(57)【要約】本発明は、低密度標的抗原に結合し、Ｆａｂ抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。また、本発明は、かかるＣＡＲを発現する細胞および疾患の処置におけるその使用に関する。本発明は、低密度標的抗原を標的にするＣＡＲ−Ｔ細胞について、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲを使用するとＣＡＲ媒介シグナル伝達がより効率的になることを見出したという知見に基づく。上記Ｆａｂ抗原結合ドメインは、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低密度標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記標的抗原が、標的細胞あたり１５００コピー未満の平均密度で発現される、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記標的抗原が、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、およびＢＣＭＡから選択される、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記標的抗原がＢＣＭＡである、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＳＤＹＮ（配列番号７９）
ＣＤＲ２−ＩＩＹＤＧＳＳＴ（配列番号８０）
ＣＤＲ３−ＡＴＲＰＧＰＦＡＹ（配列番号８１）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号８２）
ＣＤＲ２−ＬＶＳ（配列番号８３）
ＣＤＲ３−ＶＨＧＴＨＡＷＴ（配列番号８４）
を含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、配列番号２９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号３０として示した配列を有するＶＬドメインを含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原がＢＣＭＡである、請求項７に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含む、請求項７または８に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を用いて切断可能である、請求項９に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記請求項のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項１２】
核酸構築物であって、請求項１〜６のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ；
ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ；または
ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
【請求項１３】
核酸構築物であって、請求項７〜１０のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
【請求項１４】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体もコードする、請求項１２または１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記第２のキメラ抗原受容体が、以下の抗原：ＣＤ１９、ＦｃＲＬ５、およびＴＡＣＩのうちの１つに結合する、請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
請求項９に記載の核酸配列または請求項１２〜１５のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれかに記載の第１のＣＡＲ、および請求項１４または１５に定義の第２のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【請求項１９】
構成性に活性なサイトカイン受容体も発現する請求項１７または１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１１に記載の核酸配列；請求項１２〜１５のいずれかに記載の核酸構築物；または請求項１６に記載のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
【請求項２３】
前記がんが多発性骨髄腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がんの処置で使用するための請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
がんを処置するための医薬組成物の製造における請求項１７〜１９のいずれかに記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）などの低密度標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性疾患である。異常な形質細胞の集合体が骨髄内に蓄積し、骨髄においてこれらの集合体が正常な血球の産生を妨害する。骨髄腫は、米国において２番目によくみられる（非ホジキンリンパ腫に次ぐ）血液学的悪性疾患であり、血液学的悪性疾患のうちの１３％および全ての癌のうちの１％を構成する。この疾患は、病的骨折を引き起こすことによる医療保険支出、感染に対する感受性、腎不全、その後の骨髄不全を経て死に至ることを考慮すると負荷の大きな疾患である。
【０００３】
多くのリンパ腫と異なり、骨髄腫は、現在のところ不治の病である。リンパ腫で使用される標準的な化学療法剤は、骨髄腫にはほとんど効果がない。さらに、形質細胞においてＣＤ２０発現が喪失するので、この疾患に対してリツキシマブを使用できない。ボルテザミブおよびレノリドミドなどの新規の薬剤は部分的には有効であるが、寛解を持続させることはできない。
【０００４】
したがって、有効性が高く、長期間の効果が改善された骨髄腫処置のための代替薬が必要である。
【０００５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、その通常の形態では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能とつなぎ合わせたタンパク質である。その通常の形態は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインと全てが接続された膜貫通ドメインを有するタイプＩ膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００６】
これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するためにモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を使用する。ｓｃＦｖは、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合している。かかる分子により、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞を活性化させる。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現するとき、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのＣＡＲが開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた養子移入アプローチは、種々の癌処置について現在臨床試験中である。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（８）２０４８−６０）は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対するｓｃＦｖを組み込んだＣＡＲを記載している。
【０００７】
ＢＣＭＡは、成熟リンパ球（すなわち、記憶Ｂ細胞、形質芽球、および骨髄形質細胞）で優先的に発現する膜貫通タンパク質である。また、ＢＣＭＡは多発性骨髄腫細胞上に発現される。
【０００８】
Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞が骨髄腫患者のプラズマ細胞腫由来の骨髄腫細胞を特異的に死滅させることができることを実証している。
【０００９】
抗ＢＣＭＡ抗体を使用したＣＡＲアプローチは有望であるが、この抗原を標的にしたときの特定の問題は、例えばリンパ腫細胞上のＣＤ１９と比較して、骨髄腫細胞上のＢＣＭＡの密度が特に低いことである。ＣＡＲ−Ｔ細胞媒介処置は、ＣＤ１９またはＧＤ２などの大量の標的抗原に対しては臨床的に成功しているが、キメラ抗原受容体は、非常に低密度の抗原に応答してシグナルを伝達することはできないと報告されている。
【００１０】
例えば、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）を標的にしたＣＡＲ−Ｔ研究では、ヒト神経芽細胞腫の２つの異種移植片モデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が限定されていることを示した。サイトカイン産生はＡＬＫ標的密度に対する依存度が高く、神経芽細胞腫細胞株上のＡＬＫの標的密度はＣＡＲ  Ｔ細胞の最大活性化に不十分であることが示された（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５，２１８９−２２０１）。
【００１１】
再発性および／または難治性プレＢ細胞型急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）の処置における抗ＣＤ２２  ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する別の研究では、用量依存性の抗白血病活性が認められたが、再発したものもあった。再発は、ＣＤ２２部位密度の低下に関連し、それにより、ＣＤ２２＋細胞がＣＤ２２−ＣＡＲ  Ｔ細胞による死滅を回避したと考えられる（Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４４４１）。
【００１２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、死滅から、サイトカイン放出、増殖まで段階を経て活性化する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低密度の抗原を有する標的細胞を死滅させる場合があるが、完全に活性化できない。
【００１３】
したがって、抗原密度が低い標的抗原を発現する標的細胞を死滅させることができる代替のＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（８）２０４８−６０
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５，２１８９−２２０１
【非特許文献３】Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４４４１
【発明の概要】
【００１５】
発明の態様の要旨
本発明者らは、低密度標的抗原を標的にするＣＡＲ−Ｔ細胞について、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲを使用するとＣＡＲ媒介シグナル伝達がより効率的になることを見出した。
【００１６】
したがって、第一の態様では、本発明は、低密度標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００１７】
標的抗原は、標的細胞あたり１５００コピー未満の平均密度で発現され得る。
【００１８】
標的抗原は、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、およびＢＣＭＡから選択され得る。例えば、標的抗原はＢＣＭＡであり得る。
【００１９】
本発明の第１の態様の別の実施形態では、Ｆａｂ抗原結合ドメインは、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含み得る。
【００２０】
第１の標的抗原または第２の標的抗原は、ＢＣＭＡであり得る。
【００２１】
この実施形態では、ＦａｂＣＡＲは、第１およびと第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含み得る。
【００２２】
リンカーは、酵素などの薬剤を用いて切断可能な場合がある。例えば、リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を用いて切断可能な場合がある。第１の結合ドメインを切り出して第２の結合ドメインを露呈させるために、本発明のＣＡＲ発現細胞の投与前または投与後に薬剤を被験体に投与しても良い。あるいは、切断剤（例えば、酵素）が特異的部位で発現される場合、特異的部位で切断が自然に起こり得る。前述の部位は、例えば、炎症部位または腫瘍部位であり得る。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、核酸構築物であって、本発明の第１の態様に記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ；
ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ；または
ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物を提供する。
【００２５】
本発明の第３の態様の別の実施形態では、核酸構築物は、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し得、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。
【００２６】
核酸構築物は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体もコードし得る。
【００２７】
第２のキメラ抗原受容体は、以下の抗原：ＣＤ１９、ＦｃＲＬ５、およびＴＡＣＩのうちの１つに結合し得る。
【００２８】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸配列または本発明の第３の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００２９】
第５の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【００３０】
細胞は、上記定義の本発明の第１の態様の第１のＣＡＲ、および第２のキメラ抗原受容体を発現し得る。
【００３１】
また、細胞は、構成性に活性なサイトカイン受容体を発現し得る。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、第５の態様の細胞を作製する方法であって、本発明の第２の態様の核酸配列；本発明の第３の態様の核酸構築物；または本発明の第４の態様のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、第５の態様の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００３４】
第８の態様では、本発明は、請求の第７の態様の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００３５】
癌は、多発性骨髄腫であり得る。
【００３６】
第９の態様では、本発明は、がんの処置で使用するための本発明の第７の態様の医薬組成物を提供する。
【００３７】
第１０の態様では、本発明は、がんを処置するための医薬組成物の製造における本発明の第５の態様の細胞の使用を提供する。
【００３８】
本発明は、標的細胞上に低密度で発現された抗原を標的にするときにＣＡＲ媒介シグナル伝達達および標的細胞死滅が改善されたキメラ抗原受容体を提供する。かかる抗原は、最適以下のＴ細胞：標的細胞シナプスを形成するので、古典的ＣＡＲを用いて標的にすることが困難である（図３）。
【００３９】
かかる抗原を標的にすることができると、がん処置の全く新しい可能性が広がる。多くの潜在的に有用な癌標的抗原は、標的細胞上に低密度発現される（ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、およびＢＣＭＡなど）。本発明は、これらの抗原を標的にするための改良された構築物を提供し、前記構築物は、これらの標的を単一の標的として使用することができ、重要には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効率および安全性を高めるために複数の抗原を標的にするためのストラテジーに含めることができる。
