(57)【要約】  Ｔ細胞を活性化及び拡大培養するための方法が本明細書に提供される。治療のためにＴ細胞を使用するための方法がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲ改変免疫細胞を活性化及び／又は拡大培養するためのインビトロ方法であって、
（ａ）ＣＡＲ改変免疫細胞の開始集団を得ることと、
（ｂ）前記ＣＡＲ改変免疫細胞の集団を、プロテインＬの存在下において、活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の集団を生成するために十分な期間にわたって培養することと
を含むインビトロ方法。
【請求項２】
前記プロテインＬは、培養表面上にコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養表面が、培養プレート、培養フラスコ、マイクロキャリア、微小粒子、ハイドロゲル粒子又は培養バッグである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養が、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗原特異的標的細胞の不在下で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及び／又はマクロファージである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、αβＴ細胞又はγδＴ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ８+Ｔ細胞について選択することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞が、同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞が、自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉＰＳＣが、血球からリプログラムされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｉＰＳＣが、Ｔ細胞からリプログラムされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳＣが、エピソーム的にリプログラムされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞が、初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は初代造血幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉＰＳＣが、サイトカイン誘導分化を通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｉＰＳＣが、フォワードプログラミングを通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＡＲが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＲが、ＣＤ２８同時刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養表面が、レトロネクチン、フィブロネクチン又はＶＣＡＭ１でさらにコーティングされている、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記レトロネクチンが、０．１〜１μｇ／ｃｍ2の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記レトロネクチンが、０．５μｇ／ｃｍ2の濃度である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養表面が、ノッチリガンドＤＬＬ４でさらにコーティングされている、請求項２又は２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＬＬ４が、０．１〜１μｇ／ｃｍ2の濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＬＬ４が、０．５μｇ／ｃｍ2の濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養が、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１５が、５〜１５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１５が、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養が、低酸素条件下におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記低酸素条件が、５％の酸素を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記十分な期間が、８〜１２日である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記十分な期間が、８、９又は１０日である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養が、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＬ−７を含む培地中におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＬ−７が、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地が、ニコチンアミドをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
非ＣＡＲ改変免疫細胞と比べてＣＡＲ改変免疫細胞の選択的な拡大培養をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＡＲ改変免疫細胞の拡大培養された集団の少なくとも４０％又は５０％が、ＣＡＲ改変免疫細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団が、少なくとも２５％のＣＤ３+ＣＤ８+ＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団が、抗ＣＤ３で拡大培養されたＣＡＲ改変Ｔ細胞と比べて２〜３倍高い細胞傷害性活性を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団が、抗ＣＤ３で拡大培養されたＣＡＲ改変Ｔ細胞と比べて増加したＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαレベルを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の集団。
【請求項４２】
請求項４１に記載の活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の集団及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項４３】
対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の、請求項４１に記載の活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞が、同種異系である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞が、自己である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも第２の治療薬が、治療有効量の免疫調節剤又は免疫抑制剤である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも第２の治療薬が、化学療法、放射線療法及び免疫療法からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記活性化及び／若しくは拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞並びに／又は前記少なくとも第２の治療薬が、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病変内に、経皮的に、皮下に、局所に、直接注射によって又は灌流によって投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための、請求項４１又は４２に記載の組成物の使用。
【請求項５１】
ＣＡＲ改変免疫細胞及びプロテインＬを含む組成物。
【請求項５２】
前記プロテインＬが、培養表面上にコーティングされている、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
レトロネクチンをさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７３３，２９１号明細書の利益を主張し、その全体は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、概して、免疫学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞の方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
養子がん免疫療法は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）のインビトロ拡大培養によって作製され得る、腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変された免疫細胞の移植を含む。現在、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３活性化抗体（Ａｂ）を用いる従来の方法を用いてインビトロで拡大培養される。この方法では、すべてのＴ細胞は、ＣＡＲの発現と無関係に増殖するように誘導され、ＣＡＲに特異的な様式ではない。この方法は、ＣＤ３で拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ集団におけるＣＡＲの発現及び機能の「サイレンシング」をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、単離された形態であるか又は支持細胞によって発現されるかのいずれかである、ＣＡＲに特異的な腫瘍抗原を有する培養物中で選択的に拡大培養され得るが、抗原培養物は、特異的なＣＡＲタイプに限って適用可能である。この手法は、特に治療用細胞の作製にとって一般的でないか又はあまり実用的でない。したがって、ＣＤ３活性化に基づく汎Ｔ細胞拡大培養物と同様に、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の分野は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＡＲに特異的な様式で活性化及び拡大培養され得る場合、一般的な汎ＣＡＲ特異的インビトロ培養物から利益を得るであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態では、本開示は、ＣＡＲ改変免疫細胞を活性化及び／又は拡大培養するためのインビトロ方法であって、ＣＡＲ改変免疫細胞の開始集団を得ることと、前記ＣＡＲ改変免疫細胞の集団を、プロテインＬの存在下において、活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の集団を生成するために十分な期間にわたって培養することとを含むインビトロ方法を提供する。
【０００６】
特定の態様では、プロテインＬは、０．１〜５μｇ／ｃｍ2、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０．１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４又は２．５μｇ／ｃｍ2の濃度で存在する。特に、プロテインＬは、１〜５μｇ／ｍＬ、例えば１．５、２、２．５、３、３．５、４又は４．５μｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。いくつかの態様では、プロテインＬは、培養表面上にコーティングされる。例えば、培養表面は、培養プレート、培養フラスコ、マイクロキャリア、微小粒子、ハイドロゲル粒子又は培養バッグであり得る。
【０００７】
いくつかの態様では、培養物は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗原特異的標的細胞を含まない。特定の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及び／又はマクロファージである。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、αβＴ細胞又はγδＴ細胞である。特定の態様では、方法は、ＣＤ８+Ｔ細胞について選択することをさらに含む。
【０００８】
特定の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、同種異系（allogeneic）である。他の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、自己である。具体的な態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来する。特定の態様では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの態様では、ｉＰＳＣは、血球又はＴ細胞からリプログラムされる。具体的な態様では、ｉＰＳＣは、エピソーム的にリプログラムされる。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は初代造血幹細胞に由来する。特定の態様では、ｉＰＳＣは、サイトカイン誘導分化を通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される。特定の態様では、ｉＰＳＣは、フォワードプログラミングを通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される。例えば、ＣＡＲは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合ドメインを含み得る。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２８同時刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【０００９】
いくつかの態様では、培養表面は、レトロネクチン、フィブロネクチン又はＶＣＡＭ１でさらにコーティングされる。特定の態様では、レトロネクチンは、０．１〜１μｇ／ｃｍ2、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０μｇ／ｃｍ2又はそれを超える濃度で培養物に添加される。さらなる態様では、培養プレートは、ノッチリガンドＤＬＬ４でさらにコーティングされる。具体的な態様では、ＤＬＬ４は、０．１〜１μｇ／ｃｍ2、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０μｇ／ｃｍ2又はそれを超える濃度で培養物に添加される。
【００１０】
さらなる態様では、培養物は、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５をさらに含む。いくつかの態様では、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１５は、５〜１５ｎｇ／ｍＬ、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｎｇ／ｍＬ又はそれを超える濃度で存在する。
【００１１】
特定の態様では、培養は、低酸素条件下におけるものである。いくつかの態様では、低酸素条件は、５％の酸素を含む。
【００１２】
いくつかの態様では、十分な期間は、８〜１２日、例えば８、９又は１０日である。いくつかの態様では、培養は、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＬ−７を含む培地中におけるものである。特定の態様では、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ及び／又はＩＬ−７は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの態様では、培地は、ニコチンアミドをさらに含む。
【００１３】
特定の態様では、方法は、非ＣＡＲ改変免疫細胞と比べてＣＡＲ改変免疫細胞の選択的な拡大培養をもたらす。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞の拡大培養された集団の少なくとも４０％又は５０％は、ＣＡＲ改変免疫細胞である。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団は、少なくとも２５％のＣＤ３+ＣＤ８+ＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む。特定の態様では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団は、抗ＣＤ３で拡大培養されたＣＡＲ改変Ｔ細胞と比べて２〜３倍高い細胞傷害性活性を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の拡大培養された集団は、抗ＣＤ３で拡大培養されたＣＡＲ改変Ｔ細胞と比べて増加したＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαレベルを含む。
【００１４】
別の実施形態では、本明細書に提供される実施形態及びそれらの態様の活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の集団が提供される。さらに、実施形態のＣＡＲ改変免疫細胞の集団及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【００１５】
本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の、実施形態の拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、同種異系である。他の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、自己である。
【００１６】
さらなる態様では、方法は、少なくとも第２の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の治療薬は、治療有効量の免疫調節剤又は免疫抑制剤である。いくつかの態様では、少なくとも第２の治療薬は、化学療法、放射線療法及び免疫療法からなる群から選択される。特定の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞及び／又は少なくとも第２の治療薬は、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病変内に、経皮的に、皮下に、局所に又は直接注射若しくは灌流によって投与される。
【００１７】
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための、本明細書に提供される実施形態の活性化及び／又は拡大培養されたＣＡＲ改変免疫細胞の組成物の使用。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、同種異系である。他の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、自己である。
【００１８】
さらに、ＣＡＲ改変免疫細胞及びプロテインＬを含む組成物が本明細書に提供される。特定の態様では、プロテインＬは、０．１〜５μｇ／ｃｍ2、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０．１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４又は２．５μｇ／ｃｍ2の濃度で存在する。特に、プロテインＬは、１〜５μｇ／ｍＬ、例えば１．５、２、２．５、３、３．５、４又は４．５μｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。いくつかの態様では、プロテインＬは、培養表面上にコーティングされる。例えば、培養表面は、培養プレート、培養フラスコ、マイクロキャリア、微小粒子、ハイドロゲル粒子又は培養バッグであり得る。
