(57)【要約】高密度に詰め込まれた基材からの光学シグナルの検出および識別のための方法およびシステムが、本明細書において開示される。これらは、ポリヌクレオチドの配列決定での適用における効率および正確性の改善を含む、光学システムの回折限界付近またはこれ未満での生体分子の検出のための、幅広い用途を有する。2022501026.tif 000012
2022501026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の表面上に高密度で配置された複数の分析物を配列決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)  表面を含む基材を提供する工程であって、該表面がパターン化されておらず、かつ、該複数の分析物のうちの分析物の結合位置の間の最小有効ピッチが λ/(2*NA) 未満であるような密度で該表面上に配置された、複数の分析物を、該表面が含み、ここで「NA」とは光学画像化モジュールの開口数であり、かつ該表面が、合成による配列決定（sequencing by synthesis）のための試薬を含む、工程；
(b)  該複数の分析物へのプローブ結合の複数のサイクルを実施する工程であって、該複数のサイクルのうちのサイクルが以下を含む、工程：
(i)  複数のプローブとの、該複数の分析物の接触であって、該複数のプローブのうちのプローブが、検出可能な標識を含む、接触；
(ii)  該複数の分析物と接触させた各プローブからの光学シグナルを検出するための、光学システムを用いた、該表面のフィールドの画像化であって、それにより、該サイクルについて該フィールドにおける複数の光学シグナルを検出する、画像化；
(c)  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；
(d)  各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上で検出された各プローブの相対位置を決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程；
(e)  該決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルを解像する工程；
(f)  各フィールドおよび各サイクルについて、該検出可能な標識を、デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程；ならびに
(g)  各分析物の位置で、該複数のサイクルの全体にわたって同定された該検出可能な標識から、基材の表面上に配置された分析物を同定する工程。
【請求項２】
前記複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物が、反発性（repellant）または誘引性（attractive）の物質を用いて処理される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記反発性または誘引性の物質が、両性イオンの特徴を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記反発性または誘引性の物質が、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物がDNAコンカテマーである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記DNAコンカテマーが、ssDNAヘア（ssDNA hair）とハイブリダイズする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが、複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドが、それぞれ別個の検出可能な標識を有する少なくとも4つの別個のヌクレオチドを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記解像する工程が、
隣接するポリヌクレオチドからの干渉光学シグナルを、該隣接するポリヌクレオチド間の中心間距離を用いて、前記決定された相対位置から除去すること
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記解像関数がデコンボリューションを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１２】
近接するポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドからの前記検出可能な標識によって放出される光学シグナル間にオーバーラップが存在するように、前記ポリヌクレオチドが前記基材上に高密度に詰め込まれており、かつ、該近接するポリヌクレオチドがそれぞれ別個の配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
1平方ミクロンにつき分子4個超の平均密度で、ポリヌクレオチドが前記表面上に付着されている、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面の前記画像化が、画像フィールドの1つの軸に沿って300 nmにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
各サイクルからの前記フィールド画像のそれぞれから、より高いピクセル密度を有するオーバーサンプリングされた画像を生成する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記ピーク位置をオーバーレイする前記工程が、
複数の前記サイクルから、各ポリヌクレオチドについての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、前記複数のサイクルについて、各フィールドにおいて検出された前記光学シグナルピークの位置をアラインすること
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピーク位置をオーバーレイする前記工程が、
前記サイクルのサブセットから、各ポリヌクレオチドについての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、サイクルの該サブセットについて、各フィールドにおいて検出された前記光学シグナルピークの位置をアラインすること
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記光学分布モデルが点像分布関数を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
基材の表面に付着している前記分析物の前記相対位置が、10 nm以内のRMSで決定される、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
高密度に詰め込まれた基材の表面上に付着している分析物の相対位置を正確に決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)  表面を含む基材を提供する工程であって、該表面が、パターン化されているかまたはパターン化されておらず、かつ該表面が、表面上で別々の位置に付着している複数の分析物を含む、工程；
(b)  該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルを実施する工程であって、各サイクルが以下を含む、工程：
(i)  プローブセットからの複数のプローブとの、該分析物の接触であって、該プローブが、検出可能な標識を含み、該プローブのそれぞれが、標的分析物に特異的に結合する、接触；および
(ii)  該表面上の別々の位置で該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するための、光学システムを用いた、該表面のフィールドの画像化；
(c)  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；ならびに
(d)  各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上で検出された各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程。
【請求項２１】
以下の工程をさらに含む、請求項20に記載の方法：
(a)  前記決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における前記光学シグナルを解像する工程；ならびに
(b)  各フィールドおよび各サイクルについて、前記付着している分析物に結合した、前記検出可能な標識を、デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程。
【請求項２２】
前記複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物が、反発性または誘引性の物質を用いて処理される、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
前記反発性または誘引性の物質が、両性イオンの特徴を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記反発性または誘引性の物質が、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析物がDNAコンカテマーである、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
前記DNAコンカテマーが、ssDNAヘアとハイブリダイズする、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項20に記載の方法。
【請求項２８】
前記基材上の複数の前記分析物を同定するために、各サイクルにおいて検出された各分析物についての前記検出可能な標識のアイデンティティを用いる工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２９】
前記解像する工程が、
隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物間の中心間距離を用いて、該隣接する分析物の前記決定された相対位置から除去すること
を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３０】
前記解像関数がデコンボリューションを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
前記分析物が単一の生体分子である、請求項20に記載の方法。
【請求項３２】
前記表面上に付着している前記分析物が、平均して、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、請求項20に記載の方法。
【請求項３３】
付着している分析物が、500 nm未満の、各分析物とそれに最も近い近接する分析物との間の平均中心間距離を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３４】
前記ピーク位置をオーバーレイする前記工程が、
前記複数のサイクルから、各分析物についての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、該複数のサイクルについて、各フィールドにおいて検出された前記光学シグナルピークの位置をアラインすること
を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３５】
前記相対位置が、10ナノメートル以内のRMSの正確性で決定される、請求項20に記載の方法。
【請求項３６】
1平方ミクロンにつき分析物約4個〜約25個の密度で、表面からの光学シグナルを解像する、請求項20に記載の方法。
【請求項３７】
(a)  基材の表面上に付着している分析物へのプローブ結合の複数のサイクルにわたる、基材のフィールドからの複数の光学シグナルを画像化するように構成されている、光学画像化装置であって、該表面がパターン化されていない、光学画像化装置；ならびに
(b)  画像処理モジュールであって：
(i)  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する；
(ii)  該複数のサイクルからの光学シグナルの各クラスターに光学分布モデルを適用することにより、該表面上で検出された各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定する；および
(iii)  該決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルをデコンボリューションする
ように構成されている、画像処理モジュール
を含む、複数の分析物のアイデンティティを決定するためのシステム。
【請求項３８】
前記画像処理モジュールが、前記デコンボリューションされた光学シグナルを用いて、前記表面上に付着している前記分析物のアイデンティティを決定するように、さらに構成されている、請求項37に記載のシステム。
【請求項３９】
前記光学画像化装置が、スキャン可能な領域を画定する可動ステージを含む、請求項37に記載のシステム。
【請求項４０】
前記光学画像化装置が、前記スキャン可能な領域において、回折限界未満で基材の表面をサンプリングするように構成されているセンサーおよび光学拡大力（magnification）を含む、請求項37に記載のシステム。
【請求項４１】
パターン化されていない基材表面に、回折限界未満の中心間の間隔で付着している分析物を含む、基材
をさらに含む、請求項37に記載のシステム。
【請求項４２】
前記解像が、
隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物の前記相対位置を決定するために、該隣接する分析物間の中心間距離を用いて除去すること
を含む、請求項37に記載のシステム。
【請求項４３】
複数の分析物を処理または分析するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)  最小有効ピッチがλ/（2*NA）未満の寸法である密度で、基材の表面に近接して、該複数の分析物を配置する工程であって、該表面がパターン化されていない、工程；
(b)  該基材に近接して配置された該複数の分析物のうちの分析物へのプローブ結合の1または複数サイクルにわたって、該基材から複数の光学シグナルを取得する工程であって、該複数の光学シグナルの少なくとも1サブセットがオーバーラップしており、該複数の光学シグナルが、波長（λ）を有する光を含む、工程；
(c)  該複数の光学シグナルを処理して、該複数の分析物のうちの分析物の位置を、または該複数の分析物のうちの別の分析物に対する該分析物の相対位置を同定するために、画像化アルゴリズムを適用する工程；および
(d)  該複数の分析物のうちの該分析物を同定するために、該位置または該相対位置を使用する工程。
【請求項４４】
前記複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物が、反発性または誘引性の物質を用いて処理される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記反発性または誘引性の物質が、両性イオンの特徴を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記反発性または誘引性の物質が、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
前記分析物がDNAコンカテマーである、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
前記DNAコンカテマーが、ssDNAヘアとハイブリダイズする、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項43に記載の方法。
【請求項５０】
工程(b)が、分析物へのプローブ結合の前記1または複数サイクルからの前記複数の光学シグナルをオーバーレイするように、光学処理モジュールを構成することをさらに含み、かつ
工程(c)が、検出された各分析物の相対位置を決定するために、該複数の光学シグナルの該オーバーレイに光学分布モデルを適用することをさらに含む、
請求項43に記載の方法。
【請求項５１】
前記画像化アルゴリズムが、解像関数を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５２】
前記解像関数がデコンボリューションを含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記解像関数が、
隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物間の中心間距離を用いて除去すること
を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
前記複数の分析物が、1平方ミクロンにつき分子約1〜25個の密度で、前記基材に近接して配置される、請求項43に記載の方法。
【請求項５５】
光学画像化モジュールが、300ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、前記複数の光学シグナルを取得するように構成されている、請求項43に記載の方法。
【請求項５６】
パターン化されていない表面上に付着している複数の分析物のうちの分析物間の、平均最少中心間距離の分布を制御する方法であって、該1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する工程を含む、方法。
【請求項５７】
前記反発性または誘引性の物質が、両性イオンの特徴を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記反発性または誘引性の物質が、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記分析物がDNAコンカテマーである、請求項56に記載の方法。
【請求項６０】
前記DNAコンカテマーが、ssDNAヘアとハイブリダイズする、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項56に記載の方法。
【請求項６２】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約500ナノメートル未満である、請求項56に記載の方法。
【請求項６３】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約315ナノメートルである、請求項56に記載の方法。
【請求項６４】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約250ナノメートルである、請求項56に記載の方法。
【請求項６５】
前記1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する前記工程が、
前記複数の分析物を前記表面に付着させる前に、前記反発性または誘引性の物質を前記パターン化されていない表面に適用すること
を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項６６】
パターン化されていない表面上に付着している複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、平均最少中心間距離の分布を制御する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a)  該1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する工程；
(b)  該複数の分析物が、該パターン化されていない表面全体に付着した分析物の単層を形成するように、該複数の分析物を気液界面に曝露する工程。
【請求項６７】
前記気液界面が、空気−水界面である、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
(c)の付着させる工程が、引き延ばすこと（pulling）または引っ張ること（dragging）を含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約500ナノメートル未満である、請求項66に記載の方法。
【請求項７０】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約315ナノメートルである、請求項66に記載の方法。
【請求項７１】
複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、前記平均最少中心間距離が、約250ナノメートルである、請求項66に記載の方法。
【請求項７２】
表面に近接した複数の核酸分子を含むシステムであって、該複数の核酸分子のうちの近接した核酸分子が、少なくとも10ナノメートルの、中心間の平均間隔を有し、かつ互いに接触しない、システム。
【請求項７３】
前記表面がパターン化されていない、請求項72に記載のシステム。
【請求項７４】
前記複数の核酸分子が、複数のコンカテマーである、請求項72に記載のシステム。
【請求項７５】
前記中心間の平均間隔が約500ナノメートル未満である、請求項72に記載システム。
【請求項７６】
表面に近接した複数の核酸分子を提供する工程を含む方法であって、該複数の核酸分子のうちの近接した核酸分子が、少なくとも10ナノメートルの、中心間の平均間隔を有し、かつ互いに接触しない、方法。
【請求項７７】
前記表面がパターン化されていない、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
前記複数の核酸分子が、複数のコンカテマーである、請求項76に記載の方法。
【請求項７９】
前記中心間の平均間隔が約500 nm未満である、請求項76に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2018年9月19日に提出された米国特許仮出願第62/733, 525号の優先権を主張するものであり、該仮出願は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
手ごろな価格の高速な配列決定は、医学およびヘルスケアにおいて世界的に革命を引き起こしている。最初のヒトゲノムが2000年に配列決定されて以来、ゲノムの価格は劇的に低下してきており、1つの重要なマイルストーンである1,000ドルゲノムが最近達成された。しかしながら、大集団における配列決定、疾患のスクリーニングおよび早期検出といった応用を可能にする、より低コストの配列決定に対する巨大な需要が存在する。
【０００３】
配列決定のコストを判定するための基準は、90ギガ塩基として定義される、30Xヒトゲノムの価格である。配列決定システムに関する主なコスト構成要素は、第一にはバイオチップおよび試薬を含む消耗品、そして第二には機器コストである。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書において、画像化方法の改善、ならびに基材の改善および高密度な分析物の層を有する基材を作製する方法の改善に対する必要性が、認識される。たとえば、10ドルの30Xゲノム、すなわち100倍のコスト削減に到達するためには、チップの単位面積あたりのデータの量を100倍増大させること、および／またはデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させることが望ましいであろう。したがって、高密度に詰め込まれたデオキシリボ核酸（DNA）を有するチップであって、超解像画像化システムによって画像化されることができるチップを提供することが望ましいであろう。
【０００５】
1平方センチメートルにつき1000万個の分子のクラスター密度を有する、1,000ゲノムプラットフォームの例において、各分子は平均で10 um2のチップ面積を占める。したがって、平均有効ピッチは3,160 nmである。もし密度を100倍増加させれば、同じチップ面積および試薬で100倍多い情報が取得され得、結果として100倍のコスト削減をもたらす。100倍高い密度において、新規なピッチは320 nmであることが必要とされ得る。
【０００６】
したがって、配列決定コストを削減するためには、低コストのバイオチップの表面上に分布している標的DNA分子の高密度な詰め込みを達成することが必須である。しかしながら、これらの高密度に詰め込まれた分子から生じる蛍光シグナルは、配列決定の最中に、光の回折限界未満で光学シグナルを解像することができる超解像光学画像化システムによって解像されることが必要である。
【０００７】
