(57)【要約】  修飾ｔＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現させ、かつ／または未成熟終止コドンによって媒介される疾患を治療することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを前記細胞に導入することを含み、それによって前記ｔＲＮＡは、前記細胞内で発現されて、前記アミノ酸でアミノアシル化されると、前記未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ前記未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、前記アミノ酸が前記遺伝子産物に組み込まれることを可能にする、方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法であって、前記方法は、（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを前記細胞に導入することを含み、それによって前記ｔＲＮＡは、前記細胞に導入されて前記アミノ酸でアミノアシル化されると、前記未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ前記未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、前記アミノ酸が前記遺伝子産物に組み込まれることを可能にする、方法。
【請求項３】
前記遺伝子は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＡＲＳＢ、β−グロビン、ＣＦＴＲ、ＣＨＭ、ＤＨＣＲ７、ジストロフィン、フィブリン−１（ＦＢＮ１）、ＫＩＦ１Ａ、ＮＡＧＬＵ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＭＮ１、およびＳＭＰＤ１遺伝子から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法であって、前記方法は、（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを前記細胞に導入することを含み、それによって前記ｔＲＮＡは、前記細胞内で発現されて、前記アミノ酸でアミノアシル化されると、前記未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ前記未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、前記アミノ酸が前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする、方法。
【請求項６】
細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法であって、前記方法は、（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを前記細胞に導入することを含み、それによって前記ｔＲＮＡは、前記細胞に導入されて前記アミノ酸でアミノアシル化されると、前記未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ前記未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、前記アミノ酸が前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする、方法。
【請求項７】
前記細胞は、前記ｔＲＮＡを有さない細胞よりも少ない切断遺伝子産物を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、前記ｔＲＮＡを有さない細胞よりも多い量の機能的遺伝子産物を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｔＲＮＡによって生成される前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、前記切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物よりも高い活性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、Ｎａｖ１．１タンパク質である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、配列番号４、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸を含むポリペプチドを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、配列番号４を含むポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｔＲＮＡは、前記細胞内でアミノアシル化される、請求項２〜４または６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
未成熟終止コドン媒介性障害の治療を必要とする対象において、未成熟終止コドン媒介性障害を治療する方法であって、前記対象は未成熟終止コドンを伴う遺伝子を有し、前記方法は、前記対象に、（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを投与し、それによって前記対象における前記障害を治療すること含む、方法。
【請求項１７】
未成熟終止コドン媒介性障害の治療を必要とする対象において、未成熟終止コドン媒介性障害を治療する方法であって、前記対象は未成熟終止コドンを伴う遺伝子を有し、前記方法は、前記対象に、（ｉ）前記未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを投与し、それによって前記対象における前記障害を治療することを含む、方法。
【請求項１８】
前記対象は、ヒトである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記障害は、β−サラセミア、コロイデレミア（ＣＨＭ）、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ＫＩＦ１Ａ、リソソーム蓄積症（例えば、マロトー・ラミー症候群、ニーマン・ピック病、およびサンフィリッポ症候群）、マルファン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、および脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記障害は、ドラベ症候群である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、スチリペントール、カンナビジオール、ケトン食、クロバザム、トピラメート、またはバルプロ酸を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における前記未成熟終止コドンは、ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ、ｃ．１４９２Ａ＞Ｔ、ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１８３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１３４Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５９３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３６３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３７３３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３９８５Ｃ＞Ｔ、ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ、ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ、およびｃ．５７３４Ｃ＞Ｔから選択される変異によって引き起こされる、請求項４〜１５または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における前記未成熟終止コドンは、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔおよびｃ．３９８５Ｃ＞Ｔから選択される変異によって引き起こされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸は、セリン、ロイシン、グルタミン、およびアルギニンから選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸は、グルタミンおよびアルギニンから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸は、アルギニンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンチコドンは、ＵＡＧ、ＵＧＡ、およびＵＡＡから選択されるコドンにハイブリダイズする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アンチコドンは、ＵＧＡおよびＵＡＡから選択されるコドンにハイブリダイズする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンチコドンは、ＵＧＡにハイブリダイズする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１および配列番号２から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｔＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１７および配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｔＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド修飾を含む、請求項２〜４、６〜１５、または１７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｔＲＮＡは、５−メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１−メチルアデノシンから選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１、３〜５、７〜１４、１６、または１８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記発現ベクターは、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１、３〜５、７〜１４、１６、１８〜３５、または３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞に導入されるか、または前記対象に投与される前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、別の部分にコンジュゲートまたは会合されていない、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞に導入されるか、または前記対象に投与される前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、担体粒子にコンジュゲートまたは会合されていない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記担体粒子は、アミノ脂質粒子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、ナノ粒子を欠く投与形態で、前記細胞に導入されるか、または対象に投与される、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、アミノ脂質送達化合物を欠く投与形態で、前記細胞に導入されるか、または対象に投与される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、ｔＲＮＡ。
【請求項５０】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５１】
前記ｔＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５２】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５３】
前記ｔＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５４】
前記ｔＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド修飾を含む、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５５】
前記ｔＲＮＡは、５−メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１−メチルアデノシンから選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載のｔＲＮＡ。
【請求項５６】
請求項４９〜５５のいずれか一項に記載のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５８】
前記発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
前記発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
前記発現ベクターは、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載の発現ベクター。
【請求項６１】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６２】
前記ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターである、請求項６１に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６１または６２に記載の発現ベクター。
【請求項６４】
請求項４９〜５５のいずれか一項に記載のｔＲＮＡまたは請求項５７〜６３のいずれかに記載の発現ベクター、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６５】
前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、別の部分にコンジュゲートまたは会合されていない、請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記ｔＲＮＡまたは発現ベクターは、担体粒子にコンジュゲートまたは会合されていない、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記担体粒子は、アミノ脂質粒子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記組成物は、ナノ粒子を含まない、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記組成物は、アミノ脂質送達化合物を含まない、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年９月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／７３６，８３４号および２０１９年２月１４日に出願された第６２／８０５，７９３号からの優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、全般的には、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物を発現し、かつ／または未成熟終止コドンによって媒介される障害を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質合成は、合成されるタンパク質に組み込まれるアミノ酸をコードする６１種の３塩基対コドン、およびタンパク質の合成を終結する３種の３塩基対コドン（終止コドンまたは終結コドンと呼ばれる）を含む遺伝暗号によって指示される。タンパク質をコードする核酸配列が、変異されて次のアミノ酸のコドンではなく、未成熟終止コドンを含むとき、生じるタンパク質は未成熟で終結され、しばしば非機能性であるか、または非切断もしくは全長タンパク質よりも低い機能性である。かかる変異は、ナンセンス変異と呼ばれ、しばしば、多くの異なる遺伝疾患に関連しているか、またはそれらの原因因子である。
【０００４】
多くの障害は、ナンセンス変異に関連しているか、またはナンセンス変異によって引き起こされる。これらには、β−サラセミア、コロイデレミア（ＣＨＭ）、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ＫＩＦ１Ａ、リソソーム蓄積症（例えば、マロトー・ラミー症候群、ニーマン・ピック病、およびサンフィリッポ症候群）、マルファン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、および脊髄性筋萎縮症が含まれる。
【０００５】
ドラベ症候群は、乳児期に始まる難治性てんかんのまれで壊滅的な形態である。最初に、患者は長期の発作を経験する。それらの２年目には、追加のタイプの発作が発生し始め、おそらく繰り返えされる脳低酸素症に起因した、発達の低下傾向と典型的には一致する。これは、言語および運動能力の発達不良につながる。ＳＣＮ１Ａ（電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットをコードする）、ＳＣＮ１Ｂ（電位依存性ナトリウムチャネルβ１サブユニットをコードする）、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ９Ａ、ＧＡＢＲＧ２（γ−アミノ酪酸受容体γ２サブユニットをコードする）、ＧＡＢＲＤ（γ−アミノ酪酸受容体Δサブユニットをコードする）、および／またはＰＣＤＨ１９遺伝子における変異は、ドラベ症候群に関連付けられている。
【０００６】
例えば、ドラベ症候群は、遺伝子のナンセンス変異によって引き起こされ得、未成熟終止コドン、および未切断または機能性タンパク質の欠如または量の減少をもたらす。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は通常、ニューロンの電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットであるＮａ（Ｖ）１．１をコードする。マウスモデルでは、ＳＣＮ１Ａの機能喪失型変異は、ナトリウム電流の減少、および海馬のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの損なわれた興奮性をもたらすことが観察されている。
【０００７】
したがって、当技術分野では、ドラベ症候群を含む、未成熟終止コドンによって媒介される疾患を治療するための改良された組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示の一態様は、哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞内で発現されて、アミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸が遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【０００９】
本開示の別の態様は、哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞に導入されてアミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸が遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００１０】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、遺伝子は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＡＲＳＢ、β−グロビン、ＣＦＴＲ、ＣＨＭ、ＤＨＣＲ７、ジストロフィン、フィブリン−１（ＦＢＮ１）、ＫＩＦ１Ａ、ＮＡＧＬＵ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＭＮ１、またはＳＭＰＤ１遺伝子であることができる。ある特定の実施形態において、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子である。
