(57)【要約】或る実施形態では、本開示は、（ｉ）ＤＮＡ−バーコード化されたペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）をスクリーニングしてこれらのペプチドに特異的なＴリンパ球を検出すること、および（ｉｉ）スクリーニングで識別されたＴリンパ球を単一細胞シーケンシングしてそれらのトランスクリプトームを解析することを組み合わせる方法を提供する。
2022502029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を含む試料における単一細胞分解能での同時のＴ細胞エピトープマッピングおよび／またはトランスクリプトーム特性解析方法であって、以下：
（ａ）固有のバーコードで各固有のペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）を標識し、それによりバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団を産生すること；
（ｂ）Ｔ細胞を含む試料をバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団と接触させること、ここでＴ細胞の少なくとも１のＴ細胞受容体が少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトに結合する（「Ｔ細胞受容体エピトープ」）；および
（ｃ）単一細胞シーケンシングを使用してＴ細胞をシーケンシングすること、ここで単一細胞シーケンシングが各Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体エピトープおよびトランスクリプトーム遺伝子を同時に識別する、
を含む方法。
【請求項２】
単一細胞シーケンシングが液滴ベースの単一細胞シーケンシングである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シーケンシングの各液滴が：
ａ）（ｂ）における少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトにより標識されたＴ細胞；および
ｂ）トランスクリプトーム測定のプライマーを含むプライマービーズ、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各バーコードが一本鎖の核酸である、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖の核酸がＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各バーコードが固有の試料識別配列を含む、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試料識別配列がハミング符号に基づいて設計される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料識別領域が、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１１ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１３ｂｐ、少なくとも１４ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも１６ｂｐ、少なくとも１７ｂｐ、少なくとも１８ｂｐ、少なくとも１９ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２１ｂｐ、少なくとも２２ｂｐ、少なくとも２３ｂｐ、少なくとも２４ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも２６ｂｐ、少なくとも２７ｂｐ、少なくとも２８ｂｐ、少なくとも２９ｂｐまたは少なくとも３０ｂｐ長である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
試料識別領域が２つの定常領域（５’定常領域および３’定常領域）に隣接する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
５’定常領域がＰＣＲ増幅およびインデックスプライマーとのアニーリングのために使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インデックスプライマーが固有の分子インデックス（ＵＭＩ）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＵＭＩが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｉ７  ＵＭＩを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
３’定常領域が液滴ベースの単一細胞シーケンシングプラットフォームでテンプレートスイッチオリゴとアニールする、請求項９−１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
テンプレートスイッチオリゴが、１０Ｘ細胞バーコードまたはＤｒｏｐｓｅｑ細胞バーコードを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトがスキャフォールドを含む、請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
スキャフォールドがニュートラアビジンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
スキャフォールドがデキストランを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトがニュートラアビジンスキャフォールドに付着した４同一ｐＭＨＣモノマーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトがデキストランスキャフォールドに付着した５同一ｐＭＨＣモノマーを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔリンパ球を含む試料が末梢血、臍帯血、組織生検、または液体生検である、請求項１−１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
