(57)【要約】  【解決手段】  リンパ管異常の診断および治療のための組成物および方法が開示される。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの患者のリンパ異常を診断する方法であって、
ａ）前記患者から核酸を含む生体試料を取得する工程と、
ｂ）前記核酸をアッセイする工程であって、
ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬの１またはそれ以上に一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、または
ｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬの１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するか、
を決定するために前記核酸をアッセイする工程と、および
ｃ）ｉ）またはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、前記患者をリンパ系異常と診断する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
ヒトの患者のリンパの異常を診断する方法であって、
ａ）ヒトの患者から遺伝子型の配列情報を取得する工程と、
ｂ）前記配列情報から決定する工程であって、
ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、ＣＢＬの１またはそれ以上に一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、または
ｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬの１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するか、
を前記配列情報から決定する工程と、および
ｃ）ｉ）またはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、前記患者をリンパ系異常と診断する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
ヒトの患者のリンパ異常を治療する方法であって、
ａ）前記患者から核酸を含む生体試料を取得する工程と、
ｂ）前記核酸をアッセイする工程であって、
ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬの１またはそれ以上に一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、または
ｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、およびＣＢＬの１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するか、
を決定するために前記核酸をアッセイする工程と、および
ｃ）ｉ）またはｉｉ）の１またはそれ以上のＳＮＶを有すると同定された前記患者に、前記リンパ系異常の治療に適した１またはそれ以上の薬剤を投与し、それによって前記リンパ系異常を治療する工程と、
を含む方法。
【請求項４】
ヒトの患者のリンパ異常を治療する方法であって、
ａ）ヒトの患者から遺伝子型の配列情報を取得する工程と、
ｂ）前記配列情報から決定する工程であって、
ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、ＣＢＬの１またはそれ以上の一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、または
ｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、およびＣＢＬの１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するか、
を前記配列情報から決定する工程と、および
ｃ）ｉ）またはｉｉ）の１またはそれ以上のＳＮＶを有すると同定された前記患者に、リンパ系異常の治療に適した１またはそれ以上の薬剤を投与し、それによって前記リンパ系異常を治療する工程と、
を含む方法。
【請求項５】
請求項３または４記載の方法において、前記リンパ異常の治療に適した前記薬剤が、１）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、２）表１および２に記載の薬剤／阻害剤、３）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤と表１および２に記載の１またはそれ以上の薬剤／阻害剤の組み合わせ、および／または４）１）ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および２）１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の組み合わせである、方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法において、前記薬剤が、表１または表２に記載の阻害剤、またはそれらの組み合わせである、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法において、前記ＳＮＶが、少なくとも１つの
ａ）ＰＴＮ１１のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、Ｃ１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、およびｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒと、
ｂ）ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄと、
ｃ）ＢＲＡＦのｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓおよびｃ．２１２８−Ｇ＞Ｔと、
ｄ）ＳＯＳ１のｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋと、
ｅ）ＩＴＧＡ９のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇと、
ｆ）ＲＡＳＡ１のｃ．４７５＿４７６ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ１５９Ｇｆｓ＊２０）およびｃ．２２４６Ｇ＞Ｃｐ．Ｒ７４９Ｐと、
ｇ）ＲＡＦ１のｃ．４３３Ａ＞Ｃ：ｐ．Ｔ１４５Ｐと、
ｈ）ＲＩＴ１のｃ．２７０Ｇ＞Ｔ：ｐ．Ｍ９０Ｉと、
ｉ）ＰＩＥＺ０１のｃ．７２８９Ｃ＞Ｔ：ｐ．Ｐ２４３０Ｌと、
ｊ）ＥＰＨＢ４のｃ．２２８８Ｇ＞Ａ：ｐ．Ｒ７６３Ｑおよびｃ．２６５４Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｋ８８５Ｒと、
ｋ）ＮＦ１のｃ．１０３４＿１０４３ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ３４５Ｐｆｓ＊２８と、
ｌ）ＣＢＬのｃ．１０９６−１Ｇ＞Ｔおよびｃ．２３２２Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｙ７７４＊と、
ｍ）ＡＲＡＦのｃ．６４０Ｔ＞ｃ：ｐＳ２１４Ｐと、および
ｎ）１またはそれ以上のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）と、ｊ）、ｋ）、ｌ）、およびｍ）と連鎖不平衡状態にあるＳＮＶと、
から選択される、方法。
【請求項８】
ヒト患者のリンパ異常を治療する方法であって、１）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、２）表１および２に記載の薬剤／阻害剤、３）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤と表１および２に記載の１またはそれ以上の薬剤／阻害剤の組み合わせ、および／または４）１）ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および２）１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の組み合わせ、から選択される薬剤の有効量を投与する工程を含み、それにより前記リンパ異常を治療する、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において、前記リンパ管異常が、リンパ管の異常形成および／または組織の過成長によって特徴づけられる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において、前記リンパ系異常が、リンパ管腫症（ＬＡＭ）である、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において、前記リンパ系異常が、汎発性リンパ系異常（ＧＬＡ）である、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、前記リンパ系異常が、心嚢液、胸膜液、または腹膜液を含む乳び滲出液によって特徴づけられる、方法。
【請求項１３】
請求項１または請求項３に記載の方法において、生前記方法が、前記生体試料での検出後に、ＳＮＶを特定するレポートを生成する工程をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法において、前記方法が、前記方法で特定されたＳＮＶに基づいて、前記リンパ異常に対する推奨される治療法を特定するレポートを生成する工程をさらに含む、方法。
【請求項１５】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記方法が、前記診断された患者に、前記リンパ異常を治療するのに適した１またはそれ以上の薬剤の有効量を投与する工程をさらに含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記薬剤または前記阻害剤が、表１および表２に記載される、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法において、ピマセルチブ、リファメチニブおよび／またはトラメチニブから選択されるＭＥＫ阻害剤を投与する、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法において、前記薬剤が１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、前記薬剤が、ｍＴＯＲシグナルを阻害し、さらなる生物活性を有する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記追加の生物活性が、ＰＩ３Ｋの阻害、ＦＫ５０６結合タンパク質の阻害、ＤＮＡ−ＰＫの阻害、ｐ１１０の阻害、またはｐ７０Ｓ６Ｋの阻害である、方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法において、前記患者がＰＴＰＮ１１のＳＮＶを有さない、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法において、前記患者がＫＲＡＳのＳＮＶを有さない、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法において、前記患者がＢＲＡＦのＳＮＶを有さない、方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法において、前記患者がＳＯＳ１のＳＮＶを有さない、方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法において、前記患者がＩＴＧＡ９のＳＮＶ有さない、方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法であって、前記患者が、以下のＳＮＶ
ａ）ＰＴＮ１１のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、Ｃ１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、ｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、
ｂ）ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、
ｃ）ＢＲＡＦのｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓおよびｃ．２１２８−Ｇ＞Ｔ、
ｄ）ＳＯＳ１のｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、
ｅ）ＩＴＧＡ９のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇ、
ｆ）ＲＡＳＡ１のｃ．４７５＿４７６ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ１５９Ｇｆｓ＊２０）およびｃ．２２４６Ｇ＞Ｃｐ．Ｒ７４９Ｐ、
ｇ）ＲＡＦ１のｃ．４３３Ａ＞Ｃ：ｐ．Ｔ１４５Ｐ、
ｈ）ＲＩＴ１のｃ．２７０Ｇ＞Ｔ：ｐ．Ｍ９０Ｉ、
ｉ）ＰＩＥＺ０１のｃ．７２８９Ｃ＞Ｔ：ｐ．Ｐ２４３０Ｌ、
ｊ）ＥＰＨＢ４のｃ．２２８８Ｇ＞Ａ：ｐ．Ｒ７６３Ｑおよびｃ．２６５４Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｋ８８５Ｒ、
ｋ）ＮＦ１のｃ．１０３４＿１０４３ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ３４５Ｐｆｓ＊２８、
ｌ）ＣＢＬのｃ．１０９６−１Ｇ＞Ｔおよびｃ．２３２２Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｙ７７４＊、
ｍ）ＡＲＡＦのｃ．６４０Ｔ＞ｃ：ｐＳ２１４Ｐ、
の１、２、３、４、または５を任意の組み合わせで有する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、前記患者が、ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬの１またはそれ以上において、前記ＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶを有する、方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法において、前記治療が、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線治療、および／または外科手術を行う工程をさらに含む、方法。
【請求項３４】
請求項１または３に記載の方法において、１またはそれ以上のＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＩＥＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬおよびＡＲＡＦの一塩基変異（ＳＮＶ）、または前記ＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかを決定するために前記核酸をアッセイする工程が、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、一塩基プライマー伸長反応、および増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択される処理を実行することによって、前記ＳＮＶの存在を決定するためにポリヌクレオチドサンプルを分析する工程をさらに含む、方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法において、前記生体試料がＤＮＡを含む、方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法において、前記生体試料がＲＮＡを含む、方法。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法において、前記ＳＮＶを含む核酸が、ヒトの患者の単離された細胞から取得される、方法。
【請求項３８】
ＳＮＶを有する核酸をコードする単離されたベクターであって、
ａ）ＰＴＮ１１のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、Ｃ１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、ｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、
ｂ）ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、
ｃ）ＢＲＡＦのｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓおよびｃ．２１２８−Ｇ＞Ｔ、
ｄ）ＳＯＳ１のｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、
ｅ）ＩＴＧＡ９のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇ、
ｆ）ＲＡＳＡ１のｃ．４７５＿４７６ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ１５９Ｇｆｓ＊２０）およびｃ．２２４６Ｇ＞Ｃ  ｐ．Ｒ７４９Ｐ、
ｇ）ＲＡＦ１のｃ．４３３Ａ＞Ｃ：ｐ．Ｔ１４５Ｐ、
ｈ）ＲＩＴ１のｃ．２７０Ｇ＞Ｔ：ｐ．Ｍ９０Ｉ、
ｉ）ＰＩＥＺ０１のｃ．７２８９Ｃ＞Ｔ：ｐ．Ｐ２４３０Ｌ、
ｊ）ＥＰＨＢ４のｃ．２２８８Ｇ＞Ａ：ｐ．Ｒ７６３Ｑおよびｃ．２６５４Ａ＞Ｇ：ｐ．Ｋ８８５Ｒ、
ｋ）ＮＦ１のｃ．１０３４＿１０４３ｄｅｌ：ｐ．（Ｌ３４５Ｐｆｓ＊２８、
ｌ）ＣＢＬのｃ．１０９６−１Ｇ＞Ｔおよびｃ．２３２２Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｙ７７４＊、および
ｍ）ＡＲＡＦのｃ．６４０Ｔ＞ｃ：ｐＳ２１４Ｐ、
から選択されるＳＮＶを持つ核酸をコードする単離されたベクター。
【請求項３９】
請求項３８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
【請求項４１】
請求項４０に記載のトランスジェニック動物において、前記トランスジェニック動物がマウスまたはゼブラフィッシュである、トランスジェニック動物。
【請求項４２】
細胞内シグナル伝達を変化させる薬剤を同定する方法であって
ａ）１〜４１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＳＮＶまたは前記ＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶを含む少なくとも１つの核酸を発現する細胞を提供する工程と、
ｂ）ａ）のＳＮＶに対応する同族の野生型配列を発現する細胞を提供する工程と、
ｃ）ａ）およびｂ）の細胞をテスト剤と接触させる工程と、および
ｄ）前記薬剤が、工程ａ）の細胞の細胞シグナルを工程ｂ）の細胞と比較して変化させるかどうかを分析する工程と、
を含む、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法において、前記薬剤がＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤である、方法。
【請求項４４】
請求項５３に記載の方法において、前記ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤が、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＴＡＫ−７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２、ＡＲＲＹ−４３８１６２）、ＳＬ−３２７、リファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ  ８６−９７６６）、およびコビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＲＧ７４２０）から選択される、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法において、前記阻害剤がセルメチニブである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月７日に出願された米国仮出願第６２／７２８，４４４号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝学、個別化医療、およびリンパ系奇形の分野に関するものである。具体的には、リンパ管腫症やその他の汎発性リンパ系奇形（ＧＬＡ）に関連する症状を改善するための新たな遺伝子標的および治療レジメンを提供する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中では、本発明に関連する技術の状況を説明するために、いくつかの出版物や特許文献を引用する。これらの引用文献は、すべてが記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
リンパ系は、体液の循環を維持し、病気から体を守り、小腸で食事の脂肪を吸収するという極めて重要な役割を果たす（１）。複雑なリンパ系異常は、リンパ管の異常な形成と組織の過剰増殖を特徴とする。患者さんはしばしば重複した症状を呈し、重篤な肺疾患に至ることもある（２、３）。リンパ管異常症の例としては、全身性リンパ管異常症（ＧＬＡ）、リンパ管拡張症、および胆汁貯留（心膜、胸膜、腹膜）などがある。複雑なリンパ管異常症の研究は、診断に大きな困難を伴うため、分類や命名法に一貫性がないことが障害となっている（３−６）。複雑なリンパ系異常の分子遺伝学的な病因はあまり理解されていないが、リンパ系の先天性奇形には関連した遺伝学的な病因があるようだ（７−９）。実際、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に集約される遺伝子には、生殖細胞変異と体細胞変異の両方が確認される（１、８）。
【０００５】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲおよびＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の乱れや異常は、成熟したリンパ管ネットワークを構築する際の正常な拡張とリモデリングを損なうことが示されており、そのような乱れはリンパ管疾患と関連する。ＡＫＴ１およびＰＩＫ３ＣＡの機能変異の獲得は、哺乳類ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）活性の上昇をもたらし、Ｐｒｏｔｅｕｓ症候群（ＯＭＩＭ  １７６９２０）、ＣＬＯＶＥＳ症候群（ＯＭＩＭ  ６１２９１８）、Ｋｌｉｐｐｅｌ−Ｔｒｅｎａｕｎａｙ−Ｗｅｂｅｒ症候群（ＯＭＩＭ  １４９０００）などの症候群の一部を構成するリンパ管奇形の患者で確認される（９−１１）。ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１、およびＲＡＳＡ１の変異により、ＲＡＳ経路の活性が制御されなくなり、ヌーナン症候群（ＯＭＩＭ  １６３９５０）、コステロ症候群（ＯＭＩＭ  ２１８０４０）、心筋梗塞症候群（ＯＭＩＭ  １１５１５０）、および毛細血管奇形−動静脈奇形（ＣＭ−ＡＶＭ）症候群（ＯＭＩＭ  ６０８３５４）などでリンパ浮腫やリンパ管拡張症を引き起こす（１２−１７）。
【０００６】
しかし、リンパ管腫症／リンパ管拡張症（ＬＡＭ）、汎発性リンパ管異常（ＧＬＡ）、胸水などのリンパ系疾患やリンパ系異常の患者を特定するための遺伝子バイオマーカーや、これらの疾患に関連する遺伝子マーカーを標的とした治療法は不足している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の一実施形態では、ヒトの患者のリンパ異常を診断する方法が提供される。例示的な方法は、患者から核酸を含む生物学的サンプルを取得する工程と、ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬ、およびＡＲＡＦの１またはそれ以上の一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、またはｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬ、およびＡＲＡＦのうち１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するかを判断するために核酸をアッセイする工程と、およびｉ）またはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合に、患者をリンパ異常と診断する工程を含む。別の態様では、ヒト患者のリンパ系異常を診断する方法であって、ヒト患者から遺伝子型配列情報を取得する工程と、ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬ、およびＡＲＡＦの１またはそれ以上の一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、またはｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬ、およびＡＲＡＦのうち１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するかを配列情報から判断する工程と、およびｉ）またはｉｉ）のＳＮＶが存在する場合、患者をリンパ系異常と診断する工程とを含む。
【０００８】
本発明はまた、ヒトの患者のリンパ異常を治療する方法を提供する。例示的な方法は、患者から核酸を含む生物学的試料を取得する工程と、ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、およびＣＢＬのうちの１またはそれ以上の一塩基変異（ＳＡＮＶ）が存在するか、またはｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、およびＣＢＬのうちの１またはそれ以上のＳＮＶと連鎖不平衡にあるＳＮＶが存在するかを判断するために核酸をアッセイする工程と、ｉ）またはｉｉ）の１またはそれ以上のＳＮＶを有すると同定された患者に、前記リンパ異常の治療に適した１またはそれ以上の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療する工程を含む。本方法の代替実施形態では、患者から遺伝子型情報を取得する工程と、ｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、およびＣＢＬのうち１またはそれ以上の一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するか、またはｉｉ）ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、およびＣＢＬのうち１またはそれ以上の一塩基変異と連鎖不平衡状態にあるＳＮＶが存在するかを判断するためにアッセイする工程と、ｉ）またはｉｉ）の１またはそれ以上のＳＮＶを有すると同定された患者に、前記リンパ異常の治療に適した１またはそれ以上の薬剤を投与し、それによってリンパ異常を治療する工程とを含む。本方法の代替実施形態では、遺伝子型情報が患者から取得される。
【０００９】
特定の実施形態では、リンパ異常は、リンパ管の異常形成および／または組織の過成長を特徴とする。他の実施形態では、リンパ系異常は、リンパ管腫症（ＬＡＭ）である。別の実施形態では、リンパ系異常は、汎発性リンパ系異常（ＧＬＡ）である。リンパ異常は、心嚢液、胸膜液、または腹膜液を含む、乳び滲出液（ｃｈｙｌｏｕｓ  ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ）を特徴とし得る。
【００１０】
