(57)【要約】バイオリアクタ(100)は、生体細胞(1)を培養するよう適合化されており、また、培地(2)を収容するよう適合化された容器(19)と、容器(10)内に配置され生体細胞(1)が一時的に付着結合されるよう適合化された複数の支持フィラメント(20)とを含んでいる。支持フィラメント(20)は表面層(21)を備えている。表面層(21)は、生体細胞(1)が付着形態で表面層(21)に結合され得る付着状態と、生体細胞(1)の表面層(21)への付着結合がその付着状態と比較して低減した解放状態との間で切り替えることができる。バイオリアクタ(100)において生体細胞１を処理するための方法も記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体細胞（１）を培養するよう適合化されたバイオリアクタ（１００）であって、
−  培地（２）を収容するよう適合化された容器（１０）と、
−  前記容器（１０）内に配置され、前記生体細胞（１）を一時的に付着結合させるよう適合化された複数の支持フィラメント（２０）と、
を含み、
特徴として、
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は表面層（２１）を備え、前記表面層（２１）は、前記生体細胞（１）が付着形態で前記表面層（２１）に結合され得る付着状態と、前記生体細胞（１）の前記表面層（２１）への付着結合が前記付着状態と比較して低減した解放状態との間で切り替えることができるものである、
バイオリアクタ（１００）。
【請求項２】
−  前記表面層（２１）は、光の作用に応答して前記付着状態と前記解放状態の間で切り替えることができるものである、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３】
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は複数の光導体（２２）を含み、前記複数の光導体（２２）は、それぞれ、切替え光源装置（３０）に接続するようおよび前記光導体（２２）からの前記表面層（２１）への切替え可能な照射に適合化されているものである、
請求項２に記載のバイオリアクタ。
【請求項４】
−  前記切替え光源装置（３０）は、別々に切替え可能な複数の光源を含み、
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は、それぞれ、前記複数の光源の中の１つに接続されるよう適合化され、
−  各支持フィラメント（２０）の前記表面層（２１）は、関連する前記光源を作動させることによって、前記付着状態と前記解放状態の間で個々に切替え可能である、
請求項３に記載のバイオリアクタ。
【請求項５】
−  前記切替え光源装置（３０）は、前記バイオリアクタ（１００）の一部であり、前記複数の光導体（２２）に確実に接続されるものである、
請求項３または４に記載のバイオリアクタ。
【請求項６】
−  前記複数の光導体（２２）は、複数のエバネッセント波を前記表面層（２１）に切替え可能に照射するよう適合化され、前記複数のエバネセント波の各々は、前記複数の光導体（２２）の内側から前記表面層（２１）中に浸透するものである、
請求項３または４に記載のバイオリアクタ。
【請求項７】
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は、前記表面層（２１）への切替え可能な照射にそれぞれ適合化された、液晶で切替え可能な光素子、発光ダイオード（２４）、特に有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、および／または、化学発光素子、を用いるのに適合化されるものである、
請求項２乃至６のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項８】
前記表面層（２１）が、
−  光応答性ヒドロゲル層、および
−  前記複数の支持フィラメント（２０）の表面上の機能化層、
のうちの少なくとも一方である、
請求項２乃至７のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
−  前記表面層（２１）は、熱の作用に応答して、前記付着状態と前記解放状態の間で切り替えることができるものである、
請求項１乃至８のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１０】
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は複数の中空ファイバ（２５）を含み、前記複数の中空ファイバ（２５）は、それぞれ、温度制御装置（４０）への接続に、および前記複数の中空ファイバ（２５）の中を通って流れる温度制御媒体による前記表面層（２１）の切替え可能な温度制御に、適合化されるものである、
請求項１乃至９のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１１】