【００１１】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞内で発現されて、アミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００１２】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞に導入されて、アミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００１３】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞よりも少ない切断遺伝子産物を含む。ある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞よりも多い量の機能的遺伝子産物を含む。
【００１４】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、ｔＲＮＡによって生成される（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物よりも高い活性を有する。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、Ｎａｖ１．１タンパク質である。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、配列番号４、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００１５】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は中枢神経系細胞、例えばニューロンである。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、細胞内でアミノアシル化されるようになる。
【００１６】
別の態様において、本開示は、未成熟終止コドン媒介性障害、例えば、ドラベ症候群を治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを有する遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を有する。本方法は、対象に、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡを発現することができる有効量の発現ベクターを投与し、それによって対象における障害を治療することを含む。
【００１７】
別の態様において、本開示は、未成熟終止コドン媒介性障害、例えば、ドラベ症候群を治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを有する遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を有する。本方法は、対象に、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡを投与し、それによって対象における障害を治療することを含む。
【００１８】
上記治療方法のある特定の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、β−サラセミア、コロイデレミア（ＣＨＭ）、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ＫＩＦ１Ａ、リソソーム蓄積症（例えば、マロトー・ラミー症候群、ニーマン・ピック病、およびサンフィリッポ症候群）、マルファン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、および脊髄性筋萎縮症から選択される。ある特定の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、ドラベ症候群である。ある特定の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、ドラベ症候群であり、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
【００１９】
上記治療方法のいずれかの他の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、てんかん障害、てんかん性脳症、ドラベ症候群、レノックス・ガストー症候群、クリーフストラ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＫＣＮＱ２脳症、ＳＹＮＧＡＰ１脳症、ＧＢＡを有するパーキンソン病、ＣＤＫＬ５、ＳＬＣ６Ａ１、ＢＲＭＵＴＤ、ソトス症候群、ＧＬＵＴ１欠損症候群、および中枢神経系（ＣＮＳ）関連障害に関連する任意の他の未成熟終止コドン媒介性障害から選択される。いくつかの実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、ドラベ症候群およびレノックス・ガストー症候群を含む、てんかん障害またはてんかん性脳症から選択される。
【００２０】
上記治療方法のいずれかのさらに他の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、選択される５ｑ症候群、アダムス・オリバー症候群１、アラジール症候群１、自己免疫リンパ増殖性症候群１Ａ型、カーニー複合Ｉ型、チャージ症候群、コフィン・サイリズ症候群、デュアン症候群、嚢胞性線維症、マルファン症候群、エーラス・ダンロス症候群、ファインゴールド症候群１、デニス・ドラッシュ症候群／フレイジャー症候群、ディジョージ症候群（ＴＢＸ１関連）、鎖骨頭蓋異形成症、または上記に列挙されていない任意の他のＣＮＳ関連障害である。
【００２１】
上記治療方法のいずれかのある特定の実施形態において、対象はヒトである。ある特定の実施形態において、本方法はさらに、ＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸を、対象に投与することを含む。
【００２２】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における未成熟終止コドンは、ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ、ｃ．１４９２Ａ＞Ｔ、ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１８３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１３４Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５９３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３６３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３７３３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３９８５Ｃ＞Ｔ、ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ、ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ、およびｃ．５７３４Ｃ＞Ｔから選択される変異、または変異の組み合わせによって引き起こされる。ある特定の実施形態において、未成熟終止は、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔおよびｃ．３９８５Ｃ＞Ｔから選択される変異によって引き起こされる。
【００２３】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、アミノ酸は、セリン、ロイシン、グルタミン、およびアルギニンから選択され、例えば、アミノ酸は、グルタミンおよびアルギニンから選択され、例えば、アミノ酸は、アルギニンである。ある特定の実施形態において、アンチコドンは、ＵＡＧ、ＵＧＡ、およびＵＡＡから選択されるコドンにハイブリダイズし、例えば、アンチコドンは、ＵＧＡおよびＵＡＡから選択されるコドンにハイブリダイズし、例えば、アンチコドンは、ＵＧＡにハイブリダイズする。
【００２４】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１および配列番号２から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、例えば、５−メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１−メチルアデノシンから選択される、１つ以上の天然起源のヌクレオチド修飾を含む。
【００２５】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００２６】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞に導入されるか、または対象に投与されるｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、別の部分、例えば、担体粒子、例えば、アミノ脂質粒子に、コンジュゲートまたは会合されていない。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、ナノ粒子を欠く投与形態で、細胞に導入されるか、または対象に投与される。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、アミノ脂質送達化合物を欠く投与形態で、細胞に導入されるか、または対象に投与される。
【００２７】
別の態様において、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含むｔＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、例えば、ｔＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含み、例えば、ｔＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド修飾を含み、例えば、ｔＲＮＡは、５−メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１−メチルアデノシンから選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。
【００２８】
別の態様において、本開示は、上記ｔＲＮＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本開示は、上記核酸を含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００２９】
別の態様において、本開示は、上記ｔＲＮＡのいずれか、または上記発現ベクターのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、別の部分、例えば、担体粒子、例えば、アミノ脂質粒子に、コンジュゲートまたは会合されていない。ある特定の実施形態において、組成物は、ナノ粒子および／またはアミノ脂質送達化合物を含まない。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の態様ならびに特徴は、以下の詳細な説明および特許請求に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】切断タンパク質産物、例えば、ドラベ症候群を有する対象におけるタンパク質産物をもたらす、未成熟終止コドン（ＰＳＣ）を含むＳＣＮ１Ａ転写物の概略図である。終止コドンは影付きの円で示され、未成熟終止コドンは影なしの円で示される。サプレッサーｔＲＮＡ（アンチコドン修飾アルギニンｔＲＮＡ）の発現は、ＰＳＣのリードスルーを可能にし、全長タンパク質の発現を促進する。
【図２Ａ】コンセンサスｔＲＮＡ二次構造である。残基の番号付けは、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２１：３０１１−１５に記載されているｔＲＮＡ番号付けシステムに基づいている。２１：３０１１−１５．
【図２Ｂ】特定の真核生物のサイトゾルに由来するｔＲＮＡ配列における修飾プロファイルを示す表である。表中の比は、図２Ａに示されている番号の付いた位置での列挙されたヌクレオチドの出現頻度を示す。修飾された残基に関する略語は、Ｍｏｔｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．で定義されている。
【図３】ＰＳＣ＋／−８隣接コドンを含む介在配列を介してホタルルシフェラーゼに連結したウミシイタケルシフェラーゼを含むルシフェラーゼレポーター構築体の概略図である。
【図４】Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１（配列番号１）、Ａｒｇ−ＴＣＡ−３−１（配列番号２）、およびＡｒｇ−ＴＣＡ−６−１（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列を示す。変異型ＴＣＡアンチコドンは枠で特定される。
【図５Ａ−５Ｂ】示されるルシフェラーゼレポーター構築体および／またはサプレッサーｔＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における未成熟終止コドン（ＰＳＣ）のリードスルーを示すグラフである。ＰＳＣのリードスルーは、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性の比（ホタル／ウミシイタケ）として計算した。ｙ軸に示されている平均リードスルーは、コントロールＣＧＡ含有構築体（ホタル／ウミシイタケ）の平均リードスルーで除した、ＰＳＣ含有構築体（ホタル／ウミシイタケ）の平均リードスルーである。
【図６】Ｇｌｎ−ＴＴＡ−１−１（配列番号１６）、Ｇｌｎ−ＴＴＡ−２−１（配列番号１７）、およびＧｌｎ−ＴＴＡ−３−１（配列番号１８）をコードするヌクレオチド配列を示す。変異型ＴＴＡアンチコドンは、枠で特定される。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、全般的には、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物を発現し、かつ／または未成熟終止コドンによって媒介される障害を治療するための方法および組成物に関する。
【００３３】
本開示は、部分的には、アミノ酸が哺乳動物細胞における遺伝子によってコードされる遺伝子産物に組み込まれることを、そうでなければ遺伝子における未成熟熟終止コドン（ＰＳＣ）によって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で可能にする、ｔＲＮＡ（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ）の発見に基づいている。さらに、アミノ酸が遺伝子によってコードされる遺伝子産物に組み込まれることを、そうでなければ遺伝子におけるＰＳＣによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、可能にするｔＲＮＡを使用して、対象における遺伝子のＰＳＣによって媒介される疾患を治療することができることが発見された。
【００３４】
したがって、一態様において、本開示は、哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子によってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を発現することができる有効量の発現ベクターを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞内で発現されて、アミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸が遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００３５】
別の態様において、本開示は、哺乳動物細胞において、未成熟終止コドンを含む遺伝子よってコードされる機能的遺伝子産物を発現する方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞に導入されてアミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸が遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００３６】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞よりも少ない切断遺伝子産物を含む。例えば、ある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞と比較して、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％の切断遺伝子産物を含む。ある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞と比較して、約５％〜約８０％、約５％〜約６０％、約５％〜約４０％、約５％〜約２０％、約５％〜約１０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、または約６０％〜約８０％の切断遺伝子産物を含む。ある特定の実施形態において、細胞内に検出可能な切断遺伝子産物は存在しない。切断遺伝子産物の量または発現は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【００３７】
ある特定の実施形態において、細胞は、ｔＲＮＡを有さない細胞よりも多い量の機能的遺伝子産物を含む。例えば、ある特定の実施形態において、本方法は、細胞、組織、または対象における機能的遺伝子産物の量を、ｔＲＮＡを有さない細胞、組織、または対象と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、もしくは約５００％増加させる。ある特定の実施形態において、本方法は、細胞、組織、または対象における機能的遺伝子産物の量を、ｔＲＮＡを有さない細胞、組織、または対象と比較して、約２０％〜約２００％、約２０％〜約１８０％、約２０％〜約１６０％、約２０％〜約１４０％、約２０％〜約１２０％、約２０％〜約１００％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約４０％〜約２００％、約４０％〜約１８０％、約４０％〜約１６０％、約４０％〜約１４０％、約４０％〜約１２０％、約４０％〜約１００％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、約６０％〜約２００％、約６０％〜約１８０％、約６０％〜約１６０％、約６０％〜約１４０％、約６０％〜約１２０％、約６０％〜約１００％、約６０％〜約８０％、約８０％〜約２００％、約８０％〜約１８０％、約８０％〜約１６０％、約８０％〜約１４０％、約８０％〜約１２０％、約８０％〜約１００％、約１００％〜約２００％、約１００％〜約１８０％、約１００％〜約１６０％、約１００％〜約１４０％、約１００％〜約１２０％、約１２０％〜約２００％、約１２０％〜約１８０％、約１２０％〜約１６０％、約１２０％〜約１４０％、約１４０％〜約２００％、約１４０％〜約１８０％、約１４０％〜約１６０％、約１６０％〜約２００％、約１６０％〜約１８０％、もしくは約１８０％〜約２００％増加させる。機能的遺伝子産物の量または発現は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【００３８】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、遺伝子は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＡＲＳＢ、β−グロビン、ＣＦＴＲ、ＣＨＭ、ＤＨＣＲ７、ジストロフィン、フィブリン−１（ＦＢＮ１）、ＫＩＦ１Ａ、ＮＡＧＬＵ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＭＮ１、およびＳＭＰＤ１遺伝子から選択される。ある特定の実施形態において、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子である。
