(57)【要約】  本発明は、腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する個体が、前記個体由来の糞便試料中に存在する微生物叢の分析に基づいて、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体に基づく治療に応答する可能性があるかどうかをインビトロで決定する方法に関する。上記方法を実行するのに有用な１２のモデル、ならびにこの方法を容易に実行するように設計されたツールを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する個体が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）ベースの治療に応答する可能性があるかどうかをインビトロで決定するための方法であって、以下：
（ｉ）前記個体の糞便試料から、以下：
【表１−１】
2022502038.tif 000041
【表１−２】
2022502038.tif 000042
からなる群から選択される少なくとも８つの細菌種を含む一組の細菌種の相対的存在量に基づいて存在量パターンを得る工程；
（ｉｉ）１つ又は複数の予め定められた方程式を用いて、各々が、前記細菌種のセットから少なくとも８つの細菌種について得られたモデルに対応し、前記個体がＩＣＩに基づく治療に反応する確率（ＰＲ）又は前記個体がＩＣＩに基づく治療に抵抗する確率（ＰＮＲ）を計算する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｉｉ）において、少なくとも１つの方程式が、前記個体の糞便試料中に存在する少なくとも８つの細菌種のセットに関するモデルに対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）で使用されるモデルが、少なくとも７５％の個体の確率、及び／又は少なくとも６５％の予測可能性及び少なくとも７０％の成功率をもたらす、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
動物モデルにおいて、個体がＩＣＩに基づく治療に対して良好な反応を示す可能性があるかどうかを評価する工程（ｉｉｉ）をさらに含み、工程（ｉｉｉ）が、（ｉｉｉａ）個人から無菌（ＧＦ）モデル動物への糞便の糞便微生物移植（ＦＭＴ）を実施する工程；（ｉｉｂ）工程（ｉｉｉａ）から少なくとも７〜１４日後に、前記動物に移植可能な腫瘍モデルを接種する工程；（ｉｉｉｃ）前記接種動物をＩＣＩベースの治療で処置する工程；及び（ｉｉｉｄ）処置動物における腫瘍の大きさを測定する工程を含み、ここで、工程（ｉｉｉｄ）の結果は、前記治療に対する前記個体に期待され得る反応示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
過去２ヵ月間の個体の抗生物質レジメン曝露が不明であり、工程（ｉ）において、細菌種のセットが、以下
【表２】
2022502038.tif 000043
からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）において、１つ、２つ又は３つの方程式が、細菌種のＣＡＧ番号によって同定される、以下：
【表３】
2022502038.tif 000044
の細菌種のセットについて得られるモデルに対応し、好ましくは、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が前記治療に応答する確率（ＰＲ）を計算するための方程式は、以下：
【数１】
2022502038.tif 000045
の通りであり、式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は、以下：
【表４】
2022502038.tif 000046
の回帰係数である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体が、過去の２ヶ月間、抗生物質を摂取せず、工程（ｉ）において、細菌種のセットが、以下：
【表５】
2022502038.tif 000047
からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）において、１つ、２つ又は３つの方程式が、細菌種のＣＡＧ番号によって同定される、以下：
【表６】
2022502038.tif 000048
の細菌種のセットについて得られるモデルに対応し、好ましくは、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が治療に抵抗する（ＰＮＲ）又は応答する（ＰＲ）確率を計算するための方程式は、以下：
【数２】
2022502038.tif 000049
の通りであり、式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は、以下：
【表７】
2022502038.tif 000050
の回帰係数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体がＩＣＩベースの治療による長期的利益を有する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、ここで、過去の２ヶ月間の個体の抗生物質レジメン曝露が不明であり、工程（ｉ）において、細菌種のセットが、以下：
【表８】
2022502038.tif 000051
からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）において、１つ、２つ又は３つの方程式が、細菌種のＣＡＧ番号によって同定される、以下：
【表９】
2022502038.tif 000052
の細菌種のセットについて得られるモデルに対応し、好ましくは、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記個体が治療に対して抵抗する確率（ＰＮＲ）を計算するための方程式は、以下：
【数３】
2022502038.tif 000053
の通りであり、式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は、以下：
【表１０】
2022502038.tif 000054
の回帰係数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
個体がＩＣＩベースの治療による長期的利益を有する可能性があるかどうかを決定するための方法であって、ここで、個体が、過去の２ヶ月間に抗生物質を服用しておらず、工程（ｉ）において、細菌種のセットは、以下：
【表１１】
2022502038.tif 000055
からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）において、１つ、２つ又は３つの方程式が、細菌種のＣＡＧ番号によって同定される、以下；
【表１２】
2022502038.tif 000056
の細菌種のセットについて得られるモデルに対応し、好ましくは、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記個体が治療に抵抗する（ＰＮＲ）又は応答する（ＰＲ）確率を計算するための方程式は、以下：
【数４】
2022502038.tif 000057
の通りであり、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は、以下：
【表１３】
2022502038.tif 000058
の回帰係数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
糞便試料が、ＩＣＩの１回目の投与前に得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＣＩベースの治療が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２抗体による治療である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＣＩベースの治療が、抗ＰＤ１抗体による治療である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌患者が、ＩＣＩベースの治療の投与前及び／又はそのような治療の間に細菌補償を必要とするかどうかを決定するためのセラノスティック方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって、患者が、そのような治療に対する良好な応答者である可能性が高いかどうかを評価する工程を含み、患者が良好な応答者である可能性が高いと同定されない場合、患者は細菌補償を必要とする、前記方法。
【請求項２１】
前記方法において検出されるべき微生物種のそれぞれに特異的な核酸プローブを含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法を実施するように設計された核酸マイクロアレイ。
【請求項２２】
前記方法において検出されるべき微生物種の各々に特異的な配列を増幅するためのプライマー対を含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌治療の分野に関する。特に、本発明は、腎細胞癌（ＲＣＣ）の治療における免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の投与を含む治療の有効性における腸内微生物叢の役割に関する。本発明は、「メタゲノミクスに基づく腸オンコミクロビオームシグネチャー」（ＧＯＭＳ）を、最良の臨床転帰に対する反応又は耐性の新規予測因子として、また腎細胞癌の治療の６か月後に、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１／ＰＤＬ−２遮断前の診断時に提供する。また、本発明は、ＩＣＩを受ける前及び／又はＩＣＩによる治療中に細菌補償治療を必要とする患者を同定するためのセラノスティックス的方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌生物学における概念上の大きな進歩は、過去１０年間にわたってなされてきた。免疫応答は、癌関連突然変異によって発現され、免疫抑制性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって一般的に減弱される腫瘍特異的新生抗原に対して日常的に生成されるという理解は、腫瘍進行に対する免疫制御を誘発することを目的とした効果的な免疫療法の開発にとって極めて重要であった（Sharma and Allison, 2015a, 2015b）。癌免疫療法の進歩は、メラノーマ、肺、膀胱、腎臓、ホジキンリンパ腫、急性Ｂ細胞白血病、肝臓、メルケル細胞癌及び頭頸部腫瘍などの様々な血液学的及び固形転移性悪性腫瘍の治療において、特に顕著な成功をもたらした（Borghaei et al., 2015; Nghiem et al., 2016; Robert et al., 2011; Rosenberg et al, 2016）。今日まで、適応抗癌免疫応答の初期プライミング期（流入リンパ節における）又はエフェクター期（腫瘍床における）にＴリンパ球（いわゆる「免疫チェックポイント」）によって発現される抑制性シグナル伝達経路を遮断する治療法は、全生存において最大の臨床的利益を示している（Ribas et al, 2016; Topalian et al, 2012）。この成功の原型例は、ＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（活性化／消耗Ｔ細胞により発現される）又はそのリガンドＰＤ−Ｌ１（一般にＴＭＥの癌細胞又は細胞により発現される）（Pardoll, 2015）の使用である。これらの分子ブレーキを放出することによって、このようなｍＡｂは免疫応答の抗癌適応腕を回復させる。
【０００３】
ＰＤ−１遮断は、Ｂ−ＲＡＦ野生型黒色腫における最も有効な一次治療であり、二次切除不能肺癌における最良の選択肢であるが、腫瘍の約６０〜７０％はこの治療戦略に対して一次抵抗性を示す。一次耐性は、腫瘍細胞の低い腫瘍突然変異負荷及び不良な内因性抗原性（Riaz et al, 2016; Rizvi et l., 2015）、抗原提示及びプライミング相の欠損（Spranger et al, 2015）、Ｔ細胞機能の消耗に関連する限定的な腫瘍内浸潤（Smyth et al, 2016）、ならびにアデノシン及びインドールアミン、２，３−ジオキシゲナーゼに関連する代謝性免疫抑制経路（Koyama et al, 2016; Smyth et al, 2016）に起因している。同様に、ＣＴＬＡ−４遮断に対する一次耐性機序も解明されている。例えば、ＩＦＮ−γシグナル伝達の喪失を呈する黒色腫は、イピリムマブに対する応答を欠いている（Gao et al, 2016）。
【０００４】
より最近では、ＰＤ−１受容体の慢性阻害に対する二次耐性機序がメラノーマ患者の約２５％で報告されている（Koyama et al, 2016; Ribas et al, 2016; Zaretsky et al, 2016）。ペンブロリズマブによる継続治療にもかかわらず中央値で１．８年間進行した黒色腫患者７４例中４例が、ジャヌスキナーゼＪＡＫ１又はＪＡＫ２の機能喪失型突然変異を呈する病変を発現し、その結果、ＳＴＡＴ１リン酸化が低下し、ＩＦＮの抗増殖作用に対する感受性が低下するか、又はβ−２ミクログロブリンをコードする遺伝子内の突然変異が生じ、腫瘍細胞のＴ細胞認識のためのＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面へのフォールディング及び輸送が妨げられた（Zaretsky et al, 2016）。これらのダーウィン的な遺伝的（又は後成的）形質の自然選択に加えて、他の獲得耐性機構がマウスで報告されている。主に、ＰＤ−Ｌ１のＩＦＮ−γ誘導性発現（Pardoll, 2012; Taube et al, 2012）、ＰＤ−１の主要リガンド、ＴＮＦ誘導性抗原変異体の喪失（Landsberg et al, 2012）、ならびにＴｉｍ３／ＨＡＶＣＲ２（Koyama et al, 2016; Restifo et al, 2012; Smyth et al, 2016）などの活性化Ｔリンパ球上のさらなる消耗マーカーのＴＣＲ依存性アップレギュレーション、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ３）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｂ及びＴ細胞リンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、及びＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）から生じる適応免疫抵抗性である。
【０００５】
本発明者らのチームは、Routy et al Science Jan 5, 2018において、他の２つの報告（Gopalakrishnan V et al and Matson V et al）と共に、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１に基づく免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）に対する一次耐性は腸内微生物叢の異常による可能性があることを報告した。抗生物質（ＡＴＢ）は進行肺癌、腎癌、膀胱癌患者におけるＩＣＩの臨床的利益を阻害した。無菌又はＡＴＢ処置マウスへのＩＣＩに反応した（しかし反応しなかった患者からではなかった）癌患者からの糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）は、ＰＤ−１遮断の抗腫瘍効果を改善した。診断時の患者の便のメタゲノミクスから、ＩＣＩに対する臨床反応と専用の微生物パターンとの間に相関があることが明らかになり、肺癌患者と腎癌患者の両方を総合的に検討すると、Akkermansia muciniphilaが相対的に増加した。消化管異形成症の診断は、ＩＣＩの有効性を回復する治療法が適用可能であるため重要である。実際、A. muciniphila又はAlistipes indistinctusをＦＭＴ後に非反応性糞便とともに経口補給すると、ＣＣＲ９＋ＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球の腫瘍床への動員を増加させることにより、ＩＬ−１２依存的にＰＤ−１遮断の有効性が回復した。
【０００６】
本出願に開示された結果は、診断時に、そのような治療の臨床的利益のために、チロシンキナーゼ阻害剤又はｍＴＯＲ阻害剤耐性進行性又は転移性ＲＣＣに対してニボルマブ又はペンブロリズマブによる二次治療を受けた腎細胞癌患者（ＲＣＣ）６９人のより大規模なコホートのデータから計算された、メタゲノミクスに基づく腸オンコミクロビオーム署名（ＧＯＭＳ）の適中率を示す。本試験は、抗ＰＤ１抗体の初回投与中又は初回投与の２ヵ月前に抗生物質を投与したＲＣＣ患者１１例を含む、又は除外した３つのＲＥＣＩＳＴ基準（最良の転帰、３ヵ月時点での増悪までの時間（ＴＴＰ）、６ヵ月時点でのＴＴＰ）を用いて実施した。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様によれば、本発明は、腎細胞癌患者（ＲＣＣ）を有する個体が、以下の工程を含む、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療に応答する可能性があるかどうかをインビトロで決定する方法に関する：
