【手続補正書】
【提出日】平成22年9月28日(2010.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、以下を含む組成物を提供する:
(a)鋳型核酸鎖に結合した第1の親和性要素;
(b)相補的な核酸鎖に結合した第2の親和性要素；
ここで、第1の親和性要素および第2の親和性要素は、共通の標的に非競合的に結合し;
鋳型核酸鎖および相補的な核酸鎖は、塩基対合によってアニールしてアセンブリを形成し;
第1の親和性要素および第2の親和性要素は、アセンブリ中で離れており;かつ、
鋳型核酸鎖、相補的な核酸鎖のいずれか、または両方が、支持体の表面に結合している。
[請求項101]
以下の段階を含む、関心対象の標的に対する親和性要素を同定するための方法:
(a)支持体上に標的親和性要素が存在する場合に、標的が標的親和性要素に中程度に親和性結合するのに適した条件下で、組成が公知である102〜107個の異なる試験化合物のアレイを含む支持体表面を関心対象の標的と接触させる段階であって、該標的は抗体のFv部分ではなく、該異なる試験化合物は該標的に由来しない段階;および
(b)少なくとも中程度の親和性で前記標的に結合する試験化合物を同定する段階であって、このような化合物が標的親和性要素を含む段階。
[請求項102]
支持体表面がアドレス指定可能である、請求項101記載の方法。
[請求項103]
さらに以下の段階を含む、請求項101または102記載の方法:
(c)少なくとも中程度の親和性で前記標的に結合しない試験化合物を同定する段階。
[請求項104]
試験化合物が1000ダルトン〜10,000ダルトンの分子量を有する、請求項101〜103のいずれか一項記載の方法。
[請求項105]
試験化合物がポリペプチドである、請求項101〜104のいずれか一項記載の方法。
[請求項106]
同じ支持体表面または別の支持体表面を競合物と接触させる段階、および標的に結合する試験化合物と競合物に結合する試験化合物との比率を求める段階をさらに含む、請求項101〜105のいずれか一項記載の方法。
[請求項107]
同じ標的上の異なる部位に結合する標的親和性要素の組合せを同定する段階をさらに含む、請求項101〜106のいずれか一項記載の方法。
[請求項108]
標的に対する標的親和性要素単独の結合親和性および/または特異性と比べて、該標的に対する親和性要素の組合せの結合親和性および/または特異性を増大させるために、該親和性要素の組合せ中の該標的親和性要素間の適切な間隔を決定する段階をさらに含む、請求項107記載の方法。
[請求項109]
親和性要素の組合せを連結する段階をさらに含み、リンカーが、第1の親和性要素と第2の親和性要素の間に約0.5nm〜約30nmの間隔を提供する、請求項107または108記載の方法。
[請求項110]
第1の親和性要素および第2の親和性要素の1つまたは両方の、第1の標的に対する結合の解離定数が、約1μM〜500μMである、請求項101〜109のいずれか一項記載の方法。
[請求項111]
第1の親和性要素および第2の親和性要素の1つまたは両方の標的に対する結合親和性を最適化する段階をさらに含む、請求項108〜110のいずれか一項記載の方法。
[請求項112]
請求項109〜111のいずれか一項記載の方法によって作製した合成抗体。
[請求項113]
以下を含む合成抗体:
(a)第1の標的に結合できる第1の親和性要素;
(b)前記第1の標的に結合することができ、かつ、該第1の標的に結合された前記第1の親和性要素の存在下で該第1の標的に結合することができる第2の親和性要素;ならびに
(c)前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素をつなぐリンカー;
ここで、前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素の1つまたは両方は、少なくとも1000ダルトンの分子量を有し;
前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素のうち少なくとも1つは、前記第1の標的に由来せず;
前記合成抗体は、前記第1の標的に対する前記第1の親和性要素の結合親和性および/または特異性と比べて、ならびに該標的に対する前記第2の親和性要素の結合親和性および/または特異性と比べて、該第1の標的に対する結合親和性および/または特異性が高く;かつ、
前記第1の標的は抗体のFvではない。
[請求項114]
第1の親和性要素および第2の親和性要素の両方が、約1000ダルトン〜10,000ダルトンの分子量を有する、請求項113記載の合成抗体。