【００３９】
ある特定の実施形態において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における未成熟終止コドンは、ｃ．５８Ｇ＞Ｔ、ｃ．５７５Ｇ＞Ａ、ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．９６２Ｃ＞Ｇ，ｃ．１０９５ｄｕｐＴ、ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３１５Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３４８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３６６Ｇ＞Ｔ、ｃ．１４９２Ａ＞Ｔ、ｃ．１５３７Ｇ＞Ｔ、ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１８０４Ｇ＞Ｔ、ｃ．１８３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１３４Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３７０Ｔ＞Ａ、ｃ．２４９５Ｇ＞Ａ、ｃ．２５９３Ｃ＞Ｔ、ｃ．２６３５ｄｅｌＣ、ｃ．２９０４Ｃ＞Ａ、ｃ．３２９５Ｇ＞Ｔ、ｃ．３３１１Ｃ＞Ａ、ｃ．３４５２Ｃ＞Ｇ、ｃ．３６３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３６５６Ｇ＞Ａ、ｃ．３７３３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３７８３Ｃ＞Ａ、ｃ．３８２９Ｃ＞Ｔ、ｃ．３９８５Ｃ＞Ｔ、ｃ．４３５９Ｔ＞Ｇ、ｃ．４５４７Ｃ＞Ａ、ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ、ｃ．４７２１Ｃ＞Ｇ、ｃ．４９５４Ｇ＞Ｔ、ｃ．５６４１Ｇ＞Ｔ、ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ、およびｃ．５７３４Ｃ＞Ｔから選択される変異、または変異の組み合わせによって引き起こされる。ある特定の実施形態において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における未成熟終止コドンは、ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１２９Ｃ＞Ｔ、ｃ．１４９２Ａ＞Ｔ、ｃ．１６２４Ｃ＞Ｔ、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１８３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．２１３４Ｃ＞Ｔ、ｃ．２５９３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３６３７Ｃ＞Ｔ、ｃ．３７３３Ｃ＞Ｔ、ｃ．３９８５Ｃ＞Ｔ、ｃ．４５７３Ｃ＞Ｔ、ｃ．５６５６Ｃ＞Ｔ、およびｃ．５７３４Ｃ＞Ｔから選択される変異によって引き起こされる。ある特定の実施形態において、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における未成熟終止コドンは、ｃ．１７３８Ｃ＞Ｔおよびｃ．３９８５Ｃ＞Ｔから選択される変異によって引き起こされる。
【００４０】
ある特定の実施形態において、遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、ｔＲＮＡによって生成されるＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物である。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物よりも高い活性、例えば、より高い電位依存性ナトリウムチャネル活性を有する。ある特定の実施形態において、本方法は、細胞、組織、または対象における電位依存性ナトリウムチャネル活性を、ｔＲＮＡを有さない細胞、組織、または対象と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％増加させる。ある特定の実施形態において、本方法は、細胞、組織、または対象における電位依存性ナトリウムチャネル活性を、ｔＲＮＡを有さない細胞、組織、または対象と比較して、約２０％〜約２００％、約２０％〜約１８０％、約２０％〜約１６０％、約２０％〜約１４０％、約２０％〜約１２０％、約２０％〜約１００％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約４０％、約４０％〜約２００％、約４０％〜約１８０％、約４０％〜約１６０％、約４０％〜約１４０％、約４０％〜約１２０％、約４０％〜約１００％、約４０％〜約８０％、約４０％〜約６０％、約６０％〜約２００％、約６０％〜約１８０％、約６０％〜約１６０％、約６０％〜約１４０％、約６０％〜約１２０％、約６０％〜約１００％、約６０％〜約８０％、約８０％〜約２００％、約８０％〜約１８０％、約８０％〜約１６０％、約８０％〜約１４０％、約８０％〜約１２０％、約８０％〜約１００％、約１００％〜約２００％、約１００％〜約１８０％、約１００％〜約１６０％、約１００％〜約１４０％、約１００％〜約１２０％、約１２０％〜約２００％、約１２０％〜約１８０％、約１２０％〜約１６０％、約１２０％〜約１４０％、約１４０％〜約２００％、約１４０％〜約１８０％、約１４０％〜約１６０％、約１６０％〜約２００％、約１６０％〜約１８０％、または約１８０％〜約２００％増加させる。電位依存性ナトリウムチャネル活性は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定され得、例えば、Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．２７（４１）：１１０６５−７４、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＮＡＴ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．９（９）：１１４２−９、およびＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＮＡＴＵＲＥ４８９（７４１６）：３８５−３９０に記載されている。
【００４１】
ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、Ｎａｖ１．１タンパク質である。ある特定の実施形態において、機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物は、配列番号４、配列番号１４、もしくは配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチド、あるいは配列番号４、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一を有するポリペプチドである。
【００４２】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を発現させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を発現することができる有効量の発現ベクターを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞内で発現されて、アミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００４３】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる機能的ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を発現させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞に導入されてアミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００４４】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡ（例えば、表２で示される）を発現することができる有効量の発現ベクターを細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞内で発現されて、アミノ酸でアミノアシル化されるとき、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００４５】
別の態様において、本開示は、細胞において、未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる電位依存性ナトリウムチャネル活性を増加させる方法を提供する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を細胞に導入することを含み、それによってｔＲＮＡは、細胞に導入されてアミノ酸でアミノアシル化されると、未成熟終止コドンにハイブリダイズし、そうでなければアミノ酸が未成熟終止コドンによって引き起こされる切断ＳＣＮ１Ａ遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸がＳＣＮ１Ａ遺伝子産物に組み込まれることを可能にする。
【００４６】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は中枢神経系細胞、例えばニューロンである。
【００４７】
別の態様において、本開示は、未成熟終止コドン媒介性障害を治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを伴う遺伝子を有する。本方法は、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を発現することができる有効量の発現ベクターを対象に投与し、それによって対象における障害を治療することを含む。
【００４８】
別の態様において、本開示は、未成熟終止コドン媒介性障害を治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを伴う遺伝子を有する。本方法は、対象に、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる有効量のｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を投与し、それによって対象における障害を治療することを含む。
【００４９】
ある特定の実施形態において、未成熟終止コドン媒介性障害は、以下で表１に列挙される障害であり、未成熟終止コドンを有する遺伝子は、以下で表１の対応する行に列挙される遺伝子である。
【表１】
2022501055.tif 000003
【００５０】
別の態様において、本開示は、ドラベ症候群を治療する方法を、それを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを伴うＳＣＮ１Ａ遺伝子を有する。本方法は、対象に、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化することができる、ｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を発現することができる有効量の発現ベクターを投与し、それによって対象におけるドラベ症候群を治療することを含む。
【００５１】
別の態様において、本開示は、ドラベ症候群を治療する方法をそれを必要とする対象において提供し、対象は、未成熟終止コドンを伴うＳＣＮ１Ａ遺伝子を有する。本方法は、対象に、（ｉ）未成熟終止コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）アミノ酸とアミノアシル化することができる、有効量のｔＲＮＡ（例えば、以下で表２に示される）を投与し、それによって対象におけるドラベ症候群を治療することを含む。
【００５２】
別の態様において、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含むｔＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、例えば、ｔＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のヌクレオチド配列を含み、例えば、ｔＲＮＡは、配列番号１７または配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。別の態様において、本開示は、上記ｔＲＮＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本開示は、上記核酸を含む発現ベクターを提供する。別の態様において、本開示は、上記ｔＲＮＡのいずれか、または上記発現ベクターのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
上記方法のいずれかのある特定の実施形態において、細胞に導入されるか、または対象に投与されるｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、別の部分、例えば、担体粒子、例えば、アミノ脂質粒子にコンジュゲートまたは会合されていない。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、ナノ粒子を欠く投与形態で、細胞に導入されるか、または対象に投与される。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、例えば、米国特許公開第２０１７／０３５４６７２号に記載されているように、アミノ脂質送達化合物を欠く投与形態で、細胞に導入されるか、または対象に投与される。
【００５４】
ｔＲＮＡおよびサプレッサーｔＲＮＡ
タンパク質合成の際、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、成長中のタンパク質（ポリペプチド）鎖への組み込みのためにアミノ酸をリボソームに送達する。ｔＲＮＡは、典型的には約７０〜１００ヌクレオチドの長さである。活性ｔＲＮＡは、その合成の際にｔＲＮＡに転写され得るか、または転写後処理の際に後から追加され得る、３’ＣＣＡ配列を含む。アミノアシル化の際、所与のｔＲＮＡ分子に結合しているアミノ酸は、３’末端リボースの２’または３’ヒドロキシル基に共有結合して、アミノアシル−ｔＲＮＡ（ａａ−ｔＲＮＡ）を形成する。アミノ酸は、２’−ヒドロキシル基から３’−ヒドロキシル基に、またはその逆に自発的に移動することができるが、リボソームで成長中のタンパク質鎖に３’−ＯＨ位置から組み込まれると理解される。折り畳まれたａａ−ｔＲＮＡ分子の他端にあるループには、アンチコドンとして知られる３個の塩基の配列が含まれる。このアンチコドン配列がリボソーム結合メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における相補的な３塩基コドン配列とハイブリダイズまたは塩基対形成すると、ａａ−ｔＲＮＡはリボソームに結合し、そのアミノ酸がリボソームによって合成されるポリペプチド鎖に組み込まれる。特定のコドンと塩基対形成するすべてのｔＲＮＡは、単一の特定のアミノ酸によってアミノアシル化されるため、遺伝暗号の翻訳はｔＲＮＡによって影響される。ｍＲＮＡにおける６１種の非終結コドンの各々は、その同族のａａ−ｔＲＮＡの結合、およびリボソームによって合成される成長中のポリペプチド鎖への単一の特定のアミノ酸の付加を指示する。
【００５５】
ｔＲＮＡは一般的に高度に保存されており、多くの場合、種をまたがって機能する。したがって、細菌ｔＲＮＡ、非哺乳動物の真核生物ｔＲＮＡ、または哺乳動物（例えば、ヒト）ｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡは、本明細書に記載の方法または組成物の実施に有用であり得る。天然起源のヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋなどの供給源によって当業者に一般的に入手可能である。Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．３３：Ｄ１３９−４０、Ｂｕｃｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＧＥＮＯＭＩＣＳ３５（１）：１６４−７１、Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９７９）“Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｇｒｉｓ（１９８３）“Ｔｈｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ，ＩＩ，”Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．も参照する。ｔＲＮＡは、一般的に高度に保存されており、多くの場合、種をまたがって機能する。
【００５６】
サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子における変異部位、例えばＰＳＣに好適なアミノ酸を挿入する修飾ｔＲＮＡである。サプレッサーというこの単語の使用は、特定の状況下で、修飾ｔＲＮＡは、コード化変異の表現型効果を「抑制する」という事実に基づいている。サプレッサーｔＲＮＡは典型的には、アンチコドン、コドン特異性の変化、またはｔＲＮＡのアミノアシル化の固有性を変化させる位置、のいずれかに変異（修飾）を含む。
【００５７】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡ（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ）は、修飾アンチコドン領域を含み、修飾アンチコドンは、対応する天然起源のアンチコドンとは異なるコドンとハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、修飾アンチコドンは、終止コドン、例えば、ＰＳＣとハイブリダイズし、その結果、ｔＲＮＡは、タンパク質合成を終結するのではなく、アミノ酸を遺伝子産物に組み込む。ある特定の実施形態において、修飾アンチコドンは、未成熟終止コドンとハイブリダイズし、その結果、ｔＲＮＡは、そうでなければ未成熟終止コドンによって引き起こされる切断遺伝子産物を生じるであろう位置で、アミノ酸を遺伝子産物に組み込む。
【００５８】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、ＵＡＧ（すなわち、「アンバー」終止コドン）、ＵＧＡ（すなわち、「オパール」終止コドン）、およびＵＡＡ（すなわち、「オーカー」終止コドン）から選択されるコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む。ある特定の実施形態において、アンチコドンは、ＵＧＡからＵＡＡまでで選択されたコドンにハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、アンチコドンは、ＵＧＡにハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、非標準的な終結コドン、例えば、４−ヌクレオチドコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２９８：１９５、およびＨｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２１：１２１９４を参照する）。
【００５９】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、任意の天然アミノ酸でアミノアシル化されるか、またはアミノアシル化することができる。例えば、ｔＲＮＡは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンでアミノアシル化することができる。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、セリン、ロイシン、グルタミン、またはアルギニンでアミノアシル化することができる。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、グルタミンまたはアルギニンでアミノアシル化することができる。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、アルギニンでアミノアシル化することができる。
