(57)【要約】テンプレートスパイクの組み合わせを含む、内部標準スパイクイン混合物を生成および使用するための組成物、システム、および方法。本明細書に記載の組成物、システム、および方法は、内部標準スパイクイン混合物を使用してワークフローパイプラインのセットを評価し、目的の標的核酸配列のバリエーションを含む試料に対して示差的存在量分析を実行することを目的とする。本明細書に記載の組成物、システム、および方法は、内部スパイクイン混合物を使用して、目的の標的核酸配列のバリエーションを含む試料で実行された示差的存在量分析から得られた結果を検証することを目的とし、バリエーションは、相対的な存在量の、非常に変動するレベルのものであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ本のチューブのセットを含む組成物であって、
各チューブがスパイク混合物を含み、前記スパイク混合物がｍ個のポリヌクレオチド配列を含み、
すべてのｎ本のチューブが、同じｍ個のポリヌクレオチド配列のセットを含み、
前記ｍ個のポリヌクレオチド配列のそれぞれが、前記ｎ本のチューブのそれぞれに、あるコピー数のセットからのコピー数で存在し、
前記コピー数のセットが、高、低、または超低から選択されるレベルを含み、前記高レベルが１０００コピーを超え、前記低レベルが５０〜１０００コピーであり、前記超低レベルが５０コピー未満である、
前記組成物。
【請求項２】
それぞれがスパイク混合物を含む３本のチューブのセットを含む組成物であって、
前記スパイク混合物が６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列を含み、
３本のチューブすべてが、６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列の同じセットを含み、
前記６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列のそれぞれが、前記３本のスパイク混合物チューブのそれぞれに、高、低、または超低のコピー数で存在し、高が１０００コピーを超え、低が５０〜１０００コピーであり、超低が５０コピー未満であり、
前記６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列のそれぞれが、５’から３’方向に、ＰＣＲ増幅反応中にマーカ遺伝子の第１の末端にアニーリングするヌクレオチド配列、前記ＰＣＲ増幅反応中に前記マーカ遺伝子にアニーリングしないネガティブコントロールヌクレオチド配列、および前記ＰＣＲ増幅反応中に前記マーカ遺伝子の第２の末端にアニーリングするヌクレオチド配列を含む、
前記組成物。
【請求項３】
前記ネガティブコントロールヌクレオチド配列のそれぞれが、他の６８個のマーカ遺伝子配列とは異なる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）前記３つのチューブ内の前記６９個のポリヌクレオチド配列のそれぞれの前記コピー数が、３つのチューブすべてにおいて同じである、
（ｂ）前記コピー数が、３つのチューブすべてにおいて異なる、または
（ｃ）前記コピー数が、３本のチューブのうち２本において同じである、
請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
試料からのＰＣＲ増幅のために５’および３’末端にアニーリングするようにユニバーサルプライマーセットを設計することができるように、前記マーカ遺伝子が、調査される生物間で保存されている任意の遺伝子である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記マーカ遺伝子が、原核生物、真核生物、またはウイルスの遺伝子である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記マーカ遺伝子が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８および／またはＶ９領域、１８Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
試料中の微生物の数を決定するための方法であって、以下：
前記試料からゲノムＤＮＡを分離する工程と；
マーカ遺伝子配列を増幅するためにＰＣＲ反応を実行する工程であって、
前記マーカ遺伝子配列が前記微生物中に存在し、
前記試料が複数の反応容器に分割されかつ前記複数の反応容器のそれぞれが前記３つのスパイク混合物チューブのうちの１つを含むように、前記ＰＣＲ反応が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物の存在下で実行される、工程と
を含む、前記方法。
【請求項９】
プロセッサにより実施される、微生物叢の示差的存在量分析のための信頼性推定値を決定および提供する方法であって、以下：
前記微生物叢に関連するデータを含む配列データを受信する工程であって、
前記配列データが、既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物のセットに関連するデータをさらに含む、工程と；
前記配列データから配列類似度を算出する工程と；
配列類似度に基づいて前記配列データを１つまたは複数のユニットに編成する工程と；
前記１つまたは複数のユニットの計算された示差的存在量推定値のセットを取得するために統計分析を実行する工程であって、
前記計算された示差的存在量推定値が、前記微生物叢に関連する計算された推定値と、既知のテンプレートスパイク配列を含む前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された推定値とを含む、工程と；
既知のテンプレートスパイク配列を含む前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する予想される示差的存在量推定値を算出する工程と；
前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する前記予想される示差的存在量推定値を、前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する前記計算された示差的存在量推定値と比較する工程と；
前記比較に基づいて、既知のテンプレートスパイク配列を含む前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された推定値に関連する信頼度を算出する工程と；
前記微生物叢の前記示差的存在量分析の信頼性推定値として前記信頼度を提供する工程と
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に含まれる各テンプレートスパイクの相対的存在量の測定値に基づいて、既知のテンプレートスパイク配列を含む前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する前記予想される示差的存在量推定値と前記計算された示差的存在量推定値とを分類する工程
をさらに含み、
前記比較する工程が、各カテゴリにおける前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する前記予想される示差的存在量推定値を、同じカテゴリにおける前記ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する前記計算された示差的存在量推定値と比較すること、をさらに含み、
前記信頼度を算出する工程が、示差的存在量推定値の各カテゴリに関連付けられた一意の信頼度を算出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物のセットが、すべてのポリヌクレオチドスパイク混合物が同じテンプレートスパイク配列のセットを含むように構成され、
各ポリヌクレオチドスパイク混合物が、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物におけるテンプレートスパイク配列のその第１のサブセットの前記コピー数と同じコピー数を有する前記テンプレートスパイク配列のセットの第１のサブセットを含み、
各ポリヌクレオチドスパイク混合物が、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物の少なくとも１つにおけるテンプレートスパイク配列のその第２のサブセットのコピー数とは異なるコピー数を有する前記テンプレートスパイク配列のセットの第２のサブセットを含み、前記コピー数の差が約１桁であり、
各ポリヌクレオチドスパイク混合物が、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物の少なくとも１つにおけるテンプレートスパイク配列のその第３のサブセットの前記コピー数とは異なるコピー数を有する前記テンプレートスパイク配列のセットの第３のサブセットを含み、前記コピー数の差が１桁を超える
ように、前記ポリヌクレオチドスパイク混合物がさらに構成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列データを１つまたは複数のユニットに編成する工程が、
前記配列データを操作上の分類学的ユニットにクラスタ化すること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列データを１つまたは複数のユニットに編成する工程が、
配列の参照データベースに対して前記配列データをマッピングすること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列データを１つまたは複数のユニットに編成する工程が、
前記ユニットがアンプリコン配列変異体のセットに基づいて画定されるように、エラー訂正の１つまたは複数の方法を実施すること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記統計分析を実行する工程が、
前記編成された配列データを使用する、仮説検定すること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
プロセッサにより実施される、ワークフローパイプラインを評価する方法であって、以下：
パフォーマンスの測定値または測定基準を生成するために、ポリヌクレオチドスパイク混合物を使用する工程と；
最終パイプラインランキング測定基準を計算する工程と；
最終パイプラインランキング測定基準の前記計算に基づいて、調査プロトコルの研究で使用するワークフローパイプラインを選択する工程と
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記最終パイプラインランキング測定基準が、
（正規化シータ／２）＋（正規化シグマ／２）＋検出率＋感度＋特異度＋正確さ＋精度＋Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ＊１．５−（偽陽性１６Ｓ率＋偽陰性率）
として計算される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記最終ランキング測定基準を使用して、精度および検出に敏感な研究で使用されるワークフローパイプラインを選択することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的試料の分析結果の妥当性を判定する方法であって、以下：
前記生物学的試料をスパイク混合物と混合する工程と；
前記生物学的試料および前記スパイク混合物中の１つまたは複数の標的配列を増幅する工程であって、それによって増幅産物を得る、工程と；
前記増幅産物を配列決定および処理する工程と；
前記スパイク混合物内の１つまたは複数の標的配列の統計的尺度を決定する工程であって、それによって前記生物学的試料の前記分析結果の前記妥当性を推測する、工程と
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記生物学的試料が、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、または便試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が便試料である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１９年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／７３５，３７４号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
いくつかの生物（例えば、人間、動物、植物）は微生物と共生関係にある。例えば、人体には１００兆を超える微生物が含まれている可能性がある。土壌試料などの環境生態系にも、生態系のかなりの部分を形成する微生物群集の豊富なレパートリーが含まれている。微生物叢は、環境ニッチに存在する微生物の集合的なゲノムを表す。
【０００３】
一例として、ヒトゲノムには約２５，０００のヒト遺伝子が含まれている可能性があるが、人体には１，０００万を超える細菌遺伝子も含まれており、血流中の分子の推定３０％は腸内細菌に由来する。人体と細菌との共生関係は、いくつか例を挙げると、免疫調節、エネルギー生合成、神経学的シグナル伝達、感染制御、ビタミン、アミノ酸、食事成分の合成など、人体への深刻な生物学的影響を通じて、人体の健康および好調さに影響を与える微生物集団の固有の能力に関連している。同様に、土壌試料などの環境源における様々な微生物群集の組成または相対的な存在量は、直接の環境および源に依存するより大きな生態系に影響を与える。したがって、環境試料とヒト試料の両方における微生物群集の相対的な存在量の分析は、非常に有益であり、関心のある分野である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、微生物叢の核酸配列を処理し、検査された試料中の様々な微生物株の示差的存在量を分析することを目的としている方法の検証を提供するための組成物および方法に関する。本開示はまた、微生物叢配列処理および示差的存在量分析の検証のために構成された複数の特注スパイクイン混合物の生成に関する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、ｎ本のチューブのセット（「ｎ」はチューブの数）を含む組成物であって、各チューブはスパイク混合物を含み、スパイク混合物はｍ個のポリヌクレオチド配列を含み（「ｍ」はポリヌクレオチド配列の数）、すべてのｎ本のチューブは、同じｍ個のポリヌクレオチド配列のセットを含み、ｍ個のポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ｎ本のチューブのそれぞれに、あるコピー数のセットからのコピー数で存在し、コピー数のセットは、高、低、または超低から選択されるレベルを含み、高レベルは反応単位あたり１０００コピーを超え、低レベルは反応単位あたり５０〜１０００コピーであり、超低は反応単位あたり５０コピー未満である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、それぞれがスパイク混合物を含む３本のチューブのセットを含む組成物であって、スパイク混合物は、６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列を含み、３本のチューブすべてが６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列の同じセットを含み、６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列のそれぞれが、３つのスパイク混合物チューブのそれぞれに高、低、または超低のコピー数で存在し、高は反応単位あたり１０００コピーを超え、低は反応単位あたり５０〜１０００コピーであり、超低は反応ユニットあたり５０コピー未満であり、６９個のテンプレートポリヌクレオチド配列のそれぞれは、５’から３’方向に、ＰＣＲ増幅反応中にマーカ遺伝子の第１の末端にアニーリングするヌクレオチド配列（例えば、順方向プライマー配列）、ＰＣＲ増幅反応中にマーカ遺伝子にアニーリングしないネガティブコントロールヌクレオチド配列、およびＰＣＲ増幅反応中にマーカ遺伝子の第２の末端にアニーリングするヌクレオチド配列（例えば、逆方向プライマー配列）を含む。いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールヌクレオチド配列のそれぞれが、他の６８個のマーカ遺伝子配列とは異なる。いくつかの実施形態では、（ａ）３つのチューブ内の６９個のポリヌクレオチド配列のそれぞれのコピー数が、３つのチューブすべてにおいて同じ（高／高／高、低／低／低、超低／超低／超低）である、（ｂ）コピー数が３つのチューブすべてにおいて異なる（高／低／超低、高／超低／低、低／高／超低、低／超低／高、超低／低／高、または超低／高／低）、または（ｃ）コピー数が３本のチューブのうち２本で同じ（高／高／低、高／高／超低など）である。いくつかの実施形態において、試料からのＰＣＲ増幅のために５’および３’末端にアニーリングするようにユニバーサルプライマーセットを設計することができるように、マーカ遺伝子は、調査される生物間で保存されている任意の遺伝子である。いくつかの実施形態において、マーカ遺伝子は、原核生物、真核生物、またはウイルスの遺伝子である。いくつかの実施形態において、マーカ遺伝子は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８および／またはＶ９領域、１８Ｓ  ｒＲＮＡからなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、試料中の微生物の数を決定するための方法であり、この方法は、試料からゲノムＤＮＡを分離することと；ＰＣＲ反応を実行してマーカ遺伝子配列を増幅することであって、マーカ遺伝子配列は微生物中に存在し、ＰＣＲ反応は、試料が複数の反応容器に分割され、複数の反応容器のそれぞれが３つのスパイク混合物の１つを含むように、上記の組成物のいずれか１つの組成物の存在下で行われる、増幅することと、を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、プロセッサにより実施される、微生物叢の示差的存在量分析のための信頼性推定値を決定および提供する方法であって、方法は、微生物叢に関連するデータを含む配列データを受信することであって、配列データは既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物のセットに関連するデータをさらに含む、受信することと；配列データから配列類似度を算出することと；配列類似度に基づいて配列データを１つまたは複数のユニットに編成することと；統計分析を実行して、１つまたは複数のユニットの計算された示差的存在量推定値のセットを取得することであって、計算された示差的存在量推定値は、微生物叢に関連する計算された推定値と、既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された推定値と、を含む、実行および取得することと；既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する予想される示差的存在量推定値を算出することと；ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する予想される示差的存在量推定値を、ポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された示差的存在量推定値と比較することと；比較に基づいて、既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された推定値に関連する信頼度を算出することと；微生物叢の示差的存在量分析の信頼性推定値として信頼度を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ポリヌクレオチドスパイク混合物に含まれる各テンプレートスパイクの相対的存在量の測定に基づいて、既知のテンプレートスパイク配列を含むポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する予想される示差的存在量推定値と計算された示差的存在量推定値とを分類すること、をさらに含み、比較することは、各カテゴリにおけるポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する予想される示差的存在量推定値を、同じカテゴリにおけるポリヌクレオチドスパイク混合物に関連する計算された示差的存在量推定値と比較すること、をさらに含み、信頼度を算出することは、示差的存在量推定値の各カテゴリに関連付けられた一意の信頼度の算出を含む。いくつかの実施形態では、既知のテンプレートスパイク配列を有するポリヌクレオチドスパイク混合物のセットは、すべてのポリヌクレオチドスパイク混合物が同じテンプレートスパイク配列のセットを含むように構成され、ポリヌクレオチドスパイク混合物は、各ポリヌクレオチドスパイク混合物が、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物におけるテンプレートスパイク配列のその第１のサブセットのコピー数と同じコピー数を有するテンプレートスパイク配列のセットの第１のサブセットを含み、各ポリヌクレオチドスパイク混合物は、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物の少なくとも１つにおけるテンプレートスパイク配列のその第２のサブセットのコピー数とは異なるコピー数を有するテンプレートスパイク配列のセットの第２のサブセットを含み、コピー数の差が約１桁であり、各ポリヌクレオチドスパイク混合物は、残りのポリヌクレオチドスパイク混合物の少なくとも１つにおけるテンプレートスパイク配列のその第３のサブセットのコピー数とは異なるコピー数を有するテンプレートスパイク配列のセットの第３のサブセットを含み、コピー数の差は１桁を超える、ように構成されている。いくつかの実施形態では、配列データを１つまたは複数のユニットに編成することは、配列データを操作上の分類学的ユニットにクラスタ化することを含む。いくつかの実施形態では、配列データを１つまたは複数のユニットに編成することは、配列の参照データベースに対して配列データをマッピングすることを含む。いくつかの実施形態では、配列データを１つまたは複数のユニットに編成することは、ユニットがアンプリコン配列変異体のセットに基づいて画定されるように、エラー訂正の１つまたは複数の方法を実施することを含む。いくつかの実施形態では、統計分析を実行することは、編成された配列データを使用する仮説検定を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、プロセッサにより実施される、ワークフローパイプラインを評価する方法であって、最終パイプラインランキング測定基準を計算することと、最終パイプラインランキング測定基準の計算に基づいて、調査プロトコルの調査で使用するワークフローパイプラインを選択することと、を含む。いくつかの実施形態では、最終パイプラインランキング測定基準は、