−  前記温度制御装置（４０）は、別々に切替え可能な複数の温度制御要素を含み、
−  前記複数の中空ファイバ（２５）は、それぞれ、前記複数の温度制御要素の中の１つの要素に接続するよう適合化されており、
−  各中空ファイバ（２５）の前記表面層（２１）は、関連する前記１つの温度制御要素を作動させることによって、前記付着状態と前記解放状態の間で個々に切り替えることができるものである、
請求項１０に記載のバイオリアクタ。
【請求項１２】
−  前記表面層（２１）は温度応答性ヒドロゲルで形成されたものである、
請求項９乃至１１のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１３】
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は、前記容器（１０）内で伸びる柔軟なファイバを含むものである、
請求項１乃至１２のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１４】
−  前記容器（１０）は細長い形状を有し、
−  前記複数の支持フィラメント（２０）は前記容器（１０）の長手方向に伸びるものである、
請求項１乃至１３のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１５】
−  前記容器（１０）は、少なくとも２つの流体コネクタ（１１）を有しており、かつ、液体フラッシュ媒体が通って流れるよう適合化されており、
−  前記解放状態では、前記フラッシュ媒体の流動力の作用下で前記生体細胞（１）が前記複数の支持フィラメント（２０）から分離され得るように、前記表面層（２１）に対する前記生体細胞（１）の付着結合が低減するものである、
請求項１乃至１４のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１６】
−  前記容器（１０）は、少なくとも１つのセンサ（１３）を前記バイオリアクタ（１００）に一体化するよう適合化された少なくとも１つのセンサ・コネクタ（１２）を有するものである、
請求項１乃至１５のいずれかに記載のバイオリアクタ。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれかに記載のバイオリアクタ（１００）において生体細胞（１）を処理するための方法であって、
−  前記複数の支持フィラメント（２０）の前記付着状態を設定する工程と、
−  前記生体細胞（１）を前記複数の支持フィラメント（２０）に付着結合させる工程と、
−  付着結合された前記生体細胞を培養（１）する工程と、
−  前記複数の支持フィラメント（２０）の前記解放状態を設定する工程と、
−  前記生体細胞（１）を前記複数の支持フィラメント（２０）から分離する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体（生物）細胞を培養するためのバイオリアクタに関し、特に、細胞が付着する複数の支持（基礎、培地、培養基）フィラメント（ファイバ状体、繊維状体）（Substratfilamente）を含みその付着結合（接着）した状態で細胞を培養するよう適合化されたバイオリアクタに関する。また、本発明は、バイオリアクタが使用される、生体細胞を培養するための方法に関する。
本発明の適用例は、例えば、生物学、バイオテクノロジ、生化学および医学において、特に生体細胞の培養においておよび／または（ヒト）組織工学（Tissue Engineering：再生医療）において、利用可能である。
【０００２】
細胞培養容器の、例えば皿の、底部上での接着性（付着性）生体細胞の培養が、一般的に知られている。多数の適用例、例えばバイオテクノロジおよび医学において、特に組織工学において、または細胞スクリーニングにおいて、非常に大量の細胞を培養することに関心が持たれている。簡易な細胞培養容器は、効率、拡張性および細胞収量が限られているので、これらの適用例には適していない。従って、例えば誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞のような接着性細胞の培養には、高い表面積対体積比（培養面の総表面積／容器の容積）を有する培養面が使用され、それによって効率および細胞収量を増大させることができる。実務上知られている例は、マイクロキャリア（微小担体）上での付着浮遊培養（adhaerente Suspensionskultur）、または中空ファイバ（Hohlfaser：中空繊維）バイオリアクタでの細胞の処理である。
【０００３】
細胞増殖後のマイクロキャリアまたは中空ファイバからの細胞の採取は、通常の技術の使用における課題である。典型的には、細胞は、接着性細胞を、それぞれの培養面からその細胞を分離する酵素で処理することによって、収集される。ここでは、特異性（Spezifitaet：選択性）が低いので、酵素が同時に細胞の膜タンパク質を破壊する可能性があることが、欠点である。さらに、細胞を分離するには、望ましくない剪断応力を細胞に生じさせ得る流動力が、培地において必要である。
