(57)【要約】本開示は、生物活性剤の送達、例えば、操作された細胞を調製するための細胞への生物活性剤の送達に有用なイオン化可能なアミン脂質及びその塩（例えば、その薬学的に許容される塩）を提供する。本明細書に開示されるイオン化可能なアミン脂質は、脂質ナノ粒子ベースの組成物の製剤化におけるイオン化可能な脂質として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2022501412.tif 000153
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１１アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化２】
2022501412.tif 000154
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｚ２は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、及び−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３から選択され、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−３アルキルである〕
またはその塩。
【請求項２】
前記塩が薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が直鎖Ｃ５−１１アルキレンである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１が直鎖Ｃ６−１０アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ１が、直鎖Ｃ６アルキレン、直鎖Ｃ７アルキレン、直鎖Ｃ８アルキレン、または直鎖Ｃ９アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｙ１が直鎖Ｃ４−９アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙ１が直鎖Ｃ６−８アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｙ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１がＣ４−１２アルケニルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がＣ９アルケニルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｙ２が
【化３】
2022501412.tif 000155
である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜２１原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｚ１が直鎖Ｃ２−４アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｚ１が、Ｃ２アルキレンまたはＣ３アルキレンである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｚ２が−ＯＨである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｚ２が−ＮＨ２である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｚ２が、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、または−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ３がメチルである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１が直鎖Ｃ４−１２アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が直鎖Ｃ８−１０アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１が直鎖Ｃ９アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１が分岐鎖Ｃ６−１２アルキルである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１が、分岐鎖Ｃ８アルキル、分枝鎖Ｃ９アルキル、または分岐鎖Ｃ１０アルキルである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
各Ｒ２が、独立して、直鎖Ｃ５−１２アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
各Ｒ２が、独立して、直鎖Ｃ６−８アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ５−１２アルキルである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ６−８アルキルである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｘ１及びＲ２部分の１つが、アセタールの炭素及び酸素原子を含む１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記化合物が、式（ＩＩ）の化合物
【化４】
2022501412.tif 000156
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１０アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化５】
2022501412.tif 000157
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルである〕
またはその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３１】
前記塩が薬学的に許容される塩である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｘ１が直鎖Ｃ５−１１アルキレンである、請求項３０または３１に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｘ１が直鎖Ｃ６−８アルキレンである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｘ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｙ１が直鎖Ｃ４−９アルキレンである、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｙ１が直鎖Ｃ５−９アルキレンである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｙ１が直鎖Ｃ６−８アルキレンである、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｙ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｙ２が
【化６】
2022501412.tif 000158
である、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ１がＣ４−１２アルケニルである、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ１がＣ９アルケニルである、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜２１原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｚ１が直鎖Ｃ２−４アルキレンである、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｚ１がＣ２アルキレンである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｒ１が直鎖Ｃ４−１２アルキルである、請求項３０〜３９及び４２〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｒ１が直鎖Ｃ８−１０アルキルである、請求項３０〜３９及び４２〜４６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｒ１が直鎖Ｃ９アルキルである、請求項３０〜３９及び４２〜４７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４９】
各Ｒ２がＣ５−１２アルキルである、請求項３０〜４８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５０】
各Ｒ２が直鎖Ｃ５−１２アルキルである、請求項３０〜４９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５１】
各Ｒ２が直鎖Ｃ６−１０アルキルである、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５２】
各Ｒ２が直鎖Ｃ６−８アルキルである、請求項３０〜５１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｘ１及びＲ２部分の１つが、アセタールの炭素及び酸素原子を含む１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、請求項３０〜５２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５４】
前記化合物が、
【化７】
2022501412.tif 000159
2022501412.tif 000160
2022501412.tif 000161
2022501412.tif 000162
2022501412.tif 000163
2022501412.tif 000164
2022501412.tif 000165
またはそれらの塩から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５５】
前記塩が薬学的に許容される塩である、請求項５５に記載の化合物。
【請求項５６】
前記化合物のプロトン化形態のｐＫａが約５．１〜約８．０である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５７】
前記化合物のプロトン化形態のｐＫａが約５．７〜約６．４である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５８】
前記化合物のプロトン化形態のｐＫａが約５．８〜約６．２である、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５９】
前記化合物のプロトン化形態のｐＫａが約５．５〜約６．０である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６０】
前記化合物のプロトン化形態のｐＫａが約６．１〜約６．３である、請求項５９に記載の化合物。
【請求項６１】
先行請求項のいずれか１項に記載の化合物と、脂質コンポーネントと、を含む組成物。
【請求項６２】
前記組成物が、約５０％の先行請求項のいずれか１項に記載の化合物と、脂質コンポーネントと、を含む請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記組成物が、ＬＮＰ組成物である、請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記脂質コンポーネントがヘルパー脂質及びＰＥＧ脂質を含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記脂質コンポーネントがヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及び中性脂質を含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
凍結保護剤をさらに含む、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
緩衝液をさらに含む、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
核酸コンポーネントをさらに含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記核酸コンポーネントがＲＮＡまたはＤＮＡコンポーネントである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記組成物が約３〜１０のＮ／Ｐ比を有する、請求項６８または６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記Ｎ／Ｐ比が約６±１である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記Ｎ／Ｐ比が約６±０．５である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記Ｎ／Ｐ比が約６である、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７４】
ＲＮＡコンポーネントを含み、前記ＲＮＡコンポーネントがｍＲＮＡを含む、請求項６１〜７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記ＲＮＡコンポーネントが、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＲＮＡ誘導性ＤＮＡ結合剤を含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ＲＮＡコンポーネントがクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項７４または７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ＲＮＡコンポーネントがＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ｍＲＮＡが修飾されたｍＲＮＡである、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ＲＮＡコンポーネントがｇＲＮＡ核酸を含む、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ｇＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ＲＮＡコンポーネントがクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ｇＲＮＡ核酸がデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ｇＲＮＡ核酸がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ｇＲＮＡが修飾されたｇＲＮＡである、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記修飾されたｇＲＮＡが、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記修飾されたｇＲＮＡが、３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、請求項８４または８５に記載の組成物。
【請求項８７】
少なくとも１つのテンプレート核酸をさらに含む、請求項６１〜８６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８８】
細胞を、請求項６１〜８７のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む遺伝子編集の方法。
【請求項８９】
細胞を、請求項６１〜８７のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含むＤＮＡを切断する方法。
【請求項９０】
前記接触させるステップが一本鎖ＤＮＡニックをもたらす、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記接触させるステップが二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記組成物がクラス２Ｃａｓ  ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ核酸を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
少なくとも１つのテンプレート核酸を前記細胞に導入することをさらに含む、請求項８８または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞を、テンプレート核酸を含む組成物と接触させることを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記組成物を動物に投与することを含む、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組成物をヒトに投与することを含む、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物を細胞に投与することを含む、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞が真核細胞である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
第１のＬＮＰ組成物中に製剤化されたｍＲＮＡと、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ核酸、及びテンプレート核酸のうちの１つ以上を含む第２のＬＮＰ組成物と、を投与することを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１及び第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１及び第２のＬＮＰ組成物が逐次的に投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
単一のＬＮＰ組成物に製剤化された前記ｍＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡ核酸を投与することを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、請求項８８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記遺伝子編集が遺伝子修正をもたらす、請求項８８〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月２日に出願された米国特許仮出願第６２／７４０２７４号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
イオン化可能なアミン含有脂質によって製剤化された脂質ナノ粒子は、生物活性剤、特にＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡなどのポリヌクレオチドを細胞に送達するためのカーゴビヒクルとして役立つことができる。イオン化可能な脂質を含むＬＮＰ組成物は、細胞膜を通過するオリゴヌクレオチド剤の送達を促進することができ、生細胞に遺伝子編集用のコンポーネント及び組成物を導入するために使用することができる。細胞への送達が特に困難な生物活性剤には、タンパク質、核酸ベースの薬物、及びそれらの誘導体、特に、ｍＲＮＡなどの比較的大きなオリゴヌクレオチドを含む薬物が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムコンポーネントの送達など、有望な遺伝子編集技術を細胞に送達するための組成物は、特に興味深い（例えば、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及び関連するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのタンパク質及び核酸コンポーネントを患者の細胞などの細胞に送達するための組成物が必要である。特に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質コンポーネントをコードするｍＲＮＡを送達するための、及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを送達するための組成物は、特に興味深い。ＲＮＡコンポーネントを安定化及び送達することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ送達に有用な特性を有する組成物もまた特に興味深い。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の製剤に有用なアミン含有脂質を提供する。このようなＬＮＰ組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集コンポーネントなどの核酸カーゴを細胞に送達するのに有利な特性を有し得る。
【０００５】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物、
【化１】
2022501412.tif 000002
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１１アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化２】
2022501412.tif 000003
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｚ２は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、及び−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３から選択され、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−３アルキルである〕
またはその塩に関する。
【０００６】
特定の実施形態では、本発明は、塩が薬学的に許容される塩である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明は、Ｘ１が直鎖Ｃ５−１１アルキレン、例えば直鎖Ｃ６−１０アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ７アルキレンまたは直鎖Ｃ９アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。特定の実施形態では、Ｘ１は直鎖Ｃ８アルキレンである。特定の実施形態では、Ｘ１は直鎖Ｃ６アルキレンである。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１が直鎖Ｃ４−９アルキレン、例えばＹ１が直鎖Ｃ５−９アルキレン、または直鎖Ｃ６−８アルキレン、好ましくはＹ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ２が
【化３】
2022501412.tif 000004
である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１がＣ９アルケニルなどのＣ４−１２アルケニルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜２１原子、好ましくは１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は、Ｚ１が直鎖Ｃ２−４アルキレンであり、好ましくは、Ｚ１がＣ２アルキレンまたはＣ３アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｚ２は−ＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｚ２は−ＮＨ２である。特定の実施形態では、Ｚ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、及び−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３から選択され、例えば、Ｚ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３または−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３である。いくつかの実施形態では、Ｚ２は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３または−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３である。
【００１４】
特定の実施形態では、Ｒ３はメチルである。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が直鎖Ｃ４−１２アルキルであり、例えば、Ｒ１が直鎖Ｃ６−１１アルキル、例えば直鎖Ｃ８−１０アルキルであり、好ましくはＲ１が直鎖Ｃ９アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が分岐鎖Ｃ６−１２アルキルであり、例えば、Ｒ１が分岐鎖Ｃ７−１１アルキル、例えば分岐鎖Ｃ８アルキル、分岐鎖Ｃ９アルキル、または分岐鎖Ｃ１０アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、Ｃ５−１２アルキル、例えば、直鎖Ｃ５−１２アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、直鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば直鎖Ｃ６−８アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ５−１２アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば、分岐鎖Ｃ８アルキルなどの分岐鎖Ｃ７−９アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、アセタールの炭素及び酸素原子を含む１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するようにＸ１及びＲ２部分の１つが選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、式ＩＩの化合物、
【化４】
2022501412.tif 000005
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１０アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化５】
2022501412.tif 000006
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルである〕
またはその塩に関する。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、塩が薬学的に許容される塩である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、Ｘ１が直鎖Ｃ５−１１アルキレン、例えば直鎖Ｃ６−８アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ７アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１が直鎖Ｃ５−９アルキレンであり、例えばＹ１がＣ４−９アルキレン、または直鎖Ｃ６−８アルキレン、好ましくはＹ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ２が
【化６】
2022501412.tif 000007
である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１がＣ４−１２アルケニルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜２１原子、好ましくは１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、Ｚ１が直鎖Ｃ２−４アルキレンであり、好ましくは、Ｚ１がＣ２アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が直鎖Ｃ４−１２アルキルであり、例えば、Ｒ１が直鎖Ｃ８−１０アルキルであり、好ましくは、Ｒ１が直鎖Ｃ９アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、Ｃ５−１２アルキル、例えば、直鎖Ｃ５−１２アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、直鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば直鎖Ｃ６−８アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、アセタールの炭素及び酸素原子を含む１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するようにＸ１及びＲ２部分の１つが選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００３１】
特定の実施形態では、本発明は、以下から選択される化合物：
【化７】
2022501412.tif 000008
2022501412.tif 000009
2022501412.tif 000010
2022501412.tif 000011
2022501412.tif 000012
2022501412.tif 000013
2022501412.tif 000014
またはそれらの塩、好ましくはそれらの薬学的に許容される塩に関する。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、化合物のプロトン化形態のｐＫａが約５．１〜約８．０、例えば、約５．７〜約６．５、約５．７〜約６．４、または約５．８〜約６．２である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、化合物のプロトン化形態のｐＫａは、約５．５〜約６．０である。特定の実施形態では、化合物のプロトン化形態のｐＫａは、約６．１〜約６．３である。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の任意の化合物及び脂質コンポーネント、例えば、約５０％の先行請求項のいずれか１つの化合物及び脂質コンポーネント、例えば、アミン脂質、好ましくは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む組成物に関する。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は、組成物がＬＮＰ組成物である、本明細書に記載の任意の組成物に関する。例えば、本発明は、本明細書に記載の任意の化合物及び脂質コンポーネントを含むＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、脂質コンポーネントがヘルパー脂質及びＰＥＧ脂質を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、脂質コンポーネントがヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、及び中性脂質を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、凍結保護剤をさらに含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、緩衝液をさらに含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明は、核酸コンポーネントをさらに含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡコンポーネントをさらに含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＬＮＰ組成物が、約３〜１０のＮ／Ｐ比を有し、例えば、Ｎ／Ｐ比が、約６±１であり、またはＮ／Ｐ比は、約６±０．５である、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＬＮＰ組成物が約６のＮ／Ｐ比を有する、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡコンポーネントがｍＲＮＡを含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡコンポーネントが、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡまたはＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡが修飾されたｍＲＮＡである、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡコンポーネントがｇＲＮＡ核酸を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ｇＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡコンポーネントがクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ｇＲＮＡ核酸がデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、ｇＲＮＡ核酸がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明は、ｇＲＮＡが修飾されたｇＲＮＡである、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、修飾されたｇＲＮＡが、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、修飾されたｇＲＮＡが、３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのテンプレート核酸をさらに含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、細胞をＬＮＰと接触させることを含む、遺伝子編集の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＤＮＡを切断することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明は、細胞をＬＮＰ組成物と接触させることを含む、ＤＮＡを切断する方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、切断するステップが、一本鎖ＤＮＡニックを導入することを含む、本明細書に記載のＤＮＡを切断する任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、切断するステップが、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することを含む、本明細書に記載のＤＮＡを切断する任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、ＬＮＰ組成物が、クラス２Ｃａｓ  ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ核酸を含む、本明細書に記載のＤＮＡを切断する任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのテンプレート核酸を細胞に導入することをさらに含む、本明細書に記載のＤＮＡを切断する任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、細胞をテンプレート核酸を含むＬＮＰ組成物と接触させることを含む、本明細書に記載のＤＮＡを切断する任意の方法に関する。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明は、ＬＮＰ組成物を動物、例えばヒトに投与することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、真核細胞などの細胞にＬＮＰ組成物を投与することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明は、第１のＬＮＰ組成物中に製剤化されたｍＲＮＡと、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ核酸、及びテンプレート核酸のうちの１つ以上を含む第２のＬＮＰ組成物と、を投与することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、第１及び第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、第１及び第２のＬＮＰ組成物が逐次的に投与される、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、単一のＬＮＰ組成物中に製剤化されたｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ核酸を投与することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明は、遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明は、遺伝子編集が遺伝子修正をもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例５２に記載されるように、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＢ２Ｍの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図２Ａ】実施例５３に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物（化合物１）または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。用量反応データも示す。
