(57)【要約】  本発明は、細胞スフェロイドを製造するためのマイクロ流体装置（１；８）であって、チャンバ（２；９）に流体を導入するための流体入口（３）と、チャンバ（２，９）から前記流体を除去するための流体出口（４）とを含む少なくとも１つのチャンバ（２；９）を含み、前記少なくとも１つのチャンバ（２；９）は、基板（５，１０）が流体と接触したときに生物細胞を含む流体を収集するための少なくとも２つの凹部（６；１１）を含む基板（５；１０）によって形成された基部を含み、少なくとも２つの凹部（６；１１）のサイズは、少なくとも１つのチャンバ（２；９）の流体入口（３）から流体出口（４）まで減少することを特徴とする、マイクロ流体装置に関する。
2022501041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞スフェロイドを製造するためのマイクロ流体装置（１；８）であって、
チャンバ（２；９）内に流体を導入するための流体入口（３）と、チャンバ（２，９）から前記流体を除去するための流体出口（４）とを含む少なくとも１つのチャンバ（２；９）を含み、
前記少なくとも１つのチャンバ（２；９）は、基板（５，１０）が流体と接触したときに生物細胞を含む流体を収集するための少なくとも２つの凹部（６；１１）を含む基板（５；１０）によって形成された基部を含み、
少なくとも２つの凹部（６；１１）のサイズは、少なくとも１つのチャンバ（２；９）の流体入口（３）から流体出口（４）まで減少することを特徴とする、マイクロ流体装置。
【請求項２】
前記流体入口（３）および前記流体出口（４）は、前記流体入口（３）から前記チャンバ（２；９）を通って前記流体出口（４）に流れる流体を導くように配置されることを特徴とする、請求項１に記載の装置（１；８）。
【請求項３】
前記基板（５；１０）が、生体適合性材料を含むか、生体適合性材料からなるか、または生体適合性材料でコーティングされていることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置（１；８）。
【請求項４】
前記生体適合性材料が、シリコーンまたはプラスチック材料またはガラスであることを特徴とする、請求項３に記載の装置（１；８）。
【請求項５】
前記生体適合性材料が、ポリスチレン、シクロオレフィンコポリマー、ポリメチルメタクリレート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、ポリウレタン、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエステルおよびチオール−エンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３または４に記載の装置（１；８）。
【請求項６】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）および／または前記基板（５；１０）が少なくとも部分的に防汚層でコーティングされていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項７】
前記防汚層が、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのポリマー、好ましくは、異なる長さを有し、約２２〜４５０の繰り返し単位で変化し、および／または１０００〜２００００Ｄａの範囲の分子量に対応する、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧまたはＰＥＧＳ、
ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）またはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）などのポリベタイン、
両性高分子電解質、
フッ素化ポリマー、
寒天またはアガロースなどの多糖類、
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）またはポリヒドロキシプロピルメタクリレート（ポリ−ＨＰＭＡ）などのポリヒドロキシポリマー、
ポリ（エチレンオキシド）、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、
ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、
デキストラン、
ヒドロキシルエチルセルロース（ＨＥＣ）、
天然生体高分子（疎水性物質、Ｓ層タンパク質ＳｂｐＡ）、
高分子電解質多層（ＰＥＭ）または自己組織化単層（ＳＡＭ）などの防汚ナノ界面、
ポリオキシエチレンドデカノール、Ｔｗｅｅｎ−２０、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）およびプルロニクス（トリブロックコポリマーＰＥＯ−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）−ｂ−ＰＥＯ）などの非イオン界面活性剤、
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）および３−クロロプロピルトリクロロシラン（ＣＰＴＭＳ）および（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシラン
からなる群の材料から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の装置（１；８）。
【請求項８】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）は、半球、球形キャップ、半楕円体、円錐、円錐台、テラス円錐、ピラミッド、角錐台、テラスピラミッド、トーラス、または楕円放物面の形状を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項９】
球形キャップの形状を有する前記少なくとも２つの凹部（６；１１）を用いて、球形キャップは、３０°〜９０°、好ましくは４０°〜９０°、より好ましくは５０°〜９０°、より好ましくは６０°〜９０°、より好ましくは７０°〜９０°、より好ましくは８０°〜９０°、より好ましくは８５°〜９０°の極角（α）を有することを特徴とする、請求項８に記載の装置（１；８）。
【請求項１０】
楕円放物面の形状を有する前記少なくとも２つの凹部（６；１１）を用いて、前記楕円放物面のシェル表面（１８）の少なくとも一部が、空間内で回転される公式ｙ＝Ａ×ｘＢを有する放物線によって形成され、ここで、Ａは０．０５〜１０、好ましくは０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、Ｂは、２、４または６であることを特徴とする、請求項８に記載の装置（１；８）。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）が、５０μｍ〜１ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜８００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜５００μｍの深さを有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１２】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）が、１００μｍ〜２ｍｍ、好ましくは１００μｍ〜１．５ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜１ｍｍの幅または直径を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）の深さ対幅の比率が、１：１〜１：３、好ましくは１：１〜１：２であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）が、異なるサイズおよび形状を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）が、１０μｍ〜６ｍｍ、好ましくは２０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは３０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは５０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは７０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜５ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜４ｍｍの距離で互いに離間していることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１６】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）がグループ化され、各グループ（７ａ〜７ｅ）の凹部（６；１１）が同じサイズおよび／または同じ形状を有し、異なるグループ（７ａ〜７ｅ）の凹部（６；１１）が異なるサイズまたは異なるサイズおよび異なる形状を有することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置（１；８）。
