【手続補正書】
【提出日】平成21年10月28日(2009.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む、精製された化合物。
【請求項２】
前記化合物が配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１８からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２、またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含み、該天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３が配列番号２、配列番号３または配列番号４に少なくとも８５％は相同である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、４００未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物の少なくとも１つのアミノ酸がペプチド模倣物によって表される、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できる、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
放射性部分、抗原、蛍光部分またはＨｉｓ６部分からなる群より選択される検出可能部分または結合部分をさらに含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物がＡｂｌキナーゼと結合するとき、前記蛍光部分の検出可能蛍光が強度を変える、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを決定する方法であって、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物を該Ａｂｌキナーゼの存在下で該薬剤と接触させる工程と；
該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合するかどうかを評価する工程、
とを含み、ここで、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合しない場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤であり、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合する場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない、
方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの前記化合物または前記Ａｂｌキナーゼがさらに検出可能部分を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ａｂｌキナーゼに結合する化合物の前記評価が、非変性条件下においてＡｂｌキナーゼのペプチドの見かけサイズの測定によって行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
候補阻害剤の存在下で前記Ａｂｌキナーゼのキナーゼ活性を評価する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
Ａｂｌキナーゼを阻害するための組成物であって、請求項１０に記載の化合物を含み、該組成物は該Ａｂｌキナーゼと接触させられることを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
前記化合物が配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１８からなる群より選択される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ａｂｌキナーゼが、突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているかまたはそのリスクを有する生きている哺乳動物の一部である、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
前記病気が癌である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているかまたはそのリスクを有する患者を処置するための組成物であって、該組成物は請求項１〜１２いずれか一項に記載の化合物を含み、該化合物は該突然変異体Ａｂｌキナーゼの活性を阻害でき、該組成物は投与に適している、組成物。
【請求項２２】
前記化合物が前記患者に非経口投与されるのに適していることを特徴とする、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記病気が癌である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項２５】
Ａｂｌキナーゼを阻害するための組成物であって、請求項２４記載の薬剤を含み、該組成物は該Ａｂｌキナーゼと接触させられる、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
化合物のアミノ酸配列は約４００未満のアミノ酸長さでよい、例えば１００未満のアミノ酸残基、または２００未満のアミノ酸残基など。好ましい長さは１４アミノ酸残基である。特に、化合物は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなることができる。これまでに記載された化合物の場合のように、これらの化合物はペプチド模擬体をアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸として含むことができる。化合物は、配列番号１内にはない、野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフ、一般にはＰＰＳＰＰ（配列番号１７）、を含むのが好ましい。化合物は配列番号１のチロシンの残基１０の位置がリン酸化されていてもよい。化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できることも好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
【表１】
2009519237.tif 000001
トリプシン消化後に試料を分析した。記載されるチロシン２１３またはフェニルアラニン置換を含む特異的イオンの予測および実験的質量を列挙する。野生型（ＷＴ）トリプシンペプチドの配列はＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤｐＹＭＴＳＰＡＲ（配列番号１４）である；ホスホチロシン２１３は太字で書かれている。＊Ｆ２１３：ＷＴと同じだが太字のＹ２１３Ｆ置換有する：ＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤＦＭＴＳＰＡＲ（配列番号１５）。Ｔ１５ＷＳはＡｂｉ１アイソホーム４の残基１４４−３０３を含み（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）、ＷＴと同じトリプシンペプチドを含む。‡Ｍｅｔ−Ｏ：すべての試料に存在した酸化メチオニンである（上のトリプシンフラグメントでは下線が引かれている）；したがって２種類（非リン酸化試料）または４種類（リン酸化試料）の分子が認められた。方法。ニューイングランド  ビオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＡｂｌキナーゼ、Ｔ１５ＷＳ、またはバキュロウイルス精製Ａｂｌ、アイソホーム２によって試料をリン酸化した。キナーゼ反応を３０分間行った後に４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でプロテイン類を分離した。特異的プロテインバンドを単離し、トリプシン分解にかけた（シグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）。それら試料を０．５％ＴＦＡで酸化した後、ＺＩＰ  ＴＩＰ−１８（ミリポア  コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて試料を濃縮し、０．１％ＴＦＡおよび５０％アセトニトリルで溶出し、５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡ中α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸基質（シグマ  アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）を含むチューブに受け入れた。質量分析はアプライド  ビオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ、ＣＡ）のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行われた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
Ａｂｉ１（ジーンバンク受入れ番号ＮＭ００５４７０およびＵ８７１６６（配列番号１８））。野生型または突然変異体Ａｂｉ１アイソホーム２（残基番号はＺｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８による）はプラスミドから発現した。Ａｂｉ１のエクソン６が欠如している突然変異体Ａｂｉ１−△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）はＬｎＣＡＰ細胞からサブクローニングされた。突然変異体Ａｂｉ１−Ｆ２１３はＹ２１３Ｆ置換を含む。突然変異体Ａｂｉ１−Ｐｒｏは、Ａｂｉ１の残基１８１−１８５であるＰＰＳＰＰの代わりに配列ＡＥＳＥＡを含み、その結果ＰＸＸＰ  ＳＨ３結合モチーフを喪失している。ＧＦＰをコードする配列を除去し、Ｃ−末端にＨＡタグを導入した後、すべてのＡｂｉ１  ｃＤＮＡｓをｐＥＧＦＰ−Ｎ２プラスミドにサブクローンニングした（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウンテンビュー、ＣＡ）。質量分析（表１）、またはＳＨ３結合アッセイ（図２Ａ）のためにＡｂｉ１のＧＳＴ融合プロテインをｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（アマーシャム  ビオサイエンシス社、ピスカタウエイ、ＮＪ）から発現させた。すべての発現プラスミドをシーケンシングによって確定した。Ａｂｉ１のＮ−末端のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を記載のように実施した（Ｍａｃｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
キナーゼアッセイ。キナーゼ活性の測定は、ビオチニル化モデル基質ペプチドＧＧＥＡＩＹＡＡＰＦＫＫ（配列番号１６）（Ｂｒａｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ，２０００；Ｓｏｎｇｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）および３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて、実質上記載のように行われた（Ｔａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＳＡＭ２ストレプトアビジン塗布膜（プロメガ  コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マジソン  ＷＩ）を用いて基質を捕獲した。キナーゼアッセイ混合物は、記載のように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、および１００μＭのＡＴＰ、２ｎＭのＡｂｌキナーゼ、基質ペプチド、およびＡｂｉ１リガンドペプチドを含んでいた。反応は３０℃で５分間行われた。ＬｎＣＡＰ細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼを評価するために、細胞溶解前に細胞を１０分間ペルバナデートで処理した。溶解した細胞からの免疫沈降物を、基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて試験した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
【表１０】
2009519237.tif 000002