５’定常領域が配列番号１（ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣ）に記載の核酸配列を含む、請求項９−２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
３’定常領域が配列番号２（ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣ）に記載の核酸配列を含む、請求項９−１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれか一項に記載の方法により識別されるＴ細胞エピトープ。
【請求項２４】
請求項１−２２のいずれか一項に記載の方法により識別されるＴ細胞のトランスクリプトーム。
【請求項２５】
共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールド分子に付着した少なくとも１のｐＭＨＣペプチド、および共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールドに付着した少なくとも１のバーコードを含むＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクト。
【請求項２６】
スキャフォールド分子がニュートラアビジンまたはデキストランである、請求項２５に記載のＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクト。
【請求項２７】
ＤＮＡバーコードが配列番号３を含む、請求項２５または２６のいずれか一項に記載のＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクト。
【請求項２８】
請求項２５−２７のいずれか一項に記載のＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの製造方法であって、以下：
（ａ）４または５ｐＭＨＣペプチドをスキャフォールドに付着させること、ここでスキャフォールドがデキストランまたはニュートラアビジンである；および
（ｂ）少なくとも１のＤＮＡバーコードをスキャフォールドに付着させること、ここでＤＮＡバーコードが配列番号３を含む、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／７３５，８０３号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞エピトープマッピングおよびトランスクリプトーム解析に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
Ｔ細胞は、ウイルス感染や腫瘍に対抗するための重要な役割を果たす。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）との相互作用によって活性化される。ＴＣＲとｐＭＨＣの相互作用は増殖を誘導し、サイトカインの放出を含むエフェクター表現型の形成を誘導する。したがって、個々のＴ細胞が認識するペプチド（抗原）を識別し、ペプチド特異的Ｔ細胞を特性解析することは、免疫関連疾患の理解と処置に不可欠である。
【０００４】
現在、マスサイトメトリーベースのアプローチ（Ｎｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６２３−６２９）、蛍光ベースのアプローチ（Ａｌｔｍａｎ  （１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ９４−９６）または二本鎖ＤＮＡバーコードベースのアプローチ（Ｂｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０３７−１０４５）は、抗原特異的Ｔ細胞の限定されたフローベースの特性解析による個々のＴ細胞により認識された抗原の識別に限定される。同様に、ＤＮＡバーコード抗体標識戦略（Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ８６５−８６８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９３６−９３９）は、遺伝子発現および細胞表面エピトープ発現の同時測定に限定される。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本開示は、Ｔ細胞を含む試料における単一細胞分解能での同時のＴ細胞エピトープマッピングおよび／またはトランスクリプトーム特性解析方法であって、以下：
（ａ）固有のバーコードで各固有のペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）を標識し、それによりバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団を産生すること；（ｂ）Ｔ細胞を含む試料をバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団と接触させること、ここでＴ細胞の少なくとも１のＴ細胞受容体が少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトに結合する（「Ｔ細胞受容体エピトープ」）；および（ｃ）単一細胞シーケンシングを使用してＴ細胞をシーケンシングすること、ここで単一細胞シーケンシングが、各Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体エピトープおよびトランスクリプトーム遺伝子を同時に識別する、
を含む方法を提供する。
【０００６】