【００４０】
さらなる態様
本発明はまた、以下の番号をつけたパラグラフにまとめた態様を提供する。
【００４１】
１．第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含むＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
２．第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含む、パラグラフ１に記載のＣＡＲ。
３．前記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）で切断可能である、パラグラフ２に記載のＣＡＲ。
４．前述の第１の標的抗原が腫瘍部位で発現され、それにより、前述のＣＡＲを発現する細胞を癌患者に投与したときに、前述の細胞が前述の被験体内の腫瘍部位に帰巣する、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ。
５．前述の第２の標的抗原が、腫瘍部位に発現され、１またはそれを超える正常組織上にも発現される、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ。
６．前述の第１および／または第２の標的抗原が、以下の群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ：ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、ＥｒｂＢ２、ＭＵＣ１、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＮＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、およびＭＵＣ１６。
７．前述の第１の標的抗原／第２の標的抗原が、以下の抗原対のうちの１つから選択される、パラグラフ１〜５のいずれかに記載のＣＡＲ：ＥｒｂＢ２およびＭＵＣ１；ＣＤ３３およびＣＤ１２３；ＰＳＭＡおよびＥｐＣＡＭ；ＧＤ２およびＮＣＡＭ；葉酸結合タンパク質およびＭＵＣ１６。
８．前記第１の標的抗原／第２の標的抗原が、表２に示す標的抗原対のうちの１つである、パラグラフ７に記載のＣＡＲ。
９．前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
１０．核酸構築物であって、パラグラフ１〜８のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
１１．パラグラフ９に記載の核酸配列またはパラグラフ１０に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
１２．パラグラフ１〜８のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
１３．パラグラフ９に記載の核酸配列；パラグラフ１０に記載の核酸構築物；またはパラグラフ１１に記載のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、パラグラフ１２に記載の細胞を作製する方法。
１４．パラグラフ１２に記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
１５．パラグラフ１４に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
１６．がんの処置で使用するためのパラグラフ１４に記載の医薬組成物。
１７．がんを処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフ１２に記載の細胞の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】多発性骨髄腫患者におけるＢＣＭＡの発現。
【００４３】
【図２】キメラ抗原受容体の異なる結合ドメイン形式。  （ａ）Ｆａｂ  ＣＡＲ形式；（ｂ）ｄＡｂ  ＣＡＲ形式；（ｃ）ｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式。
【００４４】
【図３】古典的なＣＡＲ−Ｔ細胞の、低密度で標的抗原を発現する標的細胞との相互作用を示す概略図。（ａ）基底状態のＣＡＲ  Ｔ−細胞膜；（ｂ）ＣＡＲ  Ｔ−細胞膜は、高密度標的発現細胞と免疫シナプスを形成する；（ｃ）低密度抗原を有する標的細胞に応答したＣＡＲ  Ｔ−細胞膜。
【００４５】
【図４】構成性に活性なキメラサイトカイン受容体を示す概要図。キメラ膜貫通タンパク質は、二量体化ドメインおよびサイトカイン受容体エンドドメインを含む。示した実施形態は、二量体化ドメインが抗体型重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含むので、「Ｆａｂ」型構造を有する。これらのドメインの間が定常的に二量体化すると、ＩＬ２受容体共通γ鎖がＩＬ−２受容体β鎖またはＩＬ−７受容体α鎖のいずれかと結びつき、構成性のサイトカインシグナル伝達に至る。
【００４６】
【図５】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式およびＦａｂＣＡＲ形式との間で比較した死滅アッセイの結果。ＣＡＲ発現細胞を、非ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１  ＮＴ）、低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１ＢＣＭＡｌｏｗ）、または超低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＪｅＫｏ−１）と、１：４（図５Ａ）または１：８（図５Ｂ）の比で共培養した。以前に特徴づけられた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ｂｂ２１２１）を、正の対照として使用した。２４時間後、標的細胞の死滅をＦＡＣＳによってアッセイし、標的細胞数を、非トランスフェクトＴ細胞（ＮＴ）を用いて得た細胞数に対して正規化した。
【００４７】
【図６】抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式およびＦａｂＣＡＲ形式との間で比較した死滅アッセイの結果。ＣＡＲ発現細胞を、非ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１  ＮＴ）、低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１ＢＣＭＡｌｏｗ）、または超低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＪｅＫｏ−１）と、１：４（図６Ａ）または１：８（図６Ｂ）の比で共培養した。以前に特徴づけられた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ｂｂ２１２１）を、正の対照として使用した。７２時間後、標的細胞の死滅をＦＡＣＳによってアッセイし、標的細胞数を、非トランスフェクトＴ細胞（ＮＴ）を用いて得た細胞数に対して正規化した。
【００４８】
【図７】標的細胞との共培養後のｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式またはＦａｂＣＡＲ形式のいずれかの抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞によるＩＦＮγ産生。  ＣＡＲ発現細胞を、非ＢＣＭＡ発現標的細胞（図７Ａ）または低ＢＣＭＡ発現標的細胞（図７Ｂ）と、１：４または１：８の比で共培養した。以前に特徴づけられた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ｂｂ２１２１）を、正の対照として使用した。２４時間後、ＩＦＮγ産生をＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【００４９】
【図８】標的細胞との共培養後のｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式またはＦａｂＣＡＲ形式のいずれかの抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞のＣＤ４細胞数およびＣＤ８細胞数。  ＣＡＲ発現細胞を、非ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１  ＮＴ）、低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１ＢＣＭＡｌｏｗ）、または超低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＪｅＫｏ−１）、またはＭＭ．１ｓ標的細胞と、１：１の比で９６時間共培養した。ＣＤ４（図８Ａ）およびＣＤ８（図８Ｂ）Ｔ細胞のホールセル数を、ＣＤ３およびマーカーＲＱＲ８、次いで、ＣＤ８＋またはＣＤ８−のいずれかに対するゲーティングによって得た。
【００５０】
【図９】切断性ＦａｂＣＡＲを示す概要図。  切断性ＦａｂＣＡＲは、以下の２つの抗原結合ドメインを含む：外部（膜遠位）結合ドメイン１および内部（膜近位）結合ドメイン２。結合ドメイン１および２は、切断性リンカーによって連結している。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によってリンカーを切断すると、結合ドメイン１が除去される。切断していない場合（ＦａｂＣＡＲがインタクトであるとき）、内部結合ドメインは、立体障害に起因する外部ドメインの存在によって部分的に閉塞される。内部ドメインは、重鎖および軽鎖が切断されたときに活性化される。
【００５１】
【図１０】実施例７に記載の可溶性抗体を示す概要図。  可溶性抗体を、２つの可変ドメイン、ＢＣＭＡに対する外部結合ドメイン（抗ＢＣＭＡ  Ｄ８）、およびＣＤ１９に対する内部結合ドメイン（抗ＣＤ１９  ＣＡＴ）を用いてデザインした。ＭＭＰ−９切断性リンカーを、一方の鎖上のＶＨドメインと他方の鎖上のＶＬドメインとの間に含めた。また、ＶＨ含有鎖は、抗体のＦｃ部分を含んでいた。
【００５２】
【図１１】ＭＭＰ−９の存在下でのインキュベーション後の経時的な可溶性抗体（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９）の切断率を示すためのグラフ。ＭＭＰ−９切断部位を含まないスクランブルリンカーを有する等価な抗体（Ｄ８−ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＣＡＴ１９）を、負の対照として使用した。
【００５３】
【図１２】ＥＬＩＳＡを用いた、無処置のままか、ＭＭＰ−９での処置後の可溶性抗体（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９）またはスクランブルリンカーを有する負の対照（Ｄ８−ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＣＡＴ１９）によるＣＤ１９結合を示すためのグラフ。
【００５４】
【図１３】無処理のまま（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９）またはＭＭＰ−９での処理後（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９切断）のＣＤ１９に対する可溶性抗体の結合動態学を示すためのグラフ。ＣＤ−１９モノクローナル抗体（ＣＡＴ１９  ＩｇＧ）を、正の対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
キメラ抗原受容体
本発明は、Ｆａｂ抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体に関する。
【００５６】
古典的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラタイプＩ膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくことができる。スペーサードメインは、通常、バインダーを膜から分離し、適切な配向を可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じて、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみですら十分な場合がある。膜貫通ドメインは、細胞膜内にタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００５７】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果的に、これらの第１世代の受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞による殺滅を引き起こすのに十分であったが、Ｔ細胞を、それが増殖および生存するように十分に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合により、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは最も効力のある共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を引き起こす免疫学的シグナル２）を供給する。いくつかの受容体も記載されており、この受容体には、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなど）が含まれる。活性化、増殖、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより効力のある第３世代のＣＡＲをここに記載している。
【００５８】
ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。
【００５９】
したがって、ＣＡＲは、典型的には、以下を含む：（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むか、それと会合している細胞内ドメイン。
【００６０】
ＣＡＲは、以下の一般構造を有し得る：
抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
【００６１】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するキメラ受容体の一部である。古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む（図２ｃを参照のこと）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）抗原結合ドメインまたはＶＨＨ抗原結合ドメインを有するＣＡＲも産生されている（図２ｂを参照のこと）。
【００６２】
本発明のキメラ抗原受容体では、抗原結合は、例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ断片を含む（図２ａを参照のこと）。ＦａｂＣＡＲは、以下の２つの鎖を含む：抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する鎖；および重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する鎖。一方の鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＬとＣＨとの間の会合により、受容体が組み立てられる。
【００６３】
Ｆａｂ  ＣＡＲの２本の鎖は、以下の一般構造を有し得る：
ＶＨ−ＣＨ−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ−ＣＬ
または
ＶＬ−ＣＬ−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ−ＣＨ
【００６４】
本明細書中に記載のＦａｂ型キメラ受容体について、抗原結合ドメインは、一方のポリペプチド鎖由来のＶＨおよび他方のポリペプチド鎖由来のＶＬで構成されている。
【００６５】
ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインとＣＨ／ＣＬドメインとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、可動性を示し、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的に分離するのに役立ち得る。
【００６６】
