(57)【要約】  第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差を表す単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする。変化した状態は、第１の細胞状態から変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じる。移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定、並びに、各このような細胞成分について、それぞれの細胞成分の発現の変化と、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第１の重要度スコアを含む。移行シグネチャーは、非摂動細胞と摂動に曝された摂動細胞との間の細胞成分の発現の差を表す摂動シグネチャーと比較される。摂動シグネチャーは、各それぞれの細胞成分について、（ｉ）非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞成分の発現の変化と、（ｉｉ）非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコアを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測するための方法であって、前記方法が、
メモリ及び１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムにおいて：
第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記変化した細胞状態は、前記第１の細胞状態から前記変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じ、前記単一細胞の移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定及び、前記複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、前記それぞれの細胞成分の発現の変化と、前記第１の細胞状態と前記変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第１の重要度スコアを含む、工程と；
複数の非摂動細胞と摂動に曝された複数の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記摂動シグネチャーは、前記複数の細胞成分の全て又は一部の同定及び、前記複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について、（ｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、（ｉｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコアを含む、工程と；
前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーを比較し、それによって、前記摂動が前記細胞の移行に影響を与えるかどうかを決定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程が、
（ｉ）第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット、及び（ｉｉ）第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、前記単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含み、ここで：
前記第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第１の単一細胞細胞成分の発現データセットが、前記第１の細胞状態の第１の複数の細胞の対応する単一細胞から得られ、
前記第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第２の単一細胞細胞成分の発現データセットが、前記変化した細胞状態の第２の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第１の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含み、
前記第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第２の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含み、
前記第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルが、複数の要素を含み、前記それぞれの細胞成分ベクトル中の各それぞれの要素が、前記複数の細胞成分中の対応する細胞成分に関連しており、前記第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの前記それぞれのデータセットによって表される前記対応する単一細胞についての前記対応する細胞成分の量を表す対応する値を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び／又は前記第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに対して次元削減を行って、複数の次元削減成分を生成する工程と；
前記第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルについて、前記複数の次元削減成分を、前記それぞれの細胞成分ベクトルに適用して、前記複数の次元削減成分中の各それぞれの次元削減成分についての次元削減成分値を含む対応する次元削減ベクトルを形成し、それによって、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルを形成する工程と；
クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、前記第１及び第２の複数の次元削減ベクトルのサブセットに対応する複数の点を含む、工程と；
前記クラスターのセットＣｊの第１のクラスターから前記第１の複数の細胞を同定する工程と；
前記クラスターのセットＣｊの第２のクラスターから前記第２の複数の細胞を同定する工程とをさらに含み、
前記方法が、任意に、前記対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルを用いて多様体学習を行って、前記第１及び第２の複数の細胞における各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞状態を同定する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の非摂動細胞が、摂動に曝されていない対照細胞であり、又は前記非摂動細胞が、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーをプルーニングして、前記複数の細胞成分を、任意にＲＮＡレベルで測定される転写因子に制限する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程が、
母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、（ｉ）前記第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセットと、前記第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の前記複数の細胞成分にわたる細胞成分量の差を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
細胞成分の発現の差の尺度が、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、（ｉ）第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセットと、（ｉｉ）第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の細胞成分量の差を定量し、ここで：
前記第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第３の単一細胞細胞成分の発現データセットが、前記複数の非摂動細胞中の対応する単一細胞から得られ、
前記第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第４の単一細胞細胞成分の発現データセットが、摂動に曝された前記複数の摂動細胞中の第４の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーをフィルタリングして、前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程をさらに含み、
任意に、前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーをフィルタリングする工程が、閾値ｐ値にしたがって、又は細胞成分の閾値数にしたがって、前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
それぞれの細胞成分についての前記対応する第２の重要度スコアを決定する工程が、
前記複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、前記それぞれの細胞成分についての前記重要度スコアを、前記それぞれの細胞成分についての対応するマッチングスコアで置き換える工程と；
前記複数の細胞成分についての前記マッチングスコアを組み合わせて、前記摂動についてのマッチングスコアを生成する工程と；
前記摂動が、前記それぞれの摂動についての前記マッチングスコアに基づいて、前記第１の細胞状態と前記変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含み、
任意に、前記対応するマッチングスコアが、別個の又は連続したスコアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記重要度スコアを置き換える工程が、
前記それぞれの細胞成分についての前記単一細胞の移行シグネチャーからの前記細胞成分量及び前記それぞれの細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が両方とも上方制御される場合、前記重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；
前記それぞれの細胞成分についての前記単一細胞の移行シグネチャーからの前記細胞成分量が上方制御され、前記それぞれの細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が下方制御される場合、前記重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；
前記それぞれの細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、前記重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記重要度スコアを置き換える工程が、
前記それぞれの細胞成分についての前記単一細胞の移行シグネチャーからの前記細胞成分量及び前記細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が両方とも下方制御される場合、前記重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；
前記それぞれの細胞成分についての前記単一細胞の移行シグネチャーからの前記細胞成分量が下方制御され、前記細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が上方制御される場合、前記重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；
前記細胞成分についての前記摂動シグネチャーからの前記細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、前記重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の細胞成分が、任意にＲＮＡレベルで測定される複数の遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット及び前記第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各単一細胞細胞成分の発現データセットが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ、並びに単一細胞細胞成分の発現データセットにおける活性化された経路を表す線形組合せなどの組合せを含む、上記のものの集合からなる群から選択される方法を用いて生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較に基づいて、前記変化した細胞状態を促進するものとして前記摂動を同定する工程、又は
前記比較に基づいて、前記変化した細胞状態を阻害するものとして前記摂動を同定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーが、異なるタイプの細胞成分を用いて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーが、同じタイプの細胞成分を用いて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記電子的形態でアクセスする工程が、複数の摂動における各それぞれのシグネチャーについて行われ、それによって、複数の摂動シグネチャーを得て、
前記比較する工程が、前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーを、複数の摂動シグネチャーにおける各それぞれのシグネチャーと比較し、それによって、前記第１の細胞状態と前記変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する前記複数の摂動のサブセットを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上のプロセッサ及びメモリを含むコンピュータシステムであって、前記メモリが、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測するための方法を実行するための命令を保存し、前記方法が、
第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記変化した細胞状態は、前記第１の細胞状態から前記変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じ、前記単一細胞の移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定及び、前記複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、前記それぞれの細胞成分の発現の変化と、前記第１の細胞状態と前記変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第１の重要度スコアを含む、工程と；
複数の非摂動細胞と摂動に曝された複数の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記摂動シグネチャーは、前記複数の細胞成分の全て又は一部の同定及び、前記複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について、（ｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、（ｉｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコアを含む、工程と；
前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーを比較し、それによって、前記摂動が前記細胞の移行に影響を与えるかどうかを決定する工程とを含む、コンピュータシステム。
【請求項２０】
摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測するための、コンピュータによって実行可能な１つ以上のコンピュータプログラムを保存する非一時的なコンピュータ可読媒体であって、前記コンピュータが、１つ以上のプロセッサ及びメモリを含み、前記１つ以上のコンピュータプログラムが、
第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記変化した細胞状態は、前記第１の細胞状態から前記変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じ、前記単一細胞の移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定及び、前記複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、前記それぞれの細胞成分の発現の変化と、前記第１の細胞状態と前記変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第１の重要度スコアを含む、工程と；
複数の非摂動細胞と摂動に曝された複数の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、前記摂動シグネチャーは、前記複数の細胞成分の全て又は一部の同定及び、前記複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について、（ｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、（ｉｉ）前記複数の非摂動細胞と前記複数の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコアを含む、工程と；
前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーを比較し、それによって、前記摂動が前記細胞の移行に影響を与えるかどうかを決定する工程と
を含む方法を実行するコンピュータで実行可能な命令を集合的に符号化する、非一時的なコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９８，７０１号、２０１９年２月１４日に出願された同第６２／８０５，８８４号、及び２０１９年２月１４日に出願された同第６２／８０５，８８８号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、一般に、細胞を分析するためのシステム及び方法に関する。より具体的には、本発明は、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測することに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞機構の研究は、疾患を理解するために重要である。
【０００４】
組織は、個々の細胞の複雑な生態系であり、そこでは、細胞状態の調節異常が疾患の基礎となる。既存の創薬努力は、細胞を健康な状態から疾患状態へと移行させる分子機構を特徴付け、これらの移行を食い止めるか又は阻害する薬理学的な手法を特定しようとしている。過去の努力はまた、これらの移行を特徴付ける分子シグネチャーを同定し、これらのシグネチャーを食い止める薬理学的な手法を特定しようとしてきた。
【０００５】
表面マーカーによって豊富になった組織又は細胞における大量の細胞コレクションについての分子データは、集団中の個々の細胞の表面型多様性及び分子多様性を隠している。これらの大量の細胞コレクション中の細胞の不均一性により、疾患促進機構を解明することを目的とした現在の取り組みの結果が、誤解を招くか又は完全に誤ったものにさえなる。単一細胞ＲＮＡシーケンシングなどの新たな手法は、分子レベルで個々の細胞を特徴付けることができる。これらのデータは、様々な細胞状態をより高い解明度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で理解するための基盤を提供し、細胞が有する状態の豊かで且つ驚くべき多様性を明らかにする。
【０００６】
単一細胞のデータを解釈する場合、重大な問題が存在し、すなわち、これらのデータのまばらさ（ｓｐａｒｓｉｔｙ）により、細胞中に存在する分子の存在、及びノイズが見落とされ、これらの分子測定の正確性における不確実さが伴うことである。したがって、新たな手法が、個々の細胞状態を制御するための薬理学的手法への洞察を導き、それに応じて疾患を解明するために必要とされている。
【０００７】
化学物質（小分子、細胞外リガンド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びその他を含む）のコンピュータによるポジショニング及びリポジショニングは、創薬を加速させるのに非常に大きな可能性を有する。過去の手法は、小分子で摂動されるバルク細胞から生じる発現シグネチャーの差を、健康な状態と疾患状態との間の細胞の発現デルタにマッピングしていた。この手法は、可能性を有するが、その現在の形態では、バルク細胞の不均一性及び分子的に摂動される細胞及び病変細胞の著しい細胞型の差のため、限られた適用性を有する。
【０００８】
上記の背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされているのは、向上した細胞分析を可能にするシステム及び方法である。特に、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかの予測を可能にすることが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、上に示される欠点に対処するものである。本開示は、単一細胞のデータ及び分子摂動のデータを主なデータ基盤として用いて、これらの欠点に、少なくとも部分的に対処し、機械学習を用いて、天然の多様な細胞状態の理解を精緻化し、細胞が別の状態を選択する主な移行状態を明らかにし、細胞状態の変化の根底にある分子機構の理解を促進し、これらの状態変化を制御するための薬理学的な手法を発見するものである。
【００１０】
本開示の一態様は、摂動が細胞の移行に影響を与える（例えば、移行を促進するか又は移行を阻害する）かどうかを予測するための方法を提供する。本方法は、単一細胞の移行シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程を含む。移行シグネチャーは、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。変化した細胞状態は、第１の細胞状態から変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じる。単一細胞の移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定を含む。複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、対応する第１の重要度スコアが、それぞれの細胞成分の発現の変化と、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する。実際に、いくつもの単一細胞の移行シグネチャーが、このように得られ、それぞれが、第１の細胞状態と異なる変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。したがって、いくつもの異なる変化した細胞状態が、本出願の開示内容を用いて同時に分析され得る。
【００１１】
本方法は、摂動シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程をさらに含む。ある実施形態において、摂動シグネチャーは、１つ以上の非摂動細胞と摂動に曝された１つ以上の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。さらに、摂動シグネチャーは、複数の細胞成分の全て又は一部の同定を含む。複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について、１つ以上の非摂動細胞と１つ以上の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、１つ以上の非摂動細胞と１つ以上の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコア。実際に、いくつもの摂動シグネチャーが、このように得られ、それぞれが、１つ以上の非摂動細胞と、複数の摂動における異なる摂動に曝された１つ以上の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。さらに、本方法は、単一細胞の移行シグネチャー、又は複数の単一細胞の移行シグネチャー、及び摂動シグネチャー、又は複数の摂動シグネチャーを比較し、それによって、摂動（又は複数の摂動）が、変化した状態への細胞の移行に影響を与える（又は複数の変化した状態への複数の細胞の移行に影響を与える）かどうかを決定する工程を含む。ある実施形態において、２、３、４、１０又はそれ以上、例えば、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００、又はそれ以上の変化した状態が、このように同時に分析される。ある実施形態において、２、３、４、１０又はそれ以上、例えば、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００又はそれ以上の摂動が、このように同時に分析される。
【００１２】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程は、第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット、及び第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含む。第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第１の単一細胞細胞成分の発現データセットが、第１の細胞状態の第１の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる。さらに、第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第２の単一細胞細胞成分の発現データセットが、変化した細胞状態の第２の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる。
【００１３】
ある実施形態において、第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第１の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含む。さらに、第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第２の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含む。さらに、第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルが、複数の要素を含む。それぞれの細胞成分ベクトル中の各それぞれの要素が、複数の細胞成分中の対応する細胞成分に関連しており、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットのそれぞれのデータセットによって表される対応する単一細胞についての対応する細胞成分の量を表す対応する値を含む。
【００１４】
ある実施形態において、次元削減が、第１及び／又は第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにおいて行われて、複数の次元削減成分を生成する。したがって、第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルについて、複数の次元削減成分が、それぞれの細胞成分ベクトルに適用されて、複数の次元削減成分中の各それぞれの次元削減成分についての次元削減成分値を含む対応する次元削減ベクトルを形成する。これにより、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルが形成される。本方法は、クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程を含む。各クラスターは、第１及び第２の複数の次元削減ベクトルのサブセットに対応する複数の点を含む。第１の複数の細胞は、クラスターのセットＣｊの第１のクラスターから同定され、第２の複数の細胞は、クラスターのセットＣｊの第２のクラスターから同定される。
【００１５】
ある実施形態において、多様体学習が、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルを用いて行われて、第１及び第２の複数の細胞における各細胞の他の各細胞に対する相対的細胞状態が同定される。
【００１６】
ある実施形態において、複数の非摂動細胞は、摂動に曝されていない対照細胞であり、又は非摂動細胞は、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均である。
【００１７】
ある実施形態において、本方法は、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをプルーニングして、複数の細胞成分を転写因子に制限する工程をさらに含む。
【００１８】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセットと第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の複数の細胞成分にわたる細胞成分量の差を決定する工程を含む。
【００１９】
ある実施形態において、細胞成分の発現の差の尺度は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセットと第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の細胞成分量の差を定量する。第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第３の単一細胞細胞成分の発現データセットが、複数の非摂動細胞の対応する単一細胞から得られ、第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第４の単一細胞細胞成分の発現データセットが、摂動に曝された複数の摂動細胞中の第４の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる。
【００２０】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、フィルタリングされて、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数が減少される。ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングする工程は、閾値ｐ値にしたがって、又は細胞成分の閾値数にしたがって、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程を含む。
【００２１】
ある実施形態において、それぞれの細胞成分についての対応する第２の重要度スコアを決定する工程は、それぞれの細胞成分についての重要度スコアを、複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、それぞれの細胞成分についての対応するマッチングスコアで置き換える工程を含む。マッチングスコアは、複数の細胞成分のために組み合わされて、摂動についてのマッチングスコアが生成される。摂動が、それぞれの摂動についてのマッチングスコアに基づいて、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかの決定が行われる。
【００２２】
ある実施形態において、対応するマッチングスコアは、別個の又は連続したスコアを含む。
【００２３】
ある実施形態において、重要度スコアを置き換える工程は、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びそれぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも上方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程を含む。それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が上方制御され、それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が下方制御される場合、重要度スコアは、第２のスコアで置き換えられる。さらに、それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアは、第３のスコアで置き換えられる。
【００２４】
ある実施形態において、重要度スコアを置き換える工程は、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及び細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも、それらの同等物（例えば、それぞれ第１の細胞状態及び非摂動状態）と比較して下方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程を含む。それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が、それらの同等物（例えば、それぞれ第１の細胞状態及び非摂動状態）と比較して下方制御され、細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が上方制御される場合、重要度スコアは、第２のスコアで置き換えられる。さらに、細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、それらの同等物（例えば、それぞれ第１の細胞状態及び非摂動状態）と比較して有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアは、第３のスコアで置き換えられる。
