(57)【要約】本発明は、記憶及び認知機能の分野に関する。本明細書では、本発明者らは、記憶刺激がマウス海馬においてオートファジーを誘導し、海馬オートファジーの局所的な薬理学的及び遺伝的調節が記憶獲得に強く影響を及ぼすことを示す。さらに、本発明者らは、加齢の間に海馬オートファジーが減退することを観察し、本発明者らは、オートファジー誘導因子（例えばＴＡＴ−ベクリン−１など）に続いて、老齢マウスの海馬において特異的にオートファジーを回復することによって、加齢に関連する記憶減退を有意に逆転することができることを見出した。本発明者らの結果は、海馬に依存的な記憶機能を調節する際でのオートファジーの新規の生理学的役割を明らかにし、認知機能に対する加齢の有害な効果を防止及び／又は逆転させるために、オートファジーを調節することの潜在的な治療上の利点を実証する。本発明は、それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項２】
それを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項３】
認知機能に対する加齢の有害な効果の防止及び／又は逆転における使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項４】
それを必要とする被験者における加齢に関連する記憶減退又は加齢に関連する記憶喪失の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項５】
アクチベーターが、Ｅａｒｌｅの平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、ブレフェルジンＡ、タプシガルギン、ツニカマイシン、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７６、小分子エンハンサーラパマイシン（ＳＭＥＲ）、トレハロース、Ｌ−６９０，３３０、カルバマゼピン、バルプロン酸ナトリウム塩、Ｎ−アセチル−Ｄ−スフィンゴシン（Ｃ２−セラミド）、ペニトレムＡ、カルパスタチン、ゼストスポンギンＢ、アケビアサポニン、アミオダロン塩酸塩、ＡＴＧ１３、ＧＦ  １０９２０３Ｘ（合成）、ＧＦ  １０９２０３Ｘ塩酸塩、Ｎ−ヘキサノイル−Ｄ−スフィンゴシン、ＭＲＴ６８９２１二塩酸塩、ニクロサミド、Ｑｃ１、ロットレリン、ＳＴＦ−６２２４７、タモキシフェン、テムシロリムス、ＵＬＫ  Ａｃｔｉｖｅ、Ｚ３６及びヒドロキシクエン酸塩からなる群において選択される、請求項１から４に記載の使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項６】
アクチベーターがベクリン１である、請求項１から４に記載の使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項７】
アクチベーターが、式（Ｉ）（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１から４に記載の使用のためのオートファジーのアクチベーター：
Ｘａａ１−Ｎ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５、それにおいて：
Ｘａａ１、Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４、Ｘａａ５はアミノ酸アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）、ノルロイシン、ノルバリン、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｇｕ））、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、又はペンタフルオロフェニルアラニンである。
【請求項８】
アクチベーターが配列番号３７のペプチドＴＡＴ−ベクリン１である、請求項７に記載の使用のためのオートファジーのアクチベーター。
【請求項９】
それを必要とする被験者において、治療有効量のオートファジーのアクチベーターを投与することを含む、それを必要とする被験者において認知機能を回復及び／又は改善するための方法。
【請求項１０】
それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターを含む治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な脳の加齢は、中年頃に発生し始める認知機能における進行性の減退により特徴付けられる。脳の最も一般的に影響を受ける領域の１つは海馬であり、それは学習症及び記憶障害に導く。世界保健機関による報告によると、６５歳又はそれ以上の人々の数は２０４０年に１５億人近くまで増えると予想されており、世界の人口の１６パーセントに相当する。実際に、個人の有意な割合が、通常の加齢に関連付けられる記憶機能における変化に対処する必要がある。従って、健康な脳がどのように加齢するかについてのより深い理解によって、加齢に関連する認知欠損に関与する機構の同定から利益が得られるであろうし、加齢の間での我々の精神面の健康期間の減退を防止する、及び／又はレジリエンスを回復させる新規治療戦略の開発に導かれうる。
【０００３】
哺乳類の脳の海馬は、学習及び記憶の制御のための中枢である。一生を通じた記憶の統合及び強化は、ニューロンの構造的再構築及び可塑性についての海馬の能力に頼っている（５、６）。これは主に、樹状突起及びシナプスの複雑さにおける継続的な再編成、神経伝達により、ならびに成人の神経新生を通じた新生児ニューロンの生成により特徴付けられる（５、７、８）。しかし、この高度な海馬ニューロン及びシナプスの再編成も、加齢の間でのその極端な脆弱性についての主要な理由の１つである。実際に、海馬の加齢の特徴は、加齢に関連する認知減退が神経可塑性における低下と相関していることである（５、９、１０）。この減退は、海馬に依存的な学習及び記憶の進行性の障害に導き（５、６、１０）、それは、エピソード記憶、注意、作業記憶、及び空間学習における欠損により特徴付けられる（１０、１１）。先進社会での平均余命における進行性の増加に伴い、加齢に関連する記憶喪失により影響を受ける個人の数は増加する運命にある。従って、海馬に依存的な記憶獲得及び加齢に関連する認知欠損を制御する細胞機構のより深い理解が現在基本となっている。
【０００４】
この問題に取り組むために、本発明者らは、マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）、タンパク質及び細胞小器官がオートファゴソーム（ＡＰ）と呼ばれる二重膜小胞に貪食されて、次に分解のためにリソソームに輸送される細胞異化過程に焦点を当てた（１、３、１２）。ＡＰの生合成は、複数のシグナル伝達経路及び動的膜複合体により編成され、それはオートファジー関連タンパク質（ＡＴＧ）及び関連タンパク質（例えばＶＰＳ３４、ＶＰＳ１５、及びＡＭＢＲＡ１など）を含む（１、２）。ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２−ＡＴＧ１６Ｌ１複合体は、ＬＣ３タンパク質（ＬＣ３−ＩＩ）の脂質化を可能にし、それは次に、新生ＡＰの部位に動員され、二重膜構造の形成及び成熟を支持する（１３）。重要なことに、オートファジーはまた、種々の生理学的刺激（１、２）へのストレス応答機構（１、１２）において及び幹細胞前駆細胞の再生能力の維持（１４、１５）のために基本的な役割を果たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書では、本発明者らは、記憶刺激によってマウス海馬においてオートファジーが誘導され、海馬オートファジーの局所的な薬理学的及び遺伝的調節が記憶獲得に強く影響することを示す。これらの効果は、記憶刺激に応答したニューロンのシナプス可塑性及び樹状突起棘形成の誘導に関連付けられる。重要なことに、本発明者らは、加齢の間に海馬のオートファジーが減退することを観察し、本発明者らは、オートファジー誘導因子（例えばＴＡＴ−ベクリン１など）に続いて、老齢マウスの海馬において特にオートファジーを回復することによって、加齢に関連した記憶力の減退を有意に逆転することができることを見出した。最後に、本発明者らは、オートファジーが、加齢の間での記憶機能に対する若齢血漿の最近記載された有益な効果を媒介することを実証する。
【０００６】
本発明者らの結果は、海馬に依存的な記憶機能を調節する際でのオートファジーの新規の生理学的役割を明らかにし、認知機能に対する加齢の有害な効果を防止及び／又は逆転させるために、オートファジーを調節することの潜在的な治療上の利益を実証しており、それは、現在、西欧社会における非常に優先されている医療制度の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このように、本発明は、それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【０００８】
発明の詳細な説明：
【０００９】
本発明の第１の態様は、それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１０】
言い換えると、本発明は、それを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１１】
一実施形態では、オートファジーはニューロンのオートファジーである。
【００１２】
一実施形態では、認知機能は、知識、注意、記憶及び作業記憶、判断及び評価、推論及び計算、問題解決及び意思決定、言語の理解及び産生である。
【００１３】
一実施形態では、認知トラブルは、知識、注意、記憶及び作業記憶、判断及び評価、処理速度、推論及び計算、実行機能、視空間能力、問題解決及び意思決定、言語の理解及び産生におけるトラブルである。
【００１４】
このように、一実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における記憶の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１５】
本発明によれば、オートファジーのアクチベーターは、加齢に関連する記憶減退を伴う高齢者において使用してもよい。
【００１６】
このように、本発明はまた、それを必要とする被験者における加齢に関連する記憶減退又は加齢に関連する記憶喪失の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１７】
このように、本発明はまた、それを必要とする被験者における認知症の処置における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１８】
言い換えると、本発明は、認知機能に対する加齢の有害な効果の防止及び／又は逆転における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、記憶に対する加齢の有害な効果の防止及び／又は逆転における使用のためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００２０】
本発明によれば、オートファジーのアクチベーターは、記憶に対する影響を有する疾患を伴う人々において使用してもよい。そのような疾患は、アルツハイマー病、認知症、健忘症、胸腺肥大症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、ストレス又はウェルニッケ・コルサコフ症候群でありうる。
【００２１】
このように、本発明の第２の態様は、アルツハイマー病、認知症、健忘症、胸腺肥大症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、ストレス又はウェルニッケ・コルサコフ症候群に罹患している、それを必要とする被験者において記憶を回復及び／又は改善するためのオートファジーのアクチベーターに関する。
【００２２】
本明細書で使用するように、用語「オートファジー」は、分解のために細胞質成分（タンパク質及び細胞小器官）をリソソームに送達する天然の細胞内システムを表示する。オートファジーの３つの形態が一般的に記載されている：マクロオートファジー、マイクロオートファジー、及びシャペロン媒介オートファジー（ＣＭＡ）（マイトファジーと共に）。本発明者は、マクロオートファジー（以下、オートファジーとして言及する）、即ち、細胞質の一部がオートファゴソームとして公知である二重膜又は多重膜小胞内に捕捉され、次に、大量分解のためにリソソームに送達される、真核細胞における最も特徴付けられたオートファジー機構に焦点を当てる。実際に、それはリソソーム分解を通じて細胞小器官及び高分子の量及び質を調節することにより細胞の健康を維持する必須のタンパク質恒常性及びストレス反応機構である。
【００２３】
マクロオートファジーの初期段階は、ファゴフォア（分離膜とも呼ばれる）の形成、ファゴフォアによる細胞質物質の貪食、ファゴフォア膜の伸長、及びオートファゴソームを閉じるためのその縁の融合からなる。オートファゴソームの外膜はリソソームと融合してオートリソソーム（オートファゴソームとも呼ばれる）を形成し、内膜を含む管腔物質が分解される。
【００２４】
オートファゴソームの生合成は、複数のシグナル伝達経路及び、二重膜オートファゴソームの形成のために不可欠であるオートファジー関連（ＡＴＧ）タンパク質（例えばＢｅｃｌｉｎ−１、ＡＴＧ１４、Ｖｐｓ３４など）を含む動的膜複合体により編成される。ＡＴＧ５／１２／１６Ｌ１複合体は、最終的にＬＣ３タンパク質（ＬＣ３ＩＩ）の脂質化を可能にし、それは次に、新生オートファゴソームの部位に動員され、二重膜構造の成長及びその成熟を支持する。オートファゴソームは最終的にリソソームと融合し、その内容物は分解されてリサイクルされる。
【００２５】
細胞レベルでは、マクロオートファジーは細胞小器官及びタンパク質凝集体を分解するための唯一の異化機構としての役割を果たす。オートファジーは、細胞内成分の代謝回転（例えばアミノ酸、脂質、及び糖など）の調節に関与し、それにより細胞代謝及びエネルギー産生に直接的に寄与する。実際に、オートファジーは細胞の恒常性及び細胞小器官の代謝回転を制御する。オートファジーの調節不全は、癌、糖尿病、肥満、及び神経変性疾患に関連付けられる。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における記憶の回復及び／又は改善における使用のためのマクロオートファジーのアクチベーターに関する。
【００２７】