診断方法は、生物学的サンプルでの検出後に、ＳＮＶを特定するレポートを生成する工程をさらに含むことができる。上述の治療方法は、当該方法で特定されたＳＮＶに基づき、リンパ異常に対する推奨される治療法（複数可）を特定する報告書を生成する工程をさらに含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＳＮＶ陽性の対象者に投与される薬剤は、１）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤；２）表１および２に記載の薬剤／阻害剤；３）ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤と表１および２に記載の１またはそれ以上の薬剤／阻害剤との組み合わせ、および／または４）１）ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および２）１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の組み合わせである。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の診断方法は、前記リンパ異常を治療するのに適した１またはそれ以上の薬剤の有効量を、診断された患者に投与する工程をさらに含むことができる。
【００１２】
治療方法の特定の実施形態では、１またはそれ以上のリンパ異常関連ＳＮＶを保有する患者などに投与される薬剤は、１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤、および前記阻害剤のいずれかの１またはそれ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、表１および表２に記載された１またはそれ以上の薬剤である。いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤および表１および２に記載の１またはそれ以上の薬剤である。いくつかの実施形態では、投与する薬剤は、１）ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＰＩＫ３Ｋ阻害剤；および２）１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の組み合わせである。いくつかの実施形態では、薬剤がｍＴｏｒ阻害剤である場合、ラパマイシンおよびまたはＢＥＺ−２３５（ダクトリシブ）が投与される。特定の実施形態では、１またはそれ以上のｍＴＯＲ阻害剤、１またはそれ以上のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および／または１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、患者はＰＴＰＮ１１におけるＳＮＶを有さない。いくつかの実施形態では、患者は、ＢＲＡＦにおけるＳＮＶを有さない。いくつかの実施形態では、患者は、ＫＲＡＳにおけるＳＮＶを有さない。いくつかの実施形態では、患者は、ＳＯＳ１におけるＳＮＶを有さない。一部の実施形態では、患者はＩＴＧＡ９におけるＳＮＶを有さない。
【００１４】
いくつかの実施形態では、表１および表２に記載の薬剤を組み合わせて使用する。これらの組み合わせには、限定されないが、ａ）リダフロリムスおよびトラメチニブ、ｂ）リダフロリムスおよびセルメチニブまたはコビメチニブ、ｃ）ＢＥＺ２３５およびセルメチニブ、ｄ）オミパリシブおよびセルメチニブまたはトラメチニブ、ｅ）エベロリムスおよびトラメチニブまたはセルメチニブ、ｆ）シロリムス、リダフロリムスおよびセルメチニブ、ｇ）シロリムス、リダフロリムスおよびトラメチニブ、ｈ）トルキニブおよびトラメチニブ、ｉ）ＢＥＺ２３５、トルキニブおよびトラメチニブ、およびｊ）シロリムスおよびゲダトリシブおよびトラメチニブを含む。他の実施形態では、治療は、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線治療、および／または手術を投与する工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＳＮＶは、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ（ＰＴＰＮ１１遺伝子）、ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ（ＫＲＡＳ遺伝子）、ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ（ＢＲＡＦ遺伝子）、ａ  ｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ（ＳＯＳ１遺伝子）、およびＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇと、ｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを含む複合変異があり、「ｃ．」はコード化されたＤＮＡ配列を、「ｐ．」はタンパク質配列を示す、から選択されるＳＮＶから選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、診断方法は、上述のＳＮＶのうちの１またはそれ以上の検出を含む。いくつかの実施形態では、診断方法は、リンパ異常を治療することが知られる１またはそれ以上の薬剤を対象者に投与する工程とをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、表１および表２に記載の１またはそれ以上の薬剤である。いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤および表１および２に記載の１またはそれ以上の薬剤である。いくつかの実施形態では、投与する薬剤は、１）ｍＴＯＲ阻害剤および／またはＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および２）１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の組み合わせである。本剤の投与により、リンパ構造の改善、乳び胸水の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用量の漸減を可能にすること、および／または生存率の増加の１またはそれ以上が改善される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、診断方法は、ＰＴＰＮ１１遺伝子におけるｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒのうち１またはそれ以上を検出する工程と、少なくとも１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独または組み合わせて投与する工程とを含む。他の実施形態では、薬剤は表１〜２から選択され、それにより、リンパ管構造の改善、胸水の胆汁の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用量の漸減を可能にすること、または生存率の向上の１つ以上を実現する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、診断方法は、ＢＲＡＦ遺伝子におけるｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓの検出を含む。いくつかの実施形態では、診断方法は、１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独または組み合わせて前記患者を治療する工程をさらに含む。他の実施形態では、薬剤は、表１〜２から選択され、それによって、リンパ構造の改善、胸水のエチル化の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用量の漸減を可能にすること、または生存率の増加のうちの１またはそれ以上を改善する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、診断方法は、ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄを検出することと、１またはそれ以上のｍＴｏｒ阻害剤、および１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独または組み合わせて投与する工程とを含む。他の実施形態では、少なくとも１つの薬剤が表１〜２から選択されて投与され、それにより、リンパ管構造の１またはそれ以上を改善し、乳び胸水を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬の使用量の漸減を可能にし、または生存率を向上させる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、診断方法は、ＳＯＳ１遺伝子におけるｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋの検出を含む。いくつかの実施形態では、診断方法は、１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独または組み合わせて前記患者を治療する工程をさらに含む。他の実施形態では、表１〜２からの薬剤が選択され、それによって、リンパ構造の改善、胸水の胆汁の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用量の漸減を可能にすること、または生存率の増加のうちの１またはそれ以上が改善される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、診断方法は、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよび／またはｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを検出する工程と、１またはそれ以上のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を単独または組み合わせて投与する工程とを含む。いくつかの実施形態では、表１〜２からの少なくとも１つの薬剤が投与され、それによって、リンパ構造の１またはそれ以上を改善し、胸水の胆汁を減少させ、呼吸機能を改善し、併用薬使用の漸減を可能にし、または生存率を増加させる。
【００２２】
治療に適したＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤としては、限定されるものではないが、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＴＡＫ−７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２、ＡＲＲＹ−４３８１６２）、ＳＬ−３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ  ８６−９７６６）、およびコビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＲＧ７４２０）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳ遺伝子のｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａ  ｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、およびＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７の１またはそれ以上における一塩基変異（ＳＮＶ）が存在するかどうかを決定するために、拡散をアッセイする工程は、さらに、特異的ハイブリダイゼーションの検出、対立遺伝子サイズの測定、制限断片長多型分析、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析、一塩基プライマー伸長反応、および増幅されたポリヌクレオチドの配列決定からなる群から選択される処理を実行することにより、前記ＳＮＶの存在を決定するためにポリヌクレオチドサンプルを分析する工程をさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、ＤＮＡを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、ＲＮＡを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記ＳＮＶ（複数）を含む核酸は、ヒト患者の単離された細胞から得られる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、単離されたベクターは、ＳＮＶを有する核酸をコードしており、ＳＮＶは、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはａ  ｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇとｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇからなる複合変異から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＳＮＶを有する核酸をコードする単離されたベクターを含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、宿主細胞を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は、マウスまたはゼブラフィッシュである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、薬剤の効果をスクリーニングする方法は、宿主細胞またはトランスジェニック動物を、本明細書に記載された１またはそれ以上の阻害剤を単独でまたは組み合わせて接触させる工程を含むが、表１〜２の薬剤も包含される。いくつかの実施形態では、スクリーニングされる薬剤の効果は、ゼブラフィッシュにおける尾部レスキューまたは分枝レスキューである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞シグナルを変化させる薬剤を同定する方法は、上述のような少なくとも１つのＳＮＶを含む核酸を発現する細胞と、ＳＮＶを欠く同族の野生型配列を発現する細胞とを提供する工程と、両方の細胞集団を試験薬剤と接触させる工程と、前記薬剤が、ＳＮＶを含む核酸を保有する細胞の細胞シグナルを、前記ＳＮＶを欠く細胞と比較して変化させるかどうかを分析する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１．Ｅａ．ｈｙ９２６細胞株でＢＲＡＦとＰＴＰＮ１１の変異体を過剰発現させると、ＥＲＫシグナルが活性化する。
【図２】図２．Ｅａ．ｈｙ９２６細胞株でＢＲＡＦ  Ｆ４８６Ｓを過剰発現させると、細胞の形態とアクチン組織が変化する。
【図３】図３．ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを投与すると、ＢＲＡＦ  ＷＴおよびＦ４８６Ｓ変異体を過剰発現させた細胞において、ＶＥ−カドヘリンの表面染色およびフィラメント状アクチンが増加する。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂ．ＭＥＫ阻害剤は、ＢＲＡＦＷＴおよびＦ４８６Ｓ変異体を過剰発現させた細胞において、ＥＲＫの活性化／リン酸化を減少させる。
【図４Ｂ】図４Ｂ−ＭＥＫ阻害剤は、ＢＲＡＦＷＴおよびＦ４８６Ｓ変異体を過剰発現させた細胞において、ＥＲＫの活性化／リン酸化を減少させる。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂ．ＭＥＫ阻害剤は、ＰＴＰＮ１１変異体を過剰発現させた細胞におけるＥＲＫの活性化／リン酸化を抑制する（図５Ａ）。
【図５Ｂ】ＭＥＫ阻害剤は、ＰＴＰＮ１１変異体を過剰発現させた細胞におけるＥＲＫの活性化／リン酸化を抑制する（図５Ｂ）。
【図６】図６．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するＰＤ０３２５９０１の効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ＰＤ０３２５９０１によって救済され、ｐＥＲＫのレベルの低下と細胞膜でのＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示された。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図７】図７．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するＣＩ１０４０の効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ｐＥＲＫのレベルの低下および細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示されるように、ＣＩ１０４０によって回復した。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図８】図８．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するＰｉｍａｓｅｒｔｉｂの効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ｐＥＲＫのレベルの低下および細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示されるように、ピマセルチブによって救済された。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図９】図９．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するＴＡＫ−７３３の効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ＴＡＫ−７３３によって救済され、ｐＥＲＫのレベルの低下と細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示された。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図１０】図１０．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するＡＺＤ８３３０の効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ｐＥＲＫのレベルの低下および細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示されるように、ＡＺＤ８３３０によって回復した。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図１１】図１１．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するリファメチニブの効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ｐＥＲＫのレベルの低下および細胞膜でのＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示されるように、Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂによって回復した。緑はＡＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色である。
【図１２】図１２．ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するウリクセルチニブの効果。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ＥＲＫ基質ＲＳＫ３のリン酸化レベルの低下および細胞膜でのＶＥ−カドヘリン蓄積の増加によって示されるように、ウリクセルチニブによって回復した。緑はＡＲＡＦ発現細胞を示すＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色、白は核を示すＤＡＰＩ染色である。
【図１３】図１３．ＢＲＡＦ突然変異Ｆ４８６Ｓを発現するＨＤＬＥＣに対するウリクセルチニブの効果。ＢＲＡＦ−Ｆ４８６Ｓによって誘発された細胞形態の違いは、細胞膜でのＶＥ−カドヘリン蓄積の増加によって示されるように、ウリクセルチニブによって回復した。緑はＢＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色、白は核をマークするＤＡＰＩ染色である。
【図１４】図１４．ＢＲＡＦ変異Ｆ４８６Ｓを発現するＨＤＬＥＣに対するトラメチニブの効果。ＢＲＡＦ−Ｆ４８６Ｓによって誘発された細胞形態の違いは、ＥＲＫのリン酸化レベルの低下および細胞膜でのＶＥ−カドヘリン蓄積の増加によって示されるように、トラメチニブによって回復した。緑はＢＲＡＦ発現細胞をマークするＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色、白は核をマークするＤＡＰＩ染色である。
【図１５】図１５．ＲＡＦ１変異Ｔ１４５Ｐを発現するＨＤＬＥＣに対するトラメチニブの効果。ＲＡＦ１−Ｔ１４５Ｐによって誘発された細胞形態の違いは、ＥＲＫのリン酸化レベルの低下および細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示されるように、トラメチニブによって回復した。
【図１６】図１６．ＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄを発現するＨＤＬＥＣｓに対するウリクセルチニブおよびトラメチニブの効果。ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄによって誘発された細胞形態の違いは、トラメチニブおよびウリクセルチニブによって回復し、ＥＲＫのリン酸化レベルの低下および細胞膜におけるＶＥ−カドヘリンの蓄積の増加によって示された。
【図１７】図１７．ＲＩＴ１の変異によって誘発されるｐ−ＥＲＫの弱い活性化。
【図１８】図１８．３次元リンパ球スフェロイド発芽アッセイでは、ＥＰＨＢ４−ＷＴと比較して、３種類のＥＰＨＢ４変異を発現するＨＤＬＥＣの発芽活性が上昇することが、下段の発芽長さで測定される。ラパマイシンとＯＳＩ−０２７の両方が、変異Ｌ７７８＿Ｇ７７９ｉｎｓＬＭＧＳによって誘発されたスプラウトの増加を救済することができた。
【図１９】図１９．ＭＥＫ阻害剤とＢＥＺ２３５での治療により、ＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄで誘発された浮腫の有意な改善が見られた
【図２０】図２０．ＰＴＰＮ１１のＳ５０２ＡまたはＧ５０３Ｒ変異をモザイク状に発現させると、軽度のリンパ管異常の表現型となった。
【図２１】図２１．ｒａｓａ１ａおよびｒａｓａ１ｂの残基７４９付近をＣＲＩＳＰＲでノックアウトすると、ゼブラフィッシュに大きな浮腫が形成されるが、シングルターゲティング（ｒａｓａ１ａまたはｒａｓａ１ｂ）やＡＴＧターゲティングでは表現型が得られない。
【図２２Ａ−Ｅ】図２２Ａ〜２２Ｇ．リンパ管異常のリードプロバンドにおける臨床像と分子解析。図２２Ａ）Ｔ２強調非造影リンパ管造影のコロナルスライスで，大きな心嚢液貯留（矢印）が認められる。図２２Ｂ）健常対照者の動的造影ＭＲＩリンパ管造影図の最大強度投影図で、左分身静脈に向かって流れる正常なＴＤを示す。図２２Ｃ）Ｐ１の造影ＭＲＩリンパ管造影図の最大強度投影図。逆行性肝門部流を伴う拡張したランバーリンパ管網（矢頭）と、左の内分身静脈に向かって流れる拡張した蛇行したＴＤ（矢印）を示し、さらに縦隔と心膜に逆行性灌流を供給する（ボックス）。図２２Ｄ）ｃのボックス領域の造影剤によるリンパ管造影図。ＴＤ遠位部が拡張して曲がりくねっており、ＴＤ遠位部を起点とする拡張したリンパ管網を介して縦隔、心膜、肺に向かって逆流していることがわかる（矢印）。図２２Ｅ）骨盤と生殖器の冠状最大強度投影図。両側の鼠径部リンパ節に由来する複数の拡張した管（矢頭）が認められ、陰茎と陰嚢に逆行性の流れを供給する（矢印）。
【図２２Ｆ】図２２Ｆ）無関係な家系で確認されたＡＲＡＦの再発性変異、ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｓ２１４Ｐ）の血統と遺伝子型。
【図２２Ｇ】図２２Ｇ）ＡＲＡＦタンパク質の模式的なトポロジー。このＳｅｒ２１４残基は、脊椎動物およびすべてのＲＡＦアイソフォームで高度に保存される。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｊ．ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐ変異は、ＥＲＫ１／２活性を増加させ、リンパ管形成能を増強し、ＨＤＬＥＣにおけるアクチン骨格およびＶＥ−カドヘリン接合を変化させ、ゼブラフィッシュにおける胸管（ＴＤ）の拡張をもたらし、これはコビメチニブによって元に戻される。図２３Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡＲＡＦ変異体をトランスフェクションすると、１４−３−３タンパク質との結合が損なわれ、ｐ−ＥＲＫｓが増加する。正規化した１４−３−３／ＦＬＡＧ比を右のパネルで示しており、変異体では１４−３−３タンパク質の共免疫沈降が低下することがわかる。データは、３回の独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。両側一致のｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ（自由度４）、＊＊＊＊Ｐ＝８．６×１０−６。画像はより見やすくするためにトリミングした。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＲＡＦ変異体のトランスフェクションは、ＷＴを発現している細胞と比較して、ｐ−ＥＲＫ１／２の発現の増加を誘導する（＊＊Ｐ＝０．００２６；両側不対のｔ−ｔｅｓｔ；ｄｆ＝８）。ＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲおよびｐ３８のリン酸化は、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって変化しなかった。正規化された比率は、右の箱ひげ図（最小値から最大値まで、すべての点を示す）で示されており、中央線は中央値を、箱の限界は四分位範囲を、ひげは最小値から最大値までのデータ範囲を示す。６回の独立した実験を行った。画像はより見やすくするためにトリミングした。
【図２３Ｃ−Ｄ】図２３Ｃ）ＡＲＡＦ−ＷＴまたはＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐでトランスフェクトされた初代ＨＤＬＥＣを、増加する濃度のトラメチニブで培養した。３つの独立した形質転換からの細胞を用いた結果を定量化し、各個別の値をドットとして重ねた散布ドットプロットにグラフ化した。データは、３回の独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（エラーバー）として示される。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを導入すると、ｐ−ＥＲＫｓのレベルが有意に上昇した（＊Ｐ＝０．０３；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ４  ｄｆ）。トラメチニブ処理は、ｐ−ＥＲＫｓの有意な減少をもたらした（＊Ｐ＝０．０２  ｆｏｒ  １００ｎＭトラメチニブ処理および３００ｎＭトラメチニブ処理；＊Ｐ＝０．０１  ｆｏｒ  １，０００ｎＭトラメチニブ処理および、３，０００ｎＭトラメチニブ処理、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ４  ｄｆ）；ＮＳ，顕著でない．画像は、より見やすくするためにトリミングした。図２３Ｄ）三次元リンパ球スフェロイド発芽アッセイは、ＡＲＡＦ−ＷＴと比較してＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現するＨＤＬＥＣにおける発芽活性の上昇を、発芽数（＊＊＊Ｐ＝０．０００２）および底面の発芽長さ（＊＊＊Ｐ＝０．０００５）の両方で測定して示す。２２ｄｆを用いた両側対向ｔ−ｔｅｓｔ。また、スフェロイドをトラメチニブの濃度を上げて培養したところ、３０ｎＭ（＊＊＊＊Ｐ＝４．６８×１０−５；ｄｆ＝２５）、１００ｎＭ（＊＊＊Ｐ＝９．５×１０−４；ｄｆ＝２３）および３００ｎＭ（＊＊＊Ｐ＝４．４×１０−４；ｄｆ＝２４）の濃度で新芽の数を、３０ｎＭ（＊＊＊Ｐ＝１．８×１０−４；ｄｆ＝２５）、１００ｎＭ（＊＊Ｐ＝０．００１；ｄｆ＝２３）および３００ｎＭ（＊＊＊Ｐ＝３．２×１０−４；ｄｆ＝２４）の濃度で新芽の長さを、それぞれ減少させた。両側対向のｔ−検定。ＨＤＬＥＣｓの独立した導入で行った３つの実験を定量化し、３つの実験すべてのポイントをインターリーブした箱ひげ図にプロットした（１つの実験につき３〜６個のスフェロイド）。中央線は中央値を、箱の限界値は四分位範囲を、ひげはデータの最小値から最大値までの範囲を表している。