【図２Ｂ】実施例５３に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。用量反応データも示す。
【図２Ｃ】実施例５３に記載されるように、血清ＴＴＲ（ＴＳＳ％）を示すグラフである。用量反応データも示す。
【図３】実施例５３に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物（化合物１）または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＢ２Ｍの編集の用量反応パーセンテージを示すグラフである。
【図４】実施例５４に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物（化合物４）または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＢ２Ｍの編集の用量反応パーセンテージを示すグラフである。
【図５Ａ】実施例５５に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。用量反応データも示す。
【図５Ｂ】実施例５５に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。用量反応データも示す。
【図５Ｃ】実施例５５に記載されるように、血清ＴＴＲ（ＴＳＳ％）を示すグラフである。用量反応データも示す。
【図６Ａ】実施例５８に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図６Ｂ】実施例５８に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例５９に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図７Ｂ】実施例５９に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図８Ａ】実施例６０に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図８Ｂ】実施例６０に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図９Ａ】実施例６１に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図９Ｂ】実施例６１に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図１０Ａ】実施例６２に記載されるように、化合物１９、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物または対照を含むＬＮＰを使用する送達後のマウス肝細胞におけるＴＴＲの編集のパーセンテージを示すグラフである。
【図１０Ｂ】実施例６２に記載されるように、血清ＴＴＲ（μｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓコンポーネントＲＮＡ（「カーゴ」）などの核酸を含む生物活性剤を細胞に送達するのに有用な脂質、特にイオン化可能な脂質、ならびにそのような組成物を調製及び使用するための方法を提供する。脂質及びその薬学的に許容される塩は、任意選択で、ＬＮＰ組成物を含む、脂質を含む組成物として提供される。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、生物活性剤、例えば、ＲＮＡコンポーネント、及び本明細書で定義される式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む脂質コンポーネントを含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡコンポーネントは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコンポーネントは、核酸を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、生物活性剤、例えば、ｍＲＮＡなどの核酸を肝細胞などの細胞に送達するために使用される。特定の実施形態では、ＲＮＡコンポーネントは、ｇＲＮＡ及び任意選択でクラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。これらの組成物を使用する、遺伝子編集の方法及び操作された細胞を作製する方法も提供される。
【００４９】
脂質ナノ粒子組成物
本明細書に開示されるのは、核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴを含む、ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡなどの生物活性剤を送達するための様々なＬＮＰ組成物である。このようなＬＮＰ組成物は、中性脂質、ＰＥＧ脂質、及びヘルパー脂質とともに、「イオン化可能なアミン脂質」を含む。「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、意味を限定することなく、分子間力によって互いに物理的に結合する複数の（すなわち、２つ以上の）ＬＮＰコンポーネントを含む粒子を指す。
【００５０】
脂質
本開示は、ＬＮＰ組成物で使用することができる脂質を提供する。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物、
【化８】
2022501412.tif 000015
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１１アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化９】
2022501412.tif 000016
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｚ２は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、及び−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３から選択され、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−３アルキルである〕
またはその塩に関する。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明は、塩が薬学的に許容される塩である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明は、Ｘ１が直鎖Ｃ５−１１アルキレン、例えば直鎖Ｃ６−１０アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ７アルキレンまたは直鎖Ｃ９アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。特定の実施形態では、Ｘ１は直鎖Ｃ８アルキレンである。特定の実施形態では、Ｘ１は直鎖Ｃ６アルキレンである。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１が直鎖Ｃ４−９アルキレン、例えばＹ１が直鎖Ｃ５−９アルキレン、または直鎖Ｃ６−８アルキレン、好ましくはＹ１が直鎖Ｃ７アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ２が
【化１０】
2022501412.tif 000017
である、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１がＣ９アルケニルなどのＣ４−１２アルケニルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明は、Ｙ１、Ｙ２、及びＲ１が、１６〜２１原子、好ましくは１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するように選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明は、Ｚ１が直鎖Ｃ２−４アルキレンであり、好ましくは、Ｚ１がＣ２アルキレンまたはＣ３アルキレンである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｚ２は−ＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｚ２は−ＮＨ２である。特定の実施形態では、Ｚ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３、及び−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３から選択され、例えば、Ｚ２は、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ３または−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３である。いくつかの実施形態では、Ｚ２は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ３または−ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ３である。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｒ３はメチルである。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が直鎖Ｃ４−１２アルキルであり、例えば、Ｒ１が直鎖Ｃ６−１１アルキル、例えば直鎖Ｃ８−１０アルキルであり、好ましくはＲ１が直鎖Ｃ９アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１が分岐鎖Ｃ６−１２アルキルであり、例えば、Ｒ１が分岐鎖Ｃ７−１１アルキル、例えば分岐鎖Ｃ８アルキル、分岐鎖Ｃ９アルキル、または分岐鎖Ｃ１０アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、Ｃ５−１２アルキル、例えば、直鎖Ｃ５−１２アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、直鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば直鎖Ｃ６−８アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ５−１２アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、各Ｒ２が、独立して、分岐鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば、分岐鎖Ｃ８アルキルなどの分岐鎖Ｃ７−９アルキルである、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明は、アセタールの炭素及び酸素原子を含む１６〜１８原子の直鎖の鎖を形成するようにＸ１及びＲ２部分の１つが選択される、本明細書に記載の任意の化合物に関する。
【００６６】
特定の実施形態では、脂質は、式（ＩＩ）の構造を有する化合物、
【化１１】
2022501412.tif 000018
〔式中、各々の存在について独立して、
Ｘ１は、Ｃ５−１１アルキレンであり、
Ｙ１は、Ｃ３−１０アルキレンであり、
Ｙ２は、
【化１２】
2022501412.tif 000019
であり、ａ１はＹ１に対する結合であり、ａ２はＲ１に対する結合であり、
Ｚ１は、Ｃ２−４アルキレンであり、
Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキルもしくはＣ３−１２アルケニルであり、
各Ｒ２は、独立してＣ４−１２アルキルである〕
またはその塩、例えばその薬学的に許容される塩に関する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は、直鎖Ｃ５−１１アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ６−８アルキレン、より好ましくはＣ７アルキレンである。
【００６８】
特定の実施形態では、Ｙ１は、直鎖Ｃ５−９アルキレン、例えば直鎖Ｃ６−８アルキレンまたは直鎖Ｃ４−９アルキレン、好ましくは直鎖Ｃ７アルキレンである。
【００６９】
特定の実施形態では、Ｙ２は
【化１３】
2022501412.tif 000020
である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ４−１２アルキル、好ましくは直鎖Ｃ８−１０アルキル、より好ましくは直鎖Ｃ９アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ４−１２アルケニルである。
【００７１】
特定の実施形態では、Ｚ１は、直鎖Ｃ２−４アルキレン、好ましくはＣ２アルキレンである。
【００７２】
特定の実施形態では、Ｒ２は、直鎖Ｃ５−１２アルキル、例えば、直鎖Ｃ６−１０アルキル、例えば、直鎖Ｃ６−８アルキルである。
【００７３】
式（Ｉ）の代表的な化合物は以下を含む：
【化１４】
2022501412.tif 000021
2022501412.tif 000022
2022501412.tif 000023
2022501412.tif 000024
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2022501412.tif 000026
2022501412.tif 000027
特定の実施形態では、本明細書に開示されるように製剤化された脂質組成物の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の少なくとも７５％は、投与後８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に対象の血漿から除去される。特定の実施形態では、本明細書に開示される式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む脂質組成物の少なくとも５０％は、投与後８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に対象の血漿から除去される。これは、例えば、血漿中の脂質（例えば、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または他のコンポーネントを測定することによって決定することができる。特定の実施形態では、脂質組成物の脂質カプセル化対遊離脂質、ＲＮＡ、または核酸コンポーネントが測定される。
【００７４】
脂質クリアランスは、文献に記載されているように測定することができる。Ｍａｉｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１３，  ２１（８），  １５７０−７８  （「Ｍａｉｅｒ」）を参照されたい。例えば、Ｍａｉｅｒでは、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムが、６〜８週齢のオスＣ５７Ｂｌ／６マウスに０．３ｍｇ／ｋｇで、外側尾静脈からの静脈内ボーラス注射によって投与された。血液、肝臓、及び脾臓の試料は、投与後０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６、及び１６８時間に収集された。組織採取の前にマウスを生理食塩水で灌流し、血液試料を処理して血漿を得た。全ての試料はＬＣ−ＭＳによって処理及び分析された。さらに、Ｍａｉｅｒは、ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の毒性を評価するための手順を記載する。例えば、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡは、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに５ｍＬ／ｋｇの用量で単回静脈内ボーラス注射により、０、１、３、５、及び１０ｍｇ／ｋｇ（５匹の動物／群）で投与された。２４時間後、意識のある動物の頸静脈から約１ｍＬの血液が得られ、血清が単離された。投与後７２時間で、全ての動物を剖検のために安楽死させた。臨床徴候、体重、血清化学、臓器重量、及び組織病理学の評価が行われた。ＭａｉｅｒはｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ組成物を評価する方法を記載しているが、これらの方法は、本開示の脂質組成物、例えばＬＮＰ組成物の投与のクリアランス、薬物動態、及び毒性を評価するために適用できる。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を使用する脂質組成物は、代替のイオン化可能なアミン脂質と比較して増加したクリアランス速度を示す。いくつかのそのような実施形態では、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度、例えば、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物が血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、カーゴ（例えば、生物活性剤）のクリアランス速度、例えば、カーゴコンポーネントが血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えば、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡが血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＬＮＰが血液、血清、または血漿から除去される速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＬＮＰが肝臓組織または脾臓組織などの組織から除去される速度である。望ましくは、高いクリアランス速度は、実質的な有害作用のない安全性プロファイル、及び／または循環及び／または組織におけるＬＮＰ蓄積の減少をもたらし得る。
【００７６】
本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、それらが含まれる媒体のｐＨに応じて塩を形成し得る。例えば、わずかに酸性の媒体において、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物はプロトン化され得、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない。いくつかの実施形態では、本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、少なくとも約９のｐＨで主にプロトン化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、少なくとも約１０のｐＨで主にプロトン化され得る。
【００７７】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物が主にプロトン化されるｐＨは、その固有のｐＫａに関連している。好ましい実施形態では、本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の塩は、約５．１〜約８．０、さらにより好ましくは約５．５〜約７．５、例えば約６．１〜約６．３の範囲のｐＫａを有する。好ましい他の実施形態では、本開示の式（Ｉ）の化合物の塩は、約５．３〜約８．０、例えば、約５．７〜約６．５の範囲のｐＫａを有する。他の実施形態では、本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の塩は、約５．７〜約６．４、例えば約５．８〜約６．２の範囲のｐＫａを有する。他の好ましい実施形態では、本開示の式（Ｉ）の化合物の塩は、約５．７〜約６．５、例えば約５．８〜約６．４の範囲のｐＫａを有する。代替的に、本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の塩は、約５．８〜約６．５の範囲のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のプロトン化形態のｐＫａは、約５．５〜約６．０である。本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の塩は、約６．０〜約８．０、好ましくは約６．０〜約７．５の範囲のｐＫａを有し得る。式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の塩のｐＫａは、約５．５〜約７．０の範囲のｐＫａを有する特定の脂質で製剤化されたＬＮＰが、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば肝臓へのカーゴの送達に有効であることが見出されているので、ＬＮＰを製剤化する際の重要な考慮事項となり得る。さらに、約５．３〜約６．４の範囲のｐＫａを有する特定の脂質で製剤化されたＬＮＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば腫瘍への送達に有効であることが見出されている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照されたい。
【００７８】
追加の脂質
本開示の脂質組成物における使用に好適な「中性脂質」は、例えば、様々な中性、非荷電、または双性イオン性の脂質を含む。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）から選択され得る。
【００７９】
「ヘルパー脂質」としては、ステロイド、ステロール、及びアルキルレゾルシノールが挙げられる。本開示での使用に好適なヘルパー脂質としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、及びコレステロールヘミスクシナートが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、ヘミコハク酸コレステロールであり得る。
【００８０】
ＰＥＧ脂質は、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、血液中）で存在し得る時間の長さに影響を及ぼし得る脂質である。ＰＥＧ脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用であり得る。本明細書で使用されるＰＥＧ脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。典型的には、ＰＥＧ脂質は、脂質部分及びＰＥＧに基づくポリマー部分（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）（ＰＥＧ部分）を含む。本開示の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物を含む脂質組成物での使用に適したＰＥＧ脂質、及びそのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１），  ２００８，  ｐｐ．  ５５−７１及びＨｏｅｋｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６６０  （２００４）  ４１−５２に見出すことができる。追加の適切なＰＥＧ脂質は、例えば、ＷＯ２０１５／０９５３４０（３１ページ１４行目〜３７ページ６行目）、ＷＯ２００６／００７７１２、及びＷＯ２０１１／０７６８０７（「ステルス脂質」）に開示されている。
【００８１】
いくつかの実施形態において、脂質部分は、独立して約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステル等の官能基を含み得る。いくつかの実施形態では、アルキル鎖長は、約Ｃ１０〜Ｃ２０を含む。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。鎖長は対称でも非対称でもよい。
【００８２】
特に明記しない限り、本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマー、例えば、任意選択で置換された直鎖または分岐鎖の、エチレングリコールまたはエチレンオキシドのポリマーを意味する。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は非置換である。代替的に、ＰＥＧ部分は、例えば、１つ以上のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換され得る。例えば、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ−ポリウレタンまたはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含み得る（例えば、Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９９２）を参照されたい）。代替的に、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧホモポリマーであり得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１３０〜約５０，０００、例えば、約１５０〜約３０，０００、さらには約１５０〜約２０，０００の分子量を有する。同様に、ＰＥＧ部分は、約１５０〜約１５，０００、約１５０〜約１０，０００、約１５０〜約６，０００、またはさらには約１５０〜約５，０００の分子量を有し得る。特定の好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１５０〜約４，０００、約１５０〜約３，０００、約３００〜約３，０００、約１，０００〜約３，０００、または約１，５００〜約２，５００の分子量を有する。
【００８３】
特定の好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、「ＰＥＧ２０００」とも呼ばれる「ＰＥＧ−２Ｋ」であり、これは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ−２Ｋは、本明細書では、以下の式（ＩＩ）によって表され、式中、ｎは４５であり、これは、数平均重合度が約４５のサブユニットを含むことを意味する。
【化１５】
2022501412.tif 000028
しかしながら、例えば、数平均重合度が約２３サブユニット（ｎ＝２３）、及び／または６８サブユニット（ｎ＝６８）を含む、当該技術分野において公知の他のＰＥＧの実施形態を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ｎは約３０〜約６０の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約３５〜約５５の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４０〜約５０の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４２〜約４８の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは４５であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、及び非置換アルキルから選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチルなどの非置換アルキルであってよい。
【００８４】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（カタログ番号ＧＭ−０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ，ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）（カタログ番号８８０１２０Ｃ  Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ；ＧＳ−０２０，ＮＯＦ  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ））、及び１，２−ジステアリルオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択され得る。特定のそのような実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧであり得る。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡであり得る。さらに他の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ−ＤＭＡであり得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＷＯ２０１６／０１０８４０（段落［００２４０］〜［００２４４］）に開示されている化合物Ｓ０２７であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡであり得る。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１４であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１６であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１８であり得る。
【００８５】
本発明の脂質組成物に適したカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロリル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジラウリル（Ｃ１２：０）トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＴＡＰ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｉ、ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、２−［５’−（コレスト−５−エン−３［ベータ］−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰまたはＤＬＴＡＰである。
【００８６】
本発明での使用に適したアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンコレステロールヘミコハク酸（ＣＨＥＭＳ）、及びリシルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
脂質組成物
本発明は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物またはその塩（例えば、その薬学的に許容される塩）と、少なくとも１つの他の脂質コンポーネントと、を含む脂質組成物を提供する。そのような組成物はまた、任意選択で１つ以上の他の脂質コンポーネントと組み合わせて、生物活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、脂質コンポーネントと、生物活性剤を含む水性コンポーネントと、を含む。
【００８８】