【００６０】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、（ｉ）表２に示されるコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、（ｉｉ）表２に示されるアミノ酸でアミノアシル化されるか、またはアミノアシル化することができる。
【表２】
2022501055.tif 000004
【００６１】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００６２】
配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で決定され得る。プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６，２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２５：３３８９−３４０２）によって用いられるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析は、配列類似性検索用に調整されている。配列データベースを検索する際の基本的な問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ６：１１９−１２９を参照する。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができ、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。ヒストグラム、記述、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルターに関する検索パラメーターは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘで使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ったすべてのｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈ位置でワードヒットを生成する）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）として調整され得る。同等のｂｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であり得る。検索はまた、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｐｔｉｏｎパラメーター（例：−Ｇ、ギャップを開くためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合５／タンパク質の場合１１；−Ｅ、ギャップを拡張するためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合２／タンパク質の場合１；−ｑ、ヌクレオチド不一致に対するペナルティ［整数］：デフォルト＝−３；−ｒ、ヌクレオチド一致に対する報酬［整数］：デフォルト＝１；−ｅ、期待値［実数］：デフォルト＝１０；−Ｗ、語長［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドの場合１１／メガブラストの場合２８／タンパク質の場合３；−ｙ、ビットでのブラスト拡張のドロップオフ（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎの場合２０、その他の場合７；−Ｘ、ギャップアラインメントのＸドロップオフ値（ビット）：デフォルト＝すべてのプログラムの場合１５、ｂｌａｓｔｎには適用されない；および−Ｚ、ギャップアラインメントの最終Ｘドロップオフ値（ビット）：ｂｌａｓｔｎの場合５０、その他の場合２５）を使用して実行され得る。ペアワイズタンパク質アラインメント用のＣｌｕｓｔａｌＷも使用され得る（デフォルトのパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスおよびＧａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、およびＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１を含み得る）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間の最良適合比較では、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ作成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用し、タンパク質比較の同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００６３】
ｔＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得ることが企図される。例示的な修飾ｔＲＮＡには、アシル化ｔＲＮＡ、アルキル化ｔＲＮＡ、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシル以外の１つ以上の塩基を含むｔＲＮＡ、特定のリガンドまたは抗原性、蛍光性、親和性、反応性、スペクトル性、または他のプローブ部分の結合によって共有結合的に修飾されたｔＲＮＡ、メチル化またはそれ以外で修飾された１つ以上のリボース部分を含むｔＲＮＡ、試薬、特定のリガンドの担体として、または抗原性、蛍光性、反応性、親和性、スペクトル性、もしくは他のプローブとして機能する非天然アミノ酸を含む、２０種の天然アミノ酸以外のアミノ酸でアミノアシル化されたａａ−ｔＲＮＡ、あるいはこれら組成物の任意の組み合わせが含まれる。例示的な修飾ｔＲＮＡ分子は、Ｓｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“ｔＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｌ  Ｙａｃｏｕｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．４６：６９−９５、Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ．”ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．７３：１４７−１７６，２００４、Ｉｂｂａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．６９：６１７−６５０、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＳＹＭＰ．ＱＵＡＮＴ．ＢＩＯＬ．６０：７１−８２、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１５６：１１３−１４０、Ｃｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＣＥＬＬ  ７８：６１−７１、Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２９：４７６７−４７８２、Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＴＲＥＮＤＳ  ＭＯＬ．ＭＥＤ．２０：３０６−３１４、およびＢｊｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．５６：２６３−２８７に記載されている。
【００６４】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド修飾を含む。天然起源のｔＲＮＡには、広範に様々な転写後修飾ヌクレオチドが含まれ、例えば、Ｍａｃｈｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＲＮＡ  ＢＩＯＬＯＧＹ  １１（１２）：１６１９−１６２９に記載されており、図２Ｂに示される残基のうちの１つ以上が含まれる。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、０位の２’−Ｏ−メチルグアノシンまたはＧ、１位のシュードウリジンまたはＵ、４位の２’−Ｏ−メチルアデノシン、Ａ、２’−Ｏ−メチルウリジン、Ｕ、２’−Ｏ−メチルシチジン、Ｃ、２’−Ｏ−メチルグアノシン、またはＧ、６位のＮ２−メチルグアノシンまたはＧ、７位のＮ２−メチルグアノシンまたはＧ、９位の１−メチルアデノシン、Ａ、１−メチルグアノシン、Ｇ、または修飾Ｇ、１０位のＮ２−メチルグアノシンまたはＧ、１２位のＮ４−アセチルシチジンまたはＣ、１３位のシュードウリジン、Ｕ、２’−Ｏ−メチルシチジン、またはＣ、１４位の１−メチルアデノシン、Ａ、または修飾Ａ、１６位のジヒドロウリジン（Ｄ）またはＵ、１７位のＤまたはＵ、１８位の２’−Ｏ−メチルグアノシンまたはＧ、２０位の３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、Ｄ、またはＵ、２０ａ位の３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、Ｄ、シュードウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、２０ｂ位のＤ、シュードウリジン、またはＵ、２５位のシュードウリジンまたはＵ、２６位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２、Ｎ２−ジメチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｇ、または修飾Ｇ、２７位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、またはＧ、２８位のシュードウリジンまたはＵ、３０位のシュードウリジンまたはＵ、３１位のシュードウリジンまたはＵ、３２位の２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、２’−Ｏ−メチルシチジン、３−メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、３４位のイノシン、Ａ、２−チオウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、修飾Ｕ、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｃ、修飾Ｃ、キューオシン、マンノシル−キューオシン、ガラクトシル−キューオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、またはＧ、３５位のシュードウリジンまたはＵ、３６位のシュードウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、３７位の１−メチルイノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ａ、修飾Ａ、１−メチルグアノシン、ペルオキシワイブトシン、ワイブトシン、Ｇ、または修飾Ｇ、３８位のシュードウリジン、Ｕ、５−メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、３９位の１−メチルシュードウリジン、２’−Ｏ−メチルシ���ードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、２’−Ｏ−メチルグアノシン、またはＧ、４０位のシュードウリジン、Ｕ、５−メチルシチジン、またはＣ、４４位の２’−Ｏ−メチルウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、ｅ１１位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ１２位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ１４位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ２位の３−メチルシチジンまたはＣ、４６位の７−メチルグアノシンまたはＧ、４７位のＤ、Ｕ、または修飾Ｕ、４８位のＤ、Ｕ、５−メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、４９位のＡ、修飾Ａ、５−メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、５０位のシュードウリジン、Ｕ、５−メチルシチジン、またはＣ、５４位の５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５−メチルウリジン、シュードウリジン、またはＵ、５５位のシュードウリジンまたはＵ、５８位の１−メチルアデノシン、Ａ、または修飾Ａ、６４位の２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）、Ａ、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）、Ｇ、または修飾Ｇ、６５位のシュードウリジンまたはＵ、６７位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２−メチルグアノシン、またはＧ、６８位のシュードウリジンまたはＵ、および７２位のシュードウリジン、Ｕ、５−メチルシチジン、またはＣからなる群から選択される残基のうちの１つ以上を含む。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵは、それぞれ未修飾のアデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルを指す。残基の番号付けは、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２１：３０１１−１５に記載されているｔＲＮＡ番号付けシステムに基づいている。
【００６５】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、５−メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１−メチルアデノシンから選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。
【００６６】
ｔＲＮＡを作製する方法
本明細書に記載の方法および組成物に有用なｔＲＮＡ分子（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ）は、合成化学法による細胞外生成、組換えＤＮＡ法による細胞内生成、または天然供給源からの精製を含む、当技術分野で知られている方法によって生成することができることが企図される。
【００６７】
例えば、ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、化学的に、または組換えＤＮＡ方法論によって合成することができる。例えば、ｔＲＮＡの配列は、適切な合成核酸プライマーを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によってライブラリーから合成またはクローニングすることができる。得られるｔＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、例えば、ｔＲＮＡをコードする従来の遺伝子発現構築体（すなわち、発現ベクター）を生成するための発現制御配列を含む、他の適切なヌクレオチド配列に連結することができる。定められる遺伝子構築体の生成は、当技術分野の範囲内である。所望のｔＲＮＡをコードする核酸は、以下のセクションで説明される発現ベクターなどの発現ベクターに組み込む（連結する）ことができ、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術を介して宿主細胞に導入することができる。宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞がｔＲＮＡをコードする遺伝子を発現することを可能にする条件下で成長させることができる。特定の発現および精製条件は、使用される発現システムに応じて変化する。
【００６８】
あるいは、ｔＲＮＡは、当技術分野で知られている方法によって、化学的に合成または天然供給源から精製することができる。ｔＲＮＡが細胞への導入または対象への投与の前にアミノアシル化される場合、ｔＲＮＡは、化学的または酵素的なアミノアシル化を含む、当技術分野で知られている任意の方法によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
【００６９】
発現ベクター
目的のｔＲＮＡは、目的のｔＲＮＡをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことによって、目的の細胞で発現され得る。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、目的の組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる）、レトロトランスポゾン（例えば、ピギーバック、スリーピングビューティー）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で知られているすべてのものが含まれる。
【００７０】
ある特定の実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターである。「ウイルス」という用語は、本明細書では、タンパク質合成またはエネルギー生成のメカニズムを有さない偏性細胞内寄生体を指すために使用される。例示的なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ポリオーマウイルスベクター（例えば、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター）、ポックスウイルスベクター、および偽型ウイルスベクターが含まれる。
【００７１】
ウイルスは、ＲＮＡウイルス（ＲＮＡで構成されるゲノムを有する）またはＤＮＡウイルス（ＤＮＡで構成されるゲノムを有する）であり得る。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターである。ＤＮＡウイルスの例には、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アスファルウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０））、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、鶏痘ウイルス、羊痘ウイルス、粘液腫ウイルス）が含まれる。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターである。ＲＮＡウイルスの例には、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１））、およびトロウイルスが含まれる。
【００７２】
ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節配列またはプロモーターを含む。「操作可能に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されるとき、「操作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが遺伝子の転写に影響を与える場合、遺伝子に操作可能に連結されている。操作可能に連結されたヌクレオチド配列は、典型的には、隣接している。しかし、エンハンサーは、一般にプロモーターから数キロ塩基離れたときに機能し、イントロン配列は可変長であり得、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは操作可能に連結されているが直接的に隣接されておらず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスで機能することさえあり得る。
【００７３】
ｔＲＮＡ遺伝子は、様々な細胞タイプにおいて活性である強力なプロモーターを有することができる。真核生物のｔＲＮＡ遺伝子のためのプロモーターは、典型的には、ｔＲＮＡ分子自体をコードする構造配列内に存在する。５’上流領域内に転写活性を調節するエレメントがあるが、活性な転写ユニットの長さは、５００塩基対よりかなり短いものであり得る。
【００７４】
使用され得るプロモーターの追加の例には、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーターなどの細胞プロモーター、例えば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターが含まれるがこれらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであろう。