さらに、Ion TorrentおよびOxford Nanoporeなどの会社によって開発された電気に基づくシステムなどの、光学シグナルの回折限界に拘束されない他の方法は存在するが、既存のすべての技術の中で最少の配列決定コストは、高スループットの画像化と低コストの消耗品との組み合わせを用いた、光学に基づくシステムによって、達成されるであろう。
【０００８】
手ごろな価格の高速な配列決定は、医学およびヘルスケアにおいて世界的に革命を引き起こしているであろう。最初のヒトゲノムが2000年に配列決定されて以来、ゲノムの価格は劇的に低下してきており、1つの重要なマイルストーンである1,000ドルゲノムが最近達成された。しかしながら、本明細書において、大集団における配列決定、疾患のスクリーニングおよび早期検出といった応用を可能にする、より低コストの配列決定に対する巨大な需要が認識される。本開示は、実質的に短縮された期間で10ドルゲノムを達成する方法およびシステムを提供する。この小売価格において、全新生児を配列決定することが経済的となるであろう、かつ、ディープシーケンシングおよびシングルセル解析に対するコスト障壁が取り除かれるであろう。
【０００９】
配列決定のコストを判定するための基準は、90ギガ塩基として定義される、30Xヒトゲノムの価格である。配列決定システムに関する主なコスト構成要素は、第一にはバイオチップおよび試薬を含み得る消耗品に関連し得、そして第二には機器コストに関連し得る。したがって、10ドルの30Xゲノム、すなわち100倍のコスト削減に到達するためには、チップの単位面積あたりのデータの量を100倍増大させること、および／またはデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させることが望ましいであろう。したがって、高密度に詰め込まれたDNAを有するチップであって、超解像画像化システムによって画像化されることができるチップを提供することが望ましいであろう。
【００１０】
1平方センチメートルにつき1000万個の分子のクラスター密度を有する、1,000ゲノムプラットフォームの一例において、各分子は平均で10マイクロメートル（um2）のチップ面積を占める。したがって、平均有効ピッチは3,160ナノメートル（nm）である。もし密度を100倍増加させれば、同じチップ面積および試薬で100倍多い情報が取得され得、結果として100倍のコスト削減をもたらす。100倍高い密度において、新規なピッチは320 nmであることが必要とされ得る。
【００１１】
したがって、配列決定コストを削減するためには、低コストのバイオチップの表面上に分布している標的DNA分子の高密度な詰め込みを達成することが必須であろう。しかしながら、これらの高密度に詰め込まれた分子から生じる蛍光シグナルは、配列決定の最中に、光の回折限界未満で光学シグナルを解像することができる超解像光学画像化システムによって解像されることが必要であろう。
【００１２】
さらに、Ion TorrentおよびOxford Nanoporeなどの会社によって開発された電気に基づくシステムなどの、光学シグナルの回折限界に拘束されない他の方法は存在するが、既存のすべての技術の中で最少の配列決定コストは、高スループットの画像化と低コストの消耗品との組み合わせを用いた、光学に基づくシステムによって、達成される。
【００１３】
本開示は、（たとえば、実質的に短縮された期間でS10ゲノムを達成するための）核酸の配列決定といった、分析物の検出のための方法およびシステムを提供する。本開示の方法およびシステムは、DNAもしくはリボ核酸（RNA）分子などの核酸分子、ポリペプチド、および／またはタンパク質を同定するために使用され得る。本開示の方法およびシステムを用いて達成され得る小売価格において、全新生児を配列決定することが経済的となるであろう、かつ、ディープシーケンシングおよびシングルセル解析に対するコスト障壁が取り除かれるであろう。
【００１４】
本開示の1つの局面は、基材の表面上に高密度で配置された複数の分析物を配列決定するための方法を含み、該方法は以下の工程を含む：表面を含む基材を提供する工程であって、該複数の分析物のうちの分析物の結合位置の間の最小有効ピッチが λ/(2*NA) 未満であるような密度で、該表面上に配置された複数の分析物を、該表面が含み、ここで「NA」とは該光学画像化モジュールの開口数であり、かつ該表面が、合成による配列決定（sequencing by synthesis）のための試薬を含む、工程；該複数の分析物へのプローブ結合の複数のサイクルを実施する工程であって、該複数のサイクルのうちのサイクルが以下を含む、工程：複数のプローブとの、該複数の分析物の接触であって、該複数のプローブのうちのプローブが、検出可能な標識を含む、接触；(ii)  該複数の分析物と接触させた各プローブからの光学シグナルを検出するための、光学システムを用いた、該表面のフィールドの画像化であって、それにより、該サイクルについて該フィールドにおける複数の光学シグナルを検出する、画像化；該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上で検出される各プローブの相対位置を決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程；該決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルを解像する工程；各フィールドおよび各サイクルについて、該検出可能な標識を、該デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程；ならびに各分析物の位置で、該複数のサイクルの全体にわたって同定された該検出可能な標識から、基材の表面上に配置された分析物を同定する工程。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25ナノメートル（nm）の変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。複数の分析物は、核酸分子（DNAおよび／もしくはRNA）、タンパ��質、ならびに／またはポリペプチドであり得る。該複数の分析物のうちの個々の分析物が解像（たとえば、光学的に解像）され得るように、該複数の分析物は、表面に近接して配置され得る。該複数の分析物のうちの近接した分析物が互いに触れ合わず、接触もしないように、該複数の分析物は、表面に近接して配置され得る。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物は、反発性（repellant）または誘引性（attractive）の物質を用いて処理される。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、両性イオンの特徴を含む。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む。いくつかの態様において、該分析物は、DNAコンカテマーである。いくつかの態様において、該DNAコンカテマーは、ssDNAヘア（ssDNA hair）とハイブリダイズする。いくつかの態様において、該分析物は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、該プローブは、複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドは、それぞれ別個の検出可能な標識を有する少なくとも4つの別個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該解像する工程は、隣接するポリヌクレオチドからの干渉光学シグナルを、該隣接するポリヌクレオチド間の中心間距離を用いて、該決定された相対位置から除去する工程を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、機械学習を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、最近傍変数回帰（nearest neighbor variable regression）を含む。いくつかの態様において、近接するポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドからの該検出可能な標識によって放出される光学シグナル間にオーバーラップが存在するように、該ポリヌクレオチドは該基材上に高密度に詰め込まれており、かつ、該近接するポリヌクレオチドはそれぞれ別個の配列を含む。いくつかの態様において、1平方ミクロンにつき分子4個超の平均密度で、ポリヌクレオチドは該表面上に付着されている。いくつかの態様において、該表面の該画像化は、画像フィールドの1つの軸に沿って300 nmにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で実施される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、250ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、200ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、150ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、100ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、方法は、各サイクルからの該フィールド画像のそれぞれから、より高いピクセル密度を有するオーバーサンプリングされた画像を生成する工程を、さらに含む。いくつかの態様において、該ピーク位置をオーバーレイする該工程は、複数の該サイクルから、各ポリヌクレオチドについての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、該複数のサイクルについて、各フィールドにおいて検出された該光学シグナルピークの位置をアラインする工程を含む。いくつかの態様において、該ピーク位置をオーバーレイする該工程は、該サイクルのサブセットから、各ポリヌクレオチドについての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、サイクルの該サブセットについて、各フィールドにおいて検出された該光学シグナルピークの位置をアラインする工程を含む。いくつかの態様において、該光学分布モデルは点像分布関数を含む。いくつかの態様において、基材の表面に付着している該分析物の該相対位置は、10 nm以内のRMSで決定される。
【００１５】
本開示の別の局面は、高密度に詰め込まれた基材の表面上に付着している分析物の相対位置を正確に決定するための方法を含み、該方法は以下の工程を含む：表面を含む基材を提供する工程であって、表面が、表面上で別々の位置に付着している複数の分析物を含む、工程；該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルを実施する工程であって、各サイクルが以下を含む、工程：プローブセットからの複数のプローブとの、該分析物の接触であって、該プローブが検出可能な標識を含み、該プローブのそれぞれが標的分析物に特異的に結合する、接触；および該表面上の別々の位置で該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するための、光学システムを用いた、該表面のフィールドの画像化；該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；ならびに各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上で検出される各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、方法は、以下をさらに含む：該決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルを解像する工程；ならびに各フィールドおよび各サイクルについて、該付着している分析物に結合した、該検出可能な標識を、該デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物は、反発性または誘引性の物質を用いて処理される。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、両性イオンの特徴を含む。いくつかの態様���おいて、該反発性または誘引性の物質は、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む。いくつかの態様において、該分析物は、DNAコンカテマーである。いくつかの態様において、該DNAコンカテマーは、ssDNAヘアとハイブリダイズする。いくつかの態様において、該分析物は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、方法は、該基材上の複数の該分析物を同定するために、各サイクルにおいて検出される各分析物の、該検出可能な標識のアイデンティティを用いる工程を、さらに含む。いくつかの態様において、該解像する工程は、隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物間の中心間距離を用いて、該隣接する分析物の該決定された相対位置から除去する工程を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、機械学習を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、最近傍変数回帰を含む。いくつかの態様において、該分析物は、単一の生体分子である。いくつかの態様において、該表面上に付着している該分析物は、平均して、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される。いくつかの態様において、付着している分析物は、500 nm未満の、各分析物とそれに最も近い近接する分析物との間の平均中心間距離を含む。いくつかの態様において、該ピーク位置をオーバーレイする該工程は、複数の該サイクルから、各分析物についての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、該複数のサイクルについて、各フィールドにおいて検出された該光学シグナルピークの位置をアラインする工程を含む。いくつかの態様において、該相対位置は、10 nm以内のRMSの正確性で決定される。いくつかの態様において、該方法は、1平方ミクロンにつき分析物約4個〜約25個の密度で、表面からの光学シグナルを解像する。
【００１６】
本開示の別の局面は、複数の分析物のアイデンティティを決定するためのシステムを含み、該システムは、以下を含む：基材の表面上に付着している分析物へのプローブ結合の複数のサイクルにわたる、基材のフィールドからの複数の光学シグナルを画像化するように構成される、光学画像化装置；ならびに画像処理モジュールであって：該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する；該複数のサイクルからの光学シグナルの各クラスターに光学分布モデルを適用することにより、該表面上で検出される各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定する；および該決定された相対位置および解像関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルをデコンボリューションするように構成される、画像処理モジュール。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該画像処理モジュールは、該デコンボリューションされた光学シグナルを用いて、該表面上に付着している該分析物のアイデンティティを決定するように、さらに構成される。いくつかの態様において、該光学画像化装置は、スキャン可能な領域を画定する可動ステージを含む。いくつかの態様において、該光学画像化装置は、該スキャン可能な領域において、回折限界未満で基材の表面をサンプリングするように構成されるセンサーおよび光学拡大力（magnification）を含む。いくつかの態様において、システムは、回折限界未満の中心間の間隔で基材の表面に付着している分析物を含む基材を、さらに含む。いくつかの態様において、該解像は、隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物の該相対位置を決定するために、該隣接する分析物間の中心間距離を用い���除去することを含む。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。
【００１７】
本開示の別の局面は、複数の分析物を処理または分析するための方法を含み、該方法は以下の工程を含む：最小有効ピッチが λ/(2*NA) 未満の寸法である密度で、基材の表面に近接して、該複数の分析物を配置する工程；該基材に近接して配置された該複数の分析物のうちの分析物へのプローブ結合の1または複数サイクルにわたって、該基材から複数の光学シグナルを取得する工程であって、該複数の光学シグナルの少なくとも1サブセットがオーバーラップしており、該複数の光学シグナルが、波長（λ）を有する光を含む、工程；該複数の光学シグナルを処理して、該複数の分析物のうちの分析物の位置を、または該複数の分析物のうちの別の分析物に対する該分析物の相対位置を同定するために、画像化アルゴリズムを適用する工程；および該複数の分析物のうちの該分析物を同定するために、該位置または該相対位置を使用する工程。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物は、反発性または誘引性の物質を用いて処理される。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、両性イオンの特徴を含む。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む。いくつかの態様において、該分析物は、DNAコンカテマーである。いくつかの態様において、該DNAコンカテマーは、ssDNAヘアとハイブリダイズする。いくつかの態様において、該分析物は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、工程(b)は、分析物へのプローブ結合の該1または複数サイクルからの該複数の光学シグナルをオーバーレイするように、光学処理モジュールを構成することをさらに含み、かつ工程(c)は、検出される各分析物の相対位置を決定するために、該複数の光学シ��ナルの該オーバーレイに光学分布モデルを適用することをさらに含む。いくつかの態様において、該画像化アルゴリズムは、解像関数を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、機械学習を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、最近傍変数回帰を含む。いくつかの態様において、該解像関数は、隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、該隣接する分析物間の中心間距離を用いて除去することを含む。いくつかの態様において、該複数の分析物は、1平方ミクロンにつき分子約1〜25個の密度で、該基材に近接して配置される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、300ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、250ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、200ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、150ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。いくつかの態様において、光学画像化モジュールは、100ナノメートルにつき1ピクセルかまたはそれより高い分解能で、該複数の光学シグナルを取得するように構成される。
【００１８】
本開示の別の局面は、表面上に付着している複数の分析物のうちの分析物間の、平均最少中心間距離の分布を制御する方法を含み、該方法は、該1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する工程を含む。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、両性イオンの特徴を含む。いくつかの態様において、該反発性または誘引性の物質は、PEG、多糖、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および／またはBSAを含む。いくつかの態様において、該分析物は、DNAコンカテマーである。いくつかの態様において、該DNAコンカテマーは、ssDNAヘアとハイブリダイズする。いくつかの態様において、該分析物は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約500 nm未満である。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約315 nmである。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約250 nmである。いくつかの態様において、該1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する該工程は、該複数の分析物が該表面に付着する前に、該反発性または誘引性の物質を該表面に適用する工程を含む。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。
【００１９】
本開示の別の局面は、表面上に付着している複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、平均最少中心間距離の分布を制御する方法を含み、該方法は以下の工程を含む：該1つまたは複数の分析物を、反発性または誘引性の物質を用いて処理する工程；該複数の分析物が、該表面全体に付着した分析物の単層を形成するように、該複数の分析物を、気液界面に曝露する工程。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該気液界面は、空気−水界面である。いくつかの態様において、(c)の付着させる工程は、引き延ばすこと（pulling）または引っ張ること（dragging）を含む。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約500 nm未満である。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約315 nmである。いくつかの態様において、複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物間の、該平均最少中心間距離は、約250 nmである。
【００２０】
本開示の別の局面は、表面に近接している複数の核酸分子を含むシステムを含み、該複数の核酸分子は互いに接触しない。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該複数の核酸分子は、複数のコンカテマーである。いくつかの態様において、該複数の核酸分子のうちの近接する核酸分子は、約500 nm未満の、中心間の平均間隔を有する。
【００２１】
本開示の別の局面は、複数の核酸分子が互いに接触しないような条件下で、表面に近接している複数の核酸分子を提供する工程を含む方法を、含む。いくつかの態様において、コンカテマーは表面上にロードされ、そして+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。いくつかの態様において、該表面はパターン化されていない。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。いくつかの態様において、該複数の核酸分子は、複数のコンカテマーである。いくつかの態様において、該複数の核酸分子のうちの近接する核酸分子は、約500 nm未満の、中心間の平均間隔を有する。
【００２２】
本開示の別の局面は、機械で実行可能なコードを含む、コンピューターで読み取り可能な非一時的な媒体を提供し、該コードは、1つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行に際し、上述のまたは本明細書の他の箇所に記載の方法のいずれかを遂行する。
【００２３】
本開示の別の局面は、1つまたは複数のコンピュータープロセッサ、およびそれに連結されたコンピューターメモリーを含む、システムを提供する。コンピューターメモリーは、機械で実行可能なコードを含み、該コードは、1つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行に際し、上述のまたは本明細書の他の箇所に記載の方法のいずれかを遂行する。
