【手続補正書】
【提出日】平成22年1月6日(2010.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７０】
【図１】図１は、ｓｉＮＡ分子の合成のためのスキームに関する非限定的な例を示す。相補的ｓｉＮＡ配列鎖である鎖１及び鎖２は、直列で合成され、固体支持体上で固相合成のために使用される開裂可能なリンカーと同一又は別異であり得る、コハク酸ヌクレオチド又は脱塩基コハク酸塩等の開裂可能な連結によって接続される。合成は、固相又は液相の何れかであり得、示されている例において、合成は固相合成である。合成は、ジメトキシトリチル基等の保護基が直列型オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドにおいて変化しないままであるように実施される。オリゴヌクレオチドの開裂及び脱保護の際、２つのｓｉＮＡ鎖は、ｓｉＮＡ二本鎖を形成するように自発的にハイブリダイズし、これにより、末端保護基の特性を利用することによって、例えば末端保護基を有する二本鎖／オリゴヌクレオチドのみが単離される精製法においてトリチルを適用することによって前記二本鎖を精製できる。
【図２】図２は、本発明の方法によって合成される精製されたｓｉＮＡ二本鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。示されている２つのピークは、個別のｓｉＮＡ配列鎖の推定質量に相当する。本結果は、直列型合成から生じたｓｉＮＡ二本鎖が、トリチルを適用する単純な精製法を使用して、単一の実体として精製できることを示す。
【図３】図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解に関する非限定的な提唱された機序の提示を示す。外来の一本鎖ＲＮＡ、例えばウイルス、トランスポゾン、又は他の外因性ＲＮＡからＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって生じる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ダイサー酵素を活性化し、ダイサー酵素が次にｓｉＮＡ二本鎖を発生させる。あるいは、合成の又は発現されたｓｉＮＡは、適切な手段によって細胞中へ直接導入することができる。標的ＲＮＡを認識する活性型ｓｉＮＡ複合体が形成し、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解又はＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）による更なるＲＮＡの合成を生じ、これがダイサーを活性化でき、更なるｓｉＮＡ分子を生じ、これによりＲＮＡｉ反応を増幅できる。
【図４】図４ＡないしＦは、本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。前記図において、Ｎは、何れかのヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン、又は場合によってチミジン）を表し、例えばチミジンは、括弧付きの（Ｎ  Ｎ）によって指定される突出領域において置換できる。多様な修飾が、ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖に関して示されている。（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチド位置は、本明細書に記載のとおりに化学的に修飾することができ（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ等）、対応する標的核酸配列から誘導され得、又は誘導されえない（例えば、図６Ｃを参照されたい。）。更に、図４に示されている配列は、場合によって、センス鎖の５’末端から９番目の位置に又はガイド鎖の５’末端にある１１個のヌクレオチド位置を計数することによってガイド鎖の５’末端を基礎とした１１番目の位置にリボヌクレオチドを含み得る（図６Ｃ参照）。  図４Ａ：センス鎖は、２１個のヌクレオチドを含み、この中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって塩基対形成され、存在する全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除くリボヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって、３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在する全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除くリボヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。  図４Ｂ：センス鎖は、２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここ中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載された他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、センス鎖及びアンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。  図４Ｃ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。  図４Ｄ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。  図４Ｅ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、その中で、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合に��って３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載されている他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。  