(57)【要約】  血液試料中の循環細胞を検出および特徴付ける方法およびデバイスが提供される。このような方法は、体液の試料を、カーボンナノチューブを備えるデバイス上に置くステップであって、カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；およびカーボンナノチューブに接着した標的細胞を検出するステップを含むことができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の標的細胞を捕捉する方法であって、
血液試料から赤血球を除去するステップ、
前記血液試料を、１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、前記カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；および
前記カーボンナノチューブに接着した標的細胞を検出するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記試料をカーボンナノチューブを備える前記デバイス上に置く前に、前記試料から血清を除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
赤血球を除去するステップが、赤血球を溶解することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
赤血球を除去するステップが、前記試料を遠心分離することを含む、請求項１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カーボンナノチューブを備える前記デバイスから非接着細胞または材料を除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デバイスから非接着細胞または材料を除去するステップが、前記デバイスを洗浄することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非接着細胞が、白血球を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記カーボンナノチューブに接着した細胞をカウントするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料に培養培地を添加するステップをさらに含み、前記培養培地が、前記標的細胞または循環腫瘍細胞に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カーボンナノチューブに接着した標的細胞を回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記回収された標的細胞を特徴付けるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
特徴付けるステップが、前記回収された標的細胞の遺伝子型解析、前記回収された標的細胞の表現型解析、またはその両方を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
表現型解析が、前記回収された標的細胞の上皮、間葉、および上皮間葉移行の状態を決定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記デバイスの表面が、ＳＵ８層を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記デバイスが、アレイの表面上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料を前記デバイス上に置く間に経過する時間を増加させることが、標的細胞の捕捉率を改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
血液１ミリリットルあたり１〜１５００個の標的細胞または循環腫瘍細胞が捕捉される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記非官能化カーボンナノチューブが、コラーゲンで被覆されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記カーボンナノチューブの密度が、１マイクロメートルあたりナノチューブ１〜５本である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌を有することが疑われるまたは癌と以前に診断された対象における循環腫瘍細胞を検出する方法であって、
前記対象に由来する血液試料から赤血球を除去するステップ；
前記対象に由来する試料を、１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、前記カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；および
前記カーボンナノチューブに接着した循環腫瘍細胞の存在または非存在を検出するステップであって、循環腫瘍細胞の存在が癌を示すステップ
を含む方法。
【請求項２１】
前記試料をカーボンナノチューブを備える前記デバイス上に置く前に、前記試料から血清を除去するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
赤血球を除去するステップが、赤血球を溶解することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
赤血球を除去するステップが、前記試料を遠心分離することを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
