(57)【要約】本発明は、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤とを一緒に含む医薬品、特に治療組合せ、医薬組成物および方法に関する。これらの組合せおよびこれらの組合せを使用するための方法は、Ｂ細胞リンパ性がんなどの特定のがんを含む様々な状態を処置するのに有用な治療効果をもたらす。本明細書において提供されるデータは、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤が、一緒に使用される場合、相乗的治療効果をもたらし得ることを実証する。
2022500408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を含む組成物。
【請求項２】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブならびにこれらの前記薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはイブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１種の薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を含む治療組合せ。
【請求項６】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくは前記ＢＴＫ阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの前記薬学的に許容される塩から選択される、請求項５に記載の治療組合せ。
【請求項７】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはその薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの前記阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項５または６に記載の治療組合せ。
【請求項８】
エンザスタウリンおよびＢＴＫの前記阻害剤が同時投与用に調製される、請求項５から７のいずれか一項に記載の治療組合せ。
【請求項９】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、および前記ＢＴＫ阻害剤が別個の投与用に調製される、請求項５から７のいずれか一項に記載の治療組合せ。
【請求項１０】
被験体の血液または血漿中にエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を含むｉｎ  ｖｉｖｏ治療組合せ。
【請求項１１】
腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害、および代謝障害から選択される障害または疾患を処置または防止するための方法であって、このような処置を必要とする被験体に、エンザスタウリンおよびＢＴＫの阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、再発性ＣＬＬ、難治性ＣＬＬ、濾胞性リンパ腫、腺癌、転移性腺癌（例えば、膵臓の）、非ホジキンリンパ腫、膵がん、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病、転移性乳がん、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、難治性多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、胃がん、結腸直腸がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞ホジキンリンパ腫）、転移性黒色腫、非小細胞肺がん、原発性ＣＮＳリンパ腫、腎細胞癌、続発性ＣＮＳリンパ腫、移行上皮癌、尿路上皮細胞癌、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、卵巣上皮細胞、卵管がん、腹膜がん、（再発）頭頚部がん、扁平上皮癌、（再発）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫から選択されるがんの処置または防止のための方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リンパ腫の処置もしくは防止、またはリンパ腫のための処置を受けた被験体における転移もしくは再発のリスクの低減のための方法であって、それを必要とする被験体に、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくは前記ＢＴＫ阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにこれらの前記薬学的に許容される塩から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの前記阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＢＴＫの前記阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの前記阻害剤が一緒に投与される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの前記阻害剤が別々に投与される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの前記阻害剤が、処置された前記被験体の血液または血漿中に両者を一緒に存在させるようなスケジュールで投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンパ腫が、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、菌状息肉腫、小リンパ球性リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、請求項１１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＴＫの前記阻害剤が経口投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＢＴＫの前記阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、バイオマーカーの発現または存在に基づいて選択される、請求項１１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
バイオマーカーがＤＧＭ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
このような処置または防止を必要とする被験体における腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害および代謝障害から選択される障害または疾患を処置または防止するための医薬の製造のための、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩と、ＢＴＫの阻害剤との組合せの使用。
【請求項３０】
このような処置もしくは防止を必要とする被験体におけるリンパ腫を処置もしくは防止するための、またはリンパ腫のための処置を受けた被験体における転移もしくは再発のリスクを低減するための、医薬の製造のための、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩と、ＢＴＫの阻害剤との組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その開示が参照によりあらゆる目的でその全体として組み込まれる、２０１８年９月１２日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０５２１７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、医薬組成物および組合せ、ならびにリンパ腫および関連する状態、特にＢ細胞リンパ性がんを含むがんなどの状態を処置するためにこれらの組成物および組合せを使用する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、その例が本明細書に開示されているエンザスタウリンとブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤とを含む組合せ、ならびにリンパ腫を処置するためにこれらの組合せを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ腫の最も一般的な形態である、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、形態学的症状、生物学的症状、免疫表現性症状、および臨床症状において、ならびに治療上の転帰において変化し得る不均一な腫瘍実体によって特徴付けられる［１、２］。遺伝子発現プロファイルによれば、２つのサブタイプ：ＤＬＢＣＬの胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）サブグループ、および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）サブグループが一般的である。組み合わされたこれらの２つのサブタイプは、ＤＬＢＣＬ症例の約８０％を占め、およそ１０〜２０％は「未分類」症例のままである［２］。ＤＬＢＣＬのＡＢＣおよびＧＣＢサブタイプは、治療に対する応答を含む腫瘍の発達および維持を理解することに対する主な障壁となる様々な細胞経路に関与する［３］。これらの患者の半数より多くにおいて持続的な寛解が達成され得るが、患者のおよそ３０％が治癒しておらず、ＤＬＢＣＬは大きな臨床課題のままである［４］。特に、生存率の低い再発性／難治性ＤＬＢＣＬ患者に対しては、新規かつ有効な治療戦略が早急に必要とされる。
【０００４】
異常なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達は、Ｂ細胞悪性疾患の病因に関与しており、疾患進行を促進する主要な機序の１つとして広く認識されている［５、６］。ＤＬＢＣＬにおけるＢＣＲの継続的活性化によって、特にＡＢＣ型ＤＬＢＣＬにおいて、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、およびプロテインキナーゼＣ−β（ＰＫＣβ）などの調節およびアダプタータンパク質のリン酸化および活性化がもたらされる［３、７、８］。対照的に、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬにおける発がんシグナル伝達は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）には依存しないが、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達への依存を共有することによって開始および強化される［９、１０］。近年では、研究量の増加によって、ＢＣＲシグナル伝達の治療的阻害、特にＤＬＢＣＬを処置するための組合せに基づく治療レジメンに焦点が当てられている［７、１１、１２］。
【０００５】
ＤＬＢＣＬは不均一リンパ腫であり、リツキシマブの導入によって多くの転帰が大きく改善されたが、すべての症例の約３０％〜４０％は治癒しないままである［３２］。この状況に関する１つの重要な理由は、上述したように、ＡＢＣおよびＧＣＢ  ＤＬＢＣＬが異なるシグナル伝達経路に関与することである。ＡＢＣサブタイプの顕著な特徴は、あまり好ましくない臨床転帰を呈する、構成的に促進されたＮＦ−κＢ経路シグナル伝達によって特徴付けられるＭＹＤ８８、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂに変異を有することである［８、３３、３４］。対照的に、ＧＣＢサブタイプは、ＮＦ−κＢ経路よりもＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性により依存する［１０］。このシグナルの多様性は、様々なレベルの腫瘍攻撃性および治療手法に対する異なる応答に変換される［３５］。よって、ＢＴＫ、ＰＩ３Ｋ、ＳＹＫ、およびＰＫＣβの阻害剤を含むＢＣＲ阻害剤によってＤＬＢＣＬ患者に対する有望な治療戦略が示される。本明細書のデータは、エンザスタウリンとイブルチニブ（ＢＴＫ阻害剤）による組合せ処置によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、ＤＬＢＣＬへの抗腫瘍効果が増強されることをはじめて実証する。機序データは、この効果が、関連するシグナル伝達経路の不活性化とＮＯＴＣＨ１発現の下方調節に依拠し得ることを示唆する。
【０００６】
エンザスタウリンは、比較的よく研究された抗腫瘍剤である。エンザスタウリンは、６ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０でＰＫＣβを標的とし、より高い濃度では他のＰＫＣアイソフォームも阻害する。エンザスタウリンに関する前臨床研究によって、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、および他の固形腫瘍において有望な結果が生じた［３６〜３９］。以前の研究では、ＤＬＢＣＬ腫瘍試料の２２％が５０％を超える細胞の免疫染色によって定義されるＰＫＣβ発現について陽性であり、さらに、ＰＫＣβ発現がＤＬＢＣＬの予後不良の有用なマーカーであることが確立された［４０、４１］。第Ｉ／ＩＩ相試験では、エンザスタウリンが患者において忍容性が良好であり、患者の１５％（８／５５）が無増悪期間を延長し（ＦＦＰ≧４サイクル）、患者の７％（４／５５）が２０〜５０カ月のＦＦＰをさらに経験することが示された［１８、１９］。しかし、第ＩＩＩ相臨床試験（ＰＲＥＬＵＤＥ）では、エンザスタウリン単独では、Ｂ細胞リンパ腫の寛解後に、高リスクＤＬＢＣＬ患者の無病生存期間（ＤＦＳ）は有意に改善されなかった。これにより、ＤＬＢＣＬの単剤療法としてのエンザスタウリンの開発が停止された。
【０００７】
失敗した治療法を解析することによって、治療組合せの開発に対する洞察をもたらすことができるため、前臨床調査と臨床調査の両方を進める機会が与えられる。以前の研究では、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）が生存シグナルの活性化をもたらすＰＫＣβの発現を増加させ得るため、ＨＤＡＣｉとエンザスタウリンの組合せ処置がＤＬＢＣＬにおける相乗効果を示すことが留意された［１６］。さらに、レナリドマイド、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、およびボルテゾミブのような他の薬剤と組み合わせてエンザスタウリンを含む治療レジメンが、非ホジキンリンパ腫細胞株を処置するために利用されている［１４、４２、４３］。これらは、潜在的に有益なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有するにもかかわらず、開発するのに十分な単剤有効性を示さなかった薬剤を利用するための治療組合せを特定する試みの例である。
【０００８】
ＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ性がんに対する新たな処置、特に複数の生化学的経路を標的とし、よってより良く、不均一な腫瘍を処置し、かつ抵抗性機序と闘うことができる組合せに対する必要性が存在する。本発明は、このような組合せおよびそれらを使用するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかのＰＫＣアイソフォームの強力かつ選択的な経口投与阻害剤である、エンザスタウリンは、固形悪性疾患および血液悪性疾患におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫ、およびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を調節することが示された［１３〜１６］。興味深いことに、何人かの研究者は、ＰＫＣβが、ＢＴＫの膜局在を変更することによってシグナル伝達経路をモジュレートする、ＢＴＫ活性化のフィードバックループ阻害剤として作用することを見出した［２３、２４］。ＰＫＣβは、Ｔｙｒ５５１におけるトランスリン酸化とＴｙｒ２２３における自己リン酸化の両方によって、ＢＴＫの活性化を下方調節することができる。そのうえ、ＰＫＣβの阻害によって、ＢＴＫの膜標的化の促進、ＰＬＣγ２のリン酸化の上方調節、およびＢＣＲに媒介されるＣａ２＋シグナル伝達の増幅がもたらされる［２４］。
【化１】
2022500408.tif 000003
【００１０】
ＤＬＢＣＬにおけるエンザスタウリンの効果がＤＬＢＣＬの前臨床研究および第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において確認されたが、その第ＩＩＩ相臨床試験は主要エンドポイントを満たさず［１７〜１９］、治験依頼者（ｓｐｏｎｓｏｒ）に臨床試験を停止させた。いくつかの試みによって、異なる臨床試験においてエンザスタウリンによる治療効果が示されたが、米国ではいずれの治療用途についても認可されていない。
【００１１】
イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）は、ＢＴＫのキナーゼドメインのシステイン−４８１に結合するＢＴＫ阻害剤の経口活性阻害剤であり、Ｔｙｒ−２２３における不可逆的阻害をもたらす。近年、イブルチニブの開発が著しく進行し、種々のＢ細胞悪性疾患における有効性が実証されている。ＤＬＢＣＬのＡＢＣおよびＧＣＢサブタイプにおいて、シグナル経路の差異がＢＴＫに対する応答の差異に変換され、このことは、ＤＬＢＣＬ再発患者におけるイブルチニブの第ＩＩ相試験において大いに確認されている。この結果によって、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬを有する患者の３７％（１４／３８）が、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬを有する患者では５％（１／２０）のみが、奏効率（ＯＲＲ）を生じることが明らかになった［３］。これ以外に、ＣＤ７９Ａ／Ｂｍｕｔ、ＣＡＲＤ１１ｍｕｔ、ＴＮＦＡＩＰ３ｍｕｔ、またはＭＹＤ８８ｍｕｔを有するＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ患者は、イブルチニブに対する一次耐性を示した［３、７］。最初に、イブルチニブによる処置後の応答が良好であった患者のサブセットは、最終的に再発し、これは明らかにＢＴＫまたはＰＬＣ−γ２（ＢＴＫのすぐ下流のタンパク質）における活性化変異によるものであった。このことは、耐性が腫瘍不均一性に起因して存在するかまたは処置の結果として生じる場合に、処置の転帰を改善するために新たな標的薬剤および組合せ処置を開発する必要性を強調する［４４］。より最近では、ＤＬＢＣＬにおいて、薬物の組合せ、特にＢＴＫ阻害剤とレナリドマイド、ボルテゾミブ、ＰＩＫ３阻害剤、およびＰａｎ−ＳＲＣキナーゼ阻害剤との同時処置に注目が集まっている［７、１２、４５〜４８］。イブルチニブがこれらの薬剤で処置したＤＬＢＣＬ細胞に添加された場合、薬物は細胞への相乗的な細胞毒性効果を示した。再発性または難治性ＣＬＬ／ＳＬＬの処置に対してリツキシマブとオファツムマブとによる併用療法におけるイブルチニブの使用を支持する臨床データも存在する［４９］。現在進行中の試験は、Ｂ細胞リンパ系悪性疾患における先行療法および／または組合せ処置としてのイブルチニブの役割をさらに定義することとなる。
【化２】
2022500408.tif 000004
【００１２】
本明細書のデータによって、ＰＫＣβ阻害剤であるエンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤との組合せによって、ＤＬＢＣＬにおける相乗的抗腫瘍効果がもたらされることが実証される。エンザスタウリンと低用量のイブルチニブ（例えば、単剤用量よりも少ない）との組合せは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＤＬＢＣＬの細胞成長を抑制するために相乗的に作用する。この結果に基づき、エンザスタウリンのイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤との組合せは、分子サブタイプおよびシグナル伝達への依存性とは無関係に、ＤＬＢＣＬを有する患者に対する有効な治療処置となり、細胞免疫系の他の悪性疾患、特にＢ細胞起源の悪性疾患の処置に対して有効であることが期待される。
【００１３】
