(57)【要約】Ｓｉｇｌｅｃ−３受容体への結合親和性を示す新規モノクローナル抗体がここに開示される。実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ＨＢＶ誘導性免疫抑制を回復させることができる。したがって、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置及び／又は予防におけるその使用もここに開示される。【選択図】図６（Ａ）
2022501319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の予防又は処置のための抗体又はそのフラグメントであって、
ＶＹＹ、ＩＳＳＡＧ（配列番号３）及びＱＹＦＮＦＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を備える軽鎖可変領域と、
ＮＮＧＷ（配列番号５）、ＧＩＧＰＹＧＧＳＴＦ（配列番号６）及びＳＲＦＩＧＳＹＳＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を備える重鎖可変領域と、
を備える抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
被検体におけるＨＢＶ感染を予防又は処置する方法であって、請求項１に記載の抗体の有効量を前記被検体に投与するステップを備える方法。
【請求項５】
前記抗体の前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記抗体の前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記被検体がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
被検体におけるＨＢＶ感染を予防又は処置する医薬品の調製のための請求項１に記載の抗体の使用。
【請求項９】
前記抗体の前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記抗体の前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ＨＢＶ感染の前記予防及び処置における使用のための請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体の前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記抗体の前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項１１に記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
ＨＢＶ感染の予防又は処置のための薬学的組成物であって、請求項１に記載の抗体の有効量と、薬学的に許容可能な担体とを備える薬学的組成物。
【請求項１５】
前記抗体の前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記抗体の前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概略として、感染を処置する分野に関する。より具体的には、本開示は、新規の抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体並びにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置及び／又は予防におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶは、レトロウイルスと同様の珍しい特徴を備えた、エンベロープを有する部分的に二本鎖のＤＮＡウイルスである。一般に、ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介して複製し、宿主ゲノムに統合できる。ＨＢＶ複製サイクルの固有の特徴は、感染した細胞で存続するというウイルスの特有の能力を与える。ＨＢＶ感染は、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む広範囲な肝疾患につながる。世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０１５年には約８８７，０００人の死亡をもたらしたＨＢＶ感染して生存する人が世界的に２億５７００万人いると推定する。
【０００３】
急性Ｂ型肝炎（ＡＨＢ）感染に対する特定の処置は存在ない。したがって、介護は、快適さ、並びに嘔吐及び下痢で失った水分の補充を含む適切な栄養バランスを維持することを目的とする。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染に関しては、エンテカビル（バラクルード）、ラミブジン（エピビルＨＢＶ）、アデフォビルジピボキシル（ヘプセラ）、インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ）、ペグインターフェロン（ペガシス）、テルビブジン（タイゼカ）及びテノホビル（ビリアード）を含むいくつかの薬が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。しかし、ほとんどの人については、これらの治療はＨＢＶ感染を治すのではなく、ウイルスの複製を抑制するだけである。したがって、Ｂ型肝炎治療を開始するほとんどの人は、一生それを続けなければならない。
【０００４】
上記を考慮して、肝硬変及びＨＣＣの発生率を低減させることによって患者の長期生存を改善するようにＨＢＶ感染を効率的に予防及び／又は治療するための新規な方法に対するニーズが本関連技術には存在する。
【発明の概要】
【０００５】
以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の広範な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。
【０００６】
ここで具現化され、広く記載されるように、本開示の一態様は、ＨＢＶ感染の処置又は予防に対する抗体又はそのフラグメントに向けられる。抗体は軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を備え、ＶＬ領域が第１の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｌ１）、第２の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ２）及び第３の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ３）を備え、ＶＨ領域が第１の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１）、第２の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ２）及び第３の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ３）を備える。
【０００７】
本開示のある実施形態によれば、ＣＤＲ−Ｌ１はＶＹＹのアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２はＩＳＳＡＧ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：）３）のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３はＱＹＦＮＦＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ１はＮＮＧＷ（配列番号５）のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２はＧＩＧＰＹＧＧＳＴＦ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３はＳＲＦＩＧＳＹＳＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
好ましくは、ＶＬ領域は配列番号８に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を備え、ＶＨ領域は配列番号９に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を備える。特定の一実施例では、ＶＬ領域は配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＶＨ領域は配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
したがって、ＨＢＶ感染の予防又は処置のための医薬品又は薬学的組成物を製造する上記実施形態のいずれかによる本抗体の使用を提供することが、この開示の第２の態様である。医薬品又は薬学的組成物は、上記の抗体の有効量及び薬学的に許容可能な担体を備える。
【００１０】
この発明の抗体は、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、約０．１重量％〜９９重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、この発明の抗体は、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも１重量％のレベルで存在する。所定の実施形態では、この発明の抗体は、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、この発明の抗体は、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。またさらに他の実施形態では、この発明の抗体は、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００１１】
本開示の他の態様は、被検体におけるＨＢＶ感染を予防又は処置する方法に関する。本方法は、上記の態様及び実施形態のいずれかによる抗体、薬学的組成物又は医薬品の有効量を被検体に投与するステップを備える。
【００１２】
本方法によって処置可能な被検体は、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウサギである。好ましくは、被検体はヒトである。
【００１３】
本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。
【００１４】
本説明は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本開示の実施例１による、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）上の特定されたグリカンのパーセンテージを示すデータである。パネルＡ：ＣＨＢ患者から単離されたＨＢＶ（ｈＨＢＶ）に由来し、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。パネルＢ：ｈＨＢＶに由来し、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド。パネルＣ：トランスジェニックマウスから単離されたＨＢＶ（ｍＨＢＶ）に由来し、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド。ｂｉ：末端Ｎｅｕ５Ａｃなし、ｂｉＳ１：１個のＮｅｕ５Ａｃ、ｂｉＳ２：２個のＮｅｕ５Ａｃ。
