenewizに提出した。
【０５５４】
Genewizで作成されたDNAシーケンシングデータの解析から関心対象のクローンを同定した後、マスタープレートから関心対象のクローンを回収し、100μg/mLカルベニシリンを含有する液体LBブロス（Teknova, USA）において密度まで個々に成長させ、次いで、PureYield Plasmid Miniprep System（Promega）またはMidiPlusキット（Qiagen）等の標準的なキットを用いて各クローンのプラスミドDNAを調製するために培養物を使用した。Genewizのシーケンシングデータから関心対象のクローンを同定するには、一般的に、以下の手順を含む。まず、DNA配列データファイルをGenewizのウェブサイトからダウンロードした。次いで、IgVドメインのコード領域の先頭から始まるように、全ての配列をマニュアルキュレーションした。次いで、URL:www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/で入手可能な好適なプログラムを使用して、キュレーションした配列をバッチ翻訳した。次いで、URL:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlで入手可能な好適なプログラムを使用して、翻訳した配列をアライメントした。あるいは、Genewizで配列決定されたものを加工して、Ugeneソフトウェア（http://ugene.net）を用いてアラインメントを作成した。
【０５５５】
次いで、以下の基準を用いてアラインメントから関心対象のクローンを同定した：（1）同一のクローンがアラインメントにおいて少なくとも2回生じること、および（2）変異がアラインメントにおいて少なくとも2回生じ、好ましくは異なるクローンに生じること。これら基準のうちの少なくとも1つを満たすクローンを、結合が改善されたために選別プロセスによって濃縮されたクローンであると考えた。
【０５５６】
少なくとも1つの親和性改変ドメインを有するCD80のIgVドメインを含有するFc融合タンパク質（例えば、バリアントCD80 IgV-Fc）である組換え免疫調節タンパク質を作製するために、以下の通りにタンパク質をコードするように、バリアントをコードしているDNAを作製した：バリアント（変異体）CD80 IgVドメイン、続いて、3つのアラニン（AAA）のリンカー、続いて、エフェクター機能を欠く不活性Fc。場合によって、不活性Fcは、例えばSEQ ID NO:1519に記載されているような、変異C220S、R292C、N297G、およびV302C（EU番号付けによる）（SEQ ID NO:1502に記載の野生型ヒトIgG1 Fcを参照すると、C5S、R77C、N82G、およびV87Cに対応する）を含有するFcである。場合によって、不活性Fcは、例えばSEQ ID NO.1518または1520に記載されているような、変異C220S、L234A、L235E、およびG237A（EU番号付けによる）を含有するFcであった。あるいは、アミノ酸（GSGGGGS；SEQ ID NO:1522）を含有するリンカーの後に、SEQ ID NO:1520に記載のエフェクター機能を欠く不活性Fcまたはそのアロタイプが続くことを除いて同様の方法で、CD80 IgVドメインを融合させた。場合によって、ヒトIgG1 Fcがエフェクター活性可能であった（エフェクター）ことを除いて同様の方法でCD80 IgVドメインを融合させた。この構築物は抗体を含まないので、システインと共有結合を形成することができる軽鎖、例えば、例示的なヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:1517に記載）は、EU番号付けによる220位のシステイン残基のセリン残基への置換（C220S）を含有していた（SEQ ID NO:1502に記載の野生型または非改変のFcを参照すると5位（C5S）に対応する）。
【０５５７】
実施例5
Fc-融合体の発現および精製
実施例5では、上記実施例に記載のバリアントIgV CD80を含有するFc融合タンパク質のハイスループット発現および精製について説明する。
【０５５８】
Expi293発現系（Invitrogen, USA）を用いて、懸濁適応ヒト胚腎臓（HEK）293細胞から組換えバリアントFc融合タンパク質を生成した。前の工程からの各プラスミドDNA 4μgを200μLのOpti-MEM（Invitrogen, USA）に添加し、同時に10.8μLのExpiFectamineを別の200μLのOpti-MEMに別々に添加した。5分後、200μLのプラスミドDNAを200μLのExpiFectamineと混合し、追加で20分間さらにインキュベーションした後、この混合物を細胞に添加した。1000万個のExpi293細胞を、滅菌した10mLのコニカル底深型24ウェル成長プレート（Thomson Instrument Company, USA）の別々のウェルの、体積4mLのExpi293培地（Invitrogen, USA）中に分注した。湿度95％および8％CO2に設定した哺乳類細胞培養インキュベータにおいて、120RPMで5日間プレートを振盪した。5日間インキュベーションした後、細胞をペレット化し、そして、培養上清を保持した。
【０５５９】
ハイスループット96ウェルフィルタープレート（Thomsonカタログ番号931919）を用いて上清からタンパク質を精製し、各ウェルに60μLのMab SelectSure settled bead（GE Healthcareカタログ番号17543801）をロードした。50mM酢酸塩pH3.3の200μLの画分でタンパク質を4回連続して溶出させた。各画分のpHを、4μLの2M Tris pH8.0でpH5.0超に調整した。画分をプールし、そして、Nanodrop装置（Thermo Fisher Scientific, USA）によって測定した280nmの吸光度を用いて定量し、そして、Mini-Protean TGX Stain-Freeゲルに5μgの非還元タンパク質をロードすることによって、タンパク質の純度を評価した。次いで、Bio Rad Chemi Doc XRSゲルイメージャでタンパク質を可視化した。
【０５６０】
実施例6
親和性が改変されたIgSFドメインを含有する分子の結合の評価
この実施例では、CD80ドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性および親和性を評価するために、細胞で発現したCTLA4、PD-L1、およびCD28のカウンター構造への上記実施例からの精製タンパク質のFc融合体結合試験について説明する。ヒトのCTLA4、PD-L1、およびCD28のそれぞれについての完全長哺乳類表面発現構築物を、pcDNA3.1発現ベクター（Life Technologies）で設計し、そして、Genscript, USAから入手した。Expi293F一過性トランスフェクション系（Life Technologies, USA）を用いて完全長哺乳類表面リガンドを発現するように作製した、トランスフェクションされたHEK293細胞において結合試験を行った。対照として、モック（トランスフェクションされていない）細胞への結合も評価した。実験に必要な細胞数を求め、そして、製造業者推奨のプロトコルを用いて適切な30mLスケールのトランスフェクションを行った。各CTLA4、PD-L1、CD-28、またはモックの30mLトランスフェクションごとに、7500万個のExpi293F細胞を30μgの発現構築物DNAおよび1.5mLの希釈したExpiFectamine293試薬と共に48時間インキュベーションし、その時点で染色のために細胞を収集した。
【０５６１】
フローサイトメトリーによる染色および分析のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照（モック）の細胞100,000個を96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞をスピンダウンし、そして、染色バッファ（PBS（リン酸緩衝生理食塩水）、1％BSA（ウシ血清アルブミン）、および0.1％アジ化ナトリウム）に20分間再懸濁させて、非特異的結合を遮断した。その後、細胞を遠心分離し、そして、50μL中に、各候補バリアントCD80 Fcタンパク質の実験に応じて200nM〜91pMの各候補バリアントCD80 Fcを含有する染色バッファに再懸濁させた。対照として、野生型CD80-ECD-Fc（R&D Systems）、野生型CD80-ECD-Fc（不活性）、野生型IgV-Fc（不活性）、および／またはヒトIgG（Sigma）の結合活性も評価した。氷上で45分間一次染色を行い、その後、染色バッファで2回細胞を洗浄した。PEコンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を50μLの染色バッファで1:150希釈し、細胞に添加し、そして、氷上でさらに30分インキュベーションした。二次抗体を2回洗い流し、細胞を4％ホルムアルデヒド／PBSで固定し、そして、サンプルをIntellicytフローサイトメータ（Intellicyt Corp, USA）で分析した。各トランスフェクタントおよびモックトランスフェクションされたHEK293について、FlowJoバージョン10ソフトウェア（FlowJo LLC, USA）を用いて平均蛍光強度（MFI）を計算した。
【０５６２】
例示的なCD80バリアントについての2つの結合試験の結果を表E1およびE2に示す。表中。例示的なアミノ酸置換は、それぞれの参照非改変ECD配列の付番に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。例えば、参照非改変ECD配列は、SEQ ID NO:2に記載の非改変CD80 ECD配列である。アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が数字の前に記載され、同定されたバリアントのアミノ酸置換が数字の後に記載されている。2列目には、各バリアントIgV-Fc融合分子のバリアントIgVの配列番号識別子が記載されている。
【０５６３】
また、指定の同族カウンター構造リガンド（すなわち、CTLA-4、PD-L1、またはCD28）を発現するように遺伝子操作された細胞に対する各バリアントCD80 Fc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された結合活性、および同じ細胞で発現しているカウンター構造リガンドに対するアミノ酸置換を含有しない対応する非改変CD80 IgV-Fc融合分子の結合と比較したバリアントCD80 IgV-FcのMFIの比も示す。CD28カウンター構造リガンドに対するバリアントCD80IgV-Fcの結合と比較した、CTLA-4カウンター構造リガンドに対するバリアントCD80IgV-Fcの結合の比も、表の最後の列に示す。
【０５６４】
表E1および表E2に示すように、この選択の結果、CTLA-4および/またはPD-L1のカウンター構造リガンドへの結合の増加を呈するように親和性が改変された多数のCD80 IgVドメインバリアントが同定された。さらに、結果は、CD28カウンター構造リガンドと比較したCTLA-4カウンター構造リガンドに対する結合（CTLA4:CD28の比）の増加を呈する幾つかのCD80 IgVドメインバリアントを含む、CD28に対する結合の減少を呈する多数のバリアントが選択されたことを示す。
【０５６５】
（表Ｅ１）CTLA4、CD28、またはPD-L1でトランスフェクションされたHEK293細胞に対するバリアントCD80の結合
2022501361.tif 000059
2022501361.tif 000060
【０５６６】
（表Ｅ２）CTLA4、CD28、またはPD-L1でトランスフェクションされたHEK293細胞に対するバリアントCD80の結合
2022501361.tif 000061
2022501361.tif 000062
【０５６７】
実施例7
追加のバリアントCD80 IgVドメインの選択および結合活性の評価
CD80 IgVバリアントとカウンター構造CTLA4、CD28、およびPDL1との相互作用の親和性および機能的効力を改良するために、実質的に実施例1〜3に記載されている手順を用いて、第2世代および第3世代（Gen）のランダム変異誘発および選択を行った。簡潔に述べると、FACS選択後より速く成長した（outgrown）酵母から酵母プラスミドDNAを単離し、そして、変異誘発性PCRのテンプレートとして使用した。多様性を最大化するために、特性評価された個々のバリアントおよびFACSで選択されたバリアントのプールの両方をテンプレートとして使用した。その結果得られたライブラリを、FACS選択および成長の反復ラウンドに供した。CD28親和性を維持しながらPDL1親和性を高めるために、複数のFASC選別進行経路をとった。第2世代の変異誘発ライブラリをCD28-の選択とCTLA4+の選択とを交互に行う4回のFACS選択に供し、カウンター構造に対してタイトレーションした際に、Fcベクターに再フォーマット化するために選択されたアウトプットが作製された。第3世代の変異誘発ライブラリでは、以下のFACS選択経路を使用して、カウンター構造に対してタイトレーションした際に、Fcベクターに再フォーマット化するために選択された酵母アウトプットが得られた。1. 50nM PDL1+、2a. 1nM CTLA4+、2b. 20nM CTLA4-、2a3. 10nM PDL1+、2b3. 10nM PDL1+、2b34. 25nM CD28+。CD80の親和性改変バリアントを発現している酵母を選択した後、選択されたバリアントを、IgV CD80バリアントを含有する追加のFc融合タンパク質を作製するためにFc融合体として再フォーマット化した。配列解析後、タンパク質の生成、結合、および機能のアッセイのために、個々のバリアントを選択した。第1世代の変異誘発からのバリアントを表E1に示し、第2世代を表E2に示し、第3世代を表E3およびE4に示す。
【０５６８】
選択された免疫調節融合タンパク質の同族結合パートナーに対する結合を評価した。CD80同族結合パートナーhuCTLA4およびhuPD-L1を発現する細胞を生成するために、完全長哺乳類表面発現構築物を作製し、レンチウイルスに組み込み、そして、CHO細胞に形質導入した。細胞をBio-Rad S3細胞選別機（Bio-Rad Corp., USA）で＞98％の純度になるように選別した。内因的にCD28を発現するJurkat/IL2レポーター細胞を使用して、CD28に対する結合を検出した。
【０５６９】
フローサイトメトリーによる染色および分析のために、適切なトランスフェクションされた細胞100,000個を96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞をスピンダウンし、そして、染色バッファ（リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、および0.1％アジ化ナトリウム）に20分間再懸濁させて、非特異的結合を遮断した。その後、細胞を遠心分離し、そして、50μLにおいて各候補バリアントCD80-Fcタンパク質の6点連続希釈液（濃度は100nM〜41pMの範囲）を含有する染色バッファに再懸濁させた。氷上で45分間一次染色を行い、その後、染色バッファで2回細胞を洗浄した。フィコエリトリン（PE）コンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を1:150希釈し、細胞に添加し、そして、氷上でさらに30分インキュベーションした。次いで、細胞を150μL/ウェルの染色バッファで2回洗浄し、2%ホルムアルデヒド/PBSで固定し、そして、Intellicytフローサイトメータ（Intellicyt Corp., USA）で分析した。各細胞型について、FlowJoバージョン10ソフトウェア（FlowJo LLC, USA）を用いてPE平均蛍光強度（MFI）を計算した。
【０５７０】
例示的なCD80バリアントについての2つの結合試験の結果を表E3およびE4に示す。表中、例示的なアミノ酸置換は、それぞれの参照非改変IgV配列の付番に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。例えば、参照非改変ECD配列は、SEQ ID NO:2に記載の非改変CD80 ECD配列である。アミノ酸位置が中央に示されており、対応する非改変（例えば、野生型）のアミノ酸が数字の前に記載され、同定されたバリアントのアミノ酸置換が数字の後に記載されている。2列目には、各バリアントIgV-Fc融合分子のバリアントIgVの配列番号識別子が記載されている。
【０５７１】
また、指定の同族カウンター構造リガンド（すなわち、CTLA-4、PD-L1、またはCD28）を発現するように遺伝子操作された細胞に対する33nMの各バリアントCD80 Fc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された結合活性、および同じ細胞で発現しているカウンター構造リガンドに対するアミノ酸置換を含有しない非改変CD80 ECD-Fc融合分子（R&D Systems, USA）の結合と比較したバリアントCD80 IgV-FcのMFIの比も示す。CD28カウンター構造に対するバリアントCD80 IgV-Fcの結合と比較した、PD-L1カウンター構造に対するバリアントCD80 IgV-Fcの結合の比も、表の最後の列に示す。