（正規化シータ／２）＋（正規化シグマ／２）＋検出率＋感度＋特異度＋正確さ＋精度＋Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ＊１．５−（偽陽性１６Ｓ率＋偽陰性率）
として計算される。いくつかの実施形態では、最終ランキング測定基準を使用して、精度および検出に敏感な研究で使用されるワークフローパイプラインを選択することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、生物学的試料の分析結果の妥当性を判定する方法であって、この方法は、生物学的試料をスパイク混合物と混合することと；生物学的試料およびスパイク混合物中の１つまたは複数の標的配列を増幅し、それによって増幅産物を得ることと；増幅産物を配列決定および処理することと；スパイク混合物内の１つまたは複数の標的配列の統計的尺度を決定し、それによって生物学的試料の分析結果の妥当性を推測することと、を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、または便試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は便試料である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、環境試料の分析結果の妥当性を判定する方法であって、この方法は、環境試料をスパイク混合物と混合することと；環境試料およびスパイク混合物中の１つまたは複数の標的配列を増幅し、それによって増幅産物を得ることと；増幅産物を配列決定および処理することと；スパイク混合物内の１つまたは複数の標的配列の統計的尺度を決定し、それによって環境試料の分析結果の妥当性を推測することと、を含む。いくつかの実施形態では、環境試料は、土壌試料または水試料である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、スパースデータに関連する問題を説明する、現在利用可能な配列処理方法の結果のプロット例を示している。
【図２】図２は、一実施形態による、示差的存在量分析システム（ＤＡＡシステム）の概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用する配列処理方法を検証する際のスパイクとして使用することができる例示的なテンプレートポリヌクレオチド配列の概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用する配列処理方法を検証する際のスパイクとして使用することができる例示的なテンプレートポリヌクレオチド配列の概略図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用する配列処理方法を検証する際のスパイクとして使用することができる例示的なテンプレートポリヌクレオチド配列の概略図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、一実施形態によるＤＡＡシステムによる示差的存在量分析の検証に使用される、様々なＧＣ含量および様々な相対的存在量を有するテンプレートポリヌクレオチドスパイクのセットの概略図を示すプロットである。入力コピー（ｘ）＝１、５０ｆｇでのＰＣＲ検出限界。読み取り（ｙ）＝１、１０万回の読み取りでの配列検出限界。
【図４Ａ】図４Ａは、３つのスパイク混合物（Ａ、Ｂ、およびＣ）の概略図であり、各スパイク混合物に含まれる固有のテンプレートスパイク（マーカ）および各スパイク混合物における各テンプレートスパイクの相対的存在量を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示される３つのスパイク混合物における例示的な固有のテンプレートスパイクの様々な相対的存在量を示すプロットのセットである。
【図５Ａ】図５Ａは、一実施形態による、ＤＡＡシステムを使用して示差的存在量分析を実施するためのスパイク混合物を生成するための例示的なワークフローの概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、一実施形態による、ＤＡＡシステムを使用して示差的存在量分析を実施するための配列データを調製するための例示的なワークフローの概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、イルミナ配列決定のためのアンプリコンを生成するためのＰＣＲ順方向および逆方向プライマーの例を示す（例えば、Ｃａｐｏｒａｓｏら、２０１１、ＰＮＡＳ、１０８：４５１６を参照のこと）。
【図６】図６は、一実施形態による、示差的存在量分析から得られた結果を検証するための方法を説明するフローチャートである。
【図７Ａ】図７Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して評価および検証することができる、示差的存在量分析に使用することができるいくつかの例示的なワークフローパイプラインの概略図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して評価および検証することができる、示差的存在量分析に使用することができるいくつかの例示的なワークフローパイプラインの概略図である。
【図８Ａ】図８Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準としてテンプレートスパイクの検出を使用して、示差的存在量分析のためのいくつかのワークフローパイプラインを評価した結果の例である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準としてテンプレートスパイクの検出を使用して、示差的存在量分析のためのいくつかのワークフローパイプラインを評価した結果の例である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、予想される存在量のレベルによって分類されたテンプレートスパイクのクラスをリストした表である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ａからの結果を示し、図８Ｃに示される相対的存在量のレベルによって分類された異なるクラスのテンプレートスパイクにわたるテンプレートスパイクの検出をさらに示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、図８Ｂからの結果を示し、図８Ｃに示される相対的存在量のレベルによって分類された異なるクラスのテンプレートスパイクにわたるテンプレートスパイクの検出のさらなる指標を伴う。
【図９】図９は、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準としてベースコールエラー率を使用して、差分存在量分析のためのワークフローパイプラインを評価した結果の例である。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析に基づいて病状の検出の精度を評価するために生成された真理値表の例である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用した、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用した、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用した、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果の概略図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用した、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果の概略図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として感度を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として感度を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として特異性を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として特異性を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として検出精度を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、評価測定基準として検出精度を使用する、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価からの例示的な結果である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価に使用される逆エラー率のプロットである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価に使用される逆エラー率のプロットである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価に使用される正の予測値のプロットである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価に使用される正の予測値のプロットである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためのワークフローパイプラインの評価に使用される、存在量の相対レベルによって分類された正の予測値のプロットである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、相対的存在量のレベルによって分類されたテンプレートスパイクのクラス、および示差的存在量分析のための様々なパイプラインを使用して計算された対応する陽性予測値を示す表である。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用した示差的存在量分析の期待される結果と観察された結果との間の定量化された差異の概略図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためにパイプラインを評価した結果の概略図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、示差的存在量分析のためにパイプラインを評価した結果の概略図である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の概略図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の概略図である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、ランキングスコアによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果を表す表である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、ランキングスコアによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果を表す表である。
【図２３】図２３Ａ〜Cは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の概略図のセットである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の追加の概略図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の追加の概略図である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の追加の概略図である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の追加の概略図である。
【図２６】図２６は、スパイクの存在量に基づいたスパイクのＰＰＶおよびミス率の推定からの結果の例である。
【図２７】図２７は、スパイク混合物分析からのＰＰＶおよびミス率を適用して、チェックポイント阻害剤療法中の黒色腫対象におけるレスポンダコントラストに対するノンレスポンダで同定された有意な微生物叢シフトに関連する信頼を同定した結果の例である。
【図２８】図２８は、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して評価および検証することができる、示差的存在量分析に使用することができるいくつかの例示的なワークフローパイプラインの概略図である。
【図２９】図２９は、１つのワークフロー（ＤＤＳＳ：Ｑ２＋ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ）の混合物間で予想される差量（予想されるｌｏｇ２倍の変化、Ｅｘｐ＿ｌ２ｆｃ）と比較した、観測された差量シフト（観測されたｌｏｇ２倍の変化、ｏｂｓ＿ｌ２ｆｃ）の分類の概略図である。
【図３０】図３０は、４０のワークフローすべてについての混合物間の予想される差異の存在量と比較した、観察された差異の存在量シフトの分類の概略図である。
【図３１】図３１は、３つのトレーサ混合物（Ａ対Ｂ、Ｂ対Ｃ、Ａ対Ｃ）のいずれかの間で観察された効果サイズ（存在量のｌｏｇ２倍の変化）のバイオリン図の概略図である。
【図３２Ａ】図３２Ａは、すべての示差的存在量検査メソッドと配列処理ワークフローの正の予測値のプロットである。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ＡＳＶ、ＯＴＵ、またはＭＣＭの最大観測相対的存在量によって層化された正の予測値のプロットである。
【図３３】図３３は、一実施形態によるＤＡＡシステムを使用して、複数の評価パラメータによって定量化された、示差的存在量分析のためのパイプラインを評価した結果の追加の概略図である。
【図３４】図３４は、全体的なパイプラインスコアの計算に使用されるすべての測定基準のレーダープロットである。
【図３５】図３５は、残りの４つの示差的存在量法、すなわち、ａ）ＤＥＳｅｑ２．ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓ、ｂ）ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ、ｃ）ｅｄｇｅＲ、およびｄ）ｔ検定、のすべての配列処理パイプラインのすべての測定基準にわたるスコアリングレーダープロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本開示のシステム、方法および装置は、例えば、ＰＣＲ増幅試料から得られたデータなどのハイスループット配列決定データの示差的存在量分析に使用される配列処理方法およびワークフローパイプラインの検証を提供することに関連する。本明細書に開示される方法および装置はまた、試料ソースに関連する異常または逸脱状態（例えば、病状）の試験のために実施される示差的存在量分析に関連する信頼性または誤差推定を予測および提供することに関連する。
【００１４】
ヒト、動物、植物、土壌に関連する微生物叢のマーカ遺伝子ベースの次世代シーケンシング調査により、宿主の健康におけるこれらのコミュニティの役割についての理解が劇的に高まった。人間の健康との関連で重要な焦点は腸内細菌叢であり、多くの研究が食事、抗生物質、遺伝的および環境的要因、免疫機能、および微生物叢の間の相関関係を調査してきた。例えば、最近の研究では、チェックポイント阻害剤療法を受けている黒色腫患者の応答者と非応答者の集団を描写する腸内微生物が特定されている。さらに、腸内細菌叢の腸内毒素症は、炎症性腸疾患、ＮＡＳＨ、その他の代謝障害などの障害に関係している。このような腸内毒素症は、通常、腸内細菌叢の多様性の減少、日和見病原体の存在量の増加、または酪酸産生菌などの機能的に重要な細菌の減少を特徴としている。例えば、腸内細菌叢の組成の分析は、診断および／または治療において重要な役割を果たすことができる。ただし、データの希薄性は、他の検証ソースがない場合の推定値としての統計的検出力および／または信頼性の欠如により、問題のある結論につながる可能性がある。図１は、正常な耐糖能（ＮＧＴ）、耐糖能障害（ＩＧＴ）、およびＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、およびＴ２Ｄの患者と比較した人口などの、様々な健康状態、および正常なソースからの２つの例示的な微生物群集の組成推定を示すまばらなデータからの結果の例示的なセットを示す。さらに、微生物叢の示差的存在量分析の現在の方法は、厳密な横断研究分析の課題を生み出す。スパースまたはノイズの多いデータからの結果を評価し、横断研究データを比較および使用してより厳密な結論に到達するために使用できる検証方法が必要である。
【００１５】
微生物群集組成の分析
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、細菌および古細菌ドメインに遍在しているため、細菌群集組成の分析に広く使用されているマーカ遺伝子として浮上している。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の９つの超可変領域に隣接する保存領域により、１つまたは複数の超可変領域のＰＣＲ増幅が可能になる。各領域には、細菌分類群の分化を可能にするのに十分な配列多様性が含まれているが、分類学的解像度のレベルは、対象となる超可変領域によって異なる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ベースの研究の典型的な目標は、コミュニティ内のメンバの数と分類学的注釈、および試料間のコミュニティ構成の変動を正確に決定することである。しかし、微生物叢の正確な組成と構造を決定することは、膨大な数の細菌分類、コミュニティメンバ、宿主と環境の間の多数の相互作用、およびそのようなマーカ遺伝子調査で生成されるデータの量のために困難である。
【００１６】
微生物群集構成の推論は、バイオインフォマティクスパイプライン、すなわち、母親などの配列処理パイプライン（Ｓｃｈｌｏｓｓ、Ｐ．Ｄ．他（２００９）の選択によって影響を受ける。ｍｏｔｈｕｒの紹介：微生物群集を記述および比較するための、オープンソースでプラットフォームに依存しない、群集支援ソフトウェア。応用および環境微生物学、７５（２３）、７５３７−７５４１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＡＥＭ．０１５４１−０９）およびＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏ、Ｊ．Ｇ．他（２０１０）。ＱＩＩＭＥを使用すると、高スループットのコミュニティ配列データを分析できる。Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７（５）、３３５−３３６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．ｆ．３０３）は、品質に基づいて配列された読み取りの処理を許可し、類似の配列を定義された割合の類似性で操作分類単位（ＯＴＵ）にクラスタ化し、分類学的注釈をＯＴＵクラスタまたは読み取りに割り当てる。ＯＴＵクラスタリングは、配列エラーの伝播に関連するノイズを低減するが、配列エラーに起因する少量のスプリアス配列は、生物学的に意味のあるＯＴＵとして解釈され、コミュニティの豊かさと多様性を膨らませる。
【００１７】
ＯＴＵのクラスタリングに通常使用される９７％の類似性カットオフは、種レベルのクラスタリングに近いと予想されるが、系統発生的に異なる種を同じクラスタに配置すると、コミュニティ間の細かいスケールの変動が失われる可能性がある。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子調査研究が成長するにつれて、定義された割合の類似性に基づいてＯＴＵをクラスタリングすることの重要な欠点は、有意な再分析なしに研究間でＯＴＵを比較できないことである。配列を参照データベースにマッピングすることによってクラスタを生成するＯＴＵピッキング戦略は、この警告を部分的に回避し、研究全体のメタ分析を可能にするが、データベースに一致しない真の生物学的配列に関する情報は失われる。
【００１８】
