【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年8月10日(2010.8.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および改変のためのデバイスおよび方法
【背景技術】
【０００１】
本発明は、医療診断法およびマイクロ流体の分野に関する。
【０００２】
癌は、異常細胞の抑制されていない増殖を特徴とする疾患である。正常組織において、細胞は、周辺細胞からの信号に応答して、組織内で分裂し、組織化する。癌細胞は、これらの信号に同様には反応せず、これにより、癌細胞は増殖して、多くの器官において、腫瘍を形成する。腫瘍の成長が続くと、遺伝子の変性は蓄積し得、癌細胞のより積極的な成長表現型として現れる。無処置のまま放置すると、転移、つまりリンパ系または血流を介して身体の遠い領域への癌細胞の拡散が結果的に起こり得る。転移は複数の部位で結果として二次腫瘍の形成をもたらし、健康な組織に損傷を与える。ほとんどの癌死は、このような二次腫瘍が原因である。
【０００３】
癌診断および療法の数十年に及ぶ進歩にもかかわらず、その進行が後期になるまで、多くの癌は検知されないままとなっている。１つの例として、ほとんどの初期肺癌は症状が現れず、治療的処置に間に合うようには検出されず、肺癌患者の全体の五年生存率は１５％未満となる。しかしながら、肺癌が初期で検出および治療される患者の例において、予後は、はるかに有利である。
【０００４】
したがって、疾患の進行のより早期で癌を検出する新規な方法を開発することが、必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
ａ）第１の方向に、癌細胞を誘導して、癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含むデバイスに、細胞サンプルを導入するステップと、
ｂ）第１の出力サンプルにおいて、癌細胞の有無を検出するステップとによって細胞サンプルの癌細胞を検出する方法を特徴とする。
【０００６】
構造は、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができる。障害物は、癌細胞を選択的に捕捉することが可能であり得る。チャネルは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含み得、流体は、該流体が主流束および副流束に不均等に分割されるように、該ギャップを通って流れる。細胞サンプルは、例えば、血液サンプルまたはその分画である。
【０００７】
ステップｂ）は、癌細胞に対して、例えば、表１から選択される、マーカーに対する抗体と、第１の出力サンプルを反応させるステップを含み得る。ステップｂ）はまた、例えば、第１の出力サンプルのＤＮＡの総量を決定することによって、第１の出力サンプルの細胞の数を決定するステップも含み得る。代替として、ステップｂ）は、第１の出力サンプルの癌細胞の数を決定するステップ、および任意に、例えば、内皮細胞に対する癌細胞の比を決定するために、細胞サンプルの内皮細胞の数を決定するステップを含む。ステップｂ）は、例えば、表１に列挙されるポリペチドをコードする遺伝子において、第１の出力サンプルのＤＮＡまたはＲＮＡの突然変異を検出するステップを含んでよい。ステップｂ）はまた、第１の出力サンプルにおいて、タンパク質のリン酸化、タンパク質のグリコシル化、ＤＮＡのメチル化、マイクロＲＮＡレベル、または細胞の形態を分析するステップを含んでよい。ステップｂ）はまた、第１の出力サンプルにおいてミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼ、または核マトリクスタンパク質を検出するステップ、第１の出力サンプルにおいて１つ以上のミトコンドリア異常を検出するステップ、第１の出力サンプルの細胞において核周囲部の有無を検出するステップ、または第１の出力サンプルの遺伝子発現解析、ｉｎ−ｃｅｌｌ  ＰＣＲ法、または蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成法を行なうステップを含んでよい。遺伝子発現解析は、癌細胞の起源の１つまたは複数の組織を決定するために使用され得、単一の癌細胞に対して行われ得る。
【０００８】
細胞サンプルは、１つ以上の前駆内皮細胞を含むことができ、少なくとも１つの前駆内皮細胞は、第１の出力サンプルに存在する。
【０００９】
デバイスは、第１の入口、第１の出口、および第２の出口を有する連続流動デバイスをさらに含み得、細胞サンプルは、第１の入口に適用され、第１の出力サンプルは、第１の出口から流出し、第２の出力サンプルは、第２の出口から流出する。デバイスは、第２の入口をさらに含み得、例えば、緩衝液、溶解試薬、核酸増幅試薬、容積モル浸透圧濃度調節試薬、標識試薬、防腐剤、または固定試薬等の第２の流体は、該第２の入口に適用される。
【００１０】
検出するステップは、第１の出力サンプルのハイパースペクトル画像を含み得る。ステップａ）の前、またはステップａ）と同時に、細胞サンプルはまた、癌細胞を優先的に標識化する標識試薬と接触し得る。該標識試薬は、ビーズを含み得、標識化癌細胞の流体力学的サイズは、標識の非存在下で、癌細胞の流体力学的サイズよりも少なくとも１０％大きい。
【００１１】
本発明は、
ａ）磁性粒子を用いることなく、あるいは抗体またはそのフラグメントを用いることなく、細胞サンプルから癌細胞の１つ以上を濃縮するステップであって、該濃縮するステップは、細胞のサイズ、細胞の形状、または細胞の変形能に基づく、ステップと、
ｂ）濃縮された癌細胞の数を決定するステップとによって細胞サンプルの癌細胞を検出する方法をさらに特徴とする。
【００１２】
該方法は、
ｉ）該細胞サンプルから１つ以上の内皮細胞を濃縮するステップと、
ｉｉ）例えば、内皮細胞に対する癌細胞の比を決定するために、濃縮された内皮細胞の数を決定するステップとをさらに含み得る。
【００１３】
ステップｂ）は、例えば、濃縮された癌細胞を計数するステップ、または濃縮された癌細胞のＤＮＡの総量を決定するステップを含む。ステップａ）およびｂ）は、例えば、第１の細胞サンプルと同一の対象から採取された、第２の細胞サンプルを用いて、繰り返すことができる。
【００１４】
本発明はまた、
ａ）第１の方向に、１つ以上の癌細胞を誘導して、癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含むデバイスに、対象からの細胞サンプルを導入するステップと、
ｂ）第１の出力サンプルにおいて、癌細胞の有無を検出するステップと、
ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて、病態の有無を診断するステップとによって対象における病態を診断するための方法も特徴とする。
【００１５】
該方法は、コンピュータ連動断層撮影法、陽電子射出断層撮影法、または磁気共鳴映像法等によって、診断の前に、対象の一部を画像化するステップをさらに含むことができ、該診断は、画像の結果にさらに基づく。
【００１６】
該方法はまた、
ｉ）細胞サンプルにおいて、例えば、前駆内皮細胞等の内皮細胞の数を決定するステップと、
ｉｉ）内皮細胞に対する癌細胞の比を決定するステップとを含み得、
該診断は、比にさらに基づく。
【００１７】
病態は、例えば、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全である。
【００１８】
本発明は、対象における病態を診断するための方法をさらに特徴とし、該方法は、
ａ）第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含むデバイスに、対象からの細胞サンプルを導入するステップと、
ｂ）第１の出力サンプルを分析するステップと、
ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて、病態の有無を診断するステップとを含む。
【００１９】
チャネルは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができ、流体は、該流体が主流束および副流束に不均等に分割されるように、該ギャップを通って流れるように構成される。
【００２０】
デバイスは、第１の方向に、１２ミクロンを超える、好ましくは１４ミクロンを超える、流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００２１】
デバイスはまた、第１の方向に、５ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１０ミクロン以上の流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００２２】
デバイスはまた、第１の方向に、４ミクロン以上８ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、８ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００２３】
好ましい実施形態において、第１の出力サンプルは、該細胞サンプル中の第１の細胞の少なくとも９０％を構成する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ステップａ）からｃ）は、対象からの追加の細胞サンプルを用いて１回以上繰り返され、細胞サンプルは、１日間、２日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間等の一定間隔にて得られる。
【００２５】
他の実施形態において、第１の出力サンプルは、細胞サンプルの少なくとも１，０００倍で第１の細胞が濃縮される。
【００２６】
診断される病態は、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全であり得る。腫瘍性の病態は、急性リンパ芽球性白血病、急性もしくは慢性リンパ球性もしくは顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、ヘアリー細胞腫瘍、頭部癌、過形成、増殖性角膜神経腫、上皮内癌、腸神経節細胞腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群様体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、頸部癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、上皮小体癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セミノーマ、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織の肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、およびウイルムス腫瘍からなる群から選択され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、細胞サンプルは、体積が５０ｍＬ未満である。
【００２８】
癌の診断のために、ステップｂ）は、第１の出力サンプルにおいて癌バイオマーカーの有無を検出するステップを含むことができ、癌バイオマーカーは、表１から選択されるポリペチドまたはポリペチドをコードする核酸である。癌関連の核酸バイオマーカーは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであり得る。該方法のステップｂ）はまた、癌に関連する核酸の発現パターンを分析するステップを含むこともでき、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであり得る。癌関連の核酸は、突然変異を含み得、例えば、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチン８、ＥＧＦＲ
、または白血球関連受容体（ＬＡＲ）等の表１から選択されるポリペプチドをコードするものであり得る。
【００２９】
該方法において、ステップｂ）は、急性リンパ芽球性白血病、急性もしくは慢性リンパ球性もしくは顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、ヘアリー細胞腫瘍、頭部癌、過形成、増殖性角膜神経腫、上皮内癌、腸神経節細胞腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群様体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、頸部癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、上皮小体癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セミノーマ、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織の肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、またはウイルムス腫瘍に関連する上皮細胞または腫瘍性細胞等の第１の出力サンプルからの１つ以上の細胞を選択的に結合する１つ以上の結合部分がある表面を有するデバイスと、第１の出力サンプルを接触させることをさらに含むことができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、癌は、甲状腺癌ではない。
【００３１】
結合部分は、例えば、ＥｐＣＡＭ等に結合する抗体（例えば、モノクローナル）またはそのフラグメント等のポリペプチドであり得る。
【００３２】
他の実施形態において：
構造は、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含み、障害物は、該第１の細胞を選択的に捕捉することが可能である。
【００３３】
障害物間のギャップは、１５ミクロンを超える、２０ミクロンを超える、または６０ミクロン未満である。
【００３４】
細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳液、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、もしくは尿生殖路の分泌物、羊水、または水サンプルであり得る。
【００３５】
他の実施形態において：
ステップｂ）は、第１の出力サンプルのサイズ分布を分析するステップを含み、
ステップｂ）は、第１の細胞の数を決定するステップを含む。
【００３６】
本発明はまた、関心対象となる病態に関連する細胞パターンを同定するための方法も特徴とし、該方法は、
ａ）複数の対照対象および関心対象となる病態を有する複数の症例対象のそれぞれから細胞サンプルを採取するステップと、
ｂ）それぞれの細胞サンプルから、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞をサイズごとに濃縮するステップと、
ｃ）ステップｂ）で濃縮された細胞を分析するステップと、
ｄ）ステップｃ）において得られた結果を用いて関連研究を行なうステップとを含む。
【００３７】
本発明はまた、対象における病態を診断するための方法も特徴とし、該方法は、
ａ）病態に関連する細胞パターンを提供するステップと、
ｂ）対象から細胞サンプルを採取するステップと、
ｃ）細胞サンプルから、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞をサイズごとに濃縮するステップと、
ｄ）ステップｃ）で濃縮された細胞を分析するステップと、
ｅ）ステップａ）の細胞パターンとステップｄ）の分析とに基づいて、対象における病態の有無を診断するステップとを含む。
【００３８】
本方法において、ステップｃ）は、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等のステップｂ）で濃縮された細胞におけるＲＮＡレベルを検出するステップを含む。
【００３９】
好ましくは、該方法は、少なくとも５０の症例対象および少なくとも５０の対照対象を利用する。
【００４０】
該方法の一実施形態において、ステップｃ）は、ステップｂ）で濃縮された細胞の数を決定することを含む。これは、例えば、インピーダンス、光吸収、光散乱、または静電容量等の細胞特徴を用いて達成することができる。
【００４１】
別の実施形態において、ステップｃ）は、ステップｂ）で濃縮された細胞のサイズ分布を分析するステップを含む。これは、サイズ分布を決定するために、顕微鏡、細胞計数器、磁石、バイオキャビティレーザー、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリクス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトル結像システムを用いて達成することができる。
【００４２】
細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳液、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、もしくは尿生殖路の分泌物、羊水、または水サンプルであり得る。
【００４３】
別の実施形態において、ステップｃ）は、ステップｂ）で濃縮された細胞の起源の１つまたは複数の組織を決定するステップを含む。
【００４４】
他の実施形態において、ステップｃ）は、ステップｂ）で濃縮された細胞から、１つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体を同定することを含む。
【００４５】
他の実施形態において、ステップｅ）は、例えば、抗Ｂｅｒ−Ｅｐ４、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗ムチン−１、抗サイトケラチン８、および抗ＣＤ３４＋等の抗体（例えば、モノクローナル）またはそのフラグメント等の、例えば、ポリペプチド等の第１の細胞を選択的に結合する１つ以上の結合部分と、ステップｂ）で濃縮された細胞を接触させるステップを含む。
【００４６】
別の実施形態において、デバイスは、第１の方向に、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成される。
【００４７】
別の実施形態において、デバイスは、ステップｂ）で濃縮された細胞を選択的に捕捉する。
【００４８】
本発明はまた、対象に投与される薬物処置の効力を決定するための方法も特徴とし、該
方法は、
ａ）処置の前に、対象から第１の細胞サンプルを採取するステップと、
ｂ）第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含むデバイスに、第１の細胞サンプルを導入するステップと、
ｃ）第１の出力サンプルを分析するステップと、
ｄ）薬物処置と同時に、または薬物処置の後に、対象から第２の細胞サンプルを採取するステップと、
ｅ）第２の細胞サンプルに対してステップｂ）およびｃ）を繰り返すステップと、
ｆ）第１の細胞サンプルおよび第２の細胞サンプルに対する、ステップｃ）の結果を比較するステップであって、
比較は、薬物処置の効力を決定する、ステップとを含む。
【００４９】
一部の実施形態において、デバイスは、第１の方向に、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成される。
【００５０】
一部の実施形態において、デバイスは、第１の方向に、６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞、または１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成される。
【００５１】
ステップｃ）は、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルからの第１の細胞におけるＲＮＡレベルを検出するステップを含むことができ、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり得る。
【００５２】
ステップｃ）はまた、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルからの第１の細胞の数を決定するステップを含むこともできる。
【００５３】
ステップｄ）は、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルからの第１の細胞から、１つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体を同定するステップを含むことができる。
【００５４】
本発明はまた、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、患者からの体液サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行い、療法の効力の兆候として既定のサイズを超える細胞の評価を行なうことによって、患者における病態に対する療法の効力を決定する方法も特徴とする。病態は、例えば、炎症性の病態、虚血性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または肺癌、乳癌、もしくは前立腺癌等の腫瘍性の病態である。体液は、例えば、血液、汗、涙、リンパ液、耳液、痰、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、および泌尿生殖路の分泌物、羊水、または体組織抽出物である。評価は、細胞の数および／または細胞の型を同定するステップ、または細胞中のＤＮＡの総量を決定するステップを含み得る。代替として、評価は、内皮細胞の数を決定するステップ、内皮細胞に対する癌細胞の比を決定するステップ、ＤＮＡまたはＲＮＡの突然変異を検出するステップ、ＳＮＰを分析するステップ、細胞の形態を分析するステップ、（例えば、マーカーに対して特異的な特定の結合剤と細胞を反応させることにより）細胞のマーカーを検出するステップ、および細胞の活性を検出するステップからなる群から選択される。該評価はまた、細胞のパターンを同定するステップを含んでもよい。該
方法は、複数の濃縮および評価ステップをさらに含み得、評価ステップの結果は、療法の効力の兆候として比較される。複数の濃縮および評価ステップは、概して、例えば、毎日、毎週、隔週、隔月、毎月、３ヶ月ごと、隔年、または毎年等の一定間隔にて分けられる。該方法は、少なくとも１つの一定間隔中、患者に対して療法を提供するステップをさらに含み得る。濃縮ステップは、障害物のアレイを含む、例えば、マイクロ流体デバイス等のデバイスを用いて行なわれることが好ましい。
【００５５】
本発明はまた、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する、例えば、癌細胞等の細胞を誘導することによって、患者からの体液サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行ない、既定のサイズを超える細胞の第１の評価を行ない、少なくとも１つの治療剤と細胞を接触させ、細胞の第２の評価を行ない、そして治療剤のためのスクリーニングとして細胞の第１および第２の評価を比較することによって、患者における病態に対する治療剤のためのスクリーニングの方法も特徴とする。細胞は、治療剤と接触させる前に培養され得る。該方法はまた、異なる治療剤と濃縮された細胞の分離サンプルを接触させるステップと、接触させた後、細胞の評価を比較するステップとを含み得る。濃縮ステップは、障害物のアレイを含むデバイスを用いて行なわれることが好ましい。該方法は、スクリーニングにおいて同定された最も効力のある治療剤を用いて患者を治療するステップをさらに含み得る。該評価は、細胞の数または細胞のパターンを同定するステップを含み得る。望ましくは、細胞のいくつかは保存される。保存された細胞のいくつかは、その後、治療剤と接触させ、治療剤の効力の兆候として評価され得る。病態は、例えば、炎症性の病態、虚血性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または肺癌、乳癌、もしくは前立腺癌等の腫瘍性の病態である。体液は、例えば、血液、汗、涙、リンパ液、耳液、痰、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、もしくは泌尿生殖路の分泌物、羊水、または体組織抽出物である。
【００５６】
本発明はまた、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、体組織サンプルからの細胞のサイズごとに濃縮ステップを行ない、既定のサイズの細胞を回収し、細胞の特性を評価し、アーカイブの細胞を保存し、そして細胞の特性から病態に対して有効な治療剤を同定することによって、病態に対して有効な治療剤を決定する方法も特徴とする。病態は、例えば、炎症性の病態、虚血性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または肺癌、乳癌、もしくは前立腺癌等の腫瘍性の病態である。該方法は、遺伝子型またはＳＮＰの判定のために細胞を分析するステップをさらに含み得る。
【００５７】
本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスをさらに特徴とし、該デバイスは、
ａ）第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を含むチャネルであって、該デバイスは、
ｉ）第１の方向に、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を誘導する、あるいは
ｉｉ）第１の方向に、６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞、または１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成される、チャネルと、
ｂ）第１の出力サンプルまたは第２の出力サンプルを分析するための検出モジュールであって、該検出モジュールは、チャネルに流体的に結合される、検出モジュールとを含む。
【００５８】
チャネルは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができ、流体は、該流体が主流束および副流束に不均等に分割されるように、該ギャップを通って流れる。
【００５９】
デバイスは、第１の方向に、６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞、または１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００６０】
代替として、該デバイスは、第１の方向に、８ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、８ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞、または１０ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００６１】
該デバイスの検出モジュールは、第１の細胞において癌に関連するマーカーを同定するように適合され得る。検出モジュールは、例えば、表１から選択される１つ以上のマーカーを特異的に結合する抗体等の第１の細胞を特異的に結合する抗体を含むことができる。検出モジュールは、１つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体を検出するように構成することができる。
【００６２】
検出モジュールは、顕微鏡、細胞計数器、磁石、バイオキャビティレーザー、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリクス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトル結像システムを含むことができる。
【００６３】
別の態様において、本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスを特徴とし、該デバイスは、
ａ）第１の方向に、１つ以上の癌細胞を誘導して、癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を含むチャネルと、
ｂ）癌細胞または第２の細胞を捕捉するための捕捉モジュールであって、該捕捉モジュールは、チャネルに流体的に結合され、該捕捉モジュールは、癌細胞または第２の細胞に選択的に結合する１つ以上の結合部分を含む、捕捉モジュールとを含む。
【００６４】
構造は、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができる。結合部分は、１つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体に特異的に結合するものであり得、障害物は、結合部分を含むことができる。デバイスは、第１の方向に、１２、１４、または１６ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができ、捕捉モジュールに流体的に結合される細胞計数モジュールをさらに含むことができる。結合部分は、例えば、ＥｐＣＡＭに結合するもの等の抗体（モノクローナル性であり得る）等のポリペプチドを含むことができる。
【００６５】
別の態様において、本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスを特徴とし、該デバイスは、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含み、該構造は、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含み、障害物のうちの少なくともいくつかは、第１の細胞または第２の細胞に選択的に結合するモノクローナル
抗ＥｐＣＡＭ抗体またはそのフラグメントを含む。
【００６６】
別の態様において、本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスを特徴とし、該デバイスは、
ａ）サイズに基づいて、細胞サンプルにおいて細胞を濃縮することが可能である濃縮モジュールと、
ｂ）濃縮モジュールによって濃縮された細胞の数を決定するための細胞計数モジュールであって、該細胞計数モジュールは、濃縮モジュールに流体的に結合される、細胞計数モジュールとを含む。
【００６７】
濃縮モジュールは、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞（例えば、癌細胞）を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を含むチャネルを含むことができる。
【００６８】
デバイスは、第１の方向に、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。代替として、デバイスは、第１の方向に、６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞、および第２の方向に、６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞、または１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。デバイスの構造は、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができる。細胞計数モジュールは、インピーダンス、光学、または静電容量を利用し、第１の出力サンプルまたは第２の出力サンプルにおいて細胞の数を決定することができる。
【００６９】
該デバイスは、第１の出力サンプルまたは第２の出力サンプルを可視化するように適合された検出器をさらに含むことができ、該検出器は、捕捉モジュールに流体的に結合される。
【００７０】
本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスをさらに特徴とし、該デバイスは、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を含むチャネルを含み、該デバイスは、１時間当たり少なくとも２０ｍＬ、好ましくは少なくとも５０ｍＬの流体を処理することが可能である。
【００７１】
構造は、サイズが２０ミクロンと１００ミクロンとの間であり得る、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができる。
【００７２】
チャネルは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含むことができ、流体は、該流体が主流束および副流束に不均等に分割されるように、該ギャップを通って流れる。
【００７３】
障害物のアレイは、障害物の互い違いに配置された二次元アレイであり得る、または該アレイは、複数の列を含むことができ、それぞれの連続する列は、前列の周期の半分未満だけ偏移される。デバイスは、障害物の第１のアレイと直列または並列で、障害物の１つ以上の追加アレイをさらに含むことができる。
【００７４】
第１の細胞は、第２の細胞よりも大きい平均流体力学的サイズを有し得る。
【００７５】
細胞サンプルは、血液またはその分画であり得る。
【００７６】
該デバイスは、第１の方向に、１２ミクロン、１４ミクロン、または１６ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導するように構成することができる。
【００７７】
該デバイスは、第１の入口、第１の出口、および第２の出口を有する連続流動デバイスを含むことができ、該細胞サンプルは、該第１の入口に適用され、第１の出力サンプルは、該第１の出口から流出し、第２の出力サンプルは、該第２の出口から流出する。
【００７８】
該デバイスは、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成することが可能であり、第１の出力サンプルの体積は、細胞サンプルの体積よりも小さい。
【００７９】
該デバイスは、第１の出力サンプルが、細胞サンプル中の第１の細胞の少なくとも８０％を含み、第２の出力サンプルが細胞サンプル中の第１の細胞の２０％未満を含むように、構成することができる。
【００８０】
デバイスが連続流動を提供する場合、それは、第２の流体が適用される、第２の入口を含むことができる。
【００８１】
第１の細胞は、上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体であり得る。
【００８２】
デバイスは、チャネルに流体的に結合される検出モジュールをさらに含むことができ、該検出モジュールは、顕微鏡、細胞計数器、磁石、バイオキャビティレーザー、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリクス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトル結像システムを含むことができ、それは、第１の細胞に選択的に結合する標識を検出することができる。
【００８３】
デバイスは、例えば、対象の循環器系内または近傍における、対象内への移植に適合され得る。
【００８４】
別の態様において、本発明は、対象の循環器系に流体的に結合させることが可能であるシステムを特徴とし、該システムは、細胞サンプルを処理するためのデバイスを含み、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含む。該システムは、管組織または動静脈シャントを通って循環器系に対して流体的に結合され得、循環器系から１つ以上の検体を除去することが可能である。該システムは、デバイスを通る連続的な血流に適合され得、使い捨て可能であり得る。
【００８５】
別の態様において、本発明は、細胞サンプルから検体を枯渇させるための方法を特徴とし、該方法は、細胞サンプルを処理するためのデバイスに細胞サンプルを導入するステップを含み、該デバイスは、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含み、第１の出力サンプルまたは第２の出力サンプルは、細胞サンプルと比較して、検体について枯渇している。細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳液、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、もしくは尿生殖路の分泌物、羊水、または水サンプルであり得る。
【００８６】
