(57)【要約】  本発明は、抗原ペプチドと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原ペプチド応答性Ｔ細胞などの結合相手との間の相互作用の検出に関する。具体的には、本発明は、ハイスループットのエピトープ同定及びＴＣＲ特理性決定に利用されるペプチドフリーＭＨＣ分子をもつロード可能な検出分子を提供することに関する。
2022502045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．前記ロード済み検出分子を前記試料と接触させること、並びに
ｖ．前記ロード済み検出分子の前記１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出すること
を含み、
少なくとも１つの抗原ペプチドがそれぞれ、
−少なくとも２つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも１つの検出可能な標識、
によって表され、
前記ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−１ドメインにおいてアミノ酸残基８４又は８５に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−２ドメインにおいてアミノ酸残基１３９に配置される方法。
【請求項２】
前記ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、コネクター分子と前記ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のアフィニティータグとの間の非共有相互作用によって前記コネクター分子に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コネクター分子がストレプトアビジンであり、前記アフィニティータグがビオチンである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ロード可能な検出分子が、少なくとも３つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子など、少なくとも２つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子、好ましくは４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ロード可能な検出分子が、ストレプトアビジンと各ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のビオチン標識との間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの検出可能な標識が前記コネクター分子に結合している請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個の異なる抗原ペプチドなどの、少なくとも２つの異なる抗原ペプチドがステップｉｉ）で用意される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの抗原ペプチドが少なくとも２つの異なる検出可能な標識によって表され、前記ロード済み検出分子の前記１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合が、前記ロード済み検出分子を通して抗原応答性Ｔ細胞に結合された前記少なくとも２つの異なる検出可能な標識の存在を検出することによって検出される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つの異なる検出可能な標識が、蛍光マーカー、放射性同位体、磁気マーカー及び金属標識からなる群より選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つの異なる検出可能な標識が蛍光マーカーである請求項８及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの異なる検出可能な標識が金属標識である請求項８及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの検出可能な標識が、
ｉ．５’第１のプライマー領域（フォワード）、バーコード領域及び３’第２のプライマー領域（リバース）、並びに
ｉｉ．ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域
を含む核酸標識であり、
前記バーコード領域が、前記検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子であって、
前記ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−１ドメインにおいてアミノ酸残基８４又は８５に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−２ドメインにおいてアミノ酸残基１３９に配置されるロード可能な検出分子。
【請求項１４】
前記核酸標識が請求項１２に画定されている通りである請求項１３に記載のロード可能な検出分子。
【請求項１５】
前記ロード可能な検出分子が、ストレプトアビジンと各ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のビオチン標識との間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む前述の請求項１３及び１４のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子。
【請求項１６】
試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための組成物であって、
（ａ）請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも２つのロード可能な検出分子、又は
（ｂ）各ロード可能な検出分子が異なる検出可能な標識を含み、それぞれが少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含む少なくとも３つのロード可能な検出分子
を含み、
前記ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインを含む重鎖を含み、前記重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
変異体システイン残基が前記アルファ−１ドメインにおいてアミノ酸残基８４又は８５に配置され、かつ変異体システイン残基がアルファ−２ドメインにおいてアミノ酸残基１３９に配置される組成物。
【請求項１７】
試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子又は請求項１６に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するためのキットであって、
ｉ．請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子又は請求項１６に記載の組成物、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチド、及び
ｉｉｉ．任意選択で、使用説明書
を含むキット。
【請求項１９】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
ｉｉｉ．前記ロード可能な検出分子を前記抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
ｉｖ．前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を前記ロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
ｖ．前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と前記ロード済み検出分子のライブラリーの結合を検出すること
含む方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定するための請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のロード可能な検出分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原ペプチドと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）や抗原ペプチド応答性Ｔ細胞などの結合相手との間の相互作用の検出に関する。具体的には、本発明は、ハイスループットのエピトープ同定及びＴＣＲ特理性決定に利用されるペプチドフリーＭＨＣ分子をもつロード可能な検出分子を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）タンパク質は、細胞プロテオームを小さなペプチド断片として細胞表面に提示して、Ｔ細胞による免疫監視を媒介し、ウイルス感染やがんなどの細胞の異常に対抗するために必要不可欠である。抗原特異的Ｔ細胞の同定と特性解析は、治療法の開発や、免疫が冒された疾患のメカニズムの洞察に非常に重要である。大きなｐＭＨＣ分子のライブラリーを用いたＴ細胞の特異性のスクリーニングは、モデル抗原の選択に限定した解析よりもむしろ、潜在的に全ゲノムレベルでＴ細胞の認識を解析するのに適している。そのような戦略は、疾患の発症や免疫療法への反応に関与する免疫特異性についての新たな洞察をもたらし、Ｔ細胞の認識パターン及びＴＣＲによる交差認識に関連する基本的な知見を広げる。
【０００３】
これまでのプロトコールは、ＭＨＣマルチマーに基づく検出技術の能力を拡大し、限られた生物学的材料における大規模なエピトープの発見や免疫モニタリングを容易にすることを目指してきた。
【０００４】
Ｈａｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）及び国際公開第２０１０／０６０４３９Ａ１号には、蛍光標識されたＭＨＣマルチマーのコンビナトリアルエンコーディングに基づいたアプローチが記載されている。この方法では、それぞれの異なるｐＭＨＣマルチマーにユニークな２色コードが割り当てられ、それを用いてこの特定のｐＭＨＣ分子に結合するＴ細胞が同定される。ユニークな２色コードを採用した場合、予め決められた色の組み合わせに一致しないいずれのＴ細胞もバックグラウンドイベントとして記録される。このコンビコーディング（ｃｏｍｂｉｃｏｄｉｎｇ）アプローチは、８つのフルオロフォアの組み合わせが２８個のユニークな２色コードを生み出すので、従来の蛍光標識されたＭＨＣマルチマーをベースとしたアッセイと比較して、低い検出限界をもたらし、スループットの増加を可能にする。
【０００５】
Ｂｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）及び国際公開第２０１５／１８８８３９Ａ２号には、ＭＨＣマルチマーに結合したＤＮＡバーコードが、ｐＭＨＣエピトープそれぞれに特異的なタグを形成する別のアプローチが記載されている。そのＤＮＡバーコードは、異なるユニークな配列が最大で１０10通りの複雑さで設計でき、したがって抗原応答性Ｔ細胞の検出は、この技術を用いて利用可能な標識の数に制限されない。
【０００６】
このように、ＭＨＣマルチマーに基づくＴ細胞の検出アプローチは、試料当たり数個の抗原特異的Ｔ細胞集団の検出から、１０００を超える特異性を並行して同定するまで進化してきた。しかし、これらの最先端のＴ細胞検出プラットフォームの柔軟性、迅速性、及び品質保証を制限する大きな制約は、異なるペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）（しばしば１００−１０００の異なるｐＭＨＣ）の大きなライブラリーを生成することである。この課題を克服するために、ペプチド交換技術が開発されて、所与のＨＬＡ又はＨ−２分子に対する条件付きリガンドＭＨＣ−Ｉの単一ストックから複数のｐＭＨＣを容易に生成することができるようになった。これらの戦略には、ペプチド交換の触媒としてのジペプチドの使用、広く使用されているＵＶ媒介ペプチド交換技術、及び最近開発された温度誘導交換技術が含まれる。残念ながら、追加のペプチド交換プロセスのステップを必要とすること以外に、交換技術には欠点があり、例えばＨＬＡに特異的な設計及び最適化、低親和性の入力ペプチドの非効率的なペプチド交換、ペプチド交換後にのみ多量体化する能力、並びに長い交換時間などが挙げられる。
【０００７】
現在のマルチマーに基づくＴ細胞検出アプローチのさらに別の限界は、抗原ペプチド依存性の寿命を有することが知られている主要組織適合性複合体固有の不安定性である。ｐＭＨＣの不安定性は、ｐＭＨＣが完全に機能を維持しており、したがってＴ細胞検出に有用である時間枠を制限する。また、ｐＭＨＣ複合体の不安定性は、ＭＨＣマルチマーが完全に機能を維持し、効率的かつ抗原特異的にＴ細胞を同定できる時間を制限する。
【０００８】
米国特許第９，４９４，５８８号には、抗原ペプチドなしで作製できる変異ＭＨＣクラスＩ分子の提供が記載されている。この空のＭＨＣクラスＩ分子は、ハイスループットのＭＨＣに基づくＴ細胞検出に必要な、異なるペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）の大きなライブラリーを生成するために使用されうる。しかし、この方法論がそのような設定での使用に適用できるかどうかは、純粋に推測であり、開示されていない。例えば、野生型（ｗｔ）ＭＨＣ分子と同様の抗原特異的相互作用特性をもつＴ細胞と相互作用するそれらの分子の能力は示されていない。さらに、導入された変異がＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用に構造的又は機能的に影響を与えるかどうかは不明であり、抗原ペプチドとＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の本来の相互作用を反映していない、信頼性の低い結果をもたらす可能性がある。
【０００９】
さらに、ＭＨＣに基づくＴ細胞検出アッセイのための既存の技術はすべて、抗原ペプチドとＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の稀で弱い相互作用を検出することに関しては一貫性がない。一例として、コンビコーディング技術の蛍光をベースとする読み出しはフローサイトメトリーによって検出され、したがって所与のｐＭＨＣに関連するシグナル強度は、ＭＨＣマルチマーと特異的に相互作用するＴ細胞とそうでないＴ細胞を区別する唯一の尺度となる。したがって、十分な蛍光強度を得て、それによってその特異性の明確な識別を可能にするためには、所与のＴ細胞が多数のＭＨＣマルチマーと結合することが不可欠である。結果として、抗原ペプチドの相互作用が弱くなり、発生頻度が少なくなるにつれて、その相互作用を正確に解明し発見することがますます困難になる。これにより、一貫性のない結果がもたらされる可能性がある。したがって、がん関連抗原及び変異由来ネオエピトープの発見に特に重要となる、稀で弱い相互作用を検出する能力は、現状では不十分である。低アビディティーの相互作用と小さなＴ細胞集団を特徴とすることが多い自己抗原の認識では尚更そうである。今もなお疾患の発症にする可能性のあるそのような稀な集団を検出するためには、検出技術の向上が必要である。
【００１０】
したがって、ハイスループットにエピトープを同定し、ＴＣＲ特異性を決定するための改良された方法は有利であることになる。具体的には、エンドユーザーが必要に応じて、スクリーニングのための大きな抗原ペプチドライブラリーを容易に生成でき、稀で弱い相互作用、例えばがん関連抗原及び変異由来のネオエピトープの相互作用でさえも確実に発見できる、より柔軟な、感度の高い、より迅速な方法は有益であろう。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ハイスループットのエピトープ同定及びＴＣＲ特異性決定に利用できる改良された検出分子を提供することに関する。
【００１２】
具体的には、抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）の大きなライブラリーの生成及び稀で弱い相互作用を検出するのに感度が不十分という先行技術の上記問題を解決する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
したがって、本発明の１つの態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法に関し、その方法は以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
ｖ．ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも１つの抗原ペプチドはそれぞれ、
−少なくとも２つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも１つの検出可能な標識
によって表される。
【００１４】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子に関する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための組成物を提供することであり、その組成物は、
（ａ）少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含む少なくとも２つのロード可能な検出分子、又は
（ｂ）各ロード可能な検出分子が異なる検出可能な標識を含み、少なくとも３つの少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための、本明細書に記載の少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子又は組成物の使用に関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するためのキットを提供することであり、そのキットは、
ｉ．本明細書に記載の少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子又は組成物、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチド、並びに
ｉｉｉ．任意選択で、使用説明書を含む。
【００１８】
本発明のさらにさらなる態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定する方法に関し、その方法は以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
ｉｖ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞をロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
ｖ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞とロード済み検出分子のライブラリーの結合を検出することを含む。
【００１９】
本発明のさらにさらなる態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーの間の相互作用を決定するための、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）健常なドナーのＰＢＭＣからＣｙｓ変異体ＭＨＣ及び野生型ＭＨＣ検出分子（ＰＥタグ付き）を用いてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（Ａ２）制限−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的Ｔ細胞を検出するためのフローサイトメトリー解析の比較ドットプロット。２×１０6個のＰＢＭＣを、Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶウイルス由来抗原に特異的なＣｙｓ変異体Ａ２検出分子又は野生型Ａ２検出分子で染色した。同等の抗原特異的Ｔ細胞頻度（ドットプロット上の数字は全ＣＤ８＋細胞に対するパーセント割合）が見られたが、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子を用いると、より明るく、より良好な分離が得られた。（Ｂ）図１ＡのプロットからＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的Ｔ細胞を検出するためのＣｙｓ変異体ＭＨＣと野生型ＭＨＣ検出分子を比較した染色指数。染色指数は（陽性の中央値−陰性の中央値）／（陰性のＳＤ＊２）として計算した。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子で３倍高い染色指数が検出された。