【０５７２】
示すように、この選択の結果、PD-L1および/またはCD28カウンター構造への結合の増加を呈するように親和性改変された幾つかのCD80 IgVドメインバリアントが同定された。また、幾つかのバリアントはCTLA-4に対する結合を維持していたかまたは結合の増加を呈したが、他のバリアントはCTLA-4に対する結合の減少を呈した。さらに、結果は、CD28カウンター構造リガンドと比較したPD-L1カウンター構造リガンドに対する結合（PD-L1:CD28の比）の増加を呈する幾つかのCD80 IgVドメインバリアントを含む、CD28に対する結合の減少を呈する多数のバリアントが選択されたことを示す。したがって、これらバリアントは、フローサイトメトリーによって測定した細胞表面CTLA4、CD28、およびPD-L1の結合について固有のプロファイルを有する。
【０５７３】
（表Ｅ３）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkat細胞（CD28）およびCHO細胞に対するバリアントCD80フロー結合
2022501361.tif 000063
2022501361.tif 000064
2022501361.tif 000065
【０５７４】
（表Ｅ４）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkat細胞（CD28）およびCHO細胞に対するバリアントCD80フロー結合
2022501361.tif 000066
2022501361.tif 000067
2022501361.tif 000068
【０５７５】
結合をさらに比較するために、様々な濃度の例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子を評価し、そして、細胞表面で発現したPD-L1、CD28、およびCTLA-4に対する結合について野生型CD80 IgV-Fcと比較した。例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcは、以下を含んでいた：
E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）、
H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、
H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G（SEQ ID NO:490）、および
E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）。
CD28を発現しているJurkat/IL2レポーター細胞を用いてCD28に対する結合を評価し、そして、上記の通りhuCTLA-4またはhuPD-L1を発現するよう安定的にトランスフェクションされたCHO細胞を用いてCTLA-4およびPD-L1に対する結合を評価した。指定のトランスフェクタントまたは細胞株をプレーティングし、そして、タイトレーションされた量のCD80 vIgD-Fcまたは野生型CD80 IgV-Fcで染色した。結合したタンパク質を蛍光色素コンジュゲート抗huFcで検出し、フローサイトメトリーによって平均蛍光強度（MFI）を測定した。図4に示すように、いくつかの試験したCD80 vIgD-Fcは、野生型のCD80よりも高い親和性でヒトPD-L1、ヒトCTLA-4、およびヒトCD28に結合した。
【０５７６】
実施例8
Jurkat/IL2レポーターアッセイを用いた親和性成熟CD80 IgSFドメイン含有分子の生物活性の評価
この実施例では、CD28共刺激の遮断についてCD80ドメインバリアント免疫調節タンパク質の生物活性を評価するためのJurkat/IL2レポーターアッセイについて説明する。
【０５７７】
アッセイの前日にアッセイプレートを調製した。アッセイプレートを調製するために、PBS中10nM 抗CD3抗体（クローンOKT3；BioLegend、カタログ番号317315）および20nM CD86-Fc（R&D Systems、カタログ番号141-B2）を、100μL/ウェルで白色平底96ウェルプレート（Costar）に分注した。このプレートを4℃で一晩インキュベーションして、抗体およびCD86-Fcタンパク質をプレートの表面に付着させた。翌日、アッセイ前に、アッセイプレートのウェルを150μLのPBSで2回洗浄した。
【０５７８】
アッセイ当日、60μLの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc融合分子、および対照である野生型CD80 IgV-Fcもしくは野生型CD80（ECD）-Fcの分子、もしくは陰性対照であるFcのみを、アッセイバッファ（RPMI1640＋5％ウシ胎児血清（FBS））中40nMの濃度に希釈して、またはバッファのみを、新たな96ウェルポリプロピレンプレートのウェルに添加した。IL-2-ルシフェラーゼレポーターを発現しているJurkatエフェクター細胞をカウントし、そして、2×106細胞/mLの濃度になるようにアッセイバッファに再懸濁させた。次いで、60μLのJurkat細胞懸濁液を、CD80-Fc融合分子または対照を含むウェルに添加した。細胞およびCD80タンパク質を室温で15分間インキュベーションし、次いで、100μLの細胞/CD80タンパク質混合物を、調製された抗CD3/CD86-Fcアッセイプレートのウェルに移した。
【０５７９】
アッセイプレートを短時間スピンダウンし（1200RPMで10秒間）、そして、37℃で5時間インキュベーションした。5時間インキュベーションした後、プレートを取り出し、そして、15分間室温に平衡化させた。100μLのBio-Glo（Promega）をアッセイプレートのウェルに添加し、次いで、これをオービタルシェーカー上に10分間置いた。BioTek Cytation 3 ルミノメータを用いて、1ウェルあたり1秒の積分時間で発光を測定した。
【０５８０】
各バリアントCD80 IgV Fcについて平均相対発光値を求め、そして、野生型CD80 IgV-Fcタンパク質と比較して、各バリアントについてのIL-2レポーターシグナルの増加倍率を計算した。結果を以下の表E5に与える。
【０５８１】
表E5に示すように、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子の多くを、IL-2-ルシフェラーゼレポーターを発現しているJurkatエフェクター細胞と共培養した結果、バッファのみまたはFcのみの陰性対照と比較して、CD28の共刺激が減少した（すなわち遮断）。バリアントCD80 IgV-Fc分子の幾つかは、野生型CD80 IgV-Fc分子と比較してCD28の共刺激シグナルを増加させると考えられ、これは、アゴニスト活性の可能性を示唆している。
【０５８２】
（表Ｅ５）Jurkat/IL2レポーターアッセイ：CD28共刺激の遮断
2022501361.tif 000069
2022501361.tif 000070
【０５８３】
実施例9
Jurkat/IL2レポーターアッセイを用いたPD-L1の存在下および非存在下における親和性成熟CD80 IgSFドメイン含有分子の生物活性の評価
この実施例では、PD-L1を発現している抗原提示細胞の存在下または非存在下において、不活性なFc分子（例えば、SEQ ID NO:1520またはそのアロタイプ）またはエフェクター活性を媒介することができるFc分子（SEQ ID NO:1517）のいずれかに融合したCD80ドメインバリアント免疫調節タンパク質がCD28共刺激シグナルを調節する能力を評価するためのJurkat/IL2レポーターアッセイについて説明する。
【０５８４】
A. PD-L1依存性CD28共刺激
IL-2-ルシフェラーゼーレポータを発現しているJurkatエフェクター細胞（Promega Corp., USAから購入）を、Jurkatアッセイバッファ（RPMI1640＋5% FBS）に2×106細胞/mLで懸濁させた。次いで、1ウェルあたり合計100,000個のJurkat細胞を50μL/ウェルでプレーティングした。
【０５８５】
各ウェルに、25μLの試験タンパク質をJurkat細胞に添加した。試験タンパク質は、バリアントCD80 IgV-Fc（不活性）融合分子またはフルCD80-ECD-Fc（R&D Systems, USA）または野生型CD80-IgV-Fc（不活性）を含んでいた。全てのタンパク質を、200nM、66.7nM、および22.2nM（PD-L1なし）、または200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM、および2.5nM（+PD-L1）で添加した。試験タンパク質または対照タンパク質を含むJurkat細胞を室温で15分間インキュベーションした。形質導入された細胞表面抗CD3一本鎖Fv（OKT3）（すなわち、PD-L1なし）またはOKT3およびPD-L1（すなわち、+PD-L1）を提示しているCHO由来の人工抗原提示細胞（aAPC）を0.8×106細胞/mLにし、そして、各ウェルに25μLの細胞を添加して、各ウェルの最終体積を100μLにした。各ウェルのJurkat：CHO細胞の最終比率は5:1であり、かつ、試験タンパク質濃度は50、16.7、もしくは5.6nM（PD-L1なし）、または50、16.7、5.6、1.9、および0.6nM（＋PD-L1）であった。Jurkat細胞およびCHO細胞を、加湿された5％CO2インキュベーションチャンバー内において摂氏37度で5時間インキュベーションした。次いで、プレートをインキュベータから取り出し、15分間室温に順化させた。100μLの細胞溶解液およびルシフェラーゼ基質溶液（BioGloルシフェラーゼ試薬, Promega）を各ウェルに添加し、そして、プレートをオービタルシェーカーで10分間インキュベーションした。BioTek Cytationルミノメータを用いて、1ウェルあたり1秒の積分時間で発光を測定し、各試験サンプルの相対発光値（RLU）を求めた。結果を表E6に与える。
【０５８６】
aAPC上にPD-L1が存在しない場合、不活性Fcに融合したバリアントCD80分子がCD28を介した共刺激シグナルを誘導することができなかったという所見と一致して、共刺激シグナルはほとんどまたは全く観察されなかった。しかし、PD-L1の存在下では、試験したバリアントCD80-IgV-Fc（不活性）分子の幾つかが濃度依存性のCD28共刺激を呈し、これはバリアント分子のCD28および/またはPD-L1結合親和性と相関していた。この結果は、PD-L1に対する親和性が増大したバリアントCD80分子がCD28のPD-L1依存性共刺激を媒介できることを示す。
【０５８７】
（表Ｅ６）PD-L1依存性CD28共刺激
2022501361.tif 000071
【０５８８】
さらなる実験では、各試験タンパク質の最終濃度が50nMおよび5nMであったことを除いて上記の通り、aAPC+/-PD-L1の非存在下におけるCD28刺激について、他のバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）融合タンパク質を試験した。各試験サンプルについて相対発光値（RLU）を求め、そして、各バリアントCD80-IgV分子についてIL-2レポーターシグナルの増加（または減少）倍率を計算し、野生型CD80-ECD-Fc（不活性）およびCD80-IgV-Fc（不活性）タンパク質と比較した。
【０５８９】
表E7およびE8に示すように、K562/OKT3/PD-L1 aAPCおよび50nM CD80-IgV-Fc（不活性）分子と共培養したJurkatエフェクター細胞のルシフェラーゼ活性は、試験した分子の幾つかで変化（増加または減少）していた。aAPCにおけるPD-L1およびJurkat細胞におけるCD28が同時に結合した結果、CD28共刺激および下流のIL-2シグナル伝達が増加した。野生型CD80-IgV-Fc（不活性）に対する発光の増加（または減少）倍率も示す。表中、1列目に変異が記載され、そして、2列目に試験したCD80-IgV Fc（不活性）バリアントの各CD80-IgVについての配列番号識別子が記載されている。
【０５９０】
（表Ｅ７）Jurkat/IL2+K562/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000072
【０５９１】
（表Ｅ８）Jurkat/IL2+K562/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000073
【０５９２】
さらに活性を比較するために、上記のK562/OKT3/PDL1 aAPC細胞株を用いて、様々な濃度の例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）をJurkat/IL2レポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導について評価し、そして、活性を野生型CD80 IgV-Fc（不活性）と比較した。試験した例示的なバリアントCD80 IgV分子は、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G（SEQ ID NO:490）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、およびE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）を含んでいた。図5に示すように、例示的な試験したバリアントCD80 IgVドメイン含有分子は、用量依存的にPD-L1依存性CD28共刺激を誘導した。評価した濃度のいずれにおいても、野生型CD80 IgV-FcによるPD-L1依存性CD28共刺激は観察されなかった。
【０５９３】
B. PD-L1依存性共刺激後のサイトカイン産生
上記のK562/OKT3/PDL1 aAPC細胞をマイトマイシン-cで処理し、そして、タイトレーションされた漸増濃度のCD80 IgV-Fc（不活性）または野生型CD80 IgV-Fc（不活性）の存在下で初代ヒト汎T細胞と共培養した。試験した例示的なバリアントCD80-Fcは、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E（SEQ ID NO:499）を含んでいた。さらなる対照として、初代ヒト汎T細胞を、例示的な抗PD-L1デュルバルマブまたはFc（不活性）のみの対照とも一緒に培養した。図6に示す結果は、試験した例示的なバリアントCD80-IgV-Fc分子によってPD-L1依存性共刺激が誘導されたという所見と一致して、試験したバリアントCD80-IgV-Fc分子が培養上清中にIL-2を分泌したことを示した。野生型CD80-IgV Fcまたは他の試験した対照と共に培養したとき、T細胞培養物においてIL-2の産生は観察されなかった。
【０５９４】
C. Fc依存性CD28共刺激+/-PD-L1
さらなる実験において、FcがFc受容体（FcR）への結合を介してエフェクター活性を媒介することができるIgG1 Fc（例えばSEQ ID NO:1517）である場合のバリアントCD80-IgV-Fc融合タンパク質について、CD28共刺激を評価した。CHO/OKT3およびCHO/OKT3/PD-L1の細胞の代わりに、OKT3（K562/OKT3）またはOKT3およびPD-L1（K562/OKT3/PD-L1）が安定的に形質導入されたCD32発現K562細胞を用いたことを除いて、上記パートAに記載の通り実験を行い、そして、結果を表E9に示す。
【０５９５】
（表Ｅ９）Fc受容体またはPD-L1依存性架橋を介したCD28共刺激
2022501361.tif 000074
【０５９６】
E35D、E35D/M43L/L70M、およびA26E/E35D/M47L/L85Qを含む例示的な評価したバリアントCD80-IgV Fc（エフェクター）免疫調節タンパク質の幾つかは、FcRに結合することによって架橋されたときにCD28共刺激に影響を及ぼさなかった。しかし、この結果は、FcRに結合することができるFc（エフェクター）を有する幾つかの例示的な評価したバリアントが、FcRの架橋とトランスでCD28共刺激を提供できることを示していた。中でも、E35D/M47I等の例示的な評価したCD80-IgV Fc（エフェクター）免疫調節タンパク質の幾つかは、PD-L1およびFcRの両方の架橋を介してCD28共刺激を強化した。場合によって、結果は、FcRおよびPD-L1の架橋によって強化されたCD28共刺激が、PD-L1のみの架橋よりも強力であったことを示した。
【０５９７】
実施例10
追加のバリアントCD80 IgVドメインの作製
A. 追加のCD80 IgV結合ドメインおよび結合評価
本質的に実施例2〜5に記載の通り、追加のCD80バリアントを作製し、そして、Fc融合タンパク質として発現させた。実質的に実施例7に記載の通り結合について、そして、実質的に実施例9に記載の通り生物活性について、バリアントを試験した。結合および活性の試験結果を表E10〜E13に与える。
【０５９８】
1.  結合評価
（表Ｅ１０）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000075
【０５９９】
（表Ｅ１１）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000076
