(57)【要約】水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子または糖タンパク質Ｂ遺伝子の一部を増幅するための試薬および方法。試料において、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が存在する場合、ＶＺＶの標的核酸配列、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンの高感度かつ特異的な検出を提供するオリゴヌクレオチドプローブ、プライマー対を含むオリゴヌクレオチド組成物および方法が開示される。オリゴヌクレオチド、組成物および方法を使用して、試料中のＶＺＶの存在を検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）標的核酸配列を増幅するための組成物であって、（ａ）配列番号３８もしくはその相補体または配列番号３９もしくはその相補体に存在する１９〜２３個のヌクレオチドの配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する１９〜２３個の連続核酸塩基を含む１９〜５０核酸塩基の長さの順方向増幅プライマー、および（ｂ）配列番号３８もしくはその相補体または配列番号３９もしくはその相補体に存在する１９〜２３個のヌクレオチドの配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する１９〜２３個の連続核酸塩基を含む１９〜５０核酸塩基の長さの逆方向増幅プライマーを含む組成物。
【請求項２】
前記順方向増幅プライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、２３、２４、２５、２６、または２７の核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３４、３５、３６または３７の核酸塩基配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号１の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１６の核酸塩基配列を含み、
（ｂ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号１の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１７の核酸塩基配列を含み、
（ｃ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１７の核酸塩基配列を含み、
（ｄ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号３の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１８の核酸塩基配列を含み、
（ｅ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号４の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１９の核酸塩基配列を含み、
（ｆ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号５の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２０の核酸塩基配列を含み、
（ｇ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号６の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２１の核酸塩基配列を含み、
（ｈ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号７の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２２の核酸塩基配列を含み、
（ｉ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２３の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３４の核酸塩基配列を含み、
（ｊ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２４の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３４の核酸塩基配列を含み、
（ｋ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２５の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３５の核酸塩基配列を含み、
（ｌ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２６の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３６の核酸塩基配列を含み、または
（ｍ）前記順方向増幅プライマーが、配列番号２７の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３７の核酸塩基配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
増幅された水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）標的核酸配列を検出するための検出プローブをさらに含み、前記検出プローブが、少なくとも１つの検出可能な標識を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記検出プローブが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２８、２９、３０、３１、３２、または３３の核酸塩基配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）前記検出プローブが、配列番号８もしくは９の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号１の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１６もしくは１７の核酸塩基配列を含み、
（ｂ）前記検出プローブが、配列番号９の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号２の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１７の核酸塩基配列を含み、
（ｃ）前記検出プローブが、配列番号１０の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号３の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１８の核酸塩基配列を含み、
（ｄ）前記検出プローブが、配列番号１１もしくは１２の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号４の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号１９の核酸塩基配列を含み、
（ｆ）前記検出プローブが、配列番号１３の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号５の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２０の核酸塩基配列を含み、
（ｇ）前記検出プローブが、配列番号１４の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号６の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２１の核酸塩基配列を含み、
（ｈ）前記検出プローブが、配列番号１５の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号７の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号２２の核酸塩基配列を含み、
（ｉ）前記検出プローブが、配列番号２８の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号２３もしくは２４の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３４の核酸塩基配列を含み、
（ｊ）前記検出プローブが、配列番号２９もしくは３０の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号２５の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３５の核酸塩基配列を含み、
（ｋ）前記検出プローブが、配列番号３１の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号２６の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３６の核酸塩基配列を含み、または
（ｌ）前記検出プローブが、配列番号３２もしくは３３の核酸塩基配列を含み、前記順方向増幅プライマーが、配列番号２７の核酸塩基配列を含み、前記逆方向増幅プライマーが、配列番号３７の核酸塩基配列を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記順方向増幅プライマー、前記逆方向増幅プライマー、および／または前記検出プローブが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５−メチルシトシンを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの検出可能な標識が、
（ａ）化学発光標識、
（ｂ）蛍光標識、
（ｃ）消光剤、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの検出可能な標識が、前記蛍光標識、前記消光剤、または前記蛍光標識および前記消光剤の両方を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記検出プローブが、前記検出プローブの３’末端と塩基対合する５’非標的ハイブリッド形成配列、または前記検出プローブの５’末端と塩基対合する３’非標的ハイブリッド形成配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記検出プローブが、分子ビーコンまたは分子トーチを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
緩衝液、塩、ｄＮＴＰ、界面活性剤、および酵素のうちの１種以上をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記酵素が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼのうちの任意の２種以上の組み合わせを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記増幅プライマーが、水溶液中に存在するか、凍結されているか、または凍結乾燥されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、２対以上の増幅プライマーおよび／または２つ以上の検出プローブを含み、増幅プライマーの各対が、順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーからなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記２対以上の増幅プライマーおよび／または２つ以上の検出プローブが、同じまたは異なる生物の標的核酸配列を増幅する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
内部標準の標的核酸配列、内部標準の標的核酸配列を増幅および／もしくは検出するためのオリゴマー、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２８、２９、３０、３１、３２、または３３の核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、ＶＺＶ標的核酸配列を検出するための検出プローブであって、前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の検出可能な標識を含む、検出プローブ。
【請求項２１】
前記検出プローブが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の検出プローブ。
【請求項２２】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５−メチルシトシンを含む、請求項２１に記載の検出プローブ。
【請求項２３】
前記検出可能な標識のうちの１つ以上が、
（ａ）化学発光標識、
（ｂ）蛍光標識、
（ｃ）消光剤、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の検出プローブ。
【請求項２４】
前記検出可能な標識のうちの１つ以上が、前記蛍光標識、前記消光剤、または前記蛍光標識および前記消光剤の両方を含む、請求項２３に記載の検出プローブ。
【請求項２５】
前記検出プローブが、前記検出プローブの３’末端と塩基対合する５’非標的ハイブリッド形成配列、または前記検出プローブの５’末端と塩基対合する３’非標的ハイブリッド形成配列を含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の検出プローブ。
【請求項２６】
前記検出プローブが、分子ビーコンまたは分子トーチを含む、請求項２５に記載の検出プローブ。
【請求項２７】
ＶＺＶ標的核酸配列を増幅するための方法であって、
（ａ）ＶＺＶ標的核酸配列を含むまたは含む疑いがある試料を入手することと、
（ｂ）前記試料を請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物と接触させることと、
（ｃ）前記標的核酸配列を増幅するのに十分な条件を提供することにより、前記ＶＺＶ標的核酸配列が前記試料中に存在する場合、前記ＶＺＶ標的核酸配列の増幅産物を生成することと、を含む方法。
【請求項２８】
前記方法が、前記増幅産物の存否を決定するために、前記試料と請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の検出プローブとを接触させることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料中のＶＺＶの存否を決定するための方法であって、
（ａ）ＶＺＶ標的核酸配列を含むまたは含む疑いがある試料を入手することと、
（ｂ）前記試料と請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることと、
（ｃ）前記標的核酸配列を増幅するのに十分な条件を提供することによって増幅産物を生成することと、
（ｄ）前記増幅産物の存否を検出することと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／７３９，５７１号の優先権を主張するものであり、該号は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
出願された５３６４４２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載の配列表は、サイズが１７キロバイトであり、２０１９年９月３０日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書の実施形態は、感染性病原体を検出する分野を対象としている。具体的には、特許請求された組成物、キット、方法、製剤、および反応混合物は、水痘帯状疱疹ウイルスなどのウイルスを検出するように設計されている。
【背景技術】
【０００４】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、αヘルペスウイルス科に属する感染性の高いヒトウイルスである。ＶＺＶゲノムは、１２４，８８４ヌクレオチドの長さの線状二本鎖ＤＮＡ分子である。皮膚病変または空気伝染による直接曝露を介した一次感染は、水痘を引き起こす。感染後、ウイルスは感染者の神経系に潜伏し続ける。その後、ＶＺＶは後年に再活性化し、帯状疱疹などの二次感染を誘発する可能性がある。場合によっては、ＶＺＶ感染は、肝炎、膵炎、肺炎、脳炎、気管支炎、細菌性重複感染などのさらなる合併症を惹起する可能性もある。現在、ＶＺＶを高感度、特異的、迅速に検出する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で提供されるのは、ＶＺＶまたはＶＺＶ標的核酸配列の高感度かつ特異的な増幅および／または検出のための増幅オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド組成物、キット、反応混合物、製剤、および方法である。増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を増幅するための増幅プライマー、および標的配列または増幅配列を検出するための検出プローブを含む。記載する増幅オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド組成物、キット、反応混合物、および製剤は、核酸系検出技術での使用に適し、該技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅系技術、およびリアルタイムＰＣＲ技術を含むがこれらに限定されない。記載する増幅オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド組成物、キット、反応混合物、製剤および方法は、ＶＺＶの迅速な検出および／または定量化を提供する。本開示は、これらのニーズを満たすこと、他の利益を提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することを目的とする。
【０００６】
定義
本開示の態様の理解を助けるために、本明細書で使用されるいくつかの用語をより詳細に定義する。本明細書で使用される他の全ての科学用語および／または技術用語は、関連技術の当業者により一般に理解されるのと同じ意味、またはｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）およびＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  １９９１，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）で提供されるのと同じ意味を有する。別段の言及がない限り、本明細書で使用または企図される技術は、分子生物学の当業者に周知の標準的な方法である。
【０００７】
本教示を詳細に記載する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されないため、変化し得ることを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白に他を指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。例えば、本明細書で使用される場合、「核酸」は、１つ以上の核酸を表すと理解される。よって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。したがって、「オリゴマー」への言及は、複数のオリゴマーを含み得る。接続詞「または」は、包括的な意味が文脈において不当でない限り、包括的な意味で（例えば、「および／または」と同等であると）解釈されるべきである。
【０００８】
本明細書では、僅かで非実質的な逸脱が本教示の範囲内であるように、本開示で考察される温度、濃度、時間などには、付随する言外の「約」があることが理解されよう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に有意な影響を及ぼさない組成物の構成要素量の非実質的な変動を示す。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明確な除外がない場合には、端点を包含すると解釈されるべきである。例えば、「１０〜１５以内」には、１０および１５の値が含まれる。さらに、実務的な程度で、範囲には端点間の全整数および部分的な数値が含まれる。参照により組み込まれるいかなる資料も、本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
【０００９】
特に記述がない限り、様々な構成要素を「含むこと」を列挙する本明細書の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「から本質的になる」とも企図され、様々な構成要素「からなること」を列挙する本明細書の実施形態は、列挙された構成要素「を含む」または「から本質的になる」とも企図され、様々な構成要素「から本質的になること」を列挙する本明細書の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「を含む」とも企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「から本質的になる」は、本明細書に記載の組成物および方法の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させない追加の構成要素（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）が、これらの組成物または方法に含まれ得ることを意味する。このような特徴には、試料中のＶＺＶ核酸配列から、標的核酸領域内に位置する標的核酸配列を検出する能力が含まれ、これにより、他の既知のウイルスとは対照的に、試料にＶＺＶが存在することを示す。
【００１０】
「試料」には、ＶＺＶ、またはその構成要素、例えば、核酸、核酸断片、またはＶＺＶに由来する核酸を含む、または含む疑いがある任意の検体が含まれる。試料は、任意の起源に由来するものであり、例えば、生体検体、臨床検体、および環境源であるが、これらに限定されない。生体試料は、ＶＺＶまたはＶＺＶ由来の標的核酸配列を含み得る哺乳動物または生物（生死を問わない）に由来する任意の組織または材料を含み、例えば、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄検査（ＢＡＬ）または肺生検などの呼吸組織または浸出液、痰、唾液、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液または他の体液もしくは材料もしくは病変スワブを含む。いくつかの態様において、ＶＺＶについて試験するために、研究室では血漿／血清または病変スワブを試験する場合がある。血漿／血清試験などの試験は、医学的処置または外科的処置の前および／または後に実施することができ、該処置には、例えば、移植があるが、これに限定されない。いくつかの態様において、病変スワブは、水痘などにおいて、ＶＺＶの存在を評価するために使用され得る。生体試料は、物理的、化学的、または機械的に処理され、組織または細胞の構造を破壊することによって、細胞内成分を溶液中に放出することができる。溶液はさらに、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを含み、これらは、標準的な方法を使用して、分析用の生体試料を調製するために使用される。いくつかの態様において、試料は、濾過装置に試料を通過させて得られる試料、または遠心分離後に得られる試料、または媒体、マトリックス、もしくは支持体への付着により得られる試料などの処理試料を含み得る。
【００１１】
「類似体」という用語は、共通の特徴をもつ２つ以上の構造を定義するために使用される。「構造類似体」という用語は、別の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と同様の構造建築を共有する化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）などの物体を指す。共通の構造的類似性を示すにもかかわらず、各類似体は異なる生化学的特性を有する可能性がある。あるいは、「機能的類似体」は、各類似体が構造的に異なる場合があるが、同じ作用機序（または生化学的特性）を共有する化合物などの２つ以上の物体を指す。
【００１２】
「部分」という用語は、分子の１つ以上の識別可能な生化学的特性に関与する、分子内の基または官能基を示すために使用される。
【００１３】
本明細書で互換的に使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）から構成される多量体化合物を指す。ポリヌクレオチドの従来例には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびポリマー（反復ヌクレオチドサブユニットからなる分子構造を有する物質）が含まれる。ポリヌクレオチド「骨格」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合、ペプチド核酸（ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合から構成され得る。ポリヌクレオチド、または他のオリゴヌクレオチドの長さの範囲に言及する場合、その範囲は全ての整数を含む（例えば、１９〜２５個の連続ヌクレオチドの長さには、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５個が含まれる）ことが理解されよう。
【００１４】
「ヌクレオチド」は、単一の５炭素（ペントース）糖部分、窒素複素環式塩基、および１〜３個のホスフェート基を含む化合物である。基本単位として、ヌクレオチドは共有結合で結合し、核酸を形成する。各ヌクレオチドの糖部分は、リボース（ＲＮＡ）、２’−デオキシリボース（ＤＮＡ）、またはこれらの類似体であり、置換（例えば、２’−メトキシ置換または２’−ハロゲン化物置換）を有する類似化合物を含む。ペントース糖部分に加えて、各ヌクレオチドには、グリコシド結合を介してペントース環に結合した窒素複素環式塩基が含まれる。窒素複素環式塩基の従来例には、プリン類（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））ならびにピリミジン類（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ））が含まれる。プリン塩基は、２つの共有原子によって結合した６原子環および５原子環で構成される。ピリミジン塩基は６原子環で構成される。一般に、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）は、４つのデオキシリボヌクレオチド、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰについて考察する場合に、総称として使用される。窒素複素環式塩基は、その非従来型の類似体でもあり（例えば、イノシン（Ｉ）または他、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  １１ｔｈ  ｅｄ．，  １９９２を参照）、またはプリン類もしくはピリミジン類の類似誘導体でもあり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上の「脱塩基」残基を含む可能性があり、この場合、骨格はポリマーの位置（複数可）に窒素塩基を含まない（米国特許第５，５８５，４８１号）。従来型のポリヌクレオチド形成に加えて、ポリヌクレオチドは、「ロックド核酸」（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ＬＮＡ）、すなわち、ＲＮＡを模倣する糖立体配座にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含む類似体を形成する場合があり、該立体配座は、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリッド形成親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，  ２００４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ハイブリッド形成複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態には、ペプチド核酸オリゴマー、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、ハイブリッド形成複合体の全電荷、電荷密度、立体対合（ｓｔｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすオリゴマー（ホスホロチオエートなどの荷電した結合を含むオリゴマーを含む）、または中性基（例えば、メチルホスホネート）が含まれる。別に示さない限り、５−メチルシトシンは、ＲＮＡまたはＤＮＡ骨格（またはこれらの混合物）を含む前述の骨格／糖／結合のいずれかと共に使用され得る。
【００１５】
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」とは、結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットから構成されるポリマーである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびにこれらの類似体であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、５〜２１個の核酸塩基の下限および１８〜５００個の核酸塩基の上限を有するサイズ範囲にある。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１０〜１００個の核酸塩基、１０〜９０個の核酸塩基、１０〜８０個の核酸塩基、１０〜７０個の核酸塩基、または１０〜６０個の核酸塩基のサイズ範囲にある。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の核酸塩基の下限および約１８〜５０個もしくは１８〜１００個の核酸塩基の上限を有するサイズ範囲にある。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、約１０〜２１個の核酸塩基の下限および約１８〜１００個の核酸塩基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物から構成されない。オリゴマーは、任意の周知のインビトロの化学的方法または酵素的方法を使用することによって合成的に作製することができ、標準的方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって合成後に精製することができる。オリゴマーは、機能名（例えば、検出プローブまたは増幅プライマー）で言及され得る。オリゴヌクレオチドという用語は、本明細書に記載のかかる全ての試薬を網羅するために一般的に使用されるため、試薬に対していかなる特定の機能も示さない。
【００１６】
「アニーリング」または「アニール」という用語は、核酸の２つの相補鎖が塩基対（ｂｐ）ハイブリッド形成によって結合するプロセスを記述している。一般に、分子生物学の当業者は、増幅反応の指数関数的段階の間、算出された融解温度（Ｔｍ）より５℃低い温度でアニーリング（ＰＣＲに関係するため）が可能であることを理解するであろう。
【００１７】
「ハイブリッド形成」または「ハイブリッド形成する」という用語は、核酸の２つの相補鎖のヌクレオチドサブユニット間での水素結合の形成を記述している。
【００１８】
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」という用語は、水素結合（塩基対合）を介して結合している二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）領域からなる核酸構造を指し、各鎖は互いに十分に相補的である。ハイブリッドの例には、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子が含まれる。
