(57)【要約】  本発明はマルトトリオースを発酵させることができるサッカロミセス・ユーバヤヌスの突然変異体に、及びハイブリッド酵母を生成するためのこの突然変異体の使用、及び生じたハイブリッド酵母に関する。本発明は前記突然変異体及び/又は前記ハイブリッド酵母を用いることによって発酵ビール製品を生産する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトトリオースを発酵させることができる突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母であって、生成されるキメラタンパク質が第1の遺伝子生成物の一部及び第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を含む突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母。
【請求項２】
SeMALT1、SeMALT2、SeMALT3及び/又はSeMALT4、好ましくはSeMALT4/SeMALT1/SeMALT2又はSeMALT4/SeMALT3からの遺伝子部分を含む、請求項1に記載の突然変異体S.ユーバヤヌス酵母。
【請求項３】
図3Cに表されるように、SeMALT4のヌクレオチド1〜434、SeMALT1のヌクレオチド430〜1122、SeMALT2又はSeMALT4のヌクレオチド1113〜1145及びSeMALT3のヌクレオチド1141〜1842を含むキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を有する、請求項1又は2に記載の突然変異体S.ユーバヤヌス酵母。
【請求項４】
フェノール酸の低下した脱炭酸活性を有し、好ましくは4-ビニルグアヤコールを生成しない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の突然変異体S.ユーバヤヌス酵母。
【請求項５】
ハイブリッド酵母を生成する方法であって、
a)第1の親として請求項1〜4のいずれか一項に記載の突然変異体S.ユーバヤヌス酵母及び第2の親として第2の酵母を提供する工程であって、前記第2の親は前記第1の親と異なる工程と、
b)前記第1の親からの細胞を前記第2の親からの細胞とハイブリダイズさせる工程と、
c)生じたハイブリッド生物体を同定する工程
を含む方法。
【請求項６】
前記第2の親は、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスの酵母である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記第1及び/又は第2の親からの細胞が前記細胞をハイブリダイズさせる前に蛍光色素で標識される、請求項5又は請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションが、前記第1及び/又は前記第2の親の最適な増殖温度より少なくとも5℃低い温度で実行される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法によって生成されるハイブリッド酵母であって、生成されるキメラタンパク質が第1の遺伝子生成物の一部及び第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を含むハイブリッド酵母。
【請求項１０】
発酵ビール製品を生産する方法であって、
請求項1〜4又は9のいずれか一項に記載の発酵性酵母を麦芽汁に加える工程、及び
前記麦芽汁を少なくとも部分的に発酵させて発酵ビール製品を生産する工程
を含む方法。
【請求項１１】
前記発酵性酵母が、遺伝子PAD1及びFDC1の少なくとも1つの不活性化、及び/又はフェノール酸、好ましくはフェルラ酸の取り込みに関与するか、脱炭酸フェノール化合物、好ましくは4-ビニルグアヤコールのエクスポートに関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活性化をもたらす突然変異を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記の生産される発酵ビール製品がビール、好ましくはラガービールである、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵ビール製品のアルコール含有量が発酵の後に好ましくは精留蒸発によって低減される、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリッド酵母を生成するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母の使用。
【請求項１５】
発酵ビール製品、好ましくはビール、より好ましくはラガービールを生産するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母又は請求項9に記載のハイブリッド酵母の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に、特に新規酵母及び酵母ハイブリッドの生産に関する。本発明は、発酵ビール製品、好ましくはビールを生産するための、これらの酵母及び酵母ハイブリッドの使用に更に関する。
【背景技術】
【０００２】
1. 発明の背景
サッカロミセス・ユーバヤヌスはパタゴニアで発見され、ラガータイプのビール醸造用のS.パストリアヌス(S. pastorianus)ハイブリッドの非S.セレビシエ(S. cerevisiae)親種と同定された(Libkindら、2011。Proc Natl Acad Sci USA 108: 14539〜44頁; Sampaio、2018。Microbiology 164: 1069〜71頁)。S.ユーバヤヌス(S. eubayanus)は野性から単離されているだけだが(Perisら、2014。Mol Ecol 23: 2031〜45頁; Bingら、2014。Curr Biol 24: R380-R1; Gayevskiy及びGoddard、2016。Environ Microbiol 18: 1137〜47頁)、S.セレビシエは特に生地パン種、ビール醸造及びワイン発酵のためにヒトバイオテクノロジーと強く関連する(Dequin、2001。Appl Environ Microbiol 56: 577〜88頁)。ビール醸造は、麦芽汁、60%麦芽糖、25%マルトトリオース及び15%グルコースの発酵性糖混合物を含有する複合媒体で実行される(Zastrowら、2001。J Ind Microbiol Biotechnol 27: 34〜8頁)。ほとんどのS.セレビシエ株は3つの糖の全てを効果的に利用することができるが、S.ユーバヤヌス株はグルコース及び麦芽糖を利用することができるもののマルトトリオースは利用できない(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005; Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9: 1786頁; Galloneら、2016。Cell 166: 1397〜410 e16)。S.セレビシエでは、麦芽糖及びマルトトリオースを利用する能力はMAL遺伝子座: S.セレビシエ株の中の最高5つの異なる染色体の上に存在する遺伝子クラスタと関連している(Naumovら、1994。Genetics 136: 803〜12頁)。MAL遺伝子座は、3つの遺伝子で構成される:麦芽糖プロトン共輸送体をコードするScMALx1、糖をグルコースに加水分解するα-グルコシダーゼをコードするScMALx2、及び麦芽糖の存在下でScMALx1及びScMALx2の発現を誘導する調節因子をコードするScMALx3(Charronら、1989。Genetics 122: 307〜16頁)。ScMALx1はツラノース及びスクロース等の他の二糖を輸送することもできるが(Marquesら、2017。FEMS Yeast Res 17: fox006; Changら、1989。J Bacteriol 171: 6148〜54頁)、それらは三糖マルトトリオースをインポートすることができない(Alvesら、2008。Appl Environ Microbiol 74: 1494〜501頁)。しかし、第VII染色体に位置するMAL1遺伝子座は、ScMALx1輸送体遺伝子とわずか57%の同一性を有するだけである異なる輸送体をコードするScAGT1遺伝子を含有する(Hanら、1995。Mol Microbiol 17: 1093〜107頁)。ScAgt1は、マルトトリオース取り込みを可能にする広い基質特異性のプロトン共輸送体である(Alvesら、2008。Appl Environ Microbiol 74: 1494〜501頁; Stambukら、1999。FEMS Microbiol Lett 170: 105〜10頁)。麦芽糖を利用するS.ユーバヤヌスの能力は、ScMALx1遺伝子と高い相同性を有する4つの輸送体の存在と整合している: SeMALT1、SeMAL2、SeMALT3及びSeMALT4 (Bakerら、2015。Mol Biol Evol 32: 2818〜31頁)。S.ユーバヤヌス基準株CBS 12357におけるこれらの遺伝子の欠失は、麦芽糖輸送のためにそれがSeMALT2及びSeMALT4の発現に頼ることを示した(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)。SeMALT1及びSeMALT3は、おそらくそれらを含むMAL遺伝子座の不完全さのために、麦芽糖の存在下で十分に発現されなかった。しかし、ScAGT1のいかなる相同体も基準株CBS 12357のゲノムで見出されず、CBS 12357もSeMALT遺伝子が過剰発現される由来元のいかなる株もマルトトリオースを利用することができなかった(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9: 1786頁)。
【０００３】
S.パストリアヌスの推定上のハイブリッド祖先を再構築するために、S.セレビシエ及びS.ユーバヤヌス株を交配させた。研究所製のS.セレビシエ×ユーバヤヌスハイブリッドは、S.セレビシエの発酵能力及び糖利用をS.ユーバヤヌスの低温での増殖能力と組み合わせた(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005; Krogerusら、2015。J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769〜78頁; Mertensら、2015。Appl Environ Microbiol 81: 8202〜14頁)。おそらく、マルトトリオース利用は、S.セレビシエの親ゲノムの中のScAGT1遺伝子によるものだった。逆に、マルトトリオースを利用するS.パストリアヌス分離株の能力はScAGT1によるものでないが、それはこの遺伝子がトランケーションされているからである(Vidgrenら、2009。Appl Environ Microbiol 75: 2333〜45頁)。代わりに、マルトトリオース利用は、S.パストリアヌスに特異的である2つの遺伝子: SpMTY1及びSeAGT1と関連した。遺伝子SpMTY1は様々なS.パストリアヌス株で見出され、ScMALx1遺伝子と90%の配列同一性を共有し、麦芽糖より高い親和性でもマルトトリオース輸送を可能にした(Salema-Oomら、2005。Appl Environ Microbiol 71: 5044〜9頁; Dietvorstら、2005。Yeast 22: 775〜88頁)。興味深いことに、SpMTY1はSeMALT遺伝子と配列類似性を示した(Cousseauら、2013。Lett Appl Microbiol 56: 21〜9頁; Nguyenら、2011。PLoS One 6: e25821)。SeAGT1はScAGT1と85%の配列同一性を共有するが、それはS.ユーバヤヌスの第VIII〜XV染色体で見出された(Nakaoら、2009。DNA Res 16: 115〜29頁)。その高い配列類似性により、SeAgt1はScAgt1と類似の輸送特性を示し、高親和性マルトトリオースインポートも可能にした(Vidgren及びLondesborough、2012。J Inst Brew 118: 148〜51頁)。S.パストリアヌスゲノムにおけるそれらの存在にもかかわらず、マルトトリオース輸送体SpMty1及びSeAgt1はS.ユーバヤヌス基準株CBS 12357のゲノムシークエンシングで見出されなかった。これらのマルトトリオース輸送体はCBS 12357よりもS.パストリアヌスのS.ユーバヤヌス祖先に緊密に関係した株に存在する可能性があるが(Bingら、2014。Curr Biol 24: R380〜1頁)、それらは、ラガー醸造環境でのS.パストリアヌスの順化の間に進化した可能性もある。
【０００４】
S.パストリアヌスにおけるS.ユーバヤヌスマルトトリオース輸送体の起源に関係なく、効率的なマルトトリオース利用がラガー醸造のために決定的である。現在、工業的ラガー醸造のために、新規S.セレビシエ×ユーバヤヌスハイブリッドの形成のために大量の研究が実行されており(Krogerusら、2017。Appl Environ Microbiol 101: 65〜78頁)、S.ユーバヤヌスも醸造のためにそれ自体使用されている(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)。この関係において、残留マルトトリオースはビールの風味プロファイル及び芳香に影響し、同時により低いエタノール収率はプロセス収益性を制限する可能性があるので、マルトトリオースを利用できないことはそれらの工業パフォーマンスに有益でない(Zhengら、1994。J Am Soc Brew Chem 52: 41〜7頁)。しかし、マルトトリオースを利用するS.ユーバヤヌス株は醸造産業にとって貴重だろうが、遺伝子改変生物体が顧客に不人気なために、それは標的化ゲノム編集によって構築されるべきでない(Varzakasら、2007。Crit Rev Food Sci Nutr 47: 335〜61頁)。実験室進化は、所望の表現型を発達させる細胞を有利にする条件下での長期にわたる増殖及び選択によって所望の特性を得るための、一般的に使用される非GMO方法である(Mansら、2018。Curr Opin Biotechnol 50: 47〜56頁)。サッカロミセス属の酵母では、選択可能な特性には、高温耐性、効率的な栄養素利用及び阻害剤耐性等の複合的で多様な表現型が含まれる(Yonaら、2012。Proc Natl Acad Sci USA 109: 21010〜5頁; Greshamら、2008。PLoS Genet 4: e1000303; Gonzalez-Ramosら、2016。Biotechnol Biofuels 9: 173頁; Caspetaら、2014。Science 346: 75〜8頁)。アラビノース、ガラクトース、グルコース及びキシロースのための糖利用を向上させるために実験室進化が応用され、成功を収めた(Greshamら、2008。PLoS Genet 4: e1000303、Papapetridisら、2018。FEMS Yeast Res 18: foy056; Verhoevenら、2018。FEMS Yeast Res 18: doi: 10.1093/femsyr/foy062; Hongら、2011。Proc Natl Acad Sci USA 108: 12179〜84頁)。S.パストリアヌスでは、マルトトリオース取り込みは、マルトトリオースが富化された培地でケモスタット培養を実行することによって首尾よく向上した(Brickweddeら、2017。Front Microbiol 8: 1690頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】独国特許第2145298号
【特許文献２】独国特許第2413236号
【特許文献３】ベルギー特許第717847号
【特許文献４】独国特許第2323094号
【特許文献５】独国特許第2339206号
【特許文献６】米国特許第4,317,217号
【特許文献７】欧州特許出願第332,738号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Libkindら、2011。Proc Natl Acad Sci USA 108: 14539〜44頁
【非特許文献２】Sampaio、2018。Microbiology 164: 1069〜71頁
【非特許文献３】Perisら、2014。Mol Ecol 23: 2031〜45頁
【非特許文献４】Bingら、2014。Curr Biol 24: R380-R1
【非特許文献５】Gayevskiy及びGoddard、2016。Environ Microbiol 18: 1137〜47頁
【非特許文献６】Dequin、2001。Appl Environ Microbiol 56: 577〜88頁
【非特許文献７】Zastrowら、2001。J Ind Microbiol Biotechnol 27: 34〜8頁