【００７５】
ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号１６、配列番号１７、もしくは配列番号１８と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を、含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるｔＲＮＡコード配列を含む。
【００７６】
ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡコード配列に加えて、発現ベクターは、対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子に隣接するゲノムＤＮＡ配列に対応するヌクレオチド配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列、または配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を、含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
ある特定の実施形態において、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、ディペンドパルボウイルス属およびパルボウイルス科の小型で無エンベロープの二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、約４．７ｋｂの一本鎖線形ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、いくつかの組織タイプの分裂細胞および静止細胞の両方に感染することができ、異なる組織向性を示す異なるＡＡＶ血清型を有する。
【００７８】
ＡＡＶには、血清型ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−１２ならびに非ヒト霊長類に由来する１００を超える血清型を含む、多数の血清学的に識別可能なタイプが含まれる（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（２００８）Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０５（１）：１７−２４、およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７８（１２），６３８１−６３８８を参照する）。本明細書に記載の方法および組成物で使用されるＡＡＶベクターの血清型は、送達の効率、組織向性、および免疫原性に基づいて当業者によって選択され得る。例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８、およびＡＡＶ−９は、中枢神経系への送達に使用することができ、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−８、およびＡＡＶ−９は、心臓への送達に使用することができ、ＡＡＶ−２は、腎臓への送達に使用することができ、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、およびＡＡＶ−９は、肝臓への送達に使用することができ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−９は、肺への送達に使用することができ、ＡＡＶ−８は、膵臓への送達に使用することができ、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、およびＡＡＶ−８は、光受容細胞への送達に使用することができ、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、およびＡＡＶ−８は、網膜色素上皮への送達に使用することができ、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、およびＡＡＶ−９は、骨格筋への送達に使用することができる。ある特定の実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、米国特許第７，１９８，９５１号に開示されている配列を含み、ＡＡＶ−９（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号１〜３）、ＡＡＶ−２（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号４）、ＡＡＶ−１（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号５）、ＡＡＶ−３（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号６）、およびＡＡＶ−８（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号７）などが挙げられるが、これらに限定されない。アカゲザルから同定されたＡＡＶ血清型、例えば、ｒｈ．８、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、およびｒｈ．７４もまた、本明細書に記載の組成物および方法において企図される。天然ＡＡＶ血清型に加えて、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＡＡＶキャプシドが、送達の効率、組織向性、および免疫原性を改善するために開発されている。例示的な天然および改変ＡＡＶキャプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号、同第９，４９３，７８８号、および同第７，１９８，９５１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１８９９６４Ａ２号に開示されている。
【００７９】
野生型ＡＡＶゲノムには、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれ、それらにはＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成、および組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を指示するシグナル配列が含まれる。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーターであるｐ５、ｐ１９、およびｐ４０は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシングによって結合され、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）の生成をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、ゲノム複製に関与している。Ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現し、ｃａｐ遺伝子のスプライス変異体である３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のキャプシドを形成する。
【００８０】
複製、キャプシド形成、および組み込みのためのシス作用性シグナルは、ＩＴＲ内に含まれているため、４．３ｋｂの内部ゲノムのいくつかまたはすべては、外来ＤＮＡ、例えば目的の外因性遺伝子のための発現カセットに置き換えられ得る。したがって、ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接する外因性遺伝子の発現カセットを含むゲノムを含む。ＩＴＲは、キャプシドまたはその誘導体と同じ血清型に由来し得る。あるいは、ＩＴＲは、キャプシドとは異なる血清型であり得、それによって偽型ＡＡＶを生成する（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ−２に由来する。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ−５に由来する。ＩＴＲの少なくとも１つは、末端分解部位を変異または欠失するように改変され得、それによって、自己相補的ＡＡＶベクターの生成を可能にする。
【００８１】
ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、ＡＡＶベクターを生成するために、例えばプラスミドにトランスで提供することができる。ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、およびヘルパーウイルスによって提供されるヘルパー機能、例えば、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡを発現しなければならない（Ｗｅｉｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１−２３，２０１１）。ＡＡＶベクターを生成および精製するための方法が詳細に記載されている（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１４Ｄ．１．１−１４Ｄ．１．２１，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓを参照する）。多くの細胞タイプを使用してＡＡＶベクターを生成することができ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ならびに昆虫細胞が含まれる（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号、同第５，３８７，４８４号、同第５，７４１，６８３号、同第５，６９１，１７６号、同第５，６８８，６７６号、および同第８，１６３，５４３号、米国特許公開第２００２／００８１７２１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ００／４７７５７号、同第ＷＯ００／２４９１６号、および同第ＷＯ９６／１７９４７号を参照する）。ＡＡＶベクターは典型的には、ＩＴＲ隣接発現カセットを含む１つのプラスミド、ならびに追加のＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つ以上の追加のプラスミドによって、これらの細胞タイプで生成される。
【００８２】
任意の血清型のＡＡＶが、本明細書に記載の方法および組成物で使用され得る。同様に、任意のアデノウイルスタイプが使用され得、当業者は、それらの所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の生成のために使用することができるＡＡＶおよびアデノウイルスタイプを特定することができると企図される。ＡＡＶ粒子は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオジキソナル勾配、またはＣｓＣｌ勾配によって精製され得る。
【００８３】
ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂ、または４．７ｋｂよりも大きい、もしくは小さい一本鎖ゲノムを有し得、５．２ｋｂのように大きく、または３．０ｋｂのように小さい過剰サイズのゲノムが含まれる。したがって、ＡＡＶベクターから発現される目的の外因性遺伝子が小さい場合、ＡＡＶゲノムはスタッファー配列を含み得る。さらに、ベクターゲノムは実質的に自己相補的であり得、それによって細胞内での迅速な発現を可能にする。ある特定の実施形態において、自己相補的ＡＡＶベクターのゲノムは、５’から３’までに、５’ＩＴＲ、目的の遺伝子のコード配列に操作可能に連結されたプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む第１の核酸配列、機能的な末端分解部位を有さない改変ＩＴＲ、第１の核酸配列に相補的または実質的に相補的な第２の核酸配列、ならびに３’ＩＴＲを含む。すべてのタイプのゲノムを含むＡＡＶベクターは、本明細書に記載の方法で使用することができる。
【００８４】
ＡＡＶベクターの非限定的な例には、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＡＡＶＫ−ＥＦ１α−ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ  ＢｉｏカタログＮｏ．ＡＡＶ５０２Ａ−１）、ｐＡＡＶＫ−ＥＦ１α−ＭＣＳ１−ＣＭＶ−ＭＣＳ２（Ｓｙｓｔｅｍ  ＢｉｏカタログＮｏ．ＡＡＶ５０３Ａ−１）、ｐＡＡＶ−ＺｓＧｒｅｅｎ１（ＣｌｏｎｔｅｃｈカタログＮｏ．６２３１）、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ２（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．４６９５４）、ＡＡＶ−Ｓｔｕｆｆｅｒ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．１０６２４８）、ｐＡＡＶｓｃＣＢＰＩＧｐｌｕｃ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．３５６４５）、ＡＡＶＳ１＿Ｐｕｒｏ＿ＰＧＫ１＿３ｘＦＬＡＧ＿Ｔｗｉｎ＿Ｓｔｒｅｐ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．６８３７５）、ｐＡＡＶ−ＲＡＭ−ｄ２ＴＴＡ：：ＴＲＥ−ＭＣＳ−ＷＰＲＥ−ｐＡ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．６３９３１）、ｐＡＡＶ−ＵｂＣ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．６２８０６）、ｐＡＡＶＳ１−Ｐ−ＭＣＳ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８０４８８）、ｐＡＡＶ−Ｇａｔｅｗａｙ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．３２６７１）、ｐＡＡＶ−Ｐｕｒｏ＿ｓｉＫＤ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８６６９５）、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＭＣＳ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８０４８７）、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＣＡＧ−ＤＥＳＴ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８０４８９）、ｐＡＡＶＳ１−Ｐ−ＣＡＧ−ＤＥＳＴ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８０４９０）、ｐＡＡＶｆ−ＥｎｈＣＢ−ｌａｃＺｎｌｓ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．３５６４２）、およびｐＡＡＶＳ１−ｓｈＲＮＡ（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＮｏ．８２６９７）が含まれる。これらのベクターは、治療的使用のために改変することができる。例えば、目的の外因性遺伝子を、複数のクローニング部位に挿入することができ、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏまたは蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を削除するか、または目的の別（同じまたは異なる）の外因性遺伝子で置き換えることができる。ＡＡＶベクターのさらなる例は、米国特許第５，８７１，９８２号、同第６，２７０，９９６号、同第７，２３８，５２６号、同第６，９４３，０１９号、同第６，９５３，６９０号、同第９，１５０，８８２号、および同第８，２９８，８１８号、米国特許公開第２００９／００８７４１３号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０７５３３５Ａ１号、同第ＷＯ２０１７／０７５３３８Ａ２号、および同第ＷＯ２０１７／２０１２５８Ａ１号に開示されている。
【００８５】
ある特定の実施形態において、発現ベクターは、対象、例えば、ヒト対象において、神経系、例えば、中枢神経系を標的とすることができるＡＡＶベクターである。神経系を標的とすることができる例示的なＡＡＶベクターには、ＡＡＶ９変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（例えば、Ｄｅｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．３４（２）：２０４−２０９を参照する）、ＡＡＶ−ＡＳ（例えば、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＭＯＬ．ＴＨＥＲ．２４：７２６−３５を参照する）、およびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ（例えば、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ＮＡＴ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．２０：１１７２−７９を参照する）が含まれる。神経系を標的とするための追加の例示的なＡＡＶに基づいた戦略は、Ｂｅｄｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）ＡＮＮＵ  ＲＥＶ  ＮＥＵＲＯＳＣＩ．４１：３２３−３４８に記載されている。
【００８６】
レンチウイルスベクター
ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、脾臓壊死ウイルスベクター、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターが含まれる。レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入を媒介する薬剤として有用である。
【００８７】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。例示的なレンチウイルスベクターには、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）に由来するベクターが含まれる。
【００８８】
レトロウイルスベクターは典型的には、ウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が削除され、目的の遺伝子（複数可）に置き換えられるように構築される。多くの場合、構造遺伝子（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）は、当技術分野で知られている遺伝子工学技術を使用してレトロウイルス骨格から除去される。したがって、最小のレトロウイルスベクターは、５’から３’までに、５’長末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル、任意選択的な外因性プロモーターおよび／またはエンハンサー、目的の外因性遺伝子、ならびに３’ＬＴＲを含む。外因性プロモーターが提供されていない場合、遺伝子発現は、弱いプロモーターであり、発現を活性化するためにＴａｔの存在を必要とする、５’ＬＴＲによって駆動される。構造遺伝子は、レンチウイルスの製造のために別々のベクターで提供することができ、生成されたビリオンを複製欠損にする。具体的には、レンチウイルスに関して、パッケージングシステムは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＴａｔ遺伝子をコードする単一のパッケージングベクター、ならびにエンベロープタンパク質Ｅｎｖ（通常、その広い感染性のためにＶＳＶ−Ｇ）をコードする第３の別のベクターを含み得る。パッケージングシステムの安全性を改善するために、パッケージングベクターを分割して、１つのベクターからＲｅｖを、別のベクターからＧａｇおよびＰｏｌを発現させることができる。Ｔａｔはまた、キメラ５’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを使用することによってパッケージングシステムから排除することができ、５’ＬＴＲのＵ３領域は、異種調節エレメントで置き換えられる。
【００８９】
遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に組み込むことができる。最も単純な構造は、レトロウイルスの構造遺伝子が、ＬＴＲ内のウイルス調節配列の制御下で転写される単一遺伝子によって置き換えられるものである。１つを超える遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクターも構築されている。通常、かかるベクターでは、１つの遺伝子がウイルスＬＴＲの調節制御下にあり、第２の遺伝子はスプライシングされたメッセージがなくとも発現されるか、それ自体の内部プロモーターの制御下にある。
【００９０】
したがって、新しい遺伝子（複数可）は、それぞれビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ５’および３’ＬＴＲに隣接している。「長末端反復」または「ＬＴＲ」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの自然な配列関連では、直接的な反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含む。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、ポリアデニル化）およびウイルス複製に基本的な機能を提供する。ＬＴＲには、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要とされる配列を含む、多数の調節シグナルが含まれる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域によって隣接される。ある特定の実施形態において、Ｒ領域は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）遺伝子エレメントを含み、トランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられる実施形態において必要とされない。
【００９１】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスを複製欠損にすることによって、レンチウイルスまたはレトロウイルスシステムの安全性を改善するためにしばしば行われる。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターである。本明細書で使用される場合、ＳＩＮレトロウイルスベクターは、ウイルス複製の初回を超えるウイルス転写を防止するように３’ＬＴＲ  Ｕ３領域が改変されている（例えば、欠失または置換によって）、複製欠損レトロウイルスベクターを指す。これは、３’ＬＴＲ  Ｕ３領域がウイルス複製の際に５’ＬＴＲ  Ｕ３領域のテンプレートとして使用され、そのためウイルス転写はＵ３エンハンサープロモーターなしでは作製できないためである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリアデニル化配列で置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’および５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変もまた、本明細書に記載の方法および組成物に含まれることに留意されたい。
【００９２】
ある特定の実施形態において、５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルス粒子の生成の際にウイルスゲノムの転写を駆動するために異種プロモーターで置き換えられる。使用できる異種プロモーターの例には、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが含まれる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的様式で高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えは、ウイルス生成システムに完全なＵ３配列がないため、複製能力のあるウイルスを生成する組換えの可能性を低減させる。
【００９３】
５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージング（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルス粒子形成の際にレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す（例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，６９（４）：２１０１−０９を参照する）。パッケージングシグナルは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要とされる最小限のパッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ψ］配列とも呼ばれる）であり得る。
【００９４】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ＦＬＡＰをさらに含む。本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ」という用語は、配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン配列および中央終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む、核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＣＥＬＬ，１０１：１７３に記載されている。逆転写の際、ｃＰＰＴでのプラス鎖ＤＮＡの中央開始、およびＣＴＳでの中央終結は、中央ＤＮＡフラップという３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核移行のシス活性決定因子として作用し得、かつ／またはウイルスの力価を増加させ得る。特定の実施形態において、レトロウイルスベクター骨格は、ベクター中の目的の異種遺伝子の上流または下流に、１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態において、転移プラスミドは、ＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【００９５】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、輸出エレメントをさらに含む。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、１つ以上の輸出エレメントを含む。「輸出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節する、シス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸出エレメントの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＲＥ（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＣＥＬＬ５８：４２３を参照する）およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡ輸出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
【００９６】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な転写後調節エレメントが、異種核酸の発現を増加させることができ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７３：２８８６を参照する）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，５：３８６４）など（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），ＧＥＮＥＳ  ＤＥＶ．，９：１７６６）が挙げられる。転写後調節エレメントは、一般に、異種核酸配列の３’末端に配置される。この構成は、５’部分が異種核酸コード配列を含み、３’部分が転写後調節エレメント配列を含む、ｍＲＮＡ転写物の合成をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ＷＰＲＥもしくはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠くかまたは含まず、なぜなら、これらのエレメントは、場合によって、細胞形質転換のリスクを増加させ、かつ／あるいはｍＲＮＡ転写物の量を実質的もしくは有意に増加させないか、またはｍＲＮＡの安定性を増加させないためである。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のベクターは、追加の安全手段として、ＷＰＲＥもしくはＨＰＲＥを欠いているか、または含まない。
【００９７】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般的にポリアデニル化シグナルの下流に認められる。したがって、ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＨによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。組換え転写物の効率的なポリアデニル化は、ポリアデニル化シグナルを欠く転写物が不安定であり、急速に劣化するときに望ましい。本明細書に記載のベクターで使用することができるポリアデニル化シグナルの例示的な例には、理想的なポリアデニル化配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ  ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリアデニル化配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で知られている別の好適な異種または内因性ポリアデニル化配列が含まれる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、インスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レトロウイルス発現配列、例えば治療用遺伝子を、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントによって媒介され、転移配列の調節解除された発現につながり得る組み込み部位効果から保護することに寄与し得る（すなわち、位置効果、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、およびＺｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．，１０９：４７１を参照する）。ある特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、一方もしくは両方のＬＴＲ、または他の場所として、細胞ゲノムに組み込まれるベクターの領域に、インスレーターエレメントを含む。本明細書に記載の方法および組成物における使用のためのインスレーターの例には、ニワトリβ−グロビンインスレーターが含まれるが、これに限定されない（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）．ＣＥＬＬ  ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ９４：５７５、およびＢｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．ＣＥＬＬ  ９８：３８７を参照する）。インスレーターエレメントの例には、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座からのインスレーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
レンチウイルスベクターの非限定的な例には、ｐＬＶＸ−ＥＦ１α−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ１（ＣｌｏｎｔｅｃｈカタログＮｏ．６３１９８４）、ｐＬＶＸ−ＥＦ１α−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣｌｏｎｔｅｃｈカタログＮｏ．６３１９８７）、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（ＣｌｏｎｔｅｃｈカタログＮｏ．６３２１５９）、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（ＣｌｏｎｔｅｃｈカタログＮｏ．６３２１８６）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＬＫＯ．１（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１０８７８）、ｐＬＫＯ．３Ｇ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１４７４８）、ｐＳｉｃｏ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１１５７８）、ｐＬＪＭ１−ＥＧＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１９３１９）、ＦＵＧＷ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１４８８３）、ｐＬＶＴＨＭ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１２２４７）、ｐＬＶＵＴ−ｔＴＲ−ＫＲＡＢ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１１６５１）、ｐＬＬ３．７（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１１７９５）、ｐＬＢ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１１６１９）、ｐＷＰＸＬ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１２２５７）、ｐＷＰＩ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１２２５４）、ＥＦ．ＣＭＶ．ＲＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１７６１９）、ｐＬｅｎｔｉ  ＣＭＶ  Ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１７４５２）、ｐＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．３９４８１）、ｐＵＬＴＲＡ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．２４１２９）、ｐＬＸ３０１（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．２５８９５）、ｐＨＩＶ−ＥＧＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．２１３７３）、ｐＬＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．３６０８４）、ｐＬｉｏｎＩＩ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．１７３０）、ｐＩｎｄｕｃｅｒ１０−ｍｉｒ−ＲＵＰ−ＰｈｅＳ（ＡｄｄｇｅｎｅのプラスミドＮｏ．４４０１１）が含まれる。これらのベクターは、治療的使用に適するように改変することができる。例えば、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏ、ＥＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ）を削除するか、目的の第２の外因性遺伝子に置き換えることができる。レンチウイルスベクターのさらなる例は、米国特許第７，６２９，１５３号、同第７，１９８，９５０号、同第８，３２９，４６２号、同第６，８６３，８８４号、同第６，６８２，９０７号、同第７，７４５，１７９号、同第７，２５０，２９９号、同第５，９９４，１３６号、同第６，２８７，８１４号、同第６，０１３，５１６号、同第６，７９７，５１２号、同第６，５４４，７７１号、同第５，８３４，２５６号、同第６，９５８，２２６号、同第６，２０７，４５５号、同第６，５３１，１２３号、および同第６，３５２，６９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０９１７８６号に記載されている。
【０１００】
アデノウイルスベクター
ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることができる。アデノウイルスは、中型（９０〜１００ｎｍ）で非エンベロープ型（ネイキッド）の二十面体ウイルスであり、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムからなる。「アデノウイルス」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、ネズミ、およびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されない、アデノウイルス属における任意のウイルスを指す。典型的には、アデノウイルスベクターは、例えば、遺伝子導入のためにアデノウイルスへの非天然核酸配列の挿入に対応するように、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムに１つ以上の変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することによって生成される。
【０１０１】
ヒトアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためにアデノウイルスゲノムの供給源として使用することができる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、および５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、および４２〜４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１）、未分類の血清型（例えば、血清型４９および５１）、またはその他のアデノウイルス血清グループもしくは血清型であることができる。アデノウイルス血清型１〜５１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手可能である。非グループＣアデノウイルスベクター、非グループＣアデノウイルスベクターを生成する方法、および非グループＣアデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第５，８３７，５１１号、および同第５，８４９，５６１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９９７／０１２９８６号および同第ＷＯ１９９８／０５３０８７号に記載されている。
【０１０２】
非ヒトアデノウイルス（例えば、類人猿、サル、トリ、イヌ、ヒツジ、またはウシアデノウイルス）を使用して、アデノウイルスベクターを生成することができる（すなわち、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として）。例えば、アデノウイルスベクターは、新世界ザルおよび旧世界ザルの両方を含むサルアデノウイルスに基づくことができる（例えば、Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：ＶＨＩｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（２００５）を参照する）。霊長類に感染するアデノウイルスの系統発生分析は、例えば、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬＯＳ  ＰＡＴＨＯＧ．５（７）：ｅ１０００５０３で開示されている。ゴリラアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として使用することができる。ゴリラアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５２７９９号、同第ＷＯ２０１３／０５２８１１号、および同第ＷＯ２０１３／０５２８３２号に記載されている。アデノウイルスベクターはまた、サブタイプの組み合わせを含むことができ、したがって「キメラ」アデノウイルスベクターであることできる。