【００１９】
「相補的」または「十分に相補的」という用語は、２つの一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、増幅オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列）、または同じ一本鎖ポリヌクレオチドの２つの異なる領域（例えば、分子ビーコン）間の特定のヌクレオチド塩基対合関係を意味し、これはハイブリッド形成（例えば、安定な二本鎖ハイブリッドの形成）を可能にする。相補配列は、安定した二本鎖を形成するために完全に相補的（１００％相補的）である必要はない。いくつかの実施形態において、部分的に相補的な（１００％未満の相補性、標準的な核酸塩基対合とのミスマッチによる）配列は、ポリヌクレオチド配列がアニーリングできるならば、十分に相補的であり続ける。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成することができる第１の核酸配列における連続鎖の塩基の百分率を示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。相補性パーセントは、同一性パーセントと同様の様式で算出される。プリン塩基は、チミンまたはウラシルとアデニンとの対（ＡおよびＴまたはＵ）およびシトシンのみとグアニンとの対（ＣおよびＧ）を示す塩基対合規則に従って、ピリミジン塩基に結合する。注目すべきは、塩基対合は、これらの従来の（例えば、「正準的な」）対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非正準的な塩基対合は、分子生物学の当業者によく知られている（例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ  ｅｄ．１９９２）を参照）。適切なハイブリッド形成条件は、分子生物学の当業者に周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または常套試験を使用することによって経験的に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．の§§  １．９０−１．９１，  ７．３７−７．５７，９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１，１１．１２−１１．１３，  １１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７）。
【００２０】
配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用し、デフォルトのギャップパラメータを使用して配列を整列させることによって、または検査および最良の整列（すなわち、比較ウィンドウ全体にわたる最高の配列類似性の割合をもたらす）によって、決定することができる。配列同一性の割合は、比較ウィンドウ全体にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、比較ウィンドウ内のギャップ（すなわち、ウィンドウサイズ）を計数せずにマッチした位置の数をマッチした位置およびミスマッチの位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合をもたらすことによって計算される。別に示さない限り、２つの配列間の比較ウィンドウは、２つの配列のうちのより短い方の全長によって定義される。
【００２１】
「自己相補性」とは、互いにハイブリッド形成することができる内部相補配列を含むオリゴヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチド内に二本鎖の構造または領域を作成する。オリゴヌクレオチド内の相補配列の位置に応じて、配列のハイブリッド形成は、ヘアピンループ、ジャンクション、バルジまたは内部ループの形成に至る場合がある。いくつかの実施形態において、自己相補配列は、それぞれ４〜６核酸塩基の長さであり得る。いくつかの実施形態において、自己相補配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、自己相補配列は、検出プローブなどのオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に付加され得る。
【００２２】
「特異的にハイブリッド形成するように構成された」という用語は、特定（ｃｅｒｔａｉｎ）のオリゴヌクレオチドの特定（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）の使用の特定（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の意図および意図的な使用が、ＶＺＶの標的核酸配列を増幅または検出したいという願望に基づいて明示的に選択されることを意味する。例えば、特定の標的核酸配列から特定のアンプリコンを生成するように構成された増幅プライマーは、ＶＺＶの標的核酸領域内に位置する標的オリゴハイブリッド形成配列が試料中に存在する場合、該配列への正確なハイブリッド形成を提供する特定の順方向および逆方向の増幅オリゴを利用し、対象とするＰＣＲ産物（例えば、アンプリコン）を生成する。分子生物学の当業者は、非標的核酸に対していくらかの少量レベルのハイブリッド形成が起こり得ることを理解するため、特異的にハイブリッド形成するように構成されていることは、排他的にハイブリッド形成することを意味しない。
【００２３】
「優先的にハイブリッド形成する」または「優先的ハイブリッド形成」とは、厳密なハイブリッド形成条件下で、増幅オリゴヌクレオチドがその標的核酸にハイブリッド形成して安定なオリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドを形成することができるが、十分な数の安定なオリゴヌクレオチド：非標的ハイブリッドを形成することができないことを示す。標的核酸に優先的にハイブリッド形成する増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸の増幅および検出に有用であるが、特に系統学的に近縁の生物における非標的核酸には有用ではない。したがって、増幅オリゴヌクレオチドは、非標的核酸よりも十分にかなりの程度まで標的核酸にハイブリッド形成し、当業者が、必要に応じて、特定のＶＺＶに由来する核酸を正確に増幅し、および／またはその存在（もしくは不在）を検出することを可能にする。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との相補性の程度を低下させることは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の特異性または比率を低減させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的ヌクレオシドまたは核酸塩基を含めることは、オリゴヌクレオチドが非標的生物を識別する能力を促進し得る。
【００２４】
優先的ハイブリッド形成は、当技術分野で既知であり、かつ本明細書、例えば、以下に提供される実施例などに記載される技術を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差、少なくとも２０倍の差、少なくとも５０倍の差、少なくとも１００倍の差、少なくとも２００倍の差、少なくとも５００倍の差、または少なくとも１，０００倍の差が存在する。いくつかの実施形態において、試験試料中の非標的ハイブリッド形成シグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
【００２５】
「厳密なハイブリッド形成条件」という用語は、オリゴマーが、近縁の非標的核酸に由来する核酸ではなく、標的核酸配列に優先的にハイブリッド形成することを可能にする条件を意味する。厳密なハイブリッド形成に使用することができる反応環境は、オリゴマーのＧＣ含量および長さ、オリゴマー配列と試験試料中に存在し得る非標的核酸配列との類似性の程度、ならびに標的配列を含む因子によって変化し得る。ハイブリッド形成条件には、温度およびハイブリッド形成試薬または溶液の組成が含まれる。特定のハイブリッド形成アッセイ条件は、実施例の節で後述する。他の許容される厳密なハイブリッド形成条件は、当業者によって容易に確認される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「実質的に対応する」という用語は、オリゴマーが標的核酸中の相補的オリゴハイブリッド形成配列にアニーリングすることができ、試料中の標的核酸配列への正確なハイブリッド形成または検出を可能にする状況を意味する（試験試料で見出される他の核酸の存在）。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、相補性塩基対合が１００％〜約８０％、１００％〜約８５％、または１００％〜約９０％、または１００％〜約９５％の範囲であるオリゴハイブリッド形成配列に「実質的に対応する」。相補性の程度は、配列内のヌクレオチド置換数またはヌクレオチドミスマッチ数に関しても説明され得る。
【００２７】
「相同体」とは、標的核酸配列の連続ヌクレオチド配列に類似しているが、最終的には増幅プライマーまたは検出プローブの目的の標的ではない連続ヌクレオチド配列である。したがって、リアルタイムＰＣＲ用の増幅オリゴヌクレオチドを設計する場合、標的核酸配列上で固有のオリゴハイブリッド形成配列を選択することにより、増幅オリゴヌクレオチドが相同配列をアニーリングおよび増幅する可能性が低減する。
【００２８】
「非標的特異的配列」または「非標的ハイブリッド形成配列」という用語は、標準的なハイブリッド形成条件下で、その領域が標的核酸の相補的なオリゴハイブリッド形成配列にアニーリングしないオリゴマーの領域を指す。このような非標的特異的配列は、オリゴヌクレオチドの標的特異的配列の一部に相補的であり得る。非標的特異的配列を有するオリゴマーの例としては、分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「センス」および「アンチセンス」は、反対方向に走る２つの相補的なポリヌクレオチド鎖（５’から３’に配列する）を説明するために使用される。一例として、二本鎖ＤＮＡは、逆平行鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖で構成される。アンチセンス鎖は転写のテンプレートとして機能し、転写されたｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
一般に、分子生物学の当業者は、ＤＮＡ配列に関連する「またはその相補物」、または「ＲＮＡ等価物」、または「そのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という語句が、（参照ＤＮＡ配列に加えて）ＤＮＡ配列の相補体、参照ＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物、参照ＤＮＡ配列の相補体のＲＮＡ等価物、参照ＤＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照ＤＮＡ配列の相補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含むことを理解するであろう。同様に、ＲＮＡ配列に関連する「またはその相補物」、または「ＲＮＡ等価物」、または「そのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という語句は、（参照ＲＮＡ配列に加えて）ＲＮＡ配列の相補体、参照ＲＮＡ配列のＤＮＡ等価物、参照ＲＮＡ配列の相補体のＤＮＡ等価物、参照ＲＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照ＲＮＡ配列の相補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。
【００３１】
頭字語ＶＺＶは、α−ヘルペスウイルス科に属するヒトウイルスである水痘帯状疱疹ウイルスを指す。アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によると、ＶＺＶの実験室株は、１２４，８８４ヌクレオチドの長さである。ＶＺＶは一次感染（水痘など）を引き起こし、二次感染（帯状疱疹など）を引き起こす可能性がある。
【００３２】
本明細書で使用される「ＶＺＶ核酸配列」という用語は、水痘帯状疱疹ウイルス全体を指す。具体的には、ＶＺＶ核酸配列は、ＮＣＢＩによって定義されているように、ＶＺＶの実験室株全体（長さ１２４，８８４ヌクレオチド）を説明するために本明細書で使用される。
【００３３】
本明細書で使用される「標的核酸領域」という用語は、ＶＺＶ核酸配列内の特定の遺伝子または領域を指す。
【００３４】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸である。「標的核酸配列」、「標的配列」または「標的領域」は、増幅オリゴヌクレオチドがアニーリングする連続ヌクレオチド配列（より大きな連続標的核酸領域内）であり、増幅されるＶＺＶなどの標的生物のヌクレオチド配列を含む。標的配列またはその相補体は、標的核酸の増幅および／または検出に使用される増幅プライマー、および／または検出プローブにハイブリッド形成する配列を含む。標的核酸は、増幅されなくてもよい標的配列以外の他の配列を含んでもよい。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、ゲノム核酸、ｒＲＮＡなどの転写核酸、またはゲノム核酸もしくは転写核酸に由来する核酸であり得るが、これらに限定されない。順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーの間の連続ヌクレオチド配列は、増幅されるポリヌクレオチドを定義する。
【００３５】
「オリゴハイブリッド形成配列（ｏｌｉｇｏ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「オリゴハイブリッド形成配列（ｏｌｉｇｏ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、増幅プライマーまたは検出プローブが結合する（すなわち、アニーリングまたはハイブリッド形成する）、より広い標的核酸配列内の位置（例えば、連続ヌクレオチド配列）を指す。場合によっては、オリゴハイブリッド形成配列への言及は、センス配列およびアンチセンス配列の両方を含む。
【００３６】
「領域」という用語は、より広いＶＺＶ核酸配列内に含まれる連続ヌクレオチドのサブセットを指し、連続サブセットは、より大きなポリヌクレオチドよりも少ないヌクレオチド塩基対を含む。ポリヌクレオチドが標的核酸配列である非限定的な例として、領域という用語は、より小さなオリゴハイブリッド形成配列を意味するために使用され得る。
【００３７】
「増幅」とは、標的核酸配列、またはその相補体、またはその断片の複数のコピーを得るための任意の既知の手順を指す。既知の増幅方法には、熱増幅法および等温増幅法が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ、例えば、ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、米国特許第５，８８８，７７９号および国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４６１５４Ａ１号および第ＷＯ２００６／０２６３８８Ａ２号に記載されている）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）は、ポリヌクレオチド増幅法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）。ＰＣＲ増幅では、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクルを使用して、テンプレートまたは標的の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から二本鎖ＤＮＡの複数のコピーを合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリッド形成、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼ、および標的配列を含む不完全修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマー使用し、それにより、一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が生じる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号、および米国特許第５，６４８，２１１号）。「アンプリコン」または「増幅産物」は、核酸増幅反応で生成する核酸分子（複数可）、および標的核酸に由来する核酸分子である。アンプリコンまたは増幅産物は、標的核酸と同じおよび／または反対のセンスであり得る標的核酸配列を含む。
【００３８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）とは、標的ＤＮＡまたはｃＤＮＡの特定の配列をコピーして複製する周期的増幅法を指す。増幅オリゴヌクレオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および熱サイクルを使用して、ＰＣＲ反応はポリヌクレオチドの特定標的核酸配列（例えば、アンプリコン）の多くのコピーを生成する。ＰＣＲは指数関数的に増幅するため（増幅サイクルのたびに標的核酸配列の数が２倍になる）、４０サイクルからなるＰＣＲは、数百万の標的核酸コピーを生成し得る。ＰＣＲは次の３つのステップで構成される。（１）ｄｓＤＮＡを一本鎖に「融解」するために高温が使用される（テンプレートＧＣ含量が高い場合は温度が上昇する可能性があるが、通常は約９５°Ｃで遂行される）変性、（２）増幅プライマーが標的核酸配列にアニーリングすることができる（一般に、増幅プライマーの計算された融解温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度で遂行される）アニーリング、および（３）熱安定性ポリメラーゼがアンプリコンを生成するために使用される（例えば、７０〜７２℃）伸長。アンプリコンの長さは通常１０００塩基未満である。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、６０〜２００塩基の長さである。いくつかの実施形態において、アンプリコンの検出および定量化は、ＰＣＲ反応が完了した後に実施され、アガロースゲルの使用および画像分析を伴う。
【００３９】
「リアルタイム増幅」、「リアルタイム検出」、または「リアルタイムＰＣＲ」は、増幅中のアンプリコンのリアルタイム検出を指す。リアルタイムＰＣＲは、核酸配列を標的とするように構成された特定の増幅オリゴヌクレオチドを使用する。リアルタイムＰＣＲにより、アンプリコン産物をリアルタイムで（各増幅サイクルの最後に）定量することができる。したがって、リアルタイムＰＣＲは、試料中に存在するアンプリコンのリアルタイム定量化用の検出プローブをさらに組み込んでいる。いくつかの実施形態において、検出プローブはフルオロフォアを含む。蛍光レベルは、反応中に存在する増幅産物量の直接的な尺度である。蛍光は、増幅反応中または各サイクルの終わりに継続的に測定できる。相対蛍光対サイクル数をプロットすることにより、増幅プロットを作成して、経時的に生成された増幅産物の量を示すことができる。当技術分野で知られている既知のリアルタイム検出方法、システム、および／または機器のいずれかを、記載の増幅オリゴヌクレオチドと共に使用することができる。
【００４０】
「増幅プライマー」または「プライマー」（例えば、第１の増幅プライマー、第２の増幅プライマー、順方向増幅プライマー、第２の増幅プライマー、順方向プライマー、および逆方向プライマー）は、標的核酸にハイブリッド形成する増幅オリゴヌクレオチド、またはその相補体を指し、核酸増幅反応に関与する。増幅プライマーはテンプレート核酸にハイブリッド形成し、重合によって伸長できる３’−ＯＨ（３’−ヒドロキシル）基を有する。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは一本鎖である。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、主に一本鎖であり、５対以下の塩基対を有する。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、長さが１９〜５０個、１９〜４０個、または１９〜３０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、長さが１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の核酸塩基である。増幅プライマーは、標的核酸配列にアニーリングする標的ハイブリッド形成配列を含む。順方向および逆方向の増幅プライマーの標的ハイブリッド形成配列は、標的核酸配列上の相補的ヌクレオチド配列にハイブリッド形成する。順方向および逆方向の増幅プライマーは、標的核酸配列内の特定のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成し、増幅される標的核酸配列に隣接する。増幅プライマーの標的ハイブリッド形成配列は、標的核酸配列内のそのオリゴハイブリッド形成配列に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または完全に（１００％）相補的であり得る。増幅プライマーは、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み得る。このような非標的ハイブリッド形成配列には、当技術分野で理解されているように、タグ、アダプター、バーコード、プロモーター、自己相補的領域、および他の核酸成分が含まれる。
【００４１】
リアルタイムでアンプリコンを検出する周期的増幅法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）では、「ベースライン」という用語は、最初の増幅サイクル中に検出された測定可能なシグナルレベルを指す。この低レベルの信号は「バックグラウンド」または「ノイズ」と呼ばれることが多く、実験条件によって異なるであろう。初期のサイクル（一般的に増幅サイクル：１〜１５）を通して、蛍光シグナルの変動はほとんどない。しかしながら、反応が進行するにつれて（通常、サイクル１５＋）、蛍光の測定値はサイクルのたびに指数関数的に増加し始める。ベースラインの計算では、通常、測定された増幅シグナルがバックグラウンドを超えて上昇し始めるサイクルは除外される。
【００４２】
「閾値」という用語は、測定された蛍光シグナルがベースライン（例えば、バックグラウンド）シグナルよりも統計的に大きいとみなされるポイントに関連することにより、測定可能な増幅シグナルをノイズと区別する。いくつかの実施形態において、閾値は、ベースラインの蛍光値の標準偏差の１０倍に設定される。
【００４３】
「閾値サイクル」（Ｃｔ）という用語は、反応の蛍光シグナルが閾値を超える特定のサイクル数である。注目すべきことに、Ｃｔ値が標的の出発量に反比例するため、Ｃｔは、最初のＤＮＡコピー数を計算するために使用することができる。同量の入力とすれば、１つの増幅／検出システムのＣＴが別の増幅／検出システムよりも低くなる可能性がある。このＣＴの違いの原因は、プライマーの感度である。同様に、反応成分（非核酸）は、Ｃｔを改変させる可能性がある。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲ反応では、「検量線」とは、増幅の実際の有効性（実測効率）を理論上の有効性と比較する数式を指す。検量線を計算するために様々な方法が使用されるが、通常、検量線は、標的核酸配列の希釈系列を作成し、リアルタイムＰＣＲを実施することによって生成される（増幅プライマーは比例の用量反応曲線を生成する必要があるという理論の下で機能する）。いくつかの態様において、標準曲線の希釈範囲は、実験試料について予測される濃度範囲に及ぶ。結果をグラフにプロットすると（ｙ軸上にＣｔ値を用いて）、勾配が生成し、反応効率を比較するために使用される。ＰＣＲの理論効率は１００％である必要があるため（指数関数的増幅中に各サイクル後にテンプレートが２倍になることを示す）、効率データは反応に関する有益な情報を提供する。重要なことに、プライマーの長さ、プライマー組成（および二次構造の存在）、アンプリコンのＧＣ含量などの実験的要因により、効率が低下する可能性がある。
【００４５】
「正規化」という用語は、本明細書では、相対的Ｃｔ値（試料間の生物学的差異を示す）が誤って非生物学的要因（例えば、試料調製の相違または溶液中の塩濃度）によって影響を受けないプロセスを説明するために使用される。したがって、正規化は実験のばらつきの影響を軽減し、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用できる。一般に、分子生物学の当業者は、試料量への正規化、ＲＮＡもしくはＤＮＡ量への正規化、または参照遺伝子への正規化を含む、正規化のための様々な方法を理解するであろう。通常、内在性対照は試料間で一貫した発現をもたらすため、ハウスキーピング遺伝子（内在性対照）などの参照遺伝子への正規化は、リアルタイムＰＣＲの変動性に対処するために使用される。一般的に使用される内在性正規化群には、β−アクチンなどの細胞骨格成分、１８Ｓ  ｒＲＮＡなどのリボソームサブユニット、シクロフィリンＡなどのセリン−スレオニンホスファターゼ阻害剤、およびグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などの解糖経路タンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。一般的なハウスキーピング遺伝子は、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：３３２  （２０００）およびＪ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２５：１６９  （２０００）に見出すことができる。
【００４６】
「内部標準」（ＩＣ）は、試料と並行して増幅される核酸配列であり、これは、アッセイステップおよび／もしくはアッセイ条件が適切に実施されたか否か、ならびに／または試薬および装置が機能したか否かを示し得る。ＩＣは外因性または内因性のいずれかである。外因性細胞源は、試料に添加された場合に、試料と同じ試料処理手順に曝され、増幅され、必要に応じて、同じ増幅プライマーおよび検出プローブを使用して検出される細胞を含み得る。増幅されたＩＣからのシグナル検出（目的の標的核酸配列からのシグナルを検出せずに）は、アッセイが適切に実施されたこと、および試料がＶＺＶに対して陰性であったことを示す。内因性ＩＣは、通常、試料検体に関連する／見られる細胞源である（例：β−アクチンなどのハウスキーピング遺伝子）。内因性細胞源も同様に処理および増幅され、必要に応じて、同じ増幅プライマーおよび／または検出プローブを使用して検出される。同様に、目的の標的核酸配列からのシグナルがない場合、増幅ＩＣからのシグナル検出は、適切な実験設計を示し、試料がＶＺＶに対して陰性であったことを示す（例えば、Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ，２５：Ｓ８９−９７，２００２、米国特許第６，４１０，３２１号、および米国特許出願公開第２００４−００２３２８８号を参照、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、定量的な結果が望ましい場合、ＩＣは、アッセイ用の内部標準物質として使用することもできる。プライマーおよびプローブがＩＣ標的配列を増幅するために機能すること、ならびにＶＺＶ由来の標的核酸配列からアンプリコンを増幅し検出するために使用される同様のアッセイ条件下において、増幅されたＩＣ配列の検出が可能であるという条件で、プライマーおよびプローブ用のＩＣは、任意の様々な周知の方法を使用して構成され得る。
【００４７】
「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）とは、蛍光強度の測定単位である。ＲＦＵは、使用される検出手段の特徴によって変化する。ＲＦＵは、試料および／または対照のＰＣＲ産物を比較定量化するために使用できる。増幅産物を多く含む試料は、対応するＲＦＵ値が高くなる。
【００４８】
「特異性」とは、プライマーおよび／または検出プローブなどのオリゴヌクレオチドを含む連続ヌクレオチドの特定の配置と、標的核酸配列上のオリゴハイブリッド形成配列を含む連続ヌクレオチドの特定の配置とのハイブリッド形成の程度を指す（例えば、特異性とは、標的配列と非標的配列とを区別する能力である）。核酸増幅に関して、特異性は、一般に、副産物の数、または非標的アンプリコンの数に対する生成された特異的アンプリコンの数の比（例えば、シグナル対ノイズ比）を指す。検出に関して、特異性は、一般に、非標的核酸から生成されたシグナルと比較して、目的の標的核酸配列に対する検出プローブの結合親和性に関するシグナルを指す。
【００４９】
「融解曲線分析」は、ｄｓＤＮＡが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に解離する場合の蛍光の変化を測定し、プライマーの特異性を測定するために使用できる。融解温度（Ｔｍ）でｄｓＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに分離し、増幅に関与する後続のプロセスが検出プローブを正常に切断する場合に、蛍光は検出可能である。得られた蛍光を測定し、温度に対してプロットすることができる（−ΔＦ／ΔＴ）。類似のＰＣＲ産物は、多くの場合、融解特性を使用して比較される。
【００５０】
「感度」という用語は、本明細書では、増幅産物を検出および／または定量化することができる精度を定義するために使用される。増幅反応の感度は、一般に、確実に検出することができる標的核酸配列の最小コピー数の尺度である。一般に、２〜１０コピーは、一貫して定量化することができる標的核酸配列の最小数とみなされる。
【００５１】
「検出プローブ」（「検出オリゴマー」または「プローブ」とも呼ばれる）は、ハイブリッド形成を促進する条件下で、特定のオリゴハイブリッド形成配列にアニーリングする標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。具体的には、検出プローブを使用して、標的核酸配列またはアンプリコンの存在を同定する。検出は、直接的（例えば、検出プローブを含む連続ヌクレオチド配列が、標的核酸上のオリゴハイブリッド形成配列を含む相補的連続ヌクレオチド配列に直接ハイブリッド形成する）または間接的（例えば、プローブが、ヘアピン構造などの標的核酸配列とプローブとを連結させる中間構造にハイブリッド形成する（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、第５，３１２，７２８号、第６，８３５，５４２号、および第６，８４９，４１２号））であり得る。検出プローブは、順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーとの間で標的核酸配列にアニーリングするように設計される。検出プローブは、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み得る。このような非標的ハイブリッド形成配列には、当技術分野で理解されているように、自己相補的領域、タグ、および他の核酸成分が含まれる。一般に、分子生物学の当業者は、プローブが、化学合成などの様々な技術によって、または組換え核酸分子からのインビトロもしくはインビボ発現によって生成され得ることを理解するであろう。検出プローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせを含むオリゴマー、または修飾骨格を有する合成オリゴマー（例えば、１つ以上の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマー）であり得る。一般的に、検出可能な標識は検出プローブと結合する。いくつかの実施形態において、検出プローブは、長さが２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、または２０〜３０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個の核酸塩基である。
