(57)【要約】本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。代替の実施形態では、網膜変性の処置に使用されるものを含む、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するための、製造製品およびキットを含む組成物、ならびに定量的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含む（またはその使用を含む）方法が提供される。１つの実施形態では、細胞に基づく治療または処置は、網膜疾患または状態を処置するためのものであってもよい。
2022501056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、
第１の複数の細胞を、毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記馴化培地が、前記細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
少なくとも第２の複数の細胞を、前記毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記第１の複数の細胞の生存度を前記第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって前記細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記効力が、前記第１の複数の細胞の生存度の、前記第２の複数の細胞の生存度との比である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、
第１の複数の細胞を、毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記馴化培地が、前記細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
少なくとも第２の複数の細胞を、前記毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、
前記第１の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、前記倍数変化保護値が、前記第１の複数の細胞の生存度の、前記第１の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、
前記少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、前記倍数変化保護値が、前記少なくとも第２の複数の細胞の生存度の、前記少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、
前記細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、前記効力が、前記第１の複数の細胞の前記倍数変化保護値の、前記少なくとも第２の複数の細胞の前記倍数変化保護値に対する比である、ステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップ
をさらに含み、前記効力が前記所定のカットオフ値よりも大きい場合には、前記細胞に基づく治療または処置が、対象への投与に関して十分強力であると確認される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップと、
前記効力が前記所定のカットオフ値よりも大きい場合、前記細胞治療または処置の少なくとも１つの治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するステップと
をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記所定のカットオフ値が約２である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞に基づく治療または処置が、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞に基づく治療または処置が、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せから選択される細胞に由来するエクソソームを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞に基づく治療または処置が、ＲＰＣを含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、網膜芽細胞腫（ＲＢ）細胞、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、ミュラー細胞由来細胞、ＭＩＯ−Ｍ１細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、線維芽細胞、非眼細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、ＲＢ細胞を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、少なくとも約１，０００個のＲＢ細胞〜少なくとも約２５０，０００個のＲＢ細胞を、少なくとも約１０μｌ〜少なくとも約４０μｌの培地中に含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、少なくとも約２５，０００個のＲＢ細胞を、少なくとも約２５μｌの培地中に含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、それぞれ少なくとも約５０μｌ〜少なくとも約１００μｌの馴化培地および対照培地と共にインキュベートされる、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、それぞれ少なくとも約７５μｌの馴化培地および対照培地と共にインキュベートされる、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記毒性化合物がアポトーシスを誘導する、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記毒性化合物が酪酸ナトリウムである、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記酪酸ナトリウムが、約２ｍＭ〜約３２ｍＭの濃度で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酪酸ナトリウムが、約１６ｍＭの濃度で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、少なくとも約１時間〜少なくとも約７２時間の期間にわたりインキュベートされる、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞が、少なくとも約４６時間の期間にわたりインキュベートされる、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定することが、前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の代謝能を測定することを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記代謝能が、蛍光に基づくアッセイを使用して測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光に基づくアッセイが、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞を、レサズリン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン１０−オキシドナトリウム塩）と共に、少なくとも約１時間の間インキュベートすることと、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の前記蛍光を測定することと
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光に基づくアッセイが、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存度アッセイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも約２０μｌの、１：４希釈ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬が、前記第１の複数の細胞に、および前記少なくとも第２の複数の細胞に添加される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性が、発光に基づくアッセイを使用して測定される、請求項３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記発光に基づくアッセイが、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞を、発光性カスパーゼ−３／７基質と共に、少なくとも約１時間にわたりインキュベートすることと、
前記第１の複数の細胞および前記少なくとも第２の複数の細胞の前記発光を測定することと
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記発光性カスパーゼ−３／７基質が、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７により切断されるテトラペプチド配列ＤＥＶＤを含み、それによってルシフェラーゼ基質を生成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発光に基づくアッセイが、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイシステムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも約１２０μｌのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ試薬が、前記第１の複数の細胞に、および前記少なくとも第２の複数の細胞に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、前記倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、
前記不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、前記効力が、前記少なくとも第３の複数の細胞の前記倍数変化保護値の、前記少なくとも第２の複数の細胞の前記倍数変化保護値に対する比である、ステップと、
前記不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、前記不活性細胞に基づく治療の効力が前記所定のカットオフ値よりも低いまたはそれに等しい場合には、前記方法が妥当であると確認される、ステップと
をさらに含む、請求項３から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記第３の複数の細胞の生存度を、前記第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって、前記不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、
前記不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、前記不活性細胞に基づく治療の効力が前記所定のカットオフ値よりも低いまたはそれに等しい場合には、前記方法が妥当であると確認される、ステップと
をさらに含む、請求項１、２、および４から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記不活性細胞に基づく治療または処置が、皮膚Ｔリンパ球、ＨｕＴ７８細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、前記倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、
前記活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、前記効力が、前記少なくとも第３の複数の細胞の前記倍数変化保護値の、前記少なくとも第２の複数の細胞の前記倍数変化保護値に対する比である、ステップと、
前記活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、前記活性細胞に基づく治療の効力が前記所定のカットオフ値よりも大きい場合には、前記方法が妥当であると確認される、ステップと
をさらに含む、請求項３から３２および３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、前記活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、
前記少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、
前記第３の複数の細胞の生存度を、前記第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって、前記活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、
前記活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、前記活性細胞に基づく治療の効力が前記所定のカットオフ値よりも大きい場合には、前記方法が妥当であると確認される、ステップと
をさらに含む、請求項１、２、４から３１、および３３から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記活性細胞に基づく治療が、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、線維芽細胞、ＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対照培地が標準培地を含む、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞に基づく治療または処置が、網膜疾患または状態を処置するためのものである、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／７３７，３５９号の優先権および利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は一般に、細胞に基づくアッセイおよび治療に関する。代替の実施形態では、網膜変性の処置に使用されるものを含む、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するための、製造製品およびキットを含む組成物、ならびに定量的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含む（またはその使用を含む）方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
