(57)【要約】本発明は、中隔軟骨から単離された細胞によって培地に放出されるエクソソームによって製造される製剤による軟骨の生成に関する。本発明の目的は、軟骨形成を誘導し、また炎症反応を抑制するゆえに、変形性関節症または関節症などの軟骨組織欠損の治療に使用することができる、軟骨を生成することである。
2022501034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞が軟骨分化に対して有効であるという事実により、軟骨組織形成を誘導するために使用される単離された中隔軟骨エクソソーム。
【請求項２】
5〜100%を使用する場合に有効である、請求項１に記載の単離された中隔軟骨エクソソーム。
【請求項３】
dH2O、EtOH、細胞培養培地、PBS、DMSOおよびそれらの混合物からなる群から選択される溶液で溶解することができる、請求項１に記載の単離された中隔軟骨エクソソーム。
【請求項４】
変形性関節症、肋骨肋軟骨連結の炎症、ティーツェ症候群または関節症などの軟骨組織の欠損の治療のために使用される、請求項１に記載の単離された中隔軟骨エクソソーム。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された中隔軟骨エクソソームから軟骨組織を生成する方法であって、
−  細胞培養インキュベーター内で、10%のエクソソーム枯渇ウシ胎児血清(Invitrogen)および1%のPSA(Biological Industries、Beit Haemek、イスラエル)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、軟骨細胞を培養するステップ；
−  培養液中の中隔軟骨細胞から微小胞を分離するために、二相性PEG-デキストランを含むエクソソーム単離溶液を使用するステップ；
−  廃細胞を除去するために、培養培地から収集した培地を300gで10分間遠心分離するステップ；
−  可能性がある細胞成分を除去するために、上清を新しいチューブに移し、14000gで30分間遠心分離するステップ；
−  上清を新しいチューブに移し、その上に1/1体積のPEG-デキストラン溶液を加え、1000gで10分間遠心分離し、次に、下相に残っているエクソソームを収集するステップ；
−  軟骨分化のための分化溶液を中隔軟骨エクソソームに1日おきに10日間投与するステップ；
−  分化の結果として軟骨組織を得るステップ；
を含む方法。
【請求項６】
軟骨細胞が、温度37℃および5%CO2にて、細胞培養インキュベーター内で培養される、請求項３に記載の単離された中隔軟骨エクソソームから軟骨組織を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨を生成するために使用され、中隔軟骨から単離された細胞によって培地に放出されるエクソソームによって製造される製剤による軟骨の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、いくつかの臓器で骨の機能を果たす、柔軟で硬く、白い組織である。ほとんどの原始脊椎動物および発達した脊椎動物では、胚の骨格は軟骨で構成されている。完全に成長した人体では、鼻、喉頭、耳に軟骨部分がある。また、それは、互いに向かい合う関節を形成する骨の面を覆うクッションとしても機能する。関節軟骨は、さまざまな方法で損傷および侵食される可能性がある。これにより、変形性関節症または関節症と呼ばれる変性関節疾患がもたらされる[1]。変形性関節症は、進行性の軟骨破壊、骨棘形成、および特に耐荷重性関節における軟骨下硬化症を特徴とする非炎症性の慢性および変性疾患である。変形性関節症、変形性関節症または肥大性関節炎とも呼ばれるこの疾患では、関節軟骨が徐々に失われる[2]。
【０００３】
骨とは異なって、軟骨は生存するために骨と直接接触する必要はない。組織液が軟骨の線維性マトリックスに到達すると、軟骨芽細胞に栄養が与えられ、同種異形成インプラントとは異なって、組織に埋め込まれる必要はない。そのため、鼻腔内および上皮下ポケットにも簡単に使用することができる。この目的のために、使用準備済みの軟骨または中隔、軟骨または肋軟骨を使用することができる。軟骨は容易に成形することができ、その柔軟な構造により、鼻内の小さな欠損やエッジの不規則性のサポートおよび充填材の両方として使用することができる。使用される軟骨移植片のほとんどは自己移植である。新鮮な、あるいは保存された同種軟骨および照射された異種軟骨が長年使用されてきたが、時間の経過とともに吸収されるため、それらの使用は減少している[3]。中隔軟骨、無血管軟骨および肋軟骨は、頭頸部領域の軟組織欠損、および鼻の再建手順の代替として広く使用されている。
【０００４】
組織工学に関する研究は、適切な細胞を適切な吸収された生体材料の足場に播種することによって、インビトロおよびインビボで軟骨を形成することを試みてきた。さらに、頭頸部の軟組織置換のためのヒト中隔軟骨の組織工学は、近い将来に臨床的利益を提供する可能性がある[4]。
【０００５】