【０１０３】
アデノウイルスベクターは、増殖型、制限増殖型、または複製欠損型であることができる。増殖型アデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞、すなわち、典型的にはアデノウイルスが感染することができる細胞において複製することができる。制限増殖型アデノウイルスベクターは、所定の条件下で複製するように操作されているアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス初期領域によってコードされる遺伝子機能は、誘導性、抑制性、または組織特異的な転写制御配列、例えば、プロモーターに操作可能に連結することができる。制限増殖型アデノウイルスベクターは、米国特許第５，９９８，２０５号にさらに記載されている。複製欠損型アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが、典型的な宿主細胞、特にアデノウイルスベクターが感染するヒトの宿主細胞において複製しないように、例えば、１つ以上の複製に必須の遺伝子機能または領域の欠損の結果として、複製に必要とされるアデノウイルスゲノムの１つ以上の遺伝子機能または領域の補完を必要とするアデノウイルスベクターである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠損型であり、そのため、複製欠損型アデノウイルスベクターは、増殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域（すなわち、Ｅ１−Ｅ４領域）のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域（すなわち、Ｌ１−Ｌ５領域）のみ、アデノウイルスゲノムの初期領域および後期領域の両方、またはすべてのアデノウイルス遺伝子（すなわち、高容量アデノベクター（ＨＣ−Ａｄ））のうちの１つ以上の複製に必須な遺伝子機能を欠損していることができる。例えば、Ｍｏｒｓｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９５：９６５−９７６、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９４：１６４５−１６５０、およびＫｏｃｈａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＨＵＭ．ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲ．１０（１５）：２４５１−９を参照する。複製欠損型アデノウイルスベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１２７，１７５号、同第６，４８２，６１６号、および同第７，１９５，８９６号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／０２８１５２号、同第ＷＯ１９９５／００２６９７号、同第ＷＯ１９９５／０１６７７２号、同第ＷＯ１９９５／０３４６７１号、同第ＷＯ１９９６／０２２３７８号、同第ＷＯ１９９７／０１２９８６号、同第ＷＯ１９９７／０２１８２６号、および同第ＷＯ２００３／０２２３１１号に開示されている。
【０１０５】
複製欠損型アデノウイルスベクターは、複製欠損型アデノウイルスベクターには存在しないが、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルでウイルス増殖に必要とされる、遺伝子機能を提供する補完性細胞株で生成することができる。かかる補完性細胞株は知られており、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．３６：５９−７２に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９７／０００３２６号、ならびに米国特許第５，９９４，１２８号および同第６，０３３，９０８号に記載されている）、および２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９５／０３４６７１号およびＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．７１：９２０６−９２１３に記載されている）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の複製欠損型アデノウイルスベクターを生成する他の補完性細胞株には、発現が宿主細胞におけるウイルス成長を阻害する導入遺伝子をコードする、アデノウイルスベクターを増殖させるために生成されている補完性細胞が含まれる（例えば、米国特許公開第２００８／０２３３６５０号を参照する）。追加の補完性細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号および同第６，６８２，９２９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０２０８７９号に記載されている。アデノウイルスベクター含有組成物のための製剤は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号および同第６，５１４，９４３号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３４４４４号にさらに記載されている。
【０１０６】
追加の例示的なアデノウイルスベクター、および／またはアデノウイルスベクターを作製または増殖するための方法は、米国特許第５，５５９，０９９号、同第５，８３７，５１１号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第５，９９４，１２８号、同第５，９６５，５４１号、同第５，９８１，２２５号、同第６，０４０，１７４号、同第６，０２０，１９１号、同第６，０８３，７１６号、同第６，１１３，９１３号、同第６，３０３，３６２号、同第７，０６７，３１０号、および同第９，０７３，９８０号に記載されている。
【０１０７】
市販のアデノウイルスベクターシステムには、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）アデノウイルス発現システム、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＡｄＥａｓｙ（商標）アデノウイルスベクターシステム、およびＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃから入手可能なＡｄｅｎｏ−Ｘ（商標）発現システム３が含まれる。
【０１０８】
ウイルスベクター生成
ウイルスベクターを生成するための方法は当技術分野で知られている。典型的には、目的のウイルスは、感染性ウイルス粒子の生成を可能にするように、好適な条件下でトランスフェクトまたは感染した宿主細胞を培養することを含む、従来の技術を使用して、好適な宿主細胞株において生成される。ウイルス遺伝子および／またはｔＲＮＡをコードする核酸は、プラスミドに組み込み、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術を介して宿主細胞に導入することができる。開示されるウイルスの生成のための宿主細胞の例には、ＨｅＬａ、Ｈｅｌａ−Ｓ３、ＨＥＫ２９３、９１１、Ａ５４９、ＨＥＲ９６、またはＰＥＲ−Ｃ６細胞などのヒト細胞株が含まれる。特定の生成および精製条件は、使用するウイルスおよび生成システムに応じて変化させることができる。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、プロデューサー細胞は、対象に直接投与され得るが、他の実施形態において、生成に続いて、感染性ウイルス粒子は、培養物から回収され、必要に応じて精製される。典型的な精製ステップは、プラーク精製、遠心分離、例えば、塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えば、ベンゾナーゼまたはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィーステップ、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは濾過ステップを含み得る。
【０１１０】
医薬組成物
治療的使用のために、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わされる。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくはその他の問題、または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適しており、合理的な利益／リスク比に見合った、これらの化合物、材料、組成物、および／または投与形態を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するための緩衝液、担体、および賦形剤を指す。薬学的に許容される担体には、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、および様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが含まれる。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤、およびアジュバントの例について、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照する。薬学的に許容される担体には、医薬品投与と適合性がある緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色調、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を、改変、持続、または維持するための製剤材料を含み得る。そのような実施形態において、製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖、二糖類、およびその他の炭水化物（ブドウ糖、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど）、着色剤、香料および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）、安定性向上剤（ショ糖またはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または医薬品アジュバントを含むが、これらに限定されない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照する）。（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）．
【０１１３】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、リポソーム、またはミセルを含み得る（Ａｎｓｅｌｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＢＩＯＥＮＧ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＥＤ．１：１０−２９を参照する）。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、米国特許公開第２０１７／０３５４６７２号に記載されているように、ナノ粒子またはアミノ脂質送達化合物を含まない。ある特定の実施形態において、細胞に導入されるか、または対象に投与されるｔＲＮＡもしくは発現ベクターは、別の部分、例えば、担体粒子、例えば、アミノ脂質粒子にコンジュゲートまたは会合されていない。本明細書で使用される場合、「コンジュゲートされる」という用語は、２つ以上の部分に関して使用されるとき、部分が、直接または連結物質として機能する１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または結合されて、十分に安定な構造を形成し、それによって、部分は構造が使用される、例えば、生理学的条件下で物理的に会合され続けることを意味する。典型的には、部分は、１つ以上の共有結合によって、または特異的結合を含むメカニズムによって結合される。あるいは、十分な数のより弱い相互作用は、部分が物理的に会合され続けるのに十分な安定性を提供することができる。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、持続した、または制御された送達製剤を含み得る。リポソーム担体、生体分解性微粒子、または多孔質ビーズおよびデポー注射などの持続した、または制御された送達手段を製剤化するための技術もまた、当業者に知られている。徐放性調製物には、例えば、多孔質ポリマー微粒子または成型品形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルが含まれ得る。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチル−イネタクリラート）、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれ得る。徐放性組成物はまた、当技術分野で知られているいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含み得る。
【０１１５】
本明細書に開示されるｔＲＮＡおよび／または発現ベクターを含む医薬組成物は、投薬単位形態で提供することができ、任意の好適な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化されるべきである。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、髄腔内、および直腸投与である。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、髄腔内に投与される。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、注射によって投与される。有用な製剤は、製薬分野で知られている方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照する。非経口投与に好適である製剤成分には、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための薬剤が含まれる。
【０１１６】
静脈内投与では、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、製造および保存の条件下で安定しているべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。
【０１１７】
一般に、核酸分子を送達する任意の方法は、ｔＲＮＡでの使用に適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＴＲＥＮＤＳ  ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．２（５）：１３９−１４４、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５９５号を参照する）。ｔＲＮＡは、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｔＲＮＡの急速な分解を防ぐために、修飾するか、あるいは薬物送達システムを使用して送達することができる。ｔＲＮＡ分子は、コレステロールなどの親油性基への化学的結合によって修飾して、細胞の取り込みを増強させて、分解を防止することができる。ｔＲＮＡ分子はまた、アプタマーとコンジュゲートさせるか、そうでなければ会合させることができる。ｔＲＮＡはまた、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達することができる。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｔＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用を高めて、細胞によるｔＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、もしくはポリマーは、ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡに結合するか、または誘導されてＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成することができる（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ  １２９（２）：１０７−１１６を参照する）。カチオン性ＲＮＡ複合体を作製および投与するための方法は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ  ３２７：７６１−７６６、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ．９：１２９１−１３００、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．ＨＹＰＥＲＴＥＮＳ．２５：１９７−２０５を参照する）。ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）上記、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、上記）、オリゴフェクタミン、固体核酸脂質粒子（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＮＡＴＵＲＥ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＣＡＮＣＥＲ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲ．１２：３２１−３２８、Ｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＩＮＴ  Ｊ．ＯＮＣＯＬ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエタノールアミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＨＡＲＭ．ＲＥＳ．２５（１２）：２９７２−８２、Ａｉｇｎｅｒ（２００６）Ｊ．ＢＩＯＭＥＤ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ（２００６）ＭＯＬ．ＰＨＡＲＭ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＢＩＯＣＨＥＭ．ＳＯＣ．ＴＲＡＮＳ．３５：６１−６７、Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＰＨＡＲＭ．ＲＥＳ．１６：１７９９−１８０４）が含まれる。ある特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に記載されている。
【０１１８】
医薬製剤は、無菌であることができる。滅菌は、任意の適切な方法、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行うことができる。
【０１１９】
本明細書に記載の組成物は、局所的または全身的に投与することができる。投与は、一般的に非経口投与である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は皮下投与され、他の実施形態において、静脈内投与される。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。
【０１２０】