【００１９】
いくつかの態様では、培養表面は、レトロネクチン、フィブロネクチン又はＶＣＡＭ１でさらにコーティングされる。特定の態様では、レトロネクチンは、０．１〜１μｇ／ｃｍ2、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０μｇ／ｃｍ2又はそれを超える濃度で培養物に添加される。さらなる態様では、培養プレートは、ノッチリガンドＤＬＬ４でさらにコーティングされる。具体的な態様では、ＤＬＬ４は、０．１〜１μｇ／ｃｍ2、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０μｇ／ｃｍ2又はそれを超える濃度で培養物に添加される。
【００２０】
いくつかの態様では、培養物は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗原特異的標的細胞を含まない。特定の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及び／又はマクロファージである。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、αβＴ細胞又はγδＴ細胞である。特定の態様では、ＣＤ８+Ｔ細胞について選択することをさらに含む方法である。
【００２１】
特定の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、同種異系である。他の態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、自己である。具体的な態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来する。特定の態様では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの態様では、ｉＰＳＣは、血球又はＴ細胞からリプログラムされる。具体的な態様では、ｉＰＳＣは、エピソーム的にリプログラムされる。いくつかの態様では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は初代造血幹細胞に由来する。特定の態様では、ｉＰＳＣは、サイトカイン誘導分化を通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される。特定の態様では、ｉＰＳＣは、フォワードプログラミングを通してＣＤ３４+前駆細胞まで分化される。例えば、ＣＡＲは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合ドメインを含み得る。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２８同時刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び改変形態がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、あくまで例示を目的として与えられることが理解されるべきである。
【００２３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の１つ以上を、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】プロテインＬは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の発現を用量依存的に誘導する。Ｔ細胞の拡大倍数がプロテインＬ単独の存在下又はレトロネクチン及び／若しくはＤＬＬ４との組み合わせで示される。
【００２５】
【図２】プロテインＬとレトロネクチンとの組み合わせにより、プロテインＬ単独と比べて効率的なＣＡＲ−Ｔの拡大培養が得られた。プロテインＬ単独の存在下又はレトロネクチン及び／若しくはＤＬＬ４の組み合わせで拡大培養されたＴ細胞について、ＣＤ８及びＣＤ３発現のフローサイトメトリー分析が示される。
【００２６】
【図３】抗ＣＤ３モノクローナル抗体によるＴ細胞拡大培養と、プロテインＬによるＴ細胞拡大培養との比較である。
【００２７】
【図４Ａ−Ｂ】（図４Ａ）ＣＤ１９+Ｐ１５細胞を有する培養物は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、ｓＦａｓＬ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２及びＩＬ１３の誘導性産生を示した。抗ＣＤ３モノクローナル抗体によるＴ細胞拡大培養におけるサイトカイン産生と、プロテインＬによるＴ細胞拡大培養におけるサイトカイン産生との比較である。（図４Ｂ）プロテインＬによって誘導されたＣＡＲ依存性インビトロサイトカイン産生である。
【００２８】
【図５】抗ＣＤ３  ｍＡｂで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞と、プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞との両方がＣＤ１９+Ｐ８１５、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞に対して強力な細胞傷害性活性を示す。
【００２９】
【図６】ＣＡＲ−Ｔ注射後６週までのＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスにおける腫瘍成長である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
プロテインＬは、ＣＡＲの抗原結合部位を構成する、最小抗原結合部分−一本鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）を含む免疫グロブリンの軽鎖に結合するような固有の特異性を有する細菌タンパク質である。プロテインＬが細胞表面ＣＡＲに結合し得ることが示された（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、Ｚｈｅｎｇらは、フローサイトメトリーにより、ＣＡＲの発現を検出するための試薬としてのプロテインＬの可能性を実証した。
【００３１】
プロテインＬは、抗原結合部位に干渉することなく、可変軽鎖との特異的な高親和性相互作用を通して免疫グロブリン（Ｉｇ）に結合する細菌タンパク質である。プロテインＬは、ＣＡＲの抗原結合ドメインを構成する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）内部の軽鎖成分にも結合し得る。プロテインＬの別の固有の特徴は、１分子中に５つの同一のＩｇ結合部位を有するその多重ドメイン構造である。多価結合、したがって細胞表面に発現される標的分子の潜在的な架橋は、プロテインＬが強力な細胞アクチベーターとして機能し得ることを示す。
【００３２】
プロテインＬは、ＣＡＲのｓｃＦｖ部分に結合されるとき、抗原結合部位に直接的に結合し、遮断しない一方、抗原結合を模倣し、ＣＡＲ活性化を誘導し得る。このようにして、それは、ＣＡＲ誘導性細胞応答の機能的分析及び治療適用のためのＣＡＲ発現細胞の拡大培養を含む、ＣＡＲ改変細胞を伴う細胞培養用途における一般的なＣＡＲ活性化試薬として使用可能である。
【００３３】
したがって、特定の実施形態では、本開示は、ＣＡＲ改変エフェクター免疫細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞及びＣＡＲ−マクロファージ細胞の活性化及び／又は拡大培養のための、プロテインＬの使用を含む方法及び組成物を提供する。したがって、本方法は、ＣＡＲ改変細胞の、その抗原特異性に依存しない活性化及び拡大培養のための一般的な細胞培養系を提供する。
【００３４】
抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ改変ＰＳＣ由来のＴ細胞を使用して、本研究は、固定化されたプロテインＬがＣＡＲ改変Ｔ細胞内で（非改変Ｔ細胞内でない）特異的な増殖性応答を誘導するという実験的証拠を提供する。レトロネクチン（組換えフィブロネクチン断片）がプロテインＬのＣＡＲ誘導性機能を支持する一方、ノッチリガンドＤＬＬ４がＣＤ１９+ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖性応答及び拡大培養をさらに改善し得ることが見出された。抗ＣＤ３モノクローナル抗体及びプロテインＬの培養物中で拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞を比較したとき、優位なＣＡＲ媒介性サイトカイン産生、インビトロ及びインビボ抗腫瘍活性は、プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞内で見出された。
【００３５】
したがって、プロテインＬは、インビトロでのＣＡＲ改変細胞の特異的な活性化、拡大培養及び分析のための細胞培養試薬として同定された。プロテインＬは、動物を含まない条件下で生成されることから、治療用途に適したＧＭＰ適合培養として使用され得る。本方法は、ＰＳＣ由来のＣＡＲ−Ｔ治療薬の開発のために使用され得る。具体的用途として、ＰＳＣ由来のＴ細胞にとって最適なＣＡＲ立体配置の選択、ＣＡＲ−Ｔ細胞のための品質管理アッセイ及び前臨床動物試験のためのＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大培養が挙げられる。
【００３６】
Ｉ．定義
本明細書で用いられるとき、「本質的に含まない」は、特定の成分の観点から、意図的に組成物に製剤化されている特定の成分がなく、且つ／又はあくまで汚染物質として若しくは微量に存在することを意味するように本明細書で用いられる。したがって、組成物の任意の意図されない汚染物質から得られる特定の成分の総量は、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％未満である。標準的な分析法で特定の成分の量が検出できないような組成物が最も好ましい。
【００３７】
本明細書で用いられるとき、本明細書における「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書では、請求項において用語「含む」と組み合わせて用いられるとき、用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００３８】
特許請求の範囲内での用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すことが明示されない限り、「及び／又は」を意味するように用いられるか、又は本開示が選択肢のみと「及び／又は」とを指す定義を支持しても、選択肢は、相互に排他的である。本明細書で用いられるとき、「別の」は、少なくとも第２の又はそれを超えるものを意味し得る。
【００３９】
用語「約」は、記載される値±５％を指す。
【００４０】
本明細書で用いられるとき、特定の物質又は材料を「本質的に含まない」組成物は、３０％、２０％、１５％、より好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％又は最も好ましくは１％のその物質又は材料を含有する。
【００４１】
「発現構築物」又は「発現カセット」は、転写を誘導する能力がある核酸分子を意味する。発現構築物は、最低限、１つ以上の所望される細胞型、組織又は臓器における遺伝子発現を誘導する１つ以上の転写調節エレメント（プロモーター、エンハンサー又はその機能的に均等な構造など）を含む。追加的なエレメント、例えば転写終結シグナルも含まれ得る。
【００４２】
「ベクター」又は「構築物」（ときに遺伝子送達系又は遺伝子導入「媒体」と称される）は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む分子の高分子又は複合体を指す。
【００４３】
ベクターの一般的なタイプとして、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと独立に複製する能力がある、染色体ＤＮＡから分離された染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合、それは、環状の二本鎖である。
【００４４】
本明細書で用いられるとき、用語「患者」又は「対象」は、生存哺乳動物、例えばヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット又はそれらのトランスジェニック種を指す。特定の実施形態では、患者又は対象は、霊長類である。ヒト患者の非限定例として、成人、若年者、幼児及び胎児が挙げられる。
【００４５】
用語「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」及び「がん細胞抗原」は、本明細書で互換可能に用いられる。それぞれの場合、用語は、がん細胞によって特異的又は優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質又は炭水化物を指す。
【００４６】
「エピトープ」は、アミノ酸配列の特異性によって判定される、抗体によって認識される抗原上の部位である。２つの抗体は、競合的結合アッセイにおいて測定されるとき、各々が抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じエピトープに結合すると言われる。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減又は除去する抗原内の大部分のアミノ酸突然変異が他方の結合を低減又は除去する場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、各々が他方の抗原への部分的に阻害する場合、及び／又は一方の抗体の結合を低減若しくは除去する一部のアミノ酸突然変異が他方の結合を低減若しくは除去する場合、重複エピトープを有すると言われる。
【００４７】
疾患又は病態の「処置する」又は「処置」は、疾患の徴候又は症状を軽減するための取り組みにおいて、１つ以上の薬剤を患者に投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。望ましい治療の効果は、疾患進行の速度を低減すること、病態を寛解又は緩和させること及び軽快又は改善された予後を含む。軽減は、疾患又は病態の徴候又は症状が出現する前及びそれらの出現後に生じ得る。したがって、「処置する」又は「処置」は、疾患又は望ましくない状態を「予防する」こと又はその「予防」を含み得る。さらに、「処置する」又は「処置」は、徴候又は症状の完全軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には患者に対する限界効果のみを有するプロトコルを含む。
【００４８】
用語「有効な」は、その用語が本明細書及び／又は特許請求の範囲で使用されるとき、所望、予想又は意図される結果を得るのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」又は「医薬的有効量」は、化合物による患者又は対象の処置との関連で使用される場合、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与されるとき、化合物の量が、疾患のかかる処置又は予防をもたらすのに十分な量であることを意味する。
【００４９】
「処置」又は「処置する」は、（１）疾患の病理又は症候を経験しているか又は呈している対象又は患者における疾患を阻害すること（例えば、病理及び／又は症候のさらなる発生を停止させること）、（２）疾患の病理又は症候を経験しているか又は呈している対象又は患者における疾患を寛解させること（例えば、病理及び／又は症候を回復させること）、及び／又は（３）疾患の病理又は症候を経験しているか又は呈している対象又は患者における疾患又はその症状における任意の測定可能な減少をもたらすことを含む。
【００５０】
「予防」又は「予防する」は、（１）疾患のリスクがあり、且つ／又は素因となり得るが、疾患の病理又は症候のいずれか又はすべてを依然として経験又は呈していない対象又は患者における疾患の発症を阻害すること、及び／又は（２）疾患のリスクがあり、且つ／又は素因となり得るが、疾患の病理又は症候のいずれか又はすべてを依然として経験又は呈していない対象又は患者における疾患の病理又は症候の発症を緩徐化することが挙げられる。
【００５１】
用語「フォワードプログラミング」は、１つ以上の特異的な系列決定遺伝子又は遺伝子産物の多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）若しくは多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞への供給による、多能性を有しない分化された体細胞と異なる多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）又は多能性（複能性：ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞のプログラミングを指す。
【００５２】
本明細書で一般に用いられる通り、「薬学的に許容できる」は、健全な医学的判断の範囲内において、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わない、ヒト及び動物の組織、臓器及び／又は体液との接触における使用に適するような化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
【００５３】
「薬学的に許容できる塩」は、上で定義される通り、薬学的に許容可能であり、且つ所望される薬理学的活性を有する、本明細書で開示される化合物の塩を意味する。かかる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；又は１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ及びジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第三級ブチル酢酸、トリメチル酢酸などの有機酸と形成される酸付加塩を含む。薬学的に許容できる塩は、存在する酸性陽子が無機又は有機塩基と反応する能力があるときに形成され得る塩基付加塩も含む。許容できる無機塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム及び水酸化カルシウムを含む。許容できる有機塩基は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどを含む。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオン又はカチオンは、塩が全体として薬理学的に許容できる限り、重要でないことが理解される必要がある。薬学的に許容できる塩のさらなる例並びにそれらの調製及び使用方法については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ＆Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ  ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２００２）に提示されている。
【００５４】
「薬学的に許容できる担体」、「薬物担体」又は単純に「担体」は、化学薬品の運搬、送達及び／又は輸送に関与する活性成分薬物とともに製剤化された薬学的に許容できる物質である。例えば、薬剤の生物学的利用率を調節し、薬剤代謝を減少させ、且つ／又は薬剤毒性を低減するための徐放性技術を含めて、薬剤の送達及び有効性を改善するために薬物担体が使用され得る。いくつかの薬物担体は、特異的な標的部位への薬物送達の有効性を増強し得る。担体の例として、リポソーム、ミクロスフェア（例えば、乳酸−グリコール酸共重合体から作製）、アルブミンミクロスフェア、合成高分子、ナノファイバー、タンパク質−ＤＮＡ複合体、タンパク質コンジュゲート、赤血球、ビロソーム及びデンドリマーが挙げられる。
【００５５】