（ｉ）前記個体の糞便試料（又は回腸若しくは結腸粘膜試料）から、下記の表１に開示される種群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む一組の細菌種の相対的存在量に基づいて存在量パターンを得る。
（ｉｉ）１つ又は複数の予め定められた方程式を用いて、各々が、前記細菌種のセットから少なくとも８つの細菌種について得られたモデルに対応し、前記個体が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療を用いて、前記個体が治療（ＰＲ）に応答する確率又は前記個体が治療（ＰＮＲ）に抵抗する確率を計算する。
【０００８】
本発明はまた、上記方法を実施するのに有用な１２のモデルに関し、そのうちの６つは、過去２ヶ月間にいずれの抗生物質も服用しなかった患者のデータから得られたが、他の６つは、最近の抗生物質取り込みが不明の患者に使用することができる。これらのモデルは、微生物叢（下記の表３、６、９及び１２に列挙される）の異なるサブセットに（部分的に）依存しており、単独で使用することも組み合わせて使用することもできる。
【０００９】
上記方法を容易に実施するように設計されたツールも、本発明の一部であり、例えば、本方法の工程（ｉ）において検出されるべき微生物種の各々に特異的な核酸プローブを含む核酸マイクロアレイ、及び、該方法の工程（ｉ）において検出されるべき微生物種の各々に特異的な配列を増幅するためのプライマー対を含むプライマーのセットなどである。
【００１０】
抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体ベースの治療を受ける前に、個体が細菌組成物による細菌補償を必要とするか、及び／又はＦＭＴによって細菌補償を必要とするかどうかを決定するためのセラノスティック方法も本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】最良の転帰と関連する共生種。臨床的有益性の予測因子として考慮されたＲＥＣＩＳＴ  １．１の基準は、「最良の臨床転帰」であった。Ａ．ボルケーノプロット（左）及び線形判別分析効果サイズ（ＬＥｆＳｅ）（右）分析を用いて、抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中のメタゲノミクスに基づくＧＯＭＳ構築のための推定細菌バイオマーカーを評価した。ボルケーノプロットは、各細菌種について計算して作成した：ｉ）Ｒ対ＮＲの平均相対存在量（ｘ軸）の間の倍数比（ＦＲ）のｌｏｇ２、ｉｉ）絶対値（ｙ軸）の相対存在量で計算したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定から導出したＰ値のｃｏ−ｌｏｇ１０。ＬＥｆＳｅプロットは、ＬＥｆＳｅパイプライン由来の出力ファイルについてＰｙｔｈｏｎ  ２．７を用いて作成し、ＬＤＡスコアが２以上のすべての種をその後の分析のために検討した。
【図１Ｂ】Ｂ．抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中のメタゲノムベースのＧＯＭＳの予測可能性を評価するためのＢ．ＲＯＣ曲線。ＩＣＩ治療時に、患者を「抵抗性」又は「反応性」の臨床表現型に従ってＮＲとＲに分けた。パネルＡの特定の細菌種の組み合わせをＰｙｔｈｏｎ  ２．７で実施し、ＲＯＣ分析を行った。５倍のクロスバリデーション（ノイズ添加なし）を行ったところ、最良のＡＵＣを有する細菌種コンソーシアムに対応するＲＯＣ曲線が描かれた。各曲線（挿入図）について、特異度（ｘ軸）及び感度（ｙ軸）ならびに最良値を報告した。対角線は、最良の臨床転帰に対する予測可能性がないことを示す。
【図１Ｃ】Ｃ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図１Ｄ】Ｄ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図２Ａ】ＴＴＰ＞３ヵ月と関連する共生種。臨床的有益性の予測因子として考慮されたＲＥＣＩＳＴ  １．１の基準は「ＴＴＰ＜又は３ヵ月を超える」であった。Ａ．ボルケーノプロット（左）及びＬＥｆＳｅ（右）分析を行い、抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中にメタゲノミクスに基づくＧＯＭＳを構築するための推定細菌バイオマーカーを評価した。ボルケーノプロットは、各細菌種について計算して作成した：ｉ）Ｒ対ＮＲの平均相対存在量（ｘ軸）の間の倍数比（ＦＲ）のｌｏｇ２、ｉｉ）絶対値（ｙ軸）の相対存在量で計算したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定から導出したＰ値のｃｏ−ｌｏｇ１０。ＬＥｆＳｅプロットは、ＬＥｆＳｅパイプライン由来の出力ファイルについてＰｙｔｈｏｎ  ２．７を用いて作成し、ＬＤＡスコアが２以上のすべての種をその後の分析のために検討した。
【図２Ｂ】Ｂ．抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中のメタゲノムベースのＧＯＭＳの予測可能性を評価するためのＲＯＣ曲線。ＩＣＩ治療時に、患者を「抵抗性」又は「反応性」の臨床表現型に従ってＮＲとＲに分けた。パネルＡの特定の細菌種の組み合わせをＰｙｔｈｏｎ  ２．７で実施し、ＲＯＣ分析を行った。５倍のクロスバリデーション（ノイズ添加なし）を行ったところ、最良のＡＵＣを有する細菌種コンソーシアムに対応するＲＯＣ曲線が描かれた。各曲線（挿入図）について、特異度（ｘ軸）及び感度（ｙ軸）ならびに最良値を報告した。対角線は、最良の臨床転帰に対する予測可能性がないことを示す。
【図２Ｃ】Ｃ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図２Ｄ】Ｄ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図３Ａ】ＴＴＰ＞６ヵ月と関連する共生種。臨床的有益性の予測因子として考慮されたＲＥＣＩＳＴ  １．１の基準は「ＴＴＰ＜又は６ヵ月を超える」であった。Ａ．ボルケーノプロット（左）及びＬＥｆＳｅ（右）分析を行い、抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中にメタゲノミクスに基づくＧＯＭＳを構築するための推定細菌バイオマーカーを評価した。  ボルケーノプロットは、各細菌種について計算して作成した：ｉ）Ｒ対ＮＲの平均相対存在量（ｘ軸）の間の倍数比（ＦＲ）のｌｏｇ２、ｉｉ）絶対値（ｙ軸）の相対存在量で計算したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定から導出したＰ値のｃｏ−ｌｏｇ１０。ＬＥｆＳｅプロットは、ＬＥｆＳｅパイプライン由来の出力ファイルについてＰｙｔｈｏｎ  ２．７を用いて作成し、ＬＤＡスコアが２以上のすべての種をその後の分析のために検討した。
【図３Ｂ】Ｂ．抗生物質の使用に関係なく、ＲＣＣ患者の便中のメタゲノムベースのＧＯＭＳの予測可能性を評価するためのＢ．ＲＯＣ曲線。ＩＣＩ治療時に、患者を「抵抗性」又は「反応性」の臨床表現型に従ってＮＲとＲに分けた。パネルＡの特定の細菌種の組み合わせをＰｙｔｈｏｎ  ２．７で実施し、ＲＯＣ分析を行った。５倍のクロスバリデーション（ノイズ添加なし）を行ったところ、最良のＡＵＣを有する細菌種コンソーシアムに対応するＲＯＣ曲線が描かれた。各曲線（挿入図）について、特異度（ｘ軸）及び感度（ｙ軸）ならびに最良値を報告した。対角線は、最良の臨床転帰に対する予測可能性がないことを示す。
【図３Ｃ】Ｃ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図３Ｄ】Ｄ．Ａ−Ｂと考えているが、ＡＴＢを服用しなかった患者のみ考慮。
【図４−１】ＴＴＰ６ヵ月では、ＭＧ組成に基づいて、Ｒと、ＡＴＢを服用しなかったＮＲ  ＲＣＣ患者とを分離することが可能である。Routy et al Science 2018のデータベースからＡＴＢを摂取しなかったＲＣＣ患者は全員、ＴＴＰ６の発見及び妥当性確認コホートを統一すると考えられた。アルファダイバーシティ、ベータダイバーシティ、ボルケーノ及びＬＥｆＳｅプロットは、図１、２、３及び４に記載されているように生成された。ＮＲ（オレンジ色）及びＲ（青色）コホートについてペアワイズ解析を実施し、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７を用いて作成した箱ひげ図を報告したが、有意な比較（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）のみを行った（Ｐ≦０．０５）。応答者はＮＲと比較して有意に高いα多様性を有する傾向があり、ＮＲから有意に分けられる（β多様性、Ｐ値は順序プロット内に示される）。ＬＥｆＳｅ、ボルケーノ及びペアワイズ解析プロットは、２つのコホートＮＲ及びＲ内の識別種を強調している。
【図４−２】ＴＴＰ６ヵ月では、ＭＧ組成に基づいて、Ｒと、ＡＴＢを服用しなかったＮＲ  ＲＣＣ患者とを分離することが可能である。Routy et al Science 2018のデータベースからＡＴＢを摂取しなかったＲＣＣ患者は全員、ＴＴＰ６の発見及び妥当性確認コホートを統一すると考えられた。アルファダイバーシティ、ベータダイバーシティ、ボルケーノ及びＬＥｆＳｅプロットは、図１、２、３及び４に記載されているように生成された。ＮＲ（オレンジ色）及びＲ（青色）コホートについてペアワイズ解析を実施し、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７を用いて作成した箱ひげ図を報告したが、有意な比較（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）のみを行った（Ｐ≦０．０５）。応答者はＮＲと比較して有意に高いα多様性を有する傾向があり、ＮＲから有意に分けられる（β多様性、Ｐ値は順序プロット内に示される）。ＬＥｆＳｅ、ボルケーノ及びペアワイズ解析プロットは、２つのコホートＮＲ及びＲ内の識別種を強調している。
【図４−３】ＴＴＰ６ヵ月では、ＭＧ組成に基づいて、Ｒと、ＡＴＢを服用しなかったＮＲ  ＲＣＣ患者とを分離することが可能である。Routy et al Science 2018のデータベースからＡＴＢを摂取しなかったＲＣＣ患者は全員、ＴＴＰ６の発見及び妥当性確認コホートを統一すると考えられた。アルファダイバーシティ、ベータダイバーシティ、ボルケーノ及びＬＥｆＳｅプロットは、図１、２、３及び４に記載されているように生成された。ＮＲ（オレンジ色）及びＲ（青色）コホートについてペアワイズ解析を実施し、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７を用いて作成した箱ひげ図を報告したが、有意な比較（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）のみを行った（Ｐ≦０．０５）。応答者はＮＲと比較して有意に高いα多様性を有する傾向があり、ＮＲから有意に分けられる（β多様性、Ｐ値は順序プロット内に示される）。ＬＥｆＳｅ、ボルケーノ及びペアワイズ解析プロットは、２つのコホートＮＲ及びＲ内の識別種を強調している。
【図５−１】ＲＣＣ患者に基づくロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果１基準に関係なく（結果１は、応答者の間のすべてのＳＤを考慮することを意味する）。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果１基準にかかわらず、ＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。各モデルは、特徴選択（左）、混乱行列（中央）、ＲＯＣ曲線（右）の３つのグラフで表される。混乱マトリックス及びＲＯＣ曲線は、５倍の交差検証後に作成した。交差する「真のラベル」及び「予測されるレベル」細胞内のパーセンテージが高いほど、モデルの予測可能性は高くなる。ＲＯＣ曲線については、ＡＵＣ（曲線下面積）とＣＶ ＡＵＣ（曲線下面積）の両方を考慮する必要がある。各トリプレットの下部には、ロジスティック回帰によって記述されるモデル方程式が報告されている。すなわち、ｅｘｐは天然塩基をもつ指数であり、ＣＡＧは閉じた区間［０：１］内で表現され、標準化された各ＣＡＧ種の相対的存在量である（ゼロ平均と単位分散）。
【図５−２】ＲＣＣ患者に基づくロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果１基準に関係なく（結果１は、応答者の間のすべてのＳＤを考慮することを意味する）。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果１基準にかかわらず、ＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。各モデルは、特徴選択（左）、混乱行列（中央）、ＲＯＣ曲線（右）の３つのグラフで表される。混乱マトリックス及びＲＯＣ曲線は、５倍の交差検証後に作成した。交差する「真のラベル」及び「予測されるレベル」細胞内のパーセンテージが高いほど、モデルの予測可能性は高くなる。ＲＯＣ曲線については、ＡＵＣ（曲線下面積）とＣＶ ＡＵＣ（曲線下面積）の両方を考慮する必要がある。各トリプレットの下部には、ロジスティック回帰によって記述されるモデル方程式が報告されている。すなわち、ｅｘｐは天然塩基をもつ指数であり、ＣＡＧは閉じた区間［０：１］内で表現され、標準化された各ＣＡＧ種の相対的存在量である（ゼロ平均と単位分散）。
【図６−１】抗生物質治療を受けていないＲＣＣ患者と結果１基準（結果１とは、応答者の間のすべてのＳＤを考慮することを意味する）に基づくロジスティック回帰モデル。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質を使用せず、結果１基準のＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【図６−２】抗生物質治療を受けていないＲＣＣ患者と結果１基準（結果１とは、応答者の間のすべてのＳＤを考慮することを意味する）に基づくロジスティック回帰モデル。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質を使用せず、結果１基準のＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【図７−１】ＲＣＣ患者に基づくロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果２基準に関係ない（結果２とは、奏効例において６ヵ月を超えるＳＤのみを考慮することを意味する）。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果２基準にかかわらず、ＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【図７−２】ＲＣＣ患者に基づくロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果２基準に関係ない（結果２とは、奏効例において６ヵ月を超えるＳＤのみを考慮することを意味する）。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質の使用及び結果２基準にかかわらず、ＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【図８−１】抗生物質治療を受けていないＲＣＣ患者及び結果２基準（結果２とは、奏効例において６ヵ月を超えるＳＤのみを考慮することを意味する）に基づくロジスティック回帰モデル。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質を使用せず、結果２基準のＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【図８−２】抗生物質治療を受けていないＲＣＣ患者及び結果２基準（結果２とは、奏効例において６ヵ月を超えるＳＤのみを考慮することを意味する）に基づくロジスティック回帰モデル。ロジスティック回帰モデルは、抗生物質を使用せず、結果２基準のＲＣＣ患者の糞便ＭＧから抽出した。図６のような三重グラフ（特徴選択、混乱行列、ＲＯＣ曲線）の記述。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本文では、以下の定義を使用する。
「免疫チェックポイント阻害剤」（ＩＣＩ）とは、Ｔ細胞などのある種の免疫系細胞やある種の癌細胞が産生するある種のタンパク質を阻害する、あらゆる薬物、分子、組成物を指す。これらのタンパク質は、免疫応答を抑制するのを助け、Ｔ細胞が癌細胞を殺傷するのを防ぐことができる。これらのタンパク質が阻害されると、免疫系の「ブレーキ」が解除され、Ｔ細胞は癌細胞をよりよく殺すことができる。Ｔ細胞又は癌細胞上に見出されるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２が挙げられる。特に、ＩＣＩは、抗ＰＤ１抗体（ニボルマブ又はペンブロリズマブなど）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ又はダルバルマブなど）、抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体を包含する。科学文献では、ＩＣＩは「免疫チェックポイントを遮断する薬物」、「免疫チェックポイント遮断薬」又は「免疫チェックポイント遮断薬」としても指定されている。
【００１３】
