【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月21日(2010.9.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】    明細書
【発明の名称】  自己由来トロンビン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、
患者から得た血液製剤から血漿を分離するステップと、
血漿にエタノールを添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
溶液中のプロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを濾別して、粒状物を除去するステップと、からなり、
前記エタノールが前記溶液中に単位体積当たり体積率で８％から２０％の濃度で存在する、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項２】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
変換するステップがカルシウムイオン源を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
血漿を得るために血液製剤を遠心分離することを含む、請求項３の方法。
【請求項５】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水、ＣａＣｌ２溶液、および無菌水からなるグループのいずれかによってトロンビンを希釈することを含む、請求項２の方法。
【請求項６】
重量、大きさ、及び蛋白質結合によって血漿を濾別することを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項８】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項９】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項１０】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
単一の人物から採取された血漿からエタノールを加えることでプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を除去するステップと、からなり、
前記エタノールが単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、トロンビンを生成する方法。
【請求項１２】
トロンビンを希釈して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
カルシウムイオン源を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＣａＣｌ２を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
食塩水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項１２の方法。
【請求項１６】
無菌水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項１２の方法。
【請求項１７】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
単一の人物から採取した全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、からなり、
前記エタノールが前記溶液中に単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、トロンビンを生成する方法。
【請求項１８】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を２秒ないし５秒の間の時間に変化させるステップを含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項１８の方法。
【請求項２２】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項１８の方法。
【請求項２３】
トロンビンを１５分ないし３６０分の間の時間にわたって安定させるようにすることを含む、請求項１７の方法。
【請求項２４】
カルシウムイオン源を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
ＣａＣｌ２を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
食塩水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】
無菌水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項２３の方法。
【請求項２８】
患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
患者から得た血液製剤から血漿を分離するステップと、
血漿にエタノールを添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
溶液中のプロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを濾別して、粒状物を除去するステップと、からなり、
前記エタノールが前記溶液中に単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項２９】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
単一の人物から採取された血漿からエタノールを加えることでプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を除去するステップと、からなり、
前記エタノールが単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、トロンビンを生成する方法。
【請求項３０】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
単一の人物から採取した全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、からなり、
前記エタノールが前記溶液中に単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、トロンビンを生成する方法。
【請求項３１】
エタノールは、単位体積当たりの体積率で１８．９％の濃度で存在する、請求項３０の方法。
【請求項３２】
トロンビンを生成するに要する時間は、３０分ないし７５分の間である、請求項３０の方法。
【請求項３３】
変換するステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項３０の方法。
【請求項３４】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を２秒ないし５秒の間の時間に変化させるステップをさらにを含む、請求項３０の方法。
【請求項３５】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項３４の方法。
【請求項３８】
トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項３４の方法。
【請求項３９】
トロンビンを１５分ないし３６０分の間の時間にわたって安定させるようにすることを含む、請求項３０の方法。
【請求項４０】
トロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
人物から採取した全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなり、
