【手続補正書】
【提出日】平成21年10月22日(2009.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
請求項３に記載のヒト化抗体断片であって、ここで前記ペプチド配列が、配列［（ＧＧＧＳ）２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）］を含む、ヒト化抗体断片。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
最初の実施態様において、本発明は、癌細胞の表面のＰＳＣＡに特異的に結合する、ヒト化抗体断片を提供する。本発明の抗体断片の例は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマー（二重特異性抗体）、ｓｃ−Ｆｖ−ＣＨ３ダイマー（ミニボディ）、およびｓｃＦｖ−Ｆｃを含み、ここでその抗体断片は、図１に示すような、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）領域の配列を含む。この実施態様の局面において、ｓｃＦｖダイマーは、リンカーによって連結した２つのｓｃＦｖモノマーを含み得る。適当なリンカーは、ペプチド配列を含み、そのうち、配列［（ＧＧＧＳ）２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）］は、都合のよい例である。この実施態様の他の局面において、その抗体断片は、ＫＤ＝２．０ｎＭまたはそれより低い、またはＫＤ＝５．５ｎＭまたはそれより低い親和性を有する。本発明の実施に都合のよい抗体断片は、ｓｃＦｖダイマー（二重特異性抗体）およびｓｃ−Ｆｖ−ＣＨ３ダイマー（ミニボディ）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
我々は最初、ヒト化過程が、できた抗体のＰＳＣＡへの結合親和性を４倍減少させることを見出した。タンパク質モデリングによって、結合親和性の潜在的な増加に関して試験するために、６つのフレームワーク変異が特異的に選択された。この仕事の結果として、親の、そして親和性が発達した、両方とも８アミノ酸のリンカーペプチド［（ＧＧＧＳ）２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）］を有する、２つの別々の二重特異性抗体が産生された。見かけの親和性が、Ｂｉａｃｏｒｅによって、それぞれＫＤ＝５．４１ｎＭおよび１．８９ｎＭと決定された。サイズ排除クロマトグラフィーは、均一なダイマーが、親の二重特異性抗体には好都合であるが、親和性が発達したものにはそうでないことを明らかにした。それに加えて、均一なダイマー調製物を得るために、異なるリンカーの長さ（５対８アミノ酸）および保存条件を調査した。インビトロにおけるＰＳＣＡ結合を、ＰＳＣＡ陽性前立腺癌細胞系統を用いた免疫蛍光によって示した。二重特異性抗体を放射ヨウ素標識して、親および親和性が発達した二重特異性抗体に関して、それぞれ１７％および２２％の免疫反応性を保持した。１２４Ｉ標識二重特異性抗体を用いたマイクロＰＥＴ研究は、ＬＡＰＣ−９異種移植ＳＣＩＤマウスにおけるＰＳＣＡ陽性腫瘍への有効な局在化を示した。１２４Ｉ標識二重特異性抗体による体内分布研究は、１．２２％ＩＤ／ｇの腫瘍取り込みを示した。そのようなタンパク質工学方法によって、我々は、２Ｂ３二重特異性抗体の結合親和性およびコンフォメーションのようなパラメーターを最適化した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
いくつかの実施態様において、その抗体は１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、２本鎖抗体において見出されるものと同様の抗原結合部位を作るようフォールディングされた１本鎖を含む。一旦フォールディングされると、非共有結合相互作用が、１本鎖抗体を安定化する。いくつかの抗体実施態様のＶＨおよびＶＬ領域を直接結合し得るが、当業者は、１つまたはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによってその領域を分離し得ることを認識する。ペプチドリンカーおよびその使用は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：５８７９（１９８８）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３６（１９８８）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１３６２（１９９０）；米国特許第４，９４６，７７８号；米国特許第５，１３２，４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２５６−２６５（１９９３）を参照のこと。一般的に、ペプチドリンカーは、領域を結合する、またはＶＨおよびＶＬ間のいくらかの最低限の距離または他の空間的関係を保存する以外の、特定の生物学的活性は有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸を、フォールディング、全体の荷電、または疎水性のような、分子のいくらかの性質に影響を与えるように選択し得る。１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、任意で長さが５０アミノ酸より小さい、一般的には４０アミノ酸より小さい、好ましくは３０アミノ酸より小さい、そしてより好ましくは２０アミノ酸より小さいペプチドリンカーを含む。いくつかの実施態様において、そのペプチドリンカーは、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）（ＧＧＧＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のコンカテマー、好ましくは２、３、４、５、または６つのそのような配列である。しかし、リンカー内のいくつかのアミノ酸置換をし得ることが認識される。例えば、バリンがグリシンを置換し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
【図１−１】図１は、ヒト化抗ＰＳＣＡミニボディのＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および翻訳されたタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。以下のタンパク質部分の始まりも示される：シグナルペプチド（哺乳類の分泌のため）、ヒト化２Ｂ３抗ＰＳＣＡ抗体からの軽鎖可変領域（ＶＬ）、１８アミノ酸のドメイン間リンカーペプチド、ヒト化２Ｂ３からの重鎖可変領域（ＶＨ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列および１０アミノ酸の延長、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインに続く２つの停止コドン。
【図１−２】図１は、ヒト化抗ＰＳＣＡミニボディのＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および翻訳されたタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。以下のタンパク質部分の始まりも示される：シグナルペプチド（哺乳類の分泌のため）、ヒト化２Ｂ３抗ＰＳＣＡ抗体からの軽鎖可変領域（ＶＬ）、１８アミノ酸のドメイン間リンカーペプチド、ヒト化２Ｂ３からの重鎖可変領域（ＶＨ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列および１０アミノ酸の延長、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインに続く２つの停止コドン。