【非特許文献８】Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005
【非特許文献９】Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9: 1786頁
【非特許文献１０】Galloneら、2016。Cell 166: 1397〜410 e16
【非特許文献１１】Naumovら、1994。Genetics 136: 803〜12頁
【非特許文献１２】Charronら、1989。Genetics 122: 307〜16頁
【非特許文献１３】Marquesら、2017。FEMS Yeast Res 17: fox006
【非特許文献１４】Changら、1989。J Bacteriol 171: 6148〜54頁
【非特許文献１５】Alvesら、2008。Appl Environ Microbiol 74: 1494〜501頁
【非特許文献１６】Hanら、1995。Mol Microbiol 17: 1093〜107頁
【非特許文献１７】Stambukら、1999。FEMS Microbiol Lett 170: 105〜10頁
【非特許文献１８】Bakerら、2015。Mol Biol Evol 32: 2818〜31頁
【非特許文献１９】Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁
【非特許文献２０】Krogerusら、2015。J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769〜78頁
【非特許文献２１】Mertensら、2015。Appl Environ Microbiol 81: 8202〜14頁
【非特許文献２２】Vidgrenら、2009。Appl Environ Microbiol 75: 2333〜45頁
【非特許文献２３】Salema-Oomら、2005。Appl Environ Microbiol 71: 5044〜9頁
【非特許文献２４】Dietvorstら、2005。Yeast 22: 775〜88頁
【非特許文献２５】Cousseauら、2013。Lett Appl Microbiol 56: 21〜9頁
【非特許文献２６】Nguyenら、2011。PLoS One 6: e25821
【非特許文献２７】Nakaoら、2009。DNA Res 16: 115〜29頁
【非特許文献２８】Vidgren及びLondesborough、2012。J Inst Brew 118: 148〜51頁
【非特許文献２９】Bingら、2014。Curr Biol 24: R380〜1頁
【非特許文献３０】Krogerusら、2017。Appl Environ Microbiol 101: 65〜78頁
【非特許文献３１】Zhengら、1994。J Am Soc Brew Chem 52: 41〜7頁
【非特許文献３２】Varzakasら、2007。Crit Rev Food Sci Nutr 47: 335〜61頁
【非特許文献３３】Mansら、2018。Curr Opin Biotechnol 50: 47〜56頁
【非特許文献３４】Yonaら、2012。Proc Natl Acad Sci USA 109: 21010〜5頁
【非特許文献３５】Greshamら、2008。PLoS Genet 4: e1000303
【非特許文献３６】Gonzalez-Ramosら、2016。Biotechnol Biofuels 9: 173頁
【非特許文献３７】Caspetaら、2014。Science 346: 75〜8頁
【非特許文献３８】Papapetridisら、2018。FEMS Yeast Res 18: foy056
【非特許文献３９】Verhoevenら、2018。FEMS Yeast Res 18: doi: 10.1093/femsyr/foy062
【非特許文献４０】Hongら、2011。Proc Natl Acad Sci USA 108: 12179〜84頁
【非特許文献４１】Brickweddeら、2017。Front Microbiol 8: 1690頁
【非特許文献４２】Hittinger、2013。Trends Genet 29: 309〜317頁
【非特許文献４３】Naseebら、2017。Int J Syst Evol Microbiol 67: 2046〜2052頁
【非特許文献４４】Libkindら、2011。Proc Natl Acad Sci 108: 14539〜44頁
【非特許文献４５】Perisら、2014。Mol Ecol 23: 2031〜45頁
【非特許文献４６】Bingら、2014。Curr Biol 24: R380〜1頁
【非特許文献４７】Gayevskiy及びGoddard、2016。Environ Microbiol 18:1137〜47頁
【非特許文献４８】Krogerusら、2015。J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769〜78頁
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【非特許文献９２】Gorter de Vriesら、2017。Microb Cell Fact 16:222頁
【非特許文献９３】SWISS-MODELサーバー(https://swissmodel.expasy.org/)
【非特許文献９４】Biasiniら、2014。Nucleic Acids Res 42(W1): W252〜W8頁
【非特許文献９５】Lamら、1980。J Bacteriol 143: 396〜402頁
【非特許文献９６】Guexら、2009。Electrophoresis 30: S162〜S73頁
【非特許文献９７】Henderson及びPoolman、2017。Sci Rep 7: 14375頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、標的化ゲノム編集によって構築されないマルトトリオースを利用するS.ユーバヤヌス株の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
2. 発明の簡単な説明
この試験では、S.ユーバヤヌス基準株CBS 12357を、マルトトリオースを利用する能力について選択する条件下でUV突然変異誘発及び実験室進化にかけた。CBS 12357はマルトトリオースの上で増殖することが完全にできないので、UV突然変異誘発突然変異体を、唯一の炭素源としてマルトトリオースを含む合成培地を含む好気的振盪フラスコに先ず導入した。増殖が観察された場合、増殖が速く、一貫するまで、連続好気的バッチ処理を同じ条件下で実行した。しかし、工業用醸造麦芽汁で増殖させた場合、生じた突然変異体はいかなるマルトトリオースも消費しなかった。したがって、生じた突然変異体を、マルトトリオースが富化された醸造麦芽汁での嫌気的ケモスタットの間に更に進化させた。生じた突然変異体を、工業用麦芽汁において特徴付けた。マルトトリオースを利用する突然変異体のゲノムを、ショート及びロングリードシークエンシングを使用して配列決定をし、SNP、INDEL及び染色体組換えを含む突然変異を特定した。推定上の原因の突然変異の導入は、未進化CBS12357株でマルトトリオース利用を首尾よく回復した。S.ユーバヤヌスは工業用ラガー醸造で使用されるので、非GMO進化突然変異体の工業パフォーマンスは工業条件下で評価した。
【０００９】
したがって、本発明は、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異体サッカロミセス属酵母を提供する。前記突然変異体サッカロミセス属酵母は、好ましくは、突然変異体S.セレビシエ、S.ウバルム(S. uvarum)、S.バヤナス(S. bayanus)又はS.ユーバヤヌス酵母である。前記突然変異体サッカロミセス属酵母は、好ましくは、生成されるキメラタンパク質が第1の遺伝子生成物の一部及び第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ輸送体遺伝子、好ましくはキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を含む。前記突然変異体サッカロミセス属酵母は、好ましくはSeMALT1、SeMALT2、SeMALT3及び/又はSeMALT4からの、好ましくはSeMALT4/SeMALT1/SeMALT2又はSeMALT4/SeMALT3からの配列エレメント又は遺伝子部分を含む。マルトトリオースを発酵させることができる突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母は、好ましくは、生成されるキメラタンパク質が第1の遺伝子生成物の一部及び第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を含む。
【００１０】
一実施形態では、前記サッカロミセス属酵母は、図3Cに表されるように、SeMALT4のヌクレオチド1〜434、SeMALT1のヌクレオチド430〜1122、SeMALT2又はSeMALT4のヌクレオチド1113〜1145、及びSeMALT3のヌクレオチド1141〜1842を含むキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を有する、突然変異体S.ユーバヤヌス酵母である。前記突然変異体S.ユーバヤヌス酵母は、好ましくはフェノール酸の低下した脱炭酸活性を有し、好ましくは4-ビニルグアヤコールを生成しない。
【００１１】
本発明は、ハイブリッド酵母を生成する方法であって、a)第1の親として本発明の突然変異体S.ユーバヤヌス酵母及び第2の親として第2の酵母を提供する工程であって、前記第2の親は前記第1の親と異なる工程、b)前記第1の親からの細胞を前記第2の親からの細胞とハイブリダイズする工程、及びc)生じたハイブリッド生物体を同定する工程を含む方法を更に提供する。前記第2の親は、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックス(Saccharomyces sensu stricto complex)の酵母である。
【００１２】
本発明の好ましい方法では、第1及び/又は第2の親からの細胞は、細胞をハイブリダイズする前に蛍光色素で標識される。更に好ましい方法では、ハイブリダイゼーションは、第1及び/又は第2の親の最適な増殖温度より少なくとも5℃低い温度で実行される。
【００１３】
本発明は、本発明によるハイブリッド酵母を生成する方法によって生成されるハイブリッド酵母を更に提供する。前記ハイブリッド酵母は、生成されるキメラタンパク質が第1の遺伝子生成物の一部及び第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を含む。
【００１４】
本発明は、発酵ビール製品を生産する方法であって、本発明による発酵性酵母を麦芽汁に加えるステップ、及び前記麦芽汁を少なくとも部分的に発酵させて発酵ビール製品を生産するステップを含む方法を更に提供する。
【００１５】
前記発酵性酵母は、遺伝子PAD1及びFDC1の少なくとも1つの不活性化、及び/又はフェノール酸、好ましくはフェルラ酸の取り込みに関与するか、脱炭酸フェノール化合物、好ましくは4-ビニルグアヤコールのエクスポートに関与するタンパク質をコードする遺伝子の不活性化をもたらす突然変異を好ましくは含む。前記の生産される発酵ビール製品は好ましくはビール、好ましくはラガービールである。発酵ビール製品を生産する好ましい方法では、発酵ビール製品のアルコール含有量は、発酵の後に好ましくは精留蒸発によって低減される。
【００１６】
本発明は、本発明の方法によって生産される発酵ビール製品を更に提供する。
【００１７】
本発明は、ハイブリッド酵母を生産するための、本発明による突然変異体サッカロミセス属酵母の使用を更に提供する。
【００１８】
本発明は、発酵ビール製品、好ましくはビール、より好ましくはラガービールを生産するための、本発明による突然変異体サッカロミセス属酵母又はハイブリッド酵母の使用を更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
3. 図面の説明
【図１】S.ユーバヤヌス CBS 12357における工業関連のマルトトリオース利用法を開発するプロセスの概略図である。新規表現型を生成するために、胞子を形成したS.ユーバヤヌス細胞をUVで照射した。唯一の炭素源としてマルトトリオースを含むSMでの増殖によって、突然変異体プールをマルトトリオース消費細胞について富化した。FACSを使用して富化培養から単一コロニー分離株を作製し、それらをマイクロタイタープレートで高いOD660のためにその後スクリーニングした。得られた分離株を工業条件下でのマルトトリオースの消費のために強化するために、7つの突然変異体をプールし、追加のマルトトリオースを富化した改変工業用麦芽汁での炭素制限嫌気性ケモスタットにおいて進化させた。進化の後、FACSを使用して単一コロニー分離株を生成し、工業条件下で特徴付けた。進化に成功した突然変異体は全ゲノム配列決定をし、生じた転位はCBS 12357でのSeMALT413の過剰発現によってリバースエンジニアリングした。最後に、適用性及び工業的妥当性を実証するために、進化した突然変異体を工業用のパイロットスケールで試験した。
【図２】マルトトリオース消費S.ユーバヤヌスを得るための突然変異誘発及び進化を示す図である。(A)20℃におけるSMMtでのS.パストリアヌス CBS 1483(
【化１】
2022502086.tif 000002
)、S.ユーバヤヌス CBS 12357(
【化２】
2022502086.tif 000003
)及びIMS0637(
【化３】
2022502086.tif 000004
)の特徴付け。IMS0637のデータは、他の突然変異体IMS0638〜IMS0643を代表する。マルトトリオースの平均濃度(
【化４】
2022502086.tif 000005
)及び平均偏差は、2つの反復から判定した。(B) 20℃における麦芽汁でのS.パストリアヌス CBS 1483(黒色)、S.ユーバヤヌス CBS 12357(白色)及びIMS0637(灰色)の特徴付け。(
【化５】
2022502086.tif 000006
)グルコース、(
【化６】
2022502086.tif 000007
)麦芽糖及び(
【化７】
2022502086.tif 000008
)マルトトリオースの濃度は、単一の生物学的測定から測定した。(C)マルトトリオース富化麦芽汁での20℃の嫌気性ケモスタットにおけるIMS0637〜IMS0643株の実験室進化の間の、排出流中の残留マルトトリオース濃度。グルコース(
【化８】
2022502086.tif 000009
)、麦芽糖(
【化９】
2022502086.tif 000010
)及びマルトトリオース(
【化１０】
2022502086.tif 000011
)の濃度は、HPLCによって測定した。技術的失敗(点線)の後にケモスタットを再開した。(D) 250mLのマイクロ好気的ボトルでの12℃における麦芽汁でのS.パストリアヌス CBS 1483(黒色)、S.ユーバヤヌス CBS 12357(白色)、IMS0750(暗灰色)及びIMS0752(明灰色)の特徴付け。(
【化１１】
2022502086.tif 000012
)グルコース、(
【化１２】
2022502086.tif 000013
)麦芽糖及び(
【化１３】
2022502086.tif 000014
)マルトトリオースの平均濃度及び標準偏差は、3つの生物学的反復から判定した。
【図３−１】図３。突然変異株IMS0637及び進化株IMS0750における突然変異の同定を示す図である。(A)野生型CBS 12357と比較したUV突然変異IMS0637及び進化したIMS0750で見出された突然変異のベン図。一塩基多型(SNP)、小さい挿入及び欠失(INDEL)及びコピー数変動(CNV)は、Pilonによって検出された通りに示す。(B)ミニオン技術及び新規のゲノム構築を使用した全ゲノムシークエンシングによって検出された、IMS0637及びIMS0750における組換え染色体構造。CHRII及びCHRXVIの左腕の最初の15'000ヌクレオチドを図式的に表す。配列の起点はCHRIIでは黒色で示され、CHRVIIIではマークされ、CHRXIIIでは明灰色で、CHRXVIでは暗灰色で示される。更に、配列の上に存在するSeMALT輸送体遺伝子は、矢印で示す。CHRII及びCHRVIIIの組換えはIMS0637及びIMS0750に存在したが、CHRXVIの両コピーの組換えはIMS0750だけで見出されIMS0637では見出されなかった。CHRXVIでの組換えは、キメラSeMALT413輸送体を作製した。(C) SeMALT1、SeMALT3及びSeMALT4と比較したSeMALT413の1842ヌクレオチドの配列類似性の概要。遺伝子の読取り枠を整列させ、100%配列同一性を有する領域を同定した。配列同一性が100%より低かった領域の場合、各SeMALT遺伝子の実際の配列同一性を示す。配列の起点はCHRIIでは黒色で示され、CHRVIIIではマークされ、CHRXIIIでは明灰色で、CHRXVIでは暗灰色で示される。(D)左側に膜貫通像及び右側に輸送チャネル像を示すSeMalt413のタンパク質構造の予測。S.ユーバヤヌスのSeMalt輸送体に由来するドメインは、暗灰色(SeMalt4第XVI染色体)、黒色(SeMalt1第II染色体)及び明灰色(SeMalt3第XIII染色体)によって示される。
