(57)【要約】  本教示の様々な細胞分析システムは、単一の生細胞の電気的および代謝的活性を、細胞内アドレス可能性、および単一の分析で約１０個の細胞〜約５００，０００個の細胞の同時データ獲得で測定することができる。本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、大規模に並列化されたアレイに組み込まれた２，０００万から６億６０００万のＣｈｅｍＦＥＴセンサーのあるセンサーアレイを有することができ、キロヘルツ（ｋＨｚ）範囲のデータ獲得速度で細胞の同時測定を提供することができる。本教示の様々なＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイは、化学分析物を検出して、細胞膜電位の変化を検出することができるので、本教示の様々な細胞分析システムはまた、細胞の制御された化学的および電気的調査を提供する。フレーム速度は、監視する画素のより小さなサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集される、センサーアレイデバイスの領域をウィンドウダウンすることによって増加されることができる。【選択図】図６Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分析システムであって、
化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）センサーのアレイを含むデバイスであって、前記センサーのアレイが、約８５０ｎｍ〜約３．３μのセンサーピッチを有し、前記デバイスが、細胞接着を促進するように処理された実質的に平面の表面を有する、デバイスと、
前記デバイス上に装着されたフローセルであって、前記細胞分析システムとの流体界面を前記デバイスに提供するように構成されている、フローセルと、
前記フローセルと流動連通している基準電極であって、前記センサーのアレイに安定した基準電位を提供するように構成されている、基準電極と、
電力電圧およびバイアス電圧、ならびに制御信号およびタイミング信号を前記デバイスに提供し、前記デバイスから獲得したデータをシステムプロセッサに提供するように構成されているアレイコントローラと、を備える、細胞分析システム。
【請求項２】
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーが、イオン選択性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサーである、請求項１に記載の細胞分析システム。
【請求項３】
前記ＩＳＦＥＴセンサーが、水素イオンに対して選択的である、請求項２に記載の細胞分析システム。
【請求項４】
前記細胞分析システムが、前記フローセルを通した制御可能な液体送達のために構成されている流体システムをさらに備える、請求項１に記載の細胞分析システム。
【請求項５】
前記表面が、コーティングで処理されている、請求項１に記載の細胞分析システム。
【請求項６】
前記コーティングが、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の細胞分析システム。
【請求項７】
前記コーティングが、基底膜マトリックス調製物である、請求項５に記載の細胞分析システム。
【請求項８】
前記デバイスが、前記センサーのアレイ上に配置されたマイクロウェル構造のアレイをさらに含み、各マイクロウェル構造が、少なくとも１つのセンサー上に配置されている、請求項１に記載の細胞分析システム。
【請求項９】
前記マイクロウェル構造が、前記センサーのアレイ内のセンサーのセンサープレートの幅の９０％以下である、請求項８に記載の細胞分析システム。
【請求項１０】
マイクロウェル構造の高さが、前記マイクロウェル構造の幅の約２倍〜約４倍である、請求項９に記載の細胞分析システム。
【請求項１１】
前記デバイスと流動連通している脱分極電極をさらに備え、前記脱分極電極が、前記細胞に電気刺激を適用するように構成されている、請求項１に記載の細胞分析システム。
【請求項１２】
細胞分析のための方法であって、
ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスのセンサーアレイ表面に細胞のサンプルをプレーティングすることであって、前記センサー表面が、細胞接着を促進するように調製され、前記細胞のサンプル中の各細胞が、前記センサーアレイ表面上に定義されたフットプリントを有する、細胞のサンプルをプレーティングすることと、
前記センサーアレイ表面にプレーティングされた前記細胞のサンプルの画像から関心領域を選択することであって、データ獲得のためのフレーム速度を定義することである、関心領域を選択することと、
前記定義されたフレーム速度で選択された前記関心領域のデータを獲得するように、細胞分析アプリケーションを実行することと、
前記細胞分析アプリケーションで前記選択された関心領域の結果を表示することと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記表示される結果が、少なくとも１つの細胞の電気顕微鏡画像である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記表示される結果が、少なくとも１つの細胞の時間応答曲線である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記フレーム速度が、約３０行の画素をカバーするフットプリントのある細胞に対して約１，２５０ｆｐｓである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記フレーム速度が、約４行の画素をカバーするフットプリントのある細胞に対して約４０，５００ｆｐｓである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記フレーム速度を定義することが、定義されたデバイスフレーム速度があるＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスを選択することである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記定義されたデバイスフレーム速度が、約１５ｆｐｓ〜約２４０ｆｐｓである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスが、約８５０ｎｍ〜約３．３μのセンサーピッチを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記関心領域を選択する前に、前記方法が、
前記センサーアレイ表面にプレーティングされた前記細胞のサンプルを、細胞膜の脱分極を引き起こす刺激に供することと、
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイに分散された各応答性細胞の電気顕微鏡画像を表示することと、をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイベースのシステムを使用する細胞画像化のための方法であって、
フローセルの中に装着されたＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスのセンサーアレイ表面に細胞のサンプルをプレーティングすることであって、前記細胞のサンプル中の各細胞が、前記センサーアレイ表面上にフットプリントを有する、細胞のサンプルをプレーティングすることと、
前記細胞のサンプルに対して実験を実行することであって、前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイベースのシステムが、前記実験中に前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイ内の各センサーの信号を出力するように構成される、実験を実行することと、
前記実験のための電気顕微鏡画像を表示することであって、前記電気顕微鏡画像が、前記実験中の選択された時間で前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイ内の各センサーの出力信号を含む、電気顕微鏡画像を表示することと、を含む、方法。
【請求項２２】
前記表示される電気顕微鏡画像が、前記細胞のサンプル中の少なくとも１つの細胞の画像を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの細胞の時間応答曲線を表示することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
表示される前記電気顕微鏡画像が、少なくとも１つの細胞の細胞流出の画像を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記実験を実行することが、前記細胞のサンプルを刺激に供することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞のサンプルを刺激に供することが、細胞応答を誘発するように前記フローセルを通して試薬を流すことを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞のサンプルを刺激に供することが、細胞応答を誘発する電気刺激を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記実験を実行することが、前記細胞のサンプルの自発的活動を監視することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイが、約８５０ｎｍ〜約３．３６μのセンサーピッチを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記センサーアレイ表面上の前記細胞のフットプリントが、約２個のセンサー〜約１２，６６８個のセンサーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記センサーアレイ表面上の前記細胞のフットプリントが、３行のセンサー中の約８個のセンサーから、約１１８行のセンサー中の約１２，６６８個のセンサーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスの各画素が、前記細胞のフットプリントの１２％の被覆から約０．００８％の被覆を提供する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記実験を実行した後に、
前記ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスの関心領域を選択することであって、前記関心領域が、少なくとも１つの関心細胞を含む、関心領域を選択することと、
前記関心領域の電気顕微鏡画像を表示することと、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
表示される前記電気顕微鏡画像が、前記関心領域内の少なくとも１つの細胞の画像を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記関心領域内の前記少なくとも１つの細胞の時間応答曲線を表示することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞のサンプルを前記センサーアレイ表面にプレーティングする前に、前記方法が、前記センサーアレイ表面への細胞接着を促進するように、前記センサーアレイ表面を処理することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記センサーアレイ表面を処理することが、前記センサーアレイ表面への細胞接着を促進する材料で前記センサーアレイ表面をコーティングすることを適用することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記コーティングが、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記コーティングが、基底膜マトリックス調製物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記コーティングが、原位置で前記センサー表面に適用される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／７３０，９６０号、および２０１９年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／８４８，８４２号の利益を主張する。このセクションにおいて指定されている両方の出願は、各々が全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
概要
細胞挙動の電気生理学的および代謝的表現型は、現代の細胞生物学における研究の重要な手段であり、例えば、人工組織、一次電池タイプ、および腫瘍学の発見などの分野の研究者にとっては満たされていない大きなニーズがある。細胞の興奮性の測定の成功は、現在、面倒なパッチクランプ法および微小電極ボルタンメトリー法によって妨げられている一方で、代謝機能の調査は、大規模な集団および生化学的ワークフローの技術的制限によって妨げられたままであり、単一の細胞の挙動の重要な測定基準にアクセスするために非効率的に展開されている。
【０００３】
細胞内の２０，０００個の遺伝子と２００，０００個のタンパク質の間で起こる可能性があるすべての相互作用を測定することは、不可能または実用的ではないが、単一の細胞レベルでのモデルシステムの研究は、癌、糖尿病、神経変性疾患などの病的状態の間の正常な細胞生理学および変化へのより深い洞察を提供するであろうことが、より明白になりつつある。単一の細胞研究対（ｖｓ）細胞集団研究の利点を強調する最近のアプリケーションは、例えば、トランスクリプトミクスと老化の研究、細胞内のシグナル伝達経路の研究、および代謝の生体エネルギー測定などを含む。
【０００４】
したがって、集団内の単一の細胞の調査のためのツールをエンドユーザーに提供することができ、ハイスループット多重方式で時間応答の細胞レベルの離散測定を可能にするシステムおよび方法が当技術分野で必要とされている。
【０００５】
本教示の特徴および利点のより良好な理解は、例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載、および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本教示のシステムおよび方法の様々な実施形態による、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）ベースの細胞分析システムを描写するブロック図である。
【図２Ａ】本教示の細胞分析システム上に配置された細胞の概略描写図である。
【図２Ｂ】本教示のセンサーデバイス上に配置された細胞の概略断面図である。
【図３】様々な細胞サイズにわたる細胞分析のためのＣｈｅｍＦＥＴシステム属性を表示する表である。
【図４Ａ】本教示による、様々な設計のセンサーおよび関連する構造の断面図である。
【図４Ｂ】本教示による、様々な設計のセンサーおよび関連する構造の断面図である。
【図４Ｃ】本教示による、様々な設計のセンサーおよび関連する構造の断面図である。
【図４Ｄ】細胞が、膜電位の脱分極のための条件下で調査され、その後、静止電位に戻る、ウェルのあるアレイデバイス（図４Ａおよび図４Ｂに示されている）対（ｖｓ）ウェルのないアレイデバイス（図４Ｃに示されている）でのＵ−２ＯＳ細胞応答の比較である。
【図５Ａ】本教示のシステムおよび方法の様々な実施形態による、ＣｈｅｍＦＥＴベースの細胞分析システムのセンサーアレイ、アレイコントローラおよびコンピュータインターフェースの様々な実施形態を描写するブロック図である。
【図５Ｂ】教示のシステムおよび方法の様々な実施形態による、ＣｈｅｍＦＥＴベースの細胞分析システムのセンサーアレイおよびアレイコントローラの様々な実施形態を描写するブロック図である。
【図６Ａ】本教示のシステムおよび方法の様々な実施形態による、細胞分析に関係するワークフローを描写するフロー図である。
【図６Ｂ】本教示のシステムおよび方法の様々な実施形態による、細胞分析に関係するワークフローを描写するフロー図である。