網膜変性は、網膜における光受容細胞の進行性および不可逆的減少および死によって引き起こされる悪化または変性を指す。光受容細胞の死は、失明をもたらし得る。幹細胞および他の多能性細胞は、網膜変性の患者を処置する際の使用が企図されており、胚性組織、成熟脳、遺伝子操作された皮膚線維芽細胞、およびさらに網膜も含むいくつかの供給源から単離することができる。しかしながら、これらの細胞に基づく治療および処置、より一般的にはがんおよび自己免疫状態を含む広く様々な疾患に向けられた細胞に基づく治療および処置を試験することは、ヒトまたはモデル生物でのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイに費用がかかり、時間もかかり、しばしば定量結果が不十分であるので、困難なままである。したがって、網膜変性の処置に使用されるものを含む、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するための、堅牢で費用効果のある時間効率の良い定量的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、当技術分野で必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、第１の複数の細胞を、毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、馴化培地が、細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞を、毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞の生存度を第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップとを含む、方法を提供する。効力は、第１の複数の細胞の生存度の、第２の複数の細胞の生存度との比であり得る。
【０００５】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、第１の複数の細胞を毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、馴化培地が、細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞を、毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、第１の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、第１の複数の細胞の生存度の、第１の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、少なくとも第２の複数の細胞の生存度の、少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、第１の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップとを含む、方法を提供する。
【０００６】
先行する方法は、細胞に基づく治療または処置の効力を所定のカットオフ値と比較するステップをさらに含み得、効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合には、細胞に基づく治療または処置が、対象への投与に十分強力であると確認される。
【０００７】
先行する方法は、細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップと、効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合、細胞治療または処置の少なくとも１つの治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するステップとをさらに含み得る。
【０００８】
所定カットオフ値は、約２であり得る。
【０００９】
細胞に基づく治療または処置は、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。細胞に基づく治療または処置は、ＲＰＣを含む。
【００１０】
第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、網膜芽細胞腫（ＲＢ）細胞、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、ミュラー細胞由来細胞、ＭＩＯ−Ｍ１細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、線維芽細胞、非眼細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、ＲＢ細胞を含み得る。第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、少なくとも約１，０００個のＲＢ細胞〜少なくとも約２５０，０００個のＲＢ細胞を、少なくとも約１０μｌ〜少なくとも約４０μｌの培地中に含み得る。第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、少なくとも約２５，０００個のＲＢ細胞を、少なくとも約２５μｌの培地中に含み得る。
【００１１】
第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、それぞれ少なくとも約５０μｌ〜少なくとも約１００μｌの馴化培地および対照培地と共にインキュベートすることができる。第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、それぞれ少なくとも約７５μｌの馴化培地および対照培地と共にインキュベートすることができる。
【００１２】
毒性化合物は、アポトーシスを誘導することができる。毒性化合物は、酪酸ナトリウムであり得る。酪酸ナトリウムは、約２ｍＭ〜約３２ｍＭの濃度で存在し得る。酪酸ナトリウムは、約１６ｍＭの濃度で存在し得る。
【００１３】
第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、少なくとも約１時間〜少なくとも約７２時間の期間にわたりインキュベートすることができる。第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞は、少なくとも約４６時間の期間にわたりインキュベートすることができる。
【００１４】
第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定することは、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の代謝能を測定することを含み得る。代謝能は、蛍光に基づくアッセイを使用して測定することができる。
【００１５】
蛍光に基づくアッセイは、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞を、レサズリン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン１０−オキシドナトリウム塩）と共に、少なくとも約１時間の間インキュベートすることと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の蛍光を測定することとを含み得る。蛍光に基づくアッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存度アッセイであり得る。少なくとも約２０μｌの、１：４希釈ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞に添加することができる。
【００１６】
第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性は、発光に基づくアッセイを使用して測定することができる。発光に基づくアッセイは、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞を、発光性カスパーゼ−３／７（luminogenic  caspase−3/7）基質と共に、少なくとも約１時間にわたりインキュベートすることと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の発光を測定することとを含み得る。発光性カスパーゼ−３／７基質は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７により切断されるテトラペプチド配列ＤＥＶＤを含み得、それによってルシフェラーゼ基質を生成する。発光に基づくアッセイは、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイシステムであり得る。少なくとも約１２０μｌのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ試薬は、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞に添加することができる。
【００１７】
先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、不活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも低いまたはそれに等しい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。
【００１８】
先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第３の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、不活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも低いまたはそれに等しい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。
【００１９】
不活性細胞に基づく治療または処置は、皮膚Ｔリンパ球、ＨｕＴ７８細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００２０】
先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。
【００２１】
先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第３の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって、活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。
【００２２】
活性細胞に基づく治療は、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、線維芽細胞、ＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００２３】
対照培地は、標準培地を含み得る。細胞に基づく治療または処置は、網膜疾患または状態を処置するためのものである。
【００２４】
細胞に基づく治療または処置の効力または有効性を測定するための方法であって、１）第１の複数の細胞を、候補化合物および細胞に基づく治療または処置と共にインキュベートするステップと、２）第２の複数の細胞を、候補化合物と共にインキュベートするステップと、３）第１の複数の細胞の生存度および／または代謝活性を決定するステップと、４）第２の複数の細胞の生存度および／または代謝活性を決定するステップと、５）第１の複数の細胞の生存度および／または代謝活性を、第２の複数の細胞の生存度および／または代謝活性と比較し、それによって処置の効力を決定するステップとを含む方法が提供される。一部の態様では、第１の複数の細胞は、第２の複数の細胞と実質的に同じである。
【００２５】
第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、同じ細胞型を含み得る。非限定的な例として、細胞型は、ヒト網膜芽細胞腫細胞であり得る。
【００２６】
第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、それぞれ、約１，０００個〜約２５０，０００個の間の細胞（例えば、約１，０００；２５，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；１２５，０００；１５０，０００；１７５，０００；２００，０００；２２５，０００；または２５０，０００個）を含み得る。一部の非限定的な例では、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、それぞれ、約２５，０００個の細胞を含み得る。
【００２７】
細胞に基づく治療または処置は、馴化培地を含み得る。馴化培地は、第３の複数の細胞を培養するのに使用される培地を収集することによって、生成することができる。第３の複数の細胞は、哺乳動物網膜前駆細胞を含み得る。哺乳動物網膜前駆細胞は、ヒト網膜前駆細胞であり得る。第３の複数の細胞は、０．１×１０６〜１×１０７個の間のヒト網膜前駆細胞（例えば、０．１×１０６、０．２×１０６、０．３×１０６、０．４×１０６、０．５×１０６、０．６×１０６、０．７×１０６、０．８×１０６、０．９×１０６、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、または１×１０７個の細胞）を含み得る。一部の非限定的な例では、第３の複数の細胞は、約９×１０６個のヒト網膜前駆細胞を含み得る。
【００２８】
他の実施形態では、第３の複数の細胞は、ヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ）を含む（例えば、図８参照）。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「候補化合物」という用語は、毒性化合物、または半毒性化合などを指すことができる。非限定的な例として、毒性化合物は、アポトーシスを誘導することができる。毒性化合物は、酪酸ナトリウムであり得る。酪酸ナトリウムは、約０ｍＭ〜約２６ｍＭの量（例えば、約０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ｍＭ）で存在し得る。一部の非限定的な例では、酪酸ナトリウムは、約８ｍＭの量で存在し得る。
【００３０】
第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、少なくとも１時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、またはそれよりも長い時間の期間、インキュベートすることができる。第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、約２時間、インキュベートすることができる。
【００３１】
第１の複数のおよび第２の複数の細胞の生存度を決定することは、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞の代謝能を測定することを含み得る。第１の複数の細胞および第２の複数の細胞の代謝能は、蛍光に基づくアッセイを使用して測定することができる。
【００３２】
蛍光に基づくアッセイは、１）第１の複数の細胞および第２の複数の細胞を、レサズリン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン１０−オキシドナトリウム塩）と共に、少なくとも１時間の間インキュベートすることと、２）第１の複数の細胞および第２の複数の細胞の蛍光を測定することと、３）測定された蛍光を比較し、それによって第１の複数の細胞および第２の複数の細胞の生存度を決定することとを含み得る。
【００３３】
上記態様のいずれかは、任意の他の態様と組み合わせることができる。
【００３４】
