(57)【要約】本明細書に提供されるのは、Coleopteran昆虫を制御するための、アポトーシス阻害(IAP)遺伝子を標的とするRNAi分子を用いるための方法、IAPを標的とするRNAi分子を産生するための方法、およびIAPを標的とするためのRNAi分子を含む組成物である。
2022502049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Coleopteranアポトーシス阻害(IAP)遺伝子の発現を特異的に阻害する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
Coleopteran IAP遺伝子が、配列番号1のデオキシ核酸(DNA)配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、リボ核酸(RNA)である、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
RNAが、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な第一の鎖、および第一の鎖に相補的な第二の鎖を含む二本鎖RNA(dsRNA)である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
mRNAが、配列番号19のRNA配列を含む、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
dsRNAの第一の鎖が、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに70％〜100％相補的なRNA配列を含む、請求項4または5に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
dsRNAの第一の鎖が、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、または98％〜100％相補的なRNA配列を含む、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
mRNAのセグメントが、少なくとも18〜500ヌクレオチド、少なくとも21〜500ヌクレオチド、少なくとも50〜500ヌクレオチド、少なくとも100〜500ヌクレオチド、または少なくとも200〜500ヌクレオチドの長さを有する、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
dsRNAの第一の鎖が、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに少なくとも90％〜100％、95％〜100％、または少なくとも98％〜100％相補的な少なくとも18〜21の連続したヌクレオチドを含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
dsRNAの第一の鎖が、配列番号37のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％同一性を有するRNA配列を含む、請求項4〜9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
dsRNAの第一の鎖が、配列番号37のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、または98％〜100％同一性を有するRNA配列を含む、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号37のRNA配列のセグメントが、少なくとも18〜500ヌクレオチド、少なくとも21〜500ヌクレオチド、少なくとも50〜500ヌクレオチド、少なくとも100〜500ヌクレオチド、または少なくとも200〜500ヌクレオチドの長さを有する、請求項10または11に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
dsRNAの第一の鎖が、配列番号37のRNA配列に対して少なくとも90％〜100％、95％〜100％、または少なくとも98％〜100％同一性を有する少なくとも18〜21の連続したヌクレオチドを含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
RNAが、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAへ結合する一本鎖RNA(ssRNA)である、請求項2または3に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
mRNAが、配列番号19のRNA配列を含む、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ssRNAが、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに70％〜100％相補的なRNA配列を含む、請求項14または15に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ssRNAが、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、または98％〜100％相補的なRNA配列を含む、請求項16に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
mRNAのセグメントが、少なくとも18〜500ヌクレオチド、少なくとも21〜500ヌクレオチド、少なくとも50〜500ヌクレオチド、少なくとも100〜500ヌクレオチド、または少なくとも200〜500ヌクレオチドの長さを有する、請求項17に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ssRNAが、mRNAに少なくとも90％〜100％、95％〜100％、または少なくとも98％〜100％相補的な少なくとも18〜21の連続したヌクレオチドを含む、請求項14〜18のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ssRNAが、配列番号37のRNA配列に対して70％〜100％同一性を有するRNA配列を含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ssRNAが、配列番号37のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、または98％〜100％同一性を有するRNA配列を含む、請求項20に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号37のRNA配列のセグメントが、少なくとも18〜500ヌクレオチド、少なくとも21〜500ヌクレオチド、少なくとも50〜500ヌクレオチド、少なくとも100〜500ヌクレオチド、または少なくとも200〜500ヌクレオチドの長さを有する、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ssRNAが、配列番号37のRNA配列に対して少なくとも90％〜100％、95％〜100％、または少なくとも98％〜100％同一性を有する少なくとも18〜21の連続したヌクレオチドを含む、請求項20〜22のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項1〜23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２５】
組成物が、
(a)アジュバント、誘引剤、成長調節物質、昆虫の飼料、フェロモン、タンパク質、炭水化物、ポリマー、有機化合物、生物製剤、および駆除剤からなる群から選択される少なくとも1の添加剤をさらに含む;
(b)液体、溶液、懸濁液、エマルション、乳化可能な濃縮物、濃縮液、低濃縮液、超少量濃縮液、水溶性濃縮液、ベイト、逆エマルション、流動体、エアロゾル、煙、霧、流動体、均質混合物、非均質混合物、固体、粉塵、粉末、顆粒、ペレット、カプセル、燻蒸剤、カプセル製剤、またはマイクロカプセル製剤として製剤化される；または
(c)スプレー、霧、種子処理、ドレンチ、ドリップ灌漑、インファロー、昆虫の食餌、またはベイトとして送達される、
請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
0.001 μg/cm2〜10 μg/cm2の濃度で製剤化された、請求項24〜26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項3〜26のいずれか一項に記載のRNAをコードする、デオキシリボ核酸(DNA)。
【請求項２８】
Coleopteran昆虫被害を制御するための方法であって、該方法は、植物、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、請求項1〜23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子または請求項24〜27のいずれか一項に記載の組成物を送達することを含む、前記方法。
【請求項２９】
Coleopteran昆虫被害を制御するための方法であって、該方法は、植物、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、Coleopteranアポトーシス阻害(IAP)遺伝子の発現を特異的に阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物を送達することを含む、前記方法。
【請求項３０】
組成物が、植物の葉、茎、種子、根、または土壌へ送達される、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
植物が、Solanaceae植物、Brassicaceae植物、Poaceae植物、Cucurbitaceae植物、Fobaceae植物、Apiaceae植物、Amaranthaceae植物、およびMalvaceae植物からなる群から選択される、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドまたは組成物が、Coleopteran昆虫の発育阻止、死亡、摂食の減少、または繁殖の阻害を引き起こすために充分な量で送達される、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
Coleopteran昆虫が、Leptinotarsa種、Phyllotreta種、Cerotoma種、Diabrotica種、tribolium種、Anthonomus種およびAlticini種からなる群から選択される種のものである、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
Coleopteran昆虫が、Leptinotarsa種昆虫である、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
Leptinotarsa種昆虫が、コロラドハムシである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
送達ステップが、ポリヌクレオチドを、植物の表面へ、地面へ、Coleopteran昆虫へ、またはColeopteran昆虫の食餌へ、少なくとも0.001 μg/cm2の、0.001 μg/cm2〜10 μg/cm2の、または0.001 μg/cm2〜0.1 μg/cm2の濃度で適用することを含む、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも30％に増加する、請求項29〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
植物の落葉率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、15％未満に減少する;またはColeopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露後少なくとも10日後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、15％未満のままである、請求項28〜37のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2018年9月26日に出願された米国仮出願番号第62/737,041号の35 U.S.C. § 119(e)の下の利益を請求し、その内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）は、ジャガイモ作物の主要な害虫である。コロラドハムシを制御するための年間コストは数千万ドルと推定されており、コロラドハムシを制御しないままにしておくと、作物の損失にかかる年間コストは数十億ドルに達すると予測されている。その上、コロラドハムシの制御は、無数の化学物質および殺虫剤に対するその耐性によって複雑になっている。したがって、コロラドハムシを制御する新しい方法が求められる。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、いくつかの側面において、コロラドハムシの被害を制御するための組成物、遺伝子コンストラクト、および方法を提供する。広域スペクトルの化学殺虫剤への我々の依存およびそれらに関連する問題を減らすには、リスクの低減された駆除薬が必要である。昆虫害虫制御へのリスク低減アプローチを約束する新技術は、RNA干渉（RNAi）である。いくつかの態様において、本開示は、コロラドハムシ損害を、コロラドハムシアポトーシス阻害（IAP）遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)を標的とする（例えば、結合する）およびこれに干渉するリボ核酸（RNA）干渉（RNAi）分子を送達することによって軽減し得る、RNAiベースの技術を提供する。
【０００４】
アポトーシスは、細胞自殺の進化的に保存された経路であり、正常な細胞の発達およびホメオスタシスにとって不可欠である。アポトーシスの主要調節因子はIAPである。IAPは、昆虫バキュロウイルス（Cydia pomonella granulosisウイルスおよびOrgyia pseudotsugata核多角体病ウイルス）で発見され、それ以来、蚊の虹色ウイルス、昆虫、酵母、およびヒトなどの他の多くの生物で同定されてきた。多くのIAPは、他の種の細胞で過剰発現する場合に、アポトーシスを遮断する。RNA干渉を介したIAPのノックダウン発現は、典型的には、アポトーシスを誘導する。例として、Pridgeon JW et al., J Med Entomol 2008; 45(3):414-420を参照のこと。
【０００５】
実験室での研究は、作用機序がRNAiプロセスを介するものであるRNA分子（例として、二本鎖RNA（dsRNA））の経口送達が多くの昆虫種に有効であることを確認したため、局所のdsRNAは好適な送達形態であるとみなされる。しかしながら、スプレー式のdsRNA昆虫害虫制御技術は今日存在しない。相対的に低価格でのdsRNAの製造コストは、Ag-Bio産業にとって主要な挑戦である。農業害虫の場合、殺虫性dsRNAを発現し得るトランスジェニック植物は、植物を昆虫の食害から保護するかもしれない。しかしながら、すべての国が遺伝子組み換え作物を受け入れているわけではなく、dsRNAのスプレー式の適用は、保護の代替的な送達方法として検討されている。
【０００６】
RNAiノックダウンのための標的を特定するために、標的種（Leptinotarsa decemlineata）におけるIAPについて適切な遺伝子配列を特定するために全ゲノム情報が用いられ、それは選択的にサイレンシングされると、ジャガイモ農業の生態系における非標的種に悪影響を与えることなく、これらの重大な害虫を制御する。興味の対象となるDNA配列および出力配列についての設計基準のルールセットを前提として、適切な計算アルゴリズムが公的に入手可能なRNAi設計ツールと組み合わされ、これらの基準を満たす出力配列を作成した。dsRNAを設計するために選択された元の/初期領域は、TriboliumおよびDrosophilaゲノム（Flybase、SnapDragon、Beetlebase等々）の包括的な配列データベースを検索することによって同定された。予測されたsiRNAベースのアプローチを用いてdsRNAを設計するために用いられ得る公的に入手可能なE-RNAiツールが、独自のアルゴリズムと組み合わされ、設計ワークフローを作成した。次いで、この設計ワークフローが、（a）所望の長さの、（b）元の配列に対して所望のパーセント同一性の（ランダムな突然変異を導入することによる）、および（c）初期のIAP遺伝子配列を複数のフラグメントに分割することにより、特定の長いdsRNA配列を作成するために用いられた。
【０００７】
いくつかの態様において、RNAi分子は一本鎖RNA(ssRNA)を含み、およびいくつかの態様において、RNAi分子は二本鎖RNA(dsRNA)または部分的にdsRNAを含む。さらに他の態様において、RNAi分子は、これに限定されないがヘアピンRNAなどの、有意な二本鎖特性を含有する二次構造を伴う一本鎖RNA分子であってもよい。本開示は、IAP mRNAを標的とするためのRNA、例えば一本鎖RNA(ssRNA)、低分子干渉(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、短ヘアピン(shRNA)または二本鎖RNA(dsRNA)を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、IAP RNAは、昆虫におけるIAP 発現の低減、幼虫の発育阻止、昆虫の成長、繁殖(reproduction)(例として、生殖能力(fertility)および/または多産能力(fecundity))および/または回復の阻害、幼虫または昆虫の死滅、および昆虫の摂食の減少のために、有効である。結果的に、本開示の一側面は、有効量のIAP標的化RNAを植物および/または昆虫に送達すること(例として、これと接触させること)を含む、昆虫を制御するための方法を提供する。IAP RNAは、Coleopteran昆虫(例として、コロラドハムシ)を制御するのに特に有用であり、それによって、ヒトにとって主要な食品供給源である特定の植物(例として、ジャガイモ)の被害を低減および/または予防する。
【０００９】
本開示のいくつかの側面はまた、IAP標的化RNAを産生する無細胞法を提供し、該方法は、(a)5'ヌクレオシド一リン酸(5'NMP)の産生のために適切な条件下で、反応混合物において、細胞のRNAおよびリボヌクレアーゼをインキュベートすること；(b)リボヌクレアーゼを除去すること；および(c)反応混合物を、または第二の反応混合物において、5’NMP、ポリホスフェートキナーゼ、ポリホスフェート、ポリメラーゼ、およびDNA(DNA鋳型とも呼ばれる)を、DNAからIAP標的化RNAの産生について適切な条件下でインキュベートすること、を含む。
【００１０】
また本明細書に提供されるのは、IAP標的化RNAを含む組成物である。いくつかの態様において、IAP標的化RNAを含む組成物は、添加剤、例えば、化学物質、駆除薬、界面活性剤、生物物質、または他の非駆除成分をさらに含む。いくつかの態様において、IAP標的化RNAは、発現ベクターにおいて提供される。いくつかの態様において、IAP標的化RNAは、植物または植物細胞において提供される。
【００１１】
「IAPを標的とするRNAi分子」は、「IAPによってコードされるmRNAを標的とするRNAi分子」を包含することが理解されるべきである。例として、mRNAが分解されることに起因して、RNAi分子がmRNAに結合し（例として、一時的に結合し）およびmRNAの翻訳を阻害（低減または遮断）する場合、RNAi分子は、興味の対象となる遺伝子を標的とするとみなされる。いくつかの態様において、後成的変化がある場合、RNAi分子は、関心のある遺伝子によってコードされるmRNAの発現を阻害してもよい。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、遺伝子(例として、IAP)のコード領域の発現を阻害する二本鎖RNA(例として、dsRNA GS3)であることが理解されるべきである。他の態様において、ポリヌクレオチドは、dsRNAをコードするDNA配列である。もう１つの他の態様において、ポリヌクレオチドは、アンチセンスRNAである。DNA配列として本明細書に開示される配列は、各チミジンをウラシルで置き換えることによって、DNA配列からRNA配列へ変換され得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面の簡単な記載
【図１Ａ−Ｂ】図1A〜1Bは、CPBの、本開示のIAP RNAi(GS3)組成物(IAP mRNAを標的とする二本鎖RNA(dsRNA)を含有するもの)または対照RNAi(GS4)組成物(10 μg/cm2の濃度のRNAi)のいずれかへの9日間の曝露後の、コロラドハムシ(CPB)の死亡率(図1A)およびCPBによる葉片消費率(図1B)を示すグラフを含む。
【００１３】
【図２Ａ−Ｂ】図2A〜2Bは、本開示のIAP RNAi組成物(1.0 μg/cm2、0.1 μg/cm2、0.01 μg/cm2、または0.001 μg/cm2でのGS3)または対照RNAi組成物(1.0 μg/cm2でのGS4)のいずれかへ、最初の3日間曝露されたCPBにおける、8日間の用量試験時間経過後の、コロラドハムシ(CPB)の死亡率(図2A)およびCPBによる葉片消費率(図2B)を示すグラフを含む。
【００１４】