一実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、少なくとも１つの他の脂質コンポーネントと、を含む。別の実施形態では、脂質組成物は、任意選択で１つ以上の他の脂質コンポーネントと組み合わせて、生物活性剤をさらに含む。さらに別の実施形態では、組成物は、リポソームの形態である。さらに別の実施形態では、組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態である。別の実施形態では、脂質組成物は肝臓への送達に適している。
【００８９】
一実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、別の脂質コンポーネントと、を含む。そのような他の脂質コンポーネントとしては、中性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質、カチオン性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意選択で１つ以上の追加の脂質コンポーネントとともに中性脂質、例えばＤＳＰＣと、を含む。別の実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意選択で１つ以上の追加の脂質コンポーネントとともに、ヘルパー脂質、例えばコレステロールと、を含む。さらなる実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意選択で１つ以上の追加の脂質コンポーネントとともに、ＰＥＧ脂質と、を含む。さらなる実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意選択で１つ以上の追加の脂質コンポーネントとともにカチオン性脂質と、を含む。さらなる実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意選択で１つ以上の追加の脂質コンポーネントとともに、アニオン性脂質と、を含む。サブ実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、ヘルパー脂質と、任意選択で中性脂質とともにＰＥＧ脂質と、を含む。さらなる実施形態では、脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、ヘルパー脂質と、ＰＥＧ脂質と、中性脂質と、を含む。
【００９０】
式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の脂質またはその薬学的に許容される塩を含む組成物、またはその脂質組成物は、様々な分子を細胞に送達するのに役立つ、微粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤を含む粒子形成送達剤を含むがこれらに限定されない様々な形態であり得る。特定の組成物は、生物活性剤をトランスフェクトまたは送達するのに効果的である。好ましい生物活性剤は、ＲＮＡ及びＤＮＡである。さらなる実施形態では、生物活性剤は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びＤＮＡから選択される。特定の実施形態では、カーゴは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、及びｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡの組み合わせを含む。
【００９１】
上述の脂質組成物で使用するための式（Ｉ）の例示的な化合物は、実施例に示されている。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３である。式（Ｉ）の化合物は化合物４である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物５である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物６である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物７である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物８である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物９である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１０である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１２である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１３である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１４である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１５である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１６である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物１７である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２０である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２２である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２３である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２４である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２５である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２７である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２８である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物２９である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３０である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３２である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３３である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３４である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３５である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３６である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３７である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３８である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物３９である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４０である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４１である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４２である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４３である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４４である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４５である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４６である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４７である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４８である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物４９である。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は化合物５０である。特定の実施形態では、化合物は、化合物が化合物１８、化合物１９、または化合物２６でないという条件で、表１の化合物から選択される化合物である。
【００９２】
ＬＮＰ組成物
脂質組成物は、ＬＮＰ組成物として提供され得る。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア（単層及び多層の小胞、例えば、いくつかの実施形態において、実質的に球形であり、より特定の実施形態において、水性コアを含み得る「リポソーム」ラメラ相脂質二重層を含み、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であってよい。
【００９３】
ＬＮＰは、約１〜約１，０００ｎｍ、約１０〜約５００ｎｍ、約２０〜約５００ｎｍ、サブ実施形態では約５０〜約４００ｎｍ、サブ実施形態では約５０〜約３００ｎｍ、サブ実施形態では約５０〜約２００ｎｍ、及びサブ実施形態では約５０〜約１５０ｎｍ、及び別のサブ実施形態では約６０〜約１２０ｎｍのサイズを有する。好ましくは、ＬＮＰは、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍのサイズを有する。完全に形成されたＬＮＰの平均サイズ（直径）は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒでの動的光散乱によって測定できる。ＬＮＰ試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈され、カウント速度は約２００〜４００ｋｃｐｓである。データは、強度測定値の加重平均として表示される。
【００９４】
本開示の実施形態は、組成物中のコンポーネントの脂質のそれぞれのモル比に従って記載される脂質組成物も提供する。全てのモル％数は、脂質組成物、より具体的にはＬＮＰ組成物の脂質コンポーネントの割合として示される。特定の実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のモル％は、約３０モル％〜約７０モル％であり得る。特定の実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のモル％は、少なくとも３０モル％、少なくとも４０モル％、少なくとも５０モル％、または少なくとも６０モル％であり得る。
【００９５】
特定の実施形態では、中性脂質のモル％は、約０モル％〜約３０モル％であり得る。特定の実施形態では、中性脂質のモル％は、約０モル％〜約２０モル％であり得る。特定の実施形態では、中性脂質のモル％は、約９モル％であり得る。
【００９６】
特定の実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約０モル％〜約８０モル％であり得る。特定の実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約２０モル％〜約６０モル％であり得る。特定の実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約３０モル％〜約５０モル％であり得る。特定の実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、３０モル％〜約４０モル％、または約３５％モル％〜約４５モル％であり得る。特定の実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物、中性脂質、及び／またはＰＥＧ脂質濃度に基づいて調整され、脂質コンポーネントを１００モル％にする。
【００９７】
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約１モル％〜約１０モル％であり得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質のモル％は、約１モル％〜約４モル％であり得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質のモル％は、約１モル％〜約２モル％であり得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は、約１．５モル％であり得る。
【００９８】
様々な実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその塩（例えば、その薬学的に許容される塩（例えば、本明細書に開示される））と、中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）と、ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）と、を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩（例えば、本明細書に開示される）と、ＤＳＰＣと、コレステロールと、ＰＥＧ脂質と、を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧなどのＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の好ましい実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、コレステロールと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧと、を含む。
【００９９】
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、脂質コンポーネント及び核酸コンポーネント、例えば、ＲＮＡコンポーネントを含み、そして式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の核酸に対するモル比を測定することができる。本開示の実施形態はまた、式（Ｉ）または式（ＩＩ）（Ｎ）の化合物の薬学的に許容される塩の正に帯電したアミン基とカプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間の定義されたモル比を有する脂質組成物を提供する。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む脂質コンポーネントと、Ｎ／Ｐ比が約３〜１０である核酸コンポーネントと、を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む脂質コンポーネントと、Ｎ／Ｐ比が約３〜１０であるＲＮＡコンポーネントと、を含み得る。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約４〜７であり得る。あるいは、Ｎ／Ｐ比は、約６、例えば、６±１、または６±０．５であり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、生物活性剤を含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、任意選択で核酸と組み合わせて、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、ＲＮＡなどの核酸を含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、核酸コンポーネントである。いくつかの実施形態では、核酸コンポーネントはＤＮＡを含み、それはＤＮＡコンポーネントと呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、核酸コンポーネントはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡコンポーネントなどの水性コンポーネントは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。特定の実施形態では、水性コンポーネントは、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、水性コンポーネントは、ｇＲＮＡを含み得る。ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物において、組成物は、ｇＲＮＡなどのｇＲＮＡ核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、水性コンポーネントは、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、ヘルパー脂質と、任意選択での中性脂質と、ＰＥＧ脂質と、を含み得る。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む特定の組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む他の組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。特定の組成物では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、を含む。特定の組成物では、組成物は、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡなどのｇＲＮＡをさらに含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、ｇＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、ｇＲＮＡと、ヘルパー脂質と、任意選択での中性脂質と、ＰＥＧ脂質と、を含み得る。ｇＲＮＡを含む特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｇＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。特定の組成物において、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡから選択される。
【０１０３】
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、水性コンポーネント中のＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするｍＲＮＡと、脂質コンポーネント中の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、を含む。例えば、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｇＲＮＡと、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ＰＥＧ脂質と、を含み得る。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む特定の組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むいくつかの組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、クラス２Ｃａｓ  ｍＲＮＡなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤と、少なくとも１つのｇＲＮＡと、を含む。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約１：１または約１：２のクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどの、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤ｍＲＮＡに対するｇＲＮＡの比を含む。いくつかの実施形態では、この比は、約２５：１〜約１：２５、約１０：１〜約１：１０、約８：１〜約１：８、約４：１〜約１：４、または約２：１〜約１：２である。
【０１０５】
ＬＮＰ組成物などの本明細書に開示される脂質組成物は、テンプレート核酸、例えば、ＤＮＡテンプレートを含み得る。テンプレート核酸は、ＬＮＰ組成物として含まれる、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む脂質組成物とともに、またはそれとは別に送達され得る。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸は、所望の修復メカニズムに応じて、一本鎖または二本鎖であり得る。テンプレートは、例えば標的ＤＮＡ配列内の標的ＤＮＡ、及び／または標的ＤＮＡに隣接する配列と相同性のある領域を有し得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、水性ＲＮＡ溶液を有機溶媒ベースの脂質溶液と混合することによって形成される。適切な溶液または溶媒には、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが含まれるか、または含まれ得る。例えば、有機溶媒は１００％エタノールであり得る。例えば、ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容される緩衝液を使用することができる。特定の実施形態では、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持するために使用される。特定の実施形態では、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持するために使用される。特定の実施形態では、組成物は、約７．２〜約７．７の範囲のｐＨを有する。追加の実施形態では、組成物は、約７．３〜約７．７の範囲または約７．４〜約７．６の範囲のｐＨを有する。さらなる実施形態では、組成物は、約７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７のｐＨを有する。組成物のｐＨは、マイクロｐＨプローブで測定することができる。いくつかの実施形態では、凍結保護剤が組成物に含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物は、例えば、スクロースなどの最大１０％の凍結保護剤を含み得る。特定の実施形態では、組成物は、ｔｒｉｓ生理食塩水スクロース（ＴＳＳ）を含み得る。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％の凍結保護剤を含み得る。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％のスクロースを含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、及びそれらの混合物を含み得る。特定の例示的な実施形態では、緩衝液は、ＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを欠いている。ＮａＣｌの例示的な量は、約２０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲であり得る。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの量は約４５ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液である。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であってよい。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓの量は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＮａＣｌ及びＴｒｉｓを含む。ＬＮＰ組成物の特定の例示的な実施形態は、Ｔｒｉｓ緩衝液中に５％スクロース及び４５ｍＭ  ＮａＣｌを含む。他の例示的な実施形態では、組成物は、約５％ｗ／ｖの量のスクロース、約４５ｍＭのＮａＣｌ、及び約５０ｍＭのＴｒｉｓをｐＨ７．５で含む。塩、緩衝液、及び凍結保護剤の量は、組成物全体の浸透圧が維持されるように変えることができる。例えば、最終浸透圧は４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持できる。さらなる実施形態では��浸透圧は、３５０〜２５０ｍＯｓｍ／Ｌである。特定の実施形態は、３００＋／−２０ｍＯｓｍ／Ｌまたは３１０＋／−４０ｍＯｓｍ／Ｌの最終浸透圧を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、有機溶媒中のＲＮＡ水溶液と脂質溶液とのマイクロ流体混合、Ｔ混合、または交差混合が使用される。特定の態様では、流速、接合部のサイズ、接合部の形状、接合部の形状、管の直径、溶液、及び／またはＲＮＡ及び脂質の濃度を変えることができる。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば、透析、遠心フィルター、タンジェント流濾過、またはクロマトグラフィーを介して濃縮または精製することができる。ＬＮＰは、例えば、懸濁液、エマルション、または凍結乾燥粉末として保存することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は２〜８℃で保存され、特定の態様では、ＬＮＰ組成物は室温で保存される。追加の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、−２０℃または−８０℃で凍結保存される。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約０℃〜約−８０℃の範囲の温度で保存される。ＬＮＰ組成物は、使用前に、例えば、氷上、室温、または２５℃で解凍することができる。
【０１０８】
ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層及び多層の小胞、例えば、いくつかの実施形態において、実質的に球形であり、より特定の実施形態において、水性コアを含み得る「リポソーム」ラメラ相脂質二重層を含み、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であってよい。
【０１０９】
ＬＮＰ組成物などの好ましい脂質組成物は、治療上有効な用量でｉｎ  ｖｉｖｏで細胞毒性レベルまで蓄積しないという点で生分解性である。いくつかの実施形態では、組成物は、治療用量レベルで実質的な有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こさない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、治療用量レベルで毒性を引き起こさない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、約０．００５〜約０．７５の範囲であり得る多分散指数（ＰＤＩ）を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０．０１〜約０．５の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０〜約０．４の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０〜約０．３５の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０〜約０．３５の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのＰＤＩは、約０〜約０．３の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０〜約０．２５の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのＰＤＩは、約０〜約０．２の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約０．０８、０．１、０．１５、０．２、または０．４未満であり得るＰＤＩを有する。
【０１１１】
本明細書に開示されるＬＮＰは、約１〜約２５０ｎｍのサイズ（例えば、Ｚ平均直径）を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約１０〜約２００ｎｍのサイズを有する。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜約１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは約５０〜約１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０〜約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０〜約１２０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは約６０〜約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは約７５〜約１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７５〜約１２０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７５〜約１００ｎｍのサイズを有する。特に明記しない限り、本明細書で言及される全てのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒでの動的光散乱によって測定されるときの、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈され、カウント速度は約２００〜４００ｋｃｐｓである。データは、強度測定値の加重平均（Ｚ平均直径）として表示される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％〜約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％〜約９５％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７０％〜約９０％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９０％〜約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７５％〜約９５％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。
【０１１３】
カーゴ
ＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴは、生物活性剤であり得る。特定の実施形態では、カーゴは、１つ以上の生物活性剤、例えば、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、発現ベクター、テンプレート核酸、抗体（例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、及びそれらの断片など）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法剤及び他のタイプの抗腫瘍薬、低分子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイ及びその類似体、プラスミド及び他の種類のベクター、及び小核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び「自己複製ＲＮＡ」（レプリカーゼ酵素活性をコードし、それ自体のｉｎ  ｖｉｖｏでの複製または増幅を指示することができる）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（小さな内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、及びｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）であるか、またはそれらを含む。上述の生物活性剤のリストは単なる例示であり、限定することを意図するものではない。そのような化合物は、精製または部分的に精製することができ、天然に存在するか合成することができ、化学的に修飾することができる。
【０１１４】
ＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子などのＲＮＡであり得る。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、Ｃａｓヌクレアーゼなどのタンパク質を発現するためのｍＲＮＡが含まれる。ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質などのクラス２Ｃａｓヌクレアーゼの細胞での発現を可能にするクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物が提供される。さらに、カーゴは、１つ以上のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。例えば、修復または組換えのためのテンプレート核酸もまた、組成物に含まれ得るか、またはテンプレート核酸が、本明細書に記載の方法で使用され得る。サブ実施形態では、カーゴは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、及び任意選択でＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｇＲＮＡを含む。さらなるサブ実施形態では、カーゴは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、任意選択で、ｎｍｅのｇＲＮＡを含む。
【０１１５】
「ｍＲＮＡ」は、ポリヌクレオチドを指し、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として役立つことができる）オープンリーディングフレームを含む。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば、２’−メトキシリボース残基を含むリン酸糖骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸−糖骨格の糖は、本質的に、リボース残基、２’−メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせからなる。一般に、ｍＲＮＡは実質的な量のチミジン残基を含まない（例えば、０残基または３０、２０、１０、５、４、３、または２未満のチミジン残基、または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のチミジン含有量）。ｍＲＮＡは、そのウリジン位置の一部または全てに修飾されたウリジンを含むことができる。
