(57)【要約】本発明は、抗ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント、および医薬用途を提供する。さらに、本出願は、キメラ抗体およびヒト化抗体、抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合フラグメントに由来するＣＤＲ領域を含むキメラ抗体およびヒト化抗体を提供し、ならびに抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物および癌治療薬としてのその使用もまた提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
重鎖可変領域は、
Ｉ）それぞれ配列番号３、４および５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号３、４、および５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と比較して３、２もしくは１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体；
ＩＩ）それぞれ配列番号１１、１２および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、１２および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２もしくは１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体；
ＩＩＩ）それぞれ配列番号１１、３３および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、３３および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体；あるいは
ＩＶ）それぞれ配列番号１１、３４および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、３４および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２もしくは１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体を含み、ならびに／あるいは
軽鎖可変領域は、
Ｉ）それぞれ配列番号６、７および８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号６、７および８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体；あるいは
ＩＩ）それぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体を含み；
好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ｉ）それぞれ配列番号３、４および５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号６、７および８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｉｉ）それぞれ配列番号１１、１２および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｉｉｉ）それぞれ配列番号１１、３３および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
ｉｖ）それぞれ配列番号１１、３４および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択され、前記抗体の重鎖可変領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはその変異体に由来する重鎖フレームワーク領域をさらに含む、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体が、定常領域を含む、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
好ましくは、前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはその変異配列に由来し、
好ましくは、前記軽鎖定常領域が、ヒトカッパ、ラムダ鎖、またはその変異配列に由来し、
より好ましくは、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３５に示されるものであるか、または配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、
より好ましくは、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３６に示されるものであるか、または配列番号３６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖可変領域が、
Ｉ）配列番号１に示されるか、または配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ＩＩ）配列番号９に示されるか、または配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ＩＩＩ）配列番号１７、１８、３１および３２のいずれか１つに示されるか、または配列番号１７、１８、３１または３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
ＩＶ）配列番号２６、２７、２８、２９および３０のいずれか１つに示されるか、または配列番号２６、２７、２８、２９または３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは
前記軽鎖可変領域が、
Ｉ）配列番号２に示されるか、または配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ＩＩ）配列番号１０に示されるか、または配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
ＩＩＩ）配列番号１９および２０のいずれか１つに示されるか、または配列番号１９または２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
ＩＶ）配列番号２１、２２、２３、２４および２５のいずれか１つに示されるか、または配列番号２１、２２、２３、２４または２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ｉ）配列番号１に示される重鎖可変領域、および配列番号２に示される軽鎖可変領域；
ｉｉ）配列番号９に示される重鎖可変領域、および配列番号１０に示される軽鎖可変領域；
ｉｉｉ）配列番号１７または１８に示される重鎖可変領域、および配列番号１９に示される軽鎖可変領域；
ｉｖ）配列番号１７または１８に示される重鎖可変領域、および配列番号２０に示される軽鎖可変領域；あるいは
ｖ）配列番号２６、２７、２８、２９および３０のいずれか１つに示される重鎖可変領域、および配列番号２１、２２、２３、２４および２５のいずれか１つに示される軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ｉ）配列番号３７に示されるか、または配列番号３７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖、および／または
配列番号３８に示されるか、または配列番号３８に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖；あるいは
ｉｉ）配列番号３９に示されるか、または配列番号３９に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖、および／または
配列番号４０に示されるか、または配列番号４０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ヒトＯＸ４０への結合について、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターが、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター、またはウイルスベクターである、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞が、細菌、酵母および哺乳動物細胞からなる群から選択され、より好ましくは、前記宿主細胞が、Ｅｓｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎細胞２９３からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、
請求項１０に記載の宿主細胞を培養し；
前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを回収し；
適宜、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを精製すること
を含む、方法。
【請求項１２】
ＯＸ４０を検出し、または測定するための方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを試料と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、試薬。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療上または予防上有効な量；および１つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
疾患または障害を治療し、または予防するための方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１４に記載の医薬組成物の治療上または予防上有効な量を、対象に投与することを特徴とする、方法であって、好ましくは、前記疾患または障害が、癌であり、より好ましくは、前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、メラノーマ、腎臓癌、扁平上皮癌、および血液癌からなる群から選択される、方法。
【請求項１６】
ヒト対象における免疫応答を増強するための方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１４に記載の医薬組成物の治療上または予防上有効な量を、対象に投与することを特徴とする、方法であって、好ましくは、前記増強された免疫応答が、Ｔエフェクター細胞の増加した免疫刺激／エフェクター機能、および／または制御性Ｔ細胞の下方制御された免疫抑制機能を引き起こす、方法。
【請求項１７】
医薬の製造における下記：
−請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、
−請求項８に記載のポリヌクレオチド、
−請求項９に記載のベクター、
−請求項１４に記載の医薬組成物
から選択されるいずれか１つの使用であって、
前記医薬が、ヒト対象において、癌を治療し、もしくは予防し、または免疫応答を増強するために用いられる、使用であって、
好ましくは、前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、メラノーマ、腎臓癌、扁平上皮癌、および血液癌からなる群から選択される、使用。
【請求項１８】
ＯＸ４０発現に関連する疾患または障害を検出し、または診断するためのキットの製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、
好ましくは、前記疾患または障害が、癌であり、
より好ましくは、前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、メラノーマ、腎臓癌、扁平上皮癌、および血液癌からなる群から選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月２６日に提出された第２０１８１１１２８６６９．３号および２０１８年１１月２６日に提出された第２０１８１１４１７６６６．１号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、生物医学分野に属し、抗ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント、キメラ抗体、抗ＯＸ４０抗体のＣＤＲ領域を含むヒト化抗体、ならびに抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、および抗癌剤としてのこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、人間社会が長年直面している深刻な健康問題である。広がった固形腫瘍の場合、従来の外科手術、化学療法、および放射線療法は、通常、限られた効果しか示さない。
【０００４】
腫瘍免疫療法は、腫瘍治療分野において途切れることなく熾烈な分野である。最近の研究では、抗腫瘍Ｔ細胞の機能を強化することで癌に対抗できることが証明されている。主に制御性Ｔリンパ球によって介在される能動免疫寛容を誘導することによって腫瘍細胞が免疫系から「回避する」ことを示す多くの証拠が存在する（Ｔｒｅｇ；Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118）。それゆえ、エフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）と免疫寛容原性Ｔｒｅｇとのバランスは、有効な抗腫瘍免疫療法に不可欠である。よって、有効な抗腫瘍免疫応答は、腫瘍特異的Ｔｅｆｆのエフェクター機能を増強することによって、および／または腫瘍特異的Ｔｒｅｇの阻害機能を低下させることによって得ることができる。
【０００５】
ＣＤ１３４（ＯＸ４０）受容体は、これらの応答を介在する重要な受容体であることが示されている（Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4:420-431）。
【０００６】
ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員であり、細胞表面上で発現する約５０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質である。ＯＸ４０の細胞外リガンド結合ドメインは、４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）から構成される。ＯＸ４０の天然リガンドは、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）であり、ＯＸ４０とＯＸ４０ＬはＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体を形成する。
【０００７】
ＯＸ４０は、主に、活性化したＴ細胞上に発現され、ＯＸ４０は、活性化２４〜７２時間後に発現される二次的共刺激分子である。ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０のリガンドであり、主に、活性化された抗原提示細胞上で発現される。ＯＸ４０を発現するＴリンパ球は、様々なヒト悪性腫瘍や癌の患者の流入するリンパ節に存在することが確認されている。重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のマウスモデルでは、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合ドメインとの相互作用が抗腫瘍免疫を増強し、それによりリンパ腫、前立腺癌、結腸癌および乳癌などの様々なヒト悪性腫瘍細胞株の腫瘍増殖阻害を生じさせることができる。
【０００８】
現在、多くの国際的な製薬会社がＯＸ４０に対するモノクローナル抗体を開発している。ＯＸ４０抗体は、特異的な刺激により免疫を活性化し、腫瘍に対する患者自身の免疫系の応答を改善し、腫瘍細胞を死滅させるという目的を達成する。関連する特許は、ＷＯ２０１３０３８１９１、ＷＯ２０１５１５３５１３、ＷＯ２０１６１７９５１７、ＷＯ２０１７０９６１８２、ＣＮ１１００７８８２５Ａ、ＷＯ２０１６１９６２２８などである。これまで、アストラゼネカやＢＭＳなどの企業が開発した抗ＯＸ４０抗体は、第ＩＩ相臨床試験が行われており、ジェネンテックやＧＳＫなどの関連製品もまた、臨床試験が行われている。
【０００９】
しかしながら、治療効果の観点から、上記の薬剤の改善が依然として必要とされている。それゆえ、高い選択性、高い親和性、および好ましい有効性を備えた抗ＯＸ４０抗体をさらに開発する必要がある。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ヒトＯＸ４０に特異的に結合し、以下に示されるＣＤＲ：
