(57)【要約】  本発明は、ナノポアの分野に関し、特に、改変Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポアと、単分子（タンパク質）配列決定などのバイオポリマー及び他の（生物学的な）化合物の分析における当該ナノポアの応用に関する。脂質二重層内に含まれた多量体Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポアを含むシステムであって、七量体（ＩＩ型）状態のナノポアの割合と六量体（ＩＩＩ型）状態のナノポアの割合との合計が前記ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システムが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重層内に含まれた多量体Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポアを含むシステムであって、七量体（ＩＩ型）状態のナノポアの割合と六量体（ＩＩＩ型）状態のナノポアの割合との合計が前記ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システム。
【請求項２】
ＩＩ型及びＩＩＩ型状態のナノポアの合計は、前記ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％に相当する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩ型状態である、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩＩ型状態である、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項５】
前記ＦｒａＣナノポアは、Ｗ１１２及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
１つ又は複数の前記変異は、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧでの、好ましくは、Ｓ又はＴでの、Ｗの置換を含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記ＦｒａＣナノポアは、Ｄ１０９の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含み、好ましくは、前記変異は、Ｓ又はＴでの、好ましくは、Ｓでの、Ｄの置換を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記変異型ＦｒａＣ単量体は、Ｗ１１２Ｓ、Ｗ１１６Ｓ、及び／又は、Ｄ１０９Ｓの変異を含み、好ましくは、ＦｒａＣ変異体は、Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓ／Ｗ１１６Ｓ又はＤ１０９Ｓ／Ｗ１１６Ｓである、請求項５から７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記システムは、分析物が電気泳動的及び／又は電気浸透的に前記ナノポアを通過して移動するように前記ナノポアに電場をかけて前記分析物の性質を検出する機能を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記分析物は、タンパク質性物質、好ましくは、ペプチド、より好ましくは、約３０アミノ酸長までのペプチドである、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のシステムを提供するための方法であって、
（ｉ）複数の組み換えＦｒａＣ単量体を提供する工程と、
（ｉｉ）前記単量体とリポソームとを集合して多量体とするために前記単量体を前記リポソームに接触させる工程と、
（ｉｉｉ）前記多量体を前記リポソームから回収する工程と、
（ｉｖ）ＦｒａＣナノポアの形成を可能とするために前記多量体を脂質二重層に接触させる工程と、
を含み、
任意で、（ｖ）ＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画及び／又はＩＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画を単離する工程をさらに含む、
方法。
【請求項１２】
Ｗ１１２及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む変異型Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ポリペプチドであって、番号付けがＵｎｉＰｒｏｔでＢ９Ｗ５Ｇ６というアクセッション番号で利用可能なＦｒａＣアミノ酸に対応しており、１つ又は複数の当該Ｗ残基は、独立して、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧで置換されている、変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【請求項１３】
Ｄ１０９の位置での変異を含む変異型Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ポリペプチドであって、番号付けがＵｎｉＰｒｏｔでＢ９Ｗ５Ｇ６というアクセッション番号で利用可能なＦｒａＣアミノ酸に対応しており、当該Ｄ残基は、無荷電残基で、好ましくは、Ｓ又はＴで、より好ましくは、Ｓで、置換されている、変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【請求項１４】
Ｗ１１２Ｓ、Ｗ１１６Ｓ、及び／又は、Ｄ１０９Ｓの変異を含み、好ましくは、前記変異型ＦｒａＣは、Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓ又はＤ１０９Ｓ／Ｗ１１６Ｓである、請求項１２又は１３に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【請求項１５】
Ｄ１０Ｃの変異をさらに含む、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
ペプチド質量検出及び／又はペプチド配列決定を好ましくは含むペプチド分析における、請求項１から１０のいずれか１項に記載のシステム又は請求項１２から１５のいずれか１項に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドの使用。
【請求項２０】
ハイスループット分析と好ましくは組み合わされた単分子検出における、請求項１から１０のいずれか１項に記載のシステム又は請求項１２から１５のいずれか１項に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドの使用。
【請求項２１】
前記システムが請求項１から１０のいずれか１項に記載の個別のシステムの複数を含む携帯装置に組み込まれている、請求項１９又は２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、ナノポア並びにバイオポリマー及び他の（生物学的）化合物の分析における当該名のポアの使用の分野に関する。特に、本発明は、改変Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポア及び単分子ペプチド配列決定などの単分子分析における当該ナノポアの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的ナノポアは、生物膜又は合成膜上にナノスケールの水路を開くタンパク質である。外部電位のもと、単一のナノポアを通るイオン電流が、当該ナノポアを移動する分析物を認識するために用いられる。とりわけ、ナノポアは単分子レベルで核酸の配列決定を行うために現在用いられている。ナノポアＤＮＡ配列決定では、個々の核酸の列が塩基１つずつにナノポアを通され、イオン電流が個々の核酸塩基を同定するために用いられる（非特許文献１、２）。
【０００３】
Ｗａｔａｎａｂｅ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１７  ８９  （２１），  １１２６９−１１２７７）は、ＦｒａＣを始めとする５種類の異なるポア形成タンパク質のなかの大きなナノポアを用いた、ポア形成の分析及びタンパク質単分子の検出を記載する。ナノポアセンシングに適したポアの同定がチャネル電流信号を分類しノイズ分析を行うことで実現できることが示されている。
【０００４】
しかし、ナノポアを用いたタンパク質の配列決定は一連の新しい課題を提起する。アミノ酸は核酸に比べより大きな化学的変動性を有し、アミノ酸をナノポア内の電位により画一的に捕捉したり引っ張ったりすることはできない。さらに、タンパク質又はポリペプチドをアミノ酸１つずつに処理する酵素はいまだ知られていない。
【０００５】
別の方法では、タンパク質をまず断片化し、個々のペプチドの質量をナノポア電流により同定することが考えられる。この手法は、タンデム質量分析を用いた従来のタンパク質配列決定手法と類似するだろう。しかし、ナノポアペプチド質量同定器は、低価格且つ携帯可能であるという利点、及び、単分子という利点を有するだろう。後者の利点は、翻訳後修飾での化学的不均一性の分析を可能とし、特に、ハイスループット装置と組み合わせた場合、低含量タンパク質の検出を可能とするだろうことから、重要である。ＰＥＧ分子（非特許文献３、４、５、６、７、８）、中性ペプチド（非特許文献９）、又はオリゴ糖（非特許文献１０）、均一荷電ペプチド（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５）及び他のペプチド（非特許文献１６）を用いた従来の研究は、分析物の組成が均一である場合に、電流遮断の深さとポリマーの分子量との間に直接的な相関があるかもしれないことを明らかにした。一方、ＤＮＡ（非特許文献１７、１８）及びアミノ酸エナンチオマー（非特許文献１９）をはじめとする豊富な他の研究は、分子の化学的アイデンティティ、特に、ナノポア（非特許文献２０）内部の電荷が、イオン電流に強力かつ予測不可能な影響を与えることを明らかにしており、これは、ペプチドなどの複雑なバイオポリマーの質量の同定が不可能かもしれないことを示唆している。さらなる懸案事項として、反対電荷のペプチドが固定電位では効率的に捕捉・分析されない（非特許文献１６、２１、２２、２３、２４）点が挙げられる。最後に、生物学的ナノポアの直径及び幾何学的配置は、溶液中のポリペプチドの、一連の大きさ、形状、及び化学組成を研究するために、容易に適合することができない。
【０００６】
最近、本発明者等は、イソギンチャクであるＡｃｔｉｎｉａ  ｆｒａｇａｃｅａ由来の八量体Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポア（非特許文献２５）が、ＤＮＡ（非特許文献２６）、タンパク質、及びペプチド（非特許文献２７）の研究に使用できることを示した。本出願の出願人名義の特許文献１も参照されたい。ＦｒａＣの膜貫通領域は、バイオポリマー分析で用いられる他のナノポアと比べて、ナノポアのトランス出口に急で狭い狭窄部を持つαヘリックスにより形成される点で、独特である。特に重要なことに、発明者等は、ナノポアを通過する電気浸透流がその電荷組成にもかかわらず固定電位でポリペプチドを捕捉するように改変できることを示した（非特許文献２７）。しかし、サイズが１．６ｋＤａ未満のペプチドはナノポアの通過が速すぎるためサンプリングできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１８／０１２９６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｂａｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ２６５−２７０  （２００９）．
【非特許文献２】Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｉ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＭｓｐＡ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０７，  １６０６０−１６０６５  （２０１０）．
【非特許文献３】Ｂｅｚｒｕｋｏｖ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｖｏｄｙａｎｏｙ，  Ｉ．，  Ｂｒｕｔｙａｎ，  Ｒ．  Ａ．  ＆  Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ａ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｐｏｒｅ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２９，  ８５１７−８５２２  （１９９６）．