【図２】図２は、本開示の実施例２による、ＨＢＶ及びＳｉｇｌｅｃ−３の相互作用を示すデータである。パネルＡ及びＢ：ＳｉｇｌｅｃＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質によるｈＨＢＶ（パネルＡ）及びｍＨＢＶ（パネルＢ）の免疫沈降。Ｓ／Ｍ／Ｌ：スモール／ミドル／ラージＨＢｓＡｇ、ｇＳ：グリコシル化されたスモールＨＢｓＡｇ。パネルＣ：ＥＬＩＳＡによるｈＨＢＶ及びｍＨＢＶのＳｉｇｌｅｃＥＣＤ．Ｆｃとの相互作用の決定。パネルＤ：ｈＨＢＶとインキュベートした単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるｈＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ−３、−７、−９との間のＦＲＥＴ効率。パネルＥ：新たに単離されたＣＨＢ患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｈＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ−３、−７、−９との間のＦＲＥＴ効率（血清ＨＢＶのＤＮＡレベル＞２．０×１０７ＩＵ／ｍＬ）。ＦＲＥＴ効率は、ＦＬＩＭ−ＦＲＥＴアナライザーソフトウェアによって決定され、「材料及び方法」に言及されている式に従って計算された。データは、条件ごとにｎ＝１０〜１５個の細胞に対して平均±ｓ．ｄ．として表される。＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。パネルＦ及びＧ：シアログリカン（パネルＦ）及びシアリダーゼ−Ｃ／シアリダーゼ−Ｓ処置シアログリカン（パネルＧ）によるｈＨＢＶ及びＳｉｇｌｅｃ−３相互作用の競合アッセイ。パネルＨ：ｈＨＢＶ及びＳｉｇｌｅｃ−３相互作用に対するシアリダーゼ−Ｃ及びシアリダーゼ−Ｓの効果。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。図示されるすべてのデータは、３つの独立した実験の代表値である。
【図３】図３は、本開示の実施例４による、ＴＬＲリガンド誘導性サイトカイン分泌に対するｈＨＢＶの抑制効果を示すデータである。パネルＡ〜Ｄ：ｈＨＢＶは、Ｐａｍ３ｃｓｋ４で刺激されたｍｏＤＣ（パネルＡ及びＢ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたｍｏＤＣ（パネルＣ及びＤ）のサイトカイン分泌を阻害する。ＭｏＤＣは、ｐａｍ３ｃｓｋ４（パネルＡ及びＢ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）＋インターフェロン−γ（パネルＣ及びＤ）と共にさらに２４時間インキュベートする前に、２４時間にわたってｈＨＢＶ又はｍＨＢＶで前処置された。上清中のサイトカインのレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。データは、３回の独立した実験に対する平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）として表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。パネルＥ及びＦ：時間依存的（パネルＥ）及び用量経過依存的（パネルＦ）な態様におけるｈＨＢＶによるＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の漸増現象。ＭｏＤＣは、種々の用量のｈＨＢＶ（パネルＥ）又は異なる時間（パネルＦ）で処置され、ｍｏＤＣでのＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の漸増現象をウエスタンブロッティングによって観察した。シグナルは、ソフトウェアを使用したデンシトメトリーによって定量化された。値は、開始点に対して正規化された倍率変化を表した。
【図４】図４は、本開示の実施例５による特定されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のデータである。パネルＡ：ｍｏＤＣにおける、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の、ｈＨＢＶ又は抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ（クローン２Ｂ９又は１０Ｃ８）によって誘導されたＳｉｇｌｅｃ−３との会合。細胞溶解物は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂによってプルダウンされ、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２はウエスタンブロッティングによって検出された。パネルＢ：抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ（クローン２Ｂ９）によるｐａｍ３ｃｓｋ４で刺激されたｍｏＤＣからのＴＮＦ−α分泌の阻害。ＭｏＤＣは、ｐａｍ３ｃｓｋ４とインキュベートする前に、１時間にわたって抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂで前処置された。上清中のＴＮＦ−αは、ＥＬＩＳＡで決定された。データは３つの独立した実験に対する平均±ｓ．ｄ．として表される。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図５】図５は、本開示の実施例５．１によるｍＡｂ  １０Ｃ８の生物活性を示すデータであり、Ｓｉｇｌｅｃ−３とｈＨＢＶの間のＦＲＥＴ効率は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ（クローン＃１０Ｃ８）によって弱められた。パネルＡ：ＣＨＢ患者のＰＢＭＣにおけるＳｉｇｌｅｃ−３及びｈＨＢＶの相互作用。パネルＢ：外因性ｈＨＢＶとインキュベートされたｍｏＤＣにおけるＳｉｇｌｅｃ−３及びｈＨＢＶの相互作用。ＦＲＥＴ効率は、ＦＬＩＭ−ＦＲＥＴアナライザーソフトウェアによって決定され、「材料及び方法」に言及されている式に従って計算された。データは、条件ごとにｎ＝１０〜１５個の細胞に対して平均±ｓ．ｄ．として表される。＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。
【図６】図６は、本開示の実施例５．２によるｈＨＢＶ媒介性免疫抑制に対するｍＡｂ  １０Ｃ８の効果を示すデータである。パネルＡ〜Ｄ：抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂによる、ｐａｍ３ｃｓｋ４で刺激されたｍｏＤＣ（パネルＡ及びＢ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激されたｍｏＤＣ（パネルＣ及びＤ）からのサイトカイン分泌の回復。ＭｏＤＣは、ｐａｍ３ｃｓｋ４（パネルＡ及びＢ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＩＦＮ−γ（パネルＣ及びＤ）の存在下で種々の量のｈＨＢＶと２４時間インキュベートする前に、１時間にわたって抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂで前処置された。サイトカインのレベルはＥＬＩＳＡによって決定された。パネルＥ：抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂによる、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２のｈＨＢＶ媒介性漸増現象の阻害。ＭｏＤＣは、ＨＢＶと共に３０分間インキュベートされる前に、１時間にわたって抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂで前処置され、続いて抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂでプルダウンされた。免疫沈降物は、ブロッティングの前にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画され、続いて抗ＳＨＰ−１及び抗ＳＨＰ−２ｍＡｂでプロービングされた。定量化はソフトウェアを使用したデンシトメトリーによって決定され、数字は未処置のコントロールの値に対して正規化された各値の倍数を表した。パネルＦ〜Ｉ：ｐａｍ３ｃｓｋ４で刺激された（パネルＦ及びＧ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激された（パネルＨ及びＩ）ＣＨＢ患者のＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌の回復。新たに単離されたＣＨＢ患者のＰＢＭＣは、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂで前処置され、その後ｐａｍ３ｃｓｋ４（パネルＦ及びＧ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）（パネルＨ及びＩ）と共にインキュベートされた。上清中のサイトカインのレベルはＥＬＩＳＡによって分析された。データは、３つの独立した実験に対する平均±ｓ．ｄ．として表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その記載は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。
【００１７】
Ｉ．定義
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
【００１８】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【００１９】
用語「抗体」は、広義で使用され、それらが所望の生物学的活性を示す限り、具体的に、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを網羅する。「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般にその抗原結合又は可変領域を備える。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、二特異性抗体、リニアな抗体、一本鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。
【００２０】
「抗体フラグメント」は、損傷のない抗体の一部のみを備え、その部分は、損傷のない抗体に存在する場合、通常その部分に関連する機能を少なくとも１つ及びほとんど又はすべてと同じ数だけ保持する。一実施形態では、抗体フラグメントは、損傷のない抗体の抗原結合部位を備え、それゆえ抗原に結合する能力を保持している。他の実施形態では、抗体フラグメント、例えば、Ｆｃ領域を備えるものは、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合など、損傷のない抗体に存在する場合に通常Ｆｃ領域に関連する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体フラグメントは、損傷のない抗体と実質的に同等の生体内半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体フラグメントは、フラグメントに生体内安定性を与えることができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを備え得る。本発明における抗体フラグメントは、一本鎖抗体だけでなく、例えば、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）及びＦ（ａｂ）２を含む様々な形態で存在し得る。