[請求項115]
リンカーが、第1の親和性要素と第2の親和性要素の間に約0.5nm〜約30nmの間隔を提供する、請求項113または114記載の合成抗体。
[請求項116]
第1の親和性要素も第2の親和性要素も、抗体のFv領域に由来しない、請求項113〜115のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項117]
第1の親和性要素も第2の親和性要素も、第1の標的に由来しない、請求項113〜116のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項118]
第1の親和性要素および第2の親和性要素がポリペプチドを含む、請求項113〜117のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項119]
第1の親和性要素および第2の親和性要素が核酸を含む、請求項113〜117のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項120]
合成抗体のpH7での正味電荷が+2〜-2である、請求項118記載の合成抗体。
[請求項121]
第1および第2の親和性要素のうち少なくとも1つが非天然化合物である、請求項113〜120のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項122]
リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項113〜121のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項123]
リンカーが核酸リンカーである、請求項113〜121のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項124]
第1の親和性要素および第2の親和性要素の1つまたは両方が核酸ではない、請求項123記載の合成抗体。
[請求項125]
第1の親和性要素および第2の親和性要素が異なり、第1の標的の別の領域に結合する、請求項113〜124のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項126]
第1の親和性要素および第2の親和性要素に結合された第3の親和性要素をさらに含む、請求項113〜125のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項127]
第3の親和性要素が、第1の標的と異なる第2の標的に結合することができる、請求項126記載の合成抗体。
[請求項128]
第2の親和性要素も同様に第2の標的に結合し、かつ、第1の親和性要素、第2の親和性要素、および第3の親和性要素の空間的配置により、第1の標的および第2の標的のうち1つのみが合成抗体によって結合されることができる、請求項127記載の合成抗体。
[請求項129]
第1の親和性要素、第2の親和性要素、および第3の親和性要素につながれた第4の親和性要素をさらに含み、該第3および該第4の親和性要素を該第1の親和性要素および該第2の親和性要素に対して空間的に配置して、合成抗体に結合された第1の標的の存在下でさらなる標的の結合を提供する、請求項126記載の合成抗体。
[請求項130]
第1のシグナル伝達要素および第2のシグナル伝達要素をさらに含み、該第1のシグナル伝達要素および該第2のシグナル伝達要素の空間的関係を変更して、合成抗体に標的が結合した際に検出可能なシグナルを生じるようにした、請求項113〜129のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項131]
支持体に結合された、請求項113〜130のいずれか一項記載の合成抗体。
[請求項132]
以下を含む支持体:
(a)表面;および
(b)前記表面に付着させた、請求項113〜130のいずれか一項記載の複数の合成抗体。
[請求項133]
複数の合成抗体が、複数の異なる合成抗体を含む、請求項132記載の支持体。
[請求項134]
所与の標的に対する少なくとも第1の親和性要素および第2の親和性要素をリンカーを介してつなぐ段階を含む、合成抗体を作製するための方法であって、
前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素の1つまたは両方は、少なくとも1000ダルトンの分子量を有し;
前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素のうち少なくとも1つは、第1の標的に由来せず;