本明細書中の「抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療」は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に拮抗する薬物の使用を含む任意の治療を示す。これらには、主にＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に拮抗する薬物などのＩＣＩに基づく治療、ならびにいくつかのＩＣＩ及び／又は化学療法薬などの追加の抗癌剤を用いる複合治療が含まれる。「抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療」という語句により包含される併用療法の非限定的な例としては、抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１＋多剤化学療法（ペメトレキセド＋カルボプラチン）、抗Ｌａｇ３＋抗ＰＤ１、抗ＮＫＧ２Ａ＋抗ＰＤ１、ＩＤＯ阻害剤＋抗ＰＤ１及び抗ＩＣＯＳ＋抗ＰＤ１が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質に拮抗する現在使用されている薬物はモノクローナル抗体であるが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又は他のタンパク質に特異的に結合する他の分子は、将来のＩＣＩ、例えば、抗体断片又は特異的に設計されたアプタマーの開発に使用することができる。もちろん、語句「抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療」は、ＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に拮抗する活性分子を含む任意の治療を包含する。
【００１４】
「ＮＲ」とは、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１／ＰＤＬ−２遮断に対する非応答者の状態を定義する。
【００１５】
「Ｒ」はＰＤ−１／ＰＤＬ−１／ＰＤＬ−２遮断に対する応答者の状態を定義する。
【００１６】
「ＮＧＳ」は、過去、現在又は将来に利用可能な次世代シーケンスプラットフォームを定義する。
【００１７】
本文では、各「細菌種」は、消化管微生物叢由来の細菌遺伝子群（すなわち、消化管微生物叢の遺伝子レパートリー）であるＣｏ−Ａｖｕｎｄａｎｃｅ遺伝子群（「ＣＡＧ」）によって定義され、その存在量レベルは、異なる個々の試料間で同じ割合で変動する。言い換えれば、本発明による細菌種は、細菌遺伝子配列のクラスターによって定義され、このクラスターは、異なる対象からの試料中の存在量レベルが、ランダムに分布するのではなく、統計的に関連している。
【００１８】
メタゲノムデータを分析するための現在のアプローチのほとんどは参照ゲノムの比較に依存しているが、ヒト腸内微生物叢の多様性は、現在参照データベースでカバーされているものを超えている。本明細書に開示された結果において、本発明者らは、参照配列を必要とせずに、新規微生物の包括的な発見を可能にする、一連のメタゲノム試料にわたって共豊富な遺伝子をビニングすることに基づく方法を使用した。以下では、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対する抗体に基づく治療に対する患者の反応に役割を果たす可能性が高いと同定された種の一部は、新たに同定された種であり、公的データベースではまだ正確には参照されていない。同定された種（新しく同定された種及び既に参照されている種に非常に近い種の両方）の各々について、本出願は、非重複配列であり、対応する種に対する存在及び相対的存在量を評価するためにトレーサー遺伝子として単独又は組み合わせて用いることができる５０の細菌遺伝子のセットを開示する。もちろん、種が、本明細書に開示された一組の非重複遺伝子によって、又はその後、それらのさらなる同定及び／又はデータベースへの包含によって同定されると、当業者は、例えば、本出願に開示された５０個の配列と同時変動する他の非重複遺伝子のコピー数を測定することによって、又は核酸試料中ではなくタンパク質レベルでこの種の特徴を同定することによってさえ、任意の適切な手段によって、それらの相対的存在量を評価することができる。したがって、本発明は、対応する種の相対的存在量を測定するための開示された配列の使用に限定されない。
【００１９】
ある特定の細菌の「相対的存在量」は、この細菌種に属する細菌生態系全体の画分と定義される。本テキスト全体を通して、すべての相対的存在量は閉じた区間［０：１］内で表される。ここで、１は単一の細菌種（すなわち、相対的存在量が１に等しい細菌種は、試料中に存在する細菌の１００％が考慮される種であることを意味する）に利用可能な最大画分を示す。ＮＧＳ法では、細菌種の相対的存在量は、選択された種の読みの数を、細菌群集全体を表す読みの総数で割ったものとみなす。ｑＰＣＲ法では、細菌種の相対的存在量を、その種ＸのΔＣｔ値（Ｘに特異的な１対のプライマーで増幅）を総細菌のΔＣｔ値で除した値（試料中に存在するすべての真正細菌を捕捉することができるユニバーサルプライマー対、ＰＲＫ３４１Ｆ及びＰＲＫ８０６Ｒのプライマー、又は２７Ｆ及び１４９２Ｒのプライマーからなる対で増幅）とみなす。
【００２０】
「予測可能性」は、選択された細菌種に基づいてロジスティック回帰を用いて行われた全体モデルの予測可能性を表す。予測可能性は、閉じた区間［０：１００］内のパーセンテージ値として表される。
【００２１】
「成功率」は、５倍のクロスバリデーション後のＮＲ又はＲが認められた対象の割合であり、モデルの予測可能性とは異なる。
【００２２】
必要に応じて、本テキストの後半で、他の定義を提供する。
【００２３】
本発明は、腎細胞癌を有する被験体が、ＩＣＩによる癌治療、より具体的には、免疫チェックポイントブロッカーＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対する抗体（又は他の阻害分子）による治療から、単独で、又はＣＴＬＡ４及び／又は上述のような他の薬物と共に、有益であるかどうかをインビトロで決定する方法に関する。応答者（ＮＲ）又は応答者（Ｒ）のステータスは、次の工程に従って確立される：
（ｉ）前記被験体の糞便試料（又は回腸又は結腸粘膜試料）から、閉鎖区間［０：１］内に発現した一連の細菌種の相対的存在量に基づいて「存在量パターン」を得る。
（ｉｉ）得られた存在量パターンを用いて、本出願で提案された相補的モデルの１つ（又は複数）を用いて、対象が治療に反応しない（ＮＲ）又は反応しない確率を計算する。
【００２４】
上述したように、本発明は、ＮＧＳ（任意の過去又は将来のＮＧＳプラットフォームを通じて、市場で入手可能な第１世代から最後の世代まで、及び開発中のものを通して、ファストック、ＢＡＭ、ＳＡＭ、又は他の種類のファイル拡張として提供される任意のＮＧＳ出力ファイルを使用して）又は任意の他の技術、例えば、ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）及びマイクロアレイなど、本明細書に提供される配列又は任意の他の共変配列を使用して、選択された細菌種の相対的存在量を発現するための、任意の他の技術によって得られる、細菌種の相対的存在量を測定するために使用される技術によって制限されないことに留意することが重要である。相対的存在量が遺伝学的分析によって評価される場合、データは、好ましくは、下記の材料及び方法に記載されるバイオインフォマティクスのパイプラインに準拠するために、ショットガン配列決定に由来し、１６Ｓ標的配列決定に由来しない。
【００２５】
第１の態様によれば、本発明は、腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する個体が、以下の工程を含む、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療などのＩＣＩベースの治療に応答する可能性があるかどうかをインビトロで決定する方法に関する。
（ｉ）前記個体の糞便試料から、以下からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む一組の細菌種の相対的存在量に基づいて存在量パターンを得る。
【００２６】
【表１−１】
2022502038.tif 000002
【００２７】
【表１−２】
2022502038.tif 000003
【００２８】
（ｉｉ）１つ又は複数の予め定められた方程式を用いて、各々が、前記細菌種のセットから少なくとも８つの細菌種について得られたモデルに対応し、前記個体がＩＣＩに基づく治療に反応する確率（ＰＲ）又は前記個体がＩＣＩに基づく治療に抵抗する確率（ＰＮＲ）を計算する。
【００２９】
上記方法において、「一組の細菌種の相対的存在量に基づく存在量パターン」は、例えば、前記相対的存在量のベクターの形態であり得る。この存在量パターンは、その方法を実行する人物（例えば、臨床医）によって実行可能プログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳ環境）に挿入され、対象のＮＲ又はＲ確率パーセントを得る。
【００３０】
下記の実験的部分に記載されるように、いくつかのモデルは、代表的なコホートの臨床データから得られ、個体について、治療に反応する（又は反応しない）確率を評価することができる。実験部分では、１２の可能なモデルについて詳細に説明する。これらのモデルは、異なる戦略に基づいているが、いずれも非常に良好な予測可能性と成功率を提供する。
【００３１】
上の表１で「良好な細菌」として同定された細菌種の過剰表現、及び／又は同表で「悪い細菌」として同定された細菌種の過少表現は、個体が治療に反応する可能性が高いことを示し、一方、上の表１で「悪い細菌」として同定された細菌種の過剰表現、及び／又は同表で「良好な細菌」として同定された細菌種の過少表現は、個体が治療に対する不良な応答者である可能性が高いことを示すことを念頭に置いて、他のモデルを使用することも可能である。細菌種が糞便試料中に過剰に存在するか、又は過少に存在するかを評価するために、その相対的存在量は、正常／健康志願者（すなわち、癌を有していない個人）における同じ細菌種の相対的存在量に対応する対照値と比較される。対照群のボランティアでは検出されなかった細菌種については、細菌の存在のみが過剰表現とみなされる。式は、各種の過剰表現又は過小表現の予測値を「重み付け」するために使用され、患者がＩＣＩに基づく治療に反応する確率（ＰＲ）、又は患者がＩＣＩに基づく治療に抵抗する確率（ＰＮＲ）をより正確に計算するために使用される。
【００３２】
工程（ｉｉ）において、いくつかの方程式を使用することができ、各方程式は、工程（ｉ）に列挙されたセットからの８個の細菌のサブセットに基づくモデルに対応する。次に、臨床医は、これらの方程式の各々で得られた結果を組み合わせて、患者のＲ又はＮＲ状態をより正確に予測する。
【００３３】
上記方法の特定の実施形態によれば、工程（ｉｉ）で使用される少なくとも１つの方程式は、該個体の糞便試料中に存在する少なくとも８つの細菌種のセットに関するモデルに対応する。しかし、試料中に全部存在しない８種類の細菌に基づくモデルも、特に１つ又は複数のモデルに組み合わせた場合に使用することができる。
【００３４】
上記方法の別の特定の実施形態によれば、工程（ｉｉ）で使用されるモデルは、少なくとも６５％の全体的な予測可能性及び少なくとも７０％の成功率をもたらす。モデルの性能は、それが得られたコホートの代表性とモデルを構築するために用いた戦略の妥当性に依存する。統計の当業者は、モデルの全体的な予測可能性及び成功率を容易に計算し、それが必要な予測可能性及び成功率基準を満たすか否かを判断することができる。
【００３５】
上記方法の別の特定の実施形態によれば、工程（ｉｉ）で得られた確率スコアは、それが７５％（固定した閾値）を超える場合、及び／又は使用した異なるモデル間で一致する場合、常に抗生物質の使用（既知又は未知）を考慮に入れて、臨床的に意味があると解釈される。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、上記方法は、動物モデルに基づいて、ＲＣＣ患者からの糞便試料から、前記患者がＩＣＩによる治療に対して良好な応答者である可能性が高いかどうかを決定するための別の方法と組み合わされる。このような方法は、発明者らのチーム（ＷＯ２０１６／０６３２６３）からの先の出願において既に記載されており、（ｉ）患者からの糞便微生物移植（ＦＭＴ）を無菌（ＧＦ）モデル動物（例えば、ＧＦマウス）に実施する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）少なくとも７〜１４日後に、前記マウスに移植可能な腫瘍モデルを接種する工程、（ｉｉｉ）接種されたマウスをＩＣＩで処置する工程、及び（ｉｖ）処置された動物における腫瘍サイズを測定する工程を含む。工程（ｉｖ）の結果は、前記治療に対する前記患者に対して期待され得る反応を示す。動物で得られた結果が、モデルによって予測されるＮＲ又はＲの状態（確率Ｘ％）と異なる場合、動物モデルによる結果が臨床家の結論において優勢となる。
【００３７】
過去２ヶ月間の個体の抗生物質レジメン曝露が不明である場合、本発明の方法は、好ましくは、工程（ｉ）において、以下からなる群から選択される少なくとも８つの細菌種を含む一組の細菌種を用いて実施される。
【００３８】
【表２】
2022502038.tif 000004
【００３９】
過去２ヵ月間の抗生物質レジメン曝露が不明である患者のＲ又はＮＲ状態（最良の転帰基準）を評価するための方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）で１、２又は３の方程式が使用され、これは、ＣＡＧ番号により同定される以下の細菌種のセットについて得られるモデルに対応する。
【００４０】
【表３】
2022502038.tif 000005
【００４１】
上記方法の好ましい態様によれば、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する。しかし、たとえ少数の細菌が存在しなくても、モデルを実行することができる。このような場合、工程（ｉｉ）において、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの方程式を用いることが好ましい。
【００４２】
下記の実験部に示されるモデル１．２、２．２及び／又は３．２に基づく上記方法の特定の実施形態によれば、前記個体が治療（ＰＲ）に応答する確率を計算するための方程式は、以下の通りである。
【００４３】
【数１】
2022502038.tif 000006
【００４４】
式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は次の回帰係数である。
【００４５】
【表４】
2022502038.tif 000007
【００４６】
当然、これらの係数は、当業者によって、他の臨床データ（すなわち、本発明者らが使用したデータに加えて、又は代替して、他のコホートから得られた臨床データ）から出発して、本出願に記載されたものと同じ戦略を実行することによって、又は単に、ロジスティック回帰（方法を参照のこと）で使用された１００００回の繰り返しによって、各係数の弱い「浮動ランダム性」が毎回保証され、０．２ユニットを超えないことさえ、精緻化され得る。また、細菌種の相対的存在量を測定するために異なる技術を用いる場合（例えば、ＭＧＳ分析の代わりにｑＰＣＲを用いる場合）、係数は異なる可能性がある。重要なことは、異なる技術を用いても、回帰係数は、それらの正符号又は負符号を保持し、これは、全体モデルに対する明確なＣＡＧ種の正又は負の寄与を意味する。
【００４７】
患者が過去２ヶ月間に抗生物質を服用しなかった場合、本発明に係る方法は、好ましくは、工程（ｉ）において、以下からなる群から選択される少なくとも８つの細菌種を含む細菌種のセットを用いて実施される。
【００４８】
【表５】
2022502038.tif 000008
【００４９】
過去２ヵ月間に抗菌薬を服用しなかった患者のＲ又はＮＲ状態（最良の転帰基準）を評価する方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）において、１、２又は３の方程式が使用され、その各方程式は、ＣＡＧ番号により同定される、以下の細菌種のセットについて得られたモデルに対応する。
【００５０】
【表６】
2022502038.tif 000009
【００５１】
上記方法の好ましい態様によれば、使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する。しかし、たとえ少数の細菌が存在しなくても、モデルを実行することができる。このような場合、工程（ｉｉ）において、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの方程式を用いることが好ましい。
【００５２】
下記の実験部に例示されるモデル４．２、５．２及び／又は６．２に基づく上記方法の特定の実施形態によれば、処理に対する前記個々の耐性（ＰＮＲ）又は応答（ＰＲ）の確率を計算するための方程式は、以下の通りである。
【００５３】
【数２】
2022502038.tif 000010
【００５４】
式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は以下の回帰係数である。
【００５５】
【表７】
2022502038.tif 000011
【００５６】
上述のように、これらの係数は、いくつかの理由で精緻化することができ、また、細菌種の相対的存在量を測定するために異なる技術を用いる場合（例えば、ＭＧＳ分析の代わりにｑＰＣＲを用いる）には、変化させることもできる。
【００５７】