【００２４】
本開示の追加の局面および利点は、本開示の例示的態様のみが示されそして記載される以下の詳細な説明から、当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる態様が可能であり、かつ、そのいくつかの詳細は、さまざまな明らかな点において、本開示から一切逸脱することなく改変することができる。したがって、図面および説明は、本質的に、例示としてみなされるべきものであり、かつ制限するものとしてみなされるべきではない。
【００２５】
参照による組み入れ
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、参照により組み入れられるように具体的にかつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において含まれる本開示と相反する、参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願の範囲については、本明細書が、そのような相反する事柄のどれよりも優先され、および／または上位に立つことが、意図される。
【００２６】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲において記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的態様が記載される以下の詳細な説明、ならびに添付される以下の図面（本明細書においてはまた、「図（Figure）」および「図（FIG.）」とも言う）の参照により、得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】シーケンサーのスループット 対 アレイのピッチを示し、そして10ドルゲノムのために必要とされる基準を満たすシステム設計を概説する。
【図２Ａ】低コストの配列決定のための、240 nmのピッチで80 nmの直径の結合領域（スポット）という高密度領域の提案される態様を示す。
【図２Ｂ】1,000ゲノムのために使用される試料の有効密度と比較した、提案される基材密度の比較である。
【図３】600 nmのピッチで2Xフィルターで処理された、シミュレートされた個々の分析物の検出のためのクロストーク計算を示す。
【図４】400 nm、300 nm、および250 nmの中心間距離の基材上の単一分析物の検出の画像の、2Xオーバーサンプリングされたシミュレーション（左） 対 4Xオーバーサンプリングされ、そしてデコンボリューションされたシミュレーション（右）を示す。200 nmの中心間距離で、4Xオーバーサンプリングされ、デコンボリューションされた単一画像も示される。
【図５】2Xオーバーサンプリングされたシミュレーション 対 4Xオーバーサンプリングされそしてデコンボリューションされたシミュレーションを用いて処理された、単一分析物間の異なる中心間距離（アレイのピッチ（nm））で近接するスポット間の、クロストークのプロットを示す。
【図６】本開示の1つの態様にしたがった、基材上の分析物の相対位置を高い正確性で決定する方法のためのフローチャートを示す。
【図７】本開示の1つの態様にしたがった、基材から検出された、デコンボリューションされた光学シグナルから、個々の分析物を同定する方法のための、フローチャートを示す。
【図８】本開示の1つの態様にしたがった、基材上に付着したポリヌクレオチドを配列決定する方法のためのフローチャートを示す。
【図９】本開示の1つの態様にしたがった、反復検出からの光学シグナル検出プロセスにおける操作の概要を示す。
【図１０Ａ】本開示の1つの態様にしたがった、最初の生画像分析のための操作のフローチャートを示す。
【図１０Ｂ】本開示の1つの態様にしたがった、複数のサイクルからの光学シグナルピーク情報からの位置決定のための操作のフローチャートを示す。
【図１０Ｃ】本開示の1つの態様にしたがった、正確な相対位置情報および画像デコンボリューションアルゴリズムを用いる、画像からの、オーバーラップする光学シグナルの同定のための操作のフローチャートを示す。
【図１１】本開示の1つの態様にしたがった、高密度に詰め込まれた基材の反復検出からの画像についての光学シグナル検出およびデコンボリューションプロセスのための操作の、詳細なフローチャートを示す。
【図１２】図12Aは、生画像から検出された光学シグナルからの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図12Bは、4Xオーバーサンプリングされた画像からの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。
【図１３】図13Aは、デコンボリューションまたは最近傍修正無しでの、4Xオーバーサンプリングされた画像からの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図13Bは、本発明の1つの態様にしたがった、分析物の正確な位置情報を用いるデコンボリューションアルゴリズムを用いて、4Xオーバーサンプリングされ、そしてデコンボリューションされた画像からの、4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。
【図１４】分析物の間が約315 nmの中心間の間隔での、フィールドの生画像のシミュレートされた4色合成画を示す。図14Bは、分析物の間が約315 nmの中心間の間隔での、デコンボリューションされた画像のシミュレートされた4色合成画を示す。
【図１５Ａ】変異体標的および野生型（WT）標的の等量を含む、EGFR遺伝子におけるコドン790付近の領域に対応する合成オリゴヌクレオチド鋳型の1:1の混合物の、配列決定の結果を示す。
【図１５Ｂ】塩基の組み込みおよび切断の交互のサイクルからの画像を示す。
【図１６】基材上に付着し、かつフルオロフォアを含むプローブによって結合された単一分析物の画像である。
【図１７】図17の右パネルは、基材上のいくらかの分析物からのオーバーレイされた各サイクルからのフィールドのオーバーサンプリングされた画像からのピーク（ピークのクラスター）を示す。左パネルは、右パネルの平滑化されたバージョンであり、相対位置情報を示す高度に正確なピークを有する複数のサイクルにわたる分析物からのピークのガウス分布を概括する。
【図１８】フィールドにおいて見いだされる複数の分子のそれぞれについてのローカライゼーションの変動を示す。ローカライゼーションの分散の中央値は5 nmであり、かつ3シグマのローカライゼーションの分散は10 nmより小さい。
【図１９】本開示の1つの態様にしたがった、デオキシリボ核酸（DNA）ライブラリーの構築、環状化、およびコンカテマー形成のフローチャートを示す。
【図２０】本開示の1つの態様にしたがった、DNAライブラリーの構築、環状化、およびコンカテマー形成のフローチャートを示し、これは、コンカテマーの層を形成するための排除を容易にする、コンカテマーにおけるssDNA「ヘア」の合成を含む。
【図２１】本開示の1つの態様にしたがった、コンカテマーの層において他のコンカテマーの排除を容易にする、コートされたコンカテマーを示す。
【図２２】本開示の1つの態様にしたがった、密接して詰め込まれ、ランダムに分布している、コンカテマーの層の態様を示す。
【図２３Ａ】本開示の1つの態様にしたがった、試料からの標的配列を含む環状化されたDNAのライブラリーを形成するためのフローチャートを示す。
【図２３Ｂ】本開示の1つの態様にしたがった、基材上の層にコンカテマーをロードし、そしてコンカテマーを配列決定するためのフローチャートを示す。
【図２４】本開示の1つの態様にしたがった、供給源の情報（または他の情報）を各コンカテマーに包含させるために、固有の分子識別子（unique molecule identifier）を使用する態様を示す。
【図２５Ａ】本開示のいくつかの態様にしたがった、基材の表面上に高密度で分布しているコンカテマー層の画像を示す。
【図２５Ｂ】本開示のいくつかの態様にしたがった、基材の表面上に高密度で分布しているコンカテマー層の画像を示す。
【図２５Ｃ】本開示のいくつかの態様にしたがった、基材の表面上に高密度で分布しているコンカテマー層の画像を示す。
【図２５Ｄ】本開示のいくつかの態様にしたがった、コンカテマーの表面密度のグラフを示す。
【図２６Ａ】コンカテマー標的の配列決定のために使用される基材に結合した、コンカテマーの画像を示し、近接する周囲のコンカテマー間において、配列が成功裏に解像されることを示す。
【図２６Ｂ】コンカテマー標的の配列決定のために使用される基材に結合した、コンカテマーの画像を示し、近接する周囲のコンカテマー間において、配列が成功裏に解像されることを示す。
【図２６Ｃ】コンカテマー標的の配列決定のために使用される基材に結合した、コンカテマーの画像を示し、近接する周囲のコンカテマー間において、配列が成功裏に解像されることを示す。
【図２６Ｄ】コンカテマー標的の配列決定のために使用される基材に結合した、コンカテマーの画像を示し、近接する周囲のコンカテマー間において、配列が成功裏に解像されることを示す。
【図２７Ａ】本明細書に記載される方法およびシステムを用いた、大腸菌（E. coli）の、合成による配列決定の結果を示す。さまざまな塩基対のリードを示す。
【図２７Ｂ】本明細書に記載される方法およびシステムを用いた、大腸菌（E. coli）の、合成による配列決定の結果を示す。さまざまな塩基対のリードを示す。
【図２７Ｃ】本明細書に記載される方法およびシステムを用いた、大腸菌（E. coli）の、合成による配列決定の結果を示す。大腸菌の配列決定のための個々のスポットにおける、ベースコーリングの解像を示す。
【図２８】本明細書において提供される方法を遂行するようにプログラムされた、またはあるいはそのように構成されたコンピューターシステムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明のさまざまな態様が本明細書において示されかつ記載されているが、そのような態様が単なる例として提供されていることは、当業者には明らかである。無数の変形、改変、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者に想起され得る。本明細書において記載される本発明の態様のさまざまな代替物が採用され得ることが、理解されるべきである。
【００２９】
2つ以上の数値が連続していて、最初／最後の数値の前／後に「少なくとも」、「超」、または「より大きいかまたは等しい」との語が置かれている場合は常に、該「少なくとも」、「超」、または「より大きいかまたは等しい」との語は、該連続している数値において、それぞれの数値に適用される。たとえば、1、2、もしくは3より大きいかまたはそれらと等しい、とは、1より大きいかもしくは1と等しい、2より大きいかもしくは2と等しい、または3より大きいかもしくは3と等しい、と同義である。
【００３０】
2つ以上の数値が連続していて、最後の数値の後に「以下」、「未満」、または「より小さいかまたは等しい」との語が置かれている場合は常に、該「以下」、「未満」、または「より小さいかまたは等しい」との語は、該連続している数値において、それぞれの数値に適用される。たとえば、3、2、もしくは1より小さいかまたはそれらと等しい、とは、3より小さいかもしくは3と等しい、2より小さいかもしくは2と等しい、または1より小さいかもしくは1と等しい、と同義である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「中心間距離」との語は一般に、基材上の各分子の平均位置の間の差によって判定される、2つの近接する分子の間の距離を指す。平均最少中心間距離との語は、基材上に置かれた各分析物の中心とその最近傍の分析物の中心との間の平均距離を特に指すが、一方で、中心間距離との語はまた、基材上の分析物の密度に関連する限定の文脈においては、最少の中心間距離をも指す。本明細書において使用される場合、「ピッチ」または「平均有効ピッチ」との語は、概して、平均最少の中心間距離を指すために使用される。分析物の規則正しいアレイの文脈においては、ピッチはまた、画定された軸に沿って、近接する分子の間の中心間距離を決定するために、使用されてよい。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「オーバーレイ」との語（たとえば、画像をオーバーレイする）は一般に、複数のサイクルにわたって各分析物から検出される光学シグナル（たとえば位置および強度、またはピークの位置）の分布を生成するために、異なるサイクルからの画像をオーバーレイすることを指す。検出される光学シグナルのこの分布は、画像をオーバーレイすることによって、処理された人工的な画像をオーバーレイすることによって、または位置情報を含むデータセットをオーバーレイすることによって、生成され得る。したがって、本明細書において使用される場合、「画像をオーバーレイする」との語は一般に、複数のサイクルのそれぞれについて、単一の分析物に結合する単一のプローブからの光学シグナルについての位置情報の分布を生成するための、これら機構の任意のものを包含する。
【００３３】
「サイクル」は一般に、1つまたは複数のパスの完了、および検出可能な標識を基材から取り除くことによって、定義される。1サイクルにつき1つまたは複数のパスという、後続のサイクルが、実施され得る。本明細書において記載される方法およびシステムに関して、複数のサイクルが、単一の基材または試料に対して実施される。デオキシリボ核酸（DNA）配列決定に関して、複数のサイクルは、可逆的ターミネーター、および組み込まれたヌクレオチドから除去可能な、検出可能な標識の使用を必要とする場合がある。タンパク質に関して、複数のサイクルは、それらの適切な立体配置で折りたたまれたタンパク質を維持するか、または使用されるプローブが、結合効率がタンパク質の折りたたみの立体配置とは無関係であるようペプチド配列に結合するように選ばれるかのいずれかの、プローブを除去する（取り除く）条件を必要とする場合がある。
【００３４】
検出アッセイにおける「パス」とは一般に、検出可能な標識を含む複数のプローブが、結合した分析物に導入され、プローブと別個の標的分析物との間に選択的な結合が生じ、そして検出可能な標識から複数のシグナルが検出されるというプロセスを指す。パスは、標的分析物に特異的に結合する抗体のセットの導入を含む。パスはまた、合成による配列決定中に伸長する鎖への組み込みのための、標識されたヌクレオチドのセットの導入を含み得る。基材からすべての検出可能な標識が取り除かれる前に、または検出可能な標識もしくは可逆的ターミネーターが配列決定中に組み込まれたヌクレオチドから除去される前に、プローブの異なるセットの複数のパスが存在し得る。一般的に、4つのヌクレオチドがパス中に使用される場合、サイクルは、標準的な4つのヌクレオチドでの合成による配列決定について、単一のパスのみを含む場合がある。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「画像」とは一般に、サイクル中またはサイクル内のパス中に取得される、フィールドの画像を指す。いくつかの態様において、単一の画像は、単色の検出可能な標識の検出に限定される。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「フィールド」との語は一般に、画像化される基材の、単一の領域を指す。典型的なアッセイ中に、単一のフィールドは、1サイクルにつき少なくとも1回画像化される。たとえば、4色を用いる20サイクルのアッセイについて、すべて同じフィールドの、20 * 4 = 80枚の画像が存在し得る。
【００３７】
「標的分析物」または「分析物」とは一般に、同定、定量化、あるいは特徴付けされようとする、分子、化合物、複合体、物質、もしくは成分を指す。標的分析物は、限定するものではないが、例として、単一の分子（任意の分子サイズのもの）、単一の生体分子、ポリペプチド、タンパク質（折りたたまれている、もしくは折りたたまれていない）、ポリヌクレオチド分子（リボ核酸（RNA）、相補的DNA（cDNA）、もしくはDNA）、それらの断片、修飾核酸などのそれらの修飾分子、またはそれらの組み合わせを含み得る。1つの態様において、標的ポリヌクレオチドは、合成による配列決定を容易にするように、ハイブリダイズされるプライマーを含む。標的分析物は、本明細書において記載される光学的検出方法を用いて標的分析物を配列決定する、同定する、および定量化するために使用され得るプローブによって、認識される。
【００３８】
「プローブ」とは一般に、本明細書において使用される場合、分子、細胞の構成要素もしくは構造、または細胞の特性を検出するまたは評価するための、他の分子（たとえば合成による配列決定中に標識される相補的ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは全長のタンパク質等）、細胞の構成要素もしくは構造（脂質、細胞壁等）、または細胞に結合することができる、分子を指す。プローブは、標的分析物に結合する構造または構成要素を含む。いくつかの態様において、複数のプローブが、同じ標的分析物の異なる部分を認識してよい。プローブの例は、限定するものではないが、標識された可逆的ターミネーターヌクレオチド、アプタマー、抗体、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド（DNA、RNA）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。プローブとしての、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせはまた、以下に詳細に記載される。
【００３９】
プローブは、プローブの標的分析物への結合を検出するために使用される、検出可能な標識を含み得る。プローブは、直接的にまたは間接的に、標的分析物に結合され得るか、ハイブリダイズされ得るか、コンジュゲートされ得るか、もしくは共有結合され得る。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」との語は一般に、プローブが標的分析物に結合され、そして光学画像化システムを用いて画像化される際に、検出可能な光学シグナルを発生させることができる、プローブに結合される分子を指す。検出可能な標識は、直接的にまたは間接的に、プローブに結合され得るか、ハイブリダイズされ得るか、コンジュゲートされ得るか、もしくは共有結合され得る。いくつかの態様において、検出可能な標識は、蛍光分子または化学発光分子である。プローブは、検出可能な標識を介して光学的に検出され得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「光学分布モデル」との語は一般に、点光源からの光検出に関する統計学的な確率の分布を指す。これらは、たとえばガウス分布を含む。ガウス分布は、光学分布モデルとして点像分布関数を生成するために、検出において予想される収差を含むように修正され得る。
【００４２】
本明細書において、基材の表面に結合している密集して詰め込まれた分析物に結合したプローブの、光学検出および識別を容易にするシステムおよび方法が、提供される。部分的には、本明細書において記載される方法およびシステムは、基材上の各分析物の相対位置の同定の正確性を改善するために、基材の表面上の複数の標的分析物の、繰り返しの検出に依存する。この情報はその後、各サイクルについての基材のフィールドの各画像におけるシグナルの解像を実施して、標的分析物に結合したプローブからのシグナルを信頼性をもって同定するために、使用され得る。いくつかの態様において、解像はデコンボリューションを含む。いくつかの態様において、このタイプのデコンボリューション処理は、活性化光によって活性化された場合にオーバーラップする放出スペクトルを有する標的分析物に結合する、異なるプローブの間を区別するために使用され得る。いくつかの態様において、デコンボリューション処理は、光学シグナルを隣接する分析物から分離するために使用され得る。これは、光学システムの回折限界のために光学的検出が困難である密度を有する分析物を有する基材にとって、特に有用である。
【００４３】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法およびシステムは、配列決定のために特に有用である。高密度に詰め込まれた基材上での、信頼性を有する光学的検出を容易にする方法およびシステムを提供することにより、試薬、使用されるクローン分子の数、処理と読み取りの時間などの、配列決定に関連するコストをすべて削減することができ、配列決定技術、具体的には、光学的に検出されるヌクレオチドを用いる、合成による配列決定を、大きく進展させる。
【００４４】
本明細書において記載されるシステムおよび方法は、進展中の配列決定技術に重要な関連を有するが、本明細書において記載される方法およびシステムは、概して、単一分子のレベルでのものを含む、基材の表面に結合した分析物の光学的検出に適用可能である。
【００４５】
配列決定コストの削減
配列決定技術は、IlluminaおよびComplete Genomicsなどの会社によって開発された、画像に基づくシステム、ならびにIon TorrentおよびOxford Nanoporeなどの会社によって開発された、電気に基づくシステムを含む。画像に基づく配列決定システムは、現在、既存のすべての配列決定技術の中で最少の配列決定コストを有する。画像に基づくシステムは、高スループットの画像化光学系および低コストの消耗品の組み合わせによって低コストを達成する。しかしながら、先行技術の光学的検出システムは、部分的には光学システムの回折限界のため、約1ミクロンという、近接する解像可能な分子間の最少の中心間の間隔を有する。いくつかの態様において、既存の生化学を用いる、画像に基づく配列決定システムに関して、回折限界未満の、詰め込みの増大した密度に対応するために、反復検出、分析物の正確な位置の決定、および画像化されたシグナルの高度に正確なデコンボリューションのための位置情報の使用を用いる、有意により低いコストを達成するための方法が、本明細書において記載される。
【００４６】
高密度に詰め込まれた分析物の層および検出方法
本明細書において、回折限界未満の中心間の間隔で表面上に付着した分析物からのシグナルの画像化を容易にするためのシステムおよび方法が提供される。これらのシステムおよび方法は、超分解能の画像を生成するために、先進の画像化システムを使用し、かつ、高い正確性での基材上の分子の位置決定を容易にするために、反復検出を使用し、かつ、高密度に詰め込まれた表面上の各分子についてのシグナルのアイデンティティを高い正確性で取得するために、画像の解像を使用する。これらの方法およびシステムは、高密度に詰め込まれた基材上での、合成による配列決定を可能にして、高い正確性での高効率かつ非常に高スループットのポリヌクレオチドの配列決定を提供する。
【００４７】
配列決定システムに関する主なコスト構成要素は、第一にはバイオチップおよび試薬を含む消耗品、そして第二には機器コストである。10ドルの30Xゲノム、すなわち100倍のコスト削減に到達するためには、単位面積あたりのデータの量を100倍増大させる必要があり、かつデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させる必要がある。
【００４８】
図1は、シーケンサーのスループット 対 アレイのピッチを示し、そして10ドルゲノムのために必要とされる基準を満たすシステム設計を概説する。基本的な考え方は、100倍のコスト削減を達成するために、単位面積あたりのデータの量を100倍増大させる必要があり、かつデータ点あたりの試薬の量を100倍低下させる必要がある、というものである。コストにおけるこれらの削減を達成するために、本明細書において、回折限界未満の密度で基材の表面上に付着したポリヌクレオチドの、信頼性のある配列決定を容易にする方法およびシステムが提供される。これらの高密度アレイは、より効率の良い試薬の使用を可能にし、かつ単位面積あたりのデータの量を増大させる。加えて、検出の信頼性の増大は、配列決定および検出において、誤差を同定しそして補正するために合成され得るクローンコピーの数の減少を可能にし、試薬のコストおよびデータ処理のコストをさらに減少させる。
【００４９】
基材の表面上における、分析物の高密度分布
図2Aは、240 nmのピッチで80 nmの直径の結合領域（スポット）という高密度領域の、提案される態様を示す。この態様において、単鎖DNA分子のみがチップ上の特定の領域に結合した、規則的なアレイが使用され得る。いくつかの態様において、スポットを埋め尽くさないよう、40 kBより小さいコンカテマー（すなわち、連続して連結された同じDNA配列の複数のコピーを含む、長く連続したDNA分子）が使用される。コンカテマーのサイズはほぼ領域に対応しており、同じ増幅プロセスが使用される場合、より小さいコンカテマーの予測される長さは、およそ10コピーをもたらすおよそ4 kB〜5 kBとなり得ることを意味する。4 kBの長さのDNAを使用し、そして各コンカテマーを直接的に配列決定することもまた、可能である。別の選択肢は、排他的な分子を作るのに必要なサイズまで全長を伸ばすために、DNAのより短いセグメントに、配列決定されないフィラーDNAを結合させることである。