【００２１】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。これらのドメインは、一般に抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００２２】
用語「可変の」は、可変ドメインの所定の部分が、抗体間の配列において大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるということをいう。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインの全体を通して均等に分布されない。それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインの双方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。生来の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にベータシート構成を採用し、３つのＣＤＲによって接続される４つのＦＲ領域を備え、ＣＤＲはベータシート構造を接続し場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して結束され、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を示す。
【００２３】
ここで使用される用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、結合した抗原の三次元表面に相補的な表面を形成する抗体分子の超可変領域をいう。Ｎ末端からＣ末端に向けて、抗体の重鎖及び軽鎖の各々は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を備える。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合部位は、重鎖の可変領域からの３つのＣＤＲ及び軽鎖の可変領域からの３つのＣＤＲを備える合計６つのＣＤＲを含む。
【００２４】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は既知であり、例えば、Ａｂｂａｓ他、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  ｅｄ．（２０００）に一般に説明されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有な会合によって形成される、より大きな融合分子の一部であり得る。
【００２５】
ここに記載されるように、抗体のアミノ酸配列における軽微な変更は、アミノ酸配列の変更が、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性など、少なくとも８５％の配列同一性を維持することを条件として、ここに開示され又は請求項に記載される発明の概念によって包含されているものとして考慮される。本開示の抗体は、具体的にはその生理学的活性に無関係であるペプチドの特徴を変化するように変性され得る。例えば、所定のアミノ酸は、本研究における抗体の生理学的活性（すなわち、ＨＢＶ感染を処置及び／又は予防するその能力）に影響を与えることなく変化及び／又は欠失され得る。特に、保存アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、以下のファミリー：（１）酸性のもの＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性のもの＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）無極性のもの＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非電荷極性のもの＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、に大別される。より好ましいファミリーとして：セリン及びスレオニンが脂肪族ヒドロキシファミリーであり、アスパラギン及びグルタミンがアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンが脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの単独置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の単独置換、セリンによるスレオニンの単独置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様な置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合、結果として得られる分子の結合又は特性に大きな影響がないと想定するのが合理的である。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ペプチド誘導体の特異的な活性をアッセイすることによって直ちに判定され得る。抗体のフラグメント又は類似体は、当業者によって容易に調製可能である。フラグメント又は類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近にある。一実施例では、本抗体の１つのアミノ酸残基（例えばバリン）は、（例えばロイシンにより）保存的に置換される。他の実施例では、本抗体の２つのアミノ酸残基は、他の適切なアミノ酸残基によって保存的に置換され、例えば、バリン（Ｖ）及びアルギニン（Ｒ）は、メチオニン（Ｍ）及びリジン（Ｋ）、リジン（Ｋ）及びプロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）及びイソロイシン（Ｉ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）及びバリン（Ｖ）並びにグルタミン（Ｇ）及びリジン（Ｋ）を含むがこれらに限定されないアミノ酸の対によって置換される。
【００２６】
「パーセンテージ（％）配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を得るように必要に応じて配列の整列及びギャップの導入を行った後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特定のペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセンテージ配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ）によって実行された。所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのパーセンテージアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して所定％のアミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Ａということもできる）は、以下の定式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００
ここで、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、いずれか短い方のＡ又はＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。
【００２７】
ここでいう用語「有効量」は、所望の反応をもたらすのに充分な量の成分を示す。処置の目的のため、有効量は、処置的に有益な効果が成分の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。具体的な有効な又は充分な量は、処置されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置されている哺乳類又は動物の種類、処置の継続期間、（それがある場合には）併用療法の性質、並びに採用される具体的処方及び化合物又はその誘導体の構造といった要因で変化することになる。有効量は、例えば、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで、又は体重の１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され得る。あるいは、有効量は、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比などの活性成分（例えば、本抗体）の濃度で表現され得る。当業者であれば、動物モデルから決定された用量に基づいて（本抗体のような）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された工業用ガイダンス「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」に従うことができる。
【００２８】
ここで使用されるように、用語「治療／処置する」、「治療／処置している」又は「治療／処置」は、互換可能であり、ＨＢＶ感染に関連する症状、続発性障害又は状態の部分的又は完全な予防、改善、緩和及び／又は管理を含む。ここで使用される用語「治療／処置している」は、ＨＢＶ感染に関連する１以上の症状、続発性障害又は特徴の部分的若しくは完全な軽減、改善、解放、発症の遅延、進行の阻害、重症度の低減及び／又は発症率の低減の目的で、ＨＢＶ感染に関連する症状、続発性障害又は状態を有する被検体に対しての本開示の１以上の抗体の適用又は投与をいう。ＨＢＶ感染に関連する症状、続発性障害及び／又は状態には、倦怠感、吐き気、嘔吐、暗色尿、関節及び筋肉の痛み、食欲不振、発熱、腹部不快感、脱力感、黄疸並びに肝不全が含まれるが、これらに限定されない。治療／処置は、ＨＢＶ感染に関連する症状、続発性障害及び／又は状態の進展のリスクを減少させる目的のために、そのような症状、障害及び／又は状態の初期の兆候のみを示す被検体に施され得る。治療／処置は一般に、その用語がここで定義されるように１以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合に「有効」となる。あるいは、治療／処置は、症状、障害又は状態の進行が低減又は停止される場合に「有効」となる。
【００２９】
ここで使用される用語「予防する」、「予防している」及び「予防」は、互換可能であり、被検体が症状、続発的障害又は状態を進展させる可能性を減少させるように、ＨＢＶ感染に関連する症状、続発的障害又は状態の進展のリスクがある被検体の予防的処置をいう。具体的には、用語「予防する」、「予防している」又は「予防」は、ＨＢＶ感染に関連する症状、続発的障害又は状態の発生を阻害すること、すなわち、症状、続発的障害又は状態の発生率又は発生頻度を低減することをいう。抗体、それを備える薬学的組成物及び／又は方法をいうここで使用される用語「予防する」、「予防している」及び「予防」は、抗体、それを備える薬学的組成物及び／又は方法の使用が症状、続発的障害又は状態が決して発生しないことの保証を提供するということではなく、むしろ、抗体、それを備える薬学的組成物及び／又は方法は症状、続発的障害又は状態の発生を阻害し、症状、続発的障害又は状態の発生率及び／又は頻度が低減されるということを意味又は示唆する。
【００３０】
「薬学的に許容可能」という文言は、例えば、ヒトに投与された場合に生理学的に寛容性があり、一般にアレルギー又は類似の胃の不調及びめまいなどの有害な反応を生成しない「一般に安全であるとみなされる」分子実体及び組成物のことをいう。好ましくは、ここで使用されるように、用語「薬学的に許容可能」とは、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されており、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。