前記合成抗体は、前記第1の標的に対する前記第1の親和性要素の結合親和性および/または特異性と比べて、ならびに該標的に対する前記第2の親和性要素の結合親和性および/または特異性と比べて、該第1の標的に対する結合親和性および/または特異性が高く;かつ、
前記第1の標的は抗体のFvではない、
前記方法。
[請求項135]
第1の親和性要素および第2の親和性要素の両方が、1000ダルトン〜10,000ダルトンの分子量を有する、請求項134記載の方法。
[請求項136]
リンカーが、第1の親和性要素と第2の親和性要素の間に約0.5nm〜約30nmの間隔を提供する、請求項134または135記載の方法。
[請求項137]
第1の親和性要素も第2の親和性要素も、抗体のFv領域ではない、請求項134〜136のいずれか一項記載の方法。
[請求項138]
第1の親和性要素および第2の親和性要素のうち少なくとも1つが核酸を含む、請求項134〜137のいずれか一項記載の方法。
[請求項139]
第1の親和性要素および第2の親和性要素のうち少なくとも1つがポリペプチドを含む、請求項134〜137のいずれか一項記載の方法。
[請求項140]
合成抗体のpH7での正味電荷が+2〜-2である、請求項139記載の方法。
[請求項141]
以下の段階を含む、リガンド同定のための方法:
(a)標的アレイを含む支持体表面を1種または複数種の潜在的なリガンドと接触させる段階であって、該支持体上に存在する適切な標的への該1種または複数種のリガンドの中程度から高度の親和性結合に適した条件下で実施される段階;および
(b)少なくとも中程度の親和性で前記1種または複数種のリガンドに結合する標的を同定する段階。
[請求項142]
1種または複数種の潜在的なリガンドが、抗体および請求項113〜131のいずれか一項記載の合成抗体からなる群より選択される、請求項141記載の方法。
[請求項143]
標的のアレイがフローチャンバー中に取り付けられ、
(i)1種または複数種の潜在的なリガンドを含む第1の緩衝液が、アドレス指定可能なアレイ上に流され、
(ii)少なくとも中程度の親和性で前記1種または複数種のリガンドに結合する標的を同定する段階が、アレイリーダーによって集められたリアルタイムの親和性データを解析することを含み、
(iii)前記アドレス指定可能なアレイへの少なくとも中程度の結合が検出された後に、該アレイ上の第1の緩衝液フローが停止され;
(iv)1種または複数種のさらなる潜在的なリガンドを含む別の緩衝液を用いて、(i)〜(iii)のステップを所望の回数繰り返す、
請求項141または142記載の方法。
[請求項144]
本発明による複数の合成抗体を含む支持体を試験試料と接触させる段階および該試験試料に対する合成抗体の結合を対照試料に対する合成抗体の結合と比較する段階を含む、関心対象の試験試料に対する合成抗体プロファイルを同定するための方法であって、該対照試料と比べて該試験試料中の標的に差次的に結合する合成抗体が、該試験試料に対する合成抗体プロファイルを構成する方法。
[請求項145]
対照試料を試験試料と同じ支持体に接触させる、請求項144記載の方法。
[請求項146]
試験試料が疾患状態の試験試料である、請求項144または145記載の方法。
[請求項147]
試験試料が研究用の試験試料である、請求項144または145記載の方法。
[請求項148]
以下を含む組成物:
(a)鋳型核酸鎖に結合した第1の親和性要素;
(b)相補的な核酸鎖に結合した第2の親和性要素;
ここで、前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素は、共通の標的に非競合的に結合し;
前記鋳型核酸鎖および前記相補的な核酸鎖は、塩基対合によってアニールしてアセンブリを形成し;
前記第1の親和性要素および前記第2の親和性要素は、前記アセンブリ中で離れており;かつ、
前記鋳型核酸鎖、前記相補的な核酸鎖のいずれかまたは両方が、支持体の表面に結合している。
[請求項149]
支持体表面に結合した請求項148記載の複数の組成物を含むアレイであって、該複数の組成物が以下の1つまたは両方を含む、アレイ:
(a)第1のリガンドおよび第2のリガンドが各組成物に対して同じであるが、アセンブリ中の該第2のリガンドからの該第1のリガンドの分離が異なる、複数の組成物;ならびに
(b)前記第1のリガンドおよび/または前記第2のリガンドが各組成物に対して異なる、複数の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】図2〜8に示すシンボディ(synbody)変種の概念図の記号一覧。
【図２】単純なシンボディの概略図。