【００５０】
図2Bは、1,000ドルゲノムのために使用される試料の有効ピッチと比較した、提案されるピッチの比較である。新規なアレイの密度は170倍高く、100倍高い密度を達成するという基準を満たす。単位面積あたりの画像化スポットあたりのコピーの数もまた、先行する既存のプラットフォームよりも少なくとも100倍低いという基準を満たす。これは、試薬コストが基準よりも100倍費用効果が高いことを確実にする助けとなる。
【００５１】
高密度に詰め込まれた単一生体分子の画像化および回折限界
画像化プラットフォームの増大した分子密度に関する制約の1つは、回折限界である。光学システムの回折限界のための方程式は、
D = λ/2NA
であり、ここでDは回折限界であり、λは光の波長であり、かつNAは光学システムの開口数である。典型的な空気中の画像化システムは、1.0〜1.2のNAを有する。λ = 600 nmを用いると、回折限界は250 nm〜300 nmとなる。水浸システムに関して、NAは1.0であり、300 nmの回折限界となる。
【００５２】
もしも、生体分子を含む、アレイ上または他の基材表面上の特徴物が近すぎると、2つの光学シグナルは実質的にオーバーラップして、画像のみに基づいて信頼性をもって解像することができない、単一のブロブしか見えない。これは、動く基材の不正確な追尾によるぼけ、またはセンサーと基材の表面との間の光路における光学的変動などの、光学画像化システムによって導入される誤差によって悪化し得る。
【００５３】
顕微鏡の試料平面における1点から発せられる透過光または蛍光放出の波面は、波面を効果的に広げる対物レンズの開口の端で回折し、有限であるが元の点より大きいサイズの中心ディスクを有する回折パターンへと広がった、点光源の画像を生成する。したがって、光の回折のため、試料の画像は、試料に存在する実際の細部を完全に表現することはない、なぜならば、それを下回って顕微鏡の光学システムが構造の細部を解像することができない、下限が存在するからである。
【００５４】
顕微鏡での、波長以下の構造の観察は、回折限界のために困難である。蛍光タンパク質またはポリヌクレオチドなどの、顕微鏡における点物体は、中間平面において、干渉の作用によって作り出された回折パターンを含み得る画像を生成し得る。高度に拡大されると、点物体の回折パターンは、一連の回折環によって囲まれた中心のスポット（回折ディスク）を含むように観察され得る。組み合わせて、この点光源回折パターンは、エアリーディスクと称される。
【００５５】
エアリーパターンの中心スポットのサイズは、光の波長、および対物レンズの開口角に関連付けられる。顕微鏡の対物レンズに関して、開口角は開口数（NA）によって記述され、これは試料から光を集めることができる対物レンズの半角である、 sin（θ）との語を含む。分解能に関して、横方向の（x、y）画像平面における回折エアリーディスクの半径は、以下の式によって定義される：アッベ分解能 = λ/2*NA、ここでλは透過光における光の平均波長、または蛍光における励起波長帯域である。対物レンズの開口数（NA = n・sin(θ)）は、開口角のサイン（sin(θ)）を乗じた画像化媒質（n；通常は空気、水、グリセリン、または油）の屈折率によって定義される。この関連性の結果、点光源によって作られるスポットのサイズは、波長が減少するにつれて、および開口数が増大するにつれて、減少するが、常に有限の直径のディスクを維持する。アッベの分解能（すなわちアッベ限界）はまた、本明細書において回折限界と称され、かつ光学システムの分解能の限界を定義する。
【００５６】
2つのエアリーディスクまたは点像分布関数の間の距離が回析限界よりも大きい場合、2つの点光源は解像されるとみなされる（そして、容易に区別され得る）。そうでなければ、エアリーディスクはともに合体し、そして解像されないとみなされる。
【００５７】
したがって、波長 2で検出可能な標識の点光源から放出され、屈折率 n で媒質中を進み、そして半角0でスポットに収束する光は、直径：d = λ/2*NA を有する回折限界のスポットを作り出し得る。500 nm付近の緑色光で1のNA（開口数）であるとすると、回折限界はおよそ d = λ/2 = 250 nm（0.25 pm）であり、これは従来の画像化技術によって画像化され得る、表面上のタンパク質、ヌクレオチド、および他の配列決定基質（たとえば、図20に示す）などの分析物の密度を制限する。本明細書において、配列決定基質は、配列決定反応の鋳型など、配列情報がそれに由来する任意の分析物を含む。光学顕微鏡が、利用可能な最高の品質のレンズ要素を備え、完璧に調整され、かつ最大の開口数を有する場合でさえも、分解能は、最良のシナリオにおいて、光の波長のおよそ半分に制限されたままである。分解能を増大させるために、UV顕微鏡およびX線顕微鏡など、より短い波長が使用され得る。これらの技術は、より良い分解能を提供するが、しかし高価であり、生物学的試料におけるコントラストの欠如という難点があり、かつ試料に損傷を与え得る。
【００５８】
画像解像
いくつかの態様において、本明細書に記載の画像解像法はデコンボリューションを含む。デコンボリューションは、記録されたデータに対するコンボリューションの作用を逆転させるために使用される、アルゴリズムに基づくプロセスである。デコンボリューションの概念は、シグナル処理および画像処理の技術において広く使用されている。これらの技術は次々に、多くの科学および工学の分野において広く使用されているので、デコンボリューションは多くの応用性を提供している。
【００５９】
光学系および画像化において、「デコンボリューション」との語は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、望遠鏡、または他の画像化機器において起こる光学ひずみを逆転させるプロセスを指すために特に使われ、そうしてより明瞭な画像を作り出す。それは、通常、一連の顕微鏡画像処理技術の一部として、ソフトウェアアルゴリズムによって、デジタル領域においてなされる。
【００６０】
通常の方法は、機器を通り抜ける光路が光学的に完璧であると仮定して、光（または他の波）の理論上の点光源が機器を通り抜ける経路に関してひずみを記述する数学関数である、点像分布関数（PSF）を用いてコンボリューションされている。通常、そのような点光源は、最終的な画像に、小さなぼやけた領域をもたらす。この関数が決定され得る場合、その後は、その逆関数または補関数をコンピューターで計算し、そして取得された画像をそれでコンボリューションすればよい。デコンボリューションは、フーリエ終域における除算に写像する。これは、フーリエ変換の対象である実験データにデコンボリューションが容易に適用されることを可能にする。一例はNMR分光法であり、これにおいてはデータは時間領域において記録されるが、周波数領域において分析される。指数関数による時間領域データの除算は、周波数領域におけるローレンツ（Lorenzian）線の幅を減少させる作用を有する。結果は、本来の、ひずみのない画像である。
【００６１】
しかしながら、回折限界の画像化のためには、点像分布関数が完全に既知であるとしても、デコンボリューションは、回折限界を超えて分解能を改善するために、シグナルをさらに精製することも必要とする。ナイキスト距離より短い距離にある2つの物体を信頼性をもって分離することは、非常に困難である。しかしながら、ナイキスト距離よりもはるかに短い距離で隔てられている物体を信頼性をもって検出するために、反復検出、分析物の位置決定、アラインメント、およびデコンボリューションを用いる方法ならびにシステムが、本明細書において記載される。
【００６２】
配列決定のための、高密度でランダムな、コンカテマーの層の作製
本明細書において、高密度コンカテマー層を作製および使用する方法もまた、提供される。いくつかの態様において、コンカテマーは、基材の表面上において、個々の検出および配列決定のための、密接して詰め込まれた層の中で、ランダムに分布している。いくつかの態様において、本明細書において、コンカテマーが高い密度または平均中心間距離を達成するように、基材上で、コンカテマーの層を作製する、および該層をランダムに分布させる方法が、提供される。
【００６３】
コンカテマー（すなわちCAT）は、ss環状DNAのローリングサークル型増幅（RCA）によって作製される、長い一本鎖のDNA分子である。いくつかの態様において、コンカテマーはそれぞれ、既知の配列アダプターの間に挿入された標的DNA配列の、数コピーから数百コピーまでを含む。標的DNA配列を含むコンカテマーのライブラリーを、作製することができる。いくつかの態様において、最少のオーバーラップを有するかまたは近接するコンカテマー間の最少距離を有し、かつ基材上の特別な結合ポイントを必要とすることなく、基材上において密接して詰め込まれたコンカテマーの単層を形成させることを容易にするような、それ自体が排他性である（self-exclude）という特徴を、コンカテマーは含む。本明細書において記載されるように、これらの排他的な特徴は、層の密接した詰め込みを容易にし、一方で、光学画像化によって解像されるには近すぎる、最近傍のコンカテマーの数を最少にする。
【００６４】
いくつかの態様において、本明細書において表面を含む基材が提供され、ここで該表面には、密接して詰め込まれ、ランダムに分布している、増幅された標的の集団、たとえばDNAコンカテマーの集団が、結合している。
【００６５】
いくつかの態様において、この基材は、全ゲノムまたは全エキソームの配列決定を含むヌクレオチドの配列決定を容易にするために、使用される。いくつかの態様において、多数の個別の細胞性標的を配列決定することができる。これらは、クラスター配列決定を用いる、標的の選択されたパネルを意味し得る。本明細書に記載される配列決定法は、たとえば、 (i) 複数の遺伝的バリアントを（たとえば、ジェノタイピング、薬剤耐性決定、父子鑑定、もしくは同定のために）検出するために、 (ii) パスウェイダイナミクスの調査（enumeration of pathway dynamics）に関して遺伝子発現解析のため複数のcDNA分子を配列決定するために、または (iii) バイサルファイト処理の後で、標的ポリヌクレオチド上のメチル化残基を検出するために、使用することができる。いくつかの態様において、本態様に記載されるように、配列決定方法は、標的の− 200コピーの小さなクラスターを作製するために、標的の増幅を必要とする。
【００６６】
該方法は、1つの態様において以下を含む：リガーゼ反応を用いて、ゲノム全体にわたる標的のための環状化された一本鎖分子を作製する工程、数百コピーを有する、環状化され増幅された標的（CAT）のクラスターを作製するために、等温全ゲノム増幅法を用いて、環状化されたDNAを増幅する工程、およびおよそ250 nmであっておよそ225〜275 nmに分布する均一なサイズを有するナノスフェアを作製するために、適切な試薬を用いてCATがコートされることを確実にする工程。
【００６７】
該方法は、1つの態様においてさらに以下を含む：バイオチップ上において、高密度に詰め込まれた集団中にCATを分布させる工程、およびコーティング材料を除去しつつ、表面にCATを結合させる工程、および配列決定反応の複数サイクルの間、CATがスライドに結合したままであることを確実にする工程。
【００６８】
いくつかの態様において、標的の生体分子は検出および／または配列決定され、そして反復ハイブリダイゼーションに基づいて認証される。これは、鋭敏性および／または特異性の低下の改善を含む、正確性の改善を容易にし、標的の同定および／または配列決定の改善をもたらす。
【００６９】
いくつかの態様において、一塩基伸長アッセイおよびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、認証を提供するために、単一分子レベルで実施される。このレベルの認証は、光学画像化を用いた際には以前には利用不可能であったより高い正確性で、相対量および絶対量を定量化するための、非常に高度な多重化ならびにデジタル計数を可能にする。
【００７０】
配列決定
光学的検出画像化システムには回折限界があり、そのためこれは、配列決定において典型的に使用されるフルオロフォアに関して、300 nmの、理論上の最大分解能を有する。現在まで、最良の配列決定システムは、それらのアレイ上で600 nmの、または2X回折限界の、近接するポリヌクレオチドの間の中心間の間隔を有している。この 2X という係数は、結果として位置の誤差を生じ得る、強度の、アレイの、および生物学的な変動を明らかにするために、必要とされる。10ゲノムを達成するために、およそ200 nmの中心間の間隔が必要とされ、これは回折限界未満の画像化能力を必要とする。
【００７１】
配列決定に関して、本明細書において記載されるシステムおよび方法の目的は、光学システムの回折限界未満の中心間の間隔を有する基材上で、配列決定されるポリヌクレオチドを解像することである。
【００７２】
本明細書において記載されるように、本発明者らは、部分的には、各分析物の位置を高い正確性（たとえば10 nm以下のRMS）で同定することにより、回折限界未満での画像化を達成するための方法およびシステムを提供する。比較として、最新のSuper Resolution systemsは、20 nm RMSにまで下げた正確性でしか位置を同定することができず、本システムより2Xで劣る。したがって、本明細書において開示される方法およびシステムは、基材上に高密度に詰め込まれた分子を同定する回折限界未満の画像化を可能にして、酵素1単位あたりの高いデータレート、時間1単位あたりの高いデータレート、および高いデータ正確性を達成する。本明細書において記載されるように、これらの回折限界未満の画像化技術は、反復検出を用いる技術に対して広く適用可能である。
【００７３】
複数サイクルの配列決定
コンカテマー
CATを作製する方法
環状化されたssDNA標的の作製
いくつかの態様において、本明細書において、基材の表面上の層として、たとえば、ランダムに分布しており、高密度に詰め込まれた層として分布させるための、コンカテマーのライブラリーを調製する方法が記載される。配列決定されようとする標的DNAを含むコンカテマーを合成するために、最初に標的DNAを増幅することができ、それから環状DNA鋳型へと変換することができる。いくつかの態様において、環状DNA鋳型のローリングサークル型増幅によって形成されるコンカテマーの前駆体を形成させるために、増幅産物は、環状鋳型のライゲーションを受け、これは、鋳型を使用する酵素によるライゲーション（たとえば、T4 DNAリガーゼ）を用いて、または特別なDNAリガーゼを使用する鋳型無しのライゲーション（すなわち、CircLigase）を用いて、実施することができる。
【００７４】
RCA／RCRの基本的な技術
ローリングサークル型複製は、一方向性の核酸複製のプロセスを指し、これは、DNAまたはRNAの環状分子の複数コピーを迅速に合成することができる。
【００７５】
RCA（ローリングサークル型増幅）は等温での核酸増幅技術であり、該増幅においてポリメラーゼは、環状鋳型にアニールしたプライマーに1ヌクレオチドを連続的に付加し、数十個から数百個のタンデムリピート（環状鋳型に相補的）を含む、長いコンカテマーssDNAをもたらす。
【００７６】
ローリングサークル型増幅は、環状DNA鋳型（tmeplate）を以下のものに接触させることによって実施され得る：
1. DNAポリメラーゼ。
2. ポリメラーゼに適合性を有する、適切な緩衝液。
3. 短いDNAプライマーまたはRNAプライマー。
4. デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）。
【００７７】
いくつかの態様において、ローリングサークル増幅に使用されるポリメラーゼは、DNA増幅用にはPhi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、またはVent exo- DNAポリメラーゼであり、かつRNA増幅用にはT7 RNAポリメラーゼである。RCAは、一定の温度（室温〜37℃）で、溶液無しであってかつ付着している標的の上部において（固相増幅）、実施することができる。DNA RCA反応は、典型的には、プライマーに誘導される一本鎖DNAの伸長によって進行する。
【００７８】
いくつかの態様において、物理的な基材の上に、たとえばフローセルなどの上にロードするための、配列決定基質のコンカテマーライブラリーを構築するための方法が、図19に示される。いくつかの態様において、配列決定基質のコンカテマーライブラリーは、図20に示されるように構築される。「ヘア」とは、逆方向に合成するリバースプライマーを用いることによって、伸長するコンカテマーDNAとして作製することができる、ssDNA分子である。これらの「ヘア」は、コンカテマーのサイズおよび／またはその排他的な特性を制御するために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される配列決定反応は、ssDNA「ヘア」を鋳型として用いて行われる。
【００７９】
RCR反応の終結
CATのローリングサークル型増幅は、phi29酵素の必須の補因子であるMg2+をキレートするEDTAを添加することによって、停止させることができる。Phi29は、強い鎖置換活性を有する（displacing）ポリメラーゼであるが、一方で、配列決定に用いられる標準的なポリメラーゼ、たとえばTherminator 9は、弱い鎖置換活性しか有さない。この基質を配列決定するために、さらに強い鎖置換活性を有する酵素が使用され得、または該酵素を適合させ得る。
【００８０】
あるいは、一本鎖結合タンパク質（SSB）もしくはヘリカーゼ、またはそれらの組み合わせが、鎖置換（displacement）を補助するために使用され得る。これらは、伸長反応に添加されてよく、または配列決定のための基質を調製するためのプレインキュベーション操作として使用されてもよい。
【００８１】
あるいは、ローリングサークル反応は、未標識の可逆的ターミネーターを用いて停止させてもよい。これは、溶液内でより均一な停止を生じさせる手段であり得、EDTAを用いる停止と比べて、より均一なサイズのCATをもたらし得る。加えて、配列決定反応はその後、保護を解除する（unblocking）操作から開始され得、その後に、標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いた伸長が続き得る。これは、伸長している3’末端が、合成による配列決定の通常の反応を受けやすかった場所である基質の、自然選択を可能にし得る。
【００８２】
phi29は、CATの伸長末端に非常に強固に結合しているようである。反応を停止させるための、可逆的ターミネーターの使用は、該相互作用を不安定化させ得る。カオトロピック塩または界面活性剤のような他のタンパク質変性剤が、phi29を取り外して配列決定反応を可能にするために、必要であり得る。
【００８３】
コンカテマーの組成
CATは、伸長する一本鎖において、標的DNAの同一コピーをいくつか有する。CATsはまた、上述のように作製されたssDNA「ヘア」において、標的DNAの同一なリバースコピーもいくつか有し得る。
【００８４】
いくつかの態様において、コンカテマーは、少なくとも1,000ヌクレオチドの長さである（400,000以下）。
【００８５】
いくつかの態様において、コンカテマーは、直径が少なくとも150 nmである（300 nm以下）。好ましくは、近接するコンカテマー間の排他ゾーンは、所望の密度またはピッチを達成するために必要な最少中心間距離を、下回るわけではない。
【００８６】
高密度に詰め込まれたランダムアレイ
アレイ（ランダムに分布しており、密接して詰め込まれた、コンカテマーの層）を作製する方法
間隔の制御
本明細書において、パターン化されていない表面上に配置されたCAT間の、分布の最少中心間距離を制御するためのメカニズムが、いくつか提供される。いくつかの態様において、色素標識された配列決定基質間のクロストークを最小限にしてCATが配列決定されることができるような、近接するCAT間の制御された最少中心間距離を有するCATの層であって、均一であり、密接して詰め込まれており、自己集合性であり、ランダムである、CATの層の形成を、本方法および組成物は容易にする。
【００８７】
CATそれ自体は、それらの強い負電荷のために、溶液中で互いに反発性であるが、それにもかかわらず、いったん表面に吸着されてしまうと、標識された近接するCATの、拡散律速の（diffusion-limited）有効な解像を行うには、CATが互いに近くなりすぎる可能性がある。
【００８８】
いくつかの態様において、CATそれ自体のサイズを変えることも、コンカテマーが含む配列決定基質のコピー数を変えることも無しに、コンカテマーの有効排他サイズを増大させるために、コンカテマーは、反発性または誘引性の物質の殻に「包まれる」かまたは「覆われる」。
【００８９】
いくつかの態様において、基材の表面上においてCATが吸着する、タンパク質層は、表面から突き出た相互作用タンパク質を配置するように修飾される。たとえば、表面に先に吸着させておいたタンパク質との相互作用によって、CATは、ガラス表面、シリコン表面、または修飾されている（たとえばアミノシラン化されている）表面と、相互作用することができる。
【００９０】
したがって、CATの、または結合ペアのタンパク質パートナーの修飾は、CATのための特別な結合ポイント無しで、表面上において、均一であって高密度に詰め込まれているコンカテマーの層を達成するために、サイズ排除を補助することができる。いくつかの態様において、これらの修飾は、CATまたはそのタンパク質結合パートナーをコートするために、PEGもしくは多糖のような分子を架橋または結合させることを含む。
【００９１】
図21Aに示されるように、UBは、コートされたコンカテマーを示す態様である。
【００９２】
この態様において内部コアは、絡み合ったDNA標的の複数コピーであり得る。外層、すなわちコーティングは、PEGのような化合物、両性イオンの特徴を有する化合物、アンフォライン両性電解質、スルホベタイン、および、核酸と相互作用する正電荷を内側に有し、かつナノスフェアが凝集しないことを確実にする負電荷を外側に有する、他の類似する分子を含むことができる。
【００９３】
チップ上へのCATのローディング
いくつかの態様において、コンカテマーは、基材のパターン化されていない表面上において、高密度の層の中に分布している。この密接して詰め込まれた形態は、密集して詰め込まれた配列決定基質の形成を容易にし、より高いスループットおよび／またはより低いコストの配列決定を可能にする。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。パターン化されていない表面上の、高密度に詰め込まれたコンカテマー層の一例は、図25に示される。
【００９４】
いくつかの態様において、コンカテマーは、バイオチップ上にロードされ、そして、+/- 25 nmの変動を有する− 250 nmの中心間距離を可能にするように、密接して詰め込まれる。
【００９５】
いくつかの態様において、約315 nmの、分子間の平均中心間距離。いくつかの態様において、該複数の分析物のうちの近接する分析物が、少なくとも10ナノメートル（nm）の、50 nmの、100 nmの、110 nmの、120 nmの、130 nmの、140 nmの、150 nmの、160 nmの、170 nmの、180 nmの、190 nmの、200 nmの、210 nmの、220 nmの、230 nmの、240 nmの、250 nmの、260 nmの、270 nmの、280 nmの、290 nmの、300 nmの、310 nmの、320 nmの、330 nmの、340 nmの、350 nmの、360 nmの、370 nmの、380 nmの、390 nmの、400 nmの、410 nmの、420 nmの、430 nmの、440 nmの、450 nmの、460 nmの、470 nmの、480 nmの、490 nmの、500 nmの、またはさらに大きい、中心間の平均間隔を有し得るように、該複数の分析物（たとえば核酸分子）は、表面に近接して付着し得る。中心間の平均間隔は、500 nm、490 nm、480 nm、470 nm、460 nm、450 nm、440 nm、430 nm、420 nm、410 nm、400 nm、390 nm、380 nm、370 nm、360 nm、350 nm、340 nm、330 nm、320 nm、310 nm、300 nm、290 nm、280 nm、270 nm、260 nm、250 nm、240 nm、230 nm、220 nm、210 nm、200 nm、190 nm、180 nm、170 nm、160 nm、150 nm、140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、50 nmより小さいかもしくはそれらと等しくてよく、またはさらに小さくてもよい。
【００９６】
いくつかの態様において、検出間のクロストークを最小にする、近接するコンカテマー間の中心間距離のより低い閾値を達成するためのコーティングを、コンカテマーは含む。いくつかの態様において、表面にコンカテマーを結合させた後で、コーティングは溶解され、かつCATは表面に結合し、そして配列決定されることができる。