上記のモデル１．２、２．２、３．２、４．２、５．２及び６．２は、最良の転帰の基準を用いて得られている。治療に最初に反応したが、数ヵ月後に再発した患者を奏効例とみなした。ある個体が、少なくとも６か月の無増悪期間（ＴＴＰ）として定義される、治療から長期的な利益を得る可能性があるかどうかを評価するために、本発明者らは、応答者のうち６か月を超える（ＳＤ＞６か月）安定した疾患のみを考慮することにより、追加モデルを得た（実験部分の結果２）。これらのモデルは、微生物叢組成の部分的に異なるサブセットに基づいている。
【００５８】
過去２ヵ月間の抗生物質レジメン曝露が不明である個体が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療による長期的利益を有する可能性があるかどうかを評価するために、本発明の方法は、好ましくは、工程（ｉ）において、以下からなる群から選択される少なくとも８つの細菌種を含む一組の細菌種を用いて実施される。
【００５９】
【表８】
2022502038.tif 000012
【００６０】
過去２ヶ月間の抗生物質投与レジメン曝露が不明である患者のＲ又はＮＲ状態（ＴＴＰ＞６ヶ月基準）を評価する方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）で１、２又は３の方程式が使用され、これは、ＣＡＧ番号により同定される以下の細菌種のセットについて得られるモデルに対応する。
【００６１】
【表９】
2022502038.tif 000013
【００６２】
上記方法の好ましい態様によれば、工程（ｉｉ）で使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する。しかし、たとえ少数の細菌が存在しなくても、モデルを実行することができる。このような場合、工程（ｉｉ）において、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの方程式を用いることが好ましい。
【００６３】
下記の実験部分に例示されるモデル７．２、８．２及び／又は９．２に基づく上記方法の特定の実施形態によれば、前記個体が治療に対して抵抗する確率（ＰＮＲ）を計算するための方程式は、以下の通りである。
【００６４】
【数３】
2022502038.tif 000014
【００６５】
式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は続く回帰係数である。
【００６６】
【表１０】
2022502038.tif 000015
【００６７】
すでに述べたように、これらの係数は、細菌種の相対的存在量を測定するために異なる技術を用いた場合には、いくつかの理由から精緻化することができ、また変化させることもできる。
【００６８】
患者が過去２ヶ月間に抗生物質を服用しなかった場合、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療からの長期的利益（ＴＴＰ＞６ヶ月）を有する確率を評価するための本発明による方法は、好ましくは、工程（ｉ）において、以下からなる群から選択される少なくとも８種の細菌種を含む細菌種の組を用いて実施される。
【００６９】
【表１１】
2022502038.tif 000016
【００７０】
過去２ヵ月間に抗生物質を服用しなかった患者のＲ又はＮＲ状態（ＴＴＰ＞６ヵ月基準）を評価する方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）では、１、２、又は３つの方程式が使用され、各方程式は、ＣＡＧ番号により同定される、以下の細菌種のセットについて得られたモデルに対応する。
【００７１】
【表１２】
2022502038.tif 000017
【００７２】
上記方法の好ましい態様によれば、工程（ｉｉ）で使用される少なくとも１つの方程式は、個体の試料中にすべて存在する一組の細菌で得られるモデルに対応する。しかし、たとえ少数の細菌が存在しなくても、モデルを実行することができる。このような場合、工程（ｉｉ）において、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの方程式を用いることが好ましい。
【００７３】
下記の実験部分に例示されるモデル１０．２、１１．２及び／又は１２．２に基づく上記方法の特定の実施形態によれば、前記個体が治療（ＰＮＲ）に抵抗する、又は応答する確率を計算するための方程式は、以下の通りである。
【００７４】
【数４】
2022502038.tif 000018
【００７５】
式中、Ｘｊ（ｊ＝１〜８）は個体の試料中で測定された細菌種の相対的存在量であり、βｊ（ｊ＝１〜８）は以下の回帰係数である。
【００７６】
【表１３】
2022502038.tif 000019
【００７７】
他のモデルについては、これらの係数は、いくつかの理由から精緻化することができ、また、細菌種の相対的存在量を測定するために異なる技術を用いる場合には、変化させることさえできる。
【００７８】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、糞便試料は、任意のＩＣＩ、例えば抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体の最初の投与前に得られる。
【００７９】
別の特定の実施形態によれば、患者は、患者のＲＣＣを治療するために、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体に基づく治療とは異なる第一選択の治療を既に受けていた。しかしながら、本発明の方法は、二次治療としてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療を受けている患者に限定されず、本開示の方法は、単独で、又は他の抗腫瘍薬（化学療法、又は上記のような抗ＣＴＬＡ−４のような他のＩＣＩ）と組み合わせて、一次治療としてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療を受けているＲＣＣ患者の応答者又は非応答者の状態を評価するために使用することもできる。
【００８０】
別の特定の実施形態によれば、患者に投与される抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療は、例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブのような抗ＰＤ１抗体、又は例えば、アテゾリズマブ又はｄｕｒｖａｌｕｍａｂのような抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療である。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、癌患者が、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体ベースの治療の投与前及び／又はこの治療中に、細菌補償を必要とするかどうかを決定するためのセラノスティック方法に関し、上記開示の方法によって、患者がそのような治療に対して良好な応答者である可能性が高いかどうかを評価することを含み、患者が良好な応答者である可能性が高いと同定されない場合、患者は細菌補償を必要とする。
【００８２】
本発明のこの態様によれば、細菌補償は、糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）、１つ又は複数のドナーからの微生物叢（例えば、治療に対する応答者からの）を用いること、この状況で有益であることが知られている細菌株を多量に含むこと、又は細菌組成物の投与のいずれかによって行うことができる。本発明者らは、このような補償のために使用することができ、患者が治療に応答する能力を回復することができる細菌組成物を既に記載した（例えば、ＷＯ２０１６／０６３２６３及びＷＯ２０１８／１１５５１９）。初期ＮＲ状態の患者に有益であり得る細菌株の非限定的例は、Enterococcus hirae、Akkermansia muciniphila、Blautia strains、Coprococcus comes strains、Alistipes shahii、他のAlistipes species（例えば、Alistipes indistinctus及び／又はonderdonkii及び／又はfinegoldii)、Ruminococcacae、Clostridiales species、Bacteroidales species、Actinobacteria、Coriobacteriales species、Methanobrevibacter smithii、Burkholderia cepacia、Bacteroides fragilis、Actinotignum schaalii、ならびに以下の追加の細菌：
・Christensenella minuta種のClostridiales細菌；
・Dielma fastidiosa種又はErysipelatoclostridium ramosum種のErysipelotrichia；
・Eubacterium limosum；
・Bacteroides salyersiae種及び／又はBarnesiella intestinihominis種のBacteroidales細菌；
・Collinsella intestinalis種及び／又はCollinsella tanakaei種のCoriobacteriales細菌；
・Flavonifractor plauti種のFirmicutes細菌。
【００８３】
本発明の方法によって評価される初期ＮＲ状態を有する患者に有益であり得る組成物の例は、以下の通りである：
・以下を含む組成物：
（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で２０１３年１１月７日にＩ−４８１５番号で寄託されたEnterococcus hirae株１３１４４、ＣＮＣＭで２０１７年８月３１日にＩ−５２２４番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＩ−５２６０番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＩ−５２６１番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ１１、及びそれらの混合物からなる群から選択されるEnterococcus hirae；及び
（ｉｉ）ともにＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｓｏｕｃｈｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｕｎｉｔｅ  ｄｅｓ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ（ＣＳＵＲ）で寄託されたAkkermansia muciniphila株ｐ２２６１及びｐ３４１５、及びそれらの混合物からなる群から選択されるAkkermansia muciniphila；
（ｉｉｉ）Eubacterium limosum。
【００８４】
・以下を含む組成物：
（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で２０１３年１１月７日にＩ−４８１５番号で寄託されたEnterococcus hirae株１３１４４、ＣＮＣＭで２０１７年８月３１日にＩ−５２２４番号寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ１１、及びそれらの混合物からなる群から選択されるEnterococcus hirae；及び
（ｉｉ）Barnesiella intestinihominis。
【００８５】
・以下を含む組成物：
（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で２０１３年１１月７日にＩ−４８１５番号で寄託されたEnterococcus hirae株１３１４４、ＣＮＣＭで２０１７年８月３１日にＩ−５２２４番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ１１、及びそれらの混合物からなる群から選択されるEnterococcus hirae；及び
（ｉｉ）Christensenella minuta。
【００８６】
・以下を含む組成物：
（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で２０１３年１１月７日にＩ−４８１５番号で寄託されたEnterococcus hirae株１３１４４、ＣＮＣＭで２０１７年８月３１日にＩ−５２２４番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ７、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６０番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ４、ＣＮＣＭで２０１７年１１月２７日にＣＮＣＭ  Ｉ−５２６１番号で寄託されたEnterococcus hirae株ＩＧＲ１１、及びそれらの混合物からなる群から選択されるEnterococcus hirae；及び
（ｉｉ）Actinotignum schaalii。
【００８７】
本発明による方法を実施するように設計された核酸マイクロアレイもまた、本発明の一部である。そのような核酸マイクロアレイは、前記方法の工程（ｉ）で検出されるべき微生物種の各々に特異的な核酸プローブ（すなわち、表１に列挙されたものの中から選択される少なくとも８種）を含む。特定の実施形態では、核酸マイクロアレイは、配列番号１〜２９５０から選択される少なくとも１つの配列に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。例えば、前記マイクロアレイは、少なくとも８個のオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは、表１に列挙された異なる種の１つの配列に対して特異的である。本発明のマイクロアレイは、もちろん、配列番号１〜２９５０の配列に特異的なより多くのオリゴヌクレオチド、例えば、少なくともｎｘ９６オリゴヌクレオチドを含み、本明細書に記載された１２のモデルに対応する１２セットのｎｘ８オリゴヌクレオチドに分割され、ｎは、１つの特定の細菌種の存在を特異的に評価するために使用されるオリゴヌクレオチドの数に対応する１〜２５を含む整数である。本発明によるマイクロアレイは、さらに、少なくとも１つの対照細菌種の少なくとも１つの遺伝子を検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。便利な細菌種は、例えば、その存在量がＲ又はＮＲ状態を有する個体間で変化しない細菌種であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約５０塩基長である。配列番号１〜２９５０のいずれかの遺伝子に特異的な適当なマイクロアレイオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知のマイクロアレイオリゴヌクレオチド設計の任意の方法を用いて、各遺伝子のゲノム配列に基づいて設計することができる。特に、マイクロアレイオリゴヌクレオチドの設計のために開発された任意の利用可能なソフトウェア、例えば、オリゴアレイソフトウェア、ゴアレイソフトウェア、アレイデザイナーソフトウェア、プライマー３ソフトウェア、又はプロミドソフトウェアを使用することができ、これらは全て当業者に公知である。
【００８８】
上述のように、列挙された細菌種の相対的存在量は、本明細書中で使用されるメタゲノミクス分析とは異なる技術によって、特に当業者がどの細菌種が測定されるべきかを知っている場合に、測定することができる。この目的に使用できる特定の技術は、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）である。ＰＣＲに基づく技術は、測定される配列に特異的であるように設計された増幅プライマーを用いて実施される。したがって、本発明は、上記方法を実施するのに適したプライマーのセット、すなわち、上記方法の工程（ｉ）で検出される微生物種の各々に特異的な配列を増幅するためのプライマー対を含むプライマーのセット（すなわち、表１に列挙されたものの中から選択される少なくとも８種）にも関する。このような一組のプライマーは、少なくとも１６個のプライマーを含むが、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００以上のより多くのプライマーを含むことができる。特定の実施形態によれば、一組のプライマーは、配列番号１〜２９５０の中で選択された配列の一部を特異的に増幅する少なくとも１つのプライマー対を含む。もちろん、本発明によるプライマーセットは、有利には、それぞれ、配列番号１〜２９５０の間で選択された配列の一部を特異的に増幅するプライマーのペアの２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２００、３００、５００、１０００以上を含むことができる。
【００８９】
本発明の他の特徴は、本発明の枠組みにおいて実施され、その範囲を制限することなく、必要な実験的裏付けを提供する生物学的アッセイの以下の記載の過程においても明らかになる。
【実施例】
【００９０】
材料及び方法
糞便試料のメタゲノム解析
ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓ（フランス、Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ）で開発された定量的メタゲノミクスパイプラインを用いて、ＲＣＣ腸内微生物叢の種レベルの記述に到達した。自動化プラットフォーム（ＳＡＭＢＯ、ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓ）を介して６９の糞便サンプルからＤＮＡを抽出し、イオンプロトンシーケンサーを用いてショットガンシーケンシングを行い、２，０００万を超える短いＤＮＡ配列読取りを行った（ＭｅｔａＱｕａｎｔプラットフォーム、ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓ）。読み取り値を濾過（Ｑ＞２５）し、ヒトの読み取り値として可能性のある汚染物質を除去するために洗浄した。次いで、高品質（ＨＱ）リードをＭｅｔａＨＩＴ  ｈｓ ９．９Ｍ遺伝子カタログに対してマッピングし、２段階手順：１）一意的にマッピングされたリードを使用する；２）一意的なリードに基づくマッピング比に従って共有リードを帰属させる。遺伝子対立遺伝子変異及びカタログ自体の非重複性を克服するために、マッピングの同定閾値を＞９５％に設定した。ＨＱの読み取り値は、シークエンシングの深さを補正するために、各サンプルに対して１，３００万でダウンサイジングされ、次いで、ＲＰＫＭ（マップされた読み取り１００万個あたりのキロベースあたりの読み取り）法によって正規化された。このようにして、遺伝子頻度のプロファイルマトリックスが得られ、ＭｅｔａＧｅｎｏＰｏｌｉｓで開発された一連のＲパッケージであるＭｅｔａＯＭｉｎｅＲの入力ファイルとして使用された。
【００９１】
ＲＣＣ糞便試料中の微生物の種レベルの記述を達成するために、ｈｓ ９．９Ｍカタログは１４３６のＭｅｔａＧｅｎｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ（ＭＧＳ）にクラスター化され、数百の試料間で同時多量に変動し、最終的には同じ微生物種に属する約５００以上の遺伝子であった。ＭＧＳの分類学的アノテーションは、以前に配列決定された生物との遺伝子相同性を用いて、ｎｔ及びｗｇｓのＮＣＢＩデータベースに対してＢＬＡＳＴｎを用いて行った。各ＭＧＳの分類学的割り当て後、５０の共存在遺伝子（ＣＡＧ）の周波数プロフィールのマトリックスを正規化ＭＧＳ平均シグナルを用いて構築し、従って、サンプル内の各ＭＧＳの合計は１に等しい結果となった。このアプローチを用いて、各種は明確なＣＡＧ番号に割り当てられた。
【００９２】
統計分析
多変量統計を、消化管微生物組成と多様性を記述するために、頻度プロファイルのマトリックス上で使用した。Ｐｙｔｈｏｎ  ２．７及び関連する統計／図形ライブラリ（Ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ、Ｓｃｉｋｉｔ  ｌｅａｒｎ、Ｐａｎｄａｓ、Ｎｕｍｐｙ）を用いて、ペアワイズ分析、線形判別分析効果サイズ（ＬＥｆＳｅ）及びボルケーノプロットを通して、すべてのＭＧＳを比較した。０．０５以下のＰ値を統計学的に有意とみなした。ボルケーノプロットは、各細菌種について計算して作成した：ｉ）Ｒ対ＮＲの平均相対存在量（ｘ軸）の間の倍数比（ＦＲ）のｌｏｇ２、及びｉｉ）絶対値（ｙ軸）の相対存在量で計算したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定から導出したＰ値のｃｏ−ｌｏｇ１０。ボルケーノのグラフ表示を緩和するために、ＴＴＰ６で選択したＰ値は０．７以下であった。ＬＥｆＳｅプロットは、ＬＥｆＳｅパイプライン由来の出力ファイルについてＰｙｔｈｏｎ  ２．７を用いて作成し、ＬＤＡスコアが２以上のすべての種をその後の分析のために検討した。
【００９３】
予測モデルの構築
モデルを構築するために使用した細菌種を選択するために二重戦略を実施した。
【００９４】
最初のもの（「ヒト指向」）は、以下に依存する：ｉ）選択された細菌種を用いて、最良のＡｒａｅ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値を与えるコンソーシアムを探し、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）分類器を実装する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を実行すること；ｉｉ）ロジスティック回帰分類器及びＲＦＥＣＶ（クロスバリデーションを伴う再帰的特徴除去）特徴選択を構築すること；ｉｉｉ）元のデータセットから得られた列車／試験サブセットを用いて、ＲＯＣ曲線及び混乱行列として測定を実行すること。
【００９５】
２番目の戦略（「機械学習」）は、ｉ）ロジスティック回帰分類器とＲＦＥＣＶ特徴選択をすべての細菌種（置換なし）に構築し、より高いランク（１に等しい）を有するものを選択し、ｉｉ）ＲＦＥ（再帰的特徴除去）の手段により新しい特徴選択を行い、最も高いランクを有する８種を選択し、ｉｉｉ）選択された８細菌種に対して新しいロジスティック回帰分類器＋ＲＦＥＣＶ特徴選択を再構築し、ｉｖ）元のデータセットから得られた列車／試験サブセットを用いてＲＯＣ曲線及び錯乱行列として測定を実行することに依存する。
【００９６】
１番目と２番目の戦略の主な違いは、１番目と２番目の戦略は、最初のデータセットに存在する全ての細菌種の組み合わせが、最も高いＡＵＣに基づいてそれらのサブグループを選択する（「コンソーシアム」と呼ばれる）ことを可能にする一方、２番目の戦略は、ロジスティック回帰モデルの自然な収束のために単一種を選択することができ、最大の予測可能性に到達するために全ての変数を選択することができるということである。
【００９７】
ロジスティック回帰分類器と特徴選択モデルを構築するための実装は、Ｐｙｔｈｏｎ（バージョン２．７）で、Ｓｃｉｋｉｔ  Ｌｅａｒｎモジュール（バージョン０．１９．１）からの「ＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ」、「ＲＦＥ」及び「ＲＦＥＣＶ」の方法を用いて行われた。ＳＶＭ分類子（Ｃ−Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を構築するための実装は、Ｓｃｉｋｉｔ  Ｌｅａｒｎモジュール（バージョン０．１９．１）からの方法ＳＶＣを使用してＰｙｔｈｏｎ（バージョン２．７）で作成された。最初の戦略におけるＲＯＣ曲線のための組み合わせの実装は、内蔵Ｐｙｔｈｏｎ  ２．７として存在するｉｔｅｒｔｏｏｌｓモジュールからの「組み合わせ」法を用いてＰｙｔｈｏｎ（バージョン２．７）でなされた。
【００９８】
ロジスティック回帰係数βは、決定関数に定数（切片としても知られる）を加えない；１００００に等しい最大反復；リブリニアソルバ（Ｌ２ペナルティ付き）を有するロジスティック回帰分類器によって計算した。ＲＦＥＣＶ特徴選択モデル（工程＝１、３に等しいクロスバリデーション、スコアリング精度）を、ロジスティック回帰推定量（切片なし、１００００ｍａｘ反復、ｌｉｂｌｉｎｅａｒ  ｓｏｌｖｅｒ）でＰｙｔｈｏｎで実装し、区間［１：（ｎ種−１）］内のランキングを提供し、１に等しいランクを有する種のみを選択して、全ての細菌種に対して再帰的特徴選択を行うために使用した。ＲＦＥ特徴選択モデル（工程＝１、特徴選択＝８）は、ＲＦＥＣＶの同じ推定量（ロジスティック回帰、切片なし、１００００最大反復、リブリン耳ソルバ）を持つＰｙｔｈｏｎで同様に実装された。
【００９９】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、ＳＶＭ分類器（線形カーネル）を用いてＰｙｔｈｏｎ  ２．７で構築され、選択された細菌種又はコンソーシアムの実際の予測的意味を評価するために使用された。そのような選択を達成するために、２つの異なるアプローチを用いた：１）ＬＥｆＳｅ分析から回収した種（ＬＤＡスコア≧２）及び可能性のあるすべての組み合わせ（２ｘ２、３ｘ３、４ｘ４、５ｘ５など）内で組み合わせた。２）すべての種を考慮し、最も良好なＡＵＣを有する最初の５種をコンソーシアムに統合した。ＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）、特異度及び感度は、最良の組み合わせごとに計算し、ＲＯＣ曲線及び表データとして報告した。ノイズを加えずに、５倍のクロスバリデーションを使用した。平均相対存在量（±平均標準誤差）、フォールド比（ＦＲ）、ＦＲのＬｏｇ１０及びコホート比較のＰ値（Ｒ対ＮＲ、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）も報告された。
【０１００】
前述の方法に従い、細菌種を以下の方法で選択した：ｉ）最初の戦略では、全ての利用可能な種、特にＬＥｆＳｅ由来の種の全ての組合せを考慮して、ＮＲ及びＲ状態の両方について、最高ＡＵＣ値を有する各結果１、結果２、ＴＴＰ３及びＴＴＰ６時点について「コンソーシアム」を選択した；ｉｉ）２番目の戦略では、結果１及び結果２について、ＲＦＥＣＶ及びＲＦＥランクが負及び正のロジスティック回帰係数（β）に関わらず、ＲＦＥランクが１に等しい細菌種を選択した。
【０１０１】
上述の２つの戦略を考慮して、式［２］で使用される回帰係数（β）を計算するために、両者に対して標準化生データ（平均と単位分散へのスケーリングの除去）上にロジスティック回帰分類器を実施した。したがって、各モデルに対する各選択細菌種の相対的寄与をβ係数で加重し、式［２］に入れて、式［１］を通して、特定の新規対象の結果の推定（確率％）を予測した。
【０１０２】
【数５】
2022502038.tif 000020
【０１０３】
いずれの戦略についても、２つの特徴選択モデル（ＲＦＥＣＶ、次いでＲＦＥ）を実施し、８種で選択された種の数を精緻化した。この数は、将来実施されるべき有用なものであり、臨床的に実用化される予定の診断キットである。最終モデルの評価（８種類の細菌種の３つの異なるセットに基づいて構築）は、元のデータセット（Ｐｙｔｈｏｎ  ２．７とＳｃｉｋｉｔ  ｌｅａｒｎ  ０．１９で、ｔｒａｉｎ ｔｅｓｔ ｓｐｌｉｔ法を通して実装）の集合列／テストサブセットを用いて、ＲＯＣ曲線と混乱行列としての計量を通して行われた。
【０１０４】
結果１では、上述の実施形態、方法及び戦略をすべて考慮し、ロジスティック回帰分類器の二値性／相補性を考慮して、本発明では、明確な新規主題ＪＤのＮＲ又はＲ状態を予測するための４つの方程式（［３］、［４］、［６］、［７］）を提案する。そのうちの２つ（［３］、［４］）は未知の抗菌薬のレジメン／治療状態の可能性を考慮に入れており、残りの２つ（［６］、［７］）は患者が過去２ヵ月間抗菌薬を服用しなかったと考えている。
【０１０５】
対象コホート内の変動の自然発生源（糞便試料採取、糞便のコンシステンシー、試料保存、配列決定バイアスなど）に由来し、過少表現された細菌種の相対的存在量に影響を及ぼす可能性のある警告を回避するために、本発明者らは、未知の抗生物質治療を受けた対象（［５］）及び過去２ヵ月間に抗生物質を服用しなかった対象（［８］）について、間隔［０：１］（又は間隔［０：１００］で表した場合は０．１％）で表した場合に０．００１以上の平均相対的存在量を有する種のみに基づいて、２つのさらなる方程式（［５］、［８］）を構築した。これらの種のパターンは、上記のようにモデル化する第２の戦略を受けた。
【０１０６】
結果２では、上述の実施形態、方法及び戦略をすべて考慮し、ロジスティック回帰分類器の二値性／相補性を考慮して、本発明では、明確な新規主題ＪＤのＮＲ又はＲ状態を予測するための４つの方程式（［９］、［１０］、［１２］、［１３］）を提案する。そのうちの２つ（［９］、［１０］）は未知の抗菌薬レジメン／治療状態の可能性を考慮に入れており、残りの２つ（［１２］、［１３］）は、患者が過去２ヵ月間抗菌薬を服用しなかったと考えている。
【０１０７】
対象コホート内の変動の自然発生源（糞便試料採取、糞便のコンシステンシー、試料保存、配列決定バイアスなど）に由来し、過少表現された細菌種の相対的存在量に影響を及ぼす可能性のある警告を回避するために、本発明者らは、未知の抗生物質治療を受けた対象（［１１］）及び過去２ヵ月間に抗生物質を服用しなかった対象（［１４］）について、間隔［０：１］（又は間隔［０：１００］で表した場合は０．１％）で表した場合に０．００１以上の平均相対存在量を有する種のみに基づいて、２つのさらなる方程式（［１１］、［１４］）を構築した。これらの種のパターンは、上記のようにモデル化する第２の戦略を受けた。
【０１０８】
実施例１：ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に従った臨床転帰と関連するメタゲノミクスベースのＧＯＭＳ（図１）
ショットガン法による定量的メタゲノミクスを用いて消化管微生物叢の組成を調べ、１サンプルあたり２０００万以上の短いＤＮＡ配列読み取りに到達し、その結果を９９０万の遺伝子参照カタログ（J. Li, Nat. Biotechnol. 32, 834-841 (2014））で分析した。治療開始前にＲＣＣと診断された６９人の患者から全ＤＮＡを抽出した（表１）。６９名のＲＣＣ患者のうち、５８名はＡＴＢを服用せず、１１名はＭＧ分析前にＡＴＢを処方されていた。材料及び方法に記載されているように、各メタゲノム種（ＭＧＳ）は明確な共存在遺伝子プロファイル（ＣＡＧ）に割り当てられ、その後の分類学的アノテーションは以前に配列決定された生物との遺伝子相同性（ｎｔ及びＷＧＳデータベースに対するｂｌａｓｔＮを使用）に基づいて実施された。Ｒ（奏効例）は、３ヵ月を超える完全疾患又は部分疾患又は安定疾患を呈する患者と定義され、ＮＲ（非奏効例）は、進行性疾患を有する患者と定義された。
【０１０９】
【表１４】
2022502038.tif 000021
【０１１０】
（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価した最良の臨床反応に従って）全６９例の応答者（Ｒ）を非応答者（ＮＲ）から分離したところ、１０％のＦＤＲで有意差は認められなかった。
【０１１１】
不良な臨床転帰と関連するＧＯＭＳ
しかし、ＡＵＣ値０．８８２、特異度０．７７８（真の陽性例）、感度０．８６０（偽の陽性例）を有する「耐性」患者を同定できる最良の予測モデルは、ＬＥｆＳｅの組み合わせ種を考慮すると得られ、ＮＲで増加した共生体（「悪性細菌」）は以下の通りであった：
Clostridium boltae ＡＴＣＣ  ＢＡＡ  ６１３（１３倍増加）
Faecalibacterium prausnitzii ＫＬＥ１２５５−３（４．４倍増加）
Prevotella sp ＣＡＧ６１７（ＮＲにおいてのみ検出可）
Prevotella copri ＣＡＧ１６４（ＮＲにおいてのみ検出可）
Subdoligranulum sp ４ ３ ５４Ａ２ＦＡＡ（２．６倍増加）
一方、ＮＲで減少した細菌（「良好な細菌」）は以下の通りであった：
Bacteroides sp ＣＡＧ１４４（６２倍減少）
Acinetobacter ＣＡＧ１９６（３．４倍減少）
Eubacterium sp ＣＡＧ３８（２．３倍減少）
【０１１２】
カットオフ値は表２のｍｅａｎｓ±ＳＥＭに対応する。最終モデルに対してｐ値が＜０．０５の種のみを保持し、この特許で最良の結果を得るために良い細菌と悪い細菌の間の平衡を主張した。
【０１１３】
ＡＴＢを服用しなかったＲＣＣの非応答者（ＮＲ）から応答者（Ｒ）を分離した場合（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価した最良の臨床反応に従って）、ＦＤＲ  ｐ値＜０．０５で有意差を認めなかった。
【０１１４】
しかし、ＡＵＣ値０．８７９、特異度０．７０７（真陽性例）、感度０．９５０（偽陽性例）の「耐性」患者を同定できる最良の予測モデルは、ＬＥｆＳｅの組み合わせ種を考慮すると得られ、ＮＲで増加したモデルに保持された共生体（「悪性細菌」）は以下の通りであった：
Clostridium boltae ＡＴＣＣ  ＢＡＡ  ６１３（１５．７倍増加）
Prevotella sp ＣＡＧ６１７（ＮＲにおいてのみ検出可）
一方、ＮＲで減少した細菌（「良好な細菌」）は以下の通りであった：
Bacteroides sp ＣＡＧ１４４（５０倍減少）
Eubacterium sp ＣＡＧ１１５（４７倍減少）
Eubacterium siraeum sp ＣＡＧ８０（１４倍減少）
Firmicutes bacterium sp. ＣＡＧ６５ １（１．９倍減少）
【０１１５】
カットオフ値は、表１５に示す平均±ＳＥＭに対応する。最終モデルでは、ｐ値＜０．０５の種のみを維持した。本発明によれば、良好な細菌と悪い細菌の間の平衡は、最良の結果にとって重要である。
【０１１６】
最良の臨床転帰と関連するＧＯＭＳ
ＬＥｆＳｅ  ｃｏｍｂｏ種を考慮すると、ＡＵＣ値０．８６３、特異度０．７９８（真の陽性症例）、感度０．８４２（偽の陽性症例）の全患者において「反応」患者（Ｒ）を同定できる最良の予測モデルが得られた：モデルに保持された以下の有害な共生体の減少は以下の通りであった：
Clostridium boltae ＡＴＣＣ  ＢＡＡ  ６１３（１３倍増加）
Faecalibacterium prausnitzii ＫＬＥ１２５５−３（１５倍増加）
Prevotella sp ＣＡＧ６１７  （無限ＮＲにおいてのみ検出可）
Subdoligranulum sp ４ ３ ５４Ａ２  ＦＡＡ（２．６倍減少）
一方、Ｒで増加したもの（「良好な細菌」）は次の通りであった：
Bacteroides sp ＣＡＧ  １４４（６２倍増加）
Eubacterium sp ＣＡＧ３８（２．３倍増加）
Azospirillum sp ＣＡＧ  ２３９（３．８倍増加）
【０１１７】
カットオフ値は、表１５に示す平均±ＳＥＭに対応する。最終モデルのためにこれらの種（ｐ値＜０．０５）のみを保持し、この特許で最良の結果を得るために良い細菌と悪い細菌の間の平衡を主張した。