用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、本明細書で用いられるとき、例えば人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体を指し、且つ人為的特異性を特定の免疫エフェクター細胞に移植するように改変された受容体を包含し得る。ＣＡＲを利用し、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与し、それにより多数の特異的Ｔ細胞が例えば養子細胞療法における使用のために作製されることを可能にし得る。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）又はパターン認識受容体、例えばＤｅｃｔｉｎから誘導され得る。特定の場合、抗原認識ドメインのスペーシングは、活性化誘導細胞死を低減するように改変され得る。特定の場合、ＣＡＲは、追加的な同時刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えばＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０及び／又はＯＸ４０を含む。場合により、同時刺激分子、イメージング（例えば、陽電子放射断層撮影）のためのレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件的に除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含む分子がＣＡＲと同時発現され得る。
【００５６】
用語「培養する」は、好適な培地中での細胞のインビトロでの維持、分化及び／又は増殖を指す。「富化される」は、それらが、生物内に存在する組織内で見出される場合よりも大きい百分率で全細胞内に存在する細胞を含む組成物を意味する。
【００５７】
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞の死滅を促進するか、がん細胞内でアポトーシスを誘導するか、がん細胞の成長速度を低減するか、転移の発生率若しくは数を低減するか、腫瘍サイズを低減するか、腫瘍成長を阻害するか、腫瘍若しくはがん細胞への血液供給を低減するか、がん細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進するか、がんの進行を阻止若しくは阻害するか、又はがんを有する対象の寿命を延ばすことにより、対象におけるがん細胞／腫瘍に負の影響を及ぼす能力がある。
【００５８】
ＩＩ．ＣＡＲ改変免疫細胞
本開示の特定の実施形態は、ＣＡＲを発現する免疫細胞に関する。免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、α−βＴ細胞又はγ−δＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は人工多能性幹（ｉＰＳＣ）細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、単球又は顆粒球、例えば骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球及び／又は好塩基球である。さらに、免疫細胞を生成及び改変する方法並びに細胞が自己又は同種異系であり得る場合、養子細胞療法のために細胞を使用及び投与する方法が本明細書に提供される。したがって、免疫細胞は、例えば、がん細胞を標的にする免疫療法として使用され得る。
【００５９】
ＣＡＲ改変免疫細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞をプロテインＬの存在下で選択的に活性化及び／又は拡大培養するために、免疫細胞を活性化及び／又は拡大培養するための方法が本明細書に提供される。プロテインＬは、培養物中に単独で又はレトロネクチン及び／若しくはＤＬＬ４と組み合わせて存在し得る。
【００６０】
免疫細胞は、対象、特にヒト対象から単離され得る。免疫細胞は、目的の対象、例えば特定の疾患若しくは病態を有することが疑われる対象、特定の疾患若しくは病態に対する素因を有することが疑われる対象又は特定の疾患若しくは病態に対する治療を受診中の対象から得ることができる。免疫細胞は、それらが対象内で存在する任意の位置、例えば、限定はされないが、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節及び骨髄から収集され得る。単離された免疫細胞は、直接的に使用され得るか、又はある期間にわたって例えば凍結により貯蔵可能である。
【００６１】
免疫細胞は、それらが存在する任意の組織、例えば、限定はされないが、血液（血液バンク又は臍帯血バンクによって収集された血液を含む）、脾臓、骨髄、外科手技中に除去及び／又は曝露された組織並びに生検手技を介して得られた組織から濃縮／精製され得る。免疫細胞が濃縮、単離及び／又は精製される元の組織／臓器は、生存対象と非生存対象との両方から単離され得、ここで、非生存対象は、臓器ドナーである。
【００６２】
Ａ．Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。機能的な抗腫瘍エフェクター細胞の誘導、活性化及び拡大培養についてのいくつかの基本的手法は、ここ２０年において記載がなされている。これらは、自己細胞、例えば腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）；自己樹状細胞、リンパ球又はＴ細胞リガンド、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は活性化抗体でコーティングされたビーズ又は標的細胞膜を捕捉することによって単離された細胞を使用して生体外で活性化されたＴ細胞；抗宿主腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を天然に発現する同種異系細胞；並びに「Ｔボディ」として公知の抗体様腫瘍認識能力を示す腫瘍反応性ＴＣＲ又はキメラＴＣＲ分子を発現するように遺伝的にリプログラム又は「リダイレクト」された非腫瘍特異的自己又は同種異系細胞を含む。これらの手法は、本明細書に記載の方法において使用可能である、Ｔ細胞の調製及び免疫のための極めて多数のプロトコルをもたらしている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ、臍帯又はリンパ器官に由来する。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、典型的には、初代細胞、例えば対象から直接的に単離されたもの及び／又は対象から単離され、凍結されたものである。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型の１つ以上のサブセット、例えば全Ｔ細胞集団、ＣＤ４+細胞、ＣＤ８+細胞及びそれらの亜集団、例えば機能、活性化状態、成熟度、分化能、拡大培養、再循環、局在化及び／若しくは持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器若しくは区画における存在、マーカー若しくはサイトカイン分泌特性及び／又は分化度によって規定されるものを含む。処置される対象について、細胞は、同種異系であり得、且つ／又は自己であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の通り、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること及び／又は改変することと、それらを同じ患者に再導入することとを凍結保存の存在下又は不在下で含む。
【００６４】
Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団（例えば、ＣＤ４+及び／又はＣＤ８+Ｔ細胞）の中には、ナイーブＴ（ＴN）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴEFF）、メモリーＴ細胞及びそれらのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣM）、セントラルメモリーＴ（ＴＣM）、エフェクターメモリーＴ（ＴEM）又は高分化型エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然及び適応制御性Ｔ（Ｔreg）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞及びδ／γＴ細胞が含まれる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団の１つ以上は、特定のマーカー、例えば表面マーカーについて陽性である細胞又は特定のマーカーについて陰性である細胞について富化又は枯渇される。場合により、かかるマーカーは、Ｔ細胞の特定の集団（例えば、非メモリー細胞）上で不在であるか又は比較的低いレベルで発現されるが、Ｔ細胞の特定の他の集団（例えば、メモリー細胞）上で存在するか又は比較的より高いレベルで発現されるものである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞、例えばＢ細胞、単球又は他の白血球上で発現されるマーカー（例えばＣＤ１４）のネガティブ選択により、ＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞とＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞とを分離するため、ＣＤ４+又はＣＤ８+の選択ステップが使用される。かかるＣＤ４+集団及びＣＤ８+集団は、１つ以上のナイーブ、メモリー及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団上で発現されるか又は比較的より高度に発現されるマーカーについてのポジティブ選択又はネガティブ選択により、亜集団にさらに選別され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８+Ｔ細胞は、例えば、各亜集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ選択又はネガティブ選択により、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及び／又はセントラルメモリー幹細胞についてさらに富化又は枯渇される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴCM）細胞についての富化は、有効性を増強し、例えばいくつかの態様ではかかる亜集団内で特に強固である投与後の長期生存、拡大培養及び／又は生着を改善するために実施される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞である。この方法では、腫瘍サンプルが患者から得られ、単一細胞懸濁液が得られる。単一細胞懸濁液は、任意の好適な様式において、例えば機械的に（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．を用いて腫瘍を脱凝集する）又は酵素的に（例えば、コラゲナーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ）得ることができる。腫瘍酵素的消化物の単一細胞懸濁液は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）で培養される。
【００６９】
培養されたＴ細胞は、プールされ、迅速に拡大培養され得る。急速な拡大培養により、約１０〜約１４日の期間にわたり、少なくとも約５０倍（例えば、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍若しくは１００倍又はそれを超える）の、抗原特異的Ｔ細胞の数における増加がもたらされる。より好ましくは、急速な拡大培養により、約１０〜約１４日の期間にわたり、少なくとも約２００倍（例えば、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍又はそれを超える）の増加がもたらされる。
【００７０】
拡大培養は、当技術分野で公知であるいくつかの方法のいずれかにより達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、フィーダーリンパ球及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のいずれか（ＩＬ−２が好ましい）の存在下での非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ（登録商標）、Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．から入手可能）を含み得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞成長因子、例えば３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２又はＩＬ−１５（ＩＬ−２が好ましい）の存在下において、任意選択的にベクターから発現され得るがんの１つ以上の抗原（その抗原部分、例えばエピトープ又は細胞を含む）、例えばヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドによるインビトロでの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激により、急速に拡大培養され得る。インビトロで誘導されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞上に瞬間適用されるがんの同じ抗原での再刺激により、急速に拡大培養される。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、照射された自己リンパ球又は照射されたＨＬＡ−Ａ２＋異種リンパ球及びＩＬ−２で再刺激され得る。
【００７１】
自己Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞の成長及び活性化を促進するＴ細胞成長因子を発現するように改変され得る。好適なＴ細胞成長因子として、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−１２が挙げられる。好適な改変方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３rd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。特定の態様では、改変された自己Ｔ細胞は、Ｔ細胞成長因子を高レベルで発現する。Ｔ細胞成長因子コード配列、例えばＩＬ−１２のものは、プロモーターのように、Ｔ細胞成長因子コード配列に対するその作動可能な結合が高レベル発現を促進することから、当技術分野で容易に利用可能である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、プロテインＬの存在下で活性化及び／又は拡大培養される。プロテインＬは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又は３．０μｇ／ｃｍ2の濃度で培養物に添加され得る。プロテインＬは、表面に固定化された培養物に添加されるか、又は培地に可溶性であり得る。培養表面は、培養プレート、培養フラスコ、マイクロキャリア、微小粒子、ハイドロゲル粒子又は培養バッグである。プロテインＬは、細胞外マトリックスタンパク質、例えばレトロネクチン又はフィブロネクチンと組み合わせて添加され得る。
【００７３】
Ｂ．幹細胞
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ改変免疫細胞は、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来し得るか又は由来する。
【００７４】
胚細胞、赤血球及び血小板を例外として、任意の細胞がｉＰＳＣにおける開始点として使用可能である。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉系細胞、肝細胞又は胃細胞であり得る。細胞分化の程度又は細胞が収集される動物の年齢に対する制限はなく、本明細書で開示される方法における体細胞の供給源としては、未分化前駆細胞（体性幹細胞を含む）及び最終分化成熟細胞であっても使用可能である。
【００７５】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いてｉＰＳ細胞を生成するようにリプログラムされ得る。一般に、体細胞から多能性幹細胞を生成するために核再プログラミング因子が使用される。いくつかの実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の少なくとも３つ又は少なくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４が利用されるか、又はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８が利用される。
【００７６】
誘導されると、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地中で培養され得る。特定の実施形態では、未決定の条件が使用され得、例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態で維持するため、線維芽細胞支持細胞又は線維芽細胞支持細胞に曝露されている培地上で培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、支持細胞として、細胞分裂を終結させるために放射線又は抗生物質で処置されたマウス胚性線維芽細胞の共存下で培養される。代替的に、多能性細胞は、規定のフィーダー非依存性培養系、例えばＴＥＳＲ（商標）培地又はＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地を用いて、本質的に未分化な状態で培養及び維持され得る。
【００７７】
Ｃ．サイトカイン誘導分化
本開示の特定の実施形態は、ＰＳＣのＨＰＣへの分化に関する。ＰＳＣは、例えば、米国特許第８，３７２，６４２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載の当技術分野で公知の方法により、ＨＰＣに分化され得る。一方法では、造血分化を促進するため、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦの組み合わせが使用され得る。特定の実施形態では、分化のためのＰＳＣを調製するための第１の培地、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２の培地への細胞培養物の連続的曝露、それに続くＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を含む第３の培地中での培養により、多能性細胞がＨＰＣ及び造血細胞に分化され得る。第２の規定された培地は、ヘパリンも含み得る。さらに、ＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）をＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含有する培地へ含有させることにより、多能性細胞からの造血前駆細胞の生成効率が増強され得る。さらに、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ及びＳＢ−２１６７６３）を第１の規定された培地へ含有させることにより、ＨＰＣの生成がさらに増強され得る。
【００７８】
一般に、多能性細胞の造血前駆細胞への分化は、規定条件又は未規定条件を用いて実施され得る。得られる細胞がヒト対象への投与が意図される実施形態では、規定条件が一般に好ましいことが理解されるであろう。造血幹細胞は、（例えば、ＴｅＳＲ培地を使用する）規定条件下での多能性幹細胞に由来し得、また、造血細胞は、多能性細胞由来の胚様体から作製され得る。他の実施形態では、多能性細胞は、ＯＰ９細胞又はマウス胚性線維芽細胞上で共培養され、続いて分化され得る。
【００７９】
多能性細胞は、分化プロセスの一部として胚様体又は凝集体を形成することが可能であり得る。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）又は成長細胞のクラスターの形成は、一般にヒト多能性幹細胞のＥＢへのインビトロ凝集を含み、ヒト多能性幹細胞の内胚葉、外胚葉及び中胚葉起源を表す複数の組織タイプへの自発的及びランダム分化を可能にする。したがって、造血細胞及び内皮細胞のいくつかの画分を生成するため、三次元ＥＢが使用可能である。
【００８０】
ＥＢは、以下のプロトコルを用いて形成され得る。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティングプレート上でのフィーダーフリー成長に適応した未分化ｉＰＳＣは、室温で０．５ＭのＥＤＴＡ処置を用いて、培養密度で約８〜１０分間収集され得る。ＥＤＴＡは、インキュベーション後に吸引され、ＥＢは、ｒｏｃｋ阻害剤又はブレビスタチンを含有するＳＦＤ培地中の細胞を回収することにより形成され得る。培地は、翌日、異なるサイトカイン製剤を含有するＥＢ１分化培地に変更され得る。細胞は、凝集体形成を促進するため、２５万〜５０万個の細胞／ｍｌの密度で蒔かれる。