細胞サンプルは、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全に罹患する患者から採取され得る。腫瘍性の病態は、急性リンパ芽球性白血病、急性もしくは慢性リンパ球性もしくは顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、ヘアリー細胞腫瘍、頭部癌、過形成、増殖性角膜神経腫、上皮内癌、腸神経節細胞腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群様体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、頸部癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、上皮小体癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セミノーマ、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織の肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、またはウイルムス腫瘍であり得る。
【００８７】
本発明はまた、対象における病態を診断するための方法も特徴とし、該方法は、
ａ）細胞サンプルを処理するためのデバイスに対象からの細胞サンプルを導入するステップであって、第１の方向に、１つ以上の第１の細胞を誘導して、第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを生成し、第２の方向に、１つ以上の第２の細胞を誘導して、第２の細胞に濃縮された第２の出力サンプルを生成する構造を有するチャネルを含み、該デバイスは、１時間当たり少なくとも２０ｍＬの流体を処理することが可能である、ステップと、
ｂ）第１の出力サンプルを分析するステップと、
ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて、病態の有無を診断するステップとを含む。
【００８８】
ステップｂ）は、接着、移動、結合、形態、分裂、遺伝子発現のレベル、または体細胞突然変異の存在からなる特性の１つ以上について第１の出力サンプルの細胞を分析することを含むことができる。
【００８９】
代替として、ステップｂ）は、表１から選択される１つ以上のマーカーの有無を検出するステップ、表１から選択される１つ以上のマーカーをコードする核酸において突然変異の有無を検出するステップ、表１から選択される１つ以上のマーカーをコードする核酸において欠失の有無を検出するステップ、表１から選択される１つ以上のマーカーの発現のレベルを検出するステップ、あるいは第１の出力サンプルにおいてマイクロＲＮＡのレベルを検出するステップを含むことができる。
【００９０】
代替として、ステップｂ）は、第１の出力サンプルにおいて、第１の細胞の数を決定するステップを含むことができる。
【００９１】
該方法を使用して、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全を検出することができる。
【００９２】
本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスをさらに特徴とする。デバイスは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを有するチャネルを含み、流体は、該流体が主流束および副流束に不均等に分割されるように、該ギャップを通って流れ、該アレイは、該アレイにおける流動の平均方向に平行ではない方向に、上皮細胞を誘導するように構成される。
【００９３】
該デバイスの好ましい実施形態において：
該デバイスは、２つの入口をさらに含み、デバイスは、２つの出口をさらに含み、２つのこのようなデバイスは、流体的に結合され、該ギャップは、該出口のうちの１つに上皮細胞を誘導するようにサイジングされ、該ギャップは、一方の入口に流れる流体から他方の入口に流れる流体まで上皮細胞を誘導するようにサイジングされ、該障害物は、ポリマー、シリコン、ガラス、または溶融石英から構成される。
【００９４】
該デバイスは、細胞サンプルがデバイスを通って流れると、細胞サンプル中に存在する上皮細胞が、細胞サンプルの平均流動方向に平行ではない方向に誘導され、細胞サンプルの別の成分が、平均流動方向に沿って誘導されるように、該デバイスに細胞サンプルを導入し、それによって、該他の成分と比較して、上皮細胞について濃縮されたサンプルを生成するステップによって、例えば、癌幹細胞等の癌細胞等の上皮細胞の濃縮サンプルを生成するために、使用することができる。
【００９５】
該成分は、赤血球、血小板、白血球、または内皮細胞を含むことができ、直径が８μｍから３０μｍの範囲であり得る。上皮細胞は、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、タンパク質解析、またはメタボローム解析を行なうことが可能であり、１つの解析方法は、ｉｎ−ｃｅｌｌ  ＰＣＲ法である。細胞はまた、存在するサイトケラチンｍＲＮＡのレベルを決定することによって解析され得る。
【００９６】
該方法を実行する際に、濃縮サンプルの体積は、細胞サンプルの体積よりも実質的に小さく、上皮細胞の濃縮を生じ得る。
【００９７】
溶解緩衝液は、デバイスに同時に導入することができ、濃縮サンプルは、上皮細胞の成分を含むことができる。また、交換緩衝液は、デバイスに同時に導入することができ、濃縮サンプルは、交換緩衝液を含むことができる。
【００９８】
該方法は、上皮細胞を優先的に標識化する標識試薬と、該濃縮サンプルを接触させるステップをさらに含むことができる。
【００９９】
該方法はまた、例えば、濃縮サンプルにおいて５００ｆＬを超える細胞体積等の、濃縮サンプルにおいて細胞の数を定量化するステップを含むことができる。
【０１００】
該方法の他の実施形態において、デバイスは、該濃縮サンプルにおいて１４μｍを超える直径の細胞の数を決定し、デバイス内部の細胞のそれぞれに対するずれ応力は、すべての時間において、１０ダイン／ｃｍ２未満であり、細胞サンプルは、上皮細胞を優先的に標識化する標識試薬と接触させ、ここで、標識試薬は、まず、デバイスに細胞サンプルを導入する前、あるいはデバイスに細胞サンプルを導入した後、細胞サンプルと混合され、標識試薬は、粒状標識試薬であり得、標識細胞は、定量化され得る。標識試薬は、量子ドットであり得、標識細胞は、２光子励起を用いて解析され得る。該方法は、濃縮サンプルのバルク測定を行なうステップをさらに含むことができる。細胞に結合する標識試薬は、該細胞に結合されないままである標識試薬から分離され得る。標識試薬は、デバイスに同時に導入され、デバイス内において細胞の標識化をもたらすことができる。
【０１０１】
標識試薬は、量子ドット、抗体、ファージ、アプタマー、フルオロフォア、酵素、または例えば、親和性試薬もしくはポリスチレン等を含む、中性に浮遊する、もしくは抗体を含むことができるビーズを含むことができる。標識試薬は、細胞のサイズを、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１００％、または少なくとも１０００％増加することができる。
【０１０２】
該デバイスはまた、
ａ．細胞サンプルを提供するステップと、
ｂ．上皮細胞について濃縮されたサンプルを生成するように、デバイスに細胞サンプルを導入するステップと、
ｃ．上皮細胞を定量化するステップとによって、上皮細胞を定量化するために使用することもできる。
【０１０３】
該デバイスはまた、
ａ．正常血球よりも大きい細胞について濃縮されたサンプルを生成するように、デバイスに患者からの細胞サンプルを導入するステップと、
ｂ．疾患状態を決定するために、サンプルに存在する正常血球よりも大きい細胞の数を判定するステップとを含む、診断方法に使用することもできる。
【０１０４】
代替的な診断方法は、
ａ．正常血球よりも大きい細胞について濃縮されたサンプルを生成するように、デバイスに患者からの細胞サンプルを導入するステップと、
ｂ．疾患状態を決定するために、ＤＮＡ解析、ＲＮＡ解析、プロテオーム解析、またはメタボローム解析を濃縮サンプルに対して行なうステップとを含む。
【０１０５】
該ＤＮＡ解析は、上皮成長因子受容体遺伝子において１つ以上の突然変異の存在および同一性、または非存在を決定するステップを含むことができ、本方法は、
ｉ．濃縮サンプルからゲノムＤＮＡを単離するステップと、
ｉｉ．上皮成長因子受容体遺伝子のエクソン１８、１９、２０、および２１のうちの１つ以上を増幅するステップとを含むことができ、本方法は、
ｉｉｉ．公知の上皮成長因子受容体突然変異に対応する増幅産物の下位領域を増幅し、さらなる増幅産物を生じるステップと、
ｉｖ．さらなる増幅産物を配列決定するステップと、
ｖ．得られた配列を、上皮成長因子受容体遺伝子の野生型配列および上皮成長因子受容体遺伝子の公知の突然変異の一覧と比較するステップとをさらに含むことができる。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスを特徴とする。該デバイスは、
ａ．ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを有するチャネルであって、流体は、流体が主流束および副流束に不均等に分割され、よって、臨界サイズよりも大きい細胞の動きの平均方向が流体流動の平均方向に平行ではないように、ギャップを流れる、チャネルと、
ｂ．正常血球よりも大きい細胞を収集するように配置された出口と、
ｃ．細胞を計数する細胞検出器とを含む。
【０１０７】
本発明は、細胞サンプルを処理するためのデバイスをさらに特徴とし、該デバイスは、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイ上に配設されたシーリング（透明であり得る）を含むチャネルを含み、該デバイスは、臨界サイズ以下の直径を有する細胞がギャップネットワークを通って流れることを可能にし、かつシーリングと障害物との間の該臨界サイズを超える直径を有する細胞を捕捉するように構成される。
【０１０８】
臨界サイズは、例えば、１２または１４ミクロン等の５ミクロンと２０ミクロンとの間であり得る。
【０１０９】
該臨界サイズを超える直径を有する細胞は、上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、
前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、トロホブラスト、細菌、菌類、または病原体等の１つ以上の希少細胞を含むことができる。デバイスは、シーリングと障害物との間の臨界サイズを超える直径を有する細胞の有無を検出するために、使用することができる。シーリングが透明である場合、検出は、顕微鏡を用いて成し遂げることができる。
【０１１０】
該デバイスを用いる一部の方法において、該方法は、細胞サンプルを導入した後に、緩衝液、溶解試薬、核酸増幅試薬、容積モル浸透圧濃度調節試薬、標識試薬、保存剤、または固定試薬をデバイスに導入するステップを含むことができる。容積モル浸透圧濃度調節試薬は、シーリングと障害物との間の臨界サイズを超える直径を有する細胞を放出させる高浸透圧溶液を含むことができる。
【０１１１】
本発明はまた、料金と引き換えに、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、患者からの体液サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行い、治療剤に対するスクリーニングとして既定のサイズを超える細胞の評価を行なうことによって、患者における病態の治療のための治療剤を同定するビジネス方法も特徴とする。該方法は、例えば、方法ステップを行なうことを許可される、ＣＬＩＡ研究室において行なわれる。該方法は、複数の濃縮および評価ステップをさらに含み得る。細胞は、少なくとも１つの濃縮ステップと評価ステップとの間で治療剤と接触し得る。細胞は、評価ステップの前に培養され得る。既定のサイズを超える細胞の少なくともいくつかはまた、保存され得る。
【０１１２】
本発明はまた、料金と引き換えに、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、患者からの体液サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行い、かつ治療的な処置の効力の兆候として既定のサイズを超える細胞を評価することによって、病態に罹患している患者の治療的な処置の効力を決定するビジネス方法をさらに特徴とする。該方法はまた、治療的な処置のコースにわたって、複数の濃縮および評価ステップを含んでもよい。該方法は、例えば、方法ステップを行なうことを許可される、ＣＬＩＡ研究室において行なわれる。該ＣＬＩＡ研究室また、該方法を行なう医療提供者によって契約され得る。該方法は、結果を示している医療提供者への報告をＣＬＩＡ研究室が提供するステップをさらに含み得る。細胞を、例えば、少なくとも１つの濃縮ステップと評価ステップとの間で治療剤と接触させる。
【０１１３】
本発明はまた、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、患者からの体液サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行い、既定のサイズより大きい細胞を回収し、細胞の特性を評価し、アーカイブの細胞を保存し、細胞の特性から病態に対して有効な治療剤を同定することによって、患者における病態の治療のための有効な治療剤を決定するビジネス方法も特徴とする。特性は、遺伝子型またはＳＮＰによる細胞の分類を含む。特性は、例えば、炎症性の病態、虚血性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腫瘍性の病態（肺癌、乳癌、もしくは前立腺癌等）等の病態に対して有効である特定の治療剤と相関性があり得る。該方法は、例えば、該方法を行なうことを許可される、ＣＬＩＡ研究室において行なわれ得る。該方法は、病態を治療するための有効な治療剤における報告を提供し、例えば、該報告が、医療専門家、研究所、または薬品会社に提供されることをさらに含み得る。
【０１１４】
本発明はまた、料金と引き換えに、サンプルにおいて、他のより小さい成分とは異なる方向に、既定のサイズを超える流体力学的サイズを有する細胞を誘導することによって、患者からの体組織サンプルから細胞のサイズごとに濃縮ステップを行い、癌の再発の可能
性の兆候として既定のサイズを超える細胞を評価することによって、癌に罹患する患者における、例えば、乳癌、前立腺癌、または肺癌等の癌の再発の可能性を決定するビジネス方法も特徴とする。体組織サンプルは、例えば、血液、骨髄懸濁液、体液、または体組織抽出物である。該方法は、一定時間間隔にて分けられ得る、複数の濃縮および評価ステップを含み得る。患者は、濃縮および評価ステップのうちの少なくとも１つの後、癌治療をされ得る。さらに、複数の評価ステップにわたる細胞の変化は、癌の再発の可能性の兆候である。評価は、細胞の数または細胞の活性を決定するステップを含み得る。該方法はまた、例えば、医療専門家に評価の結果についての報告を提供することを含み得る。濃縮ステップは、例えば、障害物のアレイを含むデバイスを用いて行なわれる。
【０１１５】
本発明は、癌に罹患しているヒト患者における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）標的とする処置の効力の可能性を決定するための方法をさらに特徴とする。該方法は、野生型ｅｒｂＢ１遺伝子と比較して患者のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの核酸変異体の有無を検出するステップを含む。少なくとも１つの変異体の存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置の効力を示す。好ましくは、該核酸変異体は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を上昇させる。患者は、その後、ＥＧＦＲを標的とする処置で治療され得る。本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲを標的とする処置は、合成アニリノキナゾリンであり得る、アニリノキナゾリン等のチロシンキナーゼ阻害剤である。しばしば、合成アニリノキナゾリンは、ゲフィチニブあるいはエルロチニブのいずれかである。
【０１１６】
別の実施形態において、ＥＧＦＲを標的とする処置は、４−ジメチルアミノ−ブタ−２−エン酸［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−３−シアノ−７−エトキシ−キノリン−６−イル］−アミド（「ＥＫＢ−５６９」、時々、「ＥＫＩ−５６９」とも称される；例えば、国際公開第ＷＯ  ２００５／０１８６７７号およびＴｏｒｒａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ．２０００，ｐ．１０２４参照）および／またはＨＫＩ−２７２またはＨＫＩ−３５７（Ｗｙｅｔｈ；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．１１ｔｈ  ＮＣＩ  ＥＯＲＴＣ−ＡＡＣＲ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．６  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｎｏｖ．２０００，ＩＳＳＮ  １０７８−０４３２、Ｒａｂｉｎｄｒａｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：３９５８−３９６５（２００４）、Ｈｏｌｂｒｏ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘ．４４：１９５−２１７（２００４）、Ｔｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８，１１０７−１１３１、およびＴｅｊｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃ．Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１４Ｓ：３５７９（２００４）参照）を含む、不可逆ＥＧＦＲ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲは、癌を罹患している患者、または癌を発症する危険性がある患者からの生体サンプルから得られる。ＥＧＦＲ（またはｅｒｂＢ１遺伝子）のキナーゼドメインにおける変異体は、ＡＴＰ結合ポケットの立体配座構造に影響を及ぼす。好ましくは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける変異体は、エクソン１８、１９、２０、または２１のインフレームの欠失または置換である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ｅｒｂＢ１遺伝子の突然変異および核酸変異体は、配列番号５１１のヌクレオチド２１５５にてグアニンに代えてチミンもしくはグアニンに代えてアデニンの置換；配列番号５１１のヌクレオチド２２３５から２２４９、２２４０から２２５１、２２４０から２２５７、２２３６から２２５０、２２５４から２２７７、または２２３６から２２４４の欠失；配列番号５１１のヌクレオチド２３１６の後、およびヌクレオチド２３１７の前にヌクレオチドグアニン、グアニン、およびチミン（ＧＧＴ）の挿入；または配列番号５１１のヌクレオチド２５７３にてチミンに代えてグアニンもしくはヌクレオチド２５８２にてチミンに代えてアデニンの置換である。
【０１１８】
別の実施形態において、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、変異体部位を含むＥＧＦＲ核酸を少なくとも１つの核酸プローブと接触させることを提供する。プローブは、変異体部位を含み、変異体部位にて相補的ヌクレオチド塩基を含む核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションを、検出可能な標識を用いて検出することができる。
【０１１９】
さらに別の実施形態において、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、少なくとも１つの核酸配列を配列決定するステップおよび得られた配列を、公知のｅｒｂＢ１核酸配列と比較するステップを含む。
【０１２０】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの核酸変異体の有無の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なうステップを含む。仮定的変異体を含むｅｒｂＢ１核酸配列を増幅し、増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定する。該増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定するステップは、少なくとも１つの核酸のセグメントを配列決定するステップを含む。代替として、増幅産物は、自動および手動ゲル電気泳動等を含む、それらのサイズに従って、増幅産物を分離することが可能な任意の方法を用いることにより分析することができる。
【０１２１】
代替として、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、遺伝子の複数の変異体のハプロタイプを決定するステップを含む。
【０１２２】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ変異体の有無は、ｅｒｂＢ１遺伝子産物（タンパク質）を分析することによって検出することができる。本実施形態において、変異ＥＧＦＲに特異的に結合するプローブを、利用する。好ましい実施形態において、該プローブは、変異ＥＧＦＲに優先的に結合する抗体である。変異ＥＧＦＲの存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置の効力の可能性を予測する。代替として、該プローブは、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはアプタマーであり得る。
【０１２３】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子（ｅｒｂＢ１）において少なくとも１つの核酸変異体を含む核酸配列に、選択的結合条件下で、特異的に結合するプローブをさらに提供する。一実施形態において、変異体は、ＡＴＰ結合ポケットの構造的変化を与えるｅｒｂＢ１のキナーゼドメインにおける突然変異である。
【０１２４】
本発明のプローブは、約５００のヌクレオチド塩基、好ましくは約１００のヌクレオチド塩基、および最も好ましくは、約５０もしくは約２５のヌクレオチド塩基またはそれ未満の長さの核酸配列を含み得る。該プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）から構成され得る。さらにまた、該プローブは、例えば、蛍光または酵素標識等の検出可能な標識を含み得る。
【０１２５】
本発明は、加えて、癌に罹患している患者における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）標的とする処置の効力の可能性を決定するための方法を提供する。該方法は、患者からの生体サンプルにおいてＥＧＦＲのキナーゼ活性を決定するステップを含む。正常対照と比較して、ＥＧＦＲリガンドによる刺激後のキナーゼ活性の上昇は、ＥＧＦＲを標的とする処置が有効である可能性が高いことを示す。
【０１２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、変異上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の触媒キナーゼ活性を阻害する化合物を選択する方法を開示する。第１のステップとして、変異ＥＧＦＲを、潜在的化合物と接触させる。その後、得られた変異ＥＧＦＲのキナーゼ活性を検出し、変異ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を選択する。一実施形態におい
て、変異ＥＧＦＲは、細胞内に含まれる。
【０１２７】
該方法はまた、例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ等のＴＫＩに対する耐性を与えるキナーゼドメインの二次突然変異を有する変異ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を選択するために使用することができる。
【０１２８】
別の実施形態において、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの二次突然変異の獲得を予測する（または突然変異のために選択する）ための方法を開示する。ｅｒｂＢ１遺伝子の変異型を発現する細胞を、有効ではあるが、亜致死量のチロシンキナーゼ阻害剤と接触させる。チロシンキナーゼ阻害剤の成長停止効果に耐性を示す細胞が選択され、ｅｒｂＢ１核酸がｅｒｂＢ１キナーゼドメインのさらなる突然変異の存在に対して分析される。一実施形態において、細胞は、体外である。別の実施形態において、細胞は、トランスジェニック動物から得られる。一実施形態において、該トランスジェニック動物は、マウスである。このマウスモデルにおいて、研究される細胞は、腫瘍生検から得られる。本発明により選択されるｅｒｂＢ１キナーゼドメインの二次突然変異を含む細胞は、キナーゼドメインの二次突然変異を有する変異ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を選択するための上記の方法において使用することができる。
【０１２９】
ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの二次突然変異の獲得を予測するための代替的な実施形態において、ｅｒｂＢ１遺伝子の変異型を発現する細胞を、まず、有効量の突然変異誘発剤と接触させる。突然変異誘発因子は、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、塩酸ホカルバキシン（Ｐｒｃ）、メタンスルホン酸メチル（ＭｅＭＳ）、クロラムブシル（Ｃｈｉ）、メルファラン、塩酸ポルカルバジン、シクロホスファミド（Ｃｐ）、ジエチル硫酸（Ｅｔ２ＳＯ４）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、７，１２  ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）、酸化エチレン、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、またはエチルメタンスルホレート（ＥｔＭｓ）である。その後、細胞を、有効ではあるが、亜致死量のチロシンキナーゼ阻害剤と接触させる。チロシンキナーゼ阻害剤の成長停止効果に耐性を示す細胞が選択され、ｅｒｂＢ１核酸がｅｒｂＢ１キナーゼドメインのさらなる突然変異の存在に対して分析される。
【０１３０】
本出願の一実施形態において、ＥＧＦＲ突然変異の存在は、例えば、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＡＣＳスキャニング、免疫ブロット法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、免疫沈降、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の抗体技法、およびＥＧＦＲの活性化下流の標的に誘導される抗体を利用する派生的な技法等の当技術分野に周知の免疫学的な技法を用いて決定することができる。このような標的の例としては、例えば、リン酸化されたＳＴＡＴ３、リン酸化されたＳＴＡＴ５、およびリン酸化されたＡｋｔが挙げられる。リン酸特異的抗体を用いて、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＡｋｔの活性化状態を決定することができる。ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＡｋｔの活性化は、ＥＧＦＲ突然変異を活性化する診断指標として有用である。一実施形態において、活性化（リン酸化）ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３、またはＡｋｔの存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置が有効である可能性が高いことを示す。
【０１３１】
本発明は、免疫組織化学または免疫細胞化学法により試験生体サンプルにおいて、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの変異体のためのスクリーニングの方法をさらに提供する。
【０１３２】
抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）は、様々な商業的な供給元から購入する
ことができる、または例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されるように、周知の方法を用いて製造され得る。概して、本発明に有用な抗体の例としては、抗ホスホＳＴＡＴ３、抗ホスホＳＴＡＴ５、および抗ホスホＡｋｔ抗体が挙げられる。このような抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入することができる。このような検出アッセイに適切な生体サンプルとしては、細胞、組織生検、全血、血漿、血清、痰、脳脊髄液、乳房吸引液、胸膜液、尿等が挙げられるが、こららに限定されない。直接的な標識化技術のためには、標識された抗体が利用される。間接的な標識化技術のためには、サンプルを、標識された物質とさらに反応させる。本発明の免疫学的方法は、これらが少量の生物物質だけしか必要としないので有利である。このような方法は、細胞レベルで行なってもよく、これにより最小限の１細胞が必要となる。
【０１３３】
好ましくは、癌に罹患している患者、または癌を発症する危険性がある患者、および本発明の方法に従ってアッセイされる患者から、一部の細胞を得る。
【０１３４】
突然変異ＥＧＦＲタンパク質を検出するための薬剤は、突然変異ＥＧＦＲタンパク質に結合することが可能な抗体、好ましくは、検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル性、またはさらに好ましくは、モノクローナル性であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２）を使用することができる。検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識化、ならびに直接的に標識化される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を達成し得る。間接的な標識化の例としては、蛍光標識した二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンでビオチンを検出することができるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。
【０１３５】
別の実施形態において、該方法は、対照対象から対照生体サンプルを得るステップと、突然変異ＥＧＦＲタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの存在を生体サンプル中に検出できるように、突然変異ＥＧＦＲタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡを検出することが可能な化合物もしくは薬剤と対照サンプルを接触させるステップと、対照サンプル中の突然変異ＥＧＦＲタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中の突然変異ＥＧＦＲタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの存在と比較するステップとをさらに含む。
【０１３６】
異なる実施形態において、診断アッセイは、突然変異ＥＧＦＲ活性のためのものである。特定の実施形態において、突然変異ＥＧＦＲ活性は、チロシンキナーゼ活性である。１つのこのような診断アッセイは、少なくとも１つのＥＧＦＲ基質のＥＧＦＲ媒介のリン酸化を検出するためにある。ＥＧＦＲ活性のレベルを、例えば、様々な突然変異ＥＧＦＲポリペプチド、突然変異ＥＧＦＲを含む様々な組織、少なくとも１つの突然変異ＥＧＦＲを有することが疑われる癌組織からの生検等についてアッセイすることができる。
【０１３７】
これらの様々な細胞、組織、またはそれらの抽出物中のＥＧＦＲ活性のレベルの比較を、任意に行なうことができる。一実施形態において、癌組織におけるＥＧＦＲ活性の高レベルは、１つ以上のチロシンキナーゼ阻害剤による治療の影響を受けやすいであろう癌について特徴的である。関連した実施形態において、ＥＧＦＲ活性レベルを、処置したおよび未処置の生検サンプル、細胞株、トランスジェニック動物、またはこれらのいずれかからの抽出物との間で決定して、突然変異ＥＧＦＲ活性における既定の処置の効果を未処置
対照と比較して決定することができる。
【０１３８】
一実施形態において、本発明は、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの少なくとも１つのキナーゼ活性を増大する核酸変異の有無を決定することにより、癌に罹患している患者または癌を発症する危険性がある患者に対する処置を選択するための方法を提供する。別の実施形態において、変異体は、複数の変異体であり、それにより、複数とは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える遺伝子座からの変異体を含んでよい。
【０１３９】
ある実施形態において、少なくとも１つの変異体の存在は、処置が、患者において有効であり得る、またはさもなければ有益であり得る（または有益である可能性が高い）ことを示す。処置が有効であり得るという記述は、有益な治療効果の可能性が、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの特定のキナーゼ活性を増大する核酸変異の適切な存在を有しない人においてよりも高いことを意味する。
【０１４０】
また、ＥＧＦＲ突然変異の検出のためのキットも含む。これらのキットは、第１への出力の第１の方向に、１つのサイズの第１の細胞を、および第２の出力への第２の方向に、第２の細胞を誘導する構造を含むチャネルを含む分離デバイスを含む。任意に、キットは、第１の細胞を特異的に結合する特異的結合部分を含む捕捉デバイスを含む。キットはまた、ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの標的核酸を増幅する縮重プライマーも含む。代替として、キットはまた、増幅産物の増幅および分析を行なうための緩衝液、酵素、および容器を含んでもよい。キットはまた、ＤＮＡマイクロアレイ等の他のツールを含むスクリーニング、診断用、または予後診断用のキットの構成要素であり得る。しばしば、キットはまた、正常組織サンプル、および／またはｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの異なる変異を示す一連のサンプルから単離される核酸等の１つ以上の対照鋳型を提供する。
【０１４１】
一実施形態において、キットは、２つ以上のプライマー対を提供し、それぞれの対は、ｅｒｂＢ１遺伝子の異なる領域（それぞれの領域が潜在的変異の部位）を増幅することが可能であり、それにより、１つの反応またはいくつかの平行反応において、生体サンプルのいくつかの遺伝子変異体の発現を解析するためのキットを提供する。
【０１４２】
本発明のデバイスのいずれかを、デバイスのための一組の説明書と共に使用することができる。
【０１４３】
長さ、サイズ、面積、または他の測定値の文脈における「ほぼ等しい」とは、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％以内で同等であることを意味する。
【０１４４】
「生物学的粒子」とは、水媒体に不溶性である生物学的起源の任意の種を意味する。例としては、細胞、粒状細胞成分、ウイルス、ならびにタンパク質、脂質、核酸、および炭水化物を含む複合体が挙げられる。
【０１４５】
「生体サンプル」とは、生物学的起源の任意のサンプル、または生物学的粒子を含む、もしくは潜在的に含む、任意のサンプルを意味する。好ましい生体サンプルは、細胞サンプルである。
【０１４６】
「血液成分」とは、宿主赤血球、白血球、血小板、または上皮細胞、特に、ＣＴＣを含む、全血の任意の成分を意味する。血液成分はまた、例えば、タンパク質、脂質、核酸、および炭水化物等の血漿の成分、ならびに、例えば、現在もしくは過去の妊娠、臓器移植、感染、損傷、または疾患のため、血液に存在し得る任意の他の細胞の成分も含む。
【０１４７】
「細胞サンプル」とは、細胞またはその成分を含むサンプルを意味する。このようなサンプルとしては、自然に存在する流体（例えば、血液、汗、涙、耳液、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、尿、唾液、精液、膣液、脳脊髄液、頚部洗浄液、脳液、腹水、乳汁、気道、腸管、もしくは尿生殖路の分泌物、羊水、および水サンプル）および細胞を導入している流体（例えば、培地および液化組織サンプル）が挙げられる。用語はまた、溶解物も含む。
