【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年8月17日(2010.8.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの１，３−プロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに関しての増加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、そして配列番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号２に示す配列を有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１に示す配列を有する、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項４】
請求項２記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
工程：ｉ．対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの１，３−プロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに関しての増加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む微生物を得る工程であって、該変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、そして配列番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、該微生物は活性のある１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を発現することができる少なくとも一つの遺伝子を含む工程、および
ｉｉ．上記微生物を炭素基質に接触させる工程
を含む、微生物において１，３−プロパンジオールを生産する方法。
【請求項８】
微生物が、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有する単離された微生物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
当業界において開示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの核酸およびアミノ酸の配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３０９０３（Ｗｉｌｌｉａｒ，１９９４，”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １，３−ｐｒｏｐａｎｘｄｉｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ａｎｄ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ”化学工学学位論文、ウイスコンシン−マジソン大学）；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０９７７１（Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００６０３４（Ｌｕｅｒｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４：３３７−３４５）を含む。
発明の概要
本発明は、野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅには通常毒性のレベルである少なくとも１０５ｇ／ｌの１，３−プロパンジオールの存在下で生育できるＥ．ｂｌａｔｔａｅの誘導体から単離された、変異体形態の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）の発見に関する。本発明は、よって、上記変異形態のＰＤＤが、通常は毒性のレベルの１，３−プロパンジオールに対してのＥ．ｂｌａｔｔａｅの耐性に関連するとの発見に一部基づく。本発明は、この変異対ＰＤＤが１，３−プロパンジオールとＮＡＤに関して変更されたＫｍを有するとの発見にも一部基づく。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
従って、本発明は、１，３−プロパンジオールに関して野生型ＰＤＤのＫｍを超えるように増加する１，３−プロパンジオールのＫｍを有する変異体ＰＤＤを提供する。一つの態様において、変異体ＰＤＤのＫｍは１，３−プロパンジオールに関しての野生型ＰＤＤのＫの約３倍である。別の態様において、変異体ＰＤＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２から得ることができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
本明細書にて使用される句「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、実施例３に例示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ間のアミノ酸の関連性を意味する。本明細書にて論じられる特定の残基は、図３に示すＥ．ｂｌａｔｔａｅのＧＥＢのＰＤＤに指定された番号を引用するアミノ酸残基数を意味する。ＨｉｓからＬｅｕへの変異を図３の残基１０５に示す。図３は、様々な微生物源からの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを計算法ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて並置することができる。本発明は、図１または２に示されるＥ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤの変異、またはＡＴＣＣに寄託されて受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅに限定されないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の特定の同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＰＤＤｓ全てを包含する。Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ中の残基の特定の残基または部分に相同（即ち、一次構造または三次構造の何れかの位置に対応する）または類似のいずれかであれば、残基は均等である（即ち、化学的にかまたは構造上、結合するか（ｃｏｍｂｉｎｅ）、反応するか（ｒｅａｃｔ）または相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ）、同じかまたは類似の機能上の能力を有する）。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
