(57)【要約】  本発明は、ＰＤＧＦ受容体に対する抗体、前記ＰＤＧＦ受容体に対する抗体に化学療法剤を接合した抗体−薬物接合体およびこれを用いた血管新生性疾患の予防または治療用途に関する。
2022502457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＰＤＧＦＲ−β）を特異的に結合し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片：
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、１０、１８、２６、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４、１２、２０、２８、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、１４、２２、３０、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
【請求項２】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤＧＦＲ−βの細胞外領域に特異的に結合するものである、請求項１に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ−ＢＢと非−競争的に結合するものである、請求項１に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片の
重鎖可変領域は、配列番号１、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
軽鎖可変領域は、配列番号４、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含むものである、
請求項３に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞によって内在化されるものである、請求項１に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片の
重鎖可変領域は、配列番号１、１７、２５、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、１８、２６、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１９、２７、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
軽鎖可変領域は、配列番号４、２０、２８、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、２１、２９、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、２２、３０、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含むものである、
請求項５に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体は、完全な抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４形態である、請求項１に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体の抗原結合断片は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に順次に軽鎖可変領域（ＶＬ）、リンカーおよび重鎖可変領域（ＶＨ）を含むｓｃＦｖである、請求項８に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、化学療法薬物、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、酵素、ペプチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識が接合されたものである、請求項８に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記ハプテンは、ＰＤＧＦＲ−βに特異的に結合するものである、請求項１０に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ハプテンは、コチニン、ＤＮＰ（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ＴＮＰ（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ｂｉｏｔｉｎ、またはｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎである、請求項１０に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記ハプテンは、化学療法薬物が結合したものである、請求項１０に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＰＤＧＦＲ−β）を特異的に結合する抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片と、化学療法薬物に対するハプテンに対する抗体またはその抗原結合断片を含む、抗−ＰＤＧＦ受容体と前記ハプテンとを特異的に結合する二重特異抗体。
【請求項１５】
抗−ＰＤＧＦ受容体抗体の抗原結合断片とハプテンに結合する抗体の抗原結合断片を含むものである、請求項１４に記載の二重特異抗体。
【請求項１６】
前記二重特異抗体は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体のｓｃＦｖと、化学療法薬物に対するハプテンに対する抗体のｓｃＦｖとが直接または第１リンカーを介して連結されたものである、請求項１５に記載の二重特異抗体。
【請求項１７】
前記二重特異抗体は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体のｓｃＦｖのＣ−末端と、化学療法薬物に対するハプテンに対する抗体のｓｃＦｖのＮ−末端とが第１リンカーを介して連結されたものである、請求項１６に記載の二重特異抗体。
【請求項１８】
抗−ＰＤＧＦ受容体抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が第２リンカーを介して連結されたｓｃＦｖと、抗−コチニン抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が第３リンカーを介して連結されたｓｃＦｖとが、第１リンカーを介して連結された二重特異抗体であって、
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、１０、１８、２６、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４、１２、２０、２８、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、１４、２２、３０、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含むものである、請求項１７に記載の二重特異抗体。
【請求項１９】
前記化学療法薬物は、ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ、ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ、ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ（ＰＢＤ）、ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ、ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ａｍａｔｏｘｉｎ、ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ、ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ、ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ、ＳＮ−３８、５−Ａｍｉｎｏｌａｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＬＡ）、Ｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍｏｎｏａｃｉｄ  ｒｉｎｇ  Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、Ｃｈｌｏｒｉｎｓ、Ｔｅｔｒａ（ｍ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｌｏｒｉｎ（ｍＴＨＰＣ）、またはＬｕｔｅｔｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎである、請求項１４に記載の二重特異抗体。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片を含むＰＤＧＦ受容体を発現する細胞に薬物を伝達する薬物伝達体。
【請求項２１】
前記薬物免疫療法剤または化学療法剤である、請求項２０に記載の薬物伝達体。
【請求項２２】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体は、化学療法薬物に対するハプテンに対する抗体またはその抗原結合断片を追加的に含み、抗−ＰＤＧＦ受容体と前記ハプテンとを特異的に結合するものである、請求項２０に記載の薬物伝達体。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片、または請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片と薬物に対するハプテンに対する抗体またはその抗原結合断片を含む、抗−ＰＤＧＦ受容体と前記ハプテンとを特異的に結合する二重特異抗体と薬物を含む眼球の血管新生性疾患の予防、改善または治療用薬学組成物。
【請求項２４】
前記眼球の血管新生性疾患は、虚血性網膜病症、紅彩血管新生、眼内血管新生、老人性黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜虚血または増殖性糖尿病性網膜病症である、請求項２３に記載の薬学組成物。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片、または請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片と薬物に対するハプテンに対する抗体またはその抗原結合断片を含む、抗−ＰＤＧＦ受容体と前記ハプテンとを特異的に結合する二重特異抗体と、化学療法薬物を含む癌疾患の予防、改善または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＧＦ受容体に対する抗体、前記ＰＤＧＦ受容体に対する抗体に化学療法剤を接合した抗体−薬物接合体およびこれを用いた眼球の血管新生性疾患の予防または治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）とも呼ばれる血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管から突出部が形成され、これらが周辺組織に浸潤する段階を伴う。これと関連がある過程の脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、組織全体にすでに存在している内皮細胞と血管芽細胞が分化し、以降にはこれらが共に連結されながら血管が形成される段階を伴う。
【０００３】
血管形成は発生中に広範囲に行われ、また、健康な身体においても損傷や傷害後に組織への血流復旧のための創傷治癒の間に行われる。しかし、血管形成は癌および腫瘍形成とも関連がある。
【０００４】
各種眼球障害は、血管形成における変更を伴う。例えば、成人失明の原因の一つである糖尿病性網膜病症は過度の血管形成と関連がある。非増殖性網膜病症は網膜内の血管周囲細胞の選択的消失を伴い、このような消失によって関連毛細管が拡張して血流が増加する。拡張された毛細管では内皮細胞が増殖し嚢状突出を形成して微細動脈瘤になり、隣接毛細管が遮断されてこれら微細動脈瘤周辺の網膜領域で灌流が起こらない。実際に、微細動脈瘤の隣接領域の間では短絡血管が現れ、初期糖尿病性網膜病症の臨床的像は微細動脈瘤および灌流されない網膜領域があることが分かる。微細動脈瘤で漏出が生じて毛細血管が裂けることがあり、滲出と出血を起こしかねない。増殖性糖尿病性網膜病症は、網膜の一部領域が引き続き毛細血管を消失し灌流されない状態になり、ディスクおよび網膜上の他の領域で新しい血管が現れる時に発生する。このような新しい血管は、ガラス質および出血部位に成長しやすくて網膜前出血を起こす。増殖性糖尿病性網膜病症が進展すれば、過度のガラス質出血がガラス体腔内の大部分を満たすことがある。また、新しい血管は牽引性網膜剥離を起こしうる繊維状組織の増殖を伴う。
【０００５】
黄斑浮腫および増殖性糖尿病性網膜病症の早期治療は９５％の患者で５年間失明を予防するが、治療が遅れればたった５０％の患者でのみ失明が予防される。したがって、早期診断および早期治療が必須である。
【０００６】
血管新生に伴う他の眼球障害は、老人性黄斑変性（ＡＭＤ）である。ＡＭＤは、網膜の中央領域である黄斑で起こる一連の病理変化を特徴とし、特に中心部視力に影響を及ぼす視力問題を伴う。網膜色素上皮は、ＡＭＤで厚くなり、硬化する基底膜複合体のブルッフ膜上に存在する。新しい血管は、豊富な血管層を含有する下側脈絡膜からブルッフ膜を通過しながら生成されることがある。次に、これら血管は網膜色素上皮の下側のみならず網膜色素上皮と感覚性網膜との間で乳液を漏出させたり出血を起こすことがある。以降の線維性瘢痕形成は、光受容体細胞への栄養分の供給を遮断して、これら細胞を死滅させて中心部視力の喪失を招く。このような類型の老人性黄斑病症は、漏出血管および網膜下浮腫または血液のため、「湿性（ｗｅｔ  ｔｙｐｅ）」と呼ばれる。「乾性（ｄｒｙ  ｔｙｐｅ）」老人性黄斑病症は、網膜色素上皮がその上に存在する光受容体細胞の消失とともに崩壊することを伴う。このような乾性は視力を低下させる。
【０００７】
このような血管形成調節子の中で、信号伝達分子のＰＤＧＦ族に属するＰＤＧＦ−Ｂ構成員の役割が研究されているが、これらがたまに壁在性細胞、例えば、血管平滑筋、血管間細胞および血管周囲細胞とも称される血管周囲細胞の形成、増殖および適当な機能を行ううえで所定の役割を果たすとされるからである。
【０００８】
ＰＤＧＦファミリー（ｆａｍｉｌｙ）は、単量体ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄと、二量体ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤから構成されている。ＰＤＧＦ二量体の結合により、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ受容体αとβに結合する。前記ＰＤＧＦ受容体はチロシンリン酸化酵素の一種で、αα、ββおよびαβ二量体として３つの組み合わせを形成することができる。ＰＤＧＦ受容体の細胞外領域は、５つの免疫グロブリン様領域から構成されており、細胞内領域は、チロシンリン酸化領域を含んでいる。受容体のリガンド結合部位は、最初３つの免疫グロブリン様領域に位置する。ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と３に結合して受容体の二量体化を誘導し、追加的な安定化のために、免疫グロブリン様ドメイン４と５を含む直接的な受容体−受容体の相互作用を誘導する。
【０００９】
ＰＤＧＦ−ＣＣは特に、ＰＤＧＦ受容体−ααおよびＰＤＧＦ受容体−αβと相互作用するが、ＰＤＧＦＲ−ββとは相互作用しないので、ＰＤＧＦ−ＡＢと類似している。ＰＤＧＦ−ＤＤは、ＰＤＧＦＲ−ββと高い親和力で結合し、ＰＤＧＦ受容体−αβとははるかに低い程度で結合するので、ＰＤＧＦＲ−ββに特異的と見なされる。ＰＤＧＦ−ＡＡは、単にＰＤＧＦ受容体−ααとのみ結合し、ＰＤＧＦ−ＢＢは唯一すべての３つの組み合わせの受容体と高い親和力で結合する。
【００１０】
ＰＤＧＦとＰＤＧＦ受容体との間の過度の信号は、腎臓細胞癌腫、肺癌、膠芽腫、慢性リンパ性白血病、前立腺癌のような多くの癌において重要な役割を果たす。ＰＤＧＦ受容体は、腫瘍成長、関連血管、ｓｔｒｏｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（間質線維芽細胞）などに直接影響を与えて腫瘍持続力を促進することによって腫瘍成長を促進する。
【００１１】
ＰＤＧＦとＰＤＧＦ受容体の信号伝達を標的とする単クローン抗体として、Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ（ＩＭＣ−３Ｇ３、ＬａｒｔｒｕｖｏＴＭ）は、ＰＤＧＦ受容体αと特異的に結合し、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−ＣＣの結合および受容体の活性化を防止しＰＤＧＦＲ−βと交差反応しないα−ＰＤＧＦＲに対する組換え型ヒトＩｇＧ１抗体である。Ｏｌａｒａｔｕｍａｂとドキソルビシンの併用療法がドキソルビシンの単独使用に比べて全体平均生存率を大きく向上させたという後期軟部組織肉腫のＩｂ／ＩＩ段階の研究結果に基づき、Ｏｌａｒａｔｕｍａｂは２０１６年１０月に米国で初めて癌治療承認を受けた。
【００１２】
抗体−薬物接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＤＣｓ）は、細胞毒性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ）−単一抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含む治療剤であって、非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）毒性を最小化しながら、標的抗原を発現する癌細胞に毒性剤を伝達する治療剤である。
【００１３】
最適化抗体−薬物接合体開発のためには、抗体、リンカー、結合部位、腫瘍の種類、抗原発現率、毒性物、薬物−抗体比率（ｄｒｕｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）などの複雑な考慮事項がある。例えば、結合部位は、結合率、親和力、安定性に影響を与える。薬物−接合体は、細胞内に内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）して薬物を放出するため、毒性効能は薬物をどれだけ効果的に細胞内に伝達するかが重要である。また、細胞表面にある同一ターゲット抗原にくっつく抗体同士も内在化効率性が異なる。かくして、効率的に内在化する抗体を選別することは、抗体−薬物複合体の効能に極めて重要である。薬物の細胞毒性効能は、標的抗原に対する抗体−薬物接合体の再循環（ｒｅｃｙｃｌｅ）と細胞内輸送（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などの多くの要因があるため、内在化する抗体の毒性率を精密に測定する方法は、実際の抗体−薬物接合体を作製した後に確認することができる。残念ながら、様々な種類の抗体を用いた抗体−薬物接合体の候補物質を作るのに多くの努力と時間が費やされている。
【００１４】
現在流通しているＰＤＧＦＲ−β治療剤は、ＰＤＧＦリガンドの対抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）効果に集中しており、ＰＤＧＦＲ−βの内在化に効率的に内在化することができない。よって、ＰＤＧＦＲβに効率的に内在化してＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞の内部に抗体または抗体と薬物接合体を伝達できる抗体の開発が求められるのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の一例は、抗−ＰＤＧＦ受容体、詳しくは、ＰＤＧＦ受容体−βを特異的に認識する抗体または抗体の抗原結合断片に関する。
【００１６】
本発明のさらなる例は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体に関する。前記抗体−薬物接合体は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体に薬物が非共有的または共有的結合で結合した結合体であってもよい。
【００１７】
本発明のさらに他の例は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはこれら抗体の抗原結合断片は、薬物と接合できるヘプテンを特異的に認識する抗体または抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体であってもよい。
【００１８】
前記抗体の抗原結合断片は、抗原結合部位は少なくとも１つのＣＤＲを有する抗体の部位を意味し、これは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２であってもよい。
【００１９】
本発明の一例は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体を含む、ＰＤＧＦ受容体、詳しくは、ＰＤＧＦ受容体−βを細胞表面に有し、細胞または組織に薬物を伝達する薬物伝達体の用途に関する。前記薬物伝達体は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはこれら抗体の抗原結合断片は薬物と接合できるヘプテンを特異的に認識する抗体または抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体であってもよい。前記薬物伝達体がヘプテンを認識する抗体またはその抗原結合断片が結合したものである場合、前記薬物は、ヘプテンと結合してヘプテンを介して抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片に結合して標的細胞または組織に伝達されるものであってもよい。前記標的細胞に伝達される薬物は、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ受容体関連疾患、例えば、血管新生性疾患の予防、改善または治療用薬物であってもよい。前記薬物は、免疫療法剤または化学療法剤であってもよいし、前記免疫療法剤は、抗体であってもよい。
【００２０】
本発明の一例は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片にヘプテンを介して薬物が接合された抗体−薬物接合体を含む、血管新生性疾患の予防、改善または治療用薬学組成物に関する。
【００２１】
本発明の一例は、血管新生性疾患を患っていると診断されたか、血管新生性疾患の発病の危険がある対象を治療する方法であって、前記対象に１次治療剤または補助治療剤として前記疾患を予防、改善または治療するのに十分な量で、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片にヘプテンを介して薬物が接合された抗体−薬物接合体を投与する段階を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２３】
本発明の一例は、抗−ＰＤＧＦ受容体、詳しくは、ＰＤＧＦ受容体−β（ＰＤＧＦＲ−β）を特異的に認識する抗体または抗体の抗原結合断片に関する。
【００２４】
本発明で使用された「抗体」は、抗原の刺激により作られる物質である。抗体の例としては、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを含み、これに限定されない。
【００２５】
また、分離された抗原結合部位も、本発明の抗体の範疇内に属する。相補性領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）は、抗原特異性に重要な抗体の可変部位（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。前記説明された抗原結合部位は、少なくとも１つのＣＤＲを有する抗体の部位を意味し、これは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２であってもよいし、好ましくは、ｓｃＦｖであってもよい。前記抗体は、多クローン抗体または単クローン抗体であってもよい。前記抗体は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）から選択されたものであってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態であってもよい。
【００２６】