【００５２】
「標識」または「検出可能な標識」とは、検出可能なプローブまたは検出可能なシグナルを生成するプローブに直接的に（または間接的に）結合した部分または化合物を指す。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合され得る。例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは共有結合を利用して、５’および３’末端にレポーター色素および一般的な消光剤色素を結合する。標識の間接的な結合は、検出可能なシグナルを増幅するために、架橋部分またはリンカー（例えば、抗体または追加のオリゴヌクレオチド（複数可））を使用し得る。検出可能な標識には、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチンまたはアビジン）、酵素、酵素基質、反応性基、発色団（例えば、色素、またはラテックスもしくは金属ビーズなどの粒子）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物（例えば、フルオロフォア）が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な標識には、検出可能な光シグナルを発する化合物（例えば、フルオロフォア）、または均一な混合物中で検出することができる発光（例えば、化学発光化合物）が含まれる。特定のプローブには、複数の標識、または複数のタイプの標識が存在する場合がある。検出は、各プローブが検出可能なシグナルを生成する化合物で標識されるプローブ混合物を使用することに依存し得る（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照、各々が参照によって本明細書に組み込まれる）。多くのリアルタイム蛍光ＰＣＲ化学が存在するが、一般に、フルオロフォアに近接した場合に光を吸収する消光剤分子と組み合わせて５’ヌクレアーゼ活性を利用する蛍光検出プローブが最も広く使用されている。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブに加えて、他の一般的に利用される標識の例には、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。いくつかの実施形態において、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、または分子ビーコンは、直接消光剤励起から蛍光を発しない非蛍光アクセプター（消光剤）を含む。
【００５３】
「蛍光共鳴エネルギー移動」（ＦＲＥＴ）は、検出プローブの５’ドメイン上の第１の蛍光色素（例えば、「レポーター色素」）と、３’ドメイン上の第２の蛍光色素（例えば、「消光剤」）との相互作用を説明する。検出プローブは未変性の状態で、消光剤（より長い波長を含む）は、レポーター色素のより短い波長から発するより高いエネルギーを吸収する。しかしながら、ＰＣＲ中、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性（およびその後の検出プローブの酵素分解）により、結果として５’レポーターが３’消光色素から分離されるため、レポーター色素から発する蛍光シグナルを吸収する消光剤の能力が失われる。したがって、消光剤がもはや近接していない状態で、より高エネルギーのレポーターから発するシグナルを測定することができる。蛍光標識およびＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブのような消光剤の両方を含む検出プローブは、５’ドメインでの蛍光標識（レポーター色素など）の遊離とそれに続く蛍光の増加を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ反応におけるアンプリコン産物の相対量を定量化できるため、とりわけ有用である。このような検出プローブの特定のバリエーションには、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブ（カタログ番号：４０１８４６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州プレザントンのＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって開発された、米国特許第５，７２３，５９１号、第５，８０１，１５５号、および第６，０８４，１０２号）が含まれる。ミスマッチのフルオロフォアと消光剤の組み合わせがバックグラウンド蛍光の増加につながる可能性があることは、分子生物学の当業者にはよく知られている。標識を核酸に結合させ、標識を検出する合成技術および方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）、第１０章、Ｎｅｌｓｏｎらの米国特許第５，６５８，７３７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号、Ｈｏｇａｎらの米国特許第５，５４７，８４２号、Ａｒｎｏｌｄらの米国特許第５，２８３，１７４号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙらの米国特許第４，５８１，３３３号）、およびＢｅｃｋｅｒらの欧州特許出願第０７４７７０６号を参照）。
【００５４】
「分子ビーコン」は、自己相補性を示し、ヘアピンループ立体配座を形成する一本鎖、二標識、蛍光プローブである。分子ビーコンの標識部分には、フルオロフォアを含む第１の部分および消光剤を含む第２の部分が含まれる。ヘアピンループのステムは、レポーター分子および消光剤分子を含むプローブの５’末端および３’末端の自己相補的塩基対合によって結合している。いくつかの実施形態において、分子ビーコンは、３’末端の４〜６ヌクレオチドの配列に相補的であり、それとハイブリッド形成することができる４〜６ヌクレオチドの配列を５’末端に含む。いくつかの実施形態において、５’または３’の相補配列のいずれかは、非標的ハイブリッド形成配列（標的閉鎖ドメインとも呼ばれる）である。いくつかの実施形態において、５’末端の４〜６ヌクレオチドに相補的であり、それとハイブリッド形成することができる３’末端の４〜６ヌクレオチド配列は、リンカーを介して分子ビーコンと連結する。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｃ１〜Ｃ１６リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｃ９リンカーである。分子ビーコンは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリッド形成を優先するように設計される。いくつかの実施形態において、分子ビーコンは、５’末端に結合した蛍光分子、および３’末端に結合した消光剤を含む。あるいは、蛍光分子をトーチの３’末端に結合させ、消光剤を検出オリゴマーの５’末端に結合させてもよい。ハイブリッド形成すると、ヘアピンループ構造が開くため、レポーターが消光剤から分離される（消光剤の有効性が無効になる）。消光剤がレポーターに近接しなくなったため、蛍光を測定できる。発する蛍光は、標的ＤＮＡ量に正比例する。分子ビーコンについては、米国特許第５，９２５，５１７号に詳しく説明されている。
【００５５】
「分子トーチ」は、アンプリコンが試料に存在するか否かを示すために使用できる。分子トーチには、自己相補性の異なる領域が含まれる。標的に曝露されると、分子トーチの２つの自己相補的領域（完全にまたは部分的に相補的）が融解するため、個々のヌクレオチド（標的結合ドメインを含む）は、標的核酸配列上の相補的連続ヌクレオチドにハイブリッド形成することが可能になる。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリッド形成を優先するように設計されることが重要である。分子トーチが標的核酸配列にハイブリッド形成する場合とは対照的に、分子トーチが自己ハイブリッド形成する場合には異なるシグナルが生成するように、分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、相互作用標識（例えば、蛍光色素および消光剤）を含む（それにより、ハイブリッド形成していないプローブの存在下で、試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、および標識からのシグナルを検出する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）  第１０章、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０７４７７０６号）。
【００５６】
「デルタＧ」または「ΔＧ」は、ハイブリッドを融解または解離するために必要なエネルギー量を表す。ΔＧが大きいほど（負の値が大きいほど）、２つのハイブリッド形成配列を解離するために必要なエネルギー量は大きくなる。低いΔＧ数（ゼロに近い負の値）は、ハイブリッドを融解または解離するために必要なエネルギーが少ないことを示す。エネルギーは温度に比例することが重要である（ΔＧが高くなるほど高い温度を要する）。
【００５７】
「配列番号：＿」への言及は、別に示さない限り、対応する配列表事項の連続ヌクレオチド配列を指し、骨格（例えば、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）の同一性または塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）を必要としない。
【００５８】
「単離された」という用語は、その天然環境から取得される核酸に関して本明細書で使用されるが、この用語は、いかなる程度の精製も含意しない。
【００５９】
「試料調製」は、増幅および／または検出のために試料を調製するために必要な任意のステップまたは方法を指す。試料調製には、より大きい試料体積からポリヌクレオチドなどの成分を濃縮する任意の既知の方法、例えば、より大きい体積試料からの空中浮遊性粒子もしくは水媒介性粒子の濾過による方法、または標準的な微生物学的方法を使用することにより試料からの微生物の単離による方法が含まれ得る。試料調製には、細胞内成分を実質的に水相または有機相に放出するための細胞成分の物理的破壊および／または機械的破壊および／または化学的溶解、ならびにデブリの除去が含まれ得る。試料調製には、標的核酸を選択的または非特異的に捕捉し、それを他の試料成分から分離するポリヌクレオチドの使用も含まれ得る（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０１６９８８号の記載など、各々が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
「分離すること」または「精製すること」という用語は、試料などの混合物中の１種以上の他の成分から、混合物の１種以上の成分を除去することを指す。試料成分には、核酸、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の化合物が含まれる場合がある。分離または精製は、特定の精製度を含意しない。いくつかの実施形態において、標的核酸または増幅産物の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、混合物中の他の成分から分離されるまたは除去される。
【００６１】
「縮重」塩基とは、複数の核酸塩基との塩基対またはハイブリッド形成することができるヌクレオチドを指す。「ゆらぎ塩基対」とは、ワトソン−クリックの塩基対規則に従わないＲＮＡ分子の２つのヌクレオチド間の対合である（例えば、ピリミジン（ＣとＴ）またはプリン（ＡとＧ）間の結合）。不完全なハイブリッドは適度に安定な二本鎖を形成する可能性があるため、縮重塩基の存在は必ずしも安定なハイブリッドの形成を妨げるわけではない。５−ニトロインドールは縮重塩基の一例であり、４つ全ての天然塩基と対合し得る。
【００６２】
記載の増幅オリゴヌクレオチドはいずれも、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５−メチルシトシンであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチドは、２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチド中の全ヌクレオチドが修飾される。２つ以上の修飾ヌクレオチドは、同じであっても、異なってもよい。いくつかの実施形態において、記載の増幅オリゴヌクレオチドはいずれも、１つ以上の５−メチルシトシンを含み得る。増幅オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７以上の５−メチルシトシンを有し得る。いくつかの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチド中の全シトシンヌクレオチドが、５−メチルシトシン修飾ヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７以上の２’−ＯＭｅリボヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、増幅オリゴヌクレオチド中の全ヌクレオチドが、２’−ＯＭｅリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、チミジンヌクレオチドを、ウリジンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかの実施形態において、全てのチミジンヌクレオチドを、ウリジンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかの増幅オリゴヌクレオチドでは、５−メチル−２’デオキシシトシン塩基を使用して、（対応する非メチル化増幅オリゴヌクレオチドと比べて）オリゴヌクレオチドに組み込まれた各５−メチル−２’−デオキシシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）のＴｍを約０．５℃〜１．３℃上げることによって、二本鎖の安定性を増加させることができる。
【００６３】
「アッセイ条件」という用語は、特定のオリゴハイブリッド形成配列へのオリゴヌクレオチドの安定なハイブリッド形成を可能にする条件を示すために使用される。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリッド形成を必要としない。
【００６４】
「安定な」または「検出に対して安定な」という用語は、核酸二本鎖が変性する温度よりも低い反応混合物の温度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本開示は、試料中のＶＺＶを検出するための増幅オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド組成物、キット、方法、製剤、および反応混合物を提供する。さらに、オリゴヌクレオチド組成物、キット、方法、製剤、および反応混合物は、試料中にＶＺＶの標的核酸配列が存在する場合、該配列からアンプリコンを生成するためにさらに有用である。ＶＺＶの増幅および検出は診断に使用できる。診断を使用して、ウイルスの蔓延を制限するための効果的な治療を容易にし得る。そのため、増幅オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド組成物、キット、方法、製剤、および反応混合物は、ＶＺＶ感染の可能性がある個体（症状を呈するか否かにかかわらず）、またはＶＺＶ感染から重篤な合併症の危険性が高い個体（例えば、若年、高齢、または免疫不全）をスクリーニングするのに有用である。そのため、開示されたオリゴヌクレオチド組成物、キット、方法、製剤、および反応混合物は、ＶＺＶに感染または曝露された可能性のある患者からの臨床試料の迅速で高感度かつ特異的な試験の必要性に対応する。
【００６６】
特定の態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、ＶＺＶ核酸配列内の標的核酸配列を増幅するための増幅プライマーを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、ＶＺＶを検出するための検出プローブを開示している。いくつかの実施形態において、増幅プライマーおよび検出プローブは、２つの別個の製品である。いくつかの実施形態において、増幅プライマーおよび検出プローブは、キットで提供される。特定の態様において、本開示は、試料を少なくとも１つの増幅プライマー対と接触させ、インビトロ核酸増幅反応を実施するためのオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法に関し、試料中に存在する任意の標的核酸配列は、増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用することができる。いくつかの態様において、本開示は、試料を少なくとも１つの検出プローブと接触させるためのオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法に関し、試料またはその増幅産物に存在する任意の標的核酸配列は、検出を容易にするために検出プローブにハイブリッド形成することができる。
【００６７】
特定の態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、ＶＺＶ核酸配列の特定の標的核酸領域内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するための少なくとも１つの増幅プライマー対を利用するためのガイダンスを提供する。特定の態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、試料中のＶＺＶを検出するために少なくとも１つの検出プローブを利用するためのガイダンスを提供する。増幅プライマーまたは検出プローブの特定の組み合わせの任意の適用は、同様に、ＶＺＶの標的核酸配列の増幅または検出のための開示方法として理解されるべきである。
【００６８】
特定の態様において、本明細書に開示されるＶＺＶ増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列内の相補ヌクレオチドサブユニットに特異的にハイブリッド形成するように構成され、したがって、試料中の他の非ＶＺＶ核酸（存在する場合）との交差反応性を最小限に抑える。
【００６９】
特定の態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、少なくとも１つの増幅プライマーを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、１セット以上または１対以上の増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態において、増幅プライマーのセットは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを含む。いくつかの実施形態において、増幅プライマーのセットは、順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、標的核酸領域から標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する単一セットの順方向および逆方向の増幅プライマーを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、２つ以上のアンプリコンを生成する２セット以上の増幅プライマーを含む。２つ以上のアンプリコンは、単一の標的核酸内の２つ以上の領域、２つ以上の標的核酸、またはこれらの組み合わせからのものであり得る。２つ以上の標的核酸は、同じ生物または異なる生物に由来する。
【００７０】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、増幅オリゴヌクレオチドは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にアニーリングするように構成されている。
【００７１】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、互いに独立して、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される。
【００７２】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号７の配列を含む。
【００７３】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１７の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２２の配列を含む。
【００７４】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーは、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【００７５】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３および１２７ヌクレオチドの長さからなる群から選択される配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは９３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１００ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１０２ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１１９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２７ヌクレオチドの長さである。
【００７６】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、（ｈ）配列番号７および配列番号２２のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【００７７】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号３と配列番号１８の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号４と配列番号１９の間に隣接している少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号７と配列番号２２の間に隣接している少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号６と配列番号２１の間に隣接している少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｆ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｇ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１６または配列番号５と配列番号２０の間に隣接している少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【００７８】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【００７９】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは約２０〜約２２ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２７の配列を含む。
【００８０】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは、約２０〜約２２ヌクレオチドの長さであり、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３７の配列を含む。
【００８１】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６、および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーは約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。
【００８２】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９９、１０９、１２６および１４３ヌクレオチドの長さからなる群から選択される配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは９９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１０９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１２６ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１４３ヌクレオチドの長さである。
【００８３】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、（ｅ）配列番号２７および配列番号３７のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【００８４】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２５と配列番号３５の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２４と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２３と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２７と配列番号３７の間に隣接している少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２６と配列番号３６の間に隣接している少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【００８５】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、少なくとも１つの増幅プライマーは、順方向（ｆｏｒｗａｒｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で標的核酸配列にアニーリングするように構成され、少なくとも１つの増幅プライマーは、逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で標的核酸配列にアニーリングするように構成され、順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）および逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）の増幅プライマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内で増幅される標的核酸配列上のオリゴハイブリッド形成配列を含む連続ヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成する。
【００８６】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法のいくつかの実施形態において、試料中のＶＺＶの標的核酸配列の存在（または不在）を決定するための組成物は、（１）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの順方向増幅プライマー、および（２）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの逆方向増幅プライマーを含む。
【００８７】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、順方向増幅プライマーは少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００８８】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、順方向増幅プライマーは２〜６個の修飾核酸塩基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【００８９】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、逆方向増幅プライマーはさらに少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００９０】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、逆方向増幅プライマーは２〜６個の修飾核酸塩基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【００９１】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、第３のオリゴマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域内の増幅される標的核酸配列に特異的にアニーリングするように構成されている。特定の態様において、第３のオリゴマーは、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴマーは、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、第３のオリゴマーは検出プローブである。
【００９２】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである。
【００９３】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１５の配列を含む。
【００９４】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７である場合は配列番号８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７である場合は配列番号９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３および配列番号１８である場合は配列番号１０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号５および配列番号２０である場合は配列番号１３、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号６および配列番号２１である場合は配列番号１４、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号７および配列番号２２である場合は配列番号１５。