【００８１】
凝集体形成を促進するため、細胞は、低吸着プレートに移され、ＲＡ補助剤を有しない０．０５％Ｎ２及びＢ−２７、２００ｍＭの１−グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ  ２−Ｐ）（ＷＡＫＯ）及び４．５×１０-4のＭＴＧが添加された、７５％ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２５％ハム改変Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）からなる血清不含分化（ＳＦＤ）培地中で一晩インキュベートされ得る。翌日、細胞は、各ウェルから収集され、遠心分離され得る。次に、細胞は、分化の最初の４日間にわたり、約５０ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ４）、約５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び５０ｎｇ／ｍｌのｚｂ  ＦＧＦが添加されたＳＦＤ基礎培地からなる「ＥＢ分化培地」に再懸濁され得る。細胞は、４８時間ごとに半分供される。分化の５日目、培地は、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）が添加されたＳＦＤ培地からなる第２の培地と置換される。細胞は、４８時間ごとに新しい分化培地で半分供される。培地変更は、分化培養物を３００ｇで５分間遠心し、分化培養物から体積の半分を吸引し、それを新しい培地で補充することにより実施される。特定の実施形態では、ＥＢ分化培地は、ＢＭＰ４（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）及び任意選択的にＦＧＦ−２（例えば、約２５〜７５ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌ）を含み得る。上清は、吸引され、新しい分化培地と置換され得る。代替的に、細胞は、２日ごとに新しい培地で半分供され得る。細胞は、分化プロセス中の異なる時点で収集され得る。
【００８２】
ＨＰＣは、規定された培地を使用して多能性幹細胞から培養され得る。規定された培地を使用して、多能性細胞を造血ＣＤ３４+幹細胞に分化させるための方法は、例えば、米国特許出願公開第１２／７１５，１３６号明細書（その全体が参照により援用される）に記載されている。これらの方法は、本開示とともに使用され得ることが予測される。
【００８３】
例えば、造血ＣＤ３４+分化を誘導するため、規定された培地が使用され得る。規定された培地は、成長因子ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３及び／又はＧＭＣＳＦを含有し得る。多能性細胞は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ及び任意選択的にＦＧＦ−２を含む第１の規定された培地で培養され、続いて（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３及びＧＭＣＳＦ）又は（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地で培養され得る。第１及び第２の培地は、ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ−２及び／又はＴＰＯの１つ以上も含み得る。実質的な低酸素条件（例えば、２０％Ｏ２未満）は、造血又は内皮分化をさらに促進し得る。
【００８４】
細胞は、機械的又は酵素的手段（例えば、トリプシン又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用する）を介して実質的に個別化され得る。ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ１１５２又はＹ−２７６３２）も培地中に含まれ得る。これらの手法は、例えば、ロボティックオートメーションを用いて自動化され得ることが予測される。
【００８５】
特定の実施形態では、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するため、実質的な低酸素条件が使用され得る。当業者によって理解されるであろう通り、約２０．８％未満の大気酸素含量は、低酸素と考えられるであろう。培養中のヒト細胞は、外気と比べて低下した酸素含量を有する大気条件下で成長し得る。この相対的低酸素は、培地に曝露された大気酸素を低減することにより達成され得る。胚細胞は、典型的には、一般に大気酸素が約１％〜約６％であり、二酸化炭素が周囲レベルであるような低酸素条件下においてインビボで発生する。理論によって拘束されることを望まないが、低酸素条件は、特定の胚発生条件の態様を再現し得ると予測される。下の例で示される通り、特定の実施形態では、多能性細胞、例えばｉＰＳＣ又はｈＥＳＣのより分化した細胞型、例えばＨＰＣへのさらなる分化を促進するため、低酸素条件を用いることができる。
【００８６】
多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するため、以下の低酸素条件が用いられ得る。特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するため、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％の大気酸素含量が用いられ得る。特定の実施形態では、低酸素雰囲気は、約５％の酸素ガスを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するため、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％又は約５％の溶解酸素含量が用いられ得る。特定の実施形態では、溶解酸素含量レベルは、約２５％の酸素である。
【００８８】
任意の所与の造血前駆細胞の拡大培養において使用されている特定の培地と無関係に、使用される培地は、好ましくは、少なくとも１つのサイトカインを約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ  ｍＬ、より通常的には１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される。好適なサイトカインとして、限定はされないが、ｃ−キットリガンド（ＫＬ）（造血幹細胞因子（ＳｔＩ）、マスト細胞成長因子（ＭＧＦ）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも称される）、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１１、ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が挙げられる。特に、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯの少なくとも１つを含むことになる。より詳細には、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯを含むことになる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＨＰＣは、破壊されたメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を示し、骨髄分化又はリンパ系分化を促進するための条件下で培養される。いくつかの態様では、ＨＰＣは、メチル化ＤＮＡへの結合を本質的に有しない非機能的ＭｅＣＰ２を発現する。特定の態様では、ＨＰＣは、ＭｅＣＰ２を、ＭｅＣＰ２  ＤＮＡ結合活性をもたらすのに十分なレベルで発現しない。特定の態様では、ＭｅＣＰ２は、ＭｅＣＰ２遺伝子における切断又は突然変異のために非機能的である。いくつかの態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を示すＨＰＣを得ることは、ＨＰＣをＭｅＣＰ２のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は小分子阻害剤と接触させることを含む。
【００９０】
Ｄ．フォワードプログラミング
本開示の特定の実施形態は、造血細胞分化／機能にとって重要なプログラミング遺伝子の組み合わせの発現を介したＣＡＲ−ＰＳＣのフォワードプログラミングにより、ＨＰＣを提供する。一方法では、ＰＳＣは、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０５７８９３号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のような、ＥＴＳ遺伝子（例えば、ＥＴＣ２又はＥＲＧ）、造血発生遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ２）及びホメオボックス遺伝子（例えば、ＨＯＸＡ９）などの少なくとも３つの造血前駆体のプログラミング遺伝子を発現するように改変される。特定の態様では、ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２及びＨＯＸＡ９遺伝子は、ＣＡＲ−ＰＳＣにトランスフェクトされる双方向性Ｔｉｇｈｔプロモーターを使用して、１つのベクター、例えば誘導性ＰｉｇｇｙＢａｃベクターにより同時発現される。
【００９１】
さらに、長期生着能についての追加的な遺伝子を発現させるため、ＥＧＨ−ＣＡＲ−ＰＳＣがさらに改変され得る。例示的な遺伝子として、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０及び／又はＲＢＡＫが挙げられる。例えば、ＰＳＣは、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１及びＨＯＸＡ４を発現させるため、１つ以上のベクターをトランスフェクトされ得る。
【００９２】
好ましくは、ＥＴＶ２／ＧＡＴ２／ＨＯＸＡ９遺伝子は、ＰＳＣの造血前駆細胞へのフォワードプログラムに十分な期間に限り発現される。したがって、造血前駆体のプログラミング遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下であり得る。したがって、造血前駆体のプログラミング遺伝子の発現は、多系統の造血前駆細胞に対するフォワードプログラムに十分な期間にわたり、ＰＳＣにおいて誘導され得る。その期間は、約１〜約２０日、例えば約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０日であり得る。あるいは、造血前駆体のプログラミング遺伝子は、エピソームベクターによりＰＳＣに導入され得る。したがって、造血前駆体のプログラミング遺伝子は、ＰＳＣにおいて一過性に発現され得る。
【００９３】
Ｅ．抗原
本明細書に提供されるＣＡＲは、疾患又は障害の処置において有用な任意の抗原特異性を有し得る。遺伝子改変抗原受容体によって標的にされる抗原の中には、養子細胞療法を介する標的化対象の疾患、病態又は細胞型との関連で発現されるものがある。疾患及び病態の中には、増殖性、腫瘍性及び悪性の疾患及び障害、例えばがん及び腫瘍、例えば血液がん、免疫系のがん、例えばリンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫、例えばＢ、Ｔ及び骨髄性白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫がある。いくつかの実施形態では、抗原は、正常な又は標的化されない細胞又は組織と比べて、疾患又は病態の細胞、例えば腫瘍又は病原細胞上で選択的に発現されるか又は過剰発現され、自己免疫若しくは同種免疫異常に関連する抗原又は病原体特異抗原である。他の実施形態では、抗原は、正常細胞上で発現され、および／又は操作された細胞上で発現される。
【００９４】
任意の好適な抗原は、本方法における使用を見出し得る。例示的な抗原として、限定はされないが、感染病原体からの抗原分子、自己（ａｕｔｏ）／自己（ｓｅｌｆ）抗原、腫瘍／がん関連抗原及び腫瘍ネオ抗原が挙げられる。特定の態様では、抗原としては、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４及びＣＥＡが挙げられる。
【００９５】
腫瘍関連抗原は、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、膵がん、腎がん、中皮腫がん、卵巣がん又はメラノーマがんに由来し得る。例示的な腫瘍関連抗原又は腫瘍細胞由来抗原として、ＭＡＧＥ１、３及びＭＡＧＥ４；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  ＥＳＯ１としても公知）；ＳＡＧＥ；及びＨＡＧＥ又はＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定例は、メラノーマ、肺がん、肉腫及び膀胱がんなどの広範な腫瘍タイプで発現される。前立腺がんの腫瘍関連抗原として、例えば、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスフェート、ＮＫＸ３．１及び前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が挙げられる。
【００９６】
他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ及びＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。加えて、腫瘍抗原は、自己ペプチドホルモン、例えば多くのがんの処置において有用である、短い１０アミノ酸長ペプチドの全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモンであり得る。
【００９７】
腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原の発現、例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現によって特徴付けられるがんに由来する腫瘍抗原を含む。目的の腫瘍関連抗原は、メラニン細胞−メラノーマ系統抗原ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質などの系統特異的腫瘍抗原を含む。例示的な腫瘍関連抗原として、限定はされないが、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃ−ファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ及びＳＴＡＴＥのシグナルトランスデューサー及びアクチベーター、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２）、核内因子κＢ（ＮＦ−Ｂ）、ノッチ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１−４）、ｃ−Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソセリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−α、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても公知）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１及びイディオタイプに由来するか又はそれらの任意の１つ以上を含む腫瘍抗原が挙げられる。
【００９８】
抗原は、腫瘍細胞内で突然変異された遺伝子に由来するか、又は正常細胞と比べて腫瘍細胞内で異なるレベルで転写された遺伝子に由来するエピトープ領域又はエピトープペプチド、例えばテロメラーゼ酵素、サバイビン、メソセリン、突然変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌの再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異型又は野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１及び異常発現されたイントロン配列、例えばＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ；骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫において固有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再構成；がんウイルスのプロセス由来のエピトープ領域又はエピトープペプチドを含む腫瘍抗原、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍選択的発現を有する非突然変異がん胎児性タンパク質、例えばがん胎児性抗原及びαフェトプロテインを含み得る。
【００９９】
他の実施形態では、抗原は、病原微生物又は日和見病原微生物（本明細書では感染症微生物とも称される）、例えばウイルス、真菌、寄生虫及び細菌から得られるか又は誘導される。特定の実施形態では、かかる微生物由来の抗原は、完全長タンパク質を含む。
【０１００】
抗原について本明細書に記載の方法における使用が検討される例示的な病原性生物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルスＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルス及びＪＣウイルス）、アデノウイルス、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む。当業者によって理解されるであろう通り、本明細書に記載のような抗原としての使用のためのこれら及び他の病原微生物に由来するタンパク質及びタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、刊行物並びにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて同定され得る。
【０１０１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来の抗原は、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素又はｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のいずれかを含む。
【０１０２】
単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１及びＨＳＶ２）由来の抗原として、限定はされないが、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられる。遺伝子の後期群は、主にビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。かかるタンパク質は、ウイルスカプシド：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８並びに主要なカプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５及びＵＬ２７を形成する（ＵＬ）由来の５つのタンパク質を含み、それらの各々は、本明細書に記載のような抗原として使用され得る。本明細書における抗原としての使用が検討される他の例示的なＨＳＶタンパク質は、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のタンパク質を含む。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４の遺伝子を含み、各々は、潜在的に抗原として使用可能なタンパク質をコードする。
【０１０３】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原は、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の最初期相及び初期相中に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質Ｉ及びＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、下部マトリックスタンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１及び１Ｅ２（ＵＬ１２３及びＵＬ１２２）、ＵＬ１２８〜ＵＬ１５０からの遺伝子のクラスター由来のタンパク質生成物、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ及びｐｐ１５０を含む。当業者によって理解されるであろう通り、本明細書に記載の抗原としての使用のためのＣＭＶタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて同定され得る。