【００２５】
ある実施形態において、複数の細胞成分は、複数の遺伝子を含む。
【００２６】
ある実施形態において、第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット及び第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各単一細胞細胞成分の発現データセットが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチン（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）の単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、又はそれらの組合せ若しくは集合を含む方法を用いて生成される。
【００２７】
ある実施形態において、本方法は、比較に基づいて、変化した細胞状態を促進するものとして摂動を同定する工程をさらに含む。
【００２８】
ある実施形態において、細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、異なるタイプの細胞成分を用いて生成される。ある実施形態において、細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、同じタイプの細胞成分を用いて生成される。
【００２９】
ある実施形態において、電子的形態でアクセスする工程は、複数の摂動における各それぞれのシグネチャーについて行われ、それによって、複数の摂動シグネチャーを得る。さらに、比較する工程は、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーを、複数の摂動シグネチャーにおける各それぞれのシグネチャーと比較し、それによって、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する複数の摂動のサブセットを決定する。
【００３０】
本開示の別の態様は、複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにアクセスする工程を含む方法を提供する。各単一細胞細胞成分の発現データセットが、同じ「前駆」細胞型から移行された複数の細胞の１つの細胞から得られる。各データセットは、細胞成分のベクトルｒｉを含む。細胞成分のベクトルｒｉ中の各エントリは、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値は、細胞についての細胞成分の量を表す。本方法は、データセットの次元削減を行って、行列Ｍを生成する工程をさらに含む（例えば、図１の無次元削減成分ストア１４６−１のものなどの複数の無次元成分）。行列Ｍは、第１の次元における行及び第２の次元における列を含む。各行は、複数の細胞の１つに対応する。行列Ｍの値は、第１及び第２の次元空間中の点に位置する細胞成分の量から生成される値を含む。本方法は、クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程をさらに含む。各クラスターは、行列Ｍ中の行のサブセットに対応する複数の点、及びそれらの対応する細胞を含む。本方法は、クラスターのセットＣｊを用いて、細胞についての、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程をさらに含む。
【００３１】
特定の実施形態において、本方法は、点の相対的類似度の近似による行列Ｍを用いて多様体学習を行って、行列Ｎを生成する工程をさらに含む。行列Ｎは、複数の行（行列Ｍの行と同じ行）及び２つの列を含む。各行は、複数の細胞の１つに対応し、２つの列のそれぞれが、２次元空間の２つの次元の１つに対応する。行列Ｎの値は、データセットに基づいて、各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞型を示す。
【００３２】
データセットが得られる複数の細胞の複数の実施形態がある。特定の実施形態において、複数の細胞は、単一細胞細胞成分の発現データセットが得られるとき、様々な細胞型を有する不均一な細胞集団である。さらなる実施形態において、複数の細胞は、「前駆」細胞型を有する細胞の均一な集団であり、単一細胞細胞成分の発現データセットは、細胞が「前駆」細胞型から移行する際に複数の時点のそれぞれで得られ、複数のデータセットの異なるデータセットが、各独自の細胞及び時点の組合せのために収集されるようになっている。このような実施形態において、複数の時点は、少なくとも３つの時点を含み得る。さらなる実施形態において、複数の時点は、複数の細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型から移行されていない「前駆」時点を含み得る。あるさらなる実施形態において、複数の時点は、複数の細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型から移行された移行時点を含み得る。あるさらに他の実施形態において、複数の時点は、細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型から少なくとも部分的に移行された少なくとも１つの中間時点を含み得る。
【００３３】
複数の細胞成分はまた、様々であり得る。例えば、本明細書に開示される方法のある実施形態において、複数の細胞成分は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。このような実施形態において、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択され得る。さらなる実施形態において、ＲＮＡは、コーディング及びノンコーディングＲＮＡからなる群から選択され得る。特定の実施形態において、複数の単一細胞細胞成分の発現データセットは、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ及びそれらの任意の組合せ又は集合からなる群から選択される方法を用いて生成される。
【００３４】
次元削減は、データセットに対して行われて、複数の方法で（例えば、上述される行列Ｍの形態で）次元削減成分を生成し得る。特定の実施形態において、次元削減を行う工程は、単一細胞細胞成分の発現データセットに対する主成分分析（ＰＣＡ）を行って、次元削減成分を生成する工程を含む。さらなる実施形態において、次元削減を行う工程は、データセットに対して拡散マップ及び／又はニューラルネットワークオートエンコーダを用いて達成されて、次元削減成分を生成し得る。
【００３５】
同様に、多様体学習は、（例えば、行列Ｍの形態で）次元削減成分を用いて行われて、複数の方法で行列Ｎなどの別のデータ形式を生成し得る。本開示のある実施形態において、多様体学習を行う工程は、行列Ｍにおけるデータの幾何学的配列（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を推定して、行列Ｎを生成する工程を含み得る。このような実施形態において、多様体学習を行う工程は、局所線形埋め込み、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｔ−Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＰＨＡＴＥ）、又は一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）を行う工程を含み得る。さらなる実施形態において、多様体学習を行う工程は、行列Ｍにおけるデータに基づいて力指向レイアウトを作成して、行列Ｎを生成する工程を含み得る。一実施形態において、力指向レイアウトは、Ｆｏｒｃｅ  Ａｔｌａｓ  ２アルゴリズムを用いて作成され得る。
【００３６】
クラスタリングはまた、複数の異なる方法を用いて行われ得る。特定の実施形態において、クラスタリングを行う工程は、各クラスター中の複数の点の組織化の予備知識を仮定しない。本明細書に開示されるさらなる実施形態において、クラスタリングを行う工程は、ＨＤＢＳＣＡＮ及び／又はＬｏｕｖａｉｎコミュニティ検出を行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程を含む。さらなる実施形態において、クラスタリングを行う工程は、点に関連する単一細胞細胞成分の発現データセットが収集された時点に基づいて、各点をクラスターＣｊの１つに割り当てる工程を含む。ある実施形態において、クラスタリングを行う工程は、点がクラスターからどのくらい末端にあるかの測定に基づいて、点をクラスターに割り当てる拡散経路アルゴリズムを用いて複数の点を分析する工程を含む。
【００３７】
異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定するために、複数の異なる方法が使用され得る。例えば、一実施形態において、各細胞成分について、クラスターＣｊの少なくとも１つについて、少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量は、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量に対して比較され得る。次に、少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量が、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量を超える閾値レベルであることに応答して、細胞成分は、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに加えられ得る。特定の実施形態において、少なくとも１つのクラスターは、クラスターＣｊの系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）のものを含むことができ、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）クラスターは、所望の細胞型を有する複数の点を含む。さらなる実施形態において、少なくとも１つの他のクラスターは、クラスターＣｊの系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）のものを含むことができ、系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）クラスターは、所望されない細胞型を有する点を含む。
【００３８】
さらなる実施形態において、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定するために、各細胞成分について、クラスターの少なくとも１つについて、少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量と、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量との間の距離計量が、計算され得る。次に、距離計量が統計的に有意であることに応答して、細胞成分は、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに加えられ得る。
【００３９】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、転写因子データベースに対して、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットをスクリーニングして、異なって発現された転写因子のセットを同定する工程をさらに含み得る。異なって発現された転写因子のセットが同定されるこのような実施形態において、本方法は、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに対して経験的モード分解を行って、データセットの擬似時間表現を生成する工程と、擬似時間表現に基づいて、異なって発現された転写因子のセットを同定する工程とを含み得る。
【００４０】
別の態様において、本開示は、複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにアクセスする工程を含む方法を提供する。各データセットが、同じ「前駆」細胞型から移行された複数の細胞の１つの細胞から得られる。各データセットは、細胞成分のベクトルｒｉを含む。細胞成分のベクトルｒｉ中の各エントリは、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値は、細胞についての細胞成分の量を表す。本方法は、ｋＮＮアルゴリズム及び単一細胞細胞成分の発現データセットを用いてｋＮＮグラフを生成する工程と、クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程と、クラスターのセットＣｊを用いて、複数の細胞についての、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程とをさらに含む。各クラスターは、複数の点を含み、各点は、複数の細胞の１つの細胞についての単一細胞細胞成分の発現データセットに対応する。ある実施形態において、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程は、クラスターＣｊ中の複数の点間の距離計量を決定する工程を含む。
【００４１】
別の態様において、本開示は、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程を含む方法を提供する。本方法は、摂動に曝されていない非摂動細胞と摂動に曝された摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーにアクセスする工程をさらに含む。本方法は、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの比較に基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００４２】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程は、第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット（各第１のデータセットが、第１の細胞状態における第１の複数の細胞の１つの細胞から得られる）、及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット（各第２のデータセットが、変化した細胞状態における第２の複数の細胞の１つの細胞から得られる）に基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含む。第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各データセットが、各細胞について、細胞成分のベクトルｒｉを含むことができ、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、細胞についての細胞成分の量を表す。ある実施形態において、第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの間の細胞成分量の差を決定する工程を含む。
【００４３】
単一細胞の移行シグネチャーが、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含むこのような実施形態において、本方法は、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程をさらに含み得る。ここで、取得する工程は、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの次元削減を行って、行列Ｍを生成する工程を含む。行列Ｍは、第１の次元における行及び第２の次元における列を含む。行列Ｍの各行は、複数の細胞の１つの細胞に対応する。行列Ｍの値は、第１及び第２の次元空間中の点に位置する細胞成分の量から生成される値を含む。第１及び第２の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程は、クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程をさらに含む。各クラスターは、行列Ｍ中の行のサブセットに対応する複数の点、及びそれらの対応する細胞を含む。第１及び第２の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程は、クラスターのセットＣｊの第１のクラスターから第１の複数の細胞を同定する工程と、クラスターのセットＣｊの第２のクラスターから第２の複数の細胞を同定する工程と、第１の複数の細胞から第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程と、第２の複数の細胞から第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程とをさらに含む。
【００４４】
特定の実施形態において、第１及び第２の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程は、点の相対的類似度の近似による行列Ｍを用いて多様体学習を行って、行列Ｎを生成する工程をさらに含む。行列Ｎは、複数の行及び２つの列を含む。各行は、第１及び第２の複数の細胞の１つの細胞に対応し、列のそれぞれは、２次元空間中の１つ又は２つの次元に対応する。行列Ｎの値は、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞状態を示す。
【００４５】
特定の実施形態において、摂動シグネチャーにアクセスする工程は、摂動に曝されていない非摂動細胞の複数の非摂動単一細胞細胞成分の発現データセット、及び摂動に曝された摂動細胞の複数の摂動単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、摂動シグネチャーを決定する工程を含み得る。非摂動細胞は、摂動細胞の摂動に曝されていない対照細胞であり得る。或いは、非摂動細胞は、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均であり得る。ある実施形態において、複数の非摂動単一細胞細胞成分の発現データセット及び複数の摂動単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、摂動シグネチャーを決定する工程は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、複数の非摂動及び摂動単一細胞細胞成分の発現データセットの間の細胞成分量の差を決定する工程を含み得る。
【００４６】
ある実施形態において、本方法は、転写因子である細胞成分を含む単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングする工程をさらに含む。さらなる実施形態において、本方法は、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングして、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程をさらに含む。具体的には、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、閾値ｐ値にしたがって又は細胞成分の閾値数にしたがって、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させるようにフィルタリングされ得る。
【００４７】
本明細書に開示される方法のさらなる実施形態において、摂動シグネチャーは、複数の細胞成分を含むことができ、各細胞成分は、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連する。このような実施形態において、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程は、各細胞成分についての重要度スコアを、細胞成分についてのマッチングスコアで置き換える工程と、複数の細胞成分についてのマッチングスコアを組み合わせて、摂動についてのマッチングスコアを生成する工程と、摂動についてのマッチングスコアに基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含み得る。マッチングスコアは、別個のスコア又は連続したスコアを含み得る。重要度スコアを置き換える工程は、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びその細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも上方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が上方制御され、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が下方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含み得る。或いは、重要度スコアを置き換える工程は、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びその細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも下方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が下方制御され、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が上方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含み得る。
【００４８】
本明細書に開示される方法の代替的な実施形態において、マッチングスコアは、摂動シグネチャーの細胞成分に関連する重要度スコアを置き換えるのに使用されない。そうではなく、代替的な実施形態において、摂動シグネチャーは、複数の細胞成分を含むことができ、各細胞成分は、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連する。このような実施形態において、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程は、複数の細胞成分についての重要度スコアを単に組み合わせて、摂動についての重要度スコアを生成する工程と、摂動についての重要度スコアに基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含み得る。
【００４９】
ある実施形態において、摂動についてのマッチングスコアについての偽細胞成分発見率が、摂動への信頼度を決定するために推定される。このような実施形態において、偽細胞成分発見率は、複数の細胞成分の各細胞成分についての経験的な周辺発現頻度（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を計算し、複数の細胞成分についての経験的な周辺発現頻度を、それらの組合せにわたって合計して、独立に分布した発現を偶然呈するいくつかの細胞成分を同定する確率を生成し、確率に基づいて、摂動についてのマッチングスコアについての偽細胞成分発見率を推定することによって、推定される。
【００５０】
特定の実施形態において、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程は、摂動の共変量に依存する。例えば、ある実施形態において、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程は、摂動の共変量の閾値量が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連していることを決定する工程、及び決定に応答して、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連していることを決定する工程を含み得る。特定の実施形態において、摂動は、小分子への細胞の曝露を含み得る。摂動の共変量は、小分子の特定の用量、摂動細胞が小分子に曝される時間に対する、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞成分の発現の差が測定される時間、及び摂動細胞の細胞株を含み得る。
【００５１】
特定の実施形態において、細胞成分は、遺伝子を含み得る。単一細胞細胞成分の発現データセットは、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ又は集合からなる群から選択される方法を用いて生成され得る。
【００５２】
本明細書に開示される方法のある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの少なくとも１つが、データベースから得られる。摂動シグネチャーは、複数の摂動について複数の摂動シグネチャーを含むデータベースから得ることができる。このような実施形態において、データベース中の複数の摂動の各摂動について、摂動についての摂動シグネチャーは、データベースからアクセスされ、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの比較に基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかが決定される。
【００５３】
本明細書に開示される方法のさらなる実施形態において、本方法は、複数の摂動細胞から複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程と、複数の摂動シグネチャーのそれぞれについて、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの比較に基づいて、摂動シグネチャーに関連する摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定することによって、変化した細胞状態を促進する摂動についてスクリーニングする工程とをさらに含み得る。摂動シグネチャーが、変化した細胞状態を促進する摂動についてスクリーニングされるこのような実施形態において、複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程は、細胞を複数の摂動に曝して、複数の摂動細胞を生成する工程と、複数の摂動細胞から細胞成分量を測定する工程とを含み得る。
【００５４】
本方法は、変化した細胞状態を促進する摂動を同定する工程をさらに含み得る。変化した細胞状態を促進する工程は、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の細胞状態から変化した細胞状態への移行を促進する工程を含み得る。或いは、変化した細胞状態を促進する工程は、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の状態、又は、任意に、変化した細胞状態以外の状態における細胞の数に対する、別の状態における細胞の数の比率を増加させる工程を含み得る。さらなる代替的な実施形態において、変化した細胞状態を促進する工程は、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、変化した細胞状態における細胞の絶対数を増加させる工程を含み得る。さらに他の代替的な実施形態において、変化した細胞状態を促進する工程は、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の細胞状態又は、任意に、変化した細胞状態以外の状態における細胞の絶対数を減少させる工程を含み得る。
【００５５】
特定の実施形態において、細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、異なるタイプの細胞成分を用いて生成され得る。例えば、細胞の移行シグネチャーは、ＲＮＡ発現（例えば、ＲＮＡ転写物の数）に基づいて生成され得、摂動シグネチャーは、タンパク質発現（例えば、アミノ酸の数）に基づいて生成され得る。代替的な実施形態において、細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは、同じタイプの細胞成分を用いて生成され得る。例えば、細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーは両方とも、ＲＮＡ発現（例えば、ＲＮＡ転写物の数）に基づいて生成され得る。
【００５６】
別の態様において、本開示は、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程を含む方法を提供する。本方法は、複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程をさらに含み、各摂動シグネチャーが、摂動に曝されていない非摂動細胞と摂動に曝された摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動に関連する。本方法は、単一細胞の移行シグネチャー及び複数の摂動シグネチャーの比較に基づいて、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する摂動のサブセットを決定する工程をさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態において、各摂動シグネチャーは、複数の細胞成分を含み、各細胞成分は、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連する。このような実施形態において、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する摂動のサブセットを決定する工程は、各摂動シグネチャーについて、各細胞成分についての重要度スコアを、細胞成分についてのマッチングスコアで置き換える工程と、複数の細胞成分についてのマッチングスコアを組み合わせて、摂動についてのマッチングスコアを生成する工程とを含む。次に、本方法は、摂動を、それらのマッチングスコアにしたがってランク付けする工程と、摂動のランク付けされたリストに基づいて、摂動のサブセットを選択する工程とをさらに含む。
【００５８】
別の態様において、本明細書に開示される本開示は、命令が符号化された非一時的なコンピュータ可読記録媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供する。プロセッサによって実行されるとき、符号化された命令は、プロセッサに、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれかを実行させる。さらに別の態様において、本明細書に開示される本発明は、命令が符号化された非一時的なコンピュータ可読記録媒体を含むシステムを提供する。プロセッサによって実行されるとき、符号化された命令は、プロセッサに、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれかを実行させる。
【００５９】
さらに別の態様において、本開示は、ニューロン及び／又は「前駆」細胞を促進するための方法を提供する。本方法は、線維芽細胞の開始集団を、線維芽細胞の開始集団の、「前駆」細胞及び／又はニューロンへの移行を促進する摂動シグネチャーを有する摂動に曝す工程を含む。このような実施形態において、摂動シグネチャーは、Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ９４１、Ｔａｆ５Ｂ、Ｓｔ１８、Ｚｋｓｃａｎ１６、Ｃａｍｔａ１、及びＡｒｎｔ２の１つ以上の増大した活性、及び／又はＡｓｃｌ１、Ａｔｆ３、Ｒｏｒｃ、Ｓｃｘ、Ｓａｔｂ１、Ｅｌｆ３、及びＦｏｓの１つ以上の低下した活性である。
【００６０】
ニューロン及び／又は「前駆」細胞を促進するための方法の特定の実施形態において、ニューロン及び／又は「前駆」細胞は、ニューロン及び／又は「前駆」細胞の絶対数を増加させること、線維芽細胞の絶対数を減少させること、線維芽細胞の、ニューロン及び／又は「前駆」細胞への移行を促進すること、ニューロン又は「前駆」細胞の寿命を促進すること、線維芽細胞の寿命を減少させること、又は線維芽細胞に対するニューロン及び／又は「前駆」細胞の比率を増加させることのうちの１つ以上によって促進される。さらなる実施形態において、摂動は、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない。
【００６１】
さらに別の態様において、本開示は、ニューロン及び／又は「前駆」細胞の量を増加させる方法を提供する。本方法は、線維芽細胞の集団を、線維芽細胞の集団の、ニューロンへの移行を促進する摂動シグネチャーを有する医薬組成物に曝す工程を含む。医薬組成物は、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、トリコスタチンＡ、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４、ゲルダナマイシン、マヌマイシンＡ、ミトキサントロン、クルクミン、アルボシジブ、ボリノスタット、ＫＩ２０２２７、又は上記の組合せ、例えば、上記の２、３、４、５つ、若しくはそれ以上の組合せを含む。ある実施形態において、医薬組成物は、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない。
【００６２】
さらに別の態様において、本開示は、ニューロン及び／又は「前駆」細胞を促進するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、トリコスタチンＡ、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４、ゲルダナマイシン、マヌマイシンＡ、ミトキサントロン、クルクミン、アルボシジブ、ボリノスタット、ＫＩ２０２２７、又は上記の組合せからなる群から選択される摂動、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。ある実施形態において、摂動は、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない。
【００６３】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に開示される医薬組成物の１つを含む単位剤形を提供する。
【００６４】
さらに別の態様において、本開示は、線維芽細胞の開始集団の、ニューロン及び／又は「前駆」細胞への移行を促進するための候補の摂動を同定する方法を提供する。本方法は、線維芽細胞の開始集団を摂動に曝す工程と、摂動についての摂動シグネチャーを同定する工程とを含む。摂動についての摂動シグネチャーは、１つ以上の細胞成分及び各細胞成分に関連する重要度スコアを含む。各細胞成分の重要度スコアは、線維芽細胞の集団の、摂動への曝露の後、細胞成分の発現の変化と、線維芽細胞の集団の、ニューロン及び／又は「前駆」細胞への細胞状態の変化との間の関連性を定量する。摂動シグネチャーは、Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ９４１、Ｔａｆ５Ｂ、Ｓｔ１８、Ｚｋｓｃａｎ１６、Ｃａｍｔａ１、及びＡｒｎｔ２の１つ以上の増大した活性、及び／又はＡｓｃｌ１、Ａｔｆ３、Ｒｏｒｃ、Ｓｃｘ、Ｓａｔｂ１、Ｅｌｆ３、及びＦｏｓの１つ以上の低下した活性を含む。本方法は、摂動シグネチャーに基づいて、線維芽細胞の集団の、ニューロン及び／又は「前駆」細胞への移行を促進するための候補の摂動として摂動を同定する工程をさらに含む。
