(57)【要約】本発明は、酵素及び酵素系の普遍的な固定化のための材料、特に、磁性材料を提供する。生体ナノ触媒（ＢＮＣ）として公知の磁気的に固定化される酵素のための足場として用いられる粉末、単層化、又は多層化材料を形成するための、熱可塑性プラスチックと磁性粒子との高磁性及び高多孔度の複合体ブレンドが本明細書に記載される。設計される対象物は、３Ｄプリンティングを用いて複合体磁性粉末を焼結することにより生成される。一部の実施形態において、選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）が用いられる。本発明は、例えば、小分子の連続生成を可能とする酵素支持体及びフローセルの３Ｄプリンティングのための材料組成物の使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱可塑性ポリマー及び磁性ミクロ粒子を含む磁性マクロポーラス粉末であって、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体を固定化するための形状化磁性マクロポーラス足場の付加生産（ＡＭ）のために操作可能である、磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２】
前記磁性粒子が、約５０〜１００μｍのサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項３】
前記磁性粒子が、約１０〜５０μｍのサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項４】
前記磁性粒子が、約５〜１０μｍのサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項５】
前記磁性粒子が、約１０μｍのサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項６】
前記磁性粒子が、約５μｍのサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項７】
前記磁性粒子が、５μｍ未満のサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項８】
前記磁性粒子が、１００μｍ超のサイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項９】
約１５０μｍの平均サイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１０】
約７５μｍの平均サイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１１】
約１５μｍの平均サイズを有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１２】
前記磁性粒子が、０〜１０重量％の濃度を有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１３】
前記磁性粒子が、１０〜５０重量％の濃度を有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１４】
前記磁性粒子が、５０〜９０重量％の濃度を有する、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１５】
前記熱可塑性ポリマーが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アクリル（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロン６及びナイロン１２を含むポリアミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリベンゾイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、コポリエステル、及びそれらの化学的機能化誘導体からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１６】
前記磁性ミクロ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（α−Ｆｅ２Ｏ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、スピネルフェライト、天然磁石、コバルト、ニッケル、希土類、及び磁性複合体からなる群から選択される磁性材料を含む、請求項１に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１７】
前記希土類が、ネオジム、ガドリニウム、シスプロシウム、サマリウム−コバルト、又はネオジム−鉄−ホウ素である、請求項１６に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１８】
前記磁性複合材料が、セラミック、フェライト、又はアルニコ磁石を含む、請求項１６に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項１９】
前記熱可塑性ポリマー及び前記磁性ミクロ粒子が、化学的にブレンドされている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２０】
前記熱可塑性ポリマー及び前記磁性ミクロ粒子が、熱的にブレンドされている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２１】
前記熱可塑性ポリマー及び前記磁性ミクロ粒子が、物理的にブレンドされている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２２】
０．５〜２００μｍのサイズを有するマクロ細孔を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２３】
セルロース繊維、セルロースナノファイバー、ガラス繊維、又は炭素繊維をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２４】
磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体及び前記メソ細孔内に又はそれらの表面上に磁気的に固定化された酵素をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末を含み、前記粉末は、三次元（３Ｄ）プリンティングにより前記形状に形成された、形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項２６】
前記形状が、円柱、球体、ビーズ、ストリップ、カプセル、立方体、スクエアロッド、ピラミッド、ダイヤモンド、格子、又は不規則形状である、請求項２５に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項２７】
磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体をさらに含む、請求項２５又は２６に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項２８】
磁性ナノ粒子の前記自己アセンブリしたメソポーラス凝集体が、前記磁性ナノ粒子の前記メソ細孔内に又は表面上に磁気的に固定化された１つ以上の酵素をさらに含む、請求項２７に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項２９】
前記１つ以上の酵素が、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトララーゼ、ヒドラターゼ、脱水素酵素、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤＳ）エネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、カタラーゼ、ジスムターゼ、オキシダーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、シンテターゼ、トランスフェラーゼ、オキシニトリラーゼ、イソメラーゼ、グルドシダーゼ、キナーゼ、リアーゼ、スクラーゼ、インベルターゼ、エピメラーゼ、及びリパーゼからなる群から選択される、請求項２８に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３０】
磁性ナノ粒子の前記自己アセンブリしたメソポーラス凝集体が、ミクロソームを含み、第１の酵素活性を有する拡散性補助因子を要求する第１の酵素は、前記ミクロソーム内に含有され、補助因子再生活性を含む第２の酵素は、前記メソ細孔内に磁気的に包括され、前記補助因子は、前記第１の酵素活性において利用され；前記第１及び第２の酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能し；前記磁性ナノ粒子は、前記磁性マクロポーラス足場と磁気的に会合している、請求項２７に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３１】
磁性ナノ粒子の前記自己アセンブリしたメソポーラス凝集体が、第１の酵素活性を有する拡散性補助因子を要求する第１の酵素；補助因子再生活性を含む第２の酵素を含み、前記補助因子は、前記第１の酵素活性において利用され；前記第１及び第２の酵素は、磁性ナノ粒子の前記凝集体により形成された前記メソ細孔内に磁気的に包括され、前記第１及び第２の酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能する、請求項２７に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３２】
前記第１の酵素が、酸化酵素である、請求項３１に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３３】
前記酸化酵素が、フラビン含有オキシゲナーゼであり；前記組成物が、前記第１の酵素と同時局在する補助因子レダクターゼ活性を有する第３の酵素をさらに含む、請求項３２に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３４】
前記酸化酵素が、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり；前記組成物が、前記第１の酵素と同時局在する補助因子レダクターゼ活性を有する第３の酵素をさらに含む、請求項３２に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３５】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び前記第３の酵素が、単一タンパク質内に含まれる、請求項３２に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３６】
前記単一タンパク質が、二機能性シトクロムＰ４５０／ＮＡＤＰＨ−−Ｐ４５０レダクターゼを含む、請求項３５に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３７】
前記単一タンパク質が、ＢＭ３活性を有し、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３５に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３８】
前記足場が、特定の生体触媒プロセスに適した形状に形成される、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の形状化磁性マクロポーラス足場。
【請求項３９】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラス粉末を含む形状化磁性マクロポーラス足場を形成する方法であって、三次元（３Ｄ）プリンタを用いて前記形状化磁性マクロポーラス足場を付加生産（ＡＭ）し、前記形状を３Ｄモデルから得るステップを含む方法。
【請求項４０】
前記３Ｄモデルが、電子ファイルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記電子ファイルが、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）又はステレオリソグラフィー（ＳＴＬ）ファイルである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＡＭが、熱融解フィラメント製法（ＦＦＦ）又は選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）である、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記マクロ細孔が、塩、糖、又は小型可溶性ポリマーからなる群から選択される可溶性薬剤を用い、前記可溶性薬剤を溶剤により除去して形成される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
酵素反応を触媒するための装置を形成する方法であって、形状化磁性マクロポーラス足場を、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体及び酵素と組み合わせ、前記酵素は、前記メソ細孔内に磁気的に固定化されるステップを含む方法。
【請求項４５】
複数の基質間の反応を触媒する方法であって、請求項２４に記載の磁性マクロポーラス粉末を、前記酵素が前記基質間の前記反応を触媒する条件下で前記基質に露出させるステップを含む方法。
【請求項４６】
複数の基質間の反応を触媒する方法であって、請求項２８又は２９に記載の形状化磁性マクロポーラス足場を、前記酵素が前記基質間の前記反応を触媒する条件下で前記基質に露出させるステップを含む方法。
【請求項４７】
前記反応が、医薬製品の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記反応が、医薬品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記反応が、食品製品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記反応が、風味料の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記反応が、香料の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記反応が、甘味料の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記反応が、農薬の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記反応が、抗菌剤の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記反応が、毒素の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記反応が、洗剤の生産において用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記反応が、燃料製品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記反応が、生化学製品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記反応が、紙製品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項６０】
前記反応が、プラスチック製品の生産に用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項６１】
前記反応が、溶液から汚染物を除去するプロセスにおいて用いられる、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記溶液は、水溶液、溶剤、又は油である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記メソポーラス凝集体を除去し、それらをメソポーラス凝集体の新たな調製物により置き換えるステップをさらに含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項６４】
フローセル及び連続生産を使用して実施される、請求項４５又は４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書において参照によりその全体が援用される、２０１８年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／７３７，９１０号明細書に係る利益を主張する。
【０００２】
本発明は、酵素及び酵素系の普遍的な固定化のための材料、特に、磁性材料を提供する。生体ナノ触媒（ＢＮＣ）として公知の磁気的に固定化される酵素のための足場として用いられる粉末、単層化、又は多層化材料を形成するための、熱可塑性プラスチックと磁性粒子との高磁性及び高多孔度の複合体ブレンドが本明細書に記載される。設計される対象物は、３Ｄプリンティングを用いて複合体磁性粉末を焼結することにより生成される。いくつかの実施形態において、選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）が用いられる。本発明は、例えば、小分子の連続生成を可能とする酵素支持体及びフローセルの３Ｄプリンティングのための組成物材料の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
グリーンテクノロジーとしての生体触媒は、慣習的な高価で非効率的なプロセスと比べて化学的生産においてますますポピュラーになりつつある。この用途としては、食品成分、風味料、香料、コモディティ及びファインケミカル、並びに活性医薬の生成が挙げられる。しかしながら、化学製品を産業規模で生成する場合、酵素は顕著な性能降下を引き起こす活性及び充填の大幅な損失を被ることがある。
【０００４】
磁性酵素の固定化は、酵素周囲に自己アセンブリするメソポーラス磁性クラスタ中への酵素の包括を含む（レベル１）。固定化効率は、酵素及びナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面の性質、並びに、接触時間を含む多数の要因に応じる。生体触媒プロセスにおける産業的目的のために用いられる酵素は、効率が高く、プロセスの前及びその最中において安定であり、多数回の生体触媒サイクルにわたって再使用可能であり、及び、経済的であるべきである。
【０００５】
磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体は、連続するか、又は、粒状のマクロポーラス足場に組み込まれ得る（レベル２）。足場は磁性であってもなくてもよい。このような足場は、参照によりその全体が本明細書において援用される、国際公開第２０１４／０５５８５３号パンフレット、国際公開第２０１７／１８０３８３号パンフレット、及び、Ｃｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｏｄａｙ  ３４（５）：１５−２０（２０１６）において考察されている。高磁性足場は、任意の酵素を固定化し、安定化し、最適化するために設計される。これとしては、高充填及び完全活性における、例えば、小分子の生成のための完全酵素系が挙げられる。
【０００６】
選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）は、出力源としてレーザを用いてナイロン又はポリアミドなどの粉末化材料を焼結する付加生産（ＡＭ）技術である。３Ｄモデルにより規定された空間中の点に自動的に標的化されるレーザは、材料を一緒に結合させて固体構造を作出する。これはダイレクト金属レーザ焼結（ＤＭＬＳ）と類似するが、技術的詳細が異なる。ＤＭＬＳは同等の概念を用いるが、ＤＭＬＳにおいて、材料は焼結されるのではなく完全に溶融される。これにより、異なる特性（例えば、結晶構造及び多孔度）を有する材料を生産することが可能となる。ＳＬＳは、商業規模の生産プロセスに拡張し得る比較的新しい技術である。
【０００７】
ＳＬＳは、付加生産レーザ技術である。これは、高出力化レーザ（例えば、二酸化炭素レーザ）がプラスチック、金属、セラミック、又はガラス粉末の小粒子を、所望の三次元形状を有する塊状物に熱融解することを含む。レーザは、出力ベッドの表面上で部品の３Ｄデジタル記述から（例えば、ＣＡＤファイル又はスキャンデータから）生成される断面をスキャンすることにより粉末化材料を選択的に熱融解する。各断面がスキャンされた後、出力ベッドを１層の厚さだけ低下させ、新たな層の材料を頂部上に施与し、部品が完成するまでこのプロセスを繰り返す。
【０００８】