さらに、本明細書において提供されるデータに基づいて、エンザスタウリンは、概して治療上の使用のためのＢＴＫ阻害剤の有効性を増強することができるようである。理論に拘束されないが、生化学的相互作用によって、エンザスタウリンが、腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害、および代謝障害を処置するために、ＢＴＫ阻害剤と組み合わせて使用される場合に相乗効果を示すことが可能になると考えられる。
【００１４】
本発明の組合せにより処置可能な免疫学的障害としては、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、尋常性疱瘡、シューグレン症候群、および他の自己免疫障害が挙げられる。
【００１５】
本発明の組合せにより処置可能な胃腸障害としては、全身性肥満細胞症が挙げられる。
【００１６】
本発明の組合せにより処置可能なＣＮＳ障害としては、多発性硬化症、特に再発性の多発性硬化症が挙げられる。
【００１７】
本発明の組合せにより処置可能な皮膚障害としては、慢性蕁麻疹が挙げられる。
【００１８】
本発明の組合せにより処置可能な血液学的障害としては、血小板減少性紫斑病が挙げられる。
【００１９】
本発明の組合せにより処置可能な腫瘍学適応症としては、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、再発性ＣＬＬ、難治性ＣＬＬ、濾胞性リンパ腫、腺癌、転移性腺癌（例えば、膵臓の）、非ホジキンリンパ腫、膵がん、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病、転移性乳がん、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫（multiple  meloma）、難治性多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、胃がん、結腸直腸がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞ホジキンリンパ腫）、転移性黒色腫、非小細胞肺がん、原発性ＣＮＳリンパ腫、腎細胞癌、続発性ＣＮＳリンパ腫、移行上皮癌、尿路上皮細胞癌、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、卵巣上皮細胞、卵管がん、腹膜がん、（再発）頭頚部がん、扁平上皮癌、（再発）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫が挙げられる。
【００２０】
一態様では、本発明は、腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害、および代謝障害から選択される疾患または状態を処置するための方法を提供する。本方法は、このような処置を必要とする被験体に、有効量のエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤とを投与することを含み、好ましくは本方法は、相乗的有効性をもたらすのに十分な量でエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、本発明は、がん、特にＢ細胞関連がんを処置するための方法を提供する。
【００２１】
一態様では、本開示は、リンパ腫および関連する状態を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩、および第２の治療剤を投与することを含み、第２の治療剤がブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤である、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、リンパ腫、特にＤＬＢＣＬを処置するために使用される。
【００２２】
別の態様では、本開示は、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩およびＢＴＫ阻害剤を含む組成物であって、典型的には、低分子量有機化合物、例えば、２００から約２０００の間の分子量を有するものである、組成物を提供する。必要に応じて、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでもよい。好適には、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブであってもよい。
【００２３】
別の態様では、本開示は、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫ阻害剤を含む治療組合せを提供する。２つの治療剤（エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤）は一緒にまたは別々に投与されてもよく、通常は、これらは、一緒にまたは異なる時間に摂取されてもよい別々の投与単位（例えば、丸剤またはカプセル剤）中に存在する。各構成成分は、投与するために別々に調製されてもよく、またはこの２つが単一組成物中で組み合わされてもよい。
【００２４】
前述の態様に関するＢＴＫ阻害剤は、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ（ｐｏｓｅｌｔｉｎｉｂ）、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、またはこれらのうちの１つの薬学的に許容される塩から選択され得る。本発明の組成物、組合せおよび方法は、これらのＢＴＫ阻害剤のいずれかまたはこれらのうちの２つもしくはそれより多くの混合物、またはこれらのＢＴＫ阻害剤の薬学的に許容される塩を用いて実施することができる。
【００２５】
ＧＤＣ−０８３４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素および細胞実験において、それぞれ５．９ｎＭおよび６．４ｎＭのＩＣ５０を有する強力かつ選択的なＢＴＫ阻害剤であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、マウスおよびラットにおいて、それぞれ１．１μＭおよび５．６μＭのＩＣ５０を示した。ＢＭＸ−ＩＮ−１は、第Ｘ染色体（ＢＭＸ）阻害剤に関する選択的な、不可逆的骨髄チロシンキナーゼである。ＢＭＸ  ＡＴＰ結合ドメインでは、化合物は、８ｎＭのＩＣ５０でＣｙｓ４９６を標的とし、ＢＴＫでは、そのＩＣ５０値は１０．４ｎＭである。ＲＮ４８６は、４．０ｎＭのＩＣ５０を有する高度に活性なＢｔｋ阻害剤である。ＳＮＳ−０６２は、それぞれ０．３ｎＭおよび２．２ｎＭのＫｄ値を有する、ＢＴＫの強力な、非共有結合阻害剤およびインターロイキン−２−誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）阻害剤であり、ＳＮＳ−０６２はＩＴＫに対して２４ｎＭのＩＣ５０を有する。ＬＦＭ−Ａ１３は、それぞれ２．５μＭ、１０μＭおよび６１μＭのＩＣ５０でＢＴＫ、Ｐｌｘ１およびＰＬＫ３の活性を阻害する、強力なＢＴＫ、ＪＡＫ２、ＰＬＫ阻害剤である。ＰＣＩ−３２７６５はイブルチニブのラセミ形態であり、０．５ｎＭのＩＣ５０を有するＢｔｋの選択的阻害剤であり、Ｂｍｘ、ＣＳＫ、ＦＧＲ、ＢＲＫ、およびＨＣＫの中程度の阻害ならびにＥＧＦＲ、Ｙｅｓ、ＥｒｂＢ２、およびＪＡＫ３に対してより低い活性を示す。ＣＧＩ−１７４６は、１．９ｎＭのＩＣ５０を有する、強力な、高度に選択的なＢＴＫ阻害剤である。ＯＮＯ−４０５９は、２．２ｎｍのＩＣ５０値を有し、選択的なＢＴＫ阻害剤である。Ｂ細胞では、ＯＮＯ−４０５８はＢＴＫに結合し、よって、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達をブロックし、Ｂ細胞の発達を妨げる。ＱＬ４７は、７ｎＭのＩＣ５０を有する不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。
【００２６】
好ましくは、ＢＴＫの阻害剤は、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される。イブルチニブは、本組成物、組合せおよび方法に対して好ましいＢＴＫ阻害剤である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療組合せであって、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩が同時に被験体に投与される場合に、被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏで形成されるエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を含む混合物である、治療組合せを提供する。２つの活性物質の投与は、これらが一緒に投与される場合、または両方が１時間以内、もしくは２時間以内に投与される場合、またはこれらが、この両方が、個々の構成成分のそれぞれについて、少なくとも５％、典型的には少なくとも１０％のレベルのＣｍａｘで被験体の血漿もしくは血液中に同時に存在するのに十分近接した時間内に投与される場合に、同時に起こる。好ましくは、治療組合せは、構成成分のそれぞれ（使用されるエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤）について、少なくとも約２０％のＣｍａｘの血中または血漿中濃度を同時に含む。この文脈でのＣｍａｘは、併用療法においてその構成成分に関して使用されるのと同じ投与経路、投与および製剤を使用して、成分が単独で投与される場合に見られる最大血中または血漿中濃度を指す。本明細書で使用される場合、「ＢＴＫ阻害剤」および「ＢＴＫの阻害剤」は同じ意味を有することが意図され、別段に明示的に示されていなければ、この用語は薬学的に許容される塩を含む。
【００２８】
本明細書における組成物および方法は、任意の好適な状態を処置するため、最も典型的には、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫ならびにマントル細胞リンパ腫などのＢ細胞リンパ系障害の処置のために使用することができる。本明細書のデータは、本方法および組成物が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を処置するのに特に有用であることを示す。
【００２９】
一部の実施形態では、処置される被験体は、Ｂ細胞増殖性障害、例えば、リンパ腫の一形態を有すると診断されている被験体である。一部の実施形態では、被験体は、ＤＧＭ１（Ｄｅｎｏｖｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｒｋｅｒ  １）などのバイオマーカーの存在に基づいて選択される。
【００３０】
一部の実施形態では、本方法および組成物は、本発明の組合せで処置される被験体を処置するのに有用な少なくとも１種のさらなる治療剤と組み合わせて使用される。一例として、被験体は、被験体における同じ状態を処置するのに有用な従来の化学療法剤、例えば、リツキシマブで処置されてもよく、または被験体は、薬物としてシクロホスファミド、塩酸ドキソルビシン（ヒドロキシダウノルビシン）、硫酸ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、およびプレドニゾンを含む従来の化学療法レジメンであるＣＨＯＰなどの組合せ処置と併せて、本発明の組合せで処置されてもよい。他の実施形態では、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を含む本方法および組成物は、非ホジキンリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を処置するために使用され、他のタイプのがんの処置において研究されている化学療法組合せに対する略語であるＲ−ＣＨＯＰと一緒に使用されてもよい。Ｒ−ＣＨＯＰは、薬物としてリツキシマブ、シクロホスファミド、塩酸ドキソルビシン（ヒドロキシダウノルビシン）、硫酸ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、およびプレドニゾンを含む。エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤との組合せと共に使用され得る他の治療剤としては、例えば、レナリドマイド、ボルテゾミブ、およびＢＥＺ２３５などのＰＩ３Ｋ阻害剤が挙げられる。
【００３１】
また、ますます一般的になっているように、本明細書に開示される治療組合せは、がん免疫治療剤、例えばＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはがん細胞を認識し、それと闘う身体自体の免疫系を補助する他の公知の免疫チェックポイント阻害剤と併せて投与することができる。チェックポイント阻害剤は、がん性細胞などの異常細胞を認識および攻撃する際に被験体の免疫系を助け、本明細書に開示されているようにエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤との組合せなどの化学療法の有効性を有意にブーストすることができる。好適なチェックポイント阻害剤としては、生物製剤および小分子治療薬が挙げられ、これらの例としては、イピリムマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ペンブロリズマブ、チスレリズマブ、およびデュルバルマブが挙げられる。
【００３２】
任意の好適なＢＴＫ阻害剤は、本発明の組成物、組合せおよび方法に対して、エンザスタウリンと組み合わせて使用することができる。前述の態様に関するＢＴＫ阻害剤は、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、またはこれらのうちの１つの薬学的に許容される塩から選択され得る。好ましくは、ＢＴＫの阻害剤は、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される。イブルチニブは、本発明の組合せ、組成物および方法に対して好ましいＢＴＫ阻害剤である。
【００３３】
組成物および方法は、ＤＬＢＣＬを処置するために使用されるのが好ましい。
【００３４】
本明細書のデータにおいて、ＰＫＣβ阻害剤であるエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤であるイブルチニブとの組合せは、ＤＬＢＣＬのＡＢＣおよびＧＣＢタイプにおいて相乗的な抗腫瘍効果を示し、それによって、これらの組合せの前臨床および臨床調査に対する理論的根拠を与え、ＤＬＢＣＬに対する、特に再発性または難治性ＤＬＢＣＬを有する被験体に対する特定の、忍容性が良好かつ効率的ながん治療薬の開発を可能とする。
【００３５】
一部の研究は、ＢＴＫの負の調節におけるＰＫＣβの役割を実証し、ＰＫＣβ阻害剤は、ＢＴＫシグナル伝達を増強させるＢＴＫのリン酸化レベルを変更する［２３、２４］。本明細書に開示される結果はこの関連性を支持する。ｐ−ＢＴＫの発現は、エンザスタウリンによる処置後に著しい増加を示した。よって、ＰＫＣβは、ＢＴＫの負のフィードバックシグナルとして強力に作用し、このことは、ＰＫＣβ阻害剤が、ＢＴＫの活性化を上方調節し、ＢＣＲの下流の発がんシグナル（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）を変更し得ることを意味する。このことにより、ＰＫＣβ阻害剤であるエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤であるイブルチニブとの組合せがＤＬＢＣＬにおける相乗的抗腫瘍効果を有する理由が説明され得る。これら２つの薬剤の相乗的抗腫瘍効果は、それらのＩＣ５０値より低い濃度で見られ、増殖の低減、アポトーシスの促進、Ｇ１期停止の誘導、細胞侵入および遊走の防止、ならびに下流シグナル伝達の下方調節活性化を含む。理論に拘束されないが、この関係によって、エンザスタウリンがＢＴＫ阻害剤の治療効力を増加させ、本明細書に記載されている相乗効果を生じると考えられる。
【００３６】
下流シグナル伝達カスケードの研究は、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤による組合せ処置によってＮＯＴＣＨ１のｍＲＮＡレベルの時間依存的阻害を誘発することも実証したが、一方、これらの薬物のいずれか単独では、ＮＯＴＣＨ１の発現にほんのわずかしか影響を及ぼさない。ＮＯＴＣＨ１は、細胞外シグナルを遺伝子発現の変化に直接変換する膜貫通受容体ファミリーに属する［２９］。ＮＯＴＣＨ１の発がん能は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ホジキンおよび未分化大細胞リンパ腫を含む血液疾患において検証された［２７、２８、３０］。多くの近年の研究によって、多数のＤＬＢＣＬ患者がＮＯＴＣＨ１の変異および異常を有することも示され、ＤＬＢＣＬの遺伝的ドライバーとしてのＮＯＴＣＨ１の発がん的役割が強調される［５０〜５２］。さらに、ＮＯＴＣＨ１は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲおよびＮＦ−кＢシグナル伝達経路の活性化を促進し、Ｔ細胞新生物だけでなくＢ細胞新生物の成長を加速させ、これらのアポトーシスを阻害する際に重要な役割を果たす［２８、２９］。本研究は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによるＤＬＢＣＬの処置がＮＯＴＣＨ１の遺伝子発現を有意に低減させたことを示す。ＮＯＴＣＨ１発現におけるｓｈＲＮＡに媒介される低減によって、ＤＬＢＣＬの細胞増殖が劇的に阻害された。これらのデータは、ＮＯＴＣＨ１の下方調節が、細胞成長を抑制することにおけるエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤とによる同時処置の相乗効果の根底にある重要な生体機序である可能性があることを示す。これらの研究によって、エンザスタウリンがＢＴＫ阻害剤と組み合わせて使用される場合に相乗的活性を示す理由が説明され得る。
【００３７】
それにもかかわらず、この機序に関する理論に拘束されないが、本明細書において実証されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＬＢＣＬにおけるエンザスタウリンとイブルチニブとの組合せの相乗効果は、エンザスタウリンとＢＴＫの阻害剤との同時処置によって、分子サブタイプとは無関係に、ＤＬＢＣＬにおいて抗腫瘍効果がもたらされることを示す。これらの結果は、このような組合せが実行可能な治療処置であり、ＢＴＫおよびＰＫＣβを同時に抑制することはＤＬＢＣＬのＡＢＣサブタイプとＧＣＢサブタイプの両方を処置するための新たな手法であると考えられる。
【００３８】
本明細書に記載の組成物および方法は、任意の好適な目的のために使用することができる。一部の実施形態では、上記組成物は、治療、特にリンパ腫などのＢ細胞関連悪性疾患の処置において使用することができる。示されているように、この組合せの相乗効果は、ＤＬＢＣＬのＡＢＣ形態とＧＣＢ形態の両方に適用される。
【００３９】
また別の態様では、本開示は、エンザスタウリンおよび本明細書に記載されているものなどのＢＴＫ阻害剤を含む医薬組成物を提供する。これらの実施形態では、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される場合が多い。一部の実施形態では、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、少なくとも２つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。
【００４０】
さらに別の態様では、本開示は、リンパ腫などのＢ細胞リンパ系障害を処置および／または防止するための方法であって、それを必要とする被験体に、エンザスタウリンおよびイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤を含む、上記のような組合せ、または本明細書に記載されているこれらの物質を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法を提供する。エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、必要に応じて、薬学的に許容される塩の形態で使用され得る。一部の実施形態では、Ｂ細胞リンパ系障害はＤＬＢＣＬであり、ＤＬＢＣＬのＡＢＣおよびＧＣＢサブタイプを含む。これらの方法の一部の実施形態では、被験体は、バイオマーカー、例えば、バイオマーカーＤＧＭ１の存在などに基づいて選択される。
【００４１】