（ｉ）それぞれ配列番号３、４および５に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；またはそれぞれ配列番号３、４、および５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と比較して３、２、もしくは１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体、ならびに／あるいは
それぞれ配列番号６、７および８に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号６、７および８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体、
特に、それぞれ配列番号３、４および５に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号６、７および８に示される軽鎖ＬＤＣＲ１、ＬＤＣＲ２およびＬＤＣＲ３；あるいは
（ｉｉ）それぞれ配列番号１１、１２および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、１２および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体、ならびに／あるいは
それぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体、
特に、それぞれ配列番号１１、１２および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；あるいは
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１１、３３および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、３３および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体、ならびに／あるいは
それぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体、
特に、それぞれ配列番号１１、３３および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
（ｉｖ）それぞれ配列番号１１、３４および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１１、３４および１３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＨＣＤＲ変異体、ならびに／あるいは
それぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と比較して３、２または１個のアミノ酸の差異を有するＬＣＤＲ変異体、
特に、それぞれ配列番号１１、３４および１３に示される重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１４、１５および１６に示される軽鎖ＬＤＣＲ１、ＬＤＣＲ２およびＬＤＣＲ３
を含む、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
ある実施態様において、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらのフラグメント、特に、ヒト化抗体である。
【００１２】
ある実施態様において、前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントのＣＤＲ（３個の重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含む）は、３、２または１個のアミノ酸の差異（すなわち、ＣＤＲ変異体）を含むことができる。ＣＤＲ変異体は、アフィニティー成熟法によって取得される。
【００１３】
ある実施態様において、ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの親和性（ＫＤ）は、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下である。
【００１４】
ある実施態様において、前記マウス抗体は、以下に示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（ｉ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、または配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；ならびに／あるいは
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２に示され、または配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号９に示され、または配列番号９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；ならびに／あるいは
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、または配列番号１０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００１５】
ある実施態様において、ヒト化抗体は、ヒト生殖系列に由来するＦＲ領域またはその変異配列を含む。
【００１６】
ある実施態様において、ヒト化抗体は：
（ｉ）配列番号１７、１８、３１または３２のいずれか１つに示され、または配列番号１７、１８、３１または３２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖可変領域；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つに示され、または配列番号２６、２７、２８、２９または３０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、重鎖可変領域
のうちのいずれか１つを含む。
【００１７】
１の実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは：
（ｉ）配列番号１９または２０に示され、または配列番号１９または２０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；あるいは
（ｉｉ）配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれか１つに示され、または配列番号２１、２２、２３、２４または２５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域
を含む。
【００１８】
ある特定の実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは：
（ｉ）配列番号１７、１８、３１および３２のいずれか１つに示される重鎖可変領域および配列番号１９または２０に示される軽鎖可変領域；あるいは
（ｉｉ）配列番号２６、２７、２８、２９および３０のいずれか１つに示される重鎖可変領域および配列番号２１、２２、２３、２４および２５のいずれか１つに示される軽鎖可変領域
を含む。
【００１９】
ある特定の実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下に示される可変領域：
（１）配列番号１７に示される重鎖可変領域、および配列番号１９に示される軽鎖可変領域；
（２）配列番号１８に示される重鎖可変領域、および配列番号１９に示される軽鎖可変領域；
（３）配列番号３１に示される重鎖可変領域、および配列番号１９に示される軽鎖可変領域；
（４）配列番号３２に示される重鎖可変領域、および配列番号１９に示される軽鎖可変領域；
（５）配列番号１７に示される重鎖可変領域、および配列番号２０に示される軽鎖可変領域；
（６）配列番号１８に示される重鎖可変領域、および配列番号２０に示される軽鎖可変領域；
（７）配列番号３１に示される重鎖可変領域、および配列番号２０に示される軽鎖可変領域；または
（８）配列番号３２に示される重鎖可変領域、および配列番号２０に示される軽鎖可変領域
を含む。
【００２０】
ある実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下に示される可変領域：
（１）配列番号２６に示される重鎖可変領域、および配列番号２１に示される軽鎖可変領域；
（２）配列番号２６に示される重鎖可変領域、および配列番号２２に示される軽鎖可変領域；
（３）配列番号２６に示される重鎖可変領域、および配列番号２３に示される軽鎖可変領域；
（４）配列番号２６に示される重鎖可変領域、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域；
（５）配列番号２６に示される重鎖可変領域、および配列番号２５に示される軽鎖可変領域；
（６）配列番号２７に示される重鎖可変領域、および配列番号２１に示される軽鎖可変領域；
（７）配列番号２７に示される重鎖可変領域、および配列番号２２に示される軽鎖可変領域；
（８）配列番号２７に示される重鎖可変領域、および配列番号２３に示される軽鎖可変領域；
（９）配列番号２７に示される重鎖可変領域、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域；
（１０）配列番号２７に示される重鎖可変領域、および配列番号２５に示される軽鎖可変領域；
（１１）配列番号２８に示される重鎖可変領域、および配列番号２１に示される軽鎖可変領域；
（１２）配列番号２８に示される重鎖可変領域、および配列番号２２に示される軽鎖可変領域；
（１３）配列番号２８に示される重鎖可変領域、および配列番号２３に示される軽鎖可変領域；
（１４）配列番号２８に示される重鎖可変領域、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域；
（１５）配列番号２８に示される重鎖可変領域、および配列番号２５に示される軽鎖可変領域；
（１６）配列番号２９に示される重鎖可変領域、および配列番号２１に示される軽鎖可変領域；
（１７）配列番号２９に示される重鎖可変領域、および配列番号２２に示される軽鎖可変領域；
（１８）配列番号２９に示される重鎖可変領域、および配列番号２３に示される軽鎖可変領域；
（１９）配列番号２９に示される重鎖可変領域、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域；
（２０）配列番号２９に示される重鎖可変領域、および配列番号２５に示される軽鎖可変領域；
（２１）配列番号３０に示される重鎖可変領域、および配列番号２１に示される軽鎖可変領域；
（２２）配列番号３０に示される重鎖可変領域、および配列番号２２に示される軽鎖可変領域；
（２３）配列番号３０に示される重鎖可変領域、および配列番号２３に示される軽鎖可変領域；
（２４）配列番号３０に示される重鎖可変領域、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域；ならびに
（２５）配列番号３０に示される重鎖可変領域、および配列番号２５に示される軽鎖可変領域
を含む。
【００２１】
ある実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体は、定常領域を含み、ある特定の実施態様において、前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり、前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはこれらの変異配列に由来し、前記軽鎖定常領域は、ヒトカッパ鎖、ラムダ鎖、またはこれらの変異配列に由来し、他の特定の実施態様において、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３５に示され、または配列番号３５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３６に示され、または配列番号３６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００２２】
ある実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号３９または３７に示され、または配列番号３９または３７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％を有する。少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、ならびに／あるいは前記抗ＯＸ４０の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４０または３８に示され、または配列番号４０または３８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０を有する％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００２３】
１の実施態様において、前記抗ＯＸ４０抗体は、
（ｉ）重鎖であって、そのアミノ酸配列が、配列番号３７に示され、または配列番号３７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、および
軽鎖であって、そのアミノ酸配列が、配列番号３８に示され、または配列番号３８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖；あるいは
（ｉｉ）重鎖であって、そのアミノ酸配列が、配列番号３９に示され、または配列番号３９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、および
軽鎖であって、そのアミノ酸配列が、配列番号４０に示され、または配列番号４０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖
を含む。
【００２４】
本開示はまた、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するものであって、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＯＸ４０への結合について上記に記載のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメントと競合するか、または同一のＯＸ４０エピトープへの結合について上記に記載のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する。
【００２５】
本開示はまた、
−上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの治療上／予防上有効な量、および
−１つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤
を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
ある特定の実施態様において、前記医薬組成物は、単位剤形で調製され、その単位用量は、０．０１〜９９重量％の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含みうるか、または前記医薬組成物に含まれるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、０．１〜２０００ｍｇ／単位用量である。ある特定の実施態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、１〜１０００ｍｇである。
【００２７】
ある特定の実施態様において、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記組成物に含まれる唯一の活性成分であってもよく、他の特定の実施態様において、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の活性成分と組み合わせて用いられる。
【００２８】
本開示はまた、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。本明細書の文脈において、前記核酸分子の相補配列もまた、本出願の範囲に含まれる。
【００２９】
本開示はまた、上記に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。前記ベクターは、真核生物の発現ベクター、原核生物の発現ベクター、またはウイルスベクターであり得る。
【００３０】
本開示はまた、上記に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞からなる群から選択される。
【００３１】
ある特定の実施態様において、前記宿主細胞は、真核細胞である。ある特定の実施態様において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であって、前記哺乳動物細胞は、下記に限定されないが、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、およびＮＳＯを含む。本開示の宿主細胞は、ヒトに発生することができるいかなる細胞も含まないことを理解されたい。
