(57)【要約】多層フィルムは、プラスモディウム・ファルシパルム、特にスポロゾイト周囲のCIS43エピトープおよびスポロゾイト周囲のT1、BまたはT*エピトープの1つ以上からの、ポリペプチドエピトープを含む。多層フィルムは、宿主への投与時に宿主において免疫応答を誘発することができる。多層フィルムは、熱帯熱マラリア原虫からの1つ以上のポリペプチドエピトープを含む、少なくとも1つの設計ペプチドを含み得る。
2022502459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層フィルムを含む組成物であって、
多層フィルムが、複数の反対に帯電した高分子電解質層を含み、
多層フィルム中の高分子電解質層の1つが、抗原性高分子電解質を含み、抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープ、および抗原性高分子電解質に共有結合したT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含み；
多層フィルム中の高分子電解質が、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む、
組成物。
【請求項２】
抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープのうち2つを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの3つすべてを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
第1抗原性高分子電解質が、ポリペプチドである、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
多層フィルムが、TLRリガンドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
多層フィルムが、コア粒子上に沈着している、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
抗原性高分子電解質が、多層フィルムの最外層中にある、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
多層フィルムを含む組成物であって、
多層フィルムが、複数の反対に帯電した高分子電解質層を含み、
多層フィルム中の第1高分子電解質層が、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質を含み、
多層フィルム中の第2高分子電解質層が、第2高分子電解質に共有結合したT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含み、第1および第2の高分子電解質層が、同一または異なる層であり、
多層フィルム中の高分子電解質が、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む、
組成物。
【請求項９】
第2抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープのうち2つを含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
第2抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの3つすべてを含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１１】
第1抗原性高分子電解質、第2抗原性高分子電解質、またはその両方が、ポリペプチドである、請求項8に記載の組成物。
【請求項１２】
多層フィルムが、TLRリガンドをさらに含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１３】
多層フィルムが、コア粒子上に沈着している、請求項8に記載の組成物。
【請求項１４】
第1および第2の高分子電解質層が、多層フィルムの同一層中にある、請求項8に記載の組成物。
【請求項１５】
第1および第2の高分子電解質層が、多層フィルムの最外層中にある、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
複数の反対に帯電した高分子電解質層を含む、第1多層フィルムであって、第1多層フィルム中の第1高分子電解質層が、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質を含む、第1多層フィルム、および
複数の反対に帯電した高分子電解質層を含む、第2多層フィルムであって、第2多層フィルム中の第2高分子電解質層が、第2高分子電解質に共有結合したT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含む、第2多層フィルム
を含む組成物であって、
多層フィルム中の高分子電解質が、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む、
組成物。
【請求項１７】
第2抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープのうち2つを含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
第2抗原性高分子電解質が、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの3つすべてを含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１９】
第1抗原性高分子電解質、第2抗原性高分子電解質、またはその両方が、ポリペプチドである、請求項16に記載の組成物。
【請求項２０】
多層フィルムが、TLRリガンドをさらに含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項２１】
第1および第2の多層フィルムが、別々のコア粒子上に沈着している、請求項16に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項1に記載の組成物を脊椎動物に投与することを含む、脊椎動物において免疫応答を誘発する方法。
【請求項２３】
請求項8に記載の組成物を脊椎動物に投与することを含む、脊椎動物において免疫応答を誘発する方法。
【請求項２４】
請求項16に記載の組成物を脊椎動物に投与することを含む、脊椎動物において免疫応答を誘発する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2018年10月4日出願の米国仮出願第62/741,198号に基づく優先権を主張し、当該出願は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
（発明の分野）
本開示は、マラリア感染の予防のための組成物および方法、特に抗原エピトープを含む多層フィルム組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、世界中の熱帯および亜熱帯地域で最も蔓延している感染症の1つである。マラリア感染は、世界中の何億もの人々に重篤な病気を引き起こし、主に発展途上国および新興国で毎年何百万人もの死につながっている。マラリアの広範な発生および発生率の上昇は、薬物耐性の寄生虫および殺虫剤耐性の寄生虫ベクターの数の増加の結果である。他の要因には、環境および気候の変化、内乱ならびに人口の流動性の増加が挙げられる。
【０００３】
マラリアは、プラスモディウム（Plasmodium）属に属する蚊媒介性血性原生動物寄生虫によって引き起こされる。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium protozoa）の4種（P.ファルシパルム（P. falciparum）、P.ビバックス（P. vivax）、P.オバレ（P. ovale）およびP.マラリアエ（P. malariae））は、ヒトの疾患の原因であり；マウスにおけるP.ヨエリ（P. yoelii）およびP.ゲルヘイ（P. berghei）などの他の多くが、動物において疾患を引き起こす。P.ファルシパルムは、感染症の大部分を占め、最も致死的なタイプであり、「熱帯マラリア」と呼ばれることもある。マラリア寄生虫は、いくつかの病期からなるライフサイクルを持つ。各病期は、対応して生じる病期特異的抗原に対する特異的免疫応答を誘発することができる。
【０００４】
マラリアに対する免疫応答を刺激するのに適した抗原組成物の改善が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、組成物は、
複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含む多層フィルムを含み、ここで、
多層フィルム中の高分子電解質層の1つは、抗原性高分子電解質を含み、抗原性高分子電解質は、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープ、および抗原性高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含み；
多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。
【０００６】
一態様において、組成物は、
複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含む多層フィルムを含み、ここで、
多層フィルム中の第1高分子電解質層は、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質を含み、
多層フィルム中の第2高分子電解質層は、第2高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含み、第1および第2の高分子電解質層は、同一または異なる層であり、
多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。
【０００７】
別の一実施態様において、組成物は、
複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含む、第1多層フィルムであって、第1多層フィルム中の第1高分子電解質層が、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質を含む、第1多層フィルム、および
複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含む、第2多層フィルムであって、第2多層フィルム中の第2高分子電解質層が、第2高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含む、第2多層フィルム
を含み、ここで、
多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、CIS43（枠内）、T1（太字）、B（太字のイタリック体）およびT*（太字と下線）の特定の残基を強調した完全長のP.ファルシパルムのCSタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０００９】
【図２】図2は、スポロゾイト周囲ペプチド含有ナノ粒子またはマイクロ粒子のエピトープおよび抗原ペプチドを示す。（上部パネル）CIS43、T1、B、およびT*エピトープの位置および配列を示すP.ファルシパルムのCSタンパク質の略図。（下部パネル）ポリ-リシンテールに融合したCSサブユニットペプチドのデザイン。