【０１４８】
「チャネル」とは、流体が流れ得るギャップを意味する。チャネルは、毛細管、導管、または水性流体が制限される他の種類の疎水性表面上の親水性パターンのストリップであり得る。
【０１４９】
「循環腫瘍細胞」（ＣＴＣ）とは、対象の固形腫瘍から剥離され、対象の循環血液中に認められる癌細胞を意味する。
【０１５０】
細胞の「成分」とは、細胞の溶解に際し少なくとも部分的に単離され得る細胞の任意の成分を意味する。細胞成分は、オルガネラ（例えば、核、核周辺部、核膜、ミトコンドリア、クロロプラスト、または細胞膜）、高分子もしくは分子複合体（例えば、脂質、多糖類、タンパク質（膜、貫通膜、または細胞質ゾル）、核酸（天然、治療的、または病原性）、ウイルス粒子またはリボソーム）、または他の分子（例えば、ホルモン、イオン、補因子、または薬物）であり得る。
【０１５１】
細胞サンプルの「成分」とは、サンプル内に含まれる、細胞またはその成分のサブセットを意味する。
【０１５２】
障害物のアレイに関する「密度」とは、面積の１単位当たりの障害物の数、あるいは、このような障害物により占められる体積の割合を意味する。アレイ密度は、障害物を互いにより一層近接して配置する、あるいは障害物間のギャップに対して、障害物のサイズを増大させることによって、増大する。
【０１５３】
「濃縮サンプル」とは、サンプル中に一般的に存在する他の成分と比較して、関心対象となる成分の関連の集団を増大させるように処理されている成分を含むサンプルを意味する。例えば、サンプルは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％で、または少なくとも１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、もしくは１００，０００，０００倍で、関心対象となる細胞の関連の集団を増大させることによって、濃縮され得る。
【０１５４】
「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子受容体」、および「ＥＧＦＲ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８８１−９１４（１９８７）に開示されるような、天然配列ＥＧＦＲを指し、その変異体（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７−４２１１（１９９０）に記載の欠失突然変異ＥＧＦＲ）を含む。ＥｒｂＢ１とは、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。
【０１５５】
細胞サンプルの文脈において「交換緩衝液」とは、細胞サンプルを、元来、懸濁する媒体とは異なり、細胞サンプルの１つ以上の成分を交換される媒体を意味する。
【０１５６】
「流動抽出境界」とは、アレイから流体を除去するように設計される境界を意味する。
【０１５７】
「流動供給境界」とは、アレイに流体を加えるように設計される境界を意味する。
【０１５８】
「ギャップ」とは、流体または粒子が流れ得る開口部を意味する。例えば、ギャップは
、毛細管、流体が流れ得る２つの障害物間の空間、または水性流体が制限される他の種類の疎水性表面上の親水性パターンであり得る。本発明の好ましい実施形態において、ギャップネットワークは、障害物のアレイによって画定される。本実施形態において、ギャップは、隣接障害物間の空間である。好ましい実施形態において、ギャップネットワークは、基盤の表面上の障害物のアレイで構成される。
【０１５９】
「流体力学的サイズ」とは、流動、障害物、または他の粒子と相互作用する場合、有効サイズの粒子を意味する。それは、流動において、粒子体積、形状、および変形能のための一般用語として使用される。
【０１６０】
画像化処理または方法に関する「ハイパースペクトル」とは、５つ以上の波長または波長帯での画像の獲得を意味する。
【０１６１】
「細胞内活性化」とは、転写因子活性化、またはキナーゼもしくは他の代謝経路の活性化をもたらすセカンドメッセンジャー経路の活性化を意味する。外部の細胞膜抗原の調節による細胞内活性化はまた、受容体の輸送の変化をもたらし得る。
【０１６２】
「標識試薬」とは、検体に結合し、内在化もしくは吸収され、および例えば、形状、形態、色、蛍光、発光、リン光、吸光度、磁気特性、もしくは放射性発光等により検出することが可能な試薬を意味する。
【０１６３】
「マイクロ流体」とは、１ｍｍ未満の少なくとも一つの寸法を有するものを意味する。
【０１６４】
表面に関する「マイクロ構造」とは、少なくとも一つの寸法において、１ｍｍ未満を計測している１つ以上の個々の特徴を含む微視的表面構造を意味する。例示的なマイクロ特徴は、マイクロ障害物、マイクロポスト、マイクログルーブ、マイクロフィン、およびマイクロコルゲーションである。
【０１６５】
「障害物」とは、例えば、一方の表面からの突起部等のチャネルにおける流れに対する妨害物を意味する。例えば、障害物は、ベース基盤において突出する支柱または水性流体の疎水性障壁を指し得る。いくつかの実施形態において、該障害物は、部分的に浸透性であってもよい。例えば、障害物は、多孔質材で作られている支柱であり得、孔は、水性成分の浸透を許容するが、粒子が分離して進入するには小さすぎる。
【０１６６】
「収縮試薬」とは、粒子の流体力学的サイズを減少させる試薬を意味する。収縮試薬は、体積を減少させる、変形能を増加させる、または粒子の形状を変化させることによって、作用し得る。
【０１６７】
「膨張試薬」とは、粒子の流体力学的サイズを増加させる試薬を意味する。膨張試薬は、体積を増加させる、変形能を減少させる、または粒子の形状を変化させることによって、作用し得る。
【０１６８】
他の特長および利点は、以下の説明および請求項から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１−１】側方変位に基づいて細胞を分離するアレイの概略図である。（Ａ）は、後続列の側方変位を説明する。（Ｂ）は、後続列において、ギャップを通って流れる流体が、いかに障害物周辺において不均等に分割されるかを説明する。（Ｃ）は、臨界サイズを超える流体力学的サイズを有する粒子が、いかにデバイスにおいて側面に沿って変位するかを説明する。（Ｄ）は、円柱状の障害物のアレイを説明する。（Ｅ）は、楕円形の障害物
のアレイを説明する。
【図１−２】側方変位に基づいて細胞を分離するアレイの概略図である。（Ａ）は、後続列の側方変位を説明する。（Ｂ）は、後続列において、ギャップを通って流れる流体が、いかに障害物周辺において不均等に分割されるかを説明する。（Ｃ）は、臨界サイズを超える流体力学的サイズを有する粒子が、いかにデバイスにおいて側面に沿って変位するかを説明する。（Ｄ）は、円柱状の障害物のアレイを説明する。（Ｅ）は、楕円形の障害物のアレイを説明する。
【図１−３】側方変位に基づいて細胞を分離するアレイの概略図である。（Ａ）は、後続列の側方変位を説明する。（Ｂ）は、後続列において、ギャップを通って流れる流体が、いかに障害物周辺において不均等に分割されるかを説明する。（Ｃ）は、臨界サイズを超える流体力学的サイズを有する粒子が、いかにデバイスにおいて側面に沿って変位するかを説明する。（Ｄ）は、円柱状の障害物のアレイを説明する。（Ｅ）は、楕円形の障害物のアレイを説明する。
【図２】後続列の障害物周辺のギャップを通る流束の不均等な分割を説明する概略図である。
【図３】臨界サイズが、いかに、この例において放物線である流動プロファイルに依存するかを示す概略図である。
【図４】形状が、いかにデバイスを通る粒子の動きに影響を及ぼすかを示す図である。
【図５】変形能が、いかにデバイスを通る粒子の動きに影響を及ぼすかを示す図である。【図６】側方変位を示す概略図である。臨界サイズを超える流体力学的サイズを有する粒子は、アレイの端に移動するが、臨界サイズに満たない流体力学的サイズを有する粒子は、側方変位せずにデバイスを通過する。
【図７】３段階デバイスを示す概略図である。
【図８】図７のデバイスのための最大サイズおよびカットオフサイズを示す概略図である。
【図９】バイパスチャネルを示す概略図である。
【図１０】バイパスチャネルを示す概略図である。
【図１１】共通のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。
【図１２】共通のバイパスチャネルを有する３段階の二重デバイスを示す概略図である。【図１３】デバイスを通る流動が、実質的に一定である、共通のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。
【図１４】デバイスを通る流動が、実質的に一定である、共通のバイパスチャネルを有する３段階の二重デバイスを示す概略図である。
【図１５】バイパスチャネルおよび隣接段階の流体抵抗が、実質的に一定である、共通のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。
【図１６】バイパスチャネルおよび隣接段階の流体抵抗が、実質的に一定である、共通のバイパスチャネルを有する３段階の二重デバイスを示す概略図である。
【図１７】２つの別個のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。【図１８】任意の構成にある、２つの別個のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。
【図１９】３つの別個のバイパスチャネルを有する３段階の二重デバイスを示す概略図である。
【図２０】それぞれの段階を通る流動が、実質的に一定である、２つの別個のバイパスチャネルを有する３段階デバイスを示す概略図である。
【図２１】それぞれの段階を通る流動が、実質的に一定である、３つの別個のバイパスチャネルを有する３段階の二重デバイスを示す概略図である。
【図２２】流動抽出境界を示す概略図である。
【図２３】流動供給境界を示す概略図である。
【図２４】バイパスチャネルを含む、流動供給境界を示す概略図である。
【図２５】中央バイパスチャネルの隣接する２つの流動供給境界を示す概略図である。
【図２６】チップ上での流動抵抗器としての役割を果たす４つのチャネルを有するデバイスを示す概略図である。
【図２７】デバイスにおいて流れる２つの流体の相対幅におけるチップ上での抵抗器の効果を示す概略図である。
【図２８】デバイスにおいて流れる２つの流体の相対幅におけるチップ上での抵抗器の効果を示す概略図である。
【図２９】２つの外側領域の共通の入口を有する二重デバイスを示す概略図である。
【図３０Ａ】デバイスにおける多重アレイを示す概略図である。
【図３０Ｂ】デバイスにおける共通の入口および産物出口を備える多重アレイを示す概略図である。
【図３１】設置面積が小さい多段デバイスを示す概略図である。
【図３２】デバイスを通過する血液を示す概略図である。
【図３３Ａ】正常全血のマイクロ流体分離における細胞数対流体力学的サイズを示すグラフである。
【図３３Ｂ】循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の集団を含む、全血のマイクロ流体分離における細胞数対流体力学的サイズを示すグラフである。
【図３３Ｃ】ほとんどの天然血液細胞を除くサイズカットオフをさらに示す、図３３Ｂのグラフである。
【図３３Ｄ】サイズカットオフよりも大きい細胞の集団をさらに示し、疾患状態を示す、図３３Ｃのグラフである。
【図３４Ａ】単段（Ａ）、３段階（Ｂ）、二重（Ｃ）、または３段階の二重（Ｄ）デバイスにおいて、サンプルから緩衝液に粒子を移動することを示す概略図である。
【図３４Ｂ】単段（Ａ）、３段階（Ｂ）、二重（Ｃ）、または３段階の二重（Ｄ）デバイスにおいて、サンプルから緩衝液に粒子を移動することを示す概略図である。
【図３４Ｃ】単段（Ａ）、３段階（Ｂ）、二重（Ｃ）、または３段階の二重（Ｄ）デバイスにおいて、サンプルから緩衝液に粒子を移動することを示す概略図である。
【図３４Ｄ】単段（Ａ）、３段階（Ｂ）、二重（Ｃ）、または３段階の二重（Ｄ）デバイスにおいて、サンプルから緩衝液に粒子を移動することを示す概略図である。
【図３５Ａ】血液から緩衝液に粒子を移動し、３つの産物を産生するために利用される、２段階デバイスを示す概略図である。
【図３５Ｂ】２段階の最大サイズおよびカットオフサイズを示す概略グラフである。
【図３５Ｃ】３つの産物の組成物を示す概略グラフである。
【図３６】それぞれの段階がバイパスチャネルを有する、改変のための２段階デバイスを示す概略図である。
【図３７】デバイスにおいて２段階を接続する流体チャネルの使用を示す概略図である。【図３８】デバイスにおける２段階を接続する流体チャネルの使用を示す概略図であり、この２段階は、小設置面積アレイとして構成される。
【図３９Ａ】双方の段階から出力を受け入れるバイパスチャネルを有する２段階デバイスを示す概略図である。
【図３９Ｂ】このデバイスで達成可能な産物のサイズ範囲を示す概略図である。
【図４０】各段階に隣接し、同一の出口に流入するバイパスチャネルを有する改変のための２段階デバイスを示す概略図である。
【図４１】粒子の連続的な動きおよび改変のためのデバイスを示す概略図である。
【図４２Ａ】本発明のデバイスおよびその動作を示す概略図である。
【図４２Ｂ】図４２Ａのデバイスの図および本デバイスのさらに図式化した説明である。【図４３Ａ】２台のデバイスを接続するための２つの異なる構成の概略図である。図４３Ａは、１台のデバイスのうちの出口１が第２のデバイスのサンプル入口に接続される、カスケード構成を示す。図４３Ｂは、１台のデバイスのうちの出口２が第２のデバイスのサンプル入口に接続される、バンドパス構成を示す。
【図４３Ｂ】２台のデバイスを接続するための２つの異なる構成の概略図である。図４３
Ａは、１台のデバイスのうちの出口１が第２のデバイスのサンプル入口に接続される、カスケード構成を示す。図４３Ｂは、１台のデバイスのうちの出口２が第２のデバイスのサンプル入口に接続される、バンドパス構成を示す。
【図４４】標的細胞がイムノアフィニティーのビーズで標識化される、サイズ分離の強化された方法を示す概略図である。
【図４５】本発明のデバイスを用いることによって、サイズ分画を行い、結合標識試薬から、例えば、抗体等の遊離標識試薬を分離する方法を示す概略図である。
【図４６】図４５に示される方法を示す概略図である。この場合、非標的細胞は、標的細胞と同時精製し得るが、これらの非標的細胞は、標的細胞の定量化を妨害しない。
【図４７】混合物から大型細胞を濃縮し、これらの細胞の濃縮サンプルを生成する方法を示す概略図である。
【図４８】本発明のデバイス内部で細胞を溶解して、細胞全体をオルガネラおよび他の細胞成分から分離する方法を示す概略図である。
【図４９】カスケード構成において配列され、本発明のデバイスを用いることによって、サイズ分画を行ない、結合標識試薬から遊離標識試薬を分離するために使用される２台のデバイスを示す概略図である。
【図５０】カスケード構成において配列され、本発明のデバイスを用いることによって、サイズ分画を行ない、結合標識試薬から遊離標識試薬を分離するために使用される２台のデバイスを示す概略図である。この図では、ファージは、抗体よりもむしろ結合および検出のために利用される。
【図５１】バンドパス構成において配列される２台のデバイスを示す概略図である。
【図５２】正常全血のマイクロ流体分離における細胞数対流体力学的サイズを示すグラフである。
【図５３】Ｃｏｕｌｔｅｒ「Ａｃ−Ｔｄｉｆｆ」臨床血液分析器を用いて発生させる、入力、産物、および廃棄サンプルからの一組のヒストグラムである。Ｘ軸は、フェムトモルの細胞体積を表す。
【図５４】細胞濃縮モジュールで処理された胎児血の産物の流れおよび廃棄物の流れからの一組の代表的な顕微鏡写真であり、有核細胞および赤血球の明らかな分離を示す。
【図５５】パラホルムアルデヒドを用いて細胞濃縮モジュール上に固定され、蛍光顕微鏡法によって観察される、細胞を示す、一組の画像である。標的細胞は、障害物および捕捉モジュールの床部に結合される。
【図５６】本発明の方法を示す概略図である。この方法は、細胞サンプル内で大型細胞を単離し、計数し（この計数は、患者の疾患状態を示す）、次いで、大型細胞亜集団をさらに分析することを特徴とする。
【図５７Ａ】本発明の好ましい実施形態のための設計である。
【図５７Ｂ】図５７Ａに対応する設計パラメータを示す表である。
【図５７Ｃ】本発明のチップを示すマスク設計である。
【図５８】血液中のＣＴＣにおける上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の突然変異を検出する方法を示す概略図である。
【図５９】ＥＧＦＲシーケンシング鋳型を作製するための過程を示す概略図である。ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを作製し、次に、２つのＰＣＲ増幅を連続的に行なう。
【図６０】関心対象となる特定の突然変異に特異的なＥＧＦＲ亜区を増幅するために使用される対立遺伝子特異的なＴａｑＭａｎ  ５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲアッセイを示す概略図である。
【図６１】蛍光のバックグラウンドレベルを超えるいくつかのＥＧＦＲ突然変異（網掛け領域）の検出を示す一組のシーケンシングチャートである。
【図６２Ａ】ＥｐＣＡＭおよびＥＧＦＲが腫瘍細胞に発現するが白血球には発現しないことを示すアガロースゲルの画像である。ＢＣＫＤＫは、双方の細胞型に発現する一方、ＣＤ４５は、白血球中のみ発現する。
【図６２Ｂ】ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現のＰｈａｒｍａｇｅｎｅ  ＸｐｒｅｓｓＷａｙ（登録商標）プロファイルを示すグラフおよび表である。発現レベルは、定量ＲＴ−ＰＣＲによって、７２の組織においてプロファイルされ、１細胞当たり１０，０００を超えるコピーが、血液を除いてプロファイルされたほとんどの組織に検出される。表は、グラフから組織＃１〜４のｍＲＮＡの定量を示す。
【図６３】二組のＰＣＲアッセイの結果を示すアガロースゲルの一組の画像である。第１の組（左）では、ＰＣＲは、様々な濃度でＥＧＦＲ  入力ＲＮＡにおいて行なわれる。アッセイの第２の組では、ＰＣＲ反応の第１の組からのサンプルを、入れ子プライマーを用いて増幅する。
【図６４Ａ】ＮＣｌ−Ｈ１９７５  ＲＮＡを、様々な量の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ＲＮＡと混合し、ＰＣＲの前に逆転写する一組のＰＣＲアッセイの結果を示す、アガロースゲルの画像である。疑似増幅バンドは、最高の希釈で見られる。
【図６４Ｂ】図６４Ａに示されるサンプルは、入れ子プライマーを用いてさらに増幅される、一組のＰＣＲアッセイの結果を示すアガロースゲルの画像である。最高の希釈でさえ、疑似増幅バンドを生成しない。
【図６５】一組のＰＣＲアッセイの結果を示す、アガロースゲルの画像である。関連実験において、Ｈ１６５０細胞を加えた全血を本発明の２台のデバイス上を流動させ、ｃＤＮＡを、得られた濃縮サンプルから合成した。ＥＧＦＲおよびＣＤ４５プライマーを用いたＰＣＲを行なった。野生型（１３８ｂｐ）および突然変異（１２３ｂｐ）  ＥＧＦＲバンドの双方は、ＥＧＦＲ増幅を示すレーンに見られる。
【図６６Ａ】互い違いに配置された副アレイを含む本発明のアレイを示す概略図である。【図６６Ｂ】規則的アレイを互い違いに配置されたアレイと対比している概略図である。【図６６Ｃ】互い違いに配置されたアレイにおける細胞の流動および捕捉を示す概略図である。
【図６６Ｄ】狭くなる流路の領域により囲まれている出口ポートを含むデバイスを示す概略図である。
【図６６Ｅ】狭くなる流路を作製するために深さ寸法において構築されるデバイスを示す概略図である。
【図６６Ｆ】捕捉された細胞を示す、図６６Ｅのデバイスを示す概略図である。
【図６６Ｇ】本発明のデバイスの狭くなる流動領域において捕捉される染色されたＨ１６５０細胞を示す一組の顕微鏡図である。
【図６７Ａ】Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２計数デバイスにより測定されるように、白血球細胞および様々な癌細胞株を含む、いくつかの細胞サンプルのサイズ分布を示すチャートおよび挿入図である。主要チャートは、体積軸に対し対数尺度を使用する一方、挿入図は、白血球細胞の分布をより良好に示す線形尺度を使用する。
【図６７Ｂ】いくつかの癌細胞株のサイズ分布を示すチャートである。
【図６７Ｃ】図６７Ｂのチャートであり、３つの例示的なサイズカットオフをさらに示す。
【図６８Ａ】サンプルチャンバーの底部で官能化された顕微鏡スライドを特徴とする本発明の捕捉デバイスを示す概略図である。
【図６８Ｂ】細胞の回転を保ち、沈殿を防ぐために、捕捉デバイスにおいて細胞をロッキングする方法を示す概略図である。
【図６８Ｃ】ロッキングに対する代替として、捕捉デバイスを回転させる方法を示す概略図である。
【図６８Ｄ】デバイスの主チャンバー内に流体運動を引き起こすために交互に充填し、空にすることができる、２つの追加の流体チャンバーを含む捕捉デバイスを示す概略図である。
【図６８Ｅ】表面上に多重の、空間的にパターン化された捕捉機能を有する、顕微鏡スライドを示す概略図である。
【図６９Ａ】静止および作動中の双方に示される、本発明の遠心分離デバイスを示す概略
図である。
【図６９Ｂ】重力場（上）および遠心力場（下）における官能化された表面に結合される細胞を示す概略図である。
【図６９Ｃ】チャンバーは、スピン中反転する、図６９Ａのデバイスを示す概略図である。
【図６９Ｄ】夾雑細胞を捕捉するために第２の官能化された表面をさらに示す、図６９Ｃのデバイスを示す概略図である。
【図６９Ｅ】官能化されたスライドをスピン中傾斜する、遠心分離デバイスを示す概略図である。
【図６９Ｆ】最適化され得る期間：「スピンアップ」（１）、「スピン時間」（２）、「スピンダウン」（３）、および静止時間（４）を含む、回転速度対動作時間を示す一組のチャートである。
【図６９Ｇ】官能化されたマイクロ構造の表面を含む、遠心分離デバイスを示す概略図である。
【図７０Ａ】小型細胞（左）および大型細胞（右）の流路を示す、濃縮デバイスの画像である。小型細胞は、障害物との相互作用がほとんどなく、平均流動方向に基本的に流れる一方、大型細胞は、その流路に沿ってそれぞれの障害物に接触し、アレイを通り側面に誘導される。
【図７０Ｂ】障害物の規則的アレイを含む本発明のデバイスを示す概略図である。
【図７０Ｃ】偏向方向、ギャップサイズ、および／または障害物間の距離は、デバイスを通して変化する一方、臨界サイズは一定に保たれる、多重アレイを含む、本発明のデバイスを示す概略図である。
【図７１−１】野生型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）核酸（配列番号５１１）およびアミノ酸（配列番号５１２）配列の一覧表である。
【図７１−２】野生型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）核酸（配列番号５１１）およびアミノ酸（配列番号５１２）配列の一覧表である。
【図７１−３】野生型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）核酸（配列番号５１１）およびアミノ酸（配列番号５１２）配列の一覧表である。
【図７１−４】野生型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）核酸（配列番号５１１）およびアミノ酸（配列番号５１２）配列の一覧表である。
【図７２】ＥＧＦＲ変異体の配列部分を示すクロマトグラフィーの配列プロファイルである。
【０１７０】
【発明を実施するための形態】
図面は、必ずしも縮尺通りではない。
【０１７１】
本発明は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および他の粒子を検出、濃縮、および分析するためのデバイスおよび方法を特徴とする。本発明は、さらに、対象からの細胞サンプルを分析することによって、対象における、例えば、癌の病態を診断する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のデバイスは、ＣＴＣまたは他の流体成分の移動を可能にする障害物のアレイを含む。
【０１７２】
本出願は、主として、ＣＴＣまたは上皮細胞の検出、濃縮、および分析に焦点をあてる一方、本発明のデバイスおよび方法は、例えば、赤血球、白血球、胎児細胞、幹細胞（例えば、未分化）、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、トロホブラスト、癌細胞、免疫系細胞（宿主または移植）、結合組織細胞、細菌、菌類、細胞病原体（例えば、細菌または原生動物）、細胞器官、および他の細胞成分（例えば、ミトコンドリアおよび核）、ならびにウイルス等の広範囲の他の細胞および粒子を処理するために有用である。
【０１７３】
本発明の例示的なデバイスおよび方法を以下に詳細に説明する。
【０１７４】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
固形腫瘍から剥離される上皮細胞は、乳房、結腸、肝臓、卵巣、前立腺、および肺の進行癌に罹患する患者の循環において、非常に低い濃度で認められ、血液中のこれらの細胞の存在または相対数は、全体的な予後および療法への応答と相関している。これらのＣＴＣは、臨床症状が現れる前に、腫瘍の膨張または転移の早期指標であり得る。
【０１７５】
ＣＴＣは、概して、約１日の短い半減期を有し、それらの存在は、一般的に、増殖性腫瘍からの最近の流入を示す。したがって、ＣＴＣは、患者の疾患および治療反応の現在の臨床状態を反映し得る動的過程の一部である。本発明のデバイスおよび方法を用いた、ＣＴＣの計数および特性記述は、癌の予後を評価し、疾患の再発をもたらし得る治療の失敗の早期発見のための治療効果をモニタリングするのに有用である。また、本発明によるＣＴＣ分析は、療法を完了した前駆症状患者における早期再発の検出を可能にする。
【０１７６】
ＣＴＣは、通常、ほとんどの血液細胞より大きい（例えば、図３３Ｂ参照）。したがって、血液中のＣＴＣを分析するための１つの有用な方法は、サイズに基づいて細胞を濃縮し、ＣＴＣについて濃縮された細胞集団をもたらすことである。この細胞集団は、その後、さらに処理または分析に供され得る。ＣＴＣの濃縮の他の方法はまた、本発明を用いて可能である。ＣＴＣを濃縮、計数、および分析するためのデバイスおよび方法を以下に記載する。
【０１７７】
デバイス
一般に、デバイスは、ＣＴＣおよび流体の他の成分の側方変位を許容する障害物の１つ以上のアレイを含み、それにより、このような成分を濃縮する、または処理する機構を提供する。本目的のために障害物を利用する、本発明のデバイスとは異なるが、本発明のデバイスと類似する先行技術のデバイスは、例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４，９８７−９９０（２００４）および米国公開第２００４０１４４６５１号に記載される。サイズにより粒子を分離するための本発明のデバイスは、一般に、ギャップネットワークのアレイを利用し、ギャップを通過する流体は、ギャップが、寸法において同一であり得るとしても、後続のギャップに不均等に分割される。該方法は、ギャップのアレイを通って分離される細胞を担持する流動を使用する。流動は、アレイの見通し線に関して、小角（流動角度）で整列配置される。臨界サイズより大きい流体力学的サイズを有する細胞は、アレイを通って見通し線に沿って、すなわち、側面に沿って、移動するが、臨界サイズより小さい流体力学的サイズを有するものは、平均流動方向をたどる。デバイスの流動は、層流条件下で発生する。本発明のデバイスは、任意に、連続流動デバイスとして構成される。
【０１７８】
臨界サイズは、いくつかの設計パラメータの関数である。図１Ａ〜１Ｃの障害物アレイに関して、障害物のそれぞれの列は、前列に関してΔλだけ水平に移動され、λは、障害物間の中心間の距離である（図１Ａ）。パラメータΔλ／λ（「分岐比」、ε）は、次の障害物の左に分岐される流動の比を決定する。図１Ａ〜１Ｃにおいて、εは、説明の便宜のために１／３である。一般に、２つの障害物間のギャップを通る流束は、φであり、副流束は、εφであり、主流束は、（１−ε）φである（図２）。この例では、ギャップを通る流束は、基本的に３分割される（図１Ｂ）。ギャップを通る３つの流束のそれぞれは、障害物のアレイ周辺でジグザグに進みつつ、それぞれの流束の平均方向は、全体的な流動方向にある。図１Ｃは、アレイを通って臨界サイズを超える大きさである粒子の動きを例示する。このような粒子は、主流束と共に移動し、それぞれのギャップを通過する主流束に連続して移される。
【０１７９】
図２を参照すると、臨界サイズは、約２Ｒ臨界であり、Ｒ臨界は、停留した流動線と障害物との間の距離である。例えば、細胞等の粒子の質量中心が、Ｒ臨界の外側に入る場合、粒子は、主流束に従って、アレイを通って側面に移動する。Ｒ臨界は、ギャップを横断する流動プロファイルが公知である場合（図３）、決定され得、副流速を形成する流体の層の厚みである。既定のギャップサイズｄに対して、Ｒ臨界は、分岐比εに基づいて調整され得る。一般に、εが小さくなるほど、Ｒ臨界が小さくなる。
【０１８０】
側方変位のアレイにおいて、異なる形状の粒子は、異なるサイズを有するように挙動する（図４）。例えば、リンパ球は、直径約５μｍの球であり、赤血球は、直径約７μｍであり、厚み約１．５μｍの両凹面の円盤形である。赤血球の長軸（直径）は、リンパ球の長軸よりも大きいが、短軸（厚さ）はより小さい。赤血球が、流れによって障害物のアレイを通り抜ける際、流れに対してそれらの長軸を整列配置する場合、それらの流体力学的サイズは、有効にそれらの厚さ（約１．５μｍ）であり、それは、リンパ球よりも小さい。赤血球が流体力学的流れによって障害物のアレイを通り抜ける際、流れに対してその長軸を整列配置し、有効にリンパ球よりも「小さい」約１．５μｍ幅の粒子のように挙動する傾向がある。したがって、方法およびデバイスは、細胞体積が同一であり得るが、それらの形状により細胞を分離し得る。加えて、異なる変形能を有する粒子は、異なるサイズを有するように振る舞う（図５）。例えば、同一の変形されていない形状を有する２つの粒子は、より大きな変形能を有する細胞がアレイにおいて障害物と接触したときに変形し、形状を変化させ得るので、側方変位によって分離され得る。したがって、デバイス中での分離は、粒子の物理的寸法、形状、および変形能を含む流体力学的サイズに影響を及ぼす任意のパラメータに基づいて達成され得る。
【０１８１】
図６を参照にすると、図式的に示されるように、アレイの上部から異なる流体力学的サイズの粒子（例えば、細胞等）の混合物を供給し、下部で粒子を回収することにより、２つの産出物である、臨界サイズ、２Ｒ臨界よりも大きい細胞を含む産物および臨界サイズよりも小さい細胞を含む廃棄物を生成する。図６において「廃棄物」と標識されるが、臨界サイズ未満の粒子は、臨界サイズを超える粒子が廃棄される一方、回収され得る。産出部の双方の型はまた、望ましくは、例えば、２つ以上のサブサンプルにサンプルを分画する際、回収され得る。ギャップサイズよりも大きい細胞は、アレイ内部で捕捉される。したがって、アレイは、実用的なサイズ範囲を有する。細胞は、カットオフサイズ（２Ｒ臨界）よりも大きく、主流束に誘導され得る、最大パススルーサイズ（アレイギャップサイズ）よりも小さくなければならない。アレイの「サイズ範囲」は、カットオフサイズに対する最大パススルーサイズの比として定義される。
【０１８２】
場合によっては、障害物間のギャップは、１５ミクロン超、２０ミクロン超、または６０ミクロン未満の大きさである。他の場合では、該ギャップは、２０ミクロンから１００ミクロンの間の大きさである。
【０１８３】
ある実施形態において、本発明のデバイスは、例えば、上皮性起源の細胞（例えば、腫瘍細胞等）等の特定の細胞型に選択的に結合する、例えば、モノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体またはそのフラグメント等の結合部分を含む、障害物を含み得る。デバイスの障害物のすべては、これらの結合部分を含み得る、あるいは、障害物のサブセットのみ、それらを含む。デバイスはまた、例えば、細胞計数モジュールまたは検出モジュール等の流体的に結合される追加モジュールも含み得る。例えば、該検出モジュールは、デバイスの出力サンプルを可視化するように構成され得る。加えて、本発明のデバイスは、一方向に選択されたサイズ範囲において細胞、および第２の方向に他の細胞を誘導するように構成され得る。例えば、該デバイスは、サンプルにおいて、より小さい細胞から１２ミクロン、１４ミクロン、１６ミクロン、１８ミクロン、または２０ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を濃縮するように構成され得る。代替として、該デバイスは、他の細胞か
ら、例えば、８ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞等の６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る。該デバイスはまた、１０ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞から、５ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る；代替として、８ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞から、４ミクロン以上８ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る。一般に、該デバイスは、細胞の２つの群に分離するように構成され得、ここでは、第１群が、第２群よりも大きい平均流体力学的サイズを有する。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本発明のデバイスは、１時間当たり２０ｍＬ超の流体、または１時間当たり５０ｍＬ超の流体さえ処理し得る。
【０１８５】
上に記載されるように、本発明のデバイスは、概して、ギャップネットワークを形成する障害物のアレイを含む。例えば、このようなデバイスは、例えば、それぞれの連続する列が、前列の周期の半分未満だけ偏移されるように、障害物の互い違いに配置された二次元アレイを含み得る。該デバイスはまた、任意に、第１のアレイとは異なる方法に配向される、障害物の第２の互い違いに配置された二次元アレイも含み得る。この場合、第１のアレイは、第２のアレイの上流に位置し得、第２のアレイは、第１のアレイよりも高い密度を有し得る。多重アレイは、それぞれの追加アレイが、追加アレイの任意のアレイ上流と同等またはそれより高い密度を有するように、この方法において構成され得る。
【０１８６】
本発明のデバイスは、対象における移植に適合され得る。例えば、このようなデバイスは、血液サンプルを処理することができるように、対象の循環器系内または近傍における配置に適合され得る。このようなデバイスは、例えば、管組織または動静脈シャントを通って対象の循環器系に対して流体的に結合される本発明の移植可能なシステムの一部であり得る。場合によっては、例えば、使い捨て可能なシステム等の移植可能なデバイスを含む本発明のシステムは、循環器系からの１つ以上の検体、成分、または物質を除去することができる。これらのシステムは、デバイスを通る連続的な血流に適合され得る。
【０１８７】
サンプル移動デバイス
本発明は、例えば、サンプル移動を利用する、ＣＴＣの濃縮等の細胞濃縮のためのデバイスをさらに包含する。サンプル移動デバイスは、例えば、デバイスの障害物等の特徴と関連して、細胞、または流体サンプルの他の成分の動きを引き起こす。例えば、本発明の一デバイスは、細胞サンプルを保持することができる容器、関心対象となる細胞を選択的に捕捉する１つ以上の捕捉部分を含む官能化されたふた表面を含む容器内に収まるように構成される着脱可能に取り付けられたふた、および容器あるいはふたのいずれかに接続されるサンプルモビライザーを含む。任意に、該容器は、第２の細胞型を選択的に捕捉する１つ以上の捕捉部分を含む官能化された表面を有する。ふた表面は、例えば、正方形、長方形、または円形等のいかなる形状も有し得る。デバイスは、例えば、ガラス、シリコン、またはプラスチック等の当技術分野において公知の任意の材料を用いて製造され得る。場合によっては、該ふた表面または容器表面は、例えば、マイクロ障害物、マイクロコルゲーション、マイクログルーブ、またはマイクロフィン等のマイクロ構造を含む。捕捉部分は、特定の細胞型に特異的に結合する１つ以上の抗体を含み得、これらの抗体は、アレイにおいて構成され得る。本発明の他のデバイスと同様に、抗体は、例えば、白血球または上皮細胞等の多種多様な細胞のいずれかに特異的に結合し得る。好ましくは、抗体は、ＣＴＣに特異的に結合することができる。さらに、抗体は、例えば、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチン８、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、および白血球関連受容体（ＬＡＲ）等の細胞表面癌マーカー、または表１から選択されるマーカーに特異的に結合し得る。場合によっては、サンプル移動デバイスのふたは、容器の壁に対して非直交角度で容器に収まるように設計され得る。該容器は、例えば、１０ｍＬまたは５０ｍＬ等の任意の望ましい量のサンプルを保持するように設計され得る。