【請求項１７】
凹部（６；１１）の１つのグループ（７ａ〜７ｅ）が、２００μｍ〜１０ｍｍの距離で凹部（６；１１）の別のグループと離間していることを特徴とする、請求項１６に記載の装置（１；８）。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのチャンバ（９）は、前記流体入口（３）から前記流体出口（４）へと先細りになることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置（８）。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つのマイクロ流体装置（１；８）を含むことを特徴とする、細胞スフェロイドの製造のためのシステム（１３、２０）。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのマイクロ流体装置の各々は、流体入口（３）を介してグラジエントジェネレータ（２２）の流体出口（２１）に流体接続されることを特徴とする、請求項１９に記載のシステム（１３、２０）。
【請求項２１】
前記グラジエントジェネレータ（２２）は、少なくとも２つの流体入口（２３）を含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載のシステム（１３、２０）。
【請求項２２】
細胞スフェロイドの製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置（１；８）または請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のシステム（１３、２０）の使用。
【請求項２３】
細胞スフェロイドに対する種々の物質濃度の影響を決定するための、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のシステム（１３、２０）の使用。
【請求項２４】
細胞スフェロイドの製造方法であって、
生物細胞を含む流体を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置（１；８）の少なくとも１つのチャンバ（２；９）内に適用し、それによって前記流体を少なくとも２つの凹部（６；１１）に提供する工程と、
少なくとも１つの細胞スフェロイドが前記少なくとも２つの凹部（６；１１）内に形成されるまで、前記流体を含む装置（１；８）を少なくとも２時間インキュベートする工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２５】
前記流体を含む装置（１；８）が、最大６ヶ月間、好ましくは最大３ヶ月間、より好ましくは最大１ヶ月間、好ましくは最大１４日間、好ましくは最大７日間、好ましくは最大９６時間、好ましくは最大７２時間、好ましくは最大４８時間インキュベートされることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記流体を含む装置（１；８）が１〜７日間インキュベートされることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物細胞を含む前記流体が、４μＬ／分〜８μＬ／分の範囲の速度で、前記少なくとも１つのチャンバ（２；９）内に適用されることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも２つの凹部（６；１１）に形成された少なくとも１つの細胞スフェロイドが、細胞スフェロイドを溶出するのに十分な速度にて排出流体で少なくとも１つのチャンバ（２；９）をすすぐことによって溶出されることを特徴とする、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
異なるサイズの少なくとも２つの凹部（６；１１）を含む基板（５；１０）を用いて、種々の速度にて排出流体で前記少なくとも１つのチャンバ（２；９）を連続的にすすぐことによって、細胞スフェロイドが溶出されることを特徴とする、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞スフェロイドを溶出するための速度が、
０．５μＬ／分〜１２０μＬ／分の範囲であり、
好ましくは、
９００μｍ〜１０００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも１００μＬ／分であり、
５００μｍ〜７００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも３０μＬ／分であり、および／または、
１５０μｍ〜３００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも２０μＬ／分であることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも２つの凹部（６、１ｖｆｃ１）内の細胞スフェロイドが、細胞スフェロイドを形成する生物細胞に特異的に結合する少なくとも１つの抗体（２４）と共にインキュベートされることを特徴とする、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの抗体（２４）が、蛍光物質、ペルオキシダーゼ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは放射性同位体で標識されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞スフェロイドの製造のためのマイクロ流体装置、システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織および器官の形成、ならびにインビトロでの疾患を理解するために、従来の二次元（２Ｄ）細胞培養を使用して、これらの問題を解明する。しかし、２Ｄ細胞培養技術は、生物学が明らかに複雑な３Ｄシステムであるため、体内に存在する機械的および生化学的シグナルを忠実に複製することはない。２Ｄ技術では、細胞−表面間相互作用が、正常な細胞機能の基礎を形成する重要な細胞−細胞間および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）間相互作用よりも優勢である。しかしながら、過去２０年間にわたり、細胞微小環境の関連性に対する認識が高まった。この新しい細胞培養パラダイムは、３Ｄ細胞培養と呼ばれ、急速に普及している。対照的に、三次元（３Ｄ）細胞培養物は、天然の微小環境を模倣する空間的に関連する様式で、ホモタイプまたはヘテロタイプの細胞培養物の製造を容易にする。３Ｄ細胞培養物を使用する利点は、細胞がその天然ＥＣＭによって取り囲まれ、互いに直接細胞接触している、改善されたインビボ様状況を含む。さらに、インビボの状況に類似した、広範な細胞−細胞間および細胞−ＥＣＭ間相互作用の存在は、元の組織生物学の天然構造および機能のリカバリーを促進する。
【０００３】
多細胞スフェロイドは、化学療法、細胞および抗体に基づく免疫療法、遺伝子療法および併用療法のような治療的処置を評価するための非常に有望なモデルである３Ｄ細胞凝集体である。３Ｄスフェロイドモデルは、組織への化合物の浸透および標的化のための送達システムを改善するために使用され得る。３Ｄスフェロイドは、スフェロイドサイズおよびその後の薬物スクリーニング研究に対するより良好な制御を可能にしたマイクロ流体技術の最近の進歩に対する適応応答を示している。マイクロ流体技術は、器官・オン・チップとも呼ばれ、分析研究所の手順を単一の装置または「チップ」に適応、小型化、集積化、自動化することである。