【００１０】
上記およびその他の特徴は、下記の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から当業者に明らかであり、理解されるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
熱帯熱マラリア原虫からのポリペプチドエピトープを含む多層フィルムを開示するものであり、ここで、多層フィルムは、宿主への投与時に宿主において免疫応答を誘発することができる。これまでに、P.ファルシパルムのスポロゾイト周囲[CS]のタンパク質のT1BT*エピトープを含有するペプチドを負荷した多層フィルムを含む粒子は、マウス、ウサギおよび非ヒト霊長類において寄生虫中和抗体応答を誘発し、またP.ファルシパルムのCSの中央反復領域を発現するトランスジェニックP.ゲルヘイを用いた負荷からマウスを保護することが示されている。これらのフィルムおよび粒子は、米国特許第9,433,671号に記載されている。最近記載されているのは、弱毒化P.ファルシパルムスポロゾイトで免疫化された患者から単離されたヒトモノクローナル抗体CIS43の結合標的として同定されたCIS43エピトープである。受動移入実験において、CIS43は、P.ファルシパルムCSに発現するプラスモディウムスポロゾイト（トランスジェニックまたは内因性のいずれか）での負荷からマウスを保護した。結合試験は、CIS43が、2段階のプロセスでCSと相互作用し、最初に、結合領域エピトープ（101-NPDPNANPNVDPNAN-115；配列番号20）に高い親和性で結合し、次に、T1BT*のB反復エピトープ129-140と重複するB反復エピトープ（133-NANPNANPNANPNAN-147：配列番号21）における残基に高い親和性で結合することを示した。この2段階の結合プロセスが、CSタンパク質の構造変化を誘発し得て、タンパク質分解的切断から保護し得ることが仮説立てられた。
【００１２】
P.ファルシパルムのCIS43エピトープならびにP.ファルシパルムのT1、BおよびT*エピトープの1つ以上を含有する多層フィルムおよび粒子を記載する。いくつかの実施態様において、T*エピトープは、米国特許第9,968,665号に記載されているようにCysからSerへの置換を有するT*M変異体である。具体的には、一実施態様において、フィルムは、1つ以上のプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のタンパク質抗原を含み、ここで、スポロゾイト周囲タンパク質抗原は、CIS43エピトープ、ならびにT1エピトープ、Bエピトープ、T*エピトープおよびT*Mエピトープの少なくとも1つを含む。また、2つ以上の異なる多層フィルムを含む組成物も含まれる。
【００１３】
本明細書で用いるP.ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43、T1、B、T*またはT*Mエピトープは、免疫系によって認識されるP.ファルシパルムのCSタンパク質の一部を指す。典型的には、エピトープの長さは、約4〜約25アミノ酸であり、P.ファルシパルムのCSタンパク質全体を含まない。
【００１４】
T1エピトープ、Bエピトープ、T*エピトープおよびT*Mエピトープの少なくとも1つを含有する多層フィルムにCIS43エピトープを加えることが、現在のワクチンと比較して、より高い力価でより高いアビディティーの改変ワクチンによる抗体応答の誘導によって、より強力なマラリアワクチンをもたらすと予想される。CSタンパク質は、配列番号1を有する。
【００１５】
本明細書で用いるプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のタンパク質エピトープは、
T1：DPNANPNVDPNANPNV（配列番号2）
B：NANP（配列番号3）
T*：EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT（配列番号4）
T*M（改変T*）：EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT（配列番号5）
CIS43：PADGNPDPNANPNV（配列番号6）
である。
【００１６】
特定の実施態様において、T1、B、T*またはT*Mエピトープ、特にBエピトープは、2回以上繰り返される。
【００１７】
例示的なペプチドは、
T1BT*M：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGK20（配列番号7）
T1BT*：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGK20（配列番号8）
T*M：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGK20（配列番号9）
T*：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGK20（配列番号10）
T1B：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPK20（配列番号11）
を含む。
【００１８】
例示的な本発明のペプチドは、
CIS43：PADGNPDPNANPNVDPNANK20（配列番号12）
CIS43T1BT*M：PADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGK20（配列番号13）
CIS43T1BT*：PADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGK20（配列番号14）
CIS43T1B：PADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPK20（配列番号15）
CIS43T1：PADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPK20（配列番号16）
CIS43B：PADGNPDPNANPNVDPNANNANPNANPNANPK20（配列番号17）
CIS43T*M：PADGNPDPNANPNVDPNANEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGK20（配列番号18）
CIS43T*：PADGNPDPNANPNVDPNANEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGK20（配列番号19）
を含む。
【００１９】
任意の組合せのペプチドが用いられ得る。一実施態様において、可動性リンカー、例えばSGSは、融合ポリペプチド、例えばCYS43-SGS-T1*M内の隣接する抗原領域の間に配置され得る。
【００２０】
一実施態様において、多層フィルムは、複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含み、ここで、多層フィルム中の高分子電解質層の1つは、抗原性高分子電解質を含み、抗原性高分子電解質は、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープ、および抗原性高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含み；多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。この実施態様において、CIS43エピトープならびにT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上は、同一の抗原性高分子電解質に存在する。
【００２１】
別の一実施態様において、組成物は、複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含む多層フィルムを含み、ここで、多層フィルム中の第1高分子電解質層は、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質を含み、多層フィルム中の第2高分子電解質層は、第2高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含み、第1および第2の高分子電解質層は、同一または異なる層であり、多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。この実施態様において、CIS43エピトープならびにT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上は、異なる抗原性高分子電解質上にあり、ここで高分子電解質は、多層フィルムの同一または異なる層中であり得る。
【００２２】
また更なる実施態様において、第1多層フィルムは、複数の交互に反対に帯電した高分子電解質層を含み、ここで、第1多層フィルム中の第1高分子電解質層は、共有結合したプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43エピトープを含む、第1抗原性高分子電解質、ならびに複数の反対に帯電した高分子電解質層を含む、第2多層フィルムを含み、ここで、多層フィルム中の第2高分子電解質層は、第2高分子電解質に共有結合した、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上を含む、第2抗原性高分子電解質を含み、第2多層フィルム中の高分子電解質は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン性材料またはポリアニオン性材料を含む。この実施態様において、CIS43エピトープならびにT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上は、異なる多層フィルム中にあり、これはその後混合される。例えば、この実施態様において、CIS43エピトープならびにT1、B、T*およびT*Mエピトープの1つ以上は、別々のマイクロ粒子上に重層され得て、該マイクロ粒子は、その後混合されて、組成物を形成する。
【００２３】
具体的には、多層フィルムは、交互に反対に帯電した高分子電解質の交互層を含む。所望により、高分子電解質の1つ以上は、ポリペプチドである。特定の実施態様において、多層フィルムは、熱帯熱マラリア原虫からの複数のエピトープを含む。例えば、第1および第2の熱帯熱マラリア原虫のポリペプチドエピトープは、同一または異なる高分子電解質と結合し得て、および／または同一または異なる多層フィルムに存在し得る。一実施態様において、第1および第2の熱帯熱マラリア原虫のポリペプチドエピトープは、同一高分子電解質に共有結合しており、それ故に同一多層フィルム中にある。別の一実施態様において、第1および第2の熱帯熱マラリア原虫のポリペプチドエピトープは、異なる高分子電解質に共有結合しているが、同一多層フィルム内で重層されている。また別の一実施態様において、第1および第2の熱帯熱マラリア原虫のポリペプチドエピトープは、異なる高分子電解質に共有結合しているが、その後投与前に混合される異なる多層フィルムに重層されている。
【００２４】
