(57)【要約】  特定の有効比で、任意選択により栄養補助又は医薬組成物中で、ウロリチンＡ（３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン）及びウロリチンＢ（３−ヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン）の相乗的組み合わせが提供される。本組成物は、認知機能又は認知能（向知性活性）を向上させることを含め、認知欠損を処置する際の使用のためである。本組成物は、不安症又はアルツハイマー病などのヒト対象における認知症関連障害を処置又は予防する際の使用のため及びアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害のためである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロリチンＡ及びウロリチンＢを含む組成物において、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１〜約０．６：１であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１であることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の医薬又は栄養補助組成物において、薬学的又は栄養補助的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする医薬又は栄養補助組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、治療的有効投与量が約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、治療的有効投与量が約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
ヒト対象における認知症関連障害を処置又は予防するための方法における使用のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記認知症関連障害がアルツハイマー病であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬組成物において、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の医薬組成物において、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．０６μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
ヒト対象において不安障害を処置又は予防するための方法での使用のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物において、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の医薬組成物において、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．０６μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
個体において認知障害を処置又は予防するための方法において、このような処置を必要とする前記個体にウロリチンＡ及びウロリチンＢを含む組成物の治療的有効量を投与することを含み、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１〜約０．６：１であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記認知障害が、認知症関連障害、ストレス誘発性認知症、不安症、うつ及びアルツハイマー病からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法において、前記組成物が、約０．２：１〜の、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比を有し、ヒトアセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約４０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、ヒトアセチルコリンエステラーゼの前記阻害が、個別にウロリチンＡ又はウロリチンＢにより示される阻害よりも少なくとも５倍高いことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記治療的有効量が、ヒトにおいて約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの１日用量であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法において、前記治療的有効量が、ヒトにおいて約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇ／ｋｇの１日用量であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、本明細書中で参照により本明細書によって組み込まれる２０１８年２月１９日提出のインド特許仮出願第２０１８４１００６１７３号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
特定の有効比のウロリチンＡ（３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン）及びウロリチンＢ（３−ヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン）の相乗的組み合わせが提供される。本発明は、ウロリチンＡ及びウロリチンＢを組み合わせて使用したアルツハイマー病の症状の改善に関する。本発明は、この組み合わせを使用して認知能又は認知機能を改善する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶及び認知機能低下に関連する認知症の最も一般的な形態であると考えられる。ＡＤは、認知症の症状が数年にわたり徐々に悪化する進行性の神経変性障害である。
【０００４】
ＡＤの生化学的特徴としては、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドオリゴマー及び可溶性高リン酸化型タウタンパク質の蓄積が挙げられる。ＡＤには、最終ステージのＡＤ患者における、不安定ニューロンにおけるコリン作動性マーカーの喪失及び前脳基底部皮質コリン作動性ニューロンの変性も付随する。記憶消失及び認識機能障害は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性の変化と強く関連する。さらに、ＡＣｈＥは、強力なアミロイド促進因子としてアミロイド−β−結合タンパク質を結合させることにより細線維化速度を向上させ得る。従って、コリン作動仮説はＡＤに対する臨床的に有効な治療薬の開発につながった。ミトコンドリアの機能不全も認知機能低下の要因である。
【０００５】
この疾患を処置するための承認薬は数種類あるが、有効な医薬品に対する直接的なニーズが今もなお存在する。
【０００６】
３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＡとしても知られる）及び３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＢとしても知られる）は、堆積岩からの腐植質浸出液由来であるシラジット中に存在する生理活性化合物である。新しい研究から、これらの分子は、動物のＧＩ管中のマイクロバイオームにより産生されるエラジタンニンの代謝産物でもあることが示されている。認知機能を改善するか又は認知能を向上させるか又はさらに認知欠損を処置するために１つ以上のウロリチンを有利に使用するための方法が発見され得るならば、栄養学又は薬学分野に対する価値ある貢献となろう。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書中でこれらの化合物の認知促進効果に対して行われたいくつかの実験が記載され、驚くべきことに、特定の比での３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン及び３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロンの組み合わせが抗アセチルコリンエステラーゼ活性に対して相乗効果を有することが発見されたが、これは次に認知能（向知性活性）及び／又は認知機能の改善につながる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、ウロリチンＡ及びウロリチンＢを含み、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１〜約０．６：１である組成物を記載する。医薬又は栄養補助組成物は、許容可能な担体又は賦形剤を含むことにより調製され得る。
【０００９】
一実施形態では、本医薬組成物は、ヒト対象における、認知症関連障害、例えばストレス誘発性認知症などを処置又は予防するための方法での使用のためである。
【００１０】
認知症関連障害としては、不安症又はうつ病性障害、アルツハイマー病又は加齢ゆえの他の認知障害が挙げられ得るが限定されない。本組成物は、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．０６μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、シラジット５０ｍｇ／ｋｇ、ウロリチンＢ５０ｍｇ／ｋｇ及びウロリチンＡ５０ｍｇ／ｋｇでの２１日間の処置後の呼吸調節率（皮質の脳ミトコンドリアにおけるＲＣＲ）を示す。バーは群平均±ＳＥＭ（各群ｎ＝５）を表す。
【図２】図２は、若齢及び高齢マウスにおけるシラジット５０ｍｇ／ｋｇ、ウロリチンＢ５０ｍｇ／ｋｇ及びウロリチンＡ５０ｍｇ／ｋｇでの２１日間の処置後の脳ミトコンドリアの皮質部分におけるミトコンドリア呼吸の異なるｓｔａｔｅを表す典型的な棒グラフを示す。バーは群平均±ＳＥＭ（各群ｎ＝５）を表す。
【図３】図３は、試行１での好奇心行動におけるスコポラミン（Ｓｃ）誘導性変化の効果を表す棒グラフを示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図４】図４は、試行２での好奇心行動におけるスコポラミン誘導性変化の効果を表す棒グラフを示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図５】図５は、新規環境に対する対処行動を表す棒グラフを示す。値は全て平均±ＳＥＭである。ラットにおける対処行動は、試行２中の装置の新規アーム滞在時間のパーセンテージに関して示される。
【図６】図６は、アーム弁別の変化を判定するためのＹ迷路における既知アーム進入数（％）対新規アーム進入数（％）を表す棒グラフを示す（空間認識記憶）。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図７】図７は、標準的方法（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９６１）７：８８−９５）に従い行ったアセチルコリンエステラーゼ（「ＡＣｈＥ」）酵素阻害アッセイを表す棒グラフを示し、対照に対してシラジット（Ｓ）、ウロリチンＢ（Ｂ）及びウロリチンＡ（Ａ）を試験し、ドネペジル（Ｄ）と比較した。値は平均±ＳＥＭである。
【図８】図８は、図７のように行ったアセチルコリンエステラーゼ（「ＡＣｈＥ」）酵素阻害アッセイを表す棒グラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＴｈＴ蛍光強度により定量される、固定濃度アミロイドベータ（１０μＭ）との、それぞれ化合物Ｂ、Ａ及びＳとして示される試験化合物３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びシラジットの異なる化学量論的組み合わせによる、Ａβ４０凝集体の阻害を例示する棒グラフを示し、ある時点（４８ｈ）に対する４８５ｎｍでの相対蛍光単位として表す。ドネペジル（Ｄ）を参照標準物として使用した。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴｈＴ蛍光強度により定量される、固定濃度アミロイドベータ（３０μＭ）との、それぞれ化合物Ｂ、Ａ及びＳとして示される試験化合物３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びシラジットの異なる化学量論的組み合わせによる、Ａβ４０凝集体の阻害を例示する棒グラフを示し、ある時点（４８ｈ）に対する４８５ｎｍでの相対蛍光単位として表す。ドネペジル（Ｄ）を参照標準物として使用した。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１０】図１０は、図７のように行ったヒト組み換えアセチルコリンエステラーゼ（「ＡＣｈＥ」）酵素阻害アッセイを表す棒グラフを示す。
【図１１】図１１は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット法を使用して行ったヒト組み換えアセチルコリンエステラーゼ（「ＡＣｈＥ」）酵素阻害アッセイを表す棒グラフを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＴｈＴ蛍光強度により定量される、固定濃度アミロイドベータ（１０μＭ）との、それぞれ化合物Ｂ、Ａ及びＳとして示される試験化合物３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びシラジットの異なる化学量論的組み合わせによる、ヒト組み換えＡｃｈＥを使用したＡβ４０凝集体の阻害を例示する棒グラフを示し、ある時点（４８ｈ）に対する４８５ｎｍでの相対蛍光単位として表す。ドネペジル（Ｄ）を参照標準物として使用した。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＴｈＴ蛍光強度により定量される、固定濃度アミロイドベータ（３０μＭ）との、それぞれ化合物Ｂ、Ａ及びＳとして示される試験化合物３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びシラジットの異なる化学量論的組み合わせによる、ヒト組み換えＡＣｈＥを使用したＡβ４０凝集体の阻害を例示する棒グラフを示し、ある時点（４８ｈ）に対する４８５ｎｍでの相対蛍光単位として表す。ドネペジル（Ｄ）を参照標準物として使用した。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１３】図１３は、８日間にわたりＤＢＰｓ、即ち３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ  ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びそれらの組み合わせの相乗効果を試験する、スコポラミン誘導性健忘ラットモデルの実験設計を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、スコポラミン誘導性健忘ラットモデル試験の試行１中の総アーム進入のスコポラミン（Ｓｃ）誘導性変化に対する、ＤＢＰ’ｓ、即ち３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びそれらの組み合わせの効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａのように行った試験の試行２を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、スコポラミン誘導性健忘ラットモデル試験の試行２における、新規環境に対する対処行動のスコポラミン誘導性変化に対する、ＤＢＰ’ｓ、即ち３（ＯＨ）−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）、３，８（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）及びそれらの組み合わせの効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、アーム弁別（空間認識記憶）の変化を判定するための、スコポラミン誘導性健忘ラットモデル試験のＹ迷路タスクにおける既知アーム進入（％）対新規アーム進入（％）のスコポラミン誘導性変化の効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１５】図１５は、受動的回避試験におけるスコポラミン誘導性記憶障害の効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１６】図１６は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイキット法を使用した、海馬（ＨＩＰ）組織におけるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性のスコポラミン誘導性変化の効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【図１７】図１７は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイキット法を使用した、ＨＩＰ組織におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）レベルのスコポラミン誘導性変化の効果を示す。値は全て平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様では、本発明は、認知症関連状態、うつ及び／又は不安障害などの認知障害を処置するか、軽減するか又は予防することにおけるシラジット及びその化学構成物の有用性を明らかにする。
【００１３】
