【事件の表示】
　特許第２８１４４３３号「ｍＲＮＡの翻訳」の請求項１、２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８１４４３３号の特許請求の範囲第１項ないし第２項に記載された発明についての特許を維持する。
【理　由】
I．手続の経緯
　特許第２８１４４３３号の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載された発明についての出願は、昭和６２年６月４日（パリ条約に基づく優先権主張外国調受理　１９８６年６月４日　英国）を国際出願日とする出願であって、平成１０年８月１４日にその特許の設定登録がなされ、その後、平成１１年４月２２日付で中澤恵理より特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１７年１２月１３日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正の適否についての判断
　特許権者は、平成１７年１２月１３日付の訂正請求書により、特許第２８１４４３３号の明細書の訂正を請求しているので、まず、この訂正が認められるか否かについて検討する。
　
１．訂正事項
　
（１）特許請求の範囲第１項に係る記載
「１．下記のi）、ii）及びiii）を含む配列を有するDNA分子：
（i）プロモーター
（ii）RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（但し、ブロウムモザイクウイルスRNA ４の５′−非翻訳リーダー配列を除く）、及び
（iii）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するRNAウイルスに非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、mRNA種を産出するようなもので、上記コード配列の発現産物を産出するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するmRNAの部分によって増強される。」を、
「１．下記のi）、ii）及びiii）を含む配列を有するDNA分子：
（i）プロモーター
（ii）RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（ここで、５′−非翻訳リーダー配列はタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列である）、及び
（iii）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するRNAウイルスに非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、mRNA種を産出するようなもので、上記コード配列の発現産物を産出するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するmRNAの部分によって増強される。」と訂正し、特許請求の範囲第２〜５項を削除する。
　
（２）特許請求の範囲第６項に係る記載
「６．下記のi）、ii）及びiii）を含むDNA配列を細胞中に組込んでなる微生物又は細胞培養物：
（i）プロモーター
（iii）RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（但し、ブロウムモザイクウイルスRNA ４の５′−非翻訳リーダー配列を除く）、及び
（iii）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するRNAウイルスの非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、mRNA種を産生するようなもので、上記コード配列の発現産物を産生するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するmRNAの部分によって増強される。」を、
「２．下記のi）、ii）及びiii）を含むDNA配列を細胞中に組込んでなる微生物又は細胞培養物：
（i）プロモーター
（ii）RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（ここで、５′−非翻訳リーダー配列はタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列である）、及び
（iii）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するRNAウイルスの非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、mRNA種を産生するようなもので、上記コード配列の発現産物を産生するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するmRNAの部分によって増強される。」
と訂正し、特許請求の範囲第７〜１０項を削除する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項（１）及び（２）は、訂正前の必須要件項である請求項１及び６に記載された、発明の構成に欠くことができない事項である「RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（但し、ブロウムモザイクウイルスRNA ４の５′−非翻訳リーダー配列を除く）」を、「RNAウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（ここで、５′−非翻訳リーダー配列はタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列である）」とするものであり、訂正前の特許請求の範囲に記載された「５′−非翻訳リーダー配列」を、「タバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列」に限定し、それに伴って、特定が不要となった「（但し、ブロウムモザイクウイルスRNA ４の５′−非翻訳リーダー配列を除く）」との記載を削除するものである。したがって、この訂正は、特許請求の範囲の減縮、及び明瞭でない記載の釈明を目的とするものと認められる。
　また、訂正事項（２）のうち、ローマ数字の「(iii)」を「(ii)」とする訂正は、誤記の訂正を目的とするものと認められ、請求項の番号を「６」から「２」とする訂正は、請求項の削除に伴う、明瞭でない記載の釈明を目的とするものと認められる。
また、この点は、特許明細書において、実施態様項である請求項４及び９等に記載されていた事項であるから、この訂正は、新規事項を追加するものではなく、また、目的のコード配列の翻訳を増強するという訂正前の本件発明の目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
３．独立特許要件
　次に、訂正後の本件発明（以下、訂正後の特許請求の範囲第１項及び第２項に記載された発明を、それぞれ「訂正発明１」及び「訂正発明２」という。）が、特許出願の際独立して特許を受けることができる発明であるか否かについて、平成１１年８月５日付で通知した取消理由（理由３〜５）に関して検討する。
　
（ａ）取消理由３（１）及び（２）について
該取消理由通知で引用した、刊行物１（Gene Anal. Techn., Vol.3(3), May/June 1986, p.45-52、甲第１号証）に基づく新規性の欠如を理由とする理由３（１）及び（２）は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガプライム配列以外のＲＮＡウイルスの５’−非翻訳領域を使用する場合も含む、訂正前の本件発明が、本件の優先権主張の基礎となった英国出願８６１３４８１号明細書に実施可能に開示されていないために、優先権主張の利益を享受できないことを前提とするものと認められる。そして、今回の訂正により、本件発明は、優先権主張の基礎となった出願において実施可能に開示されているＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列又はその誘導体もしくは部分を用いる場合に限定された。したがって、取消理由の３（１）及び（２）は、その前提を欠くものとなったから、この理由で、本件訂正発明１及び２が独立して特許を受けることができない発明であるということはできない。
　
（ｂ）取消理由４について
次に、該取消理由通知で引用した、刊行物２（FIRST INTERNATIONAL CONGRESS OF PLANT MOLECULAR BIOLOGY 講演要旨集、THE UNIVERSITY OF GEORGIA, BICENTENNIAL, PO-1-147, 1985、甲第４号証）、刊行物３（Science, Vol.231 (1986) 14 March, p.1294-1297、甲第５号証）、及び刊行物４（Eur. J. Biochem. Vol.114 (1981), p.221-227、甲第６号証）、に基づく進歩性の欠如を理由とする理由４について検討する。
　
（ｂ−１）刊行物２記載されている事項
刊行物２は、「植物メッセンジャーＲＮＡの翻訳効率の増強」と題する論文であり、以下の事項が記載されている。