さらに別の態様では、本開示は、リンパ腫などのＢ細胞リンパ系障害に関して処置された、被験体における転移または再発のリスクを低減するための方法であって、それを必要とする被験体に、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤とを含む、上記のような組合せ、または本明細書に記載されているこれらの物質を含有する医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法を提供する。エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、必要に応じて、薬学的に許容される塩の形態で使用され得る。一部の実施形態では、Ｂ細胞リンパ系障害は、ＤＬＢＣＬであり、ＤＬＢＣＬのＡＢＣおよびＧＣＢサブタイプを含む。これらの方法の一部の実施形態では、被験体は、バイオマーカー、例えば、バイオマーカーＤＧＭ１の存在などに基づいて選択される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、治療において使用するための、特にＤＬＢＣＬなどのリンパ腫の治療処置のための治療組合せであって、エンザスタウリンと本明細書に開示されるものから選択されるＢＴＫ阻害剤とを含む、組合せを提供する。治療組合せは、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤の両方を含有する単一の医薬組成物であってもよく、またはその組合せは一緒に使用するためであって、別々に投与することができない２つの別々の医薬組成物であってもよい。治療組合せは、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤の両方を関連する血漿中または血中濃度で同時に存在させるように、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を被験体に投与する際に、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じさせてもよい。
【００４３】
さらに別の態様では、本開示は、医薬の製造のための、上記治療組合せ、例えばエンザスタウリンおよびイブルチニブの使用を提供する。２つの活性治療剤は別々に投与することができることが理解されるが、本発明の一部の実施形態では、これらは、医薬、特にＤＬＢＣＬを含むリンパ腫を処置するための医薬として投与するための単一投与単位中に一緒に製剤化される。
【００４４】
さらに別の態様では、本開示は、リンパ性がん、好ましくはＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ腫を処置および／または防止するために使用するための、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤との組合せを提供する。
【００４５】
さらに別の態様では、本開示は、リンパ性がん、特にＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ腫のための処置を受けた被験体において転移または再発のリスクを低減するために使用するための、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤との組合せを提供する。
【００４６】
さらに別の態様では、本開示は、リンパ性がん、好ましくはＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ腫を処置および／または防止するための方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の上記組合せを投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、被験体は、ＤＧＭ１（Ｄｅｎｏｖｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｒｋｅｒ  １）などのバイオマーカーの発現または存在のレベルに基づいて選択される。ＤＧＭ１およびエンザスタウリンによる処置のために被験体を選択するためのバイオマーカーとしてのその使用については、公開された特許出願第ＷＯ２０１８／０４５２４０号において開示および記載されており、この方法は、本明細書の治療組合せ、例えばエンザスタウリンおよびイブルチニブを用いて処置される被験体を選択するために同様に使用することができる。
【００４７】
さらに別の態様では、本開示は、細胞、器官または組織中で、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢｔｋまたはＢＴＫ）およびＰＫＣβの活性、およびそれぞれの経路を阻害するための方法であって、ＢＴＫまたは細胞、器官もしくは組織を、上記のような有効量のエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤、例えばイブルチニブとの組合せ、または上記のような組合せを含む医薬組成物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００４８】
さらに別の態様では、本開示は、このような処置または防止を必要とする被験体における腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害および代謝障害から選択される障害または疾患を処置または防止するための医薬の製造のための、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩と、ＢＴＫの阻害剤との組合せの使用を提供する。
【００４９】
さらに別の態様では、本開示は、このような処置もしくは防止を必要とする被験体におけるリンパ腫を処置もしくは防止するための、またはリンパ腫のための処置を受けた被験体における転移もしくは再発のリスクを低減するための、医薬の製造のための、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩と、ＢＴＫの阻害剤との組合せの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】図１（図１ａ〜１ｃを含む）は、エンザスタウリンによるＡＢＣおよびＧＣＢ細胞株の阻害、ならびにＢＴＫリン酸化の上方調節を示す。
【図１−２】図１（図１ａ〜１ｃを含む）は、エンザスタウリンによるＡＢＣおよびＧＣＢ細胞株の阻害、ならびにＢＴＫリン酸化の上方調節を示す。
【００５１】
【図２Ａ】図２（図２ａ〜２ｃを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとがＤＬＢＣＬ細胞において一緒に使用された場合の相乗効果を示す。
【図２Ｂ】図２（図２ａ〜２ｃを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとがＤＬＢＣＬ細胞において一緒に使用された場合の相乗効果を示す。
【図２Ｃ】図２（図２ａ〜２ｃを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとがＤＬＢＣＬ細胞において一緒に使用された場合の相乗効果を示す。
【００５２】
【図３Ａ】図３（図３ａ〜３ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがアポトーシスを促進し、ＤＬＢＣＬ細胞におけるＧ１期停止を誘導したことを示す。
【図３Ｂ】図３（図３ａ〜３ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがアポトーシスを促進し、ＤＬＢＣＬ細胞におけるＧ１期停止を誘導したことを示す。
【図３Ｃ】図３（図３ａ〜３ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがアポトーシスを促進し、ＤＬＢＣＬ細胞におけるＧ１期停止を誘導したことを示す。
【図３Ｄ】図３（図３ａ〜３ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがアポトーシスを促進し、ＤＬＢＣＬ細胞におけるＧ１期停止を誘導したことを示す。
【００５３】
【図４Ａ】図４（図４ａ〜４ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがＤＬＢＣＬ細胞による遊走および侵入を相乗的に阻害することを示す。
【図４Ｂ】図４（図４ａ〜４ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがＤＬＢＣＬ細胞による遊走および侵入を相乗的に阻害することを示す。
【図４Ｃ】図４（図４ａ〜４ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがＤＬＢＣＬ細胞による遊走および侵入を相乗的に阻害することを示す。
【図４Ｄ】図４（図４ａ〜４ｄを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せがＤＬＢＣＬ細胞による遊走および侵入を相乗的に阻害することを示す。
【００５４】
【図５】図５は、３つの細胞株におけるエンザスタウリンとイブルチニブとによる下流シグナル伝達の阻害における相乗効果を示す。
【００５５】
【図６Ａ】図６（図６ａ〜６ｆを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって引き起こされるＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトソーム変化を示す。
【図６Ｂ】図６（図６ａ〜６ｆを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって引き起こされるＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトソーム変化を示す。
【図６Ｃ−Ｄ】図６（図６ａ〜６ｆを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって引き起こされるＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトソーム変化を示す。
【図６Ｅ】図６（図６ａ〜６ｆを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって引き起こされるＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトソーム変化を示す。
【図６Ｆ】図６（図６ａ〜６ｆを含む）は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって引き起こされるＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトソーム変化を示す。
【００５６】
【図７−１】図７（図７ａ〜７ｄを含む）は、ＤＬＢＣＬ由来の異種移植片腫瘍におけるエンザスタウリンとイブルチニブとによる相乗的抗腫瘍効果を示す。
【図７−２】図７（図７ａ〜７ｄを含む）は、ＤＬＢＣＬ由来の異種移植片腫瘍におけるエンザスタウリンとイブルチニブとによる相乗的抗腫瘍効果を示す。
【００５７】
【図８−１】図８（図８ａ〜８ｃを含む）は、エンザスタウリンを１μＭ、３μＭおよび５μＭの濃度で７２時間、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤を単独または組み合わせることによるＳＵ−ＤＨＬ−６細胞の成長阻害を示す。３つのＢＴＫ阻害剤、ザヌブルチニブ、アカラブルチニブ、およびＡＲＱ５３１を単独または組合せアッセイにおいて試験した。データは、ビヒクル対照で処置した細胞の複合阻害効果として表される。結果は、処置ごとに三連で、平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８−２】図８（図８ａ〜８ｃを含む）は、エンザスタウリンを１μＭ、３μＭおよび５μＭの濃度で７２時間、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤を単独または組み合わせることによるＳＵ−ＤＨＬ−６細胞の成長阻害を示す。３つのＢＴＫ阻害剤、ザヌブルチニブ、アカラブルチニブ、およびＡＲＱ５３１を単独または組合せアッセイにおいて試験した。データは、ビヒクル対照で処置した細胞の複合阻害効果として表される。結果は、処置ごとに三連で、平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００５８】
【図９Ａ】図９（図９ａ〜９ｂを含む）は、ＳＵ−ＤＨＬ−５（上のグラフ）およびＳＵ−ＤＨＬ−６（下のグラフ）の細胞成長阻害アッセイにおける、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤であるベカブルチニブとの相乗効果を示す。組み合わせた薬物の用量選択のために、一定比率の濃縮方法を使用した。細胞を、エンザスタウリン（０．０８〜５μＭ）およびベカブルチニブ（０．０６〜４μＭ）を単独で、または同比率の組合せで、処置ごとに三連で、７２時間にわたり処置した。組合せ指数（ＣＩ）値を計算し、エンザスタウリンの相乗効果を評価するために上のグラフに列挙した。この結果によって、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞において、２．５μＭのエンザスタウリンを除いて、すべての試験した用量で、ＣＩ＜１の２つの薬物の相乗的活性が実証された。
【図９Ｂ】図９（図９ａ〜９ｂを含む）は、ＳＵ−ＤＨＬ−５（上のグラフ）およびＳＵ−ＤＨＬ−６（下のグラフ）の細胞成長阻害アッセイにおける、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤であるベカブルチニブとの相乗効果を示す。組み合わせた薬物の用量選択のために、一定比率の濃縮方法を使用した。細胞を、エンザスタウリン（０．０８〜５μＭ）およびベカブルチニブ（０．０６〜４μＭ）を単独で、または同比率の組合せで、処置ごとに三連で、７２時間にわたり処置した。組合せ指数（ＣＩ）値を計算し、エンザスタウリンの相乗効果を評価するために上のグラフに列挙した。この結果によって、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞において、２．５μＭのエンザスタウリンを除いて、すべての試験した用量で、ＣＩ＜１の２つの薬物の相乗的活性が実証された。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
詳細な説明
一般的定義
別段に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。この項で示される定義が参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、または他の刊行物に示される定義に反するかまたは他の点で一致しない場合、この項で示される定義が参照により本明細書に組み込まれる定義に対して優先される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を意味する。
【００６１】
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」は、標的病態または障害が治癒しないか、またはその状態の再発が防止されない場合に、対象物を遅延させる（軽減する）治療処置を指す。治療量の治療剤または処置を受けた後、被験体が特定の疾患の１つもしくは複数の徴候および症状の観察可能なおよび／もしくは測定可能な低減またはその非存在を示した場合、被験体は「処置される」ことに成功している。疾患の徴候または症状の低減は、患者に感じられるものであってもよい。患者は、その患者が安定した疾患を経験する場合に処置されるとも考えられる。一部の実施形態では、治療剤による処置は有効であり、患者を処置後３カ月、好ましくは６カ月、より好ましくは１年、さらにより好ましくは処置後２年またはそれより長い年月無病状態にする。一部の実施形態では、治療剤による処置は有効であり、結果として患者により長い生存時間および／またはより良い生存率をもたらす、例えば、患者の全生存期間を増加させる。処置の成功および疾患の改善を評価するためのこれらのパラメーターは、当技術分野において適切な技術を有する医師によく知られている日常的手順によって容易に測定可能である。一部の実施形態では、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、状態、障害または疾患の症状が好転するかまたは他の点で有益に変更される任意の手法を意味する。処置は、本明細書の組成物の任意の薬学的使用も包含する。一部の実施形態では、特定の医薬組成物の投与による特定の障害の症状の「好転」は、永久的であろうと一時的であろうと、持続的であろうと一過性であろうと、その組成物の投与に起因または関連する可能性のあるいずれかの軽減を指す。
【００６２】
用語「予測」または「予後」は、薬物または薬物のセットに対し、患者が好ましい応答をするかまたは好ましくない応答をするかのいずれかの見込み、または疾患について予想される転帰を指すために本明細書において使用されることが多い。一実施形態では、予測は、これらの応答または転帰の程度に関する。一実施形態では、予測は、患者が、処置、例えば特定の治療剤による処置後に、疾患の再発なしに一定期間生存するもしくは改善するか否か、および／またはその確率に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者に対する最も適切な処置モダリティを選択することによって処置決定を行うために臨床的に使用され得る。本発明の予測方法は、処置レジメン、例えば、所与の治療剤または組合せの投与、外科的介入、ステロイド処置などを含む所与の治療レジメンなどの処置レジメンに対して患者が好ましい応答をする可能性があるかどうかを予測する際に、価値のあるツールである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、専門語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。例えば、Remington,  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,  20th  ed.,  (Lippincott,  Williams  &  Wilkins  2003)を参照されたい。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるこのような使用が企図される。
【００６４】
「薬学的に許容される塩」は、被験体への投与に対して非毒性であるか、生物学的に忍容性があるか、または他の点で生物学的に好適である、本明細書で表される化合物の遊離酸または塩基の塩を意味することが意図される。概して、Berge,  et  al.,  J.  Pharm.  Sci.,  1977,  66,  1-19を参照されたい。好ましい薬学的に許容される塩は、薬理学的に有効、かつ過度な毒性、刺激、またはアレルギー応答なく、被験体の組織と接触するのに好適なものである。エンザスタウリンおよび本明細書に記載のブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤は、十分な酸性基、十分な塩基性基、両タイプの官能基、または各タイプのうちの２つ以上を有していてもよく、したがって、いくつかの無機または有機塩基、ならびに無機および有機酸と反応し、薬学的に許容される塩を形成する。
【００６５】
一部の実施形態では、用語「薬学的に許容される塩」は、患者、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与するのに許容される塩（所与の投薬量レジメンに対して許容される哺乳動物安全性を有するカウンターイオンとの塩）を意味する。このような塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基および薬学的に許容される無機または有機酸に由来し得る。一部の実施形態では、「薬学的に許容される塩」は、化合物の薬学的に許容される塩を指し、この塩は当技術分野で周知の種々の有機および無機カウンターイオンに由来し、例としてのみであるが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなど；分子が塩基性官能基を含有する場合は、有機酸または無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。
【００６６】
薬学的に許容される塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、およびマンデル酸塩が挙げられる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」または「有効量」は、単独で、または追加の治療剤と組み合わせて、細胞、組織、または被験体に投与される場合に、被験体における疾患または障害、増殖性疾患もしくは障害を防止または好転させるのに有効な治療剤の量を指す。さらに、治療有効用量は、症状の好転、例えば関連する医学的状態の処置、治癒、防止もしくは好転、またはこのような状態の処置、治癒、防止もしくは好転の速度の増加をもたらすのに十分な治療剤の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療有効用量はその成分単独を指す。組合せに適用される場合、治療有効用量は、組み合わせて、連続してまたは同時に投与されるか否かにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の合計量を指す。一部の実施形態では、「特定の疾患を処置するための化合物の有効量」は、好転させるか、または一部の方式では疾患に関連する症状を低減するのに十分な量である。このような量は単一投薬量として投与されてもよく、レジメンに従って投与され、それによってこのような量が有効であってもよい。この量は、疾患を治癒させることができるが、典型的には、疾患の症状を好転させるために投与される。症状の所望の好転を達成するために反復投与が必要とされてもよい。