【０００４】
細胞スフェロイドは、通常、懸濁液滴下法を用いて製造される。それによって、細胞（例えば、真核細胞、哺乳類細胞）を含有する流体が懸垂式で物体スライド上の個々の液滴に適用される（例えば、Ｆｏｔｙ  Ｒ（Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１１；（５１）：２７２０を参照のこと）。細胞は互いに結合する傾向があり、それによって、細胞スフェロイドが、ある時間の後に液滴中に形成される。各液滴は、１つの細胞スフェロイドを含有する。細胞スフェロイドを製造するこのような方法は、いくつかの欠点を有する。表面張力は懸濁液滴下法によって調製される液滴の最大サイズを制限し、また、懸濁液滴下のサイズが小さいため、蒸発が大きな問題である。液滴内の水が蒸発するにつれて、培地中のタンパク質および塩などの可溶性成分の濃度が増加し、細胞を変化する浸透圧にさらし、したがって、それらの正常な形態および機能を損なう。液滴の脱水を回避するために、および円形スフェロイドのサイズを増大させるために追加の細胞および栄養素を液滴に供給するために、液滴は、時々注意深く再充填される必要がある。最も一般的には、水滴は、細い針を有するシリンジで再充填される。液滴の落下を避けるために、再充填は特別な注意を必要とするが、それは過剰充填または震えのために物体スライドから液滴が落下する危険性があるからである。いずれにしても、既に形成された細胞スフェロイドは破壊される。
【０００５】
したがって、スフェロイドの培養者の技能およびその器用さに応じて、多くのスフェロイドが培養中に一度に失われる可能性がある。そのため、特に、より大きな細胞スフェロイドを製造する必要がある場合、製造は非常にフラストレーションがかかり、時間がかかる可能性がある。
【０００６】
公知の製造方法の別の欠点は、物体スライドが十分に注意深く取り扱われていない場合に過度の損失を回避するために、各物体スライドに少量の液滴しか適用できないことである。したがって、十分な量の細胞スフェロイドを製造するためには、膨大な数の個々の物体スライドが必要である。また、単一のスフェロイドのサイズは、ほとんど影響を受けず、種々のサイズを有するスフェロイドをもたらす。
【０００７】
Ｋｗａｐｉｓｚｅｗｓｋａら（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２０１４、１４、２０９６）は、例えば腫瘍細胞の細胞スフェロイドの培養のためのマイクロ流体チップを記載している。
【０００８】
Ｚｕｃｈｏｗｓｋａら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０１７、３８、１２０６−１２１６）には、マイクロ流体システムを用いて製造された腫瘍細胞スフェロイドに対する異なる濃度の抗癌剤の効果が開示されている。
【０００９】
Ｐａｔｒａら（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、２０１３、７、０５４１１４）は、例えば癌細胞からのスフェロイドの形成、培養および収集のためのマイクロ流体装置を記載している。
【００１０】
米国特許出願公開第２０１６／０９７０２８号は、スフェロイドを培養し、前記装置から前記スフェロイドを回収するためのマイクロ流体装置を開示している。
【００１１】
国際公開第２０１７／１８８８９０号パンフレットには、マイクロウェルを含む装置における希少血液細胞の濃縮および増殖が記載されている。
【００１２】
国際公開第２０１８／０６７８０２号パンフレットは、多重化学物質のハイスループット分析のためのマイクロ流体装置を開示している。
【００１３】
米国特許出願公開第２００９／２９８１１６号は、三次元多細胞細胞クラスターの培養のためのマイクロウェルを含む細胞培養装置を記載する。
【００１４】
Ｍｏｓｈｋｓａｙａｎら（Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２０１８、２６３、１５１−１７６）は、スフェロイドの形成および培養のためのいくつかのマイクロ流体設計を概説している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、細胞スフェロイドの製造を増強および促進するための手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明は、細胞スフェロイドを製造するためのマイクロ流体装置であって、チャンバに流体を導入するための流体入口と、チャンバから前記流体を除去するための流体出口とを含む少なくとも１つのチャンバを含み、前記少なくとも１つのチャンバは、基板が流体と接触したときに生物細胞を含む流体を収集するための少なくとも２つの凹部を含む基板によって形成された基部を含み、少なくとも２つの凹部のサイズは、少なくとも１つのチャンバの流体入口から流体出口まで減少する、マイクロ流体装置に関する。
【００１７】
本発明の別の態様は、細胞スフェロイドを製造するためのマイクロ流体装置であって、チャンバに流体を導入するための流体入口と、チャンバから前記流体を除去するための流体出口とを含む少なくとも１つのチャンバを含み、前記少なくとも１つのチャンバは、基板が流体と接触したときに生物細胞を含む流体を収集するための少なくとも１つの凹部を含む基板によって形成された基部を含む、マイクロ流体装置に関する。任意選択で、そのような装置は少なくとも２つの凹部を含み、少なくとも２つの凹部のサイズは、少なくとも１つのチャンバの流体入口から流体出口まで減少してもよい。
【００１８】
本発明はまた、以下の工程を含む、細胞スフェロイドの製造方法に関する：
生物細胞を含む流体を、本発明による装置の少なくとも１つのチャンバ内に適用し、それによって前記流体を少なくとも１つの凹部に提供する工程と、
少なくとも１つの細胞スフェロイドが少なくとも１つの凹部内に形成されるまで、前記流体を含む装置を少なくとも２時間インキュベートする工程。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、本明細書に定義される少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む細胞スフェロイドの製造のためのシステムに関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、細胞スフェロイドの製造のための、本明細書で定義されるような装置またはシステムの使用に関する。
【００２１】
驚くべきことに、本発明のマイクロ流体装置は、基板の基部の少なくとも２つの凹部内に細胞スフェロイドを製造する優れた能力を示すことが判明した。本発明によるマイクロ流体装置および方法を用いて、再現性があり、信頼性があり、効率的な様式で、基板中の少なくとも１つの凹部中に細胞スフェロイドを製造することが可能である。
【００２２】
本発明のマイクロ流体装置の１つの主要な利点は、規定されたサイズ／直径を有する細胞スフェロイドを製造することが、懸濁液滴下法細胞培養のような他の技術と比較して、はるかに再現性がある様式でできることである（例えば、Ｆｏｔｙ  Ｒ（Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１１；（５１）：２７２０を参照のこと）。細胞スフェロイドを製造するために本発明のマイクロ流体装置を使用する別の利点は、製造中に単に培養培地の流れを提供するだけで、スフェロイド形成中に細胞に新鮮な培養培地を供給することができることである。
【００２３】
本発明の装置の基板に少なくとも２つの凹部を設けることにより、１つのマイクロ流体装置内に任意の円形スフェロイドを製造することが可能になる。さらに、基板上に複数の凹部を設けることによって、細胞スフェロイドを非常に費用効率よく製造することができる。好ましくは、本発明によるマイクロ流体装置は、１５〜３０個の凹部を有する。
【００２４】
少なくとも２つの凹部は、異なるサイズおよび形状を有する。これは、異なるサイズの細胞スフェロイドが１つの単一のマイクロ流体装置内で製造され得るという利点を有する。
【００２５】