【０１８８】
【表１−１】
2008538282.tif 000001
【０１８９】
【表１−２】
2008538282.tif 000002
【０１９０】
【表１−３】
2008538282.tif 000003
【０１９１】
【表１−４】
2008538282.tif 000004
【０１９２】
【表１−５】
2008538282.tif 000005
【０１９３】
【表１−６】
2008538282.tif 000006
【０１９４】
【表１−７】
2008538282.tif 000007
【０１９５】
【表１−８】
2008538282.tif 000008
【０１９６】
【表１−９】
2008538282.tif 000009
任意のサンプル移動成分を該デバイスに使用し得る。例えば、サンプルモビライザーは、機械的振動の発生デバイスまたは超音波発生デバイスを含み得る。代替として、それは、遠心力を容器およびふたに提供するように適合され得る。遠心サンプルモビライザーを使用して、例えば、遊離表面を有する流体サンプル等の流体サンプル内で、例えば、細胞等のサンプル成分を移動し得る。また、遠心サンプルモビライザーを使用して、ふた表面に沿って回転する細胞を促進し得る。一例において、遠心サンプルモビライザーは、容器を回転する回転軸を含み得、いくつかの実施形態において、デバイスを動作することによって発生する遠心力は、車軸に対して非直交角度にふたを駆動することができる。
【０１９７】
該デバイスに使用され得る別のサンプル移動成分は、２つの流体的に結合されるチャンバーを利用し、それらのそれぞれは、容器の内部空間と接触する表面を有する。圧力駆動流体流動を利用する、このようなデバイスにおいて、それぞれのチャンバーは、例えば、空気等の流体で充填され、１つのチャンバーが圧縮される際、その中で流体の一部が他のチャンバーに進入し、その体積を増加させる。容器中で細胞サンプルと接触してこれらのチャンバーを配置し、例えば、交互にチャンバーを圧搾する等、それらの体積を変更することによって、サンプルを動かす。
【０１９８】
本発明のデバイスの使用
本発明は、サイズにより、ＣＴＣ、ならびに細菌、ウイルス、菌類、細胞、細胞成分、ウイルス、核酸、タンパク質、およびタンパク質複合体を含む、他の粒子の濃縮のための改善されたデバイスを特徴とする。デバイスを使用し、サンプルの粒子上の様々な操作を遂行することができる。このような操作は、サイズベースの分画、または粒子自体の改変、または粒子を担持している流体を含む、粒子の濃縮または濃縮を含む。好ましくは、デバイスを利用して、不均質な混合物からＣＴＣまたは他の希少粒子を濃縮する、または例えば、懸濁液中の液体を交換する、もしくは粒子を試薬と接触させることによって希少粒子を変える。このようなデバイスは、例えば、細胞の機械的溶解または細胞内活性化の減少等の細胞に対する限られたストレスで高度な濃縮を可能にする。
【０１９９】
アレイ設計
単段式アレイ  一実施形態において、単段は、例えば、円柱状の障害物等の障害物のアレイを含み（図１Ｄ）、ギャップネットワークを形成する。ある実施形態において、アレイは、例えば、血液サンプル中の他の細胞からＣＴＣを濃縮する際、カットオフサイズよりも数倍大きい、最大パススルーサイズを有する。この結果は、大きなギャップサイズｄおよび小さい分岐比εの組み合わせを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、εは、多くても１／２（例えば、多くても１／３、１／１０、１／３０、１／１００、１／３００、または１／１０００）である。このような実施形態において、障害物の形状は、例えば、ギャップを通って流れる流体が、障害物の周辺に不均一に分布されるように、ギャップにおいて流動プロファイルに影響を及ぼし得るが、障害物は、流動方向に圧縮され、アレイを短くし得る（図１Ｅ）。単段アレイは、本明細書に記載されるように、バイパスチャネルを含み得る。
【０２００】
多段アレイ  別の実施形態において、多段を利用し、広範なサイズ範囲にわたって粒子を濃縮する。例示的なデバイスを図７に示す。示されるデバイスは、３段を有するが、段数はいくらでも利用してもよい。概して、第１段階のカットオフサイズは、第２段階のカットオフよりも大きく、第１段のカットオフサイズは、第２段の最大パススルーサイズよりも小さい（図８）。同一のことは、以下の段にとっても真である。第１段は、障害物が第２段に到達する前に、例えば、第２段において詰まりを生じる粒子を偏向させる（および除去する）。同様に、第２段は、障害物が第３段に到達する前に、第３段において詰まりを生じる粒子を偏向させる（および除去する）。一般に、アレイは、直列または並列に接続される、所望に応じた数の段を有し得る。
【０２０１】
記載されるように、多段アレイにおいて、例えば、下流に詰まりを生じ得る細胞等の大きな粒子は、まず、偏向され、これらの偏向された粒子は、詰まりを避けるために下流段を回避する必要がある。したがって、本発明のデバイスは、アレイから出力を除去するバイパスチャネルを含み得る。臨界サイズを超える粒子を除去するという意味で、本明細書に記載されるが、バイパスチャネルはまた、アレイのいかなる部分からも出力を除去するために利用され得る。
【０２０２】
バイパスチャネルに対する異なる設計は以下の通りである。
【０２０３】
単一バイパスチャネル。この設計において、すべての段は、１つのバイパスチャネルを共有する、または１つの段のみがある。バイパスチャネルの物理的境界は、一方のアレイ境界および他方の側壁によって規定され得る（図９〜１１）。単一バイパスチャネルはまた、二重アレイと共に利用され得る（図１２）。
【０２０４】
単一バイパスチャネルはまた、アレイと連結して、デバイスを通って一定流量を維持するように設計され得る（図１３）。バイパスチャネルは、チャネルにおける流動が、アレイの流動を妨害しないように、すべての段を通って一定流量を維持するように設計された、変動する幅を有する。このような設計はまた、二重アレイと共に利用され得る（図１４）。単一バイパスチャネルはまた、アレイと連結して、すべての段を通って一定流体抵抗を実質的に維持するように設計され得る（図１５）。このような設計はまた、二重アレイと共に利用され得る（図１６）。
【０２０５】
多重バイパスチャネル。この設計（図１７）において、それぞれの段は、それ自身のバイパスチャネルを有し、該チャネルは、側壁によって互いに分離される。例えば、細胞等の大きな粒子は、第１段階の右下角に向かって、主流束内へと偏向され、その後、バイパスチャネル（図１７のバイパスチャネル１）内へと偏向される。第２段において詰まりを
生じないより小さい細胞は、第２段に進み、第２段の臨界サイズを超える細胞は、第２段の右下角に向かって、別のバイパスチャネル（図１７のバイパスチャネル２）内へと偏向される。この設計は、所望に応じた数の段に対して繰り返され得る。本実施形態において、バイパスチャネルは、流体的に接続されず、多重分画の回収または他の操作を可能にする。バイパスチャネルは、まっすぐである、または互いに物理的に平行である必要はない（図１８）。多重バイパスチャネルはまた、二重アレイと共に利用され得る（図１９）。
【０２０６】
多重バイパスチャネルは、アレイと連結して、デバイスを通って一定流量を維持するように設計され得る（図２０）。本実施例において、バイパスチャネルは、アレイの流動が不安定でない、すなわち、実質的に一定であるため、流動の量を除去するように設計される。このような設計はまた、二重アレイと共に利用され得る（図２１）。この設計において、中心バイパスチャネルは、二重部分において２つのアレイ間で共有され得る。
【０２０７】
最適境界設計  アレイが非常に大きい場合、流動分布は、それぞれのギャップで同一である。ギャップを通過する流束φは、同一であり、副流束は、すべてのギャップに対してεφである。実際には、アレイの境界は、この無限流動パターンを混乱させる。アレイの境界部分は、無限アレイの流動パターンを生成するように設計され得る。境界は、流動供給（すなわち、境界が、流体をアレイに注入する）、または流動抽出（すなわち、境界が、流体をアレイから抽出する）であり得る。
【０２０８】
好ましい流動抽出境界は、境界（ｄ＝２４μｍ、ε＝１／６０）で、それぞれのギャップからεφ（図２２の矢印により示される）を抽出するために、徐々に拡大する。例えば、アレイと側壁との間の距離は、それぞれのギャップから境界までのεφの追加を可能にさせるために徐々に増加する。本アレイ内部の流動パターンは、境界設計のため、バイパスチャネルの影響を受けない。
【０２０９】
好ましい流動供給境界は、境界（ｄ＝２４μｍ、ε＝１／６０）で、それぞれのギャップにεφ（図２３の矢印により示される）を正確に供給するために、徐々に狭くなる。例えば、アレイと側壁との間の距離は、境界からそれぞれのギャップまでのεφの除去を可能にさせるために徐々に減少する。また、本アレイ内部の流動パターンは、境界設計のため、バイパスチャネルの影響を受けない。
【０２１０】
流動供給境界はまた、アレイのギャップと同じ幅またはより広い幅であり得る（図２４）（ｄ＝２４μｍ、ε＝１／６０）。境界が、例えば、粒子の回収を可能にするために、バイパスチャネルとしての役割を果たす場合、広い境界が望ましい場合がある。アレイを供給するためにその全流動の部分を使用し、境界（図２４の矢印により示される）でそれぞれのギャップにεφを供給する境界を利用してもよい。
【０２１１】
図２５は、二重アレイ（ε＝１／１０、ｄ＝８μｍ）の単一バイパスチャネルを示す。バイパスチャネルは、２つの流動供給境界を含む。バイパスチャネルの破線１を横断する流束は、Фバイパスである。流動oは、ギャップから破線の左にФバイパスを接合する。境界で障害物の形状は、アレイを通過する流動が、境界でそれぞれのギャップでεφであるように、調整される。破線２で流束は、再度、Фバイパスである。
【０２１２】
場合によっては、本発明のアレイは、障害物の複数の列を含み得、それぞれの連続する列は、前列の周期の半分未満だけ偏移され、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の障害物間のギャップはそれぞれ、第１の長さパラメータにほぼ等しい長さを有し、せいぜい５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％のそれぞれ、障害物間のギャップはそれぞれ、第１の長さパラメータよりも短い第２の長さパラメータにほぼ等しい長さを有する。第２の長さパラメータにほぼ等しい
長さを有するギャップは、均一に、あるいは不均一に、アレイを通して分布し得る。第２の長さパラメータは、細胞サンプルから既定のサイズよりも大きい関心対象となる細胞を捕捉するようにサイジングされ得る。第１の長さパラメータは、第２の長さパラメータよりも、例えば、１．１、１．５、２、３、５、１０、２０、５０、または１００倍長い。第１の長さパラメータに対する例示的な距離は、３０ミクロンから１００ミクロンのの範囲であり、第２の長さパラメータについての例示的な距離は、１０ミクロンから５０ミクロンの範囲である。
【０２１３】
任意に、本発明のアレイのそれぞれの障害物は、ほぼ同一のサイズを有する、あるいは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の障害物は、ほぼ同一のサイズを有する。場合によっては、それぞれの列において、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の障害物間のギャップはそれぞれ、第１の長さパラメータにほぼ等しい長さを有し、それぞれの列において、最高５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％のそれぞれの障害物間のギャップはそれぞれ、第２の長さパラメータにほぼ等しい長さを有し、それは、第１の長さパラメータよりも短い場合がある。
【０２１４】
一部のアレイにおいて、例えば、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％等の障害物のサブセットは、それらの列において、残りの障害物の中心で整列しない。整列しない障害物は、均一に、あるいは不均一に、アレイを通して分布され得る。
【０２１５】
本発明のアレイは、異なる断面を有する障害物を有し得、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の障害物はそれぞれ、第１のエリアパラメータにほぼ等しい断面積を有し得、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％のそれぞれの障害物はそれぞれ、第２のエリアパラメータにほぼ等しい断面積を有し得る。任意に、第２のエリアパラメータは、第１のエリアパラメータよりも大きい。加えて、第１のエリアパラメータまたは第２のエリアパラメータにほぼ等しい断面積を有する少なくとも１つの障害物は、非対称断面を有し得る。
【０２１６】
本発明のアレイはまた、サブアレイのそれぞれが、そのサブアレイにおいて２つの障害物間でギャップを含み、該アレイが、いずれかのサブアレイにおいて２つの障害物間でのギャップよりも小さい制限されたギャップを含む第１のサブアレイと第２のサブアレイとの間の接合部分を含むような、障害物の第１のサブアレイおよび障害物の第２のサブアレイも含み得る。サブアレイは、二次元構造で配列され得、さらに、それらは、周期的に、あるいは均一に、交互にされ得る。それぞれのサブアレイは、例えば、２から２００、３から５０、または６から２０等の任意の数の障害物を含み得る。サブアレイの障害物の例示的な直径は、例えば、２５ミクロンから２００ミクロンの範囲である。一般に、本発明のアレイにおいて、２つの障害物間のギャップは、例えば、少なくとも２０、４０、６０、８０、または１００ミクロンであり得、上に記載される制限されたギャップの場合には、このギャップは、例えば、せいぜい１００、８０、６０、４０、または２０ミクロンであり得る。他のギャップの長さも可能である。
【０２１７】
本発明のアレイは、例えば、プラスチック等の基盤に結合され得、マイクロ流体のギャップを含み得る。アレイは、例えば、関心対象となる細胞に選択的に結合する、本明細書に記載される結合部分等の１つ以上の結合部分にさらに結合され得る。アレイはまた、例えば、透明カバーに結合される容器等の容器内部であり得る。
【０２１８】
別の実施形態において、障害物の二次元アレイは、障害物のアレイが、デバイスを通って流体の流路を作成する表面上に分布された複数の列を含むような、ギャップネットワークを形成し、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９
％の流路のそれぞれは、第１の幅パラメータにほぼ等しい幅を有し、せいぜい５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％のそれぞれ、流路のそれぞれは、第２のより小さい幅パラメータにほぼ等しい幅を有する。このようなアレイを使用して、例えば、流体サンプルから検体を濃縮し得る。第２の幅パラメータにほぼ等しい幅を有する流路のそれぞれは、均一に、あるいは不均一に、デバイスを通して分布され得、第２の幅パラメータは、ほぼ第２の幅パラメータである流路内に所望の検体を捕捉するためにサイジングされ得る。任意に、アレイは、入口および出口を含む。任意に、アレイにおいて、出口周辺の第２の幅に等しい、またはより小さい流路幅を有する障害物の領域は、出口を含む。このようなデバイスは、例えば、第２の幅の流路の割合は、デバイスを通って流体の流動の方向に増加するような、直列に流体的に接続される３つの二次元アレイを有し得る。
【０２１９】
アレイは、本発明のデバイスを形成する他の要素に結合され得る。例えば、アレイは、本明細書に記載されるサンプル容器、検出器、または他の要素もしくはモジュールに流体的に結合され得る。アレイはまた、追加の要素またはモジュールを必要としないデバイスとして機能し得る。加えて、本発明のアレイは、二次元アレイであり得る、またはそれらは、別の形状を採用してもよい。
【０２２０】
本明細書に記載されるアレイのいずれかを、本発明のデバイスまたは方法のいずれかと共に使用することができる。
【０２２１】
デバイス設計
流動を画定および安定化するためのチップ上の流動抵抗器
本発明のデバイスはまた、アレイ内で流動を画定し、安定化する流体抵抗器を利用し得、また、アレイから回収された流動も画定し得る。図２６は、平面デバイスの概略図を示し、例えば、ＣＴＣを含む血液等のサンプル、入口チャネル、緩衝液入口チャネル、廃棄物出口チャネル、および産物出口チャネルはそれぞれ、アレイに接続される。入口および出口は、流動抵抗器としての役割を果たす。図２６はまた、これらの異なるデバイスの構成要素の対応する流体耐性を示す。
【０２２２】
アレイ内の流動画定
図２７および２８は、デバイスが、一定の深さを有し、既定の圧力低下を伴い操作される際、アレイ内で流れるサンプルおよび緩衝液の流れおよび対応する幅を示す。流動は、抵抗によって分割される圧力低下によって決定される。この特定のデバイスにおいて、Ｉ血液およびＩ緩衝液は、等価であり、これは、アレイにおいて、血液および緩衝の流れの等価幅を決定する。
【０２２３】
回収分画の画定
産物および廃棄物出口チャネルの相対抵抗を制御することによって、それぞれの分画に対する回収許容差を調整し得る。例えば、概略図のこの特定の組みにおいて、Ｒ産物が、Ｒ廃棄物を超える場合、さらに濃縮された産物分画は、廃棄物分画への損失および廃棄物分画への希釈を潜在的に増加させ得る。逆に、Ｒ産物が、Ｒ廃棄物よりも少ない場合、さらに希釈し、より高い収率の産物分画は、廃棄物の流れから潜在的に夾雑して回収され得る。
【０２２４】
多重アレイ
本発明は、多重アレイを特徴とする。１台のデバイス上に多重アレイを設置することは、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞のサンプル処理スループットを増加させ、異なる分画または操作に対する複数のサンプルまたはサンプルの一部の並列処理を可能にする。多重化は、調製デバイスにとってはさらに望ましい。最も簡素な多重デバイスは、直列、
すなわち、カスケードに取り付けられた２台のデバイスを含む。例えば、１台のデバイスの主流束からの出力は、第２のデバイスの入口に連結され得る。代替として、１台のデバイスの副流束からの出力は、第２のデバイスの入口に連結され得る。
【０２２５】
二重  ２つのアレイは、例えば、鏡像等として並列に配置され得る（図２９）。このような配列において、２つのアレイの臨界サイズは、同一である、または異なっていてもよい。さらに、アレイは、主流束が、２つのアレイの境界、それぞれのアレイの端、またはそれらの組み合わせに流れるように、配列され得る。このような多重アレイはまた、例えば、臨界サイズを超える粒子を回収する、または例えば、緩衝液交換、反応、または標識化等を通してサンプルを改変するために、アレイ間で配置される中央領域を含むこともできる。
【０２２６】
デバイス上の多重化  二重を形成することに加えて、別々の入口を有する２つ以上のアレイを、同一のデバイス上に配置してもよい（図３０Ａ）。このような配列は、多重サンプルに利用され得る、または複数のアレイを、同一のサンプルの並列処理に対して同一の入口に接続してもよい。同一のサンプルの並列処理において、出口は、流体的に接続され得る、または接続され得ない。例えば、複数のアレイが、同一の臨界サイズを有する場合、出口は、高スループットのサンプル処理に対して接続され得る。別の例において、アレイはすべて、同一の臨界サイズを有し得ない、またはアレイにおいて粒子はすべて、同一方法において処理され得ない、そして、出口は、流体的に接続され得ない。
【０２２７】
多重化はまた、単一デバイス上に複数の二重アレイを設置することによっても達成され得る（図３０Ｂ）。複数のアレイ（二重または単一）は、互いに任意の考えられる三次元関係に設置され得る。
【０２２８】
本発明のデバイスはまた、小さな設置面積を特徴とする。アレイの設置面積を削減することは、コストをさらに低減し、任意の潜在的な機械的損傷または粒子への他の効果をなくす障害物の衝突の数をも減らし得る。多段アレイの長さは、段の間の境界が、流動の方向に対して垂直でない場合、削減され得る。長さの削減は、段の数が増加する際、重要になる。図３１は、小さな設置面積の３段のアレイを示す。
【０２２９】
追加の要素
ギャップのアレイに加えて、本発明のデバイスは、例えば、ＣＴＣの単離、濃縮、回収、操作、または検出等の追加の要素またはモジュールを含み得る。このような要素は、当技術分野において公知である。例えば、デバイスは、サンプルまたは緩衝液入力のための１つ以上の入口、およびサンプル出力のための１つ以上の出口を含み得る。アレイはまた、濃縮の他の型、または親和性、磁気、電気泳動、遠心分離、および誘電泳動濃縮を含む他の操作に対する、要素を有するデバイス上で利用され得る。本発明のデバイスはまた、例えば、ウェルのアレイまたは平板表面等のデバイスからの出力の二次元画像のための要素と共に利用され得る。好ましくは、本明細書に記載されるように、ギャップのアレイは、親和性濃縮と共に利用される。
【０２３０】
一例において、検出モジュールは、本発明の分離または濃縮デバイスに流体的に結合される。検出モジュールは、本明細書に開示される任意の検出の方法、または当技術分野において公知の他の方法を用いて操作し得る。検出モジュールは、例えば、顕微鏡、細胞計数器、磁石、バイオキャビティレーザー（例えば、Ｇｏｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３６：Ｒ２２８−Ｒ２３９（２００３）を参照されたい）、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリクス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトル結像システム（例えば、Ｖｏ−Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＥＥＥ  Ｅｎｇ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｇ．２３：４０−４９（２００４）を参照
されたい）を含む。一実施形態において、コンピュータ端末は、検出モジュールに接続され得る。例えば、検出モジュールは、関心対象となる細胞に選択的に結合する標識を検出し得る。
【０２３１】
別の例において、捕捉モジュールは、本発明の分離または濃縮デバイスに流体的に結合される。例えば、捕捉モジュールは、例えば、癌細胞または他の稀な細胞等の特定の細胞型を選択的に結合する１つ以上の結合部分を含む。障害物のアレイを含む捕捉モジュールの実施形態において、障害物は、このような結合部分を含み得る。
【０２３２】
さらに、例えば、コールターカウンター等の細胞計数モジュールは、本発明の分離または濃縮デバイスに流体的に結合され得る。代替として、例えば、プログラム可能な加熱デバイス等の他のモジュールは、流体的に結合され得る。
【０２３３】
本発明の方法を、同一のデバイス、あるいは異なるデバイスにおいて、任意の濃縮または分析デバイスとも関連して利用し得る。例としては、親和性カラム、粒子分類デバイス（例えば、蛍光活性化細胞分類器）、キャピラリー電気泳動、顕微鏡、分光光度計、サンプル保存デバイス、およびサンプル調製デバイスが挙げられる。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるシステムに関連して特定の関心対象を示す。
【０２３４】
例示的な分析デバイスは、サイズ、形状、または変形能ベースの粒子の濃縮に有用なデバイスを含み、それには、フィルター、ふるい、ならびに、例えば、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号および第ＷＯ  ２００４／１１３８７７号、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：９８７−９９（２００４）、米国公開第２００４／０１４４６５１号、米国特許第５，８３７，１１５号および第６，６９２，９５２号、および米国出願第６０／７０３，８３３号、第６０／７０４，０６７号、および第１１／２２７，９０４号に記載されるもの等の濃縮または分離デバイス；例えば、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号および米国公開第２００５／０２６６４３３号に記載されるもの等の親和性捕捉に有用なデバイス；例えば、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号、米国特許第５，６４１，６２８号、および米国出願第６０／６６８，４１５号に記載されるもの等のサンプル中の細胞の優先的な溶解に有用なデバイス；例えば、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号、米国特許第６，６９２，９５２号、米国公開第２００４／０１６６５５５号、および米国出願第１１／１４６，５８１号に記載されるもの等の細胞を配列するのに有用なデバイス；ならびに、例えば、米国公開第２００５／０２８２２９３号および米国出願第１１／２２７，４６９号に記載されるもの等の流体送達に有用なデバイスを含む。２つ以上のデバイスは、例えば、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号に記載されるように、直列に結合され得る。
【０２３５】
製造方法
本発明のデバイスは、当技術分野において周知である技術を用いて加工され得る。製造技術の選択は、デバイスに使用される材料およびアレイの大きさに依存する。本発明のデバイスを製造するための例示的な材料としては、ガラス、シリコン、鋼鉄、ニッケル、ポリマー（例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン）、シリコン類（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン））、ポリプロピレン、ｃｉｓ−ポリイソプレン（ゴム）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリ（酢酸ビニル）（ＰＶＡｃ）、ポリクロロプレン（ネオプレン）、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ポリ（塩化ビニリデン）（ＳａｒａｎＡ）、および環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、および環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。他の材料は、当技術分野において公知である。例えば、深反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）は、小さいギャップ、小さい障害物、および大きな縦横比（横方向寸法に対する障害物の高さの比）を有する、シリコンベー
スのデバイスを加工するために使用される。プラスチックデバイスの熱成形（エンボス加工、射出成形）はまた、例えば、最小側面特性が＞２０ミクロンであり、これらの特性の縦横比が≦１０である場合に使用し得る。追加の方法は、フォトリソグラフィー（例えば、ステレオリソグラフィーまたはｘ線フォトリソグラフィー）、成形、エンボス加工、シリコンマイクロマシニング、ウェットまたはドライケミカルエッチング、フライス加工、ダイヤモンド加工、リソグラフィー電鋳と成型（ＬＩＧＡ；Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  ａｎｄ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）、および電気メッキを含む。例えば、ガラスのために、従来のフォトリソグラフィーのシリコン製造技術、次いで、ウェット（ＫＯＨ）またはドライエッチング（フッ素または他の反応性ガスを有する反応性イオンエッチング）を利用し得る。レーザーマイクロマシニング等の技術は、高光子吸収効率を有するプラスチック材料のために採用され得る。この技術は、製造過程の連続性質のため、低スループットの製造に適している。量産されたプラスチックデバイスのために、熱可塑性射出成形および圧縮成形が適している場合がある。コンパクトディスク（サブミクロンの特徴の忠実度を保持する）の大量加工に使用される従来の熱可塑性射出成形はまた、本発明のデバイスを加工するために利用され得る。例えば、デバイスの特徴は、従来のフォトリソグラフィーによってガラスマスター上に複製される。ガラスマスターは、堅い、耐熱衝撃性、熱伝導、堅型成形を産出するように電鋳される。この成形は、プラスチックデバイスに特徴を射出成形または圧縮成形するためのマスター鋳型としての役立つ。デバイスを加工するために使用されるプラスチック材料および最終産物の光学的品質およびスループットにおける要件に応じて、圧縮成形または射出成形が、製造の方法として選択され得る。圧縮成形（熱エンボス加工またはレリーフインプリンティングとも称される）は、高分子量ポリマーに適合する利点を有し、小さい構造に適し、高縦横比の構造を複製し得るが、より長いサイクル時間を有する。射出成形は、低縦横比の構造に効果があり、低分子量ポリマーに最も適している。
【０２３６】
デバイスは、その後、組み立てられる１つ以上の部品において加工され得る。デバイスの層は、表面群間のクランプ、接着剤、熱、陽極接合、または反応によって共に接合され得る（例えば、ウエハー接合）。代替として、１面以上のチャネルを有するデバイスは、例えば、ステレオリソグラフィーまたは他の三次元製造技術を用いて、単一の部品として加工され得る。
【０２３７】
チャネル壁に細胞または溶解細胞によって放出された化合物の非特異的吸着を低減するために、１つ以上のチャネル壁は、非接着または反発性であるように化学修飾され得る。壁は、ヒドロゲルを形成するために使用されるもの等の市販のノンスティック試薬の薄フィルム被覆（例えば、単層）で被覆され得る。チャネル壁を修飾するために使用され得る追加の化学種の例としては、オリゴエチレングリコール、フッ素化ポリマー、オルガノシラン、チオール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ムチン、ポリＨＥＭＡ、メタクリル酸ＰＥＧ、およびアガロースが挙げられる。荷電ポリマーはまた、逆帯電された種に抵抗するために利用され得る。反発力に使用される化学種の型およびチャネル壁への付着方法は、反発される種の性質、壁の性質、および付着される種に依存するであろう。このような表面修飾技術は、当技術分野において周知である。壁は、デバイスを組み立てる前または後に官能化され得る。チャネル壁はまた、例えば、膜断片またはタンパク質等のサンプルにおいて材料を捕捉するために被覆され得る。
【０２３８】
操作方法
本発明のデバイスは、臨界サイズを超える、または下回る粒子について濃縮されたサンプルの生成が望ましい、任意の適用において利用され得る。デバイスの好ましい使用は、ＣＴＣまたは他の希少細胞について濃縮されたサンプルを生成することである。濃縮サンプルが生成されると、分析のために回収される、または別の方法で操作され得る。
【０２３９】
本発明のデバイスは、例えば、粒子が接触し、互いに流体力学的に相互作用する、または別の粒子周辺で流動分布において効果を発揮する等、濃縮したサンプル中で利用され得る。例えば、該方法は、ヒトドナーからの全血において、他の細胞からのＣＴＣを濃縮し得る。ヒト血液は、概して、約４５容量％の細胞を含む。細胞は、アレイを通って流れる場合、流体力学的に互いに物理的接触および／または結合される。図３２は、細胞がアレイ内部で密に充填され、互いに物理的に相互に作用し得る概略図を示す。
【０２４０】
濃縮
一実施形態において、本発明のデバイスを利用して、所望の流体力学的サイズの粒子について濃縮されたサンプルを生成する。このような濃縮の適用は、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞を濃縮する、および例えば、サイズフィルタリング（特定のサイズ範囲の細胞を選択する）等のサイズ細分を含む。デバイスはまた、例えば、核等の細胞の成分を濃縮するために使用され得る。望ましくは、本発明の方法は、初期の混合物と比較して、所望の粒子の少なくとも５０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を保有しつつ、１つ以上の所望されない粒子と比較して、少なくとも１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、または１００，０００，０００倍で所望の粒子に潜在的に濃縮する。望ましくは、デバイスが、濃縮サンプルに加えて任意の出力サンプルを生成する場合、この追加の出力サンプルは、初期の混合物に対して、所望の粒子の５０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満を含む。濃縮はまた、サンプル中の他の粒子に対する濃縮された粒子の濃度が増加しているが、元のサンプルと比較して、濃縮された粒子の希釈をもたらし得る。好ましくは、該希釈は、せいぜい９０％（例えば、せいぜい７５％、５０％、３３％、２５％、１０％、または１％）である。
【０２４１】
好ましい実施形態において、デバイスは、例えば、細胞等の希少粒子について濃縮されるサンプルを生成する。一般に、希少粒子は、１０％未満のサンプルとして存在する粒子である。希少粒子としては、サンプルに応じて、希少細胞、例えば、ＣＴＣ、上皮細胞、胎児細胞、幹細胞（例えば、未分化）、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、トロホブラスト、癌細胞、免疫系細胞（宿主または移植）、結合組織細胞、細菌、菌類、および病原体（例えば、細菌または原生動物）が挙げられる。希少粒子はまた、ウイルス、ならびにオルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよび核）等の細胞成分も含む。希少粒子は、例えば、血液等の体液、または例えば、水サンプル中の病原体等の環境源を含む、サンプルから単離され得る。胎児赤血球は、発育中の胎児において、例えば、性別を決定する目的のために、ならび、例えば、突然変異等の異数性または遺伝的特性を同定する目的のために、母親の末梢血から濃縮され得る。上皮型および起源からなる、ＣＴＣはまた、治療および治療進行をモニタリングする目的のためにも、末梢血から濃縮され得る。循環する内皮細胞を、同様に、末梢血から濃縮され得る。体液または環境サンプルはまた、病原体（例えば、コリフォーム細菌）、敗血症、または細菌もしくはウイルス性髄膜炎等の血液による病気に対してスクリーニングされ得る。希少細胞はまた、例えば、移植器官からの細胞等の別の生物に存在するある生物からの細胞を含む。
【０２４２】
希少粒子の濃縮に加えて、本発明のデバイスは、調製適用のために利用され得る。例示的な調製適用は、血液からの細胞充填の生成を含む。本発明のデバイスは、血小板、赤血球、および白血球について濃縮された分画を生成するように構成され得る。多重デバイスまたは多段デバイスを用いることによって、すべての３つの細胞分画は、同一のサンプルから並列または直列に生成され得る。他の実施形態において、デバイスは、例えば、臍帯
血源等の無核細胞から有核細胞を分離するために利用され得る。
【０２４３】
本発明のデバイスを用いることは、濃縮される粒子が、損傷または他の劣化に影響を受けやすい状態において、有利である。本明細書に記載されるように、本発明のデバイスは、細胞と障害物との間で最小数の衝突を有する細胞を濃縮するように設計され得る。この最小化は、細胞への機械的損傷を低減し、また、衝突によって引き起こされる細胞の細胞内活性化を防ぐ。細胞のこの丁重な扱いは、サンプル中の限定された数の希少細胞を保存し、細胞内成分によって夾雑または劣化をもたらす細胞の破損を防ぎ、例えば、幹細胞または血小板等の細胞の突然変異または活性化を防ぐ。好ましい実施形態において、細胞は、３０％、１０％、５％、１％、０．１％、または０．０１％未満が活性化される、または機械的に溶解されるように、濃縮される。
【０２４４】
図３３Ａは、ヒト末梢血における細胞の典型的なサイズ分布を示す。白血球は、約４μｍから約１２μｍの範囲である一方、赤血球は、約１．５〜３μｍである（短軸）。図３３Ｂは、ＣＴＣの大部分が約８から約２２μｍの範囲である、ＣＴＣが、通常、血液細胞よりも著しく大きいことを示す。したがって、サイズカットオフが、例えば、１２μｍであるように選択される（図３３Ｃ）、本発明のデバイスを用いたサイズベースの濃縮は、他の血液細胞からＣＴＣを濃縮するのに有効であり得る。ＣＴＣに対して類似の分布を有するいかなる細胞集団も、同様に、血液細胞から濃縮され得る（図３３Ｄ）。
【０２４５】