【図７Ａ】静止電位で膜を有する細胞のための時間応答曲線であり、その後、膜電位の脱分極のための条件下で調査され、静止電位に戻る。
【図７Ｂ】静止電位で膜を有する細胞のための時間応答曲線であり、その後、膜電位の脱分極のための条件下で調査され、静止電位に戻る。
【図８Ａ】図８Ｂにおいて示される時点でセンサーアレイから作成された細胞電気顕微鏡画像である。
【図８Ｂ】図８Ａの画像の線画レンダリングである。
【図９Ａ】各細胞タイプが、カルシウムイオンチャネル遮断薬（ｂｌｏｃｋｅｒ）ベラパミルで処理された、様々な電位依存性カルシウムチャネルサブユニットでトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されたＵ−２ＯＳ細胞（Ｃ3およびＣ4）と比較して、Ｕ−２ＯＳ細胞（Ｃ1およびＣ2）のための時間応答曲線を示す。
【図９Ｂ】図９Ａにおいて示されるように、Ｕ−２ＯＳ細胞（左）の応答がトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞（右）と比較される２つの関心領域を比較している、フレーム２５（１．７秒）に対応する時間で撮影された図９Ａの複合電気顕微鏡画像である。
【図９Ｃ】細胞の鮮明な画像を提供するように、細胞内の領域を示す四角が除去された、図９Ｂの複合電気顕微鏡画像である。
【図１０Ａ】いくつかの細胞（Ｃ1）が、休止状態（Ｃ2）に留まっている集団における脱分極応答対（ｖｓ）他の例示的な細胞を表す、４．５ｍＭのＫＣｌのパルスに供されたラット新生児細胞の電気顕微鏡画像である。
【図１０Ｂ】実験が、異なるデータ獲得速度で２つの異なるデバイスで実行された、４．５ｍＭのＫＣｌのパルスに供されたラット新生児細胞の時間応答曲線の比較である。
【図１１】いくつかの例示的な細胞が、細胞流出に関連して示されている、ミトコンドリア毒素であるカルボニルシアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）に供されたＨＥＰＧ２細胞の電気顕微鏡画像である。
【図１２Ａ】ＦＣＣＰで処理されたＵ−２ＯＳ細胞の平均背景減算時間用量応答曲線を示す。
【図１２Ｂ】ＦＣＣＰで処理する前にオリゴマイシンを包含する栄養溶液で前処理したＵ−２ＯＳ細胞の平均背景減算時間用量応答曲線を示す。
【図１３Ａ】ＦＣＣＰに供された異なる細胞タイプの混合物についての平均背景減算時間用量応答曲線である。
【図１３Ｂ】ＦＣＣＰに供された異なる細胞タイプの混合物についての平均背景減算時間用量応答曲線である。
【図１３Ｃ】ＦＣＣＰに供された異なる細胞タイプの混合物についての平均背景減算時間用量応答曲線である。
【図１４Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｃにおいて提示される細胞の混合物中の選択された細胞の時間用量応答曲線を示す。
【図１４Ｂ】フレーム４０（２．７秒）に対応する時間で撮影された図１４Ａの実験の電気顕微鏡画像である。
【図１４Ｃ】細胞の鮮明な画像を提供するように、図１３Ｂの細胞内の四角が除去された、図１４Ｂの電気顕微鏡画像である。
【図１５Ａ】連続的な時点で様々な電位依存性カルシウムチャネルサブユニットでトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞（Ｃ3およびＣ4）の電気顕微鏡画像である。
【図１５Ｂ】連続的な時点で様々な電位依存性カルシウムチャネルサブユニットでトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞（Ｃ3およびＣ4）の電気顕微鏡画像である。
【図１５Ｃ】図１５Ａおよび図１５Ｂの時点を含む間隔にわたる時間応答曲線である。
【図１６】図７Ａ〜図１５Ｃの細胞株の細胞分析のためのＣｈｅｍＦＥＴシステム属性を表示した表である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本教示のシステムおよび方法は、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）センサーアレイ技術に基づく細胞分析システムに関係している。本教示の様々な細胞分析システムは、単一の生細胞の電気的および代謝的活性を、細胞内アドレス可能性、および単一の分析で約１０個の細胞〜約５００，０００個の細胞の同時データ獲得で測定することができる。本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、大規模に並列化されたアレイに組み込まれた２０００万〜６億６０００万のＣｈｅｍＦＥＴセンサーがあるセンサーアレイを有することができ、センサーアレイのセンサーが、それぞれ、約３．３６μｍ〜約８５０ｎｍのピッチを有することができる。さらに、本教示の様々な細胞分析システムは、キロヘルツ（ｋＨｚ）範囲のデータ獲得速度で細胞の同時測定を提供することができる。そのうえ、本教示の様々な細胞分析システムに統合された完全に自動化された流体システムは、例えば、様々なタイプの化学的調査に対する細胞応答の測定が示される様々な研究で使用される化学薬品の、厳密に制御されたアプリケーションを可能にする。本教示の様々なＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイは、化学的分析物を検出し、細胞膜電位の変化を検出することができるので、制御された電気刺激を使用して、本教示の様々な細胞分析システムにおいて細胞を調べることもできる。
【０００８】
細胞分析のための化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）アレイ
図１は、概して、本教示による、細胞分析システム１００の例示的な構成要素のブロック図を示している。図１に描写されるように、細胞分析システム１００は、様々な流体システム、ならびにアレイコントローラ５０、ユーザーインターフェース６０、およびセンサーアレイデバイスアセンブリ１１５を含むことができる。本明細書でより詳細に記載されるように、様々な細胞分析は、センサーアレイデバイスアセンブリ１１５のセンサーアレイデバイス１１０を使用して実行されることができる。
【０００９】
図２Ａは、概して、細胞分析システム１００Ａの写実描写を示している。図２Ａに描写されるように、核２および細胞膜４のある細胞５は、マイクロウェルの複数のサブセット上に配置され、それにより、細胞５が対応するセンサーのサブセット上に占める、接触またはフットプリントの領域を定義する。本明細書に列記されているように、「接触領域」および「フットプリント」は、交換可能に使用されることができる。細胞分析システム１００Ａは、図１の細胞分析システム１００の概略描写について記載されたのと同じ特徴の多くを共有している。図２Ａの細胞分析システム１００Ａは、試薬流体システム１０および洗浄溶液流体システム２０を含むことができる。試薬流体システム１０は、図２Ａの試薬容器１１Ａ〜１１Ｄなどの、複数の試薬容器を含むことができる。各試薬容器は、図２Ａの、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｄなどの、試薬流体ラインと流体連通されることができる。本教示の細胞分析システムの各試薬流体ラインからの流動は、図２Ａの試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｄなどの、バルブによって制御されることができる。洗浄溶液流体システム２０は、既知の電解質組成の洗浄溶液を収容することができる洗浄溶液容器２１、ならびに洗浄溶液流体ライン２３、洗浄溶液流体ラインバルブ２５、および洗浄溶液流体ライン２３内の基準電極２７を含むことができる。本明細書でより詳細に記載されるように、基準電極２７は、センサーアレイデバイス内のセンサーに安定した基準電圧１２７を提供することができる。そのため、図２Ａのセンサーアレイデバイス１１０は、試薬流体システム１０および洗浄溶液流体システム２０と流体連通されることができる。図２Ａには示されていないが、センサーアレイデバイスと連通されることができる、追加の電極は、図２Ａの細胞５などの、センサーアレイ上の細胞に電気刺激を提供するように、利用されることができる。
【００１０】
センサーアレイデバイス１１０は、センサーアレイまたは画素アレイ１２０を含むことができる。本明細書に列記されているように、「センサー」および「画素」という用語、ならびに「デバイス」および「チップ」という用語、ならびにこれらの用語の派生物は、交換可能に使用されることができる。追加的に、「センサーアレイ」および「ＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイ」、ならびにそれらの派生物は、交換可能に使用されることができる。図２Ａには通常のアレイとして２次元アレイが描写されているが、本教示のセンサーアレイの様々な実施形態は、様々なアレイ形状、例えば、六方最密充填形状に配置されることができる。センサーアレイデバイス１１０は、マイクロウェルアレイ１２２を含むことができ、これは、図２Ａに示されるように、センサーアレイ１２０内の各センサーまたは画素と協調的に係合する各マイクロウェルを描写し、その結果、マイクロウェル１２２Ａ１からマイクロウェル１２２Ａ６の各々は、対応するセンサー１２０Ａ１からセンサー１２０Ａ６と協調的に係合する。しかしながら、本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態では、ウェルごとに２つ以上の画素が存在することができる。本明細書でより詳細に記載されるように、本教示の様々なタイプのセンサーアレイデバイスは、定義されているが異なるマイクロウェルの深さで製造されることができる。本教示のさらに他のタイプのセンサーアレイデバイスは、センサーアレイ上に形成されたマイクロウェル構造を有さないことがあり得る。センサーアレイ１２０の各センサーは、マイクロウェルアレイ１２２内の流体と流体連通する感知表面を有することができる。本教示の細胞分析システム１００の様々な実施形態では、センサーアレイ１２０の各センサーは、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）であり得、センサーアレイ１２０内の各センサーが、少なくとも１つの化学感応性電界効果トランジスタを含む。本教示によれば、センサーアレイ１２０は、例えば、グルコース、スクロース、乳酸塩および尿素などの、細胞生物学の対象となる標的化学種の分析のために選択的に改変された感知表面で製造されることができる、ＣｈｅｍＦＥＴを含むことができる。別の非限定的な例として、イオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）は、関心のある様々なイオン、特に、水素、カリウム、カルシウムおよび塩化物などの様々な細胞代謝研究に対して選択的であるように変更された感知表面を有することができる。
【００１１】
その点に関して、本発明者らは、本教示の細胞分析システムの様々な実施形態が、例えば、様々な条件または刺激のいずれかに供された細胞の細胞電気生理学および代謝の変化を監視するように使用されることができることを認識した。そのうえ、本発明者らは、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの感知表面の電位の変化を引き起こすことができる細胞の状態における変化が、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイの様々な実施形態のセンサーによって監視されることができることを認識した。例えば、本発明者らは、細胞膜を横切る電位が、化学的または電気的刺激に応答して変化すると、細胞膜を横切る電位の変化が、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイの様々な実施形態のセンサーによって検出されることができるように、細胞が、センサーの感知表面に容量的に結合されていることを認識している。追加的に、任意の変化、例えば、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの感知表面の電位の変化を引き起こし得る細胞代謝における変化は、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイの様々な実施形態のセンサーによって検出され得る。本明細書でより詳細に記載されるように、そのような変化は、例えば、状態または刺激に応答して細胞から流れる可能性のある細胞流出の場合など、センサーアレイ表面上に固定された細胞の接触領域またはフットプリントに関連して局所的に検出することができ、または細胞フットプリントに関連しない領域で検出することができる。
【００１２】
本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスの様々な実施形態での、様々な刺激への細胞応答を監視する実験において収集されたデータは、多数の形式でエンドユーザーに提示されることができる。１つの形式において、時間応答は、時間の関数としての感知表面電位におけるミリボルト（ｍＶ）変化と容易に相関されることができる、検出器カウントとして提示される。別の形式において、選択されたアプリケーションの過程にわたる選択された時間のいずれかについて、細胞の空間的視覚化は、電気顕微鏡画像として提示されることができる。本発明者らは、電気顕微鏡画像化が、生細胞に対して誘発されることができる、様々な応答に基づいているので、例えば、センサーアレイ上の細胞を視覚化するための一般的なツールとして有用であることができることを認識した。例えば、センサーアレイに固定された細胞の電気顕微鏡画像を確認することによって、エンドユーザーは、実験を実行する前にアプリケーション構成の一部として関心領域を選択することができる。本明細書でより詳細に記載されるように、センサーアレイデバイスの選択された領域をウィンドウダウンすることにより、実験のデータ速度が増加する。本教示によれば、高いデータ速度と結合された細胞のフットプリントにわたる実質的な画素被覆は、例えば、サブミリ秒範囲のデータ速度が必要とされ得る、様々な興奮性細胞の活動電位の細胞内監視を提供することができる。
【００１３】
図２Ｂにおいて、センサーアレイ１２０の部分断面図は、第１のセンサー１２０−１および第２のセンサー１２０−２とともに描写されている。本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態において、センサーアレイ１２０は、センサーフローティングゲート構造１４０に結合されたフローティングゲート上部１３０を含むことができる。代替的に、本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態では、センサーアレイ１２０は、センサーフローティングゲート構造１４０を含むことができる。本明細書でより詳細に記載されるように、フローティングゲート上部１３０は、誘電体１３５において形成された、上部金属層、センサープレート１３２、ならびに金属ビア１３４を含むことができる。
【００１４】
センサーフローティングゲート構造１４０は、金属ビア１３４を通ってセンサープレート１３２に結合された金属層１３６を有することができる。金属層１３６は、センサーフローティングゲート構造１４０における最上部のフローティングゲート導体である。図示の例において、センサーフローティングゲート構造１４０は、誘電体材料１５０の層内に導電性材料の複数の層を含む。センサー１２０−１および１２０−２は、半導体基板１６０内にソース／ドレイン領域１４２およびソース／ドレイン領域１４４を含む導通端子を含むことができる。ソース／ドレイン領域１４２およびソース／ドレイン領域１４４は、基板１６０の導電率タイプとは異なるタイプの導電率を有するドープされた半導体材料を含む。例えば、ソース／ドレイン領域１４２およびソース／ドレイン領域１４４は、ドープされたＰ型半導体材料を含むことができ、基板１６０は、ドープされたＮ型半導体材料を含むことができる。チャネル領域１５２は、ソース／ドレイン領域１４２およびソース／ドレイン領域１４４を隔てる。フローティングゲート構造１４０は、チャネル領域１４６を覆い、ゲート誘電体１５２によって基板１６０から隔てられている。ゲート誘電体１５２は、例えば、二酸化ケイ素であることができる。代替的に、他の適切な誘電体、例えば、より高い誘電率を有する材料、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、窒化ケイ素（Ｓｉ3Ｎ4）、酸窒化ケイ素（Ｓｉ2Ｎ2Ｏ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、二酸化ハフニウム（ＨｆＯ2）、酸化スズ（ＳｎＯ2）、酸化セシウム（ＣｅＯ2）、酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化タングステン（ＷＯ3）、酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）、酸化ランタン（Ｌａ2Ｏ3）、酸化ガドリニウム（Ｇｄ2Ｏ3）、およびそれらの任意の組み合わせなどの、他の適切な誘電体をゲート誘電体１５２に使用することができる。