一実施態様において、第1抗原性高分子電解質は、CIS43エピトープ、ならびにプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの少なくとも1つを含む。一実施態様において、第1抗原性高分子電解質は、CIS43エピトープ、ならびにプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、BおよびT*エピトープのうち2つ、例えばCIS43T1T*、CIS43T1T*M、CIS43T1B、CIS43BT*またはCIS43BT*Mを任意の順序で含む。また別の一実施態様において、第1抗原性高分子電解質は、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、BおよびT*エピトープの3つすべてを含む。
【００２５】
一実施態様において、第1高分子電解質は、ポリペプチドである。エピトープは、ポリペプチド鎖上で隣接していてもよく、あるいはスペーサー領域により隔てられていてもよい。同様に、エピトープは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端またはその間の任意の場所にあり得る。エピトープは、ポリペプチドの隣接部分にあってもよく、あるいはいずれかまたはすべてのエピトープは、スペーサー領域により隔てられていてもよい。
【００２６】
一実施態様において、第1抗原性高分子電解質は、CIS43エピトープを含み、第2高分子電解質は、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、B、T*およびT*Mエピトープの少なくとも1つを含む。一実施態様において、第2抗原性高分子電解質は、プラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のT1、BおよびT*エピトープのうち2つ、例えばT1T*、T1T*M、T1B、BT*またはBT*Mを任意の順序で含む。
【００２７】
一実施態様において、第1および第2の高分子電解質は、ポリペプチドである。エピトープは、ポリペプチド鎖上で隣接していてもよく、あるいはスペーサー領域により隔てられていてもよい。同様に、エピトープは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端またはその間の任意の場所にあり得る。エピトープは、ポリペプチドの隣接部分にあってもよく、あるいはいずれかまたはすべてのエピトープは、スペーサー領域により隔てられていてもよい。
【００２８】
第1抗原性高分子電解質がポリペプチドであるとき、ポリペプチドは、ポリペプチド多層フィルムへの沈着に十分な電荷を含有することに留意されたい。一実施態様において、ポリペプチドの残基当たりの正味電荷は、本明細書で説明するようにpH7.0にて0.1、0.2、0.3、0.4または0.5と等しいかまたはそれ以上である。
【００２９】
一実施態様において、抗原ポリペプチドは、ポリペプチドが安定して多層フィルムに沈着できるように電荷を提供する表面吸着領域を含む。一実施態様において、表面吸着領域は、5個以上の負または正に帯電したアミノ酸残基を含む。
【００３０】
一実施態様において、多層フィルムは、37℃のリン酸緩衝生理食塩水中で24時間インキュベートするとき、高分子電解質の少なくとも半分を保持する。
【００３１】
別の一実施態様において、同一高分子電解質上にあるプラスモディウム・ファルシパルムのスポロゾイト周囲のCIS43、T1、B、T*およびT*Mエピトープの代わりに、2または3つのエピトープが、別々の高分子電解質上に存在し、同一多層フィルムに重層にされ得る。あるいは、別々の高分子電解質上に存在するCIS43、T1、B、T*およびT*Mエピトープは、異なる多層フィルムに存在し得る。
【００３２】
特定の実施態様において、多層フィルムは、トール様受容体リガンドをさらに含む。本明細書で用いるトール様受容体リガンドまたはTLRリガンドは、TLRに結合し、TLR受容体を活性化または抑制する分子である。病原体関連分子パターン（PAMP）および類似体の認識によるTLRシグナル伝達の活性化は、抗原特異的適応免疫応答の活性化を制御し得る、炎症誘発性サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子をコードする遺伝子の転写活性化につながる。TLRは、様々な炎症性疾患および癌の潜在的な治療標的として探求されてきた。活性化後、TLRは、炎症性サイトカイン、I型インターフェロンおよびケモカインを含む多くのタンパク質ファミリーの発現を誘発する。TLR受容体リガンドは、免疫応答のアジュバントとして機能し得る。
【００３３】
例示的なTLRリガンドとしては、TLR1リガンド、TLR2リガンド、TLR3リガンド、TLR4リガンド、TLR5リガンド、TLR6リガンド、TLR7リガンド、TLR8リガンド、TLR9リガンドおよびその組合せが挙げられる。
【００３４】
例示的なTLR1リガンドとしては、細菌のリポペプチドが挙げられる。例示的なTLR2リガンドとしては、リポペプチド、例えばPam3Cys（[N-パルミトイル-S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン]）およびPam2Cys（Pam2Cys[S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン]）が挙げられる。例示的なTLR6リガンドは、ジアシルリポペプチドである。TLR1およびTLR6は、リガンドを識別するためにTLR2とヘテロ二量体化を必要とする。交差認識される場合もあるが、TLR1/2は、トリアシルリポタンパク質（またはリポペプチド、例えばPam3Cys）により活性化され、一方、TLR6/2は、ジアシルリポタンパク質（例えばPam2Cys）により活性化される。
【００３５】
例示的なTLR3リガンドはポリ(I:C)である。例示的なTLR4リガンドは、リポ多糖（LPS）および一リン脂質A（MPL）である。例示的なTLR5リガンドは、フラジェリンである。例示的なTLR7リガンドは、イミキモドである。例示的なTLR8リガンドは、一本鎖RNAである。例示的なTLR9リガンドは、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチドDNAである。
【００３６】
一実施態様において、第1、第2または第3の抗原性高分子電解質、例えば抗原ポリペプチドは、それに共有結合したTLRリガンドを有する。例えば、Pam3Cysは、標準的なポリペプチド合成化学によってポリペプチド鎖に共有結合させ得る。
【００３７】
別の一実施態様において、基質、例えば鋳型コアは、高分子電解質の沈着前に、その上にTLRリガンドを沈着させている。別の一実施態様において、TLRリガンドは、多層フィルムの組織化中に、1つ以上の高分子電解質層と共沈着され得る。
【００３８】
一実施態様において、多層フィルムは、コア粒子、例えばCaCO3ナノ粒子、ラテックス粒子または鉄粒子上に沈着している。直径が5ナノメーター（nm）〜15マイクロメーター（μm）のオーダーの粒子サイズは、直径が1μm以上の粒子、例えば直径3μmの粒子と同様に、特に有用である。他の材料で作られた粒子はまた、生体適合性であり、制御可能なサイズ分布を有し、かつ、高分子電解質ペプチドに結合するのに十分な表面電荷（正または負）を有する場合、コアとして用いられ得る。例としては、ポリ乳酸（PLA）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリエチレングリコール（PEG）、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチン、またはその組合せなどの材料で作られたナノ粒子およびマイクロ粒子が挙げられる。コア粒子はまた、フィルム製造後に溶解して多層フィルムから分離できる場合、ヒトでの使用に不適切と考えられている材料で作られ得る。鋳型コア物質の例としては、有機ポリマー、例えばラテックスまたは無機材料、例えばシリカが挙げられる。
【００３９】
高分子電解質多層フィルムは、反対に帯電した高分子電解質の交互層で構成される薄いフィルム（例えば数ナノメートルから数マイクロメートルの厚さ）である。このようなフィルムは、適切な基質上に層ごとに構築することにより形成され得る。静電的交互吸着自己組織化（layer-by-layer self-assembly、「LBL」）において、高分子電解質の組織化の物理的基礎は、静電引力である。フィルムの表面電荷密度の符号が連続層の沈着で反転するため、フィルムの積層が可能である。LBLフィルム製造の一般性および相対的単純性により、多くの異なるタイプの表面上に多くの異なるタイプの高分子電解質を沈着させることが可能である。ポリペプチド多層フィルムは、本明細書で設計ポリペプチドと称する、帯電したポリペプチドを含む少なくとも1つの層を含む、高分子電解質多層フィルムのサブセットである。他のポリマーから作られたフィルムに対するポリペプチド多層フィルムの重要な利点は、生体適合性である。LBLフィルムはまた、カプセル化に用いられ得る。ポリペプチドフィルムおよびマイクロカプセルの用途は、例えばナノリアクター、バイオセンサー、人工細胞および薬物送達ビヒクルを含む。
【００４０】
用語「高分子電解質」は、1,000を超える分子量および分子当たり少なくとも5つの電荷を有する、ポリカチオン性およびポリアニオン性材料を含む。適切なポリカチオン性材料としては、例えばポリペプチドおよびポリアミンが挙げられる。ポリアミンは、例えば、ポリペプチド、例えばポリ-L-リシン（PLL）またはポリ-L-オルニチン、ポリビニルアミン、ポリ(アミノスチレン)、ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N-メチルアミノアクリレート)、ポリ(N-エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノアクリレート)、ポリ(アミノメタクリレート)、ポリ(N-メチルアミノ-メタクリレート)、ポリ(N-エチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノメタクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)、ポリ(N,N,N-トリメチルアミノアクリレートクロリド)、ポリ(メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド)、キトサン、および1つ以上の前記ポリカチオン性材料を含む組合せを含む。適切なポリアニオン性材料としては、例えば、ポリペプチド、例えばポリ-L-グルタミン酸（PGA）およびポリ-L-アスパラギン酸、核酸、例えばDNAおよびRNA、アルギン酸、カラギーナン、フルセララン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ポリ(メタ）アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、酸性多糖類およびクロスカルメロース、ペンダントカルボキシル基を含む合成ポリマーおよびコポリマー、および1つ以上の前記ポリアニオン性材料を含む組合せが挙げられる。一実施態様において、熱帯熱マラリア原虫のエピトープおよび高分子電解質は、同じ電荷の符号を有する。
【００４１】
