【手続補正書】
【提出日】平成22年8月3日(2010.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるターゲットタンパク質候補の発現を検出および／または定量する方法であって、以下の工程：
マーカータンパク質をコードする第一の核酸をベクターに導入する工程、
発現を検出および／または定量する予定の該ターゲットタンパク質候補をコードする第二の核酸を、該第一および第二の核酸が作動可能に連結するように該ベクターに導入する工程であって、該マーカータンパク質の発現が該ターゲットタンパク質候補の発現の指標となる工程、
該ベクターを細胞に導入する工程、
該マーカータンパク質の発現を検出および／または定量する工程、
該マーカータンパク質の該発現を該ターゲットタンパク質候補の発現と関連させることによって、該ターゲットタンパク質候補の発現を検出および／または定量する工程
を含む方法。
【請求項２】
第一および第二の核酸が、以下の配置：
ａ）該第一の核酸が、第一のプロモーターのコントロール下にあり、そして該第二の核酸が、該第一のプロモーターと離れて位置する第二のプロモーターのコントロール下にあり、そして該第一および第二のプロモーターが、配列において同一であるか、または同一の活性を有する、
ｂ）該第一の核酸が、第一のプロモーターのコントロール下にあり、そして該第二の核酸が、該第一のプロモーターと離れて位置する第二のプロモーターのコントロール下にあり、そして該第一および第二のプロモーターが、配列において同一でなく、該プロモーターのそれぞれの活性が予測可能である、
ｃ）該第一および第二の核酸が、単一のプロモーターのコントロール下にあり、そして該第一および第二の核酸が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むヌクレオチドのストレッチによって相互に分離されている
の一つによってベクター内で作動可能に連結される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マーカータンパク質が蛍光タンパク質、抗体のフラグメント、エピトープ、酵素、アビジン、ペプチド性ビオチン模倣体、直接結合によって検出することができるペプチド、または化学フルオロフォアもしくは光学的に検出可能なシグナルが生成されるような類似構造を含む有機分子との化学結合または化学反応によって検出することができるペプチドである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＩＲＥＳが、ウイルス由来のＩＲＥＳ、細胞性ｍＲＮＡ由来のＩＲＥＳ、特にポリオ、ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶなどのピコナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのフラビウイルス、古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）などのペスチウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのレンチウイルス、およびコオロギ麻痺病ウイルス（ＣＲＰＶ）などの昆虫ＲＮＡウイルス由来のＩＲＥＳ、ならびに細胞性ｍＲＮＡ、例えばｅＩＦ４ＧおよびＤＡＰ５などの翻訳開始因子、ｃ−ＭｙｃおよびＮＦ−κＢ抑制因子（ＮＲＦ）などの転写因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）などの成長因子、アンテナペディアなどのホメオティック遺伝子、Ｘ連鎖アポトーシス阻害因子（ＸＩＡＰ）、およびＡｐａｆ−１などの生存タンパク質、ならびにＢｉＰなどの他の細胞性ｍＲＮＡ由来のＩＲＥＳより選択される、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
第一および第二のプロモーターが配列において同一である場合に、これらが、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ヒトＨ１およびＵ６プロモーターを含む群より選択され、
該第一および第二のプロモーターが、同一の活性を有する場合に、これらのそれぞれが、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ヒトＨ１およびＵ６プロモーターを含む群より独立して選択され、
該第一および第二のプロモーターが、配列において同一でなく、そして該プロモーターの活性が予測可能である場合に、該プロモーターのそれぞれが、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ヒトＨ１およびＵ６プロモーターを含む群より独立して選択され、
単一のプロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ヒトＨ１およびＵ６プロモーターを含む群より選択され、そしてＩＲＥＳが、配列番号：１〜１５を含む群より選択される配列を有する核酸より選択される、
請求項２〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
細胞へのベクターの導入が、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルストランスダクション、トランスダクション、バリスティックデリバリーによって起こる、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
検出および／または定量が、定量測定可能な任意の光学的検出方法、特に空間的分解、顕微鏡法、蛍光標示式細胞分取、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、蛍光またはリン光測定、生物ルミネセンス測定を用いた光学的検出によって起こる、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
顕微鏡法が、光学顕微鏡法、明視野顕微鏡法、偏光顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、特に共焦点蛍光顕微鏡法、エバネッセント光励起顕微鏡法、蛍光相関分光法、蛍光寿命顕微鏡法、蛍光相互相関顕微鏡法、光退色後蛍光回復顕微鏡法、ラインスキャンイメージング、ポイントスキャンイメージング、構造化照明、デコンボリューション顕微鏡法、光子計数イメージングを含む群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ターゲットタンパク質候補およびマーカータンパク質が、別々のタンパク質として細胞において発現される、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