本発明の１つまたは複数の例示的な実施形態の詳細を、添付図面および以下の記述で述べる。本発明の他の特色、目的、および利点は、記述および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００３５】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、参照により全ての目的で本明細書に明示的に組み込まれる。
【００３６】
上記およびさらなる特色は、添付図面と併用すると以下の詳細な記述から、より明らかに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本開示の方法で使用される、蛍光に基づく細胞生存度アッセイの結果を示す、一連のチャートを示す。
【００３８】
【図２】図２は、本開示の方法を使用して測定された、酪酸ナトリウムの様々な濃度でのヒト網膜前駆細胞馴化培地（ｈＲＰＣ  ＣＭ）の効力を示す一連の棒グラフを、図式的に示す。各群の青または第１の棒は、標準培地（ＳＭ）でインキュベートした細胞に該当し、各群の橙または第２の棒は、ｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。
【００３９】
【図３】図３は、本開示の方法を使用して測定された、酪酸ナトリウムの様々な濃度でのｈＲＰＣ  ＣＭの効力を示す一連の棒グラフを、図式的に示す。各群の青または第１の棒は、ＳＭでインキュベートした細胞に該当し、各群の橙または第２の棒は、ｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。
【００４０】
【図４】図４は、本開示の方法を使用して測定された、様々な希釈度のｈＲＰＣ  ＣＭの効力を示す棒グラフを、図式的に示す。各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭでインキュベートした細胞に該当する。各群のグレーまたは第２の棒は、希釈されていないｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。各群の黄色または第３の棒は、２倍に希釈されたｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。各群の暗青色または第４の棒は、４倍に希釈されたｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。各群の緑または第５の棒は、８倍に希釈されたｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。
【００４１】
【図５】図５は、本開示の方法を使用して測定された、種々の量のヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）を使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭの効力を示す棒グラフを、図式的に示す。各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭでインキュベートした細胞に該当する。各群の橙または第２の棒は、９．０×１０６ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。各群のグレーまたは第３の棒は、６．０×１０６ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当する。
【００４２】
【図６】図６は、本開示の方法を使用して測定された、ｈＲＰＣの種々の集団から生成したｈＲＰＣ  ＣＭの効力を示す一連の棒グラフを、図式的に示す。左のパネルでは、各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭと共にインキュベートした細胞に該当し；橙または第２の棒は、ロットＧ１からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞であり；グレーまたは第３の棒は、ロットＧ２からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の黄色または第４の棒は、ロットＧ３からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の暗青色または第５の棒は、ロットＧ５からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当する。右のパネルでは、各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭと共にインキュベートした細胞に該当し；橙または第２の棒は、ロットＧ１からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞であり；グレーまたは第３の棒は、ロットＧ２からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の黄色または第４の棒は、ロットＧ３からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の暗青色または第５の棒は、ロットＧ５からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当する。
【００４３】
【図７】図７は、本開示の方法を使用して測定された、ｈＲＰＣの種々の集団から生成したｈＲＰＣ  ＣＭの効力を示す棒グラフを、図式的に示す。各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭと共にインキュベートした細胞に該当し；橙または第２の棒は、ロットＧ１からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞であり；グレーまたは第３の棒は、ロットＧ２からのｈＲＰＣから生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の黄色または第４の棒は、ロットＧ３からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の暗青色または第５の棒は、ロットＧ４からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の緑または第６の棒は、ロットＧ５からのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群の薄青色または第７の棒は、ロットＬ−ＳＢからのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当し；各群のピンクまたは第８の棒は、ロットＬ−ＰＢからのｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞に該当する。
【００４４】
【図８】図８は、本開示の方法を使用して測定された、様々な細胞型を使用して生成した馴化培地の効力を示す一連の棒グラフを、図式的に示す。左のパネルでは、各群の青または第１の棒は、ＳＭでインキュベートした細胞に該当し；各群の橙または第２の棒は、ｈＲＰＣ  ＣＭでインキュベートした細胞に該当し；各群の黄色または第３の棒は、ヒト網膜芽細胞腫細胞を使用して生成した馴化培地でインキュベートした細胞に該当する。右のパネルでは、各群のシアンまたは第１の棒は、ＳＭでインキュベートした細胞に該当し、各群の緑または第２の棒は、ヒト網膜色素上皮細胞を使用して生成した馴化培地でインキュベートした細胞に該当する。
【００４５】
【図９】図９は、ｈＲＰＣに関する候補神経栄養因子として選択される、選択されたサイトカインに関する遺伝子発現データを示す。データは、（左から右へ）ｈＲＰＣ、ｈＲＢ、ｈＲＰＥ、およびｈＦＢを含む多数の細胞型から、ｑＰＣＲを介して得た。網膜細胞型は、線維芽細胞とは別にグループ分けされる。ｈＲＢ系は腫瘍に由来し、他の全ての細胞型は、胎児組織に由来するものであった。推定栄養因子ＯＰＮの発現は、ｈＲＰＣに関して最も高くなることがわかる。
【００４６】
【図１０】図１０は、本開示の多重化効力アッセイからの結果を示す一連のグラフを、図式的に示す。左上のパネルは、測定された細胞生存度を示す。右上のパネルは、測定されたアポトーシス活性を示す。下のパネルは、上の２つのパネルで示したデータを使用して計算された効力値を示す。
【００４７】
【図１１】図１１は、濾過されていないおよび濾過された馴化培地を試験する、本開示の多重化効力アッセイの結果を図式的に示す。
【００４８】
【図１２】図１２は、陰性対照馴化培地および陽性対照馴化培地を試験する、本開示の多重化効力アッセイの結果を図式的に示す。
【００４９】
【図１３】図１３は、様々なロットのｈＲＰＣに由来する馴化培地を試験する、本開示の多重化効力アッセイの結果を、図式的に示す。
【００５０】
【図１４】図１４は、種々の播種密度を有するｈＲＰＣ培養物に由来する馴化培地を試験する、本開示の多重化効力アッセイの結果を図式的に示す。
【００５１】
【図１５】図１５は、多重化効力アッセイが線形性の応答を示す、様々な希釈度の馴化培地を試験する本開示の多重化効力アッセイの結果を、図式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
遺伝性網膜疾患（ジストロフィー）の最も一般的なタイプは網膜色素変性（ＲＰ）であり、最も一般的な変性疾患は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。潜在的な治療には、ＲＰの処置におけるヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）の使用、およびＡＭＤの処置における幹細胞由来ヒト色素上皮（ＲＰＥ）細胞生成物の使用が含まれる。ＲＰの処置におけるｈＲＰＣの試験は、処置が、複数のサイトカインのカクテルからもたらされる可能性がある神経栄養効果に依拠することを示していた。これらのサイトカインの役割は、現在のところ部分的にしか描かれていない。製造されたｈＲＰＣ細胞生成物の効力はバッチごとに様々であることが予想され得るので、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験および関連する基盤および人員要件を必要とすることなく、患者で使用する前に所与のロットの製造された細胞生成物の栄養有効性を前向きに測定することが可能な、単純で便利なｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイを有することが助けになり得る。
【００５３】
ｈＲＰＣ処置効力を評価する現行の方法は、常染色体劣性ＲＰの十分特徴付けられたモデルである、英国王立外科医師会（ＲＣＳ）ラットでのｉｎ  ｖｉｖｏ試験である。これらの試験を行うには、その全てにこれらの領域の特殊専門技術を有する関連ある人員を配置しなければならない手術室、電気生理学室、および眼組織学研究室と共に、ＲＣＳコロニーを有する動物施設が必要とされる。したがって現行のｉｎ  ｖｉｖｏ試験法は煩雑であり、熟練技術を要し、多くの労力を要し、非常に時間を要し、かつ多くの資源を要する。
【００５４】
ｈＲＰＣ処置の神経栄養効果により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムで再現するのを困難になっている。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された処置の栄養効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持しようと試みる細胞である、光受容体のレベルで生じるようである。一態様では、本開示の方法は、動物での試験を必要とすることなく、ヒトでの使用の前に、製造された細胞生成物の効力を測定する手段を提供する。本開示の方法は、細胞培養設備、適度で様々な機器、加えて１日の過程にわたり１名の熟練技術者の労力の使用のみが必要であり得る。容易に入手可能な不死細胞系またはヒト腫瘍細胞系、およびいくつかの他の容易に入手可能な試薬も必要とされる。試験物は、特定の治療細胞型の生きている培養物から以前に採取した細胞培養培地の小試料である。試験設備は、繊細な細胞型の処理を取り扱う必要がないことに、留意されたい。したがって本開示の方法は、既存のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイと比較して、費用が安く、最小限の労力を必要とし、時間的に有効である。本開示の方法は、以前は専門チームを必要とした何カ月にもわたるｉｎ  ｖｉｖｏプロセスであったものを、１日の１名の技術者によるｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスに低減する。
【００５５】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定する方法を提供する。方法は、細胞に基づく治療または処置がどの程度強力に細胞の集団の生存度を増加させるのかを決定するのに使用することができる、定量的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイを提供する。したがってアッセイは、細胞に基づく治療または処置の、栄養効果の効力を定量する方法を提供する。一態様では、本開示の方法は、毒性化合物を使用して、細胞の集団に代謝傷害をもたらして、細胞に基づく治療または処置の栄養効果の効力をより良く検出する。１つの非限定的な例では、本開示の方法は、特に宿主錐体を含む宿主網膜に対する、ドナー胎児網膜細胞（網膜前駆細胞）の栄養効果の効力を試験するのに使用することができる。ドナー胎児網膜細胞は、改善された視覚機能により決定されるように、神経保護的であるだけでなく、残留宿主網膜細胞に対して急速な再活性化効果も有する、栄養効果を有することが示されている。ドナー細胞は、網膜に統合することが可能であり、細胞分化を介して光受容体の代わりになる（限られた数であり得る）。全体的な効果は、網膜における臨床的に有意な程度の視覚機能を急速にかつ持続的に回復し保存することであり、そうでなければ完全に視覚機能不全となり患者を完全に失明させる。
【００５６】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、第１の複数の細胞を、毒性化合物および細胞に基づく治療または処置と共にインキュベートするステップと、第２の複数の細胞を、毒性化合物と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって処置の効力を決定するステップとを含む方法を提供する。
【００５７】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、第１の複数の細胞を、毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、馴化培地が、細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞を、毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップとを含む方法も提供する。
【００５８】
先行する方法の一部の態様では、効力は、第１の複数の細胞の生存度の、第２の複数の細胞の生存度との比である。
【００５９】