前記エタノールが前記溶液中に単位体積当たりの体積率で８％から２０％の濃度で存在する、トロンビンを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
以下の発明は一般的に、所与の単位の血漿から高い比活性を有するトロンビン酵素を調製することに関する。このトロンビン酵素は十分に安定であって、室温またはそれ以下に保たれるときは、フィブリノゲンに富む凝固接着性蛋白質溶液を急速に凝固させる能力を６時間超にわたって保つ。
（背景技術）
フィブリン密封剤の処方は、凝固カスケード反応の最後のステップを模倣したものである。この反応においてトロンビン酵素はフィブリノゲンを開裂し、開裂したフィブリノゲンは架橋して半固体または可撓性のフィブリン凝塊となる。このフィブリン凝塊は創傷部に接着して、液の浸出に対する障壁を形成するとともに組織間の接着をもたらし、かくして処置部に止血および治癒能力を提供する。
今日市販されている、出願者のクリオシールＴＭシステムは、提供者の血漿から約１時間で、フィブリノゲンおよび第八因子を含む、寒冷沈降され、濃縮された凝固接着性蛋白質を採取する装置である。血液銀行で常用されている、１日ないし２日を要する寒冷沈降工程に較べれば、クリオシールＴＭシステムが提供する約１時間の寒冷沈降採取が意味するところは大きい。すなわちクリオシールＴＭシステムによる凝固接着性蛋白質の採取を、手術周辺環境で患者をそばにして行うことができ、したがって何日も前から工程を開始する必要を避けることができる。
このようなクリオシールＴＭ採取された凝固接着性蛋白質は、ウシまたはヒト・トロンビンと組み合わされて、外科手術の止血および組織接着に有用な生物的接着剤を形成する。しかしながら市販のトロンビンは一般にウシまたはヒトのプールされた血漿から由来しているので、患者は依然として望ましくない免疫反応や、血液中の感染性ウイルスおよび可能性としてはクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）すなわち新変異型ＣＪＤ（ＮＶＣＪＤ）による汚染の危険にさらされている。クリオシールＴＭ寒冷沈降の発明の一つの利点は、採取された凝固接着性蛋白質が患者自身の血液に由来しているので、このような凝固接着性蛋白質を患者の外科的創傷部に局所的に適用するときに、血液感染性の病気による汚染の危険が避けられるということにある。
しかしながら、外科手術患者の最も安全な条件は、凝固接着性蛋白質を採取したのと同じ提供者からトロンビン成分を採取して、二成分生物的密封剤を調製すること−すなわち完全に自己由来の生物的密封剤ないし接着剤を形成することによってもたらされる、ということは以前から理解されていた。
患者に由来するトロンビンおよび／またはフィブリノゲンを当該の患者に行われる医学的処置に利用するという発想は新規なものではなく、１９７４年にアンドリャノヴァが最初に記述している。約２０年後、セデルホルム−ウィリアムスのＰＣＴ特許（ＷＯ９４／００５６６、１９９４年１月６日）が改良されたフィブリン接着剤を記載しており、ここではトロンビン成分は遠心分離、中間的沈殿物の分離、血液のイオン強度および血漿のＰＨの調整等を含む１３のステップを要して得られ、これも同じ提供者の血漿に由来するフィブリノゲン成分と組み合わされる。しかしながらこのような多くの調製ステップは非常に時間を要するので、処理時間が１時間以内でなければならない手術周辺環境での用途には実用的ではない。
３年後、１９７７年にヒルシュ等（米国特許第５，６４３，１９２号）が、上記セデルホルム−ウィリアムスに続いて、フィブリノゲンおよびトロンビン成分が同一提供者の血漿から由来する、他のフィブリン接着剤調製法を教示した。ヒルシュ特許は血漿中のフィブリノゲンの大部分を最初に沈殿除去して上澄みを調製し、次いでこの上澄み中の残部のフィブリノゲンを凝固させるトロンビン調製法を記載している。この方法はセデルホルム−ウィリアムスが教示する方法とは異なってより単純であるが、商業的に有用なトロンビンは得られない。なぜならば（ヒルシュ等の図１参照）このトロンビンが５秒以下の凝固速度を与えるのはわずか４分間に過ぎず、１０秒未満の凝固速度を与えるのはわずか４７分間に過ぎないからである。
このような凝固速度は外科医の要求には合致しない、なぜならば外科医はヒルシュ等のフィブリン接着剤の限界前後で外科手術全体の計画をたてることは不可能だからである。
外科医はほとんどの場合、止血および組織密封または接着のために速効性（＜５秒）の凝固時間を必要とする。凝固の遅い生物的接着剤（＞５秒）は毛細管出血および出血によって、しばしば機能を果たす前に外科的創傷部から洗い去られてしまう。ヒルシュのフィブリン接着剤を使用する外科医は、ヒルシュ接着剤処置によって行おうとする止血および組織密封が、凝固時間が５秒未満に収まる４分間の枠内に行われるように、外科手術を組むことが要求されるが、これはほとんどの外科手術にとってヒルシュ発明を全く非実用的なものにしている。なぜならば６時間に及ぶこともある外科手術の全経過にわたって、急速な止血と組織接着が要求されることがほとんどだからである。
以下に挙げる先行技術は出願者が知るところの先端技術を反映しており、関係する先行技術を開示すべき出願者の義務を果たすために包含されたものである。しかしながらこれらの参考文献のなかに、以下において詳細に開示し、具体的に請求する本発明の概念を、単独で教示したり、あるいは全ての考えられる組み合わせにおいて明白にしたりするものはない。
米国特許文献
発明者 特許番号 発行日
Pumphrey                           713,017                  1902年11月 4日
Mobley                         1,614,532                   1927年1月18日
Ferry 他                        2,533,004                   1950年12月5日
Wahlin                          2,747,936                   1956年5月29日
Clark                           3,179,107                  1965年4月20日
Cobey                           3,223,083                  1965年12月14日
Kennedy 他                      3,236,457                  1966年2月22日
Meurer 他                       3,269,389                   1966年8月30日
Venes, Jr.                      3,416,737                  1968年12月17日
Horn                            3,467,096                  1969年9月16日
Creighton 他                    3,828,980                  1974年8月13日
Green                          3,942,725                   1976年3月9日
Polnauer（故人）他              3,945,574                  1976年3月23日
Speer                          4,040,420                  1977年8月9日
Reinhardt 他                    4,067,333                  1978年1月10日
Kozam 他                       4,109,653                  1978年8月29日
Sugitachi 他                   4,265,233                   1981年5月5日
Schwartz 他                     4,298,598                   1981年11月3日