本開示はまた、試料から得られる単一のＴ細胞における同時のＴ細胞エピトープマッピングおよび／またはトランスクリプトーム特性解析方法であって、以下（ａ）固有のバーコードで各固有のペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）を標識し、それによりバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団を産生すること；（ｂ）Ｔ細胞をバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団と接触させること、ここでＴ細胞のＴ細胞受容体が少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトに結合する（「Ｔ細胞受容体エピトープ」）；および（ｃ）単一細胞シーケンシングを使用してＴ細胞をシーケンシングすること、ここで単一細胞シーケンシングが、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体エピトープおよびトランスクリプトーム遺伝子を同時に識別する、
を含む方法を提供する。
【０００７】
いくつかの態様では、単一細胞シーケンシングは、液滴ベースの単一細胞シーケンシングである。いくつかの態様では、シーケンシングの各液滴は、（ｉ）（ｂ）における少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトにより標識されたＴ細胞；および（ｉｉ）トランスクリプトーム測定のプライマーを含むプライマービーズを含む。
【０００８】
いくつかの態様では、各バーコードは一本鎖の核酸である。いくつかの態様では、一本鎖の核酸はＤＮＡである。いくつかの態様では、各バーコードは固有の試料識別配列を含む。いくつかの態様では、試料識別配列はハミング符号に基づいて設計される。いくつかの態様では、試料識別領域は、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１１ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１３ｂｐ、少なくとも１４ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも１６ｂｐ、少なくとも１７ｂｐ、少なくとも１８ｂｐ、少なくとも１９ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２１ｂｐ、少なくとも２２ｂｐ、少なくとも２３ｂｐ、少なくとも２４ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも２６ｂｐ、少なくとも２７ｂｐ、少なくとも２８ｂｐ、少なくとも２９ｂｐまたは少なくとも３０ｂｐ長である。いくつかの態様では、試料識別領域は１０ｂｐ−３０ｂｐ、１１ｂｐ−２９ｂｐ、１２ｂｐ−２８ｂｐ、１３ｂｐ−２７ｂｐ、１４ｂｐ−２６ｂｐ、１５ｂｐ−２５ｂｐ、１６ｂｐ−２４ｂｐ、１７ｂｐ−２３ｂｐ、または１８ｂｐ−２２ｂｐである。
【０００９】
いくつかの態様では、試料識別領域は２つの定常領域（５’定常領域および３’定常領域）に隣接する。いくつかの態様では、５’定常領域はＰＣＲ増幅およびインデックスプライマーとのアニーリングのために使用される。いくつかの態様では、インデックスプライマーは固有の分子インデックス（ＵＭＩ）を含む。いくつかの態様では、ＵＭＩは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｉ７  ＵＭＩを含む。いくつかの態様では、３’定常領域は液滴ベースの単一細胞シーケンシングプラットフォームでテンプレートスイッチオリゴとアニールする。
【００１０】
いくつかの態様では、テンプレートスイッチオリゴは、１０Ｘ細胞バーコードまたはＤｒｏｐｓｅｑ細胞バーコードを含む。いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、スキャフォールドを含む。いくつかの態様では、スキャフォールドは、ニュートラアビジンを含む。いくつかの態様では、スキャフォールドは、デキストランを含む。いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、ニュートラアビジンスキャフォールドに付着した４同一ｐＭＨＣモノマーを含む。いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、デキストランスキャフォールドに付着した５同一ｐＭＨＣモノマーを含む。
【００１１】
いくつかの態様では、Ｔリンパ球を含む試料は末梢血、臍帯血、組織生検、または液体生検である。いくつかの態様では、５’定常領域は、配列番号１（ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣ）に記載の核酸配列を含む。いくつかの態様では、３’定常領域は配列番号２（ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣ）に記載の核酸配列を含む。
【００１２】
本開示はまた、本明細書中で開示される方法のいずれか一つにより識別されるＴ細胞エピトープを提供する。本明細書中で開示される方法のいずれかにより識別されるＴ細胞のトランスクリプトームもまた提供される。
【００１３】
本開示はまた、共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールド分子に付着した少なくとも１のｐＭＨＣペプチド、および共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールドに付着した少なくとも１のバーコードを含むＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトを提供する。いくつかの態様では、スキャフォールド分子はニュートラアビジンまたはデキストランである。いくつかの態様では、ＤＮＡバーコードは配列番号３を含む。
【００１４】