【００６８】
用語「組合せ」は、１つの単位剤型に固定された組合せ、またはエンザスタウリンとブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤（例えば、「治療剤」または「補助剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）」とも称される、以下に説明されるような別の薬物）とが、独立して同時にまたは特に組合せパートナーが協同性、例えば、相乗効果を示すのを可能にする時間間隔内で別々に投与させ得る組合せ投与のキットの部分のいずれかを指す。用語「同時投与」または「組合せ投与」などは、本明細書で利用される場合、選択された組合せパートナーの、それを必要とする単一の被験体（例えば、患者）への投与を包含し、薬剤が同じ投与経路でまたは同時に必ずしも投与される必要のない治療レジメンを含むことが意図される。用語「医薬組成物」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の有効成分の混合または組合せから生じる生成物を意味し、有効成分の固定された組合せと固定されていない組合せの両方を含む。一部の実施形態では、用語「固定された組合せ」は、エンザスタウリンとブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤とがいずれも単一の実体または投薬量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。一部の実施形態では、用語「固定されていない組合せ」は、エンザスタウリンとブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤がいずれも、別々の実体として、具体的な時間制限なく同時に、一致してまたは逐次的に患者に投与されることを意味し、ここで、このような投与は、患者の体内に治療有効レベルの２つの物質を提供する。後者はまた、カクテル療法、例えば、３つまたはそれより多い有効成分の投与も適用する。
【００６９】
用語「レベル（複数可）」は、標的、例えば、疾患または障害の病因の一部である物質または生物の存在および／または量を指すために使用され、定性的または定量的に決定され得る。標的レベルの「定性的」変化は、検出可能でないか、または正常な対照から得られた試料中に存在する標的の出現または消失を指す。１つまたは複数の標的のレベルの「定量的」変化は、健康な対照と比較した場合の標的レベルの測定可能な増加または低下を指す。
【００７０】
「健康な対照」または「正常な対照」は、疾患または障害、例えば増殖性疾患または障害を患っていない個体から得られた生体試料である。「陰性対照」は、アッセイが検出するために設計されている特定の解析物のいずれかを欠き、よって、アッセイのための基準ベースラインを提供する試料である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」は、哺乳綱の種のいずれかを指す。高頻度で、用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、ヒト、ヒト被験体またはヒト患者を指す。「哺乳動物」は、非ヒト哺乳綱の種のいずれか、例えば実験、伴侶または経済上の非ヒト哺乳動物も指す。例示的な非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ゴリラおよびチンパンジーが挙げられる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、特定の種または試料のタイプに限定されない。例えば、用語「被験体」は、患者、および高頻度でヒト患者を指し得る。しかし、この用語はヒトに限定されず、よって、種々の非ヒト動物または哺乳類の種を包含する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の際に、代謝されるか、または他の点で物質の生物学的、薬学的または治療的に活性な形態に変換される物質である。プロドラッグを生成するために、薬学的に活性な物質は、活性物質が代謝プロセスで再生成されるように改変される。プロドラッグは、薬物の代謝安定性または輸送特徴を変更する、副作用もしくは毒性を遮蔽する、薬物の風味を改良するまたは薬物の他の特徴または特性を変更するように設計されてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬力学プロセスおよび薬物代謝についての知識のおかげで、当業者は、一旦薬学的に活性な化合物が公知になると、その化合物のプロドラッグを設計することができる（例えば、Nogrady  (1985)  Medicinal  Chemistry  A  Biochemical  Approach,  Oxford  University  Press,  New  York,  pages  388-392を参照されたい）。
【００７４】
本明細書において交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー中に組み込むことができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーのアセンブリーの前または後に加えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって妨げられる場合もある。ポリヌクレオチドは、例えば標識化構成成分によるコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変されてもよい。改変の他のタイプとしては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数のアナログによる置換、例えば、荷電していない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート（phosphoamidate）、カルバメート（cabamate）など）および荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなどのヌクレオチド間の改変、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン（ply-L-lysine）など）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、改変された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態が挙げられる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられてもよく、標準的な保護基によって保護されてもよく、または活性化されてさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製してもよく、または固体支持体にコンジュゲートされてもよい。５’および３’末端のＯＨはリン酸化されてもよく、またはアミンまたは１から２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されてもよい。他のヒドロキシルは、標準的保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよびメチルリボシドなどの無塩基ヌクレオシドアナログを含む、当技術分野で一般的に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖のアナログ形態も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替の連結基によって置き換えられてもよい。これらの代替の連結基としては、以下に限定されないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」）によって置き換えられている実施形態（ここで各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−−Ｏ−−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキル（araldyl）を必要に応じて含有する置換されたかまたは置換されていないアルキル（１〜２０Ｃ）である）が挙げられる。ポリヌクレオチドにおける連結のすべてが同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００７５】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、一般的に、概して長さが約２００ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうでなくてもよい、短い、概して一本鎖の、概して合成のポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、等しくかつ十分に、オリゴヌクレオチドに適用可能である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「ホモログ」は、天然に存在する核酸（例えば、「プロトタイプ」または「野生型」核酸）とは天然に存在する核酸に対するわずかな改変によって異なるが、天然に存在する形態の基本的なヌクレオチド構造を維持する核酸を指すために使用される。このような変化としては、以下に限定されないが、欠失（例えば、核酸の短縮型バージョン）、挿入および／または置換を含む１つまたは数個のヌクレオチドにおける変化が挙げられる。ホモログは、天然に存在する核酸と比較して、増強されたか、減少したか、または実質的に類似の特性を有し得る。ホモログは、天然に存在する核酸と相補的であってもよく、またはマッチしていてもよい。ホモログは、以下に限定されないが、組換えＤＮＡ技法、化学合成などを含む核酸の生成に関して当技術分野で公知の技法を使用して生成されてもよい。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的なまたは実質的にマッチした」とは、２つの核酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。あるいは、「実質的に相補的なまたは実質的にマッチした」とは、２つの核酸配列が高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００７８】
一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシー条件下で実施され、その後、種々の、しかしより高いストリンジェンシーの洗浄が実施される。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子が相補的な核酸分子に結合することを可能にする条件を指す。ハイブリダイズした核酸分子は、一般的に、少なくとも６０％の同一性（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性のうちの少なくともいずれかが挙げられる）を有する。中程度にストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃での洗浄に等しい条件である。高いストリンジェンシー条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、１０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、２２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、１×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、３７℃での洗浄に等しい条件を指す。デンハルト溶液は、１％のＦｉｃｏｌｌ、１％のポリビニルピロリドン、および１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、および０．０２５Ｍの（ＥＤＴＡ）を含有する。他の好適な中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知である。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ベクター（またはプラスミド）」は、その発現または複製のいずれかのために、細胞内に異種ＤＮＡを導入するために使用される別の要素を指す。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者に周知である。発現ベクターには、このようなＤＮＡフラグメントの発現に影響を与えることが可能である、プロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結しているＤＮＡを発現可能なベクターが含まれる。よって、発現ベクターは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞への導入に際し、クローン化されたＤＮＡの発現をもたらす他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞および／もしくは原核細胞中で複製可能であるものならびにエピソーム性のままであるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものを含む。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター領域またはプロモーターエレメント」は、プロモーターが作動可能に連結しているＤＮＡまたはＲＮＡの転写を制御するＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントを指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分は、プロモーターと称される。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列は、シス作用性であるかまたはトランス作用因子に対して応答性であってもよい。プロモーターは、調節の性質に応じて、構成的であるかまたは調節的であってもよい。原核生物における使用を企図される例示的なプロモーターとしては、バクテリオファージＴ７およびＴ３プロモーターなどが挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結したまたは作動可能に会合した」は、ＤＮＡの、ヌクレオチドの調節およびエフェクター配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列との機能的関係を指す。例えば、ＤＮＡのプロモーターへの作動可能な連結は、このようなＤＮＡの転写がＤＮＡを特異的に認識し、ＤＮＡに結合し、およびＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるように、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的関係を指す。発現および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分な潜在的に不適切な選択的翻訳開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）（すなわち、開始（ｓｔａｒｔ））コドンまたは転写もしくは翻訳レベルいずれかで発現に干渉するかもしくは発現を低減することがある他の配列を排除することが必要である場合がある。あるいは、コンセンサス部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入して発現を増進させることができる。例えば、Kozak  (1991)  J.  Biol.  Chem.  266:19867-19870を参照されたい。このような改変の望ましさ（または必要性）は、経験的に決定されてもよい。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、巨大分子および生体分子の、生物もしくはウイルス供給源または他の供給源から得られた任意の試料を指し、核酸またはタンパク質または他の巨大分子を得ることができる被験体の任意の細胞型または組織を含む。生体試料は、生物源から直接得られた試料または処理された試料であってもよい。例えば、増幅された、単離された核酸は、生体試料を構成する。生体試料としては、以下に限定されないが、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、動物および植物からの組織および器官試料、ならびにそれらに由来する処理された試料が挙げられる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「組換え手段による生成」は、クローン化された核酸によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法に依拠する組換え核酸方法を使用する生成方法を指す。
【００８４】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を含むことが理解される。
【００８５】
本開示全体を通して、本発明の様々な態様は範囲形式で表される。範囲形式での記載は単に便利かつ簡便なだけでなく、本発明の範囲の柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲についての記載は、すべての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１から６までなどの範囲についての記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの下位範囲、およびこの範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関係なく当てはまる。
【００８６】
本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と併せて以下の明細書から明らかとなるであろう。
【００８７】
例示的な実施形態
一部の実施形態では、本発明は、以下に列挙した実施形態によって例示される。
１．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を含む組成物。これらの実施形態の一部では、エンザスタウリンは、その塩酸塩として存在する。
２．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１に記載の組成物。
３．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブならびにこれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはイブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、実施形態１または２に記載の組成物。
４．少なくとも１種の薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、実施形態１から３のいずれかに記載の組成物。必要に応じて、組成物は、２種またはそれより多い薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
５．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を含む治療組合せ。
６．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫ阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにこれらの薬学的に許容される塩から選択される、実施形態５に記載の治療組合せ。
７．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはその薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、実施形態５または６に記載の治療組合せ。
８．エンザスタウリンおよびＢＴＫの阻害剤が同時投与用に調製される、実施形態５から７のいずれか１つに記載の治療組合せ。