【００１５】
本明細書でより詳細に記載されるように、センサープレート１３２の感知表面１２６Ｓは、例えば、様々な条件または刺激のいずれかに供された細胞の細胞電気生理学および代謝の変化を監視するためのセンサー表面として機能することができる。その点に関して、細胞の部分断面として図２Ｂにおいて示される細胞５は、センサー１２０−１および１２０−２のセンサープレート１３２上に配置されるように描写されている。細胞５は、表面コーティング１２４を介してセンサーアレイ１２０に固定されているように描写されている。表面コーティング１２４は、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびそれらの組み合わせを含む様々な生体高分子材料、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の様々な調製物などの、任意の細胞適合性材料であることができる。エンドユーザーは、図２Ｂの上部で矢印によって示されるように、様々な試薬および溶液がセンサーアレイ１２０の表面上に制御可能に流動することができる、本教示の細胞分析システムを使用してアプリケーションを実行することができる。
【００１６】
センサー１２０−１および１２０−２は、フローティングゲート１４０の電圧における変化を引き起こすことができる、感知表面１２６Ｓに近接するイオン層１２８の表面電位における変化に応答する。そのため、印加基準電圧は、図２Ａについて本明細書で前述されたように、フローティングゲート電圧における小さな変化がチャネル領域１４６を通って流動する電流を引き起こすことができるという条件で、フローティングゲートの電圧が閾値電圧を超えることを保証し、センサー１２０−１および１２０−２の出力信号における結果をもたらす。その点に関して、イオン層１２８の表面電位への変化は、例えば、ソース領域１４２とドレイン領域１４４との間のチャネル領域１４６内における電流を測定することによって測定されることができる。そのため、センサー１２０−１および１２０−２は、ソース領域１４２またはドレイン領域１４４に接続されたアレイライン上に電流ベースの出力信号を直接的に提供するように、または電圧ベースの出力信号を追加的回路で間接的に提供するように、使用されることができる。
【００１７】
本明細書で記載されるように、イオン層１２８における表面電位を変えることができる、細胞５の状態における変化は、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスの様々な実施形態によって監視されることができる。出力信号に関して、表面電位を増加させることができる、細胞活動は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの正の振幅の出力信号をもたらし、一方、表面電位を減少させることができる、細胞活動は、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの負の振幅の出力信号をもたらす。その点に関して、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの表面電位を変化させることができる、細胞の状態における変化は、測定可能な出力信号をもたらすことができる。例えば、ＩＳＦＥＴセンサーが選択的である、カチオン種のイオン濃度を増加させることができる、代謝活動は、表面電位における増加を引き起こす。その結果は、そのＩＳＦＥＴセンサーの正の振幅の出力信号になる。逆に、ＩＳＦＥＴセンサーが選択的である、カチオン種のイオン濃度を低下させることができる、代謝活性は、表面電位における低下を引き起こす。その結果は、そのＩＳＦＥＴセンサーの負の振幅の出力信号になる。別の例において、表面電位は、センサーアレイ１２０への細胞５の容量結合によって変更されることができ、その結果、細胞膜４を横切る電位が、化学的または電気的刺激に応答して変化すると、細胞膜を横切る電位の変化が、ＣｈｅｍＦＥＴセンサー１２０−１および１２０−２によって検出されることができる。
【００１８】
【表１】
2022500634.tif 000003
【００１９】
本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態は、約２０Ｍ〜約６６０Ｍ画素を有することができ、各センサー間の中心間間隔、またはピッチで、約８５０ｎｍ〜約３．３６μｍである。データ収集に関して、アレイにおけるすべてのセンサーからのセンサー出力信号の収集は、データのフレームを構成する。約２０００万画素〜約６億６０００万画素での本教示の様々なセンサーアレイデバイスでは、のフレームは、秒あたりのフレームとしてヘルツ（Ｈｚ）の単位で収集される、かなりのサイズのデータファイルである。さらに、画素数を表す選択された関心領域と、データが収集されることができる速度との間には反比例の関係があるため、監視する画素のより小さなサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサーアレイデバイスの領域をウィンドウダウンすることによって、フレーム速度が増加されることができる。ウィンドウダウンの影響は、デバイス全体からデータを収集するための最大フレーム速度である、最後から２番目の列に入力された値と、デバイスの単一の行からデータを収集するため最大フレーム速度である、最後の列に入力された値との比較によって、表Ｉにおいて明示される。そのため、単一の行からデータを収集するようにウィンドウダウンすることによって、フレーム速度は、実質的に増加される。
【００２０】
追加的に、表Ｉにおいて提供されているように、デバイスＡとデバイスＢの唯一の相違は、デバイスあたりのセンサーの総数であり、デバイスＡと対比したデバイスＢあたりのセンサーの数は、２倍である。表１において示されるように、デバイスＢに対するフレーム速度は、デバイスＡの半分であり、画素数と収集されることができるデータでの速度との間で、反比例関係と一致する。そのため、アプリケーションに適合した望ましいフレーム速度があるデバイスが、選択されることができる。
【００２１】
したがって、本教示の細胞分析システムの様々な実施形態では、エンドユーザーは、関心のある細胞分析に一致させることができる、異なる属性を有する様々なセンサーアレイデバイスからセンサーアレイデバイスを選択することができる。例えば、細胞の電気生理学的活動の検出に使用されるセンサーアレイデバイスは、代謝研究のための特定の分析物の検出に使用されるセンサーアレイデバイスとは異なる属性を有することができる。
【００２２】
本教示の様々なセンサーアレイデバイスを提供するように変更されることができる、センサーアレイデバイス属性は、画素寸法、ならびにデータがセンサーアレイデバイスから収集されることができる速度を含む。図３は、デバイスＢからデバイスＥについて表１において与えられているように、様々なセンサー（画素）寸法の４つの例示的なセンサーアレイデバイスに関係するサイズによる細胞の５つのカテゴリーの概要を提供する。細胞の５つのカテゴリーは、平均直径および平均フットプリントだけでなく、記述的に識別される。
【００２３】
図３の精査によって、平均直径が５μｍおよび平均面積が２０μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定された極小細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約１行および約２画素に対応し、チップ４デバイスでは６行および３２画素に増加する。同様に、平均直径が１０μｍおよび平均面積が７８μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定された小形細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約３行および約８画素に対応し、チップ４デバイスでは１２行および１２６画素に増加する。平均直径が２５μｍおよび平均面積が４９１μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定された中形細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約７行および約５０画素に対応し、チップ４デバイスでは２９行および７９２画素に増加する。平均直径が５０μｍおよび平均面積が１，９６４μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１では約１５行および約２０１画素に対応する最小接触面積またはフットプリントを有することができ、チップ４デバイスでは５９行および３，１６８画素に増加する。最後に、平均直径が１００μｍおよび平均面積が７，８５４μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定された特大細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約３０行および約８０３画素に対応し、チップ４デバイスでは１１８行および１２，６６８画素に増加する。図３の精査から、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、画素被覆が増加する傾向にある。
【００２４】
画素の観点から、パーセント画素被覆の列は、単一の画素がカバーする、細胞の面積のパーセンテージである。センサーアレイ表面上に固定された極小細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは５０％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、３％の被覆に対応する。同様に、センサーアレイ表面上に固定された小形細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは１２％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．８％の被覆に対応する。センサーアレイ表面上に固定された中形細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは２％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．１％の被覆に対応する。センサーアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１デバイスでは０．５％の被覆に対応する単一の画素を有することができるが、チップ４デバイスでは単一の画素は、０．０３％の被覆に対応する。最後に、センサーアレイ表面上に固定された特大細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは０．１％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．００８％の被覆に対応する。図３の精査から、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、画素あたりの細胞被覆のパーセンテージが減少する傾向にある。
【００２５】
図３の表に提示されたものを考慮すると、本教示の例示的なセンサーアレイデバイスの画素被覆の選択は、様々な平均細胞直径に対して行われる行ことができる。例えば、約５μｍ〜約１００μｍの細胞では、センサーアレイデバイスの選択は、センサーアレイ表面上に固定された細胞の対応するフットプリントに対して、３行の画素を越える約８画素から１１８行の画素を超える１２，６６８画までの被覆を提供するように行われることができる。細胞サイズのその範囲にわたって、画素サイズが変化することができるので、選択されたセンサーアレイデバイスの各画素は、細胞の約１２％から細胞の約０．００８％までをカバーすることができる。図３に提示されたデータに基づいて、任意の細胞サイズでは、細胞がセンサーアレイデバイス上で占めることができる、接触領域に関連するかなりの数のセンサーを提供することができる、例示的なセンサーアレイデバイスを選択できることは、明らかである。本教示の様々なセンサーアレイデバイスによって提供されることができる、空間分解能は、信号の細胞内識別を可能にすることができ、それゆえ、細胞内分析を提供している。
【００２６】
データ収集に関して、本教示の様々な細胞分析システムでは、アレイにおけるすべてのセンサーからのセンサー出力信号の収集は、データのフレームを構成する。本教示の様々なセンサーアレイデバイスが約２０００万画素〜約６億６０００万画素を有することができることを考えると、本教示の様々なセンサーアレイデバイスからのデータのフレームは、かなりのサイズのデータファイルである。追加的に、本教示の様々な細胞分析システムは、毎秒センサーアレイデバイスから、かなりの数のデータフレームを生成するように構成されている、センサーアレイデバイスに結合された制御回路を含む。そのうえ、選択された関心領域と、データが収集されることができる速度との間には反比例の関係があるため、監視する画素のより小さなサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサーアレイデバイスの領域をウィンドウダウンすることによって、フレーム速度が増加されることができる。
【００２７】
例えば、表Ｉを参照すると、４，０００万画素のあるセンサーアレイデバイスは、約１２０フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でデータを収集することができる。その後、２，０００万画素の関心領域が選択されると、約２４０フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でのデータは、収集されることができ、単一のセンサーアレイ行の関心領域が選択されると、約７５，０００フレーム／秒（ｆｐｓ）のフレーム速度でのデータは、収集されることができる。具体的には、図３に提示された本教示の例示的なセンサーアレイデバイスに関して、センサーの行あたりの最大フレーム速度は、最後から２番目の列において提供される。最後の列において、行ごとの最大フレーム速度を細胞直径あたりの行で割ることによって導き出される、細胞によってカバーされる行の小数部分について、データが収集されることができる、最大フレーム速度は、提示される。
【００２８】
図３の最後の列の精査によってわかるように、秒あたりのかなりの数のフレームは、様々な細胞サイズにわたって対象の標的領域について、収集されることができ、ｋＨｚ範囲内で快適にデータ収集を提供する。センサーアレイ表面上に固定された極小細胞では、データは、チップ１デバイスでは７５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、２７，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。同様に、センサーアレイ表面上に固定された小形細胞では、データは、チップ１デバイスでは２５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、１３，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。センサーアレイ表面上に固定された中形細胞では、データは、チップ１デバイスでは１０，７１４ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、５，５８７ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。センサーアレイ表面上に固定された大形細胞は、チップ１デバイスでは５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度を有することができるが、チップ４ではデータは、２，７４６ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。最後に、センサーアレイ表面上に固定された特大細胞では、データは、チップ１デバイスでは２，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、１，３７３ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。