【図２３Ｅ】図２３Ｅ）ＡＲＡＦ変異体はＶＥ−カドヘリンの局在に影響を与え（＊＊＊＊Ｐ＝１．８８×１０−２６）、トラメチニブで処理すると、ＶＥ−カドヘリンの細胞表面の局在が増加する（＊＊＊＊Ｐ＝１．６３×１０−１９）。赤の矢頭は細胞膜染色、黄の矢頭は細胞内染色と呼ばれる染色を示す。ＨＤＬＥＣｓを独立して導入して行った３つの実験で、細胞内および細胞膜の染色を定量化し、３つの実験のポイントを左の箱ひげ図（最小値から最大値）にプロットした（１条件につき７５ポイント）。中央の線は中央値を、箱の限界は四分位範囲を、ひげは最小値から最大値までのデータ範囲を表す。１４８ｄｆの両側対角線付きｔ−検定、ＮＳは有意ではない。図２３Ｅの実験で得られた細胞の最大の長さと幅を測定し、長さと幅の比を計算して、右の箱ひげ図（最小値から最大値；右下）にプロットした。中央の線は中央値を、箱の限界は四分位間範囲を、ひげは最小値から最大値までのデータ範囲を表す。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐの発現により、縦横比が有意に増加し（＊＊＊＊Ｐ＝９．５７×１０−１５）、トラメチニブによる治療により、縦横比が正常化する（＊＊＊＊Ｐ＝７．５１×１０−１７；１４８ｄｆの両側被対向ｔ−ｔｅｓｔ；ＮＳ，ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。
【図２３Ｆ】図２３Ｆ）ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイにより、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐは、トランスフェクトされたＨＤＬＥＣにおいて、増殖の増加をもたらさないことが示される。代謝活性は、２つの波長（５５０ｎｍおよび７００ｎｍ）で測定される。方法」に記載されているように、指示された時間に３重のウェルの内容物（ｎ＝３の独立したウェル）を回収した。傾向線は各時点での各導入剤の平均値を示し、点はすべてのデータポイントの測定値を示す。この実験は、２つの独立したレトロウイルスの導入から得られた結果を代表するものである。
【図２３Ｇ−Ｊ】図２３Ｇ〜図２３Ｉ）上：魚類のリンパ系の概要。白枠は、共焦点スキャンのオーバーレイ（最大強度投影）を示す図２３Ｇ〜図２３Ｉで調査した領域を示す。図２３Ｇ〜図２３Ｉでは、ＴＤと後枢静脈（ＰＣＶ）を緑色（ｇｇ（ｍｒｃ１ａ：ＥＧＦＰ））で表示し、ＴＤを点線で示している。ＡＲＡＦトランスジェニック（ｍｒｃ１ａ：ａｒａｆ）細胞は赤で表示されている（緑＋赤→黄）。図２３Ｇ）ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させると、ＴＤの激しい拡張が起こる。図２３Ｈ）ＡＲＡＦ−ＷＴ（赤）の発現は、ＴＤとＰＣＶ（ともに緑）の形態に影響を及ぼさない。図２３Ｉ）コビメチニブ（１ｕＭ）は、突然変異によって誘発された拡張を部分的に逆転させる。独立した３回の実験を繰り返し、図２３Ｇ−２３Ｉと同様の結果が得られた。図２３Ｊ），コビメチニブ処理の有無による体節の拡張に関する表現型採点カテゴリー：正常、中程度の拡張（ＴＤは拡張しているがＰＣＶと分離できる）、重度の拡張（ＴＤとＰＣＶが重なっている）。コビメチニブを投与すると、重度の拡張が有意に抑制され（＊＊＊＊Ｐ＝１．３３×１０−５；片側不対のｔ−ｔｅｓｔ；青色のヒストグラム）、正常な形態に回復した（＊＊＊Ｐ＝０．０００５１；片側不対のｔ−ｔｅｓｔ；緑色のヒストグラム）。３回の独立した実験で、合計４０匹の幼虫と１２０個の体節を分析した。データは独立した３回の実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。未処理のブロット画像はソースデータとして提供される。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｆ．ＭＥＫ阻害剤の治療前と治療後のリードプロバンドの肺機能検査と臨床画像。図２４Ａ）ＭＥＫ阻害剤の治療前と治療後の肺機能検査の結果。ＦＥＶ１が予測値の２３％から４２％に、ＴＬＣが予測値の２９％から５６％に、最大吸気圧（ＭＩＰ）が予測値の７１％から１１５％に、すべてのスパイロメトリー測定値が有意に改善していることに注目してほしい（赤でマーク）。ＦＶＣは強制生存能力、ＦＥＦ２５−７５は中間強制呼気流量、ＲＶは残量，ＲＶ／ＴＬＣはＲＶとＴＬＣの比、ＤＬＣＯ［Ｈｂ］はヘモグロビンで補正した一酸化炭素に対する肺の拡散能力、ＤＬＣＯ／ＶＡはＤＬＣＯを肺胞容積（ＶＡ）で割ったもの、ＭＥＰは最大呼気圧、Ｏ２  Ｓａｔは酸素飽和度である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂ）内科的治療開始直前（左）とＭＥＫ阻害剤治療開始１２か月後（右）のＴ２強調非造影リンパ管の冠状最大強度投影図では、大規模に拡張しビーディングした皮下のリンパ管がほぼ完全に吸収されていることがわかる。
【図２４Ｃ】図２４Ｃ）治療前の骨盤と胸部の造影剤によるリンパ管造影の冠状最大強度投影図（左）では、中心リンパ管が少なく、横隔膜より上の中心リンパ管の流れがなく、腹壁に沿って流れる両側の皮下管が大量に拡張し、ビーズ状になっていることがわかる。治療開始から１２ヵ月後（右）、拡張した皮下管は吸収され、腹壁に沿って胸部まで伸びる、より正常な外観のリンパ管網が新たに形成されている。
【図２４Ｄ】図２４Ｄ）治療前の骨盤と大腿部の造影剤によるリンパ管造影の冠状最大強度投影図（左）でも、大腿部には管が少なく、リンパ管が大きく拡張し、ビーディングしていることがわかる。治療後（右）では、やはり異常に拡張した管が吸収され、新たな、より正常な外観のリンパ管網が形成されています。
【図２４Ｅ】図２４Ｅ）治療前（左）と治療後１２ヶ月（右）の胸部Ｘ線写真では、胸水が減少し、肺活量が顕著に改善している。
【図２４Ｆ】図２４Ｆ）患者の成長記録（左）。１３歳直前にトラメチニブによる治療が開始され（＊）、治療開始から約３〜６カ月後からリンパ浮腫と臨床症状の改善が認められた。右上の画像は、ピーク時の体重で圧迫ストッキングを脱いだ直後の患者さんの下肢の写真です。右下の画像は、対応する下肢の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｒａｓ／ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）経路は、細胞の増殖、移動、分化、アポトーシスに重要な役割を果たしており、これらはすべて正常な発生に不可欠である。中心導管性リンパ管異常症（ＣＣＬＡ）は、リンパ管の拡張、リンパ管の運動障害、およびリンパ管の遠位部の閉塞を特徴とする複雑なリンパ管異常症である。ＣＣＬＡは、Ｔｒｅｎｏｒ  ＩＩＩとＣｈａｕｄｒｙ、Ｃｌｅｍｅｎｓらによって最初に報告され、２０１５年には国際血管異常研究学会（ＩＳＳＨＡ）によってチャネル型リンパ管奇形に分類された。臨床症状は、乳び胸、ｈｙｌｏｕｓ腹水、リンパ液の漏出または逆流、四肢の腫脹など、密接に関連する診断名である一般化リンパ管奇形（ＧＬＡ）と大きく重なるパターンを示す。私たちは最近、ＬＡＭ、ＧＬＡ、およびＣＣＬＡを含むリンパ系異常の原因として、ＡＲＡＦの機能獲得変異を同定した。ここでは、ＬＡＭ、ＧＬＡ、ＣＣＬＡを含むリンパ系異常の原因変異として、ＫＲＡＳ、ＢＩＲＡＦ、ＰＮＰＮ１１の機能獲得型変異を紹介する。また、ＳＯＳ１、ＩＴＡＧ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＩＥＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＣＢＬ、ＡＲＡＦなどの変異がこの疾患の発症に寄与することも明らかにした。
【００３３】
リンパ管異常症は、ほとんどが原因不明の稀で壊滅的な疾患スペクトラムであり、その治療法は患者の症状によって異なる。原因となる遺伝子を特定することで、精密医療の実施に沿った安価な治療法の開発が可能になる。
【００３４】
実施例ＩＩでは、従来のシロリムス療法に反応しない進行性の異常リンパ疾患を持つ１２歳の少年と、血縁関係のない成人の別の患者において、再発性の機能獲得型ＡＲＡＦ変異（ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐ）を特徴づけた。この突然変異により、保存されたリン酸化部位が失われた。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを導入した細胞では、ＥＲＫ１／２活性の上昇、リンパ管形成能の亢進、アクチン骨格とＶＥ−カドヘリン接合部の崩壊が見られたが、これらはＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを用いて回復させることができた。また、ゼブラフィッシュのモデルでリンパ管の表現型を再現し、ＭＥＫ阻害剤を用いて異常な表現型を救済することで、この変異の機能的関連性が検証された。その後、ＭＥＫ阻害剤を用いた治療により、患者のリンパ系のリモデリングとリンパ浮腫の解消、肺機能検査の顕著な改善、酸素補給の中止、日常生活のほぼ正常化など、臨床的に劇的な改善が見られた。今回の結果は、遺伝子の分類とメカニズムの理解が、生物学的根拠に基づく治療法の指針となることを示す代表的な例であり、私たちの例では命を救うことができた。
【００３５】
次に、本発明の特定の実施形態を詳細に参照するが、その例は添付の図面に示される。本発明は、図示された実施形態に関連して説明されるが、それらは本発明をそれらの実施形態に限定することを意図していないことが理解されるだろう。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれ得る、すべての代替物、修正物、および等価物を覆うことが意図される。
【００３６】
本発明の教示を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物またはプロセス工程に限定されるものではなく、そのようなものは変化する可能性があることを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の参照を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」への言及は、複数のｃｏｎｊｕｇａｔｅを含み、「ａ  ｃｅｌｌ」への言及は、複数の細胞などを含む。
【００３７】
本開示で議論される温度、濃度、時間などの前には、わずかなおよび実質的でない逸脱が本明細書の教示の範囲内であるような、暗黙の「約」があることが理解されるだろう。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図したものではない。前述の一般的な説明と詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものであり、教示を制限するものではないことを理解していただきたい。
【００３８】
上記明細書に特に記載のない限り、様々な成分から「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載されている明細書中の実施形態は、記載される成分から「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ことも企図されており、様々な成分から「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」と記載される明細書中の実施形態は、記載される成分から「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ことも企図される。また、本明細書において、様々な成分から「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」と記載される実施形態は、記載されている成分から「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とも考えられる（この互換性は、請求項におけるこれらの用語の使用には適用されません）。
【００３９】
本明細書で使用されているセクションの見出しは、整理を目的としたものであり、所望の主題をいかなる方法でも限定するものと解釈されるものではない。参照により組み込まれた文献が、本明細書で定義された任意の用語と矛盾する場合、本明細書が支配する。本発明の教示は、様々な実施形態と併せて説明されるが、本発明の教示がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。それどころか、本教示は、当業者が理解できるように、様々な代替物、修正物、および等価物を包含する。
【００４０】
さらに、「〜からなる群から選択される」化合物とは、以下のリストにある１またはそれ以上の化合物のことであり、２またはそれ以上の化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）も含まれる。本発明によれば、単離された、または生物学的に純粋な分子とは、その自然な環境から取り除かれた化合物である。このように、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、化合物が精製された程度を必ずしも反映していない。本発明の単離された化合物は、その天然源から得ることができ、実験室での合成技術を用いて製造することができ、またはそのような任意の化学合成経路によって製造することができる。
【００４１】
「リンパ異常」とは、リンパ管の異常形成および組織の過成長を特徴とする疾患または障害をいう。リンパ異常の非限定的な例としては、「リンパ管腫症」または「リンパ管拡張症」（本明細書では総称してＬＡＭと呼ぶ）、リンパ管腫、汎発性リンパ管異常（ＧＬＡ）、および、乳び滲出液、汎発性リンパ管腫。全身性嚢胞性血管腫症、多発性リンパ管拡張症、汎発性リンパ管奇形、ＣＣＬＡ、びまん性リンパ管奇形、Ｋａｐｏｓｉｆｏｒｍ  ＬＡＭ、進行性の骨溶解を特徴とするリンパ由来のまれな血管障害であるゴーラム・スタウト病（ＧＳＤ）などがある。
【００４２】
臨床的には、リンパ管腫はいくつかのタイプに分類される。これらには、（１）毛細血管サイズの薄壁リンパ管で構成されるシンプレックスが含まれる。このタイプは通常、皮膚に影響を及ぼす（リンパ管腫周囲）。（２）嚢胞性リンパ管腫（または嚢胞性ヒグローマ）：これは、若い年齢で、一般的には首または腋窩に見られる、数ミリメートルから数センチメートルのサイズの範囲である可能性がある。（３）海綿体：このタイプは、拡張したリンパ管で構成されており、多くの場合、線維性の外膜がある。これは通常、胸部、腹部、骨の臓器に影響を与えるタイプである。これらのリンパ管腫のそれぞれは、本発明に含まれる。
【００４３】
「一塩基多型（ＳＮＶ）」とは、ゲノムＤＮＡ上のある位置に、通常の塩基とは異なる１つの塩基が存在することを指す。ＳＮＶはＳＮＰと似てるが、ＳＮＰは一般的にある程度の頻度で発生する（例えば、人口の一定割合以上に発生する）ＳＮＰを指すのに対し、ＳＮＶは頻度の情報はない。ヒトゲノムには数百万個のＳＮＶがカタログ化される。病気の原因となるＳＮＶもあれば、ゲノムの正常な変異であるＳＮＶもある。
【００４４】
「リンパ系異常関連ＳＮＶまたは−特異的マーカー」とは、リンパ系異常を発症するリスクの増加と関連し、この疾患を発症していない患者には見られないＳＮＶのことである。このようなマーカーには、核酸、それによってコードされるタンパク質、またはその他の小分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本明細書で使用される「遺伝子改変」という用語は、１またはそれ以上の核酸分子の野生型配列または参照配列からの変化を意味する。遺伝的変化には、限定されないが、既知の配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドのＳＮＶおよびＳＮＰ、コピー数変異（ＣＮＶ）、塩基対置換、付加、および欠失が含まれる。
【００４６】
「連鎖」とは、遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、または遺伝子マーカーが、同じ染色体上に位置することにより、一緒に遺伝する傾向のことで、２つの遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、または遺伝子マーカー間の組換え率（組換え率、またはθとも呼ばれる）で測定される。染色体上の２つの遺伝子座が物理的に近ければ近いほど、組換え率は低くなる。通常、病気の原因となる遺伝子の中の多型部位と病気との関連を調べると、組み換え率は０になり、病気と病気の原因となる遺伝子は常に共連れであることを示す。まれに、ある遺伝子がゲノムの非常に大きな部分を占めている場合には、遺伝子の一方の端にある多型部位と他方の端にある原因となる突然変異との間で組換えが観察されることがある。しかし、原因となる変異が、病気との関連性を調べるために検査されている多型である場合には、組み換えは観察されない。
【００４７】
「センチモルガン」とは、２つの遺伝子マーカー、対立遺伝子、遺伝子、または遺伝子座の間の連結を意味する遺伝的距離の単位であり、任意の減数分裂事象における２つのマーカーまたは遺伝子座間の組換え確率が１％に相当する。
【００４８】
「連鎖不平衡」または「対立遺伝子の関連性」とは、ある特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子または遺伝マーカーと、その近傍の染色体上の位置にある特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子または遺伝マーカーとが、集団における特定の対立遺伝子の頻度について偶然に予想されるよりも高い頻度で優先的に関連することを意味する。
【００４９】
ここでいう「固体マトリックス」とは、ビーズ、微粒子、マイクロアレイ、微量滴定用ウェルや試験管の表面、ディップスティック、フィルターなど、あらゆる形式を指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストランまたはアガロースであっても良い。固体マトリックスは、溶液中でマトリックスから除去されないように、その上に固定化された核酸を含むことができる。
【００５０】
「標的核酸」とは、本明細書で使用される場合、複合核酸混合物中に存在する核酸の以前に定義された領域を指し、定義された野生型領域は、リンパ系異常と関連していてもいなくても良い、少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含むものである。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離されても良いし、手動で合成されても良い。核酸分子は、トリエステル合成法により手動で合成しても良いし、自動ＤＮＡ合成機を用いて合成しても良い。
【００５１】
本発明で使用される核酸に関して、ＤＮＡに適用される用語「単離された核酸」は、それが由来する生物の自然発生的なゲノムにおいて、それがすぐに連続する（５'方向および３'方向に）配列から分離されたＤＮＡ分子を意味する。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドやウイルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、または原核生物や真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子で構成されていても良い。また、「単離された核酸分子」は、ｃＤＮＡ分子を含んでいても良い。ベクターに挿入された単離された核酸分子は、本明細書では組換え核酸分子とも呼ばれることがある。
【００５２】
ＲＮＡ分子に関して、「単離された核酸」という用語は、主に、上記で定義した単離されたＤＮＡ分子によってコード化されたＲＮＡ分子を指す。また、この用語は、自然な状態（すなわち、細胞や組織内）で関連しているだろうＲＮＡ分子から十分に分離され、「実質的に純粋な」形態で存在するＲＮＡ分子を指すこともある。
【００５３】
核酸に関して「濃縮された」という用語を使用することは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、正常な細胞または配列が採取された細胞に比べて、目的の細胞または溶液中に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡの中で有意に高い割合（２〜５倍）を構成することを意味する。これは、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量が優先的に減少することによる人、特定のＤＮＡまたはＲＮＡの配列の量が優先的に増加することによる人、またはその２つの組み合わせによって引き起こされる可能性がある。しかし、「濃縮された」とは、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するのではなく、関心のある配列の相対量が著しく増加したことを意味するだけであることに留意すべきである。
【００５４】
また、ある目的のためには、ヌクレオチド配列が精製された形であることが有利である。核酸に関する「精製された」という用語は、絶対的な純度（均質な調製物など）を必要とせず、代わりに、配列が自然環境よりも相対的に純粋であることを示す。
【００５５】
相補的」という用語は、互いに複数の有利な相互作用を形成することができる２つのヌクレオチドを表す。例えば、アデニンはチミンと相補的で、２つの水素結合を形成することができる。同様に、グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成することができるので、相補的である。したがって、ある核酸配列が、チミン、アデニン、グアニン、シトシンという塩基配列を含んでいる場合、この核酸分子の「相補体」は、チミンの代わりにアデニンを、アデニンの代わりにチミンを、グアニンの代わりにシトシンを、シトシンの代わりにグアニンを含む分子となる。補体は、親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、そのような補体は親分子に高い親和性で結合することができる。
【００５６】
一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般的に使用されるあらかじめ決められた条件下で、そのようなハイブリダイズを可能にするような十分に相補的な配列を持つ２つの一本鎖ヌクレオチド分子の間の関連性を意味する（「実質的に相補的」と呼ばれることもある）。特に、この用語は、非相補的配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に除外し、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることを指す。例えば、特異的ハイブリダイゼーションとは、任意のリンパ異常特異的マーカー核酸にハイブリダイズするが、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしない配列を指すことができる。このようなマーカーとしては、例えば、本明細書に含まれる表に示されるリンパ系異常特異的マーカーが挙げられる。相補性の異なる一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当技術分野でよく知られる。
【００５７】
例えば、特定の配列相同性を持つ核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を計算する一般的な式の一つを以下に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）−二重構造で６００／＃ｂｐ
上の式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］、５０％ホルムアミドを用い、ＧＣ含量４２％、平均プローブサイズ２００塩基の場合、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低下するごとに１〜１．５℃ずつ低下する。したがって、約７５％以上の配列同一性を持つターゲットは、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察されることになる。ハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度と温度に依存する。一般的に、プローブとターゲットのアニーリング速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションは通常、ハイブリッドの計算上のＴｍより２０〜２５℃低い塩と温度の条件で行われる。洗浄条件は、ターゲットに対するプローブの同一性の程度に応じて、可能な限り厳しいものとする。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍよりも約１２〜２０℃低い温度になるように選択される。特定の局面において、本発明の核酸では、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃でハイブリダイゼーションを行い、２Ｘ  ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５５℃で１５分間洗浄することと定義される。ハイストリンジェンシーハイブリダイゼーションとは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハルト液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを用いて４２℃でハイブリダイゼーションを行い、１Ｘ  ＳＳＣと０．５％ＳＤＳを用いて６５℃で１５分間洗浄したものである。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを用いて４２℃でハイブリダイゼーションを行い、０．１Ｘ  ＳＳＣと０．５％ＳＤＳで６５℃で１５分間洗浄したものをいう。
【００５８】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２またはそれ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つ以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因や、オリゴヌクレオチドの特定の用途や使用方法に依存する。プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドから核酸分子の全長までの任意の長さであることができ、３からポリヌクレオチドの全長までの連続する核酸のあらゆる可能な数を明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。
【００５９】
ここでいう「プローブ」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸のことで、精製された制限酵素の消化物のように天然に存在するものであれ、合成されたものであれ、プローブに相補的な配列を持つ核酸にアニーリングするか、または特異的にハイブリダイズすることができるものをいう。プローブは、一本鎖でも二本鎖でも良い。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源、方法の用途など、多くの要因に左右される。例えば、診断用途では、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブ（特定の場合には、ｄｂＳＮＰデータベースで利用可能な一塩基多型に関連する指定されたｒｓ番号に関連する核酸）は、典型的には、１５〜２５、１５〜３５、２０〜５０、または１００以上のヌクレオチドを含むが、ＳＮＶの部位がプローブに含まれていれば、より少ないヌクレオチドを含んでいても良い。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的であるように選択される。つまり、プローブは、あらかじめ決められた一連の条件下で、それぞれの標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」またはアニーリングすることができるように、十分な相補性を有していなければならない。したがって、プローブの配列は、ターゲットの正確な相補的配列を反映している必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片をプローブの５'または３'末端に結合させ、プローブ配列の残りの部分は標的鎖に相補的であっても良い。また、非相補的な塩基やより長い配列をプローブに散りばめることもできるが、プローブ配列が標的核酸の配列と十分な相補性を持ち、それと特異的にアニーリングすることができれば良い。
【００６０】