シラジットは、海洋有機物及び微生物代謝産物と混合される岩石層により圧縮された岩石腐植質、岩石鉱物及び有機物質から構成される。これは、黒色の塊として１０００〜５０００メートルの範囲のより高い高度のヒマラヤの岩石から漏出し、３５００Ｂ．Ｃに遡る伝統的なインドの医学体系であるアーユルベーダでマハラサ（ｍａｈａｒａｓａ）（超活力剤）とみなさている。シラジットは、ジベンゾ−α−ピロン（「ＤＢＰｓ」）及びジベンゾ−α−ピロン色素タンパク質とともに主要構成成分としてフルボ酸を含有する。
【００１４】
シラジットの２つの主要なＤＢＰ構成成分は、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン（ａ．ｋ．ａ．「ウロリチンＡ」又は或いは「３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ」）及び３−ヒドロキシ−ジベンゾ−アルファ−ピロン（別名「ウロリチンＢ」又は或いは「３−（ＯＨ）−ＤＢＰ」）である。ウロリチンＡ及びウロリチンＢは両方ともＮａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から入手可能である。
【００１５】
シラジット由来のフルボ酸複合体は、フルボ酸（「ＦＡ」）とともに、コア核としての、還元形態並びに酸化形態の両方の、含酸素ジベンゾ−アルファ−ピロン（ＤＢＰｓ）と、部分的な構造単位としてのアシル化ＤＢＰｓ及び脂質と、を含む天然の低及び中分子量化合物の集合体である。堆積起源由来のフルボ酸複合物質はＤＢＰｓを欠き；代わりに堆積フルボ酸のコア核は安息香酸から構成される。
【００１６】
従って、シラジットの活性構成成分は、ジベンゾ−アルファ−ピロン及び関連代謝産物、小ペプチド（非タンパク質アミノ酸を構成）、いくつかの脂質及び担体分子（フルボ酸）を含有する。全て本明細書中で参照により本明細書によって組み込まれる、Ｇｈｏｓａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｈｉｌａｊｉｔ  Ｐａｒｔ  １−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７６）６５：７７２−３；Ｇｈｏｓａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｈｉｌａｊｉｔ  Ｐａｒｔ  ７−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ，ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｙｕｒｖｅｄｉｃ  ｒａｓａｙａｎａ，”Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（ＩＵＰＡＣ）（１９９０）６２：１２８５−８；Ｇｈｏｓａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｈｕｍｕｓ，”Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２３：６７３−８０；及び米国特許第６，４４０，４３６号明細書及び同第６，８６９，６１２号明細書（及びそこで引用される参考文献）を参照。
【００１７】
シラジット（例えばＰｒｉｍａＶｉｅ（登録商標））は、多様な臨床条件に対して、アーユルベーダにおいて広範囲にわたり用途がある。数世紀にわたり、ヒマラヤ及び隣接地域の孤立した村に住む人々は、糖尿病を伴う問題を予防し、それに対抗するために、シラジットを単独で、又は他の植物療法と組み合わせて使用してきた（Ｔｉｗａｒｉ，Ｖ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｙｕｒｖｅｄｉｃａ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｏｎ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ，”Ｊ．Ｒｅｓ．Ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｄ．（１９７３）８：５７）。これは、抗酸化剤であることに加えて、細胞毒性酸素ラジカルにより誘発される膵島細胞に対する損傷を防ぐ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ．Ｋ．，“Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９５）９：４１−４；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ．Ｋ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｏｎ  ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ，”Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９５）９：５６−９；及びＧｈｏｓａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３４Ｂ：５９６−６０２）。糖尿病中のグルコース、脂肪及びタンパク質代謝の撹乱の結果、高脂血症が起こることが提示されている。ある試験において、シラジットは、ラットにおける脂質プロファイルでの顕著な有益効果を生み出した（Ｔｒｉｖｅｄｉ  Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｈｉｌａｊｉｔ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ａｌｌｏｘａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ，”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００４）３６（６）：３７３−３７６）。
【００１８】
論じられるように、シラジットは、様々な病気を処置するために使用されてきた。これは、機能促進剤としても推奨される。フルボ酸（ＦＡ）は、植物の生体系において、動物並びにヒトにおいて、多くの重要な役割を引き出すことが報告されており、これには、（ａ）鉱物及び栄養素のバイオアベイラビリティの改善、（ｂ）電解質として作用すること、（ｃ）重金属を含む毒性物質の解毒、（ｄ）抗酸化剤として機能すること、及び（ｅ）免疫機能の改善が含まれる。さらに、ジベンゾ−α−ピロンは、ミトコンドリア内部の電子伝達に関与すると仮定されており、従ってより多くのＡＴＰの産生を促進し、エネルギー増加につながる。
【００１９】
一態様では、本発明は、様々な認知欠損又は認知能若しくは機能の低下が起こっているヒト個体を処置することにおける、３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（３−ＯＨ−ＤＢＰ）、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ）又はそれらの組み合わせの有用性を明らかにする。
【００２０】
３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＡ）、３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＢ）及びシラジットのアンチエイジング効果を評価するために、次の試験を行った：
試験１：若齢及び高齢マウスにおけるミトコンドリアの生体エネルギー特性及び機能に対する実験薬の効果；
試験２：ラットにおけるスコポラミン誘発性認知症に対する実験薬の効果；
試験３：インビトロでのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性に対する、３，８−ジヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＡ）及び３−ヒドロキシ−ジベンゾ−α−ピロン（ウロリチンＢ）及び異なる比でのそれらの組み合わせの効果。
【実施例】
【００２１】
実施例１（試験１）
１．試験１の目的：若齢及び高齢マウスにおいてミトコンドリアの生体エネルギー特性及び機能に対して実験薬を試験すること。
【００２２】
１．１．この試験の実験設計を表１で示す。
2022500347.tif 000002
【００２３】
２．材料及び方法
２．１．化学物質
シラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡはＮａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）により提供された。マンニトール、スクロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＨｉＭｅｄｉａ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄ．（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）から入手可能である。ＥＧＴＡ、ＨＥＰＥＳカリウム塩、リン酸カリウム一塩基性無水物（ＫＨ２ＰＯ４）、ＭｇＣｌ２、リンゴ酸塩、ピルビン酸塩、ＡＤＰ、コハク酸塩、オリゴマイシン、カルボニルシアン化物４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）及びロテノンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から調達した。
【００２４】
３．ミトコンドリアの生体エネルギー特性の評価
３．１．ミトコンドリアの単離
以前に記載の方法（Ｂｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｔ．Ｇ．，“Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｌｔｅｒｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９９）７３：１１２７−１１３７）に従い、一部僅かに改変して（Ｓａｍａｉｙａ，Ｐ．Ｋ．，Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｏｘｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｒａｔｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．（２０１５）４７：２１７−２２２）、標準的な分画遠心法によりマウス脳の皮質からのミトコンドリアの単離を行った。簡潔に述べると、脳を切開し、単離緩衝液（１００ｍｌ蒸留水中、２１５ｍＭマンニトール、７５ｍＭスクロース、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液及び１ｍＭ  ＥＧＴＡからなり、ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）中でホモジナイズし、最初に１３００ｇで３分間遠心分離した。上清をＳ１として保管し、Ｓ２を回収するためにペレットを再び上記のように遠心分離した。次にＳ１及びＳ２を混合し、次いで各上清の上にＥＧＴＡ入りの単離緩衝液を置き、４℃にて１４，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、より堅いミトコンドリアのペレットを得た。次に、ＥＧＴＡなしの単離緩衝液中でペレットを懸濁することによって洗浄段階を行い、１４，０００ｘｇで１０分間再び遠心分離して、ペレットからＥＧＴＡを除去した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，ＵＳＡ）を用いて、ミトコンドリアタンパク質を熱量測定により推定した（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｉｎ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）１９３：２６５−２７５）。
【００２５】
３．２．ミトコンドリアの機能の測定
３７℃で密封サーモスタット制御チャンバーにおいて小型のＣｌａｒｋ型電極を用いて以前に記載のように（Ｓａｍａｉｙａ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，２０１５）ミトコンドリアの呼吸を評価した（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．）。簡潔に述べると、ミトコンドリアをチャンバーに添加し、適切な基質及び阻害剤によって呼吸状態を評価した。２５０μＬの最終体積で、呼吸緩衝液中で精製ミトコンドリアタンパク質を懸濁した。基底呼吸数でのピルビン酸塩／リンゴ酸塩（Ｐ／Ｍ）の添加によって、Ｓｔａｔｅ  ＩＩ呼吸が開始された。ＡＤＰの添加によって、Ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ呼吸が開始され；酸素利用が高レベルであることは、ＡＤＰがＡＴＰに変換されていることを示す。オリゴマイシンの添加によってＳｔａｔｅ  ＩＶを測定した。ＡＴＰシンターゼが遮断され、マトリクスに戻ることが可能な電子がないので、呼吸は基底速度に戻る。電子伝達系（ＥＴＣ）は、マトリクスへ戻る陽子の喪失により、ミトコンドリア膜電位を維持することのみ継続する。ＦＣＣＰの添加によってＳｔａｔｅ  Ｖを測定した。これは呼吸の最大速度を表し、それによりＡＴＰ合成に対するＥＴＣの脱共役が起こり、陽子がマトリクスに駆け戻ることが可能になる。次に、複合体Ｉ−推進呼吸を遮断するためにロテノンを添加した。コハク酸塩の添加によりＳｔａｔｅ  Ｖ（コハク酸塩）を決定した。ＦＣＣＰが系に存在するので、これは複合体ＩＩを介した呼吸の最大速度である。Ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ呼吸（ＡＤＰの存在）に対する単離ミトコンドリアの応答の勾配をＳｔａｔｅ  ｒＩＶ呼吸（１ｌＭオリゴマイシンあり、ＡＤＰなし）に対する応答の勾配で除することによって、呼吸調節率（ＲＣＲ）を計算した（Ｓａｍａｉｙａ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，２０１５）。
【００２６】
４．結果及び考察
Ａ．若齢及び高齢マウスにおけるミトコンドリアの生体エネルギー特性（ＲＣＲ）に対するシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡの効果を図１で示す。二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的分析から、群内（行因子）［Ｆ（３，３２）＝１３．１６，Ｐ＜０．０５］及び群間（列因子）［Ｆ（１，３２）＝２１２．２０，Ｐ＜０．０５］のＲＣＲにおいて有意差があったことが明らかになった。ボンフェローニ事後検定から、年齢によるＲＣＲの有意な低下があったことが示された。高齢ラットのＲＣＲは、より若齢のラットと比較してより低かった。このことから、高齢ラットではミトコンドリアの生体エネルギー特性において顕著な支障があることが示される。シラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）によって、高齢マウスにおいてＲＣＲが有意に上昇し、これにより、これらの化合物が高齢ラットにおいてミトコンドリア生体エネルギー特性の混乱を改善し得ることが示された。さらに、処置した若齢ラットの間でもＲＣＲの有意な上昇があり、このことから、加齢に関連する障害において、それぞれ、栄養補助食品として、及びまた薬物としても、これらの化合物を使用し得ることが示されたが；２１日の処置中に若齢及び高齢マウスの両方においてミトコンドリアの機能が改善された。
【００２７】
Ｂ．若齢及び高齢マウスにおけるミトコンドリア呼吸の異なるｓｔａｔｅに対するシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）の効果を図２で示す。二元配置ＡＮＯＶＡから、群内（行因子）［Ｆ（４，８０）＝７．５，Ｐ＜０．０５］及び群間（列因子）［Ｆ（４，２８）＝３３５，Ｐ＜０．０５］の異なるｓｔａｔｅで有意差があったことが明らかになった。ボンフェローニ事後分析から、シラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）が、２１日間の処置中、それらの個々の群で正常対照マウスと比較して、全てのｓｔａｔｅにおいてミトコンドリア呼吸を有意に上昇させたことが明らかになった。
【００２８】
加齢は体細胞構成成分への未修復損傷の蓄積によるものである可能性がより高い。酸化的リン酸化の正常な過程中に産生されるフリーラジカルは、細胞損傷の主要な起源であることが提起されており、加齢のフリーラジカル理論が最初に提案されたのは５０年以上前であった（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，“Ａｇｅｉｎｇ：ａ  ｔｈｅｏｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．（１９５６）１１：２９８−３００）。加齢のミトコンドリア理論（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，“Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｌｏｃｋ：ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ？”Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．（１９７２）２０：１４５−１４７）は、細胞におけるＲＯＳ産生の殆どがミトコンドリア由来であったことを報告した試験に従い提起された（Ｃｈａｎｃｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｏｒｇａｎｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９７９）５９：５２７−６０５）。本明細書中に記載の例では、１０〜１５ｇｍ体重の若齢（６〜８週）マウス及び２０〜２５ｇｍ体重の高齢（１８〜２０か月）マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇの用量での２１日間の治療スケジュール中、次の薬物のミトコンドリア機能に関して抗老化効果を評価した。続いて、ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸数でｓｔａｔｅ  ＩＩＩを除することによって呼吸調節率（ＲＣＲ）を計算した。（Ｇｉｌｍｅｒ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４  ｒａｔ，”Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．（２０１０）１３１：１３３−１４３）。２１日間の実験スケジュールにおいて、５０ｍｇ／ｋｇの用量のシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡが、ミトコンドリアの複合酵素活性、ミトコンドリア呼吸数を改善し、若齢マウスで老化を遅らせ、高齢マウスで老化速度を低下させたことが分かった。