一部の態様では、先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第３の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、不活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも低いまたはそれと等しい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。理論に拘泥するものではないが、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む不活性馴化培地は、不活性であることが公知であり、第３の複数の細胞を毒性化合物（例えば、酪酸ナトリウム）の有害作用から保護せず、したがってある特定の所定の値よりも高い効力値を有するべきではない馴化培地である。したがって、不活性馴化培地は陰性対照として働き、特定のアッセイの結果が、不活性馴化培地が低い効力を有するかまたは全く有さないことを示す場合、アッセイの結果はより正確であるとみなすことができる。しかしながら、特定のアッセイの結果が、不活性馴化培地が効力を有することを示す場合には、アッセイの結果は損なわれ、試験される細胞に基づく処置または治療の実際の効力を反映していない場合がある。不活性細胞に基づく治療または処置は、皮膚Ｔリンパ球、ＨｕＴ７８細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００６０】
一部の態様では、先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第３の複数の細胞の生存度を、第２の複数の細胞の生存度と比較し、それによって、活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、活性細胞に基づく治療の効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。理論に拘泥するものではないが、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む活性馴化培地は、活性であることが公知であり、第３の複数の細胞を毒性化合物（例えば、酪酸ナトリウム）の有害作用から保護し、したがってある特定の所定の値よりも高い効力値を有するべきである馴化培地である。したがって、活性馴化培地は陽性対照として働き、特定のアッセイの結果が、活性馴化培地の効力が低いか全くないことを示す場合には、アッセイの結果は損なわれ、試験される細胞に基づく処置または治療の実際の効力を反映しない場合がある。しかしながら、特定のアッセイの結果が、活性馴化培地が効力を有することを示す場合には、結果は正確であるとみなすことができる。活性細胞に基づく治療または処置は、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、線維芽細胞、ＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００６１】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、第１の複数の細胞を、毒性化合物および細胞に基づく治療または処置と共にインキュベートするステップと、少なくとも第２の複数の細胞を、毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、第１の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、第１の複数の細胞の生存度の、第１の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、少なくとも第２の複数の細胞の生存度の、少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、第１の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップとを含む方法も提供する。本明細書で使用される場合、この方法は「多重化効力アッセイ」と呼ばれる。
【００６２】
本開示は、細胞に基づく治療または処置の効力を測定するための方法であって、第１の複数の細胞を、毒性化合物および馴化培地と共にインキュベートするステップであって、馴化培地が、細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞を、毒性化合物および対照培地と共にインキュベートするステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞の生存度を決定するステップと、第１の複数の細胞および少なくとも第２の複数の細胞のアポトーシス活性を決定するステップと、第１の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、第１の複数の細胞の生存度の、第１の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、少なくとも第２の複数の細胞の生存度の、少なくとも第２の複数の細胞におけるアポトーシス活性に対する比である、ステップと、細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、第１の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップとを含む方法も提供する。本明細書で使用される場合、この方法は、「多重化効力アッセイ」とも呼ばれる。
【００６３】
先行する方法は、細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合には、細胞に基づく治療または処置が、対象への投与に関して十分強力であると確認される、ステップをさらに含み得る。
【００６４】
先行する方法は、細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップと、効力が所定のカットオフ値よりも大きい場合、細胞治療または処置の少なくとも１つの治療有効用量を、それを必要とする対象に投与するステップとをさらに含み得る。
【００６５】
先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および不活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、不活性馴化培地が、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞におけるアポトーシス活性を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップと、不活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、不活性細胞に基づく治療の効力が、所定のカットオフ値よりも低いまたはそれと等しい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとをさらに含み得る。理論に拘泥するものではないが、不活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む不活性馴化培地は、不活性であることが公知であり、第３の複数の細胞を毒性化合物（例えば、酪酸ナトリウム）の有害作用から保護せず、したがってある特定の所定の値よりも高い効力値を有するべきではない馴化培地である。したがって、不活性馴化培地は陰性対照として働き、特定のアッセイの結果が、不活性馴化培地の効力が低いか全くないことを示す場合、アッセイの結果は、より正確であるとみなすことができる。しかしながら、特定のアッセイの結果が、不活性馴化培地が効力を有することを示す場合には、アッセイの結果は損なわれ、試験される細胞に基づく処置または治療の実際の効力を反映しない場合がある。不活性細胞に基づく治療または処置は、皮膚Ｔリンパ球、ＨｕＴ７８細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００６６】
一部の態様では、先行する方法は、少なくとも第３の複数の細胞を、毒性化合物および活性馴化培地と共にインキュベートするステップであって、活性馴化培地が、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む、ステップと、少なくとも第３の複数の細胞の生存度を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞のアポトーシス活性を決定するステップと、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値を決定するステップであって、倍数変化保護値が、生存度の、アポトーシス活性に対する比である、ステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を決定するステップであって、効力が、少なくとも第３の複数の細胞の倍数変化保護値の、少なくとも第２の複数の細胞の倍数変化保護値に対する比である、ステップと、活性細胞に基づく治療または処置の効力を、所定のカットオフ値と比較するステップであって、活性細胞に基づく治療の効力が、所定のカットオフ値よりも大きい場合には、方法が妥当であると確認される、ステップとを含み得る。理論に拘泥するものではないが、活性細胞に基づく治療または処置を培養するのに使用される培地を含む活性馴化培地は、活性であることが公知であり、第３の複数の細胞を毒性化合物（例えば、酪酸ナトリウム）の有害作用から保護し、したがってある特定の所定の値よりも高い効力値を有するべきである馴化培地である。したがって、活性馴化培地は陽性対照として働き、特定のアッセイの結果が、活性馴化培地の効力が低いか全くないことを示す場合には、アッセイの結果は、損なわれ、試験される細胞に基づく処置または治療の実際の効力を反映しない場合がある。しかしながら、特定のアッセイの結果が、活性馴化培地が効力を有することを示す場合には、結果は正確であるとみなすことができる。活性細胞に基づく治療または処置は、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、線維芽細胞、ＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００６７】
一部の態様では、所定のカットオフ値は、約０．５、または約１．０、または約１．５、または約２．０、または約３．０、または約３．５、または約４．０、または約４．５、または約５．０、または約５．５、または約６．０、または約６．５、または約７．０、または約７．５、または約８．０、または約８．５、または約９．０、または約９．５、または約１０、または約１５、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００であり得る。
【００６８】
本開示の方法の一部の態様では、細胞に基づく治療または処置は、馴化培地を含む。「馴化培地」は、標準培地、基本培地、または基礎培地と比較して変更した培地を指す。培地の馴化は、栄養素および／または成長因子などの分子を、基本培地に見出される当初のレベルに追加しまたは当初のレベルから枯渇させ得る。一部の態様では、培地は、ある特定の型の細胞を、ある特定の条件下の培地中である特定の期間にわたり成長させるまたは維持することによって、馴化される。本開示の一部の態様では、馴化培地は、第３の複数の細胞を培養するのに使用される培地を収集することによって生成される。非限定的な例では、第３の複数の細胞は、哺乳動物網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）、哺乳動物網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せを含み得る。哺乳動物網膜前駆細胞は、ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）であり得る。第３の複数の細胞は、ｈＲＰＣを含み得る。一部の態様では、培地は、網膜前駆細胞を、定められた組成の培地中で、定められた温度で定められた時間数にわたり増やす、分化させる、または維持させることによって馴化することができる。当業者に理解されるように、細胞、培地のタイプ、持続時間、および環境条件の数多くの組合せを使用して、ほぼ無限で様々な馴化培地を生成することができる。
【００６９】
本明細書で提供される方法の一部の態様では、馴化培地は、１×１０６〜１×１０７個の間のヒト網膜前駆細胞を含む第３の複数の細胞を培養する、増やす、分化させる、または維持するのに使用される培地を収集することによって、生成することができる。他の態様では、第３の複数の細胞は、約９×１０６個のヒト網膜前駆細胞を含み得る。一部の態様では、第３の複数の細胞は、約８×１０６個のヒト網膜前駆細胞を含み得る。一部の態様では、第３の複数の細胞は、約６×１０６個のヒト網膜前駆細胞を含み得る。一部の態様では、第３の複数の細胞は、約４×１０６個のヒト網膜前駆細胞を含み得る。ヒト網膜前駆細胞から馴化培地を培養および生成する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１５８９１０に記載されている。一部の態様では、馴化培地は、少なくとも約１×１０６個の細胞、または少なくとも約２×１０６個の細胞、または少なくとも約３×１０６個の細胞、または少なくとも約４×１０６個の細胞、または少なくとも約５×１０６個の細胞、または少なくとも約６×１０６個の細胞、または少なくとも約７×１０６個の細胞、または少なくとも約８×１０６個の細胞、または少なくとも約９×１０６個の細胞、または少なくとも約１０×１０６個の細胞の密度で播種された第３の複数の細胞を培養する、増やす、分化させる、または維持するのに使用される培地を収集することによって生成することができる。一部の態様では、馴化培地は、播種後、少なくとも約４時間、または少なくとも約８時間、または少なくとも約１２時間、または少なくとも約１６時間、または少なくとも約２０時間、または少なくとも約２４時間、または少なくとも約３６時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約６０時間、または少なくとも約７２時間培養された第３の複数の細胞を培養する、増やす、分化させる、または維持するのに使用される培地を収集することによって生成することができる。
【００７０】
本開示の方法の一部の態様では、馴化培地は、本開示のアッセイで使用する前に濾過することができる。一部の態様では、馴化培地は、濃縮器またはフィルターデバイスを遠心分離と組み合わせて使用して、濾過することができる。一部の態様では、馴化培地は、ＭＷＣＯが少なくとも約３ｋＤａ、または少なくとも約１０ｋＤａ、または少なくとも約３０ｋＤａ、または少なくとも約５０ｋＤａ、または少なくとも約１００ｋＤａのフィルターに通して濾過することができる。一部の態様では、馴化培地を濾過した後、「保持液」または「上層」画分を、本開示の方法での使用のために単離することができる。一部の態様では、馴化培地を濾過した後、「濾液」または「下層」画分のいずれかを、本開示の方法での使用のために単離することができる。
【００７１】
本明細書で提供される方法の一部の態様では、細胞に基づく治療または処置は、哺乳動物網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）、哺乳動物網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せを含む。哺乳動物網膜前駆細胞は、ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）であり得る。細胞に基づく治療または処置は、ｈＲＰＣを含み得る。細胞は、遺伝子改変された細胞であってもよい。非限定的な例では、遺伝子改変された細胞には、少なくとも１種のポリペプチドを発現するように、遺伝子をトランスフェクトしておくことができる。非限定的な例では、遺伝子改変された細胞は、少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のウイルス粒子に細胞を接触させることにより、感染させておくことができる。
【００７２】