ＤＡＤＡ２などのノイズ除去アルゴリズムに基づく方法（Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｂ．Ｊ．他（２０１６）。ＤＡＤＡ２：イルミナアンプリコンデータからの高解像度試料推論。Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３（７）、５８１−５８３。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３８６９）、Ｄｅｂｌｕｒ（Ａｍｉｒ  Ａら２０１７年。Ｄｅｂｌｕｒは、単一ヌクレオチドのコミュニティ配列パターンを迅速に解決する。ｍＳｙｓｔｅｍｓ  ２：ｅ００１９１−１６。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｍＳｙｓｔｅｍｓ．００１９１−１６）、ＵＮＯＩＳＥ２（Ｅｄｇａｒ、Ｒ．Ｃ．（２０１６）。ＵＮＯＩＳＥ２：イルミナ１６ＳおよびＩＴＳアンプリコン配列のエラー訂正が改善された。ｂｉｏＲｘｉｖ。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０８１２５７）、およびＳｅｅｋＤｅｅｐ（Ｈａｔｈａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．他（２０１８）。ＳｅｅｋＤｅｅｐ：アンプリコンディープ配列用のシングルベースレゾリューションｄｅ  ｎｏｖｏクラスタリング。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６（４）、ｅ２１−ｅ２１。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ１２０１）配列エラーを修正することにより、イルミナの配列データからアンプリコン配列バリアント（ＡＳＶ）を推測できるようになった。例えば、ＤＡＤＡ２は、配列品質エラーモデルを構築し、エラーモデルと一致する読み取りをＡＳＶに分割することにより、ＡＳＶを推測する。これらの方法は、配列変異を推測するための参照なしの戦略を提供し、ＡＳＶは推定上真の生物学的配列を代表するため、横断研究のメタ分析も可能にする。さらに、これらの方法は、健康と病気を区別するキーストーンマイクロバイオータを特定する際に重要となる可能性のある一塩基変異を正確に捉えることができることが示されている。
【００１９】
正規化は、数桁にわたって観察できる試料間の配列深度の変動を説明するために、試料間の比較を行うために重要になる。総和正規化（ＴＳＳ）を使用すると、試料全体の組成データを比較できるが、分類群の合計が１に比較的多いため、標準統計はＴＳＳ正規化データに適用できない。一方、データセットを均等な深さに希薄化すると、データと精度が失われる。ＤＥＳｅｑ２などの分類群の存在量の差異を検査するための統計的手法（Ｌｏｖｅ、Ｍ．Ｉ．他（２０１４）。ＤＥＳｅｑ２を使用したＲＮＡ−ｓｅｑデータの倍率変化と分散の適度な推定。ゲノム生物学、１５（１２）、５５０。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０５９−０１４−０５５０−８）、ＭｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ（ポールソン、Ｊ．Ｎ．等。（２０１３）。微生物マーカ遺伝子調査のための示差的存在量分析。Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０（１２）、１２００〜１２０２。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６５８）、ＥｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｍ．Ｄ．等。（２００９）。ｅｄｇｅＲ：デジタル遺伝子発現データの差次的発現解析用のＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ。バイオインフォマティクス、２６（１）、１３９−１４０。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ６１６）、およびＶｏｏｍ（Ｌａｗ、Ｃ．Ｗ．他。（２０１４）。ｖｏｏｍ：精密な重みにより、ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りカウントの線形モデル分析ツールのロックが解除される。ゲノム生物学、１５（２）、Ｒ２９。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｇｂ−２０１４−１５−２−ｒ２９）データの分布を仮定し、パラ測定基準統計検査を採用することで、マーカ遺伝子データセットの非正規性と不均一な配列深度の課題を克服する。これらの方法は、正規化または希薄化の必要性を排除し、微生物叢データセットで一般的なスパース性（過剰なゼロ）およびアンダーサンプリングにもかかわらず、有意差を検出するためのロバスト統計も提供する。
【００２０】
コミュニティ構成の推論を伴う複雑さは、抽出、増幅、およびシーケンシングからのシーケンシングプロセスの技術的変動、およびシーケンサーからのベースコールの精度の決定からも生じる。バイオインフォマティクスツールは、シーケンシングに関連するいくつかの固有のエラーの削減を可能にするが、技術的なばらつきと微生物叢データセットの再現性の低さは、横断研究の傾向の特定に課題をもたらす。
【００２１】
微生物群集の相対的な存在量の推定値の検証
ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡマイクロアレイ、および１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子実験用に開発された内部標準により、転写産物またはマーカ遺伝子の存在量推定における感度、再現性、および精度の評価が可能になる。ヒト微生物叢コンソーシアムによって開発された２１の細菌株からのゲノムＤＮＡの等モルまたは千鳥混合などの複雑性の低い模擬コミュニティは、ウェットラボおよびバイオインフォマティクスパイプラインのベンチマークで日常的に使用されている。
【００２２】
本明細書に開示される実施形態は、ＮＩＳＴ標準参照材料から供給される、６９の固有のテンプレートからなる一連の微生物叢制御標準混合物を開発および適用するために使用される組成物、方法、およびシステムを含む。いくつかの実施形態では、６９個の固有のテンプレートからなる一連の微生物叢制御標準混合物は、６桁にわたるＮＩＳＴ標準参照材料から供給される。本明細書では「スパイク混合物」または「内部スパイクイン標準」または「定量的微生物叢シーケンシングトレーサ」とも呼ばれる３つの固有の混合物。各混合物には、２１の異なるレベルにわたる６９のテンプレートスパイクすべての様々な存在量が含まれる。ここで説明するのは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の有意示差的存在量を推定する際のバイオインフォマティクスパイプラインの精度と制限について重要な洞察をもたらすことができる、内部スパイクイン標準の追加とその評価の例である。例のデモンストレーションは、スパイク混合物を使用して、バイオインフォマティクスパイプラインを特定およびベンチマークする例を示している。これにより、非常に豊富な分類群を特定する際の忠実度が高くなり、横断研究のメタ分析も容易になる。デモンストレーションの例では、スパイク混合物を使用して、存在量のレベルに基づいて予測された信頼度または誤差の推定値を提供するなど、存在量の差異分析から得られた結果の有意性を検証する方法も示している。
【００２３】
示差的存在量分析システム
図２は、本明細書では「ＤＡＡシステム」または「システム」１００とも呼ばれる例示的な示差的存在量分析システムの概略図を示す。ＤＡＡシステムは、スパイクイン混合物を生成するように構成できる。いくつかの実施形態では、ＤＡＡシステムは、スパイクイン混合物に関連する情報を使用し、配列データの示差的存在量分析のために２つまたはそれ以上のワークフローパイプラインを評価するように構成することができる。いくつかの実施形態では、ＤＡＡシステムは、スパイクイン混合物に関連する情報を使用し、配列データの示差的存在量分析から得られた結果を検証するように構成することができる。
【００２４】
システム１００は、通信ネットワーク１０６を介してユーザ装置１０２に結合された、または適切に接続された（有線または無線接続方法を介して）配列処理検証装置１１０を含む。１つのユーザ装置１０２として示されているが、配列処理検証装置（またはＳＰＶ装置）１１０は、必要に応じて、任意の数のユーザ装置および／またはリモートまたはローカルデータソースに結合することができる。
【００２５】
ユーザ装置１０２は、任意の適切なクライアント装置またはコンピューティングマシンであり得る。例えば、ユーザ装置１０２は、ハードウェアベースのコンピューティング装置および／またはマルチ媒体装置、例えば、サーバ、デスクトップコンピューティング装置、スマートフォン、タブレット、ウェアラブル装置、ラップトップ、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、携帯情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォン、タブレットＰＣ、サーバ装置、ワークステーションなどであり得る。場合によっては、ユーザ装置１０２はまた、計算から生じるデータを転送することができるように構成された試料を分析するように構成されたマシン（例えば、配列マシン）の一部であり得る。ユーザ装置１０２は、図１には示されていないが、少なくともメモリ、プロセッサ、ネットワークインターフェース、および出力装置を含むことができる。
【００２６】
通信ネットワーク１０６は、有線または無線接続をサポートすることができる。いくつかの実施形態では、システム１００は、例えば、ウェブサーバ、アプリケーションサーバ、プロキシサーバ、電話ネットサーバ、ファイル転送プロトコル（ＦＴＰ）サーバ、メールサーバ、リストサーバ、コラボレーションサーバなどなどのエンタープライズサーバで少なくとも部分的にホストされるエンタープライズシステムであり得る。
【００２７】
ＳＰＶ装置１１０は、プロセッサ１２０、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ユニット１４０、メモリ１６０、およびコミュニケータ１８０を含み、および／またはそれらにアクセスすることができ、これらはそれぞれ互いに相互接続されている。いくつかの実施形態では、ＳＰＶ装置１１０は、サーバ装置であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＰＶ装置１１０は、例えば、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットパーソナルコンピュータ（ＰＣ）などのエンタープライズ装置であり得る。さらに他の実施形態では、ＳＰＶ装置１１０の一部は、例えば、有線または無線接続によって相互接続された多くのシャーシおよび／またはモジュール全体に物理的に分散させることができる。ネットワークは、有線ネットワークおよび／または無線ネットワークとして実装された、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、仮想ネットワーク、電気通信ネットワークなどの任意のタイプのネットワークであり得る。例えば、入力／出力ユニット１４０、またはメモリ１６０は、１つの装置に収容することができ、またはいくつかの実施形態では、多くの装置に分散させることができる。同様に、コミュニケータ１８０は、いくつかの実施形態では１つの装置に収容することができ、いくつかの他の実施形態では多くの装置に分散させることができる。
【００２８】
プロセッサ１２０は、例えば、ハードウェアベースの集積回路（ＩＣ）、または一連の命令またはコードを実行および／または遂行するように構成された任意の他の適切な処理装置であり得る。例えば、プロセッサ１２０は、汎用プロセッサ、中央処理装置（ＣＰＵ）、加速処理装置（ＡＰＵ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブル・ロジック・アレイ（ＰＬＡ）、コンプレックス・プログラマブル・ロジック装置（ＣＰＬＤ）、プログラマブル・ロジック・コントローラ（ＰＬＣ）などであり得る。プロセッサ１２０は、システムバス（例えば、アドレスバス、データバス、および／または制御バス）を介してメモリ１６０に動作可能に結合することができる。
【００２９】
プロセッサ１２０は、１つまたは複数のワークフローパイプラインを使用する配列データの処理および本明細書で説明するワークフローパイプラインのセットを介して実行される配列処理の統計的評価に関与する様々な方法をサポートする１つまたは複数のアプリケーションを実行するように構成することができる。いくつかの実施形態では、プロセッサ１２０で実行される１つまたは複数のアプリケーションは、エンタープライズソフトウェアまたは分析パッケージ（例えば、バイオインフォマティクスパッケージまたは統計分析パッケージ）の一部であり得る。プロセッサ１２０は、例えば、本明細書で説明されるようにスパイクおよび／またはスパイク混合物として機能することができる１つまたは複数のテンプレートポリヌクレオチドを生成するために必要な設計または構築情報の様々な部分を実行するための１つまたは複数の関連ソフトウェアを含み得る１つまたは複数の装置を装備することができる。プロセッサ１２０は、配列処理を設計する様々な部分を実行するための１つまたは複数の関連ソフトウェアを含むことができ、様々な部分は、例えば、ゲノムまたは微生物データにおけるＰＣＲ増幅マーカのハイスループットシーケンシングから得られたゲノムデータセット（例えば、マイクロバイオーム）の配列リードのアノテーション、配列リードの分析に基づくアンプリコン配列バリアント（ＡＳＶ）またはオペレーショナルタクソノミックユニット（ＯＴＵ）分類群のグループ化および／または分類、相対的な存在量の違いを評価するための統計検査の予測および／または実行、などを含む。いくつかの実施形態では、プロセッサ１２０は、未知の試料を受け取り、その意図されたソースまたは起源または作成者を検証するための装置および関連ソフトウェアを装備することができる。いくつかの実施形態では、プロセッサ１２０の上記の部分のそれぞれは、メモリ１６０に格納され、プロセッサ１２０によって実行されるソフトウェアであり得る。
【００３０】
メモリ１６０は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、メモリバッファ、ハードドライブ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）などであり得る。メモリ１６０は、例えば、テンプレートスパイクポリヌクレオチドの設計、配列処理、事前定義されたワークフローパイプラインを使用して差分存在量分析を実行すること、様々な異なるワークフローパイプラインを使用して実行される差分存在量分析を評価すること、エラーまたは統計的推定を予測することなどの１つまたは複数のプロセス、機能などをプロセッサ１２０に実行させる命令を含むことができる１つまたは複数のソフトウェアモジュールおよび／またはコードを格納することができる。いくつかの実施形態では、メモリ１６０は追加して段階的に使用できる拡張可能なストレージユニットを含むことができる。いくつかの実装形態では、メモリ１６０は、プロセッサ１２０に動作可能に結合することができるポータブルメモリ（例えば、フラッシュドライブ、ポータブルハードディスクなど）であり得る。他の例では、メモリは、コンピューティング装置と遠隔操作可能に結合することができる。例えば、リモートデータベースサーバはメモリとして機能し、コンピューティング装置に動作可能に結合できる。
【００３１】
メモリ１６０は、配列読み取り、テンプレートスパイクの生成および使用に関連する配列情報、スパイク混合物の組成、各スパイク混合物における各テンプレートスパイクの相対的存在量、固有のワークフローパイプラインを使用した配列処理の結果などを含む生データに関連する情報を格納する１つまたは複数のデータベースまたはルックアップテーブル（図２には示されていない）を含むことができる。メモリ１６０は、これらの特定のユースケースに関連する情報のための１つまたは複数のストレージシステム（例えば、テンプレートスパイク、スパイク混合物の固有の識別子、または、示差的存在量分析などのための配列処理パイプライン）を含み得る。
【００３２】
コミュニケータ１８０は、通信ネットワーク１０６を介して、ユーザ装置１０２または他の任意の外部装置またはデータソースから送信された情報を受信するように構成することができる。通信ネットワーク１０６は、有線または無線の通信方法をサポートすることができる。コミュニケータ１８０は、プロセッサ１２０およびメモリ１６０に動作可能に結合されたハードウェア装置、および／またはプロセッサ１２０によって実行されるメモリ１６０に格納されたソフトウェアであり得る。コミュニケータ１８０は、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉ（商標）モジュール、ブルートゥース（登録商標）モジュール、および／または他の任意の適切な有線および／または無線通信装置であり得る。さらに、コミュニケータ１８０は、スイッチ、ルータ、ハブ、および／または他の任意のネットワーク装置を含むことができる。コミュニケータ１８０は、ＳＰＶ装置１１０を通信ネットワーク１０６に接続するように構成することができる。場合によっては、コミュニケータ１８０は、例えば、インターネット、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、メトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、ワールドワイド・インターオペラビリティ・フォー・マイクロウェーブ・アクセス（ＷｉＭＡＸ（登録商標））、光ファイバ（または光ファイバ）ベースのネットワーク、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）ネットワーク、仮想ネットワーク、および／またはそれらの任意の組み合わせの世界的な相互運用性などの通信ネットワークに接続するように構成することができる。
【００３３】
場合によっては、コミュニケータ１８０は、通信ネットワーク１０６を介したファイルおよび／またはファイルのセットの受信および／または送信を容易にすることができる。場合によっては、受信したファイルは、本明細書でさらに詳細に説明するように、プロセッサ１２０によって処理され、および／またはメモリ１６０に格納され得る。場合によっては、前述のように、コミュニケータ１８０は、プロセッサ１２０によって収集および／または分析されたデータを、ＳＰＶ装置１１０が接続されている別の装置に送信するように構成することができる。
【００３４】
図１の概略図には示されていないが、ＳＰＶ装置１１０は、データ提示または表示装置（例えば、ＬＣＤディスプレイ）などの出力装置を含むことができる。
【００３５】
テンプレートポリヌクレオチド配列−スパイク
本明細書に記載の実施形態は、示差的存在量分析法の検証のためのテンプレートスパイクとして役立つことができる独特のポリヌクレオチドの設計および生成に使用されるシステムおよび方法を含む。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応する微生物叢の領域を使用して示差的存在量分析を検証するために使用することができる例示的なテンプレートスパイクの例示的な配列構造の概略図である。テンプレートスパイクのセット（６９個のテンプレートスパイクなど）を設計および生成して、ライブラリを形成できる。上記のシステム１００などのＤＡＡシステムを使用して、テンプレートスパイクのライブラリを生成することができる。スパイクには、調査対象の標的分子（１６Ｓ領域など）とは明らかに異なり、対象の標的分子のＧＣ含量に匹敵する様々なＧＣ含量を持つ複数の異なるＤＮＡ配列を含めることができる。例えば、微生物叢データの示差的存在量分析の検証の図解されたアプリケーションでは、テンプレートスパイクは、様々な微生物群集を模倣するために可変ＧＣ含量を持つことができる。可変ＧＣ含量および可変入力コピーおよび／または配列決定時の読み取りカウントを有する６９個の固有のテンプレートスパイクの分布例が図３Ｄに示されている。テンプレートスパイクの試料セットでは、ＱＳ入力レベル（存在量レベル）ごとに３〜４個の一意の配列があり、合計２１レベルで、各レベルでＧＣ含量が異なる。テンプレートスパイクのライブラリは、ＱＳ桁にまたがるように構成されており、例えば、反応ユニットごとに、最大開始量２，０００コピー（入力マスプレＰＣＲに基づく）までである。
【００３６】
スパイクには、ライブラリ構築前の試料の標的ＤＮＡフラグメントとほぼ同じ長さのコントロールＤＮＡフラグメントを含めることができる。いくつかの実施形態では、それらは、標的アンプリコンの長さに類似した長さを有する。
【００３７】