【００２９】
図３の精査から、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、フレーム速度が減少する傾向にあり、これは、選択された関心領域と収集されることができるデータでの速度との間で、反比例関係と一致する。そのため、監視する画素のより小さなサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサーアレイデバイスの領域をウィンドウダウンすることによって、フレーム速度が増加されることができる。追加的に、表１を参照して、アプリケーションに一致する望ましいフレーム速度のあるデバイスは、選択されることができる。
【００３０】
変化されることができる、追加のセンサーアレイデバイス属性は、本教示の様々なセンサーアレイデバイスに関連付けられることができる、様々なタイプのマイクロウェル構造に関係する。図２Ａのセンサーアレイ１２０上に配置されたマイクロウェルアレイ１２２に関して、マイクロウェルアレイは、マイクロウェルごとに少なくとも１つのセンサーまたは画素があることができる、センサーアレイ上に製造されることができる。本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態では、マイクロウェルごとに複数のセンサーまたは画素があることができる。
【００３１】
図４Ａから図４Ｃは、図２Ａのセンサーアレイ１１０などの、センサーアレイデバイスの上部の、概して拡大された部分断面図を示す。図４Ａのセンサーアレイ１２０は、マイクロウェルアレイ１２２Ａが製造された、本教示のセンサーアレイの実施形態の部分断面図である。マイクロウェルアレイ１２２Ａのすべてのマイクロウェルを例示する、例示的なマイクロウェル１２２Ａ１は、様々な化学分析物がセンサーから拡散するのを防ぐことができる収容構造である、側壁１２４Ａ、例えば、センサーの近位の細胞によって放出される関心のある分析物を有することができる。図４Ｂのセンサーアレイ１２０は、マイクロウェルアレイ１２２Ｂが形成された、本教示のセンサーアレイの実施形態の部分断面図である。例示的なマイクロウェル１２２Ｂ１は、図４Ａのマイクロウェルアレイ１２２Ａよりも実質的により浅いマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイを提供する、側壁１２４Ｂを有する。図４Ｃは、センサーアレイ１２０Ｃ上に作製されたマイクロウェルアレイを有さない、本教示のセンサーアレイの実施形態の部分断面図である。
【００３２】
図４Ｄは、細胞が、膜電位の脱分極のための条件下で調査され、その後、静止電位に戻る、ウェルのあるアレイデバイス（図４Ａおよび図４Ｂに示されている）対（ｖｓ）ウェルのないアレイデバイス（図４Ｃに示されている）でのＵ−２ＯＳ細胞応答の比較である。測定された細胞電位の変化が、センサーからの細胞の距離の二乗として低下することを考えると、距離は、図４Ｂのマイクロウェルアレイ１２２Ｂなどの、浅いマイクロウェルのあるセンサーアレイを使用することによって、または図４Ｃのセンサーアレイ１２０などをまったく使用しないことによって、最小化されることができる。図４Ｄに示される比較は、ウェルのないデバイスの応答の大きさの増加を例示している。
【００３３】
様々なタイプのセンサーアレイデバイスでは、各センサー間の中心間の間隔、またはピッチは、約８５０ｎｍ〜約３．３６μｍであることができるが、センサープレート１３２は、約６００ｎｍ〜約３．１μの幅を有することができる。本教示によれば、センサープレート上のマイクロウェルの底部でのマイクロウェルの幅は、センサープレート１３２の幅の約９０％を超えることはできない。非限定的な例として、図４Ａ〜図４Ｃのセンサープレート１３２などの、幅が約６００ｎｍのセンサープレートでは、様々なマイクロウェルアレイは、センサープレート上のマイクロウェルの底部で約５４０ｎｍの幅を有することができ、一方、幅が３．１μのセンサープレートでは、様々なマイクロウェルアレイは、センサープレート上のマイクロウェルの底部で約２．８μの幅を有することができる。本教示によれば、マイクロウェルアレイの様々な実施形態では、マイクロウェルの幅と高さとの比率は、約１：２〜約１：４であることができる。非限定的な例として、幅が約５４０ｎｍのマイクロウェルを有する様々なマイクロウェルアレイでは、マイクロウェルの高さは、約１．１μまでであることができ、一方、幅が約２．８μのマイクロウェルを有する様々なマイクロウェルアレイでは、マイクロウェルの高さは、約５．６μまでであることができる。追加の非限定的な例として、幅が約５４０ｎｍのマイクロウェルを有する様々なマイクロウェルアレイでは、マイクロウェルの高さは、約２．２μまでであることができ、一方、幅が約２．８μのマイクロウェルを有する様々なマイクロウェルアレイでは、マイクロウェルの高さは、約１１．２μまでであることができる。非限定的な例が与えられているが、本教示のマイクロウェルアレイの様々な実施形態は、幅と高さとの任意の比率が約１：２〜約１：４であることができる。
【００３４】
図４Ａから図４Ｃでは、フローティングゲート構造の上部の部分断面図は、フローティングゲート上部１３０として描写されている。フローティングゲート構造を組み込んだセンサーアレイの様々な実施形態は、例えば、米国特許第９，１２８，０４４号および米国特許第９，８４１，３９８号に記載されており、これらは両方とも、各々が全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３５】
図４Ａから図４Ｃのフローティングゲート上部１３０は、上部金属層、センサープレート１３２、ならびに金属ビア１３４および金属層１３６を含むことができ、これらはすべて、誘電体基板１３５で形成される。パッシベーション層１２６は、マイクロウェルアレイの各マイクロウェルを定義する表面上に連続的な最上層を形成するように堆積されることができる。感知表面１２６Ｓは、センサープレート１３２上に形成されたパッシベーション層の一部である。金属層１３２、１３４、および１３６は、適切な金属材料または、例えば、チタン、銀、金、白金、およびタングステンの合金であることができる。誘電体基板１３５は、二酸化ケイ素または窒化ケイ素などの、誘電体材料であることができる。パッシベーション層１２６は、酸化チタン、窒化チタン、および酸窒化チタンなどの、金属酸化物層であることができる。ＣｈｅｍＦＥＴデバイスの様々な実施形態では、図４Ａから図４Ｃの感知層１２６Ｓなどの、感知層と接触する溶液との間に形成される固液界面での電位における変化は、フローティングゲート上の電圧における変化を引き起こすことができる。印加基準電圧は、図２Ａについて本明細書で前述されたように、フローティングゲート電圧における小さな変化が、例えば、図２Ｂのセンサーアレイ１２０のセンサー１２０−１および１２０−２などのセンサーに対して出力信号をもたらすという条件で、フローティングゲートの電圧が閾値電圧を超えることを保証する。
【００３６】
様々な変更は、関心のある様々な分析物、例えば、様々な細胞代謝および栄養研究のための関心のある分析物に選択性を提供するように、感知表面の組成に作られることができる。例えば、様々なイオンの検出は、パッシベーション層自体を使用することを通して、またはパッシベーション層にコーティングされたイオノフォア（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）を使用することを通して達成されることができる。例えば、水素イオンは、酸化チタン、窒化チタン、または酸窒化チタンであることができる、図４Ａから図４Ｃの感知層１２６Ｓなどの、感知層を変更することなく検出されることができる。カリウムイオンは、例えば、バリノマイシンまたはサリノマイシンで感知層をコーティングすることによって選択的に検出されることができる。ナトリウムイオンは、例えば、モネンシン、ナイスタチン、または合成イオノフォア、ＳＱＩ−Ｐｒ（ＣＡＳ＃１０２２５９５−１６−９）で感知層をコーティングすることによって選択的に検出されることができる。カルシウムイオンは、例えば、イオノマイシン、カルシマイシン、またはＥＴＨ１００１（ＣＡＳ＃５８８０１−３４−６）で検知層をコーティングすることによって選択的に検出されることができる。追加的に、様々な分析では、イオノフォアの選択性は、単一の種に対して行われる必要はないかもしれないが、そのうえ、イオンの属内における複数の種のイオンに結合することができる。例えば、ビューベリシン（ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）で感知層をコーティングすることによって、カルシウムおよびバリウムイオンは、検出されることができ、一方、ニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）で感知層をコーティングすることによって、カリウム、水素および鉛イオンは、検出さることができる。グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）は、水素、ナトリウム、カリウムイオンを検出するように、検知層にコーティングされることができる。本教示によれば、イオンの属に対して選択性を有する様々なイオノフォアは、単一のイオン特異性が必要とされない、または化合物が結合する他のイオンが存在または生成される可能性が低い、アプリケーションで使用されることができる。追加的に、様々なクラスの光硬化性ポリマーは、カリウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硝酸塩などの、様々なイオン、およびグルコース、スクロース、尿素など、細胞生物学研究の対象となる様々な分析対象物に選択性を提供することができる（例えば、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２００９，９，７０９７−７１００を参照）。
【００３７】
センサープレートと接触しているパッシベーション層の感知表面部分の組成を変えることによって、様々な分析物に検出選択性を提供することに加えて、パッシベーション層は、図２Ｂにおいて描写されるように、細胞適合性を提供する材料で処理されることができる。追加的に、図２Ａにおいて描写されるように、センサーアレイ上に配置されたマイクロウェルアレイのあるセンサーアレイデバイスのセンサー表面は、マイクロウェルアレイを含むセンサーアレイ表面上に細胞適合性材料をコーティングすることによって処理されることができる。本教示のセンサーアレイデバイスの様々な実施形態をコーティングするために、エンドユーザーは、興味のある細胞株および一連の実験に最も適し得る、様々な細胞適合性材料から特定の材料を選択することができ、細胞のサンプルのあるセンサーアレイを準備する前に、細胞適合性材料のあるセンサーアレイ表面をコーティングすることができる。センサーデバイス表面にコーティングされることができる、例示的な細胞適合性材料は、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびそれらの組み合わせなどの様々な生体高分子材料、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の様々な調製物を含む。
【００３８】
センサーアレイ上に細胞適合性コーティングを提供することは、図２Ａおよび図２Ｂにおいて描写されるように、様々なタイプの細胞がセンサーアレイ表面上に固定することができる、界面を提供することができる。細胞が安定して固定されると、例えばフローセルに栄養溶液を流すことによって、継続的にリフレッシュされる栄養溶液を提供することによって、細胞は、成長および分裂することができる。
【００３９】
したがって、本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、標的細胞分析のために選択されることができる、様々なセンサーアレイデバイスを提供することができる、色々な属性を有することができる。そのような属性は、センサーアレイ上に製造されたマイクロウェルアレイの有無、マイクロウェルアレイを含むセンサーアレイデバイス用のマイクロウェルアレイ内の各マイクロウェルの深さ、化学分析の選択性を提供する感知表面の表面処理の性質、細胞互換コーティング、画素ピッチおよびサイズを提供するセンサーアレイデバイスの表面処理のタイプ、ならびにデータが収集されることができる速度、を含むことができる。非限定的な例として、本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、センサーアレイ上に配置されたマイクロウェルアレイを有することができ、またはセンサーアレイ上に配置されたマイクロウェルアレイを有さないことができる。本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、細胞分析において関心のある様々な化学分析物に対して選択性を提供する、感知表面を有することができる。このようなセンサーアレイデバイスは、例えば、様々な細胞代謝および電気生理学的研究において使用されることができ、様々な自発的および時間細胞活動を監視することを提供することができる。
【００４０】
細胞分析用の化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）アレイベースのシステム
本明細書で前述したように、図１は、概して、本教示による、細胞分析システム１００の例示的な構成要素のブロック図を示している。図１において描写されるように、細胞分析システム１００は、様々な流体システム、ならびにアレイコントローラ５０、ユーザーインターフェース６０、およびセンサーアレイデバイスアセンブリ１１５を含むことができる。
【００４１】
センサーアレイデバイス１１０上で様々な細胞分析を実行するための流体送達および制御に関して、細胞分析システム１００は、試薬流体システム１０、洗浄溶液流体システム２０、流体マルチプレクサシステム３０、およびバルブコントローラ４０を含むことができる。追加的に、フローセル１０７が、センサーアレイデバイス１１０上の様々な試薬および洗浄溶液の流路を定義することができるので、フローセル１０７は、細胞分析システム１００の流体工学システムの不可欠な部分である。本教示による、試薬流体システム１０は、フローセル入口ライン１０３Ａを介してセンサーアレイデバイス１１０との制御可能な流体連通に配置されることができる、試薬容器１１Ａ〜１１Ｎなどの、複数の試薬容器を含むことができる。試薬流体システム１０は、それぞれ、試薬容器１１Ａ〜１１Ｎに対応する、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎなどの、各試薬容器の試薬流体ラインを含むことができる。追加的に、各流体試薬ラインは、それぞれ、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎの各々のインラインバルブとして図１において描写示されている、試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｎなどの、バルブによって制御される流体流動を有することができる。洗浄溶液流体システム２０は、洗浄溶液流体ラインバルブ２５を介してフローセル入口ライン１０３Ａと制御可能な流体連通に配置されることができる、洗浄溶液洗浄溶液容器２１を含むことができる。流体マルチプレクサシステム３０は、流体マルチプレクサ流体ライン３３を介して流体マルチプレクサ３５と流体連通している、流体マルチプレクサシステム廃棄物容器３１を含むことができる。
【００４２】