代替的な実施形態において、細胞サンプルを、デバイスのサンプル入口を通して加え、緩衝媒体を流体入口を通して加える（図４２Ａ）。臨界サイズを下回る細胞は、偏向されずにデバイスを通って移動し、それらの元のサンプル媒体を含む端出口から流出する。臨界サイズを超える細胞（例えば、上皮細胞、特に、ＣＴＣ）は、偏向され、流体入口を通して加えた緩衝媒体を含む中央出口から流出する。したがって、デバイスの動作は、臨界サイズを超える、および下回る細胞について濃縮されたサンプルを生成する。上皮細胞は、血流中の最大細胞のうちの１つであるため、デバイスのギャップのサイズおよび形状は、事実上、すべての他の細胞型を端出口に誘導するために選択され得る一方、デバイスを通して単一通過後、上皮細胞内で実質的に濃縮されるサンプルを中央出口から生成する。
【０２４６】
本発明のデバイスは、本明細書に記載されるように、動作するために、図４２Ａに示されるように二重化する必要はない。図４２Ｂに示される図式化した説明は、二重デバイスあるいは単一アレイを示し得る。
【０２４７】
濃縮は、多数の方法において強化され得る。例えば、標的細胞を、イムノアフィニティービーズを用いて標識化し得、それにより、それらのサイズを増加させる（図４４に示されるように）。例えば、ＣＴＣ等の上皮細胞の場合は、これは、それらのサイズをさらに増加させ得、ひいては、さらになお有効な濃縮をもたらす。代替として、より小型細胞のサイズは、溶液中で最大の物体になる、または細胞サンプルの他の成分と比較して独自のサイズ範囲を占める程度まで、あるいは他の細胞と同時精製するように増加され得る。標識化された標的細胞の流体力学的サイズは、標識の非存在下でこのような細胞の流体力学的サイズよりも少なくとも１０％、１００％、または１，０００％を超え得る。ビーズは、ポリスチレン、磁気物質、または細胞に付着され得る任意の他の物質で作られ得る。望ましくは、このようなビーズは、本発明のデバイスを通って標識細胞の流動を中断しないように中立的に浮遊する。
【０２４８】
本発明の濃縮方法は、例えば、上皮細胞（例えば、ＣＴＣ）等の関心対象となる細胞を選択的に捕捉することが可能な障害物を含むデバイスを含む。
【０２４９】
本発明の方法はまた、例えば、上に記載の方法を用いて別の検体について濃縮されたサ
ンプルを生成することによって、細胞サンプルから検体を枯渇させる、または除去するために使用され得る。例えば、細胞サンプルは、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞に対して濃縮することによって、１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を枯渇させ得る。枯渇または除去の任意の方法は、本発明のアレイおよびデバイスと共に使用され得る。検体の枯渇または除去を特徴とする本発明の方法において、サンプル処理は、連続的であり得、生体内または生体外で生じ得る。さらに、いくつかの実施形態において、枯渇または除去し得る検体が、本発明のデバイスに貯留している場合、検体は、該デバイスに高張液を適用することによってデバイスから放出され得る。検体は、その後、デバイスから溶出液中に検出され得る。
【０２５０】
改変
他の実施形態において、濃縮に加えて、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞を、懸濁液中の粒子または流体を化学的または物理的に改変し得る改変試薬と接触させる。このような適用は、精製、緩衝液交換、標識化（例えば、免疫組織化学的、磁気的、および組織化学的標識化、細胞染色、流動ｉｎ−ｓｉｔｕ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、細胞固定、細胞安定化、細胞溶解、および細胞活性化を含む。
【０２５１】
このような方法は、異なる流体に、サンプルから、例えば、ＣＴＣ等の粒子の移動を可能にする。図３４Ａは、単段デバイスに対するこの効果を図式的に示し、図３４Ｂは、多段デバイスに対するこの効果を示し、図３４Ｃは、二重アレイに対するこの効果を示し、図３４Ｄは、多段二重アレイに対するこの効果を示す。このような方法を用いることによって、血液細胞を、血漿から分離し得る。一流体から別の流体への粒子のこのような移動はまた、例えば、チップ上のＷｒｉｇｈｔ染色血液等の一連の改変に影響を及ぼすように利用され得る。このような一連の改変は、粒子を第１の試薬と反応させ、その後、粒子を洗浄緩衝液に移動し、その後別の試薬に移動することを含み得る。
【０２５２】
図３５Ａ〜３５Ｃは、２つのバイパスチャネルを有する２段デバイスにおいて、改変のさらなる例を説明する。この例において、大型血液粒子を、血液から緩衝液に移動させ、第１段において回収し、媒体血液粒子を、第２段において、血液から緩衝液に移動させ、第１段および第２段において血液から移動されない小型血液粒子もまた、回収される。図３５Ｂは、２段のサイズカットオフを説明し、図３５Ｃは、回収された３つの分画のサイズ分を説明する。
【０２５３】
図３６は、アレイの側方端とチャネル壁との間に配置されるバイパスチャネルを有する２段デバイスにおいて改変の例を説明する。図３７は、２つの段が流体チャネルによって接続されることを除いては、図３６におけるデバイスと類似するデバイスを説明する。図３８は、小フットプリントで２段を有するデバイスにおける改変を説明する。図３９Ａ〜３９Ｂは、第１段および第２段からの出力が、単一チャネルにおいて捕捉されるデバイスにおける改変を説明する。図４０は、本発明の方法で用いる別のデバイスを説明する。
【０２５４】
図４１は、粒子上の多重の、連続的な改変を行なうデバイスの使用を説明する。このデバイスにおいて、血液粒子を、血液から粒子と反応させる試薬に移動し、反応させた粒子を、その後、緩衝液に移動し、それによって、未反応の試薬または反応副産物を除去する。追加ステップを加えてもよい。
【０２５５】
濃縮および改変はまた、例えば、所望の細胞を、溶解試薬と接触させ、細胞成分（例えば、核）を、サイズに基づいて濃縮する場合、組み合わせてもよい。別の例において、粒子を、該粒子に結合する、微粒子標識（例えば、磁気ビーズ）と接触させてもよい。非結合微粒子標識を、サイズに基づいて、除去してもよい。
【０２５６】
細胞に結合する標識試薬からの遊離標識試薬の分離
本発明のデバイスは、ＣＴＣまたは他の細胞に結合される標識試薬から遊離標識試薬を分離するために利用され得る。図４５に示されるように、標識試薬は、デバイスに導入する前に、細胞サンプルと一緒に事前に培養され得る。望ましくは、標識試薬は、例えば、ＣＴＣ等の上皮細胞のような関心対象となる細胞集団を特異的に、または優先的に結合する。例示的な標識試薬としては、抗体、量子ドット、ファージ、アプタマー、フルオロフォア含有分子、検出可能な化学反応を実行可能な酵素、または官能化ビーズが挙げられる。通常、標識試薬は、関心対象となる細胞、またはビーズに結合する関心対象となる細胞よりも小さく、したがって、標識試薬と混合する細胞サンプルをデバイスに導入する場合、遊離標識試薬は、偏向されないでデバイスを通って移動し、端出口から流出する一方、結合標識試薬は、上皮細胞と共に中央出口から流出する。有利に、本方法は、サイズ分離、および結合標識試薬から遊離標識試薬の分離を同時に達成する。さらに、以下に記載されるように、この分離方法は、放出ステップまたは分析の破壊的な方法を必要とせず、下流サンプル分析を容易にする。
【０２５７】
図４６は、濃縮された標識サンプルが、類似のサイズであるため、標的細胞と同時に分離する非標的細胞の集団を含む、さらに一般的なケースを示す。非標的細胞は、この試薬が、関心対象となる細胞に選択的に結合するため、結合標識試薬の検出に依存する下流サンプル分析を妨害しない。
【０２５８】
緩衝液交換
本発明のデバイスは、緩衝液交換のために利用され得る。この結果を達成するために、濃縮に使用されるプロトコルに類似するプロトコルは以下の通りである。細胞サンプルを、デバイスのサンプル入口を通して加え、所望の最終緩衝媒体を流体入口を通して加える。上に記載されるように、臨界サイズを超える細胞は、偏向され、緩衝液に流入する。
【０２５９】
濃縮
本発明のデバイスは、例えば、ＣＴＣを含むサンプルのような関心対象となる細胞サンプルを濃縮するために利用され得る。図４７に示されるように、細胞サンプルを、デバイスのサンプル入口に導入する。緩衝液の体積が、細胞サンプルの体積よりも有意に小さくなるように、流体入口に導入される緩衝液の体積を減少させることによって、より小さい体積において、標的細胞の濃縮をもたらす。この濃縮ステップは、行なわれるいかなる下流分析の結果も改善し得る。
【０２６０】
細胞溶解
本発明のデバイスは、細胞溶解のために利用され得る。これを達成するために、濃縮に使用されるプロトコルに類似するプロトコルは以下の通りである。細胞サンプルを、デバイスのサンプル入口を通して加え（図４８）、溶解緩衝液を、流体入口を通して加える。上に記載されるように、臨界サイズを超える細胞は、偏向され、溶解緩衝液に流入し、これらの細胞の溶解を生じる。結果として、中央出口から流出するサンプルは、オルガネラを含む溶解した細胞成分を含む一方、偏向されない全細胞は、他の出口から流出する。したがって、該デバイスは、標的細胞を選択的に溶解する方法を提供する。
【０２６１】
多段
本発明のデバイスは、濃縮および反応の多段を提供するように共に接合され得る。例えば、図４３Ａは、１台のデバイスの出口１が、第２のデバイスのサンプル入口に接合される、「カスケード」構成を示す。これは、第２のデバイスに導入されるサンプルが、関心対象となる細胞に対して既に濃縮されているように、第１のデバイスを用いて初期濃縮ステップを可能にする。２台のデバイスは、意図された適用に応じて、同一あるいは異なる臨界サイズを有し得る。
【０２６２】
図４９において、非標識細胞サンプルを、サンプル入口を介してカスケードにおいて、第１のデバイスに導入し、標識試薬を含む緩衝液を、流体入口を介して第１のデバイスに導入する。例えば、ＣＴＣ等の上皮細胞は、偏向され、標識試薬を含む緩衝液中で中央出口から流出する。その後、この濃縮された標識サンプルを、サンプル入口を介してカスケードにおいて、第２のデバイスに導入する一方、緩衝液を、流体入口を介して第２のデバイスに加える。標的細胞のさらなる濃縮および遊離標識試薬の分離は達成され、濃縮サンプルは、さらに分析され得る。代替として、標識試薬を、第２のデバイスに導入する前に、第１のデバイスの中央出口から流出するサンプルに直接加えてもよい。カスケード構成の使用は、図５５の単一デバイス構成よりも安価で、標識試薬のより少量またはより高濃度の使用を可能にし、加えて、生じ得るいかなる非特異的結合も、第１のデバイスを用いる初期濃縮ステップの存在によって有意に減少する。
【０２６３】
２台以上のデバイスの段の代替的な構成は、「バンドパス」構成である。図４３Ｂは、１台のデバイスのうちの出口２が、第２のデバイスのサンプル入口に接合する、本構成を示す。これは、第２のデバイスに導入されるサンプルが、第１のデバイス内に偏向されない状態で留まる細胞を含むように、第１のデバイスを用いて初期濃縮ステップを可能にする。本方法は、関心対象となる細胞が、サンプルにおいて最大の大きさの細胞ではない場合、有用であり得、この場合には、第１段は、中央出口にそれらを偏向させることによって、多数の大型非標的細胞を削減するために使用され得る。カスケード構成の場合、２台のデバイスは、意図された適用に応じて、同一あるいは異なる臨界サイズを有し得る。例えば、異なる臨界サイズは、より小さい内皮細胞の濃縮を必要とする適用と比較して、上皮細胞（例えば、ＣＴＣ）の濃縮を必要とする適用に適切である。
【０２６４】
図５１において、標識試薬を用いて事前に培養された細胞サンプルを、バンドパス構成の第１のデバイスのサンプル入口に導入し、緩衝液を、流体入口を介して第１のデバイスに導入する。第１のデバイスは、大型の、非標的細胞が、偏向され、中央出口から流出する一方、標的細胞、小型非標的細胞、および標識試薬の混合物が、第１のデバイスの出口２から流出する方法で配置される。この混合物を、その後、サンプル入口を介して第２のデバイスに導入する一方、緩衝液を、流体入口を介して第２のデバイスに加える。標的細胞の濃縮および遊離標識試薬の分離は達成され、濃縮サンプルは、さらに分析され得る。第１の段において偏向された細胞に対する標識試薬の非特異的結合は、偏向された細胞およびいずれの結合標識試薬もシステムから除去するため、本方法において受け入れ可能である。
【０２６５】
上に記載される多重デバイス構成のいずれかにおいて、デバイスおよびそれらに接合する接続部は、単一デバイスに組み込まれ得る。例えば、２つ以上の段を含む単一カスケードデバイスは、２つ以上の段を含む単一バンドパスデバイスである場合、可能である。
【０２６６】
下流分析
多くの診断に関するアッセイに対して有用なステップは、分析されるサンプルからの遊離標識試薬の除去である。上に記載されるように、本発明のデバイスは、例えば、ＣＴＣ等の細胞に結合する標識試薬から遊離標識試薬を分離することができる。その後、遊離標識試薬からのバックグラウンド干渉の有意なレベルがない標識サンプルのバルク測定を行なうことは可能である。例えば、ＥｐＣＡＭ等の特定の上皮細胞マーカーに対して選択的な蛍光抗体は、使用され得る。蛍光部分は、Ｃｙ染色、Ａｌｅｘａ染色、または他のフルオロフォア含有分子を含み得る。結果として得られた標識サンプルは、その後、蛍光光度計を用いて細胞を濃縮された結果として得られた標識サンプルの蛍光を測定することによって分析される。代替として、発色団含有標識は、例えば、紫外線または可視分光計等の分光計と共に使用され得る。得られた測定値は、サンプルにおいて多数の標的細胞または
すべての細胞を定量化するために使用され得る。代替として、例えば、内皮細胞に対する癌細胞の比等のサンプルにおける２つの細胞型の比が、決定され得る。この比は、それぞれの細胞型の数の比であり得る、または代替として、それぞれの細胞型の任意の測定特性の比であり得る。
【０２６７】
例えば、癌に関連する細胞表面マーカー（例えば、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＣＤ３４＋、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチン８、ＥＧＦＲ、および白血球関連受容体（ＬＡＲ））を有する細胞等の細胞を同定する任意の方法を使用し得る。例えば、ＣＴＣの濃縮サンプルを、濃縮サンプルの１つ以上の細胞に選択的に結合する１つ以上の結合部分を有する表面を含むデバイスと接触し得る。結合部分は、例えば、抗体またはそのフラグメント（例えば、モノクローナル）等のポリペプチドを含み得る。例えば、このようなモノクローナル抗体は、例えば、抗ヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ１（カタログ＃ＡＦ９６０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等のＥｐＣＡＭに対して特異的であり得る。
【０２６８】
多くの他の測定方法および標識試薬は、本発明の方法において有用である。例えば、ハイパースペクトル画像等のいかなる画像技術を、使用してもよい。標識抗体（例えば、任意の癌マーカー（例えば、表１に列挙されるもの等）に対して選択的な抗体）は、基質を開裂する共有結合酵素を所有し得、既定の波長でその吸光度を改変し、開裂の範囲は、その後、分光計で定量化される。比色分析または発光読み出しは、使用する基質に応じて、可能である。有利に、酵素標識の使用は、測定信号の有意な増幅を可能にし、検出感度の閾値を低下させる。
【０２６９】
例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ社からのＱｄｏｔｓ（登録商標）等の量子ドットはまた、標的抗体に共有結合する標識試薬として利用され得る。Ｑｄｏｔｓは、光退色に耐性を示し、二光子励起測定と共に使用され得る。
【０２７０】
本発明の方法において有用な他の考えられる標識試薬は、ファージである。ファージディスプレイは、結合ペプチドが、標的タンパク質（例えば、関心対象となる細胞の表面上に認められるもの）に対して強力な結合親和性を有する操作されたファージ株により提示される技術である。既定のファージに対応するペプチド配列は、そのファージの核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）においてコード化される。したがって、ファージは、それらが、ＣＴＣ等の上皮細胞と比較して小さく、したがって、容易に分離され得るという点において、有用な標識試薬であり、それらは、ＰＣＲまたは類似の技術を用いて分析および定量化され得る核酸をさらに担持し、濃縮された結合サンプルに存在する細胞数の定量的決定を可能にする。
【０２７１】
図５０は、２台のデバイスの段が、カスケード構成において配列される、標識試薬としてのファージの使用を示す。図５０に示される方法は、利用する標識試薬を除いて、図４９の概要と一致する。
【０２７２】
望ましくは、下流分析は、分析されるサンプルにおいて標的細胞の数の正確な決定をもたらす。正確な定量化の結果を得るために、関心対象となる細胞上に標的とされる表面抗原は、典型的には、公知または予測可能な発現レベルを有しており、標識試薬の結合はまた、干渉する基質がない、予測可能な方法で進行するはずである。したがって、標識試薬の導入前に、高度に濃縮された細胞サンプルをもたらす本発明の方法は、特に有用である。加えて、発する信号の増幅を可能にする標識試薬は、血流において、上皮細胞（例えば、ＣＴＣ）等の標的細胞における低い発生率のため、好ましい。信号増幅を可能にする試薬は、酵素およびファージを含む。簡便な増幅を考慮に入れないが、量子ドット等の強い信号を発する他の標識試薬もまた、望ましい。
【０２７３】
本発明の方法において標識試薬を含む必要はない。例えば、一方法は、本発明のデバイスに、例えば、末梢血のサンプル等の細胞サンプルを導入するステップを含む。例えば、該デバイスは、サンプルにおいて、より小さい細胞から１２ミクロン、１４ミクロン、１６ミクロン、１８ミクロン、または２０ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を濃縮する。代替として、該デバイスは、他の細胞から、例えば、８ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞等の６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る。該デバイスはまた、１０ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞から、５ミクロン以上１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る；あるいは、８ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞から、４ミクロン以上８ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮し得る。細胞のこれらのサブセットのそれぞれは、その後回収され、例えば、このように回収されたサンプルのうちの１つにおいて特定の細胞型（例えば、希少細胞（例えば、上皮細胞または前駆内皮細胞）等）の存在を検出することによって分析され得る。本方法が、通常、達成する濃縮のため、希少細胞の濃縮は、開始細胞サンプルよりも回収したサンプルにおいて高くなり得、様々な手段によって希少細胞の検出を可能にする。一実施形態において、細胞サンプルは、デバイスの入口に適用され、例えば、緩衝液（例えば、ＢＳＡを含む緩衝液）、溶解試薬、核酸増幅試薬、容積モル浸透圧濃度調節試薬、標識試薬、防腐剤、または固定試薬等の第２の試薬は、任意に、第２の入口に適用され、２つの出力サンプルは、デバイスの２つの出口から流出する。例えば、デバイスの入口への癌細胞を含む細胞サンプルの適用は、このような細胞について濃縮される１方の出力サンプルをもたらし得る一方、他方のサンプルは、これらの細胞において欠失する、またはそれらを完全に欠いている。上記に列挙される第２の試薬のいずれも、例えば、デバイスが第２の入口を含むようなもの等の本発明のデバイスおよび方法のいずれにおいても利用され得る。
【０２７４】
２つの細胞型が、異なる方向に誘導される実施形態において、第１の細胞型は、関心対象となる細胞型であり、第２の細胞型は、任意の他の細胞型であり得る。例えば、第２の細胞型は、白血球、または例えば、除核赤血球等の赤血球を含み得る。
【０２７５】
本発明の方法は、例えば、細胞サンプルからの癌細胞等の関心対象となる細胞を濃縮するために、磁気粒子、あるいは、抗体またはそのフラグメントとの相互作用を利用する必要がない。細胞サイズ、形状、または変形能に基づいたいかなる方法も、関心対象となる細胞を濃縮するために使用され得、次いで、細胞検出、または例えば、本明細書に記載されるもの等の任意の他の下流適用を行い得る。
【０２７６】
本発明の方法は、細胞の同一セットの濃縮、定量化、および分子生物学分析を可能にする。本発明のデバイスにおける細胞の緩徐処理は、記載されるバルク測定方法に加えて、所望に応じて、さらなる分析が行なわれ得るように、細胞の完全性を維持する。例えば、細胞の完全性を破壊する技術は、バルク測定に続いて行なわれ得、このような技術は、ＤＮＡまたはＲＮＡ解析、プロテオーム解析、またはメタボローム解析を含む。例えば、サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの総量は、決定され得、代替として、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、特定の配列または突然変異（例えば、欠失等）の存在は、例えば、表１に列挙されるポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異等に検出され得る。さらに、サンプル中のミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼ、または核マトリクスタンパク質を、分析し得る（癌におけるミトコンドリア突然変異に関しては、例えば、Ｐａｒｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７６２３−７６２６（２００１）、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１２９９−１３０４（２００１）、およびＦｌｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２０１７−２０１９（２０００）を参照；テロメラーゼに関しては、例えば、Ｓｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：９７１−９７５（１９９９）を参照されたい）。例えば、サンプルを分析し、いずれかのミトコンドリア異常（例えば、Ｃａｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １：９（２００２）、およびＷａｌｌａｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１４８２−１４８８（１９９９）を参照されたい）または核周辺部が存在するかどうかを決定し得る。ＤＮＡを解析するための１つの有用な方法は、ＰＣＲであり、細胞を溶解し、特定のＤＮＡ配列のレベルを増幅する。このような技術は、単離される標的細胞の数が非常に少ない場合、特に有用である。Ｉｎ−ｃｅｌｌ  ＰＣＲを、利用してもよく、加えて、遺伝子発現解析（例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．．
Ｐａｔｈｏｌ．  １５９：１２３１−１２３８（２００１）、およびＢｕｃｋｈａｕｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：４１４４−４１４９（２００３）を参照されたい）、または蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、例えば、分析される細胞の起源の細胞を決定するために使用され得る。タンパク質のリン酸化、タンパク質のグリコシル化、ＤＮＡのメチル化（例えば、Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４６３２−４６４２（２００４）を参照されたい）、マイクロＲＮＡのレベル（例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８２８−８３３（２００５）、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３４−８３８（２００５）、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３９−８４３（２００５）、およびＣａｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１７９３−１８０１（２００５）を参照されたい）、もしくは細胞の形態、または他の構造特性（例えば、多形態性、接着、移動、結合、分裂、遺伝子発現レベル、および体細胞突然変異の存在）等の様々な細胞特性は、任意の上記の技術を用いて測定され得る。本分析は、例えば、癌細胞等の関心対象となる単一細胞を含む、かなり多数の細胞において行なわれ得る。加えて、細胞のサイズ分布を分析し得る。望ましくは、例えば、検出等の下流分析は、好ましくは、同一の対象からの１つ以上のサンプルにおいて行なわれる。
【０２７７】
細胞の定量化
血液中に認められる細胞は、様々な型からなり、一連のサイズ範囲に及ぶ。本発明の方法を用いて、例えば、ＣＴＣ等の血液細胞集団のサイズを識別し、計数することが可能である。例えば、コールターカウンターを使用してもよい。図３３Ａは、正常血液サンプルに対する典型的なサイズ分布を示す。例えば、腫瘍細胞が剥離する体内の腫瘍の存在等の一部の条件下で、血液に在来しない細胞が、末梢循環において出現し得る。血液中に出現し得る大型細胞、または他の所望の細胞を単離および計数する能力は、疾患状態を診断するために効果を発揮する機会を提供する。
【０２７８】
望ましくは、コールターカウンター、または他の細胞検出器は、本発明のデバイスの出口に流体的に結合され、細胞サンプルを、本発明のデバイスに導入する。コールターカウンターに流体的に結合される出口を通って流れ、コールターの開口部を通過する細胞は、細胞が通過する開口部によって分離された２つの電極を含み、それぞれの細胞が開口部を通過する際、排除される体積を測定する。好ましくは、コールターカウンターは、濃縮サンプル中の５００ｆＬを超える細胞体積の細胞の数を決定する。代替として、コールターカウンターは、好ましくは、濃縮サンプル中の１４μｍを超える直径の細胞の数を決定する。コールターカウンター、または他の細胞検出器はまた、別個のデバイスを構成するよりもむしろ本発明のデバイスの不可欠な一部であり得る。計数器は、例えば、インピーダンス、光吸収、光散乱または静電容量等の任意の細胞特性を利用し得る。
【０２７９】
一般に、細胞数を生成する任意の手段は、本発明の方法において有用である。このような手段は、散乱、吸収、または蛍光手段等の光学手段を含む。代替として、静電容量を決定する等の非開口電気手段は、有用である。
【０２８０】
他の濃縮技術との組み合わせ
本発明のデバイスを利用する濃縮および改変方法は、他の微粒子サンプル操作技術と組み合わせてよい。特に、ＣＴＣまたは他の粒子のさらなる濃縮または精製は、望ましくな
り得る。さらなる濃縮は、親和性濃縮を含む、いかなる技術によっても行われ得る。好適な親和性濃縮技術には、関心対象となる粒子をチャネル壁または障害物のアレイに結合する親和性剤と接触させることが含まれる。このような親和性剤は、例えば、癌細胞等の任意の細胞型に対して選択的であり得る。これには、標的細胞に対して特異的な抗体が、デバイス内で固定化される本発明のデバイスを用いることが含まれる。これは、デバイス内で標的細胞の結合および濃縮を可能にし、次いで、標的細胞を、より高速な流速、競合するリガンドを用いて、または別の方法を用いて、溶出する。
【０２８１】
診断
本明細書に記載されるように、固形腫瘍から剥離される上皮細胞は、乳癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌に罹患する患者の循環において認められている。一般に、療法後のＣＴＣの存在は、腫瘍進行および広がり、治療への不良な反応、疾患の再発、および／または数年間にわたる生存率の低下に関連している。したがって、ＣＴＣの列挙は、初期の危険、および療法への反応に基づいたその後の危険を予測する基本特性について、患者を階層化する手段を提供する。
【０２８２】
本発明のデバイスおよび方法は、例えば、癌患者、および癌の危険性がある患者を評価するために使用され得る。本明細書に記載される診断の方法のいずれにおいても、例えば、癌細胞等の癌の指標、または任意の他の疾病の指標の有無は、診断を生成するために使用され得る。一例において、血液サンプルは、患者から採取され、他の血液細胞からの、例えば、ＣＴＣ等の上皮細胞を濃縮するために適切に選択された臨界サイズを用いて、本発明のデバイスに導入される。本発明の方法を用いて、血液サンプル中の上皮細胞の数が、決定される。例えば、細胞は、ＥｐＣＡＭに結合する抗体で標識化され得、抗体は、共有結合している蛍光標識を有し得る。バルク測定値は、その後、デバイスによって生成される濃縮サンプルから行なわれ得、この測定から、初期血液サンプル中に存在する上皮細胞の数が、決定され得る。顕微鏡技術は、バルク測定を血液サンプル中の標識細胞の対応する数と相関するように、細胞を視覚的に定量化するために使用され得る。
【０２８３】
上皮腫瘍細胞の他に、転移性腫瘍形成に関与している他の細胞型がある。研究は、転移において、造血骨髄前駆細胞および内皮前駆細胞の関与の証拠を提供している（例えば、Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：８２０−８２７（２００５）、およびＢｒｕｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８３：６３６−６４０（１９９４）を参照されたい）。例えば、造血骨髄前駆細胞、例えば、前駆内皮細胞等の第２の細胞型の細胞の数が、決定され得、第２の細胞型の数に対する上皮腫瘍細胞の比が、算出され得る。このような比は、適切な療法を選択し、治療の効力をモニタリングする際の診断価値を示す。
【０２８４】
転移性腫瘍形成に関与する細胞は、当技術分野において公知である任意の方法を用いて検出され得る。例えば、特定の細胞表面マーカーに対して特異的な抗体が、使用され得る。有用な腫瘍内皮細胞表面マーカーは、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４４、およびＣＤ１４６を含み、有用な内皮細胞表面マーカーは、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、およびＴＥＭ８を含み（例えば、Ｃａｒｓｏｎ−Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６６４９−６６５５（２００１）を参照されたい）、有用な間葉細胞表面マーカーは、ＣＤ１３３を含む。これら、または他のマーカーへの抗体は、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ａｂｃａｍ，  ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られ得る。
【０２８５】
１日間、２日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間等の一定間隔で任意に行なわれる、一連の測定を行なうことによって、時間関数として、患者の血流に存在する上皮細胞のレベルを追跡記録し得る。癌患者が存在する場合、これは、疾患の進行の有用な指標を提供し、患者の血流において、上皮細胞（
例えば、ＣＴＣ）の増加、減少、または変化の欠如に基づいて適切な療法選択を行なう際、医療実行者を支援する。癌の危険性がある患者に関しては、検出された細胞の数の突然の増加は、患者において腫瘍ができているという早期警告を提供し得る。この早期診断は、その後の治療的介入と組み合わせて、診断情報の非存在と比較して改善された患者予後をもたらす可能性が高い。
【０２８６】
診断方法には、血液から単離される標識化された上皮細胞（例えば、ＣＴＣ）のバルク測定、ならびに細胞の完全性を破壊する技術を行なうことが含まれる。例えば、ＰＣＲは、単離される標的細胞の数が非常に低いサンプルに行なわれ得、特定の癌マーカーに対して特異的なプライマーを用いることによって、情報が、分析された細胞が由来した腫瘍の型について得られ得る。さらに、ＲＮＡ解析、プロテオーム解析、またはメタボローム解析を、患者に存在する癌の型を診断する手段として行ない得る。
【０２８７】
肺癌および他の癌に対して１つの重要な診断上の指標は、ＥＧＦＲにおけるある突然変異の有無である（例えば、国際公開第ＷＯ  ２００５／０９４３５７号を参照されたい）。ＥＧＦＲは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通部分、および細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインからなる。ＥＧＦＲの正常な生理的な役割は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含むＥｒｂＢリガンドを細胞外結合部位で結合し、細胞増殖、生存、運動、および他の関連活動をもたらす下流細胞内信号のカスケードを引き起こすことである。ＥＧＦＲ突然変異を有する多くの非小細胞肺腫瘍は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ；  ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）等の小分子ＥＧＦＲ阻害剤に反応するが、しばしば、それらを薬物耐性にする二次突然変異を最終的に得る。本発明のデバイスおよび方法を用いて、しばしば、血液のサンプルを採取し、時間の関数としてそれぞれのサンプル中の上皮細胞（例えば、ＣＴＣ）の数を決定することによって、このような薬物を摂取する患者をモニタリングし得る。これは、疾患過程に関する情報を提供する。例えば、時間と共に循環する上皮細胞数の減少は、疾患の重症度および腫瘍のサイズの減少を示唆する。上皮細胞の定量化の直後、これらの細胞は、ＰＣＲによって分析され、どのような突然変異が、上皮細胞に発現したＥＦＧＲ遺伝子に存在し得るかを決定し得る。ＥＧＦＲ  ＴＫドメインのＡＴＰ結合ポケット周辺にクラスター形成するもの等のある突然変異は、癌細胞をゲフィチニブ阻害に影響を受けやすくすることは公知である。したがって、これらの突然変異の存在は、ゲフィチニブを用いる治療へ反応する可能性が高い癌の診断を支援する。しかしながら、ゲフィチニブに反応する多くの患者は、最終的に、二次突然変異（しばしば、ＴＫドメインのエクソン２０における７９０位にて、メチオニンからスレオニンに置換）を生じ、ゲフィチニブに対して耐性となる。本発明のデバイスおよび方法を用いることによって、本突然変異を十分に試験し得、疾患の経過およびそれがゲフィチニブまたは類似の化合物に反応するであろう可能性についてさらなる診断情報を提供する。ゲフィチニブへの感受性または耐性を与えることで知られている今まで報告されたＮＳＣ肺癌におけるすべてのＥＧＦＲ突然変異を含む多くのＥＧＦＲ突然変異が、エクソン１８〜２１のコーディング領域内にあるため、ＥＧＦＲ遺伝子の本領域は、突然変異の存在に対してアッセイの開発において強調され得る（実施例４〜６を参照されたい）。
【０２８８】
本発明は、上記患者のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの核酸変異体の有無を検出する方法を含む。少なくとも１つの変異体の存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置が有効である可能性が高いことを示す。好ましくは、該核酸変異体は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を上昇させる。患者は、その後、ＥＧＦＲを標的とする処置で処置され得る。本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲを標的とする処置は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与を含む。
【０２８９】
したがって、本発明は、癌に罹患しているヒト患者における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする処置の効力の可能性を決定するための方法を提供する。該方法は、野
生型ｅｒｂＢ１遺伝子と比較して該患者のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの核酸変異体の有無を検出するステップを含む。少なくとも１つの変異体の存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置が有効である可能性が高いことを示す。好ましくは、該核酸変異体は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を上昇させる。患者は、その後、ＥＧＦＲを標的とする処置で処置され得る。本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲを標的とする処置は、チロシンキナーゼ阻害剤である。