図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃに示されるように、本明細書に記載の例示的な実装における各例示的なテンプレートスパイクは、非１６Ｓ配列のいずれかの末端にある１６Ｓ  Ｖ４プライマーへの相補体を含むことができる。いくつかの実装形態では、中間の非１６Ｓ領域は、所定の長さ（例えば、２５０塩基）であるように構成することができる。一部の実装では、非１６Ｓ領域は、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）によって維持されている外部ＲＮＡ制御用のＤＮＡ配列ライブラリを含むＳＲＭ２３７４データベースなどの既存のデータベースから取得できる。一部の実装では、テンプレートの全長を事前定義された標的を満たすように構成できる（例：約２９５ｂｐ、Ｖ４アンプリコンサイズに匹敵）。二本鎖ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲに対応するように構成でき、ＰＣＲ反応に直接追加できる（試料あたり＊１混合物）。例えば、テンプレートスパイクの生成には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ４ユニバーサルプライマー配列に隣接する非１６Ｓ配列を使用して、ＮＩＳＴデータベースから派生した６９個のネガティブコントロールテンプレートスパイクを増幅するように設計されたプライマー（ＰＯＳＡ）の生成を含めることができる。すべてのプライマーは、５’末端に微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｖ４領域を増幅するためのユニバーサル配列を含み、３’末端にそのテンプレートスパイクのＮＩＳＴ配列に特異的にアニーリングする配列を含むことができる。いくつかのプライマー配列の例を以下の表１に示す。場合によっては、増幅産物はサンガーシーケンシングおよび定量化（ＰＯＳＡ）によって検証できる。
【００３８】
上記の図は、１６Ｓ  Ｖ４領域のテンプレートスパイクの生成に関連しているが、このアプローチは、例えばＶ１−Ｖ３領域、Ｖ３−Ｖ４領域、または１８Ｓ領域、またはキャプシドタンパク質、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、テールタンパク質などに対応するウイルスゲノムを含む任意のアンプリコン領域に適切に使用することができる。
【００３９】
スパイクイン標準混合物
生成されたテンプレートスパイクのライブラリを使用して、所定の数（例えば、３つ）のスパイクイン混合物を生成し、各混合物に同じテンプレートスパイクのセットが含まれるが、各テンプレートスパイクの所定の相対的存在量の既知の組み合わせが含まれるようにすることができる。一部の実装では、３つの混合物に一定濃度のＮ個のスパイクと様々な濃度のＮ個のスパイクを含めることができる。テンプレートスパイクの数（Ｎ）は、混合物試料中に、１より大きい任意の数、例えば、７５〜１００、５０〜１００、２５〜１００、１０〜１００、２〜１００、５０〜７５、２５〜７５、１０〜７５、２〜７５、２５〜５０、１０〜５０、２〜５０、１０〜２５、２〜２５、２００未満、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００を超える数にすることができる。
【００４０】
図４Ａは、マーカによって示されるテンプレートスパイクを有する３つの混合物Ａ、Ｂ、およびＣを示し、各混合物は、同じレベル（直線の水平線）または各スパイクの異なるレベルを有する。図示の例では、３つの混合物のそれぞれに、様々なレベルの６９個の固有のスパイクテンプレートがすべて含まれている。混合物間のシフトが高い、低い、またはまったくないスパイクを含めることにより、スパイク混合物を使用して、各スパイクの予想されるシフトと観測されたシフトを比較することにより、ワークフローの有効性を検証できる。
【００４１】
図４Ｂは、３つの混合物にわたるテンプレートスパイクの相対レベルのプロット例を示しており、いくつかは一定のままであり、他は可変度のシフト（例えば、１桁または数桁など）で混合物間で変化する。
【００４２】
図５Ａは、内部スパイクイン標準混合物を生成するための例示的な方法の概略図である。テンプレートスパイクの６９の固有の構成がプールされて、アッセイに使用するために凍結できる３つのマザーストックを形成することが示されている。スパイクイン混合物を生成するためのテンプレートスパイクのいくつかの組み合わせの例を以下の表２に示す。「ＰＣＲ濃度  ｎｇ／ｕＬ」は、ネガティブコントロールテンプレートスパイクポリヌクレオチド（上記）の濃度を示し、「ＰＣＲ濃度  分子／ｕＬ」は、絶対コピー数を示す。
【００４３】
表２は、定量化されたストックを使用して、混合物Ａ、混合物Ｂ、および混合物Ｃ（チューブＡ、Ｂ、およびＣ）のそれぞれで事前定義された濃度（分子／ｕＬ）を持つ５０，０００Ｘマスターストックを作成する方法を示している。手順の例には、１．３４ｕＬ  ＥＲＣＣ−０００４を取り、ＴＥで１０倍に希釈し、チューブＡに追加すること、１．００ｕＬ  ＥＲＣＣ−０００７を取り、ＴＥで１０倍に希釈し、チューブＡに追加すること…、１．００ｕＬ  ＥＲＣＣ−００１７１を取り、希釈せず（希釈係数＝１）、チューブＡに追加し、チューブＡの容量を１００ｕＬまで最大にすること（０．２１ｕＬ  ＴＥを追加）が含まれ得る。混合物Ａには、５０，０００Ｘストック混合物にＥＲＣＣ−０００４の１．８８Ｅ＋０７コピーが含まれる。混合物Ａの５Ｘチューブには、１．８８Ｅ＋０２のコピーがある。
【００４４】
調製したスパイクイン混合物は、内部標準として使用でき、実験用ＤＮＡ試料の処理中にＰＣＲ混合物に直接追加できる。図５Ｂは、試料ＤＮＡが内部スパイクイン混合物と混合され、ＰＣＲによって処理され、配列決定される（例えば、イルミナＭｉＳｅｑを使用する）手順例の概略図である。図５Ｂに示される手順は、試料ＤＮＡとスパイクイン混合物を使用して、示差的存在量分析に使用されるメソッドを検証する準備をしている可能性がある。
【００４５】
手順では、１つまたは複数の試料（例えば、血液、尿、唾液などの対象の体液、または、便、切除組織などの対象から供給される生物学的物質、または土壌試料）を収集することができる。例えば、５５３で、ＤＮＡは各試料から分離され、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  ＰｏｗｅｒＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）などの標準プロトコルを使用して定量化される。ｇＤＮＡの定量化は、例えばＱｕａｎｔ−ｉＴＴＭ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）  ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行できる。
【００４６】
５５５で、試料は内部スパイクイン標準混合物および融合プライマーと混合され、ＰＣＲによって処理される。１６Ｓ  ｒＤＮＡ、Ｖ４領域（ＰｏｓＣｔｒｌ  ＤＮＡ、複数のアリコート）のＰＣＲの例として、ＰＣＲライブラリ増幅ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行できる。順方向１６Ｓ  Ｖ４プライマーは、
2022502027.tif 000002
であり得る。
【００４７】
イルミナシーケンシング用のアンプリコンを生成するためのＰＣＲ順方向および逆方向プライマーは、Ｃａｐｏｒａｓｏ他、２０１１、ＰＮＡＳ、１０８：４５１６による科学出版物から派生している図５Ｃに示されるものと同じであり得る。リンカーが余分なスペースを提供するため、チップへのアニーリングは配列反応を妨げない。
2022502027.tif 000003
【００４８】
【表３】
2022502027.tif 000004
【００４９】
９６ウェルプレートの各ウェルに入れるマスター混合物には、プラチナホットスタートマスター混合物、順方向プライマー、および水のみ（２０．５ｕｌ）を含めることができる。次に、２ｕｌの試料を各ウェルに個別に分注できる。場合によっては、試料が１つしかない場合、同じ試料がネガティブコントロールウェルを除くすべてのウェルにピペットで移される。２ｕＬの標準スパイクイン混合物Ａ、Ｂ、またはＣを各ウェルに分注し、０．５ｕｌの逆方向プライマーを各ウェルに分注する。表３に、試薬とその容量のリストを示す。逆方向プライマーには固有のバーコード配列を含めることができるため、各ウェルのＰＣＲアンプリコンは、逆方向プライマーのバーコード配列に組み込まれているバーコードで識別できる（つまり、９６ウェルプレートに、バーコード配列においてのみ一意である９６個の逆方向プライマーがある）。
【００５０】
手順５００の５５７で、９６ウェルプレートの増幅後、すべての試料をプールして配列することができ、この配列を使用して、各アンプリコン配列の試料ソースを特定できる。ＰＣＲは、以下の条件で実行できる。
サーモサイクラーの条件：
初期変性：９４℃
サイクル：
９４℃、３０秒で変性
５０℃、３０秒でのアニーリングプライマー
ＤＮＡを７２℃、３０秒で伸長
手順ａ、ｂ、ｃを２５回繰り返す
７２℃、１０分での最終伸長
４℃で保持
【００５１】
ＰＣＲ試料は、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｌｅａｎｕｐ＆Ｓｉｚｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、２０℃で保存できる。各ＰＣＲ反応産物のアンプリコンは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ７５００キットおよびＡｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して品質チェックできる。各ＰＣＲ反応産物のアンプリコンは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴＴＭ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量できる。品質管理と定量化の後、手順５００の５５９で、等モル量の各アンプリコン製品を１つのチューブに追加して、イルミナＭｉＳｅｑシステムで配列することができる。ＤＮＡは４ｎＭに希釈でき、イルミナの「１６Ｓメタゲノム配列ライブラリ調製」で提供されているプロトコルを使用して手動配列を実行できる。
【００５２】
場合によっては、ＰｈｉＸコントロールライブラリは、変性Ｖ４ライブラリを６ｐＭに希釈し、変性ＰｈｉＸコントロールライブラリを６ｐＭに希釈し、１５％ＰｈｉＸライブラリを６ｐＭ  Ｖ４ライブラリ（９０ｕＬ  ６ｐＭ  ＰｈｉＸライブラリ、５１０ｕＬ  ６ｐＭ  Ｖ４ライブラリ）にスパイクすることで調整され得る。
【００５３】
イルミナ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙ−ｔｙｐｅ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｋｉｔｓ／ｃｌｕｓｔｅｒ−ｇｅｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｐｈｉｘ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｖ３．ｈｔｍｌ）経由で入手可能な情報から、「ＰｈｉＸＣｏｎｔｒｏｌ  ｖ３は、イルミナの配列実行のコントロールとして使用される、信頼性の高いアダプターライゲーションライブラリである。ライブラリは、小さく、よく特徴付けられたＰｈｉＸゲノムから派生しており、配列とアラインメントにいくつかの利点がある。用途の広いＰｈｉＸＣｏｎｔｒｏｌ  ｖ３は、すぐに使用できるライブラリとして提供され、様々なアプリケーションで利用して、ワークフローに価値を付加し、結果の信頼性を高めることができる。ＰｈｉＸライブラリは、クラスタの生成、配列、およびアラインメントの品質管理と、クロストークマトリックスの生成、フェージング、およびプレフェージングのキャリブレーション制御を提供する。フェーズやエラー率などの合成による関連配列（ＳＢＳ）測定基準を推定するために、迅速に調整できる。」
【００５４】
手順５００の５５９での配列は、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（６００サイクル）を使用して実行できる。結合されたライブラリ（ＰｈｉＸでスパイクされたＶ４）を試料ポートにロードできる。配列結果は、以下でさらに説明するように処理および分析することができる。
【００５５】
示差的存在量分析の検証のためのスパイクイン標準混合物の使用
図６は、配列処理パイプラインの性能を検証するために内部スパイクイン標準混合を使用する方法６００を示している。方法６００はまた、示差的存在量分析の結果に基づいて、信頼性の測定値（例えば、状態（健康状態など）の診断または検出を示す検査の信頼性と感度の測定値）を提供する際の標準混合物の内部スパイクの使用を示している。方法６００の部分は、図５Ｂの図を参照して上記で説明した手順５００と実質的に同様であり得る。したがって、同様の部分は、本明細書ではさらに詳細に説明されない。例えば、６０１での方法６００は、テンプレートポリヌクレオチドスパイクのライブラリを受け取ることを含み、６０３では、示差的に豊富なテンプレートスパイクの既知の組み合わせを含むスパイク混合物を生成することを含む。テンプレートスパイクは、図３Ａ〜図３Ｄを参照して上で説明したものと実質的に同様であり得、スパイク混合物は、図４Ａ、図４Ｂ、および図５Ａ〜図５Ｃを参照して上記で説明した混合物と同様であり得る。６０５で、スパイク混合物は、１つまたは複数の試料から単離されたＤＮＡに加えることができ、６０７で、組み合わされた混合物は、ＰＣＲ法を使用して増幅され得、そして６０９で、図５に示されるとともに上述した手順５００を参照して記載されるように配列決定される。
【００５６】
６１１で、配列決定結果は、所定のワークフローパイプラインを使用して処理することができる。ワークフローパイプラインは、以下でさらに詳細に説明するパイプラインの例を含む多くのパイプラインの１つにすることができる。６１１での配列処理に続いて、６１３で、各試料に追加されたスパイク混合物に関する事前情報（例えば、追加のスパイク混合物が与えられた場合の各テンプレートスパイクの予想される相対的存在量または存在量のシフトに関する情報）を使用して、期待される一連の結果を生成できる。期待される結果は、配列処理から得られた計算結果と比較できる。比較は、計算結果を取得するために使用されたワークフローの適切な検証、または取得された結果の重要性を検証するために使用できる。例えば、６１５では、比較に基づいて、２つまたはそれ以上のワークフローパイプラインのパフォーマンスを同じデータを使用して評価できる。６１７では、６１３での期待される結果と計算された結果の比較に基づいて、計算された結果から生成された結果に関連する有意性または信頼性を確認することができる。例えば、相対的存在量のシフトを検出する信頼性または精度の測定値は、テンプレートスパイクの各存在量レベルの期待データと計算データの差を使用して算出でき、これらの測定値を使用して、未知の試料から取得した微生物叢データの分析から得られた結果を検証できる。
【００５７】
示差的存在量分析のために評価されたワークフローパイプラインの例
実証的な例として、ＤＡＡシステムと、ここで説明する標準のスパイクイン混合物を生成および使用する方法を使用して、選択した配列処理ワークフローパイプラインのセットを比較および評価し、これらのパイプラインを使用して得られた結果を評価した。図７Ａおよび図７Ｂは、評価された選択されたワークフローパイプラインのセットを示している。示されているように、いくつかのワークフローパイプラインの例では、シーケンスの読み取りは、クラスタリングまたはグループ化ルーチン（ＵＰＡＲＳＥなど）および統計分析ツール（ＤＥＳｅｑ２、ｍｔｇＳｅｑ、ｅｄｇｅＲ、ｔ検定など）を使用した示差的存在量分析の統計的検定を実行する前に、注釈ツールまたはマッピングアルゴリズム（ＳＴＲＡＩＮなど）を介して実行された。一部のワークフローパイプラインでは、エラー修正ルーチン（ＤＡＤＡ２など）を実行した後に注釈が付けられた。いくつかのパイプラインの例は、ここで説明する実装例で検査された。
【００５８】
ＵＰＡＲＳＥを使用した配列のｄｅ  ｎｏｖｏクラスタリング
ＵＰＡＲＳＥを使用して、配列は９７％の配列類似性でＯＴＵにクラスタ化された。代表的な配列は、各ＯＴＵクラスタから推測された。特に、生成されたＯＴＵは研究間で比較できず、複数の研究間で分析するために結合されたＯＴＵテーブルを生成することはできない。ＵＰＡＲＳＥルーチンを使用したパイプラインでは、配列読み取りは最初にＵＳＥＡＲＣＨ  １０．０．２４０を使用してマージおよび方向付けされた（例えば、デフォルト設定を使用して、それぞれ−ｆａｓｔｑ＿ｍｅｒｇｅｐａｉｒｓおよび−ｏｒｉｅｎｔコマンドを使用）（Ｅｄｇａｒ、２０２０、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６：２４６０−２４６１を参照））。読み取りは、ＵＳＥＡＲＣＨの−ｄｅｒｅｐ＿ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈコマンドと−ｓｏｒｔｂｙｓｉｚｅコマンドを使用して、複製解除され、サイズで並べ替えられる（シングルトンを破棄する）前に、予想される最大エラー１に基づいて品質フィルタ処理された。次に、ＵＳＥＡＲＣＨの−ｃｌｕｓｔｅｒ＿ｏｔｕｓコマンドを使用して、運用分類単位ＯＴＵのｄｅｎｏｖｏクラスタリングを９７％の同一性しきい値で実行した。
【００５９】
ＤＡＤＡ２を使用した配列処理
ＤＡＤＡ２を使用するパイプラインでは、アンプリコン配列バリアント（ＡＳＶ）は、配列読み取りのエラーをモデル化し、エラー訂正後に「真の」配列を推測することによって推測された。この方法は、ＡＳＶ間の単一ヌクレオチドの違いを推測することが期待される。特に、ＤＡＤＡ２を使用すると、結果のＡＳＶは研究間で比較可能である。ＤＡＤＡ２ルーチンを実施するために、生の配列読み取りは、フィルタリング、学習エラー、重複排除、ＡＳＶ推論、およびキメラ除去のデフォルト設定を使用してＤＡＤＡ２で処理された（Ｃａｌｌａｈａｎ他、２０１６、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３：５８１−５８３）。トランケーション品質（ｔｒｕｎｃＱ）は、配列処理ワークフローに応じて２、５、または１０に設定された。順方向リードと逆方向リードの両方で、各リードの開始と終了から１０ヌクレオチドがトリミングされた。
【００６０】
ひずみデータベースへの読み取りのマッピング
ＳＴＲＡＩＮ＝ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔＲは、ＵＳＥＡＲＣＨを利用して、ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔ２０１６の参照データベースとスパイクに対してすべての読み取りを同時にマッピングする新しいＳｅｃｏｎｄ  ＧｅｎｏｍｅＲパッケージである。ＳＴＲＡＩＮ１４＝ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔ２０１４は、ＵＳＥＡＲＣＨを使用して読み取りをＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔ２０１４にマップするＰｙｔｈｏｎスクリプトベースの分類ツールである。スパイクは、ＯＴＵの代表的な配列をスパイクテンプレート配列にマッピングすることにより、事後に識別された。７つの合計配列処理ワークフローのうち４つ（ＳＳ１４またはＳＳ１６−ｘｘと表記）では、最初に社内の株データベースに対して読み取りがマッピングされた。次に、ＵＳＥＡＲＣＨ（それぞれ−ｆａｓｔｑ＿ｍｅｒｇｅｐａｉｒｓおよび−ｏｒｉｅｎｔコマンド）を使用して読み取りをマージおよび方向付けした（Ｅｄｇａｒ、２０２０、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６：２４６０−２４６１）。さらに、特定の株に一致する読み取りは、ＳＳ＃＃−ｘｘワークフローの後続の分析には実行されなかった。読み取りは、ＳＴＲＡＩＮとＳＴＲＡＩＮ１４の２つの株データベースにマッピングされた。ＳＴＲＡＩＮは、既知の原核生物株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定、ゲノム、ドラフトゲノム、およびメタゲノムアセンブリから取得された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のデータベースに対する読み取りマッピング（ｕｓｅａｒｃｈ）を指す。ＳＴＲＡＩＮ１４は、同じデータベースの古いバージョンを参照する。
【００６１】
示差的存在量検査
すべての検査で、実行された有病率フィルタリングが実行された。ＯＴＵ／ＡＳＶ／ひずみ／スパイクは、試料の少なくとも５％に存在する場合に保持された。各グループの陽性試料が３つ未満の機能の場合、３つの試料が正の値になるように、グループごとに最も深い配列試料が１回読み取られた（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑの要件）。
【００６２】
５つの固有の統計的検定が適用された：（ｉ）スパース微生物叢データを処理するために適用されたポジティブカウント法を使用したＤＥＳｅｑ２（１．１８．１）、（ｉｉ）ベータプライアを適用したＤＥＳｅｑ２、（ｉｉｉ）ｅｄｇｅＲ（３．２０．５）、（ｉｖ）ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ（１．２０．１）、および（ｖ）ｔ検定（統計パッケージ、ｖ３．４．１）（Ｌｏｖｅ他、２０１４、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、１５：１−２１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００９、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６：１３９−１４０；ＭｃＣａｒｔｈｙ他、２０１２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、４０：４２８８−４２９７）。ＤＥｓｅｑ２（ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ）は、微生物叢分析に一般的に使用されるパラメータ（ＤＥｓｅｑ２（ｂｐ）、ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓ＝ＴＲＵＥ、以前の微生物叢標準）を模倣するが、新しいバージョンのＤＥｓｅｑ２の実装を可能にする。どちらのＤＥｓｅｑ２分析でも、同様の結果が得られると予想される。
