(57)【要約】  少なくともＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子（これは、コード配列、該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）；及びｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）をコードしているｌａｃＩ遺伝子（これは、コード配列、ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）を含む）を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の産生のためのゲノムに基づいた発現系。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも
ａ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質をコードしている遺伝子
（これは、
−コード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）をコードしているｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−コード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）を含む）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の産生のためのゲノムに基づいた発現系。
【請求項２】
関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、（ｉ）プロモーター配列内に１つのｌａｃＯ、又は（ｉｉ）プロモーター配列内に１つのｌａｃＯと、第一のｌａｃＯの上流に１つのｌａｃＯとを含有している、請求項１記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項３】
関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、プロモーター配列内に１つのｌａｃＯを含有し、ｌａｃＩプロモーターが、ＬａｃＩ発現を増加させるプロモーターである、請求項１又は２記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項４】
関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、プロモーター配列内に１つのｌａｃＯと、第一のｌａｃＯの上流に１つのｌａｃＯとを含有し、ｌａｃＩプロモーターが、ＬａｃＩ発現を増加させるプロモーターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項５】
原核細胞宿主が、大腸菌（エシェリヒア・コリ）（Escherichia coli）（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、好ましくは宿主がＢＬ２１又はＫ−１２株の大腸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項６】
ＲＮＡポリメラーゼが、異種又は同種のＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＲＮＡポリメラーゼが、宿主と同種のＲＮＡポリメラーゼであり、特にそれはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはσ７０Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項７】
請求項１記載のｂ）のプロモーターが、Ｔ５、Ｔ５Ｎ２５、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、及びｔｒｃからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項８】
ＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターが、配列番号１を含むｌａｃＩＱプロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項９】
ｌａｃオペレーターが、配列番号３を含むｌａｃＯ１、配列番号４を含むｌａｃＯ２、又は配列番号５を含むｌａｃＯ３、又は少なくとも６５％の配列同一率若しくは完全に対称なｌａｃＯを有するその機能的変異体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項１０】
関心対象タンパク質をコードしているコード配列に作動可能に連結された前記プロモーターが、初期転写配列（ＩＴＳ）、好ましくは配列番号２を含む天然Ｔ７Ａ１初期転写配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項１１】
誘導物質が、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ラクトース、メチル−β−Ｄ−チオガラクトシド、フェニル−β−Ｄ−ガラクトース、及びオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項１２】
関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内に１つのｌａｃＯ１オペレーターと、配列番号２を含む天然Ｔ７Ａ１初期転写配列とを含有し、そしてｌａｃＩプロモーターがｌａｃＩＱプロモーターである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項１３】
関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、少なくとも９２又は９４塩基対（ｂｐ）離れている、好ましくは１０３、１０５、１１４、１１６、１２５、１２７、１３４、１３６、１３８、又は１４９塩基対離れている、２つのｌａｃオペレーターを含有し、ここでの一方のｌａｃオペレーターは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターはプロモーターの上流にある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系。
【請求項１４】
ａ）宿主細胞を培養し、誘導物質の添加によって、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の発現を誘導する工程、
ｂ）関心対象タンパク質を収集する工程、
ｃ）関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｄ）修飾する工程、そして
ｅ）関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のゲノムに基づいた発現系を使用して、原核細胞宿主における関心対象タンパク質をプラスミドフリーに製造する方法。
【請求項１５】
ａ）１つ以上の関心対象タンパク質をコードしている１つ以上のコード配列、
ｂ）１つ以上のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び
ｃ）該プロモーター配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）
（ここでの、ｃ）のｌａｃＯに対するｌａｃＩの親和性は、宿主細胞の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対する、ｌａｃＩの親和性よりも低い）
を含む、少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された少なくとも１つの異種遺伝子を含む発現カセット。
【請求項１６】
少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子が、少なくとも９２又は９４ｂｐ離れている、２つのｌａｃオペレーターを含み、ここでの一方のｌａｃオペレーターはプロモーター配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターはプロモーターの上流にある、請求項１５記載の発現カセット。
【請求項１７】
配列番号１を含むｌａｃＩＱプロモーターである異種ｌａｃＩプロモーターをさらに含み、少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内にｌａｃＯ１オペレーターと、配列番号２を含む天然Ｔ７Ａ１初期転写配列を含む、請求項１５又は１６記載の発現カセット。
【請求項１８】
ａ）発現カセットを原核細胞宿主の染色体内に組み込む工程、
ｂ）宿主細胞を培養し、誘導物質の添加によって、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の発現を誘導する工程、
ｃ）関心対象タンパク質を収集する工程、そして
ｄ）関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｅ）修飾する工程、そして
ｆ）関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の発現カセットを使用して、製造規模で原核細胞宿主における関心対象タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の発現のためのプラスミドフリーな誘導系の分野に関する。本発明はさらに、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の産生のためのこのような系を使用する方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
工業用タンパク質の産生プロセスでは、遺伝子の調節は、重要な必要条件である。転写速度は、プロモーターとＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の相互作用によって制御される。この相互作用の理解及び外的調節は、プロセスの制御と、産物の収量及び品質の最適化をもたらすために必要である。低減させたプロモーター強度は、特に、抗体断片、膜タンパク質、又は毒性タンパク質のような困難なタンパク質にとって有益であり得る（１〜３）。可溶性かつ適切に折り畳まれたタンパク質という最終産物の収量は、プロモーター系の強度によって直接的に決まらないことが多く、周辺質への移行及び適切なジスルフィド結合形成のような、ペプチド鎖のさらなるプロセシングによって決まることが多い。
【０００３】
最も卓越しかつよく研究された遺伝子調節機序は、ラクトース（ｌａｃ）オペロンである（４）。野生型Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｌａｃインヒビター（ＬａｃＩ）はホモ四量体を形成し、これはｌａｃ−オペレーター配列（ｌａｃＯ）に結合し、ｌａｃＺＹＡオペロンの転写を抑制する（５）。ラクトース又は代謝不可能なイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下では、ＬａｃＩは構造を変化させ、ｌａｃ−オペレーターにはもはや結合することができず、その結果、転写が誘導される。ｌａｃ−オペレーター部位は、逆方向で対称性の反復配列を有するＤＮＡ配列である（６）。
【０００４】
対称度が高くなればなるほど、オペレーター配列に対するＬａｃＩの結合親和性は高くなる。人工的な完全に対称的なｌａｃＯ（ｓｙｍ−ｌａｃＯ）は、最大の親和性でＬａｃＩに結合することが判明し（７）、一方、およその対称性を示す、３つの野生型オペレーターのｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２及びｌａｃＯ３は、より低い親和性を示し、その結果として以下の順である：ｓｙｍ−ｌａｃＯ＞ｌａｃＯ１＞ｌａｃＯ２＞ｌａｃＯ３（８）。ＬａｃＩは、ＤＮＡループ形成機序を通して、第一のオペレーターｌａｃＯ１と、ｌａｃＯ２又はｌａｃＯ３のいずれかの双方に同時に結合する（９）。ＬａｃＯ２はｌａｃＯ１の４０１ｂｐ下流に位置し、一方、ｌａｃＯ３はｌａｃＯ１の僅か９２ｂｐ上流にある（１０）。ｌａｃＯ２の役割は依然として不明である。なぜなら、抑制への主な寄与は、ｌａｃＯ１とｌａｃＯ３がより近接しているために、ｌａｃＯ１とｌａｃＯ３のＤＮＡループ形成から生じるからである（８）。さらに、ｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３がＬａｃＩと結合すると、ＬａｃＩそれ自体の産生が妨げられる。ｌａｃＩ遺伝子の３'末端は、ｌａｃＯ３と重複する。抑制された状態では、ｌａｃＩの転写により、切断短縮されたｍＲＮＡが生じ、これは細胞によって迅速に分解される。この自己調節に因り、ＬａｃＩ四量体の濃度は、誘導された細胞では約４０個の分子であり、非誘導細胞では約１５個の分子である（１１）。
【０００５】
ＬａｃＩリプレッサータンパク質及びｐＬａｃＩプロモーターのいくつかの突然変異体が存在する。Penumetcha et al.は、転写の読み漏らしの減少した系を発見するための努力において、リプレッサーの突然変異体とプロモーターの突然変異体の様々な組合せを試験した。彼らは、ｐＬａｃＩＱ１プロモーターと組み合わせた野生型ＬａｃＩリプレッサータンパク質の使用が、高レベルの誘導と低レベルの転写の読み漏らしをもたらすことを報告する（３４）。
【０００６】
Oehler et al.は、Ｌａｃリプレッサーによる抑制に対する、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の染色体ｌａｃオペロンの３つ全てのｌａｃオペレーターの系統的破壊の効果を試験し、ｌａｃオペロンの３つのオペレーターは抑制において協力することを報告する（３５）。
【０００７】
四量体のＬａｃリプレッサーは、同じＤＮＡ分子上の２つのｌａｃオペレーターに同時に結合することができ、これにより、ＤＮＡループの形成を含む。Muller et al.は、オペレーター間のＤＮＡ長が減少するにつれて、抑制は有意に増加することを報告する（３６）。
【０００８】
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと比べて異なる位置にｌａｃオペレーターを配置する効果が試験されている。転写は、ＲＮＡ開始点から１５塩基対下流にあるオペレーターに結合したｌａｃリプレッサーによって強く抑制され得る（３７）。
【０００９】
国際公開公報第２００３／０５０２４０Ａ２号は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている相同的に組み込まれた遺伝子と、標的タンパク質をコードしている組み込まれていない遺伝子とを含む、宿主細胞において標的タンパク質を産生するための発現系を開示する。
【００１０】
ｌａｃ調節機序の最初の適用の１つは、今日では組換えタンパク質の産生のために最も広く使用されているＥ．ｃｏｌｉ発現系である、ｐＥＴ系であった（１２、１３）。この系は、Ｔ７ファージに由来するＴ７ＲＮＡポリメラーゼと強力なＴ７プロモーターとの特別な相互作用に基づく。バクテリオファージλのリコンビナーゼ機能は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムへのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の部位特異的挿入のために使用された。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、異化代謝抑制に非感受性である、ラクトースプロモーターの変異体である、ｌａｃＵＶ５プロモーターによって制御される。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を高いレベルで誘導し、これは次にＴ７プロモーターの制御下にある標的遺伝子を転写する。この直交している発現系は、組換えタンパク質の非常に高い産物の力価を与え、これは、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に産生され得る。しかしながら、特に高コピー数のプラスミドと組み合わせた場合の、Ｔ７発現系の並外れた強度は、宿主細胞に極端な代謝負荷を及ぼす。関心対象遺伝子が、困難なタンパク質をコードしている場合、ストレス及び代謝負荷によりしばしば、減少した収量、短縮された産生期間、及びさらには細胞死に至る（１４、１５）。
【００１１】
多い遺伝子量及び抗生物質耐性遺伝子の転写などの、プラスミドにより媒介されるストレス作用は、関心対象遺伝子（ＧＯＩ）、すなわち、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子を宿主のゲノムに組み込むことによって克服され得る（１６、１７）。
【００１２】
国際公開公報第２００８／１４２０２８Ａ１号は、関心対象タンパク質をコードしているＤＮＡが、細菌細胞のゲノムの予め選択された部位に組み込まれる、関心対象タンパク質を産生するための方法を開示する。
【００１３】
Striedner et al.は、標的遺伝子が宿主のゲノムに部位特異的に組み込まれている、プラスミドフリーなＴ７に基づいたエシェリヒア・コリ発現系を開示している。
【００１４】
ゲノムに組み込まれたＴ７に基づいた発現系は、意義ある利点を与える。プラスミドに基づいた発現系と比較して、プラスミドにより媒介される代謝負荷は全くなく、産生プロセス中の遺伝子量のばらつきも全くない。しかしながら、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）は、長期間の産生条件下で突然変異を受けやすい。これは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの突然変異により、産生していない細胞集団がより急速に増殖し、したがって、産物の収量が大きく低下した、ケモスタット培養において、Striedner et al.（１７）によって実証された。 
【００１５】
したがって、低い誘導物質濃度でも、改善された発現速度、低い基礎発現、及び細胞レベルで発現速度を真に調節可能である、改善された誘導発現系が当技術分野において明らかに必要である。
【００１６】
発明の要約
本発明の目的は、プラスミドフリーな関心対象タンパク質の産生における、関心対象タンパク質の改善された発現速度の制御と、非常に低い基礎発現を伴う、改善された誘導系を提供することである。
【００１７】
問題は本発明によって解決される。
【００１８】
本発明によると、少なくとも