【００３２】
本開示はまた、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、
−上記に記載の宿主細胞を培養し；
−前記抗体またはその抗原結合フラグメントを回収し；
−適宜、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを精製すること
を含む方法を提供する。
【００３３】
本開示はまた、ヒトＯＸ４０を検出し、または測定するための方法であって、
−上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを試料（例えば、ヒト由来）と接触させ、
−適宜、試料中のＯＸ４０の量を調べるか、またはＯＸ４０が存在するかどうかを調べること
を含む方法を提供する
【００３４】
本開示はまた、ヒトＯＸ４０を検出し、または測定するための試薬であって、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか１つを含む試薬を提供する。
【００３５】
本開示はまた、ヒトＯＸ４０に関連する疾患の診断薬であって、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む診断薬を提供する。
【００３６】
本開示はまた、ヒトＯＸ４０に関連する疾患を診断するための方法であって、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、ヒトＯＸ４０またはＯＸ４０陽性細胞を検出し、または測定することを含む方法を提供する。
【００３７】
本開示はまた、ヒトＯＸ４０に関連する疾患の診断薬の製造における前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【００３８】
本開示はまた、有効量の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは上記の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を治療するための方法を提供する。
【００３９】
ある実施態様において、前記疾患または障害は、癌または細胞増殖性疾患でありうる。ある特定の実施態様において、前記癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、メラノーマ、腎臓癌、扁平上皮癌、血液癌、または制御されていない細胞増殖によって特徴付けられる他の疾患または障害のいずれかである。
【００４０】
ある特定の実施態様において、前記血液癌には、下記に限定されないが、急性および慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄組織増殖性疾患、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性中心細胞リンパ腫、および慢性骨髄性白血病が含まれる。
【００４１】
本開示はまた、ヒト対象における免疫応答を増強するための医薬の製造における、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００４２】
本開示はまた、癌の治療／予防のための薬剤の製造における、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００４３】
本開示はまた、キットの製造における、上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは上記に記載の抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００４４】
ある実施態様において、前記増強された免疫応答には、Ｔエフェクター細胞の免疫刺激／エフェクター機能の増加、および／または制御性Ｔ細胞の免疫抑制機能の下方制御が含まれる。ここで、前記増加は、細胞増殖の結果であってもよく、前記下方制御は、細胞数の増加の欠如（または細胞数の減少）の結果であってもよい。
【００４５】
本開示は、下記：Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）の死滅、エフェクターＴ細胞機能の改善および／または記憶Ｔ細胞機能の改善、腫瘍免疫の低下、Ｔ細胞機能の増強および／またはＯＸ４０発現細胞の低下のうちの１つまたはそれ以上における使用のための前記抗ヒトＯＸ４０抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００４６】
本開示は、下記：癌の治療、対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、Ｔ細胞（ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γなど）におけるサイトカイン産生の増加、および／またはＴ細胞増殖の増加、腫瘍における制御性Ｔ細胞数の減少または枯渇、および／または腫瘍細胞の増殖の阻害のための前記抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。
【００４７】
本開示はまた、薬剤の製造における前記抗ＯＸ４０抗体の使用であって、前記薬剤が、対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化または共刺激、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生の増加、および／またはＴ細胞の増殖、腫瘍における制御性Ｔ細胞数の減少または枯渇、および／または腫瘍細胞の増殖の阻害における使用のためである、使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａから図１Ｂは、ヒトＯＸ４０に対するマウス抗体およびキメラ抗体の親和性を示すＥＬＩＳＡ試験結果である。図１Ａは、マウス抗体ｍ２Ｇ３およびキメラ抗体ｃｈ２Ｇ３の親和性の結果を、ｍ２Ｇ３−ＮＣおよびｃｈ２Ｇ３−ＮＣをネガティブコントロールとして示す。図１Ｂは、マウス抗体ｍ４Ｂ５およびキメラ抗体ｃｈ４Ｂ５の親和性の結果をｍ４Ｂ５−ＮＣおよびｃｈ４Ｂ５−ＮＣをネガティブコントロールとして示す。
【図２】図２は、抗ＯＸ４０抗体によって刺激されたＴ細胞で分泌されたＩＦＮ−γを示す試験である。前記結果は、試験ＯＸ４０抗体が１０ｎｇ／ｍＬの濃度で最大の刺激効果を達成することを示す。
【図３】図３Ａから図３Ｂは、マウスにおける抗ＯＸ４０抗体の抗腫瘍効果を示す。図３Ａは、投与後の異なるマウスにおける腫瘍体積の変化を示し、図３Ｂは、投与後のマウスの腫瘍重量に対する異なる抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。前記結果は、投薬治療後２０日目に、用量が３ｍｇ／ｋｇの場合、２Ｇ３抗体の腫瘍阻害率が最大９７％であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
用語
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の技術的および科学的用語を下記で具体的に定義する。本明細書で特に他で定義されない限り、本明細書で用いられる他の全ての技術的および科学的用語は、本出願が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００５０】
用語「Ｔ細胞機能の増強」は、エフェクターまたは記憶Ｔ細胞が、再生し、持続し、または増幅した生物学的機能を有するようにそれらを誘導し、誘発し、または刺激することを意味する。増強されたＴ細胞機能の例として、治療前のレベルと比較して、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞からのγ−インターフェロンの分泌増加、ＣＤ４＋記憶および／またはエフェクターＴ細胞からのγ−インターフェロンの分泌増加、ＣＤ４＋エフェクターおよび／または記憶Ｔ細胞の増殖増加、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増殖増加、および抗原に対する応答増加（例えば、クリアランス）が含まれる。
【００５１】
用語「免疫応答の増強」は、哺乳動物における免疫系応答を活性化し、刺激し、増加し、改善し、または増強することを意味する。前記免疫応答は、細胞性応答（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球介在などの細胞介在）または体液性応答（すなわち、抗体介在応答）であり得、一次または二次免疫応答でありうる。増強された免疫応答の例には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性の増加および細胞傷害性Ｔ細胞の産生が含まれる。前記増強された免疫応答は、下記に限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカイン放出（例えば、ＩＬ−２産生）、腫瘍の退縮、腫瘍を有する動物の生存、抗体産生、免疫細胞の増殖、細胞表面マーカーの発現および細胞傷害性を含む、当業者に公知のインビトロまたはインビボ測定法によって評価することができる。１の実施態様において、前記方法は、細胞性免疫応答、特に、細胞傷害性Ｔ細胞応答を増強する。
【００５２】
「腫瘍免疫」は、腫瘍が免疫の認識とクリアランスから免れるプロセスを意味する。治療の概念として、腫瘍の免疫が免疫の認識とクリアランスから免れる能力が弱くなると、腫瘍は、免疫系によって認識され、攻撃され、その結果、患者が治療される。腫瘍の認識の例として、腫瘍への結合、腫瘍の縮小、および腫瘍のクリアランスが含まれる。
【００５３】
「Ｔエフェクター細胞」（「Ｔｅｆｆ」）は、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）およびＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を意味する。Ｔｅｆｆは、サイトカインを分泌し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）以外の免疫細胞を活性化し、誘導する。本開示に記載される抗ＯＸ４０抗体は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞などのＴｅｆｆ細胞を活性化することができる。
【００５４】
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」は、他のＴ細胞の応答を抑制することができる特殊なタイプのＣＤ４＋Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ−２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）、および転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）を発現することによって特徴付けられ（Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)）、末梢の自己寛容の誘導と維持において重要な役割を果たす。前記寛容は、腫瘍によって発現される抗原に対する標的である。
【００５５】
「ＯＸ４０」は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０−Ｌ）に結合する受容体を意味し、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である。ＯＸ４０はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＡＣＴ３５、ＩＭＤ１６、ＴＸＧＰ１Ｌ、およびＣＤ１３４としても公知である。用語「ＯＸ４０」には、細胞によって自然に発現されるＯＸ４０の変異体またはアイソタイプのいずれもが含まれる。それゆえ、本開示に記載されるＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ヒト以外の種に由来するＯＸ４０（例えば、カニクイザルＯＸ４０）と交差反応することができる。あるいは、前記ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントは、ヒトＯＸ４０に特異的であってもよく、他の種のＯＸ４０と交差反応性を示さない。
【００５６】
ＯＸ４０またはその変異体およびアイソフォームは、それが自然に発現される細胞または組織から単離されるか、あるいは当該技術分野および／または本開示で周知の技術を用いて組換えで産生される。特に示されない限り、「ＯＸ４０」は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、脊椎動物種に由来する天然のＯＸ４０でありうる。前記用語には、「全長」、未処理のＯＸ４０、および細胞内で生じた処理によるＯＸ４０のいずれの形態も包含される。前記用語はまた、ＯＸ４０の天然に存在する変異体、例えば、スプライシング変異体または対立遺伝子変異体なども包含される。
【００５７】
「ＯＸ４０活性化」は、前記ＯＸ４０受容体の活性化を意味する。一般に、ＯＸ４０活性化はシグナル伝達を引き起こす。
【００５８】
「抗ＯＸ４０抗体」または「ＯＸ４０に結合する抗体」は、十分な親和性でＯＸ４０に結合することができ、ＯＸ４０を標的とするための診断薬および／または治療薬として使用することができる抗体を意味する。
【００５９】
用語「ＯＸ４０発現細胞を減少させる」は、抗ＯＸ４０抗体またはそのフラグメントがＯＸ４０発現細胞を死滅させるか、または排除することを意味する。ＯＸ４０発現細胞の減少は、様々なメカニズム、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または食作用などにより達成することができる。
【００６０】
用語「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出されるタンパク質の一種についての一般的な用語であり、前記サイトカインは、別の細胞に影響を与える細胞間メディエーターとして機能する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、単球；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；および他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびＫｉｔリガンド（ＫＬ）を含む）、およびγ−インターフェロンである。本開示で用いられるように、サイトカインという用語は、天然の供給源または組換え細胞培養に由来するタンパク質、および人工合成によって生成された小分子物質を含むその生物学的に活性な同等物、ならびにこれらの医薬的に許容される誘導体および塩を含む。
【００６１】
本開示で用いられるように、アミノ酸の三文字表記および一文字表記は、J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)に記載されるとおりである。
【００６２】
用語「抗体」は、抗体を産生するためのいずれか特定の方法によって限定されない。例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体が含まれる。前記抗体は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の抗体であってもよい。
【００６３】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端付近において、可変領域（Ｖ領域）として知られる約１１０アミノ酸の配列が大きく変化しており、定常領域（Ｃ領域）として知られるＣ末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定している。前記可変領域は、３個の超可変領域（ＨＶＲ）および比較的保存された配列を有する４個のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。前記３個の超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる抗体の特異性を決定する。各軽鎖可変領域（ＶＬ）および各重鎖可変領域（ＶＨ）は、３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端への順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４である。３個の軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を意味し、３個の重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を意味する。
【００６４】