一実施態様において、フィルムの1つ以上の高分子電解質層は、所望により、熱帯熱マラリア原虫のエピトープを含む高分子電解質を含み、設計ポリペプチドである。一実施態様において、静電的交互積層沈着（electrostatic layer-by-layer deposition）に適したポリペプチドの設計原理は、米国特許出願第2005/0069950号で説明されており、当該出願は、ポリペプチド多層フィルムの教示のために出典明示により本明細書の一部とする。簡単には、主要な設計上の懸念事項は、ポリペプチドの長さと電荷である。静電気は、LBLの基礎であるため、最も重要な設計上の懸念事項である。適切な電荷特性がなければ、ポリペプチドは、pH4〜10の水溶液中で実質的に溶解しない可能性があり、LBLによる多層フィルムの製造に容易に用いることができない。他の設計上の懸念事項としては、ポリペプチドの物理的構造、ポリペプチドから形成されるフィルムの物理的安定性、ならびにフィルムおよび構成ポリペプチドの生体適合性および生体活性が挙げられる。
【００４２】
設計ポリペプチドは、反対に帯電した表面に安定して結合するのに十分な電荷を有するポリペプチド、すなわち、フィルム形成の駆動力が静電気である多層フィルムの層に沈着し得るポリペプチドを意味する。短く安定なフィルムは、形成されると、37℃のPBS中で24時間インキュベートした後に構成成分の半分以上を保持するフィルムである。特定の実施態様において、設計ポリペプチドの長さは、少なくとも15アミノ酸であり、ポリペプチドの残基当たりの正味電荷の大きさは、pH7.0にて、0.1、0.2、0.3、0.4または0.5と等しいかまたはそれ以上である。pH7.0にて正に帯電した（塩基性）天然に存在するアミノ酸は、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、オルニチン（Orn）およびリシン（Lys）である。pH7.0にて負に帯電した（酸性）天然に存在するアミノ酸残基は、グルタミン酸（Glu）およびアスパラギン酸（Asp）である。全体的な正味電荷比が特定の基準を満たす限り、反対の電荷のアミノ酸残基の混合物は、用いられ得る。一実施態様において、設計ポリペプチドは、ホモポリマーではない。別の一実施態様において、設計ポリペプチドは、分岐していない。
【００４３】
設計上の懸念事項の1つは、ポリペプチドLBLフィルムの安定性の制御である。イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用は、多層フィルムの安定性に寄与する。また、同一層内または隣接する層中のポリペプチドにおけるスルフヒドリル含有アミノ酸間に形成される共有ジスルフィド結合は、構造強度を増加させ得る。スルフヒドリル含有アミノ酸は、システインおよびホモシステインを含み、これらの残基は、合成設計ペプチドに容易に組み込まれ得る。また、スルフヒドリル基は、文献に十分記載されている方法によって、高分子電解質ホモポリマー、例えばポリ-L-リシンまたはポリ-L-グルタミン酸に組み込まれ得る。スルフヒドリル含有アミノ酸は、酸化電位の変化により多層ポリペプチドフィルムの層を「ロックする」（一緒に結合する）および「ロック解除する」ために用いられ得る。また、設計ポリペプチドにおけるスルフヒドリル含有アミノ酸の組み込みは、分子間ジスルフィド結合の形成により、薄いフィルムの製造において比較的短いペプチドの使用を可能にする。
【００４４】
一実施態様において、設計スルフヒドリル含有ポリペプチドは、化学的に合成されたかまたは宿主生物体で産生されたかにかかわらず、還元剤の存在下でLBLにより組織化して、早期のジスルフィド結合形成を防ぐ。フィルムの組織化後に、還元剤を取り除き、酸化剤を加える。酸化剤の存在下で、スルフヒドリル基間でジスルフィド結合が形成され、これにより、チオール基が存在する層内または層間でポリペプチドを一緒に「ロックする」。適切な還元剤は、ジチオスレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール（BME）、還元型グルタチオン、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロリド（TCEP）、および1つ以上のこれら化学物質の組合せを含む。適切な酸化剤は、酸化型グルタチオン、tert-ブチルヒドロペルオキシド(t-BHP)、チメロサール、ジアミド、5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ-安息香酸)（DTNB）、4,4'-ジチオジピリジン、臭素酸ナトリウム、過酸化水素、テトラチオ酸ナトリウム、ポルフィリンジン、オルトヨード安息香酸ナトリウム、および1つ以上のこれら化学物質の組合せを含む。
【００４５】
ジスルフィド結合の代わりに、他の共有結合を生じる化学物質を用いて、LBLフィルムを安定化し得る。ポリペプチドで構成されるフィルムについて、アミド結合を生じる化学物質が特に有用である。適切なカップリング剤の存在下で、酸性アミノ酸（カルボン酸基を含む側鎖を有するもの、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）は、アミン基を含む側鎖を有するアミノ酸（例えばリシンおよびオルニチン）と反応して、アミド結合を形成する。アミド結合は、生物学的条件下でジスルフィド結合より安定であり、アミド結合は、交換反応を受けない。多くの試薬を用いて、アミド結合のためにポリペプチド側鎖を活性化し得る。カルボジイミド試薬、例えば水溶性1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）は、わずかに酸性のpHにてアスパラギン酸またはグルタミン酸と反応するものであり、アミンと不可逆的に反応して、アミド結合を生じる中間体生成物を形成する。添加物、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドは、アミド形成の速度および効率を加速するために堪能にしばしば加えられる。反応後、可溶性試薬は、遠心分離および吸引によりナノ粒子またはマイクロ粒子から取り除かれる。他のカップリング剤の例としては、ジイソプロピルカルボジイミド、HBTU、HATU、HCTU、TBTUおよびPyBOPが挙げられる。他の添加物の例としては、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾールが挙げられる。アミド架橋の程度は、カップリング剤の化学量論、反応時間または反応温度を調節することにより制御され得て、フーリエ変換赤外分校法（FT-IR）などの技術によりモニターされ得る。
【００４６】
共有結合的に架橋したLBLフィルムは、所望の特性、例えば増加した安定性を有する。より高い安定性によって、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセルまたはマイクロカプセルの製造中により厳しい条件を用いることができる。厳しい条件の例としては、高温、低温、極低温、高遠心分離速度、高塩緩衝液、高pH緩衝液、低pH緩衝液、ろ過および長期保存が挙げられる。
【００４７】
高分子電解質多層フィルムの製造方法は、反対に帯電した化学種の複数の層を基質の上に沈着させることを含む。一実施態様において、少なくとも1つの層は、設計ポリペプチドを含む。連続して沈着している高分子電解質は、反対の正味電荷を有する。一実施態様において、高分子電解質の沈着は、LBLに適した正味電荷を有するpHにて高分子電解質を含む水溶液に基質を暴露することを含む。他の実施態様において、基質上への高分子電解質の沈着は、反対に帯電したポリペプチドの溶液を連続的に噴霧することにより達成される。また別の実施態様において、基質上への沈着は、反対に帯電した高分子電解質の溶液を同時に噴霧することによるものである。
【００４８】
多層フィルムを形成するLBL法において、隣接する層の反対の電荷は、組織化のための駆動力を提供する。反対の層上の高分子電解質が同じ正味の線形電荷密度を有することは重要ではなく、反対の層が反対の電荷を有することが重要である。沈着による1つの標準的な組織化手順は、イオン化するpH（すなわちpH4〜10）にてポリイオンの水溶液を形成すること、表面電荷を有する基質を提供すること、帯電した高分子電解質溶液へ基質を交互に浸すことを含む。基質は、所望により、交互層の沈着の間に洗浄される。
【００４９】
高分子電解質の沈着に適した高分子電解質の濃度は、当業者によって容易に決定され得る。例示的な濃度は、0.1〜10 mg/mLである。典型的な非ポリペプチド高分子電解質、例えばポリ(アクリル酸)およびポリ(アリルアミン塩酸塩)については、典型的な層の厚さは、溶液のイオン強度に応じて約3Å〜約5Åである。短い高分子電解質は、典型的には、長い高分子電解質より薄い層を形成する。フィルムの厚さに関して、高分子電解質フィルムの厚さは、湿度ならびにフィルムの層数および組成に依存する。例えば、厚さ50 nmのPLL/PGAフィルムは、窒素との乾燥の際に1.6 nmに縮む。一般的に、フィルムの水和状態および組織化に用いられる高分子電解質の分子量に応じて、厚さが1 nm〜100 nm以上のフィルムを形成し得る。
【００５０】
また、安定な高分子電解質多層フィルムを形成するのに必要とされる層数は、フィルム中の高分子電解質に依存する。低分子量ポリペプチド層のみを含むフィルムについては、フィルムは、典型的には、反対に帯電したポリペプチドの二重層を4つ以上有する。高分子量高分子電解質、例えばポリ(アクリル酸)およびポリ(アリルアミン塩酸塩)を含むフィルムについては、反対に帯電したポリペプチドの二重層を1つ含むフィルムが安定であり得る。研究は、高分子電解質フィルムが動的であることを示している。フィルム内に含まれる高分子電解質は、層間を移動し得て、また、高分子電解質溶液に懸濁させたときに同様の電荷の可溶性高分子電解質と交換し得る。さらに、高分子電解質フィルムは、懸濁緩衝液の温度、pH、イオン強度または酸化電位などの環境の変化に応答して分解または溶解し得る。したがって、いくつかの高分子電解質、特にペプチド高分子電解質は、一時的な安定性を示す。ペプチド高分子電解質フィルムの安定性は、フィルムを適切な緩衝液中に制御された条件下で一定時間懸濁させ、その後フィルム内の一定量のペプチドを、アミノ酸分析、HPLCアッセイまたは蛍光アッセイなどの適切なアッセイを用いて測定することにより、モニターされ得る。ペプチド高分子電解質フィルムは、ワクチンとしての貯蔵および使用に関連する条件下で、例えば中性緩衝液中で、4〜37℃などの周囲温度にて、最も安定である。これらの条件下で、安定なペプチド高分子電解質フィルムは、少なくとも24時間および多くの場合最大14日間以上、その構成成分のペプチドのほとんどを保持する。
【００５１】
一実施態様において、設計ポリペプチドは、1つ以上の熱帯熱マラリア原虫のエピトープに共有結合した1つ以上の表面吸着領域を含み、ここで、設計ポリペプチドおよび1つ以上の表面吸着領域は、同じ符号の電荷を有する、すなわち、全体として両方正に帯電しているかまたは両方負に帯電している。本明細書で用いる表面吸着領域は、熱帯熱マラリア原虫からのエピトープを含有するペプチドが、例えば多層フィルムに沈着し得るように、十分な電荷を有利に提供する、設計ポリペプチドの帯電した領域である。一実施態様において、1つ以上の表面吸着領域および1つ以上の熱帯熱マラリア原虫のエピトープは、同じ正味の極性を有する。別の一実施態様において、pH4〜10における設計ポリペプチドの溶解度は、約0.1 mg/mL以上である。別の一実施態様において、pH4〜10における設計ポリペプチドの溶解度は、約1 mg/mL以上である。溶解度は、水溶液からのポリペプチドの沈着を容易にする実質的な制限である。抗原ポリペプチドの重合度の実質的な上限は、約1,000残基である。しかしながら、より長い複合ポリペプチドは、適切な合成方法によって実現され得ると考えられる。
【００５２】