【００３１】
用語「被検体」は、本発明の方法で処置可能なヒト種を含む哺乳類をいう。用語「被検体」は、ある性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方の性別をいうものとする。
【００３２】
ＩＩ．本発明の説明
本開示は、ＨＢＶがシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン−３（Ｓｉｇｌｅｃ−３）への結合親和性を示し、Ｓｉｇｌｅｃ−３に特異的な抗体がＨＢＶ誘導性免疫抑制を回復させることができるという発見に少なくともある程度基づく。
【００３３】
そこで、本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ−３受容体への結合特異性を示すモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのフラグメントを提供する。
【００３４】
本開示の実施形態によれば、本ｍＡｂは、ファージディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーによって生成される。理解されるように、本ｍＡｂは、代替的に、従来の免疫付与方法（すなわち、特定のペプチドで動物に免疫を付与する）によって生成され得る。
【００３５】
一般に、ポリペプチド（すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−３ポリペプチド）は、アルファアミノ基のｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣ保護などの一般的に使用される方法によって合成され得る。双方の方法は段階的な合成を含み、それによってペプチドのＣ末端から始まる各ステップで単一のアミノ酸が追加される。発明のポリペプチドは、周知の固相ペプチド合成法によっても合成され得る。
【００３６】
そして、抗体は、マウス、ラット又はウサギなどの宿主動物を合成ポリペプチドで免疫を付与することによって生成され得る。免疫付与は、一般的に採用される手順に従って行われ得る。免疫付与の間隔は特に限定されない。免疫付与は、所望の抗体力価に到達するまで、数日から数週間、好ましくは１週間の間隔で、２〜１０回実行され得る。例えば、宿主動物は、８週間連続して週１回の頻度での合成ポリペプチドの皮下注入によってワクチン投与を受け得る。
【００３７】
最後の免疫付与後、脾臓細胞及び所属リンパ節は除去される。免疫付与後、血液サンプルは定期的に採取され、血清を分離するように遠心分離に供される。そして、結果として得られた血清は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）又は放射免疫測定法（ＲＩＡ）を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法による抗体力価の測定に供される。好ましい一実施例では、抗体力価は、ＥＬＩＳＡによって測定される。そして、最後の免疫付与は、合成ポリペプチドに対して高い抗体力価を示すそれらの動物に与えられる。抗体生成細胞は、免疫付与された動物の脾臓細胞及び所属リンパ節などから調製される。抗体生成細胞の調製においては、組織残渣及び赤血球を可能な限り除去することが好ましい。市販の赤血球除去剤が、この目的に使用され得る。あるいは、塩化アンモニウム及びＴｒｉｓ緩衝液が、調製されて使用され得る。結果として調製された抗体生成細胞は、ハイブリドーマ細胞を生成するのに骨髄腫細胞などの不死細胞と直ちに融合されるべきであり、それは抗体を生成しつつ半永遠的に増殖を続ける。マウスなどの動物に由来する一般的に入手可能な細胞株が使用され得る。この発明で使用される好ましい細胞株は、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含むＨＡＴ選択培地中で生存するべきではなく、抗体生成細胞と融合された場合にのみそこで生存するべきである。骨髄腫細胞の例は、（骨髄腫ＦＯ細胞のような）マウス骨髄腫細胞株及び（Ｋａｒｐａｓ７０７Ｈのような）ヒト骨髄腫細胞株を含むがこれに限定されない。細胞融合は、通常、約２００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの細胞融合促進剤の存在下で、脾臓細胞又はリンパ節細胞を市販の骨髄腫細胞と混合することによって実行される。あるいは、細胞融合は、エレクトロポレーションなどの電気刺激を利用する市販の細胞融合装置で実行されてもよい。融合後、結果として得られた細胞は希釈され、ＨＡＴ培地で培養される。
【００３８】
そして、目的のハイブリドーマが、融合細胞から選択される。ＨＡＴ培地で培養されて生存している融合細胞は、コロニーを生成する。そして、各培養ウェルの上清が収集されポリペプチドに対する抗体力価の有無について調べられる。確認の方法として、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡが使用され得る。抗体陽性のウェルが同定されると、それから細胞はアミノプテリンを含まないＨＴ培地で培養される。しばらく培養した後、培養上清中の抗体力価を再度確認する。そして、最終的に選択された細胞は、単一の細胞を得るためにクローニングに供される。ポリペプチドに対して高い特異性を示すクローンが選択され、ハイブリドーマを確立するようにある程度増殖される。
【００３９】
ハイブリドーマによって生成されるモノクローナル抗体は、任意の既知の方法によって単離又は調製され得る。例えば、抗体は、低血清濃度の培地でハイブリドーマを培養することによって得られた培養上清から調製され得る。あるいは、ハイブリドーマは動物の腹部腔に注入されてもよく、結果として得られた腹部滴は抗体を調製するのに収集される。抗体は、アフィニティーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどを採用する方法によって精製又は単離され得る。これらの既知の方法はいずれも、適切に選択されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。
【００４０】
あるいは、本ｍＡｂはＤＮＡクローニングによって生成され得る。本ｍＡｂをコードするＤＮＡは、ｍＡｂの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用するような従来の手順を使用することによって容易に単離され配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクターに入れられ、そしてそれは免疫グロブリンタンパク質を生成しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞において所望のｍＡｂを合成する。
【００４１】
そして、生成されたｍＡｂ及びそのようなｍＡｂをコードするＤＮＡは、それに由来するキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体及び／又は抗体フラグメントを生成するのに使用され得る。
【００４２】
非ヒト起源ｍＡｂの主要な懸念は、場合によっては危険なアレルギー反応が引き起こされる受体に対するその免疫原性である。ほとんどのｍＡｂはマウス起源であり、ヒトに注入される場合免疫原性があることが分かっている。非ヒト起源ｍＡｂの免疫原性を低減させるために、ヒト化抗体は、非ヒト起源ｍＡｂの重鎖及び軽鎖における可変ドメインをヒト抗体の定常領域に付着させることにより生成される。
【００４３】
ヒト化ｍＡｂを作成するために、そのような抗体をコードするＤＮＡが単離及び配列決定され、そしてヒト化構築物を作成するのに使用された。
【００４４】
本開示の好ましい実施形態によれば、非ヒト起源のｍＡｂのＶＨ及びＶＬ遺伝子は、ヒトＩｇＧ１ベクターになるように構築される。したがって、結果として得られた抗体は非ヒト起源のｍＡｂに由来するＶＨ及びＶＬ領域を有し、その一方で定常領域遺伝子（すなわち、ＣＫ又はＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）はヒトＩｇＧのものである。
【００４５】
ヒト化ｍＡｂは、生成されると、クロスフロー濾過、アフィニティーカラムクロマトグラフィー及びゲル濾過などを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製され得る。ヒト化ｍＡｂは、非ヒト起源のｍＡｂのものと同一又は実質的に同様の態様で機能しなければならないことが理解されるべきである。好ましくは、ヒト化ｍＡｂは、非ヒトバージョンと比較して、ヒト被検体で使用するのにより効果的でなければならない。
【００４６】
したがって、本開示の第１の態様は、Ｓｉｇｌｅｃ−３受容体に特異的な（すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ又は抗Ｓｉｇｌｅｃ−３抗体フラグメントとしての）ｍＡｂ又はそのフラグメントに関する。本開示の実施形態によれば、ｍＡｂはＶＬ領域及びＶＨ領域を備え、ＶＬ領域がＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を備え、ＶＨ領域がＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を備える。
【００４７】
本開示の実施形態によれば、本ｍＡｂは抗体１０Ｃ８と表され、ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３はそれぞれ、ＶＹＹ、ＩＳＳＡＧ（配列番号３）及びＱＹＦＮＦＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を有し、ｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３はそれぞれ、ＮＮＧＷ（配列番号５）、ＧＩＧＰＹＧＧＳＴＦ（配列番号６）及びＳＲＦＩＧＳＹＳＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。
【００４８】
好ましくは、ＶＬ領域は配列番号８に対して少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を備え、ＶＨ領域は配列番号９に対して少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を備える。理解され得るように、ＶＬ及びＶＨ領域のフレームワーク配列は、本抗体の結合親和性及び／又は特異性に影響を与えることなく変化し得る（例えば、保存又は非保存アミノ酸残基によって置換される）。好ましくは、フレームワークの配列は、同様の特性を有する１以上の適切なアミノ酸によって保存的に置換され、例えば、ロイシン（非極性アミノ酸残基）のイソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン若しくはトリプトファン（他の非極性アミノ酸残基）による置換、アスパラギン酸（酸性アミノ酸残基）のグルタミン酸（他の酸性アミノ酸残基）による置換、又はリジン（塩基性アミノ酸残基）のアルギニン若しくはヒスチジン（他の塩基性アミノ酸残基）による置換である。好ましい実施形態によれば、ＶＬ及びＶＨ領域は、それぞれ、配列番号８及び９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を備える。より好ましくは、ＶＬ及びＶＨ領域は、それぞれ、配列番号８及び９に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を備える。本開示の効果的な一実施例では、ＶＬ領域は配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＶＨ領域は配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【００４９】
