(57)【要約】  非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法であり、（ａ）参照ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、少なくとも１つの比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。さらに、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法であり、（ａ）参照ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、（ｃ）第２のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、参照ＤＮＡ配列は、既知の参照配列もしくはこの属の非維管束植物、またはこの属の非維管束植物である。【選択図】図１
2022501014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法であって、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、前記試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）前記第２のセットのミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、前記ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、前記試験サンプルは、前記関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、
前記少なくとも１つの比較サンプルは、前記関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、前記参照ＤＮＡ配列は、前記属の非維管束植物の既知の参照配列である、方法。
【請求項２】
非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法であって、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、前記試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）前記第２のセットの配列ミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、前記試験サンプルおよび前記比較サンプル（複数可）は、前記関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、前記独立した非維管束植物は、同じ属であり、前記参照ＤＮＡ配列は、前記属の非維管束植物の既知の参照配列である、方法。
【請求項３】
前記方法は、
（ｂ−ｉ）少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定することをさらに含み、前記追加の比較サンプル（複数可）は、前記関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、前記独立した非維管束植物は、同じ属であり、
（ｃ）前記第３のセットの配列ミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定することをさらに含み、前記ミスマッチの２つのサブセットは、前記原因となる変異の候補変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記関心対象の表現型は、収量の増加、ストレス耐性、ストレス抵抗性、非生物ストレス耐性、非生物ストレス抵抗性、耐塩性、塩抵抗性、不稔性、乾燥抵抗性、耐乾燥性、高温または低温に対する抵抗性、霜抵抗性、耐霜性、植物成長速度、植物細胞分裂速度、耐病性、病害抵抗性、病害感受性、除草剤耐性、除草剤抵抗性、除草剤感受性、抗生物質耐性、抗生物質抵抗性および抗生物質感受性からなる群から選択される観察可能特性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記関心対象の表現型は、天然の、合成の、もしくは化学的除草剤に対する増加した抵抗性または増加した耐性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記非維管束植物が葉状苔類、単純葉状体苔類または複雑葉状体苔類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記非維管束植物は、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｌｐｅｓｔｒｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｑｕａｔｉｃａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃａｒｒｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃｈｅｎｏｐｏｄａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｅｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｏｍｉｎｇｅｎｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｆｏｌｉａｃｉａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｇｒｏｓｓｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｉｎｆｌｅｘａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｍａｃｒｏｐｏｒａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｏｖｏｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｅａｃｅａ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｉｌｌａｔｅ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｐｅａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｒｕｂｒｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｏｌｏｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｔｒｅｉｍａｎｎｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｕｂｇｅｍｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｗａｌｌｉｓｉｉおよびＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記変異誘発された試験サンプルは、Ｍ１変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
独立した非維管束植物由来の前記比較サンプルは、変異誘発された非維管束植物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異誘発された試験サンプルは、天然に存在しない変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、分離分析、複合分離分析またはバルク分離分析の工程を含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、自家受精、受精、異系交配、戻し交配または前記非維管束植物の近同質遺伝子系統による受精の工程を必要としない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、（ｄ）前記候補変異を生物学的フィルターでさらにフィルタリングすることを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非維管束植物は一倍体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記非維管束植物は、蘚類、苔類およびツノゴケ類からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記非維管束植物は、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓまたはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｒｅａｄｅｒｉから選択される蘚類である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記関心対象の表現型は、植物サイズ、植物の高さ、葉のサイズ、植物の色および植物の構造からなる群から選択される形態的特徴である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記関心対象の表現型は、ウイルス、細菌もしくは真菌の病原体に対する増加した抵抗性または増加した耐性である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を薬剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、をさらに含み、（ｉ）〜（ｉｖ）は、（ａ）に先立って実施される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、コンピュータ実装方法である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法またはシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
関心対象の表現型に関連する遺伝子型の同定は、植物生物学での多数の応用において重要である。変異誘発実験後の変異の発見は、典型的には、変異体を野生型植物と異系交配させること、バルク状野生型および変異体集団を生成すること、ならびに変異体のバルクでのみ起こる変異を同定することを伴う。そうすることによって、野生型および変異体のゲノムが再結合することが可能になるため、変異ゲノムにおけるバックグラウンド変異の数が減少し、原因となる変異を同定する可能性が高まる。しかしながら、この準備工程にはコストがかかる。
【０００３】
第１に、異系交配の必要性は、不稔変異体を交配できないという点では、典型的な変異発見パイプラインに対する量的制限を表す。多くの変異（原因となる変異またはバックグラウンド変異に関わらず）は、不稔性を引き起こす可能性がある。
【０００４】
第２に、異系交配の必要性は、異系交配が、少なくとも１回（およびしばしばそれより多くの）生殖サイクルを行う必要があり、時間および費用がかかるため、パイプラインのスループットが制限されるという点では、典型的な変異発見パイプラインに対する量的制限を表す。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、既存の構成の１つ以上の欠点を実質的に克服するか、または少なくとも改善することである。
【０００６】
本発明につながる研究は、欧州連合の第７次フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７−２０１３）／ＥＲＣ助成契約第２５０２８４号において欧州研究会議からの資金を受けている。
【０００７】
試験されたサンプルにおける関心対象の表現型を引き起こすサンプルＤＮＡのＤＮＡ配列（原因となる変異）の一部を発見する前に、異系交配の必要性を回避することによって上記の問題に取り組もうとする構成が開示される。
【０００８】
本開示の第１の態様によれば、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法が提供され、ｉ）試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測、ならびに／またはｉｉ）比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する工程を含む方法であり、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサの工程をさらに含む方法であり、コンピュータプログラムコードは、試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得る方法を実行する。
【０００９】
本開示の第２の態様によれば、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するためのシステムが提供され、ｉ）試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測、ならびに／またはｉｉ）比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する方法を含むシステムであり、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサをさらに含むシステムであり、コンピュータプログラムコードは、試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得るように構成される。
【００１０】
本開示の第３の態様によれば、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【００１１】
本開示の第４の態様によれば、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【００１２】
本開示の第５の態様によれば、シダ類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立したシダ類に由来し、独立したシダ類は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属のシダ類の既知の参照配列である。
【００１３】
本開示の第６の態様によれば、シダ類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示すものに由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立したシダ類に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属のシダ類の既知の参照配列である。
【００１４】
本開示の第７の態様によれば、藻類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した藻類に由来し、独立した藻類は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の藻類の既知の参照配列である。
【００１５】
本開示の第８の態様によれば、藻類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す藻類に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した藻類に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の藻類の既知の参照配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を、以下の図面を参照してこれから説明する。
【００１７】
【図１】本発明の実施形態による、試験されたサンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法のプロセスフロー図である。
【図２】本発明の実施形態による、記載された構成を実施することができるコンピュータシステムの概略ブロック図を形成する。
【図３】本発明の実施形態による、試験されたサンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法のさらなるプロセスフロー図である。
【図４】本発明の実施形態による、様々なプロセスの例として、参照リードと比較した配列リードを図示したものである。
【図５】同上
【図６】同上
【図７】同上
【図８】：２日齢のＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ植物の仮根の表現型。野生型の仮根の表現型（Ａ）、波状の仮根の表現型（Ｂ）。仮根は、野生型（Ａ）ではまっすぐに成長し、一部の変異体（Ｂ）では波状に成長する細胞である。
【図９】：２ヶ月齢のＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ植物の背側表皮表現型。野生型表皮表現型（Ａ）、延伸した表皮表現型（Ｂ）。背側表皮は気室孔（Ａ、矢印）を示し、一部の変異体（Ｂ）では延伸している。
【図１０】：ＵＶ４．３２での非対立性ベースの変異発見パイプラインの性能。Ａ：フィルタリング効率に対する非対立遺伝子変異体バックグラウンドの増加数の影響。Ｂ：８つの非対立遺伝子ＵＶ変異系統を使用した場合、各フィルタリング工程後に残っているＵＶ４．３２ミスマッチの数。
【図１１】：クロルスルフロン抵抗性変異体における非対立性に基づく変異発見パイプラインの性能。対立遺伝子変異体バックグラウンドの数を増やすと、フィルタリング効率が向上する。左端の散布ボックスは、再配列決定された野生型ゲノムでも観察されるミスマッチを除外する前の、クロルスルフロン抵抗性変異系統のミスマッチの総数を表す。
【００１８】
最良の態様を含む詳細な説明
添付図面のうち１つ以上において、同じ参照番号を有する工程および／または特徴が参照される場合、これらの工程および／または特徴は、反する意図が示されない限り、この説明のために、同じ機能（複数可）または操作（複数可）を有する。