一実施態様において、設計ポリペプチドは、表面吸着領域のN末端と表面吸着領域のC末端の2つの表面吸着領域に隣接する、単一抗原性熱帯熱マラリア原虫エピトープを含む。別の一実施態様において、設計ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫のエピトープのN末端に結合した1つの表面吸着領域に隣接する、単一抗原性熱帯熱マラリア原虫エピトープを含む。別の一実施態様において、設計ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫のエピトープのC末端に結合した1つの表面吸着領域に隣接する、単一抗原性熱帯熱マラリア原虫エピトープを含む。
【００５３】
設計ポリペプチドの独立した領域（例えば、熱帯熱マラリア原虫のエピトープおよび表面吸着領域）の各々は、液相合成ペプチド、固相ペプチド合成、または適切な宿主生命体の遺伝子工学によって別々に合成され得る。液相ペプチド合成は、今日上市中の承認されているペプチド医薬品の多くの製造に用いられる方法である。液相法と固相法の組合せは、比較的長いペプチドおよび極めて小さいタンパク質を合成するのに用いられ得る。ペプチド合成会社は、対価（fee-for-service）ベースで難しいペプチドを合成する専門知識および経験を有する。合成は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準（GMP）の条件下で、臨床試験および市販薬の発売に適した規模で、実施される。
【００５４】
あるいは、様々な独立した領域は、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、または適切な宿主生命体の遺伝子工学によって、単一ポリペプチド鎖として一緒に合成され得る。特定の場合のアプローチの選択は、利便性または経済性の問題である。
【００５５】
様々な熱帯熱マラリア原虫のエピトープおよび表面吸着領域が別々に合成されるならば、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによって精製されると、それらはペプチド結合合成によってつなげられる。すなわち、表面吸着領域のN末端および熱帯熱マラリア原虫のエピトープのC末端を、共有結合させて、設計ポリペプチドを生成する。あるいは、表面吸着領域のC末端および熱帯熱マラリア原虫のエピトープのN末端を、共有結合させて、設計ポリペプチドを生成する。個々のフラグメントは、固相法によって合成され、そして完全に保護されたか、完全に保護されていないかまたは部分的に保護されたセグメントとして得られ得る。セグメントを、液相反応または固相反応において共有結合させ得る。一方のポリペプチドフラグメントがN末端残基としてシステインを含み、他方のポリペプチドフラグメントがC末端残基としてチオエステルまたはチオエステル前駆体を含む場合、2つのフラグメントは、ネイティブライゲーションとして（当業者に）一般的に知られている特定反応により、溶液中で自発的に結合する。ネイティブライゲーションは、水溶液中で希釈濃度にて完全に脱保護されているかまたは部分的に保護されているペプチドフラグメントを用いて実施できるため、設計ペプチド合成に対して特に魅力的な選択肢である。
【００５６】
一実施態様において、熱帯熱マラリア原虫のエピトープおよび／または表面吸着領域は、米国特許第7,723,294号に記載のペプチド結合または非ペプチド結合によりつなげられ、当該特許は、多層フィルムにおける使用のためのポリペプチドのセグメントをつなぐ非ペプチド結合の使用の教示のために、出典明示により本明細書の一部とする。適切な非ペプチドリンカーは、例えばアルキルリンカー、例えば式中s=2〜20である-NH-(CH2)s-C(O)-を含む。アルキルリンカーは、所望により、非立体障害基、例えば低級アルキル（例えばC1-C6）、低級アシル、ハロゲン（例えばCl、Br）、CN、NH2、フェニルなどにより置換される。別の例示的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー、例えば-NH-(CH2-CH2-O)n、-C(O)-（式中、nは、リンカーが100〜5000 Da、特に100〜500 Daの分子量を有するようなものである）である。本明細書に記載のリンカーの多くは、固相ペプチド合成における使用に適した形態で、商業的供給業者から入手可能である。
【００５７】
一実施態様において、熱帯熱マラリア原虫からのポリペプチドエピトープの1つ以上は、共有結合により、ポリペプチドなどの高分子電解質の1つ以上、または他の高分子電解質と共有結合される。適切な共有結合の例としては、アミド、エステル、エーテル、チオエーテルおよびジスルフィドが挙げられる。当業者は、エピトープペプチド内で見られる様々な官能基を利用して、適切な電解質との結合を設計することができる。例えば、エピトープペプチドにおけるカルボン酸は、アミノ酸のアスパラギン酸またはグルタミン酸のC末端または側鎖のいずれかにおいて見られる。カルボン酸は、ペプチド高分子電解質で見られる第1級または第2級アミン、例えばポリ-L-リシンとの反応に適したペプチドカップリング剤、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）により活性化され得る。得られるアミド結合は、周囲環境条件下で安定である。反対に、ペプチド高分子電解質における酸基は、エピトープペプチドにおけるアミン基との反応のためにEDCにより活性化され得る。有用なアミン基は、エピトープペプチドのN末端またはリシン残基の側鎖にて見られ得る。
【００５８】
エピトープペプチドはまた、ジスルフィド結合を介して高分子電解質と結合し得る。高分子電解質、例えばPGAまたはPLLは、側鎖の一部がスルフヒドリル基を含むように、化学的に修飾され得る。適切な酸化剤の存在下で、これらのスルフヒドリルは、エピトープペプチド内に含まれるシステイン残基のスルフヒドリル基と反応する。システインは、熱帯熱マラリア原虫などの病原体のタンパク質配列からの天然システインであってもよく、あるいはペプチド合成中にエピトープに意図的に組み込まれた非天然システインであってもよい。適切な酸化剤は、DTNB、2,2'-ジチオピリジン、過酸化水素、システインおよび酸化型グルタチオンを含む。ジスルフィド結合による高分子電解質とのエピトープペプチドの結合は、特に有用である。ジスルフィドは、フィルム製造および貯蔵の通常の条件下で安定であるが、細胞において天然で見られる還元剤により容易に切断され、免疫処理のためにエピトープペプチドを解放する。
【００５９】
エピトープペプチドはまた、チオエーテル結合により高分子電解質と結合し得る。合成エピトープペプチドは、スルフヒドリルと特異的に反応するハロアセチル基などの適切な求電子剤を用いて合成され得る。例えば、N末端にてクロロアセチルを含むエピトープペプチドは、上記のPGA-SHなどのスルフヒドリル含有高分子電解質との安定な結合を形成する。
【００６０】
エピトープペプチドはまた、二官能性リンカー分子によって高分子電解質と共有結合し得る。二官能性リンカーは通常、エピトープペプチドまたは高分子電解質分子のいずれかに存在する求核剤と反応し得る2つの求電子基を含む。ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの2種類のリンカー分子が市販されている。ホモ二官能性リンカーは、非反応性スペーサーにより結合された2コピーの求電子基を含む。多くの場合、求電子剤は、求核性アミンと反応する、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルまたはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホNHS）などの活性エステルである。ホモ二官能性NHSエステルの例としては、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビス(スクシンイミジル)プロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタルトレートが挙げられる。時には、求電子剤は、エピトープおよび高分子電解質分子上の求核性アミンとイミドを形成するアルデヒド基である。イミド結合は、一時的に安定であるが、還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたは接触水素化を用いて安定な構造に変換され得る。最も一般的に用いられるホモ二官能性アルデヒドリンカーは、グルタルアルデヒドである。
【００６１】
他の一般的に用いられるホモ二官能性リンカーは、上記のように、システイン含有エピトープペプチドをスルフヒドリル含有高分子電解質と結合させるのに用いられ得る、求核性チオールと特異的に反応する求電子剤を含む。スルフヒドリル特異的ホモ二官能性リンカーの例としては、1,4-ビスマレイミドブタン、1,4-ビスマレイミジル-2,3-ジヒドロキシブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビス-マレイミドエタン、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ブタン、ジチオ-ビスマレイミドエタン、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホンが挙げられる。
【００６２】
架橋試薬のヘテロ二官能性クラスのメンバーは、2つの異なる反応性基を含み、これは、常にではないが多くの場合、基質分子において異なる官能基と特異的に反応する求電子剤である。特に有用なものは、スルフヒドリルに特異的である1つの求電子基、およびアミンに特異的である別の求電子剤を含むリンカーである。これらの試薬の例としては、N-スルホスクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート、N-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート、スクシンイミジル3-[ブロモアセタミド]プロピオネート、N-スクシンイミジルヨードアセテート、スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート、([N-e-マレイミドカプロイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート、スクシンイミジル6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-a-[2-ピリジルジチオ]トルエンが挙げられる。
【００６３】
エピトープペプチドおよび高分子電解質の両方に通常存在するか、またはいずれかの分子に容易に組み込まれ得る、幅広い官能性により、目的の基質に最も適した結合戦略を選択することができる。可能性の高い例は、PLLへのシステイン含有エピトープペプチドの結合である。
【００６４】
ポリペプチドセグメントは、非ペプチドのリンカーの化学的性質に応じて、様々な方法で結合し得る。例えば、第1ポリペプチドセグメントのN末端は、第2ポリペプチドセグメントのC末端に結合し；第1ポリペプチドセグメントのN末端は、第2ポリペプチドセグメントのN末端に結合し；第1ポリペプチドセグメントのC末端は、第2ポリペプチドセグメントのC末端に結合し；第1ポリペプチドセグメントのC末端は、第2ポリペプチドセグメントのN末端に結合し；第1ポリペプチドセグメントのC末端またはN末端は、第2ポリペプチドセグメントのペンダント側鎖に結合し；あるいは、第2ポリペプチドセグメントのC末端またはN末端は、第1ポリペプチドセグメントのペンダント側鎖に結合する。しかしながら、結合点にかかわらず、第1および第2のセグメントは、非ペプチドのリンカーにより共有結合する。