【００９７】
BSAなどの別のタンパク質は、CATもしくはタンパク質結合パートナーに化学的に架橋させること、またはストレプトアビジン（strepavidin）相互作用を介して、スペーサータンパク質（たとえばBSA）を、共通のライブラリーアダプター配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合させることのいずれかによって、使用され得る。CATをコートするためのBSAの使用は、結合したCATの層においてタンパク質ゲルを生じさせるという、追加の利点を有し得、これは、酵素反応のための局所環境を、ポリメラーゼが通常作用する場所である、核の天然の環境に、より類似したものにさせ得る。
【００９８】
共通のライブラリーアダプター配列に対して部分的に相補的であり、かつ相同性を有さない該配列を越えて伸長する、長い一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることもまた可能であろう。いくつかの態様において、長い一本鎖オリゴヌクレオチドは、上の段落[00113]において言及されたヘアである。そのような長いオリゴヌクレオチドは、CATが含む配列決定基質の数を変えることなくCATのサイズを増大させるように作用し得る。表面への結合後、これらの長いオリゴヌクレオチドは洗い流され得、そして各CATは、その結合部位の中心に向かって崩壊し得るので、近接するCAT間の有効中心間距離を増大させる。
【００９９】
タンパク質結合パートナーを（ストレプトアビジン（strep-avidin）などの架橋または結合によって）修飾して、反発性である領域、たとえばその負電荷のために反発性である領域とは別に、誘引性の部位であるタンパク質結合部位を有する表面を作製するために、DNAもまた使用され得る。
【０１００】
密接して詰め込まれたコンカテマー層の、パターン化されていない表面上への付着
水溶液から、パターン化されておらず接着性である固体表面上への、生物学的分析物の最適な詰め込み密度を制限するものの1つは、接着した分析物が横方向に動くことができず、かつ結合した分子間の間隔を最小化することができないために、表面への分析物のランダムな結合は、最大限密接した詰め込みをもたらさないことである。結果的に、このランダムで不可逆的な、分析物の粘着は、それがなければ最大限に密接したアレイとして配置され得るものにおいて、欠陥のある配置を生じさせる。
【０１０１】
しかしながら、タンパク質および核酸を含む多くの生物学的分析物は、界面活性作用を有することが知られており、かつ空気−水界面へと移動して、該界面において表面張力を低下させ、生体分子の準安定な単層を生成する。この場合、界面活性作用を有する分析物は、界面において横方向に自由に動き、そして、最大限の詰め込みのための駆動力である、溶液中で反発的な疎水性相互作用を用いて、最大限密接して詰め込まれた密度を達成する。
【０１０２】
したがって、いくつかの態様において、すでに空気と接触している固体表面全体にわたって、生体分子溶液のかたまりを引き延ばすかまたは引っ張ることによって、空気−水界面にある、密接して詰め込まれ、自発的に形成された、生体分子の単層構築物を、固体表面上に移すかまたは付着させることができる。それにより、かたまりが固体表面全体にわたって移動する際に、空気−水界面にある、密接して詰め込まれた生体分子構築物を、3相（空気−水、固体）が接触する点から、固体表面上に付着させる。
【０１０３】
いくつかの態様において、タンパク質の層は、CATが添加される前に表面上に形成され得る。その後、すでに形成されているタンパク質層にCATが添加され得る。この連続的な添加は、結合タンパク質が、修飾されているパートナーである場合に、特に有効であり得る。
【０１０４】
配列決定
配列決定のワークフロー
いくつかの態様において、本明細書において、たとえば、高密度に詰め込まれた層をパターン化されていない表面上に形成し、そして反復される、合成による配列決定を実施することによって、コンカテマーからポリヌクレオチドの配列を検出するための方法が、提供される（たとえば図23参照）。いくつかの態様において、該表面はパターン化されている。
【０１０５】
標的の検出、および反復ハイブリダイゼーションに基づくそれらの認証は、標的の同定、および定量化のための計数を可能にする、重要な特徴である。
【０１０６】
同期化およびシグナルコーリング（ddNTPによる、未反応のオリゴヌクレオチドのキャッピング）
いくつかの態様において、合成による配列決定は、未伸長のオリゴヌクレオチドをキャッピングするために、伸長サイクル後に不可逆的ddNTPターミネーターを添加することを含む。たとえば、標識された可逆的ターミネーターおよび未標識の（cold）可逆的ターミネーターの混合物を用いた、最大限の反応開始（initiation）ならびに／または伸長を行った後での、（たとえば、ddNTPのより優れた組み込みを行うことができる、異なるポリメラーゼ）および非常に高濃度の全4種類のddNTPを用いての、1サイクルの伸長。この操作は、当該サイクルにおいて伸長しなかった、CAT内の配列決定鋳型のいずれの伸長も、不可逆的に終結させ得る。これは、反応開始（initiation）または伸長の効率の悪さに比例して、シグナルを進行性に消失させ得るが、重要なことにこれはまた、CAT内のそれら鋳型の後に続くサイクルにおいてバックグラウンドを低下させ得る、いずれかのサイクルにおいて「スキップされた」該伸長は、CAT内の同一の鋳型のいくつかにおけるラギング合成からの混ざったシグナルをもたらすプロセスである。
【０１０７】
このプロセスは、CAT内の鋳型の同期を増大させ得、したがってラギング鋳型からのシグナルを減らし、そのため配列における正しい塩基からの、より純粋なシグナルを生じさせ得る。他の条件が同等であれば、これは、より長い有効配列リードを生じさせ得る。
【０１０８】
反応
CATは、標的DNAの同一なコピーをいくつか有するが、ローリングサークル型増幅中に産生される最後のコピーは、活発に伸長中の3’末端を含む点で独特である。このss環、および活発に伸長中のその末端は、CATであるDNAの球の中心付近にあるようである、つまりこれは、CATの単層内の、排他ゾーンの中心付近である。これはまた、単層がそこに形成される表面から、離れている。活発に伸長中の末端を表面から離しておくことは、配列決定反応に使用される化学物質および酵素をより近づきやすくさせ得、かつまた、おそらく、表面上のバックグラウンド蛍光の焦平面よりも高く色素標識を持ち上げる。これらの特性は、単一分子配列決定にとって理想的なものである。
【０１０９】
ペアエンド配列決定
UMIの態様
固有の分子識別子（Unique Molecular identifier）（UMI）は、分子にタグを付けて、重複（duplicate）PCR産物の同定を可能にするために、およびまた、誤りを低下させる二本鎖配列決定の適用を可能にするために、使用されている。
【０１１０】
いくつかの態様において、UMIを含むアダプターは、コンカテマーを形成するために使用される、環状化されたDNA鋳型に組み込まれる。
【０１１１】
1つの態様において、図24に示されるように、UMIであるA1およびA2アダプターは、A鎖ならびにB鎖の5’末端および3’末端に付加される。A1およびA2は、試料IDに関するバーコードを有することができる。それらはまた、ライゲーション／環作製のために使用される領域、および両方の鎖の配列決定を可能にする、配列決定プライマーの結合領域をも有する。アダプターは、UMI配列をも有し得る。
【０１１２】
配列決定の完了後、UMIを、同じDNA断片から生じる環の位置を特定するために使用することができ、かつペアエンドリードとして解析することができる。ペアエンドリードは、リード長が短い場合にマッピングに有用である。
【０１１３】
UMIが使用され得るが、NIPT、PCR増幅されたパネル、およびゲノムの大部分などの、多くの応用物を、ペアエンド機能を有さなくても、信頼性をもって配列決定することができる。
【０１１４】
画像化および反復検出
本明細書において記載されるように、検出方法およびシステムのそれぞれは、回折限界未満の画像化を達成するために、反復検出を必要とした。反復検出は、結合および画像化、または可視光の光学シグナルを放出することができる検出可能な標識に結合した抗体もしくはヌクレオチドなどのプローブを含む。異なるサイクルからの、フィールドの一連の画像からの位置情報を用いることにより、高密度に詰め込まれた基材からのシグナルを解像するデコンボリューションを、光学画像化の回折限界のために不明瞭にされたシグナルからの個々の光学シグナルを効果的に同定するために、使用することができる。複数のサイクル後、分子の厳密な位置は、ますますより正確となり得る。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用のために生じる、クロストークマトリックスにおける既知の非対称に関するクロストーク補正を補助するために、追加の計算が実施され得る。
【０１１５】
分析物の光学的検出のための方法
いくつかの態様において、光学シグナルはデジタル化され、そして分析物は、各分析物についてのデジタルシグナルのコード（IDコード）に基づいて同定される。
【０１１６】
本明細書において記載されるように、分析物は固体の基材に付着しており、かつプローブは該分析物に結合する。プローブのそれぞれはタグを含み、かつ標的分析物に特異的に結合する。いくつかの態様において、タグは、同じ蛍光色を放出する蛍光分子であり、かつ、さらなる蛍光についてのシグナルが、後に続くパスのそれぞれにおいて検出される。パスの最中に、タグを含むプローブのセットが基材と接触し、それらが、それらの標的と結合することを可能にする。基材の画像がキャプチャーされ、そして検出可能なシグナルが、各パス後に取得された画像から解析される。検出可能なシグナルの存在および／または非存在についての情報は、基材上の検出された位置それぞれ（たとえば、標的分析物）について記録される。
【０１１７】
いくつかの態様において、本開示は、タグを含むプローブから放出された光学シグナルを検出するための操作、基材上のさまざまな位置において複数回のパスおよび／または複数回のサイクルの間に放出されたシグナルを計数するための操作、ならびに基材上の各標的分析物を同定するために、Kビットに基づく計算を用いてデジタル情報としてシグナルを解析するための操作を含む方法を、含む。後述のように、光学的に検出されるシグナルにおける誤りに対処するために、誤り訂正を使用することができる。
【０１１８】
いくつかの態様において、基材を、N個の標的分析物を含む分析物と結合させる。N個の標的分析物を検出するために、プローブ結合およびシグナル検出の、M回のサイクルが選択される。M回のサイクルのそれぞれは1つまたは複数のパスを含み、かつ、プローブの各セットがN個の標的分析物の1個に特異的に結合するように、各パスは、Nセットのプローブを含む。ある態様において、N個の標的分析物に対して、Nセットのプローブが存在する。
【０１１９】
各サイクルにおいて、各パスにプローブのセットを導入するための、あらかじめ定められた順序が存在する。いくつかの態様において、プローブのセットについてのあらかじめ定められた順序は、ランダム化された順序である。他の態様において、プローブのセットについてのあらかじめ定められた順序は、ランダム化されていない順序である。1つの態様において、ランダムでない順序は、コンピュータープロセッサによって選択され得る。あらかじめ定められた順序は、各標的分析物についてのキーとして表される。キーは、プローブのセットの順序を含むように生成され、そしてプローブの順序は、標的分析物のそれぞれを同定するためのコードとして、デジタル化される。
【０１２０】
いくつかの態様において、順序付けられたプローブの各セットは、標的分析物を検出するための別個のタグに関連付けられ、かつ別個のタグの数は、N個である標的分析物の数よりも少ない。その場合、N個の標的分析物それぞれを、M回のサイクルについてのM個のタグの配列と、整合させる。タグの順序付けられた配列は、同定コードとして、標的分析物と関連付けられる。
【０１２１】
光学的に検出されたプローブの定量化
検出プロセスの後で、各プローブプールからのシグナルは計数され、そしてシグナルの存在または非存在、およびシグナルの色が、基材上の各位置について記録され得る。
【０１２２】
検出可能なシグナルから、M回のサイクルのそれぞれにおいて、N個の別個の標的分析物についてKビットの情報が取得される。K X M = Lビットの情報 であり、かつ L ≧ log2 (N) であるような、Lビットの全情報を決定するために、Kビットの情報が使用される。Lビットの情報は、N個の別個の標的分析物のアイデンティティ（および存在）を決定するために使用される。サイクルが1回のみ（M = 1）実施される場合、K x 1 = L となる。しかしながら、分析物1つあたりのLビットの全情報をさらに多く生成するために、複数回のサイクル（M > 1）を実施することができる。後に続くサイクルのそれぞれは、標的分析物を同定するために使用される、追加の光学シグナル情報を提供する。
【０１２３】
実際には、シグナルにおいて誤りが生じ、そしてこれは、標的分析物の同定の正確性を悪化させる。たとえば、プローブは、誤った標的に結合する可能性があり（たとえば偽陽性）、または正しい標的への結合に失敗する可能性がある（たとえば偽陰性）。後述のように、光学的シグナル検出および電気的シグナル検出における誤りに対処するための方法が提供される。
【０１２４】
電気的検出方法
他の態様において、電気的検出方法が、基材上における標的分析物の存在を検出するために使用される。標的分析物には、オリゴヌクレオチドテール領域がタグ付けされ、そして該オリゴヌクレオチドタグは、溶液中の水素イオン濃度を測定するイオン感応性電界効果トランジスタ（ISFET、またはpHセンサー）を用いて検出される。ISFETは、2007年12月14日に提出されたRothbergらへの米国特許第7,948,015号、および2009年5月29日に提出されたRothbergらへの米国特許出願公開第2010/0301398号においてさらに詳細に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により組み入れられる。
【０１２５】
ISFETは、分析物の同定および特徴付けのための、鋭敏かつ特異的な電気的検出システムを提供する。1つの態様において、本明細書において開示される電気的検出方法は、コンピューター（たとえばプロセッサ）によって実施される。溶液のイオン濃度は、ISFETの電極によって、対数で表される電位へと変換されることができ、そして電気的出力シグナルが、検出かつ測定されることができる。
【０１２６】
ISFETは、DNA配列決定を容易にするために、以前から使用されている。一本鎖（ss）DNAから二本鎖DNAへの、酵素による変換の間に、各ヌクレオチドがDNA分子に付加されると、水素イオンが放出される。ISFETは、これらの放出された水素イオンを検出し、そしてヌクレオチドがいつDNA分子に付加されたかを決定することができる。ヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP）の組み込みを同期させることによって、DNA配列もまた、決定され得る。たとえば、一本鎖DNA鋳型をdATPに接触させた際には電気的出力シグナルが検出されないが、dGTPの存在下では電気的出力シグナルが検出される場合、DNA配列は当該位置において、相補的なシトシン塩基から構成される。
【０１２７】
1つの態様において、プローブのテール領域を検出し、そして次に対応する標的分析物を同定するために、ISFETは使用される。たとえば、標的分析物は、基材、これは1つまたは複数のISFETを含む集積回路チップなどであるが、該基材上に付着させることができる。対応するプローブ（たとえば、アプタマーおよびテール領域）が添加され、そして標的分析物に特異的に結合する際に、テール領域の転写のため、ヌクレオチドおよび酵素（ポリメラーゼ）が添加される。ISFETは、放出される水素イオンを電気的出力シグナルとして検出し、そして、dNTPがテール領域に組み込まれる際の、イオン濃度の変化を測定する。放出された水素イオンの量は、テール領域の長さおよび停止（stop）に対応しており、かつテール領域についてのこの情報を、さまざまなタグを互いに区別するために使用することができる。
【０１２８】
最も単純なタイプのテール領域は、全体が1種類のホモポリマー塩基領域から構成されるものである。この場合、可能なテール領域が4種類存在する：ポリAテール、ポリCテール、ポリGテール、およびポリTテール。しかしながら、テール領域に高度な多様性をもたせることが望ましい場合が多い。
【０１２９】
テール領域に多様性を生じさせる方法の1つは、テール領域のホモポリマー塩基領域内に停止塩基（stop base）を入れることによるものである。停止塩基とは、ホモポリマー塩基領域に隣接している少なくとも1つのヌクレオチドを含む、テール領域の一部分であって、該少なくとも1つのヌクレオチドは、ホモポリマー塩基領域内の塩基とは異なる塩基から構成されるような、テール領域の一部分である。1つの態様において、停止塩基は、1つのヌクレオチドである。他の態様において、停止塩基は、複数のヌクレオチドを含む。一般的に、停止塩基は、2つのホモポリマー塩基領域に挟まれている。1つの態様において、1つの停止塩基に接する2つのホモポリマー塩基領域は、同じ塩基から構成される。別の態様において、該2つのホモポリマー塩基領域は、2種類の別々の塩基から構成される。別の態様において、テール領域は、複数の停止塩基を含む。
【０１３０】
一例として、ISFETは、最少閾値数として100個の水素イオンを検出することができる。標的分析物1を、テール領域を有する組成物に結合させる、ここで該テール領域は、100ヌクレオチドのポリAテールと、それに続く1つのシトシン塩基と、それに続く別の100ヌクレオチドのポリAテールから構成され、テール領域の長さは全部で201ヌクレオチドである。標的分析物2は、200ヌクレオチドのポリAテールから構成されるテール領域を有する組成物に結合させる。dTTPが添加され、かつポリヌクレオチド合成が促される条件下においては、標的分析物1に結合したテール領域における合成は、100個の水素イオンを放出し得、これは、200個の水素イオンを放出し得る、標的分析物2に結合したテール領域におけるポリヌクレオチド合成とは、区別することができる。ISFETは、各テール領域について、異なる電気的出力シグナルを検出し得る。さらに、dGTPが添加され、それに続いてさらなるdTTPが添加された場合、標的分析物1に結合したテール領域は、さらなるポリヌクレオチド合成に起因して、まず1個の、その後100個の、さらなる水素イオンを放出し得る。テール領域の組成に基づく特定のヌクレオシド三リン酸の添加から生成される、異なる電気的出力シグナルは、ISFETが、テール領域のそれぞれからの水素イオンを検出することを可能にし、かつ該情報を、テール領域およびそれらに対応する標的分析物を同定するために、使用することができる。
【０１３１】
さまざまな長さの、ホモポリマー塩基領域、停止塩基、およびそれらの組み合わせを、試料中の各分析物を一意的にタグ付けするために使用することができる。基材において標的分析物を同定するための、アプタマーおよびテール領域の電気的検出についての追加の説明は、その全体が参照により組み入れられる、米国特許仮出願第61/868,988号に記載されている。
【０１３２】
他の態様において、上述の電気的検出方法においては、プローブとして抗体が使用される。抗体は、タグとして作用するオリゴヌクレオチドテール領域にリンカー領域を介して結合する、一次抗体または二次抗体であり得る。
【０１３３】
これらの電気的検出方法は、数百個の（または数千個もの）別個の標的分析物を同時に検出するために使用することができる。別個のデジタル識別子の数が試料中の別個の標的分析物の数と比例するように、各標的分析物は、デジタル識別子と関連付けられることができる。識別子は、いくらかのビットのデジタル情報によって表され得、かつ順序付けられたテール領域セット内にエンコードされる。順序付けられたテール領域セット中の各テール領域を、プローブ領域のリンカー領域に連続して特異的に結合させる、ここで該プローブ領域は、標的分析物に特異的に結合している。あるいは、テール領域が、それらに対応するプローブ領域に共有結合している場合、順序付けられたテール領域セット中の各テール領域を、標的分析物に連続して特異的に結合させる。
【０１３４】
1つの態様において、1サイクルは、ポリヌクレオチドの合成が生じ、そして水素イオンを放出して、該水素イオンが電気的出力シグナルとして検出されるような、テール領域のリンカー領域への結合および取り除きによって表される。したがって、標的分析物を同定するためのサイクルの数は、順序付けられたテール領域セット中のテール領域の数に等しい。順序付けられたテール領域セット中のテール領域の数は、同定されようとする標的分析物の数、および生成されようとする情報のビットの全数によって変わる。別の態様において、1サイクルは、プローブ領域に共有結合しているテール領域の、標的分析物への特異的結合、および標的分析物からの取り除きによって、表される。
【０１３５】
各サイクルから検出される電気的出力シグナルは、ビットの情報へとデジタル化され、そして、各テール領域をその対応するリンカー領域へ結合させるための、すべてのサイクルが実施された後で、取得されたデジタル情報の全ビットを、当該標的分析物を同定かつ特徴付けするために使用することができる。標的分析物の同定のためのいくらかの同定ビット、および誤り訂正のためのいくらかのビットによって、ビットの全数は変わる。誤り訂正のためのビットの数は、電気的出力シグナルの所望のロバストネスおよび正確性に基づいて選択される。一般的に、誤り訂正ビットの数は、同定ビットの数の2倍または3倍であり得る。
【０１３６】
検出された分析物の順序およびアイデンティティのデコーディング
分析物を検出するために使用されるプローブは、各サイクルにおいて、順序付けられた様式で基材に導入される。キーは、各標的分析物に関するプローブの順序についての情報をエンコードするように生成される。各分析物について検出されたシグナルは、ビットの情報にデジタル化されることができる。シグナルの順序は、各分析物を同定するためのコードを提供し、これは、ビットの情報にエンコードされることができる。
【０１３７】
誤り訂正方法
上述の光学的検出方法および電気的検出方法においては、結合、および／またはシグナルの検出において、誤りが生じ得る。いくつかの場合において、誤り率は、5つに1つ程度と高率であり得る（たとえば、5つの蛍光シグナルのうち1つが不正確である）。これは、5サイクルのシーケンスごとに1つの誤りと同等である。実際の誤り率は、20%のような高率ではないであろうとしても、数パーセントの誤り率は生じ得る。一般的に、誤り率は、試料中の分析物のタイプおよび使用されるプローブのタイプを含む、多くの要因によって変わる。電気的検出方法においては、たとえば、サイクル中、アプタマー上の対応するプローブ領域に、テール領域が適切に結合しない可能性がある。光学的検出方法においては、抗体プローブはその標的に結合しない可能性があり、または抗体プローブは誤った標的に結合する可能性がある。
【０１３８】
検出されるシグナルにおける誤りに対処するために、かつ、パリティビットなどの、情報の追加のビットを取得するために、追加のサイクルが生成される。情報の追加のビットは、誤り訂正符号を用いて誤りを訂正するために使用される。1つの態様において、誤り訂正符号はリード・ソロモン符号であり、これは、システムにおける誤りを検出かつ訂正するために使用される非2元巡回符号である。他の態様において、さまざまな他の誤り訂正符号を使用することができる。他の誤り訂正符号は、たとえば、ブロック符号、畳み込み符号、ゴレイ符号、ハミング符号、BCH符号、AN符号、リード・マラー符号、ゴッパ符号（Gappa code）、アダマール符号、ウォルシュ符号（Walsh code）、ハーゲルバーガー符号、ポーラ符号（polar code）、反復符号、反復累積符号（repeat-accumulate code）、消失符号（erasure code）、オンライン符号（online code）、群符号、エキスパンダー符号（expander code）、定重み符号、トルネード符号（tornado code）、低密度パリティ検査符号、最大距離符号（maximum distance code）、バースト誤り符号、ルビートランスフォーム符号（luby transform code）、噴水符号、およびラプター符号（raptor code）を含む。Error Control Coding, 2nd Ed., S. Lin and DJ Costello, Prentice Hall, New York, 2004参照。サイクルを追加し、そして情報の追加のビットを取得することにより、誤り訂正のための方法を実例説明する例もまた、以下に提供される。
【０１３９】
