(57)【要約】本開示は、カチオン性ボロン酸含有ポリマー、ならびに代謝および胃腸障害を処置するためのその使用方法に関する。発明は、被験体の胃腸（ＧＩ）管の腸管内層と内腔内容物との間に物理的バリアを形成するためのポリマー組成物を提供する。本発明のポリマーはムチン相互作用剤であり、ＧＩ管内の常在ムチンとの相互作用によって物理的バリアを系中で形成する。本発明者らは、ペンダントボロン酸部分をある特定のカチオン性ポリマーに組み込むと、ポリマーのムチン複合体化活性が劇的に改善されることを発見した。
2022501483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つの繰り返し単位の繰り返し単位を含むポリマーであって、
【化２７】
2022501483.tif 000034
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルであり；
Ｙ１は、各出現において、独立して、直接結合または−Ｌ１−Ａ１−Ｌ２−Ａ２−であり；
Ｌ１は、各出現において、−ＮＲ９−、−ＮＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｎ−であり；
Ｌ２は、各出現において、存在しない、−ＮＲ９−、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｙ２は、各出現において、独立して、直接結合または−Ｌ３−Ａ１−Ｌ２−Ａ２−であり；
Ｌ３は、各出現において、−Ｃ（Ｏ）−である、または存在しない；
Ｌ２は、各出現において、存在しない、−ＮＲ９−、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ａ１およびＡ２は、各出現において、独立して、存在しない、または必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ５アルキレンであり；
Ｒ９は、各出現において、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルであり；
Ｚは、各出現において、
【化２８】
2022501483.tif 000035
【化２９】
2022501483.tif 000036
であり、好ましくは、−Ｂ（ＯＨ）２は環の３または４位にあり；
ｎは１から１００，０００の整数であり、
ｍは０から４の整数である）；ただし、前記ポリマーは
【化３０】
2022501483.tif 000037
ではなく、そして前記ポリマーが
【化３１】
2022501483.tif 000038
である場合、前記ポリマーは１００，０００を超える分子量を有さない、ポリマー。
【請求項２】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含む、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
式（Ｉ）の前記繰り返し単位が、
【化３２】
2022501483.tif 000039
【化３３】
2022501483.tif 000040
からなる群から選択され、好ましくは、−Ｂ（ＯＨ）２が環の３または４位にある、請求項２に記載のポリマー。
【請求項４】
請求項３に記載の式（Ｉａ）から（Ｉｆ）の繰り返し単位を含むポリマーであって、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が水素であり；
Ａ１およびＡ２が、独立して、存在しない、または必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ５アルキレンである、ポリマー。
【請求項５】
請求項３に記載の式（Ｉａ）から（Ｉｆ）の繰り返し単位を含むポリマーであって、
Ｒ１およびＲ２が水素であり；
Ｒ３がメチルであり；
Ａ１およびＡ２が、独立して、存在しない、または必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ５アルキレンである、ポリマー。
【請求項６】
式（ＩＩ）の繰り返し単位を含む、請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
式（ＩＩ）の前記繰り返し単位において、
Ｙ２が直接結合であり；
Ｚが
【化３４】
2022501483.tif 000041
であり、好ましくは、−Ｂ（ＯＨ）２が環の３または４位にある、請求項６に記載のポリマー。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の繰り返し単位を含む、請求項１に記載のポリマー。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）の前記繰り返し単位において、
Ｙ２が直接結合であり；
Ｚが
【化３５】
2022501483.tif 000042
であり、好ましくは、−Ｂ（ＯＨ）２が環の３または４位にある、請求項８に記載のポリマー。
【請求項１０】
ａ）
【化３６】
2022501483.tif 000043
【化３７】
2022501483.tif 000044
【化３８】
2022501483.tif 000045
（式中、「ｍ」は、１から１００，０００の整数を表す）からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位、ならびに
ｂ）
【化３９】
2022501483.tif 000046
【化４０】
2022501483.tif 000047
【化４１】
2022501483.tif 000048
（式中、「ｎ」は、１から１００，０００の整数を表す）からなる群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位
を含むポリマー。
【請求項１１】
【化４２】
2022501483.tif 000049
【化４３】
2022501483.tif 000050
【化４４】
2022501483.tif 000051
【化４５】
2022501483.tif 000052
からなる群から選択されるポリマーであって、ただし、前記ポリマーが
【化４６】
2022501483.tif 000053
である場合、前記ポリマーは１００，０００を超える分子量を有さない、ポリマー。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか一項に記載のポリマーまたは
【化４７】
2022501483.tif 000054
および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、液剤、錠剤、カプレット剤またはカプセル剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、腸溶性コーティング錠剤、カプレット剤またはカプセル剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記腸溶性コーティング錠剤、カプレット剤またはカプセル剤が、十二指腸への標的送達のためのものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
被験体における代謝障害を処置するための方法であって、治療有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリマーまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
別の治療剤を、それを必要とする前記被験体に投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記代謝障害が、グルコース不耐症、Ｔ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭ、前糖尿病、高脂血症、肥満、体重過多、脂質異常症、高血圧症、高血糖症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝障害が２型真性糖尿病である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
被験体における胃腸障害を処置するための方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載の治療有効量のポリマーまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
米国成人人口の約１１．３％が２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を患い、米国成人の３５％が前糖尿病症状を有する。糖尿病に起因する米国の医療費は年間２，０００億ドルに迫りつつある。Ｔ２ＤＭの発生率は肥満の流行と並行して増加し続けており、Ｔ２ＤＭのための現在の処置の大部分は、経口および静脈内医薬のレジメンからなり、このレジメンは、その医薬の全身性吸収に伴い副作用が生じることが一つの理由で、多くの被験体にとって最適まで及ばない可能性がある。消化管から十二指腸をバイパスまたは除去するための肥満外科手術はＴ２ＤＭを改善することが示されている。糖尿病外科サミットでは、一部の肥満患者（グレードＩＩＩの肥満）におけるＴ２ＤＭを処置するために肥満外科手術を推奨しており、その肥満外科手術を他の患者の処置のために検討すべきであるとしている（例えば、Koliaki,  C.  et  al.,  BMC  Endocr  Disord.  (2017)  17:50  DOI  10.1186/s12902-017-0202-6を参照のこと）。
【０００２】
第一選択薬からインスリンならびに外科手術および他の高侵襲性処置までの典型的な糖尿病患者のパスの分析から、効果のない処置および臨床イナーシャに限らず、著しいギャップが明らかになっている。外科手術および薬理学的解決策も広く採用されることはなかった。専門臨床医がケアパスに加わったことが、これらの失敗の一因になっている。したがって、プライマリケア医の管理下での有効な処置が、専門医、例えば内分泌専門医、消化器専門医、または外科医を必要とするものよりも対象母集団のはるかに大きなセグメントに到達する可能性が高く、したがって、より大きな影響を与えるであろう。
【０００３】
米国特許出願公開第２００６／０１３４０６２号では、ある特定のアリールボロン酸部分が加水分解に不安定なリンカーを介してポリマー骨格に結合しているポリマー、およびリパーゼ阻害剤としてのそのようなポリマーの使用が開示されている。この場合、ポリマーコンジュゲートが低分子リパーゼ阻害剤を送達するために、ポリマー骨格はリパーゼ阻害に関しては重要ではないことが記載されている。Ｔ２ＤＭは検討されていない。
【０００４】
米国特許第７，９４３，７１３号では、ある特定のポリアミンボロン酸誘導体、ならびに紙の湿紙強度および湿潤強度を増加させるためのその使用が開示されている。好ましいポリマーは、ポリマー骨格の炭素原子に直接結合しているか、またはポリマー骨格の炭素原子にアミド結合を介して結合しているアリールボロン酸部分によって特徴付けられる。薬理学的使用は検討されていない。
【０００５】
国際公開第２０１７／０２４２３７号では、ある特定のカチオン性ポリマー、および粘液を複合体化して十二指腸に閉塞性バリアを形成するためのポリマーの使用が開示されている。
Seno,  M.  et.  al,  Materials  Science  and  Engineering  C,  62  (2016)  474-479では、フェニルボロン酸修飾ポリ（アリルアミン塩酸塩）およびポリ（pol）（ビニルアルコール）から構成されるある特定のｐＨおよび糖感受性多層フィルムが開示されている。Sato,  K.  et  al,  Langmuir,  2014,  30,  9247-9250でも、フェニルボロン酸修飾ポリ（アリルアミン塩酸塩）およびポリ（ビニルアルコール）から構成される多層フィルムが開示されている。
したがって、Ｔ２ＭＤおよび関連する代謝障害を呈する被験体を処置するための新規の医薬および非侵襲的方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１３４０６２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，９４３，７１３号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１７／０２４２３７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Koliaki,  C.  et  al.,  BMC  Endocr  Disord.  (2017)  17:50  DOI  10.1186/s12902-017-0202-6
【非特許文献２】Seno,  M.  et.  al,  Materials  Science  and  Engineering  C,  62  (2016)  474-479
【非特許文献３】Sato,  K.  et  al,  Langmuir,  2014,  30,  9247-9250
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、被験体の胃腸（ＧＩ）管の腸管内層と内腔内容物との間に物理的バリアを形成するためのポリマー組成物を提供する。本発明のポリマーはムチン相互作用剤であり、ＧＩ管内の常在ムチンとの相互作用によって物理的バリアを系中で形成する。
【０００９】
本発明者らは、ペンダントボロン酸部分をある特定のカチオン性ポリマーに組み込むと、ポリマーのムチン複合体化活性が劇的に改善されることを発見した。対照的に、ペンダントボロン酸部分を添加しても、中性またはアニオン性ポリマーのムチン複合体化活性は顕著に変化しなかった。
【００１０】
実施例で示すように、本明細書において記載するポリマーは、相当するカチオン性ポリマーと比較して、ムチンおよび粘液複合体化活性が改善されており、十二指腸のｐＨにおいてムチンおよび粘液を効果的に濃縮することができる。ポリマーは、十二指腸のｐＨにおいて粘液と強固に結合し、粘液に結合すると、高濃度の塩（例えば、１Ｍ  ＮａＣｌ）または酸性条件（例えば、０．０２Ｍ  ＨＣｌ）による除去に耐性を示す。得られたポリマー−粘液複合体は、遊離粘液と比較して劇的に異なる特性を有する。例えば、本明細書において示すように、ポリマーは、粘液中の小粒子の拡散係数を約２桁（約１／１００に）減少させる。糖尿病のラットモデルに投与された場合、ポリマーは、経口グルコース耐性試験において血中グルコースレベルを効果的に減少させ、血中グルコースレベルにおいて用量応答性の改善を示した。これらの結果は、消化管から十二指腸をバイパスまたは除去するための「代謝外科手術」が行われた患者において観察される、グルコースホメオスタシスの改善およびインスリン抵抗性の低下を再現しているが、外科手術または侵襲性内視鏡的手順とは異なり、本発明のポリマーは非侵襲的様式で容易に投与される。任意の特定の理論または機序に拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、ポリマーを経口で投与した場合に、十二指腸において粘液を複合体化して、閉塞性非吸収性内腔バリアを形成することが可能であることを実証する。十二指腸の閉塞性バリアの形成は、外科的または内視鏡的手順によって十二指腸をバイパス、除去、または切除することと機能的に類似しているかまたは同等であり、グルコースホメオスタシスの改善をもたらす（例えば、Koliaki,  C.  et  al.,  BMC  Endocr  Disord.  (2017)  17:50  DOI  10.1186/s12902-017-0202-6を参照のこと）。
【００１１】
本開示は、アミンまたはアミドまたはカルバメートまたはチオカルバメート結合官能基を介してポリマー骨格に直接的または間接的に結合されたペンダントボロン酸基を含有するカチオン性ポリマー、および代謝疾患を処置する方法であって、治療有効量のそのようなポリマーを、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明のポリマーを担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物である。医薬組成物は、例えば本明細書において記載する障害の処置における治療法のために使用してもよい。同様に、本発明は、本明細書において開示するポリマーの医薬としての使用、および本明細書において記載する障害を処置するための医薬の製造における本明細書において開示するポリマーの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ムチン複合体化アッセイを例示する。
【００１４】
【図２】図２は、ムチン通過遠心分離アッセイを例示する。
【００１５】
【図３】図３は、ムチン通過遠心分離アッセイを使用した、３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）と、中性（２−ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ＨＰＭＡ）、アニオン性（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ＡＭＰＳ）、およびカチオン性（（３−メタクリルアミド）プロピルアミン、ＭＡＰＡｎ）コモノマーとの共重合体の評価の結果を示すチャートである。評価した共重合体は、中性、アニオン性およびカチオン性モノマーと７．５％、１５％または３０％のＡＰＢＡとを含有していた。結果によって、ＡＰＢＡをカチオン性ポリマーに添加すると、ポリマーのムチン複合体化活性が劇的に改善されるが、アニオン性または中性ポリマーでは改善されなかったことが示される。
【００１６】
【図４】図４は、ムチン通過遠心分離アッセイを使用した、いくつかのカチオン性ポリマー、および３０％、２０％のＡＰＢＡを含有する対応する共重合体の評価の結果を示すチャートである。試験したポリマーは、ポリ（（３−メタクリルアミド）プロピルアミン（ＭＡＰＡｎ）、ＭＡＰＡｎ／ＡＰＢＡ（７０／３０）、ポリ（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム塩化物（ＡＰＴＡＣ）、ＡＰＴＡＣ／ＡＰＢＡ（７０／３０）、ポリ（３−アクリルアミドプロピル）ジメチルアミン（ＡＰＤＭＡｎ）、ＡＰＤＭＡｎ／ＡＰＢＡ（７０／３０）、ポリ４−ビニルピリジン（４−ＶＰｙ）、４−ＶＰｙ／ＡＰＢＡ（８０／２０）および１−ビニルイミダゾール（１−ＶＩ）、１−ＶＩ／ＡＰＢＡ（８０／２０）であった。結果によって、ＡＰＢＡを添加すると、各カチオン性ポリマーのムチン複合体化活性が強化されたことが示される。
