(57)【要約】  キチナーゼを産生するためのストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１８２６３を提供する。本株は、麻エビの発酵に用いられ、キチナーゼの酵素活性は最高で５７．３Ｕ／Ｌであり、キトオリゴ糖含有量は０．５８ｍｏｌ／Ｌである。本株は、キトオリゴ糖の製造に用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１と名付けられ、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１８２６３であることを特徴とする、キチナーゼ産生菌株。
【請求項２】
前記菌株ＣＳ１８０１の培養条件が、温度３０℃、ｐＨ６．５〜７であることを特徴とする、請求項１に記載のキチナーゼ産生菌株。
【請求項３】
キトオリゴ糖の発酵生産における、請求項１に記載の菌株の使用。
【請求項４】
発酵培地が以下の通りであり、使用前にＡ液とＢ液とを等体積に混合させることを特徴とする、請求項３に記載の使用：
Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ６．５；
Ｂ液：１０ｇ／Ｌコロイド状キチン、ｐＨ６．５；
【請求項５】
前記コロイド状キチンは、１０ｇの粉末キチンを量り取り、２００ｍＬの濃塩酸をゆっくりと加え、すばやく攪拌して、全てが溶解した後、グラスウールでろ過して不純物を除去し、１０００ｍＬの蒸留水を溶液に加え、遠心分離して沈殿物を得て、中性になるまで蒸留水で洗浄することにより調製されることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
発酵培地が以下の通りであり、Ａ液とＢ液とを等体積で混合することを特徴とする、請求項３に記載の使用：
Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６  ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ６．５；
Ｂ液：１００ｇ／Ｌ麻エビ粉末、ｐＨ６．５。
【請求項７】
前記麻エビ粉末は、冷凍麻エビを流水で解凍し、乾燥及び粉末化して、100メッシュの篩にかけることにより調製される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
発酵培地は以下の通りあることを特徴とする、請求項３に記載の使用：
３００ｇ／Ｌの湿った麻エビ、ｐＨ６．５；前記湿った麻エビは、冷凍麻エビを流水で解凍することによって得られる。
【請求項９】
以下の手順が含まれることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法：
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）で培養された菌株を発酵培地に入れ、３０〜３７℃で５〜７日間振とう、発酵させ、発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取する。
【請求項１０】
前記手順（２）の発酵培養温度が３０℃であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一株により生産されるキチナーゼ産生菌株及び麻エビの発酵により生産されるキトオリゴ糖における使用に関し、産業微生物の分野における技術に属する。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、β−１，４グリコシド結合で結合されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン高分子重合体で、自然界で広く見られ、その埋蔵量はセルロースに次ぐ２番目である。キチンの水不溶性は、適用範囲を大きく制限するが、キチナーゼの作用により、水溶性のキトオリゴ糖（ＣＯＳ）に分解することができる。その分解生成物は、抗菌、抗酸化、動植物の成長及び発達の促進等、多くの機能を持っている。多くの研究により、キトサン及びキトオリゴ糖には重要な抗神経炎症作用と抗酸化作用があり、将来、アルツハイマー病の治療に広く使用される可能性があることが分かっている。また、キトオリゴ糖には重要な抗腫瘍活性もあり、食品、農業、医学で幅広い応用の見通しがある。
【０００３】
