(57)【要約】本開示は、逆転写の間の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法およびキットを提供する。本明細書で提供される方法およびキットは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むものなどのブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する。別の態様では、本開示は、望ましくないＲＮＡ種の複数の領域に相補的である（好ましくは完全に相補的である）ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットであって、各ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域へのその結合を増大させる、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、セットを提供する。
2022502028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写の間に、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の所望のＲＮＡ種および１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を含むＲＮＡ試料を提供するステップと、
（ｂ）１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを前記ＲＮＡ試料中の前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域にアニールさせて鋳型混合物を生成するステップであって、
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記１つまたは複数の領域に相補的であり、それに安定して結合し、前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変を含む、ステップと、
（ｃ）前記鋳型混合物を、
（ｉ）少なくとも１つの逆転写酵素、
（ｉｉ）１つまたは複数の逆転写プライマー、および
（ｉｉｉ）反応緩衝液
を含む反応混合物と、前記１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を鋳型として使用してｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件の下で一緒にインキュベートするステップであって、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を使用したｃＤＮＡ合成は阻害される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つまたは各々が、前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間の結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つまたは各々が、前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間の結合を増大させるいかなる改変されたヌクレオチドも含まず、長さが少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つまたは各々が１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド中のＬＮＡの数が、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよぶ、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの長さが、１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２２ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記１つまたは複数の領域との間で形成される二重鎖の融点（Ｔｍ）が、８０〜９６℃、好ましくは８６〜９２℃の範囲におよぶ、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの数が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、もしくは少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００もしくは少なくとも１０，０００、および／または多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００もしくは多くとも５０，０００、例えば２〜１００，０００、１００〜８０，０００もしくは８００〜５０，０００である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの数が少なくとも５であり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの２つまたはそれより多くは、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の少なくとも１つの異なる領域にアニールする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記２つまたはそれより多くのブロッキングオリゴヌクレオチドがアニールする前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記少なくとも１つの２つの近隣領域の間の距離が、０〜１００ヌクレオチド、０〜７５ヌクレオチド、０〜５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜７５ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜７５ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチドまたは３０〜４５ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記少なくとも１つの前記異なる領域が均一に分布し、２つの近隣領域の間の距離が２０〜５０ヌクレオチド、好ましくは３０〜４５ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記少なくとも１つの前記異なる領域が均一に分布しておらず、２つの近隣領域の間の距離が０〜１００ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドがアニールする前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の数が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００もしくは多くとも２０００、例えば２〜１，０００，０００、１００〜５００，０００、５００〜１００，０００および１０００〜１０，０００である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種が、ｒＲＮＡ、例えば２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリアの１２Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリアの１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／またはプラスチドｒＲＮＡを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種が、豊富なタンパク質コードｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記豊富なタンパク質コードｍＲＮＡがグロビンＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）がＫＣｌなどの塩の存在下で実行される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）の前記鋳型混合物中の塩の濃度が、５ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば１０ｍＭ〜３０ｍＭまたは１５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲におよぶ、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）の前記鋳型混合物中の前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの各々の量が、１ブロッキングオリゴヌクレオチドにつき約０．１ｐｍｏｌ〜約５０ｐｍｏｌ、例えば１ブロッキングオリゴヌクレオチドにつき約０．５ｐｍｏｌ〜約２０ｐｍｏｌ、約０．５ｐｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌ、約１ｐｍｏｌ〜約２０ｐｍｏｌ、約１ｐｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌ、約１．５ｐｍｏｌ〜約１０ｐｍｏｌ、約１．５ｐｍｏｌ〜約８ｐｍｏｌ、または２ｐｍｏｌ〜約７ｐｍｏｌである、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを前記ＲＮＡ試料と接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の混合物を少なくとも６５℃、例えば少なくとも７０℃または少なくとも７５℃で、少なくとも３０秒間、例えば少なくとも１分間または少なくとも２分間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の後、温度を４０℃未満、例えば２５℃未満に下げるステップと
を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の逆転写プライマーがランダムプライマー、例えばランダムな６ｍｅｒである、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡ試料が断片化したＲＮＡ分子を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡ試料が全血、血清または血漿から調製される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成される前記ｃＤＮＡ分子の相補鎖を合成して二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成するステップ
をさらに含む、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡ分子を増幅してシークエンシングライブラリーを構築するステップ
をさらに含む、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
（ｆ）ステップ（ｅ）で構築された前記シークエンシングライブラリーを使用して前記１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を配列決定するステップ
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記１つまたは複数の領域に完全に相補的である、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
望ましくないＲＮＡ種の複数の領域に相補的である（好ましくは完全に相補的である）ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットであって、各ブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記望ましくないＲＮＡ種の領域へのその結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２９】
各ブロッキングオリゴヌクレオチドが、その伸長を防ぐ３’改変を含む、請求項２８に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３０】
各ブロッキングオリゴヌクレオチドが１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項２８または２９に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３１】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチド中のＬＮＡの数が、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよぶ、請求項３０に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３２】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さが、１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２２ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項２８から３１のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３３】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間で形成される二重鎖の融点（Ｔｍ）が、８０〜９６℃、好ましくは８６〜９２℃の範囲におよぶ、請求項２８から３２のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３４】
前記セットの中の前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの数が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０もしくは少なくとも５０、および／または多くとも１０００、多くとも９００、多くとも８００、多くとも７００、多くとも６００、多くとも５００、多くとも４００、多くとも３００、もしくは多くとも２００、例えば２〜１０００、５〜５００および１０〜３００である、請求項２８から３３のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３５】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記セットがアニールする前記望ましくないＲＮＡ種の２つの近隣領域の間の距離が、０〜１００ヌクレオチド、０〜７５ヌクレオチド、０〜５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜７５ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜７５ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチドまたは２５〜３５ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項２８から３４のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３６】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが前記望ましくないＲＮＡ種の等間隔の領域に相補的である、請求項２８から３５のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３７】
各セットが請求項２８から３６のいずれかによる、ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項３８】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの異なるセットが異なる望ましくないＲＮＡ種の領域にアニールする、請求項３７に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項３９】
前記異なる望ましくないＲＮＡ種の数が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００または多くとも２０００、例えば２〜１，０００，０００、１００〜５００，０００、５００〜１００，０００、および１０００〜１０，０００である、請求項３７または３８に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４０】
ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットの数が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００もしくは多くとも２０００、例えば２〜１０，０００、２〜５０００、２〜１０００、２〜５００、２〜２００、１０〜１０，０００、１０〜５０００、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２００、１００〜１０，０００、１００〜５０００、１００〜１０００、もしくは１００〜５００である、請求項３７から３９のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４１】
前記複数のセットの中のブロッキングオリゴヌクレオチドの総数が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００もしくは少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００もしくは少なくとも１０，０００、および／または多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００もしくは多くとも５０，０００、例えば２〜１００，０００、１００〜８０，０００、もしくは８００〜５０，０００である、請求項３７から３９のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４２】
前記異なる望ましくないＲＮＡ種が単一の生物体に由来する、請求項３７から４１のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４３】
前記異なる望ましくないＲＮＡ種が複数の異なる生物体に由来する、請求項４２に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４４】
異なる生物体の数が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、および／または多くとも１０，０００、多くとも５，０００、多くとも１０００、多くとも５００もしくは多くとも１００、例えば２〜１０，０００、５〜５，０００もしくは１０〜１，０００である、請求項４３に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４５】
前記異なる望ましくないＲＮＡ種が同じタイプの望ましくないＲＮＡ種である、請求項４３または４４に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセット。
【請求項４６】
前記望ましくないＲＮＡ種が、ｒＲＮＡ、例えば２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリアの１２Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリアの１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／またはプラスチドｒＲＮＡを含む、請求項２８から４５のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは複数のセット。
【請求項４７】
前記望ましくないＲＮＡ種が豊富なタンパク質コードｍＲＮＡ（例えばグロビンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡを含む、請求項２８から４５のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは複数のセット。
【請求項４８】
ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＲＮＡ合成を阻害するキットであって、
（１）（ａ）前記ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的である１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドであって、各々は、前記１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間の結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、または
（ｂ）請求項２８から４７のいずれかに記載のブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは複数のセット、および
（２）逆転写酵素
を含む、キット。
【請求項４９】
逆転写プライマー、逆転写緩衝液、第２ｃＤＮＡ鎖合成のための酵素、ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、シークエンシングのためのＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ増幅および／またはシークエンシングのためのオリゴヌクレオチドプライマーならびにアダプターからなる群の１つまたは複数をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
逆転写の間にＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法であって、
（ａ）前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的な複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを生成するステップと、
（ｂ）許容されないブロッキングオリゴヌクレオチドをフィルタリングするステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の群を生成するステップと、
（ｄ）必要に応じて前記群の間でブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルしてブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群を生成し、ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記新しい群の１つまたは複数を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記複数の異なる領域が、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種に沿って均等に間隔があいている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変を各々含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間の結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを各々含む、請求項５０から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を各々含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、以下の特徴：