【図３Ａ−Ｂ】図3A〜3Bは、本開示のIAP RNAi組成物(GS3)、灌漑(1/2インチの雨を想定して、植物あたりおよそ500mlの水)が後続するIAP RNAi組成物、対照組成物(+対照)、または非処理(未処理)のいずれかでの葉処理後の、植物あたりの生きているCPB幼虫の数(図3A)および植物の落葉率(図3B)を示すグラフを含む。
【００１５】
【図４】図4は、本開示のIAP RNAi組成物(GS3)、対照組成物(+対照、例として、CORAGEN(登録商標))、および非処理(未処理)での葉処理後の、植物の落葉率を示すグラフを含む。
【００１６】
【図５】図5は、IAP DNA(GS167)の5’末端の領域によってコードされるIAP mRNAを標的とする二本鎖RNA(dsRNA)を含むRNAi組成物、IAP DNA(GS168)の中央領域によってコードされるIAP mRNAを標的とするdsRNAを含むRNAi組成物、IAP DNA(GS169)の3’末端の領域によってコードされるIAP mRNAを標的とするdsRNAを含むRNAi組成物、または陰性対照RNAi組成物(GS4)(n=2)への、経口曝露の9日後のコロラドハムシ(CPB)の死亡率を示すグラフを含む。
【００１７】
【図６Ａ−Ｂ】図6A〜6Bは、IAP mRNAを標的とするdsRNAを含むRNAi組成物への経口曝露の9日後の、CPBの死亡率を示すグラフを含む。dsRNAはサイズが異なり、GS3は432ヌクレオチド長を有し、GS176は200ヌクレオチド長を有し、GS177は150ヌクレオチド長を有し、G178は100ヌクレオチド長を有し(図6A)、GS179は50の相補的ヌクレオチドを伴う74ヌクレオチド長を有し、およびGS193は25の相補的ヌクレオチドを伴う49ヌクレオチド長を有する(図6B)。陰性対照RNAi組成物(GS4)は、さらに評価された。
【００１８】
【図７】図7は、432ヌクレオチド長を有する領域(GS3)にわたって、IAP mRNAに70％(GS170)、75％(GS171)、80％(GS172)、85％(GS173)、90％(GS174)、または95％(GS175)相補的なdsRNAを含むRNAi組成物への経口曝露の9日後の、CPBの死亡率を示すグラフを含む。陰性対照RNAi組成物(GS4)は、さらに評価された。
【００１９】
【図８】図8は、0.1 μg/cm2でのGS3およびGS4を3日間摂食し、3日後に回収された一齢CPB幼虫のIAP mRNAの相対的発現レベルを示すグラフを含む。相対的発現は、内在性対照RP4遺伝子を用いて正規化され、および2-ddCt方法を用いて計算された。
【００２０】
【図９Ａ】図9Aは、野外試験において、21日期間にわたる、本開示のIAP RNAi組成物(GS3)、対照陽性組成物(標準、例として、CORAGEN(登録商標)、ENTRUST(登録商標)、NOVODOR（商標）)、および非処理(未処理対照)での葉処理後の植物の落葉率を示すグラフを含む。
【図９Ｂ】図9Bは、野外試験において、21日期間にわたる、本開示のIAP RNAi組成物(GS3)、対照陽性組成物(標準、例として、CORAGEN(登録商標)、ENTRUST(登録商標)、NOVODOR（商標）)、および非処理(未処理対照)での葉処理後の植物の落葉率を示すグラフを含む。
【図９Ｃ】図9Cは、野外試験において、21日期間にわたる、本開示のIAP RNAi組成物(GS3)、対照陽性組成物(標準、例として、CORAGEN(登録商標)、ENTRUST(登録商標)、NOVODOR（商標）)、および非処理(未処理対照)での葉処理後の植物の落葉率を示すグラフを含む。
【００２１】
詳細な記載
本開示のいくつかの側面に従って、IAPを標的とするRNAi分子(例として、dsRNA)は、Coleopteran昆虫細胞におけるIAP遺伝子によってコードされるmRNAで干渉するのに有効であり、それによって(例として、その対応するタンパク質への)mRNAの翻訳を低減または除去する。結果的に、いくつかの側面において、本開示は、植物の任意の部分(例として、根、塊茎、茎、枝、葉、花、等々)、地面(例として、土壌、土、草、等々)、Coleopteran昆虫および/または昆虫の食餌(例として、これによって摂取される食品および/または水)を、本明細書に提供されるとおりのRNAi分子に接触させることによって、Coleopteran被害を制御する組成物および方法を提供する。また、本明細書に提供されるのは、IAP遺伝子産物(mRNA)を標的とするRNAi分子を合成する無細胞法である。
【００２２】
Coleopteran昆虫は、本明細書に使用されるときは任意の発生段階におけるColeopteran昆虫を指す。いくつかの態様において、Coleopteran昆虫は、昆虫の卵である。いくつかの態様において、Coleopteran昆虫は、昆虫幼虫である。いくつかの態様において、Coleopteran昆虫は、昆虫のさなぎである。いくつかの態様において、Coleopteran昆虫は、成体昆虫である。
【００２３】
Coleopteran昆虫は、Coleoptera目の任意のColeopteran昆虫であってもよい。Coleoptera目の昆虫の例は、これらに限定されないが、Chrysomelidae(ハムシ)、Curculionidae(ゾウムシ)、Meloidae(ツチハンミョウ)、Tenebrionidae(ゴムムシダマシ)、Scarabaeidae(コガネムシ)、Cerambycidae (マツノマダラカミキリ)、Curculionidae(中国白色パインビートル(Chinese white pine beetle))、Nitidulidae(ハチノスムクゲケシキスイ)、Chrysomelidae(広肩ハムシ(broad-shouldered leaf beetle))、Cerambycidae(桑カミキリムシ)、Phyllotreta(ノミハムシ)、Diabrotica(コーンルートワーム) Chrysomela (コットンウッドハムシ)、Hypothenemus(コーヒーノミキクイムシ)、Sitophilus (コクゾウムシ)、Epitrix(タバコノミハムシ)、E. cucumeris (ジャガイモノミハムシ)、P. pusilla(西洋黒色ノミハムシ)；Anthonomus(コショウウィービル)、Hemicrepidus(ハリガネムシ)、Melanotus (ハリガネムシ)、Ceutorhychus(キャベツ種莢ゾウムシ)、Aeolus (ハリガネムシ)、Horistonotus(砂ハリガネムシ)、Sphenophorus (トウモロコシビルバグ)、S. zea(ティモシービルバグ)、S. parvulus(ブルーグラスビルバグ)、S. callosus (サザンコーンビルバグ)；Phyllophaga(地虫)、Chaetocnema(トウモロコシノミハムシ)、Popillia(マメコガネ)、Epilachna(インゲンテントウ)、Cerotoma(マメハムシ)、Epicauta(ツチハンミョウ)、Chrysomelidae(アリゲーター雑草ノミハムシ)およびそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２４】
さらに、Coleopteran昆虫は、Leptinotarsaの任意の種であってもよい。Leptinotarsa 種は、これらに限定されないが、Leptinotarsa decemlineata(コロラドハムシ)、Leptinotarsa behrensi、Leptinotarsa collinsi、Leptinotarsa defecta、Leptinotarsa haldemani(ハルデマンの緑色ジャガイモハムシ)、Leptinotarsa heydeni、Leptinotarsa juncta(偽ジャガイモハムシ)、Leptinotarsa lineolata(burrobrushハムシ)、Leptinotarsa peninsularis、Leptinotarsa rubiginosa、Leptinotarsa texana、Leptinotarsa tlascalana、Leptinotarsa tumamoca、およびLeptinotarsa typographicaを含む。
【００２５】
アポトーシス阻害(IAP)を標的とするRNAi分子
IAPを標的とするRNAi分子は、IAP mRNAの調査およびin vivo(例として、植物/野外)試験を介して、同定されてきた。IAPを標的とするかかるRNAi分子は、例えば、IAPの発現を阻害または低減することによって、およびその結果として、昆虫死亡を増加させること、ならびにColeopteran昆虫の成長、繁殖(例として、生殖能力および/または多産能力)、および/または摂食(例として、食べることおよび/または飲むこと)を減少させることによって、Coleopteran昆虫(例として、コロラドハムシ)を制御するのに有用である。
【００２６】
細胞(例として、昆虫細胞)における遺伝子の発現は、例えば、mRNAおよび/または遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルが、RNAi分子と接触されていない対照細胞と比べて細胞において少なくとも10％低減された場合、RNAi分子との接触を介して阻害されたまたは低減されたとみなされる。例えば、IAPを標的とするRNAi分子(例として、dsRNA)を細胞へ送達すること(例として、細胞に接触させること)は、IAPを標的とするRNAi分子と接触されない細胞と比較して、RNA転写産物および/またはタンパク質(例として、IAP遺伝子によってコードされるもの)の量における低減(例として、少なくとも10％)をもたらしてもよい。
【００２７】
いくつかの態様において、本開示のRNAi分子は、生物学的に関連するまたは生物学的に有意なオフターゲット効果なしに(非IAP遺伝子の発現に関連あるまたは有意な変化なしに)、IAP遺伝子の発現を特異的に阻害する。いくつかの態様において、RNAi分子は、IAPタンパク質をコードするIAP mRNA(例として、配列番号19のIAP mRNA)の発現を特異的に阻害(例として、分解)することによって、IAPタンパク質の翻訳を特異的に阻害(低減または遮断)する。IAP遺伝子の特異的な阻害は、IAP遺伝子発現(例として、IAP mRNA発現、および/またはIAPタンパク質発現)における測定可能な低減、または検出可能な遺伝子発現(例として、IAP mRNA発現、および/またはIAPタンパク質発現)の完全な欠如を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示のRNAi分子は、生物学的に関連するまたは生物学的に有意なオフターゲット効果なしに(非IAP遺伝子の発現に関連あるまたは有意な変化なしに)、IAP遺伝子の発現を特異的に阻害する。いくつかの態様において、RNAi分子は、IAPタンパク質をコードするmRNA(例として、配列番号19のIAP mRNA)を特異的に阻害することによって、IAPタンパク質の発現を特異的に阻害する。IAP遺伝子の特異的な阻害は、IAP遺伝子発現(例として、IAP mRNA発現、および/またはIAPタンパク質発現)における測定可能な低減、または検出可能な遺伝子発現(例として、IAP mRNA発現、および/またはIAPタンパク質発現)の完全な欠如を含む。
【００２９】
本明細書に提供されるIAPを標的とするRNAi分子は、いくつかの態様において、Coleopteran昆虫、例として、コロラドハムシのIAP mRNAに相補性を有するように設計される。コロラドハムシIAPをコードするDNA配列の例は、配列番号1の配列において提供される。コロラドハムシIAPをコードするmRNA配列の例は、配列番号19の配列において提供される。本開示のRNAi分子のコードにより標的にされるコロラドハムシIAP mRNA配列の例は、配列番号19〜21および23〜36の配列において提供される。IAPを標的とするRNA分子の例は、配列番号37〜39および41〜54の配列において提供される。
【００３０】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるIAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran昆虫、例として、Chrysomelidae(ハムシ)、Curculionidae(ゾウムシ)、Meloidae(ツチハンミョウ)、Tenebrionidae(ゴムムシダマシ)、Scarabaeidae(コガネムシ)、Cerambycidae(マツノマダラカミキリ)、Curculionidae(中国白色パインビートル)、Nitidulidae(ハチノスムクゲケシキスイ)、Chrysomelidae(広肩ハムシ)、Cerambycidae(桑カミキリムシ)、C. scripta(コットンウッドハムシ)、H. hampei(コーヒーノミキクイムシ)、S. Zeamais(コクゾウムシ)、f. hirtipennis(タバコノミハムシ)、F. cucumeris(ジャガイモ ノミハムシ)、P. cruciferae(crucifer ノミハムシ)およびP. pusilla(西洋黒色ノミハムシ)、A. eugenii(コショウウィービル)、H. memnonius(ハリガネムシ)、M. communis(ハリガネムシ)、C. assimilis(キャベツ種莢ゾウムシ)、P. striolata(縞模様のノミハムシ)、A. mellillus(ハリガネムシ)、A. mancus(小麦ハリガネムシ)、H. uhlerii(砂ハリガネムシ)、S. maidis(トウモロコシビルバグ)、S. zeae(ティモシービルバグ)、S. parvulus(ブルーグラスビルバグ)、およびS. callosus(サザンコーンビルバグ)、Phyllophaga種(地虫)、C. pulicaria(トウモロコシノミハムシ)、P. japonica(マメコガネ)、F. varivestis(インゲンテントウ)、C. trifurcate(マメハムシ)、F. pestiferaおよびF. lemniscata(ツチハンミョウ)、Oulemmelana melanapus(Cerealハムシ)、Hypera postica(ムラサキウマゴヤシゾウムシ)、Dendroctonus(アメリカマツノキクイムシ)、Agrilus(アオナガタマムシ)、Hylurgopinus(ネイティブニレキクイムシ)、Scolytus(ヨーロッパのニレキクイムシ)および/またはChrysomelidae(アリゲーター雑草ノミハムシ)のIAP mRNAに相補性を有するように設計される。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるIAPを標的とするRNAi分子は、Leptinotarsa 昆虫、例として、Leptinotarsa decemlineata(コロラドハムシ)、Leptinotarsa behrensi、Leptinotarsa collinsi、Leptinotarsa defecta、Leptinotarsa haldemani(ハルデマンの緑色ジャガイモハムシ)、Leptinotarsa heydeni、Leptinotarsa juncta(偽ジャガイモハムシ)、Leptinotarsa lineolata(burrobrushハムシ)、Leptinotarsa peninsularis、Leptinotarsa rubiginosa、Leptinotarsa texana、Leptinotarsa tlascalana、Leptinotarsa tumamoca、および/またはLeptinotarsa typographicaのIAP mRNAに相補性を有するように設計される。
【００３２】
本開示の二本鎖RNA(dsRNA)は、いくつかの態様において、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)へ結合する(例として、これに少なくとも部分的に相補的な、またはこれに完全に相補的な)第一の鎖、および第一の鎖に相補的な第二の鎖を含む。
【００３３】
dsRNAは、同じ長さまたは異なる長さであるRNA鎖を含んでもよい。いくつかの態様において、dsRNAは、第二の鎖(例として、センス鎖)と同じ長さである第一の鎖(例として、アンチセンス鎖)を含む。いくつかの態様において、dsRNAは、第二の鎖(例として、センス鎖)とは異なる長さである第一の鎖(例として、アンチセンス鎖)を含む。第一の鎖は、第二の鎖より、約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、または20％超長くてもよい。第一の鎖は、第二の鎖より、1〜5、2〜5、2〜10、5〜10、5〜15、10〜20、15〜20、または20超ヌクレオチド長くてもよい。
【００３４】
dsRNA分子はまた、ステムループ構造の単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、ここで、RNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー（単数または複数）、ならびに2以上のループ構造を有する環状の一本鎖RNAおよび自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムを用いて連結され、ここで、環状のRNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されて、RNAiを媒介することができる活性なRNAi分子を生成することができる。RNAi分子は、分子の一端に3'突出を含んでもよく、他端は、平滑末端であってもよくまたは突出(5'または3')をまた有してもよい。RNAi分子が分子の両端に突出を含む場合、突出の長さは同じでもまたは異なってもよい。
【００３５】
本開示の一本鎖RNAは、いくつかの態様において、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAへ結合する鎖を含む。
【００３６】
本明細書に提供されるとおりのIAPを標的とするRNAi分子は、長さが変化してもよい。いくつかの態様において、長いRNA(例として、dsRNAまたはssRNA)分子が殺虫剤として適用(例として、植物へ)される一方で、細胞へ入った後でこのdsRNAは、Dicer酵素によって、例えば、15〜25ヌクレオチドの長さを有するより短い二本鎖RNAフラグメントへと切断されることが理解されるべきである。よって、本開示のRNAi分子は、15〜25ヌクレオチドフラグメントとして送達されてもよく、例えば、またはそれらは、より長い二本鎖核酸(例として、少なくとも100ヌクレオチド)として送達されてもよい。
【００３７】
よって、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、15〜1564ヌクレオチド(ssRNA)またはヌクレオチド塩基対(dsRNA)を含む。例えば、本開示のRNAi分子は、15〜1000、15〜950、15〜900、15〜850、15〜800、15〜750、15〜700、15〜650、15〜600、15〜500、15〜450、15〜400、15〜350、15〜300、15〜250、15〜200、15〜150、15〜100、15〜50、19〜1000、18〜950、18〜900、18〜850、18〜800、18〜750、18〜700、18〜650、18〜600、18〜500、18〜450、18〜400、18〜350、18〜300、18〜250、18〜200、18〜180、18〜100、18〜50、19〜1000、19〜950、19〜900、19〜850、19〜800、19〜750、19〜700、19〜650、19〜600、19〜500、19〜450、19〜400、19〜350、19〜300、19〜250、19〜200、19〜190、19〜100、19〜50、20〜1000、20〜950、20〜900、20〜850、20〜800、20〜750、20〜700、20〜650、20〜600、20〜500、20〜450、20〜400、20〜350、20〜300、20〜250、20〜200、20〜200、20〜100、20〜50、15211000、21〜950、21〜900、21〜850、21〜800、21〜750、21〜700、21〜650、21〜600、21〜500、21〜450、21〜400、21〜350、21〜300、21〜250、21〜210、21〜210、21〜100、21〜50、22〜1000、22〜950、22〜900、22〜850、22〜800、22〜750、22〜700、22〜650、22〜600、22〜500、22〜450、22〜400、22〜350、22〜300、22〜250、22〜220、22〜220、22〜100、22〜50、23〜1000、23〜950、23〜900、23〜850、23〜800、23〜750、23〜700、23〜650、23〜600、23〜500、23〜450、23〜400、23〜350、23〜300、23〜250、23〜230、23〜230、23〜100、23〜50、24〜1000、24〜950、24〜900、24〜850、24〜800、24〜750、24〜700、24〜650、24〜600、24〜500、24〜450、24〜400、24〜350、24〜300、24〜250、24〜240、24〜240、24〜100、24〜50、25〜1000、25〜950、25〜900、25〜850、25〜800、25〜750、25〜700、25〜650、25〜600、25〜500、25〜450、25〜400、25〜350、25〜300、25〜250、25〜250、25〜250、25〜100、または25〜50ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含んでもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、または少なくとも1000ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むか、またはそれらからなる。