「プライマー」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡの一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドで、生物学的システムに由来するもの、制限酵素消化によって生成されたもの、または合成されたもので、適切な環境に置かれた場合、鋳型依存性の核酸合成の開始剤として機能することができるものを指す。適切な核酸鋳型、適切な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補酵素、および適切な温度やｐＨなどの条件が提示されると、プライマーは、ポリメラーゼまたは同様の活性の作用によるヌクレオチドの添加によって、その３'末端で延長され、プライマー延長産物を得ることができる。プライマーは、アプリケーションの特定の条件や要件に応じて長さが異なっていても良い。例えば、診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５２５、１５−４０、２０−５０など、またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。プライマーは、所望の伸長産物の合成を促進するために、所望の鋳型に対して十分な相補性を有していなければならない。すなわち、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の開始に使用するために、プライマーの３'ヒドロキシル部分を適切な並置状態に提供するのに十分な方法で、所望の鋳型鎖とアニールすることができなければならないのである。プライマーの配列は、所望の鋳型の正確な相補性を示すことは必須ではない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列を相補的なプライマーの５'末端に結合しても良い。あるいは、非相補的な塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在していても良い。ただし、プライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を持ち、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供することが条件である。
【００６１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１９５号、同第４，９６５，１８８号に記載されており、これらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子の配列と相同性のある小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供することにより、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックダウンのためのＲＮＡ干渉プロセスに関与する分子を意味する。小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されるか、またはリボヌクレアーゼＩＩＩによる長いｄｓＲＮＡからの切断によって生成され、配列特異的なｍＲＮＡの分解の媒介となる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の市販業者としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（ドイツ、ハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国、コロラド州、ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社の一部）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国、バージニア州、スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（米国、マサチューセッツ州、アシュランド）、Ｃｒｕａｃｈｅｍ社（英国、グラスゴー）などが挙げられる。リムファン血管腫症のｍＲＮＡを阻害するための特異的なｓｉＲＮＡコンストラクトは、例えば、長さが１５〜３５ヌクレオチド、より典型的には長さが約２１ヌクレオチドであっても良い。
【００６３】
「ベクター」とは、一本鎖または二本鎖の環状核酸分子で、細胞に感染、トランスフェクション、または形質転換し、独立してまたは宿主細胞のゲノム内で複製することができるものをいう。円形の二本鎖核酸分子は、制限酵素で処理することにより切断され、それにより線状化することができる。ベクター、制限酵素、および制限酵素が標的とするヌクレオチド配列の知識は、当業者が容易に入手可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどの任意のレプリコンを含み、これに別の遺伝的配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を付着させ、付着した配列または要素の複製をもたらすことができる。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、２つのピースをライゲーションすることでベクターに挿入することができる。重複や欠失を含む遺伝子領域をクローニングする場合、適切な長さ（例えば、５０〜１００以上のヌクレオチドの間）の影響を受ける領域の上流および下流のフランキング配列がクローニングプロセスに採用されるであろうことを、当業者は十分に認識する。このようなベクターは、例えば、そのような変化がコードされたタンパク質に与える影響を研究するための細胞株において、有用である。
【００６４】
発現コンストラクトの原核生物または真核生物への形質転換、トランスフェクション、トランスダクションを容易にするために、当業者には多くの技術が利用可能である。形質転換」、「トランスフェクション」、および「導入」という用語は、核酸および／または発現コンストラクトを細胞または宿主生物に挿入する方法を指す。これらの方法には、高濃度の塩、電界、洗剤などで細胞を処理して、宿主細胞の外膜や壁を目的の核酸分子に対して透過性にする方法、マイクロインジェクション、ＰＥＧフュージョンなどの様々な技術が含まれる。
【００６５】
「プロモーターエレメント」とは、ベクターに組み込まれたヌクレオチド配列のことで、適切な細胞内に入ると、転写因子やポリメラーゼが結合しやすくなり、その後、ベクターＤＮＡの一部がｍＲＮＡに転写されやすくなる。一実施形態では、本発明のプロモーター要素は、リンパ系異常特異的マーカー核酸分子の５'末端に先行し、後者がｍＲＮＡに転写される。その後、宿主細胞の機械がｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。プロモーターエレメントは、目的のコーディング領域を構成的または誘導的に発現させることができる。
【００６６】
当業者は、核酸ベクターが、プロモーター要素およびリンパ系異常特異的マーカーをコードする核酸以外の核酸要素を含むことができることを認識するだろう。これらの他の核酸要素には、複製の起源、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またはポリペプチドの精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
レプリコン」とは、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、ウイルスなど、大部分が自己制御で複製可能な任意の遺伝的要素のことである。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり、一本鎖または二本鎖のいずれかである。
【００６８】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＡＴＧコドンやＡＵＧコドンなど）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写・翻訳制御配列を有し、宿主細胞や生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する可能性のある核酸セグメントを指す。
【００６９】
本明細書では、「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、「レポーター遺伝子製品」という用語は、核酸が、発現すると、例えば、生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または比色法、蛍光法、化学発光法などの方法で容易に測定可能なレポーターシグナルを生成する製品をコードする遺伝子を含む動作可能な遺伝システムを意味するものとする。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンス極性またはセンス極性のいずれであっても良く、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素と作動可能に連結される。必要な制御要素は、レポーターシステムの性質や、レポーター遺伝子がＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの形態であるかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
導入された核酸は、レシピエントの細胞や生物の核酸に統合（共有結合）されていてもいなくても良い。例えば、細菌、酵母、植物、哺乳類の細胞では、導入された核酸は、エピソーム要素やプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持されていても良い。あるいは、導入された核酸は、受容者の細胞または生物の核酸に統合され、その細胞または生物において安定的に維持され、さらに受容者の細胞または生物の子孫の細胞または生物に受け継がれるか、または継承されても良い。最後に、導入された核酸は、一過性にしかレシピエント細胞または宿主生物に存在しなくても良い。
【００７１】
選択可能なマーカー遺伝子」とは、発現すると形質転換された細胞に抗生物質耐性などの選択可能な表現型を付与する遺伝子のことである。
【００７２】
「作動可能に連結される」とは、コード化された配列の発現に必要な制御配列が、コード化された配列に対して適切な位置にＤＮＡ分子内に配置され、コード化された配列の発現をもたらすことを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニットおよび他の転写制御要素（例えば、エンハンサー）の配置にも適用されることがある。
【００７３】
「組換え生物」または「遺伝子導入生物」とは、遺伝子または核酸分子の新しい組み合わせを持つ生物を指す。遺伝子や核酸分子の新しい組み合わせは、当業者が利用可能な広範な核酸操作技術を用いて生物に導入することができる。「生物」とは、少なくとも１つの細胞から構成されるあらゆる生物のことである。生物は、１つの真核細胞のように単純なものから、哺乳類のように複雑なものまである。したがって、「組換え生物」という言葉には、組換え細胞のほか、真核生物や原核生物も含まれる。トランスジェニック生物の例としては、ゼブラフィッシュやマウスなどが挙げられる。
【００７４】
本明細書では、「単離されたタンパク質」または「単離および精製されたタンパク質」という用語が使用されることがある。この用語は、主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を指す。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然に関連するであろう他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指すこともある。「単離された」とは、他の化合物や材料との人工的または合成的な混合物や、基本的な活性を妨げない不純物の存在を除外する意味ではなく、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、または例えば免疫原性製剤や薬学的に許容される製剤への配合などにより存在する可能性があるものである。
【００７５】
「特異的結合対」とは、互いに特定の特異性を持ち、通常の状態では他の分子よりも優先的に結合する特異的結合メンバー（ｓｂｍ）と結合パートナー（ｂｐ）からなる。特定の結合ペアの例としては、抗原と抗体、リガンドと受容体、相補的なヌクレオチド配列などが挙げられる。当業者であれば、他にも多くの実施例を知る。さらに、「特異的結合対」という用語は、特異的結合メンバーおよび結合パートナーのいずれかまたは両方が大きな分子の一部を構成する場合にも適用される。特異的結合対が核酸配列からなる実施形態では、それらは、アッセイの条件下で互いにハイブリダイズする長さ、好ましくは１０ヌクレオチド以上の長さ、より好ましくは１５または２０ヌクレオチド以上の長さになる。
【００７６】
「サンプル」または「患者サンプル」または「生物学的サンプル」は、一般的に、特定の分子、好ましくは、以下に提供される表に示されるマーカーなどのリンパ系異常特異的マーカー分子について検査され得るサンプルを指す。サンプルには、細胞、血液、血清、血漿、尿、リンパ、唾液、涙、胸膜液などの体液が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
「遺伝子型配列情報」とは、一般的に、対象者のＤＮＡまたはＲＮＡの配列に関連するあらゆる情報を 指す。遺伝子型配列情報は、対象者のゲノム内の全ゲノム、全エクソーム、エクソームシーケンス、または関心のある領域のターゲットシーケンスを含む。また、遺伝子型配列情報には、本明細書でリンパ系異常に関連するものなど、特定のＳＮＶの有無に関するデータを生成することも含まれる。さらに、遺伝子型配列情報は、１つまたは複数のリンパ系異常に関連するＳＮＶの存在および／または発現を検出するためのプローブの使用を含むだろう。遺伝子型配列情報を得るためにプローブがどのように使用されるかの実施例としては、以下：（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書では、「薬剤」および「試験化合物」という用語は互換的に使用され、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または細菌、植物、真菌、動物（特に哺乳類）の細胞や組織などの生物学的材料から作られた抽出物を示す。生物学的高分子には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書に記載のＳＮＶ含有核酸またはそのコード化されたタンパク質の活性を調節する能力を示す任意の核酸ベースの分子が含まれる。例示的な薬剤には、限定されないが、少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤が含まれる。追加の薬剤には、表１−２に記載されているものも含まれる。薬剤は、以下の本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに含めることによって、潜在的な生物活性について評価される。
【００７９】
「治療」は、本明細書で使用される場合、ヒトを含む哺乳類の疾患に対する治療薬の任意の投与または適用をカバーし、疾患またはその進行を阻害すること、疾患またはその進行を抑制または遅らせること、その発生を阻止すること、疾患を部分的または完全に緩和すること、疾患の発症を予防すること、または疾患の症状の再発を予防することを含む。例示的な治療法には、少なくとも１つのＭＥＫ阻害剤、または表１〜２に記載された薬剤の少なくとも１つを、有効な用量で投与することが含まれる。
【００８０】
「阻害」または「抑制」という用語は、任意の事象（タンパク質のリガンド結合など）の減少または停止、または任意の表現型の特性の減少または停止、またはその特性の発生率、程度、または可能性の減少または停止を意味する。「削減」または「阻害」とは、基準と比較して、活性、機能、および／または量を減少させる、減らす、または停止させることである。抑制または減少が完全であることは必要ではない。例えば、ある実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」または「抑制する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「削減する」または「抑制する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
【００８１】
阻害剤」とは、特定の化学反応、シグナル伝達経路、その他のプロセスを遅らせたり、防いだりする薬剤、あるいは特定の反応物質、触媒、酵素の活性を低下させる薬剤を指す。
【００８２】
患者」および「被験者」という用語は、ヒトを含む哺乳類を意味するものとして互換的に使用される。
【００８３】
ＭＥＫ」とは、細胞表面の受容体から細胞核内のＤＮＡにシグナルを伝達する細胞内のタンパク質の連鎖を構成するＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路とも呼ばれる）のこと。シグナルは、シグナル分子が細胞表面の受容体に結合したときに始まり、核内のＤＮＡがタンパク質を発現し、細胞分裂などの細胞内の何らかの変化を生じさせたときに終わる。この経路には、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ、元々はＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ）と呼ばれていた）をはじめとする多くのタンパク質が含まれており、これらのタンパク質は、隣接するタンパク質にリン酸基を付加することで、「オン」または「オフ」のスイッチの役割を果たしながら情報伝達を行う。
【００８４】
ＭＥＫ阻害剤」または「ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤」とは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、および／またはＥＲＫを阻害する薬剤を指す。これらは、いくつかの癌でしばしば過剰に活性化するＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を与えるために使用することができる。細胞内シグナル伝達」という用語は、ｍＴＯＲシグナルだけでなく、細胞のホメオスタシスまたは活性を支配する他のシグナル伝達経路プロセスを含むだろう。
【００８５】
リンパ系異常の患者を診断する
いくつかの実施形態では、リンパ系異常の患者は、患者から得られた生体試料から遺伝子型配列情報を得た後に、ＳＮＶの存在に基づいて診断される。いくつかの実施形態では、リンパ系異常を有する患者は、ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１，ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬから選択される遺伝子における１またはそれ以上のＳＮＶ、またはリンパ異常に関連するＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１，ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬから選択される遺伝子のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶである。いくつかの実施形態では、この１つまたは複数のＳＮＶは、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳのａ  ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３のＴ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇとｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇからなる複合変異、または表３に記載されている変異のいずれかである。
【００８６】
いくつかの実施形態では、特定の対象に存在するＳＮＶを特定する報告書が、実験データから生成されても良い。いくつかの実施形態では、遺伝子型配列情報を用いて特定されたＳＮＶ（複数可）のデータに基づいて、リンパ異常に対する推奨治療法を特定するレポートが生成されても良い。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１，ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、およびＣＢＬから選択される遺伝子における１またはそれ以上のＳＮＶの存在、またはＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、ＣＢＬから選択される遺伝子のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶを、患者から得られた生物学的サンプルから遺伝子型配列情報を得た後、患者の治療法の選択を導く。いくつかの実施形態では、ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１，ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬから選択される遺伝子の１つ以上のＳＮＶの存在、またはＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１，ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦおよびＣＢＬから選択される遺伝子のＳＮＶと連鎖不平衡状態にあるＳＮＶであっても、患者から得られた生体試料から遺伝子型配列情報を得た後に、患者の治療法の選択を誘導したり、影響を与えたりすることはない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、リンパ系異常の診断は、臨床症状、スキャン結果、および／または家族歴のみに基づいて行われる。いくつかの実施形態では、リンパ系異常の診断は、遺伝子配列情報の検査を行わずに行われる。いくつかの実施形態では、リンパ系異常の診断は、遺伝子配列情報とともに臨床症状に基づいて行われる。
【００８９】
本発明で開示されたリンパ異常関連ＳＮＶは、リンパ異常を診断するために様々な方法で使用することができる。
【００９０】
例えば、リンパ系異常関連ＳＮＶを含む核酸は、リンパ系異常特異的マーカーの存在および／または発現を検出するためのプローブとして利用することができる。リンパ系異常関連マーカー核酸がそのようなアッセイのためのプローブとして利用され得る方法には、以下：（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのアソート増幅反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
さらに、リンパ系異常に関連するＳＮＶ、またはそれによってコードされるタンパク質を検出するアッセイは、体液（血液、尿、血清、胃洗浄液など）、あらゆる種類の細胞（脳細胞、白血球、単核細胞など）、体組織など、あらゆる種類の生物学的サンプルに対して実施することができる。
【００９２】
リンパ管異常関連ＳＮＶ含有核酸、それを発現するベクター、リンパ管異常関連ＳＮＶ含有マーカータンパク質、および抗リンパ管異常特異的マーカー抗体を用いて、体組織、細胞、または体液中のリンパ管異常関連ＳＮＶを検出し、リンパ管異常関連ＳＮＶ含有マーカータンパク質の発現を変化させて、リンパ管異常の検出および診断を目的とすることができる。
【００９３】
リンパ系異常関連ＳＮＶに基づいてリンパ系異常を検出および／または診断する方法が包含される。本方法は、リンパ系異常関連ＳＮＶを検出することを含んでいても良く、サンプル中のリンパ系異常関連ＳＮＶ含有核酸は、最初に、例えばＰＣＲを用いて増幅され、サンプル中に存在する他の配列と比較してテンプレートの量が増加する。これにより、標的配列がサンプル中に存在する場合、高感度で検出することができる。この初期段階は、当技術分野で重要性を増している高感度アレイ技術を用いることで回避することができる。
【００９４】
一方、新しい検出技術は、この制限を克服し、わずか１μｇの合計ＲＮＡを含む少量サンプルの分析を可能にする。従来の蛍光技術とは異なり、共鳴光散乱（ＲＬＳ）技術を用いることで、ビオチン標識されたハイブリダイズターゲットと抗ビオチン抗体を用いて、マルチプルリードにより少量のｍＲＮＡを検出することができる。また、ＰＣＲ増幅に代わる技術として、平面波導波路技術（ＰＷＧ）を用いてＳ／Ｎ比を向上させ、バックグラウンドの干渉を低減する方法がある。どちらの技術も、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（米国）から市販される。
【００９５】
このように、上述の技術のいずれかを用いて、リンパ系異常に関連するＳＮＶマーカーの発現を検出または定量化し、それに応じてリンパ系異常またはその発症リスクを診断することができる。
【００９６】
リンパ系異常の患者さんへの対応
本明細書に記載されたリンパ異常関連ＳＮＶがリンパ異常の表現型を調節する際に果たす役割が解明されれば、リンパ異常の治療に有用な既存の治療法の再利用、および新しい治療法の開発が容易になる。いくつかの実施形態では、本発明は、１またはそれ以上のｍＴＯＲ阻害剤、１またはそれ以上のＰＩＫ３Ｋ阻害剤、および／または１またはそれ以上のＭＥＫ阻害剤（例えば、表１−２の１またはそれ以上の薬剤）を、リンパ系異常を有する患者に投与する工程を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、治療すべきリンパ系異常を有する患者は、症状およびリンパ系異常の陽性家族歴に基づいて診断される。いくつかの実施形態では、リンパ異常を診断するために、プレーンフィルムＸ線撮影、骨スキャン、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴画像、およびリンパシンチグラフィなどの様々なスキャン技術が、臨床症状と一緒に使用される。いくつかの実施形態では、リンパ管異常を診断するために生検が行われる。いくつかの実施形態では、リンパ管の過成長に基づいてリンパ異常を診断する。いくつかの実施形態では、リンパ異常は、リンパ管の異常な形成に基づいて診断される。いくつかの実施形態では、リンパ系異常は、心嚢液、胸膜液、または腹膜液を含む、乳び滲出液に基づいて診断される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、治療対象のリンパ異常を有する患者は、本明細書に記載の診断方法に従って診断される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１またはそれ以上のＭＥＫ阻害剤（例えば、表１〜２；実施例ＩＩの１またはそれ以上の薬剤）は、リンパ系異常を治療するための医薬品の調製に有用である。１またはそれ以上の薬剤は、当業者によく知られる薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または他の材料と一緒に製剤化されても良い。このような材料は、毒性がなく、活性成分の有効性を阻害しないことが望ましい。担体やその他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔内、エアロゾル化、筋肉内、および腹腔内の経路に依存する場合がある。リンパ系異常に関連する突然変異を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムまたはトランスジェニック生物は、ヒトの治療のために特定の薬剤を選択するために使用されても良い。
【０１００】
治療に有用な薬剤としては、表１および表２の薬剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。表１と表２の両方に記載される薬剤もあり、両方の表に記載されていないことに何の意味もない。
【表１】
2022500020.tif 000002
2022500020.tif 000003
2022500020.tif 000004
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【０１０１】
表２は、リンパ異常を治療するために、単独で、または表１または表２のいずれかの薬剤と組み合わせて使用することができる薬剤を提供する。
【表２】
2022500020.tif 000006
2022500020.tif 000007
【化１】
2022500020.tif 000008
【０１０２】
リンパ管異常を有する個体を治療するために、あるいは疾患の徴候や症状を緩和するために、本明細書に開示された遺伝子を標的とする適切な薬剤を組み合わせて投与することで、患者に治療上の利益をもたらすことができる。このような薬剤は、有効な用量で投与されるべきである。
【０１０３】