【００２１】
【図２】（Ａ）２つの異なる健常なドナーのＰＢＭＣからＣｙｓ変異体ＭＨＣ及び野生型ＭＨＣ検出分子（ＡＰＣタグ付き）を用いてＡ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的Ｔ細胞を検出するためのフローサイトメトリー解析の比較ドットプロット。２×１０6個のＰＢＭＣを、Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶウイルス由来抗原に特異的なＣｙｓ変異体Ａ２検出分子又は野生型Ａ２検出分子で染色した。同等の抗原特異的Ｔ細胞頻度（ドットプロット上の数字は全ＣＤ８＋細胞に対するパーセント割合）が見られたが、やはり、ＡＰＣフルオロフォアでタグ付けしたＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子用いると、より明るく、より良好な分離が得られた。（Ｂ）図２Ａのプロットから、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的Ｔ細胞を検出するためのＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子と野生型ＭＨＣ検出分子を比較した染色指数。染色指数は（陽性の中央値−陰性の中央値）／（陰性のＳＤ＊２）として計算した。２つのドナー試料のどちらにおいても、ＡＰＣでタグ付けしたＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子で、野生型ＭＨＣ検出分子と比較して６〜８倍の染色指数が検出された。
【００２２】
【図３】（Ａ）健常なドナーのＰＢＭＣからＣｙｓ変異体ＭＨＣ及び野生型ＭＨＣ検出分子（ＡＰＣタグ付き）を用いてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（Ａ２）制限−ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（ＥＢＶ  ＢＲＬＦ１）及びＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（ＣＭＶ  ＩＥ１）特異的Ｔ細胞を検出するためのフローサイトメトリー解析の比較ドットプロット。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子は、低頻度（Ａ２−ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ）と高頻度（Ａ２−ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を、野生型ＭＨＣ検出分子と同等に検出したが（ドットプロット上の数字は全ＣＤ８＋細胞に対するパーセント割合）、より明るく、より良好な分離が得られた。（Ｂ）図３Ａのプロットから、Ａ２−ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ及びＡ２−ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ特異的Ｔ細胞を検出するためのＣｙｓ変異体ＭＨＣと野生型ＭＨＣ検出分子を比較した染色指数。どちらのタイプの抗原特異的Ｔ細胞においても、野生型ＭＨＣ検出分子と比較して、ＡＰＣでタグ付けしたＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子ではるかに高い染色指数が検出された。
【００２３】
【図４Ａ】コンビコーディングを用いて検出された抗原特異的Ｔ細胞のフローサイトメトリープロット。ドットプロットは、検出された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示し、灰色のドットはｐＭＨＣ検出分子陰性又は単色陽性細胞を表し、黒色のドットは２色検出分子陽性細胞を表す。ドットプロットは、並行してＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子及び野生型ＭＨＣ検出分子を用いて検出したＴ細胞を比較する。２×１０6個の健常なドナーのＰＢＭＣを、異なる抗原特異性の、２色コンビコーディングした検出分子のプールで染色した。同定された２色の検出分子陽性のＣＤ８細胞を、それぞれの色の組み合わせでＸ軸とＹ軸にプロットしたプロットに示している。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣと野生型ＭＨＣ検出分子の間で、抗原特異的Ｔ細胞検出の相対的な頻度（ドットプロット上の数字は全ＣＤ８＋細胞に対するパーセント割合）が見られた。
【図４Ｂ】図４Ａで検出された所与の抗原特異的Ｔ細胞集団に用いた標識各色について、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣと野生型ＭＨＣ検出分子を比較した染色指数の倍率変化。３つの抗原特異的Ｔ細胞すべてにわたって、野生型ＭＨＣ検出分子と比べてＣｙｓ変異体ＭＨＣについては、より高い倍数変化が染色指数で見られた。
【００２４】
【図５】（Ａ）メラノーマ患者の増殖ＴＩＬからＣｙｓ変異体ＭＨＣ及び野生型ＭＨＣ検出分子を用いて検出されたメラノーマ関連抗原特異的Ｔ細胞を表すドットプロット。１２個のメラノーマ関連抗原ペプチドのライブラリーを、コンビコーディング法を用いてスクリーニングした。メラノーマ患者試料の２つの同定されたＴ細胞集団を、それぞれの色の組み合わせで示し、同定された頻度（ドットプロット上の数字は全ＣＤ８＋細胞に対するパーセント割合）を２つのタイプのＴ細胞検出分子間で比較したドットプロット。（Ｂ）図５Ａのドットプロットに示されたメラノーマ関連抗原特異的Ｔ細胞の染色指数（図４Ｂに記載）の倍率変化。ドットプロットの上の数字は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのｐＭＨＣマルチマー陽性細胞のパーセント割合を表す。どちらのタイプの抗原特異的Ｔ細胞でも、野生型ＭＨＣ検出分子と比べてＣｙｓ変異体ＭＨＣについては、より高い倍数変化が染色指数で見られた。
【００２５】
【図６】（Ａ）Ｃｙｓ変異体ＭＨＣＩ分子を用いて組み立てられたロード可能な検出分子の模式図。ロード可能なＣｙｓ変異体検出分子を−２０℃で保存し、必要に応じてペプチドでロードした。（Ｂ）ロード可能なマルチマーに対するペプチドのロード時間とペプチド濃度の最適化。ＦＬＵ  ＭＰ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ抗原ペプチドを異なる時点で４つの異なる抗原濃度（０．１、１、１０、及び１００μＭ）でＣｙｓ変異体Ａ２検出分子にロードした。所与のペプチド濃度の各時点の後、健常なドナーのＰＢＭＣから２ｘ１０6細胞を染色することによって、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的Ｔ細胞を検出した。試験ペプチド濃度ごとに、検出分子陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞として検出された頻度をインキュベーション時間に対してプロットした。機能的な抗原特異的ロード済み検出分子は、わずか１分で、ロード可能なＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子から変換することができる。
【００２６】
【図７】ロード可能なＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子を用いたコンビコーディング戦略によって同定されたメラノーマＴＩＬ中のネオアンチゲン特異的Ｔ細胞。４３個のＡ２制限ペプチド（ネオアンチゲン）に対するｐＭＨＣ  Ｃｙｓ変異体検出分子を、それぞれ２色の組み合わせで精製した。ロード可能なＣｙｓ変異体Ａ２検出分子を１００μＭのペプチドと１５分間インキュベートし、続いてメラノーマ患者の２×１０6個のＴＩＬを染色した。ドットプロットは、この患者試料で同定された３つのネオアンチゲン特異的Ｔ細胞集団を示し、それぞれの集団は蛍光色素とペプチド配列の表示とともに示されている。ネオアンチゲンの変異したアミノ酸の位置を下線と太字で示した。ドットプロットの上の数字は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのｐＭＨＣマルチマー陽性細胞のパーセント割合を表す。
【００２７】
【図８Ａ】Ｃｙｓ変異体Ａ２分子を用いて調製した検出分子の間で比較した抗原ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）。Ａ２−ＧＩＬＧＧＦＶＦＴＬ（ＦＬＵ  ＭＰ）特異的検出分子を、野生型Ａ２又はＣｙｓ変異体Ａ２を用い、ロード可能なマルチマーを用いて調製した。ｐＭＨＣマルチマーを調製した後、分子量カットオフスピンカラムを用いて過剰なペプチドを除去し、マルチマーを３つの異なる温度で指示された時間インキュベートし、その後健常なドナーのＰＢＭＣから、Ｔ細胞検出の効率を測定した。Ｔ細胞検出の効率として測定したペプチドの解離率は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の優れた安定性を示している。野生型のＭＨＣ  Ａ２を用いて調製した検出分子は、３７℃で１２時間後からＴ細胞検出の効率の減少を示すのに対して、Ｃｙｓ変異体Ａ２検出分子は、３７℃で４８時間時点まで同じ検出効率で機能する。
【図８Ｂ】野生型ＭＨＣ  Ａ２分子を用いて調製した検出分子の間で比較した抗原ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）。Ａ２−ＧＩＬＧＧＦＶＦＴＬ（ＦＬＵ  ＭＰ）特異的検出分子を、野生型Ａ２又はＣｙｓ変異体Ａ２を用い、ロード可能なマルチマーを用いて調製した。ｐＭＨＣマルチマーを調製した後、分子量カットオフスピンカラムを用いて過剰なペプチドを除去し、マルチマーを３つの異なる温度で指示された時間インキュベートし、その後健常なドナーのＰＢＭＣから、Ｔ細胞検出の効率を測定した。Ｔ細胞検出の効率として測定したペプチドの解離率は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の優れた安定性を示している。野生型のＭＨＣ  Ａ２を用いて調製した検出分子は、３７℃で１２時間後からＴ細胞検出の効率の減少を示すのに対して、Ｃｙｓ変異体Ａ２検出分子は、３７℃で４８時間時点まで同じ検出効率で機能する。
【００２８】
【図９】抗原特異的Ｔ細胞検出のためのハイスループットのバーコーディング法に利用したＣｙｓ変異体Ａ２分子。１７５個の抗原（１６７個のがん関連抗原及び８個のウイルス由来抗原）のライブラリーをスクリーニングして、健常なドナーのＰＢＭＣから抗原特異的Ｔ細胞を同定した。検出分子は、Ｃｙｓ変異体Ａ２又は野生型Ａ２分子を用いて組み立てた。各抗原特異的検出分子を、ユニークなＤＮＡバーコードでタグ付けした。１７５個の抗原特異的検出分子のプールしたライブラリーを５×１０6個の健常なドナーＰＢＭＣと染色した。１７５個すべてのｐＭＨＣ特異性（ｘ軸）に対するＣｙｓ変異体Ａ２分子と野生型Ａ２分子から作った検出分子の比較結果をプロット上に示す。Ｙ軸にしたデータは、ＤＮＡバーコード化検出分子の−ｌｏｇ１０（Ｐ）（ｐＭＨＣ関連ＤＮＡバーコードを対する）である。ｘ＝３の点線（−ｌｏｇ１０（０．００１））は、選択された閾値を表し、これより上の読み出しはすべて、同定された抗原特異的Ｔ細胞に対して有意であるとみなされる。
【００２９】
【図１０】Ｃｙｓ変異体Ａ２分子を用いたハイスループットのバーコーディング法で想定されたがん関連抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞。２名のメラノーマ患者のＴＩＬにおいて、１７５個の抗原（１６７個のがん関連抗原及び８個のウイルス由来抗原）のライブラリーをスクリーニングして抗原特異的Ｔ細胞を同定した。検出分子は、Ｃｙｓ変異体Ａ２分子又は野生型Ａ２分子を用いて組み立てた。各抗原特異的検出分子を、ユニークなＤＮＡバーコードでタグ付けした。１７５個の抗原特異的Ｔ細胞検出分子のプールされたライブラリーを３〜５×１０6個のメラノーマ患者ＴＩＬと染色した。１７５個すべてのｐＭＨＣ特異性（ｘ軸）に対するＣｙｓ変異体Ａ２分子と野生型Ａ２分子から作った検出分子の比較結果をプロット上に示す。Ｙ軸にプロットしたデータは、ＤＮＡバーコード化検出分子の−ｌｏｇ１０（Ｐ）（ｐＭＨＣ関連ＤＮＡバーコードに対する）である。ｘ＝３の点線（−ｌｏｇ１０（０．００１））は、選択された閾値を表し、これより上の読み出しはすべて、同定された抗原特異的Ｔ細胞に対して有意であるとみなされる。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子（三角形）のみが、メラノーマ患者試料の両方において、がん関連抗原特異的Ｔ細胞を同定することができた。
【００３０】
【図１１】Ｃｙｓ変異体Ａ２分子と野生型Ａ２分子のＴＣＲ認識プロファイルの比較。シャノンロゴ（Shannon logos）は、ペプチドの各位置におけるｐＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用に必要なアミノ酸を示している。ＴＣＲ認識プロファイルは、元のＫＬＬＥＩＡＰＮＹペプチドのアミノ酸バリデーションをもつ１９２個のペプチド−Ａ２マルチマーのＤＮＡバーコード標識ライブラリーを用いて生成した。これらのペプチドバリエーションそれぞれに対するＴＣＲ認識を、メルケル細胞ポリオーマウイルス由来エピトープであるＡ２−ＫＬＬＥＩＡＰＮＹを認識する２つのＴ細胞クローンについて、Ｃｙｓ変異体Ａ２分子又は野生型Ａ２分子から調製したｐＭＨＣデキストラーマーを用いて決定した。Ｃｙｓ変異体Ａ２分子又は野生型Ａ２分子いずれかを用いた２つのＴ細胞クローンのＴＣＲフィンガープリントを示すシャノンロゴを表す。
【００３１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本発明をさらに詳しく論じる前に、まず以下の用語や慣例（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）を定義する。
【００３３】
検出分子
本発明の文脈では、「検出分子」という用語は、抗原ペプチドと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の相互作用を検出するために使用され得る実体を指す。
【００３４】
本明細書に記載の検出分子は２つの形態で存在する。（ｉ）いかなる抗原ペプチドも結合していない１つ又は複数のＭＨＣクラスＩ分子（すなわちペプチドフリー／空のＭＨＣ分子）を含むロード可能な形態及び（ｉｉ）１つ又は複数のペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済みの形態ある。
【００３５】
検出分子はまた、検出分子によって提示される抗原ペプチドと、ＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の相互作用の検出を可能にする１つ又は複数の検出可能な標識も含む。したがって、検出分子は、例えば、（ｉ）Ｔ細胞の集団における１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞の同定、及び（ｉｉ）抗原特異的検出分子の大きなライブラリーのＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用をスクリーニングすることによるＴＣＲフィンガープリンティングに利用することができる。
【００３６】
検出分子は、１つ又は複数のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び検出可能な標識に結合しているコネクター分子及び／又はスカフォールド分子を含んでいてもよい。検出分子が２つ以上のＭＨＣ分子を含む場合は、マルチマーと呼ばれることがある。
【００３７】
検出分子の１つのバリアントでは、コネクター分子は、４つのＭＨＣ分子と結合したストレプトアビジンであり、それによってテトラマーを形成している。あるいは、検出分子は、ＭＨＣ分子が直接又はコネクター分子を介して結合した多糖スカフォールドを含むこともできる。多糖はデキストランであることができる。
【００３８】
ＭＨＣ及びＣｙｓ変異体ＭＨＣ
本発明の文脈では、「ＭＨＣ」という用語は主要組織適合性複合体を指し、その主な機能が、病原体に由来する抗原ペプチドと結合し、それらを適切なＴ細胞による認識のために細胞表面に提示することあるタンパク質複合体である。
【００３９】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子という２つの大きなクラスがある。本明細書では、「ＭＨＣ」はＭＨＣクラスＩ分子を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣ遺伝子から作られるアルファ鎖（重鎖）及びβ２−マイクログルブリン遺伝子から作られるベータ鎖（軽鎖又はβ２−マイクログルブリン）からなる。
【００４０】
重鎖は、それぞれアルファ−１、アルファ−２、アルファ−３と呼ばれる３つのドメインからなる。アルファ−１ドメインは、非共有結合で結合したβ２−マイクログルブリンの隣に位置する。アルファ−３ドメインは膜貫通ドメインであり、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞膜に固定している。アルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインは一緒になって、特異的な抗原ペプチドを結合するペプチド結合溝を含有するヘテロ二量体を形成する。ペプチド結合溝のアミノ酸配列は、どの特異的抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合するかに関する決定因子である。
【００４１】
天然では、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖には、２つのジスルフィド架橋の形成をもたらす４つの保存されたシステイン残基がある。ＭＨＣクラスＩ分子が正しく折り畳まれたコンフォメーションには、アルファ−２ドメイン内のＣｙｓ１０１とＣｙｓ１６４の間に１つのジスルフィド架橋があり、アルファ−３ドメイン内のＣｙｓ２０３とＣｙｓ２５９の間にもう１つのジスルフィド架橋があり、アミノ酸の番号付けはシグナルペプチドを含まないＨＬＡ−Ａを参照している。
【００４２】
本発明では、２つのシステイン残基を組換え導入することによって、アルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインの間に追加のジスルフィド架橋を導入している。したがって、「Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ」という用語が本明細書において使用され、ＭＨＣ分子のペプチド結合クレフトに結合した抗原ペプチドなしに調製できる、ＭＨＣクラスＩ分子のジスルフィド安定化バージョンを指す。
【００４３】
したがって、「Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ」は、空の状態か、抗原ペプチドと結合しているかのいずれかでありうる。したがって、本発明の文脈では、抗原ペプチドを含まない空のＭＨＣ分子（Ｃｙｓ変異体ＭＨＣのみ可）と、抗原ペプチドが結合したＭＨＣ分子（野生型（ｗｔ）ＭＨＣでもＣｙｓ変異体ＭＨＣでも可）を指すｐＭＨＣ分子の間に区別がある。
【００４４】
ヒトの場合、ＭＨＣ複合体はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子複合体にコードされている。したがって、本発明の文脈では、「ＭＨＣ」という用語は「ＨＬＡ」も包含する。ＨＬＡには３つの主なタイプが存在し、したがって、本発明の文脈では、ＭＨＣには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃの遺伝子座にコードされているＨＬＡアレルが含まれるが、これらに限定されない。同様に、ＭＨＣには、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＭＩＣ  Ａ、ＭＩＣ  Ｂ、ＣＤ１ｄ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、及びＵＬＢＰ−３などのＭＨＣクラスＩ様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子