可動性リンカーは、グリシン、トレオニン、およびセリンなどの小型で非極性の残基から構成され得る。リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７８）リンカー（式中、ｎは反復数である）などの１またはそれより多くのグリシン−セリンリンカーの反復を含み得る。各リンカーは、５０、４０、３０、２０、または１０アミノ酸長未満であり得る。
【００６７】
また、本発明は、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含む切断性ＦａｂＣＡＲを提供する。かかる切断性Ｆａｂ  ＣＡＲを、図９に模式的に示す。
【００６８】
切断性Ｆａｂ  ＣＡＲは、第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含み得る。
【００６９】
切断性Ｆａｂ  ＣＡＲの２本の鎖は、以下の一般構造を有し得る：
ＶＨ１−ＶＨ２−ＣＨ−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ１−ＶＬ２−ＣＬ
または
ＶＬ１−ＣＬ１−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ２−ＣＨ２
【００７０】
切断性ＦａｂＣＡＲでは、第１の結合ドメインによる立体障害に起因して、切断されていない状態では膜近位結合ドメイン（図９中の結合ドメイン２）への接近性は低い。切断されると、結合ドメイン１が除去されて結合ドメイン２への接近性が増加するので、結合ドメイン２がその標的抗原の存在下で活性化される。
【００７１】
切断性リンカーは、小分子などの薬剤またはプロテアーゼなどの酵素によって切断され得る。リンカーを切断して第２の結合ドメインを介したシグナル伝達を活性化するか増強するために、薬剤が患者に投与され得る。あるいは、切断剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、炎症または腫瘍成長／転移部位で）天然に発現され得る。
【００７２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、器官形成および成長中のほとんどの細胞外基質タンパク質の分解を担う酵素群である。成人臓器におけるＭＭＰの発現および活性は通常は低いが、炎症および癌が含まれる種々の病的状態において著しく増加する。
【００７３】
ＭＭＰは、共通のドメイン構造を有するカルシウム依存性の亜鉛含有エンドペプチダーゼである。３つの共通のドメインは、プロペプチド、触媒ドメイン、および可動性ヒンジ領域によって触媒ドメインに連結したヘモペキシン様Ｃ末端ドメインである。
【００７４】
ＭＭＰは、ほぼ全てのヒト癌に存在し；隣接する間質内の線維芽細胞、癌関連線維芽細胞、および／または非線維芽細胞性癌細胞によって発現され得る。したがって、ＭＭＰは、血管形成、腫瘍成長、および転移の促進によって腫瘍環境に影響を及ぼすことができる。したがって、ＭＭＰ発現は、腫瘍の侵襲性、病期、および患者の予後に関連する。
【００７５】
ＭＭＰ発現の増加は、癌細胞増殖の増加および腫瘍サイズの増加に相関する。ＭＭＰファミリーのほとんどすべてのメンバーは、ヒト癌において無調節であることが見出されており、ＭＭＰ−１、−２、−７、−９、−１３、および−１４は最もよく影響を受ける。
【００７６】
本発明の切断性ＦａｂＣＡＲでは、第１および第２の結合ドメインとの間のリンカーは、ＭＭＰ、特に、ＭＭＰ−１、−２、−７、−９、−１３、および−１４から選択されるＭＭＰによって切断され得る。
【００７７】
例えば、以下のＭＭＰ酵素で切断可能な種々の配列が公知である：
ＭＭＰ−１：  ＰＬＧＬＷＡ  （配列番号８５）
ＭＭＰ−２：  ＰＡＧＬＡＧ  （配列番号８６）
ＭＭＰ−９：  ＰＬＧＬＡＧ  （配列番号８７）
【００７８】
本発明の切断性ＦａｂＣＡＲの切断性リンカー配列は、配列番号８５〜８７として示した配列のうちの１つを含み得る。
【００７９】
定常領域ドメイン
ヒトには以下の２つのタイプの軽鎖が存在する：カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖。ラムダクラスは、以下の４つのサブタイプを有する：λ１、λ２、λ３、およびλ４。Ｆａｂ型キメラ受容体の軽鎖定常領域は、これらの軽鎖タイプのいずれかに由来し得る。
【００８０】
本発明のキメラ受容体の軽鎖定常ドメインは、カッパ鎖定常ドメインである配列番号１として示した配列を有し得る。
【００８１】
配列番号１
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００８２】
哺乳動物免疫グロブリン重鎖には以下の５つのタイプが存在する：γ、δ、α、μ、およびε（それぞれ、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥクラスを定義する）。重鎖γ、δ、およびαは、３つのタンデムＩｇドメインから構成される定常ドメインを有し、可動性を付与するヒンジを有する。重鎖μおよびεは、４つのドメインから構成される。
【００８３】
本発明のＦａｂ型キメラ受容体のＣＨドメインは、γ免疫グロブリン重鎖に由来する配列番号２として示した配列を含み得る。
【００８４】
配列番号２
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
【００８５】
スペーサー
古典的ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、かつ抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含む。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを異なる方向に配向させて結合を容易にすることが可能である。
【００８６】
ＦａｂＣＡＲ（図２ａ）では、古典的キメラ抗原受容体（図２ｃ）およびｄＡｂ  ＣＡＲ（図２ｂ）において見られるように、スペーサーにより２本のポリペプチド鎖を二量体化させることができる。２本のポリペプチド鎖は、例えば、ジスルフィド架橋（複数可）を形成するのに適切な１またはそれより多くのシステイン残基を含み得る。ＩｇＧ１由来のヒンジは、これに関して適切である。ＩｇＧ１ヒンジに基づいたスペーサーは、配列番号３として示した配列を有し得る。
【００８７】
配列番号３（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
【００８８】
あるいは、ヒンジスペーサーは、配列番号４として示した配列を有し得る。
【００８９】
配列番号４（ヒンジスペーサー）
EPKSCDKTHTCPPCP
【００９０】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を横切るキメラ受容体の一部である。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを、キメラ受容体の膜貫通部分を供給するために使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの配列および全長を、当業者がＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して決定することができる。あるいは、人為的にデザインされたＴＭドメインを使用しても良い。
【００９１】
エンドドメイン
エンドドメインは、キメラ受容体のシグナル伝達部分である。エンドドメインは、キメラ受容体の細胞内ドメインの一部であり得るか、前記細胞内ドメインに会合し得る。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されているエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。共刺激シグナルは、Ｔ細胞の増殖および生存を促進する。共刺激シグナルには以下の２つの主なタイプが存在する：Ｉｇファミリーに属するもの（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）およびＴＮＦファミリーに属するもの（ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲなど）。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、増殖／生存シグナルを伝達させるためにＣＤ３−ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。
【００９２】
エンドドメインは、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン（ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン（ＣＤ２８またはＩＣＯＳ由来のエンドドメインなど）；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＧＩＴＲなど）。
【００９３】
抗原認識部分がシグナル伝達部分由来の個別の分子上に存在するいくつかの系が記載されている（ＷＯ０１５／１５０７７１号；ＷＯ２０１６／１２４９３０号、およびＷＯ２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。したがって、本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分を含むことができ、この成分は、シグナル伝達ドメインを含む個別の細胞内シグナル伝達成分と相互作用することが可能である。本発明のベクターは、かかる抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むキメラ受容体シグナル伝達系を発現し得る。
【００９４】
キメラ受容体はシグナルペプチドを含み得るため、シグナルペプチドが細胞の内側で発現されるときに、新生タンパク質は小胞体、その後に細胞表面に向かい、そこで発現される。シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。
【００９５】
標的抗原
「標的抗原」は、本発明のキメラ受容体の抗原結合ドメインによって特異的に認識および結合される実体である。
【００９６】
標的抗原は、がん細胞上に存在する抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。
【００９７】
ＣＡＲの標的抗原は、標的細胞上に比較的低い密度で発現し得る。
【００９８】
本発明の細胞は、低密度のＣＡＲ標的抗原を発現する癌細胞などの標的細胞を死滅させることが可能な場合がある。ある特定の癌において低密度で発現されることが公知の腫瘍関連抗原の例には、ＣＬＬにおけるＲＯＲ１、黒色腫におけるＴｙｐｒ−１、骨髄腫におけるＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ、ならびに神経芽細胞腫におけるＡＬＫが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
実施例１は、骨髄腫細胞上のＢＣＭＡの発現を調査する研究を記載する。骨髄腫細胞表面上のＢＣＭＡコピー数の範囲が狭いことが見出された：細胞あたり３４８．７〜４２６８．４  ＢＣＭＡコピー、平均１１８１および中央値１０８４．９（図１）。
【０１００】
ＣＡＲの標的抗原の平均コピー数は、標的細胞あたり約１０，０００；５，０００；３，０００；２，０００；１，０００；または５００コピーより少ない場合がある。
【０１０１】
癌細胞などの細胞表面上のコピー数は、実施例１に記載のＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズなどの標準的技術を使用して測定され得る。
【０１０２】
ＣＡＲの標的抗原は、細胞あたり１５００コピーまたはそれ未満、または細胞あたり１０００コピーまたはそれ未満の平均コピー数で標的細胞によって発現され得る。
【０１０３】
標的抗原は、例えば、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、またはＡＬＫであってよい。
【０１０４】
ＢＣＭＡ
Ｂ細胞成熟標的（ＢＣＭＡ；ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても公知）は、成熟リンパ球（例えば、記憶Ｂ細胞、形質芽球、および骨髄形質細胞）で発現される膜貫通タンパク質である。また、ＢＣＭＡは、骨髄腫細胞上で発現される。ＢＣＭＡは、非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、これは、Ｂ細胞の成熟、成長、および生存に関与する。
【０１０５】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合することができる任意のドメインであってよい。１４の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列を以下に示し、ＣＤＲ配列は太字で下線を引いている。
【０１０６】
【化１】
2022502036.tif 000002
【化２】
2022502036.tif 000003
【化３】
2022502036.tif 000004
【化４】
2022502036.tif 000005
【０１０７】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、上記のように、Ａｂ１４に対する抗ＢＣＭＡ  Ａｂ１のうちのいずれか由来のＣＤＲを含んでよい。
【０１０８】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、上記のように、Ａｂ１４に対する抗ＢＣＭＡ  Ａｂ１のうちのいずれか由来のＶＨ配列および／またはＶＬ配列、または少なくとも７０、８０、９０、もしくは９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでよく、前述のバリアントは、ＢＣＭＡへの結合能力を保持している。
【０１０９】
また、本発明は、Ａｂ１〜Ａｂ１４と命名された新規のＢＣＭＡ結合抗体を提供する。Ａｂ１〜Ａｂ１４のＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲ配列を、上記の配列番号５〜３０中に示すか、これらの配列番号として示す。
【０１１０】
ＢＣＭＡ結合抗体Ａｂ１は、ＣＡＲ形態において特に良好な有効性を示す。例えば、ｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式のＡｂ１は、別のＢＣＭＡ結合ドメインを有する種々の等価なＣＡＲよりも標的細胞死滅、ＩＬ−２放出、および増殖を改善した（データ示さず）。
【０１１１】
本発明はまた、以下の番号をつけたパラグラフにまとめた態様を提供する。
【０１１２】
１．以下を含む抗原結合ドメイン：
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９に示した配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０に示した配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）。
２．以下を含むパラグラフ１に記載の抗原結合ドメイン：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＤＳＹ（配列番号６８）
ＣＤＲ２−ＩＹＡＧＤＧＡＴ（配列番号６９）
ＣＤＲ３−ＡＲＰＬＹＴＴＡＹＹＹＶＧＧＦＡＹ（配列番号７０）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＬＳＳＧＮＱＫＮＹ（配列番号７１）
ＣＤＲ２−ＷＡＳ（配列番号７２）
ＣＤＲ３−ＱＱＹＹＤＴＰＬＴ（配列番号７３）。
３．以下を含むパラグラフ１に記載の抗原結合ドメイン：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＳＤＹＮ（配列番号７９）
ＣＤＲ２−ＩＩＹＤＧＳＳＴ（配列番号８０）
ＣＤＲ３−ＡＴＲＰＧＰＦＡＹ（配列番号８１）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号８２）
ＣＤＲ２−ＬＶＳ（配列番号８３）
ＣＤＲ３−ＶＨＧＴＨＡＷＴ（配列番号８４）。
４．配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、または２９として示した配列のうちの１つを有するＶＨドメイン；および配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０として示した配列のうちの１つを有するＶＬドメインを含む、パラグラフ１に記載の抗原結合ドメイン。
５．配列番号５として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号６として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフ３に記載の抗原結合ドメイン。