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４，  ８２０７−８２１１  （２００７）．
【非特許文献５】Ｂａａｋｅｎ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｉｚｅ−Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ９，  ６４４３−６４４９  （２０１５）．
【非特許文献６】Ａｋｓｏｙｏｇｌｕ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒｃｅｄ  ＰＥＧ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：  ＶＤＡＣ，  ＯｍｐＣ，  ａｎｄ  α−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １１３，  ９００３−９００８  （２０１６）．
【非特許文献７】Ｋｒａｓｉｌｎｉｋｏｖ，  Ｏ．  Ｖ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  Ｃ．  Ｇ．  ＆  Ｂｅｚｒｕｋｏｖ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｐｏｒｅ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ．  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ９７，  １−４  （２００６）．
【非特許文献８】Ｏｕｋｈａｌｅｄ，  Ａ．  Ｇ．，  Ｂｉａｎｃｅ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｐｅｌｔａ，  Ｊ．，  Ａｕｖｒａｙ，  Ｌ．  ＆  Ｂａｃｒｉ，  Ｌ．  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｄｉｌｕｔｅ  ｒｅｇｉｍｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  １０８，  １−４  （２０１２）．
【非特許文献９】Ｚｈａｏ，  Ｑ．，  Ｊａｙａｗａｒｄｈａｎａ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｗａｎｇ，  Ｄ．  ＆  Ｇｕａｎ，  Ｘ．  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １１３，  ３５７２−３５７８  （２００９）．
【非特許文献１０】Ｂａｃｒｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４１２，  ５６１−５６４  （２０１１）．
【非特許文献１１】Ｍｏｖｉｌｅａｎｕ，  Ｌ．，  Ｓｃｈｍｉｔｔｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｓｃｈｏｌｔｚ，  Ｊ．  Ｍ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｒｅ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ８９，  １０３０−１０４５  （２００５）．
【非特許文献１２】Ｍｏｈａｍｍａｄ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｐｒａｋａｓｈ，  Ｓ．，  Ｍａｔｏｕｓｃｈｅｋ，  Ａ．  ＆  Ｍｏｖｉｌｅａｎｕ，  Ｌ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｒａｐｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  ４０８１−４０８８  （２００８）．
【非特許文献１３】Ｐｉｇｕｅｔ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｅｒｏｌｙｓｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ９，  （２０１８）．
【非特許文献１４】Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｍｅｓｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ：  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｅｖｅｌ．  Ｅｕｒ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ４２，  ３６３−３６９  （２０１３）．
【非特許文献１５】Ｓｔｅｆｕｒｅａｃ，  Ｒ．，  Ｌｏｎｇ，  Ｙ．  Ｔ．，  Ｋｒａａｔｚ，  Ｈ．  Ｂ．，  Ｈｏｗａｒｄ，  Ｐ．  ＆  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  α−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ａｅｒｏｌｙｓｉｎ  ｐｏｒｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５，  ９１７２−９１７９  （２００６）．
【非特許文献１６】Ｃｈａｖｉｓ，  Ａ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  ＡＣＳ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２，  １３１９−１３２８  （２０１７）．
【非特許文献１７】Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．，  Ｒｅｓｔｒｅｐｏ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，  Ｅ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ｂｙ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｈａｒｇｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０５，  １９７２０−１９７２５  （２００８）．
【非特許文献１８】Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ｄ．，  Ｈｅｒｏｎ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，  Ｅ．，  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０６，  ７７０２−７７０７  （２００９）．
【非特許文献１９】Ｂｏｅｒｓｍａ，  Ａ．  Ｊ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍｉｅ  −  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５１，  ９６０６−９６０９  （２０１２）．
【非特許文献２０】Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｓＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｐｏｒｅ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  １０，  ３６３３−３６３７  （２０１０）．
【非特許文献２１】Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｅ．，  Ｄｏｎｇ，  Ｚ．，  Ｔｅｎｎａｎｔ，  Ｃ．  ＆  Ｔｉｍｐ，  Ｇ．  Ｒｅａｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ０．０７  ｎｍ  ３  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｕｂｎａｎｏｍｅｔｒｅ−ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｐｏｒｅ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１，  ９６８−９７６  （２０１６）．
【非特許文献２２】Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｃａｏ，  Ｃ．，  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  ＆  Ｌｏｎｇ，  Ｙ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｃｈａｒｇｅｓ  ａｎｄ  Ｌｅｎｇｔｈｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ．  ４，  １−５  （２０１８）．
【非特許文献２３】Ａｓａｎｄｅｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃ  Ｔｒａｐ  Ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｎｅａｒ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．  ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ８，  １３１６６−１３１７９  （２０１６）．
【非特許文献２４】Ｃｈｉｎａｐｐｉ，  Ｍ．  ＆  Ｃｅｃｃｏｎｉ，  Ｆ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖｉａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ：  ａ  ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｏｎｄｅｎｓ．  Ｍａｔｔｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，  （２０１８）．
【非特許文献２５】Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．，  Ｃａａｖｅｉｒｏ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｍ．，  Ｍｏｒａｎｔｅ，  Ｋ．，  Ｇｏｎｚａ´ｌｅｚ−Ｍａｎａ〜ｓ，  Ｊ．  Ｍ．  ＆  Ｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｒｅ  ｌｉｎｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６，  ４−６  （２０１５）．
【非特許文献２６】Ｗｌｏｋａ，  Ｃ．，  Ｍｕｔｔｅｒ，  Ｎ．  Ｌ．，  Ｓｏｓｋｉｎｅ，  Ｍ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ａｌｐｈａ−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍｉｅ  −  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５５，  １２４９４−１２４９８  （２０１６）．
【非特許文献２７】Ｈｕａｎｇ，  Ｇ．，  Ｗｉｌｌｅｍｓ，  Ｋ．，  Ｓｏｓｋｉｎｅ，  Ｍ．，  Ｗｌｏｋａ，  Ｃ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ＦｒａＣ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８，  １−１３  （２０１７）．
【非特許文献２８】Ｓｏｓｋｉｎｅ，  Ｍ．，  Ｂｉｅｓｅｍａｎｓ，  Ａ．，  Ｄｅ  Ｍａｅｙｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＣｌｙＡ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３５，  １３４５６−１３４６３  （２０１３）．