軟骨の喪失において、組織の自己治癒能力は非常に限られている。限られた修復が行われるが、得られる組織は線維性軟骨であり、元の関節軟骨と同じ生体力学的特性を持たない。したがって、軟骨組織工学の目的は、得られた人工軟骨が通常の関節軟骨と同じ生体力学的特性を持つことである[5]。実施されている臨床試験では、軟骨修復に使用される技術が、短期および中期の結果をもたらすことが見られる。軟骨修復のための第2世代組織工学ソリューションのための広範な研究が進行中である。細胞の関節鏡による移植を可能にし、したがって罹患率を低下させるさまざまなアプローチおよび新しい技術が研究されている。今日利用可能な多くの技術のいずれも、正常な硝子軟骨を一貫して再現することができず、最良の長期処置はまだ不明である[6]。生体力学的試験により、組織工学による軟骨の生体力学的特性が、正常な中隔軟骨の生体力学的特性と互換性があることが証明されている[4、7]。
【０００６】
軟骨欠損に対する現在の治療法には、外科的介入(たとえば、マイクロフラクチャー、モザイク形成術、高度および模倣生体材料足場を含む組織工学)、細胞移植(幹細胞または軟骨細胞移植)、標的療法および疾患修飾療法(抗炎症剤)が含まれる[8]。
【０００７】
最先端技術で遭遇する問題は、以下のようにリストすることができる：
・軟骨形成、組織工学、治療研究および審美的軟骨移植、軟骨形成および軟骨充填に使用される材料に対する炎症および免疫応答が、体に対して発生し、細胞がこれらの材料の使用を制限する；
・軟骨形成に対するこれらの材料の活性が、不十分である；
・細胞療法が行われている研究では、細胞によって引き起こされるその後の合併症が不明である；
・治療の短期的な効果が、長期的には不十分である。
【０００８】
最先端の出願の1つであるEP2551342の番号が付けられた欧州特許出願文書は、軟骨細胞、骨細胞、神経細胞または脂肪細胞へのヒト下鼻甲介間葉系間質細胞の分化を誘導する方法を開示する。前記発明の方法は、軟骨細胞を単離および培養するための方法である。
【０００９】
最先端の出願の1つであるEP3145514の番号が付けられた欧州特許出願文書は、骨、軟骨、歯、および歯周組織の再生のための製剤を開示する。前記発明で開発された製剤を投与することにより、骨および/または軟骨の成長は、骨折および軟骨損傷の治療のために刺激される。本発明を開発するために実施された実験的研究において、歯髄から単離された幹細胞は、ペトリ皿にてDMEM培地中で培養される。
【００１０】
最先端の出願の1つであるEP1926507の番号が付けられた欧州特許出願文書は、軟骨欠損の修復のためのインプラントおよび前記インプラントを製造するための方法を開示する。インプラントは、軟骨形成能を有する自家細胞でコーティングされている天然軟骨組織のインプラント体を含む。これらの細胞は、軟骨生検から単離された軟骨細胞から始まるインビトロ細胞増殖によって産生される。
【００１１】
最先端の出願の1つであるUS2017296590の番号が付けられた米国特許出願文書は、軟骨細胞の分化を誘導するか、または軟骨組織を再生するための組成物を開示する。前記発明の組成物は、軟骨細胞に分化する幹細胞に由来するエクソソームを含む。前記発明において、脂肪幹細胞は軟骨細胞に分化し、軟骨細胞からエクソソームが単離される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概略
本発明の目的は、審美的および治療的目的のために、単離された中隔軟骨エクソソームから軟骨形成を誘導することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、その抗炎症特性の結果として、身体および細胞への免疫応答、炎症、毒性および刺激を生じさせない軟骨の形成である。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、変形性関節症または関節症などの軟骨組織欠損の治療に使用される軟骨組織を、それが軟骨形成を誘導し、また炎症反応を抑制するので、単離された中隔軟骨エクソソームから得ることである。
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明の目的を達成するために開発された「軟骨組織を生成するために使用される単離された中隔軟骨エクソソーム」は、添付の図で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】MTS試験を使用した、中隔細胞から得られたエクソソームの異なる濃度での幹細胞への24、48および72時間の投与が細胞生存率に及ぼす影響の評価のグラフ表示である。
【図２】幹細胞に異なる濃度を投与することによる、CD44(a)およびSOX9(b)遺伝子発現レベルに対する中隔細胞および軟骨分化培地から得られた効果エクソソームの評価のグラフ表示である。
【図３】幹細胞に異なる濃度のエクソソームを投与することによる、細胞に対する中隔細胞から得られたエクソソームのアポトーシス効果の評価のグラフ表示である。(a1-中隔細胞から得られたエクソソームのみの投与(100%)、a2-中隔細胞から得られたエクソソームのみの投与(50%)、a3-中隔細胞から得られたエクソソームのみの投与(25%)、a4-細胞培地のみを投与することによる細胞の増殖、b-図3a1、a2、a3、a4のグラフ表示)