９．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫ阻害剤が別個の投与用に調製される、実施形態５から７のいずれか１つに記載の治療組合せ。
１０．被験体の血液または血漿中にエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤とを含むｉｎ  ｖｉｖｏ治療組合せ。
１１．腫瘍学的状態、免疫学的障害、胃腸障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、血液学的障害、および代謝障害から選択される障害または疾患を処置するための方法であって、このような処置を必要とする被験体に、エンザスタウリンおよびＢＴＫの阻害剤を投与することを含む、方法。これらの方法では、被験体は、典型的にはヒトであり、必要に応じてリンパ腫を有すると診断されたヒトである。これらの実施形態の一部では、エンザスタウリンはその塩酸塩として使用される。一部の実施形態では、有効量のエンザスタウリンおよび／またはＢＴＫ阻害剤が投与される。好ましい実施形態では、相乗的量のエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤が投与される、すなわちエンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤の量は相乗効果をもたらすのに十分である。
１２．慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、再発性ＣＬＬ、難治性ＣＬＬ、濾胞性リンパ腫、腺癌、転移性腺癌（例えば、膵臓の）、非ホジキンリンパ腫、膵がん、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病、転移性乳がん、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、難治性多発性骨髄腫、再発性多発性骨髄腫、胃がん、結腸直腸がん、膀胱がん、ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞ホジキンリンパ腫）、転移性黒色腫、非小細胞肺がん、原発性ＣＮＳリンパ腫、腎細胞癌、続発性ＣＮＳリンパ腫、移行上皮癌、尿路上皮細胞癌、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、卵巣上皮細胞、卵管がん、腹膜がん、（再発）頭頚部がん、扁平上皮癌、（再発）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫から選択されるがんの処置のための方法である、実施形態１１に記載の方法。
１３．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１２に記載の方法。一部のこのような実施形態では、ＢＴＫの阻害剤は、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である。
１４．リンパ腫の処置もしくは防止、またはリンパ腫のための処置を受けた被験体における転移もしくは再発のリスクの低減のための方法であって、それを必要とする被験体に、エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤を投与することを含む、方法。
１５．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、エボブルチニブ、チラブルチニブ、フェネブルチニブ、ポセルチニブ、ＢＭＳ−９８６１４２、ＡＲＱ−５３１、ＬＯＵ−０６４、ＰＲＮ−１００８、ＡＢＢＶ−５９９、ＡＣ−０５８、ＡＲＱ−５３１、ＢＩＩＢ−０６８、ＢＭＳ−９８６１９５、ＨＷＨ−４８６、ＰＲＮ−２２４６、ＴＡＫ−０２０、ＧＤＣ−０８３４、ＢＭＸ−ＩＮ−１、ＲＮ４８６、ＳＮＳ−０６２、ＬＦＭ−Ａ１３、ＰＣＩ−３２７６５（イブルチニブのラセミ体）、ＣＧＩ−１７４６、ＯＮＯ−４０５９、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫ阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９、ならびにこれらの薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１４に記載の方法。
１６．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブ、ＣＴ−１５３０、ＤＴＲＭＷＸＨＳ−１２、スペブルチニブベシル酸塩、ベカブルチニブ、ＡＲＱ−５３１、およびＳＨＲ−１４５９ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択され、好ましくはＢＴＫの阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、実施形態１５に記載の方法。
１７．ＢＴＫの阻害剤が、Ｍ７５８３、イブルチニブ、およびアカラブルチニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩から選択される、実施形態１４、１５または１６に記載の方法。
１８．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤が一緒に投与される、実施形態１１から１７のいずれか１つに記載の方法。これらの実施形態では、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩は、必要に応じて単一の医薬組成物としてＢＴＫ阻害剤と同時に製剤化される。これらの実施形態のうちの他のものでは、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩およびＢＴＫ阻害剤は別々の医薬組成物中に存在するが、ほとんど同時に投与される、すなわちそれらは、別々であるが、１時間を超えて間隔を空けずに、せいぜい数分以内または約１時間以内に摂取される。
１９．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤が別々に投与される、実施形態１１から１７のいずれか１つに記載の方法。これらの実施形態では、エンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩およびＢＴＫ阻害剤は、別々の医薬組成物中に存在し、ほとんど同時に投与されてもよい、すなわちそれらは、別々であるがせいぜい数分以内に摂取されてもよく、またはそれらは、１時間もしくはそれより長い時間、または食事もしくは他の事象の介在によって間隔を空けるなどの異なる時間に投与されてもよいが、いずれも２４時間の期間内、または４８時間の期間内に投与される。
２０．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩、およびＢＴＫの阻害剤が、処置された被験体の血液または血漿中に両者を一緒に存在させるようなスケジュールで投与される、実施形態１９に記載の方法。これらの実施形態では、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、処置された被験体の血液または血漿中に、２つの個々の薬剤のそれぞれのＣｍａｘについて測定可能なレベルで、典型的には少なくとも５％のレベルで、典型的には少なくとも１０％のレベルで両者を存在させるのに十分な時間で密接に投与される。
２１．リンパ腫が、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、実施形態１１から２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫である、実施形態２１に記載の方法。
２３．リンパ腫が、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、菌状息肉腫、小リンパ球性リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫から選択される、実施形態２２に記載の方法。この実施形態の好ましいバージョンでは、リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
２４．エンザスタウリン、またはその薬学的に許容される塩が経口投与される、実施形態１１から２３のいずれか１つに記載の方法。これらの実施形態の一部では、エンザスタウリンはその塩酸塩として投与される。これらの実施形態の一部では、被験体に投与されるエンザスタウリンおよびエンザスタウリン塩酸塩の量は、１日当たり５００ｍｇ、または１日当たり５００ｍｇ未満である。
２５．ＢＴＫの阻害剤が経口投与される、実施形態２４に記載の方法。
２６．ＢＴＫの阻害剤が、イブルチニブまたはその薬学的に許容される塩である、実施形態１１から２５のいずれか１つに記載の方法。これらの実施形態の一部では、ＢＴＫ阻害剤の投薬量は、１日当たり４００ｍｇ、または１日当たり４００ｍｇ未満である。一部の実施形態では、エンザスタウリンのＢＴＫ阻害剤（特に、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである）に対する重量比は、１：１またはそれを超える、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、または８：１である。
２７．被験体が、バイオマーカーの発現または存在に基づいて選択される、実施形態１１から２６のいずれかに記載の方法。
２８．バイオマーカーがＤＧＭ１である、実施形態２６に記載の方法。
【００８８】
全体を通して、エンザスタウリンまたはイブルチニブへの言及は、中性化合物または各化合物の薬学的に許容される塩を含むことを意図する。特に、エンザスタウリンは、中性分子として、またはその塩酸塩として調製、製剤化または使用され得る。イブルチニブは、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５６３１２号および同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６９４３０号に開示されている塩および固体形態を含む、任意の好適な酸付加生成物として調製、製剤化または使用され得る。好ましくは、イブルチニブは中性化合物として使用される。本明細書に開示される重量および投薬量は中性化合物を指し、例えば、量が５００ｍｇのエンザスタウリンまたはその薬学的に許容される塩について言及する場合、重量は、存在する場合、塩が使用されているか否かにかかわらず、一貫性のために使用される中性エンザスタウリンの重量を記載することが意図される。別段に指定されていなければ、エンザスタウリンまたはＢＴＫ阻害剤の重量は、特定の量の±１０％の範囲を含む。
【００８９】
本明細書に記載の化合物および組成物は、がんなどの細胞増殖性障害、特にＢＴＫの阻害剤による処置に対して応答するがんに対する処置、または本明細書に開示される他の適応症の処置を必要とする被験体に投与され得る。
【００９０】
一部の実施形態では、障害は、白血病、リンパ腫、肺がん、結腸がん、ＣＮＳがん、黒色腫、卵巣がん、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、頭頚部がん、および膵臓がんから選択されるがんである。被験体は、典型的にはこのような増殖性障害のうちの１つまたは複数に対する処置を必要としていると診断された哺乳動物であり、高頻度で、被験体はヒトである。方法は、組合せ、すなわちエンザスタウリンまたはＢＴＫ阻害剤のうちの少なくとも１つの化合物の有効量、および他の化合物の有効量であってもよい量を投与することを含む。一部の実施形態では、２つの構成成分は、相乗的活性をもたらす量または割合もしくは比率で投与され、よって、投与される組合せは有効量であり、別々に投与される場合でさえ、個々の薬剤はその量で使用される場合に治療効果をもたらすことが期待されず、よって、組合せの文脈における「有効」には相乗効果が含まれる。必要に応じて、治療組合せまたは医薬組成物は、１つもしくは複数の追加の治療剤、特に特定の被験体を苦しめるがんもしくは増殖性障害を処置するのに有用であることが公知の治療剤、および／またはＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストと組み合わせて投与されてもよい。
【００９１】
本発明の組合せに加えて、またはその使用前に、被験体は、処置される特定の状態に対して指示された他の治療剤で処置されてもよい。一般的に、リンパ腫を有する被験体は、他の認可された治療薬と組み合わせて、リツキシマブおよび／またはドキソルビシンで処理される。エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ）による処置と組み合わせてまたはその処置の前に使用され得る従来の化学療法組合せとしては、ＣＨＯＰおよびＲ−ＣＨＯＰが挙げられる。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン（塩酸ドキソルビシン）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（硫酸ビンクリスチン）、およびプレドニゾンを含む処置レジメンに対する頭文字である。Ｒ−ＣＨＯＰは、非ホジキンリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を処置するために使用され、他のタイプのがんの処置において研究されている化学療法組合せに対する略記である。これは、薬物として、リツキシマブ、シクロホスファミド、塩酸ドキソルビシン（ヒドロキシダウノルビシン）、硫酸ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、およびプレドニゾンを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明は、被験体がＤＬＢＣＬなどのリンパ腫に対して任意の好適な方法によって処置された後に、被験体を転移または再発から保護するための方法であって、このような保護を必要とする被験体に、エンザスタウリンおよびイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。
【００９３】
前記方法のそれぞれにおいて、この方法を使用して、ＤＬＢＣＬなどのリンパ腫を有する被験体を処置することができ、一部の方法では、被験体は、例えば、ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＨＯＰなどの少なくとも１つの他の方法によってすでに処置されており、さらに進行を経験した被験体である。他の実施形態では、被験体は、これらの方法によって処置されており、少なくとも部分奏功を達成した被験体であり、この場合には、被験体はエンザスタウリンおよびイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤で処置され、再発または転移から被験体を保護することができる。さらに、一部の実施形態では、被験体は、バイオマーカーの応答に基づいて選択され、例えば、被験体は、特にバイオマーカーの発現または存在に基づいて選択される場合に、本明細書に開示される組成物および治療組合せによる処置に対して好適であると思われ得る。
【００９４】
医薬組成物、組合せ、および他の関連する使用
また別の態様では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合した、本明細書に記載されているエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。必要に応じて、医薬組成物は、少なくとも２種の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これらの化合物の医薬組成物中で使用するのに好適な賦形剤および担体は当技術分野で公知である。
【００９５】
上記組合せおよび組成物は、任意の好適な目的のために使用することができる。例えば、これらは治療および／または試験において使用することができる。典型的には、これらを使用して、Ｂ細胞障害、特にリンパ腫などのＢ細胞がんに対する処置を必要とする被験体を処置する。
【００９６】
さらに別の態様では、本開示は、医薬を製造するために上記のような組合せの使用を提供する。
【００９７】
一態様では、本発明は、治療において使用するための、エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤との組合せを提供する。
【００９８】
一部の実施形態では、この組合せは、ＤＬＢＣＬなどのリンパ腫の形態を処置するための治療において有用である。
【００９９】
さらに別の態様では、本開示は、細胞、器官または組織中でＢＴＫの活性を阻害するための方法であって、細胞、器官または組織を、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤、好ましくはイブルチニブとの組合せと接触させることを含む、方法を提供する。
【０１００】
製剤
本明細書に記載の化合物の任意の好適な製剤を使用することができる。全体として、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  (2000)  Hoover,  J.  E.  editor,  20th  edition,  Lippincott  Williams  and  Wilkins  Publishing  Company,  Easton,  Pa.,  pages  780-857を参照されたい。製剤は、適切な投与経路に関して好適であるように選択される。エンザスタウリンの実行可能な製剤は公知であり、ＢＴＫ阻害剤との組合せのような新たな製剤の設計に関する情報として使用することができる。同様に、イブルチニブを含むいくつかのＢＴＫ阻害剤の安全かつ有効な製剤も公知であり、本発明に対して使用することができ、エンザスタウリンも含有する医薬組成物において使用するためなど、必要に応じて改変することもできる。
【０１０１】
化合物が、安定した非毒性の酸または塩基塩を形成するのに十分な塩基性または酸性である場合には、塩としての化合物の投与は適切であり得る。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオン、例えば、トシル酸イオン、メタンスルホン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、マロン酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン、安息香酸イオン、アスコルビン酸イオン、α−ケトグルタル酸イオン、およびα−グリセロリン酸イオンを形成する酸と形成された有機酸付加塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩、および炭酸塩を含む、好適な無機塩も形成することができる。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知の標準的手順を使用して、例えば、生理学的に許容されるアニオンを与える、アミンなどの十分に塩基性の化合物と好適な酸とによって、得られる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も作製される。エンザスタウリンの場合には、本明細書に開示される組成物、組合せおよび方法において、公知の塩酸塩を使用することができる。
【０１０２】
企図された化合物が薬理組成物中で投与される場合、化合物は薬学的に許容される賦形剤および／または担体との混合物中で製剤化され得ることが企図される。例えば、企図された化合物は、中性化合物として、もしくは薬学的に許容される塩として経口投与されるか、または食塩水溶液中で静脈内投与され得る。リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液またはクエン酸緩衝液などの従来の緩衝液をこの目的のために使用することができる。当然のことながら、当業者は、本明細書の教示内で製剤を改変させて、特定の投与経路のための多数の製剤を提供することができる。特に、企図された化合物は、水または他のビヒクルにおいてそれらをより可溶性にするために改変することができ、これは、例えば、十分に当業者の技量の範囲内である軽微な改変（塩形成、エステル化など）によって容易に達成することができる。患者における有益な効果の最大化のために本化合物の薬物動態を管理するために、特定の化合物の投与経路および投薬量レジメンを改変することもまた十分に当業者の技量の範囲内である。
【０１０３】