Redl 他                        4,359,049                   1982年11月16日
Schwartz 他                     4,362,567                  1982年12月7日
Altshuler                       4,363,319                  1982年12月14日
Schneider                      4,374,830                   1983年2月22日
Schwartz 他                    4,377,572                  1983年3月22日
Schwartz 他                     4,414,976                   1983年11月15日
Stroetmann                     4,427,650                   1984年1月24日
Stroetmann                      4,427,651                  1984年1月24日
Stroetmann                      4,442,655                  1984年4月17日
Zimmerman 他                   4,453,939                  1984年6月12日
Rose 他                        4,627,879                   1986年12月9日
Redl 他                         4,631,055                  1986年12月23日
Sakamoto 他                     4,655,211                  1987年4月7日
Silbering 他                    4,696,812                   1987年9月29日
Alterbaum                       4,714,457                   1987年12月22日
Koizumi 他                     4,734,261                   1988年3月29日
Eibl 他                         4,735,616                   1988年4月5日
Saferstein 他                   4,752,466                   1988年6月21日
Wolf 他                         4,767,416                   1988年8月30日
Skorka 他                       4,826,048                  1989年5月2日
Davis                           4,842,581                   1989年6月27日
Miller 他                       4,874,368                   1989年10月17日
Avoy                           4,902,281                   1990年2月20日
Seelich                        4,909,251                  1990年3月20日
Tanaka 他                      4,923,815                   1990年5月8日
Silbering 他                   4,965,203                  1990年10月23日
Capozzi 他                      4,978,336                   1990年12月18日
Wolf 他                        4,979,942                   1990年12月25日
L’Hermite 他                  4,987,336                   1991年1月22日
La Duka                         5,089,415                  1992年2月18日
Kotitschke 他                  5,099,003                  1992年3月24日
Wolf 他                         5,104,375                  1992年4月14日
Capozzi 他                     5,116,315                  1992年5月26日
Nishimaki 他                   5,130,244                  1992年7月14日
Kraus 他                       5,143,838                  1992年9月1日
Crowley 他                     5,151,355                   1992年9月29日
Knighton                       5,165,938                  1992年11月24日
Galanakis                      5,185,001                   1993年2月9日
Morse 他                       5,219,328                  1993年6月15日
Fischer                         5,290,259                  1994年3月1日
Sierra 他                      5,290,552                   1994年3月1日
Michalski 他                   5,304,372                  1994年4月19日
Fischer                        5,328,462                  1994年7月12日
Lonneman 他                     5,368,563                   1994年11月29日
Linnau                         5,393,666                  1995年2月18日
Epstein                        5,405,607                   1995年4月11日
Marx                           5,411,885                   1995年5月2日
Kikuchi 他                     5,443,959                   1995年8月22日
Miller 他                      5,474,540                  1995年12月12日
Broly 他                       5,474,770                  1995年12月12日
Weis-Fogh 他                   5,480,378                   1996年1月2日
Proba 他                        5,506,127                  1996年4月9日
Cochrum                         5,510,102                   1996年4月23日