本発明の文脈では、「ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子」という用語は、抗原ペプチドが結合していないＭＨＣクラスＩ分子を指す。「ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子」、「空のＭＨＣクラスＩ分子」及び「ペプチド受容性ＭＨＣクラスＩ分子」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００４６】
ｐＭＨＣ
本発明の文脈では、「ｐＭＨＣ」という用語は、抗原ペプチドに結合している上記で定義されたＭＨＣ分子を指す。「ｐＭＨＣ」という用語は、抗原ペプチドに結合している野生型ＭＨＣ又はＣｙｓ変異体ＭＨＣのいずれかを指しうる。
【００４７】
変異体システイン残基
本発明の文脈では、「変異体システイン残基」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に人為的に導入されたシステイン残基を指す。したがって、変異体システイン残基は、対応する野生型ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖には存在しない。
【００４８】
変異体システイン残基は、当業者に公知の変異誘発技術、例えば部位特異的変異誘発によって導入することができる。
【００４９】
抗原ペプチド
本発明の文脈では、「抗原ペプチド」という用語は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合してペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を形成できるペプチドを指す。ｐＭＨＣ複合体は、抗原ペプチドを免疫細胞に提示して、Ｔ細胞受容体依存性の免疫応答を誘発することができる。ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子でありうる。
【００５０】
本発明の文脈では、「異なる抗原ペプチド」という表現は、非同一のアミノ酸配列をもつ抗原ペプチドを指す。
【００５１】
本発明の文脈では、「標的抗原ペプチド」という用語は、医薬候補の標的である抗原ペプチドを指す。したがって、医薬候補は、ＴＣＲ、抗原ペプチド応答性Ｔ細胞、小分子薬物、又は天然化合物でありうるが、これらに限定されない。潜在的なオフターゲットの問題を特定するために、標的抗原ペプチドの単一位置変異に基づく抗原ペプチドのライブラリーを作り、医薬候補との意図しない相互作用についてスクリーニングすることができる。これらの医薬候補のフィンガープリントを利用して有害作用のリスクを評価することができる。
【００５２】
標的抗原ペプチドは、がん関連エピトープ、ウイルスエピトープ、自己エピトープ又はその他の臨床的に関連性のある標的でありうるが、これらに限定されない。
【００５３】
エピトープ
本発明の文脈では、「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞のＴＣＲ又は医薬候補物質などの別の結合相手によって認識される抗原決定基を意味する。ｐＭＨＣによって提示されるエピトープは、いかなる異物に対しても高い特異性をもち、ＴＣＲとの相互作用は、ペプチド−ＭＨＣ−指向性方式での特異的なＴ細胞の効果的な増殖及び機能的な刺激を確実にする。
【００５４】
ライブラリー
本発明の文脈では、「ライブラリー」という用語は、複数の実体を指す。したがって、ライブラリーは、異なる抗原ペプチド又は核酸標識の複数（又はコレクション）であることができる。
【００５５】
検出可能な標識
本発明の文脈では、「検出可能な標識」という用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能な部位を指す。検出可能な標識は、試料中の結合した検出可能な部分の量を定量するために使用できる、蛍光シグナル、放射性シグナル、発色性シグナルなどの測定可能なシグナルを生成することができる。検出可能な標識はまた、核酸標識などの、シークエンシングによって解読されうる分子コード化標識であってもよい。
【００５６】
検出可能な標識は、共有結合的に、又はイオン結合、ファンデルワールス結合若しくは水素結合を通して、ＭＨＣ分子又はコネクター分子を介して検出分子に結合することができる。検出可能な標識の例としては、蛍光マーカー、核酸標識、放射性同位体、磁気マーカー及び金属標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の文脈では、「異なる検出可能な標識」という表現は、異なる読み出し、例えば異なる波長の蛍光発光又は異なる配列の核酸などを生じる検出可能な標識を指す。異なる検出可能な標識は、例えば２つの異なるフルオロフォアのように同じカテゴリーの標識に属してもよく、例えば放射性同位体及び核酸標識にように２つの異なるカテゴリーの標識に属してもよい。
【００５８】
試料
本発明の文脈では、「試料」という用語は、Ｔ細胞の集団を含む任意の溶液又は固体画分を指す。Ｔ細胞集団には、異なる特異性をもつＴ細胞が入っている可能性がある。
【００５９】
試料はどの特定のソースにも限定されないが、末梢血単核細胞、腫瘍、組織、骨髄、生検組織（biopsies）、血清、血液、血漿、唾液、リンパ液、胸膜液、脳脊髄液（cerospinal fluid）及び滑液でありうる。試料は対象から抽出することができる。個人から抽出された試料は、がん若しくは疾患の間又は免疫療法後の免疫応答を特定及び評価するために、本明細書に記載の方法に供することができる。
【００６０】
コネクター分子
本発明の文脈では、「コネクター分子」という用語は、検出分子の一部であり、１つ又は複数のＭＨＣ分子に結合している分子実体を指す。コネクター分子は、ＭＨＣ分子上に位置するアフィニティータグに非共有結合的に結合することができる。
【００６１】
コネクター分子の例としては、ストレプトアビジン、アビジン、金属イオンキレート、抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
コネクター分子はまた、デキストランのような多糖などのスカフォールド分子に結合していてもよい。それによって、検出分子は、少なくとも５つのコネクター分子、少なくとも１０個のコネクター分子、例えば少なくとも１５個のコネクター分子などの、スカフォールド分子に結合した２つ以上のコネクター分子を含みうる。
【００６３】
アフィニティータグ
本発明の文脈では、「アフィニティータグ」という用語は、ＭＨＣ分子上に位置する部位を指す。アフィニティータグは、コネクター分子に非共有相互作用で非常に特異的に結合する。アフィニティータグの例としては、ビオチン、抗体エピトープ、Ｈｉｓタグ、ストレプトアビジン、ストレプトタクチン、ポリヒスチジン、ペプチド、ハプテン、及び金属イオンキレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
非共有相互作用
本発明の文脈では、「非共有相互作用」という用語は、共有結合以外の相互作用を介した任意の結合を意味する。非共有結合は、例えば疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン相互作用、ファンデルウォール力、水素結合、及びそれらの組み合わせによって形成されうる。
【００６５】
バーコード領域
本発明の文脈では、「バーコード領域」という用語は、核酸標識の一部を形成する領域を指す。バーコード領域は、増幅及び／又はシーケンシングの際に、核酸標識が付いた検出分子を識別するために使用できるコードとして機能する多数の連続した核酸を含む。
【００６６】
核酸標識のライブラリーの各メンバーは、核酸標識ライブラリーの１つ１つのメンバー及びそれに結合している検出分子の識別を可能にする別個のヌクレオチド配列をもつユニークなバーコード領域を含む。ユニークなバーコード領域により、検出分子と、それらが結合する標的、例えばＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の相互作用をモニタリングすることが可能になる。
【００６７】
バーコード領域は、核酸標識ライブラリーのサイズに応じて長さが異なっていてもよい。したがって、バーコード領域は、いかなる特定の長さに限定されず、５〜１００個のヌクレオチド、好ましくは５〜３０個のヌクレオチドを含みうる。
【００６８】
バーコード領域はＰＣＲで増幅することができる。この目的を達成するために、バーコード領域は、バーコード領域の増幅を可能にするプライマー領域（フォワード及びリバース）によって隣接されていてもよい。プライマー領域は核酸標識の３’末端と５’末端に配置され、バーコード領域はプライマー領域間に配置されている。
【００６９】
ユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域
本発明の文脈では、「ユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域」という用語は、増幅に続いて特定の配列のオリゴヌクレオチドソースの初期数を決定するために使用できる核酸標識の領域を指す。ＵＭＩ領域は、２〜４、４〜６、６〜８、又は８〜１０個のヌクレオチド塩基を含みうるランダムな配列である。非常に大きなライブラリーの場合、ＵＭＩ領域は１０個より多い塩基を含むこともある。
【００７０】
固体基材
本発明の文脈では、「固体基材」という用語は、検出分子が結合できる任意の種類の不溶性材料を指す。検出分子は、固体基材に共有結合又は可逆的に結合することができる。固体基材に結合している検出分子は、過剰な試薬又は溶媒から（濾過、クロマトグラフィー、遠心分離などによって）容易に分離することができる。
【００７１】
固体基材としては、マイクロアレイ、スライドガラス（ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅｓ）、ビーズ、ウェルプレート、粒子、フィルター、ゲル、チューブ、ペトリ皿などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
固定化されたロード可能な検出分子を含む固体基材は、ＴＣＲや抗原ペプチド応答性Ｔ細胞などの医薬候補物質のフィンガープリンティングのアレイ化した抗原ペプチドライブラリーを迅速に生成するために利用することができる。
【００７３】
配列同一性
本発明の文脈では、「配列同一性」という用語は、ここでは、遺伝子又はタンパク質間の、それぞれヌクレオチド、塩基又はアミノ酸レベルでの配列同一性として定義される。具体的には、ＤＮＡ配列の転写物が同一のＲＮＡ配列に転写されうる場合、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列は同一であるとみなされる。
【００７４】
したがって、本発明の文脈では、「配列同一性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度であり、ヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列をアラインメントしたときに、各配列の所与の位置のアミノ酸配列を比較することによって決定することができる。同様に、核酸配列同一性は、配列をアラインメントしたときに、各配列の所与の位置のヌクレオチド配列を比較することによって決定することができる。
【００７５】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性のパーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列にギャップが導入されることがある）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば重複位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【００７６】
別の実施形態では、２つの配列は異なる長さであり、ギャップは異なる位置と見なされる。手作業で配列をアラインメントし、同一のアミノ酸の数を数えることもできる。あるいは、パーセント同一性の決定に数学的アルゴリズムを用いて２つの配列のアライメントを行うこともできる。そのようなアルゴリズムは、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ. １９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて行って、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。
【００７７】
比較目的のためにギャップのあるアラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができまる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うこともできる。ＮＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖを参照されたい。あるいは、配列同一性は、例えば、ＥＭＢＬデータベースのＢＬＡＳＴプログラム（ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｇｏｖ/ｃｇｉ-ｂｉｎ/ＢＬＡＳＴ）によって配列をアラインメントした後に計算することもできる。一般的には、例えば「スコアリングマトリクス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）」や「ギャップペナルティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）」などに関するデフォルトの設定を、アライメントに使用することができる。本発明においては、ＢＬＡＳＴＮ及びＰＳＩ  ＢＬＡＳＴのデフォルト設定が有利なことがある。
【００７８】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容してもしなくても、上記ものと同様の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の計算では、完全な一致だけがカウントされる。したがって、本発明の一実施形態は、ある程度の配列多様性を有する本発明の配列に関する。
【００７９】
抗原ペプチドとＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞との間の相互作用を、柔軟にかつ迅速に高感度でスクリーニングする方法
ペプチド−主要組織適合複合体（ｐＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ分子のＴ細胞媒介認識は、細胞内病原体及び癌がんの制御、並びに効率的な細胞傷害性応答の刺激及び維持に極めて重要である。そのような相互作用はまた、自己免疫疾患の発症にも関与している可能性がある。この機構への新しい洞察は、疾患発症を理解し、新しい治療戦略を確立するために極めて重要である。Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）による最初の報告が、ｐＭＨＣクラスＩ分子の四量体化はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ｐＭＨＣ相互作用に十分な安定性をもたらし、フローサイトメトリーを用いたＭＨＣマルチマー結合Ｔ細胞の検出を可能にすることを示して以来、ＭＨＣマルチマーが抗原応答性Ｔ細胞の検出に使用されてきた。ｐＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用のスクリーニングのための迅速で信頼性の高いプラットフォームを提供することを目的として、数多くの方法が開発されてきた。ＭＨＣマルチマーに基づいたさまざまな種類の標識を含む検出分子が検討されてきた。
【００８０】
しかし、ＭＨＣ抗原提示に基づく技術を、高感度で真にハイスループットのプラットフォームに発展させるという難しい課題が未だに残っている。これは、抗原ペプチドがなければＭＨＣ分子の再折り畳みは不可能であり、結果的にその作製は複雑で高価であるからである。数千のＭＨＣクラスＩアロタイプが存在するだけでなく、スクリーニングされるべき抗原ペプチドごとに新たに個別化されたｐＭＨＣマルチマーが作製されなければならない。抗原ペプチドなしでＭＨＣ分子を作製し、代わりに、検出分子を組み立てる直前に必要に応じて抗原ペプチドを加えれば、より効率的でかつ柔軟性があると思われる。ＭＨＣ分子を含む完全に組み立てられた検出分子を抗原ペプチドなしで作製し、その代わりに必要に応じて抗原ペプチドを加えることはさらに好ましいであろう。
【００８１】
したがって、Ｔ細胞の検出のためのハイスループットの方法を提供するために、本発明の検出分子は、検出分子の作製の後に抗原ペプチドを添加できる空のＭＨＣクラスＩ分子を備えることができる。ＭＨＣクラスＩ分子は、重鎖のアルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインを連結するジスルフィド架橋を人為的に導入することによって安定化され、それによってＣｙｓ変異体ＭＨＣバリアントを生成することができる。ジスルフィド架橋は、Ｃ末端のペプチド結合ポケットの遠位端のペプチド結合溝の外側に配置されている。このＭＨＣクラスＩ分子の構造の変化は、結合した特異的な抗原ペプチドのコンフォメーション効果及び動的効果を模倣し、それによってＭＨＣクラスＩ分子を安定化する。
【００８２】
天然のクラスＩ  ＭＨＣ分子は、多様な配列のペプチドに特異的な親和性で結合する。これは、ペプチドの結合を促進するポケット（典型的にはＭＨＣ結合溝のＡ及びＦポケット）を形成するペプチド結合溝の末端に保存されたアミノ酸を使用することによって達成される。これらの結合ポケットは、通常アンカーモチーフと呼ばれる抗原ペプチド（典型的には２位又は３位、ペプチドのＣ末端位置）の結合に必要な一連の要件を決定する。天然のＭＨＣクラスＩ分子は、アンカーモチーフの認識を通して多くの異なる抗原ペプチドと結合するが、各アレルは、利用可能なすべての抗原ペプチドのうちの特異なサブセットのみと高い親和性で結合する。しかし、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の人為的に導入されたジスルフィド結合は、結合した特異的抗原ペプチドのコンフォメーション効果と動的効果を模倣するので、本明細書に記載の検出分子は、多種多様な抗原ペプチドを結合できるペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を用いて作製することができる。これらのすぐに使えるロード可能な検出分子は、単一ステップのペプチド添加で抗原特異的ｐＭＨＣクラスＩ分子を含むロード済み検出分子に変換でき、ＭＨＣマルチマーの大きなアレイを迅速に生成することを必要とする最先端の抗原特異的Ｔ細胞検出プラットフォームに完璧に適合する。
【００８３】
さらに、本発明者らは、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドを含む検出分子は、従来のｐＭＨＣ分子を含む検出分子よりも、長期間にわたって安定であり、より良好な性能（すなわち高感度）を示すことを見出した。したがって、改良された検出分子は、例えば個別化免疫療法のためにＴ細胞の認識を迅速かつ効果的に評価する上で非常に有利であろう。
【００８４】
ここでは、迅速なワンステップで抗原ペプチドと組み立てることができるペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子について記載する。この検出分子は、ＴＣＲ又はＴ細胞の検出の向上に利用でき、最終的には、稀で弱い相互作用であっても同定することを可能にする。したがって、本発明の第１の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
ｖ．ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも１つの抗原ペプチドがそれぞれ、
−少なくとも２つの異なる検出可能な標識、又は
−核酸標識である少なくとも１つの検出可能な標識
によって表される方法に関する。
【００８５】
ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖内部にアルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインを結ぶジスルフィド架橋を人為的に導入することで安定化させることができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は本明細書に記載の方法に関し、ここではペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によってアルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインを含む重鎖を含む。
【００８６】
そのような改変は、当業者に公知の変異誘発技術、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。具体的には、重鎖のアミノ酸配列に２つの変異体システイン残基が導入されて、アルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインの間のジスルフィド架橋の形成が可能になる。したがって、本発明の一実施形態は、ジスルフィド架橋がアルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基との間に形成される本明細書に記載の方法に関する。
【００８７】
好ましくは、変異導入の位置は、アルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基が、正常なタンパク質フォールディング条件下でジスルフィド架橋の形成を可能であろう空間的距離内にあるように選択される。したがって、本発明の一実施形態は、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基との間の空間距離が、２〜８オングストロームなどの２〜１０オングストローム、好ましくは２〜５オングストロームである本明細書に記載の方法に関する。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列が、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性などの（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
前記（said）アミノ酸配列が、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９０】
２つのシステイン残基の好ましい変異には、１３９位のアミノ酸及び８４位又は８５位のいずれかのアミノ酸の改変が含まれる。１３９位のアミノ酸は、重鎖のアルファ−２ドメインに位置し、多くの場合、アラニン残基である。８４位又は８５位のアミノ酸は、重鎖のアルファ−１ドメインに位置し、多くの場合、チロシン残基である。システインの変異は、標準的な遺伝子工学を用いて重鎖の遺伝子配列を改変することを通したアミノ酸の置換によって導入することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、アルファ−１ドメインの変異体システイン残基がアミノ酸残基８４又は８５にあり、アルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基がアミノ酸残基１３９にある本明細書に記載の方法に関する。
【００９１】
ＭＨＣクラスＩ分子が折り畳まれると、Ｃｙｓ−８４又はＣｙｓ−８５とＣｙｓ−１３９の間にジスルフィド架橋が形成される。新たに形成されたジスルフィド架橋は、ＭＨＣクラスＩ分子を安定化し、その結果抗原ペプチド不在でも溶液中で安定した状態を維持する。システイン変異体残基の導入は、どのようなタイプのＭＨＣクラスＩ分子にも適用することができる。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、脊椎動物のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子、例えばヒトや、ネズミ、ラット、ブタ、ウシ又はトリなどの分子である本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がヒトの分子である本明細書に記載の方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＭＩＣ  Ａ、ＭＩＣ  Ｂ、ＣＤ１ｄ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、及びＵＬＢＰ−３からなる群より選択されるＭＣＨ分子に基づく本明細書に記載の方法に関する。
【００９２】
本明細書に記載の方法はまた、マウスに由来するペプチドフリーＭＨＣ分子での使用にも適用可能である。このマウスＭＨＣ分子はＨ−２複合体と呼ばれる。したがって、本発明の一実施形態は、重鎖が、Ｈ−２ＫｂやＨ−２ＤｂなどのＨ−２分子である本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号１２若しくは配列番号１３のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９３】
ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子の好ましいバリアントとしては、それぞれが２つの変異体システイン残基を含むＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨ−２が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２〜１３のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列が、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９４】
本発明の別の実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２〜１３のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性などの（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
そのアミノ酸配列が、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９５】
「配列番号２〜１３」という表現は、「配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３」と理解されるべきであることに留意されたい。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２〜１１のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９７】
本発明のさらにさらなるは、重鎖が、
（ａ）配列番号２〜６のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９８】
Ｔ細胞検出によく利用されるＨＬＡのアレルは、ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１アレルである。したがって、本発明の好ましい実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性などの（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、又はその配列からなる本明細書に記載の方法に関する。
【０１００】
天然では、重鎖はβ２−ミクログロブリン分子（Ｂ２Ｍ）と結合してＭＨＣクラスＩ分子を形成する。具体的には、重鎖のアルファ−３ドメインがＢ２Ｍに隣接して配置されている。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がβ２−ミクログロブリン分子を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１０１】
本発明の別の実施形態は、β２−ミクログロブリン分子が
（ａ）配列番号１５、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１０２】
ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子はまた、は、Ｂ２Ｍがリンカーを介して重鎖に連結された最終的な融合タンパク質として提供することもできる。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、
（ａ）配列番号１６、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１０３】
本発明の検出分子は、単一の検出分子内に例えば数個のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を組み立てるのに適したコネクター分子をさらに含む複合分子として提供することができる。したがって、本発明の一実施形態は、ロード可能な検出分子が、少なくとも１つのコネクター分子、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がコネクター分子に結合している本明細書に記載の方法に関する。
【０１０４】
コネクター分子は、アフィニティータグ付きのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がモジュール式で固定できる柔軟なテンプレートを形成する。アフィニティータグは、限定されないが非共有相互作用を介してコネクター分子に特異的に結合する分子種である。ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子それぞれにアフィニティータグを結合することによって、カスタムメイドのロード可能な検出分子を組み立てることが容易である。したがって、本発明の好ましい実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がアフィニティータグを含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、コネクター分子とペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のアフィニティータグとの間の非共有相互作用を介してコネクター分子に結合している本明細書に記載の方法に関する。
【０１０６】
アフィニティータグとコネクター分子の多くの既知の互いに対応するペアが本発明に使用することができ、例としては、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラビジン、ビオチン／ストレプトタクチン、ポリＨｉｓ／金属イオンキレート、ペプチド／抗体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、エピトープ／抗体、マルトース結合タンパク質／アミラーゼ及びマルトース結合タンパク質／マルトースなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の既知の互いに対応するアフィニティータグとコネクター分子のペアも、本発明に使用することができる。本発明の一実施形態は、アフィニティータグが、ビオチン、抗体エピトープ、Ｈｉｓタグ、ストレプトアビジン、ストレプトタクチン、ポリヒスチジン、ペプチド、ハプテン及び金属イオンキレートからなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、コネクター分子が、ストレプトアビジン、アビジン、金属イオンキレート及び抗体からなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、コネクター分子がストレプトアビジンであり、アフィニティータグがビオチンである本明細書に記載の方法に関する。
【０１０７】
ビオチンなどのアフィニティータグは、ＭＨＣクラスＩ分子上に配置される。ビオチンの重鎖への結合は、重鎖のビオチン化のためのＡｖｉタグなどのハンドル（ｈａｎｄｌｅ）を含めることによって達成することができる。したがって、本発明の一実施形態は、重鎖がＡｖｉタグを含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号１４、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１０８】
本発明の変形形態では、検出分子は、コネクター分子又はペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が結合できるスカフォールド分子を含む。典型的には、この変形形態では、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子がコネクター分子に結合することになり、次にそれがスカフォールド分子に結合している。これらの結合は共有結合でも非共有結合でもよく、好ましくは非共有結合である。スカフォールド分子は、デキストランなどの多糖類でありうるが、これに限定されない。したがって、本発明の一実施形態は、ロード可能な検出分子が、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含む少なくとも１つのコネクター分子に結合しているスカフォールド分子を含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、スカフォールド分子がデキストランであり、コネクター分子がストレプトアビジンである本明細書に記載の方法に関する。
【０１０９】
他の好適なスカフォールド分子の例としては、多糖類、合成多糖類、ビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、誘導体化セルロース系プラスチック、ストレプトタクチン、ポリストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
試料中の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞に対する検出分子の十分な結合を確保するために、ロード可能な検出分子は、２つ以上のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を備えることができる。ＭＨＣマルチマーはここ数十年の間に広く使用されてきており、特にＭＨＣテトラマーはＴ細胞検出技術のなかでも最先端の技術とみなされている。したがって、本発明の一実施形態は、ロード可能な検出分子が、少なくとも３つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子などの少なくとも２つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子、好ましくは４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、ロード可能な検出分子が、ストレプトアビジンと、各ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のビオチンタグとの間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１１１】
ロード可能な検出分子は、少なくとも１つの検出可能な標識を含み、コネクター分子、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子又はスカフォールド分子に結合されていてもよい。好ましくは、検出可能な標識はコネクター分子に結合している。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つの検出可能な標識がコネクター分子に結合している本明細書に記載の方法に関する。検出可能な標識の結合は、共有結合又は非共有結合のいずれでもよい。
【０１１２】
各検出分子の検出可能な標識の数は、検出のモードに応じて異なりうる。少なくとも１つの抗原ペプチドのそれぞれが、少なくとも２つの異なる検出可能な標識によって表される検出の場合、各検出分子は、蛍光マーカーや放射性同位体などの単一の検出可能な標識のみを含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施形態は、検出分子は単一の検出可能な標識を含む本明細書に記載の方法に関する。少なくとも１つの抗原ペプチドのそれぞれが、核酸標識である少なくとも１つの検出可能な標識によって表される検出の場合、各検出分子は、前記核酸標識にくわえて、追加の検出可能な標識を含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施形態は、検出分子が核酸標識及び少なくとも１つの検出可能な標識を含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、検出分子が、核酸標識及び少なくとも１つの蛍光マーカー、好ましくは１つの蛍光マーカーを含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１１３】
ロード可能な検出分子は、抗原ペプチドが結合していない状態で組み立てられるので、必要に応じて使用直前に大きなライブラリーを迅速に生成するのに適している。スクリーニングの設定に応じて、異なる数の抗原ペプチドがアッセイに望まれる場合がある。あるアッセイでは、少量の非常に特異的なタイプのＴ細胞のみをスクリーニングするのが好ましいことがある一方で、他のアッセイでは、多くのさまざまな異なるＴ細胞を並行して同定するのが目的となることがある。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個の異なる抗原ペプチドなどの少なくとも２つの異なる抗原ペプチドが、ステップｉｉ）で用意される本明細書に記載の方法に関する。しかし、ロード可能な検出分子を利用する方法は、より大きなライブラリーにも適している。したがって、本発明の別の実施形態は、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個の異なる抗原ペプチドなどの少なくとも１，０００個の異なる抗原ペプチドがステップｉｉ）で用意される本明細書に記載の方法に関する。
【０１１４】
多数の異なる抗原ペプチドを同時にハイスループットでスクリーニングするためには、複数の異なるロード済み検出分子が生成され、試料と接触することが理解されるべきである。したがって、本発明の一実施形態は、複数のロード可能な検出分子が提供される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、試料が、複数又はライブラリーの異なるロード済み検出分子と接触する本明細書に記載の方法に関する。
【０１１５】
ｐＭＨＣ分子によって提示される抗原ペプチドが、最終的に本明細書に記載の方法によってどのタイプのＴ細胞が同定されるかを決める。本発明によるαＡＰＣスカフォールドと使用するのに適した抗原ペプチドは、本質的にどのようなソースからでもよい。抗原の源としては、ヒトや、ウイルス、細菌、寄生虫、植物、菌類、腫瘍を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明の一実施形態は、ｐＭＨＣ分子の抗原ペプチドが、ヒト、ウイルス、細菌、寄生虫、植物、真菌、及び腫瘍からなる群より選択される供給源に由来する本明細書に記載の方法に関する。
【０１１６】
抗原ペプチドは、例えばウイルスや腫瘍細胞の既知の免疫原性エピトープである可能性があり、したがって、この抗原に応答するＴ細胞の存在を検出及びそれに続くウイルス感染又はがんの診断を可能にする。抗原ペプチドは、未知のエピトープであることもあり、このエピトープに応答するＴ細胞の検出は、このペプチド内に免疫原性アミノ酸配列が存在することを意味し、例えばポリペプチドなどの免疫原性領域又はエピトープの同定を可能にする。
【０１１７】
本明細書に記載の方法の変形形態では、コンビコーディングアプローチに従って、ロード可能な検出分子が少なくとも１つの検出可能な標識を備え、抗原は少なくとも２つの異なる標識検出分子によって表されるか、又はコードされる。したがって、個々の抗原ペプチドは、それぞれが異なる蛍光マーカー又は放射性同位体などの異なる検出可能な標識を含む少なくとも２つの別個の検出分子にロードされる。
【０１１８】
ロード可能な検出分子は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの異なる検出可能な標識などの少なくとも２つの異なる検出可能な標識を備えていてもよい。したがって、抗原ペプチドは１つの多重標識検出分子によって表されうる。本発明の方法のこの変形形態では、各抗原ペプチドは、異なる蛍光マーカーなどの２つの異なる検出可能な標識を含む別個の検出分子にロードされる。