【００１９】
「背景」セクションに含まれる議論、および先行技術の取り決めに関する上記の議論は、それぞれの公開および／または使用を通じて公の知識を形成する文書またはデバイスの議論に関連することに留意されたい。そのようなものは、このような文書またはデバイスが、何らかの形で当技術分野における一般的知識の一部を形成するという本発明者（複数可）または特許出願人による表明として解釈されるべきではない。
【００２０】
以下に、本明細書で使用する用語のある特定の定義を提供する。
【００２１】
表現型：個体の観察可能な特性のセット。
【００２２】
関心対象の表現型：本明細書に開示される方法およびシステムを使用して調査される表現型。関心対象の表現型は、望ましい観察可能な特性または形質であり得る。場合によっては、関心対象の表現型は、野生型植物と比較して好ましい観察可能な特性のセットであり得る。場合によっては、関心対象の表現型は、野生型植物と比較して異なる観察可能な特性のセットであり得る。場合によっては、関心対象の表現型は、野生型藻類またはシダ類と比較して好ましい観察可能な特性のセットであり得る。場合によっては、関心対象の表現型は、野生型藻類またはシダ類と比較して異なる観察可能な特性のセットであり得る。
【００２３】
Ｍ０、Ｍ１およびＭ２：Ｍ０は、変異原への曝露前の変異誘発実験における植物集団（すなわち、親集団）を意味する。Ｍ１は、変異原への曝露後の同じ植物集団（すなわち、親集団）を指すために使用される表記である。Ｍ２世代は、自家受粉後の子孫（すなわち、変異体とそれ自体を交配するプロセス）を指す。
【００２４】
ミスマッチ：リードが最適に整列する参照ＤＮＡ配列の一部と比較した、リードの配列の違い（例えば、試験されたサンプル内の原因となる変異を同定するために試験されている試験されたサンプルのＤＮＡ配列の一部）。
【００２５】
変異：参照ＤＮＡ配列と比較した変異誘発された植物のＤＮＡ配列の物理的変化。
【００２６】
原因となる変異：関心対象の表現型を引き起こす変異。
【００２７】
バックグラウンド変異：関心対象の表現型を引き起こしていない変異。
【００２８】
ゲノムワイド関連解析：疾患または特定の形質のリスクに関連する遺伝性の遺伝的多様体の同定。この方法は、対照（疾患または形質のない人）より症例（評価されている疾患または形質のある人）において頻繁に起こる、天然に存在する遺伝的多型、典型的には一塩基多型（ＳＮＰ）についてゲノム全体を調べる。
【００２９】
一倍体／二倍体／倍数体：倍数性状態は、生物がそのライフサイクルのある一定の時間に含有する染色体のセットの数である。植物は、そのライフサイクル間に一倍体状態と二倍体状態を交互に繰り返し得る。一倍体植物は、主にそのライフサイクルを一倍体状態で、すなわち染色体の単一のセットで過ごす植物である。二倍体植物は、主にそのライフサイクルを二倍体状態で、すなわち染色体の２つのセットで過ごす植物である。倍数体植物は、主にそのライフサイクルを二倍体状態で、すなわち染色体の３つ以上のセットで過ごす植物である。苔類、例えばＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、そのライフサイクルの大部分の間、一倍体であり、すなわち染色体の単一のセットを含有する。比較すると、草または双子葉植物などの高等植物は、二倍体または倍数体であり、すなわちライフサイクルの大部分の間、染色体の２つ以上のセットを有する。
【００３０】
除草剤：植物、植物細胞、植物の種子もしくは植物組織の成長を死滅させるまたは阻害するために使用される化学物質。
【００３１】
ヘテロ／ホモ接合体：一倍体、二倍体、倍数体の生物は、染色体のセットと同数種のある一定の遺伝子を含有することができる。例えば、一倍体生物は、１つのみのバージョン、すなわち対立遺伝子を含有するが、二倍体生物は、同じ遺伝子の２つの異なるバージョン（ヘテロ接合体）または同じ遺伝子の２つの同一のバージョン（ホモ接合体）を含有することができる。
【００３２】
異系交配：原因となる変異からバックグラウンド変異を分離することを目的として、多型系統を参照の系統（通常は親系統）と交配するプロセス。
【００３３】
調査される変異体：原因となる変異が同定される変異系統を指す。
【００３４】
非維管束植物：維管束系（木部および師部）を欠く植物。
【００３５】
分離分析：研究中の形質または疾患の最も可能性の高い遺伝様式を決定するために、生物学的家族における発現した形質または疾患（表現型）に関するデータに正式な遺伝的モデルを適合させるための統計的手法。分離分析では、分析される表現型の遺伝パターンを決定するために、複数世代の家族を必要とする。
【００３６】
変異体の減算：調査される変異体からバックグラウンド変異を計算で除去するために使用される独立した変異系統。これらは、独立した対立遺伝子変異系統または独立した非対立遺伝子変異系統であり得る。比較サンプルは、減算変異体のサンプルである。
【００３７】
相補性群：相補性群は、互いに補完できない対立遺伝子の群を定義する（すなわち遺伝子のバージョン）。そしてさらに、相補性群はまた、互いに補完できない対立遺伝子を含む変異系統群を定義し得る。すなわち、同じ相補性群の変異系統間の交配からの子孫には、親の表現型の組換えは観察されない。例えば、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａでは、２つの変異体対立遺伝子が同じ相補性群にある場合、変異体間の交配から生じるＦ１植物の１００％は、すべて変異体表現型を示す。
相補性群は典型的には、単一の多型遺伝子（すなわち、ＤＮＡ配列が変異している遺伝子）を同定する。
【００３８】
参照ＤＮＡ配列：調査されている植物、藻類またはシダ類の参照ゲノム配列。参照ＤＮＡ配列は、一般に公開されているデータベース上で公開されている。
【００３９】
本明細書に記載されたプロセスおよびシステムの目的は、選択された植物サンプルにおける原因となる変異の同定を可能にすることである。すなわち、記載されたプロセスおよびシステムは、選択された植物サンプルにおける遺伝子配列の一部（原因となる変異）の同定を可能にする。
【００４０】
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６（Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ，Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：１２６８−１２７６）は、タマホコリカビ、変形菌における変異遺伝子の同定のための全ゲノムシークエンシングの使用について記載する。タマホコリカビは、動菌下（アメーバ動物）門のメンバーであるため、非維管束植物および藻類から系統学的に離れている。Ｔｈｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｑｕｉｃｋｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ＥＭＳ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  １０：１−４）は、Ｍ４変異体における全ゲノムシークエンシングを使用したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのメタンスルホン酸エチル生成変異の同定を詳しく述べる。本発明は、稔性変異体に依存しないため、より広範囲の変異体を検出することができる。
【００４１】
本明細書に記載されたプロセスおよびシステムは、変異フィルタリングへの代替アプローチを使用する。異系交配の代わりに、プロセスおよびシステムは最初に、バックグラウンドおよび原因となる変異の両方で、調査された変異体のすべての変異を同定する。すなわち、記載されたプロセスおよびシステムは、参照ＤＮＡ配列と比較したときに変異したＤＮＡ配列のすべての部分を同定する工程を含む。これらの変異のいくつかは、バックグラウンド変異（有用とは見なされない）であり、他は原因となる変異である。異系交配の方法では、異系交配工程は、この段階でバックグラウンド変異の数を減らすことを試みた。
【００４２】
次に、プロセスおよびシステムは、それらを、調査された変異体の原因となる変異を保有しないと予想される、または試験されたサンプルとの相補性群の一部であると予想される他の変異体由来のすべての変異と比較する。複数の減算変異体を使用することによって、フィルタリングの能力は向上し、バックグラウンド変異および技術的アーティファクトが除去される。
【００４３】
図１は、試験されたサンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法のプロセスフロー図である。
【００４４】
一般に、プロセスは工程Ｓ１０１から始まる。Ｓ１０３、Ｓ１０５、Ｓ１０７で、サンプル、参照および比較（減算）ＤＮＡ配列データは、図１を参照して記載されたコンピューティングシステムのコンピュータプログラムコードによって得られる。例えば、ＤＮＡ配列データは、ＤＮＡシークエンシングシステム１３２９から直接得るか、またはコンピュータシステム内のメモリから得るか、またはコンピュータシステムの外部にメモリを形成するか、またはＷＡＮもしくはＬＡＮを介してコンピュータシステムの外部にあるデバイスから得ることができる。
【００４５】
サンプルＤＮＡ配列データは、試験されたサンプルに関連する。参照
ＤＮＡ配列データは、参照サンプルに関連する。比較（または減算）ＤＮＡ配列データは、比較（または減算）サンプルに関連する。複数の比較サンプルが選択され、複数の比較サンプルの各々の選択は、ｉ）試験されたサンプルおよび選択された比較サンプルは、相補性群の一部に由来するという予測またはｉｉ）選択された比較サンプルは原因となる変異を含まないという予測のいずれかに基づいて行われる。
【００４６】
工程Ｓ１０９で、プロセスは、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する。
【００４７】
工程Ｓ１１１で、プロセスは、比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する。
【００４８】
工程Ｓ１１３で、プロセスは、原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを生成するために、選択された比較サンプルのタイプに基づいて（後述のように）様々なフィルタリング工程を実行する。特に、工程Ｓ１１３で、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得る。
【００４９】
上記の工程（および追加の工程）は、本明細書でより詳細に記載されている。
【００５０】
図２は、記載された構成を実施することができる、コンピュータシステム１３００を示す。本明細書に記載されたプロセスが、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードによってコンピュータシステム内に実装されると、コンピュータシステムは特有の様式で動作すると理解されるであろう。コンピュータシステム内のプロセッサは、コンピュータプログラムコードを実行するように構成され、本明細書に記載されたプロセス工程を実行する。
【００５１】
図２で明らかなように、コンピュータシステム１３００は、コンピュータモジュール１３０１、キーボード１３０２、マウスポインタデバイス１３０３、スキャナ１３２６、カメラ１３２７、タッチスクリーン１３２８、およびマイクロフォン１３８０などの入力デバイス、ならびにプリンタ１３１５、ディスプレイデバイス１３１４およびラウドスピーカー１３１７を含む出力デバイスを含む。さらに、コンピュータシステムは、ＤＮＡシークエンシングシステム１３２９の形態の入力デバイスを含み得る。ＤＮＡシークエンシングシステムは、例えば、ＤＮＡシークエンシングシステムは、ＨｉＳｅｑ２０００またはＨｉＳｅｑ４０００などのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑシリーズシークエンシングプラットフォームであり得る。ＤＮＡシークエンシングシステムからの出力は、ローリード（ｒａｗ  ｒｅａｄｓ）を含む２つのファイルであり、ペアリードの各メイトに１つずつある。すなわち、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームは、ＤＮＡ配列の先端を読み取るように設計されている。メイトとも呼ばれる、両方の先端が連結され、ペアリードをともに形成する。したがって、２つのファイルがＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングによって生成され、１つは左のメイト用で、もう１つは右のメイト用である。本発明は、ペアリードを生成することに限定されないと理解されるであろう。
【００５２】
ＤＮＡシークエンシングシステム１３２９は、Ｉ／Ｏインターフェース１３１３によってコンピュータシステムに直接接続されない場合があると理解されるであろう。例えば、ＤＮＡシークエンシングシステム１３２９は、ワイドエリアネットワーク１３２０またはローカルエリアネットワーク１３２２に接続され得る。
【００５３】
外部モジュレータ−デモジュレータ（モデム）トランシーバデバイス１３１６は、接続１３２１を介して通信ネットワーク１３２０との間で通信するために、コンピュータモジュール１３０１によって使用され得る。通信ネットワーク１３２０は、インターネット、セルラー通信ネットワーク、またはプライベートＷＡＮなどのワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）であり得る。接続１３２１が電話回線である場合、モデム１３１６は、大容量（例えば、ケーブル）接続であり得るか、またはモデム１３１６は、広帯域モデムであり得る。無線モデムはまた、通信ネットワーク１３２０への無線接続のために使用され得る。
【００５４】
コンピュータモジュール１３０１としては典型的には、少なくとも１つのプロセッサユニット１３０５、およびメモリユニット１３０６が挙げられる。例えば、メモリユニット１３０６は、半導体ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）および半導体リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を有し得る。コンピュータモジュール１３０１はまた、ビデオディスプレイ１３１４、ラウドスピーカー１３１７およびマイクロフォン１３８０に接続するオーディオビデオインターフェース１３０７、キーボード１３０２、マウス１３０３、スキャナ１３２６、カメラ１３２７、タッチスクリーン１３２８およびＤＮＡシークエンシングシステム１３２９（例えば）または他のヒューマンインターフェースデバイス（図示せず）に接続する入出力インターフェース１３１３、ならびに外部モデム１３１６およびプリンタ１３１５用のインターフェース１３０８を含む多数の入出力（Ｉ／Ｏ）インターフェースを含む。いくつかの実装形態では、モデム１３１６は、コンピュータモジュール１３０１内、例えば、インターフェース１３０８内に組み込まれ得る。コンピュータモジュール１３０１はまた、ローカルネットワークインターフェース１３１１を有し、接続１３２３を介して、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）として知られるローカルエリア通信ネットワーク１３２２へのコンピュータシステム１３００の接続を可能にする。図２に図示されるように、ローカル通信ネットワーク１３２２はまた、接続１３２４を介してワイドネットワーク１３２０に接続することができ、これは、典型的には、いわゆる「ファイアウォール」デバイスまたは同様の機能のデバイスを含む。ローカルネットワークインターフェース１３１１は、イーサネット回路カード、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）無線構成、またはＩＥＥＥ８０２．１１無線構成を含み得る。しかしながら、多数の他のタイプのインターフェースは、インターフェース１３１１に対して実施され得る。
【００５５】
Ｉ／Ｏインターフェース１３０８および１３１３は、シリアル接続およびパラレル接続のいずれかまたは両方を行うことができ、前者は、典型的には、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）標準に従って実装され、対応するＵＳＢコネクタ（図示せず）を有する。記憶デバイス１３０９は、典型的には、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）１３１０を含んで提供される。フロッピーディスクおよび磁気テープドライブ（図示せず）などの他の記憶デバイスも使用され得る。光ディスクドライブ１３１２は、典型的には、データの不揮発性のソースとして動作するために提供される。光ディスク（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）ディスク）、ＵＳＢ−ＲＡＭ、ポータブル、外付けハードディスクなどのポータブルメモリデバイスは、例えば、システム１３００へのデータの適切なソースとして使用され得る。
【００５６】
コンピュータモジュール１３０１の構成要素１３０５〜１３１３は、典型的には、相互接続バス１３０４を介して、関連する分野の当業者に知られているコンピュータシステム１３００の動作の従来のモードとなるような様式で通信する。例えば、プロセッサ１３０５は、接続１３１８を使用してシステムバス１３０４と接続する。同様に、メモリ１３０６および光ディスクドライブ１３１２は、接続１３１９によってシステムバス１３０４に接続される。記載された構成が実施され得るコンピュータの例として、ＩＢＭ−ＰＣの、および互換性のあるＡｐｐｌｅ  ＭＡＣ（商標）または同様のコンピュータシステムが挙げられる。
【００５７】
本明細書に記載の方法は、コンピュータシステム１３００を使用して実装され、記載される図１のプロセスおよび関連するプロセスは、コンピュータシステム１３００内で実行可能な１つ以上のソフトウェアアプリケーションプログラム１３３３として実装され得る。特に、原因となる変異を同定する記載された方法の工程は、コンピュータシステム１３００内で実行されるソフトウェア１３３３における命令１３３１（図２を参照）によって達成される。ソフトウェアの命令１３３１は、各々が１つ以上の特定のタスクを実施するための、１つ以上のコードモジュールとして形成され得る。