少なくとも２つの凹部のサイズは、流体入口から少なくとも１つのチャンバの流体出口まで減少する。したがって、最小の１つまたは複数の凹部は、流体出口に最も近いところに位置する。本明細書で説明するように、少なくとも１つのチャンバを異なる速度にて排出流体ですすぐ（ゆすぐ）（ｒｉｎｓｉｎｇ）ことによって、細胞スフェロイドを、それらのサイズに従って溶出することができる。最小の１つまたは複数の凹部が流体出口に最も近いところに配置され、残りの凹部が流体入口に向かって大きくなるように配置されており、したがって、最小の１つまたは複数の凹部から出発して、細胞スフェロイドのサイズに従って細胞スフェロイドを溶出することによって、溶出された細胞スフェロイドは、細胞スフェロイドをまだ含有している他の凹部に固着することがないという利点が得られる。
【００２６】
「細胞スフェロイド」（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、本明細書中で使用される場合、スフェロイド（球状体、回転楕円体）の形態またはスフェロイド様の形態を有する三次元細胞凝集体である。このようなスフェロイドは「オルガノイド」とみなすこともできる。「細胞スフェロイド」は、真核細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）によって形成することができ、したがって、特に好ましい細胞は、哺乳動物の器官および組織に存在する細胞である。これらのスフェロイドは、１つ以上のタイプの細胞を含み得る。種々の種類の細胞の使用が、より複雑な「オルガノイド」または組織様構造を製造することを可能にする。
【００２７】
本発明によるマイクロ流体装置は、チャンバ内に流体を導入するための流体入口と、チャンバから前記流体を除去するための流体出口とを含む少なくとも１つのチャンバを含む。前記少なくとも１つのチャンバは、基板が前記流体と接触したときに生物細胞を含む流体を収集するための少なくとも２つの凹部を含む基板によって形成された基部を含む。
【００２８】
好ましくは、生物細胞を含む流体はまた、細胞に供給するための栄養素を含有する。
【００２９】
本発明によるマイクロ流体装置の好ましい実施形態では、流体入口および流体出口は、流体入口からチャンバを通って流体出口に流れる流体を導くように配置される。流体入口および流体出口を用いて、生物細胞を含有する流体を、容易かつ制御可能な方法で少なくとも２つの凹部に供給することができ、それによって、少なくとも１つの凹部内で成長する円形スフェロイドを破壊する危険性が最小限に減少される。好ましくは、流体入口および流体出口は、流体入口および流体出口の接続性を強化するために、結合部を備える。結合部は例えば、ルアーロック接続（Ｌｕｅｒ  Ｌｏｃｋ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）または単純なルアー接続（Ｌｕｅｒ−ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）とすることができる。
【００３０】
本発明のさらに好ましい実施形態では、マイクロ流体装置の基板が、生体適合性材料を含むか、生体適合性材料からなるか、または生体適合性材料でコーティングされる。好ましくは、生体適合性材料は、シリコーンまたはプラスチック材料またはガラスである。特に、生体適合性材料は、好ましくは、ポリスチレン、シクロオレフィンコポリマー、ポリメチルメタクリレート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、ポリウレタン、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエステルおよびチオール−エンからなる群から選択される。基板に生体適合性材料を使用すること、または基板を生体適合性材料でコーティングすることは、細胞スフェロイドの細胞が影響を受けず、したがっておそらく基板によって中毒されないという利点を有する。本発明によるマイクロ流体装置の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのチャンバ全体が生体適合性材料からなるか、または生体適合性材料でコーティングされる。
【００３１】
本発明によるマイクロ流体装置の別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの凹部および／または基板が少なくとも部分的に防汚層でコーティングされる。防汚層の使用は、培養培地または洗浄溶液中に存在する物質、ならびにマイクロ流体装置内の細胞の堆積を減少または防止する。
【００３２】
好ましくは、防汚層は以下からなる群の材料から選択される：
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのポリマー、好ましくは、異なる長さを有し、約２２〜４５０の繰り返し単位で変化し、および／または１０００〜２００００Ｄａの範囲の分子量に対応する、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧまたはＰＥＧＳ、
ポリ（スルホベタイン）（ＰＳＢ）またはポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）などのポリベタイン、
両性高分子電解質、
フッ素化ポリマー、
寒天またはアガロースなどの多糖類、
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）またはポリヒドロキシプロピルメタクリレート（ポリ−ＨＰＭＡ）などのポリヒドロキシポリマー、
ポリ（エチレンオキシド）、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、
ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、
デキストラン、
ヒドロキシルエチルセルロース（ＨＥＣ）、
天然生体高分子（疎水性物質、Ｓ層タンパク質ＳｂｐＡ）、
高分子電解質多層（ＰＥＭ）または自己組織化単層（ＳＡＭ）などの防汚ナノ界面、
ポリオキシエチレンドデカノール、Ｔｗｅｅｎ−２０、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）およびプルロニクス（トリブロックコポリマーＰＥＯ−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）−ｂ−ＰＥＯ）などの非イオン界面活性剤、
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）および３−クロロプロピルトリクロロシラン（ＣＰＴＭＳ）および（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシラン。
【００３３】
防汚層は、少なくとも２つの凹部の表面上の少なくとも１つの細胞スフェロイドの付着と同様に、破片の付着を防止する。それによって、少なくとも２つの凹部は容易に洗浄することができるだけでなく、また、細胞スフェロイドが一旦所定のサイズに達すると、少なくとも２つの凹部から細胞スフェロイドを除去することがより容易になる。本発明によるマイクロ流体装置の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのチャンバはまた、少なくとも部分的に防汚層でコーティングされる。
【００３４】
好ましくは、少なくとも２つの凹部は、半球、球形キャップ、半楕円体、円錐、円錐台、テラス円錐、ピラミッド、角錐台、テラスピラミッド、トーラス、または楕円放物面の形状を有する。特に、半球の形状の２つの凹部を用いて、本発明によるマイクロ流体を用いて、著しく丸い細胞スフェロイドを製造することができる。以下の実施例を参照されたい。
【００３５】
球形キャップの形状を有する少なくとも２つの凹部を用いて、球形キャップは、３０°〜９０°、好ましくは４０°〜９０°、より好ましくは５０°〜９０°、より好ましくは６０°〜９０°、より好ましくは７０°〜９０°、より好ましくは８０°〜９０°、より好ましくは８５°〜９０°の極角αを有する。
【００３６】
楕円放物面の形状を有する少なくとも２つの凹部を用いて、楕円放物面のシェル表面の少なくとも一部が、空間内で回転される公式ｙ＝Ａ×ｘＢを有する放物線によって形成され、ここで、Ａは０．０５〜１０、好ましくは０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、Ｂは２、４または６である。
【００３７】