図１において描写されるように、試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｎは、バルブコントローラ４０によって制御されることができる。その点に関して、バルブコントローラ４０は、各試薬容器１１Ａ〜１１Ｎから流体マルチプレクサ３５への流体流動を制御することができる。追加的に、図１において描写されるように、バルブコントローラ４０は、洗浄溶液流体ライン２３上の洗浄溶液流体ラインバルブ２５として、図１に描写される、洗浄溶液流体ラインバルブ２５の制御を通じて、洗浄溶液流体システム２０の洗浄溶液容器２１からの流体流動を制御することができる。図１に示されるように、バルブコントローラ４０から各試薬容器１１Ａ〜１１Ｎへの制御ラインによって、バルブコントローラ４０はまた、各試薬容器１１Ａ〜１１Ｎ、ならびに洗浄溶液容器２１に制御可能な圧力ヘッドを提供する、不活性ガス源（図示せず）からの空気圧ライン上の空気圧バルブの制御を作動させることができる。したがって、細胞分析システム１００の様々な試薬および洗浄溶液容器からの流体は、供給源から出口までの圧力差を原動力として使用して、流体ラインを通って制御可能に移動されることができる。
【００４３】
バルブコントローラ４０によって提供される制御と併せて、図１の流体マルチプレクサ３５は、例えば、ただし限定はされないが、センサーアレイデバイス１１０への選択された試薬送達を提供すること、流体マルチプレクサ３５およびフローセル１０７を洗浄すること、および選択された試薬のある流体マルチプレクサ３５をプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）することを含む、流体操作を制御可能に実行することができる。そのような流体操作は、フローセル１０７への試薬の相互汚染のない送達を提供することができ、試薬流体ストリーム間の鋭い遷移を提供することができ、ならびに洗浄溶液流体ライン２３の基準電極２７に一定の電解質流体環境を提供して、それによってセンサーアレイデバイス１１０への一定の安定した基準電圧を提供する。センサーアレイシステム用の流体システムの様々な実施形態における、流動を方向付けるための流体マルチプレクサ３５の様々な実施形態の機能は、米国特許公開第２０１０／０１３７１４３号、米国特許第８，５４６，１２８号、および米国特許第８，６７３，６２７号に記載されており、これらはすべて、各々が全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
例えば、バルブコントローラ４０と併せて、図１の流体マルチプレクサ３５は、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎのいずれかとフローセル入口ライン１０３Ａとの間の流体通信を選択的に提供することができ、それにより、センサーアレイデバイスアセンブリ１１５のフローセル１０７を通る選択的な試薬フローを提供する。本教示の非限定的な例示的な試薬溶液流体経路は、選択された試薬の１つが流体マルチプレクサ３５と流体連通しているという条件で、洗浄溶液流体ラインバルブ２５が閉状態にあり、試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｎの１つが開状態にある、試薬送達操作によって与えられる。そのような条件下で、選択された試薬は、流体マルチプレクサ３５を通って流動し、その後、流体マルチプレクサ流体ライン３３を通って流体マルチプレクサ廃棄物容器３１に流動することができる。追加的に、選択された試薬は、流体マルチプレクサ３５を通ってフローセル入口ライン１０３Ａに流動することができ、そこでフローセル１０７を通って入口ポート１０２から出口ポート１０４に流動し、最後にフローセル出口ライン１０３Ｂを通ってフローセル廃棄物容器１０１に流動することができる。
【００４５】
洗浄溶液の流体制御に関して、バルブコントローラ４０と併せて、図１の流体マルチプレクサ３５は、洗浄溶液容器２１とフローセル入口ライン１０３Ａとの間の流体通信を選択的に提供することができる。そのため、洗浄溶液流体ラインバルブ２５が開状態で、溶液容器２１は、流体マルチプレクサ３５およびフローセルの１０７の洗浄が行われることができるという条件で、流体マルチプレクサ廃棄物容器３１と、ならびにフローセル廃棄物容器１０１と流体連通することができる。本教示の非限定的な例示的な洗浄溶液流体経路は、洗浄溶液が、洗浄溶液流体ライン２３を通って、フローセル入口ライン１０３ＡとのＴ接合部に流動することができることを条件として、洗浄溶液流体ラインバルブ２５が開状態にあり、試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｎの各々が閉状態にある、洗浄操作によって与えられる。フローセル入口ライン１０３Ａが、流体マルチプレクサ３５と流体連通しているので、洗浄溶液は、流体マルチプレクサ流体ライン３３を通って流体マルチプレクサ廃棄物容器３１に流動することができる。フローセル入口ライン１０３Ａが、追加的に、センサーアレイデバイスアセンブリ１１５と流体連通しているので、洗浄溶液は、フローセル１０７を通って入口ポート１０２から出口ポート１０４に流動することができ、その後、フローセル出口ライン１０３Ｂを通ってフローセル廃棄物容器１０１に流動することができる。
【００４６】
本教示によれば、選択された試薬のある流体マルチプレクサ３５のプライミングは、例えば、洗浄操作の後で、選択された試薬が図１のフローセル１０７と流体連通する前に、一連で行われることができる。本教示の非限定的な例示的な試薬プライミング流体経路は、選択された試薬の１つが流体マルチプレクサ３５と流体連通しているという条件で、洗浄溶液流体ラインバルブ２５が開状態にあり、試薬流体ラインバルブ１５Ａ〜１５Ｎの１つが開状態にある、試薬プライミング操作によって与えられる。そのような操作の下で、試薬の流量に対する洗浄溶液の流量は、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎのうちの１つなど、選択された試薬流体と流体連通するマルチプレクサ３５における通路を除いて、洗浄溶液が流体マルチプレクサ３５を通って流体マルチプレクサ流体ライン３３を通って流体マルチプレクサ廃棄物容器３１に流動するように選択される。したがって、本明細書で前述したような試薬送達操作が開始されたとき、試薬プライミング操作で選択された試薬は、フローセル入口ライン１０３Ａと直接流動連通している。
【００４７】
そのため、本教示の流体システムの様々な実施形態は、洗浄、プライミング、および試薬送達を含むことができる、一連の操作を実行するように構成される。一連で実行されこのような操作は、システム流体ラインおよびコンパートメントにおける試薬の相互汚染を回避し、試薬流体ストリーム間の鋭い遷移を提供し、および基準電極に一定の電解質流体環境を提供し、それによってセンサーアレイに一定の安定した基準電圧を提供している。
【００４８】
本教示によれば、流体ラインから起きるノイズ源は、基準電圧、例えば、図１の洗浄溶液流体ライン２３に配置された、基準電極２７によって提供される、基準電圧に影響を及ぼすことができる。本明細書で前述したように、図１のセンサーアレイデバイス１１０のための基準電極２７からの安定した基準電圧は、基準電極２７が既知の電解質組成の洗浄溶液と連続的に接触していることを保証する、流体システムを有することによって提供されることができる。追加的に、流体ライン、例えば、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎおよび流体マルチプレクサ流体ライン３３からの高周波ノイズは、流体ラインに配置された電極を基準電極に容量的結合することによって濾過されることができる。本教示によれば、電極は、例えば、不活性金属の中空円筒構造であることができ、その非限定的な例が、白金またはチタンを含む。そのような中空円筒金属構造は、流動ストリームにおける流体との効果的なオーミック接触を提供することができる。図１において描写されるように、試薬流体ライン１３Ａ〜１３Ｎにそれぞれ配置される、試薬流体ライン電極１７Ａ〜１７Ｎは、各々が試薬流体ライン電極１７Ａ−１７Ｎにそれぞれ結合される、別々の試薬流体ラインコンデンサ１９Ａ〜１９Ｎを通して基準電極２７に結合される。同様の仕方において、流体マルチプレクサ流体ライン３３内に配置された、流体マルチプレクサ流体ライン電極３７は、流体マルチプレクサ流体ラインコンデンサ３９を通して基準電極２７に結合される。
【００４９】
図１において描写されるように、細胞分析システム１００は、追加的に、アレイコントローラ５０およびユーザーインターフェース６０を含むことができる。本教示によれば、アレイコントローラ５０は、様々な動力電源およびバイアス電圧、ならびにセンサーアレイデバイス１１０への制御およびタイミング信号、追加的に、センサーアレイデバイス１１０からのデータの高速獲得のためのデータおよびプロセッサインターフェースを提供することができる。その点に関して、図５Ａおよび図５Ｂは、本教示のセンサーアレイデバイス１１０の様々な機能に関係して、アレイコントローラ５０の様々な機能を描写している。
【００５０】
図５Ａは、概して、センサーアレイデバイス１１０のセンサーアレイ１２０に関係するアレイコントローラ５０間、ならびにアレイコントローラ５０とユーザーインターフェース６０との間の機能の様々な態様を示している。本教示の細胞分析システムの様々な実施形態によれば、アレイコントローラ５０は、センサーアレイデバイス１１０に電力を供給するために、ならびにセンサーアレイデバイス１１０によって生成されたデータを読み取るように構成されている高速デジタルインターフェースである、デジタルインターフェース５４をサポートするために、複数の動力電源５２を有することができる。追加的に、アレイコントローラ５０は、信号コントローラ５６からの制御信号、ならびにタイミングジェネレータ５８からのタイミング信号などの信号をセンサーアレイデバイス１１０に提供するように構成される。複数の動力電源は、アナログ電源、デジタル電源、Ｉ／Ｏ電源、およびアースを含む、センサーアレイデバイス１１０に提供されることができる。１つの例示的な実装形態において、各供給電圧は、１．２〜３．３Ｖの範囲で制御可能であることができる。これらの動力電源電圧の各々は、ノイズ分離を容易にするように、別々の導電経路を介してセンサーアレイデバイス１１０に提供されることができる。これらの供給電圧は、それぞれの動力電源から生じることができ、またはこれらの供給電圧の１つ以上は、アレイコントローラ５０における共通電源から生じることができる。本教示のアレイコントローラの様々な実施形態によれば、動力電源は、システムプロセッサ６２によって制御されて、ソフトウェア制御下で供給電圧のいずれかまたはすべてを変更することを可能にする、１つ以上のデジタル−アナログ変換器（ＤＡＣ）を含むことができる。例えば、コンピュータ制御に応答する動力電源は、センサーアレイデバイスの様々な実施形態に記憶されたデータから読み取られるように、使用中のセンサーアレイデバイスのタイプの要件に応じて、１．６ボルトの供給電圧と１．８ボルトの供給電圧との間の切り替えを容易にすることができる。
【００５１】
図５Ａにおいて示されるハードウェアコントローラ７０は、１つ以上の別々の回路基板として、またはインターフェースボードの一部として実装されることができる。ハードウェアコントローラ７０の１つの機能は、例えば、センサーアレイ１２０における各センサーの感知表面上を流動する、様々な流体および試薬のタイミングおよび持続時間を制御するように、空気圧および流体制御を提供し、ならびにシステムプロセッサ６２ソフトウェアによって決定される、空気圧および流体流動制御に関係する圧力および流動センサーを読み取ることである。追加的に、ハードウェアコントローラ７０は、センサーアレイデバイス１１０の温度測定および制御、ならびにシステムのアセンブリおよびサブアセンブリの温度測定および制御をサポートすることができる。本教示によれば、温度測定は、非限定的な例として、サーミスタおよび熱電対を使用して行われることができる。温度測定に応答して、システムプロセッサ６２は、ファン、ヒーター、および熱電冷却器などの非限定的な例を含むことができる、デバイスを制御することができる。
【００５２】
アレイコントローラ５０は、「スタンドアロン」回路基板として、またはコンピュータの一部を形成する１つ以上のコンピュータ互換性「カード」として製造されることができる。一態様において、本教示のアレイコントローラの機能は、プロセッサインターフェース５５（例えば、ＰＣＩバス、イーサネット接続など）を通してシステムプロセッサ６２によって制御されることができる。一実施形態において、アレイコントローラの全部または一部は、１つ以上のプリント回路基板として製造され、センサーアレイデバイスは、プリント回路基板の１つに取り付けるように構成される。システムプロセッサ６２への外部接続は、イーサネットおよびＵＳＢなどの、標準的なコンピュータインターフェースを含むことができる。最後に、システムプロセッサ６２は、ディスプレイ６４を含むことができる。
【００５３】
図５Ｂにおいて描写されるように、様々な動力電源およびバイアス電圧は、アレイコントローラ５０からセンサーアレイデバイスに提供される。図５Ｂのセンサーアレイデバイス１１０は、センサーアレイ１２０のアナログ出力信号を高速シリアルデータインターフェース５４に変換するように、１つ以上のアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）１１４と、１つ以上のデータマルチプレクサおよび高速シリアル出力１１６とを組み込むことができ、それにより、プロセッサインターフェース５５を介してセンサーアレイデバイス１１０からシステムプロセッサ６２（図５Ａを参照）にデジタルデータを提供する。センサーアレイデバイス１１０の様々な実施形態では、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）１１４は、異なる範囲のセンサー出力信号との互換性を容易にするように、コンピュータ選択可能な入力範囲（例えば、２００ｍＶ、３００ｍＶ）を有することができる。
【００５４】
本教示によれば、図５Ｂのセンサーアレイデバイス１１０の様々な実施形態では、アレイ行選択および順序付け１１２、ＡＤＣ１１４、およびデータマルチプレクサおよび高速シリアル出力１１６は、アレイコントローラ５０によって提供されるタイミングで、センサーアレイデバイス１１０のタイミングシーケンサー１１８上の論理によって制御されることができる。一例示的な実装形態において、データが獲得される行数、および獲得のサンプリング速度は、アレイコントローラ５０からセンサーアレイデバイス１１０に提供される制御データに基づいて、制御されることができる。１つの非限定的な例において、タイミングジェネレータ５８は、異なるセンサーアレイデバイスタイプ、動作モード、および獲得データ速度の制御を可能にするために、システムプロセッサ６２によって制御される、プログラム可能なクロックジェネレータ集積回路として実装されることができる。アレイコントローラ５０とセンサーアレイデバイスタイミングシーケンサー１１８との間の制御信号は、Ｉ２ＣまたはＳＰＩなどの、標準的なシリアルインターフェースタイプを使用して交換されることができる。センサーアレイデバイス１１０に書き込まれる情報は、センサーアレイデバイス１１０の動作モードを制御するように、ならびにセンサーアレイデバイス１１０からデータを読み取るように、センサーアレイデバイスタイミングシーケンサー１１８にデバイス上のレジスタに格納または書き込まれる値を含むことができる。センサーアレイデバイス１１０から読み取られる情報は、チップタイプ、シリアル番号、製造日などを含む記憶されたデータを含むことができる。
【００５５】
図５Ｂの基準電極２７は、センサーアレイ１２０の各センサーからの出力電圧（出力信号）のための基準電位を提供するように、動力電源に結合されることができる。非限定的な例として、基準電極２７の基準電極電圧は、既知の安定したｐＨのある溶液をセンサーアレイデバイス１１０上に流動ことによって設定されることができる（図２Ａを参照）。そのような定義されたｐＨ条件下で、基準電極電圧は、センサーアレイ内のセンサー、例えば、図２Ａのセンサーアレイ１２０のセンサーの出力信号が、センサーが所望の基準レベルの電圧を有することを示すまで、調整されることができる。既知の安定したｐＨのある溶液を使用して基準電圧が設定されると、センサー電圧のその後の変化は、センサーアレイのセンサーの感知表面で、ｐＨの局所的な変化が発生したことを反映することができる。
【００５６】