【図３】(a)ホモ二量体および(b)ヘテロ二量体に特異的なシンボディの概略図。
【図４】(a〜b)化学的ORゲートまたはスイッチとして作用するシンボディの概略図。
【図５】複数のA分子に協同的に結合するシンボディの概略図(a≠1;正の協同性または負の協同性のいずれか)。
【図６】複数の異なる分子に協同的に結合するシンボディの概略図(a≠1;正の協同性または負の協同性のいずれか)。
【図７】シグナル伝達分子センサーとして作用するシンボディの概略図;(a)2つの要素が相互作用してシグナルを形成する;(b)2つの要素がずらされてシグナルを形成する。
【図８】酵素活性の作動装置として作用するシンボディの概略図(ホモ多量体またはヘテロ多量体)。
【図９】(a)合成抗体の図示。(b)ペプチド間の距離が異なるシンボディのミニライブラリーの構築。(c)分子計算尺組成物の1つの態様。
【図１０】(a)マレイミドスルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシラート)の構造。(b)スルホ-SMCCを用いた、ポリリジン表面コーティングのリジン単量体のεアミンへのポリペプチドのC末端システインのチオール結合による、ポリリジン表面コーティングへのポリペプチドの結合。
【図１１】(a)SPRチップ表面へのタンパク質標的の結合の間に予想されるシグナル。(b)SPRチップ表面へのタンパク質標的の結合の段階。
【図１２】(a)第1のリガンドのみと固定化された標的との相互作用;(b)第2のリガンドのみと固定化された標的との相互作用;(c)第1のリガンドおよび第2のリガンドと固定化された標的との相互作用(これらのリガンドは競合も干渉もしない);(d)標的上の異なる部位に結合しないが、その代わりに同じ結合部位を求めて競合する2つのリガンドの結合の際に予想されるSPRシグナル。
【図１３】実施例2において説明するようにして同定したポリペプチドのいくつかのペア(表1を参照されたい)を異なる標的部位への結合に関して評価した結果。
【図１４】オリゴヌクレオチド中にアミンで修飾されたシトシンを提供するために使用された、5'-ジメトキシトリチル-N-ジメチルホルムアミジン-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシシチジン、3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト。
【図１５】DNAリンカーによって連結された、実施例3において説明するようにして同定した2つのポリペプチド親和性要素を含む、gal80に特異的なシンボディの概略図。
【図１６】ポリペプチド親和性要素を含むシンボディ。出現順に、それぞれSEQ ID NO：20および23として開示されるペプチドを示す。
【図１７】ポリペプチド親和性要素を含むシンボディの合成のフローチャート。
【図１８】BP1およびBP2を含むシンボディのgal80に対する相対的なSPR応答。
【図１９】親和性要素BP1単独およびBP2単独、BP1-BP2を含むシンボディ、ならびにDNAリンカーに結合させたBP1単独およびBP2単独のgal80に対する親和性(Kd)。
【図２０】BP1-BP2を含むシンボディと比較して、gal80に対するBP1単独およびBP2単独の結合親和性を確認するELISAタイプの解析から得られたデータ。
【図２１】リジン分子のαアミン部分およびεアミン部分に2つの20量体ポリペプチドのC末端グリシンを連結し、それによって約1nmの間隔を提供することによって構築したシンボディの概略図。
【図２２】1C10が最も高い強度で結合した18種のタンパク質、および観察された相対強度を示すグラフ。
【図２３】SYN23-26が最も高い強度で結合した18種のタンパク質、および観察された相対強度を示すグラフ。
【図２４】SYN21-22が最も高い強度で結合した18種のタンパク質、および観察された相対強度を示すグラフ。
【図２５】gal80シンボディが最も高い強度で結合した15種のタンパク質、および観察された相対強度を示すグラフ。
【図２６】(a)DNAオリゴヌクレオチドから構築した4-らせんDNAタイルリンカーの概略図。(b)一本鎖DNAループ中に組み込まれたトロンビンに特異的なアプタマーの位置。概略的に示したように、アプタマーがタイルから伸びた構造物を提供する。(c)単一のアプタマーを含むループのみを有する構造物。(d)単一のアプタマーを含むループのみを有する別の構造物。
【図２７】DNAタイルシンボディにおけるトロンビン結合アッセイ法の結果を示すグラフ。
【図２８】クリック型の化学反応による結合に適した化学的部分のペア。
