(57)【要約】  本発明は、サイトカインの放出を刺激しうる新規なペプチド、及び薬剤としての当該ペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０；
（式中、
Ｘ１は、ＰｙｒｏＱ及びＡより選択され；
Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｌ及びＭからなる群より選択され；
Ｘ５は、Ｔ及びＳからなる群から選択され；
Ｘ６は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ７は、Ｈ、Ｋ、Ｑ及びＲからなる群より選択され；
Ｘ８は、Ｅ、Ａ、Ｎ、及びＱからなる群から選択される；
Ｘ９は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ１０は、Ｎ、Ｄ、及びＡからなる群から選択される）
又はその機能的変異体の断片、
を含む単離されたポリペプチド、。
【請求項２】
Ｘ１は、ＰｙｒｏＱである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ２は、Ｅである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ３は、Ｔである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ４は、Ｖである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ５は、Ｓである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ６は、Ｓである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ７は、Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ８は、Ｅである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ９は、Ｑである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ１０は、Ｄである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列、若しくはその断片又はその機能的変異体を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜４７のいずれか１つから選択されるポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
少なくとも１つの請求項１３又は１４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の少なくとも１つのベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
医薬として用いられる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞を、それらを必要とする患者に投与することを含む、治療方法。
【請求項２０】
サイトカインのレベルを高めるか、又はその放出を刺激する方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞を標的細胞又は患者に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の少なくとも１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
がんの治療に用いる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞の少なくとも１つを、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの放出を刺激しうる新規なペプチド、及び薬剤としてのそのペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは免疫応答の調節に重要な役割を果たす。自然免疫細胞から放出されるこれらの細胞間メッセンジャーにより、病原体や傷害に対して協調した、強力な、自己限定的な応答が可能になる。しかしながら、過去２０年間以上、サイトカインががん免疫療法において果たす役割に対する関心が高まっている。
【０００３】
サイトカインは、腫瘍部位において免疫エフェクター細胞及び間質細胞を直接刺激し、つまり、細胞傷害性エフェクター細胞による腫瘍細胞の認識を増強することができる。多くの動物腫瘍モデル研究により、サイトカインには広範な抗腫瘍活性があり、かつ、これはがん治療では多くのサイトカイン系アプローチに翻訳されていることが実証されている（Ｌｅｅ＆Ｍａｒｇｏｌｉｎ，２０１１）。そのようなサイトカインは、当該がん細胞に対して直接的に、又は、例えば免疫細胞集団との相互作用を介して間接的に、抗腫瘍効果を呈示する。これらのメカニズムの多くは、一連のがん動物モデルでは有望な抗腫瘍効果にもかかわらず、未だ同定されていない。
【０００４】
例えば、ＩＬ−２は、T細胞増殖を駆動することにより抗腫瘍免疫応答を増強させるため、最初に「Ｔ細胞増殖因子」として発見された後、メラノーマや腎細胞がんを含む多くのがんの治療に承認されている。（Ｊｉａｎｇら、２０１６）。上記のがんで用いる臨床承認に加えて、上記文献では特に他の抗がん免疫療法と併用による免疫系の活性化能があることから「ｇｏ−ｔｏ」がん免疫療法と高く評価されている（Ｊｉａｎｇら、２０１６）。実際、ＩＬ−２は「ヒトがんに対する最初の有効な免疫療法」とみなされており、あらゆる種類のがんに適用される可能性が高い（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２０１４）。
【０００５】
さらに、ＩＬ−４は当初「Ｂ細胞増殖因子」として報告され、抗腫瘍免疫応答を増強し、かつ、乳がんを含むがん細胞においてアポトーシスを直接誘導する（Ｎａｇａｉ  ａｎｄ  Ｔｏｉ，２０００）。腫瘍免疫におけるＩＬ−４の機能には多少の矛盾はあるが、ＩＬ−４は多くのがんの予防及び治療モデルにおいていくつかのサイトカインの中で最も有効な免疫応答を誘導しうることが示されている（Ｌｉら、２００９）。
【０００６】
ＩＬ−１２は、免疫応答の先天性（ＮＫ細胞）及び適応性（細胞傷害性Ｔリンパ球）アームをともに活性化しうることから（Ｌａｓｅｋら、２０１４）、ヒトにおける腫瘍免疫療法の最も有望な候補の１つであると考えられてきた。ＩＬ−１２系治療法は、乳がん、膵臓がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、腎臓がん、肉腫、肝臓がんを含む多くの種類のがんで成功しており（Ｌａｓｅｋら、２０１４）、最近の多くの臨床試験でこの効能が確認されている（Ｌａｓｅｋ＆Ｚａｇｏｚｄｚｏｎ，２０１６）。
【０００７】
