(57)【要約】  本発明によれば、下記式（１）で表される、核酸デリバリー用両親媒性ポリアミノ酸が提供される。2022502384.tif 000016（式中、Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、  Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、ｍは、９以上の整数であり、ｎは、０〜ｍの整数であり、ｘは、２〜３００の整数であり、ｙは、０〜ｘの整数であり、ｚは、０〜ｘの整数であり、ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たし、上記式（１）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
2022502384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される、核酸デリバリー用両親媒性ポリアミノ酸：
【化１】
2022502384.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍは、９以上の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｘは、２〜３００の整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たし、上記式（１）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
【請求項２】
前記Ｒ６ａおよびＲ６ｂが、相互に独立して、脂環を含む、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表す、請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項３】
前記式（１）において、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２の関係を満たす、請求項１または２に記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項４】
前記Ｒ７ａおよびＲ７ｂが、前記（ｉ）の基を表す、請求項１から３のいずれかに記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項５】
下記式（１’）で表される、核酸デリバリー用両親媒性ポリアミノ酸：
【化２】
2022502384.tif 000015
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍおよびｘは、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２の関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たす整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係を満たし、
上記式（１’）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
【請求項６】
前記Ｒ６ａおよびＲ６ｂが、相互に独立して、脂環を含む、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表す、請求項５に記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項７】
前記ｍが、５以上の整数である、請求項５または６に記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項８】
前記Ｒ７ａおよびＲ７ｂが、前記（ｉ）の基を表す、請求項５から７のいずれかに記載の両親媒性ポリアミノ酸。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の両親媒性ポリアミノ酸由来のポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む、ブロックコポリマー。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかに記載の両親媒性ポリアミノ酸または請求項９に記載のブロックコポリマーと核酸とを含む、複合体。
【請求項１１】
タンパク質をさらに含む、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記核酸が、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ドナーＤＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムから選択される少なくとも１種を含む、請求項１０または１１に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれかに記載の両親媒性ポリアミノ酸または請求項９に記載のブロックコポリマーとタンパク質とを含む、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性ポリアミノ酸、該両親媒性ポリアミノ酸を用いたブロックコポリマー、および該両親媒性ポリアミノ酸または該ブロックコポリマーと核酸とを含む複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アンチセンス核酸、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等の核酸医薬、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等の治療用タンパク質の遺伝子をコードした核酸からなる遺伝子医薬、さらには、ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）とＣａｓ９ヌクレアーゼとを用いたゲノム編集技術等が急速に発展している。これに伴い、核酸を細胞内に的確に導入するためのキャリアの開発が求められている。
【０００３】
核酸を細胞に導入するキャリアとしては、ウイルスベクターと非ウイルス性キャリアとに大別される。非ウイルス性キャリアは、免疫原性を示さず、調製や取り扱いが容易である等の利点を有する。非ウイルス性キャリアの具体例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）シリーズ等のカチオン性脂質や、側鎖にカチオン性基を含むカチオン性ポリアミノ酸が挙げられる。これらのキャリアは、核酸と複合体（それぞれリポプレックスおよびポリプレックス）を形成し、エンドサイトーシスを介して細胞内に導入し得る。
【０００４】
上記カチオン性ポリアミノ酸の一例としては、側鎖にエチレンジアミン構造を有するポリ（Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルタミド）（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））および該ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）をブロックコポリマーの一ブロック成分として含むブロックコポリマーが挙げられる。これらは、プラスミドＤＮＡとポリプレックスを形成して、当該プラスミドＤＮＡを高効率で細胞内に導入し、該プラスミドＤＮＡ中に組み込まれた遺伝子を発現することが確認されている（非特許文献１、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００５】
上記のとおり、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）およびＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を一ブロック成分として含むブロックコポリマーはプラスミドＤＮＡを細胞に導入するキャリアとして有効であるが、ｍＲＮＡの導入に関しては、満足のいくものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０８５６６４  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２００７／０９９６６０  Ａ１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００８，１３０，１６２８７−１６２９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、ｍＲＮＡを含む核酸を好適に細胞に導入できる非ウイルス性キャリアを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの実施形態によれば、下記式（１）で表される、核酸デリバリー用両親媒性ポリアミノ酸が提供される。
【化１】
2022502384.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍは、９以上の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｘは、２〜３００の整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たし、上記式（１）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
１つの実施形態において、上記Ｒ６ａおよびＲ６ｂが、相互に独立して、脂環を含む、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表す。
１つの実施形態において、上記式（１）において、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２の関係を満たす。
１つの実施形態において、上記Ｒ７ａおよびＲ７ｂが、上記（ｉ）の基を表す。
本発明の別の実施形態によれば、下記式（１’）で表される、核酸デリバリー用両親媒性ポリアミノ酸が提供される。
【化２】
2022502384.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍおよびｘは、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２の関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たす整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係を満たし、