Antanavich 他                  5,585,007                  1996年12月17日
Pines 他                       5,605,887                   1997年2月25日
Cochrum                         5,614,204                  1997年3月25日
Marx                           5,631,019                   1997年5月20日
Hirsh 他                        5,643,192                  1997年7月1日
Epstein                         5,648,265                   1997年7月15日
Edwardson 他                    5,750,657                  1998年5月12日
Cederholm-Williams              5,795,571                   1998年8月18日
Cederholm-Williams              5,795,780                  1998年8月18日
Edwardson 他                    5,804,428                   1998年9月8日
外国特許文献
出願者 国 特許番号 発行日
Zdaril                         DE         DE 25,913         1884年2月12日
Szent-Gyorgyi 他              CH         259,254           1949年6月1日
The Trustees of Columbia
University in the City
of New York                 WIPO       WO 86/01814       1986年3月27日
Weis-Fogh                     WIPO       WO 88/02259       1988年4月7日
Board of Reagents,
The University of
Texas System                WIPO       WO 88/03151       1988年5月5日
SU         1,527,261 A1      1989年12月7日
Cryolife, Inc.                 WIPO      WO 91/09641       1991年7月11日
Baxter International, Inc.     EP         0 443 724 A1      1991年8月28日
Warner-Lambert Co.             EP        0 505 604 A1      1992年9月30日
Octapharma AG                 EP        0 534 178 A2      1993年3月31日
Cryolife, Inc.                WIPO       WO 93/19805       1993年10月14日
Cederholm-Williams 他         WIPO       WO 94/00566       1994年1月6日
E. R. Squibb & Sons           EP         0 592 242 A1      1994年4月13日
Plasmaseal Coporation          WIPO       WO 96/17871       1996年6月13日
その他の先行技術（著者、題名、関係ページ、日付、等を含む）
Fenton, J.W.他、"Human Thrombins"、Chemistry & Biology of Thrombin、43-70ページ。
Rosemberg, R.D.他、"Bovine Thrombin: Constant Specific Activity Products From Single Animals"、Fed. Proc.、321ページ、要約  第361番。
Quick, A.J.他、"Production Of Thrombin From Precipitate Obtained By Acidification Of Diluted Plasma"、114-118ページ。
Eagle. H.、"Studies On Blood Coagulation"、531-545ページ、1934年。
Mann, K.G.他、"The Molecular Weights Of Bovine Thrombin And Its Primary Auto-lysis Products"、6555-6557ページ、1969年。
Mann, K.G.他、"Multiple Acrtive Forms Of Thrombin"、5994-6001ページ、1971年。
Martin. M.他、"Thrombolysis In Patients With Chronic Arterial Occlusions"、Throm-bolytic Therapy、第 47巻、235-241ページ、1971年。
Fenton, J.W.他、"Large-Scale Preparation And Preliminary Characterization Of Human Thrombin"、Biochimica et Biophysica Acta. 第229卷、26-32ページ、1971年。
Andrianova 他、"An Accessible Methoc Of Simultaneous Production Of Fibrinogen And Thrombin From Blood"、648-650ページ、1975年 (Plus English Translation)。
Georgi, M.他、"Occlusion Of The Renal Artery By Intra-Arterial Injection Of Thrombin In A Case Of Inoperable Renal Tumor"、Deutsche Medizinische Wochen-Schrift、第 100(47)巻、2428-2429ページ、1975年(Plus English Translation)。
Lundblad, R.L.他、"Preparation And Partial Characterization Of Two Forms Of Bovine Thrombin"、Biochemical and Biophysical Research Communications、第 66(2)巻、482-489ページ、1975年。
Sakuragawa, N.他、"Purification And Some Characterization Of Human Thrombin"、Acta Medical et Biologica、第 23(1)巻、65-73ページ、1975年。
Fenton, J.W.他、"Human Thrombins: Production, Evaluation, And Properties Of α-Thrombin"、The Journal of Biologocal Chemistry、第 252(11)巻、3587-3598ページ、1977年。
Nordenman, B.他、"Purification Of Thrombin By Affinity Chromatography On Immobilized Heparin"、Thrombosis Research、第 11巻、799-808ページ、1977年。
Nowotny, R.他、"Mechanical Properties Of Fibrinogen-Adhesive Material"、Bio-materials 1980、第 3巻、677-682ページ、1982年。