【図３−２】図３の続き。
【図４−１】図４。CBS 12357でのSeMALT413のリバースエンジニアリング及びSMでの輸送体機能の特徴付けを示す図である。(A) CBS 12357のSeSGA1遺伝子座に結合したCRISPR-Cas9 gRNA複合体(発現されたgRNAからの5'ハンマーヘッドリボザイム及び3'肝炎δウイルスリボザイムの自己切断の後)の図。輸送体カセットScTEF1p-SeMALT413-ScCYC1tを含む修復断片をプライマー13559/13560でpUD814(SeMALT413)から増幅し、組換えのためにSeSGA1遺伝子座とのオーバーハングを含有する。SeSGA1は、ScTEF1p-SeMALT413-ScCYC1tカセットと置き換えられた。SeSGA1遺伝子座の上流及び下流のプライマー12635/12636を使用して、正しい形質転換体を検査した。株は、サンガーシークエンシングを使用して検証した。(B、C、D) SMグルコース(B)、麦芽糖(C)及びマルトトリオース(D)の上での(
【化１４】
2022502086.tif 000015
)CBS 12357、(
【化１５】
2022502086.tif 000016
) IMS0750、(
【化１６】
2022502086.tif 000017
) IMX1941、(
【化１７】
2022502086.tif 000018
) IMX1942の特徴付け。株は20℃で培養し、培養上清をHPLCによって測定した。データは、3つの生物学的反復の平均及び標準偏差を表す。
【図４−２】図４の続き。
【図５】7Lパイロットスケールでの高重力麦芽汁(17°P)におけるS.ユーバヤヌス株CBS 12357(黒色)及びIMS0750(白色)の細胞外代謝産物プロファイルを示す図である。(A)糖消費及びエタノール生産。%(m/v)で表される糖の時間経過データは、以下の通りに表される:グルコース(
【化１８】
2022502086.tif 000019
)、麦芽糖(
【化１９】
2022502086.tif 000020
)、マルトトリオース(
【化２０】
2022502086.tif 000021
)。%(v/v)で表されるエタノール生産プロファイルは、(
【化２１】
2022502086.tif 000022
)で表される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
4. 発明の詳細な説明
4.1 定義
本明細書で使用されるように、用語「発酵ビール製品」は、例えば、作物及びその産物、例えば、穀物、イネ、ブドウ及び他の果実、ナッツ類並びに/又は、例えばリュウゼツラン、ユッカ及びサボテンからの浸出物の発酵によって生成されるビール製品を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「アルコール低減発酵ビール製品」は、対応する通常の発酵ビール製品と比較したときに低減されたレベルのエタノールを有する発酵ビール製品を指す。例えば、アルコール低減ビールは、アルコールとして5体積%未満、例えば0.5〜1.2体積%のエタノールを好ましくは含む。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「無アルコール発酵ビール製品」は、エタノールが存在しないか、又は0.03体積%未満が存在する発酵ビール製品を指す。無アルコールビールの最大百分率は、国の間で異なることがあることに注意する。例えば、「ノンアルコールビール」とも呼ばれる無アルコールビールは、USA及び一部のヨーロッパ諸国では0.5体積%未満を含有することができるが、UKでは0.05体積%以下である。しかし、本明細書で使用されるように、用語「無アルコール発酵ビール製品」は、エタノールが存在しないか、又は0.03体積%未満が存在する発酵ビール製品を指す。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「マルトトリオース」は、α-1,4グリコシド結合を通して連結される3つのグルコース分子からなる三糖を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「フェノール酸の脱炭酸活性」は、その脱炭酸形に変換されるフェノール酸の量、好ましくはその脱炭酸形に酵素的に変換されるフェノール酸の量を指す。酵素的変換は、好ましくは、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ(PAD1)及び/又はフェルラ酸デカルボキシラーゼ(FDC1)をコードする遺伝子によってコードされる2つのタンパク質の少なくとも1つ又は両方によって触媒される。これらの2つの遺伝子の1つの不活性化は、フェノール酸の脱炭酸に干渉するのに十分であることが示されている。フェノール酸の脱炭酸活性、すなわちその脱炭酸形に変換されるフェノール酸の量は、当技術分野で公知である任意の方法によって判定することができる。例えば、フェルラ酸及び4-VGは、200〜400nmでそれらの光吸収スペクトルの強力な差を示す。フェルラ酸は300nmより上で高い吸収値を示すが、4-VGへの変換は300nmより上で吸収値の低下をもたらす。この差は、フェノール酸の脱炭酸活性の推定値として、4-VGへのフェルラ酸の変換能力を推定するために使用することができる。例えば、例えばフェルラ酸の存在下において合成麦芽汁で増殖させたマイクロタイタープレート培養の上清は、例えば4℃で2500×gの5分間の遠心分離によって収集し、マイクロタイタープレートに移すことができ、96穴マイクロタイタープレートの250nmから400nmの吸収スペクトルを判定することができる。別の例として、脱炭酸活性は、酵母細胞又は酵母細胞の培養を基質、すなわちフェノール酸、例えばフェルラ酸又はケイ皮酸の存在下でインキュベートし、質量分析又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によってその脱炭酸形へのフェノール酸の変換を判定することによって判定することができる。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「フェノール酸の低下した脱炭酸活性」は、対照、好ましくは未改変の対照と比較したときに低下した、酵母の脱炭酸活性の百分率を指す。フェノール酸の変換を、例えば所定時間の間に判定して、同じ時間の間の対照の酵母細胞又は酵母細胞の培養におけるフェノール酸の変換と比較することができる。別の例として、脱炭酸活性は、ケイ皮酸の存在下で培養した酵母細胞の増殖及びケイ皮酸の非存在下で培養した酵母細胞の増殖の比を判定することによって、より間接的な方法で判定することができる。ケイ皮酸はその脱炭酸形スチレンより酵母細胞に毒性であるので、参照と比較した酵母細胞又は酵母細胞の培養の、ケイ皮酸の存在下での酵母細胞の増殖の低下は、脱炭酸活性が低下することを意味する。百分率の低下は、例えばケイ皮酸の存在下で培養した酵母細胞の増殖の比を判定することによって判定することができる。或いは、ケイ皮酸の存在下又は非存在下での酵母細胞の増殖を判定することができ、ケイ皮酸の存在下で培養した酵母細胞の増殖及びケイ皮酸の非存在下で培養した酵母細胞の増殖の比を脱炭酸活性の尺度として判定することができる。参照として、ビール発酵のための発酵プロセスで普通に使用される通常の酵母株、例えばHeineken-A酵母及び/又はHeineken D-酵母を、フェノール酸の低下した脱炭酸活性を判定するための参照として使用することができる。前記低下は、指示された発酵プロセスで普通に使用される通常の酵母株と比較して、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも99%である。これは、フェノール酸の低下した脱炭酸活性を有する酵母が、参照の脱炭酸活性の多くても40%、より好ましくは前記参照の脱炭酸活性の多くても30%、より好ましくは多くても25%、より好ましくは多くても20%、より好ましくは多くても15%、より好ましくは多くても10%、より好ましくは多くても5%、より好ましくは多くても1%である脱炭酸活性を有することを意味する。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「突然変異」は、点突然変異、1つ又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失、1つ又は複数のヌクレオチドの置換、フレームシフト突然変異、及び一本鎖又は二本鎖DNAの切断、例えば染色体切断又は転位、及びその任意の組合せを限定されずに含む、酵母のゲノムDNAにおける改変を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるように、用語「転位」は、染色体セグメントが、同じ染色体の中で又は別の染色体に、1つの位置から別の位置に移動することを指す。転位は相互であってよく、2つの染色体位置の間で、例えば2つの染色体の間で断片が相互に交換されることを意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子」は、その遺伝子によってコードされる生成物が発現されることを確実にする、エンハンサー及びプロモーター配列、エキソン及びイントロン配列を含む全てのシス作用性ゲノム配列を指す。前記生成物は、mRNA分子若しくはsiRNA分子等のRNA分子及び/又はタンパク質であってよい。
【００２９】
本明細書で使用されるように、別の遺伝子の「転写制御に関与する遺伝子」という用語は、その他の遺伝子の発現を調節する転写制御因子又は因子をコードする遺伝子を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「不活性化遺伝子」は、その通常の機能を果たすことができない遺伝子を示す。例えば、タンパク質をコードする遺伝子の場合、「不活性化」は、その遺伝子がタンパク質に翻訳されないか、不活性タンパク質をコードするか、低下した活性を有するタンパク質をコードすることを意味する。前記不活性化は、例えば、プロモーターが遺伝子の転写を開始することが可能でないようなプロモーター配列の改変、転写される前mRNAの正しいスプライシングを妨害する、イントロンのスプライシング部位の改変、又は遺伝子のコード領域の改変であって、コードされるタンパク質の活性を弱めるか又はそれを不活性にさえする改変によることができる。前記不活性化は、好ましくは未不活性化遺伝子と比較して少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくても70%、より好ましくは少なくて80%、より好ましくは少なくても90%、より好ましくは少なくても99%である。
【００３１】
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」は、その転写を開始するために必要とされる遺伝子の調節領域とみなされるゲノム配列を指す。それは、遺伝子の5'部分の、一般的に、しかし排他的にではなく、転写開始部位の前に一般的に位置する。
【００３２】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリッド」又は「ハイブリッド酵母」は、異なる変種又は種の2つの酵母のゲノムを組み合わせた結果である酵母を指す。ハイブリッドは、好ましくは有性交配の結果であり、そのハイブリッド酵母が異なる性の2つの細胞、例えば異なる交配タイプの2つの細胞、好ましくは2つの生殖体の融合の結果であることを意味する。
【００３３】
本明細書で使用されるように、用語「種間ハイブリッド」は、異なる種又は属の2つの生物体のゲノムを組み合わせた結果である酵母を指す。
【００３４】
本明細書で使用されるように、用語「第1の親」及び「第2の親」は、異なる変種又は種の2つの酵母を指す。前記2つの酵母は、ハイブリダイゼーション適合性である。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション適合性」は、交配させること、好ましくは有性的に交配させることができる2つの酵母を指す。用語「交配適合性」を使用することができ、それは用語「ハイブリダイゼーション適合性」に等しい。
【００３６】
用語「色素A」及び「色素B」は、酵母細胞を染色するために使用することができる異なる蛍光色素を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるように、用語「最適な増殖温度」は、第1の親生物体及び第2の親生物体からの酵母細胞が最適に増殖する温度を指し、細胞が最も速く完全な細胞周期を完了することを意味する。ほとんどの酵母は、10〜40℃、好ましくは15〜30℃、例えば18℃〜25℃、より具体的には20℃〜22℃の最適な増殖温度を有する。
【００３８】
本明細書で使用されるように、用語「栄養要求性マーカー」は、生合成で使用される必須の代謝産物、特に単量体への代謝経路における鍵酵素をコードするマーカー遺伝子を指す。例はURA3遺伝子であり、それは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるピリミジン生合成の必須酵素オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードする。同様に、HIS3、LEU2、TRP1及びMET15マーカー遺伝子は、アミノ酸ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びメチオニンの新規合成のための必須酵素をそれぞれコードする。栄養要求性マーカーの存在は、対応する必須代謝産物の非存在下での細胞の増殖を可能にする。
【００３９】
本明細書で使用されるように、用語「二倍体」は、2セットの染色体を含む細胞又は生物体を指す。1セットの染色体は1つの親から得られるが、第2のセットの染色体は第2の親から通常得られる。用語「二倍体」は、2セットの染色体を有する細胞及び生物体を、半数体と呼ばれる1セットの染色体を有する細胞及び生物体から、並びに倍数体と呼ばれる複数セットの染色体を有する細胞及び生物体から区別するために使用される。倍数体の細胞及び生物体には、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体及び八倍体の細胞及び生物体が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「異数体」は、全ての染色体が同じコピー数で存在するとは限らない細胞又は生物体を指す。したがって、当業者に公知であるように、染色体組は、完全な染色体セットの規定数、例えばn、2n、3n又は4nで示すことはできない。用語異数性は、正倍数性の細胞と対照的に、細胞又は生物体の中の異常な数の染色体の存在を指す。異数体細胞は染色体の一部を失うか余分の一部を有することができるか、又は1つ又は複数の染色体を失うか1つ又は複数の余分の染色体を有することができる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、用語「発芽」は、種子又は生殖体が無性的に増殖する能力を回復して、多細胞構造又は有糸分裂増殖による細胞複製をもたらす過程を指す。発芽の最も一般的な例は、種子からの苗の新芽形成である。更に、真菌胞子からの菌糸の胞子等の胞子からの若い胞子体の増殖も、発芽と呼ばれる。更に、酵母で起こるような、真菌胞子がその胞子壁を脱ぎ捨て、通常の代謝活性を回復する過程も発芽と呼ばれる。発芽は、温度、湿度、酸素供給及び時には光又は暗闇のような条件にしばしば依存する。
【００４２】
本明細書で使用されるように、用語「酵母」及び「発酵性酵母」は、真菌界のメンバーに分類される真核生物の単細胞微生物を指す。好ましい酵母は、その任意のハイブリッドを含む、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスの酵母である。現在、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスは9つの異なる種を包含する:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、S.パラドクサス(S. paradoxus)、S.カリオカヌス(S. cariocanus)、S.ウバルム(S. uvarum)、S. ミカタエ(S. mikatae)、S. クドリアブゼビイ(S. kudriavzevii)、Ｓ．アルボリコラ(S. arboricola)、S.ユーバヤヌス及び最近発見されたS. Jurei (Hittinger、2013。Trends Genet 29: 309〜317頁; Naseebら、2017。Int J Syst Evol Microbiol 67: 2046〜2052頁)。
【００４３】