上記式（１’）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
１つの実施形態において、上記Ｒ６ａおよびＲ６ｂが、相互に独立して、脂環を含む、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表す。
１つの実施形態において、上記ｍが、５以上の整数である。
１つの実施形態において、上記Ｒ７ａおよびＲ７ｂが、上記（ｉ）の基を表す。
本発明の別の局面によれば、上記両親媒性ポリアミノ酸由来のポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む、ブロックコポリマーが提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、上記両親媒性ポリアミノ酸または上記ブロックコポリマーと核酸とを含む複合体が提供される。
１つの実施形態において、上記複合体は、タンパク質をさらに含む。
１つの実施形態において、上記核酸が、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ドナーＤＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＥＲ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムから選択される少なくとも１種を含む。
本発明のさらに別の局面によれば、上記両親媒性ポリアミノ酸または上記ブロックコポリマーとタンパク質とを含む複合体が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の両親媒性ポリアミノ酸は、カチオン性側鎖に加えて、所定の脂肪族炭化水素基を含む疎水性側鎖を所定数以上有する。このような構成を有することにより、本発明の両親媒性ポリアミノ酸は、ｍＲＮＡを含む核酸を好適に細胞に導入できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とＦＬｕｃ  ｍＲＮＡとのポリプレックス溶液を電気泳動した後のゲル像である。
【図２】Ａは、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを含むポリプレックスを用いてトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞の発光強度を示すグラフであり、Ｂは、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを含むポリプレックスを用いてトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の発光強度を示すグラフである（各ポリプレックスに関して、右側のバーがＮ／Ｐ＝５の結果を示し、左側のバーがＮ／Ｐ＝３の結果を示す）。結果はすべて、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【図３−１】Ａは、ＣＨＥ部分の導入数が異なるＰＡｓｐ（ＣＨＥ／ＤＥＴ）を用いて５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの量でＧＬｕｃ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされた培養Ｃ２Ｃ１２細胞の発光強度を示すグラフであり、Ｂは、重合度が異なるＰＡｓｐ（ＣＨＥ／ＤＥＴ）またはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの量でＧＬｕｃ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされた培養Ｃ２Ｃ１２細胞の発光強度を示すグラフである。結果はすべて、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【図３−２】種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）の室温における１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）への溶解度（ＳＨＥＰＥＳ）に対する１−オクタノールへの溶解度（ＳＯＣＴＡＮＯＬ）の比（ＬｏｇＰ；ＬｏｇＰ＝Ｌｏｇ（ＳＯＣＴＡＮＯＬ／ＳＨＥＰＥＳ））と、各ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とＧＬｕｃ  ｍＲＮＡとのポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝５）を用いてトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞の発光強度と、の関係を示すグラフである。結果はすべて、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【図４】Ａは、ＣＨＥ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）の用量依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルを示すグラフであり、Ｂは、ＣＨＥ−、ＯＣＴ−、およびＤＥＴ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）の時間依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルを示すグラフである。結果はすべて、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【図５】種々の濃度のＣＨＥ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡ使用）で２４時間処理されたＣ２Ｃ１２細胞の生存割合を示すグラフである。
【図６】４時間のインキュベーションにおけるＣｙ５−ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡとのポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５、５００ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェル）の培養Ｃ２Ｃ１２細胞内への取り込みプロファイルを示すグラフである。図中、バッファーで処理した細胞をコントロールとして示す（左側に位置し、色が薄くよりシャープな方のピークがコントロールに該当する）。
【図７】マウス脳室内投与後のＦＬｕｃ  ｍＲＮＡ発現レベルの定量評価結果を示すグラフである。結果は、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝３）。
【図８】ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを含むポリプレックスを用いてトランスフェクトされたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の発光強度を示すグラフである。結果は、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【図９】Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９  （ＳｐＣａｓ９）  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むポリプレックスを用いてトランスフェクトされたＡｉ９マウス由来肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）の共焦点レーザー走査型顕微鏡写真である。
【図１０】ゲノム編集効率のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ評価系を説明する図である。
【図１１】ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含むポリプレックスを脳室内投与した後の脳切片の顕微鏡写真である。
【図１２】ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを含むポリプレックスを用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞の発光強度を示すグラフである。結果は、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ａ．両親媒性ポリアミノ酸
Ａ−１.第１の実施形態
本発明の第１の実施形態における両親媒性ポリアミノ酸は、下記式（１）で表される。当該両親媒性ポリアミノ酸は、代表的には、生理的条件下（ｐＨ７．４）においてｍＲＮＡ等の核酸と相互作用して複合体を形成して、細胞に好適に取り込まれ得る。
【化３】
2022502384.tif 000005
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環（シクロアルキル環）を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍは、９以上の整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｘは、２〜３００の整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たし、上記式（１）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
【００１３】
上記式（１）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ２の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。
【００１４】
Ｒ２の基で定義する、炭素数１〜２４の直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にできる。炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
【００１５】
上記アルキル基またはアルキル部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素原子またはフッ素原子等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味する。
【００１６】