【０１１８】
ＡＵＣ値０．８４５、Ｓｐｅｃ＝０．９９０；Ｓｅｎｓ＝０．６１４のＡＴＢを摂取しなかった患者の「反応」患者（Ｒ）を同定できる最良の予測モデルは、ＬＥｆＳｅ  ｃｏｍｂｏ種を考慮すると得られ、モデルに保持された共生体は以下の通りであった。
【０１１９】
Ｒでは、以下のものが減少する：
Prevotella sp ＣＡＧ ６１７（無限、Ｒに存在しない）
Clostridium clostridioforme ２ １ ４９ＦＡＡ １（Ｒで６．３倍減少）
Ｒでは、次のものが増加する：
Bacteroides plebeius  ＣＡＧ  ２１１（Ｒで３２７倍増加）
Bacteroides coprophilus  ＤＳＭ  １８２２８  ＪＣＭ  １３８１８（Ｒのみ存在）
Eubacterium siraeum ＣＡＧ ８０（Ｒで１４倍増加）
Eubacterium sp ＣＡＧ ２０２（Ｒで５．４倍増加）
Eubacterium sp ＣＡＧ １１５（Ｒで４７倍増加）
【０１２０】
カットオフ値は、表１５に示す平均±ＳＥＭに対応する。最終モデルではこれらの種（ｐ値＜０．０５）のみを維持した。本発明によれば、良好な細菌と悪い細菌の間の平衡は、最良の結果にとって重要である。
【０１２１】
【表１５】
2022502038.tif 000022
【０１２２】
実施例２：ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に従い、ＴＴＰ＞３ヵ月に関連するメタゲノミクスベースのＧＯＭＳ（図２）
ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準（図２）に従い、ＴＴＰ＞３ヵ月と関連するメタゲノムベースのＧＯＭＳ。
【０１２３】
全６９例（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価した最良の臨床反応による）において、応答者（Ｒ、ＴＴＰ＞３ヵ月）を非応答者（ＮＲ、ＴＴＰ＜３ヵ月）から分離したところ、ＦＤＲ  ｐ値＜０．０５との有意差は認められなかった。ＡＴＢを服用しなかったＲＣＣの非応答者（ＮＲ、ＴＴＰ＜３か月）から応答者（Ｒ、ＴＴＰ＞３か月）を分離すると（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価した最良の臨床反応に従って）、ＦＤＲ  ｐ値＜０．０５で有意差を観察できなかった。
【０１２４】
しかし、多変量モデルにより、臨床的に意義のあるいくつかのＧＯＭＳを見出すことができた。
【０１２５】
ＴＴＰ＜３ヵ月に関連するＧＯＭＳ
ＲＣＣ患者を対象とした本発明者らの解析では、３ヵ月時点での耐性が最良の臨床読み取り値であった。
【０１２６】
ＡＵＣ値が０．９１３、特異度が０．７９８（真の陽性例）、感度が０．９１０（偽の陽性例）の全患者において「耐性」患者（ＮＲ）を同定できる最良の予測モデルは、ＬＥｆＳｅの併用を考慮すると得られ、ＮＲにおいて「不良細菌」が増加したとしてモデルに保持された共生体は、表１６に示すように、以下の通りであった：
Clostridium sp ＣＡＧ ７ １（ＮＲで２倍増加）
Hungatella hathewayi １２４８９３１ １（ＮＲで４７倍増加）
Prevotella sp ＣＡＧ ６１７（無限大、ＮＲでのみ検出可能）及び
Holdemanella biformis ＤＳＭ ３９８９ １（ＮＲで４８倍増加）、
一方、Azospirillum sp ＣＡＧ ２３９ではＮＲ（良好な細菌）が１１倍減少した。
【０１２７】
しかし、ＡＴＢを服用しなかった患者では、ＡＵＣが０．８８４、特異度が０．６６７、感度が１．０００であったモデルに保持された細菌のリストは次の通りであった。悪い細菌では、次のように増加する：
Clostridium bolteae ＡＴＣＣ ＢＡＡ ６１３（ＮＲで１５倍増加）
Prevotella sp ＣＡＧ ６１７（ＮＲにのみ存在）
Holdemanella biformis ＤＳＭ ３９８９ １（ＮＲで３２倍増加）及び
Faecalibacterium cf prausnitzii ＫＬＥ１２５５（ＮＲで８．８倍増加）
良好な細菌では、次のように減少する：
Eubacterium sp ＣＡＧ ３８（ＮＲで２倍減少）
Eubacterium sp ＣＡＧ １１５（ＮＲで３７倍減少）
【０１２８】
本発明者は、最終モデルにおいて、ＴＴＰ３  ＮＲの良好な細菌と悪い細菌の比を保持した（表１６、パートＢを参照）。
【０１２９】
ＴＴＰ＞３ヵ月に関連するＧＯＭＳ
ＡＵＣ＝０．８７６；Ｓｐｅｃ＝０．９９０；Ｓｅｎｓ＝０．７２７の全患者において「応答者」患者（Ｒ）を同定することができる最良の予測モデルは、ＬＥｆＳｅの併用を考慮すると得られ、Ｒにおいて「不良細菌」が減少したとしてモデルに保持された共生体は、表１６に示すように、以下の通りであった：
Clostridium bolteae ＡＴＣＣ ＢＡＡ ６１３（Ｒで９２％減少）
Clostridium sp ＡＧ ７ １（４６％減少）
Faecalibacterium cf prausnitzii ＫＬＥ１２５５ ３（８３％減少）
Prevotella sp ＣＡＧ ６１７（ＮＲにのみ存在）
Holdemanella biformis ＤＳＭ ３９８９ １（７９％減少）
Peptoniphilus sp ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ８３６ ｓｔｒ Ｆ０１４１（ＮＲにのみ存在）
一方、Azospirillum sp ＣＡＧ ２３９は、Ｒにおいて１１倍増加した（良好な細菌）。
【０１３０】
しかしながら、ＡＴＢを服用しなかった患者では、このモデルに保持されたＡＵＣ＝０．８９９；Ｓｐｅｃ＝０．９９０；Ｓｅｎｓ＝０．８３６を与えた細菌のリストは次の通りであった：
悪い細菌では、次のように減少する：
Clostridium bolteae ＡＴＣＣ ＢＡＡ ６１３（Ｒで９３．２％減少）
Clostridium ｓｐ ＣＡＧ ７ １（４４．５％減少）
Prevotella sp ＣＡＧ ６１７（ＮＲにのみ存在）
Prevotella copri ＣＡＧ １６４（ＮＲのみ存在）
Holdemanella biformis ＤＳＭ ３９８９ １（９６．９％減）
Prevotella sp ＣＡＧ ２７９ １（ＮＲにのみ存在）
Faecalibacterium cf prausnitzii ＫＬＥ１２５５（８８．６％減少）
良好な細菌では、次のように増加する：
Akkermansia muciniphila ＣＡＧ １５４（Ｒで２．５倍増加）
Eubacterium sp ＣＡＧ １１５（Ｒで３７倍増加）
【０１３１】
本発明者らは、最終モデルにおいて、ＴＴＰ３  Ｒの良好な細菌と悪い細菌の比を保持した（表１６、パートＢを参照）。
【０１３２】
【表１６】
2022502038.tif 000023
【０１３３】
実施例３：ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に従い、ＴＴＰ＞６ヵ月と関連するメタゲノミクスベースのＧＯＭＳ（図３）
全ＲＣＣ患者（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価したＴＴＰ６による）において、非応答者（ＮＲ、ＴＴＰ＜６か月）から応答者（Ｒ、ＴＴＰ＞６か月）を分離した場合、ＦＤＲ  ｐ値＜０．０５との有意差は認められなかった（図示せず）。ＡＴＢを服用しなかったＲＣＣの非応答者（ＮＲ、ＴＴＰ＜６か月）から応答者（Ｒ、ＴＴＰ＞６か月）を分離すると（ＲＥＣＩＳＴ１．１で評価したＴＴＰ６に従って）、ＦＤＲ  ｐ値＜０．０５で有意差が認められた（図４）。注目すべきことに、Subdoligranulum sp ＣＡＧ ３１４ １及びEubacterium sp ＣＡＧ １１５は、抗生物質を服用しなかったＲＣＣ患者において６か月を超えるＴＴＰと関連していた。
【０１３４】
本発明者らは、臨床的関連性を有する非常に頑健なＧＯＭＳを見出すことを可能にする多変量モデルを行った。
【０１３５】
ＴＴＰ＞６ヵ月に関連するＧＯＭＳ
ＡＵＣ値が０．８４５、特異度が０．８８９（真陽性例）、感度が０．８００（偽陽性例）の全患者の「反応」患者（Ｒ）を同定できる最良の予測モデルは、表１７のパートＡに示されるように、ＬＥｆＳｅの併用を考慮した場合に得られ、モデルに保持された良好な共生体は以下の通りであった：
−  Clostridium sp ＣＡＧ ２３０（Ｒで６．７倍増加）
−  Clostridium sp ＣＡＧ １６７（Ｒで２．８倍増加）
−  Azospirillum sp ＣＡＧ ２３９ ３（Ｒでのみ検出可能）
−  Firmicutes bacterium ＣＡＧ １７６ １２（Ｒで６．９倍増加）
減少すべき不良な共生対は、以下の通りである：
−  Coprococcus catus ＧＤ ７ ６（６５．６％減）
−  Oscillibacter sp ＫＬＥ １７４５ ６（５６．６％減）
【０１３６】
カットオフ値は、表１７に示される平均±ＳＥＭに対応する。
【０１３７】
しかしながら、ＡＴＢを服用しなかった患者では、このモデルに保持された良好な細菌のリストは異なっており、ＬＥｆＳｅの併用を考慮すると、ＡＵＣ値０．８０４、特異度０．８４８（真陽性例）、感度０．７７０（偽陽性例）が得られた（表１７パートＢ）：
Eubacterium sp ＣＡＧ １８０ １（Ｒで３倍増加）
Eubacterium sp ＣＡＧ １１５（Ｒで１３倍増加）
Eubacterium siraeum ＣＡＧ ８０（Ｒで５．４倍増加）
Butyrivibrio crossotus ＤＳＭ ２８７６（Ｒでのみ検出可能）
【０１３８】
カットオフ値は、表１７に示される平均±ＳＥＭに対応する。これらの好ましい共生種と好ましくない共生種は、ＰＤ１遮断に対する良好な反応に影響する主要な種である。
【０１３９】
６ヵ月＜ＴＴＰに関連するＧＯＭＳ
全患者における短いＴＴＰ＜６か月に関連する細菌に関しては、有意な細菌のリストはＡＴＢなしで非常に抑制された。耐性と有意に関連することがわかっているのはごくわずかである。
Clostridiales bacteriumv ＶＥ２０２ １４ １（ＮＲでは検出不可）
Clostridium sp ＣＡＧ ２３０（Ｒの６．７倍の増加）
Azospirillum sp ＣＡＧ  ２３９ １（ＮＲでは検出不可）。
【０１４０】
【表１７】
2022502038.tif 000024
【０１４１】
実施例４：抗生物質の使用に関わらずＲＣＣ患者の結果、結果１基準
この例では、３つの異なるモデルを、ロジスティック回帰モデルのトレーニングに使用された６９のサンプルから得られた標準化された存在量プロファイル（ゼロ平均及び単位分散）である６９名の「参照パターン」の束に基づいて構築した。細菌種の存在量のダイナミックレンジを均質化するためには、標準化が必要である。
【０１４２】
材料と方法に記載された最初の戦略に基づき、未知の抗生物質使用歴と結果１基準（最良の結果）を有する６９名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２７；Ｒ＝４２）に適用し、８９．８６％に等しいロジスティック回帰モデル全体の予測可能性を示す２５種の細菌種を選択した（モデル１．１）。２５種のモデルの適合性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍の交差検証の後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．９１７及びＡＵＣ＝０．７８５で、ＮＲの６０％及びＲ対象の６９％を予測することができた。ＲＦＥＣＶ及びＲＦＥ特性の選択に際して、前述の２５種から８種を選択した：これら８種に基づいて構築されたモデルは７９．７１％の全体的な予測可能性を与え（モデル１．２、図５）、これらの種の要約統計量を以下の表１８に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．６３５及びＡＵＣ＝０．８１５で、ＮＲの４０％及びＲ対象の７７％を予測することができた。
【０１４３】
２番目の戦略（機械学習）を未知の抗生物質使用歴と結果１基準を有する６９名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２７；Ｒ＝４２）に適用し、データセットの全ての細菌種（ｎ＝１１１２）を考慮した。特徴選択の第１ラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜３１種を与え、５倍の交差検証後、ＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝１で、ＮＲの１００％及びＲ対象の１００％を予測することができた（モデル２．１）。第２ラウンドの特徴選択の際に、ＲＦＥはランク＝１〜８種を与え、それは次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルでは、全体的な予測可能性は８９．８６％（モデル２．２、図５）であり、これらの種の要約統計量は下記の表１９に報告されている。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝０．９２３でＮＲの８０％及びＲ対象の９２％を予測することができた。
【０１４４】
【表１８】
2022502038.tif 000025
【０１４５】
【表１９】
2022502038.tif 000026
【０１４６】
全ＲＣＣコホート内の間隔［０：１］（したがって、０．１％）で表現した場合、０．００１以上の平均相対存在量を有する細菌種（ｎ＝１８１、総種１１１２種以上、総微生物組成の１６．３％）を考慮して、未知の抗生物質使用歴及び結果１基準を有する６９名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２７；Ｒ＝４２）に第２の戦略（機械学習）を適用した。特徴選択の第１ラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜２１種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝０．５７３及びＡＵＣ＝１（モデル３．１）でＮＲの１００％及びＲ対象の９２％を予測できた。２回目の特徴選択の後、ＲＦＥは、ランク＝１〜８種を与え、それは、次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルでは、全体的な予測可能性は８５．５１％（モデル３．２、図５）であり、これらの種の要約統計量を以下の表２０に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．６３５及びＡＵＣ＝０．８３１でＮＲの８０％及びＲ対象の８５％を予測することができた。この最後のモデルは、糞便試料の保存、シークエンシング、硬さなどに問題がある場合に、より手ごろな価格になるように設計された。
【０１４７】
モデル１．２、２．２、３．２は、未知の抗生物質使用歴と結果１基準をモデル化したもので、すべて８種類の細菌種に基づいており、適切に比較できるようになっており、モデル２．２は最高のＣＶ ＡＵＣとＡＵＣを有する最も高い予測可能性（８９．８６％）を有することが示されている。
【０１４８】
【表２０】
2022502038.tif 000027
【０１４９】
実施例５：抗生物質の使用に関わらずＲＣＣ患者の予測モデル、結果１基準
実施例４で得られた結果に従い、８種を用いて提案された３つのモデルすべてにおいて、応答者（Ｒ）が非応答者（ＮＲ）よりも良好に予測されることから（図５）、Ｒに対するロジスティック回帰β係数を考慮した。
【０１５０】
モデル１．２では、Ｒのβ係数（Ｒ係数）に従って、被験対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）を以下のように計算する：
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−１．０３２３×ＣＡＧ００００８＋
−１．０８４×ＣＡＧ０１０３９＋
−０．９７２３×ＣＡＧ００４７３＋
−０．９９０７×ＣＡＧ００１４０＋
−０．６２３４×ＣＡＧ００６１０＋
−０．８４６８×ＣＡＧ０１１４１＋
０．８９９４×ＣＡＧ００４１３＋
０．６０４１×ＣＡＧ００３１７）］      ［３］
【０１５１】
式［３］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均及び単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束、すなわち、ロジスティック回帰モデルの訓練に使用される各糞便試料についての各細菌種の相対的存在量の全てで標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームに言及する。試験された対象の標準化された存在量パターンから、式［３］を適用して、モデル予測可能性７９．７１％及び成功率７７％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１５２】
モデル２．２では、Ｒのβ係数（Ｒ係数）に従って、被験対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）を以下のように計算する：
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−１．０７９１×ＣＡＧ００７２７＋
−１．１１６４×ＣＡＧ０１１４１＋
−１．２８３９×ＣＡＧ００６５０＋
−１．１１５６×ＣＡＧ００９２８＋
−１．０１４×ＣＡＧ００４７３＋
−０．９３９４×ＣＡＧ００１２２＋
−０．８０８５×ＣＡＧ０１１４４＋
−０．７６７９×ＣＡＧ０００６３）］      ［４］