　(a)「真核生物における遺伝子発現の翻訳レベルにおける制御は、メッセンジャーＲＮＡのいくつかの種は他の種より大きな効率で翻訳されるといった、メッセンジャーＲＮＡ翻訳識別能によって特徴付けられる。」（１−３行）
　(b)「加えて、高い翻訳効率を示すメッセンジャーＲＮＡは、翻訳機構の制限要素と効率的に競合するための内在的能力もまた有しているかもしれない。」（３−６行）
　(c)「多粒子性ＲＮＡゲノムをもつ植物ウイルスに由来する外皮タンパク質メッセンジャーＲＮＡはその相対的翻訳効率において卓越しており、そしてアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ＡｌＭＶ４）の二次構造は、一本鎖特異的核酸分解酵素及び二本鎖特異的核酸分解酵素によるＲＮＡ解裂の感受性を決定すること（構造マッピング）によって解析されてきた。」（６−１１行）
　(d)「データは安定的５’二次構造がないことと高い翻訳効率との間に強い相関があることを教示する。」（１１−１３行）
　(e)「ｍＲＮＡ翻訳効率向上における５'ｍＲＮＡ配列及び／又は構造の役割をより直接に決めるために、低い競争能力を持つｍＲＮＡの５'非翻訳リーダー、例えばオオムギアルファアミラーゼのものを、ＡｌＭＶ４（アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４）由来の５'非翻訳リーダーに置き換えるのに組換えＤＮＡ／ＲＮＡ方法が使用されている。」（１３−１７行）
　(f)「キメラＲＮＡの翻訳効率は次いでin vitro翻訳によって決定される。」（１７−１９行）
　(g)「この研究の目的はｍＲＮＡ翻訳識別の分子的基礎を明らかにすると共に、あまり翻訳されないが農業的には重要なｍＲＮＡの翻訳効率を増強するためのシグナル伝達の実現可能性を評価することである。」（１９−２２行）
　
（ｂ−２）対比
　本件訂正発明１を、上記刊行物２に記載された事項と比較すると、両者は、ｍＲＮＡの翻訳効率を向上させることを目的として、ＲＮＡウイルスの５’非翻訳リーダー配列の下流にコード配列を有する核酸である点で共通するが、少なくとも、本件訂正発明１で用いているＲＮＡウイルスの５’非翻訳リーダー配列が、ＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列であるのに対し、刊行物２に記載のものでは、ＡｌＭＶ４（アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４）由来の５’非翻訳リーダー配列である点で相違している。
　
（ｂ−３）相違点についての判断
　次にこの相違点について検討する。
　刊行物３（特に1295頁左欄下から5行〜中欄3行）には、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）のコード配列を外来のＣＡＴに置き換えたものが記載されているが、これはコード配列を変更したものであって、ＢＭＶの５’非翻訳リーダー配列が翻訳増強配列として作用することを示すものではないし、ＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列については何ら記載されていない。
　また、刊行物４（特に221頁要約、226頁右欄15〜17行）には、ＴＭＶの５’端が、翻訳を開始させるリボソーム結合部位を形成すること、ＴＭＶのＳＰＳ分離株の５’Ω’（リーダー）配列が、直鎖状及び環状のいずれも大腸菌７０ｓリボソームに良好に結合することが記載されている。しかし、小麦リボゾームとは直鎖状のもののみが相互作用したことが記載されており（要約）、また、他の配列との比較もされておらず、リボゾームとの結合性が単純に翻訳増強効果をもたらすというわけでもない。したがって、刊行物４には、ＴＭＶオメガプライム（Ω’）配列が翻訳増強配列として作用することは記載されていない。
　さらに、刊行物２自体が、ＡｌＭＶ４由来の５'非翻訳リーダーの翻訳増強効果を確認すべきことを教示してはいるものの、それを実際に確認しているわけではなく、前記記載事項(e)にあるように、翻訳効率と関連する事項として配列と構造の２つの可能性を示し、記載事項(c)及び(d)においては、構造との強い関連について言及している。
　とすると、刊行物２〜４には、ＴＭＶオメガプライム配列が翻訳増強配列として機能することが記載されておらず、該配列を非相同のコード配列と組み合わせて、本件訂正発明１に容易に想到できたことが十分に論理付けできるものとはいえない。
　
（ｂ−４）本件訂正発明の効果
　また、本件特許明細書の表３〜６、１０には、ＴＭＶオメガプライム配列の翻訳増強効果が、他ウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列と比較して示されている。他ウイルス由来のものと同様に、断片化又は塩基の置換を行っていないもので比較すると、ＴＭＶオメガプライム配列を用いたことによる効果は、以下のようなものである。
　本件特許明細書の第３表には、ゼノパス卵母細胞中でのＣＡＴ発現において、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列が、コントロールと比較して翻訳増強効果がみられない（減少している場合すらある）のに対し、ＴＭＶオメガプライム配列では、３５．８〜４６．５倍の翻訳増強効果がみられることが記載されている。
　本件特許明細書の第４表には、小麦麦芽無細胞系におけるＣＡＴ発現において、非キャップ体では、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列がコントロールと比較して最大でも２．１倍であるのに対し、ＴＭＶオメガプライム配列では２．８倍であり、キャップ体では、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列がコントロールと比較して最大でも３．０倍（刊行物２記載のＡｌＭＶ４由来のものでは２．３倍）であるのに対し、ＴＭＶオメガプライム配列では３．０〜３．７倍であることが記載されている。
　本件特許明細書の第５表には、大腸菌無細胞系でのＣＡＴ発現において、非キャップ体で、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列がコントロールと比較して最大でも３．７倍（刊行物２記載のＡｌＭＶ４由来のものでは１．４倍）であるのに対し、ＴＭＶオメガプライム配列では６．６〜９．０倍であることが記載されている。
本件特許明細書の第６表には、タバコ原形質体中のβ−グルコニダーゼ（GUS）mRNAの翻訳増強効果について、非キャップリーダーの場合には、他ウイルス由来のものがコントロールと相違しないのに対し、ＴＭＶオメガプライム配列は１５〜２５倍以上、キャップリーダーの場合は、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来のものが最大でも８倍であるのに対し、ＴＭＶオメガプライム配列は１４〜１８倍であることが記載されている。
　本件特許明細書の第１０表には、形質転換大腸菌中のTrpプロモータコントロール下でのGUSの発現において、コントロールに対して、ＡｌＭＶ４等の他ウイルス由来のものが最大でも３．４倍であるのに対して、ＴＭＶオメガプライム配列は７〜８倍の翻訳増強効果を有している。
　これらの記載をみれば、ＴＭＶのオメガプライム配列を用いる本件訂正発明１の奏する効果は、刊行物２に記載されたＡｌＭＶ４由来の５’非翻訳リーダー配列や他のウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列を用いた場合と比較して、全体としてみて、従来技術からは予測できない顕著なものであるというべきである。
（ｂ−５）小括
　以上のことから、本件訂正発明１は、刊行物２〜４に記載された事項に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　訂正発明２についても同様である。
　
（ｃ）取消理由５（１）〜（３）について
　取消理由５（１）は、本件明細書の第３〜８表の記載から見て、あらゆる５’−非翻訳リーダー配列、コード配列及び翻訳系の組み合わせについて所期の目的が達成できるものではなく、このようなあらゆる組み合わせについて、当業者が容易に実施しうるものとは認められないというものである。
　しかし、上記訂正により、本件訂正発明は、５’−非翻訳リーダー配列として、ＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列又はその誘導体もしくは部分を用いることが発明の構成に欠くことができない事項となった。そして、本件明細書中の記載をみると、ＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列又はその誘導体もしくは部分については、例えば欠失の程度によっては効果が認められない場合も例外的には見られるものの、一般的には翻訳増強効果が認められる。したがって、特許請求の範囲に記載された、「コード配列の発現産物を産出するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するｍＲＮＡの部分によって増強される」組み合わせを選択することは、当業者にとって格別困難なこととはいえない。
　したがって、本件発明が、当業者が容易にその実施をすることができる程度に発明の詳細な説明に記載されていない、ということはできない。