（１）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの長さが、１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは１６〜２４ヌクレオチド、１７〜２３ヌクレオチドまたは１８〜２２ヌクレオチドの範囲におよぶこと；
（２）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの各々の中のＬＮＡの数が、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよぶこと；
（３）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の前記領域との間で形成される二重鎖の融点が、８０〜９６℃、または８２〜９４℃、好ましくは８６〜９２℃の範囲におよぶこと；
（４）ステップ（ａ）で生成される前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの数が、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００もしくは少なくとも１００００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００もしくは多くとも５０，０００、例えば１００〜１，０００，０００、５００〜１００，０００および１０００〜１０，０００であること；
（５）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、それら自体に対してではなく、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の前記領域に結合する可能性があること；
（６）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記望ましくないＲＮＡ種が属するトランスクリプトームの中の他の領域に対してではなく、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の前記領域に結合する可能性があること；および
（７）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的（好ましくは完全に相補的）である異なる前記望ましくないＲＮＡ種の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００もしくは多くとも２０００、例えば２〜１，０００，０００、１００〜５００，０００、５００〜１００，０００および１０００〜１０，０００であること
の１つまたは複数を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の近隣領域の間の距離が、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５または３１〜４３ヌクレオチドの範囲におよぶ、請求項５０から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、ステップ（ｄ）を含み、ステップ（ｄ）で選択される前記新しい群の少なくとも１つの中のブロッキングオリゴヌクレオチドの数が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０もしくは少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、もしくは少なくとも１０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチド、および／または多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００もしくは多くとも５０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチド、例えば１０〜１０，０００または１００〜５０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドである、請求項５０から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の数が少なくとも１００であり、ステップ（ｃ）がブロッキングオリゴヌクレオチドの前記１つまたは複数の群の生成で貪欲アルゴリズムを使用する、請求項５０から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成および／またはステップ（ｃ）で生成されるかステップ（ｄ）で選択されるブロッキングオリゴヌクレオチドの前記１つまたは複数の群のオフターゲット消去を阻害することにおける有効性を実験により試験するステップをさらに含む、請求項５０から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ａ）の前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが前記１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の前記領域に完全に相補的である、請求項５０から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害することにおける、請求項４８または４９に記載のキットまたはその成分（１）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する表明
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、８３０１０９＿４１６ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは９７．５ＫＢであり、２０１９年９月１５日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通して電子的に提出されている。
【０００２】
背景
本開示は、特にトランスクリプトームシークエンシングライブラリーを構築するための、ＲＮＡ試料から望ましくないＲＮＡ種を消去するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスクリプトームシークエンシングのために構築されるライブラリーは、シークエンシング予算の大半を取り上げ、ＲＮＡシークエンシングを極めて非効率にする、大量の望ましくない種（例えば、細胞質リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアリボソームＲＮＡおよびグロビンｍＲＮＡ）で構成される。ｒＲＮＡだけで、試料で見出されるＲＮＡの８０％より多くを構成する。その結果、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリーからｍＲＮＡを富化するかまたは望ましくないＲＮＡを消去するために、様々な方法が開発されている。例えば、ポリ（Ａ）ＲＮＡは、ＲＮＡ試料から単離される。有効であるが、この手順は面倒であり、長い非コードＲＮＡまたはポリＡテールが欠如している他のＲＮＡの特徴付けを可能にしない。さらに、それはＦＦＰＥ試料などの、かなり傷害を受けた試料に不適当である。他の方法は、ＮＧＳライブラリー構築の前にＲＮＡ試料中の望ましくないＲＮＡをハイブリダイズするために、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡのプローブを使用する。ハイブリダイゼーションの後、一手法では、試料を二本鎖ＲＮＡ特異的酵素（ＲＮアーゼＨ）で消化し、このようにしてＲＮＡプローブおよび望ましくないＲＮＡを除去する。しかし、この方法はあまり効率的でなく、技術的不確実性に満ちている。代わりの手法ではプローブはビオチン化プローブであり、プローブ／標的ＲＮＡ分子をストレプトアビジンでコーティングされたビーズまたは表面に捕捉することによって、望ましくないＲＮＡが試料から選択的に除去されることを可能にする。しかし、この方法は時間がかかり、高コストであり、若干有効なだけである。さらに、ビーズの結合および洗浄は困難であり、非特異的結合および捕捉のために通常かなりの試料喪失をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ＲＮＡ試料から望ましくないＲＮＡ種を消去するための方法、ブロッキングオリゴヌクレオチド、組成物およびキットを提供する。
【０００５】
一態様では、本開示は、逆転写の間に、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法であって：
（ａ）１つまたは複数の所望のＲＮＡ種および１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を含むＲＮＡ試料を提供するステップ、
（ｂ）１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域にアニールさせて鋳型混合物を生成するステップであって、
１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的であり、それに安定して結合し、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変を含む、ステップ、および
（ｃ）鋳型混合物を：
（ｉ）少なくとも１つの逆転写酵素、
（ｉｉ）１つまたは複数の逆転写プライマー、および
（ｉｉｉ）反応緩衝液
を含む反応混合物と一緒に、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を鋳型として使用してｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件の下でインキュベートするステップであって、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を使用したｃＤＮＡ合成は阻害される、ステップ、を含む方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本開示は、望ましくないＲＮＡ種の複数の領域に相補的である（好ましくは完全に相補的である）ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットであって、各ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域へのその結合を増大させる、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、セットを提供する。
【０００７】
関連する態様では、本開示は、ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットを提供する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するキットであって：
（１）（ａ）ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的である１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドであって、各々は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、または
（ｂ）本明細書で提供されるブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットのセット、および
（２）逆転写酵素
を含むキットを提供する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、逆転写の間に、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法であって：
（ａ）１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的な複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを生成するステップ、
（ｂ）許容されないブロッキングオリゴヌクレオチドをフィルタリングするステップ、
（ｃ）１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の群を生成するステップ、および
（ｄ）必要に応じて群の間でブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルしてブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群を生成し、ブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群の１つまたは複数を選択するステップ
を含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害することにおける、請求項２８から４３のいずれかのキットまたはその構成要素（１）の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例２による望ましくないＲＮＡ種の消去における、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の使用とブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカーＢ１からＢ１９３）の使用の間で非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する散布図である。
【００１２】
【図２】図２は、実施例２による望ましくないＲＮＡ種の消去における、ブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカーＢ１からＢ１９３）の使用とポリＡ選択の間で非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する散布図である。
【００１３】
【図３】図３は、実施例２による望ましくないＲＮＡ種の消去における、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の使用とポリＡの使用の間で非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する散布図である。
【００１４】
【図４】図４は、実施例２による望ましくないＲＮＡ種の消去におけるＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の使用と消去なしの間で非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する散布図である。
【００１５】
【図５】図５は、実施例２による望ましくないＲＮＡ種の消去におけるブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカーＢ１からＢ１９３）の使用と消去なしの間で非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する散布図である。
【００１６】
【図６】図６は、実施例４に記載のブロッカーを設計するための例示的なアルゴリズムを記載する。
【００１７】
【図７】図７は、実施例４に記載されるブロッカーの数とブロッカーによってカバーされる標的５Ｓ  ｒＲＮＡの割合の間の関係を示すグラフである。
【００１８】
【図８】図８は、実施例４に記載されるブロッカーの数とブロッカーによってカバーされる標的１６Ｓ  ｒＲＮＡの割合の間の関係を示すグラフである。
【００１９】
【図９】図９は、実施例４に記載されるブロッカーの数とブロッカーによってカバーされる標的２３Ｓ  ｒＲＮＡの割合の間の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、ＲＮＡ試料から望ましくないＲＮＡ種を消去するための方法、ブロッキングオリゴヌクレオチド、組成物およびキットを提供する。生じる消去されたＲＮＡ試料は様々な下流の適用のために、特にトランスクリプトームシークエンシングライブラリーを構築するために有益である。
【００２１】
本明細書で提供される方法は、逆転写の間に望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するために、望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的なブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）強化アンチセンスオリゴヌクレオチド）を使用する。
【００２２】
同様に、指定された位置で望ましくないＲＮＡ（例えば、細胞質およびミトコンドリアのｒＲＮＡ、グロビンｍＲＮＡ）に沿って、敷き詰められたブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ強化アンチセンスオリゴヌクレオチド）を設計するための方法も開示される。一般的に使用される逆転写温度で望ましくないＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドの持続的な結合を促進するために、ＬＮＡ塩基はオリゴヌクレオチドに配置される。
【００２３】
本明細書で提供される望ましくないＲＮＡ種を消去する方法は、既存の方法と比較して以下の利点の１つまたは複数を有する：（１）本方法による望ましくないＲＮＡ消失はＮＧＳライブラリー構築の前というよりはその間に起こるので、それらはより速く、より少ない工程をとる；（２）本方法は、係留されたオリゴ（ｄＴ）プライムドライブラリーだけでなく、ランダムな６ｍｅｒプライムドライブラリーと使用することもできる；（３）本方法は、（オリゴ（ｄＴ）を使用してポリ（Ａ）含有ＲＮＡだけを富化することと対照的に）いかなる望ましくないＲＮＡも消去するために使用することができる；（４）本方法は、（オリゴ（ｄＴ）を使用したポリ（Ａ）ｍＲＮＡ富化と対照的に）試料の残りのＲＮＡプロファイルを有意に変化させない；（５）本方法は、望ましくないＲＮＡを消去することにおいて既存の方法よりも有効であるかまたは少なくともそれと同じくらい有効である；および（６）本方法は、より少ない試料喪失（例えば、ビオチン標識アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用したｒＲＮＡ除去と比較して）を引き起こす。
【００２４】
以下の記載では、本明細書で提供されるいかなる範囲も、その範囲内の全ての値を含む。用語「または」は、内容が別途指図しない限り、「および／または」（すなわち、代替物のいずれか１つ、両方またはその任意の組合せを意味する）を含むその意味で一般的に用いられる点に注意すべきである。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、内容が別途指図しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。用語、「含む（include）」、「有する」、「含む（comprise）」およびそれらの変異体は同義的に使用され、非限定的であると解釈すべきである。用語「約」は、参照値の±１０％を指す。例えば、「約５０℃」は「５０℃±５℃」（すなわち、５０℃±５０℃の１０％）を指す。
【００２５】
Ａ．望ましくないＲＮＡ種を消去する方法
一態様では、本開示は、逆転写の間に、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法であって：
（ａ）１つまたは複数の所望のＲＮＡ種および１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を含むＲＮＡ試料を提供するステップ、
（ｂ）１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域にアニールさせて鋳型混合物を生成するステップであって、
１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的であり、それに安定して結合し、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変を含む、ステップ、および
（ｃ）鋳型混合物を：
（ｉ）少なくとも１つの逆転写酵素、
（ｉｉ）１つまたは複数の逆転写プライマー、および
（ｉｉｉ）反応緩衝液
を含む反応混合物と一緒に、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を鋳型として使用してｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件の下でインキュベートするステップであって、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を使用したｃＤＮＡ合成は阻害される、ステップ
を含む方法を提供する。
【００２６】
１．ｃＤＮＡ合成を阻害すること
ＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成は、逆転写の間にＲＮＡ種を鋳型として使用して生成される一本鎖または二本鎖のｃＤＮＡの量が、参照条件の下で（例えば、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの不在下で）逆転写の間に生成される一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡの量と比較して、改変された条件の下で（例えば、ＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的な１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で）統計的に有意な程度で低減される場合、阻害される。
【００２７】
合成されたｃＤＮＡの量の低減は、本明細書で提供される実施例で開示されるｑＰＣＲまたはトランスクリプトームシークエンシングを使用して測定することができ、当業者に公知である他の技術（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を含むこともできる。
【００２８】
ＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成の阻害は、ＲＮＡ種の消去、またはＲＮＡ種を消去することと呼ぶことができる。ＲＮＡ種が最初のＲＮＡ試料から物理的に除去されなくても、最初のＲＮＡ試料の下流での操作または分析におけるＲＮＡ種の関与は、ＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成の阻害のために低減または排除される。
【００２９】
２．望ましくないＲＮＡ種
用語「望ましくないＲＮＡ種」、「望ましくないＲＮＡ」または「望ましくないＲＮＡ分子」は、ＲＮＡ組成物の所与の下流の操作または分析のために最初のＲＮＡ組成物で望ましくないＲＮＡ種または分子を指す。そのようなＲＮＡ種または分子は、下流の操作または分析の標的でなく、それらに干渉することがある。