本開示に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントのＬＣＶＲ領域およびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、公知のＫａｂａｔ番号付け基準（ＬＤＣＲ１−３、ＨＣＤＲ１−３の場合）に準拠する。
【００６５】
用語「組換えヒト抗体」は、組換え方法によって調製され、発現され、作成され、または単離されたヒト抗体を含み、その関連する技術および方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、
（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物またはトランス染色体動物（例えば、マウス）あるいはこれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体；
（２）トランスフェクトーマなどの抗体を発現する形質転換された宿主細胞から単離された抗体；
（３）組換えヒト抗体のコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体；ならびに
（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を別のＤＮＡ配列などにスプライシングすることによって調製され、発現され、作成され、または単離された抗体
である。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を含むが、抗体成熟中に起こるようなその後の再構成および変異も含む可変領域および定常領域を含む。
【００６６】
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を意味する。
【００６７】
ある実施態様において、前記抗体は、ヒト化抗体である。
【００６８】
本明細書における用語「マウス抗体」は、ヒトＯＸ４０に対するモノクローナル抗体を意味し、当該技術分野の知識および技術に従って調製される。調製時に、試験対象物にＯＸ４０抗原を注入し、目的の配列または機能特性を有する抗体を発現する脾細胞（Ｂリンパ球）を分離し、次いで前記Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて相当するハイブリドーマ細胞を取得する。
【００６９】
ある特定の実施態様において、マウスＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはその変異体をさらに含むか、あるいはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはこれらの変異体をさらに含む。
【００７０】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を意味するものではない。
【００７１】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種のＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって作成される抗体、すなわち、様々なタイプのヒト生殖細胞系抗体フレームワーク配列から作成された抗体を意味する。ヒト化抗体は、大量の不均一なタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘発される不均一な応答を克服する。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開されているＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（www.mrccpe.com.ac.uk/ vbase）、およびKabat, E.A, et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th editionから取得することができる。免疫原性の低下に伴う活性の減少を回避するために、ヒト抗体の可変領域におけるＦＲ配列は、活性を維持するための最小の逆突然変異または復帰突然変異に供されうる。本開示のヒト化抗体にはまた、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイによるＣＤＲのさらなる親和性成熟後に得られるヒト化抗体が含まれる。
【００７２】
ＣＤＲ移植の場合、得られたＯＸ４０抗体（またはその抗原結合フラグメント）の抗原に対する親和性の低下は、抗原との接触に関連するフレームワーク残基に生じた変化によるものである。このような相互作用は、体細胞における高頻度変異の結果でありうる。それゆえ、このようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体のフレームワークに移植する必要は依然として存在する。抗原結合に関連する非ヒトＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントに由来するアミノ酸残基は、非ヒトモノクローナル抗体の可変領域の配列および構造を検出することにより同定することができる。生殖細胞系列の残基とは異なるＣＤＲドナーフレームワークの残基が関連していると考慮することができる。最も近い生殖細胞系列が決定できない場合、前記配列は、サブタイプのコンセンサス配列に対して、または高い割合の類似性を有するマウス配列のコンセンサス配列に対して整列させることができる。まれなフレームワーク残基は、体細胞の高頻度変異の結果であり、それゆえ結合において重要な役割を果たしていると考えられる。本開示のある実施態様において、ＯＸ４０ヒト化抗体の抗体軽鎖は、ヒトカッパ、ラムダ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含む。ＯＸ４０ヒト化抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域、特に、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をさらに含む。
【００７３】
用語「逆突然変異」は、ヒト抗体のＦＲ領域におけるアミノ酸変異の、元の抗体供給源の対応する位置におけるアミノ酸残基への回復を意味する。通常、ヒト化抗体によって引き起こされる免疫原性の低下、それによる活性の低下を回避するために、ヒト化抗体の可変領域は、抗体の活性を維持するために最小の逆突然変異に供することができる。
【００７４】
用語「キメラ抗体」は、非ヒト抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合することによって形成される抗体であり、前記キメラ抗体は、非ヒト抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。一例として、キメラ抗体を樹立するために、特異的なマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に樹立し、次に可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマからクローン化し、続いてヒト抗体の定常領域遺伝子を必要に応じてクローン化し、前記マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子にライゲーションして、ヒトベクターに挿入できるキメラ遺伝子を形成させ、最後に前記キメラ抗体分子を真核生物または原核生物の産生システムで発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらの変異体の重鎖定常領域から選択される。特に、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。
【００７５】
抗体の「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」という用語は、抗原（例えば、ＯＸ４０）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを意味する。全長抗体の断片は、抗原結合の機能を達成するために用いることができることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域のジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントによって形成された二価フラグメント；
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；
（ｉｖ）抗体の１つのアームに由来するＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント；
（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature, 341:544-546）；ならびに
（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；または
（ｖｉｉ）適宜、合成リンカーにより結合された２つまたはそれ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ
が含まれる。
【００７６】
また、前記ＦｖフラグメントのＶＬドメインとＶＨドメインは、２つの別々の遺伝子によってコードされているが、一価分子がＶＬをＶＨドメインと対にすることによって形成される単一タンパク質鎖を作成するために、組換え法を用いて合成リンカーで連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Bird et al. (1988): Science 242:423-426；およびHuston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883を参照のこと）。このような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれるものとされる。このような抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて取得され、無傷の抗体の場合と同様の方法を用いて機能的フラグメントについてスクリーニングすることができる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術または無傷の免疫グロブリンの酵素学的もしくは化学的消化によって生成することができる。抗体は、異なるアイソタイプの形態、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体でありうる。
【００７７】
ある実施態様において、「抗原結合フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ペプチボディ、ドメイン抗体および多重特異性抗体（二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）を意味する。
【００７８】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子を（Ｈ鎖における２２４位のアミノ酸残基を切断する）パパインで処理することによって得られる抗体フラグメントである。得られたフラグメントは、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有し、Ｎ末端へのＨ鎖のほぼ半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して結合している。本開示におけるＦａｂは、（ヒトＯＸ４０を特異的に認識し、細胞外ドメインのアミノ酸配列またはその３Ｄ構造に結合する）本開示のモノクローナル抗体をパパインで処理することによって調製することができる。さらに、前記Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現させることによって調製することができる。
【００７９】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量と抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味し、ＩｇＧのヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで消化することにより得られる。Ｆ（ａｂ’）２には、ヒンジ領域で連結された２つのＦａｂが含まれる。
【００８０】
本開示のＦ（ａｂ’）２は、本開示のモノクローナル抗体をペプシンで処理することによって調製することができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、下記に記載のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合により連結することによって調製することができる。
【００８１】
Ｆａｂ’は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、上記に記載のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域でジスルフィド結合を切断することによって得られる。本開示のＦａｂ’は、本開示のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって調製することができる。
【００８２】
さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって調製することができる。
【００８３】
用語「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーを介して抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）に連結された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）を含む分子を意味する。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨの共通の構造を有する。従来技術における適切なリンカーは、繰り返されるＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体、例えば、１〜４回の繰り返しを伴う変異体からなる（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。本開示で用いることができる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されている。
【００８４】
本開示のｓｃＦｖは、下記の工程によって調製することができる：本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物または真核生物発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｓｃＦｖを発現させる工程。
【００８５】
「ダイアボディ」は、ｓｃＦｖが二量体化した抗体フラグメントであり、二価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。二価の抗原結合活性において、その２つの抗原は同一であってもよく、あるいは異なっていてもよい。
【００８６】
本開示のダイアボディは、下記の工程によって調製することができる：本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、リンカーペプチドの長さを８個またはそれ以下のアミノ酸残基とし、前記ＤＮＡを原核生物または真核生物発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してダイアボディを発現させる工程。
【００８７】
「ｄｓＦｖ」は、ＶＨおよびＶＬの各々における１個のアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、次いで前記置換されたポリペプチドを、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して連結させることによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、公知の方法に従って抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる（Protein Engineering, 7, 697 (1994)）。
【００８８】
本開示のｄｓＦｖは、下記の工程によって調製することができる：本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物または真核生物発現ベクターに挿入し、次いで発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｄｓＦｖを発現させる工程。
【００８９】
「ＣＤＲ含有ペプチド」は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲにおける１つまたはそれ以上の領域を組み込むことによって構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適切なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００９０】