一次構造に関する相同性を確立するために、ＰＤＤのアミノ酸配列を、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ一次構造（図２に示す）、そして特に配列が公知の全てのＰＤＤｓに対して不変であることが知られている残基のセット（例えば、図３を参照）と、直接比較する。本発明は、変異形態が１，３−プロパンジオールの活性のＫｍを変更することができる限り、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの全ての源における均等残基の変化を包含する。好ましい態様において、変異形態のＫｍは１，３−プロパンジオールに関して増加する。配列番号１の核酸配列はＰＣＲ技術により得た。そのような技術は、しばしば、偶然にＰＣＲで生じた配列エラーにより特徴付けられる。よって、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの他の微生物の源の中の対応する変異を包含する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
Ｉ．ＰＤＤ配列
配列番号１に示すポリヌクレオチド配列は、図３に示すとおり、残基１０５においてＨｉｓからＬｅｕへの変異を有する１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（配列番号２）をコードする。当業者には理解されるとおり、遺伝子コードの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号２をコードし得る。本発明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。本発明は、図３に示すとおり、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅの残基Ｈｉｓ  １０５に対応する変異を含むＰＤＤをコードする核酸を包含する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰＤＤに関する核酸およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３０９０３にて提供され；Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＰＤＤはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０９７７１にて提供され；そしてＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０００３４にて提供される。本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができる変異ＰＤＤも包含する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
発酵のための適切なｐＨ範囲はｐＨ５．０からｐＨ９．０であるが、ｐＨ６．０が初期条件の範囲としては好ましい。
本発明を実施する様式および方法は以下の実施例に体する引用により当業者によりさらに完全に理解されるかもしれず、それらの実施例はいかなる様式においても本発明または特許請求の範囲に制限することを意図されない。
実施例
実施例１は配列番号２に示す変異体ＰＤＤに付随する動力学上の変化を記載する。
材料と方法
株−野生型ＡＴＣＣ３３４２９、変異体ＰＤＤのＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を含むＥ．ｂｌａｔｔａｅ。
生育−細胞は、複合培地中で、３０Ｃ  ５００ｍｌにおいて２８００ｍｌ発酵バッチ中で２２５ｒｐｍにて撹拌しながら２０時間生育させた。培地は、ＫＨ２ＰＯ４，５．４ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，０．４ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２．０ｇ／Ｌ；トリプトン、２．０ｇ／Ｌ；およびグリセロール、９．２ｇ／Ｌを水道水中に含む。
抽出物の調製−嫌気条件を避けるために注意しながら細胞を遠心分離により回収した。沈殿物は、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍｌのＴｒｉｃｉｎｅ  ｐＨ８．２に懸濁した。細胞はフレンチ細胞プレッシャーを通して破壊した。粗抽出物を、２０Ｋ  Ｘ  ｇで２０分間遠心分離してから、１００Ｋ  Ｘ  ｇで１時間遠心分離することにより透明にして、高速上清（ＨＳＳ）画分を生じさせた。
アッセイ−ＰＤＤに関するアッセイはＪｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４に記載されたとおりに実施した。
ＰＤＤの部分精製−ＨＳＳを１６  Ｘ  １００  Ｐｏｒｏｓ  ２０ＨＱカラム上で分離させた。バッファーは、Ａは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４であり、１００ｕＭ  ＭｎＣｌを含み、そしてＢは５００ｍＭ  ＫＣｌを含むＡＴＣＣバッファーである。カラムを１０ｍｌ／分にて負荷および展開した。勾配は１０ＣＶ洗浄、１０ＣＶにて７０％Ｂまで直線勾配、そして１００％まで１ＣＶであった。活性は勾配の極めて初期の画分において検出された。１ｍＭまで追加のＤＴＴを添加した後に、３３４２９株のプールされたカラム画分をアッセイのために回収されたとおりに使用した。株ＧＥＢ０３１からの活性画分をプールして、ＰＭ３０上で濃縮して、追加の１ｍＭ  ＤＴＴの添加後に濃縮されたとおりに使用した。
株            ＧＤ（Ｕ／ｍｇ）  ＰＤＤ（Ｕ／ｍｇ）    ＧＤ／ＰＤＤ比
３３４２９      ０．６４            ０．２２              ２．９
ＧＥＢ０３１    ０．７９            ０．０８              ９．９
ＰＤＤ動力学−結果を以下に示す。
株            Ｋｍ（ｍＭプロパンジオール）  Ｋｍ（ｕＭ  ＮＡＤ）
３３４２９              ２８                      ５７
実施例２：Ｅ．ｂｌａｔｔａｅからの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のクローン化と配列決定
ｄｈａＴ遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのゲノミックＤＮＡから、鋳型ＤＮＡとしてＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｄｈａＴ配列に基づく合成プライマー（プライマー１と２）を用いて５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を取り込んだ。生成物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。クローン化されたｄｈａＴを次に標準技術により配列決定した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
ＤＮＡ配列決定の結果を配列番号１および配列番号２として与える。
プライマー１
５’ＴＣＴＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＴ３’
プライマー２
５’ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧ３’
当業者には容易に理解されるとおり、ＰＣＲ方法を通して生成された核酸配列は不注意によるエラーを含んでいるかもしれない。本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができるＰＤＤをコードする核酸も包含する。