【手続補正書】
【提出日】平成22年10月15日(2010.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）のコグネイト対を哺乳動物宿主細胞に提供する方法であって、
（ａ）１種以上の真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される候補Ｏ−ＲＳメンバーのライブラリーを１種以上の酵母宿主細胞で発現させる段階と；
（ｂ）前記酵母宿主細胞に対して直交性の第１のＯ−ｔＲＮＡを前記酵母宿主細胞で発現させる段階と；
（ｃ）非天然アミノ酸の存在下で前記酵母宿主細胞を培養する段階と；
（ｄ）前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを前記ライブラリーから選択する段階と；
（ｅ）活性Ｏ−ＲＳメンバーの少なくとも１個を第２の真正細菌Ｏ−ｔＲＮＡと共に哺乳動物宿主細胞で発現させることにより、コグネイト対を提供する段階を含み、前記第２の真正細菌Ｏ−ｔＲＮＡは前記哺乳動物宿主細胞を前記非天然アミノ酸の存在下で培養した場合に前記Ｏ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される前記方法。
【請求項２】
前記真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットの１個以上のアミノ酸位置を部位特異的突然変異誘発により突然変異させることにより前記候補Ｏ−ＲＳメンバーを作製する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであり；あるいは
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが大腸菌ｔＲＮＡから誘導され、第２のＯ−ｔＲＮＡがバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｔＲＮＡから誘導され；あるいは
前記哺乳動物宿主細胞が齧歯類宿主細胞又は霊長類宿主細胞であり；あるいは
前記哺乳動物宿主細胞がラット宿主細胞、マウス宿主細胞及びＣＨＯ宿主細胞から選択される齧歯類宿主細胞であり；あるいは
前記哺乳動物宿主細胞がヒト宿主細胞、チンパンジー宿主細胞、ボノボ宿主細胞、ゴリラ宿主細胞、オランウータン宿主細胞、テナガザル宿主細胞、マカクザル宿主細胞、タマリン宿主細胞、マーモセット宿主細胞、及び２９３Ｔ宿主細胞から構成される群から選択される霊長類宿主細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非天然アミノ酸が、
ｉ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
ｉｉ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
ｉｉｉ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
ｉｖ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
ｖ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；及び
ｖｉ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）
から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非天然アミノ酸が、
ｉ）α−アミノカプリル酸；
ｉｉ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
ｉｉｉ）１，５−ダンシルアラニン；及び
ｉｖ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択段階が前記活性Ｏ−ＲＳメンバーをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含み；あるいは
前記選択段階が前記１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーをコードするポリヌクレオチドを選択する段階を含み；あるいは
活性Ｏ−ＲＳメンバーの少なくとも１個を哺乳動物宿主細胞で発現させる前記段階が該当蛋白質をコードする核酸の存在下で発現させる段階を更に含み、前記核酸が第２の真正細菌Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）（ｉ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
（ｉｉ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
（ｉｉｉ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
（ｉｖ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
（ｖ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
（ｖｉ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
（ｖｉｉ）α−アミノカプリル酸；
（ｖｉｉｉ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
（ｉｘ）１，５−ダンシルアラニン；及び
（ｘ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｃ）真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞
を含む翻訳系。
【請求項８】
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項７に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされ；あるいは
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導され；あるいは
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含み；あるいは
前記宿主細胞が該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項７に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記宿主細胞が第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸と、第２のＯ−ＲＳと、第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸によりコードされるセレクターコドンを認識する請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含み；あるいは
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含み；あるいは
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み；あるいは
前記齧歯類宿主細胞がラット宿主細胞、マウス宿主細胞及びＣＨＯ宿主細胞から選択され；あるいは
前記霊長類宿主細胞がヒト宿主細胞、チンパンジー宿主細胞、ボノボ宿主細胞、ゴリラ宿主細胞、オランウータン宿主細胞、テナガザル宿主細胞、マカクザル宿主細胞、タマリン宿主細胞、マーモセット宿主細胞及び２９３Ｔ宿主細胞から選択される請求項７に記載の翻訳系。
【請求項１２】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産方法であって、
（ａ）（ｉ）Ａ）ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；
Ｂ）ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；
Ｃ）ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；
Ｄ）ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；
Ｅ）ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；
Ｆ）ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；
Ｇ）α−アミノカプリル酸；
Ｈ）ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；
Ｉ）１，５−ダンシルアラニン；及び
Ｊ）ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）
から構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸（但し、前記核酸におけるセレクターコドンの位置は前記蛋白質における選択位置に対応する）と；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含み、齧歯類細胞と霊長類細胞から選択される宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）前記非天然アミノ酸、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの存在下で前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１３】
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号５７〜１０１のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観測される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされ；あるいは
第１のＯ−ＲＳを準備する段階が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含み；あるいは
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導され；あるいは
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５７〜１０１に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体の群から選択されるアミノ酸配列を含み；あるいは
第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含み；あるいは
第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含み、前記ポリヌクレオチドが配列番号８〜５６に記載のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含み；あるいは
第１のＯ−ＲＳを準備する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、その結果として得られるＯ−ＲＳとして、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記第１のＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１のＯ−ｔＲＮＡを準備する前記段階が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含み；あるいは
前記蛋白質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含み、前記方法が前記第２の非天然アミノ酸と第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを準備する段階を更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識し；あるいは
前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の非天然アミノ酸がフォトケージドアミノ酸を含み、前記方法が宿主細胞に紫外線を照射する段階を更に含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞に紫外線を照射する段階が宿主細胞における蛋白質活性の空間制御を提供する請求項１７に記載の方法。