2022501361.tif 000077
2022501361.tif 000078
【０６００】
生物活性評価
（表Ｅ１２）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000079
【０６０１】
（表Ｅ１３）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000080
2022501361.tif 000081
【０６０２】
B. バリアントCD80 IgV結合ドメインの作製およびハイスループット選択
実施例7に記載した酵母アウトプットから300個のCD80 IgV-Fc構築物を作製した後、追加のCD80 IgVバリアントを選択した。次いで、CD80 IgV-Fcタンパク質を含有する上清を、Octet（登録商標）システムを用いて96ウェルプレートフォーマットでPD-L1結合についてスクリーニングした。上記の実施例7に記載の通り高いPD-L1結合を呈したバリアントを選択し、結合について再スクリーニングを行い、そして、高いPD-L1結合を呈したバリアントを選択した。例示的なバリアントおよびFACS結合データを表E14に与える。選択されたバリアントを、実質的に実施例9に記載の方法を用いて生物活性についても評価し、そして、その結果を表E15に示す。
【０６０３】
（表Ｅ１４）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000082
【０６０４】
（表Ｅ１５）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000083
【０６０５】
C. CD80 IgVコンセンサスバリアントの作製
上記酵母選択の全てからのアウトプットのアラインメントに基づいて、CD80 IgVバリアントのコンセンサスバリアントを設計した。次いで、このコンセンサス配列を用いてCD80 IgV-Fcタンパク質を作製し、次いで、上記の通り結合および生物活性について試験した。結合および生物活性の結果を、それぞれ表E16とE17に与える。
【０６０６】
（表Ｅ１６）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000084
【０６０７】
（表Ｅ１７）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000085
【０６０８】
実施例11
CD80 IgVバリアントのパネルの結合活性の評価
SEQ ID NO:465、491、および495に記載の選択されたバリアントのセットを参照して結合および活性に関与する残基を同定するために、復帰（逆）変異のパネルを設計し、そして、実質的に実施例4および5に記載の通りFc融合タンパク質として発現させた。作製されたバリアントは、表E18に記載の通り、SEQ ID NO:465、491、および495にみられる1〜6個の変異を様々な組み合わせで含んでいた。
【０６０９】
（表Ｅ１８）追加のCD80バリアント
2022501361.tif 000086
2022501361.tif 000087
2022501361.tif 000088
【０６１０】
上記の通り、バリアントを結合および生物活性について試験した。結合結果を表E19およびE20に記載し、そして、生物活性結果を表E21およびE22に記載する。
【０６１１】
（表Ｅ１９）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000089
2022501361.tif 000090
【０６１２】
（表Ｅ２０）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞へのフロー結合
2022501361.tif 000091
2022501361.tif 000092
2022501361.tif 000093
【０６１３】
（表Ｅ２１）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000094
2022501361.tif 000095
【０６１４】
（表Ｅ２２）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000096
【０６１５】
実施例12
NNKライブラリ選択を介したバリアントの最適化
SEQ ID NO:465、491、および495に記載されている位置を参照して18、26、35、47、48、68、71、85、88、90、および93位に変異の組み合わせを有する追加のバリアントCD80 IgVドメイン含有分子を作製した。縮重コドンが全ての潜在的なアミノ酸をコードするが、2つの終止残基TAAおよびTGAをコードするのは防ぐように、選択された位置でNNKライブラリ（式中、N=A、G、CまたはTであり、そして、K=TまたはGである）からバリアントを作製した。NNK含有DNAを実質的に実施例2に記載の通り酵母に導入して、酵母ライブラリを作製した。このライブラリを用いて、実質的に実施例3に記載の通りCD80の親和性改変バリアントを発現している酵母を選択した。
【０６１６】
実質的に実施例4に記載の通りrhPD-L1-Fcを用いた3ラウンドのFACS選択からのアウトプットを、実質的に実施例5に記載の通りさらにフォーマット化し、選択し、そして、不活性Fc融合タンパク質として発現させた。実質的に実施例7に記載の通り結合について、そして、実質的に実施例9に記載の通り生物活性について、Fc融合タンパク質を試験した。野生型CD80 ECD-Fc（不活性）、野生型CD80 IgV-Fc（不活性）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）CD80 IgV-Fc（不活性）、および不活性Fcのみの結合および生物活性についても参照用に測定した。結合および活性の試験結果を、それぞれ表E23およびE24に与える。
【０６１７】
（表Ｅ２３）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkat（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000097
2022501361.tif 000098
【０６１８】
（表Ｅ２４）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000099
【０６１９】
実施例13
CD80 IgV-Fcリンカーバリアント
IgVドメインとFcドメインとの間に様々な連結領域（リンカー）を有するCD80 IgV-Fcバリアントを構築し、そして、結合および／または生物活性を評価した。EAAAK（SEQ ID NO:1241）、(EAAAK)3（SEQ ID NO:1242）、GS(G4S)3（SEQ ID NO:1243）、GS(G4S)5（SEQ ID NO:1244）のリンカーを含有する、CD80 E35D/M47V/N48K/V68M/K89N IgV-FcおよびE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV-Fcタンパク質を含有する融合タンパク質を作製した。
【０６２０】
また、野生型CD80においてIgVをIgCに接続させる3つのアミノ酸が欠失したCD80 IgV骨格配列にE35D/M47V/N48K/V68M/K89NまたはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88Dの改変を含有するCD80 IgV-Fcタンパク質も作製した（骨格配列はSEQ ID NO:1245に記載）。次いで、作製されたバリアントCD80 IgVを、さらにヒンジ領域の6アミノ酸を欠く不活性Fc（SEQ ID NO:1240に記載のFc）に融合させた。この戦略によって作製された分子を、追加のリンカーなしに直接Fcに融合させ、「デルタ」リンカーと命名した。
【０６２１】
次いで、CD80-IgV-Fcバリアントを、実施例7および9に記載の通り結合および生物活性について試験した。また、比較のために、GSG4Sリンカー（SEQ ID NO:1522）を含有する野生型CD80 IgV（SEQ ID NO:150）-Fc（不活性）、CD80 ECD（SEQ ID NO:2）-Fc（不活性）、および不活性Fcのみの結合および生物活性も測定した。結果をそれぞれ表E25およびE26に与える。
【０６２２】
（表Ｅ２５）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているJurkats（CD28）およびCHO細胞に対するフロー結合
2022501361.tif 000100
【０６２３】
（表Ｅ２６）Jurkat/IL2+CHO/OKT3/PD-L1レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000101
【０６２４】
実施例14
T細胞刺激アッセイを用いた親和性成熟CD80 IgSFドメイン含有分子の生物活性の評価
不活性FcまたはエフェクターFcのいずれかを含有するCD80-IgV-Fc分子を、人工抗原提示細胞（aAPC）、K562/OKT3+/-PD-L1の存在下で、サイトカイン放出（IFN-γおよびIL-2）およびT細胞増殖によって測定されるT細胞を刺激する能力について、1nM、10nM、および100nMの3つの濃度で試験した。
【０６２５】
100,000個の単離された汎T細胞を、8,000個のK562/OKT3細胞またはK562/OTK3/PD-L1細胞（12.5:1比）および1nM、10nM、または100nMのCD80-IgV-Fc（エフェクター）またはCD80-IgV-Fc（不活性）と共にインキュベーションした。また、細胞混合物を、抗PD-L1抗体、野生型ヒトIgG1、ヒトIgG1 Fc（不活性）、野生型CD80 IgV-Fc（エフェクター）、野生型CD80 IgV-Fc（不活性）、野生型CD80 ECD-Fc（不活性）、野生型CD80 ECD-Fc（エフェクター）と共に、または対照として無処理でインキュベーションした。72時間インキュベーションした後、IFN-γ、IL-2、および増殖を測定した。
【０６２６】
IL-2放出の結果を表E27に記載する。第1の実験では、特定の例示的な評価したバリアントCD80 IgV-Fc（エフェクター）分子の存在下でT細胞およびK562/OKT3 aAPC（PD-L1を発現していない）を共培養した結果、IL-2産生が増加した。第2の実験では、これらバリアントのPD-L1依存性CD28共刺激活性と一致して、T細胞をK562/OKT3/PD-L1 aAPCと共培養すると、特定のバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）分子の存在下でCD28共刺激が増加した。PD-L1との結合が乏しいCD80 IgV-Fc分子（すなわち、E35G/K54E/A71D/L72P）では、著しい共刺激およびIL-2産生は生じなかった。場合によって、E35Dのような特定のバリアントCD80 IgV-Fc（エフェクター）分子は、PD-L1を発現しているaAPCの存在下でのみCD28共刺激を引き起こすことができた。IFN-γおよび増殖の結果は、IL-2放出で観察された結果と同様であった。
【０６２７】
（表Ｅ２７）CD80-IgC-Fc分子のFc受容体またはPD-L1が媒介する架橋を介した初代T細胞CD28共刺激
2022501361.tif 000102
【０６２８】
実施例15
PD-L1/PD-1相互作用またはPD-L1依存性共刺激を遮断するバリアントCD80ポリペプチドの評価
A. PD-L1/PD-1の結合および遮断
PD-L1を発現している細胞に対する選択された免疫調節融合タンパク質の結合を評価して、PD-L1/PD-1の相互作用の遮断について試験した。CHO/PD-L1細胞を、バリアントCD80 IgV-Fcドメイン含有分子のタイトレーションを伴って染色し、洗浄し、次いで、蛍光的にコンジュゲートしたPD-1-Fcと共にインキュベーションした。試験した例示的なバリアントCD80 IgVドメイン含有分子は、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G（SEQ ID NO:490）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、およびE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）を含有していた。対照として、抗PD-L1抗体および野生型CD80 IgV-Fcについても評価した。フローサイトメータでサンプルを取得し、そして、Flowjoソフトウェア解析によって蛍光標識されたPD-1のMFIを求めた。図7に示すように、試験した例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子は、PD-1のPD-L1への結合をアンタゴナイズまたは遮断することが示された。
【０６２９】
B. 活性
上記の通り、PD-1を発現しているJurkat/IL-2レポーター細胞を用いて、例示的なバリアントCD80-FcポリペプチドをPD-L1依存性共刺激を送達する能力について評価した。タイトレーションされた量（40pM〜100nMの範囲）の例示的なバリアントCD80 IgV-Fcポリペプチドの存在下で、上記の通り、Jurkat/IL-2レポーター細胞をK562/OKT3/PD-L1人工抗原提示細胞（aAPC）と共にインキュベーションした。例示的なバリアントCD80 IgV-Fcポリペプチドの中には、例示的なFc（EU番号付けによるC220S/L234A/L235E/G237A；SEQ ID NO:1520）に融合しているE35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G（SEQ ID NO:490）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ IN NO:491）、またはE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）のいずれかのバリアントIgV、またはそのアロタイプを含有する分子があった。他の試験したバリアントCD80 IgV-Fcポリペプチドは、野生型IgG1（SEQ ID NO:1517）に融合したバリアントIgV（E35D/M47I/L70M、SEQ ID NO:199；またはE35D/M47L、SEQ ID NO:208のいずれか）を含有していた。対照として、PD-L1発現細胞を、野生型CD80 IgV-Fc（SEQ ID NO:150）または抗PDL1抗体（BioLegend USA）とも一緒にインキュベーションした。
【０６３０】
Jurkat/IL-2/PD-1レポーター細胞を、Jurkatアッセイバッファ（RPMI1640+5%FBS）中1ウェルあたり100,000細胞でプレーティングした。次いで、Jurkat細胞を試験または対照のタンパク質と共に室温で15分間インキュベーションした。次いで、各ウェルの最終比率がJurkat細胞：K562細胞＝5:1となるようにK562/OKT3/PD-L1細胞を添加した。Jurkat細胞、K562細胞、および試験または対照のタンパク質を、加湿された5％CO2インキュベーションチャンバー内において摂氏37度で5時間インキュベーションした。次いで、プレートをインキュベータから取り出し、そして、15分間室温に順化させた。100μLの細胞溶解液およびルシフェラーゼ基質溶液（BioGlo luciferase reagent, Promega）を各ウェルに添加し、そして、プレートをオービタルシェーカーで10分間インキュベーションした。BioTek Cytationルミノメータを用いて、1ウェルあたり1秒の積分時間で発光を測定し、各試験サンプルの発光値（RLU）の増加倍率を求めた。
【０６３１】
図8に示すように、例示的な評価したバリアントCD80 IgV-Fcを添加すると、TCR活性化のPD-L1が媒介する抑制が遮断され、および／またはCD28がアゴナイズされ、その結果、発光が増加した。PD-L1に対する結合親和性の増大について同定されたバリアント分子は、T細胞の活性化をアゴナイズするより高い活性を呈した。
【０６３２】
実施例16
バリアントCD80ポリペプチドのインビボ抗腫瘍活性
A. CD80バリアントの抗腫瘍活性
マウスMC38腫瘍細胞に、ヒトPD-L1を安定的にトランスフェクションし（MC38 hPD-L1）、そして、C57BL/6マウスに皮下移植した。不活性Fc対照、または不活性Fc分子（例えば、SEQ ID NO:1520、またはそのアロタイプ）もしくはエフェクター活性を媒介することができるFc分子（SEQ ID NO:1517）に融合させたバリアントIgV（E35D/M47I/L70M、SEQ ID NO:199；またはE35D/M47L、SEQ ID NO:208）を含有する例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子を、移植後8日目、10日目、13日目、15日目、および17日目に100μg/マウスでi.p.注射した。腫瘍体積を経時的に追跡した。
【０６３３】
図9に示すように、Fc対照と比較して、CD80-IgVで処置した全てのマウスにおいて腫瘍成長の抑制が観察され、このことから、バリアントCD80 IgV-Fc分子がインビボで機能的に活性であることが証明された。
【０６３４】
B. 抗腫瘍活性の用量依存性
