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　平成　４年特許願第２４１７９８号「２段サーモサイクルＰＣＲ法」拒絶査定不服審判事件〔平成　６年　４月　５日出願公開、特開平　６−　９０７５６〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　出願の経緯及び本願発明
　本願は，平成４年９月１０日の出願であって，その請求項１ないし５に係る発明は，平成１４年２月１８日付けで提出された手続補正書によって補正された明細書の特許請求の範囲の請求項１〜５に記載されたとおりのものと認められるところ，その請求項１に係る発明は次のとおりのものである。
　
「【請求項１】　人体から採取された検体における標的微生物の存在の有無を，当該微生物に由来するＤＮＡの存否を検出することによって確認する，精度良好かつ簡便な臨床検査方法において，当該微生物に由来するＤＮＡを次ぎの工程から成る２段サーモサイクルＰＣＲ法により増殖させることを特徴とする方法：
　第１段工程：上記検体を９０〜９５℃に保持して，当該検体中に存在する可能性のある上記標的微生物に由来する標的２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる；および
　第２段工程：その結果得られた１本鎖ＤＮＡを含む検体を，（１）当該１本鎖ＤＮＡの塩基配列に対応する鎖長少なくとも３５塩基以上の塩基配列を有する正方向および逆方向のプライマー，（２）４種の塩基ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰならびに（３）ＤＮＡポリメラーゼの存在下，７０〜８０℃に保持して，上記１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う；
　ただし，標的微生物の種類が変化しても，上記第１段工程において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる温度および第２段工程において１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う温度は，変化させることなく，一定に保持するものとする。」（以下，「本願発明１」という。）
　
第２　原査定の拒絶理由
　これに対し，原査定の拒絶理由の概要は，以下のとおりのものである。
　
「この出願の請求項に係る発明は，その出願前に頒布された刊行物であるLeukemia and Lymphoma, 1990, Vol.3, p.109-17（以下，「引用例１」という。）に記載された発明に基いて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。」
　
第３　当審の判断
１．引用例１に記載された発明
　原査定の拒絶の理由に引用された引用例１は，次の事項が記載されている。 　
ア．「
Ｂ細胞リンパ腫におけるt(14;18)bcl-2/J
H
　ＤＮＡ連結領域の迅速且つ高度の特異的増幅のために，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用した。Ｔａｑ−ポリメラーゼ及びbcl-2に対する比較的長いオリゴヌクレオチド・プライマー（３３ｍｅｒ）とJ
H
コンセンサス配列に相補的な普遍的なプライマー（２５ｍｅｒ）を使用して，プライマー・アニーリング工程とプライマー・伸長工程を同じ温度（７０℃）で行うことができた。これにより，反応時間が著しく短くなり，反応特異性が有意に改善された。
イ．「エチジウムブロミド染色ゲル上の
bcl-2/J
H
　ＰＣＲ増幅産物の直接の可視的な同定は，非特異的バンドがともに増幅されることにより困難である。
臨床試料から抽出されたＤＮＡが，多くの異なるリアレンジされたJ
H
セグメントを含む
通常のプライマー・アニーリングで用いられる低い温度では特に，３×１０
９
塩基のヒトゲノム中の部分的に相同なセグメントにハイブリダイゼーションする頻度は増加する。我々は，迅速で且つ特異的な増幅のために，相対的に長いbcl-2とJ
H
　特異的プライマー，並びに，高い反応温度を用いて，従来，特性化されていなかったＢ細胞リンパ腫におけるt(14;18)連結領域のＤＮＡ配列分析を行える変更されたＰＣＲ法を開発した。
ウ．「すべての患者は，我々の診察と治療のための施設に参加した。・・・精製ＤＮＡ１マイクログラム（・・・）を，・・・
ＰＣＲ緩衝液（・・・，ｄＮＴＰｓ　それぞれ０．２ｍＭ）に添加した。
プライマー３００ｎｇと２．５ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（・・・）が加えられ
Oligo１と２によるサイクリング条件は，・・・９２℃で６０秒間（変性）及び７０℃で３０秒間（アニーリングとＤＮＡ合成）であって
第３のnested プライマー（Oligo３）による増幅は
プライマー・アニーリングと伸長工程を６０℃で３０秒間行う
短いプライマー３，４又は７（bcl-2）と５又は６（J
H
）の増幅は，プライマー・アニーリングを６０℃で３０秒間，次いで，プライマー・伸長工程７２℃で３０秒間を行う
エ．bcl-2/JH　配列を増幅するためのプライマーとして，bcl-2プライマー（２，３，４及び７），JHプライマー（１，５及び６）を用い，該JHプライマー（１，５及び６）はJHコンセンサス配列の逆方向に相補的であること。また，プライマー１（Oligo１）は２５塩基，プライマー２（Oligo２）は３３塩基，プライマー３（Oligo３）は１５塩基の鎖長であり，プライマー４〜７の鎖長はそれぞれ１８，１５，１５及び１５塩基であること。（Figure ２及びTable １） 