上記に説明された構成による球形キャップまたは楕円放物面の形状を有する少なくとも２つの凹部では、真円度因子≧０．９を有する単一の丸い細胞スフェロイドが、少なくとも２つの凹部内に形成される。真円度因子（真円度係数、丸み因子、丸み係数）は、以下の式に従って計算される：
真円度因子＝（４×面積）／（π×最大直径２）
ここで、面積は、上面図の細胞スフェロイドの２Ｄ画像で測定された面積に対応する面積であって、上面図の細胞スフェロイドの投影面積にも対応し、πはＰＩに対応し、最大直径は上面図の細胞スフェロイドの２Ｄ画像で測定された面積の最大直径に対応する。真円度因子は、スフェロイドの投影面積の真円度のインジケータである。
【００３８】
有利には、少なくとも２つの凹部は、５０μｍ〜１ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜８００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜５００μｍの深さを有する。
【００３９】
有利には、少なくとも２つの凹部は、１００μｍ〜２ｍｍ、好ましくは１００μｍ〜１．５ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜１ｍｍの幅または直径を有する。
【００４０】
有利には、少なくとも２つの凹部の深さ対幅の比率は、１：１〜１：３、好ましくは１：１〜１：２である。
【００４１】
実際には、少なくとも２つの凹部は、１０μｍ〜６ｍｍ、好ましくは２０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは３０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは５０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは７０μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜６ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜５ｍｍ、より好ましくは１００μｍ〜４ｍｍの距離で互いに離間している。
【００４２】
本発明によるマイクロ流体装置の別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの凹部がグループ化され、各グループの凹部は同じサイズおよび／または同じ形状を有し、異なるグループの凹部は異なるサイズまたは異なるサイズおよび異なる形状を有する。好ましくは各グループが少なくとも３つの凹部を含み、これらの凹部は有利には一行に配置される。
【００４３】
好ましくは、凹部の１つのグループが、２００μｍ〜１０ｍｍの距離で凹部の別のグループと離間される。
【００４４】
好ましくは、少なくとも２つの凹部に形成された少なくとも１つの細胞スフェロイドが、細胞スフェロイドを溶出するのに十分な速度にて排出流体で少なくとも１つのチャンバをすすぐことによって溶出される。
【００４５】
好ましくは、異なるサイズの少なくとも２つの凹部を含む基板を用いて、種々の速度にて排出流体で少なくとも１つのチャンバを連続的にすすぐことによって、細胞スフェロイドが溶出される。これは、細胞スフェロイドが溶出後にそれらのサイズに従って既に仕分けされているという利点を有する。したがって、後続の分離は必要ではない。特定のサイズのスフェロイドが基板の少なくとも１つの凹部から除去される排出流体の速度は、細胞の密度および細胞タイプに依存し得るので、以下に述べる範囲内で実験的に試験することができる。
【００４６】
好ましくは、円形スフェロイドを溶出する速度は、それらのサイズ、幅または直径に従って細胞スフェロイドを溶出するように選択される。好ましくは、少なくとも１つの細胞スフェロイドを溶出するための速度は、０．５μＬ／分〜１２０μＬ／分の範囲である。より好ましくは、少なくとも１つの細胞スフェロイドを溶出するための速度は、９００μｍ〜１０００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも１００μＬ／分であり、５００μｍ〜７００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも３０μＬ／分であり、および／または、１５０μｍ〜３００μｍの幅または直径を有する凹部については少なくとも２０μＬ／分である。
【００４７】
本発明によるマイクロ流体装置の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つのチャンバは、流体入口から流体出口へと先細りになる。これは、少なくとも１つのチャンバを通って流れる流体の速度をチャンバ内で変化させることができるという利点を有する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、生物細胞を含む流体を、本発明による装置の少なくとも１つのチャンバ内に適用し、それによって前記流体を少なくとも２つの凹部に提供する工程と、少なくとも１つの細胞スフェロイドが少なくとも２つの凹部内に形成されるまで、前記流体を含む装置を少なくとも２時間インキュベートする工程とを含む、細胞スフェロイドの製造に関する。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法において、生物細胞を含む前記流体を含むマイクロ流体装置は、最大６ヶ月間、好ましくは最大３ヶ月間、より好ましくは最大１ヶ月間、好ましくは最大１４日間、好ましくは最大７日間、好ましくは最大９６時間、好ましくは最大７２時間、好ましくは最大４８時間インキュベートされる。より好ましくは、生物細胞を含む前記流体を含む装置は、１〜７日間インキュベートされる。細胞スフェロイドの成長は本質的に、インキュベーション時間、供給される細胞の量、および／または凹部のサイズに依存する。
【００５０】
本発明による方法の好ましい実施形態において、生物細胞を含む流体は、４μＬ／分〜８μＬ／分の範囲の速度で、少なくとも１つのチャンバ内に適用される。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つのマイクロ流体装置を含む細胞スフェロイドの製造のためのシステムに関する。
【００５２】
本発明によるシステムは、本発明による少なくとも１つのマイクロ流体装置、好ましくは本発明による複数のマイクロ流体装置を含む。これは、複数の細胞スフェロイドを、信頼性があり、費用効率のよい方法で製造することができるという利点を有する。本発明のシステムの一部は、本発明の装置内で流体を移動させるためのポンプおよび配管である。
【００５３】
好ましくは、本発明によるシステムはグラジエントジェネレータ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を含み、少なくとも１つのマイクロ流体装置の各々は、流体入口を介してグラジエントジェネレータの流体出口に流体接続される。グラジエントジェネレータに別々の物質を独立して同時に提供するために、グラジエントジェネレータは、実際には少なくとも２つの流体入口を含む。
【００５４】
グラジエントジェネレータを含む本発明によるシステムは、本発明の方法によって得られる細胞スフェロイド内の細胞への物質の影響の評価に使用することができる。特に、本発明のシステムおよび装置は、合成分子、天然産物または抽出物、通常は化学合成に由来する伝統的な小分子薬物、ならびに組み換えタンパク質、ワクチン、治療的に使用される血液産物（例えば、静脈内免疫グロブリン）、遺伝子治療、モノクローナル抗体および細胞治療（例えば、幹細胞治療）を含む生体医薬の化学ライブラリーのスクリーニングのために使用され得る。種々の濃度の化合物を細胞スフェロイドに適用することにより、物質が細胞スフェロイド内の細胞に有益な効果を有するかまたは負の効果を有するかを決定することができる。このような方法は例えば、細胞スフェロイドに対して、有益な、毒性の、阻害性の、および／または刺激性の、効果を有し得る化合物の投与量を特定するために使用され得る。したがって、本発明によるシステムは、細胞スフェロイドに対する種々の物質濃度の影響を決定するために使用することができる。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、細胞スフェロイドの製造のための、本発明による装置または本発明によるシステムの使用に関する。
【００５６】