ａ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はｌａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターからなる群より選択され、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）を含む）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の産生のためのゲノムに基づいた発現系を提供する。
【００１９】
具体的な実施態様によると、少なくとも
ａ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内のｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、好ましくはｌａｃＯ１を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、ｌａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、好ましくはそれはｌａｃＩＱプロモーターであり、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）を含む）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の産生のためのゲノムに基づいた発現系を提供する。
【００２０】
具体的には、関心対象タンパク質の発現のための遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内に１つのｌａｃＯを含有し、ｌａｃＩプロモーターは、ＬａｃＩ発現を増加させるプロモーターである。
【００２１】
さらなる具体的な実施態様によると、少なくとも
ａ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−少なくとも９２ｂｐ、特に９４ｂｐ離れている少なくとも２つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）（ここでの一方のｌａｃＯは、プロモーター配列内にあり、他方のｌａｃＯはプロモーターの上流にある）を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは野生型ｌａｃＩプロモーターであり、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の産生のためのゲノムに基づいた発現系を提供する。
【００２２】
代替的な実施態様によると、少なくとも
ａ）宿主の染色体におけるＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、及びｌａｃＩの発現を増加させるｌａｃＩプロモーターからなる群より選択される）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生のための誘導系を提供し、ここで、ｂ）の１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに対するｌａｃＩの親和性は、宿主の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するｌａｃＩの親和性よりも低く、関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される。
【００２３】
さらなる実施態様によると、少なくとも
ａ）宿主の染色体におけるＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内のｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、好ましくはｌａｃＯ１を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、ｌａｃＩの発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、好ましくはそれはｌａｃＩＱプロモーターである）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生のための誘導系を提供し、ここで、ｂ）の１つのｌａｃＯに対するｌａｃＩの親和性は、宿主の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するｌａｃＩの親和性よりも低く、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される。
【００２４】
本発明のさらなる具体的な実施態様によると、少なくとも
ａ）宿主の染色体におけるＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質の発現のための遺伝子
（これは、
−関心対象タンパク質をコードしているコード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−少なくとも９２ｂｐ離れている、少なくとも２つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯｓ）（ここでの一方のｌａｃＯはプロモーターの配列内にあり、他方のｌａｃＯはプロモーターの上流にある）を含む）；及び
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーターである）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生のための誘導系を提供し、ここで、ｂ）の少なくとも２つのｌａｃＯｓに対するｌａｃＩの親和性は、宿主の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するｌａｃＩの親和性よりも低く、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される。
【００２５】
特に、原核細胞宿主は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。具体的には、宿主は、ＢＬ２１又はＫ−１２株のＥ．ｃｏｌｉである。
【００２６】
特に、ＲＮＡポリメラーゼは、宿主と同種なＲＮＡポリメラーゼであり、特にσ７０Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼである。
【００２７】
特に、関心対象タンパク質をコードしているコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、Ｔ５、Ｔ５Ｎ２５、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、若しくはｔｒｃ、又はＴ５、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、若しくはｔｒｃに対して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０％の配列同一率を有するその機能的変異体からなる群より選択される。
【００２８】
本明細書に記載の誘導系の好ましい実施態様によると、ｌａｃＩプロモーターは、野生型宿主と比較して、ＬａｃＩの発現を増加させるプロモーターであり、これはｌａｃＩＱプロモーター（配列番号１）である。特に、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子は、たった１つのｌａｃＯ、好ましくはｌａｃＯ１を含み、ｌａｃＩプロモーターはｌａｃＩＱ（配列番号１）である。
【００２９】
好ましくは、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子は、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３からなる群より選択された少なくとも１つのｌａｃＯ、及びその任意の組合せを含む。特に、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子は、２つのｌａｃＯ、好ましくはｌａｃＯ１とｌａｃＯ１、又はｌａｃＯ１とｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ１とｌａｃＯ３を含む。
【００３０】
特に、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子に含まれる少なくとも１つのｌａｃオペレーターは、ｌａｃＯ１（配列番号３）、ｌａｃＯ２（配列番号４）、又はｌａｃＯ３（配列番号５）である。
【００３１】
特に、少なくとも１つのｌａｃオペレーターは、少なくとも６５％の配列同一率又は完全に対称なｌａｃＯを有する、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３の機能的変異体である。特に、ｌａｃオペレーターは、野生型ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３に対して少なくとも６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、又は９５％の配列同一率を有する、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３の機能的変異体である。代替法によると、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３の機能的変異体は、１個、２個、３個、４個、若しくは５個の点突然変異、又は１個、２個、３個、４個、若しくは５個の塩基対（ｂｐ）の欠失を含む。
【００３２】
特に、関心対象タンパク質をコードしているコード配列に作動可能に連結された該プロモーターは、初期転写配列（ＩＴＳ）、好ましくは天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）を含む。
【００３３】
本明細書に提供された系によると、関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される。特に、ＬａｃＩは少なくとも１つのｌａｃＯに結合し、これにより、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の転写を抑制する。特に、ＬａｃＩに結合することのできる誘導物質を添加すると、少なくとも１つのｌａｃＯとＬａｃＩの相互作用が妨げられ、その結果、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の転写が誘導される。
【００３４】
特に、誘導物質は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ラクトース、メチル−β−Ｄ−チオガラクトシド、フェニル−β−Ｄ−ガラクトース、及びオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）からなる群より選択される。
【００３５】
特に、関心対象タンパク質を発現しているコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、初期転写配列、好ましくは天然Ｔ７Ａ１初期転写配列を含む。特に、初期転写配列は、Ｔ７Ａ１の初期転写配列に限定されず、当業者には公知である任意の初期転写配列であり得る。
【００３６】
本明細書に提供された誘導系の具体的な実施態様によると、関心対象タンパク質の発現のための遺伝子は、天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）及びコード配列に作動可能に連結された、プロモーター配列内に１つのｌａｃＯ１オペレーターを含有し、ここでのＬａｃＩプロモーターはｌａｃＩＱプロモーターである。
【００３７】
本明細書に提供された誘導系のさらなる具体的な実施態様によると、関心対象の遺伝子は、少なくとも約９２又は９４塩基対（ｂｐ）離れている、好ましくは少なくとも約１０３、１０５、１１４、１１６、１２５、１２７、１３６、１３８、又は１４９ｂｐ離れている、２つのｌａｃオペレーターを含有し、ここでの一方のｌａｃオペレーターは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターの配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターはプロモーターの上流にある。
【００３８】
特に、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子は、異種遺伝子である。特に、原核細胞宿主に対して異種である該遺伝子は、組換え遺伝子であり、これが宿主に導入される。
【００３９】
さらなる具体的な実施態様によると、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子は、同種遺伝子である。特に、原核細胞宿主と同種である該遺伝子は、関心対象タンパク質をコードしているコード配列、該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、宿主の染色体における遺伝子から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む。
【００４０】
特に、原核細胞宿主と同種な該遺伝子は、組換え遺伝子であり、これが宿主に導入される。またさらなる具体的な実施態様によると、原核細胞宿主と同種な該遺伝子は、本明細書に記載のプロモーターを用いて、該遺伝子に対して内因性であるプロモーターを置換することよって修飾される。置換はまた、本明細書に記載のプロモーターの組込みも意味し、これにより、それは宿主細胞の染色体／ゲノム内の内因性の同種遺伝子／ポリペプチドに作動可能に連結されるようになり、ここでの内因性同種遺伝子／ポリペプチドの天然プロモーターは、天然プロモーター内の少なくとも１つの点突然変異によって不活化される。特に、該遺伝子に対して内因性であるプロモーターを、プロモーター配列内に少なくとも１つのｌａｃＯ、好ましくは少なくとも２つのｌａｃＯｓを含む、本明細書に記載のプロモーターを用いて置換し、ここでの一方のｌａｃＯは、プロモーターの配列内にあり、第二のｌａｃＯはプロモーターの上流にある。特に、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の内因性プロモーターを置換する、プロモーターの１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに対するｌａｃＩの親和性は、内因性ｌａｃオペロンのｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するＬａｃＩの親和性よりも低い。
【００４１】
特に、関心対象タンパク質の発現のための、遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、組換えプロモーターである。特に、該プロモーターは、野生型ｌａｃプロモーターではないが、それはｌａｃプロモーターの変異体であってもよい。本明細書に記載のプロモーターがｌａｃプロモーターの変異体である場合、それは、その配列内に少なくとも１つのｌａｃＯを含み、特にそれは、−１０から−３５のプロモーターエレメントの配列内に少なくとも１つのｌａｃＯを含む。
【００４２】
さらに本明細書において、
ａ）宿主細胞を培養し、誘導物質の添加によって、関心対象遺伝子の発現を誘導する工程、
ｂ）関心対象タンパク質を収集する工程、そして
ｃ）関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｄ）関心対象タンパク質を修飾する工程、そして
ｅ）関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、本明細書に記載の誘導系を使用した、原核細胞宿主における関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生法を提供する。
【００４３】
本明細書に記載の系の具体的な実施態様によると、関心対象タンパク質を産生するための遺伝子及び／又はｌａｃリプレッサータンパク質を産生するためのｌａｃＩ遺伝子は、少なくとも１つの発現カセットに含まれる。好ましくは、該発現カセットを使用して、関心対象タンパク質を産生するための遺伝子、及び／又は、ｌａｃリプレッサータンパク質を産生するためのｌａｃＩ遺伝子を、原核細胞宿主の染色体に組み込む。
【００４４】
また、本明細書において、関心対象の少なくとも１つの異種タンパク質を産生するように設計された少なくとも１つの異種遺伝子を含む発現カセットも提供され、関心対象遺伝子は、
ａ）関心対象の１つ以上のタンパク質をコードしている１つ以上のコード配列、
ｂ）コード配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び
ｃ）該プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）
を含む。
【００４５】
特に、発現カセットに含まれる少なくとも１つのｌａｃＯに対するＬａｃＩの親和性は、宿主細胞のｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対する、ＬａｃＩの親和性よりも低い。好ましくは、該ｌａｃオペロンは、宿主細胞に対して内因性であるｌａｃオペロンである。
【００４６】
本明細書に提供される発現カセットの具体的な実施態様によると、関心対象の少なくとも１つの異種タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子は、少なくとも９２又は９４ｂｐ離れている、２つのｌａｃオペレーターを含み、ここでの一方のｌａｃオペレーターは、プロモーター配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターは、プロモーターの上流にある。好ましくは、前記の２つのｌａｃオペレーターは、少なくとも約９２から１３４ｂｐ離れ、好ましくはそれらは少なくとも約１０３、１０５、１１４、１１６、１２５、又は１３６、又は１３８、又は１４９ｂｐ離れている。特に、前記の２つのｌａｃオペレーターは、９２、９４、１０３、１０５、１１４、１１６、１２５、１３６、１３８、又は１４９ｂｐ離れている。
【００４７】