【０００４】
Ｄ．Ｃ．ワトソン（Watson）氏、他は、“Biomaterials”105（2016）195-205において、中空ファイバが配置された容器を備えた中空ファイバ・バイオリアクタについて記述している。その中空ファイバの外側表面に細胞が付着する。培地がその中空ファイバの中を通って流れ、その培地は中空ファイバの各壁中の細孔を通ってその細胞に達する。細胞産物（生成物）は、液体培地を容器内に通し中空ファイバをその培地で洗い流す（フラッシュする）ことによって、採取される。Ｄ．Ｃ．ワトソン氏、他の技術は、細胞産物の採取だけが記述されているという点に、限定される。中空ファイバから細胞を分離するためには、酵素による分離が必要となるであろう。さらに、その中空ファイバは比較的大きい直径を有し、それによって細胞培養の収量が制限される。
【０００５】
国際公開第２０１１／１６６９２１号には、生体細胞を付着結合（接着）させるよう配置された熱反応性支持体（Substraten：培地、培養基）を有する培養装置が開示されている。しかし、表面積対体積の比が比較的小さいので、この培養装置は培養効率および細胞収量（収率）に限界がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１６６９２１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D. C. Watson et al., "Biomaterials" 105 (2016) 195-205
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、生体細胞を培養するための改良されたバイオリアクタを実現することであり、それによって通常の技術の欠点を解消（回避）することができる。特に、バイオリアクタは、効率および収量が増大しおよび／または培養支持体（培地）から細胞が穏やかに分離されるような生体細胞の培養を可能にするように意図される。特に、その細胞は、流体力学に関連する応力が低減されおよび／または細胞の化学的応力が低減されるように分離が可能であるべきである。本発明の別の目的は、バイオリアクタで実現できるような、生体細胞を処理するための改善された方法を実現することであり、それ（方法）によって通常の技術の欠点を解消（回避）することができる。
【０００９】
発明の概要
これらの目的は、それぞれ、独立請求項の特徴を有する、バイオリアクタによって、およびそのバイオリアクタで実施される生体細胞を処理するための方法、特に細胞培養のための方法によって、達成される。本発明の有利な実施形態および適用例が従属請求項に記載されている。
【００１０】
本発明の第１の一般的な態様（特徴）によれば、上述の目的は、生体細胞を培養するよう（特に、増殖および／または分化）に適合化されたバイオリアクタであって、培地（栄養培地）および複数の支持フィラメント（ファイバ、繊維）を収容するための容器（ハウジング、エンクロージャ（囲い））を含むバイオリアクタによって達成される。複数の支持フィラメントは、互いに離間するようにおよび／または少なくとも複数区域（セクション）において互いに接触するように容器内に配置され、また、生体細胞をその複数の支持フィラメントの表面に一時的に（可逆的に）付着結合するよう適合化される。複数の支持フィラメントは、剛性または柔軟性（可撓性）を有するよう構成され得るものであり、バイオリアクタにおいて固定された培養表面を提供する。複数の支持フィラメントの各表面への生体細胞の付着結合は、細胞と支持体表面の相互作用による、特に細胞表面結合分子を介した、複数の支持フィラメントの各表面への細胞の結合を含むものである。
【００１１】
本発明によれば、容器内の複数の支持フィラメントは、付着状態（Adhaerenzzustand：接着状態）（結合状態（Bindungszustand）、相互作用状態（Interaktionszustand））と解放（剥離、脱着）状態（Freigabezustand）の間で切り替えることができる可変表面層を有する。その表面層は、閉じたカバー（被覆）を形成する切替え可能な材料の層であり得る。代替的に、その表面層は、切替え可能な分子の単層または部分単層（サブモノレイヤ）によって形成され得る。その付着状態では、複数の支持フィラメントの表面は、細胞を表面層に付着結合させるよう構成され、即ち、複数の支持フィラメントの表面は、細胞がその表面との結合力を生じるように形成され、その結合力の作用下で細胞がその表面に固定される。その解放状態では、その表面層への生体細胞の付着結合は、付着状態と比較して低減し、即ち、細胞がその表面との結合力を生じないように複数の支持フィラメントの表面が形成され、または、その結合力は、培地の動き（流動）の作用下で、例えば培地のまたはフラッシュ媒体（フラッシング媒体、洗浄培地）の流れの作用下で、細胞がその表面から解放され（freigegeben：脱着し、離脱し）または表面から分離され得るように、減少する。その表面層は、単一の（不可逆な）切替えまたは複数の（可逆な）切替えに適合化させることができる。