３Ｄプリンティングは、コンピュータ制御下で材料を結合し、又は凝固して三次元対象物を作出するプロセスを含む。一緒に熱融解される材料は、一緒に添加される（例えば、液体分子又は粉粒）。３Ｄプリンティングは、ラピッドプロトタイピング及び付加生産の両方で用いられる。対象物は、ほぼあらゆる形状又はジオメトリのものであり得、典型的には、３Ｄモデルからのデジタルモデルデータ又は付加生産ファイル（ＡＭＦ）などの別の電子データソースを用いて生成される。典型的には、材料は、連続層で添加される。多くの異なる技術、例えば、ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）又は熱融解積層造形（ＦＤＭ）が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、酵素及び酵素系の普遍的な固定化のための材料、特に、磁性材料を提供する。生体ナノ触媒（ＢＮＣ）として公知の磁気的に固定化される酵素のための足場として用いられる粉末、単層化、又は多層化材料を形成するための、熱可塑性プラスチックと磁性粒子との高磁性及び高多孔性の複合体ブレンドが本明細書に記載される。設計される対象物は、３Ｄプリンティングにより複合体磁性粉末を焼結することにより生成される。いくつかの実施形態において、選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）が用いられる。本発明は、例えば、小分子の連続生成を可能とする酵素支持体及びフローセルの３Ｄプリンティングのための組成物材料の使用を提供する。任意のプロセスのための任意の酵素を固定化する能力により、本明細書に開示の材料は、酵素又は酵素系により機能化される場合、医薬活性剤、農薬活性剤、風味料及び香料、ファイン及びコモディティケミカル、並びに食品成分の生成に用い得る。
【００１０】
本発明は、熱可塑性ポリマー及び磁性ミクロ粒子を含む磁性マクロポーラス粉末であって、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体を固定化するために操作可能である、磁性マクロポーラス粉末を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約５０〜１００μｍ、１０〜５０μｍ、５〜１０μｍ、１０μｍ、又は５μｍのサイズを有する。他の実施形態において、磁性粒子は、５μｍ未満、１００μｍ超のサイズを有し、又は約１５０μｍ、約７５μｍ、若しくは約１５μｍの平均サイズを有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、０〜１０重量％の濃度を有する。他の実施形態において、磁性粒子は、１０〜５０重量％又は５０〜９０重量％の濃度を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、熱可塑性ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アクリル（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロン６、ナイロン１１及びナイロン１２を含むポリアミド、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリベンゾイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、コポリエステル、及びそれらの化学的機能化誘導体からなる群から選択されるポリマーを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、磁性ミクロ粒子は、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（α−Ｆｅ２Ｏ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、スピネルフェライト、天然磁石、コバルト、ニッケル、希土類、及び磁性複合体からなる群から選択される磁性材料を含む。好ましい実施形態において、希土類は、ネオジム、ガドリニウム、シスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、又はネオジム−鉄−ホウ素である。他の実施形態において、磁性複合体は、セラミック、フェライト、又はアルニコ磁石を含む。
【００１５】
本発明は、本明細書に開示の磁性マクロポーラス粉末において、熱可塑性ポリマー及び磁性ミクロ粒子が化学的、熱的、又は物理的にブレンドされていることを提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、マクロ細孔は、０．５〜２００μｍのサイズを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明のマクロポーラス粉末は、セルロース繊維、セルロースナノファイバー、ガラス繊維、又は炭素繊維又は他の強化マクロ構造をさらに含む。
【００１８】
本発明の磁性マクロポーラス粉末のいくつかの実施形態は、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体及びメソ細孔内に又はその表面上に磁気的に固定化された酵素をさらに含む。
【００１９】
本発明は、本明細書に開示の磁性マクロポーラス粉末を含む形状化磁性マクロポーラス足場であって、粉末は三次元（３Ｄ）プリンティングによりその形状に形成された、形状化磁性マクロポーラス足場を提供する。いくつかの実施形態において、形状は、円柱、球体、ビーズ、ストリップ、カプセル、立方体、スクエアロッド、ピラミッド、ダイヤモンド、格子、又は不規則形状である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の形状化磁性マクロポーラス足場は、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体をさらに含む。好ましい実施形態において、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体は、前記メソ細孔内に又は前記磁性ナノ粒子の表面上に磁気的に固定化された１つ以上の酵素をさらに含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素は、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトララーゼ（ｎｉｔｒａｌａｓｅ）、ヒドラターゼ、脱水素酵素、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤＳ）エネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、カタラーゼ、ジスムターゼ、オキシダーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、シンテターゼ、トランスフェラーゼ、オキシニトリラーゼ、イソメラーゼ、グルドシダーゼ（ｇｌｕｄｏｓｉｄａｓｅ）、キナーゼ、リアーゼ、スクラーゼ、インベルターゼ、エピメラーゼ、及びリパーゼからなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態において、２つ以上の酵素が組み合わされる。
【００２２】
本発明の他の実施形態において、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体は、ミクロソームを含み、第１の酵素活性を有する拡散性補助因子を要求する第１の酵素は、ミクロソーム内に含有され、補助因子再生活性を含む第２の酵素は、メソ細孔内に磁気的に包括され、補助因子は、第１の酵素活性において利用され；第１及び第２の酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能し；磁性ナノ粒子は、磁性マクロポーラス足場と磁気的に会合している。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体は、第１の酵素活性を有する拡散性補助因子を要求する第１の酵素；補助因子再生活性を含む第２の酵素を含み；補助因子は、第１の酵素活性において利用され；第１及び第２の酵素は、磁性ナノ粒子の凝集体により形成されたメソ細孔内に磁気的に包括され、第１及び第２の酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能する。好ましい実施形態において、第１の酵素は、酸化酵素である。より好ましい実施形態において、酸化酵素は、フラビン含有オキシゲナーゼであり、第１の酵素と同時局在する補助因子レダクターゼ活性を有する第３の酵素をさらに含む。
【００２４】
より好ましい実施形態において、酸化酵素は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり、組成物は、第１の酵素と同時局在する補助因子レダクターゼ活性を有する第３の酵素をさらに含む。より好ましい実施形態において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び第３の酵素は、単一タンパク質内に含まれる。より好ましい実施形態において、単一タンパク質は、二機能性シトクロムＰ４５０／ＮＡＤＰＨ−−Ｐ４５０レダクターゼを含む。より好ましい実施形態において、単一タンパク質は、ＢＭ３活性を有し、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に開示のマクロポーラス足場は、特定の生体触媒プロセスに適した形状に形成される。
【００２６】
本発明は、本明細書に開示の磁性マクロポーラス粉末を含む形状化磁性マクロポーラス足場を形成する方法であって、三次元（３Ｄ）プリンタを用いて形状化磁性マクロポーラス足場を付加生産（ＡＭ）し、形状を３Ｄモデルから得るステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、３Ｄモデルは、電子ファイルである。好ましい実施形態において、電子ファイルは、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）又はステレオリソグラフィー（ＳＴＬ）ファイルである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＡＭは、熱融解フィラメント製法（ＦＦＦ）又は選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態において、マクロ細孔は、塩、糖、又は小型可溶性ポリマーからなる群から選択される可溶性薬剤を用いて形成される。可溶性薬剤は、溶剤により除去される。
【００２９】
本発明は、酵素反応を触媒するための装置を形成する方法であって、形状化磁性マクロポーラス足場を、磁性ナノ粒子の自己アセンブリしたメソポーラス凝集体及び酵素と組み合わせ、酵素は、メソ細孔内に磁気的に固定化されるステップを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明は、複数の基質間の反応を触媒する方法であって、酵素を含む本明細書に開示の磁性マクロポーラス粉末を、酵素が基質間の反応を触媒する条件下で基質に露出させるステップを含む方法を提供する。
【００３１】
本発明は、複数の基質間の反応を触媒する方法であって、酵素を含む本明細書に開示の形状化磁性マクロポーラス足場を、酵素が基質間の反応を触媒する条件下で基質に露出させるステップを含む方法を提供する。
【００３２】
他の実施形態において、反応は、医薬製品、医薬品、食品製品、風味料、香料、甘味料、農薬、抗菌剤、毒素、洗剤、燃料製品、生化学製品、紙製品、又はプラスチック製品の生産において用いられる。他の実施形態において、反応は、溶液から汚染物を除去するプロセスにおいて用いられる。好ましい実施形態において、溶液は、水溶液、溶剤、又は油である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の生産方法は、メソポーラス凝集体を除去し、それらをメソポーラス凝集体の新たな調製物により置き換えるステップをさらに含む。他の実施形態において、方法は、フローセル及び連続生産を用いて実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（図１Ａ）低温微粉化及び１００ミクロン開き目に通すふるいがけ；（図１Ｂ）１０５℃のチャンバ温度、１２５℃の表面温度、及び６５０ｎｍ／ｓのレーザ速度における選択的レーザ焼結；並びに（図１Ｃ）表面上に磁気的に包括されたＢＮＣ（インベルターゼ酵素）を示す焼結足場（十字）の酵素固定化後のポリプロピレンマグネタイト複合体押出複合体のＳＥＭ画像。
【図２】溶解コーティングプロセスを介して生成されたナイロン１２マグネタイト複合体のＳＥＭ画像。図２Ａは、後方散乱検出器を示す。図２Ｂは、１０，０００倍の倍率におけるそれを示す。
【図３】低温微粉化後のポリプロピレンマグネタイト押出複合体の物品サイズ分析を示す。
【図４】酵素固定化のための３Ｄプリンティング対象物の焼結。３Ｄレンダリングを、ストリップ（図４Ａ）、ビーズ（図４Ｂ）、十字（図４Ｃ）、及び静的混合エレメント（図４Ｄ）について示す。対応するＳＬＳプリント対象物を、図４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、及び４Ｈに示す。これらは、１１０℃のチャンバ温度、１２５℃の製法表面温度、及び６５０ｍｍ／ｓのレーザ速度を用いてプリントした。図４Ｉは、酵素固定化のためのプリントバーの３Ｄレンダリングを示す。図４Ｊは、ＳＬＳプリントバーを示す。
【図５】インベルターゼの固定化。図５Ａは、３Ｄプリントポリプロピレン−マグネタイト足場（ポリプロピレン−マグネタイト十字及びビーズ）上のインベルターゼの固定化収率を示す。固定化条件：５００μｇ／ｍＬのＮＰ  ｐＨ３。図５Ｂは、還元糖ＰＡＨＢＡＨアッセイにより判定された５分後のラフィノースの加水分解についての非固定化及び固定化インベルターゼ（１００μｇ／ｍＬ）の相対活性を示す。
【図６】リパーゼの固定化。図６Ａは、３Ｄプリント足場（ポリプロピレン−マグネタイト十字及びビーズ）上のＣＡＬＢの固定化収率を示す。固定化条件：２５０μｇ／ｍＬのＮＰ  ｐＨ３。図６Ｂは、比色アッセイにより判定された４分後のｐ−ＮＰＬの加水分解についての非固定化及び固定化ＣＡＬＢ（１００μｇ／ｍＬ）の相対活性を示す。
【図７】ポリプロピレン−マグネタイト十字及びビーズ上の３Ｄプリント足場の再使用。図７Ａは、比色アッセイにより判定された４分後のｐ−ＮＰＬの加水分解についての非固定化ＣＡＬＢ（１００μｇ／ｍＬ）並びに予め固定化された十字及びビーズ（沸騰ｐＨ２の水中での１０分間の洗浄後）の相対活性を示す。図７Ｂは、３Ｄプリント足場（十字及びビーズ）上のＣＡＬＢの再固定化収率を示す。固定化条件は、ｐＨ３における２５０μｇ／ｍＬのＮＰであった。図７Ｃは、ｐ−ＮＰＬ加水分解により判定された洗浄足場上の非固定化ＣＡＬＢ及び再固定化ＣＡＬＢの相対活性を示す。
【図８】種々の初期スクロース濃度Ｓ０の関数としての固定化インベルターゼのフローセル（ＰＢＲとしてモデリング）中のスクロース反応混合物からの流量Ｆ（ｍＬ／分）のプロットを示す。これはまた、スクロースのグルコース及びフルクトースへの変換率Ｘを示す。
【図９】比色アッセイにより判定された４−ＡＡＰ及びフェノールの同時酸化についての固定化収率について正規化された非固定化酵素に対する固定化ＨＲＰの相対活性を示す。
【図１０】シリンジポンプを用いる３Ｄプリントフローセル設定。ＨＲＰをフローセル上に固定化し、活性を４−ＡＡＰ及びフェノールの同時酸化について比色アッセイにより確認した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ＢＮＣの有効性を支持し、増大させるための組成物及び方法を提供する。これは、高磁性、高多孔度の熱可塑性プラスチックブレンドである粉末、単層化、及び多層化形態を用いて初めて達成される。これらは、複合体磁性粉末の焼結を含む３Ｄプリンティングを用いて形成し得る。
【００３６】
本発明は、従来技術と比べて多くの利点を有する。これは、小分子合成のための酵素の普遍的な固定化を可能とする。材料は、ＢＮＣ固定化のための大きいマクロ細孔又は高磁性表面積を含有し得る。焼結磁性足場のためのフレキシブル組成物は、任意の溶融性熱可塑性プラスチック及び磁性材料組成物から形成し得る。材料は、溶剤に耐性とし得る。
【００３７】
プロセスは、ＢＮＣを磁気的に包括する３Ｄ設計を用いて対象物を生産するためにフレキシブルで調整可能である。これは、ミクロ構造から生体触媒反応器のためのフローセルまで拡大可能である。大きい表面積は、焼結プロセス自体から生じ得る。材料はまた、ＢＮＣを除去し、次いでそれらを反復使用のために再機能化することにより再循環し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、熱可塑性プラスチック、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、及びポリ乳酸（ＰＬＡ）が磁性材料（例えば、マグネタイトＭＭＰ）と、溶融／押出を介して又は溶剤中のプラスチックの溶解による磁性材料のコーティングを介してブレンドされる。他の実施形態において、粉末は、ＳＬＳを用いてレーザにより焼結される。多孔性は、ＳＬＳの間に形成し得る。
【００３９】
他の実施形態において、押出複合体材料は、クライオミリング又は別の形態のミリングを介して微粉化される。他の実施形態において、複合体粉末は、理想粒子サイズにふるいがけされる。好ましい実施形態において、粒子サイズは、６０＋／−２０μｍである。
【００４０】
粉末又は３Ｄプリント対象物は、１つ以上の酵素又は酵素系を含有するＢＮＣにより機能化し得る。ＢＮＣは、粉末又は３Ｄプリント対象物の表面に磁気的に包括される。
【００４１】
複合体粉末はまた、流動性について最適化し得る。いくつかの実施形態において、３Ｄ対象物は、フロー反応器において用いるべき内部フローを最適化するようにプリントし得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、３Ｄ対象物及び複合体粉末は、ＢＮＣから酸洗浄により洗浄し、水によりリンスし、次いで新たなＢＮＣにより再機能化し得る。
【００４３】
高磁性足場（マクロポーラス磁性足場又はＭＭＰ）は、任意の酵素含有ＢＮＣを固定化し、安定化し、最適化するように設計される。これは、小分子の生成のための高充填及び完全活性における完全酵素系を含む。天然又は改変酵素を補助因子再循環系と組み合わせることにより、足場は、革新の生体触媒を生産規模及び生成にスケールアップすることを可能とする。
【００４４】
本発明の熱可塑性プラスチック及び磁性材料から形成されたＭＭＰは、連続バッチ反応における使用に好適な磁性粉末の形態を取り得る。フローケミストリー用途のため、これらの粉末はＳＬＳにより構造として、機能対象物として、又はフローセル若しくはプレート反応器として３Ｄプリントし得る。高表面積により酵素充填を最大化し得、フローは最大生産性における生体触媒を可能とするように材料内で改変し得る。
【００４５】
ＳＬＳは、テーラーメイド複合体材料のために金属、セラミック、プラスチック、及びそれらの組合せからのほぼあらゆる種類の材料を加工するために用い得る。しかしながら、材料が微細粉末形態において利用可能であること及び粉末粒子が熱に露出させた場合に熱融解操作可能であることが重要である（参照によりその全体が本明細書において援用されるＫｒｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ２３（４）：３５７−３７１（２００３））。
【００４６】
材料がそれらの特性を欠く場合、又は焼結プロセスの温度範囲若しくは条件において相転移の傾向がある場合、犠牲バインダの添加により、このプロセスを依然としてその材料のために実行可能とし得る。一般に、ポリマーがこの技術に好適な材料の範囲を拡張するために犠牲バインダとして用いられる。焼結後、犠牲バインダは、熱分解により除去し、又は組成物の一部として維持し得る。
【００４７】
この概念は、５８５℃超で永久磁性を損失するマグネタイトに当てはまる。これは、その融点（１５３８℃）よりも顕著に低い。マグネタイト粒子を組み込むためにポリマーマトリックスを用いる別の利点は、ポリマーマトリックスが酸化及び腐食を防止する保護バリア並びにマグネタイト粒子を分散させる補助物として作用し得ることである。また、マグネタイトはポリマーを機械的に補強し得る。（参照によりその全体が本明細書において援用されるＳｈｉｓｈｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４６：８５−９１（２０１５））。
【００４８】
プラスチック部品のレーザ焼結は、ラピッドマニュファクチャリングに用いられる２つの付加生産プロセスの１つである（参照によりその全体が本明細書において援用されるＷｅｇｎｅｒ，Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｄｉａ  ８３：１００３−１０１２（２０１６））。焼結能を決定し、良品質の３Ｄ対象物を生成するいくつかのポリマー特性が存在する。これらとしては、結晶構造（すなわち、Ｔｍ、Ｔｇ、及びＴｃなどの熱特性）、機械的特性（ヤング率及び破断伸びなど）、密度、粒子サイズ、及び形状などの構造特性が挙げられる。
【００４９】
ＳＬＳにおいて、温度加工ウインドウは、ポリマーの溶融及び結晶化温度間の差から決定される。例えば、ナイロン１２（ＰＡ１２）は、最大操作可能ウインドウの１つを有し、したがって広く用いられるＳＬＳ材料である。理論上、この値が高ければ、材料はより容易に焼結し得る。しかしながら、実際、任意の規定のポリマーについて依然としてこのプロセスを困難とし得るより多くのパラメータが存在する（参照によりその全体が本明細書において援用されるＳｈｉｓｈｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４６：８５−９１（２０１５））。焼結部品のカーリングを防止するため、低いポリマー結晶化速度が、好適なレオロジー及び表面張力を提供するメルトインデックスと一緒に望まれる。