本明細書に提供された発現カセットの具体的な実施態様によると、関心対象の少なくとも１つの異種タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内にｌａｃＯ１オペレーター、及び天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）を含む。特に、該発現カセットはさらに、異種ｌａｃＩプロモーターを含み、これはｌａｃＩＱプロモーター（配列番号１）である。
【００４８】
さらに本明細書において、
ａ）発現カセットを、原核細胞宿主の染色体に組み込む工程、
ｂ）宿主細胞を培養し、誘導物質の添加によって、関心対象の遺伝子の発現を誘導する工程、
ｃ）関心対象タンパク質を収集する工程、そして
ｄ）関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｅ）関心対象タンパク質を修飾する工程、そして
ｆ）関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、本明細書に記載の発現カセットを使用した、製造規模での原核細胞宿主における関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生法を提供する。
【００４９】
本明細書に提供された方法及び系の具体的な実施態様によると、原核細胞宿主は、付着部位、好ましくはａｔｔＴｎ７、ｌａｃＺ、ｒｅｃＡ、ｔｕｆａ、又はａｔｔｎＢ部位に組み込まれた発現カセットを含有している。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】組込みカートリッジの図。ＧＦＰｍｕｔ３．１の発現は、７つの異なるプロモーター／オペレーターの組合せによって制御される。Ｔ７発現系は、基準として使用される。カートリッジは、ｐＥＴ３０ａ−ｃｅｒベクター（丸括弧を用いて示されている）にクローニングされたか、又は、ＢＬ２１ゲノム（Ｂ）綴り直すとＢＬ２１Ｑ（実施例１に記載のような）（ＢＱ）のａｔｔＴＮ７部位（角括弧を用いて示されている）に組み込まれた。２つのプロモーター／オペレーターの組合せにおいて、野生型ｌａｃＩプロモーター（ｌａｃ ｗｔ）をｌａｃＩＱプロモーター（ｌａｃＩＱ）と交換した。ＬａｃＯ１＊は、野生型ｌａｃＯ１の２ｂｐ切断短縮形である。Ｓｙｍ−ｌａｃＯは完全に対称なｌａｃオペレーターである。＋１Ｔ７Ａ１＋２０は、Ｔ７Ａ１プロモーターの天然初期転写配列である。転写は、ｔＺＥＮＩＴ（ｔＺ）によって終結される。ＧＦＰｍｕｔ３．１は、ＧＦＰｍｕｔ３．１タンパク質の発現のためのコード配列である。ｌａｃＯ１は野生型ｌａｃＯ１である。−３５及び−１０は、それぞれのプロモーターであるＡ１及びＴ５の−３５及び−１０のプロモーター領域である。
【図２】誘導されていない条件下（０mMのＩＰＴＧ）及び誘導された条件下（０．５mMのＩＰＴＧ）における、様々なプロモーター／オペレーターの組合せのプロモーター活性。リポーターＧＦＰｍｕｔ３．１の蛍光（ｙ軸）を使用して、ゲノムに組み込まれた発現系（Ａ）及びプラスミドに基づいた発現系（Ｂ）を特徴付けた。ｐＥＴ３０ａ−ｃｅｒベクターにクローニングされた組込みカートリッジは丸括弧で示され、ＢＬ２１ゲノム（Ｂ）綴り直すとＢＬ２１Ｑ（実施例１に記載のような）（ＢＱ）のａｔｔＴＮ７部位に組み込まれたものは、角括弧で示されている。
【図３】フェッドバッチ様マイクロタイター培養中におけるＧＦＰのオンラインでの蛍光の経緯（ｙ軸）によって表現される、ＧＦＰの発現及びＧＦＰの発現の調整力に対する、ｌａｃオペレーターの影響。縦の点線は、誘導時間を示す。Ａ〜Ｄ：３つのｌａｃＯ（Ｂ＜３ｌａｃＯ−Ｔ５＞）（Ａ）、２つのｌａｃＯ（Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ｔ５＞）（Ｂ）、１つのｌａｃＯ（Ｂ＜１ｌａｃＯ−Ｔ５＞）（Ｃ）、及び１つのｌａｃＯ／ｌａｃＩＱプロモーター（ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ｔ５＞）（Ｄ）によって制御されるＴ５Ｎ２５プロモーター。Ｅ〜Ｇ：２つのｌａｃＯ（Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞）（Ｅ）、１つのｌａｃＯ（Ｂ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞）（Ｆ）、及び１つのｌａｃＯ／ｌａｃＩＱプロモーター（ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞）（Ｇ）によって制御されるＴ７Ａ１プロモーター。Ｔ７発現系は基準として使用される（Ｈ）。
【図４】様々なレベルの誘導物質を用いた、組換え遺伝子発現の制御。Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞、ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞、及びＢ３＜Ｔ７＞における、ＧＦＰｍｕｔ３．１発現のフローサイトメトリーによる分析。
【図５】天然ｌａｃ−オペロン（上）及び関心対象の遺伝子（下）における、ｌａｃ−オペレーター結合部位の図。関心対象の遺伝子のためのプロモーターは、１つのｌａｃ−オペレーター（Ａ）、又は６２ｂｐ離れている２つのｌａｃ−オペレーター（Ｂ）によって調節される。
【図６−１】本明細書に言及された配列番号。
【図６−２】本明細書に言及された配列番号。
【図７】ＬａｃＩ濃度に対する、組換え発現速度の制御の影響。（Ａ）ＢＬ２１野生型細胞（レーン１〜３）及びＢ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞（レーン４〜６）を、ＩＰＴＧを用いずに（レーン１及び４）、０．０１mMのＩＰＴＧ（レーン２及び５）及び０．５mMのＩＰＴＧ（レーン３及び６）を用いて増殖させた。約１．２×１０７個の細胞のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＬａｃＩ抗体を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。（Ｂ）０mMのＩＰＴＧのＢＬ２１−ｗｔに対する、変化倍率が示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す（ｎ＝２）。
【図８】炭素を制限された指数関数的なフェッドバッチ培養中のＢ３＜Ｔ７−ｄＦＴＮ２＞のプロセスの特徴及び産物形成の動態。培養は、最終容量１．２Ｌである１．５ＬのＤＡＳＧＩＰ（登録商標）平行バイオリアクターシステム中で行なわれた。縦の点線は、誘導時間を示す。
【図９】炭素を制限された指数関数的なフェッドバッチ培養中のＢＱ＜Ａ１−ｄＦＴＮ２＞のプロセスの特徴及び産物形成の動態。培養は、最終容量１．２Ｌである１．５ＬのＤＡＳＧＩＰ（登録商標）平行バイオリアクターシステム中で行なわれた。縦の点線は、誘導時間を示す。
【００５１】
詳細な説明
そうではないと示されるか又は定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (第２版), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York,（1990）及びJaneway et al, "Immunobiology" (第５版又はもっと最近の版), Garland Science, New York, 2001に言及されている。
【００５２】
本明細書において使用する「含む（comprise）」、「含有している」、「有する」及び「含む（include）」という用語は同義語として使用することができ、さらなるメンバー又は部分又は要素を可能とする、自由な限定されない定義であると理解されるだろう。「からなる」は、構成している定義の特色のさらに他の要素を含まない、最も狭い定義であると考えられる。したがって、「含んでいる」はより範囲が広く、「からなる」という定義を含有している。
【００５３】
本明細書において使用する「約」という用語は、同じ数値、又は所与の数値の＋/−５％だけ異なる数値を指す。
【００５４】
ゲノムに組み込まれた、すなわちプラスミドフリーな発現系は、意義ある利点を与える。プラスミドに基づいた発現系と比べて、産生プロセス中にプラスミドにより媒介される代謝負荷は全くなく、遺伝子量のばらつきも全くない。しかしながら、誘導性プロモーターの制御下にある、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに依存した、強力なＴ７プロモーターを利用する現在の最先端技術のＴ７に基づいた発現系は依然として、かなりの欠点に苦しむ。Ｔ７発現系の強度は、宿主細胞に対して極度の代謝負荷を及ぼす。関心対象の遺伝子が困難なタンパク質をコードしている場合、ストレス及び代謝負荷により、しばしば、減少した収量、短縮された産生期間、及びさらには細胞死に至る。さらに、Ｔ７発現系は読み漏れしやすい。なぜなら、それはかなりの基礎発現を示し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、長期の産生条件下で突然変異し易いからである。
【００５５】
本明細書において提供されるプラスミドフリーな誘導発現系は、発現速度を単一細胞のレベルで調整することができ、それは非常に低い基礎発現を示し、それは組換えタンパク質産生において非常に効率的であるという著しい利点を有する。さらに、それは、発現速度の真の制御、無視できる基礎発現、及び低い誘導剤濃度でさえも高い発現速度を与え、これは困難なタンパク質の産生にとって特に有益である。
【００５６】
本明細書において使用する「プラスミドフリー」又は「ゲノムに基づいた」という用語は、関心対象タンパク質の発現のための遺伝子が宿主のゲノムに位置する、原核細胞宿主における関心対象タンパク質の発現系を指す。特に、該遺伝子は、原核細胞宿主の染色体上に位置する内因性の同種遺伝子であるか、又は、原核細胞宿主の染色体に組み込まれた、組換えの異種又は同種の遺伝子である。
【００５７】
特定の実施態様によると、関心対象タンパク質の発現のための遺伝子及び場合によりｌａｃリプレッサータンパク質の発現のためのｌａｃＩ遺伝子又は組換えｌａｃＩプロモーターは、該遺伝子を含んでいる１つ以上の発現カセットを使用して、宿主のゲノムに組み込まれる。
【００５８】
特に、さらなる組換えの異種又は同種の遺伝子、例えばＲＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子、又は補助タンパク質をコードしている遺伝子を、原核細胞宿主に導入する。前記のさらなる組換えの異種又は同種の遺伝子は、宿主の染色体に導入されても、又は、宿主細胞内のプラスミド上に存在していてもよい。
【００５９】
「発現カセット」又は単に「カセット」という用語は、「発現カートリッジ」又は単に「カートリッジ」の同義語として使用されるが、これは、原核細胞ゲノム、例えば細菌ゲノムに組み込まれる予定の、鎖状又は環状のＤＮＡ構築物を指す。組込みの結果として、発現宿主細胞は、組み込まれた発現カセットを有する。好ましくは、カセットは、実質的にプロモーター、関心対象の遺伝子、関心対象の遺伝子のすぐ上流にあるシャインダルガーノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）とも呼ばれる）、及び、ゲノム領域に対して相同でありかつ相同的組換えを可能とする２つの末端にフランキングしている領域を含む、鎖状ＤＮＡ構築物である。さらに、カセットは、他の配列、例えば抗生物質選択マーカー、原栄養選択マーカー又は蛍光マーカー、代謝遺伝子をコードしているマーカー、タンパク質の発現を向上させる遺伝子、又は組込み後に特定の配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）の除去を可能とする２つのフリッパーゼ認識標的部位（ＦＲＴ）を含有していてもよい。
【００６０】
発現カセットは、当技術分野において公知の方法によって、鎖状カセットの場合には、通常、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成及び増幅される。鎖状カセットは、通常、構築し易いので、それらは、本明細書において提供される系及び方法に使用される宿主発現細胞を得るために好ましい。さらに、鎖状発現カセットの使用は、ゲノム組込み部位を、カセットのフランキングしている相同領域のそれぞれの設計によって自由に選択することができるという利点を提供する。これにより、鎖状発現カセットの組込みは、ゲノム領域に関してより大きな多様性を可能とする。
【００６１】
発現ベクターは、本明細書に記載の発現カセットを含み、さらに場合により、ゲノム組込み部位に対して相同なフランキング領域、多くの制限酵素切断部位、初期転写配列（ＩＴＳ）、及び転写終結因子、及び場合により１つ以上の選択マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール若しくはストレプトマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）を含み、これらの成分は互いに作動可能に連結されている。一般的な種類のベクターは「プラスミド」であり、これは一般的に、追加の（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる自己に含まれている二本鎖ＤＮＡ分子であり、これは適切な宿主細胞に容易に導入され得る。特に、「ベクター」又は「プラスミド」という用語はビヒクルを指し、これにより、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる。
【００６２】
本明細書において使用する「原核細胞宿主」という用語は、細菌宿主を指し、特にそれは、細菌宿主細胞を指す。原則的に、以下に詳述されているある特定の必要条件を除いて、細菌宿主細胞の選択に関する制限は全くない。細菌宿主細胞は、それらが有利には部位特異的組込みのために、関心対象の遺伝子の挿入のための遺伝子操作を可能とする限りにおいて、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）であっても古細菌であってもよい。好ましくは、細菌宿主細胞は、製造規模での培養を可能とする。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度まで培養を可能とする特性を有する。組換え工業タンパク質産生のために適していることが示されている、細菌宿主細胞の例は、エシェリヒア・コリ、枯草菌、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、並びに、その変種、及びラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株である。好ましくは、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。
【００６３】
宿主細胞に対する必要条件は、それが、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子を制御するプロモーターに結合することのできるＲＮＡポリメラーゼを含むことである。
【００６４】
特定の実施態様では、宿主細胞は、そのゲノム内に、選択の見地からマーカー遺伝子を有する。
【００６５】
部位特異的遺伝子挿入の見地から、宿主細胞に対する別の必要条件は、それが、その配列が既知であり、細胞に害を及ぼすことなく、異種配列の挿入を可能とするように破壊又は別の方法で操作されることのできる、少なくとも１つのゲノム領域（１つのコーディング若しくはいずれかのノンコーディングな機能的若しくは非機能的な領域、又は未知の機能を有する領域のいずれか）を含有していることである。
【００６６】
組込み遺伝子座に関して、本発明において使用される発現系は、広範な多様性を可能とする。原則的には、既知の配列を有する任意の遺伝子座を選択することができ、ただし、配列の機能は不必要であるか、又は不可欠である場合には、補なうことができる（例えば、栄養素要求性の場合など）。
【００６７】
関心対象の遺伝子の細菌ゲノムへの組込みは、従来の方法によって、例えば、（３０）において、ａｔｔＴｎ７部位について記載されたような、例えば、染色体上の特定の部位に対して相同的なフランキング配列を含有している鎖状カートリッジを使用することによって成し遂げられ得る。さらに、鎖状発現カートリッジの使用は、ゲノム組込み部位を、カートリッジのフランキングしている相同領域のそれぞれの設計によって自由に選択することができるという利点を提供する。それにより、鎖状発現カートリッジの組込みは、ゲノム領域に関してより大きな多様性を可能とする。好ましい実施態様では、鎖状カートリッジの組込みは、ａｔｔＢ部位又はａｔｔＴｎ７部位のような付着部位であり、これはよく証明されている組込み部位である。本発明において有用な他の組込み法の例は、例えば（３１）に記載のＲｅｄ／ＥＴ組換えに基づいたものであるが、これに限定されない。あるいは、発現カセットをまず、中間体ドナー宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、その後、それから、例えば（３２）に記載のＰ１ファージによる形質導入により宿主細胞に導入することができる。本明細書において使用される組込み法は、上記の例に限定されず；むしろ、当技術分野において公知である任意の組込み法を使用することができる。
【００６８】
宿主発現細胞を得るための組込み法は、関心対象の１つの遺伝子を、ゲノム内の１つの部位に組み込むことに限定されず；それらは、組み込み部位及び発現カセットの両方に関して多様性を可能とする。例えば、１つを超える関心対象の遺伝子を挿入し得、すなわち、同一又は異なるプロモーターの制御下にある２つ以上の同一又は異なる配列を、ゲノム上の１つ以上の異なる遺伝子座に組み込むことができる。例えば、それは、ヘテロ二量体複合体を形成する、２つの異なるタンパク質の発現を可能とする。ヘテロ二量体タンパク質は、２つの個々に発現されているサブユニットタンパク質、例えばモノクロ―ナル抗体の重鎖及び軽鎖、又は抗体断片からなる。
【００６９】
本発明は、関心対象タンパク質のプラスミドフリーな産生を可能とするが、宿主発現細胞において、関心対象遺伝子以外の発現させる予定の配列、例えば補助タンパク質及び／又は組換えタンパク質を有するプラスミドが存在する可能性があることを除外しない。好ましくは、このような実施態様では、本発明の利点が、プラスミドの存在によって覆されないように、すなわち、プラスミドが少ないコピー数で存在するように、そしてプラスミドが細胞に代謝負荷を及ぼさないように、注意すべきである。
【００７０】