オ．「最初の実験において，短い１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドbcl-2（Oligo ３又は７）及びJH（Oligo５又は６）プライマーを用いて，bcl-2/ JH　融合遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。bcl-2遺伝子がリアレンジされた３つ中心細胞―胚中心細胞ＣＣ−ＣＢ（centrocytic-centroblastic）と１つの胚中心細胞ＣＢ（centroblastic）ＮＨＬを・・・ポジティブコントロールとした。bcl-2遺伝子のリアレンジがない多くの異なったＢ−及びＴ−ＮＨＬをネガティブコントロールとして用いた。Figure ３に示すように，２００−１０００塩基の多様な長さの非特異的なＰＣＲ産物がt(14;18)ポジティブ及びネガティブコントロールから増幅された。・・・要するに，
これらの短い１５ｍｅｒのbcl-2（Oligo３又は７）及びJ
H
（Oligo５又は６）のプライマーを用いた我々の研究は，不満足な結果であった。違う温度や違うＭｇＣｌ
２
濃度（１．５−１０ｍＭ）のＰＣＲ緩衝液を用いても，可視的に識別できる特異的なバンドは，Figure ３に示すように，再現性があるようには得られなかった。反応温度を上げた際には，特異的なバンドが消失している一方で，非特異的なバンドはまだ見ることができた。低い温度では，大幅な非特異的なバンドが共に増幅されるため，特異的なバンドはしばしば覆い隠されてしまった。
カ．「ついで我々は，
J
H
コンセンサス配列の３’位に逆相補的２５塩基プライマー（Oligo１；ＧＣ含量７２％）及びbcl-2遺伝子の２８６６−２８９８位ヌクレオチドに対応する３３塩基プライマー（Oligo２；ＧＣ含量３６％）を調整した。これらのプライマーは，アニーリング工程とプライマー伸長工程を７０℃で３０秒間，同時に行うことを可能にした。この変更は，ＰＣＲを完了する時間を短縮させただけでなく，bcl-2/ J
H
　増幅の総体的な反応特異性を有意に上昇させた。６個のＢ細胞リンパ腫に対して，Figure ４に示されるように，これらの試料（１ＣＢ，４ＣＣ−ＣＢ及び１t(14;18)を坦持するセルライン）中における特異的bcl-2/J
H
　ＰＣＲ生産物を表す顕著なバンドをプライマー１及び２による増幅後のエチジウムブロミド染色アガロースゲルにおいて，明らかに同定することができた。
第３のnested プライマー（Oligo３）を，Oligo１とともに使用した場合，予期されたように，結果の特異性をさらに支持する１４２塩基以下の小さなＰＣＲ断片を生成する。さらに，感度は第２の増幅工程によって上昇する（Figure ４）。
キ．「予想外に，
約６０塩基のバンドがすべての実験で見られた。配列分析から，これはプライマー１及び２の二量体化によるものということがわかった。
ク．「１９８５年に提示された骨髄は標準の組織学的基準に従えば正常であったが，Oligo１と２によるＰＣＲ（４０サイクル），それに続くOligo１と３による２％溶液のさらなる２５サイクルの再増幅（Methods を参照）により，含まれたリンパ節と形態学的に正常な骨髄からのＤＮＡを使用して，明らかに同定可能なbcl-2/JH　断片が生成された（Figure ５左）。この断片は各試料において，同じ大きさであった。骨髄ＤＮＡ中の増幅されたbcl-2/ JH　融合遺伝子断片を表す淡いバンドは，Oligo１と３よる第２の増幅工程の後にのみ観察されたが，
強いバンドはOligo１と２による４０サイクル後のリンパ節ＤＮＡ中に既に認められた（示さず）。
ケ．「提示の際の骨髄からのＤＮＡは入手されなかったが，最初のリンパ節生検と放射療法の完了後１０ヶ月で集められた末梢血液細胞から得られたＤＮＡにより実施されたＰＣＲ（Oligo１と２による４０サイクルの第１ＰＣＲ，それに続くOligo１と３による２％溶液の２５サイクルの再増幅）は，同じ大きさの増幅bcl-2/ JH　断片を生成し，完全な臨床的軽減の間における循環リンパ腫の存在を示した。」（第１１４頁右欄下から第７行〜第１１５頁第３行） 
コ．上記ケ．において，リンパ節から抽出したＤＮＡをOligo1と２による増幅することにより，強いバンドが示されること。（Figure ５右）
　
　上記ア．〜コ．によれば，引用例１に記載された発明（以下，「引用発明１」という。）は，潜在的Ｂ細胞リンパ腫の存在の証明を，人体から採取された検体中のt(14;18)bcl-2/JH ＤＮＡ連結領域の存否を検出することによって確認する臨床検査方法であって，該t(14;18)bcl-2/JH ＤＮＡ連結領域の迅速且つ高度に特異的な増幅をＰＣＲ法により行う方法であり（上記ア．を参照。），該ＰＣＲ法による増幅は，bcl-2に対する比較的長いオリゴヌクレオチド・プライマー（３３ｍｅｒ）とJHコンセンサス配列に相補的な普遍的なプライマー（２５ｍｅｒ）を使用して，検体からの精製ＤＮＡを，該プライマー，ｄＮＴＰｓ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液中で，９２℃で６０秒間の変性，及び，７０℃で３０秒間のアニーリングとＤＮＡ合成を行うサイクルにかけることにより行うものである（上記ウ．及びエ．を参照）。