【０１１９】
したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つの抗原ペプチドが少なくとも２つの異なる検出可能な標識によって表され、ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合が、ロード済み検出分子を通して抗原応答性Ｔ細胞に結合した少なくとも２つの異なる検出可能な標識の存在を検出することによって検出される本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、個々の抗原ペプチドが、それぞれが異なる検出可能な標識を含む少なくとも２つの別個の検出分子上にロードされる本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の好ましい実施形態は、各抗原ペプチドが、２つの異なる検出可能な標識を含む別個の検出分子上にロードされる本明細書に記載の方法に関する。
【０１２０】
検出分子と抗原ペプチド応答性Ｔ細胞の間の相互作用は、検出可能な標識によって生じる読み出しによって検出される。原則として、どのような種類の検出可能な標識でも本発明の方法に使用することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、単独で、又は互いに組み合わせて、異なる種類の検出可能な標識の選択を用いて適用することができる。したがって、本発明の実施形態は、少なくとも２つの異なる検出可能な標識が、蛍光マーカー、放射性同位体、磁気マーカー及び金属標識からなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。これは例えば、２つの異なる蛍光標識又は金属標識を組み合わせた蛍光マーカーでありうる。
【０１２１】
蛍光マーカーは、蛍光マーカーが広範に利用可能であること及び大部分の研究室が蛍光測定に広く精通していることから、特に好ましい検出可能な標識を構成する。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも２つの異なる検出可能な標識が蛍光マーカーである本明細書に記載の方法に関する。本発明の方法にとって実用上重要なことは、蛍光マーカーが、一般的なフローサイトメーターに見られるレーザーラインで励起できることである。したがって、ＵＶレーザー（３５５ｎｍ）、紫レーザー（４０５ｎｍ）、青レーザー（４８８ｎｍ）、黄／緑レーザー（５６１ｎｍ）又は赤レーザー（６４０ｎｍ）で励起可能な蛍光マーカーが好ましい。したがって、本発明の一実施形態は、蛍光マーカーが、３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４０ｎｍからなる群より選択される波長で励起される１つ又は複数の蛍光マーカーである本明細書に記載の方法に関する。好適な蛍光マーカーの例としては、ＰＥ、ＢＶ４２１、ＢＵＶ３９５、ＡＰＣ−Ｃｙ（商標）７、ＡＰＣ、ＢＶ５１０、ＢＶ４８０、ＰＥ−Ｃｙ（商標）５、ＰＥ−ＣＦ５９４、ＰＥ−Ｃｙ（商標）７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ（商標）５．５、ＰｅｒＣＰ、ＦＩＴＣ、ＢＶ６０５、ＢＵＶ７３７、ＢＶ６５０、Ｖ５００、ＢＶ７８６、ＢＵＶ４９６、ＢＵＶ８０５、Ｖ４５０、ＡＰＣ−Ｒ７００、ＢＵＶ５６３、ＢＶ７１１、ＢＢ５１５及びＢＵＶ６６１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
量子ドット（ＱＤｏｔ）などの代替的な蛍光マーカーも、本明細書に記載の方法のために利用することができる。
【０１２３】
好ましい検出可能な標識の別のグループは、金属標識であり、これは良く知られた有益な標識グループを構成する。マスサイトメトリーは、細胞の特性の測定（サイトメトリー）に使用される、誘導結合プラズマ質量分析法と飛行時間型質量分析法に基づく質量分析技術である。このアプローチでは、抗体及びＭＨＣテトラマーなどの検出分子は、同位体的に純粋な金属元素を結合し、これらの抗体及びＭＨＣテトラマーを使用して細胞タンパク質、例えばＴ細胞を標識する。細胞を霧状にして、金属結合抗体とテトラマーをイオン化するアルゴンプラズマに通す。次いで、金属シグナルを飛行時間型質量分析計で分析する。このアプローチは、幅広い発光スペクトルを有しうる従来のフルオロフォアの代わりに、レポーターシステムとして別個の同位体を利用することによって、フローサイトメトリーにおけるスペクトル重複による潜在的な限界を克服する。
【０１２４】
ＣｙＴＯＦ（飛行時間によるサイトメトリー）が商品化され、一般的に使用されるさまざまな金属−抗体結合体が入手可能である。利点は、金属シグナルのオーバーラップが最小であることであり、その装置は、理論的には１つの細胞あたり１００個を超えるパラメーターを検出することができる。しかし、単一の金属標識に基づく現在の方法では、サイトメーターの使用が１つの細胞あたり約４０パラメーターに制限される。ＭＨＣテトラマーなどの検出分子に２つ以上の金属標識を組み合わせることにより、試料内で解析できるＴ細胞の特異性の数が劇的に増える。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも２つの異なる検出可能な標識が金属標識である本明細書に記載の方法に関する。
【０１２５】
コンビコーディングアプローチを用いて異なるＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞のより大きなプールを検出するためには、その方法では、より多く数の異なる検出可能な標識を導入する必要がある。したがって、本発明の一実施形態は、異なる検出可能な標識の数が、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０などのなどの少なくとも３である本明細書に記載の方法に関する。
【０１２６】
並行して検出できる抗原ペプチド応答性Ｔ細胞の数を増やす別の手段は、各抗原ペプチドを３つ以上の異なる検出可能な標識によって表すことである。したがって、本発明の一実施形態は、各抗原ペプチドが、少なくとも３つ又は少なくとも４つの異なる標識で表される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、各検出分子が、少なくとも３つ又は少なくとも４つの異なる標識を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１２７】
本明細書に記載の方法による検出のモードは検出可能な標識の選択に依存する。典型的には、当業者であれば、所与の検出可能な標識と、どの検出手段を組み合わせるべきかを知っているであろう。本発明の一実施形態は、検出が、フローサイトメトリー、蛍光スペクトロメトリー及びマスサイトメトリーからなる群より選択される１つ又は複数の方法を含む本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、検出可能な標識が蛍光マーカーであり、検出のモードがフローサイトメトリーである本明細書に記載の方法に関する。
【０１２８】
（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ座位の）アレル産物それぞれについて、推定１００，０００〜７５０，０００個のｐＭＨＣクラスＩ複合体が発現しており、各個人は〜１０7個の異なるＴＣＲを保有し、それぞれは所与のペプチド配列の最大で１０6の多様性を検出する。したがって、本明細書に記載の方法別の変形は、バーコーディングアプローチに従って、評価可能な抗原ペプチドのライブラリーのサイズを拡大し、ＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞が検出できる解析範囲を増加させる。
【０１２９】
バーコードは、結合している実体を一意的に識別する標識である。ユニークな標識の大きなリザーバーを生成できる優れた組み合わせの可能性があるので、核酸はバーコードとして好ましい構成要素である。核酸標識は、標識の識別を可能にする連続したヌクレオチドのユニークな領域（バーコード領域）、及びラベルの増幅を可能にするプライマー領域を含んでいてもよい
さらに、核酸標識は、特定の配列のオリゴヌクレオチドソースの初期数を推定するために使用することができる領域を含んでいてもよい。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つの検出可能な標識が、
ｉ．５’第１のプライマー領域（フォワード）、バーコード領域及び３’第２のプライマー領域（リバース）、並びに
ｉｉ．ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域を含む核酸標識であり、
そのバーコード領域が、検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである本明細書に記載の方法に関する。
【０１３０】
本発明の別の実施形態は、核酸標識が、ＤＮＡ標識、ＲＮＡ標識及び人工核酸標識からなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、核酸標識がＤＮＡ標識である本明細書に記載の方法に関する。
【０１３１】
増幅されたオリゴヌクレオチド材料を定量する際に考慮すべき重要なことは、得られたオリゴヌクレオチド材料の量が、単一のオリゴヌクレオチドソースに由来するのか、又はいくつかの同一のオリゴヌクレオチドソースに由来するのかということである。この問題を克服するために、オリゴヌクレオチド材料にユニークな分子識別子（ＵＭＩ）と呼ばれる小さな領域を加えることができる。これらのＵＭＩ領域は、増幅の後に、特定の配列のオリゴヌクレオチドソースの初期数を決定するために使用できるランダムな配列である。したがって、本発明の一実施形態は、核酸標識がランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域を含む本明細書に記載の方法に関する。このようなＵＭＩ領域は、２〜４、４〜６、６〜８又は８〜１０個のヌクレオチド塩基を含みうる。非常に大きなライブラリーの場合、ＵＭＩ領域は１０塩基より多い塩基を含むこともある。したがって、本発明の一実施形態は、ＵＭＩ領域が６〜８個のランダムヌクレオチド塩基を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１３２】
核酸標識のデザインは、１つ又は複数の追加要素を加えることによってさらに修正することができる。したがって、本発明の一実施形態は、核酸標識が、リンカー分子、シーケンシング用アダプター、及びアニーリング領域からなる群より選択される１つ又は複数をさらに含む本明細書に記載の方法に関する。中でも、シングルオリゴ核酸標識とデュアルオリゴ核酸標識の２つのデザインが好ましい。シングルオリゴ核酸標識は、フォワードプライマー、バーコード領域、リバースプライマー及びＵＭＩ領域を含む。デュアルオリゴ核酸標識は２つの配列からなり、第１の配列はフォワードプライマー領域、ＵＭＩ領域、第１のバーコード領域、及びアニーリング領域を含み、第２の配列は相補的なアニーリング領域、第２のバーコード領域、ＵＭＩ領域及びリバースプライマー領域を含む。デュアルオリゴ核酸標識の第１の配列はビオチン化されていてもよい。実施例６では、第１の配列はオリゴＡと呼ばれ、第２の配列はオリゴＢと呼ばれ、第１のバーコードはバーコードＡと呼ばれ、第２のバーコードはバーコードＢと呼ばれる。第１の配列を第２の配列とアニーリングした後、検出分子に結合する前に、第１及び第２の配列が伸長されて、それらの二本鎖の形態が得られる。検出分子結合Ｔ細胞を分離した後、ＤＮＡバーコードはＰＣＲで増幅され、シークエンシングで解析される。したがって、本発明の一実施形態は、核酸標識が２つの配列を含み、第１の配列がフォワードプライマー領域、ＵＭＩ領域、バーコード領域、及びアニーリング領域を含み、第２の配列が相補的なアニーリング領域、バーコード領域、ＵＭＩ領域及びリバースプライマー領域を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１３３】
Ｔ細胞に結合しているバーコード標識検出分子は、最初に蛍光マーカーを用いてソートすることができる。したがって、本発明の一実施形態は、ロード可能な検出分子が核酸標識及び蛍光マーカーを含む本明細書に記載の方法に関する。Ｔ細胞に結合している検出分子はしたがって、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などによって蛍光的にソートし、その後、関連する核酸標識の組成物を核酸増幅やハイスループットシーケンシングによって回収することができる。
【０１３４】
核酸標識は、大きな検出分子のライブラリーから個々のメンバーを同定するのに適している。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも５０個などの、少なくとも１００個などの、少なくとも５００個などの、少なくとも１，０００個などの、少なくとも１０，０００個などの、少なくとも１００，０００個などの、少なくとも１，０００，０００個などの少なくとも２５個の異なる抗原ペプチドが、ステップｉｉで用意される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、検出が、標識の増幅、標識のシーケンシング、ＤＮＡシーケンシング、質量分析、ゲル電気泳動、ゲル濾過、ＰＡＧＥ、カラム分画、ＰＣＲ、及びＱＰＣＲからなる群より選択される１つ又は複数の方法を含む本明細書に記載の方法に関する。好ましくは、ＤＮＡ標識を含む検出分子の検出はＤＮＡシーケンシングで行われる。
【０１３５】
本明細書に記載の方法は、性能を上げるための１つ又は複数の追加ステップを含むことができる。したがって、本発明の一実施形態は、インキュベーション、洗浄、精製及び分離からなる群より選択される１つ又は複数の追加のステップを含む本明細書に記載の方法に関する。追加のステップは、コンビコーディングアプローチ又はバーコードアプローチのいずれかに続いて、その方法に適用することができる。本発明の好ましい実施形態は、分離のステップが、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳソーティング、洗浄、遠心分離、沈殿、濾過、アフィニティーカラム、及び固定化からなる群より選択される１つ又は複数の方法を含む本明細書に記載の方法に関する。
【０１３６】
本発明の方法は、特定の種類の試料に限定されず、Ｔ細胞の集団を含むあらゆる溶液や固体画分に適用することができる。Ｔ細胞集団には、異なる特異性をもつＴ細胞が入っている可能性がある。試料の起源はどの特定の生物種にも限定されないが、ヒトの試料が好ましい。本発明の一実施形態は、試料が、末梢血単核細胞、腫瘍、組織、骨髄、生検組織、血清、血液、血漿、唾液、リンパ液、胸膜液、脳脊髄液及び滑液からなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態、細胞が、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ細胞、及び自然免疫型粘膜関連インバリアント（ｉｎｎａｔｅ  ｍｕｃｏｓａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ）Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞からなる群より選択される本明細書に記載の方法に関する。
【０１３７】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子は、どのような種類の抗原ペプチドでもロードでき、したがって、本方法は抗原ペプチドの特定の種類又はバリアントに限定されない。しかし、いくつかの抗原ペプチドのグループは、その治療又は診断用途の可能性に起因して、他のものよりも関心が高い。がん免疫療法では、がん関連エピトープ及び変異由来のネオエピトープに対するＴ細胞の認識を理解し、これらを治療戦略に活用する可能性に大きな関心が寄せられている。ほとんどの場合、ネオエピトープの認識を包括的に評価するためには、大きなｐＭＨＣライブラリーのスクリーニングが必要である。ロード可能な検出分子を適用する能力は、そのような大きなｐＭＨＣライブラリーを生成するプロセスを容易にすることになる。したがって、本発明の一実施形態は、抗原ペプチドが、がん関連エピトープ、ウイルスエピトープ、自己エピトープ及びそのバリアントから選択される本明細書に記載の方法に関する。本発明の別の実施形態は、がん関連エピトープが、ウイルスによって誘発されるがんに関連するウイルスエピトープ本明細書に記載の方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、ウイルスエピトープが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する本明細書に記載の方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、抗原ペプチドがネオエピトープである本明細書に記載の方法に関する。
【０１３８】
本明細書に記載のＣｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子は、免疫モニタリング用の、診断用の、及び免疫療法アプローチにおける適応Ｔ細胞移植に向けた抗原特異的Ｔ細胞の分離又は特異的刺激などの治療用途の、品質が保証された試薬（例えば検出分子）を作製するための効率的なツールである。本明細書に示されるように、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子は、野生型ＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子と比べて、柔軟性、安定性、感度に関して性能の向上をもたらす。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子は、野生型ＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子よりも高い蛍光強度を示し、検出分子陰性Ｔ細胞からの分離が良好で、その結果染色指数を増加させる。理論に縛られるものではないが、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子を含むロード済み検出分子の安定性の向上は、染色能に影響を与える可能性があると考えられる。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含むロード可能な検出分子が、野生型ＭＨＣクラスＩ分子を含む検出分子と比較して染色指数を増加させる本明細書に記載の方法に関する。染色指数は、検出の間の蛍光出力に基づいて、（陽性の中央値−陰性の中央値）／（陰性のＳＤ＊２）として計算される。
【０１３９】
本発明の別の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
ｖ．ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出することを含み、
少なくとも１つの抗原ペプチドがそれぞれ、少なくとも２つの異なる検出可能な標識によって表される方法に関する。他の態様のいずれか１つの文脈で記載された実施形態及び特徴はすべて、この特定の態様にも適用される。
【０１４０】
本発明の別の実施形態は、検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合が、少なくとも２つの異なる検出可能な標識を検出することによって検出される本明細書に記載の方法に関する。
【０１４１】
本発明のさらなる態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．ロード済み検出分子を試料と接触させること、並びに
ｖ．ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出することを含む方法に関する。
【０１４２】
他の態様のいずれか１つの文脈で記載された実施形態及び特徴はすべて、この特定の態様にも適用される。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つのｐＭＨＣクラスＩ分子の同一性を決定する追加のステップ（ｖｉ）を含む本明細書に記載の方法に関する。より明瞭には、本発明の一実施形態は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの核酸標識を含むロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチドを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を少なくとも１つの抗原ペプチドと接触させて、少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子を形成すること、