本明細書に記載の化合物は、全体として、有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、グリセロール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（N,N-dimetheylaceatmide）、ジメチルスルホキシドなどに可溶性である。一実施形態では、本発明は、エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤との組合せを薬学的に許容される担体と混合することによって調製される製剤を提供する。一態様では、製剤は、ａ）選択された化合物を水溶性有機溶媒、非イオン性溶媒、水溶性脂質、シクロデキストリン、トコフェロールなどのビタミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、またはこれらの組合せ中に溶解させて、溶液を提供することと、ｂ）食塩水または１〜１０％の炭水化物溶液を含有する緩衝液を付加することとを含む方法を使用して調製することができる。一例では、炭水化物はデキストロースを含む。本発明の方法を使用して得られた医薬組成物は、動物および臨床適用に対して安定かつ有用である。
【０１０４】
本発明の方法において使用するための水溶性有機溶媒の実例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。アルコールの例としては、以下に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、またはプロピレングリコールが挙げられる。
【０１０５】
本発明の方法において使用するための可溶性非イオン性界面活性剤の実例は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ、ポリエチレングリコール改変ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）（ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５）、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ４０、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ６０、ＰＥＧ−スクシネート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ（ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート）、モノオレイン酸ソルビタン、ポロキサマー、ＬＡＢＲＡＦＩＬ（登録商標）（エトキシル化杏仁油）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（登録商標）（カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド）、ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）（グリセロールエステル）、ＳＯＦＴＩＧＥＮ（登録商標）（ＰＥＧ６カプリリルグリセリド）、グリセリン、グリコール−ポリソルベート、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
本発明の方法において使用するための水溶性脂質の実例としては、以下に限定されないが、植物油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌ）、トリグリセリド、植物油（ｐｌａｎｔ  ｏｉｌ）、またはこれらの組合せが挙げられる。脂質油の例としては、以下に限定されないが、ヒマシ油、ポリオキシヒマシ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、落花生油、ペパーミント油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、水素化植物油、水素化ダイズ油、ココナッツ油のトリグリセリド、パーム核油、およびこれらの水素化形態、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１０７】
本発明の方法において使用するための脂肪酸および脂肪酸エステルの実例としては、以下に限定されないが、オレイン酸、モノグリセリド、ジグリセリド、ＰＥＧのモノもしくはジ脂肪酸エステル、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１０８】
本発明の方法において使用するためのシクロデキストリンの実例としては、以下に限定されないが、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、またはスルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリンが挙げられる。
【０１０９】
本発明の方法において使用するためのリン脂質の実例としては、以下に限定されないが、ダイズホスファチジルコリン、またはジステアロイルホスファチジルグリセロール、およびそれらの水素化形態、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１１０】
一部の実施形態では、エンザスタウリンおよび選択されたＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ）を単一の医薬組成物中で、典型的には、１種または複数の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に組み合わせる。別々の化合物のそれぞれに対して好適な担体および賦形剤は当技術分野で公知であり、組合せに対する担体および賦形剤は、別々の製剤に対して好適であることが公知のものから選択することができる。これらの実施形態では、医薬組成物中のエンザスタウリンのＢＴＫ阻害剤に対する割合は、当技術分野で公知の情報に基づいて選択することができ、典型的には、ＢＴＫ阻害剤に応じて約５：１から約１：２の範囲である。単位用量サイズは、同様に、別々の有効成分の臨床試験などの情報と組み合わせて、本明細書のデータに基づいて決定することができる。本明細書の情報は、その組合せに対して相乗効果が期待されることが実証されるため、さらなるガイダンスを提供することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤は、別々に製剤化される。これらの化合物のそれぞれに対して好適な製剤は当技術分野で公知である。
【０１１２】
好ましくは、本発明の医薬組成物および組合せは、丸剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、カプセル剤、または類似する固形剤型として、経口投与用に調製される。構成成分は単一の組成物中に組み合わされてもよいが、一部の実施形態では、これらは、単一の組成物または単位用量中に組み合わされる代わりに別々の単位用量として調製される。このことによって、特定の患者に対する組合せを最適化する際に最大限の柔軟性をもたらし、よって、各構成成分の投与頻度、タイミングおよび投薬量は、処置される特定の被験体に対して最も最適化することができる。エンザスタウリンとイブルチニブなどのＢＴＫ阻害剤の両方の固体剤型は当技術分野で公知であり、本発明の一部の実施形態では、公知の固体剤型は被験体に投与され、投薬量は投与される個々の治療剤に対するガイドラインを使用して確立される。
【０１１３】
別個の投与用に調製される場合、本発明の治療組合せの構成成分は別々の投与単位中に含有されてもよく、例えば、エンザスタウリンおよびイブルチニブなどの選択されたＢＴＫ阻害剤は、異なる丸剤、カプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、または懸濁剤中に存在してもよい。組合せの２つの活性構成成分が混合されない場合、別々の投与単位は、同時投与のためのブリスターパックなどに一緒にパッケージングされてもよく、２つの活性物質（例えば、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤（イブルチニブであってもよい））のいずれかまたは両方は、別々の投与単位中に存在する場合、エンザスタウリン組成物をＢＴＫ阻害剤組成物と共に使用するための使用説明書と共にパッケージングすることができ、逆もまた同様である。よって、一部の実施形態では、治療組合せは、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を、リンパ腫、特にＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ性がんに対する処置を必要とする被験体に投与するために、本明細書の方法に従って使用するための使用説明書と共にパッケージングされたエンザスタウリンまたはイブルチニブ（または別の選択されたＢＴＫ阻害剤）のいずれかを含む医薬組成物を含み得る。一部の実施形態では、治療組合せは、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤を、リンパ腫、特にＤＬＢＣＬなどのＢ細胞リンパ性がんに対する処置を必要とする被験体に投与するための使用説明書と共に、単一の組成物として製剤化するか別々の単位用量として製剤化するかにかかわらず、有効量のエンザスタウリンおよびイブルチニブを含むキットであってもよい。
【０１１４】
投薬量
一部の実施形態では、個々の構成成分は、単剤治療薬として使用するための通常投薬量の範囲の下限、またはより低い投薬量で投与される、すなわち、これらは、単剤療法として有効であることが期待される最低投薬量で、またはより低い投薬量で投与することができる。よって、被験体は、治療効果を得ることが意図される１日の投薬量よりも少ない活性剤（エンザスタウリン、または例えば、イブルチニブ）を含有する１日の投薬量で処置されてもよい。よって、被験体は、治療効果を誘発するために投与されるよりも少ない１日当たりの単位用量で処置されてもよく、活性剤の一方または両方の単位用量は、単剤としての治療効果を誘発することが意図される場合にそれらが投与される頻度よりも少ない頻度で投与されてもよい。「単位用量」は、本明細書で使用される場合、被験体への投与を意図した最小単位、例えば、注射用単一アンプル、または経口投与用単一錠剤もしくはカプセル剤として調製された治療剤または組合せの用量を指す。単回用量は、２つまたはそれより多くのこのような単位用量から構成されてもよく、１日の投薬量は、１回ですべてを得られるか、または１日の間に２時間もしくはそれより長時間の間隔を空けて２もしくは３回の別個の投与のような複数回用量ですべてを得られてもよいことが理解される。
【０１１５】
また、エンザスタウリンをＢＴＫ阻害剤と組み合わせることによってもたらされる相乗的活性により、この組合せの個々の構成成分は、単剤療法として投与される場合にそれらが投与される頻度よりも低い頻度で投与されて、単剤の治療効果に対して標的とされるものより低い血漿中濃度を生じ得る。一部の実施形態では、この組合せの２つの構成成分のうちの少なくとも１つは、単独で使用される場合に治療結果を達成することが期待されない投薬量、例えば、単剤投薬量の約９０％もしくは９０％未満、または単剤療法に対して使用される投薬量の半分、もしくはその投薬量の半分未満で投与される。
【０１１６】
イブルチニブは、例えば、特定のＢ細胞がん（マントル細胞リンパ腫、ＣＬＬ、小リンパ球性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、辺縁帯リンパ腫）を処置するために米国において認可されており、カプセル剤（７０ｍｇおよび１４０ｍｇ）と錠剤（１４０ｍｇ、２８０ｍｇ、４２０ｍｇおよび５６０ｍｇ）の両方として入手可能である。処置される状態に応じて、推奨される投薬量は、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇのいずれかを１日に１回である。Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標）の処方情報を参照されたい。エンザスタウリンと組み合わせて使用される場合、イブルチニブは、１日当たり４００ｍｇ未満の投薬量で摂取することができ、一部の実施形態では、本明細書の組成物、組合せおよび方法において使用するためのイブルチニブの１日の投薬量は、７０ｍｇ、１４０ｍｇ、２１０ｍｇ、２８０ｍｇ、または３５０ｍｇであってもよい。
【０１１７】
エンザスタウリンは、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンを含む）として公知の強力な化学療法レジメンと組み合わせて使用するための臨床試験におけるものであり、エンザスタウリンの開始投薬量は、エンザスタウリンが有意な治療利益をもたらさない一部のより早期のがん試験において使用したのと同じ投薬量である１日に５００ｍｇである。本発明の組成物、組合せおよび方法に対して、ＢＴＫ阻害剤と組み合わせて使用する場合、エンザスタウリンは、１日当たり５００ｍｇ、または５００ｍｇ未満、例えば、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、または４５０ｍｇの１日の投薬量で投与されてもよい。
【０１１８】
好ましくは、本発明の範囲内の組合せの２つの構成成分である、エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ）は、相乗効果を生じる投薬量で投与される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータが実証するように、この組合せは、濃度および割合の範囲にわたり相乗効果をもたらす。例えば、図２にまとめられたデータによって示されているように、２〜１２μＭの濃度のエンザスタウリンは、０．００２μＭから８μＭの範囲の濃度のイブルチニブと組み合わせた場合に、５つの異なるＤＬＢＣＬ細胞株で相乗的活性を生じた。実際に、相乗効果に関する指数（ＣＩ）は、試験した濃度および細胞株のすべてにおいて１未満であり、これは相乗効果を示し、１つの事例を除くすべてにおいて０．８未満であった（７μＭのイブルチニブと組み合わせた６μＭのエンザスタウリンにおけるＳＵ−ＤＨＬ２細胞株ではＣＩ＝０．９２３）。したがって、ＤＢＣＬＣを処置するためにこれら２つの治療剤が一緒に使用される場合、相乗効果が期待される。さらに、エンザスタウリンおよびイブルチニブが１００対１２の割合で毎日経口投与される場合、エンザスタウリンおよびイブルチニブがｉｎ  ｖｉｖｏでＤＢＣＬＣ（マウスの異種移植片）を処置するために使用される際に相乗効果が観察された。よって、ＢＴＫ阻害剤（特にＢＴＫ阻害剤がイブルチニブである場合）に対するエンザスタウリンの重量比が１：１またはそれより高い比率、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、または８：１である場合に、相乗効果の観察が期待される。
【０１１９】
例として、エンザスタウリンは、処置される被験体に対して１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇまたは７００ｍｇの１日の投薬量で投与されてもよく、投薬量は単回用量で投与されてもよく、または投薬量は、１日の間に２回、３回、または３回より多い用量に分割されてもよい。一部の実施形態では、エンザスタウリンは、１日に１回または１日に２回投与される。イブルチニブは、エンザスタウリンの投薬量と比較して同じ１日の投薬量またはそれより低い１日の投薬量で投与されてもよく、典型的には、１日１回用量で投与される。
【０１２０】
投与の用量および頻度は特定の被験体に対して処置する医師によって最適化され得るが、イブルチニブは、通常、１日当たり１００から１０００ｍｇの間の１日の投薬量で、しばしば１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇを１日に１回の単回１日用量として、カプセル剤の形態で投与される。さらに、本明細書において議論されるように、エンザスタウリンおよびイブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤が組み合わせて使用される場合に相乗的有効性が観察され、よって、各薬剤が治療用に単剤として使用される場合に典型的に推奨される用量よりも低い用量で２つの薬剤を投与することが好適であり得る。
【０１２１】
本発明の組合せにおける２つの治療剤が別々に投与される場合、これらは同じ投薬スケジュールで（およそ同じ時間に摂取される別々の投与単位として）または異なる投薬スケジュールで投与されてもよく、但し、これらが、被験体の系において両者を同時に存在させるように投与される、すなわち、それぞれが他方と同じ日に、典型的には１２時間もしくはそれより短い時間内、または４時間もしくはそれより短い時間内に投与されるように投与されるか、あるいはこれらがそれぞれ、両化合物（エンザスタウリンおよびＢＴＫ阻害剤）をこれらそれぞれの最大血中または血漿中レベル（Ｃｍａｘ）の少なくとも約１０％のレベルで同時に存在させるのに十分な時間内に他方に密接に投与されることを条件とする。
【０１２２】
当業者は、本明細書の教示内で製剤を改変して、特定の投与経路に対する多数の製剤を提供することができる。特に、化合物は、これらを水または他のビヒクル中により可溶性にするように改変され得る。患者における有益な効果の最大化のために本化合物の薬物動態を管理するために、特定の化合物の投与経路および投薬量レジメンを改変することもまた十分に当業者の技量の範囲内である。
【０１２３】
薬物の組合せ
この実施形態の方法は、有効量のエンザスタウリンおよびＢＴＫを阻害することが公知の少なくとも１つの化合物を投与することを含み、必要に応じて、この組合せは、１つまたは複数の追加の治療剤、特に本発明の組合せで治療されるリンパ性増殖性障害を処置するのに有用であることが公知の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０１２４】
追加の有効成分は、本開示の組合せと別の医薬組成物中で投与されてもよく、または本発明の組合せの少なくとも１つの化合物と共に単一の医薬組成物中に含まれてもよい。追加の有効成分は、本開示の少なくとも１つの例示的化合物の投与と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示するため、およびその実施を補助するために提供され、これらは本発明の全範囲またはその範囲の限定とみなされるべきではない。
【０１２６】
（実施例１）
材料および方法
細胞株および細胞培養
ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８、ＯＣＩ−ＬＹ７細胞株は、ネブラスカ大学のＭｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｍａｈａ、ＮＥ、ＵＳＡ）のＦｕ博士によって厚意により提供された。ＳＵ−ＤＨＬ−２およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。１０〜２０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、ベータ−メルカプトエタノールを追加補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で細胞を成長させた。ベータ−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２０％のヘパリン処理ヒト血漿を追加補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で維持したＯＣＩ−Ｌｙ７を除く。すべての細胞株は、３７℃で加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で維持した。すべてのＤＬＢＣＬ細胞株の同定は、ショートタンデムリピートＤＮＡフィンガープリント解析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって確認した。
【０１２７】
薬物および試薬
エンザスタウリンはＤｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）からの寄贈であり、イブルチニブはＭｅｄｃｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。最初に、１０ｍＭの濃度で１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中に溶解させ、−８０℃で保存した。一次および二次抗体を追加ファイル１に列挙した。
【０１２８】
細胞増殖の解析
細胞を１００μｌ当たり３０００個の細胞密度で９６ウェル培養プレート中に播種し、異なる濃度のエンザスタウリンおよびイブルチニブで７２時間にわたり処置した。細胞を計数し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ生存率アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して生存率を評価した。ルミネッセントシグナルをＬＭａｘ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって測定した。式：阻害率＝（１−投薬／ビヒクル）×１００％に従って、阻害率を計算した。
【０１２９】
アポトーシス細胞および細胞周期アッセイ