リード・ソロモン符号の一例は、4ビットの記号を用いたRS (15,9) 符号を含み、ここで、n = 15であり、k = 9であり、s = 4であり、かつt = 3であり、かつn = 2s-1であり、かつk = n-2tであり、「n」は記号の数であり、「k」はデータ記号の数であり、「s」は各記号のビットでのサイズであり、かつ「t」は訂正できる誤りの数であり、かつ「2t」はパリティ記号の数である。ここでは、9個のデータ記号（k = 9）、および6個のパリティ記号（2t = 6）が存在する。Xを底とする数が使用され、かつ X = 4 である場合、各蛍光色は、2ビット（0および1）で表される。1組の色は、2個の上位ビットおよび2個の下位ビットを含む、4ビットの記号によって表され得る。
【０１４０】
底4が選択されたため、7個のプローブプール、つまり7色の配列が、各標的分析物を同定するために使用される。この配列は、3と1/2の、4ビットの記号として表される。残りの5と1/2のデータ記号は、ゼロにセットされる。リード・ソロモン RS （15,9）エンコーダーは次に、6個のパリティ記号を生成し、これは、12個の追加のプローブプールによって表される。したがって、全部で19個のプローブプール（7 + 12）が、 t = 3 の記号の誤り訂正を行うために必要とされる。
【０１４１】
誤り訂正符号の能力のモンテカルロシミュレーションが、7個のプローブプールと仮定して、16,384個までの別個の標的を同定するために実施された。これらのシミュレーションを用いて、10-5の訂正された誤り率を達成するために、許容される最大限の生の誤り率（蛍光標識の同定に関連する）が、さまざまな数のパリティビットについて決定された。
【０１４２】
いくつかの態様において、分析物に関連付けられる情報（たとえば、分析物に関して予想される、プローブの順序およびシグナルのタイプ）の予想されるビットを含むキーが、生成される。特定の分析物についての情報の、これらの予想されるビットは、標的分析物から取得される情報の実際のLビットと比較される。リード・ソロモンアプローチを用いて、シグナルにおいて誤りはt個までという許容量を、情報の予想されるビットと情報の実際のLビットとの比較において容認することができる。
【０１４３】
いくつかの態様において、予想されるシグナルの配列を、特定のプローブで観察されたシグナルの配列と比較するために、リード・ソロモンデコーダーが使用される。たとえば、標的分析物を同定するために7個のプローブプールが使用され得、予想される色の配列はBGGBBYYであり、14ビットで表される。その後、追加のパリティプールが、誤り訂正のために使用され得る。たとえば、4ビットのパリティ記号が6個使用され得る。
【０１４４】
反復されるプローブ結合および光学的検出を用いる方法ならびにシステムは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2015年11月19日発行の米国特許出願公開第2015/0330974号Digital Analysis of Molecular Analytes Using Single Molecule Detection、および2018年9月6日発行の米国特許出願公開第2018/0252936号High Speed Scanning With Acceleration Trackingに記載されている。
【０１４５】
いくつかの態様において、生画像は、オーバーサンプリングされた画像のより正確な決定を容易にするために、少なくともナイキスト限界であるサンプリングを用いて取得される。ナイキスト限界より大きいサンプリング（オーバーサンプリング）による、画像を表すために使用されるピクセルの数の増大は、画像処理および表示に利用可能なピクセルデータを増大させる。
【０１４６】
理論上、帯域制限されたシグナルは、ナイキストレート以上でサンプリングされた場合に、完全に再構成され得る。ナイキストレートは、シグナルにおける最高の周波数成分の2倍として定義される。オーバーサンプリングは、分解能を改善し、ノイズを減少させ、そしてアンチエイリアシングフィルターの性能要件を緩和することによって、エイリアシングおよび位相ひずみを回避する助けとなる。シグナルは、それがナイキストレートのN倍でサンプリングされた場合に、N倍オーバーサンプリングされた、と言われる。
【０１４７】
したがって、いくつかの態様において、各画像は、観察している光の波長の半分以下のピクセルサイズで取得される。いくつかの態様において、ナイキスト限界以上でのサンプリングを達成するために、約200 nm x 200 nm未満のピクセルサイズが検出において使用される。基材の生画像形成中の、少なくともナイキスト限界の周波数でのサンプリングは、本明細書において記載されるシステムまたは方法の分解能を最適化するために好ましい。これは、高い正確性で、回折限界未満で基材上で特徴物を解像するために、本明細書において記載されるデコンボリューション方法および光学システムとともになされ得る。
【０１４８】
異なるサイクルからの画像の処理
回折限界未満での画像化を達成するために、本発明によって克服されるいくつかの障壁がある。
【０１４９】
ピクセル化の誤差は生画像に存在し、そしてピクセル化のために、存在している情報の光学シグナルからの同定を妨害する。本明細書において記載されるような、少なくともナイキスト周波数でのサンプリング、およびオーバーサンプリングされた画像の生成はそれぞれ、ピクセル化（pixilation）の誤差を克服する助けとなる。
【０１５０】
さまざまな分子の点像分布（PSF）はオーバーラップする、これは、PSFのサイズがピクセルサイズ（ナイキストを下回る）より大きいからであり、かつ中心間の間隔が、空間上のオーバーラップに起因するクロストークが生じるほど小さいからである。最近傍変数回帰（中心間のクロストーク修正に関して）は、複数のオーバーラップする光学シグナルのデコンボリューションを助けるために使用され得る。しかしこれは、基材上の各分析物の相対位置が既知であり、かつフィールドの画像の優れたアラインメントを有していれば、改善され得る。いくつかの態様において、機械学習（たとえば、人工知能、すなわち「AI」）は、複数のオーバーラップする光学シグナルのデコンボリューションを助けるために使用され得る。いくつかの態様において、機械学習プロセスはプローブ結合および画像化の複数サイクルにわたりデータをインプットし、さらなる画像をデコンボリューションする。
【０１５１】
複数のサイクル後、分子の厳密な位置は、ますますより正確となり得る。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用および回折限界のために生じる、光学シグナルの空間上のオーバーラップにおける既知の非対称を補正することによってデコンボリューションを補助するために、追加の計算が実施され得る。それらはまた、放出スペクトルにおける、異なる放出スペクトルからのオーバーラップを補正するために、使用され得る。
【０１５２】
各分析物についての高度に正確な相対位置情報は、各分析物に結合した異なるプローブの光学シグナルからの測定されたピークの分布を生成するために、異なるサイクルからの同じフィールドの画像をオーバーレイすることによって、獲得され得る。この分布はその後、分析物の単一の相対位置に対応するピークシグナルを生成するために使用され得る。サイクルのサブセットからの画像は、各分析物についての相対位置情報を生成するために使用され得る。いくつかの態様において、この相対位置情報は、ローカライゼーションファイルにおいて提供される。
【０１５３】
各サイクルについて、フィールドの画像化される特定の領域は、サイクルからサイクルへと変更されてよい。したがって、各画像について分析物の位置の同定の正確性を改善するために、複数のサイクルにわたるフィールドの画像間のアラインメントが実施され得る。このアラインメントから、参照ファイルと比較したオフセット情報が、その後、同定され得、そして、回折限界のために不明瞭にされた光学シグナルについてデコンボリューションおよびシグナル同定の正確性をさらに増大させるために、デコンボリューションアルゴリズムに組み込まれ得る。いくつかの態様において、この情報はフィールドアラインメントファイルとして提供される。
【０１５４】
シグナル検出（クロストーク／最近傍）
基材上の分析物について相対位置情報が正確に決定され、そして各サイクルからのフィールド画像がこの位置情報とアラインされると、クロストークおよび最近傍回帰を用いる、オーバーサンプリングされた各画像の分析が、各画像における各分析物からの光学シグナルを正確に同定するために、使用され得る。
【０１５５】
いくつかの態様において、光学システムの回折限界によって不明瞭にされた複数の光学シグナルは、基材上に付着し、かつ検出可能な標識を含むプローブに結合された、複数の生体分子のそれぞれに関して、同定される。いくつかの態様において、プローブがヌクレオチドに組み込まれ、そして一連のサイクルが、アレイ上に付着したポリヌクレオチドの配列を、合成による配列決定を用いて決定するために、使用される。
【０１５６】
画像に適用されるデコンボリューションのシミュレーション
分子の密度は、隣接する分子からのクロストークにより制約を受ける。図3は、単一分析物のシミュレートされた画像を示す。この特定の画像は、2Xオーバーサンプリングフィルターで処理された、600 nmのピッチの分析物の層のシミュレーションである。8つの近接するスポット中へのクロストークは、アレイのピッチおよびアルゴリズムのタイプの関数として平均される。
【０１５７】
図4は、複数のピッチ、および画像処理アルゴリズムの2つのバリエーションで処理された、一連の画像であり、1つ目は2Xオーバーサンプリングされた画像であり、そして二つ目は、本明細書において記載されるようにデコンボリューションをともなって4Xオーバーサンプリングされた画像である。図5は、200 nmに下げたピッチでのこれら2つのタイプの画像処理の、クロストーク分析である。2Xオーバーサンプリングでの、25%以下の許容可能なクロストークレベルは、275 nm以上のピッチについて生じる。光学システムの点像分布関数を用いる4Xデコンボリューションでの、25%以下の許容可能なクロストークレベルは、210 nm以上のピッチについて生じる。
【０１５８】
分子の物理的なサイズは、スポットを、結合領域のサイズのほぼ半分、拡張するであろう。たとえば、80 nmのスポットについて、ピッチはおよそ40 nm増大されるであろう。より小さいスポットサイズが使用されてよいが、しかしこれは、より少ないコピーしか許容されず、かつより強い光の強度が必要であるという、代償を有するであろう。単一のコピーは、最も単純な試料調製をもたらすが、しかし、最も強い光の強度を必要とする。
【０１５９】
この点を取り扱う回折限界未満の画像化のための方法は、オーバーサンプリング、デコンボリューション、およびクロストーク補正の画像処理技術を含む。本明細書において、分析物についての、プローブの光学シグナル画像化の複数のサイクルからの情報を用いる、基材上の分析物の正確な相対位置の決定を組み込む方法およびシステムが、記載される。この情報を用いて、ピクセルへの離散化作用のために生じる、クロストークマトリックスにおける既知の非対称に関するクロストーク補正を補助するために、追加の計算が実施され得る。
【０１６０】
方法
いくつかの態様において、図6に示されるように、本明細書において、高密度に詰め込まれた基材の表面上に付着した分析物の相対位置を正確に決定するための方法が提供される。該方法は、表面を含む基材を提供する工程を最初に含み、ここで表面は、表面上で別々の位置に付着した複数の分析物を含む。その後、該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルが実施される。検出の各サイクルは、分析物を、表面上に付着した標的分析物に結合することができるプローブセットと接触させる工程、該表面上の別々の位置で該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するために、光学システムを用いて該表面のフィールドを画像化する工程、および検出の別のサイクルが実施されようとする場合に、結合したプローブを除去する工程を含む。各画像から、該複数のサイクルの少なくとも2つ（すなわち、サブセット）からの該フィールドの画像から、該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置が検出される。各分析物についてのピークの位置がオーバーレイされて、それから基材上の各分析物の正確な相対位置がその後決定される、ピークのクラスターが生成される。
【０１６１】
いくつかの態様において、図7に示されるように、基材上での分析物についての正確な位置情報はその後、該画像のそれぞれからのオーバーラップする光学シグナルをデコンボリューションするために画像に適用され得る、位置情報を組み込む（たとえば、基材における隣接する分析物間の中心間の間隔を同定するため）デコンボリューションアルゴリズムにおいて使用される。いくつかの態様において、デコンボリューションアルゴリズムは、オーバーラップする光学シグナルを有する隣接する分析物の間の空間上の識別のための、最近傍変数回帰を含む。
【０１６２】
いくつかの態様において、図8に示されるように、分析物検出の方法は、基材上に付着した個々のポリヌクレオチドの配列決定に適用される。
【０１６３】
いくつかの態様において、図11に示されるように、光学シグナルは、高密度に詰め込まれた基材からデコンボリューションされる。図9に示されるように、操作は、4つの異なるセクションに分割されることができる：1)  画像分析、これは各サイクルについてのフィールドの各画像からのオーバーサンプリングされた画像の生成、ならびに画像における検出される各光学シグナルのピーク位置および強度を含むピークファイル（すなわちデータセット）の生成を含む。2)  ローカライゼーションファイルの生成、これは基材上の分析物の正確な相対位置を決定するための、各分析物についての光学シグナル検出の複数のサイクルから生成される複数のピークのアラインメントを含む。3)  フィールドアラインメントファイルの生成、これは選択された参照画像に対して、異なる検出サイクルからのフィールドの画像をアラインするための、各画像についてのオフセット情報を含む。4)  強度の抽出、これは、オーバーサンプリングされた各画像から検出されるシグナルの正確なアイデンティティを決定するために、デコンボリューションモデリングとともに、オフセット情報および位置情報を使用する。「強度の抽出」操作はまた、合成による配列決定の処理および検出における誤差を補正するために使用される、前のサイクルの回帰などの、他の誤差の補正を含み得る。各セクションにおいて実施される操作は、以下に、さらに詳細に記載される。
【０１６４】
図10Aおよび図11に示される画像分析操作において、各サイクルからの各フィールドの画像は、検出された各シグナルについてピクセルの数を増大させるように、各シグナルについてピークを鋭利にするように、そして各シグナルからのピーク強度を同定するように、処理される。この情報は、各サイクルについての各フィールドのピークファイルを生成するために使用され、ピークファイルは、各分析物の位置の測定値（観察された光学シグナルのピークから）、および各シグナルからのピーク強度からの強度を含む。いくつかの態様において、各フィールドからの画像は、画像からのノイズの最初の除去を実施するために、バックグラウンド除去を最初に受ける。その後画像は、各画像において観察されたシグナルのモデリングに基づく人工的に生成されたピクセルを含むオーバーサンプリングされた画像を生成するために、平滑化およびデコンボリューションを用いて処理される。いくつかの態様において、オーバーサンプリングされた画像は、生画像からの各ピクセルから、4ピクセル、9ピクセル、または16ピクセルを生成することができる。
【０１６５】
各生画像において検出される、またはオーバーサンプリングされた画像に存在する、光学シグナルからのピークはその後同定され、そして検出される各分析物についての強度および位置情報は、さらなる処理のためにピークファイル中に置かれる。
【０１６６】
いくつかの態様において、基材の各サイクルおよび各フィールドから検出されるすべての画像に対応するN枚の生画像、または画像化された各フィールドについてのN枚のオーバーサンプリングされた画像およびN個のピークファイルへの出力。ピークファイルは、各画像に関して検出される各分析物の、相対位置を含む。いくつかの態様において、ピークファイルはまた、検出される各分析物についての強度情報を含む。いくつかの態様において、1つのピークファイルが、各色、および各サイクルにおける各フィールドについて生成される。いくつかの態様において、各サイクルは、1つのピークファイルが、各色、および各サイクルにおける各パスの各フィールドについて生成され得るように、複数のパスをさらに含む。いくつかの態様において、ピークファイルは、単一のフィールド中の光学シグナルからピーク位置を特定する。
【０１６７】
好ましい態様において、ピークファイルは、各サイクルについてのフィールドの、処理された、オーバーサンプリングされた各画像からの、XY位置情報を含む。XY位置情報は、プローブからの検出された検出可能な各標識（フルオロフォアなど）の位置の、オーバーサンプリングされた画像から判断された座標を含む。ピークファイルは、個々の検出可能な標識それぞれからのシグナルからの強度情報もまた、含み得る。
【０１６８】
オーバーサンプリングされた画像の生成は、ピクセル化のために抽出することができない、存在している情報を同定して、ピクセル化の誤差を克服するために、使用される。平滑化およびデコンボリューションによる生画像の最初の処理は、各分析物の位置をより高い正確性をもって決定できるように、ピークファイルにおいてより正確な情報を提供する助けとなり、そしてこの情報は続いて、回折限界での画像化において不明瞭にされたシグナルのより正確な決定を提供するために使用され得る。
【０１６９】
いくつかの態様において、生画像は、オーバーサンプリングされた画像のより正確な決定を容易にするために、少なくともナイキスト限界であるサンプリングを用いて取得される。ナイキスト限界より大きいサンプリング（オーバーサンプリング）による、画像を表すために使用されるピクセルの数の増大は、画像処理および表示に利用可能なピクセルデータを増大させる。
【０１７０】
理論上、帯域制限されたシグナルは、ナイキストレート以上でサンプリングされた場合に、完全に再構成され得る。ナイキストレートは、シグナルにおける最高の周波数成分の2倍として定義される。オーバーサンプリングは、分解能を改善し、ノイズを減少させ、そしてアンチエイリアシングフィルターの性能要件を緩和することによって、エイリアシングおよび位相ひずみを回避する助けとなる。シグナルは、それがナイキストレートのN倍でサンプリングされた場合に、N倍オーバーサンプリングされた、と言われる。
【０１７１】
したがって、いくつかの態様において、各画像は、観察されている光の波長の半分以下のピクセルサイズで取得される。いくつかの態様において、ナイキスト限界以上でのサンプリングを達成するために、約200 nm x 200 nm未満のピクセルサイズが検出において使用される。
【０１７２】
平滑化は、データにおける重要なパターンを捕捉するが一方でノイズまたは他の微細な規模の構造／急速な現象を排除する近似関数を、使用する。平滑化において、シグナルのデータ点は、個々の点が減少し、かつ近接する点よりも低い点が増やされるように修正されて、より平滑なシグナルがもたらされる。平滑化は、本明細書において、各画像において検出される回折限界の光学シグナルを平滑化して、シグナルからのピークおよび強度をより良く同定するために、使用される。
【０１７３】
各生画像には回折限界があるが、本明細書において、異なるサイクルからの同じ分析物からの複数のシグナルの収集をもたらす方法が記載される。この方法の態様は、図10Bのフローチャートにおいて示される。各分析物からのこれらの複数のシグナルは、それぞれの個々の画像からの回折限界のシグナルよりもはるかにより正確な位置を決定するために使用される。それらは、5 nm未満の分解能でフィールド内の分子を同定するために使用され得る。この情報はその後、図11に示されるように、ローカライゼーションファイルとして保管される。高度に正確な位置情報は、クロストーク回帰および最近傍変数回帰などのデコンボリューションアルゴリズムと組み合わせて、それぞれの個々のフィールド画像からのシグナル同定を大幅に改善するために、その後使用され得る。
【０１７４】
図11に示されるように、ローカライゼーションファイルを生成する操作は、基材上の分析物のセットの相対位置を決定するために、ピークファイルにおいて提供される位置情報を使用する。いくつかの態様において、各ローカライゼーションファイルは、基材の単一の画像化フィールドからの分析物のセットからの相対位置を含む。ローカライゼーションファイルは、回折限界未満で検出される分析物についての高度に正確な位置情報を生成するために、複数のサイクルからの位置情報を組み合わせる。
【０１７５】
いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの標準偏差（すなわちRMSまたは二乗平均平方根）で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの2X標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、平均で、10 nm未満までの3X標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の2X標準偏差で決定される。いくつかの態様において、各分析物についての相対位置情報は、10 nm未満までの中央値の3X標準偏差で決定される。
【０１７６】
異なるサイクルからのフィールドについてのピークファイルのサブセットから、ローカライゼーションファイルが、アレイ上の分析物の位置を決定するために生成される。図11に示されるように、いくつかの態様において、ピークファイルは最初に、光学システムにおける収差を明らかにするために、点像分布関数を用いて正規化される。正規化されたピークファイルは、ピークファイルにおいて提供される位置および強度情報に基づき、人工的な正規化された画像を生成するために使用され得る。各画像は、その後アラインされる。いくつかの態様において、アラインメントは、各画像ペアを相関させ、そしてファインフィット（fine fit）を実施することによって、実施され得る。アラインされたら、各サイクルからの各分析物についての位置情報は、基材上の位置測定値の分布を提供するために、その後オーバーレイされ得る。この分布は、基材上の分析物の高度に正確な相対位置を提供する単一のピーク位置を決定するために使用される。いくつかの態様において、ポアソン分布が、単一のピークを決定するために、各分析物についてのオーバーレイされた位置に適用される。
【０１７７】
サイクルからの位置情報の少なくとも1つのサブセットから決定されるピークはその後、ローカライゼーションファイルに記録され、このローカライゼーションファイルは、正確性を有する、回折限界未満で検出される各分析物の相対位置の測定値を含む。記載されるように、サイクルのサブセットのみからの画像が、この情報を決定するために必要とされる。
【０１７８】
図11に示されるように、各サイクルおよび各色についての各フィールドからの正規化されたピークファイル、ならびに正規化されたローカライゼーションファイルが、フィールドの参照画像に対する、フィールドからの各画像についてのオフセット情報を生成するために、使用され得る。このオフセット情報は、高密度に詰め込まれた基材および回折限界の画像からのシグナル同定のさらなる改善の目的で、各生画像における分析物の相対位置決定の正確性を改善するために使用され得る。いくつかの態様において、このオフセット情報は、フィールドアラインメントファイルとして保管される。いくつかの態様において、組み合わされたローカライゼーションファイルおよびフィールドアラインメントファイルからの、フィールドにおける各分析物の位置情報は、10 nm未満のRMS、5 nm未満のRMS、または2 nm未満のRMSである。
【０１７９】
いくつかの態様において、フィールドアラインメントファイルは、フィールドのマスターファイルに対するオフセット情報を決定することによる、単一のフィールドからの画像のアラインメントによって、生成される。1つのフィールドアラインメントファイルが、各フィールドについて生成される。このファイルは、すべてのサイクルからのフィールドのすべての画像から生成され、かつフィールドからの参照画像に対する、フィールドのすべての画像についてのオフセット情報を含む。
【０１８０】
いくつかの態様において、アラインメントの前に、各ピークファイルは点像分布関数を用いて正規化され、その後に正規化されたピークファイルからの人工的な画像の生成、および人工的な画像のフーリエ変換が続く。正規化されたピークファイルの人工的な画像のフーリエ変換はその後、対応するフィールドについて正規化されたローカライゼーションファイルからの人工的な画像のフーリエ変換の複素共役を用いてコンボリューションされる。これは、各サイクルの各ピークファイルについてなされる。結果として生じるファイルはその後、画像ファイルを再生成するために逆フーリエ変換を受け、そして画像ファイルは、各画像ファイルについてのオフセット情報を生成するために、フィールドからの参照ファイルに対してアラインされる。いくつかの態様において、このアラインメントは、参照ファイルに対するファインフィットを含む。