【０１１６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴ
特定の実施形態では、開示された組成物は、ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、開示された組成物は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９などのクラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。
【０１１７】
本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ここで、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓ切断酵素／ニッカーゼ及びその不活化形態（「ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用されるとき、「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ切断剤、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤を包含する。Ｃａｓ切断剤／ニッカーゼ及びｄＣａｓＤＮＡ結合剤としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、さらにＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断酵素またはニッカーゼ活性を有するクラス２Ｃａｓ切断酵素／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａ変異体）、及び切断酵素／ニッカーゼ活性が不活性化されている、クラス２ｄＣａｓＤＮＡ結合剤が挙げられる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ  Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、及びそれらの修飾が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １６３：  １−１３  （２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １３（１１）：  ７２２−３６  （２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，  ６０：３８５−３９７（２０１５）を参照されたい。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、「リボヌクレオプロテイン」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ切断酵素、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤と一緒にされるガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤を標的配列に誘導し、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、そして結合剤が標的配列に結合する。結合剤が切断酵素またはニッカーゼである場合、結合の後に切断またはニッキングが起き得る。
【０１１９】
本開示のいくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物のカーゴは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）であり得るＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤を標的ＤＮＡに誘導するガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸分子上の標的配列に誘導できる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼと結合し、そしてそれによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、リボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などのタイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼ及び同族のｇＲＮＡは対になり得る。各クラス２ＣａｓヌクレアーゼとペアになるｇＲＮＡ足場構造は、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって異なる。
【０１２０】
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、本明細書では互換的に使用され、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを指す。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるように修飾されたＲＮＡを含むことができる。ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）として結合され得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」はそれぞれのタイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して改変または変化を伴うｔｒＲＮＡ配列であり得る。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、「ガイド配列」は、標的配列に相補的であり、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のためにガイドＲＮＡを標的配列に誘導するように機能するガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的配列」または「スペーサー配列」と呼ばれることもある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、長さが２０塩基対であり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短いまたはより長い配列もまたガイドとして使用できる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の度合いは、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％、または少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続するヌクレオチドの領域にわたって１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１つのミスマッチを含み得る。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４つのミスマッチを含み得、ここで、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１〜４のミスマッチを含み得、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含み得、ここで、ガイド配列は、２０ヌクレオチドを含む。
【０１２２】
Ｃａｓタンパク質の核酸基質は二本鎖核酸であるので、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合タンパク質の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖の両方（すなわち、与えられる配列と、配列の逆の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ））を含む。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的」であると言われる場合、ガイド配列は、ガイドＲＮＡを、標的配列の逆の相補体に結合するよう誘導できると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ガイド配列が、標的配列の逆の相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
【０１２３】
標的化配列の長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとコンポーネントによって異なり得る。例えば、様々な細菌種に由来する様々なクラス２Ｃａｓヌクレアーゼは、様々な最適な標的化配列の長さを有する。したがって、標的化配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０ヌクレオチドを超える長さを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化配列の長さは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのガイド配列よりも０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド、長いまたは短い。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ足場は、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するであろう。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８〜２４ヌクレオチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、標的化配列は、１９〜２１ヌクレオチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、標的化配列は、２０ヌクレオチドを含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃｐｆ１  ｓｇＲＮＡ」である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との能動複合体を形成し、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質との能動複合体を形成し、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ  ２０１５を参照されたい。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態はまた、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする核酸、例えば、発現カセットを提供する。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書では、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸であるガイドＲＮＡ発現カセットを指すために使用される。
【０１２６】
修飾されたＲＮＡ
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物などの脂質組成物は、修飾されたＲＮＡを含む修飾された核酸を含む。
【０１２７】
修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡに存在することができる。例えば、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、「修飾された」ＲＮＡと呼ばれ、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりにまたはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在するコンポーネントまたは構成の存在を記載する。いくつかの実施形態において、修飾されたＲＮＡは、非標準のヌクレオシドまたはヌクレオチドによって合成され、本明細書において「修飾された」と呼ばれる。
【０１２８】
修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドは：（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、及び／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（非標準的な核酸塩基によるものを含む）（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置き換え、または部分、キャップ、もしくはリンカーの結合（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する３’末端修飾を含む。修飾されたＲＮＡは、５’末端及び３’末端修飾を含むことができる。修飾されたＲＮＡは、非末端位置に１つ以上の修飾された残基を含むことができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、少なくとも１つの修飾された残基を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾された残基を含む。
【０１２９】
修飾されていない核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによって分解されやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書において記載されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、例えば、細胞内または血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン発現及び放出の誘導（特にインターフェロン）及び細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
【０１３０】
したがって、いくつかの実施形態では、開示されたＬＮＰ組成物中のＲＮＡまたは核酸は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ消化に対する改善された耐性を含む、核酸に増加または増強された安定性を与える少なくとも１つの修飾を含む。本明細書で使用されるとき、「修飾」及び「修飾された」という用語は、本明細書で提供される核酸に関連する場合、好ましくは安定性を増強し、ＲＮＡまたは核酸を、ＲＮＡまたは核酸の野生型または天然に存在するバージョンよりも安定にする（例えば、ヌクレアーゼ消化に耐性にする）少なくとも１つの変更を含む。本明細書で使用されるとき、「安定」及び「安定性」という用語は、本発明の核酸に関連する場合、特にＲＮＡに関して、例えば、通常、そのようなＲＮＡを分解することができるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解に対する耐性の増加または増強を指す。安定性の増加には、例えば、内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞または組織内の条件による加水分解または他の破壊に対する感受性の低下が含まれ得、それにより、標的細胞、組織、対象及び／または細胞質におけるそのようなＲＮＡの滞留が増加または増強される。本明細書で提供される安定化されたＲＮＡ分子は、それらの天然に存在する未修飾の対応物（例えば、野生型バージョンのｍＲＮＡ）と比較してより長い半減期を示す。本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のｍＲＮＡに関連するそのような用語として「修飾」及び「修飾された」という用語によっても企図されるのは、例えば、タンパク質翻訳の開始において機能する配列（例えば、Ｋｏｚａｃコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善または増強する変化である。（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５  （２０）：  ８１２５−４８  （１９８７）。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のＲＮＡまたは核酸は、それをより安定にするために化学的または生物学的修飾を受けている。ＲＮＡへの例示的な修飾には、塩基の枯渇（例えば、欠失による、またはあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換による）または塩基の修飾、例えば、塩基の化学的修飾が含まれる。本明細書で使用されるとき、「化学修飾」という句は、天然に存在するＲＮＡに見られるものとは異なる化学的性質を導入する修飾、例えば、修飾ヌクレオチドの導入などの共有結合修飾（例えば、そのようなＲＮＡ分子には天然で見られないヌクレオチド類似体、またはペンダント基の包含）を含む。
【０１３２】
骨格修飾のいくつかの実施形態において、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸骨格の骨格修飾は、非荷電のリンカーまたは非対称電荷分布の荷電のリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
【０１３３】
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルを含む。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。リン酸基は、ある骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、荷電リン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例としては、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）が挙げられ得る。
【０１３４】
ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物または製剤は、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼまたはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供され、使用され、または投与される。ｍＲＮＡは、５’キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、及びポリアデニンテールのうちの１つ以上を含み得る。ｍＲＮＡは、例えば、核局在化配列をコードするために、またはタンパク質をコードするために代替コドンを使用するために、改変されたオープンリーディングフレームを含み得る。
【０１３５】
開示されたＬＮＰ組成物中のｍＲＮＡは、例えば、分泌されたホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチド、または通常分泌される他の目的のタンパク質をコードし得る。本発明の一実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、そのようなｍＲＮＡの安定性及び／または半減期を改善するか、またはタンパク質産生を改善またはさもなければ促進する化学的または生物学的修飾を任意選択で有し得る。
【０１３６】
さらに、適切な修飾には、コドンが同じアミノ酸をコードするが、野生型バージョンのｍＲＮＡに見られるコドンよりも安定であるような、コドンの１つ以上のヌクレオチドの変化が含まれる。例えば、ＲＮＡの安定性と、より多くのシチジン（Ｃ）及び／またはウリジン（Ｕ）残基との逆相関が実証されており、Ｃ及びＵ残基を欠くＲＮＡは、ほとんどのＲＮａｓｅに対して安定であることが判明している（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，  ２１３１−８  （１９９４））。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列中のＣ及び／またはＵ残基の数は減少する。別の実施形態では、Ｃ及び／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同じまたは関連するアミノ酸をコードする別のコドンで置換することによって減少する。本発明のｍＲＮＡ核酸への企図された修飾には、シュードウリジンの組込みも含まれる。本発明のｍＲＮＡ核酸へのシュードウリジンの組込みは、安定性及び翻訳能力を増強し、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を低下させる可能性がある。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６  （１１）：  １８３３−１８４０  （２００８）を参照されたい。本発明のｍＲＮＡに対する置換及び改変は、当業者に容易に知られている方法によって実施することができる。
【０１３７】
配列内のＣ及びＵ残基の数を減らすことに対する制約は、非翻訳領域と比較して、ｍＲＮＡのコード領域内でより大きくなり得る（すなわち、所望のアミノ酸配列をエンコードするメッセージの機能を保持しながら、メッセージに存在する全てのＣ及びＵ残基を排除することは不可能である可能性がある）。しかしながら、遺伝暗号の縮重は、同じコーディング能力を維持しながら、配列に存在するＣ及び／またはＵ残基の数を減らすことを可能にする機会を提供する（すなわち、どのアミノ酸がコドンにコードされているかに応じて、ＲＮＡ配列の修飾のためのいくつかの異なる可能性が可能であり得る）。
【０１３８】
修飾という用語はまた、例えば、本発明のｍＲＮＡ配列への非ヌクレオチド結合または修飾ヌクレオチドの組込み（例えば、機能的な分泌されたタンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３’及び５’末端の一方または両方への修飾）を含む。そのような修飾には、ｍＲＮＡ配列への塩基の付加（例えば、ポリＡテールまたはより長いポリＡテールの包含）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの変更、ｍＲＮＡと薬剤（例えば、タンパク質または相補的核酸分子）との複合体形成、及びｍＲＮＡ分子の構造を変化させる（例えば、二次構造を形成する）要素の包含が含まれる。
【０１３９】
ポリＡテールは天然のメッセンジャーを安定させると考えられている。したがって、一実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加して、ｍＲＮＡをより安定にすることができる。ポリＡテールは、当該技術分野で認められた様々な技術を使用して付加できる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して、合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １９９６；１４：  １２５２−１２５６）。転写ベクターは、長いポリＡテールをコードすることもできる。さらに、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することで付加できる。一実施形態では、ポリＡテールの長さは、少なくとも約９０、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチドである。一実施形態では、ポリＡテールの長さは、本発明の修飾されたｍＲＮＡ分子の安定性、したがってタンパク質の転写を制御するように調整される。例えば、ポリＡテールの長さはｍＲＮＡ分子の半減期に影響を与える可能性があるため、ポリＡテールの長さを調整して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性レベルを改変し、それによって細胞内のタンパク質発現の経時変化を制御することができる。一実施形態では、安定化されたｍＲＮＡ分子は、（例えば、ヌクレアーゼによる）ｉｎ  ｖｉｖｏ分解に対して十分に耐性があり、その結果、それらは、移送ビヒクルなしで標的細胞に送達され得る。
【０１４０】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、野生型ｍＲＮＡに天然には見られない３’及び／または５’非翻訳（ＵＴＲ）配列を組み込むことによって修飾することができる。一実施形態では、ｍＲＮＡに天然で隣接し、第２の無関係なタンパク質をコードする３’及び／または５’隣接配列を、それを改変するために、治療的または機能的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に組み込むことができる。例えば、安定しているｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）からの３’または５’配列を、センスｍＲＮＡ核酸分子の３’及び／または５’領域に組み込み、センスｍＲＮＡ分子の安定性を高めることができる。例えば、ＵＳ２００３／００８３２７２を参照されたい。
【０１４１】
ｍＲＮＡ修飾のより詳細な説明は、ＵＳ２０１７／０２１０６９８Ａ１の５７〜６８ページに記載されており、その内容は本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
テンプレート核酸
本明細書に開示される組成物及び方法は、テンプレート核酸を含み得る。テンプレートを使用して、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合タンパク質の標的部位またはその近くに核酸配列を変更または挿入することができる。いくつかの実施形態では、方法は、テンプレートを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、単一のテンプレートが提供され得る。他の実施形態において、２つ以上のテンプレートが提供され、編集が２つ以上の標的部位で生じ得るようになる。例えば、異なるテンプレートが、細胞内の単一の遺伝子を編集するため、または細胞内の２つの異なる遺伝子を編集するために提供され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、テンプレートは、相同組換えにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、相同組換えはテンプレート配列またはテンプレート配列の一部の、標的核酸分子中への組込みをもたらすことができる。他の実施形態では、テンプレートは、核酸の切断部位でのＤＮＡ鎖の侵入を含む、相同性指向の修復に使用することができる。いくつかの実施形態において、相同性指向の修復は、編集された標的核酸分子中にテンプレート配列を含むことをもたらし得る。さらに他の実施形態では、テンプレートは、非相同末端結合によって媒介される遺伝子編集において使用され得る。いくつかの実施形態において、テンプレート配列は、切断部位近傍の核酸配列に対して類似性を有さない。いくつかの実施形態において、テンプレートまたはテンプレート配列の一部が組み込まれる。いくつかの実施形態において、テンプレートは隣接する末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、テンプレート配列は、標的細胞の内因性配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなり得る。それはまた、または代替的に、標的細胞の外因性配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなることができる。本明細書で使用されるとき、「内因性配列」という用語は、細胞に固有の配列を指す。「外因性配列」という用語は、細胞に固有ではない配列、または細胞のゲノム内の固有の位置が異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態では、内因性配列は、細胞のゲノム配列であり得る。いくつかの実施形態では、内因性配列は、染色体または染色体外配列であり得る。いくつかの実施形態では、内因性配列は、細胞のプラスミド配列であり得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、テンプレートは、隣接する末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を含むｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、テンプレートは、ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、核酸は、精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載されるような）を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＨＰＬＣベースの方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載されるような）などのクロマトグラフィーベースの方法を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）とＨＰＬＣベースの方法の両方を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）によって精製される。
【０１４７】
化合物または組成物は、必ずしもではないが、一般に、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。「賦形剤」という用語は、本開示の化合物（複数可）、他の脂質コンポーネント（複数可）、及び生物活性剤以外の任意の成分を含む。賦形剤は、組成物に機能的（例えば、薬物放出速度制御）及び／または非機能的（例えば、加工助剤または希釈剤）特性のいずれかを付与し得る。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解性及び安定性に対する賦形剤の効果、及び剤形の性質などの因子に大きく依存するであろう。
【０１４８】
非経口製剤は、典型的には、水溶液または油性の溶液または懸濁液である。製剤が水性である場合、賦形剤は、糖（グルコース、マンニトール、ソルビトールなどを含むがこれらに限定されない）、塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくは３〜９のｐＨ）などであるが、しかしいくつかの用途では、それらは無菌の非水溶液で、または無菌のパイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの適切なビヒクルと組み合わせて使用される乾燥形態として、より適切に製剤化され得る。
【０１４９】
本発明は、列挙される実施形態と組み合わせて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替形、修正形、及び同等物（特定の特徴の同等物を含む）を網羅することが意図されている。
【０１５０】
前述の一般的な説明と詳細な説明、ならびに以下の実施例は、例示的及び説明的なものに過ぎず、本教示を限定するものではない。本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、決して所望の主題を限定すると解釈されるものではない。参照により組み込まれた文献が本明細書で定義された用語と矛盾する場合、本明細書が優先する。特に明記されていない限り、本出願で指定されている全ての範囲はエンドポイントを包含する。
【０１５１】
定義
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに記載しない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（組成物）」への言及は、複数の組成物を含み、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数の細胞を含むなどである。「または」の使用は包括的であり、特に明記しない限り「及び／または」を意味する。
【０１５２】
上述の明細書に特に記載されていない限り、様々なコンポーネントを「含む」と記載する明細書の実施形態は、記載されたコンポーネント「からなる」または「本質的になる」とみなされる。様々なコンポーネント「からなる」と記載する明細書の実施形態はまた、記載されたコンポーネントを「含む」またはそれ「から本質的になる」と企図される。様々なコンポーネント「付近」と記載する本明細書の実施形態はまた、記載されたコンポーネント「で」として企図される。また、様々なコンポーネント「から本質的になる」と記載する明細書の実施形態は、記載されたコンポーネント「からなる」またはそれを「含む」とみなされる（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
【０１５３】
数値範囲は範囲を定義する数を含む。測定値と測定可能値は、有効数字と測定に関連する誤差を考慮して、概算であると理解される。本願で使用されるとき、「約」及び「おおよそ」という用語は、当該技術分野で理解される意味を有し、一方と他方の使用は、必ずしも異なる範囲を意味するわけではない。別途示されない限り、「約」または「おおよそ」などの用語の修飾を含むかまたは含まずに本願で使用される数字は、関連技術分野の当業者によって理解されるように、通常の発散及び／または変動を包含すると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、言及された参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の範囲内の値の範囲を指す。
【０１５４】
本明細書で使用されるとき、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的な接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳動物細胞とナノ粒子が物理的接続を共有するようにされることを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と哺乳動物内に配置された哺乳動物細胞とを接触させることは、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）によって行われてよく、様々な量のナノ粒子組成物を含み得る。さらに、１つを超える哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させてもよい。
【０１５５】
本明細書で使用されるとき、「送達すること」という用語は、成分を目的地に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むナノ粒子組成物を対象に投与すること（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路による）を含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのナノ粒子組成物の投与は、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含み得る。