【００５０】
また、粉末の嵩密度、粒子形状、及びサイズ分布がキー因子である（参照によりその全体が本明細書において援用されるＷｅｇｎｅｒ，Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｄｉａ  ８３：１００３−１０１２（２０１６））。最適な粒子サイズ範囲は約４０〜約９０ミクロンであることが決定されている。より小さい粒子は流動性を妨げ、それらの急速な蒸発は焼結装置の光学センサに有害である。これは装置を曇らせ、不正確に焼結された部品をもたらし得る（参照によりその全体が本明細書において援用されるＧｏｏｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５７：２２９−２６７（２０１２））。粉末は、良好な流動特性及び好ましくは略円形の粒子形状を有するべきである。これは、プロセスの間の良好な粉末分散を可能とする。材料の高い熱伝導率は、ＣＯ２レーザビーム波長（１０．６ミクロン）において望まれる。これは、ほとんどのポリマーについて当てはまらない。最後の２つの要件は、熱吸収を改善するための高エネルギー吸収材料、例えば、カーボンブラック、及び不規則形状粒子についての粒子流動性を補助するためのヒュームシリカナノ粒子（タルク）などの添加剤の組み込みにより適合し得る。
【００５１】
付加生産（ＡＭ）は３Ｄプリンティングとも称され、材料を一層ずつ積層することにより部品を生産することを含む。これは、除去プロセス（すなわち、ミリング又は穴開け）、造形プロセス（すなわち、鋳造又は鍛造）、及び結合プロセス（すなわち、溶接又は締結）などの慣用のプロセスと異なる。迅速な生成時間、低いプロトタイピングコスト、及び設計フレキシビリティにより、３Ｄプリンティングはプロトタイピング及び産業生産の両方について有用なツールとなる。３Ｄプリンタの３つの最も一般的なタイプは、熱融解フィラメント製法、ステレオリソグラフィー、及び選択的レーザ焼結である。
【００５２】
熱融解フィラメント製法（ＦＦＦ）は、熱可塑性プラスチック連続フィラメントを溶融し、プリントが完成するまで対象物を一層ずつ構築する。代替材料が存在するが、２つの最もポピュラーなフィラメント材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）である。ＦＦＦプリンタ及び材料は市場で最も安価のものであるが、現在、低いプリント解像度及び構築品質を有する。
【００５３】
ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）は、レーザを用いて感光性樹脂を重合する。未硬化液体樹脂をバット中に置き、そこでレーザを用いて樹脂を固体プラスチックに硬化し、対象物を一層ずつ構築する。ＳＬＡプリンタは、レーザの微細スポットサイズに起因してＦＦＦプリンタよりもかなり高い解像度を有し、したがって入り組んだフィーチャ及び複雑な形状をプリントし得る。しかしながら、樹脂はフィラメントよりも高価であり、完成したプリントは、現在、表面仕上及び材料特徴を最適化するための溶剤による後加工を要求する。
【００５４】
選択的レーザ焼結（ＳＬＳ）は、一般に、ラピッドプロトタイピング及びラピッドツーリング向けの粉末ベースの層付加生産プロセスである。連続又はパルスモードのいずれかのレーザビームが、層の所定サイズ及び形状における粉末のスキャン及び結合のための熱源として用いられる。スキャンされる層のジオメトリは、対象物のコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）モデル又はステレオリソグラフィー（ＳＴＬ）ファイルの種々の断面に対応する。第１の層がスキャンされた後、ルース粉末の第２の層がその上に積層され、アーティファクト（３Ｄ対象物）が完成するまで底部から頂部までこのプロセスが繰り返される（参照によりその全体が本明細書において援用されるＫｕｍａｒ，ＪＯＭ，５５（１０），４３−４７（２００３））。
【００５５】
ＳＬＳは、ＢＮＣを固定化するために用い得る磁性特性を有する対象物のプリンティングについての利点を提供する。これは、プリンティングプロセスが多孔性及び高表面積を作出するためである。周囲の未焼結粉末は、専用の支持構造の必要性を排除する天然支持体として作用する。支持構造の欠落により、そうでなければ代替３Ｄプリンティング法を用いて生産することが不可能である複雑なジオメトリが可能となる。さらに、焼結自体の性質が、マクロ及びミクロポーラス体積を作出する。プリンティングプロセスの間、レーザは、熱可塑性結晶性熱可塑性プラスチック粉末（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン）をそれらのガラス転移温度及び融点の間でフラッシュ照射して堅い部品を生成する。迅速なレーザスキャン速度（＞１００ｍｍ／ｓ）によりアモルファス挙動を回避することにより、粉末は焼結されてそれら自体の間の小さい結合を形成する。低密度粉末はそれらの構造中に空気を包括し、三次元の顕著な多孔性及び表面積をもたらす。これらの細孔は、酵素固定化のための表面積を増加させる。
【００５６】
近年、酵素の産業的使用は、広範囲の潜在的な生産用途に起因して顕著な注目を集めている。産業プロセスにおける酵素の使用は、慣用の化学法と比べていくつかの利点を提供する。これとしては、高い触媒活性、複雑な反応を実行する能力、並びに副生物及び毒性化学物質の必要性の低減によるグリーンケミストリーの促進が挙げられる（参照によりその全体が本明細書において援用されるＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ．３  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６（２）：１７４（２０１６））。
【００５７】
産業生成における幅広い生体触媒使用への最も大きい障害の１つは、低い酵素安定性である。これは、酵素を脱安定化し、それらの寿命を減少させ得る比較的厳しいプロセス条件によりさらに阻まれる（参照によりその全体が本明細書において援用されるＭｏｈａｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ２９（２）：２０５−２２０（２０１５））。さらに、これらのプロセスにおいて用いられる非固定化酵素は、一般に、廃棄生成物として系から損失され、したがって高い操作コストになる。これらの問題に対する主な解決策は、酵素の操作安定性及び触媒活性を増大させるための足場上への酵素の固定化である。酵素固定化はまた、酵素回収の方法を提供し、生体触媒プロセスをより経済的に実行可能とする。
【００５８】
現在、産業生成のための生体触媒プロセスは、一般に、簡易性及び操作の容易性に起因してバッチ反応器中で実施される。バッチ反応器を用いる利益にかかわらず、連続フロー系は、より高い生産性及びより良好なプロセス制御を可能とする（Ｗｉｌｅｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．（１４）：３８−５４（２０１２））。生体触媒プロセスにおけるフローケミストリーの急速な発展は、主にプロセス強化及びグリーンケミストリーの関心の成長により推進されてきた。連続フロー系は、滞留時間（数時間から数分のこともある）を減少させ、要求される設備のサイズを低減させ、生成体積増大を可能とすることによりプロセス強化を容易にする（Ｔａｍｂｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．３６（１）：７３−７８（２０１８））。グリーンケミストリーの立場から、これらの系は、熱管理及び混合制御に起因して安全性、廃棄物生成、及びエネルギー効率において有意な改善を提供する（Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．（１５）：１４５６−１４７２（２０１３））。前述の文献は参照によりその全体が援用される。
【００５９】
生体触媒及び連続フロー系の組み合わせに対する解決策は、機能化フローセルの使用である。生体触媒フローセルは、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）及び充填床反応器（ＰＢＲ）などの反応器中の使用のための固定化酵素を含有する足場である。両方のタイプの反応器は当分野において公知であるが、主に用いられる固定化のタイプに基づき選択される。２０１０年において５８億ドルの総市場価値で、固定化酵素は高フルクトースコーンシロップ生成（１０７トン／年）、食用油のエステル交換（１０５トン／年）、バイオディーゼル合成（１０４トン／年）、及びアルコール及びアミンのキラル分解（１０３トン／年）を含む多様な範囲の大規模プロセスにおいて用いられている（参照によりその全体が本明細書において援用されるＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（４２）：６４３７−６４７４（２０１３））。これらの系は、インライン制御、酵素再使用、及び生成スケーラビリティに関してバッチ反応器と比較して改善された酵素系のための下流プロセス管理を可能とする。
【００６０】
上記の理由から、本明細書に記載の発明は、３Ｄプリンティングにより形状化された足場中のＢＮＣを用いる小規模から大規模生産のための生体触媒系を提供する。いくつかの実施形態において、生体触媒系は、連続フローである。
【００６１】
本明細書に開示の新規の足場は、不水溶性架橋ポリマー及び略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含み得る。架橋ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及び、任意選択により追加のポリマー材料を含む。足場は、３Ｄプリンティングを用いることにより任意の形状とし得る。天然又は改変酵素を補助因子及び補助因子再循環系と組み合わせることにより、本明細書に開示の足場技術は、生体触媒における革新を生成における革新に迅速に転換することを可能とする。磁性粉末は、連続バッチ反応における使用に好適である。フローケミストリー用途のため、これらの粉末は、機能対象物中の構造として、又はフローセル若しくはプレート反応器として３Ｄプリントし得る。高表面積は酵素充填を最大化することを可能とし、フローは最大生産性における生体触媒を可能とするように材料内で改変し得る。
【００６２】
任意のプロセスのために任意の酵素を固定化する能力により、酵素、又は酵素系により機能化された材料は、医薬活性剤、農薬活性剤、風味料及び香料、ファイン及びコモディティケミカル、並びに食品成分の生成のための用途を有する。
【００６３】
被包括酵素を含む自己アセンブリしたメソポーラスナノクラスタは、活性が高く、かつ、頑強である。本技術は、３段階の総合的な組織化レベルでの生化学、ナノテクノロジー及び生体工学の効果的な融合であり：レベル１は、磁性メソポーラスナノクラスタの合成のための磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を含む酵素の自己アセンブリである。このレベルでは、酵素の固定化及び安定化のために分子自己包括メカニズムが用いられる。レベル２は、ＭＮＰの他のマトリックスへの安定化である。レベル３は、レベル１＋２を発送するための生成物の検査及びパッケージングである。酵素に吸着された磁性ナノ粒子のアセンブリは、本明細書においては、「生体ナノ触媒」（ＢＮＣ）とも称される。
【００６４】
ＭＮＰは、温度、イオン強度及びｐＨなどの幅広い範囲の操作条件を許容する。（ＭＮＰのサイズ及び磁化がＮＰの形成及び構造に関係し、これらはすべて、被包括酵素の活性に対して顕著な影響を有する。種々の反応条件下におけるその意外な復元力のために、ＭＮＰは、現在他の同様の薬剤が用いられる場合において向上した酵素又は触媒薬剤として用いられることが可能である。さらに、これらは、酵素が考慮されていないか、又は、適用可能であることが見出されていない他の用途において用いられることが可能である。
【００６５】
ＢＮＣは、磁性ナノ粒子間の間隙空間であるメソ細孔を含む。酵素は、ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部分中に包埋又は固定化されていることが好ましい。本明細書において用いられるところ、「磁性」という用語は、永久磁性、超常磁性、常磁性、強磁性及びフェリ磁性挙動を含むすべてのタイプの有用な磁性特徴を包含する。
【００６６】
磁性ナノ粒子又はＢＮＣはナノ単位（すなわち、一般に５００ｎｍ以下）のサイズを有する。本明細書において用いられるところ、「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子が略又は実質的に球状である場合には磁性ナノ粒子の直径を指すことが可能である。磁性ナノ粒子が略又は実質的に球状ではない（例えば、実質的に卵形又は不規則）場合においては、「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子の最大の寸法又は３つの寸法の平均のいずれかを指すことが可能である。「サイズ」という用語はまた、磁性ナノ粒子群全体のサイズの平均（すなわち、「平均サイズ」）を指し得る。
【００６７】
異なる実施形態において、磁性ナノ粒子は、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ若しくは１ｎｍのサイズ（正確に、約、以下又は未満）、又は、前述の例示的なサイズのいずれか２つによって定められる範囲内のサイズを有する。
【００６８】
ＢＮＣにおいて、個別の磁性ナノ粒子は、上記サイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、一次微結晶）であると考えることが可能である。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体はナノ粒子よりもサイズが大きく、一般に少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。異なる実施形態において、凝集体は、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ若しくは８００ｎｍのサイズ（正確に、約、少なくとも、超、以下又は未満）、又は、前述の例示的なサイズのいずれか２つによって定められる範囲内のサイズを有する。
【００６９】
典型的には、一次及び／若しくは凝集磁性ナノ粒子又はそのＢＮＣはサイズにばらつきがあり、すなわち、これらは一般に、狭い又は広いばらつきでサイズがばらついている。異なる実施形態において、一次若しくは凝集体サイズの任意の範囲が、一次若しくは凝集体サイズの全範囲の主たる割合若しくは副次的な割合を構成することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５又は１０ｎｍ以上、及び、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｎｍ以下）又は凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約５、１０、１５又は２０ｎｍ以上、及び、約５０、１００、１５０、２００、２５０又は３００ｎｍ以下）は、一次粒径の全範囲の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％以上又は超を構成する。他の実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５若しくは１０ｎｍ未満、又は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍ超）又は凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約２０、１０若しくは５ｎｍ未満、又は、約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０若しくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％若しくは０．１％以下又は未満を構成する。
【００７０】
磁性ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）又はそのＢＮＣは、これらを形成する個別の一次微結晶の量に応じて、実質的に多孔度を有さないものを含めて任意の多孔度を有することが可能である。特定の実施形態において、凝集体は、間隙のメソ細孔を含有する（すなわち、パッキング配置によって形成される、一次磁性ナノ粒子間に位置するメソ細孔）ことによりメソポーラスである。メソ細孔は一般に、少なくとも２ｎｍ及び５０ｎｍ以下のサイズである。異なる実施形態において、メソ細孔は、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍの孔径（正確に又は約）、又は、前述の例示的な孔径のいずれか２つによって定められる範囲内の孔径を有することが可能である。粒径の場合と同様に、メソ細孔は典型的にはサイズにばらつきがあり、すなわち、これらは一般に、狭い又は広いばらつきでサイズがばらついている。異なる実施形態において、メソ孔径の任意の範囲が、メソ孔径の全範囲又は総細孔体積の主たる割合若しくは副次的な割合を構成することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、メソ孔径の特定の範囲（例えば、約２、３又は５以上、及び、８、１０、１５、２０、２５又は３０ｎｍ以下）は、メソ孔径の全範囲又は総細孔体積の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％以上又は超を構成する。他の実施形態において、メソ孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４若しくは５ｎｍ未満、又は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍ超）は、メソ孔径の全範囲又は総細孔体積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％又は０．１％以下又は未満を構成する。
【００７１】
磁性ナノ粒子は、技術分野において公知である組成のいずれかを有することが可能である。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、磁性を有するゼロ価の金属部分であるか、これを含む。このようなゼロ価の金属のいくつかの例としては、コバルト、ニッケル及び鉄、並びに、その混合物及び合金が挙げられる。他の実施形態において、磁性ナノ粒子は、コバルト、ニッケル若しくは鉄、又は、これらの混合物の酸化物などの磁性金属の酸化物であるかこれらを含む。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、明確なコアと表面部分とを有する。例えば、磁性ナノ粒子は、元素鉄、コバルト又はニッケルから組成されるコア部分と、金、白金、パラジウム又は銀の層などの金属酸化物又は貴金属コーティングなどの不動態化層から組成される表面部分とを有し得る。他の実施形態において、金属酸化物磁性ナノ粒子若しくはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆されている。貴金属コーティングは、例えば、磁性ナノ粒子表面における荷電数を低減させ得、これは、溶液中における分散性を高め、及び、ＢＮＣのサイズの制御が良好となり、有利であり得る。貴金属コーティングは、クエン酸塩、マロン酸塩又は酒石酸塩などのキレート化有機酸が生体化学反応又はプロセスにおいて用いられる場合における、リーチングによる又はキレート化による可溶化、酸化から磁性ナノ粒子を保護する。不動態化層は、いずれかの好適な厚さであって、特に、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ若しくは１０ｎｍ（少なくとも、以下又は未満、約）、又は、これらの値のいずれか２つによって定められる範囲内の厚さを有することが可能である。
【００７２】
本発明に有用な磁性材料は技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイト又は天然磁石）、コバルト及びニッケルなどの鉱石を含む強磁性体及び強磁性材料を含む。他の実施形態においては、希土類磁石が用いられる。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、シスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素等が挙げられる。さらなる実施形態において、磁石は、複合体材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト及びアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態において、磁性ナノ粒子は酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａは二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋又はこれらの組み合わせ）であり、及び、Ｂは三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋又はこれらの組み合わせ）である）に従う、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（α−Ｆｅ２Ｏ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）又はスピネルフェライトといった技術分野において公知である磁性又は超常磁性酸化鉄組成物のいずれかであることが可能である。
