【手続補正書】
【提出日】平成21年11月30日(2009.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物であって、組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位領域を含み、改変活性部位領域が改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である１種以上の構造改変を野生型活性部位領域に対して含み、ヌクレオチドアナログに対する組換えＤＮＡポリメラーゼの特性が野生型ポリメラーゼに比較して改変されている前記組成物。
【請求項２】
組換えＤＮＡポリメラーゼがΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ又はＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼのクレノウフラグメントに対応するポリメラーゼに相同であるか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼがΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、又はＬ１７からのポリメラーゼに相同であるか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼがその活性部位内又はその近位に野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対して残基５０５−５２５の欠失、残基５０５−５２５内の欠失、Ｋ１３５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｈ突然変異、Ｅ３７５Ｓ突然変異、Ｅ３７５Ｋ突然変異、Ｅ３７５Ｒ突然変異、Ｅ３７５Ａ突然変異、Ｅ３７５Ｑ突然変異、Ｅ３７５Ｗ突然変異、Ｅ３７５Ｙ突然変異、Ｅ３７５Ｆ突然変異、Ｅ４８６Ａ突然変異、Ｅ４８６Ｄ突然変異、Ｋ５１２Ａ突然変異及びその組み合わせから選択される構造改変を含むか、又は
ポリメラーゼがΦ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、構造改変がエキソヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸欠失又は改変であり、場合により改変が野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対するＮ６２の突然変異に対応する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組換えＤＮＡポリメラーゼが更にＬ３８４Ｒ突然変異を含むか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型ポリメラーゼに対して組換えポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低下させる構造改変を含むか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼが表８から選択される突然変異又は突然変異組み合わせを含むか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼが１個以上の外来アフィニティータグ配列を含み、アフィニティータグ配列が６Ｈｉｓタグ配列、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ配列、複数の６Ｈｉｓタグ配列、複数のＧＳＴタグ、複数のＨＡタグ配列及びその組み合わせから適宜選択されるか、又は
組換えＤＮＡポリメラーゼが表３から選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ヌクレオチドアナログを含有する請求項１に記載の組成物であって、
ヌクレオチドアナログがフルオロフォア又は色素部分を含むか、又は
ヌクレオチドアナログがリン酸標識ヌクレオチドアナログであり、随意に３〜６個のリン酸基をもち、場合によりリン酸基の少なくとも１つが標識を含み、場合により構造改変がヌクレオチドアナログのリン酸残基と結合する正電荷アミノ酸残基の付加を含むか、又は
ヌクレオチドアナログがモノデオキシ又はジデオキシヌクレオチドアナログである組成物。
【請求項５】
改変特性がＫｍ、ヌクレオチドアナログに対するＫｍの低下、ｋｃａｔ、ヌクレオチドアナログに対するｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍの増加、Ｖｍａｘ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼプロセッシビティ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼによる平均鋳型読み取り長、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼの特異性、ヌクレオチドアナログの結合速度、産物放出速度、及び分岐速度から選択されるか、又は
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼの比活性が野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高く、鋳型の存在下におけるプロセッシビティが天然ヌクレオチドの存在下における野生型ポリメラーゼよりも少なくとも５％高いか、又は
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高いか、又は
天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ又はＶｍａｘ／Ｋｍが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約２５％高い請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヌクレオチドアナログとＤＮＡ鋳型を含有しており、組換えポリメラーゼが鋳型ＤＮＡに応答してヌクレオチドアナログをコピー核酸に組込む請求項１に記載の組成物であって、場合により鋳型が環状鋳型であり、場合により前記組成物がゼロモード導波管を適宜備えたＤＮＡシーケンシングシステムに存在している請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、前記組換えＤＮＡポリメラーゼは野生型ＤＮＡポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位を含み、改変活性部位は改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの１種以上の非天然特徴に相補的である１種以上の構造改変を野生型活性部位に対して含む）と；
組換えポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。
【請求項８】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼのＫｍ値はヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼのＫｍよりも小さい）と；
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させることにより、得られるＤＮＡに少なくとも１個のヌクレオチドアナログ残基を組込む段階を含む前記方法。
【請求項９】
ＤＮＡの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む１個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階（なお、前記ポリメラーゼはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、Ａ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＫｍはＡ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ又は両者に対するＧＳＴ−Ｎ６２Ｄ  Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体のＫｍの約７５％未満である）と；
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。
【請求項１０】
鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する段階と；
状態間の複数の速度遷移速度を定義する段階と；
所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて、可能な状態遷移の多次元確率行列を作成する段階と；
コンピューター読み取り可能な媒体に多次元確率行列を保存する段階を含むコンピューター実施方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対してＥ３７５Ｙ突然変異及びＫ５１２Ｙ突然変異を含み、場合により組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに対するＤ１２Ａ又はＮ６２Ｄ突然変異を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
組換えＤＮＡポリメラーゼが野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同であり、ヌクレオチドアナログが該アナログのδ−リン酸に標識された四リン酸塩標識アナログである請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに相同な組換えポリメラーゼを含む組成物であって、組換えポリメラーゼがその活性部位に１種以上の突然変異を含み、突然変異が野生型Φ２９ＤＮＡポリメラーゼに比較して活性部位への四リン酸塩アナログ導入の立体妨害を軽減する前記組成物。
【請求項１４】
組換えポリメラーゼがＥ３７５若しくはＫ５１２突然変異又はＥ３７５Ｙ若しくはＫ５１２Ｙ突然変異を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
四リン酸塩アナログが該アナログのδ−リン酸に標識されるか、又は四リン酸塩アナログがＡ４８８ｄＣ４Ｐ、Ａ５６８ｄＣ４Ｐ、Ａ６３３ｄＣ４Ｐ、Ａ５４６ｄＧ４Ｐ若しくはＡ５９４ｄＴ４Ｐである請求項１３に記載の組成物。