カーボンナノチューブを備える前記デバイスから非接着細胞または材料を除去するステップをさらに含み、前記非接着細胞が、白血球を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
カーボンナノチューブを備える前記デバイスから非接着細胞または材料を除去するステップが、前記デバイスを洗浄することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非接着細胞が、白血球を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記カーボンナノチューブに接着した細胞をカウントするステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料に培養培地を添加するステップをさらに含み、前記培養培地が、前記標的細胞または循環腫瘍細胞に基づいて選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記カーボンナノチューブに接着した標的細胞を回収するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記回収された標的細胞を特徴付けるステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
特徴付けるステップが、前記回収された標的細胞の遺伝子型解析、前記回収された標的細胞の表現型解析、またはその両方を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
表現型解析が、前記回収された標的細胞の上皮、間葉、および上皮間葉移行の状態を決定することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記非官能化カーボンナノチューブが、コラーゲンで被覆されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記デバイスの表面が、ＳＵ８層を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記デバイスが、アレイの表面上に配置される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料を前記デバイス上に置く間に経過する時間を増加させることが、標的細胞の捕捉率を改善する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
血液１ミリリットルあたり１〜１５００個の標的細胞または循環腫瘍細胞が捕捉される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記カーボンナノチューブの密度が、１マイクロメートルあたりナノチューブ１〜５本である、請求項３３〜３７に記載の方法。
【請求項３９】
試料中の標的細胞を捕捉する方法であって、
体液の試料から標的細胞の沈降速度よりも高い沈降速度を有する細胞を除去するステップ；
前記試料を１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、前記カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；および
前記カーボンナノチューブに接着した標的細胞の検出するステップ
を含む方法。
【請求項４０】
前記カーボンナノチューブに接着した細胞をカウントするステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料に培養培地を添加するステップをさらに含み、前記培養培地が、前記標的細胞または循環腫瘍細胞に基づいて選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
カーボンナノチューブを備える前記デバイスから非接着細胞または材料を除去するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
非接着細胞または材料を除去するステップが、前記デバイスを洗浄することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記カーボンナノチューブに接着した標的細胞を回収するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記回収された標的細胞を特徴付けるステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
特徴付けるステップが、前記回収された標的細胞の遺伝子型解析、前記回収された標的細胞の表現型解析、またはその両方を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
表現型解析が、前記回収された標的細胞の上皮、間葉、および上皮間葉移行の状態を決定することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記非官能化カーボンナノチューブが、コラーゲンで被覆されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記デバイスの表面が、ＳＵ８層を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記デバイスが、アレイの表面上に配置される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料を前記デバイス上に置く間に経過する時間を増加させることが、標的細胞の捕捉率を改善する、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