ｉｖ．ロード済み検出分子を試料と接触させること、
ｖ．ロード済み検出分子の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞への結合を検出すること、並びに
ｖｉ．少なくとも１つのｐＭＨＣクラスＩ分子の同一性を決定することを含む方法に関する。
【０１４４】
少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子は、試料からＴ細胞を検出するために、又は親和性に基づくＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用を測定し、結果としてＴＣＲの認識の優先傾向を示すために使用することができる。したがって、本発明の別の態様は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子に関する。他の態様のいずれか１つの文脈で記載された実施形態及び特徴はすべて、この特定の態様にも適用される。
【０１４５】
本発明の一実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が本明細書で画定された通りである本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。本発明の別の実施形態は、ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ−１ドメイン及びアルファ−２ドメインを含む重鎖本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号１、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性などの（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、又はその配列からなり、
前記アミノ酸配列が、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１４７】
本発明のさらなる実施形態は、アルファ−１ドメインの変異体システイン残基がアミノ酸残基８４又は８５にあり、アルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基がアミノ酸残基１３９にある本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１４８】
本発明のさらにさらなる実施形態は、重鎖が、
（ａ）配列番号２〜１３のいずれか１つ、又は
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性などの（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
そのアミノ酸配列は、アルファ−１ドメインに配置された変異体システイン残基とアルファ−２ドメインに配置された変異体システイン残基を含む本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１４９】
ロード可能な検出分子の核酸標識は、本明細書で先に画定された通りであることができる。本発明の一実施形態は、核酸標識が本明細書に記載のように画定された通りである本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び核酸標識を含むロード可能な検出分子に関し、その少なくとも１つの検出可能な標識は、
ｉ．５’第１のプライマー領域（フォワード）、バーコード領域及び３’第２のプライマー領域（リバース）、並びに
ｉｉ．ランダムヌクレオチド塩基からなるユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域を含む核酸標識であり、
そのバーコード領域は、検出分子の識別タグとして機能するユニークなバーコードである。
【０１５０】
ロード可能な検出分子は、１つ又は複数のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び検出可能な標識に結合した、ストレプトアビジンなどのコネクター分子及び／又はデキストランなどのスカフォールド分子を含むことができる。本発明の好ましい実施形態は、ロード可能な検出分子は、ストレプトアビジンと各ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子上のビオチン標識との間の非共有相互作用を介してストレプトアビジンに結合した４つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１５１】
ロード可能な検出分子溶液中に存在してもよく、固体基材に固定化されてもよい。検出分子を固体支持体に固定化することによって、ＴＣＲ又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞に結合したロード済み検出分子を、洗浄過程の間などに残留する未結合の試薬及び／又は交換バッファーから容易に分離することが可能である。さらに、ロード可能な検出分子を固体基材に予め決められたパターンでスポットすることによって、スクリーニング目的のための既知の座標をもつ高度なアレイを提供することが可能である。したがって、本発明の一実施形態は、ロード可能な検出分子が固体基材に固定化されている本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１５２】
固体基材は、ロード可能な検出分子が使用される設定に応じて、さまざまな材料からなるものであることができる。ロード可能な検出分子のマイクロアレイは大きなライブラリーのスクリーニングに有利でありうる一方で、ビーズに固定化されたロード可能な検出分子は精製プロトコールに有利でありうる。したがって、本発明の一実施形態は、固体基材が、マイクロアレイ、スライドガラス、ビーズ、ウェルプレート、粒子、フィルター、ゲル、チューブ、及びペトリ皿からなる群から選択される本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。本発明の好ましい実施形態は、固体基材がマイクロアレイである本明細書に記載のロード可能な検出分子に関する。
【０１５３】
本発明の追加の態様は、少なくとも１つのペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子を含む固体基材に関する。ペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子は、ジスルフィド架橋で連結されたアルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインを含む重鎖を含むなど、本明細書で画定された通りでありうる。
【０１５４】
ロード可能な検出分子はまた、本明細書に記載のコンビコーディングアプローチ又はバーコーディングアプローチのいずれかを用いる使用に適した組成物として提供されうる。したがって、本発明の一態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための組成物に関し、この組成物は、
（ａ）少なくとも２つの本明細書に記載のロード可能な検出分子、又は
（ｂ）少なくとも３つの、少なくとも１つの本明細書に記載のペプチドフリーＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つの検出可能な標識を含むロード可能な検出分子
を含み、各ロード可能な検出分子は異なる検出可能な標識を含む。
【０１５５】
本発明の別の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するための、本発明に記載のロード可能な検出分子又は本明細書に記載の組成物の使用に関する。
【０１５６】
ロード可能な検出分子又はその組成物は、ロード済み検出分子を必要に応じて容易かつ迅速に形成するための、ロード可能な検出分子及び目的の抗原ペプチドを含むすぐに使えるパッケージ／キットとして提供することができる。キットには、例えば、所与の疾患に重要な少数の非常に特異的な抗原ペプチドから、ヒトペプチドームの抗原ペプチドライブラリーに及ぶさまざまなサイズの抗原ペプチドのライブラリーが入っている。したがって、本発明の別の態様は、試料中の１つ又は複数の抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を検出するためのキットに関し、このキットは、
ｉ．本発明に記載のロード可能な検出分子又は本明細書に記載の組成物、
ｉｉ．少なくとも１つの抗原ペプチド、及び
ｉｉｉ．任意選択で、使用説明書
を含む。
【０１５７】
本発明の一実施形態は、検出分子が抗原ペプチドで予めロードされている本明細書に記載のキットに関する。この実施形態では、キットは追加の抗原ペプチドを含まない。本発明の別の実施形態は、ロード可能な検出分子がマイクロアレイなどの固体基材に固定化されている本明細書に記載のキットに関する。
【０１５８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の雑多な（promiscuous）性質は、私たちが幅広く病原体を認識する能力の基礎となっている。しかし、この性質はＴ細胞認識の理解及び制御を困難なものにしている。既存の技術では、Ｔ細胞認識にとって重要な要件や、ＴＣＲが構造的に関連する要素を相互に認識する能力について限られた情報しか得られない。本明細書に記載の検出分子は、ｐＭＨＣのＴＣＲ認識を支配するパターンを確立するための「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」戦略として機能する。本明細書に記載の検出分子を使用して、ペプチドバリアントをロードしたＭＨＣとのＴＣＲ相互作用の親和性に基づく階層を決定し、この知識を適用して、ここでＴＣＲフィンガープリントと呼ばれる認識モチーフを理解することができる。ロード可能な検出分子は、高品質なＴＣＲフィンガープリンティングに必要な抗原ペプチドの大きなライブラリーを迅速に調製するのに完璧に適した柔軟な解決策である。ＴＣＲフィンガープリントの決定は、Ｔ細胞の相互作用を理解し、臨床開発に向けてＴＣＲを選択する前に潜在的な相互認識を評価するための貴重な戦略である。したがって、本発明の一態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーとの間の相互作用を決定する方法に関し、この方法は以下のステップ：
ｉ．本明細書に記載のロード可能な検出分子を用意すること、
ｉｉ．抗原ペプチドのライブラリーを用意すること、
ｉｉｉ．ロード可能な検出分子を抗原ペプチドのライブラリーと接触させて、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子を含むロード済み検出分子のライブラリーを形成すること、
ｉｖ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞を、ロード済み検出分子のライブラリーと接触させること、及び
ｖ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞とロード済み検出分子のライブラリーとの結合を検出することを含む。
【０１５９】
この方法は、「ＴＣＲフィンガープリントを得るための方法」とも呼ばれる。したがって、本発明の一実施形態は、抗原ペプチドのライブラリーが、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個の異なる抗原ペプチドなどの少なくとも２５個の異なる抗原ペプチドを含むＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。本発明の別の実施形態は、抗原ペプチドのライブラリーが、少なくとも１，０００，０００個の異なる抗原ペプチドなどの少なくとも１００，０００個の異なる抗原ペプチドを含むＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。
【０１６０】
本明細書に記載の方法とロード可能な検出分子によって提供されるさまざまな抗原ペプチドライブラリーを迅速に生成するための柔軟なプラットフォームを考慮すると、大きな、複雑かつ／又は多様な抗原ペプチドライブラリーに対する詳細なＴＣＲフィンガープリントを、単純に必要に応じて確立することが可能である。したがって、本発明の一実施形態は、抗原ペプチドのライブラリーがヒトペプチドームを含むＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。本発明の別の実施形態は、抗原ペプチドのライブラリーが、標的抗原ペプチド及び前記標的抗原ペプチドの単一位置のバリエーションから生み出されるＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、抗原ペプチドのライブラリーが、天然に存在するペプチドから選択されるＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。
【０１６１】
ＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に適した抗原ペプチドとしては、病原性が知られている、又は疑われている抗原ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の一実施形態は、標的抗原ペプチドは、がん関連エピトープ、ウイルスエピトープ及び自己エピトープから選択されるＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。本発明の別の実施形態は、がん関連エピトープは、ウイルスによって誘発されるがんに関連するウイルスエピトープであるＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、ウイルスエピトープは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来するＴＣＲフィンガープリントを得るための方法に関する。
【０１６２】
本発明の別の態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗原ペプチド応答性Ｔ細胞と抗原ペプチドのライブラリーとの間の相互作用を決定するための、本発明に記載のロード可能な検出分子の使用に関する。
【０１６３】
本発明の態様の１つに関連して記載された実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。
【０１６４】
本出願で引用されているすべての特許文献及び非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
以下の非限定的な実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の作製と抗原特異的Ｔ細胞検出のための検出分子の組み立て
ここでは、ｗｔ（野生型）ＭＨＣクラスＩ分子とＣｙｓ変異体ＭＨＣクラスＩ分子の作製法と本発明による検出分子を作る方法について説明する。この実施例では、野生型ＭＨＣ及びジスルフィドで安定化したＣｙｓ変異体ＭＨＣの両方を用意し、検出分子の組み立てに使用する。
【０１６７】
この実施例では、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）など、例えばＢＤバイオサイエンスから市販されている、さまざまな蛍光色素で標識されたストレプトアビジン分子を使用して検出分子を調製する。
【０１６８】
野生型ＭＨＣとＣｙｓ変異体ＭＨＣはともに、古典的な大腸菌の発現によって作られ、ここでは、それぞれ野生型ＨＬＡ−Ａの重鎖（配列番号１）及びＣｙｓ変異体ＨＬＡ−Ａの重鎖（配列番号２）を用いて例示されている。野生型ＭＨＣ及びＭＨＣ  Ｃｙｓ変異体タンパク質と軽鎖ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質はいずれも、ｐＥＴシリーズのプラスミドを用いて大腸菌で作製する。大腸菌によって作られたタンパク質が入っている封入体を超音波処理で集め、大腸菌細胞を溶解バッファー（ＴｒｉｓＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％スクロース）で溶解する。変性タンパク質の可溶性画分を、界面活性剤バッファー（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸）、及び洗浄バッファー（０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、それに続いて再可溶化バッファー（ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ、ｐＨ６．５、８Ｍ尿素、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で４℃にて４８時間インキュベートすることによって封入体から回収し、ＭＨＣクラスＩモノマー作製に使用するまで−８０℃で保存する。
【０１６９】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣモノマーは、例えばジペプチド／トリペプチド／小分子などのヘルパー分子の存在下で、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣタンパク質及びＢ２Ｍのインビトロでの折り畳みによって作製する（折り畳みバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）。野生型ＭＨＣは、ヘルパー分子が含まれていないことを除いて、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ単量体と同様に作る。その代わりに、野生型ＭＨＣ分子は、ＵＶで不安定なペプチドＫＩＬＧＦＶＦ−Ｘ−Ｖ（配列番号１７）の存在下で再度折り畳まれる。ここで、ＸはＵＶ感受性アミノ酸である３−アミノ−２−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を指し、ＵＶ光に曝露すると全長ペプチドを切断する。切断されたペプチド断片のＭＨＣ分子への結合親和性が低下することにより、入ってくる交換抗原ペプチドの結合が可能になる。
【０１７０】
ＭＨＣモノマーは従来のサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。あるいは、他の標準的なタンパク質精製方法を使用することも可能である。サイズ排除クロマトグラフィーによるＣｙｓ変異体ＭＨＣモノマーの精製は、ＭＨＣモノマーを安定化させるヘルパー分子を含む、又は含まないバッファーを用いて行うことができる。
【０１７１】
ｐＭＨＣは、標準的な化学的及び酵素的プロトコールの両方でビオチン化する。これらの実施例では、部位特異的ビオチン化を可能にするＭＨＣ重鎖にビオチン化コンセンサスペプチド配列を含めることによって、精製過程の間にＢｉｒＡ酵素（アビディティー社（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｉｎｃ.）から入手可能）及び遊離ビオチンを用いて、アビディティー社のプロトコールに従ってｐＭＨＣを酵素的にビオチン化する。
【０１７２】
本明細書に記載の実施例では、野生型及びＣｙｓ変異体ＭＨＣの抗原特異的ＭＨＣ検出分子、又はＣｙｓ変異体ＭＨＣのロード可能な検出分子を、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介して組み立てる。簡単に説明すると、ビオチン化した分子とフルオロフォア結合ストレプトアビジンを、ＰＢＳなどの水性バッファー中で、下記の実施例に従って相対的な化学量論で混合（１００μｇ／ｍＬのＭＨＣ分子と１８μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−フルオロフォア結合体を混合）し、氷上で３０分間インキュベートする。組み立てた検出分子は、４℃では少なくとも１週間、−２０℃ではより長い期間保存することができる。検出分子はこの温度で少なくとも６か月間機能的に安定である。
【０１７３】