本明細書で使用されるように、用語「発酵性酵母」は、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスの酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ若しくはS.ユーバヤヌス酵母、及び/又はそのハイブリッド、例えばS.カリスベルゲネス(S. carlsbergensis)とも呼ばれるS.パストリアヌスを指す。
【００４４】
4.2 マルトトリオースを利用しないサッカロミセス属のマルトトリオース利用突然変異体を選択する方法
サッカロミセス属酵母の突然変異誘発は、従来のランダムな突然変異誘発方法、例えば放射線及び化学的処理、及び組換えDNA技術、例えば位置指定突然変異誘発又は標的化突然変異誘発を含む、当技術分野で公知である任意の方法を使用して実行することができる。したがって、酵母細胞は、紫外線照射、X線照射、ガンマ線照射及び突然変異誘発剤による処理を含むランダム突然変異誘発に、又は遺伝子操作にかけられていてもよい。
【００４５】
用語「ランダム突然変異誘発」は、突然変異の正確な部位が予測可能でなく、酵母細胞又は胞子の染色体のどこにも存在することができる突然変異誘発技術を指す。一般に、これらの方法は、少なくとも1つの突然変異を誘発するために化学薬剤又は放射線の使用を含む。ランダム突然変異誘発は、DNAポリメラーゼのコピー精度が低く、PCR生成物で比較的高率の突然変異をもたらす条件の下でPCRが実行される、変異導入型PCRを使用して更に達成することができる。
【００４６】
「遺伝子操作」は当技術分野で周知であり、生物工学的な方法を使用して酵母のゲノムを改変し、それによって、位置指定突然変異誘発と呼ばれるように、酵母のゲノムDNAの改変を好ましくは所定の部位に、及び所定の改変により導入することを指す。
【００４７】
位置指定突然変異誘発とも呼ばれる標的化突然変異誘発は、目的のゲノムDNA配列で部位特異的突然変異を生成するためにオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を使用して達成することができる。標的化突然変異誘発は、例えばプログラム可能なRNA誘導ヌクレアーゼ、例えばTALEN、CRISPR-Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼ技術等によって特異的遺伝子をin vivoで改変し、特異的部位に向けられる遺伝子構造の変化をもたらす突然変異誘発方法を指す。
【００４８】
前記突然変異誘発は、好ましくは、酵母を放射線、例えば紫外線照射、X線照射、ガンマ線照射、及び/又は突然変異誘発剤、好ましくはNTG(N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)若しくはEMS(エチルメタンスルホン酸)等の化学的薬剤による処置にかけることによって実行される。特に好ましい突然変異誘発手順は、例えば10秒から3分間、好ましくは概ね1〜2分間の紫外線照射を含む。好ましい方法は、253,7 nmの放射線ピーク、及び0.1〜10分、好ましくは0.5〜5分、例えば約90分間の紫外線(TUV 30W T8、Philips社、アイントホーフェン、オランダ)への曝露を含む。
【００４９】
前記突然変異誘発、好ましくはランダム突然変異誘発は、2ラウンド以上で好ましくは実行される。各ラウンドは、突然変異誘発工程、好ましくは軽い突然変異誘発工程、好ましくはUV介在性突然変異誘発工程を好ましくは含み、それは20〜60%、好ましくは40〜50%の中程度の生存率をもたらす。
【００５０】
第1ラウンドでは、突然変異した酵母は、マルトトリオースを消費することができる突然変異体を富化させる、唯一の炭素源としてマルトトリオースを含有する合成培地に接種することができる。
【００５１】
突然変異誘発の第2ラウンドは、マルトトリオースを富化した醸造用麦芽汁での増殖を好ましくは含む。これらの条件下で、マルトトリオースの上での増殖のための向上した親和性又はより高い輸送速度を有する突然変異体は栄養制限がより低くなり、非突然変異酵母と比較して選択的利点をもたらす。これのために、麦芽汁は2〜10倍、例えば6倍に希釈することができる。前記希釈された麦芽汁には、マルトトリオースの相対濃度を増加させるために、マルトトリオースを例えば1〜20g L-1、例えば10g L-1、追加することができる。酸素及び窒素制限を阻止するために、エルゴステロール、例えば1〜100mg L-1、TWEEN(登録商標) 80、例えば100〜1000mg L-1、及び硫酸アンモニウム、例えば1〜20mg L-1を追加することができる。
【００５２】
マルトトリオースを富化した醸造用麦芽汁での前記増殖は、連続培養によって好ましくは実行される。前記連続培養は、0.001〜0.2h-1、好ましくは0.01〜0.1h-1、例えば0.03h-1の希釈率で操作することができる。マルトトリオース濃度が減少する時点で、例えばFACS選別によって培養からの単一細胞を好ましくは単離する。単離された細胞は、マルトトリオースを利用することができるサッカロミセス属の突然変異体、好ましくはS.ユーバヤヌス突然変異体を更に選択するために、唯一の炭素源としてマルトトリオースを含有する合成培地の上に、及び/又は本明細書で上に記載されている、マルトトリオースを富化した醸造用麦芽汁の上にプレーティングすることができる。
【００５３】
マルトトリオースを利用することができない更なるサッカロミセス属の酵母には、いくつかのS.セレビシエ株、S.ウバルム及びS.バヤナスが含まれる。マルトトリオースを利用しないサッカロミセス属のマルトトリオース利用突然変異体を選択する上記の方法は、S.ユーバヤヌスに加えてS.ウバルム及びS.バヤナスに適用可能である。
【００５４】
4.3 マルトトリオースを利用する突然変異サッカロミセス属酵母
S.ユーバヤヌスは、北西部パタゴニアのノトファガス(Nothofagus)樹木及びキッタリア・ハリオッティ(Cyttaria harioti)のストローマから先ず分離された(Libkindら、2011。Proc Natl Acad Sci 108: 14539〜44頁)。S.ユーバヤヌスの株は、北アメリカ(Perisら、2014。Mol Ecol 23: 2031〜45頁)、アジア(Bingら、2014。Curr Biol 24: R380〜1頁)及びオセアニア(Gayevskiy及びGoddard、2016。Environ Microbiol 18:1137〜47頁)の位置からもその後分離された。パタゴニアのS.ユーバヤヌス株CBS12357Tの最初の生理的特徴付けは、それが10℃未満の温度でS.セレビシエより速く増殖すること(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)、劣ったフロキュレーションを示すこと(Krogerusら、2015。J Ind Microbiol Biotechnol 42: 769〜78頁)及び麦芽糖を消費するがマルトトリオースを消費しないこと(Gibsonら、2013。Yeast 30: 255〜266頁)を明らかにした(Gibsonら、2017。FEMS Yeast Res 17: fox038; Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)。
【００５５】
ほとんどのS.ユーバヤヌス株は、マルトトリオースを輸送すること及び/又はマルトトリオースをエタノールに変換することができない。
【００５６】
S.ユーバヤヌスのゲノムは、ヘキソース促進因子(HXT)輸送体オルソログと注釈された9つの遺伝子を持つ(Bakerら、2015。Mol Biol Evol 32: 2818〜2831頁; Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)。これらのエネルギー非依存性ヘキソース促進因子に加えて、フルクトース/H+共輸送体がS.ユーバヤヌスに存在する(Pengelly及びWheals、2013。FEMS Yeast Res 13: 156〜161頁)。S.ユーバヤヌス基準株CBS 12357のゲノムは、SeMALT1、SeMALT2、SeMALT3及びSeMALT4と呼ばれる4つのSeMalt麦芽糖輸送体を更に持つが、それらはまだ機能的に分析されていない(Bakerら、2015。Mol Biol Evol 32: 2818〜2831)。S.ユーバヤヌス CBS12357はこの三糖の上で増殖することができないので、それらのいずれもマルトトリオースを輸送しないようである(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)。S.ユーバヤヌスは、S.セレビシエマルトトリオース輸送体ScAgt1又はS.パストリアヌスマルトトリオース輸送体SpMty1及びSeAgt1に高い類似性を有するいかなる輸送体もコードしないようである(Bakerら、2015。Mol Biol Evol 32: 2818〜2831頁; Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)が、S.セレビシエからのAGT1パーミアーゼと81%の相同性を有する遺伝子が報告されている(Cousseauら、2012。Letters in Applied Microbiology 56: 21〜29頁)。
【００５７】
前記突然変異酵母は、好ましくは、記載される活性化輸送体をコードする遺伝子並びにサッカロミセス属ゲノムのこれらの輸送体にパラロガス及び相同的である任意のキメラ遺伝子を含む、サッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスのものである。
【００５８】
本発明による好ましい突然変異S.ユーバヤヌス酵母は、ランダム突然変異誘発の後に、好ましくはUV突然変異誘発の後に得られる。
【００５９】
S.ユーバヤヌスの突然変異誘発は、活性化の後にマルトトリオースを輸送することができる1つ又は複数の輸送体遺伝子の活性化、及び/又は1つ又は複数の細胞内α-グルコシダーゼの活性化をもたらすことができる。
【００６０】
前記活性化輸送体遺伝子は、S.セレビシエの公知の麦芽糖輸送体遺伝子、又はS.ユーバヤヌスにおけるそれらの相同体、例えばMPH2、MPH3及びMALx1遺伝子、例えばMAL21、MAL31、MAL41、MAL61、AGT1(MAL11とも呼ばれる)を含むことができる。前記活性化は、S.ユーバヤヌスでのS.パストリアヌスからのMTY1相同体(MTT1とも呼ばれる)、及び/又はSeMALT1、SeMALT2、SeMALT3、SeMALT4を含むS.ユーバヤヌスのAGT1及びMALT遺伝子の活性化を更に又は追加で含むことができる。
【００６１】
S.ユーバヤヌスの突然変異誘発は、9つのHXT遺伝子、フルクトース/H+共輸送体及び/若しくは4つのSeMalt麦芽糖輸送体を含む1つ又は複数の輸送体遺伝子における改変をもたらすことができ、並びに/又は、例えば、未知のマルトトリオース輸送体の活性化、上流の転写活性化因子の活性化、及び/若しくは上記の公知の若しくは未知の輸送体遺伝子の1つ又は複数の転写リプレッサーの不活性化をもたらす1つ又は複数の改変をもたらすことができる。
【００６２】
同様に、S.ユーバヤヌスの突然変異誘発は、コードされる生成物がグルコースへのマルトトリオースの分解に関与する1つ又は複数の遺伝子の改変をもたらすことができる。グルコースへのマルトトリオースの加水分解は、マルターゼとも呼ばれる細胞内α-グルコシダーゼによって促進され、それは末端の1,4連結α-D-グルコース残基を加水分解し、それによってα-D-グルコースを放出する。3つの異なるα-グルコシダーゼが醸造用酵母から単離され、そのうち2つのタンパク質はマルトトリオースを加水分解することが可能である(Matsusakaら、1977。Agric Biol Chem 41: 1917〜1923頁)。演繹的に、1つ又は複数の細胞内α-グルコシダーゼの活性化をもたらす遺伝子の改変は、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異体S.ユーバヤヌス酵母をもたらすことができる。1つ又は複数の細胞内α-グルコシダーゼの活性化をもたらす前記突然変異は、S.ユーバヤヌス酵母のマルトトリオースの少なくとも1つの輸送体の活性化をもたらす1つ又は複数の突然変異と別であっても又はそれに加えるものであってもよい。
【００６３】
更に、グルコース輸送体をコードする遺伝子を抑圧するために、細胞表面グルコースセンサーRgt2及び/若しくはSnf3、並びに/又は下流の核転写因子Rgt1の改変を用いることができる(Royら、2016。Mol Biol Cell 27: 862〜871頁)。当業者は、S.ユーバヤヌスにおいてマルトトリオースの取り込み、発酵及び/又は好気的分解における鍵酵素をコードする1つ又は複数の遺伝子の、好ましくはランダム突然変異誘発による改変は、マルトトリオースをエタノールに変換すること、好ましくは例えば麦芽汁に存在するマルトトリオースをエタノールに完全に変換することが可能である発酵性のS.ユーバヤヌス酵母をもたらすことができることを理解する。
【００６４】
したがって、本発明は、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異体サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母を提供する。
【００６５】
前記突然変異体S.ユーバヤヌス酵母は、生成されるタンパク質が前記第1の遺伝子生成物の一部及び前記第2の遺伝子生成物の一部を持つように、第1のコード遺伝子配列の一部が第2のコード遺伝子配列の一部に隣接するように転位したキメラ遺伝子を好ましくは含む。例えば、前記キメラ遺伝子は、SeMalt4の第1の部分及びSeMalt1の第2の部分をコードすることができる。前記キメラタンパク質は、好ましくは、N末端部分がSeMalt1によって提供され、C末端部分がSeMalt4によって提供される、SeMalt1/SeMalt4タンパク質で表されるSeMalt1及びSeMalt4のアミノ酸配列の組合せ、又はSeMalt1/SeMalt2タンパク質、SeMalt1/SeMalt3タンパク質、SeMalt2/SeMalt1タンパク質、SeMalt2/SeMalt3タンパク質、SeMalt2/SeMalt4タンパク質、SeMalt3/SeMalt1タンパク質、SeMalt3/SeMalt2タンパク質、SeMalt3/SeMalt4タンパク質、SeMalt4/SeMalt1タンパク質、SeMalt4/SeMalt2タンパク質又はSeMalt4/SeMalt3タンパク質を含む。
【００６６】
前記キメラタンパク質は、例えば、SeMalt1/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt1/SeMalt3/SeMalt3、SeMalt1/SeMalt2/SeMalt4、SeMalt1/SeMalt3/SeMalt4、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3、SeMalt3/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt3/SeMalt2/SeMalt1、SeMalt3/SeMalt2/SeMalt4、SeMalt3/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1又はSeMalt4/SeMalt3/SeMalt2を含む、3つのSeMaltアミノ酸配列の組合せを含むことができる。
【００６７】
SeMALT2及びSeMALT4はS.ユーバヤヌス酵母で発現されることが知られているので、キメラタンパク質のN末端部分は好ましくはSeMALT2又はSeMALT4からのものである。したがって、更なる好ましいキメラタンパク質は、例えば、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt3、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt3、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt1、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt1、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt2、SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4/SeMalt2、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4/SeMalt2、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2、SeMalt2/SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt3/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt2/SeMalt3/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt1/SeMalt4、SeMalt4/SeMalt3/SeMalt2/SeMalt4又はこれらの輸送体の他の組合せを含む。