いくつかの用途、例えば、微小組織および器官スフェロイドのための免疫蛍光および生化学的染色プロトコルの特定のためには、スフェロイド、特にスフェロイドを形成する細胞が、前記細胞に特異的に結合する抗体またはその機能的断片で標識されることが有利である。したがって、本発明の特に好ましい態様において、少なくとも２つの凹部内のスフェロイドは、スフェロイドを形成する生物細胞に特異的に結合する少なくとも１つの抗体と共にインキュベートされる。少なくとも１つの抗体は、モノクローナル抗体、組み換え抗体およびポリクローナル抗体、それらのサブクラスの免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ、Ｗ、Ｙ、アプタマー、および／またはヒトもしくは動物抗体（例えば、ラット、マウス、ヤギ、ウサギ、ウマ、ロバなど）であり得る。スフェロイドを抗体で標識するために、流体、好ましくは生理学的ｐＨを示す緩衝液を含む抗体を本発明の装置に適用する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの抗体は以下のもので標識される：
蛍光物質；
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰ）；それによって、以下のペルオキシダーゼ基質の１つが、好ましくは前記抗体のスフェロイドおよびそれらのそれぞれの細胞への結合を検出するために使用され得る：
ＡＢＴＳ  （２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、
ＡＥＣ  （３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、
ＣＮ  （４−クロロ−１−ナフトール）、
ＤＡＢ  （３，３’−ジアミノベンジジン）、
ルミノールおよび他のジオキセタン、
ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；それによって、以下のホスファターゼ基質の１つが、好ましくはスフェロイドおよびそれらのそれぞれの細胞への前記抗体の結合を検出するために使用され得る：
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート（ＢＣＩＰ）、
ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスフェート、
ニューフクシン
放射性同位体；放射性同位体は、好ましくは以下の同位体のうちの１つから選択される：
１３１ｉｏｄ
３２リン
３トリチウム。
【００５８】
本発明のこれらおよびさらなる有利な実施形態は、以下の説明および添付の図面に基づいて説明される。当業者は、様々な実施形態を組み合わせることができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるマイクロ流体装置の実施形態を模式的平面図で示す。
【図２】本発明によるマイクロ流体装置の実施形態を模式的平面図で示す。
【図３】本発明によるマイクロ流体装置の別の実施形態を模式的平面図で示す。
【図４】本発明によるシステムの実施形態を模式的平面図で示す。
【図５ａ】円筒形状の凹部を有する、図１に記載のマイクロ流体装置の実施形態の側断面図（断面側面図）を示す。
【図５ｂ】図５ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。
【図６ａ】ディスク形状の凹部を有する、図１によるマイクロ流体装置の実施形態の側断面図を示す。
【図６ｂ】図６ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。
【図７ａ】球形キャップの形状を有する凹部を有する、図１によるマイクロ流体装置の実施形態の側断面図を示す。
【図７ｂ】図７ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。
【図８ａ】楕円放物面の形状を有する凹部を有する、図１に記載のマイクロ流体装置の実施形態の側断面図を示す。
【図８ｂ】図８ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。
【図９ａ】半球形状の凹部を有する、図１によるマイクロ流体装置の実施形態の側断面図を示す。
【図９ｂ】図９ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図および側断面図にて模式的に示す。
【図１０】凹部の直径にわたって、凹部当たりのスフェロイドの数を有するグラフを示す。
【図１１】異なる形状およびサイズの凹部にわたる細胞スフェロイドの真円度因子を示すグラフを示す。
【図１２】異なる形状の凹部にわたるスフェロイド直径を有するグラフを示す。
【図１３】図１による６つのマイクロ流体装置およびグラジエントジェネレータを有する、本発明によるシステムの実施形態を模式的平面図で示す。
【図１４】抗体とのインキュベーション中の、図９ａによるマイクロ流体装置における細胞スフェロイドを模式的な図で示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
図１および図２は、本発明によるマイクロ流体装置１の実施形態を模式的平面図で示す。マイクロ流体装置１は、チャンバ２内に流体を導入するための流体入口３と、チャンバ２から前記流体を除去するための流体出口４とを有するチャンバ２を備える。さらに、チャンバ２は基板５によって基部されたベースを備え、基板５は１５個の凹部６を備える。
【００６１】
凹部６はグループ７ａ〜７ｅにグループ化され、各グループ７ａ〜７ｅは一行に配置された３つの凹部６を含む。各グループ７ａ〜７ｅの凹部６は、同じサイズおよび同じ形状を有し、異なるグループ７ａ〜７ｅの凹部は、異なる大きさを有する。例えば、第１グループ７ａの凹部６は２００μｍの直径を有し、第２グループ７ｂの凹部６は５００μｍの直径を有し、第３グループ７ｃの凹部６は７００μｍの直径を有し、第４グループ７ｄの凹部６は９００μｍの直径を有し、第５グループ７ｅの凹部６は１０００μｍの直径を有する。
【００６２】
細胞スフェロイドを成長させるために、生物細胞を含む流体が、流体入口３を通ってチャンバ２内に適用される。その結果、基板５は流体と接触し、凹部６は流体で満たされる。細胞スフェロイドの必要とされるサイズに応じて、細胞スフェロイドがチャンバ２から溶出され得る前に、インキュベーション時間が満たされる必要がある。より小さい細胞構造は、２時間後にすでに形成されている。
【００６３】
細胞スフェロイドを凹部から溶出するために、流体入口３を通じて排出流体を適用してチャンバ２をすすぐ。排出流体は、流体出口４を通って排出される。排出流体は、チャンバ２を通って方向１２に流れる。図２を参照されたい。好ましくは、排出流体は、サイズに応じて、またはサイズに応じて各グループで、細胞スフェロイドを溶出するために、種々の速度で流体入口３を通して供給される。
【００６４】
図２に示す例では、排出流体がグループ７ａの凹部６から最初に最小の円形スフェロイドを溶出するのに十分な第１の低速度で流体入口３に供給される。第１の速度は、例えば２０μＬ／分である。さらなる工程において、排出流体の速度は、第２の速度まで増加される。第２の速度は、例えば３０μＬ／分である。これにより、グループ７ｂおよび７ｃの凹部６に形成された細胞スフェロイドが溶出する。速度を第３の速度、例えば１００μＬ／分にさらに増加させることによって、グループ７ｄおよび７ｅの凹部６の円形スフェロイドの残りが溶出される。速度をより細かく目盛ると、グループ７ｂおよび７ｄに形成された細胞スフェロイドも、グループごとに個別に溶出することができることに注意されたい。図２に示された速度は単に例示的なものであり、凹部６のサイズに応じてこの値とは異なっていてもよいことに注意されたい。さらに、細胞スフェロイドの溶出のために、チャンバ２から全ての細胞スフェロイドを一度に溶出するのに十分な速度で、排出流体を流体入口３を通して適用することも可能であることに注意されたい。
【００６５】
全ての細胞スフェロイドが溶出された後、マイクロ流体装置１は、洗浄流体で洗浄され、さらなる使用の準備が整う。
【００６６】
好ましくは、生物細胞を含む流体は、流体入口３を通って連続的な様式でチャンバ２に適用され、そしてインキュベーションの間、流体出口４によってチャンバ２から排出される。これは、細胞に栄養素を連続的に供給することができて新しい細胞がマイクロ流体装置１に供給されるという利点を有する。