【００６５】
一実施態様において、設計ポリペプチドは、共有結合した1つ以上の表面吸着領域と1つ以上の熱帯熱マラリア原虫のエピトープの固有の組合せである。線形エピトープまたは立体構造エピトープであり得る、熱帯熱マラリア原虫のエピトープの長さに特段の制限はない。エピトープは、複雑な立体構造のエピトープでは約3個のアミノ酸残基から数百個のアミノ酸残基を含み得る。
【００６６】
一実施態様において、設計ポリペプチドは、1つの熱帯熱マラリア原虫のエピトープおよび1つの表面吸着領域を含む。別の一実施態様において、設計ポリペプチドは、1つの熱帯熱マラリア原虫のエピトープ、および2つの表面吸着領域である、熱帯熱マラリア原虫のエピトープのN末端に結合するものおよび熱帯熱マラリア原虫のエピトープのC末端に結合するものを含む。表面吸着領域の目的は、多層フィルムを構築するために、反対に帯電した表面上にポリペプチドを吸着させることを可能とすることである。
【００６７】
熱帯熱マラリア原虫のエピトープの数および／または長さと関連する設計ポリペプチドにおける表面吸着領域の数は、溶解度の要件に関連する。例えば、熱帯熱マラリア原虫のエピトープが、短いアミノ酸配列、例えば3つのアミノ酸残基である場合、少なくとも8つのアミノ酸残基の表面吸着領域1つのみが、適切に帯電した表面上に設計ポリペプチドを吸着させるのに必要とされる。対照的に、熱帯熱マラリア原虫のエピトープが、例えば120個のアミノ酸残基を含むタンパク質の可溶性折り畳み構造ドメインである場合、2つの表面吸着領域が、設計ポリペプチドが水溶性であり、かつ吸着に適するのに十分な電荷を与えるのに必要とされる。表面吸着領域は、ドメインのN末端に隣接して位置するか、ドメインのC末端に隣接して位置するか、またはN末端の1つおよびC末端の1つに非隣接である。また、熱帯熱マラリア原虫のエピトープは、表面吸着領域として機能し得る天然の配列内に帯電したセグメント（負に帯電または正に帯電）を含み得る。
【００６８】
ポリペプチドまたは抗原は、1つ以上の異なる抗原決定基を含み得る。抗原決定基は、多鎖タンパク質の免疫原性部分を指し得る。
【００６９】
特定の抗体の抗原決定基またはエピトープの位置および組成を決定するための方法および技術は、当該技術分野で周知である。これらの技術は、熱帯熱マラリア原虫のエピトープとして用いるためのエピトープを同定および／または特性評価するのに用いられ得る。一実施態様において、抗原特異的抗体についてのエピトープのマッピング／特性評価方法は、抗原タンパク質中の露出アミン／カルボキシルの化学的修飾を用いるエピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術の一例は、HXMS（質量分析により検出される水素-重水素交換）の使用であり、受容体およびリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素／重水素交換、結合および逆交換が生じ、タンパク質結合に参加する骨格アミド基は、逆交換から保護され、それ故に重水素化されたままである。関連する領域は、消化性タンパク質分解、迅速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析によってこの時点で同定され得る。
【００７０】
別の一実施態様において、適切なエピトープの同定技術は、核磁気共鳴エピトープマッピング（NMR）であり、典型的には、遊離抗原、および抗体などの抗原結合ペプチドと複合体化した抗原の二次元NMRスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。NMRスペクトルで、抗原に対応するシグナルのみが見られ、抗原結合ペプチドからのペプチドは見られないように、抗原は、典型的には、15Nで選択的に同位体標識される。抗原結合ペプチドの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的には、遊離抗原のスペクトルと比較して複合体のスペクトルの位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸は、そのように同定され得る。
【００７１】
別の一実施態様において、エピトープのマッピング／特性評価は、ペプチドスキャンにより行われ得る。このアプローチにおいて、抗原のポリペプチド鎖の完全長にまたがる一連の重複ペプチドが製造され、免疫原性に関して個別に試験される。対応するペプチド抗原の抗体価は、標準的な方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイにより決定される。その後、様々なペプチドは、ワクチン開発のためのペプチド設計を選択するための経験的基礎を提供する、免疫原性に関するランクが付けられ得る。
【００７２】
別の一実施態様において、プロテアーゼ消化技術もまた、エピトープマッピングおよび同定との関連で有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えば、トリプシンを抗原タンパク質に対しておよそ1：50の比で用いて37℃、pH7〜8にて一晩（O/N）消化し、その後ペプチド同定のために質量分析（MS）をすることにより、決定され得る。抗原タンパク質によるトリプシン切断から保護されるペプチドは、続いて、トリプシン消化に供された試料と、CD38BPとインキュベートし、その後例えばトリプシンによる消化に供された試料との比較により、同定され得る（これによりバインダーのフットプリントが明らかになる）。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素は、これに加えてまたはこれとは別に、同様のエピトープ特性評価方法で用いられ得る。また、プロテアーゼ消化は、公知の抗体を用いて公知の抗原タンパク質内の潜在的な抗原決定基配列の位置を決定するための迅速な方法を提供し得る。別の一実施態様において、プロテアーゼ消化技術はまた、エピトープマッピングおよび同定との関連で有用であり得る。
【００７３】
本明細書はまた、高分子電解質の2つ以上の層を含む多層フィルムを含む免疫原性組成物であって、隣接する層が、反対に帯電した高分子電解質を含み、1つの層が、熱帯熱マラリア原虫のエピトープを含む、免疫原性組成物を開示する。免疫原性組成物は、所望により、設計ポリペプチドを含む1つ以上の層をさらに含む。
【００７４】
一実施態様において、免疫原性組成物は、複数の熱帯熱マラリア原虫のエピトープを、同一または異なる高分子電解質、例えば設計ポリペプチド上に含む。複数の抗原決定基は、同一または異なる感染性因子に由来し得る。一実施態様において、免疫原性組成物は、複数の固有の抗原性高分子電解質を含む。別の一実施態様において、免疫原性組成物は、各高分子電解質内に複数の熱帯熱マラリア原虫のエピトープを含む、複数の免疫原性高分子電解質を含む。これらの免疫原性組成物の利点は、単一線形抗原決定基の複数の抗原決定基または複数の立体構造が、単一の合成ワクチン粒子に存在し得ることである。複数の抗原決定基を有するこのような組成物は、潜在的に複数のエピトープに対する抗体を産生し得て、生物体の免疫系により生じる抗体の少なくとも一部は、例えば、病原体を中和するか、または癌細胞上の特定の抗原を標的とする可能性を高める。
【００７５】
免疫原性組成物の免疫原性は、様々な方法で増強され得る。一実施態様において、多層フィルムは、所望により、1つ以上の更なる免疫原性生物活性分子を含む。必須ではないが、1つ以上の更なる免疫原性生物活性分子は、典型的には、1つ以上の更なる抗原決定基を含む。適切な更なる免疫原性生物活性分子は、例えば、薬物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、リン脂質、炭水化物、多糖、リポ多糖、低分子量免疫刺激分子、または1つ以上の前記生物活性分子を含む組合せを含む。他のタイプの更なる免疫増強剤は、機能性膜フラグメント、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体、細胞小器官、または1つ以上の前記生物活性構造を含む組合せを含む。
【００７６】
一実施態様において、多層フィルムは、所望により、1つ以上の更なる生物活性分子を含む。1つ以上の更なる生物活性分子は、薬物であり得る。あるいは、免疫原性組成物は、中空シェルまたはコア周囲のコーティングの形態である。コアは、様々な異なるカプセル化剤、例えば1つ以上の更なる生物活性分子、例えば薬物を含む。したがって、本明細書に記載のように設計された免疫原性組成物はまた、例えば免疫応答を誘発する組合せ療法、および標的化薬物送達のために用いられ得る。「結晶」形態の適切な治療材料のマイクロサイズ化「コア」は、抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物にカプセル化され得て、得られたマイクロカプセルは、薬物送達に用いられ得る。コアは、いくつかの条件下、例えば高pHまたは低温で不溶性であり得て、制御放出が生じる条件下で可能性であり得る。結晶上の表面電荷は、ゼータ電位測定（液体媒体中のコロイド粒子上の静電単位における電荷を決定するのに用いられる）によって決定され得る。マイクロ内容物がマイクロカプセルの内部から周囲環境へ放出される速度は、カプセル化シェルの厚さ、シェルで用いられる抗原ポリペプチド、ジスルフィド結合の存在、ペプチドの架橋程度、温度、イオン強度およびペプチドの組織化に用いられる方法を含む、多くの因子に依存する。一般的に、カプセルが厚いほど、放出時間は長くなる。
【００７７】
別の一実施態様において、更なる免疫原性生体分子は、所望の免疫原の宿主生物体合成を指示することができるか、または病原体からの遺伝情報の発現を妨害することができる核酸配列である。前者の場合、このような核酸配列は、例えば、当業者に公知の方法により適切な発現ベクターへ挿入される。インビボで高効率の遺伝子導入を行うのに適した発現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベクターを含む。このような発現ベクターの操作要素は、そのような発現ベクターの操作要素は、少なくとも1つのプロモーター、少なくとも1つのオペレーター、少なくとも1つのリーダー配列、少なくとも1つの終止コドン、およびベクター核酸の適切な転写およびその後の翻訳に必要または好ましい他のあらゆるDNA配列を含む。特に、このようなベクターは、核酸配列の転写を開始することができる少なくとも1つの選択可能なマーカーおよび少なくとも1つのプロモーター配列とともに、宿主生物体によって認識される少なくとも1つの複製起点を含むことが企図される。後者の場合、このような核酸配列の複数のコピーは、例えば、静脈内送達のためのカプセルの形態でポリペプチド多層フィルム内に核酸をカプセル化することによって、送達のために調製される。
【００７８】
組換え発現ベクターの構築において、目的の核酸配列およびそれに付随する操作要素の複数のコピーが各ベクターに挿入され得ることにさらに留意されたい。このような実施態様において、宿主生物体は、所望のタンパク質のベクター当たりより多くの量を産生する。ベクターに挿入され得る核酸配列の複数のコピーの数は、そのサイズのために、適切な宿主微生物に導入され、複製され、転写される得られたベクターの能力によってのみ制限される。
【００７９】
更なる実施態様において、免疫原性組成物は、抗原性高分子電解質／免疫原性生物活性分子の混合物を含む。これらは、同一抗原に由来してもよく、同一の感染性因子または疾患からの異なる抗原であってもよく、あるいは、異なる感染性因子または疾患に由来してもよい。したがって、複合体または混合物は、送達システムの抗原ペプチド／タンパク質の成分によって特定される、多くの抗原およびおそらく多くの感染性因子または疾患に対する免疫応答を生じる。