1. 腫瘍体積（50μg、100μg、および500μgの用量）
MC38 hPD-L1腫瘍細胞を移植した後、およそ50〜51mm3の同程度の腫瘍体積を有する70頭のC57CL/6雌マウスを病期分類し、そして、それぞれ14頭のマウスを含む5つの処置群に分けた。8日目、10日目、および12日目に、群1（アイソタイプ対照）には、75μgのFcのみ（SEQ ID NO:1520）を投与し、群2、3、および4には、GSG4Sリンカー（SEQ ID NO:1522）を介して不活性なヒトFc（SEQ ID NO:1520、またはそのアロタイプ）に融合しているCD80バリアントE35D/M47L（SEQ ID NO:208）をそれぞれ50、100、および500μg投与し；そして群5には、100μgのヒト抗PD-L1 mAb（デュルバルマブ）を投与した。7日目、10日目、および12日目に腫瘍体積を測定した。13日目に、以下の章に記載する通り、分析のために5頭の動物を屠殺した。各群の残りの9頭のマウスについては、17日目、20日目、および27日目に腫瘍の測定を再開した。26日目、28日目、および31日目に、群1（Fcアイソタイプ対照）の動物に、100μgのE35D/M47L CD80-IgV-Fcを腫瘍内注射した。
【０６３５】
腫瘍体積の中央値および平均値を図10に示す。図示の通り、CD80-IgV-Fcで処置した場合、Fc対照と比較して、用量依存的な腫瘍体積の減少が観察された。この試験では、100μg〜500μgのCD80-IgV-Fcで処置したマウスで観察された腫瘍体積の中央値は、抗PD-L1抗体対照で処置したマウスと同程度であった。
【０６３６】
サイトカイン分析
MC38腫瘍を酵素で消化した後、溶解物溶液を遠心分離し、上清を回収し、そして、アッセイの準備が整うまで-80℃で保存した。次いで、市販のELISAキット（R&D Systems, Inc）を用いて製造元の指示に従って各サンプル中のマウスIFNγの濃度を測定し、そして、腫瘍の重量または腫瘍から単離された総細胞数のいずれかに基づいて濃度を正規化した。図11に記載する結果は、E35D/M47L CD80-IgV-Fcの最高用量（500μg）で腫瘍溶解物中のIFNγの濃度が最も高くなることを示し、このことは、CD80-IgV-Fcがその処置の結果としてIFNγを産生していることを示唆しており、これは抗腫瘍免疫を促進することが知られている機序である。
【０６３７】
C. CD80選択バリアントの抗腫瘍活性および再チャレンジ活性
95頭の雌C57BL/6マウスにMC38 hPD-L1腫瘍細胞を移植した。7日目に腫瘍を病期分類し、そして、約60mm3の同程度の腫瘍体積を有する77頭のマウスを、それぞれ11頭のマウスを含む7つの処置群に分けた。7日目、9日目、および11日目に、群1（アイソタイプ対照）には、75μgの不活性Fcのみ（SEQ ID NO:1520）を投与し；群2には、100μgのCD80バリアントE35D/M47V/N48K/V68M/K89N IgV（SEQ ID NO:465）-Fc（不活性）を投与し；群3には、100μgのCD80バリアントH18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G IgV（SEQ ID NO:491）-Fc（不活性）を投与し；群4には、100μgのCD80バリアントE35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV（SEQ ID NO:495）-Fc（不活性）を投与し；群5には、100μgのCD80バリアントE35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E IgV（SEQ ID NO:499）-Fc（不活性）を投与し；群6には、100μgのCD80バリアントE35D/M47L（SEQ ID NO:208）-Fc（不活性）を投与し；そして、群7には、100μgのヒト抗PD-L1 mAb（デュルバルマブ）を投与した。バリアントCD80-IgV-Fc分子については、GSG4Sリンカー（SEQ ID NO:1522を介して、SEQ ID NO:1520に記載されているような不活性ヒトFcまたはそのアロタイプにCD80IgVドメインを融合させた。14日目、17日目、21日目、24日目、28日目、31日目、および37日目に腫瘍の体積を測定した。Fcアイソタイプ対照を投与した動物は、腫瘍量が過剰になったため28日目までに終了した。
【０６３８】
腫瘍体積の中央値および平均値を図12に示し、これは、試験した全てのCD80-IgV-Fc分子が、抗PD-L1対照と比較して同様の、または場合によっては実質的に改善された活性を呈したことを示す。試験の終了時に、群3の8頭のマウス、群4の2頭のマウス、群6の1頭のマウス、および群7の2頭のマウスはもはや検出可能な腫瘍を有しておらず、「無腫瘍」と命名された。
【０６３９】
49日目に、群3、4、6、および7の無腫瘍マウスと2頭のナイーブC57CL/6マウスにhPD-L1 MC38細胞を追加で注射して再チャレンジした。56日目、59日目、および63日目に腫瘍の体積を測定した。結果を図13に示す。ナイーブマウスは、予想通り、急速な腫瘍の成長を呈した。59日目には、群3の8頭中8頭のマウス、群4の2頭中1頭のマウス、群6の1頭中1頭のマウス、および群7の2頭中2頭のマウスが無腫瘍であり、そして、63日目までに、群3、群4、群6、および群7の全てのマウスが無腫瘍になった。この結果は、CD80-IgV-Fc分子を含む試験した剤が、長期間にわたる持続的な免疫、抗腫瘍効果を提供できるという所見と一致している。
【０６４０】
2回目の投与の3日後に屠殺したマウスの腫瘍を消化し、そして、フローサイトメトリーによって、結合した不活性Fc、CD80バリアントFc、および抗PD-L1抗体の存在について生存CD45-腫瘍細胞を分析した。群1、3、6、および7の結果を図14に与える。上記の試験と同様に、この結果は、抗PD-L1抗体対照と比較して、CD80-IgV-Fc分子の腫瘍に対する結合が少ないことを示した。これにもかかわらず、活性の差別化要因がCD28アゴニズム（PD-L1依存性CD28共刺激）および／またはCTLA-4アンタゴニズムによるものであることと一致して、SEQ ID NO:491に記載の例示的なCD80-IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）で処置したマウスが示すような、CD80-IgV-Fcによる優れた活性を達成することができた。
【０６４１】
D. CD80バリアントおよび抗PD-L1抗体の抗腫瘍活性
hPD-L1 MC38腫瘍細胞を移植した7日後に、75頭の動物を3つの処置群に分類した。群1には、75μgの不活性Fc（SEQ ID NO:1520）を3回注射し、群2には、100μgのCD80バリアントH18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G IgV（SEQ ID NO:491）-Fc（不活性）を3回注射し、そして、群3には、100μgのヒト抗PD-L1 mAb（デュルバルマブ）を3回注射し、注射は移植後8日目、10日目、および12日目に行った。11日目から35日目まで、3〜4日ごとに腫瘍の体積を測定した。1回目の投与、2回目の投与、および3回目の投与の3日後に、腫瘍およびLNの分析のために各群から4頭のマウスを屠殺し、試験期間全体にわたって腫瘍体積の測定のために13頭のマウスを残した。
【０６４２】
図15は、この試験において例示的なCD80-IgV-Fcで処置したマウスの腫瘍体積の中央値および平均値が、抗PD-L1対照と比較して大きく減少することを示す。18日目に、群1（Fc対照で処置）の13頭中0頭のマウスが無腫瘍であり、群2（CD80バリアントIgV-Fcで処置）の13頭中6頭のマウスが無腫瘍であり、そして、群3（デュルバルマブで処置）の13頭中3頭のマウスが無腫瘍であった。35日目には、群1、2、および3で、それぞれ13頭中1頭、13頭中6頭、および13頭中3頭のマウスが無腫瘍であった。バリアントCD80-IgV-Fcで処置したマウスは、抗hPD-L1抗体または不活性Fc対照で処置したマウスの腫瘍と比較して、平均してサイズが縮小している腫瘍を呈した。
【０６４３】
腫瘍細胞の特性評価
Fc対照、CD80バリアントIgV-Fc、および抗PD-L1抗体（デュルバルマブ）の2回目の投与の3日後、各処置群の3〜4頭のマウスから腫瘍および流入領域リンパ節（LN）を摘出した。組織を単細胞懸濁液に加工し（加工の一環として腫瘍を酵素的に消化したが、流入領域LNは消化しなかった）、CD45+細胞サブセット（LNまたは腫瘍における免疫細胞）に対するCD8+T細胞の多色フローサイトメトリー分析に加えて、腫瘍細胞に結合した分子（CD80-IgV-Fcまたは抗PD-L1）を検出するためのCD45-細胞サブセット（腫瘍細胞）に対する% hIgG+染色に供した。結果を図16A〜Cに与える。
【０６４４】
CD8+T細胞の割合は、Fc対照または抗PD-L1抗体による処置と比較して、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-IgV-Fcで処置したマウスのTILおよびLNのいずれにおいても有意に高かった（p<0.05またはp<0.01）（図16A（LN）および16B（腫瘍）。これは、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-IgV-Fc処置がインビボにおいてCD8+T細胞の増殖を促進することができ、抗腫瘍免疫に対する重要な寄与要因であることを示す。さらに、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-IgV- Fcは、抗PD-L1抗体と比較して低いレベルではあるが、腫瘍において検出された（エクスビボでCD45-細胞に対するhIgG+染色を介して）（図16C）。検出された抗PD-L1と比較して腫瘍におけるE35D/M47L CD80-Fcの存在は少なかったにもかかわらず、抗腫瘍活性は、抗PD-L1抗体と比較してCD80-Fcの方が優れていた（上記B1セクションを参照）。これら結果は、CD80-IgV-Fcの活性がPD-L1/PD-1アンタゴニズムに対するものだけではない可能性があるが、差別化要因はCD28アゴニズム（PD-L1依存性CD28共刺激）および/またはCTLA4アンタゴニズムの活性に関連している可能性があるという所見と一致している。
【０６４５】
実施例17
抗PD-L1抗体と比較した、HuPD-L1が形質導入されたMC38腫瘍細胞に対する細胞傷害性
この実施例では、huPD-L1が形質導入されたMC38腫瘍細胞のインビトロ細胞傷害性の評価について説明する。形質導入されていないかまたはhuPD-L1が形質導入されたMC38腫瘍細胞をマイトマイシンCで処理し、そして、CFSEで標識したヒト汎T細胞と共に1:5の比率でプレーティングした。E35D/M47I/L70M（SEQ ID NO:125）を含有するバリアントCD80 IgV-Fcを、WT IgG1 Fcまたは不活性Fcのいずれかと共に100nMまたは10nMでMC38腫瘍細胞に添加し、そして、72時間細胞と共に培養した。対照として、例示的な抗PD-1抗体ニボルマブまたはFc（不活性）のみの対照も評価した。次いで、細胞を収集し、そして、7-AAD生死判別色素で染色した。フローサイトメータでサンプルを取得した後、CFSE-ゲートにおいて7-AAD+細胞をゲートオンすることによってFlowjo解析を用いて死細胞の割合を計算した。図17に示すように、huPD-L1を形質導入したMC38腫瘍細胞に対する細胞傷害性は増加したが、形質導入されていないMC38親細胞では増加しないことが、例示的な評価したバリアントCD80 IgV-Fc分子によって観察された。このアッセイでは、対照である抗PD-1抗体の存在下において細胞傷害活性が観察されなかったことから、バリアントCD80 IgV Fc分子は、抗PD-1抗体対照と比較して改善された活性を呈することが示された。
【０６４６】
実施例18
初代ヒトT細胞および単球に対するCD80バリアントの結合
例示的なバリアントCD80-IgV Fc分子の初代CD28+ヒトCD4 T細胞およびヒトPD-L1+単球への結合を評価した。評価した例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子は、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）、およびE35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E（SEQ ID NO:499）を含有していた。
【０６４７】
不活化されたヒト汎T細胞を様々な濃度のバリアントCD80 IgV-Fcと共にインキュベーションし、次いで、抗CD4、抗CD8、および抗ヒトIgGで染色して、CD80 IgV-FcのFc部分を検出した。対照として、野生型CD80 IgV-Fc、Fcのみの陰性対照、およびCD28結合ICOSL vIgD-Fcの結合も評価した。結合をフローサイトメトリーによって評価し、そして、Flowjo解析ソフトウェアを用いてMFIを求めた。図18に示す通り、試験したバリアントCD80 IgV-Fc分子は、初代ヒトT細胞との結合に差があり、場合によっては、野生型CD80-IgV-Fcよりも多かった。
【０６４８】
ヒト単球で発現しているPD-L1に対する結合については、ヒトPBMCを抗CD3および抗CD28の存在下で一晩プレーティングした。翌日、細胞を収集し、様々な濃度のバリアントCD80 IgV-Fcまたは抗PD-L1抗体対照（デュルバルマブ）と共にインキュベーションし、次いで、単球を同定するために抗CD14で、そして、CD80 IgV分子のFc部分を検出するために抗ヒトIgGで染色した。結合をフローサイトメトリーによって評価し、そして、Flowjo解析ソフトウェアを用いてMFIを求めた。図19に示すように、試験した全てのバリアントCD80 IgV-Fc分子は、野生型CD80 IgV-Fcよりも実質的に多い初代ヒト単球に対する結合を示した。
【０６４９】
実施例19
PD-L1が媒介するPD-1 SHP2動員のバリアントCD80 IgV-Fcのアンタゴニズム
この実施例では、PD-L1/PD-1の相互作用を遮断することにより、細胞質タンパク質チロシンホスファターゼSHP-2のPD-1への動員をアンタゴナイズするバリアントCD80 IgV-Fc分子の効果を評価するための、Jurkat/PD-1/SHP2シグナル伝達アッセイについて説明する。例示的なアッセイでは、組換えβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）断片エンザイムドナー（ED）タグ付きPD-1受容体およびエンザイムアクセプター（EA）タグ付きSHP-2ドメインを含むJurkat細胞株を使用した（例えば、DiscoverX, USA;カタログ93-1106C19）。このアッセイでは、SHP-2がPD-1に動員された結果、EAとEDが近接して、2つの酵素断片が相補し、基質を加水分解して化学発光シグナルを生じさせる機能的なβ-Gal酵素を形成することが可能になる。
【０６５０】
K562/OKT3/PD-L1 aAPCを、様々な濃度の例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）と共に30分間プレインキュベーションした。評価した例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子は、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）、およびE35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E（SEQ ID NO:499）を含有していた。対照として、野生型CD80 IgV-Fc（不活性）、抗PD-L1抗体、およびFc（不活性）のみの対照も評価した。Jurkat/PD-1/SHP2細胞（DiscoverX Pathhunter Enzyme Complementation Fragment Recruitment line）を添加し、そして、細胞を2時間インキュベーションした。β-Galの基質（DiscoverX Bioassay Detection reagent）をウェルに添加し、暗所において室温で1時間インキュベーションし、そして、マイクロプレートリーダー（BioTek Cytation）でルシフェラーゼを測定した。
【０６５１】
図20に示すように、バリアントCD80 IgV-Fc分子が、PD-L1が媒介するPD-1 SHP2動員をアンタゴナイズする強力な活性を呈した所見と一致して、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc分子はルシフェラーゼ活性を低下させた。強力なアンタゴニスト活性は、抗PD-L1陽性対照によっても観察されたが、野生型CD80 IgV-Fc分子の存在下ではルシフェラーゼシグナルの低下が検出されなかったことによって証明される通り、野生型CD80 IgV-Fc分子はPD-1/PD-L1アンタゴニスト活性を呈しなかった。
【０６５２】
実施例20
B7/CTLA-4結合のCD80バリアントアンタゴニズム