６．配列番号２９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号３０として示した配列を有するＶＬドメインを含む、パラグラフ３に記載の抗原結合ドメイン。
７．前述のパラグラフのいずれかに記載の抗原結合ドメインを含む抗体。
８．パラグラフ７に記載の抗体を含む、抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）または二重特異性Ｔ細胞誘導物（ＢｉＴＥ）。
９．パラグラフ１〜６のいずれかに記載の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１０．ＦａｂＣＡＲである、パラグラフ９に記載のＣＡＲ。
１１．パラグラフ１〜６のいずれかに記載の抗原結合ドメイン、およびパラグラフ６に記載の抗体、パラグラフ８に記載のＡＤＣもしくはＢｉＴＥ、またはパラグラフ９または１０に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
１２．パラグラフ１１に記載の核酸配列を含むベクター。
１３．パラグラフ９または１０のＣＡＲを発現する細胞。
１４．パラグラフ１１に記載のＣＡＲコード核酸配列を細胞に導入する工程を含む、パラグラフ１３に記載の細胞を作製する方法。
１５．パラグラフ１３に記載の複数の細胞を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
１６．パラグラフ１５に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、癌を処置する方法。
１７．癌がＢ細胞白血病またはリンパ腫である、パラグラフ１５に記載の方法。
１８．癌の処置で使用するためのパラグラフ１３に記載の細胞。
１９．癌を処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフ１３に記載の細胞の使用。
【０１１３】
例えば、キメラ抗原受容体、核酸配列および構築物、ベクター、細胞、医薬組成物、ならびに前節および後節に記載の細胞を作製および使用する方法の一般的な特徴も、上記パラグラフ中に記載の対応する構成要素に適用する。
【０１１４】
ＲＯＲ１
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体−１（ＲＯＲ１）（神経栄養性チロシンキナーゼおよび関連受容体１（ＮＴＲＫＲ１）としても公知）は、中枢神経系における神経突起成長を調整する受容体チロシンキナーゼである。これは、Ｉ型膜タンパク質であり、細胞表面受容体のＲＯＲサブファミリーに属する。
【０１１５】
ＲＯＲ１は、卵巣癌幹細胞上で発現することが示されており、この細胞に関して、ＲＯＲ１は、遊走／侵入またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスフェロイド形成および免疫不全マウスにおける腫瘍生着の促進において機能的役割を果たすようである。ＲＯＲ１に特異的なヒト化ｍＡｂで処置すると、卵巣癌細胞が遊走するか、スフェロイドを形成するか、免疫不全マウスにおいて生着する能力を阻害することができる。
【０１１６】
ＷＯ２０１７／０７２３６１号は、ＣＡＲでの使用に適切ないくつかのＲＯＲ１特異的抗体を記載している。
【０１１７】
ＴＡＣＩ
膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）インタラクター）ＴＡＣＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４８３６）は、免疫応答における制御因子であり、ＢＣＭＡと同様に、ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞（特に周辺帯Ｂ細胞）などの成熟リンパ球、骨髄形質細胞、および骨髄腫細胞に優先的に発現される。
【０１１８】
さらに、ＴＡＣＩは、マクロファージ上に発現され、マクロファージの生存を媒介する。ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのリンパ球特異的メンバー（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）としても公知）であり、細胞表面から脱落してその可溶性形態で循環することができる。ＢＣＭＡと対照的に、ＴＡＣＩは、胚中心Ｂ細胞に明らかに不在である。ＴＡＣＩは、ＴＮＦＳＦ１３／ＡＰＲＩＬおよびＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＢＡＦＦの受容体として機能を果たすことが公知であり、両方のリガンドに高い親和性で結合する。ＴＡＣＩは、Ｂ細胞拡大を阻害し、形質細胞の分化および生存を促進する。
【０１１９】
ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞機能の重要な制御因子としての機能を果たす。ＴＡＣＩは、２つのリガンド（ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ）に高い親和性で結合し、その細胞外領域に２つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む。しかしながら、Ｎ末端ＣＲＤがオルタナティブスプライシングによって除去されたＴＡＣＩの別の形態が存在する。このより短い形態がリガンド誘導性細胞シグナル伝達が可能であること、および第２のＣＲＤのみ（ＴＡＣＩ＿ｄ２）が両方のリガンドに対して完全な親和性を示すことが示されている（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ  ２００５  Ａｍ  Ｓｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｃ  ２８０（８）７２１８−７２２７）。
【０１２０】
ＴＡＣＩ＿ｄ２の結晶構造が、ＡＰＲＩＬＴＡＣＩ＿ｄ２の共結晶構造およびＡＰＲＩＬ  ＢＣＭＡ複合体と共に解析されている（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，上記の通り）。
【０１２１】
ＴＡＣＩのＣＲＤは、他のＴＮＦＲのＣＲＤと共に、保存された６残基配列（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ／Ｔｈｒ）−（Ａｒｇ／Ｇｌｙ）（配列番号７４）からなる共通の配列フィーチャ（いわゆるＤＸＬモチーフ）を有する。このモチーフは、ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦのいずれかの結合に必要である。受容体モチーフは、疎水性ポケットに結合し、ＢＡＦＦ表面上の２つの保存されたアルギニン残基と相互作用する。
【０１２２】
ＴＡＣＩに結合するＣＡＲまたはｔａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＴＡＣＩに結合することができる任意のドメインであり得る。例えば、抗原結合ドメインは、表１に列挙した市販の抗ＴＡＣＩ抗体のうちの１つから誘導可能なＴＡＣＩバインダーを含み得る。
【０１２３】
【表１】
2022502036.tif 000006
【０１２４】
抗原結合ドメインは、クローン２Ｈ６、２Ｇ２、１Ｇ６、または４Ｂ１１由来のＴＡＣＩバインダーのうちの１つを含み得る。
【０１２５】
これらのＴＡＣＩバインダーは、以下の配列を有する：
２Ｈ６  
ＳｃＦｖ：EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKASGYTFTNYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPSNDDTKYTEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTHGDYYALDYWGQGTSVTVSSGGGGAGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQSVTISCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQAPKLLIYGASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR（配列番号３１）
ＣＤＲ  Ｈ１：NYVMH（配列番号３２）
ＣＤＲ  Ｈ２：YINPSNDDTKYTEKFKG（配列番号３３）
ＣＤＲ  Ｈ３：GTHGDYYALDY（配列番号３４）
ＣＤＲ  Ｌ１：RASESVEYYGTSLMQ（配列番号３５）
ＣＤＲ  Ｌ２：GASNVES（配列番号３６）
ＣＤＲ  Ｌ３：QQSRKVP（配列番号３７）
【０１２６】
２Ｇ２
ＳｃＦｖ：QVTLKESGPGMLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDAQYSNPALRSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCSRIHSYYSYDEGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSYRTFGGGTKLEIKR（配列番号３８）
ＣＤＲ  Ｈ１：TFGMGVG（配列番号３９）
ＣＤＲ  Ｈ２：HIWWDDAQYSNPALRS（配列番号４０）
ＣＤＲ  Ｈ３：RIHSYYSYDEGFAY（配列番号４１）
ＣＤＲ  Ｌ１：KASQNVGTAVA（配列番号４２）
ＣＤＲ  Ｌ２：SASNRYT（配列番号４３）
ＣＤＲ  Ｌ３：QQYSSY（配列番号４４）
【０１２７】
１Ｇ６
ＶＨ：QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVDWVRQSPGKGLEWLGIIWGGGRTNYNSAFKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCASGDRAADYWGQGTSVTVSS（配列番号４５）
ＣＤＲ  Ｈ１：SYGVD（配列番号４７）
ＣＤＲ  Ｈ２：IIWGGGRTNYNSAFKS（配列番号４８）
ＣＤＲ  Ｈ３：GDRAADY（配列番号４９）
VL:DIVMTQSQKFMSTTVGDRVTITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPVRFTGSGSGTDFTLTINNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK  (配列番号46)
ＣＤＲ  Ｌ１：KASQNVGTAVA（配列番号５０）
ＣＤＲ  Ｌ２：SASNRYT（配列番号５１）
ＣＤＲ  Ｌ３：QQYSSYP（配列番号５２）
【０１２８】
４Ｂ１１
ＶＨ：EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGNSEYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTTIYYCTSGYGAYWGQGTTLTVSS（配列番号５３）
ＣＤＲ  Ｈ１：NTYIH（配列番号５５）
ＣＤＲ  Ｈ２：KIDPANGNSEYAPKFQG（配列番号５６）
ＣＤＲ  Ｈ３：GYGAY（配列番号５７）
VL:DIVLSQSPSSLAVSIGEKVTLSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWFQQKPGQSLKLLIYWASTREFGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQYYTWTFGGGTKLEIK（配列番号５４）
ＣＤＲ  Ｌ１：KSSQSLLYSSNQKNYLA（配列番号５８）
ＣＤＲ  Ｌ２：WASTREF（配列番号５９）
ＣＤＲ  Ｌ３：QQYYTW（配列番号６０）
【０１２９】
本発明は、クローン２Ｈ６、２Ｇ２、１Ｇ６、または４Ｂ１１のうちの１つに基づいたＴＣＩ結合ドメインを含む抗ＴＡＣＩ剤（抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、またはｔａｎＣＡＲなど）を提供する。抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号３２〜３７；３９〜４４；４７〜５２；５５〜６０として示した配列を有する１またはそれを超えるＣＤＲを含み得る。薬剤は、以下の６ＣＤＲ群のうちの１つを含み得る：配列番号３２〜３７；配列番号３９〜４４；配列番号４７〜５２、および５５〜６０。
【０１３０】
抗ＴＡＣＩ剤は、例えばＦａｂ形式で、配列番号３１または３８に示したＶＨ配列および／またはＶＬ配列（ＶＨはセリン−グリシンリンカーの前にあり、ＶＬはセリン−グリシンリンカーの後にある）を含み得る。抗ＴＡＣＩ剤は、例えばＦａｂ形式で、配列番号４５または５３に示したＶＨ配列および／または配列番号４６または５４に示したＶＬ配列を含み得る。抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号３１もしくは３８に示したｓｃＦｖまたは配列番号４５の配列番号４６との連結もしくは配列番号５３の配列番号５４との連結によって形成されたｓｃＦｖを含み得る。
【０１３１】
上記配列の全てに関して、抗ＴＡＣＩ剤は、バリアント配列がＴＡＣＩへの結合能力を保持する場合、所与の配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する配列を含み得る。
【０１３２】
ＴＹＲＰ−１
Ｔｙｒｐ１は、メラニン合成に関与するメラノサイト特異的遺伝子産物である。マウスＴｙｒｐ１は、ジヒドロキシインドールカルボン酸オキシダーゼ活性を有するが、ヒトメラノサイトにおける機能はあまりわかっていない。メラニン合成におけるその役割に加えて、Ｔｙｒｐ１は、チロシナーゼタンパク質の安定化およびその触媒活性の調整に関与する。また、Ｔｙｒｐ１は、メラノソーム構造の維持に関与し、メラノサイトの増殖およびメラノサイトの細胞死に影響を及ぼす。
【０１３３】
ＷＯ２００９１１４５８５号は、Ｔｙｒｐ−１に結合するいくつかの抗体を記載している。また、抗Ｔｙｒｐ−１抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている（ＳＡＢ１４０６５６６およびＨＰＡ０００９３７など）。
【０１３４】
ＡＬＫ
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、インスリン受容体スーパーファミリーに属する受容体チロシンキナーゼである。このタンパク質は、細胞外ドメイン、１回膜貫通領域に対応する疎水性ストレッチ、および細胞内キナーゼドメインを含む。ヒトＡＬＫ配列は、公的に利用可能である（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００４２９５（タンパク質）、およびＮＭ＿００４３０４（核酸）およびＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＵＭ７３）。
【０１３５】
ＷＯ２０１５０６９９２２号は、ＡＬＫに結合するいくつかのｓｃＦｖ型抗原結合ドメインを記載している。
【０１３６】
切断性Ｆａｂ  ＣＡＲの標的抗原
図９に模式的に示すように、本発明のＦａｂ  ＣＡＲは、２つの抗原結合ドメインを有し得る。
【０１３７】
本発明の切断性ＦａｂＣＡＲでは、第１および／または第２の結合ドメインは、標的細胞上に比較的低レベルで発現される抗原に結合し得る。例えば、前述のドメインは、ＲＯＲ１、Ｔｙｐｒ−１、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびＡＬＫから選択される抗原に結合し得る。特に、第２の（膜近位）結合ドメインの標的抗原は、標的細胞上に比較的低レベルで発現される抗原であり得る。
【０１３８】
第１の（膜遠位）結合ドメインによる標的抗原結合を使用して、ＣＡＲが腫瘍を標的にすることができる。腫瘍内でリンカーが切断されると、第２の結合ドメインによる第２の標的抗原の結合を介して活性化し、腫瘍細胞が死滅する。しかしながら、第１の結合ドメインによる第１の標的抗原の結合も細胞死滅を誘発する場合があるが、非効率なシナプス形成に起因して、（第２の結合ドメインを介した標的抗原結合によって誘導される死滅と比較して）死滅効率は低下し得ることに留意すべきである。
【０１３９】
切断性ＦａｂＣＡＲの利点の１つは、内部結合ドメイン（すなわち、第２の結合ドメイン）が立体障害に起因してインタクトな分子内に部分的に閉塞されることである。第１の結合ドメインが切り取られるまで第２の結合ドメインのその標的抗原への暴露が減少し、前述の切り取りはＣＡＲ発現細胞が腫瘍に到達するまで起こり得ないので、第２の標的抗原が１またはそれを超える正常組織上にいくらかの範囲で発現される場合、この閉塞によって安全性を改善することができる。
【０１４０】
したがって、第２の抗原は、腫瘍細胞上では高レベルで発現され得るが、１またはそれを超える（one  of  more）正常組織上では低レベルで発現され得る。