【００３８】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号1〜3または5〜18のいずれか1つのDNA配列によってコードされるmRNAまたはmRNAのセグメントに相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号1のDNA配列によってコードされるmRNAに相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。
【００３９】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran IAP DNAの領域またはセグメントによってコードされるmRNAに相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、RNAi分子は、Coleopteran IAP DNAの5'領域またはセグメントによってコードされるmRNAを標的とする。Coleopteran IAP DNAの5'領域は、IAP DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド1〜600）のヌクレオチド1〜600、ヌクレオチド10〜600、ヌクレオチド25〜600、ヌクレオチド50〜600、ヌクレオチド100〜600、ヌクレオチド150〜600、ヌクレオチド200〜600、ヌクレオチド250〜600、ヌクレオチド300〜600、ヌクレオチド350〜600、ヌクレオチド400〜600、ヌクレオチド450〜600、またはヌクレオチド500〜600に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい。いくつかの態様において、RNAi分子は、Coleopteran IAP DNAの中央領域またはセグメントによってコードされるmRNAを標的とする。Coleopteran IAP DNAの中央領域は、IAP DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド400〜1200）のヌクレオチド400〜1200、ヌクレオチド450〜1200、ヌクレオチド500〜1200、ヌクレオチド550〜1200、ヌクレオチド600〜1200、ヌクレオチド650〜1200、ヌクレオチド700〜1200、ヌクレオチド850〜1200、ヌクレオチド900〜1200、ヌクレオチド950〜1200、ヌクレオチド1000〜1200、ヌクレオチド1050〜1200、またはヌクレオチド1100〜1200に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい。いくつかの態様において、RNAi分子は、Coleopteran IAP DNAの3'領域またはセグメントによってコードされるmRNAを標的とする。Coleopteran IAP DNAの3'領域は、IAP DNA（例として、配列番号1のヌクレオチド1000〜1564）のヌクレオチド1000〜1564、ヌクレオチド1050〜1564、ヌクレオチド1100〜1564、ヌクレオチド1150〜1564、ヌクレオチド1200〜1564、ヌクレオチド1250〜1564、ヌクレオチド1300〜1564、ヌクレオチド1350〜1564、ヌクレオチド1400〜1564、ヌクレオチド1450〜1564、またはヌクレオチド1500〜1564に包含される任意の配列を含むか、またはそれらからなってもよい。
【００４０】
遺伝子という用語は、コード核酸および非コード核酸を包含することが理解されるべきである。よって、いくつかの態様において、IAP遺伝子は、5'非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、および3'非翻訳領域を含むmRNAをコードする。よって、本明細書のRNAi分子は、いくつかの態様において、mRNAの5'非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、および／または3'非翻訳領域へ結合する。
【００４１】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37〜39または41〜54のいずれか1つのRNA配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37のRNA配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４２】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19〜21または23〜36のいずれか1つのRNA配列に相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19のRNA配列に相補的な配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４３】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるRNA配列に対して70％〜100％の同一性（例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性）を有する（少なくとも1の）連続した配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAP遺伝子は、配列番号1のDNA配列を含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号1〜3または5〜18のいずれか1つのDNA配列によってコードされるRNA配列に対して70％〜100％の同一性（例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性）を有する（少なくとも1の）連続した配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４４】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるRNA配列に70％〜100％相補的な(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補的な)（少なくとも1つの）連続した配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAP遺伝子は、配列番号1のDNA配列を含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号1〜3または5〜18のいずれか１つのDNA配列によってコードされるRNA配列に70％〜100％相補的な(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の)(少なくとも1の)連続した配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４５】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37〜39または41〜54のいずれか１つのRNA配列に対して70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する(少なくとも1の)連続した配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37のRNA配列に対して70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する連続した配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４６】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19〜21または23〜36のいずれか１つのRNA配列に70％〜100％相補的な(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補的な)、(少なくとも1の)連続した配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19のRNA配列に、70％〜100％相補的な(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補的な)連続した配列を含むか、またはそれらからなる。
【００４７】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37〜39または41〜54のいずれか１つのRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むか、またはそれらからなる。
【００４８】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19〜21または23〜36のいずれか１つのRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％相補性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補性)を有する少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して、70％〜100％相補性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補性)を有する、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を含むか、またはそれらからなる。
【００４９】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37〜39または41〜54のいずれか１つのRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して、70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する、10〜25、10〜24、10〜23、10〜22、10〜21、10〜20、11〜25、11〜24、11〜23、11〜22、11〜21、11〜20、12〜25、12〜24、12〜23、12〜22、12〜21、12〜20、13〜25、13〜24、13〜23、13〜22、13〜21、13〜20、14〜25、14〜24、14〜23、14〜22、14〜21、14〜20、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、16〜25、16〜24、16〜23、16〜22、16〜21、16〜20、17〜25、17〜24、17〜23、17〜22、17〜21、17〜20、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、または18〜20の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号37のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して、70％〜100％同一性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一性)を有する、10〜25、10〜24、10〜23、10〜22、10〜21、10〜20、11〜25、11〜24、11〜23、11〜22、11〜21、11〜20、12〜25、12〜24、12〜23、12〜22、12〜21、12〜20、13〜25、13〜24、13〜23、13〜22、13〜21、13〜20、14〜25、14〜24、14〜23、14〜22、14〜21、14〜20、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、16〜25、16〜24、16〜23、16〜22、16〜21、16〜20、17〜25、17〜24、17〜23、17〜22、17〜21、17〜20、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、または18〜20の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【００５０】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19〜21または23〜36のいずれか１つのRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％相補性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補性)を有する、10〜25、10〜24、10〜23、10〜22、10〜21、10〜20、11〜25、11〜24、11〜23、11〜22、11〜21、11〜20、12〜25、12〜24、12〜23、12〜22、12〜21、12〜20、13〜25、13〜24、13〜23、13〜22、13〜21、13〜20、14〜25、14〜24、14〜23、14〜22、14〜21、14〜20、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、16〜25、16〜24、16〜23、16〜22、16〜21、16〜20、17〜25、17〜24、17〜23、17〜22、17〜21、17〜20、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、または18〜20の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19のRNA配列またはRNA配列のセグメントに対して70％〜100％相補性(例として、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、85％〜100％、90％〜100％、95％〜100％、96％〜100％、97％〜100％、98％〜100％、99％〜100％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％相補性)を有する、10〜25、10〜24、10〜23、10〜22、10〜21、10〜20、11〜25、11〜24、11〜23、11〜22、11〜21、11〜20、12〜25、12〜24、12〜23、12〜22、12〜21、12〜20、13〜25、13〜24、13〜23、13〜22、13〜21、13〜20、14〜25、14〜24、14〜23、14〜22、14〜21、14〜20、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、16〜25、16〜24、16〜23、16〜22、16〜21、16〜20、17〜25、17〜24、17〜23、17〜22、17〜21、17〜20、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、または18〜20の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【００５１】
2つの核酸配列（例として、本明細書に提供されるIAPを標的とするRNAi分子および、例えば、配列番号1、19、または37のいずれか1つ）の「パーセント同一性」は、当該技術分野において知られている任意の方法によって決定されてもよい。本明細書で提供されるバリアントは、いくつかの態様において、所定の突然変異に対してほぼ等しい確率で選択された4つのヌクレオチド（A、U、G、C）を有するランダムに配置された突然変異を含有する。いくつかの態様において、これらの突然変異は、配列の小さな領域に分布されているか、または配列の長さにわたって広く分布されている可能性がある。いくつかの態様において、2つの核酸配列のパーセント同一性は、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを用いて決定され、KarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変された。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. J. Mol. Biol. Biol.215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、score=100、wordlength-12を用いて実行され、標的核酸に相同なガイド配列を得ることができる。2つの配列の間にギャップが存在する場合、Altschul et al. Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402, 1997に記載されているように、Gapped BLASTが利用され得る。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータが用いられ得る。
【００５２】
IAPを標的とするRNAi分子などの本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、いくつかの態様において、Coleopteran昆虫、例としてコロラドハムシのIAP mRNAの配列のセグメントに相補的な（例えば、完全に（100％）または部分的に（100％未満、例として、90％〜99％）相補的な）少なくとも1のサイレンシング要素を有するように設計される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、Coleopteran昆虫のIAP mRNAと本質的に同一または本質的に相補的な少なくとも1のサイレンシング要素を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、2〜5個、〜10個、2〜20個、2〜20個、2〜40個、または2〜50個のサイレンシング要素を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、または少なくとも50個のサイレンシング要素を含む。
【００５３】
本明細書で提供されるIAPを標的とするRNAi分子は、一本鎖RNA（ssRNA）および二本鎖RNA（dsRNA）を含む、任意の形態のRNAであってもよい。一本鎖RNAの非限定例は、mRNA、マイクロRNA（miRNA）（例として、人工miRNA（amiRNA））、低分子干渉RNA（siRNA）、piwi結合RNA（piRNA）、およびアンチセンスRNAを包含する。二本鎖RNAは、一本鎖領域（例として、ループまたは突出）を含有しない完全二本鎖分子、ならびに二本鎖領域と一本鎖領域（例として、ループおよび突出）を含有する部分二本鎖分子を包含する。さらに、RNAi分子は、これに限定されないが、ヘアピンRNAなどの、重要な二本鎖の特性を含有する二次構造を伴う一本鎖RNA分子であってもよい。よって、IAPを標的とするRNAi分子は、いくつかの態様において、短ヘアピンRNA（shRNA）であってもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、dsRNA、ssRNA、siRNA、miRNA（例として、amirRNA）、piRNA、mRNA、またはshRNAを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、1より多い形態のRNAを含む。例えば、IAPを標的とするRNAi分子は、ssRNAおよびdsRNAを含んでいてもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、RNAとDNAとのハイブリッドを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、標的mRNAのサイレンシングを媒介するために部分的に自己相補的である、非タンパク質コードRNAの長い前駆体転写産物からプロセシングされたamiRNAを含む。amiRNAは、いくつかの態様において、前駆miRNA内の成熟した21のヌクレオチドmiRNA配列を、標的遺伝子に由来する21ヌクレオチド長のフラグメントで置き換えることによって設計される（Frontiers in Plant Science、Sebastian et al., 2017）。amiRNAは、例えば、少なくとも18〜500ヌクレオチド、少なくとも21〜500ヌクレオチド、少なくとも50〜500ヌクレオチド、少なくとも100〜500ヌクレオチド、または少なくとも200〜500ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【００５５】
IAPを標的とするRNAi分子は、IAPを標的とするRNAi分子の混合物として提供されてもよく、例えば、異なる配列を有するIAPを標的とするRNAi分子の混合物であってもよい。IAPを標的とするいくつもの別個のRNAi分子は、IAPを標的とするRNAi分子の混合物において提供されてもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の混合物は、IAPを標的とする少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10の別個の（異なる配列／ヌクレオチド組成を有する）RNAi分子を含む。