ゲノムへの１つ以上の組換え遺伝子の組込みにより、１つの細胞あたり、別個かつ所定の数の関心対象の遺伝子がもたらされる。１コピーの遺伝子を挿入する本発明の実施態様では、この数は通常１であるが（細胞分裂中に一過性に起こるような、細胞が１つを超える染色体又はゲノムを含有している場合を除く）、これに対して、プラスミドに基づいた発現では、数百個までのコピー数を伴う。本発明の方法に使用される発現系では、宿主の代謝をプラスミド複製から解放することによって、増加した割合の細胞合成能が、組換えタンパク質の産生のために利用される。
【００７１】
特有の利点は、本明細書に記載の誘導発現系が、誘導レベルに関して全く限界を有さないことである。このことは、系が、プラスミドに基づいた系又はＴ７発現系などの強力なプロモーターを利用する系ではしばしば起こるような、「過剰誘導」され得ないことを意味する。ゲノムに基づいた発現系は、タンパク質発現の正確な制御を可能とするので、良好に制御された発現に依存又は依拠する、発現標的化経路と組み合わせると特に有益である。好ましい実施態様では、本発明の方法は、細菌細胞質から周辺質及び／又は培養培地中への関心対象タンパク質の分泌（排泄）を含む。この実施態様の利点は、最適化され持続したタンパク質分泌速度であり、その結果、先行技術の分泌系と比較して、より高い力価の分泌タンパク質が得られる。特に、これは、関心対象タンパク質に対してＮ末端にシグナルペプチド／シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を融合することによって成し遂げられ得、これにより、関心対象タンパク質は宿主の輸送体に至り、宿主の周辺質への移行を引き起こし、宿主のシグナルペプチダーゼによって切断される。ｏｍｐＡ−、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥ−、ｐｈｏＡ−、ｄｓｂＡ−、ｌｙｓＣ−、ｌｏｌＢ−、ｐｙｒＬ−リーダーペプチドなどであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドを使用することができる。
【００７２】
本明細書において使用する「ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子」という用語は、ＲＮＡＰを発現している遺伝子を指し、この遺伝子はゲノム内に、例えばプラスミド内に、又は原核細胞宿主の染色体内に含まれる。好ましくは、該遺伝子は、原核細胞宿主に対して内因性であるＲＮＡＰを発現する。
【００７３】
細菌では、同じ酵素が、ｍＲＮＡ及び非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の合成を触媒する。ＲＮＡＰは、大きな分子であり；コア酵素は、５つのサブユニット（約４００ｋＤａ）を有する。プロモーターに結合するために、ＲＮＡＰコアは、転写開始因子シグマ（σ）と会合することにより、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素を形成する。シグマは、プロモーターに対する特異性は増加させつつ、非特異的ＤＮＡに対するＲＮＡＰの親和性は低下させ、これにより、正しい部位における転写の開始を可能とする。それ故、完全なホロ酵素は、６つのサブユニット（約４５０ｋＤａ）を有する。コア酵素は、鋳型ＤＮＡに結合してＲＮＡを合成することに関与し、これは、σ因子によって補完されることによりホロ酵素を形成し、これはプロモーター配列を認識して、プロモーター特異的転写を開始する。
【００７４】
好ましい実施態様によると、本明細書に記載の系の原核宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、ＲＮＡＰは、Ｅ．ｃｏｌｉに対して内因性であるＲＮＡＰであり、最も好ましくはそれはσ７０Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼである。細菌ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のσサブユニットは、プロモーター特異的な転写開始に必要とされる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他のグラム陰性桿菌の場合、「ハウスキーピング」又は「第一の」シグマ因子はσ７０である。それぞれの細胞は、不可欠な遺伝子及び経路の作動を保持する、「ハウスキーピング」シグマ因子を有する。ＲＮＡＰコア酵素（サブユニット構造α２ββ’ω）と複合体を形成すると、異なるσ因子は、異なるクラスのプロモーターの認識に特化する。σ７０によって認識される遺伝子は全て、２つの部分からなる類似したプロモーター共通配列を含有している。エシェリヒア・コリにおける第一のσ因子であるσ７０は、典型的には、転写開始部位（＋１の位置）に対するそれらの関係から−１０及び−３５エレメントと呼ばれる、２つの保存された六量体ＤＮＡ配列エレメントによって定義されるプロモーターからの転写開始を指令する。ＲＮＡ転写物の開始に対応するＤＮＡ塩基に関して、共通プロモーター配列は、特徴的には、転写開始の１０及び３５ヌクレオチド前に中心が置かれている（−１０及び−３５）。
【００７５】
「発現」という表現は、以下のように理解される。例えば本明細書に記載のような組換えタンパク質などの発現産物の所望のコード配列と、例えば作動可能に連結しているプロモーターなどの制御配列とを含有している核酸分子を、発現の目的のために使用し得る。これらの配列を用いて形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。形質転換を起こすために、発現系がベクターに含まれてもよいが、しかしながら、最も好ましくは、関連するＤＮＡは、宿主の染色体に組み込まれる。
【００７６】
本明細書において使用する「遺伝子」という用語は、少なくともプロモーターのＤＮＡ（場合によりオペレーターＤＮＡを含んでいる）と、特定のポリペプチド又はタンパク質についての特定のアミノ酸配列をコードしているコーディングＤＮＡとを含む、ＤＮＡ配列を指す。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、調節、又は別の方法で媒介若しくは制御する、ＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコーディングＤＮＡは、同じ遺伝子に由来しても、又は異なる遺伝子に由来していてもよく、同じ生物に由来していても、又は異なる生物に由来していてもよい。
【００７７】
本明細書において使用する「組換え」という用語は、「遺伝子工学操作によって調製されるか又はその結果であること」を意味する。組換え宿主は具体的には、組換え発現ベクター若しくはクローニングベクターを含むか、又は、それは、特に宿主に対して外来的であるヌクレオチド配列を利用して、組換え核酸配列を含有するように遺伝子工学操作されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。
【００７８】
関心対象タンパク質（ＰＯＩ）に関して、制限は全くない。より具体的には、該タンパク質は、宿主細胞において天然に存在しないポリペプチド、すなわち異種タンパク質であっても、又は、宿主細胞に対して天然、すなわち宿主細胞と同種なタンパク質であってもよいが、例えば、同種の関心対象タンパク質をコードしている核酸配列の１つ以上のコピーの、宿主細胞のゲノム若しくは染色体への組換え技術による、又は、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の発現を制御するプロモーター配列の組換え修飾による、組込みにより産生される。関心対象タンパク質は、単量体、二量体、又は多量体であり得、それはホモマーであってもヘテロマーであってもよい。
【００７９】
本発明の方法によって産生され得るタンパク質の例は、酵素、調節タンパク質、受容体、ペプチド、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、膜タンパク質、又は輸送タンパク質であるがこれらに限定されない。関心対象タンパク質はまた、ワクチン接種、ワクチンのために使用されるような抗原、抗原結合性タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体、又は抗体断片若しくは誘導体であってもよい。抗体誘導体は、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、又は単一ドメイン抗体であってもよい。
【００８０】
関心対象タンパク質をコードしているＤＮＡ分子はまた、「関心対象遺伝子」とも呼ばれる。特に、関心対象遺伝子は、関心対象タンパク質、コード配列に作動可能に連結されているプロモーター、及びプロモーター配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーターをコードしているＤＮＡ配列を含む。
【００８１】
さらに、関心対象タンパク質をコードしている関心対象遺伝子は、天然に存在しているＤＮＡ配列であっても、非天然ＤＮＡ配列であってもよい。１つ以上の関心対象遺伝子は、本明細書に記載のような１つのプロモーターの制御下にあってもよい。あるいは、各々の関心対象遺伝子は、１つのプロモーター下にある。関心対象遺伝子は全て、同じ発現カセット上にあっても、複数の発現カセット上にあってもよい。関心対象タンパク質は、任意の方法で修飾されていてもよい。修飾の非制限的な例は、翻訳後修飾部位の挿入若しくは欠失、標的シグナル（例えばリーダーペプチド）の挿入若しくは欠失、タグへの融合、精製若しくは検出を容易にするタンパク質若しくはタンパク質断片、安定性の変化若しくは溶解度の変化に影響を及ぼす突然変異、又は、当技術分野において公知である任意の他の修飾であり得る。本発明の特定の実施態様では、組換えタンパク質は、哺乳動物における治療目的又は予防目的に適した任意のタンパク質であり得る、バイオ医薬品である。
【００８２】
本明細書において使用する「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を可能とする、発現制御エレメントを指す。特に、本明細書に記載のような関心対象遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、その配列内に少なくとも１つのｌａｃオペレーターを含む。特に、前記の少なくとも１つのｌａｃオペレーターは、−１０から−３５のエレメントに位置し、このエレメントは好ましくは、図１に例示されているように、転写開始の１０及び３５ヌクレオチド前（−１０及び−３５）に位置する。
【００８３】
ｌａｃプロモーターは、ｌａｃオペロンのプロモーターであり、これは３つのｌａｃ遺伝子、すなわちｌａｃＺ、ｌａｃＹ及びｌａｃＡの転写を制御する。野生型ｌａｃプロモーターは、−１０から−３５のプロモーターエレメントにｌａｃオペレーターを含まないため、その配列内にｌａｃオペレーターを含まない。好ましくは、本明細書に記載の誘導発現系では、ｌａｃプロモーターは、内因性ｌａｃオペレーターを含む、内因性ｌａｃプロモーターである。特定の実施態様によると、内因性ｌａｃプロモーターの１つ以上のｌａｃオペレーターを遺伝子的に改変することにより、ｌａｃリプレッサー分子であるＬａｃＩに対するそれらの結合親和性を増加させる。特に、それらは、ｌａｃリプレッサーであるＬａｃＩに対するそれらの親和性が、関心対象遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターのｌａｃオペレーターの親和性より高くなるように遺伝子的に改変される。
【００８４】
本明細書において使用するｌａｃＩプロモーターは、ｌａｃＩ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターである。特に、本明細書に記載の誘導系は、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はＬａｃＩの発現を増加させる遺伝子的に改変されたｌａｃＩプロモーター、例えば本明細書に記載の例示的なｌａｃＩＱプロモーターを含む。特に、ｌａｃＩプロモーターは構成性プロモーターである。特に、天然ｌａｃＩプロモーターよりも強力な任意の構成性プロモーターを、本発明に従ってｌａｃＩプロモーターとして使用してもよい。特に、天然ｌａｃＩプロモーターよりも強力な任意のプロモーターを、本明細書に提供される系に応じて、ｌａｃＩプロモーターとして使用し得、これらは、例えばＴ５、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、Ｔ７、ｄｎａＫ／Ｊ、ｓｐａｃ、ｂｌａ、ｎｐｔＩＩ、ｃａｔプロモーターであるがこれらに限定されない。
【００８５】
本明細書に記載のような関心対象タンパク質をコードしている遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、宿主の染色体に含まれるＲＮＡＰ遺伝子によってコードされるＲＮＡＰによって認識される、任意の誘導性プロモーターであり得る。
【００８６】
本発明の特定の実施態様によると、関心対象遺伝子は、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、又はｔｒｃプロモーター、ｌａｃ若しくはｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ５プロモーター（Gentz and Bujard, 1985）、例えばＴ５Ｎ２５、又はＴ７プロモーター（Hawley and McClure,1983）、例えばＴ７Ｃ又はＴ７Ｄ又はＴ７Ａプロモーター、例えばＴ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、又はＴ７Ａ３プロモーター（全てラクトース又はその類似体のＩＰＴＧによって誘導可能である）、又は組換えタンパク質の発現に適した他のプロモーターの制御下にあり得、これらは全てＥ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼを使用する。このようなプロモーターの配列は当技術分野において周知であり、例えばGentz及びBujard, 1985（33）又はHawley及びMcClure,1983（38）に記載されているものである。特に、該プロモーターの配列は、本明細書に記載のような少なくとも１つのｌａｃＯをそれらの配列内に含むように改変されている。
【００８７】
特定の実施態様によると、本明細書に記載のプロモーターは、関心対象タンパク質をコードしている配列に対して作動可能に連結されているが、これはｌａｃＯをその配列内に含む。細菌では、プロモーター配列は典型的には、２つの短い配列エレメントを含有し、これは野生型プロモーターでは、典型的には、転写開始部位の約１０及び３５ヌクレオチド上流にある。これらの配列は、多くの細菌株の間で保存されている。例えば、−１０ヌクレオチドにおける配列（−１０エレメントとも呼ばれる）は典型的には、共通配列ＴＡＴＡＡＴ（配列番号３４）を含み、−３５における配列（−３５エレメントとも呼ばれる）は、共通配列ＴＴＧＡＣＡ（配列番号３５）を有する。上記の共通配列は、平均して保存されているが、これらは全てのプロモーターにおいてインタクトでは見られない。平均して、各共通配列中の６個のうちの僅か３〜４個の塩基対が、任意の所与のプロモーターに見られる。−１０及び−３５エレメントの両方においてインタクトな共通配列を有する、僅かな天然プロモーターが現在までに同定されている。特に、−１０及び−３５エレメントが完全に保存された人工プロモーターは、共通配列にいくつかのミスマッチを有するものよりも低い頻度で転写する。
【００８８】
特に、本明細書に記載のプロモーターは、−１０から−３５のエレメントに少なくとも１つのｌａｃＯを含む。
【００８９】
「誘導物質」という用語は、「誘導剤」と同義語として使用されるが、これはプロモーター活性の直接的又は間接的な調節を通して、転写の誘導をもたらすことのできる因子を指す。特に、本明細書において使用されているような、誘導物資は、ｌａｃリプレッサー分子に結合でき、関心対象遺伝子に作動可能に連結された遺伝子とのその相互作用を阻害することのできる、任意の因子である。好ましくは、本明細書において使用される誘導物質は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ラクトース、メチル−β−Ｄ−チオガラクトシド、フェニル−β−Ｄ−ガラクトース、又はオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）である。
【００９０】
タンパク質発現の誘導が行なわれる機序に関する制約は全くない。例えば、誘導物質は、単一若しくは複数のボーラスとして添加されても、又は連続的なフィーディングによって添加されてもよく、後者は、「誘導剤のフィード（フィーディング）」としても知られている。誘導が行なわれる時点に関する制約は全くない。誘導剤は、培養開始時に、又は連続的な栄養分のフィーディングの開始時点で、又はフィーディング開始の後に（過ぎてから）添加されてもよい。誘導剤のフィーディングは、誘導剤を培養培地中に含有させることによって、又はそれを別々にフィーディングすることによってのいずれかで成し遂げられ得る。誘導剤のフィーディングの利点は、誘導剤の用量を制御することが可能となることであり、すなわち、産生系における一定数の関心対象遺伝子あたりの、規定量の又は一定量の誘導剤の用量を維持することが可能となることである。例えば、誘導剤のフィーディングは、バイオマスに比例する誘導剤の用量を可能とし、結果として、バイオマスに対する誘導剤の比は一定となる。バイオマスの単位（これに誘導剤の用量は基づき得る）は、例えば、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）、湿潤細胞重量（ＷＣＷ）、吸光度、総細胞数（ＴＣＮ；容量あたりの細胞）、又はコロニー形成単位（容量あたりのＣＦＵ）、又はバイオマスに比例するオンラインでモニタリングされたシグナル（例えば、蛍光、濁度、光散乱、誘電能、排気ガス中の二酸化炭素の濃度など）であり得る。本質的には、本発明の方法は、シグナルがオフラインで測定されようとオンラインで測定されようと関係なく、バイオマスに比例する、任意のパラメーター又はシグナルあたりの、誘導剤の正確な用量を可能とする。バイオマス１単位あたりの関心対象遺伝子の数は、規定され一定であるので（１つの細胞あたり１つ以上の遺伝子）、この誘導様式の結果は、１つの関心対象遺伝子あたり一定用量の誘導剤である。さらなる利点として、バイオマスの量と比較した誘導剤の量の正確かつ最適な用量は、実験で決定され得、最適化され得る。
【００９１】
分析法によって実際のバイオマスレベルを決定することが必要ではない場合がある。例えば、以前の培養（歴史的なバイオマスデータ）に基づく量の誘導剤を添加することで十分な場合がある。別の実施態様では、理論的に計算又は予測されるような、バイオマス１単位あたりの誘導剤の量を添加することが好ましい場合がある。例えば、フィーディングに基づいた培養（フェッドバッチ培養又は連続培養のような）では、フィード培地中の１単位の増殖律速成分、通常は炭素源により、特定の量のバイオマスが得られるであろうことは周知である。