下記実施例で詳述するように、これらの検出分子を用いて、ヒトＰＢＭＣ又はＴＩＬから抗原特異的Ｔ細胞を検出する。２〜５×１０6細胞を検出分子と３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞表面マーカー抗体を４℃で３０分間染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファー（２％のＦＣＳを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、フローサイトメーターで染色された細胞を得ることによって抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有無を解析する。
【０１７４】
実施例２：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製した検出分子は、抗原特異的Ｔ細胞検出を向上させて優れたものにする
この実施例では、検出分子を用いて健常なドナーのＰＢＭＣから抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する方法を詳述し、検出分子はＣｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製される。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製した検出分子は、検出されたすべての抗原特異的Ｔ細胞特異性に関して、野生型ＭＨＣモノマーから調製した検出分子と比較して、染色指数として算出して有意に明るい染色が得られる。これは、異なる色のフルオロフォアでも一貫して見られた。図１では、フローサイトメトリーのデータを用いて、健常なドナーＰＢＭＣ試料での抗原特異的Ｔ細胞検出について、野生型及びＣｙｓ変異体ＭＨＣモノマーでそれぞれ調製した検出分子を比較している。
【０１７５】
健常なドナーＰＢＭＣ試料を検出分子に供して、ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１８、ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶ）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する。野生型及びＣｙｓ変異体Ａ２分子を用いてＨＬＡ  Ａ＊０２：０１（Ａ２）特異的ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ検出分子を調製し、Ｔ細胞検出の効率を比較する。野生型及びＣｙｓ変異体Ａ２分子は実施例１に記載のように作製及び精製する。ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ抗原特異的検出分子を作製するために、２μＭ野生型Ａ２分子を、１００μＭのＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドと、ＵＶランプ（３６５ｎｍ）下で１時間インキュベートして、ＵＶ光媒介ペプチド交換を促進して、Ａ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶモノマーを作製した（野生型Ａ２分子は、折り畳みの間に付加され、これらの分子の安定に必要なＵＶ不安定性ペプチドを持つので、ＵＶ媒介交換プロセスを必要とする）。
【０１７６】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の場合、１００μＭ  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを、２μＭ  Ｃｙｓ変異体Ａ２分子と４℃で１時間直接インキュベートする。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子は、折り畳み後、ペプチドを含まない構造で安定しているので、いかなる交換プロセスも必要とせず、選択したペプチドを交換プロセスなしに直接ロードすることができる。したがって、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞検出のため抗原ペプチドを直接、簡単かつ迅速にロードするのに理想的な分子である。
【０１７７】
次いで、２μＭのＡ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを、１８μｇ／ｍＬのフルオロフォアを結合させたストレプトアビジンと４℃で３０分間インキュベートすることによって、野生型及びＣｙｓ変異体のＡ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶモノマーをＭＨＣ検出分子に変換する。健常なドナーのＰＢＭＣを、これらの野生型及びＣｙｓ変異体Ａ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的検出分子を用いて染色する。Ａ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示す代表的なドットプロットを図１Ａに示す。
【０１７８】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子によってＡ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的Ｔ細胞に検出されたより明るい染色、すなわち背景シグナルからの検出分子陽性（抗原特異的）Ｔ細胞のより良好な分離を、染色指数を計算することによって検証した。Ｃｙｓ変異体検出分子では、野生型検出分子に比べて３倍近く高い染色指数が見られた（図１Ｂ）。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子から調製した検出分子の優位性は、異なるフルオロフォアタグを用いた２つの追加の健常なドナー試料でも見られた（図２Ａ）。どのフルオロフォアタグ検出分子を使用したかにかかわらず、染色指数の計算を用いて決定された、いずれの健常なドナーの試料においても、Ｃｙｓ変異体Ａ２  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的検出分子は、野生型ＭＨＣ検出分子よりも優れた性能を示した（図２Ｂ）。
【０１７９】
健常なドナーのＰＢＭＣにおいて、さらに２つのウイルス特異的抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞を検出することで示されるように、Ｃｙｓ変異体Ｔ細胞検出分子の染色指数の優位性はいくつかの抗原特異異性にわたって見出される。Ａ２  ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（配列番号１９、ＥＢＶ  ＢＲＬＦ１  ＹＶＬ）、及びＡ２  ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号２０、ＣＭＶ  ＩＥ１  ＶＬＥ）抗原特異的検出分子は、本実施例で前述したように野生型Ａ２又はＣｙｓ変異体Ａ２を用いて組み立てる。健常なドナーのＰＢＭＣを検出分子とインキュベートし、野生型及びＣｙｓ変異体検出分子について染色指数を比較する。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子は、どちらのタイプの抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞（Ａ２  ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ及びＡ２  ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ）に対しても、はるかに優れた染色指数（４〜５倍高い）をもたらす（図３Ａ、Ｂ）。
【０１８０】
結論：この実験は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子で調製した検出分子を用いて抗原特異的Ｔ細胞を検出することが実行可能であることを示している（図１）。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子のＴ細胞検出の効率は、野生型の検出分子と同等であることがわかった。
【０１８１】
Ｔ細胞検出の効率は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子と野生型ＭＨＣ検出分子の間で同等であるので、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の利点は、抗原ペプチドのロードがより速いことである。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子は空っぽに折り畳まれており、安定であるのに完全な長さのペプチドを必要としない。したがって、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子はペプチド受容性であり、ペプチド交換技術又は各ｐＭＨＣ特異性の個々の折り畳及び精製を使用することなく、任意の抗原ペプチドをロードすることができる。
【０１８２】
さらに、Ｃｙｓ変異体検出分子の別の利点は、染色指数によって示されるように、より良好Ｔ細胞検出の効率からくるものである（図１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ）。Ｃｙｓ変異体Ａ２検出分子は、３つの異なる抗原（Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、Ａ２  ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ及びＡ２  ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ）にわたって、３つの異なるドナー試料（ＢＣ６０、８９、９０）において２つの異なる色（ＰＥ、ＡＰＣ）で、野生型Ａ２検出分子と比べて３〜８倍高い染色指数を示す。これらのデータは、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子を用いたＭＨＣ検出分子による抗原特異的Ｔ細胞検出の進歩を実現し、Ｔ細胞検出における既存のアプローチと比べて向上した特徴を示している。
【０１８３】
図３Ａは、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いたＴ細胞検出におけるこの進歩の特長を示している。健常なドナーのＰＢＭＣで検出された低頻度のＡ２  ＹＶＬＤＨＬＩＶＶ（ＥＢＶ  ＢＲＬＦ１）特異的Ｔ細胞は、Ｃｙｓ変異体検出分子を使用した場合、より明るい染色（すなわち、より良好な染色指数）起因し、検出分子陰性集団と明確に区別され、より良好に分離される。対照的に、同じ抗原特異的Ｔ細胞を検出するために使用された野生型Ａ２検出分子は、検出分子陽性細胞の分離が悪く、識別不能でこの集団をほとんど検出することができない。したがって、低頻度で低親和性の抗原特異的Ｔ細胞を同定するには、より明るい分離（染色指数の向上）が重要であり、これはＣｙｓ変異体ＭＨＣ分子を使用することで促進され、したがって既存のアプローチから明らかに進歩している。
【０１８４】
実施例３：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子から作られた検出分子をコンビコーディングすることにより、抗原特異的Ｔ細胞の検出が著しく向上する
この実施例では、試料中の複数のＴ細胞特異性を検出するために、コンビコーディングと呼ばれる検出分子の組み合わせ設定を適用する利点を示す。コンビコーディングは、従来の野生型ＭＨＣ検出分子と比較して、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子に特に有利である。複数の抗原を検出するために、１つのフルオロフォアタグが、１つの抗原のみに特異的な第２のフルオロフォアタグと組み合わせて使用され、それによって各抗原特異性に対してユニークな２色の組み合わせが形成すされる組み合わせ設定において、Ｃｙｓ変異体／野生型検出分子のより良好な染色指数比が見られることが示されている。大きなペプチドライブラリーをコンビコーディングによってスクリーニングするとき、検出分子陽性Ｔ細胞の明確な分離は、特に抗原特異的Ｔ細胞が希で、所与の抗原ペプチドとＭＨＣの組み合わせに対する親和性が低い場合に、大きな細胞プールからのより良好な同定を容易にする。コンビコーディング技術は、Ｈａｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）及び国際公開第２０１０／０６０４３９Ａ１号によって以前に記載されている。
【０１８５】
コンビコーディング例では、Ａ２−ＦＬＵ  ＭＰ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２１、ＦＬＵ  ＭＰ  ＧＩＬ）、Ａ２−ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２２、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣ）、及びＡ２  ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号２３、ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＦＬＹ）の３つの異なる抗原にわたって、野生型及びＣｙｓ変異体Ａ２検出分子をＴ細胞検出の効率について比較している。３つの抗原特異的検出分子はすべて、実施例２に記載の方法と同様に調製する。簡単に説明すると、２００μＭの各抗原ペプチドを２μＭ  野生型又はＣｙｓ変異体Ａ２分子とＵＶランプ下（野生型Ａ２交換反応の場合）又はそのまま４℃（Ｃｙｓ変異体Ａ２）で１時間インキュベートする。１時間後、各抗原特異的モノマーを２つの反応に分け、それぞれを異なる色のフルオロフォア結合ストレプトアビジンと３０分間インキュベートする。３つの抗原特異性すべてに対してＡＰＣを第１の色として使用し、第２の色としてＢＵＶ３９５  （Ａ２−ＦＬＵ  ＭＰ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬの場合）、ＢＵＶ７３７（Ａ２−ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬの場合）、及びＰＥ（Ａ２  ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＦＬＹＡＬＡＬＬＬの場合）を使用する。したがって、この二色アプローチにより、抗原特異的検出分子それぞれに固有の色の組み合わせが与えられる。Ａ２−ＦＬＵ  ＭＰ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬに対してＡＰＣ−ＢＵＶ３９５、Ａ２−ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬに対してＡＰＣ−ＢＵＶ７３７、及びＡ２  ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＦＬＹＡＬＡＬＬＬに対してＡＰＣ−ＰＥ。
【０１８６】
細胞を染色する前に、３つすべてにわたって各抗原特異性に対する二色組み合わせ検出分子コンビコーディング検出分子を等量でプールする（１μＬ／色／特異性）。次いで、プールした検出分子を、２〜５×１０6細胞と３７℃で１５分間、細胞表面マーカー抗体と４℃で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞に対するフローサイトメトリーで捕捉する。図４Ａのドットプロットは、野生型及びＣｙｓ変異体Ａ２検出分子の抗原特異的Ｔ細胞検出効率の比較を示す。染色指数を、所与の組み合わせの両方の色に関して検出された抗原特異的Ｔ細胞プロットそれぞれについて計算する（図４Ｂ）。ドットプロット及び染色指標の棒グラフ（倍率変化Ｃｙｓ変異体／野生型Ａ２検出分子）は、野生型検出分子と比較して、Ｃｙｓ変異体検出分子を用いた際、検出の向上を示している。
【０１８７】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子はまた、コンビコーディングの設定で、メラノーマ患者試料から、がん関連抗原特異的Ｔ細胞を同定するのにも有利である（図５）。１２個のメラノーマ関連がん抗原（ＨＬＡ  Ａ＊０２：０１制限）のライブラリーを解析し、メラノーマ患者のＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）中のＣＤ８＋Ｔ細胞を同定する。１２個の抗原をカバーするコンビコーディング検出分子のパネルを生成し、ｐＭＨＣの組み合わせをそれぞれ、この実施例で上記したように２色の検出分子をタグ付けする。染色する前に、２色の組み合わせのｐＭＨＣ検出分子をそれぞれ１μｌずつ、１本のチューブにプールし、２×１０6個のメラノーマ患者ＴＩＬと混ぜ、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、細胞表面の抗体と４℃で３０分間インキュベートした後、フローサイトメーターで細胞を捕捉する。図５のドットプロットは、２つのがん関連抗原（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号２４、ｇｐ１００  ＩＴＤ）及びＡＭＬＧＴＨＴＭＥＶ（配列番号２５、ｇｐ１００  ＡＭＬ））に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が同定されたことを示し、Ｃｙｓ変異体と野生型Ａ２検出分子の比較を示す。Ｃｙｓ変異体検出分子は、同定されたすべての抗原特異的Ｔ細胞特異性に関して一貫して優れた染色指数を示し、コンビコーディングでのＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子の有利な点がさらに確認された。
【０１８８】
結論：この実施例は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製した検出分子が、抗原特異的なＣＤ８Ｔ細胞をコンビコーディングによって同定及び検出する際に有用であることを示している。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子の特長は、より良好な染色指数にあり、したがってＴ細胞の陰性集団からのより良好な分離が生じる。この特徴はコンビコーディングにとって非常に重要である。その理由は、単一の蛍光体タグが複数の抗原特異的検出分子によって表すことができ、したがって、最終的なフローサイトメーターの読み出しにおいて、単一の色の検出分子陽性Ｔ細胞集団が２つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を表すことができるからである。これらの細胞は、検出分子ペアの第２の色を識別することによってのみ分離することができる。したがって、Ｃｙｓ変異体の検出分子によって示されるように、より良好な分離及びより高い染色指数は決定的に有利である。
【０１８９】
Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子によって提供される利点は、メラノーマ患者試料中のがん関連抗原の同定及び検出によって示されている（図５）。ＭＨＣ検出分子に基づくコンビコーディングなどのハイスループットアプローチでは、免疫療法開発に向けて患者試料中のがん関連抗原特異的Ｔ細胞を同定するために、大きなペプチドライブラリーをスクリーニングすることが必要である。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子は、スクリーニングに大きなペプチドライブラリーが必要とされる場合にはるかに速くロードでき、がん関連抗原についても染色指標の向上をもたらすので、そのようなハイスループットアプローチにより適している。がん関連抗原に対する染色指数の向上も、ｐＭＨＣとＴ細胞受容体の相互作用の可能性が広範であるので、大きな利点を有する。
【０１９０】
実施例４：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製したロード可能な検出分子は、コンビコーディングによって抗原特異的Ｔ細胞を検出するための抗原特異的検出分子を迅速に生成する方法をもたらす
この実施例は、大きな抗原ライブラリーをスクリーニングして抗原特異的なＣＤ８Ｔ細胞を同定するために、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣを用いて検出分子を作製する迅速な方法を示す。野生型ＭＨＣ分子と違って、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子は安定性が高く、ペプチドを受容する性質があるので、これらの空のモノマーは迅速に検出可能な分子に変換することができる（図６Ａ）。この方法は、−２０℃で保存できるロード可能な検出分子を生成することを含む。これらのロード可能な検出分子は、ワンステップのインキュベーションによって、選択した抗原ペプチドをロードすることができる。この実施例は、このプロセスがわずか１分で達成でき、そのような抗原ペプチド特異的検出分子はＴ細胞検出において機能的に活性を有することを示している。