本開示のＣＤＲ含有ペプチドは、下記の工程によって調製することができる：本開示におけるモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、次いで前記発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してペプチドを発現させる工程。前記ＣＤＲ含有ペプチドはまた、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって調製することができる。
【００９１】
本開示で用いられるように、用語「フレームワーク（ＦＲ）」は、ＶＬまたはＶＨのいずれかの可変ドメインの一部を意味し、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のための骨格として機能する。必須として、これはＣＤＲのない可変ドメインである。
【００９２】
用語「アミノ酸の差異」は、ポリペプチドと、そのポリペプチドフラグメント上の特定のアミノ酸位置におけるその変異体との間の差異を意味し、前記変異体は、前記ポリペプチド上の特定の位置におけるアミノ酸を置換し、挿入し、欠失することによって得ることができる。
【００９３】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合する抗原上の部位を意味する。前記エピトープは、隣接するアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングにより近づけられた非隣接アミノ酸によって形成させることができる。隣接するアミノ酸によって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露時に保持される一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的に、変性溶媒による処理後には存在しない。エピトープには、典型的に、ユニークな空間立体構造において少なくとも３〜１５個のアミノ酸が含まれる。免疫ブロッティングおよび免疫沈殿アッセイなどを含むエピトープを決定するための方法が当該技術分野で周知である。エピトープの空間立体構造を決定するための方法には、当該技術分野の技術および本明細書に記載の技術、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などが含まれる。
【００９４】
本発明で用いられる用語「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を意味する。典型的には、抗体は、約１０−７Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原に結合し、所定の抗原への結合についての抗体の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術による機器で測定されるように（組換えヒトＯＸ４０が分析物として使用され、前記抗体がリガンドとして使用される）、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）への結合よりも少なくとも２倍高い。用語「抗原を認識する抗体」は、本明細書では、用語「特異的に結合する抗体」と交換可能に使用することができる。
【００９５】
用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。典型的には、本開示の抗体は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定されるように、約１０−７Ｍ以下、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＯＸ４０に結合する。
【００９６】
用語「競合」が、同一のエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈で使用される場合、それは、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、共通の抗原（例えば、ＯＸ４０抗原またはその断片）に対して対照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を妨げ、または阻害する（例えば、減少させる）アッセイによって調べられるように、競合が抗原結合タンパク質間で生じることを意味する。抗原結合タンパク質が他のタンパク質と競合するかどうかを判断するために、多数のタイプの競合結合アッセイが利用可能である。これらのアッセイは、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照）、Ｉ−１２５標識による固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15を参照）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82）である。典型的には、アッセイは、標識されていない試験抗原結合タンパク質および標識された対照抗原結合タンパク質の両方に結合することができる精製された抗原の使用に関する（前記抗原は、固体表面または細胞表面上にロードされる）。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞表面に結合した標識の量を測定することによって決定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、対照抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質および対照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近いエピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれ、前記２つのエピトープは空間的に相互に干渉して結合が妨げられる。競合結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例で提供される。典型的には、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、これは、対照抗原結合タンパク質の共通する抗原への特異的結合の少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％またはそれ以上を阻害する（例えば、減少する）。ある場合では、前記結合は、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％またはそれ以上に阻害される。
【００９７】
用語「交差反応」は、異なる種に由来するＯＸ４０に結合する本発明の抗体の能力を意味する。例えば、ヒトＯＸ４０に結合する本発明の抗体はまた、別の種に由来するＯＸ４０に結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡなど）で精製された抗原との特異的反応性を検出するか、またはＯＸ４０を生理学的に発現する細胞との結合または機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定するための方法には、本明細書に記載される標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーなどが含まれる。
【００９８】
用語「抑制」または「阻害」は、交換可能に使用され、部分的および完全な抑制／阻害の両方が包含される。
【００９９】
用語「増殖の阻害」（例えば、細胞に適用される場合）は、細胞増殖における測定可能な減少を意味するものとされる。
【０１００】
用語「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」は、交換可能に使用され、特定の抗原の刺激に対する免疫応答（すなわち、受動的または適応的）を意味する。ＣＤＣまたはＡＤＣＣを誘導するという文脈での用語「誘導」は、特定の直接的な細胞死滅メカニズムの刺激を意味する。
【０１０１】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージなど）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する分泌型免疫グロブリンが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原を有する標的細胞に特異的に結合させ、次いで細胞毒によって標的細胞を死滅させるような細胞傷害性の一形態を意味する。ＡＤＣＣを介在する主な細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃｙＲＩＩＩのみを発現する一方、単球は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号もしくは第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されるインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示の方法などの動物モデルにおけるインビボで評価することができる。さらに、ＩｇＧのＦｃセグメントは、抗体のＡＤＣＣ効果を減少させ、または排除するように改変することができる。前記改変は、抗体の重鎖定常領域の変異、例えば、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、およびＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ変異からなる群から選択される変異などを意味する。
【０１０２】
用語「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を意味する。補体活性化の古典的経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、その同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列を有するポリペプチド変異体（変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド）、ならびに増加し、または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異体は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号およびＷＯ１９９９／５１６４２に記載されている。例えば、Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【０１０３】
本開示で用いられるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、特に二本鎖ＤＮＡであり得る。核酸は、別の核酸配列と機能的な相互関係に位置する場合、「作動可能に連結されている」と見なされる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に作用する場合、コードする配列に作動可能に連結される。
【０１０４】
用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を送達することができる核酸分子を意味する。１の実施態様において、ベクターは、さらなるＤＮＡ断片が連結されてもよい環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別の実施態様において、ベクターは、さらなるＤＮＡ断片がウイルスゲノムに連結されていてもよいウイルスベクターである。本明細書で開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができるか（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主のゲノムと共に複製されてもよい（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。
【０１０５】
抗体およびその抗原結合フラグメントを調製し、および精製するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15である。例えば、マウスをヒトＯＸ４０またはそのフラグメントで免疫することができ、次いで得られた抗体を、当該技術分野で周知の従来方法を用いることにより、再生し、精製し、およびアミノ酸配列について配列決定することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製することができる。本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つまたはそれ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域に挿入するように操作される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩＭＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のＷｅｂサイトhttp://imgt.cines.fr、あるいはＭＯＥソフトウェアを用いてＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアラインメントすることによりThe Immunoglobulin Facts Book, 2001 ISBN012441351から取得することができる。
【０１０６】
本開示における抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法を用いて調製し、および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローン化され、ＧＳ発現ベクターに組み換えられてもよい。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトされてもよい。当該技術分野でより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ末端において、抗体のグリコシル化を生じうる。安定なクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現により得られうる。陽性クローンは、バイオリアクター中の抗体産生のための無血清培地中で増殖させられうる。抗体が分泌される培地は、従来の手法によって精製され、次いで回収されうる。前記抗体は、一般的な技術を用いて濾過および濃縮にかけられうる。可溶性混合物および多量体は、モレキュラーシーブまたはイオン交換などの一般的な技術によって効果的に除去されうる。得られた生成物は、例えば、−７０℃で直ちに冷凍されるか、または凍結乾燥されうる。
【０１０７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、細胞株の真核生物、原核生物、またはファージクローンに限定されない、細胞株の単一クローンから得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、ＣＤＲ移植）、または当該技術分野で公知の他の技術によって取得することができる。
【０１０８】
用語「宿主細胞」は、発現ベクターが導入されている細胞を意味する。宿主細胞には、微生物（例えば、細菌）、植物、または動物細胞が含まれうる。形質転換されやすい細菌には、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの一員が含まれる。適切な微生物には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが含まれる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＮＳ０および２９３細胞が含まれる。
【０１０９】
「保存的改変」または「保存的置換または置換」は、改変がタンパク質の生物学的活性を変化させることなく高頻度で行われうるように、タンパク質中のアミノ酸について同様の性質（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖立体構造および剛性など）を示す他のアミノ酸への置換を意味する。当業者にとって、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことは公知である（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224 (4th edition)を参照のこと）。さらに、同様の構造または機能を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性を喪失する可能性が低い。
【０１１０】