　
　取消理由５（２）は、訂正前の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載された発明について、「５’−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分」がどのようなものかが不明であるから、当業者が容易にその実施をすることができないというものである。しかし、上記訂正により、発明の詳細な説明に、誘導体もしくは部分について具体例をもって記載されているＴＭＶのオメガプライム（Ω’）配列に関するものに限定されたため、この理由によって、本件発明が、当業者が容易にその実施をすることができる程度に発明の詳細な説明に記載されていない、ということはできない。
　
　また、取消理由５（３）は、本件特許明細書中の「８１塩基オリゴヌクレオチド」及び「オメガプライム」の定義が不明であるというものであるが、本件特許の特に第１図には、６７塩基からなる「オメガプライム」配列、及びその両端に制限酵素開裂部位を組み込んだ配列が明確に記載されており、このような理由で、本件発明が、当業者が容易にその実施をすることができる程度に発明の詳細な説明に記載されていない、ということはできない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、訂正後の本件特許の特許請求の範囲第１項及び第２項に記載されている事項により構成される発明が、独立して特許を受けることができない発明であるということはできない。
　したがって、上記訂正は、特許法の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、平成１１年改正前の特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．特許異議の申立てについての判断
　
１．申立ての理由の概要
　申立人は、以下の理由１〜３により、本件特許を取り消すべきであると主張している。
　
理由１：
　本件特許の特許請求の範囲第１、３及び５項に係る特許発明は、以下の甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条１項３号に掲げる発明に該当し、特許を受けることができないものである。
　
理由２：
　本件特許の特許請求の範囲第１〜１０項に係る特許発明は、甲第１及び４〜６号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものである。
　
理由３：
　本件の特許請求の範囲第１〜１０項に係る特許は、本件特許明細書の発明の詳細な説明に不備があるため、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
　
甲第１号証　：　Gene Anal. Techn., Vol.3[3] (1986) p.45-52
甲第４号証　：　FIRST INTERNATIONAL CONGRESS OF PLANT MOLECULAR BIOLOGY 講演要旨集、THE UNIVERSITY OF GEORGIA BICENTENNIAL, PO-1-147, 1985
甲第５号証　：　Science, Vol.231 (1986) 14 March, p.1294-1297
甲第６号証　：　Eur. J. Biochem. Vol.114 (1981), p.221-227
　
２．判断
　これらの理由については、前記II．３．で示したように、本件特許を取り消すべき理由とはいえない。また、他に訂正後の本件発明に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ｍＲＮＡの翻訳
（５７）【特許請求の範囲】
　１．下記のｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）を含む配列を有するＤＮＡ分子：
　（ｉ）プロモーター
　（ｉｉ）ＲＮＡウイルスの５′−非翻訳リーダー配列又はその誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列（
ここで、５′−非翻訳リーダー配列はタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列である
　（ｉｉｉ）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するＲＮＡウイルスに非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、ｍＲＮＡ種を産出するようなもので、上記コード配列の発現産物を産出するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するｍＲＮＡの部分によって増強される。
　
２
　（ｉ）プロモーター
　
（ｉｉ）
ここで、５′−非翻訳リーダー配列はタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）配列である
　（ｉｉｉ）上記翻訳増強配列の下流に、５′−非翻訳リーダー配列が由来するＲＮＡウイルスの非相同のコード配列（但し、適切な開始コドンを含む）
但し、上記プロモーター、翻訳増強配列及びコード配列間の該プロモーターのコントロール下における関係は、ｍＲＮＡ種を産生するようなもので、上記コード配列の発現産物を産生するその翻訳は、翻訳増強配列に相当するｍＲＮＡの部分によって増強される。
【発明の詳細な説明】
　本発明はｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーに関する。
　真核生物及び原核生物が翻訳を開始するメカニズムは、一部共通の特徴を有しているが、他の点では異なっていることが知られている。真核生物のメッセージは機能上モノシストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）であって、翻訳は５′末端で始まり、この末端におけるキャップ構造（ｍ７Ｇ５′ｐｐｐ５′Ｇ…）の存在によって促進される〔シャトキン，セル，第９巻，第６４５頁，１９７６年（Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，９，６４５（１９７６）〕。原核生物のメッセージはポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）であって、５′末端以外の部位で開始しうるが、キャップの存在は翻訳促進に繋がらない。真核生物及び原核生物は双方ともコドンＡＵＧで翻訳を開始するが、但し原核生物はＧＵＧを利用することもできる。双方における翻訳は、開始コドン近くのある配列によって促進される。前核生物の場合には、それは所謂シャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（開始コドンより上流のプリンに富む３〜１０ヌクレオチドの領域）である。真核生物の場合には、それは（ＡＵＧ開始コドンのＡが＋１と表示される場合に）−３位のプリン及び＋４位のＧ残基であるが、更に効果的なチューニング（ｔｕｎｉｎｇ）のためには他の配列も加わる必要がある。これはスキャニング（ｓｃａｎｎｉｇ）モデルの“緩和”バージョン（”ｒｅｌａｘｅｄ”ｖｅｒｓｉｏｎ）の一部であり〔コザック，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第８５７頁，１９８４年（ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，８５７（１９８４）〕、それによって４０Ｓリボソームサブユニットが真核生物ｍＲＮＡの５′末端で結合し、モデルの要求を満たす最初のＡＵＧと出会うまで、即ち６０Ｓサブユニヅトが４０Ｓサブユニットと結合してタンパク質倉成が始まる時点まで、配列をスキャニングし続ける。この点については、下記コザックの文献を参考にすることができる：セル，第１５巻，第１１０９頁，１９７８年；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第９巻，第５２３３頁，１９８１年；及びセル，第４４巻，第２８３頁，１９８６年。
　開始コドンの中及び近辺で必要なこれらの配列以外に、翻訳を複製の面で促進させることが知られた他のｍＲＮＡ領域は存在しない。
　真核生物の転写において、“エンハンサー”領域として知られる配列は転写促進を図ることができる。
　ＲＮＡウイルスは、正もしくは負の一重鎖ＲＮＡ又は二重鎖ＲＮＡを含んでいる。ＲＮＡウイルス群としては、大多数の植物ウイルス（９０％以上）、一部の動物ウイルス及び数種のバクテリオファージがある。
　ＲＮＡウイルスの中で最も広く研究されたものの１つは、タバコモザイクウイルス（以後ＴＭＶと称される）である。ＴＭＶの完全ヌクレオチド配列が知られている〔ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年（Ｇｏｅｌｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ，７９，５８１８（１９８２））〕。ＴＭＶ　ＲＮＡの５′領域は鎖長７０ヌクレチオドのＲＮアーゼＴ１耐性断片として１９６５年に始めて単離されたが〔マンドリー，ツァイトシュリフト・フュール・フェレルブングスレーレ，第９７巻，第２８１
