【手続補正書】
【提出日】平成22年5月17日(2010.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減するホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を１以上の位置に含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメイン、並びに
b）上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインに機能的に連結された膜輸送機能を有する少なくとも１つの導入ドメイン
を含む、核酸構築物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、カチオン荷電ドメインである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、タンパク質導入ドメイン（PTD）である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記核酸構築物の総電荷が、非保護オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対して、中性又は正荷電である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１】
2009543783.tif 000001
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２】
2009543783.tif 000002
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化３】
2009543783.tif 000003
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化４】
2009543783.tif 000004
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA7は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化５】
2009543783.tif 000005
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化６】
2009543783.tif 000006
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化７】
2009543783.tif 000007
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化８】
2009543783.tif 000008
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、MeO-、EtO-、iPrO、
【化９】
2009543783.tif 000009
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、以下：
【化１０】
2009543783.tif 000010
からなる群より選択される構造を含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項８】
リンカーを介して前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基に結合されてRNB保護基を形成する、塩基性置換、グアニジニウム、アミン又は尿素基をさらに含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記RNB保護基が、以下：
【化１１】
2009543783.tif 000011
からなる群より選択される構造を含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのタンパク質導入ドメインが、ヘルペスウイルスVP22ドメインを含むポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）TATドメインを含むポリペプチド、アンテナペディアタンパク質のホメオドメイン（Antp HD）ドメインを含むポリペプチド、N末端カチオン性プリオンタンパク質ドメイン、ポリアルギニン、及びそれらの機能的断片からなる群より選択される、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインが、dsRNA又はsiRNAを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸構築物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減する、又は該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のカチオン電荷を供給する、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を１以上の位置に含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項１４】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１２】
2009543783.tif 000012
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１３】
2009543783.tif 000013
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１４】
2009543783.tif 000014
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１５】
2009543783.tif 000015
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA7は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
式中、X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化１６】
2009543783.tif 000016
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１７】
2009543783.tif 000017
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１８】
2009543783.tif 000018
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１９】
2009543783.tif 000019
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、MeO-、EtO-、iPrO、
【化２０】
2009543783.tif 000020
からなる群より選択される、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、以下：
【化２１】
2009543783.tif 000021
からなる群より選択される構造を含む、請求項14に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
リンカーを介して前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基に結合されてRNB保護基を形成する、塩基性置換、グアニジニウム、アミン又は尿素基を含む、請求項14に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記RNB保護基が、以下：
【化２２】
2009543783.tif 000022
からなる群より選択される構造を含む、請求項17に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに機能的に連結されたターゲティングドメインをさらに含む、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記ターゲティング部分が、細胞表面タンパク質に結合する抗体である、請求項19に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記ターゲティングドメインが、細胞表面受容体の受容体リガンドを含む、請求項19に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
カチオン荷電ポリペプチド又はペプチドをさらに含む、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
前記カチオン荷電ポリペプチド又はペプチドが、タンパク質導入ドメインを含む、請求項22に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項13〜23のいずれか一項に記載の核酸構築物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
１以上のタンパク質導入ドメインを請求項13に記載の核酸構築物に連結させるステップを含む方法。
【請求項２６】
前記１以上のタンパク質導入ドメインが、2〜5つのタンパク質導入ドメインを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記１以上のタンパク質導入ドメインが、3つのタンパク質導入ドメインを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質導入ドメインを実質的に精製するステップ；
オリゴヌクレオチドを合成するステップ；
該オリゴヌクレオチドのアニオン電荷をホスホトリエステル基で電荷中和するステップ；
該オリゴヌクレオチドを１以上のタンパク質導入ドメインに連結させるステップ
を含む、核酸構築物の作製方法。
【請求項２９】
細胞を、請求項1又は13に記載の核酸構築物とin vitroで接触させるステップを含む、細胞のトランスフェクト方法。
【請求項３０】
前記核酸構築物が、アンチセンス分子を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
R1が、メチル、エチル又はS-ピバロイルチオエタノールである、請求項５又は14に記載の核酸構築物。
【請求項３２】
ヌクレオチド上に存在する前記ホスホトリエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、2'-W（式中、Wは、H、F、OH、O-Me、又はO-アルキルである）を含む、請求項31に記載の核酸構築物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、2つ以上の導入ドメインを含む、請求項10に記載の核酸構築物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインの5’末端、3’末端又は両末端に、可逆的又は不可逆的に結合される、請求項１又は33に記載の核酸構築物。
【請求項３５】
前記2'-Wが-OHである、請求項32に記載の核酸構築物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA7は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化５】
2009543783.tif 000023
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA7は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
式中、X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化１４】
2009543783.tif 000024
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA7は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化２３】
2009543783.tif 000025