【００１２】
利点として、本発明によるバイオリアクタによって、切替え可能な表面層の効果により、酵素または他の化学物質が作用することなくかつ細胞を変化させる剪断応力を及ぼす（働かせる）であろう流動力が作用することなく、複数の支持フィラメントから細胞を分離させることが可能になる。さらに、通常の中空ファイバ・バイオリアクタと比較して、切替え可能な表面層を備えた複数の支持フィラメントによって、減少された直径および／または増大された充填密度を有する複数の支持フィラメントの使用が可能になり、これには、表面積対体積比の増大による細胞培養の効率および収量（収率）について有利な効果がある。また、熱反応性支持体（培地）を使用する通常の技術と比較して、表面積対体積比の大幅な（実質的な）増大を達成することができる。少なくとも１００個（本）の、特に少なくとも１０００個の、例えば５０００個以上の、支持フィラメントを、例えばバイオリアクタ内に、配置することができる。その複数の支持フィラメントは、好ましくは、少なくとも１０％（容器内部における体積分率）の、例えば３５％の、特に５０％のまたはそれより高い、容器内の充填密度を有する。
【００１３】
本発明の第２の一般的態様によれば、上述の目的は、本発明によるバイオリアクタにおいて生体細胞を処理するための方法によって達成され、複数の支持フィラメントの付着状態を設定することによって複数の支持フィラメントへの生体細胞の一時的な付着結合が生じる。一時的に付着結合した生体細胞の培養（任意に分化を伴う）は、付着状態で行われる。その培養が完了すると、生体細胞が複数の支持フィラメントから分離され得るように、複数の支持フィラメントの解放状態が設定される。
【００１４】
利点として、切替え可能な表面層を形成するために様々な物質が利用可能である。本発明の第１の実施形態によれば、表面層は、付着状態と解放状態の間を光の作用によって切替え可能である。その光は、ＵＶ（紫外線）、可視および／またはＩＲ（赤外線）のスペクトル範囲の波長を含み得る。本発明の第２の実施形態によれば、表面層は、熱の作用によって付着状態と解放状態の間で切替え可能である。両実施形態は、例えば光の作用によって、特にＩＲ照射によって、表面層に温度変化を生じさせるように、組み合わせることができる。
【００１５】
第１の実施形態（表面層の光応答機能（Funktionalitaet：官能基））において、付着状態は、表面層が、有効にまたは実質的に照射されないことによって、特に照射されないことによって、形成され、解放状態は、表面層の照射によって設定されることが、好ましい。代替的に、逆に、付着状態は、表面層の照射状態で設定することができ、解放状態は、有効にまたは実質的に照射されない、特に照射されない、表面層の状態で設定することができる。利点として、表面層の光応答機能は、特に、表面層の化学的性質（特性）の光誘起変化（結合分子の活性化）、表面層の温度の光誘起変化、または、表面層への若しくは表面層からの物質の光誘起結合若しくは光誘起解放、を含む様々な作用に基づくものとすることができる。
【００１６】
第１の実施形態では、好ましい本発明の変形例は、複数の支持フィラメントが複数の光導体（ライトガイド、光導波路）（または光ファイバ）を含み、その光導体が、それぞれ、切替え光源装置（デバイス）への接続に適合化されかつその光導体からのその表面層への切替え可能な照射に適合化されるものである。これによって、複数の支持フィラメントへの内側からの均一な照射が有利に達成される。その光導体は、例えばガラスまたはプラスチックで形成された導波路（Wellenleiter：導波管）であり、これらの導波路は、中実（コンパクト）または中空であり得、および／または単一材料で形成されまたは多層化されてもよい。各支持フィラメントは、表面層を備えた、１つの単一光導体または一束の光導体（光導波路）を含んでもよい。
【００１７】
ここに記載された表面層を備える光導体は、付着状態と解放状態の間を光を使用して切替え可能なものであり、本特許出願においてその保護を求める本発明の独立の構成を表す。
【００１８】
利点として、切替え光源装置は、別々に切替え可能な複数の光源を含むことができる。この場合、各支持フィラメントは、それぞれ複数の光源の中の１つの光源に光学的に結合することができ、各支持フィラメントの表面層は、関連する光源の作動によって、付着状態と解放状態の間で個々に切替え可能である。本発明のこの実施形態には、例えば、試験目的のためにまたは様々な分化状態の細胞を供給するために、複数の支持フィラメントから細胞を選択的に解放（剥離、脱着）することができる、という利点がある。代替的に、切替え光源装置は、全ての支持フィラメントが集合的に光学的に結合される少なくとも１つの光源を含むことができる。この場合、全ての支持フィラメントは、少なくとも１つの光源と同時に（並行して）切り替えることができる。
【００１９】
切替え光源装置は、バイオリアクタの一部であることが特に好ましく、複数の支持フィラメントの複数の光導体に確実に接続される。これによって、バイオリアクタのコンパクトな（小型の、集密な）構造が有利に達成される。