【００９５】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号３および配列番号１８から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１０の配列を含み、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号４および配列番号１９から、少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１１または配列番号１２の配列を含み、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２および配列番号１７から、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号９の配列を含み、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号７および配列番号２２から、少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１５の配列を含み、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号６および配列番号２１から、少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１４の配列を含み、（ｆ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１７から、少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号８または配列番号９の配列を含み、（ｇ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１６から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号８もしくは配列番号９の配列を含むか、または順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号５および配列番号２０から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１３の配列を含む。
【００９６】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである。
【００９７】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２８、２９、３０、３１、３２、および３３からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３３の配列を含む。
【００９８】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４である場合は配列番号２８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号２９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号３０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２６および配列番号３６である場合は配列番号３１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３３。
【００９９】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２５および配列番号３５から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２９または配列番号３０の配列を含み、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２４および配列番号３４から、少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２８の配列を含み、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２３および配列番号３４から、少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２８の配列を含み、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２７および配列番号３７から、少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号３２または配列番号３３の配列を含み、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２６および配列番号３６から、少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号３１の配列を含む。
【０１００】
特定の態様において、本明細書に記載されるような試料中のＶＺＶの存在（または不在）を決定するためのオリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域に特異的にアニーリングするように構成された少なくとも１つの検出プローブを含み、検出プローブは順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーとの間に隣接している。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。特定の態様において、検出プローブは、消光剤などの第１の標識と相互作用する第２の標識をさらに含む。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標識は、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、蛍光標識を含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、消光剤を含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、蛍光標識および消光剤の両方を含む。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、検出プローブは線形であり、分子内結合によって保持されるいかなる程度の自己相補性も示さない。このような実施形態において、線形検出プローブは、標識としてフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、線形検出プローブは、フルオロフォアおよび消光部分（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）の両方を含む。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、検出プローブは、少なくともある程度の自己相補性を示し、検出前にまずハイブリッド形成していないプローブの除去を必要とせずに、試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために使用される。
【０１０５】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、少なくともある程度の自己相補性を示すヘアピン検出プローブは、分子ビーコンまたは分子トーチである。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、標識された検出プローブは伸長不可能である。例えば、標識された検出プローブは、３’−末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有するか、３’末端−反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、３’から３’へのホスホジエステル結合もしくはその類似体（ホスホロチオエートなど）によって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有するか、または結合したフルオロフォア、消光剤、もしくは伸長を妨害する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’−リン酸化によって伸長不可能にすることができる。特定の態様において、３’末端ヌクレオチドはメチル化されていない。
【０１０７】
オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの修飾された核酸塩基をさらに含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０８】
特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、例えば、緩衝液、塩、種々のｄＮＴＰ、および／または酵素などの、インビトロ増幅を実施するのに適した追加の試薬をさらに含み得る。
【０１０９】
特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物、キット、および方法は、様々な異なる実施形態で包装され得、当業者は、本開示が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。
【０１１０】
特定の態様において、オリゴヌクレオチド組成物は、水性であるか、凍結または凍結乾燥され得る。
【０１１１】
本開示は、試料中のＶＺＶの検出または増幅のための製剤を提供する。特定の態様において、本明細書に開示される製剤は、ＶＺＶ核酸配列内の標的核酸配列を増幅するための増幅プライマーを含む。いくつかの態様において、製剤は、ＶＺＶを検出するための検出プローブを開示している。いくつかの実施形態において、増幅プライマー製剤および検出プローブは、２つの別個の製品として、または別個のバイアルで提供される。
【０１１２】
特定の態様では、オリゴヌクレオチド製剤は、標的核酸配列内の相補ヌクレオチドサブユニットに特異的にハイブリッド形成するように構成され、したがって、試料中の他の非ＶＺＶ核酸（存在する場合）との交差反応性を最小限に抑える。
【０１１３】
特定の態様において、本明細書に開示される製剤は、少なくとも１種の増幅プライマーを含む。特定の態様において、製剤は、増幅プライマーのセットを含む。いくつかの態様において、製剤は増幅プライマーのセットを含み、第１の増幅プライマーは順方向増幅プライマーを含み、第２の増幅プライマーは逆方向増幅プライマーを含む。特定の態様において、製剤は、標的核酸領域から標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する単一セットの順方向および逆方向の増幅プライマーを含む。特定の態様において、製剤は、種々の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する複数セットの増幅プライマーを含む。特定の態様において、製剤は、単一の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する複数セットの増幅プライマーを含む。
【０１１４】
製剤の特定の態様において、増幅プライマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にアニーリングするように構成されている。
【０１１５】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、互いに独立して、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される。
【０１１６】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号７の配列を含む。
【０１１７】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２の核酸塩基配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１７の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２２の配列を含む。
【０１１８】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーは、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１１９】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３および１２７ヌクレオチドの長さからなる群から選択される配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは９３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１００ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１０２ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１１９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２７ヌクレオチドの長さである。
【０１２０】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、（ｈ）配列番号７および配列番号２２のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【０１２１】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号３と配列番号１８の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号４と配列番号１９の間に隣接している少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号７と配列番号２２の間に隣接している少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号６と配列番号２１の間に隣接している少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｆ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｇ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１６または配列番号５と配列番号２０の間に隣接している少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１２２】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１２３】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは約２０〜約２２ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２７の配列を含む。
【０１２４】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは、約２０〜約２２ヌクレオチドの長さであり、配列番号３４、３５、３６または３７の核酸塩基配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３７の配列を含む。
【０１２５】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーは約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１２６】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９９、１０９、１２６および１４３ヌクレオチドの長さからなる群から選択される配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは９９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１０９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１２６ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１４３ヌクレオチドの長さである。
【０１２７】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向増幅プライマーは配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーは配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、（ｅ）配列番号２７および配列番号３７のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【０１２８】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２５と配列番号３５の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２４と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２３と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２７と配列番号３７の間に隣接している少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成され、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーは、標的核酸領域内の配列番号２６と配列番号３６の間に隣接している少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１２９】
製剤の特定の態様において、少なくとも１つの増幅プライマーは、順方向で標的核酸配列にアニーリングするように構成され、少なくとも１つの増幅プライマーは、逆方向で標的核酸配列にアニーリングするように構成される。製剤の特定の態様において、順方向および逆方向の増幅プライマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内で増幅される標的核酸配列上のオリゴハイブリッド形成配列を含む連続ヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成する。
【０１３０】
製剤のいくつかの実施形態において、試料中のＶＺＶの標的核酸配列の存在（または不在）を決定するための組成物は、（ａ）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの順方向増幅プライマー、および（ｂ）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの逆方向増幅プライマーを含む。
【０１３１】
製剤の特定の態様において、順方向増幅プライマーは少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチル−シトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１３２】
製剤の特定の態様において、順方向増幅プライマーは２〜６個の修飾核酸塩基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【０１３３】
製剤の特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチル−シトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１３４】
製剤の特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の修飾された核酸塩基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の５−メチル−シトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の５−メチル−シトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。特定の実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【０１３５】
製剤の特定の態様において、第３のオリゴマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域内の増幅される標的核酸配列に特異的にアニーリングするように構成されている。特定の態様において、第３のオリゴマーは、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴマーは、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。製剤の特定の態様において、第３のオリゴマーは検出プローブである。
【０１３６】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである。
【０１３７】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１５の配列を含む。
【０１３８】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７である場合は配列番号８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７である場合は配列番号９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３および配列番号１８である場合は配列番号１０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号５および配列番号２０である場合は配列番号１３、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号６および配列番号２１である場合は配列番号１４、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号７および配列番号２２である場合は配列番号１５。
【０１３９】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号３および配列番号１８から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１０の配列を含み、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号４および配列番号１９から、少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１１または配列番号１２の配列を含み、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２および配列番号１７から、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号９の配列を含み、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号７および配列番号２２から、少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１５の配列を含み、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号６および配列番号２１から、少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１４の配列を含み、（ｆ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１７から、少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号８または配列番号９の配列を含み、（ｇ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１６から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号８もしくは配列番号９の配列を含むか、または順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号５および配列番号２０から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、検出プローブは配列番号１３の配列を含む。
【０１４０】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである。
【０１４１】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２８、２９、３０、３１、３２、および３３からなる群から選択される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３３の配列を含む。
【０１４２】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４である場合は配列番号２８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号２９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号３０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２６および配列番号３６である場合は配列番号３１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３３。
【０１４３】
製剤の特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２５および配列番号３５から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２９または配列番号３０の配列を含み、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２４および配列番号３４から、少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２８の配列を含み、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２３および配列番号３４から、少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号２８の配列を含み、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２７および配列番号３７から、少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号３２または配列番号３３の配列を含み、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２６および配列番号３６から、少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、第３のオリゴマーは配列番号３１の配列を含む。
【０１４４】
特定の態様において、本明細書に記載されるような試料中のＶＺＶの存在（または不在）を決定するための製剤は、配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にアニーリングするように構成された少なくとも１つの検出プローブをさらに含み、検出プローブは順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーとの間に隣接している。
【０１４５】
製剤の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。特定の態様において、検出プローブは、第１の標識と相互作用する第２の標識、例えば消光剤をさらに含む。製剤の特定の態様において、標識は、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の態様において、標識は蛍光標識を含む。特定の態様において、標識は消光剤を含む。特定の態様において、製剤は、蛍光標識および消光剤の両方を有する検出プローブを含む。
【０１４６】
製剤の特定の態様において、検出プローブは線形であり、分子内結合によって保持されるいかなる程度の自己相補性も示さない。このような実施形態において、線形検出プローブは、標識としてフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、線形検出プローブは、フルオロフォアおよび消光部分（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）の両方を含む。
【０１４７】
製剤の特定の態様において、検出プローブは、少なくともある程度の自己相補性を示し、検出前にまずハイブリッド形成していないプローブの除去を必要とせずに、試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために使用される。製剤の特定の態様において、少なくともある程度の自己相補性を示すヘアピン検出プローブは、分子ビーコンまたは分子トーチである。
【０１４８】
製剤の特定の態様において、標識された検出プローブは伸長不可能である。例えば、標識された検出プローブは、３’−末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有するか、３’末端−反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、３’から３’へのホスホジエステル結合もしくはその類似体（ホスホロチオエートなど）によって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有するか、または結合したフルオロフォア、消光剤、もしくは伸長を妨害する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’−リン酸化によって伸長不可能にすることができる。特定の態様において、３’末端ヌクレオチドはメチル化されていない。
【０１４９】
製剤の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチル−シトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１５０】
特定の態様において、製剤は、例えば、緩衝液、塩、種々のｄＮＴＰ、および／または酵素などの、インビトロ増幅を実施するのに適した追加の試薬をさらに含み得る。
【０１５１】
特定の態様において、製剤は、様々な異なる実施形態で包装され得、当業者は、本開示が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。
【０１５２】
特定の態様において、本明細書に開示される製剤は、水性であるか、凍結または凍結乾燥され得る。
【０１５３】
試料中のＶＺＶ核酸配列の存否を決定し、ＶＺＶの標的核酸配列が存在する場合、それを増幅するための反応混合物も提供される。増幅プライマー製剤および検出プローブ製剤は、別個の製剤または組成物として、または組成物の単一製剤で提供することができる。反応混合物は、インビトロ増幅に必要な他の試薬をさらに含み、緩衝液、塩、種々のｄＮＴＰ、酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、および試験試料を含むがこれらに限定されない。
【０１５４】
特定の態様において、ＶＺＶの標的核酸領域内の標的核酸配列を増幅するための反応混合物、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するための反応混合物は、第１の増幅プライマー、および検出プローブを含む。
【０１５５】
特定の態様において、反応混合物は、試料中のＶＺＶ核酸配列の存否を決定するための増幅プライマーのセットを含み、第１の増幅プライマーは順方向増幅プライマーを含み、第２の増幅プライマーは逆方向増幅プライマーを含む。
【０１５６】
特定の態様において、反応混合物は、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にアニーリングするように構成されている。
【０１５７】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、互いに独立して長さ約１９〜約２３ヌクレオチドの順方向および逆方向の増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３８の標的核酸領域から長さ約８９〜約１２７ヌクレオチドのアンプリコンを生成するように構成される。
【０１５８】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される順方向増幅プライマーならびに長さ約１９〜約２３ヌクレオチドの逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸領域からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増幅プライマーは配列番号１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向増オリゴマーは配列番号２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、順方向オリゴマーは配列番号７の配列を含む。