【００５８】
ソフトウェアは、例えば、後述の記憶デバイスを含むコンピュータ可読媒体に格納され得る。ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体から、コンピュータシステム１３００にロードされ、次にコンピュータシステム１３００によって実行される。コンピュータ可読媒体に記録された、そのようなソフトウェアまたはコンピュータプログラムを有するコンピュータ可読媒体は、コンピュータプログラム製品である。コンピュータシステム１３００におけるコンピュータプログラム製品の使用により、原因となる変異を同定するための有利な装置が好ましくもたらされる。
【００５９】
ソフトウェア１３３３は、典型的には、ＨＤＤ１３１０またはメモリ１３０６に格納される。ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体から、コンピュータシステム１３００にロードされ、コンピュータシステム１３００によって実行される。したがって、例えば、ソフトウェア１３３３は、光ディスクドライブ１３１２によって読み取られる光学的可読ディスク記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）１３２５に格納され得る。それに記録された、そのようなソフトウェアまたはコンピュータプログラムを有するコンピュータ可読媒体は、コンピュータプログラム製品である。コンピュータシステム１３００におけるコンピュータプログラム製品の使用により、原因となる変異を同定するための装置が好ましくもたらされる。
【００６０】
いくつかの場合では、アプリケーションプログラム１３３３は、１つ以上のＣＤ−ＲＯＭ１３２５上で符号化されて、ユーザーに提供され、対応するドライブ１３１２を介して読み取られ、または、代わりに、ネットワーク１３２０もしくは１３２２から、ユーザーにより読み取られ得る。さらに、ソフトウェアは、他のコンピュータ可読媒体から、コンピュータシステム１３００へロードされ得る。コンピュータ可読記憶媒体は、実行および／または処理のために記録された命令および／またはデータをコンピュータシステム１３００に提供する任意の非一時的な有形記憶媒体を指す。そのような記憶媒体の例としては、コンピュータモジュール１３０１の内部または外部であるかを問わず、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）ディスク、ハードディスクドライブ、ＲＯＭもしくは集積回路、ＵＳＢメモリ、光磁気ディスク、またはＰＣＭＣＩＡカードなどのコンピュータ可読カードが挙げられる。コンピュータモジュール１３０１への、ソフトウェア、アプリケーションプログラム、命令、および／またはデータの提供に関与し得る、一時的または非有形のコンピュータ可読送信媒体の例としては、無線または赤外線送信チャネル、ならびに、別のコンピュータまたはネットワーク化されたデバイスへのネットワーク接続、および、ｅ−ｍａｉｌ送信およびウェブサイトなどに記録された情報を含むインターネットまたはイントラネットなどが挙げられる。
【００６１】
上述した、アプリケーションプログラム１３３３の第２のパートおよび対応するコードモジュールは、レンダリングされ、そうでなければ、ディスプレイ１３１４上に表され、１つ以上のグラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を実装するために実行され得る。典型的にはキーボード１３０２およびマウス１３０３の操作を介して、コンピュータシステム１３００およびアプリケーションのユーザーは、制御コマンドおよび／またはＧＵＩ（複数可）に関連するアプリケーションへの入力を提供するために、機能的に調整可能な様式で、インターフェースを操作し得る。ラウドスピーカー１３１７を介したスピーチプロンプトの出力およびマイクロフォン１３８０を介した音声コマンドの入力を利用するオーディオインターフェースのような、機能的に調整可能なユーザーインターフェースの他の形態もまた、実装され得る。
【００６２】
一般に、プロセッサ１３０５は、そこで実行される命令のセットが与え得られる。プロセッサ１３０５は、次の入力を待ち、プロセッサ１３０５は、命令の別のセットを実行することによって反応する。各入力は、１つ以上のソースから提供され得る。当該ソースは、入力デバイス１３０２、１３０３の１つ以上によって生成されたデータ、ネットワーク１３２０、１３０２のうちの１つを渡る外部ソースから受信したデータ、記憶デバイス１３０６、１３０９のうちの１つから取り出されたデータ、または対応するリーダ１３１２に挿入された記憶媒体１３２５から取り出されたデータを含み、これらはすべて図２に示されている。命令のセットの実行は、場合によっては、データの出力をもたらす。実行はまた、メモリ１３３４にデータまたは変数を格納することを含み得る。
【００６３】
図３は、試験されたサンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法のプロセスフロー図である。
【００６４】
工程Ｓ３０１で、調査される（サンプル）変異体（および減算（比較）変異体（複数可））のゲノムは、ＤＮＡシークエンシングシステムによって配列決定され、試験されたサンプルＤＮＡ配列データ（および比較、つまり減算、ＤＮＡ配列データ）が生成される。上述のように、ＤＮＡシークエンシングシステムを使用して、試験されたサンプルおよび比較サンプルの各々のＤＮＡ配列データが生成される。ＤＮＡ配列データとしては、複数のリードまたはテキストの配列から構成されるローリードデータが挙げられる。ＤＮＡ配列データは、ＤＮＡシークエンシングデータに対してクオリティートリミング、インターリービング、および正規化プロセスが実行された後、分析用に作製される。
【００６５】
工程Ｓ３０２で、プロセッサは、試験されたサンプルＤＮＡ配列データのクオリティートリミングプロセスを実行し、例えば、プログラムＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ−０．３２などの任意の好適な既知のソフトウェアプログラムを呼び出すスクリプトを使用して実行することができる。トリミングプログラムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプターおよび、シークエンシングクオリティーの低下に関連するリードの一部をトリミングする。クオリティートリミングを実行するための他の既知のプロセスも使用することができる。
【００６６】
工程Ｓ３０３で、プロセッサは、インターリービングプロセスを実行することができ、例えば、任意の好適な解析スクリプトを使用して実行することができる。例えば、ペアリードがシークエンシングシステムによって得られる場合、解析スクリプトを使用して、すべてのペアリードの２つのメイトリードを単一のファイルに再結合することができる。
【００６７】
工程Ｓ３０４で、プロセッサは、正規化プロセスを実行することができ、例えば、Ｋｈｍｅｒ−０．７．１などの任意の好適な既知のソフトウェアプログラムを呼び出すスクリプトを使用して３１−ｍｅｒによって正規化することによって実行することができる。この例では、正規化プログラムは、ｋの事前定義された値を使用して、すべてのリードにおけるｋ−ｍｅｒの分布を調べ、余分な情報しか提供しないという理由で、最も頻繁なｋ−ｍｅｒを含むリードの比例量を破棄する。この工程により、次の工程のメモリ効率が向上する。
【００６８】
さらに、工程Ｓ３０５で、正規化されたリードファイルは、２つのファイル内のすべてのペアリードの２つのメイトリードを分離する任意の好適な解析スクリプトを使用して、プロセッサによってデインターリービングまたはデカップリングされる。この工程は、インターリービング工程の反対である。ペアリードごとに、同じペアリードに属するものとして同定される２つのメイトがある。それらは、同じファイル（つまりインターリービング）または別々のファイル（デインターリービング）のいずれかに書き込むことができる。あるものから別のものに移動するプロセスは、同じペアリードに属するものとしてメイトを同定するタグ付け文字列に従って解析するだけである。このタグ付けは、シークエンシングプラットフォームによって生成されたファイルに由来し、メイト１の場合はＸＹＺ／１、メイト２の場合はＸＹＺ／２のように見える。ソフトウェアはテキストマッチングによってそれらを同定し、対応するＤＮＡ配列を同じファイルまたは２つの別々のファイルに書き込む。
【００６９】
この工程は、リードが次の工程で処理されるために必要である。
【００７０】
工程Ｓ３０６およびＳ３０７で、サンプルＤＮＡ配列データの作製されたリードは、参照ゲノムに対してプロセッサによって整列され、アライメントファイルは、参照ゲノムにおけるアライメントのポジションによってプロセッサでソートされる。さらに、比較（すなわち減算）ＤＮＡ配列データの作製されたリードは、参照ゲノムに対してプロセッサによって整列され、アライメントファイルは、参照ゲノムにおけるアライメントのポジションによってプロセッサでソートされる。
【００７１】
工程Ｓ３０６のアライメント工程（サンプルおよび比較ＤＮＡ配列データの両方について）について、関連する正規化されたリードは、例えば、プログラムｂｏｗｔｉｅ２−２．１．０などの任意の好適な既知のソフトウェアプログラムを呼び出すスクリプトを使用して、参照ＤＮＡ配列データに対して整列される。ペアリードは、変異体の野生型親のゲノムの全配列と効果的に比較され、最良のマッチングが保持される。アライメントのポジション、ペアリードがこのポジションで整列する信頼度、アライメント内のミスマッチの存在、タイプ、詳細など、アライメントを説明する多数のパラメータが出力され、アライメントファイルに書き込まれる。
【００７２】
Ｓ３０７でのポジションソート工程（サンプルおよび比較ＤＮＡ配列データの両方）の場合、関連するアライメントファイルは、例えば、プログラムｂｉｏ−ｓａｍｔｏｏｌｓ−２．０．５の関数「ソート（ｓｏｒｔ）」などの任意の好適な既知のソフトウェアプログラムを呼び出すスクリプトを使用して、参照ゲノム内のアライメントのポジションによってソートされる。
【００７３】
ミスマッチが説得力のあるアライメントスコアによってサポートされている場合、ミスマッチは、工程Ｓ３０８でポジションソートされたアライメントファイルからプロセッサによって抽出され、候補ミスマッチファイルに配置される。例えば、ミスマッチは、例えば、プログラムｂｉｏ−ｓａｍｔｏｏｌｓ−２．０．５からのプログラム関数パイルアップ（ｍｐｉｌｅｕｐ）などの任意の好適な既知のソフトウェアプログラムを呼び出すスクリプトを使用して、ポジションソートされたアライメントファイルから抽出される。パイルアップ関数は、ポジションソートされたアライメントファイルを調べてミスマッチを探し、事前定義された閾値を超えて正しく整列される可能性のあるリードからのミスマッチに関連するすべての情報を新しいファイルに書き込む。
【００７４】
工程Ｓ３０９において、予想よりも多くのリードが整列するゲノムの領域は、プロセッサによって除外される。つまり、シーケンス深度は、参照ＤＮＡ配列の領域に対して整列するサンプルからのシーケンスリードの数によって定義される。サンプルのＤＮＡ配列を配列決定する場合、ユーザーはＤＮＡ配列の同じ部分を配列決定する回数を選択できる。この選択により、予想されるシーケンス深度が定義される。例えば、シーケンス深度１を目指すには、サンプリングシステムがサンプルのＤＮＡ配列全体を１回配列決定する必要がある。予想されるシーケンス深度が２０の場合、サンプリングシステムはサンプルのＤＮＡの２０倍を配列決定する。
【００７５】
したがって、例として、定義されたポジションで観察されたシーケンス深度が１０の場合、１０個のシーケンスリードがこのポジションを含む参照ＤＮＡ配列の領域に整列される。予想されるシーケンス深度が１の場合、これは１０個のリードのうち９個が誤ってＤＮＡ配列のこの領域に対して整列されたことを示唆する。このため、ソフトウェアは、観察されたシーケンス深度が予想されるシーケンス深度よりも高い参照ＤＮＡ配列の領域のミスマッチを、誤って整列されたリードの結果である可能性が高いと見なし、ミスマッチデータのセットから除去する。言い換えると、ミスマッチはアライメントアーティファクトと見なされ、候補変異とは見なされないため、データセットから破棄または除去される。この実施形態によれば、ソフトウェアは、ミスマッチファイルデータを使用し、ｂｃｆｔｏｏｌｓと呼ばれるプログラムからｖａｒＦｉｌｔｅｒと呼ばれる関数を呼び出す。この機能を実装するために、任意の他の好適なソフトウェアプログラムを使用できると理解されるであろう。
【００７６】
決定工程ＳＸ０１および工程Ｓ３０９での上記のシーケンス深度プロセスは、参照ＤＮＡ配列データに関する比較ＤＮＡ配列データのさらなるセットにも適用される。
【００７７】
言い換えれば、ミスマッチＤＮＡ配列データの第１またはそれ以上のセットを決定するために、記載された方法およびソフトウェアは、実際のリード深度が予想されるリード深度を超えていることに基づいて、参照ＤＮＡ配列データと整列するサンプルＤＮＡ配列データの少なくとも１つの領域を拒絶し得る。
【００７８】
さらに、システムは、ゲノム内のあるポジションに整列するリード群におけるミスマッチの発生頻度を使用して、決定工程ＳＸ０２および工程Ｓ３１０でアライメントアーティファクトを除外する。例えば、変異体が二倍体種である場合、変異体ゲノムでのミスマッチの予想頻度は５０％であるが、一倍体種では１００％である。観察されたシーケンス深度が定義された種の予想されるシーケンス深度と一致しない場合、関連するリードはデータセットから破棄される。また、これはサンプルおよび比較ＤＮＡ配列の両方のデータのセットに適用される。最後に、決定ＳＸ０３および工程Ｓ３１１で、ごくわずかなリードによってサポートされるミスマッチは、候補ミスマッチファイルからミスマッチを除去することによって、プロセッサによって無視される。システムはさらに、生物学的基準を使用してミスマッチをフィルタリングする。最初の生物学的基準は、調査された変異体（複数可）に対するミスマッチの特異性である。別々にまたは一緒に使用できる２つの主要なシナリオがある。シナリオＡの場合、減算変異体および試験されたサンプルは同じように見えるか、同様に動作する（つまり、表現型的に似ている）、および／またはシナリオＢの場合、独立した変異系統および試験されたサンプルは見た目も動作も異なる（つまり、表現型的に異なる）。シナリオＡの場合、比較（減算）サンプルは、調査された（サンプル）変異体および減算（比較）変異体が、表現型的に類似していることに基づいて相補性群を形成するという予測に基づいて選択される。これは、変異体が不稔性でない場合、ペアワイズクロッシングによって任意に試験され得る。この予測工程は、特定の実施形態では「相補性群予測工程」と呼ばれ得る。次に、システムは、減算系統（すなわち、仮定された比較変異体サンプルの遺伝子配列）のミスマッチリード（ミスマッチ）のクオリティートリミング、正規化、アライメント、ポジショニングおよびソート（上記のとおり）の工程を実行する。次に、システムは、調査された（サンプル）変異体のミスマッチのセットを減算（比較）変異体のミスマッチのセットと比較し、調査された変異体およびすべての減算変異体の両方で見つかったミスマッチのみをミスマッチの候補セットに保持する。調査された変異体および減算変異体の両方にあるミスマッチ（参照サンプルと比較して）を保持することにより、ミスマッチの１つが原因となる変異に関連する可能性がはるかに高くなる。したがって、この工程により、候補となる変異の数が減り、原因となる変異を同定するために必要な追加の処理の量が減る。シナリオＢの場合、比較（減算）サンプルは、減算（比較）変異体が調査された（サンプル）変異体の原因となる変異を含まないという予測に基づいて選択される。これは、変異体が不稔性でない場合、ペアワイズクロッシングによって任意に試験され得る。この予測工程は、特定の実施形態では「比較原因となる変異予測工程」と呼ばれ得る。次に、システムは、減算比較系統のミスマッチリード（ミスマッチ）のクオリティートリミング、正規化、アライメント、ポジショニングおよびソート（上記のとおり）の工程を実行する。次に、システムは、調査された（サンプル）変異体のミスマッチのセットを減算（比較）変異体のミスマッチのセットと比較し、調査された変異体に特異的なミスマッチのみをミスマッチの候補セットに保持する。つまり、減算変異サンプルおよび調査された変異サンプルの両方で遺伝子配列に同じミスマッチが見つかった場合、その特定のミスマッチは原因となる変異ではないと見なされる。
【００７９】
システムは、シナリオＡおよびシナリオＢの両方に関連するプロセスを連続的または同時に実施して、プロセス全体の能力を高めることができる。
【００８０】
最後に、標準的な生物学的基準を使用して、原因となる変異である可能性が低い調査された変異体のミスマッチを破棄することもできる。第１に、システムは、変異体を作成するために使用される変異誘発方法から期待される変異の特徴と一致しないミスマッチを破棄する可能性がある。すなわち、非標準的なミスマッチフィルタリングは、システムが、調査される変異体を生成するために使用される変異誘発方法の変異シグネチャーと一致しない候補ミスマッチのセットのミスマッチのみを保持する場合に実行され得る。次に、システムは、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こさないミスマッチ（すなわち、遺伝子間領域、非翻訳領域、またはイントロンにある変異）を破棄する。すなわち、システムがタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こす候補ミスマッチのセットのミスマッチのみを保持する場合、非コーディングミスマッチフィルタリングを実行することができる。
【００８１】
例えば、プロセッサは、変異した遺伝子（サンプル）のコード配列を入力として得て、対応する翻訳されたタンパク質配列を一時的なアレイに格納する。次に、システムは、参照コード配列について同じことを繰り返し、対応するタンパク質配列を一時的なアレイにプッシュすることができる。さらに、システムは次いで、一時的なアレイの両方の要素にテキストを一致させ、一致がない場合、関連するミスマッチを候補ミスマッチのセットに書き込むことができる。