【００６８】
本発明による更に好ましい突然変異体S.ユーバヤヌス酵母は、SeMalt2及び/又はSeMalt4のN末端部分及びC末端部分を含むキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を有する。
【００６９】
本発明によるほとんどの好ましい突然変異体S.ユーバヤヌス酵母は、SeMalt4/SeMalt1/SeMalt2又はSeMalt4/SeMalt3を含むキメラ麦芽糖輸送体遺伝子を有する。前記ほとんどの好ましいキメラ遺伝子は、図3に表されるように、SeMALT4のヌクレオチド1〜434、SeMALT1のヌクレオチド430〜1122、SeMALT2又はSeMALT4のヌクレオチド1113〜1145、及びSeMALT3のヌクレオチド1141〜1842を好ましくは含む。
【００７０】
好ましくはランダム突然変異誘発によって好ましくは改変される更なる遺伝子は、好ましくは4-ビニルグアヤコールの生成における、より好ましくは4-ビニルグアヤコールへのフェルラ酸の脱炭酸におけるフェノール酸の脱炭酸活性に関与する遺伝子である。フェノール化合物が一般的に異臭とみなされる発酵飲料には、ビール、より好ましくはラガー、ワイルドラガー、ピルスナー、ライトエール及びセゾンビールからなる群から選択されるビールが含まれる。
【００７１】
ビールでは、フェノール臭(異臭)は、麦芽汁を直接起源とするものもあれば、酵母による酵素的変換の結果であるか、又は酸素及び温度の結果としての化学的変換(例えば麦芽汁沸騰又はボトルの中の熟成の間の)を通したものもある。ビール発酵の間、麦芽汁に存在するフェルラ酸は、酵素的脱炭酸を通してフェノール異臭4-VGに変換される。当初、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼをコードするPAD1だけが関与すると考えられたが、Mukaiら(Mukaiら、2010。J Bioscie Bioeng 109: 564〜569頁)からの結果は、フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするPAD1及びFDC1の両方が脱炭酸のために必要であることを示唆する。最高位の発酵酵母はPAD1及びFDC1の活性セットを一般的に含有するが、最下位の発酵酵母はフェノール酸を対応するフェノール異臭に変換することができない。
【００７２】
好ましい発酵性酵母は、遺伝子PAD1及びFDC1、及び/又は前記遺伝子の少なくとも1つの転写制御に関与する遺伝子、及び/又はフェノール酸、好ましくはフェルラ酸の取り込みに関与するか、又は脱炭酸フェノール化合物、好ましくは4-ビニルグアヤコールのエクスポートに関与するタンパク質をコードする遺伝子、及び/又は前記遺伝子の転写制御に関与する遺伝子の少なくとも1つの突然変異を含む。
【００７３】
前記フェノール酸は、好ましくは、PAD1によってコードされるタンパク質及び/又はFDC1によってコードされるタンパク質が変換することができるフェノール酸、より好ましくは、フェルラ酸、4ヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、カフェー酸、ケイ皮酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、没食子酸、p-クマル酸、4-メトキシケイ皮酸、p-ヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシベンズアルデヒド、プロトカテク酸、サリチル酸、シリンガ酸、タンニン酸及び/又はバニリン酸から選択されるものである。特に好ましい基質はフェルラ酸であり、その取り込みは、好ましくは本発明の方法で使用される好ましい発酵性酵母で低減されるか、阻害されさえする。
【００７４】
PAD1によってコードされるタンパク質及び/又はFDC1によってコードされるタンパク質の生成物のエクスポートに関与するタンパク質の例は、Pdr16/YNL231C、Pdr8/YLR266C、Pdr12/YPL058C、Pdr10/YOR328W、Pdr5/YOR153W、Pdr18/YNR070W、Pdr3/YBL005W、Pdr15/YDR406W、Pdr17/YNL264C及びPdr11/YIL013Cである。前記生成物は、好ましくは脱炭酸フェノール化合物、より好ましくは4-VG、4-ビニルフェノール、4エチルフェノール、グアヤコール及びオイゲノールである。特に好ましい生成物は、4-VGである。
【００７５】
したがって、本発明は本発明による突然変異S.ユーバヤヌス酵母を提供し、それは、フェノール酸の低下した脱炭酸活性を有し、好ましくは4-ビニルグアヤコールを生成しない。
【００７６】
本発明による好ましい突然変異S.ユーバヤヌス酵母は、第VIII染色体の右腕の複製、転写因子遺伝子SEF1の改変、エンドサイトーシス及び細胞形状制御に関与するパルミトイル転移酵素遺伝子AKR1の改変、グルコース感知シグナル経路Mth1のリプレッサーの改変、細胞表面フロクリンFlo11pに類似した未確認の機能のタンパク質である、終止コドンバイパスタンパク質1をコードする遺伝子(Bsc1)の改変、アンモニウムパーミアーゼ調節遺伝子PAR32の改変、胞子形成の負の調節因子Mds3の改変、エルゴステロール生合成遺伝子Erg25の改変、絶食応答に関与する転写因子をコードする遺伝子ZPR1の改変、絶食応答に関与する転写因子をコードする遺伝子STP2の改変、低温での発酵のために必要とされるタンパク質をコードする遺伝子CSF1の改変、ステロール生合成の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子NSG1の改変から選択される、1つ又は複数のゲノム改変を更に含むことができる。
【００７７】
追加の1つ又は複数の前記ゲノム改変は、好ましくは、転写因子遺伝子SEF1におけるL895P改変;パルミトイル転移酵素遺伝子AKR1におけるS50P改変; MTH1のDNAプロモーター領域の改変、好ましくはG(-753)A改変; BSC1におけるL469S改変;PAR32のDNAプロモーター領域の改変、好ましくはG(-1266)A、G(-1265)A、G(-1237)A及び/又はG(-1236A); MDS3におけるP727H改変; ERG25の核酸ターミネーター領域の改変、好ましくはG(+165)A改変; ZPR1の片方又は両方のジンクフィンガードメイン(AA 52〜210及び293〜486)の改変、好ましくはS327P改変;転写因子STP2におけるS181L改変; CSF1におけるS2708P改変;及び/又はNSG1におけるG163A改変を含む。
【００７８】
別途指示がない限り、改変とは、指示された位置の第1の指定される一文字アミノ酸残基の第2の指定される一文字アミノ酸残基へのアミノ酸改変を指す。例えば、AKR1におけるS50P改変は、AKR1における50位のセリンのプロリンとの交換を指す。核酸のプロモーター及びターミネーター領域における位置とは、転写開始に対する又は終止コドンに対するヌクレオチド位置をそれぞれ指す。
【００７９】
4.4 突然変異S.ユーバヤヌス酵母から生成されるハイブリッド酵母
本発明は、ハイブリッド酵母を生成する方法であって、a)第1の親として本発明による突然変異S.ユーバヤヌス酵母及び第2の親として第2の酵母を提供する工程であって、前記第2の親は前記第1の親と異なる工程、b)前記第1の親からの細胞を前記第2の親からの細胞とハイブリダイズする工程、及びc)生じたハイブリッド生物体を同定する工程を含む方法を更に提供する。
【００８０】
サッカロミセス属のハイブリッドは順応させた環境で最も一般的に見出され、様々な工業的発酵プロセスで使用される(Boynton及びGreig、2014。Yeast、31: 449〜462頁; Gorter de Vriesら、2017。Applied Environm Microbiol 83: e03206〜16頁)。例えば、ラガー醸造は、S.セレビシエとS.ユーバヤヌスの間のハイブリッドであるS.パストリアヌスで実行され(Libkindら、2011。PNAS 108: 14539〜14544頁)、それは、S.セレビシエの発酵能力及び糖利用をS.ユーバヤヌスの低温耐性と組み合わせる(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)。S.セレビシエ、S. kudriavzevii及びS.ウバルムの間の様々な二重及び三重ハイブリッドがワイン発酵から単離されており、芳香の生成で重要な役割を演ずるようである(Gonzalezら、2006。FEMS Yeast Res 6: 1221〜1234頁)。
【００８１】
前記第2の親は、好ましくはサッカロミセス・センス・ストリクト・コンプレックスの酵母である。より好ましい酵母は、サッカロミセス・セレビシエ酵母、S.カリスベルゲネス酵母、S.パストリアヌス酵母、S.ユーバヤヌス酵母及び/又はそのハイブリッドであり、好ましくはS.セレビシエ酵母である。
【００８２】
ハイブリッド中の2つ以上のサッカロミセス属ゲノムの組合せは、「ヘテロシス」又は「雑種強勢」と呼ばれる現象である相乗効果を一般的にもたらし、それは、特定の環境でハイブリッドがその親のいずれよりも優れた性能を発揮することを可能にする(Shapiraら、2014。Heredity 113: 316頁)。したがって、サッカロミセス属酵母の標的化ハイブリダイゼーションは、工業適用のために新しいか向上した表現型を有する株を作製するために一般的に使用される。例えば、研究所作製のS.セレビシエ×S.ユーバヤヌスハイブリッドは、それらの親株より高い耐冷性及びオリゴ糖消費(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)、異なる風味プロファイル(Steenselsら、2014。Applied Environment Microbiol 80: 6965〜6975頁)、より高速な発酵及びより高いエタノール力価(Krogerusら、2015。J Industrial Microbiol & Biotechnol 42: 769〜778頁)を示した。
【００８３】
ヘテロシスは、まだ完全には理解されていない複雑な現象である;それは、おそらく染色体コピー数の量(Gorter de Vriesら、2017。Applied Environm Microbiol 83: e03206〜16頁; Krogerusら、2016。Appl Microbiol Biotechnol 100: 7203〜7222頁)、異なる優性及び劣性対立遺伝子の間の相互作用並びに上位の相互作用(Shapiraら、2014。Heredity 113: 316頁)を含む、複数の因子の組合せによって引き起こされる。生じる表現型は、必ずしも曖昧ではない:優性及び通常より複雑な表現型、例えば低温耐性又はフロキュレーションは、通常親株の1つから完全に受け継がれるが(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005; Colorettiら、2006。Food Microbiol 23: 672〜676頁)、風味化合物及び他の二次代謝産物では、ハイブリッドはそれらの親株によってもたらされる濃度のおよそ平均の濃度を一般的にもたらす(Krogerusら、2015。J Industrial Microbiol & Biotechnol 42: 769〜778頁; Bellonら、2011。Appl Microbiol and Biotechnol 91: 603〜612頁)。ヘテロシスは種間雑種形成のために使用される親の種だけでなく、使用される特定の株にも依存し、異系交配の表現型を予測することを更に困難にする。
【００８４】
前接合体障壁のない種の種間ハイブリッドは、種内交配と同様に得ることができる:ハイブリッドは、反対の交配タイプのハプロイド株を交配することによって、又は、交配タイプ遺伝子座にヘテロ接合性の自発的な喪失を経た反対の交配タイプを有しない株の間の稀な交配によって形成される(Steenselsら、2014。FEMS Microbiol Reviews 38: 947〜995頁)。種間雑種形成は、比較的低い発生率を有する;ハイブリダイゼーション頻度は、胞子対胞子の交配では1.5〜3.6% (Krogerusら、2016。Appl Microbiol Biotechnol 100: 7203〜7222頁; Mertensら、2015。Appl Environment Microbiol 81: 8202〜8214頁)から、稀な交配では1×10-6〜1×10-7の低い頻度(Krogerusら、2017。Microbial Cell Factories 16: 66頁;Gunge及びNakatomi、1972。Genetics 70: 41〜58頁)の範囲内であることが報告されている。
【００８５】
特に稀な交配事象のハイブリッド生成物の同定を増強するために、ハイブリッド酵母を生成する好ましい方法は、細胞をハイブリダイズする前に第1及び/又は第2の親からの細胞を蛍光色素で標識することを含む。
【００８６】
第1の親酵母の細胞は、本明細書で以降色素Aと呼ぶ第1の色素で標識することができ、第2の親酵母の細胞は、本明細書で以降色素Bと呼ぶ第2の色素で標識することができる。色素A及び色素Bは蛍光色素であり、色素Aは色素Bと異なる。更に、色素Aで標識される細胞は、例えば、異なる励起及び/又は発光スペクトルを有する色素を用いることによって、好ましくは色素Bで標識される細胞から区別することができる。本発明の方法で使用することができる好適な色素は、単色光源、好ましくはレーザーによって、より好ましくは紫外レーザー(約355nm)、バイオレットレーザー(約405nm)、青色レーザー(約488nm)又は赤色レーザー(約640nm)によって励起することができる。例えば、色素Aは約630nmの赤色レーザーで励起され、約661nmで発光する色素であってよく、色素Bは約492nmの青色レーザーで励起され、約517nmで発光する色素であってよい。
【００８７】
標識は、好ましくは直接的である。標識は、好ましくはタンパク質の一級アミン(R-NH2)、アミン改変オリゴヌクレオチド、及び他のアミン含有分子を標識することによって予め形成される。
【００８８】
これのために、色素を細胞内リジン残基及び他のアミン源に結合させるために、色素はスクシンイミジル基、好ましくはスクシンイミジルエステルを好ましくは含む。
【００８９】
更なる好ましい色素にはチオール反応性色素が含まれ、ここでは、蛍光標識は、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、ベンジルハライド又はブロモメチルケトンに結合する。更に、全細胞パッチクランピング、イオントフォレシス、飲作用小胞の浸透圧性溶解によって細胞に導入することができる極性色素、例えばルシファーイエローCH、カスケードブルーヒドラジド、Alexa Fluorヒドラジド及びビオサイチンを含むマイクロインジェクション可能な色素;並びに/又は、侵襲的技術、例えばマイクロインジェクション、全細胞パッチクランピング、スクレイプローディング、微粒子銃、エレクトロポレーション又は浸透圧ショックによって細胞にロードすることができる蛍光性デキストランコンジュゲート又は蛍光性マイクロスフェアを、本発明の方法で細胞を染色するために使用することができる。
【００９０】
前記蛍光性標識は、Abz(アンスラニリル、2-アミノベンゾイル)、N-Me-Abz(N-メチル-アンスラニリル、N-メチル-2-アミノベンゾイル)、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、5-FAM(5-カルボキシフルオレセイン)、6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、TAMRA(カルボキシテトラメチルローダミン)、Mca(7-メトキシクマリニル-4-アセチル)、AMCA又はAmc(アミノメチルクマリン酢酸)、ダンシル(5-(ジメチルアミノ)ナフタレン-1-スルホニル)、EDANS(5-[2-アミノエチル)アミノ]ナフタレン-1-スルホン酸)、Atto(例えばAtto465、Atto488、Atto495、Atto550、Atto647)、シアニン(Cy)色素、例えばCy3(1-(5-カルボキシペンチル)-3,3-ジメチル-2-((1E,3E)-3-(1,3,3-トリメチルインドリン-2-イリデン)プロパ-1-エン-1-イル)-3H-インドール-1-イウムクロリド)、Cy5(1-(5-カルボキシペンチル)-3,3-ジメチル-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-トリメチルインドリン-2-イリデン)ペンタ-1,3-ジエニル)-3H-インドリウムクロリド)、例えば三スルホン化Cy5及びCy7(1-(5-カルボキシペンチル)-2-[7-(1-エチル-5-スルホ-1,3-ジヒドロ-2H-インドール-2-イリデン)ヘプタ-1,3,5-トリエン-1-イル]-3H-インドリウム-5-スルホン酸)、Alexa Fluor(例えば、Alexa Fluor647、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa594、Alexa633、Alexa647)、Bodipy(例えばBodipy(R) FL)、Dylight(例えばDyLight 488、DyLight 550)、ルシファーイエロー(エチレンジアミン又は6-アミノ-2-(2-アミノ-エチル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[デ]イソキノリン-5,8-ジスルホン酸)及びその誘導体から好ましくは選択される。