（１）４または５ｐＭＨＣペプチドをスキャフォールドに付着させること、ここでスキャフォールドがデキストランまたはニュートラアビジンである；および（２）少なくとも１のＤＮＡバーコードをスキャフォールドに付着させること、ここでＤＮＡバーコードが配列番号３を含む、を含む本開示のＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの製造方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は２つの代替的なＤＮＡバーコード標識戦略を示す。ｐＭＨＣを含むこれらのＤＮＡ−バーコード化コンストラクトは単一細胞シーケンシングプロトコル中に抗原特異的Ｔ細胞を識別するために使用され得る。一戦略では、ＤＮＡ−バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、ニュートラアビジンスキャフォールドを含むｐＭＨＣ四量体コンストラクトである。代替的戦略では、ＤＮＡ−バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、デキストランスキャフォールドを含むｐＭＨＣ多量体コンストラクト（例えば、五量体）である。
【図２】図２は各ＤＮＡバーコードが固有のｐＭＨＣマルチマーに対応するようにｐＭＨＣマルチマーのＤＮＡ−バーコード化ライブラリーを生成するための戦略を示す。
【図３】図３は、Ｔ細胞、ＤＮＡ−バーコード化ｐＭＨＣコンストラクト（特に、ニュートラアビジン複合体）、およびトランスクリプトーム解析の一部として増幅される遺伝子のそれぞれに対応する一連のプライマーを含むであろうトランスクリプトーム解析のシーケンシングプライマービーズを含むシーケンシングの液滴を示す概略図である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本開示は、同時の抗原特異的Ｔ細胞の検出および単一細胞レベルでそれらのトランスクリプトームの測定を可能にする方法を提供する。開示された方法は、スキャフォールドに付着した幾つかのｐＭＨＣモノマーを含むスキャフォールド、並びにＤＮＡバーコードを含むペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）コンストラクトを使用する。各固有のバーコードは、二意的に（ｂｉｕｎｉｖｏｃａｌｌｙ）固有のｐＭＨＣに関する。
【００１７】
単一細胞シーケンシングを特定の一本鎖ＤＮＡでバーコードされたｐＭＨＣと組み合わせることにより、これらの方法は、細胞表面の特定のＴ細胞受容体の迅速かつ同時の識別および定量ならびにＴリンパ球のトランスクリプトーム特性解析を可能にする。これらの方法は、例えば、ペプチド特異性のスクリーニング、単一細胞レベルでの多様な抗原特異的Ｔ細胞のトランスクリプトームの同時特性解析、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシングの結果の検証、診断テスト、免疫療法の効果予測、またはワクチン接種もしくは免疫療法後の免疫反応の測定などに使用され得る。
【００１８】
さらに、本明細書中で開示される方法は、リガンドへの親和性に基づいて希少な細胞型を識別または特性解析するためにも使用され得る。
【００１９】
したがって、本開示は、Ｔ細胞を含む試料における単一細胞分解能での同時のＴ細胞エピトープマッピングおよび／またはトランスクリプトーム特性解析方法であって、以下：（ａ）固有のバーコードで各固有のペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ｐＭＨＣ）を標識し、それによりバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団を産生すること；（ｂ）Ｔ細胞を含む試料をバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトの集団と接触させること、ここでＴ細胞の少なくとも１のＴ細胞受容体が少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトに結合する（「Ｔ細胞受容体エピトープ」）；および（ｃ）単一細胞シーケンシングを使用してＴ細胞をシーケンシングすること、ここで単一細胞シーケンシングが、各Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体エピトープおよびトランスクリプトーム遺伝子を同時に識別する、
を含む方法を提供する。
【００２０】
本明細書中で使用される「固有」という用語は、ＤＮＡバーコードとバーコードまたはバーコードを含むコンストラクトにコンジュゲートしたｐＭＨＣとの間の二意的な関係を指す。したがって、「固有」という用語は、その特定のＤＮＡバーコードが特定のｐＭＨＣに対応し、その特定のｐＭＨＣのみに対応すること、およびその特定のｐＭＨＣが特定のＤＮＡバーコードに対応し、その特定のＤＮＡバーコードのみに対応することを意味する。
【００２１】
本明細書中で使用される「単一細胞分解能での」または「単一細胞レベルでの」という用語は、試料がＴ細胞の集団を含むが、各単一細胞シーケンシング反応で得られたＴエピトープマッピングデータおよびトランスクリプトームデータの各セットが単一細胞に対応することを意味する。
【００２２】
いくつかの態様では、単一細胞シーケンシングは、液滴ベースの単一細胞シーケンシングである。しかしながら、別のコンパートメント（例えば、ビーズ、アレイウェル等）における単一細胞のシーケンシングを可能にする他のシーケンシング方法はまた、本明細書中で開示される方法を実施するために使用され得る。本明細書中で開示される方法はまた、単一細胞をシーケンスしないが多数の細胞の多重シーケンスを可能にするシーケンシング方法を使用して実施され得、ここで各細胞は固有に識別される（例えば、バーコード化によって）。
【００２３】
いくつかの態様では、シーケンシングの各液滴は、（ｉ）（ｂ）における少なくとも１のバーコード化ｐＭＨＣコンストラクトにより標識されたＴ細胞；および（ｉｉ）トランスクリプトーム測定のプライマーを含むプライマービーズを含む。上述したように、シーケンシング反応は、反応物が閉じ込められた代替システム、例えば、アレイウェル、マイクロ流体システムのキャピラリーまたはコンパートメント、ビーズ、リポソームなどを使用して実施されてもよい。さらに、トランスクリプトーム測定のプライマーは、例えば、デンドリマー、直鎖状または分岐状のポリマー、ウェル、ドロップレットなどの代替のスキャフォールドまたはコンテナに結合させることができる。