【００２０】
本発明の第１の実施形態の特に好ましい変形例によれば、複数の光導体は複数のエバネッセント波を表面層に切替え可能に照射するよう適合化され、その複数のエバネッセント波の各々は複数の光導体の内側から表面層中に浸透する。これによって、利点として、特に光を外部結合するための追加的な手段なしで、構造化されていない表面を有する利用可能な光導体の使用が可能になる。さらに、複数のエバネッセント波は隣接の光導体に作用しないので、個々の光導体の選択的照射が容易になる。
【００２１】
第１の実施形態では、その照射は、代替的にまたは追加的に、バイオリアクタの容器内に配置された少なくとも１つの光源によって、制御することができる。これによって、利点として、複数の支持フィラメントをそれらの表面において照射することができる。少なくとも１つの光源は、例えば、容器内の複数の支持フィラメントの隣に（に隣接して）配置することができる。代替的または追加的に、複数の支持フィラメントは複数の活性光源を支持することができ、その活性光源は、液晶で切替え可能な光素子、発光ダイオード、特に有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、および／または、化学発光性の光素子を含み、これら（素子）はそれぞれ表面層の切替え可能な照射に適合化される。これらの光源は、複数の光導体または他のワイヤ形状またはストリップ形状の複数のフィラメント、例えばプラスチックまたはガラス製のフィラメント、の各表面に配置することができる。利点として、複数の活性（アクティブ、能動）光源によって、複数のエバネッセント波による照射と比較して、照射強度の増大が可能になる。
【００２２】
本発明の第１の実施形態において、本発明の好ましい変形例によれば、表面層は、光応答性ヒドロゲル層、特にアルギン酸塩層、を、および／または、機能化層（Funktionalisierungsschicht：官能基化層）を、複数の支持フィラメントの表面上に含むことができる。バイオリアクタ内の全ての支持フィラメントは同じ表面層を有することができ、または複数の支持フィラメントは様々な表面層を有することができる。
【００２３】
光応答性ヒドロゲル層は、ヒドロゲルポリマーで形成された層であり、生体細胞を結合させるそれ（ポリマー）の能力は照射に依存するものである。この機能（官能化）は、ヒドロゲルのポリマーによって直接（共有結合的に）、および／または、ヒドロゲルポリマーと光応答性成分、例えば、ミセル、微粒子、ナノ粒子、を用いたヒドロゲル層の複合材料の形成によって、形成され得る。適切なヒドロゲルポリマーには、例えば、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリアクリルアミド、ゲランガム（Gellan-Gum）、ヒアルロン酸、またはポリビニルアルコール、またはこれらの例に類似する特性を有するヒドロゲルポリマーが含まれる。光応答性成分は、例えば、埋め込まれた金属ナノ粒子および活性物質（反応性物質）を有するベシクル（Vesikeln：小胞、気孔）であり得る。表面層の照射時に、ベシクルが破裂して活性物質を放出（解放）するようにナノ粒子を加熱することができ、それ（物質）は、例えば、細胞を表面層から分離するよう適合化される。通常の酵素による分離（剥離）とは違って、活性物質は表面層で局所的に作用して、細胞に対する望ましくない影響を、無視し得るレベルに最小限に抑えまたは排除することができる。
【００２４】
機能化層は、例えば、複数の支持フィラメントの表面、特に複数の光導体の表面、に配置されたアゾベンゼン、Ｏ−ニトロベンジル基、および／またはベンゾニトリル、で形成することができる。
【００２５】
本発明の第２の実施形態によれば、表面層は、正または負の熱の作用（または熱的作用）に応答して、付着状態と解放状態の間で切替え可能である。付着状態および解放状態は、それぞれ、複数の支持フィラメントを冷却し加熱すること（またはその逆）によって設定することができる。従って、利点として、他の刺激可能な分子を使用して表面層を形成することができる。
【００２６】
複数の支持フィラメントは、複数の中空ファイバを含むことが好ましく、そのファイバは、それぞれ、温度制御装置への接続に、およびその中空ファイバの中を通って流れる温度制御媒体を用いた表面層の切替え可能な温度制御（冷却および／または加熱）に、適合化される。バイオリアクタは、特に、中空ファイバ・バイオリアクタとして構築する（組み立てる）ことができるが、それとは異なり（相違点として）、複数の中空ファイバは温度応答性層（例えば、ポリマーＰＮＩＰＡＡｍ製のもの）で被覆される。複数の中空ファイバは、多孔性であるよう、かつ細胞に培地を供給するよう適合化させてもよく、その際、培地の温度を調整することによって表面層の切替えが行われてもよい。代替的に、複数の中空ファイバは、不浸透性の壁を有することができ、それら（壁）を通して温度制御媒体、例えば水、を流すことができる。
【００２７】