　そして，引用発明１の方法は，通常のＰＣＲ法，すなわち，短いプライマー（１５塩基）を用いて，低い温度（６０℃）でアニーリングを行う方法では，非特異的な増幅が起こってしまい，同定が困難とされていた臨床検体に対して，より長いプライマーを用いて，より高いアニーリング温度でＰＣＲを行うことにより，特異的な増幅を実現するとともに，プライマー・アニーリング工程とプライマー・伸長工程を同じ温度（７０℃）で行うことにより迅速な増幅を実現したものであって（上記イ．，オ．及びカ．等を参照。），実際に，リンパ節中のt(14;18)bcl-2/JH ＤＮＡ連結領域の存否の検出が可能であることが示されている（上記ク．及びコ．を参照。）。
　
２．対比
　本願発明１と引用発明１を対比する。
　引用発明１は，検体中の標的となるＤＮＡを迅速で且つ特異的な増幅をして検出する臨床検査方法であるから，本願発明１における「精度良好かつ簡便な臨床検査方法」といえる。また，引用発明１における「９２℃で６０秒間の変性，及び，７０℃で３０秒間のアニーリングとＤＮＡ合成を行うサイクルにより行う」ＰＣＲ法は，本願発明１における「検体を９０〜９５℃に保持して，当該検体中に存在する標的２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる；および　第２段工程：その結果得られた１本鎖ＤＮＡを含む検体を，７０〜８０℃に保持して，上記１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う；２段サーモサイクルＰＣＲ法」に相当するから，両発明は，
「検体におけるＤＮＡの存否を検出することによる，精度良好かつ簡便な検査方法において，当該ＤＮＡを次ぎの工程から成る２段サーモサイクルＰＣＲ法により増殖させることを特徴とする方法：
　第１段工程：上記検体を９０〜９５℃に保持して，当該検体中に存在する可能性のある標的２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる；および
　第２段工程：その結果得られた１本鎖ＤＮＡを含む検体を，（１）当該１本鎖ＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有する正方向および逆方向のプライマー，（２）４種の塩基ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰならびに（３）ＤＮＡポリメラーゼの存在下，７０〜８０℃に保持して，上記１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う。」という点で一致し，以下の点で相違する。
　
（相違点１）本願発明１は，「人体から採取された検体における標的微生物の存在の有無を，当該微生物に由来するＤＮＡの存否を検出することによって確認する方法」であるのに対し，引用発明１は，「潜在的Ｂ細胞リンパ腫の存在の有無を，人体から採取された検体中のt(14;18)bcl-2/JH ＤＮＡ連結領域の存否を検出することによって確認する方法」である点。
　
（相違点２）「正方向および逆方向のプライマー」が，本願発明１では，鎖長少なくとも３５塩基以上の塩基配列を有するプライマーであるのに対し，引用発明１では，２５塩基プライマーと３３塩基プライマーである点。
　
（相違点３）本願発明１で行われる２段サーモサイクルＰＣＲ法においては，「標的微生物の種類が変化しても，第１段工程において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる温度および第２段工程において１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う温度は，変化させることなく，一定に保持」されるものであるのに対し，引用発明１にはそのような特定がない点。
　
３．当審の判断
　上記の相違点について検討する。
　
３−１．（相違点１）について
　本願発明１は，本願明細書及び図面（以下，「本願明細書等」という。）の記載によれば，標準的なＰＣＲ法，すなわち，ＤＮＡ試料，緩衝液，２０塩基程度のプライマー２種及びポリメラーゼを含む反応系を，ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて，９４℃２０秒間（第１段：変性），５５℃２０秒間（第２段：アニーリング）及び７２℃，３０秒間（第３段：伸長）の３段のサーモサイクルに３０〜３５回程度さらすことにより行う方法では，臨床検査検体（血液，尿，組織ホモジネート等）中の微生物の存在を証明しようとする際に，種々雑多なＤＮＡが共存する系では，多数のバンドによる広範な発色が見られ，検出困難となるという課題を解決するために，プライマーとして従来の約２倍程度の長いものを用い，アニーリング温度を従来のものより高くして伸長反応の温度と同程度にし，それによってアニーリングと伸長反応を同時に行うようして，臨床検査検体のような系でも微生物のＤＮＡを特異的に検出できるようにしたものである（本願明細書【０００２】〜【０００４】）。
　これに対して，引用発明１は，上記１．で述べたとおり，通常のＰＣＲ法，すなわち，短いプライマー（１５塩基）を用いて，低い温度（６０℃）でアニーリングを行う方法では，非特異的な増幅が起こってしまい，同定が困難とされていた臨床検体に対して，より長いプライマーを用いて，より高いアニーリング温度でＰＣＲを行い，プライマー・アニーリング工程とプライマー・伸長工程を同じ温度（７０℃）で行うことにより，迅速で且つ特異的な増幅を実現した方法である。 