本ｍＡｂ（すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ）は、ＨＢＶ感染の処置又は予防に有用である。そこで、ＨＢＶ感染を予防若しくは処置し、及び／又はＨＢＶ感染に関連する／ＨＢＶ感染によって引き起こされる症状を軽減若しくは改善する薬学的組成物又は医薬品も、ここに開示される。薬学的組成物又は医薬品は、本開示の任意の態様又は実施形態に従って有効量のｍＡｂ又はそのフラグメント、及び選択的に薬学的に許容可能な担体を備える。
【００５０】
一般に、本発明のｍＡｂ／抗体フラグメントフラグメントは、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、約０．１重量％〜９９重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、本発明のｍＡｂ／抗体フラグメントは、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも１重量％のレベルで存在する。所定の実施形態では、ｍＡｂ／抗体フラグメントは、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、ｍＡｂ／抗体フラグメントは、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。またさらに他の実施形態では、ｍＡｂ／抗体フラグメントは、薬学的組成物又は医薬品の総重量に基づいて、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００５１】
本薬学的組成物は、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤及び注射などの固体、半固体又は液体の形態に処方され得る。したがって、本ｍＡｂ／抗体フラグメントの投与は、経口、口腔、直腸、非経口、静脈内及び腹腔内などの投与を含む種々の態様で達成され得る。薬学的投薬形態では、本ｍＡｂ／抗体フラグメントは、ＨＢＶ感染によって引き起こされる疾患及び状態を処置するように、単独又は他の既知の薬学的活性薬剤と併用で投与され得る。当業者は、各経路での使用に適した種々の投薬形態を熟知している。なお、任意の所与の場合における最も適切な経路は、処置される疾患又は状態の性質又は重症度に依存する。
【００５２】
医薬品又は上記の薬学的組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｅｄ、Ａｌｆｏｎｏｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン（１９８５）に記載されているような許容可能な薬学的手順に従って調製される。薬学的に許容可能な担体は、処方において他の成分と適合性があり、生物学的に許容可能な担体である。
【００５３】
適用可能な固体担体は、香味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤若しくはタブレット崩壊剤又は封入材料としても作用し得る１以上の物質を含み得る。粉末では、担体は、細かく分割された有効成分と混合されている細かく分割された固体である。タブレットでは、有効成分は、必要な圧縮特性を有する担体と適切な比率で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及びタブレットは、好ましくは、９９％に至るまでの有効成分を含む。適切な固体担体は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリジンなどを含む。
【００５４】
本発明のｍＡｂ／抗体フラグメントは、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、腹腔内又は小脳内注入によって投与され得る滅菌の溶液又は懸濁液である液体薬学的組成物又は医薬品にも処方され得る。
【００５５】
本開示の薬学的組成物又は医薬品は、皮下、ボーラス注入、筋肉内、腹腔内及び静脈内注入を含むがこれに限定されない注入による投与などの非経口投与に適した製剤である。薬学的組成物又は医薬品は、油性又は水性ビヒクルにおける等張性懸濁液、溶液又は乳濁液として処方されてもよく、懸濁剤、安定剤又は分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、組成物及び医薬品は、使用前に滅菌発熱性物質除去蒸留水又は等張食塩水と共に粉末、結晶又は凍結乾燥固体などの乾燥形態で提供され得る。それらは、滅菌アンプル又はバイアルで提供され得る。
【００５６】
本ｍＡｂ／抗体フラグメントが静脈内、皮膚又は皮下注入により投与されるように処方される場合、ｍＡｂは発熱性物質除去による非経口的に許容可能な水溶液の形態となる。ｐＨ、等張性、安定性などを適切に考慮してそのような非経口的に許容可能なポリペプチド溶液の調製は、当技術内のものである。静脈内、皮膚又は皮下注入のための好ましい薬学的組成物又は医薬品は、本ｍＡｂ／抗体フラグメントに加えて、塩化ナトリウム液、リンゲル液、デキストロース液、デキストロース及び塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液、又は当技術で公知の他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含有すべきである。本発明の薬学的組成物又は医薬品はまた、安定化剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤又は当業者に公知の他の添加物を含有してもよい。本発明の薬学的組成物又は医薬品を用いる静脈内処置の継続期間は、処置されている疾患の深刻度、並びに各個々の被検体の状態及び潜在的な特異体質的な反応に応じて変わることになる。本ｍＡｂの各適用の継続期間は連続静脈内投与の１２〜２４時間の範囲となることが考慮される。最終的には、主治医が、静脈内処置の適切な継続期間を決定することになる。
【００５７】
本開示の他の態様は、被検体のＨＢＶ感染を予防及び／又は処置する方法に関する。方法は、本開示の有効量のｍＡｂ／抗体フラグメント、薬学的組成物又は医薬品を被検体に投与するステップを備える。
【００５８】
被検体に投与される有効用量は、被検体の体重１Ｋｇ当たり０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１，０００ｍｇのような被検体の体重１Ｋｇ当たり約０．０１〜１０００ｍｇであり、好ましくは被検体の体重１Ｋｇ当たり約０．１〜１００ｍｇである。用量は、単一のアリコート又は２以上のアリコートで投与され得る。当業者又は臨床開業医は、患者の体調又は疾患の重症度に従って投薬量又はレジュメを調整し得る。
【００５９】
本開示のある実施形態によれば、ＨＢＶ感染は被検体の免疫応答を抑制し、本ｍＡｂ（すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ）の処置はＨＢＶ誘導性免疫抑制を回復させる。これらの実施形態では、本抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂは、ＨＢＶとＳｉｇｌｅｃｔ−３の間の相互作用を遮断するのに有用であり、それにより、宿主免疫を活性化／改善して被検体におけるＨＢＶ粒子を根絶する。そこで、本抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂは、ＨＢＶ感染を予防若しくは処置する、及び／又はＨＢＶ感染に関連する／ＨＢＶ感染によって引き起こされる症状を軽減若しくは改善する有望な手段を提供する。
【００６０】
基本的に、本方法によって処置可能な被検体は、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びウサギである。好ましくは、被検体はヒトである。
【００６１】
本ｍＡｂ（すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ）は、経口、経腸、経鼻、局所、経粘膜及び非経口投与からなる群から選択される経路によって被検体に投与されてもよく、非経口投与は筋肉内、静脈内又は腹腔内注入のいずれかである。
【００６２】
理解されるように、本方法は、単独で又はＨＢＶ感染の予防若しくは処置に対してある有益な効果を有する追加の療法と組み合わせて被検体に適用され得る。意図される／処置上の目的に応じて、本方法は、追加の療法の施用前、施用中又は施用後に被検体に適用可能である。
【００６３】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を明瞭にして本発明の実施の際に当業者を補助するように提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて本発明をその最大の範囲で利用することができるはずである。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。
【実施例】
【００６４】
材料及び方法
血液ドナー
Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに収容されたＨＢｅＡｇ陽性（ＨＢＶ  ＤＮＡ＞２×１０７ＩＵ／ｍＬ）の投薬による未感作（Naive（iはiウムラウト））未処置のＣＨＢ患者（ｎ＝６）が、この研究について登録された。患者は全員、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を含む他のウイルス感染に対して陰性であった。健常なドナー（ｎ＝６）は、台湾の血液センターから登録された。この研究は現地の倫理委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントが参加者の全員から得られた。
【００６５】
プラスミド及び融合タンパク質
ヒトＳｉｇｌｅｃ−３／−７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＤＮＡフラグメントを、ヒトＧＭ−Ｍφからの逆転写ＰＣＲによって増幅し、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｈＩｇＧベクターにサブクローニングして組換えＳｉｇｌｅｃ−３／−７ＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質を生成した。組換えＳｉｇｌｅｃ−３／−７／−９ＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質を、供給業者の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって過剰発現した。培養上清をトランスフェクション後３日目及び５日目に回収し、組換え融合タンパク質をプロテインＡカラムによって精製した。
【００６６】
ＨＢＶウイルスの精製及び定量化
慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者及びＨＢＶトランスジェニックマウスの血液サンプルからそれぞれＨＢＶを精製した。ＨＢＶに対するプロトコルを従来の方法によって精製した。ＨＢＶウイルス負荷を、標準的なＨＢＶプラスミドによるＲＴ−ＰＣＲによって限定した。ＨＢｓＡｇレベルをＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡキットによって定量化した。