【０１５３】
式［４］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［４］を適用して、モデル予測可能性８９．８６％及び成功率９２％でＲコホートに属することを予測することができる。
【０１５４】
モデル３．２では、Ｒのβ係数（Ｒ係数）に従って、被験対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）を以下のように計算する：
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−１．１７３５×ＣＡＧ００２４３＋
−１．０２７×ＣＡＧ００４７３＋
−０．９９６８×ＣＡＧ００３２７＋
−１．００４３×ＣＡＧ０１０３９＋
−０．７４５６×ＣＡＧ００１４０＋
−０．８７３６×ＣＡＧ０１２６３＋
０．７０３２×ＣＡＧ０００３７＋
−０．６０７３×ＣＡＧ００３５７）］      ［５］
【０１５５】
式［５］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［５］を適用して、モデル予測可能性８５．５１％、成功率８５％でＲコホートに属することを予測することができる。
【０１５６】
実施例６：抗生物質を使用しないＲＣＣ患者の結果、結果１基準
この例では、３つの異なるモデルを、ロジスティック回帰モデルのトレーニングに使用された５８のサンプルから得られた標準化された存在量プロファイル（ゼロ平均及び単位分散）である５８の「参照パターン」の束に基づいて構築した。細菌種の存在量のダイナミックレンジを均質化するためには、標準化が必要である。
【０１５７】
抗生物質使用歴がなく結果１基準（最良の転帰）を有する５８名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝１９；Ｒ＝３９）に適用した最初の戦略に基づき、８９．６６％に等しいロジスティック回帰モデル全体の予測可能性を示す２５の細菌種を選択した（モデル４．１）。２５種のモデルの適合性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍の交差検証の後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝０．７７８でＮＲの６７％及びＲ対象の１００％を予測することができた。ＲＦＥＣＶ及びＲＦＥの特徴選択に際して、前述の２５種から８種を選択した：これら８種に基づいて構築されたモデルは８７．９３％の全体的な予測可能性を与え（モデル４．２、図６）、これらの種の要約統計量を以下の表２１に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝１でＮＲの１００％及びＲ対象の９２％を予測することができた。
【０１５８】
２番目の戦略（機械学習）を、抗生物質使用歴及び結果１基準を持たない５８名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝１９；Ｒ＝３９）に適用し、データセットの全ての細菌種（ｎ＝１０８３）を考慮した。特徴選択の最初のラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜９種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝１（モデル５．１）でＮＲの１００％及びＲ対象の９２％を予測することができた。第２ラウンドの特徴選択の際に、ＲＦＥはランク＝１〜８種を与え、それは次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルでは、全体的な予測可能性は９３．１％（モデル５．２、図６）であり、これらの種の要約統計量を以下の表２２に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝１でＮＲの１００％及びＲ対象の９２％を予測することができた。
【０１５９】
【表２１】
2022502038.tif 000028
【０１６０】
【表２２】
2022502038.tif 000029
【０１６１】
全ＲＣＣコホート内の間隔［０：１］（したがって、０．１％）で表された場合、０．００１以上の平均相対存在量を有する細菌種（ｎ＝１８３、総種数１０８３以上、総微生物組成の１６．９％）を考慮して、抗生物質使用歴がなく結果１基準のある５８名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝１９；Ｒ＝３９）に対して第２の戦略（機械学習）を適用した。特徴選択の第１ラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜２０種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝０．９１７及びＡＵＣ＝１（モデル６．１）でＮＲの１００％及びＲ対象の９２％を予測できた。２回目の特徴選択の後、ＲＦＥは、ランク＝１〜８種を与え、それは、次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルは、８４．４８％の全体的な予測可能性を与え（モデル６．２、図６）、これらの種の要約統計量を以下の表２３に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．９１７及びＡＵＣ＝０．８８９でＮＲの６７％及びＲ対象の１００％を予測することができた。この最後のモデルは、糞便試料の保管、シークエンシング、硬さなどの問題が生じた場合に、より手ごろな価格で利用できるように設計される。
【０１６２】
モデル４．２、５．２及び６．２に従い、抗生物質使用歴及び結果１基準をモデル化し、適切に比較するためにすべて８種類の細菌種に基づいており、モデル５．２は最適ＣＶ ＡＵＣ及びＡＵＣで最も高い予測可能性（９３．１％）を有することが示された。
【０１６３】
【表２３】
2022502038.tif 000030
【０１６４】
実施例７：抗生物質を使用しないＲＣＣ患者の予測モデル、結果１基準
実施例６で得られた結果に従い、また、８種から提案された最初の２つのモデル（図７）において、非応答者（ＮＲ）は応答者（Ｒ）よりも良好に予測されるが、最後のモデルでは逆であることから、モデル４．２及び５．２のＮＲに対するロジスティック回帰β係数、及びモデル６．２のＲに対するロジスティック回帰β係数を考慮した。
【０１６５】
モデル４．２に関して、及びＮＲのβ係数（ＮＲ係数）に従って、試験された対象ＪＤのＮＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）は、以下のように計算される：
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（０．９５５×ＣＡＧ００００８＋
０．８７６１×ＣＡＧ０１０３９＋
０．９９５１×ＣＡＧ００４７３＋
０．７６０９×ＣＡＧ００４８７＋
１．１１０７×ＣＡＧ００１４０＋
０．９４０２×ＣＡＧ０１１４１＋
０．７１８７×ＣＡＧ０１２０８＋
−０．５８１２×ＣＡＧ００４１３）］      ［６］
【０１６６】
式［６］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［６］を適用して、モデル予測可能性８７．９３％及び成功率１００％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１６７】
モデル５．２に関して、及びＮＲのβ係数（ＮＲ係数）に従って、試験対象ＪＤのＮＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）は、以下のように計算される：
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（０．７１１２×ＣＡＧ０００４８ １＋
０．８９３１×ＣＡＧ００３００＋
１．００４２×ＣＡＧ００４７３＋
１．１２８２×ＣＡＧ００６５０＋
１．２５６９×ＣＡＧ００７２０＋
１．２３９７×ＣＡＧ００７２７＋
０．７５９５×ＣＡＧ００９６３＋
１．０２３５×ＣＡＧ０１１４１）］      ［７］
【０１６８】
式［７］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［７］を適用して、モデル予測可能性９３．１％及び成功率１００％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１６９】
モデル６．２について、また、Ｒのβ係数（Ｒ係数）に従って、試験された対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）は、以下のように計算される：
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−１．２９０７×ＣＡＧ００２４３＋
−０．８８４８×ＣＡＧ００００８＋
−０．９７７６×ＣＡＧ００６９８＋
−０．９９９７×ＣＡＧ００４７３＋
−１．０６９７×ＣＡＧ００３２７＋
−０．７８０６×ＣＡＧ０１０３９＋
−０．８３７６×ＣＡＧ００８９７＋
−０．７４５９×ＣＡＧ００７６６）］      ［８］
【０１７０】
式［８］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料において、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［８］を適用して、モデル予測可能性８４．４８％及び成功率１００％でＲコホートに属することを予測することができた。
【０１７１】
実施例８：抗生物質の使用に関わらずＲＣＣ患者の結果、結果２基準
この例では、３つの異なるモデルを、ロジスティック回帰モデルを訓練する際に使用した６７のサンプルから得られた標準化された存在量プロファイル（ゼロ平均及び単位分散）である６７の「参照パターン」の束に基づいて構築した。細菌種の存在量のダイナミックレンジを均質化するためには、標準化が必要である。
【０１７２】
抗生物質使用歴が不明で結果２基準（ＴＰＰ＞６か月）を有する６７名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝３７；Ｒ＝３０）に適用した最初の戦略に基づいて、６５．２２％に等しいロジスティック回帰モデル全体の予測可能性を与える１０種の細菌種を選択した（モデル７．１）。１０種を用いたモデルの適合性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．３７０及びＡＵＣ＝０．７１６で、ＮＲの７８％及びＲ対象の４４％を予測することができた。ＲＦＥＣＶ及びＲＦＥの特徴選択に際して、８種を前述の１０種から選択した：これら８種に基づいて構築したモデルは、全体的な予測可能性が６６．６７％（モデル７．２、図７）であり、これらの種の要約統計量を表２４に報告した。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．４８１及びＡＵＣ＝０．７０４で、ＮＲの７８％及びＲ対象の４４％を予測することができた。
【０１７３】
２番目の戦略（機械学習）を未知の抗生物質使用歴と結果２基準を有する６７名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝３７；Ｒ＝３０）に適用し、データセットの全ての細菌種（ｎ＝１１１２）を考慮した。特徴選択の最初のラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜１０７０種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝０．６６７及びＡＵＣ＝０．６６７（モデル８．１）でＮＲの１１％及びＲ対象の１００％を予測できた。第２ラウンドの特徴選択の際に、ＲＦＥはランク＝１〜８種を与え、それは次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルは、８８．４１％の全体的な予測可能性を与え（モデル８．２、図７）、これらの種の要約統計量を表２５に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．６６７及びＡＵＣ＝０．９２６で、ＮＲの１００％及びＲ対象の６７％を予測することができた。
【０１７４】
全ＲＣＣコホート内の間隔［０：１］（したがって、０．１％）で表現した場合、０．００１以上の平均相対存在量を有する細菌種（ｎ＝１８１、総種１１１２種以上、総微生物組成の１６．３％）を考慮して、未知の抗生物質使用歴及び結果２基準を有する６７名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝３７；Ｒ＝３０）に第２の戦略（機械学習）を適用した。特徴選択の最初のラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜１７５種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝０．２２２及びＡＵＣ＝０．６０５（モデル９．１）でＮＲの３３％及びＲ対象の７８％を予測できた。２回目の特徴選択の後、ＲＦＥは、ランク＝１〜８種を与え、それは、次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルは８８．４１％の全体的な予測可能性を与え（モデル９．２、図７）、これらの種の要約統計量を表２６に報告する。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．４８１及びＡＵＣ＝０．８６４でＮＲの８９％及びＲ対象の７８％を予測することができた。この最後のモデルは、糞便試料の保存、シークエンシング、硬さ、エテラに問題がある場合に、より手ごろな価格になるように設計された。
【０１７５】
未知の抗生物質使用歴と結果２基準に基づいてモデル化された全てのモデルによれば、モデル８．２は良好なＣＶ ＡＵＣとＡＵＣで良好な予測可能性（８４．４１％）を有し、ＮＲとＲ患者の中で最も判別可能であることが示された。
【０１７６】
【表２４】
2022502038.tif 000031
【０１７７】
【表２５】
2022502038.tif 000032
【０１７８】
【表２６】
2022502038.tif 000033
【０１７９】
実施例９：抗生物質の使用に関わらずＲＣＣ患者の予測モデル、結果２基準
実施例８で得られた結果に従い、モデル７．２、８．２及び９．２のＮＲに対するロジスティック回帰β係数を考慮した。
【０１８０】
モデル７．２では、非応答者のβ係数（ＮＲ係数）に従い、被験対象ＪＤのＮＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表す）を以下のように計算する：
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−０．２０３４×ＣＡＧ００７８２＋
０．４０９２×ＣＡＧ０００１３＋
０．２７０８×ＣＡＧ００８７３＋
０．７６６５×ＣＡＧ０１１４１＋
−０．５８９９×ＣＡＧ００６６８＋
−０．５１８１×ＣＡＧ００６６９＋
−０．８４１５×ＣＡＧ００８８６＋
−０．７３３９×ＣＡＧ００８８９）］      ［９］
【０１８１】
式［９］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験された対象の標準化された存在量パターンから、式［９］を適用して、モデル予測可能性６６．６７％及び成功率７８％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１８２】
モデル８．２では、ＮＲのβ係数（ＮＲ係数）に従って、被験対象ＪＤのＮＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）を以下のように計算する：
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（０．６４２２×ＣＡＧ００２１１＋
−１．０５８１×ＣＡＧ００４７４＋
−０．８９８４×ＣＡＧ００６２４＋
１．３１８９×ＣＡＧ００６５０＋
−０．７３２４×ＣＡＧ００６７６＋
−０．６６２３×ＣＡＧ００７７１＋
−１．１３７２×ＣＡＧ０１１９７＋
−０．８５２５×ＣＡＧ０１３２１）］      ［１０］
【０１８３】
式［１０］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［１０］を適用して、モデル予測可能性８４．４１％及び成功率１００％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１８４】
モデル９．２では、ＮＲのβ係数（ＮＲ係数）に従って、被験対象ＪＤのＮＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）を以下のように計算する。
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（０．９３４１×ＣＡＧ００５５７＋
０．８９２７×ＣＡＧ００６０１＋
０．７１０８×ＣＡＧ００６０７＋
−１．２３４１×ＣＡＧ００６６９＋
１．０３７９×ＣＡＧ００８６１＋
−１．００１６×ＣＡＧ００８８０＋
−０．８７２×ＣＡＧ００９３７＋
−０．８３６２×ＣＡＧ０１３２１）］      ［１１］
【０１８５】
式［１１］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［１１］を適用して、モデル予測可能性８８．４１％及び成功率８９％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０１８６】