【００１７】
【図５】図５は、４−カルボキシフェニルボロン酸（ＣＰＢＡ）で修飾されたポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＡｎ−ＨＣｌ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。ＮＭＲスペクトルによって、ポリマーが１６ｍｏｌ％の置換度を有することが示される。予想される不純物由来のＮＭＲシグナルは観察されなかった。
【００１８】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、対照およびポリマー処置群に関する研究８日目の経口グルコース耐性試験の結果をそれぞれ例示する。図６Ａは、グルコース投与後の各群からの１２０分にわたる血中グルコースレベルを示す。図６Ｂは、対照および処置群に関する血中グルコース曲線下増加面積における減少をそれぞれ比較している。
【００１９】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、対照およびポリマー処置群に関する研究３０日目の経口グルコース耐性試験の結果をそれぞれ例示する。図７Ａは、グルコース投与後の各群からの２１０分にわたる血中グルコースレベルを示す。図７Ｂは、対照および処置群に関する血中グルコース曲線下増加面積における減少をそれぞれ比較している。
【００２０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、対照およびポリマー処置群に関する研究３９日目の経口グルコース耐性試験の結果をそれぞれ例示する。図８Ａは、グルコース投与後の各群からの２４０分にわたる血中グルコースレベルを示す。図８Ｂは、対照および処置群に関する血中グルコース曲線下増加面積における減少をそれぞれ比較している。
【００２１】
【図９】図９は、対照およびポリマー処置群に関する研究４２日目のインスリン耐性試験の結果をそれぞれ例示する。
【００２２】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、対照およびポリマー処置群に関する研究４６日目の混合餌耐性試験の結果をそれぞれ例示する。図１０Ａは、グルコース投与後の各群からの１８０分にわたる血中グルコースレベルを示す。図１０Ｂは、対照および処置群に関する血中グルコース曲線下増加面積における減少をそれぞれ比較している。
【００２３】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、対照およびポリマー処置群に関する研究５２日目の経口グルコース耐性試験の結果をそれぞれ例示する。例示する全ての他の耐性試験において、処置用ポリマーはグルコース負荷の６０分前に与えられた。図１１で例示する研究に関しては、最後の前処置用量は、一晩絶食の前、グルコース負荷の１５時間前に与えられた。図１１Ａは、グルコース投与後の各群からの１２０分にわたる血中グルコースレベルを示す。図１１Ｂは、対照および処置群に関する血中グルコース曲線下増加面積における減少をそれぞれ比較している。
【００２４】
【図１２】図１２は、対照およびポリマー処置群に関する研究５５日目のインスリン耐性試験の結果をそれぞれ例示する。
【００２５】
【図１３】図１３は、対照およびポリマー処置群に関する６０日の慢性投薬研究が完了したＧＫラットに関する正規化された体重をそれぞれ例示する。
【００２６】
【図１４】図１４は、対照群に関する６０日の投薬研究が完了したＧＫラットに関する体重減少を例示する。
【００２７】
【図１５】図１５は、対照およびポリマー処置群に関する研究期間にわたる餌摂取量をそれぞれ比較している。
【００２８】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、慢性ＧＫ齧歯動物研究の１週目の後に行った代謝試験の結果を例示する。図１６Ａは、対照およびポリマー処置群に関する血中グルコースをそれぞれ比較している。図１６Ｂは、対照およびポリマー処置群に関するインスリンレベルをそれぞれ比較している。図１６Ｃは、それぞれ対照およびポリマー処置群に関するインスリン抵抗性の恒常性モデル評価である。
【００２９】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃは、慢性ＧＫ齧歯動物研究の８週目の後に行った代謝試験の結果を例示する。図１７Ａは、対照およびポリマー処置群に関する血中グルコースをそれぞれ比較している。図１７Ｂは、対照およびポリマー処置群に関するインスリンレベルをそれぞれ比較している。図１７Ｃは、それぞれ対照およびポリマー処置群に関するインスリン抵抗性の恒常性モデル評価である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本開示は、アミンまたはアミド結合を介してポリマー骨格に直接的または間接的に結合されたペンダントボロン酸基を含有するカチオン性ポリマーに関する。カチオン性ポリマーは、好ましくは、アミンまたはアンモニウム含有繰り返し単位を含み、必要に応じて他のカチオン性基、例えばイミダゾリル、ピリジニル、およびグアニジノを含有していてもよいポリカチオンである。本発明のカチオン性ボロン酸ポリマーは、カチオン性の繰り返し単位とボロン酸の繰り返し単位の両方を好ましくは含有する。一部の実施形態では、本発明のポリマーは、カチオン性基およびボロン酸基を含有する繰り返し単位を含有していてもよい。カチオン性ポリマーは、本明細書においてさらに記載するように、任意の所望の中性またはアニオン性の繰り返し単位も含有する共重合体であってもよく、ただし、ポリマーは正味のカチオン性電荷を保持する。
【００３１】
これらのポリマーを含む医薬組成物、ならびに代謝障害、例えば、２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、前糖尿病、高脂血症、肥満、体重過多、代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝および多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を処置するためのこれらのポリマーを使用した処置方法も開示する。
【００３２】
例示的なポリマーは、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のボロン酸部分含有繰り返し単位を含む。
【化１】
2022501483.tif 000003
【００３３】
式（Ｉ）から（ＩＩＩ）において：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルであり；
Ｙ１は、各出現において、独立して、直接結合または−Ｌ１−Ａ１−Ｌ２−Ａ２−であり；
Ｌ１は、各出現において、−ＮＲ９−、−ＮＣ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｎ−であり；
Ｌ２は、各出現において、存在しない、−ＮＲ９−、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｙ２は、各出現において、独立して、直接結合または−Ｌ３−Ａ１−Ｌ２−Ａ２−であり；
Ｌ３は、各出現において、−Ｃ（Ｏ）−である、または存在しない；
Ｌ２は、各出現において、存在しない、−ＮＲ９−、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ａ１およびＡ２は、各出現において、独立して、存在しない、または必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ５アルキレンであり；
Ｒ９は、各出現において独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルであり；
Ｚは、各出現において、
【化２】
2022501483.tif 000004
【化３】
2022501483.tif 000005
であり、
好ましくは−Ｂ（ＯＨ）２は、環の３または４位にあり；
ｎは１から１００，０００の整数であり、
ｍは０から４の整数である。
【００３４】
一部の好ましい態様では、ポリマーは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含有する。
【００３５】
式（Ｉ）の好ましい繰り返し単位は、式（Ｉａ）〜（Ｉｆ）の繰り返し単位を含む。
【化４】
2022501483.tif 000006
【化５】
2022501483.tif 000007
【００３６】
式（Ｉａ）から（Ｉｆ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ａ１、Ａ２およびｎは、式（Ｉ）で記載したとおりであり、好ましくは−Ｂ（ＯＨ）２は、環の３または４位にある。
【００３７】
一部の特定の例では、ポリマーは、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）または（Ｉｆ）の繰り返し単位を含み、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。
【００３８】
他の特定の例では、ポリマーは、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）または（Ｉｆ）の繰り返し単位を含み、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素であり、Ｒ３はアルキルであり、好ましくはＲ３はメチルである。
【００３９】
他の好ましい態様では、ポリマーは、式（ＩＩ）の繰り返し単位を含有する。式（ＩＩ）の繰り返し単位を含有するポリマーの一部の例では、Ｙ２は直接結合であり、Ｚは
【化６】
2022501483.tif 000008
であり、好ましくは−Ｂ（ＯＨ）２は、環の３または４位にある。
【００４０】
他の好ましい態様では、ポリマーは、式（ＩＩＩ）の繰り返し単位を含有する。式（ＩＩＩ）の繰り返し単位を含有するポリマーの一部の例では、Ｙ２は直接結合であり、Ｚは
【化７】
2022501483.tif 000009
であり、好ましくは−Ｂ（ＯＨ）２は、環の３または４位にある。
【００４１】
ポリマーはホモポリマーであってもよい。ホモポリマーの場合、ポリマーは、窒素含有繰り返し単位（例えばポリアミンまたはポリアミドである）を含有し、繰り返し単位の窒素原子を介してポリマー骨格に直接的または間接的に結合されたペンダントボロン酸部分を伴う。したがって、ポリマーは、ボロン酸部分が結合した第二級もしくは第三級アミン、または必要に応じて第四級アンモニウムを典型的には含有する。第二級または第三級アミンは、約ｐＨ５〜７でプロトン化され、カチオン性ポリマーを提供することになる。
【００４２】
好ましくは、ポリマーは、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つの繰り返し単位、１つまたは複数の他の繰り返し単位を含有する共重合体である。他の繰り返し単位は、好ましくは、カチオン性（例えば、窒素含有繰り返し単位）であるが、中性またはアニオン性であってもよく、ただし、ポリマーは全体的にカチオン性電荷を保持する。
【００４３】
ペンダントボロン酸部分を含むように修飾してもよい好ましい窒素含有繰り返し単位としては、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｎ）、ポリ（ジアリルアミン）（ＰＤＡＡｎ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリ（メタクリルアミドプロピルアミン）（ＰＭＡＰＡｎ）がある。
【００４４】
本明細書において開示するポリマーでは、繰り返し化学的単位のうちの少なくとも約５％は、ペンダントボロン酸基、例えば、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つの繰り返し単位を含有する。一部の場合では、ポリマー中の化学的繰り返し単位の実質的に全てが、ペンダントボロン酸基を含有する。好ましくは、繰り返し化学的単位のうちの約５％から約５０％、約５％から約４０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、または約５％から約１５％はペンダントボロン酸基を含有する。
【００４５】
ポリマー中に含むのに好適な窒素含有繰り返し単位は、当技術分野において周知であり、例えば、ポリビニルアミン、ポリ−Ｎ−アルキルビニルアミン、ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド（例えばポリメタクリルアミド）、ポリ−Ｎ−アルキルアクリルアミド、ポリアルキル−Ｎ−アルキルアクリルアミド、ポリアリルアミン、ポリ−Ｎ−アルキルアリルアミン、ポリジアリルアミン、ポリ−Ｎ−アルキルジアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリアミノスチレン、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジンなどがある。
【００４６】
アミノ窒素がプロトン化された場合、アミン含有繰り返し単位はカチオン性である。必要に応じて、カチオン特性は、公知の方法を使用して、例えばアミンをグアニジノ、ビグアニド、芳香族、例えばイミダゾリルおよびピリジニル、第四級アンモニウムに変換することによって、または追加のアミノ基を導入することによって、例えば、アミンをアルキルアミノもしくはアルキルアンモニウム基でアルキル化することによって変更してもよい。
【００４７】
ポリアミンは、典型的には、十二指腸のｐＨ（約ｐＨ５〜６）で高度に帯電するが、近接するプロトン化アミン部位の密度が高いことに起因して、これらは、摂取後、胃（ｐＨ約２）から十二指腸（ｐＨ約５）へ通過したときにわずかに脱プロトン化する。少量の中和でさえ、ポリマーの電荷密度は効果的に低下し、ｐＨが増加するにつれてこれらのポリマー鎖がよりコイル状になり、圧縮され、水和が不十分になることにつながる。理論に束縛されることを望むものではないが、このｐＨ応答性が、胃よりも十二指腸において粘液が優先的に複合体化する一因になると考えられる。十二指腸のｐＨ増加に応答し得る本発明の他のポリマーは、標準的なプロトン化脂肪族アミンのものよりも低いｐＫａ値をもたらす誘導的または構造的特徴を有するカチオン性の繰り返し単位（例えば、プロトン化アミンを伴う繰り返し単位）を含有する。これらのプロトン化ポリマーのｐＫａが低いことによって、胃から十二指腸への移動と一致するｐＨ増加に対する感度が高くなる。その結果、これらのタイプのポリマーは、近位十二指腸の緩い粘液と相互作用するように標的化することができ、そのポリマーとしては、プロトン化アミンから３炭素原子未満離れて、極性基、例えばヒドロキシル基で置換されたポリアミンがある。一部の実施形態では、ポリマーは、未修飾アミンよりも低いｐＫａを有するように修飾されたアミンを含む。例えば、カチオン性ポリマーは、９．０未満のｐＫａ値、より好ましくは８．０未満のｐＫａ、最も好ましくは７．０未満のまたはそれに等しいｐＫａを有していてもよい。
【００４８】
本明細書において記載するポリマー中に含むのに好適なボロン酸含有繰り返し単位としては、これらに限定されないが、例えば、以下を含む、式（Ｉ）、（Ｉａ）〜（Ｉｆ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の繰り返し単位がある：
【化８】
2022501483.tif 000010
【化９】
2022501483.tif 000011
（式中、「ｍ」は、１から１００，０００の整数を表す）。
【００４９】
好適な窒素含有カチオン性モノマーの繰り返し単位としては、これらに限定されないが、例えば、以下のものがある：
【化１０】
2022501483.tif 000012
【化１１】
2022501483.tif 000013
【化１２】
2022501483.tif 000014
（式中、「ｎ」は、１から１００，０００の整数を表す）。
【００５０】
必要に応じて、ペンダントボロン酸基を含有するカチオン性ポリマーは、疎水性基、例えば、ペンダント疎水性基も含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、疎水性基は、水よりもオクタノール中で（個別の化学物質として）溶解しやすい部分である。例えば、オクチル置換基は、オクタンが水中よりもオクタノール中で溶解しやすいために疎水性基である。好適な疎水性基は、例えば、１つまたは複数のヒドロキシ、ハロ、および／またはアリール（例えば、ベンジル）基で置換されていてもよいＣ６またはそれを超える直鎖状、分枝状または環式炭化水素である。
【００５１】
所望の場合、追加の繰り返し単位が本明細書において記載するポリマーに含まれていてもよく、ポリマーとしては、中性またはアニオン性の繰り返し単位、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキレングリコール、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスフェート、ポリビニルスルフェートなどがあり得る。
【００５２】
本開示のポリマーの特定の例としては、
【化１３】
2022501483.tif 000015
がある。
【００５３】
一部の実施形態では、以下の構造のポリマーが本発明の組成物のポリマーから除外される
【化１４】
2022501483.tif 000016
。ポリマーが
【化１５】
2022501483.tif 000017
である場合、ポリマーは１００，０００もしくは７５，０００もしくは５０，０００を超える分子量を有さないか；または構造
【化１６】
2022501483.tif 000018
のポリマーが本発明から除外される。
【００５４】
本開示のポリマーの追加の特定の例としては、
【化１７】
2022501483.tif 000019
【化１８】
2022501483.tif 000020
がある。
【００５５】
本開示のポリマーの追加の特定の例としては、
【化１９】
2022501483.tif 000021
がある。
【００５６】
本開示のポリマーの追加の特定の例としては、
【化２０】
2022501483.tif 000022
がある。
【００５７】
本開示のポリマーの追加の特定の例としては、
【化２１】
2022501483.tif 000023
【化２２】
2022501483.tif 000024
がある。
【００５８】