遺伝子の変化が明らかになったら、その遺伝子の影響を受ける生物学的経路やシグナル伝達経路を調節する治療法が考案される。例えば、ＭＡＰＫ（ＭＥＫ１／ＭＥＫ２）およびＥＲＫ経路を阻害することが望ましい場合には、ＭＥＫ阻害剤を単独で、または他のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、治療は、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤と一緒にｍＴＯＲ阻害剤などの表１または２に記載された薬剤の投与を伴う。他の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤およびＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を組み合わせて、患者に治療上の利益を提供する。別のアプローチでは、ＰＩＫ３Ｋ阻害剤とＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を組み合わせて、疾患の症状を改善する。本明細書に記載された特定のＡＲＡＦ機能獲得変異に対して、有効な治療法はＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の投与からなる。上述のコンビナトリアル療法は、相加的に作用することができる。他の実施形態では、組み合わせた薬剤は、症状を緩和するために相乗的に作用する。
【０１０４】
まず、患者さんから生物学的サンプルや遺伝子型情報を入手する。そして、サンプルに含まれる核酸から得られた遺伝子情報をもとに、例えば、リンパ系異常に関連するＳＮＶの有無を評価する。リンパ管異常のリスクや疾患の存在を示すこれらの変異の存在は、影響を受けた遺伝子の同時同定とともに、どの治療薬が適切かというガイダンスを臨床医に提供する。総治療量または投与量（２またはそれ以上の標的が調節される場合）は、単回投与として対象者に投与することができ、または分画治療プロトコルを使用して投与することができる。このプロトコルでは、複数／別々の投与量をより長期間にわたって投与し、例えば、１日の投与量を投与できるように１日の期間にわたって投与するか、または所望の期間にわたって投与するためにより長い期間にわたって投与する。当業者であれば、対象者において有効量を得るために必要なリンパ異常剤の量は、対象者の年齢、体重、一般的な健康状態のほか、投与経路や投与する治療回数など、多くの要因に依存することを知っているだろう。これらの要因を考慮して、当業者は、リンパ異常を有する個体を治療するための有効な用量を得るように、特定の用量を調整するだろう。
【０１０５】
リンパ異常治療剤の有効量は、投与方法および治療を受ける個体の体重に依存する。本明細書に記載されている投与量は、一般的に平均的な成人に対するものであるが、子供の治療のために調整することができる。投与量は、一般的に約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲となる。
【０１０６】
特に、より重篤な形態のリンパ異常を患っている個人において、リンパ異常治療剤の投与は、例えば、そのような疾患を治療するための従来の薬剤と組み合わせて投与すると、特に有用である。当業者であれば、リンパ異常治療剤を単独または組み合わせて投与し、肺、腸、甲状腺、または炎症機能の測定、放射線または免疫学的なアッセイ、あるいは必要に応じて病理組織学的な方法などの日常的な方法を用いて、このような治療の効果をモニターするだろう。リンパ異常の治療のための他の薬剤には、疾患の基礎となる症状を緩和するための全身化学療法、インターフェロンアルファ療法、放射線療法、または外科手術が含まれる。
【０１０７】
医薬製剤の投与は、好ましくは「有効量」であり、これは個人に利益を示すのに十分な量である。この量は、患者におけるリンパ系異常の症状を防ぐ、緩和する、軽減する、またはその他の方法で重症度を軽減する。効果的な量のＭＥＫ阻害剤およびまたは表１−２）の薬剤によるリンパ系異常を有する患者の治療は、リンパ構造の改善、胸水の減少、呼吸機能の改善、併用薬の使用量の漸減、または生存率の向上をもたらす可能性がある。
【０１０８】
本製品は、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位の形で処方される。ここでいう投与単位とは、治療を受ける患者に適した、物理的に分離した医薬製剤の単位のことである。各投与量は、選択された医薬担体と組み合わせて所望の効果をもたらすように計算された活性成分の量を含むべきである。適切な投与単位を決定する手順は、当業者にはよく知られる。
【０１０９】
投与単位は、患者の体重に応じて比例的に増減させることができる。特定の病状を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られているように、投与濃度曲線計算によって決定することができる。
【０１１０】
本発明の方法に有用な医薬組成物は、非経口、経口固体および液体製剤で全身的に、皮下、皮内、筋肉内、舌下、局所的に、耳介（ＯＴＩＣ）、頬側、結膜、皮膚、歯牙、電気浸透を介して、子宮頸部、洞または気管を介して、経腸、硬膜外、浸潤、間質性、腹腔内、動脈内、関節内、胆道内、気管内、心臓内、心臓内、気管内、胸骨内、胸腔内、脳内、皮内、リンパ内、心内、腹腔内、鼻腔内、経皮、呼吸器、眼科、座薬、エアロゾル、局所、その他の既知の投与経路を介して投与することができる。リンパ管異常の治療に有用な薬剤に加えて、医薬組成物は、薬剤の投与を強化および促進することが知られる薬学的に受容可能なキャリアおよび他の成分を含んでも良い。したがって、そのような組成物は、任意に、他の成分、例えばアジュバント、例えば水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムの水性懸濁液、および／または他の薬学的に許容されるキャリア、例えば生理食塩水を含むことができる。本発明の方法に従って適切な薬剤を患者に送達／投与するために、ナノ粒子、リポソーム、再封入された赤血球、および免疫学的に基づいたシステムなどの他の可能な製剤を使用することもできる。このような薬剤を送達するためのナノ粒子の使用、および使用可能な細胞膜透過性ペプチドキャリアについては、Ｃｒｏｍｂｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｖ３５：ｐ４４（２００７）に記載される。
【０１１１】
リンパ系異常の治療に有用な薬剤の投与は、リンパ系異常に関連するＳＮＶマーカーの発現を検出または定量化することに成功し、それによりリンパ系異常またはその発生のリスクを診断した後に行うことができる。リンパ系異常に関連するＳＮＶマーカーの発現を検出または定量することで、治療に使用する特定の薬剤を選択することができる。リンパ異常に関連するＳＮＶマーカーの発現を検出または定量化することで、特定の治療法が対象者にとって適切でないことを示すことができる。
【０１１２】
他の実施形態では、リンパ系異常に対する治療は、疾患の臨床診断に基づいて行われても良く、遺伝子配列情報の検出または定量化が行われなくても、治療が開始されても良い。他の実施形態では、リンパ系異常に対する治療は、疾患の臨床診断に基づいて行われても良く、リンパ系異常に関連するＳＮＶマーカーの発現を検出または定量化しない状態で治療が開始されても良い。
【０１１３】
他の実施形態では、リンパ系異常に対する治療は、疾患の臨床診断に基づいて行われ、リンパ系異常に関連するＳＮＶマーカーの発現が対照（コントロール）と変わらない場合に治療が開始されても良い。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１、ＩＴＧＡ９、ＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＰＥＩＺＯ１、ＥＰＨＢ４、ＮＦ１、ＡＲＡＦ、ＣＢＬのＳＮＶを持たない患者に治療を行う。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２を阻害するＭＥＫ１／２阻害剤である。これらは、いくつかのがんやその他の障害でしばしば過剰に活性化しているＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を与えるために使用することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、共同投与される薬剤（複数可）は、ラパマイシンまたはＢＥＺ−２３５（ダクトリシブ）である。ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンは、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）としても知られる。ＢＥＺ−２３５は、ダクトリシブまたはＮＶＰ−ＢＥＺ２３５としても知られており、ｐ１１０、ＰＩ３Ｋ、およびｍＴＯＲに対する既知の活性を有する化合物である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、治療方法で投与される薬剤は、ラパマイシン（シロリムス）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＡＺＤ８０５５、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ  ６８３８６４）、ＫＵ−００６３７９４、ＭＨＹ１４８５，ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ダクトリシブ）、ＰＩ−１０３，トルキニブ（ＰＰ２４２）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ（Ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ、ＭＫ−８６６９）、ＩＮＫ  １２８（ＭＬＮ０１２８）、ヴォクサタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５），Ｔｏｒｉｎ１，オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８，ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＧＳＫ１０５９６１５、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＷＹＥ−３５４、ＡＺＤ２０１４、Ｔｏｒｉｎ２、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６）、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９（Ｐ５２９）、Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｉｃ  Ａｃｉｄなどから選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、投与される薬剤は、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＴＡＫ−７３３、ＡＺＤ８３３０、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２、ＡＲＲＹ−４３８１６２）、ＳＬ−３２７、リファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ８６−９７６６）、およびコビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＲＧ７４２０）から選択されるＭＥＫ阻害剤である。
【０１１９】
また、上述の薬剤の組み合わせは、リンパ系異常を治療するために本明細書に記載された治療方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、以下の組み合わせは、ＧＬＡおよびＬＡＭを含むリンパ系異常を治療するために、付加的または相乗的に作用することができる。特定の実施形態では、投与のための組み合わせは、１）リダフロリムスおよびトラメチニブ、２）リダフロリムスおよびセルメチニブまたはコビメチニブ、３）ＢＥＺ２３５およびセルメチニブ、４）オミパリシブおよびセルメチニブまたはトラメチニブ、５）エベロリムスとトラメチニブまたはセルメチニブ、６）シロリムス、リダフォリムスとセルメチニブ、７）シロリムス、リダフォリムスとトラメチニブ、８）トルキニブとトラメチニブ；９）ＢＥＺ２３５、トルキニブとトラメチニブ、１０）シロリムスとゲダトリシブとトラメチニブから選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている薬剤による治療は、全身化学療法、インターフェロンアルファ、放射線治療、および／または手術の１つ以上と組み合わせて使用される。
【０１２１】
追加の有用な治療用試薬を特定する方法
ここで同定されたＳＮＶは、リンパ異常の病因と関連しているので、そのようなＳＮＶを含む遺伝子およびそのコード化された製品の活性を調節する薬剤を同定する方法は、この状態の治療のための有効な治療剤の生成につながるはずである。
【０１２２】
ここに記載されている染色体領域には、タンパク質をコードする領域が含まれており、これらの領域を利用してタンパク質の活性を調節する治療薬を合理的に設計することができます。これらの領域に対応する小さなペプチド分子は、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療薬を設計する際に有利に使用することができる。
【０１２３】
分子モデリングにより、ＳＮＶを含む核酸にコードされたタンパク質の活性部位に結合する能力を持つ特定の有機分子を、コンフォメーションや機能に必要な主要アミノ酸残基に基づいて同定することができるはずである。コンビナトリアルケミストリーの手法を用いて、最大の活性を持つ分子を同定し、これらの分子を反復して開発し、さらなるスクリーニングのサイクルを行う。ある実施形態では、合成化合物または天然化合物の大規模なライブラリから候補薬剤をスクリーニングすることができる。一例として、ヒトが使用できる化合物のＦＤＡ承認ライブラリがある。さらに、化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国、コーンウォール、トレビレット）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ニュージャージー州、プリンストン）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（コネチカット州、ニューミルフォード）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ワイオミング州、ミルウォーキー），ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（スイス、バーゼル）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランス、パリ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシア、モスクワ），Ａｕｒｏｒａ（アーストリア、グラーツ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｂｉｏｎｅｔ（英国、キャメルフォード）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ，（カルフォルニア州、サンディエゴ）、ＣｈｅｍＤｉｖ，（カルフォルニア州、サンディエゴ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ，（ロシア、モスクワ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（ロシア、モスクワ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｔｄ  （ロシア、オブニンスク）、Ｅｎａｍｉｎｅ（ウクライナ、キエフ）、Ｅｖｏｔｅｃ（ドイツ、ハンブルグ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（ニュージャージー州、ヒルスボロウ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（ロシア、モスクワ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス、モンツルコン），Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（コネティカット州、オレンジ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（ロシア、モスクワ）、Ｏｔａｖａ，（オンタリオ州  トロント）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（ロシア、モスクワ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ニュージャージー州、モンマウス  ジャンクション）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ニューハンプシャー州、センター  オシピー）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ），ＴｉｍＴｅｃ（デラウェア州、ニューアーク），Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（オンタリオ州、ノースヨーク）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ウクライナ、キエフ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ，（ロシア、モスクワ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，（ロシア、モスクワ）、ａｎｄ  Ｂｉｃｏｌｌ（中国、上海）を含むが、これに限定されない多くの企業から市販される。
【０１２４】
細菌、真菌、植物、動物の抽出物の形で天然化合物のライブラリが市販されているか、当技術分野でよく知られる方法で容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉や樹皮などの植物、海洋試料などの天然物から単離された化合物を、潜在的に有用な医薬品の存在を示す候補としてアッセイすることが提案される。また、スクリーニングされる医薬品は、化学組成物または人工化合物から誘導または合成される可能性もあることが理解されるだろう。スクリーニングには、いくつかの市販ライブラリを使用することができる。
【０１２５】
薬物スクリーニングに用いられるポリペプチドやフラグメントは、溶液中で遊離していても、固体の支持体に付着していても、細胞内に存在していても良い。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定的に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を利用し、好ましくは競合的な結合アッセイを行う。このような細胞は、生存中または固定された形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントと試験される薬剤との間の複合体の形成を決定したり、ポリペプチドまたはフラグメントと既知の基質との間の複合体の形成が試験される薬剤によって妨害される程度を調べたりすることができる。
【０１２６】
薬物スクリーニングのためのさらなる技術は、非機能性または変化したリンパ系異常関連遺伝子を有する宿主の真核細胞株、細胞（内皮細胞など）または全動物モデル（例えば、トランスジェニックマウスまたはゼブラフィッシュ）を使用することを含む。いくつかのケースでは、トランスジェニック生物は、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒの変異、ＫＲＡＳのａ  ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ｃ．ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇとｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを含む複合変異、または表３に示す１またはそれ以上の変異を有する。これらの宿主細胞株、細胞またはトランスジェニック動物は、ポリペプチドレベルで欠損している。宿主細胞株や細胞は、薬剤化合物の存在下で培養される。例えば、ゼブラフィッシュモデルでは、尾部およびまたはＤ／Ｖ血管構造の救済を評価することができる。さらに、宿主細胞株におけるｍＴＯＲによるリン酸化の誘導を評価しても良い。
【０１２７】
薬物スクリーニングの例示的な方法は、表１−２に記載された薬剤のような、細胞のシグナル伝達を変化させる薬剤を同定する方法である。この方法は、少なくとも１つのリンパ系異常関連ＳＮＶを含む少なくとも１つの核酸を発現する細胞を提供する工程と、リンパ系異常関連ＳＮＶに対応する同族の野生型配列を発現する細胞を提供する工程と、少なくとも１つのリンパ系異常関連ＳＮＶを発現する細胞および同族の野生型配列を発現する細胞を試験剤と接触させる工程と、および前記試験剤が細胞のシグナル伝達を変化させるかどうかを分析する工程とを含むだろう。
【０１２８】
本発明のリンパ系異常関連ＳＮＶまたはその機能的断片を発現する宿主細胞は、リンパ系異常の発生を調節する能力について、潜在的な化合物または薬剤をスクリーニングするシステムを提供するものである。したがって、一実施形態では、本発明の核酸分子を使用して、リンパ系異常および異常血管形成に関連する異常ＭＡＰＫシグナル伝達の側面を調節する薬剤を同定するためのアッセイで使用する組換え細胞株を作成することができる。また、本明細書では、ＳＮＶ含有核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【０１２９】
もう一つの方法は、ＳＮＶを含む核酸によってコードされるポリペプチドの断片をファージ表面に発現するように設計されたファージディスプレイライブラリを使用することである。このようなライブラリは、次に、発現したペプチドと化学ライブラリの成分との間の結合親和性が検出される条件下で、コンビナトリアル化学ライブラリと接触させる。米国特許第６，０５７，０９８号および第５，９６５，４５６号は、このようなアッセイを行うための方法および装置を提供する。
【０１３０】
別の実施形態では、リンパ系異常関連改変核酸の利用可能性により、本発明の改変核酸を有する実験用マウスの系統の生産が可能となる。これらのリンパ系異常関連改変核酸は、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳのａ  ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇとｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを含む複合変異や、表３に示した他の変異のいずれかにも対応する。本発明のリンパ系異常関連変異を発現するトランスジェニックマウスは、リンパ系異常の発生および進行における、変異した核酸によってコードされるタンパク質の役割を検討するモデルシステムを提供する。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者に知られている。一般的な方法としては、以下の３つが挙げられる。１．目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの初期胚への組み込み、２．新たに受精した卵の前核へのＤＮＡの注入、３．遺伝的に操作された胚性幹細胞の初期胚への組み込み、である。上述のトランスジェニックマウスを作製することで、リンパ管異常の表現型に関連する様々なプロセスにおいて標的タンパク質が果たす役割を分子レベルで解明することが可能になる。このようなマウスは、全動物モデルにおいて推定治療薬を研究するためのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングツールを提供し、本発明に包含される。
【０１３１】
本明細書では、「動物」という用語は、ヒトを除くすべての脊椎動物を含む意味で使用される。また、胚および胎児期を含むすべての発達段階にある個々の動物も含まれる。「トランスジェニック動物」とは、標的組換えやマイクロインジェクション、組換えウイルスの感染など、細胞以下のレベルでの意図的な遺伝子操作により、直接的または間接的に変更されたまたは受け取られた遺伝情報を持つ１またはそれ以上の細胞を含む動物をいう。「トランスジェニック動物」という用語は、古典的な異種交配や体外受精を包含するものではなく、むしろ、１またはそれ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子によって変化した、または組換えＤＮＡ分子を受け取った動物を包含するものである。この分子は、特定の遺伝子座を標的としたものであっても、染色体にランダムに組み込まれたものであっても、あるいは染色体外で複製されたＤＮＡであっても良い。「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系細胞に導入され、それによって遺伝情報を子孫に伝える能力が付与されたトランスジェニック動物を指す。その子孫が実際にその変化や遺伝情報の一部または全部を持っていれば、その子孫もトランスジェニック動物であると言える。
【０１３２】
遺伝情報の改変は、レシピエントが属する動物種にとって異質なものであったり、特定のレシピエント個人にとってのみ異質なものであったり、あるいは、レシピエントが既に持っている遺伝情報であったりする。最後のケースでは、改変または導入された遺伝子は、ネイティブな遺伝子とは異なる形で発現することがある。このような改変されたまたは外来の遺伝情報は、改変されたリンパ管異常関連のヌクレオチド配列の導入を包含するだろう。
【０１３３】
標的遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡは、ゲノムソースからの単離、単離されたｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接合成、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、幅広い技術によって得られる。
【０１３４】
導入対象となる細胞の一つに、胚性幹細胞（ＥＳ）がある。ＥＳ細胞は、インビトロで培養した着床前の胚から得ることができる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８、Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９０６５−９０６９）に記載される。）導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションやレトロウイルスを介した導入などの標準的な技術によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。その結果、形質転換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物の胚盤胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞は、その後、胚に定着し、得られたキメラ動物の生殖系列に貢献する。
【０１３５】
個々の遺伝子およびその発現産物の貢献度を決定する問題に対する１つのアプローチは、単離された変異を含むリンパ系異常関連遺伝子を挿入カセットとして使用して、（上述のような）全能性ＥＳ細胞において野生型遺伝子を選択的に不活性化し、その後トランスジェニックマウスを生成することである。遺伝子を標的としたトランスジェニックマウスの生成における遺伝子を標的としたＥＳ細胞の使用が記載されており、他の場所でレビューされる（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：１４５−１４７；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４−５３９）。
【０１３６】
染色体の対立遺伝子に特定の変化を挿入する標的相同組換えを用いて、任意の遺伝子領域を不活性化したり、所望の変異に変更する技術がある。しかし、１００％に近い頻度で起こる染色体外の相同組換えに比べて、プラスミドと染色体の相同組換えは１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないことが報告される。非相同プラスミド−染色体相互作用は、同等の相同挿入よりも１０５倍〜１０２倍の頻度で発生する。
【０１３７】