【０１５６】
本明細書で使用されるとき、「カプセル化効率」とは、ナノ粒子組成物の調製に使用される治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に最初に提供された合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がナノ粒子組成物にカプセル化される場合、カプセル化効率は９７％として与えられ得る。本明細書で使用されるとき、「カプセル化」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉じ込め、囲い込み、または包装を指し得る。
【０１５７】
本明細書で使用されるとき、「生分解性」という用語は、細胞に導入されると、細胞機構（例えば、酵素分解）によって、または細胞が細胞への重大な毒性の影響（複数可）なしに再利用または処分できるコンポーネントへと加水分解によって分解される材料を指すために使用される。特定の実施形態では、生分解性材料の分解によって生成されたコンポーネントは、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症及び／または他の有害作用を誘発しない。いくつかの実施形態では、生分解性材料は酵素的に分解される。代替的に、または付加的に、いくつかの実施形態では、生分解性材料は、加水分解によって分解される。
【０１５８】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ／Ｐ比」は、脂質中の（生理学的ｐＨ範囲内で）イオン化可能な窒素原子対ＲＮＡ中の（例えば、脂質成分とＲＮＡを含むナノ粒子組成物中の）リン酸基のモル比である。
【０１５９】
組成物はまた、１つ以上の化合物の塩を含んでもよい。塩は、薬学的に許容される塩であり得る。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）親化合物が改変される、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されないアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性の塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機溶媒または２つの混合物中の化学量論的な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．  １４１８，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．  Ｈ．  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００８、及びＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  １−１９  （１９７７）に見出され、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
本明細書で使用されるとき、「多分散指数」は、系の粒子サイズ分布の均一性を表す比率である。例えば、０．３未満の小さい値は、狭い粒径分布を示す。いくつかの実施形態では、多分散指数は０．１未満であり得る。
【０１６１】
本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」とは、種（例えば、ＲＮＡ）の細胞への導入を指す。トランスフェクションは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。
【０１６２】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどの１〜２４個の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基である。アルキル基は、環状または非環状であり得る。アルキル基は、分岐または非分岐（すなわち、直鎖状）であり得る。アルキル基はまた、置換または非置換（好ましくは非置換）であり得る。例えば、アルキル基は、本明細書に記載されているように、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホキソ、スルホネート、カルボキシレート、またはチオールを含むがこれらに限定されない１つ以上の基で置換することができる。「低級アルキル」基は、１〜６個（例えば、１〜４個）の炭素原子を含むアルキル基である。
【０１６３】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む脂肪族基を指し、「非置換アルケニル」と「置換アルケニル」の両方を含むものとし、後者はアルケニル基の１つ以上の炭素原子上の水素を置換する置換基を有するアルケニル部分を指す。そのような置換基は、１個以上の二重結合に含まれるかまたは含まれない１個以上の炭素上にあってよい。さらに、そのような置換基には、安定性により禁止である場合を除いて、以下に述べるようなアルキル基について企図される全てのものが含まれる。例えば、１個以上のアルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基により置換され得るアルケニル基が企図される。例示的なアルケニル基としては、はビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）、及び５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
「アルキレン」基は、二価のアルキルラジカルを指し、これは、分岐または非分岐（すなわち、直鎖状）であり得る。上述の一価アルキル基のいずれも、アルキルからの第２の水素原子の引き抜きによってアルキレンに変換することができる。代表的なアルキレンとしては、Ｃ２−４アルキレン及びＣ２−３アルキレンが挙げられる。典型的なアルキレン基としては、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−などが挙げられるが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されていても非置換でもよい。例えば、アルキレン基は、本明細書に記載されているように、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホキソ、スルホネート、スルホンアミド、尿素、アミド、カルバメート、エステル、カルボキシレート、またはチオールを含むがこれらに限定されない１つ以上の基で置換することができる。
【０１６５】
「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、一実施形態では、炭素−炭素三重結合を有さない、二価の、直鎖状または分岐鎖状の、不飽和の非環式ヒドロカルビル基を含む。上述の一価アルケニル基のいずれも、アルケニルからの第２の水素原子の引き抜きによってアルケニレンに変換することができる。代表的なアルケニレンとしては、Ｃ２−６アルケニレンが挙げられる。
【０１６６】
「Ｃｘ−ｙ」という用語は、アルキルまたはアルキレンなどの化学部分とともに使用される場合、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む基を含むことを意味する。例えば、「Ｃｘ−ｙアルキル」という用語は、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む、直鎖状及び分岐鎖状のアルキル及びアルキレン基を含む、置換または非置換の飽和炭化水素基を指す。
【０１６７】
参照による組込み
本明細書で言及または引用されている記事、特許、及び特許出願の内容、ならびに他の全ての文書及び電子的に入手可能な情報は、各々個別の刊行物が参照により具体的かつ個別に組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。出願人は、そのような記事、特許、特許出願、またはその他の物理的及び電子的文書からの全ての資料及び情報をこの出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【実施例】
【０１６８】
【表１】
2022501412.tif 000029
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【０１６９】
一般情報
全ての試薬と溶媒は、商業ベンダーから購入し、受け取ったまま使用するか、引用された手順に従って合成された。全ての中間体及び最終化合物は、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。ＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒまたはＶａｒｉａｎの４００  ＭＨｚの分光計で記録し、ＮＭＲデータは、周囲温度でＣＤＣｌ３中で回収した。化学シフトは、ＣＤＣｌ３（７．２６）と比較した１００万分の１部（ｐｐｍ）で報告される。１Ｈ  ＮＭＲのデータは、化学シフト、多重度（ｂｒ＝ブロード、ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ｍ＝マルチプレット）、結合定数、及び積分として報告される。ＭＳデータは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを備えたＷａｔｅｒｓ  ＳＱＤ２質量分析計で記録された。最終化合物の純度は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）及び蒸発光散乱（ＥＬＳ）検出器を備えたＳＱＤ２質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈクラス液体クロマトグラフィー装置を使用したＵＰＬＣ−ＭＳ−ＥＬＳによって決定された。
【０１７０】
実施例１−化合物１
中間体１ａ：ノニル−８−ブロモオクタノエート
【化１６】
2022501412.tif 000037
ＤＣＭ（５６ｍＬ）中の８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）及びノナン−１−オール（１〜２当量）の溶液に、ＤＩＥＡ（２〜３当量）、ＤＭＡＰ（０．１〜０．２５当量）、及びＥＤＣ・ＨＣｌ（１〜１．５当量）を、１５〜２５℃で少なくとも４時間連続して加えた。完了したら、反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和重曹水溶液及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（０〜３３％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を使用する精製により、所望の生成物（４．５ｇ、１３ｍｍｏｌ、５９％の収率）を透明な油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．１８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６１ （ｍ， ４Ｈ）， １．４３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３１ （ｍ， １８Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７１】
中間体１ｂ：ノニル８−（２−ヒドロキシエチルアミノ）オクタノエート
【化１７】
2022501412.tif 000038
エタノール（ＥｔＯＨ）（１０ｍＬ）中の中間体１ａ（１２ｇ、３４．３５ｍｍｏｌ）及び２−アミノエタノール（２０〜４０当量）の溶液を２０℃で少なくとも１２時間撹拌した。次いで、反応物を濃縮してＥｔＯＨを除去し、水に注ぎ、ＥｔＯＡｃ中に抽出した（３回）。混合有機層をブラインで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の２０〜１００％ＥｔＯＡｃ、続いてＭｅＯＨ）を使用して精製して、所望の生成物（４ｇ、１２ｍｍｏｌ、３５％収率）を黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ） δ ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５６−１．２０ （ｍ， ２４Ｈ）， ０．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７２】
中間体１ｃ：８−ブロモオクタナール
【化１８】
2022501412.tif 000039
ＤＣＭ（７００ｍＬ）中の８−ブロモオクタン−１−オール（４５．１ｍＬ、２６３ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）（１〜２当量）を加えた。１５℃で少なくとも２時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、真空濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の２〜２０％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、所望の生成物（３７．５ｇ、１６３．０ｍｍｏｌ、６２％収率）を無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ９．７７ （ｔ， Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．６３ （ｍ， ２Ｈ）， １．４５ （ｍ， ２Ｈ） １．３４ （ｍ， ４Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７３】
中間体１ｄ：８−ブロモ−１，１−ジオクトキシ−オクタン
【化１９】
2022501412.tif 000040
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の８−ブロモオクタナール（１２．５ｇ、６０．３ｍｍｏｌ）及びオクタン−１−オール（２〜３当量）の溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．１〜０．２当量）及びＮａ２ＳＯ４（２〜３当量）を加えた。反応混合物を１５℃で少なくとも２４時間撹拌した、次いで濾過し、真空濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（１００％石油エーテル）を使用して精製して、所望の生成物（６ｇ、１３．４ｍｍｏｌ、２２％収率）を無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５９ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３−１．２８ （ｍ， ３４Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７４】
化合物１：ノニル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化２０】
2022501412.tif 000041
３：１ＭｅＣＮ／ＣＰＭＥ中（０．１〜０．５Ｍ）の中間体１ｄ（１ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）、中間体１ｂ（０．９〜１．１当量）、Ｋ２ＣＯ３（２〜４当量）、及びＫＩ（０．１〜０．５当量）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を８２℃に加温し、不活性雰囲気下で少なくとも２時間撹拌した。次いで、反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ中に少なくとも２回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の１０〜３３％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、所望の生成物（７００ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、４５％収率）を無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４５−１．２１ （ｍ， ５０Ｈ） ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ６９９．２９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１７５】
実施例２−化合物２
中間体２ａ：１−（８−ブロモ−１−ノノキシ−オクトキシ）ノナン
【化２１】
2022501412.tif 000042
中間体２ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１ｃ及びノナン−１−オールから２４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３ （ｍ， ３２Ｈ）， ０．８９ （６， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７６】
化合物２：８−［８，８−ジ（ノノキシ）オクチル−（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化２２】
2022501412.tif 000043
化合物２は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体２ａから５４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４６−１．２１ （ｍ， ５４Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ７２７．０１ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１７７】
実施例３−化合物３
中間体３ａ：１−（８−ブロモ−１−デコキシ−オクトキシ）デカン
【化２３】
2022501412.tif 000044
中間体３ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１ｃ及びデカン−１−オールから２４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３ （ｍ， ３６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１７８】
化合物３：ノニル８−［８，８−ジデコキシオクチル（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化２４】
2022501412.tif 000045
化合物３は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体３ａから２８％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４６−１．２０ （ｍ， ５８Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ７５５．０４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１７９】
実施例４−化合物４
中間体４ａ：１０−ブロモオクタナール
【化２５】
2022501412.tif 000046
中間体４ａは、中間体１ｃに採用された方法を使用して、１０−ブロモオクタノールから５５％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ９．７７ （ｓ， １Ｈ）， ３．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６３ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３０ （ｍ， ８Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８０】
中間体４ｂ：１０−ブロモ−１，１−ジヘプトキシ−デカン
【化２６】
2022501412.tif 000047
中間体４ｂは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体４ａ及びヘプタン−１−オールから３２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３ （ｍ， ２８Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８１】
化合物４：ノニル８−［１０，１０−ジヘプトキシデシル（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化２７】
2022501412.tif 000048
化合物４は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体４ｂから１９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ４Ｈ）， ２．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５９ （ｍ， １０Ｈ）， １．４４−１．２２ （ｍ， ５０Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９９．５３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１８２】
実施例５−化合物５
中間体５ａ：１０−ブロモ−１，１−ジヘプトキシ−デカン
【化２８】
2022501412.tif 000049
中間体５ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体４ａ及びオクタン−１−オールから３４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３ （ｍ， ３２ Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８３】
化合物５：８−［１０，１０−ジオクトキシデシル（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化２９】
2022501412.tif 000050
化合物５は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体５ａから２７％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５９ （ｍ， １０Ｈ）， １．４７−１．２５ （ｍ， ５４Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＵＰＬＣ−ＭＳ−ＥＬＳ： ｒ．ｔ． ＝ ６．５８分， ７２７．５４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１８４】
実施例６−化合物６
中間体６ａ：１０−ブロモ−１，１−ビス（ノニルオキシ）デカン
【化３０】
2022501412.tif 000051
中間体６ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体４ａ及びノナン−１−オールから４１％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， ６Ｈ）， １．４２−１．２８ （ｍ， ３６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８５】
化合物６：８−［１０，１０−ジ（ノノキシ）デシル−（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化３１】
2022501412.tif 000052
化合物６は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体６ａから４１％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４６−１．２４ （ｍ， ５８Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ７５５．７１ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１８６】
実施例７−化合物７
中間体７ａ：８−ブロモ−１，１−ビス（ヘプチルオキシ）オクタン
【化３２】
2022501412.tif 000053
中間体７ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１ｃ及びヘプタン−１−オールから３９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３２ （ｍ， ２４Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８７】
化合物７：ノニル８−（（８，８−ビス（ヘプチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化３３】
2022501412.tif 000054
化合物７は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体７ａから２２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６０ − ３．４８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．５， ６．３ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ − １．５２ （ｍ， １０Ｈ）， １．４８−１．１９ （ｍ， ４６Ｈ）， ０．８８ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ６７１．６６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１８８】
実施例８−化合物８
中間体８ａ：８−ブロモ−１，１−ビス（ヘキシルオキシ）オクタン
【化３４】
2022501412.tif 000055
中間体８ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１ｃ及びヘキサン−１−オールから３８％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３５ （ｍ， ２０Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１８９】
化合物８：ノニル８−（（８，８−ビス（ヘキシルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化３５】
2022501412.tif 000056
化合物８は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体８ａから１３％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６０ − ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４７ − １．１９ （ｍ， ４２Ｈ）， ０．８８ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ６４３．５８ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１９０】
実施例９−化合物９
中間体９ａ：９−ブロモノナナール
【化３６】
2022501412.tif 000057
中間体９ａは、中間体１ｃに採用された方法を使用して、９−ブロモオクタノールから４０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ９．７０ （ｔ， Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３６ （ｍ， ２Ｈ）， １．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ２Ｈ）， １．３６ （ｍ， ２Ｈ）， １．２６ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１９１】
中間体９ｂ：９−ブロモ−１，１−ビス（オクチルオキシ）ノナン
【化３７】
2022501412.tif 000058
中間体９ｂは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体９ａ及びオクタン−１−オールから４４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８６ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３１ （ｍ， ３０Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１９２】
化合物９：ノニル８−（（９，９−ビス（オクチルオキシ）ノニル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化３８】
2022501412.tif 000059
化合物９は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体９ｂから１７％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ − ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４８ − １．１９ （ｍ， ５２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ７１３．５２ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１９３】
実施例１０−化合物１０
中間体１０ａ：７−ブロモヘプタナール
【化３９】
2022501412.tif 000060
中間体１０ａは、中間体１ｃに採用された方法を使用して、７−ブロモヘプタノールから３５％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ９．７７ （ｓ， １Ｈ）， ３．４１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｍ， ２Ｈ）， １．８７ （ｍ， ２Ｈ）， １．６５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４７ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （ｍ， ２Ｈ） ｐｐｍ．
【０１９４】
中間体１０ｂ：１−（（７−ブロモ−１−（オクチルオキシ）ヘプチル）オキシ）オクタン
【化４０】
2022501412.tif 000061
中間体１０ｂは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１０ａ及びオクタン−１−オールから４２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， ６Ｈ）， １．３３ （ｍ， ２６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０１９５】
化合物１０：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化４１】
2022501412.tif 000062
化合物１０は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体１０ｂから１９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９ − ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｍ， １０Ｈ）， １．４７ − １．２１ （ｍ， ４８Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ６８５．７５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１９６】
実施例１１−化合物１１
中間体１１ａ：２−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）アミノ）エタン−１−オール
【化４２】
2022501412.tif 000063
ＤＣＭ（２４０ｍＬ）中の中間体１ｄ（２４ｇ、１１５．８８ｍｍｏｌ）及びオクタン−１−オール（２〜４当量）の溶液に、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．１〜０．３当量）及びＮａ２ＳＯ４（２〜３当量）を加えた。混合物は２５℃で少なくとも１２時間撹拌した。完了したら、反応混合物を減圧濃縮してＤＣＭを除去した。この残渣を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、生成物を無色の油状物（２５ｇ、４８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６１ − ３．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７５ − ２．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９７ （ｄ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．５８ − １．３５ （ｍ， ８Ｈ）， １．３４ − １．０１ （ｍ， ２７Ｈ）， ０．９３ − ０．７２ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ．ＭＳ： ４３０．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１９７】
中間体１１ｂ：ヘプチル１０−ブロモデカノエート
【化４３】
2022501412.tif 000064
中間体１１ｂは、中間体１ａに採用された方法を使用して、１０−ブロモデカン酸とヘプタン−１−オールから３２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８３ − １．６８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５ （ｄ， Ｊ ＝ １４．３ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２２ （ｍ， １６Ｈ）， ０．８６ − ０．７８ （ｍ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０１９８】
化合物１１：ヘプチル１０−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）デカノエート
【化４４】
2022501412.tif 000065