【００５６】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、IAP遺伝子によってコードされるmRNA（例として、配列番号1の配列を含むもの）の異なるセグメントに（全体的または部分的に）相補的なRNAi分子の混合物として提供される。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、配列番号19のRNA配列の異なるセグメントに（全体的または部分的に）相補的であるRNAi分子の混合物として提供される。IAP遺伝子（例として、配列番号1の配列を含むもの）によってコードされるmRNA（例として、配列番号19の配列を含むもの）の異なるセグメントに相補的であるIAPを標的とするいくつものRNAi分子が、IAPを標的とするRNAi分子の混合物において提供されてもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の混合物は、IAPを標的とする少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10のRNAi分子を含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の混合物は、IAPを標的とする2〜5、または2〜10のRNAi分子を含む。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書で提供されるIAPを標的とするRNAi分子は、IAP mRNAの対応する配列（例として、配列番号19）と比較して、1以上のミスマッチを有していてもよい。IAPを標的とするRNAi分子の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でIAP mRNAと相補的な塩基対を形成する能力を維持することを条件に、最大で1つ、最大で2つ、最大で3つ、最大で4つなどのミスマッチを有してもよい。代替的に、IAPを標的とするRNAi分子上の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でIAP mRNAと相補的な塩基対を形成する能力を維持することを条件に、1個以下、2個以下、3個以下、または4個以下のミスマッチを有してもよい。いくつかの態様において、相補性領域に2つ以上のミスマッチがある場合、IAPを標的とするRNAi分子が適切なハイブリダイゼーション条件下でIAP mRNAと相補的な塩基対を形成する能力を維持することを条件に、連続して（例として、2、3、4、またはそれ以上続けて）配置されてもよいし、相補性領域全体に点在されてもよい。
【００５８】
IAPを標的とするRNAi分子は、特異性、安定性、送達、バイオアベイラビリティ、分解、ヌクレアーゼ分解への耐性、塩基対の特性、RNAの分布、および細胞取り込み、ならびにその使用に関連する他の特色を改善または制御するために、様々な手法で改変されてもよい。例として、Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen and Kjems, Frontiers in Genetics, 3 (2012): 1-22を参照のこと。したがって、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、1以上の（少なくとも1の）好適な改変を包含してもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とする改変RNAi分子は、その塩基、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、またはリン酸基に改変を有する。
【００５９】
本明細書で提供される方法によって産生されたIAPを標的とするRNAi分子は、本明細書に記載のとおりに改変されてもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、本明細書に記載の方法に従って産生され、その後に改変される。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、改変された出発材料を用いて、本明細書に記載の方法に従って産生される。いくつかの態様において、改変された出発材料は、改変された核酸塩基である。いくつかの態様において、改変された出発材料は、改変されたヌクレオシドである。いくつかの態様において、改変された出発材料は、改変されたヌクレオチドである。
【００６０】
いくつかの態様において、IAPを標的とする改変RNAi分子は、主鎖改変を含む。いくつかの態様において、主鎖改変には、低減された分解（例として、ヌクレターゼ媒介分解）に起因して、より長いRNAの半減期をもたらす。これは順に、より長い半減期をもたらす。好適な主鎖改変の例は、これらに限定されないが、ホスホロチオアート改変、ホスホロジチオアート改変、p-エトキシ改変、メチルホスホナート改変、メチルホスホロチオアート改変、アルキルおよびアリールホスファート（荷電したホスホナート酸素がアルキルまたはアリール基によって置換されている）、アルキルホスホトリエステル（荷電した酸素部分がアルキル化されている）、ペプチド核酸（PNA）主鎖改変、およびロックド核酸（LNA）主鎖改変を含む。これらの改変は、互いに組み合わせて用いられてもよいし、ホスホジエステル主鎖連結と組み合わせて用いられてもよい。
【００６１】
代替的または追加的に、IAPを標的とするRNAi分子は、塩基部または糖部での改変を含む他の改変を含んでいてもよい。例は、3'位のヒドロキシル基以外および5'位のリン酸基以外の低分子有機基に共有結合した糖を有するRNA（例として、2'-O-アルキル化リボース）、またはリボースの代わりにアラビノースなどの糖を有するRNAを包含する。RNAはまた、C-5プロピン改変塩基のような置換されたプリンおよびピリミジンを包含する（Wagner et al., Nature Biotechnology 14：840-844, 1996）。他のプリンおよびピリミジンは、これらに限定されないが、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、およびヒポキサンチンを含む。他のかかる改変は、当業者に周知である。
【００６２】
標的配列の全てまたはセグメントに相補的なヌクレオチド配列を含むRNAi分子は、任意の好適な方法を用いて設計および調製され得る。いくつかの態様において、RNAi分子は、TriboliumおよびDrosophilaの遺伝学について知られているものなどの包括的な配列データベース（例えば、Flybase、SnapDragon、Beetlebase等々）からの助けを借りて、設計されてもよい。いくつかの態様において、配列データベースは、設計されたRNAi分子のオフターゲット効果を決定するために、利用される（例として、Arziman, Z., Horn, T., & Boutros, M. (2005). E-RNAi: a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Research, 33 (Web Server issue), W582-W588. doi:10.1093/nar/gki468.におけるように。)
【００６３】
使用方法
本開示の側面は、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子（またはIAPを標的とするRNAi分子を含む組成物）の有効量を、植物またはColeopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）に送達することを含む、Coleopteran昆虫被害を制御するための方法を提供する。いくつかの態様において、送達方法は、RNAi分子を含む組成物を、植物またはColeopteran昆虫の表面へ適用することを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子を含む組成物は、固体または液体（例として、溶液、懸濁液、またはエマルション）である。非限定例は、乳化可能な濃縮液、濃縮液、低濃縮液、超少量濃縮液、水溶性濃縮液、水溶性液体溶液、ベイト（ペースト、ゲル、液体、固体または注射剤）、煙、霧、逆エマルション、流動体、エアロゾル、均質および非均質混合物、懸濁液（水性および油性）、粉塵、粉末（濡れ性または可溶性）、顆粒（水分散性または乾燥流動体）、ペレット、カプセル、燻蒸剤、カプセルまたはマイクロカプセル製剤、またはそれらの組み合わせを包含する。
【００６４】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子を含む組成物は、濃縮物、スプレー（希釈または濃縮後）、霧、インファロー、種子処理、ドレンチ、ドリップ、昆虫食、ベイト、またはファローへ適用するために適した任意の他の形態として適用されてもよい。本明細書に記載のIAPを標的とするRNAi分子は、葉、茎、花、果実、苗条、根、種子、塊茎、葯、雄しべ、および／または花粉を含むがこれらに限定されない植物の任意の部分へ、送達されてもよい。いくつかの態様において、RNAiは、高圧スプレーまたはサンドブラストを通じて、機械的に送達される。いくつかの態様において、組成物は、RNAi分子および、アジュバント、誘引剤、殺菌剤、成長調節物質、担体または希釈剤、安定剤、および／または駆除剤（単数または複数）（例として、殺虫剤、殺菌剤、および／または除草剤）から選択される少なくとも1の添加剤を含む。駆除剤は、例えば、IAPとは別個の遺伝子を標的とする他のdsRNA、パタチン、植物レクチン、フィトエクジステロイド、クライタンパク質、植生殺虫タンパク質（vip）、細胞溶解タンパク質（cyt）、ビオチン結合タンパク質、プロテアーゼインヒビター、キチナーゼ、有機化合物、またはこれらの任意の組み合わせを含む。また、非駆除剤もまた、用いられても良い（例として、消泡剤、緩衝剤、相溶化剤、ドリフトコントロール添加剤、乳化剤、エクステンダー、逆乳化剤、植物浸透剤、安全剤、展着剤、シール剤、界面活性剤、増粘剤、湿潤剤などのアジュバント）。
【００６５】
組成物は、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子および、スピロメシフェン、スピロディクロフェン、スピロテトラマット、ピリダベン、テブフェンピラド、トルフェンピラド、フェンピロキシメート、フルフェネリム、ピリミジフェン、フェナザキン、ロテノン、シアノピラフェン、ハイドラメチルノン、アセキノシル、フラクリピリム、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィン、リン化亜鉛、シアン化物、ジアフェンチウロン、アゾシクロチン、シヘキサチン、フェンブタチンオキシド、プロパルギット、テトラジフォン、ベンスルタップ、チオシクラム、チオスルタップナトリウム、フロニカミド、エトキサゾール、クロフェンテジン、ジフロビダジン、ヘキシチアゾクス、クロルフルアズロン、ビストリフルロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、ノバルロン、ノビフルムロン、テフルベンズロン、トリフルムロン、ブプロフェジン、サイロマジン、ハイドロプレン、キノプレン、メトプレン、フェノキシカルブ、ピリプロキシフェン、パイメトロジン、ピリフルキナゾン、クロルフェナピル、トラロピリル、臭化メチルおよび／または他のアルキルハライド、クロルピクリン、フッ化スルフリル、ベンクロチアズ、チノメチオナート、クライオライト、メチルネオデカナミド、ベンゾキシメート、シミアゾール、フルエンスルホン、アザジラクチン、ビフェナゼート、アミドフルメット、ジコホル、プリフェネート、シフルメトフェン、ピリダリル、Beauveria bassiana GHA、スルホキサフロール、スピノトラム、スピノサド、エマメクチン安息香酸塩、レピメクチン、ミルベメクチン、アバメクチン、メトキシフェノジド、クロマフェノジド、ハロフェノジド、テブフェノジド、アミトラズ、クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、フルベンジアミド、α-エンドスルファン、クロルデン、エンドスルファン、フィプロニル、アセトプロール、エチプロール、ピラフルプロール、ピリプロール、インドキサカルブ、メタフルミゾン、アクリナトリン、アレトリン、アレトリン-シス-トランス、アレトリン-トランス、β-シフルトリン、β-シペルメトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレトリンS-シクロペンテニル、ビオレスメトリン、シクロプロトリン、シフルトリン、シハロトリン、シペルメトリン、シフェノトリン[(1R)-トランス-異性体]、ジメフルトリン、エンペントリン［(EZ)-(1R)-異性体］、エスフェンバレレート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリネート、フルメトリン、ガンマ-シハロトリン、ラムダ-シハロトリン、メパーフルトリン、メトフルトリン、ペルメトリン、フェノトリン［(1R)-トランス-異性体］、プラレトリン、プロフルトリン、プロトリフェンビュート、レスメトリン、シラフルオフェン、タウ-フルバリネート、テフルトリン、テトラメトリン、テトラメトリン［(1R)-異性体］、テトラメチルフルトリン、θ-シペルメトリン、トラロメトリン、トランスフルトリン、ζ-シペルメトリン、α-シペルメトリン、デルタメトリン、DDT、メトキシクロル、チオジカルブ、アラニカルブ、アルディカルブ、ベンジオカルブ、ベンフラカルブ、ブトキシカルボキシム、カルバリル、カルボフラン、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、フェノブカルブ、ホルメタネート、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メチオカルブ、メトミル、メトルカルブ、オキサミル、ピリミカルブ、プロポクスル、チオファノックス、トリアザメート、トリメタカルブ、XMC、キシリルカルブ、クロルピリホス、マラチオン、アセフェート、アザメチホス、アジンホスエチル、アジンホスメチル、カズサホス、クロルピリホス、クロルフェンビンホス、クロルメホス、クロルピリホスメチル、クマホス、シアノホス、デメトン-S-メチル、ダイアジノン、ジクロルボス/DDVP、ジクロトホス、ジメトエート、ジメチルビンホス、ジスルホトン、EPN、エチオン、エトプロホス、ファムファー、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、フォノフォス、フォスチアゼート、イミシアフォス、イソフェンホス-メチル、メカルバム、メタミドホス、メチダチオン、メビンフォス、モノクロトフォス、ナレッド、オメトエート、オキシデメトン-メチル、パラチオン、パラチオン-メチル、フェントエート、フォレート、ホスアローネ、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホスエチル、プロフェノホス、プロパホス、プロペタンホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルフォス、スルフォテップ、テブピリムホス、テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオメトン、トリアゾホス、トリクロルフォン、バミドチオン、イミダクロプリド、チアメトキサム、アセタミプリド、クロチアニジン、ジノテフラン、ニテンピラム、ニチオジン、ニコチン、チアクロプリド、シアントラニリプロール、カーバメート系、有機リン系、シクロジエン系有機塩素化合物、フェニルピラゾール系（フィプロール系）、ピレスロイド系、ピレチン系、DDTメトキシクロル、ネオニコチノイド系、ニコチン、スルホキシミン系、ブテノライド系、メソイオン系、スピノシン系、エバーメクチン系、ミルバニシン、幼若ホルモン類似体、フェノキシカルブ、ピリプロキシフェン、ハロゲン化アルキル、クロルピクリン、フッ化物、ホウ酸塩、ターターエメティック、メチルイソチオシアネート発生剤、ピリジンアゾメチン誘導体、ピロペン類、クロフェンテジン、ジフロビダジン、ヘキシチアゾックス、エトキサゾール、ディアフェンチウロン、有機スズ系殺虫剤、プロパルギット、テトラジホン、ピロール類、ジニトロフェノール類、スルフラミド、ネレイストキシン類縁化合物、ベンゾイルレア類、ブプロフェジン、サイロマジン、ジアシルヒドラジン類、アミトラズ、ヒドラメチルノン、アセキノシル、フラアクリピリム、ビフェナザート、METI殺ダニ剤および殺虫剤、ロテノン、オキサジアジン類、セミカルバゾン類、テトロン酸誘導体、テトラミック酸誘導体、リン化物、シアン化物、β-ケトニトリル誘導体、カルボキサニリド、ジアミド、フロニカミド、メタジアミド、イソキサゾリン、グラニュロウイルス（GV）、ヌクレオポリヘドロウイルス（NPV）、GS-オメガ/カッパHXTX-Hv1aペプチド、アザディラクチン、ベンゾキシメート、ブロモプロピレート、チノメチオナート、ジコフォール、ライムスルフ、マンコゼブ、ピリダリル、イオウ、ベンズイミダゾール類、ジカルボキシミド類、ピリジン類、ピリミジン類、トリアゾール類、アシルアラニン類、ピリジンカルボキサミド類、アニリノピリミジン類、キノンアウトサイドインヒビター（QoI-殺菌剤）、フェニルピロール類、キノリン類、ヒドロキシアニリド類、トルアミド類、シアノアセタミドオキシム類、ジニトロフェニルクロトネート類、ホスホン酸塩、カルボン酸アミド（CAA-殺菌剤）、M1無機物、M2無機物、M3ジチオカルバメート、M4フタルイミド、パラフィン油、石油系園芸油、パルミチン油、ステリク油、リノール油、オレイン酸油、カノーラ油、大豆油、オレガノ油、タジェット油、バルサムファー油、タイム油、ブラックペッパー油、ミント油、シダーウッド油、フィッシュオイル、ホホバ油、ラバジン油、ヒマシ油、ユーカリ油、オシマム油、パチュリー油、シトラス油、アルテミシア油、クスノキ油、ウィンターグリーン油、メチルオイゲノール油、チモール油、ゼラニウム油、ゴマ油、アマニ油、綿実油、レモングラス油、ベルガモット油、マスタード油、オレンジ油、シトロネラ油、ティーツリー油、ニーム油、ガーリック油、Bacillus sphaericus、Bacillus thuringiensis（例として、Bacillus thuringiensis var. aizawai、Bacillus thuringiensis var. israelensis、Bacillus thuringiensis var. kurstaki、Bacillus thuringiensis var. sphaericus、Bacillus thuringiensis var. tenebrionensis）と、それらが産生する殺虫タンパク質（例えば、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry1A.105、Cry2Ab、Vip3A、mCry3A、Cry3Ab、Cry3Bb、Cry34Ab1／Cr35Ab1）、Paenibacillus popilliae、Serratia entomophila、核ポリヘドロシスウイルス、グラニュロシスウイルス、非閉塞性バキュロウイルス、Beauveria種、Metarhizium、Entomophaga、Zoopthora、Paecilomyces fumosoroseus、Normuraea、Lecanicillium lecanii、Nosema、Thelohania、Vairimorpha、Steinernema種、Heterorhabditis 種、または以下からなる群から選択された活性成分をさらに含んでいてもよいそれらの組み合わせ；アジンホスメチル、アセフェート、イソキサチオン、イソフェンホス、エチオン、エトリムホス、オキシデメトンメチル、オキシデメトン・メチル、オキシデプロフォス、キナルフォス、クロルピリフォス、クロルピリフォス・メチル、クロルフェンビンフォス、シアノフォス、ジオキサベンゾフォス、ジクロルボス、ジスルホトン、ジメチルビンフォス、ジメトエート、スルプロフォス、ダイアジノン、チオメトン、テトラクロルビンフォス、テメフォス、テブピリムフォス、テルブフォス、ナレッド、バミドチオン、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、ピリミホスメチル、フェニトロチオン、フェンチオン、フェントエート、フルピラゾホス、プロチオホス、プロパホス、プロフェノホス、ホキシム、ホサロン、ホスメット、フォルモシオン、ホレート、マラチオン、メカバム、メスルフェンホス、メタミドホス、メチダチオン、パラチオン、メチルパラチオン、モノクロトホス、トリクロルホン、EPN、イサゾホス、イサミドホス、カデュサホス、ジアミダホス、ジクロフェンチオン、チオナジン、フェナミホス、フォスチアゼート、フォスチエタン、ホスホカルブ、DSP、エトプロホス、アラニカルブ、アルジカルブ、イソプロカルブ、エチオフェンカルブ、カルバリル、カルボスルファン、キシリルカルブ、チオジカルブ、ピリミカルブ、フェノブカルブ、フラチオカルブ、プロポクスル、ベンジオカルブ、ベンフラカルブ、メトミル、メトルカルブ、XMC、カルボフラン、アルドキシカルブ、オキサミル、アクリントリン、アレトリン、エスフェンバレレート、エンペントリン、シクロプロトリン、シハロトリン、ガンマ-シハロトリン、ラムダ-シハロトリン、シフルトリン、ベータ-シフルトリン、シペルメトリン、アルファ-シペルメトリン、ゼータ-シペルメトリン、シラフルオフェン、テトラメトリン、テフルトリン、デルタメトリン、トラロメトリン、ビフェントリン、フェノトリン、フェンバレレート、フェンプロパトリン、フラメトリン、プラレトリン、フルシトリン、フルバリネート、フルブロシトリン、ペルメトリン、レスメトリン、エトフェンプロックス、カルタップ、チオシクラム、ベンサルタップ、アセタミプリド、イミダクロプリド、クロチアニジン、ジノテフラン、チアクロプリド、チアメトキサム、ニテンピラム、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、テフルベンズロン、トリフルムロン、ノバルロン、ノビフルムロン、ビストリフルロン、フルアズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、クロマフェンオジド、テブフェノジド、ハロフェンオジド、メトキシフェンオジド、ジオフェンオラン、サイロマジン、ピリプロキシフェン、ブプロフェジン、メトプレン、ハイドロプレン、キノプレン、トリアザメート、エンドスルファン、クロルフェンソン、クロロベンジレート、ジコフォール、ブロモプロピレート、アセトプロール、フルプロニル、エチプロール、ピレトリン、ロテノン、ニコチンスルフェート、スピノサド、フィンプロニル、スピロテトラマット、アバメクチン、アセキノシル、アミドフルメット、アミトラズ、エトキサゾール、チノメチオナート、クロフェンテジン、フェンブタチンオキサイド、ジエノクロル、シヘキサチン、スピロディクロフェン、スピロメシフェン、テトラジフォン、テブフェンピラド、ビナパクリル、ビフェナザート、ピリダベン、ピリミジフェン、フェナザキン、フェノチオカルブ、フェンピロキシメート、フルアクリピリム、フルアジナム、フルフェンジン、ヘキシチアゾックス、プロパルジャイト、ポリナクチン複合体、ミルベメク