Kotelba-Witkowska, B.他、"Cryopreservation Of Platelet Concentrates Using Glycerol-Glucose"、Transfusion、第 22(2)巻、121-124ページ、1982年。
Redl, H.他、"Fibrin Sealant-Antibiotic Mixture - Stability And Elution Behavior"、Fibrinkleber Orthop. Traumatol. Orthop. Symp.、第 4巻、178-181ページ、1982年 (Plus English translation)。
Redl, H.他、"In Vitro Properties Of Mixtures Of Fibrin Seal And Antibiotics"、Biomaterials、第 4(1)巻、29-32ページ、1983年。
Gestring, G.他、"Autologous Fibrinogen For Tissue-Adhesion, Hemostasis And Embolization"、Vascular Surgery、第 17巻、294-304ページ、1983年。
Wolf, G.、"The Concentrated Autologous Tissue Glue"、Archives of Oto-Rhino-Laryngology、第 237巻、279-283ページ、1983年。
Tsvetkov, T.S.他、"A Method For Preparation Of Dry Thrombin For Topical Application"、Cryobiology、第 21(6)巻、661-663ページ、1984年。
Yu, X.J.他、"Affinity Chromatography Of Thrombin On Modified Plystyrene Resins"、Journal of Chromatography、第 376巻、429-435ページ、1986年。
Fischer, A.M.他、"Thrombin Purification By One-Step Preparative Affinity Chromatography On Modified Polystyrenes"、Journal of Chromatography、第 363(1)巻、95-100ページ、1986年。
Harpel, P.C.、"Blood Proteolytic Enzyme Inhibitors: Their Role In Modulating Blood Coagulation And Fibrinolytic Enzyme Pathways"、219-234ページ、1987年。
Fenton, J.w.、"Regulation Of Thrombin Generation And Functions"、Seminars in Thrombosis and Hemostasis、第 14(3)巻、234-240ページ、1988年。
Awano, K.他、"Role Of Seratonin, Histamin, And Thromboxane A2 In Platelet-Induced Contractions Of Coronary Aeteries And Aortae From Rabbits"、Journal of Cardiovascular Pharmacology、第 13(5)巻、781-792ページ、1989年。
Mulvihill, J.他、"Thrombin Stimulated Platelet Accumulation On Protein Coated Glass Capillaries: Role Of Adhesive Plateletα-Granule Proteins"、Thromosis and Hemostasis、第 62(3)巻、989-995ページ、1989年。
Suzuki, S.他、"A Study On The Properties Of Commercial Thrombin Preparations"、Thrombosis Research、第 53(3)巻、271-277ページ、1989年。
Ronfard, V.他、"Use Of Human Keratinocytes Cultured On Fibrin Glue In The Treatment Of Burn Wounds"、Burns、第 17(3)巻、181-184ページ、1991年。
Brennan, M.、"Fibrin Glue"、Blood Reviews、第 5巻、240-244ページ、1991年。
DePalma, L.他、"The Preparation Of Fibrinogen Concentrate For Use As Fibrin Glue By Four Different Methods"、Transfusion、第33(9)巻、717-720ページ、1933年。
McCarthy, P. "Fibrin Glue In Cardiothoratic Surgery"、Transfusion Medicine Reviews、第 7(3)巻、173-179ページ、1993年。
Cederholm-Williams, S.、"Benefits Of Adjuvant Fibrin Glue In Skin Grafting"、The Medical Journal of Australia、第 161(9)巻、575ページ、1994年。
Cederholm-Williams, S.、"Autologous Fibrin Sealants Are Not Yet Available"、The Lancet、第 344巻、336ページ、1994年。
Wiegand, D.A.他、"Assessment Of Cryoprecipitate-Thrombin Solution for Dural Repair"、Head & Neck、569-573ページ、1994年。
上に列挙したその他の先行技術は、そのすべてについて具体的に論評しないが、出願者の知るところの先行技術を網羅したものである。これらの論評されない参考文献は、以下に具体的に特徴を述べる本発明とは、さらに明瞭に異なっている。
（発明の開示）
本発明は、長い手術時間（例えば６時間）にわたって急速な（＜５秒）凝固を提供するような安定なヒト・トロンビンを、提供者の血液から調製するための簡単で実用的で早い方法という、長い間感じられていた必要性に指向されたものであり、またこのヒト・トロンビンを、同じ単位の血液から採取され、濃縮された凝固接着性蛋白質と組み合わせることによって、患者を微生物やＣＪＤまたはＮＶＣＪＤによる汚染にさらすことのない生物的密封剤を形成することに指向されたものである。この分野におけるこれまでの研究（ヒルシュ等）によって提示されたトロンビンは最小限度の安定性しかなかった、すなわちこのトロンビンは４分ないし５分という非常に短い時間の間しか、急速な（つまり５秒未満の）フィブリノゲン凝固を達成できなかった。またそれは非常に多くのステップと経過時間を要するために、手術周辺での調製に適しなかった。これら二つの事情は広範囲の手術に対して全く非実用的であった。
本発明が提供する安定なトロンビン酵素は、６時間に達する経過時間にわたって−すなわち長時間の手術であっても、その間にわたって−凝固接着性蛋白質の急速な、または緩徐な重合を、正確に再現性良く起こさせることができる。さらに、すべて単一の提供者に由来する凝固接着性蛋白質およびトロンビンを用いることによって、市販のフィブリン接着剤を使用することによって生じる様々な病気の危険が排除される。市販のフィブリン接着剤においては、フィブリンは何千人という提供者からプールされた血漿に由来しており、トロンビンは同様なプールされたヒト血漿に由来するか、またはウシ由来のものである。本発明による安定なトロンビンの製造は早くて簡単なので、手術処置の直前またはその過程で調製することが可能になり、得られたトロンビンは最も長時間の手術においても、その間にわたって急速凝固を提供する。本発明によって製造されたトロンビンは食塩水（生理食塩水）、水、または希薄ＣａＣｌ２溶液（例えば１２５ｍＭのＣａＣｌ２）に希釈可能であり、希釈によって正確な、より遅い凝固時間を提供する。このようにして、５秒未満から２分間超にわたる任意の凝固時間が得られる。