　なるほど，本願発明１は，臨床検体中の標的微生物の存在の有無を検査する方法であるのに対し，引用発明１は臨床検体中のＢ細胞リンパ腫の存在の有無を検査するものである点で相違するが，血液等の臨床検体中の微生物をＰＣＲ法により検出し，その存在の有無を検査することは周知の課題であり（必要であれば，Science, 1988, Vol.242, p.229-37, Journal of Clinical Microbiology, 1991, Vol. 29 (10), p.2228-33, Journal of Clinical Microbiology, 1989, Vol.27 (2), p.261-5, JARMAM, 1991, Vol.3 (2), p.115-23を参照。），且つ，両発明で用いている検体はともに通常のＰＣＲ法を用いては，非特異的な増幅が生じ，特異的検出が困難であった臨床検体であるから，より高い精度で検出を行おうとする当業者にとっては，臨床検体中の微生物をＰＣＲ法により検出する際に，引用発明１の方法を採用することは自然に発想することと認められる。
　これにつき審判請求人は，平成１７年７月１９日付けの審尋（以下，「第１の審尋」という。）に対する平成１７年９月２０日付け回答書において，「引用文献１の検出対象は，臨床検体中のＢ細胞リンパ腫であり，これと比較的高いホモロジーのＤＮＡを有するものが混在する可能性の低いものである。これに対して，本願発明の検出対象は，臨床検体中の特定の微生物であって，これと比較的ホモロジーの高い微生物が混在する可能性の高いものである。」旨，主張するが（第３頁参照。），そもそも引用発明１で解決すべき課題とする非特異的な増幅は，通常のプライマー・アニーリングで用いられる低い温度では，プライマーが非特異的に複数の箇所にハイブリダイズする結果生じているのであり，このことは引用発明１においても，使用するプライマーについて，検体中に検出対象と比較的ホモロジーの高い配列が混在していることに他ならず，請求人の主張は妥当性を欠くものである。 
　
３−２．（相違点２）について
（１）本願発明１のプライマーが通常のものよりも長いことについて
　引用例１には，引用発明１のプライマーとして，鎖長３５塩基以上のプライマーを用いることは記載されていないが，通常用いるプライマーよりも鎖長の長いプライマーを用い，通常のアニーリング温度よりも高い温度でＰＣＲを行うことにより，類似する配列が混在する状況下において，通常の条件では行うことができなかった特異的な増幅が実現できたことが記載されており，これは，以下に述べるように，鎖長１５〜３０塩基程度のプライマーを用い，６０℃程度までの温度でアニーリングを行う，通常のＰＣＲ法における，一般に，鎖長の長いプライマーは特異性が増大する反面，ミスアニーリングしやすくなること，並びに，アニーリングを高い温度で行うことにより，ミスアニーリングを防ぎ得ることという本願出願時に当業者によく知られていた事象に基づくものであると認められ，そのようなプライマー長とアニーリング温度の関係が，通常より長いプライマーを用い，通常より高い温度でアニーリングを行う場合にも成り立つことが見出されたことに他ならないから，ＰＣＲ反応の特異性を高めるために，引用発明１で実際に採用されている３３塩基長のプライマーよりも鎖長の長いプライマーを用い，それに適したアニーリング温度等の条件を検討してみることは，引用例１の記載及び出願時の周知技術から容易に想到し得たことと認められる。
　すなわち，本願明細書中【０００６】において引用されている「遺伝子増幅ＰＣＲ法−基礎と新しい展開（藤永薫編，共立出版株式会社発行，１９９０年１２月１０日発行）」（以下，「周知例１」という。）には，ＰＣＲ法に用いるプライマーとアニーリング温度に関し，次の事項が記載されている。 
　
サ．「Ｂ．アニーリング温度と時間 　これはプライマーの長さとＧＣ含量に依存する。通常アニーリング温度をＴｍより（Ｔｍ−２０）℃までの間とする。Ｔｍは次の式から計算する。　 
 　　Ｔｍ（℃）＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２×（Ａ＋Ｔ） 
　ミスアニーリングを防ぐためには，Ｔｍを越えない範囲でアニーリング温度をできるだけ上昇させる。ただし，高くても６０℃とする。２０残基ほどのプライマーの場合，反応液中には大過剰のプライマーが存在するために，ハイブリダイゼーションは瞬時に起こり，通用２０秒で十分である。」（第１１頁左欄第１６行〜第２６行） 
シ．「４．プライマー  　ＰＣＲの成否はプライマー選びにあるといっても過言ではない。プライマーは２０〜２５ｍｅｒのものがもっともよく使われている。・・・」（第１１頁右欄下から第１５行〜下から第５行） 
ス．「より長いプライマー（２５〜３０塩基）を用いることによって，反応の特異性を増強し目標外の増幅が少なくなる可能性も考えられる。なぜならば，長いプライマーを用いれば，アニーリングと伸長反応の温度を若干高くすることによって，特異性の増大を期待することができる。より高い温度でＰＣＲを行っても，余分なバンドが現れる場合は，プライマーのハイブリダイズ可能な配列が，他にも存在している可能性を示している。」（第１２頁右欄第１５行〜第２２行） 
セ．「プライマーのデザイン  １．プライマーの満たしているべき条件 
　一般に，ＰＣＲ用のプライマーが満たしているべき条件をあげると，次のようになる。 