細胞分析のためにＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイベースのシステムを使用するアプリケーションおよび方法
図６Ａのフロー図２００は、本教示の細胞分析システムならびに関係するデバイス、コンポーネント、およびアセンブリを使用して実行されることができる、本教示のアプリケーションおよび方法の実施形態に関係するワークフローを提示する。例えば、フロー図２００は、図１、図５Ａおよび図５Ｂのセンサーアレイデバイス１１０、アレイコントローラ５０、およびユーザーインターフェース６０などの、アレイコントローラおよびシステムプロセッサにインターフェースされるセンサーアレイデバイスを含むことができる、図１の細胞分析システム１００を使用して実行されることができる。
【００５７】
図６Ａのフロー図２００は、ステップ２１０で開始されることができ、細胞サンプルのあるＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスをプレーティングする。既知の密度での細胞の懸濁液は、フラッシュされるか、さもなければ、図１のセンサーアレイデバイスアセンブリなどの、センサーアレイデバイスアセンブリに引き込まれることができる。細胞サンプルのプレーティングに続いて、センサーアレイデバイスアセンブリは、細胞がセンサーアレイ表面上に定着して固定することが可能なように、カバーされて、標的の期間インキュベーションに置かれることができる。細胞サンプルのあるセンサーアレイデバイスアセンブリをプレーティングする前に、フロー図２００は、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびそれらの組み合わせを含む様々な生体高分子材料、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の様々な調製物など、ユーザが選択した細胞適合性材料でセンサーアレイ表面を準備するステップを追加的に含むことができる。細胞適合性材料のあるセンサーアレイ表面の準備は、プレーティング先立って行われることができ、センサーアレイデバイスは、将来のために格納されることができる。代替的に、細胞適合性材料のあるセンサーアレイ表面の原位置での調製は、細胞サンプルのあるセンサーアレイデバイスアセンブリをプレーティングする前に、行われることができる。
【００５８】
細胞がセンサーアレイ表面に安定して関連付けられた後、フロー図２００のステップ２１２で、生細胞画像化アプリケーションが、実行されることができ、ステップ２１４で、結果が、表示されることができる。生細胞画像化アプリケーションからのステップ２１４での情報は、エンドユーザーに、センサー表面上の細胞分布の一般的な調査、個々の細胞形態に関する情報、および個々の細胞生存率の評価を提供することができる。例えば、図１の細胞分析システム１００は、エンドユーザーに電気顕微鏡細胞画像化を提供することができる。このような画像化アプリケーションでは、ＣｈｅｍＦＥＴセンサーの感知表面の電位における変化を引き起こすことができる、センサーアレイデバイスの表面上に固定された細胞の状態における変化は、細胞活動細胞に応答するセンサーアレイにおける各センサーによって検出されることができる。例えば、生細胞画像化アプリケーション中の選択された時間での応答性細胞の電気顕微鏡画像は、例えば、図５Ａのユーザーインターフェース６０のディスプレイ６４などの、ディスプレイ上で、エンドユーザーに提示されることができる。本明細書で前述したように、電気顕微鏡画像化が、生細胞に対して誘発されることができる、様々な応答に基づいていることを考えると、センサーアレイ表面上の応答性細胞の電気顕微鏡画像を取得することは、細胞の視覚化および評価のための最初のステップとして有用であることができる。電気顕微鏡画像化の代替として、またはそれに加えて、細胞を視覚化する他の方法は、光学マイクロコピーなどが、使用されることができる。
【００５９】
生細胞画像表示ステップ２１４から提供される情報に基づく、フロー図２００のステップ２１６で、関心領域は、例えば、細胞の分布および活動に関する最適領域を特定することに基づいて、および興味のあるアプリケーションを考慮して、選択されることができる。本明細書で前述されたように、データが収集されることができる速度と、関心領域の選択との間には反比例の関係があるため。例えば、様々な興奮性細胞の活動電位を監視するように、サブミリ秒からミリ秒の範囲のデータ獲得速度が必要であり得、一方、酸化的リン酸化からの乳酸塩生成を監視するように、数秒から数分のデータ獲得速度が必要であり得る。ステップ２１８で、エンドユーザーは、例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）上に提示されたメニューからアプリケーションを選択することができ、その後、ステップ２２０で与えられるように、実行を開始することができる。最後に、ステップ２２２で、エンドユーザーは、例えば、限定されないが、図５Ａのユーザーインターフェース６０のディスプレイ６４などの、ディスプレイ上に提供されるように、図５Ａのユーザーインターフェース６０のシステムプロセッサ６２などの、システムプロセッサにレポートとして送信することによって提供されるように、またはその両方で、実験の結果を受信することができる。
【００６０】
代替的に、エンドユーザーは、関心領域を選択するように、最初に生細胞画像化アプリケーションを実行せずにアプリケーションを実行することができる。図６Ｂのフロー図３００は、図６Ａのステップ２１０について前述されたように、ステップ３１０で開始されることができ、細胞サンプルのあるＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイデバイスをプレーティングする。本教示によれば、細胞のプレーティングは、細胞適合性材料で処理されたセンサーアレイデバイス上で行われることができる。ステップ３２０で、エンドユーザーは、例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）上に提示されたメニューからアプリケーションを選択することができ、その後、ステップ３３０で与えられるように、実行を開始することができる。最後に、ステップ３４０で、エンドユーザーは、例えば、限定されないが、図５Ａのユーザーインターフェース６０のディスプレイ６４などの、ディスプレイ上に提供されるように、図５Ａのユーザーインターフェース６０のシステムプロセッサ６２などの、システムプロセッサにレポートとして送信することによって提供されるように、またはその両方で、実験の結果を受信することができる。関心領域を選択せずにアプリケーションが実行されるとき、例えば、表Ｉに示すように、センサーアレイデバイスに関連付けられたフレーム速度でデータが収集される。エンドユーザーは、例えば、電気顕微鏡画像の、デバイス上の任意の領域を拡大および拡張することができるが、最終的に提示されるデータの解像度は、デバイスに関連付けられたフレーム速度によって固定される。
【００６１】
センサーアレイ表面上に細胞適合性材料のコーティングを提供するセンサーアレイデバイスの原位置処理の様々な方法は、例えば、図３の表に提示されるように、本教示の様々なセンサーアレイデバイスに適用可能である。細胞適合性材料でセンサーアレイ表面を原位置で修飾するための例示的な方法に関して、例示的な細胞適合性材料の以下の溶液は、水素イオン（ｐＨ）を感知するために選択的な３つのＩＳＦＥＴセンサーの表面をコーティングするように、使用された。
１．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）
２．０．１％ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）＋ＰＢＳ中の０．０５％ラミニン
３．細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の市販製剤、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、希釈せずに使用
【００６２】
図３の表におけるチップ１として識別されるタイプの、３つのセンサーアレイデバイスは、滅菌された層フローセル培養フード内で開かれ、その後のすべての操作は、滅菌された溶液および材料を用いて滅菌条件下で実行された。各センサーアレイデバイスは、水中の７０％エタノールから構成される２００μＬの溶液で２回フラッシュされ、ピペットで一方の溶液ポートに注入され、もう一方のポートから穏やかに吸引された。溶液がチップ表面に適用されると、フローセルより低い表面またはチャンバーが乾燥されるまで吸引されたり、または乾燥したりしないように注意が払われたため、真空ラインが、溶液注入に使用したポートの反対側の出口ポートの真上に配置され、チップが、真空乾燥されなかった。７０％エタノール溶液は、センサーアレイデバイス上に室温で３０分間放置され、その後、２００μＬの細胞培養グレードのＰＢＳで繰り返しフラッシュされた。その後、センサーアレイデバイスは、上で記載されたように２００μＬの溶液でフラッシュされ、２００μＬの新鮮なＰＢＳで３回フラッシュされる前に、使用の準備がされた後、室温で１時間静置された。代替的に、記載されているように細胞適合性表面を提供するように調製されたセンサーアレイデバイスは、後で使用するために密封および保存されることができる。
【００６３】
細胞適合性センサー表面を提供するように、上で記載されたように処理されたセンサーアレイデバイスのセンサーアレイ機能を検証するために、図１の細胞分析システム１００などの、細胞分析システムは、処理されたセンサーアレイデバイスを評価するように、使用される。洗浄溶液容器および３つの試薬容器は、以下の組成の以下の溶液で満たされた。
１．洗浄溶液容器および第１の試薬容器は、以下の組成および特性を有する溶液で満たされた。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４
１４０ｍＭのＮａＣｌ
２．５ｍＭのＫＣｌ
１．８ｍＭのＣａＣｌ2
１．０ｍＭのＭｇＣｌ2
浸透圧：３００ｍＯｓｍ
２．第２の試薬容器は、以下の組成および特性を有する溶液で満たされた。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６
１４０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのＮａＣｌ
１．８ｍＭのＣａＣｌ2
１．０ｍＭのＭｇＣｌ2
浸透圧：３００ｍＯｓｍ
３．第３の試薬容器は、第２の試薬容器を満たすために使用された溶液の組成および特性を有する溶液で満たされたが、塩酸の希薄溶液を使用してｐＨ７．１に調整された。
【００６４】
各センサーアレイデバイスおよび未処理の表面のある対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、次のようなテストプロトコルに供された。
１．洗浄緩衝液は、基準電極の電位を設定するため、ならびにセンサーアレイデバイスを調整するために使用された。
２．各センサーデバイスでは、異なるセンサー領域における２つの画素は、テスト中の電位を測定するように、選択された。
３．溶液が、各デバイスのフローセルを通して吸引される順序は、次のとおりである。
ａ．異なる容器において同じ溶液を切り替える際に大きな影響がないことを確認するために、洗浄溶液から第１の試薬容器における溶液に切り替える。
ｂ．ｐＨ７．４から７．６への変化の影響を測定するために、洗浄溶液に切り替えてから、第２の試薬容器溶液に切り替える。
ｃ．ｐＨ７．４から７．１への変化の影響を測定するために、洗浄溶液に切り替えてから、第３の試薬容器溶液に切り替える。
【００６５】
テストプロトコルから生成されたデータは、細胞互換性のある表面を提供するように処理されたセンサーアレイデバイスが、デバイスのコーティングによる、センサーアレイデバイス性能への悪影響がないことを示す、応答を有していることが確認された。デバイスのためのｐＨ応答のグラフは、次のグラフにおいて提示される。
【表２】
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【００６６】
図７Ａから図８Ｂは、誘導された脱分極とそれに続く回復段階の時間経過にわたる細胞膜電位の変化の測定に関するデータを提示する。この研究において使用されたセンサーアレイデバイスは、水素イオンを感知するために選択的な図３の表において示されるようなチップ１デバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、本明細書で前述されたように、細胞適合性のポリ−Ｄ−リジンコーティングを提供するように処理された。異種発現研究に一般的に使用されるヒト骨肉腫細胞株である、Ｕ−２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−ＨＢ−９６）は、蛍光顕微鏡を使用してセンサーアレイ表面の細胞を監視するために提供するように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で形質導入され、ならびに脱分極刺激への応答のために提供するように、イオンチャネル構築物で形質導入される。Ｕ−２ＯＳは、標準的な解離手順を使用してプレーティング用に調製され、２００ｘｇでの遠心分離を使用してペレット化され、１ミリリットルあたり２５０，０００細胞の密度で完全な細胞培養培地に再懸濁された。その後、２００μＬの細胞懸濁液は、センサーアレイデバイスを通して吸引された。その後、センサーアレイデバイスは、無菌の１０ｃｍ細胞培養皿に入れられ、カバーされた。その後、この方法で調製されたセンサーアレイデバイスは、インキュベーターに移され、本教示の細胞分析システムにおいて使用される前に、少なくとも一晩、３７℃でインキュベートされた。
【００６７】
図７Ａに提示されたグラフは、細胞画像化研究の過程で２つの細胞、Ｃ1およびＣ2の活動に焦点を合わせた、関心領域にわたって収集されたデータを表す、時間応答曲線である。図７Ａから図８Ｂにおいて提示された細胞画像化研究のために、２つの解決策が使用された。
１．洗浄溶液容器および第１の試薬容器は、以下の組成および特性を有する溶液で満たされた。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３
１４０ｍＭのＮａＣｌ
２．５ｍＭのＫＣｌ
１．８ｍＭのＣａＣｌ2
１．０ｍＭのＭｇＣｌ2
浸透圧：３００ｍＯｓｍ
２．残りの試薬容器、容器２から４は、以下の組成と特性を持つ溶液で満たされた。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３
１４０ｍＭのＫＣｌ
２．５ｍＭのＮａＣｌ
１．８ｍＭのＣａＣｌ2
１．０ｍＭのＭｇＣｌ2
浸透圧：３００ｍＯｓｍ
【００６８】
細胞画像化研究を開始する前の初期条件のためのフローセルにおける溶液は、洗浄溶液であった。研究は、試薬容器２〜４のうちの１つにおける溶液が、フローセルを通したセンサーアレイ上に吸引されたときに、開始された。その溶液における優勢な濃度の陽イオンは、カリウムであるため、それは、細胞のために脱分極刺激を提供することができる溶液である。細胞の活動を監視することに加えて、基準応答ＦＥＴRは、細胞が固定されていない、センサーアレイの領域において監視された。
【００６９】
図７Ｂにおける、細胞Ｃ1およびＣ2の細胞画像化研究の進行に関して、脱分極溶液がグラフに示されるフェーズＩで細胞に到達すると、脱分極の早期の兆候は、細胞Ｃ1およびＣ2の信号の増加で実証され、応答が維持される、フェーズＩＩＩで平衡に到達するまで、フェーズＩＩで増加し続ける。洗浄溶液がフローセルに導入され、脱分極溶液がフローセルから洗浄されると、回復が、グラフのフェーズＩＶで示され、細胞Ｃ1およびＣ2がフェーズＶで洗浄溶液に平衡化されるまで進行する。細胞の応答は、基準曲線のわずかな負の応答と比較して、センサーアレイ表面上での、それらの存在のシグネチャーであり、脱分極を受けている細胞は、ベースラインノイズレベルよりも約２０倍高い、強い正の電圧応答を示す。
【００７０】