【図４】中隔細胞エクソソーム(a)、エクソソーム/軟骨分化培地混合物(1：1)(b)、軟骨分化培地で10日間処理した細胞のアルシアンブルー染色の表現(c)、および光学顕微鏡による対照適用(d)。
【図５】本発明の範囲における花粉(a)およびダニ(b)アレルゲン活性化白血球に対する中隔細胞エクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図６】本発明の範囲におけるIL2(a)およびPHA(b)活性化白血球に対する中隔細胞エクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、中隔軟骨から単離された細胞によって放出される微小胞によって生成される、軟骨組織の生成のための製剤の開発に関する。本発明の実施において、中隔軟骨幹細胞が使用される。軟骨細胞から得られた微小胞は、幹細胞の軟骨分化に影響を与えることが観察されている。これらの微小胞の有効範囲は、5〜100体積%と決定されている。微小胞は、dH2O、EtOH、細胞培養培地、PBS、DMSOおよびそれらの混合物の溶液で溶解することができる。軟骨由来細胞からのこれらのエクソソームの単離は、これらのエクソソームに軟骨を形成する能力を提供し、同様に幹細胞の炎症抑制特性を組み込む。したがって、これらのエクソソームが軟骨形成を促進し、炎症を抑制するという事実は、実験的に証明され、図に示される。これらの特性により、これらのエクソソームは軟骨損傷および免疫系関連疾患の治療に使用することができる。
【００１８】
最新技術に関する本発明の製剤の差異の1つは、中隔軟骨から単離された細胞の使用であり、それは、それがどこから単離されるか、および特徴的に異なる細胞型の使用の両方に関して有意な差異をもたらす。さらに、本発明の範囲内で、これらの細胞の特別な成分であるエクソソームが使用される。これらのエクソソームは、細胞外へ細胞から放出される化学物質の一部にすぎない。本発明の範囲内で、中隔細胞のエクソソームの使用は、軟骨組織形成を増加させ、それが自家ではない場合でも炎症を引き起こさない。幹細胞の免疫抑制作用を有する、これらの幹細胞由来のエクソソームは、自家ではないが炎症を起こさず、また、炎症を抑制する(図5および6)。本発明の範囲内で、化学物質に曝露されていない未分化の中隔細胞によって培地に放出されたエクソソームが単離される。
【００１９】
単離された中隔軟骨エクソソームは、変形性関節症、肋骨肋軟骨連結の炎症、ティーツェ症候群または関節症などの軟骨組織の欠損の治療に使用するための軟骨組織の形成を誘導する；そしてそれらの抗炎症特性の結果として、それらは免疫応答、炎症、毒性および身体と細胞への刺激を引き起こさない軟骨の形成を可能にする。本発明の範囲内でこれらの単離された中隔軟骨エクソソームから軟骨組織を形成する方法は、以下のステップを含む：
−  細胞培養インキュベーター内で、温度37℃および5%CO2にて、10%のエクソソーム枯渇ウシ胎児血清(Invitrogen)および1%のPSA(Biological Industries、Beit Haemek、イスラエル)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、軟骨細胞を培養する；
−  培養液中の細胞から微小胞を分離するために、二相性PEG-デキストランを含むエクソソーム単離溶液を使用する；
−  廃細胞を除去するために、培養培地から収集した培地を300gで10分間遠心分離する；
−  可能性がある細胞成分を除去するために、上清を新しいチューブに移し、14000gで30分間遠心分離する；
−  上清を新しいチューブに移し、その上に1/1体積のPEG-デキストラン溶液を加え、1000gで10分間遠心分離し、次に、下相に残っているエクソソームを収集する；
−  軟骨分化のための分化溶液を中隔軟骨エクソソームに1日おきに10日間投与する；
−  分化の結果として軟骨組織を得る。
【実施例】
【００２０】
実験的研究
1．毒性
96ウェル培養プレート(Corning Glasswork、Corning、NY)に、培養培地中に10%のエクソソーム枯渇ウシ胎児血清(Invitrogen)と1%のPSA(Biological Industries、Beit Haemek、イスラエル)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、5000細胞/ウェルで細胞を播種した後、細胞の生存率を1、2および3日目に測定した。3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシ-メトキシ-フェニル)-2-(4-スルホ-フェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)-法(CellTiter96 AqueousOne Solution；Promega、Southampton、UK)を用いて、細胞生存率を決定した。10μlのMTS溶液を100μlの培地中の細胞に加え、それを37℃にて暗所で2時間インキュベートした。インキュベーションプロセス後、ELISAプレートリーダー(Biotek、Winooski、VT)デバイスを介して490nmの波長で吸光度測定を行うことによって、細胞の生存率を観測した。