本発明に使用された、抗体または免疫グロブリンの鎖（重鎖または軽鎖）の「抗原結合断片」は、全長鎖と比較して一部のアミノ酸が欠如したが、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含むものである。このような抗原結合断片は、標的抗原に特異的に結合でき、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的に活性があるといえる。具体的には、前記抗原結合断片は、前記相補性決定領域を１つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定しない。このような生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または例えば完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片はこれに限定しない。
【００２７】
非−ヒト（例えば、ニワトリ、マウス、ラットなど）抗体の「ヒト化」形態は、非−ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２または抗体のその他の抗原−結合結果物）である。概して、ヒト化抗体は、受容子抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和度および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非−ヒト種（供与子抗体）のＣＤＲからの残基に代替されたヒトイムノグロブリン（受容子抗体）である。いくつかのケースにおいて、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、相応する非−ヒトＦＲ残基に代替される。また、ヒト化抗体は、受容子抗体においても、導入されたＣＤＲまたはＦＲ配列でも発見されない残基を含むこともできる。前記変形を行って抗体の性能を追加的に精練し最適化することができる。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非−ヒトイムノグロブリンの領域に相応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ残基がヒトイムノグロブリンコンセンサス配列の残基である少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、最適にはイムノグロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒトイムノグロブリンの少なくとも一部を含む。
【００２８】
本発明は、ＰＤＧＦＲ−β  ｉｓｏｆｏｒｍの細胞外領域（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に対する抗体である。ＰＤＧＦ受容体はチロシンリン酸化酵素の一種で、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βの２つのｉｓｏｆｏｒｍがあり、これらはαα、ββおよびαβ二量体として３つの組み合わせを形成することができる。ＰＤＧＦ受容体の構造は、５つの免疫グロブリン様ドメインから構成された細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域（チロシンリン酸化領域）を含んでいる。受容体のリガンド結合部位は、細胞外領域を構成する５つの免疫グロブリン様ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ）のうち、前方に位置する３つの免疫グロブリン様領域に位置する。ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と３に結合して受容体の二量体化を誘導し、さらなる安定化のために、免疫グロブリン様ドメイン４と５を含む直接的な受容体−受容体の相互作用を誘導することが知られている。
【００２９】
本発明による抗体は、ファージディスプレイ技術（文献［ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３］）を用いて、試験管内で非免疫化された供与子からのイムノグロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体断片を生産することができる。
【００３０】
本発明は、ＰＤＧＦＲ−βに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関し、前記抗体または抗原結合断片は、重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含み、ＰＤＧＦＲ−βに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
【００３１】
具体的な一例は、抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体およびその抗原結合断片は、
（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３からなる群より選択された１つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３からなる群より選択された１つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域；
前記１つ以上の重鎖相補性決定領域および前記１つ以上の軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせ
を含むものであってもよい。
【００３２】
追加的に、前記重鎖可変領域、前記軽鎖可変領域、または前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせにおいて、前記重鎖可変領域は、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３およびＨ−ＦＲ４からなる群より選択された１つ以上の重鎖フレームワークを含むことができ、前記軽鎖可変領域は、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４からなる群より選択された１つ以上の軽鎖フレームワークを含むことができる。
【００３３】
本発明による（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２またはＨ−ＣＤＲ３の重鎖相補性決定部位は、下記表１および表２に記載のアミノ酸配列の中から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。また、（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３の軽鎖相補性決定部位は、下記表１および表２に記載のアミノ酸配列の中から選択されるか、前記選択されたアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明において、単鎖Ｆｖは、重鎖および軽鎖可変領域が直接またはリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態で連結されたｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマーのような構造（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、および重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態で連結されたｓｃＦｖ−Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。単鎖Ｆｖは、重鎖および軽鎖可変領域がリンカーによって連結可能であり、リンカーは特に限定されず、例えば、下記表２の配列番号５７のアミノ酸配列を有するリンカー配列であってもよい。
【００３５】
本発明において、標的抗原の一例として、マウスまたはヒトの血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＰＤＧＦＲ−β）に対する抗体を含み、前記抗体のｓｃＦｖを二重特異抗体の製造に使用することができる。例えば、ｓｃＦｖは、抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を有するｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎと、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を有するｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎとがリンカーで連結されている抗体であってもよい。追加的に、二重特異抗体として、（抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体のｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニン抗体のｓｃＦｖ）の融合タンパク質は、各抗体のｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎの３つのＣＤＲおよびｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの３つのＣＤＲを含むことができ、これは、下記表２に明示されたようにＣκで連結可能である。
【００３６】
具体的な一例において、本発明による標的抗原の一例であるマウスＰＤＧＦＲ−β（ｍＰＤＧＦＲ−β）に対する抗体の具体的な一例は、ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３であり、これらの重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびこれら領域のＣＤＲ配列を下記表１に示す。
【００３７】
【表１−１】
2022502457.tif 000003
【表１−２】
2022502457.tif 000004
【００３８】
前記ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３抗体のうち、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争して、結合部位がＰＤＧＦＲ−βの免疫グロブリン様ドメイン２および／または３と見なされ、ＰＲｂ−ＣＮ０１は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、ＰＤＧＦＲ−βの免疫グロブリン様ドメイン１、４または５に結合すると予想される。ＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−３２は、いずれもｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく同一の毒性を示し、ＰＲｂ−ＣＮ０１およびＰＲｂ−３２は、代理抗体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）であることを確認した（図２０Ａ、図２０Ｂ）。
【００３９】
本発明による新規な抗体、例えば、ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３抗体、抗体断片、その混合物または誘導体は、抗−コチニン抗体と二重抗体を製造した場合に、ＰＤＧＦ受容体に対して１ｘ１０−７Ｍ〜１ｘ１０−１０Ｍの範囲の結合親和性を有する。
【００４０】
前記ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３抗体はエンドソームを介して細胞内在化することを確認したが、ＰＲｂ−ＣＣ０１は内在化されないことを確認した。薬物−接合体は、細胞内に内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）して薬物を放出するため、毒性効能は薬物をどれだけ効果的に細胞内に伝達するかが重要である。また、細胞表面にある同一ターゲット抗原にくっつく抗体同士も内在化効率性が異なる。かくして、効率的に内在化する抗体を選別することは、抗体−薬物複合体の効能に極めて重要である。
【００４１】
また、前記ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３抗体は細胞毒性を示し、４つの抗体のうち、特にＰＲｂ−ＣＮ０１がｃｏｔｉｎｉｎｅ−ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎとｃｏｍｐｌｅｘを形成する場合、最も高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すため、ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎのような薬物の最も効果的な標的化伝達体として考えられる。ｍＰＤＧＦ−ＢＢを追加した後にも、ｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと複合体をなしたＰＲｂ−ＣＮ０１含有二重抗体の細胞毒性は依然として高かったが、ｍＰＤＧＦ−ＢＢを追加すれば、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争するｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと複合体をなした３つの抗体（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３）の毒性がやや減少した。本発明において、ＰＲｂ−ＣＮ０１を含む二重抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、ＰＤＧＦ−ＢＢと関係なく細胞毒性を誘発した（図５Ａ〜図５Ｄ）。
【００４２】
本発明による標的抗原の一例であるヒトＰＤＧＦＲ−β（ｈＰＤＧＦＲ−β）に対する抗体の具体的な一例は、ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６であり、これらの重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびこれら領域のＣＤＲ配列を下記表２に示す。
【００４３】
【表２−１】
2022502457.tif 000005
【表２−２】
2022502457.tif 000006
【００４４】
前記ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６抗体は、いずれもｈＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、よって、ｈＰＤＧＦＲ−βの免疫グロブリン様ドメイン１、４または５に結合すると予想される。前記ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６抗体は、いずれもｈＰＤＧＦＲ−β、ｍＰＤＧＦＲβ、レサスＰＤＧＦＲβ、サイノモルガスＰＤＧＦＲβおよびスーススクローファＰＤＧＦＲ−βに結合することが確認される。ＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−３２は、いずれもｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく同一の毒性を示し、ＰＲｂ−ＣＮ０１およびＰＲｂ−３２は、代理抗体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）であることを確認した（図２０Ａ、図２０Ｂ）。
【００４５】
本発明による新規な抗体、例えば、ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６抗体、抗体断片、その混合物または誘導体は、抗−コチニン抗体と二重抗体を製造した場合に、ＰＤＧＦ受容体に対して１ｘ１０−７Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍの範囲の結合親和性を有する。
【００４６】
本発明による標的抗原の一例であるヒトＰＤＧＦＲ−β（ｈＰＤＧＦＲ−β）に対する抗体の細胞内在化性能評価において、ｈＰＤＧＦ−ＢＢがない場合、ＰＲｂ−ＣＮ３２がｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｃｙｔｅ細胞に内在化を最も良くし、その次にＰＲｂ−ＣＮ１６であり、ＰＲｂ−ＣＮ２６は内在化しない。また、細胞内在化性能評価でｈＰＤＧＦ−ＢＢを共に処理した場合、ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６抗体は、いずれも細胞内在化性能に優れている。薬物−接合体を製造する場合、細胞内に内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）して薬物を放出するため、本発明によるｈＰＤＧＦＲ−β抗体が標的細胞に移動して内在化が良くなるので、前記抗体を用いて薬物−接合体を製造する場合、細胞内に内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）して細胞内に薬物を放出するため、薬物の効能増加に寄与する。Ｗｅｔ  ｔｙｐｅ  ＡＭＤおよびＰＤＧＦＲ−βが問題になる疾患を有する患者はＰＤＧＦＲ−βの発現レベルの増加および／またはＰＤＧＦ−ＢＢの発現レベルが増加し、この増加した発現レベルにより抗体の内在化または効能が抑制される傾向がある。これに関連し、本発明による抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢの発現レベルが増加しても、抗体の内在化レベルが抑制されなかったり、内在化がさらに増加するという利点がある。
【００４７】
前記ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２およびＰＲｂ−ＣＮ２６抗体のうち、特にＰＲｂ−ＣＮ３２とＰＲｂ−ＣＮ２６がｃｏｔｉｎｉｎｅ−ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎとｃｏｍｐｌｅｘを形成する場合、最も高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すので、ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎのような薬物の最も効果的な標的化伝達体として考えられる。
【００４８】
前記ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６のすべては、ＰＤＧＦＲ−βの発現細胞株においてｈＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく対照抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、高い毒性を示し、特にＰＲｂ−ＣＮ２６とＰＲｂ−ＣＮ３２が高い細胞毒性を示す（図１４Ａおよび１４Ｂ）。また、前記ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６のすべては、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しない細胞株において対照抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、細胞毒性が同等である。よって、ｈＰＤＧＦＲｂ非発現細胞株とｈＰＤＧＦＲｂ発現細胞株に対する二重抗体−薬物の毒性（ＩＣ５０）の差を有し、ｈＰＤＧＦＲｂを発現する細胞により低い濃度で毒性を示して、当該濃度では正常細胞または正常組織には毒性を最小化しながら、ｈＰＤＧＦＲ−βが多く発現する病的な細胞または組織に特異的により多くの毒性を示す。また、Ｗｅｔ  ｔｙｐｅ  ＡＭＤおよびＰＤＧＦＲ−βが問題になる疾患を有する患者は、ＰＤＧＦＲ−βの発現レベルの増加（Ｃ．Ｚｅｈｅｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５５（２０１４）３３７−４４）および／またはＰＤＧＦ−ＢＢの発現レベルが増加し（Ｃ．Ｚｅｈｅｔｎｅｒ，Ｒ．Ｋｉｒｃｈｍａｉｒ，Ｓ．Ｂ．Ｎｅｕｒｕｒｅｒ，Ｍ．Ｔ．Ｋｒａｌｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｅ．Ｂｅｃｈｒａｋｉｓ，Ｇ．Ｆ．Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＧＦ−Ｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ＡＭＤ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５５（２０１４）３３７−４４））、この増加した発現レベルにより抗体の内在化または効能が抑制される傾向がある。これに関連し、本発明による抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢの発現レベルが増加しても、抗体の内在化レベルが抑制されなかったり、内在化がさらに増加するという利点がある。
【００４９】
さらに詳しくは、本発明による抗体は、血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＰＤＧＦＲ−β）を特異的に結合し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片：
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、１０、１８、２６、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１１、１９、２７、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
前記抗−ＰＤＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４、１２、２０、２８、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、１４、２２、３０、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
【００５０】
前記抗体は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ−ＢＢと非−競争的に結合するものであってもよいし、例えば、重鎖可変領域は、配列番号１、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
軽鎖可変領域は、配列番号４、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含むものであってもよい。
【００５１】
前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞によって内在化されるものであってもよいし、例えば、
重鎖可変領域は、配列番号１、１７、２５、３３、４１または４９のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１と、配列番号２、１８、２６、３４、４２または５０のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２と、配列番号３、１９、２７、３５、４３または５１のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３とを含み、
軽鎖可変領域は、配列番号４、２０、２８、３６、４４または５２のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と、配列番号５、２１、２９、３７、４５または５３のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と、配列番号６、２２、３０、３８、４６または５４のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含むものであってもよい。
【００５２】
本発明の具体的な抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１〜３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号４〜６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、
（ｂ）配列番号９〜１１のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号１２〜１４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、