【０１８１】
フィールドアラインメントファイルは、このようにオーバーサンプリングされた各画像についてのオフセット情報を含み、かつ、続く「強度の抽出」操作における使用のための各分析物についての高度に正確な相対位置を生成するために、対応するフィールドについてのローカライゼーションファイルとともに使用され得る。
【０１８２】
例として、20サイクルが1つのフィールドにおいて実施され、かつ1枚の画像が検出されようとする4色のそれぞれについて生成されるとすると、フィールドの80枚の画像が生成され、1つのフィールドアラインメントファイルが、フィールドから取得された80枚すべての画像（20サイクル* 4色）について生成される。いくつかの態様において、フィールドアラインメントファイルの内容は、以下を含む：フィールド、各画像について観察された色、反復検出における操作のタイプ（たとえば結合または取り除き）、および参照画像に対する画像のオフセット座標。
【０１８３】
いくつかの態様において、アラインメントのプロセス中、2枚の画像をアラインするために必要なXY「シフト」または「残余」が計算され、そしてプロセスは残りの画像について繰り返され、すべてに適用されるベストフィット（best fit）の残余が計算される。
【０１８４】
いくつかの態様において、閾値を超える残余は排除され、そしてベストフィットが再度計算される。このプロセスは、すべての個々の残余が閾値内になるまで繰り返される。
【０１８５】
オーバーサンプリングされた各画像はその後、ローカライゼーションファイルからの正確な位置情報、およびフィールドアラインメントファイルからのオフセット情報を用いてデコンボリューションされる。強度抽出操作の1つの態様が、図10Cおよび図11において示される。さまざまな分子の点像分布関数（PSF）がオーバーラップする、なぜならば、中心間の間隔は、近接する分析物からのシグナルの点像分布関数がオーバーラップするほど小さいからである。正確な分析物の位置情報および／またはオフセット情報と組み合わせた最近傍変数回帰は、回折限界のために分解能が阻害される中心間距離を有する、近接する分析物からのシグナルをデコンボリューションするために、使用され得る。各分析物についての正確な相対位置情報の使用は、回折限界未満で隣接する分析物からの光学シグナルの空間上のデコンボリューションを容易にする。いくつかの態様において、隣接する分析物の相対位置は、隣接する分析物間の正確な中心間距離を決定するために使用され、これは、それぞれの個々の画像からのシグナルのデコンボリューションにおける使用に関して隣接する分析物間の空間上のクロストークを判断するために、光学システムの点像分布関数と組み合わせて使用され得る。これは、ポリヌクレオチドの配列決定などの光学検出技術について、回折限界未満の分析物の密度での基材の使用を可能にする。
【０１８６】
ある態様において、放出スペクトルは、異なるシグナル間でオーバーラップする（すなわち「クロストーク」）。たとえば、合成による配列決定中に、配列決定プロセスにおいて使用される4つの色素は、典型的に、放出スペクトルにおいていくらかのオーバーラップを有する。
【０１８７】
特定の態様において、クロストークが異なる色チャンネルの間で生じる場合に、およびクロストークが画像の異なるセットで異なる場合に、サイクルについて得られた画像のセットにおいて、異なる特徴物に対して色を割り当てることの問題（たとえばベースコール）は、使用される異なる検出可能な各標識からの光学シグナルからオーバーラップする放出スペクトルを除去するための、オーバーサンプリングされた各画像についてのローカライゼーションファイルおよびフィールドアラインメントファイルと組み合わせたクロストーク回帰によって、解決され得る。これは、基材上の各分析物に結合する各プローブについての検出可能な標識のアイデンティティの同定の正確性をさらに増大させる。
【０１８８】
したがって、いくつかの態様において、本明細書において開示されるように、サイクルからのフィールドの単一の画像からのシグナル、および／またはその強度の同定は、以下の特色を使用する：1)  オーバーサンプリングされた画像  −  画定された位置において強度およびシグナルを提供する。2)  正確な相対位置  −  ローカライゼーションファイル（サイクルの少なくとも1つのサブセットからの情報からの位置情報を提供する）およびフィールドアラインメントファイル（フィールドにおけるすべての画像についてのオフセット／アラインメント情報を提供する）。3)  画像処理  −  フィールドにおける各分析物についての正確な相対位置情報を用いる最近傍変数回帰（空間上のデコンボリューション）およびクロストーク回帰（放出スペクトルデコンボリューション）。各分析物のためのプローブ（たとえば、検出用の抗体、または配列決定用の相補的ヌクレオチド）の正確な同定。
【０１８９】
画像処理シミュレーション
本明細書において開示される方法およびシステムの効果は、図12A、図12B、図13A、および図13Bに示される、シミュレートされたクロストークプロットにおいて例示される。これらの図のそれぞれについて、10 um X 10 umの領域での検出された各分析物における4つのフルオロフォアの1つと相関する放出スペクトルの強度を示すクロストークプロットが、示される。4つのフルオロフォアのうちの1つに対応するそれぞれの軸は、プロットのそれぞれの角へと伸長する。したがって、プロットの中心に位置するスポットは、すべての4つのフルオロフォアからの、強度の等しい寄与を有し得る。画像化サイクル中の個々のフルオロフォアから検出された放出強度は、X、Y；X、-Y；-X、Y；または-X、-Yのいずれかの方向にスポットを移動させるように割り当てられる。したがって、これらの4つの軸に沿ったスポットの集団の分離は、分析物の位置におけるフルオロフォアからの明確なデコンボリューションされたシグナルを示す。各シミュレーションは、10.075 um x 10.075 umの領域における1024分子の検出に基づいており、これは1平方ミクロンあたり10.088分子の密度、または約315 nmの分子間の平均中心間距離を示す。これは、約200 nm x 200 nm未満のピクセルサイズでの約62 x 62ピクセルの画像領域と相関する。
【０１９０】
いくつかの態様において、分子間の平均中心間距離は、約150 nm〜約500 nmである。いくつかの態様において、分子間の平均中心間距離は、約150 nm〜約175 nm、約150 nm〜約200 nm、約150 nm〜約225 nm、約150 nm〜約250 nm、約150 nm〜約275 nm、約150 nm〜約300 nm、約150 nm〜約325 nm、約150 nm〜約350 nm、約150 nm〜約375 nm、約150 nm〜約400 nm、約150 nm〜約500 nm、約175 nm〜約200 nm、約175 nm〜約225 nm、約175 nm〜約250 nm、約175 nm〜約275 nm、約175 nm〜約300 nm、約175 nm〜約325 nm、約175 nm〜約350 nm、約175 nm〜約375 nm、約175 nm〜約400 nm、約175 nm〜約500 nm、約200 nm〜約225 nm、約200 nm〜約250 nm、約200 nm〜約275 nm、約200 nm〜約300 nm、約200 nm〜約325 nm、約200 nm〜約350 nm、約200 nm〜約375 nm、約200 nm〜約400 nm、約200 nm〜約500 nm、約225 nm〜約250 nm、約225 nm〜約275 nm、約225 nm〜約300 nm、約225 nm〜約325 nm、約225 nm〜約350 nm、約225 nm〜約375 nm、約225 nm〜約400 nm、約225 nm〜約500 nm、約250 nm〜約275 nm、約250 nm〜約300 nm、約250 nm〜約325 nm、約250 nm〜約350 nm、約250 nm〜約375 nm、約250 nm〜約400 nm、約250 nm〜約500 nm、約275 nm〜約300 nm、約275 nm〜約325 nm、約275 nm〜約350 nm、約275 nm〜約375 nm、約275 nm〜約400 nm、約275 nm〜約500 nm、約300 nm〜約325 nm、約300 nm〜約350 nm、約300 nm〜約375 nm、約300 nm〜約400 nm、約300 nm〜約500 nm、約325 nm〜約350 nm、約325 nm〜約375 nm、約325 nm〜約400 nm、約325 nm〜約500 nm、約350 nm〜約375 nm、約350 nm〜約400 nm、約350 nm〜約500 nm、約375 nm〜約400 nm、約375 nm〜約500 nm、または約400 nm〜約500 nmである。いくつかの態様において、分子間の平均中心間距離は、約150 nm、約175 nm、約200 nm、約225 nm、約250 nm、約275 nm、約300 nm、約325 nm、約350 nm、約375 nm、約400 nm、または約500 nmである。いくつかの態様において、分子間の平均中心間距離は、少なくとも約150 nm、約175 nm、約200 nm、約225 nm、約250 nm、約275 nm、約300 nm、約325 nm、約350 nm、約375 nm、または約400 nmである。いくつかの態様において、分子間の平均中心間距離は、最大で約175 nm、約200 nm、約225 nm、約250 nm、約275 nm、約300 nm、約325 nm、約350 nm、約375 nm、約400 nm、または約500 nmである。
【０１９１】
図12Aは、生画像から検出された光学シグナルからの4つのフルオロフォア間のフルオロフォア強度のクロストークプロットを示す。図12Bおよび図13Aはそれぞれ、4Xオーバーサンプリングされた画像を生成することによって達成された、4つのフルオロフォア間の分離を示し、これは各分析物におけるクロストークのいくつかの除去の達成を示す。図13Bは、同じ画像化領域であるが、図11に示されるように、かつ本明細書において記載されるように実施されるデコンボリューションおよび最近傍回帰を用いたクロストークプロットを示す。図13Aおよび図12Aと比べ、検出された各分析物は、その光学シグナルの、他のフルオロフォアからの明確な分離を示し、これは、各分析物についての高度に正確なフルオロフォアの同定を示す。
【０１９２】
図14Aおよび図14Bは、上記シミュレートされた場合の、検出された10.075 μm x 10.075 μmの各領域のシミュレートされた4色合成画を示す。これは、生画像（図14A）および本明細書において記載されるように処理された画像（図14B）からの（form）分析物間の明瞭性を、視覚的に表現する。
【０１９３】
配列決定
上述のおよび図11において記載される方法はまた、高密度に詰め込まれたポリヌクレオチドを含む基材上で伸長する相補鎖へと組み込まれる相補的な可逆的ターミネーターの光学的検出を用いる、合成による配列決定による配列決定を容易にする。したがって、回折限界未満の中心間距離で隣接しているポリヌクレオチドの配列と相関するシグナルは、本明細書において記載される方法および光学検出システムを用いて、信頼性をもって検出され得る。配列決定中の画像処理はまた、配列決定反応または検出における誤差を補正するための、基材上の繰り返されたクローン配列に基づく、もしくはデータそれ自体に基づく、前のサイクルの回帰を含み得る。いくつかの態様において、配列決定のために基材上に付着されているポリヌクレオチドは、コンカテマーである。コンカテマーは、配列決定されようとするポリヌクレオチドの、複数の同一コピーを含み得る。したがって、本明細書において記載される方法およびシステムによって同定される各光学シグナルは、組み込まれたヌクレオチドからの単一の検出可能な標識（たとえばフルオロフォア）を指すことができ、または、シグナルが複数の位置からの平均であるように、単一のコンカテマーにおいて複数の位置に結合した複数の検出可能な標識を指すことができる。生じるであろう分解能は、個々の検出可能な標識の間ではなく、基材に付着した異なるコンカテマーの間であり得る。
【０１９４】
いくつかの態様において、1つまたは複数のコピーの、配列決定されようとする分子は、共有結合を用いて、表面上の捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズによって、または他の非共有結合によって、表面に結合され得る。結合した分子は、数百サイクルの間、表面上にとどまり、そして特定の変種の存在の確認のため、最初の配列決定プライマーを取り除いた後で、異なるプライマーセットを用いて再度調査されることができる。
【０１９５】
1つの態様において、フルオロフォアおよび保護基は、化学反応を用いて除去されてよい。
【０１９６】
別の態様において、蛍光基および保護基は、UV光を用いて除去されてよい。
【０１９７】
1つの態様において、配列決定されようとする分子は、50〜100 nMの直径を有しておりかつこれらの領域が150〜300 nMのピッチで配置され得る反応性の表面上に、付着され得る。これらの分子は、標的のデコンボリューションのためにそれら分子に結合されたバーコード、および配列決定を開始するために配列決定プライマーが結合する領域を有してよい。緩衝液は、伸長反応を可能にする適切な量のDNAポリメラーゼを含むであろう。これらは、利用可能な遺伝子増幅方法（PCR、全ゲノム増幅等）のいずれかによって生成された、配列決定されようとする標的の10〜100コピーを含み得る。
【０１９８】
別の態様において、バーコードおよびプライマーアニール部位でタグ付けされた単一標的分子は、60〜150 nMのピッチで配置された直径20〜50 nMの反応性の表面上に付着され得る。分子は個々に配列決定され得る。
【０１９９】
1つの態様において、プライマーは標的に結合し得、かつ1回につき1つまたは複数のフルオロフォアを有する1つのdNTPを用いて伸長し得；表面は画像化され得、フルオロフォアは除去されかつ洗浄され得、そしてプロセスは、第二の伸長を産生するために繰り返され得る。同じdNTPにおける複数のフルオロフォアの存在は、ゲノムのいくつかの領域に存在するヌクレオチドのリピートの数（2〜5個またはそれより多く）を決定することを可能にするであろう。
【０２００】
異なる態様において、プライマーのアニーリングに続き、フルオロフォアを有する4つすべてのdNTP、および保護された3' ヒドロキシル基は、ポリメラーゼ伸長反応において使用され得、表面は画像化され得、そしてフルオロフォアおよび保護基は除去され得、そしてプロセスは複数のサイクルの間、繰り返され得る。
【０２０１】
別の態様において、配列は、所定の位置での特定のヌクレオチドの存在に基づいてライゲーションする特定のプローブにアニールするライゲーション反応に基づいて、推定され得る。
【０２０２】
上記概説した技術を用いる、先行技術のランダムなアレイに対して改善された密度を有するランダムなアレイが使用されてよいが、しかしながら、ランダムなアレイは一般的に、規則的なアレイから4X〜10X減少した表面密度を有する。ランダムなアレイの利点は、チップの均一な非パターン化表面、およびより短い核酸鎖の使用を含む、なぜならば、より長い鎖の排他的な特性に依存する必要がないからである。
【０２０３】
コンピューターシステム
本開示は、本開示の方法を遂行するようにプログラムされたコンピューターシステムを提供する。図28は、コンピューターシステム2801を示し、これは、本明細書に記載される方法を管理するように、かつ本明細書に記載されるシステムを利用するように、プログラムされているか、またはあるいは、そうするように構成されている。コンピューターシステム2801は、本開示のさまざまな局面を、たとえば、本明細書に記載されるプローブ結合のサイクルの管理などを、制御することができる。コンピューターシステム2801は、ユーザーの電子装置か、または該電子装置に対して遠隔に位置するコンピューターシステムであり得る。電子装置は、携帯型電子装置であり得る。
【０２０４】
コンピューターシステム2801は、中央処理装置（CPU、本明細書においてはまた「プロセッサ」および「コンピュータープロセッサ」）2805を含み、これはシングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピューターシステム2801はまた、メモリーまたはメモリーロケーション2810（たとえば、ランダムアクセスメモリー、読み出し専用メモリー、フラッシュメモリー）、電子ストレージユニット2815（たとえばハードディスク）、1つまたは複数の他のシステムとの通信のための通信インターフェース2820（たとえばネットワークアダプター）、ならびにキャッシュ、他のメモリー、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺装置2825をも含む。メモリー2810、ストレージユニット2815、インターフェース2820、および周辺装置2825は、マザーボードなどの通信バス（実体のある配線）を経由して、CPU 2805と通信する。ストレージユニット2815は、データを保管するためのデータストレージユニット（またはデータレポジトリ）であり得る。コンピューターシステム2801は、通信インターフェース2820の補助を受けて、コンピューターネットワーク（「ネットワーク」）2830に機能的に連結され得る。ネットワーク2830は、インターネット（the Internet）、インターネット（an internet）および／もしくはエクストラネット、またはインターネット（the Internet）と通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク2830は、いくつかの場合において、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク2830は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る1つまたは複数のコンピューターサーバーを、含み得る。ネットワーク2830は、いくつかの場合において、コンピューターシステム2801の補助を受けて、コンピューターシステム2801に連結される装置がクライアントまたはサーバーとして機能することを可能にし得るピアトゥピアネットワークを、実装し得る。
【０２０５】
CPU 2805は、プログラムまたはソフトウェアの形で具現化され得る、機械で読み取り可能な指示のシーケンスを、実行することができる。指示は、メモリー2810などのメモリーロケーションにおいて、記憶されてよい。指示はCPU 2805に向けられ得、これは次いで、本開示の方法を遂行するように、CPU 2805をプログラムするかまたはあるいは構成することができる。CPU 2805により実施される作業の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含み得る。
【０２０６】
CPU 2805は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム2801の1つまたは複数の他の構成要素は、該回路に含まれ得る。いくつかの場合において、該回路は特定用途向け集積回路（ASIC）である。
【０２０７】
ストレージユニット2815は、ドライバー、ライブラリー、および保存されたプログラムなどのファイルを記憶可能である。ストレージユニット2815は、たとえば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムといったユーザーデータを記憶可能である。コンピューターシステム2801は、いくつかの場合において、イントラネットまたはインターネット（the Internet）を経由してコンピューターシステム2801と通信する遠隔のサーバーに位置するものなどの、コンピューターシステム2801の外部の、1つまたは複数の追加のデータストレージユニットを含み得る。
【０２０８】
コンピューターシステム2801は、ネットワーク2830を経由して、1つまたは複数の遠隔のコンピューターシステムと通信可能である。たとえば、コンピューターシステム2801は、ユーザーの遠隔のコンピューターシステムと通信可能である。遠隔のコンピューターシステムの例は、パーソナルコンピューター（たとえば携帯型PC）、スレート型もしくはタブレット型PC（たとえばApple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab）、電話機、スマートフォン（たとえばApple（登録商標）iPhone、Androidが作動可能な装置、Blackberry（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントを含む。ユーザーは、ネットワーク2830を介してコンピューターシステム2801にアクセス可能である。
【０２０９】
本明細書において記載されるような方法は、たとえばメモリー2810上または電子ストレージユニット2815上などのコンピューターシステム2801の電子ストレージロケーション上に記憶された、機械（たとえばコンピュータープロセッサ）で実行可能なコードによって、遂行され得る。機械で実行可能なまたは機械で読み取り可能なコードは、ソフトウェアの形で提供され得る。使用の間に、コードはプロセッサ2805によって実行され得る。いくつかの場合において、コードはストレージユニット2815から引き出され得、そしてプロセッサ2805の速やかなアクセスのためにメモリー2810に記憶され得る。いくつかの状況においては、電子ストレージユニット2815は除外され得、かつ機械で実行可能な指示はメモリー2810に記憶される。
【０２１０】
コードはプリコンパイルされ得、かつコードを実行するために適合されたプロセッサ（processer）を有する機械での使用のために構成され得るか、または実行の最中にコンパイルされ得る。コードは、プリコンパイルされる様式かまたは実行時にコンパイルされる（as-compiled）様式でコードを実行することを可能にするように選択され得るプログラミング言語で、供給され得る。
【０２１１】
コンピューターシステム2801などの、本明細書において提供されるシステムおよび方法の局面は、プログラミングの形で具現化され得る。技術のさまざまな局面が、機械で読み取り可能な媒体の一種類として運ばれるかもしくは具現化される、典型的には機械（もしくはプロセッサ）で実行可能なコードおよび／もしくは関連付けられるデータの形である「物品」または「製品」として、みなされてよい。機械で実行可能なコードは、メモリー（たとえば読み出し専用メモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）またはハードディスクのような、電子ストレージユニット上に記憶され得る。「ストレージ」タイプの媒体は、コンピューター、プロセッサ等の有形メモリー、またはさまざまな半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブ等といった関連するそのモジュールの、あらゆるものを含み得、これらはソフトウェアプログラミングの際にいつでも非一時的なストレージを提供し得る。ソフトウェアのすべてまたは一部分は、インターネット（the Internet）またはさまざまな他の電気通信ネットワークを経由して、時々通信してよい。そのような通信は、たとえば、1つのコンピューターまたはプロセッサから別のものへ、たとえば、マネージメントサーバーまたはホストコンピューターからアプリケーションサーバーのコンピュータープラットフォームへ、ソフトウェアを読み込ませることを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を運び得る別の種類の媒体は、ローカル装置間の物理的なインターフェースを通過して使用されるもの、有線のおよび光学の固定電話ネットワークを経由して使用されるもの、ならびにさまざまなエアリンクを通じて使用されるものなどの、光波、電波、ならびに電磁波を含む。有線または無線リンク、光学リンク等といった、そのような波を運ぶ物理的な要素もまた、ソフトウェアを運ぶ媒体としてみなされてよい。本明細書において使用される場合、非一時的で有形の「ストレージ」媒体に限定されない限り、コンピューターでまたは機械で「読み取り可能な媒体」などの語は、実行のためのプロセッサへの指示の提供に関与する、任意の媒体を指す。
【０２１２】