【図２９】結合が表示した順序で実施される場合に、4つの相互作用しない(orthogonal)結合を提供する、クリック型の化学反応による結合に適した化学的部分の4つのペア
【図３０】ポリ-(Gly-Ser)リンカーを含むシンボディの合成の図。SEQ ID NO：27として開示されるペプチドを示す。
【図３１】マレイミド官能化ポリペプチドとチオール官能化オリゴヌクレオチドの結合を示す図。
【図３２】ポリ-(Gly-Hyp-Hyp)リンカーを含むシンボディの合成の図。SEQ ID NO：29として開示されるペプチドを示す。
【図３３】両方の親和性要素がクリック型の化学結合によって結合されている、ポリ-(Gly-Hyp-Hyp)リンカーを含むシンボディの合成の図。SEQ ID NO：29として開示されるペプチドを示す。
【図３４】シンボディを標的と結合させて自己組み立てさせることにより、最適化した親和性要素および/またはリンカーを同定するための方法の根底にある概念概略図
【図３５】3つの潜在的に可逆的な結合化学反応を示す図。
【図３６】シンボディリンカーとして使用するのに適したテトラペプチド骨格の合成を示す図。
【図３７】テトラペプチド骨格リンカーへの最大3つの親和性要素の相互作用しない結合を示す図。
【図３８】シンボディリンカーとして使用するのに適したデカペプチド（SEQ ID NO：24）骨格の合成を示す図。
【図３９】デカペプチド（それぞれ、流れ図に沿って出現順にSEQ ID NO：24、30、30、24、および24）骨格リンカーへの親和性要素の相互作用しない結合を示す図。
【図４０】Symphonyペプチド合成機において標準的な固相ペプチド合成方法を用いて、図に示すようにポリペプチド親和性要素400、ポリ-(Pro-Gly-Pro)リンカー410（SEQ ID NO：31）、およびリジン402に結合させたアジド部分を含む、図40に示す構造物を合成した。第2のポリペプチド親和性要素406を含み、かつ図に示すようにアルキン部分404を有する第2の構造物を別に合成した。これら2つの構造物を、ビタミンCおよびCuSO4の存在下、溶液中で反応させて、連結されたシンボディ構造物408を作製した。正確なシンボディ構造物の合成をMALDIによって確認した。
【図４１】図41に示すチアゾリジン形成プロセスによって、ポリ-(Pro-Gly-Pro)で連結されたシンボディも構築した。この合成において、標準的な固相ペプチド合成方法により、ポリペプチド親和性要素TRF26(SEQ ID NO. 8)412をポリ-(Pro-Gly-Pro)リンカー414（SEQ ID NO：33）（全体の配列、すなわちTRF26＋414は、SEQ ID NO：32として開示される）と共に合成した。これは、図に示すようにポリペプチド親和性要素412と反対側のリンカーの端またはその近くにシステイン残基416を有する。C末端近くにセリン残基420を有する第2のポリペプチド親和性要素TRF23(SEQ ID NO. 5) 418を合成し、これを424（SEQ ID NO：34）に示すように改変した。これら2つの実体をpH4.5の溶液中で反応させて、422に示すチアゾリジン環結合を作製した。正確なシンボディ構造物426の合成をMALDIによって確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
ポリプロリンおよびその変異体が、いくつかの態様においてリンカーとして使用され得る。ポリプロリンは、三回転対称性の比較的剛性かつ安定ならせん構造を形成し、したがって、残基3個の間隔をあけて並んだ結合部位は、軸次元に対するそれらの角度関係を基準としてほぼ整列している。このような結合部位(3残基分離れている)間の距離は、ポリプロリンIIの場合、約9.4Aであり、ペプチド結合はトランス立体構造であり、ポリプロリンIの場合、約5.6Aであり、ペプチド結合はシス立体構造である。これらの構築物中のプロリンをヒドロキシプロリンで置換して、より親水性の構造物を提供し、溶解性を改善することができる。参照により本明細書に組み入れられる、Schumacher M, Mizuno K, Chinger HPB: The Crystal Structure of the Collagen-like Polypeptide (Glycyl-4(R)- hydroxyprolyl-4(R)-hydroxyprolyl)9 （SEQ ID NO：25）at 1.55 Å Resolution Shows Up-puckering of the Proline Ring in the Xaa Position. Journal of Biological Chemistry 2005, 280(21):20397-20403を参照されたい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