（ｃ）配列番号１７〜１９のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号２０〜２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、
（ｄ）配列番号２５〜２７のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号２８〜３０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、
（ｅ）配列番号３３〜３５のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、
（ｆ）配列番号４１〜４３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号４４〜４６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含み、または
（ｇ）配列番号４９〜５０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１〜ＶＨ−ＣＤＲ３と、配列番号５２〜５４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１〜ＶＬ−ＣＤＲ３とを含むことができる。
【００５３】
本発明の一例は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体を含む、ＰＤＧＦ受容体、詳しくは、ＰＤＧＦ受容体−βを細胞表面に有し、細胞または組織に薬物を伝達する薬物伝達体の用途に関する。前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、抗−ＰＤＧＦ受容体を有するターゲット細胞に標的化し、ターゲット細胞の内部に内在化（ｉｎｔｅｒｎｌｉｚａｔｉｏｎ）されて、ターゲット細胞の内部に、抗体またはその抗原結合断片に接合された物質を効率的に伝達することができる。前記伝達可能な薬物は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体に直接またはリンカーを介して結合して抗体−薬物接合体を形成することができるか、ハプテン−薬物接合体を形成してハプテンを介して抗−ＰＤＧＦ受容体抗体に結合できる薬物であってもよい。
【００５４】
本発明の一例は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片は、化学療法薬物、酵素、ペプチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、毒素、親和性リガンド、または検出標識のような接合化合物を接合した抗体またはその抗原結合断片と接合化合物を含む複合体を提供する。前記接合化合物の種類によって、前記複合体は疾病の診断または治療に多様に適用可能である。
【００５５】
本発明のさらなる例は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体に関する。前記抗体−薬物接合体は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体に薬物が非共有的または共有的結合で結合した結合体であってもよい。
【００５６】
本願において、「接合体」または「コンジュゲート」は、本願に開示された抗体またはその抗原結合断片と他の分子、特に後述する治療剤とのキメラ分子を称するものである。コンジュゲートにおいて、本願による抗体またはその抗原結合断片は、他の分子と、例えば、共有結合またはファンデルワールスまたは疎水性相互作用による物理的力、カプセル化、埋め込み化（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）または前記組み合わせを含む方法によって物理的に結合する。一実施形態によるコンジュゲートにおいて、本願による抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを介して連結可能である。
【００５７】
本発明のさらに他の例は、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはこれら抗体の抗原結合断片は、薬物と接合できるヘプテンを特異的に認識する抗体または抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体であってもよい。前記抗体の抗原結合断片は、抗原結合部位は少なくとも１つのＣＤＲを有する抗体の部位を意味し、これは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２であってもよい。本発明において、「多重特異抗原結合タンパク質」または「多重特異抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープを標的とするもので、２つ以上の抗原結合部位を含む。本発明において、「二重特異」または「二重特異的」抗原結合タンパク質または抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二重特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種で、公知の多様な方法、例えば、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生産できる。
【００５８】
本発明による薬物伝達体がヘプテンを認識する抗体またはその抗原結合断片が結合したものである場合、前記薬物は、ヘプテンと結合してヘプテンを介して抗−ＰＤＧＦ受容体抗体またはその抗原結合断片に結合して標的細胞または組織に伝達されるものであってもよい。前記標的細胞に伝達される薬物は、ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ受容体関連疾患、例えば、血管新生性疾患の予防、改善または治療用薬物であってもよい。
【００５９】
本発明の一例は、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片にヘプテンを介して薬物が接合された抗体−薬物接合体を含む、血管新生性疾患の予防、改善または治療用薬学組成物に関する。
【００６０】
本発明の一例は、血管新生性疾患を患っていると診断されたか、血管新生性疾患の発病の危険がある対象を治療する方法であって、前記対象に１次治療剤または補助治療剤として前記疾患を予防、改善または治療するのに十分な量で、前記抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体、抗−ＰＤＧＦ受容体抗体または抗体の抗原結合断片にヘプテンを介して薬物が接合された抗体−薬物接合体を投与する段階を含む。
【００６１】
さらに他の例において、本発明の薬学的組成物は、眼球の血管新生性疾患を予防、改善、抑制または治療するための手段を提供する。
【００６２】
本発明の薬学組成物によって治療または抑制できる眼球の血管新生性疾患（ｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、虚血性網膜病症（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、紅彩血管新生（ｉｒｉｓ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、眼内血管新生（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、老人性黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、角膜血管新生（ｃｏｒｎｅａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、網膜血管新生（ｒｅｔｉｎａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜虚血（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）または増殖性糖尿病性網膜病症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）などがある。
【００６３】
具体的には、酸素誘導網膜病動物モデルは、未熟児網膜症の動物モデルであり（Ａ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｌ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｄａｍｍａｎｎ，Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ，Ｌａｎｃｅｔ．３８２（２０１３）１４４５−５７）、レーザ誘導脈絡膜血管新生動物モデルは、湿性老人性黄斑変性の動物モデルであり（Ｖ．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｌｅｃｏｍｔｅ，Ｓ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｌａｃｈｅｒ，ＭＬ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ，Ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．８（２０１３）２１９７−２１１）、これら２つはいずれも血管新生合成が重要な機序で発病する疾患であることが分かる。また、増殖性糖尿網膜病（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）のように血管新生合成が重要な機序で発病する疾病の治療剤としても使用することができる（Ｙ．Ｑａｚｉ，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．８８（２００９）４９５−５１５）。
【００６４】
さらに他の例において、本発明の薬学的組成物は、血管新生性疾患、例えば、癌または腫瘍を予防、改善、抑制または治療するための手段を提供する。前記癌は、ＰＤＧＦＲ−βが問題になる癌であって、網膜芽細胞腫、神経膠腫、睾丸癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌および前立腺癌を含み、これに限定されない。
【００６５】
また、ｍＰＤＧＦＲｂを発現するＮＩＨ３Ｔ３とｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ）で細胞毒性を示したもので、ＰＤＧＦＲ−βが問題になる疾患としては、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）（Ｚ．Ｋ．Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５９（２０１８）４４８６−４４９５）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）（Ｉ．Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１１７（２０１２）９９−１１２）、ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ（Ｓ．Ｆｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．３９（２０１８）２１７８−２１８４）、睾丸癌（Ｓ．Ｂａｓｃｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４９（２００８）６２２６−３５）、乳癌（Ｊ．Ｐａｕｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．３（２０１７）３８−４３）、卵巣癌（Ｓ．Ａｖｒｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．８（２０１７）９７８５１−９７８６１）、黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍａ）、肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）および前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）（Ｍ．Ｒａｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌｓ）．３（２０１０）５７２−５９９）などを含む。
【００６６】
本願に使用されたように、用語「血管新生」および「血管形成」は互いに入れ替えて使うことができる。血管新生および血管形成は、新しい血管が細胞、組織または器官内に発生することを指し示す。血管形成の調節は、典型的には特定の疾患状態で変化し、多くの場合で、この疾患に関連する病理学的損傷は変化したり、調節されなかったり制御されない血管形成に関連する。持続的で調節されない血管形成が内皮細胞による異常成長を特徴とすることをはじめとする多数の疾患状態で起こり、血管の漏出および透過性をはじめとするこれらの状態で観察される病理学的損傷を裏付ける。
【００６７】
本明細書において、「眼球の血管新生性障害」または「眼球の血管新生性疾患」は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の目で変化したり調節されない血管形成を特徴とする障害を意味する。例示的な眼球の血管新生性障害としては、虚血性網膜病症、紅彩血管新生、眼内血管新生、老人性黄斑変性、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜虚血または増殖性糖尿病性網膜病症などがある。
【００６８】
本明細書において、「ＰＤＧＦ」または「血小板−由来成長因子」は、血管形成または血管形成過程に影響を与える哺乳動物血小板−由来成長因子を意味する。本願に使用されたように、一般に、用語「ＰＤＧＦ」は、反応性細胞の類型に対する血小板−由来成長因子細胞表面受容体（つまり、ＰＤＧＦ受容体）の結合および活性化によりＤＮＡ合成および有糸分裂を誘導する成長因子部類の構成員を指し示す。
【００６９】
本発明において、血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ｍＰＤＧＦＲ−β）に対する抗体の単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）−カッパ不変領域（ｋａｐｐａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｃκ）−ｓｃＦｖ融合タンパク質とコチニン−デュオカルマイシンが抗体−薬物接合体の複合体を形成してＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対抗して細胞毒性を誘導できることを観察する。多数の抗ｍＰＤＧＦＲ−Β抗体候補物質を二重特異性ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質フォーマットで製造し、コチニン−結合細胞毒性薬物を伝達する能力を試験することによって、抗体−薬物接合体の製造において抗体選択のための改善された接近法を提供する。
【００７０】
本発明の一例は、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）−薬物接合体および二重特異抗体を用いて薬物をターゲット細胞内に効率的に伝達する抗体を選別する方法に関する。
本発明のさらなる例は、前記選別された抗体と薬物を含む薬物−抗体接合体、または前記選別された抗体と薬物−ヘプテンを含む複合体に関する。
【００７１】
本発明による方法で使用されるハプテン（ｈａｐｔｅｎ）−薬物接合体は、標的細胞に伝達しようとする対象薬物とハプテンとが結合した接合体をいう。前記ハプテンは、細胞と結合するのを防止するために生体内に本来存在しない物質であり、体内で生合成（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）されず、生理的活性も誘発せず、接合物質との効果的な結合のために化学官能基（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を有しなければならない。本発明に使用可能なヘプテンは特に限定されず、例えば、コチニン、ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓであるＤＮＰ（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ＴＮＰ（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ｂｉｏｔｉｎ、およびｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎの中から選択できる。
【００７２】
前記ハプテンの一例として、コチニンは、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）の主要代謝物であって、外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｉｔｙ）、非毒性、生理不活性（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｅｒｔｎｅｓｓ）のため、本プラットフォームで用いられる理想的なハプテンであり、市販のトランス−４−コチニンカルボン酸（ｔｒａｎｓ−４−ｃｏｔｉｎｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）は様々な物質に結合することができる。コチニン−薬物接合体は容易に合成可能であり、純度も既存の抗体−薬物接合体より高く、多様な薬物とリンカーを有するコチニン−薬物接合体の組み合わせへの合成が可能である。また、薬物が抗体に直接接合されず、抗体の親和力と安定性に影響を与えない。抗体−薬物接合体は、二重抗体とコチニン−薬物接合体を簡単に反応するもので作られる。
【００７３】
本発明に適用可能な薬物は、抗体を用いて標的に伝達する対象であり、特に限定されず、例えば、ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例、ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ、ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ（ＰＢＤ）、ｄｕｏｃａｒｍｙｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ、ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ／Ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ａｍａｔｏｘｉｎ）、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（例、ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ、ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ、ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、Ｔｏｐｏ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＮ−３８）、ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ（例、５−Ａｍｉｎｏｌａｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＬＡ）、Ｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍｏｎｏａｃｉｄ  ｒｉｎｇ  Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、Ｃｈｌｏｒｉｎｓ、Ｔｅｔｒａ（ｍ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｌｏｒｉｎ（ｍＴＨＰＣ）、Ｌｕｔｅｔｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）などを含むが、これに限定されない。前記光敏感剤は、単独で薬効を発揮することはできないが、標的細胞や組織に局所的に伝達されるか全身に伝達され、特定部位、例えば、眼球または眼などの病変部位にレーザを照射して伝達された薬物を活性化して薬物の効能を発揮させる。したがって、前記光敏感剤は、抗体に接合してこれを必要とする対象に投与した後に、レーザを照射して薬効を発揮する段階を追加的に行うことができる。
【００７４】
本発明による方法は、標的抗原に結合する二重特異抗体は、薬物を伝達する対象組織または細胞に存在する標的抗原に特異的に結合し、ハプテン−薬物接合体に含まれているハプテンにも特異的に結合できる二重特異抗体であってもよい。例えば、本発明に適用可能な二重抗体は、第１抗体−リンカー−第２抗体の構造を有することができ、前記第１抗体および第２抗体は、それぞれハプテンまたは標的抗原に特異的に結合する抗体であってもよい。前記第１抗体−リンカー−第２抗体構造を有する二重特異抗体は、第１抗体（ｓｃＦｖ）−Ｃκ（ｋａｐｐａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）−第２抗体（ｓｃＦｖ）の融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｎ末端からＶＨ−ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ−ＶＬの順序で結合され、前記リンカーは、ＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端を連結したものである。（抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体のｓｃＦｖ）−（ＧＧＧＧＳ）３−Ｃｋ−（ＧＧＧＧＳ）３−（抗−コチニン抗体のｓｃＦｖ）構造であってもよい。本発明に使用可能なコチニンのアミノ酸配列または塩基配列は本技術分野で広く知られており、例えば、ＵＳ８００８４４８Ｂなどを参照することができる。
【００７５】
本発明の一例として、前記標的抗原が血小板由来成長因子受容体−ベータ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＰＤＧＦＲ−Β）であり、ハプテンがコチニンの場合、前記二重特異抗体は、標的抗原に対する抗体（抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体）とハプテン（抗−ヘプテン抗体）に対する抗体とをリンカーで連結することができ、さらに詳しくは、第１抗体（抗−ＰＤＧＦＲ−β抗体のｓｃＦｖ）−Ｃκ−第２抗体（抗−ヘプテン抗体のｓｃＦｖ）の構造を有する融合タンパク質であってもよい。
【００７６】
本発明者らは、本プラットフォームの有用性（ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）を確認するために、（抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体のｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニン抗体のｓｃＦｖ）二重抗体融合タンパク質を用いる。本発明者らは、一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）と二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）コチニン−デュオカルマイシンを作製する。これは、コチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）とコチニン−デュオカルマイシン−コチニン（ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ）と称する（図１Ｂ）。本発明において、既存のプラットフォーム対比、抗体−薬物接合体開発のための最適な抗体と薬物の組み合わせを選別できることを確認した。
【００７７】
二重抗体（例、抗−ＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ）とハプテン−薬物接合体（例、コチニン−デュオカルマイシン接合体）を含む複合体は、標的抗原（例、ｍＰＤＧＦＲ−β）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株に特異的毒性を発揮する。本発明が抗体−薬物接合体の開発において好ましい内在化抗体と毒性薬物の組み合わせを選別することができる。例えば、４つの抗体クローンは、底にコーティングされたｍＰＤＧＦＲ−βに濃度依存的に結合し（図３Ａ）、陰性対照群としてコーティングされたヒトＦｃタンパク質には結合しなかった。本発明者らは、流細胞測定器を用いてそれぞれクローンがｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞結合能を確認し、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）−ｍＰＤＧＦ−ＢＢが細胞に結合することを確認した（図４Ｂ）。