【０１４１】
第１または第２の結合ドメインの標的抗原は、以下のうちの１つから選択され得る：ＥｒｂＢ２、ＭＵＣ１、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＮＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、およびＭＵＣ１６。
【０１４２】
特に、本発明の切断性ＦａｂＣＡＲは、以下の標的抗原の対のうちの１つに対して指向する結合ドメインを含み得る：ＥｒｂＢ２およびＭＵＣ１；ＣＤ３３およびＣＤ１２３；ＰＳＭＡおよびＥｐＣＡＭ；ＧＤ２およびＮＣＡＭ；葉酸結合タンパク質およびＭＵＣ１６。これらの標的抗原対では、結合ドメイン１および結合ドメイン２は、例えば標的抗原対ＥｒｂＢ２およびＭＵＣ１のいずれかの抗原に結合し得る（may  by）か、結合ドメイン１はＥｒｂＢ２に結合し得、かつ結合ドメイン２はＭＵＣ１に結合し得るか、結合ドメイン２はＥｒｂＢ２に結合し得、かつ結合ドメイン１はＭＵＣ１に結合し得る。
【０１４３】
特に、本発明の切断性ＦａｂＣＡＲは、表２に示す標的抗原対のうちの１つに対して指向する結合ドメインを含み得る。
【０１４４】
【表２】
2022502036.tif 000007
【０１４５】
ＯＲゲート
【０１４６】
本発明のＣＡＲを、１またはそれより多くの他の賦活性または抑制性のキメラ抗原受容体と組み合わせて使用してよい。例えば、本発明のＣＡＲを、「論理ゲート」において１またはそれより多くのＣＡＲと組み合わせて使用してよく、ＣＡＲ組み合わせは、Ｔ細胞などの細胞によって発現されるとき、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現パターンを検出することができる。少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示される場合、３つの可能な選択肢は以下の通りである：
「ＯＲゲート」−Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤゲート」−Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在するときに引き起こす
「ＡＮＤ  ＮＯＴゲート」−Ｔ細胞は、抗原Ａが単独で標的細胞上に存在する場合に引き起こすが、Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合に引き起こさない
【０１４７】
これらのＣＡＲ組み合わせを発現する操作されたＴ細胞を、２またはそれより多くのマーカーのがん細胞の特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整することができる。
【０１４８】
かかる「論理ゲート」は、例えば、ＷＯ２０１５／０７５４６９号、ＷＯ２０１５／０７５４７０号、およびＷＯ２０１５／０７５４７０号に記載されている。
【０１４９】
「ＯＲゲート」は、標的細胞によって発現された個別の標的抗原にそれぞれ指向する２つまたはそれより多くの賦活ＣＡＲを含む。ＯＲゲートの利点は、有効性が抗原Ａ＋抗原Ｂとなるので、標的細胞上の有効に標的可能な抗原が増加することである。単一抗原のレベルが、ＣＡＲ−Ｔ細胞が有効に標的にするのに必要な閾値未満であり得るので、このことは標的細胞上に変動するか低い密度で発現される抗原に特に重要である。また、ＯＲゲートは、抗原回避現象が避けられる。例えば、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９が標的にされた後にＣＤ１９陰性になる：この現象が起こる場合、別の抗原と組み合わせてＣＤ１９を標的にするＯＲゲートを使用すると「バックアップ」抗原が得られる。
【０１５０】
本発明のＦａｂＣＡＲは、ＯＲゲートにおいて、標的細胞によって発現される第２の標的抗原に対する第２のＣＡＲと組み合わせて使用され得る。
【０１５１】
抗ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲについて、ＯＲゲートは、Ｂ細胞または形質細胞内に発現される第２の抗原（ＣＤ１９、ＴＡＣＩ、またはＦｃＲＬ５など）に対するＣＡＲを含み得る。
【０１５２】
第２のＣＡＲは、任意の適切な抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、またはＦａｂに基づいた結合ドメイン）を有し得る。
【０１５３】
ＯＲゲートは、ダブルＦａｂ  ＣＡＲであり得る。これに関して、細胞は、Ｆａｂ型抗原結合ドメインを有する２つの個別のＣＡＲを発現し得る。ＦａｂＣＡＲは、例えば、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩまたはＢＣＭＡおよびＦｃＲＬ５に対し得る。
【０１５４】
また、本発明は、３つのＣＡＲを含み、そのうちの少なくとも１つが本発明の第１の態様のＦａｂＣＡＲであるトリプルＯＲゲートを提供する。トリプルＯＲゲートは、例えば、ＢＣＭＡ  Ｆａｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１９  ＣＡＲ、およびＦｃＲＬ５  ＣＡＲまたはＦａｂ  ＣＡＲを含み得る。
【０１５５】
第２のＣＡＲは、膜貫通ドメインから抗原結合ドメインを立体的に分離し、可動性を付与するスペーサーを含み得る。種々の配列がＣＡＲのスペーサーとして一般に使用されている（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ（上記）、またはヒトＣＤ８ストーク）。スペーサーは、例えば、ＷＯ２０１６／１５１３１５号に記載のコイルドコイルドメインを含み得る。
【０１５６】
第２のＣＡＲは、活性化エンドドメインを含む。第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含み得る。第２のＣＡＲは、１またはそれより多くの上記の共刺激ドメインを含み得る。例えば、第２のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、または４−１ＢＢ由来のエンドドメインを含み得る。
【０１５７】
ＣＤ１９バインダー
いくつかの抗ＣＤ１９抗体が、ＣＡＲ形式で以前に記載されている（ｆｍｃ６３、４Ｇ７、ＳＪ２５Ｃ１、ＣＡＴ１９（ＷＯ２０１６／１３９４８７号に記載）およびＣＤ１９ＡＬＡｂ（ＷＯ２０１６／１０２９６５号に記載）など）。
【０１５８】
本発明のダブルまたはトリプルＯＲゲートで用いるための抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、抗原結合ドメイン（これらの抗ＣＤ１９抗体のうちの１つに由来するｓｃＦｖ型抗原結合ドメインなど）を含み得る。
【０１５９】
ＣＤ１９結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＹＡＦＳＳＳ（配列番号６１）；
ＣＤＲ２−ＹＰＧＤＥＤ（配列番号６２）
ＣＤＲ３−ＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹ（配列番号６３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号６４）；
ＣＤＲ２−ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号６５）
ＣＤＲ３−ＱＱＷＮＩＮＰＬＴ（配列番号６６）。
【０１６０】
ＣＤ１９結合活性に負の影響を及ぼすことなく各ＣＤＲに１またはそれより多くの変異（置換、付加、または欠失）を導入することが可能な場合がある。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸変異を有し得る。
【０１６１】
ＣＤＲは、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドが接続された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形式であり得る。ｓｃＦｖの配向はＶＨ−ＶＬであり得る（すなわち、ＶＨがＣＡＲ分子のアミノ末端側にあり、ＶＬドメインがスペーサーに連結しており、それに膜貫通ドメインおよびエンドドメインが続く）。
【０１６２】
ＣＤＲは、ヒト抗体またはｓｃＦｖのフレームワーク上にグラフトされ得る。例えば、本発明のＣＡＲは、以下の配列のうちの１つからなるか、以下の配列のうちの１つを含むＣＤ１９結合ドメインを含み得る。
【０１６３】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
配列番号６７−マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ配列
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSS
【０１６４】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
配列番号７５−マウスモノクローナル抗体由来のＶＬ配列
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKR
【０１６５】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
配列番号７６−マウスモノクローナル抗体由来のＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ配列
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKR
【０１６６】
２つのポリペプチド配列の間の同一率は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。
【０１６７】
ＦＣＲＬ５
Ｆｃ受容体様タンパク質５（ＦｃＲＬ５）は、免疫グロブリン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｆｃ受容体様ファミリーＦｃＲＬ５は、１回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、８個の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインを含む。成熟タンパク質は、１０６ｋＤａである。
【０１６８】
ＦＣＲＬ５は、２個の抑制性ＩＴＩＭリン酸化シグナル伝達モチーフを有する細胞質側末端を有する。ＦＣＲＬ５は、Ｂ細胞抗原受容体の共刺激の際にＳＨＰ１を動員することによってＢ細胞抗原受容体シグナル伝達を抑制し、それにより、カルシウム流入およびタンパク質チロシンリン酸化を減弱する。ＦＣＲＬ５およびＢ細胞抗原受容体を共刺激すると、ナイーブＢ細胞の増殖および分化が促進される。ＦＣＲＬ５は、成熟Ｂ細胞上および形質細胞上の両方に発現され、ＥＢＶタンパク質によって誘導される。ＦＣＲＬ５は、毛様細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫の患
者の悪性Ｂ細胞上に過剰発現される。
【０１６９】
市販のＦｃＲＬ５に対するモノクローナル抗体（ＣＤ３０７ｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＲＥＡ３９１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）など）が公知である。
【０１７０】
ＷＯ２０１６０９０３３７号は、ＦｃＲＬ５に結合するいくつかのｓｃＦｖ型抗原結合ドメインを記載している。
【０１７１】
本発明のＯＲゲートでは、抗ＦｃＲＬ５  ＣＡＲは、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ抗原結合ドメインを含み得る。ＦｃＲＬ５は、Ｆａｂ抗原結合ドメインを含み得る。
【０１７２】
核酸構築物
本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードする核酸構築物を提供する。
【０１７３】
ＦａｂＣＡＲをコードする核酸構築物（図２ａ）は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬまたは
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。
【０１７４】
上記の両構造について、２つのポリペプチドをコードする核酸配列は、構築物中でいずれかの順序であり得る。
【０１７５】
２つまたはそれより多くの（two  of  more）ＣＡＲを含み、そのうちの少なくとも１つが本発明のＦａｂＣＡＲであるＯＲゲートをコードする核酸構築物も提供する。
【０１７６】
ダブルＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢＤ−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２；または
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢＤ−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで、
ＶＨは、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同一でも異なっていてもよく、第１のＣＡＲ
；ならびに第１および第２のＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの共発現が可能な核酸配列であり；
ＶＬは、第１のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、第１のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ＡｇＢＤは、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０１７７】
第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。
【０１７８】
上記の両方の構造物について、第１のＣＡＲの２つのポリペプチドをコードする核酸配列；第１および第２のＣＡＲをコードする核酸配列は、構築物内に任意の順序で存在し得る。
【０１７９】
ダブルＦａｂＣＡＲ  ＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＶＨ１−ＣＨ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ１−ＣＬ１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＨ２−ＣＨ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＬ２−ＣＬ２；
ＶＨ１−ＣＨ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ１−ＣＬ１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＬ２−ＣＬ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＨ２−ＣＨ２；
ＶＬ１−ＣＬ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ１−ＣＨ１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＬ２−ＣＬ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＨ２−ＣＨ２；または
ＶＬ１−ＣＬ１−ｓｐａｃｅｒ１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ１−ＣＨ１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＨ２−ＣＨ２−ｓｐａｃｅｒ２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＬ２−ＣＬ２；
ここで、
ＶＨ１は、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨ１は、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
Ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２、およびｃｏｅｘｐｒ３は、同一でも異なっていてもよく、第１のＣＡＲの第１および第２のポリペプチド；ならびに第２のＣＡＲの第１および第２のポリペプチドの同時発現が可能な核酸配列であり；