【００６５】
本開示のさらに別の態様は、非一時的なコンピュータ可読記録媒体を提供し、ここで、非一時的なコンピュータ可読記録媒体は、命令を記憶し、命令は、コンピュータシステムによって実行されるとき、コンピュータシステムに、本開示に記載される細胞を分析するための方法のいずれかを実行させる。
【００６６】
本明細書に開示される実施形態は、添付の図面において、限定としてではなく、例として示されている。類似の参照番号は、図面を通して対応する部分を指す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本開示の一実施形態に係る、例示的なシステム及び計算装置のブロック図を示す。
【図２】本開示の様々な実施形態に係る、細胞を分析するためのプロセスのフローチャート及びシステムの特徴を提供し、ここで、破線のボックス中の要素は任意選択である。
【図３】本開示の一実施形態に係る、異なって発現された細胞成分のセットを決定するための細胞成分の発現の差のアッセイの第１の例についてのフローチャートである。
【図４Ａ】本開示の一実施形態に係る、ある期間にわたって誘導された細胞状態の移行の軌道を辿るタイムラインを示す。
【図４Ｂ】本開示の一実施形態に係る、補足的な表１中例の行列Ｎについての力指向レイアウトアルゴリズムによって生成された多様体を示す。
【図５Ａ】本開示の一実施形態に係る、図５Ｂの多様体を示す。
【図５Ｂ】本開示の一実施形態に係る、図４Ｂの多様体中の点として示される測定日のそれぞれにおける細胞のそれぞれの中のＢＡＭ転写因子のそれぞれの発現のレベルを示す。
【図６】本開示の一実施形態に係る、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色された、Ａｓｃｌ１転写因子の発現が強制されたＭＥＦ細胞の画像、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色されたマウスニューロンの画像、並びにＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色された、Ａｓｃｌ１転写因子の発現が強制されていないＭＥＦ細胞の画像を示す。
【図７Ａ】本開示の一実施形態に係る、図４Ｂの多様体を、クラスタリングによって同定されるクラスターＣｊにグループ分けされた多様体中の点とともに示す。
【図７Ｂ】本開示の一実施形態に係る、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連することが文献において知られている転写因子及び知られていない転写因子の両方を示す。
【図８Ａ】本開示の一実施形態に係る、図４Ａに関して説明されるＭＥＦ細胞についての移行軌道のマップを示す。
【図８Ｂ】本開示の一実施形態に係る、細胞が図８Ａの移行軌道のマップにおける第１の状態から第２の状態へと移行するように細胞中の遺伝子発現を変化させることによって細胞の移行軌道に影響を与える摂動を同定するための方法を示す。
【図９】本開示の一実施形態に係る、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連する小分子摂動を示す。
【図１０Ａ】本開示の一実施形態に係る、各処理条件についてのニューロンの総数を示す棒グラフを提供し、ここで、ニューロンの総数が、陽性Ｔｕｊ１／Ｍａｐ２シグナル及び神経形態に基づいて手動で計数され、各実験について、各処理条件のデータが、ＤＭＳＯ処理されたウェル中のニューロンの数によって正規化された。
【図１０Ｂ】本開示の一実施形態に係る、各処理条件についてのニューロンパーセントを示す棒グラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
ここで、実施形態への言及が詳細になされ、その例が、添付の図面に例示される。以下の詳細な説明において、多くの具体的な詳細が、本開示の十分な理解を提供するために記載される。しかしながら、本開示が、これらの具体的な詳細なしで実施され得ることが、当業者に明らかであろう。他の例では、周知の方法、手順、構成要素、回路、及びネットワークは、実施形態の態様を不必要に分かりにくくしないように、詳細に記載されていない。
【００６９】
複数の例が、単一の例として本明細書に記載される構成要素、操作又は構造のために提供され得る。最後に、様々な構成要素、操作、及びデータストアの間の境界は、いくらか任意であり、特定の操作が、特定の例示的な形態に関連して示される。他の形態の機能が想定され、実施の範囲内に含まれ得る。一般に、例の形態における別個の構成要素として示される構造及び機能は、組み合わされた構造又は構成要素として実現され得る。同様に、単一の構成要素として示される構造及び機能は、別個の構成要素として実現され得る。これらの及び他の変形、変更、追加、及び改良は、本実施の範囲内に含まれる。
【００７０】
「第１」、「第２」などの用語は、本明細書において様々な要素を表すのに使用され得るが、これらの要素は、これらの用語によって限定されるべきではないことも理解されるであろう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するために使用されるに過ぎない。例えば、第１のデータセットは、第２のデータセットと呼ばれ得、同様に、第２のデータセットは、本発明の範囲から逸脱せずに、第１のデータセットと呼ばれ得る。第１のデータセット及び第２のデータセットは両方ともデータセットであるが、それらは、同じデータセットではない。
【００７１】
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施を説明するためのものであるに過ぎず、特許請求の範囲を限定することは意図されていない。実施の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味に解釈すべき場合を除き、複数形も含むことが意図される。本明細書において使用される際の「及び／又は」という用語が、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる可能な組合せを指し、包含することも理解されるであろう。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書において使用されるとき、記載される特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を除外しないことがさらに理解されるであろう。
【００７２】
本明細書において使用される際、「場合」という用語は、文脈に応じて、記載される前提条件が真である「とき」又は真である「と」又は真であるという「決定に応じて」又は「決定にしたがって」又は「検出に応じて」を意味するものと解釈され得る。同様に、「（記載される前提条件が真であると）決定される場合」又は「（記載される前提条件が真である）場合」又は「（記載される前提条件が真である）とき」という語句は、文脈に応じて、記載される前提条件が真であると「決定すると」又は真であるという「決定に応じて」又は「決定にしたがって」又は真であると「検出すると」又は真であるという「検出に応じて」を意味するものと解釈され得る。
【００７３】
さらに、参照番号が「第ｉ（ｉｔｈ）」表記で示されるとき、参照番号は、包括的な構成要素、セット、又は実施形態を指す。例えば、「細胞成分ｉ」と称される細胞成分は、複数の細胞成分中の第ｉの（ｉｔｈ）細胞成分を指す。
【００７４】
上記の説明は、例示的な実施を実現するシステム、方法、技術、命令シーケンス、及び計算機械プログラム製品の例を含む。説明のために、多くの具体的な詳細が、本発明の主題の様々な実施の理解を提供するために記載される。しかしながら、本発明の主題の実施が、これらの具体的な詳細なしで行われ得ることが当業者には明らかであろう。一般に、周知の命令の例、プロトコル、構造及び技術は、詳細に示されていない。
【００７５】
上記の説明は、説明のために、特定の実施に関して記載されている。しかしながら、以下の例示的な説明は、包括的であること又は開示される正確な形態に実施を限定することは意図されていない。多くの変更及び変形が、上記の教示を考慮して可能である。実施は、原理及びそれらの実際の適用を最良に説明し、それによって他の当業者が、実施及び様々な変更を伴う様々な実施を、考えられる特定の使用に合うように最良に利用することができるように選択及び記載される。
【００７６】
明確にするために、本明細書に記載される実施の所定の特徴の全てが、示され、記載されているわけではない。いずれかのこのような実際の実施の発生の際、多くの実施に固有の決定が、使用事例及び事業に関連する制約の順守などの、設計者の具体的な目的を達成するためになされること、及びこれらの具体的な目的が、ある実施と別の実施とで及びある設計者と別の設計者とで異なることが理解されるであろう。さらに、このような設計努力は複雑で時間のかかるものであり得るが、それにもかかわらず本開示の利益を有する当業者の日常的な業務であることが理解されるであろう。
【００７７】
本明細書の一部は、情報に関する操作のアルゴリズム及び記号表現に関して、本発明の実施形態を説明している。これらのアルゴリズム的記述及び表現は、研究の内容を他の当業者に効果的に伝えるために、データ処理の分野の当業者によって一般的に使用される。これらの操作は、機能的に、計算的に、又は論理的に記述されるが、コンピュータプログラム又は同等の電気回路、マイクロコードなどによって実施されることが理解される。
【００７８】
本明細書において使用される文言は、主に、読みやすさ及び説明のために選択されているが、本発明の主題の境界を明示するか又はそれを制限するように選択されていないことがある。したがって、本発明の範囲は、この詳細な説明によって限定されず、それに基づいて本出願を発行する特許請求の範囲によって限定されることが意図される。したがって、本発明の実施形態の開示内容は、例示的なものであることが意図され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７９】
一般に、特許請求の範囲及び本明細書において使用される用語は、当業者によって理解される通常の意味を有するものと解釈されることが意図される。いくつかの用語が、さらなる明瞭性を提供するために以下に定義される。通常の意味と提供される定義との間に矛盾がある場合、提供される定義が使用されるものとする。
【００８０】
本明細書に直接定義されていない用語は、本発明の技術分野内で理解されるような、それらに一般的に関連する意味を有することが理解されるべきである。いくつかの用語が、本発明の態様の組成物、デバイス、方法など、及びそれらの作製又は使用方法を説明する際に実行者にさらなる指針を提供するために本明細書に記載されている。同じことが、２つ以上の方法でも言えることが理解されるであろう。結果として、代替的な文言及び同義語が、本明細書に記載される用語のいずれか１つ以上に使用され得る。用語が本明細書において詳述又は説明されているか否かについては重要視されるべきではない。いくつかの同義語又は代替可能な方法、材料などが提供される。明記されない限り、１つ又はいくつかの同義語又は同等物の記載は、他の同義語又は同等物の使用を除外しない。用語の例を含む、例の使用は、例示のためのものに過ぎず、本明細書における本発明の態様の範囲及び意味を限定するものではない。
【００８１】
本明細書において使用される際、細胞（例えば、細胞の摂動又は細胞摂動）に関して「摂動」という用語は、１つ以上の化合物による細胞の任意の処理を指す。これらの化合物は、「摂動因子（ｐｅｒｔｕｒｂａｇｅｎ）」と呼ばれ得る。ある実施形態において、摂動因子は、例えば、小分子、生物製剤、タンパク質、小分子と組み合わされたタンパク質、ＡＤＣ、核酸、例えばｓｉＲＮＡ若しくは干渉ＲＮＡ、ｃＤＮＡ過剰発現野生型及び／又は突然変異型ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ過剰発現野生型及び／又は突然変異型ガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９システム若しくは他の遺伝子編集システム）、又は上記のいずれかの任意の組合せを含み得る。
【００８２】
本明細書において使用される際、細胞（例えば、前駆細胞）に関して「前駆」という用語は、１つの細胞状態から少なくとも１つの他の細胞状態へと移行することが可能な任意の細胞を指す。
【００８３】
本明細書において使用される際、細胞又は複数の細胞についての細胞成分の発現測定に関して「データセット」という用語は、ある文脈において、単一細胞から収集されるデータの高次元セット（例えば、単一細胞細胞成分の発現データセット）を指し得る。他の文脈において、「データセット」という用語は、単一細胞から収集されるデータの複数の高次元セット（例えば、複数の単一細胞細胞成分の発現データセット）を指し得、複数のデータの各セットは、複数の細胞の１つ細胞から収集される。
【００８４】
本明細書において使用される際、「影響を与える」という用語は、細胞の移行の変化を指す。
【００８５】
Ｉ．例示的なシステムの実施形態
本開示のいくつかの態様の概説及び本開示において使用されるいくつかの定義が提供されてきたが、例示的なシステムの詳細が、図１とともに記載される。
【００８６】
図１は、本開示のある実施形態に係るシステム１００を示すブロック図を提供する。システム１００は、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかの予測を提供する。図１において、システム１００は、計算装置として示される。当然ながら、コンピュータシステム１００の他のトポロジーが可能である。例えば、ある実施形態において、システム１００は、実際に、ネットワーク中で一緒にリンクされたいくつかのコンピュータシステムを構成し得るか、又はクラウドコンピューティング環境における仮想マシン若しくは容器であり得る。したがって、図１に示される例示的なトポロジーは、当業者に容易に理解されるように本開示の一実施形態の特徴を説明する役割を果たすに過ぎない。
【００８７】
図１を参照すると、ある実施形態において、コンピュータシステム１００（例えば、計算装置）は、ネットワークインターフェース１０４を含む。ある実施形態において、ネットワークインターフェース１０４は、システム内のシステム１００計算装置を、互いに、並びに任意選択の外部のシステム及びデバイスと、１つ以上の通信ネットワークを介して（例えば、ネットワーク通信モジュール１１８を介して）相互接続する。ある実施形態において、ネットワークインターフェース１０４は、任意に、インターネット、１つ以上のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、１つ以上の広域ネットワーク（ＷＡＮ）、他のタイプのネットワーク、又はこのようなネットワークの組合せを介して、ネットワーク通信モジュール１１８を介して通信を提供する。
【００８８】
ネットワークの例としては、ワールドワイドウェブ（ＷＷＷ）、イントラネット及び／又は無線ネットワーク、例えば携帯電話ネットワーク、無線ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／又はメトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、及び無線通信による他のデバイスが挙げられる。無線通信は、任意に、移動通信用のグローバルシステム（ＧＳＭ）、エンハンストデータＧＳＭ環境（ＥＤＧＥ）、高速ダウンリンクパケットアクセス（ＨＳＤＰＡ）、高速アップリンクパケットアクセス（ＨＳＵＰＡ）、エボリューション、データオンリー（ＥＶ−ＤＯ）、ＨＳＰＡ、ＨＳＰＡ＋、デュアルセルＨＳＰＡ（ＤＣ−ＨＳＰＤＡ）、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）、近距離無線通信（ＮＦＣ）、広帯域符号分割多元接続（Ｗ−ＣＤＭＡ）、符号分割多元接続（ＣＤＭＡ）、時分割多元接続（ＴＤＭＡ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｗｉ−Ｆｉ）（例えば、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ａ、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ａｃ、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ａｘ、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ｂ、ＩＥＥＥ  ８０２．１１ｇ及び／又はＩＥＥＥ  ８０２．１１ｎ）、ボイスオーバーインターネットプロトコル（ＶｏＩＰ）、Ｗｉ−ＭＡＸ、電子メール用のプロトコル（例えば、インターネットメッセージアクセスプロトコル（ＩＭＡＰ）及び／又はポストオフィスプロトコル（ＰＯＰ））、インスタントメッセージング（例えば、拡張メッセージング及びプレゼンスプロトコル（ＸＭＰＰ）、インスタントメッセージング及びプレゼンスレベレイジングエクステンション用のセッションイニシエーションプロトコル（ＳＩＭＰＬＥ）、インスタントメッセージング及びプレゼンスサービス（ＩＭＰＳ））、及び／又はショートメッセージサービス（ＳＭＳ）を含む複数の通信規格、プロトコル及び技術のいずれか、又は本明細書の出願日の時点でまだ開発されていない通信プロトコルを含む任意の他の好適な通信プロトコルを使用する。
【００８９】
システム１００は、ある実施形態において、１つ以上の処理装置（ＣＰＵ）１０２（例えば、プロセッサ、処理コアなど）、１つ以上のネットワークインターフェース１０４、ユーザによる使用のための（任意に）ディスプレー１０８及び入力システム１１０（例えば、入出力インターフェース、キーボード、マウスなど）を含むユーザーインターフェース１０７、メモリ（例えば、非永続的メモリ１１１、永続的メモリ１１２）、及び上記の構成要素を相互接続するための１つ以上の通信バス１１４を含む。１つ以上の通信バス１１４は、任意に、システム構成要素間の通信を相互接続及び制御する回路（チップセットと呼ばれることもある）を含む。非永続的メモリ１１１が、典型的に、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリなどの高速ランダムアクセスメモリを含む一方、永続的メモリ１１２は、典型的に、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）又は他の光学記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置又は他の磁気記憶デバイス、磁気ディスク記憶デバイス、光ディスク記憶デバイス、フラッシュメモリデバイス、又は他の不揮発性ソリッドステート記憶デバイスを含む。永続的メモリ１１２は、任意に、ＣＰＵ１０２から遠隔に配置された１つ以上の記憶デバイスを含む。永続的メモリ１１２、及び非永続的メモリ１１２内の不揮発性メモリデバイスは、非一時的なコンピュータ可読記録媒体を含む。ある実施形態において、非永続的メモリ１１１或いは非一時的なコンピュータ可読記録媒体は、以下のプログラム、モジュール及びデータ構造、又はそのサブセットを、場合により、永続的メモリ１１２とともに保存する：
・様々な基本システムサービスを処理するため及びハードウェアに依存するタスクを実行するための手順を含む、オペレーティングシステム１１６（例えば、ＡＮＤＲＯＩＤ、ｉＯＳ、ＤＡＲＷＩＮ、ＲＴＸＣ、ＬＩＮＵＸ、ＵＮＩＸ、ＯＳ  Ｘ、ＷＩＮＤＯＷＳ、又はＶｘＷｏｒｋなどの組み込みオペレーティングシステム）；
・システム１００を、他のデバイス及び／又は通信ネットワーク１０４と接続するための任意選択のネットワーク通信モジュール（又は命令）１１８；
・複数のデータセット１２２を保存するデータセットストア１２０（各データセットは、１つ以上の識別子（例えば、サンプル識別子１２４及び／又は細胞／データセット識別子１２６）、関連する期間１２８、及び１つ以上の細胞成分１３２を含む細胞成分ベクトル１３０を含む）；並びに
・１つ以上の単一細胞の移行シグネチャー１４２及び１つ以上の摂動シグネチャー１５０を保存するシグネチャーストア１４０。
【００９０】
上述されるように、データセットストア１２０は、複数のデータセット１２０を含む。各データセットが、細胞の集団（例えば、それぞれのサンプル）の単一細胞の測定（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）から得られる（例えば、収集される、通信されるなど）。各データセット１２２に関連するサンプル識別子（ＩＤ）１２４は、どのサンプルに細胞のデータセットが由来するかを示す。細胞／データセット識別子１２６は、どの細胞及び／又は複数のデータセット（例えば、データセットのサブセット）にデータセット１２２が関連するか及び／又は細胞の状態を示す。ある実施形態において、期間１２８は、データセット１２２の捕捉の期間（例えば、細胞が最初に培養される第１の期間ｔ０、細胞発現の測定が行われる第２の期間ｔ１などの、細胞の増殖中の時間）に関連する。
【００９１】
さらに、ある実施形態において、各データセット１２０は、１つ以上の細胞成分１３２を含む細胞成分ベクトル１３０を含む。ある実施形態において、１つ以上の細胞成分１３２は、細胞の全ての細胞成分又は細胞のこれらの細胞成分のサブセットを含む。各細胞成分１３２は、測定（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）に関連するデータの次元を表す。一般に、データセット１２２は、多量のデータを含む高い（例えば、３を超える、５を超える、１０を超える、１００を超えるなどの）次元を含む。さらに、ある実施形態において、各データセット１２２は、「前駆」細胞型から（例えば、第１の状態から変化した状態へと）移行された複数の細胞中の細胞から（例えば、サンプルから）得られる。
【００９２】
ある実施形態において、システムは、１つ以上の単一細胞の移行シグネチャー１４２及び１つ以上の摂動シグネチャー１５０を保存するシグネチャーストア１４０を含む。ある実施形態において、１つ以上の単一細胞の移行シグネチャー１４２は、１つ以上の所定のシグネチャー（例えば、トレーニングシグネチャー）を含む。ある実施形態において、１つ以上の単一細胞の移行シグネチャー１４２は、システム１００によって決定され、及び／又は将来の使用のためにシステム内に保存される単一細胞の移行シグネチャーを含む。各単一細胞の移行シグネチャー１４２は、複数の細胞成分（例えば、図１の細胞成分１３２−１−１〜１３２−１−Ｄ）をさらに含む細胞成分の同定１４４を含む。さらに、単一細胞の移行シグネチャー１４２に関連する各細胞成分１３２は、対応する重要度スコア１３４を含む。ある実施形態において、次元削減が、データセット１２２に対して行われ（例えば、図３の次元削減３２０）、これは、複数の次元削減成分１４８（例えば、図１の次元削減成分１４８−１−１から次元削減成分１４８−１−Ｆ）を生成する（例えば、図１の次元削減成分ストア１４６−１内に保存する及び／又は図３の行列Ｍを生成する）。したがって、システム１００は、ある実施形態において、次元削減（例えば、図３の次元削減３２０）を行って、複数の次元削減成分１４８を生成して（例えば、図３の行列Ｍを生成する）、データセット１２２の細胞成分１３２中に存在する潜在的パターンを保存する。ある実施形態において、この次元削減（例えば、図１の次元削減成分削減成分１４８−１−１〜１４８−１−Ｆ）の出力は、行列（例えば、以下に示される行列Ｍ）であり、これは、データセットの基本的な潜在構造も維持しながらデータセット１２２を圧縮形態で符号化する。
【００９３】
ある実施形態において、シグネチャー移行ストアは、多様体１４９を含む。ある実施形態において、この多様体１４９は、単一細胞の移行シグネチャー１４２の対応する次元削減成分１４８に関連する。この多様体１４９は、多様体に関連するデータセット１２２（例えば、単一細胞の移行シグネチャー１４２に関連するデータセット１２２）の細胞成分ベクトル１３０を用いて多様体学習を行うことによって同定される。
【００９４】
シグネチャーストア１４０は、対応する摂動に関連する１つ以上の摂動シグネチャー１５０をさらに含む。各摂動シグネチャーは、複数の細胞成分（例えば、図１の細胞成分１３２−１−１〜１３２−１−Ｈ）を含む細胞成分の同定１５２を含む。ある実施形態において、細胞成分の同定１５２の細胞成分は、対応する単一細胞の移行シグネチャー１４４に関連する細胞成分の一部又は全てを含む（例えば、摂動シグネチャー１５０−１の細胞成分の同定１５２は、図１の単一細胞の移行シグネチャー１４２−１の細胞成分の同定１４４のサブセットを含む）。さらに、摂動シグネチャー１５０の各細胞成分は、対応する重要度スコア１３４を含む。
【００９５】
様々な実施形態において、上で同定される要素の１つ以上が、上述されたメモリデバイスの１つ以上に保存され、上述される機能を実行するための一連の命令に対応する。上で同定されるモジュール、データ、又はプログラム（例えば、一連の命令）は、別個のソフトウェアプログラム、手順、データセット、又はモジュールとして実装される必要はなく、したがって、これらのモジュール及びデータの様々なサブセットは、様々な実施において組み合わされても又は他の形で再構成されてもよい。ある実施において、非永続的メモリ１１１は、任意に、上で同定されるモジュール及びデータ構造のサブセットを保存する。さらに、ある実施形態において、メモリは、上述されていないさらなるモジュール及びデータ構造を保存する。ある実施形態において、上で同定される要素の１つ以上は、システム１００が必要に応じてこのようなデータの全て又は一部を読み出し得るようにシステム１００によってアドレス可能な、システム１００のもの以外のコンピュータシステムに保存される。
【００９６】
図１は、「システム１００」を示すが、この図は、本明細書に記載される実施の構造概略図としてより、コンピュータシステム中に存在し得る様々な特徴の機能記述として意図される。実際には、当業者によって認識されるように、別々に示される項目は、組み合わされてもよく、いくつかの項目は、分離され得る。さらに、図１は、非永続的メモリ１１１中の特定のデータ及びモジュールを示すが、これらのデータ及びモジュールの一部又は全ては、その代わりに、永続的メモリ１１２又は２つ以上のメモリに保存され得る。例えば、ある実施形態において、少なくともデータセットストア１２０が、クラウドベースのインフラストラクチャの一部であり得る遠隔記憶デバイスに保存される。ある実施形態において、少なくともデータセットストア１２０が、クラウドベースのインフラストラクチャに保存される。ある実施形態において、データセットストア１２０及びシグネチャーストア１４０はまた、遠隔記憶デバイスに保存され得る。
【００９７】
本開示に係るシステムは、図１を参照して開示されているが、本開示に係る方法２００が、ここで、図２を参照して詳述される。
【００９８】
ブロック２０２．図２のブロック２０２を参照すると、本方法は、単一細胞の移行シグネチャー（例えば、図１の単一細胞の移行シグネチャー１４２−１）に（例えば、電子的形態で）アクセスする工程を含む。単一細胞の移行シグネチャー１４２は、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。変化した細胞状態は、第１の細胞状態から変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じる。単一細胞の移行シグネチャー１４２は、複数の細胞成分の同定（例えば、図１の細胞成分の同定１４４−１）を含む。複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について（例えば、図１の細胞成分１３２−１−１〜細胞成分１３２−１−Ｄ）、対応する第１の重要度スコア（例えば、重要度スコア１３４−１−１）は、それぞれの細胞成分の発現の変化と、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する。
【００９９】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程は、単一細胞の移行シグネチャー１４２を決定する工程を含む。この決定する工程は、第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット（例えば、データセット１２２−１、データセット１２２−２、及びデータセット１２２−３）、並びに第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット（例えば、データセット１２２−４、データセット１２２−５、及びデータセット１２２−６）に基づく。第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第１の単一細胞細胞成分の発現データセット１２２が、第１の細胞状態の第１の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）。さらに、第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第２の単一細胞細胞成分の発現データセットが、変化した細胞状態の第２の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）。
【０１００】
ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程は、複数の細胞成分１３２にわたる細胞成分量の差を決定する工程を含む。この差は、第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセットと第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の差である。ある実施形態において、この差は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、又は一般化線形モデルのうちの１つを用いて決定される。
【０１０１】
ある実施形態において、第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセット１２２が、第１の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトル（例えば、図１のデータセット１２２−１の細胞成分ベクトル１３０−１）を含む。さらに、第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第２の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトル（例えば、データセット１２２−２の細胞成分ベクトル１３０−２）を含む。第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルが、複数の要素を含む。それぞれの細胞成分ベクトル１３０中の各それぞれの要素が、複数の細胞成分中の対応する細胞成分１３２に関連しており、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットのそれぞれのデータセットによって表される対応する単一細胞についての対応する細胞成分の量を表す対応する値（例えば、表２の細胞成分及び値）を含む。
【０１０２】
さらに、ある実施形態において、細胞成分１３２は、複数の遺伝子を含む。さらに、ある実施形態において、１つ以上のデータセット１２２が、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ（例えば、表１の方法）を含む方法を用いて生成される。
【０１０３】
ブロック２０４．ブロック２０４を参照すると、本方法は、摂動シグネチャー（例えば、図１の摂動シグネチャー１５０−１）に（例えば、電子的形態で）アクセスする工程をさらに含む。摂動シグネチャー１５０は、複数の非摂動細胞と摂動に曝された複数の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す。摂動シグネチャー１５０は、複数の細胞成分の全て又は一部の同定（例えば、図１の細胞成分の同定１５２−１）を含む。複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について（例えば、図１の細胞成分１３２−３−１〜細胞成分１３２−３−Ｄ）、複数の非摂動細胞と複数の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、複数の非摂動細胞と複数の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコア（例えば、図１の重要度スコア１３４）。
【０１０４】