また、ＩＩ型ＩＦＮとしても知られるＩＦＮ−γは、免疫細胞の活性化及び生存の亢進、免疫エフェクター機能の亢進、調節性Ｔ細胞免疫抑制の低下及び細胞毒性機能の亢進を含む様々なメカニズムを介して抗腫瘍免疫を介在しうる（Ｐａｒｋｅｒら、２０１６）。さらに、ＩＦＮ−γは、全てのヒトがんの腫瘍進行、増殖及び転移性拡散を誘導するプロセスである腫瘍血管新生の阻害を介在することが示されている（Ｈａｙａｋａｗａら、２００２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これより、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは全て、明らかに、ヒトのがんの発生、増殖及び拡散に重要なサイトカインであり、すなわち、当該サイトカインの調節は、全てのがんにおいて影響する。多くのサイトカインが、がん免疫療法の前臨床開発にある。しかし、治療用サイトカインの送達には問題があり、研究者らは、サイトカイン遺伝子送達用の組換えウイルスベクターや、宿主内動態の改善のためのサイトカインタンパク質のＰＥＧ化等の代替戦略の開発を行っている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｇｏｌｉｎ，２０１１）。そこで、宿主細胞由来のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γを含むが、これらに限定されない、当該サイトカインの放出を高め、かつ、抗腫瘍免疫を促進するような、新しい方法を見出す必要がある。本発明は、当該課題に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様では、以下のアミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０；
（式中、
Ｘ１は、ＰｙｒｏＱ及びＡより選択され；
Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｌ及びＭからなる群より選択され；
Ｘ５は、Ｔ及びＳからなる群から選択され；
Ｘ６は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ７は、Ｈ、Ｋ、Ｑ及びＲからなる群より選択され；
Ｘ８は、Ｅ、Ａ、Ｎ、及びＱからなる群から選択される；
Ｘ９は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ１０は、Ｎ、Ｄ、及びＡからなる群から選択される）
又はその機能的変異体の断片、
を含む単離されたポリペプチド、が提供される。
【００１０】
１の実施形態では、Ｘ１は、ＰｙｒｏＱである。
【００１１】
１の実施形態では、あるいは、Ｘ１は、Aである。
【００１２】
第２実施形態では、Ｘ２は、Ｅである。
【００１３】
第３実施形態では、Ｘ３は、Ｔである。
【００１４】
第４実施形態では、Ｘ４は、Ｖである。
【００１５】
第５実施形態では、Ｘ５は、Ｓである。
【００１６】
第６実施形態では、Ｘ６は、Ｓである。
【００１７】
第７実施形態では、Ｘ７は、Ｈである。
【００１８】
第８実施形態では、Ｘ８は、Ｅである。
【００１９】
第９実施形態では、Ｘ９は、Ｑである。
【００２０】
第１０実施形態では、Ｘ１０は、Ｄである。
【００２１】
１の実施形態では、配列番号１〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列、若しくはその機能的変異体の断片を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
【００２２】
本発明の他の態様では、単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、単離されたポリヌクレオチドは以下の：
（ａ）上記で特定される、配列番号１〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列、若しくはその機能的変異体の断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）に相補的なヌクレオチド配列；
を含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様では、配列番号１〜４７のいずれかに定義される少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、又はその機能的変異体若しくは相同体を含む核酸構築物が提供され、ここで、少なくとも１つの前記配列が調節配列に機能的に連結されていることが好ましい。一の実施形態では、当該調節配列は構成的又は強力なプロモーターである。
【００２４】
本発明の他の態様では、上記ポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むベクターを提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、少なくとも１つの核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様では、医薬として用いられる、本明細書に記載した単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載される少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物を、それを必要とする個体又は患者に投与することを含む、治療方法が提供される。
【００２８】
本発明の他の態様では、がんの治療に用いる、本明細書中に記載されるような少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は宿主細胞が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる態様では、がんを治療する方法であって、少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、又は本明細書に記載の宿主細胞を、それを必要とする個体又は患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００３０】
一例では、がんは、以下の：膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸又は虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、神経膠腫、リンパ腫等の１つから選択されうる。一の実施形態では、がんは肝臓がんである。
【００３１】
本発明の他の態様では、本明細書に記載される少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞、及び医薬的に許容される担体を含む医薬的組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、サイトカインのレベルを高める方法であって、本明細書に記載されているように、少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞を標的細胞又は患者に投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