部Ｇ残基を有していなかった〔マンデレル，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第２４３巻，第３６７１頁（Ｍａｎｄｅｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４３，３６７１）〕。この領域〔以後、オメガと称される；マンデレス，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２４３巻，第３６７１頁〕は配列決定され〔リチャーズら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第８４巻，第５１３頁，１０７８年（Ｒｉｃｈａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８４，５１３（１９７８））〕、小麦麦芽リボソームと二重（ｄｉｓｏｍｅ）開始複合体を形成することが示された。１つのリボソームは、１２６キロドルトン（ＫＤａ）のタンパク質コード領域のＡＵＧ開始部位を占めており、第二のものは上流リーダー配列と結合している〔フィリポウィクズ（Ｆｉｌｌｉｐｏｗｉｃｚ）及びヘッニ（Ｈａｅｎｎｉ），プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第３１１１頁，１９７９年；コナルスカら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第１１４巻，第２２１頁，１９８１年（Ｋｏｎａｒｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１４，２２１（１９８１））〕。リボソーム会合におけるオメガの役割を支持するもう１つの最近の証拠は、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及び共同研究者の脱外被（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）／遺伝子発現データからきている〔ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー，第６６巻，第１２０１頁，１９８５年（Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，１２０１（１９８５））及びＵＣＬＡシンポジウム，第５４巻，第１５９頁，１９８７年（ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，５４，１５９（１９８７））で差違検討されている〕。ＴＭＶ粒子が５′末端へのリボソームの結合及び３′末端方向へのそれらの翻訳移動によって脱外被されていることは、様々なインビトロ翻訳系で観察された。
　ＲＮＡウイルスの５′領域はｍＲＮＡの翻訳エンハンサーとして機能することが、ここに発見されたのである。
　第一面として、本発明はウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）を含むｍＲＮＡを提供するが、このｍＲＮＡはリーダー配列を供与するウイルスに由来しない下流配列も含んでいる。
　第二面として、本発明はウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的なＤＮＡ配列を提供する。
　第三面として、本発明は、プロモーター、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を含んでいるＤＮＡ配列を提供する。本発明はこのようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターをも提供する。
　第四面として、本発明は、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）における、ＲＮＡとしての又は相補的ＤＮＡとしての、即ち５′−リーダーＲＮＡがｍＲＮＡと接続している場合のｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーとしての用途を提供する。
　配列決定されたほとんどのＲＮＡウイルスは、５′−リーダー配列、即ち最初の開始コドンまでの（但し、それを含まない）５′末端における配列を含んでいる。いずれのＲＮＡウイルスからの適切な５′リーダー配列も、本発明の翻訳エンハンサーとして使用可能である。
　前記のように、ＴＭＶの５′−リーダー配列＋ＡＵＧ開始コドンはオメガとして知られており、かつそのヌクレオチド配列も公知であるため（リチャーズら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，第８４巻，第５１３頁，１９７８年）、ｃＤＮＡは合成することができる。ＴＭＶのオメガプライム（Ω′，第１図参照）配列は、本発明の好ましい翻訳エンハンサーを表わしている。
　下記のような他のＲＮＡウイルスの５′リーダー配列による翻訳増強に関する情報も利用可能である：
　カブ黄斑モザイクウイルスゲノムＲＮＡ（フィリポウィクズ及びヘッニ，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第３１１１頁，１９７９年）、ブロウム（ｂｒｏｍｅ）モザイクウイルスＲＮＡ３、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年）；ラウス肉腫ウイルス〔ジェイ・エル・ダーリックス（Ｊ．Ｌ．Ｄａｒｌｉｘ）ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１０巻，第５１８３頁，１９８２年〕。
　いずれの具体的ケースにおいても、翻訳エンハンサーとしての機能が調節されるもののそれが損われないような方法で天然５′−リーダー配列を変えることは、ほぼ確実に可能であろう。このような変異体は本明細書において“誘導体”と呼ばれているが、天然配列の誘導体及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を構成している。天然５′リーダー配列（又は誘導体配列）の一部のみが翻訳増強を起こすために必要とされるケースもあるであろう。配列のこのような一部は本明細書において“部分”と呼ばれているが、天然配列もしくはその誘導体の部分及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を形成している。
　いずれの具体的ケースにおいても、ＲＮＡウイルスの５′リーダーのヌクレオチド配列の決定は、公知かつ易利用性の技術を用いる当業者の技術的範囲内にあるべきである。同様に、翻訳増強のための必要な天然５′−リーダー配列の一部及び修正もしくは削除されうる配列の同定（即ち、天然配列の誘導体及び部分の同定）は、ルーチン的実験により決定されうる問題である。
　ＲＮＡウイルスの５′リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）は、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて適切なｍＲＮＡの上流にそれらを結合させることによって、それ自体を本発明の翻訳エンハンサーとして使用することができる。５′−リーダー配列は下流ｍＲＮＡの開始コドンのすぐ隣であってもよいし、又は介在配列によってそれから離されていてもよい。しかしながら、相補的ＤＮＡの形で５′−リーダー配列を用いることが好ましい。ｃＤＮＡは望ましいいかなる方法でも得ることができる。しかしながら、問題の５′リーダー配列の比較的短い鎖長を考慮すれば、ｃＤＮＡを化学的に合成することが通常最も好都合であろう。ｃＤＮＡは通常発現ベクターに組込まれる。発現ベクターは、ベクター中に含まれているそれらのＤＮＡ配列を発現させることができ、かつそのＤＮＡ配列がそれらの発現を行なわせうる他の配列と作働可能に結合せしめられているのであれば、いかなるベクターであってもよい。発現ベクターは、プロモーター、ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでの（但しそれを含まない）ＲＮＡウイルスの５′−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を有するＤＮＡ配列を通常含んでいる。オープン読取枠は通常重要な１種以上のタンパク質についてコードしている。発現ベクターは、ＤＮＡ配列が転写及び翻訳により発現される宿主細胞中に安定的に又は一時的に直接組込まれる。安定的発現の場合には、ベクターはエピソームとして又は染色体ＤＮＡの必須部分として宿主中で複製可能でなければならない。又は、発現ベクターはインビトロで転写させることができ、その際にはＲＮＡが一時的発現のために細胞中に直接組込まれる。
　本発明の翻訳エンハンサーは、ｍＲＮＡの翻訳能力を高めることが望まれるいかなる状況下においても使用可能である。しかしながら、エンハンサーの効果はそれが存在しなければ不十分にしか翻訳されないｍＲＮＡの場合において最も著しいことに留意すべきである。したがって、本発明のキャップもしくはエンハンサー又は双方の付加は翻訳を促進させることになる。既にキャップを有しているｍＲＮＡの場合であっても、本発明のエンハンサーの効果はなお存在している。