【００７８】
本発明による３種類のマウス抗原に対する抗体クローン（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３）は、ｍＰＤＧＦＲ−βのリガンドであるｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争して、ｍＰＤＧＦＲ−βのドメイン２または３に結合する。１つの抗体クローン（ＰＲｂ−ＣＮ０１）は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、ドメイン２および３の代わりにドメイン１、４または５に結合する。ｍＰＤＧＦＲ−βに対するＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３の結合能はｍＰＤＧＦ−ＢＢが抑制したが（図４Ａ）、ＰＲｂ−ＣＮ０１の結合能はｍＰＤＧＦ−ＢＢが抑制できなかった。本発明者らは、流細胞測定法を用いてｍＰＤＧＦＲ−Βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にｍＰＤＧＦ−ＢＢが存在する時、各クローンの細胞結合能を測定し、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とビオチン−ｍＰＤＧＦ−ＢＢが細胞に結合することを確認した。競争酵素免疫測定法と同様に、ＰＲｂ−ＣＮ０１のみｍＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎがある時、ｍＰＤＧＦＲ−βに結合可能であり（図４Ｂ）、他の３種類のクローンの結合能はｍＰＤＧＦ−ＢＢによって妨げられた。
【００７９】
本発明にある抗体が二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ形態で発現した時、二重抗体は、ｍＰＤＧＦＲ−Βとコチニン２つとも結合可能である。また、二重抗体は、コチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）とコチニン−デュオカルマイシン−コチニン（ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ）のような様々なコチニン薬物と接合体を作ることができる。Ｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔのような複合体で毒性実験を進行させる時、複合体は毒性を有する。４つの二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３）は、対照二重抗体とは異なってｍＰＤＧＦＲ−Βとコチニンに同時結合可能であった（図３Ｄ）。
【００８０】
４種類の二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとコチニン−デュオカルマイシン接合体の毒性を評価するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は接合体とｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無の２つの条件で培養し、細胞内の三リン酸アデノシン（ＡＴＰ）で相対的細胞生存力を測定した。ＰＲｂ−ＣＮ０１とｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ複合体の毒性は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢを入れた時も高かったが、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争する（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３）融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ複合体の毒性率は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢを入れた時に減少した（図５）。
【００８１】
発明は、ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ二重抗体融合タンパク質とコチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）をそれぞれ製造する（図１Ｂ）。二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとコチニン−デュオカルマイシン接合体を製造し、毒性実験を行った結果、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞で特徴的毒性を発揮した。本発明の結果は、既存のプラットフォーム対比、抗体−薬物接合体開発のための最適な抗体と薬物の組み合わせを選別できることを示す。
【００８２】
例えば、本発明による標的抗原の一例であるｈＰＤＧＦＲ−βに結合する３つの抗体クローンは、ｈＰＤＧＦＲ−βに濃度依存的に結合するということを示した。３つの融合タンパク質は、底にコーティングされたｈＰＤＧＦＲ−βに濃度依存的に結合し（図１２Ａ）、陰性対照群としてコーティングされたヒトＦｃタンパク質には結合しなかった（図１２Ｂ）。本発明は、それぞれクローンがｈＰＤＧＦ−ＢＢが存在する時、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞結合能を流細胞測定器を用いて確認し、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）−ｈＰＤＧＦ−ＢＢが細胞に結合することを確認した（図１３Ｂ）。
【００８３】
本発明による３種類のｈＰＤＧＦＲ−βに対する抗体クローン（ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６）は、ｈＰＤＧＦＲ−βのリガンドであるｈＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、ドメイン２、３の代わりにドメイン１、４、５に結合する。ｈＰＤＧＦＲ−βに対するＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６の結合能はｈＰＤＧＦ−ＢＢが抑制できなかった（図１３Ａ）。
【００８４】
本発明は、ｈＰＤＧＦＲ−Βを発現するヒト周皮細胞にｈＰＤＧＦ−ＢＢが存在する時、各クローンの細胞結合能を流細胞測定法を用いて測定し、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とビオチン−ｈＰＤＧＦ−ＢＢが細胞に結合することを確認した。競争酵素免疫測定法と同様に、３種類の抗体クローン（ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６）がｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎがある時、ｈＰＤＧＦＲ−Βに結合可能であった（図１３Ｂ）。
【００８５】
本発明による標的抗原に対する抗体は、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ形態で発現した時、二重抗体は標的抗原とハプテンにすべて結合可能であり、具体的には、抗原のｈＰＤＧＦＲ−βとハプテンのコチニンにすべて結合可能である。また、二重抗体は、コチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）のような様々なコチニン−薬物接合体と複合体を作ることができる。Ｃｏｔ−ｄｕｏのような接合体で毒性実験を進行させる時、前記複合体は毒性を有する。
【００８６】
本発明によるヒトＰＤＧＦＲ−βに対する３つの二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６）は、対照二重抗体とは異なってｈＰＤＧＦＲ−βとコチニンに同時結合可能であった（図１２Ｄ）。３種類のｈＰＤＧＦＲ−β抗体を用いた二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとコチニン−デュオカルマイシン接合体の毒性を評価するために、ヒト周皮細胞は接合体とｈＰＤＧＦ−ＢＢの有／無の２つの条件で培養し、細胞内の三リン酸アデノシン（ＡＴＰ）で相対的細胞生存力を測定した。前記抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体である、ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の毒性は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れた時も高かった（図１４Ａ、および図１４Ｂ）。
【００８７】
本発明者らは、最適な抗体−薬物接合体抗体と薬物を選別するための過程を単純化する二重特異性ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とコチニン−細胞毒性薬物とから構成された新たな抗体−薬物接合体開発プラットフォームを試験した。理想的には、効率的な内在化と細胞毒性薬物の放出を保障する抗体を選択することが実用的である。しかし、候補抗体を用いた個別抗体−薬物接合体分子の生成は、ＤＡＲ（薬物−抗体比率）を含んで最適化および特性化するための大変な作業を必要とするため、抗体は、初期選別段階で内在化の速度と効率性を基準として選別されてきた。さらに、抗体−薬物接合体が細胞に作用する過程に対する理解が高まるにつれ、抗体の内在化が抗体−薬物接合体の効能を決定する唯一の要因ではないことが分かる。
【００８８】
コチニンは毒性がなく、ネズミにおいて４±０．１ｇ／ｋｇのＬＤ５０値を有する。しかも、４日連続最大１，８００ｍｇのコチニンを処理したヒトにおいて有害な副作用は誘発されなかった。本発明者らは、生体外環境で自由デュオカルマイシンとコチニン−デュオカルマイシン接合体の細胞毒性の間には若干の差があることを観察した。抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とコチニン−デュオカルマイシン結合体との間の複合体形成は、生体外環境でデュオカルマイシンの毒性を低くして二重抗体が薬物と共に複合体を形成して細胞への薬物の吸収を減少させたことを暗示する。前の研究においてデュオカルマイシンがマウスに大きな体重減少を誘導すると報告されているが、本発明による四価の二重特異性抗体を用いる生体内実験では、陰性対照群ＩｇＧと混合されたコチニン−デュオカルマイシン結合体を注入したマウスにおいて有意な体重減少を見せなかった。このような事実は、コチニンと毒性薬物（デュオカルマイシン）との間に多様な形態のリンカーを導入し、腫瘍環境でのみｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（金属タンパク質分解酵素）のようにコチニンから毒素を放出できる可能性を切り開く。コチニン−薬物接合体は、腫瘍環境で分解なく放出されるため、正常細胞を損傷させずに血流から速やかに除去されるであろう。
【００８９】
ｍＰＤＧＦ−ＢＢを追加した後にも、ｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと複合体をなしたＰＲｂ−ＣＮ０１含有二重抗体の細胞毒性は依然として高かったが、細胞増殖を促進するｍＰＤＧＦ−ＢＢを追加すれば、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと競争するｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと複合体をなした３つの抗体（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３）の毒性がやや減少した。ｍＰＤＧＦ−ＢＢは、すでにＰＲｂ−ＣＮ０１に結合したＰＤＧＦＲ−βに結合して受容体の内在化を強化してｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの細胞毒性効果を促進することができる。本発明において、ＰＲｂ−ＣＮ０１構造物は、ＰＤＧＦ−ＢＢと競争せず、ＰＤＧＦ−ＢＢと関係なく細胞毒性を誘発した（図５Ａ〜図５Ｄ）。ＰＤＧＦＲ−βは血管新生と高い関連があり、主に外膜細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）で過発現している。
【発明の効果】
【００９０】
本発明によるＰＤＧＦ受容体に対する抗体、前記ＰＤＧＦ受容体に対する抗体に化学療法剤を接合した抗体−薬物接合体およびこれを用いた眼球の血管新生性疾患の予防または治療用途において、ＰＤＧＦ受容体に対する抗体は、当該濃度では正常細胞または正常組織には毒性を最小化しながら、ｈＰＤＧＦＲ−βが多く発現する病的な細胞または組織に特異的により多くの毒性を示して優れた治療剤として使用可能であり、また、ＰＤＧＦＲ−βの発現レベルの増加および／またはＰＤＧＦ−ＢＢの発現レベルが増加しても、抗体の内在化レベルが抑制されなかったり、内在化がさらに増加するという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体とコチニン−テュオカルマイシンを示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体とコチニン−テュオカルマイシンを示す図である。
【図２】図２は、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重特異抗体をＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動の結果を示す。Ｌａｎｅ１、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０３ｘコチニン；Ｌａｎｅ２、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０３ｘコチニン；Ｌａｎｅ３、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０１ｘコチニン；Ｌａｎｅ４、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０１ｘコチニン；Ｌａｎｅ５、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ０１ｘコチニン；Ｌａｎｅ６、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ０１ｘコチニン；Ｌａｎｅ７、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０２ｘコチニン；Ｌａｎｅ８、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＣ０２ｘコチニン；Ｌａｎｅ９、ｒｅｄｕｃｅｄ抗−ＨＥＲ２ｘコチニン（対照群）；Ｌａｎｅ１０、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ抗−ＨＥＲ２ｘコチニン（対照群）。Ｍ：分子量マーカー。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の結合能を示すグラフであって、ｍＰＤＧＦＲ−βキメラがコーティングされた板に、二重抗体であるＰＲｂ−ＣＣ０１（
【化１】
2022502457.tif 000007
）；ＰＲｂ−ＣＮ０１（
【化２】
2022502457.tif 000008
）；ＰＲｂ−ＣＣ０２（
【化３】
2022502457.tif 000009
）；ＰＲｂ−ＣＣ０３（
【化４】
2022502457.tif 000010
）；ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（
【化５】
2022502457.tif 000011
）を反応した。各ウェルにはＨＲＰ−抗ヒトＣκ抗体、そしてＴＭＢを反応した。結果は２回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質は酵素免疫測定法の陰性対照抗原として使用された。
【図３Ｃ】図３Ｃは、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質のコチニンに対する結合能を確認するために、コチニン−ＢＳＡがコーティングされた板に二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖを反応し、ＨＲＰ−抗ヒトＣκ抗体とＴＭＢを処理した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質のコチニンとｍＰＤＧＦＲ−βに対する同時結合能を確認するために、コチニン−ＢＳＡがコーティングされた板にｍＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラを反応し、ＨＲＰ−抗ヒトＦｃ抗体、そしてＴＭＢを処理した。結果は、３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。対照群に比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＰＤＧＦ−ＢＢと抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内に内在化を確認したグラフである。図４Ａは、ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｍＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）反応した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図４Ｂは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｍＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で反応した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ）
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＰＤＧＦ−ＢＢと抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内に内在化を確認したグラフである。図４Ａは、ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｍＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）反応した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図４Ｂは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｍＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で反応した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ）
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＰＤＧＦ−ＢＢと抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内に内在化を確認したグラフである。図４Ａは、ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｍＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）反応した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図４Ｂは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｍＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で反応した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ）
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して抗−ｍＰＤＧＦＲ−βに対する二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図５Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは、相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図５Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。図５Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。図５Ｄは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｄは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して抗−ｍＰＤＧＦＲ−βに対する二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図５Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは、相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図５Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。図５Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。図５Ｄは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｄは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して抗−ｍＰＤＧＦＲ−βに対する二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図５Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは、相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図５Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。図５Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。図５Ｄは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して抗−ｍＰＤＧＦＲ−βに対する二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図５Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは、相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図５Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。図５Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。図５Ｄは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図６】図６は、ＰＤＧＦＲ−βを発現しないＭＯＬＴ−４細胞に対する、本発明による抗−ｍＰＤＧＦＲ−Β抗体に関する二重抗体の結合能を流細胞分析器で実験したグラフである。ＭＯＬＴ−４細胞に二重抗体（１００ｎＭ）を処理し、ＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＴＢ２８−２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色した。