「有効量」は、医学的症状または状態の症状または徴候を緩和し、または予防するために十分な量に関する。有効量はまた、診断を可能し、または容易にするために十分な量も意味する。特定の患者または獣医対象のための有効量は、治療される病気、患者の総体的な健康状態、投与経路および投与用量、および副作用の重症度などの因子により変動しうる。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大投与量または投与プロトコルでありうる。
【０１１１】
「外因性」は、文脈に応じて、生物、細胞、または人体の外部で生成される物質を意味する。
【０１１２】
「内在性」は、文脈に応じて、生物、細胞、または人体の中で生成される物質を意味する。
【０１１３】
本開示で記載される「変異配列」は、本開示のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の適切な置換、挿入、または欠失による改変後の本開示のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対する様々な割合の配列同一性を有するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を意味する。前記配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％であってもよく、非限定的な例として、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％が含まれる。２つの配列間の配列比較および同一性の割合の決定は、デフォルト設定を用いて、国立バイオテクノロジー研究所のウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて実行することができる。
【０１１４】
本開示で用いられるように、「相同性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を意味する。比較される２つの配列の両方の位置が同一の塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される一致する位置または相同な位置の数を、比較される全ての位置の数で割り、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列が最適に整列される場合、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致し、または相同である場合、２つの配列は、６０％相同として知られ、２つの配列の１００個の位置のうち９５個が一致し、または相同である場合、２つの配列は、９５％相同として知られている。一般に、２つの配列は、アラインメントが最大の相同性パーセンテージを供するところで比較される。
【０１１５】
本開示で用いられるように、用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、全てのこのような表記は、その後代も含まれる。よって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、継代数に関わらず、最初の対象細胞およびそれに由来する培養物を含む。全ての後代は、意図されるか、または意図されていない変異により、ＤＮＡ含有物という点において正確に同一でないことも理解されるべきである。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同一の機能または生物学的活性を示す変異後代が含まれる。明確な表記が記載されている場合、文脈に従って明確に理解される。
【０１１６】
本開示で用いられるように、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるような、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分の微量が増幅される方法または技術を意味する。一般に、目的の領域の末端またはそれ以上の配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように（前記プライマーは、増幅される鋳型の相補鎖の配列と同一であるか、または類似する）利用可能であることが必要となる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と同一でありうる。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、ゲノム全体および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、バクテリオファージ、またはプラスミド配列などを増幅するために用いることができる。一般的に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich editor, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY)を参照のこと。本開示で用いられるＰＣＲは、試験される核酸試料を増幅するためのポリメラーゼ反応法の一例（この１つだけではない）と考慮される。前記方法には、核酸の特定の部分を増幅し、または調製するために、核酸ポリメラーゼと組み合わせたプライマーとして公知の核酸配列の使用が含まれる。
【０１１７】
「任意の」または「適宜」は、次に記載される事象または状況が存在してもよい（ただし、必ずしも存在しない）ことを意味し、当該記載には、事象または状況が存在し、または存在しない場合が含まれる。例えば、「適宜、１〜３個の抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在しうるが、存在することが必要ではないことを意味する。
【０１１８】
「医薬組成物」は、本開示による１つまたはそれ以上の抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに生理学的／医薬的に許容される担体または賦形剤などの他の化学成分を含む混合物を意味する。前記医薬組成物は、生物への投与を容易にし、活性成分の吸収を促進し、それにより生物学的効果を示すことを目的とする。
【０１１９】
用語「癌」は、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味し、または記載する。癌の例として、以下に限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、以下に限定されないが、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌および胃腸間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性そばかすほくろメラノーマ、末端部メラノーマ、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに貪食、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するもの）およびメグズ症候群に関連する血管増殖の異常、脳腫瘍および脳癌、および頭頸部癌、ならびにこれらの関連する転移が含まれる。
【０１２０】
特定の実施態様において、本開示におけるＯＸ４０抗体またはそのフラグメントによって治療されるのに適する癌として、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、膠芽腫、非ホジキンリンパ腫瘍（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポシ肉腫、カルチノイド腫瘍、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫が含まれる。ある実施態様において、前記癌は、非小細胞肺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌（例えば、三種陰性乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、および肝細胞癌からなる群から選択される。また、ある実施態様において、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膠芽腫、および乳癌（例えば、三種陰性乳癌）（これらの癌の転移を含む）からなる群から選択される。
【０１２１】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、一定程度の異常な細胞増殖に関連する障害を意味する。ある実施態様において、前記細胞増殖性障害は、癌を意味する。
【０１２２】
用語「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず全ての腫瘍性細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を意味する。
【０１２３】
用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本開示で記載される場合、相互に排他的なものではない。
【０１２４】
「投与」、「投与」および「治療」は、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、外因性の医薬、治療剤、診断薬または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生体液と接触させることを意味する。「投与」、「投与する」および「治療」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究および実験の方法などを意味しうる。細胞の治療は、試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を細胞と接触させた液体と接触させることを含む。「投与」、「投与する」および「治療」はまた、試薬、診断、結合する組成物を使用することによるか、または別の細胞を使用することによる、例えば、細胞のインビトロおよびエクスビボ治療を意味する。「治療」は、ヒト、獣医、または研究対象に適用される場合、治療上の処置、予防的または予防上の措置、研究、ならびに診断適用を意味する。
【０１２５】
「治療する」は、治療薬（例えば、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含む組成物、または前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子）の、前記治療薬が治療作用を示すことが知られている１つまたはそれ以上の疾患または症状に罹っている患者に対する体内または体外投与を意味する。典型的には、前記治療薬は、臨床的に測定可能な程度まで、このような症状の退縮を引き起こすことによって、またはこのような症状の進行を阻害することによって、治療される患者または集団における１つまたはそれ以上の疾患または症状を軽減するための有効量で投与される。特定の疾患または症状を軽減するために有効な治療薬の量（「治療上有効な量」とも称される）は、患者の病状、年齢および体重、ならびに患者に所望される効果を引き出す薬剤の能力などの因子によって変動しうる。病気の症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって通常使用される臨床的な測定方法のいずれかによって評価することができる。本開示の実施態様（例えば、治療方法または製品）は、目的の各疾患症状を緩和するために有効でないかもしれないが、スチューデントｔ検定、カイ２乗検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ジョンクヒーレ・テルプストラ検定、ウィルコクソン検定などの当該技術分野で公知の統計学的検定によって決定されるように、統計学的に有意な対象数における対象の疾患症状を軽減しうる。
【０１２６】
用語「癌の予防」は、哺乳動物における癌の発症を遅延させ、阻害し、または予防することを意味する（癌または腫瘍の発生の開始が哺乳動物で確認されていないが、前記哺乳動物は、例えば、遺伝子スクリーニングまたは他の方法によって癌に感受性を有することが確認されているものである）。前記用語にはまた、前癌状態を、悪性腫瘍に対して進行を防止し、あるいは退縮させるために、前癌状態に罹っている哺乳動物の治療も含まれる。
【０１２７】
本発明の詳細な説明
以下では、本開示は、実施例を示してさらに記載される。しかしながら、本開示の範囲はこれらに限定されるものではない。具体的な条件が記載されていない実施例において、これらの実験は、一般に、Cold Spring HarborによるAntibodies, A Laboratory Manual and Molecular Cloning Manualに記載の従来の条件、あるいは材料または製品の製造業者によって推奨される条件で行われる。試薬の供給源が具体的に示されていない場合、その試薬は市販されている。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：抗体の調製
抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体のライブラリーは、マウスを免疫することによって作成した。実験用マウスは、ＢａｌＢ／ＣおよびＡ／Ｊ系統の雌１０週齢であった（揚州大学比較医学センター、動物生産ライセンス番号；ＳＣＸＫ（江蘇）２０１７−００７）。
【０１２９】
免疫抗原は、Ｆｃタグ付きのヒトＯＸ４０組換えタンパク質（ＯＸ４０−Ｆｃ：Ｆｃと融合させたＯＸ４０ Ｌｅｕ２９−Ａｌａ２１６（受入番号ＮＰ＿００３３１８））であり、カタログ番号＃ＯＸ４０−Ｈ５２５５でＡｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＨＥＫ２９３で発現させ、次いで従来の方法により精製した。
【０１３０】
ＯＸ４０−Ｆｃは、フロイントアジュバントで乳化させた。すなわち、フロイント完全アジュバント（シグマアルドリッチ，Ｆ５８８１−１０ＭＬ）を最初の免疫化に用い、フロイント不完全アジュバント（シグマアルドリッチ，Ｆ５５０６−１０ＭＬ）を追加免疫のリセットに用いた。抗原とアジュバントとの比率は１：１であり、２５μｇタンパク質／２００μｌ／マウスを各免疫化で注射した。具体的には、
１日目    フロイント完全アジュバントによる最初の免疫化
２１日目  フロイント不完全アジュバントによる２回目の免疫化
３５日目  フロイント不完全アジュバントによる３回目の免疫化
４２日目  採血および血清力価試験
４９日目  フロイント不完全アジュバントによる４回目の免疫化
５６日目  採血および血清力価試験。
【０１３１】
マウス血清中の抗体力価およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの結合を遮断する中和活性を、実施例２に記載されるＥＬＩＳＡ法によりマウス血清を用いて測定した。強力な血清力価、親和性、およびリガンド結合を遮断する能力を有するマウスを最終免疫化のために選択し、次に屠殺した。脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５８１（登録商標））と融合させ、プレート上に撒種して、ハイブリドーマを得た。目的のハイブリドーマは、実施例２に示される間接ＥＬＩＳＡ、捕捉ＥＬＩＳＡ、および細胞に基づく機能的スクリーニングによって選択し、モノクローナル抗体株は、限定希釈法によって樹立させた。
【０１３２】
１９株の樹立させたＯＸ４０マウスモノクローナル抗体を、無血清発現によって産生させ、精製させたマウスモノクローナル抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフによって取得した。活性化された抗ＯＸ４０抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、間接ＥＬＩＳＡ、捕捉ＥＬＩＳＡおよび細胞機能活性スクリーニングによって選択した。機能的スクリーニングの簡潔な手順は、以下のとおりであった。ＧＳ−Ｈ２／ＯＸ４０安定細胞株を培養した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから購入、カタログ番号Ｍ００６０８）。希釈した試験抗体とＯＸ４０Ｌ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１３１２７−Ｈ０４Ｈ）溶液を調製し、対数増殖期のＧＳ−Ｈ２／ＯＸ４０細胞に添加した。培養終了後、該細胞上清を回収し、上清中のＩＬ−８含有量を測定した（ヒトＩＬ−８キット，Ｃｉｓｂｉｏ，カタログ番号６２ＩＬ８ＰＥＢを使用）。抗体ＧＰＸ４（特許出願ＷＯ２０１５１５３５１３における１Ａ７．ｇｒ．１を参照して調製）を試験の陽性対照として用い、ｈＩｇＧ（研究室で調製）を陰性対照として用いた。
【０１３３】
細胞機能活性により、活性の高い１０株を遺伝子クローニングと配列決定のために選択した。全ＲＮＡを、従来のＲＮＡ抽出技術によって細胞から抽出し、次いで前記モノクローナル抗体の可変領域のＰＣＲ産物を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって取得した。前記ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し回収し、遺伝子ベクターにクローニングし、次いで大腸菌に形質転換させた。いくつかの形質転換させたコロニーを無作為に選択し、前記モノクローナル抗体の可変領域を遺伝子配列決定のためにＰＣＲによって増幅させた。得られた例示的なマウスモノクローナル抗体の対応する配列を以下に示す。