図30は、ポリGly-Serリンカーによって連結された2つのペプチド親和性要素(TRF26およびTRF23)を含み、かつ、適切な蛍光標識を用いた標識のために、ミニPEGを介して結合されたシステインをさらに含む、シンボディの合成を示す。標準的な方法により、マイクロ波合成機中で、図30(1)に示す実体を大量(すなわち、0.5〜1.0mmole)に最初に合成する。次いで、ivDDE保護基を除去し、脱保護した生成物を10個のアリコートに分割する。再びマイクロ波合成により、各アリコートに、1〜10個の範囲の所定の数のGly-Serを添加し、その結果、この時点で各アリコートは(Gly-Ser)n(nは、第1のアリコートの場合は1、第2のアリコートの場合は2（SEQ ID NO：26）など、最高10（SEQ ID NO：27）まで)を含むリンカーを有する(図30(3))。各アリコートにおいて、次いで、アミノ酸の段階的付加によって、第2のペプチド親和性要素であるTRF23を合成する(図30(4))。次いで、シンボディを樹脂から切断する。ミニPEGで連結されたシステイン上の完全なt-ブチルチオール保護基を除去し、かつ所望の場合は蛍光標識を付加してよい(図30(5))。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
図33は、互いに相互作用しない結合を用いて両方の親和性要素を結合させることによる、様々な長さのポリ-(Gly-Hyp-Hyp)リンカーを用いたシンボディの合成を示す。n=1〜n=10（SEQ ID NO：28）の様々な長さの(Gly-Hyp-Hyp)nリンカーを、第1の親和性要素を結合するためのフラニル部分376および第2の親和性要素を結合するためのベンズアルデヒド部分378と共に前もって合成する。ヒドラジド部分で官能化した第1の親和性要素380を、ポリ-(Gly-Hyp-Hyp)リンカーのベンズアルデヒド部分に結合させる(図33(a))。マレイミド部分386で官能化した第2の親和性要素384を、リンカーのフラニル部分に結合させる(図33(b))。複数の異なるリンカー長および/または複数のペプチド配列を含む反応混合物中でこれらの結合を実施して、複数のリンカー長および親和性要素の組合せに相当するコンビナトリアルライブラリーの作製を可能にすることができ、これから、アフィニティーカラムまたは他の適切なスクリーニング法を用いて、関心対象の標的に最適に結合する構築物を同定する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
修飾アミノ酸の合成
1-メチル-1-フェニルエチル3-アミノプロパノアート(図36(3))を以下のようにして合成した:NaH(50mg、2.1mmol)のジエチルエーテル(2mL)懸濁液に、ジエチルエーテル2mL中2-フェニル-2-プロパノール(2.5g、18.36mmol)溶液を滴下して加えた。この混合物を室温で20分間攪拌し、次いで0℃で冷却した。トリクロロアセトニトリル(1.9mL)を緩徐に添加し(15分間)、混合物を室温に戻した。1時間攪拌した後、混合物を濃縮乾燥させ、結果として得られる油をペンタン(2mL)中に溶解し、溶液をろ過した。ろ液を蒸発乾固させて、非常に色の濃い油を得、本発明者らはこれを次の反応で直ちに使用した。新しく調製した1-メチル-1,1-フェニルエチルトリクロロアセトイミダート(2.7g、6.424mmol)を、DCM(8mL)に溶かしたFmoc-β-アラニン(図36(1))(1g、3.212mmol)溶液に添加した。一晩攪拌した後、沈殿したトリクロロアセトアミドをろ過によって除去し、ろ液混合物を蒸発乾固させ、かつフラッシュクロマトグラフィーCH2Cl2/MeOH(0％〜1％)によって精製して、1.158g(84％)の化合物2を無色の油として得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
フラスコ中で、(図36(2))(1.158g、2.698mmol)をDCM(4mL)中に溶解し、ジエチルアミン(12mL)を添加した。すぐに、混合物は透明になる。混合物を2時間攪拌した。トルエン20mLを添加した後、混合物を濃縮乾燥させ、10％のCH2Cl2MeOHおよび2％のEt3Nを用いて、フラッシュクロマトグラフィーにより分離を実施して、526mg(94％)の(図36(3))を無色の油として得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