【００７３】
個別の磁性ナノ粒子若しくはその凝集体又はそのＢＮＣは、任意の好適な程度の磁気を有する。例えば、磁性ナノ粒子、ＢＮＣ又はＢＮＣ足場アセンブリは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｅｍｕ／ｇ以上又は以下の飽和磁化（Ｍｓ）を有することが可能である。好ましくは、磁性ナノ粒子、ＢＮＣ又はＢＮＣ−足場アセンブリは、５ｅｍｕ／ｇを超えない（すなわち、以下）又は未満の永久磁化（Ｍｒ）を有し、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ又は０．１ｅｍｕ／ｇ以下又は未満の永久磁化（Ｍｒ）を有する。磁性ナノ粒子、ＢＮＣ又はＢＮＣ−足場アセンブリの表面磁界は、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００ガウス（Ｇ）（約又は少なくとも）、又は、前述の値のいずれか２つによって定められる範囲内の磁界であることが可能である。ミクロ粒子が含まれる場合、ミクロ粒子はまた、上記の磁性強度のいずれかを有し得る。
【００７４】
磁性ナノ粒子若しくはその凝集体は、結果的なＢＮＣを生成するために、用途に応じて飽和度以下又は未満で好適な量の酵素を吸着するよう形成可能である。異なる実施形態において、磁性ナノ粒子若しくはその凝集体は、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５又は３０ｐｍｏｌ／ｍ２の酵素（約、少なくとも、以下又は未満）を吸着し得る。代替的に、磁性ナノ粒子若しくはその凝集体は、例えば、飽和度の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（約、少なくとも、以下又は未満）の量の酵素を吸着し得る。
【００７５】
磁性ナノ粒子若しくはその凝集体又はそのＢＮＣは、任意の好適な細孔体積を有する。例えば、磁性ナノ粒子又はその凝集体は、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５若しくは１ｃｍ３／ｇの細孔体積（約、少なくとも、以下又は未満）、又は、前述の値のいずれか２つによって定められる範囲内の細孔体積を有することが可能である。
【００７６】
磁性ナノ粒子若しくはその凝集体又はそのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁性ナノ粒子若しくはその凝集体は、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｍ２／ｇ（約、少なくとも、以下又は未満）の比表面積を有することが可能である。
【００７７】
ＭＮＰ、その構造、組織化、好適な酵素及び使用は、参照によりその全体が本明細書において援用される国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット及び国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットに記載されている。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒドロラーゼを含む。ヒドロラーゼは、基質として水を用いることで多くの種類の化学結合の加水分解を触媒する。基質は典型的には、破断される結合部位に水素及び水酸基を有する。ヒドロラーゼは、酵素のＥＣ番号分類におけるＥＣ３と分類される。ヒドロラーゼは、これらが作用する結合に基づいて数々のサブクラスにさらに分類されることが可能である。例示的なヒドロラーゼ及びこれらが加水分解する結合は以下を含む：ＥＣ３．１：エステル結合（エステラーゼ：ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、脱リン酸化酵素）、ＥＣ３．２：糖（ＤＮＡグリコシラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．３：エーテル結合、ＥＣ３．４：ペプチド結合（プロテアーゼ／ペプチダーゼ）、ＥＣ３．５：炭素−窒素結合、ペプチド結合以外、ＥＣ３．６酸無水物（ヘリカーゼ及びＧＴＰアーゼを含む酸無水物ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．７炭素−炭素結合、ＥＣ３．８ハライド結合、ＥＣ３．９：リン−窒素結合、ＥＣ３．１０：硫黄−窒素結合、ＥＣ３．１１：炭素−リン結合、ＥＣ３．１２：硫黄−硫黄結合、及びＥＣ３．１３：炭素−硫黄結合。
【００７９】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはグリコシドヒドロラーゼである。これらの酵素は、植物材料の分解（例えば、エタノール生成に用いられるグルコースにセルロースを分解するセルラーゼ）、食品生産（例えば、糖転化、マルトデキストリン生成）及び紙生産（紙パルプからのヘミセルロースの除去）を含む多様な用途を有する。
【００８０】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはリポラーゼ１００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）である。これは、神経障害性疼痛、不安障害及びてんかんに用いられる抗痙攣薬であるプレガバリン（ＰｆｉｚｅｒからＬｙｒｉｃａ（登録商標）として市販されている）の合成に用いられる。これらの病状は世界人口の約１％に影響を及ぼしている。リポラーゼ１００Ｌは、必要とされる出発材料を３９％低減すると共に、単位当たりの廃棄物を８０％削減することが見出されていた。
【００８１】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはγ−ラクタマーゼ（例えば、ＥＣ３．１．５．４９）である。これは、アバカビル生成（ＨＩＶ／ＡＩＤＳを処置するための抗レトロウイルス薬）のための中間体であるビンスラクタムの形成に用いられる。化学量論的プロセスを触媒性流動プロセスに変更することで、操作単位数が１７から１２に減少すると共に、廃棄率が３５％低減することが見出された。また、有害物質である塩化シアンの使用が最小限である。
【００８２】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはラクターゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．１０８）である。これらの酵素は、乳中のラクトースを単一の糖に分解してラクトースを含まない乳を生産する。この重要な生産物は、ラクトース不耐症である世界人口の略１５％の役に立っている。
【００８３】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはペニシリンアミダーゼ（例えば、ＥＣ３．５．１．１１）である。これらの酵素はペニシリンをカルボキシレートと６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）とに分離する。６−ＡＰＡは、天然及び合成ペニシリン誘導体におけるコア構造である。これらの酵素は、特定の感染症と戦うために調整された半合成ペニシリンの生成に用いられる。
【００８４】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはニトララーゼ（例えば、ＥＣ３．５．５．１）である。これらの酵素はニトリルをカルボキシル基に分離する。ニトララーゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒからＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の生産に用いられる。これは、メソ−３−ヒドロキシグルタロニトリルのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへの反応を触媒し、ここで後者は、アトルバスタチンのコアを形成する。
【００８５】
ヒドロラーゼは、参照によりその全体が本明細書において援用される以下の文献において検討されている：Ａｎａｓｔａｓ，Ｐ．Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，２００９；Ｄｕｎｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗ  Ｗｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｄｓ．Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１０．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（１２）：１４７０−９０（２０１０）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６（１２）：１９８６−１９９３（２０１２）。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素を提供する。一定の実施形態において、ＨＰＰ酵素は、ＥＸ１．１．３亜属であり得るオキシダーゼである。特定の実施形態において、オキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．８（Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１５（２−オキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１８（第二級−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸塩オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２２、ＥＣ１．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２５、ＥＣ１．１．３．２６、ＥＣ１．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２９（ナシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３１、ＥＣ１．１．３．３２、ＥＣ１．１．３．３３、ＥＣ１．１．３．３４、ＥＣ１．１．３．３５、ＥＣ１．１．３．３６、ＥＣ１．１．３．３７、Ｄ−アラビノノ−ｌ，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成）、ＥＣ１．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）又はＥＣ１．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）であり得る。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒドロキシラーゼを含み得る。ヒドロキシル化は、水酸基（−ＯＨ）を有機化合物に導入する化学プロセスである。ヒドロキシル化は、空気中における有機化合物の酸化的分解における最初のステップである。ヒドロキシル化は、親油性化合物をより容易に排出される親水性物質に転換することによる解毒に関与する。いくつかの薬物（例えば、ステロイド）は、ヒドロキシル化により活性化又は非活性化される。ヒドロキシラーゼは技術分野において周知である。例示的なヒドロキシラーゼとしては、プロラインヒドロキシラーゼ、リシンヒドロキシラーゼ及びチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態はニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含む。これらは、高い光学純度を有するキラルカルボン酸とアンモニアとのニトリルの加水分解を触媒する加水分解酵素（ＥＣ３．５．５．１）である。ＮＩＴ活性は、マンデロニトリルの（Ｒ）−マンデル酸への転換を監視することにより計測し得る。これはｐＨの低下をもたらし、これを分光測光法的に監視し得る。ニトリラーゼは、ビタミンＢ３又はナイアシンとしても知られているニコチン酸の３−シアノピリジンからの生成に用いられる。ニコチン酸は、食品における栄養補助剤食品及び薬学的中間体である。例示的な産業的用途が、本明細書における参照によりその全体が本明細書において援用されるＧｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１１（１），１４２（２０１２）において検討されている。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態はヒドラターゼを含む。これらは、水の元素の付加又は除去を触媒する酵素である。ヒドロラーゼ又はヒドラーゼとしても知られているヒドラターゼは、Ｃ−Ｏ結合の水和又は脱水を触媒し得る。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態はオキシドレダクターゼを含む。これらの酵素は、一の分子から他への電子の移動を触媒する。これには、一の物質から他へのＨ及びＯ原子又は電子の移動が含まれる。これらは典型的には、ＮＡＤＰ又はＮＡＤ＋を補助因子として利用する。
【００９１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、ポリ塩化ビフェニル及びフェノール系化合物などの汚染物質の分解、石炭の分解及び木材加水分解産物の発酵の増強に用いられる。本発明はさらに、バイオセンサ及び病害診断におけるこれらの利用を含む。
【００９２】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは脱水素酵素（ＤＨＯ）である。このグループのオキシドレダクターゼは、１種以上の水素化物（Ｈ−）を、通常はＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋又はＦＡＤ若しくはＦＭＮなどのフラビン補酵素といった電子受容体に変換する還元反応によって基質を酸化する。例示的な脱水酵素としては、アルデヒド脱水素酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱水素酵素、コハク酸脱水素酵素及びリンゴ酸脱水素酵素が挙げられる。
【００９３】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒからＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の形成に用いられるオキシドレダクターゼであるケトレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１８４）である。この生体触媒プロセスは、実質的に出発材料が減少され、有機溶剤の使用が限定され、及び、廃棄物流の生分解性が高められるために商業的に重要である。
【００９４】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、グルコース脱水素酵素（例えば、ＥＣ１．１．９９．１０）である。これらは、製薬に用いられる補助因子をリサイクルするために製薬会社によって用いられる。これらは、グルコースのグルコネートへの変換を触媒する。ＮＡＤＰ＋はＮＡＤＰＨに還元される。これはアバスタン生成に用いられる。
【００９５】
シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０又はＣＹＰと称される）は、酵素のＥ．Ｃ．１．１４クラスのものである。（参照によりその全体が本明細書において援用されるＢｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ２１５−Ｓ２１７（２００９））。これらは、薬物、生体異物、アルカン、テルペン、及び芳香族化合物の生体変換に関与するモノオキシゲナーゼのファミリーを構成する。これらはまた、化学発癌薬の代謝並びにステロイド、脂肪酸、エイコサノイド、脂溶性ビタミン、及び胆汁酸などの生理関連化合物の生合成に関与する。さらに、これらはまた、殺虫剤及び他の産業有機汚染物などの環境中の生体異物の分解に関与する。これらは、１つのヒドロキシル基を多くの代謝経路に見出される基質中に組み込むことにより機能する。この反応において、二酸素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補助因子の同時酸化により１つのヒドロキシル基及び１つのＨ２Ｏ分子に還元される。
【００９６】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＰ４５０（ＥＣ１．１４．１４．１）である。これは、製薬産業において困難な酸化に用いられる。Ｐ４５０により、天然補助因子（例えば、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋）に付随するコスト、不一致性及び非効率性が低減される。薬物代謝産物は元の薬物と比較して優れた特性を示し得るため、活性成分として薬物代謝産物を用いるいくつかの利点が存在する。これとしては、改善された薬力学、改善された薬物動態、薬物−薬物相互作用のより低い確率、低変動性の薬物動態及び／又は薬力学、改善された全安全性プロファイル並びに改善された物理化学的特性が挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、哺乳動物であるＰ４５０配列を含む。他の実施形態において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ヒトであるＰ４５０配列を含む。他の実施形態において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＰ２Ｗ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ２０Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１、ＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１、又はＣＹＰ５１Ａ１を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギからなる群から選択される起源のもののＰ４５０配列を含む。他の実施形態において、Ｐ４５０オキシゲナーゼは、昆虫、魚類、真菌、酵母、原生動物、及び植物からなる群から選択される起源のもののＰ４５０配列を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、Ｐ４５０は、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＢＭ３  Ｐ４５０などの可溶性形態である。例えば、配列番号１参照。他の実施形態において、ＢＭ３  Ｐ４５０は、野生型からの１つ以上の変異アミノ酸を有する。他の実施形態において、Ｐ４５０は、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、補助因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸＋水素（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド＋水素（ＦＡＤＨ）、又はグルタチオンである。
【０１０１】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＥＣ１．１１．１．６などのカタラーゼである。これは、食品産業において、チーズの生産に先立つ乳からの過酸化水素の除去、及び、グルコン酸などのｐＨ調整剤の生成のために用いられる。カタラーゼはまた、生地産業において布から過酸化水素を除去するために用いられる。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースオキシダーゼ（例えば、ノタチン、ＥＣ１．１．３．４）である。これは、グルコースの過酸化水素及びＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。これは、例えば、ペルオキシダーゼなどの酵素を消費する過酸化水素のための、酸化剤としての過酸化水素の生成に用いられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本発明は、フリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素を包含する。いくつかの実施形態において、ＦＲＰはペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは生体系中に広く見られ、フェノールから芳香族アミンにわたる多種多様な芳香族化合物を酸化するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水に還元するオキシドレダクターゼのサブセットを形成する。ペルオキシダーゼはきわめて効力が高い酵素であるが、過剰量の過酸化物の存在下における強力な阻害のために、産業上の環境において採用することが困難であることでもよく知られている。本発明は、高い反応交換回数及び低い阻害を提供するものである。それ故、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が産業規模で用いられ得る。