化合物１１は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１１ｂから１９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６７ − ３．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７０ （ｓ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｓ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ − １．４４ （ｍ， １５Ｈ）， １．２９ （ｍ， ４６Ｈ）， ０．９４ − ０．８１ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９９．３５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０１９９】
実施例１２−化合物１２
中間体１２ａ：デシル７−ブロモヘプタノエート
【化４５】
2022501412.tif 000066
中間体１２ａは、中間体１ａに採用された方法を使用して、７−ブロモヘプタン酸とデカン−１−オールから２６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．０９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９６ − １．８３ （ｍ， ２Ｈ）， １．７０ − １．５７ （ｍ， ４Ｈ）， １．４９ （ｍ， ２Ｈ）， １．４４ − １．２２ （ｍ， １６Ｈ）， ０．９７ − ０．８５ （ｍ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０２００】
化合物１２：デシル７−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ヘプタノエート
【化４６】
2022501412.tif 000067
化合物１２は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１２ａから５６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６０ − ３．５１ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５５ − ２．４１ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ − １．５１ （ｍ， １０Ｈ）， １．５１ − １．２０ （ｍ， ４９Ｈ）， ０．９４ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９９．５２ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２０１】
実施例１３−化合物１３
中間体１３ａ：ウンデシル６−ブロモヘキサノエート
【化４７】
2022501412.tif 000068
中間体１３ａは、中間体１ａに採用された方法を使用して、６−ブロモヘキサン酸とウンデカン−１−オールから２２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８７ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．２， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７０ − １．５７ （ｍ， ４Ｈ）， １．５３ − １．４２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３８ − １．１９ （ｍ， １６Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０２０２】
化合物１３：ウンデシル６−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ヘキサノエート
【化４８】
2022501412.tif 000069
化合物１３は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１３ａから６４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６０ − ３．５２ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ （ｑ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７０ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４０ − １．１７ （ｍ， ４５Ｈ）， ０．９３ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９９．３１ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２０３】
実施例１４−化合物１４
中間体１４ａ：ドデシル５−ブロモペンタノエート
【化４９】
2022501412.tif 000070
中間体１４ａは、中間体１ａで採用された方法を使用して、５−ブロモペンタン酸及びドデカン−１−オールから２１％の収率で合成された１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．００ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８３ （ｍ， ２Ｈ）， １．７１ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３１ − １．１３ （ｍ， １８Ｈ）， ０．８５ − ０．７８ （ｍ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０２０４】
化合物１４：ドデシル５−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ペンタノエート
【化５０】
2022501412.tif 000071
化合物１４は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１４ａから６２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６３ − ３．４９ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５８ − ２．４４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６８ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４０ − １．１９ （ｍ， ４７Ｈ）， ０．９４ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９９．４８ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２０５】
実施例１５−化合物１５
中間体１５ａ：ヘプチル８−ブロモオクタノエート
【化５１】
2022501412.tif 000072
中間体１５ａは、中間体１ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及びヘプタン−１−オールから１５％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．６３ − １．５０ （ｍ， ４Ｈ）， １．４２ − １．１３ （ｍ， １４Ｈ）， ０．８７ − ０．７７ （ｍ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０２０６】
化合物１５：ヘプチル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化５２】
2022501412.tif 000073
化合物１５は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１５ａから６４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６２ − ３．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４０ − １．１９ （ｍ， ４３Ｈ）， ０．８８ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６７１．８４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２０７】
実施例１６−化合物１６
中間体１６ａ：（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル８−ブロモオクタノエート
【化５３】
2022501412.tif 000074
中間体１６ａは、中間体１ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及び（Ｚ）−ノン−２−エン−１−オールから２６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ５．７０ − ５．５８ （ｍ， １Ｈ）， ５．５８ − ５．４７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．９， １．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０９ （ｍ， ２Ｈ）， １．８５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６７ − １．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２ − １．０９ （ｍ， １３Ｈ）， ０．９４ − ０．８０ （ｍ， ３Ｈ） ｐｐｍ．
【０２０８】
化合物１６：（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化５４】
2022501412.tif 000075
化合物１６は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１６ａから５９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ５．７０ − ５．５８ （ｍ， １Ｈ）， ５．５２ （ｍ， １Ｈ）， ４．６２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．９， １．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６４ − ３．４８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０９ （ｍ， ２Ｈ）， １．６８ − １．４１ （ｍ， １２Ｈ）， １．４１ − １．１８ （ｍ， ４１Ｈ）， ０．９６ − ０．８１ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ６９７．３３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］． ＭＳ： ６９７．３３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２０９】
実施例１７−化合物１７
中間体１７ａ：ウンデカン−３−イル８−ブロモオクタノエート
【化５５】
2022501412.tif 000076
中間体１７ａは、中間体１ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及びウンデカン−３−オールから５０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．７４ （ｍ， １Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８５ − １．６７ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ − １．０９ （ｍ， ２５Ｈ）， ０．８９ − ０．７４ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ．
【０２１０】
化合物１７：ウンデカン−３−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化５６】
2022501412.tif 000077
化合物１７は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体１７ａから６５％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８０ （ｍ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ − １．４０ （ｍ， １６Ｈ）， １．４０ − １．１７ （ｍ， ４５Ｈ）， ０．８７ （ｍ， １２Ｈ） ｐｐｍ． ＭＳ： ７２７．３４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１１】
実施例１８−化合物１８
化合物１８：ヘプタデカン−９−イル８−（（２−ヒドロキシエチル）（８−（ノニルオキシ）−８−オキソオクチル）アミノ）オクタノエート
【化５７】
2022501412.tif 000078
化合物１８は、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１８，  ２６，  １５０９−１５１９（化合物５）及びＵＳ２０１７／０２１０６９８Ａ１（化合物１８）に記載の方法に従って合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８６ （ｍ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｂｒ ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７５ − ２．３９ （ｂｒ ｍ， ６Ｈ）， ２．２８ （ｍ， ４Ｈ）， １．６１ （ｍ， ６Ｈ）， １．４９ （ｍ， ８Ｈ）， １．３８ − １．２０ （ｍ， ４９Ｈ）， ０．８７ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ；ＭＳ： ７１１ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１２】
実施例１９−化合物１９
化合物１９：３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ））−カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート
【化５８】
2022501412.tif 000079
化合物１９は、ＷＯ２０１５／０９５３４０Ａｌ（実施例１３）に記載の方法に従って合成された。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ） δ ５．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．５６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ６Ｈ）， ２．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０５ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．９２ （ｍ， ２Ｈ）， １．８４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３０ （ｍ， ３４Ｈ）， １．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ６Ｈ）， ０．８８ （ｍ， ９Ｈ） ｐｐｍ；ＭＳ： ８５３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１３】
実施例２０−化合物２０
中間体２０ａ：７−ブロモ−１，１−ビス（ヘプチルオキシ）ヘプタン
【化５９】
2022501412.tif 000080
中間体２０ａは、中間体１ｄに採用された方法を使用して、中間体１０ａ及びヘプタン−１−オールから２４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．７７ （ｔ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．４４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．３， １．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ２５．０， ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９３ − １．７９ （ｍ， ４Ｈ）， １．７１ − １．５３ （ｍ， ５Ｈ）， １．５１ − １．２９ （ｍ， ９Ｈ）．
【０２１４】
化合物２０：ノニル８−（（７，７−ビス（ヘプチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化６０】
2022501412.tif 000081
化合物２０は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体２０ａから６０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ５．９ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ − １．４１ （ｍ， １５Ｈ）， １．４１ − １．１９ （ｍ， ４０Ｈ）， ０．９６ − ０．８１ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６５７．２ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１５】
実施例２１−化合物２１
中間体２１ａ：デカン−２−イル８−ブロモオクタノエート
【化６１】
2022501412.tif 000082
ＤＣＭ（０．４Ｍ）中の８−ブロモオクタン酸（２．０ｇ、１．０当量）を含む溶液に、デカン−２−オール（１．０当量）、ＤＭＡＰ（０．２当量）、Ｅｔ３Ｎ（３．５当量）、及びＥＤＣＩ（１．２当量）を加えた。反応物を室温で１６８時間撹拌した。完了したら、完了したら、水とＤＣＭを加えることにより反応をクエンチした。有機層を１Ｍ  ＨＣｌで１回及び５％ＮａＨＣＯ３で１回洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。カラムによる精製（ＥｔＯＡｃ／ｈｅｘ）により、生成物を無色の油状物として得た（４８５ｍｇ、１２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．９７ − ４．８２ （ｍ， １Ｈ）， ３．５３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７６ （ｄｑ， Ｊ ＝ ７．８， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ − １．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５１ − １．４０ （ｍ， ３Ｈ）， １．３７ − １．２３ （ｍ， １５Ｈ）， １．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９３ − ０．８４ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２１６】
化合物２１：デカン−２−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化６２】
2022501412.tif 000083
化合物２０は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２１ａから２９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８９ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １２．１， ７．４， ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６２ − ３．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １６．９， ６．２ Ｈｚ， ４４Ｈ）， １．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９５ − ０．８２ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７１３．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１７】
実施例２２−化合物２２
中間体２２ａ：６−ブロモヘキシルウンデカノエート
【化６３】
2022501412.tif 000084
ＤＣＭ（０．２Ｍ）中のウンデカン酸（５ｇ、１．０当量）、６−ブロモヘキサン−１−オール（１．０当量）、ＥＤＣＩ（１．０当量）、ＤＭＡＰ（０．１６当量）、及びＤＩＰＥＡ（３．０当量）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで混合物を不活性雰囲気下で２０℃で５時間撹拌した。完了したら、反応混合物を減圧濃縮してＤＣＭを除去した。この残渣をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。カラムによる精製（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、生成物を無色の油状物として得た（２．３ｇ、２５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．００ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ − １．７４ （ｍ， ２Ｈ）， １．６３ − １．５０ （ｍ， ４Ｈ）， １．４５ − １．３６ （ｍ， ２Ｈ）， １．３６ − １．２８ （ｍ， ２Ｈ）， １．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．９ Ｈｚ， １５Ｈ）， ０．８６ − ０．７８ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２１８】
化合物２２：６−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）ヘキシルウンデカノエート
【化６４】
2022501412.tif 000085
化合物２２は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２２ａから６３％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ − １．０５ （ｍ， ６２Ｈ）， ０．９５ − ０．７９ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９９．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２１９】
実施例２３−化合物２３
中間体２３ａ：８−ブロモオクチルノナノエート
【化６５】
2022501412.tif 000086
中間体２３ａは、中間体２２ａで採用された方法を使用して、ノナン酸及び８−ブロモオクタン−１−オールから１９％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３４ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｐ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．４２ − １．１０ （ｍ， １９Ｈ）， ０．８７ − ０．７４ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２２０】
化合物２３：８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクチルノナノエート
【化６６】
2022501412.tif 000087
化合物２３は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２３ａから３２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５６ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６８ − １．１７ （ｍ， ６５Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９９．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２２１】
実施例２４−化合物２４
中間体２４ａ：１０−ブロモデシルヘプタノエート
【化６７】
2022501412.tif 000088
中間体２４ａは、中間体２２ａで採用された方法を使用して、ヘプタン酸及び１０−ブロモデカン−１−オールから２６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８５ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．５， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６１ （ｐ， Ｊ ＝ ７．７， ７．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．４８ − １．２３ （ｍ， １８Ｈ）， ０．９３ − ０．８４ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２２２】
化合物２４：１０−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）デシルヘプタノエート
【化６８】
2022501412.tif 000089
化合物２４は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２４ａから４０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６６ − ３．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ − ０．９８ （ｍ， ６３Ｈ）， ０．９７ − ０．７０ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９９．６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２２３】
実施例２５−化合物２５
中間体２５ａ：８−ブロモ−１，１−ビス（１−メチルヘプトキシ）オクタン
【化６９】
2022501412.tif 000090
オクタン−２−オール（１５当量）中の８−ブロモオクタナール（１００ｍｇ、１．０当量）の溶液に、硫酸（０．１当量）を加えた。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。完了したら、反応混合物を氷冷水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機層を減圧濃縮し、カラム（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、生成物を無色の油状物として得た（２０ｍｇ、９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ５．６， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６４ − ３．４９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｐ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６０ − １．４１ （ｍ， ４Ｈ）， １．４１ − １．１４ （ｍ， ２４Ｈ）， １．１０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．２， ２．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８１ （ｔｄ， Ｊ ＝ ６．８， ２．５ Ｈｚ， ６Ｈ）．
【０２２４】
化合物２５：ノニル８−［８，８−ビス（１−メチルヘプトキシ）オクチル−（２−ヒドロキシエチル）アミノ］オクタノエート
【化７０】
2022501412.tif 000091
化合物２５は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体２５ａから合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４６ − ４．４０ （ｍ， １Ｈ）， ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｔｑ， Ｊ ＝ １１．４， ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６１ − １．４２ （ｍ， ７Ｈ）， １．４１ − １．１５ （ｍ， ３９Ｈ）， １．１０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．２， ２．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９９．７ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２２５】
実施例２６−化合物２６
化合物２６：ノニル８−（（２−ヒドロキシエチル）（１０−オクチルオクタデシル）アミノ）オクタノエート
【化７１】
2022501412.tif 000092
化合物２６は、ＷＯ２０１７／０４９２４５Ａ３（実施例１５３）に記載の方法に従って合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．５４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ５Ｈ）， １．３７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．３３ − １．０７ （ｍ， ６３Ｈ）， ０．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９４．６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２２６】
実施例２７−化合物２７
中間体２７ａ：オクタン−２−イル８−ブロモオクタノエート
【化７２】
2022501412.tif 000093
ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の８−ブロモオクタン酸（１０ｇ、１．１当量）とオクタン−２−オール（１．０当量）の混合物に、ＥＤＣＩ（１．１当量）、ＤＭＡＰ（０．１当量）、及びＤＩＰＥＡ（３．０当量）を、不活性雰囲気下、０℃で一度に加えた。混合物を１５℃で少なくとも１２時間撹拌した。完了したら、反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色の油状物として得た（４．１ｇ、３０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．９０ − ４．７６ （ｍ， １Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｐ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６０ − １．４６ （ｍ， ３Ｈ）， １．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １５．５， ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３１ − １．１６ （ｍ， １２Ｈ）， １．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８６ − ０．７７ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２２７】
化合物２７：オクタン−２−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化７３】
2022501412.tif 000094
化合物２７は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２７ａから４５％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．９３ − ４．８４ （ｍ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ５２．０ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ − １．４０ （ｍ， １７Ｈ）， １．３９ − １．２１ （ｍ， ３７Ｈ）， １．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９９ − ０．６７ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６８５．６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２２８】
実施例２８−化合物２８
中間体２８ａ：ノナン−３−イル８−ブロモオクタノエート
【化７４】
2022501412.tif 000095
中間体２８ａは、中間体２７ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及びノナン−３−オールから３１％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．７５ （ｐ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｐ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５５ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．９， ８．２， ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １４．２， ７．１， ３．２ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．３６ （ｄｔ， Ｊ ＝ １０．１， ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３２ − １．１２ （ｍ， １２Ｈ）， ０．８８ − ０．７６ （ｍ， ６Ｈ）．
【０２２９】
化合物２８：ノナン−３−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化７５】