１）鎖長は１５〜３０塩基（２０〜２５が望ましい）。あまり短いと至適温度の高いＴａｑポリメラーゼの反応ではうまく鋳型とアニールしないし，必要以上に長くしてもミスアニールの確率が高くなる。・・・ 
２）２本のプライマーは，標的ＤＮＡおよびその上流と下流を含めた全体の領域とのホモロジーが低くなるようにする。とくに，プライマーの３’側５〜８塩基とのホモロジーを避ける（ホモロジー検索は標的ＤＮＡのセンスとアンチセンス両鎖について行うこと）。 
３）ＧＣ含量は５０％程度とする。部分的にＧＣあるいはＡＴに片寄るのを避ける。・・・ 
４）自己相補配列を含まないようにする（プライマー自身の二次構造を避ける）。 
５）プライマーどうしがアニールしてダイマーを形成しないように，特に３’側３，４塩基に関して相補的にならないようにする。」，「標的ＤＮＡがくり返し配列やＧＣリッチの領域を含んでいたり，得られている配列の情報が非常に限られていれば，必ずしも上記の条件を満たさないプライマーを選ばざるをえないこともあるだろう。そのときには，プライマーを少し長くしてアニーリング温度を高めにすると効果的な場合がある。・・・」（第２０７頁左欄第１０行〜第２０８頁左欄第１８行） 
　
　上記サ．〜セ．によれば，ＰＣＲ法に用いられるプライマーの鎖長は１５〜３０塩基が適当であること，アニーリング温度は，プライマーの長さとＧＣ含量に依存し，ミスアニーリングを防ぐためには，Ｔｍを越えない範囲でアニーリング温度をできるだけ上昇させること（ただし，高くても６０℃。），より長いプライマー（２５〜３０塩基）を用いれば，アニーリングと伸長反応の温度を若干高くすることによって，特異性の増大を期待することができること，並びに，必要以上に長いプライマーはミスアニールの確率が高くなることが記載されており，通常のＰＣＲ法においては，一般に，鎖長の長いプライマーは特異性が増大する反面，ミスアニーリングしやすくなること，並びに，ミスアニーリングを防ぐために，アニーリングを高い温度で行うことは，出願時に当業者によく知られていた事項であると認められる。
　その一方で，引用発明１において，通常用いるプライマーよりも鎖長の長いプライマーを用い，通常のアニーリング温度よりも高い温度でＰＣＲを行うことにより，類似する配列が混在する状況下において，通常の条件では行うことができなかった特異的な増幅が実現できたことは，上述のとおりである（上記イ．を参照。）。これは，上記周知例１で示された考え方を，通常のＰＣＲ法で用いられるプライマー長よりも長いプライマーについて採用したものといえ，引用発明１では，実際に，特異的な増幅が行われていることを考えれば，当業者が，ＰＣＲ法の特異性を向上させるために，上記考え方を通常よりも長いプライマー長，例えば，３５塩基以上のものを用い，それに適したアニーリング温度等の条件を検討してみることに何ら妨げは見当たらない。
　なお，本願出願前に頒布されたAPPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY, 1990, 56 (8), p.2494-8（以下，「参考例１」という。）には，３２塩基の鎖長を有する正方及び逆方向プライマーを用いて，９５℃で変性し，７２℃でアニーリング／伸長を行うことが記載されており（FIG. ２及び第２４９５頁左欄の「PCR detection of plasmid DNA」を参照。 ），２段階の温度変化でＰＣＲを行うことについて，２５塩基のプライマーと比べて，より高い温度でアニーリング及び伸長工程を行うことができたことが示されている。このことは，本願出願時においては，引用発明１のごとく，通常のＰＣＲ法と比べてより高い温度でより長いプライマーでＰＣＲ法を行うことが，当業者が容易に発想し得た範囲のことであることを支持するものと認められる。 
　
　これに対し，審判請求人は，第１の審尋の回答書において，正方向及び逆方向のプライマーが，引用発明１では，２５塩基のOligo１プライマー及び３３塩基のOligo２プライマーを用いているのに対して，本願発明１は，３５塩基以上の鎖長を有するプライマーを用いており，微生物に対して使用するプライマーとしては極端に長く，常識を超えた長さであると主張している。
　なるほど，上記周知例１には，ＰＣＲ法に用いられるプライマーの鎖長は１５〜３０塩基が適当であること，アニーリング温度は高くても６０℃であること，並びに，必要以上に長いプライマーはミスアニールの確率が高くなることが記載されてはいる。しかしながら，上述のとおり，引用発明１及び参考例１においては，特異性を向上するために，３０塩基より長いプライマー（３３塩基及び３２塩基）を用い，２段階でＰＣＲ法を行うことが示されている以上，上記周知例１に記載された事項は，本願発明１を構成する上での阻害要因とはなり得ない。
  　
（２）プライマー長を３５塩基以上とした効果及び臨界的意義について
　そして，本願明細書等を見ても，本願発明１において，プライマー長を特に３５塩基以上としたことにより，格別の効果が得られたものということはいえず，この点に臨界的な意義が認められない。 