【００３０】
望ましくないＲＮＡは、最初のＲＮＡ組成物に存在する任意の望ましくないＲＮＡであってよい。望ましくないＲＮＡは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列特異的設計を可能にするために、それがその配列により目的の残りのＲＮＡ集団から識別可能な限り、任意の配列を含むことができる。
【００３１】
一実施形態により、望ましくないＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよび豊富なタンパク質ｍＲＮＡからなる群の中の１つまたは複数から選択される。
【００３２】
真核生物の試料を加工する場合、望ましくないＲＮＡは、好ましくは２８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、ミトコンドリアの１２Ｓ  ｒＲＮＡおよびミトコンドリアの１６Ｓ  ｒＲＮＡから選択される真核生物のｒＲＮＡであってよい。好ましくは、前記のｒＲＮＡタイプの少なくとも２つ、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つが消去され、ここで、好ましくは１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡが消去されるべきｒＲＮＡの中にある。一実施形態により、前記のｒＲＮＡタイプの全てが消去される。さらに、２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに加えて、１２Ｓおよび１６Ｓの真核生物ミトコンドリアｒＲＮＡ分子などの他の非コードｒＲＮＡ種を消去するのも好ましい。植物試料からの全ＲＮＡを加工する場合、クロロプラストｒＲＮＡなどのプラスチドｒＲＮＡを消去することができる。
【００３３】
ある特定の実施形態では、望ましくないＲＮＡは、２３Ｓ、１６Ｓおよび５Ｓの原核生物ｒＲＮＡからなる群より選択される、１つまたは複数である。これは、原核生物試料を加工する場合に特に実行可能である。好ましくは、全てのこれらのｒＲＮＡタイプは、それぞれのｒＲＮＡタイプに特異的であるブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の群を使用して消去される。
【００３４】
さらに、本開示の方法は、豊富なタンパク質コードｍＲＮＡ種を特異的に消去するために使用することもできる。加工された試料によっては、試料に含まれるｍＲＮＡは、ある特定の豊富なｍＲＮＡタイプに主に対応することがある。例えば、血液試料のトランスクリプトームを分析すること、例えば配列決定することを意図する場合、試料に含まれるｍＲＮＡのほとんどはグロビンｍＲＮＡに対応する。しかし、多くの適用の場合、含まれるグロビンｍＲＮＡの配列は関心がなく、したがって、タンパク質をコードするｍＲＮＡであるが、グロビンｍＲＮＡは本出願にとって望ましくないＲＮＡに相当する。追加の望ましくない豊富なタンパク質コードｍＲＮＡには、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＬＤＨＡ、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣまたは様々なミトコンドリア遺伝子を含めることができる。
【００３５】
ある特定の実施形態では、下記のように、ＲＮＡ試料は、複数の生物体からの核酸を含有する出発材料、例えば植物、動物および／もしくは細菌種を含有する環境試料、またはヒト細胞もしくは組織および１つまたは複数の細菌種を含有する臨床試料に由来すること（例えば、それから単離すること）ができる。そのような実施形態では、この方法が、複数の生物体からの特異的タイプのＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害すること（例えば、出発材料中の複数の細菌からの５Ｓ  ｒＲＮＡのｃＤＮＡ合成を阻害すること）が可能であるように、望ましくないＲＮＡ種は、出発材料に存在する複数の生物体（例えば、複数の異なる細菌）からの特異的タイプのＲＮＡ種（例えば、５Ｓ  ｒＲＮＡ）を包含するかまたはそれからなることができる。一部の他の実施形態では、この方法が、複数の生物体からの複数のタイプのＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害すること（例えば、出発材料中の複数の細菌からの５Ｓ  ｒＲＮＡのｃＤＮＡ合成を阻害すること）が可能であるように、望ましくないＲＮＡ種は、出発材料に存在する複数の生物体（例えば、複数の異なる細菌）からの複数のタイプのＲＮＡ種（例えば、５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ）を包含するかまたはそれからなることができる。
【００３６】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である異なる望ましくないＲＮＡ種の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００、または多くとも２０００、例えば、２から１，０００，０００、１００から５００，０００、５００から１００，０００、および１０００から１０，０００である。
【００３７】
３．ＲＮＡ試料
上記の通り、本明細書に開示される逆転写の間にＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法のステップ（ａ）は、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種および１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を含むＲＮＡ試料を提供することである。
【００３８】
用語「ＲＮＡ試料」は、ＲＮＡ含有試料を指す。好ましくは、ＲＮＡ試料は、出発材料から単離されたＲＮＡを含有する試料である。ＲＮＡ試料は、出発材料から単離されたＤＮＡをさらに含有することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ試料は、出発材料から単離され、さらに断片化されたＲＮＡ分子を含有する。他の場合では、ＲＮＡ試料は、特異的核酸単離なしで直接的に溶解された試料に由来する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「核酸」または「核酸（複数形）」は、一般的にサブユニット間のホスホジエステル結合によって共有結合するリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを指す。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、限定されずに、ゲノムＤＮＡ、線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび遊離の循環ＤＮＡ（例えば、腫瘍由来のまたは胎児のＤＮＡ）が含まれる。ＲＮＡには、限定されずに、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）および遊離の循環ＲＮＡ（例えば、腫瘍由来のＲＮＡ）が含まれる。非コードＲＮＡには、限定されずに、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長い非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長い遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡ（小さい干渉ＲＮＡ）が含まれる。
ＲＮＡ試料が生成される出発材料は、ＲＮＡ分子を含む任意の材料であってよい。出発材料は、細胞試料、環境試料、体から得られる試料、特に体液試料、およびヒト、動物または植物組織試料などの生体試料または材料であってよい。具体的な例には、限定されずに、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、すい臓、細胞培養物からの試料を限定されずに含む、全血、血液製剤、血漿、血清、赤血球、白血球、バフィーコート、尿、痰、唾液、精液、リンパ液、羊水、脳脊髄液、腹膜滲出液、胸水、嚢胞からの流体、滑液、硝子体液、房水、ブルサ液（bursafluid）、目洗浄液、目吸引物、肺洗浄液、骨髄吸引物、肺吸引物、生検試料、スワブ試料、動物（ヒトを含む）または植物組織、ならびに上記の試料から得られる溶解物、抽出物または材料および画分、または試料の上もしくは中に存在するかもしれない任意の細胞および微生物およびウイルスなどが含まれる。
【００４０】
ＲＮＡを含有する臨床または法医学場面から得られる材料も、出発材料の意図された意味の範囲におよぶ。好ましくは、出発材料は、真核生物または原核生物、好ましくはヒト、動物、植物、細菌または真菌類に由来する生体試料である。好ましくは、出発材料は、細胞、組織、腫瘍細胞、細菌、ウイルスおよび体液、例えば血液、血液製剤（例えば、バフィーコート、血漿および血清）、尿、体液（liquor）、痰、大便、ＣＳＦおよび精液、上皮スワブ、生検、骨髄試料および組織試料、好ましくは器官組織試料、例えば肺、腎臓または肝臓からなる群より選択される。
【００４１】
出発材料には、保存、固定および／または安定化された試料などの加工された試料も含まれる。そのような試料の非限定的な例には、保存された、例えばホルマリン固定およびパラフィン包埋された細胞含有試料（ＦＦＰＥ試料）、または架橋もしくは非架橋固定剤（例えば、グルタルアルデヒド）もしくはＰＡＸｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅシステムで処理された他の試料が含まれる。例えば、ＦＦＰＥによって外科的手順の後に腫瘍生検試料が慣例的に保存され、それはＲＮＡの完全性を損なうことがあり、特に含まれるＲＮＡを分解することがある。したがって、ＲＮＡ試料は、改変または分解されたＲＮＡからなるかまたはそれを含むことができる。改変または分解は、例えば、保存剤による処理によることがある。
【００４２】
核酸は、ＲＮＡ試料を提供するために、当技術分野で公知の方法によって出発材料から単離することができる。ＲＮＡ試料は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含有することができる。ある特定の実施形態では、出発材料中のＤＮＡは除去または分解されているので、ＲＮＡ試料はＲＮＡを主に含有する。ＲＮＡ試料中のＲＮＡは、出発材料から単離された全ＲＮＡであってよい。あるいは、ＲＮＡ試料中のＲＮＡは、出発材料から単離された全ＲＮＡの画分（例えば、大部分はｍＲＮＡを含有する画分）であってよく、ここでは、ある特定のＲＮＡ種（例えば、ポリ（Ａ）テールのないＲＮＡ）が消去または除去されている。
【００４３】
上で開示される通り、ＲＮＡ試料は、出発材料から単離され、さらに断片化されたＲＮＡ分子を含有することができる。単離されたＲＮＡなどの核酸を断片化することは、物理的、酵素的または化学的に実行することができる。物理的断片化には、音響せん断、超音波処理および流体力学的せん断が含まれる。酵素的断片化は、５’リン酸および３’ヒドロキシル基を有する小さい断片にＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＩＩＩ）を使用することができる。化学的断片化には、熱および二価金属カチオン（例えば、マグネシウムまたは亜鉛）が含まれる。
【００４４】
同様に、上で開示されている通り、ある特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、特異的核酸単離が実行されていない粗製の溶解物に由来する。
【００４５】
４．所望のＲＮＡ種
望ましくないＲＮＡに加えて、ＲＮＡ試料は、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種も含有する。所望のＲＮＡ種は、その特徴（例えば、発現レベルまたは配列）に関心がある、任意のＲＮＡ種または分子であってよい。ある特定の実施形態では、所望のＲＮＡ種は、ｍＲＮＡ、好ましくはその発現レベルの変化（参照発現レベルと比較して）、またはその配列の変化（野生型配列と比較して）が疾患もしくは障害と、または疾患もしくは障害の処置への応答と関連するものを含む。
【００４６】
５．ブロッキングオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「ブロッキングオリゴヌクレオチド」は、望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的であり、それに安定して結合することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域を「標的にする」と記載することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端の改変（すなわち、「３’改変」）のために伸長させることができない。その結果として、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、逆転写の間に望ましくないＲＮＡ種の領域を鋳型として使用して、ｃＤＮＡ合成を阻害することができる。
【００４７】
ＲＮＡ種を含むＲＮＡ試料の逆転写の間に、オリゴヌクレオチドがＲＮＡ種の領域にアニールし、ＲＮＡ種の領域に結合したままであるならば、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ種の領域に安定して結合することが可能である。
【００４８】
好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、同じ配列を有するがいかなる改変されたヌクレオチドもないオリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させる、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含有する。ある特定の他の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、上記の改変されたヌクレオチドのいずれも含有しないが、逆転写の間に望ましくないＲＮＡ種の領域に安定して結合することができるほど十分に長い。
【００４９】
ブロッキングオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させる１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含有する実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域は、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、例えば長さが少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドであってよい。そのような領域は、長さが多くとも１００ヌクレオチド、例えば長さが多くとも９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ヌクレオチドであってよい。ある特定の実施形態では、領域は、長さが１０〜１００ヌクレオチド、例えば長さが１５〜８０、２０〜６０、２５〜４０、１０〜３０、１６〜２４または１８〜２２ヌクレオチドであってよい。
【００５０】
ブロッキングオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させるいかなる改変されたヌクレオチドも含有しない実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域は、長さが少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドであってよい。そのような領域は、長さが多くとも１００ヌクレオチド、例えば長さが多くとも９０、８０、７０、６０または５０ヌクレオチドであってよい。ある特定の実施形態では、領域は、長さが２０〜１００ヌクレオチド、例えば長さが２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、２５〜５０、２５〜４０、２５〜３０、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、３５〜９０、３５〜８０、３５〜７０、３５〜６０、３５〜５０、３５〜４０、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０または４０〜５０ヌクレオチドであってよい。
【００５１】
上で開示されるように、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的である。オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％または好ましくは少なくとも９５％が望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的である場合、オリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的である。ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域と１つまたは複数の（例えば、多くとも６、多くとも５、多くとも４、多くとも３、多くとも２またはわずか１つの）ヌクレオチドミスマッチを含む。好ましくは、ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近く（例えば、そこから最初の１０ヌクレオチド以内、例えば最初の５ヌクレオチド以内）にある。例えば、５’−ＧＡＣＡＡＡＣＣＣＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号１５）の配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端の「Ｇ」と望ましくないＲＮＡ種の領域の３’末端の「Ｇ」の間にミスマッチがあるとしても、望ましくないＲＮＡ種の３’−ＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＣ−５’（配列番号５０８）の領域に相補的である。ある特定の他の実施形態では、望ましくないＲＮＡ種の領域の完全に相補的な配列と比較したとき、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチド挿入（例えば、多くとも６、多くとも５、多くとも４、多くとも３、多くとも２またはわずか１つのヌクレオチドを有する挿入）を含むことができる。例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域の２つの連続したセクションにそれぞれ完全に相補的であるが、１つまたは複数のヌクレオチドによって分離される２つのセグメントを含むことができる。
【００５２】
好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の領域に完全に相補的である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが望ましくないＲＮＡ種の領域の対応位置のヌクレオチドに相補的である場合、望ましくないＲＮＡ種の領域に完全に相補的である。例えば、５’−ＧＡＣＡＡＡＣＣＣＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号１５）の配列を有するオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の３’−ＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＣ−５’（配列番号５０９）の領域に完全に相補的である。
【００５３】
同様に上で開示されるように、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、逆転写の間にオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変を有する。３’改変はオリゴヌクレオチドの３’−ＯＨを別の基（例えば、リン酸基）で置き換え、それは、生じるオリゴヌクレオチドが逆転写の間に逆転写酵素によって伸長することを不可能にする。そのような改変を含有するオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ３’改変には、限定されずに、３’ｄｄＣ（ジデオキシシチジン）、３’インバーテッドｄＴ、３’Ｃ３スペーサー、３’Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（３ＡｍＭｏ）および３’リン酸化が含まれる。３’改変のいくつかは、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。
【００５４】
ａ．結合を増大させるために改変されたヌクレオチドを有するブロッキングオリゴヌクレオチド
上で開示されるように、好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、同じ配列を有するがいかなる改変されたヌクレオチドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ブロッキングオリゴヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させる、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む。
【００５５】
改変されたヌクレオチドは、各々リン酸基、５炭糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、ならびにアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウリジンから選択される窒素塩基を含む天然に存在するヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００５６】
改変されたヌクレオチドは、それが、同じ条件（例えば、２０ｍＭ  ＫＣｌ）の下で測定した、同じ配列を有するがいかなる改変されたヌクレオチドも有さないオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点と比較して、改変されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点を上昇させる場合、同じ配列を有するがいかなる改変されたヌクレオチドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させる。
【００５７】
本開示で使用されるオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は、１１５ｍＭ  ＫＣｌにおいてオリゴヌクレオチドの５０％がその完全な相補体と二重鎖になり、５０％が遊離している温度である。Ｔｍは、その相補体によるオリゴヌクレオチドの吸光度変化を温度の関数として測定する（すなわち、融解曲線を生成する）ことによって決定される。Ｔｍは、融解曲線中の二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡのプラトーの間の半分の読取り値である。
【００５８】
そのようなヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのＴｍを上昇させることが可能な例示的なヌクレオチドには、限定されずに、２’−Ｏ−メチルリボース、５−ヒドロキシブチニル−２’−デオキシウリジン（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２−アミノ−２’デオキシアデノシン（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５−メチル−２’デオキシシチジン（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含むヌクレオチドが含まれる。
【００５９】
好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＬＮＡを含む。ＬＮＡは、改変されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する追加の架橋で改変される。架橋は３’−エンド（北）コンフォメーションでリボースを「ロック」し、それはＡ形二重鎖でしばしば見出される。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混ぜ合わせることができ、ワトソンクリック塩基対合則によってＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる。ロックされたリボースコンフォメーションは、塩基スタッキングおよび骨格前組織化を増強する。これは、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融点）を有意に上昇させる（例えば、Kaur et al., Biochemistry 45(23):7347-55, 2006;Owczarzy et al.,Biochemistry 50(43):9352-67, 2011を参照）。オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、二重鎖の融点の上昇は、ＬＮＡヌクレオチド１つあたり２〜８℃であってよい。１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」と呼ばれる。そのようなオリゴヌクレオチドは、従来のホスホアミダイト化学によって合成することができ、市販されてもいる（例えば、Ｅｘｉｑｏｎから）。
【００６０】
追加のブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似しているがペプチド結合によって連結される反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される骨格を有する合成ポリマーである、ペプチド核酸オリゴマーであってよい。ペプチド核酸オリゴマーでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレン架橋（−ＣＨ２−）およびカルボニル基（−（Ｃ＝Ｏ）−）によって骨格に連結される。
【００６１】
ブロッキングオリゴヌクレオチド中の改変されたヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）の数は、３〜３０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよぶ。
【００６２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドの長さであってよい。それらは、長さが多くとも１００ヌクレオチド、例えば長さが多くとも１００ヌクレオチド、例えば長さが多くとも９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ヌクレオチドであってよい。ある特定の実施形態では、長さは、１０〜１００ヌクレオチド、例えば１５〜８０、２０〜６０、２５〜４０、１０〜３０、１６〜２４または１８〜２２ヌクレオチドであってよい。
【００６３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点は、１１５ｍＭ  ＫＣｌで測定したとき、８０から９６℃、８２から９４℃、または好ましくは８６から９２℃の範囲におよぶ。
【００６４】
ｂ．結合を増大させるための改変されたヌクレオチドのないブロッキングオリゴヌクレオチド
上で開示されるように、ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間の結合を増大させるいかなる改変されたヌクレオチドも含まないが、逆転写の間に望ましくないＲＮＡ種の領域に安定して結合することができるほど十分に長い。
【００６５】
上記の改変されたヌクレオチドのないブロッキングオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドの長さであってよい。それらは多くとも１００ヌクレオチド、例えば多くとも９０、８０、７０、６０、５０、４５または４０ヌクレオチドの長さであってよい。ある特定の実施形態では、長さは、２５〜１００ヌクレオチド、例えば、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３５〜８０、３５〜７０、３５〜６０、３５〜５０、３５〜４５、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、４０〜５０または４０〜４５ヌクレオチドであってよい。
【００６６】
ブロッキングオリゴヌクレオチドとブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点は、１１５ｍＭ  ＫＣｌで測定したとき、８０から９６℃、８２から９４℃、または好ましくは８６から９２℃の範囲におよぶ。
【００６７】
ｃ．複数のブロッキングオリゴヌクレオチド
本明細書に開示される方法で使用されるブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００または少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００または少なくとも１０，０００、および／または多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００、または多くとも５０，０００、例えば２から１００，０００、１００から８０，０００、または８００から５０，０００であってよい。
【００６８】
ある特定の実施形態では、２つまたはそれより多くのブロッキングオリゴヌクレオチドが、単一の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０）に相補的である。ある特定の他の実施形態では、２つまたはそれより多くのブロッキングオリゴヌクレオチドが、複数の望ましくないＲＮＡ種（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の望ましくないＲＮＡ種）の複数の異なる領域（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の異なる領域）に相補的である。
【００６９】
複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域に相補的である、ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の２つの近隣領域の間の距離は、０から１００ヌクレオチド、例えば０から７５ヌクレオチド、０から５０ヌクレオチド、２０から１００ヌクレオチド、２０から７５ヌクレオチド、２０から５０ヌクレオチド、３０から１００ヌクレオチド、３０から７５ヌクレオチド、３０から５０ヌクレオチドまたは３０から４５ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。
【００７０】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、単一の望ましくないＲＮＡ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ５ＳのｒＲＮＡ）のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドのセットを含むかまたはそれからなる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、下の他のセクションに詳細に記載されているように等間隔の）領域に相補的である。
【００７１】
ある特定の他の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットを含むかまたはそれからなる。ブロッキングオリゴヌクレオチドの各セットは、前記のように望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドの異なるセットは、異なる望ましくないＲＮＡ種の等間隔の領域に相補的である。
【００７２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書で「ブロッカー」、「ブロッキングアンチセンスオリゴヌクレオチド」などと呼ぶこともできる。
【００７３】
本開示による方法でヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡを消去することで使用することができる例示的なブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカーＢ１〜Ｂ１９３）は、実施例に記載される。細菌の５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡをそれぞれ消去することで使用することができる例示的なブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカー５Ｓ１〜５Ｓ１００、ブロッカー１６Ｓ１〜１６Ｓ１００、ブロッカー２３Ｓ１〜２３Ｓ１００）は、実施例４に記載される。
【００７４】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの追加の記載が、下の本開示のセクションＢ、ＣおよびＤに提供される。
【００７５】
６．望ましくないＲＮＡにブロッキングオリゴヌクレオチドをアニールすること
上に開示の通り、本明細書に開示される逆転写の間にＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法のステップ（ｂ）は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドをＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域にアニールさせて鋳型混合物を生成することである。
【００７６】
このステップは、ブロッキングオリゴヌクレオチドがＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域にアニールするのに適当な条件の下で、ＲＮＡ試料を１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと混合することによって実行することができる。生じた混合物は、「アニーリング混合物」と本明細書で呼ばれる。
【００７７】
一般的に、アニーリング混合物は、ＲＮＡ試料中のＲＮＡ分子が変性するように、高温（例えば、約６５℃、約７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃もしくは９５℃、または少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、好ましくは少なくとも７５℃）に十分な時間（例えば、少なくとも約３０秒間、例えば少なくとも１分間または少なくとも２分間）先ず加熱され、その後、より低い温度（例えば、４０℃またはそれより低い温度、例えば、２５℃またはそれより低い温度、室温またはそれより低い温度（２２℃〜２５℃）、または４℃）に冷却される。
【００７８】
冷却プロセスは様々な方法で、例えば規定の時間、規定のレベルで温度を徐々に下げることで、または室温に自然に冷却させることで実行することができる。例示的な冷却プロセスには、限定されずに以下のものが含まれる：
プロセス１
温度  時間
７５℃  ２分間
７０℃  ２分間
６５℃  ２分間
６０℃  ２分間
５５℃  ２分間
３７℃  ５分間
２５℃  ５分間
４℃  保持
プロセス２
温度  時間
９０℃  ３０秒間
８５℃  ２分間
８０℃  ２分間
７５℃  ２分間
７０℃  ２分間
６５℃  ２分間
６０℃  ２分間
５５℃  ２分間
３７℃  ５分間
プロセス３
温度  時間
９０℃  ２分間
サーモサイクラーをオフにして、室温に自然冷却させる
プロセス４
温度  時間
８９℃  ８分間
７５℃  ２分間
７０℃  ２分間
６５℃  ２分間
６０℃  ２分間
５５℃  ２分間
３７℃  ２分間
２５℃  ２分間
【００７９】
アニーリング混合物中の１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの量は、ブロッキングオリゴヌクレオチドにつき約０．１ｐｍｏｌから約５０ｐｍｏｌ、例えばブロッキングオリゴヌクレオチドにつき約０．５ｐｍｏｌから約２０ｐｍｏｌ、約０．５ｐｍｏｌから約１０ｐｍｏｌ、約１ｐｍｏｌから約２０ｐｍｏｌ、約１ｐｍｏｌから約１０ｐｍｏｌ、約１．５ｐｍｏｌから約１０ｐｍｏｌ、約１．５ｐｍｏｌから約８ｐｍｏｌ、または２ｐｍｏｌから約７ｐｍｏｌであってよい。
【００８０】
好ましくは、異なるブロッキングオリゴヌクレオチドの各々のほぼ同じ量がアニール混合物中に存在する。ある特定の実施形態では、異なるブロッキングオリゴヌクレオチドの量は異なる。例えば、最も高い量を有するブロッキングオリゴヌクレオチドの、最も低い量を有するものに対するモル比は、約１０から約１．１、約５から約１．１または約２から約１．１であってよい。
【００８１】
アニーリング混合物からのＲＮＡの量は、約１ｐｇから約５０００ｎｇ、例えば約５ｐｇから約５０００ｎｇ、約１０ｐｇから約５０００ｎｇ、約１００ｐｇから約５０００ｎｇ、約１ｎｇから約５０００ｎｇ、約５ｎｇから約５０００ｎｇ、約１０ｎｇから約５０００ｎｇ、約１００ｎｇから約５０００ｎｇ、約５ｐｇから約３０００ｎｇ、約１０ｐｇから約３０００ｎｇ、約１００ｐｇから約３０００ｎｇ、約１ｎｇから約３０００ｎｇ、約５ｎｇから約３０００ｎｇ、約１０ｎｇから約３０００ｎｇ、約１００ｎｇから約３０００ｎｇ、約５ｐｇから約１０００ｎｇ、約１０ｐｇから約１０００ｎｇ、約１００ｐｇから約１０００ｎｇ、約１ｎｇから約１０００ｎｇ、約５ｎｇから約１０００ｎｇ、約１０ｎｇから約１０００ｎｇ、約１００ｎｇから約１０００ｎｇ、または約２５ｎｇから約５００ｎｇの範囲におよんでもよい。ＲＮＡの量は、少なくとも約１ｐｇ、約５ｐｇ、約１０ｐｇ、約５０ｐｇ、約１００ｐｇ、約５００ｐｇ、約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約５０ｎｇもしくは約１００ｎｇ、および／または多くとも約５００ｎｇ、約１０００ｎｇ、約３０００ｎｇもしくは約５０００ｎｇであってよい。
【００８２】
アニーリング混合物は、望ましくないＲＮＡ種へのブロッキングオリゴヌクレオチドのアニーリングを増加させるために、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ試料に加えて、１つまたは複数の一価のカチオン（例えば、Ｎａ＋およびＫ＋）を含有することができる。アニーリング混合物中の一価の濃度は、５ｍＭから５０ｍＭ、例えば１０ｍＭから３０ｍＭまたは１５ｍＭから２５ｍＭの範囲におよぶ。
【００８３】
好ましくは、アニーリング混合物は、１０ｍＭ〜３０ｍＭ、例えば１５ｍＭ〜２５ｍＭの濃度のＮａＣｌまたはＫＣｌを含有する。
【００８４】
アニーリング混合物は、ｐＨが５から９の範囲内の緩衝液、例えば２０〜５０ｎＭのホスフェートを含有する緩衝液ｐＨ６．５〜７．５を必要に応じて含むことができる。
【００８５】
アニーリングプロセスが実行されると、アニーリング混合物は「鋳型混合物」と呼ぶことができ、それは以降のｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用される。ある特定の実施形態では、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する前に、アニーリング混合物は浄化することができる。例えば、浄化は、アニーリング混合物を固体支持体と混合し、それに結合した核酸を有する固体支持体を液相から分離し、必要に応じて固体支持体を洗浄し、核酸を固体支持体から溶出させることによって、核酸（例えば、ＲＮＡ）に結合する固体支持体を使用して実行することができる。この混合、分離、必要に応じた洗浄および溶出プロセスは、一度（すなわち、２回の浄化）、二度（すなわち、３回の浄化）またはより多くの回数繰り返すことができる。例示的な固体支持体には、下記の実施例で使用される、ＱＩＡｓｅｑビーズが含まれる。
【００８６】
７．逆転写
上記の通り、本明細書に開示される逆転写の間にＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するための方法のステップ（ｃ）は、上記のように生成された鋳型混合物を、（ｉ）少なくとも１つの逆転写酵素、（ｉｉ）１つまたは複数の逆転写プライマー、および（ｉｉｉ）逆転写緩衝液を含む反応混合物と、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を鋳型として使用してｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件の下でインキュベートすることである。１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドは１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種にアニールするので、そのような望ましくないＲＮＡ種の転写は阻害される。
【００８７】
８．逆転写酵素
用語「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することが可能なＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを指す。ステップ（ｃ）で有益な逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＥＩＡＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＴＴＨ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｉ逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ  ＭＭＬＶ、ＡＳＬＶおよびそのＲＮアーゼＨ変異体、または上記の酵素のいくつかの混合物を非限定的に含む、１つまたは複数のウイルス逆転写酵素であってよい。好ましくは、逆転写酵素はＥｎｚＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素ＲＮＡ  Ｈ−（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）であり、それは、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素にとって天然の測定可能なＲＮアーゼＨ活性を排除する３つの点変異を含有する。ＲＮアーゼＨ活性の喪失は、完全長ｃＤＮＡ転写物（５ｋｂ）のより大きな収量、および野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素に対して増加した熱安定性を可能にする。増加した熱安定性は、第１鎖の反応のより高いインキュベーション温度（最高５０℃）を可能にし、ＧＣリッチな領域の鋳型ＲＮＡ二次構造の変性を助ける。
【００８８】
９．逆転写プライマー
ステップ（ｃ）で有益な逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、すなわち、デオキシチミン（ｄＴ）の一本鎖配列であってよい。オリゴ（ｄＴ）の長さは８塩基から３０塩基まで異なってよく、異なる長さのオリゴ（ｄＴ）、例えばオリゴ（ｄＴ）１２〜１８または単一の規定の長さのオリゴ（ｄＴ）、例えばオリゴ（ｄＴ）１８もしくはオリゴ（ｄＴ）２０の混合物であってよい。
【００８９】
好ましくは、ステップ（ｃ）で使用される逆転写プライマーは、ランダムプライマー、例えばランダムな６ｍｅｒ（Ｎ６）、７ｍｅｒ（Ｎ７）、８ｍｅｒ（Ｎ８）、９ｍｅｒ（Ｎ９）等である。
【００９０】
ある特定の実施形態では、逆転写プライマーは、１つまたは複数のオリゴ（ｄＴ）プライマーおよび１つまたは複数のランダムプライマーの混合物であってよい。
【００９１】
ある特定の他の実施形態では、逆転写プライマーは、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種に特異的なプライマーを含むことができる。
【００９２】
逆転写プライマーは、固定または係留された、例えば係留されたオリゴ（ｄＴ）プライマーであってよい。あるいは、それらは溶液中にあり、固相（例えば、ビーズ）に固定化されなくてもよい。
【００９３】
１０．反応緩衝液および他の成分
ステップ（ｃ）の反応混合物（「逆転写反応混合物」とも呼ばれる）は、逆転写のために適する反応緩衝液、例えばｐＨが約８．３または８．４のトリス緩衝液を、約２０から約５０ｍＭの範囲内の濃度で含む。
【００９４】
反応混合物は、各ｄＮＴＰが約０．１から約１ｍＭの範囲内（例えば、約０．５ｍＭ）の濃度のｄＮＴＰも含む。
【００９５】
反応混合物は、約１から約１０ｍＭ、例えば約３から約５ｍＭの範囲内の濃度のＭｇＣｌ２も一般的に含む。
【００９６】
反応混合物は、約１０ｍＭなどの約５から約２０ｍＭの範囲内の濃度の還元剤、例えばＤＴＴを、必要に応じてさらに含む。
【００９７】
１１．逆転写の条件
反応混合物は、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を鋳型として使用してｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件に曝される。条件は、反応混合物を１つまたは複数の適当な温度（例えば、約３５℃〜約５０℃または約３７℃〜４５℃、例えば約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃、約４５℃または約５０℃）で十分な時間（例えば、約３０分〜約１時間）、インキュベートすることを一般的に含む。ある特定の実施形態では、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのより高い温度のインキュベーションステップの前に、プライマーＴｍを上昇させるためのプライマー伸張のために、低温インキュベーションステップ（例えば、２５℃で約２〜約１０分間）を実行することができる。
【００９８】
１２．第２のｃＤＮＡ鎖を合成すること
ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）（すなわち、第１鎖ｃＤＮＡの合成）の後、本明細書に開示される方法は、二本鎖ｃＤＮＡを生成するために第２鎖ｃＤＮＡを合成するステップ（ｄ）を含むことができる。
【００９９】
第２鎖ｃＤＮＡを合成するための当技術分野で公知である手順を、ステップ（ｄ）で使用することができる。例えば、逆転写酵素の内因性ＲＮアーゼＨからもたらされるｍＲＮＡのニックおよびギャップを刻むために、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮアーゼＨを使用することができる。ポリメラーゼＩは、ニックトランスレーションによって第２鎖合成を次に開始する。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡリガーゼがその後第２鎖ｃＤＮＡに残されているいかなる切断も封鎖し、二本鎖ｃＤＮＡ生成物を生成する。