【００９１】
好ましい色素組合せは、好ましくは、スペクトルの重複がなく、好ましくは蛍光補償の必要性がない2つの発光フィルターで明確に測定することができる色素、より好ましくは、スペクトルの重複を最小にするために2つの異なるレーザー、例えばバイオレットレーザー(約405nm)、青色レーザー(約488nm)又は赤色レーザー(約640nm)で励起させることができる色素を含むことが当業者には明らかなはずである。色素Aで染色した細胞の色素Bで染色した細胞からの識別及び分離を可能にする好ましい組合せは、バイオレットレーザー及び青色レーザー;バイオレットレーザー及び赤色レーザー、又は青色レーザー及び赤色レーザーで励起させることができる蛍光色素である。
【００９２】
色素A及び色素Bは、好ましくは、色素A及び色素Bの両方を持つ細胞の色素Aだけ及び色素Bだけを持つ細胞からの識別及び分離も可能にする色素である。これのために、好ましい色素は、約630nmの赤色レーザーで励起され、約661nmで発光する色素、及び約492nmの青色レーザーで励起され、約517nmで発光する色素を含む。
【００９３】
当業者に明らかであるように、標識細胞のハイブリダイゼーションは、蛍光色素の退色を阻止するために暗所で好ましくは実行される。
【００９４】
特に稀な交配事象のハイブリッド生成物の同定を増強するために、標識又は非標識親酵母細胞のハイブリダイゼーションは、第1及び/又は第2の親酵母の最適な増殖温度より少なくとも5℃低い温度で実行される。
【００９５】
過剰な細胞増殖を阻止するために、ハイブリダイゼーションは、両方の親酵母の最適な増殖温度未満の温度で好ましくは実行される。温度を下げることによって、細胞分裂はより長くかかり、ハイブリダイゼーションへの影響は低下する。したがって、より高い温度でのハイブリダイゼーションと比較したとき、生じる細胞のより高い割合がハイブリッド細胞である。親酵母の最適な増殖温度より少なくとも5℃低いハイブリダイゼーション温度は、色素による染色のロスを制限すること、及び、第1の親酵母と第2の親酵母の間のハイブリダイゼーションからもたらされる稀な種間ハイブリッドの同定をもたらすことが見出された。
【００９６】
第1及び/又は第2の親生物体の最適な増殖温度より少なくとも5℃低い温度は、好ましくは18℃未満、好ましくは5℃〜15℃、より好ましくは10℃〜13℃、最も好ましくは約12℃である。当業者は、例えば異なる温度で酵母の細胞を増殖させることによって、通常でない最適な増殖温度を有する酵母の最適な増殖温度を判定することが疑いなくできる。
【００９７】
本発明は、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母のゲノムのコピーを含む、ハイブリッド酵母に更に関する。前記ハイブリッド酵母は、本発明によるハイブリッド酵母を生成する方法によって好ましくは生成される。
【００９８】
4.5 発酵ビール製品を生産する方法
酵母は、パン焼き、醸造及び蒸留において、例えばパンの製造並びにビール及びワインの発酵で長く使用されている。
【００９９】
醸造用麦芽汁は、麦芽糖(50〜60%)、マルトトリオース(15〜20%)及びグルコース(10〜15%)を含む発酵性の糖を含む。本発明の方法は、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異S.ユーバヤヌス酵母及び/又はそのハイブリッドを好ましくは用いる。本発明による、マルトトリオースを発酵させることができる突然変異サッカロミセス・ユーバヤヌス酵母、及び/又は本発明によるハイブリッド酵母の使用は、生じる発酵ビール製品の官能特性に影響する。
【０１００】
前記酵母は、1つ又は複数の天然に存在する突然変異、及び/又は遺伝子PAD1及びFDC1、前記遺伝子の少なくとも1つの転写制御に関与する遺伝子、及び/又はフェノール酸、好ましくはフェルラ酸の取り込みに関与するか、又は脱炭酸フェノール化合物、好ましくは4-ビニルグアヤコールのエクスポートに関与するタンパク質をコードする遺伝子、及び/又は前記遺伝子の転写制御に関与する遺伝子の少なくとも1つの突然変異誘発からもたらされる突然変異を更に含むことができる。
【０１０１】
発酵ビール製品を生産する前記方法は、麦芽糖を放出させるために、水性溶液中の、好ましくは水の中のつぶした穀類グレイン、好ましくはオオムギの供給を含む。この麦芽処理工程の後に、生じた麦芽汁をホップの存在下で沸騰させ、生じた煮沸麦芽汁を冷却後に発酵させることが続く。発酵が完了したとき、ビールを濾過してビン詰めすることができる。
【０１０２】
発酵プロセスの間、発酵性の糖はアルコール、例えばエタノール、CO2及び風味化合物、例えばエステル、例えば酢酸アミルに変換される。当業者に公知であるように、生じる生成物の外観及び味覚に影響する因子には、限定されずに、グレインをローストする温度及びローストする時間、グレインの浸漬、発芽及び窯焼の温度及び時間、グレインの摩砕及びすり潰しの温度及び時間、麦芽汁を作製するための生じたマッシュの濾過、麦芽汁を沸騰させる温度及び時間、ホップを加える時間及び量、使用する具体的なホップ、発酵の温度及び時間、酵母の種類、酵母を除去するための酵母の機械的濾過又は濾過剤の添加、並びに最後にビールの炭酸化及び詰め込みが含まれる。発酵後の濾過の前に開始することができる調整工程の間、硫黄、バター及び青リンゴを含む、調整不足又は「未熟な」ビールに付随する一般的な異臭を吸収するための、数日から数週の時間を酵母に与える。
【０１０３】
本発明の方法では、発酵プロセスは通常の温度で、好ましくは6〜25℃、好ましくは7〜20℃、より好ましくは8〜13℃で実行される。ラガービール発酵は、7〜13℃の温度で一般的に実行される。
【０１０４】
一実施形態では、アルコールの量は発酵後に低減する。最終ビール製品の中のアルコールの量を低減するために、4容量%より上のアルコール濃度を有する生じたビール製品は、例えば、精留及び/又は逆浸透を含む透析を含む物理的プロセスにかけられる。
【０１０５】
タンパク質及び糖等の他の成分の分解をもたらさない温度で揮発性のエタノールの沸騰を達成するために、精留は通常減圧下で実行される。前記精留は、好ましくは、減圧下の20〜50℃の上昇させた温度での発酵の後に実行される。アルコールレベルを低減する真空精留の方法は、例えばNarzissら、1993. Brauwelt 133: 1806〜1820頁及びKern 1994. Alimentacion Equipos y Tecnologia 13: 37〜41頁に記載されている。更なる好適な方法には、流下膜式精留が含まれる(Zufall及びWackerbauer、2000。Monatsschrift fuer Brauwissenschaft 53: 124〜137頁)。好適な大規模精留システムは、例えば、KmX Chemical Corporation社、ニューチャーチ、バージニア、Pope Scientific, Inc.社、ソークビル、ウィスコンシン、M&L Engineering GmbH社、Hofheim am Taunus社、ドイツ、Centec社、マインタール、ドイツ及びAPI Schmidt Bretten GmbH & Co.社、KG、ブレッテン、ドイツから入手できる。
【０１０６】
発酵飲料のアルコール含有量を低減する透析は、飲料に半透膜を通過させることを含む
(独国特許第2145298号及び2413236号)。好ましい透析プロセスは、飲料を濃縮液及び濾液に分離する単一逆浸透プロセスである(ベルギー特許第717847号、独国特許第2323094号、独国特許第2339206号)。更なる変異形は、逆浸透(米国特許第4,317,217号)及び浸透気化法(欧州特許出願第332,738号)を含む。使用される膜の閾値特性は、発酵飲料から塩、エステル及びアルデヒド等のどの低分子量分子がアルコールと一緒に除去されるかを決定する。更に、プロセスの間にかけられる高圧は、分子の変性を引き起こすことができ、物理化学的特性の改変、例えば濁度、フロキュレーション等の増加、並びに官能特性の改変、例えば改変された風味及び味覚をもたらす。好適な大規模透析システムは、例えば、Alfa Laval社、ルンド、スウェーデン及びOsmonics Inc.社、ミネトンカ、ミネソタから入手できる。
【実施例】
【０１０７】
5. 実施例
(実施例1)
材料及び方法
株及び維持
S.ユーバヤヌス基準株CBS 12357(Libkindら、2011。Proc Natl Acad Sci USA 108:14539〜44頁)は、Westerdijk Fungal Biodiversity Institute(ユトレヒト、オランダ)から得た。この試験で使用した全ての株は、Table 1 (表1)及びTable 3 (表3)に掲載する。S.ユーバヤヌス株の保存培養は、後期指数増殖期まで30(v/v)%の最終濃度まで無菌のグリセロールを補ったYPD(10g L-1酵母抽出物、20g L-1ペプトン及び20g L-1グルコース)で増殖させ、後の使用まで-80℃で保存した。
【０１０８】
培地及び培養
プラスミドは、10g L-1ペプトン、5g L-1 Bacto酵母抽出物、5g L-1 NaCl及び100mg L-1アンピシリンを含有する37℃の10mLのLB培地において、大腸菌(Escherichia coli) XL1-Blue細胞で一晩増殖させた。合成培地(SM)は、3.0g L-1 KH2PO4、5.0g L-1(NH4)2SO4、0.5g L-1 MgSO4、7H2O、1mL L-1微量元素溶液及び1mL L-1ビタミン溶液を含有し(Verduynら、1992。Yeast 8: 501〜17頁)、加圧滅菌した50%溶液の添加によって、20g L-1グルコース(SMG)、麦芽糖(SMM)又はマルトトリオース(SMMt)を追加した。95.8%の純度のマルトトリオースを使用した(Glentham Life Sciences社、コーシャム、英国)。工業用の麦芽汁は、HEINEKEN Supply Chain B.V.社、ズーターワウデ、オランダによって提供された。麦芽汁には硫酸亜鉛七水和物の添加によって1.5g L-1のZn2+を追加し、121℃で30分間加圧滅菌し、使用前にNalgeneの0.2μm SFCAボトルトップフィルター(Thermo Scientific社)を使用して濾過した。希釈した麦芽汁で実行した実験については、濾過した麦芽汁に無菌のデミウォーターを適当な量で加えた。好気的培養は、100mL培地を含む500mL振盪フラスコで増殖させた。固体培地での培養のために、培地に20g L-1の寒天を追加した。振盪フラスコ及びボトル培養は、New Brunswick Innova43/43R振盪機(Eppendorf Nederland B.V.社、ナイメーヘン、オランダ)の中で200RPMでインキュベートした。プラスミドpUDP052(gRNASeSGA1)で形質転換されたS.ユーバヤヌス株の選択は、前に記載の通り、(NH4)2SO4が5g L-1 K2SO4及び10mMアセトアミドで置き換えられたSMAceG:SMG培地で実行された(Solis-Escalanteら、2013。FEMS Yeast Res 13: 126〜39頁)。
【０１０９】
好気的振盪フラスコ培養
好気的振盪フラスコ培養は、定常期好気的前培養から接種した。SMMt及びSMMの増殖研究はSMMで前培養し、SMGの増殖研究はSMGで前培養し、3倍希釈麦芽汁の増殖研究は3倍希釈麦芽汁で前培養した。増殖実験は、100mlの培地を含有する500ml振盪フラスコで実行し、0.1のOD660まで接種した。振盪フラスコは20℃及び200RPMでインキュベートし、細胞外代謝産物濃度を判定するために試料を一定間隔でとった。
【０１１０】
微好気的ボトル特徴付け
ボトル培養は、250mLのエアロックキャップボトルの中で、発泡を阻止するために0.4mL L-1プルロニック（登録商標）を追加した3倍希釈麦芽汁において200mLの作業容量で実行した(Sigma-Aldrich社)。ふたの膜は圧増強を阻止するために0.2μmフィルターでキャップされた短針を備えていて、3mLシリンジの付いた針によって試料採取を無菌的に実行した。12℃で4日間のインキュベーションの後、ボトルは、同じ培地の30mlを含有している50mlの好気的Greinerリアクター管の中の定常期前培養から0.1のOD660まで接種した。ボトルは12℃及び200RPMでインキュベートし、OD660及び外部代謝産物を測定するために、液体ハンドラーLiHa(Tecan社、メンネドルフ、スイス)を使用して一定の間隔で24個の深いウエルプレートに3.5mLの試料を収集した。試料ごとに、96-ウエルプレートの中に30μLを150μLに5倍希釈し、Magellan Infinite 200 PRO分光計(Tecan社、メンネドルフ、スイス)を使用してOD660を測定し、残りの試料は、HPLC測定のために濾過滅菌した。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
UV突然変異誘発及び選択
CBS 12357は定常期まで20℃でSMGの上で好気的に増殖させ、milliQで1.0のOD660まで希釈した。この溶液の50mLを4816gで5分間遠心回転させ、milliQ水に2回再懸濁させた。25mlの洗浄細胞をふたなしの100mm×15mmシャーレに注ぎ、253.7nmの放射線ピークのUVランプ(TUV 30W T8、Philips社、アイントホーフェン、オランダ)で照射した。生存率を判定するために、25mLの非突然変異及び5mLの突然変異細胞を保持した。両方の試料から、100倍希釈溶液を作製し、そこから100,000倍希釈溶液まで連続10倍希釈溶液を作製した。次に、各希釈溶液の100μLをYPD寒天に平板培養し、室温で48時間のインキュベーションの後にコロニー数を数えた。10,000倍希釈の後、突然変異細胞の84コロニーに対して非突然変異細胞から182コロニーが形成し、46%の生存率であることが示された。突然変異細胞の残りの20mLを4816gで5分間遠心回転させ、1mlのmilliQ水に再懸濁させた。9mLのSMMtを含有する50mL振盪フラスコに突然変異細胞を加え、20℃及び200RPMで21日間インキュベートした。マルトトリオース濃度は、0、19及び21日目に記録した。21日目に、増殖した培養の100μLをSMMtを含む新鮮な振盪フラスコに2回移し、定常期までインキュベートした。第2の移入の終わりに、355nm、445nm、488nm、561nm及び640nmレーザー並びに70μmノズルを備えているBD FACSAria (商標) II SORP Cell Sorter(BD Biosciences社、フランクリンレイクス、NJ)を使用して単細胞分離株を得、フィルター処理したFACSFlow (商標)(BD Biosciences社)で操作した。CS&T Beads(BD Biosciences社)でCSTサイクルを実行することによって、各実験の前にサイトメーター性能を評価した。選別のためのドロップ遅延は、Accudrop Beads(BD Biosciences社)でAuto Drop Delayサイクルを実行することによって判定した。側方散乱(SSC)に対して前方散乱(FSC)をプロットすることによって、細胞形態を分析した。ゲーティングされた単細胞は、0の収量マスクに対応した「単細胞」選別マスク、32の純度マスク及び16の相マスクを使用して、SMMt含有96ウェルマイクロタイタープレートの中に選別した。96ウエルプレートをGENIosProマイクロプレート分光計(Tecan社、メンネドルフ、スイス)の中で室温で96時間インキュベートし、増殖をOD660によって監視した。最後に、バイオマスを再懸濁させ、最終OD660を測定した。最も高い最終OD660を有する7つの分離株を選び出し、再び画線培養し、IMS0637〜643として保存した。
【０１１３】
マルトトリオース制限ケモスタット培養