【００２４】
いくつかの態様では、各バーコードは一本鎖の核酸である。本開示のほかの態様では、核酸は例えば二本鎖であり得、または分岐鎖であり得る。いくつかの態様では、核酸、例えば、一本鎖の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの態様では、核酸は、例えば、非天然核酸塩基（例えば、ＬＮＡ）および／または非天然骨格結合（例えば、ホスホロチオエート）を含むことができる。いくつかの態様では、バーコードは一般的な塩基を含むことができる。いくつかの態様では、各バーコードは固有の試料識別配列を含む。
【００２５】
いくつかの態様では、試料識別配列はハミング符号に基づいて設計される。いくつかの態様では、代替的な符号は試料識別配列において使用され得る。いくつかの態様では、符号はエラー訂正コードであり、例えば、ハッシュ関数を含む符号である。いくつかの態様では、ハッシュ関数は、例えば、繰り返し符号、パリティビット、またはチェックサムである。
【００２６】
いくつかの態様では、試料識別領域は、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１１ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１３ｂｐ、少なくとも１４ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも１６ｂｐ、少なくとも１７ｂｐ、少なくとも１８ｂｐ、少なくとも１９ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２１ｂｐ、少なくとも２２ｂｐ、少なくとも２３ｂｐ、少なくとも２４ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも２６ｂｐ、少なくとも２７ｂｐ、少なくとも２８ｂｐ、少なくとも２９ｂｐまたは少なくとも３０ｂｐ長である。いくつかの態様では、試料識別領域は１０ｂｐ−３０ｂｐ、１１ｂｐ−２９ｂｐ、１２ｂｐ−２８ｂｐ、１３ｂｐ−２７ｂｐ、１４ｂｐ−２６ｂｐ、１５ｂｐ−２５ｂｐ、１６ｂｐ−２４ｂｐ、１７ｂｐ−２３ｂｐまたは１８ｂｐ−２２ｂｐである。
【００２７】
いくつかの態様では、試料識別領域は２つの定常領域（５’定常領域および３’定常領域）に隣接する。いくつかの態様では、５’定常領域はＰＣＲ増幅およびインデックスプライマーとのアニーリングのために使用される。いくつかの態様では、３’定常領域は単一細胞シーケンシングプラットフォーム、例えば、液滴ベースの単一細胞シーケンシングプラットフォームでテンプレートスイッチオリゴとアニールする。いくつかの態様では、隣接定常領域は置き換えられ、すなわち３’定常領域はＰＣＲ増幅およびインデックスプライマーとのアニーリングのために使用され、５’定常領域は単一細胞シーケンシングプラットフォーム、例えば、液滴ベースの単一細胞シーケンシングプラットフォームでテンプレートスイッチオリゴとアニールする。
【００２８】
いくつかの態様では、インデックスプライマーは固有の分子インデックス（ＵＭＩ）を含む。固有分子識別因子（ＵＭＩ）（Ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ）はいくつかの次世代シーケンシングプロトコルにおいて、各リードに付加される短い配列または「バーコード」である。これらは、検出に十分なリードを得るために必要な、ｃＤＮＡ増幅により導入される定量的バイアスを減らす役割を果たす。いくつかの特定の態様では、ＵＭＩは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｉ７  ＵＭＩを含む。
【００２９】
いくつかの態様では、テンプレートスイッチオリゴは、１０Ｘ細胞バーコードまたはＤｒｏｐ−Ｓｅｑ細胞バーコードを含む。テンプレートスイッチングポリメラーゼ連鎖反応（ＴＳ−ＰＣＲ）は、ポリアデニル化部位の天然ＰＣＲプライマー配列に依存し、マウス白血病ウイルス逆転写酵素の活性により第二のプライマーを付加する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の方法である。例えば、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑでは、シリンジポンプを使用して単離された細胞と固有にバーコードされたビーズを一定速度で伝送することにより、ポリアデニル化部位が固有の識別配列を含有するビーズ特異的プライマーと結合する溶解バッファーの液滴中で、個々の細胞とビーズを共に単離できる。このプライマーはまた、識別子の上流にある共通配列を含有しているため、逆転写で伸長した後、後続のＰＣＲのラウンドでタグを組み込み、シーケンシングされる各単離ｃＤＮＡを特定の起源のビーズまで追跡できる。これにより、多くの個々の細胞における転写物の相対的なレベルを同時に分析でき、例えば、これらの細胞を特定の細胞型に分類するための合理的な根拠を得ることができる。
【００３０】
いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、スキャフォールドを含む。当業者であれば、本明細書に開示されているスキャフォールドに加えて、特許請求の範囲に記載の発明を実施するために使用してもよい当業者に知られている多数のスキャフォールド分子があることを理解するであろう（例えば、デキストランの代わりに、他のポリマーを使用してもよい）。
【００３１】
いくつかの特定の態様では、スキャフォールドは、ニュートラアビジンを含む。ニュートラアビジンタンパク質は、アビジンを脱グリコシル化したもので、質量は約６０，０００ダルトンである。糖除去の結果、レクチンの結合が検出できないレベルまで減少するが、ビオチンの結合親和性は、糖がこの活性に必要ではないため、維持される。アビジンは高いｐＩを有するが、ニュートラアビジンは中性に近いｐＩ（ｐＨ６．３）を有し、マイナスに帯電した細胞表面またはＤＮＡ／ＲＮＡとの非特異的な相互作用を最小限にする。ニュートラアビジンは依然としてリジン残基を有し、誘導体化またはコンジュゲーションに利用できるままである。アビジンそのものと同様、ニュートラアビジンは、ビオチンに強い親和性（Ｋｄ＝１０−１５Ｍ）を有する四量体である。