【０１００】
ステップ（ｄ）は、ＱＩＡｓｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）または他の市販キット（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）を使用して実行することもできる。
【０１０１】
１３．シークエンシングライブラリーの構築およびシークエンシング
ある特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡがステップ（ｄ）で生成された後、本明細書に開示される方法は、シークエンシングライブラリーを構築するために、ステップ（ｄ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡを増幅するためのステップ（ｅ）をさらに含む。シークエンシングライブラリーは、さらなるステップ、ステップ（ｆ）で、１つまたは複数の所望のＲＮＡ種を配列決定するために使用することができる。
【０１０２】
ステップ（ｄ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡは、当技術分野で公知である方法を使用してステップ（ｅ）でシークエンシングライブラリーを調製するために使用することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡは、末端修復すること、Ａ−付加に曝すこと、およびアダプターにライゲーションすることができる。アダプター連結ｃＤＮＡ分子は、１回または複数回の増幅（例えば、ユニバーサルＰＣＲ、ブリッジＰＣＲ、エマルションＰＣＲまたはローリングサイクル増幅）を通してさらに増幅して、シークエンシングライブラリー（すなわち、例えばシークエンシングプライマー結合部位を含む、配列決定の準備のできたＤＮＡ断片の収集物）を生成することができる。
【０１０３】
シークエンシングライブラリーは、ステップ（ｆ）において当技術分野で公知の方法を使用して配列決定をすることができる（Myllykangas et al., Bioinformatics for   High Throughput Sequencing,Rodriguez-Ezpeleta et al. (eds.), Springer Science+Business Media, LLC, 2012, pages11-25を参照）。例示的な高スループットＤＮＡシークエンシングシステムには、限定されずに、元は４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発され、その後Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって獲得されたＧＳ  ＦＬＸシークエンシングシステム、Ｓｏｌｅｘａによって開発され、その後Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって獲得されたＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Bentley,Curr Opin Genet Dev 16:545-52, 2006；Bentley et al., Nature 456:53-59, 2008を参照）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によるＳＯＬｉＤ配列システム（Smithet al., Nucleic Acid Res 38: e142, 2010；Valouev et al., Genome Res 18:1051-63,2008を参照）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって開発され、ＢＧＩによって獲得されたＣＧＡ（Drmanac et al., Science327:78-81, 2010を参照）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって開発されたＰａｃＢｉｏ  ＲＳシークエンシング技術（Eidet al., Science 323: 133-8, 2009を参照）、および、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号；２０１０／０１３７１４３号；および２０１０／０２８２６１７号を参照）が含まれる。
【０１０４】
シークエンシングライブラリーのシークエンシングから得られるシークエンシング読取りは、目的のＲＮＡ種の発現レベルおよび／または配列を決定するために分析することができる。そのような情報は、疾患の診断またはＲＮＡ試料が得られる被験体の具体的な処置への応答性の予測で役立つことができる。
【０１０５】
１４．他の下流での用途
ステップ（ｄ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡは、目的のＲＮＡ種の有無を含む発現レベルを決定するために、マイクロアレイ分析で使用することができる。追加の用途には、それらのコードされたタンパク質の機能に基づいて遺伝子を特定するか、新規遺伝子を発見するか、または異なる細胞もしくは組織における選択的スプライシングを研究するための機能性クローニングが含まれる。
【０１０６】
１５．消去効率
第１鎖ｃＤＮＡ分子は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成を阻害することにおける、ブロッキングオリゴヌクレオチドの効率を検査するためにｑＰＣＲで鋳型として使用することができる。例示的な方法は、下の実施例１に開示される。簡潔には、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合と比較して、逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の、望ましくないＲＮＡ種から逆転写されるｃＤＮＡの増幅のＣｔの増加は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが望ましくないＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成の阻害において有効なことを示す。他の処理に対して同等または改善を実証するために、Ｃｔの増加を別の処理（例えば、商業的に利用可能な処理）のものと比較することができる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の望ましくないＲＮＡ種から逆転写されるｃＤＮＡの増幅のＣｔ値は、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合のＣｔ値の少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍である。
【０１０８】
望ましくないＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成の阻害におけるブロッキングオリゴヌクレオチドの効率は、全トランスクリプトームシークエンシングを通して分析することもできる。例示的な方法は、下の実施例２に開示される。簡潔には、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合と比較して、逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の、望ましくないＲＮＡ種（例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に由来する全読取りの百分率の低下は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが望ましくないＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成の阻害において有効なことを示す。百分率の低下は、他の処理に対して同等または改善を実証するために、別の処理（例えば、商業的に利用可能な処理）のものと比較することができる。
【０１０９】
本開示による逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の、望ましくないＲＮＡ種（例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に由来する全読取りの百分率は、多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、多くとも２％、多くとも１％、多くとも０．８％、多くとも０．６％、多くとも０．５％、多くとも０．４％、多くとも０．３％、多くとも０．２％、多くとも０．１％または多くとも０．０５％であってよい。
【０１１０】
逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の、望ましくないＲＮＡ種（例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に由来する全読取りの百分率の、ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合のものに対する比は、多くとも０．２、多くとも０．１５、多くとも０．１、多くとも０．０８、多くとも０．０６、多くとも０．０５、多くとも０．０４、多くとも０．０３または多くとも０．０２である。
【０１１１】
１６．オフターゲット消去
ブロッキングオリゴヌクレオチドによるオフターゲット消去の程度を検査するために、第１鎖ｃＤＮＡ分子をｑＰＣＲで鋳型として使用することができる。例示的な方法は、下の実施例１に開示される。簡潔には、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合と比較して、逆転写の間に１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を標的にする１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の、所望のＲＮＡ種から逆転写されるｃＤＮＡの増幅のＣｔの増加は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが所望のＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成の阻害を引き起こすことを示す。そのような阻害は、「オフターゲット消去」と呼ばれる。２つの治療薬のオフターゲット消去を評価するために、Ｃｔ増加を別の処理（例えば、商業的に利用可能な処理）のものと比較することができる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合と、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合の間の所望のＲＮＡ種（例えば、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）から逆転写されるｃＤＮＡの増幅のＣｔ値の増加は、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合のＣｔ値の多くとも２０％、多くとも１５％、多くとも１０％、多くとも８％、多くとも６％、または多くとも５％である。
【０１１３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドによるオフターゲット消去の程度は、全トランスクリプトームシークエンシングを通して分析することもできる。例示的な方法は、下の実施例２に開示される。簡潔には、逆転写の間に１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種をコードするもの以外の遺伝子の相対的遺伝子発現を、逆転写の間にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用されない場合と比較する散布図を作成することができる。散布図のＲ２は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドによる処理と無処理の間で相対的遺伝子発現がどの程度類似しているかについて示す。Ｒ２が１により近いほど、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用に関連したオフターゲット消去の程度はより低い。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、上で作成される散布図のＲ２は、少なくとも０．８５、少なくとも０．８６、少なくとも０．８７、少なくとも０．８８、少なくとも０．８９、少なくとも０．９０または少なくとも０．９１である。
【０１１５】
Ｂ．ブロッキングオリゴヌクレオチドを設計すること
一態様では、本開示は、逆転写の間に、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法であって：
（ａ）１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の領域に完全に相補的な（好ましくは完全に相補的な）複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを生成するステップ、
（ｂ）許容されないブロッキングオリゴヌクレオチドをフィルタリングするステップ、
（ｃ）１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の群を生成するステップ、および
【０１１６】
（ｄ）必要に応じて群の間でブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルしてブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群を生成し、ブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群の１つまたは複数を選択するステップ
を含む方法を提供する。
【０１１７】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの選択された群は、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を、好ましくは最小限のオフターゲット消去で阻害することにおいて有効である。１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種からのｃＤＮＡ合成の阻害、およびブロッキングオリゴヌクレオチドの選択された群のオフターゲット消去に対する有効性は、上でセクションＡに記載される通りに評価することができる。
【０１１８】
好ましくは、各ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種のそれらの標的にされた領域の間の結合を増大させる、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含む。同様に好ましくは、各ブロッキングオリゴヌクレオチドは、それらの伸長を防ぐ３’改変を含む。
【０１１９】
以下の記載は、例示的なブロッキングオリゴヌクレオチドとしてＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。他の改変されたヌクレオチドを含有するブロッキングオリゴヌクレオチド、ならびに望ましくないＲＮＡ種の領域への結合を増大させるためのいかなる改変されたヌクレオチドも有さないが、望ましくないＲＮＡ種の領域に安定して結合するのに十分な長さであるものは、望ましくないＲＮＡ種を、好ましくはオフターゲット消去がほとんどなしでまたは全くなしで消去するのに有効であるように同様に設計することができる。
【０１２０】
１．ステップ（ａ）
本明細書で提供されるブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法のステップ（ａ）は、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の領域に相補的な（好ましくは完全に相補的な）複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを生成することである。
【０１２１】
このステップでは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のパラメータ、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さ、ブロッキングオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種のそれらの対応する領域（すなわち、ブロッキングオリゴヌクレオチドが完全に相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域）の間で形成される二重鎖の予測されるＴｍ、自己ハイブリダイゼーション、および望ましくないＲＮＡ種が属するトランスクリプトームでのオフターゲットハイブリダイゼーションを特徴付け、スコア付けることができる。各ブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のパラメータのスコアが、最終の合わせたスコアを生成するために使用される。そのようなプロセスの間、最終の合わせたスコアを生成するために、異なるパラメータを異なって計量することができる。
【０１２２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種のそれらの対応する領域の間で形成される二重鎖のＴｍを予測するためのアルゴリズムは、Santa Lucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-5, 1998、およびＬＮＡ含有ブロッキングオリゴヌクレオチドのＴｍ測定に基づくことができる。
【０１２３】
好ましくは、異なるパラメータを試験することによって最良のブロッキングオリゴヌクレオチドを改善して、選択するために、擬似アルゴリズムが使用される。例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種のその対応する領域の間で形成される二重鎖のＴｍは、以下の４方法によって改善することができる：（１）ＬＮＡヌクレオチドの数を低減する、（２）ＬＮＡヌクレオチドの数を増加させる、（３）ＬＮＡヌクレオチドパターンを変更する、および（４）ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さを変更する。このような方法で、変更がブロッキングオリゴヌクレオチドの全体的スコアを改善するかどうか確かめるために異なるパラメータを試験するために、複数の小アルゴリズムが使用される。
【０１２４】
ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つ、複数および全てを有することができる：
【０１２５】
（１）それらの長さは、１０から３０ヌクレオチド、好ましくは１６から２４ヌクレオチド、１７から２３ヌクレオチドまたは１８から２２ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。
【０１２６】
（２）各ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチド中のＬＮＡの数は、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよんでもよい。
【０１２７】
（３）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドとＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点は、８０から９６℃、好ましくは８６から９２℃の範囲におよぶ。
【０１２８】
（４）ステップ（ａ）で生成されるＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００または少なくとも１００００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００または多くとも５０，０００、例えば１００から１，０００，０００、５００から１００，０００、および１０００から１０，０００である。
【０１２９】
（５）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、それら自体に対してではなく、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域に結合する可能性がある。
【０１３０】
（６）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種が属するトランスクリプトームの中の他の領域に対してではなく、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域に結合する可能性がある。
【０１３１】
（７）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である（好ましくは完全に相補的である）異なる望ましくないＲＮＡ種の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００または多くとも２０００、例えば２から１，０００，０００、１００から５００，０００、５００から１００，０００および１０００から１０，０００である。
【０１３２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの追加の記載は、上のセクションＡ．５．ブロッキングオリゴヌクレオチドおよびセクションＣ．ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットで提供される。
【０１３３】
２．ステップ（ｂ）
本明細書で提供されるブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法のステップ（ｂ）は、許容されないブロッキングオリゴヌクレオチドをフィルタリングすることである。これは、ブロッキングオリゴヌクレオチドのために最小限の最終の合わせたスコアを設定することによって実行することができる。最小限の最終の合わせたスコア未満の最終の合わせたスコアを有するブロッキングオリゴヌクレオチドは、許容されないとみなされ、フィルタリングで排除される。
【０１３４】
３．ステップ（ｃ）
本明細書で提供されるブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法のステップ（ｃ）は、１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の群を生成することである。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの群は、単一ＲＮＡ種（例えば、ヒト５Ｓ  ｒＲＮＡ）の複数の領域を標的にする。
【０１３６】
ある特定の他の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの群は、複数の生物体からの単一タイプの複数のＲＮＡ種（例えば、細菌５Ｓ  ｒＲＮＡ）を標的にする。
【０１３７】
ある特定の他の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの群は、単一の生物体の複数のタイプのＲＮＡ種（例えば、ヒトｒＲＮＡ）を標的にする。
【０１３８】