式（１）中において、各繰り返し単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者がエチレン基を表す場合には、代表的には、ｎ＝０であるか、またはｍ−ｎ＝０であるポリアミノ酸を表すことになる。前者は、例えば、グルタミン酸γ−ベンジルエステルのＮ−カルボン酸無水物の重合により得られるポリ（α−グルタミン酸）を表し、後者は、例えば、納豆菌等の細菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株が生産するポリ（γ−グルタミン酸）を表す。一方、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者ともメチレン基を表す場合には、これらの基を有するそれぞれの繰り返し単位は共存し得るものと理解されている。Ｒ４ａおよびＲ４ｂについても同様である。
【００１７】
脂環を含む場合のＲ６ａおよびＲ６ｂの基は、下記式（２）で表され得る。なお、脂環とは、芳香族性を有しない飽和または不飽和の炭素環を意味する。
【化４】
2022502384.tif 000006
（式（２）中、Ｒ６ｃの基は、炭素数１〜７のアルキレン基を表し、Ｒ６ｄの基は、炭素数１〜３のアルキル基を表し、環Ａは、ｋ２個のＲ６ｄで置換され得る炭素数３〜９のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環を表し、ｋ２は、０〜２の整数を表し、ただし、式（２）の基に含まれる炭素数は、７〜１２の範囲内であり、好ましくは７〜１０の範囲内である。）
【００１８】
環Ａは、例えば、炭素数３〜８のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環であり、好ましくは炭素数４〜７のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環であり、シクロペンチル環、シクロペンテニル環、シクロヘキシル環、シクロヘキセニル環等を具体例として挙げることができる。
【００１９】
Ｒ６ｃの基は、例えば炭素数１〜５のアルキレン基であり得、好ましくはエチレン基、プロピレン基またはブチレン基であり得る。
【００２０】
Ｒ６ｄの基は、好ましくはメチル基またはエチル基である。ｋ２は、０または１であり得る。
【００２１】
１つの実施形態において、Ｒ６ａおよびＲ６ｂの基は、シクロオクチルエチル基、シクロヘプチルメチル基、シクロヘプチルエチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロヘキシルプロピル基、シクロヘキシルブチル基、シクロペンチルエチル基、シクロペンチルプロピル基、シクロペンチルブチル基、シクロペンチルペンチル基、シクロブチルプロピル基、シクロブチルブチル基、シクロブチルペンチル基、シクロプロピルブチル基、シクロプロピルペンチル基、シクロプロピルヘキシル基、１−シクロヘキセン−１−エチル基、２−シクロヘキセン−１−エチル基、または３−シクロヘキセン−１−エチル基であり得る。
【００２２】
脂環を含まない場合のＲ６ａおよびＲ６ｂの基は、炭素数７〜１２、好ましくは炭素数７〜１０の直鎖状または分岐状のアルキル基であり得る。具体例としては、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基が挙げられる。
【００２３】
Ｒ７ａおよびＲ７ｂの基について定義する、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
よりなる群から選ばれる基は、同一の基であることが好ましく、式（ｉ）の基であることがさらに好ましい。また、ｐ１〜ｐ４およびｑ１〜ｑ６は、それぞれ相互に独立して２または３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１およびｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜３の整数であることが好ましい。
【００２４】
上記Ｒ７ａまたはＲ７ｂの基は、２つ（または２つ以上）の異なるアミノ基を有し、各アミノ基は異なるｐＫａ値を示す。生理条件であるｐＨ７．４においては、これらのアミノ基は部分的にプロトン化状態にあることから、式（１）のポリアミノ酸は、核酸と静電相互作用することによって複合体（例えば、ポリイオンコンプレックス）を好適に形成することができる。また、該複合体がエンドソーム内（ｐＨ５．５）へ取り込まれると、Ｒ７ａまたはＲ７ｂの基のプロトン化がさらに進行し、バッファー効果（またはプロトンスポンジ効果）によりエンドソームエスケープを促進させ得る。
【００２５】
上記Ｒ８の基は、好ましくはオルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、またはホモアルギニンの側鎖である。
【００２６】
式（１）において、ｍは所定の炭素数を有する脂肪族炭化水素基が導入された疎水性アミノ酸残基の繰り返し数を表し、ｘはカチオン性アミノ酸残基の繰り返し数を表す。ｍは、９以上の整数であり、好ましくは１０以上の整数である。ｘは、２〜３００の整数であり、好ましくは５〜２５０の整数であり、より好ましくは１０〜２００の整数である。また、ｍ＋ｘは、１１〜４００の整数であり、好ましくは２０〜３００の整数、より好ましくは２０〜２５０の整数である。ｍ＋ｘの上限は、１００、８０、６０または４０であってもよい。
【００２７】
１つの実施形態において、ｘおよびｍは、好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２、より好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．７５、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．７０、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．６５、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３８≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．６の関係を満たす。ｘおよびｍがこのような関係を満たすことにより、ｍＲＮＡ等の核酸を優れた効率で細胞内に導入することができる。
【００２８】
１つの実施形態において、式（１）で表される両親媒性ポリアミノ酸の疎水性度（ＬｏｇＰ）は、好ましくは−２．４以上であり、より好ましくは−２．４を超えて−１．８０以下である。ここで、疎水性度（ＬｏｇＰ）は、室温（例えば、２５℃）における上記両親媒性ポリアミノ酸の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）への溶解度（ＳＨＥＰＥＳ）に対する１−オクタノールへの溶解度（ＳＯＣＴＡＮＯＬ）の比であり、式：ＬｏｇＰ＝Ｌｏｇ（ＳＯＣＴＡＮＯＬ／ＳＨＥＰＥＳ）に基づいて求めることができる。このような疎水性度を有する両親媒性ポリアミノ酸を用いることによって、高い効率で、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞に導入することができる。なお、上記疎水性度（ＬｏｇＰ）は、例えば、実施例に記載の方法で求めることができる。
【００２９】
Ａ−２.第２の実施形態
本発明の第２の実施形態における両親媒性ポリアミノ酸は、下記式（１’）で表される。当該両親媒性ポリアミノ酸は、代表的には、生理的条件下（ｐＨ７．４）においてｍＲＮＡ等の核酸と相互作用して複合体を形成して、細胞に好適に取り込まれ得る。
【化５】
2022502384.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１ａ基または−ＮＨ−Ｒ１ｂ基を表し、ここでＲ１ａおよびＲ１ｂはそれぞれ独立して、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換または置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、
Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、相互に独立して、脂環を含んでいてもよい、未置換または置換された炭素数７〜１２の脂肪族炭化水素基を表し、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、およびｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ８は、オルニチン、リシン、ホモリシン、アルギニン、ホモアルギニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し、
ｍおよびｘは、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２の関係および１１≦ｍ＋ｘ≦４００の関係を満たす整数であり、
ｎは、０〜ｍの整数であり、
ｙは、０〜ｘの整数であり、
ｚは、０〜ｘの整数であり、
ただし、ｙ＋ｚ≦ｘの関係を満たし、
上記式（１’）中の各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
【００３０】
上記式（１’）におけるＲ１〜Ｒ８の基についてはそれぞれ、式（１）におけるＲ１〜Ｒ８の基と同様の説明が適用され、好ましい基も同じである。
【００３１】
式（１’）において、ｍは所定の炭素数を有する脂肪族炭化水素基が導入された疎水性アミノ酸残基の繰り返し数を表し、ｘはカチオン性アミノ酸残基の繰り返し数を表す。ｍは、好ましくは５以上の整数であり、例えば６以上、７以上または８以上の整数であり得る。また、ｘは、代表的には２〜２５０の整数であり、好ましくは５〜２５０の整数であり、より好ましくは１０〜２００の整数である。また、ｍ＋ｘは、１１〜４００の整数であり、好ましくは１５〜３００の整数、より好ましくは２０〜３００の整数、さらにより好ましくは２０〜２５０の整数である。ｍ＋ｘの上限は、１００、８０、６０または４０であってもよい。
【００３２】
式（１’）において、ｘおよびｍは、（ｍ＋ｘ）×０．３３≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．８２、好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．７５、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．７０、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３５≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．６５、さらにより好ましくは（ｍ＋ｘ）×０．３８≦ｍ≦（ｍ＋ｘ）×０．６の関係を満たす。ｘおよびｍがこのような関係を満たすことにより、ｍＲＮＡ等の核酸を優れた効率で細胞内に導入することができる。