【非特許文献２９】Ａｑｖｉｓｔ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｐｏｌｅｓ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｔ  Ｈｅｌｉｘ  Ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  Ｃｈａｒｇｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８，  ２０２６−２０３０  （１９９１）．
【非特許文献３０】Ｒｉｎｃｏｎ−Ｒｅｓｔｒｅｐｏ，  Ｍ．，  Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，  Ｅ．，  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒａｋｅｓ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  １１，  ７４６−７５０  （２０１１）．
【非特許文献３１】Ｗａｎｕｎｕ，  Ｍ．，  Ｓｕｔｉｎ，  Ｊ．，  ＭｃＮａｌｌｙ，  Ｂ．，  Ｃｈｏｗ，  Ａ．  ＆  Ｍｅｌｌｅｒ，  Ａ．  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｇｏｖｅｒｎｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ９５，  ４７１６−４７２５  （２００８）．
【非特許文献３２】Ｂｉｅｓｅｍａｎｓ，  Ａ．，  Ｓｏｓｋｉｎｅ，  Ｍ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｔａｘａｎｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  ＣｌｙＡ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  １５，  ６０７６−６０８１  （２０１５）．
【非特許文献３３】Ｈｏ，  Ｃ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．  １，  １−９  （２０１５）．
【非特許文献３４】Ｗａｎｕｎｕ，  Ｍ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｗ．，  Ｒａｂｉｎ，  Ｙ．，  Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｙ．  ＆  Ｍｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｆ  ｕｎｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｐｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５，  １６０−１６５  （２０１０）．
【非特許文献３５】Ｓｔｏｄｄａｒｔ，  Ｄ．，  Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，  Ｌ．，  Ｈｅｒｏｎ，  Ａ．，  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  ＤＮＡ  ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，  １０−１６  （２０１５）．
【非特許文献３６】Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  ｅｄ．）  （１９９５）．
【非特許文献３７】Ｓｏｓｋｉｎｅ，  Ｍ．，  Ｂｉｅｓｅｍａｎｓ，  Ａ．  ＆  Ｍａｇｌｉａ，  Ｇ．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  分析物  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣｌｙＡ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄａｐｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３７，  ５７９３−５７９７  （２０１５）．
【非特許文献３８】Ａｎｄｒｅ，  Ｉ．，  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｐ．，  Ｗａｎｇ，  Ｃ．  ＆  Ｂａｋｅｒ，  Ｄ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４，  １７６５６−１７６６１  （２００７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述の研究に基づき、本発明者等は、より低分子量のペプチドを検出するためにより小さな直径のナノポアが必要であることを理解し認識した。そこで、本発明者等は、より広範なペプチドサイズを同定できるようにＦｒａＣナノポアの直径を調節することを可能とする戦略を提供することを目標とした。
【００１０】
驚くべきことに、ＦｒａＣナノポアが脂質二重層環境に含まれた場合に異なるナノポア型（本明細書では、ＩＩ型及び／又はＩＩＩ型と呼ぶ）の形成を誘導するように改変でき、これにより、サブナノメートルの狭窄部を有する生物学的ナノポアを作ることができることがわかった。重要なことに、こうした新規の狭隘型のナノポアにより、従来のナノポアの研究では約２００Ｄａの違いのみが報告されているなか、約４０Ｄａの分解能で一アミノ酸置換だけ異なる（小さな）ペプチドを識別することが可能となる。さらに、選択ｐＨ条件下でＦｒａＣナノポア信号はペプチドの質量と直接的に相関していた。本発明は、ナノポアに基づくタンパク質の単分子同定のための新規で独特の手法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポアを含むシステムであって、ＩＩ型状態のナノポアの割合とＩＩＩ型状態のナノポアの割合との合計がＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システムに関する。
【００１２】
例えば、ＩＩ型及びＩＩＩ型状態のナノポアの合計は、ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％に相当する。
【００１３】
本明細書では、『ＩＩ型』状態という用語は、見かけ上七量体性を有し、及び／又は、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中でｐＨ７．５で測定して約１．２２−１．２６ｎＳ、若しくは、１Ｍ  ＫＣｌ溶液中でｐＨ４．５で測定して約０．９９−１．０８ｎＳのコンダクタンスを有するナノポアを指す。コンダクタンスの値は、１Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、又は１Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍ  クエン酸、１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基  ｐＨ４．５を用いて、−５０ｍＶの印加電位下、シングルチャネルを収集することで、適切に求められる。
【００１４】
ＩＩ型ＦｒａＣナノポアは、さらに、ホモロジーモデリングにより計算して（最も狭い狭窄部で）約１．１ｎｍの見かけ上のポアサイズを有することを特徴とする。
【００１５】
本明細書では、『ＩＩＩ型』状態という用語は、見かけ上六量体性を有し、及び／又は、１Ｍ  ＫＣｌ溶液中でｐＨ４．５で測定して約０．３７−０．４３ｎＳのコンダクタンスを有するナノポアを指す。
【００１６】
ＩＩＩ型ＦｒａＣナノポアは、さらに、ホモロジーモデリングにより示されるように（最も狭い狭窄部で）約０．８ｎｍのポアサイズを有することを特徴とする。
【００１７】
したがって、一実施形態では、本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、七量体（ＩＩ型）状態のナノポアの割合と六量体（ＩＩＩ型）状態のナノポアの割合との合計がＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システムを提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、（ｉ）１Ｍ  ＫＣｌ溶液中でｐＨ４．５で測定して約０．９９−１．０８ｎＳのコンダクタンスを示すナノポアの割合（ＩＩ型）、及び、（ｉｉ）１Ｍ  ＫＣｌ溶液中でｐＨ４．５で測定して約０．３７−０．４３ｎＳのコンダクタンスを示すナノポアの割合（ＩＩＩ型）の合計が、ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システムを提供する。
【００１９】
また、さらに、本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、約１．１ｎｍの見かけ上のポアサイズを有するナノポアの割合（ＩＩ型）及び約０．８ｎｍの見かけ上のポアサイズを有するナノポアの割合（ＩＩＩ型）の合計がＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システムを提供する。
【００２０】
ＩＩ型及びＩＩＩ型のナノポアの相対量は求めに応じて変わり得る。一態様では、ＦｒａＣナノポアの少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％が、ＩＩ型状態である。代替的に又は付加的に、ＦｒａＣナノポアの少なくとも１５％、好ましくは、少なくとも２０％が、ＩＩＩ型状態である。
【００２１】
一実施形態では、ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩ型状態である。別の実施形態では、ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩＩ型状態である。
【００２２】
実質的に１つの多量体形態／型のＦｒａＣを含むシステムも包含される。例えば、一実施形態では、ＦｒａＣナノポアの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％が、ＩＩ型状態である。特定の態様では、ＦｒａＣナノポアの全てがＩＩ型状態である。別の実施形態では、ＦｒａＣナノポアの少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％が、ＩＩＩ型状態である。特定の態様では、ＦｒａＣナノポアの全てがＩＩＩ型状態である。異なる多量体形態のＦｒａＣは、サイズ排除、アフィニティ、逆相、又はイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする液体クロマトグラフィー法を用いて、容易に単離できる。
【００２３】
特定の態様では、ＦｒａＣナノポアは、当該ナノポアと脂質二重層（すなわち、脂質界面）との間の相互作用を弱める１つ以上の変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含む又は当該単量体からなる。
【００２４】
ＦｒａＣがＷ１１２及び／又はＷ１１６の位置で変異されている場合に極めて良好な結果が得られる。例えば、一実施形態では、ＦｒａＣは、Ｗ１１２の位置で変異され、好ましくは、Ｗ１１６は変異されておらず、又は、ＦｒａＣは、Ｗ１１６の位置で変異され、好ましくは、Ｗ１１２は変異されていない。さらなる実施形態では、ＦｒａＣ変異体は、Ｗ１１２及びＷ１１６の両方の位置での変異を含む。本発明によれば、Ｗ残基は、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧのいずれかで、好ましくは、Ｓ又はＴで、置換される。ＦｒａＣは、２０ｋＤａの相対分子量を有する１７９アミノ酸を含む。ＦｒａＣのｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋでＦＭ９５８４５０というアクセッション番号で利用可能である。ＦｒａＣのポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔでＢ９Ｗ５Ｇ６というアクセッション番号で利用可能である。さらに、ＦｒａＣの結晶構造は、２０１０年に解明され、ＲＣＳＢ  ＰＤＢに３ＬＩＭというアクセッション番号で登録されている。本発明に係る変異体では、残基の番号付けはＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｂ９Ｗ５Ｇ６のＦｒａＣ配列での残基の番号付けに対応している。
【００２５】