　本発明の翻訳エンハンサーは、例えば植物細胞、細菌及び動物細胞のような多数の異なるタイプの発現系において有効であるが、但し特定のエンハンサーは他の系よりむしろ１つの系とより適合するようである。例えばインビドロ試験時におけるＴＭＶのオメガ配列はウサギ網状赤血球溶解物系の場合よりも小麦麦芽系及び大腸菌（Ｅｓｃｈｊｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）の場合により大きな増強性を示すようであるが、翻訳の増強自体は３種すべての系で観察される。特定のエンハンサーと特定の発現系との適合性は、通常当業者の技術的範囲内に十分属する事項であろう。
　一般的に、本発明の翻訳エンハンサーは、農業を含む商業面に対する生物又は細胞系の価値がその天然遺伝子又は人工産生遺伝子の１つの発現レベルによって決定される場合であれば、いずれにおいても利点を生かしつつ用いることができる。
　（ｉ）遺伝子工学生物又は細胞系で商業的に有用なタンパク質の産生に際して。
　（ｉｉ）酵素で触媒される中間代謝産物の産生速度が特定酵素の合成速度を増加させることによって高められうるような発酵に際して。
　（ｉｉｉ）ウイルス感染の影響がウイルス弱毒体との前接触によって抑制させることができ、かつ保護を付与する成分の産生レベルを増加させることにより保護レベルを高めることが有利であるようなウイルス交差保護に際して。例えば植物は、ウイルス外被（ｃｏａｔ）タンパク質についてコードするＴＭＶ　ＲＮＡ部分のｃＤＮＡコピーを含むアナロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）遺伝子工学株にそれらを接触されることによってＴＭＶ感染から保護することができる。植物ゲノムに挿入された細菌ｃＤＮＡは、ウイルス自体による感染から植物を保護する外被タンパク質を連続的に発現する。
　（ｉｖ）除草剤耐性等の性質が植物の中間代謝の人工的修正によって付与されるような植物の遺伝子工学に際して。
　（ｖ）例えば、部分的クローンの発現産物に対する抗体を産生させることが望まれている場合における、遺伝子の部分的クローンの発現に際して。
　本発明は下記実験操作によって更に詳細に説明されている。
実験
　ｍＲＮＡ
　本発明の態様のキメラｍＲＮＡを、第１図で示されているように、下記方法で産生した。
　ＴＭＶ　ＲＮＡブルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ）株の配列を用いて（ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年）、１２６ｋＤａオープン読取枠のＡＵＧ開始コドンの上流において５′キャップ（ｍ７Ｇｐｐｐ及び隣接Ｇ残基）を含まない６７塩基配列に対して相補的なＤＮＡ配列を含む８１塩基オリゴヌレオチドを合成した。この配列はオメガプライムと呼ばれている。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位をこのオリゴヌクレオチドの５′末端に組込み、かつＳａｌ　Ｉ部位を３′末端に組込んだ。オメガプライム配列の３′末端における１３塩基及びＳｅｌ　Ｉ部位を含む２０塩基の第二オリゴヌクレオチドを、第二鎖合成用のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として合成した。アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）後、第二鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて完了させた。
　得られた二重鎖８１ｂｐ断片をＨｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓａｌ　Ｉで消化させて一重鎖付着端をもつ７７ｄｐ断片を作成し、ｐＵＣ１９の対応部位に挿入した。合成の結果ＴＭＶのオメガプライム配列が正しい向きをしているという事実は、ジデオキシ鎖ターミネーション法〔サンガ（Ｓａｎｇｅｒ）ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７４巻，第５４６３頁，１９７７年〕を用いた配列分析によって立証された。次いで、ＴＭＶのオメガプライムを含む断片をプラスミドｐＪ　ＩＩ　１のＨｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓａｌ　Ｉ部位に組込み、ｐＪ　ＩＩ　１０１を得た。ｐＪ　ＩＩ　１は、ＢａｍＨ　Ｉ断片としてのアセンブリー（ａｓｓｅｎｂｌｙ）配列のＴＭＶ源をｐＳＰ６４の対応部位に挿入し〔メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第７０３５頁，１９８４年〕、かつＳｍａ　Ｉ部位をＢｇ１　ＩＩ部位に変えることにより〔ストリートら，バイオロジー，第１５５巻，第２９９頁，１９８６年（Ｓｌｅａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５５，２９９（１９８６））〕得られる。
　Ｔｎ９のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含むｐＣＭ１から７７９ｂｐＳａｌ　Ｉ）末端断片〔クローズ及びロドリゲス，ジーン，第２０巻，第３０５頁，１９８２年（Ｃｌｏｓｅ　ａｎｄ　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｇｅｎｅ，２０，３０５（１９８２））〕をｐＪ　ＩＩ１及びｐＪ　ＩＩ１０１のＳａ１　Ｉ部位に組込み、それぞれｐＪ　ＩＩ２及びｐＪ　ＩＩ１０２を得た。Ｔｎ５のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴ　ＩＩ）を含むｐＭＫＮＲ−Ｈからの１．２７ｋｂ　Ｂｇ１　ＩＩ／Ｓａ１　Ｉ断片〔ギャリーら，ジャーナル・オブ・バイテリオロジー，第１６１巻，第１０３４頁，１９８５年（Ｇａｌｌｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１６１，１０３４（１９８５））〕をクレノウ断片でプラント末端化し、ｐＪ　ＩＩ１及びｐＪ　ＩＩ１０１のＡｃｃ　Ｉ部位に組込み、それぞれｐＪ　ＩＩ３及びｐＪ　ＩＩ１０３を得た。ＣＡＴ及びＮＰＴ　ＩＩ双方の正確な配向性は制限断片分析によって立証された。
　ｐＪ　ＩＩ２及びｐＪ　ＩＩ１０２をＢｇ１　ＩＩでかつｐＪ　ＩＩ３及びｐＪ　ＩＩ１０３をＥｃｏＲ　Ｉで直鎖化後、各々のＲＮＡ転写体をＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼの使用により産生した。各々のキャップ体も、キャップ転写体の対応的産生を確保するＧｐｐｐＧ及びＳＰ６ポリメラーゼの反応条件を用いて産生した。キャップ及び非キャップ反応からのＲＮＡ並びにオメガ配列をもつ又はもたない構造体に関する同量産生は、ホルムアルデヒド−アガロースゲルを変性させることによって立証された。
　同量の様々なＣＡＴ含有転写及びＮＲＴ　ＩＩ含有転写体を標準的反応条件下でウサギ網状赤血球溶解物（ＭＤＬ）、小麦麦芽Ｓ−３０（ＷＧ）及び大腸菌Ｓ−３０のインビトロ翻訳系に加えた。得られたポリペプチド産物を３５Ｓ−メチオニンで標識した。
　第２図及び第３図は、ＭＤＬ（第２図，トラック１〜１１）、ＷＧ（第２図，トラック１２〜２２）及び大腸菌（第３図Ｒ＞図）からの翻訳産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析について示している。第２図において、鋳型添加物は：トラック１及び１２がＨ２Ｏ（内在性翻訳）；トラック２及び１３がＢａ１　ＩＩ直鎖化ｐＪ　ＩＩ１０２　ＤＮＡ；トラック３及び１４がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４及び１５がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック５及び１６が５′キャップＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック６及び１７が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック７及び１８がＥｃｏＲ　Ｉ直鎖化ｐＪ　ＩＩ１０３　ＤＮＡ；トラック８及び１９がＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡ；トラック９及び２０がオメガプライム−ＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡ；トラック１０及び２１が５′キャップ−ＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡ；トラック１１及び２２が５′キャップ−オメガプライム−ＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡであった。１４Ｃ標識マーカータンパク質〔アメルシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎｏｎａｌ，ｐｌｃ）〕はトラックＭに加えた。キロドルトン（ｋＤａ）としてのそれらの各々の大きさは左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートラジオグラフィーに付した。第３図において、鋳型添加物は：トラック１がＨ２Ｏ（内在性翻訳）：トラック２がＢｇ１　ＩＩ直鎖化ｐＪ　ＩＩ１０２　ＤＮＡ；トラック３がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック６が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック７がＥｃｏＲ　Ｉ直鎖化ｐＪ　ＩＩ１０３　ＤＮＡ；トラック８がＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡ；トラック９がオメガプライム−ＮＲＴ　ＩＩ　ＤＮＡ；トラック１０が５′キャップ−ＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡ；トラック１１が５′キャップ−オメガプライム−ＮＰＴ　ＩＩ　ＲＮＡであった。１４Ｃ標識マーカータンパク質はトラックＭに加え、それらの大きさ（ｋＤａ）は左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートジオグラフィーに付した。大腸菌Ｓ−３０系は転写活性系であるが、天然大腸菌ＲＮＡポリメラーゼはＳＰ６プロモーターを認識しえないことに留意すべきである。