【０１３４】
マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｂ５の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下のとおりである。
ｍ４Ｂ５重鎖可変領域：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGLHWFRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDDSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAREEYDVWGTGTTVTVSS
配列番号１；
ｍ４Ｂ５軽鎖可変領域：
DIQMTQTASSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
配列番号２
【０１３５】
マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｂ５のＣＤＲ領域の配列を表１に示す。
表１．マウスモノクローナル抗体ｍ４Ｂ５のＣＤＲ領域配列
【表１】
2022502417.tif 000002
【０１３６】
マウスモノクローナル抗体ｍ２Ｇ３の重鎖および軽鎖可変領域配列を以下のとおりである。
ｍ２Ｇ３重鎖可変領域：
QVQLKESGPGLVASSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWDGGNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号９；
ｍ２Ｇ３軽鎖可変領域：
DIQMTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIIYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVNTFPFTFGSGTKLEIK
配列番号１０
【０１３７】
マウスモノクローナル抗体ｍ２Ｇ３のＣＤＲ領域の配列を表２に示す。
表２．マウスモノクローナル抗体ｍ２Ｇ３のＣＤＲ領域配列
【表２】
2022502417.tif 000003
【０１３８】
実施例２：ＥＬＩＳＡによる抗体の同定およびスクリーニング
間接ＥＬＩＳＡ法：
２０×コーティング緩衝液を、脱イオン化水を用いて１倍に希釈した。１倍のコーティング緩衝液（炭酸緩衝液）を用いて最終濃度２μｇ／ｍＬに調製したヒトＯＸ４０−Ｈｉｓ抗原（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ，ＯＸＬ−Ｈ５２Ｑ８）の１００μＬを、各ウェルに加え、４℃で終夜または３７℃で２時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、２００μＬのブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳＴ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートし、次いで該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬの希釈した一次抗体を、各ウェルに添加し（試験抗体を１００００ｎｇ／ｍｌの濃度から５倍ずつ希釈し、１００００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、および０．６４ｎｇ／ｍｌの７つの段階希釈液を作成し、ブランクウェルは、希釈溶液（ＰＢＳＴ中の２．５％のスキムミルク）のみを含有した）、３７℃で４０分間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、酵素標識二次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入，Ｃａｔ＃１１５０３６０７１またはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入，Ｃａｔ＃１０９０３６０９８）をＰＢＳＴ緩衝液で希釈し、１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ発色溶液を各ウェルに加え、室温で暗所にて３〜１５分間インキュベートし、５０μｌの停止溶液（１Ｍの硫酸）を各ウェルに加えた。マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、ＯＤ値を４５０〜６３０ｎｍで読み取り、試験データを保存した。
【０１３９】
捕捉ＥＬＩＳＡ：
２０×ＰＢＳ緩衝液を脱イオン化水で１倍に希釈した。１×ＰＢＳで最終濃度２μｇ／ｍＬに調製した１００μＬのＧＡＭ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５−００６−０７１）を、各ウェルに添加し、４℃で終夜または３７℃で２時間インキュベートし、該プレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、２００μＬのブロッキング溶液（５％スキムミルクを含むＰＢＳＴ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートし、該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。希釈した一次抗体１００μＬを各ウェルに添加し（試験する抗体を１００００ｎｇ／ｍｌの濃度から５倍ずつ希釈し、１００００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、３．２ｎｇ／ｍｌ、および０．６４ｎｇ／ｍｌの７つの段階希釈液を作成し、ブランクウェルは希釈溶液（ＰＢＳＴ中の２．５％のスキムミルク）のみを含有した）、３７℃で４０分間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ヒトＯＸ４０−ＦＣ−ビオチン（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＯＸ０−Ｈ５２５５，標識ビオチン）をＰＢＳＴ中の２．５％スキムミルクで希釈し、１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートし、次いで該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ発色溶液を各ウェルに加え、室温で暗所にて３〜１５分間インキュベートし、５０μｌの停止溶液（１Ｍの硫酸）を各ウェルに加えた。マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、ＯＤ値を４５０〜６３０ｎｍで読み取り、試験データを保存した。
【０１４０】
リガンド結合のブロッキングＥＬＩＳＡ：
２０×コーティング緩衝液を、脱イオン化水で１倍に希釈し、１×コーティング緩衝液（炭酸緩衝液）で最終濃度２μｇ／ｍＬに調製したＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓ抗原（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ，ＯＸＬ−Ｈ５２Ｑ８）の１００μＬを、各ウェルに添加し、４℃で終夜または３７℃で２時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、２００μＬのブロッキング溶液（５％スキムミルクを含むＰＢＳＴ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートし、該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。マウス血清／抗体を、予め調製した２００ｎｇ／ｍｌのヒトＯＸ４０−Ｆｃ溶液（２．５％のスキムミルクで調製）で段階希釈し、室温で４０分間プレインキュベートし、ブロックしたＯＸ４０Ｌプレートに１００μＬ／ウェルで加え、４０分間インキュベートし、該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（ＧＡＨ−ＨＲＰ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，１０９−０３５−００６）をＰＢＳＴ緩衝液で希釈し、１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ発色溶液を各ウェルに加え、暗所にて室温で３〜１５分間インキュベートし、５０μｌの停止溶液（１Ｍ硫酸）を各ウェルに加えた。マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、ＯＤ値を４５０〜６３０ｎｍで読み取り、試験データを保存した。
【０１４１】
実施例３：抗ＯＸ４０組換えキメラ抗体の構築および発現
マウス抗体ｍ２Ｇ３およびｍ４Ｂ５重鎖可変領域（ＶＨ）をヒト免疫グロブリン重鎖定常領域と組み合わせ、および軽鎖可変領域をヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域と組み合わせ、真核生物発現ベクターに別々にクローン化し、次いで細胞にトランスフェクトしてマウス−ヒトキメラ抗体を産生した。
【０１４２】
重鎖ベクターを以下のとおり設計した：シグナルペプチド＋重鎖可変領域配列＋ヒトＩｇＧ１定常領域配列。
【０１４３】
軽鎖ベクターを以下のとおり設計した：シグナルペプチド＋軽鎖可変領域配列＋ヒトカッパ定常領域配列。
【０１４４】
上記の配列をｐＣＥＰ４ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｖ０４４５０）に挿入した。該ベクタープラスミドを取得し、該プラスミドを抽出し、確認のために配列決定を行った。適格なプラスミドを、ＰＥＩを用いてヒト２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、継続して培養し、前記２９３Ｆ細胞を無血清培地（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＰＭ−２９３ ＣＤ０３）中で培養して、細胞トランスフェクションのために対数増殖期に到達させた。２１．４μｇのキメラ抗体軽鎖プラスミドおよび２３．６μｇのキメラ抗体重鎖プラスミドを、１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（ＧＩＢＣＯ，３１９８５−０７０）に溶解し、十分に混合し、２００μｇのＰＥＩを加え、十分に混合し、室温で１５分間インキュベートし、５０ｍＬの細胞に加えた。細胞培養条件：５％ ＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍ／分。培養期間中、培地添加物を、細胞生存率が７０％以下になるまで１日目および３日目に加え、該細胞上清物を回収し、遠心分離した。遠心分離し、濾過し、該細胞培養溶液を抗体精製のためにアフィニティーカラム上にロードし、該カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ）で溶出し、１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ９．０）で中和し、リン酸緩衝液に対して透析し、精製されたキメラ抗体Ｃｈ２Ｇ３およびＣｈ４Ｂ５を最終的に得た。
【０１４５】
実施例４：インビトロ結合親和性および動力学的試験
ヒトＯＸ４０に対する親和性をマウス抗体およびキメラ抗体で検出し（方法の工程は実施例２に記載されたものと同一）、結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。ｍ２Ｇ３−ＮＣ（−ＮＣは陰性対照を表す）、Ｃｈ２Ｇ３−ＮＣ、ｍ４Ｂ５−ＮＣ、およびＣｈ４Ｂ５−ＮＣは陰性対照であり、それぞれｍ２Ｇ３、Ｃｈ２Ｇ３、ｍ４Ｂ５、およびＣｈ４Ｂ５で用いられたものと同一の定常領域を共有するが、これらの可変領域はＯＸ４０を認識しない。
【０１４６】
結果は、キメラ抗体Ｃｈ２Ｇ３およびＣｈ４Ｂ５がヒトＯＸ４０に対して高い親和性を有することを示す。
【０１４７】
実施例５：抗ＯＸ４０抗体のレポーター遺伝子のインビトロ細胞試験
ウェルプレートを抗ＣＤ３抗体（Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ，Ａ０５−００１）でコーティングし、４℃で終夜静置し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−Ｋｂ ｌｕｃ−ｈＯＸ４０細胞（ＡＴＣＣ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒによって構築されたＴＩＢ−１５２安定細胞株）およびＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−８６）を収集し、再懸濁し、混合した。試験する希釈抗体の５０μｌ／ウェルおよび２種類の混合させた細胞の５０μｌ／ウェルをプレートに加え、該プレートを、５％ ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で５時間インキュベートした。１００μｌのｏｎｅ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｅ６１２０）を各ウェルに加え、室温で３分以上インキュベートした。該発光シグナルを機器で測定し、ＲＬＵの読み取り値を記録した。結果を表３に示す。
表３．抗ＯＸ４０抗体によるレポーター遺伝子のインビトロ活性化の結果
【表３】
2022502417.tif 000004
【０１４８】
結果は、キメラ抗体Ｃｈ２Ｇ３およびＣｈ４Ｂ５が前記レポーター遺伝子を効果的に活性化することができることを示している。
【０１４９】
実施例６：マウス抗体のヒト化試験
免疫原性の可能性を減少させるために、マウス抗体をヒト化した。前記キメラ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を、それぞれＦＲ領域（フレームワーク領域）における部位特異的アミノ酸変異誘発にかけた。アミノ酸変異の異なる組み合わせにより、異なるヒト化抗体重鎖および軽鎖を設計し、異なる軽鎖／重鎖組み合わせをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトしてヒト化抗体を作製した。簡単に説明すると、以下のとおりである。
【０１５０】
まず、発現ベクターを設計した：
重鎖ベクターを以下のように設計した：シグナルペプチド＋変異が入った重鎖可変領域配列＋ヒトＩｇＧ１定常領域配列。
【０１５１】
軽鎖ベクターは以下のように設計した：シグナルペプチド＋変異が入った軽鎖可変領域配列＋ヒトカッパ定常領域配列。
【０１５２】
上記配列を、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｖ０４４５０）に別々に挿入した。該発現ベクターは、上記の設計に従い、第三者の遺伝子合成会社が合成した。該ベクタープラスミドを取得し、該プラスミドを抽出し、確認のために配列決定を行った。適格なプラスミドを、ＰＥＩを用いてヒト２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、継続的に培養し、２９３Ｆ細胞を無血清培地（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＯＰＭ−２９３ ＣＤ０３）中で培養して、細胞トランスフェクションのために対数増殖期に到達させた。ヒト化抗体軽鎖をコードするプラスミドの２１．４μｇおよびヒト化抗体重鎖をコードするプラスミドの２３．６μｌを、１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（ＧＩＢＣＯ，３１９８５−０７０）中に溶解させ、十分に混合し、２００μｇのＰＥＩを添加し、十分に混合し、室温で１５分間インキュベートし、５０ｍＬの細胞に加えた。
【０１５３】
細胞培養条件：５％ ＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍ／分。培養期間中、培地添加物を細胞生存率が７０％以下になるまで１日目と３日目に添加し、該細胞上清物を回収し、遠心分離した。遠心分離し、濾過し、該細胞培養溶液を抗体精製のためにアフィニティーカラムにロードし、該カラムをリン酸緩衝液で洗浄し、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７，０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ）で溶出し、１Ｍのトリス塩酸で中和し（ｐＨ９．０）、リン酸緩衝液に対して透析し、次いで精製されたヒト化抗体を最終的に得た。
【０１５４】
ヒト化可変領域の配列は以下のとおりである：
＞ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１
【化１】