ある実施形態において、方法２００は、第１及び／又は第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット１２２に対して次元削減（例えば、図３の次元削減３２０）を行う工程を含む。この次元削減は、複数の次元削減成分（例えば、図１の次元削減成分１４８）を生成する。ある実施形態において、次元削減は、主成分アルゴリズム、ランダム射影アルゴリズム、独立成分分析アルゴリズム、又は特徴選択方法．因子分析アルゴリズム、サモンマッピング、曲線成分分析、確率的近傍埋め込み法（ＳＮＥ）アルゴリズム、Ｉｓｏｍａｐアルゴリズム、最大分散アンフォールディングアルゴリズム、局所線形埋め込みアルゴリズム、ｔ−ＳＮＥアルゴリズム、非負値行列因子分解アルゴリズム、カーネル主成分分析アルゴリズム、グラフベースのカーネル主成分分析アルゴリズム、線形判別分析アルゴリズム、一般化判別分析アルゴリズム、一様多様体近似及び投影（ＵＭＡＰ）アルゴリズム、ＬａｒｇｅＶｉｓアルゴリズム、ラプラス固有写像（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  Ｅｉｇｅｎｍａｐ）アルゴリズム、又はフィッシャーの線形判別分析アルゴリズムである。例えば、Ｆｏｄｏｒ，２００２，“Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＵＣＲＬ−ＩＤ−１４８４９４；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，２００７，“Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＵＣＤ−ＣＳＩ−２００７−７，Ｚａｈｏｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，“Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｓｐｅｅｃｈ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”，Ｓｐｅｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｄｏｉ：１０．５７７２／１６８６３．ＩＳＢＮ  ９７８−９５３−３０７−９９６−７；及びＬａｋｓｈｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，“２０１６  ＩＥＥＥ  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ＩＡＣＣ）”，ｐｐ．３１−３４．ｄｏｉ：１０．１１０９／ＩＡＣＣ．２０１６．１６，ＩＳＢＮ  ９７８−１−４６７３−８２８６−１（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。したがって、ある実施形態において、次元削減は、主成分分析（ＰＣＡ）アルゴリズムであり、各それぞれの抽出された次元削減成分は、ＰＣＡによって得られるそれぞれの主成分を含む。このような実施形態において、複数の主成分中の主成分の数は、ＰＣＡアルゴリズムによって計算される主成分の閾値数に限定され得る。主成分の閾値数は、例えば、５、１０、２０、５０、１００、１０００、１５００、又は任意の他の数であり得る。ある実施形態において、ＰＣＡアルゴリズムによって計算される各主成分は、ＰＣＡアルゴリズムによって固有値を割り当てられ、第１の複数の抽出された特徴の対応するサブセットが、最も高い固有値を割り当てられた主成分の閾値数に限定される。第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル１３０中の各それぞれの細胞成分ベクトルについて、複数の次元削減成分が、それぞれの細胞成分ベクトルに適用されて、複数の次元削減成分中の各それぞれの次元削減成分についての次元削減成分値を含む対応する次元削減ベクトルを形成する（例えば、図３の行列Ｍを形成する）。これにより、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルが形成される。さらに、ある実施形態において、本方法は、クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程を含む（例えば、図３のクラスタリング３４０）。各クラスターは、第１及び第２の複数の次元削減ベクトルのサブセットに対応する複数の点を含む。クラスターのセットＣｊの第１のクラスターからの第１の複数の細胞及びクラスターのセットＣｊの第２のクラスターからの第２の複数の細胞の両方が同定される。
【０１０５】
ある実施形態において、方法２００は、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトル１３０を用いて、多様体学習（例えば、図３の多様体学習３３０）を行う工程を含む。この多様体学習は、第１及び第２の複数の細胞における各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞状態を同定する（例えば、図３の行列Ｎを生成する）。多様体学習については、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，“Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １７を参照されたい。
【０１０６】
ある実施形態において、複数の非摂動細胞は、対照細胞（例えば、摂動に曝されていない細胞）である。さらに、ある実施形態において、非摂動細胞は、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均である。
【０１０７】
ある実施形態において、本方法は、単一細胞の移行シグネチャー及び／又は摂動シグネチャーをプルーニングする工程を含む。このプルーニングは、複数の細胞成分１３２を制限する（例えば、細胞成分を転写因子に制限する）。
【０１０８】
ある実施形態において、細胞成分の発現の差の尺度（例えば、図３の、異なって発現された細胞成分３５０）は、第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセットと第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の細胞成分量の差を定量する。同様に、ある実施形態において、この差は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、又は一般化線形モデルのうちの１つを用いて決定される。さらに、第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第３の単一細胞細胞成分の発現データセット１２２が、複数の非摂動細胞中の対応する単一細胞から得られる。さらに、第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第４の単一細胞細胞成分の発現データセットが、摂動に曝された複数の摂動細胞中の第４の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる。
【０１０９】
ある実施形態において、それぞれの細胞成分についての対応する第２の重要度スコアを決定する工程は、複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、それぞれの細胞成分についての重要度スコアを、それぞれの細胞成分についての対応するマッチングスコアで置き換える工程を含む（例えば、細胞成分１３２−１−１に関連する重要度スコア１３４−１−１を、図１の重要度スコア１３４−ｄ−Ｅで置き換える）。ある実施形態において、この置き換えにより、マッチングスコアが形成される。マッチングスコアは、複数の細胞成分について組み合わされて、摂動についてのマッチングスコアを生成する。したがって、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する（例えば、細胞の移行に影響する）かどうかは、それぞれの摂動についてのマッチングスコアに基づいて決定される。ある実施形態において、マッチングスコアは、別個のスコア又は連続したスコアを含む。
【０１１０】
ある実施形態において、スコア１３４を置き換える工程は、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャー１４２からの細胞成分量１３２及びそれぞれの細胞成分についての摂動シグネチャー１５０からの細胞成分量１３２が両方とも上方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程を含む。この置き換える工程は、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャー１４２からの細胞成分量が上方制御され、それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャー１５０からの細胞成分量が下方制御される場合、重要度スコア１３２を第２のスコアで置き換える工程をさらに含む。さらに、それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャー１５０からの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアは、第３のスコアで置き換えられる。
【０１１１】
ブロック２０６．ブロック２０６を参照すると、方法２００は、単一細胞の移行シグネチャー１４２−１及び摂動シグネチャー１５０−１を比較する工程を含む。この比較により、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを決定する。
【０１１２】
ある実施形態において、方法２００は、単一細胞の移行シグネチャー１４２及び／又は摂動シグネチャー１５０をフィルタリングする工程を含む。このフィルタリングは、単一細胞の移行シグネチャー１４２及び摂動シグネチャー１５０に含まれる細胞成分１３２の数を減少させ、これは、方法２００を行う（例えば、図３の後処理３６０を行う）のに必要なシグネチャーのデータサイズ及び時間を減少させるのに役立つ。
【０１１３】
ある実施形態において、方法２００は、比較２０６に基づいて（例えば、図３の後処理３６０に基づいて）変化した細胞状態を促進するものとして摂動を同定する工程を含む。ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャー１４２及び／又は摂動シグネチャー１５０は、異なるタイプの細胞成分を用いて生成される。同様に、ある実施形態において、単一細胞の移行シグネチャー１４２及び／又は摂動シグネチャー１５０は、同じタイプの細胞成分を用いて生成される。
【０１１４】
ＩＩ．単一細胞分析を行うために細胞をインビトロで培養する方法
細胞の運命の原因を同定するための本明細書に記載される技術を行う際、単一細胞から得られる細胞成分測定に関するデータセットを生成することが有用である。これらのデータセットを生成する（例えば、図３の単一細胞の測定３１０によって図１のデータセット１２２−１を生成する）ために、対象とする細胞の集団が、インビトロで培養される。対象とする１つ以上の細胞成分１３２の単一細胞の測定が、培養中に１つ以上の期間で行われて、データセット１２２を生成する。（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）。ある実施形態において、対象とする細胞成分としては、ＤＮＡ、修飾（例えば、メチル化）ＤＮＡを含む核酸、コーディング（例えば、ｍＲＮＡ）若しくはノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｓｎｃＲＮＡ）を含むＲＮＡ、転写後修飾タンパク質（例えば、リン酸化、グリコシル化、ミリストイル化タンパク質など）を含むタンパク質、脂質、炭水化物、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）などの環状ヌクレオチドを含むヌクレオチド（例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ））、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）の酸化及び還元形態などの他の小分子細胞成分、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。ある実施形態において、細胞成分測定は、ＲＮＡレベルなどの遺伝子発現測定を含む。
【０１１５】
いくつかの単一細胞細胞成分の発現測定技術のいずれか１つが、データセット１２２を収集するために使用され得る（例えば、表１の技術、図１の単一細胞の測定３１０の技術など）。例としては、限定はされないが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑなどが挙げられる。細胞成分の発現測定は、測定される所望の細胞成分に基づいて選択され得る。例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、及びｍｉＲＮＡ−ｓｅｑが、ＲＮＡ発現を測定する。具体的には、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑが、ＲＮＡ転写物の発現を測定し、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑが、稀なｍＲＮＡ種の検出を可能にし、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑが、マイクロ−ＲＮＡの発現を測定する。ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ及びＥ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑが、細胞におけるタンパク質発現を測定する。ＣＩＴＥ−ｓｅｑが、細胞における遺伝子発現及びタンパク質発現の両方を同時に測定し、ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑが、細胞におけるクロマチン構造を測定する。以下の表１は、上述される単一細胞細胞成分の発現測定技術のそれぞれを行うためのプロトコルの例へのリンクを提供する。
【０１１６】
【表１】
2022501011.tif 000003
【０１１７】
使用される細胞成分の発現測定技術は、細胞死をもたらし得る。或いは、細胞成分は、生細胞から抽出することによって、例えば、細胞を死滅させずに細胞質を抽出することによって測定され得る。この種の技術は、同じ細胞が複数の異なる時点で測定されるのを可能にする。
【０１１８】
同じ「前駆」細胞から生じる複数の異なる細胞型が集団中に存在するように、細胞集団が不均一である場合、単一細胞細胞成分の発現測定が、細胞が培養物中で成長するにつれて単一の時点で又は比較的少ない時点で行われ得る。細胞集団の不均一性の結果として、収集されたデータセット１２２は、移行の軌道に沿って様々なタイプの細胞を表す。
【０１１９】
単一の細胞型のみ又は比較的少ない細胞型、主に、対象とする「前駆」細胞が、集団中に存在するように、細胞集団が、実質的に均一である場合、単一細胞細胞成分の発現測定は、細胞が移行するにつれて所定の期間にわたって複数回行われ得る。
【０１２０】
別個の単一細胞細胞成分の発現データセット１２２が、各細胞について、及び該当する場合、期間（例えば、図１の期間１２８）のそれぞれの時点で生成される。複数の異なる時点における細胞の集団からの単一細胞細胞成分の発現測定の収集は、同じ「前駆」細胞から生じる細胞型について時間とともに細胞発現の「擬似時間（ｐｓｅｕｄｏ−ｔｉｍｅ）」表現として集合的に解釈され得る。擬似時間という用語は、２つの点で使用され、第１に、細胞状態の移行が、細胞間で必ずしも同じでないため、細胞の集団が、その「前駆」タイプの細胞の移行過程が時間とともに経る可能性の高い分布を提供し、第２に、複数の時点でのそれらの複数の細胞の発現の細胞成分の発現の測定が、異なる細胞の細胞成分の発現の測定がデータセットを生じさせる場合でさえ、可能な移行挙動を時間とともにシミュレートするという点である。意図的に簡略化した例として、細胞Ｘが、時点Ａについてのデータセットを示し、細胞Ｙが、時点Ｂについてのデータセットを示す場合でさえ、これらの２つのデータセットは一緒に、時点Ａと時点Ｂとの間の移行の擬似時間を表す。
【０１２１】
説明の便宜上、２つの異なる期間に「同じ」細胞について捕捉される２つのこのようなデータセット１２２（例えば、第１のデータセット１２２−１の第１の期間１２８−１、第２のデータセット１２２−２の第２の期間１２８−２など）（上で紹介されるように細胞を死滅させない技術が使用されると仮定する）は、本明細書において異なる「細胞」（及び対応する異なるデータセット）と呼ばれ、これは、実際には、このような細胞が、わずかに又は顕著に互いに移行されることが多く、ある場合には、様々な細胞成分の相対量から決定される際に全く異なる細胞型を有するためである。この文脈から見ると、異なる時点における単一細胞のこれらの２つの測定は、細胞自体が変化しているため、分析のために異なる細胞として解釈され得る。
【０１２２】
本明細書に記載される細胞（例えば、図１の細胞／データセット識別子１２６）／期間（例えば、図１の期間１２８）によるデータセットの分離は、説明の明確さのためのものであるため、実際に、これらのデータセットは、コンピュータメモリに保存され、１つ以上の集合データセットとして（例えば、全ての期間について細胞によって、全ての細胞及び期間について一度に）論理的に操作され得る。
【０１２３】
ある実施形態において、対象とする「前駆」細胞がそのベースライン状態から摂動されているデータセット１２２を収集することが有用である。これを行ういくつかの考えられる理由があり、例えば、１つ以上の細胞成分をノックアウトして（例えば、除去する、無効にするなど）、健康な細胞状態と病変した細胞状態との間の差を評価するためである。これらの実施形態において、プロセスは、細胞への所望の改変を導入するための工程も含み得る。例えば、１つ以上の摂動が、細胞に導入されてもよく、１つ以上の細胞成分をノックアウトするように設計された調整されたウイルスが導入されてもよく、ＣＲＩＳＰＲが、細胞成分を編集するのに使用されてもよいなどである。使用され得る技術の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。
【０１２４】
どのように摂動が適用されるかに応じて、全ての細胞が同じように摂動されるわけではない。例えば、ウイルスが、特定の遺伝子をノックアウトするために導入される場合、そのウイルスは、集団中の全ての細胞に影響を与えるわけではない。より一般に、この特性は、単一の集団に対する多くの異なる摂動の影響を評価するために有利に使用され得る。例えば、多数の調整されたウイルスが導入されてもよく、これらはそれぞれ、異なる遺伝子をノックアウトさせることなどの異なる摂動を行う。ウイルスは、様々な細胞のいくつかのサブセットを様々に感染させて、対象とする遺伝子をノックアウトする。単一細胞シーケンシング、又は次に、別の技術が、どのウイルスがどの細胞に影響を与えたかを同定するのに使用され得る。次に、得られた異なる単一細胞シーケンシングデータセットが、本明細書の他の箇所に記載される方法にしたがって遺伝子発現に対する遺伝子ノックアウトの影響を同定するために評価され得る。
【０１２５】
複数の異なる摂動の導入、ＣＲＩＳＰＲのバーコーディングなどの他のタイプの多摂動細胞改変が、同様に行われ得る。さらに、２つ以上のタイプの摂動が、分析される細胞の集団中に導入され得る。例えば、細胞は、異なって影響され得（例えば、異なるウイルスが導入される）、異なる摂動が、細胞の異なる部分集団中に導入され得る。
【０１２６】
さらに、細胞の集団の異なるサブセットが、多くの摂動を単に混合すること及びどの細胞がどの摂動によって影響されたかを事後解析することを超える様々な方法で摂動され得る。例えば、細胞の集団が、マルチウェルプレートの異なるウェル中に物理的に分割される場合、異なる摂動が、各ウェルに適用され得る。異なる細胞のために異なる摂動を達成する他の方法も可能である。
【０１２７】
以下に、方法が、単一細胞遺伝子発現測定を用いて例示される。本発明は、単一細胞から得られる他の細胞成分の測定を用いた類似の方法を包含するため、これは、限定ではなく、例示としてのものであることが理解されるべきである。本発明は、本開示に記載される方法を実施する個人又は組織によって行われる実験研究から直接得られる測定を用いた方法、並びに例えば、他の人によって行われ、及び第三者による刊行物に報告されたデータ、データベース、請負業者によって行われるアッセイ、又は開示される方法を実施するのに有用な好適な入力データの他の源を含む、任意の手段又は機構を介して利用可能な、実験研究の結果の報告から間接的に得られる測定を用いた方法を包含することがさらに理解されるべきである。
【０１２８】
本明細書に記載されるように、細胞中の遺伝子発現は、細胞をシーケンシングし、次に、シーケンシング中に同定された各遺伝子転写物の量を計数することによって測定され得る。ある実施形態において、シーケンシング及び定量される遺伝子転写物は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含み得る。代替的な実施形態において、シーケンシング及び定量される遺伝子転写物は、ｍＲＮＡの下流の産物、例えば、転写因子などのタンパク質を含み得る。一般に、本明細書において使用される際、「遺伝子転写物」という用語は、遺伝子転写又は翻訳（翻訳後修飾を含む）の任意の下流の産物を示すのに使用され得、「遺伝子発現」は、一般に、遺伝子転写物の任意の尺度を指すのに使用され得る。
【０１２９】
本明細書の残りの部分は、遺伝子転写物及び遺伝子発現の分析に焦点を合わせているが、本明細書に記載される技術は全て、それらの細胞に関して単一細胞に基づいてデータを得る任意の技術に等しく適用可能である。例としては、単一細胞プロテオミクス（タンパク質発現）、クロマチン構造（クロマチン状態）、メチル化、又は他の定量可能な後成的影響が挙げられる。
【０１３０】
以下の説明は、複数の期間（例えば、図１の複数の期間１２８）にわたって単一細胞細胞成分の発現測定（例えば、図３の測定３１０）を行うために、細胞の集団をインビトロで培養するための概要の例を提供する。一般に、細胞をインビトロで培養するための方法が、当業者に公知である。当業者はまた、より長い又は短い期間にわたって増殖させるようにこのプロセスがどのように修正され得るかを理解し、さらなる又はより少ない単一細胞の測定工程を行うなどである。
【０１３１】
一実施形態において、第１の細胞状態の細胞を、変化した細胞状態の細胞になるまで培養するための方法が、以下の工程の１つ以上を含む：
０日目：第１の細胞状態のいくつかの細胞を、細胞の増殖に好適な培地中でプレート上に解凍する。
１日目：第１の細胞状態のある数の細胞を、マルチウェルプレート中に播種する。該当する場合、細胞の細胞成分に影響を与えるためのさらなる工程を行う。例えば、対象とする細胞成分をノックアウトするために１つ以上のウイルスに同時に感染させる。
ウェル中の細胞について細胞成分の発現測定の反復ｔ１を行う。
１＋ｌ日目：何らかのさらなるプロセスが行われた場合、必要に応じて培地を交換する。
該当する場合、ウェル中の細胞について細胞成分の発現測定の反復ｔｌを行う。
１＋ｍ日目：変化した細胞状態の細胞の増殖を補助するのに適切な培地に、培地を交換する。
該当する場合、ウェル中の細胞について細胞成分の発現測定の反復ｔｍを行う。
１＋ｎ、ｏ、ｐ日目など：第１の細胞状態から変化した細胞状態へのさらなる細胞状態の移行を補助するために必要に応じて培地を交換する。該当する場合、第１の細胞状態から変化した細胞状態へのさらなる移行に影響を与えるためのさらなる工程を行う。例えば、細胞を変化した細胞状態にするための、対象とする摂動を加える。
該当する場合、ウェル中の細胞について、細胞成分の発現測定の反復ｔｎ、ｔｏ、ｔｐなどを行う。
ｑ日目：ウェル中の変化した細胞状態の細胞について細胞成分の発現測定の反復ｔｑを行う。
プレートを固定し、対象とする細胞成分／タンパク質に適合した抗体で染色して、測定されるべきそれらを溶解／破壊させずに細胞をソート／同定する。それはまた、細胞質の状況におけるほどの分解を伴って見られない表面マーカーを同定するのに使用され得る。各ウェルを走査することによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＨＣＩ  ＩＸＭ４などの細胞イメージングシステムを用いでイメージングする。所望の変化した細胞状態にあるウェル当たりの細胞の数を定量する。
【０１３２】
表２は、１つ以上の時点における細胞の集団の単一細胞発現の測定（例えば、図３の単一細胞の測定３１０）から収集され得るデータの例を含む、いくつかのデータセット１２２の断片を示す。サンプルＩＤの列は、細胞のデータがどのサンプルに由来するかを示す（例えば、図１のサンプル識別子１２４−１）。実際には、集団中の細胞は、２つ以上のサンプル（例えば、第１のサンプル識別子１２４−１、第２のサンプル識別子１２４−２など）から取り出されてもよく、これらはそれぞれ、同じ又は異なる対象に由来していてもよい。細胞又はデータセットの列は、所与の行のデータがどの細胞又はデータセットに関連するかを示す（例えば、図１の細胞／データセット識別子１２６−１）。データセット１２２は、或いは、データのベクトルｒｉ（例えば、図１の細胞成分ベクトル１３０−１）として表され得る。期間の列は、関連する場合、細胞の増殖中、その行のデータセットがいつ捕捉されたかを示す（例えば、図１の期間１２８−１）。
【０１３３】
表２の残りの列は、細胞の対象とする細胞成分（細胞成分１３２−１−１〜１３２−１−Ｂ）に対応する。これは、細胞の全ての細胞成分、又は単にサブセットであり得る。各細胞成分１３２は、異なる列に関連する。データセットが、ベクトルｒｉとして表される場合、各細胞成分は、ベクトル中のエントリｉに対応する。ある実施形態において、各細胞の値は、単一細胞発現測定によって測定されるいくつかの細胞成分の（整数）数、又はそのいくつかの正規化（有理数）形態であり得る。
【０１３４】
【表２】
2022501011.tif 000004
【０１３５】
ＩＩＩ．細胞成分の発現の差を決定するために単一細胞データセットを分析する方法
ＩＩＩ．Ａ．概説
細胞状態の移行（すなわち、第１の細胞状態から変化した細胞状態への細胞の状態の移行）は、細胞における細胞成分１３２の発現の変化によって特徴付けられる。例えば、移行は、細胞における細胞成分の発現１３２の変化、ひいては細胞によって産生される細胞成分（例えば、ｍＲＮＡ、転写因子）の同定及び定量によって特徴付けられ得る。しかしながら、少なくとも現在、細胞状態の移行は、細胞内活性の複雑性のため、完全に決定性ではない。この複雑性を理解しようとして、本明細書は、細胞状態の移行の様々な段階での対象とする１つ以上の測定される細胞成分の可変の存在、非存在又は量に関連する可変の細胞成分の発現が、有意義な知識が抽出され得る高次元データセット（例えば、図１の細胞成分ベクトル１３０）を提供するという理論の下で、細胞の集団の細胞中の細胞成分１３２を定量する単一細胞データセット１２２に統計的技術を適用する。本明細書において、データの高次元は、データセット１２２に含まれる前駆細胞成分の測定に由来する。各細胞成分１３２は、次元を表し、集合的に、各細胞成分についての細胞成分測定データセット１２２が、「前駆」細胞の、異なる細胞型への移行に関する生物学的過程についての潜在情報を符号化する形状を有し得る。実際には、細胞成分１３２の数は、およそ数万であり得るため、本明細書に記載される計算は、知的に又は手動によって行うことが不可能ではないにしても実用的ではない。
【０１３６】
一般に、これらの統計技術は、高次元データが、データセット中で符号化される潜在情報が何であれその形状を保ちながらより低次元の空間へと圧縮される方法として特徴付けられ得る（例えば、図１の細胞成分ベクトル１３０は、図３の行列Ｍへと次元削減された３２０）。低次元データは、細胞状態の移行の異なる段階間で異なって存在する細胞成分を同定するために評価される。方法への入力データが、細胞ごとの対象とする複数の細胞成分の単一細胞細胞成分の発現データセット１２２である際、異なって発現された細胞成分のセットは、したがって、細胞の他の細胞成分と比べた存在、非存在又は量に関して、どの細胞成分が統計的に有意な過剰提示又は提示不足を有していたかを表す。いくつかの方法及び測定基準のいずれか１つを用いて、それらの細胞成分のうちのどれが、本明細書にしたがって「異なって発現される」とタグ付けされるように他の細胞成分に対して十分に「異なって」発現されるかを同定することができる。データセット１２２が得られる細胞の集団が、異なる型及び異なる移行段階の細胞を含む際、どの細胞成分が異なって存在するか（例えば、どの細胞成分が異なって発現されたか）を知ることは、どのような細胞成分が、移行の過程又は他の移行において活性な細胞成分の発現に影響を与えるか又はそれに関連するかについての洞察を与える。
【０１３７】
ＩＩＩ．Ｂ．使用事例
どの種類の方法が使用されるかにかかわらず、異なって発現された細胞成分の決定は、どのような結果が求められるかに応じて変化し得る。例えば、使用される方法が特定の細胞を系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）又は系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）であると同定する場合、どの細胞成分が異なって発現されるかの決定は、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）であると決定された細胞の細胞成分の発現レベルを、系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）であると決定された細胞の細胞成分と比較することによって行われ得る。それらの細胞成分の相対的発現は、どの細胞成分が、個別に又は組み合わされて、１つの型又は別の型の細胞中で活性であるかを示す。上記のように、この発現データは、異なって発現されるとフラグを付けられる細胞成分のサブセットを同定するのに使用され得る。次に、因果関係が、同定された細胞成分をインビトロでノックアウトし、実験細胞集団の細胞の運命が、どの細胞成分が活性であるかの変化によって影響されるか否かを評価することによって決定され得る。
【０１３８】
別の例として、使用される方法が、特定の細胞を系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）であると同定し、他の細胞を系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）細胞型に向かう移行軌道に沿って「前駆」細胞又は中間細胞であると同定する場合、どの細胞成分が異なって発現されるかの決定は、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）であると決定された細胞の細胞成分の発現レベルを、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）細胞の「前駆」及び／又は中間細胞であると決定された細胞の細胞成分と比較することによって行われ得る。前の段落にあるように、それらの細胞成分の相対的発現は、どの細胞成分が、個別に又は組み合わされて、１つの型又は別の型の細胞中で活性であるかを示し、同様に、この発現データは、異なって発現されるとフラグを付けられる細胞成分のサブセットを同定するのに使用され得る。また、上記のように、次に、因果関係が、同定された細胞成分をインビトロでノックアウトし、実験細胞集団の細胞の運命が、どの細胞成分が活性であるかの変化によって影響されるか否かを評価することによって決定され得る。
【０１３９】
別の例として、細胞の集団は、細胞の２つの部分集団、１つの健康な部分集団及び１つの不健康な部分集団を含み得る。細胞培養中、複数の異なる摂動が、不健康な部分集団中に導入され得る。本明細書に記載される方法とともに、その後の単一細胞発現測定によって、特に、健康な部分集団と比べて、摂動が不健康な部分集団中の細胞成分の細胞成分の発現の差にどのような影響を与えたかが決定され得る。例えば、１つ以上の摂動に曝された不健康な部分集団からの細胞のサブセットは、細胞の健康な部分集団と一致する細胞成分の発現を示すことがあり、これは、摂動が、細胞の不健康な部分集団に望ましい効果を与えたことを示す。
【０１４０】
ＩＩＩ．Ｃ．低次元データを用いた、異なって発現された細胞成分の決定
図３は、一実施形態に係る、異なって発現された細胞成分１３２のセットを決定するための細胞成分の発現の差のアッセイの第１の例についてのフローチャートである。図３は、細胞成分の発現の差を用いて記載される一般的な場合の非限定的な例示的な実施形態を提供することに留意されたい。工程３１０において、単一細胞発現測定が、上記の第ＩＩ節に記載されるように行われて、細胞の集団についての複数のデータセット１２２を生成する。上記のように、各細胞についての各データセット１２２が、細胞成分（例えば、図１の細胞成分１３２−１−１〜１３２−１−Ｂ）のそれぞれの量を含む細胞成分のベクトルｒｉ（例えば、図１の細胞成分ベクトル１３０）として表され得る。単一細胞発現測定３１０から得られるデータセット１２２は、一般に、計算装置（例えば、図１のシステム１００）の永続的メモリ（例えば、図１の永続的メモリ１１２）中にデジタル形式で保存されるが、それらは、本明細書に記載される残りの工程を行うために、必要に応じて能動メモリ（例えば、図１の非永続的メモリ１１１）中にロードされ得る。一般に、図３のプロセスの残りの工程は、１つ以上の計算装置（例えば、図１のシステム１００）によって行われる。計算装置の例が、図１に関して説明される。しかしながら、実際には、図３のプロセスは、本明細書に記載される工程の結果に基づいて行われるさらなるインビトロ試験又は臨床決定などの、コンピュータの外で行われ得るさらなる中間の又は後続の工程を含み得る。
【０１４１】
ＩＩＩ．Ｃ．１．次元削減
上で紹介されるように、細胞成分１３２のそれぞれが、データの異なる次元を表す際、データセット１２２は、全体で、高次元を有する。工程３２０において、次元削減が、計算装置（例えば、システム１００）によって行われて、データセット１２２の細胞成分１３２の量中に存在する任意の潜在的パターンの構造を保ちながらデータの次元を削減する。
【０１４２】
次元削減工程３２０への入力は、一般に、上記の表２と同様に、個々の細胞の発現ベクトル（例えば、図１の細胞成分ベクトル１３０）を連結する行列である。次元削減３２０の出力は、データの基本的な潜在構造を維持しながら元のデータを圧縮形態で符号化する、本明細書において簡略化のために行列「Ｍ」と呼ばれる行列である。行列Ｍ中の各行は、細胞の特定の１つに関連する。行列Ｍ中の各列は、次元削減によって提供される削減された次元空間における次元の１つに関連する。各行−列のグループ分けでのエントリ中の値は、元の入力データセットに基づいて次元削減によって決定される。
【０１４３】
ある実施形態において、これらの次元削減技術は、データのいくらかの不可逆圧縮をもたらすが、得られる出力行列Ｍは、計算的な記憶サイズがより小さいため、このプロセスの残りの工程において説明される他の下流の技術を用いて分析するのにより少ない計算処理能力を必要とし、これにより、現代の計算装置を用いて妥当な時間でそれらの工程の結果を得ることが計算的に実現可能になる。
【０１４４】
様々な次元削減技術が使用され得る。例としては、限定はされないが、主成分分析（ＰＣＡ）、非負値行列因子分解（ＮＭＦ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、拡散マップ、又はオートエンコーダなどの（ニューラル）ネットワーク技術が挙げられる。
【０１４５】
これらの段落において言及される技術のそれぞれは、変動の主な駆動因子を抽出し、元の入力データの次元を削減するために異なって動作するが、それぞれ、より低次元の空間において行列Ｍを出力する。
【０１４６】
ＩＩＩ．Ｃ．２．多様体学習
行列Ｍ中の削減された次元データ（例えば、次元削減成分ストア１４６）は、単一細胞発現データセット１２２から元の高次元データと比べて次元が有意に削減される。しかしながら、得られる行列Ｍは、非線形多様体（例えば、図１の多様体１４９）を埋め込む。工程３３０において、多様体学習技術は、多様体を抽出するために行列Ｍに適用される。多様体１４９自体が、擬似時間にわたって細胞の間で細胞成分の発現の差についての有用な情報を提供するだけでなく、それはまた、その情報を視覚化するのにも使用され得る。
【０１４７】
多様体学習工程３３０への入力は、次元削減工程３２０からの行列Ｍである。多様体学習３３０の出力は、本明細書において行列「Ｎ」又は多様体（例えば、図１の多様体１４９）と呼ばれる別の行列である。行列Ｎの構造は、行列Ｎの各行が、集団の元の細胞の１つに対応するようなものであり、本明細書においてこのプロセスの残りの工程のための「点」と呼ばれる。一実施形態において、行列Ｎは、多様体学習工程３３０が、使用される特定の多様体学習アルゴリズムと関係なく出力するように構成される２つの次元に対応するＸ次元及びＹ次元と任意に呼ばれる２つの列を有する。Ｘ及びＹ次元は、多様体学習工程によって決定され、どの多様体アルゴリズムが使用されるかにしたがって、行列Ｍからのデータにどの次元が最良に適合するかにしたがって選択される。２つのこのような列を有する多様体は、図４Ｂに示されるように、視覚化に好都合である。他の実施形態において、多様体行列Ｎは、本明細書に導入される２次元形態を超えてさらなる次元を有する。