100mLの一定の作業容量を維持するためにレベルセンサーを備えているMultifors 2 Mini Fermenters(INFORS HT社、フェルップ、オランダ)で、ケモスタット培養を実行した。培養温度は20℃に制御し、希釈速度は培地流入速度を制御することによって0.03h-1に設定した。培養は、10g L-1の追加のマルトトリオース(Glentham Life Sciences社)、0.2mL L-1の消泡剤エマルジョンC(Sigma-Aldrich社、ツウィンドレヒト、オランダ)、10mg L-1のエルゴステロール、420mg L-1のTWEEN(登録商標) 80及び5g L-1の硫酸アンモニウムを追加した6倍希釈麦芽汁で増殖させた。前に記載の通り、TWEEN(登録商標)及びエルゴステロールを溶液として加えた(Verduynら、1992。Yeast 8: 501〜17頁)。IMS0637〜IMS0643は、3倍希釈麦芽汁により別々の振盪フラスコの中で20℃及び200RPMで一晩増殖させた。各株のOD660を測定し、各株からの20のOD660の7mL同等物を50mLの総容積でプールした。リアクターを接種するために、プールした培養の20mLを使用した。一晩の増殖の後、培地流入ポンプをオンにし、発酵槽を20mL min-1の窒素ガスでスパージし、500RPMで撹拌した。pHは、調整しなかった。試料は、毎週とった。63日目の技術的故障のため、ケモスタットを加圧滅菌し、洗浄し、同日中にとられた試料を使用して再開した。合計122日後、ケモスタットを停止し、IMS0637〜IMS0643に関して、FACSを使用して単一コロニー分離株をSMMt寒天の上に選別した。3つのコロニーをランダムに選び出し、再び画線培養し、IMS0750〜752として保存した。
【０１１４】
ゲノム単離及び全ゲノムシークエンシング
株が12〜20のOD660の定常期に到達するまで、200RPMに設定したオービタルシェーカーの上の20℃の液体YPD培地を含有する50ml Greiner管の中で、酵母培養をインキュベートした。全ゲノムシークエンシングのためのゲノムDNAは、製造業者の使用説明書によりQiagen 100/Gキット(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ)を使用して単離し、Qubit (登録商標)蛍光光度計2.0(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)を使用して定量化した。
【０１１５】
株CBS 12357、IMS0637〜IMS0643及びIMS0750〜IMS0752のゲノムDNAは、PCRフリーライブラリー調製を使用した150bpのペアエンドリードにより、HiSeq2500シーケンサー(Illumina社、サンディエゴ、CA)でNovogene Bioinformatics Technology Co., Ltd社(元朗、香港)によって配列決定をした。全てのリードは、バイオプロジェクト受託番号PRJNA492251の下でNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)から入手できる。
【０１１６】
株IMS0637及びIMS0750のゲノムDNAは、Nanopore MinION(Oxford Nanopore Technologies社、オクスフォード、英国)で配列決定をした。ライブラリーは、前に記載の通り(Salazarら、2017。FEMS Yeast Res 17: doi: 10.1093/femsyr/fox074)、1Dライゲーション(SQK-LSK108)を使用して調製し、MinION Mk1B単位(Oxford Nanopore Technology社)に連結されたFLO-MIN106(R9.4)フローセルで分析した。活性孔の品質管理及びシークエンシングのために、MinKNOWソフトウェア(バージョン1.5.12; Oxford Nanopore Technology社)を使用した。MinKNOWによって生成される生ファイルは、Albacore(バージョン1.1.0; Oxford Nanopore Technology社)を使用してベースコールした。1000bpの最小長のリードは、fastqフォーマットで抽出された。全てのリードは、バイオプロジェクト受託番号PRJNA492251の下でNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から入手できる。
【０１１７】
ゲノム分析
株CBS 12357、IMS0637〜IMS0643、IMS0750〜IMS0752及びIMS0760〜IMS0762のために、生のIlluminaリードは、Burrows-Wheeler Alignmentツール(BWA)を使用してS.ユーバヤヌス基準株CBS 12357の染色体レベルの参照ゲノムに対して整列させ(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁) 、変異体コーリングのためにSAMtools及びPilonを使用して更に処理した(Li及びDurbin、2010。Bioinformatics 26:589〜95頁; Liら、2009。Bioinformatics 25: 2078〜9頁; Walkerら、2014。PloS One 9: e112963頁)。CBS 12357でヘテロ接合だったヘテロ接合SNP及びインデルは無視した。Breakdancerを使用して染色体転位を検出した(Chenら、2009。Nat Methods 6: 677頁)。その遺伝子座で整列したリードの少なくとも10%によって支えられた転位だけを考慮した。染色体コピー数変動は、ガンマ設定を「無」に設定したMagnolyaを使用して(Nijkampら、2012。Bioinformatics 28: 3195〜202頁)、及び29のk単量体サイズでアセンブラABySS(v1.3.7)を使用して推定した(Simpsonら、2009。Genome Res 19: 1117〜23頁)。全てのSNP、インデル、組換え及びコピー数の変化は、Integrative Genomics Viewer (IGV)ソフトウェアの中の生成された.bamファイルを可視化することによって手動で確認した(Robinsonら、2011。Nat Biotechnol 29:24頁)。
【０１１８】
株IMS0637及びIMS0750のために、ゲノムサイズを12Mbpに設定したCanu(バージョン1.3)(Korenら、2017。Genome Res 27: 722〜736頁)を使用して、ナノポアシークエンシングリードを新規に組み立てた。組立ての正確さは、Pilonを使用して調査し(Walkerら、2014。PloS One 9:e112963)、SNP及び短いインデル(-フィックス塩基パラメータ)だけの補正を使用したBWAでIlluminaリードを整列させることによって(Li及びDurbin、2010。Bioinformatics 26:589〜95頁)、シークエンシング/アセンブリエラーの更なる補正「ポリシング」を実行した。IMS0637及びIMS0750の長いシークエンシングリードは、得られた参照ゲノム及びminimap2を使用したCBS 12357の参照ゲノムに整列させた(Li、2018。Bioinformatics 34: 3094〜3100頁)。全てのリードは、バイオプロジェクト受託番号PRJNA492251の下でNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から入手できる。
【０１１９】
分子生物学方法
コロニーPCR及びサンガーシークエンシングのために、10μLの0.02M NaOHで5分間沸騰させることによってゲノムDNAを調製した。S.ユーバヤヌス種に属した分離株を検証するために、プライマー8572及び8573を使用したPCR増幅によってS.ユーバヤヌス特異的遺伝子SeFSY1の存在を試験し(Pengelly及びWheals、2013。FEMS Yeast Res 13: 156〜61頁)、プライマー8570及び8571を使用したPCR増幅によってS.セレビシエ特異的遺伝子ScMEX67の不在を試験した(Muirら、2011。FEMS Yeast Res 11: 552〜63頁)。S.ユーバヤヌスの性質の更なる確認のために、プライマー10199及び10202を使用してITS領域を増幅し、増幅された断片はサンガー配列決定をした(Schochら、2012。Proc Natl Acad Sci USA 109: 6241〜6頁)。生じた配列は、利用可能なITS配列と比較し、増幅された領域が最も高い配列同一性を有する種として分類した。SeMALT遺伝子の存在は、以下の遺伝子特異的プライマーを使用したPCRによって検証した: SeMALT1のためには10491及び10492、SeMALT2及びSeMALT4/2のためには10633及び10632、SeMALT3のためには10671及び10672、SeMALT13のためには10491及び10671、SeMALT413のためには10633及び10671。増幅された断片はゲル精製し、それらを増幅するために使用したプライマーを使用してサンガー配列決定をした。
【０１２０】
プラスミド構築
この試験で使用した全てのプラスミド及びプライマーは、Table 2 (表2)及びTable 3 (表3)に掲載する。プラスミド及び株の構築のためのDNA増幅は、供給業者の使用説明書に従ってPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific社)を使用して実行した。SeMALT413のコード領域は、プライマー対10633/10671によりIMS0750のゲノムDNAから増幅させた。各プライマーはp426-TEF-amdsのプラスミド骨格に相補的な40bp伸張部を有し(Marquesら、2017。FEMS Yeast Res 17:fox006)、それはプライマー7812及び5921を使用してPCR増幅させた。断片は、NEBuilder HiFi DNA Assembly(New England Biolabs社、イプスウィッチ、MA)を使用してp426-TEF-amdS骨格断片で「ギブソン」式(Gibsonら、2009。Nat Methods 6:343頁) に組み立てられ、プラスミドpUD814をもたらした。
【０１２１】
株構築
S.ユーバヤヌス CBS 12357でSeMALT2及びSeMALT413 ORFを組込み、過剰発現させるために、S.ユーバヤヌス第IX染色体に位置するSeSGA1遺伝子の各脇に相同的な40bp領域を有するプライマー13559/13560により、pUD480及びpUD814からSeMALT2及びSeMALT413をそれぞれ増幅させた。組込みを容易にするために、Spcas9D147Y P411T(Baoら、2014。ACS Synth Biol 4: 585〜94頁; Gorter de Vriesら、2017。Microb Cell Fact 16:222頁)及びSeSGA1を標的にするgRNA(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)を発現するプラスミドpUDP052でPCR断片を同時形質転換させた。株IMX1941は、前に記載の通り、1μgの増幅させたSeMALT2発現カセット及び500ngのプラスミドpUDP052でエレクトロポレーションによってCBS 12357を形質転換させることによって構築した(Gorter de Vriesら、2017。Microb Cell Fact 16:222頁)。形質転換体は、SMAceGプレートの上で選択された。同様に、IMX1942は、SeMALT2の代わりにSeMALT413のための1μgの増幅させたSeMALT413発現カセットでCBS 12357を形質転換させることによって構築した。正しい組込みは、プライマー対12635/12636による診断的PCRによって検証した。全てのPCR増幅遺伝子配列は、サンガー配列決定をした(Baseclear社、ライデン、オランダ)であった。
【０１２２】
タンパク質構造予測
SeMalt413輸送体の相同性モデル化は、SWISS-MODELサーバー(https://swissmodel.expasy.org/)を使用して実行した(Biasiniら、2014。Nucleic Acids Res 42(W1): W252〜W8頁)。SeMALT413を翻訳し、インプットとして使用した。キシロースプロトン共輸送体XylE(PDB: 4GBY)のモデルを鋳型として選択した(Lamら、1980。J Bacteriol 143: 396〜402頁)。ProMod3を使用した標的-鋳型アラインメントに基づいて、モデルを構築した。標的と鋳型の間で保存される座標を、鋳型からモデルにコピーする。断片ライブラリーを使用して挿入及び欠失を改造する。次に側鎖を再構築する。最後に、フォースフィールドを使用して、生じたモデルの幾何構造を調整する。ProMod3によるループモデル化が失敗する場合には、代わりのモデルをPROMOD-IIで構築する(Guexら、2009。Electrophoresis 30: S162〜S73頁)。3Dモデルを調査し、Pymolを使用して着色した(The PyMOL Molecular Graphics System社、バージョン2.1.1 Schrodinger、LLC.)。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
分析
エタノールの濃度並びに糖グルコース、麦芽糖及びマルトトリオースの濃度は、65℃のBio-Rad Aminex HPX-87Hカラム及び1分につき0.8mLの流速の5mM硫酸の移動相を使用した高圧液体クロマトグラフィー(HPLC) Agilent Infinity 1260シリーズ(Agilent Technologies社、サンタクララ、CA)を使用して測定した。化合物は、RIDを使用して35℃で測定した。試料は分析の前に上清を収集するために遠心回転(13.000×gで5分間)させたか、又は0.2μmで濾過滅菌した。
【０１２５】
結果
突然変異誘発及び進化は、S.ユーバヤヌスがマルトトリオースを利用することを可能にするサッカロミセス・ユーバヤヌス基準株CBS 12357は麦芽糖を消費するが、醸造用麦芽汁の主な発酵性糖の1つであるマルトトリオースを消費しない(Heblyら、2015。FEMS Yeast Res 15: fov005)。マルトトリオースを利用することができる突然変異体を得ようとして、実験室進化を適用した(図1を参照)。初期の遺伝的多様性を増加させるために、株CBS 12357を軽いUV突然変異誘発にかけ、それは46%の生存率をもたらした。マルトトリオース消費突然変異体を富化するために、唯一の炭素源として20g L-1マルトトリオース(SMMt)を含有するSM培地に突然変異体プールを接種し、20℃でインキュベートした。2週間の誘導期の後に増殖が観察され、マルトトリオース濃度は21日後に10.48g L-1に減少した。SMMt培地への2回の以降の移入の後、FACSを使用して96個の単細胞をマイクロタイターYPDプレートに選別した。インキュベーションの結果、生じた単細胞培養をマイクロタイターSMMtプレートに複製プレーティングし、OD660に基づいて増殖を監視した。最も高い最終OD660を有する7つの分離株を選択し、IMS0637〜IMS0643と命名した。S.ユーバヤヌス特異的SeFSY1遺伝子のPCR増幅及びITS領域のシークエンシングは、全ての7つの分離株がS.ユーバヤヌス種に属することを確認した(データ示さず)。マルトトリオースの上でのそれらの増殖を特徴付けるために、野生型CBS 12357、突然変異体IMS0637〜IMS0643及びマルトトリオース消費S.パストリアヌス株CBS 1483を、SMMtを含有する振盪フラスコにおいて20℃で特徴付けた(図2A)。CBS 12357は187時間後にいかなるマルトトリオース消費も示さなかったが、マルトトリオースの残留量はIMS0637〜IMS0643では91時間後に、CBS 1483では43時間後に50%未満に減少した。より遅いマルトトリオース利用にもかかわらず、IMS0637〜IMS0643突然変異体の最終マルトトリオース減衰は、マルトトリオース消費参照CBS 1483が到達した92.1%の最終減衰と同等に92.7±1.6%に到達した。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