ＶＬ２は、第２のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬ２は、第２のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ＶＨ２は、第２のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨ２は、第２のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒ２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、第２のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬ２は、第２のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列である；
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。
【０１８１】
当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることを理解する。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。
【０１８２】
本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を強化し、寿命を延ばすために実施され得る。
【０１８３】
ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」は、前記配列からか、前記配列への、１（またはそれより多くの）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加を含む。
【０１８４】
上記の構造物では、「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として２つのポリペプチドの共発現が可能な核酸配列である。ｃｏｅｘｐｒは、核酸構築物が切断部位（複数可）によって連結した両方のポリペプチドを産生するように、切断部位をコードする配列であり得る。ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性を必要とすることなく個別のペプチドに直ちに切断されるように、切断部位は自己切断され得る。
【０１８５】
切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。
【０１８６】
用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。
【０１８７】
切断部位は、例えば、フューリン切断部位、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、自己切断ペプチドをコードし得る。
【０１８８】
「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」かまたは分離されるように機能するペプチドを指す。
【０１８９】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０１９０】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐおよび細菌配列内の反復配列で見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０１９１】
切断部位は、配列番号７７として示した２Ａ様配列（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）を含み得る。
【０１９２】
キメラサイトカイン受容体
また、本発明の核酸構築物は、キメラサイトカイン受容体をコードする１またはそれを超える核酸配列を含み得る。
【０１９３】
キメラサイトカイン受容体は、ＷＯ２０１７／０２９５１２号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１９４】
キメラサイトカイン受容体は、以下を含み得る：
リガンドに結合するエキソドメイン；および
サイトカイン受容体エンドドメイン。
【０１９５】
リガンドは、例えば、腫瘍分泌因子、ケモカイン、または細胞表面抗原であり得る。
【０１９６】
キメラサイトカイン受容体は、以下の２つのポリペプチドを含む：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）リガンドの第１のエピトープに結合する第１の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）リガンドの第２のエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン（ｂ）サイトカイン−受容体エンドドメインの第２の鎖。
【０１９７】
別の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、二量体化ドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメインを含み得る。
【０１９８】
二量体化は自発的に起こる場合があり、この場合、キメラ膜貫通タンパク質は構成性に活性であろう。あるいは、二量体化は二量体化の化学誘導物質（ＣＩＤ）の存在下でのみ起こる場合があり、この場合、膜貫通タンパク質のみにより、ＣＩＤの存在下でサイトカイン型シグナル伝達が生じる。
【０１９９】
適切な二量体化ドメインおよびＣＩＤは、ＷＯ２０１５／１５０７７１号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２００】
例えば、一方の二量体化ドメインがＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）のラパマイシン結合ドメインを含む場合があり、他方はｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含む場合があり；ＣＩＤは、ラパマイシンまたはその誘導体であり得る。
【０２０１】
二量体化ドメインが自発的にヘテロ二量体化する場合、このドメインは、抗体の二量体化ドメインに基づき得る。特に、二量体化ドメインは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含み得る。定常ドメインの「二量体化部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成する配列の一部である。
【０２０２】
例えば、図４に模式的示すように、キメラサイトカイン受容体は、エキソドメインとして抗体のＦａｂ部分を含み得る。
【０２０３】
キメラサイトカイン受容体は、以下の２つのポリペプチドを含み得る：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）第１の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）前述の第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン−受容体エンドドメインの第２の鎖。
【０２０４】
キメラサイトカイン受容体は、以下の２つのポリペプチドを含み得る：
（ｉ）以下を含む第１のポリペプチド：
（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖；および
（ｉｉ）以下を含む第２のポリペプチド：
（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）サイトカイン−受容体エンドドメインの第２の鎖。
【０２０５】
サイトカイン受容体エンドドメインは、例えば、以下を含み得る：
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；または
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体α鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通のγ鎖受容体エンドドメイン。
【０２０６】
Ｆａｂ型の構成性に活性なキメラサイトカイン受容体をコードする核酸構築物は、以下の一般構造を有し得る：
ＣＨ−ＣＲＥ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＬ−ＣＲＥ２；または
ＣＬ−ＣＲＥ２−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＨ−ＣＲＥ１
ここで、
ＣＨは、第１のポリペプチドの重鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＲＥ１は、第１のポリペプチドのサイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖をコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする配列をコードし；
ＣＬは、第２のポリペプチドの重鎖定常ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＲＥ２は、第２のポリペプチドのサイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖をコードする核酸配列である。
【０２０７】
本発明の核酸構築物は、ＦａｂＣＡＲおよびキメラサイトカイン受容体をコードし得る。
【０２０８】
ベクター
本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードする１またはそれより多くの核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、宿主細胞が本発明の第１の態様のＣＡＲを発現するように宿主細胞内に核酸配列（複数可）を導入するために使用され得る。
【０２０９】
ＦａｂＣＡＲおよびキメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列の核酸構築物を含むベクターも提供する。
【０２１０】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２１１】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。
【０２１２】
細胞
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。細胞は、２つまたはそれより多くのＣＡＲを含み得る（例えば、細胞は、上記のダブルＯＲゲートまたはトリプルＯＲゲートを含み得る。
【０２１３】
本発明のＦａｂＣＡＲまたはＯＲゲートおよびキメラサイトカイン受容体を同時発現する細胞も提供する。
【０２１４】
細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【０２１５】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）であり得る。
【０２１６】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１つの型である。これらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など）と区別することができる。以下にまとめているように、種々のタイプのＴ細胞が存在する。
【０２１７】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫学的過程（Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化が含まれる）において他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されたときに活性化されるようになる。これらの細胞は、異なるタイプの免疫応答を容易にするために異なるサイトカインを分泌するいくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨ）のうちの１つに分化することができる。
【０２１８】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。
【０２１９】
メモリーＴ細胞は、感染から回復した後に長期間にわたって維持される抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、その同族抗原への再曝露の際に迅速に多数のエフェクターＴ細胞へと拡大増殖する（expand）ため、免疫系に過去の感染を「記憶」させている。メモリーＴ細胞は、以下の３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２２０】
以前は抑制性Ｔ細胞として公知であった制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。その主な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫を停止させること、および胸腺内でのネガティブ選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２２１】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス（内在性Ｔｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞）が記載されている。
【０２２２】
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺内で生じ、発生中のＴ細胞の、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との相互作用に関与している。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子を変異させると制御性Ｔ細胞の発生が阻止され、致死性自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２２３】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０２２４】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を成し得る。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの内生シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。
【０２２５】
ＮＫ細胞（先天性リンパ球系細胞群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ球系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に入ることが公知である。
【０２２６】
本発明の細胞は、上記の細胞型のうちのいずれかであり得る。
【０２２７】
本発明による細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）由来の造血幹細胞移植においてｅｘ  ｖｉｖｏで作り出すことができる。
【０２２８】
あるいは、細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞の、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持し、かつ治療に役立つもの（therapeutic）として作用することができる不死化Ｔ細胞株が使用され得る。
【０２２９】
これらの全ての実施形態では、キメラポリペプチド発現細胞は、多数の手段（ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションが含まれる）のうちの１つによってキメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０２３０】
本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞であり得る。細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。細胞は、本発明の第１の態様のキメラポリペプチドが得られる分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって活性化および／または拡大増殖され得る。
【０２３１】
本発明の細胞は、以下によって作製され得る：
（ｉ）上記列挙の被験体または他の供給源からの細胞を含む試料の単離；および
（ｉｉ）キメラポリペプチドをコードする１またはそれより多くの核酸配列での細胞の形質導入またはトランスフェクション。
【０２３２】
次いで、細胞は、精製され得る（例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る）。
【０２３３】
医薬組成物
本発明はまた、複数の本発明による細胞を含む医薬組成物に関する。