【００３３】
１つの実施形態において、式（１’）で表される両親媒性ポリアミノ酸の疎水性度（ＬｏｇＰ）は、好ましくは−２．４以上であり、より好ましくは−２．４を超えて−１．８０以下である。ここで、疎水性度（ＬｏｇＰ）は、室温（例えば、２５℃）における上記両親媒性ポリアミノ酸の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）への溶解度（ＳＨＥＰＥＳ）に対する１−オクタノールへの溶解度（ＳＯＣＴＡＮＯＬ）の比であり、式：ＬｏｇＰ＝Ｌｏｇ（ＳＯＣＴＡＮＯＬ／ＳＨＥＰＥＳ）に基づいて求めることができる。このような疎水性度を有する両親媒性ポリアミノ酸を用いることによって、高い効率で、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞に導入することができる。
【００３４】
式（１）または式（１’）で表される両親媒性ポリアミノ酸は、例えば、それ自体公知のβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）の重合によりポリアミノ酸エステルを製造し、次いで、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびのＲ８の基に対応するアミンを用いてアミノリシスを行うことによって製造することができる。アミノリシス時に使用する各アミンの割合を変化させることにより、所望の導入率でＲ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびＲ８の基を導入することができる。
【００３５】
なお、上記合成の過程でアミノ酸エステル残基の一部にアミンの求核攻撃に起因した構造変化（例えば、アミノ酸エステル残基の脱アルコールによるイミド環の形成）が生じる場合があるが、本明細書ではこのような構造変化を経た残基をさらに含むポリアミノ酸についても、上記式（１）または式（１’）に含めて取り扱うこととする。この場合、上記構造変化を経た残基は、アミノ酸残基には含めないものとする。また、カチオン性アミノ酸残基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基が合成過程での酸（主に塩酸）の使用に起因して塩（主に塩酸塩）になる場合があるが、本明細書ではこうした構造を含む両親媒性ポリアミノ酸についても、上記式（１）または式（１’）に含めて取り扱うこととする。すなわち、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびＲ８の基における一部のＮＨ基およびＮＨ２基は塩（例えば、塩酸塩）となっていてもよい。
【００３６】
Ｂ．ブロックコポリマー
本発明の別の局面によれば、ブロックコポリマーが提供される。該ブロックコポリマーは、Ａ項に記載の式（１）または式（１’）で表される両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとが、必要により連結基を介して結合された構造を有し、該両親媒性ポリアミノ酸由来のポリアミノ酸鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む。このような構造を有することにより、本発明のブロックコポリマーは、両親媒性ポリアミノ酸自体が有する特性を保持しつつ、循環血液中における良好な滞留性を示すポリマー粒子（例えば、ポリマーミセル）を形成することができる。
【００３７】
１つの実施形態において、上記ブロックコポリマーは、［式：Ａ−Ｌ−Ｂ（式中、Ａは親水性ポリマー鎖セグメントを表し、ＢはＡ項に記載の両親媒性ポリアミノ酸由来のポリアミノ酸セグメントを表し、Ｌは直接結合または連結基を表す。）］で表される。上記式中、Ａで表される親水性ポリマー鎖セグメントは、一本鎖であってもよく、二本鎖以上に分岐していてもよい。
【００３８】
上記親水性ポリマーとしては、任意の適切な親水性ポリマーが採用され得る。該親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、およびこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。これらのなかでも、ポリ（エチレングリコール）は、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられ得る。
【００３９】
上記ポリエチレングリコールの分子量（Ｄａ）は、例えば８００〜８０，０００、好ましくは２，０００〜６０，０００、より好ましくは５，０００〜４０，０００であり得る。
【００４０】
本発明のブロックコポリマーは、好ましくは下記式（３）または（４）で表され得る：
【化６】
2022502384.tif 000008
【化７】
2022502384.tif 000009
上記各式中、
Ｒ１〜Ｒ８、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ、およびｚについては、上記式（１）または式（１’）について定義したのと同義であり、
Ｌ１およびＬ３は、連結基であり、
Ｒ９およびＲ１０は、相互に独立して、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基であり、
ｋは、２０〜２０，０００の整数を表す。
【００４１】
Ｌ１およびＬ３はそれぞれ、親水性ポリマー鎖セグメントと両親媒性ポリアミノ酸セグメントとの連結部分であり、任意な適切な連結基であってよい。Ｌ１で表される連結基は、例えば、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｌ２−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｌ２−Ｓ−Ｌ２−ＮＨ−（ここで、Ｌ２は独立して炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。Ｌ３は、例えば、−ＯＣＯ−Ｌ４−ＣＯ−、および−ＮＨＣＯ−Ｌ４−ＣＯ−（ただし、Ｌ４は炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。
【００４２】
Ｒ９およびＲ１０の基で定義する炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。また、「置換された」場合の置換基としては、上記式（１）においてＲ１およびＲ２の基に関して例示した置換基と同様であり得る。あるいは、Ｒ９およびＲ１０の基は、標的結合部位を含む基によって置換されていてもよい。標的結合部位を親水性ポリマー鎖セグメントの末端に導入することにより、所望の標的部位への到達性を向上できる。
【００４３】
上記標的結合部位を含む基としては、標的となる組織に対する指向性または機能性を有する限りにおいて任意の適切な基であり得、例えば、抗体もしくはその断片、またはその他の機能性もしくは標的指向性を有するタンパク質、ペプチド、アプタマー、ラクトース等の糖、葉酸といった生理活性物質およびその誘導体に由来する基であり得る。
【００４４】
エチレングリコール（またはオキシエチレン）の繰り返し数を表す符号ｋは、２０〜２０，０００、好ましくは４０〜２，０００、さらに好ましくは４５〜１，０００の整数を表す。
【００４５】
本発明のブロックコポリマーは、例えば、上記両親媒性ポリアミノ酸と親水性ポリマーとをそのまま、または必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。また、例えば、一般式（３）のブロックコポリマーは、Ｒ９を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させ、得られたポリアミノ酸セグメントの側鎖にアミノリシスまたはエステル交換によりＲ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、およびＲ８の基を導入することによって、製造することができる。
【００４６】
Ｃ．核酸との複合体
本発明のさらに別の局面によれば、Ａ項に記載の両親媒性ポリアミノ酸またはＢ項に記載のブロックコポリマーと核酸とを含む複合体（以下、ポリプレックスと称する場合がある）が提供される。上記両親媒性ポリアミノ酸およびブロックコポリマーはいずれもカチオン性基に由来する正電荷を有することから、負電荷を有する核酸と静電相互作用を介して複合体を形成することができる。
【００４７】
上記核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを例示することができる。また、１つの鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も例示に含まれる。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、また、これらにアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。
【００４８】
上記核酸の鎖長（二本鎖核酸の場合は、二本鎖を形成している部分の鎖長）は特に限定されず、１００塩基未満、例えば１０塩基〜８０塩基、好ましくは１５塩基〜５０塩基程度の比較的短鎖の核酸であってもよく、あるいは、１００塩基以上、好ましくは１００塩基〜２０，０００塩基、より好ましくは２００塩基〜１０，０００塩基程度の比較的長鎖の核酸であってもよい。
【００４９】
上記核酸としては、その機能または作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ドナーＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー、リボザイム等を好ましく挙げることができる。核酸は、単独で、または、２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５０】
上記複合体の粒子径は、例えば１０ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍであり得る。
【００５１】
上記複合体は、必要により緩衝化された水溶液中で、上記両親媒性ポリアミノ酸または上記ブロックコポリマーと核酸とを所望のＮ／Ｐ比となるように混合することによって調製され得る。Ｎ／Ｐ比は、生理的条件下での複合体の安定性および細胞取り込み性を向上させる観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上である。Ｎ／Ｐ比の上限は、例えば２００以下とすることができる。なお、Ｎ／Ｐ比とは、混合液中における上記両親媒性ポリアミノ酸または上記ブロックコポリマーの側鎖由来のプロトン化可能なアミノ基のモル濃度（Ｎ）と核酸由来のリン酸基のモル濃度（Ｐ）との比を意味する。