【００６３】
ＤＥＳｅｑ２は、２つの異なる検査に使用された。スパース微生物叢データを処理するために適用されたポジティブカウント法を使用したＤＥＳｅｑ２と、ベータプライアを適用したＤＥＳｅｑ２である（Ｌｏｖｅ他、２０１４、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、１５：１−２１）。正のカウントを持つＤＥＳｅｑ２の場合、ＤＥＳｅｑ（）を使用した存在量差検査の前に、ｔｙｐｅ＝ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ設定を使用してｅｓｔｉｍａｔｅＳｉｚｅＦａｃｔｏｒｓ（）が適用された。ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓを使用するＤＥＳｅｑ２の場合、ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓ＝ＴＲＵＥの設定を使用した差分存在量検査にＤＥＳｅｑ（）が使用された。ｅｄｇｅＲを使用した検査では、ＭｃＭｕｒｄｉｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅｓ  ２０１４（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００９、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２６：１３９−１４０；ＭｃＣａｒｔｈｙ他、２０１２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、４０：４２８８−４２９７；ＭｃＭｕｒｄｉｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅｓ、２０１５、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏ  １０）で概説されている存在量差検査の手順に従った。ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑの場合、ｃｓｓ正規化をｃｕｍＮｏｒｍ（）で適用し、次にｆｉｔＦｅａｔｕｒｅＭｏｄｅｌ（）を使用して存在量差検査を実行した（Ｐａｕｌｓｏｎ他、２０１３、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０：１２００−１２０２）。ｔ検定では、対応のないｔ検定を使用して、存在量の差を検定した。さらに、ｇｔｏｏｌｓパッケージｖ３．５．０（Ｗａｒｎｅｓ  ＧＲ、Ｂｏｌｋｅｒ  Ｂ、Ｌｕｍｌｅｙ  Ｔ。２０１５．ｇｔｏｏｌｓ：様々なＲプログラミングツール。３．５．０）からｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ（）およびｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ２ｌｏｇｒａｔｉｏ（）を使用してｌｏｇ２  ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ（ｌ２ＦＣ）を計算した。調整されたｐ値は、ｐ．ａｄｊｕｓｔ（）を使用したＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｕｒｇメソッドを使用して計算された（統計パッケージ、ｖ３．４．１）（Ｔｅａｍ、２０１７、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ１０）。
【００６４】
パイプラインランキングの計算
固有のワークフローごとに、各スパイクの比較（混合物Ａと混合物Ｂ、混合物Ｂと混合物Ｃなど）は、調整されたｐ値と期待および観測されたｌｏｇ２ＦＣｓに基づいて、真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性として定義され、スパイクが、示差豊富であることが予想された場合、真陽性は、p＜０．０５および絶対ｌｏｇ２  ＦＣ＞０に調整したスパイク比較した。すべてのライブラリは同じ試料の生体試料（糞便など）から作成されたため、グループ間で存在量が大幅に異なると予想される１６Ｓアンプリコンはなかった。したがって、１６Ｓアンプリコンを含む真陰性および偽陽性の比較の数も決定した。これらの６つの値は、パイプラインランキングで使用される測定基準の過半数の計算に使用された。
【００６５】
検出率は、ワークフローで検出されたスパイクの数をスパイクの総数（合計６９スパイク）で割ったものとして計算された。感度は、真の陽性スパイク比較の合計を、予想される示差的に豊富なスパイク比較の総数で割ったものとして計算された。特異性は、真陰性スパイク比較の合計を、示差的に豊富であるとは予想されなかったスパイク比較の合計数で割ったものとして計算された。偽陰性率は、偽陰性の合計を、予想される示差的に豊富なスパイク比較の総数で割ったものとして計算された。正確さは、（真の陽性の合計＋真の陰性の合計）／（予想される差のある量の合計＋スパイクの比較の合計の差のある量と予想される）として計算された。精度は、真陽性の合計／（真陽性の合計＋偽陰性の合計）として計算された。シータおよびシグマは、観測された６９ｌｏｇ２ＦＣと予想されるｌｏｇ２ＦＣの線形回帰から計算された。シータは、この回帰の傾きを絶対値（ａｔａｎ（（（傾き−期待される傾き）／（１＋期待される傾き＊傾き））））＊（１８０／）として使用して計算された。ここで、期待される傾きは１である（観測されたｌｏｇ２ＦＣ＝予想されるｌｏｇ２ＦＣ）。正規化されたシータは１−（シータ／１８０）として計算された。シグマは、傾きが１の線と比較した各スパイク比較の残差誤差の合計の平方根として計算された（観測されたｌｏｇ２ＦＣ＝期待されたｌｏｇ２ＦＣ）。正規化されたシグマは、４０の一意のワークフローすべてのシグマ値に関連して計算された。正規化されたシグマ＝１−（シグマ−最小シグマ）／（最大信号−最小シグマ）。逆１６Ｓ偽陽性率は１−（偽陽性１６Ｓ比較の合計／１６Ｓ比較の合計）として計算された。Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ（陽性予測値）は、真陽性の合計／（真陽性の合計＋偽陽性の合計＋偽陽性の合計１６Ｓ比較）として計算された。最終パイプラインランキング測定基準は、次のように計算された：（正規化シータ／２）＋（正規化シグマ／２）＋検出率＋感度＋特異度＋正確さ＋精度＋Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ＊１．５−（偽陽性１６Ｓ率＋偽陰性率）。図８〜図２５は得られた結果を示している。
【００６６】
図８Ａおよび図８Ｂは、ＤＥＳｅｑ２．ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓ、ＤＥＳＥｑ２、ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ、ｅｄｇｅＲ、ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ２、およびｔ検定のリストからの分析ツールのそれぞれを使用して検査され、ＳＳＰ、ＳＳ１６ＵＰ、ＳＳＤＤ、ＳＳＤＤｒ、ＤＤＳＳ、ＤＤＳＳｒ、およびＤＤＳＳｍｒとラベル付けされたパイプラインのリストの各ワークフローパイプラインによって達成されたスパイク検出率をプロットしたグラフを示している。プロットは、検出されたスパイクの正規化された検出率をスパイクの総数（６９）で割ったものを示している。示されているように、ＤＡＤＡ２は最大７つのスパイクを見逃したが、使用されたチューニングパラメータによって回復が改善された。ＳＳＵＰは、ＯＴＵの代表的な配列を割り当てて、４７／６９を回復した。
【００６７】
スパイクは、次の計算でスパイクの予想される最大量に基づいて分類された。存在量は、５ｕｌ／ＰＣＲ  ｒｘｎを使用して、１Ｘストックのｕｌあたりの入力コピーとして推定された。次に、スパイクカテゴリの最大相対的存在量を使用して、１６Ｓ  ＡＳＶまたはＯＴＵを存在量カテゴリに分類した。図８Ｃの表は、存在量の相対レベルに基づくスパイクの分割を示している。例として、５ｕｌの１Ｘが混合物Ａ、Ｂ、またはＣの各ライブラリに追加され、予想される配列カバレッジにより読み取りの約１５％がスパイクとして発生した。ｍａｘＲＡスパイクカテゴリ＝すべての試料とパイプラインにわたる各スパイクの最大相対的存在量。したがって、パイプラインのパフォーマンスは、様々なレベルの存在量に基づいてさらに細分化および評価できる。図８Ｄおよび図８Ｅは、先験的に知られているスパイクの存在量のレベルも考慮して、リストされたパイプラインのそれぞれを使用して得られた結果を示している。結果は、欠落しているスパイクが超低スパイクであり、配列読み取りがほとんどまたはまったくないことを示した。
【００６８】
図９は、エラー率に基づいてパイプラインの性能をプロットするグラフを示している。スパイクの代表的な配列のベースコールエラー率を使用して、パフォーマンス測定値を算出した。スパイクは、パイプラインに基づいて異なる方法で割り当てられた。例えば、ＤＤＳＳ、ＤＤＳＳｒｅｌａｘｅｄ、ＳＳＵＰクラスタ（ＡＳＶ／ＯＴＵ）を含むパイプラインでは、代表的な配列でスパイクが検索された。ＳＳＤＤ、ＳＳ１６ＤＤを含むパイプラインでは、ｓｔｒａｉｎｓｅｌｅｃｔＲは個々の読み取りでスパイクを検索する。示されているように、すべてのパイプラインは、最初に配列の忠実度が向上した（エラー率が比較的低い）ＤＡＤＡ２を実装したパイプラインで良好に機能した。
【００６９】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、示差的存在量分析に基づいて状態、例えば病状を検出する際のパイプラインの性能精度の算出を伴う真理値表の例を示す。真理値表の変数は次のとおりである。真陽性（ＴＰ）：分析で「有り」と予測されたとき（被験者は病気にかかっている）、実際には病気にかかっている。真陰性（ＴＮ）：分析で予測されなかった場合（被験者には病気がない）、実際には病気にかかっていない。偽陽性（ＦＰ）：分析で「有り」と予測されたが、実際には病気ではない（別名「タイプＩエラー」）。偽陰性（ＦＮ）：分析で「無し」と予測されたときにカウントされたが、実際には病気がある（別名「タイプＩＩエラー」）。正の予測値（ＰＰＶ）は、ＴＲＵＥである正の結果の割合として算出された。真陽性／（真陽性＋偽陽性）として計算される。
【００７０】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓによる差分分析を含むパイプラインの真理値表変数のプロットを示している。パイプラインは、誤検知の１６Ｓ（Ｔｏｔａｌ＿ＦａｌｓｅＰｏｓ１６Ｓ）と誤検知のスパイク（Ｔｏｔａｌ＿ＦａｌｓｅＮｅｇ）の数が異なる。図１２Ａおよび図１２Ｂは、スパイク検出における偽陽性および偽陰性を示す概略図である。図１３Ａおよび図１３Ｂは、ラベル付けされたワークフローパイプラインを使用した感度測定のプロットである。感度の測定には真陽性率を使用した。つまり、診断が実際に「有り」の場合、分析で「有り」と予測される頻度である。ＴＰ／実際の「有り」によって算出されたものは「感度」または「再現率」とも呼ばれる。ＳＳＤＤおよびＳＳＵＰパイプラインは、このパフォーマンス測定基準でＤＤＳＳパイプラインを凌駕した。図１４Ａおよび図１４Ｂは、診断が実際にない（病状がない）場合の事例を測定する特異性のプロット、および分析が「無し」を予測する頻度を示す。ＴＮ／実際の「無し」で算出されたものは（１−偽陽性率）に等しくなる。ＤＥＳｅｑ２、ｅｄｇｅＲ、またはｔ検定を使用したＤＤＳＳパイプラインは、１００％未満の特異性だった。図１５Ａおよび図１５Ｂは、様々なパイプラインの精度測定値のプロットであり、モデルまたは分析が正しい頻度を測定する。これは、（ＴＰ＋ＴＮ）／合計Ｎとして算出された。ＤＥＳｅｑ２とｅｄｇｅＲは、各配列処理方法内で非常に類似した精度を達成した。
【００７１】
図１６Ａおよび図１６Ｂは、逆偽陽性率（ｉＦａｌｓｅＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔｅ）および逆偽陰性率のプロットを示している。ｉＦａｌｓｅ陽性率は、診断が実際に「無し」の場合、モデルまたは分析が「有り」を予測する頻度として計算された。（１−（ＦＰ／実際の「無し」））として算出される。ｉＦａｌｓｅ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｒａｔｅは、診断が実際に「有り」である場合、分析で「無し」と予測される頻度はどれくらいであるかのインスタンスとして計算された。（１−（ＦＮ／実際の「有り」））として算出される。示されているように、ＤＡの結果をｐａｄｊ＜０．０５でフィルタリングした場合、すべての偽陽性率は０．０５未満だった。図１７Ａおよび図１７Ｂは、スパイク＋１６Ｓ  ＰＰＶのプロットを示しており、それが「有り」と予測されたとき、どれくらいの頻度でそれが真の「有り」であるかのインスタンスの数として計算された。式ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＦＰ＿１６Ｓ）を使用して算出される。Ｓｐｉｋｅ＋１６Ｓの正の予測値は、ＤＤＳＳｘとＳＳＵＰで最も高く、予測されたヒットの信頼性が高まった。
【００７２】
上記のように、差分存在量分析パイプラインの評価は、スパイクテンプレートの相対的存在量によって細分化されたカテゴリのパフォーマンスも考慮することによって実行できる。図１８Ａは、スパイクの存在量も考慮しながら、「有り」と予測された場合のインスタンスの数として計算された、スパイク＋１６Ｓ  ＰＰＶの場合の定量化を示している。スパイク存在量レベルの各カテゴリ内でＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ＋ＦＰ＿１６Ｓ）として算出される。示されているように、スパイク＋１６Ｓの正の予測値は、存在量の高いスパイクと低いスパイクでほぼ１（最大）だった。超低スパイクは、「リラックスした」パイプラインと「よりリラックスした」パイプラインでパフォーマンスを向上させた。図１８Ｂの表は、相対的な存在量および対応するＳｐｉｋｅ１６  ＰＰＶ値に基づくスパイクのカテゴリをリストしている。
【００７３】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、シグマおよびシータの値のプロットであり、各ＯＴＵまたはＡＳＶについて計算された示差的存在量の精度を評価するために使用される。分布は、観測されたスパイクの数に対する予想される数のプロットを示している。シータは、近似された点の線と予想されるｌｏｇ２ＦＣ（勾配の線＝１）［度単位］の間の角度として算出される。逆に、正規化されたシータは（１−（シータ／１８０°））として算出される。シグマは、予想されるｌｏｇ２ＦＣ（傾きの線＝１）からの点の残余標準誤差として算出され、図１９Ｂの矢印で示される。値は０−１にスケーリングされた。逆に、正規化されたシグマは（１−（スケーリングされたシグマ値））として算出された。図２０Ａおよび図２０Ｂは、シータおよびシグマ値の逆数のプロットである。逆数をプロットすると、小さい値（この例ではより良い値）が右上隅に表示される。ＤＤＳＳパイプラインはＳＳＤＤパイプラインを上回った。品質のしきい値が下がると、ＤＤＳＳパイプラインのパフォーマンスが向上した。
【００７４】
図２１Ａおよび図２１Ｂは、感度、特異度、正確さ、精度、正規化シータ、正規化シグマ、検出率、Ｓｐｉｋｅ１６＿ＰＰＶなどを含むいくつかの測定基準を使用するパイプラインの性能のプロットであり、各測定基準はポリゴンプロットの頂点によって表される。プロットは、ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓを使用した差分分析を使用したパイプラインの結果を示しており、各パイプラインは色付きの線で示されている。図２２Ａおよび図２２Ｂは、各パイプラインの性能に関連するスコアに基づくパイプラインのランキングを示す表である。ＤＤＳＳｍｒ：ｑ２＋ＤＥＳｅｑ２は、Ｓｐｉｋｅ１６＿ＰＰＶ（ＳＧ設定）に重みを追加して最高にランク付けされた。図２３Ａ〜図２３Ｃは、スパイクの相対的な存在量によって分類されたパイプラインの性能を表す多角形プロットを示しており、図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃは、それぞれ、高存在量、低存在量、および超低存在量のスパイクに対するパイプラインの性能を表す。プロットは、ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓを使用した差分分析パイプラインの評価を示している。ＤＤＳＳｍｒ：ｑ２パイプラインは、存在量のスパイクの高低について、すべての測定基準のバランスを取る。図２４Ａおよび図２４Ｂは、検査されたすべての統計分析ツールを使用してパイプラインの性能を評価するプロットを示している。ワークフローパイプラインは、特に精度、感度、Ｓｐｉｋｅ１６＿ＰＰＶで不均一に実行され、１はすべての測定基準の完全なスコアである。前に説明したように、ｉ＝ＦａｌｓｅＰｏｓおよびＦａｌｓｅＮｅｇレートの逆数。図２５Ａおよび図２５Ｂは、カラースケールされたマップ上のワークフローパイプラインの性能の概略図である。図２４に示されるように、ワークフローは、特に精度、感度、Ｓｐｉｋｅ１６＿ＰＰＶで不均一に実行された。
【００７５】
本願技術の例示的な用途
説明されているシステムと方法を使用して、内部標準のスパイクイン混合物を生成し、その混合物を使用して、ここで説明されているパフォーマンスのいくつかの測定値または測定基準を使用して、広範囲のワークフローパイプラインを評価できる。期待される結果（使用される混合物のスパイクの既知のレベルに基づく）と様々なパイプラインを使用して得られた観察結果を比較することにより、研究プロトコルの研究のニーズに最適なワークフローパイプラインを選択できる。例えば、精度と検出感度に敏感な研究では、これらの測定基準を使用してパイプラインを選択できるが、低い検出率は許容できるが、低い偽陽性率が必要な研究は、偽陽性率に基づいて選択できる。また、上記の例で説明したように、全体的な上位パイプラインを選択することもできる。
【００７６】
特定のパイプラインが選択されると、ここで説明する検証システムと方法は、特定の研究のためにそのパイプラインを使用して得られた結果の有効性に対する内部統制も提供する。例えば、スパースデータに基づいて得られた結果は、堅牢性と再現性が変動する可能性がある。例として、単一の生物からの典型的なＲＮＡ−Ｓｅｑ実験では、生物の遺伝子の１５〜８５％が任意の１つの生物試料で観察される。別の例として、微生物叢ＮＧＳ実験では、データテーブルは非常にまばらで、１つの生物試料で遭遇する研究の累積的特徴の１〜３％しかない。ここで説明するシステムと方法を使用すると、研究を実行するときに試験片と組み合わせて分析用のパイプラインを選択するために使用したのと同じスパイクを混合で使用できる。例えば、正常なスパイク混合物と病気のスパイク混合物のグループからの試料の盲検試験では、ランダムに割り当てて文書化することができる。ワークフローパイプラインは、以前と同じように追跡できる。結果は、スパイクの検出だけでなく、目的の標的遺伝子またはＲＮＡ配列の検出にも使用できる。スパイクの結果は、各試料で使用されるスパイク混合物の既知の相対的存在量レベルに基づいて分類でき（文書化され、既知）、存在量レベルに基づくスパイクのカテゴリの結果は、それらの存在量レベルに基づいてベースの標的配列の結果と比較できる。例えば、特定の測定基準（感度など）を使用して測定されたパイプラインのパフォーマンスが、存在量が非常に少ないスパイクで大幅に低い場合、パイプラインのパフォーマンスの統計的信頼性がないため、標的配列の結果のこの測定値は無視できる。パイプラインのパフォーマンスが、存在量が非常に少ないスパイクでも最高であると測定された場合、スパイクイン混合物のスパイクの予想結果と観測結果の比較から、同じパイプラインを使用して得られた結果試料で検査された標的配列は、存在量が非常に少ない標的配列でも高い信頼性で取得できる。したがって、本明細書に記載のシステムおよび方法は、他の方法では定量化が困難であり、結果に基づく重要な診断または治療戦略を設計するために使用できる超少量の標的配列の結果の重要性を評価するために使用できる内部統制を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、スパイク混合物は、異なる疾患を有する患者またはチェックポイント阻害剤療法を受けている患者（例えば、チェックポイント阻害剤療法を受けている黒色腫対象）からベースラインで収集された便試料に加えることができる。試料中のスパイクの相対的な存在量に基づいて、スパイクは、図２６に示されるように、高（Ｈ）、低（Ｌ）、または超低（ＵＬ）の存在量スパイクとして指定された。統計的尺度、例えば、分析において、正の予測値（ＰＰＶ）およびミス率（ＭＲ）は、予想されるシフト（図２６に黒色の点として示される）のいくつが有意なシフト（図２６において三角形の点として示される）として回復されたかに基づいて計算することができる。ＰＰＶは、真陽性と真陽性＋偽陽性の比率であり、検出された有意なシフトのどの割合が高信頼性シフトであるかを示す。この例では、存在量の多いシフトと少ないシフトの場合、ＰＰＶ＝１が観察され、これは、これらのシフトに高い信頼性があることを示している。超低存在量スパイクが検出されなかったため、この例ではＰＰＶを推定できなかった。ミス率は、予想されるシフトが重要であると検出または識別されない率として計算できる。この例では、存在量の高いシフトの場合、ミス率は１４．４％、存在量の低いシフトの場合は４６．６％、存在量の非常に低いスパイクの場合は１００％（つまり、存在量の非常に低いスパイクのすべてのシフトが失われた）だった。
【００７８】