【００６７】
図３は、本発明によるマイクロ流体装置８の別の実施形態を模式的平面図で示す。マイクロ流体装置８は、マイクロ流体装置２のチャンバ９が流体入口３から流体出口４へと本質的に先細りになる（テーパー状になる）という事実、および基板１０が３０個の凹部１１につながる種々のサイズの凹部１１の５つのさらなるグループ７ｆ〜７ｊを含むという事実において、図１によるマイクロ流体装置１と区別される。先細りになることにより、チャンバ９を通ってすすぐ流体の速度が変化する。速度が速いほど、細胞スフェロイド上の剪断力が高くなる。したがって、種々の剪断力での細胞スフェロイドへの衝撃が、１つの単一のチャネルにおいてモニターされ得る。例えば、図３に示すマイクロ流体装置８の流体入口３で８μＬ／分の体積速度で流体を適用すると、チャンバ９のより広い部分間での剪断力は０．０１ｄｙｎ／ｃｍ２であり、流体出口付近の剪断力は０．０７ｄｙｎ／ｃｍ２である。したがって、流体出口付近の剪断力は、チャンバ９のより広い部分での剪断力の７倍である。
【００６８】
マイクロ流体装置８の要素は図１によるマイクロ流体装置１の要素と同様であり、同じ参照番号で示されている。基板１０は、異なる量の凹部１１を含むこともできることに留意されたい。
【００６９】
図４は、本発明によるシステム１３の実施形態を模式的平面図で示す。システム１３は図１による６つのマイクロ流体装置１を含み、システム１３は、マイクロ流体装置１の個々のチャンバ２が収容される１つの基部１４を有する。
【００７０】
図５ａは、円筒形状の凹部６を有する図１によるマイクロ流体装置１の実施形態の側断面図を示す。
【００７１】
図５ｂは、図５ａによるマイクロ流体装置１の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。単純化の理由から、図５ｂは、各グループ７ａ〜７ｅの凹部当たりの細胞構造の一例を示すに過ぎない。どの画像がどのグループ７ａ〜７ｅに対応するかを示すために、画像はグループ参照番号で示される。
【００７２】
図５ｂの画像に見られるように、円筒形の凹部６には球状の細胞構造はない。むしろ、円筒形の凹部６には、異なる形状の多数の細胞構造が形成されている。
【００７３】
図６ａは、ディスク形状の凹部６を有する図１によるマイクロ流体装置１の実施形態の側断面図を示す。
【００７４】
図６ｂは、図６ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。単純化の理由から、図６ｂは、各グループ７ａ〜７ｅの凹部当たりの細胞構造の一例を示すに過ぎない。どの画像がどのグループ７ａ〜７ｅに対応するかを示すために、画像はグループ参照番号で示される。
【００７５】
図６ｂの画像に見られるように、円盤状の凹部６には球状の細胞構造はない。また、ディスク形状の凹部６を用いて、種々の形状の多数の細胞構造が凹部６内に形成される。
【００７６】
図７ａは、球形キャップの形状を有する凹部６を有する、図１によるマイクロ流体装置１の実施形態の側断面図を示す。球形キャップは、種々の角度αを有する。角度αは球形キャップの表面１７上の例示的な点１９における接線面１５と基板５の水平面１６との間の角度であり、点１９において、球形キャップの表面１７は、基板の水平面１６と交差する。角度αは球形キャップの極角（ｐｏｌａｒ  ａｎｇｌｅ）に対応するので、以下、αを極角と呼ぶ。
【００７７】
異なるグループ７ａ〜７ｅの球形キャップは、同じ深さを有するが、その直径が変化し、したがって、極角αも変化する。例えば、最小の凹部６を含むグループ７ａは９０°の極角αを有し、グループ７ｅは、３０°の極角αを有する。異なるグループ７ａ〜７ｅの球形キャップはまた、異なる極角αを有する同じ直径を有することができ、または同じ勾配角度αを有する、異なる深さおよび直径を有することもできることに留意されたい。
【００７８】
図７ｂは、図７ａによるマイクロ流体装置１の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。単純化の理由から、図７ｂは、各グループ７ａ〜７ｅの凹部当たりの細胞構造の一例を示すに過ぎない。どの画像がどのグループ７ａ〜７ｅに対応するかを示すために、画像はグループ参照番号で示される。
【００７９】
図７ｂの画像に見られるように、球形キャップ形状の凹部６に細胞スフェロイドが形成されている。
【００８０】
図８ａは、楕円放物面の形状を有する凹部６を有する、図１に記載のマイクロ流体装置１の実施形態の側断面図を示す。楕円放物面のシェル表面１８は、空間的に回転された公式ｙ＝Ａ×ｘＢを有する放物線によって形成される。異なるグループ７ａ〜７ｅの凹部６は同じ直径を有するが、深さが変化し、したがって楕円放物面形状が変化する。例えば、最小の凹部６であるグループ７ａの凹部６は、空間的に回転されたｙ＝０．１×ｘ２の公式を有する放物線によって形成され、グループ７ｅの凹部６は、空間的に回転されたｙ＝２×ｘ２の公式を有する放物線によって形成される。異なるグループ７ａ〜７ｅの凹部６はまた、異なる楕円放物面形状で同じ深さを有することができ、または、同じ楕円放物面形状で異なる深さおよび／または直径を有することもできることに留意されたい。
【００８１】
図８ｂは、図８ａによるマイクロ流体装置の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図にて模式的に示す。単純化の理由から、図８ｂは、各グループ７ａ〜７ｅの凹部当たりの細胞構造の一例を示すに過ぎない。どの画像がどのグループ７ａ〜７ｅに対応するかを示すために、画像はグループ参照番号で示される。
【００８２】
図８ｂの画像からわかるように、楕円放物面形状の凹部６に細胞スフェロイドが形成されている。
【００８３】
図９ａは、半球形状の凹部６を有する図１によるマイクロ流体装置１の実施形態の側断面図を示す。
【００８４】
図９ｂは、図９ａによるマイクロ流体装置１の実施形態において形成された細胞構造の画像を平面図および側断面図にて模式的に示す。単純化の理由から、図９ｂは、平面図および側断面図において、各グループ７ａ〜７ｅの凹部当たりの細胞構造の一例を示すに過ぎない。どの凹部６がどのグループ７ａ〜７ｅに属するかを示すために、凹部６はグループ参照番号で示されている。
【００８５】
図９ｂに見られるように、半球形状の凹部６に完全に丸い細胞スフェロイドが形成されている。
【００８６】
図１０は、凹部の直径にわたって、凹部当たりのスフェロイドの数を有するグラフを示す。
【００８７】
図１１は異なる形状およびサイズの凹部６にわたる細胞スフェロイドの真円度因子を示すグラフを示し、凹部６のサイズ７ａ〜７ｅは、図１２に従って編成される。
【００８８】
図１２は、異なるサイズを有する異なる形状の凹部にわたるスフェロイド直径を有するグラフを示す。
【００８９】
図１３は、図１による６つのマイクロ流体装置１およびグラジエントジェネレータ２２を有する、本発明によるシステム２０の実施形態を模式的平面図で示す。グラジエントジェネレータ２２は６つの流体出口２１を備え、各流体出口２１はマイクロ流体装置１の流体入口３に接続される。さらに、グラジエントジェネレータ２２は、２つの流体入口２３を備え、流体入口２３を介して、物質Ａおよび物質Ｂをグラジエントジェネレータに供給することができる。
【００９０】
物質Ａと物質Ｂを同じ圧力で流体入口２３に供給することによって、マイクロ流体装置１は物質Ａと物質Ｂの異なる化合物ですすがれる。図１３に見られるように、化合物は、１００％のＡと０％のＢの化合物と、０％のＡと１００％のＢの化合物との間で変化する。システム２０を用いて、細胞スフェロイドに対する種々の物質濃度の影響を決定することが可能である。
【００９１】
グラジエントジェネレータ２２は、より多くの流体入口２３および／またはより多くのまたはより少ない流体出口２１を有することもできることに留意されたい。
【００９２】
図１４は、抗体２４とのインキュベーション中の、図９ａによるマイクロ流体装置１における細胞スフェロイドを模式的な図で示し、図１４は、マイクロ流体装置１の一部のみを示す。
【００９３】
〔実施例〕
〔材料および方法〕
〔マイクロ流体装置１の作製〕