本明細書に記載の表面層を有する中空ファイバは、温度変化を用いて付着状態と解放状態の間で切替え可能であり、本発明の独立した構成を表し、本特許出願においてその保護が求められる。
【００２８】
本発明の第２の実施形態では、温度は、全ての中空ファイバに結合された温度制御装置によって制御することができる。これによって、利点として、全ての支持フィラメントを、内側から同時に（並行して）温度制御することができる。しかし、温度制御装置が別々に切替え可能な複数の温度制御要素を含みかつ複数の中空ファイバがそれぞれ複数の温度制御要素の中の１つの要素への接続に適合化されるような発明の変形例が好ましい。この場合、各中空ファイバの表面層は、関連するその１つの温度制御要素の作動（活動化）によって付着状態と解放状態の間で個々に切替え可能である。
【００２９】
本発明の第２の実施形態では、表面層は温度応答性ヒドロゲルで形成されることが好ましい。使用できるヒドロゲルの例には、特に、ポリ（Ｎイソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）（Poly(N-Isopropylacrylamid) (pNIPAAM)）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）（Poly-(N-vinylalkylamide)）、例えばポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）（Poly(N-vinylcaprolactam)）、または、コポリマー（Ko-Polymere）、例えばポリ（Ｌ−乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＬＡ）トリブロックコポリマー（poly(L-lactic acid)-Poly(ethylen-Glycol)-poly(L-lactic acid)(PLLA-PEG-PLLA) triblock-Copolymere）および／またはポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）コポリマー（Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly (ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO)-Copolymere）、またはこれらの例に類似した特性を有する温度応答性ヒドロゲルポリマー（Temperatur-responsive Hydrogel-Polymere）、が含まれる。
【００３０】
本発明の別の好ましい特徴によれば、複数の支持フィラメントは、バイオリアクタの容器内で伸びる柔軟な（可撓性の）ファイバである。その容器は、特に好ましくは、長手方向に細長い形態（管状または長方形の形態）を有し、複数の支持フィラメントは容器の長手方向に伸びる。
【００３１】
その容器は、液体フラッシュ媒体が容器中を通って流れるように、互いに間隔を置いて配置された少なくとも２つの流体コネクタを有することが、好ましい。その流体コネクタは、フラッシュ媒体貯留槽（Reservoir：レザーバ、貯留器、貯留層）および切替え可能なポンプに接続される。フラッシュ媒体は、培地または生理液を含んでいる。解放状態では、生物細胞の表面層への付着結合が低減して、生体細胞がフラッシュ媒体の流動力の作用下で複数の支持フィラメントから分離され得るようにされる。細長い形態の容器を形成することによって、流体コネクタは、容器の互いに反対側にある端部（両端部）に設けられることが好ましい。
【００３２】
本発明の別に提示される好ましい特徴によれば、その容器は、少なくとも１つのセンサをバイオリアクタに一体化（統合、組込み）するよう適合化された少なくとも１つのセンサ・コネクタを有する。少なくとも１つのセンサは、温度センサ、ｐＨセンサ、グルコース・センサ、乳酸塩センサ、カメラまたはラマン（RAMAN）プローブ（ラマン分光用プローブ）の中の少なくとも１つを含むことが、好ましい。利点として、少なくとも１つのセンサによって、バイオリアクタの動作期間中に細胞培養の監視（モニタ）が可能になる。
【００３３】
本発明の他の詳細および利点を、図面を参照して以下で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態によるバイオリアクタの概略図である。
【図２】図２は、本発明の第１の実施形態によるバイオリアクタのより詳細な図である。
【図３】図３は、支持フィラメントの表面からの生体細胞の解放を示す概略図である。
【図４】図４は、本発明によるバイオリアクタの第２の実施形態の概略図である。