【００２９】
ｓｔａｔｅ  ＩＩ呼吸は、ミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）を刺激するための基質ピルビン酸塩／リンゴ酸塩の消費を示し、若齢対照マウスと比較した場合、５０ｍｇ／ｋｇの用量でシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡで処置した若齢マウスで呼吸数の有意な増加が観察された。呼吸数は、高齢対照マウスと比較した場合、５０ｍｇ／ｋｇの用量でシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡで処置した高齢マウスにおいて増加したことも分かる。一方で、呼吸数の増加は、この３種類全ての化合物で処置した高齢マウスにおいて、同じもので処置した若齢マウスよりも顕著である。単離ミトコンドリアにおけるＳｔａｔｅ  ＩＩＩは、高い外部（ミトコンドリア外）ＡＤＰ、低い外部ＡＴＰ／ＡＤＰ比及び高い（Ｃａ２＋なしで単離ミトコンドリアで最大）酸素消費及びＡＴＰ合成を伴う状態である（Ｃｈａｎｃｅ  Ｂ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｇ．Ｒ．，“Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｉ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９５５）Ｎｏｖ  １；２１７（１）：３８３−９４；及びＣｈａｎｃｅ  Ｂ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｇ．Ｒ．，“Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，”Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９５６）１７：６５−１３４）。Ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ呼吸はＡＤＰの添加により開始された。この試験において、ｓｔａｔｅ  ＩＩＩ呼吸はｓｔａｔｅ  ＩＩと同じであることも分かった。一方で、ｓｔａｔｅ  ＩＶは、非常に高いＡＴＰ／ＡＤＰ比、非常に低いＡＤＰ、ＡＴＰ合成なし及びプロトン漏出に排他的に対応する酸素消費を伴う状態として定義される（Ｇｒｏｅｎ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｔｅｐｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：２７５４−２７５７；Ｈａｆｎｅｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ，ｐｒｏｔｏｎ  ｌｅａｋ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｍｏｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ‘ｔｏｐ−ｄｏｗｎ’  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅｏｒｙ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１８８：３１３−３１９；Ｓｃｈｉｌｄ，Ｌ．，Ｇｅｌｌｅｒｉｃｈ  Ｆ．Ｎ．，”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｏｌ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）２５２：５０８−５１２；及びＷａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“���ａｃｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｉｎｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＡＤＰ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ−ｌｉｖｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１４２：４１７−４２４）。若齢及び高齢群マウスの両方でオリゴマイシン（ＡＴＰ−シンターゼ阻害剤）を使用することによって、ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸の増加が見られたが；この呼吸数増加効果は、若齢マウスよりも高齢マウスで顕著である。さらに、５０ｍｇ／ｋｇの用量のシラジットはｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸でも顕著な効果を示す。ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸の増加は、より多くのプロトンをマトリクスに漏出させるミトコンドリア内膜の損傷によるものであり得る。この結果、ＡＴＰ産生と共役させるために必要とされる最大プロトン勾配の喪失が起こる。基礎代謝量を維持することに対して、Ｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸がＡＴＰ産生を伴うプロトン輸送力の共役度を示すので、酸素利用の増加はＡＴＰ産生に対するＥＴＣの脱共役を示す。（Ｓａｍａｉｙａ  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，２０１５を参照）。穏やかな脱共役剤ＦＣＣＰの続く添加により（ｓｔａｔｅ  Ｖ）、酸化的リン酸化からＥＴＣが脱離する。これは、プロトン勾配消失を回復させるためのその試みにおけるＥＴＣの最大呼吸能を決定する（Ｂｅｎｚ，Ｒ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．，“Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｎ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  ＦＣＣＰ（ｃａｒｂｏｎｙｌｃｙａｎｉｄｅｐｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ），”Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９８３）４１：３８１−３９８）。ミトコンドリアは、複合体Ｉの機能喪失により、この影響を克服し、呼吸を維持することができなかったので、ｓｔａｔｅ  Ｖ（複合体Ｉ）での呼吸数が、シラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡで処置した若齢マウスにおいて増加したことが顕著に見られた。しかし、ウロリチンＢは、おそらくｓｔａｔｅ  Ｖ（複合体Ｉ）に対する脱共役剤としてのその作用により、この状態で効果が小さかった。高齢マウスにおいて、３つの薬物全てが呼吸数の増加を示す。複合体Ｉ推進呼吸を阻止するための競合的阻害剤として作用するロテノンの添加後、複合体ＩＩ推進呼吸が加齢により影響を受けるか否かを判定するために、コハク酸塩を添加した。高齢群マウスで複合体ＩＩ  ｓｔａｔｅ  Ｖ呼吸の顕著な喪失が観察されたが、若齢マウスでは観察されなかった。この結果から、加齢マウスに対する複合体ＩＩの感受性が示される。ＲＣＲはｓｔａｔｅ  ＩＩＩとｓｔａｔｅ  ＩＶ呼吸との比であり、ミトコンドリアの完全性の目安である（Ｇｉｌｍｅｒ  Ｌ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。若齢及び高齢実験マウスの両方において、５０ｇｍ／ｋｇの用量で３種類全ての薬物でＲＣＲの有意な上昇が見られた。上記の結果から、実験薬が若齢及び高齢マウスの両方において生体エネルギ��特性の改善を示したと結論付け得る。
【００３０】
５．結論
本試験に基づき、マウスにおける５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量のシラジット、ウロリチンＢ及びウロリチンＡは、若齢及び高齢マウスの両方でミトコンドリアの生体エネルギー特性及び機能を改善した。
【００３１】
実施例２（試験２）
１．試験２の目的：ラットにおけるスコポラミン誘導性認知症に対する実験薬の効果を評価すること。
【００３２】
２．方法
２．１．薬物。実験薬：３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ）、３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ）及びシラジットはＮａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から調達した。
【００３３】
２．２．動物対象。Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＩＭＳ），Ｂａｎａｒａｓ  Ｈｉｎｄｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＢＨＵ），Ｖａｒａｎａｓｉ，Ｕｔｔａｒ  Ｐｒａｄｅｓｈ，Ｉｎｄｉａから、近交系Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｆｏｓｔｅｒ雄アルビノラット（１３０〜１８０ｇ）を入手した。これらは病原体不含であることが証明されており、異なる実験群に無作為に分けた。ラットは、２５±１℃の周囲温度及び４５〜５５％ＲＨ、１２時間の明暗周期（７：００〜１９：００時に点灯）で動物収容部門において維持した。動物に対して標準的なペレット状の固形飼料及び水道水を自由摂取させた。実験は９：００〜１４：００時に行った。明期中に行動試験を行った。動物を群ごとに収容し、それらを実験に使用する前に少なくとも１週間にわたり馴化させた。動物を暗幕で覆ったケージ中で実験室に運んだ。実験手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従った。
【００３４】
２．３．薬物治療
経口胃チューブを通じて０．３％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中で懸濁した実験薬（１日１回１０、２５及び５０ｍｇ／ｋｇ）を７日間にわたり経口投与することによりラットを前処置した。実験手順終了まで処置を継続した（Ｓｉｎｇｈ，Ｇ．Ｋ．，Ｇａｒａｂａｄｕ，Ｄ．，Ｍｕｒｕｇａｎａｄａｍ，Ａ．Ｖ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｖ．Ｋ．，Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，“Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．（２００９）９１（３）：２８３−９０）。注射用に水中でスコポラミンを溶解させ、第７日に、薬物処置を施してから１時間後に投与した。標準薬としてドネペジル（５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）を使用した。第８日に行動試験を行った。動物を屠殺し、ラット脳アトラスの座標を使用して海馬を顕微解剖した。実験薬の体積に等しいビヒクル（０．３％ＣＭＣ懸濁液）０．３ｍｌで全対照群動物を処置した（Ｏｈｊａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｒｅｃｅｍｏｓｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｍｎｅｓｉａ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ，”Ｂｒａｉｎ  Ｃｏｇｎ．（２０１０）Ｏｃｔ；７４（１）：１−９）。
【００３５】
２．４．実験方法
Ｙ迷路試験により空間認識記憶、一般探索行動及び不安様行動を評価した。Ｙ迷路は、寸法５０ｃｍ長、１６ｃｍ幅及び３２ｃｍ高さの３本の同様のアームからなる。１回目の試行で、新規アームを遮断し、動物が他の２本のアームで１５分間動けるようにした。第１回の試行から４時間後、２回目の試行で、新規アームを開き、動物が３本全てのアームで５分間動けるようにした。全アームでの総進入数（試行−１及び試行−２の５分間）は一般探索姿勢（好奇心）を示す。試行２の５分間での既知及び新規アームにおける％進入を空間認識記憶の目安とみなした。試行２の間に全アーム及び装置中央部での滞在時間に対する、新規アーム滞在時間の比のパーセンテージにより、新規環境への対処ストラテジーを推定した。新規環境に対する対処行動の減少は、不安様行動の増加とみなした（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ｌｉｋｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅ−ｓｔｒｅｓｓ  ｍｏｄｅｌ，”Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１３）７５：６２−７７）。
【００３６】
３．結果及び考察
Ａ．Ｙ迷路試験における好奇心行動に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ）の効果
図３及び４は、試行１及び試行２における総進入数、即ちＹ迷路試験に供したラットにおける好奇心行動を示す。統計学的分析から、それぞれ試行１及び試行２において群間で有意差があったことが示された［Ｆ（９，５９）＝１０．６３ｐ＜０．０５］、［Ｆ（９，５９）＝７．９８４，ｐ＜０．０５］。一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定から、対照群ラットと比較した場合、スコポラミン投与により、好奇心行動が有意に減少したことが示唆される。しかし、５０ｍｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ及び５０ｍｇ用量の３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰにより、試行１及び試行２において好奇心行動のスコポラミン誘導性減少が弱まった。
【００３７】
Ｂ．Ｙ迷路試験での新規環境への対処行動に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ）の効果
図５は、試行２中の、装置の新規アーム滞在時間のパーセンテージの観点での、ラットにおける対処行動を示す。統計学的分析から、群間で有意差があったことが明らかになった［Ｆ（９，５９）＝１１．５３，ｐ＜０．０５］。一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定から、対照群ラットと比較して、スコポラミン処置群動物において対処行動の有意な減少があったことが示唆される。５０ｍｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ及び５０ｍｇ用量の３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰによって、新規環境への対処ストラテジーのスコポラミン誘導性の減少が弱まった。
【００３８】
Ｃ．Ｙ迷路試験でのアーム弁別行動の変化に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ）の効果
Ｙ迷路試験でのスコポラミン誘導７日後の空間記憶障害に対する効果を図６で示す。二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的分析から、群間で％既知及び新規アーム進入について有意差があったことが明らかになった［Ｆ（９，１００）＝０．０７２，ｐ＜０．０５］。二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ事後検定。事後分析から、スコポラミン処置ラットにおいて、それぞれ％既知及び新規アーム進入の有意な上昇及び低下があったことが明らかになった。５０ｍｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ及び５０ｍｇ処置用量の３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰはそれぞれ、スコポラミン処置ラットと比較した場合、Ｙ迷路試験パラダイムでの％既知及び新規アーム進入を用量依存的に逆転させた。
【００３９】
４．要約及び結論