本発明の共重合体はさまざまな形態で存在していてもよい。好適な形態としては、ブロック共重合体、グラフト共重合体、櫛型共重合体、星型共重合体、デンドリマー、超分枝状共重合体、ランダム共重合体、勾配ブロック共重合体、および交互共重合体がある。
【００５９】
本開示はまた、ペンダント疎水性基を含有するカチオン性ポリマー、および本明細書において開示する代謝疾患を処置するためのそのようなポリマーの使用に関する。
【００６０】
好ましくは、本明細書において開示するポリマーは、被験体、例えばヒトに経口で投与した場合に、ポリマーが実質的に吸収されないように十分なサイズのものである。それを超えるとポリマーがＧＩ管から全身循環に吸収されない分子量の閾値は、特定のポリマーおよびＧＩ管中の条件ならびに他の因子に依存するが、１，０００Ｄａを超えるポリマーはＧＩ管から全身循環に実質的に吸収されないことが一般的に認識されている。したがって、ＧＩ管から実質的に吸収されない本発明の組成物は、１，０００Ｄａ、好ましくは５，０００Ｄａ、またはより好ましくは１０，０００Ｄａ未満のポリマー鎖を実質的に含まず、少なくとも約１０，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００から２５０，０００Ｄａの範囲、またはそれを超える平均分子量（Ｍｗ）を有する。本発明のポリマーは、ポリマー鎖長の分布を含有していてもよく、１．５〜４．０の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）を有していてもよいが、これらは、１，０００Ｄａ未満の材料を実質的に含有せず、好ましくはこれらは５，０００Ｄａ未満、またはより好ましくは１０，０００Ｄａ未満の材料を含有しない。
【００６１】
本発明のポリマーは溶解性であり、好ましくは架橋していない。一部の実施形態では、ポリマーは、わずかに架橋していてもよいが、溶解性を保持し、広範囲のネットワークまたはゲルは形成していない。
【００６２】
開示するポリマーの薬学的に許容される塩も本発明に含まれる。例えば、酸官能基を有するポリマーも、アニオン性の形態またはカチオンと組み合わせて共役塩基の形態で存在していてもよい。好適なカチオンとしては、アルカリ土類金属イオン、例えばナトリウムおよびカリウムイオン、アルカリ土類イオン、例えばカルシウムおよびマグネシウムイオン、ならびに非置換および置換（第一級、第二級、第三級および第四級）アンモニウムイオンがある。塩基性基、例えばアミンを有するポリマーもプロトン化されていてもよく、薬学的に許容される対アニオン、例えばハロゲン化物（Ｃｌ−およびＢｒ−）、ＣＨ３ＯＳＯ３−、ＨＳＯ４−、ＳＯ４２−、ＨＣＯ３−、ＣＯ３２−、ニトレート、水酸化物、ペルスルフェート、スルファイト、アセテート、ホルメート、スルフェート、ホスフェート、ラクテート、スクシネート、プロピオネート、オキサレート、ブチレート、アスコルベート、シトレート、ジヒドロゲンシトレート、タータレート、タウロコレート、グリココレート、コレート、ヒドロゲンシトレート、マレエート、ベンゾエート、フォレート、アミノ酸誘導体、ヌクレオチド、脂質、またはリン脂質を有する。同様に、アンモニウム基は、薬学的に許容される対イオンを含む。ボロン酸基は、アニオン、例えば水酸化ナトリウムもしくはカリウム、アルコキシドまたはカルボキシレートと反応して、塩、例えば−Ｂ−（ＯＨ）３Ｎａ＋、−Ｂ−（ＯＨ）３Ｋ＋、−Ｂ−（ＯＨ）２（ＯＣＨ３）Ｎａ＋、−Ｂ−（ＯＨ）２（ＯＣＨ３）Ｋ＋、−Ｂ−（ＯＨ）２（ＯＣＯＣＨ３）Ｎａ＋、−Ｂ−（ＯＨ）２（ＯＣＯＣＨ３）Ｋ＋などを形成することができる。
【００６３】
本明細書において開示するポリマーは、鎖長に一部の変動性を有するポリマー鎖の混合物として典型的には提供される。ポリマー鎖長のこの分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、およびマルチアングルレーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）のようなポリマーのモル質量を測定することができる検出器を使用して測定することができる。この方法によって、短い低分子量のポリマー鎖が存在しないことを確認することもできる。その方法は、多分散指数（ＰＤＩ）を提供することもでき、これは典型的には、比率Ｍｗ／Ｍｎ（Ｍｗは重量分率平均分子量であり、Ｍｎは数平均分子量である）であると考えられる。
ＰＤＩ＝Ｍｗ／Ｍｎ
【００６４】
Ｍｗ、ＭｎおよびＰＤＩの値は、ＳＥＣによって得ることができ、ＭＡＬＬＳ検出器で得ることが好ましい。標準的なフリーラジカルプロセスから作製された合成ポリマー材料に関しては、２を超える、さらには３を超えるＰＤＩ値が認められるのが一般的である。対照的に、リビングフリーラジカル重合プロセス、例えば原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）または可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）は、２未満、またはさらに１．５未満のＰＤＩを有する材料を生成することができる。
【００６５】
本明細書において開示するポリマーは、任意の好適な方法を使用して、例えば１つ、２つもしくはそれを超えるモノマーを直接重合させることによってまたはポリマー修飾によって調製することができる。
【００６６】
重合は、ポリマー合成の技術分野において公知の技術を使用して行ってもよい（例えば、Shalaby  et  al,  ed.,  Water-Soluble  Polymers,  American  Chemical  Society,  Washington,  D.C.  [1991]を参照のこと）。いくつかのカチオン性モノマーは、塩酸塩として入手可能であり、当技術分野において公知の方法によって、例えば、フリーラジカル付加プロセスを介して重合してもよい。この場合、重合混合物は、フリーラジカル開始剤を含む。好適なフリーラジカル開始剤としては、アゾビス（イソブチロニトリル）、アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、および過硫酸水素カリウムがある。他の好適な開始剤としては、電離放射線および紫外線光がある。フリーラジカル開始剤は、モノマーに対して約０．０１モルパーセントから約５モルパーセントの範囲の量で反応混合物中に好ましくは存在する。
【００６７】
ポリマー修飾アプローチはポリアミンを用い、共重合体アプローチはアクリルアミド誘導体を用いる。反応スキームにおける「Ｍ」はボロン酸部分を含む基を表す。
【００６８】
ポリアミンは、粘液相互作用剤、ならびにボロン酸基を用いた化学的修飾のための出発材料としての役割を果たすことができる。例示的なポリアミンとしては、ポリエチレンイミン、ヒドロキシエチル化ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｎ）およびその共重合体、ポリ（ジアリルアミン）（ＰＤＡＡｎ）およびその共重合体、ポリ（ビニルアミン）およびその共重合体、ポリ（ビニルイミダゾール）およびその共重合体、ポリ（ビニルピリジン）およびその共重合体、ポリ（ビニルアニリン）およびその共重合体、アミン含有アクリルアミドとメタクリルアミドとの共重合体などがある。好ましいポリアミンとしては、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｎ）、ポリ（ジアリルアミン）（ＰＤＡＡｎ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリ（メタクリルアミドプロピルアミン）（ＰＭＡＰＡｎ）がある。
【００６９】
ポリアミン誘導体は、ＥＤＣカップリングを使用したアミド形成化学によるポリアミンの化学的修飾から得ることができる（スキーム１）。
【化２３】
2022501483.tif 000025
スキーム１：ＥＤＣをカップリング試薬として使用した、ポリアミンとカルボン酸とのアミド形成反応。
【００７０】
例えば、１％ｗｔ／ｖｏｌの所望のポリアミンは、ｐＨが５．０に調整された脱イオン水中で調製してもよい。エタノールまたは他の好適な有機物を、最初のポリマー溶液体積の５０％でポリマー溶液に添加する。カップリングされることになるＭ−カルボン酸を、最初のポリマー溶液体積の２５％で水に入れて、溶液またはスラリーを形成する。ＥＤＣカップリング剤を、最初のポリマー溶液体積の２５％でエタノールまたは他の好適な溶媒中に溶解する。次いでＥＤＣ溶液を、Ｍ−カルボン酸溶液またはスラリーと混合する。合わせたＥＤＣ／Ｍ−カルボン酸溶液を、ピペットまたは等圧滴下漏斗によっておよそ１０分かけてポリマー溶液に滴下して添加する。反応溶液は、約０．５％ｗｔ／ｖｏｌのポリマーと、約６２％ｖｏｌの水および約３８％ｖｏｌのエタノールまたは他の好適な有機溶媒とを含有する。反応物を撹拌し、ｐＨを５．０に維持する。ｐＨを５．０に安定化させながら、反応物を室温で約１８時間撹拌する。ポリマーを過剰な（体積の３倍の）アセトンで沈殿させる。
【００７１】
ポリアミン誘導体は、マイケル付加反応によってポリアミンの化学的修飾から得ることができる。ポリアミンは求核剤であり、アクリルアミドはマイケルアクセプターである（スキーム２）。
【化２４】
2022501483.tif 000026
スキーム２：ポリアミン求核剤とアクリルアミドマイケルアクセプターとのマイケル付加反応。
【００７２】
例えば、１％ｗｔ／ｖｏｌの所望のポリアミンを、脱イオン水中で調製し、ｐＨを８．５に調整する。このｐＨは、所望する修飾のレベルに応じて増加させても低下させてもよい。所望のＭ−アクリルアミドを、最初のポリマー溶液体積の２０％でエタノールまたは他の好適な溶媒中に溶解する。次いで、アクリルアミド溶液をポリマー溶液に添加して、約０．８３％ｗｔ／ｖｏｌのポリマーと約８３％ｖｏｌの水および約１７％ｖｏｌエタノールまたは他の好適な溶媒とを含む反応混合物を形成する。反応混合物を７０℃に加熱し、４８時間撹拌する。ポリマーを過剰な（体積の３倍の）アセトンで沈殿させる。
【００７３】
ポリアミン誘導体は、エポキシド開環化学を使用したヒドロキシアルキル化によってポリアミンの化学的修飾から得ることができる（スキーム３）。
【化２５】
2022501483.tif 000027
スキーム３：ポリアミンとエポキシドとの反応。
【００７４】
例えば、２％ｗｔ／ｖｏｌの所望のポリアミンを脱イオン水中で調製し、ｐＨを６．０に調整する。このｐＨは、所望する修飾のレベルに応じて増加させても低下させてもよい。所望のＭ−エポキシドを、最初のポリマー溶液体積の１００％で水／エタノール（２５％／７５％）中に溶解する。次いで、この溶液をポリマー溶液に添加して、ポリマーが約１％ｗｔ／ｖｏｌであり、約６２％ｖｏｌの水および約３８％ｖｏｌのエタノールを含む反応溶液を調製する。反応混合物を６０℃で４８時間加熱した。エポキシドが６０℃で完全な溶液ではない場合、少量の追加のエタノールを添加して溶解を補助してもよい。ポリマーを過剰な（体積の３倍の）アセトンで沈殿させる。
【００７５】
ポリアクリルアミド誘導体は、例えば、３−アクリルアミドプロピルアミンと所望のＭ−アクリレートまたはＭ−アクリルアミドとの重合によって得ることができる（スキーム４）。
【化２６】
2022501483.tif 000028
スキーム４：アクリルアミドとアクリレートとの反応。
【００７６】
例えば、所望の量の所望のＭ−アクリレートまたはＭ−アクリルアミドモノマーを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れる。所望のＭ−アクリレートまたはＭ−アクリルアミドモノマーを、ジメチルホルムアミドまたは他の好適な水混和性有機溶媒中に溶解する。次いで、所望の量のカチオン性、中性またはアニオン性コモノマーを添加する。２成分溶媒系中に帯電したコモノマーを十分に溶解するために少量の水が必要になる可能性があるであろう。適切な量のＡＩＢＮ開始剤を添加する。コモノマー溶液を少なくとも約１５分間Ｎ２（ｇ）パージする。次いで、反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱する。数時間加熱した後、共重合体溶液または懸濁液をアセトンから沈殿することによって単離する。アセトン中で沈殿を促進するために、いくらかの水を添加し、調整してｐＨを低下させることが一部のポリマーに必要であろう。最終的に、生成物を脱イオン水中に溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥してもよい。
【００７７】
例で示すように、本明細書において記載するポリマーは、相当するカチオン性ポリマーと比較して粘液複合体化活性を改善し、十二指腸のｐＨにおいて粘液を効果的に濃縮することができる。ポリマーは、十二指腸のｐＨにおいて粘液と強固に結合し、粘液に結合すると、高濃度の塩（例えば、１Ｍ  ＮａＣｌ）または酸性条件（例えば、０．０２Ｍ  ＨＣｌ）による除去に耐性を示す。得られたポリマー−粘液複合体は遊離粘液と比較して劇的に異なる特性を有する。例えば、本明細書において示すように、ポリマーは、粘液中の小粒子の拡散係数を約２桁（約１／１００に）減少させる。糖尿病のラットモデルに投与した場合、ポリマーは、経口グルコース耐性試験において血中グルコースレベルを効果的に減少させ、血中グルコースレベルにおいて用量応答性の改善を示した。これらの結果は、消化管から十二指腸をバイパスまたは除去するための「代謝外科手術」が行われた患者において観察される、グルコースホメオスタシスの改善およびインスリン抵抗性の低下を再現しているが、外科手術または侵襲性内視鏡的手順とは異なり、本発明のポリマーは、非侵襲的様式で容易に投与される。任意の特定の理論または機序に拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、ポリマーを経口で投与した場合に、十二指腸において粘液を複合体化することを可能にし、閉塞性非吸収性内腔バリアを形成することを実証する。十二指腸の閉塞性バリアの形成は、外科的または内視鏡的手順によって十二指腸をバイパス、除去、または切除することと機能的に類似しているかまたは同等であり、グルコースホメオスタシスの改善をもたらす（例えば、Koliaki,  C.  et  al.,  BMC  Endocr  Disord.  (2017)  17:50  DOI  10.1186/s12902-017-0202-6を参照のこと）。
【００７８】
したがって、一部の態様では、本発明は、被験体の胃腸（ＧＩ）管の腸管内層と内腔内容物との間に物理的バリアを適用するための方法を提供する。方法は、治療有効量の本明細書において記載するポリマーを被験体のＧＩ管に投与することを含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「物理的バリア」または「内腔バリア」という用語は、腸管内のポリマー−粘液複合体の下に位置する粘膜上皮に糜粥が接触するのを阻止または減少させるポリマーと粘液との複合体を指す。物理的バリアは、ポリマーが、腸壁を覆う粘液に含有されるアニオン性ムチンと系中で結合した場合に生成される。物理的バリアは実質的に完全であっても部分的であってもよい。実質的に完全な物理的バリアは、標的領域、例えば近位十二指腸の上皮内層全体を実質的に覆うように広がる。部分的な物理的バリアは、標的領域の一部、例えば十二指腸の上皮内層の一部を覆うように広がる。例えば、部分的バリアは、標的部位において、上皮の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％またはそれを超えて覆っていてもよい。
【００８０】
部分的な物理的バリアは、不連続で空間的に分布していてもよく、さまざまな程度の透過性を有していてもよい。例えば、物理的バリアは、ポリマーと腸内腔表面上の、好ましくは十二指腸内の粘液またはムチンとの半透過性複合体であってもよい。
【００８１】
実施形態では、物理的バリアまたはその製剤は、被験体の自然な消化プロセスを通過する。さらに他の実施形態では、物理的バリアは、液体または溶媒を摂取することによって除去可能であるかまたは元に戻すことができる。
【００８２】
本明細書において記載するポリマーは、粘液およびムチンと強固に結合して、解離（例えば、高濃度の塩および低いｐＨによる）に耐性を示すポリマー−粘液複合体を形成する。したがって、一度形成されると、物理的バリアは、典型的には、「保持期間」または「滞留時間」の間は存在することになり、消化系の天然の作用によって除去される。典型的な保持期間は約３０分から約７日の範囲であってもよく、約１時間から約３時間、約１時間から約５時間、約１時間から約２４時間、約１から約３日などの範囲の時間を含む。
【００８３】
所望の滞留時間は、臨床用途によって変化してもよく、投与するポリマーの量、ならびに頻度および投与間隔に基づいて調整してもよい。例えば、Ｔ２ＤＭを呈する被験体の最大５０％は胃不全麻痺または胃排出遅延を有し、前糖尿病または非糖尿病肥満被験体よりも長時間にわたって定位置に維持されるような粘膜付着性内層が必要となる場合がある。血中グルコースレベルは、食事をしてから最初の２時間以内に急上昇することが多く、大部分は最初の６０分以内であることが多く；したがって、一実施形態では、内層は最低６０分間付着するべきである。別の実施形態では、医薬を毎食前に摂取しない可能性があり、したがって処置に適合しない可能性があり、その行動を変える必要があるであろう前糖尿病被験体の場合、より長時間持続する粘膜付着性内層が必要な場合がある。本出願において、内層は、最低６〜８時間付着してもよく、最大２４時間必要な場合がある。滞留時間は、ポリマーが最も親和性を発現する粘液層によっても影響を受けるであろう。例えば、表面の緩い付着性層は、分から時間単位で脱落するが、深く固い付着性層に対する親和性は、より長時間持続する粘膜付着性のコーティングをもたらすであろう。全体的に、滞留時間は、本開示において概説する実施形態におけるさまざまな臨床的および技術的考察に合わせてもよい。
【００８４】
本発明のポリマーは、近位腸、特に十二指腸内に閉塞性バリア層を形成することができる。好ましくは、閉塞性バリアは、近位十二指腸または十二指腸球部内に形成される。その結果ポリマーは、胃から放出され、近位十二指腸に入るとすぐにバリア層を完全に形成することができる。
【００８５】
ポリマーは、任意の好適な投薬形態で経口投与される。経口投与に好適なさまざまな投薬形態が当技術分野において周知であり、液体製剤（例えば、液剤、懸濁剤、スラリー剤、シロップ剤）、ゲル剤、軟膏剤、散剤、錠剤、カプレット剤、カプセル剤などを含む。
【００８６】
１つの例では、ポリマーは液体形態で投与してもよく、典型的には、胃内で十分に安定で溶解性であり、活性状態で十二指腸への即時送達を可能にし、さらなる膨潤、可溶化、または周囲の環境との平衡化を必要としない。本明細書において記載するポリマーは、典型的にはポリアミンであり、これは強酸性の胃（ｐＨ約２）から十二指腸（ｐＨ約５）へ移動するときにある程度の脱プロトン化を受け、これがポリマーの複合体化活性を十二指腸に対して標的化する。しかし、ポリマーは、胃内でバリア層を形成する場合もある。