一般に、治療有効量の活性成分、例えば、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。ある特定の実施形態において、治療的有効量のウイルス発現ベクターは、１０２〜１０１５プラーク形成単位（ｐｆｕｓ）の範囲、例えば、１０２〜１０１０、１０２〜１０５、１０５〜１０１５、１０５〜１０１０、または１０１０〜１０１５プラーク形成単位である。投与される量は、治療される疾患または適応症のタイプおよび程度、患者の全体的な健康、抗体のインビボ効力、医薬製剤、および投与経路などの変数に依存するであろう。初期投与量は、所望の血中レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上限レベルを超えて増加させることができる。あるいは、初期投与量は、最適よりも少なくすることができ、毎日の投与量は、治療の過程で漸次的に増加させることができる。ヒトでの投与量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇまで実行するように設計された通常の第Ｉ相用量漸増試験で、最適化することができる。投与頻度は、投与経路、投与量、血清半減期、および治療される疾患などの要因に応じて変化させることができる。投与頻度の例は、１日に１回、１週に１回、２週に１回である。いくつかの実施形態において、投与経路は、非経口的、例えば、静脈内注入である。
【０１２１】
治療的使用
本明細書に開示される組成物および方法を使用して、対象における未成熟終止コドン（ＰＳＣ）媒介性障害を治療することができる。本明細書で使用される場合、「ＰＳＣ媒介性障害」という用語は、遺伝子内のＰＳＣによって媒介されるか、増強されるか、またはそうでなければ促進されるか、もしくは関連する障害を指す。ＰＳＣ媒介性障害の例には、β−サラセミア、コロイデレミア（ＣＨＭ）、嚢胞性線維症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ＫＩＦ１Ａ、リソソーム蓄積症（例えば、マロトー・ラミー症候群、ニーマン・ピック病、およびサンフィリッポ症候群）、マルファン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、および脊髄性筋萎縮症が含まれる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＰＳＣ媒介性障害は、てんかん障害、てんかん性脳症、ドラベ症候群、レノックス・ガストー症候群、クリーフストラ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＫＣＮＱ２脳症、ＳＹＮＧＡＰ１脳症、ＧＢＡを有するパーキンソン病、ＣＤＫＬ５、ＳＬＣ６Ａ１、ＢＲＭＵＴＤ、ソトス症候群、ＧＬＵＴ１欠損症候群、および中枢神経系（ＣＮＳ）関連障害に関連する任意の他のＰＳＣ媒介性障害から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＳＣ媒介性障害は、ドラベ症候群およびレノックス・ガストー症候群を含む、てんかん障害またはてんかん性脳症から選択される。
【０１２３】
上記治療方法のいずれかのさらに他の実施形態において、ＰＳＣ媒介性障害は、選択される５ｑ症候群、アダムス・オリバー症候群１、アラジール症候群１、自己免疫リンパ増殖性症候群１Ａ型、カーニー複合Ｉ型、チャージ症候群、コフィン・サイリズ症候群、デュアン症候群、嚢胞性線維症、マルファン症候群、エーラス・ダンロス症候群、ファインゴールド症候群１、デニス・ドラッシュ症候群／フレイジャー症候群、ディジョージ症候群（ＴＢＸ１関連）、鎖骨頭蓋異形成症、または上記に列挙されていない任意の他の非ＣＮＳ関連障害である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＰＳＣ媒介性障害の治療を必要とする対象におけるＰＳＣ媒介性障害を治療する方法は、対象に、有効量のｔＲＮＡおよび／または発現ベクター、例えば、本明細書に開示されるｔＲＮＡおよび／または発現ベクターを、単独または別の治療薬と組み合わせて投与して、対象におけるＰＳＣ媒介性障害を治療することを含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、ＰＳＣ媒介性障害はドラベ症候群であり、本方法は、対象における発作頻度、発作重症度、および／または認知機能障害を低減させる。例えば、ある特定の実施形態において、本方法は、対象における発作頻度を、例えば、１日、１週、または１ケ月の期間にわたって、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減させる。ある特定の実施形態において、本方法は、例えば、１日、１週、または１ケ月の期間にわたって、発作頻度を５０％低減させる。
【０１２６】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な活性剤（例えば、本明細書に記載のｔＲＮＡまたは発現ベクター）の量を指す。有効量は、１つ以上の投与、適用、または投薬量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、対象、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これには、（ａ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、および（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、病状の退行を引き起こすことを含む。本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって治療される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるがこれらに限定されず、より好ましくはヒトが含まれる。
【０１２８】
本明細書に記載の方法および組成物は、単独で、あるいは他の治療薬および／またはモダリティと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるという用語は、２つ（またはそれ以上）の異なる治療が、障害による対象の苦悩の経過の際に、患者における治療の効果がある時点で重なるように、対象に送達されることを意味すると理解される。ある特定の実施形態において、１つの治療の送達は、第２の送達が開始されたときには依然として生じており、そのため、投与に関して重複している。これは、ときどき本明細書では「同時」または「同時送達」と呼ばれる。他の実施形態において、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合のある特定の実施形態において、治療は、組み合わせた投与によって、効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、同等の効果が、より少ない第２の治療によって認められるか、または第２の治療は、第１の治療が存在せず第２の治療が投与された場合に認められるよりも症状を大きな程度で低減させるか、または同様な状況が第１の治療によって認められる。ある特定の実施形態において、本送達では、症状の低減、または障害に関連する他のパラメーターが、他方の非存在下で送達された一方の治療で観察されるよりも大きい。２つの治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的よりも大きいものであり得る。本送達では、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されたときに依然として検出可能であることができる。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法または組成物は、１つ以上の追加の療法、例えば、ＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸と組み合わせて投与される。例えば、ドラベ症候群の治療の際に、本明細書に記載の方法または組成物は、１つ以上の追加の療法、例えば、ＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸と組み合わせて投与される。
【０１３０】
本記載全体を通して、組成物が特定の成分を有するか、含むか（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、または処理および方法が特定のステップを有するか、包むか（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、さらに、列挙される成分から本質的になる、またはそれらからなる組成物が存在し、列挙される処理ステップから本質的になるか、またはそれらからなる処理およびステップが存在することが企図される。
【０１３１】
本出願において、構成要素もしくは成分が、列挙された構成要素もしくは成分のリストに含まれ、かつ／またはそれらから選択されるといわれる場合、構成要素もしくは成分は、列挙された構成要素もしくは成分のいずれか１つであることができるか、または構成要素もしくは成分は、列挙された構成要素もしくは成分のうちの２つ以上からなる群から選択することができる。
【０１３２】
さらに、本明細書に記載の組成物および／または方法の構成要素および／または特徴は、本明細書において明示的または暗示的であろうと、本明細書に記載の組成物および／または方法の精神および範囲から逸脱することなく、様々な方法で組み合わせることができることを理解されたい。例えば、特定の化合物に言及する場合、その化合物は、文脈から他に理解されない限り、組成物の様々な実施形態および／または本明細書に記載の方法で使用することができる。言い換えれば、本出願内で、実施形態は、明確で簡潔な出願を記述および描画することを可能にする方法で記載および描写されてきているが、実施形態は本教示から外れることなく様々に組み合わされるか、または分離され得ることが意図されており、理解されよう。例えば、本明細書に記載および描写さいるすべての特徴は、本明細書に記載および描写されている組成物（複数可）および方法（複数可）のすべての態様に適用可能であることが理解されよう。
【０１３３】
「の少なくとも１つ」という表現は、文脈および使用から他に理解されない限り、表現の前に列挙された対象の各々、および２つ以上の列挙された対象の様々な組み合わせを個別に含むことを理解されたい。３つ以上の列挙された対象に関連する「および／または」という表現は、文脈から他に理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
【０１３４】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有している」という用語の使用は、それらの文法的同等物を含めて、文脈から特に明記または理解されない限り、一般に、制限がなく非限定的として、例えば、追加の引用されていない構成要素またはステップを除外しないと理解されるべきである。
【０１３５】
「約」という用語の使用が定量値の前にある場合、本発明はまた、特に他に明記されない限り、特定の定量値自体も含む。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、他に指示または推測されない限り、公称値からの±１０％の変動を指す。
【０１３６】
さらに、ステップの順序または特定の操作を実施するための順序は、本発明が実施可能である限り、重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは操作は、同時に実行され得る。
【０１３７】
任意およびすべての例、または本明細書の例示的な言語、例えば「など」または「含む」の使用は、単に本発明をよりよく説明することが意図されており、請求されない限り、本発明の範囲に制限をもたらさない。本明細書における文言は、いかなる非請求要素も本発明の実施に不可欠であるとして示していないと、解釈されるべきである。
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本発明の範囲または内容を決して制限することを意図するものではない。
【０１３９】
実施例１
本実施例は、ＳＣＮ１Ａ転写物における未成熟終止コドン（ＰＳＣ）のリードスルーを促進するアルギニンアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡについて説明する。
【０１４０】
ルシフェラーゼレポーター構築体を、ＰＳＣを含む２名のドラベ症候群対象（対象Ａおよび対象Ｂ）のＳＣＮ１Ａ転写物に基づいて合成した。レポーター構築体は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、および介在配列によって連結されたホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んだ。介在配列は、対象Ａ（配列番号１２）および対象Ｂ（配列番号１３）のＳＣＮ１Ａ転写物からのＰＳＣおよび８個の隣接コドンを含んだ（図３）。レポーター構築体は、以下、対象Ａおよび対象Ｂレポーター構築体と呼ぶ。対象Ａおよび対象Ｂレポーター構築体の各々について、コントロールレポート構築体を合成し、ＰＳＣの代わりに挿入されたＣＧＡ（アルギニン）コドンを除き、同一だった。
【０１４１】
サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ−アルギニン遺伝子（ｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＣＧ−１−１、ｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＣＧ−３−１、およびｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＣＧ−６−１）に由来した。各ＲＮＡにおいて、ＴＣＧアンチコドンはＴＣＡに変異させ、Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１（配列番号１）、Ａｒｇ−ＴＣＡ−３−１（配列番号２）、およびＡｒｇ−ＴＣＡ−６−１（配列番号３）と呼ばれるｔＲＮＡを生成した。Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１（配列番号１）、Ａｒｇ−ＴＣＡ−３−１（配列番号２）、およびＡｒｇ−ＴＣＡ−６−１（配列番号３）を、示される変異型ＴＣＡアンチコドンとともに図４に示す。
【０１４２】
Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００塩基対（ｂｐ）の隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号５）、Ａｒｇ−ＴＣＡ−３−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号６）、およびＡｒｇ−ＴＣＡ−６−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号７）、をコードするヌクレオチド配列を、ＸｈｏＩおよびＰｃｉＩ制限酵素部位を使用してｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、Ｐｔｉｇｈｔ、ＭＣＳ、およびＳＶ４０ポリＡ配列の除去をもたらした。
【０１４３】
１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで３０〜４０％集密まで増殖させたＨＥＫ２９３細胞を、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してレポーター構築体およびｔＲＮＡによって共トランスフェクトした。２４時間後、細胞を収集し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定した。
【０１４４】
図５Ａに示すように、合成Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１およびＡｒｇ−ＴＣＡ−３−１サプレッサーｔＲＮＡの発現は、対象Ａおよび対象Ｂの両方のレポーター構築体のリードスルーを促進した。
【０１４５】
さらに、Ａｒｇ−ＴＣＧ−１−１は、様々な隣接配列または調節配列で試験した。Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１ｔＲＮＡとともに、（ｉ）対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの４６ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（「最小」；配列番号８）、（ｉｉ）上流Ｕ６プロモーター＋対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの４６ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（「Ｕ６Ｐ＋最小」；配列番号１０）、または（ｉｉｉ）対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（「＋／−２００」；配列番号５）、をコードするヌクレオチド配列を、上記のようにｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔにクローニングした。
【０１４６】
ＨＥＫ−２９３細胞は、ｔＲＮＡ発現構築体および対象Ｂルシフェラーゼレポーター構築体によって共トランスフェクトした。細胞トランスフェクション、発光検出、およびリードスルー計算は、上記のように実施した。図５Ｂに示すように、最小、Ｕ６Ｐ＋最小、および＋／−２００ｂｐ  ｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＣＡ−１−１構築体の各々の発現は、対象Ｂレポーター構築体のリードスルーを促進した。
【０１４７】
同時に、これらの結果は、記載のサプレッサーｔＲＮＡがドラベ症候群に関連する未成熟終止コドンを含むＳＣＮ１Ａ転写物の発現を促進することができることを示す。
【０１４８】
実施例２
この実施例は、転写物における未成熟終止コドン（ＰＳＣ）のリードスルーを促進するグルタミンアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡについて説明する。
【０１４９】
サプレッサーｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ−グルタミン遺伝子（ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ−ＴＴＧ−１−１、ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ−ＴＴＧ−２−１、およびｔＲＮＡ−Ｇｌｎ−ＴＴＧ−３−１）に由来する。各ＲＮＡにおいて、ＴＴＧアンチコドンはＴＴＡに変異させ、Ｇｌｎ−ＴＴＡ−１−１（配列番号１６）、Ｇｌｎ−ＴＴＡ−２−１（配列番号１７）、およびＧｌｎ−ＴＴＡ−３−１（配列番号１８）と呼ばれるｔＲＮＡを生成する。Ｇｌｎ−ＴＴＡ−１−１（配列番号１６）、Ｇｌｎ−ＴＴＡ−２−１（配列番号１７）、およびＧｌｎ−ＴＴＡ−３−１（配列番号１８）を、示した変異型ＴＴＡアンチコドンとともに図６に示す。
【０１５０】
Ｇｌｎ−ＴＴＡ−１−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００塩基対（ｂｐ）の隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１９）、Ｇｌｎ−ＴＴＡ−２−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号２０）、およびＧｌｎ−ＴＴＡ−３−１ｔＲＮＡとともに対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子からの２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号２１）、をコードするヌクレオチド配列を、ＸｈｏＩおよびＰｃｉＩ制限酵素部位を使用してｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、Ｐｔｉｇｈｔ、ＭＣＳ、およびＳＶ４０ポリＡ配列の除去をもたらす。
【０１５１】
本発明の上記の説明から、当業者は、改善、変更、および修正を認識するであろう。当技術分野内のかかる改善、変更、および修正は、添付の特許請求の範囲によって網羅されることが意図されている。本出願で引用されるすべての参考文献、刊行物、および特許は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、上記実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。そのため、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求によって示され、特許請求の意味および同等性の範囲内にあるすべての変更は、そこに包含されることが意図されている。
【図１】
2022501055.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
2022501055.tif 000013
2022501055.tif 000014
2022501055.tif 000015