　下記第１表はオメガプライム配列の促進効果について示している。第２図及び第３図に示されたゲルからゾーンを取出し、翻訳産物の各バンドにおける放射能を測定し、オメガプライム配列を含まないＲＮＡからの放射能に対して各々の場合データを標準化した。この方法でデータを表現すると、キャップ単独による何らかの促進効果は除かれ、オメガプライム配列の促進効果のみが示される。
考察
　ＴＭＶのオメガプライム領域の存在は、キャップ又は非キャップ状態でＣＡＴ又はＮＰＴ　ＩＩ配列を含む転写体の発現を促進させる。促進は翻訳効率の悪いＮＰＴ　ＩＩ転写体を場合に最も著しい。このように、ＮＰＴ　ＩＩ遺伝子を含むＴｎ５断片は、ＮＴＰ　ＩＩ遺伝子のＡＵＧ開始コドンのすぐ上流に更にＡＵＧを有している。しかも“コザック側（Ｋｏｚａｋ　ｒｕｌｅ）”（これに関するコザックの論文参照）によれば、ＮＰＴ　ＩＩ開始コドン近辺の領域は翻訳開始能の乏しいシグナルを構成していることを示唆する。ＷＧ及びＭＤＬの場合（第２図，第８列及び第１９列）で観察されるように、キャップ又はオメガプライムのないＮＰＴ　ＩＩ転写体はほとんど機能していない。キャップ又はオメガプライムの付加は翻訳を改善するが、オメガプライムの存在はキャップ単独の存在よりも優れた促進効果を有している。大腸菌翻訳メカニズムは、キャップ依存性でないものの、オメガプライム配列の存在によって著しく促進される（第３図Ｒ＞図，第４、６、９及び１１列）。大腸菌の場合において、ＣＡＴ又はＮＰＴ　ＩＩ　ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加してもその翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップＣＡＴ又はＮＰＴ　ＩＩ　ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると著しく増強された。
　ＣＡＴ遺伝子ｍＲＮＡは、たとえキャップ又はオメガプライム配列を有していない場合であっても、真核生物系においてはより効果的に機能する。５′末端から最初のＡＵＧはＣＡＴの開始コドンであって、開始コドン中の及びその近辺の配列は“コザック則”に十分合致している。このことは、更に著しく低いｍＲＮＡ濃度が利用可能な３５Ｓ−メチオニンプールの消費を防ぐために必要とされるＭＤＬ系の場合に最も明らかである。その際に驚くべきことではないが、ＣＡＴ　ｍＲＮＡにおけるオメガプライム配列の存在は促進的でなかった。ＭＤＬはＷＧほどキャップ依存性でないと考えられるが、しかしながら、ＮＰＴ　ＩＩ転写体上におけるキャップの存在はわずかに促進効果を有しており（第２図，第８列及び第１０列）、一方ＣＡＴ転写上におけるその存在はさほど効果がなかった（第２図，第３列及び第５列）。ＣＡＴ　ｍＲＮＡ単独ではＷＲ系において著しく低い活性しかなかった。結論として、キャップもしくはオメガプライム配列の存在又は双方の存在は非常に促進的であった（第２図，第１４〜１７列）。ＷＧにおいて、ＮＰＴ　ＩＩ　ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加しても（第２図，第２０列及び第２２列）、その翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップ又は非キャップＮＰＴ　ＩＩ　ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると（第２図，第１９列及び第２１列）著しく増強された。
　したがって、オメガプライム配列の存在は真核生物系（ＭＤＬ及びＷＧ）及び原核生物系双方において翻訳を増強する。このことはＴＭＶ粒子の脱外被能と一致し、ＲＮＡは真核生物又は原核生物の翻訳メカニズムによって翻訳される。オメガプライム配列は、キャップ単独の存在の場合よりも転写体の発現に関して通常高い促進効果を有している。しかも、オメガプライム配列は、例えば原核生物系及びある程度ＭＤＬ系において、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）では効果のない条件下で翻訳を増強する。
継続実験操作
　ＣＡＴ　ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構造体を前記と同様の方法で作成したが、最初の合成ＤＮＡ配列は必要なＲＮＡを生じうるように選択しておいた。第４図に示されているように、５つの欠失体（Δ１〜Δ５と表記されている）、１つのＡ→Ｃトランスバージョン体（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）及び１つの〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換体（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）があった。
　ＣＡＴ　ｍＲＮＡを含む別のキメラＲＮＡ構造体を、ＴＭＶ（Ｕ１，ブルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ）又は普通株）以外の下記ウイルスの５′−リーダー配列を用いて同様の方法で作成した：ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単離物）、カブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３（ＢＭＶ３）、ラウス肉腫ウイルス部分リーダー（ＲＳＶ）及びアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（Ａ１ＭＶ４）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図は第５図〜第９図にそれぞれ示されている。
　ＲＮＡ構造体の他の１組を同様の方法で製造したが、但しＣＡＴの代わりに大腸菌リポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いた。用いられたリーダー配列は、ポリリンカー（比較目的用）もしくはＵ１オメガ（即ち、ＴＭＶからのオメガプライム）又はオメガプライムの誘導体もしくは部分、及び前記のような他のウイルスのリーダーであった。ＧＵＳ遺伝子は、人工的に“良好な”コザックの配列関係（ｃｏｎｔｅｘｔ）（第９表参照）又は天然の“悪い”コザックの配列関係においてｐＲＡＪ２３５／２４０からのＳａ１　Ｉ断片として用いた〔ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら，プロシーディンクギ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年〕。リーダー配列及び制限部位地図は第１０〜第１３図に示されている。リポーター遺伝子の発現は、ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年に記載されているような螢光測定法により調べた。
　前記３つのインビトロ翻訳系に加えて、下記２つのインビボ系を用いたゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞の微量注入及びタバコ〔ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）のキサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）種〕葉肉原形質体のエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）。それぞれの操作は下記のとおりであった：