本明細書で使用するように、用語「オートファジーのアクチベーター」、より具体的には「ニューロンのオートファジーのアクチベーター」又は「海馬のオートファジーのアクチベーター」は、マクロオートファジーを回復及び／又は改善することができる化合物を表示する。この種類の化合物は、このように、生理学的及び環境的刺激への応答における細胞の適応機構ならびにリソソーム分解を通じて細胞小器官及び高分子の量及び質を維持するための細胞の能力の両方を回復及び／又は改善することができる。
【００２８】
オートファジーのアクチベーターは当技術分野において周知である（例えば、Ya-ping YANG et al 2013及びｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ？ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１０４８９９４４４を参照のこと）。オートファジーのアクチベーターは、Ｅａｒｌｅの平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、ブレフェルジンＡ、タプシガルギン、ツニカマイシン、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７６、小分子エンハンサーラパマイシン（ＳＭＥＲ）、トレハロース、塩化リチウム、Ｌ−６９０，３３０、カルバマゼピン、バルプロン酸ナトリウム塩、Ｎ−アセチル−Ｄ−スフィンゴシン（Ｃ２−セラミド）、ペニトレムＡ、カルパスタチン、ゼストスポンギンＢ、アケビアサポニン、アミオダロン塩酸塩、ＡＴＧ１３、ＧＦ  １０９２０３Ｘ（合成）、ＧＦ  １０９２０３Ｘ塩酸塩、Ｎ−ヘキサノイル−Ｄ−スフィンゴシン、ＭＲＴ６８９２１二塩酸塩、ニクロサミド、Ｑｃ１、ロットレリン、ＳＴＦ−６２２４７、タモキシフェン、テムシロリムス、ＵＬＫ  Ａｃｔｉｖｅ、Ｚ３６及びヒドロキシクエン酸塩からなる群より選択してもよい。
【００２９】
本発明によると、用語「被験者」は、哺乳動物、例えば齧歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などを表示する。特に、本発明による被験者はヒトである。特に、被験者は、認知トラブル、及び特に記憶トラブルを伴う老人又はヒトを指す。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明のアクチベーターは、それを必要とする被験者に、経口、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内、髄腔内、又は皮下に投与することができる。本発明のアクチベーターはまた、海馬の定位注射により投与してもよい。
【００３１】
特定の実施形態では、本発明のアクチベーターは、全身投与により投与する。
【００３２】
本明細書で使用するように、用語「全身投与」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、全身が影響を受けるように循環系中への薬物の投与経路を指す。
【００３３】
特定の実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、配列番号１のベクリン１である。
ベクリン１の配列番号１：
【化１】
2022502454.tif 000002
【００３４】
別の実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、ベクリン１タンパク質から由来するペプチドであって、それにおいてペプチドは、アミノ酸配列配列番号１の残基２７０から２７８を含む配列を有する。
【００３５】
別の実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、ベクリン１タンパク質から由来するペプチドであって、それにおいてペプチドは、アミノ酸配列配列番号１の残基２７０から２８３を含む配列を有する。
【００３６】
別の実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、式（Ｉ）：Ｘａａ１−Ｎ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５のアミノ酸配列（配列番号２）を含むペプチドであって、式中：
Ｘａａ１、Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４、Ｘａａ５はアミノ酸アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）、ノルロイシン、ノルバリン、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｇｕ））、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、又はペンタフルオロフェニルアラニンである。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）：Ｘａａ１−Ｎ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５のアミノ酸配列（配列番号２）からなるペプチドに関し、式中：
Ｘａａ１、Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４、Ｘａａ５はアミノ酸アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）、ノルロイシン、ノルバリン、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｇｕ））、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、又はペンタフルオロフェニルアラニンである。
【００３８】
特定の実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、アミノ酸配列：ＦＮＡＴＦＨＩＷＨ（配列番号３）、ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤ（配列番号４）、ＣＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤ（配列番号５）、ＶＷＮＡＴＦＥＩＷＨＤ（配列番号６）、ＶＦＮＡＴＦＤＩＷＨＤ（配列番号７）、ＶＦＮＡＴＦＥＬＷＨＤ（配列番号８）、ＶＦＮＡＴＦＥＩＦＨＤ（配列番号９）、ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＹＤ（配列番号１０）、ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＥ（配列番号１１）、ＶＷＮＡＴＦＥＬＷＨＤ（配列番号１２）、ＶＦＮＡＴＦＥＶＷＨＤ（配列番号１３）、ＶＬＮＡＴＦＥＩＷＨＤ  （配列番号１４）、ＶＦＮＡＴＦＥＭＷＨＤ（配列番号１５）、ＶＷＮＡＴＦＨＩＷＨＤ（配列番号１６）、ＶＦＮＡＴＦＥＦＷＨＤ（配列番号１７）、ＶＦＮＡＴＦＥＹＷＨＤ（配列番号１８）、ＶＦＮＡＴＦＥＲＷＨＤ（配列番号１９）、ＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤ（配列番号２０）、ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨ（配列番号２１）、ＦＮＡＴＦＥＩＷＨ（配列番号２２）、ＷＮＡＴＦＨＩＷＨ（配列番号２３）、ＶＷＮＡＴＦＨＩＷＨ（配列番号２４）、又はＷＮＡＴＦＨＩＷＨＤ（配列番号２５）、又はそれらの機能保存的変異体を含む、又はそれからなるペプチドである。
【００３９】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、式（ＩＩ）：Ｖ−Ｆ−Ｎ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｘａａ１−Ｉ−Ｗ−Ｈ−Ｘａａ２−Ｇ−Ｘａａ３−Ｆ−Ｇのアミノ酸配列（配列番号２６）を含むペプチドであって、式中、Ｘａａ１はグルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）、Ｘａａ２はアスパラギン酸（Ｄ）又はセリン（Ｓ）であり、Ｘａａ３はグルタミン（Ｑ）又はグルタミン酸（Ｅ）である。
【００４０】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、アミノ酸配列：ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧ（配列番号２７）又はＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧ（配列番号２８）又はその機能保存的変異体を含むペプチドである。
【００４１】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、アミノ酸配列：ＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧ（配列番号２７）又はＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧ（配列番号２８）又はその機能保存的変異体からなるペプチドである。
【００４２】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、式（ＩＩＩ）：Ｔ−Ｎ−Ｖ−Ｆ−Ｎ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｘａａ１−Ｉ−Ｗ−Ｈ−Ｘａａ２−Ｇ−Ｘａａ３−Ｆ−Ｇ−Ｔのアミノ酸配列（配列番号２９）を含むペプチドであって、式中、Ｘａａ１はグルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）でありうる、Ｘａａ２はアスパラギン酸（Ｄ）又はセリン（Ｓ）でありうる、及びＸａａ３はグルタミン（Ｑ）又はグルタミン酸（Ｅ）でありうる。
【００４３】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、アミノ酸配列：ＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３０）もしくはＴＮＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧＴ（配列番号３１）又はその機能保存的変異体を含むペプチドである。
【００４４】
一実施形態では、オートファジーのアクチベーターは、アミノ酸配列：ＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３０）もしくはＴＮＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧＴ（配列番号３１）又はその機能保存的変異体からなるペプチドである。
【００４５】
本発明によれば、本発明のアミノ酸は双性イオン形態において左（ｓ）又は右（ｒ）でありうる。
【００４６】
本発明によれば、本発明のアミノ酸は右旋性又は左旋性でありうる。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの異種ポリペプチドに融合された、本発明によるペプチド（オートファジーのアクチベーターである）を含む融合タンパク質に関する。
【００４８】
用語「融合タンパク質」は、直接的に又はスペーサーを介して少なくとも１つの異種ポリペプチドに融合されている、本発明によるポリペプチドを指す。
【００４９】
本発明によれば、融合タンパク質は、直接的に又はスペーサーを介してそのＣ末端で異種ポリペプチドのＮ末端に、あるいはそのＮ末端で異種ポリペプチドのＣ末端に融合されている、本発明によるポリペプチドを含む。
【００５０】
本明細書中で使用するように、用語「直接的に」は、ポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸が、異種ポリペプチドの末端（Ｎ又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸に融合されていることを意味する。
【００５１】
言い換えれば、本実施形態では、前記ペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸は、共有結合により、前記異種ポリペプチドのＮ末端の第１のアミノ酸に直接的に連結されており、又は前記ペプチドのＮ末端の第１のアミノ酸は、共有結合により、前記異種ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸に直接的に連結されている。
【００５２】
本明細書中で使用するように、用語「スペーサー」は、本発明のペプチドを異種ポリペプチドに連結する少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。そのようなスペーサーは、立体障害を防止するために有用でありうる。本発明によれば、ポリペプチドは、当技術分野において公知のリンカー又はスペーサー（例えばポリグリシン、ε−アミノカプロン酸など）を通じてペプチドに結合させてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、細胞透過性ペプチド、転写のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）細胞透過性配列、細胞透過性ペプチド、又は膜透過性配列である。
【００５４】
