【手続補正書】
【提出日】平成21年11月24日(2009.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の存在を検出する方法であって、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位および第二のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸と、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチドと、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にアニールするとき、３’領域が第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、および５’が非相補的５’フラップを形成する下流プローブと
を提供するステップと、
ｂ）切断構造を形成するために標的核酸に上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブをアニールするステップと、
ｃ）非相補的５’フラップを遊離するためにヌクレアーゼで切断構造を切断するステップと、
ｄ）遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示す、遊離された非相補的５’フラップを検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記下流プローブの非相補的５’フラップがｎ個のヌクレオチドから構成され、かつ、前記第一のハイブリダイゼーション部位と前記第二のハイブリダイゼーション部位とがｍヌクレオチドによって分離される請求項１に記載の方法であって、ここで、ｎは１から２５までの整数であり、ｍはｎより大きな整数である、方法。
【請求項３】
シグナルを供給する能力のある少なくとも１つの標識部分を含む切断構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼがＦＥＮヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）に由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素から構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記形成された切断構造が、検出可能なシグナルの発生を消すために有効に配置された一対の相互作用性シグナル発生標識部分を含み、前記標識部分はＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位によって分離され、その結果、前記ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は、ＦＥＮヌクレアーゼに対して感受性である部位の切断により、第二の相互作用性シグナルを発生する標識部分から第一の相互作用性シグナルを発生する標識部分を分離させ、それにより検出可能なシグナルを発生する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記一対の相互作用性シグナル発生部分が、クエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遊離された非相補的５’フラップを定量するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
下流プローブの３’伸長を防止するために、下流プローブの３’末端が封鎖されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
下流プローブの３’部分が、標的核酸の第三のハイブリダイゼーション部位に対してさらに相補的であり、第三のハイブリダイゼーション部位が、第二のハイブリダイゼーション部位に対して５’であり、第二のハイブリダイゼーション部位と第三のハイブリダイゼーション部位が標的核酸の介在領域により分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
下流プローブの３’ 部分が、第二および第三のハイブリダイゼーション部位にハイブリッド形成し、標的核酸の介在領域が非相補的領域を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記下流プローブの３’ 部分が１〜２５ヌクレオチドであり、前記介在領域が１〜２０ヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
封鎖３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的である塩基、または、核酸合成または伸長を可能にする条件下でヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
封鎖３’末端の一方または両方が、
ａ）ジデオキシヌクレオチド、
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されたヌクレオチド、または
ｃ）３’炭素に、または３’酸素に付着されたレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中において切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸と、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流伸長プライマーと、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的であるクランピング・オリゴヌクレオチドであって、前記クランピング・オリゴヌクレオチドがクランプにより封鎖された３’末端および５’末端を含み、前記クランプが、核酸ポリメラーゼによるクランピング・オリゴヌクレオチドの置換を阻害する、クランピング・オリゴヌクレオチドと、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成するとき、３’領域が第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、５’領域が非相補的５’フラップを形成する、下流プローブと
を提供するステップと、
ｂ）上流伸長プライマー、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブが標的核酸に対してアニールするステップと、ここで、クランピング・オリゴヌクレオチドと下流プローブが切断構造を形成し、
ｃ）非相補的５’フラップを遊離するためにヌクレアーゼで切断構造を切断するステップと、
ｄ）上流伸長プライマーからクランピング・オリゴヌクレオチドのクランプまで相補鎖を伸長するステップと、
ｅ）クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブによってあらかじめ保護された標的核酸に対して核酸ポリメラーゼが接近できるように、標的核酸からクランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを解離させるステップと、
ｆ）標的核酸に相補的な鎖をさらに伸長するステップと、
ｇ）遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示す、遊離された非相補的５’フラップを検出するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
上流プライマーが、クランピング・オリゴヌクレオチドよりもストリンジェントな条件下において核酸にアニールし、クランピング・オリゴヌクレオチドが、下流標識プローブよりもストリンジェントな条件下で標的核酸にアニールする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）アニールするステップｂ）が、上流伸長プライマー、クランピング・オリゴヌクレオチドおよび下流プローブのアニーリング温度未満の温度で起こり、
ｂ）解離するステップｆ）が、
ｉ）上流伸長プライマーおよびクランピング・オリゴヌクレオチドはアニールされた状態を保ったまま、下流プローブは標的核酸から解離されるように温度を上昇させるステップと、
ｉｉ）上流伸長プライマーはアニールされた状態を保ったまま、クランピング・オリゴヌクレオチドは標的核酸から解離されるように、さらに温度を上昇させるステップと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中において切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写する方法であって、
ａ）３’から５’への順で、第一のハイブリダイゼーション部位、第二のハイブリダイゼーション部位および第三のハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸と、
第一のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチド伸長プライマーと、