血液１ミリリットルあたり１〜１５００個の標的細胞または循環腫瘍細胞が捕捉される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記カーボンナノチューブの密度が、１マイクロメートルあたりナノチューブ１〜５本である、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、以下の米国仮特許出願：第６２／７３３，８４９号（２０１８年９月２０日出願）、および第６２／８２７，５７７号（２０１９年４月１日出願）の利益を主張し、それらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、概して、循環細胞の接着ベースの捕捉のための液滴生検チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
転移能を有する腫瘍の古典的な特徴は、可動性および浸潤性を含む。転移は、原発臓器由来の腫瘍細胞が脈管／リンパ管に放出され、遠隔部位に運ばれ、その状態がそれらの増殖を助長するときに起こる。このプロセスの間、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は形態、化学組成を変化させ、免疫系の防御を克服する能力、循環系に存在するせん断応力、および循環中の細胞外相互作用の欠如によるプログラム細胞死を獲得する。ＣＴＣは稀であり、１０9個の血液細胞あたりわずか１〜１０個の細胞を含み、固形腫瘍から血流中に放出されるＣＴＣは非常に不連続なプロセスである。したがって、高純度のＣＴＣの単離は依然として非常に重要な課題である。循環中の単一のＣＴＣに加えて、ＣＴＣはまた、微小触手を有するクラスターで観察され、複数の表現型を有し、これらのあまり理解されていないＣＴＣもまた転移性イニシエーターであると信じられている。このように、単一細胞レベルでのバイオマーカーの不均一性を有するＣＴＣの捕捉および研究は、作業中の複雑な生物学的プロセスに光を当て、癌転移の動的考察を可能にすることができる。また、早期癌の原発腫瘍細胞中に転移性表現型を有するＣＴＣのサブセットを同定することにより、より良好な結果をもたし得るカスタマイズされた治療介入（例えば、ＣＫ＋  ＣＴＣ群の中で少数のＥＧＦＲ＋  ＣＴＣ）をもたらす可能性があるため、潜在的に生命を救う可能性がある。
ＣＴＣ捕捉および計数のための技術は、免疫親和性（抗原依存性）に基づく捕捉、および細胞の物理的特性（抗原非依存性；例えば、サイズ、変形能、細胞表面電荷、および密度）に基づく捕捉に広く分類することができる。しかしながら、これらの技術の全てには多くの欠点と課題がある。
【０００３】
マイクロ流体工学は、ＣＴＣの単離のための活発な研究分野となっている。ポリマー流体、ＣＴＣ−チップ、Ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅチップ、ＣＴＣ−ｉＣｈｉｐ、Ｖｏｒｔｅｘ、Ａｃｃｕｃｙｔｅ、Ｆｌｕｘｉｏｎ、ＮａｎｏＶｅｌｃｒｏ、ＤＥＰ−アレイ、ＰａｒｓｏｔｒｉｘおよびＪＥＴＴＡなどのマイクロ流体技術は、ＣＴＣを捕捉することが実証されている流体デバイスである。しかしながら、これらの方法は、多大な時間を要し、労働集約的であり、連続的な製造プロセスであり、偽陽性または陰性の結果を可能にし、それにより、日常的な臨床診療へのそれらの適用性を厳しく制限する。
したがって、体液試料からＣＴＣを捕捉および単離するための方法およびシステムが必要である。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載されるように、本開示は、試料中の細胞を検出することを指向する方法および組成物を特徴とする。
一態様では、血液試料中の標的細胞を捕捉する方法であって、試料から赤血球を除去するステップ、試料を、１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；およびカーボンナノチューブに接着した標的細胞を検出するステップを伴う方法が提供される。
【０００５】
別の態様は、癌を有することが疑われるまたは癌と以前に診断された対象における循環腫瘍細胞を検出する方法であって、対象に由来する試料から赤血球を除去するステップ、対象に由来する試料を、１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ、およびカーボンナノチューブに接着した循環腫瘍細胞の存在または非存在を検出するステップであって、循環腫瘍細胞の存在が癌を示すステップを伴う方法が提供される。
【０００６】
これらの方法の一部の実施形態はまた、試料を、カーボンナノチューブを備えるデバイス上に置く前に、試料から血清を除去するステップを伴う。一部の実施形態では、赤血球を除去するステップは、赤血球を溶解することを伴う。一部の実施形態では、赤血球を除去するステップは、試料を遠心分離することを含む。一部の実施形態では、本方法はまた、カーボンナノチューブを備えるデバイスから非接着細胞または材料を除去するステップを伴う。一部の実施形態では、非接着細胞は白血球を含む。
別の態様では、体液試料中の標的細胞を捕捉する方法であって、体液の試料から標的細胞の沈降速度よりも高い沈降速度を有する細胞を除去するステップ；試料を、１つ以上のカーボンナノチューブアレイを備えるデバイス上に置くステップであって、カーボンナノチューブの表面が官能化されていないステップ；およびカーボンナノチューブに接着した標的細胞を検出するステップを含む、方法が提供される。
【０００７】