【００８７】
他の例では、ポリマーは、胃内で水和することができる固体形態で投与される。固体形態は、ゆっくりと溶解するように製剤化してもよく、これはポリマーを胃の酸性度から保護することができるが、ポリマーを完全な活性状態で近位十二指腸に侵入させる。他の例では、ポリマーは、腸溶性コーティング錠剤、カプレット剤、カプセル剤の形態またはポリマーを胃の酸性度から保護するための他の腸溶性コーティング投薬形態で投与される。そのような例では、腸溶性コーティングは、幽門弁を通過した後または通過中に（ｐＨがｐＨ約２から増加した場合に）、できるだけ早く溶解または分解し、ポリマーの即時放出を可能にするように製剤化される。そのような投薬形態は、腸管内の、例えば近位十二指腸の所望の部位でポリマーの即時放出を促進するための超崩壊剤を含んでいてもよい。好適な超崩壊賦形剤は当技術分野において周知である（例えば、Mohanachandran,  P.S.  et  al,  Superdisintegrants:  An  Overview,  Int.  J.  Pharma.  Sci.  Review  and  Research,  (2011)  6:1  pp  105-109を参照のこと）。例えば、十二指腸への送達を標的化することができる腸溶性カプセル剤は、文献に記載されている（例えば、Reix  N.  et  al.  Intl  J  Pharm  (2012)  422:1-2  pp.  338-340を参照のこと）。
【００８８】
本発明のポリマーは、経口投与後に、胃内、十二指腸内または他の粘膜表面上で素早く溶解することができる。
【００８９】
一部の態様では、本発明のポリマーの医薬製剤は、カルシウム塩、例えば塩化カルシウムまたはクエン酸カルシウムを必要に応じて含むことができる。物理的バリアの形成は、カルシウム塩の存在下で促進することができると考えられている。
【００９０】
必要に応じて、ポリマーは、内視鏡、経鼻栄養管、経口栄養管、または同様のデバイスを介して被験体の胃腸管に投与してもよい。ポリマーは、所望の作用部位において粘膜上に噴霧することもでき、例えば、噴霧は内視鏡的に行うことができる。
【００９１】
治療目的のために、ポリマーの「治療有効量」が投与される。治療有効量は、本明細書で使用される場合、臨床応答を含む所望の応答に投与条件下で影響を与えるのに十分な量である。治療有効量は、例えば、グルコースホメオスタシスを改善し、インスリン抵抗性を減少させ、体重減少をもたらし、ならびに／またはＴ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭもしくは他の代謝障害の他の徴候および／もしくは症状、例えば高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝臓ならびに他の状態、例えば肥満および体重過多を改善するのに十分なものであってもよい。例えば、治療有効量は、血中グルコースレベルを低下させるのにおよび／またはＨｂＡ１Ｃを減少させるのに十分な量とすることができる。
【００９２】
投与される正確な量は、年齢、体重、性別、処置されることになる特定の状態およびその重症度、薬物に対する感受性、ならびに被験体の健康全般を含むいくつかの公知の要件に依存することになる。熟練した臨床医であれば、これらおよび他の要件に基づいて投与するのに適切な量を決定することができる。典型的には、１用量当たり１から５錠／カプセルを投与し、それぞれのサイズは０または０Ｅまたは００または００Ｅまたは０００である。用量は、１日当たり１、２、３または４回投与してもよい。投薬のタイミングは基本的な適応に基づくことになる。好ましくは、用量は、代謝状態の処置のために、食事の少なくとも５、１０、１５、３０または６０分前および食事前の１２時間以内に投与される。他の適応に関しては、食事の直前または食事と一緒に投薬するのが好ましい場合がある。
【００９３】
本明細書で使用される場合、および当技術分野においてよく理解されているように、「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床結果としては、これらに限定されるものではないが、検出可能か不可能かにかかわらず、１つまたは複数の症状または状態の緩和または改善、疾患または苦痛の程度の減少、疾患または苦痛の安定化された（すなわち、悪化していない）状況、疾患または苦痛の拡大の阻止、疾患または苦痛の進行の遅延または鈍化、疾患または苦痛の状況の改善または緩和、および寛解（部分的か全体的かにかかわらず）があり得る。「処置」は、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味する場合もある。
【００９４】
本開示は、本明細書において開示する治療有効量のポリマーを、それを必要とする被験体に投与することによって代謝疾患を処置する方法に関する。方法を使用して処置することができる代謝疾患としては、例えば、グルコース不耐症（glucose  intolerance）、Ｔ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭ、前糖尿病、高脂血症、肥満、体重過多、肥満、脂質異常症、高血圧症、高血糖症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）および多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）がある。
【００９５】
本開示はまた、本明細書において開示する治療有効量のポリマーを、それを必要とする被験体に投与することによって胃腸障害を処置する方法に関する。方法を使用して処置することができる胃腸障害としては、例えば、セリアック疾患、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、結腸炎、クロストリジウム・ディフィシル（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、内毒素血症、下痢および便秘がある。
【００９６】
本発明の方法は、リーキーガット症候群および関連する状態の対処においても有用である。リーキーガット症候群は、上皮に密接な連結の変化／損傷に起因して腸の透過性が増加し、その結果上皮バリア機能が損なわれる状態を説明する技術用語である。この障害を受けたバリアは、管腔内巨大分子および抗原のための導管として作用して、腸壁を通過させ、炎症性の免疫学的反応を引き起こし、それがさまざまな健康状態をもたらす。例えば、リーキーガット症候群はＩＢＳ（過敏性腸症候群）に関与している。食品中のある特定のタンパク質は、免疫応答を誘発する抗原としてふるまう場合がある。例えば、セリアック疾患では、グルテンが上皮と接触することを阻止すると免疫学的応答が減少する場合がある。リーキーガットは、炎症性腸疾患（クローン疾患、潰瘍性結腸炎）などの他の免疫学的状態にも関与している。腸のバリアが強化されると、胃腸管内でエンドトキシンの吸収を低下させることができる。これらのエンドトキシンの一部は、正常な細菌性代謝／分解の結果であるかまたは細菌性異常増殖に起因する。これは肝機能障害患者に特に関連しており、例えば、肝硬変では、その患者においてエンドトキシンが肝臓によって代謝（無毒化）されず、脳機能障害をもたらす（肝性脳症と称される）。したがって、本明細書において記載する方法は、腸のバリア特性を強化するために使用することができ、肝性脳症を処置するまたはその発生を減少させることができる。尿毒症は、腸のバリア機能の障害と関連する別の状態であり、これは本明細書において記載する方法を使用して処置または減少させることができる。同様に、進行した慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を呈する患者において腸の透過性が高いことが臨床的エビデンスによって実証されているため、本明細書において記載する方法は、ＣＫＤを処置するまたはその発生を減少させるために使用することができる。
【００９７】
治療方法は、さまざまな障害と関連する臨床的バイオマーカーを減少させること、例えば、全身性炎症、酸化的ストレスおよび高尿酸症を減少させることによって利益を提供することもできる。
【００９８】
開示するポリマーは、薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝剤または希釈剤を含む医薬組成物の形態で被験体に投与してもよい。
【００９９】
経口投与に関しては、本発明の医薬組成物は、投薬形態、例えばカプセル剤、錠剤、カプレット剤、散剤、顆粒剤、ゲル剤、懸濁剤、液剤または他の好適な投薬形態で示していてもよい。カプセル剤は、ゼラチン、ソフトゲルまたは固形であってもよい。錠剤、カプレットおよびカプセル製剤は、１つまたは複数のアジュバント、結合剤、希釈剤、崩壊剤、賦形剤、フィラー、または滑沢剤をさらに含有していてもよく、これらは当技術分野においてそれぞれ公知である。そのようなものの例としては、炭水化物、例えばラクトースまたはスクロース、無水リン酸水素カルシウム、コーンスターチ、マンニトール、キシリトール、セルロースまたはその誘導体、微結晶性セルロース、ゼラチン、ステアレート、二酸化ケイ素、タルク、デンプングリコール酸ナトリウム、アカシア、香味剤、保存料、緩衝剤、崩壊剤、および着色料がある。
【０１００】
経口で投与する組成物は、薬学的に味の良い調製物を提供するために、１つまたは複数の必要に応じた薬剤、例えば、甘味剤、例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー；着色剤；および保存剤を含有する場合がある。経口投与に好適な医薬製剤およびそれを調製するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,  twentieth  edition,  2000を参照されたい。
【０１０１】
経口で使用してもよい医薬調製物としては、好適な材料、例えばゼラチンで作製されたプッシュフィットカプセル剤、ならびに好適な材料、例えば、ゼラチン、および可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールで作製された密封軟カプセルがある。プッシュフィットカプセル剤は、フィラー、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または滑沢剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム、および必要に応じて安定化剤と混合された活性成分も含有していてもよい。軟カプセルでは、活性化合物は、好適な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁してもよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に好適な投薬量でなければならない。組成物を封入する（例えば、硬ゼラチンまたはシクロデキストランのコーティング中に）ための方法は当技術分野において公知である（Baker,  et  al.,  "Controlled  Release  of  Biological  Active  Agents",  John  Wiley  and  Sons,  1986）。
【０１０２】
本発明の方法は、プロバイオティクスを含むポリマー組成物の共配合製剤を含む。プロバイオティクス製剤は、腸管内に有益なプロバイオティクス細菌を構築するのを補助する。プロバイオティクスは、糖尿病を呈する被験体において血糖、ＨｂＡ１ｃ、インスリンレベルおよびインスリン抵抗性の低下に顕著に効果を与えることは当技術分野において公知である。好適なプロバイオティクスとしては、これらに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．がある。プロバイオティクスを含有する製剤を調製するための方法は当技術分野において周知である。
【０１０３】
必要に応じて、本明細書において記載する治療方法は、ポリマー組成物と１つまたは複数の追加の治療剤とを共投与することを含んでいてもよい。糖尿病を呈する被験体における共投与のための治療剤としては、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ−２阻害剤、グルコシダーゼ阻害剤、インスリン、メトホルミン、スルホニル尿素およびチアゾリデンジオンのクラスの薬物があり得る。
【０１０４】
特定の例では、追加の治療剤は、糖尿病（１型および／または２型）、前糖尿病、高血糖症、耐糖能障害またはインスリン抵抗性の処置に適応される１つまたは複数の薬剤である。そのような薬剤としては、ビグアニド（例えば、メトホルミン）、スルホニル尿素（例えば、リメピリド、グリクラジド、ギルピジド、グリメピリド、トルブタミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリキドン、およびグリクロピラミド）、メグリニチニド（例えば、レパグリニドおよびナテグリニド）；チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボースおよびミグリトール）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤（例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、およびリナグリプチン）、ＧＬＰ−１類似体（例えば、エクセナチド、リキシセナチド、デュラグルチド、およびリラグルチド）、ナトリウム−グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ダパグリフロジン、ガナグリフロジン、およびエンパグリフロジン）、アミリン模倣体（例えば、プラムリニチド）、Ｄ２−ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン）、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレセベラム、コレスチラン、およびコレスチミド）、およびインスリン（例えば、ヒトインスリン、インスリングルリシン、インスリンリスプロ、インスリンイソファンヒト、インスリン亜鉛懸濁液混合ウシ、インスリンプロタミン亜鉛ウシ、インスリンイソファンブタ、インスリンイソファンヒトなど）がある。
【０１０５】
併用療法は、単独療法を上回るいくつかの利点を提供することができる。例えば、ポリマーおよび追加の治療剤を投与すると、所望の効果に必要な追加の治療剤の有効性を強化し、および／または量を減少させる場合がある。したがって、追加の治療剤の不所望の副作用を減少させるかまたは消失させる場合がある。さらに、本発明のポリマーおよび追加の治療薬は、単独療法としての各薬剤と比較して優れた治療法を提供することができ、併用療法は、相加または相乗効果を提供することができる。
【０１０６】
ここで開示される方法によって処置することになる被験体は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。好適な被験体としては、これらに限定されないが、霊長目、例えば、ヒト、サル、猿人類など；ウシ、例えば、畜牛、雄牛など；ヒツジ、例えば、羊など；ヤギ、例えば、山羊など；ブタ、例えば、豚、雄豚など；ウマ、例えば、馬、ロバ、シマウマなど；野生のおよび飼い猫を含むネコ；犬を含むイヌ；兎、野兎などを含むウサギ；およびマウス、ラットなどを含む齧歯動物を含む哺乳動物がある。好ましくは、被験体は、これらに限定されないが、胎児、新生児、乳児、若年、および成人を含むヒトである。
【０１０７】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願において使用する場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば「被験体（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明らかにそれとは逆である場合（例えば、複数の被験体）などを除いて、複数の被験体を含む。
【０１０８】
本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈上別段の必要がある場合を除いて、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、リスト内の項目の列挙が、挙げられた項目に置換または追加することができる他の類似の項目を除外しないように非限定的であることを意図する。
【０１０９】
本明細書において特定の用語が用いられるが、これらは一般的なかつ説明的な意味のみで使用されており、限定を目的としない。特に定義されない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、ここで記載する主題が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０１１０】
