【手続補正書】
【提出日】平成22年5月7日(2010.5.7)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現分析のために複数のＲＮＡ種を含むフラグメント化ＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フラグメント化されたｍＲＮＡを含む組織試料からＲＮＡを得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＲＮＡをポリアデニル化する、工程、および
（ｃ）工程（ｂ）において得られた、ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換する工程
を包含する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記組織試料は、固定化された、パラフィン包埋された組織試料である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化ＲＮＡ中の前記ＲＮＡ種のサイズが、約２０塩基と約２０００塩基との間である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化ＲＮＡ中の前記ＲＮＡ種の平均サイズが、約５０塩基と約３００塩基との間である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、ポリアデニル化が、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼを用いて実施される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、脱ブロック化因子を用いて、前記フラグメント化ＲＮＡ種の３’末端を脱ブロック化する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ホスファターゼ酵素である、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記ホスファターゼは、仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）、細菌のアルカリホスファターゼ、エビのアルカリホスファターゼ、およびそれらの改変体からなる群より選択される、方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、またはその改変体である、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）、またはその改変体である、方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子が、前記ポリアデニル化工程（ｂ）を実施する前に取り除かれる、方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法であって、ここで、ポリアデニル化工程（ｂ）は、前記脱ブロック化因子の事前の除去を伴わずに実施される、方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の方法であって、ここで、前記脱ブロック化因子は、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）である、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）において得られたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡが、逆転写酵素およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いた処理によってｃＤＮＡに変換される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記逆転写酵素は、トリ骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、およびＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた組み換えヘテロダイマー逆転写酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記オリゴ−ｄＴプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）において得られた前記ポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に固定化される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記固定化は、ビーズ上で実施される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記固定化されたポリアデニル化されたフラグメント化ＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換の前に濃縮される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記濃縮は、相補的ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを固定化されたビーズへのハイブリダイゼーションによるｒＲＮＡ配列の除去を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記組織試料は、腫瘍由来である、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍は、癌である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部の癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍からなる群より選択される、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
（ｄ）工程（ｃ）において得られた前記ｃＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡに変換する、工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において得られた該二本鎖ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供することによって、前記ＲＮＡを増幅し、増幅された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、工程（ｄ）において、前記ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖ＤＮＡへと変換される、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）由来の前記増幅されたｃＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングアッセイにおいて、テンプレートとして直接的に使用される、方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）は、検出可能な標識を用いて前記増幅されたｃＲＮＡを標識化する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識は、ビオチン標識または蛍光標識である、方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載の方法であって、工程（ｅ）において得られた前記増幅されたｃＲＮＡを、マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションに供する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
遺伝子発現分析のための複数ＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）固定され、パラフィン包埋された組織試料からＲＮＡを得る工程、
（ｂ）該ＲＮＡをポリアデニル化する工程；および
（ｃ）逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、該ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する、工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、ここで、前記ＲＮＡは、ブロック化された３’末端を伴うＲＮＡ種を含む、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記ブロック化されたＲＮＡ種を脱ブロック化する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、遺伝子発現分析のために、前記オリゴｄＴでプライミングされたｃＤＮＡを直接的に使用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子発現分析は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）によって実施される、方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法であって、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡｓｅ Ｈを用いて前記オリゴｄＴ−Ｔ７でプライミングされたｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する工程、ならびに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰを用いて該二本鎖ＤＮＡを増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法であって、前記オリゴｄＴ−Ｔ７でプライミングされたｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する工程、ならびに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化されたｒＮＴＰを用いて該二本鎖ＤＮＡを増幅する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３８】
遺伝子発現分析のための複数のＲＮＡ種を含むＲＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）固定され、パラフィン包埋された組織試料からＲＮＡを得る工程、
（ｂ）該ＲＮＡをポリアデニル化する工程；ならびに
（ｃ）逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴｄＴ−Ｔ７プライマーによって、該ポリアデニル化されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において得られた二本鎖ＤＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供し、増幅された相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を得る工程
を包含する、方法。