細胞を、アポトーシスおよび細胞周期解析のために、ビヒクルまたは示した濃度のエンザスタウリンおよびイブルチニブで４８時間にわたり処置した。アポトーシスアッセイでは、プロトコールに従って、細胞をアネキシンＶ−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色した。細胞周期アッセイでは、製造業者のプロトコールに従って、細胞をＰＩ染色緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。最後に、標識細胞をＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して解析した。
【０１３０】
リアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
全細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して抽出し、ｃＤＮＡをＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を使用して合成した。Ｇｏ  Ｔａｑ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲを実施するために、ＮＯＴＣＨ１に対する特異的プライマー（フォワード：５’  −ＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴ−３’（配列番号１）；リバース：５’−ＣＧＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号２））およびＧＡＰＤＨに対する特異的プライマー（フォワード：５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号３）；リバース：５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号４））を使用した。すべての反応をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）において実行し、ｍＲＮＡ発現データを以下の式：ＲＱ＝２−ΔΔＣｔを使用して計算した。
【０１３１】
ウエスタンブロッティングおよびシグナル伝達アッセイ
回収した培養細胞をプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）中で溶解させた。以前に記載されたように［２５］、ウエスタンブロットによってシグナル伝達タンパク質を検出した。製造業者の使用説明書に従って、ケミルミネッセンス検出システム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して免疫陽性バンドを可視化した。
【０１３２】
侵入および遊走アッセイ
ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０中で、細胞をビヒクルまたは示した濃度のエンザスタウリンおよびイブルチニブで示した時間にわたり処置した。細胞侵入アッセイでは、８．０μＭの孔を有するトランスウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）のＭａｔｒｉｇｅｌの基底膜マトリックスをコーティングした上のチャンバー中に細胞を配置させた。細胞遊走アッセイでは、８．０μｍの孔のポリカーボネート膜インサートを有するトランスウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）中に細胞を播種した。チャンバーの下の部分は、化学誘引物質として使用するための３０％のＦＢＳを含有した。２４時間（４８時間）後に、下のチャンバーに遊走（侵入）している細胞数をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙを使用して計数した。侵入および遊走能は、下のチャンバー中の生存細胞数によって決定した。
【０１３３】
遺伝子発現プロファイリングおよび京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）の経路エンリッチメント解析
ＨＢＬ−１細胞を示した薬物単独または組合せで２４時間にわたり処置し、次いで、全ＲＮＡを単離した。ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘを使用して、全ＲＮＡ（３μｇ）をｃＤＮＡに変換した。ＲＮＡの定量および定性、ライブラリー調製、クラスタリングおよびシーケンシング、リードマッピングおよびデータ処理をＮｏｖｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）において実施した。２つの群（条件当たり２つの生物学的反復）の差示的発現解析は、ＤＥＳｅｑ２  Ｒパッケージ（１．１６．１）を使用して実施した。補正Ｐ値０．０５および絶対倍率変化２を有意な差示的発現に対する閾値として設定した。各処置後に差示的に発現された遺伝子セットの根底にある機序を解析するために、本発明者らはｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ｒパッケージを使用して、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）の経路における差示的発現遺伝子の統計学的エンリッチメントを検査した。
【０１３４】
レンチウイルスのパッキングおよび感染
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ）またはＮＯＴＣＨ１特異的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＮＯＴＣＨ１、配列番号１：５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号５））を含有するレンチウイルスベクター（ＧＶ４９３）をＧｅｎｅｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によって構築し、パックし、精製した。細胞をＭＯＩ  １：１００でｓｈＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｈＮＯＴＣＨ１に感染させ、下流実験に使用されるよう７２時間を超えて培養した。枯渇効率はウエスタンブロット解析によって評価した。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの処置有効性の検出
すべての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する指針（ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従い、ＣｒｏｗｎＢｉｏ（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）の倫理指針に従って実施した。６から８週齢の雌の免疫欠損ＮＰＧマウス（ＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ）をＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から入手した。マトリゲルを含む無血清培地（１：１の比率）中のＨＢＬ−１腫瘍細胞（２．５×１０６）を各マウスの右側腹部の皮下領域に皮下注射した。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３に達した際に、マウスを無作為に４つの群に分割した（対照、エンザスタウリンで処置、イブルチニブで処置、エンザスタウリンとイブルチニブの両方で処置）。エンザスタウリン（５０ｍｇ／ｋｇ、１０％のＡｃａｃｉａ中に溶解させた）を１日に２回経口投与した、および／またはイブルチニブ（１２ｍｇ／ｋｇ、１％のメチルセルロース、０．４％のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）を１日に１回２１日間経口投与した。腫瘍体積（Ｖ）および体重を１週間に２から３回モニターした。腫瘍体積（Ｖ）をＶ＝（長さ×幅２）／２として計算した。腫瘍組織試料を最終用量の４時間後にすべての群から採取した。
【０１３６】
統計解析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのすべての実験は、少なくとも３回独立して行った。すべての値は、平均±ＳＥＭとして表した。すべての解析にＳＰＳＳ  ２２．０統計ソフトウェア（ＩＢＭ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。データは、対応のあるまたは対応のないスチューデントのｔ検定比較または一元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。薬物組合せに関する組合せ指数（ＣＩ）は、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（バージョン２、Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法［２６］に従って決定した。ＣＩ値＜１、＝１、および＞１は、それぞれ、相乗効果、相加効果、および拮抗効果を示す。
【０１３７】
結果
エンザスタウリンは、用量依存的方式でＡＢＣおよびＧＣＢ細胞株の増殖を阻害し、ＢＴＫのリン酸化を上方調節した
ＤＬＢＣＬ細胞株の生存に対するエンザスタウリンの効果を決定するために、本発明者らは、エンザスタウリン（０から２０．０μＭ）の存在下で９種の細胞株を７２時間培養した。細胞株は、ＤＭＳＯ単独（担体）またはＤＭＳＯ中のエンザスタウリンを用いて培養した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネッセント細胞生存率アッセイによって細胞生存率を測定した。各細胞株を三連で解析し、図１ａは、３回の反復の平均および標準偏差を示す。図１ａに示されているように、エンザスタウリンによる処置によって、細胞増殖の用量依存的阻害がもたらされ、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は６．７から１６μＭの間であった（図１ａ）。これらの結果は、エンザスタウリンが、ＤＬＢＣＬ細胞株のＡＢＣタイプとＧＣＢタイプの両方において細胞毒性を誘発することを実証した。
【０１３８】
ＰＫＣβは、ＢＴＫの一般的な下流標的である。驚くべきことに、本発明者らは、ＨＢＬ−１およびＴＭＤ８細胞が、エンザスタウリンによる処置の際に、ｐ−ＢＴＫの有意な上方調節を示したことを観察した（図１ｂは、ＤＭＳＯ中のエンザスタウリンまたはビヒクル単独による２時間の処置後の各細胞株におけるｐ−ＢＴＫレベルのウエスタンブロット解析を示す）。それによって、ＰＫＣβの阻害はＤＬＢＣＬ細胞において治療的に有効であるが、ＢＣＲシグナル伝達の正の調節をもたらす。エンザスタウリンの薬理学的阻害は、ＢＣＲシグナル伝達の一部の分岐しか遮断せず、その経路の不活性化は他のものによって補われ得る。図１ｃはＢＣＲ経路を示し、その代償経路は、特に単剤療法としての、ＤＬＢＣＬにおけるエンザスタウリンの有効性を制限し得る。
【０１３９】
分子サブタイプまたはイブルチニブに対する応答性と無関係なＤＬＢＣＬ細胞の阻害率
エンザスタウリンとイブルチニブの相乗効果を評価するために、エンザスタウリン単独、イブルチニブ単独、またはこれら２つの組合せによる細胞成長の阻害を様々な濃度で５つの細胞株（ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＯＣＬ−ＬＹ７）において測定した：図２ａに示されているように、７２時間、エンザスタウリンは２〜１２μＭの濃度で試験し、イブルチニブは０．００２から１０μＭの濃度で試験した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネッセントアッセイを使用して、阻害率を検出した。このデータから、ＣａｌｃｕＳＳｙｎソフトウェアを使用して組合せ指数（ＣＩ）値を計算した（図２ｂ）。１．０未満のＣＩ値は相乗効果を示す。組合せ処置は、すべての試験した用量で、０．２３９から０．６８６の範囲のＣＩ値で、ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＯＣＬ−ＬＹ７細胞株の成長に対する強力な相乗的阻害効果を示した。ＳＵ−ＤＨＬ２における相乗効果は、より低いイブルチニブ濃度では弱かったが（ＣＩ＝０．９２）、１０μＭのイブルチニブでは有意であった。エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せは、検査したほぼすべての投薬量の組合せで、ＧＣＢおよびＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ細胞株において相乗効果を示した（ＣＩ＜１、図２ｂ）。
【０１４０】
細胞死の時間経過解析によって、組合せ処置へのより長時間の曝露が細胞増殖をより有意に阻害することがさらに確認された（図２ｃ）。この実験では、細胞を、図２ｃに示した濃度のエンザスタウリン（ＥＮＺ）、イブルチニブ（ＩＢ）、または両方一緒（Ｃｏｍｂｏ）のエンザスタウリンとイブルチニブとで、２４、４８および７２時間にわたり処置し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネッセントアッセイによって細胞生存率をモニターした。阻害率は（１−処置／ビヒクル）×１００％として計算した。データは、三連の観察からの平均値プラスまたはマイナス標準偏差として表す。まとめると、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せは、それらのサブタイプとは無関係に、ＤＬＢＣＬ細胞の生存および増殖に対して長期にわたって相乗効果を示した。
【０１４１】
エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって、アポトーシスが促進され、ＤＬＢＣＬ細胞におけるＧ１期停止が誘導された
エンザスタウリンとイブルチニブとの同時処置により細胞成長の阻害がアポトーシスおよび／または細胞周期停止に関連したか否かを決定するために、示した濃度を有するエンザスタウリンおよび／またはイブルチニブに４８時間曝露した後に、４種の細胞株においてアポトーシスをモニターした。図３ａを参照されたい。細胞をアネキシンＶで染色し、アポトーシスをフローサイトメトリーによって評価した。アポトーシスは、ＡＰＣ＋細胞として評価した。ＨＢＬ−１では、エンザスタウリンの２つの異なる用量のイブルチニブとの組合せは、アネキシンＶ染色によって測定した場合、４３．８±８．７％または５１．４±５．９％のアポトーシスを誘導し、それぞれ単剤単独よりも高かった（エンザスタウリン＝２５．５±５．４％、イブルチニブ＝１５．９±６．０％および１９．０±６．７％、図３ａ）。これらの結果は、エンザスタウリンとイブルチニブとの同時処置によって、アポトーシスの促進に対する相乗効果がもたらされることを示した。
【０１４２】
フローサイトメトリーの結果と一致して、アポトーシスに関連するタンパク質は、ＨＢＬ−１細胞によって変化した（図３ｂ）。この実験では、細胞を示したように（図３ｃ参照）エンザスタウリンおよび／またはイブルチニブに４８時間曝露させ、次いで、タンパク質を抽出し、アポトーシスに関連するタンパク質（ＰＡＲＰ、ＸＩＡＰ、ＭＣＬ−１、カスパーゼ−３、Ｂｃｌ−２、ベータ−アクチン）のレベルを測定した。より詳細には、エンザスタウリンとイブルチニブは、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３の切断をわずかに増加させることができたが、この効果は、エンザスタウリンとイブルチニブを一緒に適用した場合に有意に増強された（図３ｂ）。組合せ処置はまた、Ｍｃｌ−１、ＸＩＡＰ、およびＢｃｌ−２を含むいくつかの抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーの発現において、急速な分解を誘導した。同様の効果は、ＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＯＣＬ−ＬＹ７細胞においても観察された（図３ｂ）。まとめると、上記の結果により、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せ使用によって、ＤＬＢＣＬ細胞においてカスパーゼに依存するミトコンドリア経路を介してアポトーシスの増加がもたらされ、最終的にＤＬＢＣＬ細胞における細胞毒性を誘導したことが判明した。
【０１４３】
細胞周期のヒストグラムは、細胞周期に対する薬物組合せの効果をさらに実証した（図３ｃ）。この研究では、細胞を示したようにイブルチニブおよび／またはエンザスタウリンで４８時間にわたり処置し、次いで、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。細胞周期は、フローサイトメトリーを使用して評価した。Ｇ１期のＨＢＬ−１細胞は、対照群の２８．５±０．０５％から組合せ処置群の４６．４±０．８４％および４７．２±３．１２％に増加し、これはＳ期の細胞の減少と相関した。同様の結果をＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＯＣＬ−ＬＹ７細胞に対しても得た（図３ｃ）。グラフは３回の反復からの平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示す。統計的に有意な結果は、対照群と比較した場合にはバー上の＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、または＊＊＊（ｐ＜０．００１）によって示し、エンザスタウリン単独群と比較した場合にはバー上の＃（ｐ＜０．０５）または＃＃（ｐ＜０．０１）で示した。
【０１４４】
さらに、Ｇ１／Ｓ遷移、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６およびサイクリンＤ１に関連するマーカータンパク質の発現または存在のレベルを、図３ｄに示されているように、これらの細胞において評価した。エンザスタウリンおよび／またはイブルチニブによる４８時間の処置後にタンパク質を抽出し、標的タンパク質をウエスタンブロットによって解析した。組合せ処置によってマーカータンパク質のレベルは急速に低下したが、いずれか単一の薬物による処置では、Ｇ１／Ｓ遷移に関連するタンパク質の発現または存在に対してわずかな効果しか有さなかった。同様の傾向は、他の３つの細胞株においても見ることができた（図３ｄ）。これらのデータは、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによってＧ１期停止が誘導され、同時処置療法によって、部分的に細胞周期停止に、および部分的にアポトーシス経路に起因する細胞増殖が抑制されたことを示唆する。
低用量のエンザスタウリンとイブルチニブとによる処置は、ＤＬＢＣＬにおける遊走および侵入を相乗的に阻害する
【０１４５】
細胞運動性に対する低用量のエンザスタウリンとイブルチニブとによる処置の可能な効果を評価するために、細胞遊走および侵入アッセイをＤＬＢＣＬ細胞を使用して実施した。ＨＢＬ−１細胞を２マイクロモル濃度のエンザスタウリンおよび／または０．０２マイクロモル濃度のイブルチニブで、示した時間（３０〜６０分）前処置し、次いで、Ｃｏｒｎｉｎｇの遊走チャンバーのトランスウェルプレート中に配置させた。侵入試験のために（遊走試験のためではない）、トランスウェルプレートをＭａｔｒｉｇｅｌで予めコーティングした。４８時間後、遊走または侵入の程度（２４時間で測定した）を、下のチャンバー内の細胞を計数することによって評価し、対照のパーセンテージとして表した。侵入能については、ＨＢＬ−１細胞において、エンザスタウリンまたはイブルチニブ単独による処置によって、侵入能はそれぞれ対照の９７．０％および８５．０％にわずかに低下した。侵入能は、対照細胞と比較して、エンザスタウリンとイブルチニブとによって処置された組合せ群において著しく抑制された（３２．８％）（図４ａ）。遊走試験では、単剤は、遊走能をそれぞれＨＢＬ−１細胞における対照の７９．０％および７０．２％に低下させた。対照的に、膜を通過した、エンザスタウリンとイブルチニブの両方で処置した細胞の数は、対照レベルのおよそ２５．５％まで低下した（図４ｂ）。侵入および遊走のヒストグラムにおいて示されているように（図４ｂ、図４ｄ）、同様の傾向は、実験をＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＯＣＬ−ＬＹ７細胞株において繰り返した場合に見られた。図４ｂおよび４ｄのヒストグラムでは、統計的有意性を、対照と比較した場合にはバーの上の＊（ｐ＜０．０５）または＊＊（ｐ＜０．０１）または＊＊＊（ｐ＜０．００１）によって示し、エンザスタウリン単独群と比較した場合にはバーの上の＃（ｐ＜０．０５）または＃＃（ｐ＜０．０１）によって示した。これらの知見は、エンザスタウリンとイブルチニブとの同時投与が相乗的に作用し、ＤＬＢＣＬ細胞運動性において必須の役割を果たし、疾患進行と相関することが予測される細胞の遊走および侵入を低下させ得ることを示す。