チン、ルフェヌロン、メカルバム、メチオカルブ、メビンホス、ハーフェンプロックス、アザジラクチン、ジアフェンチウロン、インドキサカルブ、エマメクチンベンゾエート、オレイン酸カリウム、オレイン酸ナトリウム、クロルフェナピル、トルフェンピラド、ピメトロジン、フェノキシカルブ、ヒドラメチルノン、ヒドロキシプロピルスターチ、ピリダリル、フルフェネリム、フルベンジアミド、フロニカミド、メタフルミゾール、レピメクチン、TPIC、アルベンダゾール、オキシベンダゾール、オキシフェンダゾール、トリクラミド、フェンスルフォチオン、フェンベンダゾール、塩酸レバミゾール、酒石酸モランテル、ダゾメット、メタムナトリウム、トリアジメフォン、ヘキサコナゾール、プロピコナゾール、イプコナゾール、プロクロラズ、トリフルミゾール、テブコナゾール、エポキシコナゾール、ジフェノコナゾール、フルシラゾール、トリアジメノール、シプロコナゾール、メトコナゾール、フルキンコナゾール、ビテルタノール、テトラコナゾール、トリチコナゾール、フルトリアフォル、ペンコナゾール、ジニコナゾール、フェンブコナゾール、ブロムコナゾール、イミベンコナゾール、シメコナゾール、ミクロブタニル、ヒメキサゾール、イマザリル、フラメトピル、チフルザミド、エトリジアゾール、オキスポコナゾール、オキスポコナゾールフマレート、ペフラゾエート、プロチオコナゾール、ピリフェノックス、フェナリモル、ニュアリモル、ブピリメート、メパニピリム、シプロディニル、ピリメタニル、メタラキシル、メフェノキサム、オキサディキシル、ベナラクシル、チオファネート、チオファネートメチル、ベノミル、カルベンダジム、フベリダゾール、チアベンダゾール、マンゼブ、プロピネブ、ジネブ、メチラム、マネブ、ジラム、チウラム、クロロタロニル、エタボキサム、オキシカルボキシン、カルボキシン、フルトラニル、シルチオファム、メプロニル、ジメトモルフ、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、スピロキサミン、トリデモルフ、ドデモルフ、フルモルフ、アゾキシストロビン、クレソキシムメチル、メトミノストロビン、オリサストロビン、フルオキサストロビン、トリフロキシストロビン、ジモキシストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、イプロジオン、プロシミドン、ビンクロゾリン、クロゾリン酸、フルスルファミド、ダゾメット、メチルイソチオシアネート、クロルピクリン、メタスルホカルブ、ヒドロキシイソオキサゾール、ヒドロキシイソオキサゾールカリウム、エクロメゾール、D-D,カルバム、塩基性塩化銅、塩基性硫酸銅、ノニルフェノールスルホン酸銅、オキシン銅、DBEDC、無水硫酸銅、硫酸銅五水和物、水酸化銅、無機硫黄、湿潤硫黄、石灰硫黄、硫酸亜鉛、フェンチン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、銀、エディフェンホス、トルクロホスメチル、フォセチル、イプロベンホス、ジノキャップ、ピラゾホス、カルプロパミド、フタリド、トリシクラゾール、ピロキロン、ジクロシメット、フェノキサニル、カスガマイシン、バリダマイシン、ポリオキシン、ブラスチデンS、オキシテトラサイクリン、マイルディオマイシン、ストレプトマイシン、ナタネ油、マシン油、ベンチアバリカ���ビイソプロピル、イプロバリカルブ、プロパモカルブ、ジエトフェンカルブ、フルオロイミド、フルジオキサニル、フェンピクロニル、キノキシフェン、オキソリニック酸、クロロタロニル、キャプタン、フォルペット、プロベナゾール、アシベンゾーラ-S-メチル、ティアジニル、サイフルフェナミド、フェンヘキサミド、ジフルメトリム、メトラフェノン、ピコベンズアミド、プロキナジド、ファモキサドン、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ボスカリド、シモキサニル、ジチアノン、フルアジナム、ジクロフルアニド、トリフォリン、イソプロチオラン、フェリムゾン、ジクロメジン、テクロフタラム、ペンシクロン、チノメチオナート、イミノクタジンアセテート、イミノクタジンアルベシレート、アンバム、ポリカルバメート、チアジアジン、クロロネブ、ニッケルジメチルジチオコシアネート、グアザチン、ドデシルグアニジンアセテート、キントゼン、トリルフルアニド、アニラジン、ニトロタリソプロピル、フェニトロパン、ジメチリモル、ベンチアゾール、フルメトベール、マンディプロパミド、ペンチオピラド、または任意のそれらの組み合わせなどの、様々な農業化学物質、殺虫剤、ダニ殺虫剤、殺菌剤、駆除剤および/またはバイオ駆除(例として、微生物の、PIP、および/または生物化学的物質)剤の少なくとも1の混合物を包含する。
【００６６】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran昆虫の食餌中に供給される。例えば、IAPを標的とするRNAi分子は、植物または種子へ局所的に適用されてもよく（例として、浸漬、コーティング、ダスティングまたは噴霧を介して）、または植物の細胞がRNAi分子を発現するように改変されてもよい。RNAi分子はまた、別の食品または水源中に供給されてもよい。
【００６７】
植物は、Coleopteran昆虫による被害の対象となる任意の植物であってもよい。いくつかの態様において、植物は、Solanaceous植物（例えば、Solanaceae科）である。Solanaceous植物の例は、これらに限定されないが、ジャガイモ植物（Solanum tuberosum）、バッファローバー植物（Solanum rostratum）、ナス植物（Solanum melongena）、トマト植物（Solanum lycopersicum）、タバコ植物（Nicotiana tabacum）、トウガラシ植物（Capsicum annum）、およびウッディナイトシェード植物（Solanum dulcamara）を含む。
【００６８】
よって、いくつかの態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）による植物の被害を抑制するための有効量で、植物（例として、ジャガイモ植物）へ送達することを含む。他の態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）による植物の被害を抑制するための有効量で、バッファローバー植物へ送達することを含む。もう１つの他の態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、ジャガイモ植物）による植物の被害を抑制するための有効量で、ナス植物へ送達することを含む。さらに他の態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）による植物の被害を抑制するための有効量で、トマト植物へ送達することを含む。さらなる態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）による植物の被害を抑制するための有効量で、タバコ植物へ送達することを含む。追加の態様において、本方法は、IAPを標的とするRNAi分子を、例えば、Coleopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）による植物の被害を抑制するための有効量で、トウガラシ植物へ送達することを含む。
【００６９】
IAPを標的とするRNAi分子を植物（例として、植物の一部）および／またはColeopteran昆虫へ送達することは、例えば、RNAi分子またはRNAi分子を含む組成物を植物の任意の部分（例として、根、塊茎、茎、枝、葉、花など）、地面（例として、土壌、土、草等々）、昆虫および／または昆虫の食餌へ、局所的に適用（例として、浸漬、コーティング、またはダスティング）することを含んでもよい。送達ステップはまた、RNAi分子を発現するように植物の細胞を遺伝子工学的に改変することを含んでもよい。送達ステップはまた、RNAi分子を発現するおよび／またはこれを植物またはColeopteran昆虫へ送達するように遺伝子工学的に改変された生物（例として、ウイルス、細菌、真菌等々）に、植物またはColeopteran昆虫を曝露することを包含してもよい。
【００７０】
有効量は、単独で、または1つ以上の他の添加剤と組み合わせて、Coleopteran昆虫による被害に対する有益な効果（例として、死、摂食停止、成長、発達または繁殖の阻害）を与えるのに必要なIAPを標的とするRNAi分子の量である。有益な効果は、例えば、対照と比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の、被害における低減を含む。いくつかの態様において、対照は、殺虫剤および／または駆除薬の不存在である。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、植物のColeopteran昆虫（例として、コロラドハムシ）被害を完全に除去する。
【００７１】
有効量は、当業者が認識しているように、具体的な植物、被害の重症度、被害の期間、殺虫剤への過去の曝露、および実践者の知識や専門性の範囲内の類似因子によって変化する。これらの因子は、当業者には周知であり、ルーチンの実験法によって対処され得る。一般的には、効率を高め、コストを下げるために、より低い有効濃度を用いられること、すなわち、昆虫の制御を提供する最低濃度が用いられることが好ましい。
【００７２】
IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、送達方法によって変化してもよい。
【００７３】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、植物または地面（例えば、土壌、土、草、等々）の表面の平方センチメートル（cm2）あたりのIAPを標的とするRNAi分子のマイクログラム（μg）、すなわち、μg/cm2で表される。よって、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.001μg/cm2〜10μg/cm2を含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.001μg/cm2〜9μg/cm2、0.001μg/cm2〜8μg/cm2、0.001μg/cm2〜7μg/cm2、0.001μg/cm2〜6μg/cm2、0.001μg/cm2〜5μg/cm2、0.001μg/cm2〜4μg/cm2、0.001μg/cm2〜3μg/cm2、0.001μg/cm2〜2μg/cm2、0.001μg/cm2〜1μg/cm2、0.001μg/cm2〜0.1μg/cm2、または0.001μg/cm2〜0.01μg/cm2を含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.01μg/cm2〜10μg/cm2、0.1μg/cm2〜10μg/cm2、1μg/cm2〜10μg/cm2、2μg/cm2〜10μg/cm2、3μg/cm2〜10μg/cm2、4μg/cm2〜10μg/cm2、5μg/cm2〜10μg/cm2、6μg/cm2〜10μg/cm2、7μg/cm2〜10μg/cm2、8μg/cm2〜10μg/cm2、または9μg/cm2〜10μg/cm2を含む。
【００７４】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、植物または地面（例えば、土壌、土、草、等々）の表面の1エーカー（ac.）あたりのIAPを標的とするRNAi分子のグラム（g）、すなわち、g/acで表される。よって、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.01 g/ac〜100 g/acを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.01 g/ac〜90 g/ac.、0.01 g/ac〜80 g/ac.、0.01 g/ac〜70 g/ac.、0.01 g/ac〜60 g/ac.、0.01 g/ac〜50 g/ac.、0.01 g/ac〜40 g/ac.、0.01 g/ac〜30 g/ac.、0.01 g/ac〜20 g/ac.、0.01 g/ac〜10 g/ac.、0.01 g/ac〜1 g/ac.、または0.01 g/ac〜0.1 g/acを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、0.1 g/ac〜100 g/ac.、1 g/ac〜100 g/ac.、10 g/ac〜100 g/ac.、20 g/ac〜100 g/ac.、30 g/ac〜100 g/ac.、40 g/ac〜100 g/ac.、50 g/ac〜100 g/ac.、60 g/ac〜100 g/ac.、70 g/ac〜100 g/ac.、80 g/ac〜100 g/ac.、または90 g/ac〜100 g/acを含む。
【００７５】
いくつかの態様において、Coleopteran昆虫を制御するためのRNAi分子の有効性は、昆虫または昆虫の集団を死滅させるまたは死を引き起こすRNAi分子の能力を用いて決定され得る。昆虫の集団における死の割合は、死亡率（例として、経時的な死亡率）によって決定されてもよい。一般に、昆虫の集団の死亡率は、RNAi分子の結果として死亡した該集団の昆虫のパーセンテージを反映する（例として、75％の死亡は、RNAi分子が全昆虫集団の75％を死滅させたことを示す）。いくつかの態様において、死亡率は、経時的に（例として、昆虫のRNAi分子への数日間曝露の過程で）測定される。いくつかの態様において、死亡率は、曝露の少なくとも3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、15日、または20日後に測定される。いくつかの態様において、RNAi分子は、Coleopteran昆虫集団の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％の死亡率を引き起こす。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子によって、Coleopteran昆虫集団の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％が死滅させられる。いくつかの態様において、RNAi分子の死亡率は、対照（例として、対照分子または未処理の条件）と比較される。いくつかの態様において、RNAi分子の死亡率は、対照（例として、対照分子または未処理の条件）よりも、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、または200％高い。
【００７６】
いくつかの態様において、Coleopteran昆虫を制御するためのRNAi分子の有効性は、Coleopteran昆虫または昆虫集団の葉片消費を制限するRNAi分子の能力を用いて決定され得る。葉片消費は、昆虫または昆虫集団によって消費または食される植物材料（例として、ナスの葉）の量（例として、パーセンテージ）を指す。いくつかの態様において、RNAi分子は、昆虫または昆虫集団による葉片消費量において、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％減少させる。いくつかの態様において、葉片消費を減少させるRNAi分子の能力は、対照（例として、対照分子または未処理の条件）と比較される。いくつかの態様において、葉片消費は、経時的に（例として、昆虫のRNAi分子への数日間曝露の過程で）測定される。いくつかの態様において、葉片消費は、曝露の3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、またはそれ以上の日後に測定される。
【００７７】
いくつかの態様において、Coleopteran昆虫を制御するためのRNAi分子の有効性は、Coleopteran昆虫または昆虫集団による植物の落葉率を減少させるRNAi分子の能力を用いて決定され得る。植物の落葉率は、昆虫または昆虫の集団によって破壊される（例として、消費される）植物材料（例えば、ナスの葉）のパーセンテージを指す。いくつかの態様において、RNAi分子は、昆虫または昆虫の集団による植物の落葉率において、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％減少させる。いくつかの態様において、RNAi分子は、植物の落葉率を40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、または1％未満に減少させる。いくつかの態様において、RNAi分子への昆虫の曝露後の、少なくとも5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、15日間、または20日間、植物の落葉率が40％、30、25％、20％、15％、10％、5％、3％、または1％未満に留まる。いくつかの態様において、植物の落葉率を減少させるためのRNAi分子の能力は、対照（例として、対照分子または未処理の条件）と比較される。いくつかの態様において、植物の落葉率は、経時的に（例として、昆虫のRNAi分子への数日間曝露の過程で）測定される。いくつかの態様において、植物の落葉率は、曝露の3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、またはそれ以上の日後に測定される。
【００７８】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、溶液（例として、Coleopteran昆虫および／または食餌（例として、摂取される食品および／または水）、植物または地面（例として、土壌、土、草、等々）の表面へ適用されるもの）において製剤化されてもよい。いくつかの態様において、溶液中のIAPを標的とするRNAi分子の有効量は、溶液のミリリットル（ml）あたりのIAPを標的とするRNAi分子のナノグラム（ng）またはマイクログラム（μg）、すなわち、ng／mlで表される。よって、いくつかの態様において、溶液は、10ng/ml〜100μg/mlの濃度でのIAPを標的とするRNAi分子を含む。いくつかの態様において、溶液は、IAPを標的とするRNAi分子を、10 ng/ml〜100 μg/ml、100 ng/ml〜100 μg/ml、250 ng/ml〜100 μg/ml、750 ng/ml〜100 μg/ml、1000 ng/ml〜100 μg/ml、10 μg/ml〜100 μg/ml、25 μg/ml〜100 μg/ml、50 μg/ml〜100 μg/ml、または75 μg/ml〜100 μg/mlの濃度で含む。いくつかの態様において、溶液は、IAPを標的とするRNAi分子を、10 ng/ml〜100 μg/ml、10 ng/ml〜75 μg/ml、10 ng/ml〜50 μg/ml、10 ng/ml〜25 μg/ml、10 ng/ml〜10 μg/ml、10 ng/ml〜1000 ng/ml、10 ng/ml〜1000 ng/ml、10 ng/ml〜750 ng/ml、10 ng/ml〜500 ng/ml、10 ng/ml〜250 ng/ml、10 ng/ml〜100 ng/ml、10 ng/ml〜75 ng/ml、10 ng/ml〜50 ng/ml、または10 ng/ml〜25 ng/mlの濃度で含む。
【００７９】
溶液は、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子および少なくとも1つの追加添加剤（例として、駆除薬、界面活性剤、または他の非駆除剤）を含む。いくつかの態様において、かかる混合物は、0.0001 μg/ml〜10 μg/mlの濃度のIAPを標的とするRNAi分子（例として、植物および/または地面（例えば、土壌、土、草、等々）の表面へ適用されるもの）を含む。いくつかの態様において、かかる混合物は、IAPを標的とするRNAi分子を、0.001 μg/ml〜10 μg/ml、0.01 μg/ml〜10 μg/ml、0.1 μg/ml〜10 μg/ml、1 μg/ml〜10 μg/ml、2 μg/ml〜10 μg/ml、3 μg/ml〜10 μg/ml、4 μg/ml〜10 μg/ml、5 μg/ml〜10 μg/ml、6 μg/ml〜10 μg/ml、7 μg/ml〜10 μg/ml、8 μg/ml〜10 μg/ml、または9 μg/ml〜10 μg/mlの濃度で含む。いくつかの態様において、かかる混合物は、IAPを標的とするRNAi分子を、0.0001 μg/ml〜9 μg/ml、0.0001 μg/ml〜8 μg/ml、0.0001 μg/ml〜7 μg/ml、0.0001 μg/ml〜6 μg/ml、0.0001 μg/ml〜5 μg/ml、0.0001 μg/ml〜4 μg/ml、0.0001 μg/ml〜3 μg/ml、0.0001 μg/ml〜2 μg/ml、0.0001 μg/ml〜1 μg/ml、0.0001 μg/ml〜0.1 μg/ml、0.0001 μg/ml〜0.01 μg/ml、または0.0001 μg/ml〜0.001 μg/mlの濃度で含む。