スコパラミン（Ｓｃｏｐａｌａｍｉｎｅ）対照は、Ｙ迷路で総アーム進入が減少するが、これは動物の探索行動における異常な変化を示すものであり、従って認知欠損の哺乳動物モデルをもたらす。探索行動は新規環境におけるげっ歯類の生存本能であると思われる。この動物は、潜在的な脅威及び物質的利益についてそれらの周囲に関する情報を収集しようとする。脅威と利益との間の均衡は探索行動に影響を与える。この動機付け行動は、体内の生理的変化により、又はストレスなどの外的な要因により変化し得る。この試験において、スコパラミン（Ｓｃｏｐａｌａｍｉｎｅ）は、コリン作動性系を下方制御することによりこの行動を変化させた。ドネペジル、抗コリンエステラーゼ薬は、アセチルコリンのシナプス利用可能性をおそらく向上させることによりこの活性を逆転させた。本開示で理論により束縛されるものではないが、同様の機序によって、ＤＢＰ’ｓ（即ちウロリチンＡ及びＢ）及びシラジットの両方がスコポラミン誘導性探索行動の変化を弱めると考えられる。ＤＢＰ’ｓでの処置は、Ｙ迷路試験で既知アーム及び新規アーム進入を用量依存的に逆転させ、このことから、スコポラミン誘導性空間記憶障害の減弱が示される。さらに、スコポラミン処置により、新規環境滞在時間の観点での対処行動の有意な損失が起こり、このことから、不安様行動が示される。ＤＢＰ’ｓは、新規環境への対処ストラテジーにおいてスコポラミン誘導性減少を弱めた。従って、ＤＢＰ’ｓは、Ｙ迷路パラダイムにおいて抗不安活性を明らかに示した（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．，Ｇａｒａｂａｄｕ，Ｄ．，Ｊｏｙ，Ｋ．Ｐ．“Ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ｌｉｋｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅ−ｓｔｒｅｓｓ  ｍｏｄｅｌ，”Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１３）７５：６２−７７；及びＴｒｉｐａｔｈｉ，Ａ．，Ｐａｌｉｗａｌ，Ｐ．，Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．“Ｐｉｒａｃｅｔａｍ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ＬＰＳ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，”Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１７）１−１４）。従って、ＤＢＰ’ｓは、スコポラミン誘導性認知症モデルにおいて、認知欠損を改善し、抗不安活性を示す。ＤＢＰ’ｓの効果は５０ｍｇ／ｋｇ用量であり、シラジットは１００ｍｇ／ｋｇ用量であったことに注目することは興味深い。従って、ＤＢＰ’ｓは、上記で観察される薬理学的効果におけるシラジットの２倍の強さであると思われる。  
【００４０】
実施例３（試験３）
１．試験３の目的：インビトロでのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性に対する、ウロリチンＢ（Ｂ）及びウロリチンＡ（Ａ）及び異なる比のそれらの組み合わせの効果を評価すること。（Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９６１）７：８８−９５。ＡＣｈＥ活性に対するＤＢＰ’ｓの相乗効果を決定すること。
【００４１】
シラジット、ウロリチンＢ（Ｂ）及びウロリチンＡ（Ａ）はＮａｔｒｅｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）により提供された。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ（デンキウナギ）ＣＡＳ：９０００−８１−１からのＡｃｈＥはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から調達した。５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ−エルマン試薬）及びアセチルコリンヨージド（ＡＣｈＩ）は地元の供給業者（ＨｉＭｅｄｉａ，Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）から調達した。全ての他の化学物質及び試薬は、地元の供給業者（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ及びＨｉＭｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）から市販されており、これらは分析グレードであった。
【００４２】
ＡＣｈＥ阻害アッセイのために、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．により記載される手順を幾分改変した後に使用した。アセチルチオコリンヨージド（ＡＴＣＩ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ−エルマン試薬）はＨｉｍｅｄｉａから購入した。陽性対照としてドネペジルを使用した。インビトロアッセイを行うためにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を使用した。ＩＣ５０アッセイに対する濃度範囲を選択するために、５０ｍｇ／ｍｌでパーセンテージ阻害を測定した。試験化合物Ｂ（３−ＯＨ−ＤＢＰ）：試験化合物Ａ（３，８（ＯＨ）２ＤＢＰ）に対して５種類の異なる組み合わせ濃度範囲を使用し、比は次のとおりであった：試験化合物Ａ５０ｍｇの濃度は試験化合物Ｂ（１０、２０、３０、４０、５０ｍｇ）とともに変動し、ＩＣ５０を決定するために使用した。室温で３０分間、９６ウェルプレートにおいて５０μＬのＡＣｈＥ（０．２２ＵｍＬ−１）及び１０μＬの試験化合物又は標準化合物を温置した（表３参照）。
【００４３】
さらに、基質、即ちＡＴＣＩ（１５ｍＭ、３０μＬ）を添加し、これをさらに３０分間温置した。最後にＤＴＮＢ１６０μＬ（１．５ｍＭ）を添加し、Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して４１５ｎｍで吸収を記録した。試験及び標準化合物から得られた吸収を使用して、ＩＣ５０値を計算した。３つ組及び３回の独立した操作でアッセイを行った。
パーセンテージ阻害＝（対照−試験）／対照ｘ１００  式（１）
【００４４】
１．１．この試験の実験設計を表２で示す。
2022500347.tif 000003
【００４５】
２．結果
表２で示され、図７で示されるように、併用投与１０：５０、２０：５０及び３０：５０は、３，８（ＯＨ）２ＤＢＰよりも４倍効果が高いＩＣ５０値を示し、３−ＯＨ−ＤＢＰよりも３倍高い効果を示す。参照標準としてドネペジルを使用したが、このＩＣ５０値は１０：５０、２０：５０及び３０：５０とほぼ同等であった。シラジットの効果は、ＩＣ５０値によると、１０：５０の２０分の１であり、３−ＯＨ−ＤＢＰの８分の１であり、３，８（ＯＨ）２ＤＢＰの５分の１である。シラジットの効果は、ＩＣ５０値によると、ドネペジルの２５分の１であった。これらのデータから、１０：５０、２０：５０及び３０：５０濃度で３−ＯＨ−ＤＢＰ及び３，８（ＯＨ）２ＤＢＰが相乗効果を示すことが明らかになった。
【００４６】
さらに、表２から、各構成成分単独を超えて、ウロリチンＢとウロリチンＡとの特定の比が予想外にＡＣｈＥ阻害活性を約３倍〜４倍増加させることが明らかになる。ウロリチンＢとウロリチンＡとのこの相乗的組み合わせの活性は、既知の処方せん医薬品であるドネペジルと比較して、ほぼ同等である。
【００４７】
表３は、本明細書中に記載のようにウロリチンＡとウロリチンＢとのある一定の有利で有効な組み合わせを示し、これは表２の組み合わせ及び比を反映する。さらなる有効な濃度範囲が企図される。
2022500347.tif 000004
【００４８】
一実施形態では、ウロリチンＢとウロリチンＡとの組み合わせが医薬又は栄養補助処方物として調製され得る。ウロリチンＢとウロリチンＡとの代表的なｗｔ．／ｗｔ．比の範囲は約０．２：１〜約１：１であり得る。好ましい実施形態では、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比の範囲は約０．２：１〜約０．６：１であり得る。
【００４９】
本明細書中で記載のような例によれば、ウロリチンＢ及びウロリチンＡの上述の相乗的組み合わせの１日用量の範囲は、ヒト対象において約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇであり得る。別の実施形態では、１日用量の範囲は、ヒト対象において約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００５０】
一実施形態では、ウロリチンＢ及びウロリチンＡの上述の相乗的組み合わせの１日用量の範囲は、ヒト対象において約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇであり得る。好ましい実施形態では、ウロリチンＢ及びウロリチンＡの上述の相乗的組み合わせの１日用量の範囲は、ヒト対象において約１００ｍｇ〜約５００であり得る。
【００５１】
試験３で観察される相乗効果が、哺乳動物対象において同等の用量範囲で行った場合、試験１及び２と同様に示されることがさらに予想される。ヒト対象で認知症関連障害を処置若しくは予防するための方法又はヒト対象で不安障害を処置若しくは予防するための方法において、ウロリチンＢ／ウロリチンＡ相乗効果が観察されることがさらに予想される。  
【００５２】
実施例４
一実施形態では、この試験の目的は、Ｅｌｌｍａｎ（１９６１）法を使用することによって、アセチルコリンエステラーゼ活性に対して様々な組み合わせでのシラジットとＤＢＰ’ｓとのインビトロでの相乗効果を評価することである。ＡＣｈＥ阻害アッセイの場合のように、実施例３のとおり化学試薬及び出発物質を使用した。
【００５３】
試験化合物ウロリチンＡ、ウロリチンＢ及びシラジットの５種類の異なる組み合わせを次のように作製した。表４で示されるように、ＩＣ５０値を決定するために試験化合物Ａ（５０ｍｇ）及びシラジット（５０ｍｇ）の濃度を様々な濃度の試験化合物Ｂと組み合わせた。室温で３０分間、９６ウェルプレート中で５０μＬのＡＣｈＥ（０．２２Ｕ  ｍＬ−１）及び１０μＬの試験化合物又は標準化合物を温置した。
2022500347.tif 000005
【００５４】
さらに、基質、即ちＡＴＣＩ（１５ｍＭ、３０μＬ）を添加し、これをさらに３０分間温置した。最後に、１６０μＬ（１．５ｍＭ）のＤＴＮＢを添加し、Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して４１５ｎｍで吸収を記録した。試験及び標準化合物から得た吸収を使用してＩＣ５０値を計算した。三つ組みでアッセイを行った（式１参照）。以下の表５で結果を示す。
2022500347.tif 000006
【００５５】
結論として、シラジットとＤＢＰ’ｓとの５０：１０：５０の併用投与は、シラジットよりもおよそ１．５倍効果が高いＩＣ５０値を示すが、３−ＯＨ−ＤＢＰの３．５分の１であり、３，８（ＯＨ）２ＤＢＰの３分の１である。参照標準物質としてドネペジルを使用したが、ドネペジルは５０：１０：５０よりもおよそ１２倍効果が高いＩＣ５０値を有する。この結果から、シラジットがＤＢＰ’ｓの抗コリンエステラーゼ活性を妨害することが示される。
【００５６】
実施例５
別の実施形態では、この試験の目的は、ＴｈＴ（チオフラビン−Ｔ）法を使用することによって、ラットアセチルコリンエステラーゼ−誘導性β−アミロイド凝集に対する、様々な組み合わせでのシラジットとＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＡ及びＢ）とのインビトロ相乗効果を評価することである。化学試薬及び出発物質を上記のように使用した。
【００５７】
ＡＣｈＥ誘導性β−アミロイドペプチド凝集アッセイの阻害
異常ペプチドであるＡβ１−４０は折り畳まれて規則的βシート構造になり、さらに自己集合して毒性のある原線維凝集体を形成する。これらの原線維凝集体は、ＡＤで観察される症状の開始において重要な役割を果たす。原線維凝集体形成（即ち線維化）の阻害は、ＡＤに対する有効な治療剤を開発するための最も卓越したアプローチの１つと考えられる。
【００５８】
Ａβ１−４０の凝集傾向に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）の効果及び（チオフラビン−Ｔ）ＴｈＴアッセイ測定を実施した。ＴｈＴは、完全に形成されたＡβ１−４０凝集体に結合した際に最大蛍光を示す分子色素である。従ってＡβ１−４０の線維化に対する３−（ＯＨ）−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）の効果を試験するために、ＴｈＴアッセイを行った。
【００５９】
試験化合物をＤＭＳＯ（５％）中で溶解させ、０．２１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でさらに希釈した。Ａβ１−４０（１０μＭ及び３０μＭ）をそれだけで、及びそれぞれ表６及び７で示される比での試験化合物の様々な濃度で独立に温置した。
【００６０】
表６は、次のようにＡβ１−４０（１０μＭ）とＤＢＰ’ｓとの、及びシラジットとＤＢＰとの組み合わせ比を示す。
2022500347.tif 000007
【００６１】
表７は、次のように、Ａβ１−４０（３０μＭ）とＤＢＰ’ｓとの、及びシラジットとＤＢＰ’ｓとの組み合わせ比を示す。
2022500347.tif 000008
【００６２】
３０又は１０μＭ  Ａβ４０、２３０μＭ  ＡＣｈＥ、１０、２０、５０μＭ試験化合物及び２μＬアッセイ緩衝液（体積２２μＬ）の最終濃度を得るために、様々な比の試験化合物の存在下で１６μＬのＡＣｈＥとともに２μＬの様々な濃度のＡβ４０（１０及び３０μＭ）を温置した。暗所にて２４時間又は４８時間にわたり室温で混合物を温置した（実験により時間を変化させ得る）。
【００６３】
阻害剤の存在下で、阻害剤の非存在下で、及びブランク又は溶媒対照で、Ａβ４０凝集に対して蛍光強度を得た。温置後、１７８μＬの２０μＭ  ＴｈＴを添加した。溶液の蛍光強度を４４２又は４５０ｎｍ励起及び４９０又は４８３ｎｍ発光波長で読み取った（総体積２００μＬ）。
【００６４】
ＡＣｈＥ誘導性Ａβ１−４０凝集のパーセンテージ阻害を次のように計算した。
2022500347.tif 000009
式中、ＩＦｉ及びＩＦｏは、それぞれ阻害剤の存在下及び非存在下でＡβ＋ＡＣｈＥに対して得られた蛍光強度である（Ｓｈｉｄｏｒｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉａｒｙｌｔｈｉａｚｏｌｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ａｇｅｎｔｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６）５９：５８２３−５８４６）。
【００６５】
ＴｈＴ溶液（１００μＭ）の調製：粒子不含溶液が達成されるまで１０ｍｌの超純水Ｈ２Ｏ中で０．３２ｍｇのＴｈＴを溶解させた。０．２２μｍ  ＰＥＳシリンジフィルターを使用して、溶液をろ過した。
【００６６】
Ａβ４０保存液の調製：ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、０．２ｍＬ）中でＡβ４０ペプチド（０．２５ｍｇ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ）を溶解させ、室温で１時間温置した。次に、窒素流によりＨＦＩＰを除去し、さらに真空下で乾燥させた。２７６ｎｍで１４５０ｃｍ−１Ｍ−１のモル吸光係数を使用して、ＵＶ−ｖｉｓ分光法（Ｂｉｏｔｅｋ  ＵＳＡ；プレートリーダー）によってＡβ４０ペプチドの濃度を決定した。次に、ｐＨ７．４で２００ｍＭの濃度になるように、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液中でＨＦＩＰ処理Ａβ４０を溶解させた。アッセイは三つ組みで、及び３回の独立した操作で行った。
【００６７】
ドネペジル、シラジット、３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）は、それぞれおよそ７９％、２１％、５０％及び３５％、アミロイドベータ（１０μＭ）凝集を阻害した。次に、Ａβ４０（１０μＭ）の凝集に対する様々な濃度の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（１０、３０及び５０μＭ）及び固定濃度の３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０μＭ）の効果を試験した。組み合わせ１０：５０（Ｂ：Ａ）はＡβ４０凝集に対して強力な効果を有する。１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度は、ＴｈＴ蛍光の低下を示し、これはＡβ４０凝集の７２％阻害に対応し、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれ２２％及び３８％高いが；標準薬物ドネペジルよりも７％低かった。一方で、３０：５０（Ｂ：Ａ）によりＡβ４０凝集の６０％が阻害され、これは、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれおよそ１０％及び２０％高かったが；ドネペジルよりも２０％低かった。さらに、ＤＢＰ’ｓの組み合わせへのシラジットの添加を試験した。シラジットの添加により、ＤＢＰ’ｓの組み合わせによるアミロイドベータ凝集のパーセンテージ阻害が減少した（図９Ａ）。
【００６８】
さらに、上記濃度比の試験化合物を固定濃度のＡβ４０（３０μＭ）とともに温置した。ドネペジル、シラジット、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）は、アミロイドベータ凝集をそれぞれおよそ６５％、１０％、４１％及び３２％阻害した。１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度は、ＴｈＴ蛍光低下においてより高い効果を示し、これはＡβ４０凝集の５８％阻害に対応し、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれ１７％及び２６％高かったが、標準ドネペジルよりも７％低かった。上記のように、シラジットの添加によりＤＢＰ’ｓによる阻害が減少した。（図９Ｂ）。
【００６９】
これらのデータから、固定比での試験化合物３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２ＤＢＰ（Ａ）の組み合わせがアミロイドベータ（１０μＭ、３０μＭ）凝集の阻害において相乗効果を示すことが明らかになった。
【００７０】