本発明の最後の態様では、サイトカインの放出を高めるか又は刺激する、少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物又は宿主細胞の使用が提供される。
【００３４】
一の実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの少なくとも１つである。
【００３５】
本発明は、以下の非限定的な図面にさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】本発明のポリペプチドを異なる濃度で投与した場合の、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）細胞増殖に対する毒性がないことを示す図である。
【図１Ｂ】本発明のポリペプチドを異なる濃度で投与した場合の、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）細胞増殖に対する毒性がないことを示す図である。
【図２Ａ】マウス脾臓リンパ球由来のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２）の分泌に対するポリペプチドの投与の効果を示す図である。
【図２Ｂ】マウス脾臓リンパ球由来のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２）の分泌に対するポリペプチドの投与の効果を示す図である。
【図２Ｃ】マウス脾臓リンパ球由来のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２）の分泌に対するポリペプチドの投与の効果を示す図である。
【図２Ｄ】マウス脾臓リンパ球由来のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２）の分泌に対するポリペプチドの投与の効果を示す図である。
【図２Ｅ】マウス脾臓リンパ球由来のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２）の分泌に対するポリペプチドの投与の効果を示す図である。
【図３】ＨｅｐＧ２細胞増殖に対するポリペプチド処理マウス脾臓リンパ球血清（サイトカインを含む）の投与の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明についてさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる態様をより詳細に特定する。当該特定された各態様は、別段の明示がない限り、いかなる他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示されたいかなる特徴も、好ましい又は有利であると示されたいかなる他の特徴又は特徴と組み合わせることができる。
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書中では交換可能に用いられ、ペプチド結合によって互いに連結されたいかなる長さのポリマー体であるアミノ酸をいう。
【００３８】
本明細書中で用いられる用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、天然型、変異体、合成のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、及びヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含むことを意図する。
それは、一本鎖又は二本鎖でありうる。このような核酸又はポリヌクレオチドは、構造遺伝子、アンチセンス配列、及びｍＲＮＡ又はタンパク質産物をコードしない、非コーディング調節配列のコード配列を含むが、これらに限定されない。当該用語には、遺伝子も含まれる。
用語「遺伝子」又は「遺伝子配列」は、生物学的機能に関連するＤＮＡ核酸を広く示すのに用いられる。すなわち、遺伝子は、ゲノム配列中のようにイントロン及びエキソンを含んでよく、又はｃＤＮＡ中のようにコード配列のみを含んでよく、及び／又は調節配列と組み合わせたｃＤＮＡを含んでよい。
【００３９】
発明者らは、ウサギα−１−アンチプロテイナーゼの修飾断片に相当する多くのペプチド又はその機能的変異体の断片を単離したが、それらは以下の： 
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０；
（式中、
Ｘ１は、ＰｙｒｏＱ及びＡより選択され；
Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｌ及びＭからなる群より選択され；
Ｘ５は、Ｔ及びＳからなる群から選択され；
Ｘ６は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ７は、Ｈ、Ｋ、Ｑ及びＲからなる群より選択され；
Ｘ８は、Ｅ、Ａ、Ｎ、及びＱからなる群から選択される；
Ｘ９は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ１０は、Ｎ、Ｄ、及びＡからなる群から選択される）
の共通配列を備えていた。
【００４０】
自然免疫細胞からのサイトカインの放出を亢進又は刺激することができる。
【００４１】
本発明の一実施形態では、以下のアミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０；
（式中、
Ｘ１は、ＰｙｒｏＱであり；
Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｌ及びＭからなる群より選択され；
Ｘ５は、Ｔ及びＳからなる群から選択され；
Ｘ６は、Ｔ、Ａ、及びＳからなる群から選択され；
Ｘ７は、Ｈ、Ｋ、Ｑ及びＲからなる群より選択され；
Ｘ８は、Ｅ、Ａ、Ｎ、及びＱからなる群から選択される；
Ｘ９は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、及びＡからなる群から選択され；
Ｘ１０は、Ｎ、Ｄ、及びＡからなる群から選択される）
を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００４２】
一実施形態Ｘ２はＥである。第２実施形態では、Ｘ３はＴである。第３実施形態では、Ｘ４はＶである。第４実施形態では、Ｘ５はＳである。第５実施形態では、Ｘ６はＳである。第６実施形態では、Ｘ７はＨである。第７実施形態では、Ｘ８はＥである。第８実施形態では、Ｘ９はＱである。第９実施形態では、Ｘ１０はＤである。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、当該ペプチドは、配列ＰｙｒｏＱＥＴＡＶＳＳＨＥＱＤ（配列番号１又は配列番号２５）又はその機能的変異体を含む。本明細書では、このペプチドをペプチド１という場合がある。
【００４４】
他の実施形態では、当該ペプチドは、配列番号２〜２４又は配列番号２６〜４７のいずれか１つから選択される配列を含むか、又はそれらからなる。