CD80 vIgD-FcがCTLA-4およびB7の結合の相互作用をアンタゴナイズする能力を評価するために、表面ヒトCTLA-4を安定的に発現しているCHO細胞を、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N（SEQ ID NO:465）、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G（SEQ ID NO:490）、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D（SEQ ID NO:495）、または野生型CD80 vIgD-Fc、または陽性対照としての抗CTLA-4抗体（イピリムマブ）のタイトレーションと共にプレーティングした。洗浄後、25nM 蛍光色素コンジュゲート野生型CD80-Fcと共に細胞をインキュベーションした。結合した蛍光性競合タンパク質をフローサイトメトリーによって検出および測定した。図21に示すように、全てのCD80 vIgD-FcバリアントがCD80のCTLA-4に対する結合をアンタゴナイズしたが、野生型CD80-Fcはアンタゴナイズしなかった。
【０６５３】
実施例21
huPD-L1/B16-F10メラノーマモデルにおけるCD80バリアント分子および抗PD-1抗体の組み合わせの評価
この実施例では、例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含有するバリアントCD80 IgV；SEQ ID NO:491）の抗腫瘍活性の評価について説明する。このバリアントは、野生型CD80と比較してPD-L1に対する結合親和性が増大し、そして、PD-L1およびCTLA-4を遮断し、CD28共刺激受容体を介してPD-L1依存性T細胞活性化を提供する活性が増大していることが同定された、例示的なバリアントである。例示的な変異体の抗腫瘍活性を試験するために、同系マウスメラノーマモデルであるヒトPD-L1（huPD-L1）発現B16-F10腫瘍を有するマウスにおいて、単独でまたは抗マウスPD-1モノクローナル抗体（クローンRMP1-14、ラットIgG2a）と組み合わせて評価した。このモデルは、アグレッシブであり、そして、多くの場合治療抵抗性のモデルである。
【０６５４】
B16-F10細胞株にhuPD-L1を形質導入して、バリアントCD80 IgV-Fcによる腫瘍における標的発現を確実にした。移植した日（試験日0）にサブコンフルエントな細胞（約80％コンフルエント）を収集した。細胞を2回洗浄し、DPBSで最終濃度を5×106細胞/mLにした。雌C57BL/6NJマウス（Jackson Labs, USA）に約0.5×106個のhuPD-L1/B16-F10細胞を皮下移植した。注射については、マウス1頭につき0.1mLの細胞（0.5×106個の細胞）を右中側腹部に皮下（SC）注射した。移植時にB16-F10細胞を評価して、フローサイトメトリーによってhuPD-L1の発現を確認した。マウスを6日目に病期分類し、そして、平均腫瘍体積が同程度（43mm3）の群に無作為化した。
【０６５５】
6日目に、マウスをそれぞれマウス12頭の4つの群に無作為化し、各群は同程度の平均腫瘍体積（42.8mm3）を有していた。試験した分子は、腹腔内（IP）注射を通して送達され、表E28に概要を示す通り、6日目、8日目、および11日目にIP注射を介して合計3回送達された。
【０６５６】
（表Ｅ２８）処置の説明
2022501361.tif 000103
【０６５７】
腫瘍細胞移植後6日目から始めて週2回、電子ノギスを用いて腫瘍を2次元的に測定した。長さ×（幅×2）×0.5として腫瘍体積を計算し、長さは2つの測定値のうちの長い方とした。抗腫瘍活性の尺度として、以下の式を用いて計算される腫瘍成長阻害（TGI）値を得た：［（Fc対照の腫瘍サイズの平均または中央値−処置された腫瘍サイズの平均または中央値）÷Fc対照の腫瘍サイズの平均または中央値］×100。平均値および中央値は、試験においてマウスの少なくとも70％が生存していた最後の日（腫瘍細胞移植後18日目）に計算した。
【０６５８】
図22Aに示す通り、バリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）とmPD-1 mAbとの組み合わせは、Fc対照、バリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）単独、または抗マウスPD-1 mAb単独で処置した群と比較して、経時的に腫瘍の成長（中央腫瘍体積）を有意に減少させた（p<0.05；二元配置反復測定ANOVA）。
【０６５９】
また、試験において各群のマウスのうちの少なくとも70％が生存していた最後の日（18日目）の腫瘍体積に基づいて、処置された個々のマウスにおける腫瘍成長阻害（TGI）率の平均値および中央値を以下の式を用いて求めた：［（Fc対照の腫瘍サイズの平均または中央値−試験物質で処置された腫瘍サイズの平均または中央値）÷Fc対照の腫瘍サイズの平均または中央値］×100）。表E29および図22Bに示すTGIによって測定された組み合わせの抗腫瘍活性は、バリアントCD80 IgV-FcとmPD-1 mAbとの組み合わせが、対照群と比較して腫瘍の成長を有意に減少させたという知見と一致する（Kruskal-Wallis検定：**バリアントCD80-IgV-Fcおよび抗mPD-1 mAb群に対してp<0.01;****Fc対照対照群に対してp<0.0001）。この結果は、免疫原性が乏しくかつ治療不応性であることが知られている腫瘍であるhuPD-L1+B16-F10腫瘍を有するマウスにおいて、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）が抗PD-1 mAbの抗腫瘍活性の改善に特に有効（92%腫瘍成長阻害）であることを示した。
【０６６０】
（表Ｅ２９）TGIによって測定された抗腫瘍成長活性の概要
2022501361.tif 000104
【０６６１】
これら結果は、抗PD-1と、PD-L1に対する結合親和性の増大を呈するものを含むバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）等の例示的な提供されたバリアントCD80-Fcポリペプチドとを含む併用療法の抗腫瘍活性が実質的に改善することを証明する。
【０６６２】
実施例22
CD80バリアント分子および抗PD-1抗体の組み合わせによるT細胞応答の評価
サイトメガロウイルス（CMV）抗原特異的機能アッセイを用いて、抗PD-1抗体（例えば、ニボルマブ）と例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）との組み合わせのT細胞応答に対する効果を評価した。
【０６６３】
CMV血清陽性ドナーから入手した末梢血単核細胞（PBMC）を解凍し、そして、250,000個/ウェルのPBMCにCMV溶解液を1μg/mLで添加した。50nMの濃度の抗PD-1抗体（ニボルマブ）の存在下または非存在下において、試験した例示的なバリアントCD80 IgV-Fcまたは野生型CD80 ECD-Fcを様々な濃度で添加した。加えて、抗PD-1抗体単独でも試験した。対照として、Fcのみの分子も試験した。インキュベーションの48時間後に上清を回収して、ELISAによってIL-2をアッセイした。
【０６６４】
図23に示す通り、試験したバリアントCD80 IgV-Fc分子は、Fcのみの対照と比較してIL-2産生の増強を示した。また、漸増濃度のバリアントCD80 IgV-Fcの存在下において、IL-2産生の用量依存的な増加が観察された。さらに、試験したバリアントCD80 IgV-Fc分子と抗PD-1抗体との組み合わせは、いずれかの分子のみの存在下におけるIL-2産生レベルと比較して、より大きなIL-2産生の増加を示した。
【０６６５】
実施例23
CD80バリアント分子の投与量および送達の評価
この実施例では、腹腔内（IP）投与または腫瘍内（IT）注射のいずれかによって送達された、huPD-L1発現MC38腫瘍の同系マウス腫瘍モデルにおける例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）の抗腫瘍活性の評価について説明する。
【０６６６】
A. 腫瘍モデル
MC38細胞株にヒトPD-L1（huPD-L1）を形質導入した。移植日（試験日0）にサブコンフルエントな細胞（約80％コンフルエント）を収集し、2回洗浄し、DPBSで最終濃度を15×106細胞/mLにした。雌C57BL/6NJマウス（Jackson Labs, USA）の右中側腹部に約1.5×106個の細胞（0.1mL）を皮下移植した。
【０６６７】
7日目に、マウスを6つの群に無作為化し、各群は同程度の平均腫瘍体積（46.6mm3）を有していた。
【０６６８】
B. 腫瘍成長評価
100、500、および1500μgの例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）を、細胞移植後8日目にIP注射を介して1回担癌マウス群に送達した。また、500μgの用量を分割用量としてマウス群に投与した（細胞移植後8日目、11日目、および14日目に各167μgのIP注射を3回）。8日目、11日目、および14日目にIT送達を介してバリアントCD80 IgV-Fcを各日100μgずつ追加のマウス群に投与した。試験分子で処置した群を、8日目にヒトFc対照を1回IP注射したマウス群と比較した。処置群を表E30にまとめる。
【０６６９】
（表Ｅ３０）処置群の概要
2022501361.tif 000105
【０６７０】
抗腫瘍活性を評価するために、実施例21に記載の通り腫瘍体積を測定した。個々の処置されたマウスの経時的な腫瘍成長曲線の中央値をプロットした。図24Aに示すように、単回IP注射によって例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcで処置したマウスは、Fc対照処置と比較して、用量依存的な抗腫瘍活性の増加を特徴としていた。100（1回または3回のIP注射として）、500μg（1回のIP注射として）、または1500μgのバリアントCD80 IgV-FcをIP注射した各群は、対照マウスと比較して、腫瘍体積の実質的な減少を示した。また、IT注射による投与の結果、Fc対照処置群と比較して、実質的な抗腫瘍成長活性が生じた。
【０６７１】
C.腫瘍分析
腫瘍細胞移植後11日目かつ試験物質の投与前に、群1〜4および群6のそれぞれから5頭のマウスを屠殺し、そして、腫瘍を摘出し、計量し、エクスビボ腫瘍分析のために加工した。移植時のMC38細胞、および酵素消化により11日目にマウスのサブセットから摘出した腫瘍を、フローサイトメトリーによってhuPD-L1またはヒトIgG（細胞に結合した試験分子のFcを検出するため）の発現について評価した。腫瘍細胞のCD45陰性サブセットにおいて、huPD-L1およびhuIgGの陽性率および蛍光強度中央値（MFI）を定量化した。
【０６７２】
11日目に収集した細胞からのCD45陰性細胞の中でPD-L1について陽性である細胞の割合は、全ての処置群で同程度であった。
【０６７３】
バリアントCD80 IgV-FcでIP処置したマウスの群について、11日目の腫瘍細胞は、CD45陰性細胞サブセット（図24B）またはPD-L1+CD45-細胞サブセット（図24C）の中の抗huIgGを用いて、結合した試験物質で検出された細胞の割合において顕著かつ用量依存的な増加を示した。この所見は、試験した分子の用量依存的な腫瘍局在化と一致しており、そして、より高用量のバリアントCD80 IgV-Fcによる腫瘍曝露の増加を証明する。100μgのバリアントCD80 IgV-FcをIT送達により投与したマウスでは、（IT送達されたバリアントCD80 IgV-Fcの最初の投与のみを反映している）この時点で、IP注射により投与された同じ用量レベルと同等の割合の治療用huIgG染色が検出された。
【０６７４】
また、11日目の腫瘍を、CD8+T細胞、およびCD3+細胞集団内の抗原特異的CD8+T細胞について評価した。p15Eは、C57BL/6マウス由来のMC38腫瘍細胞株で発現しているMHCクラスI拘束性T細胞抗原である。PEで標識したマウスMHCクラスI p15Eテトラマー（MBL International Corp.）を使用して、p15E-MHCクラスI拘束性T細胞受容体を検出した。
【０６７５】
腫瘍における全細胞のうちのp15eテトラマー＋CD8＋T細胞の割合を求めた。500もしくは1500μgのバリアントCD80 IgV-Fc（IP）または100μgのバリアントCD80 IgV-Fc（IT）で処置したマウスの腫瘍からの細胞は、Fc対照で処置したマウスと比較して、p15E特異的CD8+T細胞の割合が有意に多かった（図25）。この結果は、IP送達されたより高用量のまたはIT投与された用量のバリアントCD80 IgV-Fcによって、腫瘍内の抗原特異的CD8+T細胞の割合が増加したことを示す。
【０６７６】
実施例24
多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の作製および結合評価
この実施例では、同定されたバリアントCD80ポリペプチドからの少なくとも2つの親和性改変IgVドメインを含有するバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質の作製について説明する。具体的には、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G（SEQ ID NO:491）を有する例示的なバリアントCD80 IgVの2つのユニットを連結させ、そして、様々な構成でFcに融合させた。四価および六価の分子を作製した。
【０６７７】
A. 多価タンパク質の作製
以下のように様々な構成の多価のバリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を作製した。実質的に実施例5に記載の通り、多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を発現させ、そして、精製した。作製した多価タンパク質では、バリアントCD80 IgVバリアントが、
2022501361.tif 000106
ペプチドリンカーを介してヒトIgG1 Fc領域のN末端またはC末端に様々に連結されていた。この試験では、エフェクターレスヒトIgG1 Fc領域（不活性Fc）またはエフェクター活性を媒介することができるヒトIgG1 Fc領域（エフェクターFc）のいずれかを用いて構築物を作製した。
【０６７８】
作製した構築物で使用した不活性Fc領域は、SEQ ID NO:1518に記載の配列を有し、かつ、変異C220S、L234A、L235E、G237A（EU番号付けによる）を含有していた（これら変異は、SEQ ID NO:1502に記載の野生型ヒトIgG1 Fcを参照するとC5S、L19A、L20E、G22Aに対応する）。場合によって、Fcは、C末端リジンの除去K447del（EU番号付けによる）（SEQ ID NO:1502に記載の野生型または非改変Fcを参照すると232位の欠失に対応する）を含有していた。
【０６７９】
エフェクターFcは、SEQ ID NO:1527に記載の配列を有し、かつ、変異C220S、E356D、およびM358L（EU番号付けによる）（これらの変異は、C5S、E141D、およびM143Lに対応する）を含有しており、これは、C末端リジンの除去K447del（EU番号付けによる）（野生型ヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:1502に記載）を参照すると232位の欠失に対応する）をさらに含有していた。他のFc領域も多価分子の作製に好適である。
【０６８０】
2022501361.tif 000107
【０６８１】
多価構築物をコードしている核酸分子は、例示的なシグナルペプチド
2022501361.tif 000108
（SEQ ID NO:276に記載）をコードしている残基も含有していた。関心対象のFc融合タンパク質をコードしている発現構築物を、Expi293において一過性に発現させた。各多価タンパク質について、以下に示された順序で配列を含む様々な構成のタンパク質を生成するように、コーディング核酸分子を設計した：
・多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質1（SEQ ID NO:1529）:
CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−GSGGGGS（SEQ ID NO:1522）−Fc（SEQ ID NO:1518）−3×GGGGS（SEQ ID NO:1504）−CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）
・多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質2（SEQ ID NO:1531）:
CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−GSGGGGS（SEQ ID NO:1522）−Fc（SEQ ID NO:1527）−3×GGGGS（SEQ ID NO:1504）−CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）
・多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質3（SEQ ID NO:1533）:
CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−3×GGGGS（SEQ ID NO:1504）−CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−GSGGGGS（SEQ ID NO:1522）−Fc（SEQ ID NO:1518）
・多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質4（SEQ ID NO:1535）:
CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−3×GGGGS（SEQ ID NO:1504）−CD80バリアントIgV（SEQ ID NO:491）−GSGGGGS（SEQ ID NO:1522）−Fc（SEQ ID NO:1527）
【０６８２】
B. 結合評価
細胞で発現しているCTLA4、CD28、およびPD-L1のカウンター構造に対する多価タンパク質の特異性および親和性を評価するために、結合アッセイを実施した。指定の同族カウンター構造リガンド（すなわち、CTLA-4、PD-L1、またはCD28）を発現するように遺伝子操作された細胞に11.1nMの各バリアントCD80 Fc融合分子を添加したことを除いて実質的に実施例7に記載の通り、多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を結合について試験した。同じ細胞で発現しているカウンター構造リガンドに対する、アミノ酸置換を含まない非改変CD80-ECD-Fc融合分子（R&D Systems, USA）の結合と比較した、多価バリアントCD80 IgV-FcのMFIの比を表E31に示す。示されているように、多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質は、カウンター構造のうちの1つ以上に対する結合の増加を呈した。
【０６８３】
（表Ｅ３１）CD28、CTLA4、またはPD-L1を安定的に発現している細胞への結合
2022501361.tif 000109
【０６８４】
C. PD-L1/PD-1相互作用の遮断
実質的に実施例15に記載の通り実施したPD-L1/PD-1およびCTLA-4/CD80の相互作用の遮断について試験するために、多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を評価した。CHO/OKT3/PD-L1およびCHO/CTLA-4細胞をカウントし、そして、100,000細胞/ウェルでプレーティングし、次いで、蛍光でコンジュゲートされたPD-1-FcおよびCD80-Fcと共にインキュベーションした。例示的な多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を、細胞と共に30分間インキュベーションした。対照として、Fcのみの分子、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、および二価バリアントCD80 IgV-Fcも評価した。細胞を洗浄し、そして、100nMの蛍光でコンジュゲートされたPD-1-FcおよびCD80-Fcの競合因子と共に30分間インキュベーションした。次いで、細胞を洗浄し、そして、フローサイトメータでサンプルを取得し、蛍光で標識された分子のMFIを求めた。
【０６８５】
図26Aおよび26Bに示すように、試験した例示的な多価バリアントCD80 IgV-Fc分子は、PD-1のPD-L1への結合およびCD80のCTLA-4への結合をアンタゴナイズまたは遮断することが示された。二価バリアントCD80 IgV-Fcと比較して、PD1/PD-L1およびCD80/CTLA-4を遮断するアンタゴニスト活性の改善が観察された。
【０６８６】
D. サイトメガロウイルス（CMV）抗原特異的T細胞応答
実質的に実施例22に記載の通りCMVアッセイにおけるIL-2産生について試験するために、多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を評価した。上記の通り作製した例示的な多価バリアントCD80 IgSFドメイン融合タンパク質を、100000pM〜46pMの様々な濃度で試験した。
【０６８７】
図27に示す通り、試験した多価分子は、野生型CD80 ECD-Fc分子またはバリアントCD80 IgV-Fc分子を二価フォーマットで含有する分子の存在下におけるIL-2産生のレベルと比較して、IL-2産生のより大きな増加を示した。SEQ ID NO:1518に記載のFc（不活性）を含有するエフェクターレス多価分子は、エフェクターFc骨格（SEQ ID NO:1527）における対応する分子と比較して、IL-2産生の増加を示した。特に高濃度では、不活性Fc構築物と比較して、エフェクターFc構築物ではより低レベルのIL-2産生が観察された。理論に縛られるものではないが、異なるFc構築物による活性の違いは、このアッセイではFcRに対してPD-L1の曝露または親和性がより高く、それにより、このアッセイではPD-L1依存性CD28アゴニズムがFcR依存性CD28アゴニズムよりも大きくなることに起因している可能性がある。
【０６８８】
実施例25
追加のバリアントCD80 IgVドメインの作製および結合活性の評価
以下のSEQ ID NO:2（UniProtアクセッション番号P33681に記載されている残基35〜242に対応）：
2022501361.tif 000110
に記載の、細胞外ドメイン（ECD）の野生型ヒトCD80アミノ酸配列に基づいて、構築物を作製した。
【０６８９】
これらバリアントについては、CD28、CTLA-4、およびPD-L1のそれぞれに対して、酵母がディスプレイした標的またはランダムCD80ライブラリを別々に選択した。本質的に実施例2〜5に記載の通り、CD80バリアントを作製し、そして、Fc融合タンパク質として発現させた。
【０６９０】
A. 細胞で発現しているカウンター構造への結合
この実施例では、同族結合パートナーに対するCD80ドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性および親和性を示すためのFc融合体結合試験について説明する。
【０６９１】
同族結合パートナーを発現する細胞を生成するために、ヒトのCD28、CTLA-4、およびPD-L1のそれぞれについて、完全長哺乳類表面発現構築物をpcDNA3.1発現ベクター（Life Technologies）で設計し、そして、Genscript, USAから入手した。Expi293F一過性トランスフェクション系（Life Technologies, USA）を用いて結合試験を行った。実験に必要な細胞数を求め、そして、製造業者推奨のプロトコルを用いて適切な30mLスケールのトランスフェクションを行った。各CD28、CTLA-4、PD-L1、またはモックの30mLトランスフェクションごとに、7500万個のExpi293F細胞を30μgの発現構築物DNAおよび1.5mLの希釈したExpiFectamine 293試薬とともに48時間インキュベーションし、その時点で染色のために細胞を収集した。
【０６９２】
フローサイトメトリーによる染色のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照の細胞200,000個を96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞をスピンダウンし、そして、染色バッファ（PBS（リン酸緩衝生理食塩水）、1％BSA（ウシ血清アルブミン）、および0.1％アジ化ナトリウム）に20分間再懸濁させて、非特異的結合を遮断した。その後、細胞を再度遠心分離し、50μLにおいて各候補バリアントCD80 Fcタンパク質の実験に応じて100nM〜1nMのバリアント免疫調節タンパク質を含有する染色バッファに再懸濁させた。氷上で45分間一次染色を行い、その後、染色バッファで2回細胞を洗浄した。PEコンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を50μLの染色バッファで1:150希釈し、そして、細胞に添加し、氷上でさらに30分インキュベーションした。二次抗体を2回洗い流し、細胞を4％ホルムアルデヒド／PBSで固定し、そして、サンプルをFACScanフローサイトメータ（Becton Dickinson, USA）で分析した。
【０６９３】
Cell Quest Proソフトウェア（Becton Dickinson, USA）を用いて、各トランスフェクタントおよび陰性親株について平均蛍光強度（MFI）を計算した。
【０６９４】
B. 生物活性の特性評価
この実施例では、インビトロアッセイにおけるヒト初代T細胞のFc融合バリアントタンパク質の生物活性の特性評価についてさらに説明する。
【０６９５】
1. 混合リンパ球反応（MLR）
可溶性rCD80.Fcの生物活性を、ヒト混合リンパ球反応（MLR）で試験した。Ex-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）中で500U/mL rIL-4（R&D Systems, USA）および250U/mL rGM-CSF（R&D Systems, USA）と共に7日間インビトロでPBMC（BenTech Bio, USA）から単離した単球を培養することにより、ヒト初代樹状細胞（DC）を作製した。10,000個の成熟したDCおよび100,000個の精製された同種CD4+T細胞（BenTech Bio, USA）を、96ウェル丸底プレートの最終体積200μLのEx-Vivo 15培地において、バリアントCD80 Fc融合タンパク質および対照と共培養した。5日目に、Human IFN-gamma Duoset ELISAキット（R&D Systems, USA）を用いて培養上清中のIFN-γ分泌を分析した。VMax ELISA Microplate Reader（Molecular Devices, USA）によって光学濃度を測定し、そして、IFN-gamma Duo-setキット（R&D Systems, USA）に含まれるタイトレーション済みのrIFN-γ標準品に対して定量した。
【０６９６】
2. 抗CD3抗体共固定化アッセイ
抗CD3共固定化アッセイで、CD80融合バリアントの共刺激生物活性を求めた。1nMまたは4nMのマウス抗ヒトCD3（OKT3, Biolegends, USA）を、1nM〜80nMのrCD80.Fcバリアントタンパク質と共にPBSで希釈した。刺激性タンパク質がプレートのウェルに付着するのを促進するために、この混合物を組織培養物で処理した平底96ウェルプレート（Corning, USA）に一晩かけて添加した。翌日、結合していないタンパク質をプレートから洗い流し、そして、100,000個の精製ヒト汎T細胞（BenTech Bio, USA）またはヒトT細胞クローンBC3（Astarte Biologics, USA）を、各ウェルの最終体積200μLのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）に添加した。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、そして、上記の通りDuoset ELISAキット（R&D Systems, USA）を用いてヒトIFN-γレベルを測定した。
【０６９７】
C． 結果
例示的な試験したバリアントについての結合および活性試験の結果を表E32、E33、およびE34に示す。特に、表E32は、それぞれの同族構造CD28に対する親和性成熟についてのスクリーニングで選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインのアミノ酸置換（置き換え）を示す。表E33は、それぞれの同族構造PD-L1に対する親和性成熟についてのスクリーニングで選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインのアミノ酸置換（置き換え）を示す。表では、例示的なアミノ酸置換を、それぞれの参照非改変ECD配列に対応するアミノ酸位置番号によって指定する。
【０６９８】
また、同族カウンター構造リガンドを発現するように遺伝子操作された細胞に対する各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された結合活性、および同じ細胞で発現しているカウンター構造リガンドに対する、アミノ酸置換を含まない対応する非改変ECD-Fc融合分子の結合と比較した、MFIの比も示す。また、
（i）抗CD3と共固定化させた指定のバリアントECD-Fc融合分子、または
（ii）MLRアッセイにおける指定のバリアントECD-Fc融合分子
のいずれかを用いて産生された培養上清中のIFNγのレベルの計算値（pg/mL）に基づいて、T細胞の活性を調節するためのバリアントFc融合分子の機能活性も示す。表E32〜34には、両機能アッセイにおいて対応する非改変ECD-Fcと比較した、各バリアントECD-Fcによって産生されたIFNγの比率も示す。
【０６９９】
示されているように、この選択の結果、少なくとも1つ、場合によっては、1つを超える同族カウンター構造リガンドに対する結合の増加を呈するように親和性改変された多数のCD80 IgSFドメインバリアントが同定された。加えて、この結果は、バリアント分子の親和性改変が、分子のフォーマットに応じて免疫活性の上昇および低下の両方を行う改善された活性も呈することを示した。例えば、リガンドの共固定化は、細胞との多価相互作用をもたらして、クラスター化するか、または、アミノ酸置換を含まない非改変（例えば、野生型）ECD-Fc分子と比較して、アゴニスト活性に有利な結合力を増加させる、およびT細胞の活性化を増加させると考えられる。しかし、分子が溶液中で二価Fc分子として提供された場合、同じIgSFドメインバリアントは、アミノ酸置換を含まない非改変（例えば、野生型）ECD-Fv分子と比較してT細胞の活性化を減少させるアンタゴニスト活性を呈した。
【０７００】
（表Ｅ３２）CD28に対して選択されたバリアントCD80。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2022501361.tif 000111
2022501361.tif 000112
2022501361.tif 000113
【０７０１】
（表Ｅ３３）PD-L1に対して選択されたバリアントCD80。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2022501361.tif 000114
2022501361.tif 000115
【０７０２】
（表Ｅ３４）CTLA-4またはPD-L1に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
2022501361.tif 000116
2022501361.tif 000117
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2022501361.tif 000122
【０７０３】
実施例26
ヒトにおけるCD80バリアント分子の薬物動態/薬力学的モデリングおよび用量選択
この実施例では、ヒトにおける用量選択に情報を与えるために、例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）の前臨床の薬物動態（PK）および薬力学的（PD）モデリングおよび刺激について説明する。非担癌マウスおよびhuPD-L1発現MC38腫瘍の同系マウス腫瘍モデルから得られたデータに基づいてPK/PDの関係をモデル化し、そして、カニクイザルからヒトのPKを予測した。
【０７０４】
A. PKのモデリング
1. PKモデル
第1のコンパートメント（中枢コンパートメント、V1）と第2のコンパートメント（末梢コンパートメント、V2）との間でコンパートメント間分配（Q）を行う2コンパートメントモデルとして、PKモデルを設計した。腹腔内（IP）または皮下（SC）への注射経路を捕捉するために、第3のコンパートメントを第1のコンパートメントに一方向に連結する一次速度定数（Ka）と共に第3のコンパートメント（デポーコンパートメント）が含まれていた。また、IPまたはSCの注射による、第3のコンパートメント（デポーコンパートメント）から第1のコンパートメント（中枢コンパートメント、V1）に拡散するために利用可能な薬物の量の喪失を説明するために、定数Fもモデルに含めた。第3のコンパートメント（デポーコンパートメント）において利用可能な薬物の総量を、「F×Dose」と記載する。静脈注射（IV）では、第3のコンパートメント（デポーコンパートメント）を省略した。
【０７０５】
第1コンパートメント（中枢コンパートメント、V1）からの薬物クリアランス（CL）を、種ごとに別々にモデル化した。マウスモデルでは、抗薬物抗体の形成に起因するクリアランスの時間依存的な増加が以下の通り説明された：
t≦6日である場合、CL＝CL0；
t≧6日である場合、CLt＝CL0×（eβ×（t-6日））；
（式中、tは、時間（日）であり、CL0は、0日目のクリアランスであり、CLtは、t日目のクリアランスであり、そして、βは定数である）。サルの場合、第1コンパートメント（中枢コンパートメント、V1）からの直線的なクリアランスを想定した。
【０７０６】
a. PKのマウスモデル