【０１４８】
行列Ｎの例が、以下の表３に示される。図４Ｂは、力指向レイアウトが次元削減工程に使用される実施形態において、以下の実施例１からのデータのプロットを示す。図４Ｂ中のプロットは、この及び同様の例の実験において、点がＸ／Ｙ平面内の１つ以上の軌道に沿ってＸ／Ｙ次元において分離するという点で、このプロセスにしたがって達成される結果の例示であり、ここで、一般に「前駆」細胞が、Ｘ／Ｙ空間内の１つの一般的な領域において見られ、Ｘ／Ｙ空間内の別の一般的な領域で中間細胞に向かって拡散し、Ｘ／Ｙ空間内の１つ以上の異なる領域で終了し、これは、実際には、一般に、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）又は系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）の移行された細胞であると確認される。一般に、同定される領域及び軌道の数は、「前駆」細胞のタイプ及び「前駆」細胞が移行することが知られている細胞のタイプに依存する。さらに、点の領域は、それらの間にいくらかの量の拡散を有することが多く、これは、移行のプロセスにおいて異なる進行段階の細胞を示唆する。
【０１４９】
【表３】
2022501011.tif 000005
【０１５０】
様々な多様体学習技術が、行列Ｍに適用されて、行列Ｎを生成し得る。例としては、限定はされないが、力指向レイアウト（Ｆｒｕｃｈｔｅｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．，＆  Ｒｅｉｎｇｏｌｄ，Ｅ．Ｍ．（１９９１）．Ｇｒａｐｈ  ｄｒａｗｉｎｇ  ｂｙ  ｆｏｒｃｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，２１（１１），１１２９−１１６４）（例えば、Ｆｏｒｃｅ  Ａｔｌａｓ  ２）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）、局所線形埋め込み（Ｒｏｗｅｉｓ，Ｓ．Ｔ．，＆  Ｓａｕｌ，Ｌ．Ｋ．（２０００）．Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｌｉｎｅａｒ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（５５００），２３２３−２３２６）、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｂ．，Ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，Ｖ．，＆  Ｌａｎｇｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．（２０００）．Ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（５５００），２３１９−２３２３）、カーネルＰＣＡ、グラフベースのカーネルＰＣＡ、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（ＰＨＡＴＥ）、一般化判別分析（ＧＤＡ）、一様多様体近似及び投影（ＵＭＡＰ）、又はカーネル判別分析が挙げられる。判別分析は、特に、いくらかの情報が各細胞の特定の細胞型に関して予め知られている場合に使用され得る。力指向レイアウトは、細胞状態の移行のような基本的な生物学的過程から生じる基本的なデータの非線形態様を符号化する新しいより低い次元を同定するそれらの能力のため、様々な特定の実施形態において有用である。力指向レイアウトは、データを最良に表す削減された次元を決定するための機構として物理学ベースのモデルを使用する。例として、力指向レイアウトは、物理学シミュレーションの形態を使用し、この実施形態において、セット中の各細胞／データセットが、「反発」力を割り当てられ、細胞の全体にわたって計算されるとき、これらの競合する「力」の下で一緒に「拡散する」データのセクターを同定するグローバルな「重力」が存在する。力指向レイアウトは、データの構造についての仮定をほとんど立てず、ノイズ除去手法を課さない。
【０１５１】
多様体学習３３０を行う工程は任意選択の工程であることに留意されたい。ある実施形態において、多様体学習は行われない。
【０１５２】
ＩＩＩ．Ｃ．３．クラスタリング
工程３４０において、次元削減３２０によって提供される低次元空間中の点の位置におけるパターン（例えば、関連する複数の次元削減ベクトル１４６のサブセットに対応する）を同定するために、クラスタリングが行われて、ｊクラスターのセットＣｊを生成する。これらのクラスターを用いて、同様の点（細胞／データセット）を統合して、低次元空間において互いに類似している点の群（例えば、第１のクラスター、第２のクラスターなど）についての統計的に関連する情報を引き出す。以下の表４は、ラスタリング３４０の出力であり得る点のクラスタリングの例を示す。
【０１５３】
【表４】
2022501011.tif 000006
【０１５４】
いくつかのクラスタリング技術のいずれか１つが使用され得、その例としては、限定はされないが、階層的クラスタリング、ｋ−平均クラスタリング、及び密度に基づくクラスタリングが挙げられる。特定の一実施形態において、階層的密度に基づくクラスタリングアルゴリズムが使用される（ＨＤＢＳＣＡＮと呼ばれる、Ｃａｍｐｅｌｌｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｕｌａｖｉ，Ｄ．，Ｚｉｍｅｋ，Ａ．，＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．（２０１５）．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｄａｔａ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ，ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｏｕｔｌｉｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＡＣＭ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｄａｔａ（ＴＫＤＤ），１０（１），５）。別の実施形態において、Ｌｏｕｖａｉｎクラスタリングなどのコミュニティ検出に基づくクラスターアルゴリズムが使用される（Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ｖ．Ｄ．，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｍｂｉｏｔｔｅ，Ｒ．，＆  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｅ．（２００８）．Ｆａｓｔ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，２００８（１０），Ｐ１０００８）。
【０１５５】
クラスタリングのために、これらの技術は、行列Ｍのデータを使用して、クラスターを決定する。アルゴリズムと関係なく、一般に、行列Ｍの多次元空間内の互いに近い点が、同じクラスターに割り当てられる可能性が高く、互いにより離れた点は、同じクラスターに割り当てられる可能性が低い。図７Ａは、点のそれぞれへの異なる視覚的マーカーで示されるクラスター割り当て１−１０とともに、図４Ｂからのデータの例のプロットを提供する。クラスターの数は、操作者によって設定又は制限され得、及び／又は使用されるアルゴリズムに基づいて動的に決定され得る。
【０１５６】
ＩＩＩ．Ｃ．４．細胞成分の発現の差の決定
次元削減３２０、任意選択の多様体学習３３０、及びクラスタリング３４０の工程は、一般に、集団の細胞、及びそれらの対応する単一細胞発現データセット１２２を、削減された次元空間内のクラスターへと組織化するように動作し、それによって、基本的な細胞成分ごとの発現測定データが、有意義な情報を抽出するために統合及び分析され得るようになっている。ある実施形態において、この削減された次元空間は、本開示の方法を完成させるのに必要な時間及び／又は処理能力をさらに減少させる。
【０１５７】
クラスターから得られる情報の１つの項目は、どの細胞成分がどの他の細胞に対して集団において異なって発現されるかである。本明細書において、細胞成分のこのセットは、図３中で工程３５０において説明される、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットと呼ばれる。異なって発現された細胞成分のセットを生成するためのいくつかの使用事例の例が、上記の第ＩＩＩ．Ｂ．節に記載されている。
【０１５８】
異なって発現された細胞成分のセットを決定するためにクラスターＣｊ及びデータセット情報を使用するいくつかの方法がある。一実施形態において、所与の細胞成分（例えば、細胞成分Ａ）が異なって発現されるかどうかの決定は、他のクラスターＣｍ（ここで、ｍが１でない）の１つ以上の中の点によって、細胞成分Ａの量に対する所与のクラスターＣ１中の点（細胞）によって細胞成分Ａの量を評価することによって決定される。正規化も使用され得る。例えば、全体として細胞中の細胞成分による発現のレベルは、細胞状態の移行の生物学と関係ない理由のため、細胞間で異なり得る。したがって、細胞成分量は、データセット中の各細胞についての細胞成分量の全体数に基づいて正規化され得る。
【０１５９】
上記の第ＩＩＩ．Ｂ節に記載されるように、細胞成分Ａについてのどのクラスターの細胞成分量が所与のクラスターＣ１に対して比較されるかは、実施形態によって異なり得る。比較に使用される他のクラスターは、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）細胞型に最も強く関連する、系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）細胞型に最も強く関連する、「前駆」細胞型に最も関連する、中間の細胞型に最も関連するなどのクラスターであり得る。比較はまた、２つ以上の他のクラスターに対してなされ得る。
【０１６０】
比較を所与として、細胞成分Ａは、クラスターごとの総細胞成分量（同様に、クラスター中の全ての点について、若しくは平均などのいくつかの集合的な尺度（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｍｅａｓｕｒｅ））、クラスターごとの正規化された細胞成分量、クラスターごとの中央値、平均、若しくは他の集合的な細胞成分量、他の細胞成分の細胞成分量に対する発現の比率などのいくつかの測定基準のいずれか１つにしたがって、異なって発現されると同定され得る。一実施形態において、細胞成分Ａが異なって発現されることを確立するための基準は、閾値要件（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）である。
【０１６１】
例えば、クラスターＣ１中の細胞成分Ａについての正規化された細胞成分量は、少なくとも閾値だけ、１つ以上の他のクラスターＣｍ中の細胞成分Ａについての正規化された細胞成分量を超え得る。
【０１６２】
異なって発現された細胞成分の決定はまた、相対的なものであり得る。一実施形態において、複数の細胞成分／クラスターの組合せについての正規化された細胞成分量、複数の細胞成分／クラスターの組合せについての距離計量、又は他の同様の測定基準が計算され得る。それらの測定基準は、ランク付け基準にしたがってランク付けされ得（例えば、クラスター中の最も多い正規化された細胞成分量）、上位にランク付けされる細胞成分又は細胞成分／クラスターの組合せは、異なって発現された細胞成分であると決定され得る。
【０１６３】
一実施形態において、所与のクラスター中の所与の細胞成分についての細胞成分量が、どの細胞成分が異なって発現されるかを同定するのに使用され得る。一実施形態において、これらの、異なって発現された細胞成分は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて同定される。
【０１６４】
当業者は、細胞成分／クラスターの組合せ当たりの細胞成分量を含む他の測定基準も可能であることを理解するであろう。
【０１６５】
ＩＩＩ．Ｃ．５．後処理
異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットは、それ自体で有用な出力を表す。しかしながら、そのセットのサブセットを同定するために異なって発現された細胞成分のセットをさらに分析する（３６０）ことが有用であり得る。
【０１６６】
一実施形態において、異なって発現された細胞成分のセットは、転写因子データベース（例えば、図１のシグネチャーストア１４０）に対してスクリーニングされて、セット中に存在する細胞成分に関連する転写因子のセットを同定する。例として、この情報は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータセットから得られる（どの転写因子が、細胞成分に位置合わせされるＤＮＡのどの領域に結合するかについての情報）。
【０１６７】
特定の細胞について本明細書に記載されるデータセット１２２、例えば、元の入力データセットｒ（例えば、図１のデータセット１２２−１）又は異なって発現された細胞成分Ｅｋのセット及び対応するデータセットは、いくつもの理由（例えば、技術的なノイズ、ドロップアウト、低い細胞成分量など）で細胞成分量を見落としていることがある。これらの及び任意のさらなる交絡因子を説明するために、単純モデルが、データセットに適合され得る。
【０１６８】
ＩＩＩ．Ｄ．細胞状態の移行に影響を与える摂動の予測
特定の細胞の移行を特徴付ける細胞成分の発現の差を、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる細胞成分の発現の差にマッチさせることによって、特定の細胞状態の移行に影響を与える摂動が予測され得る。細胞の摂動は、１つ以上の化合物による細胞の任意の処理を含む。１つ以上の化合物は、例えば、小分子、生物製剤、タンパク質、小分子と組み合わされたタンパク質、ＡＤＣ、ｓｉＲＮＡ若しくは干渉ＲＮＡなどの核酸、ｃＤＮＡ過剰発現野生型及び／又は突然変異型ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ過剰発現野生型及び／又は突然変異型ガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９システム又は他の細胞成分編集システム）、又は上記のいずれかの任意の組合せを含み得る。特定の細胞の移行について異なって発現された細胞成分は、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる異なって発現された細胞成分と比較され得る。次に、特定の細胞の移行の細胞成分の発現の差にマッチする細胞成分の発現の差を引き起こす摂動は、特定の細胞の移行に影響を与えることが予測され得る。
【０１６９】
特定の細胞の移行を特徴付ける細胞成分の発現の差を、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる細胞成分の発現の差にマッチさせることによって、特定の細胞の移行に影響を与える摂動を予測するために、第１に、特定の細胞の移行を特徴付ける最も異なって発現された細胞成分が同定される。ある実施形態において、これらの、異なって発現された細胞成分が、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて同定される。代替的な実施形態において、任意の統計的方法が、特定の細胞の移行についての最も異なって発現された細胞成分を同定するのに使用され得る。細胞成分１３２の名称及び重要度スコア１３４の得られたランク付けされた表（又はリスト）は、「単一細胞の移行シグネチャー」とも呼ばれ得る（例えば、図１の単一細胞の移行シグネチャー１４２を含む）。各細胞成分１３２の重要度スコア１３４は、細胞成分の細胞成分の発現の変化と、元の細胞型と移行された細胞型との間の細胞型の変化との間の関連性を定量する。全体として、これらのスコア１３４は、元の細胞型（第１の細胞状態）と移行された細胞型（変化した細胞状態）との間の移行に関連する細胞成分の発現の差の全体的な尺度を形成する。
【０１７０】
同様に、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる細胞成分の発現の差が、１つ以上の摂動について同定される。ある実施形態において、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる細胞成分の発現の差を同定するために、摂動に曝された細胞における細胞成分の発現が、摂動に曝されていない対照細胞における細胞成分の発現又は関連していない摂動されたサンプルの平均と比較される（例えば、図３の後処理３６０）。ある実施形態において、この比較は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて行われる。代替的な実施形態において、任意の統計的方法が、比較を行うのに使用され得る。さらに他の代替的な実施形態において、摂動への細胞の曝露によって引き起こされる細胞成分の発現の差は、公知であり得、文献から同定され得る。細胞成分の名称及び重要度スコアの得られた同様のランク付けされた表（又はリスト）は、「摂動シグネチャー」と呼ばれる。
【０１７１】
ある実施形態において、技術的誤差、異なる実験アッセイ、並びに単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの同定における他の変数による交絡を減少させるために、シグネチャーの一方又は両方が、特定の細胞成分の発現を促すことが知られているタンパク質である転写因子のみを含むようにフィルタリングされる。これらの転写因子は、例えば、文献から同定され得る。
【０１７２】
ある実施形態において、技術的誤差及び細胞の移行の曖昧さによる交絡をさらに減少させるために、シグネチャーの一方又は両方の最も異なって発現された細胞成分が、所与のｐ値及び／又は細胞成分の閾値数で切り捨てられる（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）（又はフィルタリング若しくはサブセット化される）。細胞の移行及び摂動曝露についての、異なって発現された細胞成分の得られた切り捨てられたセットは、順序付けられず、実施に応じて、１０〜２５の細胞成分、又はそれ以上若しくはそれ以下を含み得る。
【０１７３】
シグネチャー（例えば、図１の単一細胞の移行シグネチャー１４２及び／又は摂動シグネチャー１５０）の一方又は両方の同定及び任意の処理の後、単一細胞の移行シグネチャー１４２についての、異なって発現された細胞成分は、摂動シグネチャー１５０についての、異なって発現された細胞成分と比較される。一実施形態において、比較を行うために、摂動の、異なって発現された細胞成分は、行列（例えば、図３の行列Ｍ、図１の細胞成分ベクトル１３０など）として表される。行列の各行は、単一の摂動に関連する。行列における各列は、異なって発現された細胞成分の１つに関連する。行列における各エントリは、特定の摂動について同定された異なって発現された細胞成分１３２についての重要度スコア１３４（例えば、ｐ値、ｔスコア）を含む。この行列は、単一細胞の移行シグネチャー１４２について同定された異なって発現された細胞成分のみを含むサブセットである。このフィルタリングは、前の段落に記載される方法を用いて（例えば、閾値ｐ値、細胞成分の閾値数などによって）達成され得る。
【０１７４】
行列における各重要度スコア１３４は、個別のマッチングスコアで置き換えられる。各重要度スコアを、個別のマッチングスコアで置き換えるために、細胞の移行について有意に上方制御された細胞成分１３２及び細胞の移行について有意に下方制御された細胞成分が同定される。単一細胞の移行シグネチャー１４２によって同定された有意に上方制御された細胞成分のそれぞれについて、細胞成分がまた、その摂動についての摂動シグネチャー１５０について有意に上方制御される場合、その細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「１」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。細胞成分が、単一細胞の移行シグネチャーと比べて摂動シグネチャーについて有意に下方制御される場合、その細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「−２」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。細胞成分が、摂動シグネチャーについて有意に上方制御又は下方制御されない場合、細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「０」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。
【０１７５】
逆に、単一細胞の移行シグネチャーにおいて同定された有意に下方制御された細胞成分のそれぞれについて、細胞成分がまた、摂動について有意に下方制御される場合、その細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「−１」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。細胞成分が、摂動について有意に上方制御される場合、その細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「２」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。細胞成分が、摂動について有意に上方制御又は下方制御されない場合、その細胞成分／摂動の組合せについての行列における重要度スコアは、「０」の個別のマッチングスコアで置き換えられる。当業者は、これらの特定のスコア置き換えが、ある実施形態において他の数値で置き換えられ得ることを理解するであろう。
【０１７６】
結果は、摂動の数によって示される行の数及び単一細胞の移行と異なる細胞成分によって示される列の数を有する行列並びに上述されるマッチングスコアを表すエントリである。
【０１７７】
上述される個別のマッチングスコアによる、行列における重要度スコアの置き換えの後、行列の各行における個別のマッチングスコアが合計されて、各行についての合計されたマッチングスコアを生成する。次に、それぞれ摂動に対応する行列の行が、合計されたマッチングスコアが減少する順にランク付けされる。上位にランク付けされた行が、単一細胞の移行シグネチャーの同定された細胞の移行に関連する可能性が最も高い摂動に関連する。
【０１７８】
ある実施形態において、行列における各行の合計されたマッチングスコアについて、偽細胞成分発見率の推定値が推定される。偽細胞成分発見率を推定するために、各細胞成分についての経験的な周辺発現頻度が計算され、経験的な周辺発現頻度が、それらの組合せにわたって各細胞成分について合計され、それにより、独立に分布した発現を仮定して、所与の数の細胞成分を偶然同定する確率を生成する（少なくとも、シグネチャーを生成するのに使用されるデータセットにおいて見られるのと同程度に稀であった発現がどの程度の可能性で観察されるか）。次に、その確率を用いて、偽細胞成分発見率を計算することができる。
【０１７９】
特定の実施形態において、摂動の共変量が存在し得る。例えば、摂動が小分子である場合、小分子の共変量は、小分子の特定の用量、小分子に曝された細胞が、小分子に曝された細胞の細胞成分を定量し、及び／又は（例えば、細胞株）を同定するために測定される時間を含み得る。ある実施形態において、その共変量の閾値量がまた、特定の細胞の移行に影響を与えることが予測される場合にのみ、摂動が特定の細胞の移行に影響を与えることが予測される。例えば、その共変量の少なくとも２つがまた、特定の細胞の移行に影響を与えることが予測される場合にのみ、摂動が、特定の細胞の移行に影響を与えることが予測され得る。
【０１８０】
マッチングの代替的な方法が使用され得る。例えば、細胞成分は、ウェブインターフェイス（例えば、ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｌ１０００ＣＤＳ２／＃／ｉｎｄｅｘでのワールドワイドウェブにおける、Ｌ１０００ＣＤＳ２．Ａｎ  ｕｌｔｒａ−ｆａｓｔ  ＬＩＮＣＳ  Ｌ１０００  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｇｉｎｅなど）を用いてデータベースにマッチングされ得る。このマッチングの方法は、前の段落に記載されるマッチングの方法と同様に機能せず、後者は、はるかに高い感受性で結果を生じ、はるかに良好な規模であり、はるかに多いデータをカバーし（数万の代わりに数百万のサンプル）、有意な重複を考慮に入れ、有意な不一致を考慮に入れず、シグネチャーにおける意義のない情報を無視する。
【０１８１】
特定の単一細胞状態の移行にマッチする摂動を発見することは、特定の単一細胞状態の移行についての高度に可変の細胞成分の発現及び摂動によって影響される高度に可変の細胞成分の発現のため困難であり得る。この問題を軽減するために、ある代替的な実施形態において、特定の軌道に沿って細胞状態の移行に影響を与える摂動のマッチング及びその後の同定は、トレーニングされたニューラルネットワークモデルによって行われ得る。
【０１８２】
摂動が、特定の細胞状態の移行に影響を与える摂動である例が、第ＩＶ．Ｅ．節において以下に示される上記の方法を用いて同定される。
【０１８３】
ＩＩＩ．Ｅ．摂動についての生物学的有用性を同定するための方法
ある実施形態において、開示される方法は、摂動についての生物学的有用性を同定するために使用される。これらの方法は、異なる状態又は表現型、例えば、病変及び正常表現型を有する細胞内に異なって存在することが示され得る任意の細胞成分（又は異なる細胞成分の組合せ）の測定を包含する。すなわち、細胞成分の存在、非存在、又は量は、細胞状態又は表現型に関連する。一実施形態において、本方法は、複数の細胞を摂動に曝す工程と；第１の細胞成分の発現の差のアッセイを行う工程であって、アッセイが、摂動への細胞の曝露の前及び後に複数の細胞から得られた第１の複数の単一細胞発現データセットにアクセスする工程を含み、データセットのそれぞれが、細胞成分のベクトルｒｉを含み、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、細胞についての細胞成分の量を表す、工程と；統計技術を、第１の複数のデータセットに適用して、摂動への曝露に応答して異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを生成する工程と；摂動への曝露に応答して異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットと、病変細胞表現型と正常細胞表現型との間に差に関連する異なって発現された細胞成分Ｅｌのセットとの間の類似度を決定する工程とを含み、ここで、ＥｋとＥｌとの間の有意な類似度が、病変細胞表現型と正常細胞表現型との間で細胞を移行させる摂動についての有用性を示す。
【０１８４】
ある実施形態において、統計技術を適用する工程は、第１の複数のデータセット１３２に対して次元削減（例えば、図３の次元削減３２０）を行って、第１の行列Ｍを生成する工程であって、第１の行列Ｍが、第１の次元における行及び第２の次元における列を含み、行列Ｍの値が、第１及び第２の次元空間中のその点に位置する細胞成分の量から生成される値を含む、工程と；クラスタリングを行って、第１のクラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、第１の行列Ｍにおける行のサブセットに対応する複数の点及びそれらの対応する細胞応答状態を含む、工程と；第１のクラスターのセットＣｊを用いて、細胞についての摂動への曝露に応答して異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程とを含む。
【０１８５】
ある実施形態において、病変細胞表現型と正常細胞表現型との間の差に関連する異なって発現された細胞成分Ｅｌのセットは、第２の細胞成分の発現の差アッセイを行うことによって決定され得、第２のアッセイは、正常細胞及び病変細胞などの異なる状態の複数の細胞から得られた第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにアクセスする工程であって、データセットのそれぞれが、細胞成分のベクトルｒｉを含み、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、その細胞についてのその細胞成分の量を表す、工程と；統計技術を第２の複数のデータセットに適用する工程とを含む。
【０１８６】
ある実施形態において、統計技術を第２の複数のデータセットに適用する工程は、第２の複数のデータセットに対して次元削減を行って、第２の行列Ｍを生成する工程であって、第２の行列Ｍが、第１の次元における行及び第２の次元における列を含み、第２の行列Ｍの値が、第１及び第２の次元空間中のその点に位置する細胞成分の１つ以上の量から生成される値を含む、工程と；点の相対的類似度の近似による第２の行列Ｍを用いて多様体学習を行って、複数の行及び２つの列を含む第２の行列Ｎを生成する工程であって、各行が、細胞の１つに対応し、列のそれぞれが、２次元空間の２つの次元の１つに対応し、第２の行列Ｎの値が、データセットに基づいて、各細胞と他の各細胞との間の細胞表現型の相対的な差を示す、工程と；クラスタリングを行って、第２のクラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、行列Ｎにおける行のサブセットに対応する複数の点及びそれらの対応する細胞応答状態を含む、工程と；第２のクラスターのセットＣｊを用いて、病変細胞表現型と正常細胞表現型との間の差を示す、細胞についての病変細胞表現型と正常細胞表現型との間の差に関連する異なって発現された細胞成分Ｅｌのセットを決定する工程とを含む。
【０１８７】
ある実施形態において、摂動は、規制された臨床試験において得られた結果によって決定された許容されるヒト安全性プロファイルを有することが知られている。
【０１８８】
ある実施形態において、病変細胞表現型は、病変細胞と正常細胞との間の相違によって同定される。例えば、ある実施形態において、病変細胞表現型は、細胞の機能喪失、細胞の機能獲得、細胞の進行（例えば、分化状態への細胞の移行）、細胞の状態（例えば、分化状態へと移行する細胞の能力の欠如）、細胞の侵入（例えば、異常な位置における細胞の出現）、細胞の消失（例えば、細胞が通常存在する位置における細胞の非存在）、細胞の障害（例えば、細胞の中及び／又は周囲の構造的、形態的、及び／又は空間的変化）、細胞のネットワークの喪失（例えば、子孫細胞又は細胞の下流の細胞における通常の効果をなくす細胞の変化）、細胞のネットワークの獲得（例えば、細胞の下流の細胞の子孫細胞における新たな下流の効果を引き起こす細胞の変化）、過剰な細胞（例えば、細胞の過多）、細胞の不足（例えば、臨界閾値未満である細胞の密度、細胞内の細胞成分の比率及び／又は量の差、細胞内の移行の速度の差、又はそれらの任意の組合せによって同定され得る。
【０１８９】
ある実施形態において、病変細胞は、細胞株、生検サンプル細胞、及び初代培養細胞を含む。ある実施形態において、正常細胞は、初代培養細胞及び生検サンプル細胞を含む。ある実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
【０１９０】
ある実施形態において、本方法は、上記の方法を用いて同定される示される有用性に基づいて、疾患を処置するのに有用な摂動を選択するのに使用される。ある実施形態において、本方法は、有効量の選択された摂動又は摂動誘導化合物から開発された製剤原料を対象に投与することによって、疾患に罹患している対象を治療する工程を含む。
【０１９１】
実施形態
実施形態１．複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにアクセスする工程であって、各データセットが、同じ「前駆」細胞型から移行された複数の細胞の１つの細胞から得られ、各データセットが、細胞成分のベクトルｒｉを含み、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、細胞についての細胞成分の量を表す、工程と；データセットに対して次元削減を行って、行列Ｍを生成する工程であって、行列Ｍが、第１の次元における行及び第２の次元における列を含み、各行が、複数の細胞の１つの細胞に対応し、行列Ｍの値が、第１及び第２の次元空間中のその点に位置する細胞成分の量から生成される値を含む、工程と；クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、行列Ｍ中の行のサブセットに対応する複数の点及びそれらの対応する細胞を含む、工程と；クラスターのセットＣｊを用いて、細胞についての、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程とを含む方法。
【０１９２】
実施形態２．点の相対的類似度の近似による行列Ｍを用いて多様体学習を行って、複数の行及び２つの列を含む行列Ｎを生成する工程をさらに含み、各行が、複数の細胞の１つに対応し、列のそれぞれが、２次元空間の２つの次元の１つに対応し、行列Ｎの値が、データセットに基づいて、各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞型を示す、実施形態１に記載の方法。
【０１９３】
実施形態３．単一細胞細胞成分の発現データセットが得られたとき、細胞が、様々な細胞型を有する不均一な細胞集団である、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
実施形態４．細胞が、「前駆」細胞型を有する細胞の実質的に均一な集団であり；単一細胞細胞成分の発現データセットが、細胞が「前駆」細胞型から移行された時点で、複数の点のそれぞれで得られ、複数のデータセットの異なるデータセットが、各細胞及び時点の組合せについて収集されるようになっている、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
実施形態５．複数の時点が、少なくとも３つの時点を含む、実施形態４に記載の方法。
【０１９６】
実施形態６．複数の時点が、細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型からまだ移行されていない「前駆」時点を含む、実施形態４〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態７．複数の時点が、細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型から移行された移行時点を含む、実施形態４〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
実施形態８．複数の時点が、細胞のかなりの割合が「前駆」細胞型から少なくとも部分的に移行された少なくとも１つの中間時点を含む、実施形態４〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