本明細書で提供される方法の一部の態様では、細胞に基づく治療または処置または馴化培地は、エクソソームおよび／または微小小胞を含み得る。細胞に基づく治療または処置または馴化培地は、エクソソームおよび／または微小小胞に富む画分を含み得る。エクソソームおよび／または微小小胞は、哺乳動物網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）、哺乳動物網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、神経幹／前駆細胞、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、幹／前駆細胞、白血球、線維芽細胞、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない任意の細胞型に由来し得る。細胞は、遺伝子改変された細胞であってもよい。非限定的な例では、遺伝子改変された細胞は、１種のポリペプチドを発現するように、少なくとも１つの遺伝子でトランスフェクトしておくことができる。非限定的な例では、遺伝子改変された細胞は、少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のウイルス粒子と細胞を接触させることにより感染させておくことができる。エクソソームおよび／もしくは微小小胞、またはエクソソームおよび／もしくは微小小胞に富む画分は、遠心分離、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトフラフィー、または当技術分野で標準的な任意の他の技法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で標準的なエクソソーム／微小小胞技法を使用して精製することができる。
【００７３】
本開示の方法の一部の態様では、対照培地は標準培地を含む。
【００７４】
本開示の方法の一部の態様では、細胞に基づく治療または処置は、それを必要とする対象の網膜疾患または状態を処置するためのものであり得る。網膜疾患または状態は、アッシャー病、網膜色素変性（ＲＰ）、変性網膜疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤもしくは萎縮型ＡＭＤ、地図状萎縮、網膜光受容体疾患、糖尿病性網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、ぶどう膜炎、網膜剥離、網膜損傷、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、外傷性もしくは医原性網膜損傷、神経節細胞もしくは視神経細胞疾患、緑内障もしくは視神経症、虚血性網膜疾患、例えば未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、もしくは虚血性視神経症；または明順応（昼間）視力の改善；または矯正視力の改善、または黄斑機能の改善、または視野の改善、または暗順応（夜間）視力の改善を含み得るがこれらに限定されない。
【００７５】
先行する方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、同じ細胞型を含み得るか、または異なる細胞型であり得る。第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、種々の細胞型の混合集団を含み得る。細胞型は、生体試料から単離された任意の初代細胞および／または不死ではない細胞型の細胞（即ち、多能性／幹細胞集団からの分化した細胞）であり得る。細胞型は、自発的に不死化された細胞を含むがこれらに限定されない任意の不死化細胞系であり得る。細胞型は、哺乳動物網膜芽細胞腫細胞（ＲＢ）、哺乳動物網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、哺乳動物網膜前駆細胞（ＲＰＣ）、ＡＲＰＥ−１９細胞、ミュラー細胞由来細胞、ＭＩＯ−Ｍ１細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、線維芽細胞、非眼細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。細胞型は、ヒト網膜芽細胞腫細胞（ｈＲＢ）、ヒト網膜色素上皮細胞、またはヒト網膜前駆細胞であり得る。第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、細胞培養中に懸濁液中で成長させることができる。第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、接着細胞培養法を使用して成長させることができる。
【００７６】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞はそれぞれ、約１，０００〜約２５０，０００個の間の細胞を含み得る。非限定的な例として、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞はそれぞれ、約２５，０００個の細胞を含み得る。本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せにおける細胞の数は、アッセイで使用されているマイクロタイタープレートのサイズに従い規模を定めることができる。非限定的な例では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、本開示の方法が９６ウェルプレートで行われる場合、少なくとも約２５，０００個の細胞を含み得る。６ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約４００，０００個の細胞を含み得る。１２ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約２００，０００個の細胞を含み得る。２４ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約１００，０００個の細胞を含み得る。４８ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約５０，０００個の細胞を含み得る。３８４ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約６，２５０個の細胞を含み得る。１５３６ウェルプレートが使用される場合、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約１，５６２個の細胞を含み得る。
【００７７】
本開示の方法の一部の態様では、毒性化合物ならびに馴化および／または標準培地の添加前に、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せを、少なくとも約２５μｌの標準培地中に懸濁することができる。使用することができる標準培地の量は、アッセイに使用されているマイクロタイタープレートのサイズに基づき調整することができる。非限定的な例では、６ウェルプレートが使用される場合、約４００μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、１２ウェルプレートが使用される場合、約２００μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、２４ウェルプレートが使用される場合、約１００μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、４８ウェルプレートが使用される場合、約５０μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、９６ウェルプレートが使用される場合、約２５μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、３８４ウェルプレートが使用される場合、約６．２５μｌの標準培地を使用することができる。非限定的な例では、１５３６ウェルプレートが使用される場合、約１．５６μｌの標準培地を使用することができる。
【００７８】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約５０μｌ〜少なくとも約１００μｌの馴化培地または対照培地と共にインキュベートすることができる。一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約７５μｌの馴化培地または対照培地と共にインキュベートすることができる。馴化培地または対照培地の量は、アッセイに使用されているマイクロタイタープレートのサイズに基づき調整することができる。非限定的な例では、６ウェルプレートが使用される場合、約１２００μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、１２ウェルプレートが使用される場合、約６００μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、２４ウェルプレートが使用される場合、約３００μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、４８ウェルプレートが使用される場合、約１５０μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、９６ウェルプレートが使用される場合、約７５μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、３８４ウェルプレートが使用される場合、約１８．７５μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。非限定的な例では、１５３６ウェルプレートが使用される場合、約４．６８μｌの馴化培地または対照培地を使用することができる。
【００７９】
本明細書で提供される方法の一部の態様では、毒性化合物はアポトーシスを誘導することができる。一部の態様では、毒性化合物は、アポトーシス、オートファジー、Ｉ型細胞死、ＩＩ型細胞死、壊死、ネクロプトーシス、マクロオートファジー、アノイキス、角質化、興奮毒性、フェロトーシス、活性化誘導細胞死、虚血性細胞死、オンコーシス、ピロトーシス、またそれらの任意の組合せを誘導することができる。
【００８０】
毒性化合物は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、化学療法剤、アルカロイド、タキサン、抗微小管剤、毒素、膜透過剤、酵素阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、ＤＮＡ−修復酵素阻害剤、ＤＮＡ−損傷剤、ＵＶ放射線、ガンマ放射線、ブスルファン、サイトシン、エトポシド、ブレオマイシン、ｌ−アスパラギナーゼ、カルムスチン、アラビノシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ヒドロキシ尿素、クロラムブシル、フロクスウリジン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、プロカルバジン、シスプラチン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メルカプトプリン、ビンデシン、マイトマイシン−ｃ、イフォスファミド、メトトレキセート、タキソイド、ミトキサントロン、メルファラン、ゲムシタビン、プリカマイシン、ペメトレキセド  アントラサイクリン（pemetrexed  anthracyclines）、および／またはエポチロンを含み得るがそれらに限定されない。
【００８１】
本開示の方法の一部の態様では、毒性化合物は酪酸ナトリウムである。酪酸ナトリウムは、約１ｍＭ〜約２６ｍＭの間の濃度で存在し得る。酪酸ナトリウムは、約２ｍＭ〜約２４ｍＭの間の濃度で存在し得る。酪酸ナトリウムは、約０ｍＭ〜約３２ｍＭの間の濃度で存在し得る。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約０ｍＭの濃度で存在し、即ち酪酸ナトリウムは添加されない。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約２ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約４ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約６ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約８ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約１０ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約１２ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約１４ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは約１６ｍＭの濃度で存在する。本開示の方法の一部の態様では、酪酸ナトリウムは、約１８ｍＭ、または約２０ｍＭ、または約２２ｍＭ、または約２４ｍＭ、または約２６ｍＭ、または約２８ｍＭ、または約３０ｍＭ、または約３２ｍＭ、または約３４ｍＭ、または約３６ｍＭ、または約３８ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度で存在する。
【００８２】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、または少なくとも４６時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、またはそれよりも長い期間、細胞の生存度を決定する前にインキュベートされる。一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、約１時間、または約２時間、または約７２時間、またはそれよりも長くインキュベートされる。一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、細胞の生存度を決定する前に、少なくとも４６時間インキュベートされる。
【００８３】
本明細書で提供される方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの生存度を決定することは、当技術分野で公知の任意の細胞生存度アッセイを使用することを含み得る。これらには、ＡＴＰ試験アッセイ、カルセインＡＭアッセイ、クローン原性アッセイ、エチジウムホモダイマーアッセイ、エバンスブルーアッセイ、フルオレセインジアセテート加水分解／ヨウ化プロピジウム染色アッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、ホルマザンに基づくアッセイ、ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、緑色蛍光タンパク質アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、メチルバイオレットアッセイ、ヨウ化プロピジウムアッセイ、レサズリンアッセイ、トリパンブルーアッセイ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、またはそれらの組合せが含まれるがそれらに限定されない。
【００８４】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの生存度を決定することは、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの増殖を決定することを含み得る。本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの生存度を決定することは、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの代謝能を測定することを含む。
【００８５】