【００９２】
好ましくは、誘導物質は、０．００５mMから１mM、さらにより好ましくは０．０１mMから０．５mMの範囲の濃度で使用される。特に、ＩＰＴＧの濃度は、１〜１００μmol/g（細胞乾燥重量）の範囲である。
【００９３】
本明細書において提供されているような、本明細書に記載の誘導発現系で使用される宿主は、ｌａｃオペロン、好ましくは野生型ｌａｃオペロン、及びｌａｃＩ遺伝子を含む。
【００９４】
本明細書において言及されているように、内因性ｌａｃオペロンは、３つの遺伝子、すなわちｌａｃＺ、ｌａｃＹ、及びｌａｃＡを含有している。これらの遺伝子は、１つのプロモーターの制御下で、単一のｍＲＮＡとして転写される。３つの遺伝子の他に、ｌａｃオペロンは、ｌａｃプロモーター並びにｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、及びｌａｃＯ３を含む。ｌａｃプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位である。ｌａｃオペレーターは、ｌａｃリプレッサータンパク質の結合する負の調節部位である。オペレーターはプロモーターと重複し、ｌａｃリプレッサータンパク質に結合すると、ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターと結合して転写を開始することができない。特定の実施態様によると、内因性ｌａｃオペロンは、ｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３の少なくとも１つに対する、ＬａｃＩの結合親和性を高めるために改変されている。特に、ｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、又はｌａｃＯ３の少なくとも１つは改変され、すなわち、内因性ｌａｃオペロンは、ＬａｃＩに対する増加した親和性を有する、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、及び／又はｌａｃＯ３の機能的変異体を含む。
【００９５】
本明細書において使用する「ｌａｃＩ遺伝子」という用語は、ｌａｃリプレッサータンパク質（ｌａｃインヒビター（ＬａｃＩ）とも呼ばれる）、又はｌａｃＩ（配列番号２６）に対する少なくとも３０％の配列同一率を有する任意のその機能的変異体の発現のための遺伝子を指す。特に、該遺伝子は、ｌａｃＩコード配列、ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター及びｌａｃＩの発現を増加させるｌａｃＩプロモーターからなる群より選択される）を含む。特に、ｌａｃＩ遺伝子は、ＬａｃＩ、又はＬａｃＩ（配列番号２７）に対して少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％の配列同一率を含むその機能的に活性な変異体を発現する。特に、ＬａｃＩの発現を増加させるｌａｃＩプロモーターは、ＬａｃＩの発現を少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、又は５倍、好ましくは１０倍以上増加させる、強力なプロモーターである。特に、それは、ＬａｃＩの発現を少なくとも２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又はさらには１００倍増加させる。本明細書に提供される誘導系の例示的な実施態様は、ｌａｃＩの発現を増加させるｌａｃＩプロモーターとして、ｌａｃＩＱプロモーターを含む。ｌａｃＩＱプロモーターは、プロモーター領域内の天然ｌａｃＩ遺伝子の上流に、点突然変異、すなわち単一のＣ→Ｔへの変化を含み、その結果、ｍＲＮＡの転写は１０倍増加する。ｌａｃＩコード配列のためのプロモーターは、天然ｌａｃＩ開始コドン又はその任意の変異体を含み得る。ｌａｃＩ遺伝子は好ましくは、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれるか、又は単一コピーのベクターに含有されている。
【００９６】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｌａｃリプレッサータンパク質は、ホモ四量体を形成し、これはｌａｃオペレーター配列（ｌａｃＯ）に結合し、ｌａｃＺＹＡオペロンの転写を抑制する。ラクトース又は代謝不可能なイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下では、ＬａｃＩは構造を変化させ、ｌａｃ−オペレーターにはもはや結合することができず、その結果、転写が誘導される。ｌａｃ−オペレーター部位は、逆方向で対称性の反復配列を有するＤＮＡ配列である。
【００９７】
対称度が高くなればなるほど、オペレーター配列に対するＬａｃＩの結合親和性は高くなる。人工的な完全に対称的なｌａｃＯ（ｓｙｍ−ｌａｃＯ）は、最大の親和性でＬａｃＩに結合することが判明し、一方、およその対称性を示す、３つの野生型オペレーターのｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２及びｌａｃＯ３は、より低い親和性を示し、その結果としてＬａｃＩに対する親和性に関して以下の順である：ｓｙｍ−ｌａｃＯ＞ｌａｃＯ１＞ｌａｃＯ２＞ｌａｃＯ３。ＬａｃＩは、ＤＮＡループ形成機序を通して、第一のオペレーターｌａｃＯ１と、ｌａｃＯ２又はｌａｃＯ３のいずれかの双方に同時に結合する。ＬａｃＯ２はｌａｃＯ１の４０１ｂｐ下流に位置し、一方、ｌａｃＯ３はｌａｃＯ１の僅か９２ｂｐ上流にある。抑制への主な寄与は、ｌａｃＯ１とｌａｃＯ３がより近接しているために、ｌａｃＯ１とｌａｃＯ３のＤＮＡループ形成から生じるからである。さらに、ｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３がＬａｃＩと結合すると、ＬａｃＩそれ自体の産生が妨げられる。ｌａｃＩ遺伝子の３'末端は、ｌａｃＯ３と重複する。抑制された状態では、ｌａｃＩの転写により、切断短縮されたｍＲＮＡが生じ、これは細胞によって迅速に分解される。この自己調節に因り、ＬａｃＩ四量体の濃度は、誘導された細胞では約４０個の分子であり、非誘導細胞では約１５個の分子である。
【００９８】
ｌａｃオペレーターの配列は当技術分野において周知である。例示的なｌａｃオペレーター配列は、配列番号３〜５によって提供される。
【００９９】
本明細書に開示されている、核酸配列又はポリペプチド配列の適切な変異体、特にｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２、及びｌａｃＯ３は、該配列に対応する核酸又はポリペプチドと同じ種類の活性（活性の程度に関するものではない）を有する機能的変異体である。このような活性は、以下の実施例に記載のアッセイに従って、及び当技術分野において公知である方法に従って試験され得る。
【０１００】
「機能的変異体」すなわち機能的に活性な変異体という用語はまた、天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに、突然変異体又は任意の他の天然に存在しない変異体も含む。当技術分野において公知であるように、対立遺伝子変異体は、核酸又はポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる、核酸又はペプチドの代替的な形態である。
【０１０１】
機能的変異体は、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列中の配列の改変によって、例えば１つ以上の点突然変異によって得られることができ、ここでの配列の改変は、本発明の組合せで使用された場合に、未改変のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。このような配列の改変は、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異、及び挿入を含み得るがこれらに限定されない。
【０１０２】
点突然変異は、１つ以上のシングレットな（非保存的な）又はダブレットなアミノ酸を異なるアミノ酸で置換若しくは交換、欠失、又は挿入することにより、工学操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらす、ポリヌクレオチドの工学操作であるとして特に理解される。
【０１０３】
ｌａｃＯ１オペレーターの例示的な機能的変異体は、２塩基対切断短縮された形の野生型ｌａｃＯ１であり、これは、その５'末端に２ｂｐの欠失、すなわちｌａｃＯ＊（配列番号６）を含む。
【０１０４】
タンパク質の産生の微細な調整すなわち「調整能」とも呼ばれる、転写速度制御は、バイオプロセシングにおいて非常に関連性がある。バイオプロセスは、最長期間中に細胞の合成能を最大限に活用して、適切に折り畳まれプロセシングされたタンパク質が得られるように設計されている。しかし、強力な発現系、例えばＴ７発現系は、「全か無」の行動を示すことが知られ、ここでの部分的に誘導された培養液中の低減された発現レベルは、完全に誘導された細胞及び誘導されていない細胞の亜集団の形成の結果である。このような問題は、調整能、特に単一細胞の調整能を可能とする、本明細書に記載の誘導発現系によって解決する。本明細書に記載の誘導発現系では、関心対象遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターの少なくとも１つのｌａｃＯに対するＬａｃＩの親和性は、宿主の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するＬａｃＩの親和性よりも低い。関心対象遺伝子（ＧＯＩ）における少なくとも１つのｌａｃＯに対するＬａｃＩの結合定数（Ｋａ）が、ｌａｃオペロンにおけるｌａｃＯに対する結合定数よりも高い場合、ＩＰＴＧによって不活化されない、第一のＬａｃＩ分子は、ｌａｃオペロン上のｌａｃＯ３／ｌａｃＯ１ではなく、関心対象遺伝子のｌａｃＯ結合部位に優先的に結合するだろう。したがって、ＬａｃＩの自己調節は介入せず、より多くのＬａｃＩ分子が産生され、これにより系の過剰調節がもたらされ、その結果、この細胞における関心対象遺伝子の転写は完全に停止する。特に、低い誘導物質の濃度では、このような系により、関心対象遺伝子を産生する細胞と産生しない細胞の少なくとも２つの明確に異なる亜集団がもたらされる。なぜなら、このような発現系はそれらの産生力を停止するが、依然として増殖し続けるからである。
【０１０５】
しかしながら、本明細書に記載の誘導発現系では、関心対象遺伝子（ＧＯＩ）における少なくとも１つのｌａｃＯに対するＬａｃＩの結合定数（Ｋａ）は、ｌａｃオペロンにおけるｌａｃＯに対する結合定数よりも低い。それ故、ＬａｃＩは、内因性ｌａｃオペロンのオペレーターに優先的に結合し、３つのｌａｃＺ、ｌａｃＹ、及びｌａｃＡの遺伝子の転写を妨げ、ＬａｃＩの自己調節を通して、ＬａｃＩのさらなる産生も妨げ、その結果、任意の所与の誘導物質の濃度で同種の集団が得られる。
【０１０６】
本明細書において使用する「親和性」又は「結合親和性」という用語は、解離定数及び／又は結合定数によって定義されるような、リガンドと受容体との間の会合の強度を指す。解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として定義される、平衡における解離速度定数であり、ここでのｋｏｆｆは、受容体からのリガンドの解離の速度定数であり、ｋｏｎは、受容体に対するリガンドの会合の速度定数である。会合定数（Ｋａ）は、Ｋｄの逆である。Ｋａが高い場合、Ｋｄは低く、リガンドは受容体に対する高い親和性を有する（より少ない分子が、受容体の５０％に結合するのに必要とされる）。
【０１０７】
通常、結合剤は、少なくともＫｄ＜１０−７Ｍの解離定数を有する高い親和性の結合剤と考えられ、場合によっては、例えばＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍなどの、より高い親和性が必要とされ、さらにより好ましいのはＫｄ＜１０−１０Ｍである。
【０１０８】
本明細書に記載の誘導発現系では、関心対象遺伝子の１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに対するＬａｃＩの結合親和性は、内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するＬａｃＩの親和性よりも低い。特に、ｌａｃＩはｌａｃオペレーターのｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に、少なくともＫｄ＜１０−７Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９ＭのＫｄで結合し、さらにより好ましいのはＫｄ＜１０−１０Ｍである。特に、ＬａｃＩは、関心対象遺伝子の１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％又はそれ以上増加しているＫｄで結合する。結果として、ＬａｃＩは、関心対象遺伝子の１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに、内因性ｌａｃオペロンのｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するＬａｃＩのＫａよりも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％低いＫａで結合する。
【０１０９】
特に、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。特定の実施態様では、結合親和性はビアコア、フォルテバイオ、又はＭＳＤアッセイによって決定される。特定の実施態様では、結合親和性は、速度論的方法によって決定される。特定の実施態様では、結合親和性は、平衡法／溶液法によって決定される。当業者は、特定の分子に対するリガンドの結合親和性を決定するために、適切なパラメーターを決定することができる。結合親和性は、当業者によって慣用的に決定され得る。
【０１１０】
本明細書に記載のような「配列同一率」又は「アミノ酸配列同一率（％）」は、配列をアラインさせ、必要であればギャップを導入して、最大配列同一率を達成した後、配列同一率の一部として保存的置換を全く考えず、比較される予定の特定のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列（「親配列」）におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基の比率として定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための、適切なパラメーターを決定することができる。
【０１１１】
本明細書において使用する「作動可能に連結」という用語は、１つ以上のヌクレオチド配列の機能が、該核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響を受けるような、単一の核酸分子、すなわちベクター上への、ヌクレオチド配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現を起こすことができる場合に、関心対象タンパク質をコードしているコード配列に作動可能に連結されている。特に、互いに作動可能に連結されているこのような核酸は、直接連結されていてもよく、すなわち、間にさらなるエレメント又は核酸配列を間に含まなくてもよく、スペーサー配列又は他の配列を間に含んで間接的に連結されていてもよい。特に、ｌａｃオペレーターの文脈では、プロモーターに作動可能に連結されていることは、特定の条件下でコード配列の発現を制御するプロモーターの能力を、ｌａｃオペレーターが調節することができること、例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質が関心対象遺伝子に結合すると、関心対象遺伝子のプロモーター依存的発現を、ｌａｃオペレーターが阻害することができることを指す。
【０１１２】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列又はタンパク質に関する、本明細書において使用する「異種」という用語は、所与の宿主細胞に対して、外来である、すなわち「外因性」であり、例えば天然に見られないか；又は、所与の宿主細胞において天然に見られる、例えば「内因性」であるのいずれかである化合物を指すが、しかしながら、例えば異種核酸を利用する異種構築物の文脈では、これにより「天然に存在しない」を指す。内因性に見られるような異種ヌクレオチド配列はまた、細胞内に不自然な量で、例えば、予想される量よりも多い又は天然に見られる量より多い量で産生され得る。異種ヌクレオチド配列、又は異種ヌクレオチド配列を含む核酸はおそらく、内因性ヌクレオチド配列とは配列が異なるが、内因性に見られるのと同じタンパク質をコードしている。特に、異種ヌクレオチド配列は、天然においては宿主細胞と同じ関係で見られないものである（すなわち「天然では会合していない」）。任意の組換えの又は人工のヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチド又は核酸分子の一例は、例えばハイブリッドプロモーターを得るための、プロモーターと天然的には会合していないか、又は、本明細書に記載のようにコード配列に作動可能に連結されている、ヌクレオチド配列を含む。結果として、ハイブリッド又はキメラポリヌクレオチドを得ることができる。異種化合物のさらなる例は、内因性の天然の関心対象タンパク質のコード配列が通常は作動可能に連結されていない、転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結されている、関心対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子である。
【０１１３】
本発明はさらに、以下の項目を含む：
【０１１４】
１．少なくとも
ａ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質をコードしている遺伝子
（これは、
−コード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）の発現のためのｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、ここでの関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される）を含む）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質（ＰＯＩ）の産生のためのゲノムに基づいた発現系。