小分子モデュレーターのターゲットタンパク質を同定する方法であって、以下の工程：
小分子モデュレーターに曝露された場合にシグナルを生成することができる種類の第一の細胞を提供する工程であって、該シグナルが、好ましくは顕微鏡法によって、空間的に分解することができ、所望により定量することができるシグナルである工程、
該第一の細胞を小分子モデュレーターに曝露し、そして該小分子モデュレーターに対する応答として該第一の細胞によって生成される第一のシグナルを空間的に分解し、所望により定量する工程、
該第一の細胞と同じ種類の第二の細胞を提供する工程、および
該第二の細胞に、請求項１〜９のいずれか記載の方法を行う工程、
該第二の細胞に、請求項１〜９のいずれか記載の方法を行う間に、該第二の細胞に該ベクターを導入した後に、該第二の細胞を該小分子モデュレーターに曝露し、そして該小分子モデュレーターに対する応答として該第二の細胞によって生成される第二のシグナルを空間的に分解し、所望により定量する工程、
該第一のシグナルを該第二のシグナルと比較し、該第一のシグナルと該第二のシグナルとの間に差がある場合に、該差を該第二の細胞におけるターゲットタンパク質候補の発現に帰することによって、該ターゲットタンパク質候補を該小分子モデュレーターのターゲットタンパク質として同定する工程
を含む方法。
【請求項１１】
第一のシグナルおよび第二のシグナルが、顕微鏡法により検出、空間的に分解および所望により定量することができる光学的シグナルである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第一のシグナルおよび第二のシグナルが蛍光シグナルである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
マーカータンパク質の発現が、空間的に分解され、そして第一および第二のシグナルと識別することができる第三のシグナルを生成する、請求項１０〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
第三のシグナルが、顕微鏡法により検出、空間的に分解および所望により定量することができる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第三のシグナルが蛍光シグナルであり、第一および第二のシグナルが蛍光シグナルであり、そして該第三のシグナルが該第一および第二のシグナルとスペクトル的に別個である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第一のシグナルおよび第二のシグナルが、それらのそれぞれの量によってのみ相互に識別することができる、請求項１１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
所与の小分子モデュレーターについて、一つより多い、好ましくは複数のターゲットタンパク質候補を用いて行われる、請求項１０〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
所与の小分子モデュレーターについて、生物のゲノムの全ての可能なターゲットタンパク質候補を用いて行われる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
一つより多い、好ましくは複数の小分子モデュレーターを用いて行われる、請求項１０〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
小分子モデュレーターのターゲットタンパク質を同定する方法であって、以下の工程：
小分子モデュレーターに曝露された場合にシグナルを生成することができる種類の第一の細胞を提供する工程であって、該シグナルが、好ましくは顕微鏡法によって、空間的に分解することができ、所望により定量することができるシグナルである工程、
該第一の細胞を小分子モデュレーターに曝露し、そして該小分子モデュレーターに対する応答として該第一の細胞によって生成される第一のシグナルを空間的に分解し、所望により定量する工程であって、該ターゲットタンパク質候補の発現阻害の不在下での最大半活性濃度である、該小分子モデュレーターの第一の最大半活性濃度（ＡＣ50）を決定するために、この工程を該小分子モデュレーターのいくつかの異なる濃度で行う工程、
該第一の最大半活性濃度を決定する工程、
該第一の細胞と同じ種類の第二の細胞を提供する工程、ならびに
該第二の細胞におけるターゲットタンパク質候補の発現を阻害するように選択された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を該第二の細胞に導入し、好ましくは該第二の細胞におけるターゲットタンパク質候補の発現を阻害するように選択された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して該第二の細胞をトランスフェクションする工程、
該第二の細胞を該小分子モデュレーターに曝露し、そして該小分子モデュレーターに対する応答として該第二の細胞によって生成される第二のシグナルを空間的に分解し、所望により定量する工程であって、該ターゲットタンパク質候補の発現阻害の存在下での最大半量活性濃度である、該小分子モデュレーターの第二の最大半活性濃度（ＡＣ50）を決定するために、この工程を該小分子モデュレーターのいくつかの異なる濃度で行う工程、
該第二の最大半活性濃度を決定する工程、
該第一の最大半活性濃度を該第二の最大半活性濃度と比較し、該第一の最大半活性濃度と該第二の最大半活性濃度との間に差がある場合に、該差を該ターゲットタンパク質候補の発現阻害に帰することによって、該ターゲットタンパク質候補を該小分子モデュレーターのターゲットタンパク質として同定する工程
を含む方法。
【請求項２１】
第一および第二の最大半活性濃度が、最大半阻害濃度（ＩＣ50）であり、該小分子モデュレーターが阻害剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該第一および第二の最大半活性濃度が、最大半賦活濃度（ＥＣ50）であり、そして該小分子モデュレーターが賦活剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
該第一のシグナルおよび該第二のシグナルが、顕微鏡法により検出、空間的に分解および所望により定量することができる光学的シグナルである、請求項２０〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
第一のシグナルおよび第二のシグナルが蛍光シグナルである、請求項２３記載の方法。