第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの代謝能は、蛍光に基づくアッセイを使用して測定することができる。蛍光に基づくアッセイは、１）第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せを、レサズリン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン１０−オキシドナトリウム塩）と共に、少なくとも１時間の間インキュベートすること、２）第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの蛍光を測定することを含み得る。蛍光に基づくアッセイは、３）測定された蛍光を比較し、それによって第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの生存度を決定することをさらに含み得る。一部の態様では、細胞は、レサズリンと共に少なくとも約１時間、または少なくとも約１．５時間、または少なくとも約２．０時間、または少なくとも約２．５時間、または少なくとも約３．０時間、または少なくとも約３．５時間、または少なくとも約４．０時間、または少なくとも約４．５時間、または少なくとも約５．０時間、または少なくとも約５．５時間、または少なくとも約６．０時間、または少なくとも約６．５時間、または少なくとも約７．０時間、または少なくとも約７．５時間、または少なくとも約８．０時間、または少なくとも約８．５時間、または少なくとも約９．０時間、または少なくとも約９．５時間、または少なくとも約１０時間、または少なくとも約１５時間、または少なくとも約２０時間の期間にわたりインキュベートされる。第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの代謝能は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存度アッセイを使用して測定することができる。一部の態様では、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を１：４に希釈することができる。一部の態様では、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中に１：４に希釈することができる。一部の態様では、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬は希釈されない。一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約２０μｌの希釈されていないまたは希釈されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬と共にインキュベートすることができる。一部の態様では、使用される、希釈されていないまたは希釈されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬の量は、アッセイに使用されているマイクロタイタープレートに基づき調整することができる。
【００８６】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せにおけるアポトーシス活性を決定することは、発光に基づくアッセイを含み得る。発光に基づくアッセイは、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せを、発光性カスパーゼ−３／７基質と共に少なくとも約１時間インキュベートすることと、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せの発光を測定することとを含み得る。発光性カスパーゼ−３／７基質とのインキュベーションは、少なくとも約１時間、または少なくとも約１．５時間、または少なくとも約２．０時間、または少なくとも約２．５時間、または少なくとも約３．０時間、または少なくとも約３．５時間、または少なくとも約４．０時間、または少なくとも約４．５時間、または少なくとも約５．０時間、または少なくとも約５．５時間、または少なくとも約６．０時間、または少なくとも約６．５時間、または少なくとも約７．０時間、または少なくとも約７．５時間、または少なくとも約８．０時間、または少なくとも約８．５時間、または少なくとも約９．０時間、または少なくとも約９．５時間、または少なくとも約１０時間、または少なくとも約１５時間、または少なくとも約２０時間の期間にわたり得る。一部の態様では、発光性カスパーゼ−３／７基質は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７によって切断されるテトラペプチド配列ＤＥＶＤを含み、それによって、ルシフェラーゼ基質を生成する。一部の態様では、発光に基づくアッセイは、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイシステムである。一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも約１２０μｌのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ試薬と共にインキュベートすることができる。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ試薬の量は、アッセイに使用されているマイクロタイタープレートに基づいて調整することができる。非限定的な例では、９６ウェルマイクロタイタープレートが使用される場合、約１２０μｌのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ試薬を使用することができる。
【００８７】
本開示の方法の一部の態様では、第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、第３の複数の細胞、またはそれらの任意の組合せは、標準アッセイプレートでインキュベートすることができる。これには、６、１２、１４、４８、９６、３８４、または１５３６試料ウェルを備えたマイクロタイター、マイクロプレート、またはマイクロウェルプレートが含まれるがそれらに限定されない。アッセイプレートの表面は、アッセイプレート上への細胞の付着が容易になるように、分子でコーティングすることができる。例示的なコーティングには、ポリ−Ｄ−リシンまたはヒトフィブロネクチンが含まれるがそれらに限定されない。アッセイプレートは、コーティングされないままにすることができる。
【００８８】
上記態様および実施形態のいずれかは、本明細書に開示される課題を解決するための手段および／または発明を実施するための形態の、任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
【００８９】
本明細書および添付される特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明示しない限り、複数指示対象を含む。
【００９０】
文脈から具体的に述べられるかまたは明らかではない限り、本明細書で使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解され、「または」および「および」の両方を包含する。
【００９１】
文脈から具体的に述べられるかまたは明らかではない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野での通常の許容量の範囲内、例えば平均の２標準偏差内と理解される。約は、記述される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。文脈から別段明らかにされない限り、本明細書で提供される全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。
【００９２】
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似したまたは等しい他のプローブ、組成物、方法、およびキットが、本開示の実施に際して使用することができ、例示的な材料および方法を本明細書に記載する。本明細書で使用される用語は、単に特定の態様について記載することを目的とし、限定しようとするものではないことを理解されたい。
【実施例】
【００９３】
下記の実施例では、ヒト網膜芽細胞腫（ｈＲＢ）Ｙ７９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１８（商標））細胞を、２０％ウシ胎児血清を補充したＡＴＣＣ（登録商標）−処方ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養することによって、使用のために増やし維持した。細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）の推奨に従い維持した。ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）およびヒト網膜色素上皮細胞（ｈＲＰＥ細胞）を、１８〜２０週齢のヒト胎児から単離し、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２と共に１×Ｎ−２栄養補助剤、１×ＧｌｕｔａＭａｘ−１、２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ−塩基性タンパク質、および２０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦタンパク質を含む標準培地（ＳＭ）中で増殖させた。
【００９４】
下記の実験では、馴化培地（ＣＭ）を、ＳＭ中で４８時間成長させた（２４時間後にＳＭの交換を伴う）ｈＲＰＣ、ｈＲＢ細胞、またはｈＲＰＥから収集した。細胞を回収し、各ＣＭ収集後にカウントした。
【００９５】
（実施例１）
コーティングされたおよびコーティングされていない基材
種々のコーティング試薬を試験して、本開示の方法での使用に適切な基材を決定した。
【００９６】
不透明な９６ウェルアッセイプレートを、コーティングしないままにするか、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングするか、またはヒトフィブロネクチンでコーティングした。プレートを、室温で５分〜２時間、各ウェル内で２５μｌ〜５０μｌの２００μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシン溶液をインキュベートすることにより、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングした。あるいは、２５０μｌの２００μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシン溶液を、室温で１時間、各ウェル内でインキュベートした。インキュベーション後、プレートをｄｄＨ２Ｏですすぎ、次いで２時間、空気乾燥させた。プレートを、３００μｌの２０μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチン溶液を３７℃で一晩インキュベートすることにより、ヒトフィブロネクチンでコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２ですすいだ。
【００９７】
次いでヒト網膜芽細胞腫（ｈＲＢ）Ｙ７９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１８（商標））細胞を、３つの異なるアッセイプレートに添加した。ヒトフィブロネクチンプレートの場合、ｈＲＢ細胞がコロニーをつくるのが観察された。逆に、ポリ−Ｄ−リシンプレートでは、ｈＲＢ細胞が均等に分布するのが観察された。細胞を、ヒト網膜前駆細胞標準培地中で、コーティングされていないプレートに添加した場合、細胞は、コーティングの欠如にも関わらずプレートに付着した。したがってコーティングされていないプレートも、本開示の方法で使用することができる。
【００９８】
（実施例２）
蛍光に基づく細胞生存度アッセイ
細胞生存度を測定する、蛍光に基づくアッセイを、本開示の方法での使用のために試験した。
【００９９】
最初に、１２．５×１０３、２．５×１０４、５．０×１０４、１．０×１０５、および２．０×１０５個のヒト網膜芽細胞腫（ｈＲＢ）Ｙ７９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１８（商標））細胞を、９６ウェルアッセイプレートの５つの個別のウェルに播き、５０μｌのＳＭ中でインキュベートした。細胞を３０分〜２時間沈降させた後、次いで細胞を、完全に混合した後、２５０μｌのヒト網膜前駆細胞馴化培地と共にインキュベートした。次いで２００μｌの培地を吸引し、レサズリン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン１０−オキシドナトリウム塩）を含む２０μｌの希釈されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬（ＤＰＢＳ中１：４）を、３７℃で１、２、３、または４時間、細胞に添加した。レサズリンは、生存細胞により内在化されたときに、レソルフィンとして公知の化合物に還元される化合物である。レソルフィンは蛍光性が高く、このことは、生成した蛍光シグナルを使用して、レサズリンと共にインキュベートした細胞の生存度を決定することができることを意味する。代謝能に欠ける非生存細胞は、レサズリンからレソルフィンに還元せず、したがって蛍光シグナルが発生しない。
【０１００】
各ウェルの蛍光を、レサズリンとのインキュベーション後に測定した。蛍光シグナルを、５２０ｎｍの励起波長および５８０〜６４０ｎｍの放射波長で読み取った。各処置を、三連または四連で行った。図１に示されるように、全ての細胞量にわたり、１、２、または３時間のインキュベーション時間に関して線形応答（Ｒ２＝０．９９）があった。これらの結果は、細胞当たりの最大処置効果を実現し、実験の持続時間および試料内のばらつきを最小限に抑えるために、本開示の方法が２．５×１０４細胞／ウェルおよび２時間のレサズリンインキュベーション時間を使用することができることを示す。
【０１０１】
（実施例３）
ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力の決定
本開示の方法を使用して、ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力を試験した。
【０１０２】
最初に、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、ヒト網膜前駆細胞馴化培地（ｈＲＰＣ  ＣＭ）または標準培地（ＳＭ：ヒト網膜前駆細胞に曝露されていない標準ヒト網膜前駆細胞培地）のいずれかと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないか、２ｍＭの酪酸ナトリウム、４ｍＭの酪酸ナトリウム、または８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。新たに作製された２００ｍＭの酪酸ナトリウムを、２５０μｌの培地に添加して、様々な酪酸ナトリウム濃度を生成した。ｈＲＰＣ  ＣＭを、９．０×１０６個のヒト網膜前駆細胞を使用して生成した。
【０１０３】
ｈＲＢ細胞を、３００μｌの様々な培地中で、１時間または７２時間のいずれかでインキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。簡単に言うと、２００μｌの細胞培養物を、２０μｌの希釈されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬と混合し、１〜２時間インキュベートした。次いで各試料の蛍光を測定した。図２に示されるように、細胞増殖に起因して、１時間のインキュベーション（左パネル）と比較してより強力な蛍光シグナルが、７２時間のインキュベーション（右パネル）後に観察された。しかしながら、より高い濃度の酪酸ナトリウムが蛍光シグナルの減少をもたらしたように、有意な用量依存的な酪酸ナトリウムで誘導されたアポトーシスが、７２時間インキュベートした試料中で観察され、このことから、細胞増殖および生存度の減少が示された。