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、本方法はまた、カーボンナノチューブに接着した細胞をカウントするステップを伴う。一部の実施形態では、本方法はまた、試料に培養培地を添加するステップを伴い、培養培地は、標的細胞または循環腫瘍細胞に基づいて選択される。一部の実施形態では、本方法はまた、カーボンナノチューブを備えるデバイスから非接着細胞または材料を除去するステップを伴う。一部の実施形態では、本方法はまた、非接着細胞を除去するためにデバイスを洗浄するステップを伴う。一部の実施形態では、非官能化カーボンナノチューブは、コラーゲンで被覆される。一部の実施形態では、デバイスの表面はＳＵ８層を有する。一部の実施形態では、デバイスは、アレイの表面上に配置される。一部の実施形態では、本方法はまた、カーボンナノチューブに接着した標的細胞を回収することも伴う。一部の実施形態では、本方法はまた、回収された標的細胞を特徴付けるステップを伴う。一部の実施形態では、特徴付けるステップは、回収された標的細胞の遺伝子型解析、回収された標的細胞の表現型解析、またはその両方を含む。一部の実施形態では、表現型解析は、回収された標的細胞の上皮、間葉、および上皮間葉移行の状態を決定することを含む。一部の実施形態では、試料をデバイス上に置く間に経過する時間は、標的細胞の捕捉率を改善する。一部の実施形態では、血液１ミリリットルあたり１〜１５００個の標的細胞または循環腫瘍細胞が捕捉される。一部の実施形態では、カーボンナノチューブの密度は、１マイクロメートルあたりナノチューブ１〜５本である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−１Ｂ】本開示のカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）デバイスおよびアレイを示す図である。図１Ａは、複数の（ＣＮＴ）デバイスの概略図である。図１Ｂは、複数のＣＮＴデバイスを備える液滴生検マイクロアレイの画像である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ナノチューブ−チップを用いたＣＴＣの単離および計数におけるステップを示す略図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ナノチューブの走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ナノチューブ膜の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、７６素子アレイを備えるウエハーの光学画像であり；個々のデバイス（ブランクおよび吸着された血液）が挿入図に示される。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本開示のいくつかの実施形態によるカーボンナノチューブデバイスの上面画像である。
【図１Ｈ】図１Ｈは、小さなＤバンド、大きなＧバンド、および顕著な２Ｄバンドによって特徴付けられるカーボンナノチューブのラマンスペクトルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＮＴチップを用いたＣＴＣの単離および計数におけるステップの略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の例示的な方法のステップを示すフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、血液中の接着対非接着のスパイクされた細胞の捕捉効率を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、各個々のデバイスにおける接着細胞の追跡数を示すグラフを含む。
【図３Ｃ】図３Ｃは、接着したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞対ＷＢＣ（ＤＡＰＩのみ）の蛍光画像である。
【図４Ａ】図４Ａは、ナノチューブ表面に付着した単一のＳＫＢＲ３乳癌細胞のＳＥＭ画像であり；挿入図：ナノチューブ表面に付着した細胞体からの１５０〜２００ｎｍフィラメントを示す高倍率。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４８時間が細胞付着のための最適化時間であることを示唆する、接着の最適化を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、コラーゲン接着マトリックス足場を用いたスパイクされた細胞の捕捉効率を示すグラフを含む。
【図５Ｂ】図５Ｂは、各スパイク実験についての各液滴中でカウントされた細胞数を示すグラフを含む。
【図６】図６は、乳癌患者および健常対照由来の細胞の光学、ＤＡＰＩ、ＣＫ８／１８、ＣＤ４５、および重ね合わせ画像を含む。ＣＴＣはＷＢＣほど大きくないことが多く、画像はこれを示している。スケールバーは全て同じである。
【図７】図７は、ＣＫ、Ｈｅｒ２、およびＥＧＦＲに基づいて乳癌患者から単離された不均一なＣＴＣの一組の画像である。健常対照群ではＣＴＣは見出されなかった。血液の体積：４ｍｌおよび８．５ｍｌの血液。ＣＫ＋、ＣＤ４５−およびＤＡＰＩ＋はＣＴＣとして同定されたが、ＣＤ４５＋およびＤＡＰＩ＋はＷＢＣとして同定された。
【図８Ａ】図８Ａは、同じチップ上のＣＫ＋、ＥＧＦＲ＋、およびＤＡＰＩ＋細胞の重ね合わせ画像であり；下部の細胞は、ＣＫとＥＧＦＲの両方を発現する単一細胞であり、不均一なＣＴＣ表現型が存在することを示唆する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＣＫとＥＧＦＲの両方を発現する紡錘形部分上皮細胞および部分間葉細胞の画像である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、完全上皮ＣＴＣ、ＷＢＣおよび間葉ＣＴＣ（ではなくＧＦＲのみを発現し、ＣＫ８／１８を発現しない）の画像である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＥＧＦＲを発現せず、ＣＫ８／１８のみを発現する上皮ＣＴＣの画像である。