【００５２】
上記複合体は、核酸に加えて、タンパク質をさらに含むことができる。当該タンパク質は、例えばＲＮＡ結合タンパク質であり、ＲＮＡとの複合体（リボヌクレオタンパク質、ＲＮＰ）の形態で複合体中に含まれ得る。このようなリボヌクレオタンパク質としては、例えば、ＲＮＡとＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼとの複合体（具体例としては、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９との複合体やｃｒＲＮＡとＣｐｆ１との複合体）が挙げられる。このような複合体によれば、所望の活性を有するタンパク質を直接細胞内に導入して作用を奏することができる。
【００５３】
上記タンパク質を含む複合体の一例としては、末端ＳＨ基を有し、ドナーＤＮＡと相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ−ＳＨ）を金ナノ粒子（ＧＮＰ）表面に吸着させ、ドナーＤＮＡを該ＤＮＡ−ＳＨとハイブリダイズさせてＧＮＰ−ドナー複合体を形成し、その表面にｓｇＲＮＡとＣａｓ９との複合体（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）を吸着させ、必要に応じてシリカでコーティングした後に、上記両親媒性ポリアミノ酸と静電結合させることによって得られる複合体（粒子内側から外側に向かって、ＧＮＰ／ドナーＤＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ／（シリカ）／両親媒性ポリアミノ酸）が挙げられる。当該複合体の詳細は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐａｇｅｓ８８９-９０１（２０１７）に開示されており、ゲノム編集に有効であることが示されている。
【００５４】
Ｄ．核酸以外のアニオン性化合物との複合体
Ａ項に記載の両親媒性ポリアミノ酸またはＢ項に記載のブロックコポリマーは、生理的ｐＨ（すなわち、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷よりも負電荷を多く有する核酸以外のアニオン性化合物と静電的相互作用を介して複合体を形成して、当該アニオン性化合物を細胞に導入することもできる。当該アニオン性化合物の例としては、タンパク質、多糖および脂質が挙げられる。１つの実施形態においては、Ａ項に記載の両親媒性ポリアミノ酸またはＢ項に記載のブロックコポリマーと、タンパク質とを含む複合体が提供され得る。当該タンパク質の例としては、抗体、リガンド、ホルモン、酵素等の生理活性を有するアニオン性タンパク質が挙げられる。ここで、アニオン性タンパク質は、生理的ｐＨの水性媒体中で正電荷よりも負電荷を多く有するように人工的に電荷が変換されたものであってもよい。このような電荷変換タンパク質およびＡ項に記載の両親媒性ポリアミノ酸またはＢ項に記載のブロックコポリマーと当該タンパク質との複合体は、例えば、Ｃ項に記載の方法と同様の方法またはＡｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２００９，  ４８，  ５３０９−５３１２に記載される方法を用いて調製することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【００５６】
［試験例Ａ］
１．ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）の合成
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１６２８７に記載の方法に従って、重合度が２６、６３および１２１であるポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）を調製した。β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートの重合度は、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＪＮＭ−ＥＣＳ  ４００（日本電子社製））におけるメチルプロトン（ＣＨ３（ＣＨ２）３ＮＨ，δ＝０．８）に対するフェニルプロトンのピーク強度比から算出した。また、重合度が２６、６３および１２１のＰＢＬＡに関して、ゲル浸透クロマトグラフィーによって多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を求めたところ、それぞれ１．１８、１．１９および１．３４であった。
【００５７】
２．両親媒性ポリアスパルタミド誘導体（ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ））の合成
【化８】
2022502384.tif 000010
上記合成経路に示すように、種々のアミンとジエチレントリアミン（ＤＥＴ）とを用いたＰＢＬＡの同時アミノリシス反応によって、両親媒性ポリアミノ酸である種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を調製した。なお、得られたポリアミノ酸においては、α−アスパラギン酸残基とβ−アスパラギン酸残基とがランダムに存在するとともに、その側鎖にＤＥＴ部分またはＲで表される基が種々の比率で導入されている。
【００５８】
具体例として、Ｒがシクロヘキシルエチル基である場合の合成方法を以下に示す。ＰＢＬＡ（ＤＰ＝２６，３０ｍｇ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解し、４℃に冷却した。得られたＰＢＬＡ溶液をＤＥＴ（７９０μＬ）と２−シクロヘキシルエチルアミン（２．１４ｍＬ）との混合物（モル比＝１：２）に滴下し、アルゴン雰囲気下、４℃で１時間撹拌した。反応液を中和するために冷５Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）に滴下した。４℃の０．０１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、４℃の蒸留水に対する透析によってポリマー産物を精製した。透析後の溶液を凍結乾燥して固体粉末を得た。得られた粉末を少量のトリエチルアミンを加えたメタノール（４ｍＬ）に溶解し、次いで、未反応の２−シクロヘキシルエチルアミンを完全に除去するために過剰量のジエチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物をろ取し、蒸留水に溶解した。４℃の０．０１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、４℃の蒸留水に対する透析によってポリマーをさらに精製した。透析後の溶液を凍結乾燥して最終産物を得た。側鎖におけるベンジルエステル基のＤＥＴ部分およびシクロヘキシルエチル（ＣＨＥ）部分への定量的な変換は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（１０ｍｇ／ｍＬ，８０℃）で確認した。
【００５９】
同様の手順で他のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）またはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）についても合成を行った。なお、ＤＥＴ部分とＲ部分との導入比率は、ＰＢＬＡと反応させるＤＥＴと各アミンとの混合比を変化させることによって調整した。
【００６０】
得られたポリアミノ酸を表１に示す。
【表１】
2022502384.tif 000011
【００６１】
３．ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とｍＲＮＡとのポリプレックスの調製および特性評価
（１）ポリプレックスの調製
ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）に溶解し、０、１、２、３、４または５のＮ／Ｐ比でｍＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．３）と混合してポリプレックス溶液（２０ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ）を調製した。なお、ｍＲＮＡとしては、Ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＦＬｕｃ）  ｍＲＮＡまたはＧａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬｕｃ）  ｍＲＮＡを用いた。ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡおよびＧＬｕｃ  ｍＲＮＡの塩基配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１５０７７．１およびＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ０１５９９３．１として公知である。
【００６２】
（２）ゲルシフトアッセイ
ＤＰ＝２６のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とＦＬｕｃ  ｍＲＮＡを用いて調製したポリプレックス溶液をアガロースゲル電気泳動に供した。結果を図１に示す。
【００６３】
図１に示されるとおり、高分子量領域にバンドが出現しており、このことから、ポリプレックスの形成が確認される。また、Ｎ／Ｐ比が２以上の場合にＦＬｕｃ  ｍＲＮＡ単体由来のバンドが消失しており、このことから、２以上のＮ／Ｐ比において、全てのＦＬｕｃ  ｍＲＮＡ分子がＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）と複合体を形成していることが分かる。
【００６４】
（３）ポリプレックスの特性評価
ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを用いてＮ／Ｐ比＝３および５で調製されたポリプレックスについて、２５℃の温度および１７３°の検出角で、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えたゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた動的光散乱法によってサイズ（キュムラント径）およびサイズ分布（多分散指数（ＰＤＩ））を求めた。また、同機器を用いた電気泳動光散乱法によってポリプレックスのゼータ電位を測定した。結果を表２に示す。
【００６５】
【表２】
2022502384.tif 000012