【００８２】
図４を参照すると、サンプルから採取され、参照ＤＮＡ配列４０３に対して参照される複数のリード４０１の例が提供される。４０５に示されるように、サンプルからの複数のリードは、参照ＤＮＡ配列データ４０３を参照して整列され、ポジションソートされている。つまり、（サンプルの）リードは、サンプルのリードが（ポジション的に）対応する、または整列する参照配列の上に表示される。
【００８３】
垂直線４０７は、その線を通過する任意のリードとそのポジションでの参照ＤＮＡ配列データとの間に差があることを示している。つまり、そのリードの配列および参照配列の間にミスマッチがある。
【００８４】
セクション４０９は、遺伝子のコード配列を示す。この実施形態の文脈において、遺伝子は、タンパク質をコードするＤＮＡの配列である。遺伝子の一部はタンパク質のコーディングに必要な情報を保有するが、残りは保有しない。この情報を保有する部分は、遺伝子のコード配列と呼ばれる。これは、太い黒いバー（コード配列）および細い線（非コード配列）で４０９に視覚的に表される。
【００８５】
セクション４１１は、参照配列のある一定のポジションでのサンプルのリード数を示す。
【００８６】
図４は、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データの複数のリードを参照して説明されているが、比較（減算）ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データでも同じタイプの情報が生成されることが理解されよう。
【００８７】
図５を参照すると、サンプルから採取され、参照ＤＮＡ配列データからの単一のリード５０３に対して参照される複数のリード５０１のさらなる例が提供される。このグラフ表示では、サンプルＤＮＡ配列の観察されたリード数が、参照配列に対する関連するポジションに示されている。これにより、ソフトウェアは、予想されるシーケンス深度が測定されたシーケンス深度と一致しているかどうかを決定できる。
【００８８】
ポジション５０５では、観察されたシーケンス深度（つまり、このポジションでのリード数）が予想されるシーケンス深度と一致しているため、これらのリードのミスマッチは候補ミスマッチファイルに保持されていることが読み取れる。一方、ポジション５０７では、観察されたシーケンス深度（つまり、このポジションでのリード数）が予想されるシーケンス深度と一致しないため、これらのリードは候補ミスマッチファイルに保持されないことが読み取れる。つまり、候補ミスマッチファイルから削除、除去、または破棄される。
【００８９】
図６では、予想される対立遺伝子頻度に関連する頻度基準かどうかを決定するためのグラフ表示が示されている。この例では、矢印６０１で示されるポジションで、サンプルのＤＮＡ配列は、参照ＤＮＡ配列に対して関連するポジションでのすべてのリードで異なる。そのため、対立遺伝子頻度は１００％であり、頻度基準が満たされると、ミスマッチデータは候補ミスマッチファイルに保持される。
【００９０】
図７では、予想される対立遺伝子頻度に関連する頻度基準かどうかを決定するためのグラフ表示が示されている。この例では、矢印７０１および７０３で示されるポジションで、サンプルのＤＮＡ配列は、参照ＤＮＡ配列に対して関連するポジションでのこれらのリードで異なる。そのため、対立遺伝子頻度は１００％ではなく、ミスマッチデータは候補ミスマッチファイルに保持されない。つまり、頻度基準が満たされていないため、候補ミスマッチファイルから削除、除去、または破棄される。
【００９１】
本開示の第１、第３、第５および第７の態様によれば、関心対象の表現型に関連する変異、すなわち原因となる変異を同定するための方法が提供される。これらの態様では、減算変異体および試験されたサンプルは同じように見えるか、同様に動作する（つまり、表現型的に似ている）。
【００９２】
本開示の第２、第４、第６および第８の態様によれば、関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供される。これらの態様では、独立した変異系統および試験されたサンプルは、見た目も動作も異なる（つまり、表現型的に異なる）。
【００９３】
これらの態様では、方法を実施する前に、関心対象の表現型に関連する作用機序もしくは生物学的標的の予測または知識を有することは必須ではない。したがって、この方法を使用して、原因となる変異の可能性のあるゲノムポジションが不明であり、関心対象の表現型を示す植物における原因となる変異を同定することができる。
【００９４】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物由来であり、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【００９５】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【００９６】
一実施形態では、この方法は、
（ｂ−ｉ）少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定することをさらに含み、追加の比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
（ｃ）第３のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第３のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定することをさらに含み、ミスマッチの２つのサブセットは、原因となる変異の候補変異である。
【００９７】
一実施形態では、この方法は、
（ｂ−ｉ）少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定することをさらに含み、追加の比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立したシダ類に由来し、独立したシダ類は、同じ属であり、
（ｃ）第３のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第３のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定することをさらに含み、ミスマッチの２つのサブセットは、原因となる変異の候補変異である。
【００９８】
一実施形態では、この方法は、
（ｂ−ｉ）少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定することをさらに含み、追加の比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した藻類に由来し、独立した藻類は、同じ属であり、
（ｃ）第３のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第３のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定することをさらに含み、ミスマッチの２つのサブセットは、原因となる変異の候補変異である。
【００９９】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、および
少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、および
第３のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第３のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチの２つのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、追加の比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１００】
植物または植物集団を変異原に曝露すると、植物ゲノムに変異をもたらすことができる。同様に、シダ類もしくは藻類植物または集団を曝露すると、それらのゲノムに変異をもたらすことができる。変異はランダムに発生する場合もあれば、標的となる変異の場合もある。その結果、変異誘発のプロセスによるゲノムの変化は、表現型の変化をもたらす可能性がある。多数の変異原を使用して、本発明で使用するための変異体植物、シダ類および藻類を生成することができる。
【０１０１】
一実施形態では、試験サンプルは変異誘発されている。一実施形態では、試験サンプルは変異原への曝露によって変異誘発されている。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、変異誘発されている。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、変異原への曝露によって変異誘発されている。
【０１０２】
一実施形態では、試験サンプルは変異誘発されており、変異誘発は自然には起こらない。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、変異誘発されており、変異誘発は自然には起こらない。一実施形態では、試験サンプルは変異誘発されており、変異誘発は実験的に誘発される。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、変異誘発されており、変異誘発は実験的に誘発される。
【０１０３】
一実施形態では、変異原は放射線である。一実施形態では、変異原は紫外線（ＵＶ）光、Ｘ線、ガンマ線および中性子からなる群から選択される。一実施形態では、変異原はＵＶ光、任意にＵＶ−Ａ、ＵＶ−ＢまたはＵＶ−Ｃ光である。一実施形態では、変異原はＵＶ−Ｂ光である。
【０１０４】
一実施形態では、変異原は化学薬剤である。一実施形態では、化学薬剤はアルキル化剤、任意にメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、硫酸ジメチル、アジ化ナトリウム、メチルニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）である。一実施形態では、化学薬剤は脱アミノ化剤である。一実施形態では、化学薬剤は挿入剤である。
【０１０５】
一実施形態では、変異原は転移因子（トランスポゾンとしても知られている）である。当業者は、植物に変異誘発を誘導するための多数の変異原があり、本発明の方法内で採用することができることを理解するであろう。
【０１０６】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学的または物理的薬剤への曝露によって変異誘発された非維管束植物物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学的または物理的薬剤への曝露によって変異誘発されたシダ類生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学的または物理的薬剤への曝露によって変異誘発された藻類生物質である。
【０１０７】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学薬剤によって変異誘発された非維管束植物物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、放射線によって変異誘発された非維管束植物物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学薬剤によって変異誘発されたシダ類生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、放射線によって変異誘発されたシダ類生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、化学薬剤によって変異誘発された藻類生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、放射線によって変異誘発された藻類生物質である。
【０１０８】
一実施形態では、この方法は、以下の準備工程：
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、または
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、を含み、
（ｉ）〜（ｉｉｉｉ）は（ａ）に先立って実施される。
【０１０９】
一実施形態では、この方法は、以下の準備工程：
（ｉ）シダ類の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発されたシダ類から試験サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発されたシダ類から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、または
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発されたシダ類から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、を含み、
（ｉ）〜（ｉｉｉｉ）は（ａ）に先立って実施される。
【０１１０】
一実施形態では、この方法は、以下の準備工程：
（ｉ）藻類の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発されたシダ類から試験サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発された藻類から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、または
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された藻類から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、を含み、
（ｉ）〜（ｉｉｉｉ）は（ａ）に先立って実施される。
【０１１１】
一実施形態では、この方法は、試験および／または少なくとも１つの比較サンプルを受け取ることを含む。一実施形態では、この方法は、試験および／または少なくとも１つの比較サンプルからＤＮＡ配列を受け取ることを含む。一実施形態では、この方法は、試験および／または少なくとも１つの比較サンプルを得ることを含む。一実施形態では、この方法は、試験および／または少なくとも１つの比較サンプルを単離することを含む。一実施形態では、この方法は、試験および／または少なくとも１つの比較サンプルからＤＮＡ配列を単離することを含む。
【０１１２】
一実施形態では、試験サンプルは植物全体または植物の実質的な部分であり得る。一実施形態では、試験サンプルは植物全体またはシダ類の実質的な部分であり得る。一実施形態では、試験サンプルは植物全体または藻類の実質的な部分であり得る。一実施形態では、試験サンプルは植物プロトプラスト、カルス、胞子体、胞子細胞、胞子、無性芽、配偶体、精子、造精器、仮根、接合子または胚であり得る。一実施形態では、試験サンプルは非維管束植物組織であり得る。一実施形態では、試験サンプルはシダ類組織であり得る。一実施形態では、試験サンプルは藻類組織であり得る。
【０１１３】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物由来であり、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１１４】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立したＭ１世代の非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、関心対象の表現型を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１１５】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１１６】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異である。
【０１１７】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立したＭ１世代の非維管束植物に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１１８】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｉｉ）同じ関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１１９】
一実施形態では、工程（ｂ）は、少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定することを含む。少なくとも１つの比較サンプルは、１つの比較サンプル、および１つ以上の比較サンプル（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の比較サンプル）の両方を含む。
【０１２０】
一実施形態では、（ｂ）の工程は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定することを含む。一実施形態では、この方法は、７つ以上の比較サンプルを利用する。複数の比較サンプル（つまり２つ以上）の場合、複数の独立した比較が行われる。最初に、第１の比較サンプルのＤＮＡ配列と参照ＤＮＡ配列との間で、第１のセットのミスマッチを得る。第２に、第２の比較サンプルのＤＮＡ配列と参照ＤＮＡ配列との間で、第２のセットのミスマッチを得る。第３に、第３の比較サンプルのＤＮＡ配列と参照ＤＮＡ配列との間で、第３のセットのミスマッチを得る。同様に、これは、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４または第１５のサンプルに関連して実施され、分析のために使用されるのと同じくらいの数の比較サンプルに関連して実施され得る。工程（ｂ）で同定された第１、第２、第３などのセットのミスマッチは、集合的に第２のセットのミスマッチを形成し、方法の工程（ａ）で同定された第１のセットのミスマッチに関してフィルタリングするために使用される。プログラムｖｃｆｔｏｏｌｓまたはＳｎｐＳｉｆｔなど、これらの比較工程を実施するためのいくつかのツールが知られている。