【０２３４】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０２３５】
処置方法
本発明は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置する方法を提供する。
【０２３６】
疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、もしくは改善し、および／または疾患の進行を遅延、軽減、もしく遮断するために、疾患または状態を既に有する被験体に細胞を投与することができる。
【０２３７】
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中では、未だ罹患しておらず、および／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するためにかかる細胞を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。
【０２３８】
本方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）細胞を含む試料を単離するステップ；
（ｉｉ）かかる細胞を、本発明によって提供された核酸配列またはベクターで形質導入するかトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。
【０２３９】
細胞を含む試料は、上記の被験体または他の供給源から単離され得る。
【０２４０】
本発明は、疾患の処置および／または予防で用いるための本発明の細胞を提供する。
【０２４１】
本発明はまた、疾患の処置のための医薬の製造における本発明の細胞の使用に関する。
【０２４２】
本発明の方法によって処置されるべき疾患は、がん性疾患（膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞がん）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんなど）であり得る。
【０２４３】
疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、神経芽細胞腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり得る。
【０２４４】
疾患は、形質細胞障害、例えば、プラズマ細胞腫、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症，アミロイド症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨プラズマ細胞腫、髄外形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義未確定の単クローン性免疫グロブリン血症、またはくすぶり型多発性骨髄腫であり得る。
【０２４５】
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることが可能であり得る。標的細胞は、標的細胞付近の腫瘍分泌性のリガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴付けられ得る。標的細胞は、標的細胞表面に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と共に可溶性リガンドが存在することによって特徴付けられ得る。
【０２４６】
本発明の細胞および医薬組成物は、上記の疾患の処置および／または防止で使用されるためのものであり得る。
【０２４７】
本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【０２４８】
実施例１−多発性骨髄腫細胞表面上のＢＣＭＡの発現
明らかに罹患していることが知られている多発性骨髄腫患者由来の新鮮な骨髄試料に対してＣＤ１３８免疫磁性選択を実施することによって初代骨髄腫細胞を単離した。これらの細胞を、ＰＥと抱合したＢＣＭＡ特異的Ｊ６ＭＯ  ｍＡｂ（ＧＳＫ）で染色した。同時に、結合部位数が公知のビーズの標準を、ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズキット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を製造者の説明書通りに使用して生成した。骨髄腫細胞のＢＣＭＡコピー数を、骨髄腫細胞由来の平均蛍光強度をビーズから導いた検量線と相関させることによって導いた。骨髄腫細胞表面上のＢＣＭＡコピー数の範囲が狭いことが見出された：細胞あたり３４８．７〜４２６８．４  ＢＣＭＡコピー、平均１１８１および中央値１０８４．９（図１）。これは、例えばＣＡＲの古典的な標的であるＣＤ１９およびＧＤ２よりもかなり低い。
【０２４９】
実施例２−抗ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲの構築および抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲとの比較
ＣＡＲをコードする核酸構築物のパネルを、以下のように生成した：
ＲＱＲ８−２Ａ−ａＢＣＭＡｓｃＦｖ−ＣＤ８ＳＴＫ−４１ＢＢＺ−一本鎖Ｆｖ  ＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−ａＢＣＭＡＦＡｂ−ＣＤ８ＳＴＫ−４１ＢＢＺ−ＦａｂベースのＣＡＲ構築物
ＲＱＲ８−２Ａ−ａＢＣＭＡ＿Ｃ１１Ｄ５．３−ＣＤ８ＳＴＫ−４１ＢＢ−ｚ−ｂｂ２１２１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ構築物（正の対照）
抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖおよびＦａｂドメインは、上記の抗ＢＣＭＡ  Ａｂ１のＶＨ配列およびＶＬ配列を含んでいた（それぞれ、配列番号５および６）。全ての構築物は、選別−自殺遺伝子ＲＱＲ８（ＷＯ２０１３／１５３３９１号に記載され、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式のいずれかのＢＣＭＡ結合部分を有する）と同時発現される。
【０２５０】
実施例３−ＣＡＲ発現試験
異なる形式のＣＡＲの発現を比較するために、Ｔ細胞を、ｓｃＦｖ  ＣＡＲまたはＦａｂ  ＣＡＲで形質導入し、フローサイトメトリーによって細胞表面上の受容体を検出した。可溶性のＢＣＭＡ−ＦＣおよびＱＢＥＮＤ１０（ＲＱＲ８発現を検出するため）でのＴ細胞の共染色によってＣＡＲ発現を検出する。
【０２５１】
実施例４−ＦＡＣＳベースの死滅アッセイ（ＦＢＫ）
ＣＡＲ−Ｔ細胞がＢＣＭＡを発現する標的細胞を死滅させる能力を、ＦＡＣＳベースの死滅アッセイを使用して調査した。Ｔ細胞を、エフェクター：標的比１：４および１：８で標的細胞と共培養した。生理学的レベルのＢＣＭＡ抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を、標的細胞として使用した：細胞あたり平均６８６コピーＢＣＭＡ（ＳｕｐＴ１−ＢＣＭＡ  ｌｏｗ）。また、超低レベルのＢＣＭＡを発現する標的細胞を作出した：細胞あたり平均８１コピーＢＣＭＡ（ＪｅＫｏ−１）。また、非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１−ＮＴ）を、負の対照として使用した。５×１０４形質導入標的細胞／ウェルを使用した総体積０．２ｍｌの９６ウェルプレートにおいてアッセイを行った。形質導入効率について正規化した後に共培養を設定した。インキュベーションの２４時間後および７２時間後にＦＢＫをアッセイした。
【０２５２】
結果を図５および６に示す。２４時間の共培養後（図５）、ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲおよびＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲの両方は、低レベルのＢＣＭＡ抗原を発現する標的細胞を首尾よく死滅させた。しかしながら、ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲは、超低レベルのＢＣＭＡを発現する標的細胞（ＪｅＫｏ−１）の等価なｓｃＦｖ  ＣＡＲより優れた死滅を示した。また、ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲは、他のＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（ｂｂ２１２１）より優れた死滅を示した。７２時間後（図６）、類似のパターンが認められる。Ｅ：Ｔ比１：８で、ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲは、超低ＢＣＭＡ発現標的細胞をほぼ完全に死滅させたのに対して、等価なバインダーを有するｓｃＦｖ  ＣＡＲは部分的な標的細胞死滅のみを示した。
【０２５３】
実施例５−サイトカイン放出
ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＬ−２およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の分泌を、実施例４に記載のようにエフェクター：標的比１：４および１：８での共培養から２４時間後に上清を回収することによって測定した。ＩＬ−２およびＩＦＮ−Ｇの産生を、ＥＬＩＳＡによって検出した。
【０２５４】
抗原非ＢＣＭＡ発現標的細胞（図７Ａ）または低レベルのＢＣＭＡを発現する標的細胞（図７Ｂ）を使用して実施した共培養物についてのＩＦＮγの結果を図７に示す。ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲ発現Ｔ細胞は、等価なｓｃＦｖ  ＣＡＲよりもＢＣＭＡ低発現標的細胞との共培養後に同レベルのＩＦＮγを産生した。ｂｂ２１２１および等価なｓｃＦｖ  ＣＡＲの両方についての非形質導入ＳｕｐＴ１標的細胞を用いたバックグラウンドは、ＦａｂＣＡＲで認められたバックグラウンドより高かった。
【０２５５】
実施例６−増殖アッセイ（ＰＡ）
増殖を測定するために、実施例４に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞の同一のパネルを、色素Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した。Ｔ細胞を、ＣＴＶと３７℃で２０分間インキュベートした。その後に、細胞を５Ｖの完全培地を添加してクエンチした。５分間のインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、２ｍｌの完全培地に再懸濁した。室温でさらに１０分間インキュベートして、酢酸を加水分解させ、色素を保持させた。標識されたＴ細胞を、非ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１  ＮＴ）、低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＳｕｐＴ１ＢＣＭＡｌｏｗ）、超低ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＪｅＫｏ−１）、またはＭＭ．１ｓ標的細胞と１：１の比で９６時間共培養した。ウェルあたり５×１０４個の形質導入されたＴ細胞および等数の標的細胞（比１：１）を使用して、総体積が０．２ｍｌの９６ウェルプレート中でアッセイを行った。共培養後、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析して、Ｔ細胞の分裂の際に生じるＣＴＶの希釈を測定した。
【０２５６】
また、細胞を、ＣＤ３およびマーカーＲＱＲ８に対してゲーティングし、次いで、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞についてのホールセル数を調査するためにＣＤ８＋またはＣＤ８−のいずれかに対してゲーティングした。結果を図８に示す。ＢＣＭＡ  ＦａｂＣＡＲは、３つ全てのＢＣＭＡ発現標的細胞型（低発現標的、超低発現標的、およびＭＭ．１ｓ標的）との共培養後の等価なｓｃＦｖ  ＣＡＲおよびｂｂ２１２１と比較してＣＤ８細胞数が多く、このことは、より高い増殖および／または細胞死の低下のいずれかを反映していた（図８Ｂ）。ＣＤ４細胞において、ｂｂ２１２１およびｓｃＦｖ  ＣＡＲのバックグラウンド増殖が、ＦａｂＣＡＲで認められるバックグラウンド増殖よりも高いことも注目すべきである。これは、標的細胞の増殖が見かけ上より高いことを示し得るが、実際は、抗原の非存在でのＣＡＲの活性化の増加を反映している。
【０２５７】
実施例７−切断性ＦａｂＣＡＲの抗原結合ドメインと等価なデュアル可変ドメインを有する抗体のデザインおよび構築
切断性ＦａｂＣＡＲを、図９に模式的に示す。これは、以下の２つの抗原結合ドメインを含む：外部（膜遠位）結合ドメイン１および内部（膜近位）結合ドメイン２。結合ドメイン１および２は、切断性リンカーによって連結している。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によってリンカーを切断すると、ＣＡＲから結合ドメイン１が除去される。切断していない場合（ＦａｂＣＡＲがインタクトであるとき）、内部結合ドメインは、立体障害に起因する外部ドメインの存在によって部分的に閉塞される。内部ドメインは、重鎖および軽鎖が切断されたときに活性化される。
【０２５８】
２つの結合ドメインを有する分子をデザインし、酵素での外部結合ドメインの切断によって内部結合ドメインを活性化することが可能であることを示すために、可溶性抗体を図１０に示すようにデザインした。
【０２５９】
抗体は、ＢＣＭＡに結合し、かつ上にそれぞれ配列番号２９および３０として示したＶＨ配列およびＶＬ配列を有する第１の抗原結合ドメインを含んでいた。第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、かつ上にそれぞれ配列番号６７および配列番号６８として示したＶＨ配列およびＶＬ配列を有する。
【０２６０】
配列ＰＬＧＬＡＧ（配列番号８７）を有するＭＭＰ−９切断性リンカーを、２つのＶＬドメインの間および２つのＶＨドメインの間に含めた。負の対照として、この配列のスクランブルバージョンを使用した：ＬＡＬＧＰＧ（配列番号８８）。
【０２６１】
構築物を以下のように作製した：
プラスミド１：Ｄ８＿ＭＭＰ９＿ＣＡＴ１９＿ＨＣ＿ＨｕＩｇＧ１
プラスミド２：Ｄ８＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＿ＣＡＴ１９＿ＨＣ＿ＨｕＩｇＧ１
プラスミド３：Ｄ８＿ＭＭＰ９＿ＣＡＴ１９＿ＬＣ
プラスミド４：Ｄ８＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＿ＣＡＴ１９＿ＬＣ
ＣＨＯ細胞をプラスミド１およびプラスミド３のいずれかで同時トランスフェクトすると、ＣＨＯ細胞は、図１０に示したＭＭＰ−切断性リンカーを有する抗体を産生した；あるいは、プラスミド２およびプラスミド４で同時トランスフェクトすると、ＣＨＯ細胞は、ＶＨ含有鎖およびＶＬ含有鎖中にスクランブルリンカーを有する等価な抗体を産生した。
【０２６２】
実施例８−酵素を使用して２つの結合ドメイン抗体の外部結合ドメインを切断することができることの実証
実施例７に記載の抗体は、ＢＣＭＡ結合ドメインおよびＣＤ１９結合ドメインのＶＨドメインとＶＬドメインとの間にＭＭＰ−９切断性リンカーを含んでいた。ＢＣＭＡ結合ドメインがＭＭＰ−９酵素を使用して切断され得ることを実証するために、消化アッセイを以下のように設定した。
【０２６３】
アッセイ緩衝液中１００μｇ／ｍＬの組み換えヒトＭＭＰ−９を作製した。Ｐ−アミノ酢酸フェニル水銀（ＡＰＭＡ）を、酵素を活性化するために最終濃度１ｍＭまで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２６４】
消化アッセイを、最終緩衝液体積２００ｕｌで５０ｕｇ抗体および６ｕｌ活性化酵素を混合することによって準備した。消化アッセイ試料を３７℃でインキュベートし、１ｕｇ抗体溶液（４ｕｌ）を種々の時点で取り出し、ＮｕＰＡＧＥローディング色素中に再懸濁し、ボイルし、凍結し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。切断率をデンシトメトリーによって分析し、結果を図１１に示す。
【０２６５】
ＭＭＰ−９切断性リンカーを含む抗体を、マトリックスメタロプロテイナーゼによって経時的に消化し、酵素への暴露約１時間後にプラトーに達した。スクランブルリンカーを有する抗体は、酵素への暴露２４時間後でさえも、消化の有意な増加は示さなかった。
【０２６６】
実施例９−内部結合ドメインの標的抗原への結合に及ぼす外部結合ドメイン切断の影響の調査