【００８０】
一実施態様において、多層フィルム／免疫原性組成物は、免疫系から病原体への応答を引き起こす。一実施態様において、ワクチン組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて免疫原性組成物を含む。したがって、病原体疾患に対するワクチン接種の方法は、ワクチン接種を必要とする対象体に有効量の免疫原性組成物を投与することを含む。
【００８１】
医薬的に許容される担体は、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などを含むがこれらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば無機塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩、有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩もまた、組成物において用いられ得る。組成物はまた、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤などの物質を含み得る。リポソームはまた、担体として用いられ得る。
【００８２】
脊椎動物における疾患または病原体に対する免疫応答を誘発する方法（例えばワクチン接種）は、熱帯熱マラリア原虫のエピトープを含む多層フィルムを含む免疫原性組成物を投与することを含む。一実施態様において、熱帯熱マラリア原虫のエピトープを含有する高分子電解質は、多層フィルムの最も外側または溶媒暴露層にある。免疫原性組成物は、ブースター投与の有無にかかわらず、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、舌下、皮内、経肺または経皮のいずれかで投与され得る。一般的に、組成物は、投与製剤と適合性のある方法で、かつ予防的および／または治療的に有効であるような量で投与される。投与されるべき免疫原性組成物の正確な量は、医師の判断に依存し、各対象体に特有であり得る。免疫原性組成物の治療上有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、組成物が他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、ならびに接種者の免疫状態および健康に依存することは当業者に明らかであろう。当技術分野で周知のように、治療上有効な投与量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など）に基づいて、通常の技能を有する医療従事者によって決定され得る。また、更に日常的な研究が進むに連れて、様々な患者の様々な状態の治療に適した投与量レベルに関するより具体的な情報が明らかになり、通常の技能を有する従事者は、接種者の治療状況、年齢および全体的健康状態を考慮して、適切な投与を確かめることができる。
【００８３】
免疫原性組成物は、所望によりアジュバントを含む。アジュバントは一般的に、非特異的な方法で宿主の免疫応答をブーストする物質を含む。アジュバントの選択は、ワクチン接種を受ける対象体に依存する。好ましくは、医薬的に許容されるアジュバントが用いられる。例えば、ヒト用ワクチンは、完全および不完全フロイントアジュバントを含む、油または炭化水素エマルジョンアジュバントを避けるべきである。ヒトでの使用に適したアジュバントの一例は、ミョウバン（アルミナゲル）である。しかしながら、動物用ワクチンは、ヒトでの使用に適さないアジュバントを含み得る。
【００８４】
免疫応答は、このような応答を誘発することができるあらゆるタンパク質またはペプチドの提示によって誘発され得ることが企図される。一実施態様において、抗原は重要なエピトープであり、これは、感染性疾患の特定の薬剤、すなわち免疫優勢エピトープに対して強い免疫応答を引き起こす。必要に応じて、免疫応答の可能性を高めるために、複数の抗原またはエピトープが免疫原性組成物に含まれ得る。
【００８５】
一実施態様において、複数の熱帯熱マラリア原虫ペプチドまたはタンパク質エピトープは、LBLフィルムに組み込まれる。別個のエピトープは、ただ1つの設計ペプチド分子内で合成または発現され得る。ただ1つの設計ペプチド内に複数のエピトープを配置することは、特定の利点があると予想される。例えば、LBLの製造プロセスを簡易化し、再現性を高めるべきである。また、ただ1つの設計ペプチド内に複数のエピトープを配置することは、別個のエピトープのモル比を1：1などの所望の比率に固定する。
【００８６】
あるいは、エピトープは、別々の設計ペプチドに組み込まれる。設計ペプチドは、1つ以上の層形成工程中にLBLフィルムに組み込まれる。複数の別々の設計ペプチドを用いたフィルムの製造はまた、特定の利点をもたらし得る。設計ペプチドの合成を簡易化し、コストを削減するべきである。また、フィルム内の各設計ペプチドの相対用量を変化させ、最適化することができる。例えば、前臨床または臨床の生物学的データが、最適なワクチンが1つのエピトープの5つのコピーを第2のエピトープのすべてのコピーに対して（5：1の比率）を含むべきであると示す場合、別々のエピトープ設計ペプチドアプローチは、このようなワクチンの製造を容易にする。
【００８７】
設計ペプチドは、設計ペプチドの帯電した表面吸着領域とフィルムの反対に帯電した表面との間の静電引力によって、LBLフィルムの表面に吸着する。吸着の効率は、表面吸着領域の組成に大きく依存する。したがって、エピトープは異なるが表面吸着領域が類似する設計ペプチドは、同様の効率で吸着する。2つの別個の設計ペプチドを各々1：1のモル比で含むフィルムを製造するために、そのモル比でペプチドを混合し、特定の層に同時に沈着させ得る。あるいは、各ペプチドを別々の層に個々に沈着させ得る。吸着したペプチドのモル比は、ペプチドを層形成させた相対濃度、またはペプチドを組み込ませた層形成工程数を大きく反映する。
【００８８】
LBLフィルムに組み込まれる設計ペプチドの量は、様々な方法で測定され得る。定量的アミノ酸分析（AAA）は、この目的に特に適する。設計ペプチドを含むフィルムは、濃塩酸（6 M）で処理し、典型的には115℃で15時間加熱することにより構成アミノ酸に分解される。その後、各アミノ酸の量は、当業者に周知のクロマトグラフィー技術を用いて測定される。フィルムにおいて設計ペプチドの1つにのみ生じるアミノ酸は、そのペプチドのトレーサーとして用いられ得る。設計ペプチドが特有のアミノ酸を欠く場合、非天然アミノ酸（例えばアミノ酪酸またはホモバリン）が、合成中に設計ペプチドに組み込まれ得る。これらのトレーサーアミノ酸は、AAA実験中に容易に同定され、フィルム中のペプチドの量を定量化するために用いられ得る。
【００８９】
本明細書で用いる特定のT細胞応答は、目的のエピトープ、特に熱帯熱マラリア原虫のエピトープに特異的な応答である。特定のT細胞応答は、IFNγおよび／またはIL-5のT細胞応答である。
【００９０】
本明細書で用いる特定の抗体応答は、目的のエピトープ、特に本明細書に記載の熱帯熱マラリア原虫のエピトープに特異的な応答である。
【００９１】
本明細書で用いる「層」は、例えば吸着工程後のフィルム形成のための鋳型上の、厚さの増分を意味する。「多層」は、複数（すなわち2つ以上）の厚さの増分を意味する。「高分子電解質多層フィルム」は、1つ以上の高分子電解質の厚さの増分を含むフィルムである。沈着後、多層フィルムの層は、個別の層として残っていない場合がある。実際、特に厚さの増分の境界面で、種が著しく混ざり合っていることが可能である。混ざり合っているまたは混ざり合っていないことは、分析技術、例えばゼータ電位測定、X線光電子分光法および飛行時間型二次イオン質量分析によりモニターされ得る。
【００９２】
「アミノ酸」は、ポリペプチドの構成要素を意味する。本明細書で用いる「アミノ酸」は、20個の一般的に天然に存在するL-アミノ酸、他のすべての天然アミノ酸、すべての非天然アミノ酸、およびすべてのアミノ酸模倣物、例えばペプトイドを含む。
【００９３】
「天然に存在するアミノ酸」は、グリシンと、20個の一般的に天然に存在するL-アミノ酸、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、オルニチン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンを意味する。
【００９４】
「非天然アミノ酸」は、20個の一般的に天然に存在するL-アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸は、L-またはD-立体化学を有し得る。
【００９５】
「ペプトイド」またはN-置換グリシンは、対応するアミノ酸と同じ側鎖を有するが、側鎖を残基のα-炭素ではなくアミノ基の窒素原子に有する、対応するアミノ酸モノマーの類似体を意味する。したがって、ポリペプトイド内のモノマー間の化学結合は、タンパク質分解消化を制限するのに有用であり得るペプチド結合ではない。
【００９６】
「アミノ酸配列」および「配列」は、少なくとも2アミノ酸残長である連続した長さのポリペプチド鎖を意味する。
【００９７】
「残基」は、ポリマーまたはオリゴマーにおけるアミノ酸を意味し；ポリマーを形成させたアミノ酸モノマーの残基である。ポリペプチド合成は、脱水を含み、すなわち1つの水分子がアミノ酸をポリペプチド鎖に加える際に「失われる」。
【００９８】
本明細書で用いる「ペプチド」および「ポリペプチド」はすべて、隣接するアミノ酸のαアミノ基およびαカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに結合している一連のアミノ酸を指し、修飾、例えばグリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化を、このような修飾物またはそれを欠くものが免疫原性を壊さない場合、含んでもよく、あるは含まなくてもよい。本明細書で用いる用語「ペプチド」は、ペプチドおよびポリペプチドまたはタンパク質の両方を指すことを意味する。
【００９９】
「設計ポリペプチド」は、反対に帯電した表面に安定して結合するのに十分な電荷を有するポリペプチド、すなわち、フィルム形成の駆動力が静電気である多層フィルムのフィルムに沈着し得るポリペプチドを意味する。特定の実施態様において、設計ポリペプチドの長さは、少なくとも15アミノ酸であり、ポリペプチドの残基当たりの正味電荷の大きさは、pH7.0にて、0.1、0.2、0.3、0.4または0.5と等しいかまたはそれ以上である。一実施態様において、ポリペプチド中の残基の総数に対する同じ極性に帯電した残基の数から反対の極性の残基の数を減じた比率は、pH7.0にて0.5以上である。言い換えれば、ポリペプチドの残基当たりの正味電荷の大きさは、0.5以上である。ポリペプチドの長さに絶対的な上限はないが、一般的に、LBL沈着に適した設計ポリペプチドの長さの実際的上限は、1,000残基である。設計ポリペプチドは、天然で見られる配列、例えば熱帯熱マラリア原虫のエピトープ、ならびにペプチドに機能性を提供する領域、例えば帯電した領域（本明細書では表面吸着領域とも称する）を含み得て、これにより、設計ポリペプチドがポリペプチド多層フィルムに沈着することが可能になる。
【０１００】
「一次構造」は、ポリペプチド鎖におけるアミノ酸の連続した線形配列を意味し、「二次構造」は、非共有相互作用、通常は水素結合によって安定化されているポリペプチド鎖における多かれ少なかれ規則的な構造のタイプを意味する。二次構造の例としては、α-ヘリックス、β-シートおよびβ-ターンが挙げられる。