ポア形成毒素の機能のための（保存）トリプトファン残基の重要性がこれまでに研究されている。Ｔａｎａｋａ等（非特許文献２５）は、ＦｒａＣの活性化経路の４つの異なる段階、すなわち、水溶形態、脂質結合形態、組立中間形態、及び膜貫通ポア形態に対応するＦｒａＣの構造を明らかにした。変異分析により、Ｗ１１２Ｒ／Ｗ１１６Ｆの変異体が脂質膜に結合する能力を失っており、完全に不活性になっていることが明らかとなった。Ｇａｒｃｉ´ａ−Ｌｉｎａｒｅｓ等（２０１６）は、イソギンチャクであるＳｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓのアクチノポリンであるスチコリシンＩＩ（ＳｔｎＩ）の生物膜との特定相互作用におけるトリプトファン残基の役割を研究した。残基Ｗ１１０及びＷ１１４（ＦｒａＣのＷ１１２及びＷ１１６に対応）がコレステロール存在下での膜結合の主要な駆動力のひとつである疎水効果を支えていることが解明された。特に、当該論文の筆者等は、『得られた結果はアクチノポリンのＴｒｐ残基が膜認識及び結合で主要な役割を担っていることを支持する』と述べる一方で、『こうした残基は機能性ポアを組み立てるために必要とされる拡散及び多量体化工程では僅かな影響を与えるのみである』と結論づけている。そのため、Ｗ１１２及び／又はＷ１１６がＦｒａＣの多量体状態を調節するために適宜に改変されるという発明者等の発見は、従来技術から合理的に予測できたものではない。
【００２６】
そこで、一態様では、本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、ＦｒａＣナノポアは、Ｗ１１２及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含み、好ましくは、１つ又は複数の当該Ｗ残基は、独立して、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧで、好ましくは、Ｓ又はＴで、置換される、システムを提供する。一実施形態では、本システムは、Ｗ１１２Ｓ又はＷ１１２ＴのＦｒａＣ変異体を含む又はこれらからなる。別の実施形態では、本システムは、Ｗ１１６Ｓ又はＷ１１６Ｔの変異体を含む又はこれらからなる。さらなる別の実施形態では、本システムは、Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓ、Ｗ１１２Ｔ／Ｗ１１６Ｓ、又はＷ１１２Ｓ／Ｗ１１６ＴのＦｒａＣ変異体を含む又はこれらからなる。
【００２７】
発明者等は、脂質二重層内に挿入されたＩＩ型ＦｒａＣナノポアが低ｐＨでより効率的であることに着目した。そこで、生理学的ｐＨでのＩＩ型ナノポアの産生を増加させるために、脂質界面に位置する１０９位のアスパラギン酸を無荷電残基と交換した。思ったとおり、ｐＨ７．５でのＩＩ型ナノポアの割合は、２３．０±４．９％から４８±３．６％まで増加し、ＩＩＩ型ナノポアの割合はわずかしかみられなかった。
【００２８】
本発明は、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、ＦｒａＣナノポアは、Ｄ１０９の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含み、好ましくは、ここで当該変異は、Ｓ又はＴなどの無荷電残基との、より好ましくは、Ｓとの、Ｄの置換を含む、システムも提供する。１１６位のトリプトファンのセリンとの同時置換は、ｐＨ７．５でのＩ型及びＩＩ型のナノポアの割合の僅かなさらなる増加を示した。
【００２９】
そこで、本発明は、さらに、脂質二重層内に含まれた多量体ＦｒａＣナノポアを含むシステムであって、ＦｒａＣナノポアは、Ｄ１０９ＳとＷ１１２Ｓ及びＷ１１６Ｓの一方又は両方との変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含む、システムに関する。
【００３０】
本発明のナノポアを有するシステムは、２２から４アミノ酸長の範囲のペプチドを収容できる。さらに小さいペプチドを、例えば、嵩張る側鎖を有するアミノ酸の導入による、ナノポアの膜貫通領域のさらに細かい調節を用いて、検出することができる。また、発明者等は、ナノポアがペプチドの混合物内でアラニンとグルタミン酸との間の違い（約４０Ｄａ）を区別できることを示した。さらに、発明者等は、ちょうどｐＨ３．８で、ペプチドのイオン信号が分析物の質量に依存する一方、より高いｐＨ値では、負電荷ペプチドの電流信号がその質量のみから予測された電流信号よりも高いことを発見した。
【００３１】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、発明者等の説明としては、分析されるペプチドがその電荷を失う一方で、ナノポアの狭窄部はペプチドの電荷を認識するのに十分な負電荷をまだ維持したことが考えられる。最も可能性が高い説明として、負電荷狭窄部がペプチド質量認識のための電気泳動的環境を作るために重要であると考えられる。これと同時に、当該狭窄部と負電荷分析物との静電相互作用がナノポアの読み枠内の分析物の正しい位置を妨害するのかもしれない。
【００３２】
おそらく、ペプチドは均一に荷電される必要があり、これは溶液のｐＨを下げることで実現できる。しかし、同時に、ナノポアの狭窄部は最適な質量認識を得るために負に荷電されるべきである。両方の効果を得るのは、ｐＨを下げると狭窄部の電荷も荷電が少ない状態となるので、困難かもしれない。
【００３３】
そこで、上述の本明細書に記載の１つ又は複数のアミノ酸置換に加えて、変異型ＦｒａＣ単量体は、低ｐＨで負電荷を保持する部分を含む１つ以上の非天然アミノ酸を含んでもよく、好ましくは、当該部分は硫酸基又はリン酸基である。一実施形態では、残基（例えば、１０位の残基）が、システインに変異され、そして、酸化され、こうして、その位置にスルホン酸基（又はスルフィン酸基）が導入される。こうした基の電荷は全てのｐＨ域にわたり負のままである。この手法によれば、ペプチドの認識が改善され得る。代替的に、ペプチドは、負電荷を中性化するために化学的に（例えば、エステル化により）修飾されてもよいかもしれない。
【００３４】
本発明に係るシステムでは、ＦｒａＣナノポアは脂質二重層内に含まれる。脂質二重層内のＦｒａＣナノポアの再構成については、周知技術に記載されている。典型的には、脂質二重層は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、好ましくは、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を、任意で、スフィンゴミエリン（ＳＭ）との組み合わせで、含む。ＤＰｈＰＣおよびＳＭがほぼ等質量で存在する場合に、極めて良好な結果が得られる。
【００３５】
本発明に係るシステムが使用中である場合、ナノポアは、典型的には、第１の液状媒体と第２の液状媒体との間に位置し、このとき、少なくとも１つの液状媒体は分析物を含み、また、本システムは分析物の性質を検出する機能を有する。一実施形態では、本システムは、分析物が電気泳動的及び／又は電気浸透的にナノポアを通過して移動するようにナノポアに電場をかけて前記分析物の性質を検出する機能を有する。本明細書で下記に例示のように、本明細書で提供されるシステムは、タンパク質性物質、好ましくは、ペプチド、より好ましくは、約３０アミノ酸長までのペプチドの分析に特に適している。また、特に、本発明のシステムは、異なる電荷を有するペプチドの捕捉、当該ペプチドの質量の認識、及びほんの４０Ｄａまでの分化能を提供する。
【００３６】
ただし、本発明がペプチド分析に関する用途に限定されると理解されるべきではない。例えば、本発明のシステムを用いて検出できる他の分析物として、（非タンパク質性）バイオマーカー、抗生物質又は他の薬剤、ＤＮＡ、代謝物、及び生物学的小分子が挙げられる。
【００３７】
本発明は、さらに、上述の変異の１つ以上を含む変異型Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ポリペプチドに関する。こうしたポリペプチドは、有利には、本明細書に記載の（分析）システムで用いられる。本発明に係る変異型ＦｒａＣポリペプチドをコードする単離核酸分子及び当該単離核酸分子を含む発現ベクターも提供される。また、さらに、本発明は、前述の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３８】
一実施形態では、変異型ＦｒａＣポリペプチドは、Ｄ１０９、Ｗ１１２、及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む。例えば、変異型ＦｒａＣポリペプチドは、Ｗ１１２での変異を含み（任意で、Ｗ１１６は変異されず）、又は、Ｗ１１６での変異を含む（任意で、Ｗ１１２は変異されない）。一実施形態では、変異型ＦｒａＣポリペプチドは、Ｗ１１２及びＷ１１６の両方での変異を含む。本明細書で上述したように、１つ又は複数の変異は、Ｄ又はＷの、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧでの、好ましくは、Ｓ又はＴでの置換を含んでもよい。特定の態様では、本発明は、ＦｒａＣ  Ｗ１１２Ｓ、ＦｒａＣ  Ｗ１１６Ｓ、若しくはＦｒａＣ  Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓの変異体、又は、それをコードする核酸分子、又は、当該核酸分子を含むベクターを提供する。また、さらに、本発明は、Ｄ１０９Ｓの変異を含むポリペプチド、好ましくは、当該変異体がＤ１０９Ｓ／Ｗ１１６Ｓであるもの、又は、それをコードする核酸分子、又は、当該核酸分子を含むベクターを提供する。
【００３９】
前述の変異のいずれも、低ｐＨで負電荷を保持する部分を含む１つ以上の非天然アミノ酸により補われてもよく、ここで、例えば、当該部分は、硫酸基、スルホン酸基、又はリン酸基である。こうした１つ又は複数の負電荷残基の導入に好ましい位置としては、１０位、１７位、及び２４位の１つ以上が挙げられる。
【００４０】
特定の態様では、Ｗ１１６の変異はＤ１０Ｃの変異で補われる。そして、当該システインのチオール基が、例えば、１０％（ｖ／ｖ）の過酸化水素でのＦｒａＣ二重変異単量体のインキュベートにより、酸化されて、スルホン酸になる。ＦｒａＣの１０位でのスルホン酸部分の導入が、電気生理学的記録において酸化処理に掛けられなかったナノポアで観察されるノイズがより多い信号に比べてノイズの少ない信号を示す多量体化ポアを生じさせることが判明した。したがって、一実施形態では、本発明は、Ｄ１０Ｃの置換を、好ましくは、Ｗ１１２Ｓ、Ｗ１１６Ｓ、及びＤ１０９Ｓの１つ以上との組み合わせで、より好ましくは、少なくともＷ１１６Ｓとの組み合わせで、含む変異体を提供する。
【００４１】
さらなる実施形態は、本発明に係るシステムを提供するための方法であって、
・組み換えＦｒａＣ単量体を提供する工程、
・単量体とリポソームとを集合して多量体とするために単量体をリポソームに接触させる工程、
・多量体をリポソームから回収する工程、
・ＦｒａＣナノポアの形成を可能とするために多量体を脂質二重層（これはスフィンゴミエリンを含有していてもよい）に接触させる工程、
を含む、
方法に関する。
一実施形態では、脂質二重層との接触は、４．５未満の、好ましくは、４．０未満のｐＨで行われる。
【００４２】
本発明の方法は、さらに、ＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画、及び／又は、ＩＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画を単離する工程を含んでもよい。一態様では、本発明の方法は、サイズ排除、アフィニティ、逆相、又はイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする液体クロマトグラフィー法を用いて、異なる多量体形態のＦｒａＣを単離することを含む。
【００４３】
本願発明のペプチド質量検出ＦｒａＣナノポアシステムは、有利には、リアルタイム式タンパク質配列決定システムに組み込まれる。このため、本システムは、好ましくは、１つ以上のさらなる修飾を含む。
【００４４】
一実施形態では、プロテアーゼ−アンフォルダーゼペアがＦｒａＣナノポアの上方（すなわち、そのｃｉｓ側）に直接的に結合される。そして、切断されたペプチドがナノポアを通過して連続的に認識及び移動される。例えば、樽形状のＡＴＰ依存性のＣｌｐＸＰプロテアーゼは、消化されたペプチドを包んで溶液内へのその解放を防止するため、理想的な候補である。別の手法として、プロテアソームを構成するタンパク質複合体、又は、任意の他のプロテアーゼに基づくものが挙げられる。例えば、複合体は、プロテアソームの２０Ｓα／βサブユニット、及び、ＡＴＰａｓｅが最小必要単位である１９Ｓ制御粒子を含む。しかし、他のプロテアーゼを用いることもできるだろう。プロテアーゼは、ポリペプチドを、特異的に（例えば、正電荷残基又は負電荷残基又は芳香族残基などの後で）切断し、又は、特異的に切断するように改変され、又は、ポリペプチド鎖内の非特異的な位置で切断する。プロテアーゼは、理想的には物質を包み、また、ポリペプチドをアンフォルダーゼ活性部位に供給するために他の成分（例えば、アンフォルダーゼ）のドッキングを可能とする。
【００４５】
結合は、共有結合的でも非共有結合的でもよい。例えば、結合は、化学結合により、遺伝子融合により、又は、ペプチドと非共有結合的に相互作用し得るＦｒａＣナノポア内への結合ループの導入により、実現できる。