【図９Ａ】図９Ａは、異なる焦点深度におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞を含む血液滴の蛍光顕微鏡画像である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＧＦＰ観察の数対スパイクされた細胞数を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、各液滴中で観察された細胞数を示すグラフである。観察は、８７〜１００％のどの捕捉も可能であることを示した。より低い濃度での細胞カウントのわずかな誤差は、血球計を用いたスパイクの結果である。
【図１０】図１０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞を有する全液滴の蛍光顕微鏡画像である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲＢＣ溶解プロトコールを示す略図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、溶解前後の血液塗抹標本の画像を含む。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、接着細胞対非接着細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ナノチューブ表面に接着したＵ−２５１、Ｕ−３４３、およびＬＮ−２２９細胞の画像である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＣＤ５９について染色されたナノチューブ表面に付着したＨｅＬａ細胞の画像である。
【図１３】図１３は、患者試料の光学的画像および重ね合わせ画像を含む。
【図１４】図１４は、同一チップ上の不均一なＣＴＣおよびＷＢＣを示す画像；光学、ＤＡＰＩ、ＥＧＦＲ、ＣＫおよび重ね合わせ画像を含む。単一のＣＴＣは、各画像の下部に見られ、これは、このＣＴＣがＤＡＰＩ、ＣＫ、ＥＧＦＲに対して陽性であることを示唆し、同一細胞上の複数の表現型が示唆される。
【図１５】図１５は、ＷＢＣ（ＤＡＰＩのみ）とともに上皮、間葉およびＥＭＴ関連ＣＴＣを示す画像を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、標的細胞（例えば、循環腫瘍細胞またはＣＴＣ）を捕捉するために液滴生検チップを製造および使用するための方法およびデバイスを提供する。これらの方法およびデバイスは、ＣＴＣの選択的接着、抗原およびサイズに依存しない捕捉；ＷＢＣの５〜６対数の枯渇を提供し；ＣＴＣは複数の表現型である。標的細胞を捕捉することは、患者の診断および予後に情報を与えることができ、捕捉された細胞の数、トポグラフィー、および遺伝情報を使用して、患者の処置を最適化することができる。本開示の方法およびデバイスは、患者からの体液（例えば、血液、リンパ液、尿、唾液など）の試料を要求するだけである。一部の実施形態では、本明細書において検討されるデバイスおよび方法を使用して、循環細胞はナノチューブ表面に接着する。例えば、血液試料中の標的細胞は、試料から赤血球（ＲＢＣ）および血清を除去した後、ナノチューブ表面に接着する。一部の実施形態では、除去された赤血球および血清は、適切な培地体積で置換される。一部の実施形態では、試料は、制御された環境中でインキュベートされる。標的細胞（すなわち、ＣＴＣ）はナノチューブ表面に接着するが、血液中の他の成分（例えば、白血球）は接着しない。ナノチューブ表面を穏やかに洗浄すると、非接着細胞が除去され、捕捉された標的細胞が計数され得る。
【００１０】
本開示は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）表面のマイクロアレイに基づくＣＴＣ捕捉の新しい方法を提供する。この技術は、ＣＮＴ表面へのＣＴＣの選択的接着が利用される、新しいタイプの抗原非依存性捕捉である。本方法は、１）大量の血液を液滴からのより良好な捕捉感受性を可能にし得る小部分にＲＢＣ溶解／分画することを可能にするマイクロアレイフォーマット；２）ＣＴＣの抗原非依存性捕捉は様々な表現型のＣＴＣの単離を可能にする；３）ＣＴＣのサイズに依存しない捕捉；４）ナノチューブ表面へのＣＴＣの選択的接着は白血球（ＷＢＣ）の５対数の枯渇を可能にする；５）その後の顕微鏡検査にＣＴＣを移す必要がなく、細胞の喪失を排除する；６）平面構造は、流体チャンバー内のＣＴＣのイメージングに関連するイメージングの問題および大きな画像ファイルを排除する；７）表面構造はそれ自体を、ＣＴＣが密閉されたチャンバーから回収される可能性があるマイクロフルイディクスとは異なり、ＣＴＣの下流分析を容易にするようにする；ならびに８）平面バッチ製造プロセスは、シリコンベースとガラスベースのウエハーの両方で個々のデバイスの＞９９％収率をもたらす、などの多数の利点のうちの１つ以上を有することができる。
【００１１】
一部の実施形態では、本方法は、８９〜１００％の捕捉率で癌細胞を選択的付着をもたらし、乳癌患者（血液４ｍｌおよび８．５ｍｌ）において高純度（）および１００％の感度（ｎ＝７／７）でＣＴＣを単離し、同じ患者から複数の表現型の単一ＣＴＣを捕捉する。一部の実施形態では、血液１ミリリットルあたり１〜１５００個のＣＴＣが捕捉される。一部の実施形態では、血液１ミリリットルあたり５００〜１５００個のＣＴＣが捕捉される。一部の実施形態では、血液１ミリリットルあたり１０００〜１５００個のＣＴＣが捕捉される。マイクロアレイフォーマット、接着に基づく捕捉のためのカーボンナノチューブの使用、および異なる表現型のＣＴＣの単離の成功は、ナノチューブ−ＣＴＣ−チップが患者におけるＣＴＣを捕捉するための汎用性のあるプラットフォームであることを示す。