実施形態９．複数の細胞成分が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
実施形態１０．核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
【０２０１】
実施形態１１．ＲＮＡが、コーディング及びノンコーディングＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。
【０２０２】
実施形態１２．単一細胞細胞成分の発現データセットが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ、並びに単一細胞細胞成分の発現データセットにおける活性化された経路を表す線形組合せなどの組合せを含む、上記のものの集合からなる群から選択される方法を用いて生成される、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
実施形態１３．次元削減を行う工程が、単一細胞細胞成分の発現データセットに対して主成分分析（ＰＣＡ）を行って、行列Ｍを生成する工程を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態１４．次元削減を行う工程が、単一細胞細胞成分の発現データセットに対して拡散マップを使用して、行列Ｍを生成する工程を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態１５．次元削減を行う工程が、単一細胞細胞成分の発現データセットに対してニューラルネットワークオートエンコーダを使用して、行列Ｍを生成する工程を含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
実施形態１６．多様体学習を行う工程が、行列Ｍにおけるデータの幾何学的配列を推定して、行列Ｎを生成する工程を含む、実施形態２に記載の方法。
【０２０７】
実施形態１７．多様体学習を行う工程が、局所線形埋め込みを行う工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２０８】
実施形態１８．多様体学習を行う工程が、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）を行う工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２０９】
実施形態１９．多様体学習を行う工程が、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）を行う工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２１０】
実施形態２０．多様体学習を行う工程が、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（ＰＨＡＴＥ）を行う工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２１１】
実施形態２１．多様体学習を行う工程が、一様多様体近似及び投影（ＵＭＡＰ）を行う工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２１２】
実施形態２２．多様体学習を行う工程が、力指向レイアウトを作成する工程を含む、実施形態１６に記載の方法。
【０２１３】
実施形態２３．力指向レイアウトが、Ｆｏｒｃｅ  Ａｔｌａｓ  ２アルゴリズムを用いて作成される、実施形態２２に記載の方法。
【０２１４】
実施形態２４．クラスタリングを行う工程が、各クラスター中の複数の点の組織化の予備知識を仮定しない、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
実施形態２５．クラスタリングを行う工程が、ＨＤＢＳＣＡＮを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態２６．クラスタリングを行う工程が、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出を行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
実施形態２７．クラスタリングを行う工程が、点に関連する単一細胞細胞成分の発現データセットがどの時点で収集されたかに基づいて、各点をクラスターＣｊの１つに割り当てる工程を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１８】
実施形態２８．クラスタリングを行う工程が、点がクラスターからどのくらい末端にあるかの測定に基づいて、点をクラスターに割り当てる拡散経路アルゴリズムを用いて複数の点を分析する工程を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
実施形態２９．異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程が、各細胞成分について、クラスターの少なくとも１つについて、少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量を、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量に対して比較する工程と；少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量が、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量を超える閾値レベルであることに応答して、細胞成分を、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに加える工程とを含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２０】
実施形態３０．少なくとも１つのクラスターが、クラスターＣｊの系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）のものを含み、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）クラスターが、所望の細胞型を有すると同定可能な複数の点を含む、実施形態２９に記載の方法。
【０２２１】
実施形態３１．少なくとも１つの他のクラスターが、クラスターＣｊの系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）のものを含み、系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）クラスターが、所望されない細胞型を有すると同定可能な点を含む、実施形態３０に記載の方法。
【０２２２】
実施形態３２．異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程が、各細胞成分について、クラスターの少なくとも１つについて、少なくとも１つのクラスター中の複数の点についての細胞成分の量と、少なくとも１つの他のクラスター中の複数の点についての細胞成分の量との間の距離計量を計算する工程と；距離計量が統計的に有意であることに応答して、細胞成分を、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに加える工程とを含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
実施形態３３．異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを、転写因子データベースに対してスクリーニングして、異なって発現された転写因子のセットを同定する工程をさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
実施形態３４．異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットに対して経験的モード分解を行って、データセットの擬似時間表現を生成する工程と；擬似時間表現に基づいて、異なって発現された転写因子のセットを同定する工程とをさらに含む、実施形態３３に記載の方法。
【０２２５】
実施形態３５．複数の単一細胞細胞成分の発現データセットにアクセスする工程であって、各データセットが、同じ「前駆」細胞型から移行された複数の細胞の１つの細胞から得られ、各データセットが、細胞成分のベクトルｒｉを含み、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、細胞についての細胞成分の量を表す、工程と；ｋＮＮアルゴリズムを用いて及び単一細胞細胞成分の発現データセットを用いて、ｋＮＮグラフを生成する工程と；クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、複数の点を含み、各点が、複数の細胞の１つの細胞についての単一細胞細胞成分の発現データセットに対応する、工程と；クラスターのセットＣｊを用いて、複数の細胞についての、異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程とを含む方法。
【０２２６】
実施形態３６．異なって発現された細胞成分Ｅｋのセットを決定する工程が、クラスターＣｊ中の複数の点間の距離計量を決定する工程を含む、実施形態３５に記載の方法。
【０２２７】
実施形態３７．第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程と；摂動に曝されていない非摂動細胞と摂動に曝された摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーにアクセスする工程と；単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの比較に基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含む方法。
【０２２８】
実施形態３８．単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程が、第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット（各第１のデータセットが、第１の細胞状態における第１の複数の細胞の１つの細胞から得られる）、及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット（各第２のデータセットが、変化した細胞状態における第２の複数の細胞の１つの細胞から得られる）に基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含む、実施形態３６に記載の方法。
【０２２９】
実施形態３９．第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各データセットが、細胞成分のベクトルｒｉを含み、ベクトル中の各エントリが、複数の細胞成分の１つに関連し、各エントリの値が、細胞についての細胞成分の量を表す、実施形態３８に記載の方法。
【０２３０】
実施形態４０．第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程をさらに含み、取得する工程が、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに対して次元削減を行って、行列Ｍを生成する工程であって、行列Ｍが、第１の次元における行及び第２の次元における列を含み、各行が、複数の細胞の１つの細胞に対応し、行列Ｍの値が、第１及び第２の次元空間中のその点に位置する細胞成分の量から生成される値を含む、工程と；クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、行列Ｍ中の行のサブセットに対応する複数の点及びそれらの対応する細胞を含む、工程と；クラスターのセットＣｊの第１のクラスターから第１の複数の細胞を同定する工程と；クラスターのセットＣｊの第２のクラスターから第２の複数の細胞を同定する工程と；第１の複数の細胞から第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程と；第２の複数の細胞から第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットを取得する工程とを含む、実施形態３８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
実施形態４１．点の相対的類似度の近似による行列Ｍを用いて多様体学習を行って、複数の行及び２つの列を含む行列Ｎを生成する工程をさらに含み、各行が、第１及び第２の複数の細胞の１つの細胞に対応し、列のそれぞれが、２次元空間の２つの次元の１つに対応し、行列Ｎの値が、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞状態を示す、実施形態４０に記載の方法。
【０２３２】
実施形態４２．工程が、実施形態１〜３４のいずれか１つにしたがって行われる、実施形態４０〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
実施形態４３．摂動シグネチャーにアクセスする工程が、摂動に曝されていない非摂動細胞の複数の非摂動単一細胞細胞成分の発現データセット及び摂動に曝された摂動細胞の複数の摂動単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、摂動シグネチャーを決定する工程を含む、実施形態３７〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
実施形態４４．非摂動細胞が、摂動細胞の摂動に曝されていない対照細胞であるか、又は非摂動細胞が、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均である、実施形態３７〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
実施形態４５．転写因子である細胞成分を含む単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングする工程をさらに含む、実施形態３７〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
実施形態４６．第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセット及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程が、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの間の細胞成分量の差を決定する工程を含む、実施形態３８〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
実施形態４７．複数の非摂動及び摂動単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、摂動シグネチャーを決定する工程が、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定（マン・ホイットニーのＵ検定）、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、複数の非摂動及び摂動単一細胞細胞成分の発現データセットの間の細胞成分量の差を決定する工程を含む、実施形態４３に記載の方法。
【０２３８】
実施形態４８．単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングして、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程をさらに含む、実施形態３７〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２３９】
実施形態４９．単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングする工程が、閾値ｐ値にしたがって、又は細胞成分の閾値数にしたがって、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程を含む、実施形態４８に記載の方法。
【０２４０】
実施形態５０．摂動シグネチャーが、複数の細胞成分を含み、各細胞成分が、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連し、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程が、各細胞成分についての重要度スコアを、細胞成分についてのマッチングスコアで置き換える工程と；複数の細胞成分についてのマッチングスコアを組み合わせて、摂動についてのマッチングスコアを生成する工程と；摂動についてのマッチングスコアに基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含む、実施形態３７〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
実施形態５１．マッチングスコアが、別個の又は連続したスコアを含む、実施形態５０に記載の方法。
【０２４２】
実施形態５２．各重要度スコアを置き換える工程が、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びその細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも上方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が上方制御され、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が下方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、実施形態５０〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
実施形態５３．重要度スコアを置き換える工程が、単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びその細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも下方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が下方制御され、その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が上方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；その細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、実施形態５０〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
実施形態５４．摂動シグネチャーが、複数の細胞成分を含み、各細胞成分が、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連し、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程が、複数の細胞成分についての重要度スコアを組み合わせて、摂動についての重要度スコアを生成する工程と；摂動についての重要度スコアに基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含む、実施形態３７〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
実施形態５５．複数の細胞成分の各細胞成分についての経験的な周辺発現頻度を計算し；複数の細胞成分についての経験的な周辺発現頻度を、それらの組合せにわたって合計して、独立に分布した発現を偶然呈するいくつかの細胞成分を同定する確率を生成し；確率に基づいて、摂動についてのマッチングスコアについての偽細胞成分発見率を推定することによって、摂動についてのマッチングスコアについての偽細胞成分発見率を推定する工程をさらに含む、実施形態５０〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
実施形態５６．摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程が、摂動の共変量の閾値量が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連していることを決定する工程と；決定に応答して、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連していることを決定する工程とを含む、実施形態３７〜５５に記載の方法。
【０２４７】
実施形態５７．摂動が、小分子への細胞の曝露を含み、摂動の１つ以上の共変量が、小分子の特定の用量、摂動細胞が小分子に曝される時間に対する、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞成分の発現の差が測定される時間、及び摂動細胞の細胞株を含む、実施形態５６に記載の方法。
【０２４８】
実施形態５８．細胞成分が、遺伝子を含む、実施形態３７〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
実施形態５９．単一細胞細胞成分の発現データセットが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ又は集合からなる群から選択される方法を用いて生成される、実施形態３７〜５８に記載の方法。
【０２５０】
実施形態６０．単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの少なくとも１つが、データベースから得られる、実施形態３７〜５９に記載の方法。
【０２５１】
実施形態６１．摂動シグネチャーが、複数の摂動についての複数の摂動シグネチャーを含むデータベースから得られ、方法が、データベース中の複数の摂動の各摂動について：データベースから摂動についての摂動シグネチャーにアクセスする工程と；単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーの比較に基づいて、摂動が、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とをさらに含む、実施形態６０に記載の方法。
【０２５２】
実施形態６２．複数の摂動細胞についての複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程と；複数の摂動シグネチャーのそれぞれについて、決定工程を行い、それによって、変化した細胞状態を促進する摂動についてスクリーニングする工程とをさらに含む、実施形態３７〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
実施形態６３．複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程が、細胞を複数の摂動に曝して、複数の摂動細胞を生成する工程と；複数の摂動細胞から複数の細胞成分量を測定する工程とを含む、実施形態６２に記載の方法。
【０２５４】
実施形態６４．変化した細胞状態を促進する摂動を同定する工程をさらに含む、実施形態３７〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
実施形態６５．変化した細胞状態を促進する工程が、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の細胞状態から変化した細胞状態への移行を促進する工程を含む、実施形態６４に記載の方法。
【０２５６】
実施形態６６．変化した細胞状態を促進する工程が、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の状態、又は、任意に、変化した細胞状態以外の状態における細胞の数に対する、別の状態における細胞の数の比率を増加させる工程を含む、実施形態６４に記載の方法。
【０２５７】
実施形態６７．変化した細胞状態を促進する工程が、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、変化した細胞状態における細胞の絶対数を増加させる工程を含む、実施形態６４に記載の方法。
【０２５８】
実施形態６８．変化した細胞状態を促進する工程が、第１の細胞状態を含む細胞の集団中で、第１の細胞状態又は、任意に、変化した細胞状態以外の状態における細胞の絶対数を減少させる工程を含む、実施形態６４に記載の方法。
【０２５９】
実施形態６９．細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーが、異なるタイプの細胞成分を用いて生成される、実施形態３７〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
実施形態７０．細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーが、同じタイプの細胞成分を用いて生成される、実施形態３７〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
実施形態７１．第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程と；複数の摂動シグネチャーにアクセスする工程であって、各摂動シグネチャーが、摂動に関連し、摂動に曝されていない非摂動細胞と摂動に曝された摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す、工程と；単一細胞の移行シグネチャー及び複数の摂動シグネチャーの比較に基づいて、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する摂動のサブセットを決定する工程とを含む方法。
【０２６２】
実施形態７２．各摂動シグネチャーが、複数の細胞成分を含み、各細胞成分が、細胞成分の量の変化と、非摂動細胞と摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する重要度スコアに関連し、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する摂動のサブセットを決定する工程が、各摂動シグネチャーについて：各細胞成分についての重要度スコアを、細胞成分についてのマッチングスコアで置き換える工程と；複数の細胞成分についてのマッチングスコアを組み合わせて、摂動についてのマッチングスコアを生成する工程と；摂動を、それらのマッチングスコアにしたがってランク付けする工程と；摂動のランク付けされたリストに基づいて、摂動のサブセットを選択する工程とを含む、実施形態７１に記載の方法。
【０２６３】
実施形態７３．命令が符号化された非一時的なコンピュータ可読記録媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、命令が、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、実施形態３７〜７２のいずれか１つに記載の方法を実行させる、コンピュータプログラム製品。
【０２６４】
実施形態７４．命令が符号化された非一時的なコンピュータ可読記録媒体を含むシステムであって、命令が、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサに、実施形態３７〜７２のいずれか１つに記載の方法を実行させる、システム。
【０２６５】
実施形態７５．ニューロン及び／又は前駆細胞を促進するための方法であって、線維芽細胞を含む細胞の開始集団を、線維芽細胞を含む細胞の開始集団の、前駆細胞及び／又はニューロンへの移行を促進する摂動シグネチャーを有する摂動に曝す工程を含み、ここで、摂動シグネチャーが、Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ９４１、Ｔａｆ５Ｂ、Ｓｔ１８、Ｚｋｓｃａｎ１６、Ｃａｍｔａ１、及びＡｒｎｔ２の１つ以上の増大した活性、及び／又はＡｓｃｌ１、Ａｔｆ３、Ｒｏｒｃ、Ｓｃｘ、Ｓａｔｂ１、Ｅｌｆ３、及びＦｏｓの１つ以上の低下した活性である、方法。
【０２６６】
実施形態７６．ニューロン及び／又は前駆細胞が、ニューロン及び／又は前駆細胞の絶対数を増加させること、線維芽細胞の絶対数を減少させること、線維芽細胞の、ニューロン及び／又は前駆細胞への移行を促進すること、ニューロン又は前駆細胞の寿命を促進すること、線維芽細胞の寿命を減少させること、又は線維芽細胞に対するニューロン及び／又は前駆細胞の比率を増加させることのうちの１つ以上によって促進される、実施形態７５に記載の方法。
【０２６７】
実施形態７７．摂動が、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない、実施形態７５に記載の方法。
【０２６８】
実施形態７８．ニューロン及び／又は前駆細胞の量を増加させる方法であって、線維芽細胞を含む細胞の集団を医薬組成物に曝す工程を含み、医薬組成物が、線維芽細胞を含む細胞の集団の、ニューロンへの移行を促進する摂動シグネチャーを有し、ここで、医薬組成物が、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、トリコスタチンＡ、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４、ゲルダナマイシン、マヌマイシンＡ、ミトキサントロン、クルクミン、アルボシジブ、ボリノスタット、ＫＩ２０２２７、又は上記の組合せ、例えば、上記の２、３、４、５つ、若しくはそれ以上の組合せを含む、方法。
【０２６９】
実施形態７９．医薬組成物が、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない、実施形態７８に記載の方法。
【０２７０】
実施形態８０．ニューロン及び／又は前駆細胞を促進するための医薬組成物であって、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、トリコスタチンＡ、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４、ゲルダナマイシン、マヌマイシンＡ、ミトキサントロン、クルクミン、アルボシジブ、ボリノスタット、ＫＩ２０２２７、又は上記の組合せからなる群から選択される摂動、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【０２７１】
実施形態８１．摂動が、フォルスコリン、ＰＰ１、ＰＰ２、及びトリコスタチンＡを含まない、実施形態８０に記載の医薬組成物。
【０２７２】
実施形態８２．実施形態８０又は８１に記載の医薬組成物を含む単位剤形。
【０２７３】
実施形態８３．線維芽細胞を含む細胞の開始集団の、ニューロン及び／又は前駆細胞への移行を促進するための候補の摂動を同定する方法であって、線維芽細胞を含む細胞の開始集団を摂動に曝す工程と；摂動についての摂動シグネチャーを同定する工程であって、摂動シグネチャーが、１つ以上の細胞成分及び各細胞成分に関連する重要度スコアを含み、各細胞成分の重要度スコアが、摂動への細胞の集団の曝露の後、細胞成分の発現の変化と、線維芽細胞からニューロン及び／又は前駆細胞への、細胞の集団の細胞状態の変化との間の関連性を定量する、工程と；摂動シグネチャーに基づいて、線維芽細胞を含む細胞の集団の、ニューロン及び／又は前駆細胞への移行を促進するための候補の摂動として摂動を同定する工程とを含み、ここで、摂動シグネチャーが、Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、Ｍｙｔ１、Ｚｆｐ９４１、Ｔａｆ５Ｂ、Ｓｔ１８、Ｚｋｓｃａｎ１６、Ｃａｍｔａ１、及びＡｒｎｔ２の１つ以上の増大した活性、及び／又はＡｓｃｌ１、Ａｔｆ３、Ｒｏｒｃ、Ｓｃｘ、Ｓａｔｂ１、Ｅｌｆ３、及びＦｏｓの１つ以上の低下した活性である、方法。
【実施例】
【０２７４】
ＩＶ．実施例０、１、２、及び３−ニューロン及び筋細胞へと分化するマウス胚性線維芽細胞における因果関係の特定及び細胞の運命の制御
以下の実施例は、上記の第ＩＩ及びＩＩＩ節において紹介される方法を実証する。さらに詳細には、実施例は、細胞状態の移行の軌道に影響を与えることが知られている遺伝子及び／又は摂動を正確に同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力を実証する。さらに、以下に説明される実施例は、細胞状態の移行の軌道を制御するのに使用され得る新規な生物学的洞察を生成する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力を実証する。具体的には、実施例は、以前に知られていない、細胞状態の移行に影響を与える因子（例えば、遺伝子及び摂動）を同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力を実証する。
【０２７５】
以下に説明される実施例は、第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法を、公表されているデータ及びインビトロ実験データの組合せに適用して、細胞状態の移行の軌道に影響を与えるいくつかの公知の因子及び以前に知られていない因子（例えば、遺伝子及び摂動）を実証する。公表されているデータ及びインビトロ実験データの組合せへの第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法のこの適用の結果が、図４Ｂ−５Ａ及び７Ａ−９に示される。
【０２７６】
これらの結果のいくつかはまた、インビトロ実験データのみを用いて実証された。このインビトロでの実証の結果が、図６に示される。インビトロ実験データは、以下の第ＩＶ．Ａ節に記載されるプロトコルにしたがって、細胞を成長させ、測定することによって得られた。
【０２７７】
ＩＶ．Ａ．実施例０：インビトロ細胞処理及びデータセット収集
この節は、上述されるインビトロ実験のためのプロトコルを説明する。このインビトロ実験からのデータを、公表されているデータとともにプールして、図４Ｂ−５Ａ及び７Ａ−９を生成し、独立して使用して、図６を生成した。
【０２７８】
この節は、第ＩＩ節に記載される一般化されたプロトコルを、ニューロン又は筋細胞へと分化するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を評価する特定の実施例に適用する。この特定の実施例において、ニューロンは、系統内（ｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞であり、筋細胞は、系統外（ｏｆｆ−ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞であり、ＭＥＦは、「前駆」細胞であった。プロトコルは、遺伝子Ａｓｃｌ１のレンチウイルス過剰発現及び摂動仲介を含むさらなる工程も含んでいた。