キチナーゼを産生する生物は主に微生物に由来し、主にバチルス、ストレプトマイセス、セラチアマルセセンス、シュードモナス等が含まれる。研究者は、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、スクリーニングソースの変更等の様々な方法を使用して、高収量又は耐寒性、耐熱性、酸及びアルカリ耐性等の特殊な性質を持つキチナーゼを取得する。海で採取された麻エビを塩で１ヶ月ほど自然発酵させた麻エビペーストは、タンパク質とキチンが豊富で、中国や東南アジアでよく見られる調味料である。麻エビペーストの微生物の多様性と組成は非常に複雑で、キチナーゼ産生株のスクリーニングに適している。また、麻エビはキチンが豊富で価格が安いなので、キチンの分解生成物の基質として適し、産業応用の見通しが非常に強く、現在、麻エビペーストからキチナーゼ産生株のスクリーニングを行い、麻エビを使用してキトオリゴ糖を生産することについての報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の第１の目的は、単一株により生産されるキチナーゼ産生菌株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記の技術的目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を採用する：
【０００６】
単一株により生産されるキチナーゼ産生菌株は、その分類がストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１と名付けられ、中国典型培養物保存センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。住所：中国武漢市武漢大学、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１８２６３、寄託日付：２０１８年５月１０日。
【０００７】
前記菌株は、自然発酵された麻エビペーストから分離され、取得される。
【０００８】
本発明のストレプトマイセスＣＳ１８０１の物理的及び化学的性質は以下の通りである：
【０００９】
形態学：スクリーニング培地で５〜７日間成長させると、明らかなコロニーが形成され、コロニーは丸く、乾燥、荒く、凸状、粉末状で、拾いやすく、色素がなく、土壌のカビ臭が穏やかである。ＰＤＡで明らかなコロニーも形成できるが、コロニーは丸く、乾燥、荒く、凸状、粉末状で、拾い難しく、濃い緑色の色素が現れ、土壌のカビ臭が強い。グラム陽性菌は、電子顕微鏡で観察すると、胞子鎖はまっすぐ又は柔らかいカーブで、枝があり、胞子は卵形で表面は滑らかである。
【００１０】
培養特性：最適成長温度が約３０℃で、好気性であり、最適成長ｐＨは６．５〜７である。
【００１１】
本発明の他の目的は、麻エビの発酵によるキトオリゴ糖の生産における上記の菌株の使用を提供することである。
【００１２】
更に、本発明は、キトオリゴ糖を生産するために使用できるいくつかの発酵培地を提供し、例えば、コロイド状キチンを発酵基質として使用すると、発酵培地の成分は次のようになり、使用前にＡ液とＢ液とを等体積に混合させる：
Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ６．５；
Ｂ液：１０ｇ／Ｌコロイド状キチン、ｐＨ６．５；
【００１３】
ここで、コロイド状キチンの調製方法としては、１０ｇの粉末キチンを量り取り、２００ｍＬの濃塩酸をゆっくりと加え、すばやく攪拌し、全てが溶解したらグラスウールでろ過して不純物を除去し、１０００ｍＬの蒸留水を溶液に加え、遠心分離して沈殿物を得て、中性になるまで蒸留水で洗浄することが挙げられる。
【００１４】
あるいは、麻エビ粉末を発酵基質として使用すると、発酵培地の成分は次のようになり、Ａ液とＢ液とを等体積に混合させる：
Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６  ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ６．５；
Ｂ液：１００ｇ／Ｌ麻エビ粉末、ｐＨ６．５。
【００１５】
ここで、前記麻エビ粉末の調製方法は、冷凍麻エビを流水で解凍し、乾燥及び粉末化して、１００メッシュの篩にかける。
【００１６】
あるいは、湿った麻エビを発酵基質として使用すると、発酵培地の成分は次のようになる：
３００ｇ／Ｌの湿った麻エビ、ｐＨ６．５。
【００１７】
ここで、前記湿った麻エビは、冷凍麻エビを流水で解凍することによって得られる。
【００１８】
発酵菌株によってキトオリゴ糖を生産するための手順は、次の通りである：
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）で培養された菌株を発酵培地に入れ、３０〜３７℃で５〜７日間振とう、発酵させ、発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取する。
【００１９】
更に、前記手順（２）の発酵培養は３０℃で行われている。
【００２０】
本発明の菌株を出発菌株とすると、麻エビからのキトオリゴ糖の生産を生体触媒することができる。この菌株は、伝統的な自然発酵食品に由来し、食品業界での幅広い応用の見通しがある。この菌株は、ＰＤＡ固体培地でよく成長し、培養及び保存が容易で、麻エビを発酵させて得られるキチナーゼ活性は５７．３Ｕ／Ｌに達し、キトオリゴ糖の含有量は０．５８ｍｏｌ／Ｌとなっている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１の電子顕微鏡観察図である。
【図２】はグラム染色後のストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１の顕微形態である。