上記試験から、１０：５０μＭ（ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）濃度が、ＴｈＴ法によるアミロイドベータ凝集アッセイにおいてより高い相乗効果を示すことが示される。従って、ヒトコリンエステラーゼ酵素アッセイでのさらなる試験のためにこの組み合わせを使用した。
【００７１】
実施例６
別の実施形態では、この試験の目的は、Ｅｌｌｍａｎ（１９６１）法を使用することによる、組み換えヒトアセチルコリンエステラーゼに対する様々な組み合わせでのＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＡ及びＢ）及びシラジットとＤＢＰ’ｓとのインビトロ相乗効果を評価することである。
【００７２】
インビトロヒト組み換えＡＣｈＥ阻害アッセイ：ＡＣｈＥ阻害アッセイのために幾分改変した後にＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．により記載される手順を使用した。ヒト組み換えＡＣｈＥは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。アセチルチオコリンヨージド（ＡＴＣＩ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ−エルマン試薬）は、Ｈｉｍｅｄｉａ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）から購入した。陽性対照群としてドネペジルを使用した。インビトロアッセイを行うためにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を使用した。ＩＣ５０アッセイに対する濃度範囲を決定するために、５０ｍｇ／ｍｌでパーセンテージ阻害を決定した。試験化合物Ｂ（３−ＯＨ−ＤＢＰ）：試験化合物Ａ（３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ）に対して異なる組み合わせを調製した。
【００７３】
ＩＣ５０を決定するために、５０ｍｇ／ｍｌの固定濃度の試験化合物Ａ及びシラジットとともに様々な濃度の試験化合物Ｂ（１０、３０、５０ｍｇ／ｍｌ）（それぞれ表８及び９で示す）を使用した。５０μＬのヒト組み換えＡＣｈＥ（０．２２Ｕ  ｍＬ−１）及び１０μＬの試験化合物又は標準化合物を９６ウェルプレート中で室温にて３０分間温置した。
【００７４】
表８は、次のようなＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）の組み合わせ比を示す。
2022500347.tif 000010
【００７５】
表９は、次のようなシラジットとＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）との組み合わせ比を示す。
2022500347.tif 000011
【００７６】
さらに、基質、即ちＡＴＣＩ（１５ｍＭ、３０μＬ）を添加し、これをさらに３０分間温置した。最後に、１６０μＬ（１．５ｍＭ）のＤＴＮＢを添加し、Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して４１５ｎｍで吸収を記録した。試験及び標準化合物から得た吸収を使用して、ＩＣ５０値を計算した。三つ組み及び３回の独立した操作でアッセイを行った（式１参照）。
【００７７】
エルマン法によるインビトロＡＣｈＥ活性に対する様々な濃度のウロリチンＢ（１０、３０及び５０ｍｇ／ｍｌ）及び固定濃度のウロリチンＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）の効果を試験した（図１０及び表１０）。統計学的分析から、群間で有意差があったことが示された［Ｆ（９，２９）＝５４．９３  ｐ＜０．０５］。それぞれ３０：５０（Ｂ：Ａ）、５０：５０（Ｂ：Ａ）、５０：１０：５０（シラジット：ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）、５０：５０：５０（シラジット：ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）と比較した場合、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）；１０：５０（Ｂ：Ａ）の組み合わせのＩＣ５０値は統計学的に異なった。組み合わせ薬物１０：５０（Ｂ：Ａ）のＩＣ５０値はより低かった。さらに、１０：５０（Ｂ：Ａ）及び標準ドネペジルのＩＣ５０値間で有意差はなかった。
【００７８】
表１０は、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ及びそれらの組み合わせのアセチルコリンエステラーゼ阻害活性（ＩＣ５０）を示す。
2022500347.tif 000012
【００７９】
結論として、組み合わせ用量１０：５０（Ｂ：Ａ）は、３，８（ＯＨ）２ＤＢＰ（Ａ）よりもおよそ１０倍効果が高いＩＣ５０値を示し、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）よりも７倍効果が高く、一方で３０：５０（Ｂ：Ａ）は、３，８（ＯＨ）２ＤＢＰ（Ａ）及び３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）よりもそれぞれおよそ２倍及び１．５倍効果が高いことを示す。５０：５０（Ｂ：Ａ）及び３０：５０（Ｂ：Ａ）のＩＣ５０値はほぼ同じであった。ドネペジルの効果は１０：５０（Ｂ：Ａ）とほぼ同等であった。シラジットはＤＢＰｓ及びそれらの組み合わせと比較して、効果が低いＩＣ５０値を示した。これらのデータから、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８（ＯＨ）２ＤＢＰ（Ａ）の組み合わせが１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度でより高い相乗効果を示すことが明らかになった。従って、ヒト組み換えＡＣｈＥを使用することによるＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット法でのさらなる試験のために、この濃度を採用した。
【００８０】
実施例７
別の実施形態では、この試験の目的は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ−蛍光キット法を使用することにより、組み換えヒトアセチルコリンエステラーゼに対する様々な組み合わせのＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＡ及びＢ）及びシラジットとＤＢＰ’ｓとのインビトロ相乗効果を評価することである。ヒト組み換えＡＣｈＥはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から調達した。Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄキットはＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｉａ，Ｒｅｆ  ｎｏ：Ａ１２２１７から調達した。全ての他の化学物質及び試薬は地元の供給業者から市販され（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ及びＨｉＭｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）、分析グレードであった。
【００８１】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット法によるインビトロヒト組み換えＡＣｈＥ阻害アッセイ：Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用することによって、実験薬物の抗コリンエステラーゼ活性を測定した。市販のキット（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）からの各実験薬物の存在下でヒトＡＣｈＥ活性のスクリーンに対して蛍光アッセイを使用した。コリンオキシダーゼ（ＣＯ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び蛍光発生基質Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを含め、一連のキット酵素の添加により、ＡＣｈＥ触媒作用の産物であるアセチルコリンを、レゾルフィンと呼ばれる蛍光性物質に変換した。蛍光分子レゾルフィンはアセチルコリン産生に依存し、アセチルコリン産生はＡＣｈＥ触媒作用の産物であるので、蛍光の変化速度はＡＣｈＥ活性の目安である。ＡＣｈＥの強力な阻害剤は、阻害剤なしの対照と比較して蛍光を有意に減少させる。簡潔に述べると、全ての試薬は市販のキット（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い調製した。蛍光マルチウェルプレートスキャナーとの使用のために次の手順を設計する。１６０μＬの総液体体積／ウェルで９６−ウェルプレートにおいてアッセイを行った。実験条件下で９６ウェルを行い、４０μＬのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液（２００μＬのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬保管溶液、１００μＬのＨＲＰ保管溶液、１００μＬのコリンオキシダーゼ（ＣＯ）保管溶液を９．６ｍＬの１Ｘ反応緩衝液に添加することによる、２Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ、０．２Ｕ／ｍＬコリンオキシダーゼを含有する４００μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液）、５０ｍｇ／ｍｌでの固定濃度のウロリチンＡとともに、及び任意選択により５０ｍｇ／ｍｌのシラジットとともに、８０μＬのヒト組み換えＡＣｈＥ（０．２２Ｕ／ｍｌ）及び１．６μＬの様々な濃度のウロリチンＢ（１０、３０、５０ｍｇ／ｍｌ）を使用して、ＩＣ５０を決定した（それぞれ上記表８及び９で示されるとおり）。さらに、４０μＬの４０μＭ基質アセチルコリン溶液を各ウェルにピペットで添加した。
【００８２】
１００％ヒト組み換えＡＣｈＥ活性（０％ヒト−ＡＣｈＥ阻害）に相当する陽性対照ウェルは、アセチルコリン及びＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液を含有した。陰性対照ウェルはアセチルコリン及びＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  溶液を含有した。さらに、さらなる陰性対照としてＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液単独の対照を使用した。対照ウェルにおいて、必要な場合、１Ｘ反応緩衝液を添加して、ウェルを標準体積にした。ベースラインで（各ウェルに基質が添加された直後）、及び３７℃で６０分の温置後、蛍光測定を行った。５３０〜５６０ｎｍの範囲の励起及び５９０ｎｍで検出される発光を使用して、蛍光マイクロプレートリーダーを測定した。ＡＣｈＥ、ＣＯ及びＨＲＰのパーセント阻害を計算するために、平均陰性対照蛍光を実験群蛍光から差し引き、平均陽性対照蛍光により除した。パーセント活性を１００％から差し引き、ヒトＡＣｈＥのパーセント阻害を得た。
【００８３】
表１１は、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ及びそれらの組み合わせのヒト組み換えアセチルコリンエステラーゼ阻害活性（ＩＣ５０）を示す。
2022500347.tif 000013
【００８４】
上記表１１で示されるように、組み合わせ用量１０：５０（Ｂ：Ａ）は、３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもおよそ７倍効果が高いＩＣ５０値を示し、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）よりも６倍効果が高く；一方で３０：５０（Ｂ：Ａ）は、３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）及び３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）よりもそれぞれおよそ２倍及び１．５倍効果が高い。３０：５０（Ｂ：Ａ）及び５０：５０（Ｂ：Ａ）のＩＣ５０値はほぼ同じであった。ドネペジルの効果は１０：５０（Ｂ：Ａ）とほぼ同等であった。シラジットはＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせと比較して、効果がより低いＩＣ５０値を示した。これらのデータから、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）の組み合わせが１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度でより高い相乗効果を示すことが明らかになった。従って、ヒトＡＣｈＥ誘導性アミロイドベータ凝集でのさらなる試験のためにこの組み合わせを使用した。
【００８５】
実施例８
別の実施形態では、本発明の目的は、ＴｈＴ（チオフラビン−Ｔ）法を使用することにより、組み換えヒトアセチルコリンエステラーゼ誘導性β−アミロイド凝集に対する、様々な組み合わせでのシラジットとＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＡ及びＢ）とのインビトロ相乗効果を評価することである。化学試薬及び出発物質を上記のように使用した。
【００８６】
ヒト組み換えアセチルコリンエステラーゼ酵素誘導性β−アミロイドペプチド凝集アッセイの阻害
ヒト組み換えＡＣｈＥを使用したことを除き、それぞれ表６及び７で示される比での試験化合物の濃度により、実施例５の手順を反復した。
【００８７】
ドネペジル、シラジット、３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）は、それぞれおよそ７１％、１６％、４６％及び３４％、アミロイドベータ（１０μＭ）凝集を阻害した。次に、Ａβ４０（１０μＭ）の凝集に対する様々な濃度の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（１０、３０及び５０μＭ）及び固定濃度の３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０μＭ）の効果を試験した。１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度はＴｈＴ蛍光の低下を示し、これは、Ａβ４０凝集の６７％阻害に対応し、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれ２１％及び３３％高かったが；標準薬物ドネペジルよりも４％低かった。一方で、３０：５０（Ｂ：Ａ）によってＡβ４０凝集の５０％が阻害され、これは３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれおよそ４％及び１６％高かったが；標準薬物ドネペジルよりも２１％低かった。さらに、ＤＢＰ’ｓの組み合わせに対するシラジットの添加を試験した。シラジットの添加によって、組み合わせＤＢＰ’ｓによるアミロイドベータ凝集のパーセンテージ阻害が低下した（図１２Ａ）。
【００８８】
さらに、上記濃度比の試験化合物を固定濃度のＡβ４０（３０μＭ）とともに温置した。ドネペジル、シラジット、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）は、アミロイドベータ凝集をそれぞれおよそ６４％、４．２％、４３％及び３０％阻害した。１０：５０（Ｂ：Ａ）濃度は、ＴｈＴ蛍光低下においてより高い効果を示し、これは、Ａβ４０凝集の６０％阻害に対応し、これは３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりもそれぞれ１７％及び３０％高かったが；標準薬物ドネペジルよりも４％低かった。上記のように、シラジットの添加により、ＤＢＰ’ｓの阻害が低下した（図１２Ｂ）。
【００８９】
これらのデータから、アミロイドベータ（１０μＭ、３０μＭ）凝集の阻害において、固定比の試験化合物３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）の組み合わせのみが相乗効果を示すことが明らかになった。
【００９０】
上記試験から、ＴｈＴ法により、１０：５０μＭ（ウロリチンＢ：ウロリチンＡ）濃度がアミロイドベータ凝集アッセイにおいてより高い相乗効果を示すことが示される。従って、インビボでのスコポラミン誘導性健忘モデルを用いたさらなる試験のために、この組み合わせを使用した。
【００９１】
実施例９
スコポラミン誘導性健忘ラットモデルに対するＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせのインビボ相乗効果
スコポラミン臭化水素酸塩はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から調達し、ドネペジル塩酸塩は、Ｈｅｔｅｒｏ  Ｄｒｕｇｓ  Ｌｔｄ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａにより寄付された寄贈試料として得た。
【００９２】
実験動物管理の原則に従い実験を行った。Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｎａｒａｓ  Ｈｉｎｄｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＢＨＵ），Ｖａｒａｎａｓｉ，Ｉｎｄｉａから、雄Ｗｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ）を購入した。動物に対する実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ＢＨＵ，Ｖａｒａｎａｓｉ，Ｉｎｄｉａにより承認された。２５±１℃の温度及び４５〜５５％相対湿度及び１２：１２ｈ明／暗周期の制御環境条件下で動物をポリプロピレンケージに収容した。実験動物は、実験中、市販ラット飼料及び水を自由に摂取させた。それらを実験に使用する前に、少なくとも１週間にわたり動物を馴化させ、１回のみ実験に供した。