【００４５】
本明細書で言及されるＰｙｒｏＱは、ピログルタミンとしても知られる。ＰｙｒｏＱの構造は以下の通りである：
【００４６】
【化１】
2022500069.tif 000002
疑義を避けるため、ＰｙｒｏＱは、ＰｙｒｏＥ、ＰｙｒｏＧｌｎ、ＰｙｒｏＧｌｕ又はピログルタメートとしても知られている。当該用語は、本明細書では交換可能に用いうる。つまり、ＰｙｒｏＱとＰｙｒｏＥは構造的に同一である。
【００４７】
ペプチドのＮ末端に結合したときのＰｙｒｏＱの構造を以下に示すが、ここで波線は結合点を示す：
【００４８】
【化２】
2022500069.tif 000003
ＰｙｒｏＱは以下のように（Ｒ）又は（Ｓ）エナンチオマーのいずれかで存在しうる：
【００４９】
【化３】
2022500069.tif 000004
本発明の他の態様では、配列番号１〜４７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド若しくはその断片又はそれらの機能的変異体が提供される。
【００５０】
配列番号１〜４７のいずれかに関して本明細書中で用いられる用語「変異体」又は「機能的変異体」は、完全な非変異体配列の生物学的機能を保持する変異体配列又はその配列の部分をいう。機能的変異体はまた、機能に影響を及ぼさない、例えば非保存残基における、配列に変化がある変異体、を含む。また、実質的に同一である、すなわち、配列変異がわずかであり、かつ、生物学的に活性である、変異体も包含される。コードされたポリペプチドの機能的特性に影響しない、所与の部位で異なるアミノ酸を産生させる核酸又はアミノ酸配列の変化は、当該分野で周知である。例えば、疎水性アミノ酸である、アミノ酸アラニンのコドンは、他のより疎水性でない残基、例えばグリシン、又はより疎水性の残基、例えばバリン、ロイシン、又はイソロイシンをコードするコドンによって置換されうる。同様に、グルタミン酸に対するアスパラギン酸等の他の、一つの負に荷電した残基、又はアルギニンに対するリジン等の他の、一つの正に荷電した残基、の置換をもたらす変化も、機能的に等価な生成物を生成することが期待されうる。上記で提案された修飾は各々、コード化された生成物の生物学的活性の保持の決定と同様、当技術分野における通常の技術の範囲内である。
【００５１】
本明細書中に記載される本発明のいずれかの態様において用いられる、「変異体」又は「機能的変異体」は、非変異体アミノ酸配列の完全配列との同一性が、少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。
【００５２】
２つの核酸配列又はポリペプチドは、２つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、以下に記載するように、最大限の一致をうるためにアラインメントされたときにそれぞれ同一である場合に、「同一」であると言う。用語「同一」又は％の「同一（性）」は、２又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査によって測定された、比較ウインドウ上で最大限の一致を得るために比較及びアラインメントされた場合、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドが特定比率である、２又はそれ以上の配列又はサブシークエンスをいう。配列同一性の比率を、タンパク質又はペプチドに関して用いる場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、そのため分子の機能的性質が変化しない、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識されている。保存的置換において配列が異なる場合、配列の同一性比率を上方調整して、置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。配列比較のため、通常、１つの配列が参照配列として機能して、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と参照配列がコンピュータに入力され、必要ならば、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを用いるか、代替パラメータを指定しうる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の比率を計算する。配列同一性及び配列類似性の比率に決定に適するアルゴリズムの非限定的な例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、例えば、結合タグ及び切断認識部位等の、ポリペプチドの精製に有用なＮ末端付加等の付加アミノ酸を含んでよい。
【００５４】
一例では、結合タグはグルタチオンに結合し、タグはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）でありうる。他の例では、タグはビオチンであってもよい。結合タグ標的は、好ましくは、固体支持体上に固定化され、これにより、結合したポリペプチドが、非結合生成物から容易に単離されうる。同様の固体支持体上に固定化された他の適当な結合タグを用いることができる。
【００５５】
他の例では、切断認識部位は、とりわけ、トロンビン、エンテロキナーゼ、又は第Ｘａ因子を認識する配列を含む。好ましくは、この部位は、結合タグの内側にあるか又は隣接している。
【００５６】
本発明のポリペプチドは修飾されてよい。修飾の例としては、限定はしないが、グリコシル化、アルキル化（例えば、メチル化）、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、ユビキチン化、硫酸化及びリン酸化等のいかなる翻訳後修飾、いかなる化学修飾、又は他のタンパク質又はペプチドへの非共有結合及び共有結合を含むいかなる修飾があげられる。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、当該ポリペプチドを産生又は精製する方法を提供し、当該方法は、宿主細胞において配列番号１〜４７のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを発現させる工程、ここで、当該ベクターは好ましくは本明細書に記載の調節配列を含み、当該ベクターはさらに好ましくは、結合タグをコードするヌクレオチド配列を含み；発現されたポリペプチドを前記結合タグの標的に結合させる工程；かつ、結合したポリペプチドを前記標的から放出させる工程、を含む。当該宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、他の脊椎動物又は無脊椎動物、昆虫、真菌、又は植物細胞であってよく；又は原核生物、例えば細菌であってよく；かつ細菌、酵母、他の真核生物、他の非真核生物、又はウイルス配列由来のベクターを用いてよい。次いで、本方法は、ポリペプチドを認識部位で切断する工程を含んでよい。
【００５８】
ポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法により製造又は合成することができ、例えば、一実施形態では、ポリペプチドは、化学合成を用いて製造される。本発明のポリペプチドを合成する方法の一例を、実施例２に示す。
【００５９】
本発明の他の態様では、単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、当該単離されたポリヌクレオチドは以下の：
（ａ）  配列番号１〜４７のいずれか１つ又はその変異体又はその断片から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は  
（ｂ）  （ａ）に相補的なヌクレオチド配列；  
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）のいずれかと、全体的な配列同一性が、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である核酸配列；又は、
（ｄ）  本明細書に定義するストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸配列とハイブリダイズすることができる、配列番号１〜４７のいずれかのポリペプチドをコードする核酸配列；
を含む。
【００６０】
当該配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対してよりも検出可能な程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）まで、その標的配列にハイブリダイズすることが意図される条件である。ストリンジェントな条件は塩基配列に依存し、状況によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プローブ）。あるいは、ストリンジェントな条件は、類似性がより低い配列が検出されるように、配列におけるミスマッチがいくつか可能であるように調整されうる（異種プローブ）。一般に、プローブ長は、約１０００ヌクレオチド未満、好ましくは５００ヌクレオチド未満である。
【００６１】
通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、通常ｐＨ  ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（又は他の塩）であり、温度が、短プローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃である条件であろう。ハイブリダイゼーション時間は、一般に、約２４時間未満であり、通常、約４〜１２時間である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成されうる。
【００６２】
本発明のさらなる態様では、配列番号１〜４７のいずれか１つから選択されるポリペプチド又はその機能的変異体又は相同体をコードする核酸配列を含む核酸構築物又はベクターを提供し、ここで、好ましくは、当該配列は調節配列に機能しうるように連結されている。当該調節配列は、標的又は宿主細胞において発現されたときに核酸の発現をもたらす構成的、強力、調節された、又は誘導可能なプロモーター等のいかなる形態のプロモーターでありうる。例としては、ウイルスプロモーターであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＳＶ４０（サル空胞化ウイルス４０）並びに伸長因子（ＥＦ）−１及びアクチン等の非ウイルスプロモーターがあげられるが、これらに限定されない。
【００６３】
用語「プロモーター」とは、通常、遺伝子の転写開始の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の結合に関与し、それにより作動可能に連結された核酸の転写を指令する核酸制御配列をいう。上記用語に包含されるのは、真核生物の古典的ゲノム遺伝子（ＣＣＡＡＴボックス配列の有無にかかわらず、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスを含む）及び発生及び／又は外部刺激に応答して、又は組織特異的に遺伝子発現を変化させる追加の調節因子（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）に由来する転写調節配列である。当該用語には、古典的原核生物遺伝子の転写調節配列も含まれ、この場合、それは−３５ボックス配列及び／又は−１０ボックス転写調節配列を含みうる。
【００６４】
本明細書中で用いられる用語「機能的に連結された」は、プロモーター配列が対象遺伝子の転写を開始することができるような、プロモーター配列と対象遺伝子の間の機能的連結をいう。
【００６５】
本発明の他の態様では、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。当該ベクターとしては、細菌又は酵母のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、人工染色体、又は植物もしくは哺乳類のウイルスがあげられる。好ましくは、当該ベクターは発現ベクターであり、発現構築物としても知られる。一実施形態では、発現ベクターは、開始点又は複製、少なくとも１つの選択マーカー、及び発現される核酸配列の挿入に適した多重クローニング部位を含みうる。発現ベクターは、当業者に公知の多数の技術のいずれか１つによって作製しうる。
【００６６】
本発明のさらなる態様では、核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でよく、細菌細胞、酵母等の真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞を含むことができる。単なる例として、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ、ＨＥＫ又はＨｅＬａから選択されうる。あるいは、宿主細胞は、リンパ球（Ｂリンパ球又はＴリンパ球）、マクロファージ又はマスト細胞、又は肝臓もしくは脾臓細胞、内皮細胞、線維芽細胞、又は間質細胞等の免疫細胞であってよい。また、本発明の上記の態様による外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。好ましくは、宿主細胞は当該ポリヌクレオチドを発現する。
【００６７】
本発明の他の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法であって、宿主細胞に、記載されるような核酸構築物を導入及び発現する工程、及びポリペプチドを単離する工程、を含む方法が提供される。
【００６８】