2022501412.tif 000096
化合物２８は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２８ａから５３％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ６．９， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８０ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８１ （ｓ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ − １．４０ （ｍ， １８Ｈ）， １．４０ − １．０２ （ｍ， ４２Ｈ）， ０．９５ − ０．７３ （ｍ， １２Ｈ）． ＭＳ： ６９９．３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３０】
実施例２９−化合物２９
中間体２９ａ：ペンチル８−ブロモオクタノエート
【化７６】
2022501412.tif 000097
中間体２９ａは、中間体２７ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及びペンタン−１−オールから４７％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ３．９９ （ｔｄ， Ｊ ＝ ６．８， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｔｄ， Ｊ ＝ ６．８， １．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８４ − １．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．４７ − １．３３ （ｍ， ２Ｈ）， １．２６ （ｑｔ， Ｊ ＝ ５．０， １．８ Ｈｚ， ８Ｈ）， ０．８６ − ０．８０ （ｍ， ３Ｈ）．
【０２３１】
化合物２９：ペンチル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化７７】
2022501412.tif 000098
化合物２９は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体２９ａから５８％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ３８．０ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．５， ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ （ｓ， ４Ｈ）， １．６７ − １．４１ （ｍ， １４Ｈ）， １．４１ − １．１２ （ｍ， ３７Ｈ）， １．０２ − ０．７６ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６４３．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３２】
実施例３０−化合物３０
中間体３０ａ：ヘプタン−３−イル８−ブロモオクタノエート
【化７８】
2022501412.tif 000099
中間体３０ａは、中間体２７ａに採用された方法を使用して、８−ブロモオクタン酸及びヘプタン−３−オールから４７％の収率で合成された。
【０２３３】
化合物３０：ヘプタン−３−イル８−（（８，８−ビス（オクチルオキシ）オクチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化７９】
2022501412.tif 000100
化合物３０は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体１１ａ及び中間体３０ａから６６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ６．８， ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ５３．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７１ （ｓ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８３ − １．４４ （ｍ， １７Ｈ）， １．３０ （ｄｑ， Ｊ ＝ １８．１， ３．８， ３．２ Ｈｚ， ３７Ｈ）， １．０２ − ０．６９ （ｍ， １２Ｈ）． ＭＳ： ６７１．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３４】
実施例３１−化合物３１
中間体３１ａ：２−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）エタン−１−オール
【化８０】
2022501412.tif 000101
ＥｔＯＨ（２２ｍＬ）中の中間体１０ｂ（１５ｇ、１．０当量）の溶液に、２−アミノエタノール（３０当量）を加えた。混合物を１５℃で１２時間撹拌した。完了したら、反応物を減圧濃縮して残渣を得、これをカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を濃縮した後、得られた残渣をＭｅＣＮで再構成し、ヘキサンで３回抽出した。合わせたヘキサン層を濃縮して、生成物を無色の油状物として得た（１０．５５ｇ、７３％収率）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６８ − ３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８２ − ２．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ − １．４５ （ｍ， ８Ｈ）， １．４５ − １．１９ （ｍ， ２６Ｈ）， ０．９６ − ０．８４ （ｍ， ６Ｈ）．
【０２３５】
化合物３１：ヘプチル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化８１】
2022501412.tif 000102
化合物３１は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体３１ａ及び中間体１５ａから６８％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｄ， Ｊ ＝ １３５．２ Ｈｚ， ６Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５９ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ ２１．１， １４．３， ６．８ Ｈｚ， １５Ｈ）， １．４４ − １．０２ （ｍ， ４０Ｈ）， ０．８８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．０， ２．９ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６５７．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３６】
実施例３２−化合物３２
化合物３２：オクタン−２−イル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化８２】
2022501412.tif 000103
化合物３２は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体３１ａ及び中間体２７ａから６４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８９ （ｈ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．８ Ｈｚ， ５Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．８Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．０７ − ２．３２ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４０ − １．２２ （ｍ， ３８Ｈ）， １．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６７１．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３７】
実施例３３−化合物３３
化合物３３：ノナン−３−イル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化８３】
2022501412.tif 000104
化合物３３は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体３１ａ及び中間体２８ａから６０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８１ （ｐ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８９ − ２．４０ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５７ （ｄｔｔ， Ｊ ＝ ２１．７， １４．５， ６．４ Ｈｚ， １４Ｈ）， １．４１ − １．０８ （ｍ， ３５Ｈ）， ０．８８ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．１， ２．８ Ｈｚ， １０Ｈ）． ＭＳ： ６８５．７ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３８】
実施例３４−化合物３４
化合物３４：ペンチル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化８４】
2022501412.tif 000105
化合物３４は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体３１ａ及び中間体２９ａから７２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９４ − ２．４０ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８３ − １．４３ （ｍ， １５Ｈ）， １．４２ − １．０９ （ｍ， ３６Ｈ）， ０．８９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．２， ７．０ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６２９．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２３９】
実施例３５−化合物３５
化合物３５：ヘプタン−３−イル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−ヒドロキシエチル）アミノ）オクタノエート
【化８５】
2022501412.tif 000106
化合物３５は、化合物１１に採用された方法を使用して、中間体３１ａ及び中間体３０ａから７３％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８５ − ４．７８ （ｍ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８６ − ２．３７ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５３ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １４．４， ７．４， ５．６ Ｈｚ， １６Ｈ）， １．４３ − １．０８ （ｍ， ３７Ｈ）， ０．９７ − ０．８０ （ｍ， １２Ｈ）． ＭＳ： ６５７．６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４０】
実施例３６−化合物３６
化合物３６：ノニル８−（（２−アミノエチル）（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化８６】
2022501412.tif 000107
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の化合物１０（５．１ｇ、１．０当量）及びＴＥＡ（１．３５ｍＬ、１．３当量）の混合物に、不活性雰囲気下、０℃でＭｓＣｌ（７２１ｕＬ、１．２５当量）を滴下した。混合物を１５℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣは出発物質が完全に消費されたことを示した。反応物をＨ２Ｏで希釈し、ＤＣＭで２回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濾液を減圧濃縮して、残渣を得た。
【０２４１】
得られた粗メシレートをＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解した後、不活性雰囲気下、１５℃でＮａＮ３（２．７８ｇ、５．０当量）を一度に加えた。混合物を１００℃で４時間撹拌した。ＴＬＣは完全な変位を示した。反応混合物をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで２回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濾液を減圧濃縮して、残渣を得た。
【０２４２】
得られた粗アジドをＥｔＯＨ（５ｍＬ）に溶解した後、不活性雰囲気下でＰｄ／Ｃ（１ｇ、１０％ｗ／ｗ）を加えた。懸濁液を真空下で脱気し、Ｈ２で数回パージした。混合物を、Ｈ２（１５ｐｓｉ）下、１５℃で１２時間撹拌した。完了したら、反応混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮して、残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより３回精製した後、単離した物質をＭｅＣＮ及びヘキサンで洗浄して、生成物を黄色の油状物として得た（２．３ｇ、３９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．８０ （ｓ， ３Ｈ）， ４．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．５， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ − ２．３６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６２ − １．３３ （ｍ， １５Ｈ）， １．３３ − １．０４ （ｍ， ４５Ｈ）， ０．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６８３．６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４３】
実施例３７−化合物３７
中間体３７ａ：ノニル８−（（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）オクタノエート
【化８７】
2022501412.tif 000108
ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中のノニル８−ブロモオクタノエート（１０ｇ、１．０当量）及び３−アミノプロパン−１−オール（６６．２２ｍＬ、３０当量）の混合物を２０℃で１２時間撹拌した。完了したら、反応混合物を減圧濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物（１０ｇ）を無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．０７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８４ （ｄｔ， Ｊ ＝ １０．５， ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．４３ （ｑ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ６Ｈ）， ２．８９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０３ （ｓ， １０Ｈ）， １．６６ （ｄｔ， Ｊ ＝ ２９．５， ６．６ Ｈｚ， １４Ｈ）， １．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３１ （ｄ， Ｊ ＝ １４．６ Ｈｚ， １６Ｈ）， ０．９０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）．
【０２４４】
化合物３７：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）オクタノエート
【化８８】
2022501412.tif 000109
化合物３７は、化合物１に採用された方法を使用して、中間体１ｂ及び中間体３７ａから３０％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６０ − ３．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．６８ − ２．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４７ − ２．３８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６１ （ｄｔ， Ｊ ＝ ２１．４， ７．２ Ｈｚ， ２１Ｈ）， １．３１ （ｄｔ， Ｊ ＝ １５．０， ４．１ Ｈｚ， ５１Ｈ）， ０．９０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９８．７ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４５】
実施例３８−化合物３８
化合物３８：ノニル８−（（３−アミノプロピル）（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化８９】
2022501412.tif 000110
化合物３８は、化合物３６に採用された方法を使用して、中間体３７から合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．５， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７７ （ｑ， Ｊ ＝ ５．２， ４．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３ − ２．３１ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５４ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ ２８．３， １３．８， ６．７ Ｈｚ， １２Ｈ）， １．４３ − １．１１ （ｍ， ４９Ｈ）， ０．８１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ６９７．８ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４６】
実施例３９−化合物３９
化合物３９：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−（（メチルカルバモイル）オキシ）エチル）アミノ）オクタノエート
【化９０】
2022501412.tif 000111
トルエン（０．１Ｍ）中の化合物１０（１．０当量）の混合物に、メチルイソシアネート（１．４当量）を加えた。反応物を２３℃で２４時間、続いて６０℃で４８時間撹拌した。完了したら、反応物を水で希釈し、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物（３３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１９ （ｓ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｄｐ， Ｊ ＝ ２１．１， ７．０ Ｈｚ， １３Ｈ）， １．３１ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ２３．５， １２．５， ５．９ Ｈｚ， ４６Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４２．７ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４７】
実施例４０−化合物４０
化合物４０：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（３−（（メチルカルバモイル）オキシ）プロピル）アミノ）オクタノエート
【化９１】
2022501412.tif 000112
【０２４８】
化合物４０は、化合物３９に採用された方法を使用して、中間体３７から３４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ − ３．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．３７ （ｓ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５８ （ｄｐ， Ｊ ＝ ２１．２， ７．０Ｈｚ， １３Ｈ）， １．３０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １７．９， １１．６， ５．７ Ｈｚ， ４９Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７５６．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２４９】
実施例４１−化合物４１
化合物４１：ノニル８−（（２−アセトアミドエチル）（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化９２】
2022501412.tif 000113
ＤＣＭ（０．２Ｍ）中の化合物３６（１．０当量）の混合物に、ＴＥＡ（１．１当量）を加え、０℃に冷却した。塩化アセチル（１．０４当量）を滴下し、混合物を４時間撹拌した。完了したら、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色の油状物として得た（５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ − ３．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３５ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ４８．６ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９８ （ｓ， ３Ｈ）， １．６６ − １．４１ （ｍ， １５Ｈ）， １．４１ − １．２０ （ｍ， ４８Ｈ）， ０．９０ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４０．９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５０】
実施例４２−化合物４２
化合物４２：ノニル８−（（３−アセトアミドプロピル）（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化９３】
2022501412.tif 000114
化合物４２は、化合物４１に採用された方法を使用して、中間体３８から５１％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ （ｑ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４６ − ２．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ （ｓ， ３Ｈ）， １．６８ − １．５０ （ｍ， １２Ｈ）， １．４４ （ｈ， Ｊ ＝ ６．９， ６．１ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．３９ − １．２１ （ｍ， ４５Ｈ）， ０．９２ − ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４２．７ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５１】
実施例４３−化合物４３
化合物４３：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（３−（（メトキシカルボニル）アミノ）プロピル）アミノ）オクタノエート
【化９４】
2022501412.tif 000115
ＤＣＭ（０．２Ｍ）及びＴＥＡ（１．１当量）中の化合物３８（１．０当量）の混合物を、０℃に冷却した。クロロギ酸メチル（１．１当量）を滴下し、混合物を４時間撹拌した。完了したら、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色の油状物として得た（３１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２６ （ｑ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ４４．１ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６８ − １．５０ （ｍ， １３Ｈ）， １．５０ − １．２０ （ｍ， ４９Ｈ）， ０．９３ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７５６．０ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５２】
実施例４４−化合物４４
化合物４４：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−（（メトキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノ）オクタノエート
【化９５】
2022501412.tif 000116
化合物４４は、化合物４３に採用された方法を使用して、中間体３６から５６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５８ − ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２１ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４４ （ｄ， Ｊ ＝ ４９．２ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６５ − １．５０ （ｍ， １１Ｈ）， １．４８ − １．１６ （ｍ， ５２Ｈ）， ０．９１ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４２．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５３】
実施例４５−化合物４５
化合物４５：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−（３−メチルウレイド）エチル）アミノ）オクタノエート
【化９６】
2022501412.tif 000117
トルエン（０．０２Ｍ）中の化合物３６（１．０当量）の混合物に、メチルイソシアネート（１．４当量）を加えた。反応物を２３℃で４時間撹拌した。完了したら、反応物を水で希釈し、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物（２３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ５．２０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２７ （ｄ， Ｊ ＝ １８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ５１．５ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ − １．４０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４０ − １．１９ （ｍ， ４６Ｈ）， ０．９２ − ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４１．３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５４】
実施例４６−化合物４６
化合物４６：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（３−（３−メチルウレイド）プロピル）アミノ）オクタノエート
【化９７】
2022501412.tif 000118
化合物４６は、化合物４５に採用された方法を使用して、中間体３８から２４％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２５ （ｈ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．４８ （ｓ， ５Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７３ − １．４０ （ｍ， １６Ｈ）， １．４０ − １．１９ （ｍ， ４４Ｈ）， ０．９２ − ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７５５．０ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５５】
実施例４７−化合物４７
化合物４７：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２−（メチルスルホンアミド）エチル）アミノ）オクタノエート
【化９８】
2022501412.tif 000119
ＤＣＭ（０．２５Ｍ）中の化合物３６（１．０当量）の混合物に、ＭｓＣｌ（１０当量）を加えた。混合物を２３℃で１５分間撹拌した後、水で２回洗浄し、真空濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製により、生成物を無色の残渣として得た（１３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４７ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２２ （ｓ， １Ｈ）， ２．９８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ７７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ − １．４２ （ｍ， １５Ｈ）， １．４２ − １．２３ （ｍ， ４６Ｈ）， ０．９４ − ０．８６ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７６２．９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５６】
実施例４８−化合物４８
化合物４８：ノニル８−（（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（３−（メチルスルホンアミド）プロピル）アミノ）オクタノエート
【化９９】
2022501412.tif 000120
化合物４８は、化合物４７で採用された方法を使用して、中間体３８から１６％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ − ３．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９７ （ｓ， ７Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０９ （ｓ， ２Ｈ）， １．８８ − １．５０ （ｍ， １５Ｈ）， １．４３ − １．１８ （ｍ， ４１Ｈ）， ０．９７ − ０．７６ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７７６．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５７】
実施例４９−化合物４９
化合物４９：ノニル８−（（２−アセトキシエチル）（７，７−ｂｉｓ（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化１００】
2022501412.tif 000121
ピリジン（１０当量）中の化合物１０（１．０当量）の混合物に、無水酢酸（１０当量）を加えた。混合物を２３℃で２４時間撹拌した。完了したら、水を加えることにより反応をクエンチし、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層を真空濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色の油状物として得た（５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１４ （ｑ， Ｊ ＝ ５．８， ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｓ， ４Ｈ）， ２．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）， １．６６ − １．５０ （ｍ， １１Ｈ）， １．５０ − １．３９ （ｍ， ４Ｈ）， １．３９ − １．１９ （ｍ， ４８Ｈ）， ０．９１ − ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７２７．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５８】
実施例５０−化合物５０
化合物５０：ノニル８−（（３−アセトキシプロピル）（７，７−ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）アミノ）オクタノエート
【化１０１】
2022501412.tif 000122
化合物５０は、化合物４９で採用された方法を使用して、化合物３７から４２％の収率で合成された。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｄｔ， Ｊ ＝ １７．３， ６．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ３．５５ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｄ， Ｊ ＝ ３８．１ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０４ （ｓ， ３Ｈ）， １．７５ （ｓ， ２Ｈ）， １．６６ − １．４９ （ｍ， １１Ｈ）， １．４５ − １．２１ （ｍ， ５２Ｈ）， ０．９１ − ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）． ＭＳ： ７４１．２ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