【００６６】
４．ポリプレックスの培養細胞へのトランスフェクション
（１）タンパク質の発現効率評価
Ｃ２Ｃ１２細胞またはＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ）中８０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、培地を新鮮なＤＭＥＭ／ＦＢＳと交換した。次いで、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡと種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とを用いて調製したポリプレックス溶液（Ｎ／Ｐ比＝３または５）を５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの用量で各ウェルに添加し、２４時間インキュベートした。後述する用量依存性ＧＬｕｃ発現プロファイル試験においては、ポリプレックスを０．５ｎｇ〜５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの量で各ウェルに添加して、２４時間インキュベートした。
【００６７】
ＧＬｕｃ用ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて、細胞培養液上清の発光強度からＧＬｕｃの発現レベルを求めた。発光強度は、ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、「Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０」）を用いて測定した。ＤＰ＝２６である種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を用いたポリプレックスの結果を図２のＡおよびＢに示す。また、Ｒ部分の導入数が異なるＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を用いたポリプレックスの結果および重合度が異なるＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を用いたポリプレックスの結果をそれぞれ、図３−１のＡおよびＢに示す。さらに、用量依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルおよび時間依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルをそれぞれ、図４のＡおよびＢに示す。また、ＤＰ＝２６である種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）の疎水性度（具体的には、各ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）の室温における１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）への溶解度（ＳＨＥＰＥＳ）に対する１−オクタノールへの溶解度（ＳＯＣＴＡＮＯＬ）の比（ＬｏｇＰ；ＬｏｇＰ＝Ｌｏｇ（ＳＯＣＴＡＮＯＬ／ＳＨＥＰＥＳ）））と、各ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とＧＬｕｃ  ｍＲＮＡとのポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝５）を用いてトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞の発光強度との関係を図３−２に示す。なお、上記疎水性度（ＬｏｇＰ）は、以下の方法に従って室温で測定した。ＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）を少量のトリエチルアミンを含むメタノールに溶かし、Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ６４７（Ａｌｅｘａ６４７）−ＮＨＳエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、両者を反応させた。Ａｌｅｘａ６４７で標識したＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）（１００μＭ、５０μＬ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）に溶解し、１−オクタノール（５０μＬ）と混合し、３０分間激しく撹拌した（２９００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＭｉｘＭａｔｅ）。二相混合物を短時間遠心分離し、４℃で１時間置いた。１−オクタノール相を注意深く集め、さらに４℃で１時間置いた。残りの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）を３３００ｇで５分間遠心分離し、４℃で１時間置いた。１−オクタノールおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）中のＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度を分光蛍光光度計（ＦＰ−８３００、Ｊａｓｃｏ）によって測定し、１−オクタノール相由来の蛍光強度を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）相由来の蛍光強度で除した商の常用対数をとって疎水性度（ＬｏｇＰ）を算出した。
【００６８】
図２のＡおよびＢに示されるとおり、Ｃ２Ｃ１２細胞およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の双方において、実施例のポリプレックス（ＨＥＰ−、ＯＣＴ−、ＮＯＮ−、ＤＥＣ−およびＣＨＥ−ポリプレックス）は１００，０００を超える発光強度を示した。このことから、これらのポリプレックスの使用によって、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡが細胞内で効率良く発現したことがわかる。なかでも、ＣＨＥ−ポリプレックスは、１０，０００，０００を超える顕著に高い発光強度を示した。一方、ＰＥＮ−、ＰＨＥ−およびＤＥＴ−ポリプレックスについては、対応する実施例のポリプレックスに比べて約２桁〜６桁程度小さい発光強度を示すに留まった。
【００６９】
図３−１のＡおよびＢに示されるとおり、Ｒ部分の導入数が異なるポリプレックス（ＤＰ＝２６）に関しては、ＣＨＥ部分の導入数が２および８のポリプレックスの発光強度は、導入数が１１のポリプレックスに比べて５桁程度小さかった。一方、重合度の異なるポリプレックスに関しては、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いたポリプレックスについては重合度が大きくなるにつれて発光強度が大きくなる傾向があるが、ＰＡｓｐ（ＣＨＥ／ＤＥＴ）を用いたポリプレックスについては重合度の違いに関わらず、顕著に高い発光強度を示した。また、図３−２に示されるグラフによれば、−２．４以上のＬｏｇＰ（Ｌｏｇ（ＳＯＣＴＡＮＯＬ／ＳＨＥＰＥＳ））を有するＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）は、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞内に送達する際のキャリアとして非常に有効に機能することがわかる。
【００７０】
ＣＨＥ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）の用量依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルは、Ｃ２Ｃ１２培養細胞中で試験した。図４のＡに示されるとおり、ＣＨＥ−ポリプレックスは、０．５ｎｇ〜１０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの用量において発光強度が用量依存的に増大し、１０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの用量において該増大がプラトーに達した。
【００７１】
ＣＨＥ−、ＯＣＴ−およびＤＥＴ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）の時間依存性ＧＬｕｃ発現プロファイルもまた、Ｃ２Ｃ１２培養細胞中で２時間おきに測定した。図４のＢに示されるとおり、ＤＥＴ−ポリプレックスは全ての測定時点においてバックグランドレベルの低い発光強度（５００以下）を示した。一方、ＣＨＥ−およびＯＣＴ−ポリプレックスの発光強度は時間と共に増加し、１２時間後には、前者は約６０，０００，０００、後者は約９，０００，０００という非常に高い発光強度に到達した。
【００７２】
（２）細胞毒性評価
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を用いてポリプレックス存在下の細胞生存割合を測定した。具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞をＤＭＥＭ／ＦＢＳ中、８０００細胞／ウェルの濃度となるように９６ウェルプレートに播種した。翌日、ＣＨＥ−ポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝５）を種々のＧＬｕｃ  ｍＲＮＡ用量となるようにウェルに添加し、２４時間細胞をインキュベートした。培地を上記Ｋｉｔ溶液（１０μＬ）を含む新鮮な培地（１００μＬ）に交換し、さらに１時間細胞をインキュベートした。その後、培地の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。
【００７３】
図５に示されるとおり、いずれの添加量においても細胞生存割合の低下は認められなかった。このことから、これらの添加量においてＣＨＥ−ポリプレックスは細胞毒性を有さないと考えられる。
【００７４】
５．細胞取り込み評価
Ｃ２Ｃ１２細胞をＤＭＥＭ／ＦＢＳ中、１００，０００細胞／ウェルの濃度となるように１２ウェルプレートに播種した。翌日、培地を新鮮なＤＭＥＭ／ＦＢＳに交換し、Ｃｙ５で標識したＧＬｕｃ  ｍＲＮＡ（Ｃｙ５−ｍＲＮＡ）を用いたポリプレックス溶液（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）またはＣｙ５−ｍＲＮＡ単体を５００ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェルの用量で各ウェルに添加した。４時間インキュベートした後、培地を除去して細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で１分間処理し、ＰＢＳ中に懸濁した。Ｃｙ５−ｍＲＮＡの細胞取り込みをフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製「ＢＤＴＭ  ＬＳＲ  ＩＩ」）を用いて測定した。結果を図６に示す。