図５ａ〜図９ａに示されるマイクロ流体装置１は、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）の二重キャスティング（ｄｏｕｂｌｅ  ｃａｓｔｉｎｇ）によって作製された。凹状のマイクロウェルおよびチャネルを含む第１のマトリックスは、ＣＮＣマイクロミリング（ｍｉｃｒｏｍｉｌｌｉｎｇ）を用いてポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）中で作製される。ＰＤＭＳは、プレポリマーと硬化剤とを１０：１の重量比率で混合することによって調製される。混合物をＰＭＭＡ構造体上に注ぎ、７５℃で３時間硬化させる。その後、構造体をＰＭＭＡマトリックスから剥がし、１００℃で４８時間オーブンに入れる（熱エージング工程）。その結果、凸パターンを持つ第二のマトリックスが得られた。熱エージングされたＰＤＭＳマスターを次のレプリカ成形（ｒｅｐｌｉｃａ  ｍｏｌｄｉｎｇ）手順に使用し、このようにして、マイクロシステムのＰＤＭＳ底部層を得た。管（流体入口および流体出口）用の穴をガラススライドに穿孔し、酸素プラズマ活性化を用いて９０Ｗで１分間、底部ＰＤＭＳ層に不可逆的に結合させた。ＰＤＭＳとガラス層との間の結合は、位置合わせ後、７０℃で１時間、マイクロ流体装置１を裏打ちすることによって促進された。
【００９４】
〔細胞培養〕
肝細胞癌細胞（ＡＴＣＣ、米国）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、米国）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）および１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストリア）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。この細胞を、接着性単層として、３７℃、５％ＣＯ２加湿大気中、標準的な細胞培養条件下で、７５ｃｍ２細胞培養フラスコにて培養した。８０％のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストリア）ですすぎ、３７℃で１０分間トリプシン処理して酵素分離した。相補的ＭＥＭを添加してトリプシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、オーストリア）を不活性化し、細胞懸濁液を１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿したペレットを新鮮な培地に再懸濁した。細胞を計数し、播種前に自動細胞カウンター（Ｎａｎｏ  Ｅｎ  Ｔｅｋ、韓国）を用いてトリパンブルー試薬に対して生存率を実施した。
【００９５】
〔細胞播種および細胞スフェロイド生成〕
作製後、図５ａ〜図９ａに示されるマイクロ流体装置１のチャンバ２を、シリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、７０％エタノールを用いて４μＬ・分−１の流速で１時間潅流した。滅菌ｄＨ２Ｏで洗い流した後、チャンバ２に、１μＬ・分−１の流速で防汚タンパク質溶液を装填し、室温で一晩インキュベートして、それによって、細胞接着を防止してそれぞれの凹部６において制御された細胞スフェロイド生成を誘導する、ナノバイオインターフェースを作製した。タンパク質溶液を細胞培養培地のフローインジェクションによって除去し、続いて細胞播種工程を行う。６×１０６細胞ｍＬ−１の密度の単一の細胞懸濁液を、シリンジポンプを用いて、４μＬ・分−１の流速で１０分間、チャンバ２に装填した。１時間インキュベートした後、捕捉されていない細胞を、１０μＬ・分−１の流速で細胞培養培地によって溶出した。凹部６内での細胞スフェロイド培養は、３７℃、５％ＣＯ２で、４μＬ・分−１の一定流速で行われる。
【００９６】
〔画像分析〕
図５ａ〜図９ｂに示すマイクロ流体装置１の顕微鏡画像を、画像処理および分析フリーウェア（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ、米国）を用いて分析した。デジタルカメラ（ＤＳ−Ｑｉ１ＭＣ、ニコン、日本）を装備した倒立蛍光光学顕微鏡（ＴＥ２０００、ニコン，日本）で３日間にわたりスフェロイド培養をモニターした。ＢｉｏＶｏｘｘｅｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ  （Ｂｉｏｖｏｘｘｅｌ、ドイツ）を用いて、スフェロイドの面積、周囲の長さ、剛性および真円度（丸み）を測定した。データは平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。全ての実験は、独立して三重に行った。
【００９７】
〔結果〕
再現性があって均一なサイズの単一のＨｅｐＧ２細胞スフェロイドの正確なサイズ制御のための凹部６の最適な形状を評価するために、様々な凹部の形状およびサイズを試験した。特に、円筒（深さ１００μｍおよび５００μｍ）、球形キャップ、楕円放物面および半球の形状の凹部６を試験した。播種後３日後、ＨｅｐＧ２細胞スフェロイドの形態を評価した。図１０は、凹部の直径に応じた、生成されたＨｅｐＧ２細胞スフェロイドの数に対する凹部の形状の影響を示す。結果は、半球形凹部が、凹部直径とは無関係に凹部の各々の内部に単一のスフェロイドの形成をもたらしたことを示している。対照的に、種々の曲率を有する凹部は、円筒形状と同様に、各凹部に複数のスフェロイドを形成する、より高い可能性を示し、したがって、スフェロイド製造の歩留まりと精度を減少させた。
【００９８】
スフェロイド形態の品質に対する凹部形状の影響を評価するために、円筒（深さ１００μｍおよび５００μｍ）、球形キャップおよび半球の形状を有する凹部について、各微小組織の真円度因子を測定した。図１１は、半球形状および球形キャップ形状が、各ウェルの直径において再現性がある丸いＨｅｇＧ２スフェロイドの形成を誘導したことを示す。さらに、公式ｙ＝Ａ×ｘＢ、Ａ＝０．１４〜０．３、Ｂ＝２〜４を有する放物線によって形成される放物面のシェル表面を有する楕円放物面形状は、半球形状および球形キャップ形状の凹部に匹敵する丸い単一のＨｅｐＧ２スフェロイドの形成をもたらしたが、一方、それとは異なるシェル表面を有する楕円放物面形状の凹部では、真円度の減少が観察された。０．９を超える真円度因子を有するスフェロイドは、文献に記載されるように、規則的な球形の微小組織と考えられる（Ｚａｎｏｎｉら（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６；（６）：１９１０３を参照のこと）。
【００９９】
対照的に、両方の円筒形状は、不規則な非円形のＨｅｐＧ２スフェロイドをもたらした。これらの効果をより詳細に調べるために、半球形、楕円放物面、球形キャップ形状を持つ凹部に対するスフェロイドサイズ制御性を評価した。半球形の凹部は、図１２に示すように、スフェロイドのサイズを、再現性がある方法で調節する能力を示した。半球形状は、単一のマイクロチャネル内でスフェロイドのサイズの直線的な増加をもたらしたが、楕円放物面形状および球形キャップ形状の凹部は、スフェロイドの不規則で制御性の低い（直線的な増加および相関がない）形成をもたらした。
【０１００】
〔結論〕
ここでは、マイクロ流体装置における凹部形状と直径の影響に基づく単一のマイクロチャネル内の細胞スフェロイド生成のサイズ制御のための新規な方法と装置を示す。円筒形の凹部は、複数の非規則的な細胞スフェロイドの形成を可能にし、したがって、これらの形状は、正確な微小組織サイズ制御のための予測できない構造と考えることができることを示した。楕円放物面、球形キャップおよび半球形凹部としてのさらなる凹部形状を、最適な細胞捕捉効率ならびに結果としてのサイズ調整可能な丸い細胞スフェロイドの形成に関して評価した。結論として、半球形凹部は、スフェロイドのサイズおよび形態において高い制御性を有して、１００％の収率で、各個々の凹部において再現性がある単一の細胞スフェロイドの生成をもたらす。
【０１０１】
本発明のマイクロ流体装置は、信頼性があって強固な（ｒｏｂｕｓｔ）データの基礎である、毒物学的スクリーニング、幹細胞研究、組織工学および生化学的染色プロトコルのための、最適なスフェロイドサイズを決定するための迅速な評価ツールである。要約すると、本発明によるマイクロ流体装置は、マイクロ凹部の幾何学的制御によって生成される種々のサイズのスフェロイドをスクリーニングするための容易なツールであり、これは、広範囲の用途に最適なスフェロイドサイズを実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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