ある特定の他の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの群は、複数の生物体の複数のタイプのＲＮＡ種（例えば、細菌ｒＲＮＡ）を標的にする。
【０１３９】
望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するために、望ましくないＲＮＡ種の領域がｃＤＮＡに逆転写されず、下流での分析で検出されないように、ブロッキングオリゴヌクレオチドが望ましくないＲＮＡ種に沿って拡散していることが好ましい。上位の最終の合わせたスコアを有するブロッキングオリゴヌクレオチドを選択し、望ましくないＲＮＡ種にわたって均一に拡散するものを選び出すためのプログラムを、このステップで使用することができる。
【０１４０】
好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域は、望ましくないＲＮＡ種に沿って均等に間隔があいている。異なる領域の均一な分布は、最小限のまたは低減された数の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドによる望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成の有効な阻害を可能にする。
【０１４１】
近隣領域の間の最長距離が近隣領域の間の最短距離の多くとも２．５倍、好ましくは多くとも２倍または多くとも１．５倍である場合、望ましくないＲＮＡ種の領域は均等に間隔があいている。近隣領域の間の距離は、上流領域（すなわち、望ましくないＲＮＡ種の５’末端により近い領域）の３’末端と、下流領域（すなわち、望ましくないＲＮＡ種の３’末端により近い領域）の５’末端の間のヌクレオチドの数である。例えば、望ましくないＲＮＡ種の近隣領域の間の距離が３０、３２、３５、３７、３８、４０、４３および４５である場合、近隣領域の間の最長距離が４５であり、それは最短距離３０の１．５倍であるので、そのような領域は均等に間隔があいていると考えられる。
【０１４２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の均一に分布した近隣領域の間の距離は、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５または３１〜４３ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる領域は、均一に分布していない。近隣領域の間の距離は、０〜１００ヌクレオチド、例えば、０〜７５ヌクレオチド、０〜５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜７５ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチドまたは３０〜１００ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。一般に、ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の近隣領域が互いの近くに（例えば、多くとも２５、２０、１５、１０または５ヌクレオチド離れて）位置する場合、より多くのブロッキングオリゴヌクレオチドが必要とされる。しかし、望ましくないＲＮＡ種の近隣領域の間の配列を鋳型として使用したｃＤＮＡ合成の不十分な阻害を回避するために、近隣領域は、あまりに遠くにある（例えば、７５、１００、１２５または１５０ヌクレオチドを超えて離れている）べきでない。
【０１４４】
多数（例えば、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３００、少なくとも４０００または少なくとも５０００）の異なる望ましくないＲＮＡ種を消去すべきある特定の実施形態では、標的にされた望ましくないＲＮＡ種の全カバレージを最も増加させるようにブロッキングオリゴヌクレオチドを選択することによって、群を形成することができる。異なる望ましくないＲＮＡ種は、複数の生物体からの単一タイプの望ましくないＲＮＡ（例えば、細菌５Ｓ  ｒＲＮＡ）、単一の生物体からの複数タイプの望ましくないＲＮＡ（例えば、ヒトの豊富なｍＲＮＡ）、または複数の生物体からの複数タイプの望ましくないＲＮＡ（例えば、細菌ｒＲＮＡ）であってよい。
【０１４５】
一部の実施形態では、単一のブロッキングオリゴヌクレオチドは、互いに同種である複数の生物体からの望ましくないＲＮＡ種（例えば、ある特定の細菌株からの５Ｓ  ｒＲＮＡ）を標的にすることができる。したがって、群の中のブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的にする望ましくないＲＮＡ種の数未満であってよい。
【０１４６】
多数の異なる望ましくないＲＮＡ種のカバレージを最大にするために、貪欲アルゴリズムを使用することができる。貪欲アルゴリズムは、その選択が全般的に任意の解決策につながることを希望して、常に局所的に最適な選択をするアルゴリズムである。例示的な貪欲アルゴリズムは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さ（「ＢＬＯＣＫＥＲ  ＬＥＮＧＴＨ」）、望ましくないＲＮＡ種にアニールするときの近隣のブロッキングオリゴヌクレオチド間の距離（「ＤＩＳＴＡＮＣＥ」）および群を形成するブロッキングオリゴヌクレオチドの数（「ＮＵＭＢＥＲ」）を最初に規定し、以下のステップを実行することを含むことができる：
【０１４７】
１．標的配列のセットにおいてＫ＝ＢＬＯＣＫＥＲ  ＬＥＮＧＴＨを有する全てのｋｍｅｒの頻度を数える、
２．頻度によりｋｍｅｒを分類する、
３．最も高い頻度のｋｍｅｒをブロッカーセットに加える、
４．全ての標的配列で選択されたｋｍｅｒの位置を見出す、
５．各標的配列においてｋｍｅｒ位置の０．５〜２ＤＩＳＴＡＮＣＥ（好ましくは１ＤＩＳＴＡＮＣＥ）下流の、および０．２〜１ＤＩＳＴＡＮＣＥ（好ましくは０．５ＤＩＳＴＡＮＣＥ）上流のｋｍｅｒを決定する、
６．頻度リストの中のＤＩＳＴＡＮＣＥの範囲内のｋｍｅｒを減らす、および
７．ブロッカーのＮＵＭＢＥＲに到達するまでステップ２〜６を繰り返す。
【０１４８】
細菌５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を消去するブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するためにそのようなアルゴリズムを使用する例は、実施例４に提供される。
【０１４９】
そのような設計アルゴリズムは、標的配列の全体のカバレージを最も増加させるブロッカーの選択で有益である。ｋｍｅｒの頻度はしばしば自己相関しているので、隣接したｋｍｅｒの数を減少させることは以前に選択されたブロッカーによって既にカバーされている領域でブロッカーを選択することを回避する。上流のｋｍｅｒ数を減少させることは、下流の既に選択されたブロッカーに近すぎるブロッカーを選択することを回避する。そのようなアルゴリズムは、より少ない標的配列を完全にカバーするよりは、可能な限り多くの標的配列を部分的にカバーするように調整される。
【０１５０】
４．ステップ（ｄ）
ステップ（ｃ）で複数の群が生成されるある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するための方法は、ブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群を生成するために、群の間でブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルすること、およびブロッキングオリゴヌクレオチドの新しい群の１つまたは複数を選択することをさらに含むことができる。
【０１５１】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの群は、群の中のブロッキングオリゴヌクレオチドの平均スコアとしてスコア付けることができる。スコア付けに影響するパラメータには、ブロッキングオリゴヌクレオチドの物理的パラメータ、例えばブロッキングオリゴヌクレオチドと望ましくないＲＮＡ種のそれらの対応する領域の間で形成される二重鎖の融点、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さ、ブロッキングオリゴヌクレオチドの自己ハイブリダイゼーション、ＬＮＡパターン、ブロッキングオリゴヌクレオチドの中のＬＮＡヌクレオチドの数、およびブロッキングオリゴヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーション；ならびに群パラメータ、例えば、望ましくないＲＮＡ種のそれらの対応する領域にアニールするときの近隣のブロッキングオリゴヌクレオチドの間の最小および最大の距離、および群の中のブロッキングオリゴヌクレオチドの間での交差ハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１５２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの群の間でブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルするこのステップでは、一群のブロッキングオリゴヌクレオチドの中の交差ハイブリダイゼーションは最小にされる。例えば、互いと高いＴｍ（例えば、６５℃を超える）で二重鎖を形成することができるブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、最小にされる。
【０１５３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドをシャッフルし、一群のブロッキングオリゴヌクレオチドのスコアが増加するか試験するために、プログラムを使用することができる。最も高い群スコアを有する一群のブロッキングオリゴヌクレオチドを生成するために、このプロセスを複数回繰り返すことができる。所与の望ましくないＲＮＡ種の各々のために（例えば、１つの群は最も高い群スコアを有するヒト５．８Ｓ  ｒＲＮＡを標的にし、別の群は別の最も高い群スコアを有するヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡを標的にする）、または、所与のタイプの望ましくないＲＮＡ種のために（例えば、１つの群は最も高い群スコアを有する細菌ｒＲＮＡを標的にし、別の群は別の最も高い群スコアを有する細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的にする）、最も高い群スコアを各々有するブロッキングオリゴヌクレオチドの複数の群を生成することができる。
【０１５４】
最も高いスコアを有する選択された群は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチド、および／または多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、または多くとも５０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチド、例えば１０〜１０，０００、または１００〜５０００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドを有することができる。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数の群が選択され、そのような群は、ＲＮＡ試料からの望ましくないＲＮＡ種にアニールする場合、一緒にプールしてもよい。あるいは、それらは、それらの標的の望ましくないＲＮＡ種に別々にアニールすることができる。
【０１５６】
５．ブロッキング効率およびオフターゲット消去のための実験的試験
ブロッキングオリゴヌクレオチドの選択された群は、そのブロッキング効率および／またはオフターゲット消去のために実験によりさらに試験することができる。そのような試験のための例示的な方法は、上のセクションＡおよび下の実施例に記載される。
【０１５７】
Ｃ．ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは組成物
一態様では、本開示は、望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドのセットを提供する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的（好ましくは、完全に相補的）である。
【０１５８】
セットの中のブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、もしくは少なくとも５０、および／または多くとも１０００、多くとも９００、多くとも８００、多くとも７００、多くとも６００、多くとも５００、多くとも４００、多くとも３００もしくは多くとも２００、例えば２〜１０００、５〜５００および１０〜３００であってよい。
【０１５９】
好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドのセットであり、以下の特性のうちの１つから全てを有することができる：
（１）それらの長さは、１０から３０ヌクレオチド、好ましくは１６から２４ヌクレオチド、１７から２３ヌクレオチドまたは１８から２２ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。
（２）各ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチド中のＬＮＡの数は、２〜２０、好ましくは４〜１６、より好ましくは３〜１５の範囲におよんでもよい。
（３）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドとＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域の間で形成される二重鎖の融点は、８０から９６℃、好ましくは８６から９２℃の範囲におよぶ。
（４）望ましくないＲＮＡ種の長さによって、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０または少なくとも８０である。
（５）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、それ自体ではなく、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域に結合する可能性がある。
（６）ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないＲＮＡ種が属するトランスクリプトームの中の他の領域ではなく、ＬＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域に結合する可能性がある。
（７）（ａ）ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域は、望ましくないＲＮＡ種に沿って均一に分布し、近隣領域の間の距離は、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５または３１〜４３ヌクレオチドの範囲におよんでもよいか、または
（ｂ）ブロッキングオリゴヌクレオチドが相補的である望ましくないＲＮＡ種の領域は、望ましくないＲＮＡ種に沿って均一に分布しておらず、近隣領域の間の距離は０〜１００ヌクレオチド、例えば、０〜７５ヌクレオチド、０〜５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜７５ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、または３０〜１００ヌクレオチドの範囲におよんでもよい。
【０１６０】
関連する態様では、本開示は、複数の望ましくないＲＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するためのブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットを提供する。ブロッキングオリゴヌクレオチドの各セットは、前記のように望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的（好ましくは、完全に相補的）である。ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの異なるセットは、異なる望ましくないＲＮＡ種の複数の異なる（好ましくは、等間隔の）領域に相補的である。
【０１６１】
セットの数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００もしくは多くとも２０００、例えば２〜１０，０００、２〜５０００、２〜１０００、２〜５００、２〜２００、１０〜１０，０００、１０〜５０００、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２００、１００〜１０，０００、１００〜５０００、１００〜１０００または１００〜５００であってよい。
【０１６２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットの中のブロッキングオリゴヌクレオチドの総数は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００もしくは少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００もしくは少なくとも１０，０００、および／または多くとも１００，０００、多くとも９０，０００、多くとも８０，０００、多くとも７０，０００、多くとも６０，０００もしくは多くとも５０，０００、例えば２〜１００，０００、１００〜８０，０００または８００〜５０，０００であってよい。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットが標的にする複数の望ましくないＲＮＡ種は、単一の生物体からの複数のタイプのＲＮＡ種（例えば、ヒト５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡ）に属する。ある特定の他の実施形態では、複数の望ましくないＲＮＡ種は、複数の生物体に由来する。そのような実施形態では、複数の望ましくないＲＮＡ種は、単一タイプのＲＮＡ種（例えば、複数の細菌株からの５Ｓ  ｒＲＮＡ）または複数の異なるタイプのＲＮＡ種（例えば、複数の細菌株からの５Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ）に属することができる。
【０１６４】
ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットが完全に相補的である異なる望ましくないＲＮＡ種の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４もしくは少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００、および／または多くとも１，０００，０００、多くとも５００，０００、多くとも１００，０００、多くとも５０，０００、多くとも１０，０００、多くとも９０００、多くとも８０００、多くとも７０００、多くとも６０００、多くとも５０００、多くとも４０００、多くとも３０００もしくは多くとも２０００、例えば２〜１，０００，０００、１００〜５００，０００、５００〜１００，０００および１０００〜１０，０００である。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットが調製され、各セットは、単一の生物体（例えば、ヒト、植物、特定の細菌株）からの１つまたは複数の望ましくない種を標的にする。所与の試料中にどんな生物体が潜在的に存在しているかによって、そのような生物体の望ましくない種を標的にするブロッキングオリゴヌクレオチドの異なるセットを一緒に組み合わせて、それらの生物体から望ましくないＲＮＡ種を消去することにおいて使用することができる。その望ましくないＲＮＡ種を消去すべき異なる生物体の数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０および／または多くとも１０，０００、多くとも５，０００、多くとも１０００、多くとも５００もしくは多くとも１００、例えば２〜１０，０００、５〜５，０００もしくは１０〜１，０００であってよい。
【０１６６】
関連する態様では、本開示は、このセクションおよび他のセクション（例えば、セクションＡ）に記載されている、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットおよび／またはブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットを含む組成物または混合物を提供する。例えば、混合物は、ヒトの望ましくないＲＮＡ種を標的にするオリゴヌクレオチド、および病原性細菌株からの１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種を標的にする１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドの複数のセットを含むことができる。
【０１６７】
Ｄ．望ましくないＲＮＡ種を消去するためのキット
本開示は、ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＤＮＡ種のｃＤＮＡ合成を阻害するキットであって：（１）（ａ）ＲＮＡ試料中の１つまたは複数の望ましくないＲＮＡ種の１つまたは複数の領域に相補的（好ましくは、完全に相補的）である１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、（ｂ）ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは複数のセット、および（２）逆転写酵素を含むキットも提供する。
【０１６８】
上のセクション（例えば、セクションＡ．５．およびＣ）は、キットに含まれてもよい１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットまたは複数のセット、および逆転写酵素を記載するために言及される。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、キットは以下の成分の１つから全てをさらに含むことができる：
逆転写プライマー、
逆転写に適する反応緩衝液、
第２のｃＤＮＡ鎖合成のための酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＨ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ）、
ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ）、
ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、哺乳動物のＤＮＡリガーゼおよび熱安定性のＤＮＡリガーゼ）、
シークエンシングのためのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２）、
ＤＮＡ増幅および／またはシークエンシングのためのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
アダプター（一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子にライゲーションさせることができる一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド）。
【０１７０】