【図７】図７は、ＰＤＧＦＲ−βを発現しない細胞に対して、抗−ｍＰＤＧＦＲ−Β抗体に関する二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図７の（Ａ）にてＭＯＬＴ−４細胞に二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏの複合体（ＤＡＲ４）を反応した。相対的細胞生存率を評価するために細胞ＡＴＰを測定した。図７の（Ｂ）にてＭＯＬＴ−４細胞に二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏの複合体（ＤＡＲ２）を反応した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖは陰性対照群として使用された。ＤＭＳＯはコチニン−デュオカルマイシンの賦形体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図８】図８は、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の結果である。本発明による二重抗体、二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏの複合体、二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体はＳｅｐａｘ  ＳＲＴ−Ｃ  ＳＥＣ−３００カラムが装着されているＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００を用いたサイズ排除クロマトグラフィー−ＨＰＬＣで分析した。移動相はＰＢＳで使用し、１５分間１ｍＬ／ｍｉｎで移動溶媒を溶出した。紫外線検出器は２５４ｎｍに調節されており、結果はｍＡＵでモニタリングした。ＨＭＷはｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓである。
【図９】図９は、本発明による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏ複合体が酸素誘導網膜病動物モデルにおける新生血管増殖を抑制することを示す結果である。
【図１０】図１０は、本発明による抗−ｍＰＤＧＦＲ−Β抗体に関する二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏ複合体がレーザ誘導脈絡膜血管新生動物モデルにおける新生血管増殖を抑制することを示す。
【図１１】図１１は、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体としてコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動した結果である：Ｌａｎｅ１、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ１６ｘコチニン；Ｌａｎｅ２、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ１６ｘコチニン；Ｌａｎｅ３、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ２６ｘコチニン；Ｌａｎｅ４、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ２６ｘコチニン；Ｌａｎｅ５、ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ３２ｘコチニン；Ｌａｎｅ６、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＰＲｂ−ＣＮ３２ｘコチニン；Ｌａｎｅ７、ｒｅｄｕｃｅｄ抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニン（対照群）；Ｌａｎｅ８、ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニン（対照群）。Ｍ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｈＰＤＧＦＲ−βキメラがコーティングされた板に様々な濃度の二重抗体であるＰＲｂ−ＣＮ１６（
【化６】
2022502457.tif 000012
）；ＰＲｂ−ＣＮ３２（
【化７】
2022502457.tif 000013
）；ＰＲｂ−ＣＮ２６（
【化８】
2022502457.tif 000014
）；ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（
【化９】
2022502457.tif 000015
）コチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を反応した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、各ウェルにはＨＲＰ−抗ヒトＣκ抗体、そしてＴＭＢを反応した結果であって、結果は２回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質は酵素免疫測定法の陰性対照抗原として使用された。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体のコチニンに対する結合能を確認するために、コチニン−ＢＳＡがコーティングされた板に二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖを培養し、ＨＲＰ−抗ヒトＣκ抗体とＴＭＢを処理した。本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体のコチニンとｈＰＤＧＦＲ−βに対する同時結合能を確認するために、コチニン−ＢＳＡがコーティングされた板にｈＰＤＧＦＲ−Β−Ｆｃキメラを培養し、ＨＲＰ−抗ヒトＦｃ抗体、そしてＴＭＢを処理した。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。対照群に比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢと本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内への内在化を確認したグラフである。図１３Ａは、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）培養した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図１３Ｂは、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図１３Ｃは、共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ヒト周皮細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ。図１３Ｄは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れて繰り返された。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢと本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内への内在化を確認したグラフである。図１３Ａは、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）培養した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図１３Ｂは、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図１３Ｃは、共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ヒト周皮細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ。図１３Ｄは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れて繰り返された。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢと本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内への内在化を確認したグラフである。図１３Ａは、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）培養した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図１３Ｂは、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図１３Ｃは、共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ヒト周皮細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ。図１３Ｄは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れて繰り返された。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、ＰＤＧＦ−ＢＢと本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の競争と細胞内への内在化を確認したグラフである。図１３Ａは、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラがコーティングされた板にｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖをｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）を添付しないか（左）、添付して（右）培養した後、結合している二重抗体融合タンパク質はＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体とＴＭＢで測定した。図１３Ｂは、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）をｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎの有／無で培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを処理した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図１３Ｃは、共焦点顕微鏡は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ヒト周皮細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ。図１３Ｄは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れて繰り返された。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＰＤＧＦＲ−βを発現している細胞に対して、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体／ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図１４Ａのグラフは、ヒト周皮細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体を処理した。図１４Ｂのグラフは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。細胞ＡＴＰは相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏの賦形体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＰＤＧＦＲ−βを発現している細胞に対して、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体／ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の細胞毒性能を確認したグラフである。図１４Ａのグラフは、ヒト周皮細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体を処理した。図１４Ｂのグラフは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。細胞ＡＴＰは相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。ＤＭＳＯはｃｏｔ−ｄｕｏの賦形体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図１５】図１５は、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しない細胞に対する、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の結合能を流細胞分析器で実験したグラフである。Ａ−４３１細胞は二重抗体（抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質）（１００ｎＭ）を処理し、ＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＴＢ２８−２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色した。
【図１６】図１６は、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しない細胞に対して、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−Β抗体に関する二重抗体とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の細胞毒性能を実験したグラフである。Ａ−４３１細胞に二重抗体／ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体（ＤＡＲ４）を反応した。細胞ＡＴＰは相対的細胞生存率を評価するために測定された。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖは陰性対照群として使用された。ＤＭＳＯはコチニン−デュオカルマイシンの賦形体対照群として使用された。結果は３回の繰り返し実験の平均値±標準誤差を示す。
【図１７】図１７は、発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の種間反応を実験したグラフである。ｈＰＤＧＦＲ−β、ｍＰＤＧＦＲ−β、レサスＰＤＧＦＲ−β、サイノモルガスＰＤＧＦＲ−β、スーススクローファＰＤＧＦＲ−βおよび対照群Ｆｃコーティングされたマイクロタイタープレートに、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体（１００ｎＭ）と反応し、結合した二重抗体の量をＨＲＰ接合された抗−ヒトＣκ抗体およびＴＭＢを用いて測定した。
【図１８】図１８は、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）を培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体を処理した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＰＲｂ−ＣＮ０１代理抗体に関する競争を確認した結果である。図１９Ａは、ｍＰＤＧＦＲ−β−ｈＦｃキメラタンパク質がコーティングされた板に３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度のＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（０．０１ｎＭ−１μＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、抗−ＨＥＲ２対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１００ｎＭ）を、各ウェルに３７℃で２時間反応した後、結合しているＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃタンパク質はＨＲＰ−抗ウサギＦｃ抗体とＡＢＴＳで測定した。図１９Ｂは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（５０ｎＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１μＭ）を反応した。細胞にはＦＩＴＣ−抗ウサギＦｃ抗体を培養した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＰＲｂ−ＣＮ０１代理抗体に関する競争を確認した結果である。図１９Ａは、ｍＰＤＧＦＲ−β−ｈＦｃキメラタンパク質がコーティングされた板に３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度のＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（０．０１ｎＭ−１μＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、抗−ＨＥＲ２対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１００ｎＭ）を、各ウェルに３７℃で２時間反応した後、結合しているＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃタンパク質はＨＲＰ−抗ウサギＦｃ抗体とＡＢＴＳで測定した。図１９Ｂは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（５０ｎＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１μＭ）を反応した。細胞にはＦＩＴＣ−抗ウサギＦｃ抗体を培養した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して、ＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能の差を確認したグラフである。図２０Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図２０Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して、ＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能の差を確認したグラフである。図２０Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をｍＰＤＧＦ−ＢＢなしに処理した。細胞ＡＴＰは相対的細胞生存率を評価するために測定した。二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。図２０Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明を下記の実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１．ｍＰＤＧＦＲ−βおよびＣκ融合タンパク質の発現および精製
ｍＰＤＧＦＲ−βの細胞外領域は下記表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸配列を有するペプチドであり、これを暗号化する塩基配列を製造し、前記塩基配列の末端側にＳｆｉＩ制限酵素配列を入れて合成し（ジェンスクリプトバイオテック、江蘇省、中国）、ＳｆｉＩ酵素で切断してｐＣＥＰ４ベクターにクローニングして組換えｐＣＥＰ４発現ベクターを製造し、従来報告された方法で発現した［Ｙ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４６（２０１４）ｅ１１４］。
【００９４】
【表３−１】
2022502457.tif 000016
【表３−２】
2022502457.tif 000017
【００９５】
具体的には、前記組換えｐＣＥＰ４発現ベクターは、従来報告された方法で［Ｓ．Ｅ．Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｒｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１３８（２００６）８５−９８］ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて、ヒト胎児腎臓２９３Ｆ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に形質導入した。形質導入された細胞は１０，０００ＩＵ／Ｌペニシリンと１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＧＩＢＣＯ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３の発現培地で培養された［Ｓ．Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４０（２０１４）２２７−３３］。形質導入６日後、培養上澄液を収集して、製造業者の指示の通りにＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いて親和性クロマトグラフィー方法でｍＰＤＧＦＲ−β−Ｃκ融合タンパク質を精製した。前記融合タンパク質におけるｍＰＤＧＦＲ−βアミノ酸配列は、ｍＰＤＧＦＲ−βの３２番目のＬｅｕ〜５３０番目のＬｙｓであり、これは細胞外領域に相当し、ｍＰＤＧＦＲ−βアミノ酸配列のＣ末端にＣκはリンカー−（ＧＧＧＧＳ）３を介して連結された構造を有する。
【００９６】
実施例２．二重抗体（ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ）の発現および精製
２−１：複合ｓｃＦｖを発現してファージライブラリーの作製およびバイオパンニング
抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体は免疫されたニワトリから作られたｓｃＦｖを表面に発現するファージライブラリーから選別された。
【００９７】
前記実施例１で得られたｍＰＤＧＦＲ−β−Ｃκ融合タンパク質でニワトリを計４回免疫した。免疫前と免疫の途中に翼の静脈から採血して得られた血清で酵素免疫測定法と流細胞測定器で動物の免疫状態を確認した。４番目の免疫化１週間後に犠牲にし、脾臓、ファブリキウス嚢および骨髄を収穫してＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを分離した。
【００９８】
前記分離されたＲＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、ｓｃＦｖを発現するファージライブラリーを従来報告した方法の通りに作製した［Ｍ．Ｓ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ）．２７（２００８）１８−２４］。つまり、当該ｃＤＮＡを用いて７．５×１０８、６．９×１０８、２．１×１０９、２．２×１０９ｓｃＦｖを発現するファージライブラリーを計４つ作製した。当該ライブラリーでｍＰＤＧＦＲ−β−Ｃκが結合している磁性ビーズに計５回のバイオパンニングを進行させた［Ｙ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４６（２０１４）ｅ１１４］。
【００９９】
５次排出価（ｏｕｔｐｕｔ  ｔｉｔｅｒ）からｓｃＦｖクローンをランダムに選別して、ｍＰＤＧＦＲ−β−Ｃκがコーティングされたマイクロタイター板（３６９０；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に対してファージ酵素免疫測定法を進行させた［Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ，Ｇ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１］。
【０１００】
ｍＰＤＧＦＲ−β−Ｃκに結合能（Ａ４０５＞１．５）があるクローンはマクロジェンに依頼して、ＯｍｐＳｅｑプライマーで配列分析を進行させた［Ｗ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４９（２０１７）ｅ３０８］。アミノ酸配列を確認した後、計９種類の抗体クローンを探した（表３）。発現率と結合能を考慮して計４つのクローン（ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３）を選択し、選択されたクローンに対して、追って実験を進行させた。
【０１０１】
下記表４は、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖクローンのＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列である。前記得られた４つのクローンに対するＶＨおよびＶＬとこれらのＣＤＲアミノ酸配列情報を前記表１に示す。