【００６７】
Ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＨＢｓＡｇのグリカン構造の同定
ＣＨＢ患者及びトランスジェニックマウスからの精製ＨＢＶを、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ゲルをＨＢｓＡｇの重量に従って種に切断し、続いてトリプシン及びキモトリプシンにより消化した。高分解能及び高質量精度のナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験を、ナノエレクトロスプレーイオン源、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズバイナリハイパフォーマンス液体クロマトグラフィーポンプ及びＦａｍｏｓオートサンプラーを装備したＬＴＱＦＴ  Ｕｌｔｒａ（線形四重極イオントラップフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）質量分析計で行なった。消化溶液（６μｌ）を１０μｌ／分の流量で自己充填プレカラム（１５０μｍＩ．Ｄ．×２０ｍｍ、５μｍ、１００Å）に注入した。クロマトグラフィー分離を、３００ｎｌ／ｍｉｎの流量で動作する移動相Ａとしての水における０．１％のギ酸及び移動相Ｂとしての８０％アセトニトリルにおける０．１％のギ酸を使用して、自己充填逆相Ｃ１８ナノカラム（７５μｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ、５μｍ、１００Å）で行った。検査フルスキャンＭＳ条件：質量範囲はｍ／ｚ３２０〜２０００であり、ｍ／ｚ４００での分解能は５００００である。最も強度の高い５個のイオンを、ＬＴＱによってＭＳ２に対して順次単離した。エレクトロスプレー電圧を１．８ｋＶに維持し、キャピラリー温度を２００℃に設定した。
【００６８】
シアリダーゼによるＨＢＶ及びシアログリカンからのシアル酸の除去
シアリダーゼＳ及びシアリダーゼＣを、それぞれ、ＨＢＶ又はシアログリカンからシアログリカンを除去するのに使用した。シアリダーゼＳはα（２−３）結合Ｎｅｕ５Ａｃのみ放出し、その一方でシアリダーゼＣはα（２−３）及びα（２−６）結合Ｎｅｕ５Ａｃの双方を放出する。シアリダーゼで処置された基質をＨＢＶ−Ｓｉｇｌｅｃ−３結合アッセイ及び競合アッセイに使用した。
【００６９】
ＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ．Ｆｃ融合タンパク質の間の相互作用
ＨＢＶ（１０９個のコピー／ｍＬ）を組換えＳｉｇｌｅｃ−３／−７／−９ＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質と共にそれぞれ４℃で１６時間インキュベートし、続いて免疫沈降のためにセファロース標識プロテインＡビーズと共にインキュベートした。サンプルを、ＰＶＤＦメンブレンにブロッティングする前に１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ブロッキングバッファー（５％のＢＳＡを含むＴＢＳにおける０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中に４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＨＲＰ標識ポリクローナルヤギ抗ＨＢｓＡｂと共に室温で１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：１００００希釈）と共に室温でさらに１時間インキュベートし、ＥＣＬによって可視化した。
【００７０】
競合アッセイ
ＳｉｇｌｅｃのＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ）をマイクロタイタープレートにコーティングし、続いて種々の濃度の以下のグリカン、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの存在下で、ＨＢｓＡｇ（１００ｎｇ）を無タンパク質のブロッキングバッファーと共に４℃で１２時間にわたって添加した。シアリダーゼ処置及び未処置のシアリグリカンを競合アッセイに使用した。
【００７１】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による受容体−ウイルス相互作用の判定
ヒトＳｉｇｌｅｃ．Ｆｃ融合タンパク質とＨＢＶの間の相互作用をバイオレイヤー干渉法によって判定した。簡潔には、バイオセンサーをＳｉｇｌｅｃ．Ｆｃ融合タンパク質で固定化し、Ｓｉｇｌｅｃ．ＦｃとＨＢＶの間の結合を、ランニングバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で室温において行った。ＨＢＶとヒトＳｉｇｌｅｃ−３の間の原子価を決定し、それは以下に示すように多価会合の強度を一価会合のものと相関させる：
ＫＡ，ｓｕｒｆ＝Ｆ（Ｓ×１０−２）ｎ−１×（ＫＡ，ｍｏｎｏ）ｎ
ここで、ＫＡ，ｓｕｒｆはＫＤ（ＨＢＶ及びＳｉｇｌｅｃ−３）の逆数、ＫＡ，ｍｏｎｏはＫＤ（二分岐α２−６結合シアリル糖ペプチド及びＳｉｇｌｅｃ−３）の逆数であり、ｎは原子価数の数であり、Ｆは系における統計係数であり、Ｓは４０（Å）に等しく、それはＲＣＳＢタンパク質データバンクで公開されているＳｉｇｌｅｃ−３の結晶構造（番号：５Ｊ０Ｂ）に従って推定される。ｎ（原子価の数）を計算するのに３つの個別のＢＬＩの結果を使用した。
【００７２】
抗Ｓｉｇｌｅｃ  ｍＡｂの生成及び特徴付け並びにアンタゴニスト抗体の選択
抗Ｓｉｇｌｅｃ  ｍＡｂを、ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから生成した。汎用ヒト抗体を、機能的ｓｃＦｖ変異体のヒトＩｇＧとの組合せに基づいて構築し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって生成した。
【００７３】
ＡＰＣ標識抗Ｓｉｇｌｅｃ−３及び（ＡＰＣ標識キットによって調製された）ヒトＩｇＧをフローサイトメトリーに使用して、それらの単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）への結合を判定した。抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂのアゴニスト及びアンタゴニストクローンの同定は、ｍｏＤＣからのＴＬＲ２で刺激されたサイトカイン分泌に対するそれらの阻害効果に基づく。簡潔には、ｍｏＤＣを培養プレートに２４時間にわたって播種し、続いて、ｐａｍ３ｃｓｋ４（０．０５μｇ／ｍＬ）の添加前に１時間、抗Ｓｉｇｌｅｃ  ｍＡｂと共にインキュベートし、さらに２４時間インキュベートした。上清中のサイトカインレベルをＥＬＩＳＡキットによって決定した。
【００７４】
細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナー及びＣＨＢ患者の全血から標準的な密度勾配遠心分離によって単離した。初代マクロファージを調製するために、ＣＤ１４＋細胞を抗ＣＤ１４マイクロビーズによる高勾配磁気ソーティングによってＰＢＭＣから精製した。そして、細胞を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を補足した１０％のＦＣＳによる完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で６〜７日間インキュベートしてｍｏＤＣを生成した。
【００７５】
ＨＢＶの阻害効果を試験するために、ｍｏＤＣ（６×１０４個／ウェル）を、Ｐａｍ３ｃｓｋ４（０．０５μｇ／ｍＬ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）のさらに２４時間にわたる添加前に、ＨＢＶと共に２４時間インキュベートした。アゴニスト及びアンタゴニスト抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂを同定するために、ＣＨＢ患者のｍｏＤＣ（６×１０４個／ウェル）及びＰＢＭＣ（６×１０４個／ウェル）を抗Ｓｉｇｌｅｃ  ｍＡｂと共に１時間インキュベートし、続いて、Ｐａｍ３ｃｓｋ４（０．０５μｇ／ｍＬ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍＬ）のさらに２４時間にわたる添加前に、ＨＢＶを２４時間にわたって添加した。上清を収集して、ＥＬＩＳＡキットによってサイトカインレベルを決定した。
【００７６】
共焦点顕微鏡法
ＣＨＢ患者のＭｏＤＣ（２×１０５個の細胞）及びＰＢＭＣを、氷上で、ＣＨＢ患者から単離したＨＢＶ（１０９個のコピー／ｍＬ）と共に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ（３μｇ／ｍＬ、クローン１０Ｃ８）と共に又はそれなしで１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、４℃で１時間固定し、続いて、一次抗体の添加前に、浸透性バッファー（ＰＢＳにおける０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で１５時間、及びブロッキングバッファー（３％のＢＳＡ）で室温において１時間、順次インキュベートした。細胞を、４℃で２４時間のインキュベート後に、二次抗体と共に室温でさらに１時間インキュベートし、続いて、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡下の観察前に、ファロイジン（１ユニット／μＬ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１０分間にわたって添加した。
【００７７】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）及び蛍光寿命撮像（ＦＬＩＭ）
（ドナーとして特定された）Ｓｉｇｌｅｃ−３を一次抗体と共に４℃で２４時間インキュベートし、続いてロバの抗マウス（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ６４７標識二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。（アクセプターとして特定された）ＨＢｓＡｇを１０μｇ／ｍＬの一次抗体１００μＬと共に４℃で２４時間インキュベートし、続いてロバの抗ヤギ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５４６標識二次抗体を室温で１時間にわたって添加した。細胞を、染色後に、ＰＢＳで洗浄し、マウンティング溶液に再懸濁し、カバーガラスで覆った。
【００７８】
ＦＬＩＭ−ＦＲＥＴ分析について、ＦＬＩＭをＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡上で記録した。蛍光寿命を、ＦＲＥＴドナーのみ発現する細胞並びにＦＲＥＴドナー及びアクセプターの組合せを発現する細胞において測定した。サンプルをレーザー（４８８ｎｍ）でパルス化し、放出された波長（５００〜５５０ｎｍ）を収集した。１００００個の光子を各サンプルに対して記録した。ＦＲＥＴ効率（Ｅ）は、式：Ｅ＝１−（τＤＡ／τＤ）に従って計算され、ここで、τＤＡはＦＲＥＴドナー及びアクセプターを共発現する細胞の平均蛍光寿命であり、τＤはＦＲＥＴドナーのみ発現する細胞の平均蛍光寿命である。
【００７９】
ＨＢＶ処置ｍｏＤＣにおけるＳｉｇｌｅｃ−３会合ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２の検出