スパイク混合物分析を適用して、応答者と非応答者からの便試料をチェックポイント阻害剤療法と比較する際に有意であると特定された株（図２７に黒い三角形の点として示されている）に関連する信頼度を決定できる。非レスポンダで有意に濃縮または枯渇していると識別された菌株の相対的な存在量をスパイクの相対的な存在量と比較することにより、検出されたすべての菌株シフトは高い信頼性であると判断できる（すべての菌株シフトは高い存在量のシフトであり、ＰＰＶは高いシフトの存在量のスパイクは１であり、存在量の多い株のＰＰＶが１）であることを示している。また、スパイクの分析に基づくと、超低存在株のシフトに対する感度は低く、つまり、一部の超低存在株ではシフトが欠落している可能性が高い。したがって、ヒトの糞便サンプルからの微生物叢の分析に適用されるスパイクミックスにより、菌株のシフトに関連する精度を決定することができる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は文脈で明確に別記されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「メンバ」という用語は、単一のメンバまたはメンバの組み合わせを意味することを意味し、「材料」は、１つまたは複数の材料、またはそれらの組み合わせを意味することを意味する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「微生物叢」という用語は、定義された環境における微生物（例えば、細菌、古細菌、真菌）の全体、それらの遺伝的要素（ゲノム）を指す。微生物叢は、任意の起源、例えば、腸内微生物叢、口腔微生物叢、腸内微生物叢、気管支微生物叢、皮膚微生物叢、または膣微生物叢であり得る。特定の実施形態によれば、微生物叢は腸内微生物叢である。微生物叢を分析するために、被験者から試料を採取する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「示差的存在量分析」という用語は、２つまたはそれ以上の試料またはグループにおける分類群の相対的存在量を分析および比較することを指す。示差的存在量分析により、統計的検定を通じて、２つのグループ間でどの特定の微生物が有意に示差的に存在するかを決定できる。特定の微生物の存在量の重要な変化は、炎症性腸疾患、下痢、肥満、ＨＩＶ、食事、文化、年齢、および抗生物質の使用に関連している可能性がある。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「スパイク」という用語は、細胞の数が既知であり、微生物プロファイリングを実行し、既知の「スパイク」細胞の出力に基づいて計算を行うために使用できるいくつかの微生物細胞を指す。スパイク微生物は通常、特定の環境では見られない。これらの微生物は既知の量で試料に混合され、試料の総微生物負荷の定量化と配列出力の相対的存在量の計算が可能になる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、分析されるか、検出されるか、または他の方法で使用される１つまたは複数の分析物を含む組成物を指す。試料は、様々なコンポーネント（ＤＮＡ、ＲＮＡ、様々なタンパク質など）を含む不均一なものでも、１つのコンポーネントを含む均一なものでもかまわない。場合によっては、試料は、天然に存在する、生物学的材料、および／または人工材料（例えば、合成対照ポリヌクレオチド）であり得る。さらに、試料は天然または変性の形態である可能性がある。場合によっては、試料は、単一の細胞（または単一の細胞の内容物）または複数の細胞（または複数の細胞の内容物）、血液試料、組織試料、皮膚試料、尿試料、便試料、水試料、および／または土壌試料であり得る。場合によっては、試料は、真核生物、原核生物、哺乳動物、ヒト、酵母、および／または細菌などの生物に由来することができ、または試料はウイルスに由来することができる。場合によっては、試料は１つまたは複数の幹細胞（例えば、無期限に分裂し、特殊な細胞を生じさせる能力を持つ任意の細胞）である可能性がある。
【００８４】
本明細書に開示されるユーザ装置、リモート装置、中央機関装置、またはＤＡＡシステム装置は、任意の適切な電子装置であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、電子装置は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、携帯情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォン、ラップトップ、タブレットＰＣ、サーバ装置、ワークステーションなどであり得る。電子装置は、少なくともメモリ、プロセッサ、ネットワークインターフェース、および出力装置を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、出力装置は、電子装置に実装されたソフトウェアアプリケーション（例えば、モバイルアプリケーション、ＰＣアプリケーション、インターネットウェブブラウザなど）のためのユーザインターフェースの少なくとも一部を提供することができる任意の適切なディスプレイであり得る。そのような実施形態では、ディスプレイは、例えば、ブラウン管（ＣＲＴ）モニタ、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）モニタ、発光ダイオード（ＬＥＤ）モニタなどであり得る。他の実施形態では、出力装置は、オーディオ装置、触覚装置、および／または任意の他の適切な出力装置であり得る。ネットワークインターフェースは、例えば、少なくともイーサネットポートおよび／または無線通信機（例えば、ＷｉＦｉ（登録商標）無線機、ブルートゥース（登録商標）無線機など）を含むことができるネットワークインターフェースカードなどであり得る。メモリは、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、メモリバッファ、ハードドライブ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）などであり得る。プロセッサは、一連の命令またはコードを実行または実行するように構成された任意の適切な処理装置であり得る。例えば、プロセッサは、汎用プロセッサ、中央処理装置（ＣＰＵ）、加速処理装置（ＡＰＵ）、および特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などであり得る。プロセッサは、例えば、本明細書でさらに詳細に説明されるように、ＰＣアプリケーション、モバイルアプリケーション、インターネットウェブブラウザ、セルラーおよび／またはワイヤレス通信（ネットワークを介した）などの使用に関連するメモリに格納された一連の命令またはコードを実行または遂行するように構成することができる。
【００８５】
例えば、電子装置のユーザと異なる電子装置のユーザとの間の相互作用の様々な部分、部分、層などを説明するために、本明細書および添付の特許請求の範囲において様々な用語が使用される。例えば、「通信」および「メッセージ」および「情報」という用語は交換可能に使用することができ、一般に、電子装置のユーザから別の電子装置のユーザに実質的に一方向に送信されるデータを指す。一例として、第１の電子装置のユーザから第２の電子装置のユーザへの通信またはメッセージは、本明細書に記載されているように、電子メール、音声メッセージ、インスタントメッセージ（ＩＭ）、ＳＭＳなどであり得る。第２の電子装置のユーザから第１の電子装置のユーザへの電子メールへの応答は、同様に、通信またはメッセージまたは情報と呼ばれることができる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「モダリティ」、「通信モード」、および「チャネル」という用語は互換的に使用でき、一般に、例えば、１つまたは複数の電子装置を使用する１つまたは複数の通信モードを指す。そのような通信モードは、特定のフォーマット（例えば、データユニットフォーマット）に関連付けることができ、場合によっては、その通信モード（例えば、異なるプロトコル、異なるデータユニット構造または配置など）に固有であり得る。例えば、携帯電話（例えば、スマートフォン）は、ショートメッセージサービス（ＳＭＳ）モダリティを使用して別の携帯電話に通信を送信できる。したがって、モダリティまたはチャネルに言及する場合、モダリティまたはチャネルは、その通信モードを介したデータの送信に適したデータユニットフォーマットを含み、定義し、および／または他の方法で関連付けられることを理解されたい。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「データ処理ユニット」または「プロセッサ」または「入力／出力ユニット」または「コミュニケータ」という用語は、例えば、任意のコンピュータ、電子スイッチ、スイッチファブリック、スイッチファブリックの一部、ルータ、電気および／または光信号を処理、送信および／または伝達するために使用されるホスト装置、データストレージ装置、ラインカード、バックプレーンなどを指し得る。Ｉ／Ｏユニットまたはコミュニケータは、例えば、電子通信ネットワーク内に含まれるコンポーネントを含むことができる。いくつかの実施形態では、例えば、データ処理ユニットは、データセンターのコアスイッチファブリック内に含まれるか、またはその一部を形成するコンポーネントであり得る。他の実施形態では、プロセッサまたはＩ／Ｏユニットは、データセンターのエッジに配置されたアクセススイッチ、またはアクセス装置に結合されたホストまたは周辺装置（例えば、サーバ）であり得る。例えば、アクセススイッチは、複数のホスト装置を含むシャーシの上部に配置できる。
【００８８】
本明細書に記載されるように、「核酸」という用語は、１つまたは複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。いくつかの実施形態において、「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン：「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン：「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル高分子形態、またはその任意のホスホエステル類似体を指す。一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかのホスホロチオエートおよびチオエステルなど。言い換えれば、核酸は一本鎖および／または二本鎖であり得る。核酸は「ヌクレオチド」を含み、これは、本明細書で使用される場合、プリンおよびピリミジン塩基を含む部分、ならびにそれらの修飾バージョンを含むことができる。そのような修飾は、例えば、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環を含み得る。さらに、「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含み、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく他の糖も含み得る部分を含む。
【００８９】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、一連のヌクレオチド塩基（ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸において「ヌクレオチド」とも呼ばれ、そして２つまたはそれ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する）である。ヌクレオチド配列は通常、タンパク質や酵素を作るために細胞機構によって使用される情報を含む遺伝子情報を運ぶ。これらの用語には、二本鎖または一本鎖のゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成および遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方が含まれる（ただし、本明細書ではセンススタンドのみが表されている）。これには、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸骨格に結合することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには、修飾された塩基、例えば、チオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシルを含む核酸も含まれる。
【００９０】
修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられているか、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている、糖部分の修飾を含み得る。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸（ＮＡ）分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、特定の三次形態に限定されない。したがって、この用語には、とりわけ、線状（例えば、制限断片）または環状ＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従って本明細書に記載され得る（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子のことである。
【００９１】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「ＮＡ配列」、「配列」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を包含する。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されている可能性がある。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合によって、重合後にさらに修飾することができる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「配列」は、核酸分子に関する配列情報に関連するデータの任意の適切な部分を指す。例えば、配列は、ヌクレオチド塩基の配列または塩基対の配列に関する情報などの、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を参照することができる。場合によっては、本明細書で使用される動詞形式「配列」または「配列決定」は、核酸分子の配列情報を取得する行為を指す。
【００９３】
ネットワークは、例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、メトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、ワールドワイド・インターオペラビリティ・フォー・マイクロウェーブ・アクセス（ＷｉＭＡＸ）、電話ネットワーク（パブリック・スイッチド・テレフォン・ネットワーク（ＰＳＴＮ）および／またはパブリック・ランド・モバイル・ネットワーク（ＰＬＭＮ））、イントラネット、インターネット、光ファイバ（または光ファイバ）ベースのネットワーク、仮想ネットワーク、セルラーネットワーク、および／または任意の他の適切なネットワークであり得る。さらに、ネットワークは、有線および／または無線ネットワークとして実装することができる。いくつかの実施形態では、ネットワークは、例えば、ＬＡＮおよびインターネットなどの任意のタイプの１つまたは複数のネットワークを含むことができる。
【００９４】
通信装置またはコミュニケータは、ネットワークと通信することができる任意の適切な装置であり得る（例えば、上記のいずれかまたはデータ処理ユニット、および／またはそれらの任意の組み合わせまたは一部）。さらに、通信装置は、例えば、イーサネットインターフェース、光キャリア（ＯＣ）インターフェース、および／または非同期転送モード（ＡＴＭ）インターフェースなどの、１つまたは複数の有線および／または無線インターフェースを含むことができる。いくつかの実施形態では、通信装置は、例えば、少なくともイーサネットポートおよび／または無線通信機（例えば、ＷｉＦｉ（登録商標）無線機、ブルートゥース（登録商標）無線機など）を含むことができるネットワークインターフェースカードなどであり得る。
【００９５】
メモリは、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、メモリバッファ、ハードドライブ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能なプログラム可能な読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）などであり得る。いくつかの実施形態では、メモリは、例えば、プロセッサに１つまたは複数のプロセス、機能などを実行させることができる命令を含むことができる１つまたは複数のモジュールを格納するように構成することができる。
【００９６】
プロセッサは、例えば、汎用プロセッサ（ＧＰＵ）、中央処理装置（ＣＰＵ）、加速処理装置（ＡＰＵ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ネットワークプロセッサ、フロントエンドプロセッサ、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）など、一連の命令またはコードを実行または実行するように構成された任意の適切な処理デバイスであり得る。したがって、メモリは、例えば、ＤＡＡシステムに関連するモジュール、プロセス、および／または機能をプロセッサに実行させるための命令を記憶することができる。
【００９７】
データベースは、例えば、テーブル、リポジトリ、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、オブジェクトリレーショナルデータベース、構造化クエリ言語（ＳＱＬ）データベース、拡張可能マークアップ言語（ＸＭＬ）データベース、などであり得る。いくつかの実施形態では、データベースは、例えば、ＤＡＡシステム内の一意のユーザ識別子、ユーザ識別子によって索引付けされたユーザ情報、配列情報、暗号化機能情報、暗号化マップ値などのデータを格納するように構成することができる。
【００９８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、様々なコンピュータ実施操作を実行するための命令またはコンピュータコードをその上に有する非一時的コンピュータ可読媒体（非一時的プロセッサ可読媒体とも呼ばれる）を備えたコンピュータ記憶製品に関する。コンピュータ可読媒体（またはプロセッサ可読媒体）は、それ自体が一時的な伝搬信号（例えば、空間またはケーブルなどの伝送媒体上で情報を運ぶ伝搬電磁波）を含まないという意味で非一時的である。媒体およびコンピュータコード（コードとも呼ばれる）は、特定の目的のために設計および構築されたものである場合がある。非一時的なコンピュータ可読媒体の例には、ハードディスク、フロッピーディスク、および磁気テープなどの磁気記憶媒体、コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、コンパクトディスク−読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、ホログラフィック装置などの光ディスク、光ディスクなどの光磁気記憶媒体、搬送波信号処理モジュール、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジック装置（ＰＬＤ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）装置など、プログラムコードを格納および実行するように特別に構成されたハードウェア装置が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の他の実施形態は、例えば、本明細書で論じられる命令および／またはコンピュータコードを含むことができるコンピュータプログラム製品に関する。
【００９９】
本明細書に記載のいくつかの実施形態および／または方法は、ソフトウェア（ハードウェア上で実行される）、ハードウェア、またはそれらの組み合わせによって実行することができる。ハードウェアモジュールは、例えば、汎用プロセッサ、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、および／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含み得る。ソフトウェアモジュール（ハードウェア上で実行）は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（商標）、Ｒｕｂｙ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（商標）、および／またはその他のオブジェクト指向、手続き型、またはその他のプログラミング言語および開発ツールを含む、様々なソフトウェア言語（コンピュータコードなど）で表現できる。コンピュータコードの例には、マイクロコードまたはマイクロ命令、コンパイラによって生成されるようなマシン命令、Ｗｅｂサービスの生成に使用されるコード、および通訳プログラムを使用するコンピュータによって実行される高レベルの命令を含むファイルが含まれるが、これらに限定されない。例えば、実施形態は、命令型プログラミング言語（例：Ｃ、Ｆｏｒｔｒａｎなど）、関数型プログラミング言語（Ｈａｓｋｅｌｌ、Ｅｒｌａｎｇなど）、論理プログラミング言語（例：Ｐｒｏｌｏｇ）、オブジェクト指向プログラミング言語（例：Ｊａｖａ、Ｃ＋＋など）またはその他の適切なプログラミング言語や開発ツールを使用して実施することができる。コンピュータコードの追加の例には、制御信号、暗号化されたコード、および圧縮されたコードが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