「約」という用語は、値について言及する場合、±２０％または±１０を意味する。さらに、「約」という用語は、１つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用される場合、全てのそのような数を指し、範囲内の全ての数を含むことを理解するべきであり、示される数値の上限および下限を拡大することによってその範囲を変更する。両端による数値範囲の記載には、その範囲内に含まれる全ての数、例えばこれらの端数を含む整数全体（例えば、１から５の列挙には、１、２、３、４、および５、ならびにこれらの端数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などが含まれる）およびその範囲内の任意の範囲が含まれる。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、典型的には、１から約６個の炭素原子を含有する一価の脂肪族炭化水素を指す。アルキル基は、直鎖状鎖、分枝状鎖、単環式部分もしくは多環式部分またはこれらの組合せであってもよい。アルキル基に好適な置換基としては、アリール、−ＯＨ、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉおよび−Ｆ）、−Ｏ（Ｒ’）、−Ｏ−ＣＯ−（Ｒ’）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＯＯ（Ｒ’）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｒ’）、−ＣＯＮ（Ｒ’）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＳＨおよび−Ｓ（Ｒ’）がある。各Ｒ’は、独立して、アルキル基またはアリール基である。置換アルキル基は、１つを超える置換基を有していてもよい。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル（norbornl）などがある。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「アルキレン」という用語は、必要に応じて置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｘ−（式中、ｘは１から５の間の整数である）を指す。好ましくは、ｘは１から３の間、より好ましくはｘは１または２である。アルキレン基に好適な置換基はアルキル基に好適なものと同一である。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式−Ｏ−アルキルの基を指す。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシ）、ｔｅｒｔ−ブトキシなどがある。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、環原子の全てが炭素であり、置換されていても置換されていなくてもよい、３〜７個の環原子を有する安定な芳香族単環式環系を指す。アリール置換基としては、−ＯＨ、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉおよび−Ｆ）、−Ｏ（Ｒ’）、−Ｏ−ＣＯ−（Ｒ’）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＯＯ（Ｒ’）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｒ’）、−ＣＯＮ（Ｒ’）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＳＨおよび−Ｓ（Ｒ’）がある。各Ｒ’は、独立して、アルキル基である。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「アリールオキシ」という用語は、式−Ｏ−アリールの基を指す。アリール基は必要に応じて置換されていてもよい。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」という用語は、式−ＯＨの基を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ハロ」または「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」という句は、置換されていないかまたは置換されていることを意味する。本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、水素原子が除去され、置換基で置き換えられたことを意味する。所与の原子における置換は、原子価によって制限されることを理解されたい。
【０１１９】
以下の例は、本発明の実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらは、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を代替で使用してもよい。
【実施例】
【０１２０】
Ｉ．合成：
（実施例１）
ポリ（アリルアミン塩酸塩）／ＰＡＡｎ−ＨＣｌの合成：アリルアミン２６．２８ｍｌを磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた２５０ｍｌの２首丸底フラスコの場所に入れた。温度を、氷浴を用いて５℃未満にした。３７ｗｔ％ＨＣｌ  ２８．７４ｍｌを等圧滴下漏斗に入れた。ＨＣｌを、温度が３５℃を超えないようにＮ２（ｇ）下で９０分にわたってゆっくりと添加した。脱イオン水１１．０ｍｌを添加して、アリルアミン塩酸塩の５０ｗｔ％溶液を作製した。公称の量の３７ｗｔ％ＨＣｌを添加して、溶液のｐＨを２．６０に低下させた。次いでＶ５０開始剤３２８ｍｇ（１ｗｔ％）を固形のまま添加した。モノマー溶液を約３０分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物を、Ｎ２（ｇ）下、６０℃で２４時間加熱した。粘性反応混合物をＭＷＣＯ：６ｋから８ｋのセルロース透析膜に入れ、何回か水を交換しながら２から３日にわたって透析した。透析した溶液を１μｍフィルターに通し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１２．７９ｇであった。
【０１２１】
（実施例２）
ＰＡＡｎ−４ＣＰＢＡアミド（高置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２．０５ｇおよび脱イオン水２００ｍｌを、磁気撹拌を備えた５００ｍｌの１つ首丸底フラスコに入れた。エタノール１００ｍｌを添加した。４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）２．８３ｇおよび脱イオン水５０ｍｌを含むスラリー、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  ３．２７ｇおよび変性エタノール５０ｍｌを含む溶液を個別に作製した。４ＣＰＢＡおよびＥＤＣ溶液を大部分が溶解するまで約５分一緒に混合した。「４ＣＰＢＡ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約５分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、続いてＭＷＣＯ：３．５ｋセルロース膜で何回か水を交換しながら２から３日にわたって透析した。透析した溶液を１μｍフィルターに通し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として２．５２ｇであった。
【０１２２】
（実施例３）
ＰＡＡｎ−４ＣＰＢＡアミド（低置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２．０８ｇおよび脱イオン水２５０ｍｌを、磁気撹拌を備えた５００ｍｌの１つ首丸底フラスコに入れた。エタノール５０ｍｌを添加した。４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）１．４１ｇおよび変性エタノール５０ｍｌを含むスラリー、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  １．５９ｇおよび変性エタノール５０ｍｌを含む溶液を個別に作製した。４ＣＰＢＡおよびＥＤＣ溶液を大部分が溶解するまで約５分一緒に混合した。「４ＣＰＢＡ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約５分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、続いてＭＷＣＯ：３．５ｋセルロース膜で何回か水を交換しながら２から３日にわたって透析した。透析した溶液を１μｍフィルターに通し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として２．０４ｇであった。
【０１２３】
（実施例４）
グリシドールで修飾されたＰＡＡｎ−４ＣＰＢＡアミド（高置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）−４ＣＰＢＡ（高置換度）１００ｍｇおよび脱イオン水１０ｍｌを、磁気撹拌を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れた。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨを用いて８．０に調整した。反応物を６０℃に加熱した。グリシドール６２．６μｌを添加し、４８時間加熱した。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１１９ｍｇであった。
【０１２４】
（実施例５）
ＰＡＡｎ−４ＣＰＢＡアミド（高置換度）のグアニジニル化：ポリ（アリルアミン塩酸塩）−４ＣＰＢＡ（高ＤＳ）１００ｍｇおよび脱イオン水１０ｍｌを、磁気撹拌を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れた。ピラゾールカルボキサミジン−ＨＣｌ  ９２．３ｍｇを添加した。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨを用いて８．０に調整した。反応物を４５℃に４８時間加熱した。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１００ｍｇであった。
【０１２５】
（実施例６）
ＰＡＡｎ−４ＣＰＢＡアミド（低置換度）のグアニジニル化：ポリ（アリルアミン塩酸塩）−４ＣＰＢＡ（低ＤＳ）１００ｍｇおよび脱イオン水１０ｍｌを、磁気撹拌を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れた。ピラゾールカルボキサミジン−ＨＣｌ  ２７４ｍｇを添加した。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨを用いて９．５に調整した。反応物を４５℃に４８時間加熱した。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１１８ｍｇであった。
【０１２６】
（実施例７）
ＰＡＡｎ−ベンジルアミド（高置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２．０１ｇおよび脱イオン水２００ｍｌを、磁気撹拌を備えた１Ｌの１つ首丸底フラスコに入れた。ｐＨを、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを用いて約３．６から５．２に調整した。安息香酸（Ｂｚ）２．３６ｇおよび変性エタノール１００ｍｌの溶液、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  ４．１８ｇおよび変性エタノール１００ｍｌの溶液を個別に作製した。ＢｚおよびＥＤＣ溶液を大部分が溶解するまで約５分混合した。「Ｂｚ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約５分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。反応物の内容物を、過剰なアセトンから１回沈殿させ、続いてＭＷＣＯ：６ｋから８ｋセルロース膜で何回か水を交換しながら２から３日にわたって透析した。透析した溶液を１μｍフィルターに通し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１．８２ｇであった。
【０１２７】
（実施例８）
ＰＡＡｎ−ＡＰＢＡ（高置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２５０ｍｇおよび脱イオン水２５ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの２つ首丸底フラスコに入れた。ｐＨを、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを用いて約３．５から約８．５に調整した。３−アクリルアミドフェニル−ボロン酸（ＡＰＢＡ）１２８ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含む溶液を個別に作製した。ＡＰＢＡ溶液をポリマー溶液に添加し、７０℃で４８時間加熱した。反応物の内容物を、過剰なアセトンから１回沈殿させ、固形物を脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量はオフホワイト色固形物として３０８ｍｇであった。
【０１２８】
（実施例９）
ＰＡＡｎ−ＡＰＢＡ（低置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２５０ｍｇおよび脱イオン水２５ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの２つ首丸底フラスコに入れた。ｐＨを、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを用いて約３．５から約８．５に調整した。３−アクリルアミドフェニル−ボロン酸（ＡＰＢＡ）５２ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含む溶液を個別に作製した。ＡＰＢＡ溶液をポリマー溶液に添加し、７０℃で４８時間加熱した。反応物の内容物を、過剰なアセトンから１回沈殿させ、固形物を脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量はオフホワイト色固形物として２１８ｍｇであった。
【０１２９】
（実施例１０）
ＰＡＡｎ−Ｃ８（低置換度）の合成：ポリ（アリルアミン塩酸塩）２５０ｍｇおよび脱イオン水１８ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの２つ首丸底フラスコに入れた。ｐＨを、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを用いて約３．５から約６．０に調整した。１，２−エポキシオクタン（Ｃ８）４０９μｌおよび変性エタノール１２ｍｌを含む溶液を個別に作製した。Ｃ８溶液をポリマー溶液に添加し、６０℃で２４時間加熱した。反応物の内容物を過剰なアセトンから２回沈殿させ、固形物を脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量はオフホワイト色固形物として１６９ｍｇであった。
【０１３０】
（実施例１１）
ポリ（メタクリルアミドプロピルアミン−塩酸塩）／ＰＭＡＰＡｎ−ＨＣｌの合成：メタクリルアミドプロピルアミン−塩酸塩２．０１ｇおよび脱イオン水６ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れた。ｐＨを、少量の５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２．３に調整した。「Ｖ５０」開始剤２０ｍｇ（１ｗｔ％）を添加した。モノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６０℃で２４時間加熱した。固形物を、アセトンから１回沈殿させることによって単離し、新鮮な水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１．７４ｇであった。
【０１３１】
（実施例１２）
ＰＭＡＰＡｎ−４ＣＰＢＡ（高置換度）の合成：ＰＭＡＰＡｎ−ＨＣｌ  ２５０ｍｇおよび脱イオン水２５ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの１つ首丸底フラスコに入れた。ｐＨを、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを用いて約４から約５に調整した。４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）２３２ｍｇおよび脱イオン水１２．５ｍｌを含むスラリー、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  ２６８ｍｇおよび変性エタノール１２．５ｍｌを含む溶液を個別に作製した。４ＣＰＢＡおよびＥＤＣ溶液を、大部分が溶解するまで、約２分混合した。「４ＣＰＢＡ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約２分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。固形物をアセトンから２回沈殿させることによって単離し、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１．７４ｇであった。
【０１３２】
（実施例１３）
ポリ（ビニルアミン）／ＰＶＡｎの合成：Ｎ−ビニルホルムアミド２５．０ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた５００ｍｌの３つ首丸底フラスコ中に含有されるＩＰＡ  １２５ｍｌおよび脱イオン水４２ｍｌの溶液に入れた。「Ｖ５０」開始剤１．００ｇ（４ｗｔ％）を添加した。モノマー溶液を約４５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物を、Ｎ２（ｇ）下、６０℃で２時間加熱した。ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）が、この特異的な共溶媒組成で沈殿した。母液を、ポリマーを一切失わないように慎重にデカント除去し、次いで等体積の脱イオン水（約１５０ｍｌ）で置き換えた。固形ＮａＯＨペレット１４．０７ｇを添加し、加水分解反応を７５℃で２４時間加熱した。最後に、１Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨを１３未満に低下させ、粗製ＰＶＡをＭＷＣＯ：６ｋから８ｋセルロース膜で何回か水を交換しながら２から３日にわたって透析することによって精製し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量９．４ｇで遊離塩基形態の粘着性の金色固形物を得た。
【０１３３】
（実施例１４）