本発明の他の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法であって、宿主細胞に、記載されるような核酸構築物を導入及び発現する工程、及びポリペプチドを単離する工程、を含む方法が提供される。核酸構築物は、形質転換トランスフェクションというプロセスを介して前記宿主細胞に導入される。本明細書中で言及される用語「導入」又は「形質転換」又は「トランスフェクション」は、導入に用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入を包含する。当該ポリヌクレオチドは、一過性又は安定性で宿主細胞に導入することができ、例えばプラスミドとして非組み込み状態を維持することができる。あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてよい。
【００６９】
形質転換は現在、多くの種で常套技術となっている。有利には、いくつかの形質転換方法のいずれかを用いて、目的の遺伝子を適当な祖先細胞に導入することができる。形質転換方法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを高める化学物質、宿主細胞へのＤＮＡの直接注入、粒子砲撃、ウイルス又は花粉を用いた形質転換及び微小投射があげられる。
【００７０】
本発明の他の態様では、サイトカインのレベルを高める方法であって、本明細書中に記載した単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物の少なくとも１つ又はいかなる組合せを、それを必要とする標的細胞又は患者に投与することを含む方法が提供される。
【００７１】
一の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの少なくとも１つである。
【００７２】
さらなる実施形態では、サイトカインの放出は、対照細胞におけるレベルと比較して、１０〜２００％、より好ましくは１０〜１５０％高まる。一の実施形態では、対照細胞は刺激されていない（すなわち、ペプチド投与されていない）細胞である。
【００７３】
一の実施形態では、ＩＬ−２のレベルは、対照におけるレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％以上高まる。具体的な実施形態では、ペプチドは配列番号１又は配列番号２５であり、亢進レベルは５〜４０％、より好ましくは５〜１５％である。
【００７４】
もう１つの実施形態では、ＩＬ−４のレベルは、対照におけるレベルと比較して、５〜１００％、より好ましくは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上高まる。特定の実施形態では、当該ペプチドは、配列番号１又は配列番号２５であり、亢進レベルは、対照におけるレベルと比較して、５〜４０％、より好ましくは１０〜２０％である。
【００７５】
さらなる実施形態では、ＩＦＮ−γのレベルは、対照におけるレベルと比較して、２〜１００％、より好ましくは少なくとも２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上高まる。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２５であり、増加のレベルは、対照におけるレベルと比較して、２５〜６０％、より好ましくは３０〜４０％である。
【００７６】
他の実施形態では、ＩＬ−１２のレベルは、対照におけるレベルと比較して、１０〜４００％、より好ましくは少なくとも１０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％又はそれ以上高まる。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２５であり、亢進レベルは、対照におけるレベルと比較して、１５０〜２５０％、より好ましくは１８０〜２２０％である。
【００７７】
本発明の他の態様では、医薬として用いる、本明細書中に記載される単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１つ又は任意の組み合わせが提供される。
【００７８】
本発明のさらなる態様では、本明細書中に記載される単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物の少なくとも１つ又はいかなる組合せを、それを必要とする個体又は患者に投与することを含む治療方法が提供される。
【００７９】
本発明の他の態様では、がんの治療に用いる、本明細書に記載の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物の少なくとも１つ又はいかなる組合せが提供される。
【００８０】
本発明のさらなる態様では、がんを治療する方法が提供され、該方法は、本明細書中に記載される単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物の少なくとも１つ又はいかなる組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００８１】
本発明の他の態様では、がんの治療用医薬の調製において、本明細書中に記載される単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物の少なくとも１つ又はいかなる組合せの使用を提供する。
【００８２】
一例では、がんは、以下の：膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸又は虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、神経膠腫、リンパ腫等の１つから選択されうる。一の実施形態では、がんは肝臓がんである。
【００８３】
本発明の他の態様では、少なくとも１つの単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は核酸構築物を、それを必要とする標的細胞又は患者に投与することを含む、腫瘍細胞増殖を低下させる方法が提供される。一実施形態では、低下のレベルは、対照におけるレベルと比較して、１０〜６０％、より好ましくは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％以上である。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１又は配列番号２５であり、減少のレベルは、対照のレベルと比較して、５〜２０％、より好ましくは１０〜１５％である。
【００８４】
本明細書中で用いられる場合、対照は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドで処理されていない個体、患者又は細胞でありうる。
【００８５】
本発明の他の態様では、本明細書に記載のペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター又は構築物のいずれか１つ又は少なくとも１つ、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。組成物は、通常、患者に投与する前に、周知の方法を用いて処方される。
【００８６】