　すなわち，本願明細書中の実施例等を見ても，本願発明１が，通常の標準的な３段階のＰＣＲ法では検出困難な臨床検体について，従来の約２倍程度の長いプライマーを用い，従来法より高い温度のアニーリング温度で，アニーリングと伸長反応を同時に行う２段階のＰＣＲ法を行うことにより，はじめて当該検体から標的とする微生物ＤＮＡを特異的に検出できたかものであるのかどうか不明である。本願明細書等には，ＳＡ（スタフィロコッカス・アウレウス），ＳＥ（スタフィロコッカス・エピデルミディス）等，種々雑多なＤＮＡが共存する系では，通常の標準的な３段階のＰＣＲ法では検出が困難であったことが記載されておらず，標準的な３段階のＰＣＲ法では検出困難な臨床検体を対象にしていることが示されているとはいえない（本願発明１の実施例２ａ）は，ＳＡ及びＳＥをそれぞれ単独で含む検体について，２０塩基プライマーを３段サイクルＰＣＲ法（従来法）で検出したところ，それぞれの存在を示す特異的なバンドが検出されたことを示すだけのものであり，ＳＡ及びＳＥが混在する系が，通常の長さのプライマーを用いる，通常の標準的な３段階のＰＣＲ法では，検出が困難なものであることを示すものではない。）。 
　また，仮に，本願発明１が，通常の３段階のＰＣＲ法では特異的なバンドが検出できない検体について，従来法より長いプライマーを用い，従来法より高いアニーリング温度で２段階のＰＣＲ法を行うことにより，はじめて標的とする微生物ＤＮＡを特異的に検出できたものであるとしても，本願発明１において臨床検体中の標的微生物の存在の有無を検出するために要求される検出精度の向上が，引用発明１において臨床検体中のＢ細胞リンパ腫の存在の有無を検出するために要求される検出精度の向上，すなわち，通常の３段階のＰＣＲでは特異的なバンドが検出できない検体から，より長いプライマーを用いて，より高いアニーリング温度で行う第１の増幅において，特異的なバンドを検出できる程度の精度向上と比べて格段に優れたものとは認められず，プライマーを３５塩基以上にしたことによる効果が，当業者が予測し得る範囲を超えるものとは認められないし，この点に臨界的な意義があるとは認められない。 
　なお，審判請求人は，平成１７年１１月２９日付けの審尋（以下，「第２の審尋」という。）に対する平成１８年２月６日付け回答書において，当合議体が回答を求めた「本願明細書等には，ＳＡ（スタフィロコッカス・アウレウス），ＳＥ（スタフィロコッカス・エピデルミディス）等，種々雑多なＤＮＡが共存する系では，通常の標準的な３段階のＰＣＲ法では検出が困難であったことが記載されて」いないという点に対して，「しかしながら，本願明細書の実施例６の試験結果を示す電気泳動写真図１２と図１３を対比すれば明らかなように，ＳＡは上から４番目の分子量マーカーに対応する位置に，ＳＥは上から３番目の分子量マーカーに対応する位置に，それぞれバンドが検出されている。従って，両者が混在する場合でも各々を識別できることは明らかである。」と主張しているが（第２頁参照。），上記図１２及び１３は，ＳＡ及びＳＥが混在する場合でも本願発明１の方法で識別し得ることを示しただけであり，そもそもＳＡ及びＳＥが混在する系が，通常の長さのプライマーを用いる，通常の標準的な３段階のＰＣＲ法では検出が困難な系であることを示すものではなく，当合議体の求めたものとその趣旨が異なっている。
　
（３）まとめ
　したがって，引用発明１である２段階ＰＣＲ法を，人体から採取された検体中の微生物由来のＤＮＡの存否を検出するために用いるにあたり，用いるプライマー長を３５以上とすることは，引用例１の記載及び本願出願日時点の技術常識に基づいて，当業者が適宜成し得たことと認められる。
　
３−３．（相違点３）について
　一般に，ＰＣＲ法において，「２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離させる温度」は，一方のＤＮＡ鎖を構成する塩基と他方のＤＮＡ鎖を構成する塩基の分子間結合を解離させる温度であって，微生物によって，該結合力が大きく変わることは考えにくい。また，「プライマー鎖の伸長を行う温度」は，用いるＤＮＡポリメラーゼに依存するものであるから，これらの温度については，標的微生物の種類が変化しても，特に変化させる必要があるものとは認められない。そして，「アニーリングを行う温度」については，その適切な温度は，プライマーと鋳型となるＤＮＡ鎖との結合（ハイブリダイゼーション）の程度に依存するものであり，プライマーの長さやＧＣ含量とからおおよそ定まるものと考えられるから（上記サ．を参照。），標的微生物の種類が変化しても，プライマーの長さが共通していれば，特に偏った組成のものでない限り，アニーリングを行う温度をあまり変化させる必要がないことは，当業者が容易に予測し得ることであり，本願発明１において，「標的微生物の種類が変化しても，第１段工程において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させる温度および第２段工程において１本鎖ＤＮＡに対する両プライマーのアニーリングとプライマー鎖の伸長を行う温度は，変化させることなく，一定に保持」させることは，当業者が容易に成し得たことと認められる。
　
　これにつき，審判請求人は，第１の審尋に対する回答書において，「検出すべき標的微生物が相違し，従って別のプライマーを使用する場合，温度条件やプライマー長をそれに応じた適切なものに選択，変更するのが普通である。本願発明では，別のプライマーを使用しても，温度条件やプライマー長について，そのような選択，変更を必要としない利点を有するものである。」と主張する（第４〜５頁）。