したがって、コンピューターで実行可能なコードなどの、機械で読み取り可能な媒体は、限定するものではないが、有形のストレージ媒体、搬送波媒体、または物理的な伝達媒体を含む、多くの形をとり得る。不揮発性のストレージ媒体は、たとえば、任意のコンピューター等における任意のストレージ装置などや、図面において示されるデータベース等を実装するために使用され得るものなどの、光学もしくは磁気ディスクを含む。揮発性ストレージ媒体は、コンピュータープラットフォーム等のメインメモリーなどの、ダイナミックメモリーを含む。有形の伝達媒体は、同軸ケーブル；銅線、および光ファイバーを含み、これらは、コンピューターシステム内のバスを含む配線を含む。搬送波伝達媒体は、電気信号もしくは電磁信号の形をとってよく、または無線周波（RF）での、および赤外線での（IR）データ通信の間に生成されるものなどの、音波もしくは光波の形をとってもよい。コンピューターで読み取り可能な媒体の一般的な形態は、したがって、たとえば以下を含む：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、CD-ROM、DVDもしくはDVD-ROM、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穿孔のパターンを有する任意の他の物理的なストレージ媒体、RAM、ROM、PROMおよびEPROM、FLASH-EPROM、任意の他のメモリーチップもしくはカートリッジ、データもしくは指示を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルもしくはリンク、またはコンピューターがそれからプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み込み得る、任意の他の媒体。コンピューターで読み取り可能な媒体のこれらの形態の多くが、実行のためにプロセッサへ1つまたは複数の指示の1つまたは複数のシーケンスを運ぶことに関与し得る。
【０２１３】
コンピューターシステム2801は、たとえば、本明細書において言及される検出可能なシグナル配列、または本明細書において言及されるような分析物の同定、または本明細書において開示されるような分析物の位置、または本明細書において開示されるような任意の他の情報を提供するための、ユーザーインターフェース（UI）2840を含む電子ディスプレイ2835を含むことができ、またはこれと通信することができる。UIの例は、限定するものではないが、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）およびウェブベースのユーザーインターフェースを含む。
【０２１４】
本開示の方法およびシステムは、1つまたは複数のアルゴリズムによって遂行され得る。アルゴリズムは、中央処理装置2805による実行に際し、ソフトウェアによって遂行され得る。アルゴリズムは、たとえば、本明細書において開示される光学モジュールに対し、画像をキャプチャーするように、またはプローブ結合を管理するように、指示を出す。
【０２１５】
等価物および範囲
当業者は、本明細書において記載される本開示にしたがった特定の態様の多くの等価物を認識するか、または慣例の実験だけを用いてこれらを確認することができる。本開示の範囲は、上述の説明に限定されることを意図せず、むしろ、添付の請求の範囲において記載されるように意図される。
【０２１６】
請求の範囲において、「1つ（a）」、「1つ（an）」、および「その（the）」などの冠詞は、相反する指示がない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、1つ、もしくは1つより多くを意味し得る。群の1つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求の範囲または説明は、相反する指示がない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの1つ、複数、もしくはすべてが所定のものもしくはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する場合に、充足されるとみなされる。本開示は、群のメンバーの厳密に1つが所定のものもしくはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する態様を含む。本開示は、群のメンバーの複数またはすべてが所定のものもしくはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する態様を含む。
【０２１７】
範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、他に指示されない限り、またはそうでなければ文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈が明確に異なって指示しない限り、範囲の下限の単位の10分の1まで、本開示のさまざまな態様における規定の範囲内の、任意の特定の値または部分範囲とみなし得ることが、理解される。
【０２１８】
すべての引用源、たとえば、本明細書において引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、および技術は、引用において明示的に記述されていなくても、参照によりこの出願に組み入れられる。引用源の記述と本出願の記述が矛盾する場合には、本出願における記述が優先される。
【０２１９】
項および表の見出しは、限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０２２０】
以下は、本発明を実施するための特定の態様の例である。実施例は、例示の目的のためにのみ提供するものであり、かつ、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。使用される数値（たとえば量、温度等）に関して正確性を確保するための労力が費やされているが、しかし、いくらかの実験誤差および偏差は、当然ながら許容されるべきである。
【０２２１】
本開示の実施は、他に示されない限り、当業者の技能の範囲内にあるタンパク質化学、生化学、組み換えDNA技術、および薬理学の従来の手法を利用するであろう。そのような技術は、文献において十分に説明されている。たとえば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)参照。
【０２２２】
実施例1：分子の高密度詰め込み
以下の方法は、ピッチが200 nm〜333 nmの間にわたる四角形の規則的なアレイをどのように利用するかについて記載する。より小さいピッチですらも可能にする追加の方法が、記載される。画像化システムは、2018年3月2日に出願され、かつ参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/US2018/020737に記載されており、これは回折限界未満の画像化を可能にする参照システムとして使用される。光学システムは、332.8 um x 332.8 umのフィールドサイズで100 Hzまでのフレーム毎秒（fps）で作動する、2,048 x 2,048ピクセルの複数のカメラを含み得る。このシステムは、90 fps以上で、単一のフルオロ（fluor）と同じくらい小さいものを測定することができる。85 fpsにおいて、1分子につき1〜10コピー（または1〜10個のフルオロフォア）でこのシステムを使用することにより、63 mm x 63 mmのスライドを15分未満で画像化するという、必要とされるスループットが達成される。生化学サイクルおよび画像化が、2つのチップを用いること、または単一のチップを少なくとも2領域に分割することのいずれかによって、連続的かつ同時に実施される。
【０２２３】
実施例2：合成による配列決定を用いる、単一分子の配列決定
合成による配列決定アプローチを用いる、単一分子の配列決定を、the Apton Systemにおいて評価した。方法論を試験するため、まず、5' リン酸基を有する単鎖DNA鋳型を、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-mplate dimethylaminopropyl) carbodiimide））の化学作用を介して、フローセルのカルボヒドラジド（tecarbohydrazide）活性化シリコン表面を有するチップへと結合させた。配列決定プライマーは、表面上に付着した標的にアニールされた。本発明者らの最初の研究において使用された配列決定の鋳型は、EGFRのL858R変異、EGFRのT790M変異、およびBRAFのV600E変異を含む合成オリゴヌクレオチド、ならびにERCC 00013およびERCC 00171対照RNA転写物から逆転写された2つのcDNA試料を含んでいた。DNA鋳型の固定化およびプライマーのアニーリングの後、フローセルを、配列決定反応のためthe Apton instrumentに装填する。ここで配列決定反応は、酵素学的な単一ヌクレオチドの組み込み反応、蛍光色素検出を検出するための画像化、その後に化学的切断が続くという、複数のサイクルを含む。NEBのTherminator IX DNAポリメラーゼを、単一塩基の伸長反応のために使用した。このポリメラーゼは、修飾ジデオキシヌクレオチドを組み込む能力が増強された、9°N（商標）DNAポリメラーゼの変種である。反応において使用された4つのdNTPは、4つの異なる切断可能な蛍光色素で標識されており、かつ3' -OH基において、切断可能部分で保護されている（MyChemより、dCTP-AF488、dATP-AFCy3、dTTP-TexRed、およびdGTP-Cy5）。各配列決定反応サイクル中に、標識された単一のdNTPが組み込まれ、そしてdNTPにおける3'-保護基のために、反応は終結する。dNTPの組み込み後、組み込まれなかったヌクレオチドを洗浄によってフローセルから除去し、そして組み込まれた、蛍光色素で標識されたヌクレオチドを、塩基を同定するために画像化する。画像がキャプチャーされた後、蛍光色素および保護部分を、組み込まれたヌクレオチドから、100 mM TCEP（（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）、pH9.0）を用いて切断し、次のサイクルにおける次の相補的ヌクレオチドの、その後の付加が可能になる。この伸長、検出、および切断のサイクルは、その後、読み取りの長さを増大させるために繰り返される。
【０２２４】
図15Aは、変異体標的および野生型（WT）標的の等量を含む、EGFR遺伝子におけるコドン790付近の領域に対応する合成オリゴヌクレオチド鋳型の1:1の混合物の、配列決定の結果を示す。プライマーの後の第1塩基目に変異（野生型におけるCの組み込み、および変異体におけるTの組み込み）を有する、EGFR遺伝子のコドン790の近くの領域に対応する合成鋳型を配列決定するために使用された、色素標識されたヌクレオチドの組み込みからの画像。図15Aにおけるモンタージュは、塩基の組み込みおよび切断の交互のサイクルからの画像を示す。このデータは、塩基の組み込みの10サイクルを検出できるシステムの能力を示す。矢印は、塩基の観察された変化を示す。
【０２２５】
使用された合成オリゴヌクレオチドは、およそ60ヌクレオチドの長さであった。コドン790における変異の1塩基前に終わる配列を有するプライマーを、伸長n反応を可能にするために使用した。表面を、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込み後、およびTCEPを用いる切断反応後に、画像化した。黄色い円は、色素組み込みの10回の連続サイクルからのデータを用いてアラインされた、鋳型分子の位置を示す。分子は、実際の塩基の組み込みが、労働力を必要とする目視検査によって同定された後で、既知の色の組み込み配列と同一であるとみなされた。
【０２２６】
色素標識されたヌクレオチドを、RNA鋳型から産生されたcDNAを配列決定するために使用した。使用されたRNAは、クローン化ERCC対照プラスミドから、T7での転写によって産生された。図15Bは、塩基の組み込みおよび切断の交互のサイクルからの画像を示す。データは、塩基の組み込みの10サイクルを検出できるシステムの能力を示す。観察された配列は正確であった。黄色い矢印は切断サイクルを示す。
【０２２７】
具体的には、T7での転写によってERCC（External RNA Controls Consortium）対照プラスミドから産生された転写物に対応するcDNA鋳型を、配列決定した。生成されたcDNA分子は、＞350ヌクレオチドの長さであった。表面を、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの組み込み後、およびTCEPを用いる切断反応後に、画像化した。図15Bにおける黄色い円は、色素組み込みの10回の連続サイクルからのデータを用いてアラインされた、鋳型分子の位置を示す。データは、画像の目視の観察によって、ヌクレオチド組み込みの10サイクルを手動で検出できる能力を示した。
【０２２８】
実施例3：分析物変種についての相対位置の決定
図16は、基材上に付着し、そしてフルオロフォアを含むプローブによって結合された、単一分子の画像である。分子は、抗ERK抗体が結合した、細胞溶解物からのERKタンパク質であり、ERKタンパク質は固体の支持体に共有結合している。抗体は、1分子につき3〜5個のフルオロフォアで標識されている。類似の画像は、たとえば合成による配列決定中に、単一のフルオロの核酸標的を用いて獲得可能である。
【０２２９】
検出の正確性を改善するため、分子を、プローブの結合および除去の連続したサイクル、この場合は30サイクル、に供した。各ラウンドにおいて、画像を、分子の位置を決定するために処理する。画像をバックグラウンド除去し、2Xでオーバーサンプリングし、その後ピークを同定する。サイクルの複数の層を、20 nmのグリッド上にオーバーレイする。位置の分散は、標準偏差、または測定の数の平方根で割った半径である。図17の右パネルは、オーバーレイされた各サイクルからの各ピークを示す。左パネルは、右パネルの平滑化バージョンである。それぞれの明るいスポットは分子を表す。分子の位置は、200 nmより短い分子間距離で解像可能である。図18は、フィールドにおいて見いだされる複数の分子のそれぞれについてのローカライゼーションの変動を示す。ローカライゼーションの分散の中央値は5 nmであり、かつ、3シグマのローカライゼーションの分散は10 nmより小さい。
【０２３０】
実施例4：高密度に詰め込まれた配列決定基質、および片面での密度
一本鎖環の形成：
基材の表面上において、ランダムに分布しており、密接して詰め込まれた層の中に分布するように、標的配列を含むコンカテマーのライブラリーを調製するため、標的配列を含む試料を、図23Aに示されるように、増幅され、精製され、環状化されたDNAを形成するためにライゲーションし、そして定量した。
【０２３１】
標的の増幅
Affymetrix（Santa Clara, CA − PN 14380）から購入した大腸菌DNAを使用して、標準的なプロトコルを用いて作製されたIllumina MiSeqライブラリーは、SegMatic（Fremont, CA）から購入した。
【０２３２】
ライブラリーを、PCR増幅法によって増幅した。PCRの各反応は、表1に列挙される以下の成分を含んでいた：
【表１】
2022501026.tif 000003
【０２３３】
プライマーミックスは、10 uMのP5-リン酸
2022501026.tif 000004
プライマーの、50:50の混合物である。
【０２３４】
PCR増幅を、以下の条件下で実施した：5 mMで94℃、これに続いて、以下を35サイクル：94℃で15秒；55℃で30秒；および68℃で30秒。増幅産物のアリコートを、ライブラリーの分子サイズ（この例においては300〜500塩基対）を検証するため、2%ゲルにおいて泳動させた。PCR増幅産物をその後、PureLink（登録商標）スピンカラム（Thermofisher）を製造者のプロトコルにしたがって用いて、精製した。
【０２３５】
標的DNAの環状化
精製されたPCR増幅産物をその後、表2に記載される反応ミックス中で、ライゲーションによる一本鎖環状化に供した：
【表２】
2022501026.tif 000005
【０２３６】
ブリッジングオリゴヌクレオチド配列は、
2022501026.tif 000006
であった。
【０２３７】
ライゲーションを、以下の条件下で実施した：95℃で30秒、これに続いて、以下を40サイクル：95℃で15秒；55℃で2分；および62℃で3分。
【０２３８】
ライゲーション後、それぞれ1 μLのエキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼIII（New England Biolabs）を添加し、そして反応物をさらに、37℃で45分間、および85℃で30分間、インキュベートする。結果として生じた物質を、Zymo-Spin（商標）カラム（Oligo Clean & Concentrator（商標）キット、Zymo Research, Irvine, CA）を使用し、製造者のプロトコルを用いて精製した。精製後、Qubit 2.0蛍光光度計（ThermoFisher）およびQuant-iT OliGreen（登録商標）（ThermoFisher）を既知の濃度のオリゴヌクレオチドを用いるカスタム較正試料とともに使用して、濃度を測定した。
【０２３９】
環状化されたDNAからのコンカテマーの形成
標的配列を含む環状化されたDNAからのコンカテマーは、表3に記載される反応ミックスにおいて形成された：
【表３】
2022501026.tif 000007
【０２４０】
プライマー溶液は、3x反応緩衝液中の、プライマー
2022501026.tif 000008
の750 nMの懸濁液であった。10X反応緩衝液は以下のとおりであった：500 mM Tris-HCl、100 mM (NH4)2SO4、40 mM DTT、100 mM MgCl2、25℃でpH 7.5。
【０２４１】
環状鋳型＋プライマーミックスを、10 mM、90℃でインキュベートし、そして次に、30分間30℃でインキュベートした。あらかじめ温めておいた酵素ミックスをその後、表3のように、90 mMで添加した。反応不活化緩衝液を添加して反応を停止させ、そして4℃で保管した。
【０２４２】
その後、図23Bに示されるように、かつ後述のように、高密度に詰め込まれ、ランダムに分布している層であって、基材の表面に結合した層を形成するため、コンカテマーライブラリーを基材上で層形成させ、続いて、画像化および画像処理による、結合したコンカテマーの配列決定、ならびにデータの解析を行った。
【０２４３】
1マイクロリットルの配列決定基質を、19 ulのクエン酸リン酸緩衝液と混合し、そして10 ulをカスタムバイオチップ上にロードし、一晩インキュベートした。チップをその後、クエン酸リン酸緩衝液を用いて2回、リン酸カリウム緩衝液を用いて2回、およびNA洗浄液3緩衝液を用いて2回、洗浄した。
【０２４４】
アイデンティティを決定するため、チップの表面に結合させたコンカテマー層に、蛍光プローブを結合させた。密度を示す画像は、図25A〜25Cに示される。図25Dは、本明細書に記載される方法にしたがった、片面のコンカテマー層の測定された密度（Apton − 対照標的）、およびより高密度でシミュレートされた分布（Apton − Sim）のプロットを示す。
【０２４５】
実施例5：大腸菌のリードの配列決定
画像化／配列決定
合成による配列決定を、標準的な配列決定化学を用いて実施した。高密度に詰め込まれたコンカテマー層を含むチップを、AptonBio Sequencerに装填し、そして洗浄液1（20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2 SO4、10 mM KCl、2 mM MgSo4、0.1% 100、25℃でpH 8.8、50 mM NaCl）を用いて、5 mM、60℃で、6回洗浄した。配列決定するオリゴ
2022501026.tif 000009
を、ハイブリダイゼーション緩衝液中で100 nMに希釈し、1 mMで1回インキュベートし、続いて、ハイブリダイゼーション操作の間に、10 mM、60℃で、洗浄液1を用いた2回の洗浄を行った。つまり、以下の8操作の32サイクルを実施した。
【０２４６】
1 − 開裂：表4の緩衝液を用いて、60℃で225秒
【表４】
2022501026.tif 000010
【０２４７】
2 − 洗浄：pH 8のリン酸緩衝液中で、30℃で240秒。
【０２４８】
3 − 画像化：洗浄液2（20 mM Tris-HCl、5 mM アスコルビン酸（pH 8.8）
【０２４９】
4 − 洗浄：60℃で洗浄液1
【０２５０】
5 − 伸長：表5の緩衝液を用いて、60℃で450秒
【表５】
2022501026.tif 000011
【０２５１】
6 − 洗浄：30℃で洗浄液1
【０２５２】
7 − 洗浄：pH 8のリン酸緩衝液中で、30℃で2分。
【０２５３】
8 − 画像化：洗浄液2。
【０２５４】
結果：
30〜40 bpのリードは図27Aに示される。20〜25 bpのリードは図27Bに示される。
【０２５５】
図27Cに示されるクロスプロットは、大腸菌の配列決定のための個々のスポットにおける、ベースコーリングの解像を示す。
【０２５６】
本発明の好ましい態様は本明細書において示されかつ記載されているが、そのような態様が、単なる例として提供されていることは、当業者には明らかである。本発明が、本明細書中に提供される特定の例によって限定されることを目的としているわけではない。本発明は前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における態様の説明および図面は、制限的な意味に解釈されるべきではない。無数の変更、改変、および置き換えが、本発明から逸脱することなく、今や当業者に想起されるであろう。さらに、本発明のすべての局面は、多様な条件および可変のものに左右される、本明細書において記載される特定の描写にも構成にも相対的な比率にも限定されないことが、理解されるべきである。本明細書において記載される本発明の態様のさまざまな代替物が、本発明を実践する際に採用され得ることが、理解されるべきである。したがって、本発明はまた、任意のそのような代替のもの、修飾したもの、変更したもの、または同等のものを包含することが、企図される。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、かつこの特許請求の範囲内の方法および構成、ならびにそれらの等価物がそれにより包含されることを定義することを、意図する。
【図１】
2022501026.tif 000013
【図２Ａ】
2022501026.tif 000014
【図２Ｂ】
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【図３】
2022501026.tif 000016
【図４】
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【図５】
2022501026.tif 000018
【図６】
2022501026.tif 000019
【図７】
2022501026.tif 000020
【図８】
2022501026.tif 000021
【図９】
2022501026.tif 000022
【図１０Ａ】
2022501026.tif 000023
【図１０Ｂ】
2022501026.tif 000024
【図１０Ｃ】
2022501026.tif 000025
【図１１】
2022501026.tif 000026
【図１２】
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【図１３】
2022501026.tif 000028
【図１４】
2022501026.tif 000029
【図１５Ａ】
2022501026.tif 000030
【図１５Ｂ】
2022501026.tif 000031
【図１６】
2022501026.tif 000032
【図１７】
2022501026.tif 000033
【図１８】
2022501026.tif 000034
【図１９】
2022501026.tif 000035
【図２０】
2022501026.tif 000036
【図２１】
2022501026.tif 000037
【図２２】
2022501026.tif 000038
【図２３Ａ】
2022501026.tif 000039
【図２３Ｂ】
2022501026.tif 000040
【図２４】
2022501026.tif 000041
【図２５Ａ】
2022501026.tif 000042
【図２５Ｂ】
2022501026.tif 000043
【図２５Ｃ】
2022501026.tif 000044
【図２５Ｄ】
2022501026.tif 000045
【図２６Ａ】
2022501026.tif 000046
【図２６Ｂ】
2022501026.tif 000047
【図２６Ｃ】
2022501026.tif 000048
【図２６Ｄ】
2022501026.tif 000049
【図２７Ａ】
2022501026.tif 000050
【図２７Ｂ】
2022501026.tif 000051
【図２７Ｃ】
2022501026.tif 000052
【図２８】
2022501026.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】令和3年6月2日(2021.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2022501026000001.app
【国際調査報告】
2022501026.tif 000054
2022501026.tif 000055
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