【０１０４】
特定の実施形態における使用が検討されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原は、ＥＢＶ溶解タンパク質ｇｐ３５０及びｇｐ１１０、潜伏サイクル感染中に生成されるＥＢＶタンパク質、例えばエプスタイン・バー核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−リーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）及び潜伏膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２Ａ及びＬＭＰ−２Ｂを含む。
【０１０５】
本明細書での使用が検討される呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）由来の抗原は、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１のタンパク質又はその抗原断片：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、Ｇ及びＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写調節）、ＲＮＡポリメラーゼ及びリン酸化タンパク質Ｐのいずれかを含む。
【０１０６】
使用が検討される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来の抗原は、ＶＳＶゲノムによってコードされる５つの主要なタンパク質及びその抗原断片：大きいタンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）及びマトリックスタンパク質（Ｍ）のいずれか１つを含む。
【０１０７】
特定の実施形態における使用が検討されるインフルエンザウイルス由来の抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１及びＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２及びＰＢ２を含む。
【０１０８】
例示的なウイルス抗原として、限定はされないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（Ｂ型肝炎コア又は表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＥ１若しくはＥ２糖タンパク質、コア又は非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（単純ヘルペスウイルス又は水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルソミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド及びロタウイルスポリペプチドも挙げられる。
【０１０９】
特定の実施形態では、抗原は、細菌抗原であり得る。特定の実施形態では、目的の細菌抗原は、分泌されたポリペプチドであり得る。他の特定の実施形態では、細菌抗原は、細菌の外部細胞表面に曝露されたポリペプチドの１つ以上の部分を有する抗原を含む。
【０１１０】
使用が検討されるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の抗原は、病原性制御因子、例えばＡｇｒ系、Ｓａｒ及びＳａｅ、Ａｒｌ系、Ｓａｒ相同体（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺ及びＴｃａＲ）、Ｓｒｒ系及びＴＲＡＰを含む。抗原として機能し得る他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）タンパク質は、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡ及びＣｆｖＢを含む（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄ．Ｊｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙを参照されたい）。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の２つの種におけるゲノム（Ｎ３１５及びＭｕ５０）は、配列決定されており、例えばＰＡＴＲＩＣで公的に利用可能である（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ  ＶＢＩ  ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。当業者によって理解されるであろう通り、抗原としての使用のためのブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）タンパク質もＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的なデータベースで同定され得る。
【０１１１】
本明細書に記載の特定の実施形態で使用が検討される肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の抗原は、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔ及びピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）を含む。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の抗原タンパク質はまた、当技術分野で公知であり、いくつかの実施形態において抗原として使用され得る。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の毒性株の完全ゲノム配列は、配列決定されており、当業者によって理解されるであろう通り、本明細書での使用のための肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質もＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的なデータベースで同定され得る。本開示に記載の抗原として特に興味深いタンパク質は、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）の表面で曝露されることが予測される病原性因子及びタンパク質を含む。
【０１１２】
抗原として使用され得る細菌抗原の例として、限定はされないが、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）ポリペプチド、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ポリペプチド（例えば、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＡ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）ポリペプチド、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、キャプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ポリペプチド、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ポリペプチド、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）ポリペプチド、ダーマトフィルス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）ポリペプチド、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ポリペプチド、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ポリペプチド、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、ヘモバルトネラ（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド（例えば、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の外部膜タンパク質）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ポリペプチド、Ｌ型菌（Ｌ−ｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）ポリペプチド、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ポリペプチド、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ポリペプチド、ネオリケッチア（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）ポリペプチド、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド（即ち肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ポリペプチド）（本明細書における説明を参照されたい）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ポリペプチド、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）ポリペプチド、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ポリペプチド、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、Ａ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））ポリペプチド、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）ポリペプチド及びエルシニ��（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ポリペプチド（例えば、ペスト菌（Ｙ  ｐｅｓｔｉｓ）Ｆ１及びＶ抗原）が挙げられる。
【０１１３】
真菌抗原の例として、限定はされないが、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）ポリペプチド、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）ポリペプチド、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バシジオボラス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、バイポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）ポリペプチド、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ポリペプチド、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、カーブラリア（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）ポリペプチド、表皮菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、エクソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）ポリペプチド、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）ポリペプチド、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、マヅレラ（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）ポリペプチド、小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）ポリペプチド、モニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）ポリペプチド、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）ポリペプチド、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ポリペプチド、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、フィアロフォラ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）ポリペプチド、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）ポリペプチド、シュードアレシェリア（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）ポリペプチド、シュードミクロドキウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）ポリペプチド、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）ポリペプチド、リノスポリジウム（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）ポリペプチド、スコレコバシジウム（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）ポリペプチド、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）ポリペプチド、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）ポリペプチド及びクシロヒファ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）ポリペプチドが挙げられる。
【０１１４】
原生動物寄生虫抗原の例として、限定はされないが、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）ポリペプチド、バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、ベスノイチア（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）ポリペプチド、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）ポリペプチド、エンセファリトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）ポリペプチド、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）ポリペプチド、ハモンディア（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）ポリペプチド、ヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、イソスポーラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ポリペプチド、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）ポリペプチド、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、ノゼマ（Ｎｏｓｅｍａ）ポリペプチド、腸トリコモナス（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ポリペプチドが挙げられる。蠕虫寄生虫抗原の例として、限定はされないが、アカントケイロネマ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、猫肺虫（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）ポリペプチド、住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ）ポリペプチド、ブノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、毛細線虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）ポリペプチド、カベルチア（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）ポリペプチド、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）ポリペプチド、クレノソーマ（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）ポリペプチド、肺虫（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）ポリペプチド、ディオクトファイム（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）ポリペプチド、ディペタロネマ（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）ポリペプチド、ジプリジウム（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）ポリペプチド、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ドラクンクルス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）ポリペプチド、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）ポリペプチド、フィラロイデス（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）ポリペプチド、ラゴキルアスカリス（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、ロア糸状虫（Ｌｏａ）ポリペプチド、マンソネラ（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ムエレリウス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）ポリペプチド、ナノフィエトウス（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）ポリペプチド、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ）ポリペプチド、ネマトジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）ポリペプチド、腸結節虫（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）ポリペプチド、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）ポリペプチド、パラフィラリア（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）ポリペプチド、パラスカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、フィサロプテラ（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）ポリペプチド、プロトストロンギルス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、セタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）ポリペプチド、スピロセルカ（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、スピロメトラ（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）ポリペプチド、ステファノフィラリア（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、テラジア（Ｔｈｅｌａｚｉａ）ポリペプチド、トキサスカリス（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）ポリペプチド、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）ポリペプチド、毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）ポリペプチド、ウンシナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）ポリペプチド及びウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）ポリペプチドが挙げられる（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）及び輸送タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、肉胞子虫（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）ポリペプチド、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）ポリペプチド、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド及びトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）ポリペプチドが挙げられる。