【０１０４】
ｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞は、１時間および７２時間の両方のインキュベーショに関し、ＳＭと共にインキュベーションされた細胞と比較して増加した蛍光シグナルを示した。これらの結果は、ｈＲＰＣ  ＣＭが、アポトーシス誘導性酪酸ナトリウムの存在下であっても、ｈＲＢ細胞の生存度を強力に増加させたことを示す。最高ｈＲＰＣ  ＣＭ効力は、８ｍＭの酪酸ナトリウムと共にインキュベートした細胞で観察され、ｈＲＰＣ  ＣＭは、１時間および７２時間の両方の時点で、ＳＭと比較して増加した細胞生存度において、約２倍の効力を示した。これらの予備的結果は、８ｍＭの酪酸ナトリウムが最大の検出可能なシグナルを提供することを示した。
【０１０５】
別の実験では、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、ｈＲＰＣ  ＣＭまたはＳＭのいずれかと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないか、８ｍＭの酪酸ナトリウム、１６ｍＭの酪酸ナトリウム、または２４ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。ｈＲＰＣ  ＣＭを、９．０×１０６ヒト網膜前駆細胞を使用して生成した。
【０１０６】
ｈＲＢ細胞を、１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図３に示されるように、ｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートしたｈＲＢ細胞は、ＳＭと共にインキュベートしたｈＲＢ細胞と比較して、増加した蛍光シグナルを示した。この傾向は、４つ全ての酪酸ナトリウム濃度にわたって一貫していた。これらの結果は、高濃度のアポトーシス誘導性酪酸ナトリウムの存在下であっても、ｈＲＰＣ  ＣＭが、ｈＲＢ細胞の生存度を強力に増加させたことを示す。
【０１０７】
（実施例４）
種々の用量でのヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力の決定
本開示の方法を使用して、ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力が用量依存的であるかどうかを試験した。
【０１０８】
最初に、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、ｈＲＰＣ  ＣＭ、ＳＭ、ＳＭで２倍希釈したｈＲＰＣ  ＣＭ（０．５×ｈＲＰＣ  ＣＭ）、ＳＭで４倍希釈したｈＲＰＣ  ＣＭ（０．２５×ｈＲＰＣ  ＣＭ）、またはＳＭで８倍希釈したｈＲＰＣ  ＣＭ（０．１２５×ｈＲＰＣ  ＣＭ）と共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないか、または８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。ｈＲＰＣ  ＣＭを、９．０×１０６ヒト網膜前駆細胞を使用して生成した。
【０１０９】
ｈＲＢ細胞を、１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図４に示されるように、さらに濃縮されたｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞は、さらに希釈されたｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞およびＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光シグナルを示した。これらの結果は、ｈＲＰＣ  ＣＭが、用量依存的な方法でｈＲＢ細胞の生存度を強力に増加させたことを示す。
【０１１０】
別の実験では、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、９．０×１０６ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ  ＣＭ  ９Ｍ）を使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ、６．０×１０６ヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ  ＣＭ  ６Ｍ）を使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ、またはＳＭと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないか、または８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１１１】
ｈＲＢ細胞を１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図５に示されるように、ｈＲＰＣ  ＣＭ  ９Ｍと共にインキュベートした細胞は、両方の酪酸ナトリウム濃度で、ｈＲＰＣ  ＣＭ  ６Ｍと共にインキュベートした細胞およびＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光値を示した。この結果は、ｈＲＰＣ  ＣＭ処置の効力が、馴化培地を生成するのに使用されたｈＲＰＣの数に依存することを示す。
【０１１２】
これらの結果は、本明細書で提供された方法を使用して、網膜色素変性の処置に関して、ｈＲＰＣに基づく治療の効力を決定できることを示す。
【０１１３】
（実施例５）
ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力が、種々のｈＲＰＣ集団を使用して再現可能であるかの決定
本開示の方法を使用して、馴化培地が種々の生成物ロットからの別々の集団のｈＲＰＣを使用して生成した場合、ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力が再現可能であるかどうかを試験した。
【０１１４】
最初に、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、Ｇ１と指定されたロットからの５．４×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ１  ５．４）、Ｇ２と指定されたロットからの３．７×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ２  ３．７）、Ｇ３と指定されたロットからの４．５×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ３  ４．５）、Ｇ５と指定されたロットからの５．０×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ５  ５．０）、またはＳＭと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないかまたは８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１１５】
ｈＲＢ細胞を、２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図６の左パネルに示されるように、ｈＲＰＣ  ＣＭでと共にインキュベートした細胞は、両方の酪酸ナトリウム濃度で、ＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光値を示した。この増加は、馴化培地を生成するのに使用したｈＲＰＣのロットとは無関係に観察された。
【０１１６】
別の実験では、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、Ｇ１と指定されたロットからの３．７×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ１  ３．７）、Ｇ２と指定されたロットからの２．９×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ２  ２．９）、Ｇ３と指定されたロットからの３．３５×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ４  ３．３５）、Ｇ５と指定されたロットからの３．２５×１０６／１０ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ５  ３．２５）、またはＳＭと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないかまたは８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１１７】
ｈＲＢ細胞を２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図６の右パネルに示されるように、ｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞は、両方の酪酸ナトリウム濃度で、ＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して増加した蛍光値を示した。この増加は、馴化培地を生成するのに使用したｈＲＰＣの供給源とは無関係に、観察された。
【０１１８】
別の実験では、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、Ｇ１と指定されたロットからの２．０３８×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ１  ２．０３８）、Ｇ２と指定されたロットからの１．７７４×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ２  １．７７４）、Ｇ３と指定されたロットからの１．５４３×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ３  １．５４３）、Ｇ４と指定されたロットからの１．５４２×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ４  １．５４２）、Ｇ５と指定されたロットからの１．３１８×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｇ５  １．３１８）、Ｌ−ＳＢと指定されたＣＭＯ  Ｓｅｅｄ  Ｂａｎｋ試料からの１．９７７×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｌ−ＳＢ）、Ｌ−ＰＢと指定されたＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｂａｎｋ試料からの１．１６２×１０６／４ｍｌ  ｈＲＰＣを使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  Ｌ−ＰＢ）、またはＳＭと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないかまたは８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１１９】
ｈＲＢ細胞を２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図７に示されるように、ｈＲＰＣ  ＣＭと共にインキュベートした細胞は、両方の酪酸ナトリウム濃度で、ＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光値を示した。この増加は、馴化培地を生成するのに使用したｈＲＰＣの供給源とは無関係に観察された。
【０１２０】
この実施例の結果は、強力な馴化培地を生成するのに、ｈＲＰＣの種々の集団を使用することができることを示す。種々のｈＲＰＣロットからの馴化培地の効力は、ＳＭに対し、一貫して高い代謝活性を示した。ロット間の効力にはいくらかの相違があったが、このことは馴化培地収集時の標準化の欠如に起因する可能性が最も高い。
【０１２１】
（実施例６）
ヒト網膜前駆細胞馴化培地の効力が特異的であるかの決定
本開示の方法を使用して、ｈＲＰＣ  ＣＭの効力が、他の細胞型を使用して生成した馴化培地に対してｈＲＰＣを使用して生成した馴化培地に特異的であるかどうかを試験した。
【０１２２】
最初に、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、９．０×１０６個のヒト網膜前駆細胞を使用して生成したｈＲＰＣ  ＣＭ（ｈＲＰＣ  ＣＭ  ９Ｍ）、１２．２×１０６個のｈＲＢ細胞を使用して生成したｈＲＢ馴化培地（ｈＲＢ  ＣＭ  １２．２Ｍ）、またはＳＭと共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないかまたは８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１２３】
ｈＲＢ細胞を、１または２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図８の左パネルに示されるように、ｈＲＰＣ馴化培地と共にインキュベートした細胞は、ｈＲＢ馴化培地およびＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光シグナルを示した。この傾向は、酪酸ナトリウム濃度の全体にわたって一貫していた。
【０１２４】
別の実験では、ｈＲＢ細胞を、２．５×１０４細胞／ウェルの密度でアッセイプレート上に播いた。次いで細胞を、７．０×１０６ヒト網膜色素上皮細胞を使用して生成したヒト網膜色素上皮細胞馴化培地（ｈＲＰＥ  ＣＭ  ７Ｍ）または標準培地（ＳＭ；ヒト網膜前駆細胞に曝露されていない標準ヒト網膜前駆細胞培地）と共にインキュベートした。培地に、酪酸ナトリウムを補充しないかまたは８ｍＭの酪酸ナトリウムを補充した。
【０１２５】
ｈＲＢ細胞を、１または２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存度を、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用して測定した。図８に示されるように、ｈＲＰＥ馴化培地と共にインキュベートした細胞は、ＳＭと共にインキュベートした細胞と比較して、増加した蛍光シグナルを示した。この傾向は、酪酸ナトリウム濃度の全体にわたって一貫していた。
【０１２６】
（実施例１〜６のまとめ）
先行する実施例で使用した標的細胞の型（ｈＲＢ系）は、予測されるｉｎ  ｖｉｖｏ細胞標的（即ち、患者の網膜）とは実質的に異なるが、本開示の方法は、それにも関わらず、治療細胞からの拡散性栄養活性の種々のレベルを検出および区別する能力を実証する。アッセイでの使用のための非常に異常な標的細胞の選択は、本開示の方法を、様々な異なる疾患状況、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では手に負えない標的細胞型を有し得るものに対し、高度に適応可能にする。
【０１２７】
（実施例７）
馴化培地の収集
下記の実施例は、本開示の方法での使用のための馴化培地の生成および収集について記載する。より詳細には、この実施例は、ｈＲＰＣを成長させるのに使用される馴化培地の収集について記載する。
【０１２８】