外部結合ドメインを除去するか除去しない場合の内部結合ドメインの活性を調査するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、ＣＤ１９への結合を調査するために設定した。組換えＣＤ１９を、９６ウェルプレート上に５０ｕｌ／ウェル中１ｕｇ／ｍｌでコーティングした。ブロッキング後、実施例７に記載の抗体（ＭＭＰ−９リンカーまたはスクランブルリンカーを含み、かつ事前にＭＭＰ−９に暴露しているか暴露していない）を、１５ｕｇ／ｍｌで３０分間負荷し、次いで、ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。二次抗ヒトＦｃ  ＨＲＰ抱合抗体を、１：３０００希釈で添加し、１時間インキュベートした。シグナルを１−ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質で検出し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４中でブロッキングした。結果を図１２に示す：可溶性抗体（Ｄ８−ＭＭＰ−ＣＡＴ１９）は、ＭＭＰ−９切断の際にＣＤ１９への結合が増加したのに対して、スクランブルリンカーを有する抗体（Ｄ８−ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＣＡＴ１９）では、ＣＤ１９結合はＭＭＰ−９への事前暴露による影響を受けなかった。
【０２６７】
実施例１０−ＣＤ１９結合の動態学に及ぼす外部結合ドメイン切断の影響の調査
ＣＤ１９結合動態学を、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ装置によるプロテインＡチップ上の抗体の捕捉によって試験した。実施例８に記載の抗体（ＭＭＰ−９への事前暴露ありまたはなし）および正の対照抗体（ＣＡＴ１９  ＩｇＧ）を、ＩｇＧについては７５ＲＵで、２つの結合ドメイン構築物については１００ＲＵで捕捉した。組換えＣＤ１９を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で透析し、分析物を５００ｎＭで２倍系列希釈を用いて試験した。結果を図１３に示す。ＭＭＰ−９切断性リンカーを有する抗体は、ＭＭＰ−９での切断後のＣＤ１９結合のＲｍａｘ（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９切断）が、ＭＭＰ−９へ暴露しなかった等価な抗体（Ｄ８−ＭＭＰ９−ＣＡＴ１９）より増加した。
【０２６８】
上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2022502036.tif 000008
【図２（ａ）】
2022502036.tif 000009
【図２（ｂ）】
2022502036.tif 000010
【図２（ｃ）】
2022502036.tif 000011
【図３】
2022502036.tif 000012
【図４】
2022502036.tif 000013
【図５】
2022502036.tif 000014
【図６】
2022502036.tif 000015
【図７Ａ−７Ｂ】
2022502036.tif 000016
【図８】
2022502036.tif 000017
【図９】
2022502036.tif 000018
【図１０】
2022502036.tif 000019
【図１１】
2022502036.tif 000020
【図１２】
2022502036.tif 000021
【図１３】
2022502036.tif 000022
【配列表】
2022502036000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月26日(2021.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＳＤＹＮ（配列番号７９）
ＣＤＲ２−ＩＩＹＤＧＳＳＴ（配列番号８０）
ＣＤＲ３−ＡＴＲＰＧＰＦＡＹ（配列番号８１）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号８２）
ＣＤＲ２−ＬＶＳ（配列番号８３）
ＣＤＲ３−ＶＨＧＴＨＡＷＴ（配列番号８４）
を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、配列番号２９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号３０として示した配列を有するＶＬドメインを含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を用いて切断可能である、請求項５に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項８】
核酸構築物であって、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ；
ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ；または
ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
【請求項９】
核酸構築物であって、請求項４〜６のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
【請求項１０】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体もコードする、請求項８または９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記第２のキメラ抗原受容体が、以下の抗原：ＣＤ１９、ＦｃＲＬ５、およびＴＡＣＩのうちの１つに結合する、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項７に記載の核酸配列または請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載の第１のＣＡＲ、および請求項１０または１１に定義の第２のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
【請求項１５】
構成性に活性なサイトカイン受容体も発現する請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項７に記載の核酸配列；請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸構築物；または請求項１２に記載のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項１８】
がんを処置するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記がんが多発性骨髄腫である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
がんを処置するための医薬組成物の製造における請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
１．第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含むＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
２．第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含む、パラグラフ１に記載のＣＡＲ。
３．前記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）で切断可能である、パラグラフ２に記載のＣＡＲ。
４．前述の第１の標的抗原が腫瘍部位で発現され、それにより、前述のＣＡＲを発現する細胞を癌患者に投与したときに、前述の細胞が前述の被験体内の腫瘍部位に帰巣する、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ。
５．前述の第２の標的抗原が、腫瘍部位に発現され、１またはそれを超える正常組織上にも発現される、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ。
６．前述の第１および／または第２の標的抗原が、以下の群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲ：ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、ＥｒｂＢ２、ＭＵＣ１、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＮＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、およびＭＵＣ１６。
７．前述の第１の標的抗原／第２の標的抗原が、以下の抗原対のうちの１つから選択される、パラグラフ１〜５のいずれかに記載のＣＡＲ：ＥｒｂＢ２およびＭＵＣ１；ＣＤ３３およびＣＤ１２３；ＰＳＭＡおよびＥｐＣＡＭ；ＧＤ２およびＮＣＡＭ；葉酸結合タンパク質およびＭＵＣ１６。
８．前記第１の標的抗原／第２の標的抗原が、表２に示す標的抗原対のうちの１つである、パラグラフ７に記載のＣＡＲ。
９．前述のパラグラフのいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
１０．核酸構築物であって、パラグラフ１〜８のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
１１．パラグラフ９に記載の核酸配列またはパラグラフ１０に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
１２．パラグラフ１〜８のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
１３．パラグラフ９に記載の核酸配列；パラグラフ１０に記載の核酸構築物；またはパラグラフ１１に記載のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、パラグラフ１２に記載の細胞を作製する方法。
１４．パラグラフ１２に記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
１５．パラグラフ１４に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
１６．がんの処置で使用するためのパラグラフ１４に記載の医薬組成物。
１７．がんを処置するための医薬組成物の製造におけるパラグラフ１２に記載の細胞の使用。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
低密度標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記標的抗原が、標的細胞あたり１５００コピー未満の平均密度で発現される、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記標的抗原が、ＲＯＲ１、Ｔｙｒｐ−１、ＴＡＣＩ、ＡＬＫ、およびＢＣＭＡから選択される、項目１または２に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記標的抗原がＢＣＭＡである、項目３に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＩＦＳＤＹＮ（配列番号７９）
ＣＤＲ２−ＩＩＹＤＧＳＳＴ（配列番号８０）
ＣＤＲ３−ＡＴＲＰＧＰＦＡＹ（配列番号８１）；および
ｂ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号８２）
ＣＤＲ２−ＬＶＳ（配列番号８３）
ＣＤＲ３−ＶＨＧＴＨＡＷＴ（配列番号８４）
を含む、項目４に記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、配列番号２９として示した配列を有するＶＨドメイン；および配列番号３０として示した配列を有するＶＬドメインを含む、項目５に記載のＣＡＲ。
（項目７）
前記Ｆａｂ抗原結合ドメインが、第１の標的抗原に結合する第１の結合ドメインおよび第２の標的抗原に結合する第２の結合ドメインを含む、前記項目のいずれかに記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原がＢＣＭＡである、項目７に記載のＣＡＲ。
（項目９）
第１および第２の結合ドメインとの間に切断性リンカーを含む、項目７または８に記載のＣＡＲ。
（項目１０）
前記リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を用いて切断可能である、項目９に記載のＣＡＲ。
（項目１１）
前記項目のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
（項目１２）
核酸構築物であって、項目１〜６のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ；
ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ；または
ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
（項目１３）
核酸構築物であって、項目７〜１０のいずれかに記載のＣＡＲをコードし、以下の一般構造：
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ；
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ１−Ｌ２−ＶＨ２−ＣＨ；または
ＶＨ１−Ｌ１−ＶＨ２−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ１−Ｌ２−ＶＬ２−ＣＬ−ｓｐａｃｅｒ−ＴＭ−ｅｎｄｏ
のうちの１つを有し、
ここで、
ＶＨ１は、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
Ｌ１およびＬ２は、同一でも異なっていてもよい切断性リンカーであり；
ＶＨ２は、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
ｓｐａｃｅｒは、スペーサーをコードする核酸であり；
ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のポリペプチドの同時発現を可能にする核酸配列であり；
ＶＬ１は、前記第１の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＶＬ２は、前記第２の結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である、核酸構築物。
（項目１４）
ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、またはＦａｂ抗原結合ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体もコードする、項目１２または１３に記載の核酸構築物。
（項目１５）
前記第２のキメラ抗原受容体が、以下の抗原：ＣＤ１９、ＦｃＲＬ５、およびＴＡＣＩのうちの１つに結合する、項目１４に記載の核酸構築物。
（項目１６）
項目９に記載の核酸配列または項目１２〜１５のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（項目１７）
項目１〜１０のいずれかに記載のＣＡＲを発現する細胞。
（項目１８）
項目１〜１０のいずれかに記載の第１のＣＡＲ、および項目１４または１５に定義の第２のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
（項目１９）
構成性に活性なサイトカイン受容体も発現する項目１７または１８に記載の細胞。
（項目２０）
項目１１に記載の核酸配列；項目１２〜１５のいずれかに記載の核酸構築物；または項目１６に記載のベクターを細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、項目１７〜１９のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
（項目２１）
項目１７〜１９のいずれかに記載の細胞の複数を、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物。
（項目２２）
項目２１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
（項目２３）
前記がんが多発性骨髄腫である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
がんの処置で使用するための項目２１に記載の医薬組成物。
（項目２５）
がんを処置するための医薬組成物の製造における項目１７〜１９のいずれかに記載の細胞の使用。
【国際調査報告】
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