　しかしながら，本願明細書等に記載されているのは，標的ＤＮＡであるＳＡ及びＳＥのＤＮＡを含む試料を，ＳＡ及びＳＥ由来の特定の４０塩基のプライマー対を用いて，アニーリング及び伸長温度を７２℃で，ＰＣＲを行ったときに，それぞれのプライマー対により，標的ＤＮＡがそれぞれ特異的に増幅され，標的ＤＮＡ（ＳＡ及びＳＥ）が特異的に検出できたことだけである。これについては，そもそもＳＡ及びＳＥが，同属の菌であり，配列の相同性も高いことから，使用したプライマーの塩基の組成は大きく変わるものではなく，しかも用いたプライマーの塩基長が同じなのであるから，上述のとおり，同じ温度でＰＣＲを行うことにより，特異的な増幅及び検出できることは，当業者が予測できる範囲のことである。その一方で，本願明細書等をみても，ＳＡ及びＳＥ以外の微生物由来の任意の長さ及び組成の３５塩基以上のプライマーを用いたときにも，ＳＡ及びＳＥの場合と同じ温度で十分な増幅が行えるか否かは不明であり，そのような態様をとった場合の効果については確認できず，確認できない効果については，顕著なものとはいえない。
　したがって，３５塩基以上のプライマーを用いたときに，標的微生物の種類が変わり，これによって，最適なプライマーの長さや組成が変わっても，同じ温度を保持することにより，格別の効果が奏するものとは認められないから，上記本願発明１の発明特定事項により，本願発明１に進歩性があるとは認められない。
　
　なお，念のために付記すれば，審判請求人は，本願発明１はどんな微生物にも適用できるものであると主張するが，本願明細書等を見ても，実際に実施して，その効果が確認されているのは，ＳＡとＳＥを含む検体について，特定のプライマーを用いてこれらを識別，検出したことだけであり，その他の微生物についてもこれと同様に実施し得ること，さらにその際，どのようなプライマーを用いればよいか等については何ら示されていない。上記周知例１のエ．２）等に記載されているように，プライマーの設計は，その微生物の遺伝子が如何に特異的な構造を有しているか，特異的な部分をプライマーとして選択するか，アニーリング温度の設定等に依存するものであるから，特定のプライマーを用いてＳＡとＳＥを検出したことを示したことをもって，３５塩基以上のプライマーの使用，及び，アニーリング温度を７０〜８０℃とするという設定のみによりすべての微生物が検出できるとは認められない。特に，上記第１の審尋の回答書には，「プライマー部分となるのは，全配列の任意の部分であってよく，」とあるが，選択された領域が識別すべき微生物等の間で保存性の高い領域であった場合，特定の微生物を検出できるとは認められない。特に，本願発明１の条件さえ備えれば，通常の３段階のＰＣＲ法において識別可能でないほどＤＮＡの相同性の高い微生物を含め，あらゆる微生物を相互に識別して，検出することができることが，本願明細書等において裏付けられているとはいえない。 
　まして，本願発明１は，出願時において積極的に使用することがなかった３５塩基のプライマーを用いたものであり，例えば，微生物間又は標的微生物内でホモロジーの高い部位をプライマーとして用いた場合，その際に用いるプライマーの鎖長及び温度条件等と，プライマーのハイブリダイゼーションとの挙動の関係について，理論的な背景が十分に確認されているものではなく，特定のプライマーを用いてＳＡとＳＥを検出した事実をもって，他のすべての微生物の検出が可能であることまで一般化できるとは認められない。
　
４．請求人の主張について
４−１．請求人の主張
　審判請求人は，本件審判請求に際して提出した平成１４年６月６日付け手続補正書において，すでに述べた点以外に以下の点を根拠に，「本願発明の構成と効果は，引用文献１を含め，他の如何なる公知文献にも開示も示唆もない」旨，主張している。 
　
（ａ）引用発明１のＰＣＲ法においては，第１回ＰＣＲと第２回ＰＣＲ（ｎＰＣＲ）を行うことが必要であるが，本願発明１のＰＣＲ法においては，１回のＰＣＲのみであり，ｎＰＣＲを必要としない。本願発明１のような１回ＰＣＲが２回ＰＣＲよりも操作の点で簡便かつ優位であることは明らかである。
　
（ｂ）引用発明１における第１回ＰＣＲの反応温度条件は９２℃と７０℃の２段階であり，第２回ｎＰＣＲの反応温度条件は９２℃と６０℃の２段階であって，結局のところ，６０℃，７０℃および９２℃の３段階の温度を用いている。これに対し，本願発明１の１回ＰＣＲでは，９０〜９５℃と７０〜８０℃の２段階の温度が使用されている。この点でも，本願発明１のＰＣＲ法の方が引用発明１のＰＣＲ法よりも簡便かつ優位であることは明らかである。 
　
４−２．請求人の主張（ａ）及び（ｂ）について 
　引用発明１は，上記第３の１．カ．，ク．及びコ．等のごとく，通常のＰＣＲプライマー（１５塩基）よりも長いプライマーを用い，プライマーのアニーリング反応とＤＮＡポリメラーゼによるプライマー鎖の伸長反応を同じ温度（７０℃）で行うＰＣＲ法だけでも，十分特異的な検出が行えることが記載されている。すなわち，上記第３の１．カ．には，２５塩基プライマー（Oligo１）及び３３塩基プライマー（Oligo２）を用いて，アニーリング工程及びプライマー伸長工程を７０℃で行うＰＣＲ法によって検出を行ったところ，標的となる遺伝子を特異的に増幅し，「明らかに同定することができた」と記載され，上記第３の１．ク．及びコ．には，Oligo１及びOligo２プライマーを用いたＰＣＲ法により，リンパ節中に標的とするＤＮＡを検出できたことが示されている。また，第３のnested プライマー（Oligo３）を用いた方法については，「予期されたように，」結果の特異性を支持するＰＣＲ産物が生成され，「さらに，感度は第２の増幅工程によって上昇する」と記載されている。これらの記載を勘案すれば，明らかに，nested プライマー（Oligo３）を用いて第２の増幅工程を含む方法は，Oligo１及びOligo２プライマーを用いたＰＣＲ法に対して，さらに感度をよくするために行っているだけであり，引用発明１において必須の工程であるとは認められない。 