【００８０】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、昆虫の食餌において提供される。よって、いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の有効量は、昆虫の食餌のミリリットル（ml）あたりのIAPを標的とするRNAi分子のマイクログラム（μg）、すなわちμg/mlで表される。いくつかの態様において、昆虫の食餌は、0.001 μg/ml〜10 μg/mlの濃度のIAPを標的とするRNAi分子を含む。いくつかの態様において、昆虫の食餌は、IAPを標的とするRNAi分子を、0.001 μg/ml〜9 μg/ml、0.001 μg/ml〜8 μg/ml、0.001 μg/ml〜7 μg/ml、0.001 μg/ml〜6 μg/ml、0.001 μg/ml〜5 μg/ml、0.001 μg/ml〜4 μg/ml、0.001 μg/ml〜3 μg/ml、0.001 μg/ml〜2 μg/ml、0.001 μg/ml〜1 μg/ml、0.001 μg/ml〜0.1 μg/ml、または0.001 μg/ml〜0.01 μg/mlの濃度で含む。いくつかの態様において、昆虫の食餌は、IAPを標的とするRNAi分子を、0.01 μg/ml〜10 μg/ml、0.1 μg/ml〜10 μg/ml、1 μg/ml〜10 μg/ml、2 μg/ml〜10 μg/ml、3 μg/ml〜10 μg/ml、4 μg/ml〜10 μg/ml、5 μg/ml〜10 μg/ml、6 μg/ml〜10 μg/ml、7 μg/ml〜10 μg/ml、8 μg/ml〜10 μg/ml、または9 μg/ml〜10 μg/mlの濃度で含む。
【００８１】
IAPを標的とするRNAi分子を、植物の任意の部分（例として、根、塊茎、茎、枝、葉、花、等々）、地面（例として、土壌、土、草、等々）、昆虫および／または昆虫の食餌に送達するステップは、IAPを標的とするRNAi分子の植物、地面（例として、土壌、土、草、等々）、昆虫および／または昆虫の食餌への単回の適用（単回の接触）または複数回の適用（複数回の接触）を含んでもよい。植物、昆虫および／または昆虫の食餌の一部への送達は、スプレー（例として、加圧／エアロゾル化されたスプレー、ポンプ）、固体（例として、粉末、ペレット、ベイト）、または液体（例として、溶液などの均質混合物、および懸濁液（水性および油性）、コロイド、ミセル、エマルションなどの非均質混合物）の形態であってもよい。接触の期間は、変化してもよい。いくつかの態様において、送達は、IAPを標的とするRNAi分子の、Coleopteran昆虫の成長、繁殖（例として、生殖能力および／または多産能力）、および／または摂食の低減、および／またはColeopteran昆虫の死（もしあれば）に充分な好適な期間での、植物および／またはColeopteran昆虫の一部へ曝露を含む。
【００８２】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子の植物および／またはColeopteran昆虫との送達の後に、IAPを標的とするRNAi分子の、植物および／またはColeopteran昆虫による摂取および／または吸収が続く。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子のColeopteran昆虫による摂取は、Coleopteran昆虫の生物学的機能を変化させ、それによってColeopteran昆虫による被害を制御する。Coleopteran昆虫の変化した生物学的機能の例は、これらに限定されないが、成長の低減、繁殖(例として、生殖能力および/または多産能力)の低減、摂食の低減、運動の減少、発達の減少、細胞修復の減少、および／または死亡の増加を含む。
【００８３】
いくつかの態様において、送達は、IAPを標的とするRNAi分子を、植物の表面および／またはColeopteran昆虫によって接触された表面（例として、地面（例えば、土壌、土、草、等々））の一部へ適用することを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子を表面の一部へ適用することは、表面またはその一部をスプレー、コーティング、および／またはダスティングすることを含む。いくつかの態様において、IAP RNAを標的とするRNAi分子を表面の一部へ適用することは、植物の根に隣接する土壌に、RNAi分子を顆粒状または粉末状の製剤としてグランドドレンチすること、または適用することを含む。
【００８４】
IAPを標的とするRNAi分子は、植物の任意の部分（例として、根、塊茎、茎、枝、葉、花、等々）へ適用されてもよい。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、植物の地上部分（例として、葉）および／または植物の地下部分（例として、根）と接触され、これは、粉末、顆粒、ペレット、カプセル、可溶性液体濃縮物、スプレー（希釈後または濃縮後）、霧、インファロー、種子処理、昆虫の食餌、ベイト、ドレンチ、ドリップ灌漑、またはファローへ適用するために適したいずれの他の形態からなる群から選択される少なくとも1のインファロー製剤を含んでいてもよい。本明細書に記載のIAPを標的とするRNAi分子と接触させてもよい植物の部分は、これらに限定されないが、葉、茎、花、果実、苗条、根、種子、塊茎、葯、雄しべ、または花粉を含む。いくつかの態様において、RNAiは、高圧スプレーまたはサンドブラストを介して、機械的に送達される。
【００８５】
いくつかの態様において、送達することは、Coleopteran昆虫による食餌摂取のためにIAPを標的とするRNAi分子を提供することを含む。いくつかの態様において、接触させることは、Coleopteran昆虫によって摂取され得るかまたはその他内部に吸収され得るIAPを標的とするRNAi分子を提供することを含む。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、Coleopteran昆虫による食餌摂取のための食餌において提供される。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、植物もしくは植物部分中／上に提供されるか、または植物もしくは植物部分へ局所的に適用される（例として、浸漬、コーティング、ダスティング）。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子は、植物または植物部分において発現される。
【００８６】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子のColeopteran昆虫への送達は、Coleopteran昆虫における内在性の相補的ヌクレオチド配列（例として、RNA配列）の発現を阻害する（発現を低減または抑制する）。いくつかの態様において、内在性の相補的ヌクレオチド配列は、内在性のIAP配列である。
【００８７】
阻害の結果は、昆虫の1以上の特性を評価するための任意の適切なアッセイによって、またはIAPの発現を示す分子（例として、RNA、タンパク質）を評価する生化学的技術によって、確認され得る。いくつかの態様において、本明細書で提供されるIAPを標的とするRNAi分子がIAPの発現のレベルを低減させる程度は、IAPの発現レベル（例えば、IAPのmRNAまたはタンパク質レベル）を適切な対照（例として、IAPを標的とするRNAi分子が送達されていないか、または陰性対照が送達された細胞または細胞の集団におけるIAPの発現レベル）と比較することによって、評価される。いくつかの態様において、IAP発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定する必要がないように、予め決められたレベルまたは値であってもよい。予め決められたレベルまたは値は、様々な形態をとり得る。いくつかの態様において、予め決められたレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値とされ得る。
【００８８】
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのIAPを標的とするRNAi分子の送達は、昆虫の細胞におけるIAP発現のレベルにおける低減をもたらす。いくつかの態様において、IAP発現のレベルの低減は、対照レベルと比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の低減であってもよい。いくつかの態様において、対照レベルは、RNAi分子と接触していない同様の昆虫細胞におけるIAP発現のレベル（または細胞集団間の平均レベル）である。いくつかの態様において、対照レベルは、昆虫細胞によって発現されていない遺伝子、例として緑色蛍光タンパク質（GFP）を標的とするRNAi分子と接触させた同様の昆虫細胞（または細胞集団間の平均レベル）におけるIAP発現のレベルである。
【００８９】
いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子を細胞または昆虫へ送達することの効果は、有限の期間後に評価される。例えば、IAPのレベルは、IAPを標的とするRNAi分子を細胞または昆虫へ送達してから、少なくとも4時間後、8時間後、12時間後、18時間後、24時間後；または少なくとも1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、もしくは14日後に、細胞または昆虫において測定されてもよい。
【００９０】
いくつかの態様において、本明細書に記載のIAPを標的とするRNAi分子の送達は、昆虫の成長、繁殖(例として、生殖能力および/または多産能力)、および／または摂食のレベルの低減をもたらす。いくつかの態様において、成長、繁殖(例として、生殖能力および/または多産能力)、および／または摂食のレベルの低減は、対照レベルと比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の低減であってもよい。いくつかの態様において、対照レベルは、RNAi分子と接触していない同様の昆虫の成長、繁殖（例として、生殖能力および/または多産能力）、および／または摂食のレベルである。いくつかの態様において、対照レベルは、昆虫細胞によって発現されない遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）を標的とするRNAi分子と接触させた同様の昆虫の成長、繁殖（例として、生殖能力および/または多産能力）、および／または摂食のレベルである。
【００９１】
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのIAPを標的とするRNAi分子の送達は、昆虫の集団間の死亡における増加をもたらす。いくつかの態様において、死亡のレベルにおける増加は、対照と比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の増加であってもよい。いくつかの態様において、対照は、RNAi分子と接触していない昆虫の集団間の死亡である。いくつかの態様において、対照は、昆虫細胞によって発現されない遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）を標的とするRNAi分子と接触させた昆虫の集団間である。
【００９２】
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりのIAPを標的とするRNAi分子を発現する植物を提供する。いくつかの態様において、本明細書で提供されるIAPを標的とするRNAi分子をコードするDNAは、植物がIAPを標的とするRNAi分子を発現するように、植物（植物の種子または細胞）へ提供される。いくつかの態様において、IAPを標的とするRNAi分子をコードするDNAは、トランスジェニック発現によって、例として、IAPを標的とするRNAi分子をコードするDNAを、植物がIAPを標的とするRNAi分子を発現するように、植物のゲノムに安定的に組み込むことによって、植物で発現される。
【００９３】
IAPを標的とするRNAi分子の産生方法
本明細書で提供されるとおりのIAPを標的とするRNAi分子は、当該技術分野において知られている任意の好適な方法によって産生されてもよい。IAPを標的とするRNAi分子を産生するための方法の例は、これらに限定されないが、in vitro転写（IVT）、化学合成、生物（例として、植物）中の発現、または細胞培養（例として、植物細胞培養）中の発現、および微生物発酵を含む。
【００９４】
IAPを標的とするRNAi分子は、いくつかの態様において、2017年10月12日に公開された「Cell-Free Production of Ribonucleic Acid」と題された国際出願公開WO 2017/176963 A1に記載された無細胞産生方法；2017年10月11日に出願された「Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production」と題された米国仮出願U.S.S.N. 62/571,071；および2019年4月18日に公開された「Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production」と題された国際出願公開WO 2019/075167 A1に従って産生されてもよく、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
本明細書に記載のIAPを標的とするRNAi分子をコードする任意の好適なDNAは、本明細書に記載の方法において用いられてもよい。DNAは、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA）であってもよい。いくつかの態様において、DNAは、転写される場合に一本鎖RNA（ssRNA）分子（例として、一本鎖のままであるか、またはRNAヘアピンに折り畳まれるもの）、または二本鎖RNA（dsRNA）分子を産生するためにアニールする相補的ssRNA分子を産生する1以上のDNA発現カセット（単数または複数）を含む。
【００９６】
いくつかの態様において、DNAは、IAPのセグメントに相補的なRNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されているプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、および任意にターミネーターを含む。他の態様において、DNAは、IAPのセグメントに相補的なRNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されている第一のプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、および任意にターミネーター、および第一のRNAに相補的な第二のRNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されている第二のプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、および任意にターミネーターを含む。もう1つの他の態様において、DNAは、RNAの第一の領域をコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されたプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、これに続くループ領域の1以上のヌクレオチド、これに続くRNAの第二の領域、および任意にこれに続くターミネーターを含み、ここで、RNAの第一の領域はIAPのセグメントに相補的であり、第二の領域は第一の領域に相補的である。さらに他の態様において、DNAは、IAPのセグメントに相補的な第一のRNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されている第一のプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、および任意にターミネーターを含む第一の鎖、ならびに第一のRNAに相補的な第二のRNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されている第二のプロモーター（例として、誘導性プロモーター）、および任意にターミネーターを含む第二の鎖を含み、ここで、第一および第二のプロモーターが、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されており、ここで、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列の双方向転写は、dsRNA分子を形成するためにアニールする相補的RNA分子をもたらす。
【００９７】
DNAは、他の鋳型形式（例として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、化学合成、または当該技術分野において知られている他の手段によって生成された直鎖状のDNA）を用いてもよいが、典型的には、プラスミドなどのベクター上に提供される。いくつかの態様において、1より多いDNAが反応混合物において用いられる。いくつかの態様において、2、3、4、5、またはそれより多い異なるDNAが反応混合物において用いられる。
【００９８】
プロモーターまたはターミネーターは、天然に存在する配列または、改変された（例えば、合成の）配列であってもよい。いくつかの態様において、改変された配列は、転写活性を高めるように改変される。いくつかの態様において、プロモーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、プロモーターは、改変された配列である。いくつかの態様において、ターミネーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、ターミネーターは改変された配列である。
【００９９】
例
本明細書に記載の発明がより完全に理解され得るように、以下の例が記載される。本出願に記載された例は、本明細書で提供される方法、組成物、およびシステムを描写するために提供されるものであり、それらの範囲を制限するものとしていかなる方法でも解釈されるべきではない。
【０１００】
以下の例で用いられた二本鎖RNA（dsRNA）分子は以下のとおりであり、その配列は表8に示されている。
【０１０１】
GS3：配列番号21の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号39の配列からなる別もう1本のRNA鎖が結合している。GS3は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド750〜1181によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１０２】
GS4：配列番号22の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号40の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS4は、gfpによってコードされるmRNAを標的とする。
【０１０３】
GS167：配列番号23の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号41の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS167は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド1〜521によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１０４】
GS168：配列番号24の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号42の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS168は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド522〜1044によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１０５】
GS169：配列番号25の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号43の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS169は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド1045〜1564によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１０６】
GS170：配列番号26の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号44の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS170は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド750〜1181によってコードされるmRNAを標的とするGS3に対して70%の配列同一性を有する。
【０１０７】