N2-(アリルオキシカルボニル)-N3-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-2,3-ジアミノプロパン酸(7)を以下のようにして合成した:氷浴中で冷却した4M NaOH溶液3.78mL中のアスパラギン2g(図36(4)、15.138mmol)の溶液に、アリルクロロホルマート1.615mL(15.138mmol)および4M NaOH溶液3.78mLを分割して添加した。反応をアルカリ性で維持し、室温で15分間攪拌した。エーテルでこの混合物を抽出し、濃HClで酸性にし、こうして生成物を結晶化させ、ろ過し、かつ凍結乾燥して、白色固形物として(図36(5))(2.816g、86％)を得た。[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]ベンゼン(8.402g、19.539mmol)を、(図36(5))(2.816g、13.026mmol)および水性DMF(140mL、1:1、体積/体積)の混合物に添加した。混合物を15分間攪拌し、DIEA(4.54mL、26.052mmol)を添加した。8時間の反応後、反応物の半分しか消費されなかった。したがって、同じ量の[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]ベンゼンおよびDIEAを添加し、反応物を一晩攪拌した。翌日、溶液を濃縮乾燥させ、残渣を水100mL中に溶解し、ジエチルエーテルで繰り返し洗浄することによって(4×100mL)、有機副産物を除去した。水相を蒸発乾固させて、生成物(図36(6))を得、これをそれ以上精製せずに次の反応で使用した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
先に得た油(図36(6))を水(20mL)中に再溶解し、アセトニトリル(15mL)に溶かしたDIEA(2.24mL、13.026mmol)およびFmocOSu(4.393g、13.026mmol)を添加し、この反応物を1.5時間攪拌させた。HCl添加によってこの混合物を(pH2.0まで)酸性にし、生成物をDCM中で抽出した(5×40mL)。有機相を合一し、Na2SO4で乾燥し、かつ蒸発乾固させた。粗生成物混合物をフラッシュクロマトグラフィー(DCM中10％MeOH)によって精製した。合一した生成物画分にヘキサンを添加し、形成された沈殿をろ過し、ヘキサンで洗浄し、かつ乾燥させて白色固形物(図36(7))を得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
H2O 50mLおよびMeOH 100mLに溶かしたL-アスパラギン(図36(4))(2g、15.138mmol)溶液に、以下のものを添加した:K2CO3(3.138g、22.707mmol)、CuSO4(38mg、0.151mmol)、および予め調製したTfN3のCH2Cl2溶液。この反応物を室温で一晩攪拌した。次いで、固形NaHCO3(10g)を注意深く添加し、有機溶媒を蒸発させた。濃HClを水溶液に添加してpH=6にし、かつ0.25M PBS 100mLを添加した。次いで、酢酸エチル(3×150mL)を使用して抽出を実施した。次に、さらに多くの濃HClを使用してpH=2に到達させ、酢酸エチル(5×150mL)で新たに抽出を実施し、かつ抽出物を濃縮乾燥させて、黄色の油(図36(8))を得、これをそれ以上精製せずに次の反応で使用した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
[ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨード]ベンゼン(19.529g、45.414mmol)を、粗製の(図36(8))(15.138mmol)および水性DMF(120mL mL、1:1、体積/体積)の混合物に添加した。混合物を15分間攪拌し、DIEA(10.546mL、60.552mmol)を添加した。反応を一晩継続する。翌日、溶液を濃縮乾燥させ、残渣を水100mL中に溶解し、ジエチルエーテルで繰り返し洗浄することによって(3×100mL)、有機副産物を除去した。水相を蒸発乾固させて、青白い油として生成物(図36(9))を得、これをそれ以上精製せずに次の反応で使用した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