【０１０２】
【表４】
2022502457.tif 000018
【０１０３】
２−２：二重抗体（ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ）の発現および精製
実施例１で製造した抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖクローンを用いて、（抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニンｓｃＦｖ）二重特異抗体を暗号化している遺伝子を含むｐＣＥＰ４発現ベクターが作製された。
【０１０４】
製造された（抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニンｓｃＦｖ）二重特異抗体の具体的構造とそれぞれのリンカーの結合位置は図１Ａに示す。具体的には、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖおよび抗−コチニンｓｃＦｖは、それぞれＮ末端からＶＬ−ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（表２の配列番号５７）−ＶＨの順序で結合し、つまり、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端とを連結したものである。Ｎ末端から抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ、Ｃｋおよび抗−コチニンｓｃＦｖがそれぞれリンカーを用いて連結され、前記ｓｃＦｖを連結したリンカーは表２の配列番号５９を有する（ＧＧＧＧＳ）３を用い、Ｃｋアミノ酸配列は表２の配列番号５８を有するものを使用した。
【０１０５】
二重特異抗体である融合タンパク質を製造する具体的な方法として、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖを暗号化する遺伝子と抗−コチニンｓｃｆｖを暗号化する遺伝子は、ＳｆｉＩ、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して発現ベクターに連結された。前記抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖを暗号化する遺伝子は、Ｎ−末端からＣ−末端側に前記表１のＶＬ−リンカー−ＶＨの順に連結し、前記リンクは前記表２の配列番号５７に記載の配列を用いてペプチドを製造し、これを暗号化する遺伝子配列を得た。前記抗−コチニンｓｃｆｖを暗号化する遺伝子はＵＳ８００８４４８Ｂに記載の内容に基づいて得ており、得られたコチニンのアミノ酸配列は下記表の通りである。
【０１０６】
【表５】
2022502457.tif 000019
【０１０７】
抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖの対照群としてＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｓｃＦｖを発現ベクターにクローニングした。二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）による二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を排除するために、ＣκのＣ−末端部分にあるシステインは排除した。前記得られたＤＮＡ構造物をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質導入した後、ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を生産し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔレジンを用いた親和クロマトグラフィー方法で二重抗体（ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ）を精製した。
【０１０８】
発現した二重抗体のタンパク質の純度を確認するために、ＮｕＰａｇｅ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示の通りにＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動を進行させた。タンパク質１μｇを還元剤の有無のＬＤＳサンプルバッファーに入れた後、９５℃で１０分間反応した。その後、電気泳動を進行させ、タンパク質を可視化するために、ゲルをＥｚｗａｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｌｕｅ  ＩＩ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（コマバイオテック、ソウル、韓国）で染色した。ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動を実施した（図２）。前記電気泳動結果の写真を図２に示す。
【０１０９】
図２に示すように、還元剤を用いて還元された（ｒｅｄｕｃｅｄ）タンパク質は６７ｋＤａであり、非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｅｄ）タンパク質は６０ｋＤａで染色された。コンピュータで計算した融合タンパク質の分子量は６６．７７ｋＤａであった。多量体（Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ）バンドは見えなかった。非還元タンパク質は密な固有の形態のため、ゲル上で移動時に抵抗をより少なく受けて還元タンパク質より速やかに移動したと予想される。
【０１１０】
本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果であるＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図８）において、ＰＲｂ−ＣＮ０１とは異なって、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２およびＰＲｂ−ＣＣ０３は、いずれもｍｏｎｏｍｅｒｉｃとｔｒｉｍｅｒｉｃバンドが見えた。Ｃｏｔ−ｄｕｏと接合体を形成した時、ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３とも多量のｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ＨＭＷｓ）が観察された。ＰＲｂ−ＣＮ０１のような場合、ＨＭＷが少し観察された。Ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔは４つのクローンのすべてにＨＭＷｓを作らなかった。
【０１１１】
実施例３．抗体のｍＰＤＧＦＲ−βおよびコチニンに対する結合能分析（酵素免疫測定法）
コーティングバッファー（０．１Ｍ重炭酸塩ナトリウム、ｐＨ８．６）に入っている１００ｎｇのｍＰＤＧＦＲ−β−ＦｃキメラまたはＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質をマイクロタイター板に４℃Ｏ／Ｎコーティングした。各ウェルに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ１５０μＬを、３７℃で１時間遮断剤で培養した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度のニワトリ血清（１：５００−１：６２，５００）を処理した後、３７℃で２時間培養した。マイクロタイター板は０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｉｘｏｄａｓｅ（ＨＲＰ）−抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を処理して、３７℃で１時間培養した。マイクロタイター板はもう一度０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＡＢＴＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて培養した。その後、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート機器（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１２】
コーティングバッファーに入っている１００ｎｇのｍＰＤＧＦＲ−β−ＦｃキメラまたはＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質をマイクロタイター板に４℃Ｏ／Ｎコーティングした。各ウェルに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ１５０μＬを、３７℃の温度で１時間遮断剤で培養した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度の二重抗体（０．０６ｎＭ−１μＭ）を処理した後、３７℃の温度で２時間培養した。板はＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−抗ヒトＣκ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、３７℃の温度で１時間培養した。板をＰＢＳＴで３回洗浄後、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＭＢ）（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ｂａｒｋｅｒ、ＴＸ、ＵＳＡ）を培養した。その後、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート機器（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１３】
本発明による二重抗体とｍＰＤＧＦ−ＢＢ競争を確認するために、前述のように、マイクロタイター板にｍＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラをコーティングした後、ブロッキングした。ｍＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ）の有／無の条件で様々な濃度の二重抗体（０．０６ｎＭ−１μＭ）を板に処理した後、２時間３７℃の温度で培養した。洗浄、培養、検出は前記説明された酵素免疫測定法と同様に行われた。
【０１１４】
ｍＰＤＧＦＲ−βとコチニンに対する二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の同時結合能を確認するために、酵素免疫測定法を用いた。４種類の二重特異抗体は対照−ヒトＦｃタンパク質には結合せず（図３Ｂ）、濃度依存的にｍＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラタンパク質に結合した（図３Ａ）。
【０１１５】
本発明による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体を含む二重抗体は、タンパク質はコチニン−ＢＳＡに結合能があったが、対照二重抗体として抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗−ＨＥＲ２ｘＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は結合能がなかった（図３Ｃ）。
【０１１６】
コチニンとｍＰＤＧＦＲ−βに同時結合能があるかを確認するために、抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をコチニン−ＢＳＡがコーティングされたウェルに培養した。それぞれの過程ごとに洗浄をし、ｍＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラタンパク質、ＨＲＰ−抗ヒトＦｃ抗体を順に培養した。他の対照群とは異なって、４種類の二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３）はｍＰＤＧＦＲ−βとコチニンに同時結合した（図３Ｄ）。
【０１１７】
ｍＰＤＧＦ−ＢＢが抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能に及ぼす影響を調べるために、競争酵素免疫測定法を開発した。連続希釈した二重抗体（抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−Ｃκ−コチニンｓｃＦｖ）にｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無でｍＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラ融合タンパク質がコーティングされたウェルに反応した。ＨＲＰ−抗−ヒトＣκ抗体を培養した後、ＴＭＢを入れた。ＰＲｂ−ＣＣ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３のｍＰＤＧＦＲ−βに対する結合能は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある時に阻害されたが（図４Ａ）、ＰＲｂ−ＣＮ０１の結合能は阻害されず、ｍＰＤＧＦ−ＢＢと非競争的に結合することを確認した。
【０１１８】
実施例４．抗体の細胞内在化分析（共焦点顕微鏡分析）
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質内在化の視角化のための共焦点顕微鏡で分析した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭに希釈した二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１０μｇ／ｍＬ）を処理して、３０分間３７℃で内在化させた。細胞は冷たいＰＢＳで３回洗浄後、細胞表面に結合している抗体を除去するために、酸性バッファー（０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム）を５分間常温で処理した。細胞は冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１０分間４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、予め説明されているように免疫蛍光染色を進行させた［Ｊ．Ｍ．Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１０（２０１５）２３］。
【０１１９】
簡略に説明すれば、非特異反応を有する抗体を遮断するために、細胞は５％ウマ血清を含むＰＢＳと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に３０分間培養し、２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（ＴＢ２８−２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を常温で３０分間添加した。初期エンドソームを映像化するために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５％ウマ血清を含むＰＢＳと０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を３０分間培養した後、３０分間１：２００で希釈した抗−Ｒａｂ５抗体（Ｃ８Ｂ１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を培養し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ａ−１１０３５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を順次に処理した。ＤＮＡを検出するために、細胞に０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩを処理した。共焦点顕微鏡映像はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ８８０  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて得ており、映像はＺｅｎソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）で分析された。
【０１２０】
３種類の抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質はエンドソームを介して細胞内在化することを確認した。
【０１２１】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖの細胞内在化を測定するために、抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をＮＩＨ３Ｔ３細胞に培養した後、ＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体とエンドソーム特異的抗体を処理して、共焦点顕微鏡を用いて映像化した。細胞内蛍光はＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−ＣＣ０２、ＰＲｂ−ＣＣ０３を培養した細胞内でのみ確認可能であった（図４Ｃ）。ＰＲｂ−ＣＣ０１は内在化されなかった。映像を合併した時、本発明者らは、３つの抗体クローンとエンドソーム特異的抗体の蛍光が共局在化したことを確認した。
【０１２２】
実施例５．二重抗体のｍＰＤＧＦＲ−βおよびコチニンに対する結合能分析（流細胞分析）
ＮＩＨ３Ｔ３は流細胞分析バッファー（１％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ／ＰＢＳに０．０５％［ｗ／ｖ］ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）に１：１００で希釈したニワトリ血清を４℃にて１時間培養し、流細胞分析バッファーで４回洗浄した。流細胞分析バッファーにあるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−抗ニワトリＩｇＹ抗体（７０３−５４５−１５５、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を細胞に処理した。洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分類して分析した。各測定時ごとに１０，０００細胞を確認し、結果はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞は韓国細胞株銀行から購入して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％ペニシリン、ストレプトマイシン［Ｓ．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ｅｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４４（２０１２）５５４−６１］を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、ソウル、韓国）培地で培養して用意したものである。
【０１２３】
ｍＰＤＧＦ−ＢＢは、製造業者の指示により、ｂｉｏｔｉｎ−ｘｘ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅタンパク質ラベリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ｍＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎ（１００ｎＭ）の有／無の２つの条件で二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）を用いて、４℃にて１時間培養した。細胞は流細胞バッファーで４回洗浄後、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）−抗ヒトＣκ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＴＢ２８−２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（１２−４３１７−８７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて培養した。洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分類して分析した。各測定時ごとに１０，０００細胞を確認し、結果はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。酵素免疫測定法と類似する結果の通りにｍＰＤＧＦ−ＢＢを一緒に入れた場合、ＰＲｂ−ＣＮ０１のみ細胞表面に存在するＰＤＧＦＲ−βに結合した（図４Ｂ）。他の３つのクローンの結合能はｍＰＤＧＦ−ＢＢによって阻害された。
【０１２４】
本発明者らは、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現しないＭＯＬＴ−４細胞にも二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能を流細胞実験で確認した。ＭＯＬＴ−４細胞は二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）を４℃の温度に１時間培養した。前記説明のように洗浄後、検出はＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体を処理して実験を進行させた。前記ＭＯＬＴ−４細胞は韓国細胞株銀行から購入して、１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｗｅｌｇｅｎｅ、ソウル、韓国）培地で培養して用意したものである。ＰＲｂ−ＣＮ０１と抗−ＨＥＲ２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体の両方とも、当該細胞に結合しないことを確認した（図６）。
【０１２５】
実施例６．二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）の複合体形成
６−１：コチニン−デュオカルマイシンの複合体の合成
本発明は、コチニンが接合されたバリン−シトルリン−ＰＡＢ−デュオカルマイシン、バリン−シトルリン−ＰＡＢ−モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはバリン−シトルリン−ＰＡＢ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシアレート（ｍｃｃ）ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ（ＤＭ１）を製造する。本発明において、ＤＡＲ１とＤＡＲ４のコチニン−細胞毒性薬物を試験した結果、ＤＡＲ４コチニン−細胞毒性薬物がＤＡＲ１よりも強いということを確認し、また、デュオカルマイシンはコチニンに結合した時に最も強いということを発見した。この理由から、コチニン−デュオカルマイシンを実験に使用する。
【０１２６】
Ｔｒａｎｓ−４−コチニンｃａｒｂｏｎｙｌ−（ＧＳＫ）４ペプチドは、ペプトロン（大田（テジョン）、韓国）でＡＳＰ４８Ｓ  ａｕｔｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ９ＳＰＳＳ）で合成された。Ｔｒａｎｓ−４−コチニンｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）はＦｍｏｃ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ方法を利用してペプチドのＮ−末端に付着した。
【０１２７】