【０１５９】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、長さ約１９〜約２３ヌクレオチドの逆方向増幅プライマーを含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１７の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号１９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、逆方向オリゴマーは配列番号２２の配列を含む。
【０１６０】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される逆方向増幅プライマー、ならびに長さ約２０〜約２３ヌクレオチドの順方向増幅プライマーを含み、増幅オリゴマーは、約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１６１】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３または１２７ヌクレオチドの長さの配列番号３８内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは９３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１００ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１０２ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１１９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２３ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、アンプリコンは１２７ヌクレオチドの長さである。
【０１６２】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、（ｈ）配列番号７および配列番号２２のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【０１６３】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、下記のうちの１つ以上を含む。（ａ）標的核酸領域内の配列番号３と配列番号１８の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｂ）標的核酸領域内の配列番号４と配列番号１９の間に隣接している少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｃ）標的核酸領域内の配列番号２と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｄ）標的核酸領域内の配列番号７と配列番号２２の間に隣接している少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｅ）標的核酸領域内の配列番号６と配列番号２１の間に隣接している少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｆ）標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１７の間に隣接している少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｇ）標的核酸領域内の配列番号１と配列番号１６または配列番号５と配列番号２０の間に隣接している少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー。
【０１６４】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、互いに独立して長さ約２０〜約２３ヌクレオチドの順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１６５】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに長さ約２０〜約２２ヌクレオチドの逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、順方向オリゴマーは配列番号２７の配列を含む。
【０１６６】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択され、長さ約２０〜約２２ヌクレオチドの逆方向増幅プライマーを含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３５の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３６の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、逆方向オリゴマーは配列番号３７の配列を含む。
【０１６７】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される逆方向増幅プライマー、ならびに長さ約２０〜約２３ヌクレオチドの順方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。
【０１６８】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、８９、９９、１０９、１２６、または１４３ヌクレオチドの長さの配列番号３９内の標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは８９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは９９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１０９ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１２６ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、アンプリコンは１４３ヌクレオチドの長さである。
【０１６９】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される順方向増幅プライマー、ならびに配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される逆方向増幅プライマーを含み、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、（ｅ）配列番号２７および配列番号３７のオリゴハイブリッド形成配列に対応する標的核酸配列を丁重に含む。
【０１７０】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、下記のうちの１つ以上を含む。（ａ）標的核酸領域内の配列番号２５と配列番号３５の間に隣接している少なくとも約８９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｂ）標的核酸領域内の配列番号２４と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｃ）標的核酸領域内の配列番号２３と配列番号３４の間に隣接している少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｄ）標的核酸領域内の配列番号２７と配列番号３７の間に隣接している少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー、（ｅ）標的核酸領域内の配列番号２６と配列番号３６の間に隣接している少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列からアンプリコンを生成するように構成される順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマー。
【０１７１】
特定の態様において、反応混合物は、順方向で標的核酸配列にアニーリングするように構成される少なくとも１つの増幅プライマー、および逆方向で標的核酸配列にアニーリングするように構成される少なくとも１つの増幅プライマーを含み、増幅プライマーは、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内で増幅される標的核酸配列上のオリゴハイブリッド形成配列を含む連続ヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成する。
【０１７２】
反応混合物のいくつかの実施形態において、試料中のＶＺＶの標的核酸配列の存在（または不在）を決定するための組成物は、（ａ）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの順方向増幅プライマー、および（ｂ）配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にハイブリッド形成するように構成された少なくとも１つの逆方向増幅プライマーを含む。
【０１７３】
反応混合物の特定の態様において、順方向増幅プライマーは少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１７４】
反応混合物の特定の態様において、順方向増幅プライマーは２〜６個の修飾核酸塩基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、順方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、２個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、順方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【０１７５】
反応混合物の特定の態様において、逆方向増幅プライマーは少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５’−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１７６】
特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の修飾核酸残基を含む。２〜６個の修飾核酸塩基は同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の５−メチルシトシン残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の５−メチルシトシン残基を含む。特定の態様において、逆方向増幅プライマーは、２〜６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、２つの２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、３個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、４個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、５個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。いくつかの実施形態において、逆方向増幅プライマーは、６個の２’−Ｏ−メチル残基を含む。
【０１７７】
特定の態様において、反応混合物は、試料中のＶＺＶ核酸配列（存在する場合）の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域内で増幅される標的核酸配列に特異的にアニーリングするように構成される第３のオリゴマーを含む。特定の態様において、第３のオリゴマーは、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴマーは、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成配列にハイブリッド形成する。特定の態様において、第３のオリゴマーは検出プローブである。
【０１７８】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、長さ約２３〜約２７ヌクレオチドの検出プローブを含む。
【０１７９】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される検出プローブを含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１３の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブは配列番号１４の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、検出プローブオリゴマーは、配列番号１５の配列を含む。
【０１８０】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む検出プローブを含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７である場合は配列番号８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７である場合は配列番号９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３および配列番号１８である場合は配列番号１０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号４および配列番号１９である場合は配列番号１２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号５および配列番号２０である場合は配列番号１３、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号６および配列番号２１である場合は配列番号１４、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号７および配列番号２２である場合は配列番号１５。
【０１８１】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３８であり、反応混合物は、下記のうちの１つ以上を含む。（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号３および配列番号１８から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号１０の配列を含む検出プローブ、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号４および配列番号１９から、少なくとも約９３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号１１または配列番号１２の配列を含む検出プローブ、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２および配列番号１７から、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号９の配列を含む検出プローブ、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号７および配列番号２２から、少なくとも約１０２ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号１５の配列を含む検出プローブ、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号６および配列番号２１から、少なくとも約１１９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号１４の配列を含む検出プローブ、（ｆ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１７から、少なくとも約１２３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号８または配列番号９の配列を含む検出プローブ、（ｇ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号１および配列番号１６から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号８もしくは配列番号９の配列を含む検出プローブ、または順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号５および配列番号２０から、少なくとも約１２７ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号１３の配列を含む検出プローブ。
【０１８２】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、長さ約２２〜約２７ヌクレオチドの検出プローブを含む。
【０１８３】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択される検出プローブを含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２８の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号２９の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３０の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３１の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３２の配列を含む。特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、検出プローブは配列番号３３の配列を含む。
【０１８４】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、下記のオリゴハイブリッド形成配列に実質的に対応する標的核酸配列を含む検出プローブを含む。順方向および逆方向の増幅プライマーが、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４である場合は配列番号２８、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号２９、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２５および配列番号３５である場合は配列番号３０、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２６および配列番号３６である場合は配列番号３１、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３２、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号２７および配列番号３７である場合は配列番号３３。
【０１８５】
特定の態様において、標的核酸領域は配列番号３９であり、反応混合物は、下記のうちの１つ以上を含む。（ａ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２５および配列番号３５から、少なくとも約８９ヌクレオチドの長さ標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号２９または配列番号３０の配列を含む第３のオリゴマー、（ｂ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２４および配列番号３４から、少なくとも約９９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号２８の配列を含む第３のオリゴマー、（ｃ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２３および配列番号３４から、少なくとも約１０９ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号２８の配列を含む第３のオリゴマー、（ｄ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２７および配列番号３７から、少なくとも約１２６ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号３２または配列番号３３の配列を含む第３のオリゴマー、（ｅ）順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーが、標的核酸領域上の配列番号２６および配列番号３６から、少なくとも約１４３ヌクレオチドの長さの標的核酸配列のアンプリコンを生成するように構成される場合、配列番号３１の配列を含む第３のオリゴマー。
【０１８６】
特定の態様において、試料中のＶＺＶの存在（または不在）を決定するための反応混合物は、配列番号３８または配列番号３９の標的核酸領域内のオリゴハイブリッド形成配列に特異的にアニーリングするように構成された少なくとも１つの検出プローブを含み、検出プローブは順方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーとの間に隣接している。
【０１８７】
反応混合物の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、検出プローブは、第１の標識と相互作用する第２の標識をさらに含む。いくつかの態様において、第２の標識は消光剤である。
【０１８８】
反応混合物の特定の態様において、標識は、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の態様において、反応混合物は蛍光標識を含む。特定の態様において、反応混合物は消光剤を含む。特定の態様において、反応混合物は、蛍光色素および消光剤の両方を含む。
【０１８９】
反応混合物の特定の態様において、検出プローブは線形であり、分子内結合によって保持されるいかなる程度の自己相補性も示さない。いくつかの実施形態において、線形検出プローブは、標識としてフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、線形検出プローブは、フルオロフォアおよび消光部分（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）の両方を含む。
【０１９０】
反応混合物の特定の態様において、検出プローブは、少なくともある程度の自己相補性を示し、検出前にまずハイブリッド形成していないプローブの除去を必要とせずに、試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために使用される。反応混合物の特定の態様において、少なくともある程度の自己相補性を示すヘアピン検出プローブは、分子ビーコンまたは分子トーチである。
【０１９１】
反応混合物の特定の態様において、標識された検出プローブは伸長不可能である。例えば、標識された検出プローブは、３’−末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシ−ヌクレオチド）を有するか、３’末端−反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、それが３’から３’へのホスホジエステル結合もしくはその類似体（ホスホロチオエートなど）によって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有するか、または結合したフルオロフォア、消光剤、もしくは伸長を妨害する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’−リン酸化によって伸長不能にすることができる。特定の態様において、３’末端ヌクレオチドはメチル化されていない。
【０１９２】
反応混合物の特定の態様において、検出プローブは、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１９３】
特定の態様において、反応混合物は、本明細書に記載されるように、少なくとも１つの増幅プライマーまたは検出プローブを含む。特定の態様において、反応混合物は、複数の増幅プライマー、および／または検出プローブを含む。特定の態様において、反応混合物は、標的核酸領域から標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する単一セットの順方向および逆方向の増幅プライマーを含む。特定の態様において、反応混合物は、種々の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する複数セットの増幅プライマーを含む。特定の態様において、反応混合物は、単一の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する複数セットの増幅プライマーを含む。
【０１９４】
特定の態様において、反応混合物は、試料中のＶＺＶの存在を決定するための追加の試薬、および存在する場合、試料中のＶＺＶ核酸配列の標的核酸配列の増幅を含む。特定の態様において、反応混合物は、種々のｄＮＴＰ、酵素、緩衝液、および／または塩などのインビトロ増幅を実施するのに適した試薬を含み得る。
【０１９５】
特定の態様において、反応混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰなどのＤＮＡの種々の各ヌクレオチドサブユニットを含み得る。特定の態様において、反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素または逆転写酵素を含み得る。特定の態様において、反応混合物は、有機緩衝液を含み得る。特定の態様において、反応混合物は、１種以上の界面活性剤を含み得る。
【０１９６】
特定の態様において、反応混合物は、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウムを含む群から選択される１種以上の無機塩を含み得る。特定の態様において、反応混合物は、塩化マグネシウムを含み得る。特定の態様において、反応混合物は、３ｍＭ〜６ｍＭの濃度で塩化マグネシウムを含み得る。特定の態様において、塩化マグネシウムの濃度は２ｍＭである。特定の態様において、塩化マグネシウムの濃度は４ｍＭである。特定の態様において、塩化マグネシウムの濃度は６ｍＭである。
【０１９７】
特定の態様において、反応混合物は、水性反応混合物であり得る。特定の態様において、反応混合物は凍結され得る。特定の態様において、反応混合物は凍結乾燥され得る。特定の態様において、凍結乾燥された反応混合物は、粉末または固形または球体として現れ得る。特定の態様において、凍結乾燥された反応混合物は、例えば、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせなどの充填剤を含み得る。
【０１９８】
例示的な組成物、キット、反応混合物、製剤および方法は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【０１９９】
例示的な組成物、キット、反応混合物、製剤および方法は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【０２００】
実施形態のリスト
１．ＶＺＶの標的核酸領域内の標的核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチド組成物、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するためのオリゴヌクレオチド組成物であって、少なくとも２つの増幅プライマーを含み、第１の増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、第２の増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、オリゴヌクレオチド組成物。
【０２０１】
２．標的核酸領域が、配列番号３８または配列番号３９である、実施形態１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０２】
３．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、互いに独立して、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１または２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０３】
４．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向増幅プライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、２つの増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０４】
５．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０５】
６．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０６】
７．順方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３８に沿って、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３または１２７ヌクレオチドの長さである、実施形態４または実施形態６のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０７】
８．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、または（ｈ）配列番号７および配列番号２２に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０８】
９．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、互いに独立して、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１または２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２０９】
１０．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向増幅プライマーが、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、２つの増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１または２または９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１０】
１１．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される、実施形態１０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１１】
１２．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６、および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１または２または９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１２】
１３．順方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３９に沿って、８９、９９、１０９、１２６および１４３ヌクレオチドの長さである、実施形態１０または１２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１３】