非担癌雌C57BL/6NJマウスに、腹腔内（IP）または静脈内（IV）の注射を通して単回用量20または100μgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を投与した。逐次血清サンプルをバリアントCD80 IgV-Fc濃度について分析し、そして、そのデータを用いてマウスPKモデルを開発した。
【０７０７】
図28Aは、経時的な用量群ごとの血清濃度の観察値（丸）および予測値（実線）を示す。図28Bは、マウスPKモデルの適合度を示す。結果は、一次吸収および時間依存性クリアランスを伴う2コンパートメントモデルが、IVまたはIPの注射によるマウスにおけるPKプロファイルをよく説明（予測）することを示す。
【０７０８】
また、担癌マウスにおけるPKを非担癌マウスに対して比較した。ヒトPD-L1を発現しているマウス結腸腺がん（MC38）細胞を雌C57BL/6NJマウスに移植し、そして、個々の動物の腫瘍体積が約50mm3に達した時点で、動物を2つの用量決定試験における処置群に無作為に割り付けた。一方の試験（試験#1）では、単回用量100μgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を、または7日ごとに合計3回（Q7D×3回）、1回量33μgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を、個々のマウスの群に投与した。別の試験（試験#2）では、単回用量100、500、もしくは1500μgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を、または3日ごとに合計3回（Q3D×3回）、167μgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を、個々のマウスの群に投与した。全ての処置をIP投与した。全群の担癌マウスにおけるPKを求め、そして、非担癌マウスにおける予測PKと比較した。
【０７０９】
図29A〜29Fは、経時的な処置群ごとの血清濃度の観察値（丸）および予測値（実線）を、信頼区間（破線）を含めて示す。これらデータは、hPD-L1-MC38担癌マウスにおける例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）のPKが、非担癌PKモデル予測におけるPKと重複していることを示す。これら結果は、担癌マウスおよび非担癌マウスのPKが類似しているという知見と一致しており、その結果、非担癌マウスから得られたPKパラメータを腫瘍のPK/PDモデルに使用することができる。
【０７１０】
表E35は、マウスPKモデルの推定PKパラメータを提供する。
【０７１１】
（表Ｅ３５）マウスPKモデルの推定PKパラメータ
2022501361.tif 000123
【０７１２】
b. PKのサルモデル
雌カニクイザルに、単回用量0.1、1、および10mg/kgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）をIV注入によって（30分）または10mg/kgの例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）をSC注射によって投与した。逐次血清サンプルをバリアントCD80 IgV-Fc融合タンパク質の濃度について分析し、そして、そのデータを用いてサルPKモデルを開発した。
【０７１３】
図30Aは、経時的な用量群ごとの血清濃度の観察値（丸）および予測値（実線）を示す。図30Bは、サルPKモデルの適合度を示す。これら結果は、直線的なクリアランスを伴う2コンパートメントモデルがサルのPKを特徴づけ得ることを示す。
【０７１４】
表E36は、サルPKモデルの推定PKパラメータを提供する。
【０７１５】
（表Ｅ３６）サルPKモデルの推定PKパラメータ
2022501361.tif 000124
【０７１６】
B. PDのモデリング
1. PDのマウスモデル
マウス腫瘍モデルにおいてPDをモデル化するために、NONMEM v7.4.2を用いて、マウスのPKパラメータを固定し、そして、マウスの腫瘍データを用いてPDパラメータを推定する、逐次パラメータ推定法を利用した。ビヒクル対照処置群からの個々の動物の腫瘍成長データを使用することによって、腫瘍成長モデルを特徴付けた。
【０７１７】
雌CD57BL/6NJマウスに、ヒトPD-L1を発現しているマウス結腸腺がんMC38細胞を移植し、処置群に割り付け、そして、試験#1および試験#2で上記した通り例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）を投与した。
【０７１８】
以下の模式図に従ってPDをモデル化し、この図では、シグナル分布モデル（SDM）を使用して例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcの存在下における腫瘍成長関数および腫瘍成長阻害関数を説明した（例えば、Lobo, ED et al., AAPS PharmSci.2002; 4(4):E42）。
2022501361.tif 000125
【０７１９】
PDのSDMは、以下の式を含んでいた：
2022501361.tif 000126
（式中、Rは、腫瘍体積をmm3で表し；Kg(day-1)は、正味の腫瘍成長についての一次速度定数を表し；Kmax(day-1)は、最大殺傷速度定数を表し；IC50（μg/mL）は、Kmaxの50％を生じさせる薬物濃度を表し；τ(day)は、コンパートメント間の平均移行時間であり（例えば、K1、K2、K3、およびK4、模式図を参照）；γはヒル係数であり；f[Cp]（上の模式図を参照）は、中枢コンパートメントの薬物濃度の経時変化の関数であり；およびg[R]（上の模式図を参照）は、腫瘍成長の経時変化の関数である）。このモデルでは、初期薬物効果シグナルKは、薬物濃度に依存する。初期効果シグナルは、通過するコンパートメントのカスケードを通して伝達される。伝達カスケードの終わりに、初期薬物効果の結果、腫瘍細胞の一部が死滅する。
【０７２０】
以下の通り、推定PDパラメータによって、腫瘍系が成長も退縮もしない最小の薬物濃度である腫瘍静止濃度（TSC）を計算した（Jumbe NL et al., J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2010; 37:221）：
2022501361.tif 000127
【０７２１】
図31A（試験#1）および31B（試験#2）は、数日間にわたる用量群ごとの中央腫瘍体積（mm3）の観察値（線を当てはめた三角形）および予測値（実線）を示す。推定PKパラメータを表E37に記載する。結果は、単純な指数関数的腫瘍成長モデルでhPD-L1-MC38腫瘍の成長データを表せることを裏付けるものであり；推定腫瘍倍加時間は約5.3日であった。例示的なバリアントCD80 IgV-Fcによる遅発性腫瘍成長阻害は、SDMによって適切に表された。TSCは、10.6μg/mLと計算された。結果は、例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）による腫瘍成長の阻害が、用量および曝露の両方に依存するという所見と一致している。
【０７２２】
表E37は、推定PDパラメータを示す。
【０７２３】
（表Ｅ３７）マウスPDモデルの推定PDパラメータ
2022501361.tif 000128
【０７２４】
C. ファースト・イン・ヒューマン試験におけるヒトPKの予測および用量選択
体重に基づく推定サルPKパラメータの相対成長率に基づいてヒトPKパラメータを計算し、CLおよびQについては倍率0.8、そして、第1および第2のコンパートメント（V1およびV2、上記Aセクション参照）については係数1であった。予測されるヒトの最大血清濃度および標的飽和度に基づいて出発用量を決定した。予測されたヒトのPKプロファイルをモデルで推定されたPD標的濃度（TSC）と組み合わせて使用して、ヒトにおける用量レジメンを予測した。モデリングは、IV投与経路に基づいていた。
【０７２５】
図32Aは、様々な濃度の例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcを週1回投与（Q1W）した場合の予測される標的飽和度を示す。IV注入終了時に標的飽和度が最大になると予測された。バリアントCD80-IgV-Fcの初回IV投与後の予測CD28標的飽和度16％に基づいて、0.003mg/kgの出発用量を最小予想生物学的効果レベル（MABEL）であると決定した。
【０７２６】
図32Bは、様々な濃度の例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcを週1回投与（Q1W）した場合の予測されるヒトPKを示し、そして、図32Cは、様々な濃度の例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fcを3週間ごと（Q3W）に投与した場合の予測されるヒトPKを示す。TSCに基づいて、計画された臨床的に効果的な用量レジメンは、1〜3mg/kgを週1回（Q1W）および3〜10mg/kgを3週間に1回（Q3W）であった。
【０７２７】
D. 結論
非臨床PKモデリング／シミュレーションをモデルから導き出された腫瘍静止薬物濃度（TSC）と組み合わせたトランスレーショナルストラテジーを使用して、ヒトの用量選択を決定することができる。この実施例に記載されているSDM等の伝達モデルを使用して、がん免疫生物学的治療に情報を提供することができる。
【０７２８】
実施例27
MC38マウス腫瘍モデルにおけるCD80バリアント分子および化学療法剤の組み合わせの評価
この実施例では、例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含むバリアントCD80 IgV；SEQ ID NO:491）の抗腫瘍活性の評価について説明する。例示的なバリアントの抗腫瘍活性を試験するために、同系マウス結腸がん固形腫瘍モデルであるヒトPD-L1を発現しているMC38腫瘍を有するマウスにおいて、単独でまたは白金系化学療法剤であるオキサリプラチンと組み合わせて評価した。
【０７２９】
ウイルス形質導入を用いて親MC38細胞にhuPD-L1を形質導入することによって、huPD-L1 MC38細胞株を作製した。8週齢の雌C57/BL6NJマウス（The Jackson Laboratories, Sacramento, CA）に0.5×106個のhuPD-L1/MC38細胞を皮下移植した。注射については、0.1mLの細胞（0.5×106個の細胞）を右中側腹部に皮下（SC）注射した。
【０７３０】
1日目に、マウスをそれぞれ10頭のマウスの4つの群に無作為化し、各群における全てのマウスはほぼ等しい平均腫瘍体積（約108mm3）を有していた。腫瘍細胞移植後7日目（「1日目」と称する）から始めて週2回、電子ノギスを用いて腫瘍を2次元的に測定した。長さ×（幅×2）×0.5として腫瘍体積を計算し、長さは2つの測定値のうちの長い方とした。1日目から始めて、試験した分子を腹腔内（IP）注射を通して送達し、表E38に概要を示す通り、1日目、4日目、および7日目にバリアントCD80 IgV-Fcを合計3回送達し、そして、1日目、8日目、および15日目にオキサリプラチンを投与した。
【０７３１】
（表Ｅ３８）処置の説明
2022501361.tif 000129
【０７３２】
試験において各群の全てのマウスが生存していた最後の日（25日目）の腫瘍体積を用いて、各処置群内の個々のマウスの腫瘍成長阻害（TGI）値を以下の式を用いて計算した：［（Fc対照の腫瘍サイズの平均値−個々のマウスの腫瘍サイズ）÷Fc対照の腫瘍サイズの平均値］×100。
【０７３３】
図33に示すように、huPD-L1+MC38担癌マウスにおいて、オキサリプラチン単独では単剤療法として中等度の効果しか得られなかったが、バリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）は、このモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有していた。化学療法をCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）と組み合わせて投与した場合、いずれかの剤単独よりも、経時的に腫瘍成長の著しく大きな減少が観察された。処置開始時には全ての群で腫瘍サイズが等しかったが（108mm3）、CD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）とオキサリプラチンとの組み合わせで試験した群の腫瘍体積の中央値は、投与開始の11日後にはゼロに低下していた。
【０７３４】
また、全ての群で試験においてマウスの少なくとも70％がまだ生存していた最後の日（25日目）の腫瘍体積に基づいて、処置した個々のマウスの平均腫瘍成長阻害率（TGI）を、式［（Fc対照腫瘍サイズの平均値−処置した腫瘍サイズの平均値）÷Fc対照腫瘍サイズの平均値］×100）を用いて求めた。TGIによって測定した組み合わせの抗腫瘍活性を表E39に示す。示されている通り、単剤療法群におけるマウスの30％が試験終了時に無腫瘍であった。Fc対照と組み合わせてオキサリプラチンを週3回投与した結果、単剤療法で観察された抗腫瘍活性よりも弱い活性しか得られなかった。Fc対照＋オキサリプラチン群では、無腫瘍マウスは存在しなかったが、Fc対照単独群に対するその群における腫瘍成長および平均TGI値の差は統計的に有意であった。週1回のオキサリプラチン処置とバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）投与とを組み合わせた結果、他の全ての群に比べて有意に優れた抗腫瘍活性が得られ、マウスの90％が無腫瘍となり、そして、平均TGI値はほぼ100％であった。
【０７３５】
（表Ｅ３９）抗腫瘍成長活性の概要
2022501361.tif 000130
TGI=腫瘍増殖阻害；TF=無腫瘍；D=日、IP=腹腔内。
【０７３６】
これら結果は、アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含む例示的なバリアント等のPD-L1に対する結合親和性が増大したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）分子を、例示的な白金系化学療法剤オキサリプラチン等の化学療法剤の存在下で投与することができ、そして、その組み合わせ処置により有効性が高まり得ることを示す。
【０７３７】
実施例28
MC38マウス腫瘍モデルにおけるCD80バリアント分子および抗CTLA-4抗体の組み合わせの評価
この実施例では、例示的な試験したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含むバリアントCD80 IgV；SEQ ID NO:491）の抗腫瘍活性の評価について説明する。例示的なバリアントの抗腫瘍活性を試験するために、同系マウス結腸がん固形腫瘍モデルであるヒトPD-L1を発現しているMC38腫瘍を有するマウスにおいて、バリアントCD80 IgV-Fcを単独でまたは例示的なCTLA-4に対する抗マウスチェックポイント抗体（抗CTLA-4；クローン9D9）と組み合わせて評価した。
【０７３８】
8週齢の雌C57/BL6NJマウス（The Jackson Laboratories, Sacramento, CA）に1.5×106個のhuPD-L1/MC38細胞（実施例27に記載）を皮下移植した。マウスへの腫瘍細胞移植後8日目、11日目、または14日目に、表E40に記載の通り、腹腔内（IP）注射を通して試験分子を送達した。実質的に実施例27に記載の通り、腫瘍体積を測定した。
【０７３９】
（表Ｅ４０）処置の説明
2022501361.tif 000131
【０７４０】
図34に示すように、huPD-L1+MC38担癌マウスにおいて、抗CTLA-4単独では単剤療法として中等度の効果しか得られなかったが、バリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（CD80 IgV H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、SEQ ID NO:491）は、このモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有していた。抗CTLA-4チェックポイント阻害剤をCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）と組み合わせて投与した場合、いずれかの剤単独よりも、経時的に腫瘍成長の著しく大きな減少が観察された。これら結果は、アミノ酸置換H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90Gを含む例示的なバリアント等のPD-L1に対する結合親和性が増大したバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）分子が、チェックポイント阻害剤との併用療法として適合し、そして、チェックポイントのみの遮断等、中等度にしか有効ではない他の治療モダリティの抗腫瘍活性を改善することができるという知見と一致する。
【０７４１】
実施例29
バリアントCD80 IgV-Fcの作用機序の評価