【００１２】
カーボンナノチューブデバイス
本開示は、カーボンナノチューブマイクロアレイを用いて試料中の細胞を捕捉することを記載する。一部の実施形態では、カーボンナノチューブデバイスは、標的分子または細胞を捕捉するための抗体を含まない。一部の実施形態では、カーボンナノチューブデバイスは電極を含まない。図１Ａおよび１Ｂは、非回避的検出および細胞捕捉（例えば、診断用）のための複数のＣＮＴデバイス１２を含むカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）アレイ１０（ＣＮＴチップおよび液滴生検マイクロアレイとも呼ばれる）を示す。一部の実施形態では、チップまたはアレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはさらにそれを超える個々のＣＮＴデバイスを含む。１０個のＣＮＴデバイスを備えるアレイは１０素子アレイと呼ばれる。一部の実施形態では、チップは、図１Ｂに示されるようにカーボンナノチューブデバイスの７６素子アレイを備える。アレイのサイズは、ウエハー１４のサイズに基づいて変化させることができる。例えば、４インチウエハーは７６個のＣＮＴデバイスを有することができ、６インチウエハーは１００個のＣＮＴデバイスを有することができ、１２インチウエハーは１３０個のＣＮＴデバイスを有することができる。異なる数のアレイおよび異なるサイズのデバイスを提供することができる。このようにして、アレイ内の各デバイスは、多数の細胞を捕捉することができる。一部の実施形態では、デバイスの数は、チップによって処理される血液の体積に依存して増加または減少される。血液はピペットを用いて塗布することができる。一部の実施形態では、生理食塩水がデバイスに適用され、次に、試料（例えば、血液）が生理食塩水に適用される。
一部の実施形態では、電極はＣＮＴデバイス上で利用される。一部の実施形態では、電極は、電気刺激を細胞に送達するために使用される。一部の実施形態では、電極を使用して、導電率の変化を測定して、ＣＮＴデバイスのカーボンナノチューブによる標的細胞の捕捉を検出する。
【００１３】
ＣＮＴデバイスは、種々の技術を用いて形成され得る。一部の実施形態では、図１Ｃに示されるように、ＣＮＴデバイス１２のアレイをガラスウェハー１４上に加工することができる。一部の実施形態では、真空濾過は、ＣＮＴ膜１８を生成し、ＣＮＴ膜１８をガラスウェハー１４上に転写するために使用される。これは、ランダム配向および濾過プロセスを有する巨視的ＣＮＴ薄膜１８を加工するための効果的な方法であり、ウエハー１４上のＣＮＴデバイス１２の分布を自己調節する。原液の濃度を制御することにより、ＣＮＴ膜、したがってＣＮＴデバイス１２の密度を制御することが可能である。一部の実施形態では、加工プロセス前の各ウエハー１４上のＣＮＴデバイス１２の質量は約１００μｇであり得る。質量は、ＣＮＴデバイス１２の設計およびアレイ内のデバイスの数に基づいて、約１〜約１０００μｇの範囲であり得る。一部の実施形態では、ＣＮＴデバイス１２束の高さは、約１００〜２００ｎｍの範囲である。
【００１４】
本明細書で検討されるＣＮＴデバイスおよびＣＮＴ薄膜を作製するための例示的な微細加工プロセスを示す図１Ｃに再度言及すると、ウエハー（例えば、ガラスまたはシリコン）がＣＮＴデバイス（Ｉ）のための基板として提供される。次に、ＣＮＴ膜がウエハー（ＩＩ）上に置かれる。第１のフォトリソグラフィーステップに続いて、ＣＮＴ膜がマスクされたパターンを形成し、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）が（ＩＩＩ）に示されデバイスパターンを生成する。
【００１５】
電極を用いる実施形態では、第１のマスク（例えば、アセトンを用いる）を除去した後、第２のマスクは、電極（ＩＶ）の加工のためのデバイス上の第２のフォトリソグラフィーテップを使用してパターン化することができる。特に、ＣＮＴ膜の所望の領域は、クリーンルーム内でフォトリソグラフィーを使用してフォトレジストで覆うことができる。その後、残りのＣＮＴ膜は、反応性イオンエッチャー中の酸素プラズマを用いて、１２０秒間、２００Ｗおよび２００ｍＴｏｒｒ（Ｖ）でエッチングすることができる。エッチングプロセスの持続時間および圧力は、ＣＮＴデバイスの質量に基づいて選択することができる。一部の実施形態では、厚さ約１５ｎｍのニッケル層および厚さ約９０ｎｍの金層が、スパッタリングによってＣＮＴ領域上に置かれる。ニッケル層は、金層とＣＮＴデバイスとの間に接着層を提供する。金層は、電極としての性能が減りおよび損なわれないように、十分な寸法である必要がある。本開示の範囲から逸脱することなく、ニッケルおよび金の代わりに別の材料を利用することができる。例えば、ニッケルの代わりにクロムを使用することができ、またはクロムニッケル合金を金層（または他の導電性材料）のための接着層として使用することができる。一部の実施形態では、スパッタリングＮｉ／Ａｕおよびマスク除去（例えば、アセトンを用いる）は電極（Ｖ）を作製する。第２のマスクを除去することは、最後の加工ステップであり、デバイスは応用のためにウエハーダイシングソーを使用してダイシングされる。
【００１６】
一部の実施形態では、厚いＳＵ８（エポキシ系ネガティブフォトレジスト）層は、電極を分離するだけでなく、各チップ（ＶＩ）のＣＮＴ膜領域上にのみ液滴を含有する。ＳＵ８層は不動態化に使用され、液体のみがカーボンナノチューブ領域に曝露され、電極領域には曝されない。図１Ｃは、１つの加工プロセスの非限定的な例を示す。当該技術分野において公知である他の方法を使用することもできる。
【００１７】