先に得た油(図36(9))を水(20mL)中に再溶解し、アセトニトリル(15mL)に溶かしたDIEA(2.6mL、15.138mmol)およびFmocOSu(5.106g、15.138mmol)を添加し、この反応物を1.5時間攪拌させた。HCl添加によってこの混合物を(pH2.0まで)酸性にし、生成物をDCM中で抽出した(5×40mL)。有機相を合一し、Na2SO4で乾燥し、かつ蒸発乾固させた。粗生成物混合物をフラッシュクロマトグラフィー(DCM中10％MeOH)によって精製した。合一した生成物画分にヘキサンを添加し、形成された沈殿をろ過し、ヘキサンで洗浄し、かつ乾燥させて白色固形物(図36(10))を得た。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
樹脂上での骨格の合成
1％(体積/体積)AcOH(16mL)を含む、1-メチル-1-フェニルエチル3-アミノプロパノアート(図36(3)、160mg、4当量)およびNaCNBH3(48mg、4当量)のDMF中混合物で、先に誘導体化した樹脂(1.0g、0.16mmol/gの添加量)を室温で1時間処理した。DMF、DCM、およびMeOHで樹脂を洗浄し、フィルター上で乾燥させた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
DMF-DCM(1:9、体積/体積)に溶かした5.0当量のPyAOPおよび10当量のDIEAを25℃で2時間用いて、二級アミンをAloc-Dpr(Fmoc)-OH7(5.0当量)でアシル化した。25℃で20分間、ピペリジン-DMF(1:4、体積/体積)で処理することによって、Fmoc基を除去した。25℃で1時間、DMFに溶かした5当量のアミノ酸、5当量のHATU、および10当量のコリジンで処理することによって、2-アジド-3-[(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)アミノ]プロパン酸(図36(10))およびFmoc-Dpr-(Mtt)-OH(11)のカップリングを各事例において実施して、生成物(図36(12))を得た。TFAのDCM溶液(1:99、体積/体積、25℃で6分間)で処理することにより、Mttの除去およびPhiPr保護を実施し、続いて、PyのDCM中混合物(1:5、体積/体積)で洗浄することによって直ちに中和した。次いで、PyAOPを活性化因子として用いて(DMFに溶かした5当量のPyAOP、5当量のDIEA。25℃で2時間)、ペプチド(図36(13))の環化を実施した。各カップリング(環化段階を含む)後、無水酢酸処理によって、潜在的に残存する遊離アミノ基をキャップ化した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
次いで、TFAのDCM溶液(1:1、体積/体積、25℃で30分)で樹脂を処理して、最終生成物を遊離させた((図36(14))。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
デカペプチドH2NLys(Fmoc)ProGlyLys(pNz)Lys(Boc)Lys(NHDde)ProGly-Lys(Aloc)AlaOH（SEQ ID NO：24）(図38(b))の合成
保護ペプチドの組み立てを手動で実施した。Fmoc-Ala-SASRIN(0.5g、0.75当量/g)を洗浄し、CH2Cl2(2×10mL×15分)およびDMF(2×50mL×15分)で膨張させた(swollen)。樹脂添加量に対して、DMF8mLに溶かした4当量のPyBOPおよび8当量のDIEAで30分間インサイチューで活性化した4当量のN-α-Fmoc-保護アミノ酸を用いて、カップリング反応を実施した。各カップリングの完全性をカイザー試験によって確認した。ピペリジン:DMF 1:4(10mL×4×10分)での処理により、N-α-Fmoc保護基を除去し、各脱保護の完全性を、ピペリジン洗浄物の299nmでのUV吸収によって確認した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
溶液中での環化(図38(c))
上記の直鎖状ペプチドをDMF(100mL)中に溶解し、DIEA添加によってpHを8〜9に調整した。HATU(1.1当量)を添加し、溶液を室温で3時間攪拌した。真空中で溶媒を除去した。残渣をTFA:CH2Cl2 1:1(15mL)中に溶解し、室温で45分間静置した。次いで、溶液を減圧下で濃縮し、残渣をEt2Oで粉砕し、かつろ過して、図38(c)に示す粗生成物を得た。骨格は、異なる表面にそれを結合させるため、または研究に寄与すると考えられる色素を付加するために、官能化することができる。