このようにマウスＥＳ細胞における標的組換えの割合が低いことを克服するために、稀な相同組換え体を検出または選択するためのさまざまな戦略が開発されてきた。相同性変化事象を検出するための１つのアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて形質転換細胞のプールをスクリーニングして相同性挿入を検出し、続いて個々のクローンをスクリーニングするというものである。また、相同性挿入が生じた場合にのみ活性化するマーカー遺伝子を構築し、これらの組換え体を直接選択できるようにするポジティブな遺伝的選択法も開発される。相同組換え体を選択するために開発された最も強力なアプローチの１つは、改変の直接選択が存在しない遺伝子のために開発されたポジティブネガティブセレクション（ＰＮＳ）法である。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子が独自のプロモーターを持っているため、高レベルで発現していない遺伝子を対象とする場合に効率的である。非相同組換え体は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を用いて、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）や（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄアラビノフラノシル）−５−ヨードゥ−ラシル、（ＦＩＡＵ）などの有効なヘルペス薬を用いて、非相同挿入に対して選択する。このカウンターセレクションによって、生き残った形質転換体に含まれる相同組換え体の数を増やすことができる。変異したリンパ系異常関連核酸を標的挿入カセットとして利用することで、例えばＥＰＨＢ４核酸がコードするポリペプチドに免疫学的に特異的な抗体に対する免疫反応性の獲得によって可視化されるように、挿入の成功を検出する手段が提供され、したがって、所望の遺伝子型を有するＥＳ細胞のスクリーニング／選択が容易になる。
【０１３８】
本明細書では、ノックイン動物とは、例えば内在性のマウス遺伝子が本発明のヒトリンパ管異常関連遺伝子に置換された動物である。このようなノックイン動物は、リンパ系異常の発生を研究するための理想的なモデルシステムを提供する。
【０１３９】
本明細書では、リンパ系異常関連核酸の全部または一部をコードする核酸配列が、コードされたタンパク質の発現を特定の組織または細胞型で指示する調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結されたベクターを用いて、変異したリンパ系異常関連核酸、その断片、またはリンパ系異常関連融合タンパク質の発現を「組織特異的な方法」または「細胞型特異的な方法」で標的にすることができる。このような調節要素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の用途に有利に使用することができる。組織特異的なタンパク質を指示するためのプロモーターは、当技術分野でよく知られており、本明細書に記載されている。あるいは、導入遺伝子は、組織特異的または「全身」的に機能する誘導性プロモーターの制御下にあっても良い。
【０１４０】
本発明のリンパ系異常関連変異体をコードする核酸配列は、トランスジェニック動物での発現のために、様々な異なるプロモーター配列に動作可能に連結されていても良い。そのようなプロモーターとしては、ハムスターやマウスのＴｈｙ−１プロモーターのようなプリオン遺伝子プロモーター；ＰＧＫプロモーター；または所望の細胞型で導入遺伝子を発現させるためのＣＭＶプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
本発明のトランスジェニックマウスの使用方法も本明細書で提供される。変異したリンパ系異常関連核酸またはそのコード化されたタンパク質を含む核酸が導入されたトランスジェニックマウスは、例えば、治療薬をスクリーニングする方法を開発して、リンパ系異常の発生を調節することができるものを特定するのに有用である。
【０１４２】
検出製品・キット
リンパ系異常ＳＮＶの検出に有用な組成物または製品が包含される。例えば、リンパ系異常ＳＮＶ含有核酸、それを発現するベクター、リンパ系異常ＳＮＶ含有マーカータンパク質、抗リンパ系異常特異的マーカー抗体は、ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳのａ  ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを含む複合変異などのＳＮＶを検出できる製品である。ＰＴＰＮ１１遺伝子のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、ｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ、および／またはｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ、ＫＲＡＳのａ  ｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ、ＢＲＡＦ遺伝子のａ  ｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ、ＳＯＳ１遺伝子のａｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ、ＩＴＧＡ９遺伝子のｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇを含む複合変異などのＳＮＶを検出するのに十分な長さと特性を有する核酸プローブが包含される。検出産物は、検出可能なように標識されていても良い。
【０１４３】
リンパ系異常関連ＳＮＶの検出に有用な任意の製品を、キットに組み込むことができる。リンパ系異常の治療に有用な任意の製品をキットに組み込むことができる。そのような検出製品および治療製品を含むキットが包含される。キットは、固体支持体、遺伝子チップ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、マーカー、レポーター、薬学的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、容器、投与用容器、アッセイ基質、またはそれらの任意の組み合わせに固定化されたリンパ系異常関連ＳＮＶ特異的マーカーポリヌクレオチドまたはそのようなマーカーの１つまたは集合体の１またはそれ以上を含むことができる。
【０１４４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。それらは、本発明をいかなる形でも限定することを意図していない。
【実施例１】
【０１４５】
実施例Ｉ
ＣＣＬＡは，他のリンパ管奇形と同様，先天的なリンパ管形成不全の結果として発症する。。ＣＣＬＡの遺伝的基盤を特定するために、７人の患者からのＤＮＡサンプルに対して全エクソームシーケンスを実行した。これらの患者はすべて、新しい高度な画像技術である動的コントラスト磁気共鳴リンパ管造影（ＤＣＭＲＬ）によって画像化された異形リンパ管を有し、このグループのより良い診断を可能にする。５人の患者を対象に、表現型を説明できる可能性のあるミスセンス、ナンセンス、スプライス変化、コーディングインデル変異を調べた。調査結果は、同義的な変異、マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）が０．５％を超える変異、社内のエクソーム変異データベースで対照群に既に同定される変異を除外するようにフィルタリングされた。関連する候補は、手作業によるキュレーションにかけた。その結果、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関わる４つの遺伝子（ＰＴＰＮ１１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＳＯＳ１）に、１つの体細胞変異と５つのｄｅ  ｎｏｖｏミスセンス変異を同定した（表３）。さらに、原発性リンパ浮腫と逆行性リンパ流を有する１名の患者において、ＩＴＧＡ９にｃ．１２３６＋４Ａ＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇという２つのヘテロ接合性変異が発見された。ＩＴＧＡ９は、細胞と細胞の接着や細胞とマトリックスの相互作用を媒介する細胞表面の糖タンパク質であるインターグリンα９をコードする。インテグリンα９はＶＥＧＦ−Ｃと結合し、ＩＴＧＡ９を不活性化すると、マウスでは胸郭が形成され、リンパ管弁の形成が阻害される。
これらのタンパク質の配列は、ＮＣＢＩデータベースに掲載されており、以下の通りである。
ａ）ＰＴＰＮ１１のｃ．１５０４Ｔ＞Ｇ：ｐＳ５０２Ａ、
Ｓ５０２に存在するＮＣＢＩ参照配列：：ＮＰ＿００２８２５．３
ｂ）ＰＴＰＮ１１のｃ．１５１０Ａ＞Ｇ：ｐＭ５０４Ｖ
Ｍ５０４に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８２５．３
ｃ）ＰＴＰＮ１のｃ．１５０７Ｇ＞Ｃ：ｐＧ５０３Ｒ
Ｇ５０３に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８２５．３
ｄ）ＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞Ａ：ｐＧ１２Ｄ
Ｇ１２に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２０３５２４．１
ｅ）ＢＲＡＦのｃ．１４０３Ｔ＞Ｃ：ｐＦ４６８Ｓ
Ｆ４６８に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４３２４．２
ｆ）ＳＯＳ１のｃ．２５３６Ｇ＞Ａ：ｐＥ８４６Ｋ
Ｅ８４６に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５６２４．２
ｇ）ＩＴＧＡ９のｃ．１２３６＋４Ａ＊＞Ｇおよびｃ．２８９Ｔ＞Ｇ：ｐ．Ｃ９７Ｇ
ｐＣ９７に存在するＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１９８．２
【０１４６】
エクソン−イントロン間の接合部から４ｂｐ離れた場所に存在し、イントロン内にも存在する変種
【表３】
2022500020.tif 000009
2022500020.tif 000010
2022500020.tif 000011
2022500020.tif 000012
2022500020.tif 000013
2022500020.tif 000014
2022500020.tif 000015
2022500020.tif 000016
2022500020.tif 000017
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2022500020.tif 000019
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2022500020.tif 000025
2022500020.tif 000026
2022500020.tif 000027
2022500020.tif 000028
【０１４７】
ＲＡＳｏｐａｔｈｉｅｓは、ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１、ＲＡＦ１、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＳＨＯＣ２、ＢＲＡＦ、ＲＩＴ１、Ａ２ＭＬ１、ＳＰＲＥＤ１、ＮＦ１などが関与するＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の変異を有する、ヌーナン症候群（ＮＳ）、Ｃａｒｄｉｏｆａｃｉｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ症候群（ＣＦＣ）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、多発性黒子を伴うヌーナン症候群（ＮＳＭＬ）、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ症候群（ＣＳ）、Ｌｅｇｉｕｓ症候群、コステロ症候群（ＣＳ）、レギウス症候群などの遺伝的異質な疾患の一群である。ＮＳにおけるリンパ系の欠損は、ＮＳ患者のサブセットで報告されるが、重症度、部位、発症時期は様々である。文献を検討した結果、胸水、心嚢水、液胸、水腫、リンパ管拡張症、リンパ浮腫など、ヌーナン症候群またはヌーナン様症候群の臨床的特徴とリンパ管欠損症を呈する出生前および出生後の患者、合計５２名を特定した。我々は、彼らの疾患を説明するＰＴＰＮ１１の突然変異を同定した。したがって、ｒａｓ／ＭＡＰＫ  ＥＲＫ経路に治療的介入を行えば、これまでＡＲＡＦ遺伝子変異について示してきたのと同様に、これらの患者の疾患表現型を逆転させることができるはずである。このように、中枢性リンパ管異常症の患者は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路に生殖細胞変異または体細胞変異を持っているという我々の発見は、新規性があり、治療法開発のための新しいターゲットを特定するものである。これらのＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路を支持する細胞およびモデルデータを以下に示す。
【０１４８】
ＥＲＫを活性化させる可能性のある突然変異の影響を調べるための細胞モデルを開発した細胞株Ｅａ．ｈｙ９２６において、野生型および変異型のタンパク質をレトロウイルスで発現させた。Ｅａ．ｈｙ９２６細胞株は、ヒト臍帯静脈内皮細胞とメラノーマ細胞株の融合体である。Ｅａ．ｈｙ９２６細胞株は、ヒト臍帯静脈内皮細胞とメラノーマ細胞株の融合株で、不死化されており、内皮細胞の特徴をいくつか残す。我々はこの細胞株を用いて、中枢性リンパ管異常の原因となるＡＲＡＦ遺伝子の変異が細胞に及ぼす影響を示すことに成功した。また、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを用いて、同じ細胞株で変異型ＡＲＡＦの影響を逆転させることにも成功する。
【０１４９】
図１は、ＷＴまたは変異型のＢＲＡＦまたはＰＴＰＮ１１タンパク質を発現させたＥＡ．ｈｙ９２６細胞における活性化されたＥＲＫのレベルを示したものである。タンパク質量で正規化すると、この実験では、変異型ＢＲＡＦを発現させた細胞は、野生型ＢＲＡＦを発現させた細胞の５倍以上の量のリン酸化ＥＲＫを含む。変異型ＢＲＡＦは、以前にＡＲＡＦで観察されたように、ＷＴよりも高発現する。
【０１５０】
図２では、Ｆ４８６Ｓ  ＢＲＡＦ変異体を発現させた細胞で、細胞形態の変化が観察できる。ファロイジン染色で明らかになったフィラメント状のアクチンは、野生型ＢＲＡＦを発現させた細胞の細胞体全体に存在する。しかし、ＢＲＡＦ変異体を発現させた細胞では、アクチンは大部分が周辺部に限定された。この挙動は、ＡＲＡＦ−変異体を発現する細胞に関するこれまでの観察結果と一致する。ＶＥ−カドヘリン染色は、ＢＲＡＦのＷＴまたは変異体のいずれかを発現している細胞では、大部分が細胞内に存在する。ＡＲＡＦを用いたこれまでの結果から、ＷＴ  ＢＲＡＦの発現でもＥａ．ｈｙ９２６細胞株ではＥＲＫの活性化が誘導されることが示唆された。この結果、ＷＴ  ＢＲＡＦによって細胞の形態は総体的には変化しないものの、ＶＥ−カドヘリンが内在化する。図３は、ＥＲＫの活性化がＶＥ−カドヘリンの局在化と細胞形態の両方に与える影響を強調する。ＷＴまたは変異型ＢＲＡＦを発現させた細胞を処理すると、ＶＥ−カドヘリンの細胞表面染色が劇的に増加し、細胞体の糸状アクチンが増加する。この実験では、ＷＴと変異体を発現させた細胞間の形態学的な違いはそれほど顕著ではないが、これは実験間のばらつきを表しているか、あるいは図２と比較してこの実験では培養時間と細胞密度が増加したことによると思われる。ＰＴＰＮ１１の変異体を発現させた細胞では、細胞形態の変化やＶＥ−カドヘリンの分布に変化は認められなかった。
【０１５１】
より治療効果の高い阻害剤を見つけるために、ＷＴおよび変異型ＢＲＡＦまたはＰＴＰＮ１１を発現する細胞を、さまざまなＭＥＫ阻害剤で処理した。図４と図５を参照。我々は、トラメチニブを比較対象として、ＰＤ０３５２９７１、ピマセルチブ、リファメチニブで滴定曲線を実施した。予想通り、各阻害剤は、用量依存的に細胞内のｐＥＲＫレベルを低下させることができた。なお、今回の実験では、ＰＴＰＮ１１の変異体は、ＷＴ  ＰＴＰＮ１１で見られたレベルを超えてＥＲＫを活性化するようには見えなかった。ＢＲＡＦ  Ｆ４８６Ｓは、具体的な倍数の増加はゲルごとに異なるが、一貫してＷＴレベル以上のＥＲＫ活性化を誘導する。
【０１５２】
リンパ管疾患のゼブラフィッシュモデル
クローンは、ゲートウェイシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋｗａｎ  ２００７，Ｖｉｌｌｅｆｒａｎｃ  ２００７  １７９３７３９５，１７９４８３１１）を用いて、Ｔｏｌ２トランスポザーゼのフランキングサイトを持つベクターに組み入れ、ゲノムへの組み込みを可能にした（Ｋａｗａｋａｍｉ  １９９９，１０５６４８３２）。２５ｎｇ／ｕｌのＴｏｌ２  ｍＲＮＡとベクターＤＮＡを約１０ｐｌ、新鮮な受精卵の第１細胞に注入した。ｍｒｃ１ａ：ＧＦＰを発現させたキャスパーフィッシュに構築物を注入し、リンパ管を可視化した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡とＺｅｎソフトウェアを用いて共焦点スキャンを行った。共焦点Ｚスタック画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアの最大強度投影機能を用いて重ね合わせた。画像はｉｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）｛Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ  ２０１２｝およびＰｏｗｅｒｐｏｉｎｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で編集した。
【０１５３】
変異型ヒトＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄがゼブラフィッシュのリンパ管発生に影響を与えるかどうかを評価するために、リンパ管に特異的なｍｒｃ１ａプロモーターの後に変異型とＷＴの両方の遺伝子をクローニングし（Ｊｕｎｇ  ２０１７，ＰＭＩＤ：２８５０６９８７）、ｖ２ａ自己触媒切断部位でｍＣｈｅｒｒｙ蛍光体に連結した（Ｐｒｏｖｏｓｔ  ２００７，１７９４１０４３）。ゲノムの統合には、フランキングのＴｏｌ２トランスポザーゼサイトを用いた。このコンストラクトにｔｏｌ２  ｍＲＮＡを注入したところ、７ｄｐｆ（受精後数日）で表現型を解析したところ、ほとんどの注入した魚で導入遺伝子とｍＣｈｅｒｒｙマーカーを発現するリンパ管細胞の小さなパッチが得られた。
【０１５４】
我々は、この段階で最も大きな血管の一つであり、トランスジェニッククローンの発現が最も一貫していた幹胸管の表現型を調べた。ＫＲＡＳのＷＴ発現はリンパ管の発達に影響を及ぼさなかったが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄは胸管の拡大と拡張を引き起こし、腹側の枢機卿静脈と融合するように見えた。
【０１５５】
追加研究では、リンパ系異常を説明し、新たな治療介入の機会をもたらすＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路の遺伝子／変異をさらに特定した。表３に示すように、我々は、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与するＲＡＳＡ１、ＲＡＦ１、ＲＩＴ１、ＮＦ１、ＣＢＬ１、ＢＲＡＦの生殖細胞または体細胞の変異を同定し、これらの疾患群に共通する遺伝的病因と、リンパ管異常症におけるＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路の変異の重要性をさらに裏付けた。さらに、リンパ浮腫とリンパ伝導障害を持つ患者から１つのホモ接合のミスセンス変異が発見された。本研究では、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路への治療的介入により、これまでＡＲＡＦ変異について示してきたのと同様に、この変異によって誘発されるゼブラフィッシュのＥＲＫ１／２活性の上昇とリンパ管表現型を逆転させることができることを示すデータを提示する。
【０１５６】
私たちは、ＥＲＫを活性化する潜在的な突然変異の影響をよりよく理解し研究するための細胞モデルを、確立された細胞株の代わりに初代リンパ管内皮細胞を用いて開発し、疾患に関連する細胞タイプにおける突然変異の特徴を捉えた。私たちは、ヒト真皮リンパ管内皮細胞（ＨＤＬＥＣｓ）に、野生型および変異型のタンパク質をレトロウイルスで発現させました。これらの細胞を用いて、ＡＲＡＦ遺伝子の突然変異が中枢性リンパ管異常の原因となることを実証した。また、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを用いて、変異型ＡＲＡＦの影響を逆転させることにも成功し、最近Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ誌に掲載された。さらに、このモデルで追加の７種類のＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を試験したところ、ＰＤ０３２５９０１（図６）、ＣＩ１０４０／ＰＤ１８４３５２（図７）、ピマセルチブ（図８）、ＴＡＫ−７３３（図９）、ＡＺＤ８３３０（図１０）、リファメチニブ（図１１）、ウリクセルチニブ（図１２）など、トラメチニブと同等の、ＡＲＡＦ変異によって誘発される効果の生化学的および形態学的な反転が示された。
【０１５７】
図６〜１１は、ＡＲＡＦ変異Ｓ２１４Ｐを発現させたＨＤＬＥＣに対する各異なる薬剤（図に示す）の効果を示す。試験したすべての薬剤は、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって誘発された形態学的差異を逆転させるのに十分であり、細胞膜にＶＥ−カドヘリンがより多く蓄積していることを示す。緑はＡＲＡＦ発現細胞を示すＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリンの染色である。
【０１５８】
ウリクセルチニブは、経口で有効なＥＲＫ１／２阻害剤である。これまでの研究で、ウリクセルチニブ投与後、様々ながん細胞株でｐ−ＥＲＫ１／２レベルが上昇することが明らかになる。しかし、ＲＳＫ（ＥＲＫ１／２タンパク質の基質）のリン酸化は減少しており、これは持続的なＥＲＫ１／２阻害と一致する。図１２上段に示すように、ウリクセルチニブ処理は、ＥＲＫ基質であるＲＳＫ３のリン酸化を抑制する。また、下パネルに示すように、ウリクセルチニブは、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現しているＨＤＬＥＣの細胞間接合部からのＶＥ−カドヘリンの消失を、３００ｎＭの濃度でほぼ完全に回復させて救済することができる（図１２；緑はＡＲＡＦ発現細胞を示すＨＡ染色、赤はＶＥ−カドヘリン染色、白は核を示すＤＡＰＩ染色）。同様に、ＨＤＬＥＣでＢＲＡＦ−Ｆ４８６Ｓを発現させると、隣接する細胞間でＶＥ−カドヘリンの蓄積が顕著に見られなくなり（図１３〜１４）、基本的にはＡＲＡＦ変異と同様の表現型が得られる。予想通り、ウリクセルチニブ（図１３）またはトラメチニブ（図１４）処理は表現型を救済することができ、トラメチニブ（図１４上部パネル）はＥＲＫリン酸化の上昇を抑制することができる。さらに、ＲＡＦ１またはＫＲＡＳ変異を発現するＨＤＬＥＣは、同様の形態変化を示し、同様にｐ−ＥＲＫの上昇を示したが、これらはトラメチニブおよびウリクセルチニブによって正常化することができた（図１５〜１６）。一方、ＲＩＴ１変異ではｐ−ＥＲＫの弱い活性化が誘導される（図１７）。
【０１５９】
ＨＤＬＥＣを用いたスフェロイド発芽アッセイ（３Ｄリンパ管新生アッセイ）を利用して、リンパ管新生に対する変異の影響についての洞察を得た。ＥＰＨＢ４−ｉｎｓ、ＥＰＨＢ４−Ｒ７６３Ｑ、またはＥＰＨＢ４−Ｋ８８５を発現するＨＤＬＥＣは、血管内皮増殖因子Ｃの存在下で実施された３次元リンパスフェロイド発芽アッセイで芽の長さによって測定されるように、ＥＰＨＢ４−ＷＴを発現するＨＤＬＥＣと比較してリンパ管新生能力の増強を示す。（ＶＥＧＦＣ）エフリンＢ２の有無にかかわらず（図１８、上のパネルと左下のパネル）。ラパマイシンとＯＳＩ−０２７の両方、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の強力で選択的な阻害剤は、変異体の発芽の増加を救うことができます（図１８、右下のパネル）。
【０１６０】
ゼブラフィッシュモデルでは、野生型ＫＲＡＳではなくＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄ変異体をリンパ管で過剰発現させると、胸管が拡張し、著しい浮腫が生じた。さらに、ｍＴＯＲまたはＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のいずれかが表現型を救済できるかどうかを調べた。ラパマイシン、ＣＩ１０４０、ＳＬ−３２７が有意な効果を示さなかったのとは異なり、ＭＥＫ阻害剤で処理すると表現型が大きく改善した。具体的には、コビメチニブ、ピマセルチブ、ＴＡＫ−７３３、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１で処理すると、浮腫みが減少し、無秩序なリンパの枝分かれが改善された（図１９）。さらに、ＰＩ３ＫとｍＴＯＲの二重阻害剤であるＮＶＰ−ＢＥＺ２３５で処理すると、浮腫んだ幼虫が大幅に減少した（図１９）。
【０１６１】
また、ＰＴＰＮ１１の変異をゼブラフィッシュモデルで過剰発現させた。図２０は、ＰＴＰＮ１１のＳ５０２ＡまたはＧ５０３Ｒ変異をモザイク状に発現させたところ、軽度のリンパ系異常の表現型が見られたことを示している。リンパ組織の拡張や誤導、あるいは後心静脈と胸管の融合などが見られた。
【０１６２】
ゼブラフィッシュには，ｒａｓａ１ａとｒａｓａ１ｂという２つのＲＡＳＡ１ホモログが存在する．我々は，ｒａｓａ１ａとｒａｓａ１ｂの両方の遺伝子を標的とするｇＲＮＡを設計し，Ｃａｓ９トランスジェニック胚に注入したところ，大きな浮腫が形成された（図２１）．
【０１６３】
実施例Ｉの参考文献
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９．Ｌｕｋｓ  ＶＬ，Ｋａｍｉｔａｋｉ  Ｎ，Ｖｉｖｅｒｏ  ＭＰ，  Ｕｌｌｅｒ  Ｗ，  Ｒａｂ  Ｒ，Ｂｏｖｅｅ  ＪＶ，Ｒｉａｌｏｎ  ＫＬ，Ｇｕｅｖａｒａ  ＣＪ，Ａｌｏｍａｒｉ  ＡＩ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＡＫ，Ｆｉｓｈｍａｎ  ＳＪ，Ｋｏｚａｋｅｗｉｃｈ  ＨＰ，Ｍａｃｌｅｌｌａｎ  ＲＡ，Ｍｕｌｌｉｋｅｎ  ＪＢ，Ｒａｈｂａｒ  Ｒ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＳＡ，Ｔｒｅｎｏｒ  ＣＣ，３ｒｄ，Ｕｐｔｏｎ  Ｊ，Ｚｕｒａｋｏｗｓｋｉ  Ｄ，Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＪＡ，Ｋｉｒｓｈ  Ａ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＪＴ，Ｄｏｂｙｎｓ  ＷＢ，Ｋｕｒｅｋ  ＫＣ，Ｗａｒｍａｎ  ＭＬ，ＭｃＣａｒｒｏｌｌ  ＳＡ，Ｍｕｒｉｌｌｏ  Ｒ  ２０１５  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｖｅ／ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｒｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＩＫ３ＣＡ．Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １６６：１０４８−１０５４  ｅ１０４１−１０４５
１０．Ｋｕｒｅｋ  ＫＣ，  Ｌｕｋｓ  ＶＬ，Ａｙｔｕｒｋ  ＵＭ，  Ａｌｏｍａｒｉ  ＡＩ，  Ｆｉｓｈｍａｎ  ＳＪ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＳＡ，  Ｍｕｌｌｉｋｅｎ  ＪＢ，  Ｂｏｗｅｎ  ＭＥ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＧＬ，  Ｋｏｚａｋｅｗｉｃｈ  ＨＰ，  Ｗａｒｍａｎ  ＭＬ  ２０１２  Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＰＩＫ３ＣＡ  ｃａｕｓｅ  ＣＬＯＶＥＳ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９０：１１０８−１１１５