１４．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、または（ｅ）配列番号２７および配列番号３７に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１もしくは２または実施形態９〜１３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１４】
１５．第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１５】
１６．第３のオリゴヌクレオチドが、検出プローブである、実施形態１５のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１６】
１７．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態２〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１７】
１８．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される、実施形態１７のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１８】
１９．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７を丁重に含み、（ｂ）配列番号９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７を丁重に含み、（ｃ）配列番号１０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３および配列番号１８を丁重に含み、（ｄ）配列番号１１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｅ）配列番号１２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｆ）配列番号１３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号５および配列番号２０を丁重に含み、（ｇ）配列番号１４ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号６および配列番号２１を丁重に含み、または（ｈ）配列番号１５ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号７および配列番号２２を丁重に含む、実施形態１７のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２１９】
２０．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態２または実施形態９〜１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２０】
２１．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、配列番号２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択される、実施形態２０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２１】
２２．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号２８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４を丁重に含み、（ｂ）配列番号２９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｃ）配列番号３０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｄ）配列番号３１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２６および配列番号３６を丁重に含み、（ｅ）配列番号３２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含み、または（ｆ）配列番号３３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含む、実施形態２０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２２】
２３．検出プローブが、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、実施形態１５〜２２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２３】
２４．検出可能な標識のうちの１つ以上が、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２３のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２４】
２５．検出可能な標識のうちの１つ以上が、蛍光標識を含むか、または検出可能な標識のうちの１つ以上が消光剤を含むか、または検出可能な標識のうちの１つ以上が蛍光標識および消光剤の両方を含む、実施形態２４のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２５】
２６．検出プローブが、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブである、実施形態１５〜２５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２６】
２７．検出プローブが、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み、または非標的ハイブリッド形成配列を含む検出プローブが、ヘアピン検出プローブであり、またはヘアピン検出プローブが、分子ビーコンもしくは分子トーチである、実施形態１５〜２５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２７】
２８．検出プローブが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１５〜２７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２８】
２９．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２８のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２２９】
３０．検出プローブが、３〜１０個の修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３〜１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または検出プローブが、３〜１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態２８または２９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３０】
３１．順方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３１】
３２．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態３１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３２】
３３．順方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態３１または３２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３３】
３４．逆方向増幅プライマーが少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３４】
３５．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態３４のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３５】
３６．逆方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、１個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−フッ素修飾核酸塩基であり、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、１個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基である、実施形態３４または３５のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３６】
３７．ＶＺＶの標的核酸領域内の標的核酸配列を検出するためのオリゴヌクレオチド組成物、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するためのオリゴヌクレオチド組成物であって、標的核酸配列を検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３７】
３８．標的核酸領域が、配列番号３８または配列番号３９である、実施形態３７のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３８】
３９．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態３８のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２３９】
４０．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される、実施形態３９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４０】
４１．少なくとも１つのセットの増幅プライマーをさらに含み、１つの増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、１つの増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態３９または４０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４１】
４２．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、それぞれ個別に、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態４１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４２】
４３．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向増幅プライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される、実施形態４２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４３】
４４．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される、実施形態４２または４３のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４４】
４５．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態４１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４５】
４６．順方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３８に沿って、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３または１２７ヌクレオチドの長さである、実施形態４３または４５のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４６】
４７．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、または（ｈ）配列番号７および配列番号２２に対応する標的核酸配列を含む、実施形態４１〜４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４７】
４８．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７を丁重に含み、（ｂ）配列番号９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７を丁重に含み、（ｃ）配列番号１０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３および配列番号１８を丁重に含み、（ｄ）配列番号１１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｅ）配列番号１２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｆ）配列番号１３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号５および配列番号２０を丁重に含み、（ｇ）配列番号１４ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号６および配列番号２１を丁重に含み、（ｈ）配列番号１５ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号７および配列番号２２を丁重に含む、実施形態３９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４８】
４９．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態３８のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２４９】
５０．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、配列番号２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択される、実施形態４９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５０】
５１．少なくとも１つのセットの増幅プライマーをさらに含み、１つの増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、１つの増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態４９または５０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５１】
５２．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、それぞれ個別に、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態５１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５２】
５３．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向増幅プライマーが、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される、実施形態５２のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５３】
５４．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される、実施形態５２または５３のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５４】
５５．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６、および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態５１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５５】
５６．順方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３９に沿って、８９、９９、１０９、１２６または１４３ヌクレオチドの長さである、実施形態５３または５５のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５６】
５７．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、または（ｅ）配列番号２７および配列番号３７に対応する標的核酸配列を含む、実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５７】
５８．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号２８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４を丁重に含み、（ｂ）配列番号２９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｃ）配列番号３０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｄ）配列番号３１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２６および配列番号３６を丁重に含み、（ｅ）配列番号３２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含み、（ｆ）配列番号３３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含む、実施形態４９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５８】
５９．検出プローブが、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、実施形態３７または３８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２５９】
６０．検出可能な標識のうちの１つ以上が、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５９のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６０】
６１．１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識を含むか、または１つ以上の検出可能な標識が、消光剤を含むか、または１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識と消光剤の両方を含む、実施形態６０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６１】
６２．検出プローブが、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブである、実施形態３７〜６１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６２】
６３．検出プローブが、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み、または非標的ハイブリッド形成配列を含む検出プローブが、ヘアピン検出プローブであり、またはヘアピン検出プローブが、分子ビーコンもしくは分子トーチである、実施形態３７〜６１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６３】
６４．検出プローブが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態３７〜６３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６４】
６５．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６４のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６５】
６６．検出プローブが、３〜１０個の修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３〜１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または検出プローブが、３〜１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態６４または６５のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６６】
６７．順方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態４１〜６６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６７】
６８．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態６７のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６８】
６９．順方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態６７または６８のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２６９】
７０．逆方向増幅プライマーが少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態４１〜６９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２７０】
７１．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態７０のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２７１】
７２．逆方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または少なくとも２個の修飾が、２’−フッ素修飾核酸塩基であり、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基である、実施形態７０または７１のオリゴヌクレオチド組成物。
【０２７２】
７３．試料中のＶＺＶの存在を検出し、存在する場合は、ＶＺＶの標的核酸配列を増幅するための組成物を含むキットであって、一般に、標的核酸配列を検出するための１種以上のオリゴヌクレオチド、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するための１種以上のオリゴヌクレオチド、ならびに標的核酸配列を増幅するための１種以上のオリゴヌクレオチド、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するための１種以上のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【０２７３】
７４．実施形態１〜３６のいずれか１つと同様に少なくとも２つの増幅プライマーをさらに含み、第１の増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、第２の増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態７３のキット。
【０２７４】
７５．キットが、ＶＺＶ核酸配列が試料中に存在する場合、標的核酸配列からのインビトロ増幅およびアンプリコンの生成を実施するための様々な試薬、ならびに標的核酸配列を増幅するための様々な既知の技術のいずれかを使用して、試験試料においてハイブリッド形成条件下でプローブ：標的ハイブリッドが形成されたか否かを決定するためのガイダンスをさらに含む、実施形態７４のキット。
【０２７５】
７６．キットが、緩衝液、塩、種々のｄＮＴＰ、または酵素などのインビトロ増幅を実施するのに適した種々の試薬を含み得る、実施形態７５のキット。
【０２７６】
７７．キットが、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの種々の塩を含み得る、実施形態７６のキット。
【０２７７】
７８．キットが、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、またはアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、およびウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）などの種々のｄＮＴＰを含み得る、実施形態７６のキット。
【０２７８】
７９．キットが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡポリメラーゼなどの種々の酵素を含み得る、実施形態７６のキット。
【０２７９】
８０．増幅プライマーが、水性であるか、凍結または凍結乾燥され得る、実施形態７６のキット。
【０２８０】
８１．本明細書に記載されるような種々の試薬が、様々な異なる実施形態で包装され得る、実施形態７６のキット。
【０２８１】
８２．キットに含まれる増幅プライマーが、標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する順方向および逆方向の増幅プライマーの単一セットを含み、またはキットが、種々の標的核酸領域にわたる種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み、またはキットが、単一の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み得る、実施形態７４のキット。
【０２８２】
８３．キットが、従来のエンドポイントＰＣＲ増幅を使用して標的領域の標的核酸配列を増幅し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて追加のｄｓＤＮＡ分子を生成するための指示ガイダンスを含む、実施形態７４のキット。
【０２８３】
８４．キットが、従来のエンドポイントＰＣＲ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含み、またはキットが、リアルタイムＰＣＲ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含み、またはキットが、ＬＣＲ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含み、またはキットが、ＳＤＡ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含み、またはキットが、ＴＭＡ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含み、またはキットが、ＮＡＳＢＡ増幅法を実施するのに適した種々の試薬を含む、実施形態８３のキット。
【０２８４】
８５．標的核酸配列を検出するため、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するため、実施形態３７〜７２のいずれかと同様の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態７３のキット。
【０２８５】
８６．キットが、ＶＺＶ核酸配列が試料中に存在する場合、標的核酸配列のインビトロ検出、または標的核酸配列から生成するアンプリコンの検出を実施するための種々の試薬、ならびに標的核酸配列を増幅するための様々な既知の技術のいずれかを使用して、試験試料において、ハイブリッド形成条件下でプローブ：標的ハイブリッドが形成されたか否かを決定するためのガイダンスをさらに含む、実施形態８５のキット。
【０２８６】
８７．キットが、緩衝液、塩、種々のｄＮＴＰ、または酵素などのインビトロ増幅を実施するのに適した種々の試薬を含み得る、実施形態８６のキット。
【０２８７】
８８．キットが、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの種々の塩を含み得る、実施形態８７のキット。
【０２８８】
８９．キットが、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、またはアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、およびウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）などの種々のｄＮＴＰを含み得る、実施形態８７のキット。
【０２８９】
９０．キットが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡポリメラーゼなどの種々の酵素を含み得る、実施形態８７のキット。
【０２９０】
９１．検出プローブが、水性であるか、凍結または凍結乾燥され得る、実施形態８７のキット。
【０２９１】
９２．本明細書に記載されるような種々の試薬が、様々な異なる実施形態で包装され得る、実施形態８７のキット。
【０２９２】
９３．キットに含まれるオリゴヌクレオチドが、エンドユーザーの実験室で開発された試験の特定要件に応じて、種々の増幅オリゴヌクレオチドと対形成することが意図される、実施形態８７のキット。
【０２９３】
９４．キットが、リアルタイムＰＣＲを実施するのに適した種々の試薬を含む、実施形態８６のキット。
【０２９４】
９５．キットが、リアルタイムＰＣＲを使用して１つ以上の検出プローブで標的核酸配列を検出するための説明書を含み、検出プローブが、増幅産物にハイブリッド形成してシグナルを生成する、実施形態９４のキット。
【０２９５】
９６．キットが、リアルタイムＰＣＲを使用して１つ以上の検出プローブで標的核酸配列を検出するための説明書を含み、検出プローブが、検出可能な標識で標識される、実施形態９４のキット。
【０２９６】
９７．キットが、リアルタイムＰＣＲを使用して１つ以上の検出プローブで標的核酸配列を検出するための説明書を含み、検出プローブが、非標識であり、別の結合相手をプローブ上の部分に結合させることによって間接的に検出され得る、実施形態９４のキット。
【０２９７】
９８．キットが、リアルタイムＰＣＲを使用して１つ以上の検出プローブで標的核酸配列を検出するための説明書を含み、検出プローブが、検出可能な標識で標識され、標識されたプローブが、消光剤などの第２の部分を含む、実施形態９６のキット。
【０２９８】
９９．キットが、従来のエンドポイントＰＣＲを使用して１つ以上の検出プローブで標的核酸配列を検出するための説明書を含み、検出プローブが、増幅産物にハイブリッド形成してシグナルを生成する、実施形態８６のキット。
【０２９９】
１００．エンドポイント検出がアガロースゲル電気泳動を使用して遂行される、実施形態９９のキット。
【０３００】
１０１．キットが、必要に応じて、ＩＣ配列に特異的な増幅および検出プローブを使用することによって、同じアッセイ反応混合物で増幅および検出される非ＶＺＶ内部標準核酸を含み得る、実施形態７３のキット。
【０３０１】
１０２．キットが、増幅前の試料調製、または標的核酸配列にハイブリッド形成するための捕捉オリゴマーの使用、およびプローブ：標的二本鎖で見出される非標的材料を洗浄するための常套法などに関する追加のガイダンスを含み得る、実施形態７３のキット。