【００４６】
発明者等は、ナノポアのｃｉｓ側に入ったペプチドがナノポアからｔｒａｎｓチャンバーへと出る可能性が高く、これにより二重検出現象が防がれることを示した。さらに、発明者等は、低ｐＨでペプチドがペプチドの化学組成によらず固定印加電位でナノポアにより捕捉され且つペプチドの質量が認識される可能性があることを示した。こうした低ｐＨ値が酵素活性と相性が良くない場合、ナノポアの両側で非対称的な溶液を用いることができる（非特許文献３４、３５）。こうしたシステムでは、ｃｉｓ側での条件はアンフォルダーゼ−ペプチダーゼのＡＴＰａｓｅ活性を最適化するために調節でき、一方、ｔｒａｎｓ側のｐＨとイオン強度は個々のペプチドを捕捉及び認識するために最適化できる。
【００４７】
本明細書で提供されるＦｒａＣナノポア又は変異型ＦｒａＣポリペプチドは、有利には、ペプチド又はＤＮＡ分析をはじめとするあらゆる種類の分析物分析に用いられ、好ましくは、ペプチド分析はペプチド質量検出及び／又はペプチド配列決定を含む。しかし、本明細書で提供されるシステムの有利な性質はペプチド分析の文脈で例示されているものの、当業者であれば、本システムが様々な用途に使用できることを理解できるだろう。本発明の他の用途としては以下のものが挙げられる。
・ペプチド後修飾検出（グリコシル化など）、プロテオミクス、
・高精度のＤＮＡ配列決定又はＤＮＡ後修飾検出（メチル化など）、
・他の小分析物検出又はより高い分解能でのポリマー分析、
・単分子タンパク質及びＤＮＡの配列決定、
・ヒトサンプルでの、直接的な、ペプチド、バイオマーカー、抗生物質、及び小分子の検出、
・グルコースなどの、結合リガンド分析のための異なるサイズのタンパク質のトラッピングなど。
【００４８】
質量分析法はプロテオミクスの分野に大きく貢献するものである。現在、ナノポアシステムは市販の質量分析計の分解能には及ばない。本明細書に記載のようにＦｒａＣナノポアに基づくペプチド質量分析装置は、高価で、極めて複雑で、かさばり、単分子ではない従来の質量分析計と比べて、独特の利点を有する。対照的に、ナノポアは、数十万の個々のセンサーを包含する携帯可能かつ低価格な装置に組み込むことができる。そこで、一実施形態では、ＦｒａＣナノポアシステムは、本明細書に記載のような個々のＦｒａＣナノポアシステムの複数を含む携帯装置に組み込まれる。
【００４９】
また、信号の電気的性質は生物学的サンプルをリアルタイムにサンプリングすることを可能とする。さらに、ナノポアは個々の分子を読むので、信号はアンサンブル技術では利用できない追加の情報を含む。特に、単分子検出は、とりわけ、ハイスループット分析と組み合わせた場合に、少量のペプチドを検出して、翻訳後修飾での化学的不均一性や従来の質量分析法で解決することが困難な問題を解き明かすことを可能とする。例えば、本発明は、ハイスループット分析と好ましくは組み合わされた単分子検出におけるＦｒａＣナノポアシステム又は変異型ＦｒａＣポリペプチドの使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型のＦｒａＣナノポアの調製と解析。ａ．Ｐｙｍｏｌにより計算した真空静電電位に基づいて色分けしたＷＴ−ＦｒａＣ多量体（ＰＤＢ：４ＴＳＹ）（非特許文献２５）の表面表現の切断図。１つのプロトマーをカートン表記でトリプトファン１１２及び１１６を複数の球として描写しつつ示す。ｂ．ｐＨ７．５及び４．５での、ＷＴ−ＦｒａＣ、Ｗ１１２Ｓ−ＦｒａＣ、Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣ、及びＷ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣについての、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型の分布の百分率。ｃ．ｐＨ７．５（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＫＣｌ）でのＷＴ−ＦｒａＣ、Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣ、及びＷ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣにより形成されるＩＩ型ナノポアのＩＶ曲線。ｄ．ｐＨ４．５での１Ｍ  ＫＣｌ（０．１Ｍ  クエン酸、及び、１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基）内でのＷ１１６Ｓ−ＦｒａＣのシングルナノポアコンダクタンス。ｅ．−５０ｍＶの印加電位下ｐＨ４．５での１Ｍ  ＫＣｌ内のＷ１１６Ｓ−ＦｒａＣの３種類のナノポアの型についての典型的な電流トレース。ｆ．３種類のＷ１１６Ｓ−ＦｒａＣのナノポアの型についてｐＨ４．５でＫＣｌの非対称条件（１９６０ｍＭ  ｃｉｓ、４６７ｍＭ  ｔｒａｎｓ）のもと測定された反転電位。イオン選択性はゴールドマン・ホジキン・カッツの式（式１）を用いることにより求めた。ｇ．Ｒｏｓｅｔｔａの対称ドッキング機能を用いてＦｒａＣ結晶構造から構築した３種類のＦｒａＣナノポアの分子モデル。電気生理学的記録は、１０ｋＨｚのサンプリング周波数及び２ｋＨｚのフィルター周波数で行った。ＩＶ曲線でのエラーバー及び色付き影は少なくとも３回の反復から求めた標準偏差である。
【図２】ｐＨ７．５及び４．５でのＦｒａＣナノポアのシングルチャネルコンダクタンスの分布。ａ．本表はガウス関数をコンダクタンスヒストグラムにあてはめることで得られた平均コンダクタンス値を報告する。Ｓ．Ｄ．は全てのシングルチャネル（数をｎで示す）の標準偏差を表す。ｂ−ｆ．各パネルは図示のように異なるバッチのＦｒａＣナノポアを表す。シングルチャネルを−５０ｍＶの印加電位下で収集した。ｐＨ７．５及び４．５は、それぞれ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、又は、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基を用いて得た。
【図３】ＩＩ型Ｗ１１６Ｓ−Ｆｒａｃナノポアによる混合物中でのアンジオテンシンペプチドの識別。ａ．（ｉ）は、−３０ｍＶで測定した対応するＩｒｅｓ％とともに示したアンジオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの配列を示す。（ｉｉ）は、４種類のアンジオテンシンペプチドにより引き起こされた典型的な遮断を示す。（ｉｉｉ）は、ｃｉｓコンパートメントに添加したアンジオテンシンＩについての電流振幅の標準偏差に対するＩｒｅｓ％の色密度図を示し、ｃｉｓチャンバーにアンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、及びアンジオテンシンＩＶをさらに添加した後の色密度図は（ｉｖ）に示される。ｂ．アンジオテンシンＩＩとアンジオテンシンＡとの識別。（ｉ）は、ペプチドの、配列、分子量、及びＩｒｅｓ％を示す表である。ペプチドは赤字で示したように１つのアミノ酸が異なる。（ｉｉ）は、ペプチド遮断の代表的なトレースを示す。アンジオテンシンＩＩの遮断についてｃｉｓチャンバーへのアンジオテンシンＡのさらなる添加の前（ｉｉｉ）及び後（ｉｖ）での電流振幅の標準偏差に対するＩｒｅｓ％の色密度図を示す。全ての測定及び記録は、１Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭトリス塩基を含有するｐＨ４．５緩衝液内で５０ｋＨｚのサンプリング周波数及び１０ｋＨｚのフィルター周波数で行った。標準偏差は最低３回の反復から計算した。色密度図はＯｒｉｇｉｎを用いて作成した。
【図４】異なる化学組成を有する生物学的ペプチドの評価。（ａ）Ｉ型ＷＴ−ＦｒａＣナノポア、（ｂ）ＩＩ型Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポア、及び（ｃ）ＩＩＩ型Ｗ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポアを用いた、ｐＨ４．５での、ペプチドの分子量とＩｒｅｓ％との間の関係を示す。実線は二次多項式あてはめを表す。電流遮断を、Ｉ型及びＩＩ型ポアについては、−３０ｍＶで、ＩＩＩ型ポアについては、−５０ｍＶで、測定した。エラーバー及び標準偏差は少なくとも３回の測定から得た。
【図５】ナノポアペプチド質量分析計。ａ．４種類の異なるペプチドのアミノ酸配列と異なるｐＨでのそれらの全体的変化。荷電性アミノ酸を下線で示す。ｂ．−３０ｍＶの印加電位下でのＩＩ型Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポアを用いたａに示す４種類のペプチド（ｃｉｓ）についてＩｒｅｓ％のｐＨ依存性。ｃ．ｐＨ４．５及び３．８でのペプチドの質量に対するＩｒｅｓ％の比較。ｄ．異なるｐＨでのｃ−Ｍｙｃの滞留時間の電圧依存性。全ての電気生理学的測定は、１Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸内で行い、ｐＨは、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で所望の値に調節した。電流イベントを収集するために、５０ｋＨｚのサンプリング周波数及び１０ｋＨｚのフィルター周波数を用いた。エラーバー及び標準偏差は少なくとも３回の測定から得た。ペプチドの変化は、個々のアミノ酸についてのｐＫａに基づき計算した（非特許文献３６）。
【図６】変異型Ｗ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣを含むＩＩＩ型Ｆｒａｃナノポアによる短ペプチド混合物の識別。ａ．アンジオテンシンＩＶ、アンジオテンシン４−８、エンドモルフィンＩ、及びロイシン−エンケファリンについての、配列、Ｉｒｅｓ％（−５０ｍＶ）、及びＭＷ。ｂ．異なるペプチドにより引き起こされた典型的な遮断。ｃ．アンジオテンシンＩＶ、アンジオテンシン４−８、エンドモルフィンＩ、及びロイシン−エンケファリンの混合物についての、電流遮断の標準偏差に対するＩｒｅｓ％の色密度図。全ての測定及び記録は、１Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭトリス塩基を含有するｐＨ４．５緩衝液内で５０ｋＨｚのサンプリング周波数及び１０ｋＨｚのフィルター周波数で行った。標準偏差は最低３回の反復から計算した。
【図７】１０位に酸化システインを含むＩＩ型ＦｒａＣナノポアの解析。Ｄ１０Ｃ／Ｗ１１６ＳＩＩ型ポア（パネルＡ）と酸化Ｄ１０Ｃ／Ｗ１１６ＳＩＩ型ポア（パネルＢ）との間の違いを示す。記録は、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液内、ｐＨ７．５、±５０ｍＶで、行った。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
〈実験の部〉
（材料と方法）
（化学薬品）
エンドセリン１（≧９７％、ＣＡＳ＃１１７３９９−９４−７）、エンドセリン２（≧９７％、ＣＡＳ＃１２３５６２−２０−９）、ダイノルフィンＡ（ブタ）（≧９５％、ＣＡＳ＃８０４４８−９０−４）、アンジオテンシンＩ（≧９０％、ＣＡＳ＃７０９３７−９７−２）、アンジオテンシンＩＩ（≧９３％、ＣＡＳ＃４４７４−９１−３）、ｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９（≧９７％、＃Ｍ２４３５）、Ａｓｎ１−Ｖａｌ５−アンジオテンシンＩＩ（≧９７％、ＣＡＳ＃２００７１−００−５）、Ｉｌｅ７アンジオテンシンＩＩＩ（≧９５％、＃Ａ０９１１）、ロイシンエンケファリン（≧９５％、＃Ｌ９１３３）、５−メチオニンエンケファリン（≧９５％、ＣＡＳ＃８２３６２−１７−２）、エンドモルフィンＩ（≧９５％、ＣＡＳ＃１８９３８８−２２−５）、ペンタン（≧９９％、ＣＡＳ＃１０９−６６−０）、ヘキサデカン（９９％、ＣＡＳ＃５４４−７６−３）、トリズマ（登録商標）塩酸塩（≧９９％、ＣＡＳ＃１１８５−５３−１）、トリズマ（登録商標）塩基（≧９９％、ＣＡＳ＃７７−８６−１）、塩化カリウム（≧９９％、ＣＡＳ＃７４４７−４０−７）、及びＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＡＤＯ、≧９９％、ＣＡＳ＃１６４３−２０−５）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。前駆体アンジオテンシン１−１４（≧９７％、＃００２−４５）、アンジオテンシン１−９（≧９５％、＃００２−０２）、アンジオテンシンＡ（≧９５％、＃００２−３６）、アンジオテンシンＩＩＩ（≧９５％、＃００２−３１）、及びアンジオテンシンＩＶ（≧９５％、＃００２−２８）は、Ｐｈｅｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た。アンジオテンシン４−８（≧９５％）は、ＢＩＯＭＡＴＩＫにより合成された。１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ、＃８５０３５６Ｐ）及びスフィンゴミエリン（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｂｒａｉｎ、＃８６００６２）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。クエン酸（９９．６％、ＣＡＳ＃７７−９２−９）  は、ＡＣＲＯＳから得た。ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ、≧９９．５％、ＣＡＳ＃６９２２７−９３−６）は、Ｇｌｙｃｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＥｍｂＨから購入した。ＤＮＡプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により合成され、酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによる。全てのペプチドは、さらなる精製を行わずミリＱ水で溶かし、−２０℃の冷凍庫で保存した。本研究では、１５ｍＭトリスを含有するｐＨ７．５緩衝液は、１．９０２ｇのトリズマ（登録商標）ＨＣｌと０．３５４ｇのトリズマ（登録商標）塩基とを１リットルのミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に溶かすことで調製した。