【図３】ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１の進化系統樹である。
【図４】ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１の発酵ブロスの高速液体クロマトグラムであり、４−Ａは標準品の液体クロマトグラムで、４−Ｂは発酵ブロスの液体クロマトグラムである。
【図５】ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１の発酵ブロスの質量スペクトルであり、５−Ａは標準品の質量スペクトルで、５−Ｂは発酵ブロスの質量スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に関わる生物材料は、その分類がストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１と名付けられ、中国典型培養物保存センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、「ＣＣＴＣＣ」と略称する）に寄託されている。住所：中国武漢市武漢大学、寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１８２６３、寄託日付：２０１８年５月１０日。
【実施例】
【００２３】
実施例１
本実施例は、ストレプトマイセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１のスクリーニング、精製、及び同定方法について説明する。
【００２４】
スクリーニングサンプルは、連雲港市海娃食品有限公司の麻エビペーストで、２５ｇのエビペーストと２２５ｍＬの生理食塩水を量り、細菌懸濁液を調製すると共に、その濃度をそれぞれ１０−１、１０−２、１０−３、及び１０−４倍に希釈する。細菌懸濁液原液、１０−１倍希釈菌液、１０−２倍希釈菌液、１０−３倍希釈菌液、及び１０−４倍希釈菌液を一次スクリーニング培地に塗布し、３７℃で１〜７日間成長させた後、よく成長した単一のコロニーを拾い出し、一次スクリーニング培地でストリークして分離する。一次スクリーニング培地上で生産された、その周囲に明らかに透明な円がある単一のコロニーを拾い出し、それを液体培地に接種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎのシェーカーで１〜７日間培養する。
【００２５】
一次スクリーニング培地としては、Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、寒天４０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ  ６．５。Ｂ液：１０ｇ／Ｌコロイド状キチン、ｐＨ  ６．５であり、使用前に等体積に混合させる。
【００２６】
二次スクリーニング培地としては、Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ  ６．５。Ｂ液：１０ｇ／Ｌコロイド状キチン、ｐＨ  ６．５であり、使用前に等体積に混合させる。
【００２７】
ＰＤＡ固体培地にピースを挿入し、７日間培養した後、カバーガラスシートを適切なサイズにカットし、金を直接スプレーしてスキャンし、電子顕微鏡で観察すると、胞子鎖はまっすぐ又は柔らかいカーブで、枝があり、胞子は卵形で、表面は滑らかである（図１）。
【００２８】
一次スクリーニング培地プレートからリングバクテリアを１つ拾い出し、ガラススライド上の水滴と混ぜて加熱する。クリスタルバイオレットによる最初の染色、ヨウ素溶液による酵素染色、エタノールによる脱色、及びサフラニンによる対比染色の後、顕微鏡で確認したところ、この細菌はグラム陽性菌である（図２）。
【００２９】
上記菌株の１６ＳｒＤＮＡ部分の配列決定及びＢＬＡＳＴを比較後、ＭＥＧＡ  ５．１でＮ−Ｊ進化系統樹を構築して分析すると、その１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示され、進化系統樹は図３に示されているので、ストレプトマイセス属と同定されている。微生物寄託プログラムの同定と寄託後、その分類はストレプトミセス  ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＣＳ１８０１と名付けられ、その寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１８２６３となっている。
【００３０】
実施例２
本実施例は、キトオリゴ糖を生成するためのコロイド状キチンの発酵における菌株ＣＳ１８０１の使用を具体的に説明する。
【００３１】
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）に培養された菌株を発酵培地に入れ、３０℃で７日間振とう培養する。発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取し、キチナーゼ活性は１１７．４  Ｕ／Ｌで、キトオリゴ糖の含有量は１．１８  ｍｏｌ／Ｌであることを測定している。