【０１９１】
Ｃｙｓ変異体Ａ２モノマーを実施例１に記載のように作製する。次いで、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣモノマー（１００μｇ／ｍＬ）を、フルオロフォアタグ付きストレプトアビジン（１８μｇ／ｍＬ）と４℃で３０分間インキュベートして、ロード可能な検出分子を生成する。ロード可能な検出分子を、抗原特異的検出分子の作製に使用するまで、保存バッファー（０．５％  ＢＳＡ、５％グリセロール）に−２０℃で保存する。
【０１９２】
ペプチドのロード効率を調べ、ロード可能なＡ２検出分子を機能的に検証するために、ロード可能なＭＨＣ検出分子（ＡＰＣ標識）を、異なる濃度のペプチド（０．１、１、１０、１００μＭ）、異なるインキュベーション時間（１、５、１５、３０、及び６０分）で４℃にてインキュベートすることによって、ｐＭＨＣ検出分子に変換する。この実施例（図６Ｂ）では、Ａ２  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＦＬＵ  ＭＰ）抗原を用いて抗原特異的Ｔ細胞を検出する。各ペプチドロード条件のＡ２  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ  Ｃｙｓ変異体検出分子を、健常なドナーのＰＢＭＣ（２×１０6個の細胞／染色）とインキュベートする。図６Ｂは、各ペプチドローディング条件によってドナー試料で検出されたＡ２  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的Ｔ細胞を示す。このデータは、１分間のペプチドのロードが、その制限されたＴ細胞を検出できる抗原特異的検出分子を作るのに充分であることを示している。
【０１９３】
この実施例では、メラノーマ患者の試料に含まれるネオアンチゲン反応性ＣＤ８Ｔ細胞を同定するためにコンビコーディングにロード可能な検出分子を適用することがさらに検証されている。ネオアンチゲンはがんに特異的な変異に由来し、さまざまな免疫療法アプローチに使用できる可能性がある。ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞を同定するには、個々の患者に特異的な大きなペプチドライブラリーをスクリーニングすることが必要である。したがって、そのような大きなペプチドライブラリーをスクリーニングするためには、ハイスループットの系では、検出分子の迅速な調製が求められることになろう。この実施例では、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子から作られたロード可能な検出分子が、そのようなアプローチに理想的であることが示されている。これは、４３個のペプチド抗原（ＨＬＡ−Ａ２制限）のメラノーマ患者に特異的なネオアンチゲンライブラリーを、コンビコーディング設定で生成することによって例示されている。ロード可能な検出分子（２色の組み合わせ）を１００μＭのネオアンチゲンと１５分間インキュベートし、すぐにプールしてメラノーマＴＩＬとインキュベートする。細胞を前述のように染色し、フローサイトメーターで捕捉する。ロード可能な検出分子とコンビコーディングすることによって、３つのネオアンチゲン（ＲＬＭＶＡＶＥＥＡ（配列番号２６、ＶＡＮＧＬ１  ＲＬＭ）、ＲＬＭＶＡＶＥＥＡＦＩ（配列番号２７、ＶＡＮＧＬ１（２）ＲＬＭ）及びＬＬＬＦＬＴＩＦＩ（配列番号２８、ＤＹＳＦ  ＬＬＬ））に特異的なＣＤ８Ｔ細胞が同定される（図７）。
【０１９４】
結論：ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞を同定するためにＣｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子をコンビコーディングで使用する利点がこの実施例で示されている。先行技術における他の既存のアプローチは、検出分子を作る前に目的のペプチドをロードするための交換プロセスを必要とするので、特に大きな患者特異的ペプチドライブラリーを解析する必要がある場合には、そのプロセスは非効率的で非常に時間がかかる。ワンステップで抗原特異的検出分子に変換できるロード可能な検出分子は、既存解決策の問題のあるアプローチに対して、有利で速やかな解決策を提供する。この実施例では、わずか１５分で抗原特異的検出分子に迅速に変換されるロード可能なＡ２検出分子を用いて、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞が同定され、これは検出分子に基づく既存のＴ細胞検出法のいずれと比べても大幅な改善である。
【０１９５】
実施例５：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製した検出分子は、野生型ＭＨＣを用いて調製した検出分子と比較して安定性が高い
この実施例は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子が野生型ＭＨＣ検出分子と比較して非常に安定していることを示す。抗原特異的ＭＨＣ検出分子のより高い安定性は、特に低親和性の抗原に対して、Ｔ細胞検出のためのコンビコーディング法やバーコーディング法を用いた場合にＴ細胞検出が向上する。
【０１９６】
この実施例では、Ｃｙｓ変異体抗原特異的検出分子の安定性の向上が、ペプチドの解離測定によって示され、抗原特異的検出分子と比較されている。ロード可能な検出分子（ＡＰＣタグ付き）は、実施例４に記載したようにＣｙｓ変異体Ａ２  ＭＨＣ分子から調製する。１０μＭ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＦＬＵ  ＭＰ）ペプチドを、ロード可能なＡ２検出分子と４℃で１５分間インキュベートし、Ａ２−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ抗原特異的検出分子を生成する。野生型Ａ２−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ抗原特異的検出分子を、２００μＭ  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドの存在下で野生型Ａ２モノマーをＵＶランプ（３６５ｎｍ）で１時間照射し、続いてストレプトアビジンＡＰＣと４℃で３０分間インキュベートすることによって生成する。抗原特異的検出分子を調製した後、野生型とＣｙｓ変異体検出分子の両方とも、分子量カットオフフィルター（市販）を用いて過剰なペプチドを除去する。得られたＡ２−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的検出分子を４℃、室温、及び３７℃で、１時間、１２時間、４８時間、及び１６８時間インキュベートして、ｐＭＨＣ複合体の安定性を決定する。各時点後及びインキュベーション温度でのこれらの複合体の安定性を、健常なドナーのＰＢＭＣからＡ２  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ抗原特異的Ｔ細胞を検出するための機能的読み出しとして測定する。Ｔ細胞の染色は、前述の実施例に記載のように行う。
【０１９７】
Ｃｙｓ変異体Ａ２分子を用いて調製したＡ２−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ検出分子は、同じ特異性をもつ野生型検出分子よりも明らかに安定していることがわかる。３７℃で１２時間以上インキュベートした場合、検出分子に明らかな違いが見られ、野生型検出分子では、Ａ２−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的Ｔ細胞検出の効率が有意に低下する。対照的に、３７℃で最大４８時間インキュベートしたＣｙｓ変異体検出分子は、Ａ２  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的Ｔ細胞を依然として検出することができる（図８Ａ、Ｂ）。
【０１９８】
結論：ペプチドの解離率を用いて測定して、Ｃｙｓ変異体検出分子は非常に安定である。３７℃で４８時間インキュベートした後でも、Ｃｙｓ変異体検出分子は機能的に安定し、効率的に抗原特異的な細胞を検出する。低親和性ｐＭＨＣ−ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）相互作用は、より安定なｐＭＨＣ複合体を用いた場合に検出される可能性がより高いので、検出分子のコンビコーディング及びバーコード付けなどによるハイスループットＴ細胞検出プラットフォームにおいて、Ｃｙｓ変異体ｐＭＨＣ複合体の高い安定性により、それらの複合体は野生型ｐＭＨＣ複合体と比べて明らかな利点をもつ。
【０１９９】
実施例６：Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製した検出分子は、バーコーディングに基づくハイスループットのＴ細胞検出法に大きな有意性をもたらす
この実施例では、バーコード付きのＣｙｓ変異体ＭＨＣ分子と野生型ＭＨＣ分子の検出分子を用いた抗原特異的Ｔ細胞の検出を記載する。バーコード法は、各種類のｐＭＨＣ検出分子に結合したユニークな短い核酸配列をバーコードとして利用する。この方法は、核酸バーコード付きＴ細胞検出分子を用いて、数千の抗原ペプチドをシングルポットアッセイでスクリーニングすることができる。この技術は、Ｂｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）及び国際公開第２０１５／１８８８３９Ａ２号において以前に記載されている。
【０２００】
この実施例では、健常なドナー（図９）及びメラノーマ患者の試料中のがん関連抗原特異的Ｔ細胞を検出する（図１０）。１６７個のＡ２制限がん抗原と８個のＡ２制限のウイルス由来抗原に対して、ＤＮＡバーコード付き検出分子（野生型及びＣｙｓ変異体）を調製する。
【０２０１】
ＤＮＡバーコードは、特徴的な２５ｍｅｒのヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチドから作る。特徴的な２５ｍｅｒ領域にくわえて、各オリゴには、イオントレント（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）シーケンシングに対応したプライマー領域及び６×Ｎのランダムヌクレオチドのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）領域が含まれる。５’ビオチン標識で修飾したオリゴヌクレオチド（Ａバーコード）を、無修飾の部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｂバーコード）に結合させて、１７５個のユニークな二本鎖Ａｘ−Ｂｙ  ＤＮＡバーコードを生成する（５個の代表的なＡバーコード（配列番号３２〜３６）及びＢバーコード（配列番号３７−４１）の配列と、それらがコードする抗原ペプチドを表１に示す。「Ｎ」はランダムなヌクレオチドを示す）。オリゴＡとオリゴＢ（各１個）の組み合わせを、それぞれ２６μＭ（オリゴＡ）と５２μＭ（オリゴＢ）の最終濃度になるように５×シーケナーゼ反応バッファー（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）ミックス（ＰＮ７０７０２、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））と混合し、６５℃で２分間加熱し、１５〜３０分かけて＜３５℃にゆっくりと冷却してアニーリングさせる。アニーリングしたオリゴＡとＢは、シーケナーゼポリメラーゼ（７０７７５Ｙ、アフィメトリクス）、２０μＭ  ＤＴＴ、８００μＭ又は７２μＭ  ｄＮＴＰを加え、続いてＲＴで５〜１０分間インキュベートすることによって伸長されて、二本鎖のＡｘＢｙ  ＤＮＡバーコードを作製する。伸長したＡｘＢｙバーコードを、ヌクレースフリー水＋０．１％ツイーンで（Ａオリゴについて）２．１７μＭに希釈し、−２０℃で保存する。５’ビオチン化ＡｘＢｙ  ＤＮＡバーコードは、ＰＥ及びストレプトアビジンが結合したデキストランに２：１の化学量論で結合している。ＤＮＡバーコードをデキストラン結合体と混合し、続いて４℃で３０分間インキュベートすることによって結合させる。
【０２０２】
１７５個の抗原のそれぞれについて、Ａ２分子にそれらの抗原をロードすることによって、個々のｐＭＨＣの組み合わせを調製する。野生型Ａ２分子の場合、抗原をＵＶ媒介のペプチド交換法を用いてロードされ、ここでは、１００μｇ／ｍＬの野生型Ａ２モノマーを２００μＭのペプチドとＵＶ光（３６５ｎｍ）下で１時間インキュベートする。Ｃｙｓ変異体Ａ２分子は、１００μＭのペプチド抗原をわずか１５分間インキュベートするだけで、交換プロセスを必要とせずに抗原をロードされる。
【０２０３】
【表１】
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【０２０４】
次いで、組み立てたｐＭＨＣ特異性を、ストレプトアビジン結合デキストラマー（ＤＮＡバーコードタグ付き）と４℃で３０分インキュベートして、ＤＮＡバーコード付き抗原特異性検出分子を得る。次いで、１７５個の異なるｐＭＨＣ特異的バーコード付きＴ細胞検出分子をすべて、１本のチューブにプールし（各特異性から１．５μＬ）、健常なドナーのＰＢＭＣ又はメラノーマ患者のＴＩＬ試料（２〜５×１０6細胞）と３７℃で１５分間インキュベートする。細胞を前述のように細胞表面の抗体で染色し、セルソーターで捕捉して、検出分子に陽性の抗原特異的Ｔ細胞を分離する。これらのソートした細胞から、イオントレントに適合するフォワードＰＣＲプライマーＡ−Ｋｅｙ  ２ＯＳ−Ｆ１−ｘｘｘ及びリバースＰＣＲプライマーＰ１Ｒ２を使用してＤＮＡバーコードを増幅する（フォワードプライマーの１つ、Ａ−Ｋｅｙ  ２ＯＳ−Ｆ１−２３３（配列番号４２）及びリバースプライマーＰ１Ｒ２（配列番号４３）を表１に例示）。ＰＣＲ増幅したＤＮＡバーコードを精製し、イオントレントシーケンシングによって配列を決定し、Ｂｅｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ. （２０１６）に記載のように、本質的にそれぞれのＤＮＡバーコードに結合した抗原特異的Ｔ細胞を同定する。
【０２０５】
Ｃｙｓ変異体Ａ２分子を用いて組み立てたバーコード付き検出分子は全体に、野生型Ａ２分子を用いて組み立てた検出分子と比較して、より多くの抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を検出する。健常なドナーでは、野生型Ａ２及びＣｙｓ変異体Ａ２のｐＭＨＣはともに、ウイルス由来の抗原に特異的なＴ細胞を同数検出したが、Ｃｙｓ変異体検出分子は、この試料でさらにいくつかのがん関連抗原に特異的なＴ細胞を検出し（図９）、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子の感度の高さを示した。注目すべきことに、メラノーマ患者試料のどちらにおいても、野生型Ａ２検出分子は抗原特異的Ｔ細胞を同定しなかったが、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ検出分子は、メラノーマ患者１で１つ、別のメラノーマ患者試料で２つのがん抗原特異的Ｔ細胞を同定した（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ（配列番号２９、ＭＥＬ  ＶＬＹ）及びＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号３０、ＭＥＬ  ＫＡＳ））（図１０）。
【０２０６】
結論：この実施例（図９及び１０）は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いたバーコード付き検出分子が、ハイスループットのＴ細胞検出に魅力的なプラットフォームを提供することを示している。がん抗原に特異的なＴ細胞は検出が非常に難しい。これは恐らく、低頻度又はｐＭＨＣとＴＣＲの間の低親和性の相互作用のためと思われる。Ｃｙｓ変異体Ｔ細胞検出分子のみが、メラノーマ患者試料中の稀ながん関連抗原特異的Ｔ細胞を検出するのに十分な感度を有するので、ハイスループットのＴ細胞検出に関してＣｙｓ変異体ＭＨＣ分子は野生型ＭＨＣ検出分子よりも優れている。
【０２０７】
実施例７：ＴＣＲフィンガープリントを決定するための、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子を用いて調製したＤＮＡバーコード付き検出分子
この実施例では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のフィンガープリントを決定するためのＣｙｓ変異体ＭＨＣ分子の使用を記載する。ＴＣＲフィンガープリントは、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用の詳細及びＴ細胞認識における各残基の重要性を提供する。この実施例は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子が、野生型ＭＨＣ分子を用いて同定したＴＣＲフィンガープリントと同等に、ＴＣＲフィンガープリントを同定することを示す。
【０２０８】
ＴＣＲフィンガープリントを決定するために、検出分子のバーコード化を用いて、メルケル細胞ポリオーマウイルス由来のエピトープであるＡ２−ＫＬＬＥＩＡＰＮＹ（配列番号３１、ＭＣＶ  ＫＬＬ）由来の１９２個のペプチドを、各アミノ酸の位置を天然に存在する２０個のアミノ酸で順次置き換えることによって特徴付けする。これらのペプチドバリアントをそれぞれ、Ｃｙｓ変異体Ａ２の空のモノマーにロードするか、又は野生型Ａ２のＵＶで切断可能なリガンドに置き換える。次いで、ＭＨＣマルチマーを生成し、実施例６に記載のように生成した１９２個のユニークなＤＮＡバーコードでタグ付けする。すべてのｐＭＨＣマルチマーの組み合わせの混合物を使用して、Ｔ細胞クローン（Ａ２−ＫＬＬＥＩＡＰＮＹに特異的）を染色し、親和性に基づくＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用の測定を可能にし、結果的にＴＣＲの認識優先傾向が示される。ＴＣＲフィンガープリントは、ＭＨＣマルチマー結合ＤＮＡバーコードのシークエンシングに基づいて決定され、その結果は入力ｐＭＨＣライブラリーに対するｌｏｇＦｃとして与えられる。ＬｏｇＦｃをシャノンロゴに変換して、ＴＣＲのｐＭＨＣ相互作用に必要なアミノ酸をよりわかりやすく図示している（図１１）。ＴＣＲフィンガープリントに基づくと、Ｃｙｓ変異体と野生型のＡ２はともに、Ａ２−ＫＬＬＥＩＡＰＮＹに特異的なＴＣＲクローン両方に対して同等のＴＣＲフィンガープリントパターンを示した。
【０２０９】
結論：この実施例は、Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子のＴＣＲフィンガープリント解析への適用を記載している。Ｃｙｓ変異体ＭＨＣ分子は、ＴＣＲのフィンガープリントを正確に再現し、所望の抗原ペプチドをワンステップで迅速にロードできるので、そのような解析により適していることが示されている。これは、大きなペプチドライブラリーをスクリーニングする必要があるハイスループットのバーコード法において、明らかな利点である。
【０２１０】
参考文献
Ｈａｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ６，  ５２０−５２６
国際公開第２０１０／０６０４３９Ａ１号
Ｂｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４，  １０３７−１０４５
国際公開第２０１５／１８８８３９Ａ２号
Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ. （１９９６）, Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２７４, ９４−９６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月25日(2021.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2022502045000001.app
【国際調査報告】
2022502045.tif 000018
2022502045.tif 000019
2022502045.tif 000020