【図１−３】図１は、ヒト化抗ＰＳＣＡミニボディのＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および翻訳されたタンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。以下のタンパク質部分の始まりも示される：シグナルペプチド（哺乳類の分泌のため）、ヒト化２Ｂ３抗ＰＳＣＡ抗体からの軽鎖可変領域（ＶＬ）、１８アミノ酸のドメイン間リンカーペプチド、ヒト化２Ｂ３からの重鎖可変領域（ＶＨ）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列および１０アミノ酸の延長、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３ドメインに続く２つの停止コドン。
【図２】図２は、非還元（１）および還元（２）条件下での、抗ＰＳＣＡミニボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、９５ｋＤａの共有結合ダイマーおよび４７ｋＤａのモノマーサブユニットを示す。
【図３】図３は、抗ＰＳＣＡミニボディのサイズ排除ＨＰＬＣを示し、予測される分子サイズにおける均一なピークを示す。
【図４ａ】図４は、抗ＰＳＣＡミニボディのフローサイトメトリー結合研究を示す。パネル１、抗原陰性Ｂ細胞系統；パネル２、ＰＳＣＡを発現するよう安定にトランスフェクトしたＢ細胞系統、パネル３、ＰＳＣＡ発現ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞。
【図４ｂ】図４は、抗ＰＳＣＡミニボディのフローサイトメトリー結合研究を示す。パネル１、抗原陰性Ｂ細胞系統；パネル２、ＰＳＣＡを発現するよう安定にトランスフェクトしたＢ細胞系統、パネル３、ＰＳＣＡ発現ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞。
【図４ｃ】図４は、抗ＰＳＣＡミニボディのフローサイトメトリー結合研究を示す。パネル１、抗原陰性Ｂ細胞系統；パネル２、ＰＳＣＡを発現するよう安定にトランスフェクトしたＢ細胞系統、パネル３、ＰＳＣＡ発現ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞。
【図５】図５は、免疫蛍光顕微鏡による、抗原陽性細胞に対する抗ＰＳＣＡミニボディの結合を示す。
【図６】図６は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡを注射した。
【図７ａ】図７（ａ）は、本発明の抗体断片の概略図表示を提供する。図７（ｂ）は、時間につれた（ａ）の抗体断片の相対的な腫瘍取り込みおよび血液活性を示す。
【図７ｂ】図７（ａ）は、本発明の抗体断片の概略図表示を提供する。図７（ｂ）は、時間につれた（ａ）の抗体断片の相対的な腫瘍取り込みおよび血液活性を示す。
【図８−１】図８（シート１のパネル）は、本発明のヒト化ＰＳＣＡ二重特異性抗体の概略図表示、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける〜２５ｋＤａタンパク質としての二重特異性抗体の移動を示す。シート２のパネルは、ＦＡＣＳによる、ＰＳＣＡ陽性細胞への二重特異性抗体の結合を示す。
【図８−２】図８（シート１のパネル）は、本発明のヒト化ＰＳＣＡ二重特異性抗体の概略図表示、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける〜２５ｋＤａタンパク質としての二重特異性抗体の移動を示す。シート２のパネルは、ＦＡＣＳによる、ＰＳＣＡ陽性細胞への二重特異性抗体の結合を示す。
【図９−１】図９（シート１のパネル）は、本発明のＰＳＣＡミニボディの概略図表示、および還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるミニボディの移動を示す。免疫蛍光顕微鏡による、抗原陽性細胞への抗ＰＳＣＡミニボディの結合も示す。シート２のパネルは、ＦＡＣＳによる、ＰＳＣＡ陽性細胞へのミニボディの結合、およびミニボディを用いた競合的ＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図９−２】図９（シート１のパネル）は、本発明のＰＳＣＡミニボディの概略図表示、および還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるミニボディの移動を示す。免疫蛍光顕微鏡による、抗原陽性細胞への抗ＰＳＣＡミニボディの結合も示す。シート２のパネルは、ＦＡＣＳによる、ＰＳＣＡ陽性細胞へのミニボディの結合、およびミニボディを用いた競合的ＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図１０】図１０は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡ二重特異性抗体を注射した（左のパネル）、またはＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡミニボディを注射した（右のパネル）。
【図１１−１】図１１（シート１のパネル）は、本発明の抗体断片の概略図表示を提供する。図１１（シート２のパネル）は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡ二重特異性抗体を注射した。
【図１１−２】図１１（シート１のパネル）は、本発明の抗体断片の概略図表示を提供する。図１１（シート２のパネル）は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡ二重特異性抗体を注射した。
【図１２−１】図１２（シート１のパネル）は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡミニボディを注射した。シート２のパネルは、異なるマウス体組織における、ミニボディおよび不活性化ミニボディの２１時間体内分布を示す表である。
【図１２−２】図１２（シート１のパネル）は、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。マウスにＩ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡミニボディを注射した。シート２のパネルは、異なるマウス体組織における、ミニボディおよび不活性化ミニボディの２１時間体内分布を示す表である。
【図１３−１】図１３（シート１のパネル）は、Ｉ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡ野生型ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を注射した後の、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。シート２のパネルは、Ｉ−１２４放射性標識二重変異体抗ＰＳＣＡｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を注射した後の、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。
【図１３−２】図１３（シート１のパネル）は、Ｉ−１２４放射性標識抗ＰＳＣＡ野生型ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を注射した後の、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。シート２のパネルは、Ｉ−１２４放射性標識二重変異体抗ＰＳＣＡｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を注射した後の、ＬＡＰＣ−９（ＰＳＣＡ陽性ヒト前立腺癌）およびＰＣ−３（ＰＳＣＡ陰性前立腺癌）異種移植片を有するヌードマウスの、同時記録マイクロＰＥＴ／マイクロＣＴスキャンを示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009531324000001.app