本発明のポリペプチド又は医薬組成物の投与は、経口的又は非経口的に行うことができる。非経口送達の方法には、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、粘膜又は鼻腔内投与が含まれる。活性成分に加えて、そのような組成物は、賦形剤及び活性化合物の調製物への加工を促進する他の成分を含む、適切な医薬的に許容される担体を含みうる。
【００８７】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適した投与量で、当技術分野で公知の医薬上許容される担体を用いて製剤化することができる。当該担体により、組成物を、対象の摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として処方しうる。
【００８８】
経口使用のための医薬製剤は、所望であれば適当な追加化合物を添加した後、活性化合物と固体賦形剤との組み合わせ、場合によっては混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理することで、錠剤又は糖衣錠コアを獲得しうる。適当な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖等の炭水化物又はタンパク質充填剤；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；及びアラビアゴム及びトラガカント等のガム；並びにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質があげられる。
所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はそれらの塩等の崩壊剤又は可溶化剤を添加してよい。
【００８９】
糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含んでよい濃縮糖溶液等の適当なコーティングを施すことができる。色素又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加して、製品の同定又は活性化合物の量の特徴付けを行ってもよい。
【００９０】
経口投与可能な製剤としては、ゼラチン製プッシュフィットカプセル及びゼラチン製軟性密封カプセル、並びにグリセロール若しくはソルビトール等の錠皮があげられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はデンプン等のような充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び場合によっては、安定剤と混合された活性成分を含むことができる。ソフトカプセルでは、活性化合物は、安定剤を含むか、又は含まない、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の適当な液体に溶解又は懸濁させることができる。
【００９１】
非経口投与用の医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射用に、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的に緩衝化された生理食塩水等の生理学的適合性の緩衝液中で処方されうる。水性懸濁注射液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストラン等の懸濁液の粘度を高める物質を含みうる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親脂性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームがあげられる。場合によっては、懸濁液はまた、化合物の溶解度を高め、高濃度溶液を調製しうる適当な安定剤又は剤を含有することができる。医薬組成物はまた、抗原性を促進又は調節するアジュバントを含んでよい。
【００９２】
局所又は鼻腔内投与のため、透過されるべき特定のバリアに適した浸透剤が、処方物において用いられうる。
【００９３】
一の実施形態では、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は核酸構築物は、先天性又は適応免疫を媒介し、細胞を化学誘引するための細胞アジュバント又は免疫療法として用いて、抗原性を高めることができる。一の実施形態では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は核酸構築物は、抗原又は他の免疫療法と同時投与される。
【００９４】
上記開示は、本発明を製造及び用いる方法を含む、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明、並びにその最良の形態を提供するが、以下の実施例により、当業者は本発明を実施することができ、その完全な書面による説明の提供にもたらされる。しかしながら、当業者は、当該実施例の詳細は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、その範囲は、本開示に添付された特許請求の範囲及びその均等物から理解されるべきであることを理解するであろう。本発明の様々なさらなる態様及び実施形態は、本開示を考慮して当業者に明らかであろう。
【００９５】
「及び／又は」は、本明細書において用いられる場合、２つの特定された特徴又は構成要素の各々の特定の開示とみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、あたかも各々が本明細書において個別に記載されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。
【００９６】
文脈上他に指示されない限り、上述の特徴の説明及び定義は、本発明の特定の態様又は実施形態に限定されず、説明されるすべての態様及び実施形態に等しく適用される。
【００９７】
上記出願、及びそこで引用された、又はそれらの手続き中の、すべての文献及び配列受託番号（「引用文献」）、ならびに引用文献で引用又は参照されたすべての文献、及び本明細書で引用又は参照されたすべての文献（「本明細書で引用された文献」）、及び本明細書で引用又は参照されたすべての文献、ならびに本明細書で引用された任意の製品に関する製造者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用されうる。より具体的には、参照された全ての文書は、個々の文書が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示しているのと同じ程度に、参照により組み込まれる。
【００９８】
本発明は、以下の非限定的な実施例に記載される。
【実施例１】
【００９９】
実験概要
発明者らは、以下の３つの別個の実験を用いて、免疫系亢進により、ペプチドの抗腫瘍活性を評価した：
１．  ヒト腫瘍細胞の増殖阻害能を評価する。
【０１００】
２．  マウス脾臓リンパ球処理された免疫細胞関連サイトカインの分泌亢進能。
【０１０１】
３．  最後に、ペプチド処理後のマウス脾臓リンパ球の血清を単離し、ヒト腫瘍細胞に直接添加し、腫瘍細胞増殖に対する阻害効果を評価した。
【０１０２】
実験