【０１１５】
２．関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、（ｉ）プロモーター配列内に１つのｌａｃＯ、又は（ｉｉ）プロモーター配列内に１つのｌａｃＯと、第一のｌａｃＯの上流に１つのｌａｃＯとを含有している、項目１のゲノムに基づいた発現系。
【０１１６】
３．関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、プロモーター配列内に１つのｌａｃＯを含有し、ｌａｃＩプロモーターは、ＬａｃＩ発現を増加させるプロモーターである、項目１又は２のゲノムに基づいた発現系。
【０１１７】
４．関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、プロモーター配列内に１つのｌａｃＯと、第一のｌａｃＯの上流に１つのｌａｃＯとを含有し、ｌａｃＩプロモーターは、ＬａｃＩ発現を増加させるプロモーターである、項目１〜３のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１１８】
５．原核細胞宿主が、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、項目１〜４のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１１９】
６．前記宿主が、ＢＬ２１又はＫ−１２株のＥ．ｃｏｌｉである、項目１〜５のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２０】
７．ＲＮＡポリメラーゼが、異種又は同種のＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＲＮＡポリメラーゼが、宿主と同種のＲＮＡポリメラーゼであり、特にそれはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはσ７０Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼである、項目１〜６のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２１】
８．項目１のｂ）のプロモーターが、Ｔ５、Ｔ５Ｎ２５、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、又はｔｒｃからなる群より選択される、項目１〜７のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２２】
９．ｌａｃＩプロモーターが、ＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターであり、これはｌａｃＩＱプロモーター（配列番号１）である、項目１〜８のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２３】
１０．ｌａｃオペレーターが、ｌａｃＯ１（配列番号３）、ｌａｃＯ２（配列番号４）、又はｌａｃＯ３（配列番号５）である、項目１〜９のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２４】
１１．ｌａｃオペレーターが、少なくとも６５％の配列同一率若しくは完全に対称なｌａｃＯを有する、ｌａｃＯ１、ｌａｃＯ２又はｌａｃＯ３の機能的変異体である、項目１０のゲノムに基づいた発現系。
【０１２５】
１２．関心対象タンパク質をコードしているコード配列に作動可能に連結された前記プロモーターが、初期転写配列（ＩＴＳ）、好ましくは天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）を含む、項目１〜１１のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２６】
１３．誘導物質が、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ラクトース、メチル−β−Ｄ−チオガラクトシド、フェニル−β−Ｄ−ガラクトース、及びオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）からなる群より選択される、項目１〜１２のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２７】
１４．関心対象タンパク質の発現のための遺伝子が、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内に１つのｌａｃＯ１オペレーターと、天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）とを含有し、ここでのｌａｃＩプロモーターはｌａｃＩＱプロモーターである、項目１〜１３のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２８】
１５．関心対象遺伝子が、少なくとも９２又は９４塩基対（ｂｐ）離れている、好ましくは１０３、１０５、１１４、１１６、１２５、１２７、１３４、１３６、１３８、又は１４９塩基対離れている、２つのｌａｃオペレーターを含有し、ここでの一方のｌａｃオペレーターは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターはプロモーターの上流にある、項目１〜１４のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１２９】
１６．関心対象タンパク質をコードしている遺伝子が、異種遺伝子である、項目１〜１５のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系。
【０１３０】
１７．原核細胞宿主のｌａｃオペロンの少なくとも１つのｌａｃオペレーターが、ｌａｃリプレッサー分子のＬａｃＩに対するその結合親和性を増加させるように遺伝子的に改変されている、項目１〜１６のいずれか一項の系。
【０１３１】
１８．ａ）誘導物質の添加によって、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の発現を誘導する工程、
ｂ）関心対象タンパク質を収集する工程、
ｃ）関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｄ）修飾する工程、そして
ｅ）関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、項目１〜１７のいずれか一項のゲノムに基づいた発現系を使用して、原核細胞宿主における関心対象タンパク質をプラスミドフリーに産生する方法。
【０１３２】
１９．ａ）１つ以上の関心対象タンパク質をコードしている１つ以上のコード配列、
ｂ）１つ以上のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び
ｃ）該プロモーター配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）
（ここでの、ｃ）のｌａｃＯに対するＬａｃＩの親和性は、宿主細胞の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対する、ＬａｃＩの親和性よりも低い）
を含む、少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された少なくとも１つの異種遺伝子を含む発現カセット。
【０１３３】
２０．少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子が、９２又は９４ｂｐ離れている、２つのｌａｃオペレーターを含み、ここでの一方のｌａｃオペレーターはプロモーター配列内に位置し、第二のｌａｃオペレーターはプロモーターの上流にある、項目１９の発現カセット。
【０１３４】
２１．ｌａｃＩＱプロモーター（配列番号１）である、異種ｌａｃＩプロモーターをさらに含む、項目１９又は２０の発現カセット。
【０１３５】
２２．少なくとも１つの異種の関心対象タンパク質を産生するように設計された異種遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列内にｌａｃＯ１オペレーターと、天然Ｔ７Ａ１初期転写配列（配列番号２）を含む、項目１９〜２１のいずれか一項の発現カセット。
【０１３６】
２３．ａ．発現カセットを原核細胞宿主の染色体内に組み込む工程、
ｂ．誘導物質の添加によって、関心対象タンパク質をコードしている遺伝子の発現を誘導する工程、
ｃ．関心対象タンパク質を収集する工程、
ｄ．関心対象タンパク質を単離及び精製する工程、そして場合により
ｅ．修飾する工程、そして
ｆ．関心対象タンパク質を製剤化する工程
を含む、項目１９〜２２のいずれか一項の発現カセットを使用して、製造規模で原核細胞宿主における関心対象タンパク質をプラスミドフリーで産生する方法。
【０１３７】
２４．  少なくとも
ａ）宿主の染色体におけるＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）遺伝子、
ｂ）関心対象タンパク質をコードしている遺伝子
（これは、
−コード配列、
−該コード配列に作動可能に連結されたプロモーター（ここでの該プロモーターは、ａ）から発現されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される）、及び
−該プロモーターの配列内の少なくとも１つのｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）を含む）
ｃ）ｌａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）をコードしているｌａｃＩ遺伝子
（これは、
−ｌａｃＩコード配列、
−ｌａｃＩコード配列に作動可能に連結されたｌａｃＩプロモーター（ここでのｌａｃＩプロモーターは、野生型ｌａｃＩプロモーター、又はＬａｃＩ発現を増加させるｌａｃＩプロモーターである）を含む）
を含む、原核細胞宿主における関心対象タンパク質（ＰＯＩ）のプラスミドフリーな産生のための誘導系であって、ここで、ｂ）の１つ以上のｌａｃＯ／ｌａｃＯｓに対するＬａｃＩの親和性は、宿主の内因性ｌａｃオペロンのｌａｃオペレーターｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するｌａｃＩの親和性よりも低く、関心対象タンパク質の発現速度は、ＬａｃＩに結合する誘導物質によって調節される。
【０１３８】
２５．原核細胞宿主のｌａｃオペロンの少なくとも１つのｌａｃオペレーターが、ｌａｃリプレッサー分子ＬａｃＩに対するその結合親和性を増加させるように遺伝子的に改変されている、項目２４の系。
【０１３９】
本明細書に記載の実施例は、本発明を例示し、それを制限することを意図するものではない。本発明の様々な実施態様は、本発明に従って記載されている。多くの修飾及び変化が、本明細書に記載及び例示された技術に対して、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行なわれ得る。したがって、実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。
【０１４０】
実施例
実施例１：概観並びに本明細書の実施例に使用される材料及び方法
この研究の目的は、転写効率、基礎発現速度、及び調整能の点から、σ７０Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡＰによって認識される、２つの構成性のファージ由来プロモーターのＴ５Ｎ２５及びＴ７Ａ１の能力を調べることであった。プロモーター配列は、１つ、２つ、又は３つのいずれかのｌａｃＯ結合部位を含有するように改変された（配列番号２８〜３３）。モデルタンパク質のＧＦＰｍｕｔ３．１を用いて試験された、７個のプロモーター／オペレーターの組合せが図１に示されている。発現強度、調整能、基礎発現、及び細胞増殖を、プラスミドに基づいた及びプラスミドフリーなＢＬ２１発現系において調べた。結果として得られた産生クローンのセットを、マイクロタイター発酵でフェッドバッチ様条件下で培養し、比較した。
【０１４１】
株及び培養条件。エシェリヒア・コリＫ−１２ ＮＥＢ５−α［fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA gln V44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17］は、ニューイングランドバイオラボ社（ＭＡ州、米国）から入手し、全てのクローニング手順に使用した。鎖状ＤＮＡカートリッジを、エシェリヒア・コリＢＬ２１［fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS］（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州、米国）の細菌染色体のａｔｔＴＮ７部位に組み込んだ。参照実験のために、同じ株を、それぞれのプラスミドを用いて形質転換した。可溶性タンパク質のＧＦＰｍｕｔ３．１を、組換えモデルタンパク質として使用した（１９）。
【０１４２】
制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）による消化、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）、ライゲーション、及びＥ．ｃｏｌｉプラスミドの形質転換のような基本的なクローニング法は、Sambrook et al. （２４）に従って実施された。
【０１４３】
クローニング目的のために、細胞を、Ｍ９ＺＢ培地中で慣用的に増殖させ、ＳＯＣ培地中で回収し、Ｍ９ＺＢ寒天上に蒔いた。以下の抗生物質濃度を使用した：プラスミドに基づいた及びプラスミドフリーな発現系について、それぞれ、アンピシリン（Ａｍｐ）１００μg/ml又は３０μg/ml、カナマイシン（Ｋａｎ）５０μg/ml又は３０μg/ml、及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）２０μg/ml又は１０μg/ml。
【０１４４】
培養条件
株を、Torok et al. （２３）に記載のように、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒマイクロ発酵システム中の４８ウェルのフラワープレート（登録商標）（m2p-labs社、ベスヴァイラー、ドイツ）中で培養した。炭素源としてグルコース及びデキストランを用いる合成の適時フィード（ＦＩＴ）フェッドバッチ培地（m2p-labs社、ベスヴァイラー、ドイツ）を使用した。接種する直前に、０．６％（ｖ/ｖ）のグルコース放出酵素ミックス（ＥｎｚＭｉｚ）を加えた。ＧＦＰｍｕｔ３．１発現レベルを、４８８nmの励起及び５２０nmの発光でモニタリングした。シグナルは相対蛍光単位［ｒｆｕ］で示される。全てのパラメーターのサイクル時間は、２０分間であった。初期細胞密度は、ＯＤ６００＝０．３の吸光度と等価であった。接種のために、急速冷凍した（−８０℃）ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）（ＯＤ６００＝２）を解凍し、バイオマスを遠心分離（７５００rpm、５分間）によって収集した。細胞を、５００μLの対応する培地で洗浄して残留グリセロールを除去し、遠心分離にかけた；その後、ペレットを、全培養培地中に再懸濁した。全ての培養を、３つのレプリケートで３０℃で２２時間かけて調製した。組換え遺伝子発現を、培養開始から１０時間後に、０．００５mM、０．０１mM、又は０．５mMのＩＰＴＧをそれぞれ用いて誘導した。
【０１４５】
フェッドバッチ発酵のために、細胞を、標準的なコントロールユニットを備えた、１．５Ｌ（１．２Ｌのワーキングボリューム、０．４Ｌの最小容量）のＤＡＳＧＩＰ（登録商標）パラレルバイオリアクターシステム（エッペンドルフ社、ドイツ）中で増殖させた。ｐＨは、１２．５％のアンモニア溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＭＡ州／米国）の添加によって７．０±０．０５に維持し；温度は、バッチ期間中に３７±０．５℃に維持し、フィード期間中に３０±０．５℃に下げた。溶存酸素（Ｏ２）レベルは、撹拌速度及び通気速度を制御することによって、３０％超の飽和度に安定化した。発泡は、消泡懸濁剤（Glanapon2000、Bussetti社、オーストリア）の添加によって抑制した。接種のために、急速冷凍した（−８０℃）ワーキングセルバンクバイアルを解凍し、１ml（６００nmにおける吸光度＝１）を無菌的にバイオリアクターに移した。
【０１４６】
０．６Ｌのバッチ培地中に６ｇの細胞乾燥質量（ＣＤＭ）まで増殖させた培養液が静止期に入った時に、フィーディングを開始した。指数関数的な炭素の制限された基質フィードを用いるフェッドバッチ計画を使用して、２．５の倍加時間にわたり０．１/ｈの一定の増殖速度を得た。基質フィードは、基質ボトル中の重量減少の重層的なフィードバック制御と共に、指数関数的な増殖アルゴリズムｘ＝ｘ０ｅμｔに従ってポンプ速度を増加させることによって制御された。グルコースに関する細胞乾燥重量の収量の係数は０．３ｇ/ｇであり、フィード培地は、追加の３２ｇの細胞乾燥重量を生じるのに十分なグルコース及び成分を与えた。発現系の誘導は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をリアクターに添加して、１０μmol/gの細胞乾燥重量の濃度を得ることによって行なわれた。この実験に使用される最小培地の調製及び組成は以前に記載された（１７）。
【０１４７】
株
ＢＬ２１Ｑ、簡略化するとＢＱ
Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）へのｌａｃＩＱプロモーターの組込みのために、ｐＥＴＡｍｐ−ｌａｃＩｑプラスミドを構築した。このプラスミドは、ＦＲＴ部位によってフランキングされたアンピシリン耐性遺伝子、及びｌａｃＩＱプロモーターによって制御されるｌａｃＩ遺伝子を含有している。アンピシリン耐性遺伝子は、オーバーハングＰＣＲ技術を使用してｐＥＴ１１ａから増幅して、ＦＲＴ部位並びに制限酵素部位であるＢａｍＨＩ（５’）及びＫｐｎＩ（３'）を付加した。以下のプライマーを使用した：ＢａｍＨＩ−ＦＲＴ−Ａｍｐ−ｆｏｒ及びＫｐｎＩ−ＦＲＴ−Ａｍｐ−ｒｅｖ。