用語「細胞透過性ペプチド」は当技術分野において周知であり、細胞透過性配列又は膜透過性配列、例えばタンパク質由来（例、ｔａｔ、ｓｍａｃ、ｐｅｎ、ｐＶＥＣ、ｂＰｒＰｐ、ＰＩｓｌ、ＶＰ２２、Ｍ９１８、ｐｅｐ−３）；キメラ（例、ＴＰ、ＴＰ１０、ＭＰＧＡ）又は合成（例、ＭＡＰ、Ｐｅｐ−１、Ｏｌｉｇｏ  Ａｒｇ）細胞透過性ペプチド（例、”Peptides as Drugs: Discovery and Development”, Ed. Bernd Groner, 2009 WILEY- VCH Verlag GmbH & Co, KGaA, Weinheim, esp. Chap 7: “The Internalization Mechanisms and Bioactivity of the Cell- Penetrating Peptides”, Mats Hansen, Elo Eriste, and Ulo Langel, pp. 125-144を参照のこと）又はペネトラチン、ＴＡＴミトコンドリア透過性配列及び化合物（Bechara and Sagan, 2013；Jones and Sayers, 2012；Khafagy el and Morishita, 2012；Malhi and Murthy, 2012）などを指す。本発明によれば、細胞透過性ペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄ）は、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号３２）、ＮＧＲ（ＣＣＮＧＲＣ；配列番号３３）、ＣＲＥＫＡ、ＬｙＰ−１（ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ；配列番号３４）、Ｆ３、ＳＭＳ（ＳＭＳＩＡＲＬ；配列番号３５）、ＩＦ７、及びＨ２００９．１（Li et al. Bioorg Med Chem. 2011 Sep 15;19(18):5480-9）でありうる。
【００５５】
特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、ショウジョウバエアンテナペディア／ペネトラチン（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオドメイン又は配列番号ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３６）の転写細胞透過性配列のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）のいずれかから由来する内在化配列である。
【００５６】
特定の実施形態では、１つ、２つ、又は３つのグリシン（Ｇ）残基を、ＴＡＴ細胞透過性配列（配列番号３６）のＣ末端に付加する。
【００５７】
特定の実施形態では、ＴＡＴペプチドを、直接的に又は１つ、２つ、又は３つグリシン（Ｇ）のスペーサーを介して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）のアミノ酸配列を含むペプチドに融合する。
【００５８】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号３７のＴＡＴ−ベクリン１（ベクリンから由来し、細胞透過性ペプチドＴＡＴに融合されたペプチド）である。
【００５９】
ＴＡＴ−ベクリン１の配列番号３７：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ
【００６０】
別の特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者において認知機能を回復及び／又は改善するためのアミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３７）又はその機能保存的変異体を含むペプチドに関する。
【００６１】
言い換えれば、本発明は、それを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のためのアミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３７）又はその機能保存的変異体を含むペプチドに関する。
【００６２】
別の特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者において認知機能を回復及び／又は改善するためのアミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３７）又はその機能保存的変異体からなるペプチドに関する。
【００６３】
言い換えれば、本発明は、それを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のためのアミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ（配列番号３７）又はその機能保存的変異体からなるペプチドに関する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）に対して１つ、２つ、又は３つのアミノ酸が異なりうる。
【００６５】
一実施形態では、本発明のペプチドは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）のペプチドにわたり少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を含み、依然としてオートファジーを誘導することができる。
【００６６】
一実施形態では、本発明のペプチドは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）のペプチドにわたり少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性からなり、依然としてオートファジーを誘導することができる。
【００６７】
別の実施形態では、本発明による配列番号３７のペプチドは、配列番号９に対して１つ、２つ、又は３つのアミノ酸とは異なりうる。
【００６８】
一実施形態では、本発明のペプチドは、前記配列番号３７にわたり少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を含み、依然としてオートファジーを誘導することができる。
【００６９】
一実施形態では、本発明のペプチドは、前記配列番号３７にわたり少なくとも６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性からなり、依然としてオートファジーを誘導することができる。
【００７０】
新たに生成されたペプチドが依然としてオートファジーを誘導することができるか否かを検証するために、第１に初代海馬ニューロン培養中での、及びマウス海馬における局所／全身注射後でのオートファジー形成及び流動の評価を実施する。第２に、陽性ペプチドの機能的活性を、物体位置記憶（ＯＬＭ）タスクアッセイ（海馬の機能的活性の単純で高速、堅牢な分析）を実施することにより、局所／全身注射後の若齢及び老齢マウスにおいてテストする。陽性結果の出現において、活性成分を次に、全行動バッテリーに関して評価し、記憶関連行動（新規物体認識（ＮＯＲ）、文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）、モリス水迷路タスク（ＭＷＭ））、細胞的側面（樹状突起棘形成の誘導）及び分子的側面（シナプス活動の分子強度）を評価する。
【００７１】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で上に定義する、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、５０アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列である。
【００７２】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で上に定義する、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、４５アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列である。
【００７３】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で上に定義する、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、４０アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列である。
【００７４】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で上に定義する、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、３５アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列である。
【００７５】
本明細書中で使用するように、用語「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、ペプチドの全体的な立体構造及び機能を変化させることなく、変化（挿入、欠失、又は置換）されたものを指す。そのような変異体は、アミノ酸変化（例えば欠失、挿入、及び／又は置換など）を有するタンパク質を含む。「欠失」は、タンパク質中での１つ又は複数のアミノ酸の非存在を指す。「挿入」は、タンパク質中での１つ又は複数のアミノ酸の付加を指す。「置換」は、タンパク質中での別のアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸の置換を指す。典型的には、所与のアミノ酸は、同様の特性（例えば、例、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸により置換される。この所与のアミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸でありうる。保存されているとして示されたもの以外のアミノ酸はタンパク質において異なりうるが、類似の機能の任意の２つのタンパク質間でのパーセントタンパク質又はアミノ酸配列類似性は変動しうる、例えば、アラインメントスキーム、例えばクラスター方法（それにおいて類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）などに従って決定されるように、７０%から９９%でありうる。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定されるように少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、さらに好ましくは少なくとも９０%、及びさらにより好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸同一性を有し、それが比較される天然又は親タンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。２つのアミノ酸配列は、８０%を上回る、好ましくは８５%を上回る、好ましくは９０%を上回るアミノ酸が同一である、又は約９０%を上回る、好ましくは９５%を上回り、より短い配列の全長にわたり類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、ウィスコンシン州マジソン）パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）のいずれかを使用してアラインメントにより同定する。
【００７６】
保存的置換の例には、１つの非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなど）の他での置換、１つの極性（親水性）残基の他での置換（例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間など）、１つの塩基性残基（例えばリジン、アルギニン、又はヒスチジンなど）の他での置換、又は１つの酸性残基（例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸など）の他での置換を含む。
【００７７】
用語「保存的置換」はまた、非誘導体化残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基の使用を含む。「化学誘導体」は、官能性側鎖の反応により化学的に誘導体化された１つ又は複数の残基を有する対象ペプチドを指す。そのような誘導体化分子の例は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成する分子を含む。遊離カルボキシル基を誘導体化し、塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他の型のエステルもしくはヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化し、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化し、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成してもよい。化学誘導体はまた、２０の標準アミノ酸の１つ又は複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドを含む。例えば：４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよい；５−ヒドロキシリシンでリシンを置換してもよい；３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよい；ホモセリンでセリンを置換してもよい；及びオルニチンでリジンを置換してもよい。用語「保存的置換」はまた、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化することを目的とした非天然アミノ酸の使用を含む。これらの非天然アミノ酸は、本明細書で以下に記載するように、化学的に修飾されたアミノ酸、例えばプロリノアミノ酸、ベータアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、アルファ、アルファ置換アミノ酸などである。これらの非天然アミノ酸はまた、フッ素化、塩素化、臭素化、又はヨウ素化された修飾アミノ酸を含みうる。
【００７８】
一実施形態では、本発明のペプチドはタグを含みうる。タグは、ペプチドの精製のために有用となりうるエピトープ含有配列である。それは、免疫標識技術を使用した細胞又は組織サンプル内の前記ペプチド又はポリペプチドの局在化、イムノブロッティングによる前記ペプチド又はポリペプチドの検出などのために、種々の技術（例えばアフィニティークロマトグラフィーなど）により付着させる。当技術分野において一般に用いられるタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、ＦＬＡＧ（商標）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグなどである。