　これにつき請求人は，第１の審尋に対する回答書において，「引用文献１においては，１回目のＰＣＲによりメインのバンド以外に非特異的増幅産物の影響から複数のバンドが検出されるため（Fig.４），現実に，２回目のＰＣＲ（以下，ｎＰＣＲという。）により特異性を上げてようやく検出を行っている。従って，実際に検出を行うには，ｎＰＣＲが必要であるものと理解される。」旨，主張し（第２頁参照。），また，第２の審尋に対する回答書において，「引用文献１のFig.４には，６０３塩基以上のバンドが少なくともレーン７ａ，８ａ，および９ａに認められる。これらのバンドについて，引用文献１は何ら言及するところがないが，非特異的な増幅が起こっていることは明らかである。さらに，引用文献１で言及されている６０塩基程度の非特異的増幅について，Fig.４では確認できないことから，Fig.４は少なくとも低鎖長側のゲル（場合によっては高鎖長側についても）を意図的に開示していない疑いがある。この開示されていない範囲に非特異的な増幅を表わすバンドが存在する可能性を否定することができない一方，本願発明のようなプレートアッセイによる特異性の検証もなされていない。これらの事実に鑑み，引用文献１において，１段階目の増幅で特異的な検出が可能であるとは言えないものと思料する。」と主張している（第３頁参照。）。しかしながら，Figure ４において，非特異的増幅産物として考えられているのは，６０塩基のバンドであり，これはプライマーの二量体化によるものであると示唆されており（上記第３の１．キ．），当該非特異的増幅産物はその分子量からみて，目的とする増幅産物とは明らかに識別可能なものである。また，上記６０３塩基以上のバンドについては，ＰＣＲ法において一般にみられる使用する鋳型ＤＮＡに対応するものであり（本願の図中においても，そのようなバンドは見受けられる。），６０塩基のバンドと同様にその分子量からみて，目的とする増幅産物とは明らかに識別可能なものである。そうしてみると，「１回目のＰＣＲによりメインのバンド以外に非特異的増幅産物の影響から複数のバンドが検出され」ることにより，目的とする増幅産物の検出ができないとは認められず，むしろ，上記第３の１．カ．のごとく，「明らかに同定することができた。」とあり，且つ，リンパ節中に標的とするＤＮＡを検出できたことから，引用発明の１回目のＰＣＲ法による検出は，従来のＰＣＲ法に比べて，十分な特異性を有する方法であり，nested プライマーを用いる第２の増幅工程を行わなくても実際の検出に使用できるものであると認められる。さらに，「プレートアッセイによる特異性の検証」については，本願明細書等をみても，本願発明１が引用発明１と比べて，その特異性において格別顕著な効果を奏することが示されているとは認められない。
　そして，引用発明１は，上記第３の１．ア．及びカ．等のごとく，プライマー・アニーリング工程とプライマー・伸長工程を同じ温度（７０℃）で行うことにより，反応時間が著しく短くなり，反応特異性が有意に改善されたものであるから，操作の点で簡便なものであって，本願発明１の効果は引用発明１から当業者の予測を超えるものとは認められない。 
　よって，請求人の主張（ａ）及び（ｂ）は受け入れられない。
 　 
５．付記
　本件審判請求人は，第２の審尋に対する回答書とともに，平成１８年２月８日付けで提出された手続補正書において，「上記検体を第１段工程に付するに際し，前処理として好中球画分を分取し，これに細菌溶解処理および／またはプロテアーゼ処理を施すものとする」に限定する補正案（以下，「補正案発明」という。）を示している。
　しかしながら，本願出願前に頒布された刊行物である国際公開８８／００６１８号パンフレット（以下，「参考例２」という。）には，細菌感染の有無を検査するために，ヒト等の生物に由来する検体中の細菌を検出する方法が記載され，好中球等の食細胞に貪食されている黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus），表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）等の細菌を検出するために，生体より採取した検体中の細胞（赤血球，白血球など）を溶解後，溶菌，酵素処理を行い，細菌由来の遺伝子の存在を，該遺伝子と相補的な塩基配列を含むＤＮＡ等を標識したプローブを用いて検出する方法が記載されている（第２頁左上欄第４〜５行，左下欄第７〜１４行，右下欄第１４〜１６行，第３頁左上欄第４〜１０行，右上欄第１３行〜左下欄第１８行，右下欄第５行〜下から第２行，第４頁右上欄第１〜６行及び実施例参照）。そうしてみると，細菌の感染の有無を検査するために，好中球に存在する微生物の遺伝子を対象として検出すること，並びに，検体としての好中球等の細胞について，溶菌，酵素処理をすることは知られているのだから，好中球の画分を分取して，細菌溶解処理および／またはプロテアーゼ処理をすることは，当業者が容易に成し得たことと認められるし，その効果は顕著なものとは認められない。
　よって，補正案発明は，特許法第２９条第２項の規定に違反するから，かかる補正の機会を与える必要は見いだせない。
　
第４　むすび
　したがって，本願発明１は，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないから，その余の本願の請求項に係る発明について検討するまでもなく，本特許出願は拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。