GS171：配列番号27の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号45の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS171は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド750〜1181によってコードされるmRNAを標的とするGS3に対して75%の配列同一性を有する。
【０１０８】
GS172：配列番号28の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号46の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS172は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド750〜1181によってコードされるmRNAを標的とするGS3に対して80％の配列同一性を有する。
【０１０９】
GS173：配列番号29の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号47の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS173は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド750〜1181によってコードされるmRNAを標的とするGS3に対して85％の配列同一性を有する。
【０１１０】
GS174：配列番号30の配列からなる1本のRNA鎖に配列番号48の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS174は、配列番号1のDNA配列の750〜1181番のヌクレオチドに、コードされるmRNAを標的とするGS3に対して90％の配列同一性を有する。
【０１１１】
GS175：配列番号31の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号49の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS175は、配列番号1のDNA配列の750〜1181番のヌクレオチドによってコードされるmRNAを標的とするGS3に対して95％の配列同一性を有する。
【０１１２】
GS176：配列番号32の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号50の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS176は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド909〜1108によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１１３】
GS177：配列番号33の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号51の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS177は配列番号1のDNA配列のヌクレオチド934〜1083によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１１４】
GS178：配列番号34の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号52の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS178は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド959〜1058によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１１５】
GS179：配列番号35の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号53の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS179は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド984〜1033によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１１６】
GS180：配列番号36の配列からなる1本のRNA鎖に、配列番号54の配列からなるもう1本のRNA鎖が結合している。GS180は、配列番号1のDNA配列のヌクレオチド996〜1020によってコードされるmRNAを標的とする。
【０１１７】
例1：IAP RNAi組成物がコロラドハムシを死滅させる
コロラドハムシ（CPB）に対するIAP RNAiポリヌクレオチド（配列番号21および39）の効果を評価するために、IAP RNAiポリヌクレオチド（以下、「GS3」）を含む組成物（例えば、水を含むもの）が、ジャガイモ植物の葉上に（10 μg/cm2の濃度で）処理された。GS3で覆われたジャガイモ植物の葉への9日間の曝露後、最大で90％のCPBが死亡したのに比較して、陰性対照（GS4）の葉への曝露後に死亡するCPBは10％未満であった（図1A）。このGS3への曝露に応えて増大した死亡はまた、ジャガイモの葉の消費のほぼ0％への減少をもたらす（図1B）。ジャガイモの葉の消費とは、該片のRNAi組成物での処理およびこれに続く該片の例えばコロラドハムシへの曝露後の、ジャガイモの葉片（ジャガイモの葉から打ち抜かれたもの）のパーセンテージを指す。
【０１１８】
より低濃度のIAP RNAiポリヌクレオチドがCPBの制御に同等に有効であるかどうかを決定するために、GS3組成物の用量滴定もまた行われた。1.0 μg/cm2の対照（GS4）組成物と比較して、1.0 μg/cm2および0.1 μg/cm2でのGS3へ3日間曝露の後に、最大で90％のCPBが死亡し、0.01 μg/cm2でのGS3への3日間曝露の後に、約70％のCPBが死亡し、0.001 μg/cm2でのGS3へ3日間曝露の後に、約15％のCPBが死亡した（図2A）。ジャガイモの葉の消費もまた、CPBが1.0 μg/cm2および0.1 μg/cm2のGS3へ曝露された場合、ほぼ0％へ減少したが、0.01 μg/cm2でのGS3へ曝露されたCPBは、ジャガイモの葉の約20％しか消費せず、および0.001 μg/cm2でのGS3へ曝露されたCPBは、ジャガイモの葉の約60％を消費した（図2B）。
【０１１９】
ジャガイモの葉に0.1 μg/cm2という低濃度で投与されたIAP RNAiポリヌクレオチドへのCPBの曝露は、対照へ曝露されたCPBと比較して、90%の死亡およびジャガイモの葉の消費の95%減少をもたらす。
【０１２０】
例2：IAP RNAi組成物の植物への適用がコロラドハムシを制御する
例1のIAP RNAiポリヌクレオチド（GS3）を含む組成物は、ジャガイモ植物上のコロラドハムシ（CPB）の数を制御することにおけるその有効性について試験された。手短に言えば、GS3組成物（例として、0.06g/L）、CORAGEN(登録商標)を含む組成物（+対照；CPBを死滅させることが知られている薬剤）、または非処理（-対照）が、ジャガイモ植物の葉へ適用された。GS3組成物の効き目に対する灌漑（1/2インチの雨を想定して、植物あたりおよそ500mlの水）の効果もまた試験された。灌漑を問わず、GS3で処理されたジャガイモ植物において、未処理のジャガイモ植物と比べて、植物あたりのCPB幼虫の数が約90％減少した（図3A）。また、ジャガイモ植物の落葉率もまた、灌漑を問わず、植物がGS3で処理された場合、未処理のジャガイモ植物と比べて約90％減少した（図3B）。
【０１２１】
ジャガイモ植物へ投与されたGS3組成物におけるIAP RNAiポリヌクレオチドへのCPBの曝露は、未処理であったジャガイモ植物へ曝露されたCPBと比較して、植物あたりの生きた幼虫の数および植物の落葉が約90％減少した。
【０１２２】
例3：IAP遺伝子の長さにまたがるIAP RNAi組成物が、コロラドハムシ（CPB）被害を制御するのに有効である
Coleopteran IAP遺伝子（配列番号1）によってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）（配列番号19）の全長に集合的に結合する4つのdsRNA分子が、コロラドハムシ（CPB）被害を制御するためのそれらの有効性について評価された。本例において用いられたdsRNA分子は：GS3、GS167、GS168、GS169、および陰性対照分子（GS4）である。
【０１２３】
各dsRNAについて、ナス植物から4枚の葉（〜20日齢）が切り取られ、0.5 μg/μLのdsRNAで塗布され、約30分間乾燥させられた。4枚の葉の各々は、水分を含んだ濾紙の上で、4つの異なるペトリ皿（100mm×15mm）に配置された。各ペトリ皿について、5匹の「第二齢」のCPB幼虫が、各葉の上に配置され、該皿は室温に保たれた。3日目（72時間後）および6日目（144時間後）に、新しいdsRNA処理された葉が、ペトリ皿へと配置された。各実験において、3日目、6日目、7日目、8日目、および9日目に、CPB昆虫の総数がカウントされた。各dsRNAによって引き起こされる死亡を決定するため、2日目に生きているCPB昆虫の初期数が確立された。2日目に既に死んでいたCPB昆虫は、取り扱い条件または初期の昆虫の健康状態が原因で死んだものと推測された。各dsRNA実験は、異なる週に異なるバッチの昆虫を用いて複製され、それぞれが4つの異なる葉のペトリ皿を含む。)
【０１２４】
Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAに結合するすべての試験されたdsRNA分子（GS3，GS167，GS168，GS169）は、CPB昆虫における有意な時間依存的な死亡を引き起こした（表1〜2）。曝露の9日後、GS3はCPB昆虫において平均93％の死亡を引き起こし、GS167はCPB昆虫において平均91％の死亡を引き起こし、GS168はCPB昆虫において平均83％の死亡を引き起こし、GS168はCPB昆虫において平均69％の死亡を引き起こした。逆に、陰性対照（GS4）は、平均26％の死亡しか引き起こさなかった（図5）。
【０１２５】
表2. IAP遺伝子の長さを標的とするdsRNA分子によって引き起こされた平均死亡（複合複製）
【表１】
2022502049.tif 000003
【０１２６】
例4：最小限の長さ（49〜200ヌクレオチド）のIAP RNAi組成物は、コロラドハムシを制御するのに有効である
Coleopteran IAP遺伝子（例として、配列番号1）によってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）（例として、配列番号19）に結合する最小限の長さ（49〜200ヌクレオチド）の配列を含む5つのdsRNA分子が、コロラドハムシ（CPB）を制御するためのそれらの有効性について評価された。評価されたdsRNA分子は： GS176、GS177、GS178、GS179、GS180、GS3、および陰性対照（GS4）であった。
【０１２７】
GS176、GS177、およびGS178は、例3に記載の手順に従って、GS4およびGS3で試験された。
【０１２８】
GS179およびGS193は、それぞれが「第二齢」CPB幼虫を1匹ずつ伴う12枚のナスの葉を用いて、0.027 μg/μLの濃度でのGS4およびGS3で試験された。GS179およびGS180は、T7プロモーターおよび制限部位の脇に配置されるIAP mRNAに相補的な配列を含んだ。
【０１２９】
Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるmRNAに結合する100〜200ヌクレオチドを含むすべての試験されたdsRNA分子（GS176、GS177、GS178）は、CPB昆虫における有意な時間依存性の死亡を引き起こした（表2）。曝露の9日後、200ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS176）は、CPB昆虫の平均89％の死亡を引き起こし；150ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS177）は、CPB昆虫の平均95％の死亡を引き起こし；および100ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS178）は、CPB昆虫の平均89％の死亡を引き起こした。これら3つのdsRNA分子の各々は、432ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS3）と同様のレベルでCPB昆虫を制御する／死滅させるように機能した。逆に、陰性対照（GS4）は、平均26％の死亡のみ引き起した（図6A）。
【０１３０】
49ヌクレオチド（GS179）および74ヌクレオチド（GS193）を含むdsRNA分子は、夫々、CPB昆虫における時間依存性の死亡を引き起こした（表5）。曝露の8日後、49ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS179）は、CPB昆虫における平均56％の死亡を引き起こし；および74ヌクレオチド長のdsRNA分子（GS180）は、CPB昆虫における平均60％の死亡を引き起こした。陰性対照（GS4）は、平均10％の死亡を引き起こした（図6B）。
【０１３１】
表2. IAP遺伝子を標的とする100〜200ヌクレオチドを含むdsRNA分子によって引き起こされた2つの生物学的複製の平均死亡(複合複製)
【表２】
2022502049.tif 000004
【０１３２】
表3. 標的IAP mRNA遺伝子に相補的に結合する25〜50ヌクレオチドを含むdsRNA分子によって引き起された死亡
【表３】
2022502049.tif 000005
【０１３３】
例5：IAP mRNAに対して90％相補性を有する配列を含むIAP RNAi組成物は、コロラドハムシを制御するのに有効である
Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）へ結合する432ヌクレオチドのdsRNA（GS3）は、CPB昆虫を制御する／死滅させるためのミスマッチを含むdsRNA分子の能力を評価するために、突然変異させられた。評価されたdsRNA分子は、(1）GS3に対して70％配列同一性を有し（GS170）；（2）GS3に対して75％配列同一性を有し（GS171）；（3）GS3に対して80％配列同一性を有し（GS172）；（4）GS3に対して85％配列同一性を有し（GS173）；（5）GS3に対して90％配列同一性を有し（GS174）；およびGS3に対して95％配列同一性を有する（GS175）、dsRNAである。GS170の配列は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに70％相補的であり；GS171は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに75％相補的であり；GS172は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに80％相補的であり；GS173は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに85％相補的であり；GS174は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに90％相補的であり；GS175は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに95％相補的である。
【０１３４】
すべてのdsRNA分子は、例3に記載の手順に従って、GS4およびGS3で試験された。
【０１３５】
IAP遺伝子によってコードされるmRNAに夫々90%および95%相補的であるGS174およびGS175は、CPB昆虫において時間依存性の死亡を引き起こした（表6〜7）。曝露の9日後、GS174は、CPB昆虫において平均75%死亡を引き起こし：GS175はCPB昆虫において平均84%死亡を引き起こした。これらのdsRNA分子の各々は、IAP遺伝子によってコードされるmRNAに100％相補的なdsRNA分子（GS3）と同様のレベルで、CPB昆虫を制御する／死滅させるように機能した（図7）。
【０１３６】
表4. IAP遺伝子によってコードされるmRNAへの可変の相補性を伴う配列を含むdsRNA分子によって引き起こされた、2つの生物学的複製の平均死亡（複合複製）
【表４】
2022502049.tif 000006
【０１３７】
例6：IAP RNAi組成物の例は、野外試験でコロラドハムシを制御する
Coleopteran IAP遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）へ結合する432ヌクレオチドdsRNA（GS3）は、3回のオープンフィールド野外試験でCPB昆虫を制御するその能力について評価された。手短に言えば、各野外試験において、GS3を含む組成物（2〜4g／エーカー）、CORAGEN（登録商標）（73g／エーカー）、ENTRUST（登録商標）（88g／エーカー）、および/またはNOVODOR（商標）（161M Bio En/ha）を含む1以上の陽性対照組成物（単数または複数）（標準）、または非処理（陰性対照）が、露地のジャガイモまたはナス植物の葉へ適用された。各RNAi組成物（GS3）は、葉へ、5日間隔で4回適用または7日間隔で3回適用のいずれかで適用された。標準は、7日間隔で葉へ3回適用された（0日、7日、14日）。ジャガイモの葉の落葉率は、最初の適用後から2、6、13、20日目に、ナスの葉の落葉率は最初の適用から5、14、21日目に評価された。
【０１３８】
野外試験#1（図9A）において、未処理だったジャガイモ植物は20日目に39％落葉した。逆に、GS3で処理されたジャガイモ植物は、20日目に10％落葉し；標準品（例として、CORAGEN（登録商標）およびENTRUST（登録商標）など）で処理された植物は、20日目に5％未満落葉した。
【０１３９】
野外試験#2（図9B）において、未処理だったジャガイモ植物は、20日目に48％落葉した。逆に、GS3で処理されたジャガイモ植物は、20日目でおよそ10％落葉し；標準品（例として、CORAGEN（登録商標）、ENTRUST（登録商標）、NOVODOR（商標）で処理された植物は、20日目で5％未満落葉した。
【０１４０】
野外試験#3（図9C）において、未処理だったナス植物は、21日目に45％落葉した。逆に、GS3で処理されたナス植物は、21日目に15％落葉し、標準品（CORAGEN（登録商標）およびENTRUST（登録商標）など）で処理された植物は、21日目に10％未満落葉した。
【０１４１】
これらのデータは、本開示のIAP RNAi組成物の適用が、オープンフィールド（例えば、作物の畑）において植物の葉へ適用された場合、植物（例として、ジャガイモまたはナス植物）の落葉を防ぐことを実証する。
【０１４２】
追加態様
本開示の追加態様は、以下の数字付の段落によって包含される。
1.  Coleopteranアポトーシス阻害(IAP)遺伝子を標的とするポリヌクレオチド分子であって、ポリヌクレオチド分子は:
配列番号1の配列を含むデオキシ核酸(DNA)によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)へ結合するおよびこれの発現を阻害するポリヌクレオチド分子;
配列番号19または配列番号20の配列を含むmRNAへ結合するおよびこれの発現を阻害するポリヌクレオチド分子;
配列番号21または配列番号39の配列に対して少なくとも80％同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド分子；および
少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むセグメントを含むポリヌクレオチド分子であって、ここでセグメントは、配列番号21または配列番号39の配列のセグメントに対して少なくとも90％同一性を有する、前記ポリヌクレオチド分子、
からなる群から選択される、前記ポリヌクレオチド分子。
2.  ポリヌクレオチド分子が、配列番号21の配列へ結合する、段落1に記載のポリヌクレオチド分子。
3.  ポリヌクレオチド分子は、配列番号21または配列番号39の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％同一性を有する配列を含む、段落1または2に記載のポリヌクレオチド分子。
【０１４３】
4.  ポリヌクレオチド分子が、少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むセグメントを含み、ここでセグメントが、配列番号21または配列番号39の配列と少なくとも95％または少なくとも98％同一性を共有する、段落1または2に記載のポリヌクレオチド分子。
5.  ポリヌクレオチド分子が、配列番号21または配列番号39の配列を含む、段落3または4に記載のポリヌクレオチド分子。
6.  ポリヌクレオチド分子が、配列番号39の配列または配列番号39のセグメントを任意に含む一本鎖RNA(ssRNA)分子である、段落1〜5のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド分子。
7.  ssRNA分子が、低分子干渉RNA(siRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、およびアンチセンスRNAからなる群から選択される、段落6に記載のポリヌクレオチド分子。