【０１０４】
ペルオキシダーゼは亜属ＥＣ１．１１．１に属する。一定の実施形態において、ＥＣ１．１１．１酵素は、より具体的には、例えば、ＥＣ１．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．４、ＥＣ１．１１．１．５（チトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ１．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．８（ヨージドペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１０（クロリドペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロ過酸化物グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）又はＥＣ１．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）であることが可能である。
【０１０５】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、セイヨウワサビ植物であるセイヨウワサビ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に見出されるヘム含有オキシドレダクターゼ酵素である。これは、通常、過酸化水素と一緒に発色性基質に作用して鮮やかに着色された生成物複合体をもたらすために、生化学シグナル増幅因子及びトレーサとして通例用いられる。これは、目標分子の分光測光法における検出性を向上させる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のこの特徴は、げっ歯類の神経系毛細管の浸透性の研究に適用されている。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＲＰは、種々の芳香族化合物の分解能のために、フェノール系排水の可能な修復ストラテジーの一部として用いられる。参照により本明細書においてその全体が援用されている、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１５（５），９７４−９８０（２０１４）を参照のこと。
【０１０６】
他の実施形態において、ペルオキシダーゼはまた、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ又は万能ペルオキシダーゼといった官能性によってさらに特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、真菌性、微生物性、動物又は植物ペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、クラスＩ、クラスＩＩ、又はクラスＩＩＩペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ピーナッツペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、オオムギペルオキシダーゼ又はペルオキシダシンと特定され得る。特定の実施形態において、ペルオキシダーゼはホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【０１０７】
ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ（ＬＰ／ＧＯＸ）抗菌系は、乳、唾液、涙及び粘液などの体液中に自然に生じる（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。この系は、哺乳類及び高等生物に無害である２種の天然化合物チオシアネート（ＳＣＮ−）及びヨウ化物（Ｉ−）を利用する（Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））。ＬＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下におけるチオシアネート及びヨウ化物イオンのそれぞれ次亜チオシアン酸塩（ＯＳＣＮ−）及び次亜ヨウ素酸（ＯＩ−）への酸化を触媒する。この系中のＨ２Ｏ２は、酸素の存在下におけるβ−Ｄ−グルコースに対するＧＯＸの活性によってもたらされる。これらのフリーラジカル化合物は次いで、細菌の細胞膜中のスルフヒドリル基を酸化して（Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），１１８７（１９８３）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）膜透過性の機能障害をもたらし（Ｗａｎ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６２，３５５−３６２（２００１））、最終的に微生物細胞を死滅させる。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態はトランスフェラーゼを含む。「トランスフェラーゼ」は特定の官能基を一の分子から他の分子に転移させる酵素分類を指す。転移される基の例としては、メチル基及びグリコシル基が挙げられる。トランスフェラーゼは、発癌化学物質及び環境汚染物質などの物質の処理に用いられる。また、これらは、ヒトの体内に見出される有害化学物質及び代謝産物と戦う又は中和するために用いられる。
【０１０９】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはトランスアミナーゼである。トランスアミナーゼ又はアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸との間の反応を触媒する。これらは、アミノ酸の合成において重要である。転移においては、一の分子におけるＮＨ２基が他の分子における他の基（例えば、ケト基）由来の＝Ｏと交換される。
【０１１０】
さらに好ましい実施形態において、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。これは、とりわけ、シタグリプチン（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．により、抗糖尿病薬Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）として市販されている）の合成に用いられる。改変ω−トランスアミナーゼは、生体触媒活性を例えば２５，０００倍向上させて、シタグリプチン収率の合計で１３％の増加及びプロセス廃棄物全体における１９％の低減をもたらすことが見出されている。
【０１１１】
基質に対する高い立体選択性及び生成物に対する高い立体特異性により、ω−トランスアミナーゼは、人工的なアミノ酸及び光学的に純粋なキラルアミン又はケト酸の形成に利用することが可能である（Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２（６），９９３−１００１（２０１２））。ω−トランスアミナーゼはまた、活性な薬学的中間体の生体触媒キラル分解における用途を有し、従来の化学的方法よりもプロセスを簡素化する（Ｓｃｈａｅｔｚｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８１（１９）：８２４４−４８（２００９））。前述の文献は参照によりそれらの全体が援用される。
【０１１２】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはチミジル酸シンテターゼ（例えば、ＥＣ２．１．１．４５）である。これらの酵素は、糖ヌクレオチド及びオリゴ糖の生産に用いられる。これらは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数１】
2022500067.tif 000003
【０１１３】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．５．１．１８）である。これらの酵素は、グルタチオンを他のトリペプチドに触媒する。これらは、食品産業において酸化剤として、並びに、製薬産業における抗老化薬及び皮膚配合物の形成に用いられる。
【０１１４】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルコキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２）である。これらの酵素は、グルコースのグルコース−６−リン酸塩へのリン酸化を促進させる。これらは、食品産業において生成物流中におけるグルコース濃度を低減するために、並びに、製薬産業において糖尿病薬物を形成するために用いられる。
【０１１５】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはリボフラビンキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２６）である。さらに好ましい実施形態において、リボフラビンキナーゼは、食品産業におけるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の生成に用いられる。ＦＭＮは、オレンジ−赤色の食品着色添加剤であり、及び、過剰量のリボフラビン（ビタミンＢ２）を分解する薬剤である。リボフラビンキナーゼは、例えば以下の反応を触媒する。
【数２】
2022500067.tif 000004
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態はエネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）を含む。これらの酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−に依存する形式でアルケン還元を触媒する。エネレダクターゼの例としては、オキシドレダクターゼのＦＭＮ−含有旧黄色酵素（ＯＹＥ）ファミリー（ＥＣ１．６．９９）、クロストリジウムエン酸レダクターゼ（ＥｎｏＲｓ、Ｃ１．３．１．３１）、フラビン非依存性中間鎖脱水素酵素／レダクターゼ（ＭＤＲ；ＥＣ１．３．１）、短鎖脱水素酵素／レダクターゼ（ＳＤＲ；ＥＣ１．１．１．２０７−８）、ロイコトリエンＢ４脱水素酵素（ＬＴＤ）、キノン（ＱＯＲ）、プロゲステロン５ｂ−レダクターゼ、ラットプレゴンレダクターゼ（ＰＧＲ）、タバコ二重結合レダクターゼ（ＮｔＤＢＲ）、シアノバクテリアＯＹＥ、カセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のＬａｃＥＲ、アクロモバクター属の一種（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＪＡ８１）由来のＡｃｈｒ−ＯＹＥ４、及び、イースト菌ＯＹＥが挙げられる。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態はイミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）を含む。イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）は光学的に純粋な第二級環式アミンの合成を触媒する。これらは、ケトン又はアルデヒド基質及び第一級又は第二級アミン基質を転換して、第二級又は第三級アミン生成化合物を形成し得る。例示的なＩＲＥＤは、パエニバチルスエルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  Ｂ６９）、ストレプトマイセスイポモエアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｉｐｏｍｏｅａｅ  ９１−０３）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）及びアセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）由来のものである。ＩＲＥＤは、参照によりその全体が本明細書において援用されている国際公開第２０１３１７００５０号パンフレットにおいて詳細に検討されている。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はリアーゼである。これらは、加水分解又は酸化以外のプロセスによって基質から原子群が除去される脱離反応を触媒する。度々、新たな二重結合又は環構造がもたらされる。リアーゼの７つのサブクラスが存在する。好ましい実施形態において、ペクチンリアーゼは、高エステル化ペクチン（例えば、果実中）の小分子への分解に用いられる。本発明の他の好ましい実施形態は、オキシニトリラーゼ（マンデロニトリルリアーゼ又は脂肪族（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとも称される）を含む。これらは、マンデロニトリルをシアン化水素＋ベンズアルデヒドに開裂する。
【０１１９】
好ましい実施形態において、リアーゼは、ヒドロキシニトリルリアーゼ（例えば、ＥＣ４．１．２、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）リアーゼの突然変異）である。ヒドロキシニトリルリアーゼは、幅広い範囲の化学反応及び酵素反応に対する多用途の構築ブロックとして役立つことが可能であるシアノヒドリンの形成を触媒する。これらは、酵素スループット及び低ｐＨでの安定性の向上に用いられると共に、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））の生成に用いられる。反応プロセスは、参照により本明細書においてその全体が援用されているＧｌｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４８１５（２００３）に記載されている。
【０１２０】
他の好ましい実施形態において、リアーゼは２−デオキシ−Ｄ−リボースリン酸塩アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。これは、例えばＬｉｐｉｔｏｒ生成といったスタチン側鎖の形成に用いられる。
【０１２１】
他の好ましい実施形態において、リアーゼは、（Ｒ）−マンデロニトリルリアーゼ（ＨＮＬ、ＥＣ４．１．２．１０）である。これは、ジルチアゼムの生成に用いられる前駆体シアノヒドリンであるスレオ−３−アリール−２，３−ジヒドロキシプロパン酸の合成に用いられる。ジルチアゼムは、高血圧及び胸痛（アンギーナ）を処置する強心薬である。血圧を低下させることで、脳卒中及び心臓発作のリスクが低減される。これはカルシウムチャネル遮断薬である。ジルチアゼム及びその生成は、共に参照によりそれらの全体が援用される、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．１：１１２１−４９（２０１１）及びＡｅｈｌｅ  Ｗ．２００８．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｗｅｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，ＧｍｂＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【０１２２】
他の好ましい実施形態において、リアーゼはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１）である。これは、３−シアノピリジンをニオコチンアミド（ビタミンＢ３、ナイアシンアミド）に転換するために商業的に用いられる。これはまた、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）における活性薬学処方成分であるレベチラセタムの調製にも用いられる。
【０１２３】
他の好ましい実施形態において、リアーゼはフェニルリン酸塩カルボキシラーゼである。これらは、例えば、室温及び大気圧未満のＣＯ２圧下におけるフェノールのリン酸化に用いられる。これらの酵素は、フェノール及びＣＯ２からの１００％の選択性を伴う４−ＯＨ安息香酸の合成を触媒する。４−ＯＨ安息香酸は、そのエステルの調製に用いられる。さらに好ましい実施形態において、酵素は、化粧品及び点眼剤における防腐剤として用いられるパラベンの生成に用いられる。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素は炭酸脱水酵素（例えば、ＥＣ４．２．１．１）である。炭酸脱水酵素は、すべての生体に存在する広範に分布する金属酵素である。これらは知られている中で最も効率的な酵素であり、ＣＯ２交換、ｐＨ調整及びＨＣＯ３−分泌を含む複数の生理学的な役割を果たす。炭酸脱水酵素はまた、ＣＯ２の隔離及び方解石の生成において潜在的な産業用途を有する。Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  ＆  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，（２０００），Ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ  ＥＸＳ  ９０：１７５−１９５（Ｗ．Ｒ．Ｃｈｅｇｗｉｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．２０００）；Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｐｐ．１７５−９５（Ｗ．Ｒ．Ｃｈｅｇｗｉｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．２０００）；ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３０：１４５５−１４５８（２０００）；Ｂｏｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３：２２−２７（２０１３）を参照のこと。前述の文献は参照によりそれらの全体が援用される。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はイソメラーゼである。イソメラーゼは、分子異性化、すなわち、一の異性体を他のものに転換する反応を触媒する。これらは、結合が破断及び形成される分子内転移を促進させることが可能であり、又は、これらは、配座変化を触媒することが可能である。イソメラーゼは技術分野において周知である。
【０１２６】
好ましい実施形態において、イソメラーゼは糖の生産において用いられる。さらに好ましい実施形態において、イソメラーゼは、グルコースイソメラーゼ、ＥＣ５．３．１．１８である。他の実施形態において、グルコースイソメラーゼは、アクチノプラネスミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種によって産生される。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロース及びＤ−グルコースをＤ−キシルロース及びＤ−フルクトースに転換し、これは、高フルクトースコーンシロップの生成及び生物燃料の分野において重要な反応である。
【０１２７】
他の好ましい実施形態において、イソメラーゼはマレエートｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）である。これは、マレイン酸のフマル酸への転換を触媒する。フマル酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、ポリエステル樹脂、食品及び飲料添加剤、並びに、染料用の媒染剤の生体触媒生成に重要である。
【０１２８】
他の好ましい実施形態において、イソメラーゼは、リノール酸ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．５）である。これは、共役リノール酸（ＣＬＡ）の異性化を触媒する。ＣＬＡは、肥満症、糖尿病、ガン、炎症及びアテローム発生の処置に係る数多くの潜在的な健康上の有益性を有すると報告されている。ＣＬＡの異なる異性体は、異なる生理学的な効果を発揮し得る。それ故、酵素は単一の異性体の調製に用いられる。
【０１２９】
本発明の他の好ましい実施形態において、イソメラーゼはトリースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１）である。これは、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸塩及びジヒドロキシアセトンリン酸塩の相互変換を触媒する。トランスケトラーゼ又はアルドラーゼとの組み合わせで、トリースリン酸イソメラーゼは、種々の糖又は糖類似体の立体選択的多酵素合成に用いられる。好ましい実施形態は、Ｄ−キシルロース５−リン酸塩のワンポット酵素調製である。この合成は、Ｄ−フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）によるフルクトース１，６−二リン酸の逆アルドール開裂から開始される。続くラセミ化で、トリースリン酸イソメラーゼによって、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）によってキシルロース５−リン酸塩に転換されるＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸塩の２種の均等物の生成が促進される。