【００２１】
2．軟骨分化
6ウェル培養プレート(Corning Glasswork、Corning、NY)に、培養培地中に10%のエクソソーム枯渇ウシ胎児血清(Invitrogen)と1%のPSA(Biological Industries、Beit Haemek、イスラエル)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、50,000細胞/ウェルで細胞を播種した。翌日、中隔軟骨エクソソームおよび文献で軟骨分化に使用された分化溶液を隔日で10日間投与した。
【００２２】
軟骨分化に使用した培地および中隔細胞から得られたエクソソームの軟骨分化に対する影響を比較し、エクソソームがより効果的であることを示した(図3、4および5)。
【００２３】
3．リアルタイムPCR
培養細胞は、それ自体の特性を失い、新しい特性を獲得する可能性がある。これらの特性は、形態学的レベルと遺伝子発現レベルの両方である可能性がある。遺伝子発現レベルの変化を観察するためにリアルタイムPCR法を適用した。全RNAを単離し、6ウェル培養プレート(Corning Glasswork、Corning、NY)に50,000細胞/ウェルでダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に播種した細胞からcDNAを合成した。合成したcDNAを、最終体積が20μlになるようにFermentas Maxima SYBR Green混合物中のプライマーと混合し、遺伝子の発現レベルをBIO-RADデバイスを使用して分析した。
【００２４】
単離された中隔軟骨エクソソームから軟骨組織を生成するための本発明の方法の利点は、以下のように列挙することができる：
・軟骨形成を誘導する。
・炎症抑制作用がある。
・炎症を引き起こさない。
・細胞に毒性を誘導しない。
・使用後、細胞内で代謝されうる。
・変形性関節症および関節症の治療に使用することができる。
・軟骨組織欠損の治療に使用することができる。
・鼻の再建に使用することができる。
・審美的および治療的目的で軟骨形成を誘導する可能性が高い。
・組織工学における有効な薬剤として使用することができる。
・抗炎症作用があるため、体や細胞に対する免疫反応、炎症、毒性、刺激を引き起こさない。
・免疫抑制作用があるため、自己免疫疾患に使用することができる。
・軟骨形成を可能にし、炎症反応を抑える特性があるため、関節リウマチの治療に使用することができる。
【００２５】
参考文献
[1] Deans, R. J., & Moseley, A. B. (2000). Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental hematology, 28(8), 875-884.
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[3] Dagli, A. S., Ozdem, C., Akalin, Y., Ensari, S. 1993.「Rinoplastide Biyomateryeller」, K.B.B. ve Bas Boyun Cerrahisi Dergisi, Cilt: l Sayi: 2.
[4] Rotter, N., Bonassar, L. J., Tobias, G., Lebl, M., Roy, A. K., Vacanti, C. A. 2002.「Age dependence of biochemical and biomechanical properties of tissue-engineered human septal cartilage」, Biomaterials, 23(15), 3087-3094.
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【図１】
2022501034.tif 000003
【図２（ａ）】
2022501034.tif 000004
【図２（ｂ）】
2022501034.tif 000005
【図３（ａ１）】
2022501034.tif 000006
【図３（ａ２）】
2022501034.tif 000007
【図３（ａ３）】
2022501034.tif 000008
【図３（ａ４）】
2022501034.tif 000009
【図３（ｂ）】
2022501034.tif 000010
【図４（ａ）】
2022501034.tif 000011
【図４（ｂ）】
2022501034.tif 000012
【図４（ｃ）】
2022501034.tif 000013
【図４（ｄ）】
2022501034.tif 000014
【図５（ａ）】
2022501034.tif 000015
【図５（ｂ）】
2022501034.tif 000016
【図６（ａ）】
2022501034.tif 000017
【図６（ｂ）】
2022501034.tif 000018
【国際調査報告】
2022501034.tif 000019
2022501034.tif 000020