【００９３】
次のように、各群６匹を含有する（ｎ＝６）８個の実験群にラットを無作為に割り当てた：
群１：ビヒクル群：０．３％ＣＭＣを投与；
群２：スコポラミン群（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）；
群３：ドネペジル（３ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ）群；
群４：シラジット（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）群；
群５：３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ：Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）群；
群６：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ：Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）群＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）群；
群７  ３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ）；
群８：３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ）。
【００９４】
薬物溶液を０．３％ＣＭＣ中で新たに調製し、１日１回強制経口投与により７日間投与した。簡潔に述べると、実験全体を８日間にわたり行った。スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）、ムスカリン受容体アンタゴニストを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で溶解させ、第７日に、薬物投与１時間後に腹腔内投与した。
【００９５】
行動試験は実施例９Ａ及び９Ｂに従う。
【００９６】
実施例９Ａ
Ｙ迷路試験パラダイムによる短期記憶の評価。標準的プロトコールに従うことによって、基本的に空間認識記憶、一般的探索行動及び不安様行動を評価するために、Ｙ迷路試験を行った（Ｄｅｌｌｕ，Ｆ．，Ｍａｙｏ，Ｗ．，Ｃｈｅｒｋａｏｕｉ，Ｊ．，Ｌｅ  Ｍｏａｌ，Ｍ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｈ．，“Ａ  ｔｗｏ−ｔｒｉａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｔａｓｋ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ：ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  ａｇｅｄ  ｒａｔｓ，”Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９２）５８８：１３２−１３９）。Ｙ迷路装置は、中央の点から放射状に伸びる、互いに１２０°の角度をなす３本の同一アーム（５０ｃｍ長、１６ｃｍ幅及び３２ｃｍ高）からなる。色画用紙及び実験用ガラス製品から作製される視覚的刺激を迷路の周囲長の周囲及び黒色のプレキシガラス側部上端の上に置き、動物にとっての目新しさを維持するために、各試験に対してこれらの刺激を反復しなかった。Ｙ迷路の新規アームを遮断し、１５分間にわたり迷路の他の２本のアームをラットが訪れられるようにした。第１相から４時間後、３本全てのアームに５分間、動物を自由に接近させた。各アームでの進入数を５分間記録した。全アームでの総進入数（試行１及び２の５分間）、試行２の５分間の既知及び新規アームの％進入及び試行２中の全アーム及び装置中央での滞在時間に対する新規アーム滞在時間の比率のパーセンテージなどの従属変数を測定した。全アームにおける総進入数（試行１及び２の５分間）は一般的探索態度（好奇心）を示し、試行２の５分間の既知対新規アームの％進入は、アーム弁別の目安と考えられる（空間認識記憶）。試行２中の全アーム及び装置中央での滞在時間に対する新規アーム滞在時間のパーセンテージにより、新規環境への対処ストラテジー又は行動を推定した。新規環境への対処行動の低下は、不安様行動の増加とみなした。頭部及び２本の前肢がアームの内側に入った場合にアーム進入として数え、頭部及び２本の前肢が再びアームの外側に出たときにアーム滞在の持続時間を終了した。
【００９７】
Ｙ迷路試験における認知及び好奇心行動に対するＤＢＰ’ｓ（ウロリチンＡ及びＢ）及びそれらの組み合わせの効果：試行１及び試行２における一般的探索行動（好奇心）のスコポラミン（Ｓｃ）誘導性変化に対するウロリチンＢ：３−ＯＨ−ＤＢＰ（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、ウロリチンＡ：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、ドネペジル（３ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、シラジット（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及び組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）の効果をそれぞれ図１４Ａ及び１４Ｂで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定から、スコポラミン投与は、ビヒクル群ラットと比較した場合、好奇心行動の有意な減少を引き起こしたことが示唆される。しかし、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ用量により、試行１及び試行２における好奇心行動のスコポラミン誘導性減少が弱められた。注目すべきことに、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）により、標準ドネペジルと同様に、好奇心行動のスコポラミン誘導性減少が弱められた。さらに、組み合わせたＤＢＰ’では、試行１及び試行２において、ＤＢＰ’単独と比較した場合、好奇心行動が有意に増加した。しかし、シラジット２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ用量は、試行１及び試行２における好奇心行動のスコポラミン誘導性減少を効果的に弱めなかった。
【００９８】
Ｙ迷路での新規環境への対処行動に対するＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせの効果：図１４Ｃは、試行２中の装置の新規アーム滞在時間のパーセンテージの観点での、ラットにおける対処行動を示す。統計学的分析から、群間で有意差があったことが明らかになった［Ｆ（７，４７）＝２１．７３，ｐ＜０．０５］。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定により、ビヒクル群ラットと比較して、スコポラミン処置群の動物において対処行動の有意な減少があったことが示唆される。しかし、５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）により、新規環境に対する対処ストラテジーのスコポラミン誘導性減少が弱まったが、ビヒクル群と同じではなかった。注目すべきことに、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）により、対処ストラテジーにおいてスコポラミン誘導性減少が弱まり、ビヒクル及び標準ドネペジル群と同様であった。
【００９９】
Ｙ迷路試験での空間認識記憶に対するＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせの効果：空間認識記憶でのスコポラミン誘導性変化に対する実験薬物の相乗効果を図１４Ｄで示す。二元配置ＡＮＯＶＡから、Ｙ迷路試験パラダイムにおいて、群間で（［Ｆ（７，８０）＝０．０９８；Ｐ＜０．０５］）、既知及び新規アーム間で（［Ｆ（１，８０）＝１０７；Ｐ＜０．０５］、試行２中のアーム弁別行動において有意差があり、群及びアーム間で有意な交互作用があった（［Ｆ（７，８０）＝２４；Ｐ＜０．０５］ことが示された。事後分析から、スコポラミン誘導群は、ビヒクル群と比較して、既知アームと新規アームとで％アーム進入を弁別できなかったことが明らかになり、このことから空間認識記憶の障害が示された。５０ｍｇ／ｋｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）は、スコポラミン誘導性の弁別行動失敗を有意に逆転させたが、ビヒクル群と同様ではなかった。注目すべきことに、新規環境でのアーム進入のパーセンテージを増加させることにより、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は、空間認識記憶のスコポラミン誘導性機能障害を有意に軽減させた。興味深いことに、既知及び新規両方のアーム進入において、ビヒクル、ドネペジル及び組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）間で有意差はなかった。
【０１００】
実施例９Ｂ
受動的回避（ＰＡ）試験：ＰＡタスクは、ＣＮＳ障害のげっ歯類モデルにおいて学習及び記憶を評価するために使用される不安悪化試験である。この試験において、対象は、嫌悪刺激（フットショックなど）が以前に送達された環境を回避することを学習する。動物は、チャンバーの明暗区画を自由に探索し得、区画の片側で穏やかなフットショックが与えられる。最終的に動物は、暗チャンバーに進入しないことによってフットショックを回避することを学習する。簡潔に述べると、ステップスルー型受動的回避装置は、透明プラスチック製の明チャンバー（２０ｃｍｘ２０ｃｍｘ３０ｃｍ）及び壁が暗色の不透明プラスチック製であった暗チャンバー（２０ｃｍｘ２０ｃｍｘ３０ｃｍ）からなった。両チャンバーの床は、１ｃｍ離して置かれたステンレス鋼の棒（３ｍｍ直径）からなった。暗チャンバーの床は、ショック発生器を使用して通電させ得た。四角形の開口部（６ｃｍｘ８ｃｍ）が２つのチャンバー間にあり、不透明のギロチンドアにより閉じ得た。第７日のスコポラミン又はビヒクル投与の３０分後、明区画に置くことによってラットをＰＡ試験に供した。３０秒の馴化期間後、ギロチンドアを開き、ラットが暗区画に進入した後自動的に閉じた。暗区画で対象に低強度のフットショック（０．５ｍＡ；１０ｓ）を与えた。一方の区画から別の区画への動物の移動を記録し、移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）（ＴＬＴ）を秒単位で計算した。試行の持続時間は２７０秒であった。１回目の試行は獲得のためであり、第１の試行の２４時間後に与えられた第２の試行で保持を試験した。再獲得を回避するために、保持試行においてショックを送達しなかった。学習に対する基準は、獲得試行と比較した場合の、保持試行に対するＴＬＴの増加とみなした。
【０１０１】
受動的回避タスクのＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせの効果
薬物治療計画の第７日の受動的回避タスクにおける保持及び想起でのスコポラミン誘導性変化に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）の効果を図１５で示す。二元配置ＡＮＯＶＡによる統計学的分析から、時間［Ｆ（１，８０）＝４４３，ｐ＜０．０５］及び群と時間との間の交互作用（［Ｆ（７，８０）＝１８．８；Ｐ＜０．０５］とともに、処置群間での移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）［Ｆ（７，８０）＝１３，ｐ＜０．０５］に有意差があったことが明らかになった。事後分析から、８個の群間で獲得試行（ＴＬａ）中、移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）に有意差はなかったことが明らかになった。しかし、保持試行において、ビヒクル群と比較して、スコポラミン処置群で移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）（ＴＬｒ）の有意な短縮が観察され、これにより学習及び記憶の障害が示される。獲得試行の３０分前のスコポラミン投与は、獲得試行と比較したときに保持試行でのＴＬＴの有意な延長がないことにより示されるように、記憶障害を引き起こした。７日間の５０ｍｇ／ｋｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）での処置は、獲得試行と比較して保持試行でのＴＬＴを有意に延長させた（しかし、ビヒクル処置群と比較すると効果はより低い）ことから明らかになるように、ラットにおいてスコポラミン誘導性認知症を防いだ。注目すべきこととして、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は、獲得試行と比較した場合に、保持試行でのＴＬＴが延長していた（ビヒクル群と同等）ことにより、学習及び記憶のスコポラミン誘導性障害を有意に軽減した。さらに、Ｂ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）、３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）及び標準ドネペジルと比較した場合、保持試行で移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を有意に延長させ、従って相乗効果が示された。さらに、２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄの用量のシラジットは、獲得試行と比較した場合の保持試行のＴＬＴの有意な延長がなかったことにより示されるように、記憶障害を引き起こしたが、スコポラミン処置群と比較した場合、保持試行のＴＬＴが有意に延長した。
【０１０２】
アセチルコリン作動系の評価は実施例９Ｃ及び９Ｄのとおり行う。
【０１０３】
実施例９Ｃ
試料調製：断頭術により動物を屠殺し、氷冷条件で脳組織を切除し、使用するまで−８０℃で保管した。Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーにより１．０ｍｌの０．１Ｍ過塩素酸中で組織をホモジナイズ処理した。ホモジネートをポリプロピレンチューブ中で１５分間維持し、その後、４０μＬの４Ｍ酢酸カリウムを添加してｐＨを４．０に調整し、その後、４０００ｘｇで１５分間遠心分離した。アセチルコリン及びＡＣｈＥ活性を推定するために上清を使用した。
【０１０４】
アセチルコリンエステラーゼ活性の分光蛍光分析アッセイ：Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して、脳組織におけるアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。各実験でアセチルコリンエステラーゼ標準曲線を使用した。簡潔に述べると、０．１ｍｌの対照（１０μＭ  Ｈ２Ｏ２）を添加することによって反応を開始させ、２つの個別のポリプロピレンチューブに組織ホモジネートを取り、次に２Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ、０．２Ｕ／ｍＬコリンオキシダーゼ及び１００μＭアセチルコリンを含有する４００μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬の０．１ｍｌ作業溶液を各チューブに添加した。４５分間の温置後、分光蛍光光度計を用いて５３０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光波長で蛍光を記録した。タンパク質含量は、標準プロトコール（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．，Ｒａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｉｎ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）１９３：２６５−２７５）を使用して決定した。
【０１０５】
統計学的分析：結果は平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）として表した。一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定によって群間変動を測定した。群及びアームを２つの独立変数とみなして、Ｙ迷路試験において群間変動を探索するために二元配置とそれに続くボンフェローニ検定を使用した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ５（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって統計学的分析を行った。ｐ＜０．０５のレベルを統計学的有意性として認めた。
【０１０６】