第二のハイブリダイゼーション部位に相補的である上流オリゴヌクレオチドであって、封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチドと、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成するとき、３’領域が第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、５’領域が非相補的５’フラップを形成する下流プローブと
を提供するステップと、
ｂ）切断構造を形成するために標的核酸に上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブをアニールするステップと、
ｃ）非相補的５’フラップを遊離するためにヌクレアーゼで切断構造を切断するステップと、
ｄ）上流伸長プライマーを標的核酸にアニールするステップと、
ｅ）標的核酸に相補的な鎖を合成するために、上流オリゴヌクレオチド伸長プライマーを伸長するステップと、
ｆ）遊離された非相補的５’フラップがサンプル中の標的核酸の存在を示す、遊離された非相補的５’フラップを検出するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
サンプル中において切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、標的核酸を増幅する方法であって、
ａ）領域Ａ’を含む標的核酸と、
非相補的５’タグ領域（Ｘ）および３’プライミング領域（Ａ）を含む順方向伸長プライマーであって、増幅より前には５’タグ領域が標的に相補的でなく、かつ、３’プライミング領域（Ａ）が標的核酸中の領域（Ａ’）と相補的である順方向伸長プライマーと、
領域Ｘの少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチドと、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的にハイブリッド形成するとき、３’領域が第三のハイブリダイゼーション部位に相補的であり、５’領域が非相補的５’フラップを形成する下流プローブと、
標的核酸の少なくとも一部を含む、第二の鎖の合成を準備する逆伸長プライマーと
を提供するステップと、
ｂ）順方向伸長プライマーの領域Ａを標的核酸にアニールするステップと、
ｃ）標的核酸の相補鎖を生成するために順方向伸長プライマーを伸長するステップと、ここで、相補鎖は領域Ａおよび領域Ｘを含み、
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性解離するステップと、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ａの下流の相補鎖領域にアニールするステップと、
ｆ）標的核酸配列、領域Ａ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生成するために、逆伸長プライマーから鎖を伸長するステップと、
ｇ）第二鎖から相補鎖を変性解離させるステップと、
ｈ）切断構造を形成するために、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールするステップと、
ｉ）下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離するために、ヌレアーゼで切断構造を切断するステップと、
ｊ）サンプル中の標的核酸の存在を示す、遊離された非相補的５’フラップを検出するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
ＰＣＲサイクリングステップが可能な条件下で標的配列を増幅し、切断構造を形成し、切断構造を切断するために、変性解離、伸長および、切断サイクルを反復するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸ポリメラーゼが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記下流プローブの非相補的５’フラップが、ｎ個のヌクレオチドから構成され、かつ、前記上流シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位と前記下流プローブのハイブリダイゼーション部位とがｍヌクレオチドによって分離される請求項２１に記載の方法であって、ここで、ｎは１から２５までの整数であり、ｍはｎより大きな整数である、方法。
【請求項２５】
前記ヌクレアーゼがＦＥＮヌクレアーゼを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが、アルカエグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、およびピロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）に由来するＦＥＮヌクレアーゼ酵素から構成される群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
シグナルを提供できる少なくとも１つの標識部分を含むように切断構造が形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記形成された切断構造が、検出可能なシグナルの発生を消すために有効に配置された一対の相互作用性シグナル発生標識部分を含み、前記標識部分はＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位によって分離され、その結果、前記ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は、ＦＥＮヌクレアーゼに対して感受性である部位の切断により、第二の相互作用性シグナルを発生する標識部分から第一の相互作用性シグナルを発生する標識部分を分離させ、それにより検出可能なシグナルを発生する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記一対の相互作用性シグナル発生部分が、クエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
遊離非相補的５’フラップを定量するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
下流プローブの３’伸長を防止するために、下流プローブの３’末端が封鎖されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
封鎖３’末端の一方または両方が、標的核酸に非相補的である塩基、または、核酸合成または伸長を可能にする条件下でヌクレオチド三リン酸の付加を阻害する修飾を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
封鎖３’末端の一方または両方が、
ａ）ジデオキシヌクレオチド、
ｂ）３’ヒドロキシルがリン酸基で置換されたヌクレオチド、または
ｃ）３’炭素に、または３’酸素に付着されたレポーター部分を有するヌクレオチド
を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中に切断構造を形成し、切断構造を切断し、標的核酸に相補的な核酸を転写し、標的核酸を増幅する方法であって、その方法が、
ａ）３’から５’への順でＡ’領域およびＴ’領域を含む標的核酸であって、前記Ａ’およびＴ’領域が非連続性である標的核酸と、
２つの小領域（Ｘ１およびＸ２）を含む５’タグ領域を含む順方向伸長プライマーであって、Ｘ１がＸ２および３’プライミング領域（Ａ）の上流であり、かつ、増幅前には５’タグ領域が標的に相補的でなく、３’ プライミング領域（Ａ）は標的核酸の領域Ａ’に相補的である、順方向伸長プライマーと、
領域Ｘ１の少なくとも一部を含む上流オリゴヌクレオチドであって、封鎖３’末端を有する上流オリゴヌクレオチドと、
５’領域および３’領域を含む下流プローブであって、下流プローブを標的のＡ’領域にアニールするとき、３’領域が、領域Ｘ２および領域Ｘ２の下流にある領域Ｔの少なくとも一部を含み、かつ、標的核酸のＴ’に相補的であり、および、５’領域が非相補的５’フラップを形成する、下流プローブと、
標的核酸の少なくとも一部を含む、第二の鎖の合成を準備する逆伸長プライマーと
を提供するステップと、
ｂ）順方向伸長プライマーの相補的領域Ａを標的核酸のＡ’領域およびＴ’領域にアニールするステップと、
ｃ）標的核酸の相補鎖を生成するために順方向伸長プライマーを伸長するステップと、ここで、相補鎖は領域Ａおよび領域Ｘ１およびＸ２を含み、
ｄ）標的核酸および相補鎖を変性解離するステップと、
ｅ）逆伸長プライマーを、領域Ｔの下流の相補鎖領域にアニールするステップと、
ｆ）標的核酸配列、領域Ａ’領域Ｔ’および５’タグに相補的な領域（Ｘ１’、Ｘ２’）の少なくとも一部を含む第二鎖を生成するために、逆伸長プライマーから鎖を伸長するステップと、
ｇ）第二鎖から相補鎖を変性解離させるステップと、
ｈ）切断構造を形成するために、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブを第二鎖にアニールするステップと、
ｉ）下流オリゴヌクレオチドの非相補的５’フラップを遊離するために、ヌレアーゼで切断構造を切断するステップと、
ｊ）サンプル中の標的核酸の存在を示す、遊離された非相補的５’フラップを検出するステップと
を含む方法。