【００５２】
（ＦｒａＣ単量体の発現及び精製）
５’端及び３’端にそれぞれＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含み、また、３’末端にポリヒスチジンタグをコードする配列を含むＦｒａＣ遺伝子を、ｐＴ７−ＳＣ１プラスミドにクローニングした。プラスミドを電気穿孔法でＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）コンピテントセルに形質転換した。細胞を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢアガープレートにおいて３７℃で一晩培養した。その後、プレート全体を採取し、２００ｍＬの新鮮な２ＹＴ培地に蒔き、細胞培養物の６００ｎｍでの光学密度が０．８になるまで培養液を２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。その後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを培地に加え、培養液を２５℃に移し２２０ｒｐｍで振盪しながら一晩培養した。翌日に細胞を遠心分離し（２０００×ｇ、３０分）、ペレットを−８０℃で保存した。１００ｍＬの培養培地から採取した細胞ペレットを用いてＦｒａＣ単量体を精製した。３０ｍＬの細胞溶解バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４Ｍ  尿素、０．２ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム、及び０．０５ユニット／ｍＬ  ＤＮａｓｅ）を添加し、ペレットを再懸濁し、１時間激しく撹拌した。その後、細胞溶解物を、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０で２分間超音波処理した（ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  １０％、ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ３）。その後、粗溶解物を４℃で３０分間遠心分離し（５４００×ｇ）、上澄みを１時間優しく振盪しながら１００μＬのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）とともにインキュベートした。ビーズを遠沈し、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  （Ｂｉｏ−ｒａｄ）にローディングした。２０ｍＭ  イミダゾールを含む１０ｍＬのＳＤＥＸバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を用いてビーズを洗い、タンパク質を１５０μＬの溶出用バッファー（ＳＤＥＸバッファー、３００ｍＭ  イミダゾール）で溶出させた。タンパク質の濃度を、溶出用バッファーをブランクとして用いＮａｎｏ−ｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により２８０ｎｍの吸光度を測定することで測定した。単量体の純度をさらに確認するために、単量体ＦｒａＣを溶出用バッファーで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、９μＬの希釈サンプルを３μＬの４×ローディングバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、及び４０％グリセロール）と混ぜた後、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲルに３５ｍＡの一定の印加電流を３０分間流し、ゲル撮影装置（Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて見る前にクマシー染料（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｄｅｄｅｏｎ）で１時間超染色した。
【００５３】
＞ＦｒａＣ｜Ｂ９Ｗ５Ｇ６（アミノ酸配列）
ＳＡＤＶＡＧＡＶＩＤＧＡＧＬＧＦＤＶＬＫＴＶＬＥＡＬＧＮＶＫＲＫＩＡＶＧＩＤＮＥＳＧＫＴＷＴＡＭＮＴＹＦＲＳＧＴＳＤＩＶＬＰＨＫＶＡＨＧＫＡＬＬＹＮＧＱＫＮＲＧＰＶＡＴＧＶＶＧＶＩＡＹＳＭＳＤＧＮＴＬＡＶＬＦＳＶＰＹＤＹＮＷＹＳＮＷＷＮＶＲＶＹＫＧＱＫＲＡＤＱＲＭＹＥＥＬＹＹＨＲＳＰＦＲＧＤＮＧＷＨＳＲＧＬＧＹＧＬＫＳＲＧＦＭＮＳＳＧＨＡＩＬＥＩＨＶＴＫＡ
【００５４】
＞６ｘＨｉｓ−ＷｔＦｒａＣ（アミノ酸配列）、本発明で用いられるもの
太字の残基（訳注：下記のアミノ酸配列の冒頭の「ＭＡ」及び末尾の「ＧＳＡＨＨＨＨＨＨ」は原文では太字である。）は、元の配列に加えられたＮ末端及びＣ末端の残基を示す。
ＭＡＳＡＤＶＡＧＡＶＩＤＧＡＧＬＧＦＤＶＬＫＴＶＬＥＡＬＧＮＶＫＲＫＩＡＶＧＩＤＮＥＳＧＫＴＷＴＡＭＮＴＹＦＲＳＧＴＳＤＩＶＬＰＨＫＶＡＨＧＫＡＬＬＹＮＧＱＫＮＲＧＰＶＡＴＧＶＶＧＶＩＡＹＳＭＳＤＧＮＴＬＡＶＬＦＳＶＰＹＤＹＮＷＹＳＮＷＷＮＶＲＶＹＫＧＱＫＲＡＤＱＲＭＹＥＥＬＹＹＨＲＳＰＦＲＧＤＮＧＷＨＳＲＧＬＧＹＧＬＫＳＲＧＦＭＮＳＳＧＨＡＩＬＥＩＨＶＴＫＡＧＳＡＨＨＨＨＨＨ
【００５５】
＞６ｘＨｉｓ−ＷｔＦｒａＣ（ＤＮＡ配列）
ＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＧＧＴＣＣＴＧＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＡＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ
【００５６】
（ＦｒａＣ変異調製）
ＦｒａＣ変異体はＭＥＧＡＷＨＯＰ法に基づき調製した。２５μＬのＲＥＤＴａｑ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）を、所望の変異を含む４μＭのプライマー（表１）及びテンプレートしての５０ｎｇのプラスミド（野生型ＦｒａＣ遺伝子を有するｐＴ７−ＳＣ１）と混ぜ、最終量をミリＱ水で５０μＬとした。
【００５７】
表１：ＦｒａＣ変異体を調製するために本研究で用いたプライマー配列
【表１】
2022500074.tif 000002
【００５８】
ＰＣＲプロトコルは、１５０秒の９５℃での変性工程を最初に行い、その後、変性（９５℃、１５秒）、アニーリング（５５℃、１５秒）、及び伸長（７２℃、６０秒）を３０サイクル行うものであった。ＰＣＲ産物（ＭＥＧＡプライマー）をまとめて、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて約２００ｎｇ／μＬの最終ＤＮＡ濃度で精製した。全プラスミド増幅のために２回目のＰＣＲを行った。２μＬのＭＥＧＡプライマー、１μＬのＰｈｉｒｅ  ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ、１０μＬの５×Ｐｈｉｒｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓをＰＣＲ水と混ぜ、５０μＬの最終量とした。ＰＣＲは、９８℃（３０秒）のプリインキュベーションから始め、その後、変性（９８℃、５秒）、アニーリング（７２℃、９０秒）、伸長（７２℃、１５０秒）を２５サイクル行った。ＰＣＲ完了後、１μＬのＤｐｎＩ酵素を添加し、混合液を１時間３７℃に維持した。その後、温度を１分間６５℃まで上げ、酵素を失活させた。その後、産物を電気穿孔法によりＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ  ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のコンピテントセルに形質転換した。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に蒔き、３７℃で一晩培養した。単一クローンを増やし、配列決定に回した。
【００５９】
（スフィンゴミエリン−ＤＰｈＰＣリポソーム調製）
２０ｍｇのスフィンゴミエリン及び２０ｍｇのＤＰｈＰＣ（１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、０．５％ｖ／ｖのエタノールを含む４ｍＬのペンタンに溶かし、５０ｍＬの丸底フラスコに入れた。その後、回転及びフラスコを温めるためのヘアドライヤーの使用により溶媒を蒸発させた。蒸発後、フラスコを追加で３０分間外気温に維持した。脂質薄膜を４ｍＬのＳＤＥＸバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、溶液を超音波処理槽に５分間漬けた。リポソーム懸濁液を−２０℃で保存した。
【００６０】
（ＦｒａＣ多量体化）
ＦｒａＣ単量体をスフィンゴミエリン−ＤＰｈＰＣリポソームとともにインキュベートすることによりＦｒａＣ多量体化を誘発させた。凍結リポソームを解かし、水槽内で１分間超音波処理した。ＦｒａＣ単量体をＳＤＥＸバッファーを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後、５０μＬのＦｒａＣ単量体を５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬリポソーム溶液に添加し、１０：１（リポソーム：タンパク質）の質量比とした。リポプロテイン溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、多量体化させた。その後、１０μＬの５％（ｗ／ｖ、終濃度０．５％）ＬＡＤＯをリポプロテイン溶液に添加し、リポソームを可溶化した。清澄化（通常１分）後、溶液を５０ｍＬのファルコンチューブに移した。その後、０．０２％のＤＤＭを含有する１０ｍＬのＳＤＥＸバッファー及び１００μＬの事前洗浄済みＮｉ−ＮＴＡビーズをファルコンチューブに加え、振盪機で１時間室温で優しく混ぜた。その後、ビーズを遠心分離し、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎにローディングした。１０ｍＬの洗浄用バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭイミダゾール、０．０２％ＤＤＭ、ｐＨ７．５）を用いてビーズを洗い、多量体を１００μＬの溶出用バッファー（通常、２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０２％ＤＤＭ）により溶出させた。ＦｒａＣ多量体を４℃で保存した。この条件で当該ナノポアは数ヶ月間安定である。
【００６１】
（Ｈｉｓ−ＴｒａｐクロマトグラフィーによるＷ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣ多量体分離）