様々な実施形態が本明細書に記載および図示されているが、機能を実行し、および／または結果および／または本明細書に記載の１つまたは複数の利点を得るための様々な他のツール、手段、および／または構造が、そして、そのような変形および／または修正のそれぞれは、本明細書に記載の開示および例示的な実施形態の範囲内にある。より一般的には、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的な例として提供され、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、開示された教えが／使用／実装されている特定の用途に依存し得ることを理解されたい。本明細書に記載の特定の例示的な実施形態と同等のものの多くは、容易に認識可能であり、および／または日常的な実験のみを使用して確認することができる。したがって、前述の実施形態は単なる例として提示されており、本開示の範囲およびそれと同等の範囲内であり、本開示の範囲内のさらなる実施形態は、具体的に記載／または主張されている以外の方法で実施することができることを理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれを対象とする。さらに、２つまたはそれ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の範囲の中に含まれる。
【０１０１】
上記の実施形態は、多くの方法のいずれかで実施することができる。例えば、実施形態またはその一部は、ハードウェア、ソフトウェア、および／またはそれらの組み合わせを使用して実装することができる。ソフトウェアに実装された場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピュータで提供されるか、複数のコンピュータ／サーバ／計算装置に分散されるかにかかわらず、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの収集で実行できる。そのようなコンピュータは、ローカルエリアネットワークまたはエンタープライズネットワークなどのワイドエリアネットワーク、ならびにインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットを含む、任意の適切な形態の１つまたは複数のネットワークによって相互接続され得る。そのようなネットワークは、任意の適切な技術に基づくことができ、任意の適切なプロトコルに従って動作することができ、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバネットワークを含むことができる。
【０１０２】
本明細書で概説される様々な方法またはプロセスは、様々なオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれか１つを使用する１つまたは複数のプロセッサ上で実行可能なソフトウェアとしてコード化され得る。さらに、そのようなソフトウェアは、いくつかの適切なプログラミング言語および／またはプログラミングまたはスクリプトツールのいずれかを使用して記述され得、また、フレームワークまたは仮想マシン上で実行される実行可能機械語コードまたは中間コードとしてコンパイルされ得る。
【０１０３】
この点に関して、開示された様々な概念は、１つまたは複数のコンピュータまたは他のプロセッサで実行されると、上述した本発明の様々な実施形態を実行する方法を実施する、1つまたは複数のプログラムでコード化されたコンピュータ可読記憶媒体（または複数のコンピュータ可読記憶媒体）（例えば、コンピュータメモリ、１つまたは複数のフロッピーディスク、コンパクトディスク、光ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイまたは他の半導体装置の回路構成、または他の非一時的媒体または有形コンピュータ記憶媒体）として具体化することができる。コンピュータ可読媒体または複数の媒体は、上で論じたように、本開示の様々な態様を実施するために、１つまたは複数の異なるコンピュータまたは他のプロセッサにロードできるように、移送可能であり得る。
【０１０４】
本明細書で使用される「プログラム」または「ソフトウェア」という用語は、コンピュータまたは他のプロセッサをプログラムして上記の実施形態の様々な態様を実施するために使用できる任意のタイプのコンピュータコードまたはコンピュータ実行可能命令のセットを指すことができる。さらに、一態様によれば、実行されたときに本発明の方法を実行する１つまたは複数のコンピュータプログラムは、単一のコンピュータまたはプロセッサ上に存在する必要はないが、多数の異なるコンピュータまたは現在の様々な側面を実装するプロセッサ間でモジュール方式で分散され得ることを理解されたい。
【０１０５】
プロセッサ実行可能命令は、プログラムモジュールなど、１つまたは複数の計算装置によって実行される様々な形式であり、特定のタスクを実行したり特定のデータ型を実装したりするルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含めることができ、機能は、様々な実施形態に適切に組み合わせられ、および／または分散され得る。
【０１０６】
データ構造は、プロセッサで読み取り可能な媒体に様々な適切な形式で保存できる。説明を簡単にするために、データ構造は、データ構造内の場所を介して関連するフィールドを有するように示され得る。このような関係は、フィールド間の関係を伝達するプロセッサ可読媒体内の場所にフィールドのストレージを割り当てることによって同様に実現できる。しかしながら、任意の適切なメカニズム／ツールを使用して、データ要素間の関係を確立するポインタ、タグ、および／または他のメカニズム／ツールの使用を含む、データ構造のフィールド内の情報間の関係を確立することができる。
【０１０７】
様々な開示された概念は、１つまたは複数の方法として具体化することができ、その例が提供されている。特定の方法の一部として実行される行為は、任意の適切な方法で注文することができる。したがって、例示的な実施形態では連続的な行為として示されていても、いくつかの行為を同時に実行することを含むことができる、図示／説明されたものとは異なる順序で行為が実行される実施形態を構築することができる。
【０１０８】
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御するように理解されるべきである。フロー図および／または「ステップ」言語／用語の使用は、実行される操作の順序に関して制限することを意味するものではない。本明細書に記載の主題は、異なる他の構成要素に含まれる、またはそれらと接続される異なる構成要素を示すことがある。そのような描写されたアーキテクチャは例示的であり、限定的ではなく、同じまたは類似の機能を達成し、本開示の範囲内にある他の多くのアーキテクチャを実装できることを理解されたい。概念的な意味で、開示された機能を達成するためのコンポーネントの任意の配置は、所望の機能が達成されるように効果的に「関連付け」られる。したがって、特定の機能を達成するために組み合わされた本明細書の任意の２つのコンポーネントは、アーキテクチャまたは中間コンポーネントに関係なく、所望の機能が達成されるように互いに「関連付けられている」と見なすことができる。同様に、そのように関連付けられた任意の２つのコンポーネントは、所望の機能を達成するために互いに「動作可能に接続された」または「動作可能に結合された」と見なすこともでき、そのように関連付けることができる任意の２つのコンポーネントも、目的の機能を実現するために相互に「動作可能に結合可能」と見なすことができる。動作可能に結合可能な特定の例には、物理的に結合可能および／または物理的に相互作用するコンポーネントおよび／または無線的に相互作用するおよび／または無線的に相互作用するコンポーネントおよび／または論理的に相互作用するおよび／または論理的に相互作用するコンポーネントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書および特許請求の範囲で本明細書で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１０９】
本明細書で使用される「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」でリストされた複数の要素は、同じ方法で、つまり、そのように結合された要素の「１つまたは複数」であると解釈する必要がある。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの自由形式の言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ）を指すことができ、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方に対して（任意選択で他の要素を含む）、等を指すことができる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「または」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるものとする。つまり、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数および、オプションで、追加のリストされていないアイテムを含むと解釈される。「ただ１つ」または「正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみが、数または要素のリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「のうちの１つ」、「の１つだけ」、または「正確に１つ」などの、排他的な用語が先行する場合、排他的な選択肢を示すものとしてのみ解釈される（すなわち、「一方または他方であり、両方ではない」）。「本質的にからなる」は、クレームで使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を持つものとする。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的にリストされているすべての要素の少なくとも１つを必ず含み、要素のリスト内の要素の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別される要素以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかどうかにかかわらず、オプションで存在できることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、参照することができる。一実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で２つまたはそれ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（および任意選択でＢ以外の要素を含む）。別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で２つまたはそれ以上のＢを含み、Ａが存在しない（および任意選択でＡ以外の要素を含む）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で２つまたはそれ以上のＡを含み、少なくとも１つ、任意選択で２つまたはそれ以上のＢを含む（および任意選択で他の要素を含む）。「含む」、「含む」、「運ぶ」、「持つ」、「含む」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などのすべての移行句を理解されたい。制限がない、つまり、含むがこれに限定されないことを意味する。米国特許庁の特許審査手続マニュアルのセクション２１１１．０３に記載されているように、「からなる」および「本質的にからなる」移行フレーズのみが、それぞれクローズドまたはセミクローズド移行フレーズであるものとする。
【０１１２】
様々な実施形態および／または事例が特定の特徴、コンセプト、および／または構成要素の組み合わせを有するものとして記載されているが、他の実施形態および／またはインスタンスは、任意の特徴、コンセプト、および／または本明細書に記載の実施形態／インスタンスのいずれかからの構成要素の任意の組み合わせまたはサブ組み合わせを有することが可能である。例えば、場合によっては、システムおよび方法を使用して、テンプレートスパイクおよび／または混合物のスパイクを生成することができる。場合によっては、スパイクのテンプレートを生成することができ、テンプレートスパイク自体は、合成ポリヌクレオチドを生成した市販の供給源を使用して製造することができる。場合によっては、説明したシステムと方法を使用して、ワークフローパイプラインのリストを評価し、１つまたは複数の選択した基準に基づいて１つまたは複数のパイプラインを選択できる。他のいくつかの例では、システムおよび方法を使用して、示差的存在量分析を含む研究結果の検証のための内部統制として機能することができる。場合によっては、同じシステムを使用してスパイクイン混合物を生成し、スパイクイン混合物を使用してパイプラインを選択し、そのパイプラインを使用して結果を検証できる。他のいくつかの例では、システムとメソッドは結果を検証するためにのみ使用できる。
【０１１３】
様々な実施形態が上で説明されてきたが、それらは単なる例として提示されたものであり、限定ではないことを理解されたい。上記の方法およびステップが特定の順序で発生する特定のイベントを示している場合、特定のステップの順序は変更される場合がある。さらに、特定のステップは、可能であれば並行プロセスで同時に実行することができ、また上記のように順次実行することもできる。様々な実施形態は、特定の特徴および／または構成要素の組み合わせを有すると説明されてきたが、他の実施形態は、本明細書に記載の実施形態のいずれかからの任意の特徴および／または構成要素の任意の組み合わせまたはサブ組み合わせを有することが可能である。上記の方法および／またはイベントが特定のイベントおよび／または手順が特定の順序で発生することを示している場合、特定のイベントおよび／または手順の順序は変更され得る。さらに、特定のイベントおよび／または手順は、可能であれば並行プロセスで同時に実行され得、ならびに上記のように順次実行され得る。
【実施例】
【０１１４】
例１：人工的な内部標準を使用したアンプリコン配列処理パイプラインの検証
微生物叢プロファイリング技術は、通常、コホート間で特定の生物（または配列）の存在量の結果が異なり、多くの場合、特定の変数または測定されたパラメータの影響をもたらす。ただし、これらの取り組みから生成された統計的に有意な結果の大部分は、存在量の少ない個体群から得られたものであり、これらの結果の再現性と正確性に疑問が生じる。明確に定義されたＮＩＳＴ標準核酸スイートが設計され、大量に生産され、ウェットラボプロトコルとドライラボプロトコルの両方で検証された。次に、この核酸標準の収集を定量的微生物叢配列トレーサ（ＱＭＴ）として適用して、既存の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列分析ワークフローの整合性を評価し、その中の弱点を特定した。
【０１１５】
収集から結果へのワークフローは、既知の量のＱＭＴで試料をスパイクすることによって評価された。試料処理、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列処理（すなわち、ＵＰＡＲＳＥ、ｄａｄａ２）、および生物統計学的分析（すなわち、ＤＥＳｅｑ２、ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ、ｅｄｇｅＲ、およびｔ検定）は、並行した独立したワークフローとして評価された。４０の異なるワークフローが、精度、感度、特異性、およびその他の関連する測定基準について評価され、それに応じてランク付けされた。最高ランクのワークフローは、ｄａｄａ２を使用した配列処理（エラー修正とトリミング用）、ＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓおよびＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔデータベースに従ったアンプリコン配列バリアント（ＡＳＶ）の分類学的アノテーション、およびＤＥＳｅｑ２の「ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ」メソッドによる示差的存在量分析で構成されていた。この手法の組み合わせは、ほとんどの対象となる質問やアプリケーションに最も適していると見なされた。
【０１１６】
明確に定義された内部標準を含めることは、複雑な微生物叢分析と統計的手法を検証するための鍵となる。マイクロアレイ発現研究では日常的だが、複雑な内部標準は通常、次世代シーケンシングベースのアッセイには適用されない。それぞれが６９の固有の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む３つの異なるＱＭＴカクテルの設計、開発、および実装について、本明細書で説明する。これらのＱＭＴカクテルは、４０の異なる配列処理／存在量差検査ワークフローの制限を評価するために使用された。この作業だけに基づいて、そして初めて、各微生物叢アッセイの示差的存在量分析の結果に信頼水準を追加することができる。さらに、試料処理、配列深度、またはその他の処理の考慮事項に起因するバイアスを、各配列実行で簡単に識別できるようになった。
【０１１７】
ＱＭＴカクテルは、ヒト微生物叢の糞便ＤＮＡの中でＰＣＲ増幅された。３つのＱＭＴカクテル（Ａ、Ｂ、およびＣと指定）のそれぞれの１０の複製から、３０の異なる配列ライブラリが生成された。１回のＭｉＳｅｑ配列実行により、３０のライブラリから合計１２，６６３，０６５の読み取りが生成された。生の配列は、７つの異なるパイプラインのそれぞれによって処理および分析された。様々な組成の内部ＱＭＴＳを含めることにより、ゆりかごから墓場までのワークフローにおけるいくつかの処理および分析手法の有効性が正常に評価された（図２８）。ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔからＵＰＡＲＳＥへのパイプライン（ＳＳＵＰ）は、示差的存在量分析に使用できる読み取りの最大数をもたらした（ｎ＝９，４２４，３４７；７４％）。切り捨て品質（ｔｒｕｎｃＱ）値が２（ＤＤＳＳ：Ｑ２、ｎ＝８，９６０，５６５；７０％）のｄａｄａ２−ｔｏ−ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔパイプラインは、次に高いレベルの使用可能な読み取りを持っていた。ＤＤＳＳ：Ｑ１０配列処理パイプラインは、差分存在量分析に使用できる読み取りが最も少なく（ｎ＝４，７２８，７５１；３７．８％）、ＤＤＳＳ：Ｑ２が保持する読み取りの半分よりわずかに多くを返した。当然のことながら、ＤＡＤＡ２ファースト（ＤＤＳＳ）ワークフローで切り捨て品質（ｔｒｕｎｃＱ）パラメータの厳密性が低下すると、配列の保持が増加した。これは、ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔアノテーションファースト（ＳＳＤＤ）パイプラインには当てはまらなかった。配列の忠実度、つまりＰＣＲと配列戦略から生じるエラーの組み合わせの測定値もパイプライン間で異なった。ＤＤＳＳパイプラインからの基本呼び出しエラー率は類似していたが（ＤＤＳＳ：Ｑ２およびＤＤＳＳ：Ｑ５＝０．０００５２；ＤＤＳＳ：Ｑ１０＝０．０００５７）、ＳＳＤＤパイプラインはわずかに高いエラー率を示した（最大０．００１２、ＳＳＤＤ：Ｑｘ）。ＳＳＤＤパイプラインのエラー率は、ＱＭＴとひずみレベルの配列読み取り割り当てが同時に発生したため、Ｑ値全体で同じであることに注意する必要がある。
【０１１８】
各ワークフローにおける個別のＱＭＴごとの存在量の差異の結果は、検査された特定のＱＭＴから予想される組成の変化と比較して、真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性として混同行列に分類された（図２９および図３０）。調整されたｐ値＜０．０５および０より大きい絶対効果サイズ（ｌｏｇ−２倍の変化）をもたらす示差的存在量試験は、「真陽性」シフトを示したと見なされた。すべてのライブラリに同じ便ＤＮＡ抽出物が使用されたため、観察されたＡＳＶ、ＯＴＵ、または非動的ＱＭＴのいずれも、統計的に有意な組成の変化をもたらすとは予想されなかった。調整されたｐ値＜０．０５をもたらすすべてのＱＭＴ、ＡＳＶ、およびＯＴＵの差量の結果は、「偽陽性」シフトを示したと見なされた。逆に、調整されたｐ値＞０．０５または効果量０を示した結果は、「真負」のシフトを示したと見なされた。動的ＱＭＴが統計的に有意な検査結果を示さなかった場合（調整されたｐ値＞０．０５）、またはヌル効果サイズ（ｌｏｇ−２倍の変化が０に等しい）を示した場合、「偽陰性」シフトを示したと見なされた。
【０１１９】
ＤＤＳＳ：Ｑ２＋ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ微分存在量分析ワークフロー（図２９）では、合計１４０の真陽性シフト（ＱＭＴのみ）、７つの偽陽性シフト（１つのＱＭＴと６つのＡＳＶ）、１，０７１の真陰性シフト（３１のＱＭＴと１，０４１のＡＳＶ）、および３５の偽陰性シフト（ＱＭＴのみ）が観察された。比較すると、ＳＳＤＤ：Ｑ２＋ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ分析ワークフロー（図３０）では合計１５４の真陽性シフト（ＱＭＴのみ）、４１の偽陽性シフト（ＡＳＶのみ）、１，４３１の真陰性シフト（３２のＱＭＴと１，３８１のＡＳＶ）、および２１の偽陰性シフト（ＱＭＴのみ）が観察された。真陽性のＱＭＴシフトの数は、ワークフローによって大きく異なる（平均＝１２２．８、最小＝３７、最大＝１５５、１７５が可能）。ＤＤＳＳワークフローでのみ観察された誤検知のＱＭＴシフト（最大＝１）はほとんどなかった。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＡＳＶまたはＯＴＵレベル）からの誤検出シフトの数は、０〜１７１シフト（平均＝４６．３）の範囲で、４０のワークフロー全体で大幅に異なった。これらの誤検知シフトは、ワークフローごとに評価されたすべての１６Ｓシフトの０〜５．８％（平均＝０．１７％）を占めた。