【００７５】
図６に示されるとおり、ＨＥＰ−、ＯＣＴ−、ＮＯＮ−、ＤＥＣ−、およびＣＨＥ−ポリプレックスは、ＤＥＴ−、ＰＥＮ−、およびＰＨＥ−ポリプレックスよりも顕著に高いＣｙ５−ｍＲＮＡの細胞取り込みを示した。
【００７６】
６．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡデリバリー
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー社）をイソフルランの吸入によって麻酔し、脳定位固定装置（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ社製）上に腹臥位で固定した。頭皮を１．０ｃｍ〜１．５ｃｍ長の矢状に切開し、鈍的切開により頭蓋冠を露出させた。１．１ｍｍ径の球状ヤスリバーによって、頭頂骨の矢状縫合上に小さな孔をブレグマから０．５ｍｍ後方に垂直に形成した。定位固定マイクロマニピュレーターに接続したハミルトンシリンジ（３０Ｇ針使用）を用いて、第３脳室に、脳表面に対して垂直に３．０ｍｍの深さの部位に４．５μｇ  ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡを含むＣＨＥ−、またはＤＥＴ−ポリプレックス溶液（１０μＬ）を、約２．０μＬ／ｍｉｎの速度で投与した。次いで、切開部位を縫合して閉じた。なお、コントロールとして、ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡ単体およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とＦＬｕｃ  ｍＲＮＡとの複合体を用いた。投与から４時間後および２４時間後に脳における発光強度をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を備えたＩＶＩＳ装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて測定し、これにより、ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡのタンパク発現効率を定量評価した。結果を図７に示す。
【００７７】
図７に示されるとおり、ＣＨＥ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝３および５）によれば、４時間後の時点において、ＤＥＴ−ポリプレックス（ＤＰ＝２６、Ｎ／Ｐ＝５）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と比較して顕著に高い発光強度が示された。また、ＣＨＥ−ポリプレックスによれば、発光強度が２４時間後において急速に低下しており、このことから、ＣＨＥ−ポリプレックスがｉｎ  ｖｉｖｏ条件下であっても注入後のとても速い段階でタンパク発現を誘導したことが分かる。
【００７８】
［試験例Ｂ］
１．６０％の置換率でＣＨＥ部分を有するＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）の合成
側鎖に６０％の置換率でＣＨＥ部分を有するＰＡｓｐ（ＣＨＥ／ＤＥＴ）を、ＤＥＴと２−シクロヘキシルエチルアミンとを用いたＰＢＬＡの同時アミノリシス反応によって調製した。ＰＢＬＡ（ＤＰ＝２８，３０ｍｇ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解し、１０℃に冷却した。当該ＰＢＬＡ溶液をＤＥＴ（７９０μＬ，７５５ｍｇ）と２−シクロヘキシルエチルアミン（３．４２ｍＬ，２．９８ｇ）との混合物（モル比＝１：３.２）に滴下した。得られた溶液を、アルゴン雰囲気下、１０℃で２時間撹拌した。当該反応混合物を５Ｍ  冷ＨＣｌ（６ｍＬ）に滴下して中和した。４℃の０．０１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、４℃の蒸留水に対する透析によってポリマー産物を精製した。透析後の溶液を凍結乾燥して固体粉末を得た。得られた粉末を少量のトリエチルアミンを加えたメタノール（４ｍＬ）に溶解し、次いで、未反応の２−シクロヘキシルエチルアミンを完全に除去するために過剰量のジエチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物をろ取し、蒸留水に溶解した。４℃の０．０１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、４℃の蒸留水に対する透析によってポリマーをさらに精製した。透析後の溶液を凍結乾燥して最終産物を得た。側鎖におけるベンジルエステル基のＤＥＴ部分およびＣＨＥ部分への定量的な変換を、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（１０ｍｇ／ｍＬ，８０℃）で確認したところ、ＤＥＴ部分およびＣＨＥ部分の導入数はそれぞれ１２および１６であり、ＣＨＥ部分への置換率は約６０％であった。
【００７９】
２．ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）を用いたｍＲＮＡ搭載ポリプレックスの調製
上記１．で調製した６０％の置換率でＣＨＥ部分を有するＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）に溶解し、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．３）と混合して、所望のＮ／Ｐ比でポリプレックス溶液（２０ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ）を調製した。なお、ｍＲＮＡとしては、Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬｕｃ）  ｍＲＮＡを用いた。
【００８０】
３．ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックスを用いた培養Ｎｅｕｒｏ−２ＡへのｍＲＮＡのトランスフェクション
Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ）中８０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、培地を新鮮なＤＭＥＭ／ＦＢＳと交換した。次いで、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡを用いて調製した上記ポリプレックス溶液を各ウェルに添加し（５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェル）、２４時間インキュベートした。ＧＬｕｃ用レニラ属ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて、細胞培養液上清の発光強度からＧＬｕｃの発現レベルを求めた。発光強度は、ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０）を用いて測定した。また、対照として、試験例Ａで調製したＤＰ＝２６、ＣＨＥ部分置換率＝４０％であるＰＡｓｐ（ＣＨＥ１１／ＤＥＴ１５）とＧＬｕｃ  ｍＲＮＡとのポリプレックスを用いたこと以外は同様にしてＧＬｕｃの発現レベルを求めた。結果を図８に示す。
【００８１】
図８に示されるとおり、６０％の置換率でＣＨＥ部分を有するＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）を用いたポリプレックスは、Ｎ／Ｐ比＝３または５のいずれの場合においても、４０％の置換率でＣＨＥ部分を有するＰＡｓｐ（ＣＨＥ１１／ＤＥＴ１５）を用いたポリプレックス（Ｎ／Ｐ比＝５）よりも顕著に高い発光強度を示した。
【００８２】
４．ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）を用いたｍＲＮＡ搭載ポリプレックス、ｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックス、およびｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックスの調製
ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）に溶解し、次いで、ＩＶＴ  ｍＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．３）またはｓｉｎｇｌｅ−ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｓｇＲＮＡ  ｉｎ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．３）とＮ／Ｐ比＝５で混合し、ｍＲＮＡ搭載ポリプレックスおよびｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックス（２０ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）をそれぞれ調製した。また、予めＩＶＴ  ｍＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡ）とｓｇＲＮＡ溶液（１００ｎｇ／μＬ  ｓｇＲＮＡ）を混合し、次いで、ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）溶液とＮ／Ｐ比＝５で混合することで、ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを同時に搭載したポリプレックス（ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックス）を調製した。なお、ｍＲＮＡとしては、ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを用いた。
【００８３】
５．ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックスを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム編集
Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ａｉ９マウス，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から初代肝細胞を採取し、ビトロネクチン（Ａ１４７００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で被覆された８ウェルＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、３０，０００細胞／ウェルの濃度で播種した。肝細胞培養液は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１０３７８−０１６，Ｇｉｂｏ）、１％ＤＭＳＯ、および、１％サプリメントを含むＤＭＥＭ１１９６０（Ｇｉｂｃｏ）である。サプリメント（１００×）は、１００ｍＬ純水中、デキサメタゾン（０．３９２ｇ，０４１−１８８６１，Ｗａｋｏ）、インスリン（５ｍｇ，０９６−０３４４３，Ｗａｋｏ）、Ｌ−プロリン（０．３ｇ，１６１−０４６０２，Ｗａｋｏ）、ニコチンアミド（１２．２ｇ，１４１−０１２０２，Ｗａｋｏ）、Ｌ−アスコルビン酸２−りん酸塩（０．５８ｇ，Ａ８９６０，Ｓｉｇｍａ）、および、ヒト上皮成長因子（１００μｇ，ＧＰＴ１００１５Ｌ，Ｔｏｙｏｂｏ）である。一日おきに培養液を交換しながら肝細胞を培養した。トランスフェクション当日に、培養液を新鮮な培養液に交換した。次いで、ＳｐＣａｓ９−ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡから調製したポリプレックス溶液（２０ｎｇ／μＬ  ｍＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ，Ｎ／Ｐ＝５）を種々の濃度で各ウェルに添加し、４８時間インキュベートした。また、対照として、ＳｐＣａｓ９−ｍＲＮＡを搭載したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｓｇＲＮＡを搭載したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲノム編集を行った。インキュベート後の細胞に関して、共焦点レーザー走査型顕微鏡（１０×アポクロマート）を用いて、４０５ｎｍでのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の励起および５６１ｎｍでのｔｄＴｏｍａｔｏの励起を介して蛍光観察を行った。結果を図９に示す。なお、本評価系においては、ゲノム編集が成功した場合（具体的には、図１０に示すように、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の上流にあるＳＴＯＰカセットに二本鎖切断が生じた場合）、ｔｄＴｏｍａｔｏが発現することから、ｔｄＴｏｍａｔｏ由来の発光強度からゲノム編集効果が評価される。
【００８４】
図９に示されるとおり、ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）とのポリプレックスとしてＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとが共導入された肝細胞では、ｔｄＴｏｍａｔｏ由来の蛍光が観察され、このことから、ゲノム編集によってＳＴＯＰカセットに二本鎖切断が生じたことがわかる。なお、図９ＡはＳｐＣａｓ９−ｍＲＮＡ搭載ポリプレックスとｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックスをコトランスフェクションした結果であり、図９ＢはＳｐＣａｓ９−ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ搭載ポリプレックスによるトランスフェクションの結果である。
【００８５】
６．ＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集
１．５μｇ  ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックス溶液と１．５μｇ  ｓｇＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックス溶液をそれぞれＮ／Ｐ＝５で５μＬずつ調製した。これらの２つの溶液を投与直前に混合し、次いで、Ａｉ９マウスの第３脳室に脳室内投与した。脳を処理して組織切片化し、プランアポクロマート１０×対物レンズを備えたＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ  ７８０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察し、脳内でのゲノム編集を、ｔｄＴｏｍａｔｏ由来の蛍光から評価した。結果を図１１（ａ）および（ｂ）に示す。
【００８６】
図１１（ａ）および（ｂ）に示されるとおり、ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックスおよびｓｇＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックスが脳室内注射された脳内において、ｔｄＴｏｍａｔｏ由来の蛍光が観察され、このことから、目的のゲノム編集が生じたことがわかる。
【００８７】
また、蛍光観察結果は示さないが、上記と同様にしてＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックス溶液（Ｎ／Ｐ＝５）とｓｇＲＮＡを含むＰＡｓｐ（ＣＨＥ１６／ＤＥＴ１２）ポリプレックス溶液（Ｎ／Ｐ＝５）とをＡｉ９マウスに筋肉内注射することにより、筋組織でのｔｄＴｏｍａｔｏ由来の蛍光が観察され、このことから、目的のゲノム編集が生じたことが確認された。
【００８８】
［試験例Ｃ］
１．種々の疎水性側鎖を有するＰＡｓｐ誘導体シリーズの合成
ＰＡｓｐ（ＣＨＥ／ＤＥＴ）の合成方法をわずかに変更することで、種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）（Ｒ：２−シクロヘキセニルエチル（ＨＥＸＥＮ）、シクロヘキシルメチル（ＣＨＭ）、３−シクロペンチルプロピル（ＣＰＰ）、および３−シクロヘキシルプロピル（ＣＨＰ））を合成した。ＰＢＬＡ（ＤＰ＝２１）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解し、５℃に冷却した。当該ＰＢＬＡ溶液を表３にまとめたように、ＤＥＴ（ＣＨＥ  ５３０μＬ，ＨＥＸＥＮ  ５３０μＬ，ＣＨＭ  ４４０μＬ，ＣＰＰ  １１０μＬ，ＣＨＰ  ９６μＬ）と対応する脂肪族アミン（ＣＨＥ  ２３００μＬ，ＨＥＸＥＮ  ２３００μＬ，ＣＨＭ  ２１３０μＬ，ＣＰＰ  ５６０μＬ，ＣＨＰ  ５６０μＬ）との混合物に滴下した。得られた溶液を、アルゴン雰囲気下、５℃で１日撹拌した。当該反応混合物を過剰量のジエチルエーテルに滴下して沈殿させた。沈殿物を回収して、蒸留水に溶解した。４℃の０．０１Ｍ  ＨＣｌ、次いで、４℃の蒸留水に対する透析によってポリマー産物を精製した。透析後の溶液を凍結乾燥して最終産物を得た。側鎖におけるベンジルエステル基のＤＥＴ部分および疎水性部分への定量的な変換を、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（１０ｍｇ／ｍＬ，８０℃）で確認した。反応条件およびポリマー組成を表３に示す。
【００８９】
【表３】
2022502384.tif 000013
【００９０】
２．種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）誘導体を用いたＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＲＮＡトランスフェクション
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／ＦＢＳ）中１４，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。同日、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡと種々のＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）とから調製したポリプレックス溶液を各ウェルに添加し（５０ｎｇ  ｍＲＮＡ／ウェル）、４８時間インキュベートした。ＧＬｕｃ用レニラ属ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて、細胞培養液上清の発光強度からＧＬｕｃの発現レベルを求めた。発光強度は、ルミネセンスマイクロプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０）を用いて測定した。結果を図１２に示す。
【００９１】
図１２に示されるとおり、いずれのＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）誘導体から形成したポリプレックスを用いた場合であっても、Ｎ／Ｐ比＝５の条件下では、１００，０００を超える発光強度が得られており、Ｎ／Ｐ比＝３の条件下でも、１０，０００を超える発光強度が得られている。このことから、これらのＰＡｓｐ（Ｒ／ＤＥＴ）誘導体はいずれも、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞内に送達する際のキャリアとして有効に機能することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の両親媒性ポリアミノ酸は、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞内に送達する際のキャリアとして好適に用いられ得る。
【図１】
2022502384.tif 000017
【図２】
2022502384.tif 000018
【図３−１】
2022502384.tif 000019
【図３−２】
2022502384.tif 000020
【図４】
2022502384.tif 000021
【図５】
2022502384.tif 000022
【図６】
2022502384.tif 000023
【図７】
2022502384.tif 000024
【図８】
2022502384.tif 000025
【図９】
2022502384.tif 000026
【図１０】
2022502384.tif 000027
【図１１】
2022502384.tif 000028
【図１２】
2022502384.tif 000029
【国際調査報告】
2022502384.tif 000030
2022502384.tif 000031