３０フレームで破線によって図７Ｂに示された時間は、図８Ａの電気顕微鏡画像に対応する時間である。図８Ｂは、図８Ａの電気顕微鏡画像において視覚化された主な特徴の線画である。センサーアレイ上の細胞の電気顕微鏡画像化に基づいて、研究で使用されたセンサーアレイデバイスの画素ピッチが３μであることを考えると、センサーアレイ全体の細胞のサイズは、約１０〜２０画素、つまり３０μから６０μと推定された。本明細書で前述されたように、Ｕ−２ＯＳ細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で形質導入されたので、図７Ａ〜図８Ｂにおいて提示された電気顕微鏡画像化実験用に準備されたセンサーアレイも、蛍光顕微鏡を使用して画像化された。センサーアレイの蛍光顕微鏡画像化から収集されたデータの結果から、センサーアレイ全体の細胞の直径が３０μから６０μの範囲であることが確認された。
【００７１】
図９Ａは、Ｕ−２ＯＳ細胞（Ｃ1およびＣ2）および電位依存性カルシウムチャネルアルファ、ベータおよびアルファ−２−デルタサブユニットでトランスフェクトされたＵ−２ＯＳ細胞（Ｃ3およびＣ4）の時間応答曲線を示す。図９Ａに提示された時間応答曲線は、トランスフェクトされたＵ−２ＯＳ細胞細胞と比較した、Ｕ−２ＯＳ細胞の関心領域にわたって収集されたデータを表し、カルシウムイオンチャネル遮断薬ベラパミルで処理された各タイプの細胞に対する細胞応答の影響が、静止電位の初期状態、続いて膜電位の脱分極、および静止電位に戻るための条件のサイクルを通して監視された。図９Ｂは、フレーム２５（１．７秒）に対応する時間で撮影された図９Ａの電気顕微鏡画像であり、図９Ｂにおける細胞内の四角が、図９Ａのデータのためにサンプリングされた、画素を示す。図９Ｃは、細胞の鮮明な画像を提供するように、図９Ｂにおける細胞内の四角が除去された、図９Ｂの電気顕微鏡画像である。
【００７２】
図９Ａから図９Ｃのデータが生成された、実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、水素イオンを感知するために選択的な図３の表において要約されたようなチップ２デバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、本明細書で前述したように、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製された。簡単に説明すると、センサーアレイデバイスの表面を７０％エタノール水溶液に３０分間浸し、その後、０．１％ポリ−Ｄ−リジンの溶液を加える前に、ＰＢＳですすがれ、２時間静置された。その後、デバイスは、２００μＬの細胞培養培地、例えば、１０％ウシ胎児血清のあるＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ改変培地で２回すすがれた。細胞培養培地ですすいだ後、デバイスは、細胞懸濁液でプレーティングするための準備がされた。
【００７３】
トランスフェクトされた細胞の調製は、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞の細胞懸濁液を使用して行われた。電位依存性カルシウムイオンチャネルのアルファ、ベータ、およびアルファ−２−デルタサブユニットの混合物をコードする哺乳類ＢａｃＭａｍ遺伝子送達粒子は、機能チャネルを再構成するように、細胞懸濁液に添加された。機能的な電位依存性カルシウムイオンチャネルは、表面発現およびイオンフラックスを高める働きをするアルファ−２−デルタのある、最低でもアルファおよびベータサブユニットの両方を必要とする。ＢａｃＭａｍウイルス形質導入は、細胞数に対して１０倍過剰のウイルス粒子の大まかな比率で粒子を事前に混合して細胞に添加することによって達成された。対照（ウイルスなし）およびウイルス処理細胞は、センサーデバイスにプレーティングされて、細胞培養インキュベーター内に一晩配置され、機能性イオンチャネルの付着および発現を可能にしてから、翌日実験が実行された。
【００７４】
実験中、対照またはウイルス形質導入細胞は、１０μＭのカルシウムイオンチャネル遮断薬ベラパミルの存在下で、上昇した３０ｍＭのＫＣｌ脱分極刺激に曝露された。図９Ａの時間応答曲線は、対照群（Ｃ1およびＣ2）対（ｖｓ）電位依存性カルシウムチャネルでトランスフェクトされた細胞（Ｃ3およびＣ4）における細胞から取得されたシグネチャー応答における区別可能な差異を示す。図９Ａから図９Ｃにおいて提示された発見は、本教示の細胞分析システムおよび方法が、標的タンパク質を発現する、培養物に対する遮断薬の選択的活性に基づいて、電位依存性カルシウムイオンチャネルを発現する細胞と発現しない細胞との間で、容易に区別できることを実証する。
【００７５】
図１０Ａは、４．５ｍＭのＫＣｌのパルスに供されたラット新生児海馬細胞の電気顕微鏡画像である。図１０Ｂは、実験が、異なるデータ獲得速度で２つの異なるデバイスで実行された、４．５ｍＭのＫＣｌのパルスに供されたラット新生児細胞の時間応答曲線の比較である。
【００７６】
アレイデバイス属性を要約している図３の表を参照すると、図１０Ａおよび図１０Ｂのデータが生成された、実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、３０サンプル／秒のフレーム速度でデータが収集された、チップ２の寸法を有するデバイスであった図１０ＢのＩにおけるデータが生成された、実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、デバイスのアクティブ領域が、２４０サンプル／秒の最大フレーム速度を提供するように、全デバイス領域の５０％の関心領域にウィンドウダウンされた、チップ１の寸法を有するデバイスであった。チップ１およびチップ２の両方のデバイスは、水素イオンを感知するために選択的なＩＳＦＥＴデバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、図９Ａから図９Ｃの電位依存性カルシウムチャネルでの実験において使用されるデバイスの調製のために、本明細書に記載されるように、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製された。ラット新生児海馬細胞は、無傷のラットＥ１８新生児海馬から分離され、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞の密度で再懸濁され、その後、デバイスにプレーティングされた。デバイスが、細胞培養インキュベーターの中に配置され、新鮮な神経細胞培養培地が、３日ごとに１０日間、プレーティングされた細胞上で交換され、これにより、自発的な脱分極活性を提示することができる興奮性表現型への細胞の接着および成熟が可能になった。ラット新生児海馬細胞は、２．５ｍＭ〜４．５ｍＭの基礎塩化カリウム（ＫＣｌ）濃度からの溶液パルス中の自発的活動についてテストされた。
【００７７】
調製物の細胞活性は、図１０Ａの電気顕微鏡画像において実証されるように、自発的脱分極について観察された。図１０Ｂは、データ解像度に対するフレーム速度の影響を実証する。図１０Ｂにおいて、２つのピークのある時間応答曲線（図１０Ｂ〜Ｉ）は、３０サンプル／秒のフレーム速度のあるセンサーデバイスで観察された単一のピークのある時間応答曲線（図１０Ｂ−ＩＩ）に対する、２４０サンプル／秒のフレーム速度のあるセンサーデバイスで観察された。図１０Ａの電気顕微鏡データおよび図１０Ｂの時間応答曲線は、１０日間の成熟期間後の培養における活動電位を発火させることが知られている一次細胞タイプからの固有の電気的活動を視覚化する本教示の細胞分析システムおよび方法の能力を示す。
【００７８】
図１１は、ミトコンドリア毒素カルボニルシアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）に供された不死化ヒト肝細胞株（ＨＥＰＧ２細胞；ＡＴＣＣカタログ番号ＡＴＣＣ−ＨＢ−８０６５）細胞からの細胞の電気顕微鏡画像であり、いくつかの例示的な細胞が、細胞流出のストリームに関連して示されている。ＨＥＰＧ２細胞株は、肝細胞癌のモデルとして細胞生物学で使用され、追加的に、ＬＤＬとコレステロールのインポートおよび肝臓毒性学の研究にも使用される。
【００７９】
図１１のデータが生成された、実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、水素イオンを感知するために選択的な図３のチップ２デバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、図９Ａから図９Ｃの電位依存性カルシウムチャネルでの実験において使用されるデバイスの調製のために、本明細書に記載されるように、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製された。ＨＥＰＧ２細胞は、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞で再懸濁され、細胞がチップの準備された表面に接着することが可能なように、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベートするためにチップ上にプレーティングされる。ミトコンドリアのプロトノフォアＦＣＣＰは、細胞死につながる応答を誘発することが知られている濃度である、１００μＭの濃度でテストされた。実験からの電気顕微鏡画像は、図１１に提示される。
【００８０】
ＦＣＣＰのアプリケーションの中で、細胞応答は、層流動システムへの細胞内容物の流出を視覚化する、本教示の細胞分析システムおよび方法の能力を実証することが観察された。これは、細胞内容物の流出が、それぞれ、Ｃefflux1およびＣefflux2によって示されている、図１１における２個の細胞、ＣHEPG1およびＣHEPG2、のために描写されている。特に、ＣHEPG3について図１１において描写されているように、すべての細胞が流出活性を実証されたわけではない。これらの結果は、本教示の細胞分析システムおよび方法が、毒素治療に応答して表される、急性の新規表現型をさらに区別できることを示している。
【００８１】
図１２Ａは、ＦＣＣＰで処理されたＵ−２ＯＳ細胞のための平均背景減算時間用量応答曲線を示す。図１２Ｂは、ＦＣＣＰで処理される前にオリゴマイシンを包含する栄養溶液で前処理されたＵ−２ＯＳ細胞のための平均背景減算時間用量応答曲線を示す。
【００８２】
アレイデバイス属性を要約している図３の表を参照すると、図１２Ａおよび図１２Ｂのデータからの実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、図１２Ａにおいて提示されたデータのためのチップ２デバイス、および図１２Ｂにおいて提示された日付のためのチップ１デバイスを使用して生成された。チップ１およびチップ２の両方のデバイスは、水素イオンを感知するために選択的なＩＳＦＥＴデバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、図９Ａから図９Ｃの電位依存性カルシウムチャネルでの実験において使用されるデバイスの調製のために、本明細書に記載されるように、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製された。Ｕ−２ＯＳ細胞は、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞で再懸濁され、細胞がチップの準備された表面に接着することが可能なように、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベートするためにチップ上にプレーティングされる。ＦＣＣＰ処理の用量依存性をテストするために、細胞は、図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、実験中に一連の濃度ジャンプに曝露された。図１２Ａにおいて、実験は、オリゴマイシンの非存在下で実施され、１２Ｂにおいて、ＦＣＣＰ用量応答曲線は、オリゴマイシンの存在下で生成された。
【００８３】
図１２Ａおよび図１２Ｂにおけるデータは、ＦＣＣＰで試験されたサンプルからの平均細胞応答で構成される。データは、用量依存性ＦＣＣＰ応答が、オリゴマイシンの非存在下および存在下で容易に区別可能であることを示す。細胞分析ツールのための現在の最先端技術では、オリゴマイシンは、細胞内のＦＣＣＰ応答を強化するＦＣＣＰの前処理として頻繁に使用される。対照的に、本教示の細胞分析システムは、強固である用量依存性ＦＣＣＰ時間応答曲線を証明する薬理学的プライミングを必要としない。
【００８４】
データが図１３Ａ〜図１３Ｃに提示されている実験では、３つの異なる細胞タイプは、ＦＣＣＰへの応答に基づいて細胞タイプを識別する機器の能力を試験用に選択された。多種多様な細胞タイプを比較するデータセットを生成するのに、ドナー由来の初代ヒト大動脈平滑筋（ＨＡＳＭ）細胞（ＨＡＳＭＣ；Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ｃ００７５Ｃ）、ヒト頸部癌細胞（ＨｅＬａ細胞；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＭ  ＣＣＬ２）およびマウス由来の白血病細胞株（ＭＭＭ細胞；ＡＴＣＣカタログ番号Ｊ７７４Ａ．１）は、研究のために選択された。
【００８５】
図１３Ａから図１３Ｃは、別々のデバイスで個別に試験された各タイプの細胞株についての平均背景減算時間用量応答曲線である。図１３Ａは、ＨＡＳＭ細胞の用量応答曲線のセットであり、図１３Ｂは、ＨｅＬａ細胞の用量応答曲線のセットであり、図１３Ｃは、ＭＭＭ細胞の用量応答曲線のセットである。図１４Ａから図１４Ｃに示されるデータについて、細胞の混合物は、異なる細胞タイプがＦＣＣＰへの応答によって識別されることができるか否かを理解するために、１００μＭのＦＣＣＰに曝露され、それらの応答は、記録された。図１４Ａは、細胞がＦＣＣＰに供された、異なる細胞タイプの混合物において選択された細胞の複合時間用量応答曲線を示す。図１４Ｂは、細胞内の四角が、図１４Ａのデータのためにサンプリングされた、画素を示す、フレーム４０（２．７秒）に対応する時間に撮影された図１４Ａの実験の電気顕微鏡画像である。図１４Ｃは、図１３Ｂにおける細胞内の四角が、細胞の鮮明な画像を提供するように除去された、図１４Ｂの電気顕微鏡画像である。
【００８６】
図１３Ａから図１４Ｃのデータが生成された実験で使用されたセンサーアレイデバイスは、水素イオンを感知するために選択的な図３のチップ２デバイスであり、マイクロウェルアレイが含まれる。デバイスは、図９Ａから図９Ｃの電位依存性カルシウムチャネルでの実験において使用されるデバイスの調製のために、本明細書に記載されるように、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製された。各細胞株は、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞で再懸濁され、その後、細胞がチップの準備された表面に接着することが可能なように、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベートする前に、均一な比率で混合される。
【００８７】
図１３Ａから図１３Ｃの時間応答曲線は、別々のデバイスで個別に試験された別個の組織起源の３つの細胞タイプのそれぞれを表すので、各細胞タイプがＦＣＣＰに対して別個の動的および振幅応答を示すことは注目に値する。図１３Ａ〜図１３Ｃにおいて提示されたデータは、薬理学的プローブに対するそのシグネチャー応答によって、各細胞株の同定の可能性を示唆している。図１４Ａは、単一のチップ上の３つの細胞タイプすべての分析から収集されたデータを表す。図１４Ａに提示された時間応答データ上の波形分析を使用して、Ｃ1およびＣ2は、ＨＡＳＭ細胞として識別され、Ｃ3は、ＭＭＭ細胞として識別され、Ｃ4およびＣ5は、ＨｅＬａ細胞として識別された。図１４Ｃの電気顕微鏡画像が撮影された時点で、電気顕微鏡画像は、ＨＡＳＭ細胞およびＭＭＭ細胞（Ｃ1−Ｃ3）と比較したＨｅＬａ細胞（Ｃ4およびＣ5）の挙動の相違を捉えた。まとめると、図１３Ａ〜図１３Ｃおよび図１４Ａ〜図１４Ｃにおいて提示されたデータは、本教示のシステムおよび方法が、混合細胞集団において明確に異なる細胞株を同定するように、シグネチャー細胞応答および挙動を使用することの可能性を実証する。
【００８８】