本発明の方法は好ましくは三つのステップからなり、そのはじめの二つのステップは好ましくは同時に行われる。
１．エタノールを用いてプロトロンビンの濃度を実質的に高めることによって、プロトロンビンが濃縮されたフラクション（分画）を調製し、同時に血漿中に自然に存在するフィブリノゲンやアンチトロンビンIIIなどの成分を除去または変性する。これらの成分はプロトロンビンに結合し、封鎖し、または介在して、プロトロンビンが活性化して長寿命の機能性トロンビンになるのを阻害する。
２．濃縮されたプロトロンビン溶液にカルシウムイオンを加えて軽く撹拌し、プロトロンビンを安定な長寿命トロンビンに変換する。
３．トロンビン溶液をフィルターを通して押し出して、粒状物（粒状物質）を除去する。この粒状物はトロンビンを創傷部上に狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すのを妨げる。
（産業上の利用可能性）
本発明の産業上の利用可能性は、以下に述べる本発明の目的の説明により明らかとなる。
すなわち、本発明の第１の目的は、提供者の血漿から速効性かつ安定な自己由来トロンビンを得るための、新式かつ新規な装置および方法を提供することである。
本発明の他の目的は、関連するほとんどの外科処置よりも可使用時間の長い、上記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、食塩水希釈によって凝固時間を任意にかつ予知可能に延長できるような、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、単純な調製工程を有する、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、短くて３０分、長くても７５分の工程時間を有する、前記特徴のトロンビンの製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すことのできるトロンビンを提供することである。
第１の利点から見れば本発明の目的は、エタノール分別によってプロトロンビン濃度を増加させて実質的に濃縮すると同時に、不純物としての蛋白質を除去したプロトロンビンのフラクションから、安定なヒト・トロンビンを製造するための、新規かつ実用的な方法を提供することである。濃縮されたプロトロンビンに塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加することによって、プロトロンビンはトロンビンに変換される。同じ単一の提供者の血漿から、他の方法によって凝固接着性蛋白質が同時に得られ、自己由来の生物的接着剤に必要な第２の成分となる。
第２の利点から見れば本発明の目的は、患者から自己由来のトロンビンを生成する方法を提供することであり、該方法は患者から血液製剤を得るステップ、得られた血液製剤から血漿を分離するステップ、血漿フラクション中のプロトロンビンを濃縮するステップ、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、およびトロンビンから粒状物を濾別するステップ、の各ステップを含む。
第３の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって安定な自己由来トロンビンを製造するための方法を提供することであり、該方法は血漿からプロトロンビンを分離するステップ、およびプロトロンビンをトロンビンに変換するステップを含む。
第４の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって５秒未満の急速な凝固を提供する自己由来トロンビンを提供することである。
第５の利点から見れば本発明の目的は、必須的に血漿、エタノール（ＥＴＯＨ）、ＣａＣｌ２からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物を提供することである。
第６の利点から見れば本発明の目的は、トロンビンの調製方法を提供することであり、該方法は：血漿を採取すること、血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２を添加して組成物を形成すること、組成物を撹拌すること、組成物を静置モードまたは振動モードで定温放置ないし保温（incubate）すること、組成物から粒状物を濾別し、トロンビンをフィルター通過させること、からなる。
第７の利点から見れば本発明の目的は、血漿からトロンビンを製造するための装置を提供することであり、該装置はＣａＣｌ２およびＥＴＯＨの溶液を入れた反応容器と、血漿を反応容器中に導入する手段と、反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるためのトロンビン受入注射器と、反応容器とトロンビン受入注射器の中間に位置するフィルターと、からなる。
第８の利点から見れば本発明の目的は、自己由来の生物的接着剤を処理する装置を提供することであり、該装置はトロンビン処理手段と、トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、血漿をその後にトロンビンと凝固接着性蛋白質にそれぞれ変換するために、操作可能のカップリングから血漿を受け入れる手段と、を組み合わせてなる。
本発明は、十分に安定であって最大６時間にわたって５秒未満の凝固を提供するようなトロンビンを製造するための方法及び装置を提供する。これはすべての先行技術に示されるものよりはるかに安定である。また凝固時間は食塩水希釈によって任意に調節できる。
さらにまた本発明は効率的な調製方法を提供する。クリオシールＴＭ発明による凝固接着性蛋白質の改良された寒冷沈降の所要時間は１時間未満である。これと同じ時間枠内に、自己由来ヒト・トロンビン成分を、最小限度の原料および処理で同一の血漿源から製造することができる。生物的接着剤の両方の成分は外科手術の状況において容易に組み合わされて、提供者と同一人である患者に適用され、かくして生じた凝塊は創傷部における止血と組織接着を提供する。
これに加えて本発明は生物的接着剤の両成分の無菌的製造方法を提供する。ここに記述する改良された無菌的製造方法は、本質的に非自己由来微生物による汚染のない最終製剤を提供する。
これらの、およびその他の目的は、添付の図面を参照しつつ、以下の詳細な明細書に明らかにされるであろう。
（発明を実施するための形態）
図面を参照すれば、全体的に類似の要素は類似の部品を示しているが、参照符号１０は図１Ａおよび図１Ｂに示される本発明の処理セットを表している。
基本的には、処理セット１０は液受入系統２０を含み、該系統はトロンビン処理ユニット４０と凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の、両方に連通している。
より具体的には、図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、液受入系統２０はチューブ４に連通する入口２を含み、該入口を通して血漿が処理ユニット４０，６０に入る。チューブ４にはストップバルブ６用の場所が２ヶ所あり、前記ストップバルブはチューブ４を閉止して液の流通を防ぐ。チューブ４はＴ字部品８を介して連通しており、血漿を二つの枝管に分けている。すなわちトロンビン処理ユニット４０に通じる第１の枝管１２および凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に通じる第２の枝管１４である。第１の枝管１２はまたストップバルブ６を含んでいる。
図１Ｂを参照すると、第１の枝管１２を通して血漿をトロンビン処理ユニット４０に導入する前に、あらかじめ液を入れた注射器９５からの試薬が、プランジャー９４をＡ’の方向に押すことによって、無菌バリアフィルター９２を通して液受入系統２０に注入される。試薬はワンウェイバルブ９１、カップリング１８及びバルブ９１をつけたＹ字コネクタ９０、および枝管チューブ９３を通って最終的にケーシング２２の内部に入る。図３Ｂ及び図７Ｂを参照すれば、バルブ２４は当初、試薬を反応容器２６の方へ向けている。