【０１２１】
本発明は、関心対象の表現型形質に関連する原因となる変異の遺伝様式を理解することに依存していない。したがって、本発明は、従来の変異誘発研究で採用されている、分離パターンを決定するために関心対象の変異体を異系交配するという時間のかかる工程を回避する。さらに、本発明は、関心対象の表現型およびＭ１変異体の子孫に分離する多型のグループを、関心対象の表現型と関連付けることに依存しない。したがって、本発明は、原因となる変異をマッピングするために関心対象の変異体を異系交配するという、従来の変異誘発研究で採用されている時間のかかる工程を回避する。一実施形態では、試験サンプルは、Ｍ１世代の変異体である。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍ１世代の変異体である。Ｍ１変異体であるがゆえに、非維管束植物は異系交配されない。したがって、この方法では原因となる変異を同定するために変異体を交配する必要がないため、不稔性を引き起こすＭ１変異体の原因となる変異を同定することが可能である。
【０１２２】
一実施形態では、試験サンプルは、Ｍ１またはＭ２世代の変異体である。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍ１またはＭ２世代の変異体である。一実施形態では、試験サンプルは、Ｍ１、Ｍ２またはＭ３世代の変異体である。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍ１、Ｍ２またはＭ３世代の変異体である。
【０１２３】
一実施形態では、この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、分離分析、複合分離分析、またはバルク分離分析の工程を必要としない。一実施形態では、この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、非維管束植物の受精の工程を必要としない。一実施形態では、この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、自家受精、受精、異系交配、戻し交配また非維管束植物の近同質遺伝子系統による受精を必要としない。
【０１２４】
一実施形態では、この方法は、原因となる変異を同定するために、関心対象の表現型の遺伝特性の知識を必要としない。一実施形態では、この方法は、原因となる変異を同定するために、関心対象の表現型の遺伝パターンを決定する工程を含まない。
【０１２５】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、関心対象の表現型を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、分離分析、複合分離分析、またはバルク分離分析の工程を含まない。
【０１２６】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、独立した非維管束植物は、関心対象の表現型を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、受精の工程を必要としない。
【０１２７】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、分離分析、複合分離分析、またはバルク分離分析の工程を含まない。
【０１２８】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
この方法は、関心対象の表現型に関連する原因となる変異を同定するために、自家受精の工程を必要としない。
【０１２９】
一実施形態では、試験サンプルは、一倍体植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、一倍体植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルは、そのライフサイクル間に主に一倍体相にある植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、そのライフサイクル間に主に一倍体相にある植物に由来する生物質である。
【０１３０】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、藻類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）またはストレプト藻（ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ  ａｌｇａｅ）に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、
Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｋｙｂｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｋｌｅｂｓｏｒｍｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｚｙｇｎｅｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ、ＣｈａｒｏｐｈｙｃｅａｅおよびＣｏｌｅｏｃｈａｅｔｏｐｈｙｃｅａｅに由来する生物質である。
【０１３１】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｕｄａｔａ  Ｗｉｌｌｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｅｈｒｅｎｂｅｒｇｉｉ  Ｇｏｒｏｚｈａｎｋｉｎ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｅｗｕｓｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｖａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｖｏｉｄａｅまたはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ａｌｇａｅに由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ａｌｇａｅに由来する生物質である。
【０１３２】
一実施形態では、試験サンプルは、蘚苔類である非維管束陸生植物に由来する生物質および／または少なくとも１つの比較サンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、蘚類、苔類およびツノゴケ類からなる群から選択される蘚苔類に由来する生物質である。
【０１３３】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、ツノゴケ類に由来する生物質である。
【０１３４】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、蘚類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルは、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属の蘚類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓまたはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｒｅａｄｅｒｉ蘚類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ蘚類に由来する生物質である。
【０１３５】
好ましい実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、苔類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎｉｏｐｓｉｄａ網の植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、ＪｕｎｇｅｒｍａｎｎｉｉｄａｅまたはＭｅｔｚｇｅｒｉｉｄａｅ亜綱の植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉｏｐｓｉｄａ綱の植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、ＭａｒｃｈａｎｔｉｉｄａｅまたはＳｐｈａｅｒｏｃａｒｐｉｄａｅ亜網の植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｈａｐｌｏｍｉｔｒｉｏｐｓｉｄａ網の植物に由来する生物質である。
【０１３６】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、生物質の葉状苔類、単純葉状体苔類または複雑葉状体苔類である。
【０１３７】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ種の植物に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｌｐｅｓｔｒｉｓ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｑｕａｔｉｃａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃａｒｒｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃｈｅｎｏｐｏｄａ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｅｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｏｍｉｎｇｅｎｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｆｏｌｉａｃｉａ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｇｒｏｓｓｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｉｎｆｌｅｘａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｍａｃｒｏｐｏｒａ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｏｖｏｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｅａｃｅａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｉｌｌａｔｅ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｐｅａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｍ．ａｑｕａｔｉｃａとしても知られている）、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｒｕｂｒｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｏｌｏｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｔｒｅｉｍａｎｎｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｕｂｇｅｍｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｗａｌｌｉｓｉｉまたはＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓに由来する生物質である。好ましい実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａに由来する生物質である。
【０１３８】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、シダ類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、Ｅｕｓｐｏｒａｎｇｉａｔｅシダ類またはＬｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｔｅシダ類（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｉｄａｅシダ類としても知られている）に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、シダ類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルは、Ｅｕｓｐｏｒａｎｇｉａｔｅシダ類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、ｍａｒａｔｔｉｏｉｄシダ類（Ｍａｒａｔｔｉｉｄａｅ、Ｍａｒａｔｔｉａｃｅａｅ）、トクサシダ類（Ｅｑｕｉｓｅｔｉｉｄａｅ、Ｅｑｕｉｓｅｔａｃｅａｅ）、ｗｈｉｓｋシダ類またはハナワラビ（ｍｏｏｎｗｏｒｔ）シダ類に由来する生物質である。
【０１３９】
一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ属の独立した植物に由来するサンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ種の独立した植物に由来するサンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ属の独立したシダ類に由来するサンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ種の独立したシダ類に由来するサンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ属の独立した藻類に由来するサンプルである。一実施形態では、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルは、同じ種の独立した藻類に由来するサンプルである。
【０１４０】
一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用される植物と同じ属の植物の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用される植物と同じ種の植物の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用されるシダ類と同じ属のシダ類の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用されるシダ類と同じ種のシダ類の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用されるシダ類と同じ属の藻類の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、参照ＤＮＡ配列は、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルとして使用されるシダ類と同じ種の藻類の既知のＤＮＡ配列である。一実施形態では、この方法は、（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を１つ以上の参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、および／または（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を１つ以上の参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、を含む。参照ゲノムは公開データベースで幅広く利用可能であり、当業者は適切な参照配列を選択する方法を理解している。
【０１４１】
一実施形態では、この方法は、（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を２つ以上の参照ＤＮＡ配列に整列させ、第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、および／または（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を２つ以上の参照ＤＮＡ配列に整列させ、第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、を含む。複数の参照ＤＮＡサンプル（つまり２つ以上）の場合、複数の独立した比較が行われる。最初に、試験サンプルのＤＮＡ配列と第１の参照ＤＮＡ配列との間で、第１のセットのミスマッチを得る。第２に、試験サンプルと第２の参照ＤＮＡ配列との間で、第２のセットのミスマッチを得る。第３に、試験サンプルと参照ＤＮＡ配列との間で、第３のセットのミスマッチなどを得る。第１、第２、第３などのセットのミスマッチは、集合的に、工程（ａ）の第１のセットのミスマッチを形成する。同様に、複数の独立した比較を実施し、少なくとも１つの比較サンプルを複数の参照ＤＮＡ配列と比較し、工程（ｂ）の第２のセットのミスマッチを形成する。
【０１４２】
一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、胞子形成生物、例えば胞子形成植物、胞子形成藻類または胞子形成シダ類に由来する生物質である。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、胞子を介して繁殖する非維管束植物に由来する。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、胞子を介して繁殖するシダ類に由来する。一実施形態では、試験サンプルおよび／または少なくとも１つの比較サンプルは、胞子を介して繁殖する藻類に由来する。