【００３２】
いくつかの特定の態様では、スキャフォールドはデキストランを含む。デキストランは、複雑に分岐したグルカンである（グルコース縮合由来の多糖類。ＩＵＰＡＣは、デキストランを「Ｃ−１→Ｃ−６を主とするグリコシド結合を有する微生物由来の分岐したポリ−α−ｄ−グルコシド」（「Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙ−α−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｈａｖｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  Ｃ−１  →  Ｃ−６」）と定義している。［１］デキストラン鎖の長さは様々である（３から２０００キロダルトン）。ポリマー主鎖は、グルコースモノマー間のα−１，６グリコシド結合からなり、α−１，３結合の分岐を有する。
【００３３】
いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、ニュートラアビジンスキャフォールドに付着した４同一ｐＭＨＣモノマーを含む。他の態様では、バーコード化ｐＭＨＣは、ニュートラアビジンスキャフォールドに付着した１、２、３、４ｐＭＨＣモノマーを含む。
【００３４】
いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、デキストランスキャフォールドに付着した１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｐＭＨＣモノマーを含む。いくつかの態様では、各バーコード化ｐＭＨＣコンストラクトは、デキストランスキャフォールドに付着した５同一ｐＭＨＣモノマーを含む。
【００３５】
いくつかの態様では、Ｔリンパ球を含む試料は、例えば、末梢血試料、臍帯血試料、組織生検試料、液体生検試料、またはそれらの組合せである。いくつかの態様では、試料は、精製されたまたは部分的に精製されたＴリンパ球を含む。いくつかの態様では、試料は、プールされた試料である。いくつかの態様では、プールされた試料は、同じ個体からの複数の試料を含む。いくつかの態様では、プールされた試料は、複数の個体からの複数の試料を含む。いくつかの態様では、複数の個体からプールされた試料のすべては同じタイプの試料である。
【００３６】
いくつかの態様では、試料（１つの）または試料（複数の）は、ヒト対象から得られる。他の態様では、試料（１つの）または試料（複数の）は、動物から得られる。いくつかの態様では、試料（１つの）または試料（複数の）は、動物モデル、例えばマウス、ラット、または非ヒト霊長類から得られる。いくつかの態様では、試料（１つの）または試料（複数の）は、細胞系統から得られる。
【００３７】
いくつかの態様では、ＰＣＲ増幅およびインデックスプライマーとのアニーリングのために使用される５’定常領域配列は、配列番号１に記載の核酸配列（ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣ）を含む。いくつかの態様では、単一細胞シーケンシングプラットフォームでテンプレートスイッチオリゴとアニールする３’定常領域配列は、配列番号２に記載の核酸配列（ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣ）を含む。
【００３８】
また、本開示では、本明細書中で開示される方法のいずれかにより識別されるＴ細胞エピトープが提供される。本明細書中で開示される方法のいずれかにより識別されるＴ細胞のトランスクリプトームもまた提供される。
【００３９】
本開示のいくつかの態様では、Ｔ細胞エピトープの識別は定性的であり得る。他の態様では、Ｔ細胞エピトープの識別は定量的であり得る。いくつかの態様では、トランスクリプトーム解析で識別される遺伝子は定性的に判断される。いくつかの態様では、トランスクリプトーム解析で識別される遺伝子は定量的に判断される。
【００４０】
いくつかの態様では、本明細書中で開示される方法を適用した場合に得られるＴ細胞エピトープデータおよび／またはトランスクリプトームデータは、バイオマーカーとして使用され得る。バイオマーカーの有無、１以上の閾値に関するその量、１以上のコントロールに関するその増減、またはそれらの組合せは例えば、
（ｉ）対象の集団を分類すること、
（ｉｉ）対象の予後を判断すること、
（ｉｉｉ）ある処置剤で対象を処置すること、
（ｉｖ）ある処置剤での対象の処置を中止すること、
（ｖ）ある処置剤での対象の処置を改変すること、
（ｖｉ）処置剤への対象の反応、またはその不足を判断すること、
（ｖｉｉ）処置剤での処置のための患者を選択すること、
（ｖｉｉｉ）処置剤の有効性を判断すること、
（ｉｘ）疾患を処置する処置剤の有効性または条件を判断するために処置剤をスクリーニングすること、または、
（ｘ）それらの任意の組合せ、
のために使用され得る。
【００４１】
本開示はまた、上記で開示される方法を実施するために使用され得るバーコードされたペプチドコンストラクトを提供する。これらのバーコードされたペプチドコンストラクトは、（ａ）スキャフォールド（例えば、ニュートラアビジンまたはデキストランスキャフォールド）、（ｂ）共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールドに付着したペプチドの集団（例えば、ｐＭＨＣ）、および（ｃ）共有結合的にまたは非共有結合的にスキャフォールドに付着した少なくとも１の核酸バーコード（例えば、ＤＮＡバーコード）を含む。いくつかの態様では、本明細書中で開示されるバーコードされたペプチドコンストラクトは、少なくとも１のｐＭＨＣおよび少なくとも１の試料識別配列を含む少なくとも１のＤＮＡバーコードおよび少なくとも１のＰＣＲ増幅プライマーを含む。
【００４２】