【０１１５】
外寄生生物抗原の例として、限定はされないが、ノミ；マダニ、例えばカタダニ及びヒメダニ；ハエ、例えば小虫、蚊、スナバエ、ブユ、ウシアブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症が引き起こすハエ及びブヨ；アリ；クモ、シラミ；ダニ；並びにトゥルーバグ、例えばトコジラミ及びサシガメに由来するポリペプチド（抗原及びアレルゲンを含む）が挙げられる。
【０１１６】
Ｆ．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞の表面で発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、プロセシングされたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、それは、ＴＣＲのように主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との関連において細胞表面で認識される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、改変された抗原受容体は、活性化若しくは刺激性ＣＡＲ、同時刺激性ＣＡＲ（国際公開第２０１４／０５５６６８号パンフレットを参照されたい）及び／又は阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ，Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲは、一般に、いくつかの態様では、リンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して１つ以上の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。かかる分子は、典型的には、天然抗原受容体を通るシグナル、同時刺激受容体と組み合わせてかかる受容体を通るシグナル及び／又は同時刺激受容体単独を通るシグナルを再現又は近似する。
【０１１９】
本開示の特定の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン及び１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、免疫原性を低減するためにヒト化されているＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む、抗原に特異的なＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む核酸の使用に関する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原間で共有された空間を含むエピトープを認識し得る。特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域及び／又はその抗原結合断片を含み得る。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【０１２０】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者における細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子であり得ると考えられる。具体的な実施形態では、本発明は、完全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡ又はコード領域を含む。抗原結合領域又はドメインは、例えば、米国特許第７，１０９，３０４号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載の、特定のヒトモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶH鎖及びＶL鎖の断片を含み得る。断片は、ヒト抗原特異抗体のいくつもの異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態では、断片は、ヒト細胞内での発現におけるヒトコドン使用のために最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【０１２１】
構築は、多量体的であり得、例えば二重特異性抗体又は多量体が挙げられる。多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分の二重特異性抗体への交差対形成によって最も形成されやすい。構築物のヒンジ部分は、全体的に欠失されることから、第１のシステインが維持されること、セリンではなくプロリンへの置換、第１のシステインまで切断されるといった複数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は、欠失され得る。安定的であり且つ／又は二量体化する任意のタンパク質は、この目的に役立ち得る。Ｆｃドメインの一方のみ、例えばヒト免疫グロブリンからのＣＨ２又はＣＨ３ドメインのいずれかを使用することができる。二量体化を改善するように改変されているヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域であっても使用することができる。免疫グロブリンのヒンジ部分のみであっても使用することができる。ＣＤ８αの部分であっても使用することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、他の同時刺激受容体、例えば膜貫通ドメイン及び改変ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。他の同時刺激受容体として、限定はされないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つ以上が挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、特定抗原（又はマーカー若しくはリガンド）、例えば養子療法による標的対象の特定の細胞型において発現される抗原、例えばがんマーカー及び／又は減弱応答を誘導することが意図される抗原、例えば正常若しくは非罹患細胞型で発現される抗原に対して特異性を有するＣＡＲが構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分において、１つ以上の抗原結合分子、例えば１つ以上の抗原結合断片、ドメイン若しくは部分又は１つ以上の抗体可変ドメイン及び／又は抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子の１つ以上の抗原結合部分、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重（ＶH）鎖及び可変軽（ＶL）鎖に由来する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【０１２４】
キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称され得る）受容体の抗原特異的部分は、腫瘍関連抗原又は病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原は、パターン認識受容体、例えばデクチン１によって認識される炭水化物抗原を含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面で発現される限り、任意の種類であり得る。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態として、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、突然変異ｐ５３、突然変異ｒａｓなどが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原が少量で存在するとき、持続性を改善するため、サイトカインと同時発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ−１５と同時発現され得る。
【０１２５】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から入手可能であるか若しくは（例えば、ＰＣＲを介して）合成可能であるか、又はそれらの組み合わせが可能である。イントロンがｍＲＮＡを安定化することが見出されていることから、ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡ又はその組み合わせを使用することが望ましいことがあり得る。また、ｍＲＮＡを安定化するため、内因性又は外因性非コード領域を使用することがさらに有利であり得る。
【０１２６】
キメラ構築物は、ネイキッドＤＮＡとして又は好適なベクターで免疫細胞に導入可能であると考えられる。ネイキッドＤＮＡを使用するエレクトロポレーションにより細胞に安定にトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。ネイキッドＤＮＡは、一般に、発現に適切な方向でプラスミド発現ベクター内に含有される、キメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
【０１２７】
あるいは、キメラ構築物を免疫細胞に導入するため、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を使用することができる。本開示の方法に従う使用に適したベクターは、免疫細胞内で非複製性である。細胞内で維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存度を維持するのに十分に低い場合、例えばＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ又はＢＰＶに基づくベクターなど、ウイルスに基づく多数のベクターが公知である。
【０１２８】
いくつかの態様では、抗原特異的結合又は認識成分は、１つ以上の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つに天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。場合により、膜貫通ドメインは、かかるドメインの同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、アミノ酸置換により選択又は改変される。
【０１２９】
いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの態様におけるドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８及びＧＩＴＲ／ＣＤ３５７分子に由来するものを含む（即ちそれらの少なくとも膜貫通領域を含む）。あるいは、いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、合成したものである。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各末端で見出されることになる。
【０１３０】
ＩＩＩ．使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法のための方法であって、有効量の、本開示のＣＡＲを発現する免疫細胞を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、内科疾患又は障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移植により処置される。本開示の特定の実施形態では、がん又は感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移植により処置される。個体におけるがんの進行を処置するか又は遅延させるための方法であって、有効量の抗原特異的細胞療法を個体に施すことを含む方法が本明細書に提供される。本方法は、免疫異常、固形がん、血液がん及びウイルス感染の処置に適用され得る。
【０１３１】
特定の実施形態では、前記がんによって発現される抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する、本明細書に提供されるＣＡＲを発現する免疫細胞、例えばＮＫ細胞及び／又はＴ細胞を投与することによる、がん患者を処置するための方法が提供される。
【０１３２】
本処置方法が有用である腫瘍は、任意の悪性細胞型、例えば固形腫瘍又は血液学的腫瘍において見出されるものを含む。例示的な固形腫瘍として、限定はされないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液学的腫瘍は、骨髄の腫瘍、Ｔ又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などを含む。本明細書に提供される方法を用いて処置され得るがんのさらなる例として、限定はされないが、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん及びメラノーマが挙げられる。
【０１３３】
がんは、具体的には、限定はされないが、以下の組織学的タイプ：腫瘍、悪性；がん；がん、未分化；巨細胞がん及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母がん；移行上皮がん；乳頭移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞がん；肝細胞がん；混合性肝細胞がん及び胆管細胞がん；小柱状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープにおける腺がん；腺がん、家族性大腸腺腫症；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支・肺胞腺がん；乳頭腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；塩基好性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭及び濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢腺がん；乳頭状漿液嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳腺；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生随伴腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；悪性黒子型メラノーマ；末端黒子型メラノーマ；結節性メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性がん腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンのもの；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中グレード／濾胞性ＮＨＬ；中グレードびまん性ＮＨＬ；高グレード免疫芽球性ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；及び慢性骨髄芽球性白血病であり得る。
【０１３４】
特定の実施形態は、白血病の処置方法に関する。白血病は、血液又は骨髄のがんであり、血球、通常、白血球（白血球細胞）の異常な増殖（増殖による生成）によって特徴付けられる。それは、血液学的新生物と称される広範な疾患群の一部である。白血病は、疾患のスペクトルを包含する広義語である。白血病は、臨床的且つ病理学的にその急性型及び慢性型に分かれる。
【０１３５】
本開示の特定の実施形態では、免疫細胞は、それを必要とする個体、例えばがん又は感染症を有する個体に送達される。次に、細胞は、各々のがん又は病原細胞を攻撃するための個体の免疫系を増強する。場合により、個体に１用量以上の免疫細胞が提供される。個体に２用量以上の免疫細胞が提供される場合、投与間の持続期間は、個体における増殖を時間的に可能にするのに十分である必要があり、具体的な実施形態では、投与間の持続期間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日又はそれを超える。
【０１３６】
本開示の特定の実施形態は、免疫介在性障害を処置又は予防するための方法を提供する。一実施形態では、対象は、自己免疫性疾患を有する。自己免疫性疾患の非限定例として、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスペート皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、ループスエリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（微小変化群、巣状糸球体硬化症又は膜性腎症など）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、脈管炎（結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎又はヘルペス状皮膚炎脈管炎など）、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書で開示される方法を用いて処置可能な自己免疫性疾患のいくつかの例として、限定はされないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎又は乾癬が挙げられる。対象は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。
【０１３７】
治療有効量の免疫細胞は、いくつかの経路、例えば非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内若しくは関節内注射又は注入によって投与され得る。
【０１３８】
養子細胞療法における使用のための免疫細胞の治療有効量は、処置されている対象において所望される効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するか又は自己免疫若しくは同種免疫疾患の退行をもたらすのに必要であるか、又は自己免疫性疾患によって引き起こされる症状、例えば疼痛及び炎症を軽減する能力がある免疫細胞の量であり得る。それは、炎症に関連する症状、例えば疼痛、浮腫及び温度上昇を軽減するのに必要な量であり得る。それは、移植された臓器の拒絶を低減又は阻止するのに必要な量でもあり得る。
【０１３９】
