【手続補正書】
【提出日】平成22年3月12日(2010.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸、
（ｂ）第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、および
（ｃ）第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
を含んでなり、前記第１のＯ−ＲＳが、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化する、翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記フェニルセレノシステインと、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化するか、または
前記第１のＯ−ＲＳが、配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡであるか、または
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが、配列番号１で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれによってコードされる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
対象とするタンパク質をコードする核酸をさらに含んでなり、前記核酸が少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなり、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるか、または
第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡをさらに含んでなり、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１の非天然アミノ酸、前記第１のＯ−ＲＳ、および前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含んでなる宿主細胞を含んでなる、請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記宿主細胞が真正細菌細胞であるか、または
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、または
前記ポリヌクレオチドが配列番号５、７または９で記載されるヌクレオチド配列を含んでなるか、または
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項５に記載の翻訳系。
【請求項８】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステインである第１の非天然アミノ酸、
（ｉｉ）第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）第１の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識される少なくとも１つのセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、前記非天然アミノ酸を前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込み、それによって前記非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなるタンパク質を生成するステップと
を含んでなる、選択された位置に非天然アミノ酸を含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項９】
前記第１のＯ−ＲＳが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記フェニルセレノシステインと、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を含んでなるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼとを含んでなる翻訳系について観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化するか、または
前記翻訳系が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、または
翻訳系を提供する前記ステップが、配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＯ−ＲＳを提供するステップを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを提供する前記ステップが、部位特異的変異誘発によって野生型アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合ポケットを変異させるステップと、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択し、それによって前記第１の直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを提供するステップを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択するステップが、前記部位特異的変異誘発に続いて生成した複数の突然変異アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ分子を含んでなるプールから、前記Ｏ−ＲＳをポジティブに選択し、およびネガティブに選択するステップを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供するステップを含んでなるか、または
翻訳系を提供する前記ステップが、アンバー抑圧遺伝子ｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供するステップを含んでなるか、または
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするかまたはそれを含んでなる核酸を提供するステップを含んでなり、前記核酸が配列番号１で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなるか、または
翻訳系を提供する前記ステップが、前記Ｏ−ＲＳをコードする核酸を提供するステップを含んでなり、前記核酸が配列番号５、７または９で記載されるポリヌクレオチド配列を含んでなるか、または
翻訳系を提供する前記ステップが、アンバーセレクターコドンを含んでなる核酸を提供するステップを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
さらに前記タンパク質が前記第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸を含んでなり、前記翻訳系が第２のＯ−ＲＳおよび第２のＯ−ｔＲＮＡをさらに含んでなり、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸とは異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡによって認識されるセレクターコドンとは異なる核酸中のセレクターコドンを認識する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
翻訳系を提供する前記ステップが、宿主細胞を提供するステップを含んでなり、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸、前記第１のＯ−ＲＳ、前記第１のＯ−ｔＲＮＡ、および前記核酸を含んでなり、前記組み込むステップが前記宿主細胞を培養するステップを含んでなり、前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の前記選択された位置で反応させ、前記選択された位置にデヒドロアラニンを含んでなるタンパク質を生成するステップをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応させるステップが酸化的脱離によるか、または
前記反応させるステップが前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、
（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記Ｏ−ＲＳが前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記フェニルセレノシステインで優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記Ｏ−ｔＲＮＡによって認識される前記選択された位置にセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込むステップと、
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させて、選択された位置にデヒドロアラニンを含んでなるタンパク質を生成するステップと、
（ｄ）前記デヒドロアラニンを前記タンパク質中の選択された位置で脂質部分と反応させて、タンパク質中の選択された位置に脂質およびアミノ酸部分を含んでなるタンパク質を生成するステップと
を含んでなる、選択された位置に脂質部分を含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項１８】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、酸化的脱離によるか、または
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなるか、または
前記デヒドロアラニンを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、マイケル付加反応による、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質部分が、チオパルミチン酸、ファルネシルメルカプタン、および１−ヘキサデカンチオールからなる群から選択されるか、または
前記脂質付加アミノ酸部分が、パルミトイルシステイン、ファルネシルシステイン、およびＳ−ヘキサデシルシステインからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）（ｉ）フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸、
（ｉｉ）直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）、
（ｉｉｉ）直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および
（ｉｖ）タンパク質をコードする核酸
を含んでなり、前記Ｏ−ＲＳが前記フェニルセレノシステインで前記Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、前記核酸が前記Ｏ−ｔＲＮＡによって認識される前記選択された位置にセレクターコドンを含んでなる、翻訳系を提供するステップと、
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して、前記タンパク質の翻訳中に、前記フェニルセレノシステイン非天然アミノ酸を前記タンパク質中の前記選択された位置に組み込むステップと、
（ｃ）前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させ、それによって前記デヒドロアラニン非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなる前記タンパク質を生成するステップ
を含んでなる、デヒドロアラニン非天然アミノ酸を選択された位置に含んでなるタンパク質を翻訳系中で生成する方法。
【請求項２１】
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、酸化的脱離によるか、または
前記フェニルセレノシステインを前記タンパク質中の選択された位置で反応させる前記ステップが、前記フェニルセレノシステインを過酸化水素に曝露するステップを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号４、６、８で記載されるアミノ酸配列とその保存的変異型とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項２３】
前記組成物がポリペプチドを含んでなる細胞を含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号５、７または９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞、ベクターまたは発現ベクター。