【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年5月13日(2010.5.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  血液サンプル、又は、活性なタンパク質分解酵素及びα2−マクログロブリンの複合体を含む可能性のある別の生物学的液体サンプル中の活性なタンパク質分解酵素を評価する方法であって、前記サンプルと、シグナル基質に結合し１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子を含む基質とを接触させる工程を含み、該シグナル基質は検出可能な脱離基を含み、該基質は該タンパク質分解酵素によって加水分解されるが、該複合体によっては加水分解されない、ことを特徴とする方法。
【請求項２】  前記活性なタンパク質分解酵素が、トロンビン、活性化凝固因子、活性化線維素溶解因子及び補体系の活性化成分からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記活性化タンパク質分解酵素がトロンビンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】  前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、タンパク質、多糖及び合成ポリマーからなる群より選ばれる不活性分子である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】  前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が水溶性である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】  前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、４０ｋＤのＭr及び少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】  前記１０ｋＤよりも大きいＭrを有する分子が、２０ｋＤのＭr及び少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】  前記脱離基が、吸光度シグナル又は蛍光シグナルを与える、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】  前記脱離基が、ｐ−ニトロアニリド又は７−アミノ−４−メチル−クマリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】  前記基質が、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン、Ｈ−アラニル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチル−クマリンに結合したオボアルブミン及びＨ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミンからなる群より選ばれる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】  前記基質が１以上の水素イオンの脱離基を含んでいる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】  前記基質の量及び動力学的特性が、前記サンプル中で生成する量のタンパク質分解酵素が前記基質を完全に消費しないように選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】  加水分解した基質の量が、前記タンパク質分解酵素の生成曲線下の領域に正比例する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】  前記不活性分子がオボアルブミンである、請求項４に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
活性なトロンビンは、限られた時間期間（半減期は１６〜１７秒）のみ血漿中で生存する。これは、循環アンチトロンビンによるものである。ほとんどのトロンビン（６４％）は５７ｋＤの血漿タンパク質であるアンチトロンビン（ＡＴ）により不活性化され、２３％は７２５ｋＤの血漿タンパク質であるα2−マクログロブリン（α2Ｍ）により不活性化され、１３％はその他の種々の因子により阻害される（Hemker, H.C., G.M. Willems, 及び S. Beguin, A computer assisted method to obtain the prothrombin activation velocity in whole plasma independent of thrombin decay processes, Thromb. Haemost. (1986) 56: 9-17）。α2−マクログロブリン−トロンビン複合体（α2Ｍ−ＩＩａ）は、全ての高分子基質に対しては不活性であるが、低分子量の（人工）基質に対しては活性を保持するという特性を有している。α2−マクログロブリンはＭr７２５０００の糖タンパク質であり、血漿中に２５００ｍｇ／Ｌ又は３．５μＭの濃度で存在する。α2−マクログロブリンは、１８５ｋＤの同一サブユニットのテトラマーである。活性なプロテイナーゼ又は活性化凝固因子とα2Ｍとの不活性化反応は、以下の３工程プロセス：１．緩い複合体の形成、２．α2Ｍ中の標的ペプチドの加水分解、３．α2Ｍ分子内に酵素分子を物理的に包括する急速な構造変化である（Travis, J. 及び G.S. Salvesen, Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. (1983) 52:655-709を参照のこと）。
Hemkerのグループは、適切な基質からのトロンビンが触媒する生成物形成を直接モニターする連続法を開発した（Hemker, H.C.ら, Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. Thromb. haemost. (1993) 70:617-624）。基質の速度定数は、使用する濃度において、生成物形成速度が存在する酵素（トロンビン又はα2Ｍ−ＩＩａ）の量に比例するようになるものである。サンプル中の酵素活性の時間経過は、生成物−時間曲線の一次導関数として推定することができる。