ＰＶＡｎ−４ＣＰＢＡ（高置換度）の合成：ＰＶＡ（遊離塩基）２５０ｍｇおよび脱イオン水２８ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの１つ首丸底フラスコに入れた。溶解したら、ｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌ約２ｍｌを用いて約１２から約５に調整した。４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）７７０ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含むスラリー、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  ８９０ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含む溶液を個別に作製した。４ＣＰＢＡおよびＥＤＣ溶液を、大部分が溶解するまで、約２分混合した。「４ＣＰＢＡ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約２分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。固形物をアセトンから２回沈殿させることによって単離し、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量はオフホワイト色固形物として３７８ｍｇであった。
【０１３４】
（実施例１５）
ＰＶＡｎ−４ＣＰＢＡ（低置換度）の合成：ＰＶＡｎ（遊離塩基）２５０ｍｇおよび脱イオン水２８ｍｌを、磁気撹拌を備えた１００ｍｌの１つ首丸底フラスコに入れた。溶解したら、ｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌ約２ｍｌを用いて約１２から約５に調整した。４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）３０９ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含むスラリー、ならびにＥＤＣ−ＨＣｌ  ３５７ｍｇおよび変性エタノール５ｍｌを含む溶液を個別に作製した。４ＣＰＢＡおよびＥＤＣ溶液を、大部分が溶解するまで、約２分混合した。「４ＣＰＢＡ−ＥＤＣ」溶液を、ポリマー溶液に約２分にわたって添加した。反応物は、安定化するまで、スケールに応じて約３０分から２時間、少量の飽和重炭酸塩溶液を用いてｐＨ５を維持した。反応を、ｐＨ５で安定化させながら１８時間進行させた。固形物をアセトンから２回沈殿させることによって単離し、脱イオン水中に入れ、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量はオフホワイト色固形物として２８６ｍｇであった。
【０１３５】
（実施例１６）
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、９２．５／７．５の合成：２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）５００ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．１４ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）５４ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤５ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１０分間Ｎ２（ｇ）パージし、次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数時間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。反応混合物を、脱イオン水約３ｍｌを添加して完全に溶解し、過剰なアセトンを用いて共重合体を１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として４７５ｍｇであった。
【０１３６】
（実施例１７）
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８５／１５の合成：２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）５００ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．５０ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）１１８ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤６ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１０分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数時間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。反応混合物を、脱イオン水約３ｍｌを添加して完全に溶解した。共重合体を過剰なアセトンを用いて１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として４８８ｍｇであった。
【０１３７】
（実施例１８）
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）５００ｍｇおよびジメチルホルムアミド４．４５ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２８６ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤８ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１０分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数時間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。この材料は水溶性ではなく、水を添加してもポリマーは完全に溶解しない。
【０１３８】
（実施例１９）
ポリ（ＭＡＰＡｎ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、９２．５／７．５の合成：メタクリルアミド−３−プロピルアミンＨＣｌ（ＭＡＰＡｎ）５０８ｍｇ、ジメチルホルムアミド３．０８ｍｌおよび脱イオン水０．９２４ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）４３ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤５ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで、反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として２４５ｍｇであった。
【０１３９】
（実施例２０）
ポリ（ＭＡＰＡｎ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８５／１５の合成：メタクリルアミド−３−プロピルアミンＨＣｌ（ＭＡＰＡｎ）５００ｍｇ、ジメチルホルムアミド３．３７ｍｌおよび脱イオン水１．０１ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）９４ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤６ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として３５７ｍｇであった。
【０１４０】
（実施例２１）
ポリ（ＭＡＰＡｎ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：メタクリルアミド−３−プロピルアミンＨＣｌ（ＭＡＰＡｎ）５０５ｍｇ、ジメチルホルムアミド４．１３ｍｌおよび脱イオン水１．２４ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２２９ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤７ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として４００ｍｇであった。
【０１４１】
（実施例２２）
ポリ（ＡＭＰＳ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、９２．５／７．５の合成：２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）５０４ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．０４ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに添加し、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）３７ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤５ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として３０９ｍｇであった。
【０１４２】
（実施例２３）
ポリ（ＡＭＰＳ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８５／１５の合成：２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）５０８ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．２９ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）８１ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤６ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として２５５ｍｇであった。
【０１４３】
（実施例２４）
ポリ（ＡＭＰＳ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）５００ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．９５ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）１９７ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤７ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で約１８時間加熱した。粘性共重合体溶液を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として２５０ｍｇであった。
【０１４４】
（実施例２５）
ポリ（ＶＩ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８０／２０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２５４ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．０２ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。１−ビニルイミダゾール（ＶＩ）４８２μｌおよびＡＩＢＮ開始剤７ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数分間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。反応混合物を、脱イオン水約１２ｍｌを添加し、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを約３．０に調整して完全に溶解した。共重合体を、ロータリーエバポレーションによって大部分の水を最初に除去した後に、過剰のアセトンから２回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として５９ｍｇであった。
【０１４５】
（実施例２６）
ポリ（ＶＰｙ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８０／２０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２２７ｍｇおよびジメチルホルムアミド２．９１ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。４−ビニルピリジン（ＶＰｙ）５２０μｌおよびＡＩＢＮ開始剤７ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、７０℃で加熱した。数時間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。反応混合物を、脱イオン水約１２ｍｌを添加し、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを約３．０に調整して完全に溶解した。共重合体を、ロータリーエバポレーションによって大部分の水を最初に除去した後に、過剰のアセトンから１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として６７０ｍｇであった。
【０１４６】
（実施例２７）
ポリ（ＡＰＤＭＡｎ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２６２ｍｇおよびジメチルホルムアミド３．０５ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。アクリルアミドプロピル−３−ジメチルアミン（ＡＰＤＭＡｎ）５２６μｌおよびＡＩＢＮ開始剤８ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数分間加熱した後、反応によって共重合体が沈殿した。反応混合物を、脱イオン水約１２ｍｌを添加し、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを約３．０に調整して完全に溶解した。共重合体を、ロータリーエバポレーションによって大部分の水を最初に除去した後に、過剰のアセトンから２回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１５４ｍｇであった。
【０１４７】
（実施例２８）
ポリ（ＡＰＴＡＣ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）１９９ｍｇおよびジメチルホルムアミド１．９５ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。脱イオン水６７５μｌ、７５％アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩化物（ＡＰＴＡＣ）６６５μｌおよびＡＩＢＮ開始剤７ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。数分間加熱した後、反応物は、高粘性な半固形物のようになった。反応混合物は、脱イオン水約４ｍｌを添加するだけで完全に溶解した。共重合体を、ロータリーエバポレーションによって大部分の水を最初に除去した後に、過剰なアセトンから１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として５８３ｍｇであった。
【０１４８】
（実施例２９）
ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２５３ｍｇおよびジメチルホルムアミド２．８３ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。アクリルアミド２４３ｍｇおよびＡＩＢＮ開始剤６ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。約１８時間加熱した後、粘性反応混合物を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１７０ｍｇであった。
【０１４９】
（実施例３０）
ポリ（アクリル酸−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、７０／３０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）２４９ｍｇおよびジメチルホルムアミド２．８３ｍｌを、磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。アクリル酸２２４μｌおよびＡＩＢＮ開始剤５ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。約１８時間加熱した後、粘性反応混合物を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として１６８ｍｇであった。
【０１５０】
（実施例３１）
ポリ（ＨＥＡＡｍ−ｃｏ−ＡＰＢＡ）、８０／２０の合成：３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）１４５ｍｇおよびジメチルホルムアミド２．８４ｍｌを磁気撹拌およびＮ２（ｇ）入口を備えた３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、溶解するまで撹拌した。２−ヒドロキシエチルアクリルアミド（ＨＥＡＡｍ）３１９μｌおよびＡＩＢＮ開始剤５ｍｇを添加し、溶解するまで撹拌した。コモノマー溶液を約１５分間Ｎ２（ｇ）パージした。次いで反応物をＮ２（ｇ）下、６５℃で加熱した。約１８時間加熱した後、粘性反応混合物を過剰なアセトン中で１回沈殿させた。固形物を単離し、脱イオン水を用いて溶解し、ＩＰＡ／ドライアイス凍結し、凍結乾燥した。収量は白色固形物として４８３ｍｇであった。
【０１５１】
（実施例３２）