【０１４３】
一実施形態では、苔類植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した苔類植物に由来し、独立した苔類植物は、関心対象の表現型を示し、独立した苔類植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の苔類植物の既知の参照配列である。
【０１４４】
一実施形態では、苔類植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した苔類植物に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非苔類植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した苔類植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の苔類植物の既知の参照配列である。
【０１４５】
一実施形態では、シダ類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立したシダ類植物に由来し、独立したシダ類植物は、関心対象の表現型を示し、独立したシダ類植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属のシダ類の既知の参照配列である。
【０１４６】
一実施形態では、シダ類植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立したシダ類植物に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示すシダ類植物に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立したシダ類植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属のシダ類の既知の参照配列である。
【０１４７】
一実施形態では、藻類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した藻類に由来し、独立した藻類は、関心対象の表現型を示し、独立した藻類は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の藻類の既知の参照配列である。
【０１４８】
一実施形態では、藻類における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した藻類に由来し、試験サンプルは、関心対象の表現型を示す藻類に由来し、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した藻類に由来し、参照ＤＮＡ配列は、この属の藻類の既知の参照配列である。
【０１４９】
一実施形態では、関心対象の表現型は、非維管束植物、シダ類もしくは藻類のサイズ、高さ、サイズ、色または構造などの形態的特徴である。一実施形態では、関心対象の表現型は、収量の増加、ストレス耐性、ストレス抵抗性、非生物ストレス耐性、非生物ストレス抵抗性、耐塩性、塩抵抗性、不稔性、乾燥抵抗性、耐乾燥性、高温もしくは低温に対する抵抗性、霜抵抗性、耐霜性、成長速度、細胞分裂速度、耐病性、病害抵抗性、病害感受性、除草剤耐性、除草剤抵抗性、除草剤感受性、抗生物質耐性、抗生物質抵抗性または抗生物質感受性などの観察可能特性である。所望の関心対象の表現型に応じて、植物、藻類またはシダ類は、野生型植物と比較して、関心対象の形質（例えば、除草剤抵抗性）のレベルの増加または減少を示し得る。一実施形態では、関心対象の表現型は、野生型レベルと比較して、関心対象の形質の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％の増加を示す植物である。一実施形態では、関心対象の表現型は、野生型レベルと比較して、関心対象の形質の２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００％の増加を示す植物である。一実施形態では、関心対象の表現型は、野生型レベルと比較して、関心対象の形質の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％の減少を示す植物である。
【０１５０】
一実施形態では、関心対象の表現型は、除草剤抵抗性である。一実施形態では、関心対象の表現型は、除草剤耐性である。一実施形態では、関心対象の表現型は、除草剤感受性である。一実施形態では、関心対象の表現型は、ウイルス、細菌もしくは真菌の病原体に対する増加した抵抗性または増加した耐性であり得る。一実施形態では、関心対象の表現型は、天然の、合成のもしくは化学的除草剤に対する増加した抵抗性または増加した耐性であり得る。好ましい実施形態では、関心対象の表現型は、増加した除草剤抵抗性であり得る。好ましい実施形態では、関心対象の表現型は、特定の除草剤に対する増加した除草剤抵抗性であり得る。試験サンプルは、特定の除草剤に対して抵抗性である非維管束植物に由来し得、少なくとも１つの比較サンプルは、代替の除草剤に対して抵抗性であるか、または代替の表現型を示す（すなわち、特定の除草剤に対する抵抗性を示さない）独立した非維管束植物に由来し得る。除草剤抵抗性の場合、抵抗性は、関心対象の除草剤への曝露後の植物の生存として決定することができる（すなわち、植物は除草剤曝露後に死なない）。一実施形態では、生存は、除草剤曝露後１週間での植物の生存として決定される。一実施形態では、生存は、除草剤曝露後２週間での植物の生存として決定される。一実施形態では、生存は、除草剤曝露後３週間での植物の生存として決定される。
【０１５１】
一実施形態では、この方法は、非維管束植物、シダ類もしくは藻類またはシダ類を薬剤に曝露することを含む。薬剤への曝露は、関心対象の表現型を示す植物、シダ類、または藻類をもたらす可能性がある。薬剤は、栄養素、栄養飢餓反応を誘発する分子、植物成長調節剤、植物成長阻害剤、植物成長促進剤、肥料または除草剤であり得る。一実施形態では、試験サンプルは、薬剤に曝露されている非維管束植物に由来する。一実施形態では、試験サンプルは、薬剤に曝露されているシダ類に由来する。一実施形態では、試験サンプルは、薬剤に曝露されている藻類に由来する。一実施形態では、試験サンプルは、除草剤に曝露されている非維管束植物に由来する。
【０１５２】
一実施形態では、この方法は、非維管束植物を関心対象の薬剤に曝露すること、および薬剤に対する非維管束植物の応答に基づいて、関心対象の表現型を示す非維管束植物を選択することを含む。一実施形態では、この方法は、非維管束植物を関心対象の除草剤に曝露すること、および除草剤に対する非維管束植物の応答に基づいて、関心対象の表現型を示す非維管束植物を選択することを含む。一実施形態では、この方法は、非維管束植物を関心対象の除草剤に曝露すること、および除草剤抵抗性を示す非維管束植物を選択することを含む。
【０１５３】
一実施形態では、この方法は、シダ類を関心対象の薬剤に曝露すること、および薬剤に対するシダ類の応答に基づいて、関心対象の表現型を示すシダ類を選択することを含む。一実施形態では、この方法は、藻類を関心対象の薬剤に曝露すること、および薬剤に対する藻類の応答に基づいて、関心対象の表現型を示す藻類を選択することを含む。
【０１５４】
一実施形態では、この方法は、以下の準備工程：
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を薬剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、をさらに含み、（ｉ）〜（ｉｖ）は、（ａ）に先立って実施される。
薬剤への曝露は、関心対象の表現型をもたらす可能性がある。一実施形態では、この方法は、非維管束植物を関心対象の薬剤に曝露すること、および薬剤に対する非維管束植物の応答に基づいて、関心対象の表現型を示す非維管束植物を選択することを含む。
【０１５５】
一実施形態では、方法は、以下の準備工程：
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を除草剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、をさらに含み、（ｉ）〜（ｉｖ）は、（ａ）に先立って実施される。
【０１５６】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、さらに非維管束植物は、薬剤に曝露されており、
独立した非維管束植物は、関心対象の表現型を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１５７】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、さらに非維管束植物は、除草剤に曝露されており、
独立した非維管束植物は、関心対象の表現型を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１５８】
一実施形態では、非維管束植物における除草剤抵抗性に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、さらに非維管束植物は、除草剤に曝露されており、
独立した非維管束植物は、除草剤に対する抵抗性を示し、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１５９】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、さらに非維管束植物は、薬剤に曝露されており、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６０】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、さらに非維管束植物は、除草剤に曝露されており、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６１】
一実施形態では、非維管束植物における除草剤抵抗性に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、変異原に曝露されている独立した非維管束植物に由来し、試験サンプルは、除草剤抵抗性を示す非維管束植物に由来し、比較サンプルは、異なる表現型を示す同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６２】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を薬剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６３】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を除草剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）同じ関心対象の表現型を示す独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６４】
一実施形態では、非維管束植物における除草剤抵抗性に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を除草剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）除草剤に対する抵抗性を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）同じ関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６５】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を薬剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）関心対象の表現型を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６６】
一実施形態では、非維管束植物における除草剤抵抗性に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を除草剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）除草剤抵抗性を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）同じ関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６７】
一実施形態では、非維管束植物における除草剤抵抗性に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を除草剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）除草剤抵抗性を示す変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）同じ関心対象の表現型を示さない独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、および
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
参照ＤＮＡ配列は、属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６８】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）試験サンプルからゲノムＤＮＡおよび少なくとも１つの比較サンプルからゲノムＤＮＡを得て、シークエンシングライブラリを生成すること、
（ｉｉ）クラスター形成を行うこと、
（ｉｉｉ）試験サンプルからのゲノムＤＮＡおよび少なくとも１つの比較サンプルからのゲノムＤＮＡを配列決定し、配列リードを得ること、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１６９】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するための方法が提供され、
（ｉ）試験サンプルからゲノムＤＮＡおよび少なくとも１つの比較サンプルからゲノムＤＮＡを得て、シークエンシングライブラリを生成すること、
（ｉｉ）クラスター形成を行うこと、
（ｉｉｉ）試験サンプルからのゲノムＤＮＡおよび少なくとも１つの比較サンプルからのゲノムＤＮＡを配列決定し、配列リードを得ること、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定すること、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）第２のセットの配列ミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、
試験サンプルおよび比較サンプル（複数可）は、関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物由来であり、独立した非維管束植物は、同じ属であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１７０】
一実施形態では、この方法は、ローリードを提供するために、試験サンプルおよび少なくとも１つの比較サンプルからのＤＮＡ配列を配列決定することを含む。一実施形態では、ＤＮＡを配列決定する工程は、ローリードＤＮＡ配列をクオリティートリミングおよび正規化することを含む。これらのシークエンシング工程の各々を実施するために、多数のソフトウェアパッケージが存在する。
【０１７１】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、コンピュータ実装方法である。一実施形態では、方法工程（ａ）〜（ｃ）および任意に（ｄ）は、コンピュータプログラムコードによって実行される。一実施形態では、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサは、コンピュータプログラムコードを介して方法工程（ａ）〜（ｃ）および任意に（ｄ）を実行する。
【０１７２】
一実施形態では、この方法は、同定された候補変異を生物学的フィルターでフィルタリングし、原因となる変異の候補変異の数を減らすことを含む。このさらなるフィルタリング工程は、第２のセットのミスマッチに関して第１のセットのミスマッチをフィルタリングする第１のフィルタリング工程（ｃ）の後に実施することができる。生物学的フィルターは、変異誘発方法の変異シグネチャーと一致しない変異のためのフィルター（非標準的なミスマッチフィルター）であり得る。生物学的フィルターは、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こさないミスマッチのためのフィルターであり得る。生物学的フィルターは、非コーディング変異のためのフィルターであり得る。生物学的フィルターは、予測された機能を持つ遺伝子のコード配列にあるミスマッチのためのフィルターであり得る。
【０１７３】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するためのシステムが提供され、このシステムは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサを含み、コンピュータプログラムコードは、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定し、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定し、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１および第２のセットのミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定するように構成され、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物由来であり、比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物由来であり、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１７４】