【０１２０】
３２個のヌルＱＭＴシフト（真陰性）すべてのうち３１個から３２個が、すべてのパイプラインで観察された。８６７〜２５８２の間に、ワークフロー全体で真の負の１６Ｓシフトが発生した。このバリエーションは、主に１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列をＯＴＵまたはＡＳＶにビニングする方法に起因し、その結果、非常に多くの異なるビンが生成された。すべてのライブラリに共通する１つの便ＤＮＡ抽出物のみを使用する場合、１６Ｓのすべてのヌルシフトまたは統計的に有意でない観察結果は陰性であると予想された。そのため、偽陰性の１６Ｓシフトはなかった。真陰性シフトはワークフロー全体で観察されたすべての１６Ｓシフトの９２．９〜１００％（平均、９７．３％）を占めたが、偽ネガティブＱＭＴシフトはワークフローごとに２０〜１３８（平均＝５２．２）の範囲だった。
【０１２１】
全体的なパフォーマンスを評価し、各ＱＭＴまたは１６Ｓシフトを正しく分類する際に各ワークフローの精度を比較する際に、いくつかの測定基準が考慮された。精度を向上させるためにＤＥＳＥｑ２またはｔ検定と組み合わせると、ＳＳＤＤおよびＳＳ１６ＵＰパイプラインは、感度と精度の点でＤＤＳＳパイプラインを上回った。配列処理パイプラインをｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑと組み合わせて、存在量の差の統計を生成すると、ランク付けされた精度、精度、感度の値が最低になった。修正された特異性測定基準（ＳＰＫ１６＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が作成され、ＱＭＴと１６Ｓの真陰性の存在を１つの測定基準に同時に要約した。逆偽陽性率と逆偽陰性率は、ＱＭＴと１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列について、それぞれ偽陽性と偽陰性の頻度を考慮した。ＳＳＵＰおよびＤＤＳＳ配列処理パイプラインは、特異度（ＳＰＫ１６＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ測定基準）および誤検出率（最低）に関して最高にランク付けされた。ただし、これらのレートは、すべてのパイプライン間でほとんど変化しなかった（＜０．１０）。０．２１（ＳＳＵＰ＋ｍｔｇＳｅｑ）から０．８８５（ＳＳ１６ＵＰ＋ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓ、ＳＳＤＤ：Ｑ５／Ｑ１０＋ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓ、およびＳＳＤＤ：Ｑ１０＋ＤＥＳｅｑ２．ｂｐ）の範囲の逆偽陰性率にかなりの変動が観察された。最終的に、結果として得られる標準的な分類指標に関して、他のすべてのパイプラインより優れた単一のパイプラインはなかった。
【０１２２】
ＱＭＴと１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の両方を分類する際の各ワークフローの精度を評価するために、修正された陽性予測測定基準（ＳＰＫ１６＿ＰＰＶ）が作成された。この修正されたＰＰＶ測定基準に関連するパフォーマンスは、最終的に、微生物叢分析パイプラインでのＤＤＳＳ：Ｑ２の承認と採用につながった（図３１）。ＤＤＳＳパイプラインは、様々な存在量分析手法と組み合わせて、ＳＳＤＤパイプラインの１つを除くすべてを上回った。ＳＳＵＰはＳＰＫ１６＿ＰＰＶ測定基準に関して印象的なパフォーマンスを示したが、このパイプラインのＱＭＴ検出率は著しく低くなった。さらに、ＤＤＳＳパイプラインのパフォーマンスは、品質しきい値（ｔｒｕｎｃＱ）が低下するにつれて向上した。
【０１２３】
ただし、パフォーマンスは高および中のＱＭＴ存在量レベルで一貫していたが、検査したすべての方法で、ＱＭＴの予測値は「超低」存在量レベルで急落した。
【０１２４】
示差的存在量分析に関しては、変化の程度を正確に評価することは、変化が発生したかどうかを判断することと同じくらい重要である。偽陰性と見なされるＱＭＴの結果は、ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓ（＞１５；図３２）を介して真の陽性と見なされるＱＭＴの結果で観察された結果と比較して、小さい効果サイズ（通常は存在量の＜３  ｌｏｇ−２倍の変化）を示すことがよくあった。そのため、各実験のＱＭＴシフト結果に基づく事後効果サイズのしきい値を適用することで、スプリアスヒットの誤検出を大幅に最小限に抑えることができる。誤検知は、ＳＳＤＤまたはＳＳ１６ＵＰワークフローよりもＤＤＳＳワークフローの効果サイズの範囲が狭く、ダウンストリームアプリケーションでの誤検知の影響を最小限に抑えるための効果サイズのしきい値の必要性を強調している。この目的のために、シグマとシータは、観察された効果量が期待された効果量と一致する程度を定量化する手段として評価された。
【０１２５】
配列処理および分析ワークフローは、複数の分類およびパフォーマンス検査の結果にわたる累積スコアに従ってランク付けされた（図３３、図３４、および図３５）。検査されたパイプラインのいずれも、考慮されたすべての測定基準に対して理想的な結果をもたらさなかった。ただし、分類学的参照データベースを介して注釈を読み取りマッピングする前に、配列データをＤＡＤＡ２ノイズ除去技術にかけると、評価されたすべての測定基準でパフォーマンスが向上した。検査された最低のＤＡＤＡ２値（ｑ＝２）は、最高の総合的なパフォーマンスをもたらした。ＤＥＳｅｑ２による統計的正規化は、検査された他のすべての手法よりも優れていることが証明された（ｎ＝３０、グループあたり１０）。
【０１２６】
上記で実施されたワークフローの体系的な評価に基づいて、ＤＥＳｅｑｅ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓを使用したパイプラインＤＤＳＳ：Ｑ２で最高の全体的なパフォーマンスが達成された。このアプローチは１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４超可変領域の配列に適用されるが、他のアンプリコン標的への適用に合わせて簡単に調整できる。試行錯誤された真の内部標準コントロールの必要性を認識し、試料の処理と分析に固有のバイアスを評価するために、その場（試料と同じチューブ）コントロール混合物を合成した。内部統制標準は、ハイブリダイゼーションとデータ収集の成功を確認するために、マイクロアレイベースの研究に日常的に適用されている。試料チューブ内での適用により、バイアスのより直接的な評価を提供することに加えて、設計は、他の利用可能な標準よりもはるかに大きな配列の多様性を含む（つまり、バイアス、信頼性などの優れた推定値を生成できる）。これらの進歩により、より堅牢な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン配列パイプラインが開発された。このパイプラインを使用すると、配列の実行ごとに精度を評価でき、微生物叢の信頼できる存在量差測定値を生成できる。
【０１２７】
微生物叢制御混合物
遺伝子配列テンプレートは、ＮＩＳＴストック材料から調達され、様々な濃度で調製され、事前定義されたコンソーシアムに体系的に混合され、マイクロアレイ内部標準コントロールとして使用された。これらの配列はすべて既知の非リボソーム起源であるため、活発にアッセイされている他の配列と競合することも、決して競合効果を発揮することもなかった。各コントロールテンプレートは、ＮＩＳＴ標準参照資料（ＳＲＭ  ２３７４）から供給された内部非リボソームＤＮＡ配列を持つ製造された人工プラスミド構成だった。ＰＣＲプライマーは、各ソースプラスミドから特定の長さとＧＣ含量の標的領域を増幅するように設計された。次に、これらのプラスミドを対応するプライマーでＰＣＲ増幅し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４超可変領域を標的とするプライマーを使用した後続の増幅を容易にする隣接領域を収容した。コントロールテンプレートは、既知の配列の変動性を適切に模倣するために、幅広いＧＣ含量（約３５〜６０％ＧＣ）にまたがっていた。ＰＣＲ増幅後、生成物をゲル精製および定量した。次に、得られたアンプリコン配列から３つの固有の微生物叢コントロール混合物を作成した。各アンプリコン配列は、最終濃度が６桁を超える濃度（ＰＣＲ反応あたり０．１〜１２０，０００コピー）の６９の異なる配列テンプレートすべてで構成されていた。少なくとも３つの固有の配列標準があり、それぞれがサンガー（＞４ｘ）および最終プールの深いイルミナ配列によって検証され、３つのカクテルすべての各存在量レベルに含まれていた。
【０１２８】
試料準備、配列、および配列処理
ＱＭＴの１つをスパイクした便由来のＤＮＡ抽出物を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４超可変領域を標的とするプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（ｎ＝１０）。３つの異なるＱＭＴが検査されたため、合計３０のＰＣＲライブラリが精製、定量化され、等モル方式でプールされ、イルミナＭｉＳｅｑで１回の実行で配列された。次に、生の読み取りが逆多重化され、以下に詳述する７つの配列処理ワークフローの１つを介して処理された。そのため、ワークフローごとに１つの存在量テーブルと１つのタクソノミーテーブルが作成された。
【０１２９】
デノボ配列クラスタリングＵＰＡＲＳＥを使用。  結果の配列読み取りは、ＵＳＥＡＲＣＨ  １０．０．２４０を使用してマージおよび方向付けされた（デフォルト設定を使用して、それぞれ−ｆａｓｔｑ＿ｍｅｒｇｅｐａｉｒｓおよび−ｏｒｉｅｎｔコマンド）。次に、ＵＳＥＡＲＣＨの−ｄｅｒｅｐ＿ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈおよび−ｓｏｒｔｂｙｓｉｚｅユーティリティを使用して、複製を解除し、サイズで並べ替える（シングルトンを破棄する）前に、予想される最大エラー（すなわち、１）に基づいて読み取りの品質をフィルタリングした。９７％の同一性しきい値でＯＴＵｓのデノボクラスタリングは、その後ＵＳＥＡＲＣＨで−ｃｌｕｓｔｅｒ＿ｏｔｕｓツールを用いて達成された。
【０１３０】
ＤＡＤＡ２を使用したＡＳＶの生成。  生の配列読み取りは、フィルタリング、学習エラー、重複排除、ＡＳＶ推論、およびキメラ除去のデフォルト設定を適用するＤＡＤＡ２で処理された。切り捨て品質（ｔｒｕｎｃＱ）は、特定の配列処理ワークフローに応じて２、５、または１０に設定された。次に、順方向と逆方向の両方で、各読み取りの各末端から１０ヌクレオチドをトリミングした。
【０１３１】
ひずみレベルの注釈。  採用された７つの配列処理ワークフローのうち４つ（ＳＳ１４−ｘｘまたはＳＳ１６−ｘｘと表記）の場合、読み取りは最初に社内の株データベースに対してマッピングされた。他の３つのワークフローの場合、生の読み取りは最初にＵＳＥＡＲＣＨユーティリティ（それぞれ−ｆａｓｔｑ＿ｍｅｒｇｅｐａｉｒｓと−ｏｒｉｅｎｔ）を使用してマージおよび方向付けされた。この第１の人口調査に続いて、すべての読み取りは、ＵＳＥＡＲＣＨを使用して、株固有の配列データベース（バージョン２０１４および２０１６、それぞれＳＳ１４およびＳＳ１６と省略）であるＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔに対してマッピングされた。ＳｔｒａｉｎＳｅｌｅｃｔは、既知の原核生物株の遺伝子配列決定、ゲノム配列決定、ドラフトゲノム、およびメタゲノムアセンブリから取得された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のリポジトリである。固有の株に一致する読み取りペアはそれに応じて割り当てられ、ＳＳ１４−ｘｘおよびＳＳ１６−ｘｘワークフローの後続のｄｅｎｏｖｏクラスタリングステップでは考慮されなかった。
【０１３２】
示差的存在量検査
前処理。  すべてのワークフローで、試料の少なくとも５％（つまり、２つまたはそれ以上）に存在するＯＴＵ、ＡＳＶ、株、またはＱＭＴ配列が分析で考慮されるように、有病率フィルタリングが適用された。各混合物比較グループで検出された陽性試料が３つ未満のＯＴＵ、ＡＳＶ、株、またはＱＭＴ配列の場合、比較グループごとに最も深い配列試料に１つの読み取りが追加され、３つの試料が全体的に陽性値を示した（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑの要件）。
【０１３３】
統計的検査。  コホート全体の存在量の差異を評価するために、５つの異なる統計的検定が適用された：ＤＥＳｅｑ２（ｖｅｒ。１．１８．１）スパースデータを軽減するために適用された正のカウントユーティリティ、ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓが適用されたＤＥＳｅｑ２、ｅｄｇｅＲ（ｖｅｒ。３．２０．５）、ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ（ｖｅｒ。１．２０．１）、およびＲ  ｓｔａｔｓパッケージを使用したｔ検定（ｖｅｒ。３．４．１）。ＤＥＳｅｑ２．ｐｏｓｃｏｕｎｔｓの場合、ＤＥＳｅｑ（）で示差的存在量検査を実行する前に、ｔｙｐｅ＝ｐｏｓｃｏｕｎｔｓを使用してｅｓｔｉｍａｔｅＳｉｚｅＦａｃｔｏｒｓ（）を適用した。Ｌｏｇ２の倍数変化値は、ＤＥＳｅｑ（）の結果にｌｆｃｓｈｒｉｎｋ（）を適用することによって調整された。ＤＥＳｅｑ２．ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓの場合、ＤＥＳｅｑ（）は、ｂｅｔａｐｒｉｏｒｓ＝ＴＲＵＥでの示差的存在量検査に使用された。ｅｄｇｅＲを使用した検査は、ＭｃＭｕｒｄｉｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅｓ  ２０１４（ＭｃＭｕｒｄｉｅ、Ｐ．Ｊ．＆Ｈｏｌｍｅｓ、Ｓ．（２０１４））の示差的存在量検査で概説されている手順に従って達成された。無駄にしない、したくない：微生物叢データの不正使用が許可されない理由。ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０（４）、ｅ１００３５３１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００３５３１）。ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑの場合、ｃｓｓ正規化は最初にｃｕｍＮｏｒｍ（）で適用され、次にｆｉｔＦｅａｔｕｒｅＭｏｄｅｌ（）を介した存在量の差異検査が行われた。対応のないｔ検定を実行し、ｇｔｏｏｌｓパッケージのｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ（）およびｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ２ｌｏｇｒａｔｉｏ（）ユーティリティを使用してｌｏｇ２ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅを計算した（ｖｅｒ。３．５．０）。次に、Ｒ  ｓｔａｔｓパッケージで定義されているように、メソッド＝”ＢＨ”を使用してｐ．ａｄｊｕｓｔ（）でｐ値を調整した。
【０１３４】
効果量の比較。  各ＱＭＴ比較の各分析ワークフロー内で観察された効果量の分布は、一元配置分散分析を使用して評価された。最初に、効果サイズ分布の違いを評価して、混同行列クラス内の配列処理と存在量の差異メソッドの相互作用を評価した（例えば、「真陽性のみ」の場合、ＡＮＯＶＡ式は「観察された効果サイズ」〜ＳｅｑＰｒｏｃ＊ＤＡ＿ｍｅｔｈｏｄとして評価された。続いて、ＡＮＯＶＡ検査を完了して、１）存在量差検査（ＤＡ＿ｍｅｔｈｏｄ）内の配列処理メソッド（ＳｅｑＰｒｏｃ）による違い、および２）配列処理メソッド内の存在量差検査メソッドによる違いを検査した。有意なｐ値が０．０５未満のＡＮＯＶＡについて、事後Ｔｕｋｅｙ検定を計算して、どの特定のグループが異なるかを特定した。
【０１３５】
パイプラインの比較とランキング
４０の異なるワークフローすべてについて、各ＱＭＴ比較（例えば、混合物Ａと混合物Ｂ、混合物Ｂと混合物Ｃ）は、調整されたｐ値とｌｏｇ２の倍数変化に基づいて、真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性と見なされた。ＱＭＴの比較で、調整されたｐ値＜０．０５および絶対ｌｏｇ２倍変化＞０が得られ、ＱＭＴが示差的に豊富であると予想された場合、真の陽性が得られた。すべてのライブラリは同じ糞便生体試料から供給されたため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンの存在量がグループ間で大幅に異なるとは予想されなかった。そのため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンを含む真陰性および偽陽性の比較の数も決定した。これらの６つの値は、以下に説明する測定基準を計算するために使用された。
【０１３６】
個々の測定基準計算
検出率は、ワークフローで検出されたＱＭＴ配列の数をＱＭＴ配列の総数（合計６９）で割ることによって計算された。
【０１３７】
感度は、真陽性のＱＭＴ比較の総数を、予想される示差的に豊富なＱＭＴ比較の総数で割ることによって計算された。
【０１３８】
Ｓｐｋ１６＿Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙは、真陰性のＱＭＴと１６Ｓ  ｒＲＮＡの比較の合計を、示差的に豊富であるとは予想されなかったＱＭＴと１６Ｓ  ｒＲＮＡの比較の合計で割ることによって計算された。
【０１３９】
偽陰性率は、偽陰性ＱＭＴ比較の総数を、予想される示差的に豊富なＱＭＴ比較の総数で割ることによって計算された。
【０１４０】
正確さは、真陽性と真陰性の合計比較の合計を、示差的に豊富であると予想され、示差的に豊富でないと予想される合計ＱＭＴ比較の合計で割ることによって計算された。
【０１４１】
精度は、真陽性の比較の総数を真陽性の合計と偽陰性の合計で割ることによって計算された。
【０１４２】
１６Ｓ偽陽性率は、偽陽性の１６Ｓｒ  ＲＮＡ遺伝子配列比較の総数を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列比較の総数で割ることによって計算された。逆１６Ｓ偽陽性率は、１から１６Ｓ偽陽性率を差し引くことによって決定された。
【０１４３】
Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ（陽性予測値）は、真陽性の合計／（真陽性の合計＋偽陽性の合計＋偽陽性の合計１６Ｓ比較）として計算された。
【０１４４】
シータとシグマは、観測されたｌｏｇ２ＦＣと予想されたｌｏｇ２ＦＣの線形回帰から計算された。シータは、この回帰の傾きを絶対（ａｔａｎ（（（傾き−期待される傾き）／（１＋期待される傾き＊傾き））））＊（１８０／π）として計算され、予想される傾きは１だった（観測されたｌｏｇ２ＦＣ＝予想されるｌｏｇ２ＦＣ）。正規化されたシータは１−（シータ／１８０）として計算された。シグマは、傾きが１の線と比較した各スパイク比較の残差誤差の合計の平方根として計算された（観測されたｌｏｇ２ＦＣ＝期待されたｌｏｇ２ＦＣ）。正規化されたシグマは、４０の一意のワークフローすべてのシグマ値に関連して計算された。正規化されたシグマ＝１−（シグマ−最小シグマ）／（最大信号−最小シグマ）。
【０１４５】
全体的なパイプラインスコアは次のように計算された。
（正規化シータ）＋（正規化シグマ）＋検出率＋感度＋Ｓｐｋ１６＿特異度＋正確さ＋精度＋Ｓｐｋ１６＿ＰＰＶ＊２−（偽陽性  １６Ｓ  率＊２＋偽陰性率）。最高得点は８点だった。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
2022502027.tif 000062
【図２８】
2022502027.tif 000063
【図２９】
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【図３０】
2022502027.tif 000065
【図３１】
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【図３２Ａ】
2022502027.tif 000067
【図３２Ｂ】
2022502027.tif 000068
【図３３】
2022502027.tif 000069
【図３４】
2022502027.tif 000070
【図３５】
2022502027.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月25日(2021.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2022502027000001.app
【国際調査報告】
2022502027.tif 000072
2022502027.tif 000073
2022502027.tif 000074
2022502027.tif 000075
2022502027.tif 000076
2022502027.tif 000077