ウロリチンＢの効果：ＨＩＰホモジネート中でのアセチルコリンエステラーゼ活性のスコポラミン誘導性変化に対する３−ＯＨ−ＤＢＰ（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、ウロリチンＡ：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、ドネペジル（３ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）、シラジット（２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ  ｐ．ｏ）及びＤＢＰ’ｓの組み合わせの効果を試験した（図１６参照）。一元配置ＡＮＯＶＡから、脳領域間でアセチルコリンエステラーゼ活性に有意差があったことが明らかになった（［Ｆ（７，２３）＝２５．７６，ｐ＞０．０５］。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定から、ビヒクル群と比較して、スコポラミン投与によってアセチルコリンエステラーゼ活性の有意な上昇が引き起こされたことが示唆される。しかし５０ｍｇ／ｋｇ用量の３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）は、脳領域間でアセチルコリンエステラーゼ活性のスコポラミン誘導性上昇を弱めたが、ビヒクル群とは統計学的に有意であった。参照標準物質としてドネペジルを使用したが、これはアセチルコリンエステラーゼ活性のスコポラミン誘導性上昇を有意に逆転させ、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇ群と同様であった。３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）−５０ｍｇ／ｋｇ群は３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇよりも効果が低かった。しかし、アセチルコリンエステラーゼ活性のスコポラミン誘導性上昇は組み合わせたＤＢＰ’ｓによって逆転され、ビヒクル群と同様であった。興味深いことに、Ｂ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）はドネペジルよりも効果が高いことが分かった。Ｂ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）もスコポラミン誘導性のアセチルコリンエステラーゼ活性上昇を逆転させたが、ドネペジルと比較した場合、統計学的に有意ではなかった。さらに、２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ用量のシラジットは、ＨＩＰ組織においてスコポラミン誘導性アセチルコリンエステラーゼ活性上昇を効果的に弱めなかった。
【０１０７】
実施例９Ｄ
実施例９Ｃのように試料を調製した。Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して、脳組織におけるアセチルコリンの量を測定した。アセチルコリン標準曲線を各実験において使用した。簡潔に述べると、０．１ｍｌの対照（１０μＭ  Ｈ２Ｏ２）を添加することによって反応を開始させ、２本の個別のポリプロピレンチューブに組織ホモジネートを採取し、次いで、２Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ、０．２Ｕ／ｍＬコリンオキシダーゼ及び１Ｕ／ｍＬアセチルコリンエステラーゼを含有する４００μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬の０．１ｍｌ作業溶液を各チューブに添加した。４５分間の温置後、５３０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光波長で分光蛍光光度計を使用して蛍光を記録した。標準プロトコール（Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９５１）を使用してタンパク質含量を決定した。
【０１０８】
統計学的分析：結果は平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）として表した。一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定によって群間変動を測定した。群及びアームを２つの独立変数とみなして、Ｙ迷路試験において群間変動を探索するために二元配置とそれに続くボンフェローニ検定を使用した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ５（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって統計学的分析を行った。ｐ＜０．０５のレベルを統計学的有意性として受け入れた。
【０１０９】
海馬アセチルコリン（ＡＣｈ）レベルに対するＤＢＰ’ｓ及びそれらの組み合わせの効果を測定した。
【０１１０】
一元配置ＡＮＯＶＡから、脳領域間でＡＣｈレベルに有意差があったことが明らかになった（［Ｆ（７，２３）＝２５．７６，ｐ＞０．０５］。Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定から、ビヒクル群ラットと比較した場合、スコポラミン投与がＡＣｈレベルの有意な低下を引き起こしたことが示唆される（図１７参照）。しかし、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）用量は、脳領域間でＡＣｈレベルのスコポラミン誘導性低下を弱めたが、ビヒクル群と統計学的に有意であった。ドネペジルに基づくＡＣｈレベルは３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）群と同じであった。ドネペジル処置と３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）５０ｍｇ／ｋｇ群との間で有意差が観察された。しかし、ＡＣｈレベルのスコポラミン誘導性低下は組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）によって有意に逆転し、これはドネペジル及びビヒクル群と同様であった。さらに、シラジット５０ｍｇ／ｋｇ用量は、ＨＩＰ組織においてＡＣｈレベルのスコポラミン誘導性低下を効果的に弱めなかった。
【０１１１】
以前の試験から、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ）が脳機能不全及び学習及び記憶障害を引き起こすことが示されている（Ｏｈｊａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。本明細書中で、スコポラミンは、両者ともそれぞれ学習及び記憶の空間的及び保持及び想起態様を含むと考えられるＹ迷路タスク及び受動的回避タスクで記憶障害を引き起こしたことが観察された。
【０１１２】
結果の顕著な知見から、課題を解決するための、一般的探索態度（好奇心）、新規環境に対する対処行動（不安様行動）及び試行２での既知対新規アームの％進入（空間認識記憶）のような、Ｙ迷路パラダイムでの行動指標に対する数的変化の変更をスコポラミンが引き起こしたことが示された（Ｊｏｓｈｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｉｍａｌｓ，”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ（２０１４）Ｄｅｃ；１１６：１１７−３１３；及びＴｒｉｐａｔｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。これらの結果から、スコポラミンが好奇心行動を減少させたことが示されるが、これは短期記憶の障害を示す。３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）は、試行１及び試行２における好奇心行動のスコポラミン誘導性減少を弱めた。注目すべきこととして、ＤＢＰ’ｓの組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）は、試行１及び試行２において好奇心行動のスコポラミン誘導性減少を軽減させ、ドネペジルと同様であった。さらに、シラジット５０ｍｇ／ｋｇは、好奇心行動を変化させたが、ＤＢＰ’ｓの組み合わせほど顕著ではなかった。
【０１１３】
さらに、スコポラミンは、Ｙ迷路タスクにおいて新規環境への対処ストラテジーを低下させ、受動的回避試験において保持試行中の移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を短縮させた。これらの結果から、スコポラミンが不安様行動（Ｙ迷路タスク）の増加を引き起こし、受動的回避タスクにおいて学習するための保持及び想起能力又は性能が損なわれたことが明らかになった。
【０１１４】
シラジットは、対処行動及び移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を変化させたが、ドネペジルほど効果が高くなかった。３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ）は、スコポラミン誘導性の対処行動減少及び移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）短縮（保持試行）をシラジットよりも有意に良好に逆転させた。しかし、最も注目すべきこととして、組み合わせＤＢＰ’ｓは、シラジット及び個々のＤＢＰ’ｓと比較して、スコポラミン誘導性の対処行動減少及び移動待ち時間（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）短縮を有意に軽減した。この試験中に気付いたもう１つのイントラスティングな（ｉｎｔｒｕｓｔｉｎｇ）事実は、疼痛閾値又は不安によって受動的回避反応が影響を受け得ることであった。さらに，中隔野の病変は、不安状態における障害を引き起こし、防御及び攻撃を増加させることも分かった。これらの知見は、受動的回避応答におけるスコポラミン誘導性障害が疼痛閾値又は不安の変化によるものであった可能性を指摘する。
【０１１５】
さらに、スコポラミンがＹ迷路タスクにおいて空間認識記憶の低下を誘発したことが分かった。これらの知見から、スコポラミンが試行２でのアーム弁別力を低下させ、これにより短期記憶の障害が示されることが明らかになった。３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）は、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、スコポラミン誘導性の空間認識記憶低下を逆転させた。そして、最も注目すべきこととして、組み合わせＤＢＰ’ｓは、新規環境でのアーム進入のパーセンテージを向上させることによって、空間認識記憶におけるスコポラミン誘導性障害を有意に軽減させた。
【０１１６】
組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）が、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ）と比較した場合に、空間認識記憶を有意に向上させることにより相乗効果を実証したことは注目に値する。
【０１１７】
アセチルコリンは、認知機能の制御に関与する最も重要な神経伝達物質と広く考えられている。これは、認知障害に関連する疾患、例えばその早期ステージのアルツハイマー病、の対症療法のためにＡＣｈＥ阻害剤を使用する大きな理由である。中枢コリン作動系を記憶とつなげる数々の証拠がある。認知機能不全は、コリン作動性機能障害及び記憶改善を伴う中枢コリン作動活性の逆促進と関連していることが示されている。アセチルコリンエステラーゼ活性の向上の結果また一般に、学習及び新しい記憶を形成する能力も低下する（Ｍｅｅｎａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｈｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，”Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（２０１１）５０３（１）：６−９）。従って、処置を受けたラットの海馬においてこれらの酵素の活性を評価した。この試験で、スコポラミンは、ＡＣｈ濃度と逆相関する、海馬でのＡＣｈＥ活性を向上させた。３−ＯＨ−ＤＢＰ（ウロリチンＢ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（ウロリチンＡ）は、アセチルコリンエステラーゼ活性のスコポラミン誘導性上昇とその結果起こるＡＣｈレベル低下を弱めた。最も注目すべきこととして、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｗｔ／ｗｔ）は、Ｂ又はＡの何れか個別の場合よりもはるかに顕著にスコポラミン誘導性のアセチルコリンエステラーゼ活性上昇及びＡＣｈレベル低下を軽減させる。さらに、シラジット、個々のＤＢＰ’ｓはドネペジルと等効力のものとして評価された。
【０１１８】
まとめ：３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、インビトロでの相乗的アセチルコリンエステラーゼ活性を示した。ヒトアセチルコリンエステラーゼ酵素を用いて同じ効果が観察され、従って観察される活性の臨床的可能性が強調される。
【０１１９】
３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、β−アミロイド凝集の阻害においてインビトロで相乗活性を示した。
【０１２０】
動物でのスコポラミンの投与によって短期学習及び記憶の障害が生じ、これはＡＤにおけるコリン作動性機能不全の特徴であるとみなされる。従って、スコポラミン誘導性健忘モデルは、潜在的な認知促進剤のスクリーニングに有用な認識障害の薬理学的モデルとして広く容認されている。
【０１２１】
３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、ラットでのスコポラミン誘導性健忘モデルにおいていくつかのパラメーターのインビボ減弱を示した。
【０１２２】
全アームにおける総進入数（試行１及び２）は、一般的探索姿勢（好奇心）を示し、これはスコポラミンにより減少した。この効果は３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせにより弱まった。これにより、この組み合わせが、新規環境でのアーム進入のパーセンテージを上昇させることにより、空間認識記憶においてスコポラミン誘導性障害を有意に軽減させたことが示される。試行２の５分間の既知対新規アームの％進入はアーム弁別の目安とみなす（空間認識記憶）。スコポラミンによる空間記憶の低下があり、これは、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせにより逆転した。
【０１２３】
試行２中の全アーム及びこの装置中央での滞在時間に対する新規アーム滞在時間のパーセンテージから、新規環境での対処ストラテジー又は行動を推定した。新規環境での対処行動の減少は不安様行動の増加とみなした。従って、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、対処行動増加により抗不安活性を示した。
【０１２４】
従って、上記の実施例において、スコポラミン（Ｓｃ）注射を受けたラットにおいて、組み合わせＢ：Ａ（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）及びＢ：Ａ（５０：５０ｗｔ／ｗｔ）は、短期記憶、空間記憶障害、学習及び想起能力障害を回復させるための相乗効果を示した。
【０１２５】
Ｂ：Ａのより低い組み合わせ用量（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）での活性は、ドネペジルと比較した場合、ほぼ同程度の効果を示した。
【０１２６】
機構的に、一般にアセチルコリンレベル低下の結果、学習し、新しい記憶を形成する能力が低下する。脳におけるアセチルコリン濃度は、ＡＣｈＥ活性によりダイナミックに調節される。ＡＣｈＥは、アセチルコリンを酢酸及びコリンへと加水分解し、結果的にＡＣｈＥ阻害剤は、アセチルコリンシナプスの作用を延長させ、コリン作動性神経伝達を促進する。
【０１２７】
従って、しかし何らかの理論により縛られるものではないが、これらの酵素のＡＣｈＥ活性を海馬において評価した。スコポラミンは、海馬においてＡＣｈＥ活性を上昇させ、ＡＣｈ濃度を低下させた。
【０１２８】
従って、上記実施例で示されるように、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）及び３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）：３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）（５０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、スコポラミン注射を受けたラットにおいて、ＡＣｈＥ活性を低下させ、ＡＣｈレベルを上昇させた。
【０１２９】
Ｂ：Ａの組み合わせ用量が低いほど（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）、大きな相乗効果を示し、これはドネペジルと同程度に効果的であった。
【０１３０】
これらの結果から、スコポラミン誘導性健忘ラットモデルにおける実験薬物の相乗効果は、専ら、アセチルコリン濃度の上昇と逆相関するＡＣｈＥの直接的阻害からの結果であり得ることが示唆される。
【０１３１】
Ｂ：Ａ（１０：５０ｗｔ／ｗｔ）の組み合わせは、他の比よりも良好な相乗的活性を示した。薬理学的効果は、個別のシラジット、３−ＯＨ−ＤＢＰ（Ｂ）及び３，８−（ＯＨ）２−ＤＢＰ（Ａ）よりも強力であった。殆どの例において、組み合わせはドネペジルと等効力であった。
【０１３２】
本発明の栄養補助組成物は、栄養補助的に許容可能な担体と組み合わせて投与され得る。このような処方物中の活性成分は、１重量％〜９９重量％又は或いは０．１重量％〜９９．９重量％を構成し得る。「栄養補助的に許容可能な担体」は、処方物の他の成分と適合性があり、使用者にとって有害ではない何らかの担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。一実施形態によれば、適切な栄養補助的に許容可能な担体としては、エタノール、水性エタノール混合液、水、果実及び／又は野菜汁及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与され得る。このような処方物中の活性成分は、１重量％〜９９重量％又は或いは０．１重量％〜９９．９重量％を構成し得る。「薬学的に許容可能な担体」は、処方物の他の成分と適合性があり、使用者にとって有害ではない何らかの担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。