２００μＬのＷ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣ単量体（３ｍｇ／ｍＬ）を３００μＬのスフィンゴミエリン−ＤＰｈＰＣリポソーム（１０ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、４８時間４℃に維持し、その後、リポプロテインを可溶化するために０．５％ＬＡＤＯ（終濃度）を添加した。その後、バッファーを、ＰＤ  ＳｐｉｎＴｒａｐ  Ｇ−２５  ｃｏｌｕｍｎを用いて、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１％ＤＤＭ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５（結合バッファー）に交換した。その後、Ｗ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣ多量体をＡ¨ＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を用いてＨｉｓｔｒａｐ  ＨＰ  １ｍＬ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）にローディングした。３０カラム容量にわたりイミダゾール勾配（３０ｍＭから１Ｍのイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１％ＤＤＭ、ｐＨ７．５）を掛ける前に、ローディングした多量体を１０カラム容量の５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１％ＤＤＭ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５で洗った。信号を２８０ｎｍの吸光度で監視し、吸光度が５ｍＡｕを超えたときに分画を集めた。
【００６２】
（電気生理学的測定及びデータ分析）
電気記録は従来詳述のとおりに行った（非特許文献２７、３７）。ＩＯ（開口ポア電流を指す）はイベント振幅ヒストグラムにガウス関数をあてはめることにより測定した。残余電流値（Ｉｒｅｓ％）は遮断電流（ＩＢ）を開口ポア電流で割ることで計算した（ＩＢ／ＩＯ×１００％）。滞留時間及びイベント間の時間は単一指数関数を累積分布ヒストグラムにあてはめることにより測定された。
【００６３】
（イオン透過性測定）
反転電位を測定するために、対称条件（各電気生理学的チャンバーにおいて、８４０ｍＭ  ＫＣｌ、５００μＬ）下でシングルチャネルを得て、電極をバランスさせた。３．３６Ｍ  ＫＣｌの緩衝保存液を４００μＬだけｃｉｓチャンバーにゆっくりと加え、一方、無塩緩衝液を４００μＬだけｔｒａｎｓチャンバーに加えて９００μＬの総容積とした（ｔｒａｎｓ：ｃｉｓ，４６７ｍＭ  ＫＣｌ：１９６０ｍＭ  ＫＣｌ）。平衡に達した後、ＩＶ曲線を−３０から＋３０ｍＶで集めた。結果として得られた零電流での電圧が反転電位（Ｖｒ）である。その後、イオン選択性（ＰＫ＋／ＰＣｌ−）（訳注：原文では「Ｋ＋」の正符号は「Ｋ」に対して上付きであり、「Ｃｌ−」の負符号は「Ｃｌ」に対して上付きである。以下同様。）をゴールドマン・ホジキン・カッツの式（式１）を用いて計算した。式中、［ａｋ＋／ｃｌ−］ｃｉｓ／ｔｒａｎｓはｃｉｓ又はｔｒａｎｓコンパートメントでのＫ＋又はＣｌ−の活量、Ｒは気体定数、Ｔは温度、Ｆはファラデー定数である。
【数１】
2022500074.tif 000003
イオンの活量は、平均イオン移動度（ｍｅａｎ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）（５００ｍＭ  ＫＣｌでは０．６４９、２０００ｍＭでは０．５７３）にイオンのモル濃度を掛けることで計算した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極は２．５Ｍ  ＮａＣｌ中で２．５％アガロースブリッジにより囲んだ。
【００６４】
（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＦｒａＣナノポアの分子モデル）
５〜９個の単量体の範囲の異なる多量体化数の３Ｄモデルを、Ｒｏｓｅｔｔａのｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎにより構築した（非特許文献３８）。脂質を含まない単量体を脂質を有するＦｒａＣの結晶構造（ＰＤＢ＿ＩＤ  ４ｔｓｙ）から抽出した。ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｄｏｃｋｉｎｇによりこの単量体を中央回転軸の周りに５〜９個の数で配置した。合計して、Ｒｏｓｅｔｔａは、各対称性について１００００コピーを生成・保存した。全ての場合で、前述の結晶構造に類似した対称性を有する多量体構成が一番のスコアの解答として同定できた。しかし、五量体集合体では、大部分が露出したままであり、前述の結晶構造に比べ、多量体の境界面が完全に満足のいくものとはいえなかった。一方、９倍対称モデルは、最尤のものとして６倍、７倍、及び８倍集合体とともに九量体集合体の好ましくない集合を示す６倍、７倍、及び８倍対称モデルに比べ、Ｒｏｓｅｔｔａスコアの顕著な低下を示した。脂質結合モデルを生成するため、脂質を有する前述の結晶構造を生成したモデルの各単量体に重ね合わせ、脂質座標を転移させた。脂質の４．５オングストローム内の残基をＡｍｂｅｒ１０  ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄにより最小化した。
【００６５】
（実施例１：ＦｒａＣナノポアのサイズの改変）
生物学的ナノポア分析の主要な課題のひとつが、異なるサイズと形状のナノポアを得ることである。生物学的ナノポアの大部分は、個別な単量体の複数個の繰り返しにより形成される。そこで、タンパク質多量体組成を改変することにより異なるナノポアのサイズが得られるかもしれない（非特許文献２８）。発明者等は、ｐＨ７．５で、野生型ＦｒａＣ（ＷＴ−ＦｒａＣ）ナノポアの少量の分画（１．２６±０．０８ｎＳ、−５０ｍＶ、ＩＩ型ＷＴ−ＦｒａＣ、図１ｂ）が、主要な分画に比べ（２．２６±０．０８ｎＳ、−５０ｍＶ、Ｉ型ＷＴ−ＦｒａＣ）、より低いコンダクタンスを示し、このことが、ＦｒａＣが自発的に集合してより小さいサイズを有するナノポアになるかもしれないことを示唆することに気付いた。ｐＨ４．５では、さらに低いナノポアコンダクタンスが観察された（０．４２±０．０３ｎＳ、ＩＩＩ型ＷＴ−ＦｒａＣ、−５０ｍＶ、図１ｂ）。発明者等は、より低いコンダクタンスのナノポアの再構築が幾つかの精製条件に依存することに気付いた。特に、発明者等は、多量体が溶液として数週間にわたり保存された場合、又は、単量体ＷＴ−ＦｒａＣの濃度が多量体化中に減ぜられていた場合に、ＩＩ型及びＩＩＩ型のナノポアの発生率が増加するという観察結果を得た。
【００６６】
ＩＩ型及びＩＩＩ型のＦｒａＣナノポアの増加を試みて、ＦｒａＣの脂質界面にあるＷ１１２及びＷ１１６（図１ａ）をセリンに置換することにより、ナノポアと脂質界面との間の相互作用を弱めた。本発明者等は、リポソームにより誘発された多量体化の最中の単量体の濃度を低くすればより低分子質量の多量体の集団が増加するだろうと考えていた。驚くべきことに、ｐＨ４．５でＷ１１６Ｓ−ＦｒａＣ及びＷ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣの多量体を用いるとそれぞれＩＩ型及びＩＩＩ型のＦｒａＣナノポアが優先種となることがわかった（図１ｂ、図２）。好都合なことに、異なるナノポアの種類はイミダゾール勾配を用いたＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーにより分離できた。さらに、ＩＩ型及びＩＩＩ型のＦｒａＣナノポアの増加は脂質界面にあるアスパラギン酸１０９をセリンに置換することによりｐＨ７．５で得ることもできることがわかった（図２ｅ、表２参照）。
【００６７】
表２：中性及び酸性ｐＨで調べたＦｒａＣナノポアのそれぞれについてのＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型の相対量
【表２】
2022500074.tif 000004
【００６８】
同じ型のＦｒａＣナノポアのなかにおいて、Ｗ１１２Ｓ及びＷ１１６Ｓの置換により生じた脂質界面変更は野生型に比べコンダクタンス及びイオン選択性を変化させなかったが（図１ｃ、図２、表３）、このことは、当該変更がナノポアの全体の折り畳みを変えなかったことを示唆している。脂質二重層内で解析した場合、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ナノポアは、明確な単一コンダクタンス分布及び定常開孔ポア電流を示した（図１ｄ−ｅ）。興味深いことに、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ナノポアは、増加するカチオン選択性（ｐＨ４．５、Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣで、Ｉ型についての２．０からＩＩＩ型についての４．２まで）を示し（図１ｆ、表３）、これは、より狭い狭隘部を有するナノポア内の電気二重層のより大きな重複を反映している可能性が高い。
【００６９】
表３：ｐＨ７．５及び４．５での異なるＦｒａＣポアのイオン選択性
【表３】
2022500074.tif 000005
イオン選択性（ＰＫ＋／ＰＣｌ−）は、下記のゴールドマン・ホジキン・カッツの式に基づき反転電位から計算した。
【数２】
2022500074.tif 000006
上式で、Ｖｒは反転電位であり、ＰＫ＋／ＰＣｌ−はイオン選択性であり、ａはイオンの活量であり、Ｆはファラデー定数である。電気生理学的記録は、ｃｉｓ溶液は１９６０ｍＭ  ＫＣｌ、ｔｒａｎｓ溶液は４６７ｍＭ  ＫＣｌで、行った。イオンの活量は、平均イオン移動度（５００ｍＭ  ＫＣｌでは０．６４９、２０００ｍＭでは０．５７３）にイオンのモル濃度を掛けることで計算した（非特許文献３）。誤差は少なくとも３回の実験から計算した標準偏差として求めた。
【００７０】
以上の発見は、ＦｒａＣナノポアの３種類の型が異なるプロトマー組成を有するナノポアを表していることを強く示唆するものである。分子モデルから、ＩＩ型（１．１ｎｍ）及びＩＩＩ型（０．８ｎｍ）のナノポアの直径を予測することができ（図１ｇ）、ＩＩＩ型ＦｒａＣがこれまでに知られた中で最小の狭隘部を有する生物学的ナノポアである可能性が高いことが明らかとなった。
【００７１】
（実施例２：ＩＩ型又はＩＩＩ型のＦｒａＣナノポアをセンサーとして用いた一アミノ酸置換を含むペプチドの同定）
ＩＩ型ＦｒａＣナノポアを用いて一連の（血中で血圧及び体液バランスを調節する）アンジオテンシンペプチドをサンプリングした。ペプチドをＩＩ型Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポアのｃｉｓ側に加え、誘導したイオン電流遮断（ＩＢ）を測定した。異なるナノポアの比較にあたってより信頼性の高い値を提供するので残余電流百分率（Ｉｒｅｓ％、ＩＢ／ＩＯ×１００として定義される）を電流遮断の代わりに用いた。結果を図３ａ及び表４に示す。
【００７２】
アンジオテンシンＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、１２９６．５Ｄａ）が最も深い遮断（Ｉｒｅｓ％＝８．８±０．２）を示し、アンジオテンシンＩＶ（ＶＹＩＨＰＦ、７７４．９Ｄａ）が最も浅い遮断（Ｉｒｅｓ％＝３８．９±４．０）を示した。アンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ、１０４６．２Ｄａ、Ｉｒｅｓ％＝１７．９±１．３）及びアンジオテンシンＩＩＩ（ＲＶＹＩＨＰＦ、９３１．１Ｄａ、Ｉｒｅｓ％＝２２．１±０．５）の残余電流は、中間値に収まった。４種類のペプチドを同時に試験した場合、個々のペプチドは容易に区別可能であった（図３ａ）。
【００７３】
表４：異なる型のＦｒａＣナノポアをｐＨ４．５で用いたペプチド分析
電気生理学的溶液は、ｐＨ４．５で、１Ｍ  ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基を含んでいた。記録は、５０ｋＨｚのサンプリング周波数及び１０ｋＨｚのベッセルフィルターを用いて行った。標準偏差は少なくとも３回の測定から得た。ペプチドの電荷は個々のアミノ酸についてのｐＫａに基づき計算した（非特許文献３６）。
【表４】
2022500074.tif 000007
【００７４】
ナノポアセンサーの分解能限度をペプチドの混合物をサンプリングすることで試した。顕著なことに、最初のアミノ酸以外は同組成のアンジオテンシンＩＩ及びアンジオテンシンＡ（アンジオテンシンＩＩではアスパラギン酸であるのに対しアンジオテンシンＡではアラニン）が、Ｉｒｅｓ％プロットで特有のピークを示した（図３ｂ）。ペプチド質量のより小さな差異、例えば、アンジオテンシンＩＩＩのフェニルアラニンとＩｌｅ７アンジオテンシンＩＩＩのロイシンとの間の３４Ｄａの差異がみられるものの、容易には検出できなかったが（図示せず）、このことは、本発明者等のシステムの分解能が約４０Ｄａであることを示す。より小さなペプチド（アンジオテンシンＩＩ４−８（ＹＩＨＰＦ、６７５．８Ｄａ）、エンドモルフィンＩ（ＹＰＷＦ、６１０．７Ｄａ）、又はロイシンエンケファリン（ＹＧＧＦＬ、５５５．６Ｄａ）など）は、ＩＩ型Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポアの通過が速すぎるためサンプリングできない。一方、これらはＩＩＩ型Ｗ１１２Ｓ−Ｗ１１６Ｓ−ＦｒａＣナノポアを用いて容易に測定できた（表４、図６）。