図４Ｆ：センス鎖は、５’末端及び３’末端のキャップ部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’ヌクレオチドは場合によって塩基対形成され、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、場合によって３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端の３’ヌクレオチドは、場合によって標的ＲＮＡ配列と相補的であり、１つの３’末端ホスホロチオアートヌクレオチド間連結を有し、存在し得る全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドであり、存在し得る全てのプリンヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、普遍的な塩基、又は本明細書に記載の他の化学的修飾を含み得る（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを除く２’デオキシヌクレオチドである。「ｓ」として示される、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又は本明細書に記載されている他の修飾されたヌクレオチド間連結等の修飾されたヌクレオチド間連結は、アンチセンス鎖において（Ｎ  Ｎ）ヌクレオチドを場合によって接続する。コンストラクトＡないしＦのアンチセンス鎖は、本発明の何れかの標的核酸配列と相補的な配列を含む。更に、グリセリル部分（Ｌ）が、図４ＡないしＦに示される何れかのコンストラクトのためのアンチセンス鎖の３’末端に存在するとき、修飾されたヌクレオチド間連結は場合によって存在する。
【図５】図５ＡないしＦは、本発明の化学的に修飾された具体的なｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。ＡないしＦは、図４ＡないしＦに記載されている化学的修飾をＰＣＳＫ９ｓｉＮＡ核酸配列に当てはまる。このような化学的修飾は、あらゆるＰＣＳＫ９配列及び／又はＰＣＳＫ９多型に対しても適用することができる。更に、図５に示される配列は、場合によって、センス鎖の５’末端から９番目の位置に又はガイド鎖の５’末端にある１１個のヌクレオチド位置を計数することによってガイド鎖の５’末端を基礎とした１１番目の位置にリボヌクレオチドを含み得る（図６Ｃ参照）。更に、図５に示されている配列は、アンチセンス鎖の５’末端の最大約４個の位置における末端リボヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖の５’末端での約１、２、３、又は４個の末端リボヌクレオチド）及び／又は細胞標的配列を場合によって含み得る。
【図６Ａ】図６ＡないしＣは、本発明の異なるｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。  図６Ａに示されている例（コンストラクト１、２、及び３）は、１９個の代表的な塩基対を有するが、本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている塩基対の何れかの数を含む。括弧の領域は、例えば長さ約１、２、３、又は４個のヌクレオチド、好ましくは約２個のヌクレオチドを含むヌクレオチドのオーバーハングを表す。コンストラクト１及び２は、ＲＮＡ干渉活性のために独立して使用できる。コンストラクト２は、生分解性リンカーとして場合によって設計できるポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーを含み得る。ある実施形態において、コンストラクト２に示されているループ構造は、インビボ及び／又はインビトロでのコンストラクト１の形成をもたらす生分解性リンカーを含み得る。別の例において、コンストラクト３は、同一原理の下でコンストラクト２を作製するために使用することが可能であり、ここで、リンカーは、インビボ及び／又はインビトロでの活性型ｓｉＮＡコンストラクト２を作製するために使用され、前記コンストラクト２は、インビボ及び／又はインビトロで活性型ｓｉＮＡコンストラクト１を作製するために、別の生分解性リンカーを場合によって利用できる。このように、ｓｉＮＡコンストラクトの安定性及び／又は活性は、インビボ又はインビトロで及び／又はインビトロで使用するためのｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいて調節できる。
【図６Ｂ】図６Ｂに示されている例は、ミクロＲＮＡ等の、突出部、バルジ、ループ及び部分的な相補性から生じるステムループを含み得る、本発明の二本鎖核酸分子の異なる変動を表す。バルジ、ループ、及びステムループを有するこのようなモチーフは一般的に、ミクロＲＮＡの特徴である。バルジ、ループ及びステムループは、本発明の二本鎖核酸分子の１つの鎖又は両方の鎖において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のヌクレオチドのミスマッチ又はバルジ等の部分的な相補性の何れかの程度から生じ得る。
【図６Ｃ】図６Ｃに示される例は、ジヌクレオチド３’突出部を有する２つの２１ヌクレオチド配列の１９塩基対二本鎖を含む本発明のモデルの二本鎖核酸分子を表す。上の鎖（１）は、センス鎖（パッセンジャー鎖）を表し、中間の鎖（２）は、アンチセンス（ガイド鎖）を表し、下の鎖（３）は、標的ポリヌクレオチド配列を表す。ジヌクレオチド突出部（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチドから誘導された配列を含み得る。例えば、ガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と相補的であり得る。更に、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列と同一の配列を含み得る。他の実施形態において、突出部（ＮＮ）は、例えばガイド鎖中の３’−（ＮＮ）配列が標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と相補的ではなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列が標的ポリヌクレオチド配列の５’−［ＮＮ］配列とは異なる配列を含み得る標的ポリヌクレオチド配列からは誘導されない。