一部の実施形態では、ＣＮＴ薄膜は、半導体ナノチューブの単一層から形成される。一部の実施形態では、単層カーボンナノチューブを使用することができる。一部の実施形態では、ナノチューブは、９０％より高い純度、または一部の実施形態では、９５％より高いもしくは９９．５％より高い純度を有する。一部の実施形態では、ナノチューブの密度は、１マイクロメートルあたりナノチューブ１〜５本である。一部の実施形態では、密度は、１マイクロメートルあたりナノチューブ３〜５本である。一部の実施形態では、密度は、１マイクロメートルあたりナノチューブ５本である。一部の実施形態では、密度は、出発材料中の公知の濃度のナノチューブを用いる濾過プロセスによって制御される。一部の実施形態では、ナノチューブは単一層に置かれる。
【００１８】
図１Ｄおよび１Ｅは、それぞれ、ガラスウエハー上に分布されたＣＮＴデバイスのランダム分布の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）および原子間力顕微鏡画像を示す。図１Ｆは、複数のＣＮＴデバイスを備えるアレイの写真画像であり、挿入図は、アレイ上の各デバイスの寸法（３×３ｍｍ）および血液試料を装填したデバイスを示す。図１Ｇは、２つの電極２２の間に血液試料２４を装填されたＣＮＴデバイス１０を備えるデバイスチップ２０のクローズアップである。図１Ｈは、ガラスウエハー上の例示的なＣＮＴ膜のラマンスペクトルである。最初のピーク（すなわち、半径方向呼吸モード（ＲＢＭ））は、約２５０ｃｍ-1で観察される。ＲＢＭは、ナノチューブの半径方向膨張−収縮に起因する。したがって、その周波数、ＶRBM（ｃｍ-1）は、ナノチューブ直径（ｄ）の関数である（ＶRBM＝Ａ／ｄ＋Ｂ、ここで、ＡとＢは単層ＣＮＴの定数であり、Ｂは０と推定され、Ａは２４８ｃｍ-1と推定される。図２Ｄにおいて、ＲＢＭの周波数は２７５．８ｃｍ-1であり、したがって、単層ＣＮＴの直径はほぼ０．９ｎｍと推定される。ｓｐ２混成炭素材料中の不完全活性バンドの結果として、Ｄバンドが観測され、その周波数は１３３８ｃｍ-1である。全てのｓｐ２混成炭素材料の一次ラマンバンド（「Ｇバンド」）は１５９０ｃｍ-1である。ＤバンドとＧバンドの比は、ＣＮＴデバイスの欠陥に関する情報を提供する。
【００１９】
選択的接着ベースの細胞捕捉
選択的接着とは、ＣＴＣがナノチューブ表面に選択的に付着するが、白血球（ＷＢＣ）を含む他の血液成分は接着しないという概念を指す。本方法は、裸または非官能化カーボンナノチューブ表面を使用することを含む。本明細書で使用される場合、「非官能化」とは、特定の細胞抗原に対する親和性を有する結合ドメインまたは部分を含む、いずれもの化合物、リガンドまたはタンパク質もしくはその断片を含まないカーボンナノチューブ表面を指す。例えば、それにコンジュゲートされた１つ以上の抗体を有するカーボンナノチューブ表面は、抗体によって認識される特異的抗原を発現する細胞のみに結合することができる官能化ＣＮＴ表面である。対照的に、本明細書に記載されるデバイスは、裸または非官能化カーボンナノチューブ表面を利用して、試料中の接着性細胞を捕捉する。例えば、本開示の一部の実施形態では、裸または非官能化カーボンナノチューブ表面を備えるデバイスは、カーボンナノチューブ表面に接着する血液試料中の上皮性乳房腫瘍細胞を捕捉するために使用される。
一部の実施形態では、カーボンナノチューブ表面はコラーゲンで被覆される。このような表面は、コラーゲンが細胞上で発現されるいずれもの特定の細胞または抗原に特異的に結合しないため、非官能化表面であると考えられる。
一部の実施形態において、これらのデバイスはガラスウエハー上で製造される。一部の実施形態では、デバイスはシリコンウエハー上で製造される。本方法は、全ての主要な上皮癌、すなわち、乳癌、前立腺癌、肺癌、および結腸癌に適用可能である。
【００２０】
本明細書に記載される方法を用いた異なる表現型のＣＴＣの単離、捕捉、および計数は、４ステップを有するものとして広く特徴付けることができる（図２Ａ）。ステップ１では、血液（例えば、約４００億個の赤血球、６４００万個の白血球、および異なる表現型の１〜１０個のＣＴＣからなる）が患者から採取される。ステップ２では、赤血球（ＲＢＣ）溶解プロトコールを介してＲＢＣが枯渇する。試料を遠心分離し、ＣＴＣおよびＷＢＣからなる有核細胞画分をペレット化することができる。ステップ３では、ＣＴＣおよびＷＢＣからなる有核細胞をデバイスに添加する。例えば、ＣＴＣおよびＷＢＣを、６〜１２個の個々のナノチューブデバイス上の標準的な１０〜２０μｌ液滴（合計６０〜１２０μｌ）として添加することができる。一部の実施形態では、各デバイスの寸法は、３ｍｍ×３ｍｍ〜８ｍｍ×８ｍｍの範囲である。一部の実施形態では、ＣＴＣは、ＷＢＣを含む他の有核細胞ではなく、ナノチューブ基質に付着する。抗原非依存性ＣＴＣ捕捉とも呼ばれ、この戦略は、腫瘍細胞上の潜在的に多様に発現されるマーカーの選択によってバイアスされない高純度のＣＴＣを濃縮する。ステップ４では、ナノチューブ表面上の付着ＣＴＣは、抗体を用いてオンチップで免疫染色して、異なる表現型のＣＴＣを同定し、計数することができる。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を核染色として使用し、サイトケラチン（ＣＫ８／１８）および他の抗体（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ）はＣＴＣを同定する。
【００２１】