【００７９】
一実施形態では、本発明のペプチドを蛍光色素により標識してもよい。色素標識蛍光ペプチドは、細胞試験における重要なツールである。ペプチドをＮ末端側又はＣ末端側で標識することができる。
【００８０】
アミン反応性蛍光色素を使用したＮ末端ペプチド標識：
アミン反応性蛍光プローブは、Ｎ末端残基又はリジン残基のペプチドを修飾するために広く使用されている。多数の蛍光アミノ反応性色素が、種々のペプチドを標識するために開発されており、結果として得られた複合体は生物学的適用において広く使用される。アミン反応性蛍光試薬の３つの主要なクラスがペプチドを標識するために現在使用されている：スクシンイミジルエステル（ＳＥ）、イソチオシアネート、及び塩化スルホニル。
【００８１】
アミン含有蛍光色素を使用したＣ末端標識：
アミン含有色素は、水溶性カルボジイミド（例えばＥＤＣなど）を使用してペプチドを修飾し、ペプチドのカルボキシ基をアミド基に変換するために使用される。ＮＨＳ又はＮＨＳＳのいずれかを使用し、ＥＤＣ媒介性タンパク質−カルボン酸共役の結合効率を改善させてもよい。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の治療方法において使用されるペプチドは、それらの治療効力を改善するために修飾されうることが熟慮される。治療用化合物のそのような修飾は、毒性を減少させる、循環時間を増加させる、又は体内分布を修飾するために使用してもよい。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性は、体内分布を修飾する種々の薬物担体溶媒との組み合わせにより有意に減少させることができる。
【００８３】
薬物のバイアビリティーを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーが体内分布を改変し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的バリアを通じた透過性を変化させ；及び身体からのクリアランス率を改変することが示されている。標的化効果又は徐放効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されてきた。
【００８４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性及び修飾の容易さを仮定し、薬物担体として広く使用されてきた。種々の薬物、タンパク質、及びリポソームへの付着は、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されてきた。ＰＥＧは、鎖の末端でヒドロキシル基を通じて、及び他の化学的方法を介して、活性薬剤に結合させることができる；しかし、ＰＥＧ自体は１分子当たり最大２つの活性薬剤に限定される。異なるアプローチでは、ＰＥＧ及びアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性を保持しうるが、しかし、１分子当たりの多数の付着点（より大きな薬物負荷を提供する）という追加の利点を有しうる、及び種々の適用に適するように合成的に設計されうる、新規生体材料として探索された。
【００８５】
当業者は、薬物の効果的な修飾のためのペグ化技術を認識している。例えば、ＰＥＧ及び三官能性モノマー（例えばリジンなど）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーは、VectraMed（ニュージャージー州プレインズボロ）により使用されてきた。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン又はそれ以下）は、安定したウレタン連結を通じてリジンのａ−及びｅ−アミノ基に連結されている。そのようなコポリマーはＰＥＧの望ましい特性を保持し、ポリマー鎖に沿って厳密に制御された所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋、又は他の分子との共役のために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーの間での切断可能な連結を変動させることにより、安定した長期循環プロドラッグを産生する際に有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔及び複合体の分子量当たりの薬物の量に影響を及ぼす（より小さなＰＥＧセグメントは、より大きな薬物負荷を提供する）。一般的に、ブロックコポリマー複合体の全体的な分子量を増加させることによって、複合体の循環半減期が増加する。それにもかかわらず、複合体は容易に分解可能であるか、又は閾値を限定する糸球体濾過を下回る分子量（例、４５kDa未満）を有していなければならない。
【００８６】
また、循環半減期及び体内分布を維持する際に重要であるポリマー骨格に、リンカーを使用し、特定のトリガー、典型的には標的組織中の酵素活性により骨格ポリマーから放出されるまで、治療用薬剤をプロドラッグ形態において維持してもよい。例えば、この型の組織活性化薬物送達は、体内分布の特定の部位への送達が要求され、治療用薬剤が病態の部位で又はその近くで放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達における使用のための連結基ライブラリーは当業者に公知であり、酵素動態、活性酵素の普及、及び選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づきうる（例、VectraMed（ニュージャージー州プレインズボロ）により確立された技術を参照のこと）。そのようなリンカーは、治療用送達のために、本明細書中で記載するペプチド由来物を修飾する際に使用してもよい。
【００８７】
本発明によれば、ペプチドは、従来の自動化ペプチド合成方法により、又は組換え発現により産生されうる。タンパク質を設計及び作製するための一般的な原理は当業者に周知である。
【００８８】
本発明のペプチドは、従来の技術に従って、溶液中で又は固体支持体上で合成してもよい。種々の自動シンセサイザーが商業的に入手可能であり、Stewart and Young;Tam et al., 1983；Merrifield, 1986 and Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979において記載されている公知のプロトコルに従って使用することができる。本発明のペプチドはまた、例示的なペプチドシンセサイザー、例えばApplied Biosystems Inc.からのModel 433Aなどを用いた固相技術により合成してもよい。自動ペプチド合成を通じて又は組換え方法を通じて生成された任意の所与のタンパク質の純度を、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定してもよい。各々のペプチドの化学的な真正性は、当業者に周知の任意の方法により確立してもよい。
【００８９】
自動ペプチド合成への代替物として、組換えＤＮＡ技術を用いてもよく、それにおいて選んだタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換又はトランスフェクトし、本明細書中で以下に記載するように発現のために適した条件下で培養する。組換え方法が、より長いポリペプチドを産生するために特に好ましい。
【００９０】
種々の発現ベクター／宿主系を、ペプチド又はタンパク質のコード配列を含める、及びそれを発現させるために利用してもよい。これらは、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドのＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌；酵母発現ベクター（Giga-Hama et al., 1999）を用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス、Ghosh et al., 2002を参照のこと）を用いて感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされた、又は細菌発現ベクター（例、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド；例、Babe et al., 2000を参照のこと）を用いて形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系などを含むが、これらに限定しない。当業者は、タンパク質の哺乳動物発現を最適化するための種々の技術を認識しており、例えば、Kaufman, 2000；Colosimo et al., 2000を参照のこと。組換えタンパク質産生において有用である哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、及び２９３細胞を含むが、これらに限定しない。細菌、酵母、及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコルは当業者に公知であり、本明細書中で以下に簡単に記載する。米国特許第６，５６９，６４５号；米国特許第６，０４３，３４４号；米国特許第６，０７４，８４９号；及び米国特許第６，５７９，５２０号は、ペプチドの組換え生産のための特定の例を提供し、これらの特許は、それらの教示についての参照により本明細書中に明示的に組み入れる。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系もまた当業者に周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質を処理するため、又はタンパク質活性を提供する際に有用である特定の翻訳後修飾を産生するための特定の能力について選んでもよい。ポリペプチドのそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含むが、これらに限定しない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、及び／又は機能のために重要でありうる。異なる宿主細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などは、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選んでもよい。
【００９１】
本発明のペプチド由来物の組換え産生において、ペプチド由来物をコードするためのポリヌクレオチド分子を含むベクターを用いることが必要であろう。そのようなベクターを調製する方法、ならびにそのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を産生する方法は、当業者に周知である。そのような試みにおいて使用されるポリヌクレオチド分子は、ベクターに結合されてもよく、それは一般的に、宿主中での増殖のために、選択可能なマーカー及び複製起点を含む。発現構築物のこれらのエレメントは、当業者に周知である。一般的に、発現ベクターは、適した転写又は翻訳調節配列、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子から由来するものなどに作動可能に連結されている所与のタンパク質をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳を制御する適切な配列を含む。
【００９２】
用語「発現ベクター」、「発現構築物」、又は「発現カセット」は、本明細書全体を通じて互換的に使用され、核酸のコード配列の一部又は全部が転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を含むことを意味する。
【００９３】
本発明のペプチド又はポリペプチドの発現のための適した発現ベクターの選択は、もちろん、使用される特定の宿主細胞に依存し、当業者の技術の範囲内である。哺乳動物発現ベクターの構築のための方法は、例えば、Okayama and Berg, 1983；Cosman et al., 1986；Cosman et al., 1984；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；及びＷＯ  ９１／１８９８２において開示されている。発現ベクターを産生するための他の考慮事項は、例えば、Makrides et al., 1999；Kost et al., 1999において詳述されている。Wurm et al., 1999は、組換えタンパク質生産のための哺乳動物細胞における大規模な一過性発現における考慮事項についての教示因子として本明細書中に組み入れる。
【００９４】
発現では、適切なシグナルが、ベクターにおいて提供されることが要求される（例えば宿主細胞における目的の核酸の発現を駆動するために使用されうるウイルス及び哺乳動物の両方の供給源からのエンハンサー／プロモーターなど）。通常、発現されている核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するために要求される、細胞の合成機構、又は導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を指す。ヌクレオチド配列は、調節配列が目的のペプチド（即ち、４Ｎ１Ｋ、変異体など）をコードするＤＮＡに機能的に関連している場合に作動可能に連結されている。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を方向付ける場合、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
【００９５】