合成が完了した後、ｃｒｕｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔはＴＦＡ／ＥＤＴ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＩＳ／ＤＷ（９０／２．５／２．５／２、５／２．５ｖｏｌｕｍｅ）を２時間処理してレジンから落とした。溶液は冷たいエーテルを用いて遠心分離により沈殿させた。沈殿物は空気に乾かした。Ｃｒｕｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔはＡＣＥ１０  Ｃ１８−３００  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅカラム（２５０ｍｍｘ２１．２ｍｍ、１０μＭ）を用いたｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣで精製した。０．１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｍ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含む水−アセトニトリルｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（１０〜７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で溶出された。精製されたペプチド（Ｃｏｔ−（ＧＳＫ）４ペプチド）は収集されて乾燥した。
【０１２８】
Ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（ＰＡＢ）−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌデュオカルマイシンは、コチニン−（ＧＳＫ）４に存在する４つのリシンの自由アミノ酸にＬｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって連結された。Ｃｏｔ−（ＧＳＫ）４ペプチド（３．５ｍｇ、２μｍｏｌ）はアセトニトリル／水（６／４、ｖ／ｖ、１ｍＬ）に溶かした。ＰＡＢ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌデュオカルマイシンＰＥＧ３−ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅのＮＨＳ  ｅｓｔｅｒを追加し、ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ａｑｕｅｏｕｓ  ＮａＨＣＯ３  ９μＬを順次に追加した。混合物は常温で４時間混合し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ（商標）  Ｃ１８−１００Å  ｃｏｌｕｍｎ（１００ｍｍｘ２ｍｍｘ５μＭ）を用いるｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ手法によって精製された。複合体（コチニン−［ＧＳＫ（デュオカルマイシン）］４、ＤＡＲ４）を「ｃｏｔ−ｄｕｏ」と称した。二価コチニン−（ＧＳＫ）４Ｋは、予め説明した方法でデュオカルマイシンに連結された［Ｊ．Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５０（２０１８）６７］。簡略に、ペプトロン社で２つのｔｒａｎｓ−４−コチニンｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅをＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫのＮ−末端に存在する自由アミノ酸とＣ−末端にあるリシンのｅｐｓｉｌｏｎアミノ酸に、ｂａｓｉｃ  Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ方法を利用して連結した。Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａで４つのＰＡＢ−デュオカルマイシンを二価コチニン−ＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫペプチド連結して、コチニン−［ＧＳＫ（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）］４Ｋ−コチニン（ＤＡＲ２）、ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと称された複合体を作った。図１Ａは、二重抗体の融合タンパク質とコチニン−デュオカルマイシン接合体（ｃｏｔ−ｄｕｏ、ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ）を示し、図１Ｂは、ｃｏｔ−ｄｕｏとｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの化学構造を示す。「Ｒ」は、ｖａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  ＰＡＢ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌデュオカルマイシンである。
【０１２９】
６−２：二重抗体と複合体の製造
実施例２によりＰＢＳに溶けている抗−ＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１５μＭ）は、ＤＭＳＯに溶けているｃｏｔ−ｄｕｏ（１５μＭ）と１：１、ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ（７．５μＭ）とは２：１で混合した。常温で複合体を形成した３０分後に、複合体は１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に５倍ずつ希釈した（２５．６ｐＭ−２μＭ）。
【０１３０】
６−３：二重抗体と複合体形成の確認
複合体形成を確認するために、実施例２で製造した（抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニンｓｃＦｖ）二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン接合体をサイズ排除クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いてＹ−ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（大田（テジョン）、韓国）が分析した。
【０１３１】
前記分析には５μｍの粒子に３００Åのサイズの孔で埋められているＳｅｐａｘ  ＳＲＴ−Ｃ  ＳＥＣ−３００カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）が装着されたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。移動相（ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）はＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）であり、２０μＬのサンプル（１ｍｇ／ｍＬ）を注入し、１５分間１ｍＬ／ｍｉｎで溶出液で溶出した。カラムの溶出液は２５４ｎｍでｍＡＵ値で紫外線検出器によりモニタリングした。
【０１３２】
図８は、本発明の一例による抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の結果である。本発明による二重抗体、二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏの複合体、二重抗体およびｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔの複合体は、Ｓｅｐａｘ  ＳＲＴ−Ｃ  ＳＥＣ−３００カラムが装着されているＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００を用いたサイズ排除クロマトグラフィー−ＨＰＬＣで分析した。移動相はＰＢＳで用い、１５分間１ｍＬ／ｍｉｎで移動溶媒を溶出した。紫外線検出器は２５４ｎｍに調節されており、結果はｍＡＵでモニタリングした。ＨＭＷはｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｐｅｃｉｅｓである。
【０１３３】
実施例７．ＰＤＧＦＲ−βの発現細胞株における抗増殖性分析（細胞毒性実験）
１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ５０μＬにＮＩＨ３Ｔ３細胞を入れて、９６−ウェル板（ＣＬＳ３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れて、一晩５％ＣＯ２、３７℃の培養器で培養した。細胞５０μＬが入っている各ウェルに、実験例１０で得られたｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔと複合体をなした抗−ＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（２５．６ｐＭ−２μＭ）を５０μＬ添加して、５％ＣＯ２、３７℃の培養器で７２時間培養した。ｍＰＤＧＦ−ＢＢの二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとコチニン−デュオカルマイシン複合体の毒性効果を調べるために、ｍＰＤＧＦ−ＢＢ（２ｎＭ）を二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとコチニン−デュオカルマイシン複合体５０μＬに一緒に入れた。混合された複合体はＮＩＨ３Ｔ３細胞が入っている５０μＬに添付した。
【０１３４】
二重抗体抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖは対照群として使用された。細胞に培養７２時間後、製造業者の指示の通りにＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を１００μＬずつすべてのウェルに入れて、ルミノメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で発光を測定した。実験は３回繰り返し行われた。相対的生存力は当該公式で計算した：［％生存力＝（実験ウェルの発光−背景ウェルの発光）／（対照群の発光−背景ウェルの発光）ｘ１００］。新しい培地のみ入っているウェルを背景ウェルとして用いた。
【０１３５】
抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体コチニンデュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ、ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ）複合体は、ＰＤＧＦＲ−βを発現するネズミ線維芽細胞に抗増殖性効果があることを確認した。
【０１３６】
抗−ｍＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ二重抗体とコチニンデュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ、ｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔ）複合体の毒性を評価するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に複合体はｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無の状態で処理し、細胞の三リン酸アデノシンを測定して相対的生存力を測定した。二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体の毒性はＩＣ５０で表６および図５に示した。下記表６は、抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体コチニンデュオカルマイシン複合体の試験管内力価と９５％信頼区間を適用した。
【０１３７】
【表６】
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４つの実験された抗体のうち、ｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく対照抗−ＨＥＲ２ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、ＰＲｂ−ＣＮ０１が最も高い毒性を示した（ｐ＜０．０１；図５）。ＰＲｂ−ＣＣ０２とＰＲｂ−ＣＣ０３は、対照抗体と内在化しない抗体（ＰＲｂ−ＣＣ０１）に対比して毒性を示したが、統計の有意性を見せてはいなかった。しかし、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある場合、コチニンデュオカルマイシンは、ＰＲｂ−ＣＮ０１と複合体をなす時、自由デュオカルマイシンより統計的に有意に毒性が高かった（ｐ＜０．０１）。対照実験として二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体を、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現しないＭＯＬＴ−４細胞に毒性実験を進行させた。ＰＲｂ−ＣＮ０１は、対照抗体である抗−ＨＥＲ２ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と毒性の差がなかった（図７）。
【０１３８】
図５に示すように、ｓｃＦｖ−Ｃｋ−ｓｃＦｖは、抗体濃度が上昇しても細胞を殺さずＩＣ５０値を求めることができず、表６にはｓｃＦｖ−Ｃｋ−ｓｃＦｖ単独のＩＣ５０値を入れずにｓｃＦｖ−Ｃｋ−ｓｃＦｖとｃｏｔ−ｄｕｏまたはｃｏｔ−ｄｕｏ−ｃｏｔを一緒に添加した結果を示す。また、ＭＯＬＴ−４細胞はｍＰＤＧＦＲ−βを発現しないので、ＰＲｂ−ＣＮ０１−薬物複合体と対照抗体−薬物複合体の毒性の差がない。
【０１３９】
実施例８．生体内新生血管増殖能分析
抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体にｃｏｔ−ｄｕｏが結合した複合体は生体内で新生血管増殖を抑制したことを確認した。
【０１４０】
８−１：酸素誘導網膜病動物実験
出生後７日目のＣ５７ＢＬ／６マウスを高濃度酸素（７５％）チャンバにて５日間飼育し、１２日目に正常酸素飼育施設に移すと、未熟児網膜病症の環境を作る。
【０１４１】
生後１４日目に二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏの複合体をそれぞれ１ｎＭおよび１０ｎＭの濃度で１ｕＬずつガラス体腔内に注射した。血管を標識するために、網膜フラットマウントにｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４−５９４（１：１００；１２１４１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理した。
【０１４２】
酸素誘導網膜病動物モデルにおいてＰＲｂ−ＣＮ０１ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体は濃度依存的に新生血管増殖を抑制した（図９）。
【０１４３】
８−２：レーザ誘導脈絡膜血管新生動物モデル
マウスを麻酔させた後、マウスの網膜に３００ｕｍの点サイズで４００ｍＷの強度、５０ｍｓの持続時間、８１０ｎｍ波長帯のｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＬＯＯＤＡ）レーザを照射して、ブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の破壊を誘導した。
【０１４４】
レーザ照射４日後、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体をそれぞれ１０ｎＭの濃度で１ｕＬずつガラス体腔内に注射した。レーザ照射７日後、眼球を摘出して網膜色素上皮−脈絡膜−強膜組織を得た後、脈絡膜新生血管膜の範囲を確認するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４が結合したｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４抗体で免疫蛍光染色を実施して、二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体による血管形成抑制能を確認した。脈絡膜新生血管膜の範囲を定量的分析するために、ＩｍａｇｅＪプログラム（ＮＩＨ）を用いた。
【０１４５】
レーザ誘導脈絡膜血管新生動物モデルにおいてもＰＲｂ−ＣＮ０１ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合抗体ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体は新生血管増殖を抑制した（図１０）。
【０１４６】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖの毒性はＩＣ５０（最大抑制能の５０％）で計算され、統計はｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔｓまたはｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅを用いた。Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔは二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ同士の統計の有意性を調べるために使用された。ｐ−ｖａｌｕｅ０．０５以下は統計的に有意であると見なした。すべての分析はＰｒｉｓｍ  ｖ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。
【０１４７】
実施例９．ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｃκ融合タンパク質の発現および精製
ｈＰＤＧＦＲ−β、サイノモルガス猿ＰＤＧＦＲ−β、スーススクローファＰＤＧＦＲ−βの細胞外領域に対するアミノ酸配列は、前記表３の配列番号６１、６２および６３に示し、ただし、レサスＰＤＧＦＲ−βは市販の抗原（Ｃａｔ：９０２１５−Ｃ０２Ｈ）を購入して使用した。前記製造された塩基配列の末端にＳｆｉＩ制限酵素配列を入れて合成し（ジェンスクリプトバイオテック、江蘇省、中国）、ＳｆｉＩ酵素で切断、ｐＣＥＰ４ベクターにクローニングした後、ＣκまたはｈＦｃ形態で従来報告された方法を用いて発現した［Ｙ．Ｌｅｅ，Ｈ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４６（２０１４）ｅ１１４，Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４１１（２０１０）１２３８］。
【０１４８】
形質注入および精製は実施例１のｍＰＤＧＦＲ−βにより行われたが、製造業者の指示により、タンパク質Ａゲル親和性クロマトグラフィーを用いてｈＦｃ融合タンパク質を精製するように変形した（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。前記融合タンパク質はｈＰＤＧＦＲ−βアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃκはリンカー−（ＧＧＧＧＳ）３を介して連結された構造を有する。
【０１４９】
実施例１０．二重抗体（ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ）の発現および精製
１０−１：複合ｓｃｆｖを発現してファージライブラリーの作製およびバイオパンニング
実施例２のｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−発現ファージライブラリーおよびバイオパンニングの生成と同様の方法で、実施例９でｈＰＤＧＦＲ−β−Ｃκ融合タンパク質を用いて抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−発現ファージライブラリーを生成し、バイオパンニングを行った。
【０１５０】
５次排出価からｓｃＦｖクローンをランダムに選別して、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｃκがコーティングされたマイクロタイター板に対してファージ酵素免疫測定法を進行させた。アミノ酸配列を確認した後、計３種類の抗体クローンを探した（表７）。下記表７は、抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖクローンのＨＣＤＲ３配列である。前記得られた３つのクローンに対するＶＨおよびＶＬとこれらのＣＤＲアミノ酸配列情報を前記表２に示す。
【０１５１】
【表７】
2022502457.tif 000021
【０１５２】
１０−２：二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現および精製
実施例２の抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖの作製と同様の方法により、実施例９で製造した抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖクローンを用いて、（抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニンｓｃＦｖ）二重特異抗体を暗号化している遺伝子を含むｐＣＥＰ４発現ベクターが作製された。
【０１５３】
製造された（抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ）−Ｃκ−（抗−コチニンｓｃＦｖ）二重特異抗体の具体的構造とそれぞれのリンカーの結合位置は図１Ａに示す。具体的には、抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖおよび抗−コチニンｓｃＦｖは、それぞれＮ−末端からＶＬ−ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（表２の配列番号５７）−ＶＨの順序で結合し、つまり、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端とを連結したものである。Ｎ末端から抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ、Ｃｋおよび抗−コチニンｓｃＦｖがそれぞれリンカーを用いて連結され、前記ｓｃＦｖを連結したリンカーは表２の配列番号５９を有する（ＧＧＧＧＳ）３を使用し、Ｃｋアミノ酸配列は表２の配列番号５８を有するものを使用した。
【０１５４】
二重特異抗体である融合タンパク質を製造する具体的な方法、発現した二重抗体のタンパク質の精製および純度の確認方法などは、実施例２と実質的に同様の方法で行った。ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動結果を図１１に示す。図１１は、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体としてコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動した結果である。
【０１５５】
図１１に示すように、還元剤を用いて還元された（ｒｅｄｕｃｅｄ）タンパク質は、レーン１（ＰＲｂ−ＣＮ１６ｘコチニン二重抗体）、レーン３（ＰＲｂ−ＣＮ２６ｘコチニン二重抗体）、レーン５（ＰＲｂ−ＣＮ３２ｘコチニン二重抗体）で６９．０ｋＤａであり、還元タンパク質は６７ｋＤａ、非還元タンパク質は６０ｋＤａで染色された。コンピュータで計算した融合タンパク質のサイズは６６．７７ｋＤａであった。Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ帯は見えなかった。
【０１５６】
実施例１１．二重抗体のｈＰＤＧＦＲ−βとコチニンに対する結合能分析
コーティングバッファー（０．１Ｍ重炭酸塩ナトリウム、ｐＨ８．６）に入っている１００ｎｇのｈＰＤＧＦＲ−Β−ＦｃキメラまたはＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質をマイクロタイター板に４℃Ｏ／Ｎコーティングした。各ウェルに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ１５０μＬを３７℃で１時間遮断剤で培養し、抗−ｍＰＤＧＦＲ−Β免疫ニワトリ血清結合能を実験したプロトコルに同様に従った。
【０１５７】
コーティングバッファーに入っている１００ｎｇのｈＰＤＧＦＲ−β−ＦｃキメラまたはＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質をマイクロタイター板に４℃Ｏ／Ｎコーティングした。各ウェルに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ１５０μＬを、３７℃の温度で１時間遮断剤で培養した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度の二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（０．０１ｎＭ−１μＭ）を処理した後、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の容量−依存的結合能を測定したプロトコルと同様に実験を進行させた。