１１．Ｌｉｎｄｈｕｒｓｔ  ＭＪ，  Ｓａｐｐ  ＪＣ，Ｔｅｅｒ  ＪＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＪＪ，  Ｆｉｎｎ  ＥＭ，  Ｐｅｔｅｒｓ  Ｋ，Ｔｕｒｎｅｒ  Ｊ，Ｃａｎｎｏｎｓ  ＪＬ，  Ｂｉｃｋ  Ｄ，  Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ  Ｌ，  Ｂｌｕｍｈｏｒｓｔ  Ｃ，Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ  Ｋ，  Ｃａｌｄｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｅｒｍａｎ  Ｎ，  Ｄｅａｒｄｏｒｆｆ  ＭＡ，Ｅｖｅｒｍａｎ  ＤＢ，Ｇｏｌａｓ  Ｇ，  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  ＲＭ，  Ｋａｔｏ  ＢＭ，Ｋｅｐｐｌｅｒ−Ｎｏｒｅｕｉｌ  ＫＭ，  Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ  ＳＡ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ＲＴ，Ｎｅｗｍａｎ  Ｋ，  Ｎｇ  Ｄ，  Ｏ''Ｂｒｉｅｎ  Ｋ，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  Ｓ，Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ  ＤＪ，  Ｓｉｎｇｈａｌ  Ｖ，  Ｔｉｒａｂｏｓｃｏ  Ｒ，Ｕｐｔｏｎ  Ｊ，Ｗｉｅｎｔｒｏｕｂ  Ｓ，Ｚａｃｋａｉ  ＥＨ，Ｈｏａｇ  Ｋ，Ｗｈｉｔｅｗｏｏｄ−Ｎｅａｌ  Ｔ，Ｒｏｂｅｙ  ＰＧ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ  ＰＬ，Ｄａｒｌｉｎｇ  ＴＮ，Ｔｏｓｉ  ＬＬ，Ｍｕｌｌｉｋｉｎ  ＪＣ，Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ  ＬＧ  ２０１１  Ａ  ｍｏｓａｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＫＴ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：６１１−６１９
１２．Ｒｅｖｅｎｃｕ  Ｎ，Ｂｏｏｎ  ＬＭ，Ｍｅｎｄｏｌａ  Ａ，Ｃｏｒｄｉｓｃｏ  ＭＲ，Ｄｕｂｏｉｓ  Ｊ，Ｃｌａｐｕｙｔ  Ｐ，Ｈａｍｍｅｒ  Ｆ，Ａｍｏｒ  ＤＪ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＡＤ，Ｂａｓｅｌｇａ  Ｅ，Ｄｏｍｐｍａｒｔｉｎ  Ａ，  Ｓｙｅｄ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｓａｎｔｉａｇｏ  Ａ，Ａｄｅｓ  Ｌ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｆ，Ｓｍｉｔｈ  Ｊ，Ｓａｎｄａｒａｄｕｒａ  Ｓ，Ｂａｒｒｉｏ  ＶＲ，Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＰＥ，  Ｂｌｅｉ  Ｆ，Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ  Ｍ，Ｂｒｕｎｅｔｔｉ−Ｐｉｅｒｒｉ  Ｎ，Ｖｉｃｅｎｔｅ  Ａ，Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ  Ｍ，Ｄｅｓｉｒ  Ｊ，Ｖｉｌａｉｎ  Ｃ，Ｃｈｕｎｇ  ＷＫ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ａ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ＣＡ，Ｄｗｉｇｈｔ  Ｙ，Ｌｏｒｄ  ＤＪ，Ｆｉｓｈｍａｎ  Ｌ，Ｃｙｔｒｙｎｂａｕｍ  Ｃ，Ｃｈａｍｌｉｎ  Ｓ，Ｇｈａｌｉ  Ｆ，Ｇｉｌａｂｅｒｔｅ  Ｙ，Ｊｏｓｓ  Ｓ，Ｂｏｅｎｔｅ  Ｍｄｅｌ  Ｃ，Ｌｅａｕｔｅ−Ｌａｂｒｅｚｅ  Ｃ，Ｄｅｌｒｕｅ  ＭＡ，Ｂａｙｌｉｓｓ  Ｓ，Ｍａｒｔｏｒｅｌｌ  Ｌ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｅｎｓｅｎａｔ  ＭＡ，  Ｍａｚｅｒｅｅｕｗ−Ｈａｕｔｉｅｒ  Ｊ，Ｏ'Ｄｏｎｎｅｌｌ  Ｂ，Ｂｅｓｓｉｓ  Ｄ，  Ｐｙｅｒｉｔｚ  ＲＥ，Ｓａｌｈｉ  Ａ，Ｔａｎ  ＯＴ，Ｗａｒｇｏｎ  Ｏ，Ｍｕｌｌｉｋｅｎ  ＪＢ，Ｖｉｋｋｕｌａ  Ｍ  ２０１３  ＲＡＳＡ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ６８  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３４：１６３２−１６４１
１３．Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＰＥ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｒａｙ  ＭＬ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＪＣ，  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＭＢ，  Ｇｕｉｌｌｉｏｄ  Ｒ，  Ｍａｕｓ  ＥＡ，  Ｆｉｆｅ  ＣＥ，Ｋｗｏｎ  Ｓ，  Ｌａｐｉｎｓｋｉ  ＰＥ，Ｋｉｎｇ  ＰＤ，Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ  ＥＭ  ２０１３  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＲＡＳＡ１  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｍａｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０：８６２１−８６２６
１４．Ｌｏ  ＩＦ，  Ｂｒｅｗｅｒ  Ｃ，  Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｎ，  Ｓｈｏｒｔｏ  Ｊ，Ｔａｎｇ  Ｂ，  Ｂｌａｃｋ  Ｇ，  Ｓｏｏ  ＭＴ，  Ｎｇ  ＤＫ，  Ｌａｍ  ＳＴ，Ｋｅｒｒ  Ｂ  ２００８  Ｓｅｖｅｒｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４５：１６７−１７１
１５．Ｆａｂｒｅｔｔｏ  Ａ，Ｋｕｔｓｃｈｅ  Ｋ，Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＢ，Ｄｅｍａｒｉｎｉ  Ｓ，Ｇａｓｐａｒｉｎｉ  Ｐ，  Ｆｅｒｔｚ  ＭＣ，Ｚｅｎｋｅｒ  Ｍ  ２０１０  Ｔｗｏ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｏｎａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＳＯＳ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｆ６２３Ｉ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ５３：３２２−３２４
１６．Ｊｏｙｃｅ  Ｓ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋ，Ｂｒｉｃｅ  Ｇ，  Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｐ，Ｎａｇａｒａｊａ  Ｒ，Ｓｈｏｒｔ  Ｊ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｓ，  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  Ｐ，Ｍａｎｓｏｕｒ  Ｓ  ２０１６  Ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｎｏｏｎａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｆａｃｉｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：６９０−６９６
１７．Ｍｏｒｃａｌｄｉ  Ｇ，  Ｂｅｌｌｉｎｉ  Ｔ，Ｒｏｓｓｉ  Ｃ，Ｍａｇｈｎｉｅ  Ｍ，  Ｂｏｃｃａｒｄｏ  Ｆ，  Ｂｏｎｉｏｌｉ  Ｅ，  Ｂｅｌｌｉｎｉ  Ｃ  ２０１５  Ｌｙｍｐｈｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  Ｋｒａｓ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ａ  Ｃａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ４８：１２１−１２７
１８．Ｍａｋｉｎｅｎ  Ｔ，  Ａｄａｍｓ  ＲＨ，  Ｂａｉｌｅｙ  Ｊ，  Ｌｕ  Ｑ，  Ｚｉｅｍｉｅｃｋｉ  Ａ，  Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｒ，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＧＡ  ２００５  ＰＤＺ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｅｐｈｒｉｎＢ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９：３９７−４１０
１９．Ｋｕｍｅ  Ｔ  ２０１０  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ，ｖｅｎｏｕｓ，ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２５：６３７−６４６
２０．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，Ｔｓｕｎｅｋｉ  Ｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  ＴＲ，  Ｓａｎｔａｎａ  ＪＭ，Ｂａｉ  Ｈ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｈｕ  Ｈ，Ｈａｎｉｓｃｈ  ＪＪ，Ｄａｒｄｉｋ  Ａ  ２０１６  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｃ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｄａｙ  １０８：６５−８４
２１．Ｍａｒｔｉｎ−Ａｌｍｅｄｉｎａ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｏｒｒａｌ  Ｉ，Ｈｏｌｄｈｕｓ  Ｒ，Ｖｉｃｅｎｔｅ  Ａ，Ｆｏｔｉｏｕ  Ｅ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｋ，Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＭＡ，Ｈｏｉｓｃｈｅｎ  Ａ，Ｇｉｌｉｓｓｅｎ  Ｃ，Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｈ，Ａｔｔｏｎ  Ｇ，Ｋａｒａｐｏｕｌｉｏｕ  Ｃ，Ｂｒｉｃｅ  Ｇ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｋ，Ｗｉｓｅｍａｎ  ＪＷ，Ｗｅｄｉｎ  Ｍ，Ｒｏｃｋｓｏｎ  ＳＧ，  Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｓ，  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  ＰＳ，Ｓｎｙｄｅｒ  ＭＰ，Ｂｅｒｌａｎｄ  Ｓ，  Ｍａｎｓｏｕｒ  Ｓ，Ｍａｋｉｎｅｎ  Ｔ，  Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｐ  ２０１６  ＥＰＨＢ４  ｋｉｎａｓｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｐｓ  ｆｅｔａｌｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６：３０８０−３０８８
２２．Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＲＮ，Ｂｕｓｃｈ−Ｎｅｎｔｗｉｃｈ  ＥＭ，Ｈａｒｖｅｙ  ＳＡ，Ｄｏｏｌｅｙ  ＣＭ，ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  Ｅ，ｖａｎ  Ｅｅｄｅｎ  Ｆ，Ｓｅａｌｙ  Ｉ，Ｗｈｉｔｅ  ＲＪ，Ｈｅｒｄ  Ｃ，Ｎｉｊｍａｎ  ＩＪ，Ｆｅｎｙｅｓ  Ｆ，Ｍｅｈｒｏｋｅ  Ｓ，  Ｓｃａｈｉｌｌ  Ｃ，  Ｇｉｂｂｏｎｓ  Ｒ，  Ｗａｌｉ  Ｎ，  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ  Ｓ，  Ｈａｌｌ  Ａ，  Ｙｅｎ  Ｊ，  Ｃｕｐｐｅｎ  Ｅ，  Ｓｔｅｍｐｌｅ  ＤＬ  ２０１３  Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９６：４９４−４９７
２３．Ｓｕｎ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｆ，Ｗｕ  Ｈ，ＭｃＨｕｇｈ  Ｊ，Ｂｅｒｇｉｎ  ＩＬ，Ｇｕｐｔａ  Ａ，Ａｄａｍｓ  Ｄ，Ｇｕａｎ  ＪＬ  ２０１５  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲＣ１  ｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＶＥＧＦ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２８：７５８−７７２．
【実施例２】
【０１６４】
実施例２
ＡＲＡＦの再発変異がＭＥＫ阻害剤で治療可能な中心導電性リンパ異常を引き起こす
最近の研究では、全身性リンパ管異常（ＧＬＡ）および中心性リンパ管異常（ＣＣＬＡ）３−５の治療におけるｓｉｒｏｌｉｍｕｓの有用性が示されるが、これらの疾患の希少性と診断基準の重複により、これらの疾患の明確な臨床的区別がないことが、革新的な治療法の開発の妨げとなる６−９。ＧＬＡは、微小／マクロシストのリンパ管の奇形を有し、多くの場合、骨の破壊を伴う複数の領域に存在する多巣性のリンパ異常と定義される９−１１。一方、ＣＣＬＡは、胸腔管（ＴＤ）または胸腔鏡の機能障害であり、リンパ液の逆流またはリンパ液の排出異常を引き起こす１，１２，１３。どちらの疾患も、胸郭、胸水、胆汁性腹水、リンパ浮腫を呈する。これらの一見異なる疾患の重複は、共通の遺伝子ではなく、共通の経路が原因であることを示唆する。このことは、様々な臨床症候群の原因となることを意味しており、疾患の区別が人為的である可能性を示唆する。ここでは、全エクソームシーケンス（ＷＥＳ）を用いて、２人の血縁関係のない患者の複雑なリンパ管異常を特徴とする重度の進行性リンパ疾患の基礎となるＡＲＡＦの再発性ミスセンス変異を同定したことを報告する。この結果は、遺伝子の分類が、複雑な医学的疾患を分類する方法を示す代表的な例となった。その結果、生物学的根拠に基づいた治療が可能となり、私たちの例では命が救われた。
【０１６５】
以下の材料と方法は、実施例ＩＩの実施を容易にするために提供される。
【０１６６】
患者
フィラデルフィア小児病院（ＣＨＯＰ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認と書面によるインフォームドコンセントを得た後、主治医であるプロバンド（Ｐ１）とその両親の血液検体を入手し、シーケンス解析を行った。このプロバンドは、胸部、心膜、腹部、下肢、生殖器にリンパ液が重度に貯留しており、ＣＨＯＰのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓで経過観察と治療を受けた。血縁関係のない成人の２人目の患者（Ｐ２）は、Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ&Ｇｏｒｈａｍ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｌｌｉａｎｃｅ（ＬＧＤＡ）のＰａｔｉｅｎｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（患者登録）を通じて募集し、可能な家族とともに参加した。Ｐ１の出生歴と家族歴は、左側腹部の毛細血管奇形を除いて特に問題はなく、幼少期の成長と発達は正常であった。１０歳の時、下腹部、大腿部、陰嚢、陰茎に腫れが生じた。その２ヵ月後、息切れと運動不耐性を訴えて地元の病院を受診した。胸部Ｘ線写真では心肥大が確認され、心エコー図では大きな心嚢液貯留が確認された。心嚢穿刺が行われ、１リットルの髄液が排出された。完全非経口栄養法を実施したが、心嚢液の排出は続いたため、さらなる管理のためにＣＨＯＰに移された。ＣＨＯＰでは、初期評価としてダイナミック造影磁気共鳴リンパ管造影を行い、大きな心嚢液貯留と、拡張した腰部と後腹膜のネットワークから、左の分母静脈に向かって拡張した曲がりくねったＴＤへの逆流が確認された（図１ａ，ｃ，ｄ）。なお、図１ｂには参考として無症状の人の画像を示した。さらに、肝臓、腸間膜、陰茎、陰嚢への逆行性リンパ流、ＴＤ遠位部からは縦隔、心膜への逆行性リンパ流が認められた（図１ｃ−ｅ）。このため、ＴＤ遠位部にステントを留置し、縦隔および心膜への異常なリンパ液貯留を阻止する目的でリピオドール塞栓術を行った。心嚢液は安定しており、１ヵ月後に退院したが、その後すぐに大量の体液が再貯留して呼吸困難に陥り、酸素の補給が必要になった（鼻腔カニューレで５リットルまで供給）。シロリムスの投与を開始し、１日２．５ｍｇの投与で良好に耐えられるトラフレベルに基づいて投与したところ、２０１６年５月から１１月の間にトラフレベルの中央値が１１．８となった（範囲６．８〜１６．２μｇ  ｄｌ−１）。１．５年の間に、反復的な胸腔穿刺と胸膜ドレーン、複数の経皮的リンパ塞栓術、２回の両側外科的胸膜穿刺、大腿部、腹部、後腹膜の外科的リンパ管吻合、さらに陰茎と陰嚢の浮腫が悪化したため、鼠径部リンパ管の外科的結紮と塞栓術など、複数の経皮的インターベンションと外科的リンパ管処置を受けた。心嚢液貯留のコントロールを何度も試みたが、陰茎、陰嚢、下肢、下腹部のリンパ浮腫は悪化し、症状は悪化の一途をたどり、緩和ケアを検討することになった。最後の処置を行い、トラメチニブの５か月前にシロリムスを中止した。
【表４】
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【０１６７】
患者Ｐ２は、血縁関係のない成人女性で、３１歳の時にリンパ管腫症と診断された。Ｐ２は診断される前に何年も症状が続いており、肺への浸潤が顕著で、胸膜癒着の前に何度も胸膜穿刺を行った。消化管にも広範な病変があり，特殊な脂肪制限食と中鎖トリグリセリド油の補給，および間欠的な完全非経口栄養を必要とした。原因不明の症状が続いていたため，コンピュータ断層撮影と磁気共鳴画像撮影を行ったところ，腎臓，肝臓，脾臓，肺に発生したリンパ管腫症と一致した。
【０１６８】
肝生検でリンパ管腫症と診断された。さらにアルブテロールと利尿剤で治療し、疲労感と呼吸困難のため電動スクーターを使用した。骨への浸潤は確認されなかった。この患者はＬｙｍｐｈａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ&Ｇｏｒｈａｍ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｌｌｉａｎｃｅから募集され、地元ではなかったため、フォローアップができず、基礎疾患であるリンパ系疾患に関連した合併症で亡くなったため、他の治療法の試験を受けることができなかった。
【０１６９】
ＷＥＳとバイオインフォマティクス解析
エクソームデータに含まれる優性遺伝モデルまたは劣性遺伝モデルに合致するミスセンス、ナンセンス、スプライス変化、コーディングインデルを調べた。結果は、以下の要素を持つバリアントを除外するためにフィルタリングされた：同義的バリアント、既知の偽遺伝子内のバリアント、１０００ゲノムプロジェクトまたはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＥＳＰ６５００ＳＩ）の６，５０３本のエクソームのいずれかでマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）が０．５％を超えるバリアント、社内のエクソームバリアントデータベースでコントロールで既に同定されたバリアント。その後、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎデータベースを参照し、劇症予測と生物学的関連性に基づいて遺伝子の優先順位付けを行った。
【０１７０】
哺乳類細胞株におけるＡＲＡＦ変異の発現と特性評価
ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し，１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いて３７℃で培養した。初代成人ＨＤＬＥＣは、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から入手し、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＭＶ  ２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）でメーカーの指示に従って培養した。Ａｄｄｇｅｎｅ社から入手した全長ＡＲＡＦ  ｃＤＮＡ（プラスミド番号２３７２５）４１をオリジナルのベクターから増幅し，ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして，ＦＬＡＧタグ（ＤＤＫＤＤＫ）のコピーを２つ，続いてＳＴＲＥＰタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）を２つ含むｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。Ｓ２１４Ｐの変異は，ＮＥＢ社のＱ５変異導入キットを用いて，製造元の指示に従って部位特異的変異導入を行った。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａへのトランスフェクションは，Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて，３μｇのＤＮＡ（空のベクター，ＷＴ  ＡＲＡＦ（ＡＲＡＦ−ＷＴ）またはＡＲＡＦ変異体（ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐ））と９μｌのトランスフェクション試薬を用いて，製造者のプロトコルに従って行った。トランスフェクションから３６〜４８時間後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む氷冷したばかりの細胞溶解緩衝液を用いて氷上で溶解した。４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭβ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｗ／ｖ），１％ＮＰ−４０（ｗ／ｖ），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＮａＶＯ４および完全なＥＤＴＡフリーのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含む新鮮な氷冷した細胞溶解バッファーを用いて、溶解バッファー１ｍｌあたり２０μｌで溶解した。細胞ライセートを遠心分離でクリアした後、上清を回収し、ウエスタンブロッティング、またはＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２２２０，Ｓｉｇｍａ）を用いた免疫沈降に使用した後、ウエスタンブロッティングを行った。免疫沈降物とライセートをＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行い、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０Ｓ６Ｋ−Ｔｈｒ３８９を含む一次抗体でブロッティングした（ｃａｔ．ｎｏ．９２０５Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ  Ｓｅｒ２４４８（ｃａｔ．ｎｏ．５５３６Ｐ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）、抗ＦＬＡＧ（ｃａｔ．ｎｏ．Ｆ３１６５，Ｓｉｇｍａ；１：４，０００）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２（ｃａｔ．４５１１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００），抗ＰＡＮ−１４−３−３（ｃａｔ．ｎｏ．ｓｃ−６２９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００），抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ−Ｓｅｒ４７３（ｃａｔ．ｎｏ．４０６０，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）、抗ｐｈｏｓｐｈｏｐ４４／４２−（Ｅｒｋ１／２）−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（ｃａｔ．ｎｏ．４３７６，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）または抗β−ａｃｔｉｎ（ｃａｔ．ｎｏ．ｓｃ−６９８７９，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１，０００）抗体を用いた。
【０１７１】
先に示したｐＣＤＮＡ３．１−Ｆ２Ｓ２−ＡＲＡＦ−ＷＴまたは−Ｓ２１４Ｐ構築物からのＡＲＡＦ配列をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、アミノ末端のＦＬＡＧおよびＨＡタグを含む修正版ｐＭＳＣＶプラスミドのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位に導入した。ウイルスの産生はＦｕｇｅｎｅを用いて行い、ＨＥＫ２９３Ｔに８μｇの全ＤＮＡ（エンベローププラスミドおよびパッケージングプラスミドとともにｐＭＳＣＶ−ＡＲＡＦ−ＷＴまたは−Ｓ２１４Ｐ）と１８μｌのトランスフェクション試薬を入れた。７２時間後、ウイルスの上清を回収し、ろ過した。細胞培養液をウイルス上清に置き換え、８μｇｍｌ−１のポリブレンを補充し、０．４５μｍのフィルターでろ過することで、ＨＤＬＥＣを感染させた。細胞を６５０ｇで９０分間スピンフェクションし、続いて６時間培養し、その時点でウイルス上清を標準培養液に置き換えた。導入したＨＤＬＥＣを４８時間培養した。実験に使用する前に確認した。ＨＡ染色で観察された導入効率は４０％から６０％であった。
【０１７２】
ＨＤＬＥＣｓの免疫蛍光染色とウェスタンブロッティング