いくつかの態様では、本開示のバーコードされたペプチドコンストラクトはｐＭＨＣ以外のペプチド、例えば、ＴＣＲではないＴリンパ球における表面受容体に結合する非ｐＭＨＣペプチドを含むことができる。また、いくつかの態様では、本開示のバーコードされたペプチドコンストラクトは、Ｔリンパ球以外のリンパ球、またはリンパ球でさえない細胞も標的とできる。したがって、概して、本明細書中で開示されるバーコードされたペプチドコンストラクトは、受容体またはある細胞の表面の受容体に結合するペプチドを含むバーコードされたライブラリーを生成するために使用され得、ここで、特定のバーコードされたペプチドコンストラクトと細胞の表面の特定の受容体分子との結合は、あるタイプの受容体の存在を識別するために、またはあるリガンドもしくはリガンドバリアントの受容体の特異性を識別または特性解析するために使用され得る。上記で開示されるように、本開示のバーコードされたペプチドコンストラクトを使用することによるある表面受容体の識別および特性解析は、定性的および／または定量的であり得る。
【００４３】
本開示はまた、本明細書中で開示されるバーコードされたペプチドコンストラクトを製造する方法を提供する。いくつかの態様では、当該製造方法は、少なくとも１のペプチド（例えば、ｐＭＨＣ）をスキャフォールド分子（例えば、ニュートラアビジン）に共有結合的にまたは非共有結合的に付着させること、および少なくとも１のバーコード（例えば、本明細書中で開示されるＤＮＡバーコード）をスキャフォールドに共有結合的にまたは非共有結合的に付着させることを含む。
【００４４】
特定の態様では、当該製造方法は、配列番号３のＤＮＡバーコードをニュートラアビジンスキャフォールドに共有結合的に付着させること、および４同一ｐＭＨＣモノマーをニュートラアビジンスキャフォールドに非共有結合的に付着させることを含む。
【００４５】
別の特定の態様では、当該製造方法は、配列番号３のＤＮＡバーコードをデキストランスキャフォールドに非共有結合的に付着させること、および５同一ｐＭＨＣモノマーをデキストランスキャフォールドに非共有結合的に付着させることを含む。
【００４６】
本発明は、さらなる限定と解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。すべての図の内容、および本願中に引用されたすべての文献、特許、および公開された特許出願は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００４７】
実施例１
ＤＮＡバーコードおよびニュートラアビジンまたはデキストランコンジュゲートの生成
本明細書中で開示される方法は、特定のＤＮＡバーコードを使用し、同時の抗原特異的Ｔリンパ球の識別および液滴ベースのシーケンシング方法を使用する単一細胞レベルでのそれらのトランスクリプトームの特性評価を行うことができる。
【００４８】
ＤＮＡバーコードは、５’ビオチンタグまたは５’チオール修飾剤のいずれかで合成され得、それぞれストレプトアビジン−デキストランまたはニュートラアビジンの表面に付着させることができる（図１）。ストレプトアビジンデキストランとのコンジュゲーションについて、５’改変ＤＮＡバーコードの滴定量により、デキストラン骨格あたり１個のＤＮＡバーコードを推定できる。ＤＮＡバーコードは、２つの定常領域：
５’ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣ３’（配列番号１）（ＰＣＲ増幅のため、およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉ７インデックスプライマーとアニーリングするために使用される、ＤＮＡバーコードの５’末端）、
５’ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡ  ＣＣＣ３’（配列番号２）（１０Ｘ単一細胞または他の液滴ベースの単一細胞プラットフォームにおいてテンプレートスイッチオリゴとアニーリングするために使用されるＤＮＡバーコードの３’末端）、
が隣接するハミング符号に基づいて設計された１２ｂｐの試料識別配列からなる。
【００４９】
バーコードの中央の１２ヌクレオチド（「ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ」で表示される）は、各エピトープに特異的な四量体のＤＮＡバーコードを指定する。この配列は、シーケンシング後にリードを逆畳み込みするために使用され得る。複数のエピトープの識別のために、プールされ得る目的の各エピトープについて特定のバーコードを設計でき、したがって単一細胞懸濁液とインキュベーション中にマルチプレックスが可能なる。したがって、完全なＤＮＡバーコードは、
５’−ビオチン／５’−チオール−ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＣＣＣ−３’（配列番号３）であろう。
【００５０】
実施例２
ＤＮＡ−バーコード化ｐＭＨＣマルチマーのライブラリーのコンストラクション。
Ｇａｒｂｏｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）ＰＮＡＳ，  ３４２９−３４３３に記載されるように、化学的に合成されたペプチドまたは市販のペプチドを使用して、ビオチン化ＭＨＣ／ペプチド複合体を合成する。４つまたは５つのビオチン化されたｐＭＨＣモノマーは、ＤＮＡバーコード化デキストランまたはＤＮＡバーコード化ニュートラアビジンの占有されていないＳＡ結合部位にコンジュゲートされている。各ＤＮＡバーコードが異なるｐＭＨＣマルチマーをコードするように、ＤＮＡバーコード化ｐＭＨＣマルチマー（「ｐＭＨＣコンストラクト」）はプールされている。図２はプロセスを模式的に記載している。
【００５１】
ｐＭＨＣ四量体についてストレプトアビジンではなくＤＮＡバーコード標識ニュートラアビジンをコアとして使用する戦略は、既知のビオチン結合タンパク質の中で最も非特異的結合が少ないという利点がある。
【００５２】
最終的なライブラリーは、異なるｐＭＨＣ−マルチマー（“ｐＭＨＣコンストラクト”）からなり、そのそれぞれが固有のＤＮＡバーコードによりコードされている。ＤＮＡバーコードは、このアプローチにおいて特定のｐＭＨＣマルチマーに特異的なＴリンパ球を識別するビーコンとして利用される。各特定の四量体のリードは、細胞表面の特定のエピトープの発現を示すであろう。