【０２７９】
ＭＥＦ培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×非必須アミノ酸、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及びβ−メルカプトエタノールであった。神経細胞用培地（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｅｄｉａ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びインスリン２５μｇ／ｍｌであった。
【０２８０】
後続のプロトコルが、以下に列挙される：
０日目：１００万個のＭＥＦ細胞を、ＭＥＦ培地中で１０ｃｍプレート中に解凍する。
１日目：２４ウェルプレート中に２０Ｋ／ウェルで播種する。
該当する場合、Ａｓｃｌ１ウイルスに同時にスピン感染させる（ｓｐｉｎ  ｉｎｆｅｃｔ）（感染多重度（ＭＯＩ）８）。ＭＥＦ培地（２５０μｌ／ウェル）及びポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で、３２℃で１時間にわたって２０００ｒｐｍで回転させる。
単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を行って、各細胞についてのｄ２データセットを得る。
２日目：ウイルス実験のためにポリブレン（ＭＥＦ培地）を洗い落とすために培地を交換する。
摂動実験のために、小分子（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はエタノール中で再懸濁された）を加える。
３日目：培地を神経細胞用培地に交換する。
摂動実験のために、分子（ＤＭＳＯ又はエタノール中で再懸濁された）を加える。
５日目：半分培地交換（該当する場合、小分子を加える）
８日目：半分培地交換（該当する場合、小分子を加える）
９日目：半分培地交換（該当する場合、小分子を加える）
１１日目：半分培地交換（該当する場合、小分子を加える）
１３日目：半分培地交換（該当する場合、小分子を加える）
１５日目：プレートを固定し、Ｍａｐ２及びＴｕｊ１抗体で染色する。各ウェルを走査することによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＨＣＩ  ＩＸＭ４又は他のハイコンテントイメージング顕微鏡においてイメージングする。ウェルごとのＭａｐ２／Ｔｕｊ１陽性ニューロンの数を定量する。
【０２８１】
ＩＶ．Ｂ．実施例１、２、及び３：インビトロ細胞処理及びデータセット収集
図４Ａは、一実施形態に係る、ある期間にわたって誘導された細胞状態の移行の軌道を辿るタイムラインを示す。より具体的には、図４Ａは、０日目から２２日目までの２３日の期間にわたるＭＥＦの誘導された移行の軌道を辿るタイムラインを示す。
【０２８２】
図４Ａに示されるように、２３日の期間の０日目に、ＭＥＦを入手した。代替的な実施形態において、任意の単一細胞の移行の軌道が、同様の方法にしたがって調べられ得る。例えば、代替的な実施例において、マウス胚性血球母細胞の移行の軌道が、同様の方法にしたがって調べられ得る。
【０２８３】
２３日の期間の０日目に、集団ＭＥＦの各ＭＥＦに、適切な転写因子を形質導入した。図４Ａに示されるように、Ａｓｃｌ１又はＢｒｎ２、Ａｓｃｌ１、及びＭｙｔ１ｌ（まとめてＢＡＭ転写因子として知られている）のみが、ＭＥＦにおいて過剰発現された。具体的には、図６を生成する上記の第ＩＶ．Ａ節のプロトコルを使用したインビトロ実験において、Ａｓｃｌ１のみが、ＭＥＦにおいて過剰発現された。逆に、図４Ｂ−５Ａ及び７Ａ−９を生成するために第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法を適用した公表されているデータを生成するために、Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、及びＭｙｔ１ｌのそれぞれが、ＭＥＦにおいて過剰発現された。
【０２８４】
本明細書に開示される実施形態において、Ａｓｃｌ１転写因子の発現を、レンチウイルス送達の後、Ａｓｃｌ１の誘導性発現によって強制した。代替的な実施形態において、１つ以上の転写因子の発現が、任意の代替的な手段によって強制され得る。例えば、代替的な実施形態において、１つ以上の転写因子の発現が、トランスポゾン、ｍＲＮＡ送達、又は別のタイプのウイルス送達によって強制され得る。
【０２８５】
ＢＡＭ転写因子の１つ以上の強制発現が、強制されたＭＥＦの１つ以上に、マウス「前駆」細胞、マウスニューロン、及び／又はマウス筋細胞へとより一般的に移行させることが知られている。具体的には、文献において公知であるように、Ａｓｃｌ１プライミングが、ＭＥＦを、マウス「前駆」細胞へと移行するように誘導し、Ａｓｃｌ１のみの発現が、マウス「前駆」細胞を、マウスニューロン及びマウス筋細胞へと移行するように誘導し、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１ｌの発現が、マウス「前駆」細胞を、マウスニューロンへと移行するように誘導する。しかしながら、ＢＡＭ転写因子の１つ以上による細胞状態の移行のこの誘導は、１００％の効率で起こるわけではない。具体的には、文献において公知であるように、ＢＡＭ転写因子は、２０％の効率でマウスニューロンへのＭＥＦの移行を誘導する。言い換えると、ＢＡＭ転写因子の１つ以上の発現にもかかわらず、一部の細胞は、予想どおりに移行しないことがある。ある実施形態において、この移行失敗は、再プログラミング失敗として知られている。
【０２８６】
ＢＡＭ転写因子の１つ以上が強制的に発現されたマウス細胞を、２３日の期間にわたって監視した。より具体的には、Ａｓｃｌ１の発現が強制されたマウス細胞については、集団中のマウス細胞の各単一マウス細胞についての単一細胞ＲＮＡ−シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）測定が、２３日の期間中の２、５、及び２２日目に得られた。或いは、ＢＡＭ因子の全ての発現が強制されたマウス細胞については、集団中のマウス細胞の各単一マウス細胞についてのｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ測定が、２３日の期間中の２２日目にのみ得られた。
【０２８７】
代替的な実施形態において、ＲＮＡ−シーケンシング測定が、任意の頻度で、任意の数の時点で取られ得る。より具体的には、細胞状態の移行軌道を正確に捕捉するために、ＲＮＡ−シーケンシング測定が取られる時点は、理想的には、一般に、１つ以上の移行軌道が分岐する時点に対応する。特定の日における単一細胞についてのＲＮＡ−シーケンシング測定は、その特定の日における単一細胞中でのｍＲＮＡ発現の定量を含む。言い換えると、特定の日における単一細胞についてのＲＮＡ−シーケンシング測定は、その特定の日における単一細胞中での各ｍＲＮＡ転写物の計数を含む。さらに、各ｍＲＮＡ転写物が、特定の遺伝子に関連するため、特定の日における単一細胞についてのＲＮＡ−シーケンシング測定は、その特定の日における単一細胞中での遺伝子発現の定量を含む。しかしながら、実際には、細胞は、多くの場合、細胞状態の移行のそれらの状態が完全に均一であるわけではないため、所与の日における細胞状態の移行測定は、細胞状態の移行の様々な段階での細胞の分布を捕捉することが予測される。
【０２８８】
Ａｓｃｌ１がＭＥＦにおいて過剰発現されたインビトロプロトコルを用いて、図６に示され、以下に詳細に記載される実証実験を行った。さらに、Ａｓｃｌ１がＭＥＦにおいて過剰発現されたインビトロプロトコルから得られた遺伝子発現測定を、ＢＡＭ因子の全てが過剰発現されたＭＥＦからの公表されている遺伝子発現測定とともにプールした。次に、インビトロ及び公表されているデータのこのプールを用いて、図４Ｂ−５Ａ及び７Ａ−９に示されるデータを生成した。上述されるように、これらの図は、細胞状態の移行に影響を与える遺伝子を正確に同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力を実証するだけでなく、細胞状態の移行の軌道、ひいては細胞の運命を制御するのに有用な新規な生物学的洞察を生成する第ＩＩ及びＩＩＩ節に記載される方法の能力も実証する役割を果たす。
【０２８９】
ＩＶ．Ｃ．実施例１：文献で同定された移行を実証する次元削減
上述されるように、Ａｓｃｌ１のみが過剰発現されたＭＥＦから２、５、及び２２日目に得られた遺伝子発現測定を、ＢＡＭ因子の全てが過剰発現されたＭＥＦから２２日目に取られた公表されている遺伝子発現測定とともにプールした。第ＩＩ節において上述される方法を用いて、細胞における遺伝子発現を測定した日のそれぞれについて、細胞のそれぞれについての遺伝子発現測定を用いて、転写物のベクトルｒｉのデータセットを生成した。転写物の各ベクトルｒｉは、転写物のベクトルｒｉに含まれる遺伝子発現測定が得られた特定の日における特定の細胞に関連していた。転写物のベクトルｒｉにおける各転写物は、細胞のゲノム中の特定の遺伝子に関連しており、転写物のベクトルｒｉにおける各エントリの値は、転写物のベクトルｒｉに関連していた特定の日における転写物のシーケンシング深さ（転写物数）を表した。
【０２９０】
第ＩＩＩ．Ｃ．節に関して上述されるように、測定日のそれぞれにおいて細胞のそれぞれについて遺伝子発現測定を符号化したデータセットに対して、次元削減を行った。この実施例において、主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、次元削減を行い、次元削減された行列Ｍを生成した。
【０２９１】
次に、多様体学習を、行列Ｍに対して行って、さらなる次元削減された行列Ｎを生成した。この実施例において、力指向レイアウトアルゴリズムを用いて、行列Ｎを生成した。行列Ｎが、補足的な表１に示される。行列Ｎはまた、図４Ｂに示される力指向レイアウト多様体としてプロットされる。図４Ｂの多様体中のプロットされたデータは、補足的な表１中の行列Ｎデータに対応する。行列Ｎは、主に視覚化のために使用され、ある実施形態において、生成される必要がないことに留意されたい。言い換えると、ある実施形態において、多様体学習は、行列Ｍに対して行われない。
【０２９２】
上述されるように、多様体中の各点は、行列Ｎの行のものに関連し、これは、遺伝子発現を細胞について測定した４日のうちの特定の日における細胞の特定の細胞に関連する。さらに、各点は、特定の日における特定の細胞について測定された遺伝子転写物数のデータセットに関連する。図４Ｂの多様体を解釈する際、多様体の行における次元ｘ及び次元ｙの値が、その行に関連する日における細胞についての遺伝子転写物数に基づくため、多様体における点の位置決めは、他の点に対する、点に関連する日における細胞、及びひいては多様体中の、他の日における他の細胞についての遺伝子転写物数を反映している。結果として、多様体を視覚化することにより、２３日の期間にわたる細胞についての様々な遺伝子の変化する遺伝子転写物数の観察を可能にする。
【０２９３】
図４Ｂに示される多様体において、全ての点が、同一の色で同一の形状によって表される。したがって、図４Ｂの多様体において、点によって提供される識別可能な情報のみが、多様体におけるその位置（ｘ，ｙ）である。しかしながら、遺伝子ごとの転写物数及び遺伝子転写物数が各点について得られた特定の日は、図４Ｂにおいて識別可能でない。以下にさらに詳細に記載されるように、図５Ａの多様体中の点の形状は、部分的に、遺伝子転写物数が各点について得られた日、及びひいては各細胞を示すように変化される。同様に、図５Ｂの多様体における点の陰影は、各点について、及びひいては各測定日における各細胞についての遺伝子ごとの遺伝子転写物数を示すように変化される。
【０２９４】
図５Ａは、一実施形態に係る、図４Ｂの多様体を示す。図５Ａに示される多様体の実施形態において、多様体中の各点が、点に関連する細胞の転写因子発現が測定された日、及び細胞が移行過程にある定性的な段階で標識される。例えば、図５Ａの多様体中の四角形状で標識された点は、点が、５日目に、早期誘導神経（ｉＮ）細胞として定性的に特徴付けられた細胞に関連することを示す。
【０２９５】
多様体中の点のそれぞれを、点に関連する細胞についての遺伝子発現が測定された日及び細胞の移行の定性的段階で標識することによって、移行の軌道が同定され得る。例えば、移行の２つの異なる軌道が、図５Ａ中の多様体の基礎をなす矢印によって示される。１つの同定された軌道は、ＭＥＦ細胞の、マウスニューロンへの移行の軌道を描く。図５Ａ中の別の同定された軌道は、ＭＥＦ細胞の、マウス筋細胞への移行の軌道を描く。
【０２９６】
移行の軌道に沿って異なる段階で点（例えば、細胞）の間の遺伝子発現の差を同定することによって、特定の軌道に沿った細胞の移行に寄与する遺伝子が同定され得る。しかしながら、おそらく、より重要なことには、移行の２つ以上の軌道が分岐する連接において点（例えば、細胞）の間の遺伝子発現の差を同定することによって、この移行軌道の分岐に寄与する遺伝子が同定され得る。次に、これらの同定された遺伝子は、移行の特定の軌道及び／又は段階に関連することが予測され得る。例えば、遺伝子Ａの増加したレベルの発現が、５日目の早期筋細胞として標識された細胞と比べて、５日目の早期ｉＮ細胞として標識された細胞において同定される場合、ＭＥＦからマウス筋細胞への移行の軌道ではなく、遺伝子Ａの発現は、ＭＥＦからマウスニューロンへの移行の軌道に関連すると仮説が立てられ得る。
【０２９７】
上述されるように、図５Ａは、細胞の移行過程中の定性的時点、及び細胞の移行過程の定性的段階の両方に基づいて、移行の軌道を確立する。しかしながら、図５Ａは、点（例えば、異なる時点での細胞）について遺伝子ごとの遺伝子発現のレベルを示さない。したがって、図５Ａに示される情報に基づいて、どの遺伝子が移行のどの軌道に関連するかを予測することが可能でない。しかしながら、上述されるように、図５Ｂの多様体中の点の陰影は、各点について遺伝子ごとの相対的な遺伝子転写物数を示すように変化される。遺伝子ごとの点（例えば、異なる時点での細胞）についての遺伝子発現のこの表示に基づいて、どの遺伝子が移行のどの軌道に関連するかの予測が行われ得る。
【０２９８】
図５Ｂは、一実施形態に係る、図４Ｂの多様体中の点として示される測定日（Ａｓｃｌ１について２、５、及び２２日目並びにＢｒｎ２及びＭｙｔ１ｌについて２２日目）のそれぞれにおける細胞のそれぞれの中の３つのＢＡＭ転写因子のそれぞれの発現のレベルを示す。具体的には、図５Ｂは、図４Ｂの多様体の３つの異なる形態を示す。図５Ｂに示される多様体の第１の形態は、多様体の点のそれぞれについてのＡｓｃｌ１転写因子の発現のレベルを示し、図５Ｂに示される多様体の第２の形態は、多様体の点のそれぞれについてのＢｒｎ２転写因子の発現のレベルを示し、図５Ｂに示される多様体の第３の形態は、多様体の点のそれぞれについてのＭｙｔ１ｌ転写因子の発現のレベルを示す。
【０２９９】
図５Ｂにおいて、多様体中の点（例えば、ある時点での細胞）についての転写因子の発現のレベルが、転写因子についての１００万のマッピングされたリード数当たりの転写物のキロベース当たりのフラグメント（ＦＰＫＭ）のｌｏｇとして測定される。ｌｏｇ（ＦＰＫＭ）の比較的低い値は、比較的低いレベルの転写因子発現を示す。一方、ｌｏｇ（ＦＰＫＭ）の比較的高い値は、比較的高いレベルの転写因子発現を示す。図５Ｂの多様体において、点についての転写因子の比較的低いレベルの発現（例えば、ｌｏｇ（ＦＰＫＭ）の比較的低い値）が、点に比較的暗い陰影を付けることによって示される。対照的に、点についての転写因子の比較的高いレベルの発現（例えば、ｌｏｇ（ＦＰＫＭ）の比較的高い値）が、点に比較的明るい陰影を付けることによって示される。
【０３００】
図５Ａに描かれる移行の軌道を、遺伝子ごとのＢＡＭ転写因子の発現レベルを示す図５Ｂの多様体と比較することによって、特定の移行軌道に沿って細胞の進行に影響を与える転写因子を同定した。
【０３０１】
まず、Ａｓｃｌ１転写因子の発現を示す図５Ｂの多様体を参照すると、２３日の期間中の０日目に、マウス細胞に、単にＡｓｃｌ１又はＢＡＭを形質導入した。したがって、０日目の細胞は、検出可能なレベルでＡｓｃｌ１を発現しなかった。Ａｓｃｌ１を発現しなかったこれらの０日目の細胞はＭＥＦであった。次に、２３日の期間の２日目に、Ａｓｃｌ１が、２日目の細胞に関連する点の比較的暗い陰影によって示されるように、比較的低いレベルで発現された。Ａｓｃｌ１を発現したこれらの２日目の細胞は、図５Ａに示される移行の軌道に沿って進行し始めた。具体的には、２日目の細胞の一部が、前駆マウス細胞になり、２日目の細胞の一部が、ＭＥＦからニューロンへの移行軌道における中間細胞になり、２日目の細胞の一部が、ＭＥＦから筋細胞への移行軌道における誘導された細胞になった。同様に、２３日の期間の５日目に、５日目の細胞におけるＡｓｃｌ１の発現は、５日目の細胞に関連する点の比較的明るい陰影によって示されるように、２日目の細胞と比べて増加された。Ａｓｃｌ１の増加した発現を有していたこれらの５日目の細胞は、図５Ａに示される移行の軌道に沿ってさらに進行した。具体的には、ＭＥＦからニューロンへの移行軌道における５日目の細胞は、中間及び早期ｉＮ細胞になった一方、ＭＥＦから筋細胞への移行軌道における５日目の細胞は、早期筋細胞になった。最後に、２３日の期間の２２日目に、２２日目の細胞におけるＡｓｃｌ１の発現が、５日目の細胞と比べて増加したか又は同じままであった。Ａｓｃｌ１を発現したこれらの２２日目の細胞は、図５Ａに示される移行の軌道に沿ってさらに進行した。具体的には、ＭＥＦからニューロンへの移行軌道における２２日目の細胞が、成熟したマウスニューロンになった一方、ＭＥＦから筋細胞への移行軌道における２２日目の細胞は、成熟したマウス筋細胞になった。２２日目に残っているマウス前駆細胞はなかった。
【０３０２】
Ａｓｃｌ１発現の誘導の後のＭＥＦ細胞状態の移行のこれらの観察は、文献において公知である傾向にしたがうものである。具体的には、上に簡単に説明されるように、Ａｓｃｌ１プライミングが、ＭＥＦを、マウス前駆細胞へと移行するように誘導し、Ａｓｃｌ１のみの発現が、マウス前駆細胞を、マウスニューロン及びマウス筋細胞へと移行するように誘導する。図５ＢのＡｓｃｌ１多様体に関して上に説明されるように、０日目のＭＥＦにおけるＡｓｃｌ１の強制発現の後、ＭＥＦは、マウス前駆細胞、マウス筋細胞、及びマウスニューロンのいずれか１つへと移行した。
【０３０３】
次に、Ｂｒｎ２転写因子の発現を示す図５Ｂの多様体を参照すると、２３日の期間中の０日目に、ＭＥＦに、ＢＡＭ因子を形質導入した。Ｂｒｎ２発現が、２３日の期間中の２２日目のみに測定された。図５Ｂに見られるように、２３日の期間の２２日目に、２２日目のマウスニューロンは、Ｂｒｎ２を強く発現した。したがって、Ｂｒｎ２の発現が、ＭＥＦからマウスニューロンへの移行軌道に沿ってＭＥＦ細胞の進行に関連していることが推定され得る。
【０３０４】
Ｂｒｎ２発現の誘導の後のＭＥＦ細胞状態の移行のこの観察は、文献において公知である傾向にしたがうものである。具体的には、上に簡単に説明されるように、Ｂｒｎ２発現は、マウス前駆細胞を、マウスニューロンへと移行するように誘導する。図５ＢのＢｒｎ２多様体に関して上述されるように、Ｂｒｎ２を発現したＭＥＦは、マウスニューロンへと移行した。
【０３０５】
最後に、Ｍｙｔ１ｌ転写因子の発現を示す図５Ｂの多様体を参照すると、２３日の期間中の０日目に、ＭＥＦに、ＢＡＭ因子を形質導入した。Ｍｙｔ１ｌ発現が、２３日の期間中の２２日目のみに測定された。２３日の期間の２２日目に、２２日目のマウスニューロンは、Ｍｙｔ１ｌを強く発現した。したがって、Ｂｒｎ２転写因子と同様に、Ｍｙｔ１ｌの発現が、ＭＥＦからマウスニューロンへの移行軌道に沿ってＭＥＦ細胞の進行に関連していることが推定され得る。
【０３０６】
Ｍｙｔ１ｌ発現の誘導の後のＭＥＦ細胞状態の移行のこの観察は、文献において公知である傾向にしたがうものである。具体的には、上に簡単に説明されるように、Ｍｙｔ１ｌ発現は、マウス前駆細胞を、マウスニューロンへと移行するように誘導する。図５ＢのＭｙｔ１ｌ多様体に関して上述されるように、Ｍｙｔ１ｌを発現したＭＥＦは、マウスニューロンへと移行した。
【０３０７】
したがって、第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法を用いて図５Ｂ中のＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ多様体を生成することによって得られるこれらの観察は、文献において実証される観察と一致する。Ａｓｃｌ１による、Ｂｒｎ２による、Ｍｙｔ１ｌによる移行の観察のこの一貫性は、細胞状態の移行に影響を与える遺伝子を正確に同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力を実証するのに役立つ。
【０３０８】
細胞状態の移行に影響を与える遺伝子を正確に同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力をさらに実証するために、図５Ａ及び５Ｂの多様体に基づいてなされた上記の観察を確認するために、インビトロ実験を行った。具体的には、Ａｓｃｌ１発現が、ＭＥＦを、マウス「前駆」細胞、マウスニューロン、及び／又はマウス筋細胞へと移行するように誘導するという上記の観察を確認するために、インビトロ実験を行った。
【０３０９】
インビトロ実験を、第ＩＶ．Ａ節において上に説明されるプロトコルにしたがって行った。上述されるように、このプロトコルにおいて、Ａｓｃｌ１のみの発現を、ＭＥＦにおいて強制した。２３日の期間の０日目、２３日の期間の１５日目のＭＥＦにおけるＡｓｃｌ１転写因子の強制発現の後、マウス細胞を、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色した。ＤＡＰＩは、ＤＮＡ中のアデニン−チミンリッチ領域を染色することが知られている。したがって、ＤＡＰＩは、細胞核を染色する。Ｍａｐ２抗体及びＴｕｊ１抗体は、神経系細胞を染色することが知られている。したがって、マウス細胞を、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色することによって、全マウス細胞の量に対するマウスニューロンの量が同定され得、ひいては、ＭＥＦの移行に対するＡｓｃｌ１の過剰発現の影響が決定され得る。Ａｓｃｌ１転写因子の発現を強制したマウス細胞のこのセットは、本明細書において、インビトロ実験における実験群と呼ばれる。
【０３１０】
インビトロ実験における陽性対照群として、マウスニューロンのみを含むマウス細胞のサンプルも、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色した。陰性対照群として、Ａｓｃｌ１発現を強制していないＭＥＦ細胞のサンプルも、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色した。
【０３１１】
実験群、陽性対照群、及び陰性対照群を、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色した後、各染色剤で染色された各群を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＨＣＩ  ＩＸＭ４においてイメージングした。得られた画像が、図６に示される。図６は、一実施形態に係る、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色された、Ａｓｃｌ１の発現が強制されたＭＥＦ細胞の画像、ＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色されたマウスニューロンの画像、並びにＤＡＰＩ、Ｍａｐ２抗体、及びＴｕｊ１抗体で染色された、Ａｓｃｌ１の発現が強制されていないＭＥＦ細胞の画像を示す。
【０３１２】
まず、陰性対照群の画像を参照すると、図６に示されるように、Ａｓｃｌ１の発現が強制されていないＤＡＰＩで染色されたＭＥＦ細胞の核が視認可能であるが、Ａｓｃｌ１の発現が強制されていないＭＥＦ細胞のＭａｐ２及びＴｕｊ１染色を示す画像中にニューロンはほとんどないし全くない。言い換えると、サンプル中に存在する多くのマウス細胞（特にＭＥＦ）があった一方、ニューロンは存在しなかった。これは、Ａｓｃｌ１の発現がこのサンプルのＭＥＦ細胞内で強制されず、したがって、ニューロンへのＭＥＦ細胞の移行が誘導されなかったため、予測される結果である。
【０３１３】
次に、陽性対照群の画像を参照すると、図６に示されるように、ＤＡＰＩで染色されたマウスニューロンの核が視認可能であるが、これらの同じマウスニューロンはまた、マウスニューロンのＭａｐ２及びＴｕｊ１染色を示す画像中でも視認可能である。言い換えると、陽性対照サンプル中の細胞の全てが、ニューロンとして正確に同定された。
【０３１４】
最後に、実験群の画像を参照すると、図６に示されるように、Ａｓｃｌ１の発現を強制したＤＡＰＩで染色されたＭＥＦ細胞の核が視認可能である。さらに、これらのＤＡＰＩで染色された細胞の一部がまた、Ｍａｐ２及びＴｕｊ１で染色され、これは、これらの選択された細胞がマウスニューロンであったことを示す。したがって、Ａｓｃｌ１の強制発現が、ＭＥＦからマウスニューロンへの移行の誘導に関連していることが示唆され得る。
【０３１５】
図５Ａ及び５Ｂに関して上述されるインシリコ実験において観察されるように、図６のインビトロ実験は、ＭＥＦ細胞におけるＡｓｃｌ１の強制発現が、ＭＥＦ細胞の、マウスニューロンへの移行をもたらし得ることを確認する。図５Ａ及び５Ｂ中でなされる観察のこの確認は、細胞状態の移行に影響を与える遺伝子を正確に同定する第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法の能力をさらに実証する。
【０３１６】
ＩＶ．Ｄ．実施例２：クラスタリング
第ＩＩＩ．Ｃ．節において上述されるように、次元削減による行列Ｍの生成の後、クラスタリングを行って、行列Ｍ中のデータをグループ分けして、クラスターのセットＣｊを生成する。クラスターのセットＣｊ中の各クラスターは、点のセットを含む。
【０３１７】
図７Ａは、一実施形態に係る、図４Ｂの多様体を、クラスタリングによって同定されるクラスターＣｊにグループ分けされた多様体中の点とともに示す。図７Ａの実施形態において、クラスタリングは、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出、具体的にはＧｅｎＬｏｕｖａｉｎコミュニティ検出を用いて行った。図７Ａに見られるように、クラスタリングは、多様体中の点の１０の独自のクラスターＣｊを同定した。
【０３１８】
一般に、クラスタリングは、点に関連する値の閾値類似性、例えば、多様体の削減された次元空間におけるそれらの位置、それらの関連する遺伝子転写物数などに基づいて、多様体中の点を所与のクラスターに割り当てる。特に、図７Ａの多様体について、クラスタリングは、多様体中の点間の閾値類似性に基づいて、点を所与のクラスターに割り当てる。例えば、群８に含まれる図７Ａの多様体中の点は全て、マウスニューロン、又はマウスニューロンと遺伝的に類似した他の細胞に関連する可能性が高い。同様に、群９に含まれる図７Ａの多様体中の点は全て、マウス筋細胞、又はマウス筋細胞と遺伝的に類似した他の細胞に関連する可能性が高い。
【０３１９】
上述されるように、細胞状態の移行を誘導することが文献において知られている遺伝子の正確な同定を可能にすることに加えて、第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法はまた、文献において知られていない、細胞状態の移行に影響を与える因子（例えば、遺伝子及び摂動）の同定も可能にする。図７Ｂは、一実施形態に係る、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連することが文献において知られている転写因子及び知られていない転写因子の両方を示す。特に、図７Ｂは、マウス「前駆」細胞において低発現される場合、マウス「前駆」細胞の、マウス筋細胞への移行の阻害に関連する転写因子、及びマウス「前駆」細胞において過剰発現される場合、マウス「前駆」細胞の、マウスニューロンへの移行に関連する転写因子を示す。マウス「前駆」細胞において、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する転写因子を低発現させることによって、及びマウス「前駆」細胞において、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行の誘導に関連する転写因子を過剰発現させることによって、マウス「前駆」細胞が、マウス筋細胞ではなく、マウスニューロンへと移行するように誘導され得る。
【０３２０】
第１の細胞状態から別の特定の細胞状態への移行、又は第１の細胞状態から任意の他の細胞状態への移行に関連する転写因子を同定するために、クラスターが使用され得る。具体的には、第１の細胞状態に関連するクラスター中の点に関連する遺伝子転写物数を同定し、別の特定の細胞状態、又は第１の細胞状態以外の任意の細胞状態に関連する別のクラスター中の点に関連する遺伝子転写物数と比較する。クラスター間の遺伝子転写物数のこの比較は、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルなどの任意の示差発現試験を用いて行われ得る。
【０３２１】
例として、ＭＥＦからマウスニューロンへの移行に関連する転写因子を同定するために、図７Ａに関して説明されたクラスターを使用した。まず、マウス「前駆」細胞において過剰発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行に関連する転写因子を同定するために、マウスニューロンに関連する図７Ａのクラスター（例えば、図７Ａのクラスター８）に含まれる点に関連する遺伝子転写物数を同定し、マウスニューロンに関連していない図７Ａの別のクラスターに含まれる点に関連する遺伝子転写物数と比較した。図７Ｂの実施形態において、この比較は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて行われた。しかしながら、代替的な実施形態において、比較は、統計分析の任意の他の方法を用いて行われ得る。この比較に基づいて、マウスニューロンに関連する図７Ａのクラスター中の点に関連する細胞において過剰発現された遺伝子は、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行に関連していることが予測された。これらの遺伝子の転写及び翻訳から生じる転写因子は、マウス「前駆」細胞において過剰発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行に関連する図７Ｂ中の転写因子として同定された。
【０３２２】
同様に、マウス「前駆」細胞において低発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する転写因子を同定するために、マウス筋細胞に関連する図７Ａのクラスター（例えば、図７Ａのクラスター９）に含まれる点に関連する遺伝子転写物数を同定し、マウス筋細胞に関連していない図７Ａの別のクラスターに含まれる点に関連する遺伝子転写物数と比較した。上述されるように、図７Ｂの実施形態において、この比較は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて行われた。しかしながら、代替的な実施形態において、比較は、統計分析の任意の他の方法を用いて行われ得る。この比較に基づいて、マウス筋細胞に関連する図７Ａのクラスター中の点に関連する細胞において低発現された遺伝子は、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連していることが予測された。これらの遺伝子の転写及び翻訳から生じる転写因子は、マウス「前駆」細胞において低発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する図７Ｂ中の転写因子として同定された。
【０３２３】
図７Ｂに見られるように、マウス「前駆」細胞において過剰発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行に関連する転写因子としては、Ｚｆｐ９４１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｔａｆ５Ｂ、Ｓｔ１８、Ｚｋｓｃａｎ１６、Ｃａｍｔａ１、及びＡｒｎｔ２が挙げられる。マウス「前駆」細胞において低発現される場合、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する転写因子としては、Ａｔｆ３、Ｒｏｒｃ、Ｓｃｘ、Ｓａｔｂ１、Ｅｌｆ３、及びＦｏｓが挙げられる。実施例１に関して上に詳細に説明されるように、Ｂｒｎ２及びＭｙｔ１ｌ転写因子は、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行の誘導に関連していることが文献において知られている。しかしながら、図７Ｂに示される残りの転写因子は、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連することが文献において知られていない。したがって、上記の第ＩＩ節及び第ＩＩＩ節の方法を使用することによって、細胞を、移行の特定の軌道を辿るように誘導することが文献において知られている及び知られていない遺伝子及び／又は転写因子の両方が同定され得る。次に、これらの同定された転写因子を用いて、細胞状態の移行、ひいては細胞の運命を制御することができる。
【０３２４】
ＩＶ．Ｅ．実施例３：摂動に誘導される移行
第ＩＩＩ．Ｄ及びＩＩＩ．Ｅ節において説明されるように、細胞状態の移行に影響を与える遺伝子及び転写因子の同定を可能にすることに加えて、第ＩＩ及びＩＩＩ節の方法はまた、細胞状態の移行に影響を与える、小分子などの摂動の同定も可能にする。まず、細胞を、移行の特定の軌道を辿るように誘導する摂動を同定するために、移行の可能な軌道が同定される。
【０３２５】
図８Ａは、一実施形態に係る、図４Ａに関して説明されるＭＥＦ細胞についての移行軌道のマップを示す。移行軌道のこのマップを構築するために、図４Ｂの多様体を使用した。具体的には、同様の遺伝子転写物数に関連する多様体中の点を、複数の状態（図８Ａ中で丸として表される）にグループ分けした。状態間に位置する可変の遺伝子転写物数の点を用いて、状態間の移行経路（図８Ａ中で線として表される）を同定した。図８Ａに示される移行軌道のマップは、細胞における遺伝子発現を変化させ、それによって細胞を、移行軌道のマップにおいてある状態から別の状態へと進行させることによって、細胞の移行軌道に影響を与える摂動を同定するのに使用され得る。ある実施形態において、図８Ａに示される移行軌道のマップを生成するために、標準的なマーカー遺伝子のセットによる細胞の分類が使用され得る。このような実施形態において、同じ細胞型として同定される細胞は、移行軌道のマップにおいて同じ移行軌道に沿った細胞であると予測される。代替的な実施形態において、図８Ａに示される移行軌道のマップを生成するために、図４Ｂの多様体のブランチが同定され、移行軌道のマップにおける異なる移行軌道を規定することが予測される。
【０３２６】