更なる実施形態において、全ての（ＮＮ）ヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は本明細書の他の修飾のように化学的に修飾される。更に、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖のリボヌクレオチド位置Ｎを含み得る。示されている代表的な１９塩基対２１塩基長の二本鎖に関して、位置Ｎは、パッセンジャー鎖の３’末端からの９個のヌクレオチドであり得る。しかしながら、異なる長さの二本鎖において、位置Ｎは、ガイド鎖の５’末端から１１個のヌクレオチド位置を計数し、パッセンジャー鎖中の対応する塩基対形成したヌクレオチドを選ぶことによって、ガイド鎖の５’末端をベースに決定される。Ａｇｏ２による開裂は、矢印によって示されるように、位置１０と位置１１との間で生じる。更なる実施形態において、ガイド鎖の５’末端から１０個及び１１個のヌクレオチド位置を計数し、パッセンジャー鎖中の相当の塩基対形成したヌクレオチドを選ぶことによって、ガイド鎖の５’末端をベースにした位置１０及び位置１１にある２つのリボヌクレオチドＮＮが存在する。
【図７】図７ＡないしＣは、ｓｉＮＡヘアピン状コンストラクトを作製するための発現カセットを作製する際に利用されるスキームの図を示したものである。  図７Ａ：５’制限部位（Ｒ１）配列の後に、所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が続くＤＮＡオリゴマーが合成され、ここで、センス領域は例えば、長さ約１９、２０、２１、又は２２個のヌクレオチド（Ｎ）を含み、その後に例えば約３ないし約１０個のヌクレオチドを含む所定の配列（Ｘ）のループ配列が続く。  図７Ｂ：次に、合成コンストラクトはＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、標的配列に対する特異性を有し、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ転写産物を生じる自己相補的配列を有するヘアピン状構造を生じる。  図７Ｃ：配列を直鎖化するためにコンストラクトは（例えば約９５℃に）加熱し、これにより、プライマーを使用して、相補的な第二ＤＮＡ鎖を第一鎖の３’制限配列へと伸長することが可能となる。二本鎖ＤＮＡは次に、細胞中での発現のために適切なベクター中に挿入される。コンストラクトは、３’末端ヌクレオチド突出部が、例えば制限部位を設計すること及び／又はＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９，５０５−５０８に記載されているとおりポリＵ末端領域を利用することによって転写から生じるように設計できる。
【図８】図８ＡないしＣは、二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを作製するための発現カセットを作製する際に利用されるスキームの図を示したものである。  図８Ａ：５’制限（Ｒ１）部位配列の後に、所定の標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）が続くＤＮＡオリゴマーが合成され、ここでセンス領域は例えば、長さ約１９、２０、２１、又は２２個のヌクレオチド（Ｎ）を含み、その後に規定された配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３’制限部位（Ｒ２）が続く。  図８Ｂ：次に、合成コンストラクトがＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、自己相補的配列を有するヘアピン状構造を生じる。  図８Ｃ：コンストラクトは、Ｒ１及びＲ２に特異的な制限酵素によって加工され、二本鎖ＤＮＡを生じ、次に、前記ＤＮＡが細胞中での発現のために適切なベクター中に挿入される。転写カセットは、Ｕ６プロモーター領域が、ｓｉＮＡの個別のセンス鎖及びアンチセンス鎖を生じる二本鎖ＤＮＡの各側と隣接するように設計される。ポリＴ末端配列は、前記コンストラクトへ付加でき、得られた転写産物中にＵ字型突出部を生じ得る。
【図９】図９ＡないしＥは、メッセンジャーＲＮＡ等の特定の標的核酸配列内でｓｉＮＡにより媒介されたＲＮＡ干渉のための標的部位を決定するために使用される方法の図を示したものである。  図９Ａ：ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールが合成され、ここで、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域は、標的核酸配列にわたって標的部位との相補性を有し、センス領域は、ｓｉＮＡのアンチセンス領域との配列相補性を含む。  図９ＢからＣ：（図９Ｂ）配列はプールされ、細胞中へのベクターの形質移入がｓｉＮＡの発現を生じる（図９Ｃ）ように、ベクター中へと挿入される。  図９Ｄ：細胞は、標的核酸配列の調節と関連した表現型の変化に基づいて選択される。  図９Ｅ：ｓｉＮＡは、選択された細胞から単離され、標的核酸配列内での有効な標的部位を同定するために配列決定される。
【図１０】図１０は、例えば、（１）［３−３’］逆方向デオキシリボース、（２）デオキシリボヌクレオチド、（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド、（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、（６）３’−グリセリル、（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド、（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド、及び（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを含む、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために使用できる異なる安定化化学反応（１ないし１０）の非限定的な例を示す。図に示されている修飾された及び修飾されていない主鎖の化学反応に加え、これらの化学反応は、本明細書に記載の異なる主鎖の修飾、例えば式Ｉを有する主鎖修飾と組み合わせられ得る。更に、示されている５’から示された末端の修飾までの２’−デオキシヌクレオチドは、本明細書に記載の、修飾された又は修飾されていない別のヌクレオチド又は非ヌクレオチドであり得、例えば式ＩないしＶＩＩの何れか又はその何れかの組み合わせを有する修飾であり得る。