【０２９０】
癌に罹患している、または癌を発症する危険性がある患者におけるｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおいて、特定の変異体または複数の変異体の有無を決定することは、様々な方法において行なうことができる。このような試験は、生体サンプル（例えば、組織生検、尿、糞便、痰、血液、細胞、組織剥離物、胸部吸引物、または他の細胞物質）から採取されたＤＮＡまたはＲＮＡを用いて一般的に行なわれ、ＰＣＲ、対立遺伝子特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、酵素突然変異検出、ミスマッチの化学的切断、質量分析法、またはＤＮＡシークエンシング（ミニシークエンシングを含む）が挙げられるが、これらに限定されない、様々な方法により行なうことができる。特定の実施形態において、対立遺伝子特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションは、２つの形式において実行することができる。（１）多くのＤＮＡチップ適用の場合、固相（例えば、ガラス、シリコン、またはナイロン膜）に結合される対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、および溶液中の標識サンプル、または（２）結合サンプル（例えば、クローン化ＤＮＡまたはＰＣＲ増幅ＤＮＡ）、および溶液中の標識オリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションによってシークエンシングを可能にするために、対立遺伝子特異的あるいは短い）。診断試験は、しばしば、固体支持体上に、変異体の集団を含み得、１つ以上の変異体の同時決定を可能にする。該方法は、患者のＥＧＦＲのキナーゼドメインが、少なくとも１つの核酸変異体を含むかどうかを決定するステップを含む。このような変異体の存在は、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤の投与等のＥＧＦＲを標的とする処置の効力を示す。
【０２９１】
ＥＧＦＲ遺伝子検査は、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおいて、突然変異を検出することができる。上記に概説されるように、ＤＮＡを、まず、本発明のマイクロ流体デバイスを利用して濃縮されたＣＴＣから得る。その後、ＥＧＦＲの７つのエクソン（１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４）のＤＮＡ配列を、直接、双方向性遺伝子シークエンシングによって決定する。その後、得られた配列を、公知のＥＧＦＲ配列と比較して、ＤＮＡ配列変化を同定する。ＤＮＡ配列変化が、ＣＴＣサンプル中で検出される場合、元の組織サンプルに対して試験を繰り返し得る。
【０２９２】
別の態様において、ｅｒｂＢ１遺伝子において少なくとも１つのキナーゼ活性を増大する核酸変異体の存在を決定することは、ハプロタイプテストを必要とし得る。ハプロタイプを決定する方法は、例えば、国際公開第ＷＯ  ００／０４１９４号等のように、当業者に公知である。好ましくは、キナーゼ活性を増大する核酸変異体の有無の決定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の方法によって、変異体部位の配列を決定することを含む。代替として、キナーゼ活性を増大する核酸変異体の有無の決定は、鎖停止ＤＮＡシークエンシングまたはミニシークエンシング、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、または質量分析法を含み得る。
【０２９３】
本発明の方法を、癌に罹患している、または癌を発症する危険性がある患者におけるＥＧＦＲを標的とする処置の効力の可能性（または効力の欠如）を予測するために使用し得る。好ましくは、癌としては、胃腸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭および首の癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜の癌、皮膚癌、肝臓癌、膵癌、生殖器−泌尿器の癌、ならびに膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない、上皮性起源の癌を含む。好ましい実施形態において、該癌は、非小細胞肺癌である。本発明は、通常、癌に罹患している、または癌を発症する危険性がある患者におけるＥＧＦＲを標的とする処置の効
力を示すｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける変異体の同定に関連する。さらに、実際には、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける特異的変異体の同定を、診断または予後試験として使用することができる。例えば、ｅｒｂＢ１のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの変異体の存在は、ある患者が、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤等のＥＧＦＲを標的とする化合物による処置が利益がある可能性が高いことを示す。
【０２９４】
一つの実施形態において、本発明は、ＰＣＲによって、または代替的に、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）において、試験生体サンプルにおけるｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの変異体のためのスクリーニングの方法を提供し（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ
ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０、およびＮａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照されたい）、これらの後者は、ＥＧＦＲ遺伝子の点変異を検出するために特に有用であり得る（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照されたい）。該方法は、標識配列を増幅するための縮重プライマーを設計するステップであって、該プライマーは、遺伝子の１つ以上の保存領域に対応するステップと、鋳型として、試験生体サンプルから得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、プライマーとの反応物を増幅するステップと、ＰＣＲ産物を分析するステップとを含む。対照サンプルに対する試験生体サンプルのＰＣＲ産物の比較は、試験生体サンプルにおける変異体を示す。変化は、試験生体サンプルにおける核酸変異体の非存在あるいは存在のいずれかであり得る。
【０２９５】
代替的な増幅方法は、自家持続配列複製法（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８参照）、転写増幅システム（例えば、Ｋｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照されたい）、Ｑｂレプリカーゼ（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７参照）、または任意の他の核酸増幅方法、次いで、当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出等を含む。これらの検出スキームは、このような分子が、非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。
【０２９６】
すべての配列変異体を、多数の個々のＰＣＲ増幅によって確認することができる。本発明により有用なプライマーは、例えば、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号５０９、および配列番号５１０等を指針として、タンパク質のアミノ酸配列、またはｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインの核酸配列を用いて設計される。該プライマーは、少なくとも２つの相同領域が、可変配列（該配列は、長さ、または核酸配列のいずれかが異なる）の分岐領域により分離される遺伝子の相同領域において設計される。
【０２９７】
ＰＣＲ反応のためのプライマーは、公知のＥＧＦＲヌクレオチド／タンパク質配列を利用する、当業者に利用可能で、公知の方法で得られる。例えば、受容体チロシンキナーゼのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＢＬＡＴ整列を用いてヒトゲノム集合と比較して、エクソン／イントロン境界を同定し得る。外部遺伝子特異的なプライマー対は、ＰｒｉｍｅｒＳプログラムを用いて、それぞれの側に対して、エクソン配列と少なくとも２５０ｂｐの隣接するイントロン配列または隣接するエクソン配列を増幅するように設計される。その後、結果として得られた予測された単位複製配列を使用して、エクソン（一般にエクソン／イントロン境界から５０ｂｐよりも大きい）に隣接し、添付のＭ１３順方向または逆方向プライマー尾部を含む内部プライマーを設計する。これらのネステッドプライマーセットを、対照ＤＮＡから適切な単位複製配列サイズおよび高品質の配列について試験する。４７のチロシンキナーゼの受容体チロシンキナーゼ活性化ループをコードするエクソンを包含する単位複製配列が増幅され、試験サンプル（例えば、本発明のマイクロ流体デバイスを利用する濃縮された細胞）から配列決定される。加えて、全長ＥＧＦ
Ｒを網羅する単位複製配列も増幅する。本発明の方法に使用される例示的なプライマーおよび他の配列を、表２に示す。
【０２９８】
【表２−１】
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【０２９９】
【表２−２】
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【０３００】
【表２−３】
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【０３０１】
【表２−４】
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【０３０２】
【表２−５】
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【０３０３】
【表２−６】
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【０３０４】
【表２−７】
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【０３０５】
【表２−８】
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【０３０６】
【表２−９】
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【０３０７】
【表２−１０】
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【０３０８】
【表２−１１】
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【０３０９】
【表２−１２】
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【０３１０】
【表２−１３】
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【０３１１】
【表２−１４】
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上に記載されるように、好ましくは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける変異体は、エクソン１８、１９、２０、または２１において、インフレームの欠失または置換である。しかしながら、本明細書に論じられるすべての分析、すなわち、通常、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける突然変異を検出する遺伝子検査を、追加またはすべてのエクソンに適用することができる。一実施形態において、ＤＮＡを、まず、血液（例えば、ＣＴＣ）から単離される、細胞から得る。その後、ＥＧＦＲの７つのエクソン（１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４）のＤＮＡ配列を、直接、双方向性遺伝子シークエンシングによって決定する。その後、得られた配列を公知のＥＧＦＲ配列（例えば、配列番号５１１、図７１）と比較して、ＤＮＡ配列変化を同定する。ＤＮＡ配列変化が、検出される場合、元のサンプルに対して試験を繰り返し得る。変化がゲフィチニブまたはエルロチニブ応答者において以前に報告されていなかった場合、突然変異が構成的であるか（したがって、正常に生じている多型の可能性が高い）、または腫瘍組織において体細胞性に生じたかどうかを決定するために、試験を、参照もしくは対照細胞からの、同一もしくは異なる源（例えば、患者または動物）からのサンプルでも行なう。個々のサンプルについてＰＣＲ増幅ができない場合、入力ＤＮＡ鋳型において２倍に増加して、新たなＰＣＲのラウンドを試みるべきである。例えば、ＤＮＡは、事前に増幅を行なうことができる。適切な事前の増幅法としては、多重変位増幅法、および線形増幅法（体外転写またはプライマー伸長全ゲノム事前増幅法）が挙げられる。再度ＰＣＲ増幅ができない場合、入手できるならば、その患者のための新たなＤＮＡサンプルを得るべきである。
【０３１２】
一実施形態において、インフレームの欠失は、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）のエクソン１９にある。エクソン１９におけるインフレームの欠失は、好ましくは、コドン７４７、７４８、７４９、および７５０にて、少なくともアミノ酸（ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、およびアラニン）の欠失を含む。一実施形態において、インフレームの欠失は、ヌクレオチド２２３５〜２２４９を含み、アミノ酸７４６〜７５０（配列グルタミン酸、ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、およびアラニン）を欠失する。別の実施形態において、インフレームの欠失は、ヌクレオチド２２３６〜２２５０を含み、アミノ酸７４６〜７５０を欠失する。代替として、インフレームの欠失は、ヌクレオチド２２４０〜２２５１、またはヌクレオチド２２４０〜２２５７を含む。代替として、インフレームの欠失は、ヌクレオチド２２４８にてグアニンをシトシンに置換すると共に、ヌクレオチド２２３９〜２２４７、またはヌクレオチド２２３７にてアデニンをチミンに置換すると共に、ヌクレオチド２２３８〜２２５５の欠失、またはヌクレオチド２２５４〜２２７７の欠失を含む。代替として、インフレームの欠失は、ヌクレオチド２２３９−２２５０ｄｅｌＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡ；２２５１Ａ＞Ｃ、または２２４０−２２５４ｄｅｌＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡ、または２２５７−２２７１ｄｅｌＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧを含む。追加の突然変異は、転移性肉腫において、８５７位（「Ｇ８５７Ｖ」）にてバリン（Ｖ）の代わりにグリシン（Ｇ）を置換するＥＧＦＲ突然変異、または８８３位（「Ｌ８８３Ｓ」）にてセリン（Ｓ）でロイシン（Ｌ）を置換するＥＧＦＲ突然変異であり得る。図７２Ａ〜Ｅおよび表３は、例示的なＥＧＦＲ突然変異を示す。
【０３１３】
【表３】
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別の実施形態において、置換は、ＥＧＦＲのエクソン２１にある。エクソン２１の置換は、少なくとも１つのアミノ酸を含む。一実施形態において、エクソン２１における置換は、ヌクレオチド２５７３におけるチミンからグアニンへの置換を含む。この置換は、野生型のロイシンがアミノ酸８５８にてアルギニンで置換されたアミノ酸置換を生じる。代替として、エクソン２１における置換は、ヌクレオチド２５８２におけるチミンからアデニンへの置換を含む。この置換は、野生型のロイシンがアミノ酸８６１にてグルタミンで置換されたアミノ酸置換を生じる。
【０３１４】
また、置換は、ＥＧＦＲのエクソン１８にあってもよい。一実施形態において、エクソン１８における置換は、ヌクレオチド２１５５におけるグアニンの代わりのチミンである。この置換は、野生型グリシンが、コドン７１９にてシステインで置換されたアミノ酸置換を生じる。別の実施形態において、エクソン１８における置換は、ヌクレオチド２１５５におけるグアニンの代わりのアデニンであり、野生型グリシンがコドン７１９にてセリンにより置換されたアミノ酸置換を生じる。
【０３１５】
別の実施形態において、置換は、配列番号５１１のヌクレオチド２３１６の後、およびヌクレオチド２３１７の前のグアニン、グアニン、およびチミン（ＧＧＴ）の挿入（２３１６＿２３１７  ｉｎｓ  ＧＧＴ）である。これはまた、アミノ酸７７２にて、バリン（Ｖ）の挿入（Ｐ７７２＿Ｈ７３３  ｉｎｓ  Ｖ）として記載することができる。他の突然変異としては、例えば、配列番号５１１のヌクレオチド２３０９の後、およびヌクレオチド２３１０の前のＣＡＡＣＣＣＧＧの挿入、配列番号５１１のヌクレオチド２３１１の後、およびヌクレオチド２３１２の前のＧＣＧＴＧＧＡＣＡの挿入が挙げられる。置換はまた、エクソン２０にあってもよく、一実施形態において、ヌクレオチド２３３４および２３３５にてＧＧの代わりにＡＡの置換である。
【０３１６】
したがって、好ましい実施形態において、ｅｒｂＢ１遺伝子の核酸変異体は、配列番号５１１のヌクレオチド２１５５にてグアニンの代わりにチミンもしくはグアニンによるアデニンの置換；配列番号５１１のヌクレオチド２２３５から２２４９、２２４０から２２５１、２２４０から２２５７、２２３６から２２５０、２２５４から２２７７、または２２３６から２２４４の欠失；配列番号５１１のヌクレオチド２３１６の後、およびヌクレオチド２３１７の前で、ヌクレオチドのグアニン、グアニン、およびチミン（ＧＧＴ）の挿入；および配列番号５１１のヌクレオチド２５７３にてチミンの代わりにグアニンもしくはヌクレオチド２５８２にてチミンの代わりにアデニンの置換である。
【０３１７】
少なくとも１つの核酸変異体の有無の検出は、受容体をコードする核酸のセグメントを増幅することにより決定することができる。増幅されるセグメントは、１０００ヌクレオチド長以下、好ましくは、５００ヌクレオチド長以下、最も好ましくは、１００ヌクレオチド長以下である。増幅されるセグメントは、複数の変異体を含むことができる。別の実施形態において、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、変異部位を含むＥＧＦＲ核酸を少なくとも１つの核酸プローブと接触させるステップを提供する。プローブは、変異部位を含み、変異部位にて相補的ヌクレオチド塩基を含む核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションを、検出可能な標識を用いて検出することができる。
【０３１８】
さらに別の実施形態において、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、少なくとも１つの核酸配列を配列決定するステップおよび得られた配列を、公知のｅｒｂＢ１核酸配列と比較するステップを含む。代替として、少なくとも１つの変異体の有無は、少なくとも１つの核酸配列の質量分析の決定を含む。
【０３１９】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの核酸変異体の有無の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なうステップを含む。仮定的変異体を含むｅｒｂＢ１核酸配列を増幅し、増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定する。該増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定するステップは、少なくとも１つの核酸のセグメントを配列決定するステップを含む。代替として、増幅産物は、自動および手動ゲル電気泳動等を含む、それらのサイズに従って、増幅産物を分離することが可能な任意の方法を用いることにより分析することができる。代替として、少なくとも１つの変異体の有無の検出は、遺伝子の複数の変異体のハプロタイプを決定するステップを含む。
【０３２０】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ変異体の有無は、ｅｒｂＢ１遺伝子産物（タンパク質）を分析することによって検出することができる。本実施形態において、変異体ＥＧＦＲに特異的に結合するプローブを、利用する。好ましい実施形態において、該プローブは、変異体ＥＧＦＲに選択的に結合する抗体である。変異体ＥＧＦＲの存在は、ＥＧＦＲを標的とする処置の効力の可能性を予測する。代替として、該プローブは、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはアプタマーであり得る。
【０３２１】
さらに、プローブは、ＥＧＦＲ遺伝子（ｅｒｂＢ１）において少なくとも１つの核酸変異体を含む核酸配列に、選択的結合条件下で、特異的に結合し得る。一実施形態において、変異体は、ＡＴＰ結合ポケットの構造的変化を与えるｅｒｂＢ１のキナーゼドメインにおける突然変異である。本発明のプローブは、約５００のヌクレオチド塩基以下の、好ましくは約１００のヌクレオチド塩基以下の、および最も好ましくは、約５０もしくは約２５のヌクレオチド塩基以下の長さの核酸配列を含み得る。該プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）から構成され得る。さらにまた、該プローブは、例えば、蛍光または酵素標識等の検出可能な標識を含み得る。
【０３２２】
増幅産物の分析は、自動および手動ゲル電気泳動、質量分析法等を含む、それらのサイズに従って、増幅産物を分離することが可能な任意の方法を用いることにより分析することができる。代替として、増幅産物は、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、化学開裂または制限断片多型、ならびに例えば、核酸アレイへのハイブリダイゼーションを用いて、配列相違を用いて分離することができる。
【０３２３】
配列分析および検証：フォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）クロマトグラムは、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ２．０３（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｓｔａｔｅ
Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）、続いて、マニュアルレビューによってバッチで解析される。一方または双方の方向に認められる高品質変異は、候補突然変異としてスコア化される。候補突然変異を持つエクソンは、上記のように、元のＤＮＡサンプルから再度増幅され、再度配列決定することができる。
【０３２４】
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのエクソン１９および２１は、以下のプライマー：エクソン１９センスプライマー、５’−ＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣ−３’（配列番号５０５）；エクソン１９アンチセンスプライマー、５’−ＣＡＴＡＧＡＡ
ＡＧＴＧＡＡＣＡＴＴＴＡＧＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号５０６）；エクソン２１センスプライマー、５’−ＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号５０７）；およびエクソン２１アンチセンスプライマー、５’−ＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧ  ＡＡＴＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号５０８）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅される。
【０３２５】
代替的な実施形態において、サンプル細胞からのＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターンの改変によって同定することができる。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡを単離し、任意に増幅し、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片長サイズをゲル電気泳動によって決定して比較する。サンプルと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの違いは、サンプルＤＮＡの突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号参照）を使用し、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的突然変異の存在をスコア化するために使用することができる。
【０３２６】
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を検出するための他の方法は、切断剤からの保護を使用して、ＫＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖において、ミスマッチ塩基を検出するために使用する方法を含む。例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、組織サンプルから得られる潜在的突然変異ＲＮＡまたはＤＮＡと野生型ＥＧＦＲ配列を含む（標識化）ＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイズすることによって形成されたヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二本鎖の二重鎖は、対照鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチにより存在するような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、Ｒｎａｓｅで処置し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドでは、Ｓ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。別の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡあるいはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、およびピペリジンで処理し、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域を消化した後、結果として得られた物質を、その後、変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズごとに分離して、突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７、およびＳａｌｅｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２  １７：２８６−２９５を参照されたい。一実施形態において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識化することができる。
【０３２７】
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応には、細胞のサンプルから得られるＥＧＦＲ  ｃＤＮＡにおける突然変異を検出およびマッピングするための定義されたシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を認識する１つ以上のタンパク質を利用する。例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｍｕｔＹ酵素は、Ｇｒ／ＡミスマッチにてＡを切断し、ヒーラ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにてＴを切断する。例えば、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２参照。例示的な実施形態によれば、例えば、ＤＥＬ−１〜ＤＥＬ−５、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ８５７Ｖ、Ｌ８８３Ｓ、またはＬ８５８Ｒ  ＥＧＦＲ配列等の突然変異ＥＧＦＲ配列に基づくプローブは、ｃＤＮＡまたは修復酵素にハイブリダイズされ、もしあれば、切断産物を、電気泳動法プロトコル等から検出することができる。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照されたい。
【０３２８】
他の実施形態において、電気泳動移動度の変化を用いて、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体の核酸と野生型の核酸との間の電気泳動移動度の相違を検出するために使用してもよい。例えば、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ，１９９３，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４、Ｈａｙａｓｈｉ，１９９２，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９を参照されたい。サンプルおよび対照のＥＧＦＲ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性させ、復元させることができる。一本鎖核酸の二次構造は、配列により異なり、結果として得られた電気泳動移動度の変化により、単一の塩基変化でさえ検出可能である。ＤＮＡ断片は、標識プローブを用いて標識化、または検出され得る。アッセイの感度を、二次構造が、配列の変化に対してより感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いることによって、増強してもよい。一実施形態において、本方法は、ヘテロ二重分析を利用して、電気泳動移動度の変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照されたい。
【０３２９】
さらに別の実施形態において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体のまたは野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイする。例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照されたい。ＤＧＧＥを分析の方法として使用する場合、ＤＮＡを修飾し、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチなＤＮＡのＧＣクランプを加えることによって、これが完全には変性しないことを確実にする。さらなる実施形態において、温
度勾配を、変性勾配の代わりに用いて、対照およびサンプルのＤＮＡの移動度の相違を同定する。例えば、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓｎｅｒ，１９８７，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照されたい。
【０３３０】
点突然変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、公知の突然変異を中央に配置するように調製され、次いで、完全なマッチが認められる場合のみ、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、標識ＤＮＡにハイブリダイズさせてもよい。例えば、Ｓａｉｋｉ
ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３、およびＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照されたい。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする膜に付着させ、標識された標的ＤＮＡとハイビリダイズする際に、ＰＣＲ増幅された標識ＤＮＡまたは多数の異なる突然変異体にハイブリダイズする。
【０３３１】
代替として、選択的ＰＣＲ増幅に依存的な対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と組み合わせて使用してもよい。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央に（増幅が、ディファレンシャルハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に依存するように；例えば、Ｇｉｂｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４−４８参照）、または一方のプライマーの３末端の一番端に関心対象となる突然変異を有してもよく、適切な条件下で、ミスマッチは、ポリメラーゼ伸長を防止する、または減少させることができる（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，１９９３，Ｔｉｂｔｅｅｌｉ．１１：２３８参照）。加えて、切断に基づいた検出を行なうためには、突然変異の領域に新規制限部位を導入することが望ましい。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照されたい。ある実施形態において、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて行ってもよいことが予期される。例えば、Ｂａｒａｎｙ  １９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照されたい。このような場合、完全マッチが５’配列の３’末端にある場合のみ、ライゲーションが生じ、増幅の有無について検索することによって特定の部位における公知の突然変異の存在を検出することを可能にする。
【０３３２】
ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲおよびシーケンシング法：チロシンキナーゼエクソンおよびフランキングイントロニック配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、３８４ウェル形式のネステッドＰＣＲ構成で、特異的プライマーを用いて増幅され得る。それぞれのＰＣＲ反応には、５ｎｇのＤＮＡ、１×ＨｏｔＳｔａｒ  緩衝液、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ならびに０．２ｕＭ  フォワードおよびリバースプライマーを、１０ｕＬの反応体積に含む。ＰＣＲサイクリングパラメータは、９５℃で１５分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の３５サイクル、次いで、７２℃で３分間の１サイクルである。結果として得られたＰＣＲ産物は、固相可逆固定化化学、次いで、万能Ｍ１３プライマーで二方向色素ターミネーター蛍光シーケンシング（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって精製した。シーケンシング断片は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてキャピラリー電気泳動法を経て検出する。ＰＣＲおよびシーケンシングを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって行なう。
【０３３３】
ＥＧＦＲ突然変異