入口２に導入される血液製剤は血漿であることが好ましいから、全血はまず濾別、遠心分離またはその他の沈降手段で重い赤血球を血液製剤から除去して、残った血漿を図１の装置に用いる。このシステムはどのような大きさのバッチに対しても対応する大きさにできるが、濃縮トロンビンの最終体積が凝固接着性蛋白質処理ユニット６０からの寒冷沈降された凝固接着性蛋白質の通常の収率に見合うようにするために、トロンビン処理ユニットに必要とされる血漿は通常９−１０ｍｌである。
図１Ａ及び図１Ｂに示される実施例においては、シールされたバッグ１６および７８が、トロンビン投与注射器４２（および導管６４の差し込み部）および寒冷沈降物保存注射器７６の両方を覆っており、このようにして両方の注射器が無菌の外科現場（例えば手術室）に持ち込まれるまで、無菌性が保たれる。その前に、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａから図１０までに図示説明されるように作動する。図１Ｂを参照すると、試薬が添加された後、血漿は第１の枝管１２に入り、カップリング１８を通過し、枝管チューブ９３を通って、ケーシング２２の内部に流入する。
ふたたび図１Ａを参照すると、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａ 、３Ａ 、４Ａ 、５Ａ 、６Ａ 、７Ａ 、８Ａ 、９Ａ 、および図１０に図示説明されるように作動する。前述したように、液は第１の枝管１２に入り（図１Ａ）、カップリング１８を通過してケーシング２２の内部に流入する。カップリング１８は好ましくは摩擦および／または接着剤によって枝管１２に取り付けられているが、なおトロンビン処理ユニット４０は血漿を受け入れた後、図２に示されるように（例えば図２Ａ）処理セット１０から取り外すことができる（例えば枝管１２を単に抜き取り、あるいはむしり取ることによって取り外され、その後おそらくはヒートシールされる）。接着剤が用いられる場合は、手術室で用いられるのと同様な無菌グレードのものが用いられる。
図３Ａを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方に向けている。この反応容器は好ましくはガラス製の内部チューブ２８ａ（図６Ａ）を有しており、該チューブは例えば１５ｍｌの容積（体積）を受け入れることができる。ガラスのチューブ２８ａは好ましくは外側のバレル３２より短く、その中に包み込まれている。前記バレルは好ましくはＰＶＣ製である。ＰＶＣバレル３２の窓３１ａはガラスのチューブ２８ａの内容物を計量し、および／または確認するのに用いられる。計量はガラスのチューブ上の容積（体積）を示す目盛り２９を含んでもよい。反応容器２６のガラスのチューブ２８ａは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめガラスのチューブ２８ａに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ａに示されるように、ガラスチューブの内部は好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図３Ｂを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方へ向けている。この反応容器は好ましくは透明ポリカーボネート製のチューブ２８ｂ（図６Ｂ）を有しており、例えば１５ｍｌの容積を受け入れることができる。ポリカーボネートのチューブ２８ｂ上の目盛り３１ｂは、チューブ２８ｂ中の内容物を計量するのに用いられる。反応容器２６のポリカーボネートのチューブ２８ｂは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめポリカーボネート製のチューブ２８ｂに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ｂに示されるように、ポリカーボネートのチューブ２８ｂの内部は、好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図１Ａおよび図３Ａに示される実施例の、第１と第２の端部キャップ３４を有してなる反応容器２６の詳細が、図６Ａ、７Ａおよび図８Ａに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、絞り部４８内に入れられたスクリーン２３によって、ビーズ２５から遮断されている。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は、一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのガラスのチューブ２８ａ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ａに示されるように、キャップ３４は環状の絞り部４８を有しており、これがＰＶＣバレル３２内部の空腔に摩擦的に、および／または接着剤を用いて係止している。このようにして絞り部４８はガラスのチューブ２８ａの端部に係止してこれと密閉的に係合しており、かくして反応容器の内部をＰＶＣバレル３２から遮断している。
図１Ｂおよび図３Ｂに示される実施例の、主としてポリカーボネートからなる反応容器２６の詳細が、第６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂ図に示されている。この反応容器２６を形成する第１と第２の端部キャップ３４の詳細が図８Ｂに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、内部の障害物を有し、これが液の通過は許すがビーズ２５の通過を防いでいる。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのポリカーボネートのチューブ２８ｂ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ｂに示されるように、キャップ３４は環状の内部後退部４８を有しており、これがポリカーボネートチューブ２８ｂの内部表面に接着剤によって係止している。
好ましくは、反応容器２６または試薬注射器９５にあらかじめ入れておく試薬はエタノールおよび塩化カルシウムである。図１Ａの実施例については、当初バルブ２４，４４はいずれも試薬がこれを通過しないような方向に向いていて、反応容器を密閉している。図１Ｂを参照すると、当初バルブ２４は血漿が反応容器２６に入らないような方向に、またバルブ４４は反応容器２６と吸引プランジャー５８との間の通過を許すような方向に向いている。ふたたび図１Ａを参照すれば、血漿が処理ユニット６０へポンプ送りされた後、バルブ４４はプランジャー５８への連通を許す方向に回され、バルブ２４は通路２１と反応容器２６との連通を許す方向に向けられる。トロンビン処理ユニット４０を図１Ａの平面に関して垂直に保持した状態でスライドクリップ６が開けられ、注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされて反応容器２６中の空気を脱気する。ふたたび図１Ｂを参照すれば、試薬注射器９５が無菌のバリアフィルター９２の解放端に取り付けられる。プランジャー９４が押されて、試薬を無菌のバリアフィルターおよび枝管チューブ９３を通して反応容器２６に移送する。図１Ａの実施例と同様に図１Ｂにおいても、トロンビン処理ユニット４０を図１Ｂの平面に関して垂直に保持した状態で注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされ、反応容器２６中の空気を脱気する。両実施例とも、注射器５６は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。より具体的には、バルブ４４と注射器５６の間のプランジャー４３は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。フィルター６２は無菌的な微生物バリアを提供するので、後でトロンビンを投与注射器４２（図１）に送る際に、プランジャー５８のシール５７まわりからの汚染物が注射器４２に送られることはない。次いで血漿がチューブ４から反応容器２６に入り、空気を置換する。バルブ２４はフィルター６６の方向へ向けられる。試薬と血漿はビーズ２５の助けで軽く撹拌される（そして約４０ないし７０分間だけ定温放置ないし保温（incubate）される）。定温放置ないし保温（incubate）後、トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すために撹拌される。図１Ｂの実施例においては、トロンビン処理ユニット４０は次いで１０分間以上、水平位置にもどして静置される。その後トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すためにふたたび撹拌される。両実施例とも、注射器５６のプランジャーが矢印Ａと反対の方向に動かされてトロンビンを反応容器２６からフィルター６６を通して注射器４２に送る。注射器４２へのトロンビンの送液は注射器４２のプランジャー４３を後退させて、プッシュプルシステムを形成することによって促進される。フィルター６６はトロンビンからゲルを含む粒状物を除去する。