　各合成ＳＰ６　ｍＲＮＡ（又はそれらの対応ＤＮＡ鋳型）２ｎｇを標準的方法〔コルマン・エー，ハーメス・ビー・デー及びヒギンズ・エス・ジェイ（編集），転写及び翻訳：実用的アプローチ，ＩＲＬプレス，オックスフォード，第２７１頁，１９８４年（Ｃｏｌｍａｎ　Ａ．Ｉｎ　Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．（ｅｄｓ．），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２７１（１９８４））〕に従い３０のバッチ中の第６期のＸ．ラエビス卵母細胞の細胞質に微量注入した。卵母細胞を修正バース塩水（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂａｒｔｈｓ′　Ｓａｌｉｎｅ　ＭＢＳ）中で１８時間インキュベートし、かかる後蒸留水で簡単に洗浄した。ゼノパス卵母細胞の抽出物は、１０ｍＭ　ＤＴＴ（１７μｌ／卵母細胞）含有のｐＨ７．４の０．２５ＭトリスＨｃｌ中に各サンプルを再懸濁し、しかる後１５秒間超音波処理することによって調製した。不溶性物質を１５分間の微量遠心分離によって除去し、卵母細胞と同数得られた抽出物分を公表された方法でＣＡＴ又はＧＵＳ活性について分析した（ＧＡＴ：ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１５巻，第３２５７頁、１９８７年）；ＧＵＳ：ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）。
　葉肉原形質体をＮ．タバクム（キサンチ種）の葉から分離し、０．７Ｍマンニトール中で存在した。原形質体（１０６）を６０ｘｇで３分間遠心分離し、ＲＮＡ（８μｍ）含有の氷冷０．７Ｍマンニトール１ｍｌ中に再懸濁し、エレクトロポレーション用セルに移し、セルに５０ｎＦコンデンサーを取付けることによって単一電圧パルス（２．５ｋＶ／ｃｍ）を加えた。パルスは速い立上り時間（１μｓ以下）を有しかつ半減時間約５μｓの指数減衰性を有していた。エレクトロポレーション処理原形質体を０〜４℃で１０分間保存した。０．７Ｍマンニトール０ｍｌを加え、原形質体を６０ｘｇで３分間の遠心分離によって回収した。次いで原形質体を培地中に再懸濁、９ｃｍ径ペリト皿中２５℃で２１時間インキュベートした。
　エレクトロポレーション処理原形質体の各サンプルを、ＣＡＴアッセイの場合には２ｍＭロイペプチン及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有のｐＨ７．４の０．２５ＭトリスＨＣｌ又はＧＵＳアッセイの場合には１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール含有のｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム１５０μｌ中で沈降させ、再懸濁し、超音波処理した。抽出分を室温又は４℃において１０，０００ｘｇで１０分間微量遠心分離した。
　第１４図は、エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ　ＲＮＡの発現に関してのオメガプライムの効果について示している。各原スポットは５×１０４の生存原形質体に相当する抽出物を含んでいた。各サプルに関する基質（１４Ｃ−クロラムフェニコール）からそのモノアセチル化体（左側に表示）への変換率（％）はトラックの上部に示されている。エレクトロポレーション処理ＲＮＡ又は標準は：トラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラック２がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック３がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４が５′キャップ−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック６がトラック１の同量抽出物に加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック７が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを２日間オートラジオグラフィーに付した後、除去し、モノアセチル化産物（３−Ａｃ／１−Ａｃ）に相当する１４Ｃ標識スポット中の放射能について測定したが、変換率％データは抽出物中の関連ＣＡＴ活性を表わしている。オメガプライム（＋／５′キャップ）はＣＡＴ　ＲＮＡ発現に関して最も促進的であった。
　第１５図は、Ｘ．ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップＣＡＴ　ＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果について示している。同量の各ＣＡＴ　ＲＮＡ構造体又は直鎖ＤＮＡ鋳型（２ｎｇ）を完全に卵母細胞１個当たりで注入した。同量の卵母細胞抽出物（０．３×細胞に相当する）を他に言及のない限り各ケースにおいて分析した。１４Ｃ−クロラムフェニコールからそのモノアセチル化体への変換体（％）は各トラックの上部に示されている。トラック５及び６において、ジアセチル化体への変換率（％）は＊で示されている。微量注入されたＲＮＡ又は標準は：トラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラック２がＢｇｌ　ＩＩ直鎖化ｐＪ　ＩＩ１０２；トラック３がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック６が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック７が２０倍希釈抽出物であること以外はトラック５と同様；トラック８が２０倍希釈されていること以外はトラック６と同様；トラック９がトラック１の同量抽出物に加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック１０が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを室温で１８時間オートラジオグラフィーに付した後、関連１４Ｃ標識スポットを取出してカウントした。
　下記表は更に得られた結果について示している。
　すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。
　上記結果は、オメガプライムがＣＡＴの翻訳を促進させることを示している。欠失体１〜５は、この効果を完全に消失させることなく低下させている。同様のことがＡ→Ｃトランスバージョン体にもあてはまる。〔Ｕ〕ｎ置換体は、あるとしてもほとんどが効果をもっていない。
　すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。
　オメガＵ１はＴＭＶ（ブルガレ）の標準株に由来する。
　オメガＳＰＳはＴＭＶのトマト株に由来する。
ＴＹＭＶ：カブ黄斑モザイクウイルスリーダー
ＢＭＶ３：ブロウモザイクウイルス
ＲＮＡ３ＲＳＶ：ラウス肉腫ウイルスからの部分リーダー配列
ＡｌＭＶ４：アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４
　前記結果はＴＭＶ　Ｕ１由来オメガプライムがこの系においてＣＡＴ　ＲＮＡの翻訳を促進することを示している。ＴＭＶトマト株オメガプライムも同様であるが、但しやや劣っている。他のウイルスリーダーはさほど又は全く効果がなく、ＴＹＭＶリーダーは阻害的であるかもしれない。
注：これらの数値は、ＣＡＴメッセージの５′未満の様々な配列の付加によって生じる翻訳の促進率を比較したものである。翻訳はキャップのある又はキャップのないメッセージに関して行われた。各欄は（第２表及び第３表のように）独立したゲルから切除回収された放射性ＣＡＴタンパク質の収率を示している。各バンドを切出し、カウントし、かつｍＲＮＡが未修正ＣＡＴメッセージであるバンドに対して標準化した。
　前記結果は、オメガプライムが５′キャップの存在又は非存在下でこの系において促進させることを示している。他のウイルスリーダー配列及びオメガプライムの誘導体もしくは部分は翻訳を様々な程度に増強させるが、但しオメガプライム自体よりも優位に優れているケースはまれである。
　上記結果は、オメガプライム、その誘導体の一部及びトマト株オメガプライムが翻訳を最大に促進させることを示している。他の配列も大半は、但し異なる程度で促進させる。大腸菌は翻訳のために５′キャップを要しない。
（＊構造体は５′キャップのある又はない“悪い”ＧＵＳ外来（ｅｘ）ｐＲＡＪ　２３５／２４０であった）
　すべてのｍＲＮＡ構造体を８μｇ／ｍｌでエレクトロポレーション処理し、洗浄された原形質体を（ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１５巻，第３２５７頁，１９８７年）記載のように２０時間インキュベートした。
　“悪い”コザック構造体（２３５）リーダーの配列は下記のとおりである：
ポリリンカー中へのオメガプライムの挿入は下記のとおりである：
＊この箇所におけるオメガプライムは下記のとおりである：
及び欠失オメガプライム誘導体父がしかるべく後に続く。
　子牛プレプロキモシン又はチキンプレリゾチームをコードするメッセンジャーＲＮＡを、ＴＭＶ５′末端配列（オメガプライム）を付加させて又はさせないでインビトロ合成した。ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球（ＭＤＬ）、小麦麦芽（ＷＧ）又は大腸菌（ＥＣ）由来の系でインビトロ翻訳させた。