最初に、ｈＲＰＣ細胞を含有するバイアルを液体窒素から取り出し、それらのキャップを細胞培養フード内で緩めて、圧力を解放した。次いでキャップを再び締めた。次いでｈＲＰＣ細胞を、氷の結晶が消失するまで３７℃の水浴に２〜３分間バイアルを入れることにより、解凍した。次いで全細胞懸濁液（約１ｍｌ／バイアル）を、１ｍｌのピペットチップを使用して１５ｍｌの円錐底管に移した。バイアルを新鮮な冷標準培地（ＳＭ）で１〜２回すすぎ、すすぐのに使用されたＳＭを、細胞懸濁液に滴下添加した。次いで細胞混合物全体を穏やかに振盪させた。
【０１２９】
１０〜１４ｍｌの冷やした新鮮なＳＭを、１５ｍｌの円錐底管中の細胞懸濁液に添加し、混合物を穏やかに振盪させた。次いで細胞を、管を３００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した。次いで上澄みを吸引し、廃棄した。次いで新鮮な冷ＳＭを使用して、細胞ペレットを、１ｍｌのピペットチップを使用して再懸濁して、細胞ペレットを６〜８回上下させて穏やかにピペッティングした。次いで細胞生存度および細胞数を、血球計算盤またはＣｏｕｎｔｅｓｓカウンターを使用して測定した。測定された細胞数に基づいて、８００万個の解離した生細胞を、１０ｍｌの新鮮なＳＭ中のフィブロネクチンで予めコーティングした新しいＴ７５フラスコ内に播種した。次いで細胞培養物を即座に穏やかに揺動させた。
【０１３０】
播種した後、細胞を、倒立型顕微鏡で検査して、細胞培養フラスコ内に細胞が均等に分布したことを確実にした。不均等な分布が観察された場合、均等な分布が実現されるまで細胞を穏やかにさらに揺動させた。次いで細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１３１】
翌日、細胞を、倒立型顕微鏡下でチェックし、それらの状態を記録した。観察後、細胞培養培地全体を、ｈＲＰＣ培養フラスコから吸引し、廃棄した。次いで１０ｍｌの、予め温めた（３７℃）ＳＭを各Ｔ７５フラスコに添加した。次いで細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１３２】
次に、細胞の状態を、倒立型顕微鏡下で再びチェックした。次いで馴化培地を吸引し、ｈＲＰＣ培養フラスコから収集した。次いで培地を、４７５×ｇで５分間遠心分離した。次いで遠心分離した馴化培地を、冷やしたブロック上に置いた。次いで馴化培地を、死細胞および細胞残滓を含有する管底部のペレットの吸引が回避されるよう注意を払いながら、１．５ｍｌの管に採った。次いで一定分量採取された馴化培地を、本開示の方法での使用のための長期保存に向けて即座に−８０℃に移した。
【０１３３】
その後、５ｍｌの予め温めた３７℃のＳＭ培地を、ｈＲＰＣ細胞を含有するＴ７５培養フラスコに添加した。次いでフラスコを穏やかに揺動させ、培地を吸引し、廃棄した。次いで４ｍｌのＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ作業溶液を、各Ｔ７５フラスコに添加し、次いでフラスコを穏やかに揺動させて、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ作業溶液で細胞が成長している表面を完全に覆った。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ作業溶液中で５分間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１３４】
インキュベーション後、細胞を、倒立型顕微鏡下で検査して、細胞の少なくとも９５％が細胞培養物表面から離脱するのを確実にした。さらなる離脱が必要な場合、培養フラスコをさらに撹拌した。
【０１３５】
細胞の酵素解離を停止させるため、５ｍｌのＳＭをＴ７５フラスコに添加した。次いで培地を徐々に漸増して、滅菌血清ピペットを使用してフラスコの表面から細胞を洗い落とした。次いで細胞懸濁液を、滅菌した１５ｍｌの管に移した。次いで管を、冷やしたブロックに置いた。次いでＴ７５フラスコを、追加の５ｍｌの新鮮なＳＭを使用して再びすすぎ、次いでこれを滅菌した１５ｍｌの管に移した。次いで細胞を含有する１５ｍｌの円錐管を、卓上遠心分離機で、３００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを吸引し、廃棄した。次いで冷（４℃）ＢＳＳ  Ｐｌｕｓ溶液を、ペレット化細胞に添加した。次いでペレットを、１ｍｌのピペットチップを使用して再懸濁して、ＢＳＳ  Ｐｌｕｓ溶液を６〜１０回上下させて穏やかにピペッティングした。懸濁液を、冷やしたまま保持し続けた。最後に、細胞生存度および細胞数を、血球計算盤またはＣｏｕｎｔｅｓｓカウンターを使用して測定した。
【０１３６】
（実施例８）
本開示の多重化効力アッセイ
この実施例は、本開示の多重化効力アッセイ、および細胞に基づく治療または処置の効力を決定する際のその使用を含む、様々な実験について記載する。
【０１３７】
多重化効力アッセイの非限定的な例では、ＲＢ細胞を９６ウェルプレートに播いた。各ウェルには、２５，０００個のＲＢ細胞を２５μｌのＳＭに播いた。次いで各ウェルを、７５μｌの馴化培地（場合によっては、実験に応じて希釈された馴化培地）または７５μｌの対照培地（標準培地、陽性対照馴化培地、陰性対照馴化培地）のいずれかで処置した。次いで酪酸ナトリウムを各ウェルに添加して、１６ｍＭの最終濃度にした。一部の実験では、酪酸ナトリウムを添加して８ｍＭ、１６ｍＭ、もしくは３２ｍＭの最終濃度にするか、または酪酸ナトリウムを全く添加せずに、アッセイのアウトプットに対する酪酸ナトリウム濃度の効果を決定した。次いで細胞を、３７℃で４６時間インキュベートした。
【０１３８】
４６時間のインキュベーション後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで１：４に希釈した）を各ウェルに添加した。次いで細胞を３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞の生存度を、（５３０Ｅｘ／５９０Ｅｍ）で各ウェルの蛍光を記録することにより測定した。
【０１３９】
細胞生存度の測定後、等体積（１２０μｌ）のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を各ウェルに添加した。次いで細胞を、室温で１．５時間インキュベートして、定常状態のルシフェラーゼアウトプットを実現した。インキュベーション後、各ウェルの発光を測定して、各ウェルにおけるアポトーシス活性を決定した。次いで各ウェルに対する倍数変化保護値を、上述のように計算した。次いで各ウェルに対する効力値を、各ウェルの倍数変化保護値の比を取り、対照培地、より具体的には標準培地を使用してウェルに関して計算された倍数変化保護値に対して正規化することによって計算した。
【０１４０】
図１０は、様々な量の酪酸ナトリウム、ならびに標準培地、ｈＲＰＣの１つの集団からの馴化培地、またはｈＲＰＣの異なる集団からの馴化培地を含む条件を用いた、先行する多重化法を使用した実験からの結果を示す。図１０の左上パネルは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を使用した各条件について測定された生存度を示す。図１０の右上パネルは、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を使用して各条件について測定されたアポトーシス活性を示す。図１０の下パネルは、上述のように計算された効力値を示す。これらの結果は、ｈＲＰＣの両方の集団からの馴化培地が、酪酸ナトリウムの有害作用からＲＢ細胞を保護することを示す。さらに、結果は、１６ｍＭの酪酸ナトリウムの使用が、本開示の多重化効力アッセイを使用して最大効力シグナルをもたらすことを示す。
【０１４１】
図１１は、１６ｍＭの酪酸ナトリウム、および濾過されていないまたは濾過された馴化培地を使用した、先行する多重化法を使用した実験からの結果を示す。簡単に言うと、１０ｍｌのｈＲＰＣからの馴化培地を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ３Ｋフィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ９００３２４）に添加した。スイングバケットローターを使用して、馴化培地を含むデバイスを、４，０００×ｇで約１０〜１５分間遠心分離した。「上層」または「保持液」画分は、フィルターデバイスにピペットを挿入し、左右の掃引運動により試料を取り出すことによって、全回収を確実にした。「底部」または「濾液」画分は、フィルターデバイスを除去し、フィルターを通過した試料の部分を収集することによって、回収した。図１１に示されるように、濾過されていない馴化培地は、酪酸ナトリウムの有害作用からＲＢ細胞を保護した。対照的に、「底部」、または「濾液」画分は、同程度にＲＢ細胞を保護しなかった。
【０１４２】
図１２は、１６ｍＭの酪酸ナトリウム、ならびに標準培地、ＨｕＴ７８細胞からの馴化培地、およびＡＲＰＥ−１９細胞からの馴化培地を使用した、先行する多重化法を使用した実験からの結果を示す。ＨｕＴ７８細胞からの馴化培地は、この馴化培地がＲＢ細胞を酪酸ナトリウムの有害作用から保護しないことが予想されるので、陰性対照馴化培地である。ＡＲＰＥ−１９細胞からの（form）馴化培地は、この馴化培地がＲＢ細胞を酪酸ナトリウムの有害作用から保護することが予想されるので、陽性対照馴化培地である。図１２に示されるように、予想されるようにＡＲＰＥ−１９馴化培地はＲＢ細胞を保護したが、ＨｕＴ７８馴化培地は保護しなかった。したがって本開示の方法は、行われるアッセイの完全性を確実にするために、陽性および陰性対照馴化培地の使用を含み得る。
【０１４３】
図１３は、１６ｍＭ酪酸ナトリウム、ならびに標準培地、ｈＲＰＣの３つの異なる「ロット」（異なる集団、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ５）からの馴化培地、およびＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞からの馴化培地を使用した、先行する多重化法を使用した実験からの結果を示す。ＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞からの馴化培地は、この馴化培地がＲＢ細胞を酪酸ナトリウムの有害作用から保護することが予想されるので、陽性対照馴化培地である。図１３に示されるように、ｈＲＰＣの３つ全てのロットからの馴化培地およびＣＣＤ−１１１２Ｓｋ細胞からの陽性対照馴化培地は全て、酪酸ナトリウムの有害作用からＲＢ細胞を保護した。したがってこれらの結果は、本開示の方法が、種々の細胞に基づく処置または治療の、独立した「ロット」を試験するのに使用することができ、かつ測定された効力値が堅固であることを示す。
【０１４４】
図１４は、１６ｍＭの酪酸ナトリウムならびに標準培地および様々な播種密度のｈＲＰＣ培養物からの馴化培地を使用した、先行する多重化法を使用した実験からの結果を示す。馴化培地を、４００万、６００万、または９００万個の細胞の播種密度を使用したこと以外、実施例７の方法に類似した方法を使用して、収集した。図１４に示されるように、より高い播種密度を有するｈＲＰＣ培養物に由来する馴化培地は、酪酸ナトリウムの有害作用からのＲＢ細胞のさらなる保護を提供する。したがって、本開示の方法の、測定された効力値は、用量依存性を示すことができる。
【０１４５】
（実施例９）
本開示の方法は線形性を示す
この実施例は、希釈系列の馴化培地（ＣＭ）が使用された場合、測定された効力における線形性を本開示の方法が示すことを、実証する実験について記載する。
【０１４６】
最初に、ＲＢ細胞を９６ウェルプレートに播いた。各ウェルについて、２５，０００個のＲＢ細胞を２５μｌのＳＭに播いた。次いで希釈系列の馴化培地（例えば、実施例７の方法を使用して生成した）を下記の通り調製した：
ｉ．  １００％ＣＭ：ＣＭのみ
ｉｉ．  ７５％ＣＭ：７５％ＣＭ＋２５％ＳＭ
ｉｉｉ．  ５０％ＣＭ：５０％ＣＭ＋５０％ＳＭ
ｉｖ．  ２５％ＣＭ：２５％ＣＭ＋７５％ＳＭ
ｖ．  １２．５％ＣＭ：１２．５％ＣＭ＋８７．５％ＳＭ
ｖｉ．  ０％ＣＭ：１００％ＳＭ
【０１４７】
７５μｌの馴化培地（ａ〜ｆ）のそれぞれを、９６ウェルプレートの別々のウェルに添加した。次いで酪酸ナトリウムを、１６ｍＭ酪酸ナトリウムの最終濃度に向けて各ウェルに添加した。次いで細胞を４６時間、３７℃でインキュベートした。
【０１４８】
インキュベーションの４６時間後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで１：４に希釈した）を各ウェルに添加した。次いで細胞を３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞の生存度を、（５３０Ｅｘ／５９０Ｅｍ）で各ウェルの蛍光を記録することにより測定した。
【０１４９】
細胞生存度を測定した後、等体積（１２０μｌ）のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を各ウェルに添加した。次いで細胞を、室温で１．５時間インキュベートして、定常状態のルシフェラーゼアウトプットを実現した。インキュベーション後、各ウェルの発光を測定して、各ウェルのアポトーシスを決定した。
【０１５０】
次いで各ウェルに対する倍数変化保護値を、上述のように計算した。次いで各ウェルに対する効力値を、各ウェルの倍数変化保護値の比を取り、０％ＣＭ（１００％ＳＭ）を含むウェルに関して計算された倍数変化保護値に対して正規化することによって計算した。図１５に示されるように、方法のアウトプットは線形性を示す。１００％ＣＭを含む条件は、約４．６１の測定された効力値を有していた。７５％ＣＭを含む条件は、約３．５４の測定された効力値を有し、これは１００％ＣＭの条件の効力値の０．７５×とほぼ同じである（０．７５×４．６１）。同様に、５０％ＣＭを含む条件は約２．３８の測定された効力値を有し、これは１００％ＣＭの条件の効力値の０．５×とほぼ同じである（０．５×４．６１）。したがって本開示の方法は、線形の効力アウトプットを提供する。
【０１５１】
均等物
本明細書で提供される１つまたは複数の実施形態の詳細は、上に添付された記載で述べる。本明細書で記載されるものに類似のまたは均等な任意の方法および材料は、本発明の実施または試験の際に使用することができるが、例示的な方法および材料について次に記載する。
【０１５２】
前述の記載は例示の目的でのみ提示しており、開示される厳密な形に本発明を限定するものではなく、本明細書に添付される特許請求の範囲によるものである。
【０１５３】
修正は、本発明の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに行ってもよい。本発明について、１つまたは複数の具体的な実施形態を参照しながら実質的な詳細において記載してきたが、当業者なら、本出願で具体的に開示された実施形態に変更を行ってもよく、それでもこれらの修正形態および改善形態は、本発明の範囲および精神の範囲内にあることが、理解される。本明細書に適切に、例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素（複数可）の非存在下で、実施されてもよい。したがって例えば、本明細書の各場合において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。したがって、用いられてきた用語および表現は、記載の用語として使用され、限定のものではなく、示され記載される特色の均等物またはそれらの部分は排除されず、様々な修正形態が本発明の範囲内で可能であることが理解される。本発明の実施形態は、下の特許請求の範囲に記述される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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