反応容器２６に入れられたトロンビンを撹拌の後１０分間以上静置することによって、後の使用を便にするために粒状物を除去するフィルター６６の効果が促進される。この変換と活性化のための時間によって粒状物がフィルターで十分に除去されるようになり、後でトロンビンをスプレーなどの狭いオリフィスから噴出したり、細いチューブから押し出して用いるのが容易になる。
図９Ａ、９Ｂ，および図１０はフィルター６６の別法を開示している。これは円筒形の外壁６５と端部キャップ３４を含み、各端部キャップは、円筒形のスパウト３７と、それを取り囲む環状の凹部３９を有している。図９Ａに示される別法の実施例は、中心に配置された好ましくはポリウレタンフォーム製の円筒形のフィルター要素６７ａを示している。これに対して図９Ｂに示される中心に配置された円筒形のフィルター要素６７ｂは、好ましくはポリエステルを巻いたものでできている。図９Ｂにはまた好ましくはグラスファイバーまたはポリエステル製の円形のフィルター６８が示されている。いずれの別法実施例においても、フィルター６７ａまたは６７ｂは重量、大きさ、および蛋白質結合によって濾別する。
ふたたび図１Ａおよび図１Ｂを参照して、こんどは凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に注目する。トロンビン処理ユニット４０に向けられなかったすべての血漿は、凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の内部容器７２に導入される。凝固接着性蛋白質処理ユニット６０は熱交換と回転の操作を受け、これによって血漿から抽出されたすべての凝固接着性蛋白質は内部容器７２の先端７４に沈殿し、続いて凝固接着性蛋白質収集チューブまたは無菌のパウチ７８に入れられた投与注射器７６によって抜き取られる。容器７２はこの工程の間、汚染を防ぐフィルター通気孔８２によって保護されている。トロンビンが投与注射器４２に充填され、凝固接着性蛋白質が凝固接着性蛋白質収集チューブまたは投与注射器７６に充填されたならば、二つの注射器４２，７６は処理セット１０から（例えば無菌の取り外し装置で）取り外され、無菌の外科現場の近傍に移される。続いて外側を覆うバッグが開かれ、注射器４２，７６が取り外されて外科現場に移され、ここで内容物がそれぞれの無菌の３ｃｃプラスチック注射器に分配される。これらは続いてフィブリン接着剤塗布器に充填され、線状または点状に塗布される。トロンビンを凝固接着性蛋白質と混合することによって生物的接着剤が形成される。
両投与注射器４２および７６は、室温、または好ましくはそれぞれの最適条件で保存される。すなわち寒冷沈降物７６は室温で保存され、トロンビン４２は１℃ないし５℃の氷浴中に保存される。図１３から図１６までを参照されたい。
９〜１０ｍｌの室温血漿が反応容器２６に導入されたとする。その他の血漿量も有用である。図１５および図１６を参照されたい。１．０ｍｌの７５ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および２．０ｍｌのエタノール（ＥＴＯＨ）を添加する（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られて添加され、体積／単位体積でエタノール１８．９％、あるいは重量／単位体積でエタノール１５．０２％を占める）。エタノールに関するその他の試薬量対血漿量の比も有用な相がある（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は７５ｍＭのストック溶液から採られる）。図１３および図１４を参照されたい。トロンビンの寿命は、２．９８秒の凝固時間を保ちつつ少なくとも３００分であることが示されている。エタノールの最終濃度は８．０％から２０．０％（体積／単位体積）の範囲にわたっているが、なお有用である。図１１を参照されたい。
エタノールの最終濃度が体積／単位体積で１８．９％（上述通り）で、塩化カルシウムの最終濃度が５．７ｍＭ（塩化カルシウムの７５ｍＭストック溶液の１ｍｌを採る）である場合、トロンビンの寿命は少なくとも３６０分に延び、この間凝固時間はトロンビンの室温保存において５．９８秒に保たれる。トロンビンを氷浴中で最適の１℃ないし５℃に保存すれば通常、３６０時間において２秒ないし３秒の凝固時間が保たれる。しかしながら塩化カルシウムの、５０ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲のストック溶液濃度が有用である。図１２を参照されたい。最終濃度は４．５ｍＭから２３ｍＭの範囲である。
食塩水、希薄ＣａＣｌ２（例えば４０ｍＭないし１２５ｍＭのＣａＣｌ２）などの溶液、あるいは無菌水をトロンビンに加えることによってトロンビンの凝固時間および寿命の両方を変化させることができる。エタノールの最終濃度１８．９％および塩化カルシウムの最終濃度５．７ｍＭが反応容器２６に用いられたとする。トロンビンを水で１．５倍に希釈すると、凝固時間は３０秒弱に伸び、寿命は１５０分までとなる。
以上において本発明を説明したが、以上のように説明され、以下において請求範囲に記載される本発明の範囲および正当な意味から逸脱することなく、多くの構造的な改変および適応がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である
【図２Ｂ】
図２Ｂは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図４Ａ】
図４Ａは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図６Ａ】
図６Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図７Ａ】
図７Ａは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図８Ａ】
図８Ａは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図９Ａ】
図９Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図１０】
図１０は、図９に示されるものの斜視図である。
【図１１】
図１１は、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１２】
図１２は、異なるＣａＣｌ２濃度における、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１３】
図１３はトロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１４】
図１４は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１５】
図１５は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの血漿量による感度を示している。
【図１６】
図１６は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの血漿量による感度を示している。