【００５３】
実施例３
ＤＮＡでバーコードされたｐＭＨＣマルチマーでの抗原特異的Ｔ細胞の染色
液滴ベースのシーケンシングテクノロジーを使用する抗原特異的Ｔ細胞の同時の検出および特性解析についてＤＮＡでバーコードされたｐＭＨＣマルチマーでの抗原特異的Ｔ細胞の染色。
【００５４】
末梢血、臍帯血、組織生検、液体生検、またはＴリンパ球からなるその他の細胞からの単一細胞懸濁液が回収され、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄され得る。続いて、氷冷したブロッキングバッファー（２％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０もしくは別の低イオン性試薬、ならびに１０％ＦＢＳ）で細胞を洗浄する。非特異的な相互作用は、市販のＦｃ受容体ブロッキングバッファーと１０分間氷上でインキュベートすることでブロッキングされる。ブロッキング後、ＤＮＡバーコードでコードされたｐＭＨＣマルチマーライブラリーと氷上で３０分間インキュベートすることで、細胞を染色する。
【００５５】
染色後、氷冷したブロッキングバッファーで細胞を５回洗浄することにより、Ｔ細胞受容体とＭＨＣマルチマーとの非特異的な相互作用、並びに自由に浮遊するＭＨＣマルチマーを除去する。適した数の細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、１０Ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞プラットフォームまたは他の液滴ベースのシステムにロードする。ｃＤＮＡは、油滴に封入された各細胞をコード化する固有の細胞バーコードを加えて合成される。
【００５６】
ｃＤＮＡ合成に続いて、１０Ｘプライマーまたはカスタム液滴ベースのシーケンシングの場合カスタムプライマーを使用して産物が増幅される。ｐＭＨＣマルチマーに連結したバーコードの十分な増幅を確実にするために、カスタムプライマー（ＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣ）も追加されている。遺伝子発現ｃＤＮＡライブラリーとｐＭＨＣマルチマーＤＮＡバーコードライブラリーの両方が増幅され、次世代シーケンシングテクノロジーを使用するシーケンシングのためにインデックスされる。
【００５７】
シーケンスされたリードは、デマルチプレックスされてｆａｓｔｑファイルが得られる。
【００５８】
その中から以下のような特徴が抽出される：
１．    １０ＸまたはＤｒｏｐｓｅｑ細胞バーコード  −  リードが由来した細胞を識別するために使用される、
２．    固有分子インデックス（ＵＭＩ）  −  ＰＣＲ増幅に由来するリードを識別するため、
３．    リードのシーケンシング  −  遺伝子に由来するリード、
４．    ｐＭＨＣ−マルチマーからのＤＮＡバーコード  −  ｐＭＨＣマルチマーに由来するリードを識別する。
【００５９】
Ｆａｓｔｑファイルから抽出した情報を使用して、ｐＭＨＣマルチマーとリンクした遺伝子またはバーコードを行に対応させたマトリクスを構築する。これらのマトリクス内の列は、細胞バーコードに対応する。本明細書で提示される戦略は、大量の抗原をスクリーニングし、Ｔリンパ球の表面の受容体を識別し、抗原特異的Ｔリンパ球を識別し、それらのトランスクリプトームを単一細胞レベルで研究することを可能にするだけではない。
【００６０】
＊＊＊
なお、特許請求の範囲を解釈するには、「概要」および「要約」ではなく明細書が使用されることが意図されていることを理解されたい。「概要」および「要約」のセクションは、発明者が考えた本発明の１つ以上の例示的な実施形態を示すが、すべてではなく、したがって、本発明および特許請求の範囲をいかなる方法でも限定することを意図していない。
【００６１】
本発明は、特定の機能およびそれらの関係の実行を説明する機能的構成要素を用いて上述した。これらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜のために本明細書で任意に定義されている。特定の機能とその関係が適切に実行される限り、代替の境界が定義できる。
【００６２】
特定の実施形態についての前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするものであり、他の者は、当技術分野の知識を適用することにより、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなく、そのような特定の実施形態を様々な用途のために容易に改変および／または適応できる。したがって、このような適応および改変は、本明細書に示された教示およびガイダンスに基づいて、開示された実施形態の意味および同等の範囲内にあることが意図されている。本明細書の言い回しや用語は、説明のためのものであり、限定のためのものではなく、本明細書の用語や言い回しは、当業者が教示およびガイダンスに照らして解釈するようなものであることを理解されよう。
【００６３】
本発明の幅と範囲は、上述した例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の請求項およびその等価物に基づいてのみ定義されるべきである。
【００６４】
本出願の請求項は、親出願やその他の関連出願の請求項とは異なる。したがって、出願人は、本願に関連する親出願または任意の先行する出願で行われた請求範囲のディスクレームを取り消すものとする。したがって、審査官は、そのような以前のディスクレームと、それを回避するために作られた引用文献を再検討する必要があることを助言する。さらに、審査官は、本願で行われたいかなるディスクレームも、親出願に読み込まれたり、親出願に不利になったりしてはならないことにも留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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