【０１４４】
8.  ポリヌクレオチド分子が、配列番号21の配列または配列番号21のセグメントを任意に含む二本鎖RNA(dsRNA)分子である、段落1〜5のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド分子。
9.  Coleopteranアポトーシス阻害(IAP)遺伝子の発現を特異的に阻害するポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号21または23〜36のいずれか１つの配列を含む第一の鎖を含む、前記ポリヌクレオチド。
10.  Coleopteranアポトーシス阻害(IAP)遺伝子の発現を特異的に阻害するポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号39または41〜54のいずれか１つの配列を含む鎖を含む、前記ポリヌクレオチド。
11.  ポリヌクレオチドが、配列番号21の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号39の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
【０１４５】
12.  ポリヌクレオチドが、配列番号23の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号41の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
13.  ポリヌクレオチドが、配列番号24の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号42の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
14.  ポリヌクレオチドが、配列番号25の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号43の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
15.  ポリヌクレオチドが、配列番号26の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号44の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
【０１４６】
16.  ポリヌクレオチドが、配列番号27の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号45の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
17.  ポリヌクレオチドが、配列番号28の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号46の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
18.  ポリヌクレオチドが、配列番号29の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号47の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
19.  ポリヌクレオチドが、配列番号30の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号48の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
【０１４７】
20.  ポリヌクレオチドが、配列番号31の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号49の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
21.  ポリヌクレオチドが、配列番号32の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号50の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
22.  ポリヌクレオチドが、配列番号33の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号51の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
23.  ポリヌクレオチドが、配列番号34の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号52の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
【０１４８】
24.  ポリヌクレオチドが、配列番号35の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号53の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
25.  ポリヌクレオチドが、配列番号36の配列からなる第一の鎖を含み、任意に配列番号54の配列からなる第二の鎖をさらに含む、段落9に記載のポリヌクレオチド。
26.  段落1〜25のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド分子を含む、組成物。
27.  組成物が、昆虫の飼料、昆虫誘引剤、フェロモン、タンパク質、炭水化物、ポリマー、および駆除薬からなる群から選択される添加剤をさらに含む、段落26に記載の組成物。
【０１４９】
28.  Coleopteran被害を制御するための方法であって、植物、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌を段落1〜25のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド分子、または段落26または27に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
29.  Coleopteran昆虫が、Leptinotarsa種、Phyllotreta種、Cerotoma種、Diabrotica種、Tribolium種、Anthonomus種およびAlticini種からなる群から選択される種のものである、段落28に記載の方法。
30.  Coleopteran昆虫が、Leptinotarsa種昆虫である、段落28または29に記載の方法。
31.  Leptinotarsa種昆虫が、コロラドハムシである、段落30に記載の方法。
【０１５０】
32.  植物が、Solanaceae植物、Brassicaceae植物、Poaceae植物、Cucurbitaceae植物、Fobaceae植物、Apiaceae植物、Amaranthaceae植物、およびMalvaceae植物からなる群から選択される、段落28〜31のいずれか１つに記載の方法。
33.  方法が、Coleopteran昆虫の成長、繁殖、および/または摂食を障害する、段落28〜32のいずれか１つに記載の方法。
34.  方法が、Coleopteran昆虫の死をもたらす、段落28〜32のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
35.  昆虫制御における使用のためのポリヌクレオチドを産生するための方法であって、方法が:
(a)  反応混合物において細胞のリボ核酸(RNA)およびリボヌクレアーゼをインキュベートすること、および5'ヌクレオシド一リン酸(5'NMP)を産生すること；
(b)  リボヌクレアーゼを除去すること；および
(c)  反応混合物において、または第二の反応混合物において、5'NMP、ポリホスファートキナーゼ、ポリホスファート、ポリメラーゼ、および、配列番号1に対して少なくとも80％同一性を有するかまたは少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むセグメントを含むRNA配列をコードするデオキシリボ核酸(DNA)鋳型をインキュベートすること、ここでセグメントが、配列番号2の配列のセグメントに対して少なくとも90％同一性を有し、および興味の対象となるRNAを産生すること、任意にここでステップ(c)の反応混合物が、ヌクレオシドキナーゼ、NMPキナーゼ、および/またはNDPキナーゼをさらに含む、
を含む、前記方法。
36.  細胞のRNAが、リボソームRNA、メッセンジャーRNA、および/またはトランスファーRNAを含む、段落35に記載の方法。
37.  ポリホスファートキナーゼが、PPK1ファミリー酵素およびPPK2ファミリー酵素から選択され、および任意にここで、ポリホスファートキナーゼが、Deinococcus geothermalisisからのクラスIIIポリホスファートキナーゼ2を含む、段落35または36に記載の方法。
【０１５２】
38.  ポリホスファートが、ヘキサメタリン酸塩を含む、段落35〜37のいずれか１つに記載の方法。
39.  DNA鋳型が、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されているプロモーター、および任意に、転写ターミネーターである、段落35に記載の方法。
40.  DNA鋳型が、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列の逆相補体へ動作可能に連結されているプロモーターを含む第二の鋳型をさらに含み、ここで、2つの個々のRNA分子がアニールしてdsRNA分子を形成する、段落39に記載の方法。
【０１５３】
41.  DNA鋳型が、以下をコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されているプロモーター:(a)所望されるIAP RNA、(b)RNA転写産物のループ領域の1以上のヌクレオチド、(c)所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列の逆相補体、および任意に、転写ターミネーターである、段落35に記載の方法。
42.  DNA鋳型が:
a.  第一のプロモーター、
b.  所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列、
c.  第二のプロモーター、および
d.  任意に、１以上の転写ターミネーター、
を含み、
ここで、第一のおよび第二のプロモーターは、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列へ動作可能に連結されており、およびここで、所望されるIAP標的化RNAをコードするヌクレオチド配列の双方向転写が、アニールしてdsRNA分子を形成する相補的RNA分子をもたらす、段落35に記載の方法。
【０１５４】
43.  リボヌクレアーゼ、ポリホスファートキナーゼ、DNA鋳型、および/またはポリメラーゼが、リボヌクレアーゼ、ポリホスファートキナーゼ、DNA鋳型、および/またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される、段落35に記載の方法。
44.  (a)の反応混合物が、リボヌクレアーゼ、ポリホスファートキナーゼ、DNA鋳型、および/またはポリメラーゼを発現する細胞から調製される細胞ライセートを含む、段落35に記載の方法。
45.  ステップ(b)が、温度、pH、塩、洗浄剤、アルコール、および/または化学インヒビターを介して、細胞ライセートにおけるリボヌクレアーゼおよびネイティブな酵素活性を除去することを含む、段落35に記載の方法。
【０１５５】
46.  ステップ(b)が、分離、沈殿、濾過、キャプチャ、および/またはクロマトグラフィーを介して、細胞ライセートにおける酵素のネイティブな酵素活性を除去することを含む、段落35に記載の方法。
47.  ステップ(b)が、遺伝子改変、細胞からの酵素分泌、および/またはプロテアーゼ標的化を介して、細胞ライセートにおける酵素のネイティブな酵素活性を除去することを含む、段落35に記載の方法。
48.  ネイティブな酵素活性が、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、およびヒドロラーゼから選択される、段落45〜47のいずれか１つに記載の方法。
49.  ポリホスファートキナーゼ、および/またはポリメラーゼが、除去条件に耐え得る、段落45〜48のいずれか１つに記載の方法。
50.  ポリメラーゼが、少なくとも1のRNAポリメラーゼを含む、段落35に記載の方法。
【０１５６】
51.  配列番号3の配列に対して少なくとも80％同一性を伴う配列を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。
52.  配列番号3の配列に対して少なくとも90％または少なくとも95％同一性を伴う配列を含む、段落51に記載のdsRNA。
53.  配列番号3の配列を含む、段落51に記載のdsRNA。
54.  0.001 μg/cm2〜10 μg/cm2の濃度で任意に製剤化される、段落51〜53のいずれか１つに記載のdsRNAを含む組成物。
【０１５７】
55.  接触ステップが、ポリヌクレオチドを、植物の表面、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、少なくとも0.001 μg/cm2の濃度で適用することを含む、段落28に記載の方法。
56.  接触ステップが、ポリヌクレオチドを、植物の表面、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、0.001 μg/cm2〜10 μg/cm2の濃度で適用することを含む、段落55に記載の方法。
57.  接触ステップが、ポリヌクレオチドを、植物の表面、地面、Coleopteran昆虫、またはColeopteran昆虫の食餌へ、0.001 μg/cm2〜0.1 μg/cm2の濃度で適用することを含む、段落56に記載の方法。
【０１５８】
58.  Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、または5日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも30％に増加する、段落55〜57のいずれか１つに記載の方法。
59.  Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、または6日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも40％に増加する、段落58に記載の方法。
60.  Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、または7日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも50％に増加する、段落59に記載の方法。
【０１５９】
61.  Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、または8日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも60％または少なくとも70％に増加する、段落60に記載の方法。
62.  Coleopteran昆虫の死亡率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、または9日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、少なくとも90％に増加する、段落60に記載の方法。
63.  葉片消費が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、または5日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、20％未満に減少する、段落55〜62のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
64.  葉片消費が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、または5日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、10％未満に減少する、段落63に記載の方法。
65.  植物の落葉率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、5日未満、または4日未満後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、10％未満に減少する、段落55〜64のいずれか１つに記載の方法。
66.  植物の落葉率が、Coleopteran昆虫のポリヌクレオチドへの曝露の少なくとも10日、少なくとも15日、または少なくとも20日後に、任意に未処理の条件下の対照と比べて、10％未満のままである、段落55〜65のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
表８。配列、5→3
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【０１６２】
均等物および範囲
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、それとは反対に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、1または1より多いものを意味してもよい。群のメンバーの1以上の間に「or」を含む請求項または記載は、それとは反対に指定されていない限り、または文脈から明らかでない限り、所与の製品またはプロセスに、群のメンバーの1つ、1つより多く、またはすべてが、存在する、使用される、またはそうでなければ関連している場合に、満たされていると考慮される。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、使用される、またはそうでなければ関連する形態を含む。本発明は、群の1より多い、またはすべてのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、使用される、またはそうでなければ関連する形態を含む。
【０１６３】
さらにまた、本発明は、列挙された請求項の1以上からの1以上の限定、要素、節、および記載用語が別の請求項に導入されたすべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含する。たとえば、別のクレームに従属する任意のクレームは、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームに見られる1以上の限定を包含するように改変され得る。要素が、例えばMarkush群形式で、リストとして提示される場合、要素の各下位群もまた開示され、任意の要素（単数または複数）が群から削除され得る。一般に、本発明または本発明の側面が具体的な要素および／または特徴を含むと言及される場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および／または特徴からなるか、または本質的にからなることを理解されたい。簡単にするために、これらの態様は、本明細書中でこれらの言葉で具体的に表されていない。
【０１６４】
「含む(comprising)」および「含有する(containing)」という用語は、オープンであることが意図されており、追加の要素またはステップを含めることを可能にすることにも留意されたい。範囲が指定されている場合、端点が含まれる。さらにまた、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の10分の1まで、本発明の異なる態様における記載された範囲内の任意の特定値またはサブ範囲を推測し得る。
【０１６５】
本出願は、様々な発行された特許、公開された特許出願、学術文献、および他の刊行物を指し、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参照のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合は、本明細書が優先するものとする。さらに、先行技術に該当する本発明の任意の具体的な態様は、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外されてもよい。かかる態様は当業者に知られているとみなされるので、排除が本明細書に明示的に記載されていなくても、それらは除外されてもよい。本発明の任意の具体的な態様は、先行技術の存在に関連するかどうかにかかわらず、理由を問わず、請求項から除外され得る。
【０１６６】
当業者は、本明細書に記載の特定の態様と同等の多くの同等物を、わずかルーチンの実験法を用いて認識または確認することができるであろう。本明細書に記載の本態様の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の請求項で表されるとおりである。当業者は、以下の請求項において定義されるように、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対する様々な変更および改変を行ってもよいことを理解するであろう。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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