ＣＰＢＡで修飾された（ＰＡＡｎ−ＨＣｌ）の合成：材料：ポリ（アリルアミン塩酸塩）をニットーボーメディカル、日本（ＰＡＡｎ−ＨＣｌ、カタログ番号ＰＡＡ−ＨＣｌ−３Ｌ、５０．３％溶液、水中）から得て、入手したままの状態で使用した。材料を１Ｈ−ＮＭＲ、ＴＧＡ、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）によって定性化した。４−カルボキシフェニルボロン酸をＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ（ＣＰＢＡ、カタログ番号２８０８６、９９．７％）から得て、入手したままの状態で使用した。材料を１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲ、および融点によって定性化した。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩をＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ（ＥＤＣ−ＨＣｌ、カタログ番号０００５０、９９．８％）から得て、入手したままの状態で使用した。材料を１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲ、および融点によって定性化した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物をＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ（ＨＯＢｔ、カタログ番号２４７５５、９９．８％（ｏｄｂ）、２１．３％水）から得て、入手したままの状態で使用した。材料を１Ｈ−ＮＭＲ、およびＦＴ−ＩＲによって定性化した。
【０１５２】
反応を、５リットル体積のＰＡＡｎ−ＨＣｌ  １１４ｇを使用して行った。これに基づいて、反応を２．３％のポリマー固形物で行った。反応を室温で行い、その室温は２２±３℃であった。熱電対で反応温度をモニタリングすると、反応中はこの範囲外の発熱または温度変動はないことが示された。
【０１５３】
合成：５０．３％ＰＡＡｎ溶液（２２５．９２ｇ、１．２１５アミン当量）を、磁気撹拌子および脱イオン水（４，３３３ｍｌ）を含む１０リットルビーカーに入れた。得られた透明溶液を磁気撹拌し、ｐＨ電極を入れた。ｐＨを、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を撹拌しながら滴下して添加することによって８．０に調整した。固形の９９．７％ＣＰＢＡ粉末（３２．３５ｇ、０．１９４ｍｏｌ）を反応混合物に添加し、得られた懸濁液を撹拌した。２０分撹拌した後、ｐＨは６．７に低下し、一部の固形ＣＰＢＡは溶液中に懸濁されたままであった。追加のＮａＯＨ溶液を撹拌しながら分けて添加して、ＣＰＢＡ懸濁液を完全に溶解させた。得られた透明溶液のｐＨは７．５であった。次いで固形の７８．７％ＨＯＢｔ水和物粉末（１．６７ｇ、０．０１０ｍｏｌ）を透明反応溶液に添加し、２０分撹拌した後にそれが溶解した。塩酸（４Ｎ）を反応混合物に添加して、ｐＨを５．５に低下させた。反応溶液は透明なままであった。次いで、脱イオン水１００ｍｌ中に溶解した固形の９９．８％ＥＤＣ−ＨＣｌ粉末（４１．０６ｇ、０．２１４ｍｏｌ）を、よく撹拌しながら反応混合物にゆっくりと注ぎ入れた。透明反応混合物の最終体積は５リットルであり、ｐＨは５．５〜５．７であった。この反応混合物を１８時間撹拌した。塩化ナトリウム（１２５ｇ）を反応混合物に添加し、１Ｎ  ＨＣｌを添加して、ｐＨを２．５にした。次いで、反応混合物を、０．２ミクロンＰＥＳフィルターデバイスに通して、５リットルのスクリューキャップ瓶に濾過し、２〜５℃で保存した。
【０１５４】
精製：上記で調製した濾過した反応混合物を、２つのＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＴＦＦカセットを直列に使用したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）で精製した。最初の反応混合物５，０００ｍｌを、最初にＴＦＦによって２，５００ｍｌの作業体積に濃縮した。次いで、この濃縮溶液を、２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）塩化ナトリウムを含有し、濃ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化した脱イオン水溶液を使用して連続的に補充しながら、ＴＦＦによって透析濾過した。ＴＦＦは、４倍体積（１０リットル）の濾液が収集されるまで継続した。その時点で、ＴＦＦを停止し、リザーバー中の作業溶液を、１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによってｐＨ７．９にした。次いで、この溶液の脱塩を、６リットルの濾液が収集され、濾液の導電率が１００マイクロジーメンス毎センチメートル（ｕＳ／ｃｍ）になるまで、脱イオン水を補充しながらＴＦＦで行った。精製したポリマー溶液を、デバイスの少量の脱イオン水すすぎ液（５０〜６０ｍｌ）とともにＴＦＦデバイスから回収した。収集した透明溶液は重量が２，３５７ｇであり、ｐＨが７．５であることが認められた。精製したポリマー溶液を２〜５℃で保存した。このポリマー溶液の少量の試料（３×０．５ｍｌ）を、重さを量ったバイアルに入れ、凍結乾燥すると、４．９１％の固形物含有量が明らかになった。これに基づいて、回収された精製ポリマーの量は１１６ｇであった。固形物判定のために凍結乾燥した試料のうちの１つを、Ｄ２Ｏ／ＤＣｌ中に溶解し、１Ｈ−ＮＭＲで検討した（図５）。
【０１５５】
単離：精製したポリマー溶液を、５０ｍｌのバイアルのセット（１バイアル当たり溶液２０ｍｌ）にピペットで移し、棚式凍結乾燥機で凍結乾燥した。バイアルを乾燥窒素下で密閉し、白色固形物として精製ポリマー製品を得た。
ＩＩ．ムチン混合アッセイ：
【０１５６】
水溶性ムチン糖タンパク質溶液をある特定の水溶性ポリマーと水溶液中で混合した場合、ポリマーとムチンとの間の複合体形成は、混合物の物理的状態における変化から明白である。その結果、どのポリマーがムチンと複合体化できるかを判定し、単純な等級付けスケールを使用して得られた混合物の外観を分類するためのムチン混合観察アッセイが確立された。ポリマー／ムチン複合体の物理的な見た目は、複合体の粘着性性質に関する有益な洞察を提供し、広範囲のネットワーク特性を有する閉塞性バリアが、そのようなポリマーをｉｎ−ｖｉｖｏに経口投薬することによって、粘液とともに腸内で形成され得るかどうかを評価するのに役立つ。
【０１５７】
例えば、ある特定の場合では、試験ポリマーをムチンと混合すると、最初の２つの溶液と外観が同等の透明溶液が得られる。複合体が形成されていないことは明白である。他の場合では、微粒子材料が認められない、かすんでいるかまたは濁った分散液が形成される場合がある。そのような分散液は、典型的には、凝集またはフィルム形成することなく数日間は安定である。他の場合では、粒子が認められる濁った懸濁液が形成される場合がある。これらの懸濁液は、経時的に（数時間、数日で）沈殿する場合があるが、粒子は一般的に付着性でも粘着性でもなく、これらは混合することによって一般的に再懸濁することができる。他の場合では、ポリマー／ムチン複合体は、混合容器の壁を被覆する一体化したゲルまたはフィルムを形成することになる。強力な粘着性特性を示すそのような複合体は、最も好ましい結果と本発明者らによって考えられ、粘膜表面に閉塞性バリア層を形成することが潜在的に可能な複合体が形成されていることを示す。
【０１５８】
ムチン混合アッセイの目的は、一連の標準的な条件下で溶解性ムチン糖タンパク質と混合した場合に試験ポリマーが不溶性複合体を形成するかどうかを判定し、得られた混合物の一般的な特性を観察することである。アッセイ結果は：１）透明度記述子の割付、２）物理的状態記述子の割付、３）必要に応じたコメント、写真またはビデオである。
【０１５９】
ブタ胃３型（ＭＰＳ−３）からのＳｉｇｍａ（カタログ番号１７７８）ムチンの水溶性画分の単離：ムチン混合アッセイに関するスキームを図１に示す。プロトコールは次のとおりである。ＭＰＳ−３  １．０ｇとＭｉｌｌｉＱ脱イオン水４０ｍｌとを５０ｍＬのコニカル管中で混合する。管を、回転式カルーセル混合機に取り付けることによって懸濁液を一晩放置した。次いで５０ｍｌのコニカル管を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ遠心分離機で遠心分離した（５，３００ｒｐｍ、６０分間）。上澄みを、底部の固形ペレットをかき乱さないように新しい５０ｍｌのコニカル管に慎重に注ぎ入れた。次いで、上澄みの遠心分離を繰り返した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ遠心分離機、５，３００ｒｐｍ、６０分間）。上澄みを、重さを量った５０ｍｌコニカル管中に再び収集した。ムチン溶液を−８０℃で少なくとも２時間凍結した。凍結した試料を、凍結乾燥機に少なくとも３日間入れた。凍結乾燥された生成物を収集し、管を秤量し、％収率を計算し、０．６０〜０．６５ｇの回収率を予想した。固形物は、冷蔵庫内で２〜５℃で保存した。
【０１６０】
ポリマー／ムチン混合アッセイプロトコール：ムチン混合アッセイに関するスキームを図１に示す。１．０％ｗ／ｗ溶液を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２００１２−０２７）を使用してｐＨを６．０に調整し、各試験ポリマーから作製した。水溶性ＭＰＳ−３の１．０％ｗ／ｗ溶液を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２００１２−０２７）を使用してｐＨを６．０に調整し、作製した。ムチン溶液はわずかにかすんでいた。ＭＰＳ−３溶液０．２５〜０．５ｍＬを、２ドラム（４ｍＬ）のバイアルに入れた。等体積の試験ポリマー溶液をバイアルにゆっくりと添加した。バイアルに蓋をし、ゆっくりと回転させて混合し、同時に任意の物理的変化を観察した。混合物の透明度に関する以下の記述子のうちの１つを選択して、得られた混合物を読み取ることができる：透明（わずかにかすんでいるだけ、最初のムチン溶液と同様である）；かすんでいる（最初のムチン溶液よりもかすんでいる、それを通して文字列を読み取ることができる）；濁っている（透明ではない、それを通して読み取ることはできないが、光は十分に透過する）；不透明（牛乳様、透明ではない、光はあまり透過しない）、および該当なし（材料は全体的な相分離を示す）。混合物の物理的状態に関する以下の記述子ののうちの１つを選択して得られた混合物を読み取ることができる：透明；分散液（粒子は認められない）；懸濁液（非常に細かい微粒子が観察可能）、沈殿物（大きく不規則な粒子、付着性の場合がある）および相分離（フィルム、ゲルが堆積している、透明なまたはかすんでいる上澄み流体が認められる場合がある）。蓋をしたバイアル中の混合物をおよそ１時間観察して任意の変化を記録した。
【０１６１】
ムチン混合アッセイの結果：ＰＡＡｎの化学的修飾（表１）によって、疎水性置換基を付加させると、一部の場合では不溶性の複合体を形成する傾向が高まる場合があることが明らかになった。多くの修飾されたＰＡＡｎ誘導体が、ムチンと混合した場合に濁った微粒子懸濁液（物理的状態「Ｂ」または「Ｃ」）を生成した。予想外なことに、本発明者らは、ＰＡＡｎのフェニルボロン酸置換によって、粘着性および付着性ゲルおよびフィルムの形成が生じ、それが試験バイアルの壁を被覆するのが一貫して認められた（物理的状態「Ｅ」）ことを見出した。この挙動は、カルボキシフェニルボロン酸（３−ＣＰＢＡおよび４−ＣＰＢＡ）を用いたアミド形成化学を使用して、ならびに３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）を用いたマイケル付加の生成物に関して認められた。興味深いことに、ＰＡＡｎ−４−ＣＰＢＡを、グリシドールを使用してさらに修飾するか、またはグアニジニル化によって修飾した場合、この粘着性ムチン複合体の形成は持続した。
【０１６２】
【表１】
2022501483.tif 000029
【０１６３】
アクリルアミドフェニル−３−ボロン酸（ＡＰＢＡ）といくつかの水溶性アクリルアミドモノマーとの共重合体は、ムチン混合アッセイで試験を行った（表２）。中性、アニオン性およびカチオン性の例を試験することができるように、ＡＰＢＡ共重合体の電荷は多様であった。アニオン性コモノマーに関しては、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）およびアクリル酸（ＡＡ）を使用した。中性モノマーに関しては、ヒドロキシエチルアクリルアミド（ＨＥＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡｍ）およびヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）を使用した。カチオン性共重合体に関しては、メタクリルアミド−３−プロピルアミン（ＭＡＰＡｎ）、アクリルアミド−３−プロピル−ジメチルアミン（ＡＰＤＭＡｎ）、アクリルアミド−３−プロピルトリメチルアンモニウム塩化物（ＡＰＴＡＣ）、１−ビニル−イミダゾール（１−ＶＩ）、および４−ビニルピリジン（４−ＶＰ）を使用した。
【０１６４】
表２は、ボロン酸含有共重合体に関しては、ボロン酸基およびカチオン性基を組み合わせて存在させた結果として、カチオン性電荷を有するポリマーのみがムチン複合体を形成し、いくつかは明白な広範囲のネットワーク特性を有する複合体を生成したことを示す。
【０１６５】
【表２】
2022501483.tif 000030
【０１６６】
水溶液中のムチンとの複合体形成の一次評価に関するアッセイは、ムチン相互作用薬剤としての一連の合成ポリマーをスクリーニングするために利用されている。アッセイ結果は、透明度の記述子の割付および物理的状態の記述子の割付である。アッセイは、ムチンと完全に混和性である化合物と、分散液または粒子懸濁液を形成するものとを区別し、広範囲のネットワーク特性を有する複合体を形成することができる化合物を明確に同定することができる。
【０１６７】
ムチンの粘着性塊への完全な沈殿（相分離）は、フェニルボロン酸基（４−ＣＰＢＡまたは３−ＣＰＢＡ）を有するある特定のポリカチオン誘導体のみで観察された。４−ＣＰＢＡとポリ（アリルアミン）とのアミドは特に頑強であり、ＣＰＢＡ置換のレベルが５ｍｏｌ％まで減少した場合でさえ、相分離したムチン／ポリマー複合体が実証された。ＰＡＡｎ−４−ＣＰＢＡを含む粘着性ムチン複合体の形成はｐＨ依存性であり、ｐＨ＝２で阻害され、ｐＨが増加するとともに頑強性が構築されるように思われた。補完的な結果が、３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）の共重合体で認められた。ＡＰＢＡの、ある特定のカチオン性共重合体のみが、相分離した粘着性ムチン複合体を形成することができることが見出された。
ＩＩＩ．遠心分離アッセイ：
【０１６８】
遠心分離アッセイに関するスキームを図２に示す。ポリマー−ムチン複合体が遠心分離フィルターデバイスのカップ内で形成され、標準的な一連の条件下で遠心分離が行われた場合、流体混合物は、遠心力の下でフィルター膜を通過する。しかし、ポリマー−ムチン複合体が溶液様ではない物理的性質を表した場合、この濾過プロセスは阻害されることがある。これらの場合で、混合物の大部分は、フィルターカップ内に保持される場合がある。保持された材料の画分は重量測定法で測定することができ、ポリマー−ムチン複合体の物理的性質と相関し得る。
【０１６９】
ムチンまたはポリマーのみの溶液を完全に濾過することができる一連の実験条件を定義することができる。しかし、ムチンおよびポリマー溶液がフィルターカップ内で一緒に混合されて複合体を形成した場合、遠心分離濾過は、ポリマー−ムチン複合体の物理的性質に応じてさまざまな程度で阻害される場合がある。本発明者らは、一部の場合で、ポリマー−ムチン複合体の濁った分散液が、フィルターを完全に通過する場合があることを見出した。対照的に、ゲル様または他の複雑な形態を有するポリマー−ムチン複合体は、フィルターカップ内に強力に保持されることがある。材料は、ポリマー／ムチン複合体が付着性のゲル状のまたは他の非溶液の物理的性質を表した場合のみフィルターカップ内に保持される。
【０１７０】
本発明者らは、この単純なアッセイは、流動性を維持し、溶液中に十分に分散したままのポリマー−ムチン複合体を、粘弾性の物理的性質および広範囲のネットワーク構造を示すものと区別することができると考える。濾過に対するこの抵抗性は、粘液を閉塞性バリア材料に濃縮するポリマーの能力と正の相関があり得ることが提唱される。
【０１７１】
遠心分離アッセイの目的は、遠心分離フィルターデバイスのカップ内で試験ポリマーと溶解性ムチン糖タンパク質とを混合し、一連の標準的な条件下で遠心分離した後にフィルターカップ内に保持された材料の質量を定量化することである。アッセイ結果は、フィルターカップ内に保持された画分である（保持された画分、または％Ｒ）。
【０１７２】
遠心分離フィルターアッセイプロトコール：ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２００１２−０２７）を使用した各試験ポリマーの１．０％ｗ／ｗ溶液を作製し、ｐＨを６．０にした。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２００１２−０２７）を使用して水溶性ＭＰＳ−３の１．０％ｗ／ｗ溶液を作製し、ｐＨを６．０にした。ムチン溶液はわずかにかすんでいた。全ての溶液のｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨおよび１Ｍ  ＨＣｌを用いて６に調整した。ＣＯＳＴＡＲ、Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心分離管フィルター、０．４５μｍ酢酸セルロース、２ｍｌ管、非滅菌（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を入手した。各遠心分離フィルター管にラベルを付け、フィルターカップを除いた各管の質量を記録した。これは、濾過前の管の風袋重量であった。ムチン溶液７５μＬを各フィルターカップに入れ、フィルターが完全にコーティングされていることを確実にした。試験ポリマー溶液７５μＬをフィルターカップに入れた。各ポリマーならびにムチン溶液７５μＬおよびＰＢＳ７５μＬを含み、ｐＨ＝６．０に調整したブランクに関して、所望の反復数（典型的には、ｎ＝４）の反復を行った。全ての遠心分離カップには溶液１５０μＬが含有されており、重量は１５０ｍｇであると想定される。全ての管をｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ  ｍｉｎｉ  ｓｈａｋｅｒに３００ｒｐｍ、３７℃で３０分間入れた。管をＢｅｃｋｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ−Ｒ遠心分離機（または同様の機器）に入れ、６０００×重力、２１℃で１２分間遠心分離した。管を収集し、フィルターカップを外した後に慎重に秤量した。これは、濾過後の管の重量であった。管に濾過された流体の重量を、濾過後の管の重量から濾過前の管の重量を差し引くことによって計算した。カップ内に保持された材料の画分（保持された画分、またはｆＲ）を、ポリマー−ムチン混合物（０．１５０ｇ）の合計重量から濾液の重量を差し引き、０．１５０で割ることによって計算した。「保持された画分」エンドポイントに関する平均値、標準偏差、および反復数を計算することができる。