ゲフィチニブに対する顕著な反応を有する患者からのＣＴＣサンプルは、ＥＧＦＲの突然変異を含み得、このような患者中に存在する腫瘍におけるこの成長因子シグナル伝達経路により果たされる必須の役割を示す。このような突然変異を探求するために、グリオーマの特性であるＥＧＦＲの細胞外ドメイン内の再配置が試験され得る。このような再配置が検出されない場合、全コーディング領域は、個々のエクソンのＰＣＲ増幅を用いて配列決定され得る。ヘテロ接合突然変異は、アミノ酸７４６〜７５０（ｄｅｌＥ７５６−Ａ７５０）、７４７〜７５０（ｄｅｌＬ７４７−Ｔ７５１）、および７４７〜７５２（ｄｅｌＬ７４７−Ｐ７５３）を除去するインフレームの欠失を含み得る。後の２つの欠失は、欠失のブレイクポイントで新規コドンの生成から生じているセリン残基の挿入に関連している。さらなる突然変異は、エクソン２１内のアミノ酸置換：コドン８５８（Ｌ８５８Ｒ）のロイシンからアルギニン、およびコドン８６１（Ｌ８６１Ｑ）のロイシンからグルタミンのアミノ酸置換を含み得る。Ｌ８６１Ｑ突然変異は、マウスｅｇｆｒ遺伝子の同一のアミノ酸の変化が、改変されたＥＧＦＲシグナリングと関連した、Ｄａｒｋ  Ｓｋｉｎ（ｄｓｋ５）特徴の原因となるため、特に関心対象となる。キナーゼドメインのミスセンス突然変異は、エクソン１８内のコドン７１９（Ｇ７１９Ｃ）のグリシンからシステインへの置換をもたらし得る。
【０３３４】
さらに突然変異としては、ｄｅｌＬ７４７−Ｐ７５３およびｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０が挙げられる。（２２５３＿２２７６  ｄｅｌ）の欠失は、前述のエクソン１９の欠失に重複する。欠失は、最小限で、コドン７４７〜７４９の範囲に及ぶもの（アミノ酸配列  ＬＫＥ）、およびコドン７５２〜７５９の範囲に及ぶものの２つの群のうちの１つに分類され得る。現在までに報告されたすべてのエクソン１９の欠失の分析は、多種多様のアミノ酸がコドン７４７〜７５９の範囲に及ぶＴＫ領域から欠失され得ることを示唆する。共通のコドンの欠失が必要であるとは考えられない。
【０３３５】
他の実施形態において、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン（エクソン１８〜２４および隣接イントロン領域）は、一組の個々のネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応に増幅される。ネステッドＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、プライマーの５’末端（５’  ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ）へのユニバーサル配列の追加と共に記載される。ＰＣＲ産物は、ダイターミネーター（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）シークエンシングによって二方向に直接配列決定され得る。ＰＣＲは、５ｎｇ  ゲノムＤＮＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７５ｕｌ  ＤＭＳＯ、１Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌ  プライマー、０．２ｕｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および１Ｘ緩衝液（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄと共に供給）を含む、１５ｕｌの体積において３８４ウェルプレートにおいて実行される。熱サイクル条件は、以下の通りである：９５℃で１０分間；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間として３０サイクル；７２℃で１０分間。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ（登録商標）磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）で精製する。シークエンシング産物を、Ｃｌｅａｎｓｅｑ（商標）磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製し、ＡＢＩ３７３０  ＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でキャピラリー電気泳動法によって分離する。配列分析は、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）によって、および２人の検査者によって手動で行なわれる。非同義ＤＮＡ配列変異体は、元のゲノムＤＮＡサンプルの３〜５の個々のＰＣＲ反応物の分析によって確認される。対照または参照サンプルを分析し、配列変化が、濃縮されたＣＴＣを介して、腫瘍組織に特有であるかどうか、または構造もしくはバックグラウンド変異体であるかどうかを決定する。
【０３３６】
ＥＧＦＲの追加のエクソン２〜２５はまた、ＣＴＣにおいて検出され得る。例えば、ゲノムＤＮＡのエクソンシークエンシングは、ＥＧＦＲのミスセンスおよび欠失突然変異を示し、通常、キナーゼドメインのエクソン１８〜２１内で発生する。配列変化は、腫瘍Ｄ
ＮＡのヘテロ接合体であり得、それぞれの場合に、同一の患者からの対の正常肺組織は、野生型配列を有し、このことから突然変異が起源において体細胞性であることを確認する。置換突然変異の一部の例は、Ｇ７１９ＳおよびＬ８５８Ｒである。「Ｇ７１９Ｓ」突然変異は、７１９位にてグリシン（Ｇ）をセリンに変える。これらの突然変異は、それぞれ、ヌクレオチド三リン酸結合ドメインまたはＰループのＧＸＧＸＸＧモチーフに位置し、活性化ループの高度に保存されたＤＦＧモチーフに隣接する。突然変異した残基は、すべてのタンパク質キナーゼでほとんど不変であり、Ｂ−Ｒａｆタンパク質セリン−スレオニンキナーゼの類似の残基（Ｇ４６３およびＬ５９６）が、結腸直腸癌、卵巣癌、および肺癌腫において体細胞変異している。
【０３３７】
複数の欠失突然変異の例としては、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン内のコドン７４６〜７５９に及ぶ領域にわたってクラスター形成しているものが挙げられる。例えば、２つの重複する１５ヌクレオチド欠失のうちの１つは、ヌクレオチド２２３５あるいは２２３６で開始して、ＥＧＦＲコドン７４６〜７５０を欠失する（Ｄｅｌ−１）。別の腫瘍からのＥＧＦＲ  ＤＮＡは、コドン７５２〜７５９の欠失を生じるヘテロ接合性の２４ヌクレオチドギャップを示した（Ｄｅｌ−２）。
【０３３８】
次に、１１９のＮＳＣＬＣ腫瘍の完全なコレクションにおいて、ＥＧＦＲのエクソン２から２５を試験した。ゲノムＤＮＡのエクソンシークエンシングは、合計１６の腫瘍において、ＥＧＦＲのミスセンスおよび欠失突然変異を示し、その全てがキナーゼドメインのエクソン１８から２１内であった。この群におけるすべての配列改変は、腫瘍ＤＮＡにおけるヘテロ接合体であり、同一の患者からの対の正常肺組織は、野生型配列を示し、突然変異が起源において体細胞性であることを確認する。置換突然変異Ｇ７１９ＳおよびＬ８５８Ｒは、それぞれ、２つおよび３つの腫瘍において、検出された。「Ｇ７１９Ｓ」突然変異は、７１９位にてグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に変える。これらの突然変異は、それぞれ、ヌクレオチド三リン酸結合ドメインのＧＸＧＸＸＧモチーフまたはＰループに位置し、活性化ループの高度に保存されたＤＦＧモチーフに隣接する。
【０３３９】
追加の欠失突然変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン内のコドン７４６〜７５９に及ぶ領域にわたってクラスター形成した。１０の腫瘍は、ヌクレオチド２２３５あるいは２２３６で開始し、ＥＧＦＲコドン７４６〜７５０を欠失する、２つの重複する１５ヌクレオチド欠失のうちの１つを有した。２つの他の突然変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＥＧＦＲ突然変異Ｇ８５７Ｖおよび転移性肉腫におけるＥＧＦＲの突然変異Ｌ８８３Ｓを含む。「Ｇ８５７Ｖ」突然変異は、位置８５７にてグリシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）と置換されている一方、「Ｌ８８３Ｓ」突然変異は、位置８８３にてロイシン（Ｌ）がセリン（Ｓ）と置換されている。ＥＧＦＲの突然変異は、いくつかの腫瘍型において生じ得、したがって、本明細書の方法に概説されるように、ＣＴＣを濃縮する／選択することは、このような突然変異を宿す患者の治療において有効であろうＥＧＦＲ阻害剤の選択に対する決定を可能にする。これにより、ＮＳＣＬＣ以外の腫瘍型を治療する際の、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標）として市販）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）として市販）等のキナーゼ阻害剤の使用が拡大する。さらに、ＥＧＦＲ  突然変異は、１つのコホート対別のコホートにおいて見られるより高い応答と共に、チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））に対する応答において異なる患者特性で著しい相関性を示す。異なる患者特性の例としては、喫煙者、非喫煙者、性別、年齢、人種、および急性対慢性対大気汚染への暴露などが挙げられる。
【０３４０】
上に記載の本発明の方法は、上皮細胞および癌に限定されないが、任意の病態を診断するために使用され得る。本発明の方法を用いて診断され得る例示的な病態は、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、および腎不全である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：
４３４−４３８（１９９９）、Ｈｅａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ  ４：７３６−７４０（１９９８）、およびＧｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８８：１６７−１７４（２００１）を参照されたい）。腫瘍性の病態は、急性リンパ芽球性白血病、急性もしくは慢性リンパ球性もしくは顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、ヘアリー細胞腫瘍、頭部癌、過形成、増殖性角膜神経腫、上皮内癌、腸神経節細胞腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群様体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、頸部癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、上皮小体癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セミノーマ、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織の肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、およびウイルムス腫瘍であり得る。一実施形態において、甲状腺癌に関連する腫瘍性細胞は検出されない。例えば、５０ｍＬ、４０ｍＬ、３０ｍＬ、２０ｍＬ、または１０ｍＬ未満のサンプル等の患者から採取される細胞サンプルは、例えば、希少細胞等の関心対象となる任意の細胞について濃縮されたサンプルを生成するように、本発明のデバイスによって処理され得る。濃縮サンプルにおいてこの細胞の検出は、その後、当業者が患者における特定の病態の有無を診断するのを可能にする。さらに、サンプルにおいて、内皮細胞に対する、例えば、癌細胞等の細胞の数の比の決定は、診断を行なうのに使用され得る。代替として、例えば、表１に列挙されるもののいずれか等の癌バイオマーカー、または、表１に列挙される任意のマーカーをコードする核酸等の癌関連の核酸の検出は、癌または別の病態の診断を得られ得る。例えば、細胞表面マーカー、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ等のこのようなポリペプチドまたは核酸の発現レベルまたはパターンの分析は、診断を生じ得る。
【０３４１】
細胞検出は、患者を診断するために、例えば、患者の画像研究等の他の情報と組み合わせることができる。例えば、コンピュータ連動断層撮影法、陽電子断層撮影法、または磁気共鳴映像法等を使用してもよい。
【０３４２】
診断はまた、特定の病態に関連する細胞パターンを用いて行なってもよい。例えば、例えば、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を含むサンプル等の濃縮サンプルについて、細胞のサイズ分布を、例えば、癌等の病態に関連する細胞分布と比較することによって、診断を、この比較に基づいて行なってもよい。比較の細胞パターンを、任意の方法によりもたらし得る。例えば、関連研究は、複数の対照の対象（例えば、５０）および関心対象となる病態に罹患する複数の症例対象（例えば、５０）からの細胞サンプルを、例えば、１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞を濃縮することによって処理し、得られたサンプルを分析し、分析の結果を比較することでなし得る。このような研究を行なうために、濃縮された細胞において、例えば、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡレベル等のＲＮＡレベルを分析することは、有用であり得る。代替として、それぞれの症例について濃縮された細胞の数を計数する、または例えば、顕微鏡、細胞計数器、またはマイクロアレイデバイスを用いて、細胞サイズ分布を決定することは、有用である。例えば、希少細胞等の特定の細胞型の存在はまた、同定され得る。
【０３４３】
薬物処置が患者に行なわれると、本発明の方法を用いて薬物処置の効力を決定することは可能である。例えば、薬物処置の前に、患者から採取された細胞サンプル、ならびに薬物療法と同時に、または後で、患者から採取された１つ以上の細胞サンプルは、本発明の方法を用いて処理され得る。それぞれの処理されたサンプルの分析の結果を比較すること
によって、薬物処置の効力を決定することができる。例えば、濃縮デバイスを使用して、他の細胞から１２ミクロンを超える流体力学的サイズを有する細胞、または６ミクロン以上１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を濃縮してよい。上に記載される任意の他の検出または分析は、例えば、特定の細胞型の存在または量の同定を行ない得る。
【０３４４】
サンプル移動デバイスを使用する方法
本発明のサンプル移動デバイスを使用して、サンプルからＣＴＣまたは他の細胞を濃縮し得る。一実施形態において、細胞サンプルは、例えば、容器、官能化された表面を有するふた、およびサンプルモビライザーを含むデバイス等のサンプル移動デバイスに配置される。サンプルを含む容器を、その後、ふたで覆い、サンプルモビライザーを利用して、サンプルを移動し、ふたを取り除く。このようなデバイスを使用し、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞を濃縮し得る。
【０３４５】
例えば、遠心分離等のサンプル移動の任意の型を適用し得る。例えば、１００ｇから１００，０００ｇの遠心力場等の当技術分野に公知の任意の遠心力場を、適用し得る。例えば、遠心力場は、１，０００ｇから１０，０００ｇであり得る。この場の適用は、サンプルにおける遠心力をもたらす。また、例えば、遠心力とは反対の力、さらなる力を適用してよく、さらに、力は、それぞれの力の適用の間の任意の時間間隔で、反復して、交替して適用され得る。
【０３４６】
一般的な考慮
本明細書に記載される方法において、サンプルを、例えば、ある成分の安定化および除去等の精製をして、または精製することなく、利用し得る。一部のサンプルは、デバイスに導入する前に、希釈または濃縮され得る。
【０３４７】
一実施形態において、試薬をサンプルに加え、サンプル内の粒子の流体力学的サイズを選択的に、または非選択的に増加させる。この改変されたサンプルは、その後、障害物アレイを通って送り出される。粒子は膨張し、増大した流体力学的サイズを有するため、さらに大きい、さらに容易に製造されたギャップサイズを有する障害物アレイを使用することは可能である。好ましい実施形態において、膨張およびサイズベースの濃縮ステップは、デバイス上の統合された方法において行なわれる。好適な試薬としては、例えば、脱イオン水、２％  糖溶液、または適切な非水性溶媒等の低張液が挙げられる。他の試薬としては、選択的に（例えば、抗体またはアビジン−ビジオンを通して）または非選択的に結合する、例えば、磁気またはポリマー等のビーズが挙げられる。
【０３４８】
別の実施形態において、試薬をサンプルに加え、サンプル内で粒子の流体力学的サイズを選択的または非選択的に減少させる。サンプルにおいて粒子の不均一な減少は、粒子間の流体力学的サイズの違いを増加し得る。例えば、有核細胞は、細胞を高浸透圧により収縮することによって除核細胞から分離される。除核細胞は、超小型粒子に収縮し得るが、有核細胞は、核のサイズ以下に収縮できない。例示的な収縮試薬としては、高張液が挙げられる。
【０３４９】
代替的な実施形態において、親和性官能化されたビーズおよび他の適切なビーズを使用し、サンプル中に存在する他の粒子に対して、関心対象となる粒子の体積を増加させ、それにより、さらに大きい、さらに容易に製造されたギャップサイズを有する障害物アレイの動作を可能にする。
【０３５０】
流体は、能動的に、あるいは受動的に、デバイスを通り抜けてもよい。流体は、電場、遠心力場、圧力駆動流体流動、電気浸透流、および毛細管作用を用いて送り出され得る。好ましい実施形態において、場の平均方向は、アレイを含むチャネルの壁と平行である。
【０３５１】
サンプル調製
サンプルを、例えば、ある成分の安定化および除去等の操作の有無にかかわらず、本明細書に記載される方法において、利用し得る。一実施形態において、サンプルは、本発明のデバイスに導入する前に、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞について濃縮される。細胞集団を濃縮するための方法は、例えば、親和性機構、凝集、ならびに濃縮に基づくサイズ、形状、および変形能等の当技術分野において公知である。関心対象となる細胞中のサンプルを濃縮するための例示的な方法は、米国特許第５，８３７，１１５号および第５，６４１，６２８号、国際公開第ＷＯ  ２００４／０２９２２１号および第ＷＯ  ２００４／１１３８７７号、および米国公開第２００４／０１４４６５１号に見いだされる。
【実施例】
【０３５２】
（実施例１)
本発明のマイクロ流体デバイスは、コンピュータ援用設計（ＣＡＤ）によって設計され、フォトリソグラフィーによって微細製作された。血液サンプルを、まず、減量し、多くの小型細胞集団を除去した後、標的細胞である希少標的上皮細胞をイムノ親和性捕捉により回収する、２つのステップのプロセスを開発した。該デバイスは、フォトリソグラフィーによって画定され、ＣＡＤで生成した設計に基づいたシリコン基板にエッチングされた。ほぼ標準的な顕微鏡スライドの大きさである、細胞濃縮モジュールは、１４の並列サンプル処理区域と、共通のサンプルおよび緩衝液の入口ならびに産物および廃棄物出口に接続する関連サンプル処理チャネルとを含む。それぞれの区域は、産物の流れに大型細胞を変位することにより、流体力学的サイズによって標的細胞型を濃縮するように最適化される微細製作された障害物のアレイを含む。本実施例において、マイクロチップを、より大きい白血球およびＣＴＣから赤血球（ＲＢＣ）および血小板を分離するように設計した。標的細胞の濃縮された集団を、デバイスを通過する全血から回収した。細胞濃縮マイクロチップの性能は、正常全血中の白血球（ＷＢＣ）からＲＢＣおよび血小板を分離することによって評価された（図５２）。癌患者において、ＣＴＣは、より大きなＷＢＣ分画において認められる。血液を、最小限に希釈し（３０％）、６ｍｌのサンプルを、最高６ｍｌ／時間の流速で処理した。産物および廃棄物の流れは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ「Ａｃ−Ｔ  ｄｉｆｆ」臨床血液分析器で評価され、異なる血液細胞集団を自動的に識別し、サイジングし、計数する。濃縮チップは、ＷＢＣからＲＢＣの分離を達成し、ＷＢＣ分画は、有核細胞の＞９９％の保有、ＲＢＣの＞９９％の減少、および血小板の＞９７％の減少があった。これらの細胞分画の代表的なヒストグラムを図５３に示す。通常の細胞学により、高い濃縮度のＷＢＣおよびＲＢＣ分画を確認した（図５４）。
【０３５３】
次に、上皮細胞を、固定化抗体で官能化されるマイクロ流体モジュールの親和性捕捉によって回収した。抗体被覆され、微細製作された障害物の規則的なアレイを含む単一チャンバーを有する捕捉モジュールを設計した。これらの障害物は、細胞と固定化抗体との間の接触時間を増加させるために、捕獲領域を約４倍増加することによって、および障害物に隣接した層流下で、細胞の流動を減速させることによって、細胞捕捉を最大化するように配置される。捕捉モジュールは、損傷から細胞を保護するために、比較的高い流速であるが、低いせん断の条件下で、操作され得る。捕捉モジュールの表面は、１０％  シラン、０．５％  グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、およびアビジン、次いで、ビオチン化された抗ＥｐＣＡＭで連続的に処理することにより官能化された。活性部位を、ＰＢＳ中の３％  ウシ血清アルブミンで遮断し、低濃度のトリスＨＣｌで反応停止し、低濃度のＬ−ヒスチジンで安定化した。モジュールをそれぞれの段階後、ＰＢＳ中で洗浄し、最終的に乾燥させ、室温で保存した。捕捉性能を、ヒト進行性肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１６５０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−５８８３）で測定した。この細胞株は、それをゲフィチニブに影響を受けやすい状態にするＥＧＦＲのエクソン１９のヘテロ接合１５ｂｐのインフレームの欠失を有する。コンフルエントな培養物からの細胞を、トリプシンで
採取し、生体染色色素のＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（ＣＭＲＡ試薬、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、新鮮な全血中に再懸濁し、様々な流速でマイクロ流体チップにおいて分画した。これらの初期の実現可能性実験において、細胞懸濁液は、赤血球を減量するために細胞濃縮モジュールにおける事前の分画を行なわずに、捕捉モジュールにおいて直接処理した；したがって、サンプルの流れは、正常赤血球および白血球、ならびに腫瘍細胞を含んでいた。細胞を、捕捉モジュールにおいて処理した後、デバイスを、より高い流速（３ｍｌ／時間）で緩衝液で洗浄し、非特異的結合細胞を除去した。接着性上部を除去し、接着細胞を、パラホルムアルデヒドを用いてチップ上に固定し、蛍光顕微鏡検査法によって観察した。細胞回収率を血球計数器による血球数から算出し、代表的な捕捉結果を表４に示す。未分画血液を用いた再構成研究における初期収率は、５％未満の非特異的結合で、６０％を超えた。
【０３５４】
【表４】
2008538282.tif 000025
次に、上に記載されるように、全血に加えられ、サイズ分画および親和性捕捉によって回収された、ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞は、インサイチュでうまく分析された。上皮細胞と白血球を区別するための実験において、０．５ｍｌのフルオレセイン標識ＣＤ４５パン白血球モノクローナル抗体の保存溶液を、捕捉モジュールに移し、室温で３０分間培養した。モジュールを、緩衝液で洗浄し、非結合抗体を除去し、細胞を、１％  パラホルムアルデヒドを用いてチップ上に固定し、蛍光顕微鏡検査法によって観察した。図５５に示されるように、上皮細胞は、障害物および捕捉モジュールの床に結合した。ＣＤ４５パン白血球抗体を用いた流路のバックグラウンド染色は、いくつかの染色された白血球と同様に、明らかに低レベルの非特異的捕捉のため、可視的である。
【０３５５】
（実施例２)デバイスの実施形態
本発明の好ましいデバイスの実施形態の設計を図５７Ａに示し、この設計に関連する３つの好ましいデバイスの実施形態に対応するパラメータを図５７Ｂに示す。これらの実施形態は、血液から上皮細胞を濃縮するのに特に有用である。
【０３５６】
（実施例３)非上皮細胞型の計数の決定
本発明の方法を用いて、ＣＴＣまたは他の上皮細胞以外の細胞型を計数することに基づいて診断を行ない得る。癌の非存在、存在、または進行の診断は、特定のカットオフサイズよりも大きい細胞サンプル中の細胞の数に基づいてもよい。例えば、１４ミクロン以上の流体力学的サイズを有する細胞を、選択し得る。このカットオフサイズは、ほとんどの白血球を除去する。これらの細胞の性質は、その後、下流の分子解析または細胞学的解析により決定され得る。
【０３５７】
分析するのに有用である上皮細胞以外の細胞型としては、内皮細胞、内皮前駆細胞、子宮内膜細胞、または疾患状態を示すトロホブラストが挙げられる。さらに、上皮細胞（例えば、癌細胞）および他の細胞型（例えば、内皮細胞）の個々の計数を決定して、次に上皮細胞の数と他の細胞型の数との間の比を決定することにより、有用な診断情報を提供し得る。
【０３５８】
本発明のデバイスは、図３３Ａ〜Ｄに示されるように、上に記載されるもの等の細胞の標的亜集団を単離するように構成され得る。サイズカットオフは、赤血球、白血球、および血小板を含むほとんどの天然血液細胞が廃棄物へ流れつつ、内皮細胞、内皮前駆細胞、子宮内膜細胞、またはトロホブラストを含み得る非天然細胞が濃縮サンプル中に採取されるように、選択され得る。この濃縮サンプルは、さらに分析され得る。
【０３５９】
したがって、本発明のデバイスを用いて、サイズに基づいて、血液または他の体液から細胞の亜集団を単離することは可能であり、大きな細胞型が標的とされる際、天然血液細胞の大部分の除去を適宜に可能にする。図５６に図式的に示されるように、本発明のデバイスは、濃縮サンプルの細胞の数、または濃縮サンプル中の特定の型（例えば、癌細胞）の細胞の数を決定する計数手段を含み得、濃縮サンプルの細胞のさらなる分析は、診断または他の目的のために有用である追加情報を提供し得る。
【０３６０】
（実施例４)ＥＧＦＲ突然変異の検出方法
癌患者からの血液サンプルを、本発明のデバイスおよび方法（例えば、実施例１のもの等）を用いて処理し、分析し、ＣＴＣを含む上皮細胞の濃縮サンプルをもたらす。本サンプルは、その後、潜在的なＥＧＦＲ突然変異を同定するのに分析される。該方法は、公知の、臨床的に関連するＥＧＦＲ突然変異の同定、ならびに新規突然変異の発見の双方を可能にする。この処理の概要を図５８に示す。
【０３６１】
下記は、ＥＧＦＲ突然変異の検出および確認のための戦略の概要である。
【０３６２】
１）ＣＴＣ  ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを配列決定する
ａ）血液サンプルからＣＴＣを精製する
ｂ）ＣＴＣから総ＲＮＡを精製する
ｃ）逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する
ｄ）結果として得られたｃＤＮＡを用いて、第１および第２のＰＣＲ反応を行い、シークエンシング鋳型を生成する
ｅ）ネステッドＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列ＥＧＦＲエクソン１８〜２１に対するシークエンシング鋳型として使用する
２）ＣＴＣゲノムＤＮＡを用いてＲＮＡ配列を確認する
ａ）血液サンプルからＣＴＣを精製する
ｂ）ＣＴＣからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を精製する
ｃ）ＰＣＲ反応によって、エクソン１８、１９、２０、および／または２１を増幅する
ｄ）リアルタイム定量化対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応において、結果として得られたＰＣＲ単位複製配列を用いて、ＲＮＡ配列決定によって発見された突然変異の配列を確認する
上記に概説されたそれぞれのステップにおけるさらなる詳細は以下の通りである。
【０３６３】
１）ＣＴＣ  ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを配列決定する
ａ）血液サンプルからＣＴＣを精製する。ＣＴＣは、本発明のサイズベースの濃縮および／または親和性精製デバイスのいずれかを用いて単離される。
【０３６４】
ｂ）ＣＴＣから総ＲＮＡを精製する。総ＲＮＡは、その後、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮｅａｓｙキット、または別の製造業者からの類似の総ＲＮＡ精製プロトコルを用いて、単離されたＣＴＣ集団から精製される、代替として、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿が続くグアニジウムイソチオシアネートの均質化等の標準ＲＮＡ精製プロトコルを使用し得る。このような一方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｐ．７．２４による「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）に記載される。
【０３６５】
ｃ）逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。ｃＤＮＡ反応を、逆転写酵素の供給元のプロトコルに基づいて実行する。概して、ｃＤＮＡ反応への入力ＲＮＡの量は、総ＲＮＡの１０ピコグラム（ｐｇ）から２マイクログラム（μｇ）の範囲である。第１の鎖ＤＮＡ合成は、ランダム７ｍｅｒ  ＤＮＡプライマー、またはオリゴ−ｄＴプライマー、または遺伝子特異的プライマーを、ＲＮＡ鋳型に６５℃でハイブリダイズし、次いで、氷上でスナップ冷凍することによって実行する。ｃＤＮＡ合成は、ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＢｉｏＲａｄ）、またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または適切な酵素反応緩衝液と共に別の商業的な製造供給元からの逆転写酵素の添加によって開始する。ｉＳｃｒｉｐｔのために、逆転写酵素反応は、４２℃で３０〜４５分間、次いで、８５℃で５分間、酵素不活性化を実行する。ＣＤＮＡは、ＰＣＲ反応において、使用するまで−２０℃で保存される、またはＰＣＲ反応において即座に使用される。概して、ｃＤＮＡ反応は、２０μｌの最終体積において実行し、１０％（２μｌ）の結果として得られたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応に使用する。
【０３６６】
ｄ）結果として得られたｃＤＮＡを用いて、第１および第２のＰＣＲ反応を行い、シークエンシング鋳型を生成する。逆転写酵素反応からのｃＤＮＡを、関心対象となる領域に対して特異的なＤＮＡプライマーと混合する（図５９）。エクソン１８〜２１の増幅に使用され得るプライマーのセットについて表５を参照されたい。表５では、プライマーセットＭ１３（＋）／Ｍ１２（−）は、プライマーセットＭ１１（＋）／Ｍ１４（−）の内にある。したがって、プライマーＭ１３（＋）およびＭ１２（−）は、プライマーＭ１１（＋）およびＭ１４（−）が、第１ラウンドの伸長に使用される場合、ネステッドラウンドの増幅に使用され得る。同様に、プライマーセットＭ１１（＋）／Ｍ１４（−）は、プライマーセットＭ１５（＋）／Ｍ１６（−）の内にあり、プライマーセットＭ２３（＋）／Ｍ２４（−）は、プライマーセットＭ２１（＋）／Ｍ２２（−）の内にある。ホットスタートＰＣＲ反応は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ−Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＭａｎポリメラーゼ、または他のＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ熱安定性ポリメラーゼを用いて、またはＰｒｏｍｅｇａ  ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅマスターミックス、ＴａｑＭａｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、もしくは他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてホットスタートを行なわずに、行なう。概して、反応体積は、５０μｌであり、ヌクレオチド三リン酸は、それぞれのヌクレオチドに対して２００μＭの最終濃度で存在し、ＭｇＣｌ２は、１〜４ｍＭの最終濃度で存在し、オリゴプライマーは、０．５μＭの最終濃度で存在する。ホットスタートプロトコルは、９５℃で１０〜１５分間の培養で開始し、次いで、９４℃で１分間（変性）、５２℃で１分間（アニーリング）、および７２℃で１分間（伸長）の４０サイクルを行なう。７２℃で１０分間の末端伸長は、ＰＣＲの第２（ネステッド）ラウンドにおいて鋳型として使用される、あるいは、シークエンシング前にＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製されるまで、サンプルを４℃で保存する前に行なわれる。ホットスタートプロトコルが使用されない場合、９５℃の初期インキュベーションは省略される。ＰＣＲ産物が、第２ラウンドのＰＣＲにおいて使用される場合、２μｌ（４％）の初期ＰＣＲ産物を、第２ラウンドの反応において鋳型として使用し、同一の試薬濃度およびサイクルパラメータを使用する。
【０３６７】
【表５】
2008538282.tif 000026
ｅ）ネステッドＰＣＲ単位複製配列を精製し、配列ＥＧＦＲエクソン１８〜２１に対するシークエンシング鋳型として使用する。シークエンシングをＡＢＩ自動蛍光シークエンシング機械、および蛍光ジデオキシヌクレオチド混合物を用いて、Ｓａｎｇｅｒスタイルのシークエンシング反応によって生成された蛍光標識ＤＮＡシークエンシングラダー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌａｄｄｅｒ）によって行なう。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｕｉｃｋＳｐｉｎカラム、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、または他の製造供給元から得られたＰＣ産物精製キットを用いて精製する。ＰＣＲ産物を精製した後、ヌクレオチド濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ７０００分光光度計で決定し、ＰＣＲ産物の濃度は、２５ｎｇ／μｌの濃度に達する。品質管理の尺度として、１．８を超える紫外線吸光度比（Ａ２６０／Ａ２８０）を有するＰＣＲ産物のみが、シークエンシングに使用される。シークエンシングプライマーは、３．２ｐｍｏｌ／μｌの濃度に達する。
【０３６８】
２）ＣＴＣゲノムＤＮＡを用いてＲＮＡ配列を確認する
ａ）血液サンプルからＣＴＣを精製する。上記のように、ＣＴＣは、本発明のサイズベースの濃縮および／または親和性精製デバイスのいずれかを用いて単離される。
【０３６９】
ｂ）ＣＴＣからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を精製する。ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ
ＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ｇＤＮＡキット、もしくは別の市販キットを用いて、または以下のプロトコルによって、精製される。
【０３７０】
１．細胞ペレットは、新たに溶解する、あるいは−８０℃で保存し、溶解の直前に解凍する。
【０３７１】
２．５００μｌの５０ｍＭ  トリスｐＨ７．９／１０ＯｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％ＳＤＳ（ＴＥＳ緩衝液）を加える。
【０３７２】
３．１２．５μｌのプロテイナーゼＫ（ＩＢＩ５４０６、２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、最終
［ＰｒｏｔＫ］＝０．５ｍｇ／ｍｌを生成する。
【０３７３】
４．回転培養器中で、５５℃で一晩インキュベートする。
【０３７４】