【０１３０】
本発明の他の実施形態において、酵素はリガーゼである。これらの酵素は、ヌクレオシド−三リン酸の加水分解と組み合わされる２つの分子を一緒に結合する共有結合の形成を触媒する。リガーゼは技術分野において周知であり、通例、組換え核酸用途に用いられる。好ましい実施形態において、ＤＮＡリガーゼはＥＣ６．５．１．１である。
【０１３１】
好ましい実施形態において、リガーゼはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２、ＡＣＣ）である。ＡＣＣは、脂質合成のジャンクション及び酸化経路における役割を有する。これは、本明細書に開示の本発明と共に、抗生物質の生成、糖尿病治療、肥満症及び他のメタボリックシンドロームの症状などの臨床目的で用いられる。
【０１３２】
他の好ましい実施形態において、リガーゼはプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ、ＥＣ６．４．１．３）である。これは、ミトコンドリアマトリックスにおいてＤ−メチルマロニル−ＣｏＡを生成するプロピオニル−ＣｏＡのビオチン−依存カルボキシル化を触媒する。メチルマロニル−ＣｏＡは、多くの有機化合物の生合成、並びに、炭素同化プロセスにおける重要な中間体である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本発明において用いられる酵素を発現する組換え細胞を用いる。組換えＤＮＡ技術は技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、細胞は、酵素を発現するプラスミドなどの発現ベクターで形質転換される。他の実施形態において、ベクターは、例えば転写開始、転写終了、翻訳開始及び翻訳終了に係る１つ以上の遺伝子シグナルを有する。ここで、酵素をコードする核酸は、好適な宿主生体中に適当に移された場合に発現されるよう、ベクター中においてクローン化され得る。好適な宿主細胞は、技術分野において周知であるとおりバクテリア、真菌、植物又は動物に由来するものであり得る。
【０１３４】
ＢＮＣ（レベル１）は酵素固定化能の大部分をもたらすが、往々にして、これらは、標準的な強度の磁石によって容易に捕捉されるには小さすぎる。それ故、マイクロメートル未満の磁性材料（レベル２）が、レベル１に対してバルク磁化及び追加的な安定性をもたらすために用いられる。５０〜５００ｎｍの範囲の粒径を有する市販されている非固定化マグネタイト粉末は親水性が高くプラスチック及び金属表面に貼り付く傾向にあり、これにより、経時的に、所与の反応器系中における実効上の酵素の量が低減されてしまう。加えて、粉末化されたマグネタイトはきわめて高密度であり、それ故、輸送コストが高くなってしまう。また、かなり高価でもあり、特に、１００ｎｍよりも小さい粒径では顕著である。これらの限定事項を克服するために、マグネタイト、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの不水溶性架橋ポリマーから構成される低密度ハイブリッド材料が開発された。これらの材料は、架橋後における水溶性ポリマーの凍結鋳造及び凍結乾燥によって形成される。これらの材料は外部表面に対する接着性が低く、マグネタイトの必要量が少なく、純粋なマグネタイト粉末に少なくとも匹敵するレベル１の捕捉を達成する。
【０１３５】
一実施形態においては、連続するマクロポーラス足場は架橋ポリマー組成物を有する。このポリマー組成物は、技術分野において公知である固体有機、無機又はハイブリッド有機−無機ポリマー組成物のいずれかであり得、及び、バインダとして作用する合成又はバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロポーラス足場は、階層型触媒の使用が意図される水又は他の媒質中において溶解又は分解しない。合成有機ポリマーのいくつかの例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸又はポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸又はポリメタクリル酸塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール等）、フッ素化ポリマー（例えば、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン等）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、及び、これらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーのいくつかの例としては、多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース及びアルギン酸）、ポリ乳酸及びポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定の事例においては、セルロースは、微生物由来又は藻類由来のセルロースであり得る。無機又はハイブリッド有機−無機ポリマーのいくつかの例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成によって調製されるもの）及びポリホスファゼンが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記のポリマー組成物のいずれか１つ以上の分類又は特定のタイプのものがマクロポーラス足場として排除される。
【０１３６】
本明細書に記載の発明をより完全に理解し得るようにするため、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明の目的のためのものにすぎず、いかなる様式によっても本発明を限定するものと解釈すべきでないことを理解すべきである。
【実施例】
【０１３７】
実施例１−溶融及び押出による３Ｄプリンティングのための熱可塑性プラスチック及びマグネタイトブレンド
材料：ポリアミド１２（ナイロン１２、カタログ番号ＡｄＳｉｎｔ  ＰＡ１２）及びポリスチレン（カタログ番号Ｃｏａｔｈｙｌｅｎｅ  ＰＳ  Ｓｉｎｔ）を、Ａｄｖａｎｃ３Ｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ポリプロピレン（カタログ番号Ｐｏｌｙａｘｉｓ  ＰＤ  ２０００）サンプルを、Ａ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ（Ｆａｉｒｌａｗｎ，Ｏｈｉｏ）から入手した。１０μｍよりも小さい粒子サイズを有する酸化鉄（カタログ番号ＱＭ−Ｄ５０／４マグネタイト）を、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｅａｓｔ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）から、及び５μｍよりも小さい粒子サイズの酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号３１００６９−５００Ｇ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。用いられる発泡剤は、重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＸ０３２０−１）及びクエン酸（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、カタログ番号ＢＤＨ８００３−５００Ｇ）であった。Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ１２８−４、Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）をさらに精製せずに用いた。
【０１３８】
熱可塑性プラスチック及びマグネタイトの押出ブレンディング：異なる比率のポリマー、マグネタイト、及び発泡剤粉末をガラス容器中に置き、ロータリータンブラ（Ｌｏｒｔｏｎｅ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ  ３Ａ）中で数分間混合した。粉末混合物を単軸スクリュＦｉｌａｂｏｔ押出機（カタログ番号ＥＸ００３３４）中に供給し、ポリマーマトリックス組成物及び発泡剤の組み合わせに応じて異なる範囲の温度及び速度においてこのようにさらにブレンドした。押出プロセスから得られた複合体磁性材料のサイズは、ステンレス鋼ブレンダ（Ｗａｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌカタログ番号ＣＢ１５Ｔ）中で、−７８．５℃で高速においてそれらを数分間、何度も粉砕することにより２．８２ｍｍ以下のサイズに低減させた。次いで、材料粒子サイズを、−１８４．４４℃においてそれを冷却し、粒子を２０，０００ＲＰＭにおいて稼働するインパクトミル（Ｖｏｒｔｅｃ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１）に供給することにより６０ミクロン以下にさらに低減させ、その粒子サイズを得るために要求されるだけの回数、このプロセスを繰り返した。
【０１３９】
押出複合体実施例１：１００ｇのポリプロピレン（４６％ｗ／ｗ）、マグネタイト（４６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）粉末のブレンドを、ロータリータンブラ中でガラスシリンダ中で１５分間混合した。固体ブレンド粉末を押出機に供給し、１７５℃及び２１ＲＰＭにおいて混合した。
【０１４０】
押出複合体実施例２：ポリスチレン（４８％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０ｕｍ、４８％ｗ／ｗ）及び重炭酸ナトリウム（４％ｗ／ｗ）の１００ｇの粉末混合物を用いて別のブレンドを形成した。粉末をロータリータンブラ中で１５分間予備混合した。混合物を押出機中で１７０°〜１７５℃の温度範囲及び１２ＲＰＭの速度においてさらにブレンドした。
【０１４１】
溶解コーティングによる３Ｄプリンティングのための熱可塑性プラスチック及びマグネタイトブレンド：ナイロン１２及びマグネタイト（＜５μｍ）５０／５０％ｗ／ｗの粉末を、ＤＭＳＯを含有するガラス容器中に９０％ｖ／ｖの溶剤と１０％ｖ／ｖの粉末材料との比で添加した。混合物を５００ＲＰＭにおいて均一に撹拌し、温度を１４０℃に徐々に上昇させてナイロン１２を溶解させた。材料を溶液中で１５分間維持した。この後、溶解したナイロン１２及び分散したマグネタイトの混合物をゆっくりと冷却させ、一方で、５００ＲＰＭにおいて撹拌した。この様式で、マグネタイト粒子をナイロン１２粒子中に組み込み、それは冷却プロセスの間にＤＭＳＯ溶液から沈殿を開始した。ネオジム磁石を用いてマグネタイトナイロン１２複合体粒子を精製してＤＭＳＯを可能な限り除去した。次いで、複合体粉末を冷却水により数回リンスし、その後に材料を真空オーブン中で１００℃において２４時間乾燥させて残留吸収ＤＭＳＯを除去した。最後に、１００μｍ開き目のメッシュを用いて材料をふるいがけした。
【０１４２】
焼結前後の成長複合体材料のミクロ構造特性を、電界放出形走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ、Ｔｅｓｃａｎ  Ｍｉｒａ３）下で、金−パラジウムターゲットによるスパッタコーティング（７ｎｍ厚）後に観察した。
【０１４３】
低温粉砕、焼結、及び酵素固定化後の押出ポリプロピレンマグネタイト複合体のモルホロジーをＳＥＭにより査定し、図１Ａ〜１Ｃにそれぞれ示す。低温粉砕複合体粒子の形状は完全には円形ではなく、規則形である。低温粉砕後のポリプロピレンマグネタイト複合体の粒子サイズ分布は、１．９４５〜２４８．９ミクロンの範囲である（図３）。３７ミクロンよりも小さい粒子は全体の３５％未満であり、６０％は６２．２３ミクロン未満であった。焼結プロセスのため、ポリプロピレンマグネタイト複合体粉末を１００ミクロン開き目のメッシュによりスクリーニングした。これは、ＳＥＭ画像において観察された粒子と一致する（図１Ｂ）。４０ミクロン未満の粒子は除去しなかった。これは、低温粉砕複合体粉末の利用性を全体の７５％まで最大化した。粉末の流動能は、焼結に十分に良好であった。図１Ｂは、粉末の熱融解に起因するこのプロセスの特徴的な凝固、粗大化、及び多孔度の特性を保持するポリプロピレンマグネタイト押出複合体粉末の成功裏の焼結プロセスを示す。さらに、針様形状を有する残留重炭酸ナトリウム粒子（略０．５ミクロンの直径及び８ミクロンの長さ）を確認することが可能である。重炭酸ナトリウム残留材料は酵素固定化前に水リンスにより容易に除去され、ＳＥＭによっても示された。図１Ｃ（５００ｎｍスケールバー）は、インベルターゼ固定化後の焼結ポリプロピレンマグネタイト複合体（レベル２）の表面上へのクラスタ形態のファセット化マグネタイトナノ粒子（ＭＮＰ）（レベル１）の付着を示す。これは、これまで焼結材料について観察されなかった。ＭＮＰの密度は、焼結材料の表面上で高い。これは、酵素固定化及び活性収率の結果と相関する。
【０１４４】
図２Ａ及び２Ｂは、溶解コーティングプロセスから生成されたナイロン１２マグネタイト複合体のモルホロジーを示す。５０ミクロンスケールバーを有する材料の後方散乱ＳＥＭ画像（図２Ａ）は、より淡色のマグネタイト粒子を示す。これは、ナイロン１２粉末（暗色粒子）の表面上に高密度で包埋されたマグネタイトのより高い原子番号に起因する。マグネタイトコーティングされたナイロン１２粉末のサイズは、ＳＥＭ画像から１５０個の粒子を計測した場合、略２０〜２５ミクロンのサイズであった。複合体のアセンブリを図２Ｂ（５ミクロンスケールバー）に、ファセット化マグネタイト粒子により高度にコーティングされた花様又は樹状の高表面積ナイロン１２粒子としてさらに示す。
【０１４５】
実施例２−熱可塑性プラスチック−マグネタイトブレンドの焼結及び３Ｄプリンティング
熱可塑性プラスチック−マグネタイト複合体の３Ｄプリンティングは、Ｓｉｎｔｒａｔｅｃ（著作権）Ｋｉｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｎｔｒａｔｅｃ．ｃｏｍ／，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実施した。対象物を、Ａｕｔｏｄｅｓｋ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｕｔｏｄｅｓｋ．ｃｏｍ／）によりコンピュータモデリングした。ポリアミド１２（ナイロン１２、ＡｄＳｉｎｔ  ＰＡ１２）を、Ａｄｖａｎｃ３Ｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＧｍｂＨから購入した。ポリプロピレン（Ｐｏｌｙａｘｉｓ，Ｆａｉｒｌａｗｎ，Ｏｈｉｏ、カタログ番号ＰＤ２０００）サンプルを、Ａ．Ｓｃｈｕｌｍａｎから入手した。１０μｍよりも小さい粒子サイズを有する酸化鉄（カタログ番号ＱＭ−Ｄ５０／４マグネタイト）をＲｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから及び５μｍよりも小さい粒子サイズの酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号３１００６９−５００Ｇ）から入手した。用いられる発泡剤は、重炭酸ナトリウム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＸ０３２０−１）であった。２つのタイプの低密度ヒュームドシリカを、Ｃａｂｏｔ（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ  ＴＳ−５３０、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ  ＴＳ−６１０）から入手した。追加のタイプのシリカを、Ｅｖｏｎｉｋ（ＡＥＲＯＳＩＬ  Ｒ８１２）から入手した。多数の特性、特に高いヤング率、解像度、空隙率、降伏強度、及び磁性モーメントを低い弾性域及び疎水性で最適化した。プリンティングパラメータ（粉末流動性、チャンバ温度、プリントベッド温度及びレーザ速度）を調査し、対象物強度を維持しながら最大表面積を確保した。
【０１４６】
粉末流動性−エッチング矩形溝を有するプレート及び水平レベラーを用いて流動性検査を実施した。粉末をプレート上に注ぎ、レベラーを溝の表面にわたってスクレープした。粉末が均等に分散し得なかった場合、低密度ヒュームドシリカを組成物に取り込んで流動性を改善させた。ポリプロピレン（４６％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０μｍ  ４６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンドはプリンティングにシリカを要求しなかったが、シリカ（Ｒ８１２  ０．２５％ｗ／ｗ）添加後にサンプルは著しくより液状になった。ナイロン１２（４９．６２５％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜５μｍ  ４９．６２５％ｗ／ｗ）、ＢＣ（０．５％ｗ／ｗ）、及びシリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）の物理ブレンドは、シリカ添加なしのその対応物と対照的に焼結し得た。３つすべてのシリカを分析し、同様の結果が観察された。加工された原料粉末及び添加されたフィラー熱可塑性プラスチックを有する複合体粉末は、所望の流動性を達成するために追加のシリカを要求することが多かった。０．２５〜０．７５％（ｗ／ｗ）の範囲が、分散性粉末を生成するために要求された。しかしながら、発泡剤の添加を要求しなかった組成物が最終プロセスにより望ましかった。
【０１４７】
チャンバ温度−チャンバ温度は、プリンタ内部の周囲温度を指す。プリンティング前、チャンバを空気、粉末、及び構造構成成分が均一温度になるまで加熱してプリンティングの間の伝熱の効果を最小化する。焼結層及び新たな粉末間の伝熱は、焼結片を引き起こしてプリントの不成功を引き起こし得る。一般に、最良のチャンバ温度は、ガラス転移温度の１０℃以内で見出された。ナイロン１２−マグネタイト複合体について、最適なプリントチャンバ温度は１４０℃であった。ポリプロピレン−マグネタイト複合体のチャンバ温度は１１０〜１３０℃で反復され、最適なチャンバ温度は１２０℃であった。
【０１４８】
製法表面温度−製法表面温度は、プリントベッドの表面の温度である。表面温度は、赤外線温度センサ及び３つの加熱ランプのアレイにより制御される。このパラメータは、表面温度をガラス転移温度直下にすることを担う。一般に、最適な表面温度はガラス転移温度の５℃以内で見出された。ナイロン１２−マグネタイト複合体について、最適なプリント表面温度は組成物に応じて１６０°〜１７０℃であった。ナイロン１２（４９．８７５％ｗ／ｗ）、４９．８７５％の［ＢＣ  ２％ｗ／ｗ、マグネタイト＜１０μｍ  ９８％ｗ／ｗ］、及びシリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）のブレンドは１６４℃の表面温度で最良に焼結することが見出され、その一方、７９．７５％の［４６％のナイロン１２、４６％の＜１０μｍのマグネタイト、８％の重炭酸ナトリウム］（ｗ／ｗ）、ナイロン１２（２０％ｗ／ｗ）、及びシリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）は、１７０℃の表面温度で最良に焼結された。ポリプロピレン−マグネタイト複合体についての表面温度は１１０〜１５５℃で反復され、最適な表面温度は１３０℃であった。
【０１４９】
レーザスキャン速度−これは、焼結の間のレーザ移動の速度である。このパラメータは、層間の接着、細孔サイズ、材料強度、及び焼結能を変更する。レーザスキャン速度は、粉末がレーザからのエネルギーを吸収する変動レベルに起因して各層上で粉末が一緒に結合することを確保するように変更される。レーザ速度はまた、サンプルの材料組成及び充填構造に起因して異なるサンプルの焼結に影響を与える。いくつかの例において、熱可塑性プラスチックはそれ自体と容易に結合し得ない（すなわち、異なるコーティング又は濃度）。したがって、これは、いくつかの粉末が融点に達し、アモルファスになって焼結対応物に達することを可能とするためにより長い露出時間を必要とする。これと同じ理由で、スキャン速度は細孔サイズに影響を与える。レーザ速度を１００から９５０ｍｍ／ｓまで変えた。組成物に応じて、レーザ速度を調節して粉末をガラス転移温度真上でフラッシュ照射した。ポリプロピレン及びナイロンサンプルについて、最適なレーザ速度は６５０ｍｍ／ｓであることが見出された。
【０１５０】
ポリプロピレン、マグネタイト、重炭酸ナトリウムの濃度、及びブレンドが形成される条件の変動は、異なる最適化パラメータをもたらした。以下の３つの実施例プリントは、剛性、並びにＢＮＣによる機能化及び酵素反応に耐える能力を有する成功裏に焼結され、成長した強力な安定プリントであった：