【図１１】図１１は、ＲＮＡ干渉活性を媒介する能力を保存しながら、ヌクレアーゼ耐性を有する本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために使用される戦略の非限定的な例を示す。化学的修飾は、教育された設計因子（例えば、２’−修飾を導入すること、塩基修飾、主鎖修飾、末端キャップ修飾等）をベースにしたｓｉＮＡコンストラクト中へ導入される。修飾したコンストラクトは、適切な系（例えば、示されているヌクレアーゼ耐性のためのヒト血清、又はＰＫ／送達因子のための動物モデル）において検査される。並行して、ｓｉＮＡコンストラクトは、例えばルシフェラーゼリポーターアッセイ等の細胞培養系においてＲＮＡ干渉活性に関して検査される。次に、ＲＮＡ干渉活性を維持しながら特定の特徴を有する先導ｓｉＮＡコンストラクトが同定され、更に修飾することができ、もう一度アッセイできる。この同一アプローチは、改善された薬物動態学的特性、送達、及びＲＮＡ干渉活性を有するｓｉＮＡ−抱合体分子を同定するのに使用できる。
【図１２】図１２は、直鎖及び二本鎖コンストラクト及びその非対称性誘導体を含む、本発明のリン酸化されたｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。
【図１３】図１３は、本発明の化学的に修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、標的核酸配列中に同定された回文構造核酸配列及び／又は反復核酸配列を利用する自己相補的なＤＦＯコンストラクトを設計するのに使用される方法論の非限定的な例を示している。（ｉ）回文構造配列又は反復配列は、核酸標的配列中で同定される。（ｉｉ）標的核酸配列及び回文構造配列と相補的な配列が設計される。（ｉｉｉ）相補的な配列の非回文構造部分／反復部分の逆方向の反復配列が、相補的な配列の３’末端に付加され、核酸標的と相補的な配列を含む自己相補的ＤＦＯ分子を生じる。（ｉｖ）ＤＦＯ分子は、自己重合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド配列に関する非限定的な代表例を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、二本鎖を形成する代表的なオリゴヌクレオチド配列の自己重合模式図の非限定的な例を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、二本鎖を形成する代表的なオリゴヌクレオチド配列の模式的な自己重合の後の、遺伝子発現の調節を生じる標的核酸配列との相互作用に関する非限定的な例を示す。
【図１５】図１５は、目的の何れかの標的核酸配列と相補的な配列を有するＤＦＯコンストラクト中へ組み込まれる回文構造核酸配列及び／又は反復核酸配列を利用する自己相補的なＤＦＯコンストラクトのデザインに関する非限定的な例を示す。これらの回文構造配列／反復配列の組み込みによって、各鎖が、例えばＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の調節を仲介できる二本鎖を、ＤＦＯコンストラクトのデザインが形成できる。第一に、標的配列が同定される。次に、相補的な配列が生じ、その中で、（Ｘ又はＹとして示される）ヌクレオチド又は非ヌクレオチド修飾が、（図中でＸＹＸＹＸＹとして示される）人工的な回文構造を生じる相補的な配列中に導入される。非回文構造／反復相補的配列の逆方向の反復は、相補的な配列の３’末端へ付加され、核酸標的と相補的な配列を含む自己相補的なＤＦＯを生じる。ＤＦＯは、自己重合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる。
【図１６】図１６は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導される開裂を各々媒介することができる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１６Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されている。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。図１６Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に配置される。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。
【図１７】図１７は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導される開裂を各々媒介することができる別個の領域を含む単一ポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。  図１７Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここでで、第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されている。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。  図１７Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に配置される。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。ある実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロで加工され、図１６に示されているような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生じる。