同様に、語句「転写制御下」は、プロモーターが核酸に関して正しい位置及び方向にあり、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御することを意味する。核酸の発現を駆動する任意のプロモーターを使用してもよい。目的の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞における核酸の発現を方向付けることが可能である限り、重要であるとは考えられていない。このように、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において発現することが可能であるプロモーターに隣接し、及びその制御下に核酸コード領域を位置づけることが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒト又はウイルスのいずれかのプロモーターを含みうる。一般のプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、［ベータ］−アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを含み、それらの全てが、周知で、当業者に容易に入手可能なプロモーターであり、目的のコード配列の高レベルの発現を得るために使用することができる。目的のコード配列の発現を達成するために当技術分野において周知である他のウイルス又は哺乳動物細胞又は細菌ファージのプロモーターの使用もまた、発現のレベルが目的のタンパク質の回収可能な収量を産生するのに十分であるという条件で熟慮される。周知の特性を伴うプロモーターを用いることにより、トランスフェクション又は形質転換後の目的のタンパク質の発現レベル及びパターンを最適化することができる。誘導性プロモーターもまた使用してもよい。
【００９６】
タンパク質発現において使用される別の調節エレメントは、エンハンサーである。これらは、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝子エレメントである。発現構築物でｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的には、遺伝子転写物の適当なポリアデニル化をもたらすために、ポリアデニル化シグナル配列を含めることが望まれるであろう。選択されたトランスジェニック動物種の細胞により認識される任意のポリアデニル化シグナル配列は、本発明の実施のために適している（例えばヒト又はウシ成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなど）。
【００９７】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列をコードする核酸、あるいはそれを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のための本明細書で上に記載するその機能保存的変異体に関する。
【００９８】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ酸配列をコードする核酸、あるいはそれを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のための本明細書で上に記載するその機能保存的変異体に関する。
【００９９】
一実施形態では、配列番号３７からなるアミノ酸配列をコードする前記核酸。
【０１００】
本発明の核酸は、当技術分野においてそれ自体が公知の任意の技術、例えば、限定しないが、単独又は組み合わせのいずれかでの、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術により産生されうる。
【０１０１】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７のアミノ配列をコードする核酸配列、あるいはそれを必要とする被験者において認知機能を回復及び／又は改善するための、本明細書で上に記載するその機能保存的変異体に関する。
【０１０２】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は配列番号３７を含むアミノ配列をコードする核酸配列を含む発現ベクター、あるいはそれを必要とする被験者における認知トラブルの処置における使用のための本明細書で上に記載するその機能保存的変異体である。
【０１０３】
本発明によれば、本発明における使用のための適した発現ベクターは、核酸配列に操作上連結された少なくとも１つの発現制御エレメントを含みうる。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御及び調節するためにベクター中に挿入される。発現制御エレメントの例は、ｌａｃシステム、ラムダファージのオペレーター領域及びプロモーター領域、酵母プロモーター、及びポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又はＳＶ４０から由来するプロモーターを含むが、これらに限定しない。追加の好ましい又は要求される操作エレメントは、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び宿主系における核酸配列の適切な転写及びその後の翻訳のために必要な又は好ましい任意の他の配列を含むが、これらに限定しない。要求される又は好ましい発現制御エレメントの正しい組み合わせは、選ばれた宿主系に依存することが当業者により理解されるであろう。さらに、発現ベクターは、宿主系において核酸配列を含む発現ベクターの移入及びその後の複製のために必要な追加のエレメントを含むべきであることが理解されるであろう。そのようなエレメントの例は、複製起点及び選択可能なマーカーを含むが、これらに限定しない。そのようなベクターは、従来の方法を使用して容易に構築される、又は商業的に入手可能であることが当業者によりさらに理解されるであろう。
【０１０４】
本発明の別の目的は、本明細書中で上に記載するような発現ベクターを含む宿主細胞である。
【０１０５】
本発明によれば、使用されうる宿主細胞の例は、真核細胞（例えば動物、植物、昆虫、及び酵母細胞など）ならびに原核生物細胞（例えば大腸菌など）である。遺伝子を保有するベクターを細胞中に導入することができる手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入、又はＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを使用したトランスフェクション、又は当業者に公知の他の手順を含むが、これらに限定しない。
【０１０６】
別の実施形態では、真核細胞中で機能する真核生物発現ベクターを使用する。そのようなベクターの例は、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス；レンチウイルスなど）、細菌発現ベクター、プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３など）、又はバキュロウイルス移入ベクターを含むが、これらに限定しない。好ましい真核細胞株は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状細胞、又は単球を含むが、これらに限定しない。
【０１０７】
本発明はまた、それを必要とする被験者に、治療有効量のオートファジーのアクチベーターを投与することを含む、それを必要とする被験者において認知機能を回復及び／又は改善させるための方法に関する。
【０１０８】
本発明はまた、それを必要とする被験者に、治療有効量のオートファジーのアクチベーターを投与することを含む、それを必要とする被験者において認知トラブルを処置するための方法に関する。
【０１０９】
本明細書中で使用するように、用語「処置」又は「処置する」は、予防的又は防止的処置、ならびに治癒的又は疾患修飾的処置（疾患に罹るリスクがある又は疾患に罹った疑いのある被験者ならびに病気である又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいるとして診断された被験者の処置を含む）の両方を指し、臨床的再発の抑制を含む。この処置は、障害又は再発性障害の１つ又は複数の症状を防止する、治癒させる、発症を遅延させる、その重症度を低下させる、又は寛解させるために、あるいは、そのような処置の非存在において予想されるものを上回り被験者の生存を延長するために、医学的障害を有する、又は最終的に障害を獲得しうる被験者に投与してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば、治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「誘導レジメン」又は「誘導期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に被験者に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、（部分又は全体において）「負荷レジメン」を用いてもよく、それは、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも大きな用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はそれらの両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での被験者の維持のために、例えば、被験者を長期間（月又は年）にわたり寛解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンでは、継続的治療（例、定期的な間隔で、例えば、毎週、毎月、毎年などで薬物を投与すること）又は断続的治療（例、中断された処置、断続的処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の顕在化など］の達成時の処置）を用いうる。
【０１１０】
治療用組成物
本発明の別の目的は、それを必要とする被験者における認知機能の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターを含む治療用組成物に関する。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験者における記憶の回復及び／又は改善における使用のためのオートファジーのアクチベーターを含む治療用組成物に関する。
【０１１２】
本発明の任意の治療用薬剤は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び場合により徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。
【０１１３】
「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合、有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の型の製剤補助剤を指す。
【０１１４】
医薬的組成物の形態、投与の経路、投与量及びレジメンは、当然、処置される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。
【０１１５】
本発明の医薬的組成物は、局所投与、経口投与、鼻腔内投与、非経口投与、眼内投与、静脈内投与、筋肉内投与、海馬定位投与、又は皮下投与などのために製剤化することができる。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明の医薬的組成物を全身投与用に製剤化する。
【０１１７】
好ましくは、医薬的組成物は、注射することが可能な製剤用に医薬的に許容可能である溶媒を含む。これらは、特に等張性、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物でありうるが、それよって、添加時に、滅菌水又は生理食塩水の場合に依存し、注射可能溶液の構成が可能になる。
【０１１８】
投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与の様式の、関連する病態の、又は代わりに、所望の処置期間の関数として適合させることができる。
【０１１９】
また、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形物；徐放性カプセルを含み；及び任意の他の形態を使用することができる。
【０１２０】
本発明の医薬的組成物は、さらなる治療用アクチベーターを含みうる。さらなる薬剤を、スペルミジン、ヒドロキシクエン酸塩、オステオカルシン（例えば、特許出願ＷＯ２０１４１５２４９７を参照のこと）及びレスベラトロールからなる群において選択してもよい。
【０１２１】
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】海馬オートファジーの急性調節は新規記憶獲得に影響を及ぼす。Ａ）薬理学的オートファジーモジュレーター：ＴＡＴ−ベクリン１又はＴＡＴ−スクランブルの定位注射の１２時間後での３ヶ月齢のマウス海馬におけるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩ蓄積（ウエスタンブロット）。定量化は、対応する溶媒処置群と比べている。Ｂ）溶媒ＴＡＴ−ベクリン１又はＴＡＴ−スクランブルマウスのいずれかを用いた定位注射後に３ヶ月齢のマウスにおいて実施したＮＯＲ。選好指数（新規物体の探索時間／全探索）及び識別指数（［新規物体についての探索時間−見慣れた物体についての探索時間］／全探索）をテスト段階の間に各々の群について測定した。Ｃ）溶媒、ＴＡＴ−ベクリン１、又はＴＡＴ−スクランブルマウスのいずれかを用いた定位注射後での３ヶ月齢のマウスにおいて実施されたＣＦＣ。凍結率を、訓練段階の最後の１分間及びテスト段階の４分間にわたり測定した。本明細書に表す全ての行動テストを少なくとも２つの独立した実験で実施した（各々の実験について：ｎ≧５匹マウス／群）。データを平均値±ＳＥＭとして表現する。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びそれに続くスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、ＮＳ：有意ではない。