ａ．１１０℃のチャンバ温度、１２５℃の表面温度、６５０ｍｍ／ｓのレーザ速度におけるポリプロピレン（４６％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０μｍ  ４６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンド
ｂ．１１０℃のチャンバ温度、１２５℃の表面温度、３５０ｍｍ／ｓのレーザ速度におけるポリプロピレン（４８％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０μｍ  ４８％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（４％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンド
ｃ．１１９℃のチャンバ温度、１２９℃の表面温度、３５０ｍｍ／ｓのレーザ速度におけるポリプロピレン（３６％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０μｍ  ５６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンド
【０１５１】
プリントは、それらのプリント条件だけでなく、それらの材料特性にも起因して顕微鏡的多孔度が変動する。プリントパラメータの最適化は、ＢＮＣによる機能化及び酵素反応の最大化を目的とした。
【０１５２】
ナイロン、ＢＣ、シリカ、マグネタイト、及び重炭酸ナトリウムの濃度並びにブレンドが形成される条件の変動は、異なる最適化パラメータをもたらした。以下の３つの実施例プリントは、剛性、並びにＢＮＣによる機能化及び酵素反応に耐える能力を有する強力な安定プリントの焼結、成長において成功した：
ａ．１４０℃のチャンバ温度、１６４℃の表面温度、３００ｍｍ／ｓのレーザ速度におけるナイロン１２（４９．８７５％ｗ／ｗ）、４９．８７５％の［２％のＢＣ、９８％のマグネタイト＜１０μｍ］（ｗ／ｗ）、及びシリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）の物理ブレンド
ｂ．１４０℃のチャンバ温度、１６０℃の表面温度、２００ｍｍ／ｓのレーザ速度における９９．７５％の［ナイロン１２（５０％ｗ／ｗ）、５０％の［ＢＣ（２％ｗ／ｗ）、マグネタイト（＜１０μｍ  ９８％ｗｗ）］の溶解コーティング］、シリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）の物理ブレンド
ｃ．１４０℃のチャンバ温度、１７０℃の表面温度、３００ｍｍ／ｓのレーザ速度における７９．７５％の［マグネタイト（＜１０μｍ  ４６％ｗ／ｗ）、ナイロン１２（４６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンド］、ナイロン１２（２０％ｗ／ｗ）、シリカ（ＴＳ−６１０  ０．２５％ｗ／ｗ）の物理ブレンド。
【０１５３】
プリントは、焼結条件だけでなく、粉末サイズなどのそれらの材料特性にも起因して顕微鏡的多孔度が変動した。プリントパラメータの最適化は、ＢＮＣによる機能化及び酵素反応の最大化を目的とした。
【０１５４】
ポリプロピレン−マグネタイト対象物のプリンティング：マグネタイト（＜１０μｍ  ４６％ｗ／ｗ）、ポリプロピレン（４６％ｗ／ｗ）、及び重炭酸ナトリウム（８％ｗ／ｗ）の押出複合体ブレンドの粉末を、既述のとおり調製した。粉末をＳｉｎｔｒａｔｅｃ  Ｋｉｔのプリント及びリザーバベッド中に置き、１１５℃において１時間予熱した。ストリップ、ビーズ、十字、及び混合エレメントを、１１５℃のチャンバ温度、１２５℃の表面温度、６５０ｍｍ／ｓのレーザスキャン速度、及び１００μｍの積層ピッチにおいて焼結した。焼結が完了したら、プリント部品をチャンバ中に残してゆっくりと１時間冷却させた。単層ストリップについては、長さは３０ｍｍであり、幅は３ｍｍであり、厚さは０．１ｍｍであり、質量は０．０２６ｇであり、理論表面積は２６２ｍｍ２であった。ビーズについては、直径は３ｍｍ、質量は０．０１ｇであり、体積は０．０１４ｃｍ２であり、理論表面積は０．２８３ｃｍ２であった。十字については、長さは８ｍｍであり、幅は２ｍｍであり、厚さは５ｍｍであり、質量は０．１１ｇであり、体積は０．１４７ｃｍ３であり、密度は１ｃｍ３当たり０．７５グラムであり、理論表面積は２．１６ｃｍ２であった。静的混合エレメントについては、長さは１２．７ｍｍであり、直径は１２．７ｍｍであり、質量は０．３５グラムであり、体積は０．４６ｃｍ３であり、密度は１ｃｍ３当たり０．７６グラムであった。図４Ａ〜４Ｄは３Ｄモデルを示し、図４Ｅ〜４Ｈはプリンティング後の３Ｄ対象物サンプルの高解像度画像を示す。
【０１５５】
ポリプロピレンマグネタイト複合体の焼結プロセスの間に作出された表面積の推定は、以下の合理的根拠を用いて行った。値は、水銀ポロシメトリー及びＢＥＴ  Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面キャラクタリゼーションにより計測される。複合体の理論密度は、式１（Ｓｈａｒｍａ，Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｅｎｇｉｎ．ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  １２：３２４−３３０（２００３））：
ρｃｏｍｐｏｓｉｔｅ＝ｍＣ／ｖＣ＝（ｍＰ＋ｍＭ）／（ｖＰ＋ｖＭ）（式１）
を用いて計算した。
【０１５６】
式中、ｍＣは、複合体質量であり、ｖＣは、複合体体積であり、ｍＰは、質量補強粒子であり、ｍＭは、ポリマーマトリックスの質量であり、ｖＰは、補強粒子の体積であり、ｖＭは、ポリマーマトリックス体積である。０．９２ｇ／ｃｍ３としてのポリプロピレンの密度及びマグネタイトについては５ｇ／ｃｍ３の密度を、５０対５０のポリプロピレン対マグネタイトの重量比で用いると、２ｇの材料に対するポリプロピレン及びマグネタイトのそれぞれの体積は、１．０８７ｃｍ３及び０．２ｃｍ３である。したがって、複合体の密度は１．５５ｇ／ｃｍ３である。３Ｄプリント焼結材料の理論多孔度割合は、予め計算された複合体密度（ρｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）及び実測の焼結材料の密度（ρｓｍ）を以下のとおり用いることによって計算し得る（式２）：
％多孔度＝１００×［１−（ρｓｍ／ρｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）］（式２）
【０１５７】
焼結材料密度は、焼結対象物の質量を設計（ＣＡＤソフトウェアにより計算）の実測実体積により除することにより０．７５ｇ／ｃｍ３であると決定された。したがって、焼結材料の理論多孔性は、５２％であった。このように、実測複合体粒子により占有される体積は、固相率（０．４８）に焼結材料の体積を乗ずることにより推定した。次いで、ＰＰ−Ｍａｇ粒子の球形状及び３４ミクロンの平均直径を仮定して、粒子サイズ及び利用されるサイズ範囲のそのそれぞれの割合を計算する。その体積を作出するために用いられる粒子の量は、焼結対象物の実体積を単一粒子の体積により割ることにより計算した。次いで、得られた粒子を、全体の３分の１は焼結プロセスの間の凝固によりそれらの形状を損失したと仮定して全体の３分の２に低減させた。１つの単一粒子の表面積（ＳＡ＝３Ｖ／ｒ、３．６４×１０−４ｃｍ２）に焼結３Ｄ対象物中の利用可能な粒子の総量を乗ずることにより、理論予測表面積を提供した。多孔性及び表面粗さにより作出される表面積はこの概算において考慮しなかったため、これはより高いことが予測された。平均比表面積は、１グラムの焼結材料当たり７６２ｃｍ２と計算された。
【０１５８】
３Ｄ磁性対象物は、熱可塑性プラスチックとブレンドされたマグネタイトの粉末組成物によりプリントし得、その結果、それらは酵素の固定化のための剛性及び多孔性を維持したことが実証された（図４Ｅ〜４Ｈ）。対象物を用いてＢＮＣを固定化した。
【０１５９】
プリントジオメトリ（図４Ａ〜４Ｄ）を異なる用途に設計した。ストリップは酵素の固定化の迅速な最適化のために設計し、改変した。ビーズはＢＮＣの固定化のために、及び酵素活性のスクリーニングのために９６ウェルマイクロプレート中で十分にフィットするように設計し、改変した。これらの形状は、外部磁石によるウェルからの容易な除去を可能とする。十字は、小型及び中型バッチ反応器中のＢＮＣの固定化のために設計し、改変した。十字はまた、撹拌板と組み合わせる場合、撹拌エレメントとして用い得る。静的混合器は連続フロー系におけるＢＮＣの固定化のために設計し、改変した。静的混合器は、直列に置かれた個々の混合エレメントからなる。隣接エレメントは、互いに関して９０°回転される。管収容部は静的混合器を封入し、連続フロー系内の連結を提供する。
【０１６０】
実施例３−３Ｄプリント足場上の生体ナノ触媒（ＢＮＣ）の固定化
焼結材料上のインベルターゼ固定化：パン酵母由来のインベルターゼを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ｉ４５０４）から購入した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書；国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレット）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１６１】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。１０００μｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ３の水により調製した。低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の２００μｇ／ｍＬのインベルターゼを含有する低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加し、２５℃において１時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）により、インベルターゼ酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１６２】
非固定化及び固定化インベルターゼの活性を評価するために還元糖基質アッセイを開発した。このアッセイは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログＨ９８８２）から購入した４−ヒドロキシベンズヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）を用いるラフィノースのフルクトース及びメリビオースへの加水分解を計測した。Ｄ−（＋）−ラフィノース五水和物（カタログ番号Ｒ０２５０）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ、カタログ番号ＡＡＡ１８３１３０９）から購入し、Ｄ−（＋）−グルコースをＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号ＤＸ０１４５−３）から購入した。１０×ＰＢＳ緩衝剤を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ、カタログＳＨ３０２５８．０２）から購入した。
【０１６３】
反応混合物を、１×ＰＢＳ緩衝剤（ｐＨ７．４）及びｐＨ７の水中で１ｍＭのラフィノースを用いて調製した。反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において５分間インキュベートした。得られた上澄みを回収し、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した０．５ＭのＮａＯＨ（カタログ７７０８−１０）中のＰＡＨＢＡＨの５ｍｇ／ｍＬ溶液に添加した。次いで、上澄み−ＰＡＨＢＡＨ混合物を５分間沸騰させ、４１０ｎｍにおける吸光度を介して定量化し、グルコースの検量線と比較した。
【０１６４】
３Ｄプリント十字及びビーズ上のインベルターゼの固定化収率は、それぞれ７５％及び２５％であった（図５Ａ）。十字及びビーズによるラフィノースの加水分解についての固定化インベルターゼの相対活性は、固定化収率により正規化した場合、それぞれ１４６％及び５０％であった（図５Ｂ）。
【０１６５】
３Ｄプリント十字上に固定化されたインベルターゼは、非固定化インベルターゼと同等の活性を有することが実証された。正規化した場合、十字上に固定化されたインベルターゼは、非固定化インベルターゼと比較してラフィノースの加水分解について活性の１．５倍の増加を実証した。
【０１６６】
焼結材料上のＣＡＬＢ固定化：カンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号６２２８８）から購入した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書；国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレット）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１６７】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。５００μｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ３の水により調製した。低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の２００μｇ／ｍＬのＣＡＬＢを含有する低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加し、２５℃において２時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）により、ＣＡＬＢ酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１６８】
固定化及び非固定化ＣＡＬＢの活性を評価するため、グリセロールエステル加水分解の比色アッセイを開発した。このアッセイは、パラ−ニトロフェニルラウリン酸塩（ｐ−ＮＰＬ）のパラ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）及びラウリン酸への加水分解を計測した。ｐ−ＮＰＬをＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ５０−０１４−３９０２２）から購入し、ｐ−ＮＰをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ４８５４９）から購入した。
【０１６９】
反応混合物を、ＫＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）（カタログＲＧＦ−３３５０）中の１００μＭのｐ−ＮＰＬを用いて調製した。反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において４分間インキュベートした。上澄みを回収し、次いでｐ−ＮＰを、４００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化し、ｐ−ＮＰの標準と比較した。
【０１７０】
３Ｄプリント十字及びビーズ上のＣＡＬＢの固定化収率（三重）は、それぞれ９９％±２％及び１００％であった（図６Ａ）。十字及びビーズによるｐ−ＮＰＬの加水分解についての固定化ＣＡＬＢの相対活性は、固定化収率により正規化した場合、それぞれ１８６％±１６％及び１８％±１％であった（図６Ｂ）。
【０１７１】
３Ｄプリント十字上に固定化されたＣＡＬＢは、非固定化ＣＡＬＢと同等の活性を有したことが実証された。正規化した場合、十字上に固定化されたＣＡＬＢは、非固定化ＣＡＬＢと比較してｐ−ＮＰＬの加水分解について活性の１．８倍の増加を実証した。
【０１７２】
ＣＡＬＢを用いる３Ｄ足場焼結材料の再使用：１００μｇ／ｍＬのＣＡＬＢ及び２５０μｇ／ｍＬのＮＰにより予め固定化された３Ｄプリント十字及びビーズを、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手したｐＨ２の水中で２０分間沸騰させていかなる酵素／ＮＰも除去した。すべての酵素及びＮＰが十字及びビーズから除去されたことを検証するため、グリセロールエステル加水分解の既述の比色アッセイを用いた。このアッセイは、パラ−ニトロフェニルラウリン酸塩（ｐ−ＮＰＬ）のパラ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）及びラウリン酸への加水分解を計測した。ｐ−ＮＰＬをＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ５０−０１４−３９０２２）から購入し、ｐ−ＮＰをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ４８５４９）から購入した。反応混合物を、ＫＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）（カタログＲＧＦ−３３５０）中の１００μＭのｐ−ＮＰＬを用いて調製した。反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において４分間インキュベートした。上澄みを回収し、次いでｐ−ＮＰを、４００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化し、ｐ−ＮＰの標準と比較した。
【０１７３】
洗浄した十字及びビーズを用いてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ６２２８８）から購入したカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）を再固定化した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書；国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレット）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１７４】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。５００μｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ３の水により調製した。低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の２００μｇ／ｍＬのＣＡＬＢを含有する低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加し、２５℃において２時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）により、ＣＡＬＢ酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１７５】
固定化及び非固定化ＣＡＬＢの活性を評価するため、グリセロールエステル加水分解の比色アッセイを開発した。このアッセイは、パラ−ニトロフェニルラウリン酸塩（ｐ−ＮＰＬ）のパラ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）及びラウリン酸への加水分解を計測した。ｐ−ＮＰＬをＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ５０−０１４−３９０２２）から購入し、ｐ−ＮＰをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ４８５４９）から購入した。反応混合物を、ＫＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）（カタログＲＧＦ−３３５０）中の１００μＭのｐ−ＮＰＬを用いて調製した。反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において４分間インキュベートした。上澄みを回収し、次いでｐ−ＮＰを、４００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化し、ｐ−ＮＰの標準と比較した。
【０１７６】
洗浄後の３Ｄプリント十字及びビーズ上のＣＡＬＢの相対活性（三重）は、それぞれ０％±３％及び０％±２％であった（図７Ａ）。十字及びビーズ上の再固定化ＣＡＬＢの固定化収率は、それぞれ９８％±４％及び１００％であった（図７Ｂ）。新たな固定化ＣＡＬＢの活性は、非固定化酵素よりも約２倍高かった（図７Ｃ）。洗浄した十字及びビーズに対する活性アッセイの結果は、３Ｄプリント足場から予め固定化された酵素及びＮＰを除き得ることを示す。さらに、足場は最小の固定化収率の損失で新たな酵素により再機能化し得る。
【０１７７】