【図１８】図１８は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導された開裂を各々媒介することができる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含み、従って、より短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトが、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる。  図１８Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の３’末端に配置されており、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。  図１８Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一及び第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中の各ポリヌクレオチド配列の５’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性を有しない。
【図１９】図１９は、異なる標的核酸配列のＲＮＡ干渉によって誘導された開裂を各々媒介することができる別個の領域を含む単一ポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含み、従って、より短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトが、異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる。  図１９Ａは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第二相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の３’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。  図１９Ｂは、第一標的核酸配列と相補的な第一領域（相補性領域１）及び第二標的核酸配列と相補的な第二領域（相補性領域２）を有する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し、ここで、第一相補性領域は、多機能性ｓｉＮＡ中のポリヌクレオチド配列の５’末端に配置され、第一及び第二相補性領域は更に、自己相補的領域、回文構造領域、又は反復領域を含む。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各ポリヌクレオチド配列の点線部分は、ｓｉＮＡ二本鎖の相当する部分に関して相補性を有するが、標的核酸配列との相補性は有しない。ある実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロで加工され、図１８に示されるような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生じる。
【図２０】図２０は、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子が、異なるタンパク質（例えば、本明細書のＰＣＳＫ９標的の何れか）、例えばサイトカイン及びその対応する受容体、異なるウイルス系、ウイルス感染又は複製に関与するウイルス及び細胞内タンパク質、又は疾病の進行の持続に関与する共通の又は異なる生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の、２つの個別の標的核酸分子をどのように標的化できるかに関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は、個別の標的核酸分子との相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣによって利用され、その対応する標的のＲＮＡ干渉によって媒介される開裂を開始できるように設計される。これらのデザイン因子は、ｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含み得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照されたい。）。このような脱安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替的な塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、又は本分野で公知のように末端ヌクレオチドの位置で化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化することによって達成できる。
【図２１】図２１は、本発明の多機能性ｓｉＮＡ分子が、ＲＮＡの別のコード領域、ＲＮＡのコード及び非コード領域、又はＲＮＡの選択的スプライシング変異体領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的化する方法に関する非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの各鎖は、標的核酸分子の個別の領域との相補性を有する領域を含む。多機能性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体によって利用され、その相当する標的領域のＲＮＡ干渉により媒介される開裂を開始できるように設計される。これらのデザイン因子は、ｓｉＮＡコンストラクトの各末端の脱安定化を含み得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照されたい。）。このような脱安定化は、例えばグアノシン−シチジン塩基対、代替的な塩基対（例えば、ゆらぎ）を使用することによって、又は本分野で公知のように末端ヌクレオチドの位置で化学的に修飾されたヌクレオチドを脱安定化することによって達成できる。