ＭｏＤＣをＨＢＶと共にインキュベートし、続いて、抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ポリクローナル抗体と共にインキュベートする前に溶解緩衝液に再懸濁し、続いてプロテインＡ結合セファロースを使用して免疫沈降した。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、続いて、抗ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２抗体でそれぞれプローブする前にＰＶＤＦメンブレンに転写した。免疫ブロットを、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗血清と共にインキュベートすることによって展開し、その後化学発光検出試薬で増強した。Ｓｉｇｌｅｃ−３の全量を検出するために、ブロットを、マウスの抗Ｓｉｇｌｅｃ−３抗体によるプローブ前に、Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｒｏｎｇ溶液でストリッピングした。
【００８０】
統計分析
値を平均±標準偏差として表す。すべての実験を少なくとも３回繰り返した。結果をスチューデントのｔ検定によって評価した。０．０５のＰ値を有意であると見なした。
【実施例１】
【００８１】
実施例１  ＨＢｓＡｇのグリカン構造
ｈＨＢＶ及びｍＨＢＶにおけるシアリグリカンの潜在的な差異を理解するために、ウイルス粒子を、ＣＨＢ患者（ｈＨＢＶ）及びトランスジェニックマウス（ｍＨＢＶ）の血清サンプルからＣｓＣｌ２超遠心分離によってそれぞれ精製し、続いてナノフローＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びＧｌｙｃｏＳｅｑソフトウェアによってグリカン構造を決定した。
【００８２】
ｈＨＢＶ表面抗原（ｈＨＢｓＡｇ）に由来する重複配列を有する２つのペプチドは、Ｎ−グリカンを含有することが分かった。第１のペプチドは配列番号１のアミノ酸配列（Ｔ１４０ＫＰＴＤＧＮ１４６ＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷ１５６、Ｎ−グリカンはＡｓｎ−１４６に位置する）を有し、第２のペプチドは配列番号２のアミノ酸配列（Ｐ１４２ＳＤＧＮ１４６ＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＫ１６０、Ｎ−グリカンはＡｓｎ−１４６に位置する）を有した。Ｔ／Ｓ１４３突然変異は、ＣＨＢ患者の血清中のＨＢＶ突然変異体の存在を示唆した。第１のペプチドについて、質量電荷比（ｍ／ｚ）１０６８．９４におけるシグナルはＧｌｃＮＡｃの存在を表し、ｍ／ｚ６５６．９２はＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの存在を表し、ｍ／ｚ１５１５．０２〜１９２３．８０はシアル化グリカンを有する伸長分岐フラグメンテーションを表した（データ不記載）。この情報は、二分岐Ｎグリカンの存在を示唆し、Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−ＭａｎはｈＨＢｓＡｇ中のＧｌｃＮＡｃに結合する。末端シアル酸のガラクトースへの結合を、疑似ＭＳ質量分析法によってさらに判定した。低いｍ／ｚ２７４．１２及びｍ／ｚ２９２．１５は、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの存在を示唆した（データ不記載）。加えて、約４５％のペプチドは、２個のシアル酸（ｂｉＳ２、２７．６％）又は１個のシアル酸（ｂｉＳ１、１７．９％）と結合した二分岐Ｎ−グリカンを含有した（図１、パネルＡ）。同様の観察が、第２のペプチドで見出された（図１、パネルＢ）。これに対し、ｍＨＢＶ表面抗原（ｍＨＢＡｇ）に由来する第１のペプチドは、グリカン結合に対するペプチド配列が同一であっても、Ｎ−グリカンを含有しなかった（図１、パネルＣ）。
【００８３】
データは、（ｈＨＢｓＡｇとして示される）ＣＨＢ患者によるＨＢｓＡｇがｈＨＢＶのスモールＳ抗原上のＡｓｎ−１４６に結合した二分岐Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎを含有し、一方、ＨＢＶトランスジェニックマウスによるｍＨＢｓＡｇには同じ位置における二分岐Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎがないことを示した。
【実施例２】
【００８４】
実施例２  ＨＢＶ  Ａｓｎ−１４６シアリグリカンとヒトＳｉｇｌｅｃメンバーの間の相互作用
ｈＨＢＶ二分岐グリカンはヒトＳｉｇｌｅｃ−３、−７、−９のリガンドに類似しているので、ｈＨＢＶが、樹状細胞及び他の骨髄性細胞で高度に発現されるこれらの骨髄性Ｓｉｇｌｅｃと相互作用するか否かをこの実施例において調査した。
【００８５】
組換えＳｉｇｌｅｃＥＣＤ．Ｆｃ融合タンパク質をｈＨＢＶと共にインキュベートし、上清からｈＨＢＶをプルダウンするそれらの能力を調べた。抗ＨＢｓＡｇポリクローナルＡｂはすべてのグリコシル化及び非グリコシル化ＨＢｓＡｇ（スモール、ミドル及びラージ）をプルダウンすることができ、ヒトＳｉｇｌｅｃ−３．Ｆｃは主にグリコシル化スモールＨＢｓＡｇ（ｈ）（ｇｓ、２７ＫＤａ）をプルダウンし（図２、パネルＡ）、これらのデータは、Ｓｉｇｌｅｃ−３がスモールＨＢｓＡｇにおいてｈＨＢＶシアログリカンに優先的に結合することを示唆した。しかし、Ｓｉｇｌｅｃ−７．Ｆｃ及びＳｉｇｌｅｃ−９．Ｆｃは同じ条件下ではプルダウンできず（図２、パネルＡ）、これらの観察は、ｈＨＢＶがスモールＨＢｓＡｇ上のシアログリカンを介してＳｉｇｌｅｃ−３に優先的に結合することを示唆した（図２、パネルＡ）。
【００８６】
ｍＨＢＶのＡｓｎ−１４６にシアログリカンが存在しないにもかかわらず、ｍＨＢＶにおいてグリコシル化及び非グリコシル化ＨＢｓＡｇの双方が検出されたことを見出したのは興味深い（図２、パネルＢ）。この観察は、追加のグリコシル化部位がアミノ酸残基Ａｓｎ−１２９、Ａｓｎ−１３０及びＡｓｎ−１３１において検出されたという以前の報告と一致した。骨髄性ＳｉｇｌｅｃのｍＨＢＶとの結合特異性を、免疫沈降及びＥＬＩＳＡによってさらに判定した。しかし、どのＳｉｇｌｅｃもｍＨＢＶをプルダウンできず（図２、パネルＢ）、ＥＬＩＳＡによる３つのＳｉｇｌｅｃのすべてに結合もしなかった（図２、パネルＣ）。
【００８７】
生体外でのｈＨＢＶとヒトＳｉｇｌｅｃ−３の間の特異的相互作用を確認するために、末梢血細胞を、ＣＨＢ患者から単離し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５４６で標識された二次抗体による抗ＨＢｓＡｇ、及びＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された二次抗体による抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂによって二重染色した。細胞を、ファロイジンによって輪郭表示した。データは、ＨＢｓＡｇがＳｉｇｌｅｃ−３＋細胞でのみ検出され、ＨＢｓＡｇと共局在していることを示した（データ不記載）。この観察は、ｈＨＢＶがＳｉｇｌｅｃ−３＋ヒト骨髄細胞に結合することを示唆した。ｈＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ−３の間の直接会合を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってさらに解明した。データは、高エネルギー移動がｈＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ−３の間でのみ検出され、Ｓｉｇｌｅｃ−７及びＳｉｇｌｅｃ−９では検出されなかったことを示した（図２、パネルＤ及びＥ）。さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−３リガンド（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）の添加は、Ｓｉｇｌｅｃ−３−ＨＢＶ相互作用を用量依存的に阻害し、一方、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）ＧａｌＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＧｌｃＮＡｃは同じ条件下でＳｉｇｌｅｃ−３−ＨＢＶ相互作用を阻害しなかった（図２、パネルＦ）。ｈＨＢＶ−Ｓｉｇｌｅｃ−３相互作用がα２−３結合シアル酸を介していることをさらに確認するために、シアリダーゼＳ（α２−３シアル酸を放出）及びシアリダーゼＣ（α２−３及びα２−６シアル酸の双方を放出）が添加されて、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃグリカン及びｈＨＢＶからシアル酸をそれぞれ除去した。データは、シアリダーゼＳによる処置ではなくシアリダーゼＣによって処置されたＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃグリカンがＳｉｇｌｅｃ−３−ＨＢＶ相互作用におけるその阻害効果を失い（図２、パネルＧ）、シアリダーゼＣがＳｉｇｌｅｃ−３に結合するｈＨＢＶを減少させることを示した（図２、パネルＨ）。
【００８８】
まとめると、これらの結果は、ｈＨＢＶとＳｉｇｌｅｃ−３の間の相互作用はＨＢｓＡｇと会合したシアログリカン上の末端α２−６シアル酸を主に介することを示した。
【実施例３】
【００８９】
実施例３  ＨＢＶとヒトＳｉｇｌｅｃの間の結合親和性の判定
ヒトＳｉｇｌｅｃ−３とｈＨＢＶビリオンの間の結合親和性をこの実施例において判定した。組換えＳｉｇｌｅｃ−３．Ｆｃ（Ｓｉｇｌｅｃ−３は二量体）と単量体Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃの間の平衡解離定数（ＫＤ）は１．５９（±０．９７）×１０−３であり、一方、Ｓｉｇｌｅｃ−３．Ｆｃと二分岐Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃの間のＫＤは９．５９（±１．４５）×１０−５であった（表１）。
【表１】
2022501319.tif 000003
【００９０】
組換えＳｉｇｌｅｃ−３とヒトＨＢＶ（ｈＨＢＶ）ビリオンの間のＫＤは、１．１５（±０．１１）×１０−１０に増加した（表２）。これに対し、マウスＨＢＶ（ｍＨＢＶ）ビリオンは、同じ条件下でヒトＳｉｇｌｅｃ−３に結合しなかった（表３）。
【表２】
2022501319.tif 000004
【表３】
2022501319.tif 000005
【００９１】
ＨＢＶと組換えＳｉｇｅｌｃ−３．Ｆｃの間の原子価（Ｎ）は「２」であり、各単量体Ｓｉｇｌｅｃ−３が１つの二分岐Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃに結合したことを示唆している。これに対し、ｈＨＢＶは同じ条件下で他のＳｉｇｌｅｃ−７及びＳｉｇｌｅｃ−９には結合しなかった。シアリダーゼＣによるｈＨＢＶからのα２−６結合Ｎｅｕ５Ａｃの除去は、Ｓｉｇｌｅｃ−３とｈＨＢＶの間の結合を無効にした（表４）。
【表４】
2022501319.tif 000006
【００９２】
データは、ｈＨＢＶビリオンが二分岐Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＧｌｃＮＡｃの末端α２−６シアル酸を介してＳｉｇｌｅｃ−３に結合することを示した。
【実施例４】
【００９３】
実施例４  ｈＨＢＶによるＴＬＲリガンドで刺激されたｍｏＤＣにおけるサイトカイン分泌の抑制