【０１５８】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとｈＰＤＧＦ−ＢＢ競争を確認するために、実施例３のようにマイクロタイター板にｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラをコーティングした後、ブロッキングした。ｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎＭ；２２０−ＢＢ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の有／無の条件で様々な濃度の二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（０．０１ｎＭ−１μＭ）を板に処理した後、２時間３７℃の温度で培養した。洗浄、培養、検出は前記説明された酵素免疫測定法と同様に行われた。ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６のｈＰＤＧＦＲ−Βに対する結合能は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢがある時に阻害されなかった（図１２Ａ）。
【０１５９】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の交差種結合を試験するために、マイクロタイタープレートに１００ｎｇのｈＰＤＧＦＲ−β、ｍＰＤＧＦＲ−β、レサスＰＤＧＦＲ−β（９０２１５−Ｃ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、北京、中国）、サイノモルガス猿ＰＤＧＦＲ−β、スーススクローファＰＤＧＦＲ−β−ＦｃキメラまたはＴＮＦ−α受容体の細胞外領域−ヒトＦｃ融合タンパク質で４℃の温度でＯ／Ｎコーティングした。ウェルをブロッキングした後、実施例３と同様の方法で抗−ｈＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質およびＨＲＰ接合された抗−ヒトＣκ抗体の順次的培養が続けられた。
【０１６０】
ｈＰＤＧＦＲ−βとコチニンに対する二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の同時結合能を確認するために、酵素免疫測定法を用いた。３種類の融合抗体は対照−ヒトＦｃタンパク質には結合せず（図１２Ｂ）、濃度依存的にｈＰＤＧＦＲ−Β−Ｆｃキメラタンパク質に結合した（図１２Ａ）。
【０１６１】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質のすべてと対照二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質はコチニン−ＢＳＡに結合能があった（図１２Ｃ）。コチニンとｈＰＤＧＦＲ−βに同時結合能があるかを確認するために、抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をコチニン−ＢＳＡがコーティングされたウェルに培養した。それぞれの過程ごとに洗浄をし、ｈＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃキメラタンパク質、ＨＲＰ−抗ヒトＦｃ抗体を順に培養した。３種類の二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質はｈＰＤＧＦＲ−βとコチニンに同時結合した（図１２Ｄ）。
【０１６２】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢがある場合にも、ｈＰＤＧＦＲ−βとコチニンに同時に結合できることを確認した（図１３Ａ）。
【０１６３】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の交差種間結合を試験するために、酵素免疫測定法を用いた。対照群ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を除いたすべての３つのクローンは、ｈＰＤＧＦＲ−β、ｍＰＤＧＦＲ−β、レサスＰＤＧＦＲ−β、サイノモルガスＰＤＧＦＲ−β、スーススクローファＰＤＧＦＲ−βへの結合に成功した（図１７）。
【０１６４】
図１７は、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の種間反応を実験したグラフである。ｈＰＤＧＦＲ−β、ｍＰＤＧＦＲ−β、レサスＰＤＧＦＲ−β、サイノモルガスＰＤＧＦＲ−Β、スーススクローファＰＤＧＦＲ−βおよび対照群Ｆｃコーティングされたマイクロタイタープレートに、本発明による抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体（１００ｎＭ）と反応し、結合した二重抗体の量をＨＲＰ接合された抗−ヒトＣκ抗体およびＴＭＢを用いて測定した。
【０１６５】
実施例１２．二重抗体の細胞内在化分析
ヒト周皮細胞に１０％ＦＢＳが添加された周皮生長培地に希釈した二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１０μｇ／ｍＬ）を処理して、３０分間３７℃で内在化させた。実施例４の抗−ｍＰＤＧＦＲ− βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の共焦点顕微鏡のプロトコルに同様に従った。二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質にｈＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した後、同一のプロトコルに従って共焦点顕微鏡実験が行われた。
【０１６６】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質はエンドソームを介して細胞内在化を確認した。
【０１６７】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の内在化を映像化した。ヒト周皮細胞に融合タンパク質を処理後、細胞表面に結合している抗体を除去した。細胞の固定後、融合タンパク質はＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体（緑色）で染色した。初期エンドソームをイメージ化するために、細胞は抗−Ｒａｂ５抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ヤギ抗−ウサギ抗体ＩｇＧ（赤色）で染色された。矢印で表示された部分は、拡大された部分を示しながら、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質と初期エンドソームの蛍光が共局在化されている部分を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩ（青色）で染色された。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１０μｍ。図１３Ｄは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れて繰り返された。
【０１６８】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖの細胞内在化を測定するために、抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質をヒト周皮細胞に培養した後、ＦＩＴＣ−抗ヒトＣκ抗体とエンドソーム特異的抗体を処理して、共焦点顕微鏡を用いて映像化した。細胞内蛍光はＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ１６を培養した細胞内でのみ確認可能であった（図１３Ｃ）。映像を合併した時、本発明者らは、２つの抗体クローンとエンドソーム特異的抗体の蛍光が共局在化したことを確認した。ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ２６にｈＰＤＧＦ−ＢＢを処理した時、エンドソーム特異的抗体と共局在化したことを確認した（図１３Ｄ）。ＰＲｂ−ＣＮ２６は、ＰＤＧＦ−ＢＢと共に処理した場合、３０分内に多量が内在化された。抗体の内在化は標的細胞内への薬物の伝達に極めて重要であり、いくつかの疾病にはＰＤＧＦ−ＢＢのレベルが上昇しているが、本発明による抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢのレベルが上昇しても抗体が内在化に影響を与えず、病症のある患者に薬物を細胞内に伝達するのに有用である。
【０１６９】
実施例１３．二重抗体のｈＰＤＧＦＲ−βおよびコチニンに対する結合能分析
ヒト周皮細胞は、分析用バッファー（１％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ／ＰＢＳに０．０５％［ｗ／ｖ］ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）に１：１００で希釈したニワトリ血清を４℃にて１時間培養し、流細胞分析バッファーで４回洗浄した。実施例４の抗−ｍＰＤＧＦＲ−βを試験した同一のプロトコルに従った。前記ヒト周皮細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％ペニシリン、ストレプトマイシンを添加した周皮細胞生長培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）で培養されたものである。
【０１７０】
ヒト周皮細胞は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎ（１００ｎＭ；ＢＴ２２０；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ ）の有／無の２つの条件で二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ ）を用いて、４℃にて１時間培養した。細胞は流細胞バッファーで４回洗浄後、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）−抗ヒトＣκ抗体（ｃｌｏｎｅ  ＴＢ２８−２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（１２−４３１７−８７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて培養した。洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分類して分析した。各測定時ごとに１０，０００細胞を確認し、結果はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した。
【０１７１】
Ａ−４３１細胞に二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）を４℃にて１時間培養した。前記説明のように洗浄後、検出はＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体を処理して実験を進行させた。前記Ａ−４３１細胞は韓国細胞株銀行から購入して、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）と１％ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、ソウル、韓国）培地で培養したものである。
【０１７２】
本発明者らはまた、流細胞実験でｈＰＤＧＦ−ＢＢがある時、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現するヒト周皮細胞に各クローンの結合能を確認し、抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｈＰＤＧＦ−ＢＢ−ｂｉｏｔｉｎは細胞に結合することを確認した。酵素免疫測定法と類似する結果の通りにｈＰＤＧＦ−ＢＢを一緒に入れた場合、すべての３つのクローンが細胞表面に存在するＰＤＧＦＲ−βに結合した（図１３Ｂ）。本発明者らは、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しないＡ−４３１細胞にも二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能を流細胞実験で確認し、抗−ｈＰＤＧＦＲ−ΒｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質のすべてと対照二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質が当該細胞に結合しないことを確認した（図１５）。
【０１７３】
実施例１４．二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン（ｃｏｔ−ｄｕｏ）の複合体形成
実施例６と実質的に同様の方法で行い、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体の代わりに、実施例１０で製造した抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体を使用した。実施例６による抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の作製と形質導入で言及したように、同一にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質導入した。上澄液から二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質を親和クロマトグラフィー方法で精製し、ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動を実施した（図１１）。
【０１７４】
実施例１５．ＰＤＧＦＲ−βの発現細胞株における抗増殖性分析（細胞毒性実験）
１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した周皮細胞生長培地５０μＬにヒト周皮細胞を入れて、９６−ウェル板（ＣＬＳ３５９５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れて、一晩５％ＣＯ２、３７℃の培養器で培養した。細胞５０μＬが入っている各ウェルにｃｏｔ−ｄｕｏと複合体をなした抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（２５．６ｐＭ−２μＭ）を５０μＬ添加して、５％ＣＯ２、３７℃の培養器で７２時間培養した。
【０１７５】
二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の毒性に対するｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響を分析するために、ｈＰＤＧＦ−ＢＢ（２ｎＭ）を二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖとｃｏｔ−ｄｕｏ複合体５０μＬに一緒に入れた。混合された複合体は細胞含有溶液５０μＬに添加した。二重抗体抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖは対照群として使用された。その他の実験方法は、実施例７の抗−ｍＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質のプロトコルと同様に実験を進行させた。
【０１７６】
抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の毒性を評価するために、ヒト周皮細胞に複合体をｈＰＤＧＦ−ＢＢの有／無の状態で処理し、細胞の三リン酸アデノシンを測定して相対的生存力を測定した。二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖの毒性はＩＣ５０で示した（表８）。下記表８は、抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とｃｏｔ−ｄｕｏ複合体の試験管内力価を示し、９５％信頼区間を適用した。
【０１７７】
【表８】
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【０１７８】
前記表８の結果に示すように、３つの実験された抗体（ＰＲｂ−ＣＮ１６、ＰＲｂ−ＣＮ３２、ＰＲｂ−ＣＮ２６）のすべては、ｈＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく対照抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、高い毒性を示した（ｐ＜０．０５；図１４Ａ、および図１４Ｂ）。対照実験で二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体を、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しないＡ−４３１細胞に毒性実験を進行させた。抗−ｈＰＤＧＦＲ−βｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質とも、対照抗体である抗−ｍＣＤ１５４ｘコチニンｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質より毒性が高くなかった（図１６）。よって、抗増殖性の結果、二重抗体／ｃｏｔ−ｄｕｏ複合体は、ｈＰＤＧＦＲ−β発現するヒト周皮細胞株において、対照抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、細胞毒性が高く、ｈＰＤＧＦＲ−βを発現しないＡ−４３１細胞では、対照抗−ｍＣＤ１５４ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ対比、細胞毒性の差がなかった。このような細胞毒性の結果は、ｈＰＤＧＦＲ−βによって伝達されたデュオカルマイシンの効能によるものであり、よって、ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ二重特異抗体がハプテン−薬物である（ｃｏｔ−ｄｕｏ）を効果的に標的細胞に伝達し、細胞内に薬物を効果的に放出したことを示したのである。
【０１７９】
実施例１６
まず、実施例２で製造したＰＲｂ−ＣＮ０１  ｓｃＦｖを用いて、ｓｃＦｖ−ウサギＦｃ抗体を暗号化している遺伝子を含むｐＣＥＰ４発現ベクターが作製された。前記実験に用いられたウサギＦｃ抗体のアミノ酸配列は、添付の配列リストのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に示す。
【０１８０】
具体的には、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β  ｓｃＦｖのＣ−末端にｈｉｎｇｅ（ＱＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）を用いてウサギＦｃに連結された。ｓｃＦｖ−ウサギ−Ｆｃを製造する具体的な方法として、抗−ｍＰＤＧＦＲ−βを暗号化する遺伝子はＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断して発現ベクターに連結された。形質注入および精製は、実施例のｍＰＤＧＦＲ−βにより行われたが、製造業者の指示により、タンパク質Ａゲル親和性クロマトグラフィーを用いてウサギＦｃ融合タンパク質を精製するように変形した（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。
【０１８１】
実施例５の抗体結合能に対する流細胞分析法と実質的に同様の方法で行って、ＮＩＨ３Ｔ３にＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖの両方とも当該細胞に結合することが確認された（図１８）。具体的には、ｍＰＤＧＦＲ−βを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、流細胞分析バッファーにある二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（１００ｎＭ）を培養した。細胞にはＡＰＣ−抗ヒトＣκ抗体を処理した。二重抗体である抗−ＨＥＲ２  ｘｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は陰性対照群として使用された。
【０１８２】
実施例３の抗体結合能に対する酵素免疫測定法と実質的に同様の方法で行い、ｍＰＤＧＦＲ−β−ｈＦｃキメラタンパク質をマイクロタイター板に４℃の温度でＯ／Ｎコーティングした。各ウェルに遮断剤を培養した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した様々な濃度のＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（０．０１ｎＭ−１μＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、抗−ＨＥＲ２対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１００ｎＭ）を、各ウェルに３７℃の温度で２時間反応した。板をＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−抗ウサギＦｃ抗体を３７℃の温度で１時間反応、洗浄後、ＡＢＴＳを用いて反応した。その後、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート機器（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図１９Ａ）。図１９Ａは、ＰＲｂ−ＣＮ０１代理抗体に関する競争を確認した結果である。図１９Ａに示されるように、ｍＰＤＧＦＲ−β−ｈＦｃキメラタンパク質とＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃの結合能はＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖによって阻害された。
【０１８３】
実施例５と実質的に同様の方法で行って、ＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃ（５０ｎＭ）とＰＲｂ−ＣＮ０１、対照抗体、ＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖ（１μＭ）を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に４℃にて１時間培養した。洗浄後、ＦＩＴＣ−抗ウサギＦｃ抗体（１７２−１５０６、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を４℃にて１時間培養した。洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分類して分析した。各測定時ごとに１０，０００細胞を確認し、結果はＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析した（図１９Ｂ）。
【０１８４】
図１９Ｂに示されるように、細胞表面に存在するｍＰＤＧＦＲ−βとＰＲｂ−ＣＮ０１−ウサギＦｃの結合能はＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体ｓｃＦｖ−Ｃκ−ｓｃＦｖによって阻害された。
【０１８５】
実施例７と同様の方法で行い、抗−ｍＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体と実施例１０で製造した抗−ｈＰＤＧＦＲ−β抗体に関する二重抗体を使用した。図２０Ａ〜図２０Ｂは、ＰＤＧＦＲ−βを発現する細胞に対して、ＰＲｂ−ＣＮ０１とＰＲｂ−ＣＮ３２二重抗体とコチニン−デュオカルマイシン複合体の細胞毒性能の差を確認したグラフである。図２０Ｂは、ｍＰＤＧＦ−ＢＢがある条件で実験が繰り返された。
【０１８６】
図２０Ａおよび２０Ｂに示されるように、２つの実験された抗体（ＰＲｂ−ＣＮ０１、ＰＲｂ−３２）とも、ｍＰＤＧＦ−ＢＢの有／無に関係なく同一の毒性を示した。したがって、ＰＲｂ−ＣＮ０１およびＰＲｂ−３２は、代理抗体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）であることを確認した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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