５．２０μｌのＲＮａｓｅ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（５００Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ＋２
０，０００Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１、Ａｍｂｉｏｎ  ＃２２８８）を加え、３７℃で４時間培養する。
【０３７５】
６．フェノール（Ｋｏｄａｋ、トリスｐＨ８で平衡化）で抽出し、振盪混合し、卓上遠心分離機中で５分間回転させる。
【０３７６】
７．水相を新しい管に移動させる。
【０３７７】
８．フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＥＭＤ、２５：２４：１比、トリスｐＨ８で平衡化）で抽出し、振盪混合し、卓上遠心分離機中で５分間回転させる。
【０３７８】
９．５０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ＝６を加える。
【０３７９】
１０．５００μｌ  ＥｔＯＨを加える。
【０３８０】
１１．振盪混合する。沈殿したＤＮＡのストリングは、可視化され得る。予想されたＤＮＡ濃度が非常に低い場合、キャリアヌクレオチド（通常、イーストｔＲＮＡ）を加える。
【０３８１】
１２．卓上遠心分離機中で、最大速度で１分間回転させる。
【０３８２】
１３．上澄みを除去する。
【０３８３】
１４．５００μｌの７０％  ＥｔＯＨを室温（ＲＴ）で加える。
【０３８４】
１５．振盪混合する。
【０３８５】
１６．卓上遠心分離機中で、最大速度で１分間回転させる。
【０３８６】
１７．ＴＥを加える前に、１０〜２０分間空気乾燥する。
【０３８７】
１８．４００μｌ  ＴＥにおいて再懸濁する。６５℃で１０分間培養し、その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ上で定量化する前に、室温で一晩放置する。
【０３８８】
ｃ）ＰＣＲ反応によって、エクソン１８、１９、２０、および／または２１を増幅する。ホットスタートネステッドＰＣＲ増幅を、ネステッドラウンドの増幅がない場合を除いて、ステップ１ｄにおいて上に記載されるように実行する。初期ＰＣＲステップは、増幅中、対立遺伝子特異的な情報の欠失の可能性を最小限にするために、対数期中停止され得る。ＥＧＦＲエクソン１８〜２１の伸長に対して使用されるプライマーセットを表６に列挙する（Ｐａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）（２００４）も参照されたい）。
【０３８９】
【表６】
2008538282.tif 000027
ｄ）リアルタイム定量化対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応において、結果として得られたＰＣＲ単位複製配列を用いて、ＲＮＡ配列決定によって発見された突然変異の配列を確認する。ＰＣＲ単位複製配列のアリコートは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル７５００Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機械と共に、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、多重化対立遺伝子特異的定量ＰＣＲ反応の鋳型として使用される（図６０）。ＰＣＲのこのラウンドは、それぞれの関心対象となる突然変異に特異的な初期ＰＣＲ産物の亜区を増幅する。Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲの非常に高い感度を考えると、わずか１０のＣＴＣが単離される場合でさえ、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異状態における完全情報を得ることは可能である。Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、入力ＤＮＡ濃度の８ログを超える対立遺伝子配列の定量化を提供し、したがって、不純集団におけるヘテロ接合突然変異でも、本方法を用いて容易に検出される。
【０３９０】
プローブおよびプライマーセットは、医学文献において報告されている、点突然変異、欠失、および挿入を含む４０を超えるこのような体細胞突然変異を含む、ＮＳＣＬＣ患者におけるゲフィチニブ反応に影響を及ぼすすべての公知の突然変異に対して設計される。例証目的のために、点突然変異の５つに関するプライマーおよびプローブセットの例を、表７に列挙する。一般に、オリゴヌクレオチドは、野生型ＥＧＦＲ  ＤＮＡ配列と突然変異対立遺伝子を識別するために最適化されるハイブリダイゼーション条件で、プライマー最適化ソフトウェアプログラムＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計され得る。Ｈ３５８（野生型）、Ｈ１６５０（１５−ｂｐ欠失、Δ２２３５−２２４９）、およびＨ１９７５（２つの点突然変異、２３６９  Ｃ→Ｔ、２５７３  Ｔ→Ｇ）等のＥＧＦＲ突然変異を持つことが知られている肺癌細胞株から増幅されたＥＧＦＲゲノムＤＮＡを使用して、対立遺伝子特異的Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ反応を最適化する。ＴａｑＭａｎ  ５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、野生型配列または公知のＥＧＦＲ突然変異に対して特異的な対立遺伝子特異的標識プローブを開発する。オリゴヌクレオチドは、マッチとミスマッチを容易に識別する溶解温度を有するように設計され、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ条件を最適化し、野生型および突然変異対立遺伝子を識別する。すべてのＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ反応は、三重に実行される。
【０３９１】
最初に、野生型配列を含む標識プローブは、単一の突然変異プローブを有する同一の反応において多重化する。１つの突然変異対立遺伝子配列対野生型配列の比として結果を表すことは、既定の突然変異を含む、または欠失するサンプルを同定することができる。条件を、既定のプローブセットに対して最適化した後、同一のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲアッセイ内で既定のエクソン内ですべての突然変異対立遺伝子に対するプローブを多重化し、臨床設定において、この解析ツールの使いやすさを増大させることは可能である。
【０３９２】
独自のプローブが、それぞれの野生型対立遺伝子および突然変異対立遺伝子の配列に対して設計される。野生型配列は、５’末端で、蛍光色素ＶＩＣを用いて印を付け、突然変異配列は、フルオロフォアＦＡＭを用いて印を付ける。蛍光消光剤およびＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ部分を、プローブの３’末端に結合する。ＲＯＸは、正規化の目的のために受動的な参照染料として使用される。標準曲線は、野生型配列に対して生成され、相対的な定量化のために使用される。入力細胞集団は、未知で、可変純度であるため、突然変異体の信号の正確な定量化を必要としない。アッセイは、ＡＢＩ製品概要により記載されるように設定され、突然変異の存在は、突然変異対立遺伝子プローブからの信号が蛍光のバックグラウンドレベルを上回る場合に確認され（図６１）、この閾値サイクルは、入力サンプルにおける突然変異対立遺伝子の相対頻度を与える。
【０３９３】
【表７】
2008538282.tif 000028
（実施例５)：白血球におけるＥＧＦＲ発現の非存在
実施例４のプロトコルは、ＥＧＦＲが、標的癌細胞に発現するが、バックグラウンド白血球には発現しない場合、最も有用である。ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡが、白血球中に存在するかどうかを試験するために、いくつかのＰＣＲ実験を行なった。表８に示される、プライマーの４セットは、以下の４つの対応する遺伝子を増幅するように設計された。
【０３９４】
１）ＢＣＫＤＫ（分枝鎖  ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体キナーゼ）−すべての細胞型に発現する「ハウスキーピング」遺伝子、白血球と腫瘍細胞の双方に対して陽性対照
２）ＣＤ４５−白血球に特異的に発現、白血球に対して陽性対照および腫瘍細胞に対して陰性対照
３）ＥｐＣａＭ−上皮細胞に特異的に発現、白血球に対して陰性対照および腫瘍細胞に対して陽性対照
４）ＥＧＦＲ−研究され得る標的ｍＲＮＡ
【０３９５】
【表８】
2008538282.tif 000029
本発明の細胞濃縮デバイス（カットオフサイズ４μｍ）を用いて単離した約９×１０６の白血球および５×１０６のＨ１６５０細胞の総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって単離した。２マイクログラムの白血球およびＨｌ１６５０細胞からの総ＲＮＡを、２０μｌの反応液中の１００ｐｍｏｌのランダム六量体（Ｒｏｃｈｅ）および２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写し、第１のストランドｃＤＮＡを得た。後続のＰＣＲを、全体で２５μｌの混合物の０．５μｌの第１のストランドｃＤＮＡ反応物および１０ｐｍｏｌの順方向および逆方向プライマーを用いて実行した。ＰＣＲは、９５℃で２０秒間、５６℃で２０秒間、７Ｏ℃で３０秒間の４０サイクルに対して実施した。増幅した産物は、１％  アガロースゲル上で分離された。図６２Ａに示されるように、ＢＣＫＤＫは、白血球とＨ１６５０細胞の双方において発現することが認められ、ＣＤ４５は、白血球においてのみ発現し、ＥｐＣＡＭとＥＧＦＲの双方は、Ｈ１６５０細胞においてのみ発現した。図６２Ｂに示されるＥＧＦＲ発現のプロファイルと完全に一致する、これらの結果は、ＥＧＦＲが、癌細胞のみが、信号を発することが期待されるため、白血球と癌細胞の双方を含む細胞の混合物をアッセイするために特に有用な標的であることを確認した。
【０３９６】
（実施例６)低量の標的ＲＮＡを有する、または高量のバックグラウンドＲＮＡを有するＥＧＦＲアッセイ
実施例４に記載されるアッセイの感度を決定するために、様々な量の入力ＮＳＣＬＣ細胞株の総ＲＮＡを、１００ｐｇから５０ｎｇの範囲で試験した。第１および第２のＥＧＦＲ  ＰＣＲ反応の結果（ステップ１ｄ、実施例４）を、図６３に示す。第１のＰＣＲ反応は、１ｎｇの入力ＲＮＡを検出するために十分に感度があることを示しつつ、第２ラウンドは、１００ｐｇ以下の入力ＲＮＡに対する感度が増加した。これは、７〜１０個の細胞に対応し、極めて希釈なサンプルでさえ、本アッセイを用いて、検出可能な信号を生成し得ることを示す。
【０３９７】
次に、１ｎｇのＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＲＮＡを含むサンプルを、１ｎｇから１μｇの範
囲の様々な量の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＲＮＡと混合し、前述同様にＰＣＲ反応に使用した。図６４Ａに示されるように、第１の組のＰＣＲ反応は、増幅がすべての場合に生じるが、偽のバンドが最高の夾雑レベルで現れることを示した。しかしながら、図６４Ｂに示されるように、第２の組のネステッドＰＣＲ反応後、最高の夾雑レベルでさえ疑似バンドなしで、所望の特異的単位複製配列を生成した。したがって、本実施例は、本明細書に記載されるＥＧＦＲ  ＰＣＲアッセイが、標的ＲＮＡが、試験されるサンプルにおいて総ＲＮＡのわずかな分画しか占めない場合でさえ有効であることを示す。
【０３９８】
表９は、様々な細胞のＲＮＡ収量を列挙し、１細胞当たりの収量は、細胞型に依存して、広範にわたって可変であることを示している。この情報は、細胞数に基づいてサンプル中の標的およびバックグラウンドのＲＮＡの量を評価するために有用である。例えば、１ｎｇのＮＣＬ−Ｈ１９７５  ＲＮＡは、約１００の細胞に対応する一方、１μｇのＰＢＭＣ  ＲＮＡは、約１０６細胞に対応する。したがって、上記の実験において最高の夾雑レベルは、ＮＣＬ−Ｈ１９７５ＲＮＡに対するＰＢＭＣ  ＲＮＡの１，０００：１は、実際には、１０，０００：１のＮＣＬ−Ｈ１９７５細胞に対するＰＢＭＣの比に対応する。したがって、これらのデータは、ＥＧＦＲが、１０６もの白血球によって夾雑されたわずか１００のＣＴＣから配列決定され得る。
【０３９９】
【表９】
2008538282.tif 000030
次に、１，０００細胞／ｍｌのＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−標識Ｈ１６５０細胞を加えた全血は、図５７Ｃの捕捉モジュールチップに通過させた。固定サンプルからのＲＮＡ抽出において非効率を避けるために、捕捉したＨ１６５０細胞を、起動後、直ちに計数し、次いで、ホルムアルデヒドで固定せずに、ＲＮＡ抽出のために溶解した。約８００の捕捉したＨ１６５０細胞および＞１０，０００の夾雑した白血球を、０．５ｍｌの４Ｍ  チオシアン酸グアニジン溶液でチップ上で溶解した。溶解物を、０．５ｍｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、担体として、１０μｇのイーストｔＲＮＡの存在下で、１ｍｌのエタノールで沈殿した。沈殿されたＲＮＡを、３０分間、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、その後、フェノール／クロロホルムで抽出し、第１のストランドｃＤＮＡ合成、次いで、ＰＣＲ増幅を行なう前に、エタノールで沈殿させた。これらのステップは、第２の血液サンプルおよび第２のチップを用いて繰り返し行なわれた。Ｈ１６５０および白血球のｃＤＮＡと共にチップ１およびチップ２のＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、２組のプライマーである、ＣＤ４５＿１およびＣＤ４５＿２（表８）、ならびにＥＧＦＲ＿５（順方向プライマー、５’−ＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧ−３’）（配列番号５２）およびＥＧＦＲ＿６（逆方向プライマー、５’−ＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣ−３’）（配列番号５３）を用いてＰＣＲ増幅を行なった。ＥＧＦＲ＿５およびＥＧＦＲ＿６は、Ｈ１６５０細胞において、１３８ｂｐの野生型の増幅断片および１２３ｂｐの突然変異体の増幅断片を生成する。ＰＣＲ産物を、２．５％  アガロースゲル上で分離した。図６５に示されるように、ＥＧＦＲ野生型および突然変異体増幅断片が、高白血球バックグラウンドにもかかわらず、容易に検出され、ＥＧＦＲアッセイが、堅牢であり、高度に精製されたサンプルを必要としないことを示す。
【０４００】
（実施例７)捕捉モジュールに結合された濃縮モジュールにより血液サンプルを処理するためのプロトコル
腫瘍細胞を加えた健常な血液のサンプルを用いて、捕捉モジュールに結合された濃縮モジュールを含む本発明のデバイスを、血液から腫瘍細胞を濃縮し、捕捉する能力に対して試験した。
【０４０１】
血液サンプルを調製するために、ヒト非小細胞肺癌株、ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ１６５０）を、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製のＣＭＲＡ）で染色し、その後、健常な患者からの新鮮な血液（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）に加えた。添加レベルは、１，０００細胞／ｍｌであった。添加した血液を、２：１の比に希釈した（緩衝液に対して血液、ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ）。白血球および腫瘍細胞の双方を、核染色色素であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識し、追加の染色（ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅ）で腫瘍細胞を標識化し、腫瘍細胞と白血球を識別するのに役立てた。
【０４０２】
次に、濃縮モジュールマニホールド、チップ、および配管を設定し、濃縮モジュールチップを、脱気した緩衝液で準備した。添加した血液サンプルを、２．４ｐｓｉの圧力で、濃縮モジュールに通過させ、産物の流速は、６．９１ｍｌ／時間であった。
【０４０３】
産物を捕捉モジュールを通して通過させる前に、産物の特性を示した。産物ごとに希釈係数を考慮すると、当量の全血の１ｍＬ当たりの白血球の数は、７．０２×１０５であった。白血球の除去効率は、９０％であった。腫瘍細胞の収率は、８９．５％であり、腫瘍細胞の純度は、０．１４％であった。
【０４０４】
濃縮モジュールからの産物を、その後、抗ＥｐＣＡＭ被覆した障害物を含んだ捕捉モジュールに通過させた。上皮細胞接着分子を発現する腫瘍細胞を、障害物上に捕捉した。流速は、２．１２ｍｌ／時間であり、実行時間は、１時間であった。該デバイスを、その後、より高速な流速の３ｍｌ／時間で、緩衝液で洗浄し、非特異的結合細胞を除去した。収率は、７４％であった。純度は、決定されなかった。
【０４０５】
これらの実験の結果を、表１０に要約する。
【０４０６】
【表１０】
2008538282.tif 000031
（実施例８)互い違いに配置されたアレイを用いた細胞捕捉
本発明の一実施形態において、ＣＴＣまたは選択されたカットオフサイズよりも大きい他の細胞を、サブアレイのアレイに配列される障害物を含むデバイスを用いて捕捉し得る。サブアレイは、流動線に変動を導入し、障害物と細胞の相互作用を促進するために初期設計された、わずかに互い違い、または不均等な間隔で領域にわたって配置される。本配置の１つの効果は、それぞれのサブアレイが、図６６Ａに示されるように、流路が狭窄した領域が生じることである。図に示されるアレイにおいて、障害物間の規則的なギャップは、４６μｍである一方、狭窄したギャップは、１７μｍである。アレイおよびサブアレイは、任意の所望のギャップサイズ、ならびに規則的なギャップに関して任意の所望の密度の狭窄したギャップをもたらすために変更され得る。
【０４０７】
このような互い違いに配置されたアレイは、ＣＴＣが、ほとんどの他の血液細胞よりも大きい傾向があるため、血液サンプル中のＣＴＣの優先的な捕捉に特に有用である。ＣＴＣまたは他の大型細胞は、細胞捕捉が、アレイ形状に基づいているため、抗体または他の結合部分を含む官能化された表面を必要とせずに、アレイ内に捕捉され得る。したがって、このようなデバイスの製造は、簡素化される。
【０４０８】
本発明の互い違いに配置されたアレイを図６６Ｂに示す。狭窄した流路は、デバイスを通して規則的に分散され、これらの流路は、既定の流体力学的サイズ以上の細胞を捕捉するようにサイジングされ得る一方、このカットオフサイズよりも小さい細胞が留められることなくアレイを通って流れることを可能にする。図６６Ｃに示されるように、大型細胞が、狭窄した流路で止まり、それによって、流路を遮断する場合、より小型の細胞は、遮断されていないより大きな流路を通って周辺を流れることができる。本設計は、均一のアレイに生じ得る詰まりの問題を回避する。
【０４０９】
望ましくは、該デバイスは、ＣＴＣまたは関心対象となる他の細胞が、統計的に、狭窄したギャップの領域に進入し、捕捉される可能性が高くなるように構成される。デバイスは、標的細胞の捕捉の可能性を変える制限された流路の密度を変化させることによって、特定の適用のために最適化され得る。
【０４１０】
一構成において、デバイス出口付近の流路のより大きな割合は、狭窄するように設計され得（図６６Ｄ）、それによって、アレイにおいてほかの場所で捕捉されなかったいずれの大型細胞の捕捉を可能にする。すべての利用可能な狭窄したギャップが、標的細胞によってふさがらない場合、詰まりは、この構成においてもなお回避される。
【０４１１】
本発明の一部のデバイスは、サンプルのハイスループットに適合するために比較的大きな深さ寸法を有するのに対して、他の実施形態においては、深さ寸法はずっと小さくされ、捕捉された細胞が、主に１つの焦点面に認められ、顕微鏡下で、より容易に見える結果になる。図６６Ｅに示されるデバイスにおいて、深さ寸法は、狭窄した流路を形成するように構造化され、単一の焦点面において、細胞の捕捉をもたらす（図６６Ｆ）。捕捉された細胞は、簡易化した表示のために透明な窓の真下にある。このようなデバイスの製造は、例えば、ポリマー基板の射出成形または熱エンボス加工等の様々な手段によって容易に達成され得る。
【０４１２】
捕捉されると、細胞は、例えば、細胞を縮小させる低張液による処置によって放出され、デバイスから放出され得る。放出および回収によって、細胞は、それらの元の容積モル浸透圧濃度に戻され、例えば、分子解析等のさらなる解析に供され得る。代替として、解析は、細胞を放出することなく、デバイス内で実行され得る。
【０４１３】
（実施例９)互い違いに配置されたアレイを用いたＨ１６５０細胞の細胞捕捉
捕捉モジュールチップ（図５７Ｃ）を用いて、Ｈ１６５０肺癌細胞のサンプルを処理した。捕捉モジュールのパラメータは、以下の通りである。チップ寸法は、６６．０×２４．９ｍｍであり、障害物の領域寸法は、５１．３×１８．９ｍｍであり、障害物の直径は、１０４μｍであり、出口寸法は、正面で２．８３×２．８３ｍｍ、背面で１．６６×１．６６ｍｍであり、基板はシリコンであり、エッチ深さは１００μｍである。Ｈ１６５０肺癌細胞を、バフィーコートに１０，０００細胞／ｍｌで添加し、１．６ｍｌ／時間で流
動させた（図６６Ｇ）。およそ１２，７００のＨ１６５０細胞を、デバイスに通過させた。デバイスは、活性領域において約７，２３０の捕捉配置を含んだ。実験後のＨ１６５０細胞の収率は、１６％であり、利用可能な捕捉配置の実質的な部分は、Ｈ１６５０細胞によって占められることを示した。
【０４１４】
（実施例１０)癌細胞のサイズ分布
癌細胞のサイズ分布を決定するために、いくつかの癌細胞株を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２計数デバイスに通過させた（図６７Ａ）。本実験において試験された細胞株は、結腸癌、肺癌、および乳癌細胞を含むＨ３５８、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、ＨＴ２９、およびＭＣＦ７細胞を含んだ。図６７Ａが示すように、これらの細胞株のそれぞれは、ほとんどの白血球よりも大きい細胞からなる。それぞれの癌細胞株のサイズ分布は、互いに類似しており、示される白血球の分布から十分に分離される。癌細胞のサイズ分布の拡大図（図６７Ｂ）は、サイズが、８、１０、または１２μｍ以下のごく少数の細胞のみ有する、それぞれの場合における細胞の一般的なガウス分布を示す（図６７Ｃ）。これらのデータは、サイズに基づく他の血液細胞からのＣＴＣの濃縮の原理に対する強力な裏付けを提供する。
【０４１５】
（実施例１１)顕微鏡スライドを用いた捕捉デバイス
本発明は、様々な細胞捕捉デバイスおよび方法を含む。一実施形態において、本発明の捕捉デバイスは、図６８Ａに示されるように、例えば、ガラス顕微鏡スライド等の官能化表面を利用する。スライドは、標準的な化学反応を用いて、例えば、ＣＴＣ等の関心対象となる細胞型に対して特異的な抗体または他の捕捉部分で官能化され得る。該デバイスは、例えば、１０ｍｌ以上の容量を有し得る、チャンバーの底部に官能化スライドを有する、サンプル流体チャンバーを含む。例えば、血液または血液分画等のいかなる流体も、処理するために、チャンバー内に配置され得る。
【０４１６】
流体サンプル内の細胞は、重力、または任意に遠心分離（実施例１２参照）、または他の力の適用によって、チャンバーの底部に沈降され、官能化表面によって結合される。残りの細胞を回転させたままにしておくために、チャンバーを、ロッキング（図６８Ｂ）または回転（図６８Ｃ）し得る。その後、該チャンバーを洗浄および除去し得、該スライドは、その後、染色、可視化、および／または他のその後の分析に使用可能である。
【０４１７】
このようなデバイスおよび方法のいくつかの利点は、顕著である。例えば、平坦な捕捉表面は、捕捉された細胞の容易な可視化を可能にする。さらに、平坦な表面上の均一な細胞捕捉は、細胞の定量化を簡素化する。加えて、表面に接触する細胞の滞留時間は、他の方法と比較して長く、捕捉効率を改善し、実験の全持続時間を短縮することを可能にする。この持続時間はまた、制限される流速がないという事実を考慮しても短縮され得る。細胞が、デバイスを通って流れないため、それらはまた、流動誘起せん断に曝されない。
【０４１８】
他の利点は、本明細書に記載される構成において、表面積は、一般に、希少細胞の捕捉において限定要因ではない。さらに、光学顕微鏡、または他の可視化技術を用いて捕捉された細胞を解析することは、特に容易であり、形態、オルガネラ特性、または他の細胞特性の解析を可能にする。
【０４１９】
捕捉デバイスは、細胞サンプルまたは他の流体サンプルを処理するための他のデバイスに結合され得、マイクロ捕捉技術に適合する。
【０４２０】
１つの変形において、図６８Ｄに示されるように、２つの追加の流体チャンバーが、デバイスに存在する。空気で充填され得る流体チャンバーを、デバイスの主チャンバー内に流体運動を引き起こすために交互に充填し、空にする。空気チャンバーは、それらを分離
する可塑性の壁を有し、いずれの機構を用いて充填し、空にすることができる。該デバイスは、細胞サンプルまたは他の流体サンプルを移動し、沈降した細胞を回転たままにしておき、官能化表面上の捕捉部位の妨害物を防ぐ。
【０４２１】
上記のデバイスのいずれの捕捉表面も、例えば、小起伏を有する、マイクロポスト、マイクロフィン、および／またはマイクロコルゲーションを含む、マイクロ構造化されたものであり得る。官能化表面は、例えば、微細製作されたシリコンチップ表面またはプラスチック表面等であり得る。この方法は、例えば、異なった捕捉、定量化、および／または多細胞集団の標的のために表面上に多数の、空間的にパターン化された捕捉機能性を提供する（図６８Ｅ）。
【０４２２】
（実施例１２）顕微鏡スライドを用いた遠心分離式捕捉デバイス
本発明の捕捉デバイスを用いる前に、本発明の細胞濃縮デバイスを用いたマイクロ流体ベースの細胞濃縮を行なうことが有利である。例えば、血液サンプルに第１の濃縮ステップを適用することによって、ほとんどの赤血球、白血球、および血小板を除去する。一組の実験において、血液サンプルを、８μｍ、１０μｍ、および１２μｍのカットオフを有する本発明の細胞濃縮デバイスを用いて処理した場合、それぞれの場合に、赤血球および血小板を完全に除去し、白血球濃度をそれぞれ、１．２５×１０５細胞／ｍｌ、２，９００細胞／ｍｌ、および１１１細胞／ｍｌに減少させた。したがって、血液サンプルまたは他の細胞サンプル中の大部分の夾雑細胞を、捕捉ステップ前に除去し、官能化表面上の非特異的沈降を回避するのに役立ち得る。しかしながら、結果として得られた濃縮サンプルは、高度希釈され得、それによって、例えば、ＣＴＣ等の関心対象となる細胞を補足するのに必要な処理時間を増加し得る。
【０４２３】
サンプルを処理するのに必要とされる時間を削減するには、実施例１１に記載されるデバイスを遠心分離と組み合わせて使用してもよい（図６９Ａ）。本方法において、例えば、ＣＴＣ等の関心対象となる細胞は、サンプルが、例えば、Ｎが大きな数（例えば、１，０００以上）である、Ｎ×ｇの高遠心場に暴露される場合、官能化スライドに対して平坦化する（図６９Ｂ）。この遠心分離法は、実質的に、ＣＴＣと結合部分（例えば、抗体）との間の接触位置および領域を増大する。
【０４２４】
細胞沈降速度は、等式によって推測され得る。
【０４２５】
【数１】
2008538282.tif 000032
ｕは速度を示し、ｄは細胞直径を示し、ｐは密度を示し、μは粘度、およびａは加速度、すなわち、重力場もしくは遠心場を示す。パラメータａはＮ×ｇとして表され得、重力の場合にはＮは１に等しく、遠心力の場合にはＮは一般に大きな数（例えば、１，０００以上）である。Ｎが１（すなわち、重力のみの存在下）である場合、直径が１４μｍである細胞が、２ｃｍの高液体レベルのチャンバー内に沈下するのに約１時間かかるが、Ｎ×ｇの遠心場によって、沈降時間はＮ倍減少し、それによって実験を行なうために必要とされる時間を著しく減少させる。
【０４２６】
ＣＴＣを捕捉した後、官能化表面に対して非特異的に結合される白血球または他の夾雑細胞は、チャンバーを反転し、高遠心力に対して再度、それを曝することによって除去され得る（図６９Ｃ）。このステップは、官能化表面に付着した状態である夾雑細胞の数を大いに減少させる。一実施形態において、白血球等の夾雑細胞に対して特異的な抗体は、
関心対象となる細胞を捕捉するのに使用される表面とは反対側の官能化表面に結合され得（図６９Ｄ）、それによって、夾雑細胞を捕捉し、関心対象となる捕捉された細胞の夾雑をさらに最小化する。別の変形において、関心対象となる細胞を捕捉するために使用された官能化表面は、ある角度で傾斜され、遠心力の垂直成分に加えて、平面に沿って細胞を回転させる遠心力成分をもたらし得る（図６９Ｅ）。細胞を回転させる遠心力の成分は、細胞集団を散在させるのに役立ち、細胞捕捉の効力を増大する。
【０４２７】
適用された遠心場は、多数の方法において最適化され得る（図６９Ｆ）。例えば、遠心分離のそれぞれの期間を修正してもよく、その期間としては、「スピンアップ」相（遠心分離の開始から所望の回転速度の到達までの期間）、「スピン時間」（所望の回転速度で遠心分離の期間）、「スピンダウン」（遠心分離を低速し始めてから、停止するまでの期間）、および「静止時間」（回転中の期間）が挙げられる。それぞれの場合に、持続時間、回転速度、および／または回転加速は、適用に適合するように最適化され得る。これは、上に記載のように、前方向および逆方向の双方において、チャンバーを回転することを含む。
【０４２８】
捕捉効率を改善するために、官能化表面は、実施例１１の場合、マイクロ構造化され得る（図６９Ｇ）。
【０４２９】
（実施例１３）捕捉デバイス
障害物（図７０Ａ、および上に記載）を含む本発明の濃縮デバイスにおいて、大型細胞は、通常、障害物との多数の相互作用を有しつつ、小型細胞は、障害物との最小限の接触で、デバイスを通って流れることができる。障害物に配置される表面に付着される抗体または他の結合部分を含む捕捉デバイスは、類似の原理を用いて設計され得、サイズと親和性選択性の双方を組み合わせる。
【０４３０】
障害物の規則的なアレイにおいて、臨界直径は、図７０Ｂに示されるように、ギャップサイズおよび障害物間の距離（障害物偏移）を含む、多くのパラメータに依存する。上に記載されるように、臨界直径よりも大きい細胞が偏向される一方、このパラメータよりも小さい細胞が平均流動方向に移動する。したがって、関心対象となる細胞型（例えば、ＣＴＣの特定型）のサイズに基づいて、臨界直径を最適化し得る。これは、例えば、適切なギャップサイズおよびオフセットを選択することによって、達成され得る。最適化されたデバイスは、効率的な捕捉に非常に低い夾雑を提供し得る。
【０４３１】
一例において、障害物密度は、デバイスを通して変化し得る。例えば、障害物は、デバイスのサンプル入口付近でより低い密度で、または詰まりを防ぐための順序で配置され得る一方、密度は、捕捉を最大化するためにデバイス出口付近で増加され得る。
【０４３２】
臨界サイズを一定に保ちながら障害物の配列を変化させることが可能である。したがって、本発明のデバイスは、流速を増加し、詰まりを減少し、または他の設計目標を達成するために、偏向方向、ギャップサイズ、および／または障害物間の距離がデバイスを通して異なる、種々の障害物アレイを含み得る（図７０Ｃ）。
【０４３３】
一部のデバイスにおいて、双方の標的細胞（例えば、ＣＴＣおよび夾雑細胞（例えば、白血球））は、デバイスの床部に結合する。例えば、これは、シリコン基板のすべての露出面が、一般的に、抗体または他の結合部分で官能化されるような、障害物を含む官能化シリコン基板を含むデバイスにおいて生じ得る。したがって、捕捉デバイスは、沈殿するいずれの細胞が非官能化表面と接触し、結合しないように、逆方向に操作され得る。これは、詰まりの減少をもたらし得、通常、デバイス性能を改善し得る。
【０４３４】
本実施例に記載される捕捉デバイス、または本発明の他の捕捉デバイスはまた、濃縮または他の目的のために使用され得る非官能化領域を含み得る。
【０４３５】
他の実施形態
すべての刊行物、特許、および上記の明細書に言及される特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明に記載の方法およびシステムの様々な修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には、明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関連して記載されているが、請求の範囲に記載されるように、本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されよう。実際には、当業者には明らかである本発明を実行するために記載される様式の様々な修正は、本発明の範囲内であるように意図されている。
【０４３６】
他の実施形態は、特許請求の範囲にある。
【配列表】
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１−１】
2008538282.tif 000033
【図１−２】
2008538282.tif 000034
【図１−３】
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【図２】
2008538282.tif 000036
【図３】
2008538282.tif 000037
【図４】
2008538282.tif 000038
【図５】
2008538282.tif 000039
【図６】
2008538282.tif 000040
【図７】
2008538282.tif 000041
【図８】
2008538282.tif 000042
【図９】
2008538282.tif 000043
【図１０】
2008538282.tif 000044
【図１１】
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【図１２】
2008538282.tif 000046
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008538282.tif 000049
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
2008538282.tif 000070
【図３３Ｄ】
2008538282.tif 000071
【図３４Ａ】
2008538282.tif 000072
【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６６Ｄ】
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【図６６Ｅ】
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【図６６Ｆ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６７Ｃ】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｄ】
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【図６８Ｅ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図６９Ｅ】
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【図６９Ｆ】
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【図６９Ｇ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７１−３】
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【図７１−４】
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【図７２】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５８】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５】
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【図６６Ｇ】
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【図７０Ａ】
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