免疫細胞集団は、疾患に合致する処置計画、例えば病態を寛解させるための１日〜数日にわたる単回若しくは数回用量又は疾患進行を阻害し、疾患再発を予防するための延長期間にわたる定期的用量で投与され得る。製剤中で利用される正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重篤度にも依存することになり、施術者の判断及び各患者の環境に従って決定される必要がある。免疫細胞の治療有効量は、処置中の対象、苦痛の重症度及びタイプ並びに投与様式に依存することになる。いくつかの実施形態では、ヒト対象の処置において使用可能と思われる用量範囲は、少なくとも３．８×１０4個、少なくとも３．８×１０5個、少なくとも３．８×１０6個、少なくとも３．８×１０7個、少なくとも３．８×１０8個、少なくとも３．８×１０9個又は少なくとも３．８×１０10個の免疫細胞／ｍ2である。特定の実施形態では、ヒト対象の処置において使用される用量は、約３．８×１０9〜約３．８×１０10個の免疫細胞／ｍ2の範囲である。さらなる実施形態では、免疫細胞の治療有効量は、約５×１０6個の細胞／ｋｇ体重〜約７．５×１０8個の細胞／ｋｇ体重、例えば約２×１０7個の細胞〜約５×１０8個の細胞／ｋｇ体重又は約５×１０7個の細胞〜約２×１０8個の細胞／ｋｇ体重で変動し得る。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別及び生理的状態に基づき、当業者により容易に決定される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量反応曲線から外挿することができる。
【０１４０】
免疫細胞は、免疫介在性障害の処置のため、１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与され得る。併用療法は、限定はされないが、１つ以上の抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬及び抗真菌薬）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン又はビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン又はグルココルチコイド、例えばデキサメタゾン又はプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン若しくはプレドニゾン又は非ステロイド性抗炎症剤、例えばアセチルサリチル酸、イブプロフェン又はナプロキセンナトリウム）、サイトカイン（例えば、インターロイキン１０又はトランスフォーミング成長因子β）、ホルモン（例えば、エストロゲン）又はワクチンを挙げることができる。さらに、免疫抑制剤又は免疫寛容誘発剤、限定はされないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ又はＢ細胞を認識する）抗体；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；又はケモカイン、インターロイキン若しくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２、抗ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）などが投与可能である。かかるさらなる医薬品は、所望される効果に応じて、免疫細胞の投与前、中又は後に投与可能である。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路又は異なる経路により、また同じ部位又は異なる部位のいずれかで可能である。
【０１４１】
Ｂ．医薬組成物
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物及び製剤も本明細書に提供される。
【０１４２】
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望される純度を有する活性成分（抗体又はポリペプチドなど）を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、１つ以上の任意選択的な薬学的に許容できる担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することにより調製され得る。薬学的に許容できる担体は、一般に利用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定はされないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリンなど；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４３】
Ｃ．併用療法
特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、少なくとも１つの追加的な治療法と組み合わせた免疫細胞集団を含む。追加的な治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法又は前述の組み合わせであり得る。追加的な治療法は、アジュバント又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、小分子酵素阻害剤又は抗転移薬の投与である。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、副作用制限剤（例えば、治療の副作用の発生及び／又は重症度を低減することが意図される薬剤、例えば抗悪心剤など）の投与である。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、手術である。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、γ線照射である。いくつかの実施形態では、追加的な治療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的化する治療薬、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤及び／又は化学予防剤である。追加的な治療法は、当技術分野で公知の化学療法剤の１つ以上であり得る。
【０１４５】
免疫細胞療法は、追加的ながん治療法、例えば免疫チェックポイント療法に対して前、間、後又は様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時〜数分、数日及び数週の範囲の間隔であり得る。免疫細胞療法が追加的な治療薬とは別に患者に供される実施形態では、一般に、２つの化合物が、患者に対して有利に組み合わされた効果をさらに発揮することができるように、有意な期間が各送達時点間で分断されないことが保証されることになる。そのような場合、患者に抗体療法及び抗がん療法を互いの約１２時間〜約２４時間又は約７２時間以内、より詳細には互いの約６〜１２時間以内に提供し得ると考えられる。状況によっては、各投与間で数日（２、３、４、５、６又は７日）〜数週（１、２、３、４、５、６、７又は８週）が経過する場合、処置用期間を有意に延長することが望ましいことがあり得る。
【０１４６】
様々な組み合わせが利用され得る。下記の例：
Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ
Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ
Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
では、ＣＡＲ免疫細胞療法は、「Ａ」であり、抗がん療法は、「Ｂ」である。
【０１４７】
本実施形態の任意の化合物又は治療薬の患者への投与では、薬剤の毒性（存在する場合）を考慮して、かかる化合物の投与のための一般的プロトコルに従うことになる。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性を監視するステップが設けられる。
【０１４８】
１．化学療法
多様な化学療法剤が本実施形態に従って使用され得る。用語「化学療法」は、がんを処置するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物又は組成物を示唆するように用いられる。これらの作用剤又は薬剤は、例えば、それらが細胞周期に影響するか否か、また影響するのがいずれの段階であるかなど、細胞内でのそれらの活性モードにより分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡに直接的に架橋するか、ＤＮＡにインターカレートするか、又は核酸合成に影響することにより、染色体及び有糸分裂異常を誘導するといったその能力に基づいて特徴付けられ得る。
【０１４９】
化学療法剤の例として、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロスホスファミド；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドパ；エチレンイミン及びメチルアメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタード；ニトロスレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシン；抗代謝産物、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、プテロプテリン及びトリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン及びテストラクトン；抗副腎物質、例��ばミトタン及びトリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブチル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセル・ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。
【０１５０】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に用いられている他の要素は、一般にγ線、Ｘ線として知られるもの及び／又は放射性同位元素の腫瘍細胞への直接的送達を含む。ＤＮＡ損傷要素の他の形態、例えばマイクロ波、陽子線照射及びＵＶ照射も検討される。これらの要素のすべては、ＤＮＡに対する広範囲の損傷、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復並びに染色体の構築及び維持に対して影響を及ぼす可能性が非常に高い。Ｘ線における線量は、長期間（３〜４週）にわたり５０〜２００レントゲンの一日量から２０００〜６０００レントゲンの単回用量まで及ぶ。放射性同位元素における用量範囲は、広範に変化し、同位体の半減期、放射される放射線の強度及びタイプ並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１５１】
３．免疫療法
当業者は、追加的な免疫療法が実施形態の方法と組み合わせて又は併せて用いられ得ることを理解するであろう。がん処置との関連において、免疫療法は、一般に、がん細胞を標的にし、破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、かかる例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして役立ち得るか、又はそれは、実際に細胞死に影響するように他の細胞を動員し得る。抗体は、薬剤又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にもコンジュゲートされ、標的剤として役立ち得る。あるいは、エフェクターは、直接的又は間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む。
【０１５２】
抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含み、併用療法において使用され得る。この手法は、ＭＡｂのそれらの抗原標的に対する高特異性を高度に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせることで、ペイロード（薬剤）を、豊富なレベルの抗原を有する腫瘍細胞に送達する「武装された」ＭＡｂをもたらす。薬剤の標的化送達は、正常組織内でのその曝露も最小化し、毒性低下及び改善された治療指数をもたらす。例示的なＡＤＣ薬は、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及びＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ−ＤＭ１）を含む。
【０１５３】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に適合可能である、即ち他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを有する必要がある。多数の腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかは、本実施形態との関連で標的化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ及びｐ１５５を含む。免疫療法の代替的態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８及び成長因子、例えばＦＬＴ３リガンドを含む免疫刺激分子も存在する。
【０１５４】
免疫療法剤の例として、免疫アジュバント、例えばマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン及び芳香族化合物）；サイトカイン療法、例えばインターフェロンα、β及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ；遺伝子療法、例えばＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２及びｐ５３；並びにモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２及び抗ｐ１８５が挙げられる。１つ以上の抗がん療法は、本明細書に記載の抗体療法とともに利用され得ると考えられる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、同時刺激分子）を上方制御するか又はシグナルを下方制御する。免疫チェックポイント遮断によって標的化され得る阻害性免疫チェックポイントは、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、Ｂ及びＴリンパ球減衰器（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても公知）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）及びＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）を含む。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１軸及び／又はＣＴＬＡ−４を標的にする。
【０１５６】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、リガンド若しくは受容体の組換え形態などの薬剤であり得るか、又は特に抗体、例えばヒト抗体である。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の公知の阻害剤が使用され、特にキメラ化、ヒト化され得るか、又は抗体のヒト形態が使用され得る。当業者が理解するであろう通り、本開示で記載の特定の抗体について、代替の及び／又は均等な名称が用いられ得る。かかる代替の及び／又は均等な名称は、本開示との関連で互換可能である。例えば、ランブロリズマブが代替の及び均等な名称のＭＫ−３４７５及びペンブロリズマブの下でも公知であることが認識されている。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドであり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知であるニボルマブは、使用され得る抗ＰＤ−１抗体である。ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（キイトルーダ）（登録商標）及びＳＣＨ−９００４７５としても公知であるペンブロリズマブは、例示的な抗ＰＤ−１抗体である。ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても公知であるＣＴ−０１１も抗ＰＤ−１抗体である。Ｂ７−ＤＣＩｇとしても公知であるＡＭＰ−２２４は、ＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１５９】
本明細書に提供される方法において標的化可能である別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても公知である細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全ｃＤＮＡ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合されるとき、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現され、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞同時刺激タンパク質、ＣＤ２８と類似し、両方の分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７−１及びＢ７−２とも称される）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害性シグナルを伝達する一方、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞内でも見出され、それらの機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を通したＴ細胞活性化により、Ｂ７分子における阻害性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現増加がもたらされる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドである。
【０１６１】
本方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（又はそれから誘導されるＶH及び／若しくはＶLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を用いて作製可能である。あるいは、当技術分野で公知の抗ＣＴＬＡ−４抗体が使用可能である。例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても公知）又はその抗原結合断片及び変異体である。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ−４上の上記抗体と同じエピトープとの結合について競合し、且つ／又はそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【０１６２】
４．手術
がんを有する人の約６０％は、予防的、診断的又はステージング、根治的及び姑息的手術を含むいくつかのタイプの手術を受けることになる。根治的手術は、がん組織の全部又は一部が物理的に除去、切除及び／又は破壊される摘出術を含み、他の治療法、例えば本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／又は代替療法と併用され得る。腫瘍摘出術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍摘出術に加えて、手術による処置は、レーザー手術、凍結手術、電気手術及び顕微鏡制御手術（モース手術）を含む。
【０１６３】
がん細胞、組織又は腫瘍の一部又は全部の切除時、身体内に空洞が形成され得る。処置は、灌流、直接注射又はその領域への追加的な抗がん療法の局所適用により達成され得る。かかる処置は、例えば、１、２、３、４、５、６若しくは７日ごと、又は１、２、３、４及び５週ごと、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２か月ごとに反復され得る。これらの処置は、同様に様々な用量であり得る。
【０１６４】
５．他の薬剤