１  −  腫瘍細胞に対するペプチドの細胞毒性
ａ）  細胞培養−ＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ高グルコース培地（１０容量％含有ＦＢＳ）中で増殖させ、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃培養した。トリプシン消化、通常の細胞継代。
ｂ）  細胞増殖のＣＣＫ‐８検出  対数増殖期のＨｅｐＧ２細胞を細胞懸濁液にし、５×１０３細胞を９６穴平底プレートの各ウェルに播種した。一晩培養後、接着培養物中で細胞を増殖させ、ＰＢＳ／ＤＭＳＯに溶解した異なる濃度のポリペプチドを含有する培地で交換した。ブランク溶媒を陰性対照として用いた。各試料を３回ずつ実施し、１５時間インキュベートする。その後、ｃｃｋ−８（１０μｌ／ウェル）を添加し、１時間インキュベートした。波長４５０ｎｍでの吸光度Ａ値を酵素結合免疫吸着剤で測定した。
この実験の結果を図１に示す。図１に示すように、ペプチドそれ自体は腫瘍細胞増殖に影響を及ぼさず、細胞毒性を示さない。
【０１０３】
２．候補ペプチドの免疫学的活性に関する研究
マウス脾臓リンパ球を調製し、刺激実験による免疫活性について候補ペプチドを用いて試験した。
ａ）  雄昆明（ＫＭ）マウスを頚部脱臼により殺傷し、脾臓を無菌解剖した。次いで、脾臓を５ｍＬのリンパ球分離液の入った皿に入れ、粉砕した。細胞を８００ｇで３０分間遠心分離により収集し、上清を除去した。細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０細胞培養培地（１６４０）で洗浄し、２５０ｇで１０分間遠心分離することにより単離し、１６４０及び胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を用いて細胞を再懸濁し、リンパ球の濃度を５×１０６／ｍＬに調整した。９６穴プレートの各ウェルに１００μＬの懸濁細胞を添加し、異なる濃度の候補ポリペプチド（ＰＢＳ／ＤＭＳＯのいずれかに溶解）を３回反復添加し、２４時間インキュベートした。ＣｏｎＡ／ＬＰＳを陽性対照として用いた。
ｂ）  ＥＬＩＳＡ−  インキュベーション後、試料を遠心分離し、上清を分離し、サイトカイン濃度検出のＥＬＩＳＡキットの指示に従って試験した。簡潔には、各ウェルに５０μＬのＲＤ−１４を添加し、次いで５０μＬの試料（標準、対照及び工程Ａから単離した上清）を添加した。混合後、溶液を室温で２時間インキュベートした。試料を５回洗浄し、結合液１００μＬを添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、試料を５回洗浄し、基質溶液１００μＬを加え、暗所で室温にて３０分間インキュベートした後、クエンチング溶液１００ｍＬを加え、次のＯＤ値（４５０ｎｍ）を測定した。
この実験の結果を図２に示す。図２に示すように、ポリペプチドの濃度が増加すると、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２の量が各々増加した。
【０１０４】
３．腫瘍細胞に対する候補ペプチドの免疫活性
脾臓リンパ球を（２ａ）に従って刺激して、免疫サイトカインを含む上清を遠心分離によって得る。上清を一晩培養したＨｅｐＧ２細胞に添加し、さらに２４時間培養する。（１）ブランク溶媒及び（２）ＰＢＳ／ＤＭＳＯに溶解したポリペプチドを用いて、２つの陰性対照を実施した。ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を検出し、腫瘍細胞増殖に対する影響を分析した。この実験の結果を図３に示す。図１に示すように、「０．００」の濃度は、ペプチドでチャレンジされていない脾臓上清を表し、「（１．００）」は、ＨｅｐＧ２細胞に直接投与された１ｍｇ／ｍＬの濃度のペプチドをいい、従って、サイトカイン（実験１と同様、図１に示す）を全く含まない。図３に示すように、現在請求されている種々の濃度のペプチドでチャレンジした脾臓上清は、モデルヒト肝がん細胞（ＨｅｐＧ２細胞）における細胞増殖を有意に低下させた。
【実施例２】
【０１０５】
ペプチド製造の例示的方法
一例では、本発明のペプチドは、以下の方法を用いて製造することができる：
ａ）  手動ペプチド反応器に２００ｍｇの２−クロロトリチル樹脂（１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を充填し、ＤＣＭで３０分間膨潤させた後、乾燥させる。対応するＦｍｏｃ−保護アミノ酸（０．４ｍｍｏｌ、２当量）、ＤＩＥＡ（０．４ｍｍｏｌ、２当量）、及び適当量のＤＭＦ及びＤＣＭを、Ｎ２を１時間バブリングにより混合した。次いで、ＭｅＯＨ（１．０ミリモル、５当量）及びＤＩＥＡ（０．４ミリモル、２当量）を添加し、３０分間反応させて未反応部位をキャップした。
ｂ）  樹脂をＤＭＦ（×５）で洗浄し、次にＤＭＦ中の２０％ピペリジンと１０分間反応させてＦｍｏｃ基を除去した。ＤＭＦに２０％ピペリジンを２回加える。その後、結果物樹脂をＤＭＦで洗浄し、クロラニル試験で確認した。
ｃ）  ＤＭＦ／ＤＣＭ中の次のＦｍｏｃアミノ酸（０．４ｍｍｏｌ、２当量）、ＨＢＴＵ（０．４ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＩＥＡ（０．４ｍｍｏｌ、２当量）を樹脂に添加し、Ｎ２を１時間バブリングにより混合し、樹脂をクロラニル試験で確認した。カップリングが不完全な場合、Ｆｍｏｃアミノ酸及びカップリング試薬の他の部分を加え、さらに１時間反応させる。
ｄ）  配列が完了するまで手順（ｂ）と（ｃ）を繰り返す。
ｅ）  最後のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂を他のガラスバイアルに移し、室温で切断カクテル（９５％ＴＦＡ、２％ＥＤＴ、２％ＴＩＳ及び１％水）を加え、３時間放置する。得られた混合物を濾過し、濃縮し、冷ジエチルエーテル（１０×濃縮混合物）に移す。ペプチドを遠心分離により単離する。次いで、ペレットを減圧下で乾燥し、次いで、ＨＰＬＣで精製する。
【０１０６】
【表１】
2022500069.tif 000005
【０１０７】
【表２】
2022500069.tif 000006
【０１０８】
【表３】
2022500069.tif 000007
【０１０９】
【表４】
2022500069.tif 000008
【図１Ａ】
2022500069.tif 000009
【図１Ｂ】
2022500069.tif 000010
【図２Ａ】
2022500069.tif 000011
【図２Ｂ】
2022500069.tif 000012
【図２Ｃ】
2022500069.tif 000013
【図２Ｄ】
2022500069.tif 000014
【図２−１】
2022500069.tif 000015
【図２Ｅ】
2022500069.tif 000016
【図３】
2022500069.tif 000017
【配列表】
2022500069000001.app
【国際調査報告】
2022500069.tif 000018
2022500069.tif 000019
2022500069.tif 000020