【０１４６】
エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せは下流のシグナル伝達経路を相乗的に阻害する
ＤＬＢＣＬモデルにおけるエンザスタウリンとイブルチニブとの組合せの増殖作用の根底にある機序への洞察を得るために、それぞれ単独および組合せによってもたらされるシグナル伝達経路の変化を調査した。ＨＢＬ−１、ＴＭＤ−８、およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞を、図５にまとめたように、低用量のエンザスタウリン単剤療法で６０分間および１２０分間処置し、ウエスタンブロットによる解析のためにタンパク質を細胞から回収した。エンザスタウリン単独では、エンザスタウリン活性に関するバイオマーカーとして作用するグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）のリン酸化が明らかに低減した。短期間かつ低用量のエンザスタウリン処置は、ｐ−ＢＴＫ、ｐ−ＥＲＫおよびｐ−ＡＫＴの発現を増加させても、ＰＫＣβのリン酸化に有意な影響を与えない（データは示さず）。同様に、イブルチニブ単独での処置は、ｍＴＯＲ、ＰＬＣγ２、ＥＲＫおよびＰ３８のリン酸化に対する軽微な効果と共に、ＢＴＫおよびＡＫＴのリン酸化を低減させた。しかし、エンザスタウリンとイブルチニブの両方による処置は、それぞれ単独での単剤療法と比較して、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ、ＰＬＣγ２、Ｐ３８のリン酸化のさらなる低減をもたらした（図５）。これらの結果は、ＴＭＤ８およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞においても確認された。全体的に、単一処置と対照的に、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せは、ＡＢＣとＧＣＢの両方の細胞モデルにおけるシグナル伝達の阻害により効果的であると考えられ、このことは、同時曝露によって、ＢＣＲの下流の複数のシグナルのさらなる抑制の促進がもたらされることを意味する。
【０１４７】
ＤＬＢＣＬにおける全トランスクリプトーム変化は低用量のエンザスタウリンとイブルチニブとによって誘導される
ＤＬＢＣＬ細胞における低用量のエンザスタウリンとイブルチニブとによる同時処置の役割をより理解するために、本発明者らは、ビヒクル細胞と比較して、エンザスタウリンおよび／またはイブルチニブによる処置を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑによる全トランスクリプトーム変化をアッセイした。この実験では、ＨＢＬ−１細胞を、２マイクロモル濃度のエンザスタウリン、または０．０２マイクロモル濃度のイブルチニブ、またはその両方に一緒に２４時間曝露させた。シーケンシングのためにＲＮＡを採取した。様々な処置によって上方調節または下方調節された数百個の転写物を特定した。上方調節された遺伝子はこれらの阻害剤に密接に関連しなかったため、下方調節された遺伝子のみをさらに研究した。図６ａのベン図は、異なる処置によって生じたこれらの下方調節された遺伝子変化の上位を示す（＜２倍、ｐ＜０．０５）。エンザスタウリンおよびイブルチニブは、組合せ処置よりもあまり効率的ではなく、組合せ処置の６０５個と比較して、それぞれ３３９個および３３６個の転写物が有意に下降した。エンザスタウリンによって下方調節された転写物のおよそ９１％（３６５個の遺伝子）およびイブルチニブによって下方調節された転写物の７３％（２４６個の遺伝子）が組合せ処置群に含有されていた。さらに、１６３個の転写物も組合せ処置によって効率的に低下し、これはそれぞれ単独での単剤療法においては示されなかった（図６ａ）。
【０１４８】
さらなる分析によって、上位の経路（ＫＥＧＧによる）から著しく下方調節された遺伝子が特定された。ビヒクル処置対照と比較して、処置によって上位の経路（ＫＥＧＧによる）から著しく下方調節された遺伝子が、ヒートマップに表される（図６ｂ）。カラーのスケールバーは、ＦＰＫＭ値で表したより高い発現レベル（赤色）からより低い発現レベル（青色）を表し、差は、Ｚスコア変換後のカラースケールで示される。下方調節された遺伝子をｌｏｇ２倍率変化＜０によって決定した。ＦＫＰＭは、マッピングされた１００万フラグメント当たりのエクソンのキロベース当たりのフラグメントである。低用量のエンザスタウリンとイブルチニブとによる同時処置によって、ＢＣＲ、ＮＦ−κＢ、ＪＡＫおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連する遺伝子が効果的に下方調節され、経路解析の結果は、イムノブロッティング解析と一致した（図３および５）。まとめると、これらの結果は、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せが相乗的に作用し、全トランスクリプトーム変化を調節することを示した。
【０１４９】
エンザスタウリンとイブルチニブとの相乗的抗腫瘍効果をさらに評価するために、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、組合せ処置において変化した転写物のｍＲＮＡ発現を検出した。特に、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＮＯＴＣＨ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用して検出した。ｓｈＲＮＡによるＮＯＴＣＨ１ノックダウンをＨＢＬ−１、ＴＭＤ９、ＯＣＩ−ＬＹ７、およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞においてウエスタンブロットによって検証した。ベータ−アクチンをローディング対照として使用する。ＮＯＴＣＨ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに確認した。図６ｃ、図６ｄを参照されたい。
【０１５０】
エンザスタウリンおよびイブルチニブの単剤療法と比較して、組合せ処置は、ＮＯＴＣＨ１のｍＲＮＡ発現をより有意に低減することができた（図６ｅ）。膨大なエビデンスによって、細胞の代謝、成長および増殖を促進すること、ならびにシグナル伝達経路の活性を増強することにおけるＮＯＴＣＨ１の重要な発がん性の役割が明らかである［２７〜３０］。ＤＬＢＣＬ細胞におけるＮＯＴＣＨ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、中から高レベルであった（図６ｃ）。異常なＮＯＴＣＨ１活性は、血液悪性疾患の重要な発がん調節因子として出現している［３０、３１］。ＤＬＢＣＬ細胞の増殖を阻害する際のエンザスタウリンとイブルチニブとの組合せ効果は、ＮＯＴＣＨ１発現の抑制によって達成される可能性が高い。
【０１５１】
ＤＬＢＣＬ細胞の生存および増殖におけるＮＯＴＣＨ１の役割を検証するために、ｓｈＲＮＡトランスフェクションを使用してＮＯＴＣＨ１をノックダウンさせた（図６ｄ）。ＤＬＢＣＬ細胞をＮＯＴＣＨ１を標的とするｓｈＲＮＡでトランスフェクトし、エンザスタウリンとイブルチニブとで４８時間および７２時間にわたり処置した。次いで、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネッセント細胞生存率アッセイを使用して決定した。図６ｅに示されている結果は、３回の独立した反復からの平均および標準偏差を表し、統計的有意性は、対照と比較した場合には、バーの上の＊（ｐ＜０．０５）または＊＊（ｐ＜０．０１）または＊＊＊（ｐ＜０．００１）で示し、エンザスタウリン単独群と比較した場合にはバーの上の＃（ｐ＜０．０５）または＃＃（ｐ＜０．０１）で示した。
【０１５２】
ＤＬＢＣＬ細胞におけるＮＯＴＣＨ１のサイレンシングによって腫瘍細胞に対する抗増殖活性がもたらされ、ＮＯＴＣＨ１発現がＤＬＢＣＬ細胞の生存にとって重要であることを示した。驚くべきことに、類似する増殖阻害効果が検出され、ＮＯＴＣＨ１  ｓｈＲＮＡおよび同時処置療法の時間と一致し、組合せ処置によってもＮＯＴＣＨ１発現の下方調節によって相乗的抗ＤＬＢＣＬ効果がもたらされ得ることを示した（図６ｆ）。
【０１５３】
ＤＬＢＣＬ細胞由来の異種移植片におけるエンザスタウリンとイブルチニブとの相乗的抗腫瘍効果
最後に、本発明者らは、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ  ＨＢＬ−１細胞がＮＰＧマウスに移植された、リンパ腫異種移植片モデルにおける腫瘍成長を低減する、エンザスタウリン単独およびイブルチニブとの組合せの能力を評価した（図７）。ＮＰＧマウスにＨＢＬ−１細胞（２．５×１０６個の細胞）を皮下注射し、４つの群（１群当たりｎ＝５）に無作為化した。それぞれ、エンザスタウリン、イブルチニブ、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せ、およびビヒクルで群を処置した。エンザスタウリンは、５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、ＢＩＤにて経口投与した。イブルチニブは、１２ｍｇ／ｋｇの投薬量で、ＱＤにて経口投与した（１日の投与の合計は、１日当たり１００ｍｇ／ｋｇのエンザスタウリンと１日当たり１２ｍｇ／ｋｇのイブルチニブであった）。腫瘍サイズおよび重量は平均±標準偏差として記載し、統計的有意性は、対照と比較した場合には＊（ｐ＜０．０５）または＊＊（ｐ＜０．０１）または＊＊＊（ｐ＜０．００１）で示し、エンザスタウリン単独の群と比較した場合には＃（ｐ＜０．０５）または＃＃（ｐ＜０．０１）で示される。
【０１５４】
上記投薬量におけるエンザスタウリンまたはイブルチニブの単剤療法としての投与は、腫瘍体積の低減において弱い活性しか生じさせず、いずれの治療剤も単独では腫瘍成長の統計的に有意な低減をもたらさなかった。対照および単剤療法と比較して、腫瘍体積は、接種後１８日目に処置を開始した２〜３週間後に、組合せ処置により処置したマウスにおいてより有意に少なかった（ｐ＜０．０１、図７ａ）。すべての処置は忍容性が非常に良好であり、いずれの処置群でも有意な体重変化を有さなかった（図７ｂ）。
【０１５５】
実験の終わり（３９日目）に、エンザスタウリン単独（１１５１．６２±１６３．７９ｍｇ）でもイブルチニブ単独（１１４１．８０±２３５．５７ｍｇ）でも、ビヒクル群（１３２１．５０±１６８．８４ｍｇ）のものと比較して腫瘍成長の有意な阻害を生じなかったが、組合せは、腫瘍成長を強く抑制し、腫瘍重量を抑えた（８７１．８０±１１１．４４ｍｇ、図７ｃ、７ｄ）。まとめると、これらの結果は、前臨床モデルにおいてエンザスタウリンをイブルチニブと組み合わせて使用する相乗的活性を実証し、上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの知見を確認するものである。よって、エンザスタウリンとイブルチニブとの組合せによって、ＡＢＣ（ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８、ＳＵ−ＤＨＬ−２）およびＧＣＢ（ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＯＣＩ−ＬＹ７）ＤＬＢＣＬ細胞株の生存および増殖に対する長期にわたる相乗効果が得られた。
【０１５６】
患者選択のためのバイオマーカー
ＤｅｎｏｖｏによってエンザスタウリンのＤＬＢＣＬ臨床データの解析が行われ、生存の改善を示した患者のサブセットを特定した。その独自のバイオマーカー発見プラットフォームを使用して、会社は新規バイオマーカーを特定し、それをＤｅｎｏｖｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍａｒｋｅｒ  １（ＤＧＭ１）と命名した。ＤＧＭ１およびエンザスタウリンによる処置のために被験体を選択するためのバイオマーカーとしてのその使用は、公開された特許出願第ＷＯ２０１８／０４５２４０号に開示および記載されている。データは、ＤＧＭ１陽性患者が、エンザスタウリンのＤＬＢＣＬ試験において、ＤＧＭ１陰性患者に対して有意に改善された生存を示したことを示した。エンザスタウリンは現在、ＤＧＭ１の発現または存在を使用して処置に応答する可能性が高いＤＬＢＣＬ患者を選択する第ＩＩＩ相臨床試験中である。
【０１５７】
ＥＮＧＩＮＥ試験（ＮＣＴ０３２６３０２６）は、ＤＧＭ１バイオマーカーを有するまたは有さない、第一選択のＤＬＢＣＬ患者において、Ｒ−ＣＨＯＰ単独に対して、Ｒ−ＣＨＯＰレジメン（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンからなる）と組み合わせたエンザスタウリンを評価している。この試験の主な評価項目は、バイオマーカーを有する患者における全生存期間であり、これは、２０２０年１０月の主要な完了日を有する。
【０１５８】
（実施例２）
材料および方法
細胞株および細胞培養
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の細胞株である、ＳＵ−ＤＨＬ−５およびＳＵ−ＤＨＬ−６をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を追加補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で細胞を成長させた。加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にてすべての細胞株を維持した。
【０１５９】
薬物および試薬
エンザスタウリン（ＬＹ３１７６１５）、アカラブルチニブ（ＡＣＰ−１９６）、スペブルチニブ（ＣＣ−２９２、ＡＶＬ−２９２）、およびＡＲＱ５３１をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入し、ザヌブルチニブ（ＢＧＢ−３１１１）をＭｅｄＫｏｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）から購入し、ベカブルチニブ（ＳＮＳ−０６２）をＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。すべての化合物を最初に１０ｍＭの濃度で１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中に溶解させ、アリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０１６０】
細胞増殖アッセイ
細胞をウェル当たり２．５×１０４個の密度で９６ウェル細胞培養プレート中に三連で播種し、異なる濃度のエンザスタウリンもしくはブルトンチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＴＫｉ）単独、または組合せで７２時間にわたり処置した。処置後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して細胞生存率を評価した。ＢｉｏＴｅｋ  Ｅｌｘ８００マイクロプレートリーダーによって、細胞の細胞毒性を４９０ｎｍの吸光度で測定した。各薬物のＩＣ５０値を薬物濃度０．０１４μＭから１０μＭの曲線から計算した。
【０１６１】
統計解析
すべての実験は、独立して少なくとも２回行った。すべての値は、平均±ＳＥＭとして表した。Ｐ値についてのスチューデントのｔ検定を使用して、データを解析した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。複合阻害効果は、未処置対照細胞と比較して計算した。薬物組合せに対する組合せ指数（ＣＩ）をＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（バージョン２、Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法に従って決定した。ＣＩ値＜１、＝１、および＞１は、それぞれ、相乗効果、相加効果、および拮抗効果を示す。
【０１６２】
結果
薬物組合せは、多くの疾患、例えばがんの処置において広く使用される。ＤＬＢＣＬ細胞増殖に対するエンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤との組合せ効果を決定するために、各薬物の用量応答曲線を０．０１４μＭ〜１０μＭでの薬物の処置によって決定した。有効性および５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算し、組合せ用量選択のために使用した。エンザスタウリンの処置によって、ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞株において３．６μＭ、およびＳＵ−ＤＨＬ−６細胞株において５．９μＭのＩＣ５０での細胞増殖の用量依存的阻害がもたらされた（データは示さず）。組合せ研究では、１μＭ、３μＭ、および５μＭのエンザスタウリンを、異なる濃度のＢＴＫ阻害剤、ザヌブルチニブ、アカラブルチニブ、およびＡＲＱ５３１との処置組合せのために選択した。図８に示されているように、０．１２５μＭのザヌブルチニブと組み合わせた３種の異なる用量のエンザスタウリンの処置は、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞の有意な抗増殖性活性を示したが、アカラブルチニブおよびＡＲＱ５３１と組み合わせた３つの同様の用量のエンザスタウリンは、０．０６μＭというより低濃度で同様の効果を達成した。
【０１６３】
エンザスタウリンの相乗効果定量化研究では、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙによって開発された一定比率の濃度方法を組合せ実験設計のために使用した。データ解析および組合せ指数（ＣＩ）の計算のためにＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを実施した。得られたＣＩによって、薬物組合せにおける相加効果（ＣＩ＝１）、相乗効果（ＣＩ＜１）、および拮抗効果（ＣＩ＞１）に関する定量的定義がもたらされる。エンザスタウリンとＢＴＫ阻害剤であるベカブルチニブをこのアッセイにおいて調査した。エンザスタウリンは、単独では５μＭの濃度で、または一定比率（ＩＣ５０比率）の４μＭのベカブルチニブと組み合わせて開始し、両薬物を、同じＩＣ５０比率の後に、１：１希釈でそれぞれ最終的に０．０８μＭおよび０．０６μＭまで希釈した。図９に示されているように、エンザスタウリンとベカブルチニブとの組合せによって、両細胞株における７２時間の処置後に、単一薬物よりも相乗的な細胞生存率の低下がもたらされた。ＳＵ−ＤＨＬ−５細胞では、組合せ処置によって、エンザスタウリン０．０８〜５μＭから選択されたすべての用量に対してＣＩ＜１（０．１３５〜０．７８のＣＩ）で細胞増殖に対する強力な相乗的阻害効果が示され、ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞ではエンザスタウリン０．０８〜０．６μＭで同様であった（０．１４３〜０．８５２のＣＩ）。
【０１６４】
上記に示した詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を補助するために提供される。しかし、本明細書に記載され、特許請求された発明は、本明細書に開示された特定の実施形態によって範囲を制限されるべきではなく、例および実施形態は、本発明のいくつかの態様の例示として意図される。いかなる均等な実施形態も本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、本明細書において示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱せずに、前記記載から当業者に明らかとなるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることも意図される。
【０１６５】
本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の参照文献は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願または他の参照文献が具体的かつ個別に、参照によりあらゆる目的でその全体として組み込まれることを示されたのと同程度に、参照によりあらゆる目的でその全体として本明細書に組み込まれる。本明細書における参照文献の引用は、このような文献が本発明の先行技術であることの自認として解釈されるべきではない。
【０１６６】
特定の引用された参照文献を以下に列挙する。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2022500408.tif 000034
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