【０２５９】
実施例５１−ｐＫａ測定
各アミン脂質のｐＫａは、Ｊａｙａｒａｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  ２０１２）の方法に従って、以下のように適応させた方法で決定された。ｐＫａは、２．９４ｍＭの濃度のエタノール中の未配合アミン脂質について決定された。脂質は、ｐＨが４．５〜９．０の範囲の０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で１００μＭに希釈された。蛍光強度は、３２１ｎｍ及び４４８ｎｍの励起及び発光波長を使用して測定した。表２は、列挙される化合物のｐＫａ測定値を示す。
【表２】
2022501412.tif 000123
2022501412.tif 000124
【０２６０】
実施例５２−マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ編集用のＬＮＰ組成物
様々なＬＮＰ組成物の製剤は、アミン脂質を使用して調製された。マウスの肝臓編集率のアッセイでは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと化学修飾ｓｇＲＮＡが、１：１ｗ／ｗ比または１：２ｗ／ｗ比のいずれかでＬＮＰに製剤化された。ＬＮＰは、特定のイオン化可能な脂質（アミン脂質など）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−２ｋ−ＤＭＧの組成で、６．０Ｎ：Ｐ比で製剤化される。
【０２６１】
ＬＮＰ製剤−クロスフロー
ＬＮＰは、エタノール中の脂質と２倍量のＲＮＡ溶液及び１倍量の水とのジェット混合を衝突させることによって形成された。エタノール中の脂質は、ミキシングクロスを介して２倍量のＲＮＡ溶液と混合される。第４の水の流れは、インラインティーを介してクロスの出口の流れと混合される。（例えば、ＷＯ２０１６０１０８４０、図２を参照されたい。）ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰは、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ）でタンジェント流濾過を使用して濃縮し、次いで、ダイアフィルトレーションによって５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ  ７．５（ＴＳＳ）へとバッファー交換した。代替的に、ＴＳＳへの最終的なバッファー交換はＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）によって完了した。必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した遠心分離によって組成物を濃縮した。次いで、得られた混合物を、０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終的なＬＮＰは、さらに使用するまで４℃または−８０℃で保存した。
【０２６２】
ＬＮＰ組成物分析
動的光散乱（「ＤＬＳ」）は、本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）及びサイズを特徴付けるために使用される。ＤＬＳは、試料を光源にさらした結果として生じる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されるとき、ＰＤＩは、母集団内の粒子サイズ（平均粒子サイズ付近）の分布を表し、完全に均一な母集団のＰＤＩはゼロである。
【０２６３】
電気泳動光散乱は、指定されたｐＨでのＬＮＰの表面電荷を特徴付けるために使用される。表面電荷、すなわちゼータ電位は、ＬＮＰ懸濁液中の粒子間の静電反発／引力の大きさの尺度である。
【０２６４】
非対称フローフィールドフローフラクショネーション−マルチアングル光散乱（ＡＦ４−ＭＡＬＳ）を使用して、流体力学的半径によって組成物内の粒子を分離し、分画化された粒子の分子量、流体力学的半径、及び二乗平均平方根半径を測定する。これにより、分子量とサイズの分布、及びＢｕｒｃｈａｒｄ−Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒプロット（粒子の内部コア密度を示唆する経時的な二乗平均平方根（「ｒｍｓ」）半径と流体力学的半径の比率）、ｒｍｓコンフォメーションプロット（ｒｍｓ半径の対数対分子量の対数。結果として得られる線形フィットの傾きは、コンパクトさ対伸びの程度を示す）などの二次特性を評価できる。
【０２６５】
ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を使用して、粒子サイズ分布と粒子濃度を決定できる。ＬＮＰ試料は適切に希釈され、顕微鏡スライドに注入される。粒子が視野からゆっくりと注入されるときに、カメラが散乱光を記録する。動画がキャプチャされた後、ナノ粒子追跡分析は、ピクセルを追跡し、拡散係数を計算することによって動画を処理する。この拡散係数は、粒子の流体力学的半径に変換できる。機器はまた、分析でカウントされた個々の粒子の数をカウントして粒子濃度を示す。
【０２６６】
低温電子顕微鏡法（「クライオＥＭ」）を使用して、ＬＮＰの粒子サイズ、形態、及び構造特性を決定できる。
【０２６７】
ＬＮＰの脂質組成分析は、液体クロマトグラフィーとそれに続く荷電エアロゾル検出（ＬＣ−ＣＡＤ）から決定できる。この分析は、実際の脂質含有量と理論上の脂質含有量の比較を提供することができる。
【０２６８】
ＬＮＰ組成物は、平均粒子サイズ、多分散指数（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含有量、ＲＮＡのカプセル化効率、及びゼータ電位について分析される。ＬＮＰ組成物は、脂質分析、ＡＦ４−ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、及び／またはクライオＥＭによってさらに特徴付けられ得る。平均粒子サイズと多分散度は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＤＬＳ装置を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。ＬＮＰ試料は、ＤＬＳで測定する前にＰＢＳ緩衝液で希釈した。平均粒子サイズの強度ベースの測定値であるＺ平均直径が、数平均直径及びｐｄｉとともに報告された。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器は、ＬＮＰのゼータ電位を測定するためにも使用される。試料は、測定前に０．１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１：１７（５０μＬから８００μＬ）に希釈される。
【０２６９】
蛍光ベースのアッセイ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ＲＮＡ濃度と遊離ＲＮＡを決定する。カプセル化効率は、（全ＲＮＡ−遊離ＲＮＡ）／全ＲＮＡとして計算される。ＬＮＰ試料は、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む１×ＴＥ緩衝液で適切に希釈して全ＲＮＡを測定するか、１×ＴＥ緩衝液で遊離ＲＮＡを決定する。検量線は、組成物の作成に使用した開始ＲＮＡ溶液を利用して作成し、１×ＴＥ緩衝液＋／−０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で希釈する。次いで、希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（製造元の使用説明書に従って）を各標準液と試料に添加し、光が当たらない状態で室温で約１０分間インキュベートする。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、励起波長、自動カットオフ波長、及び発光波長をそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５２５ｎｍに設定して試料を読み取る。全ＲＮＡと遊離ＲＮＡは適切な検量線から決定される。
【０２７０】
カプセル化効率は、（全ＲＮＡ−遊離ＲＮＡ）／全ＲＮＡとして計算される。ＤＮＡベースのカーゴコンポーネントのカプセル化効率を決定するために同じ手順を使用することができる。一本鎖ＤＮＡの場合はＯｌｉｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅを使用でき、二本鎖ＤＮＡの場合はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅを使用できる。
【０２７１】
ＡＦ４−ＭＡＬＳは、分子量とサイズの分布、及びそれらの計算からの二次統計を調べるために使用される。ＬＮＰは必要に応じて希釈され、ＨＰＬＣオートサンプラーを使用してＡＦ４分離チャネルに注入され、そこで集束され、チャネルを横切るクロスフローの指数関数的勾配で溶出される。全ての流体は、ＨＰＬＣポンプとＷｙａｔｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによって駆動される。ＡＦ４チャネルから溶出する粒子は、ＵＶ検出器、マルチアングル光散乱検出器、準弾性光散乱検出器、示差屈折率検出器を通過する。生データは、Ｄｅｂｅｙｅモデルを使用して処理され、検出器信号から分子量とｒｍｓ半径が決定される。
【０２７２】
ＬＮＰの脂質コンポーネントは、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）に接続されたＨＰＬＣによって定量的に分析される。４つの脂質コンポーネントのクロマトグラフィー分離は逆相ＨＰＬＣによって達成される。ＣＡＤは、全ての非揮発性化合物を検出する破壊的な質量ベースの検出器であり、分析対象物の構造に関係なく信号は一貫している。
【０２７３】
Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡカーゴ
Ｃａｓ９ｍＲＮＡカーゴは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製された。１×ＮＬＳ（配列番号３）またはＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３４２３の表２４の配列（参照により本明細書に組み込まれる）を含むキャップ化及びポリアデニル化Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、直線化プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成された。例えば、Ｔ７プロモーターと１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含むプラスミドＤＮＡは、次の条件でＸｂａＩと３７℃で２時間インキュベートすることにより、直線化できる：２００ｎｇ／μＬプラスミド、２Ｕ／μＬ  ＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応緩衝液。ＸｂａＩは、反応液を６５℃で２０分間加熱することにより不活化できる。直線化されたプラスミドは、シリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して酵素及び緩衝塩から精製し、アガロースゲルで分析して直線化を確認できる。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するＩＶＴ反応は、３７℃で４時間、以下の条件でインキュベートすることにより実施できる：５０ｎｇ／μＬの直線化プラスミド；ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１−メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各２ｍＭ；１０ｍＭ  ＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬ無機Ｅ．  ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；及び１×反応バッファー。４時間のインキュベーション後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を最終濃度０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応液をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿を含む方法で精製した。
【０２７４】
ｓｇＲＮＡ（例えば、Ｇ６５０；配列番号２）は化学的に合成され、任意選択で商業的供給業者から供給された。
【０２７５】
ＬＮＰ
これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰの脂質コンポーネント中の脂質のモル濃度は、モル％アミン脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−２ｋ−ＤＭＧとして表される（例えば、５０／１０／３８．５／１．５）。最終的なＬＮＰは、上述の分析方法に従って、カプセル化効率、多分散指数、及び平均粒子サイズを決定するために特徴付けられた。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表３に示す。
【表３】
2022501412.tif 000125
【０２７６】
化合物１９の構造及び合成方法は、ＵＳ２０１７／０１９６８０９Ａ１に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれている。
【０２７７】
特に断りのない限り、ＬＮＰは０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与でマウスに投与され、ゲノムＤＮＡは以下に説明するようにＮＧＳ分析のために単離された。
【０２７８】
ｉｎ  ＶｉｖｏでのＬＮＰ送達
各研究では、６〜１０週齢のＣＤ−１メスマウスを使用した。群の平均体重に基づいて投薬溶液を調製するために、動物の体重を測り、体重に従って群分けした。ＬＮＰは、動物あたり０．２ｍＬ（体重１キログラムあたり約１０ｍＬ）の量で、外側尾静脈を介して投与された。動物は、投与後少なくとも２４時間、有害作用について投与後に定期的に観察された。動物は、イソフルラン麻酔下での心臓穿刺による放血により、６日または７日で安楽死させた。本明細書に記載されているように、血液を血清分離管または血漿用の緩衝クエン酸ナトリウムを含む管に収集した。ｉｎ  ｖｉｖｏ編集を含む研究のために、肝臓組織は、ＤＮＡ抽出及び分析のために各動物から収集された。
【０２７９】
マウスのコホートは、肝臓編集について、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により測定された。
【０２８０】
ＮＧＳシーケンシング
簡潔に述べると、ゲノム内の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ゲノムＤＮＡが単離され、ディープシークエンシングを、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失の存在を同定するのに使用した。
【０２８１】
ＰＣＲプライマーは標的部位（例えば、Ｂ２Ｍ）の周りに設計され、目的のゲノム領域が増幅された。シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングした。読み取りを、低い品質スコアを有するものを除去した後に、ヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインした。読み取りを含む生じたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、ここで対象の標的領域にオーバーラップする読み取りを選択し、野生型の読み取りの数対挿入、置換、または欠失を含む読み取りの数を計算した。
【０２８２】
編集パーセンテージ（例えば「編集効率」または「編集パーセント」）は、野生型を含む配列読み取りの総数に対する、挿入または欠失を有する読み取りの総数として定義される。
【０２８３】
図１は、ＮＧＳによって測定されたマウス肝臓の編集パーセンテージを示す。図１と表４に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏ編集の割合は約８％から３５％を超える肝臓編集の範囲である。
【表４】
2022501412.tif 000126
【０２８４】
実施例５３−肝臓での編集の用量反応
投薬のスケーラビリティを評価するために、用量反応実験を化合物１を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで実施した。実施例５２のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）またはＢ２Ｍ（Ｇ６５０；配列番号２）のいずれかを標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表５に記載の組成物を用いて、クロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有し、必要に応じてＡｍｉｃｏｎ  ＰＤ−１０フィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃縮した後、表５に記載の濃度で使用した。
【０２８５】
ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。
【０２８６】
平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表５に示す。
【表５】
2022501412.tif 000127
【０２８７】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋまたは０．３ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後６日目に動物を屠殺した。ＴＴＲを標的とするＧ２８２を投与された動物について、血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を測定した。Ｂ２Ｍを標的とするＧ６５０を投与された動物について、肝臓を採取し、編集を測定した。
【０２８８】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）ＥＬＩＳＡ分析
血液を採取し、示されたように血清を単離した。総マウスＴＴＲ血清レベルは、マウスプレアルブミン（トランスサイレチン）ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログＯＫＩＡ００１１１）を使用して決定した。簡潔に述べると、血清をキット試料希釈液で段階希釈して、０．１ｍｐｋ用量で１０，０００倍、０．３ｍｐｋで２，５００倍の最終希釈にした。次いで、この希釈した試料をＥＬＩＳＡプレートに加え、取扱説明書に従ってアッセイを実施した。
【０２８９】
表６及び図２Ａ〜図２Ｃは、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。化合物１製剤は、各用量で化合物１９製剤よりも高いＴＴＲ編集を肝臓において示した。化合物１製剤は、０．１ｍｐｋと０．３ｍｐｋの両方の用量で５５〜６０％の範囲のＴＴＲの編集を示し、低用量での有効性を示す。
【表６】
2022501412.tif 000128
【０２９０】
表７と図３は、肝臓でのＢ２Ｍ編集の結果を示す。化合物１は、各用量で化合物１９よりも高いＢ２Ｍ編集を肝臓において示した。化合物１及び化合物１９は、肝臓におけるＢ２Ｍの編集を０．１ｍｐｋ〜０．３ｍｐｋの用量で有意に増加させた。
【表７】
2022501412.tif 000129
【０２９１】
実施例５４−化合物４を含む組成物によるマウス肝臓におけるＢ２Ｍ編集
化合物４を含む組成物中の異なる用量及びＰＥＧ脂質濃度で編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、Ｂ２Ｍ（Ｇ６５０；配列番号２）を標的とするガイドＲＮＡとともにＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表８に記載の組成物を用いて、クロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。全てのＬＮＰは、Ａｍｉｃｏｎ  ＰＤ−１０フィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び／またはタンジェント流濾過を使用して濃縮し、表８に記載の濃度で使用した。
【０２９２】
ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。
【０２９３】
平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表８に示す。
【表８】
2022501412.tif 000130
【０２９４】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋまたは０．３ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺し、肝臓を採取し、編集をＮＧＳで測定した。表９と図４は、肝臓でのＢ２Ｍ編集の結果を示す。化合物４を含む組成物は、化合物１９の比較組成物と同様に、０．１ｍｐｋの用量と比較して０．３ｍｐｋの用量で編集の増加を示した。
【表９】
2022501412.tif 000131
【０２９５】
実施例５５−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表１０に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは表１０に記載の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。
【０２９６】
平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表１０に示す。
【表１０】
2022501412.tif 000132
【０２９７】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表１１と図５は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表１１】
2022501412.tif 000133
【０２９８】
この実施例で試験された式（Ｉ）または式（ＩＩ）の各アミン脂質は、血清ＴＴＲレベルの約８０％の対応する減少を伴う、ＴＴＲの約４０〜５０％の編集を示した。これらのＬＮＰは、参照と比較して有利であった。
【０２９９】
実施例５６−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加のアミン脂質製剤について編集を評価した。実施例５２のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。ＬＮＰは、表１２に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは約０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度で使用された。ＬＮＰ製剤は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表１２に示す。
【表１２】
2022501412.tif 000134
【０３００】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表１３は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を記載する。
【表１３】
2022501412.tif 000135
【０３０１】
実施例５７−発現タンパク質の測定
ｍＲＮＡカーゴの場合、タンパク質発現は脂質ナノ粒子による送達の１つの尺度である。例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、様々なタンパク質の生体試料中のタンパク質レベルを測定できる。次のプロトコールを使用して、生物学的試料から発現したタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質の発現を測定できる。簡潔に述べると、清澄化された細胞溶解物の総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイによって決定される。ＭＳＤ  ＧＯＬＤ  ９６ウェルストレプトアビジンＳＥＣＴＯＲプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログＬ１５ＳＡ−１）は、Ｃａｓ９マウス抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログＣＦ８１１１７９）を捕捉抗体として使用し、Ｃａｓ９（７Ａ９−３Ａ３）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１４６９７）を検出抗体として使用して、製造元のプロトコールに従って調製する。組換えＣａｓ９タンパク質は、１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル、ＥＤＴＡフリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ７８４３７）とともにＤｉｌｕｅｎｔ  ３９（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のキャリブレーション標準として使用される。ＥＬＩＳＡプレートはＭｅｓｏＱｕｉｃｋｐｌｅｘ  ＳＱ１２０機器（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して読み取られ、データはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で分析される。
【０３０２】
実施例５８−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表１４に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは表１４に記載の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表１４に示す。
【表１４】
2022501412.tif 000136
【０３０３】
５匹ＣＤ−１メスマウスは、各条件において、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後６日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表１５と図６は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表１５】
2022501412.tif 000137
【０３０４】
実施例５９−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表１６に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは約０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表１６に示す。
【表１６】
2022501412.tif 000138
【０３０５】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表１７と図７は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表１７】
2022501412.tif 000139
【０３０６】
実施例６０−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ５０２；配列番号４）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：２ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表１８に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは約０．０５の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表１８に示す。
【表１８】
2022501412.tif 000140
【０３０７】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後６日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表１９と図８は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表１９】
2022501412.tif 000141
【０３０８】
実施例６１−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表２０に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは表２０に記載の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表２０に示す。
【表２０】
2022501412.tif 000142
【０３０９】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表２１と図９は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表２１】
2022501412.tif 000143
【０３１０】
実施例６２−肝臓での編集の用量反応
投与のスケーラビリティを評価するために、用量反応実験をｉｎ  ｖｉｖｏで実施した。実施例５２のＣａｓ９ｍＲＮＡは、いずれかのＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：２ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表２２に記載の組成物を用いて、クロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有し、必要に応じてＡｍｉｃｏｎ  ＰＤ−１０フィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃縮した後、表２２に記載の濃度で使用した。
【０３１１】
ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表２２に示す。
【表２２】
2022501412.tif 000144
【０３１２】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋまたは０．０３ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を屠殺した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を測定した。表２３と図１０は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表２３】
2022501412.tif 000145
【０３１３】
実施例６３−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表２４に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは表２４に記載の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表２４に示す。
【表２４】
2022501412.tif 000146
【０３１４】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を解体した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表２５は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表２５】
2022501412.tif 000147
【０３１５】
実施例６４−マウス肝臓でのＴＴＲ編集
追加の組成物について編集を評価した。実施例５２に記載のＣａｓ９ｍＲＮＡは、ＴＴＲ（Ｇ２８２；配列番号１）を標的とするガイドＲＮＡを有するＬＮＰとして製剤化された。これらのＬＮＰは、シングルガイドＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡの１：１ｗ／ｗ／比で製剤化された。ＬＮＰは、表２６に記載の組成物を用いて、実施例５２に記載されているクロスフロー手順を使用して組み立てられた。全てのＬＮＰは６．０のＮ：Ｐ比を有した。ＬＮＰは表２６に記載の濃度で使用された。ＬＮＰ組成物は、実施例５２に記載されるように、平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率について分析された。平均粒子サイズ、多分散度（ＰＤＩ）、全ＲＮＡ含有量、及びＲＮＡのカプセル化効率の分析を表２６に示す。
【表２６】
2022501412.tif 000148
【０３１６】
ＣＤ−１メスマウスは、０．１ｍｐｋで、ｉ．ｖ．投与された。投与後７日目に動物を解体した。血液と肝臓を採取し、血清ＴＴＲと編集を上述のように測定した。表２７は、肝臓におけるＴＴＲ編集と、血清ＴＴＲレベルの結果を示す。
【表２７】
2022501412.tif 000149
【０３１７】
配列表
【表２８】
2022501412.tif 000150
2022501412.tif 000151
2022501412.tif 000152
【図１】
2022501412.tif 000166
【図２Ａ】
2022501412.tif 000167
【図２Ｂ】
2022501412.tif 000168
【図２Ｃ】
2022501412.tif 000169
【図３】
2022501412.tif 000170
【図４】
2022501412.tif 000171
【図５Ａ】
2022501412.tif 000172
【図５Ｂ】
2022501412.tif 000173
【図５Ｃ】
2022501412.tif 000174
【図６Ａ】
2022501412.tif 000175
【図６Ｂ】
2022501412.tif 000176
【図７Ａ】
2022501412.tif 000177
【図７Ｂ】
2022501412.tif 000178
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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