丸型（１２ｍｍ）カバースリップ（ＶＷＲ）を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に水に溶かした０．１％ゼラチンで１０分間コーティングした後、１５分間風乾した。導入したＨＤＬＥＣを０．５ｍｌの培養液中に１ウェルあたり１００，０００個の細胞でプレーティングし、トラメチニブの存在下または非存在下で４８時間培養した。細胞を温かい無血清ダルベッコ改変イーグル培地で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡで２回洗浄した。細胞を透過させ、ＰＢＳ中の１０％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートしてブロックした。ＶＥ−カドヘリン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を，０．０１％  正常ロバ血清，０．１％  ＢＳＡ，０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ）で希釈（最終濃度：２μｇ  ｍｌ−１）し、１時間染色した。カバースリップを０．１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ）で２回洗浄した。Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ａｌｅｘａ５４６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；最終濃度：８μｇ  ｍｌ−１）およびｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａ３５０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；最終濃度：５  ｕｎｉｔｓ  ｍｌ−１）をＰＢＳ中の０．０１％正常ドンキー血清、０．１％ＢＳＡおよび０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈し、１時間染色を行った。使用する場合は，ＨＡ−Ｔａｇ（６Ｅ２）マウス抗体（ｃａｔ．ｎｏ．２３６７，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を０．１％  ＢＳＡおよび０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎ  ＰＢＳで１：１００に希釈し，１時間染色した。カバースリップを０．１％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳで２回，ＰＢＳで２回洗浄した。カバースリップを水に浸して残留塩分を除去し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてスライドにマウントした。画像の取得は，ライカＤＭ６０００電動正立顕微鏡にＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＨＱ２高解像度モノクロＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを搭載し，ＬＡＳ  ＡＦソフトウェア（ライカマイクロシステムズ）を用いて行った。Ｚ−ｓｔａｃｋは１０倍の倍率で取得した。画像はさらにフィジーソフトウェアパッケージ４２で処理された。輝度とコントラストの調整を行った。すべての画像に同一の明るさとコントラストの設定を適用した。蛍光値は，個々の細胞全体を含むように描かれた関心領域（ＲＯＩ），または細胞体全体を含むが細胞と細胞の接合部を含まないように描かれたＲＯＩで測定した。これらの測定値から、細胞膜の値（細胞全体−細胞内）を算出し、細胞膜と細胞内の値の比を算出してプロットした。また，ラインツールとＲＯＩマネージャを用いて，細胞の長さと幅を測定した。いずれの解析においても，ＨＡ染色によって明らかにＡＲＡＦを発現していると判断された細胞を，１×１０フィールドあたり５個分析した．各実験では，１条件につき５つの×１０フィールドを取得した．実験は、３つの独立した解凍��ＨＤＬＥＣの導入から得られた細胞を用いて行い、１条件につき合計７５個の細胞を使用した。ＨＤＬＥＣｓとトラメチニブとのウエスタンブロッティングのために、２０，０００個の導入したＨＤＬＥＣｓ細胞を、増加する量のトラメチニブの存在下で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を薬剤の存在下で２４時間培養した後、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１．５ｍＭ  ＮａＶＯ３およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを用いて溶解した。ライセートは２０，０００ｇで５分間、４℃で遠心分離することでクリアにした。タンパク質を４−１２％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。ブロッティングは、上述の抗体を用いて行った。
【０１７３】
３次元のリンパ球スフェロイドの発芽アッセイ
１．５％アガロースでプレコートした９６ウェルプレートのウェルに，ＡＲＡＦ−ＷＴまたはＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させたＨＤＬＥＣを７，５００個播種することで，リンパ管発芽アッセイ用の多細胞スフェロイドを作製した。この条件では、２４時間後までにすべてのＨＤＬＥＣが１つのスフェロイドに凝集する。形成後、各スフェロイドをＩ型コラーゲンからなるゲル化液（ｃａｔ  Ｎｏ．３５４２３６  Ｃｏｒｎｉｎｇ；ｆｉｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に移した。３５４２３６，Ｃｏｒｎｉｎｇ；最終濃度＝１．５ｍｇ  ｍｌ−１；ｐＨはＮａＯＨで中和）とトラメチニブを指示濃度で配合したゲル化液に移し、３７℃で重合させた。固まったところで，適切な濃度のトラメチニブを含むＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＭＶ２（ＶＥＧＦＣなし）をコラーゲンゲルの上に加えた。２日間培養した後、ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、埋め込まれたスフェロイドのＺ−スタック画像を８．５μｍのステップサイズで撮影した。各スフェロイドから生えている毛細血管状の芽の数と長さを、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）というソフトウェアを使って測定した。
【０１７４】
トランスフォームしたＨＤＬＥＣを用いたＭＴＴ増殖アッセイ
導入したＨＤＬＥＣの増殖は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ  （ＭＴＴ）を用いて測定した。簡単に説明すると、レトロウイルス導入後２日目に、ＡＲＡＦ−ＷＴ−および−Ｓ２１４Ｐ発現ＨＤＬＥＣを回収し、計数し、１００μｌの培地に１ウェルあたり１０，０００細胞で平底９６ウェルプレートに複製した。メッキ後の指示された時間に、１０μｌのＭＴＴを適切なウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。１００μｌの可溶化試薬を加えた後、３７℃で一晩インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３  Ｍｕｌｔｉ  Ｍｏｄｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて５５０ｎｍおよび７００ｎｍの吸光度を測定し、Ａ５５０ｎｍ−Ａ７００ｎｍを算出した。増殖の少ない細胞を実験に投入した場合の目安として、プレーティング後４時間の時点を入れた。
【０１７５】
ゼブラフィッシュにおけるヒトＡＲＡＦのトランスジェニック発現
ゼブラフィッシュを用いたすべての手順は，ＣＨＯＰのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣ  ００１１５４）の承認を得ており，米国国立衛生研究所によるＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（実験動物の管理と使用のためのガイド）に従った。ヒト変異体およびＷＴ  ＡＲＡＦ  ｃＤＮＡを停止コドンなしでｐＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした；ゼブラフィッシュに適応したコザック配列（ＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧ）を使用した４３。発現コンストラクトは、ゲートウェイ・クローニング・カセットを含むＴｏｌ２バックボーン・ベクターを用いて組み立てた（４４，４５）。コンストラクトにはＴｏｌ２のメッセンジャーＲＮＡを共同で注入した（４６）。
【０１７６】
ＡＲＡＦは、ゼブラフィッシュのｍｒｃ１ａｐｒｏｍｏｔｅｒを用いて静脈およびリンパ管で発現させ、自己触媒Ｖ２ａタンパク質の切断部位によってＡＲＡＦに連結されたｍＣｈｅｒｒｙによって発現を可視化した。イメージングのために、幼虫を低融点アガロースにマウントし、２０倍のレンズを用いてＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡で複数のＺ画像を撮影した。共焦点Ｚ−ｓｔａｃｋ画像は，Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアの最大強度投影機能を用いて重ね合わせた．
【０１７７】
ＴＤの拡張を分析するために、ＴＤにトランスジーンが発現しているセグメント間リンパ管で区切られた体節を選択した。形態は、正常（ＷＴ）、中程度の拡張（ＴＤは拡張しているがＰＣＶとは別個）、重度の拡張（ＴＤとＰＣＶがＺ投影で区別できない）のいずれかで評価した。画像はＩｍａｇｅＪ（フィジー）で編集した。各実験は３回行い，合計４０匹の動物を解析した。
【０１７８】
ゼブラフィッシュでの抑制性薬物処理
薬物処理は６ウェルプレートで行い、１グループあたり最大２０匹の幼虫を用いた。コビメチニブは、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２および０．１％ＤＭＳＯを含む胚培養液で希釈した。コビメチニブは１μＭで使用した。
【０１７９】
ゼブラフィッシュにおけるｐ−ＥＲＫ抗体の染色
魚を上記のように注入し、ＷＴまたは変異ＡＲＡＦ／ｍｃｈｅｒｒｙの発現が顕著な幼生を分析のために選択した。幼生は、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の４％パラホルムアルデヒド溶液で一晩固定した。幼虫をＰＢＳＴで洗浄し、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２４時間、４℃でインキュベートした。その後、幼虫を１０％ウシ血清でブロックし、４℃で一晩、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  Ｔ２０２／Ｙ２０４抗体（ｃａｔ．ｎｏ．９１０１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、１：２００）で染色し、ＰＢＳＴで洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１１００８，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１：４００）。）
【０１８０】
統計
すべての細胞ベースのアッセイについて、２つのグループを比較するために、対になっていない、両側のＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによって有意性を評価した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０ｄソフトウェアを用いて行った。データは，２５〜７５パーセンタイルのボックス，最小値から最大値までのヒゲ，中央値を中心としたボックス&ウィスカープロット，または，平均値±ｓ．ｅ．ｍ．の棒グラフを用いたドットプロットで示した。すべてのアッセイにおいてを行った場合、統計解析を行わなかった増殖試験を除き、３つの独立した実験をＨＤＬＥＣの独立したトランスフェクションで行った。１４−３−３タンパク質会合アッセイについては、３つの独立した実験がＨＥＫ２９３Ｔ細胞の独立したトランスフェクションで行われたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞についての他の結果は６つの独立した実験を表している。ゼブラフィッシュ関連のアッセイは、すべて３つの独立した実験で行い、以下のような不対数の片側スチューデントのｔ検定で２つのグループの比較のために検定した。
【０１８１】
結果
既知のリンパ系異常関連遺伝子のＷＥＳ解析の第１段階では、ＡＫＴ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＰＴＰＮ１１、ＳＨＯＣ２、ＣＢＬ、ＲＩＴ１、ＳＯＳ１の変異解析など、明らかにされなかった。その後、遺伝子の優先順位付けを行ったところ、Ｘ染色体のＡＲＡＦの新規変異、ｃ．６４０Ｔ＞Ｃ：ｐ．Ｓ２１４Ｐであることが判明した。患者Ｐ１は男性でＣＣＬＡを発症しており（図２２Ａ、２２Ｃ−２２Ｅ、詳しい臨床症状については「方法」を参照、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＧ＿０１６３３９）、患者Ｐ２は女性でリンパ管腫症と診断されたことがある。この変異は、保存されたリン酸化部位に影響を与えており、この２１４番の残基が、相同タンパク質であるＣ−ＲＡＦ（ＲＡＦ１としても知られる）において、１４−３−３タンパク質による抑制のためのパラロガス制御部位であることから、おそらく機能獲得（ＧｏＦ）効果が得られたと考えられる。このミスセンス変異は、１０００ゲノムプロジェクト、ＥＳＰ６５００ＳＩ、ＥｘＡＣ  ｖ０．３、ｇｎｏｍＡＤ  ｖ２．１、または社内データベースにある５，０００以上のサンプルから得られた追加のエクソームシーケンスデータには存在しませんでした。血液由来のサンガーシークエンスＰ１と両親から採取したＤＮＡから、このＸ連鎖性ＡＲＡＦ変異は、男性患者と同様に体細胞ヘテロ接合で発生していることが確認された（Ｆｉｇ．２２Ｆ）。Ｐ２とその非罹患の娘と母親のＡＲＡＦ突然変異をサンガーシークエンスで調べたところ、突然変異はＰ２にのみ存在することが確認された（図２２Ｆ）。父親はシークエンスに参加できなかったが、父親には呼吸器系の症状が報告されていないことから、Ｐ２のＡＲＡＦ変異はｄｅ  ｎｏｖｏまたはｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎとして生じた可能性が高いと考えられる。患者Ｐ２は追跡調査ができず、診断から５年後にリンパ系疾患の合併症で死亡したことを後から知らされた。
【０１８２】
ＡＲＡＦの１４−３−３結合部位の一つであるＳｅｒ  ２１４は、保存領域２（ＣＲ２）（１４）の中にあり、ＲＡＦタンパク質と同様に脊椎動物の種を超えて高度に保存されていることから、これらのキナーゼの機能に必須の役割を果たしていると考えられる（図２２Ｇ）。１４−３−３タンパク質がＡＲＡＦのリン酸化された２１４番目のセルに結合することで、活性化されたＲａｓによるＡＲＡＦタンパク質の細胞膜へのリクルートを防ぐことができると考えられる（１５）。これまでの研究では、このようなＣ−ＲＡＦのＡＲＡＦ−Ｓ２１４の類似残基２５９番に変異があると、１４−３−３タンパク質との結合が阻害され、細胞膜に局在化し、ＥＲＫ／ＭＥＫシグナルが誘導される（１６）。図２３Ａに示すように、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４ＰをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、１４−３−３タンパク質の共沈が減少し、リン酸化の増加によって測定されるＥＲＫ１／２の活性化が野生型（ＷＴ）のＡＲＡＦを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比べて、有意に大きくなった（Ｆｉｇ．２３Ａ，２３Ｂ）。ＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲおよびｐ３８（ＭＡＰキナーゼの別のファミリー）のリン酸化は、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐによって変化しなかった（Ｆｉｇ．２３Ｂ）。同様の結果は、ＨｅＬａ細胞および初代ヒト真皮リンパ管内皮細胞（ＨＤＬＥＣｓ）でも得られた（図２３Ｃ）。この顕著な過剰活性化は、サイトカインや成長因子の非存在下でも見られた。
【０１８３】
ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させたＨＤＬＥＣは、ＡＲＡＦ−ＷＴを発現させたＨＤＬＥＣに比べてリンパ管形成能が向上しており、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦＣ）の非存在下で実施した３次元リンパ球スフェロイド発芽試験では、発芽数と発芽長が測定された（Ｆｉｇ．２３Ｄ）。ＭＥＫ阻害剤のトラメチニブは、突然変異体の発芽の増加を回復させた（図２３Ｄ）。次に，ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させた初代ＨＤＬＥＣの内皮のアドレンスジャンクションの形態学的解析を行った。免疫蛍光顕微鏡で見ると、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させると、隣接する細胞間でＶＥ−カドヘリンの蓄積が顕著に見られなくなり、ＶＥ−カドヘリンの内在化が進んでいることが示唆された（図２３Ｅ、黄色の矢頭）。さらに、発現ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐはアクチンの構造を変化させ、変異体を発現させた細胞では、細胞体内のＦ−アクチンフィラメントの数が減少した。
【０１８４】
次に、ＭＥＫ１／２阻害剤がこれらの異常を回復させる能力を調べた。ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを１００ｎＭの濃度で投与すると、ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させたＨＤＬＥＣで観察された細胞間接合部からのＶＥ−カドヘリンの消失が修復され、細胞の単層性がほぼ完全に回復し、接合部とアクチンフィラメントにおけるＶＥ−カドヘリンの正常な出現が回復した（図２３Ｅ）。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐは明らかに活性化しているがＨＤＬＥＣではＥＲＫが活性化されており、ＥＲＫの活性化は一般的に細胞の増殖と関連しているが、ＡＲＡＦ−ＷＴと−Ｓ２１４Ｐを発現させた細胞では、増殖に測定可能な差は見られなかった。２つの独立したレトロウイルス導入でＨＤＬＥＣｓを検出した（図２３Ｆ）。
【０１８５】
ゼブラフィッシュのリンパ管発生の解析は、Ｔｇ（ｍｒｃ１ａ：ｅｇｆｐ）ｙ２５１トランスジェニックライン１７で行った。このトランスジェニックラインでは、すべてのリンパ管内皮細胞がＥＧＦＰで標識される。ＡＲＡＦの発現は、ｍｒｃ１ａプロモーターを用いてリンパ管を標的とし、ＡＲＡＦを発現する細胞はｍＣｈｅｒｒｙの発現で示された。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐの発現は、様々な場所でリンパ管の拡張を誘導し、最も一貫して幹のＴＤの拡張を観察した（図２３Ｇ）。一方、ＡＲＡＦ−ＷＴを発現させてもリンパ管の形態に影響を与えた（Ｆｉｇ．２３Ｈ）。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐの発現は，ゼブラフィッシュのｐ−ＥＲＫを誘導する．ＭＥＫシグナル阻害剤で異常が回復するかどうかを調べるため，リンパ前駆細胞が芽生えてＴＤを形成する受精後３日目（ｄｐｆ）から，ｍｒｃ１ａ：ＡＲＡＦＳ２１４Ｐ幼生をコビメチニブで処理した（１７）．体節（ｓｏｍｉｔｅ）を解析したところ、ＡＲＡＦの発現を調べたところ、コビメチニブによってダクトの形態が有意に救済されることがわかった（図２３Ｉ、２３Ｊ）。一方、ＷＴ  Ｔｇ（ｍｒｃ１ａ：ｅｇｆｐ）ｙ２５１の幼虫にコビメチニブを投与したところ、薬剤によく耐えたことがわかった。
【０１８６】
我々は、ＡＲＡＦ変異がＰ１の機能獲得につながり、シロリムスに反応しないこと、ＭＥＫ阻害剤が内皮細胞やトランスジェニック・ゼブラフィッシュ・モデルでリンパの表現型を救済することを示したことを踏まえ、以下のように考えた。
【０１８７】
Ｐ１でＭＥＫ阻害剤治療を使用するために、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの許可を得ました。その後、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブ（メキニスト）が、包括的なベースライン評価を経て、この１２歳の患者に適応外で使用されました。
【０１８８】
トラメチニブの開始用量を１ｍｇ  ｄ−１とし、治療開始から２カ月以内に肺機能検査で改善が見られ始めた（図２４Ａ）。さらに、治療開始から３カ月後には、リンパ液貯留量と酸素補給量が大幅に減少し、身体活動のレベルが向上し、トラメチニブによる有害事象も認められないまま、室内空気に移行することができた。治療開始から１２か月後の肺機能検査では、総肺活量（ＴＬＣ）がほぼ２倍になり、１秒間の強制呼気量（ＦＥＶ１）は予測値の２３％から４２％に改善した（図２４Ａ）。電解質（低Ｎａ、低Ｋ）は正常化し、磁気共鳴画像スキャンでは、リンパ系の再構築が見られ（図２４Ｂ〜２４Ｆ）、総肺活量（ＴＬＣ）と強制呼気量が２倍になるなど顕著な回復が見られた（図２４Ｃ）。秒間の容積（ＦＥＶ１）は予測値の２３％から４２％に改善した（図２４Ａ）。電解質（低Ｎａ、低Ｋ）は正常化し、磁気共鳴画像スキャンでは、リンパ系の再構築が確認された（図２４Ｂ〜２４Ｆ）。この遺伝子誘導治療を開始する前は、頻繁に入院していた患者が、驚くべき回復を遂げた（図２４Ｆ）。
【０１８９】
以上のように、我々はリンパ管異常を有する２人の血縁関係のない患者に対してＷＥＳを実施し、ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ療法に反応しない進行したリンパ管疾患を有する１２歳の男性を含めて、ＡＲＡＦ遺伝子に再発性の機能獲得変異を確認した。ＨＤＬＥＣｓ変異型ＡＲＡＦを導入したところ、ＥＲＫ１／２活性の上昇、リンパ管形成能の亢進、アクチン骨格とＶＥ−カドヘリン接合部の崩壊が見られたが、これらは回復した。
【０１９０】
をＭＥＫ阻害剤ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂを用いて行った。ＡＲＡＦ−Ｓ２１４Ｐを発現させたＨＤＬＥＣでは、ＶＥＧＦＣ（強力なリンパ管形成因子）の非存在下でスプラウティングが観察された（１８）。同じ条件で、ＡＲＡＦ−ＷＴを発現させた細胞ではスプラウティングは見られなかった。このことから、ＡＲＡＦ変異体はＶＥＧＦＣの刺激挙動を模倣しているか、あるいは多くの間質細胞で見られるような内皮細胞のスプラウトに必要なＶＥＧＦＣの発現をＨＤＬＥＣが誘導していると考えられる（１９−２１）。私たちは、異常なリンパの表現型を再現しました。これは、ＧｏＦＡＲＡＦの突然変異を持つ患者のゼブラフィッシュモデルを用いて、ＭＥＫ阻害剤による表現型の回復を観察しました。驚くべきことに、ＡＲＡＦ遺伝子変異を持つプロバンドの患者にトラメチニブを投与したところ、患者の症状が劇的に改善し、治療開始から１２カ月以内に、拡張した曲がりくねったリンパ管が再構築され、リンパ浮腫が解消され、通常の日常生活を再開することができた。
【０１９１】
現在進行中の患者募集では、ヌーナン（またはヌーナン関連）症候群、Ｇｏｒｈａｍ−Ｓｔｏｕｔ病、肩甲状リンパ管腫症（ＫＬＡ）、リンパ管拡張症、ＣＣＬＡなど、さらに多くのリンパ管異常の患者を調査しました。さらに４３人の患者の塩基配列を調べたところ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＲＡＳＡ１、ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１に、さらに７つの変異が確認された（表３）。このことから、ＲＡＳ−ＭＡＰＫシグナルが、さまざまなリンパ系疾患の臨床症状を引き起こす共通の経路であることが示唆された。実際、ＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路がリンパ管形成のシグナル伝達に重要な役割を果たすことが次第に認められるようになってきた（２１−２３）。我々は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＰＴＰＮ１１、ＳＨＯＣ２、ＣＢＬ、ＲＩＴ１、ＳＯＳ１に変異があり、胸水、心嚢水、気胸、水腫などのリンパ系異常を伴うヌーナン症候群またはヌーナン関連症候群の臨床的特徴を有する５０人以上の患者を特定した。我々の研究が進められている間に、ＧＬＡ（３７）とＫＬＡ（３８）に再発性のＮＲＡＳ変異が関与していることが明らかになり、これらの疾患群に共通する遺伝的病因と、リンパ系異常におけるＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の変異の重要性がさらに支持されることになった。
【０１９２】
ヒトのがんにＲＡＳｏｐａｔｈｉｅｓの変異が広く存在することは、何十年も前から認識されている。我々が発見したＡＲＡＦの変異を、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（３９）データベース（ｎ＝７１，８５７人の被験者、２０１９年２月６日に照会）を用いて精査したところ、ＡＲＡＦに全く同じ変異を持つ患者が２人いることがわかった。興味深いことに、２人とも発がんドライバーとされるＴＰ５３変異を併発しています。また、この残基での異なる変異（Ｓ２１４Ｔ、Ｓ２１４Ａ、Ｓ２１４Ｙ、Ｓ２１４Ｃ、Ｓ２１４Ｆ）のうち３つは、ＭＥＫ／ＥＲＫのリン酸化が上昇することが示されている（４０）が、異なる種類のがん患者１０人で観察された。しかし、１０人中９人の患者には、発がん性変異が共存しておりＴＰ５３、ＧＮＡＳ、ＡＫＴ２、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ２、ＫＩＴ、Ｕ２ＡＦ１のいずれかであり、これらの発がんドライバーががん細胞の過剰な増殖の原因となっている可能性があります。ＡＲＡＦ変異を持つ主席検診者は、リンパ管が拡張していますが、長年の追跡調査でも病変の大きさは増加していません。したがって、これらのデータは、我々が発見したＡＲＡＦ変異がリンパ管の増殖を促進しない可能性があるという観察結果と一致する。
【０１９３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞
変異陽性リンパ管異常症の有病率については、ＧＬＡ、Ｇｏｒｈａｍ−Ｓｔｏｕｔ病、ＣＣＬＡ、ＫＬＡ、Ｋｌｉｐｐｅｌ−Ｔｒｅｎａｕｎａｙ症候群、ｋａｐｏｓｉｆｏｒｍ  ｈｅｍａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａなどを含むがこれらに限定されないこのリンパ管異常症群の多施設臨床試験を促進するためにリンパ管異常症コンソーシアムを形成している米国の１１施設の間では、中等度から重度の疾患経過で募集された患者が３，０００人以上おり、年間の新規患者数は合わせて約３００人となっています。現在の分子診断の歩留まり（２０％）から、そのうち約２０％にＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路の欠損があると予想しており、以下のことが示唆される。ＭＥＫ阻害剤による治療の恩恵を受ける患者は、米国全体で数千人にのぼると考えられます。このように、私たちの研究は、患者におけるこれまで知られていなかった病因による異常、プレシジョン・メディシン・アプローチの実現をもって、遺伝子の発見が病気の分類に影響を与え、新しい生物学的治療法や救命治療法を発見することができることを例証する。
【０１９４】
文献
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【０１９５】
以上、本発明の好ましい実施形態の一部を説明し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図したものではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な変更をそれに加えることができる。
【図１】
2022500020.tif 000030
【図２】
2022500020.tif 000031
【図３】
2022500020.tif 000032
【図４Ａ】
2022500020.tif 000033
【図４Ｂ】
2022500020.tif 000034
【図５Ａ】
2022500020.tif 000035
【図５Ｂ】
2022500020.tif 000036
【図６】
2022500020.tif 000037
【図７】
2022500020.tif 000038
【図８】
2022500020.tif 000039
【図９】
2022500020.tif 000040
【図１０】
2022500020.tif 000041
【図１１】
2022500020.tif 000042
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ−Ｊ】
2022500020.tif 000061
【図２４Ａ】
2022500020.tif 000062
【図２４Ｂ】
2022500020.tif 000063
【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【配列表】
2022500020000001.app
【国際調査報告】
2022500020.tif 000068
2022500020.tif 000069