処置の治療効果を改善するため、他の薬剤が本実施形態の特定の態様と併用され得ると考えられる。これらの追加的な薬剤は、細胞表面受容体及びギャップ結合の上方制御に影響する薬剤、細胞分裂停止剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、高増殖性細胞のアポトーシス誘導因子に対する感受性を高める薬剤又は他の生物学的製剤を含む。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達における増強は、隣接する高増殖性細胞集団に対する抗高増殖性効果を増強することになる。他の実施形態では、処置の抗高増殖性有効性を改善するため、細胞分裂停止剤又は分化剤が本実施形態の特定の態様と併用可能である。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善すると考えられる。細胞接着阻害剤の例として、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンが挙げられる。さらに、処置有効性を改善するため、高増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増強する他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５は、本実施形態の特定の態様と併用可能であると考えられる。
【０１６５】
ＩＶ．製品又はキット
免疫細胞を含む製品又はキットも本明細書に提供される。製品又はキットは、個体におけるがんの進行を処置するか若しくは遅延させるか、又はがんを有する個体の免疫機能を増強するため、免疫細胞を使用するための使用説明書を含む添付文書をさらに含み得る。本明細書に記載の抗原特異的免疫細胞のいずれかは、製品又はキット中に含まれ得る。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニル又はポリオレフィンなど）又は合金（ステンレス鋼又はハステロイなど）などの種々の材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、製剤及びその上のラベルを保持するか、又はそれに関連して、容器は、使用説明書を示し得る。製品又はキットは、商業及びユーザの視点からから望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ及び使用説明書を伴う添付文書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、製品は、別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗新生物剤）の１つ以上をさらに含む。１つ以上の薬剤に適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジを含む。
【実施例】
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態を実証するため、以下の実施例が含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施における好ましい態様を構成すると考えることができることが当業者によって理解される必要がある。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態における多くの変更形態がなされ得、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、依然として同様又は類似の結果を得ることができることを理解する必要がある。
【０１６７】
実施例１  −  プロテインＬの活性化及びＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大培養
プロテインＬは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大培養を誘導する：エピソームベクターを使用して末梢血Ｔ細胞からリプログラムされたＥ１１多能性幹細胞（ＴｉＰＳＣ）を、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体由来のヒトＣＤ１９結合ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８同時刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる第２世代抗ヒトＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構成的発現のために改変した。
【０１６８】
サイトカイン誘導分化を通して非改変及びＣＡＲ改変Ｅ１１  ＴｉＰＳＣをＴ／ＮＫ  ＣＤ３４+前駆細胞に分化させた。単離したＣＤ３４＋前駆細胞を、アスコルビン酸マグネシウムリン酸（０．２５ｍＭ）、ニコチンアミド（２ｍＭ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及びサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ７；それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなるＴ細胞分化培地（ＴＣＤＭ）中、ＤＬＬ４／レトロネクチンコーティングプレート上、２週間の低酸素培養物中でＣＤ３＋Ｔ細胞までさらに分化させた。
【０１６９】
ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＩＬ２及びＩＬ１５（両方とも１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＴＣＤＭ中、１０，０００個のＣＤ３+Ｔ細胞／ｃｍ2の密度でレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ；０．５μｇ／ｃｍ2）及びヒトＤＬＬ４−Ｆｃ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；０．５μｇ／ｃｍ2）の存在下又は不在下において、異なる濃度のプロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ；０、０．１、０．５、２．５μｇ／ｃｍ2）でコーティングしたプレート上で培養した。培養物を低酸素（５％Ｏ2）条件で維持し、１０日後に収集した。すべての収集した細胞を計数し、ＣＤ３+細胞のパーセントを判定し、Ｔ細胞拡大倍数を計算した（アウトプット／インプットＴ細胞数）。
【０１７０】
プロテインＬは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大培養を用量依存的様式で誘導したが、レトロネクチンは、増殖性応答を増強した（図１）。ＤＬＬ４は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のプロテインＬ依存性拡大培養をさらに有意に改善した相補的なＴ細胞成長因子である。並行して正常酸素圧培養物が試験変異体における拡大量の低下を示したことから、低酸素環境を使用し、効率的なＣＡＲ−Ｔ細胞拡大培養を達成した。
【０１７１】
ＤＬＬ４は、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔの拡大培養を促進する：レトロネクチン及びＤＬＬ４−Ｆｃと組み合わせたプロテインＬ（すべてを０．５μｇ／ｃｍ2で使用した）での１０日目の拡大培養物から収集したＣＡＲ−Ｔ細胞において、ＣＤ８αの発現を判定した（図２）。
【０１７２】
プロテインＬとレトロネクチンとの組み合わせにより、プロテインＬ単独と比べて効率的なＣＡＲ−Ｔ拡大培養が得られた。しかし、拡大培養速度がはるかにより高いにもかかわらず、ＣＤ８の発現は、低いままであった。それに対して、ＤＬＬ４を添加したとき、ＣＡＲ−Ｔの拡大培養速度におけるさらなる約２５％の改善とともに、ＣＤ３+Ｔ細胞の有意な割合でＣＤ８αの発現が得られた（図２）。
【０１７３】
プロテインＬによって誘導されるＣＡＲ特異的Ｔ細胞の拡大培養：プロテインＬ培養物中のＣＡＲ誘導性Ｔ細胞拡大培養の特異性を、ＣＤ３誘導汎Ｔ細胞（対照）とプロテインＬ誘導拡大培養物との両方において拡大培養のために蒔いたＣＡＲ改変対非改変Ｔ細胞で検証した。ＣＡＲ改変及び非改変Ｅ１１由来Ｔ細胞を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３クローン；０．５μｇ／ｃｍ2）又はレトロネクチン及びＤＬＬ４−Ｆｃ（両培養変異体中（それぞれ０．５μｇ／ｃｍ2））とともにプロテインＬ（０．５μｇ／ｃｍ2）でコーティングしたプレート上で培養した。ＩＬ２及びＩＬ１５（両方とも１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＴＣＤＭ中、１０，０００個のＣＤ３+Ｔ細胞／ｃｍ2の密度で細胞を蒔いた。８日後、細胞を収集し、計数し、ＣＤ３+のパーセントを判定し、Ｔ細胞拡大倍率を計算した（アウトプット／インプットＴ細胞数）（図３）。
【０１７４】
Ｔ細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞との両方を同様の効率で増殖させたＣＤ３活性化培養と対照的に、プロテインＬ培養物中でＣＡＲ−Ｔ細胞の排他的な拡大培養が認められた。抗ＣＤ３及びプロテインＬ培養物中でのＣＡＲ−Ｔ細胞拡大培養の効率は、同等であった。拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現をプロテインＬ染色により判定したとき、プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ集団内でＣＡＲ+Ｔ細胞が有意により高い割合で見出され、プロテインＬ培養物中でのＣＡＲ+Ｔ細胞のポジティブ選択が示された。
【０１７５】
プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞におけるサイトカイン産生：抗ＣＤ３  ｍＡｂ培養物中及びプロテインＬ培養物中で８日間にわたって拡大培養したＣＡＲ−Ｔ細胞を、非トランスフェクトＰ８１５細胞（対照）及びヒトＣＤ１９  ＣＡＲ抗原をトランスフェクトしたＰ８１５細胞とともにインキュベートした。ＣＡＲ−Ｔエフェクター（Ｅ）及びＰ８１５標的（Ｔ）細胞を１０5個／ｍｌ及び２×１０5個／ｍｌ（１：２のＥ／Ｔ比）で共培養物に添加した。２４時間後、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ多重フローサイトメトリーアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるサイトカイン分析のために上清を収集した。
【０１７６】
非トランスフェクトＰ８１５細胞を有するＣＡＲ−Ｔ共培養物は、有意な標的細胞−誘導性サイトカイン産生を示さなかった一方、ＣＤ１９+Ｐ８１５細胞を有する培養物は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、ｓＦａｓＬ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２及びＩＬ１３の誘導産生を示し、したがってＣＡＲ活性化に応答して産生されたサイトカインのセットが明確になった。サイトカイン分泌特性は、抗ＣＤ３  ｍＡｂ培養物又はプロテインＬ培養物のいずれかで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞において類似したが、より高いＩＦＮγ及びＴＮＦαのレベルが、プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞において検出された（図４Ａ）。
【０１７７】
プロテインＬによって誘導されるＣＡＲ依存性インビトロサイトカイン産生：ＣＡＲ活性化によって誘導されるサイトカイン産生を、ＣＡＲ−Ｔ細胞をプラスチック吸着されたプロテインＬとともにインキュベートすることにより評価した。Ｅ１１  ＰＳＣ由来ＣＡＲ−Ｔ細胞を、プロテインＬ及びレトロネクチン（両方とも０．５μｇ／ｃｍ2）又はレトロネクチン単独（対照）でコーティングしたウェルに添加した。細胞を０．５ｍＬのＴＣＤＭ中において２００００個／ウェルの密度で蒔いた。２４時間のインキュベーション後、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ多重フローサイトメトリーアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるサイトカイン分析のために上清を収集した。
【０１７８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、レトロネクチン単独でコーティングしたウェル内での２４時間のインキュベーション中、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）、ＣＣＬ３及び低レベルのＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ１３を産生した。プロテインＬでコーティングしたウェル内でＣＡＲ−Ｔ細胞をインキュベートしたとき、ＴＮＦα、ＩＰ１０、ＩＦＮγ、ｓＦａｓＬ及びＩＬ６の誘導が検出され、したがってプロテインＬによって誘導されたＣＡＲ依存性サイトカイン産生応答が示された（図４Ｂ）。ＣＡＲ改変免疫細胞のプロテインＬによる処置を用いて、サイトカイン産生を含む、インビトロでのＣＡＲ依存性機能的反応を評価することができる。
【０１７９】
プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞傷害性活性：抗ＣＤ３モノクローナル抗体培養物中及びプロテインＬ培養物中で８日間にわたって拡大培養したＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性機能を、ルシフェラーゼを発現する非トランスフェクトＰ８１５細胞（対照）、ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ抗原、ＣＤ１９＋Ｂ細胞リンパ腫Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉをトランスフェクトしたＰ８１５細胞に対するインビトロ細胞傷害性アッセイを用いて評価した（図５）。ＣＡＲ−Ｔエフェクター（Ｅ）細胞を腫瘍標的（Ｔ）細胞とともに１：２のＥ／Ｔ比で２４時間インキュベートし、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、培養溶解質中でルシフェラーゼ活性を定量化した。２４時間細胞傷害性培養物中の標的細胞の絶対数を各々の標的細胞標準の段階希釈に対する較正により判定した。細胞傷害性を、単一のエフェクター細胞によって溶解された標的細胞の絶対数として表し、式：（Ｔ対照−Ｔ実験）／Ｅ（式中、「実験」及び「対照」  −  それぞれエフェクター細胞の存在下及び不在下での標的細胞培養物；Ｔ及びＥ  −  それぞれ標的及びエフェクター細胞の絶対数）により計算した。さらに、プロテインＬ培養物中で拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性機能を、ＧＦＰを発現するＲａｊｉ細胞に対して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するリアルタイムＧＦＰ＋細胞計数により検証した。
【０１８０】
最少の細胞傷害性は、ＣＤ１９  ＣＡＲ抗原陰性Ｐ８１５細胞との培養物中で検出された一方、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及びプロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞の両方は、ＣＤ１９+Ｐ８１５、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞に対して強力な細胞傷害性活性を示した。特に、プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体培養物中で拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞よりも約２〜３倍高い細胞傷害性活性を示した。プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解性活性もＧＦＰ+Ｒａｊｉ細胞との培養物中で確認され、ここで、ＧＦＰ+生細胞数における有意な減少は、非改変Ｔ細胞との培養物中ではなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞との培養物中に限って検出された。
【０１８１】
プロテインＬで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能：８週齢ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現するＤａｕｄｉ細胞を腹膜内（ｉｐ）注射した。４日後、腫瘍細胞接種が制御イメージングにより確認されたとき、マウスを、対照（腫瘍のみ）と、抗ＣＤ３モノクローナル抗体培養物又はプロテインＬ培養物のいずれかで拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞で処置される２つの実験群とに分けた。ＣＡＲ−Ｔ細胞を２日間隔で２回注射した。ＣＡＲ−Ｔの注射及びさらなる１週間中、すべてのマウスにＩＬ２及びＩＬ１５サイトカインを（ｉｐ）注射した。毎週、腫瘍増殖を生物発光インビボイメージングにより監視した。Ｉｎ  Ｖｉｖｏ−Ｇｌｏルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を（ｉｐ）注射した麻酔マウスを、ルシフェリン注射後１５分以内にＰｅａｒｌ  Ｔｒｉｌｏｇｙインビボイメージャー（ＬｉＣｏｒ）を使用して分析した。指定した群におけるマウスの画像を示す（左パネル）。腫瘍増殖を、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬｉＣｏｒ）を使用する生物発光シグナル強度（ＢＬＩ）の定量によりインビボで評価した。グラフは、各群における平均±ＳＴＤ−ＢＬＩ値を経時的に示す。
【０１８２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、ＣＡＲ−Ｔの注射後６週にわたり腫瘍成長が有意に抑制されることが認められた（図６）。インビトロでの細胞傷害能に従い、プロテインＬ培養物中で拡大培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞におけるインビボでの抗腫瘍効果は、より高かった。
【０１８３】
本明細書で開示及び特許請求される方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行わなくても、構築及び実施することができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態の観点で説明されている一方、本方法及び本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップに対して、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく変更形態が適用され得ることが当業者に明らかになるであろう。より詳細には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤と置き換えられ得る一方、同一又は類似の結果が達成されることが明らかになるであろう。当業者に明らかであるすべてのかかる類似の置換形態及び改変形態は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内に含まれるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手続き上の又は他の詳細を本明細書の記載内容に対して補足的に提示する程度まで、具体的に参照により本明細書に援用される。
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国際特許出願番号国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０５７８９３号明細書
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米国特許第８，３７２，６４２号明細書
Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，１０：２９，２０１２．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【国際調査報告】
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2022501031.tif 000013
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