実施例１０：抗生物質を使用しないＲＣＣ患者の結果、結果２基準
この例では、３つの異なるモデルを、ロジスティック回帰モデルを訓練する際に使用した５６のサンプルから得られた標準化された存在量プロファイル（ゼロ平均及び単位分散）である５６の「参照パターン」の束に基づいて構築した。細菌種の存在量のダイナミックレンジを均質化するためには、標準化が必要である。
【０１８７】
抗生物質使用歴がなく結果２基準のある５６名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２９；Ｒ＝２７）に適用した最初の戦略に基づき、７２．４１％に等しいロジスティック回帰モデル全体の予測可能性を示す１０種の細菌を選択した（モデル１０．１）。１０種を用いたモデルの適合性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体がＣＶ ＡＵＣ＝０．６６７及びＡＵＣ＝０．７９６を用いてＮＲの７８％及びＲ対象の６７％を予測することができた。ＲＦＥＣＶ及びＲＦＥの特徴選択に際して、８種を前述の１０種から選択した：これら８種に基づいて構築されたモデルは、全体的な予測可能性が６８．９７％（モデル１０．２、図８）であり、これらの種の要約統計量は表２７に報告されている。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍のクロスバリデーションの後、モデル自体がＣＶ ＡＵＣ＝０．５５６及びＡＵＣ＝０．９８１を用いてＮＲの８９％及びＲ対象の１００％を予測することができた。
【０１８８】
抗生物質使用歴と結果２基準を持たない５６名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２９；Ｒ＝２７）に適用した第２の戦略（機械学習）に基づき、データセットの全ての細菌種（ｎ＝１０８３）を考慮した。特徴選択の最初のラウンドの後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜５１種を与え、５回のクロスバリデーションの後、ＣＶ ＡＵＣ＝０．９４４及びＣＶ ＡＵＣ＝０．９４４及びＡＵＣ＝０．９４４（モデル１１．１）でＮＲの８９％及びＲの対象の８３％を予測することができた。第２ラウンドの特徴選択の際に、ＲＦＥはランク＝１〜８種を与え、それは次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルでは、全体的な予測可能性は９１．３８％（モデル１１．２、図８）であり、これらの種の要約統計量は表２８に報告されている。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍のクロスバリデーションの後、モデル自体がＣＶ ＡＵＣ＝１及びＡＵＣ＝０．９８１でＮＲの７８％及びＲ対象の１００％を予測することができた。
【０１８９】
【表２７】
2022502038.tif 000034
【０１９０】
【表２８】
2022502038.tif 000035
【０１９１】
【表２９】
2022502038.tif 000036
【０１９２】
全ＲＣＣコホート内の間隔［０：１］（したがって、０．１％）で表現した場合、０．００１以上の平均相対存在量を有する細菌種（ｎ＝１８３、総種数１０８３以上、総微生物組成の１６．９％）を考慮して、抗生物質使用歴がなく結果２基準のある５６名のＲＣＣ患者（ＮＲ＝２９；Ｒ＝２７）に第２の戦略（機械学習）を適用した。特徴選択の第１ラウンド後、ＲＦＥＣＶはランク＝１〜２０種を与え、５倍の交差検証後、集合的にＣＶ ＡＵＣ＝０．８３３及びＡＵＣ＝０．８５２（モデル１２．１）でＮＲの７８％及びＲ対象の６７％を予測できた。２回目の特徴選択の後、ＲＦＥは、ランク＝１〜８種を与え、それは、次のロジスティック回帰分類器のために選択された。これら８種に基づいて構築されたモデルでは、全体的な予測可能性は８９．６６％（モデル１２．２、図８）であり、これらの種の要約統計量は表２９に報告されている。モデルの妥当性を測定するために、元のデータセットのサブセットで実施した５倍クロスバリデーションの後、モデル自体はＣＶ ＡＵＣ＝０．８８９及びＡＵＣ＝０．６１１でＮＲの７８％及びＲ対象の５０％を予測することができた。この最後のモデルは、糞便試料の保管、シークエンシング、硬さなどの問題が生じた場合に、より手ごろな価格で利用できるように設計される。
【０１９３】
モデル１０．２、１１．２、１２．２に従い、抗生物質使用歴と結果２基準をモデル化し、適切に比較するためにすべて８種の細菌種に基づいており、モデル１１．２はＮＲとＲの中で最も高い判別力を持ち、良好な予測可能性（９１．３８％）、優れたＣＶ ＡＵＣとＡＵＣを有することが示された。
【０１９４】
実施例１１：抗生物質を使用しないＲＣＣ患者の予測モデル、結果２基準
実施例１０で得られた結果に従い、モデル１０．２及び１１．２では応答者（Ｒ）が非応答者（ＮＲ）よりも良好に予測される一方、モデル１２．２では逆であり、それらを比較するためにすべてのモデルが８種（図７）で提案されたことから、モデル１０．２及び１１．２ではＲに対するロジスティック回帰β係数を、モデル１２．２ではＮＲに対するロジスティック回帰β係数を考慮した。
【０１９５】
モデル１０．２について、また、Ｒのβ係数（Ｒ係数）に従って、試験された対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）は、以下のように計算される：
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−０．１４５６×ＣＡＧ００５８０＋
−０．５４９６×ＣＡＧ０００１３＋
−０．４６４６×ＣＡＧ００８７３＋
−０．５４９６×ＣＡＧ０１１４１＋
０．５６８４×ＣＡＧ００６６８＋
０．５１２９×ＣＡＧ００６６９＋
０．６６２３×ＣＡＧ００８８６＋
０．７１０２×ＣＡＧ００８８９）］      ［１２］
【０１９６】
式［１２］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［１２］を適用して、モデル予測可能性６８．９７％、成功率１００％でＲコホートに属することを予測することができる。
【０１９７】
モデル１１．２に関して、及びＲのβ係数（Ｒ係数）に従って、被験対象ＪＤのＲコホートに属する確率推定値（パーセンテージで表される）は、以下のように計算される。
ＰＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（−０．８４６３×ＣＡＧ００３４６＋
１．１３×ＣＡＧ００５３０＋
−１．１８３×ＣＡＧ００６０１＋
−０．９５４４×ＣＡＧ００６０７＋
０．８９２９×ＣＡＧ００６４６＋
１．０９１９×ＣＡＧ００７１３＋
０．４８８１×ＣＡＧ００９１９＋
１．１６０６×ＣＡＧ０１１５８）］      ［１３］
【０１９８】
式［１３］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料中の、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［１３］を適用して、モデル予測可能性９１．３８％及び成功率１００％でＲコホートに属することを予測することができる。
【０１９９】
モデル１２．２、及びＮＲのβ係数（ＮＲ係数）によれば、属する確率推定値（パーセンテージで表される）は次のようになる。
被検者ＪＤのＮＲコホートを以下のように算出する。
ＰＮＲ（ＪＤ）＝１／［１＋ｅｘｐ＾−（１．１３８×ＣＡＧ００１４２＋
１．１３９６×ＣＡＧ００２１８＋
−１．０１６６×ＣＡＧ００３４１＋
−０．８４０３×ＣＡＧ００４７４＋
−０．７０６７×ＣＡＧ００５０８＋
−１．１８５×ＣＡＧ００８８０＋
０．８４６６×ＣＡＧ０１２６３＋
−０．８８９５×ＣＡＧ０１３２１）］      ［１４］
【０２００】
式［１４］において、「ＣＡＧＸＸＸＸＸ」は、試験された対象ＪＤからの糞便試料において、列挙されたＣＡＧによって定義される細菌種の相対的存在量を表す。これらの相対的存在量は、標準化された値（ゼロ平均と単位分散）で表す必要がある。最良の選択肢は、試験された対象の「存在量パターン」を、既知の「参照パターン」の束で標準化することであり、本発明は、ＰＮＲ（ＪＤ）の計算を容易にするために使用されるＰｙｔｈｏｎスクリプトのクレームを参照する。試験対象者の標準化された存在量パターンから、式［１４］を適用して、モデル予測可能性８９．６６％及び成功率７８％でＮＲコホートに属することを予測することができる。
【０２０１】
考察
上述の方法は、以下の積極的特徴に依存する。
（ｉ）異なるＮＧＳ配列決定プラットフォーム（４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ、Ｎａｎｏｐｏｒｅ、ＰａｃＢｉｏ）及び分子生物学技術（ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、…）を使用することが可能である。
（ｉｉ）閉じた間隔［０：１］内のモデル選択細菌種の相対的存在量の表現。
（ｉｉｉ）試験された対象が選択されたモデルに属する１つ以上の選択された種を有していない場合、このモデルは、その相加的性質及び提案された二重戦略のために高い予測可能性を保持する。
（ｉｖ）２つの戦略のそれぞれを２つの異なるモデルに分け、一方は過去２ヵ月間に抗菌薬を服用しなかった個人に限定し、他方は未知の抗菌薬レジメン／治療状態の可能性を考慮する。
【０２０２】
材料と方法に記載されているように、特定の主題の「存在量パターン」を提案されたモデルの１つに適切に適合させるために使用される統計的方法に従って、本発明者らは以下の工程を提案する。
（ｉ）対象から採取した糞便試料は、好ましいＮＧＳプラットフォーム（上述）を用いてＤＮＡ抽出及びショットガン配列決定を行い、閉じた間隔［０：１］内の相対的存在量を、材料及び方法に記載されたバイオインフォマティクスパイプラインを介して測定する。
【０２０３】
（ｉｉ）特定のコホート（ＮＲ又はＲ）に属する確率推定値（％）を表す対象ＪＤの予測可能性スコア（Ｐ）は、以下のように定義される：
【０２０４】
【数６】
2022502038.tif 000037
【０２０５】
式中、ｚは対数オッズ比（事象が起こる確率と起こらない確率との比の自然対数を表す）、ｅｘｐは自然ベースの指数、各βは本発明に従って事前に計算された回帰係数、各ｘは閉じた区間［０：１］内で表される選択された細菌種の相対的存在量であり、標準化されたデータ（平均除去及び単位分散スケール化）として表されることが義務付けられている。
【０２０６】
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られたＰスコアは、それが７５％（固定した閾値）を超える場合、及び／又は抗生物質の使用（既知又は未知）を常に考慮して、使用した異なるモデル間で一致する場合、臨床的に意味があると解釈される。
【０２０７】
上記の方法では、回帰係数βは、決定関数に定数（切片としても知られる）を加えない；１００００に等しい最大反復；リブリン解法（Ｌ２ペナルティ付き）を備えたロジスティック回帰分類器によって計算されなければならない。ロジスティック回帰に関するこれらのパラメータはすべて、Ｓｃｉ−Ｋｉｔ  Ｌｅａｒｎライブラリーガイドの１．１．１１節で説明し、詳しく説明する。
【０２０８】
結果２とは、応答者の間でＳＤ＞６ヵ月のみを考慮することを意味する。
【０２０９】
本明細書に開示された結果に基づき、本発明者らは、以下の概念を結論付ける。
１／ＧＯＭＳ（「腸オンコミクロビオームシグネチャー」）は、ＰＤ−１遮断中の良好な臨床転帰をＡＵＣ＞０．９で確実に予測でき、ＲＣＣにおける適切な特異度及び感度を予測できる。
２／ＲとＮＲを対比するいくつかの臨床基準は、腸オンコミクロビオームの組成によって影響を受ける可能性がある。
３／ＲとＮＲのＧＯＭＳは、「ヒト主導」戦略を考慮すると、概ね同じであり、ロジスティック回帰係数に基づいて異なるＮＲ又はＲ状態を予測することができる。
４／臨床的意義は、「好ましい」共生体と「好ましくない」共生体の間の平衡に依存しており、それぞれＲ糞便又はＮＲ糞便中に高濃度で検出可能である。
５／いくつかの種はＡＴＢに耐え、主にＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門のメンバーである。
６／ＲＣＣ  ２Ｌの全集団に対する最良の予測生態系（「ＧＯＭＳ」と呼ばれる）は、ペアワイズ分析及びロジスティック回帰モデルによって証明されるように、少数のＭＧＳ（好ましくないPrevotella spp.、Faecalibcaterium spp.、Coprococcus catus、Eggerthella lenta、Clostridium teabole対好ましいSutterella spp.、Akkermansia、Alistipes spp.）に基づいている。
７／注目すべきことに、一部の良好な共生者は、健常者と癌患者との間で観察された差の一部である（ＨＶで過剰発現された細菌（癌患者に対して）も、抗ＰＤ１治療患者におけるＲ表現型と関連している）。
【０２１０】
本文では、本発明者らは、２つの主な基準：ｉ）過去２か月以内の抗生物質治療／使用の存在；ｉｉ）転帰のＲＥＣＩＳＴ定義（結果１又は結果２）に関して、ＩＣＩ治療前にＲＣＣに罹患した明確な対象のＮＲ又はＲ状態を予測するために、異なるＧＯＭＳ（腸オンコミクロビオム署名）を提案した。第一段階として、ＧＯＭＳが結果１、ＴＴＰ３、及びＴＴＰ６においてＮＲとＲをどのように区別できるかを証明し、後者はRouty et al Science 2018で報告された最初のコホートにおいて有意なα及びβの多様性を示した。ＲＯＣ曲線に基づくベストディスクリプター（単一の細菌種又はコンソーシアム）の平均ＡＵＣ値（ＮＲ及びＲ間）は、ＴＴＰ３でより高い予測値を示した：抗生物質の使用に関わらず、平均ＡＵＣ結果１＝０．８７２、平均ＡＵＣＴＴＰ３＝０．８９４、平均ＡＵＣＴＴＰ６＝０．８４０、抗生物質治療なしでの平均ＡＵＣ結果１＝０．８６２、平均ＡＵＣＴＴＰ３＝０．８９１、平均ＡＵＣＴＴＰ６＝０．７６２であった。これらの観察から、ＲＣＣでは、抗生物質圧（少なくともＩＣＩ治療前２か月以内）は、特にＴＴＰ６（＋１０％）でＧＯＭＳシグネチャの予測可能性を高め、結果１及びＴＴＰ３ではそのままであるように思われる。
【０２１１】
上記の研究では、本発明者らは、ボルケーノ、ＬＥｆＳｅ及びペアワイズ分析により、抗生物質使用に関わらず患者及びＩＣＩ治療前の２か月間に抗生物質を服用しなかった患者におけるＮＲ及びＲの細菌サインを深く分析した。本発明者らは、ＴＴＰ６における当初の特徴から、ＮＲの中でＡＴＢに抵抗性を示す細菌種はなく、応答者の中では１８％がＡＴＢに抵抗性を示すことを見出した（図３）。これらの種はいずれも、抗生物質レジメンが不明のＲＣＣ患者の良好な予測因子である可能性がある。前述のＧＯＭＳ、抗生物質使用、及びＲＥＣＩＳＴ基準に従った結果状態に基づいて、異なるロジスティック回帰モデルを本明細書で提案する。二重戦略（材料と方法に記載）に基づき、内部特徴選択及び５倍のクロスバリデーションの後、ＡＴＢに関係なくＲＣＣ患者に対して６つのモデル（モデル１．２、モデル２．２、モデル３．２、モデル７．２、モデル８．２、モデル９．２）を作製し、他の６つのモデル（モデル４．２、モデル５．２、モデル６．２、モデル１０．２、モデル１１．２、モデル１２．２）をＡＴＢ治療を受けていないＲＣＣ患者に対して作製した（表３０を参照）。最初の調査から、ロジスティック回帰モデルの後、ＡＴＢは両方のアウトコマースの全モデル予測可能性を約４％悪化させたように考えられる：実際、平均Ｐｒｅｄ．結果１ ＡＴＢとは無関係＝８５．０２％、平均Ｐｒｅｄ．結果１ ＡＴＢなし＝８８．５０％、平均Ｐｒｅｄ．結果２ ＡＴＢとは無関係＝７９．８３％、そして最後に平均Ｐｒｅｄ．結果２ ＡＴＢなし＝８３．３４％。これらの結果から、結果１基準は、結果２よりも、少なくとも全体的な予測可能性にとって最良の予測因子であると思われる。注目すべきことに、約５０％の種だけが、抗生物質使用の有無にかかわらず、主にFirmicutes門（結果１及び結果２についてはFirmicutes属、Holdemanella属、Subdoligranulum、結果２についてはEubacterium属）に属するモデル間で共通していた。抗生物質治療に耐えるProteobacteriaア門（Sutterella属及びAzospirillum属）のメンバーは、結果２で生成されたモデルでのみ見出された。
【０２１２】
【表３０】
2022502038.tif 000038
【０２１３】
【表３１−１】
2022502038.tif 000039
【０２１４】
【表３１−２】
2022502038.tif 000040
【０２１５】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2022502038.tif 000060
【図１Ｃ】
2022502038.tif 000061
【図１Ｄ】
2022502038.tif 000062
【図２Ａ】
2022502038.tif 000063
【図２Ｂ】
2022502038.tif 000064
【図２Ｃ】
2022502038.tif 000065
【図２Ｄ】
2022502038.tif 000066
【図３Ａ】
2022502038.tif 000067
【図３Ｂ】
2022502038.tif 000068
【図３Ｃ】
2022502038.tif 000069
【図３Ｄ】
2022502038.tif 000070
【図４−１】
2022502038.tif 000071
【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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