【０１０１】
「ポリペプチド多層フィルム」は、上記で定義した1つ以上の設計ポリペプチドを含むフィルムを意味する。例えば、ポリペプチド多層フィルムは、設計ポリペプチドを含む第1の層と、設計ポリペプチドと反対の極性の正味電荷を有する高分子電解質を含む第2の層を含む。例えば、第1の層が正味の正電荷を有する場合、第2の層は正味の負電荷を有し；第1の層が正味の負電荷を有する場合、第2の層は正味の正電荷を有する。第2の層は、別の設計ポリペプチドまたは別の高分子電解質を含む。
【０１０２】
「基質（substrate）」は、水溶液から高分子電解質が吸着するのに適した表面を有する固体材料を意味する。基質の表面は、本質的に任意の形状、例えば平面、球形、棒状を有し得る。基質表面は、規則的または不規則的であり得る。基質は、結晶であり得る。基質は、生物活性分子であり得る。基質のサイズ範囲は、ナノスケールからマクロスケールまでである。また、基質は所望により、いくつかの小さなサブ粒子を含む。基質は、有機材料、無機材料、生物活性材料またはその組合せで作られ得る。基質の非限定的例としては、シリコンウェーハ；帯電したコロイド状粒子、例えばCaCO3のマイクロ粒子またはメラミンホルムアルデヒドのマイクロ粒子；生物学的細胞、例えば赤血球、肝細胞、細菌細胞または酵母細胞；有機ポリマーラテックス（lattice）、例えばポリスチレンまたはスチレンコポリマーラテックス；リポソーム；オルガネラ；およびウイルスが挙げられる。一実施態様において、基質は、医療機器、例えば人工ペースメーカー、人工内耳またはステントである。
【０１０３】
フィルム形成中または形成後に基質が分解するかまたは他の方法で除去されるとき、基質は（フィルム形成のための）「鋳型」と呼ばれる。鋳型粒子は、適切な溶媒中で溶解するか、または熱処理により除去され得る。例えば、部分的に架橋したメラミン-ホルムアルデヒド鋳型粒子を用いる場合、鋳型は、DMSM中などの穏やかな化学的方法により、またはpH値の変化により分解し得る。鋳型粒子の溶解後に、交互の高分子電解質層で構成される中空多層シェルが残る。
【０１０４】
「カプセル」は、コア周囲の中空シェルまたはコーティングの形態の高分子電解質フィルムである。コアは、様々な異なるカプセル化剤、例えばタンパク質、薬物またはそれらの組合せを含む。直径が約1μmより小さいカプセルは、ナノカプセルと称される。直径が約1μmより大きいカプセルは、マイクロカプセルと称される。
【０１０５】
「架橋」は、2つ以上の分子間の共有結合、またはいくつかの結合、または多くの結合の形成を意味する。
【０１０６】
「生物活性分子」は、生物学的作用を有する分子、巨大分子または巨大分子集合体を意味する。特定の生物学的作用は、適切なアッセイで測定され、生物活性分子の単位重量または分子当たりで正規化され得る。生物活性分子は、カプセル化されるか、後ろに保持されるか、または高分子電解質フィルム内にカプセル化され得る。生物活性分子の非制限的な例は、薬物、薬物の結晶、タンパク質、タンパク質の機能性フラグメント、タンパク質の複合体、リポタンパク質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、リボソーム、活性治療薬、リン脂質、多糖、リポ多糖である。本明細書で用いる「生物活性分子」は、生物学的に活性な構造、例えば機能性膜フラグメント、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体および細胞小器官をさらに包含する。ポリペプチドフィルムにカプセル化されるかまたはその後ろに保持され得るタンパク質の例としては、ヘモグロビン；酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、リゾチームなど；細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンおよびコラーゲン；および抗体が挙げられる。高分子電解質フィルムにカプセル化されるかまたはその後ろに保持され得る細胞の例としては、移植された島細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞および酵母細胞が挙げられる。
【０１０７】
「生体適合性」は、経口摂取、局所適用、経皮適用、皮下注射、筋肉内注射、吸入、移植または静脈内注射に対して実質的に有害な健康への影響を引き起こさないことを意味する。例えば、生体適合性フィルムは、ヒトなどの免疫系と接触したときに実質的な免疫応答を引き起こさないものを含む。
【０１０８】
「免疫応答」は、体内のどこかに物質が存在することに対する細胞性または体液性免疫系の応答を意味する。免疫応答は、多くの方法、例えば特定の抗原を認識する抗体数の血流中の増加によって、特徴付け得る。抗体は、B細胞によって分泌されるタンパク質であり、免疫原は、免疫応答を誘発する実体である。人体は、血流やその他の場所で抗体数を増加させることにより、感染と戦い、再感染を阻止する。
【０１０９】
「抗原」は、感受性脊椎動物の組織に導入されたときに免疫応答（例えば、特定の抗体分子の産生）を誘発する外来物質を意味する。抗原は、1つ以上のエピトープを含む。抗原は、純粋な物質、物質の混合物（細胞または細胞断片を含む）であり得る。抗原という用語は、適切な抗原決定基、自己抗原（auto-antigen）、自己抗原（self-antigen）、交差反応性抗原、同種抗原、寛容原、アレルゲン、ハプテンおよび免疫原、またはそれらの一部、ならびにそれらの組合せを含み、これらの用語は、相互交換可能に用いられる。抗原は一般に高分子量であり、一般にポリペプチドである。強い免疫応答を誘発する抗原は、強い免疫原性があるといわれる。相補的抗体が特異的に結合し得る抗原上の部位は、エピトープまたは抗原決定基と呼ばれる。
【０１１０】
「抗原性」は、組成物に特異的な抗体を生じさせるか、または細胞介在性免疫応答を生じさせる組成物の能力を指す。
【０１１１】
本明細書で用いる用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、相互交換可能に用いられ、抗体により認識されるペプチドなどの抗原の構造または配列を意味する。通常、エピトープは、タンパク質の表面にある。「連続エピトープ」は、いくつかの隣接するアミノ酸残基を含むものであり、折り畳まれたタンパク質の限られた空間領域と偶然接触しているまたはその領域にあるアミノ酸残基を含むものではない。「立体構造エピトープ」は、タンパク質の三次元構造において接触するタンパク質の線形配列の異なる部分からのアミノ酸残基を含む。抗原と抗体の間で効率的な相互作用が生じるためには、エピトープが結合に容易に利用できなければならない。したがって、エピトープまたは抗原決定基は、抗原の本来の細胞環境に存在するか、または変性した場合にのみ露出する。天然の形態では、細胞質性（可溶性）、膜結合したもの、または分泌されたものであり得る。エピトープの数、位置およびサイズは、抗体製造プロセス中に提示される抗原の量に依存する。
【０１１２】
本明細書で用いる「ワクチン組成物」は、それが投与される哺乳動物において免疫応答を誘発し、そして免疫剤または免疫学的交差反応剤によるその後の攻撃から免疫化生物体を保護する組成物である。ワクチン接種を受けていない生物体と比較して、症状または感染の減少に関して、保護は、完全または部分的であり得る。免疫学的交差反応剤は、例えば、サブユニットペプチドが免疫原としての使用のために由来する、タンパク質全体（例えばグルコシルトランスフェラーゼ）であり得る。あるいは、免疫学的交差反応剤は、免疫剤によって誘発される抗体により全体としてまたは部分的に認識される、異なるタンパク質であり得る。
【０１１３】
本明細書で用いる「免疫原性組成物」は、それが投与される生物体において免疫応答を誘発し、そして免疫剤によるその後の攻撃から免疫化哺乳動物を保護する場合もしない場合もある組成物を包含することを意図する。一実施態様において、免疫原性組成物は、ワクチン組成物である。
【０１１４】
以下の非限定的な例により本発明をさらに説明にする。
【０１１５】
設計ペプチドCIS43、T1B、T*、CIS43T1BおよびCIS43T*（図1）を合成し、単独または組み合わせてLbL-マイクロ粒子上に層形成させる。ワクチン設計を様々に変更させて、マウスを免疫化し、抗体応答を、ELISA（アビディティーを推定するために尿素洗浄ありとなし）により、および機能的能力を決定するためにスポロゾイト中和アッセイにより測定する。CIS43、ならびにT1、BおよびT*の少なくとも1つを含む製剤が改善された抗体応答を誘発する場合、これらの製剤で免疫化したマウスは、トランスジェニックP.ファルシパルムCSを発現するP.ゲルヘイを負荷され、肝臓感染と寄生虫血症を、ワクチン有効性を決定するためにモニターする。
【０１１６】
用語「ある（a）」、「ある（an）」および「その（the）」ならびに同様の指示対象の使用は（特に特許請求の範囲との関連で）、本明細書で他に断らない限りまたは文脈で明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーする。本明細書で用いる第1、第2などの用語は、特定の順序を示すのではなく、単に便宜上、例えば層が、複数であることを示すことを意味する。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含有する（containing）」は、他に断らない限り、オープンエンドな用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。値の範囲の記載は、本明細書で他に断らない限り、範囲内にある各個別の値を個別に参照する簡略化方法として機能することを単に意図し、各個別の値は、本明細書で個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。すべての範囲のエンドポイントは、範囲内に含まれ、個別に組み合わせられる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で他に断らない限りまたは文脈で明らかに矛盾しない限り、適切な順序で実施し得る。ありとあらゆる例、または例示的な用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、他に断らない限り、本発明の範囲に制限を課さない。本明細書のいかなる文言も、本明細書で用いられる本発明の実施に不可欠であるとしてクレームされていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１１７】
本発明は例示的な実施形態を参照して説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得て、同等物をその要素の代わりに置き換え得ることが当業者に理解されるだろう。また、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲から逸脱することなく、多くの修正がなされ得る。したがって、本発明は、本発明を実施するために企図される最良の様式として開示される特定の実施態様に限定されないが、本発明は、特許請求の範囲に含まれるすべての実施態様を含むことが意図される。すべての可能な変形における上記の要素の任意の組合せは、本明細書で他に断らない限りまたは文脈で明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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