【図２】海馬におけるオートファジーレベルの維持は、通常の加齢に関連する記憶力の減退を相殺し、若齢循環因子の有益な効果を媒介するために必要である。Ａ）ＶＰＳ３４、ベクリン１、ＡＴＧ５、ＬＣ３−Ｉ、及びＬＣ３−ＩＩ蓄積（ウエスタンブロット）ならびにＶｐｓ３４、Ｂｅｃｎ  １、及びＡｔｇ５の相対的発現（ｑＰＣＲ）。Ｂ）１６ヶ月齢及び３ヶ月齢のマウスにおける溶媒又はＴＡＴ−ベクリン１（１μg/半球）のいずれかの海馬定位注射から１２時間後でのＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩ蓄積（ウエスタンブロット）。ＴＡＴ−ベクリン  １は、老齢（１６ヶ月）から若齢（３ヶ月）のレベルのマウスにおけるＬＣ３−ＩＩレベルを回復させた。βアクチンを、各々のサンプルについての負荷対照として使用した。Ｃ）溶媒、ＴＡＴ−スクランブル（１μg/半球）、又はＴＡＴ−ベクリン１（１μg/半球）のいずれかを用いた海馬定位注射から１２時間後に３ヶ月齢及び１６ヶ月齢のマウスにおいて実施された物体位置記憶（ＯＬＭ）タスク。識別指数（［新たに配置された物体を用いて費やされた時間−見慣れた、配置された物体を用いて費やされた時間］／全探索）を、テスト段階の間に各々の群について測定した。Ｄ）溶媒、ＴＡＴ−スクランブル（１μg/半球）、又はＴＡＴ−ベクリン１（１μg/半球）のいずれかを用いた海馬定位注射から１２時間後に３ヶ月齢及び１６ヶ月齢のマウスにおいて実施された新規物体認識（ＮＯＲ）。識別指数（［新たに配置された物体を用いて費やされた時間−見慣れた、配置された物体を用いて費やされた時間］／全探索）を、テスト段階の間に各々の群について測定した。Ｅ）溶媒、ＴＡＴ−スクランブル（１μg/半球）、又はＴＡＴ−ベクリン１（１μg/半球）のいずれかを用いた海馬定位注射から１２時間後に３ヶ月齢及び１６ヶ月齢のマウスにおいて実施した文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）。凍結率を、各々の群についてテスト段階の４分間にわたり測定した。識別指数（［新たに配置された物体を用いて費やされた時間−見慣れた、配置された物体を用いて費やされた時間］／全探索）を、テスト段階の間に各々の群について測定した。本明細書に表す全ての行動テストを少なくとも２つの独立した実験で実施した（各々の実験について：ｎ≧５匹マウス／群）。データを平均値±ＳＥＭとして表現する。一元配置分散分析及びそれに続くスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、ＮＳ：有意ではない。
【図３】ＴＡＴ−ベクリン１の毎日の全身注射は、通常の加齢に関連する記憶力の減退を相殺することが可能である。Ａ）ＴＡＴ−ベクリン又はＴＡＴ−スクランブルの毎日の注射後にマウスにおいて実施される行動テストの実験プロトコル、Ｂ）溶媒、ＴＡＴ−スクランブル（４５０μg）、又はＴＡＴ−ベクリン１（４５０μg）の毎日の腹腔内注射から１４日後に３ヶ月齢及び１６ヶ月齢のマウスにおいて実施される文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）。凍結率を、各々の群についてテスト段階の４分間にわたり測定した。識別指数（［新たに配置された物体を用いて費やされた時間−見慣れた、配置された物体を用いて費やされた時間］／全探索）を、テスト段階の間に各々の群について測定した。Ｃ）溶媒、ＴＡＴ−スクランブル（４５０μg）、又はＴＡＴ−ベクリン１（４５０μg）のいずれかの毎日の腹腔内注射から１４日後に３ヶ月齢及び１６ヶ月齢のマウスにおいて実施された新規物体認識（ＮＯＲ）。選好指数（新規物体についての探索時間／全探索）及び識別指数（［新たに配置された物体を用いて費やされた時間−見慣れた、配置された物体を用いて費やされた時間］／全探索）を、テスト段階の間に各々の群について測定した。本明細書に表す全ての行動テストを少なくとも２つの独立した実験で実施した（各々の実験について：ｎ≧５匹マウス／群）。データを平均値±ＳＥＭとして表現する。一元配置分散分析及びそれに続くスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、ＮＳ：有意ではない。
【実施例】
【０１２３】
材料及び方法
動物
全ての実験を、Janvier Laboratoryストックから入手したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスで実施した。全てのマウスが実験の開始時に３ヶ月齢又は１６ヶ月齢であった。全ての実験について、本発明者らは同腹仔を対照として使用した。到着時、マウスを、任意の行動テスト又は分子テストの少なくとも２週間前に収容した。マウスを、実験前に食餌及び水への自由摂取を伴う１２時間の明暗サイクル（午後８時に消灯）下で、ポリカーボネートケージ（３５．５×１８×１２．５cm）中でケージ当たり５匹の動物を収容した。全ての行動実験を午前１０時から午後５時の間に実施した。群サイズを、有意差（Ｐ≦０．０５）を検出する８０%の可能性に導くように、検出力の計算を実施した後に決定した。全ての努力を行い、３Ｒの規則に従って、動物の苦痛及び使用される動物の数を最小限にした。全ての実験において、動物を無作為に処置群に割り当てた。全ての行動実験を、実験動物使用のための欧州共同体（２０１０／６３／ＥＵ）ならびに現地の倫理委員会の審査手順及びプロトコルに従って実施した。
【０１２４】
定位手術
マウスを、ケタミン塩酸塩（２０mg/ml  ＢＷ）（1000 Virbac）及びキシラジン（100mg/ml  ＢＷ）（Rompun 2%；Bayer）の腹腔内注射により麻酔し、定位固定フレーム（900SL-KOPF）中に置いた。眼科用眼軟膏を、手術の間での乾燥を防止するために角膜に適用した。切開部周辺の部位を切り取り、Vetedine溶液（Vetoquinol）を適用した。全ての薬物を、以下の座標を使用して背側海馬中に両側から注射した（Bregma, Paxinos and Franklin, 2008から）：中外側Ｘ＝＋／−１．４mm、前後Ｙ＝２．０mm、及び高さＺ＝−１．３３mm。１μl容量のＡＡＶ又は薬物のいずれかを、１０μlのハミルトン社製シリンジ（１７０１ＲＮ）を使用し、４分間にわたり定位注射した（注射速度：０．２５μl/分）。注射追跡に沿った逆流を限定するために、針を各々の１μl注射の間に４分間にわたりインサイチュで維持した。皮膚を、絹縫合糸を使用して閉じた。行動テストを定位注射から１２時間後又は３週間後に行った。マウスを回復の間にモニターした。
【０１２５】
オートファジーの薬理学的調節。
海馬におけるオートファジーの薬理学的な誘導のために、本発明者らは、溶媒（ＰＢＳ）、１μg  ＴＡＴ−ベクリン１（ＰＢＳ中に溶解）、又は１μg  ＴＡＴ−スクランブル（ＰＢＳ中に溶解）のいずれかの定位注射を実施した。Ｔａｔ−ベクリン  １（ペプチド配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＴＮＶＦＮＡＴＦＥＩＷＨＤＧＥＦＧＴ、配列番号３７）は、Ｎ末端のＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の１１アミノ酸、柔軟性を増加させるためのＧＧリンカー、及びベクリン１から由来する１８のアミノ酸、３つの置換：Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ、Ｑ２８１Ｅを含むアミノ酸２６７〜２８４（Ｃ．  Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ博士により提供）からなる。対照ペプチドであるＴＡＴ−スクランブル（ペプチド配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＶＧＮＤＦＦＩＮＨＥＴＴＧＦＡＴＥＷ、配列番号３８）は、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン、ＧＧリンカー、及びＴａｔ−ベクリン１からのＣ末端の１８のアミノ酸のスクランブルバージョンからなった。海馬においてオートファジー形成の薬理学的な抑制のために、本発明者らは、Ｓｐａｕｔｉｎ−１（ＤＭＳＯ／ＮａＣｌ（ＳＭＬ０４４０；Sigma）中に溶解した５μg）又は溶媒（ＤＭＳＯ／ＮａＣｌ（ＳＭＬ０４４０；Sigma））のいずれかの定位注射を実施した。海馬におけるオートファジー経路の後期の薬理学的な抑制のために、本発明者らは、１００ngのロイペプチン（Ｌ２０２３−５０mg；Sigma）（ＰＢＳ中に溶解）、５０μgのクロロキン（Ｃ６６２８−２５Ｇ；Sigma）（ＰＢＳ中に溶解）、又は溶媒（ＰＢＳ）のいずれかの定位注射を実施した。全ての薬物を、背側海馬（Ｘ＝＋／−１．４mm、Ｙ＝２．０mm、Ｚ＝−１．３３mm）中の１μl（両側）の容量中で注入した。注射から１２時間後、マウスをＮＯＲ、ＣＦＣ、もしくはＯＬＭ行動タスクの訓練段階に供した、又は脳収集のために屠殺した。
【０１２６】
ｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス
ｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をVector Biosystems Inc（ペンシルベニア州モルバーン）から購入した。ベクリン１（Ｂｅｃｎ  １）（ＡＡＶ９−ＧＦＰ−Ｕ６−ｍＢＥＣＮ１−ｓｈＲＮＡ）（本文中で命名されている：ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ−Ｂｅｃｌｉｎ  １）、ＦｉＰ２００（ＡＡＶ９−ＧＦＰ−Ｕ６−Ｍ−ＲＢ１ＣＣ１−ｓｈＲＮＡ）（本文中で命名されている：ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡ−Ｆｉｐ２００）、又はスクランブル非標的陰性対照（ＡＡＶ−ＧＦＰ−Ｕ６−ｓｃｒｍｂ−ｓｈＲＮＡ）（本文中で命名されている：ＡＡＶ−スクランブル）に特異的なｓｈＲＮＡを、行動テスト又は脳組織収集の３週間前に１μl（両側）の容量中で注射した。ＡＡＶ力価は２．８〜４．６×１０１３GC/mlの間であった。
【０１２７】
ウエスタンブロット分析
マウス海馬及び小脳を解剖し、急速凍結し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２５mM  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、１５０mM  ＮａＣｌ、１%ＮＰ４０、１%デオキシコール酸ナトリウム、０．１%ＳＤＳ、及びcOmpleteプロテアーゼ阻害剤（Roche））中に溶解した。サンプルを、Pierce 660nmアッセイを使用して定量化し、ライセートを５，５×サンプル緩衝液（１１%ＳＤＳ、１．４Mサッカロース、０．５M  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ６．８、１０mg/mLブロモフェノールブルー及びＤＴＴ  １M）と混合し、１２%ＳＤＳポリアクリルアミドグラジエントゲルにロードし、その後にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Biorad）にトランスファーした。ブロットを、Tween（ＴＢＳＴ）−５%ＢＳＡを伴うトリス緩衝生理食塩水中でブロックし、マウス抗β−アクチン（１：５０００、Ａ−２２２８、Sigma）、マウス抗ベクリン１（１：１０００、６１２１１３、BD Transduction Laboratories）、ウサギ抗ＬＣ３（１：１００００、Ｌ７５４３、Sigma）、マウス抗ＡＴＧ５（１：５００、０２６２−１００／ＡＴＧ５−７Ｃ６、Nanotools）、及びウサギ抗ＶＰＳ３４（１：１０００；４２６３、Cell Signaling）のいずれかを用いてインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体（抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ連結抗体（７０７６、Cell Signaling）及び抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ連結抗体（７０７４、Cell Signaling）を、タンパク質検出用のＥＣＬキット（Clarity Western ECL Substrate、BioRad）を使用して明らかにした。複数の露光を、フィルム（GE Healthcare Amersham Hyperfilm ECL）のダイナミックレンジ内の画像を選択するために行った。選択したフィルムをスキャンし、BioRad Image Labソフトウェア（バージョン５．２）を使用して定量化した。βアクチンバンドを標準化のために使用した。
【０１２８】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
脳組織を解剖後直ぐに瞬間冷凍し、全ＲＮＡを、ホモジナイザー（OMNI TH）を使用し、Trizol試薬（カタログ番号１５５９６）を用いて単離した。一本鎖ｃＤＮＡを、SuperScript II逆転写酵素（ThermoFisherカタログ番号１８０６４０）を使用することにより、全ＲＮＡ（２μg）から合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、iTAQ SYBR Green（iTaq（商標）Universal SYBR（登録商標）Green Supermix、172-5124、BioRad）を使用して実施した。プライマーを設計して使用した。
【０１２９】
初代培養海馬ニューロン
Ｅ１６．５胚からの海馬をＬ１５冷培地中で解剖した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ０．０５%中で化学的に、ピペッティングにより機械的に解離し、次に１０%ウシ胎児血清及び１%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中に懸濁した。全ての細胞培養試薬をThermo Fischer Scientificから購入した。解離した細胞を、顕微鏡検査のためにポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたプレート又はガラスカバースリップ上にプレーティングした。プレーティングから２４時間後、培地を、Ｂ２７サプリメント、Glutamax、及びMycozapを含むNeurobasal培地と交換した。培地の半分を週に２回交換し、ニューロンをＤＩＶ１５まで５%ＣＯ２及び３７℃中で維持した。
【０１３０】
初代海馬ニューロンへのレンチウイルスの感染及びトランスフェクション