【０１３４】
送達系
適切な剤型としては、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、ガム及び菓子が挙げられる。舌下送達系としては、舌下及び舌上で溶けるタブ、液体ドロップ及び飲料が挙げられるが限定されない。可食フィルム、親水性ポリマー、経口可溶性フィルム又は経口可溶性ストリップを使用し得る。他の有用な送達系は、経口又は鼻腔スプレー又は吸入剤などを含む。
【０１３５】
経口投与の場合、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒剤又は他の適切な剤型の調製のための１つ以上の固形不活性成分と、シラジット、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ又はそれらの組み合わせをさらに組み合わせ得る。例えば活性剤を充填剤、結合剤、保水剤、崩壊剤、溶解抑制剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤又は潤滑剤などの少なくとも１つの賦形剤と組み合わせ得る。他の有用な賦形剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、マンニトール、キシリトール、甘味料、デンプン、カルボキシメチルセルロース、結結晶セルロース、シリカ、ゼラチン、二酸化ケイ素などが挙げられる。
【０１３６】
従って、本発明の構成成分は、従来のアジュバント、担体又は希釈剤と一緒に、医薬組成物及びその単位投与量の形態に入れられ得る。このような形態としては、固形及び特に錠剤、充填カプセル、粉末及びペレット形態及び液体、特に水性又は非水性溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル及びそれらを充填したカプセル、経口使用のための全て、直腸投与のための坐薬及び非経口使用のための滅菌注射溶液が挙げられる。このような医薬組成物及びその単位剤型は、多くが、さらなる活性化合物若しくは原理あり又はなしで、従来の割合で従来の成分を含み得、このような単位剤型は、使用されるべき目的とする１日投与量範囲と釣り合った活性成分の何らかの適切な有効量を含有し得る。
【０１３７】
本発明の構成成分は、多岐にわたる経口及び非経口剤型で投与され得る。次の剤型が、活性構成成分として本発明の化合物又は本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩の何れかを含み得ることは当業者にとって明白である。
【０１３８】
本発明の化合物から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容可能な担体は、固体又は液体の何れかであり得る。固体形態の調製物としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐薬及び分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤又は封入物質としても作用し得る１つ以上の物質であり得る。
【０１３９】
粉末において、担体は微粉化固体であり、微粉化活性構成成分との混合物中にある。錠剤において、適切な割合で必要な結合能を有する担体と活性構成成分を混合し、所望の形状及びサイズで圧縮する。
【０１４０】
粉末及び錠剤は、好ましくは５又は１０〜約７０パーセントの活性化合物を含有する。適切な担体は、炭酸マグネシウム、マグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔａｔｅ）、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどである。「製剤」という用語は、担体あり又はなしで活性構成成分が担体により取り囲まれる、従ってそれと会合している、カプセルを提供する担体としての封入物質との活性化合物の処方物を含むものとする。同様にカシェ剤及び薬用キャンディーが含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸剤、カシェ剤及び薬用キャンディーが含まれる。経口投与に適切な固体形態として錠剤、粉末、カプセル、丸剤、カシェ剤及び薬用キャンディーが使用され得る。
【０１４１】
液体調製物としては、溶液、懸濁液及びエマルジョン、例えば水又は水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。例えば、非経口注射液体調製物は、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として処方され得る。従って、本発明による化合物は、アンプル、プレフィルドシリンジ、小体積点滴において単位用量で、又は保存剤が添加された複数回投与容器において、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射又は連続点滴による）のために処方され得、与えられ得る。本組成物は、油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとしてこのような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有し得る。或いは、活性成分は、使用前の適切なビヒクル、例えば滅菌、発熱物質不含水を用いた構成のための、滅菌固体の無菌的単離によるか、又は溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態であり得る。
【０１４２】
活性構成成分を水中で溶解させ、必要に応じて適切な着色剤、香味剤、安定化剤及び増粘剤を添加することにより、経口使用に適切な水性溶液が調製され得る。経口使用に適切な水性懸濁液は、天然若しくは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又は他の周知の懸濁剤などの粘性物質とともに水中で微粉化活性構成成分を分散することにより作製され得る。
【０１４３】
口中での局所投与に適切な組成物としては、風味付き基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性剤を含む薬用キャンディー；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ；及び適切な液体担体中に活性成分を含む洗口剤が挙げられる。
【０１４４】
溶液又は懸濁液は、従来の手段により、例えばドロッパー、ピペット又はスプレーで、鼻腔に直接適用される。本組成物は、単回又は複数回投与形態で提供され得る。鼻腔内組成物を含む、気道への投与を目的とする組成物において、本化合物は一般に粒径が小さく、例えば５ミクロン以下の桁である。このような粒径は、当技術分野で公知の手段により、例えば微粒子化により得られ得る。
【０１４５】
本医薬品は好ましくは単位剤型である。このような形態において、適切な量の活性構成成分を含有する単位用量に調製物が細分される。単位剤型は、パッケージ化調製物、調製物の分離量を含有するパッケージ、例えばパッケージ化錠剤、カプセル及びバイアル若しくはアンプル中の粉末であり得る。また、単位剤型は、カプセル、錠剤、カシェ剤又は薬用キャンディーそれ自身であり得るか又はパッケージ化形態での適切な数のこれらの何れかであり得る。
【０１４６】
経口投与のための錠剤、カプセル及び薬用キャンディー及び経口使用のための液体は好ましい組成物である。鼻腔へ又は気道への適用のための溶液又は懸濁液は好ましい組成物である。表皮への局所投与用の経皮パッチは好ましい。
【０１４７】
処方物及び投与に対する技術におけるさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版で見られ得る。
【０１４８】
経口投与用の固体栄養組成物は、任意選択により、上で列挙される栄養組成物成分又は化合物に加えて、担体物質、例えばコーンスターチ、ゼラチン、アカシア、微結晶セルロース、カオリン、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸など；微結晶セルロース、アルギン酸などを含む崩壊剤；アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロースなどを含む結合剤；及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン溶液、タルク、ワックス、油、コロイド状シリカなどの滑沢剤を含有し得る。このような賦形剤の有用性は当技術分野で周知である。
【０１４９】
好ましい一実施形態では、栄養組成物は液体形態であり得る。この実施形態によれば、液体組成物を作製する方法が提供される。
【０１５０】
経口投与のための液体栄養組成物は、炎症、風邪及び／又はインフルエンザを予防及び／又は処置するための方法に関連して、水又は他の水性ビヒクル中で調製され得る。上で列挙される成分又は化合物に加えて、液体栄養組成物は、懸濁剤、例えば、メチルセルロース、アルギナート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラゲナン、アカシア、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどを含み得る。液体栄養組成物は、上で列挙される成分又は化合物と一緒に、湿潤剤、甘味料及び着色及び香味剤を含むか又は含有する、溶液、エマルジョン、シロップ、ゲル又はエリキシル剤の形態であり得る。従来法によって様々な液体及び粉末栄養組成物を調製し得る。様々なレディ・トゥ・ドリンク処方物（ＲＴＤ’ｓ）が企図される。
【０１５１】
投与経路
本組成物は、経口、舌下、頬側、眼、肺、直腸及び非経口投与を含むが限定されない何らかの適切な経路により、又は経口若しくは点鼻薬（例えば噴霧蒸気、液滴又は固体粒子の吸入）として投与され得る。非経口投与としては、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、膀胱内（例えば膀胱へ）、皮内、経皮、局所又は皮下投与が挙げられる。本発明の範囲内で、制御処方物での患者の身体における医薬組成物の滴下も企図され、遅れて薬物の全身又は局所放出が起こる。例えば、循環への制御放出のために又は局所部位への放出のために薬物をデポーで局在させ得る。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、気管支、鼻、肺、局所（頬側及び舌下を含む）、経皮、膣又は非経口（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、脳内、眼内注射又は点滴を含む）投与に適切であるもの、又は粉末及び液体エアロゾル投与を含む吸入若しくは吹送法による、又は持続放出系による投与に適切な形態であるものであり得る。持続放出系の適切な例としては、本発明の化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性のマトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態であり得る。
【０１５３】
ここで主張される発明を記載する文脈における「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という語及び同様の参照物の使用（特に特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書中で別段示されない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の引用は、本明細書中で別段示されない限り、単に範囲内に入る各個別値を個別に言及する省略方法となるものとし、各個別値は、本明細書中で個別に引用されるかのように、本明細書に組み込まれる。「約」という用語の使用は、述べられる値のおよそ±１０％の範囲で上回るか又は下回るかの何れかである値を記載するものとし；他の実施形態では、この値は、述べられる値のおよそ±５％の範囲で上回るか又は下回るかの何れかである値の範囲であり得；他の実施形態では、この値は、述べられる値のおよそ±２％の範囲で上回るか又は下回るかの何れかである値の範囲であり得；他の実施形態では、値は、述べられる値のおよそ±１％の範囲で上回るか又は下回るかの何れかである値の範囲であり得る。前述の範囲は、文脈により明らかにされるものであり、さらなる制限は暗示されない。本明細書中に記載の全ての方法は、本明細書中で別段示されない限り、又は文脈により別段明らかに矛盾しない限り、あらゆる適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供されるありとあらゆる例又は代表的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に対する制限を提供しない。本明細書中の言語の中で、本発明の実施に必須のものとして何らかの非主張要素を示すものとして解釈されるべきものはない。
【０１５４】
前述の明細書中である一定のその実施形態に関して本発明を記載し、多くの詳細を例示の目的で提案してきたが、本発明がさらなる実施形態を受け入れる余地があること、及び本明細書中に記載のある詳細のある種のものが、本発明の基本的原理から逸脱することなく大幅に改変され得ることは当業者にとって明らかとなろう。
【０１５５】
本明細書中で引用される全ての参考文献はそれらの全体において参照により組み込まれる。本発明は、その精神又は基本的な特質から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化され得、従って、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年10月8日(2021.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロリチンＡ及びウロリチンＢを含む組成物において、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１〜約０．６：１であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１であることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の医薬又は栄養補助組成物において、薬学的又は栄養補助的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする医薬又は栄養補助組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、治療的有効投与量が約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、治療的有効投与量が約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
ヒト対象における認知症関連障害を処置又は予防するための方法における使用のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の医薬組成物において、前記認知症関連障害がアルツハイマー病であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬組成物において、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の医薬組成物において、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．０６μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
ヒト対象において不安障害を処置又は予防するための方法での使用のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物において、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇの１日用量で投与されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の医薬組成物において、アセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約０．０５μｇ／ｍｌ〜約０．０６μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
個体における認知障害の処置又は予防に用いるための組成物において、当該組成物がウロリチンＡ及びウロリチンＢの治療的有効量を含み、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比が約０．２：１〜約０．６：１であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物において、前記認知障害が、認知症関連障害、ストレス誘発性認知症、不安症、うつ及びアルツハイマー病からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組成物において、前記組成物が、約０．２：１〜の、ウロリチンＢとウロリチンＡとのｗｔ．／ｗｔ．比を有し、ヒトアセチルコリンエステラーゼ活性の阻害に対して約４０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌの阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物において、ヒトアセチルコリンエステラーゼの前記阻害が、個別にウロリチンＡ又はウロリチンＢにより示される阻害よりも少なくとも５倍高いことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物において、前記治療的有効量が、ヒトにおいて約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの１日用量であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物において、前記治療的有効量が、ヒトにおいて約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇ／ｋｇの１日用量であることを特徴とする組成物。
【国際調査報告】
2022500347.tif 000036