一実施形態では、非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するためのシステムであって、このシステムは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサを含み、コンピュータプログラムコードは、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、
試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定し、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定し、
（ｃ）第２のセットのミスマッチに関して、第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定するように構成され、ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、
試験サンプルは、関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、少なくとも１つの比較サンプルは、関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、
参照ＤＮＡ配列は、この属の非維管束植物の既知の参照配列である。
【０１７５】
例えば、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法などの他の態様もまた想定され、ｉ）独立した対立遺伝子Ｍ１変異系統の試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという相補性群の予測ならびに／またはｉｉ）独立した非対立遺伝子Ｍ１変異系統の比較サンプルおよびＭ０野生型植物が原因となる変異を含まないという比較原因となる変異の予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する工程を含む方法であり、
相補性群の予測または比較原因となる変異の予測は、分離分析の工程を含まず、この方法は、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサの工程をさらに含み、コンピュータプログラムコードは、試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得る方法を実行する。
【０１７６】
別の例としては、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するためのシステムもまた想定され、独立した対立遺伝子Ｍ１変異系統の試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという相補性群の予測ならびに／またはｉｉ）独立した非対立遺伝子Ｍ１変異系統の比較サンプルおよびＭ０野生型植物が原因となる変異を含まないという比較原因となる変異の予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する方法を含むシステムであり、相補性群の予測または比較原因となる変異の予測は、分離分析の工程を含まず、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサをさらに含むシステムであり、コンピュータプログラムコードは、試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得るように構成される。
【０１７７】
一態様では、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するための方法が提供され、ｉ）試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測、ならびに／またはｉｉ）比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する工程を含む方法であり、この方法は、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサの工程をさらに含み、コンピュータプログラムコードは、
試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、
参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、
比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、
サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得る方法を実行する。
【０１７８】
一実施形態では、比較サンプルは、試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測に基づいて選択され、
ｉ）第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データおよびｉｉ）さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データの両方における共通のミスマッチＤＮＡ配列データを決定することによって、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、
共通のミスマッチＤＮＡ配列データに基づいて候補ミスマッチのセットを生成する方法を実行するコンピュータプログラムコードをさらに含む。
【０１７９】
一実施形態では、比較サンプルは、比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測に基づいて選択され、
第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データにあり、およびさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データにはない共通しないミスマッチＤＮＡ配列データを決定することによって、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、
共通しないミスマッチＤＮＡ配列データに基づいて候補ミスマッチのセットを生成する方法を実行するコンピュータプログラムコードをさらに含む。
【０１８０】
一実施形態では、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する工程は、コンピュータプログラムコードの工程：
サンプルＤＮＡ配列データの各リードを参照ＤＮＡ配列データに整列させ、
参照ＤＮＡ配列データに対するサンプルＤＮＡ配列データのリードのポジションに基づいて、サンプルＤＮＡ配列データの整列させたリードをソートすること、を含む。
【０１８１】
一実施形態では、第２のまたはさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する工程は、コンピュータプログラムコードの工程：
比較ＤＮＡ配列データの各リードを参照ＤＮＡ配列データに整列させ、
参照ＤＮＡ配列データに対する比較ＤＮＡ配列データのリードのポジションに基づいて、比較ＤＮＡ配列データの整列させたリードをソートすること、を含む。
【０１８２】
一実施形態では、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する工程は、コンピュータプログラムコードの工程：
所定のシーケンス深度を超えて整列する領域のサイズに基づいて、参照ＤＮＡ配列データと整列するサンプルＤＮＡ配列データの少なくとも１つの領域を拒絶すること、を含む。
【０１８３】
一実施形態では、第２のまたはさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定する工程は、コンピュータプログラムコードの工程：
所定のシーケンス深度を超えて整列する領域のサイズに基づいて、参照ＤＮＡ配列データと整列する比較ＤＮＡ配列データの少なくとも１つの領域を拒絶すること、を含む。
【０１８４】
一実施形態では、コンピュータプログラムコードは、
複数の第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
ミスマッチが発生する複数の第１のセットの中のセットの数を決定し、
ミスマッチが発生するセットの数が所定の閾値を超えるという肯定的な決定に基づいて、ミスマッチに関連するミスマッチＤＮＡ配列データを候補ミスマッチのセットに追加する、方法を実行する。
【０１８５】
一態様では、試験サンプルにおける関心対象の表現型を引き起こす原因となる変異を同定するためのシステムが提供され、ｉ）試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測、ならびに／またはｉｉ）比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測のいずれかに基づいて比較サンプルを選択する方法を含むシステムであり、このシステムは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータプログラムコードを実行するように構成されたプロセッサをさらに含み、コンピュータプログラムコードは、
試験サンプルに関連するサンプルＤＮＡ配列データを得て、
参照サンプルに関連する参照ＤＮＡ配列データを得て、
比較サンプルに関連する比較ＤＮＡ配列データを得て、
サンプルＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連する第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
比較ＤＮＡ配列データおよび参照ＤＮＡ配列データに関連するさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、候補ミスマッチ内から原因となる変異を同定するための原因となる変異を含む１セットの候補ミスマッチを得るように構成される。
【０１８６】
一実施形態では、比較サンプルは、試験サンプルおよび比較サンプルが相補性群の一部を形成するという予測に基づいて選択され、コンピュータプログラムコードは、
ｉ）第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データおよびｉｉ）さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データの両方における共通のミスマッチＤＮＡ配列データを決定するように構成されるコンピュータプログラムコードよって、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、
共通のミスマッチＤＮＡ配列データに基づいて候補ミスマッチのセットを生成するように構成されている。
【０１８７】
一実施形態では、比較サンプルは、比較サンプルが原因となる変異を含まないという予測に基づいて選択され、コンピュータプログラムコードはさらに、
第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データにあり、およびさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データにはない共通しないミスマッチＤＮＡ配列データを決定するように構成されるコンピュータプログラムコードによって、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データに関して、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データをフィルタリングし、
共通しないミスマッチＤＮＡ配列データに基づいて候補ミスマッチのセットを生成するように構成されている。
【０１８８】
一実施形態では、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定するために、コンピュータプログラムコードはさらに、
サンプルＤＮＡ配列データの各リードを参照ＤＮＡ配列データに整列させ、
参照ＤＮＡ配列データに対するサンプルＤＮＡ配列データのリードのポジションに基づいて、サンプルＤＮＡ配列データの整列させたリードをソートするように構成されている。
【０１８９】
一実施形態では、第２のまたはさらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定するために、コンピュータプログラムコードはさらに、
比較ＤＮＡ配列データの各リードを参照ＤＮＡ配列データに整列させ、
参照ＤＮＡ配列データに対する比較ＤＮＡ配列データのリードのポジションに基づいて、比較ＤＮＡ配列データの整列させたリードをソートするように構成されている。
【０１９０】
一実施形態では、第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定するために、コンピュータプログラムコードはさらに、
所定のシーケンス深度を超えて整列する領域のサイズに基づいて、参照ＤＮＡ配列データと整列するサンプルＤＮＡ配列データの少なくとも１つの領域を拒絶するように構成されている。
【０１９１】
一実施形態では、さらなるセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定するために、コンピュータプログラムコードはさらに、
所定のシーケンス深度を超えて整列する領域のサイズに基づいて、参照ＤＮＡ配列データと整列する比較ＤＮＡ配列データの少なくとも１つの領域を拒絶するように構成されている。
【０１９２】
一実施形態では、コンピュータプログラムコードはさらに、
複数の第１のセットのミスマッチＤＮＡ配列データを決定し、
ミスマッチが発生する複数の第１のセットの中のセットの数を決定し、
ミスマッチが発生するセットの数が所定の閾値を超えるという肯定的な決定に基づいて、ミスマッチに関連するミスマッチＤＮＡ配列データを候補ミスマッチのセットに追加するように構成されている。
【０１９３】
一態様では、そこに記録されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ可読記憶媒体が提供され、プログラムは、コンピュータに本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの方法を実施させるためにコンピュータ装置によって実行可能である。
【０１９４】
産業上の利用可能性
記載された構成は、ＤＮＡシークエンシング業界、特にＤＮＡ配列における原因となる変異の検出を扱う業界に適用できる。
【０１９５】
開示されたソフトウェア方法および／またはシステムは、変異体を交配させる必要なしに、原因となる変異の発見を可能にする。したがって、不稔変異体の原因となる変異は、開示されたソフトウェア方法および／またはシステムを使用して同定することができる。不稔性を引き起こす変異を同定することは、農業技術の分野で応用を有し得る。不稔性を引き起こす変異は、不稔性種子を生産するために、農業に関連する植物種で遺伝子操作され得る。例えば、不稔性を引き起こす変異は、遺伝子利用制限技術（ＧＵＲＴ）に適用され得る。
【０１９６】
前述は、本発明のいくつかの実施形態のみを記載し、修正および／または変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなくそれに行うことができ、実施形態は例示的であり、限定的ではない。
【０１９７】
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の意味は、「主だったもので、必ずしも単一としないものを含む」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、「それだけにより構成される」を意味しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の言葉の変化、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」と「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、対応して変化した意味を有する。
【０１９８】
実施例１：生殖能力を損なう植物エンハンサータンパク質遺伝子のＲＨＯ  ＧＴＰＡＳＥＳにおける変異の発見（ケースＢ）
いくつかの独立した変異系統は、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの胞子に紫外線Ｂを照射することによって生成された。変異系統は、２つの表現型群、まっすぐな仮根（図８Ａ）および無傷な表皮（図９Ａ）を有するもの、波状の仮根（図８Ｂ）および延伸した表皮（図９Ｂ）を有するもの、に分類された。
【０１９９】
波状の仮根および延伸した表皮を持つＵＶ４．３２変異系統の原因となる変異を同定することを目的とした。ＤＮＡは、サンプルとしてのすべての植物、標準ＤＮＡ  ＰｈｅｎｏｌＣｈｌｏｒｏｐｈｏｒｍ−ＩＡＡ抽出を使用して、波状の仮根および延伸した表皮を持つＵＶ４．３２変異体から抽出された。ＵＶ４．３２のゲノム、ならびにまっすぐな仮根および無傷な表皮を持つ７つの独立した変異系統のゲノムを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ−２０００プラットフォーム技術を使用して配列決定した。
【０２００】
Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ−０．３２を使用してローリードをクオリティートリミングし、ｋ−ｍｅｒサイズが３１のＫｈｍｅｒ０．７．１を使用して正規化した。−−ｖｅｒｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｌｏｃａｌモードに設定されたｂｏｗｔｉｅ２−２．１．０を使用して、得られたリードを参照ゲノムに対して整列させた。使用される参照ゲノムは、ＮＣＢＩ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｈｏｔｇｕｎ（ＷＧＳ）データベースで公開されているドラフトＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムアセンブリである。
【０２０１】
ｂｉｏ−ｓａｍｔｏｏｌｓ−２．０．５の関数ソートおよびパイルアップを使用して、アライメントをポジションソートし、ｑクオリティーが３５を超えるリード内のミスマッチを抽出した。ミスアライメントが原因である可能性が高いため、
ｓａｍｔｏｏｌｓ−０．１．９パッケージのｂｃｆｔｏｏｌｓからのｖａｒＦｉｌｔｅｒ関数を使用して、１００Ｘ超えるカバレッジを有する領域のミスマッチを除外した。次に、ミスマッチは、７を超えるリードでサポートされ、負のＦＱ値または０．５００１より高いＡＦ１値に基づいて、十分にホモ接合であるように見える場合にのみ保持された。
【０２０２】
全体で、フィルタリングの前に、ＵＶ４．３２で１４３  ２９２のミスマッチが同定された。ＵＶ４．３２に特有のミスマッチの数は、フィルタリングに使用されたまっすぐな仮根および無傷な表皮を持つＵＶ変異系統の数とともに減少した（図１０Ａ）。
【０２０３】
最終的に、配列決定されたすべてのフィルタリング系統を使用して、候補ミスマッチの数は１２０００ミスマッチ、または９０％より多く減少した（図３Ｂ）。これは、原因となる変異を含まないと予測される比較サンプルのミスマッチのセットによって、試験サンプルのミスマッチのセットを減算するフィルタリング工程が、標準のフィルタリング工程の前に候補ミスマッチの同定の厳密性を高めたことを示す。
【０２０４】
後続のフィルタリング工程を実施して、ＵＶシグネチャーと矛盾するミスマッチをフィルタリングし、遺伝子コード配列外のミスマッチをフィルタリングし、非同義のミスマッチをフィルタリングした。これらの３つのフィルタリング工程により、候補のミスマッチの数がさらに１０の変異に減少し、予想されるＵＶ変異シグネチャーと一致し（図３）、遺伝子のコード配列にあると予測され（図３）、対応するタンパク質のアミノ酸配列（表１）が変化した。
【表１】
2022501014.tif 000003
【０２０５】
１０の変異のうち、最も強い変異は２塩基対の欠失であり、ＭｐＲＥＮで早期終止コドンを引き起こす（表１）。Ｒｅｎ変異体は、ＵＶ４．３２と同じ表現型を示すことが知られている（Ｈｏｎｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６および未発表データ／図２Ｂ）。これは、その後のフィルタリング工程が十分に保守的であることを示唆している。
【０２０６】
全体として、これは、原因となる変異を含まないと予測される比較サンプルのミスマッチのセットによって試験サンプルのミスマッチのセットを減算することに基づくパイプラインのバージョンが、変異系統を異系交配する必要なく、原因となる変異を含む少数の変異の同定を可能にすることを示す。
【０２０７】
実施例２：クロルスルフロン抵抗性を引き起こすアセト乳酸シンターゼ遺伝子の変異の発見（ケースＡ）
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの胞子に紫外線Ｂ照射を照射し、除草剤クロルスルフロンに対して抵抗性である７つの独立した変異系統を同定した。クロルスルフロン抵抗性は、致死量のクロルスルフロン（０．１ｐｐｍ用量、つまり野生型植物を１００％殺すのに十分な用量）への曝露後２週間生存していたＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ植物によって決定された。
【０２０８】
すべての変異体植物は同じ表現型（クロルスルフロン抵抗性）を共有していたため、それぞれが同じ原因となる変異を含むと仮定した。クロルスルフロン抵抗性変異体を参照ゲノムと比較して、１０００００を超えるミスマッチを個別に同定し、最初にＭ０野生型ゲノムにも存在するミスマッチをフィルタリングした（図１１、左端の２つの散布ボックス）。
【０２０９】
パイプラインの対立ベースバージョンの効率を試験するために、４、５、６、および７つすべてのクロルスルフロン変異体の組み合わせに適用した。使用する対立遺伝子の減算ラインが多いほど、パイプラインはより効率的になる。実際、７つのクロルスルフロン抵抗性系統すべてを使用して、ミスマッチの数をほぼ１０００００から１１の候補変異に減らした。これは、予想される変異シグネチャーと一致し、遺伝子のコード配列にある（図１１）。
【０２１０】
７つのクロルスルフロン抵抗性変異体すべてに共通であるが野生型には存在しない１１の候補変異のうち、５つはコードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こす（表３）。それらの５つの候補変異のうち、１つだけが予測された機能を持つ遺伝子にある。実際、アセト乳酸シンターゼ遺伝子のこの正確な変異は、他の植物モデルでクロルスルフロン抵抗性を引き起こすことが知られている。
【表２】
2022501014.tif 000004
【０２１１】
実施例３：クロルスルフロン抵抗性を引き起こすアセト乳酸シンターゼ遺伝子の変異の発見（ケースＡＢ）
実施例１および実施例２で例示したパイプラインの能力を向上させるために、両方のアプローチを組み合わせた。パイプラインのこの実施形態では、対立遺伝子変異体に共通で野生型および非対立遺伝子変異体に存在しないミスマッチの群で、原因となる変異を探す。
【０２１２】
３つのクロルスルフロン感受性変異誘発系統を使用して、予想される変異シグネチャーと一致し、遺伝子のコード配列にあると以前に特定された１１つのクロルスルフロン抵抗性特定ミスマッチのうち４つをフィルタリングし、最終的にタンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こすと予測される４つの候補変異（表４）のみを残した。
【０２１３】
これは、実施例２のみで例示されているパイプラインと比較して、パイプラインの能力が２０〜３０％向上することを表している。実施例１および２のパイプラインの能力は、対立遺伝子および非対立遺伝子減算系統の数に応じて向上するため、本発明の実施例で例示されているパイプラインの能力は、対立遺伝子および非対立遺伝子減算系統をさらに使用するとさらに向上すると予測する。
【表３】
2022501014.tif 000005
【図１】
2022501014.tif 000006
【図２】
2022501014.tif 000007
【図３】
2022501014.tif 000008
【図４】
2022501014.tif 000009
【図５】
2022501014.tif 000010
【図６】
2022501014.tif 000011
【図７】
2022501014.tif 000012
【図８Ａ】
2022501014.tif 000013
【図８Ｂ】
2022501014.tif 000014
【図９Ａ】
2022501014.tif 000015
【図９Ｂ】
2022501014.tif 000016
【図１０】
2022501014.tif 000017
【図１１】
2022501014.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月3日(2020.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するためのコンピュータ実装方法であって、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、前記試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）前記第２のセットのミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１のセットのミスマッチに特有であるミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、前記ミスマッチのサブセットは、原因となる変異の候補変異であり、前記試験サンプルは、前記関心対象の表現型を示す非維管束植物に由来し、
前記少なくとも１つの比較サンプルは、前記関心対象の表現型を示さない同じ属の独立した非維管束植物に由来し、前記参照ＤＮＡ配列は、前記属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
前記方法は、分離分析、複合分離分析、バルク分離分析、自家受精、受精、異系交配、戻し交配または前記非維管束植物の近同質遺伝子系統による受精の工程を含まない、コンピュータ実装方法。
【請求項２】
非維管束植物における関心対象の表現型に関連する変異を同定するためのコンピュータ実装方法であって、
（ａ）試験サンプルのＤＮＡ配列を参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第１のセットの配列ミスマッチを同定することであって、前記試験サンプルは、変異誘発された非維管束植物に由来する、同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定すること、
（ｃ）前記第２のセットの配列ミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定すること、を含み、前記試験サンプルおよび前記比較サンプル（複数可）は、前記関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、前記独立した非維管束植物は、同じ属であり、前記参照ＤＮＡ配列は、前記属の非維管束植物の既知の参照配列であり、
前記方法は、分離分析、複合分離分析、バルク分離分析、自家受精、受精、異系交配、戻し交配または前記非維管束植物の近同質遺伝子系統による受精の工程を含まない、コンピュータ実装方法。
【請求項３】
前記方法は、
（ｂ−ｉ）少なくとも１つの追加の比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第３のセットの配列ミスマッチを同定することをさらに含み、前記追加の比較サンプル（複数可）は、前記関心対象の表現型を示す独立した非維管束植物に由来し、前記独立した非維管束植物は、同じ属であり、
（ｃ）前記第３のセットの配列ミスマッチに関して、前記第１のセットのミスマッチをフィルタリングし、前記第１および第２のセットの配列ミスマッチに共通するミスマッチのサブセットを同定することをさらに含み、前記ミスマッチの２つのサブセットは、前記原因となる変異の候補変異である、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項４】
前記関心対象の表現型は、収量の増加、ストレス耐性、ストレス抵抗性、非生物ストレス耐性、非生物ストレス抵抗性、耐塩性、塩抵抗性、不稔性、乾燥抵抗性、耐乾燥性、高温または低温に対する抵抗性、霜抵抗性、耐霜性、植物成長速度、植物細胞分裂速度、耐病性、病害抵抗性、病害感受性、除草剤耐性、除草剤抵抗性、除草剤感受性、抗生物質耐性、抗生物質抵抗性および抗生物質感受性からなる群から選択される観察可能特性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項５】
前記関心対象の表現型は、天然の、合成の、もしくは化学的除草剤に対する増加した抵抗性または増加した耐性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項６】
前記非維管束植物が葉状苔類、単純葉状体苔類または複雑葉状体苔類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項７】
前記非維管束植物は、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｌｐｅｓｔｒｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ａｑｕａｔｉｃａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃａｒｒｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｃｈｅｎｏｐｏｄａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｅｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｄｏｍｉｎｇｅｎｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｆｏｌｉａｃｉａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｇｒｏｓｓｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｉｎｆｌｅｘａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｍａｃｒｏｐｏｒａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｏｖｏｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｅａｃｅａ、
Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｌｍａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｉｌｌａｔｅ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐａｐｐｅａｎａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｒｕｂｒｉｂａｒｂａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｏｌｏｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｔｒｅｉｍａｎｎｉｉ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｓｕｂｇｅｍｉｎａｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｖｉｔｉｅｎｓｉｓ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｗａｌｌｉｓｉｉおよびＭａｒｃｈａｎｔｉａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓからなる群から選択される、請求項６に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項８】
前記変異誘発された試験サンプルは、Ｍ１変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項９】
独立した非維管束植物由来の前記比較サンプルは、変異誘発された非維管束植物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１０】
前記変異誘発された試験サンプルは、天然に存在しない変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の比較サンプルのＤＮＡ配列を前記参照ＤＮＡ配列に整列させ、前記２つの配列間の第２のセットの配列ミスマッチを同定することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１２】
前記方法は、（ｄ）前記候補変異を生物学的フィルターでさらにフィルタリングすることを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１３】
前記非維管束植物は一倍体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１４】
前記非維管束植物は、蘚類、苔類およびツノゴケ類からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１５】
前記非維管束植物は、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓまたはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｒｅａｄｅｒｉから選択される蘚類である、請求項１４に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１６】
前記関心対象の表現型は、植物サイズ、植物の高さ、葉のサイズ、植物の色および植物の構造からなる群から選択される形態的特徴である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１７】
前記関心対象の表現型は、ウイルス、細菌もしくは真菌の病原体に対する増加した抵抗性または増加した耐性である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【請求項１８】
前記方法は、
（ｉ）非維管束植物の集団を変異原に曝露すること、
（ｉｉ）非維管束植物の集団を薬剤に曝露すること、
（ｉｉｉ）変異誘発された非維管束植物から試験サンプルを得ること、
（ｉｖ）独立した変異誘発された非維管束植物から少なくとも１つの比較サンプルを得ること、をさらに含み、（ｉ）〜（ｉｖ）は、（ａ）に先立って実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のコンピュータ実装方法。
【国際調査報告】
2022501014.tif 000019
2022501014.tif 000020
2022501014.tif 000021