【００３２】
発酵培地の組成は、前記二次スクリーニング培地と同じである。
【００３３】
キチナーゼ活性の測定方法としては、発酵ブロスを３０００ｒで１０分間遠心分離し、上清をテストするサンプルとする。テストするサンプルと西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体を、キチナーゼ抗体でプレコートされたコーティングマイクロウェルに順次加え、３７℃で１時間インキュベートし、十分に洗浄する。色は、基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で発色され、ＨＲＰの触媒作用により青色に、酸の作用により最終的な黄色に変換される。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの波長でＯＤ値を測定し、標準曲線からサンプル活性を計算する。標準品は、純粋なキチン酵素で調製した０、１．５、３、６、１２、２４  Ｕ／Ｌ酵素溶液である。酵素活性の定義としては、３７℃で、１ミリグラムあたりのタンパク質が１時間あたりにキチンを分解して１ｍｇのＮ−アセチルグルコサミンを生成する酵素量は、酵素活性の１単位Ｕである。キチナーゼＥＬＩＳＡテストキットは、武漢純度生物科技有限公司から購入されている。
【００３４】
実施例３
本実施例は、菌株ＣＳ１８０１がコロイド状キチンを使用して発酵し、キトオリゴ糖を生産する製品のタイプを具体的に説明する。
【００３５】
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）に培養された菌株を発酵培地に入れ、３０℃で７日間振とう培養する。発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取する。
【００３６】
発酵培地の組成は、前記二次スクリーニング培地と同じである。
【００３７】
高速液体クロマトグラフィー-質量分析タンデム（ＵＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ）のテクニカル分析を使用して発酵ブロスの成分を分析し、キチンがストレプトマイセスＣＳ１８０１の作用により、キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトサン、キトヘキサオースに分解されることが確認された。高速液体クロマトグラフィーは図４に、質量スペクトルは図５に示される。
【００３８】
実施例４
本実施例は、麻エビ粉末を発酵させることによる、キトオリゴ糖の生産における菌株ＣＳ１８０１の使用を具体的に説明する。
【００３９】
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）に培養された菌株を発酵培地に入れ、３５℃で５日間振とう発酵させる。発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取してキチナーゼ活性を測定したところ、その酵素活性は５７．３Ｕ／Ｌ、キトオリゴ糖の含有量は０．５８ｍｏｌ／Ｌであった。キチナーゼ活性の測定は、実施例２と同じである。
【００４０】
発酵培地は下記の通りである。
Ａ液：Ｋ２ＨＰＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、脱イオン水  １０００ｍＬ、ｐＨ  ６．５。Ｂ液：１００ｇ／Ｌ麻エビ粉末、ｐＨ  ６．５。等体積で混ぜる。
【００４１】
実施例５
本実施例は、湿った麻エビの発酵によるキトオリゴ糖の生産における、菌株ＣＳ１８０１の使用を具体的に説明する。
【００４２】
（１）菌株ＣＳ１８０１をＰＤＡ液体培地に接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する；
（２）手順（１）に培養された菌株を発酵培地に入れ、３７℃で７日間振とう発酵させる。発酵ブロスを遠心分離し、沈殿物を捨て、上清を採取してキチナーゼ活性を測定したところ、その酵素活性は５０．３Ｕ／Ｌ、キトオリゴ糖の含有量は０．４３ｍｏｌ／Ｌであった。キチナーゼ活性の測定は、実施例２と同じである。
【００４３】
発酵培地は、３００ｇ／Ｌ湿った麻エビ、ｐＨ  ６．５である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2022502075.tif 000007
【配列表】
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【国際調査報告】
2022502075.tif 000008
2022502075.tif 000009
2022502075.tif 000010
2022502075.tif 000011
2022502075.tif 000012
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