【０１４８】
ｐＢＲ３２２複製起点及びｌａｃＩ遺伝子は、オーバーハングＰＣＲ技術を使用してｐＥＴ３０ａから増幅して、ｌａｃＩプロモーター内にＣからＴへの突然変異、並びに制限酵素部位であるＫｐｎＩ（５’）及びＢａｍＨＩ（３'）を付加した。以下のプライマーを使用した：ＫｐｎＩ−ｐＢＲ３２２−ｆｏｒ及びＢａｍＨＩ−ｌａｃｉｑ−ｒｅｖ。
【０１４９】
ゲノム組込みのための鎖状ＤＮＡカートリッジを、Ｑ５（登録商標）ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）を使用して、製造業者のマニュアルに従って増幅した。以下のプライマーを使用した：ＧＩ−ｌａｃＩｑ−ｆｏｒ及びＧＩ−ｌａｃＩｑ−ｒｅｖ。
【０１５０】
細菌染色体への組込みは、Sharan et al.（２６）によって記載されているような、ｐＳＩＭ５プラスミドを有する、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）のｌａｃオペロン部位で起こった。
【０１５１】
陽性クローンのスクリーニング及び組み込まれたＤＮＡカートリッジの増幅は、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）を使用して、製造業者のマニュアルに従って、基本的なコロニーＰＣＲ技術によって実施された。以下のプライマーを使用した：ｌａｃＩ／１＿ｅｘｔ及びｌａｃｉ／２＿ｅｘｔ。
【０１５２】
プライマーＡｍｐＳｔｏｐを、増幅されたＤＮＡ組込みカートリッジをシークエンスするのに使用した。
【０１５３】
ＢＬ２１Ｑ：：ＴＮ７＜１ｌａｃＯＡ１−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞、簡略化するとＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞
Ｔ７Ａ１プロモーターの配列は、（１８）から採用し（ＰＡ１/０４と命名された）、−１０から−３５のプロモーター領域に２ｂｐ切断短縮されたｌａｃＯ１配列を含有している。このプロモーターは、ｐＥＴ３０ａ由来の５'スペーサー配列と制限酵素部位であるＳｐｈＩ（５'）及びＸｂａｌ（３'）とを含有している、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社、ＩＡ州/米国）として注文され、続いて、ｐＥＴ３０ａ−ｃｅｒ−ｔＺＥＮＩＴ−ＧＦＰｍｕｔ３．１骨格にクローニングされた。新規プラスミドは、ｐＥＴｋ１ｌａｃＯＡ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１と命名された。
【０１５４】
ゲノム組込みのための鎖状ＤＮＡカートリッジを、Ｑ５（登録商標）ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）を使用して、製造業者のマニュアルに従って増幅した。以下のプライマーを使用した：ＴＮ７＿１＿ｐＥＴ３０ａｗ／ｏＫａｎＲ＿ｆｏｒ及びＴＮ７＿２＿ｐＥＴ３０ａ＿ｆｏｒ。
【０１５５】
細菌染色体への組込みは、Sharan et al.（２６）によって記載されているような、ｐＳＩＭ５プラスミドを有する、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ＱのａｔｔＴＮ７部位で起こった。
【０１５６】
以下のプライマーを陽性クローンのスクリーニングのために使用した：ＴＮ７／１＿ｅｘｔ及びＴＮ７／２＿ｅｘｔ。
【０１５７】
ｓｅｑ＿ＭＣＳ−ｆｏｒ及びｓｅｑ＿ＭＣＳ−ｒｅｖというプライマーを、増幅されたＤＮＡ組込みカートリッジのシークエンシングのために使用した。
【０１５８】
ＢＬ２１Ｑ：：ＴＮ７＜１ｌａｃＯＴ５−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞、簡略化するとＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ｔ５＞
Ｔ５Ｎ２５プロモーターの配列は（１８）から採用し、−１０から−３５のプロモーター領域に２ｂｐ切断短縮されたｌａｃＯ１配列を含有している。Ｔ５Ｎ２５の＋１から＋２０の初期転写配列（ＩＴＳ）を、Ｔ７Ａ１の初期転写配列と交換した（２１）。このプロモーターは、ｐＥＴ３０ａ由来の５'スペーサー配列と制限酵素部位であるＳｐｈＩ（５'）及びＸｂａｌ（３'）とを含有している、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社、ＩＡ州/米国）として注文され、続いて、ｐＥＴ３０ａ−ｃｅｒ−ｔＺＥＮＩＴ−ＧＦＰｍｕｔ３．１骨格にクローニングされた。新規プラスミドは、ｐＥＴｋ１ｌａｃＯＴ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１と命名された。
【０１５９】
ＢＬ２１：：ＴＮ７＜２ｌａｃＯＡ１−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞及びＢＬ２１：：ＴＮ７＜２ｌａｃＯＴ５−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞、簡略化するとＢ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞及びＢ＜２ｌａｃＯ−Ｔ５＞
ｌａｃＩＱプロモーターによって上昇したレベルのｌａｃＩの他に、第二のｌａｃＯは、ＤＮＡループ形成を可能とすることによって、基礎発現を低下させることができる。第一のｌａｃＯ１の６２ｂｐ上流への第二のｌａｃＯ１配列の付加のために、オーバーハングＰＣＲを、鋳型であるｐＥＴｋ１ｌａｃＯＡ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１又はｐＥＴｋ１ｌａｃＯＴ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１をそれぞれ用いて実施した。正方向のプライマー（２ｌａｃＯ−ｆｏｒ）は、ｌａｃオペレーター及び制限酵素部位のＳｐｈＩ（５'）を含有し、逆方向のプライマー（２ｌａｃＯ−ｒｅｖ）は、制限酵素部位のＮｄｅＩ（３'）を含有している。新規プラスミドは、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯＡ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１及びｐＥＴｋ２ｌａｃＯＴ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１と命名された。
【０１６０】
細菌染色体への組込みは、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州／米国）のａｔｔＴＮ７部位で起こった。
【０１６１】
鎖状ＤＮＡカートリッジの増幅及びスクリーニングは、以前に記載されている通りに実施された。
【０１６２】
プロモーター／オペレーターの組合せの構築及び特徴付け
制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）による消化、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）、ライゲーション、及びＥ．ｃｏｌｉプラスミドの形質転換のような基本的なクローニング法は、Sambrook et al. （２４）に従って実施された。Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ニューイングランドバイオラボ（登録商標）社、ＭＡ州／米国）へのｌａｃＩＱプロモーターの組込みのために、プラスミドｐＥＴＡｍｐ−ｌａｃＩｑを構築した。このプラスミドは、ＦＲＴ部位によってフランキングされたアンピシリン耐性遺伝子、及びｌａｃＩＱプロモーターによって制御されるｌａｃＩ遺伝子を含有している（２５）。ｐＢＲ３２２複製起点及びｌａｃＩ遺伝子は、オーバーハングＰＣＲ技術を使用してｐＥＴ３０ａから増幅して、ｌａｃＩプロモーター内にＣからＴへの突然変異を付加した。ゲノム組込みのための鎖状ｌａｃＩＱＤＮＡカートリッジを、Ｑ５（登録商標）ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ（登録商標）社、ＭＡ州／米国）を使用して、製造業者のマニュアルに従って増幅した。細菌染色体への組込みは、Sharan et al.（２６）によって記載されているような、ｐＳＩＭ５プラスミドを有する、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１のｌａｃオペロン部位で起こった。この株はＢＬ２１Ｑという名称を得た。Ｔ７Ａ１及びＴ５Ｎ２５プロモーターの配列は、Lanzer及びBujard（１８）から採用され（ＰＡ１/０４及びＰＮ２５/０４と命名された）、−１０から−３５のプロモーター領域に２ｂｐ切断短縮されたｌａｃＯ１配列を含有している。これらのプロモーターは、ｐＥＴ３０ａ由来の５'スペーサー配列と制限酵素部位であるＳｐｈＩ（５'）及びＸｂａｌ（３'）とを含有している、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社、ＩＡ州/米国）として注文され、続いて、ｐＥＴ３０ａ−ｃｅｒ−ｔＺＥＮＩＴ−ＧＦＰｍｕｔ３．１骨格にクローニングされた。ｔＺＥＮＩＴ終結因子は、他に記載されている（２７）。第一のｌａｃＯ１の６２ｂｐ上流に、第二のｌａｃＯ１配列を、オーバーハングＰＣＲを介して付加した。３ｌａｃＯ−Ｔ５プロモーター/オペレーターの組合せは、ＡＴＵＭ社（ＣＡ州/米国）のｐＪｅｘｐｒｅｓｓ  ４０１−４０６（Ｔ５）ベクターから採用された。鎖状ＤＮＡカートリッジを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１又はＢＬ２１Ｑの細菌染色体のａｔｔＴＮ７部位に組み込んだ。
【０１６３】
ＧＦＰｍｕｔ３．１のオフラインでの発現分析及び定量
組換えＧＦＰｍｕｔ３．１を、Reischer et al.（２８）に従ってＥＬＩＳＡによって定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、以前に記載されているように実施した（２９）。
【０１６４】
フローサイトメトリー
ガリオスフローサイトメーター（ベックマンコールター社、ＣＡ州／米国）を使用して、ＧＦＰｍｕｔ３．１産生細胞の割合を決定した。細胞を、接種から１２時間後に収集し、その後、ＰＢＳで１/２０２５倍に希釈した。ＧＦＰｍｕｔ３．１の蛍光の励起は、４８８nmにおける光励起半導体レーザーのサファイアレーザーを使用して実施され、その後の発光は、ＦＬ１チャネル（５０５〜５４５）の使用を通して測定された。１つの試料あたり１５０００個の細胞について約３００個のイベント/秒でデータが記録され、カルーザ分析ソフトウェア（ベックマンコールター社）を用いて分析した。
【０１６５】
ＬａｃＩのウェスタンブロット及び定量
約１．２×１０７個のＢＬ２１−ｗｔ細胞及びＢ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞細胞から得られた細胞抽出物を、以前に記載（２９）されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離後、タンパク質を、ｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライブロッティングシステムを使用して、製造業者のマニュアル（インビトロジェン（商標）／サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＣＡ州／米国）に従って、与えられた膜上にブロットした。続いて、タンパク質を、ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳダルベッコ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中３％の無脂肪ドライミルクを用いて室温で４時間かけてブロッキングした。その後、ブロットを、一次抗体（１：１０００の抗ＬａｃＩｌ抗体、クローン９Ａ５（シグマアルドリッチ社／メルク社、ＭＯ州／米国））と共に室温で１時間インキュベートした。その後、それをアルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた二次抗体（１：２０００の抗マウスＩｇＧ（完全分子）−シグマＡ５１５３（シグマアルドリッチ社／メルク社、ＭＯ州／米国））と共に室温で１時間インキュベートし、シグマＦＡＳＴ（商標）ＢＣＩＰ（登録商標）/ＮＰＴタブレット（シグマアルドリッチ社／メルク社、ＭＯ州／米国）を用いて製造業者のマニュアルに従って展開した。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬソフトウェア（ＧＥヘルスケア社、ＩＬ州／米国）を用いて定量した。
【０１６６】
【表１】
2022500036.tif 000002
【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
【表３】
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【０１６９】
実施例２：宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター／オペレーターの組合せの産生力
Ｔ７発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに組み込まれた、単一の標的遺伝子のコピーからでさえも、高い発現速度を与えることが知られている。まず、同じ産生力が、同じ実験設定でσ７０Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターによって到達できるかどうかを試験した。それ故、プラスミドフリーな及びプラスミドに基づいたＴ５Ｎ２５及びＴ７Ａ１プロモーター／オペレーターの組合せを、Ｔ７発現系と比較した。細胞を、２２時間の期間にわたり、マイクロ力価の発酵で、フェッドバッチ様の条件で増殖させた。ＧＦＰの発現は、１０時間後に０．５mmol/Lの一回のパルスのＩＰＴＧによって誘導された。
【０１７０】
全てのプロモーター／オペレーターの組合せにおいて、細胞は、マイクロ力価の発酵で１２時間の産生期間中に増殖を維持することができた。μ＝０．０５/ｈの平均増殖速度は、Ｔ７及び宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターの直接比較を可能とした。
【０１７１】
プラスミドに基づいた発現系では、ＧＦＰｍｕｔ３．１のオンラインでの蛍光測定の結果は、Ｂ（３ｌａｃＯ−Ｔ５）を除いて、全てのプロモーター／オペレーターの組合せについて、Ｔ７発現系と類似した範囲内であった。（図２Ｂ）。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された。しかしながら、ゲノムに組み込まれた発現系では、それぞれのプロモーター／オペレーターの組合せの極めて明確に異なる差異を観察することができた（図２Ａ）。Ｔ７発現系と比較して、ＧＦＰｍｕｔ３．１の収量は、Ａ１発現系において１．５倍より高かった。ゲノムに組み込まれたＴ７発現系では、ＧＦＰ遺伝子発現の誘導により、１４５の相対蛍光単位、及び約１３５mg/ｇの可溶性ＧＦＰｍｕｔ３．１という比産物濃度（ＹＰ／Ｘ）、及び無視できる量の封入体（ＩＢ）がもたらされた。Ａ１発現系を用いた同じ実験により、ほぼ５０の相対蛍光単位及び３７mg/ｇの封入体を含まない可溶性ＧＦＰｍｕｔ３．１が得られた。
【０１７２】
Ｂ（３ｌａｃＯ−Ｔ５）及びＢ＜３ｌａｃＯ−Ｔ５＞の観察された低下した産生力は、プロモーターの回避、及びそれ故、産生力に対して影響を及ぼす、初期転写配列（ＩＴＳ）における完全に対称なｌａｃ−オペレーター（ｓｙｍ−ｌａｃＯ）（７）から生じる可能性がある（２１）。この作用は、プラスミドに基づいた３ｌａｃＯ−Ｔ５発現系ではあまり見えなくなり、ここでは高いプラスミドコピー数が、低下したプロモーター活性を補っている。しかしながら、プラスミドフリーな発現系では、プロモーター活性は極めて低いので、Ａ１プロモーターについての３つのｌａｃＯ形は却下された。１つ及び２つのｌａｃＯプロモーター／オペレーターの組合せでは、ｓｙｍ−ｌａｃＯを、Ａ１プロモーターの天然初期転写配列（＋１から＋２０）と交換した。これにより、Ｔ５プロモーターの場合には、産生力は２．４倍増加した。しかしながら、ｌａｃＯ結合部位の減少により、基礎発現は必然的に上昇した。
【０１７３】
実施例３：宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現系における基礎発現
困難なタンパク質では、低い基礎発現でさえ、宿主の代謝に有害な影響を及ぼし得る。時々、プラスミドの形質転換又は組込みカートリッジにより毒性がもたらされ、形質転換体を得ることが困難である。それ故、遺伝子調節の堅固さは、発現系の重要な品質の基準である。
【０１７４】
プラスミドに基づいた系では、１つのｌａｃ−オペレーター（１ｌａｃＯ）によって制御されたプロモーターは、約１０の相対蛍光単位のレベルにおいて、特に炭素の制限された条件下で、最も高い基礎発現を示した。第二のｌａｃＯ（２ｌａｃＯ）の添加、又はｌａｃＩＱプロモーターを導入することによるインヒビターＬａｃＩの増加により、Ａ１プロモーターの基礎発現は５０％まで減少した。Ｔ５プロモーターの場合、３つのｌａｃ−オペレーター（３ｌａｃＯ）の組合せのみが、基礎発現をほぼ０の相対蛍光単位へと減少させた。プラスミドに基づいた発現系とは対照的に、全てのゲノムに組み込まれた系では、系の読み漏れに対するプロモーター／オペレーターの組合せの有意な影響を観察することができた。ＬａｃＩ分子の増加、又は第二のｌａｃＯの添加のどちらも、Ａ１発現系の基礎発現を、１４の相対蛍光単位からほぼ有意なバックグラウンド発現がないまでに減少させ、産生力の低下は伴なわなかった（図２Ａ）。どちらのプロモーターも、同一の位置にｌａｃ−オペレーターを含有しているが、増加したレベルのＬａｃＩ分子又は３つのｌａｃ−オペレーターのみが、Ｔ５発現系の基礎発現を十分に減少させた。Ｔ７Ａ１プロモーターは、Ｔ５Ｎ２５の僅か半分の効率でしかＲＮＡポリメラーゼによって認識されず（２０）、１つのｌａｃ−オペレーターは−１０から−３５のプロモーターエレメントのプロモーター配列内に位置するので、宿主のＲＮＡポリメラーゼ及びｌａｃ−リプレッサーは、互いに、それらのそれぞれの結合部位について競合し、これにより、どれぐらい効率的にプロモーター活性がリプレッサーによって制御されるかが決定される。
【０１７５】
実施例４：組換え遺伝子発現速度の制御