免疫細胞の強力な活性化因子であるＴＬＲリガンドで刺激されたヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）のサイトカイン分泌におけるＡｓｎ−１４６シアログリカンの役割をこの実施例において調査した。
【００９４】
ＣＨＢ患者及びトランスジェニックマウスからそれぞれ単離されたＭｏＤＣを、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）と併用してＰａｍ３ｃｓｋ４（ＴＬＲ−２リガンド）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ−３リガンド）と共にインキュベートした。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びインターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）の生成は、ｈＨＢＶによって用量依存的に抑制されたが、ｍＨＢＶは同じ条件下で抑制効果を有していなかった（図３、パネルＡ〜Ｄ）。この観察は、ｈＨＢＶ媒介性の抑制がＳｉｇｌｅｃ−３の活性化を介し得ることを示唆した。この推論を確認するために、ｍｏＤＣをｈＨＢＶと各時点についてインキュベートし、続いて抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂを用いて共免疫沈降して、Ｓｉｇｌｅｃ−３の活性化後にＩＴＩＭモチーフによって漸増されるＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２を検出した（図３、パネルＥ）。データは、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２のシグナルが、ｈＨＢＶとインキュベートした後１５分で検出され、３０分でピークに到達し、そして６０分で減少することを示した（図３、パネルＥ）。さらに、ｈＨＢＶはＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２を用量依存的に漸増した（図３、パネルＦ）。
【００９５】
これらの観察は、ＴＬＲリガンド誘導性サイトカイン分泌に対するｈＨＢＶ媒介性の抑制がＳｉｇｌｅｃ−３誘導性抑制シグナルを介することを示唆した。
【実施例５】
【００９６】
実施例５  ＨＢＶ感染に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂの効果の評価
５．１  抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂの生成及び特徴付け
この実施例では、アンタゴニスト抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂを同定し、それによってＨＢＶ媒介性の免疫抑制をブロックするように、Ｓｉｇｌｅｃ−３に対する４つのモノクローナル抗体を生成した。
【００９７】
この目的を達成するために、抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂをファージディスプレイされた合成ヒト抗体ライブラリーから選択し、ＨＢＶ媒介性の免疫抑制に対するその阻害効果を評価した。選択された陽性クローンの中で、クローン２Ｂ９及びクローン１０Ｃ８は、フローサイトメトリーによってｍｏＤＣに対して最も高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した（データ不記載）。配列決定のデータによると、ｍＡｂ  １０Ｃ８のＶＬ及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号８及び９のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３はそれぞれＶＹＹ、ＩＳＳＡＧ（配列番号３）及びＱＹＦＮＦＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３はそれぞれ、ＮＮＧＷ（配列番号５）、ＧＩＧＰＹＧＧＳＴＦ（配列番号６）及びＳＲＦＩＧＳＹＳＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を備えた。
【００９８】
クローン２Ｂ９は、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２を漸増し（図４、パネルＡ）、Ｐａｍ３ｃｓｋ４で刺激されたｍｏＤＣからのＴＮＦ−α生成を抑制したため（図４、パネルＢ）、明らかにアゴニストｍＡｂである。クローン３Ｂ８、４Ｄ２及び５Ｅ３はクローン２Ｂ９と同様の特徴を有したので、それらもアゴニストｍＡｂと見なされた（データ不記載）。これに対し、同じ条件下でクローン１０Ｃ８はＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２を漸増できず、Ｐａｍ３ｃｓｋ４誘導性ＴＮＦ−αの生成を抑制することもできず（図４、パネルＡ及びＢ）、クローン１０Ｃ８がＳｉｇｌｅｃ−３を介した阻害シグナルを引き起こすことができなかったことを示唆した。
【００９９】
さらに、クローン１０Ｃ８は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイによって示されるように、ＣＨＢ患者から単離されたＰＢＭＣにおいてＳｉｇｌｅｃ−３及びＨＢＶの相互作用を阻害することができた（図５、パネルＡ）。蛍光画像は、Ｓｉｇｌｅｃ−３及びＨＢＶがアイソタイプコントロールｍＡｂ（ＩｇＧ１）の存在下又はｍＡｂの非存在下でＣＨＢ患者のＰＢＭＣに共局在し、一方、クローン１０Ｃ８がＳｉｇｌｅｃ−３及びＨＢＶの相互作用をブロッキング可能であることを示した（データ不記載）。同様の観察が、外因性ｈＨＢＶと共にインキュベートしたｍｏＤＣにおいて観察された（図５、パネルＢ）。
【０１００】
これらの結果は、クローン１０Ｃ８が細胞表面におけるＨＢＶ−Ｓｉｇｌｅｃ−３相互作用をブロックするのに有用なアンタゴニスト抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂであることを示した。
【０１０１】
５．２  ＴＬＲリガンド誘導性サイトカイン生成に対するＨＢＶ媒介性の抑制を回復したアンタゴニスト抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ
クローン１０Ｃ８がｈＨＢＶ媒介性の抑制効果を回復させることができたか否かをこの実施例で調べた。
【０１０２】
ＭｏＤＣをｈＨＢＶの存在下でｐａｍ３ｃｓｋ４及びポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＩＦＮ−γと共にインキュベートし、続いてＴＮＦ−α及びＩＰ−１０をＥＬＩＳＡによって検出した。図６のデータは、Ｐａｍ３ｓｋ４又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋ＩＦＮ−γで刺激されたｍｏＤＣからのＴＮＦ−α及びＩＰ−１０がＨＢＶによって用量依存的に抑制され、一方、クローン１０Ｃ８はＨＢＶ媒介性の抑制効果を無効にすることを示した（図６、パネルＡ〜Ｄ）。さらに、クローン１０Ｃ８は、ｈＨＢＶ誘導性ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２のＳｉｇｌｅｃ−３に対する漸増現象も阻害した（図６、パネルＥ）。さらに、クローン１０Ｃ８は、ＴＬＲリガンドで刺激されたＣＨＢ患者のＰＢＭＣからのＴＮＦ−α及びＩＦＮ−αの生成を増強することができる（図６、パネルＦ及びＩ）。
【０１０３】
したがって、データは、クローン１０Ｃ８がアンタゴニスト抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂであり、それがｍｏＤＣにおけるＨＢＶ媒介性の阻害シグナルを無効にするのに有用となり得ることを示した。
【０１０４】
結論として、本発明の発明者は、ＨＢＶがＳｉｇｌｅｃ−３受容体に対して結合親和性を示すことを予想外にも確認した。研究成果に基づいて、本開示は１つの新規な抗Ｓｉｇｌｅｃ−３ｍＡｂ（すなわち、１０Ｃ８ｍＡｂ）を提供し、それはＨＢＶ誘導性免疫抑制を回復するのに有用であるため、ＨＢＶ感染の処置及び／又は予防に対する医薬品としてさらに開発され得る。
【０１０５】
実施形態の上記説明は例示のみとして与えられ、種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記明細書、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図２（Ｄ）】
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【図２（Ｅ）】
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【図２（Ｆ）】
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【図２（Ｇ）】
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【図２（Ｈ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図３（Ｅ）】
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【図３（Ｆ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図６（Ｄ）】
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【図６（Ｅ）】
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【図６（Ｆ）】
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【図６（Ｇ）】
2022501319.tif 000034
【図６（Ｈ）】
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【図６（Ｉ）】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の予防又は処置のための抗体又はそのフラグメントであって、
ＶＹＹ、ＩＳＳＡＧ（配列番号３）及びＱＹＦＮＦＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を備える軽鎖可変領域と、
ＮＮＧＷ（配列番号５）、ＧＩＧＰＹＧＧＳＴＦ（配列番号６）及びＳＲＦＩＧＳＹＳＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を備える重鎖可変領域と、
を備える抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４】
ＨＢＶ感染の予防又は処置のための薬学的組成物であって、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメントの有効量と、薬学的に許容可能な担体とを備える薬学的組成物。
【請求項５】
前記抗体の前記軽鎖可変領域が配列番号８に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備え、前記抗体の前記重鎖可変領域が配列番号９に対して少なくとも８５％同一の前記アミノ酸配列を備える、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が配列番号８の前記アミノ酸配列を有し、前記重鎖可変領域が配列番号９の前記アミノ酸配列を有する、請求項５に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2022501319.tif 000037