【図５】図５は、他の構成要素（部品）を有するバイオリアクタの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の好ましい実施形態を、光応答性または熱応答性の支持（支持体）フィラメント（Substratfilamenten：培地フィラメント）を備えたバイオリアクタを例示的に参照して以下説明する。本発明の実施は、これらの実施形態に限定されない。代替的に、光応答性および熱応答性の支持フィラメントをバイオリアクタ内で組み合わせることができる。さらに、本発明は、例として示される管状（チューブ状）形態のバイオリアクタに限定されない。本発明の適用例に応じて、バイオリアクタの他の形態、例えばボックス状または球状の形態、を選択することができる。さらに、示した例とは異なり、活性光源は、バイオリアクタの容器内、支持フィラメント上、および／または容器の内壁上に設けることができる。本発明の詳細は、特に、支持フィラメントの設計および配置、並びにバイオリアクタの動作を参照して説明する。生体細胞の培養の詳細、特に付着（接着）成長する幹細胞の分化は、通常の培養プロセスからそれ自体が既知なので、ここでは説明しない。
【００３６】
図１の概略的な部分図によれば、本発明によるバイオリアクタ１００の第１の実施形態は、複数の支持フィラメント２０が配置された容器１０を含んでいる。図１Ａによれば、容器１０は中空円筒または円柱の形状を有する。容器１０は、ここでは開放状態で示されているが、稼働（動作）状態では、全ての側面が閉じた容器壁を有し、任意に、流体コネクタおよびセンサ・コネクタ（図２参照）、窓および／または他のアクセス（連絡、出入）開口部（Zugriffsoeffnungen）を有する。
【００３７】
支持フィラメント２０は、容器１０の軸方向に伸びる。容器１０の軸方向の長さは、例えば２０ｃｍであり、容器１０の直径は、例えば５ｃｍである。例えば、１０００個の支持フィラメント２０が容器１０内に配置される。容器１０は、複数の支持フィラメント２０の周りを勢いよく流れる培地（Kultivierungsmedium）２で満たされている。培地２は、容器１０の中を通って流れることが好ましい（図２および５参照）。培地２は、例えばｍＴｅＳＲ１培地を含んでいる（ｍＴｅＳＲは製品名である）。
【００３８】
各支持フィラメント２０は、図１Ｂの概略的な部分断面図および図１Ｃの概略的な部分斜視図に示されるように、切替え（変更）可能な表面層２１を有する光導体（Lichtleite：ライトガイド、光導波路）２２を含んでいる。光導体２２は、例えばガラス製の中実な（kompakt：コンパクトな）ファイバである。光導体２２の直径は、例えば２００μｍである。
【００３９】
表面層２１は、例えばＰＮＩＰＡＡｍが結合された光応答性アルギン酸塩を含むものであり、光導体２２の表面上に配置される。表面層２１の厚さは、例えば０．０１μｍである。表面層２１は、生体細胞１が付着形態で表面層２１に結合される付着状態（図１Ｂおよび１Ｃ参照）と、生体細胞１が表面層２１から分離（剥離）され得る解放（剥離、脱着）状態（図３Ｂ参照）との間で切替え可能である。
【００４０】
図２は、本発明によるバイオリアクタ１００の第１の実施形態の他の詳細を示している。容器１０の各軸方向端部において、複数の支持フィラメント２０は、容器壁から共通の束２３として（中から）出ている（現れる）。切替え光源装置３０は、２つの光源３１、例えば、支持フィラメント２０の各自由端部に照射するよう適合化された２つのレーザ光源、を含んでいる。その照射は、各光源３１を作動させることによってまたは各シャッタ（図示せず）によって切替え可能であって、支持フィラメント２０を照射状態と非照射状態の間で変化させることができるようになっている。表面層２１（図１Ｂを参照）は、非照射状態では支持フィラメント２０の付着状態が設定され、照射状態では支持フィラメント２０の解放状態が設定されるように、設計される。
【００４１】
図２は、さらに、流体系（システム）への永続的または一時的な接続のために配置されかつ容器１０への液体媒体の供給および容器１０からの液体媒体の排出を可能にする２つの流体コネクタ１１を示している。流体コネクタ１１は、例えば、図５を参照して以下説明するように、ポンプおよび媒体貯留槽（レザーバ）に接続されている。流体コネクタ１１は、培地を収容するために容器１０の内部に直接接続され、それによって、培養期間中の、特に増殖期間中の、培地の自動交換、が可能になり、懸濁液（サスペンション）中の細胞の接種（Inokulation：移植）／除去（Entnahme）も可能になる。さらに、容器１０は２つのセンサ・コネクタ１２を備えている。温度センサ、グルコース・センサ、乳酸塩センサおよび／または光センサ、特にカメラ、が、例えばセンサ・コネクタ１２に配置される。
【００４２】