【図２２Ａ−Ｄ】図２２（ＡないしＨ）は、本発明の繋ぎ止められた多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例において、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）は、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス領域、２つのアンチセンス領域、あるいは１つのセンス領域及び１つのアンチセンス領域の両者）を接続する。第一標的配列及び第二標的配列に対応する個別のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列とハイブリダイズする。更に、多様な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はリポーター分子は、選択的な又は改善された送達特性及び／又は薬物動態学的特性のためのリンカー領域へ結合することができる。
【図２２Ｅ−Ｈ】図２２（ＡないしＨ）は、本発明の繋ぎ止められた多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示されている例において、リンカー（例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）は、２つのｓｉＮＡ領域（例えば、２つのセンス領域、２つのアンチセンス領域、あるいは１つのセンス領域及び１つのアンチセンス領域の両者）を接続する。第一標的配列及び第二標的配列に対応する個別のセンス（又はセンス及びアンチセンス）配列は、多機能性ｓｉＮＡ中のそれらの対応するセンス及び／又はアンチセンス配列とハイブリダイズする。更に、多様な抱合体、リガンド、アプタマー、ポリマー又はリポーター分子は、選択的な又は改善された送達特性及び／又は薬物動態学的特性のためのリンカー領域へ結合することができる。
【図２３】図２３は、多様なデンドリマーベースの多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。
【図２４】図２４は、超分子の多様な多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。
【図２５】図２５は、３０ヌクレオチドの前駆体のｓｉＮＡコンストラクトを使用するダイサーにより可能となった多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。３０塩基対の二本鎖は、ダイサーによって何れかの末端から２２塩基対及び８塩基対の産物へと開裂される（８塩基対断片は示されていない。）。表示を簡単にするため、ダイサーによって生成された突出部は示されていないが、補うことができる。３つの標的化配列が示されている。必要とされる重なった配列同一性は、灰色の箱型によって示されている。親の３０塩基対のｓｉＮＡのＮは、これが安定化した化学反応において検査される場合、ダイサー開裂を可能にする２’−ＯＨ位置の示唆される部位である。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０塩基長二本鎖の加工は、正確な２２＋８開裂を付与しないが、むしろ、密接に関連する一連の産物を生じる（２２＋８が一次的な部位である。）ことに留意されたい。それゆえ、ダイサーによる加工は、一連の活性型ｓｉＮＡを生じる。
【図２６】図２６は、４０ヌクレオチドの前駆体のｓｉＮＡコンストラクトを使用するダイサーにより可能となった多機能性ｓｉＮＡデザインの非限定的な例を示す。４０塩基対の二本鎖は、ダイサーによって何れかの末端から２０塩基対の産物へと開裂される。表示を簡単にするために、ダイサーによって生じたオーバーハングは示されていないが、補うことが可能である。４つの標的化配列が示されている。相同性を有する標的配列は、箱型によって囲まれている。このデザインフォーマットは、より大きなＲＮＡへと拡張できる。化学的に安定化されたｓｉＮＡがダイサーによって結合される場合、戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によって、多機能性デザインのより大規模なレパートリーを可能とするデザイナー開裂産物が可能となる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準物質に限定されない開裂産物によって、例えば約３ないし約１５のヌクレオチドに及ぶ標的配列同一性重複を有する多機能性ｓｉＮＡコンストラクトが可能となる。
【図２７】図２７は、本発明の更なる多機能性ｓｉＮＡコンストラクトデザインの非限定的な例を示す。ある実施形態において、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が、多機能性ｓｉＮＡの一領域へ結合し、送達特性又は薬物動態学的特性を改善することができる。
【図２８】図２８は、本発明の更なる多機能性ｓｉＮＡコンストラクトデザインの非限定的な例を示す。ある実施形態において、抱合体、リガンド、アプタマー、標識又は他の部分が、多機能性ｓｉＮＡの一領域へ結合し、送達特性又は薬物動態学的特性を改善することができる。
【図２９】図２９は、本発明のコレステロールによって抱合されたｓｉＮＡ分子を合成するために使用できるコレステロールにより連結されたホスホラミダイトの非限定的な例を示す。コレステロール部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端へ連結された例が示されている。
【図３０】図３０は、ＰＣＳＫ９を安定に発現している細胞及び対照細胞株中でのＰＣＳＫ９サイレンシングのウェスタンブロット分析の非限定的な例を示す。
【図３１】図３１は、対照細胞株及びＰＣＳＫ９発現細胞株によるｄｉＩ−ＬＤＬ取り込み（蛍光標識されたＬＤＬ粒子）の非限定的な例を示す。
【図３２】図３２は、Ｈｅｐａ１から６細胞中でのＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡプラスミドのインビトロスクリーニングの非限定的な例を示す。
【図３３】図３３は、Ｈｅｐａ１から６細胞中でのマウスＰＣＳＫ９のＡｄ−ＰＣＳＫ９ＳｈＲＮＡ媒介性ノックダウンを確認するデータの非限定的な例を示す。
【図３４】図３４Ａは、Ｃ５７ＢＬ６マウスの肝臓中でのアデノウイルスによって媒介されるＰＣＳＫ９の阻害の非限定的な例を示している。  図３４Ｂは、血漿ＬＤＬレベルに対する肝臓ノックダウンの非限定的な例を示している。
【図３５】図３５は、体重に対するＰＣＳＫ９の肝臓ノックダウンの非限定的な例を示している。