図８Ｂは、一実施形態に係る、細胞が図８Ａの移行軌道のマップにおける第１の状態から第２の状態へと移行するように細胞における遺伝子発現を変化させることによって細胞の移行軌道に影響を与える摂動を同定するための第ＩＩＩ．Ｄ．節に記載される方法の例を示す。具体的には、細胞に曝されるとき、細胞が第１の状態から第２の状態へと移行するように、細胞に遺伝子発現を変化させる摂動を同定するために、図８Ｂの方法は、細胞が第１の状態から第２の状態へと移行した後の細胞における遺伝子発現の変化を、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後のビヒクル細胞における遺伝子発現の変化と比較する。細胞が第１の状態から第２の状態へと移行した後の遺伝子発現の変化が、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後のビヒクル細胞における遺伝子発現の変化と一致する（例えば、同等であるか又は類似している）場合、摂動は、細胞における遺伝子発現を変化させることによって、摂動に曝された細胞の、第１の状態から第２の状態への移行を誘導することが予測され得る。このように、摂動は、細胞状態の移行の特定の軌道に関連していることが予測され得る。
【０３２７】
具体的には、図８Ｂに示される例を参照すると、図８Ｂは、６つの異なる遺伝子、遺伝子１〜６についての、状態１の細胞、状態２の細胞、ビヒクル細胞、及び小分子摂動に曝されたビヒクル細胞の遺伝子発現のレベルを示す。所与の遺伝子についての遺伝子発現のレベルは、陰影によって示される。水玉模様の陰影は、検出不可能な遺伝子発現を示す一方、網目模様の陰影は、検出可能な遺伝子発現を示す。言い換えると、図８Ｂの実施形態において、遺伝子発現が、検出可能な遺伝子発現又は検出不可能な遺伝子発現のバイナリベースで測定される。しかしながら、代替的な実施形態において、遺伝子発現のレベルは、バイナリベースで測定されず、より定量ベースで測定される。
【０３２８】
各細胞中の各遺伝子についての遺伝子発現のレベルを調べることに目を向けると、状態１の細胞については、遺伝子１〜３の発現が検出不可能であったが、遺伝子４〜６の発現は検出可能であった。対照的に、状態２の細胞については、遺伝子４〜６の発現が検出不可能であったが、遺伝子１〜３の発現は検出可能であった。ビヒクル細胞については、遺伝子１〜３の発現が検出不可能であったが、遺伝子４〜６の発現は検出可能であった。対照的に、摂動に曝されたビヒクル細胞については、遺伝子４〜６の発現が検出不可能であったが、遺伝子１〜３の発現は検出可能であった。
【０３２９】
次に、各遺伝子について、状態１の細胞における遺伝子の発現のレベルを、状態２の細胞における遺伝子の発現のレベルと比較して、状態１から状態２への細胞の移行の後の遺伝子の発現のレベルの変化を決定した。遺伝子１〜３に関連する暗色の網目模様の陰影によって示されるように、遺伝子１〜３の発現は、状態１から状態２への細胞の移行の後に増加した。一方、遺伝子４〜６に関連する暗色の水玉模様の陰影によって示されるように、遺伝子４〜６の発現は、状態１から状態２への細胞の移行の後に低下した。
【０３３０】
同様に、各遺伝子について、ビヒクル細胞における遺伝子の発現のレベルを、摂動に曝されたビヒクル細胞における遺伝子の発現のレベルと比較して、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後の遺伝子の発現のレベルの変化を決定した。遺伝子１〜３に関連する暗色の網目模様の陰影によって示されるように、遺伝子１〜３の発現は、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後に増加した。一方、遺伝子４〜６に関連する暗色の水玉模様の陰影によって示されるように、遺伝子４〜６の発現は、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後に低下した。
【０３３１】
最後に、状態１から状態２への細胞の移行の後の細胞における遺伝子発現の変化を、摂動へのビヒクル細胞の曝露の後のビヒクル細胞における遺伝子発現の変化と比較した。移行した細胞における遺伝子発現の変化を、ビヒクル細胞における遺伝子発現の変化と比較するために、任意の示差発現試験が使用され得る。例えば、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデル比較アルゴリズムのいずれか１つが使用され得る。
【０３３２】
図８Ｂに示されるように、遺伝子１〜３の発現は、状態１から状態２へと移行した細胞、及び摂動に曝されたビヒクル細胞の両方において増加した。さらに、遺伝子４〜６の発現は、状態１から状態２へと移行した細胞、及び摂動に曝されたビヒクル細胞の両方において低下した。状態１から状態２へと移行した細胞及び摂動に曝されたビヒクル細胞における遺伝子発現の変化のこの類似性に基づいて、摂動への状態１の細胞の曝露が、細胞における遺伝子発現を変化させることによって、状態１の細胞の、状態２への移行を誘導し得ることが予測され得る。したがって、摂動を用いて、状態１から状態２への細胞の移行を制御することができる。
【０３３３】
図８Ｂに関して上述される方法は、一般的状態１から一般的状態２への細胞の移行の誘導に関連する摂動の同定に関する。したがって、図８に関して上述される方法は、図８Ａの移行軌道のマップにおいて任意の他の状態に関連付けられた任意の状態からの細胞の移行の誘導に関連する摂動を同定するのに使用され得る。しかしながら、図８Ａの移行軌道のマップにおける一般的状態を参照するのではなく、図９は、図８Ａの移行軌道のマップにおける特定の状態を同定し、次に、細胞が、マウス筋細胞ではなくマウスニューロンになるような、図９におけるある同定された状態から別の同定された状態への細胞の移行の誘導又は阻害に関連する特定の摂動を同定する。具体的には、図９は、ＭＥＦ状態、マウス「前駆」細胞状態、マウス筋細胞状態、及びマウスニューロン状態を同定し、次に、細胞が、マウス筋細胞ではなく、マウスニューロンになるような、これらの状態の１つから別の状態への細胞の誘導又は阻害に関連する特定の摂動を同定する。
【０３３４】
図９は、一実施形態に係る、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連する小分子摂動を示す。特に、図９は、ＭＥＦに曝されたとき、ＭＥＦの、マウス「前駆」細胞への移行に関連する小分子摂動のセット、マウス「前駆」細胞に曝されたとき、マウス「前駆」細胞の、マウス筋細胞への移行の阻害に関連する小分子摂動のセット、及びマウス「前駆」細胞に曝されたとき、マウス「前駆」細胞の、マウスニューロンへの移行に関連する小分子摂動を示す。ＭＥＦからマウスニューロンへの移行の誘導に関連する摂動にＭＥＦを曝すことによって、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する摂動にＭＥＦを曝すことによって、及びマウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行の誘導に関連する摂動にＭＥＦを曝すことによって、ＭＥＦは、マウス筋細胞ではなく、マウスニューロンへと移行するように誘導され得る。
【０３３５】
図９に示される小分子摂動のそれぞれは、図８Ｂに関して上述される方法を実施することによって同定された。例えば、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行に関連しているものとして小分子摂動ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４を同定するために、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行の後のＭＥＦにおける遺伝子発現の変化が、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４へのビヒクル細胞の曝露の後のビヒクル細胞における遺伝子発現の変化に一致する（例えば、同等であるか又は類似している）ことが、図８Ｂの方法を用いて決定された。したがって、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４は、ＭＥＦにおける遺伝子発現を変化させることによって、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行を誘導することが予測された。同様に、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞の移行の阻害に関連しているものとして小分子摂動ダサチニブを同定するために、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の後のマウス「前駆」細胞における遺伝子発現の変化が、ダサチニブへのビヒクル細胞の曝露の後のビヒクル細胞における遺伝子発現の変化の逆数であることが、図８Ｂの方法を用いて決定された。したがって、ダサチニブは、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行を阻害することが予測された。
【０３３６】
図９に見られるように、ＭＥＦに曝されるとき、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行に関連する小分子摂動としては、ＢＲＤ−Ｋ３８６１５１０４、ゲルダナマイシン、マヌマイシンＡ、ミトキサントロン、クルクミン、及びトリコスタチンＡが挙げられる。マウス「前駆」細胞に曝されるとき、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行に関連する小分子摂動としては、アルボシジブ、ボリノスタット、ＫＩ２０２２７、フォルスコリン、ＰＰ１、及びＰＰ２が挙げられる。マウス「前駆」細胞に曝されるとき、マウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害に関連する小分子摂動としては、アルボシジブ、ゲルダナマイシン、キナクリン、ＣＧＰ−６０４７４、及びダサチニブが挙げられる。
【０３３７】
図９において同定される小分子摂動の２つである、アルボシジブ及びゲルダナマイシンは、２つの異なる状態のマウス細胞の移行を誘導及び／又は阻害することによって、マウス細胞からマウスニューロンへの移行の誘導に関連する。具体的には、図９に示されるように、アルボシジブは、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行の誘導、及びマウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害の両方に関連する。同様に、ゲルダナマイシンは、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行の誘導、及びマウス「前駆」細胞からマウス筋細胞への移行の阻害の両方に関連する。したがって、ＭＥＦを、アルボシジブ及びゲルダナマイシンの両方に曝すことによって、ＭＥＦは、マウスニューロンへと移行することが予測され得る。
【０３３８】
図９において同定される小分子摂動のいくつかは、移行の示される軌道に関連していることが文献において知られている。具体的には、フォルスコリン、ＰＰ１、及びＰＰ２は、マウス「前駆」細胞からマウスニューロンへの移行の誘導に関連していることが文献において知られている。同様に、トリコスタチンＡは、ＭＥＦからマウス「前駆」細胞への移行の誘導に関連していることが文献において知られている。図８Ｂの方法及び文献において公知の情報によってなされる予測のこの一貫性は、細胞状態の移行に影響を与える摂動を正確に同定する図８Ｂの方法の能力を実証する。
【０３３９】
細胞状態の移行に影響を与えることが文献において知られている摂動を正確に同定することに加えて、図８Ｂの方法はまた、細胞状態の移行に影響を与えることが文献において知られていない摂動も同定することが可能である。具体的には、図９に示される残りの小分子摂動は、ＭＥＦの、マウス筋細胞への移行ではなく、マウスニューロンへの移行に関連することが文献において知られていない。したがって、図８Ｂに関して上述される方法を使用することによって、細胞を、移行の特定の軌道を辿るように誘導することが文献において知られている摂動及び知られていない摂動の両方が同定され得る。次に、これらの同定された摂動を用いて、細胞状態の移行、ひいては細胞の運命を制御することができる。
【０３４０】
Ｖ．実施例４
この実施例の実験は、ニューロン及び／又は前駆細胞を促進するための方法を実証した。本明細書に記載される実験において、線維芽細胞（すなわち、初代マウス線維芽細胞）の開始集団を、Ａｓｃｌ１過剰発現レンチウイルスを含む組成物に曝した。４８時間後、化合物（例えば、フォルスコリン、グレサチニブ、ＰＤ−０３２５９０１）、又はビヒクル（すなわち、ＤＭＳＯ又はエタノール）を、組成物に加えた。ニューロンの総数を、陽性Ｔｕｊ１／Ｍａｐ２シグナル及び神経形態に基づいて手動で計数した。各実験について、各処理条件についてのニューロンの総数を、その実験に対する、ＤＭＳＯで処理されたウェル中のニューロンの数によって正規化した。図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、線維芽細胞の開始集団から発生したニューロンの存在が、これらの実験において検出された。ニューロンの総数及びニューロンのパーセンテージの両方の倍率変化は、組成物に加えられる化合物に応じて、増加するか、減少するか、又は同じままであった。これらの実験は、本発明の方法が、線維芽細胞を含む細胞の開始集団からニューロン及び／又は前駆細胞を促進するのに有用であることを実証した。
【０３４１】
細胞培養及び化合物処理
２回目の継代の初代マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、ＤＭＥＭ中１０％のＦＢＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ＭＥＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５Ｕ／ｍｌのｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及び５５μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＭＥＦ培養培地中で、２０，０００〜４５，０００個／ウェル（ロットに応じて）で、２４ウェルプレート上で平板培養した。培養物中で２４時間後、スピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（９０分間にわたって３２℃で、２０００ｒｐｍでプレートを回転させる）によって、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＭＥＦ培養培地中で、ＭＥＦを、Ａｓｃｌ１過剰発現レンチウイルスに感染させた。レンチウイルス生成については以下を参照されたい。４８時間後、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＮ２、２％のＢ２７  １：５０、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５μｇ／ｍｌのインスリン、化合物又はビヒクル（ＤＭＳＯ又はエタノール）を含有する０．０５Ｕ／ｍｌのｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む神経細胞用培地に交換した。化合物及びそれらの濃度を、以下から選択した：ＢＩ−２５３６（２００ｎＭ）、シロスタゾール（１０００ｎＭ）、ダブラフェニブ（２５００ｎＭ）、エストラジオールシピオナート（２０００ｎＭ）、ＥＸ−５２７（５０００ｎＭ）、フェドラチニブ（１０００ｎＭ）、フォレチニブ（２００ｎＭ）、フォルスコリン（５０００ｎＭ）、グレサチニブ（２５００ｎＭ）、インジルビン−３−オキシム（２０００ｎＭ）、ＫＩ２０２２７（２５０ｎＭ）、ＫＵ  ００６０６４８（２００ｎＭ）、ｍ−３Ｍ３ＦＢＳ（１０００ｎＭ）、マヌマイシン（８００ｎＭ）、ＰＤ−０３２５９０１（５０００ｎＭ）、ＰＨＡ−６６５７５２（１０００ｎＭ）、キナクリン（２００ｎＭ）、ロットレリン（１０００ｎＭ）、セルメチニブ（１００ｎＭ）、トログリタゾン（５０００ｎＭ）、及びベムラフェニブ（５０００ｎＭ）。半分培地交換を、補充される化合物とともに２〜３日ごとに行った。
【０３４２】
免疫蛍光染色
Ａｓｃｌ１感染の１２日後の時点で、細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し（０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）、５％の血清（ロバ、子牛、ヤギ血清混合物）中でブロックし、４℃で一晩、又は室温で２時間にわたってウサギ抗Ｔｕｊ１（１：１０００）及びマウス抗Ｍａｐ２（１：５００）抗体で染色した後、二次抗体及びＤＡＰＩ染色を行った。
【０３４３】
イメージング及び分析
イメージングを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏにおいて行い；ウェルごとに３６の画像を、１０倍対物レンズで撮影した。ニューロンの総数を、陽性Ｔｕｊ１／Ｍａｐ２シグナル及び神経形態に基づいて手動で計数した。各実験について、各処理条件についてのニューロンの総数を、その実験について、ＤＭＳＯで処理されたウェル中のニューロンの数によって正規化した。
【０３４４】
レンチウイルス生成
パッケージングプラスミド（Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）（ＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏ、ＬＶ５１０Ａ−１）又は同様のもの、及びＡｓｃｌ１過剰発現プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅレンチウイルス発現ベクトルへとクローニングされたＡｓｃｌ１  ｃＤＮＡ  ｃａｔ＃  ＰＳ１０００６４）とともに、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ  Ｌｅｎｔｉ  Ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ、ＭＩＲ  ６６０３）によって２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって、レンチウイルスをパッケージングし、１６，５００ＲＰＭで１．５時間にわたってＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ超遠心機において濃縮した。４８時間の時点でウサギ抗Ａｓｃｌ１（１：２００；Ａｂｃａｍ、ａｂ７４０６５−１００ＵＧ）免疫蛍光染色によって判定した際に、９０％以上の細胞のレンチウイルス感染を有する実験のみを追跡した。
【０３４５】
Ｖ．実施例５
実施形態１．摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測するための方法であって、方法が、メモリ及び１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムにおいて：第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す単一細胞の移行シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、変化した細胞状態は、第１の細胞状態から変化した細胞状態への細胞の移行を経て生じ、単一細胞の移行シグネチャーは、複数の細胞成分の同定及び、複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、それぞれの細胞成分の発現の変化と、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第１の重要度スコアを含む、工程と；複数の非摂動細胞と摂動に曝された複数の摂動細胞との間の細胞成分の発現の差の尺度を表す摂動シグネチャーに電子的形態でアクセスする工程であって、摂動シグネチャーは、複数の細胞成分の全て又は一部の同定及び、複数の細胞成分の全て又は一部の中の各それぞれの細胞成分について、（ｉ）複数の非摂動細胞と複数の摂動細胞との間のそれぞれの細胞成分の発現の変化と、（ｉｉ）複数の非摂動細胞と複数の摂動細胞との間の細胞状態の変化との間の関連性を定量する対応する第２の重要度スコアを含む、工程と；単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーを比較し、それによって、摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを決定する工程とを含む、方法。
【０３４６】
実施形態２．単一細胞の移行シグネチャーにアクセスする工程が、（ｉ）第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット、及び（ｉｉ）第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットに基づいて、単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程を含み、ここで：第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第１の単一細胞細胞成分の発現データセットが、第１の細胞状態の第１の複数の細胞の対応する単一細胞から得られ、第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第２の単一細胞細胞成分の発現データセットが、変化した細胞状態の第２の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる、実施形態１に記載の方法。
【０３４７】
実施形態３．第１の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第１の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含み、第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットの各それぞれのデータセットが、第２の複数の細胞成分ベクトル中の、対応する細胞成分ベクトルを含み、第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルが、複数の要素を含み、それぞれの細胞成分ベクトル中の各それぞれの要素が、複数の細胞成分中の対応する細胞成分に関連しており、第１及び第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットのそれぞれのデータセットによって表される対応する単一細胞についての対応する細胞成分の量を表す対応する値を含む、実施形態２に記載の方法。
【０３４８】
実施形態４．第１及び／又は第２の複数の単一細胞細胞成分の発現データセットに対して次元削減を行って、複数の次元削減成分を生成する工程と；第１及び第２の複数の細胞成分ベクトル中の各それぞれの細胞成分ベクトルについて、複数の次元削減成分を、それぞれの細胞成分ベクトルに適用して、複数の次元削減成分中の各それぞれの次元削減成分についての次元削減成分値を含む対応する次元削減ベクトルを形成し、それによって、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルを形成する工程と；クラスタリングを行って、クラスターのセットＣｊを生成する工程であって、各クラスターが、第１及び第２の複数の次元削減ベクトルのサブセットに対応する複数の点を含む、工程と；クラスターのセットＣｊの第１のクラスターから第１の複数の細胞を同定する工程と；クラスターのセットＣｊの第２のクラスターから第２の複数の細胞を同定する工程とをさらに含み、方法が、任意に、対応する第１及び第２の複数の次元削減ベクトルを用いて多様体学習を行って、第１及び第２の複数の細胞における各細胞の他の各細胞に対する相対的な細胞状態を同定する工程をさらに含む、実施形態３に記載の方法。
【０３４９】
実施形態５．複数の非摂動細胞が、摂動に曝されていない対照細胞であり、又は非摂動細胞が、摂動に曝された非関連摂動細胞の平均である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０３５０】
実施形態６．単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをプルーニングして、複数の細胞成分を、任意にＲＮＡレベルで測定される転写因子に制限する工程をさらに含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３５１】
実施形態７．単一細胞の移行シグネチャーを決定する工程が、母平均の差の検定、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、（ｉ）第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセットと、第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の複数の細胞成分にわたる細胞成分量の差を決定する工程を含む、実施形態２に記載の方法。
【０３５２】
実施形態８．細胞成分の発現の差の尺度が、ウィルコクソンの順位和検定、ｔ検定、ロジスティック回帰、及び一般化線形モデルのうちの１つを用いて、（ｉ）第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセットと、（ｉｉ）第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセットとの間の細胞成分量の差を定量し、ここで：第３の複数の第３の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第３の単一細胞細胞成分の発現データセットが、複数の非摂動細胞中の対応する単一細胞から得られ、第４の複数の第４の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各それぞれの第４の単一細胞細胞成分の発現データセットが、摂動に曝された複数の摂動細胞中の第４の複数の細胞の対応する単一細胞から得られる、実施形態１に記載の方法。
【０３５３】
実施形態９．単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングして、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程をさらに含み、任意に、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーをフィルタリングする工程が、閾値ｐ値にしたがって、又は細胞成分の閾値数にしたがって、単一細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーに含まれる細胞成分の数を減少させる工程を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０３５４】
実施形態１０．それぞれの細胞成分についての対応する第２の重要度スコアを決定する工程が、それぞれの細胞成分についての重要度スコアを、複数の細胞成分中の各それぞれの細胞成分について、それぞれの細胞成分についての対応するマッチングスコアで置き換える工程と；複数の細胞成分についてのマッチングスコアを組み合わせて、摂動についてのマッチングスコアを生成する工程と；摂動が、それぞれの摂動についてのマッチングスコアに基づいて、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連しているかどうかを決定する工程とを含み、任意に、対応するマッチングスコアが、別個の又は連続したスコアを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０３５５】
実施形態１１．重要度スコアを置き換える工程が、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及びそれぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも上方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が上方制御され、それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が下方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；それぞれの細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、実施形態１０に記載の方法。
【０３５６】
実施形態１２．重要度スコアを置き換える工程が、それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量及び細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が両方とも下方制御される場合、重要度スコアを第１のスコアで置き換える工程と；それぞれの細胞成分についての単一細胞の移行シグネチャーからの細胞成分量が下方制御され、細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が上方制御される場合、重要度スコアを第２のスコアで置き換える工程と；細胞成分についての摂動シグネチャーからの細胞成分量が、有意に上方制御又は下方制御されない場合、重要度スコアを第３のスコアで置き換える工程とを含む、実施形態１０に記載の方法。
【０３５７】
実施形態１３．複数の細胞成分が、任意にＲＮＡレベルで測定される複数の遺伝子を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３５８】
実施形態１４．第１の複数の第１の単一細胞細胞成分の発現データセット及び第２の複数の第２の単一細胞細胞成分の発現データセット中の各単一細胞細胞成分の発現データセットが、単一細胞リボ核酸（ＲＮＡ）シーケンシング（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）、ｓｃＴａｇ−ｓｅｑ、シーケンシングを用いたトランスポゼースでアクセス可能なクロマチンの単一細胞アッセイ（ｓｃＡＴＡＣ−ｓｅｑ）、ＣｙＴＯＦ／ＳＣｏＰ、Ｅ−ＭＳ／Ａｂｓｅｑ、ｍｉＲＮＡ−ｓｅｑ、ＣＩＴＥ−ｓｅｑ、及びそれらの任意の組合せ、並びに単一細胞細胞成分の発現データセットにおける活性化された経路を表す線形組合せなどの組合せを含む、上記のものの集合からなる群から選択される方法を用いて生成される、実施形態２に記載の方法。
【０３５９】
実施形態１５．比較に基づいて、変化した細胞状態を促進するものとして摂動を同定する工程、又は比較に基づいて、変化した細胞状態を阻害するものとして摂動を同定する工程をさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３６０】
実施形態１６．細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーが、異なるタイプの細胞成分を用いて生成される、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
実施形態１７．細胞の移行シグネチャー及び摂動シグネチャーが、同じタイプの細胞成分を用いて生成される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３６２】
実施形態１８．電子的形態でアクセスする工程が、複数の摂動における各それぞれのシグネチャーについて行われ、それによって、複数の摂動シグネチャーを得て、比較する工程が、前記単一細胞の移行シグネチャー及び前記摂動シグネチャーを、複数の摂動シグネチャーにおける各それぞれのシグネチャーと比較し、それによって、第１の細胞状態と変化した細胞状態との間の細胞の移行に関連する複数の摂動のサブセットを決定する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３６３】
実施形態１９．１つ以上のプロセッサ及びメモリを含むコンピュータシステムであって、メモリが、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法を実行するための命令を保存する、コンピュータシステム。
【０３６４】
実施形態２０．摂動が細胞の移行に影響を与えるかどうかを予測するための、コンピュータによって実行可能な１つ以上のコンピュータプログラムを保存する非一時的なコンピュータ可読媒体であって、コンピュータが、１つ以上のプロセッサ及びメモリを含み、１つ以上のコンピュータプログラムが、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法を実行するための、コンピュータが実行可能な命令を集合的に符号化する、非一時的なコンピュータ可読媒体。
【０３６５】
引用される参考文献及び代替的な実施形態
本明細書に引用される参考文献は、各個々の刊行物又は特許若しくは特許出願が、あらゆる目的のために全体が参照により援用されることが具体的に且つ個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のために全体が参照により本明細書に援用される。
【０３６６】
本発明は、非一時的なコンピュータ可読記録媒体に埋め込まれたコンピュータプログラム機構を含むコンピュータプログラム製品として実装され得る。例えば、コンピュータプログラム製品は、図１又は２の任意の組合せで示されるプログラムモジュールを含み得る。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク記憶装置製品、又は任意の他の非一時的なコンピュータ可読データ又はプログラム記憶装置製品に保存され得る。
【０３６７】
本発明の多くの変更及び変形が、当業者に明らかであるように、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに行われ得る。本明細書に記載される特定の実施形態は、例として提供されるに過ぎない。実施形態は、本発明の原理及びその実際の用途を最良に説明し、それによって他の当業者が、本発明及び様々な変更を有する様々な実施形態を、考えられる特定の用途に合うように最良に利用することができるように選択及び記載された。本発明は、このような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものである。
【０３６８】
【表５】
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【０３６９】
【表６】
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【０３７０】
【表７】
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【０３７１】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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