実施例４−焼結材料上のＢＭ３  Ｐ４５０固定化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた組換えＢＭ３シトクロムｐ４５０、組換えグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ肝カタラーゼ（ＣＡＴ）、ウシ赤血球細胞質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルコース（ベータ−ｄ−グルコース）、ｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩（ｐ−ＮＰＬ）、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元）四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）を、３Ｄプリント足場上で固定化する。すべてのストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により精製された１８．２ＭΩ−ｃｍ水を用いて形成した。吸光度を、Ｃｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ透過マイクロプレート中でＧｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ４（商標）プレートリーダを用いて三重で計測する。Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）製の１／８インチプローブを有する超音波処理装置（ＦＢ−５０５）を、すべての超音波処理に用いる。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書；国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレット）及び各々参照によりその全体が本明細書において援用されるＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｌｙ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２０１６；３４）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１７８】
すべての水性ストックを、超高純度（ＭＱ）水を用いて調製する。凍結乾燥ＢＭ３−Ｐ４５０、ＧＤＨ、及びＮＡＤＰＨを氷冷無酸素の２ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中で溶解させ、毎日新たに調製する。ＢＭ３−Ｐ４５０及びＧＤＨを４℃において１２０００ｇにおいて１０分間遠心分離して細胞片をペレット化する。これらの上澄みを回収し、タンパク質含有量を、ＢＳＡ標準を用いるＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）を用いて定量化する。ｐ−ＮＰＬ及びｐ−ＮＰストック溶液を純ＤＭＳＯ中で１００ｍＭに調製し、４℃において保管する。塩化マグネシウム（１Ｍ）及びグルコース（１００ｍＭ）を水中で溶解させ、４℃において保管する。すべてのストック溶液を氷上で維持する。希釈物をアッセイにおいて使用直前に形成し、室温（２１℃）と平衡させる。
【０１７９】
ＢＭ３−Ｐ４５０固定化を、各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書及び国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレットに記載の方法を用いて最適化する。固定化に対する非ＢＭ３−Ｐ４５０生物及び化学構成成分を、Ｐ４５０支持系（ＳＳ）：補助因子再生のためのＧＤＨ、反応性酸素種（ＲＯＳ）制御のためのＣＡＴ／ＳＯＤ、及び固定化の間の安定性のためのＮＡＤＰＨと称する。非固定化ＢＭ３−Ｐ４５０／ＧＤＨ／ＣＡＴ／ＳＯＤ／ＮＡＤＰＨストック（５００μｇ／ｍＬのＢＭ３−Ｐ４５０、１００：１００：１：１：１００のモル比）を、低温緩衝剤中で新たな酵素ストックを用いて調製する。２５００μｇ／ｍｌのＮＰストックを４０％振幅において１分間超音波処理し、水浴を用いて室温と平衡させ、そのｐＨを３に調節する。非固定化ＢＭ３−Ｐ４５０＋ＳＳを微小遠心チューブ中に分注し、それに超音波処理した等しい体積のＮＰを添加し、次いで１０回ピペット混合する。ＢＭ３−Ｐ４５０＋ＳＳ系を、３Ｄプリント足場（十字及びビーズ）にＢＭ３−Ｐ４５０＋ＳＳを添加することにより固定化し、１時間インキュベートしてからそれを磁気的にペレット化する。固定化収率をＢｒａｄｆｏｒｄにより定量化し、対応する酵素標準に対して比較する。
【０１８０】
ＢＭ３−Ｐ４５０活性判定法は、ｐ−ＮＰ及びω−１ヒドロキシラウリン酸を形成するためのｐ−ＮＰＬのＢＭ３−Ｐ４５０触媒酸化に基づく。酵素活性を、ｐ−ＮＰの形成に起因する４１０ｎｍにおける吸光度の増加により計測する。ＢＭ３−Ｐ４５０反応を、１００ｍＭのｐＨ８．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．２５ｍＭのｐ−ＮＰＬ（０．２５％のＤＭＳＯ）、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのグルコース、及び３．６μｇ／ｍＬのＣＹＰ（約６０ｎＭ）を含有する微小遠心チューブ中で２℃において１８時間実施する。非固定化酵素対照は、６０ｎＭのＧＤＨも含有する。上澄みを回収し、次いでｐ−ＮＰを４００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化し、ｐ−ＮＰの標準と比較する。１単位（Ｕ）のＣＹＰ−３９４活性を、１００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ８．２）中で２１℃において１分当たりで生成される１μｍｏｌのｐ−ＮＰと定義する。
【０１８１】
ＢＭ３−Ｐ４５０＋ＳＳ系は、３Ｄプリント足場（十字及びビーズ）上に完全に固定化される。活性を、非固定化酵素系と比較して３Ｄプリント足場が多酵素系及び補助因子再循環を要求する系について固定化及び酵素活性の保持において有効であることを示す。
【０１８２】
実施例５−３Ｄプリントフローセル上のインベルターゼ固定化
フローセル用に設計された３Ｄプリント足場は、インベルターゼを固定化する。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（各々参照によりその全体が本明細書において援用される米国特許第９，５９７，６７２号明細書；国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレット）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１８３】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）する。５００μｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ３の水により調製する。１グラムのフローセルのため、５２ｍＬの低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の２００μｇ／ｍＬのインベルターゼを含有する５２ｍＬの低温酵素溶液に急速に添加する。次いで、ＮＰ−酵素混合物を３Ｄプリントフローセルに添加し、２５℃において２時間インキュベートする。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりそれをインベルターゼ酵素標準と比較することにより定量化する。
【０１８４】
フローセルの活性を、既述のスクロース（Ｓｏ）加水分解の方法により判定する。フローセルは充填床反応器（ＰＢＲ）として作用し、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの動力学パラメータはＫｍ＝４９ｍＭ及びＶｍａｘ＝１２７ｍＭ／分である（参照によりその全体が本明細書において援用されるＣｏｍｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１１７（６）：２１５−２２８（１９８３））。１×ＰＢＳ緩衝剤（ｐＨ７．５）中１Ｍのスクロースを含有する反応混合物の流量（Ｆ）は、０．０８８ｍＬ／分である。
【０１８５】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により判定されるとおり、インベルターゼはフローセル上に完全に固定化され、１００％の活性が保持される。変換率は、最適な変換率についてのフロー及び充填量条件のための溶液空間を決定するためのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動力学モデルに基づく根本的なＰＢＲ物質収支に対応する（図８）：
Ｖｍａｘ／Ｆ＝［Ｓ］ｏＸ−Ｋｍ＊ｌｎ（１−Ｘ）
【０１８６】
上記パラメータを考慮すると、スクロースのグルコース及びフルクトースへの変換率（Ｘ）は、９９．９９％である。滞留時間はフローセル中の体積に基づき、１０ｍＬのフローセル中の１００ｍＬの反応混合物に関して、滞留時間は１１４分間である。
【０１８７】
上記のことは、フローセルとして用いられる３Ｄプリント足場が固定化収率及び活性保持の両方に関して有効であることを示す。
【０１８８】
実施例６−焼結材料上のＨＲＰ固定化
焼結材料上で固定化されたＨＲＰは、その活性を保持する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（カタログ７７３３２）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２  Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（Ｃｏｒｇｉｅ  ＳＣ，Ｂｒｏｏｋｓ  ＲＴ，Ｃｈａｉｒｉｌ  Ｒ，Ｃｈｕｎ  ＭＳ，Ｘｉｅ  Ｂ，Ｇｉａｎｎｅｌｉｓ  ＥＰ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｌｙ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２０１６；３４）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１８９】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。５０００μｇ／ｍＬのナノ粒子溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ９の水により調製した。低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の１０００μｇ／ｍＬのＨＲＰを含有する低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に３Ｄプリントストリップと共に添加し、２５℃において２時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）によりＨＲＰ酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１９０】
固定化及び非固定化ＨＲＰの活性を評価するため、過酸化水素の比色アッセイを開発した。このアッセイは、過酸化水素による４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）及びフェノールの同時酸化を計測した。フェノール（カタログＷ３２２３１８）及び４−ＡＡＰ（カタログＡ４３８２）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。反応混合物を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した５００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（カタログＳＨ３０２５８．０２）中の１ｍＭの過酸化水素、０．５ｍＭの４−ＡＡＰ、及び０．５ｍＭのフェノールを用いて調製した。
【０１９１】
反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において３分間インキュベートした。上澄みを回収し、次いで生成物（ピンク色キノンイミン色素）を５００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化した。
【０１９２】
３Ｄプリントストリップ上のＨＲＰの固定化収率（三重）は、９５％±１％であった。４−ＡＡＰ及びフェノールの同時酸化についての非固定化酵素に対する固定化ＨＲＰの相対活性は、固定化収率により正規化した場合、１９３％±３％であった（図９）。
【０１９３】
実施例７−３Ｄプリントフローセル上のＨＲＰ固定化
固定化ＨＲＰは、比色アッセイにより判定されるとおり３Ｄプリントフローセル中でその活性を保持する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（カタログ７７３３２）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を既述のとおり調製し（Ｃｏｒｇｉｅ  ＳＣ，Ｂｒｏｏｋｓ  ＲＴ，Ｃｈａｉｒｉｌ  Ｒ，Ｃｈｕｎ  ＭＳ，Ｘｉｅ  Ｂ，Ｇｉａｎｎｅｌｉｓ  ＥＰ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｌｙ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２０１６；３４）、ｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１９４】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。５０００μｇ／ｍＬのナノ粒子溶液を、２４ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ９の水により調製した。低温ＮＰ溶液を、ｐＨ７の水中の１０００μｇ／ｍＬのＨＲＰを含有する低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に３Ｄプリントストリップと共に添加し、２５℃において２時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）によりＨＲＰ酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１９５】
混合後、得られた溶液をフローセルに通して１時間循環させた。固定化及び非固定化ＨＲＰの活性を評価するため、過酸化水素の比色アッセイを開発した。このアッセイは、過酸化水素による４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）及びフェノールの同時酸化を計測した。フェノール（カタログＷ３２２３１８）及び４−ＡＡＰ（カタログＡ４３８２）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１９６】
反応混合物を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した５００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（カタログＳＨ３０２５８．０２）中の１ｍＭの過酸化水素、０．５ｍＭの４−ＡＡＰ、及び０．５ｍＭのフェノールを用いて調製した。反応混合物を固定化及び非固定化酵素系に添加し、次いで２５℃において３分間インキュベートした。上澄みを回収し、次いで生成物（ピンク色キノンイミン色素）を５００ｎｍにおける吸光度を計測することにより定量化した。同一の反応混合物をシリンジポンプ（ＮＥ−１００，Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を介してフローセルに通して２ｍＬ／分においてポンプ輸送して固定化ＨＲＰの活性を比色的に判定した（図１０）。ＨＲＰは３Ｄプリントフローセル上で成功裏に固定化され、比色アッセイにより決定されたとおり活性を保持した。
【０１９７】
実施例８−３Ｄプリントフローセル上のエピメラーゼ固定化
エピメラーゼを、フローセルとして設計された３Ｄプリント足場上に固定化した。すべての水を、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．２Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）を参照によりその全体が本明細書において援用されるＣｏｒｇｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ３４（５）：１５−２０（２０１６）に既述のとおり調製した。これらをｐＨ１１において４℃でＮ２スパージ雰囲気下で保管した。
【０１９８】
ナノ粒子を、固定化の日に４０％振幅において１分間超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）した。８．８ｍｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、８．９ｍｇ／ｍＬのストック溶液からｐＨ３の水により調製した。１．８グラムのフローセルのため、２６．２ｍＬの低温ＮＰ溶液を、ＫＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した４ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）（カタログＲＧＦ−３３５０）を有するｐＨ８の水中の３．５ｍｇ／ｍＬのエピメラーゼを含有する２６．２ｍＬの低温酵素溶液に急速に添加した。次いで、ＮＰ−酵素混合物を６ｍＬの３Ｄプリントフローセルに通して５ｍＬ／分において循環させ、２５℃において２時間インキュベートした。固定化収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １ｘ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＃５０００２０５）によりそれをエピメラーゼ酵素標準に対して比較することにより定量化した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析は、エピメラーゼの８７％±１％がフローセル上に固定化されたことを示した。
【０１９９】
例示的な配列
配列番号１
二機能性Ｐ４５０／ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ［巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）］
【化１】
2022500067.tif 000005
配列番号２
シトクロムＰ４５０  ３Ａ４アイソフォーム１［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化２】
2022500067.tif 000006
配列番号３
シトクロムＰ４５０  １Ａ２［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化３】
2022500067.tif 000007
配列番号４
ＣＹＰ２Ｄ６［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化４】
2022500067.tif 000008
配列番号５
シトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化５】
2022500067.tif 000009
配列番号６
シトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化６】
2022500067.tif 000010
配列番号７
シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化７】
2022500067.tif 000011
【０２００】
本明細書において開示され、又は、参照されているすべての刊行物及び特許文献は、参照によりそれらの全体が援用される。前述の記載は、単なる例示及び説明を目的とするためになされている。本記載は、本発明を開示されている詳細な形態に限定することは意図していない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることが意図されている。
【図１Ａ】
2022500067.tif 000012
【図１Ｂ】
2022500067.tif 000013
【図１Ｃ】
2022500067.tif 000014
【図２Ａ】
2022500067.tif 000015
【図２Ｂ】
2022500067.tif 000016
【図３】
2022500067.tif 000017
【図４−１】
2022500067.tif 000018
【図４−２】
2022500067.tif 000019
【図４−３】
2022500067.tif 000020
【図５】
2022500067.tif 000021
【図６】
2022500067.tif 000022
【図７】
2022500067.tif 000023
【図８】
2022500067.tif 000024
【図９】
2022500067.tif 000025
【図１０】
2022500067.tif 000026
【国際調査報告】
2022500067.tif 000027
2022500067.tif 000028