図３は、細胞処理のための方法、特に、付着状態（図３Ａ）から解放状態（図３Ｂ）へ支持フィラメント２０を切り替えるための方法、の詳細を概略的に示している。細胞１の付着（接着）および増殖は、容器１０の内部で伸びる複数の支持フィラメント２０上で生じる。複数の支持フィラメント２０は、各端部で束ねられて、コンパクトな（集密な）光導体束として容器１０（図２を参照）を出る。支持フィラメント２０のコアは、光導体２２の光導材料である。それを通して導かれる光は、特定の波長で光導体２２全体にわたって拡散的に放出される。放出された光は、光導体２２上に位置する表面層２１を励起し、化学的または物理的に特性を切り替える。例えば、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）のポリマーは、波長３６６または４５０ｎｍの光によって、ＲＧＤペプチドが結合された（ankonjugiert：共役結合された）ＡＰＡＢＡリンカー（４−［（４−アミノフェニル）アゾ］ベンゾカルボニル）を介して、接着性（付着性）から非接着性（非付着性）へと（またはその逆に）切り替えることができる。光切替え可能なカルシウムスカベンジャー（捕捉剤、掃去剤、脱助剤、脱酸素剤）（ジアゾ−２）がイオンチャネル型ヒドロゲルに導入された場合、そのヒドロゲルからの架橋が、光の照射によって結合される（gebunden：抑制される）可能性があり、従ってそのヒドロゲルを分解し（degradiert：劣化させ）得る。この場合、そのような層上の接着性細胞は、培養表面から分離し、浮遊細胞として、培地が充填された容器の内部へと通過し、そこ（内部）からその接続された流体系を介してバイオリアクタの外部へ輸送することができる。
【００４３】
光導体２２は、付着状態では照射されない（支持フィラメントの非照射、図２参照）。生体細胞１は、付着状態で表面層２１に付着結合する。この状態で、生体細胞１は、例えば、支持フィラメント２０上での細胞培養物の増殖のためにおよび／または細胞１の分化のために、培地２で培養される（図１Ａ参照）。所定の培養結果が達成された場合に、光導体２２は、光源３１が照射される（図２参照）。表面層２１は、細胞１が表面層２１から分離（剥離）するように、解放状態に切り替えられる。その分離は、その複数の支持フィラメントの周囲における培地の動き（Bewegung：流動）によって促進することができる。
【００４４】
図４は、本発明によるバイオリアクタ１００の第２の実施形態を概略的に示している。この実施形態では、複数の支持フィラメント２０は、円筒状容器１０の軸方向に伸びる中空ファイバ２５を含んでいる。中空ファイバ２５は、ポンプおよび温度制御媒体貯留槽（レザーバ）（図示せず）に接続される。中空ファイバ２５の温度は、中空ファイバ２５の中を通って流れる温度制御媒体によって調整することができる。例えば、より低い温度での付着状態と、より高い温度での解放状態との間（またはその逆）で切替えを形成することができる。
【００４５】
図４によるバイオリアクタ１００は、図１を参照して上述したように寸法を決定することができる。例えば、内径５００μｍを有する５０００本の中空ファイバ２５と、厚さ（Dicke：太さ）０．０５μｍを有するＰＮＩＰＡＡｍで形成された表面層とが設けられる。
【００４６】
図５は、例えば本発明の第１または第２の実施形態による、バイオリアクタ１００の概略図を示しており、バイオリアクタ１００は、複数の支持フィラメント（図示せず）が内部に配置された容器１０、切替え光源装置３０または温度制御装置４０、および制御装置５０を有する。図示の例では、容器１０は４つの流体コネクタ１１を備えており、これら（コネクタ）は、第１のポンプ（１３）および培地貯留槽１４を含む第１の流体系と、第２のポンプ１５およびフラッシュ媒体貯留槽１６を含む第２の流体系とに結合される。制御装置５０は、構成要素３０、４０、およびポンプ１３、１５に、およびセンサ・コネクタ１２における各センサにも接続される。さらに、流体系は、容器１０に選択的に結合されるようにするために、遮断（ブロック）要素、例えば切替え可能な弁（バルブ）、を備えることができる。また、遮断要素は制御装置５０で制御することができる。代替的に、培地を含む容器から細胞が洗い流（フラッシュ）される場合、１つの流体系だけを設けることができる。
【００４７】
例えばコンピュータ回路によって形成される制御装置５０を設けることによって、バイオリアクタ１００の動作を自動化する可能性が得られるという利点がある。制御ループを形成することができ、その際、細胞の培養状態が、センサ・コネクタ１２における各センサからの各信号に応じて（の関数として）、または所定の培養プロトコルに応じて（の関数として）検出される。培養状態に応じて、ポンプ１３を制御して培地を供給することができ、または支持フィラメントの付着状態から解放状態への切替えをトリガーする（始動する、作動させる）ことができる。さらに、解放状態では、制御装置５０を使用して、培養細胞を容器１０から洗い流すよう、およびその分離した細胞をフラッシュ媒体貯留槽１６内に収集するよう、および別の細胞処理のためにその細胞を排出するように、ポンプ１５を制御することができる （矢印参照）。
【００４８】
本発明は、上述の好ましい実施形態に限定されない。むしろ、複数の変形例および変更が可能であり、それらは本発明の概念の一部をも形成し、従って保護の範囲内にある。また、本発明は、特に、それぞれの請求項で引用される請求項に関係なく、従属請求項の構成および特徴およびその組合せに対する保護を求めるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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