図１５Ａから図１５Ｃが代表的なデータである、実験において使用されたセンサーアレイデバイスは、水素イオンを感知するために選択的な図３の表において要約されたようなチップ１デバイスであり、マイクロウェルアレイなしである。細胞内分解能および高い時間忠実度で細胞シグナルを記録する本教示の様々な細胞分析システムの能力を試験するために、データは、細胞上にかなりの数の細胞互換性表面上にプレーティングされたチップ１デバイスについて、秒あたり１２０フレームで収集された。デバイスおよび細胞調製は、図９Ａから図９Ｃについて従前に記載されたように行われた。簡単に説明すると、デバイスは、ポリ−Ｄ−リジン表面で調製され、Ｕ−２ＯＳ細胞の調製物は、電位依存性カルシウムイオンチャネルでトランスフェクトされた。チップ１デバイスは、１ｍＬあたり１ｘ１０＾６個の細胞の細胞懸濁液を使用して、トランスフェクトされたＵ−２ＯＳ細胞でプレーティングされた。本明細書で従前に記載されたように、哺乳類ＢａｃＭａｍ遺伝子送達粒子は、再構成されている機能チャネルで細胞懸濁液を提供するように、電位依存性カルシウムイオンチャネルアルファ、ベータおよびアルファ−２−デルタサブユニットの混合物をコード化する。機能的な電位依存性カルシウムイオンチャネルは、表面発現およびイオンフラックスを高める働きをするアルファ−２−デルタのある、最低でもアルファおよびベータサブユニットの両方を必要とする。
【００８９】
図１５Ａおよび１５Ｂに示されているのは、約１〜２秒の間隔でキャプチャされたデータから３４５ミリ秒（ｍｓ）隔てられている、２つの例示的な時点からの２つの電気顕微鏡画像である。データ収集の開始のおよそ５００ｍｓ前に、細胞は、次の等張試薬で灌流された。
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３
１３０ｍＭのＮａＣｌ
１２．５ｍＭのＫＣｌ
１．８ｍＭのＣａＣｌ2
１．０ｍＭのＭｇＣｌ2
浸透圧：３００ｍＯｓｍ
【００９０】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、電気顕微鏡画像において提示された色々な細胞の細胞内ドメインにおける過渡信号の例を表示する電気顕微鏡画像である。例えば、細胞ｉとして指定された細胞では、信号は、１５７７ｍｓの時点で明瞭に可視であるが、信号は、１９２２ｍｓの時点で実質的に減少される。細胞ｉｉとして指定された細胞では、１５７７ｍｓの時点で顕著に可視の信号があるが、信号は、隣接する細胞における信号を明らかにするように、１９２２ｍｓの時点で減少される。細胞ｉｉｉとして指定された細胞では、１５７７ミリ秒ｍｓの時点で顕著に可視の信号はないが、１９２２ｍｓの時点で明瞭に可視である信号がある。
【００９１】
図１５Ｃは、図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて細胞ｉ〜ｉｉｉとして指定された細胞の電気顕微鏡画像の時点を含む、時間間隔にわたる時間応答曲線である。図１５Ｃの時間応答曲線はまた、非応答細胞ｉｖ、すなわち、細胞応答制御について収集および平均化された信号、ならびにセンサー領域ｖ、すなわち、デバイス応答制御について収集および平均化された信号を含む。図１５Ｃの時間応答曲線を調べることによって見られるように、両方の制御は、データ捕捉の間、変化しないままであった。図１５Ａ〜図１５Ｃに提示されたデータのサンプリング間隔は約８．３ｍｓであったので、実験全体にわたる時間応答曲線は、図１５Ｃに示される例示的な細胞について表示されるように、上昇フェーズを捕捉し、多数の細胞の指数関数的減衰信号が続いた。図１５Ａ〜図１５Ｃに提示されたデータでは、細胞内ドメインの高フレーム速度記録は、図１５Ａおよび図１５Ｂの電気顕微鏡画像に示されるように、容易に視覚化され、ならびに図１５Ｃの時間応答曲線に示されるように、数および強度について定量化された、個別の活動領域を明らかにする。
【００９２】
高フレーム速度で収集された細胞内分解能で図１５Ａから図１５Ｃに提示されたデータの影響は、生体電気または生化学的活性と一致する、個別のマイクロドメインにおける細胞活性の実証である。このようなマイクロドメイン領域の細胞活性は、ＴＩＲＦ顕微鏡における局所的な小胞放出の従前の記載と一致している。追加的に、データはまた、正常および疾患細胞機能における小胞の融合および放出の根底にあるメカニズムを潜在的に制御し得る、遺伝的または薬理学的介入について評価分析する、本教示のＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイベースのシステムの様々な実施形態についての可能性を示す。
【００９３】
図３について本明細書で前述したように、本教示の様々なセンサーアレイデバイスを提供するように変更されることができる、センサーアレイデバイス属性は、画素寸法、ならびにセンサーアレイデバイスからデータが収集されることができる速度を含む。図１６は、本明細書のアプリケーションおよび方法の段落に記載されているのと同様の細胞の要約を提供する。
【００９４】
図１６の精査によって、平均直径６μｍおよび平均面積２８μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定されたＭＭＭ細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約２行および約３画素に対応し、チップ４デバイスのでは７行および４５画素に増加する。同様に、平均直径が１５μｍおよび平均面積が１７７μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定されたＨＥＰＧ２細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約４行および約１８画素に対応し、チップ４デバイスでは１８行および２８５画素に増加する。同様に、平均直径が１８μｍおよび平均面積が２５４μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定されたＨｅＬａ細胞、または平均直径が１９μｍおよび平均面積が２８４μｍ2のＵ−２ＯＳ細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは、それぞれ、約５行および約２６画素に、または約６行および約２９画素に対応し、チップ４デバイスでは、それぞれ、２１行および４１０画素に、または２２行および４５８画素に増加する。平均直径が２５μｍおよび平均面積が４９１μｍ2のセンサーアレイ表面上に固定されたＨＡＳＭ細胞では、最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは約７行および約５０画素に対応し、チップ４デバイスでは２９行および７９２画素に増加する。ラット新生児海馬（ＲＮＨ）細胞は、約２０μｍおよび平均面積３１４μｍ2から約１００μｍおよび平均面積７，８５４μｍ2の間で変化することができる、細胞体を有することができる。センサーアレイ表面上に固定された様々なＲＮＨ細胞では、ＲＮＨ細胞本体の最小接触面積またはフットプリントは、チップ１デバイスでは、それぞれ約６行および約３２画素と、約３０行および約８０３画素の範囲になることができ、チップ４デバイスでは、それぞれ約２４行および５０６画素と、約１１８行および１２，６６８画の範囲に増加する。図１６の精査から、図３について述べたように、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、画素被覆が増加する傾向にある。
【００９５】
画素の観点から、パーセント画素被覆の列は、単一の画素がカバーする、細胞の面積のパーセンテージである。センサーアレイ表面上に固定されたＭＭＭ細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは３３％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、２％の被覆に対応する。センサーアレイ表面上に固定されたＨＥＰＧ２細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは６％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．４％の被覆に対応する。比較すると、センサーアレイ表面上に固定されたＨｅＬａ細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは４％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．２％の被覆に対応する。センサーアレイ表面上に固定されたＵ−２ＯＳ細胞では、単一の画素は、チップ１デバイスでは３％の被覆に対応するが、チップ４デバイスでは単一の画素が、０．２％の被覆に対応する。センサーアレイ表面上に固定された様々なＲＮＨ細胞では、単一の画素の被覆は、チップ１デバイス上で、平均直径２０μｍのＲＮＨ細胞の３％から平均直径１００μｍのＲＮＨ細胞の０．１％の被覆の範囲になることができる。比較すると、チップ４デバイスでは、単一の画素は、平均直径２０μｍのＲＮＨ細胞の０．２％の被覆に対応し、平均直径１００μｍのＲＮＨ細胞の０．００８％の被覆に相当する。図１６の精査から、図３について述べたように、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、画素あたりの細胞被覆のパーセンテージが減少する傾向にある。
【００９６】
図１６の表に提示されたものを考慮すると、本教示の例示的なセンサーアレイデバイスの画素被覆の選択は、様々な平均細胞直径に対して行われる行ことができる。本教示の様々なアプリケーションで使用される細胞株とデバイス属性との相関は、図３に列挙された範囲内にある。その点に関して、約５μｍ〜約１００μｍの細胞では、センサーアレイデバイスの選択は、センサーアレイ表面上に固定された細胞の対応するフットプリントに対して、３行の画素を越える約８画素から１１８行の画素を超える１２，６６８画までの被覆を提供するように行われることができる。細胞サイズのその範囲にわたって、画素サイズが変化することができるので、選択されたセンサーアレイデバイスの各画素は、細胞の約１２％から細胞の約０．００８％までをカバーすることができる。図３および図１６に提示されたデータに基づいて、任意の細胞サイズでは、細胞がセンサーアレイデバイス上で占めることができる、接触領域に関連するかなりの数のセンサーを提供することができる、例示的なセンサーアレイデバイスを選択できることは、明白である。本教示の様々なセンサーアレイデバイスによって提供されることができる、空間分解能は、信号の細胞内識別を可能にすることができ、それゆえ、細胞内分析を提供している。
【００９７】
同様に、図３に提示されていることと一致して、図１６の最後の列の精査によって、秒あたりのかなりの数のフレームが、様々な細胞サイズにわたって対象の標的領域について、収集されることができることは明白であり、ｋＨｚ範囲内で快適にデータ収集を提供する。思い出すと、最後の列において、行ごとの最大フレーム速度を細胞直径あたりの行で割ることによって導き出される、細胞によってカバーされる行の小数部分について、データが収集されることができる、最大フレーム速度は、提示される。
【００９８】
センサーアレイ表面上に固定されたＭＭＭ細胞では、データは、チップ１デバイスでは３７，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、２３，１４２ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。センサーアレイ表面上に固定されたＨＥＰＧ２細胞では、データは、チップ１デバイスでは１８，７５０ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、９，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。センサーアレイ表面上に固定されたＨｅＬａ細胞では、データは、チップ１デバイスでは１５，０００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、７，７１４ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。同様に、センサーアレイ表面上に固定されたＵ−２ＯＳ細胞では、データは、チップ１デバイスでは１２，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、７，３６４ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。センサーアレイ表面上に固定されたＨＡＳＭ細胞では、データは、チップ１デバイスでは１０，７１４ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、５，５８６ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。最後に、センサーアレイ表面上に固定されたそのような細胞の本体である、様々なＲＮＨ細胞では、データは、チップ１デバイスでは約２，５００ｆｐｓ〜約１２，５００ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができるが、チップ４ではデータは、約１，３７３ｆｐｓ〜約６，７５０ｆｐｓの最大フレーム速度で収集されることができる。
【００９９】
本教示によれば、図１６に提示されたものは、図３に提示されたように、本教示による、様々なアプリケーションにおいて使用される細胞株の様々な最大フレーム速度が、約１，２５０ｆｐｓ〜約７５，０００ｆｐｓの範囲内にあることを明らかにする。図３および図１６の精査から、動向は、細胞サイズの増加および画素サイズの減少とともに、フレーム速度が減少する傾向にあり、これは、選択された関心領域と収集されることができるデータでの速度との間で、反比例関係と一致する。そのため、監視する画素のより小さなサブセットを選択することによって、すなわち、データが収集されるセンサーアレイデバイスの領域をウィンドウダウンすることによって、またはアプリケーションに一致する望ましいフレーム速度のあるデバイスを選択することによって、フレーム速度が増加されることができる。
【０１００】
本明細書に記載されていることは、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）センサーアレイ技術に基づく細胞分析システムのためのシステム、アプリケーション、および方法に関係している。本教示の様々な細胞分析システムは、単一の生細胞の電気的および代謝的活性を、細胞内アドレス可能性、および単一の分析で約１０個の細胞〜約５００，０００個の細胞の同時データ獲得で測定することができる。本教示の様々なセンサーアレイデバイスは、大規模に並列化されたアレイに組み込まれた２０００万〜６億６０００万のＣｈｅｍＦＥＴセンサーがあるセンサーアレイを有することができ、センサーアレイのセンサーが、それぞれ、約３．３６μｍ〜約８５０ｎｍのピッチを有することができる。さらに、本教示の様々な細胞分析システムは、キロヘルツ（ｋＨｚ）範囲のデータ獲得速度で細胞の同時測定を提供することができる。そのうえ、本教示の様々な細胞分析システムに統合された完全に自動化された流体システムは、例えば、様々なタイプの化学的調査に対する細胞応答の測定が示される様々な研究で使用される化学薬品の、厳密に制御されたアプリケーションを可能にする。本教示の様々なＣｈｅｍＦＥＴセンサーアレイは、化学的分析物を検出し、細胞膜電位の変化を検出することができるので、制御された電気刺激を使用して、本教示の様々な細胞分析システムにおいて細胞を調べることもできる。
【０１０１】
本教示の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、かかる実施形態が実施例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多くの変化形、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者に思いつくであろう。本明細書に記載される様々な実施形態に様々な代替物が本明細書に記載されていることの実施に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内のシステム、デバイス、アプリケーションおよび方法、ならびにそれらの同等物がそれにより網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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