初代海馬ニューロンを、Ｄａｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）１（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １日目）に、マウスベクリン−１（Ｂｅｃｎ  １）（Sigma-Aldrich）：５’−ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＣ−３’（センス、配列番号３９）；  ３’−  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＧＣＡ−５’（アンチセンス、配列番号４０）を標的とするＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）誘導性ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス（ｐＬＫＯ−ＩＰＴＧ−３ＸＬａｃＯ）を用いて感染（ＭＯＩ５）させた。製造者の指示に従ってＤＩＶ１１にニューロンに、Lipofectamine 2000（Thermo Fischer Scientific）を用いて、ＥＧＦＰを発現するプラスミドと共に、同じレンチウイルスプラスミドコンストラクトをコトランスフェクトし、樹状突起棘密度を試験した。感染又はトランスフェクトされたニューロンを、５mM  ＩＰＴＧ（Promega）を用いて７２時間にわたり処理し、ｓｈＲＮＡ−ベクリン−１発現を誘導した。ニューロンを次に、下に記載するようにＤＩＶ１５に処理した。
【０１３１】
初代海馬ニューロンのニューロン刺激処理
化学的長期増強（ｃＬＴＰ）のために、初代海馬ニューロン（ＤＩＶ１５）を、（Oh et al., 2005）において記載されているように処理した。ＫＣｌ脱分極のために、ニューロンを、６０nM  ＫＣＬを含む神経基礎培地を用いて１０分間にわたり前処理し、バフィロマイシン処理のために、ニューロンを、１００mMバフィロマイシンを含む神経基礎培地中で２時間にわたり処理した。処理後、ニューロンをＰＢＳ中でリンスし、タンパク質をホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含む１×Ｌａｅｍｌｉ緩衝液中で抽出した。
【０１３２】
インビトロでの樹状突起棘密度分析
ニューロンを、（２０）において記載されているように処理し、ｃＬＴＰ誘導から１時間後に４%ＰＦＡ／４%グルコース中で、室温で２０分間にわたり固定した。カバースリップを次に、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Fluoromount（商標）Aqueous Mounting Mediumを用いてマウントした。免疫蛍光法によるLacI（Millipore）検出を行い、ＥＧＦＰ及びｓｈＲＮＡベクリン１をコトランスフェクトしたニューロンを同定した。ＬａｃＩ及びＥＧＦＰ陽性ニューロンの蛍光画像を、Zeiss Apotome2（４０×対物レンズ）を使用して得た。樹状突起棘密度を、NeuronStudioソフトウェア（Rodriguez A. et al 2008）を使用して分析した。各々のニューロンについて、２つの異なる二次及び三次樹状突起セグメントからの棘をカウントした。４つの生物学的複製物からの１６のニューロンを各々の群について分析した。分析は、２人の独立した研究者（Ｍ．Ｒ．Ｂ及びＭ．Ｒ）により盲検化して実施した。
【０１３３】
ゴルジコックス染色及び樹状突起棘の定量化
３ヶ月齢の処置マウスに、４%ＰＦＡを用いて心臓内灌流し、単離した脳を、製造者の指示に従ってFD Rapid GolgiStain Kit（FD Neuro Technologies、メリーランド州ボルチモア）を使用し、ゴルジ含浸に供した。１００μm切片の明視野ｚスタックを、Zeiss Apotome2（４０×対物レンズ）を使用して得た。樹状突起棘密度を手動で定量化した（ImageJソフトウェア、米国国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，  １９９７-２０１４）。各々のマウス群について、２０〜３０の歯状回顆粒細胞からの２つの二次樹状突起セグメントを定量化した。分析は、３人の独立した研究者（Ｍ．Ｒ．Ｂ、Ｓ．Ｍ．、及びＭ．Ｒ．）により盲検化して実施した。
【０１３４】
ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２点状免疫染色及び定量化
マウスを、ケタミン／キシラジンの混合物を用いて深部麻酔し、冷ＰＢＳ、続いて冷４%ＰＦＡを用いて経心的に灌流した。脳を４℃の４%ＰＦＡ中で一晩後固定した。３０μmの連続冠状浮遊切片を、ビブラトームを使用して得た。切片を、ＰＢＳを用いて洗浄し、１０%ウシ胎児血清を用いて室温で３０分間にわたりブロックした。切片を次に、モルモット抗ｐ６２（１：２００；ＧＰ６２Ｃ、Progen）を用いて４℃で一晩インキュベートした。切片を、Alexa Fluor共役二次抗体（ロバ抗モルモットＩｇＧ（Alexa Fluor 488）、Life Technologies、１：２００）を用いた、ブロッキング緩衝液中での室温で１時間にわたるインキュベート前後に、ＰＢＳを用いて洗浄した。全ての切片を、ゼラチンで下塗りしたスライド上にマウントし、ＤＡＰＩを伴うMowiolを使用してカバースリップをかけた。画像を、Zeiss Apotome.2蛍光顕微鏡（２０×及び４０×対物レンズ）を使用して得た。画像分析を、Zen light ZeissLSMソフトウェアを使用して実施した。ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２点を伴う細胞の数を、Icyソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ）を用いてデジタル画像上で定量化した。
【０１３５】
電気生理学
全ての記録を、実験条件について盲検化して行った。３ヶ月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、１２８  ＮａＣｌ、３  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  Ｄ−グルコース、２４  ＮａＨＣＯ３、２  ＣａＣｌ２、及び２  ＭｇＣｌ２を含む冷人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を用いて灌流した（９５%Ｏ２及び５%ＣＯ２、ｐＨ  ７．３５、２９５-３０５mOsmを用いて酸素化）。ＣＡ３を含む急性脳スライスを、スクロース−ＡＣＳＦ（ＮａＣｌを２５４mMスクロースで十分に交換することにより由来する）中でマイクロスライサー（ＤＴＫ−１０００、Ted Pella）を使用して切断し、９５%Ｏ２及び５%ＣＯ２により飽和させた。スライスを３７℃で１時間にわたり保持チャンバー中で維持した。スライスを、３５℃で、９５%Ｏ２／５%ＣＯ（２．５ml/分）を用いて平衡化した一定流量のＡＣＳＦを用いて適合された記録チャンバー中に移した。１１５グルコン酸カリウム、２０  ＫＣｌ、１．５  ＭｇＣｌ２、１０ホスホクレアチン、１０  ＨＥＰＥＳ、２マグネシウムＡＴＰ、及び０．５  ＧＴＰ（mM）（ｐＨ  ７．２、２８５mOsm）を含む内部溶液で満たされたガラス微小電極（２−４ＭΩ）を使用した。細胞の興奮性を、−６０mVの保持電位で電流注入（５０、１００、１５０、及び２００  ｐＡ）の２秒の増分過程で測定した。直列抵抗を、各々の記録の開始及び終了時に全ての記録の間にモニターし、データを、値が２０%超だけ変化した場合に拒絶した。全てのデータ取得及び発火率のオンライン分析を、700B増幅器、Digidata 1322Aデジタイザー、及びpClamp 10.2（Molecular Devices）を使用して収集した。自発興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を、ピクロトキシン（５０μM）の存在において、直列抵抗＜６MΩを伴う保持電位−６０mVで、電圧クランプにおいて記録した。
【０１３６】
新規物体認識パラダイム
行動セッションを、ビデオカメラを用いて記録した。テスト活動領域は、２つの灰色のプラスチックボックス（６０×４０×３２cm）からなった。マウスは曝露の間に互いに接触する、又は会うことはできなかった。光強度は、活動領域の全ての部分において等しかった（約２０ｌｘ）。２つの異なる物体を使用し、３通りに利用可能であった。物体は（１）青色セラミックポット（直径６．５cm、最大高さ７．５cm）及び（２）透明プラスチック漏斗（直径８．５cm、最大高さ８．５cm）であった。物体は、パイロット実験及び訓練段階において決定されたのと等しいレベルの探索を誘発した。マウスを、保持マウス施設からそれらのホームケージ内のテスト室まで短距離輸送し、テストの開始前に少なくとも１時間にわたり静置した。
【０１３７】
ＮＯＲパラダイムは、３日間にわたる３つの段階：馴化段階、訓練段階、テスト段階からなる。マウスを、各々の曝露の開始時に、常に活動領域の中央に置いた。１日目：馴化段階、マウスは、任意の物体を伴わず、活動領域を探索するために５分間与えられ、次に、それらのホームケージに、又は定位手術のために戻された。２日目、訓練段階（定位手術から１２時間後に実施）、マウスを、活動領域の中心から対称の反対の位置において配置された２つの同一の物体を１０分間にわたり探索させ、次に、それらのホームケージに輸送した。３日目、テスト段階、マウスを、同じ活動領域において、同じ物体の局在化を保ちながら、２つの物体：見慣れた物体及び新規物体を探索するために１５分間与えた。新規物体としての役割を果たす物体（青色セラミックポット又はプラスチック漏斗のいずれか）、ならびに物体の左右の局在化は、各々の群内で均衡していた。マウスを、各々の曝露の開始時に活動領域の中央に置いた。曝露の間に、マウスを個別に標準ケージに保持し、物体及び活動領域を、ファゴフォアを用いて清掃し、床を交換した。以下の行動を対照の探索として考えた：鼻を用いて又は前脚を用いて物体を嗅ぐ、舐める、又は触れる、あるいは鼻を距離≦１cmで物体に向ける。研究は、マウスが物体上にある、又は完全に不動である場合、スコア化しなかった。新規物体についての選好指数を（新たな物体の探索に費やされた時間／両方の物体の探索に費やされた合計時間）として算出し、識別指数を（新たな物体の探索に費やされた時間−見慣れた物体の探索に費やされた時間）／（両方の物体の探索に費やされた合計時間）として算出した。行動は、処置について盲検化された２人の観察者によりビデオで記録され、物体の合計探索時間を訓練段階及びテスト段階において定量化した（Ｍ．Ｇ及びＳ．Ｍ）。
【０１３８】
物体位置記憶テスト
物体位置記憶タスクについて、全ての手順が、テスト段階の間に、新規物体を提示するのではなく、マウスが、活動領域中の異なる場所において配置された１つの物体を伴い、両方の見慣れた物体に遭遇したことを除き、新規物体認識タスクと同一であった。新規の／再配置された物体の探索の時間及び頻度を、記憶の指標として測定する。行動は、治療について盲検化されている２人の観察者によりビデオでスコア化され、物体の合計探索時間が、訓練段階及びテスト段階において定量化された（Ｍ．Ｇ及びＳ．Ｍ）。
【０１３９】
文脈的恐怖条件づけ
マウスを、保持マウス施設からそれらのホームケージ中のテスト室まで短距離輸送し、テストの開始前に少なくとも１時間にわたり静置した。条件づけチャンバーをBioseb（フランス）から得たが、２５×２５×２５cmの内部寸法を伴った。各々のチャンバーを、外光及びノイズからの保護を提供する、より大きな遮蔽プラスチックキャビネット（６７×５５×５０cm、Bioseb、フランス）内に配置し、マウスを条件づけボックス中で個別にテストした。チャンバーの床は、フットショックの送達のためのスクランブラーを伴うショック発生装置に配線された２７本のステンレス鋼棒からなった。マウスの動きにより生成された信号を、高感度の重量変換システムを通じて記録及び分析した。アナログ信号を、記録目的のためにロードセルユニットを通じてフリージングソフトウェアモジュールに送信し、活動時間／不動時間（フリーズ）の分析を実施した。ＣＦＣ手順を連続２日間にわたり行った。１日目に、マウスを条件づけチャンバーに置き、動物をチャンバーに置いた後６０、１２０、及び１８０秒に投与された３つのフットショック（１秒、０．５mA）を受けた。それらを最後のショックから６０秒後にそれらのホームケージに戻した。文脈的恐怖記憶を、マウスを条件づけチャンバーに戻し、４分間の保持テストの間にフリージング行動を測定することにより、条件づけから２４時間後に評価した。フリージングを、Packwin 2.0ソフトウェア（Bioseb、フランス）を使用して自動的にスコア化及び分析した。フリージング行動は、動物が少なくとも２秒間の期間にわたりフリージングした場合に生じたと考えた。行動をフリージングソフトウェアによりスコア化し、マウス処置又はＡＡＶ感染について盲検化された２人の観察者により分析された（Ｍ．Ｇ及びＳ．Ｍ）。
【０１４０】
モリス水迷路
動物を、保持マウス施設からそれらのホームケージ中のテスト室まで短距離輸送し、最初の試行の前に少なくとも１時間にわたり静置した。自動追跡システムを伴うモリス水迷路（ＭＷＭ）を、空間学習及び記憶を評価するために用いた。装置は白色の円形スイミングプール（直径：２００cm、壁：高さ６０cm）で、種々の遠位キューを伴う室中に配置した。プールを２２℃±１℃に維持された水（深さ：５０cm）で満たし、それは、無毒の白色ペンキの追加により不透明にされた。１２cmの円形プラットフォームが水面下１．０cmに隠されていた。迷路を実質的に、主要点である北（Ｎ）、東（Ｅ）、南（Ｓ）、西（Ｗ）により描写された４つの任意の等間隔の象限中に分割した。プールを明るく照らされた室中に配置する。余分な迷路の幾何学的かつ高コントラストのキューを、照明を提供する天井を伴うスイミングプールの壁に取り付けた。データを、天井に固定され、ビデオトラッキングシステム（Anymaze）に接続されたビデオカメラを使用して収集した。各々の毎日の試行は４回の水泳試行からなったが、それにおいて各々のマウスをタンクの壁に面したプール中に置き、動物は、１２０秒が経過する前にプラットフォームまで泳ぐことを可能にした。動物がプラットフォームに到達した時に試行を終了し、そこで動物は５秒間にわたりそのままでいた。マウスを取り出し、５分間の試行間隔にわたりそれらのホームケージ中に戻した。低体温症を防止するために、動物を、試行の間及び後にペーパータオルを用いて穏やかに乾燥させた。開始点は各々の試行で異なり、異なる一連の開放点を日ごとに使用した。プラットフォームまでの水泳時間を、標的を配置するマウスの成績の評価として算出した。１０日目に、動物にプローブ試行を与え、それは、マウスをプールにおいて一定時間（１２０秒）にわたり泳がせることからなり、プラットフォームは取り外したが、しかし、壁に同じ遠位キューを伴った。プローブ試行の成績を、プラットフォームが隠れプラットフォーム訓練の間に配置された標的象限において費やされた時間として表現した。動物の動きを、Anymazeを使用して記録し、マウスの成績のパラメーターを算出した。行動は、処置について盲検化された２人の観察者によりスコア化された（Ｍ．Ｇ及びＳ．Ｍ）。