【００７５】
（実施例３：ペプチド用ナノポア質量分析計）
生物学的ナノポアが既知分析物同士を区別する能力は有用ではあるが、より有力な用途として、分析物の素性についての前知識を把握することなしでのイオン電流遮断からの直接的なペプチド質量の同定が挙げられるだろう。ペプチド質量分析器としてのＦｒａＣナノポアを評価するために、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＦｒａＣナノポアを用いて、追加のペプチドをｐＨ４．５、１Ｍ  ＫＣｌで試験した（図４ａ−ｃ、表４）。重要なのは、大きく異る電荷組成を有する分析物が含まれていた点である。
【００７６】
ペプチドの殆どについてサイズと残余電流との間に直接的な相関関係があることがわかった（図４ａ−ｃ）。注目すべき例外は、負電荷残基の長い伸長を含むため意図的に選択したペプチドであるｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９（１２０３．３Ｄａ）であった（図５ａ）。このペプチドのｐＨ４．５での全体的負電荷（表４参照）は、ペプチド捕捉及び認識の両方に影響すると考えられた。ｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９は、負の印加電位（ｔｒａｎｓ）では容易に捕捉できたが、このことは、ナノポアを通過するｃｉｓからｔｒａｎｓへの電気浸透流がペプチド捕捉に抗う静電エネルギー障壁を克服できることを示す。一方、ｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９のＩｒｅｓ％（３０．０±３．４）は期待した値よりも顕著に高かった（図４ｂ）。
【００７７】
こうした異常は当該ペプチドの酸性アミノ酸とＦｒａＣナノポアの負電荷狭隘部との間の相互作用によるものではないかと本発明者等は推測した。そこで、本発明者等は、ｐＨ溶液を当該ペプチドのアスパラギン酸側鎖及びグルタミン酸側鎖がプロトン化され、そして、中性となる値まで低くした（図５ａ）。思ったとおり、ｐＨ３．８で、ｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９に対応する信号（１２０３．３Ｄａ）がアンジオテンシンＩの信号（１２９６．５Ｄａ）とアンジオテンシンＩＩ（１０４６．２Ｄａ）の信号との間に収まった（図５ｂ、ｃ）。このことは、負電荷を失った後、当該ペプチドの遮断がその期待質量に応じて増減するものであることを示した。
【００７８】
平均滞留時間（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｗｅｌｌ  ｔｉｍｅ）（τｏｆｆ）の電圧依存性がナノポアを通過した分子の移動を知らせ得ることが、推定（非特許文献１、３０、３１）及び実証（非特許文献３２）されていた。（ｃｉｓに加えられた）正電荷ペプチドについての負のバイアス（ｔｒａｎｓ）のもとで、（ｃｉｓからｔｒａｎｓへの）電気泳動力及び電気浸透力の両方がナノポアを通過する侵入及び移動を促進する（非特許文献２７）。負電荷ペプチド（ｐＨ４．５でのｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９（図５ａ）など）の場合、電気浸透駆動力はそれに抗する電気泳動力よりも強くなければならない。τｏｆｆの電圧依存性を異なるｐＨ値でｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９について調べた（図５ｄ）。ｐＨ４．５の場合、当該ペプチドは−５０ｍＶで最大のτｏｆｆを示したが、このことは、低電位（＜５０ｍＶ）ではｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９がｃｉｓチャンバーに返り、高電位（＞５０ｍＶ）ではｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９がｔｒａｎｓチャンバーに抜けることを示唆する。ｐＨ３．８以下の場合、電位が高くなるほどτｏｆｆの低下がみられたが、このことは、ｃ−Ｍｙｃ  ４１０−４１９が膜を通過してｔｒａｎｓチャンバーに至ったことを示している。
【００７９】
図６に示すように、ＩＩＩ型ＦｒａＣナノポアはペプチド混合物中で４アミノ酸までのペプチド長（約５００ダルトンの質量）の違いを識別できる。残余電流信号がペプチドの質量と良く相関していることもわかったが、このことは、ＩＩＩ型が約５００Ｄａまでの質量を有するペプチドのための検出器として使用できることを示唆している。
【００８０】
（実施例４：ｐＨ３でのペプチド質量同定器）
この実施例は、Ｄ１０Ｃの変異が電気生理学的記録においてノイズの少ない信号を示すＦｒａＣポアを得るための追加の変異として使用できることを示す。
【００８１】
例示的変異体としてＷ１１６Ｓを用いれば、ＦｒａＣの１０位のアスパラギン酸は部位特異的変異導入によりシステインに変換した。その後、標準バッファー（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌなど）に溶かした１０％過酸化水素（ｖ／ｖ）でＦｒａＣ単量体をインキュベートすることにより、システインのチオール基を酸化してスルホン酸とした。対照群として、二重変異体を酸化させないものを用いた。
【００８２】
Ｄ１０Ｃ／Ｗ１１６ＳＦｒａＣを多量体化し、この多量体を電気記録で試験した。図７は、酸化後の差異を示すためのＤ１０Ｃ／Ｗ１１６Ｓポアと酸化Ｄ１０Ｃ／Ｗ１１６Ｓポアとの間のトレース比較を示す。酸化Ｄ１０Ｃ／Ｗ１１６ＳＦｒａＣ単量体からなる多量体化ポアは、酸化に掛けなかったナノポアで観察されたノイズのより多い信号に比べ、電気生理学的記録においてノイズの少ない信号を示した。
【００８３】
［付記］
［付記１］
脂質二重層内に含まれた多量体Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ナノポアを含むシステムであって、七量体（ＩＩ型）状態のナノポアの割合と六量体（ＩＩＩ型）状態のナノポアの割合との合計が前記ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６０％に相当する、システム。
【００８４】
［付記２］
ＩＩ型及びＩＩＩ型状態のナノポアの合計は、前記ＦｒａＣナノポアの総数の少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％に相当する、付記１に記載のシステム。
【００８５】
［付記３］
前記ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩ型状態である、付記１又は２に記載のシステム。
【００８６】
［付記４］
前記ＦｒａＣナノポアの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％が、ＩＩＩ型状態である、付記１又は２に記載のシステム。
【００８７】
［付記５］
前記ＦｒａＣナノポアは、Ｗ１１２及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含む、付記１から４のいずれか１つに記載のシステム。
【００８８】
［付記６］
１つ又は複数の前記変異は、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧでの、好ましくは、Ｓ又はＴでの、Ｗの置換を含む、付記５に記載のシステム。
【００８９】
［付記７］
前記ＦｒａＣナノポアは、Ｄ１０９の位置での変異を含む変異型ＦｒａＣ単量体を含み、好ましくは、前記変異は、Ｓ又はＴでの、好ましくは、Ｓでの、Ｄの置換を含む、付記１から６のいずれか１つに記載のシステム。
【００９０】
［付記８］
前記変異型ＦｒａＣ単量体は、Ｗ１１２Ｓ、Ｗ１１６Ｓ、及び／又は、Ｄ１０９Ｓの変異を含み、好ましくは、ＦｒａＣ変異体は、Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓ／Ｗ１１６Ｓ又はＤ１０９Ｓ／Ｗ１１６Ｓである、付記５から７のいずれか１つに記載のシステム。
【００９１】
［付記９］
前記システムは、分析物が電気泳動的及び／又は電気浸透的に前記ナノポアを通過して移動するように前記ナノポアに電場をかけて前記分析物の性質を検出する機能を有する、付記１から８のいずれか１つに記載のシステム。
【００９２】
［付記１０］
前記分析物は、タンパク質性物質、好ましくは、ペプチド、より好ましくは、約３０アミノ酸長までのペプチドである、付記９に記載のシステム。
【００９３】
［付記１１］
付記１から１０のいずれか１つに記載のシステムを提供するための方法であって、
（ｉ）複数の組み換えＦｒａＣ単量体を提供する工程と、
（ｉｉ）前記単量体とリポソームとを集合して多量体とするために前記単量体を前記リポソームに接触させる工程と、
（ｉｉｉ）前記多量体を前記リポソームから回収する工程と、
（ｉｖ）ＦｒａＣナノポアの形成を可能とするために前記多量体を脂質二重層に接触させる工程と、
を含み、
任意で、（ｖ）ＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画及び／又はＩＩＩ型状態のＦｒａＣナノポアを含む分画を単離する工程をさらに含む、
方法。
【００９４】
［付記１２］
Ｗ１１２及び／又はＷ１１６の位置での変異を含む変異型Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ポリペプチドであって、番号付けがＵｎｉＰｒｏｔでＢ９Ｗ５Ｇ６というアクセッション番号で利用可能なＦｒａＣアミノ酸に対応しており、１つ又は複数の当該Ｗ残基は、独立して、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＧで置換されている、変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【００９５】
［付記１３］
Ｄ１０９の位置での変異を含む変異型Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ  Ｃ（ＦｒａＣ）ポリペプチドであって、番号付けがＵｎｉＰｒｏｔでＢ９Ｗ５Ｇ６というアクセッション番号で利用可能なＦｒａＣアミノ酸に対応しており、当該Ｄ残基は、無荷電残基で、好ましくは、Ｓ又はＴで、より好ましくは、Ｓで、置換されている、変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【００９６】
［付記１４］
Ｗ１１２Ｓ、Ｗ１１６Ｓ、及び／又は、Ｄ１０９Ｓの変異を含み、好ましくは、前記変異型ＦｒａＣは、Ｗ１１２Ｓ／Ｗ１１６Ｓ又はＤ１０９Ｓ／Ｗ１１６Ｓである、付記１２又は１３に記載の変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【００９７】
［付記１５］
Ｄ１０Ｃの変異をさらに含む、付記１２から１４のいずれか１つに記載の変異型ＦｒａＣポリペプチド。
【００９８】
［付記１６］
付記１２から１５のいずれか１つに記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【００９９】
［付記１７］
付記１６に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
【０１００】
［付記１８］
付記１７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１０１】
［付記１９］
ペプチド質量検出及び／又はペプチド配列決定を好ましくは含むペプチド分析における、付記１から１０のいずれか１つに記載のシステム又は付記１２から１５のいずれか１つに記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドの使用。
【０１０２】
［付記２０］
ハイスループット分析と好ましくは組み合わされた単分子検出における、付記１から１０のいずれか１つに記載のシステム又は付記１２から１５のいずれか１つに記載の変異型ＦｒａＣポリペプチドの使用。
【０１０３】
［付記２１］
前記システムが付記１から１０のいずれか１つに記載の個別のシステムの複数を含む携帯装置に組み込まれている、付記１９又は２０に記載の使用。
【図１】
2022500074.tif 000008
【図２】
2022500074.tif 000009
【図３】
2022500074.tif 000010
【図４】
2022500074.tif 000011
【図５】
2022500074.tif 000012
【図６】
2022500074.tif 000013
【図７】
2022500074.tif 000014
【配列表】
2022500074000001.app
【国際調査報告】
2022500074.tif 000015
2022500074.tif 000016
2022500074.tif 000017
2022500074.tif 000018