X線結晶構造解析を用いて、野生型PD-L1に対するCD80 IgV-Fc（不活性）（CD80 IgV H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）のCD80 IgVドメインの結晶構造を解明した。図35に示すように、CD80 IgV:PD-L1の結晶構造（分解能3.15Å）は、PD-L1の接触残基がCD28:CD80の接点とは異なる非重複結合界面を示した。互いに4.0Å以内のCD80とPD-L1との相互作用に関与する残基を相互作用残基と定義し（M.D. Winn et al. Acta.Cryst.D67, 235-242 (2011)、以下が含まれていた：CD80残基Lys43、Glu44、Val45、Lys88、Asn89、Arg90、Thr91、Ile92、Asp94、Met102、Leu104、Gly105、Arg 107およびPD-L1残基Ile54、Tyr56、Gln66、Val68、His69、Glu71、Arg113、Met115、Ile116、Ser117、Gly120、Ala121、Asp122、Tyr123。
【０７４２】
抗腫瘍活性を機構的にさらに評価するために、CD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491）処置を抗PD-L1または抗CD28遮断抗体と組み合わせることによって、実質的に実施例28に記載の通りヒトPD-L1が形質導入されたMC38腫瘍モデルを用いてインビボで抗腫瘍活性を評価した。逐次腫瘍測定により抗腫瘍活性を評価した。マウスへの腫瘍細胞移植後8日目、11日目、または14日目に、それぞれ単独でまたは100μgの濃度の抗体もしくはCD80 IgV-Fcと組み合わせて、腹腔内（IP）注射を通して試験分子を送達した。
【０７４３】
図36A（抗CD28）または図36B（抗PD-L1）に示すように、バリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）は、PD-L1遮断単独よりも優れた活性を示し、そして、抗CD28または抗PD-L1のいずれかとの共投与は、バリアントCD80 IgV-Fc（不活性）単独療法の抗腫瘍活性を低下させた。
【０７４４】
まとめると、これら結果は、CD80 IgVドメインがCD28とPD-L1に結合するために別々の非競合エピトープを利用しているという所見と一致している。例示的なCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）は、腫瘍細胞上のPD-L1とT細胞上のCD28またはCTLA-4とに同時に会合することができ、PD-L1およびCTLA-4の両方のチェックポイントを遮断するとともに、PD-L1の存在下でCD28共刺激を誘発する固有の能力を付与する。さらに、抗PD-L1等のチェックポイント阻害剤のみの治療法に比べて優れた例示的なバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）（H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G）の活性は、チェックポイント阻害およびCD28共刺激の両方を媒介するバリアントCD80 IgV-Fc（不活性）の能力が、抗腫瘍応答を改善し得ることを示す。
【０７４５】
実施例30
CD80 IgV-Fc分泌型免疫調節タンパク質（SIP）の作製ならびにSIPの分泌、生物活性、および結合の評価
CD80 IgV-Fc分泌型免疫調節タンパク質（SIP）を作製するために、例示的なSIPをコードしているDNAをIntegrated DNA Technologies（Coralville, USA）から遺伝子ブロックとして入手し、次いで、Gibson assembly（New England Biolabs Gibson assembly kit）によってpRRLベクターの改変バージョンのMNDプロモーターの下流にある制限酵素部位の間にクローニングした。シグナルペプチドおよびさらにタグ部分を含むタンパク質をコードするように、例示的なSIP構築物を作製した。具体的には、ベクターはGFPもコードしており、そして、SIPをコードしているDNAとGFPをコードしているDNAの間にフリン−リンカー−P2a配列を配置して、SIPタンパク質およびGFPタンパク質を連続して発現させらせるようにした。遺伝子ブロックは、以下の順に以下の構造を有していた：
2022501361.tif 000132
として記載されるシグナルペプチドをコードしている、Afe1制限酵素部位の上流にあるシグナルペプチド配列
2022501361.tif 000133
との53塩基対の重複；以下の表E41に記載のSIPアミノ酸配列をコードしているDNA配列であって、全ての場合においてSEQ ID NO:1504（3×GGGGS）またはSEQ ID NO:1522（GSGGGGS）に記載の1つまたは複数のリンカーも含むDNA配列；Fcエフェクター機能を排除するように改変されたヒトIgG1 Fc領域をコードしているDNA（SEQ ID NO:1518）；フリン切断部位（RAKR）をコードしているDNA内の固有のBlp1制限酵素部位の下流にあるコード配列との38塩基対の重複；以下の順で含まれるフリン切断部位の下流にクローニングされた追加のORF配列：リンカー配列をコードしているDNA（SSGSGGSG、SEQ ID NO:1593）；リボソーム・スキッピング配列P2a
2022501361.tif 000134
をコードしているDNA；GFPをコードしているDNA
2022501361.tif 000135
；TAA終止コドン。
【０７４６】
例示的な作製したSIP構築物を表E41に記載する。示されているように、実施例24に記載の例示的な多価フォーマットのSIPバージョンを含む、二価および他の多価、例えば四価のフォーマットを作製した。
【０７４７】
（表Ｅ４１）CD80 IgV-Fc分泌型免疫調節タンパク質（SIP）バリアント
2022501361.tif 000136
2022501361.tif 000137
【０７４８】
レンチウイルスベクターを調製するために、100mmのディッシュ1枚あたり4×106個のHEK293細胞をプレーティングした。翌日、5mLのポリプロピレンチューブにおいて、SIP構築物をコードしているDNA 6μgに、P-Mix（3μgのPAX2および1.5μgのpMD2G）4.5μgを添加した。希釈バッファ（10mM HEPES/150mM NaCl pH7.05/1L TCグレードH20）をチューブに添加して、合計体積を500μLにした。希釈DNA（PEI:全DNA 4:1）に、42μLのPEI（1μg/μL）を添加し、そして、ボルテックスによって混合した。混合物を室温で10分間インキュベーションし、そして、接着細胞を乱さずに穏やかにディッシュから培地を吸引することによって細胞を調製し、次いで、9mLのOpti-MEM（1×）に交換した。次いで、DNA/PEI混合物をディッシュに添加し、そして、37℃で24時間インキュベーションした。24時間後、ディッシュから培地を吸引し、そして、新鮮DMEM培地10mLと交換し、次いで、37℃でインキュベーションした。0.45μmのフィルターPESに装着したシリンジを用いて48時間後にウイルス上清を回収し、培養物から細胞および残屑を除去した（Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter）。
【０７４９】
Jurkat細胞およびドナー汎T細胞に、CD80 IgV-Fc SIPをコードしているウイルスベクターを形質導入した。汎T細胞を解凍し、そして、1:1の比の抗CD3/抗CD28ビーズ（Dynal）で活性化した。細胞（1×106個の細胞）を、標的MOIが0.7になるように濃度を調整した指定のCD80 IgV-Fc SIPをコードしているレンチウイルス粒子を含有する上清と混合した。対照として、細胞にモックベクター対照を形質導入した。8μg/mLのポリブレンおよび100IU/mLのIL-2の存在下で形質導入を行った。細胞を30℃、30分間1000gでスピンダウンした。24時間後、各ウェルから0.8mLの培地を取り除き、そして、新鮮Xvivo15 plus培地およびIL2と交換した。2日ごとに細胞に新鮮培地およびサイトカインを供給した。
【０７５０】
形質導入後2日目から始めて、上記形質導入した細胞の培養上清をELISAアッセイのために毎日回収した。ELISAアッセイ用のサンプルには、形質導入した細胞の未希釈上清とその1:3連続希釈液が含まれ、そして、50ng/mLの精製組換えSIPタンパク質およびその1:3連続希釈液を用いて、上清のSIP濃度を求めるための標準曲線を作成した。図37に示すように、2人の異なるドナーからの形質導入汎T細胞の上清サンプルではSIPタンパク質が検出されたが、モック形質導入細胞の上清サンプルでは検出されなかった。
【０７５１】
CD80 IgV-Fc SIPがCD28共刺激を調節する能力を評価するために、実質的に実施例9に記載の通りJurkat/IL-2レポーターアッセイを行った。IL-2-ルシフェラーゼレポーターを発現しているJurkatエフェクター細胞を、形質導入された細胞表面抗CD3一本鎖Fv（OKT3）およびPD-L1を提示しているK562由来の人工抗原提示細胞（aAPC）と共培養した。25nMから始めた精製CD80 IgV-Fcタンパク質対照（表E41のSIP1）およびその1:3連続希釈液、ならびに形質導入7日後のSIP形質導入細胞の未希釈上清およびその1:3連続希釈液を添加した際に、CD28共刺激を評価した。
【０７５２】
図38に示すように、SIPを含む上清に曝露した結果、CD28共刺激および下流のシグナル伝達が増加してIL-2プロモーターが活性化され、その結果、レポーター細胞株からルシフェラーゼが誘導された。Jurkat細胞および汎T細胞によって分泌されたSIPのCD28共刺激のEC50値を以下の表E42に示す。例示的なSIP5およびSIP6として記載された多価SIPフォーマットについて、CD28共刺激の増加（ルシフェラーゼ活性によって測定）およびEC50の低下が観察された。
【０７５３】
（表Ｅ４２）Jurkatおよび汎T細胞によって分泌されたSIPのCD28共刺激のEC50値
2022501361.tif 000138
【０７５４】
PD-L1を発現しているK562由来aAPCに対するCD80 IgV-Fc SIPの結合を評価するために、細胞結合アッセイを行った。5μg/mLの出発濃度の精製CD80 IgV-Fc SIPおよびその1:3連続希釈液と共にK562/OKT3/PD-L1+細胞をインキュベーションした。結合したCD80 IgV-Fc SIPを、フローサイトメトリーを用いて検出した。SIP結合標準曲線およびEC50値を図39に示す。
【０７５５】
まとめると、結果は、可溶性CD80-IgV SIPを発現するように遺伝子操作されたT細胞が、PD-L1およびPD1の相互作用を遮断し、そして、PDL1依存的にCD28共刺激シグナルに関与するという所見と一致している。さらに、結果から、多価フォーマットが、CD28が媒介する共刺激を誘導する効力の増大が確認される。
【０７５６】
実施例31
CD80 ECD-Fcバリアントの結合活性の評価
上記スクリーニングで同定されたCD80バリアントを用いて、CD80 ECD-Fcタンパク質を構築した。指定のアミノ酸置換を含むSEQ ID NO:2に記載のCD80の完全細胞外ドメイン（ECD）を含有する融合タンパク質を、エフェクター活性を有するヒトIgG1 Fcに融合させた。対照として、SEQ ID NO:2に記載の野生型CD80のECDを含有するFc融合タンパク質も作製した。例示的な作製された分子は、CD80（A91G/I118V/T120S/T130A）ECD-Fc、CD80（S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A）ECD-Fc、CD80（E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R）ECD-Fc、CD80（E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E）ECD-Fc、および野生型CD80 ECD-Fcを含んでいた。また、SEQ ID NO:1527に記載のエフェクターFcは、野生型ヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:1502に記載）を参照して、変異C220S（EU番号付けによる）を含んでおり（FcのC5Sに対応）、さらに、C末端リジンの除去K447del（EU番号付けによる）（232位の欠失に対応）を含んでいた。
【０７５７】
実質的に実施例7に記載の通り、細胞で発現した結合パートナーとの結合についてCD80-ECD-Fcバリアントを試験した。また、結合についてのEC50も求めた。結合に関する結果を表E43に与える。示されているように、完全ECDでフォーマットされた場合、試験した全てのバリアント分子が、野生型CD80 ECDと同様にPD-L1に対して非常に低レベルの結合を呈し、その結果、結合の程度は、PD-L1への検出可能な結合が実質的にないことを表すと判定された。対照的に、全ての例示的な分子は、野生型CD80と比較してCTLA-4に対する結合親和性の増大を呈し、場合によってはCD28に対する結合親和性の増大も呈した。
【０７５８】
（表Ｅ４３）CTLA4またはPD-L1を安定的に発現しているCHO細胞およびJurkats（CD28）に対するフロー結合
2022501361.tif 000139
【０７５９】
また、作製された分子の生物活性を実施例9に記載のJurkatレポートアッセイを用いて評価して、分子のCD28共刺激を評価した。このアッセイでは、人工抗原提示細胞（K562/OKT3）はPD-L1を発現しなかった。Jurkatレポーターアッセイの結果を表E44および図40に与える。示されているように、作製されたバリアントCD80分子は、用量依存的であった野生型CD80と比較して、このアッセイにおいてCD28の共刺激の増大を呈した。この結果は、これら分子がCD28アゴニズムを媒介することができたことを示す。
【０７６０】
（表Ｅ４４）Jurkat/IL2+CHO/OKT3レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
2022501361.tif 000140
【０７６１】
本発明は、例えば本発明の様々な局面を例証するために提供される特定の開示した態様に範囲が限定されることが意図されるものではない。本明細書の説明および教示から、記載されている組成物および方法への様々な変更が明らかになるであろう。このような変形は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施されてよく、そして、これらは本開示の範囲内にあることが意図される。
【図１Ａ】
2022501361.tif 000142
【図１Ｂ】
2022501361.tif 000143
【図２Ａ】
2022501361.tif 000144
【図２Ｂ】
2022501361.tif 000145
【図３】
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【図４】
2022501361.tif 000147
【図５】
2022501361.tif 000148
【図６】
2022501361.tif 000149
【図７】
2022501361.tif 000150
【図８】
2022501361.tif 000151
【図９】
2022501361.tif 000152
【図１０】
2022501361.tif 000153
【図１１】
2022501361.tif 000154
【図１２】
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【図１３】
2022501361.tif 000156
【図１４】
2022501361.tif 000157
【図１５】
2022501361.tif 000158
【図１６】
2022501361.tif 000159
【図１７】
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【図１８】
2022501361.tif 000161
【図１９】
2022501361.tif 000162
【図２０】
2022501361.tif 000163
【図２１】
2022501361.tif 000164
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
2022501361.tif 000175
【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
2022501361.tif 000177
【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図３０Ａ】
2022501361.tif 000181
【図３０Ｂ】
2022501361.tif 000182
【図３１Ａ】
2022501361.tif 000183
【図３１Ｂ】
2022501361.tif 000184
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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