キットの成分は、一般的に別々の容器またはコンパートメントに含有される。しかし、適当な場合、成分のいくつかは混合物または組成物として提供されてもよい。成分の追加の記載は、本開示の実施例を含む他のセクションで提供される。
【０１７１】
以下の実施例は例示のためであり、限定するものでない。
【実施例】
【０１７２】
本開示の実施例１〜３で、以下の材料および試薬が使用された：
ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（ＵＨＲＲ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
ブロッカーの１９３個のプール（Ｂ１〜Ｂ１９３）、その配列は下の表に示す。
ブロッカーの９６個のプール（Ｂ１〜Ｂ１９３の奇数のウェルだけ、すなわち、Ｂ１、Ｂ３、・・・、Ｂ１９３）。
５×ＢＣ３  ＲＴ緩衝液：Ｑｉａｇｅｎ  ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄキットからの５×逆転写緩衝液
ＱＩＡｓｅｑビーズ
Ｎ６プライマー：ＩＤＴに注文したランダムな６ｍｅｒ（標準の脱塩）。
フォワードプライマー１８Ｓ  ＦＰ２：ＣＴＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣ（配列番号１）
リバースプライマー１８Ｓ  ＲＰ２：ＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＡＧＡＡＣＧ（配列番号２）
フォワードプライマー１８Ｓ  ＦＰ１：ＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＧ（配列番号３）
リバースプライマー１８Ｓ  ＲＰ１：ＣＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧ（配列番号４）
フォワードプライマー１８Ｓ  ＦＰ３：ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ（配列番号５）
リバースプライマー１８Ｓ  ＲＰ３：ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ（配列番号６）
フォワードプライマー１８Ｓ  ＦＰ４：ＧＧＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号７）
リバースプライマー１８Ｓ  ＲＰ４：ＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＴ（配列番号８）
フォワードプライマーＧＡＰＤＨ  ＦＰ：ＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧ（配列番号９）
リバースプライマーＧＡＰＤＨ  ＲＰ：ＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧ（配列番号１０）
フォワードプライマーＡＣＴＢ  ＦＰ：ＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号１１）
リバースプライマーＡＣＴＢ  ＲＰ：ＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１２）
フォワードプライマーＲＰＬＰ０  ＦＰ：ＣＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＣ（配列番号１３）
リバースプライマーＲＰＬＰ０  ＲＰ：ＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＣ（配列番号１４）
２×ＰＡ−０１２  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：ＱＩＡＧＥＮからのＤＮＡポリメラーゼを含むｑＰＣＲのための２×マスターミックス。
【表１−１】
2022502028.tif 000003
【表１−２】
2022502028.tif 000004
【表１−３】
2022502028.tif 000005
【表１−４】
2022502028.tif 000006
【表１−５】
2022502028.tif 000007
【表１−６】
2022502028.tif 000008
【表１−７】
2022502028.tif 000009
【表１−８】
2022502028.tif 000010
【表１−９】
2022502028.tif 000011
「+」は、次のヌクレオチド(すなわち、「+」の右のヌクレオチド)がLNAヌクレオチドであることを示す。例えば、B193では、「+A」、「+C」および「+T」は、塩基A、CおよびTをそれぞれ有するLNAヌクレオチドを示す。
【０１７３】
（実施例１）
本開示の例示的な方法とＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  ＲＥＭＯＶＡＬキットの間の比較
この実施例は、ｑＰＣＲを通したＩｌｌｕｍｉｎａによるＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキットを使用したものと本開示の例示的な方法の望ましくないＲＮＡ消去を記載する。
【０１７４】
段階的ワークフロー：
１ａ．ブロッカーを全ＲＮＡ試料とハイブリダイズさせる
Ａ．２０ｍＭ  ＫＣｌも含有する１５μｌの体積で、１００ｎｇのユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（ＵＨＲＲ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をブロッカー（Ｂ１〜Ｂ１９３）と混合する。
Ｂ．サーモサイクラーでインキュベートする：
【表２】
2022502028.tif 000012
【０１７５】
１ｂ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｉｂｏ−ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキットを使用したｒＲＮＡ消去：
Ａ．反応ごとに、２２５μｌの磁気ビーズを２２５μｌの水で２回洗浄する。全ての上清を取り除く。
Ｂ．６５μｌの磁気ビーズ再懸濁溶液を加え、混合する。室温で、とっておく。
Ｃ．別のチューブでは、１０μｌのＲｉｂｏ−ｚｅｒｏ  Ｒｅｍｏｖａｌ溶液、４μｌの反応緩衝液、ＲＮＡ試料および水を、４０μｌの総体積まで混合する。６８℃で１０分間インキュベートする。室温で５分間インキュベートする。
Ｄ．ステップＣからの試料をステップＢからの試料と混合し、室温で５分間インキュベートする。５０℃で５分間インキュベートする。
Ｅ．上清（すなわち、消去した試料）を清潔なチューブに移す。
Ｆ．２体積のＱＩＡｓｅｑビーズを１体積のステップＥからの試料に加える。ＲＮＡが結合した後、２００μｌの８０％エタノールで２回洗浄する。乾燥させる。２０μｌの水に最終試料を溶出させる。
【０１７６】
２ａ．ステップ１ａの後の逆転写反応
Ａ．一緒に混合する
前のステップからのＲＮＡ：１３μｌ
【表３】
2022502028.tif 000013
Ｂ．サーモサイクラーでインキュベートする：２５℃１０分間、４２℃３０分間、４℃で保持。
【０１７７】
２ｂ．ステップ１ｂの後の逆転写反応
１つの例外を除いてステップ２ａと同じに実行する：
１３μｌの試料を使用する代わりに、０．３６μｌだけを使用する（ステップ２ａと同等のインプットを達成するために）
【０１７８】
３．ｃＤＮＡを精製する
８０μｌの水および１３０μｌのＱＩＡｓｅｑビーズを、ステップ２ａまたはステップ２ｂからの２０μｌ試料に加える。結合したｃＤＮＡを２００μｌの８０％エタノール（ＥｔＯＨ）で２回洗浄する。乾燥させる。２０μｌの水に溶出させる。
【０１７９】
４．ｑＰＣＲを実行する
Ａ．一緒に混合する
【表４】
2022502028.tif 000014
Ｂ．リアルタイム機器でインキュベートする：９５℃９分間、９８℃１分間、４０サイクルの（９８℃１５秒間、６０℃１．５分間、データ収集を行う）。
【表５】
2022502028.tif 000015
【０１８０】
データの要約：
試料１〜５のＣｔ値は、漸増量のＢ１〜Ｂ１９３ブロッカーを使用することが、ブロッカーのない試料６のものと比較して、４ｑＰＣＲプライマーアッセイによって測定された１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡ領域のより少ない合成をもたらしたことを示す（１８Ｓ  ＦＰ２およびＲＰ２、１８Ｓ  ＦＰ１およびＲＰ１、１８Ｓ  ＦＰ３およびＲＰ３、ならびに１８Ｓ  ＦＰ４およびＲＰ４）。１８．５５ｐｍｏｌの各ブロッカーを使用することは、１８Ｓ  ｒＤＮＡ  ｃＤＮＡ合成のブロッキングで最良の結果を与えた。
【０１８１】
試料２〜５の３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢおよびＲＰＬＰ０）のＣｔ値は、ブロッカーのない試料６と比較した試料２〜５の類似のＣｔ値のために、ブロッカーの存在によるオフターゲット効果がなかったことを示す。１８．５５ｐｍｏｌの各ブロッカー（試料１）は、ブロッカーなし（試料６）と比較してさらなるオフターゲット効果を引き起こした。
【０１８２】
試料７（Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ消去）および試料８（Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ消去なし）の間のＣｔ値の比較は、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌキットを使用することが、ｑＰＣＲプライマーアッセイによって測定された１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡ領域のより少ない合成をもたらしたこと、およびＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ消去がオフターゲット効果を引き起こさなかったことを示す。
【０１８３】
データは、１９３ブロッカープールのそれぞれ８．７５ｐｍｏｌが、ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡの量およびオフターゲット効果の両方の低減において少なくともＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏと同じくらい良好に作用したことをさらに示す。
【０１８４】
（実施例２）
全トランスクリプトームライブラリーのシークエンシングを介した、本開示の例示的な方法と、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏキット、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ富化および無処理との比較
この実施例は、全トランスクリプトームライブラリーのシークエンシングを介して、本開示の例示的な方法の１８Ｓ  ｒＲＮＡ消去を、ＲｉｂｏＺｅｒｏキット、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ富化、および無処理のものと比較した。
【０１８５】
段階的ワークフロー：
１．Ａ．ブロッカーの１９３プールのために：１００ｎｇ  ＵＨＲＲを、８．７５ｐｍｏｌの各ブロッカーと一緒に混合する。下のステップ２のＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットに進む。
【０１８６】
Ｂ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｒｉｂｏ−ｚｅｒｏのために：以下の改変を除いて実施例１のステップ１ｂと同じプロトコールを使用する：
＊９０μｌの磁気ビーズおよび３５μｌの再懸濁溶液を使用する。
＊２０μｌの最終体積のために、１００ｎｇのＵＨＲＲを、２μｌのＲｉｂｏ−ｚｅｒｏ除去溶液、２μｌの反応緩衝液および水を混合する。
下のステップ２のＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットに進む。
【０１８７】
Ｃ．ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ富化のために：ＱＩＡｓｅｑ鎖ｍＲＮＡ選抜キットを以下の通りに使用する：
ｉ．１００ｎｇのＵＨＲＲ、１μｌのＲＮアーゼ阻害剤、２５０μｌの緩衝液ｍＲＢＢ、２５μｌの純粋なｍＲＮＡビーズおよび水を、５２６μｌの総体積まで一緒に混合する。７０℃で３分間インキュベートする。
ｉｉ．室温で１０分間インキュベートする。磁気スタンドに置き、上清を取り除く。
ｉｉｉ．４００μｌの緩衝液ＯＷ２でビーズを２回洗浄する。上清を取り除く。
ｉｖ．５０μｌの緩衝液ＯＥＢを加え、混合し、７０℃で３分間インキュベートする。次に、室温で５分間インキュベートする。
ｖ．５０μｌの緩衝液ｍＲＢＢを加え、混合する。室温で１０分間インキュベートする。
ｖｉ．磁気スタンドの上でビーズをペレットにし、上清を次に取り除く。４００μｌの緩衝液ＯＷ２でビーズを１回洗浄する。
ｖｉｉ．７０℃に加熱した３１μｌの緩衝液ＯＥＢを加え、混合する。磁気スタンドの上でビーズをペレットにする。
ｖｉｉｉ．２９μｌ（これは、ｍＲＮＡを含有する）をとる。
ｉｘ．下のステップ２のＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットに進む。
【０１８８】
Ｄ．無処理：２９μｌの総体積のために、１００ｎｇのＵＨＲＲおよび水を一緒に混合する。下のステップ２のＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットに進む。
【０１８９】
２．ＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキット：
下に掲載されるあらゆる成分は、このキットからとられる。
【０１９０】
ＲＮＡ断片化および逆転写：
ｉ．ステップ１．Ａ、１．Ｂ、１．Ｃおよび１．Ｄから試料をとり、８μｌの５×ＲＴ緩衝液および水を３７μｌの総体積まで加える。
【０１９１】
ｉｉ．ステップ１．Ａ．からの試料のために、９５℃１５分間インキュベートし、直後に７５℃まで下降させることによって、ＲＮＡを断片化し、ブロッカーをハイブリダイズさせ、実施例１に記載されるアニーリングプログラムを実行する。ステップｉｉｉに行く。
試料１．Ｂ．、１．Ｃ．および１．Ｄ．のために、９５℃で１５分間インキュベートすることによってＲＮＡを断片化し、４℃で保持する。ステップｉｉｉに行く。
【０１９２】
ｉｉｉ．１μｌのＲＴ酵素、１μｌのＲＮアーゼ阻害剤、１μｌの０．４Ｍ  ＤＴＴを加える。２５℃で１０分間、４２℃で１５分間、７０℃で１５分間インキュベートし、４℃で保持する。
【０１９３】
ｉｖ．逆転写の後、５６μｌのＱＩＡｓｅｑビーズを加え、混合する。ｃＤＮＡがビーズに結合した後、２００μｌの８０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。ビーズを乾燥させた後、３８．５μｌの水で溶出させる。
【０１９４】
第２鎖合成／末端−修復／Ａ−付加：
ｖ．３８．５μｌの試料を５μｌの第２鎖緩衝液および６．５μｌの第２鎖酵素ミックスと混合する。２５℃で３０分間、６５℃で１５分間インキュベートし、４℃で保持する。
【０１９５】
ｖｉ．７０μｌのＱＩＡｓｅｑビーズを加え、混合する。ＤＮＡがビーズに結合した後、２００μｌの８０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。ビーズの乾燥後、５０μｌの水で溶出させる。
【０１９６】
アダプターライゲーション：
ｖｉｉ．アダプターを１：１００に希釈し、２μｌのアダプターを５０μｌの試料に次に加える。１００μｌの総体積のために、２５μｌの４×Ｕｌｔｒａｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔライゲーション緩衝液、５μｌのＵｌｔｒａｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔリガーゼ、６．５μｌのライゲーション開始剤、１１．５μｌの水を加える。混合し、次に２５℃で１０分間インキュベートする。
【０１９７】
ｖｉｉｉ．８０μｌのＱＩＡｓｅｑビーズを加え、混合する。ＤＮＡがビーズに結合した後、２００μｌの８０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。ビーズが乾燥した後、９０μｌの水で溶出させる。１０８μｌのビーズを９０μｌの試料に加え、混合する。ＤＮＡがビーズに結合した後、２００μｌの８０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。ビーズが乾燥した後、２３．５μｌの水で溶出させる。
【０１９８】
ユニバーサルＰＣＲ増幅：
ｉｖ．５０μｌの総体積のために、２３．５μｌの試料に対して、Ｉｌｌｕｍｉｎａのための１．５μｌのＣｌｅａｎＳｔａｒｔ  ＰＣＲプライマーミックス、および２５μｌのＣｌｅａｎＳｔａｒｔ  ＰＣＲミックス２×を加える。
【０１９９】
ｘ．３７℃で１５分間、９８℃で２分間、１５サイクルの（９８℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、７２℃で１分間インキュベートし、４℃で保持する。
【０２００】
ｘｉ．６０μｌのＱＩＡｓｅｑビーズを加え、混合する。ＤＮＡがビーズに結合した後、２００μｌの８０％ＥｔＯＨで２回洗浄する。ビーズが乾燥した後、２２μｌの水で溶出させる。
【０２０１】
ｘｉｉ．２２μｌの試料が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システムでのシークエンシングで直ぐに使用できる最終ライブラリーである。
【０２０２】
シークエンシングパラメータ：
１５０サイクル（７５×２のペアエンド）高アウトプットｖ２によるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システム。１．４ｐＭのライブラリーをロードする。
【０２０３】
分析は、Ｇａｌａｘｙ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇ）を使用して実行した。ＨＩＳＡＴ２アラインメントプログラム（Ｇａｌａｘｙバージョン２．１．０）を使用した、ペアエンド読取りの参照ゲノムｂ３７  ｈｇ１９とのアラインメント。遺伝子計数はｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ計数プログラム（Ｇａｌａｘｙバージョン１．６．０．２）で実行し、参照ゲノムｂ３７  ｈｇ１９およびｒＲＮＡ  ｇｔｆファイルはＵＣＳＣ表ブラウザーから得た。
【表６】
2022502028.tif 000016
【０２０４】
シークエンシング結果の要約：
ｒＲＮＡである全読取りの％の調査は、ブロッカー１９３プールがＲｉｂｏ−ｚｅｒｏに優っていることを明らかにする。
【０２０５】
散布図（図１〜５）は、各方法の非ｒＲＮＡ遺伝子の相対的な遺伝子発現を比較する。各点は、２つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの平均に正規化された各特異な非ｒＲＮＡ遺伝子の読取りのｌｏｇ２を表す。各散布図に、１６，０００個の遺伝子がある。散布図の調査は、ブロッカーおよびＲｉｂｏ−ｚｅｒｏの両方が類似の遺伝子発現プロファイル（図１、Ｒ２＝０．９１２３）を生成し、したがって、ブロッキング方法はＲｉｂｏ−ｚｅｒｏによるものを越えて遺伝子発現プロファイルを変更しなかったことを明らかにする。実際、ブロッキング方法は、無処理と比較して非ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子発現プロファイルの類似性で、Ｒｉｂｏ−ｚｅｒｏに対してわずかな改善を示した（図４および５を比較する）。ｒｉｂｏ消去または無処理およびポリ（Ａ）富化の間の低い相関が予想される（図２および３）。
【０２０６】
（実施例３）
異なるＲＮＡ量におけるブロッカーの性能
この実施例は、異なるＲＮＡ量におけるブロッカーの性能を試験した。
【０２０７】
段階的ワークフロー：
ワークフローには、異なるインプット量、異なるブロッカープール、異なるアダプター希釈およびＰＣＲ増幅のサイクルについて調整したこと以外、実施例２と同じステップが含まれた（実施例２に記載のＱＩＡｓｅｑ鎖ＲＮＡライブラリーキットプロトコールに存在したこれらの変化の詳細については、下のｑＰＣＲデータ表を参照）。各条件のために、２反復を実行した。
【表７−１】
2022502028.tif 000017
【表７−２】
2022502028.tif 000018
【表８】
2022502028.tif 000019
【０２０８】
ｑＰＣＲデータの要約：
５ｎｇインプットおよび２５ｎｇインプット
８．７５ｐｍｏｌのブロッカー（試料１および７）によるｒＲＮＡのブロッキングは、１００ｎｇインプット（試料１３）と同じくらい良好に作用した。４．３８ｐｍｏｌによるｒＲＮＡのブロッキングでは、わずかな低減だけがあった（試料３を試料１と比較し、試料９を試料７と比較する）。３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＤＰＨ、ＡＣＴＢおよびＲＰＬＰ０）については、試料５と比較した試料１および３のＣｔ値、および試料１１と比較した試料７および９のＣｔ値の低下によって示される通り、ブロッカーの包含はこれらの遺伝子の検出および定量化を有意に改善した。
【０２０９】
５００ｎｇおよび１０００ｎｇインプット
１９３個のブロッカーのプールを使用したとき、８．７５ｐｍｏｌのブロッカー（試料１９および２７）によるｒＲＮＡのブロッキングは、１００ｎｇインプット（試料１３）と同じくらい良好に作用した。再び、４．３８ｐｍｏｌによるｒＲＮＡのブロッキングでわずかな低減だけがあった（試料２３を試料１９と比較し、試料２７を試料３１と比較する）。１００ｎｇのインプット（試料１３）と比較して、３つのハウスキーピング遺伝子に対して追加の負の効果はなかった（試料１９および２７）。
【０２１０】
９６個のブロッカーのプールを使用したとき、ｒＲＮＡのブロッキングに対して、より実質的な負の影響があった（試料２１と１９の間、試料２２と２３の間、試料２９と２７の間および試料３０と３１の間で、１８Ｓ  ｒＲＮＡアッセイのＣｔ値を比較する）。しかし、１００ｎｇのインプットと比較して、ハウスキーピング遺伝子に対する追加の負の影響はなかった（試料２０、２１、２９および３０の間のハウスキーピング遺伝子アッセイのＣｔ値を試料１３と比較する）。
【０２１１】
シークエンシングパラメータ：
１５０サイクル（７５×２のペアエンド）高アウトプットｖ２によるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システムを使用して、シークエンシングを実行した。１．６ｐＭのライブラリーをロードする。
【０２１２】
分析は、Ｇａｌａｘｙ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇ）を使用して実行した。ＨＩＳＡＴ２アラインメントプログラム（Ｇａｌａｘｙバージョン２．１．０）を使用して、参照ゲノムｂ３８  ｈｇ３８とのペアエンド読取りのアラインメントを実行した。遺伝子計数はｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ計数プログラム（Ｇａｌａｘｙバージョン１．６．０．２）で実行し、参照ゲノムｂ３８  ｈｇ３８およびｒＲＮＡ  ｇｔｆファイルはＵＣＳＣ表ブラウザーから得た。
【表９−１】
2022502028.tif 000020
【表９−２】
2022502028.tif 000021