　プラスミドｐＪ　ＩＩ６及びｐＪ　ＩＩ７（第１６図）をプラスミドｐＳＴ６４ＣＴ、ｐＳＰ６４ＬＴ〔スリート（Ｓｌｅａｔ）ら，バイロロジー，第１５５巻，第２９９頁，１９８６年〕及びｐＪ　ＩＩ１０１の成分を用いて作成した。ｐＪ　ＩＩ６及びｐＪ　ＩＩ７は、Ｍ３１　ｍｐ１１由来ポリリンカー配列に隣接するバクテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む転写プラスミドｐＳＰ６４〔メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ），１９８４年〕の誘導体である。ｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴのプレプロキモシン及びプレリゾチームコード領域をそれぞれＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片として取出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でプラント末端化し、ｐＪ　ＩＩ１０１のＨｉｎｃ　ＩＩ部位に組込んでクローニングし、それぞれｐＪ　ＩＩ１０６及びｐＪ　ＩＩ１０７を得た（第１６図）。これらの構造体は、５′末端オメガプライム配列をもつメッセンジャー（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−ｓｅｎｓｅ）プレプロキモシン及びプレリゾチーム転写体の合成を指示させるために用いた。親プラスミドｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴはオメガプライムのないｍＲＮＡの合成のための鋳型であった。
　結果は下記第７表に示されている。
　前記方法と同様の方法で、様々なキメラＲＮＡ構造体を、ＮＰＴ　ＩＩコード領域、及びオメガプライム、２つのタンディ（ｔａｎｄｅｍ）オメガプライム領域、長鎖（７７塩基）“ジャンク（ｊｕｎｋ）”リーダー（ポリリンカー）配列もしくは中央オメガプライムと一緒の“ジャンク”を用いて作成した。構造体は第１７図に示されており、結果は第８表に示されている。
　これは、ランダムポリリンカー配列が８０Ｓリボソーム系においてオメガプライムの代わりにならず、原核生物（７０Ｓ）系でのみわずかに代わりになることを示している。２つのランダムオメガプライムのみが７０Ｓ発現に寄与する（例えば、オメガプライムの単一コピー）。
　β−グルクロニダーゼｍＲＮＡ（ＧＵＳ　ｍＲＮＡ）の発現に対するオメガプライムの効果に関して第６表（前掲）に掲示されたデータを更に拡張するために、別の一連の構造体として開始コドン（ＡＵＧ）近辺の配列関係が修正されたＧＵＳ遺伝子を用いた。下記の“良好な配列関係”をもつリーダー：
を含むパルスミドｐＲＡＪ２７５は、ＧＵＳのこのバージョンのための供給源であった。オメガプライム及び様々な他のリーダー構造体を前記のようにＨｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓａｌ　Ｉ部位に挿入した。ｐＲＡＪ２７５構造体の詳細は下記のとおりである：
　ｐＲＡＪ２７５はｐＲＡＪ２５５の誘導体であって（ジェファーソンら，プロシーティグ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）、ここにおいてＧＵＳの５′配列は連続的（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）ＢＡＬ３１削除によって除去され、ゴザック〔ミクロバイオロジー・レビューズ，第４７巻，第１頁，１９８３年（ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，４７，１（１９８３））〕により規定された“コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）”翻訳イニシエーターを構成していた合成オリゴヌクレオチドで置き換えられている。このプラスミドはイニシエーターＡＴＧコドンに位置する特有のＮｃｏ　Ｉ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を有しており、その周囲配列関係はＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣである。イニシエータ近辺の配列関係は所定量のｍＲＮＡの翻訳産物レベルに関して充分な効果を発揮しうることが、インビトロ及びインビボ双方で示された。この構造はこの効果を最大化させるために調整された。それはｐＵＣ１９におけるＳａｌ　Ｉ−ＥｃｏＲ　Ｉ断片として与えられた。
　５′キャップ又は非キャップ転写体を前記のようにタバコ原形質体中にエレクトロポレーションし、ＧＵＳ発現レベルを抽出物中で測定した。
　非キャップＲＮＡもＭＤＬまたはＷＧ無細胞翻訳系に加え、合成されたＧＵＳタンパク質レベルは第２図及び第３図（第１表）のように放射性ゲルバンドを切取ってカウントすることによって測定した。結果は第９表に示されている。
　ＲＮＡ構造体の別の１組を、大腸菌リポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及び更に誘導トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーターを用いて、前記と同様の方法により作成した。Ｔｒｐプロモーターはファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ．）から購入し、制限エンドヌクレアーゼ消化、補充、サブクローニング等の慣用的技術により修正し、３′−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位（第１８図）及びブラント５′末端を作出した。次いで、この二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片をＳＰ６プロモーター（インビボの大腸菌中では作動しない）及び重要な５′−リーダー構造の間で様々なリーダー−リポーター（ＧＵＳ）遺伝子プラスミド中に挿入した。
　得られたプラスミドＤＮＡは標準的方法によりコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌細胞を形質転換させるために用いたが、Ｔｒｐプロモーターは現場で誘導されて、キメラリーダー−リポーターｍＲＮＡを産出した。転写開始点はＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）中のＧに対応する。
　形質転換された大腸菌細胞中における転写体の発現は、分光測定法により調べた（ジェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）。結果（第１０表）は、ＧＵＳ発現がオメガプライムの存在により及びある程度オメガプライムの他のリーダー配列もしくは誘導体により、コザック配列関係の“良好な”又は“悪い”構造体のいずれかからインビボで増強されたことを示している。
結論
　オメガプライムは、現場でＴｒｐプロモーターを用いた場合に、プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌中でのＧＵＳ　ＲＮＡのインビボ発現を増強する。
　継続実験は超らせん二重鎖ｐＵＣ１９　ＤＮＡを用いて行なわれたが、これはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼターミネーター〔アグログバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来〕及びそれらの中間にＣＡＴ　ＤＮＡ（●，▲）もしくはオメガプライムＣＡＴ　ＤＮＡ（○，△）のいずれかを有するように修正されている。
　構造体（第１９図）は二元ベクター系から作成したが〔ベバン（Ｂｅｖａｎ），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第８７１１頁，１９８４年〕、その場合においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮｏｓターミネーターをＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＥｃｏＲ　Ｉ部位で切除し、プラスミドｐＵＣ１９に挿入することによってｐＵＣ３５Ｓ　Ｎｏｓを得た。
　構造体ｐＵＣ３５ＳＣＡＴＮｏｓ及びｐＵＣ３５ＳオメガプライムＣＡＴＮｏｓは、ＣＡＴ又はオメガプライムＣＡＴをそれぞれＢａｍＨ　Ｉ部位でプラスミド中に挿入することによって作成した。様々な量のプラスミドＤＮＡ（μｇ／ｍｌ）を前記のように原形質体にエレクトロポレーション処理し、細胞を２５℃で６時間（○，●）又は２６時間インキュベートし、溶離させて、（前記のような）ＣＡＴアッセイを行なった。
　第２０図に示された結果は、図示された１００〜１５０μｇの超らせんプラスミドＤＮＡの注入をうけた細胞はオメガプライムが構造体中に存在している場合（△，○）にＣＡＴ発現を増強させていた（２倍）ことを示している。
　これらの結果は、安定的形質転換原性（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物中での遺伝子発現がプロモーター（インビボ転写用）及び翻訳オープン読取枠の間へのオメガプライム配列の挿入によって同様に増強されるであろうということを示している。