【０１４１】
記憶刺激手順
動物をＣＦＣ又はＭＷＭに曝露し、（２１、２５）から適応した記憶刺激を誘導した。ＣＦＣについては、本発明者らは訓練段階にわたり１日又は４日を使用した。１日の訓練については、マウスは条件づけチャンバーに置かれて、６０、１２０、１８０秒（１秒、０．５mA）で３回のショックを受け、最後のショックの６０秒後に取り出してそれらのホームケージに戻した。４日間の訓練については、この手順を４回繰り返したが、しかし、ショック強度は０．２５mAであった。文脈的恐怖記憶は、訓練後２４時間に、マウスを同じ条件づけチャンバーに戻し、４分間の保持テストの間にフリージング行動を測定することにより評価した。フリージングを、Packwin 2.0ソフトウェアを使用して自動的にスコア化及び分析した。フリージング行動は、動物が少なくとも２秒間にわたりフリージングした場合に生じたと考えた。ＭＷＭについては、マウスを通常の手順（上に記載する）に供したが、しかし、連続５日間にわたった。刺激の最後の日に、マウスを、ＣＦＣ又はＭＷＭタスクへの最後の曝露から１時間後に屠殺した。
【０１４２】
血漿採取及び静脈内注射
プールされたマウスの血液を、安楽死時に心臓内放血により６０匹の若齢（８週）及び６匹の老齢（１６ヶ月）のマウスから収集した。血漿を、ＥＤＴＡを用いて収集した血液から、Capiject T-MQKチューブ中に調製し、１，０００gでの遠心分離が続いた。全ての血漿アリコートを使用まで−８０℃で保存した。投与前に、血漿をＰＢＳ中の3.5kDa Maxi D-tubeダイアライザー（７１５０８−３、Novagen）を使用して透析し、ＥＤＴＡを除去した。１６ヶ月齢のマウスに、２４日間にわたる７回の尾静脈注射により、単離血漿（注射１回当たり１００μl）を用いて注射した。マウスを次に、最後の注射から１日後にＮＯＲに供した。
【０１４３】
統計分析
全ての実験について、処置の効果を、一元配置分散分析を使用し、適切な場合には反復測定を用いて分析した。有意なＡＮＯＶＡも、適切な場合にはフィッシャーのＰＬＳＤテストを使用して分析した。全ての主な効果及び相互作用を、本文又は図面中に記述する。全てのデータを、GraphPad Prismv5ソフトウェアを使用して分析した。データ分析からの結果を平均値±ＳＥＭとして表現する。アルファを全ての分析について０．０５に設定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１４４】
結果
海馬ニューロンの機能及び挙動におけるオートファジーの役割を探索するために、本発明者らは、３ヶ月齢のマウスをモリス水迷路（ＭＷＭ）又は文脈的恐怖条件づけ（ＣＦＣ）による記憶刺激に供した。主要なＡＴＧ遺伝子及びオートファジーに関連付けられる遺伝子（Ｂｅｃｎ  １、Ｖｐｓ３４、及びＡｔｇ５）は、海馬においてｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で増加した（データは示さず）。さらに、ＡＰマーカーＬＣ３−ＩＩの蓄積があり、それは、オートファジーカーゴＳＱＳＴＭ１／ｐ６２における減少と一緒に、記憶刺激が海馬ニューロンにおけるオートファジー流動を誘導することを示唆した（データは示さず）。海馬に依存的な学習及び記憶を調節する際でのオートファジーの役割により直接的に取り組むために、本発明者らは次に、ベクリン１（Ｂｅｃｎ  １）（オートファジーの開始に関与するタンパク質である）に対するｓｈＲＮＡを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の海馬定位注射を実施した（１、２）。注射から３週間後のＡＰ関連脂質化型（ＬＣ３−ＩＩ）へのＬＣ３（ＬＣ３−Ｉ）の変換における減少によって、オートファジーが海馬において妨害されていることが立証された（データは示さず）。マウスを次に、海馬に依存的な記憶を評価する行動タスクに供した。本発明者らは、新規物体認識（ＮＯＲ）テスト及びＣＦＣ（海馬の完全性を要求する２つのテストである）により測定されるように（データは示さず）、ベクリン１発現を下方調節することによって記憶容量が損なわれることを見出した（１６）。次に、これらのマウスを、浸水プラットフォームを配置するために空間的キューを使用するマウスの能力を評価するために、連続９日間にわたり隠れプラットフォームを伴うＭＷＭに供した。ベクリン１の海馬での下方調節は、空間学習能力における有意な遅延を誘導する（データは示さず）。これは、獲得の最後の日から２４時間後のプローブ試行ＭＷＭタスクにより確認され、それによって、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡベクリン１におけるプール象限についての有意な嗜好性は実証されなかった（データは示さず）。注目すべきことに、最後の獲得日から６日後に同じ状況にマウスを再曝露することによって、ベクリン１が下方調節されたマウスでは、対照マウスと同じ程度まで記憶が固定されないことが示された（データは示さず）。ベクリン１について可能なオートファジー非依存的な役割を除外するために、本発明者らは、Ｆｉｐ２００（早期ＡＰ形成において含まれるＵＬＫ１／ＡＧＴ１複合体の成分）について標的化したマウスにおいてＮＯＲ及びＣＦＣを実施した。ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡの定位注射を用いたＦｉｐ２００下方調節及びオートファジーにおける減少を、Ｆｉｐ２００発現及びＬＣ３−ＩＩ存在量を測定することにより確認した（データは示さず）。これらのマウスは、ＮＯＲ及びＣＦＣアッセイにおいてベクリン１の下方調節後に観察された記憶成績における減少を表現型模写する（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、オートファジーの開始が、海馬に依存的な学習及び記憶の制御のために要求されることを示唆する。
【０１４５】
オートファジーが新規記憶刺激への海馬ニューロンの適応応答のために要求されるか否かを決定するために、本発明者らは、３ヶ月齢のＷＴマウスにおいてオートファジーの阻害剤又は誘導剤の単一の海馬定位注射を実施することにより、オートファジーを急性調節した（データは示さず）。急性の薬理学的注射から１２時間後のオートファジーの誘導又は阻害を、海馬におけるＬＣ３−ＩＩの存在量及びＳＱＳＴＭ１／ｐ６２レベルを測定することにより確認した（データは示さず）。本発明者らは次に、それらを１２時間後にＮＯＲ及びＣＦＣの訓練（獲得）段階に供した（データは示さず）。Ｓｐａｕｔｉｎ−１（特異的オートファジー阻害剤−１）の急性注射（データは示さず）、ＡＰ形成との干渉、又はクロロキンもしくはロイペプチンの注射によるオートファジー経路の後期の遮断（データは示さず）は全て、ＮＯＲ及びＣＦＣの両方のテスト段階の間での記憶成績における有意な減少に導いた（データは示さず）。逆に、訓練段階の間での、ＡＰ形成の誘導因子であるＴＡＴ−ベクリン１ペプチド（１７）の海馬注射後のオートファジーの急性誘導によって（図１Ａ、Ｂ、及びＣ）、両方のテストにおいて学習／記憶能力が増強された。故に、これらのデータは、海馬オートファジーが新規記憶獲得の制御のために必要であることを示す。
【０１４６】
新規記憶獲得は、刺激への海馬ニューロンの適応応答に頼り、ニューロンの形態、シナプス活動、及び神経伝達における持続的な変化により特徴付けられる（５、１０、１８）。長期増強（ＬＴＰ）は、学習及び記憶の根底にある重要な細胞機構の１つである（１８、１９）。ＬＴＰ誘導後のシナプス強度の増加は、シナプス後のＡＭＰＡグルタミン酸受容体及びＣＡＭＫＩＩ（カルシウム／カルモジュリン依存的プロテインキナーゼＩＩ）のリン酸化と共に、新たな樹状突起棘、興奮性シナプスを収容する樹状突起から伸びる小さなアクチンに富む突起の迅速な形成をもたらす（５、１８）。本発明者らは、長期的なシナプス可塑性又はＫＣＬ脱分極を誘導する化学的長期増強（ｃＬＴＰ）が、ＬＣ３−ＩＩレベルを測定することにより決定されたように（データは示さず）、成熟した初代海馬ニューロンにおいてオートファジーを増加させることを観察した。従って、本発明者らは、オートファジーの下方調節が、海馬歯状回の顆粒ニューロンにおける新規樹状突起棘の形成を促す、ｃＬＴＰ（２０）又はＭＷＭにより誘導される記憶刺激（２１）への応答において海馬ニューロンのニューロン可塑性に影響を及ぼすか否かを調べた。インビトロでは、本発明者らは、ベクリン１に対するＩＰＴＧ誘導性ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いた感染により、初代海馬ニューロンにおいてベクリン１の急性ノックダウンを実施した。ＩＰＴＧを用いた処理により、ベクリン１タンパク質レベルにおけるロバストな減少が誘導された（データは示さず）。ｃＬＴＰによる神経可塑性誘導は、新規樹状突起棘形成、ならびに対照群でのＳｅｒ８３１及びＣＡＭＫＩＩ（ｐＣａＭＫＩＩ）におけるＧｌｕＡ１受容体（ｐＧｌｕＡ１）のリン酸化を有意に増加させたのに対し、ｃＬＴＰ治療への応答における新規樹状突起棘又はシナプス分子強度のいずれかの有意な誘導は、ベクリン１の下方調節後に観察されなかった（データは示さず）。この観察は、オートファジーが、長期持続刺激への応答における海馬ニューロンの適応性を媒介するために要求されることを示唆する。この観察をインビボで確認するために、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡベクリン１又はＡＡＶ−ｓｈＲＮＡスクランブルのいずれかを用いて局所的に注射された３ヶ月齢のマウスを、連続５日間にわたりＭＷＭに供した（２２）。ゴルジ染色後、本発明者らは、対照マウス（ＡＡＶ−スクランブル注射）の海馬顆粒ニューロンにおける樹状突起棘形成の有意な誘導を観察したが、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡベクリン１注射マウスの海馬顆粒ニューロンにおいては観察しなかった（データは示さず）。したがって、電気生理学的分析によって、ベクリン１の局所的な下方調節後でのＣＡ３の海馬ニューロンにおけるニューロン興奮性（データは示さず）及びｓＥＳＰＣ頻度（データは示さず）における有意な減少が示された。これらのデータは、海馬ニューロンにおけるオートファジーが、新規記憶刺激への適応ニューロン応答のために要求されることを示す。
【０１４７】
ＡＴＧタンパク質レベル及びオートファジー流動は、通常の脳の加齢の間に低下する（３）。これらのデータと一致して、本発明者らは、タンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方でのベクリン１、ＶＰＳ３４、及びＡＴＧ５における減少、ならびに１６ヶ月齢のＷＴマウスの海馬中のＳＱＳＴＭ１／ｐ６２における増加と一緒でのＬＣ３−ＩＩ蓄積における減少を観察した（図２Ａ）。本発明者らは次に、加齢の間での海馬オートファジーにおける減少が、３又は１６ヶ月齢のＷＴマウスを、溶媒、ＴＡＴ−スクランブル、又はＴＡＴ−ベクリン１のいずれかの局所定位注射後に、ＮＯＲ、ＣＦＣ、及び物体位置記憶（ＯＬＭ）テストに供することにより、加齢に関連する認知機能減退に寄与するか否かをテストした。本発明者らは、１６ヶ月齢の動物におけるオートファジーレベルを増加することによって、加齢に関連する記憶欠損を救出し、３ヶ月齢のマウスにおいて見られるレベルに記憶を回復させるのに十分であることを観察した（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。種々の環境因子（例えば若齢循環因子など）が、加齢に関連する海馬に依存的な記憶及び成人の神経新生減退に対して保護することができるため（２３、２４）、本発明者らは、海馬オートファジーが、最近記載された海馬に依存的な記憶の老齢マウスにおける若齢血漿の有益な効果を少なくとも部分的に媒介することができうると仮定した。本発明者らは、８週齢のマウスから収集した血漿の注射を受けた１６ヶ月齢のマウスが、増加したＬＣ３−ＩＩレベルを有し、増加したオートファジー（データは示さず）及び修正された加齢に関連する記憶欠損（データは示さず）を示していることを見出した。この有益な効果は、２ヶ月齢のマウスからの血漿を、ベクリン１が下方調節された１６ヶ月齢の動物において注射した場合には観察されなかった（データは示さず）。
【０１４８】
本発明者らの試験では、海馬に依存的な記憶の調節のための、脳におけるオートファジーについての重要な役割を初めて記載している。それによって、ニューロンのオートファジーが、エネルギー不足又は誤って折り畳まれたタンパク質の分解から脳を保護するだけではなく、脳において前例のない機能的に重要な役割を有することが実証される。実際に、海馬オートファジーは、記憶刺激及び環境刺激への反応においてニューロンの活動依存的な変化を媒介するために要求される。さらに、本発明者らの知見は、古い海馬においてオートファジー活性（例えばＴＡＴベクリンを介して）レベルを回復させることによって、加齢に関連する記憶欠損を逆転させることができることを実証する。その点では、本発明者らの結果は、加齢の間でのメンタルヘルスの減退を防止し、及び／又はレジリエンスを伸ばすための重要な治療上の意味を有しうる。
【０１４９】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示は、本明細書により、参照により本開示中に組み入れられる。
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【図１Ａ】
2022502454.tif 000003
【図１Ｂ】
2022502454.tif 000004
【図１Ｃ】
2022502454.tif 000005
【図２Ａ】
2022502454.tif 000006
【図２Ｂ】
2022502454.tif 000007
【図２Ｃ】
2022502454.tif 000008
【図２Ｄ】
2022502454.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
2022502454.tif 000011
【図３Ｂ】
2022502454.tif 000012
【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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