【０３０２】
１０３．標的捕捉の常套法に関する追加の説明書が、試料にＶＺＶ核酸配列が存在する場合、その標的核酸配列を含む細胞内内容物を放出するために、試料を溶解するためのガイダンスを含み得る、実施形態１０２のキット。
【０３０３】
１０４．標的捕捉の常套法に関する追加の説明書が、試料中に見出される標的核酸配列の特異的または非特異的な標的捕捉のためのガイダンスを含み得る、実施形態１０３のキット。
【０３０４】
１０５．ガイダンスが、プローブ：標的二本鎖を形成することにより検出を可能にする厳密なハイブリッド形成条件下で、標的核酸配列またはその相補体に優先的にハイブリッド形成する非特異的捕捉プローブを推奨し得る、実施形態１０４のキット。
【０３０５】
１０６．ガイダンスが、実質的に水性の混合物に対して非特異的な捕捉プローブを優先し得る、実施形態１０２〜１０５のいずれか１つに記載のキット。
【０３０６】
１０７．ガイダンスが、非特異的捕捉プローブに結合した可能性のある全ての非標的核酸成分を除去するために、プローブ：標的二本鎖の洗浄を推奨し得る、実施形態１０２〜１０６のいずれか１つに記載のキット。
【０３０７】
１０８．ガイダンスが、プローブ：標的二本鎖を複数回洗浄することを推奨し得る、実施形態１０７のキット。
【０３０８】
１０９．ガイダンスが、試料から標的核酸配列を物理的に分離する他の手段を推奨し得る、実施形態１０２〜１０８のいずれか１つに記載のキット。
【０３０９】
１１０．常磁性ビーズを使用して、結合した標的核酸配列を回収することができる、実施形態１０９のキット。
【０３１０】
１１１．ＶＺＶの標的核酸配列を増幅または検出するための方法であって、一般に、標的核酸配列を検出するための１種以上のオリゴヌクレオチドを使用すること、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出すること、および標的核酸配列を増幅するために、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するために、１種以上のオリゴヌクレオチドを使用することを含む、方法。
【０３１１】
１１２．標的核酸配列を増幅するため、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するための実施形態１１１の方法であって、試料を入手するステップ、試料を少なくとも２つの増幅プライマーと接触させるステップ（第１の増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、第２の増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである）、標的核酸配列からアンプリコンを生成するための条件を提供するステップ、および試料中にＶＺＶが存在するか否かを決定するステップを含む、方法。
【０３１２】
１１３．標的核酸領域が、配列番号３８または配列番号３９である、実施形態１１２の方法。
【０３１３】
１１４．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、互いに独立して、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２または１１３の方法。
【０３１４】
１１５．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向増幅プライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、２つの増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１５】
１１６．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される、実施形態１１２〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３１６】
１１７．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
１１８．順方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３８に沿って、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３または１２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１１５〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３１８】
１１９．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、または（ｈ）配列番号７および配列番号２２に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１１２〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
１２０．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、互いに独立して、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２または１１３の方法。
【０３２０】
１２１．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向増幅プライマーが、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択され、逆方向増幅プライマーが、約２０〜約２２ヌクレオチドの長さであり、２つの増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２または１１３または１２０の方法。
【０３２１】
１２２．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される、実施形態１２１の方法。
【０３２２】
１２３．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６、および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１１２または１１３または１２０の方法。
【０３２３】
１２４．順方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３９に沿って、８９、９９、１０９、１２６または１４３ヌクレオチドの長さである、実施形態１２１または１２３の方法。
【０３２４】
１２５．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、または（ｅ）配列番号２７および配列番号３７に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１１２もしくは１１３または実施形態１２０〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０３２５】
１２６．第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１２〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０３２６】
１２７．第３のオリゴヌクレオチドが、検出プローブである、実施形態１２６の方法。
【０３２７】
１２８．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１１３〜１１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３２８】
１２９．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される、実施形態１２８の方法。
【０３２９】
１３０．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７を丁重に含み、（ｂ）配列番号９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７を丁重に含み、（ｃ）配列番号１０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３および配列番号１８を丁重に含み、（ｄ）配列番号１１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｅ）配列番号１２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｆ）配列番号１３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号５および配列番号２０を丁重に含み、（ｇ）配列番号１４ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号６および配列番号２１を丁重に含み、または（ｈ）配列番号１５ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号７および配列番号２２を丁重に含む、実施形態１２８の方法。
【０３３０】
１３１．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１１３または実施形態１２０〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０３３１】
１３２．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、配列番号２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択される、実施形態１３１の方法。
【０３３２】
１３３．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号２８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４を丁重に含み、（ｂ）配列番号２９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｃ）配列番号３０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｄ）配列番号３１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２６および配列番号３６を丁重に含み、（ｅ）配列番号３２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含み、または（ｆ）配列番号３３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含む、実施形態１３１の方法。
【０３３３】
１３４．検出プローブが、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、実施形態１２６〜１３３のいずれか１つに記載の方法。
【０３３４】
１３５．検出可能な標識のうちの１つ以上が、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１３４の方法。
【０３３５】
１３６．１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識を含むか、または１つ以上の検出可能な標識が、消光剤を含むか、または１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識と消光剤の両方を含む、実施形態１３５の方法。
【０３３６】
１３７．検出プローブが、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブである、実施形態１２６〜１３６のいずれか１つに記載の方法。
【０３３７】
１３８．検出プローブが、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み、または非標的ハイブリッド形成配列を含む検出プローブが、ヘアピン検出プローブであり、またはヘアピン検出プローブが、分子ビーコンもしくは分子トーチである、実施形態１２６〜１３６のいずれか１つに記載の方法。
【０３３８】
１３９．検出プローブが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１２６〜１３８のいずれか１つに記載の方法。
【０３３９】
１４０．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１３９の方法。
【０３４０】
１４１．検出プローブが、３〜１０個の修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３〜１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または検出プローブが、３〜１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態１３９または１４０の方法。
【０３４１】
１４２．順方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１１２〜１４１のいずれか１つに記載の方法。
【０３４２】
１４３．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１４２の方法。
【０３４３】
１４４．順方向増幅プライマーが、１〜６個の修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、１〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、１個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、５個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または順方向増幅プライマーが、１〜６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、１個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、５個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態１４２または１４３の方法。
【０３４４】
１４５．逆方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１１２〜１４４のいずれか１つに記載の方法。
【０３４５】
１４６．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５’−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１４５の方法。
【０３４６】
１４７．逆方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または少なくとも２個の修飾が、２’−フッ素修飾核酸塩基であり、または逆方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基である、実施形態１４５または１４６の方法。
【０３４７】
１４８．標的核酸配列を検出するため、または標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するための実施形態１１１の方法であって、試料を入手するステップ、標的核酸配列を検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと試料とを接触させるステップ、標的核酸配列の存在を検出するための条件を提供するステップ、および試料中にＶＺＶが存在するか否かを決定するステップを含む、方法。
【０３４８】
１４９．標的核酸領域が、配列番号３８または配列番号３９である、実施形態１４８の方法。
【０３４９】
１５０．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、約２３〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１４９の方法。
【０３５０】
１５１．標的核酸領域が、配列番号３８であり、検出プローブが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択される、実施形態１５０の方法。
【０３５１】
１５２．少なくとも１つのセットの増幅プライマーをさらに含み、１つの増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、１つの増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態１５０または１５１の方法。
【０３５２】
１５３．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、それぞれ個別に、約１９〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１５２の方法。
【０３５３】
１５４．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向増幅プライマーが、配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択される、実施形態１５３の方法。
【０３５４】
１５５．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択される、実施形態１５３または１５４の方法。
【０３５５】
１５６．標的核酸領域が、配列番号３８であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３８の標的核酸領域から約８９〜約１２７ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１５５の方法。
【０３５６】
１５７．順方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３８内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３８に沿って、８９、９３、１００、１０２、１１９、１２３または１２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１５４または１５６の方法。
【０３５７】
１５８．標的核酸領域が、配列番号３８であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号１および配列番号１６、（ｂ）配列番号１および配列番号１７、（ｃ）配列番号２および配列番号１７、（ｄ）配列番号３および配列番号１８、（ｅ）配列番号４および配列番号１９、（ｆ）配列番号５および配列番号２０、（ｇ）配列番号６および配列番号２１、または（ｈ）配列番号７および配列番号２２に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１５２〜１５７のいずれか１つに記載の方法。
【０３５８】
１５９．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７を丁重に含み、（ｂ）配列番号９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号１および配列番号１６または（ＩＩ）配列番号１および配列番号１７または（ＩＩＩ）配列番号２および配列番号１７を丁重に含み、（ｃ）配列番号１０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号３および配列番号１８を丁重に含み、（ｄ）配列番号１１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｅ）配列番号１２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号４および配列番号１９を丁重に含み、（ｆ）配列番号１３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号５および配列番号２０を丁重に含み、（ｇ）配列番号１４ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号６および配列番号２１を丁重に含み、（ｈ）配列番号１５ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号７および配列番号２２を丁重に含む、実施形態１５０の方法。
【０３５９】
１６０．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、約２２〜約２７ヌクレオチドの長さである、実施形態１４９の方法。
【０３６０】
１６１．標的核酸領域が、配列番号３９であり、検出プローブが、配列番号２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群から選択される、実施形態１６０または１６１の方法。
【０３６１】
１６２．少なくとも１つのセットの増幅プライマーをさらに含み、１つの増幅プライマーが順方向増幅プライマーであり、１つの増幅プライマーが逆方向増幅プライマーである、実施形態１６１の方法。
【０３６２】
１６３．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、それぞれ個別に、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１６２の方法。
【０３６３】
１６４．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向増幅プライマーが、配列番号２３、２４、２５、２６および２７からなる群から選択される、実施形態１６３の方法。
【０３６４】
１６５．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６および３７からなる群から選択される、実施形態１６３または１６４の方法。
【０３６５】
１６６．標的核酸領域が、配列番号３９であり、逆方向増幅プライマーが、配列番号３４、３５、３６、および３７からなる群から選択され、順方向増幅プライマーが、約２０〜約２３ヌクレオチドの長さであり、逆方向および順方向の増幅プライマーが、配列番号３９の標的核酸領域から約８９〜約１４３ヌクレオチドの長さのアンプリコンを生成するように構成される、実施形態１６２の方法。
【０３６６】
１６７．順方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、逆方向増幅プライマーが、配列番号３９内のオリゴハイブリッド形成領域またはその相補体にハイブリッド形成するように構成され、第１の増幅プライマーのオリゴハイブリッド形成領域と第２の増幅領域のオリゴハイブリッド形成領域との距離が、２つのオリゴハイブリッド形成領域の最も離れたヌクレオチドから測定した場合に配列番号３９に沿って、８９、９９、１０９、１２６または１４３ヌクレオチドの長さである、実施形態１６４または１６６の方法。
【０３６７】
１６８．標的核酸領域が、配列番号３９であり、順方向および逆方向の増幅プライマーが、（ａ）配列番号２３および配列番号３４、（ｂ）配列番号２４および配列番号３４、（ｃ）配列番号２５および配列番号３５、（ｄ）配列番号２６および配列番号３６、または（ｅ）配列番号２７および配列番号３７に対応する標的核酸配列を含む、実施形態１６２〜１６７のいずれか１つに記載の方法。
【０３６８】
１６９．検出プローブが、下記の標的ハイブリッド形成配列を含む場合、（ａ）配列番号２８ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、（Ｉ）配列番号２３および配列番号３４または（ＩＩ）配列番号２４および配列番号３４を丁重に含み、（ｂ）配列番号２９ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｃ）配列番号３０ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２５および配列番号３５を丁重に含み、（ｄ）配列番号３１ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２６および配列番号３６を丁重に含み、（ｅ）配列番号３２ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含み、（ｆ）配列番号３３ならば、順方向および逆方向の増幅プライマーは、配列番号２７および配列番号３７を丁重に含む、実施形態１６０の方法。
【０３６９】
１７０．検出プローブが、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、実施形態１４８または１４９の方法。
【０３７０】
１７１．検出可能な標識のうちの１つ以上が、（ａ）化学発光標識、（ｂ）蛍光標識、（ｃ）消光剤、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１７０の方法。
【０３７１】
１７２．１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識を含み、または１つ以上の検出可能な標識が、消光剤を含み、または１つ以上の検出可能な標識が、蛍光標識と消光剤の両方を含む、実施形態１７１の方法。
【０３７２】
１７３．検出プローブが、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブである、実施形態１４８〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
【０３７３】
１７４．検出プローブが、非標的ハイブリッド形成配列をさらに含み、または非標的ハイブリッド形成配列を含む検出プローブが、ヘアピン検出プローブであり、またはヘアピン検出プローブが、分子ビーコンもしくは分子トーチである、実施形態１４８〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
【０３７４】
１７５．検出プローブが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１４８〜１７４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７５】
１７６．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１７５の方法。
【０３７６】
１７７．検出プローブが、３〜１０個の修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３〜１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または検出プローブが、３〜１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、７個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または検出プローブが、１０個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態１７５または１７６の方法。
【０３７７】
１７８．順方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１５２〜１７７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７８】
１７９．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１７８の方法。
【０３７９】
１８０．順方向増幅プライマーが、２〜６個の修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１つの修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基であり、または順方向増幅プライマーが、２〜６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、２個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、３個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、４個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または順方向増幅プライマーが、６個の２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基である、実施形態１７８または１７９の方法。
【０３８０】
１８１．逆方向増幅プライマーが、少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む、実施形態１５２〜１８０のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
１８２．修飾核酸塩基のうちの１つ以上が、（ａ）２’−Ｏ−メチル、（ｂ）５−メチルシトシン、（ｃ）２’−フッ素、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１８１の方法。
【０３８２】
１８３．逆方向増幅プライマーが、１〜６個の修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、１〜６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、１個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の２’−フッ素修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、２’−フッ素修飾核酸塩基であり、または逆方向増幅プライマーが、１〜６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、１個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、２個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、３個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、４個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、５個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または逆方向増幅プライマーが、６個の５−メチルシトシン修飾核酸塩基を含み、または少なくとも１個の修飾が、５−メチルシトシン修飾核酸塩基である、実施形態１８１または１８２の方法。
【０３８３】
１８４．ＶＺＶの標的核酸配列を増幅するための製剤であって、一般に、標的核酸配列を検出するためもしくは標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するための１つ以上のオリゴヌクレオチド、または標的核酸配列を増幅するためもしくは標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するための１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、製剤。
【０３８４】
１８５．増幅プライマー製剤および検出プローブ製剤が、２つの別個の製品である、実施形態１８４の製剤。
【０３８５】
１８６．実施形態１〜３６のいずれか１つと同様に少なくとも２つの増幅プライマーをさらに含み、第１の増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、第２の増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態１８４の製剤。
【０３８６】
１８７．キットに含まれる増幅プライマーが、標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する順方向および逆方向の増幅プライマーの単一セットを含み、またはキットが、種々の標的核酸領域にわたる種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み、またはキットが、単一の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み得る、実施形態１８６の製剤。