【０２１３】
上表の要約
試験した全てのＲＮＡインプット量で、１９３個のブロッカーのプールの各々８．７５ｐｍｏｌは、ｒＲＮＡであった読取りの量を低減することで最良に作用した（試料１、２、７、８、１３、１４、１９、２０、２７および２８を参照）。１９３プールの各々の４．３８ｐｍｏｌも良好に作用したが、ｒＲＮＡブロッキング性能で多少の低減があった（試料３、４、９、１０、１５、１６、２３、２４、３１および３２を参照）。
【０２１４】
非ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンシング結果（散布図）：
２５ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇおよび１０００ｎｇのインプット量について１１，０００個の特異な非ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子発現プロファイルを示すために、１９３個のブロッカーのプールを各ブロッカーにつき４．３８ｐｍｏｌまたは８．７５ｐｍｏｌで使用して、散布図を作成した。各点は、２つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの平均に正規化された各特異な非ｒＲＮＡ遺伝子の読取りのｌｏｇ２を表す。散布図を、下の表ＡおよびＢに要約する。
【表Ａ】
2022502028.tif 000022
【０２１５】
【表Ｂ−１】
2022502028.tif 000023
【表Ｂ−２】
2022502028.tif 000024
【０２１６】
非ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンシング結果の要約（散布図）：
ＱＩＡＳｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットは１００ｎｇの全ＲＮＡの示唆された最小インプットを有するので、２５ｎｇのインプットの結果は、技術的複製が予想通りに劣ったＲ２値を有したことを示す（表Ａ、参照番号１および２を参照）。しかし、ブロッカーの包含は、ブロッカーなしと比較してＲ２値を改善した（参照番号１および２のＲ２値を参照番号３のそれと比較する）。この改善は、非ｒＲＮＡ遺伝子の検出および定量化の感度を強化するブロッカーの結果であった。
【０２１７】
技術的複製の再現性は、１００ｎｇ、５００ｎｇおよび１０００ｎｇのインプットで良好であって（表Ａ、参照番号４、５、７、８、１０および１１を参照）、再び、無処理と比較してブロッカーでより優れていた（表ＡのＲ２値を、参照番号４または５と参照番号６の間で；参照番号７または８と参照番号９；および参照番号１０または１１と参照番号１２の間で比較する）。
【０２１８】
散布図は、全てのブロッカー量について、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇの間に非ｒＲＮＡ遺伝子発現プロファイルの非常に良好な相関があったことを示し（表Ｂ、参照番号１７、２１、２５、２７、３０、３１、３３および３４を参照、その全ては０．９６を超えるＲ２値を有する）、１９３個のブロッカーのプールを８．７５ｐｍｏｌまたは４．３８ｐｍｏｌで使用することが、ｒＲＮＡをなお効果的に排除しつつも、遺伝子発現プロファイルを負に変化させなかったことを示す。
【０２１９】
（実施例４）
細菌の５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳのｒＲＮＡ配列のｃＤＮＡ合成をブロックするためのブロッカーを設計すること
この実施例は、細菌の５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳのｒＲＮＡ配列のｃＤＮＡ合成をブロックするためのブロッカーの設計を記載する。この設計は、単一種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２）、または何千もの異なるｒＲＮＡ配列が潜在的に存在する大便、汚水、環境などの複合試料におけるように、ミックスされたコミュニティである試料に適用可能である。
【０２２０】
設計のために、５Ｓ細菌ｒＲＮＡ配列（７，３００個の全配列）を５Ｓ  ｒＲＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｂｉｏ．ｐｌ／ｒｒｎａ／）からダウンロードし、１６Ｓ細菌ｒＲＮＡ配列（１６８，０９６個の全配列）をＳＩＬＶＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ−ｓｉｌｖａ．ｄｅ／）からダウンロードし、２３Ｓ細菌ｒＲＮＡ配列（５９２，６０５個の全配列）をＳＩＬＶＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ−ｓｉｌｖａ．ｄｅ／）からダウンロードした。データベースに対して配列を絶えず加え、改変し、または削除することができるので、将来の設計は変更された数の配列を考慮する可能性がある。
【０２２１】
細菌ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡ合成ブロッカーの分子的性質は、ヒト、マウスおよびラットｒＲＮＡのｃＤＮＡ合成をブロックするために使用されるものに主に類似している（上記のブロッカーＢ１〜Ｂ１９３を参照）。オリゴヌクレオチドは長さが（平均して）２０ｂｐであり、ｒＲＮＡ配列に対して敷き詰められたアンチセンスがＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有し、オリゴヌクレオチドの各々の３’末端にブロッキング残基を含有する場合、間隔は（平均して）３０ｂｐである。ブロッカーは、細菌ｒＲＮＡのｃＤＮＡ合成を、ヒト、マウスおよびラットｒＲＮＡブロッカーと類似の方法でブロックすると予想される。
【０２２２】
細菌ｒＲＮＡ配列の莫大な数のために、各ブロッカーは、特定のｒＲＮＡタイプ（それが５Ｓ、１６Ｓ、または２３Ｓであるにせよ）のｒＲＮＡ配列の全てを考慮したときに全カバレージを最も増加させるように選び出された。ブロッカーは、目的の標的ｒＲＮＡ配列にアンチセンスであるように設計される。具体的には、ＢＬＯＣＫＥＲ  ＬＥＮＧＴＨ（すなわち、約２０ｂｐ）、標的ｒＲＮＡ配列（例えば、細菌５Ｓ  ｒＲＮＡ）のセットにアニーリングするときの近接ブロッカーの間のＤＩＳＴＡＮＣＥ（すなわち、約３０ｂｐ）、および選択するブロッカーのＮＵＭＢＥＲ（例えば、１０００または２０００）を規定した後、以下の設計アルゴリズムを使用した：
１．標的配列のセットにおいてＫ＝ＢＬＯＣＫＥＲ  ＬＥＮＧＴＨを有する全てのｋｍｅｒの頻度を数える、
２．頻度によりｋｍｅｒを分類する、
３．最も高い頻度のｋｍｅｒをブロッカーセットに加える、
４．全ての標的配列で選択されたｋｍｅｒの位置を見出す、
５．各標的配列でｋｍｅｒ位置のＤＩＳＴＡＮＣＥ下流および０．５ＤＩＳＴＡＮＣＥ上流の範囲内のｋｍｅｒを決定する、
６．頻度リストの中のステップ５で特定されたｋｍｅｒを減らす、および
７．ブロッカーのＮＵＭＢＥＲに到達するまでステップ２〜６を繰り返す。
【０２２３】
上記のプロセスの例は、図６に示される。この実施例では、ブロッカー長は６ヌクレオチドであり、近接ブロッカーの間の距離は１０である。互いに対するブロッカーの配向について、ブロッカーは目的の標的ｒＲＮＡ配列にアンチセンスで設計される。第１のステップは、全ての標的配列（ただ１つの例示的な標的配列を図６の上部に示す）で全ての可能な６ｍｅｒを数え、頻度が最も高い６ｍｅｒを決定し、および左の表に示すように標的核酸の中のそれらの頻度に基づいて６ｍｅｒをランク付けすることである。次のステップは、頻度が最も高い６ｍｅｒの各発生時の選択されたＤＩＳＴＡＮＣＥの範囲内の６ｍｅｒのカウント数を減少させ、カウント数およびランクを更新し、第２の反復のために新しい頻度が最も高い６ｍｅｒを特定することである。
【０２２４】
カバーされるｒＲＮＡ配列の全割合は、ブロッカーの数が増加するときに増加する（図７〜９を参照）。５Ｓ  ｒＲＮＡについては、全てのｒＲＮＡ配列の９６％は、ブロッカーが２０ｂｐの長さであり、間隔が３０ｂｐであるときに１０，０００個のブロッカーでカバーされる（図７を参照）。１６Ｓ  ｒＲＮＡについては、全てのｒＲＮＡ配列の９０％は、ブロッカーが２０ｂｐの長さであり、間隔が３０ｂｐであるときに６，１００個のブロッカーでカバーされる（図８を参照）。２３Ｓ  ｒＲＮＡについては、全てのｒＲＮＡ配列の９６％は、ブロッカーが２０ｂｐの長さであり、間隔が３０ｂｐであるときに１０，０００個のブロッカーでカバーされる（図９を参照）。
【０２２５】
細菌ｒＲＮＡのｃＤＮＡ合成をブロックしようと試みる場合、全てのブロッカーを含むことを必要とされない。カバレージは、５Ｓ  ｒＲＮＡで８３％（最初の１０００個のブロッカーを使用する）、１６Ｓ  ｒＲＮＡで８４％（最初の２０００個のブロッカーを使用する）および２３Ｓ  ｒＲＮＡで８４％（最初の１０００個のブロッカーを使用する）であった。５Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡのための最初の１００個のブロッカーの配列を、下の表に例示的なブロッカーとして示す。標準の脱塩精製を使用して、各オリゴの３５ｎｍｏｌを合成した。合成の後、４０００個のブロッカーを含有し、実施例５〜８で使用されたブロッカーミックスを生成するために、４つのプールを組み合わせた。
【０２２６】
細菌の５Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡの各々のための１００個の例示的ブロッカーの配列を、下の表に提供する。
【表１０−１】
2022502028.tif 000025
【表１０−２】
2022502028.tif 000026
【表１０−３】
2022502028.tif 000027
【０２２７】
【表１１−１】
2022502028.tif 000028
【表１１−２】
2022502028.tif 000029
【表１１−３】
2022502028.tif 000030
【表１１−４】
2022502028.tif 000031
【０２２８】
【表１２−１】
2022502028.tif 000032
【表１２−２】
2022502028.tif 000033
【表１２−３】
2022502028.tif 000034
【０２２９】
（実施例５）
ブロッカーで細菌ｒＲＮＡをブロックすること
【０２３０】
この実施例は、実施例４に記載されているようなブロッカーミックスによる細菌ｒＲＮＡのブロッキングを記載する。この実施例で記載されるブロッカーミックスに関連する量は、ブロッカーミックス中の各ブロッカーの量である。例えば、２．９ｐｍｏｌのブロッカーミックスは、ブロックミックスが、２．９ｐｍｏｌの各ブロッカーを含有することを指す。
【０２３１】
実験詳細
ｉ．ＲＮＡ（１００ｎｇのＴｕｒｂｏ  ＤＮアーゼ処理全ＲＮＡ）：
【０２３２】
１．Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ７９４０、「Ｅ．ｃｏｌｉ試料」）
【０２３３】
２．腸マイクロバイオーム全細胞ミックス（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＭＳＡ−２００６、「ＡＴＣＣ腸試料」）
【０２３４】
ｉｉ．ブロッカー消去手順
【０２３５】
１．ブロッカーミックス（ブロッカーなし、２．９ｐｍｏｌ、１．４５ｐｍｏｌおよび０．７３ｐｍｏｌ）を全ＲＮＡ（１００ｎｇ）および１×ＦＨ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、４０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）と１５μｌの最終反応体積（最終反応を１５μｌにするのにＨ２Ｏを使用した）で合わせる
【０２３６】
２．反応を８９℃で８分間、続いて７５℃で２分間、７０℃で２分間、６５℃で２分間、６０℃で２分間、５５℃で２分間、３７℃で２分間および２５℃で２分間加熱した。
【０２３７】
３．１．３×（ビーズ対試料ｖ／ｖ比）ビーズ浄化を実行した（「浄化なし」と記された実験条件ではこれは実行されなかった）：
ａ．１９．５μｌのＱＩＡｓｅｑビーズ（室温に予熱する）を１５μｌの反応に加える。ボルテックスすることによって完全に混合し、室温で５分間インキュベートする。
ｂ．ビーズが完全にペレットになるまで（約２分間）、卓上遠心機で遠心分離する。
ｃ．チューブ／プレートを磁気ラックに２分間置く。溶液が透明になると、ビーズを磁気スタンドの上に置いたまま、上清を注意深く取り除いて捨てる。
ｄ．ビーズをなお磁気スタンドの上に置いたまま、２００μｌの８０％エタノールを加える。チューブを（２〜３回）回転させるか、または磁石の２つのカラム位置の間を側から側にプレートを動かしてビーズを洗浄する。洗浄液を注意深く取り除いて捨てる。
ｅ．エタノール洗浄を繰り返し、この２回目の洗浄の後に、あらゆる痕跡量のエタノール洗浄液を完全に取り除く。
ｆ．ビーズをなお磁気スタンドの上に置いたまま、室温で１０分間風乾させる。
ｇ．磁気スタンドからビーズを取り出し、３１μｌの無ヌクレアーゼ水を加えることによってビーズから核酸を溶出させる。ピペット操作をすることによって良く混合する。
ｈ．溶液が透明になるまで、チューブ／プレートを磁気ラックに戻す。
ｉ．２９μｌの上清を清潔なチューブ／プレートに移す。
【０２３８】
ｉｉｉ．ＱＩＡｓｅｑ鎖ＲＮＡライブラリー調製
【０２３９】
１．ＱＩＡｓｅｑ鎖全ＲＮＡライブラリーキットに関連する第１鎖合成反応をセットして実行する：
【表１３】
2022502028.tif 000035
【０２４０】
２．ユーザーマニュアルにより残りのＱＩＡｓｅｑ鎖ライブラリーを調製する
【０２４１】
ｉｖ．次世代シークエンシングを実行する
１．１５０サイクル（７５×２のペアエンド）によるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００システムを使用する。
【０２４２】
ｖ．ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用してデータ分析を実行する。
【０２４３】
結果
結果は、下の表に示す。
【表１４】
2022502028.tif 000036
ＦＰＫＭ：１００万読取りあたりのエクソン１キロベースあたりの断片
【０２４４】
結果は、以下を示す：
両試料（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡＴＣＣ腸）のブロッカーなしは、高い百分率のｒＲＮＡをもたらした。
【０２４５】
２．９ｐｍｏｌのブロッカーは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡＴＣＣ腸試料によるｒＲＮＡブロッキングに関して最良の性能を与えた。
【０２４６】
Ｅ．ｃｏｌｉ試料については、ブロッカーの量を減少させることは、ｒＲＮＡブロッキングに無視できる影響を及ぼした。しかし、ＡＴＣＣ腸試料については、ブロッカーの量が低減された場合、ｒＲＮＡにマッピングされた読取りの量は増加した。
【０２４７】
ｒＲＮＡブロッキングは、検出される遺伝子数の増加につながった。
【０２４８】
ブロッキング有効性は、ブロッカー設計アルゴリズムによって予測されたものと一致しない：Ｅ．ｃｏｌｉ試料については、設計アルゴリズムは、ブロッキング有効性が５Ｓの９３％、１６Ｓの９９％および２３Ｓの９９％であると予測した。全てのｒＲＮＡの９７％が取り除かれたので、上の結果は、これが実際に達成されたことを示す。
【０２４９】
結論
細菌のｒＲＮＡブロッカーは、ｒＲＮＡにマッピングされた読取りをＥ．ｃｏｌｉ試料の場合約９７％から約３％に、およびＡＴＣＣ腸試料の場合約９５％から約１２％に低減させた。
【０２５０】
（実施例６）
異なる量のブロッカーおよび異なるビーズ浄化ステップで細菌ｒＲＮＡをブロックすること
この実施例は、異なる濃度の実施例４に記載されているブロッカーミックスおよび異なるビーズ浄化ステップでの細菌ｒＲＮＡのブロッキングを記載する。実施例５と同様に、この実施例で記載されるブロッカーミックスに関連する量は、ブロッカーミックス中の各ブロッカーの量である。
【０２５１】
この実施例では、実施例５に記載のＡＴＣＣ腸試料をＲＮＡ試料として使用した。方法および材料は、この実施例で使用されたブロックミックスの量が２．９ｐｍｏｌおよび５．８ｐｍｏｌであったこと、ならびにビーズ浄化の２つのバージョンが実行されたこと以外は、実施例５と同じであった：１つ（「１回」）は実施例５と同じで、他（「２回」）はステップ３．ｃ．と３．ｄ．の間に以下の追加のステップを有した：
【０２５２】
（ｉ）１５μｌの無ヌクレアーゼ水および１９．５μｌのＱＩＡｓｅｑ  ＮＧＳビーズ結合緩衝液を加える。ボルテックスすることによって完全に混合し、室温で５分間インキュベートする。
【０２５３】
（ｉｉ）ビーズが完全にペレットになるまで（約２分間）、卓上遠心機で遠心分離する。
【０２５４】
（ｉｉｉ）チューブ／プレートを磁気ラックの上に２分間置く。溶液が透明になると、ビーズを磁気スタンドの上に置いたまま、上清を注意深く取り除いて捨てる。
【０２５５】
結果
結果は、下の表に示す。
【表１５】
2022502028.tif 000037
【０２５６】
結果は、以下を示す：
ブロッカーの量を２．９ｐｍｏｌから５．８ｐｍｏｌに倍増させることは、ｒＲＮＡの消去を向上させた。
【０２５７】
５．８ｐｍｏｌのブロッカーミックスが使用されたときに調製されたＮＧＳライブラリーは、低い濃度を有した。
【０２５８】
５．８ｐｍｏｌのブロッカーミックスの使用は改善されたｒＲＮＡ消去をもたらしたが、カットオフが０．３または３．０のＦＰＫＭであったかどうかにかかわらず、それは正にコールされるより少ない遺伝子をもたらした。
【０２５９】
２回の１．３×ビーズ浄化は、中立の効果を有した。
【０２６０】
結論
５．８ｐｍｏｌのブロッカーミックスはｒＲＮＡ消去においてより有効であったが、ｒＲＮＡ消去および正に発現される遺伝子の両方を考慮した場合、２．９ｐｍｏｌがより好ましいかもしれない。
【０２６１】
（実施例７）
異なる量のブロッカーおよび異なるビーズ浄化ステップで細菌ｒＲＮＡをブロックすること
この実施例も、異なる濃度の実施例４に記載されているブロッカーミックスおよび異なるビーズ浄化ステップでの細菌ｒＲＮＡのブロッキングを記載する。実施例５と同様に、この実施例で記載されるブロッカーミックスに関連する量は、ブロッカーミックス中の各ブロッカーの量である。
【０２６２】
この実施例では、実施例５に記載のＡＴＣＣ腸試料をＲＮＡ試料として使用した。方法および材料は、この実施例で使用されたブロックミックスの量が２．９ｐｍｏｌ、４．３５ｐｍｏｌおよび５．８ｐｍｏｌであったこと以外は、実施例６と同じであった。
【０２６３】
結果
結果は、下の表に示す。
【表１６】
2022502028.tif 000038
【０２６４】
結果は、以下を示す：
ブロッカーを２．９ｐｍｏｌから４．３５ｐｍｏｌに、さらに５．８ｐｍｏｌに増加させることは、ｒＲＮＡの消去を向上させた。
【０２６５】
５．８ｐｍｏｌのブロッカーミックスを使用して調製されたＮＧＳライブラリーは、ビーズ浄化の回数に関係なく低い濃度を有した。
【０２６６】
２回の１．３×ビーズ浄化は検出される遺伝子の数を向上させたが、ｒＲＮＡ百分率も増加させた。結局のところ、検出される遺伝子の増加した数を有することがより望ましい。
【０２６７】
対でマッピングされた読取りも、２回の１．３×ビーズ浄化で増加する。
【０２６８】
結論
２．９ｐｍｏｌのブロッカーミックスおよび２回の１．３×ビーズ浄化の組合せは、最も望ましい結果を提供する。
【０２６９】
（実施例８）
異なるビーズ浄化ステップでブロッカーを用いて細菌ｒＲＮＡをブロックすること
この実施例も、実施例４に記載されているブロッカーミックスを用いる異なるビーズ浄化ステップでの細菌ｒＲＮＡのブロッキングを記載する。実施例５と同様に、この実施例で記載されるブロッカーミックスに関連する量は、ブロッカーミックス中の各ブロッカーの量である。
この実施例では、２つの異なるＲＮＡ試料が使用された。１つは実施例５に記載のＡＴＣＣ腸試料であり、ＲＮＡ試料として使用した。他（「ＡＴＣＣ３ミックス」）は、以下の混合物であった：
ａ．２０株均等ミックス全細胞材料（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＭＳＡ−２００２）
ｂ．皮膚マイクロバイオーム全細胞ミックス（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＭＳＡ−２００５）
ｃ．口マイクロバイオーム全細胞ミックス（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＭＳＡ−２００４）
【０２７０】
方法および材料は、この実施例で使用されたブロックミックスの量が２．９ｐｍｏｌであったこと以外は、実施例６と同じであった。
【０２７１】
結果
結果は、下の表に示す。
【表１７−１】
2022502028.tif 000039
【表１７−２】
2022502028.tif 000040
【０２７２】
結果は、以下を示す：
ＡＴＣＣ腸試料については、１回または２回の１．３×ビーズ浄化が使用されたかどうかによって、２．９ｐｍｏｌのブロッカーミックスはｒＲＮＡを約９５％から約１３％または２０％まで消去した。１回と２回のビーズ浄化の間では、追加の回は増加した遺伝子検出を可能にした。
【０２７３】
ＡＴＣＣ３ミックス試料（重複する種によって占められる場合２８細菌種からなる）については、１回または２回の１．３×ビーズ浄化が使用されたかどうかによって、２．９ｐｍｏｌのブロッカーミックスはｒＲＮＡを約９５％から約１０％または約１５％まで消去した。１回と２回のビーズ浄化の間では、追加の回は増加した遺伝子検出を可能にした。ブロッカーミックスの量を２．９ｐｍｏｌから４．３５ｐｍｏｌに、さらに５．８ｐｍｏｌに増加させることは、ｒＲＮＡの消去を向上させた。
【０２７４】
結論
ｒＲＮＡ消去および遺伝子発現の両方の結果を考慮したとき、２．９ｐｍｏｌのブロッカーミックスおよび２回の１．３×ビーズ浄化の組合せは、最も望ましい結果を提供する。
【０２７５】
実施例５〜８の結果は、細菌ｒＲＮＡの消去に関して、２．９ｐｍｏｌの各ブロッカーが２回のビーズ浄化とともに最適な量であったことを示す。しかし、ｒＲＮＡ消去については、１回のビーズ浄化を用いたときでさえ、１．４５ｐｍｏｌ、およびさらには５．８ｐｍｏｌの各ブロッカーも、ｒＲＮＡを消去するのに作用した。
【０２７６】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。この明細書で言及するおよび／または出願データシートに掲載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、参照により本明細書に完全に組み込まれる。実施形態の態様は、さらなる他の実施形態を提供するために、様々な特許、出願および刊行物の概念を採用するのに必要な場合、改変することができる。
【０２７７】
上に詳述される記載を考慮して、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲で開示される具体的な実施形態に限定するものと解釈されるべきでなく、全ての可能な実施形態を、そのような特許請求の範囲が権利を有する全範囲の同等物とともに含むものと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【０２７８】
本出願は、本明細書に参照により完全に組み込まれる、２０１８年９月２５日に出願の米国特許仮出願第６２／７３６，００６号の優先権を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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