タンパク質の産生の微細な調整すなわち「調整能」とも呼ばれる、転写速度制御は、バイオプロセシングに非常に関連している。最適なバイオプロセスは、最長期間中に細胞の合成能を最大限に活用して、適切に折り畳まれプロセシングされたタンパク質が得られるように設計されている。所望の産物の物理的特性及び代謝必要条件に応じて、転写速度を、ＲＮＡの安定性、翻訳効率、折り畳み、輸送、系内における全ての他の相互作用に応じて適応させなければならない。
【０１７６】
本明細書に記載のプロモーター／オペレーターの組合せの調整力を評価するために、様々なＩＰＴＧレベルにおける一連のフェッドバッチ様マイクロタイター培養液を試験し、プラスミドフリーなＴ７発現系と比較した。誘導は、１回のパルスの０．００５、０．０１、及び０．５mMのＩＰＴＧを使用して実施された。オンラインな蛍光測定及び終点フローサイトメトリー分析を使用して、様々なプロモーター／オペレーターの組合せを特徴付けた。
【０１７７】
遺伝子調節のために１つのｌａｃＯによって制御される、発現系は、最も高い基礎発現を示しただけでなく、所与の誘導物質濃度において、ＧＦＰｍｕｔ３．１発現の最も顕著ではない目盛りのＧＦＰｍｕｔ３．１を示した（図３Ｃ、Ｆ）。２つのｌａｃＯを有するプロモーターは、十分に低い基礎発現を示したが、それらはより低い誘導物質濃度において、有意により低く産生した（図３Ｂ、Ｅ）。プロモーター／オペレーターの組合せである３ｌａｃＯ−Ｔ５及び２ｌａｃＯ−Ａ１により、誘導物質の濃度とは関係なく、一定時間後に、組換えＧＦＰの産生は完全に停止した（図３Ａ、Ｅ）。この挙動は、たった１つのｌａｃＯを有するプロモーター／オペレーターの組合せにおいては観察されなかった。１つのｌａｃＯによって制御されるプロモーター、ｌａｃＩＱ（図３Ｄ、Ｇ）、及びＴ７発現系（図３Ｈ）は、系の読み漏れの少なさ及び調整力という所望の特性を併せ持つ。
【０１７８】
しかしながら、Ｔ７発現系は、「全か無」の行動を示すことが知られ、ここでの部分的に誘導された培養液中の低減された発現レベルは、（２２）に概説されているように、完全に誘導された細胞及び誘導されていない細胞の亜集団の形成の結果である。疑問に答えるために、宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現系における単一細胞の調整力が可能である場合、全てのプロモーター／オペレーターの組合せのフローサイトメトリー分析を実施した。図４に示されているように、ゲノムに組み込まれたＴ７発現系は、部分的に誘導された培養液中で同種な集団を全く示さない。事実、完全に誘導された細胞、部分的に誘導された細胞、及び誘導されていない細胞の混合物が、非常に低い誘導物質濃度において特に見られた。Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞発現系では、フローサイトメトリー分析により、産生している細胞及び産生していない細胞の２つの明確に異なる亜集団が判明した（図４）。なぜなら、これらの発現系はそれらの産生力を停止したが、依然として増殖し続けたからである。この挙動はまた、Ｂ＜３ｌａｃＯ−Ｔ５＞においても観察された。これは、ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞では異なり、ここでＧＦＰの誘導により、任意の所与のＩＰＴＧ濃度において同種な集団が得られた（図４）。
【０１７９】
これらの知見に基づき、部分的に誘導された場合の、全ての他の発現系の産生力の完全な停止は、ｌａｃインヒビターの自己調節に関連しているようである。ｌａｃ−オペロンは、３つのｌａｃＯ結合部位によって調節される（図５Ａ）。ＬａｃＩ分子は、ｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３、又はｌａｃＯ１及びｌａｃＯ２のいずれかに結合する。ＬａｃＯ３は、ｌａｃＩ遺伝子の３'末端と重複する。ｌａｃＯ１及びｌａｃＯ３に対するＬａｃＩの結合は、ＤＮＡのループ形成を引き起こし、その結果、切断短縮されたｌａｃＩ ｍＲＮＡ分子が得られ、これは細胞によって消化される。これにより、完全に誘導された細胞では約４０個の分子、誘導されていない細胞では約１５個の分子という一定のレベルが得られる。
【０１８０】
関心対象遺伝子（ＧＯＩ）におけるｌａｃＯに対するＬａｃＩの結合定数（Ｋａ）が、ｌａｃ−オペロンにおけるｌａｃＯに対する結合定数よりも高い場合、ＩＰＴＧによって不活化されない、第一のＬａｃＩ分子は、ｌａｃ−オペロン上のｌａｃＯ３／ｌａｃＯ１ではなく、関心対象遺伝子のｌａｃＯ結合部位に優先的に結合するだろう。したがって、ＬａｃＩの自己調節は介入せず、より多くのＬａｃＩ分子が産生される（図５Ｂ）。系全体が過剰調節されるようになり、その結果として産生が完全に停止する。
【０１８１】
この仮説を支持するために、Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞細胞及びＢＬ２１野生型（ＢＬ２１−ｗｔ）細胞のＬａｃＩレベルに対する自己調節の効果を比較した。誘導されていない細胞、部分的に誘導された細胞、及び完全に誘導された細胞のＬａｃＩ含量は、ウェスタンブロット分析を使用して推定された。バンド強度を定量し、細胞数を用いて標準化した（図７）。
【０１８２】
完全に誘導されたＢＬ２１野生型細胞では、ＬａｃＩ分子の量は、誘導されていないＢＬ２１野生型細胞と比較して３．５倍であった。０．０１mMのＩＰＴＧを用いた部分的な誘導により、僅か０．３倍増加した。完全に誘導されたＢＬ２１−ｗｔ細胞における３．５の変化倍率は、誘導物質の非存在下において細胞１個あたり平均１５個のＬａｃＩ分子、及び完全に誘導された細胞において約４０個の分子を測定した、Semsey et al.の結果に従う（１１）。Ｂ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞では、誘導されていない細胞及び部分的に誘導された細胞のＬａｃＩ量は、ＢＬ２１野生型と比較して明らかに高かった。ＬａｃＩの収量は、ＢＬ２１−ｗｔと比較して、誘導物質の非存在下において２．３倍であり、部分的に誘導された細胞では２．７倍であった。完全に誘導された細胞では、ＬａｃＩの収量は４．０倍であり、これは完全に誘導された野生型ＢＬ２１に相当する。
【０１８３】
０．０１mMのＩＰＴＧの添加により、ほぼ最大半量のＧＦＰｍｕｔ３．１の発現がもたらされるが（図３）、それはＬａｃＩレベルに対して殆ど全く影響を及ぼさない。明らかに、ＬａｃＩは依然として、ｌａｃオペロンのｌａｃＯ１／ｌａｃＯ３に結合することができ、よってこれらの条件下でその自己調節を維持することができる。それに加えて、ｌａｃＩ遺伝子は、弱いプロモーターから転写され、その結果、強力なＴ７Ａ１プロモーターとは異なり、細胞１世代あたり約１個の新規なｍＲＮＡが生じる（３８）。しかし、誘導されていない及び部分的に誘導されたＢ＜２ｌａｃＯ−Ａ１＞細胞の高いＬａｃＩレベルは明らかに、（図）に示されているようなゲノムに組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ産生株における発現速度制御に対する、ＬａｃＩの自己調節の影響についての本発明者らの仮説を支持する。
【０１８４】
ＬａｃＩの自己調節の効果は、２つ又は３つのｌａｃオペレーターによって制御される、ゲノムに組み込まれた宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現系においてのみ観察された。しかしながら、この効果は、プラスミドに基づいた宿主ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現系において、又は慣用的なＴ７発現系においては観察されなかった。この理由は、ＬａｃＩ濃度に対するｌａｃオペレーターの平衡に認めることができる。Ｔ７発現系は、そのＤＥ３溶原菌内にさらに他のｌａｃＩ遺伝子配列を有し、よって、理論的には細胞１個あたりのＬａｃＩの濃度は倍加する。この研究に使用されるプラスミドに基づいた発現系は、さらに他のｌａｃＩ遺伝子配列をコードするｐＥＴ発現系に基づく。それにより次に、プラスミドコピー数に応じて、さらなる１５〜２０個のｌａｃＩ遺伝子配列が生じる。しかしながら、部分的に誘導された細胞に対するＬａｃＩ自己調節の効果はまた、Fujifilm Diosynth Biotechnologies社（ＮＣ州／米国）のＥ．ｃｏｌｉ ｐＡＶＥｗａｙ（商標）発現系の場合に見られるような、プラスミドに基づいた発現系にも観察することができる。このプラスミドに基づいた発現系では、転写制御は、２つの完全に対称なｌａｃオペレーターによって可能となり、１つはＴ７Ａ３プロモーターの上流に１つは下流に位置する。ＤＮＡループ形成能と組み合わせた、対称なｌａｃオペレーターに対するＬａｃＩの高い親和性により、非常に低い基礎発現がもたらされるが、部分的に誘導された培養液中の産生力の完全な停止も示す。
【０１８５】
ｌａｃインヒビターの自己調節を考えると、高い発現速度、無視できる基礎発現、及び低い誘導物質の濃度でさえも、産生力の完全な停止を伴うことのない、発現速度の真の制御などの所望の特性を充足する、プロモーター／オペレーターの組合せを、成功裡に同定されることができた。
【０１８６】
結論
Ｅ．ｃｏｌｉにおける転写調節は、かなり注目されている。なぜなら、それは組換えタンパク質産生のプロセスにおける第一工程であるからである。転写制御は、細胞がその資源を、組換えタンパク質の産生へと割り当てることを可能とし、堅固で調整可能な制御は、成功裡なバイオプロセスにとって不可欠である。本明細書において、プラスミドフリーな発現系では、ｌａｃ−オペロンの調節エレメントは、宿主のＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーターを制御するために良好にバランスがとれていなければならないことが証明される。３つのｌａｃ−オペレーターは、無視できる量まで基礎発現を低下させるが、組換え産生速度も低下させる。初期転写配列（ＩＴＳ）中の完全に対称なｌａｃＯは、プロモーターによるＲＮＡポリメラーゼの回避を妨害する。Hsu et al.によって示されているように、Ｔ７Ａ１の野生型初期転写配列は、プリンの強化及び最善のプロモーター回避特性の１つを示す（２１）。
【０１８７】
たった１つのｌａｃＯを含有しているプロモーターは、かなりより高いプロモーター強度を示すが、より高い系の読み漏れも示す。２つのｌａｃＯを含有しているプロモーター／オペレーターの組合せでは、関心対象遺伝子の部位に６２ｂｐの距離にある２つのｌａｃＯ１は、リプレッサー分子に対する非常に強力な結合親和性を示し、よってｌａｃＩの自己調節は妨げられ、その結果、部分的に誘導された細胞において産生力は完全に停止する。しかしながら、結合親和性は、ｌａｃＯ３若しくはｌａｃＯ２のような、より対称度が低いｌａｃＯの使用によって、又はそれらの間の距離を変化させることによって、低下させることができる（実施例５参照）。
【０１８８】
本明細書に実証されているように、ｌａｃＩＱプロモーターによって引き起こされた細胞内ＬａｃＩの上昇したレベルと、１つのｌａｃＯの組合せにより、高い発現速度、低い基礎発現、及び細胞レベルでの真の調整力がもたらされる。したがって、この新規発現系は、困難なタンパク質の産生に特に適している。なぜなら、プラスミドにより媒介される代謝負荷は全くなく、宿主のＲＮＡポリメラーゼの使用によって遺伝子安定性は増加するからである。
【０１８９】
重要なことには、本明細書に記載の誘導系は、有意に改善された発現速度、低下した基礎発現、及びＴ７発現系と比較して真の調整力を示す（例えば図３及び４参照）。本明細書に記載の誘導発現系は、高い発現速度、無視できる基礎発現、及び低い誘導物質の濃度でさえも、無段階に調節可能である発現速度の真の制御などの、効率的な発現系に必要とされる、全ての所望の特性を満たす。
【０１９０】
実施例５：２つのｌａｃＯを含む誘導発現系における、組換え遺伝子発現速度の制御
株：ＢＬ２１：：ＴＮ７＜２ｌａｃＯ．ｘｘＡ１−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞及びＢＬ２１：：ＴＮ７＜２ｌａｃＯ．ｘｘＴ５−ＧＦＰｍｕｔ３．１−ｔＺ＞、簡略化するとＢ＜２ｌａｃＯ．ｘｘ−Ａ１＞及びＢ＜２ｌａｃＯ．ｘｘ−Ｔ５＞。
【０１９１】
第一のｌａｃＯ１までの距離が６２ｂｐよりも大きい第二のｌａｃＯ２配列の付加のために、オーバーハングＰＣＲを、鋳型ｐＥＴｋ１ｌａｃＯＡ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１又はｐＥＴｋ１ｌａｃＯＴ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１をそれぞれ使用して実施する。２つのｌａｃＯ１オペレーターは、９２、１０３、１１４又は１２５ｂｐ離れている。以下のプライマー２ｌａｃＯ．９２−ｆｏｒ、２ｌａｃＯ．１０３−ｆｏｒ、２ｌａｃＯ．１１４−ｆｏｒ、及び２ｌａｃＯ．１２５−ｆｏｒは、ｌａｃオペレーター及び制限酵素部位ＳｐｈＩ（５'）を含有し、逆プライマー（２ｌａｃＯ−ｒｅｖ）は、制限酵素部位ＮｄｅＩ（３'）を含有している。新規プラスミドは、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．９２Ａ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１０３Ａ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１１４Ａ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１２５Ａ１ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１及びｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．９２Ｔ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１０３Ｔ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１１４Ｔ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１、ｐＥＴｋ２ｌａｃＯ．１２５Ｔ５ｔＺ．ｃ−ＧＦＰｍｕｔ３．１と命名される。
【０１９２】
細菌染色体への組込みは、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ニューイングランドバイオラボ社、ＭＡ州/米国）のａｔｔＴＮ７部位で起こる。
【０１９３】
鎖状ＤＮＡカートリッジの増幅及びスクリーニングは、上記されている通りに実施される。
【０１９４】
実施例６：フェッドバッチ培養におけるＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞を使用したＦａｂ産生
Ｔ７に基づいた発現系は、単一コピーからでさえも、高い発現率に十分な特有の強度を示す。宿主のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーターの制御下にある単一コピーの関心対象遺伝子を用いた系では、有意に低下した発現速度が予想される。結果として、このような系は、組換えタンパク質が高いレベルで産生されなければならない場合には競争力はないであろう。最終産物の収量が明確にプロモーター系の強度によって決まるのではなく、現在同定されていない理由によって決まる場合の抗体断片及び他の困難なタンパク質については状況が異なる。これらの側面を調べるために、ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞発現系が、リーダー／Ｆａｂの組合せであるｄｓｂＡ／ＦＴＮ２（ｄＦＴＮ２）の産生のために選択され、同じリーダー／Ｆａｂの組合せを産生するＢ３＜Ｔ７＞と比較した。細胞を、０．１/ｈの一定増殖速度の規定培地のフィードでフェッドバッチモードで増殖した。実験において産生される予定の細胞乾燥重量の量は、４０ｇの細胞乾燥重量と予め規定されている。組換え遺伝子発現は、フィード開始から０．５倍加時に、１回パルスの１０μmol/gの細胞乾燥重量のＩＰＴＧによって誘導された。
【０１９５】
図８及び図９の結果は、発酵上清中で測定された細胞外Ｆａｂと細胞内Ｆａｂの合計である、細胞乾燥重量あたりの組換え体Ｆａｂの合計の比含量（mg/ｇ）で示される。Ｔ７に基づいた系（図８）では、ｄＦＴＮ２発現の誘導により、誘導から１１時間後に１．８mg/ｇの最大細胞内Ｆａｂ濃度が生じ、発酵終了時には０．７mg/ｇまで下降した（図８、白抜きの菱形）。この期間において、細胞外Ｆａｂは、ほぼ０mg/ｇから２．２mg/ｇまで増加した（図８、白抜きの三角）。これにより、誘導から１５時間後に３．５mg/ｇの最大全Ｆａｂ濃度が生じ、これは、発酵終了時には２．１mg/ｇまで下降した（図８、黒色のドット）。発酵上清中の細胞外Ｆａｂの増加は、細胞溶解に起因し得、これは、発酵上清中のＤＮＡ含量を測定することによって確認することができた。
【０１９６】
ＢＱ＜１ｌａｃＯ−Ａ１＞発現系を用いた同じ実験により、有意に改善された結果が得られた（図９）。細胞内Ｆａｂの含量は、全発酵中において２．５mg/ｇに維持することができた（図９、白抜きの菱形）。細胞外Ｆａｂ含量は、発酵終了時には２．４mg/ｇまで増加した（図９、白抜きの三角）。これにより、発酵終了時に４．７mg/ｇの最大全Ｆａｂ濃度が生じる（図９、黒色のドット）。１ｌａｃＯ−Ａ１の相対的なプロモーター強度は、Ｔ７と比較して約３０％であるが、この発現系は、フィード開始から１５時間まで強力なＴ７発現系と同じ量の総Ｆａｂを生じ、発酵終了時にはＴ７系を２桁超えた。これらの結果は明らかに、低下したプロモーター強度が、困難なタンパク質の産生にとって有益であり得ることを示す。なぜなら、それは、細胞の代謝負荷及びストレスにより誘発されるタンパク質分解を減少させるからである。
【０１９７】
参考文献
【表４】
2022500036.tif 000005
2022500036.tif 000006
2022500036.tif 000007
【図１】
2022500036.tif 000008
【図２】
2022500036.tif 000009
【図３】
2022500036.tif 000010
【図４】
2022500036.tif 000011
【図５】
2022500036.tif 000012
【図６−１】
2022500036.tif 000013
【図６−２】
2022500036.tif 000014
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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