【０３８７】
１８８．製剤が、試料中のＶＺＶ核酸配列の存在を決定するための追加の試薬も含み得る、実施形態１８４の製剤。
【０３８８】
１８９．標的核酸配列を検出するため、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するため、実施形態３７〜７２のいずれかと同様の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態１８８の製剤。
【０３８９】
１９０．試料中にＶＺＶ核酸配列の標的核酸配列が存在する場合、製剤が、該配列を増幅するための追加の試薬も含み得る、実施形態１８４または１８９のいずれか１つに記載の製剤。
【０３９０】
１９１．製剤が、種々のｄＮＴＰ、酵素、緩衝液、または塩などのインビトロ増幅を実施するのに適した試薬を含み得る、実施形態１８４の製剤。
【０３９１】
１９２．製剤が、ＤＮＡの種々の各ヌクレオチドサブユニット、例えば、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、またはアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、およびウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を含み得る、実施形態１９１の製剤。
【０３９２】
１９３．製剤がＤＮＡポリメラーゼ酵素を含み、または製剤が逆転写酵素を含み、または製剤が有機緩衝液を含み、または製剤が界面活性剤を含み、または製剤が無機塩を含み得る、実施形態１９１の製剤。
【０３９３】
１９４．製剤が、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウムを含む群から選択される無機塩を含み得る、実施形態１９１の製剤。
【０３９４】
１９５．分子生物学の当業者に周知の手順に従って、水性製剤を液体窒素に滴下し、凍結乾燥することができる、実施形態１９１の製剤。
【０３９５】
１９６．凍結乾燥された製剤が、粉末または固形または球体として現れ得る、実施形態１９５の製剤。
【０３９６】
１９７．製剤が凍結乾燥される場合、製剤は、例えば、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせなどの充填剤をさらに含み得る、実施形態１９６の製剤。
【０３９７】
１９８．ＶＺＶの標的核酸配列を増幅するための反応混合物であって、一般に、標的核酸配列を検出するためもしくは標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するための１つ以上のオリゴヌクレオチド、および標的核酸配列を増幅するためもしくは標的核酸配列から生成されたアンプリコンを増幅するための１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、反応混合物。
【０３９８】
１９９．実施形態１〜３６のいずれか１つと同様に少なくとも２つの増幅プライマーをさらに含み、第１の増幅プライマーが、順方向増幅プライマーであり、第２の増幅プライマーが、逆方向増幅プライマーである、実施形態１９８の反応混合物。
【０３９９】
２００．キットに含まれる増幅プライマーが、標的核酸配列の単一のアンプリコンを生成する順方向および逆方向の増幅プライマーの単一セットを含み、またはキットが、種々の標的核酸領域にわたる種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み、またはキットが、単一の標的核酸領域内の種々の標的核酸配列から複数のアンプリコンを生成する増幅プライマーの複数セットを含み得る、実施形態１９９のいずれか１つに記載の反応混合物。
【０４００】
２０１．反応混合物が、試料中のＶＺＶ核酸配列の存在を決定するための追加の試薬も含み得る、実施形態１９８の反応混合物。
【０４０１】
２０２．標的核酸配列を検出するため、または標的核酸領域内の標的核酸配列から生成されたアンプリコンを検出するため、実施形態３７〜７２のいずれかと同様の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態１９８の反応混合物。
【０４０２】
２０３．試料中にＶＺＶ核酸配列の標的核酸配列が存在する場合、反応混合物が、該配列を増幅するための追加の試薬も含み得る、実施形態１９８〜２０２のいずれか１つに記載の反応混合物。
【０４０３】
２０４．反応混合物が、種々のｄＮＴＰ、酵素、緩衝液、または塩などのインビトロ増幅を実施するのに適した試薬を含み得る、実施形態１９８の反応混合物。
【０４０４】
２０５．反応混合物が、ＤＮＡの種々の各ヌクレオチドサブユニット、例えば、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、またはアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、およびウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を含み得る、実施形態２０４の反応混合物。
【０４０５】
２０６．反応混合物がＤＮＡポリメラーゼ酵素を含み、または反応混合物が逆転写酵素を含み、または反応混合物が有機緩衝液を含み、または反応混合物が界面活性剤を含み、または反応混合物が無機塩を含み得る、実施形態２０４の反応混合物。
【０４０６】
２０７．反応混合物が、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウムを含む群から選択される無機塩を含み得る、実施形態２０４の反応混合物。
【０４０７】
２０８．反応混合物が、塩化マグネシウムを含み、または塩化マグネシウムの濃度が、３ｍＭ〜６ｍＭであり、または塩化マグネシウムの濃度が、２ｍＭであり、または塩化マグネシウムの濃度が、４ｍＭであり、または塩化マグネシウムの濃度が、６ｍＭである、実施形態２０７に記載の反応混合物。
【実施例】
【０４０８】
提示されたオリゴヌクレオチドは、ＶＺＶ核酸配列内の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域の増幅または検出に有用である。具体的には、プライマーおよびプローブを組み合わせて使用して、ＶＺＶの標的核酸領域内の標的核酸配列を増幅および検出することができる。いくつかの実施形態において、プライマーおよびプローブは、蛍光標識されたプローブと組み合わせて使用される。オリゴヌクレオチドは、臨床検体または考案された臨床検体中の標的核酸配列を増幅または検出するように機能し、試料に潜在的に見られる一般的な生物と交差反応せず、内部標準に干渉しない。
【０４０９】
以下の実施例は、開示された特定の実施形態を例示し、いかなる方法でも本開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０４１０】
実施例１−オリゴマー設計の検討事項
表１に示すように、インビトロでのＶＺＶ検出について、１８種の固有のプライマーとプローブの組み合わせ（ＰＰＲ）を評価した。全てのオリゴセットは、より広いＶＺＶ核酸配列内の配列番号３８および配列番号３９の標的核酸領域を網羅する。
【表１−１】
2022501073.tif 000002
【表１−２】
2022501073.tif 000003
【表１−３】
2022501073.tif 000004
【表１−４】
2022501073.tif 000005
【０４１１】
１８種の異なるプライマーとプローブの組み合わせが選択され、試験された（調製と同日）。試験直前まで、試料を４℃で保存した。ＶＺＶ培養液、Ｅｌｌｅｎ（カタログ番号０８１０１７１ＣＦ、Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ、ニューヨーク州バッファロー）をＳｐｅｃｉｍｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＭ）（カタログ番号５１２８−１２２０、ＱＩＡＧＥＮ（Ｄｉｇｅｎｅ）、メリーランド州ジャーマンタウン）で希釈した。１８検体チューブのそれぞれに、ＶＺＶ培養液（１００００  ｃｐ／ｒｘｎ）を含むＳＴＭ１０００ｕｌを加えた。１０００ｕｌのＳＴＭ（ＶＺＶなし）からなる陰性対照も並行して実行した。検出プローブには、融解温度（Ｔｍ）を上げるために５−メチル−２’−デオキシシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）などの非正準塩基の使用が含まれた。全てのＰＰＲ  ＰＣＲ反応は、表２に列挙されている熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。
【表２】
2022501073.tif 000006
【表３】
2022501073.tif 000007
【０４１２】
表１に報告されている１８種の異なるＰＰＲの組み合わせのそれぞれからの閾値サイクル（Ｃｔ）および陽性反応の数を表４に示す。全てのＰＰＲ  ＰＣＲ反応は、ＦＡＭチャネルでＨｏｌｏｇｉｃのＰＡＮＴＨＥＲ  ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）機器を使用して、表２に列挙する熱サイクル条件を使用して実行された。ＰＰＲ  ＰＣＲ反応は、自動化のためＰＡＮＴＨＥＲ  ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）機器で全面的に行われたため、プレートは使用しなかった。各ＰＰＲについて合計２つの試料抽出が処理された。１つの抽出には、溶出液から３つのＰＣＲ複製が含まれていた。他の抽出には、１つのＰＣＲ複製が含まれていた。したがって、各ＰＰＲについて、２つの試料抽出で４つのＰＣＲ複製が得られる。各ＰＰＲの総反応量は４００．０μｌであった。
【表４】
2022501073.tif 000008
【０４１３】
結果：Ｃｔは、相対蛍光単位シグナルが設定されたＲＦＵ閾値（測定された蛍光シグナルが統計的にベースラインシグナルよりも大きくなるポイントに関連する）を超えるサイクル数であり、これにより、増幅信号をバックグラウンドノイズと区別する。データに基づくと、いくつかの混合物は不十分な結果を示したが、プライマーとプローブの他の組み合わせは良好な結果を示し、標的核酸領域（配列番号３８および配列番号３９）のさらなる評価のために選択された。配列番号３８の場合、勾配（反応効率の対数線形位相測定）、反応の蛍光シグナルが閾値を超えるサイクル数、相対蛍光単位、および既知のミスマッチ（分析ソフトウェアを介して）を分析した後、ＰＰＲ混合物８が推進するための最良の候補であると決定された。異なる量の標的核酸配列を含む試料からのリアルタイムＰＣＲ結果を比較する場合、低いＣｔ値は大量のアンプリコン（標的核酸配列のコピー）を示す一方、高いＣｔ値は少量のアンプリコン産物を示す。ＰＰＲ混合物８は低いＣｔ値を示し、したがって、最高量のアンプリコンを示している。一般に、約２９サイクル未満のＣｔ値は、豊富なＰＣＲ産物を示す一方、約３８サイクル超のＣｔ値は、最小量のポリヌクレオチドを示す。ＰＰＲ混合物８は高いＲＦＵ値も有する．（ポリヌクレオチドアンプリコンの量が多い試料では、対応するＲＦＵ値が高くなる）。配列番号３９については、ＰＰＲ混合物１５が本明細書に記載されているのと同様の理由で選択された。しかしながら、１つの株は逆方向プライマーで１塩基対のミスマッチを示した。ＲＦＵはＰＰＲ混合物８ほど高くなかったが、勾配およびＣｔ値は良好であることがわかった。ＰＰＲ混合物１６は同様に理想的であることが証明された（低いＣｔおよび１つの株の逆方向プライマーで１塩基対のミスマッチを有する）が、ＰＰＲ混合物１６は１４３塩基対のより大きなアンプリコンを生成し、これはＰＰＲ混合物１５より大きかった。
【０４１４】
実施例２：異なるプライマーの下でのオリゴヌクレオチドの性能、プローブ、およびＭｇＣｌ２濃度
異なるアッセイ条件下で機能する配列番号３８のオリゴヌクレオチドの柔軟性を評価するため、種々の濃度のプライマー、プローブ、およびＭｇＣｌ２を組み合わせて試験した。３種の濃度のプライマー（０．４、０．７、および１．０μＭ）、３種の濃度のプローブ（０．２、０．５、および０．８μＭ）、および３種の濃度のＭｇＣｌ２（２、４、および６ｍＭ）を、１０００ｃｐ／ｒｘｎに希釈したＶＺＶプラスミド（Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州マールボロ）に対して試験し、表２に列挙する熱サイクル条件を使用してＰＰＲ混合物１〜１８に対して試験し、内部標準に対して試験した（表３）。ＲＦＵおよびＣｔのデータは、ＰＰＲが堅牢であり、Ｃｔ値に大きな問題を引き起こすことなく、オリゴ濃度および塩分濃度の変化に耐えることができることを示している。したがって、ＶＺＶオリゴヌクレオチドの組み合わせは、幅広いアッセイ条件で機能することができる。Ｃｔ値は、全ての試験条件およびＭｇＣｌ２濃度の範囲にわたって一貫している。ベースラインの蛍光（および最終的なＲＦＵ）は、予想どおり、プローブ濃度の影響を受ける。
【０４１５】
続いて、ＰＰＲ混合物８およびＰＰＲ混合物１５の両方を種々の濃度のＶＺＶ培養液で試験して、どのオリゴセットを用いて推進するかを決定した。結果を表５に示す。全てのＰＰＲ  ＰＣＲ反応は、表２に列挙される熱サイクル条件を使用して実行された。
【表５】
2022501073.tif 000009
【０４１６】
結果：Ｃｔ、反応性、ＲＦＵ、およびノイズに対するシグナル比に基づいて、配列番号３８のＰＰＲ混合物８がさらなる試験の最良候補として選択された。
【０４１７】
ＰＰＲ混合物８およびＰＰＲ混合物１５が最良のＰＰＲ候補であることをさらに確認するために、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（同様に類似の核酸配列を共有する単純ヘルペスウイルスの２つの株）に対する交差反応性により、２つのオリゴヌクレオチドセットがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のオフ標的配列と交差反応（例えば、アニーリング、増幅および検出）するか否かを決定する。
【表６】
2022501073.tif 000010
【０４１８】
結果：単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）（ＭａｃＩｎｔｙｒｅ株）および単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）（ＭＳ株）は両方ともＳＴＭ（高濃度）で希釈した。陽性対照は、１０００ｃｐ／ｒｘｎでＶＺＶ培養液を含むＳＴＭで構成された。陰性対照はＳＴＭ（ＶＺＶなし）で構成された。ＰＣＲ熱サイクル条件は、表２の条件と相関する。Ｙ軸の時間（サイクル数）に対してＹ軸の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化率をプロットする（−ΔＦ／ΔＴ）（例えば、融解曲線分析）ソフトウェアを使用して、データにより、経時的に測定可能な蛍光（ＲＦＵ）変化は示されなかった（例えば、ＰＣＲ産物（アンプリコン）の増加はなかった）。測定されたＲＦＵ（例えば、ＰＣＲによるｄｓＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への解離に関連するバックグラウンドノイズは、４５回のＰＣＲサイクルを通して一貫していた。本明細書に要約されたデータに基づいて、ＰＰＲ混合物８（配列番号３８用）が感度および特異性の評価に選択された。
【０４１９】
実施例３−分析感度、ウイルス感度
一般に、分子生物学の技術分野の当業者は、培養液中の宿主細胞の存在がインビボ条件をエミュレートするため、ウイルス感受性実験が臨床試料に最もよく似ていることを理解するであろう。本明細書に記載のようにＳＴＭで希釈された１つのＶＺＶ株（単離株Ａ）（カタログ番号０８１０１７２ＣＦ、Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ、ニューヨーク州バッファロー）をＰＰＲ混合物８との反応性について評価した。陰性対照（ＶＺＶなしのＳＴＭで構成される）を並行して実行した。３１．６ｃｐ／ｍｌおよび１０ｃｐ／ｍｌに希釈したＶＺＶの第２の株（不明）（カタログ番号２３−２７９−１６１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ）、マサチューセッツ州ウォルサム）を、ＰＢＳ／ＰＫ混合物（３ｍｇ／ｍｌの最終ＰＫ濃度）からなる陰性対照および陽性対照（ＳＴＭで１００ｃｐ／ｒｘｎに希釈されたＶＺＶプラスミドからなる）に対して同様に試験した。ＳＴＭ中のＶＺＶは１０〜１０００ｃｐ／ｒｘｎ（２７８〜２７７７８ｃｐ／ｍｌ）で評価した。血漿中のＶＺＶは、１０〜１０，０００ｃｐ／ｍｌ（０．４〜３６０ｃｐ／ｒｘｎ）で試験した。両菌株で、ＰＰＲ混合物８は、表２に列挙する熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。結果を表７および８に列挙する。
【表７】
2022501073.tif 000011
【表８】
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【０４２０】
結果：１００ｃｐ／ｒｘｎでＳＴＭに添加されたＶＺＶで１００％の検出が見られ、１０ｃｐ／ｒｘｎで２０％が検出された。血漿中のＶＺＶは３６ｃｐ／ｒｘｎで１００％検出され、３．６ｃｐ／ｒｘｎで６６％検出された。血漿中のＶＺＶについて予測される検出限界（ＬｏＤ）は、１００ｃｐ／ｍｌでのＣｔ値に基づいて３１．６ｃｐ／ｍｌである。ＡｃｒｏＭｅｔｒｉｘ  ＶＺＶパネルには、１０００ｃｐ／ｍｌ（３６ｃｐ／ｒｘｎ）未満のＶＺＶの正確なＬｏＤが表示される。内部標準は両研究で１００％検出された。
【０４２１】
プラスミド感度
ウイルス試料とは異なり、プラスミドＤＮＡは溶液内で容易にアクセス可能であり、試験のために細胞溶解を必要としない。核酸抽出での課題により、検出限界が下がり、ＬＤＴの性能が低く見えるため、プラスミドＤＮＡを試験すると、ＤＮＡ抽出プロセスに伴う問題が解消される。ここでは、プラスミドの感度は、６種の濃度（１０〜１，０００，０００コピー／反応）でＳＴＭ中でＶＺＶプラスミドを試験することによって評価した。オリゴセット（ＰＰＲ混合物８）を使用してＶＺＶプラスミドの検出限界（ＬｏＤ）を決定すると、適合性が確保される。ＶＺＶプラスミド（Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州マールボロ）をＳＴＭで１００００００、１００００、１０００、１０００、１００、１０ｃｐ／ｒｘｎに希釈し、ＰＰＲ混合物８（配列番号３８に特異的）に対して試験した。陰性対照はＳＴＭ（ＶＺＶなし）で構成された。ＰＰＲ混合物８は、表２に列挙される熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。結果を表９に示す。
【表９】
2022501073.tif 000013
【０４２２】
結果：一般に、曲線の勾配を使用して反応効率を決定し、これは、約−３．６〜約−３．１０の勾配に対応して、約９０％〜約１１０％である必要がある。ここで、ＰＰＲ混合物８は３．４４の線形勾配を示す。相関係数（Ｒ２）値は、複製の再現性の尺度であり（データが標準曲線にどの程度適合しているかの尺度に対応し、例えば、標準曲線の直線性）、理想的には１に等しいが、一般的には０．９９９が最大値である。ここでは、０．９９８２のＲ２である。３．４４の勾配および０．９９８２のＲ２は、高いＰＣＲ効率を意味する。プラスミドの検出限界（ＬｏＤ）は、１〜１０ｃｐ／ｒｘｎ（２７〜２７７ｃｐ／ｍｌ）である。一般に、２〜１０の反応の理論的検出限界は、確実に定量化できる標的核酸配列の最小数と見なされる。選択したオリゴセット（ＰＰＲ混合物８）を使用してＶＺＶプラスミドＬｏＤを評価することにより、適合性を確認した。ＶＺＶプラスミド（Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州マールボロ）の１００％検出は、町で１０ｃｐ／ｒｘｎと測定された。
【０４２３】
ウイルスゲノムＤＮＡの感度ならびにプラスミド、ｇＤＮＡ、およびウイルスの濃度比較
ゲノムＤＮＡの試験では、ウイルスにアクセスするために細胞を溶解する必要がある。ゲノムＤＮＡの感度は、ＶＺＶ  ｇＤＮＡ（Ｅｌｌｅｎ）（カタログ番号ＶＲ−１３６７、ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）、ＶＺＶプラスミド（Ｈｏｌｏｇｉｃ、マサチューセッツ州マールボロ）、およびＶＺＶ培養液（Ｅｌｌｅｎ）を含むＳＴＭを６種の濃度（１０〜１，０００，０００コピー／反応）で試験することにより評価した。ＰＣＲ製剤は、表１のＰＰＲ混合物８に従って調製した。プラスミド、ｇＤＮＡ、およびウイルス培養液を別々に指定濃度でＳＴＭに添加した。結果を表１０に示す。
【表１０】
2022501073.tif 000014
【０４２４】
結果：逆転写酵素を含まないＩＣを使用して、ｇＤＮＡの混入が検出される。ＩＣのＣｔが、最も希薄な標的によって生成されたＣｔよりも高い場合、ＣｔはｇＤＮＡがシグナル生成に寄与していないことを示す。ここでは、３１．６ｃｐ／ｒｘｎまで下げても、ｇＤＮＡおよびプラスミドの１００％検出が見られ、同様のＣｔ値（差異０．３）であった。ウイルス培養液の場合、１００％の検出は１０００ｃｐ／ｒｘｎでのみ測定され、ｇＤＮＡと濃度で１．３〜２．２の対数差を示した。
【０４２５】
実施例４：特異性
特異性試験のために、血液、組織、または病変で一般的に見られる３８種の生物を、可能な限り１Ｅ６  ｃｐ／ｍｌに近づくように（入手可能性に応じて）ＳＴＭに添加することにより、９つのパネルで調製した。表１のＰＰＲ混合物８に従ったＰＣＲ製剤を使用して、各パネルの特異性を評価した。パネルの組成および反応性の結果を表１１に列挙する。陽性対照はＶＺＶ培養液を含むＳＴＭで構成された一方、陰性対照はＳＴＭ（ＶＺＶなし）で構成された。ＰＰＲ混合物８は、表２に列挙される熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。
【表１１−１】
2022501073.tif 000015
【表１１−２】
2022501073.tif 000016
【０４２６】
結果：試験した３８種の生物のうち、０％がＶＺＶに陽性であり、１００％が内部標準に陽性であった。ＶＺＶ培養液を含むＳＴＭからなる陽性対照は、ＶＺＶおよびＩＣに対して陽性であると報告された一方、陰性対照（ＶＺＶを含まないＳＴＭ）はＩＣのみに対して陽性であった。
【０４２７】
実施例５：干渉
干渉を測定するために、特異性研究からの３８種の生物の存在下でＶＺＶ反応性を評価した。パネル２〜８は、ＳＴＭで１：１０  ＶＺＶ株（単離株Ａ）を２７，７７８ｃｐ／ｍｌに希釈した。単離株Ａは、ＶＺＶの１種の特定菌株の培養液であり、細胞が溶解する時点まで「生きている」。パネル１および９は、同様にＳＴＭで１：１０  ＶＺＶ株（単離株Ａ）培養液を２７，７７８ｃｐ／ｍｌに希釈した。パネル１および９は特異性研究から得られたものではなかったため、新たに調製した。ＣＭＶ干渉を評価するために、各パネルにＣＭＶ培養液を２７，７７８  ｃｐ／ｍｌで添加した。９パネルのそれぞれをＰＰＲ混合物８で試験した。陽性対照は、ＣＭＶ、およびＶＺＶを２７，７７８ｃｐ／ｍｌで含むＳＴＭで構成された。陰性対照はＳＴＭ（ＶＺＶなし）で構成された。ＰＰＲ混合物８は、表２に列挙される熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。結果を表１２に示す。
【表１２−１】
2022501073.tif 000017
【表１２−２】
2022501073.tif 000018
【０４２８】
結果：ＶＺＶおよびＣＭＶは、試験した特異性パネルの１００％で検出された。ＶＺＶの場合、試験された３８種の生物のうち、０種がＶＺＶの検出に干渉した。ＣＭＶの場合、試験された３４種の生物のうち、０種がＣＭＶの検出に干渉した。Ｃｔ値は変動したが、ＣＭＶの最大Ｃｔ差は１．６であった（陽性対照と比較した場合）。全試料が臨床検体で予想される濃度よりも高い濃度を含んだため、Ｃｔは３Ｃｔよりも大きくない限り、有意とみなされなかった。内部標準はパネルの１００％で検出された。陽性対照（パネルの１００％で検出）は、ＶＺＶおよび内部標準に対して陽性であった。陰性対照は、内部標準に対してのみ陽性であった。
【０４２９】
実施例６：反応性
反応性試験では、選択したオリゴの組み合わせ（ＰＰＲ混合物８）が、市場で入手可能な全てのウイルス株で同様に機能することを確認する。なぜなら、ＶＺＶの１株のみを試験しても、ＰＰＲ混合物８が類似株で同等に機能することを示唆するものではなく、単離株ＡはＶＺＶ株全ての代表でもないからである。試験された８種の単離株は、試験時に市場で入手可能なＶＺＶの定量化された全菌株を特性評価する。定量化されていない株は、感度試験に利益をもたらさないため、ＡＴＣＣから入手可能な株と同様に、非定量化ＶＺＶ株は試験されなかった。ここでは、ＰＰＲ混合物８を、２Ｅ４細胞／ｍｌ  ＨｅＬａを含むウイルス輸送培地（ＶＴＭ）と２Ｅ４細胞／ｍｌを含むＳＴＭとの両方で、８種の異なるＶＺＶ株に対して試験した。８種の株全てが１００ｃｐ／ｒｘｎおよび１０００ｃｐ／ｒｘｎで試験された。閾値サイクル（Ｃｔ）および相対蛍光単位（ＲＦＵ）データを表１４に示す。陽性対照は、ＶＺＶを１００ｃｐ／ｒｘｎで含むＳＴＭおよび２Ｅ４細胞／ｍｌ  ＨｅＬａで構成された。陰性対照は、ＳＴＭとＨｅＬａ（ＶＺＶなし）、およびＶＴＭとＨｅＬａ（ＶＺＶなし）で構成された。ＰＰＲ混合物８は、表２に列挙される熱サイクル条件を使用して実行され、内部標準に対して試験した（表３）。結果を表１３に示す。
【表１３】
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【０４３０】
結果：全ての株はＶＺＶオリゴと反応した。１０００ｃｐ／ｒｘｎで８種のＶＺＶ株全てで１００％の陽性が見られた。単離株Ａ、単離株Ｂ、単離株Ｄ、８２、２７５、および９９３９も、１００ｃｐ／ｒｘｎで１００％陽性であった。１００ｃｐ／ｒｘｎのＳＴＭにおけるＶＺＶプラスミドの陽性対照は、ＶＺＶに対して陽性であった。シミュレーションされた両臨床マトリックスからなる陰性対照は、ＶＺＶに対して陰性であった。試験した全試料で内部標準が検出された。全株がＶＺＶオリゴと反応した。
【０４３１】
実施例７：ＶＺＶ分析物に特異的な試薬の臨床成績研究。
２０個の陽性および２０個の陰性の臨床検体とのＶＺＶ臨床反応性を調べた。ＶＺＶの記載のプライマーおよびプローブを使用したＰＣＲ製剤を使用して、保管された臨床検体中のＶＺＶを検出した。３７．５μＭのＶＺＶプライマー（配列番号４および１９）ならびに２５μＭのＶＺＶプローブ（配列番号１１、５’−フルオレセイン、３’ＢＨＱ１、全てのＣを５−Ｍｅ−ｄＣで修飾）を反応に使用した（ＰＰＲ混合物８）。試験試料には、２０個の既知のＶＺＶ陽性および２０個の既知のＶＺＶ陰性の病変スワブ検体が含まれていた。５０ｃｐ／反応のＶＺＶプラスミドを陽性対照として使用した。試料は、表７−１に記載のサイクルおよび表７−２に記載のＰＰＲ混合物を使用して、３００μＬの検体および４６８μＬのＳＴＭ（１：１．５６）で処理された。
【表１４】
2022501073.tif 000020
【表１５】
2022501073.tif 000021
【表１６−１】
2022501073.tif 000022
【表１６−２】
2022501073.tif 000023
【表１７−１】
2022501073.tif 000024
【表１７−２】
2022501073.tif 000025
【表１８−１】
2022501073.tif 000026
【表１８−２】
2022501073.tif 000027
【表１９】
2022501073.tif 000028
【０４３２】
結論：ＶＺＶに特異的なプライマーおよびプローブは、比較基準のＶＺＶアッセイと９０％以上の臨床的一致を示す。２０のＶＺＶ陰性臨床検体の陰性一致は１００．０％であった。２０のＶＺＶ陽性臨床検体の陽性一致は１００．０％であった。ＶＺＶに特異的なオリゴマーは、ＶＺＶを含むことが知られている全ての試料でＶＺＶを検出し、ＶＺＶを欠くことが知られているいずれの試料でもＶＺＶを検出しなかった。
【０４３３】
実施例８：ＶＺＶに特異的なオリゴマー反応性の分析。
ＶＺＶおよびＶＺＶ対照プラスミドの異なる株または単離株を増幅および検出する能力を評価した。３７．５μＭのＶＺＶプライマー（配列番号４および１９）ならびに２５μＭのＶＺＶプローブ（配列番号１１、５’−フルオレセイン、３’ＢＨＱ１、全てのＣを５−Ｍｅ−ｄＣで修飾）を反応に使用した（ＰＰＲ混合物８）。ＶＺＶウイルスは５００ｃｐ／反応で反応に存在した。ＶＺＶプラスミドは、１５８、５０、または１５．８ｃｐ／反応で反応に存在した。陽性対照プラスミドは、５０ｃｐ／反応で反応に存在した。
【０４３４】
試料は、表８−１に記載のサイクルおよび表８−２に記載のＰＰＲ混合物を使用して処理された。
【表２０】
2022501073.tif 000029
【表２１】
2022501073.tif 000030
【表２２】
2022501073.tif 000031
【表２３】
2022501073.tif 000032
【表２４】
2022501073.tif 000033
【０４３５】
結論：ＶＺＶに特異的なオリゴマーは、５０ｃｐ／ｒｘｎ未満のＶＺＶプラスミドＤＮＡおよび５００ｃｐ／ｒｘｎのＶＺＶゲノムＤＮＡ（ＶＺＶ単離株および／または株）を検出することができる。検出率は９５％以上であった。対照プライマーおよびプローブとの多重反応におけるＶＺＶに特異的なオリゴマーは、ＶＺＶ陽性試料が多い場合でも、ＶＺＶ  ＤＮＡと対照プラスミドの両方を増幅および検出することができる。
【０４３６】
実施例９。ＶＺＶに特異的なオリゴマー特異性および干渉試験。
ＶＺＶに特異的なオリゴマーの特異性は、一般的に血漿および血清に見られる３５種の生物に対して評価された（特異性分析。交差反応物の存在下でＶＺＶを増幅および検出するＶＺＶ特異的オリゴマーの能力も評価された（干渉分析）。３７．５μＭのＶＺＶプライマー（配列番号４および１９）ならびに２５μＭのＶＺＶプローブ（配列番号１１、５’−フルオレセイン、３’ＢＨＱ１、全てのＣを５−ｍｅ−ｄＣで修飾）を反応に使用した（ＰＰＲ混合物８）。
【０４３７】
試料は、表９−１に記載のサイクルおよび表９−２に記載のＰＰＲ混合物を使用して処理された。
【表２５】
2022501073.tif 000034
【表２６】
2022501073.tif 000035
【表２７】
2022501073.tif 000036
【０４３８】
特異性反応には、６０μＬのパネルストックおよび５４０μＬの希釈液が含まれた。
【０４３９】
干渉反応には、６０μＬのパネルストック、６０μＬのＶＺＶ、および４８０μＬの希釈液が含まれた。
【表２８】
2022501073.tif 000037
【表２９】
2022501073.tif 000038
【表３０】
2022501073.tif 000039
【表３１】
2022501073.tif 000040
【０４４０】
結論：ＶＺＶに特異的なプライマーおよびプローブは、一般的に血漿、血清、および病変スワブに見られる微生物のパネルで試験した場合、１００％の特異性を示した。ＶＺＶが、一般に血漿、血清、および病変スワブに見出される微生物の存在下で、１．５×１０３コピー／ｍＬ以下の濃度で存在した場合、ＶＺＶに特異的なプライマーおよびプローブはまた、１００％のＶＺＶ検出率であった。ＶＺＶに特異的なプライマーおよびプローブは堅牢であり、ＶＺＶ  ＥＢＮＡ１に特異的である。ＶＺＶに特異的なプライマーおよびプローブは、ＣｔまたはＲＦＵに有意に影響を及ぼすことなく、１５００ｃｐ／ｒｘｎで潜在的な干渉生物の存在下でＶＺＶを検出することができる。
【０４４１】
配列
以下の表において、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードを使用して、縮重（混合）位置（Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣなど）を同定し、組成物またはキット中の個々の分子は、ＩＵＰＡＣコードに対応するヌクレオチドのいずれかを有し得る。
【表３２−１】
2022501073.tif 000041
【表３２−２】
2022501073.tif 000042
【表３２−３】
2022501073.tif 000043
【配列表】
2022501073000001.app
【国際調査報告】
2022501073.tif 000044
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2022501073.tif 000047
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