2022502417.tif 000005
配列番号１７；
＞ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ２
【化２】
2022502417.tif 000006
配列番号１８；
＞ｈｕ２Ｇ３ ＶＬ１
【化３】
2022502417.tif 000007
配列番号１９；
＞ｈｕ２Ｇ３ ＶＬ２
【化４】
2022502417.tif 000008
配列番号２０。
注：順序は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、斜体の配列は、ＦＲを表し、下線の配列は、ＣＤＲを表します。
【０１５５】
ヒト化抗体の設計された可変領域を、以下のように異なる抗体に組み込んだ。
表４．ヒト化ｍ２Ｇ３抗体およびその重鎖および軽鎖可変領域
【表４】
2022502417.tif 000009
注：２Ｇ３−ｈｕ１は、ヒト化抗体２Ｇ３−ｈｕ１の重鎖可変領域がｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１であり、前記軽鎖可変領域がｈｕ２Ｇ３ ＶＬ１であることを意味し、他の抗体も同様に解釈できる。
【０１５６】
ｍ４Ｂ５のヒト化可変領域の配列は、以下のとおりである：
ｈｕ４Ｂ５ ＶＬ０：
【化５】
2022502417.tif 000010
配列番号２１；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＬ１：
【化６】
2022502417.tif 000011
配列番号２２；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＬ２：
【化７】
2022502417.tif 000012
配列番号２３；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＬ３：
【化８】
2022502417.tif 000013
配列番号２４；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＬ４：
【化９】
2022502417.tif 000014
配列番号２５；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＨ０：
【化１０】
2022502417.tif 000015
配列番号２６；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＨ１：
【化１１】
2022502417.tif 000016
配列番号２７；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＨ２：
【化１２】
2022502417.tif 000017
配列番号２８；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＨ３：
【化１３】
2022502417.tif 000018
配列番号２９；
ｈｕ４Ｂ５ ＶＨ４：
【化１４】
2022502417.tif 000019
配列番号３０。
【０１５７】
ヒト化抗体の設計された可変領域を、以下のように異なる抗体に組み込んだ。
表５．ｍ４Ｂ５ヒト化抗体および対応する重鎖および軽鎖可変領域
【表５】
2022502417.tif 000020
注：Ｈｕ４Ｂ５ Ｖ１は、ヒト化抗体ｈｕ４Ｂ５Ｖ１の重鎖可変領域がｈｕ４Ｂ５ ＶＨ０であり、前記軽鎖可変領域がｈｕ４Ｂ５ ＶＬ０であることを意味し、他の抗体も同様に解釈できる。
【０１５８】
より優れたヒト化改変ｍ２Ｇ３抗体を得るために、ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１のアミノ酸配列に変異を入れた。変異後の重鎖可変領域の配列は、以下のとおりである。
ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１．１
【化１５】
2022502417.tif 000021
配列番号３１；
＞ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１．２
【化１６】
2022502417.tif 000022
配列番号３２。
【０１５９】
変異後に得られたＨＣＤＲ２配列は、以下のとおりである。
表６．変異後に得られたＨＣＤＲ２配列
【表６】
2022502417.tif 000023
【０１６０】
重鎖可変領域ｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１．１およびｈｕ２Ｇ３ ＶＨ１．２を軽鎖可変領域ｈｕ２Ｇ３ ＶＬと組み合わせて新しい最適化されたヒト化抗体を形成させた。表７を参照のこと。
表７．変異後に得られた新しいヒト化ｈｕ２Ｇ３抗体の軽鎖／重鎖可変領域
【表７】
2022502417.tif 000024
【０１６１】
上記に記載のヒト化抗体を、親和性について試験し（実施例２の捕捉ＥＬＩＳＡを参照）、その試験結果は、前記ヒト化分子がＯＸ４０に結合することができることを示した。
【０１６２】
例示のｍ２Ｇ３およびそのヒト化抗体の親和性評価（捕捉ＥＬＩＳＡ）の結果を表８に示す：
表８．抗体親和性
【表８】
2022502417.tif 000025
【０１６３】
例示的なｍ４Ｂ５およびその改変された抗体の捕捉ＥＬＩＳＡ試験結果を表９に示す。
表９．抗体親和性
【表９】
2022502417.tif 000026
【０１６４】
上記に記載の軽鎖可変領域配列を、前記軽鎖定常領域配列と組み合わせて最終的な軽鎖配列を形成させ、上記に記載の重鎖可変領域配列を、重鎖定常領域と組み合わせて最終的な重鎖配列を形成させた。前記具体的な軽鎖および重鎖定常領域は、本開示で開示される抗体定常領域に限定されない。当該技術分野で公知の他の軽鎖および重鎖定常領域およびこれらの変異体もまた、抗体の能力を高めるために使用することができる。
【０１６５】
例示的な定常領域は以下のとおりである。
ＩｇＧ１重鎖定常領域：
【化１７】
2022502417.tif 000027
配列番号３５；
カッパ軽鎖定常領域：
【化１８】
2022502417.tif 000028
配列番号３６。
【０１６６】
例示的な全長２Ｇ３およびｈｕ４Ｂ５−Ｖ７（４Ｂ５としても公知）抗体のアミノ酸配列は以下のとおりである。
２Ｇ３重鎖：
【化１９】
2022502417.tif 000029
配列番号３７；
２Ｇ３軽鎖：
【化２０】
2022502417.tif 000030
配列番号３８；
４Ｂ５重鎖：
【化２１】
2022502417.tif 000031
配列番号３９；
４Ｂ５軽鎖：
【化２２】
2022502417.tif 000032
配列番号４０。
【０１６７】
陽性対照ＧＰＸ４は、特許出願ＷＯ２０１５１５３５１３で教示される１Ａ７．ｇｒ．１を参照して調製し、その重鎖および軽鎖アミノ酸配列は以下のとおりである。
ＧＰＸ４重鎖：
【化２３】
2022502417.tif 000033
配列番号４１；
ＧＰＸ４軽鎖：
【化２４】
2022502417.tif 000034
配列番号４２。
【０１６８】
実施例７：ヒト化抗体のインビトロ結合親和性および動力学的試験
Ｂｉａｃｏｒｅ法は、タンパク質間の親和性と反応速度を客観的に検出するための十分に認識された方法である。我々は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）を用いて本発明の試験対照のＯＸ４０抗体を分析して親和性と結合速度を特徴付けた。
【０１６９】
Ｂｉａｃｏｒｅから提供されたキットを用いて、本発明の試験される組換え抗ＯＸ４０抗体を、ＮＨＳ標準アミノカップリング法によってＣＭ５（ＧＥ）チップに共有結合させた。次いで、同一の緩衝液で希釈したヒトＯＸ４０−Ｈｉｓタンパク質（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃１０４８１−Ｈ０８Ｈ）の一連の濃度勾配液を、３０μＬ／分の流速で各サイクルにロードした。ロード後、該チップを、キットに含まれている再生試薬を用いて再生した。該抗原抗体結合速度を３分間追跡し、解離速度を１０分間追跡した。得られたデータは、１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを備えたＢＩＡ評価ソフトウェア（ＧＥ）を用いて解析した。この方法で測定したキメラ抗体のｋａ（ｋｏｎ）、ｋｄ（ｋｏｆｆ）、ＫＤ値を下記表に示す。
表１０．ヒト化抗体のインビトロ結合親和性を示す結果
【表１０】
2022502417.tif 000035
【０１７０】
結果は、２Ｇ３と４Ｂ５の両方がＯＸ４０に効果的に結合することができることを示す。
【０１７１】
実施例８：抗体によるＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ結合阻害のＥＬＩＳＡ試験
ウェルプレートを、ＯＸ４０リガンド（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＯＸＬ−Ｈ５２Ｑ８）でコーティングし、阻害し、勾配希釈した試験抗体を加え（前記抗体を、ヒトＢｉｏ−ＯＸ４０−ＦＣ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＯＸ４０−Ｈ５２５５（ビオチンで標識）を含む溶液で希釈し、４０分間予めインキュベートし、次いで該プレートに添加した）、４０分間インキュベートし、洗浄した。次いでＳＡ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，０１６−０３０−０８４）を加え、４０分間インキュベートした。発色液と停止液を加え、ＯＤ値を測定した。結果を下記の表に示す。
表１１．抗体によるＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ結合阻害の試験結果
【表１１】
2022502417.tif 000036
【０１７２】
前記結果は、２Ｇ３と４Ｂ５の両方がＯＸ４０のＯＸ４０Ｌへの結合を阻害することができることを示す。
【０１７３】
実施例９：ヒト化抗体の活性データ
ウェルプレートを、抗ＣＤ３抗体（Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ，Ａ０５−００１）でコーティングし、４℃で終夜静置し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−Ｋｂ ｌｕｃ−ｈＯＸ４０細胞（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ−１５２，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒによって構築された安定な細胞株）およびＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−８６）を収集した。前記２種類の細胞を再懸濁し、混合した。希釈した試験抗体の５０μｌ／ウェルおよび混合した２種類の細胞の５０μｌ／ウェルをプレートに加え、該プレートを５％ ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で５時間インキュベートした。Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｅ６１２０）を各ウェルに加え、室温で３分以上インキュベートした。発光シグナルを機器で測定し、ＲＬＵの読み取り値を記録した。結果を表１２に示す。該結果は、２Ｇ３と４Ｂ５の両方がレポーター遺伝子を効果的に活性化することができることを示す。
表１２．ヒト化抗体によるレポーター遺伝子の活性化の試験結果
【表１２】
2022502417.tif 000037
【０１７４】
実施例１０：インビトロ細胞機能試験
ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を分離し、試験抗体と一緒に抗ＣＤ３抗体（Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ、Ａ０５−００１）でコーティングした９６ウェルプレートに加え、３７℃で７２時間共培養し、上清物を回収してＩＦＮ−γを検出した。結果を図２と表１３に示す。該結果は、ＧＰＸ４、４Ｂ５、および２Ｇ３がＩＦＮ−γの放出を大幅に増強でき、２Ｇ３が１０ｎｇ／ｍＬで最大の刺激効果を達成できることを示す。
表１３．様々な抗体に対応するＩＦＮγ（ｐｇ／ｍＬ）値
【表１３】
2022502417.tif 000038
注：データは以下のとおり計算した：平均＋／−ＳＥＭ（平均＋／−平均値の標準誤差）、Ｎ＝３（３回反復）。
【０１７５】
実施例１１：抗ＯＸ４０抗体による腫瘍細胞増殖の阻害
Ｂ−ｈＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）ヒト化マウス（Ｂ−ｈＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）ヒト化マウス，Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）（雌１７〜２０ｇの６〜７週齢）。
【０１７６】
対数増殖期のＭＣ３８腫瘍細胞７を採取し（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｙｉｎｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、細胞濃度をＰＢＳ緩衝液で５×１０６／ｍＬに調整し、０．１ｍＬの細胞懸濁液をＯＸ４０マウス脇腹に接種した。該マウスを接種後に腫瘍増殖についてモニターした。接種後７日目に、担腫瘍マウスの脇腹における平均腫瘍体積は１０２．５ｍｍ３に達した。マウスを腫瘍の大きさに応じてグループに分け、投与し、モニターした。グループ化情報を表１４に示す。
表１４．マウスのグループ化と投与用量のスケジュール
【表１４】
2022502417.tif 000039
【０１７７】
該ＯＸ４０ヒト化抗体を、マウスのＭＣ３８結腸癌細胞異種移植片の増殖に対するその阻害効果について試験した。
【０１７８】
担腫瘍マウスの腫瘍体積および体重の測定：腫瘍は、キャリパーを用いて１週間に２回測定した。腫瘍体積は、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２［式中、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および広径を表す］；腫瘍増殖異種移植片ＴＧＩ（％）＝［１−Ｔ／Ｃ］×１００に従って計算した。全ての担腫瘍マウスの体重を１週間に２回測定した。
【０１７９】
投与後２０日目に、ＩｇＧ１対照群の平均腫瘍体積は、１７３２．５９３ｍｍ３に達し、試験化合物２Ｇ３低用量投与群（０．３ｍｇ／ｋｇ）、中用量投与群（２Ｇ３、１ｍｇ／ｋｇ）および高用量投与群（２Ｇ、３ｍｇ／ｋｇ）の平均腫瘍体積は、それぞれ９３０．３７ｍｍ３、３０３．４９ｍｍ３および１５５．７９ｍｍ３に達した。中用量群と高用量群は、対照群と比較して腫瘍増殖を有意に阻害し（＊＊Ｐ＜０．０１）、予備的な用量依存関係が観察され、腫瘍増殖阻害率は、それぞれ最大４９％、８８％および９７．０％であった。３ｍｇ／ｋｇのＧＰＸ４群の平均腫瘍体積は、３６２．４７ｍｍ３であり、これは対照群とは著しく異なり、３ｍｇ／ｋｇのＧＰＸ４群もまた、顕著な腫瘍増殖阻害を示し（＊Ｐ＜０．０５）、最大８４％の腫瘍増殖阻害率であった。
【０１８０】
前記試験は、投与後２０日目に終了した。結果を表１５と図３Ａおよび図３Ｂに示す。全ての処置したマウスを安楽死させ、皮下異種移植片塊を担腫瘍マウスから取り出し、秤量した。対照群の腫瘍塊の平均重量は、１．５６８ｇであり、低用量群（０．３ｍｇ／ｋｇ）、中用量群（１ｍｇ／ｋｇ）、高用量群（３ｍｇ／ｋｇ）の試験化合物２Ｇ３については、平均腫瘍重量が、それぞれ、０．９２６ｇ、０．２５１ｇ、および０．１８１ｇであり、中用量群と高用量群は、対照群と比較して腫瘍増殖を顕著に抑制した（＊＊Ｐ＜０．０１）。一方で、ＧＰＸ４（３ｍｇ／ｋｇ）投与群では、平均腫瘍重量が０．３７２ｇであり、対照群とは大きく異なり、ＧＰＸ４（３ｍｇ／ｋｇ）投与群でもＭＣ３８腫瘍細胞の増殖について顕著な抑制効果が示された（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１８１】
試験中、全ての処置した担腫瘍マウスの重量に明らかな異常はなかった。同時に、薬物治療中に明らかな異常行動やその他の症状はなかった。
表１５.マウスにおけるインビボ抗腫瘍効果
【表１５】
2022502417.tif 000040
【図１】
2022502417.tif 000041
【図２】
2022502417.tif 000042
【図３】
2022502417.tif 000043
【配列表】
2022502417000001.app
【国際調査報告】
2022502417.tif 000044
2022502417.tif 000045
2022502417.tif 000046
2022502417.tif 000047
2022502417.tif 000048
2022502417.tif 000049
2022502417.tif 000050
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