【０１７３】
ポリカチオン、例えばポリ（ジアリルアミン）（ＰＤＡＡｎ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（メタクリルアミドプロピルアミン）（ＰＭＡＰＡｎ）およびポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｎ）を化学的に修飾するとアミド誘導体が生成され、一部の場合では、濾過に対するそれらの抵抗性によって認められるように、広範囲のネットワーク構造特性を有する、ムチンとの不溶性複合体を形成する傾向が強く示された（表３）。この結果は、これらのポリマーをムチンと溶液中で混合した場合に生じた全体的な相分離の観察結果と一致する。一般的に、遠心分離アッセイにおいて大量の保持された材料をもたらすポリマーは、未修飾の親ポリカチオンによって形成された濁った分散液または懸濁液から視覚的に区別することができる相分離した沈殿物を形成した。特に顕著なものは、４−カルボキシフェニルボロン酸のアミドであり、一貫して良好に機能した（ｆＲは０．４２から０．７０）。
【０１７４】
【表３】
2022501483.tif 000031
【０１７５】
遠心分離アッセイにおける共重合体の評価：単純な市販されている重合性フェニルボロン酸は、３−アクリルアミドフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）である。ＡＰＢＡ自体は水溶性ではなく、そのホモポリマーも水溶性ではない。アクリルアミドモノマーを含むＡＰＢＡ共重合体を、粘液相互作用剤としてのその潜在力に関して評価した（図３）。ＡＰＢＡ共重合体は、中性（２−ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ＨＰＭＡ）、アニオン性（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、ＡＭＰＳ）、およびカチオン性（（３−メタクリルアミド）プロピルアミン、ＭＡＰＡｎ）コモノマーを用いて調製した。この一連の共重合体の範囲内で、ＡＰＢＡのモル比を７．５％から１５％、３０％に増加させた。
【０１７６】
最も高いＡＰＢＡ含有量を有する中性共重合体を除いて、全ての共重合体が溶解性であることが認められた。１ｗｔ％のＰＢＳ（ｐＨ＝６）中でムチンと混合した場合、中性およびアニオン性共重合体は、複合体形成の徴候を伴わない透明溶液をもたらした。対照的に、カチオン性ＭＡＰＡｎ共重合体は、７．５％および１５％ＡＰＢＡ組成物に関しては濁った分散液をもたらした。３０％ＡＰＢＡ共重合体は、全体的な相分離および白色付着性沈殿物を生成した。図３および表４は、この一連の共重合体に関する遠心分離アッセイ評価の結果を示す。
【０１７７】
【表４】
2022501483.tif 000032
【０１７８】
４つの追加のカチオン性共重合体を、ＡＰＢＡを用いて調製し、遠心分離アッセイで試験を行った。これらは、（３−アクリルアミドプロピル）ジメチルアミン（ＡＰＤＭＡｎ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム塩化物（ＡＰＴＡＣ）、４−ビニルピリジン（４−ＶＰｙ）および１−ビニルイミダゾール（１−ＶＩ）を含んでいた。これらの４つの材料およびカチオン性（（３−メタクリルアミド）プロピルアミン、ＭＡＰＡｎ）共重合体に関する遠心分離アッセイの結果を図４に示す。
【０１７９】
ＡＰＢＡの全てのカチオン性共重合体に関しては、ムチン複合体化によって、遠心分離アッセイにおいて顕著に保持された材料が得られた。ＡＰＢＡを含まないカチオン性ホモポリマーは、アッセイにおいてスコアが高くなかったことも一貫して観察された。表３の修飾ポリアミンと同様に、遠心分離アッセイで得られた正の結果（一般的にｆＲ＞０．４）は、ポリマーを希釈溶液中でムチンと混合した場合の全体的な相分離の観察結果と一致した。
ＩＶ．多粒子追跡（ＭＰＴ）アッセイ：
【０１８０】
リアルタイム多粒子追跡（ｒｔＭＰＴ）は、胃腸粘液を介した拡散を測定するための強力な方法である。ｒｔＭＰＴは十分に確立された技術であり、これはいくつかの薬物および遺伝子担体輸送研究において利用されている。ｒｔＭＰＴでは、ビデオ顕微鏡検査を使用して、高時空間分解と同時に、数百個の個々のポリスチレンナノ粒子の微視的運動を追跡する。個々の粒子とアンサンブル粒子の両方のデータを分析すると、粒子−環境相互作用およびバルク、ならびにマイクロ輸送特性に関する重要な洞察が明らかになる。定量的および定性的情報、例えば、拡散係数、粘弾性、孔径、速度、方向性、および輸送様式は、粒子の軌道から判定することができる。
【０１８１】
本発明者らは、ｒｔＭＰＴを使用した新鮮ブタ腸粘液のバリア特性に対する本発明の粘液結合ポリマーの効果を研究した。ＰＥＧ化表面を有する直径２００ｎｍの蛍光性ポリスチレンナノスフェアを、モデル拡散プローブとして使用した。表面をＰＥＧ化すると、表面電荷がなく、粘液またはポリマー試料との顕著な化学的相互作用がない容易に拡散可能な粒子が得られる。これらの「ステルス」粒子の拡散を、天然のブタ小腸粘液において研究した。粒子の軌道を使用して、時間平均二乗平均変位（ＭＳＤ）を計算し、その後これを使用して、時間依存拡散係数を判定し、個々の粒子輸送様式を特徴付けた。
【０１８２】
多粒子追跡アッセイプロトコール：腸の粘液収集：現地の食肉処理場（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８７  Ｉｎｃ．、Ｂｏｙｌｓｔｏｎ  ＭＡ）で、天然のブタ小腸粘液を採取し、冷水ですすいで、バルク材料を除去した。粘液層を、金属スパチュラを使用して徐々にこすり落とし、次いでマイクロ遠心分離管中に−８０℃で保存した。凍結粘液は、室温で３０分間解凍してから使用した。
【０１８３】
ナノ粒子調製物および特性評価：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ）架橋化学物質を使用して、２０００分子量（ＭＷ）のアミン末端ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ４、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）をカルボキシル修飾粒子（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に共有結合させた。簡潔には、カルボキシル修飾粒子を、５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ緩衝剤、ｐＨ６．５、Ｓｉｇｍａ）で希釈し、次いでＰＥＧ−ＮＨ４  ２０ｍｇおよびＥＤＣ  １０ｍｇを粒子溶液に添加し、室温で２時間混合した。反応をクエンチするために、１００ｍＭグリシン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３０分間混合した。粒子溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、１０ｋＤａカットオフ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩透析した。
【０１８４】
ナノ粒子および粘液試料の調製：ＰＥＧ表面官能化を伴う２００ｎｍの蛍光性粒子の輸送特性を、多粒子追跡技術を使用して調査した。粒子懸濁液を調製するために、１％ポリマー溶液または対照としての水の存在下で粒子を希釈して、最終濃度を０．００２５％ｗｔ／ｖｏｌとした。新鮮なブタ腸粘液（１５０μＬ）をＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（商標）（Ｎｕｎｃ（商標））に添加した。１％ポリマー溶液または水（対照）中の粒子懸濁液（７．５μＬ、ＰＥＧ修飾粒子）をボルテックスし、粘液表面に最小限の摂動で滴下して添加した。試料を、暗い加湿されたチャンバー内で室温で２時間インキュベートしてからイメージングを行った。
【０１８５】
多粒子追跡：粒子ビデオを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１倒立顕微鏡に取り付けられた、Ｘ−Ｃｉｔｅ  １２０蛍光照明システムおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０デジタルカラーカメラを使用して得た。簡潔には、２０秒の軌跡ビデオを、１秒当たり３０フレームのフレーム速度で記録した。粒子の軌道を、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＰｒｏｆ．Ｒｅｂｅｃｃａ  Ｃａｒｒｉｅｒの研究グループで以前に開発されたカスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析して、二乗平均変位および有効拡散係数（Ｄｅｆｆ）を計算した。実験は、公開されている文献［Lock,  J.  Y.,  Carlson,  T.  L.,  Wang,  C.-M.,  Chen,  A.  &  Carrier,  R.  L.  Acute  Exposure  to  Commonly  Ingested  Emulsifiers  Alters  Intestinal  Mucus  Structure  and  Transport  Properties.  Sci.  Rep.  8,  10008  (2018).］に記載されている十分に確立されたプロトコールに従って行った。
【０１８６】
４−カルボキシフェニルボロン酸（４−ＣＰＢＡ）で修飾された、ポリアリルアミン（ＰＡＡｎ）およびポリ（メタクリルアミドプロピルアミン）（ＰＭＡＰＡｎ）のｒｔＭＰＴアッセイにおける試験を、適切な対照および比較化合物とともに行った（表５）。
【０１８７】
リアルタイム多粒子追跡アッセイの結果：中性粘膜付着性のポリマーであるポリ（ビニルピロリドン）を対照として使用した。未修飾ポリ（アリルアミン）に関する相対的なＤｅｆｆ値は、同日の対照の２３％（１／４．４の減少）であった。グリシドールで修飾されたポリ（アリルアミン）に関して、同様の結果が認められた（Ｄｅｆｆにおいて、同日の対照の２７％、１／３．８の減少）。カルボキシフェニル−４−ボロン酸で修飾されたポリ（アリルアミン）に関しては、さらに低い拡散係数が得られた（Ｄｅｆｆにおいて、同日の対照の９％、または１／１１の減少）。
【０１８８】
ポリ（メタクリルアミドプロピルアミン）（ＰＭＡＰＡｎ）に関しては、未修飾ポリカチオンは、同日の対照の１７％（１／６の減少）のＤｅｆｆ値を示した。比較すると、カルボキシフェニル−４−ボロン酸修飾ポリマーは、同日の対照のわずか１％のＤｅｆｆ値（Ｄｅｆｆにおいて１／１００の減少）を示した。
【０１８９】
【表５】
2022501483.tif 000033
【０１９０】
Ｖ．慢性ラットの研究：慢性ラットの研究を、４−カルボキシフェニルボロン酸（ＣＰＢＡ）で修飾されたポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＡｎ−ＨＣｌ）の６０日の毎日の投薬に起因する代謝改善を調べるために行った。
【０１９１】
慢性ＧＫ齧歯動物の研究を、実施例３２のポリ（アリルアミン）誘導体を使用して、Ｇｏｔｏ−Ｋａｋａｚａｋｉ（ＧＫ）ラットにおいて８週間にわたって毎日投与することによって行った。動物を少なくとも１週間馴化させ、１２時間の明暗サイクルで１９℃〜２２℃および４０％〜６０％の湿度で飼育した。研究の開始時に、ラットを２つの群：０．９％生理食塩水が与えられる対照群（ｎ＝７）、および生理食塩水中に溶解したポリマー（８０ｍｇ／ｍｌ）が与えられるポリマー処置群（ｎ＝７）に無作為に割り付けた。８週の研究期間全体にわたって、対照および処置溶液を、経口経管栄養を介した１．５ｍＬのボーラスで、１日１回経口経管栄養によって投与した。ラットは、午後２：００〜５：００で毎日絶食させ、水は自由に摂取させた。経管栄養の投薬は、１日１回午後６：００に行った。
【０１９２】
代謝試験は、８週の研究全体にわたって数回行った。３つのカテゴリーの試験：（１）研究８日目（図６Ａ〜６Ｂ）、３０日目（図７Ａ〜７Ｂ）、３９日目（図８Ａ〜８Ｂ）、および５２日目（図１１Ａ〜１１Ｂ）に経口グルコース耐性試験（ｏＧＴＴ）、（２）研究４６日目（図１０Ａ〜１０Ｂ）に混合餌耐性試験（ｍｍＴＴ）、ならびに（３）研究４２日目（図９）および５５日目（図１２）にインスリン耐性試験（ＩＴＴ）を使用した。
【０１９３】
研究の主要評価項目は、各試験日の血中グルコース曲線下増加面積における減少であり、これを、各時点においておよび全体的に有意な値に関して互いに比較した。
【０１９４】
研究の副次評価項目には、体重増加プロファイルおよびインスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）が含まれていた（図１３および図１４）。
【０１９５】
計画したｏＧＴＴまたはｍｍＴＴの前夜に、全てのラットを、ハンギングケージ内で一晩、１２〜１６時間絶食させ、水は自由に摂取させた。絶食後の研究の朝に、ラットの尾に切れ目を入れて、血中グルコース測定を可能にし、全ての動物に関してベースライン血中グルコースを測定した。次いで試験物品の経口経管栄養を投与した。１時間後、４０％グルコース溶液（２．０ｇ／ｋｇ体重）の経口経管栄養を投与した。次いで、グルコースを投与してから０、３０、６０、９０、１２０分に、必要に応じて１８０、２１０、および２４０分に、血中グルコース測定値を各動物から得た。各時点における各群からの血中グルコース値を計算し、プロットしてｏＧＴＴ曲線をプロファイルし、対照と処置群との間で比較した。
【０１９６】
ＩＴＴの場合、研究のための準備は、絶食を行わず、インスリンを０．７５Ｕ／ｋｇラットで腹腔内注射した（経口で投薬されたグルコースの代わりに）という点において異なっていた。耐性試験研究の残りの部分は、２時間にわたって尾から採取する血中グルコース測定に記載されているとおりに行った。
【０１９７】
ＣＰＢＡで修飾されたＰＡＡｎ−ＨＣｌの１日１回の慢性投与は、この十分に検証されたＧＫラットモデルにおいて血糖ホメオスタシスの頑強で統計的に有意な効果が実証された。一元ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較を用いた各耐性試験に関するデータを、平均±ＳＥＭとして示す。有意性を：
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示す。
【０１９８】
慢性ＧＫ齧歯動物研究によって、実施例３２のポリ（アリルアミン）誘導体の８週間にわたる有効性および忍容性が実証される（図１６Ａ〜１６Ｃおよび図１７Ａ〜１７Ｃ）。
【０１９９】
グルコースホメオスタシスに対する経時的なポリ（アリルアミン）誘導体の効果は有意に強化された。これは、慢性十二指腸を除去することによって、改善された全身性代謝環境に対する代謝リセットが生じるという所見と一致する。また、空腹時血糖に対する効果は、慢性的なポリマー処置によって（ＩＴＴの結果に基づく）、全身性グルコースホメオスタシスにおける持続的な変化が刺激され、これは肝性グルコース産生の抑制を介したと思われることを示唆する。しかし、異なる空腹時血糖にもかかわらず、ＩＴＴ曲線は、正常な逆調節性応答が維持されることを示唆する。要するに、これらのデータは、ポリ（アリルアミン）誘導体を用いた慢性的な処置は、グルコース耐性における大幅な強化を刺激し、これは、インスリン作用における全身性の強化とは無関係と思われるが、グルコース刺激インスリン分泌の強化および肝性グルコース産出の抑制を含み得ることを示唆する。
【０２００】
研究をさらに継続した場合、処置群におけるインスリン抵抗性の継続的な改善および体重のさらなる減少が認められるであろうと仮定する。ＧＫ−ラットは痩せている糖尿病の表現型であるため、本発明者らの慢性的な研究において観察された６％の体重減少は、有意な所見である。この体重減少の規模は、同様の実験条件下でＧＫ−ラットモデルにおけるＳＧＬＴ２阻害剤で観察されたものと同等である（Takasu  T,  et  al,  Biological  and  Pharmaceutical  Bulletin,  40(5),  pp.675-680,  2017）。興味深いことに、この同じＳＧＬＴ２阻害剤は、肥満ラットモデルにおいて合計で約１５％の体重減少をもたらした（Yokono  M,  et  al,  European  Journal  of  Pharmacology,  727,  pp.66-74,  2014）。対照とポリ（アリルアミン）誘導体を用いた処置群との間の餌摂取量に差が認められなかったことに留意することも重要である（図１５）。これは、糖尿に起因して餌摂取量を増加させるＳＧＬＴ２阻害剤と非常に対照的である。
【０２０１】
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照しながら特に示し、記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく形態および詳細におけるさまざまな変更がその中で行われてもよいことは当業者によって理解されるべきである。
【図１】
2022501483.tif 000055
【図２】
2022501483.tif 000056
【図３】
2022501483.tif 000057
【図４】
2022501483.tif 000058
【図５】
2022501483.tif 000059
【図６】
2022501483.tif 000060
【図７】
2022501483.tif 000061
【図８】
2022501483.tif 000062
【図９】
2022501483.tif 000063
【図１０】
2022501483.tif 000064
【図１１】
2022501483.tif 000065
【図１２】
2022501483.tif 000066
【図１３】
2022501483.tif 000067
【図１４】
2022501483.tif 000068
【図１５】
2022501483.tif 000069
【図１６】
2022501483.tif 000070
【図１７】
2022501483.tif 000071
【国際調査報告】
2022501483.tif 000072
2022501483.tif 000073
2022501483.tif 000074