これらの結果はマルトトリオースが合成培地で利用されたことを示すが、醸造用麦芽汁でのマルトトリオース利用が工業適用性のために必要とされた。3倍希釈麦芽汁を含有する振盪フラスコで、株を特徴付けた。S.パストリアヌス CBS 1483は145時間後にマルトトリオースの50%を消費したが、突然変異体IMS0637〜IMS0643は、S.ユーバヤヌス野生型CBS 12357のように361時間後にいかなるマルトトリオースも消費しなかった(図2B)。したがって、醸造条件下でマルトトリオースを利用する能力を向上させるために、突然変異体IMS0637〜IMS0643を、マルトトリオースを富化した醸造用麦芽汁での炭素制限ケモスタットにおける実験室進化にかけた。これらの条件下で、マルトトリオースの上での増殖のための向上した親和性又はより高い輸送速度を有する突然変異体は栄養制限がより低くなり、強い選択的利点をもたらすだろう。この目的のために、10g L-1のマルトトリオースを追加した6倍希釈麦芽汁で細胞を増殖させ、2g L-1グルコース、15g L-1麦芽糖及び15g L-1マルトトリオースの最終濃度をもたらした。酸素及び窒素制限を阻止するために、10mg L-1エルゴステロール、420mg L-1 TWEEN(登録商標) 80及び5g L-1硫酸アンモニウムを追加した。UV突然変異体IMS0637〜IMS0643をプールして、リアクターに接種するために使用した。最初のバッチでは全てのグルコース及び麦芽糖が消費され、残った唯一の炭素源としてマルトトリオースが残された。連続培養を0.03h-1の希釈速度で運転し、排出流は当初13.2g L-1のマルトトリオースを含有した。121日間にわたって、マルトトリオース濃度は7.0g L-1に次第に減少した(図2C)。その時点で、培養からの10個の単細胞をSMMt寒天プレートの上でFACS選別し、20℃でインキュベートした。S.ユーバヤヌス特異的SeFSY1遺伝子のPCR増幅及びITS領域のシークエンシングは、試験した全ての分離株がS.ユーバヤヌス種に属することを確認した(データ示さず)。3つの単細胞系を単離し、IMS0750、IMS0751及びIMS0752と命名し、3倍希釈麦芽汁を含有する微好気的培養において、野生型CBS 12357及びS.パストリアヌスCBS 1483と一緒に12℃で特徴付けた(図2D)。CBS 12357及びIMS0751はグルコース及び麦芽糖だけを消費することができたが、進化した分離株IMS0750、IMS0752及びCBS 1483はマルトトリオースを消費した。263時間後、マルトトリオース濃度はIMS0750及びIMS0752では20から4.3g L-1のマルトトリオースに、CBS 1483では2.0g L-1に減少した。麦芽汁のマルトトリオースを利用することができないために、IMS0751はそれ以上研究されなかった。これらの結果は、進化した株IMS0750及びIMS0752は、麦芽汁のマルトトリオースをS.パストリアヌス参照CBS 1483とほとんど同等に消費することができたが、突然変異株IMS0637〜IMS0643は、合成培地(SMMt)で唯一の炭素源として供給されたときにだけマルトトリオースを利用することができたことを確認した。
【０１２８】
全ゲノムシークエンシングは、新しい組換えキメラSeMALT遺伝子を明らかにする
野生型CBS 12357、UV突然変異体IMS0637〜IMS0643並びに進化した株IMS0750及びIMS0752のゲノムは、150bpペアエンドIlluminaリードを使用して配列決定した。シークエンシングデータは、CBS 12357と比較したSNP、インデル及びCNV突然変異を同定するために、野生型CBS 12357のゲノムの染色体レベルのアセンブリにマッピングした(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)。UV突然変異体IMS0637、IMS0640、IMS0641及びIMS0642のゲノムは、116個のSNP、5つのインデル及び1つのコピー数変動のセットを共有した(図3A)。これらの突然変異に加えて、IMS0638、IMS0639及びIMS0643は3つの追加のSNPを有した。3つのSNPだけを除いて、IMS0637〜IMS0643における全ての突然変異はヘテロ接合だった。ヘテロ接合SNPが優勢なのは、おそらくCBS 12357の突然変異胞子の交配が原因であり、それはあらゆる突然変異位置で1つの野生型及び1つの突然変異対立遺伝子をもたらした。IMS0637における突然変異の中で、34個のSNP及び5つのインデルの全ては遺伝子間領域に影響し、30個のSNPは同義で、48個のSNPはアミノ酸置換をもたらし、4つのSNPは、早発の終止コドンをもたらした(データ示さず)。知る限り、52個の非同義のSNPのいずれも、マルトトリオース利用に前に関連付けされた遺伝子に影響しなかった。唯一のコピー数変動は、CHRVIIIの右のテロメア下領域の複製に関した。リード-メイト対形成(read-mate pairing)は、複製された領域がCHRIIの左腕に結合し、非相互転位によるCHRIIの左のテロメア下領域の置換を引き起こすことを示した。Pilonによって重要であると考えられていないが、CHRIIの左のテロメア下領域はより低いシークエンシングカバレージを実際に示した。興味深いことに、CHRIIの影響を受けた領域は発現されないSeMALT1遺伝子を持っていたが(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)、その喪失がマルトトリオース利用を向上させる可能性は低いと推定された。
【０１２９】
麦芽汁のマルトトリオースを利用する能力は実験室進化の後にだけ現れたので、IMS0750及びIMS0752に存在する突然変異を更に詳細に研究した。IMS0750及びIMS0752は、95個のSNP、3つのインデル及び1つのコピー数変動をUV突然変異体IMS0637〜643と共有した(図3A)。IMS0750及びIMS0752は、ほとんど同一だった: IMS0752は、IMS0750に不在であった1つのサイレントSNPを有した。IMS0637〜IMS0643と比較して、ヘテロ接合だった16個のSNP及び1つのインデルはホモ接合になり、IMS0637でヘテロ接合だった21個のSNP及び2つのインデルは、IMS0750及び752でもはや突然変異していなかった。更に、IMS0637〜643で不在であった5つのSNP及び4つのコピー数変動が出現した(図3A)。5つのSNPは、2つのヘテロ接合遺伝子間SNP、機能が未知のSeBSC1遺伝子のヘテロ接合非同義SNP、TOR調節経路SeMDS3の推定上の構成要素におけるホモ接合非同義SNP、及び空胞の標的化遺伝子SePEP1におけるヘテロ接合非同義SNPからなった。コピー数の変化は、SeMALT遺伝子を持ついくつかの領域に影響した: SeMALT1を含むCHRIIの550bp(座標8950〜9500)の複製、SeMALT3を含むCHRXIIIの左腕(座標1〜10275)の複製、CHRXVIの左腕(座標1〜15350)の喪失、及びSeMALT4を含むCHRXVIの5.5kb(座標16850〜22300)の喪失。リードメイト対形成の分析は、コピー数変動が第II、第XIII及び第XVI染色体の間の組換えの複合セットからもたらされることを示した。影響を受けたMAL遺伝子座の高度の類似性及びテロメア下領域におけるそれらの限局化は、突然変異の正確な再構築を困難にした。したがって、IMS0637及びIMS0750はONTのMinIONプラットホームでロングリードシークエンシングを使用して配列決定をし、新規のゲノムアセンブリを各株のために作製した。生じたアセンブリのCBS 12357の染色体レベルアセンブリとの比較は、2つの組換えが起こったことを示した。IMS0637及びIMS0750の両方で、第VIII染色体の右腕の最後の11500ヌクレオチドの追加のコピーは、第II染色体の左腕の2コピーの1つの最初の11400ヌクレオチドを置き換えた(図3B)。この組換えはIMS0637〜IMS0643、IMS0750及びIMS0752の影響を受けた領域のコピー数変化と整合していて、SeMALT1を持つMAL遺伝子座の1コピーの喪失をもたらした。更に、IMS0750のゲノムアセンブリは、CHRXVIの最初の22.3kbpの両方のコピーの、CHRII、CHRXVIII及びCHRXVIからの複合的に再編成された配列による置換を示した。組み換えられた領域は、正確に、CHRIIIの左腕の最初の10,273ヌクレオチド、続いてCHRIIからの693ヌクレオチド、CHRXVIからの1,468ヌクレオチド及びCHRXIIIからの237ヌクレオチドからなった(図3B)。組み換えられた染色体の上に存在する領域が増加したシークエンシングカバレージを示し、周囲の領域が不変であったので、組換えは相互的でなかった。この組換えは、第XVI染色体の上のSeMALT4を持つ正規のMAL遺伝子座の喪失をもたらした。しかし、組み換えられた配列は、CHRXVIからのSeMALT4の始め、CHRIIからのSeMALT1の中央及びCHRXIIIからのSeMALT3の末端からなるキメラ読取り枠を含有した(図3C)。この組換えを検証するために、SeMALT4のプロモーター及びSeMALT3のターミネーターへのプライマー結合を使用して、ORFをPCR増幅した。予想されたように、IMS0750のバンドが得られたが、CBS 12357のバンドは得られなかった。増幅された断片のサンガーシークエンシングは新しい対立遺伝子読取り枠のキメラ組織を確認し、それはSeMALT413と命名した。SeMALT413の配列は、ヌクレオチド1〜434及び1113〜1145に関してSeMALT4と100%同一性、ヌクレオチド430〜1122に関してSeMALT1に100%類似性、及びヌクレオチド1141〜1842に関してSeMALT3に100%類似性を有する完全長タンパク質をコードした(図3C)。ヌクレオチド1123〜1140はSeMALT1と72%類似性及びSeMALT3と61%類似性を示しただけなので、これらのヌクレオチドは、以前に検出されなかったCHRXVIからの追加の遺伝子移入を表す(図3B)。最初の434ヌクレオチドはSeMALT2とのヌクレオチド差のためにSeMALT4に明らかに帰することができるかもしれないが、ヌクレオチド1123〜1140はSeMALT2及びSeMALT4で同一であり、したがって、配列はCHRVの上のSeMALT2に由来した可能性もある。注目すべきことに、SeMALT413は元のSeMALT遺伝子とわずか85〜87%の配列同一性を有し、対応するタンパク質配列は52〜88%の類似性を示した。したがって、組み換えられたSeMalt413輸送体は改変された基質特異性を有するかもしれないこと、及び観察されたマルトトリオース利用の役割を担うかもしれないことを仮定した。
【０１３０】
キメラSeMALT413遺伝子の三次構造を調査するために、ScAgt1の構造をモデル化するために以前に使用された参照(Henderson及びPoolman、2017。Sci Rep 7: 14375頁)である、大腸菌からの細菌キシロースプロトン共輸送体XylEとの構造相同性に基づいたSWISS-MODELを使用して予測した(Lamら、1980。J Bacteriol 143: 396〜402頁)。サッカロミセス属での麦芽糖輸送体としてのXylEは、SeMalt413と同様に主要な促進因子スーパーファミリーに属している12α-ヘリックスで構成される膜貫通ドメインを有するプロトン共輸送体である(データ示さず)。SeMalt413の予測された構造は、1α-ヘリックスはSeMalt4からの残基によって排他的に形成され、4α-ヘリックスはSeMalt1からの残基によって排他的に形成され、5α-ヘリックスはSeMalt3からの残基によって排他的に形成されることを明らかにした(図3D)。更に、2α-ヘリックスは複数の輸送体からの残基で構成された。キシロース共輸送体参照モデルでの類似の残基の不在のために最初の100アミノ酸はモデルから排除されたので、SeMalt4配列の寄与は過小評価された。SeMalt413の予測された構造は、SeMalt1、SeMalt3及びSeMalt4の予測された構造に非常に類似し、それが機能的麦芽糖輸送体の一般的な構造を保持することを示した(データ示さず)。周辺的な構造差が特定されたが、どの残基がそのような輸送体の基質特異性を決定するかは未知であるので、これらがマルトトリオースを輸送する能力をもたらすかどうかは不明なままだった(Henderson及びPoolman、2017。Sci Rep 7:14375頁)。更に、マルトトリオースを利用する能力は、基質特異性を決定する残基の化学的特性におそらく依存する。
【０１３１】
野生型CBS 12357へのSeMALT413遺伝子の導入はマルトトリオース利用を可能にする
その機能及び基質特異性を試験するために、SeMALT413を野生型S.ユーバヤヌス CBS 12357で過剰発現させた。推定上のSeMALT413マルトトリオース輸送体は、PCRによってIMS0750から増幅させ(データ示さず)、p426-TEF-amdSのプラスミド骨格の中の構成的に発現されたScTEF1プロモーターとScCYC1ターミネーターの間に、「ギブソン」アセンブリで組み込んだ(Gibsonら、2009。Nat Methods 6:343頁)。生じたpUD814プラスミドは、サンガーシークエンシングによって検証し、それは、そのSeMALT413 ORFが、IMS0750のナノポアアセンブリで見出される組み換えられたORFと同一であることを確認した(図3C)。cas9を発現するプラスミドpUDP052及びSeSGA1を標的にするgRNAは、以前、CBS 12357のSeSGA1遺伝子座での遺伝子組込みのために首尾よく使用された(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)。したがって、SeSGA1遺伝子座での組込みのために40bp相同性腕に接してScTEF1pr-SeMALT413-ScCYC1ter発現カセットを含有したpUD814から、修復断片を増幅させた(図4)。野生型S.ユーバヤヌス CBS 12357は、pUDP052及び修復断片で形質転換させ、SeMALT413遺伝子によるSeSGA1遺伝子座の置換をもたらした(図4A)。対照として、ScTEF1プロモーターとScCYC1ターミネーターの間に野生型SeMALT2 ORFを含有する修復断片をpUD480から増幅させ、同様の方法で組み込んだ。生じた株IMX1941(ScTEF1pr-SeMALT2-ScCYC1ter)及びIMX1942(ScTEF1pr-SeMALT413-ScCYC1ter)を特徴付け、異なる炭素源を有するSMの上の野生型CBS 12357及び進化した突然変異体IMS0750と比較した。増殖速度は、一定の間隔のOD660測定値に基づいて判定した。グルコースの上で、IMX1941及びIMX1942は0.25±0.01h-1の特異的増殖速度で増殖し、IMS0750は0.28±0.01h-1の特異的増殖速度でより速く増殖した。グルコースは、33時間後に完全に消費された(図4B)。麦芽糖の上で、CBS 12357及びIMX1941は0.19±0.01h-1の特異的増殖速度で増殖し、IMX1942は0.18±0.01h-1の特異的増殖速度で増殖し、IMS0750は0.17±0.01h-1の特異的増殖速度でより遅く増殖した。麦芽糖は、43時間後に完全に消費された(図4C)。マルトトリオースの上で、進化した突然変異体IMS0750及びリバースエンジニアリングされた株IMX1942(ScTEF1pr-SeMALT413-ScCYC1ter)だけが増殖でき、マルトトリオースを消費できた。IMS0750は0.19±0.01h-1の増殖速度で指数関数的に増殖し、マルトトリオースの±55%を消費したが、IMX1942はわずか0.03±0.00h-1の増殖速度で増殖し、172時間後にマルトトリオースの45%を消費し、キメラSeMalt413輸送体の機能を実証した(図4D)。しかし、SeMALT413を過剰発現させた後のマルトトリオースの上での増殖は、進化した株IMS0750のそれに一致しなかった。更に、IMS0750は増加したグルコース取り込みを示したが、麦芽糖取り込みを減少させ、麦芽糖を代償にしてグルコース及びマルトトリオースを有利にする進化のトレードオフがあるかもしれないことを示唆する。
【０１３２】
ラガービール醸造のためのマルトトリオース消費S.ユーバヤヌス株の適用性
S.ユーバヤヌス株が現在工業用ラガービール醸造のために使用されているので(Brickweddeら、2018。Front Microbiol 9:1786頁)、進化した株IMS0750及びその親株CBS 12357を、7L発酵槽の中の高重力17°Plato麦芽汁で2反復で試験した(図5)。リバースエンジニアリングされた株IMX1942は、遺伝子改変の性格が消費者受け入れ問題のために工業的使用を妨げるので、試験しなかった(Varzakasら、2007。Crit Rev Food Sci Nutr 47: 335〜61頁)。333時間後、IMS0750は全てのグルコース及び麦芽糖を完全に消費し、マルトトリオースの濃度は1.93%(m/v)から0.47%(m/v)に低下した(図5)。マルトトリオースのこの75%の低減は、ボトルで以前に達成された60%の低減(10.5g L-1から4.3g L-1に、図2D)を超えた。対照的に、CBS 12357はいかなるマルトトリオースも利用しなかった。向上したマルトトリオース利用に加えて、IMS0750は向上した麦芽糖消費を表した:全ての麦芽糖は200時間未満に枯渇したが、CBS 12357は333時間後にのみ麦芽糖を枯渇させた(図5)。向上した糖利用により、エタノールの最終濃度はCBS 12357よりIMS0750で18.5%高かった(図5)。IMS0750の醸造関連の特徴を更に調査するために、いくつかの芳香を規定するエステル、高級アルコール及び近隣のジケトンの濃度を監視した。エステル及び高級アルコールの最終濃度は、IMS750培養上清でほとんど高かったが、酢酸アミルの増加した濃度だけが統計的に有意だった(データ示さず)。更に、エステル及びアルコールは、おそらくより速い糖消費のためにCBS 12357よりIMS0750で速く蓄積した。
【０１３３】
全体として、これらの結果はIMS0750が工業条件下でマルトトリオースを利用することができることを示し、それが醸造のためにより広い範囲の向上した特徴を表すかもしれないことを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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