この方法の欠点は、血漿中のトロンビンの一部がα2−マクログロブリンと結合することである。α2−マクログロブリンは、血漿に最も大量に存在する非特異的プロテアーゼ阻害剤である。α2−マクログロブリンは、プロテアーゼの生物活性（活性化凝固因子、活性化線維素溶解酵素及び活性化補体因子）を、その活性中心を占有することなしに失わせるので、有用なオリゴペプチドシグナル基質（signal-substrate）についての残留活性が存在する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
形成したトロンビンは、ＡＴ及びα2Ｍが最も重要である血漿阻害剤と反応するだろう。これらの反応の反応定数（減衰定数）は、それぞれ約２００００（Ｍ．ｓ）-1及び１５００（Ｍ．ｓ）-1である。
トロンビンの量を連続的に測定する場合、トロンビン基質を反応混合物へ添加する。トロンビンの作用により、ある分子が基質から分割し、これを例えば光度計又は蛍光光度計で測定することができる。
広範囲の研究及び実験の後に、小さい基質とは対照的に、比較的かさ高なトロンビン基質を使用した場合、加水分解は全てのトロンビンが不活性化されたときに停止し、トロンビンの全酵素活性をエンドポイント法（end-point assay）として測定することができることを見出した。
したがって、本発明の１つの側面では、大きなサイズの発色性及び蛍光発生性並びにその他のシグナル基質であって、前記基質はα2Ｍ分子の穴へ侵入することができず、それゆえα2Ｍ−ＩＩａにより加水分解されない程度に大きい基質が提供される。これは、シグナル基質を不活性なかさ高担体分子へ結合して「基質」にすることにより達成される。結合は、好ましくは当業者に知られる方法により化学的に行われる。
活性なプロテアーゼが包括されるαＭ2の穴の排除限界は約１０ｋＤである（Barrett, A., Methods in Enzymol. (1981) 80:737-754）。したがって、適切な不活性担体分子は１０ｋＤよりも大きく、例えばタンパク質、多糖、合成ポリマーが含まれる。好ましくは、不活性分子は良好な溶解性を有している。１つの好ましい不活性分子の群は、α2Ｍ分子の穴へ正しく適合しない大きさを有している。別の好ましい不活性分子の群は約４０ｋＤの大きさを有し、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有している。最も好ましいのは、約２０ｋＤのサイズを有し、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する不活性分子である。
適切かつ好ましいタンパク質は、商業的に入手可能であり、例えばオボアルブミン（Ｍr＝４５ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（Ｍr＝６７ｋＤ）、ヒト血清アルブミン（Ｍr＝６７ｋＤ）及び鶏卵白リゾチーム（Ｍr＝１４．４ｋＤ）である。
適切な多糖は数ｋＤ（そのため、α2Ｍ分子の穴には正しく適合しない）から５００ｋＤ超まで変化してもよいＭrを有する。そのような多糖の例はデキストランである。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
適切な合成ポリマーには、数ｋＤから５００ｋＤ超まで変化するＭrを有する親水性の水溶性ポリマー、例えばポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポリ塩化ビニル、ポリ（１−ビニルピロリドン−コ−アクリル酸）、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）等が含まれる。
本発明の目的に適切なシグナル基質は、容易に検出することができるが、プロテアーゼ／α2−マクログロブリン複合体では分割しない脱離基を有する化合物である。好ましくは、脱離基は、吸光度シグナル又は蛍光シグナルを与える。そのような脱離基の例には、それぞれ、ｐ−ニトロアニリド及び７−アミノ−４−クマリンが含まれる。
本発明の目的に適切な基質には、比較的小さいＭrを有するシグナル基質を十分な大きさを有する不活性分子へ結合することにより得られる化合物が含まれる。適切な基質の例には、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ｓ２２８８」とも呼ばれる）、Ｈ−アラニル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチル−クマリンに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ」とも呼ばれる）及びＨ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド．２ＨＣｌに結合したオボアルブミン（「ＯＡ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ」とも呼ばれる）が含まれる。別の適切な基質の例は、脱離基として１以上の水素イオンを遊離するシグナル基質に結合したオボアルブミンである。
前記の基質を使用してトロンビン生成曲線（ＴＧＣ）を測定するとき、一時的なトロンビンは特定の量の基質を加水分解し、その後、更なる加水分解は起こらないだろう。基質の量及びその動力学的特性は、好ましくは血漿（又はその他の媒体）中で生成する量のトロンビンが基質を完全に消費しないように選択される。形成した転換生成物の最終レベルは測定することができ、これはＴＧＣ下の表面（surface）に正比例する。これは内在性トロンビンポテンシャル（endogenous thrombin potential）（ＥＴＰ）と呼ばれる。
基質は、血液及びα2−マクログロブリンを含むその他の液体中のタンパク質分解酵素の生物学的に活性な形態を測定するために適切に使用することができる。重要な適用は、止血−血栓系（ＨＴＳ）の重要な機能の試験である、凝固血液中のトロンビンの生成及び消失である。
本発明は、血液及びその他の生物学的液体中の（生成した）トロンビンの評価について典型的に記載されかつ例示されるが、本発明の方法は、当業者にとって明らかな可能な変形及び改良を用いて、前記の生物学的液体中の、その他のタンパク質分解酵素の評価にも適していることが理解されるだろう。そのような他のタンパク質分解酵素には、活性化凝固因子、活性化線維素溶解因子及び補体系の活性化成分が含まれる。
本発明を以下の実施例によってより詳細に説明するが、全ての観点において本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。