図２Ｂは、本開示の例示的な方法４００を示す。ステップ４０２において、カーボンナノチューブ膜は、図２Ａ〜図２Ｅに関して検討されるように、１つ以上のＣＮＴデバイスに加工される。ステップ４０４では、溶解および遠心分離プロセスによって、赤血球（ＲＢＣ）および血清が血液試料から除去される。ＲＢＣは、他の細胞型と比較して大きい密度をもたらす鉄含有量に起因して、他の細胞型よりも速く沈降する傾向がある。沈降により、ＲＢＣは、ＣＴＣまたは他の標的細胞よりも多数であり、ナノチューブ表面への標的細胞結合を妨げるかまたは競合する可能性がより高い。ステップ４０６の間、細胞を少量の培養培地に再懸濁する。培養培地は、捕捉のために標的化される細胞のタイプに基づいて選択することができる。一部の実施形態では、ステップ４０４および４０６は、新鮮な血液試料を用いて、または試料回収から４〜８時間以内に実施される。あるいは、血液試料を（例えば、摂氏４度にて）保存することができる。
【００２２】
ステップ４０８では、ＲＢＣを除去するために処理された試料をＣＮＴデバイス上に置く。ステップ４０８の間、デバイス上の試料をインキュベートすることにより、試料中の標的細胞が、ＣＮＴデバイスのＣＮＴ膜の表面に接着することを可能にする。一部の実施形態では、インキュベーションは２４〜３６時間である。ステップ４１２では、デバイスの表面を洗浄して、非標的エレメントを除去し、さらなる処理のために標的表面に付着させた生存可能な標的細胞を残留させる。一部の実施形態では、洗浄は、デバイスの表面から液滴を穏やかに吸引し、表面を洗浄するために１０μｌのＰＢＳ液滴を添加することを含むことができる。図４に図示されるプロセス４００に従い、予備標識、予備固定、または任意の他の処理ステップなしに、ＣＮＴ膜によって標的細胞を捕捉することができる。一部の実施形態では、スパイク前に、血球計および光学顕微鏡を用いて細胞をカウントすることができる。細胞を捕捉し、デバイスを洗浄するプロセスを完了した後、細胞をカウントし、蛍光顕微鏡下でそれらの生存性を確認するために、適切なバイオマーカーで細胞を染色する必要がある。一部の実施形態では、ＤＡＰＩを用いて核を染色する。一部の実施形態では、サイトケラチンに結合する蛍光標識抗体を用いて、癌細胞をカウントする。
【００２３】
操作中、標的細胞を含む血液試料は、図１Ｇに示されるように、本開示の診断デバイス上に置かれる。一部の実施形態では、赤血球（ＲＢＣ）および血清は、溶解および遠心分離プロセスによって血液試料から除去され、少量の培養培地に再懸濁される。培養培地は、捕捉のために標的化される細胞のタイプに基づいて選択することができる。一部の実施形態では、血液試料は、新たに採取された試料であるかまたは試料回収から４〜８時間以内である。あるいは、血液試料を（例えば、摂氏４度で）保存することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、赤血球を除去するために処理された血液試料は、ＣＮＴデバイス上に置かれ、インキュベートされ、試料中の標的細胞は、ＣＮＴデバイスのナノチューブの表面に接着することが可能になる。一部の実施形態では、インキュベーションは２４〜３６時間である。一部の実施形態では、デバイスの表面を洗浄して非標的エレメントを除去し、さらなる処理のために標的表面に付着させた生存可能な標的細胞を残留させる。一部の実施形態では、洗浄は、デバイスの表面から液滴を穏やかに吸引し、表面を洗浄するために１０μｌのＰＢＳ液滴を添加することを含むことができる。一部の実施形態では、標的細胞は、予備標識、予備固定、または任意の他の処理ステップなしに、ＣＮＴデバイスによって捕捉される。一部の実施形態では、スパイク前に、血球計および光学顕微鏡を用いて細胞をカウントすることが可能である。細胞を捕捉し、デバイスを洗浄するプロセスを完了した後、細胞をカウントし、蛍光顕微鏡下でそれらの生存性を確認するために、適切なバイオマーカーで細胞を染色する必要がある。一部の実施形態では、ＤＡＰＩを使用して、核を染色する。一部の実施形態では、サイトケラチンを用いて、癌細胞をカウントする。
【００２５】
一部の実施形態では、試料は、唾液または尿試料などの体液である。これらの試料を処理するには、典型的には、ＲＢＣの除去を必要としない。しかしながら、唾液または尿中にＲＢＣが存在する場合（例えば、疾患または損傷による）、ＲＢＣは、上記される溶解プロトコールを介して除去することができる。一部の実施形態では、ＲＢＣの代わりに、標的細胞よりも高い沈降速度を有する他の細胞を除去することができる。例えば、より高密度を有する細胞は、より高い沈降速度を有することができる。
本開示のＣＮＴシステムおよび方法は、種々の応用に従って利用することができる。例えば、これは、マルチマーケットベースの捕捉、研究におけるスパイクされた癌細胞、ナノ表面に基づく接着捕捉、電気シグナルに基づくバイオマーカーの分類、異種移植マウスモデル、血液検査に基づく低侵襲診断、感染症の診断、および細胞培養研究に使用することができる。
【００２６】
本開示のデバイスおよび方法は、以下の実施例で説明され、開示の理解を助けるために記載され、その後に続く特許請求の範囲で定義される開示の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈するべきではない。以下の実施例は、本開示の実施形態をどのように作り、どのように使用するかの完全な開示および記載を当業者に提供するために提示され、本発明者らが自身らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではなく、また、下記の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図したものでもない。使用数（例えば、量、温度など）の精度を確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。
【実施例】
【００２７】
図１Ｃは、上記される加工プロセスを示す。シリコンウエハー上の６０素子、７６素子、および２４０素子アレイ、ならびにガラスウエハー上の７６素子アレイからなる４世代のデバイスを加工した。ＣＴＣの単離のために本明細書に提示されるＲＢＣ溶解プロトコールを使用して、８．５ｍｌの血液を処理し、カーボンナノチューブチップおよび本明細書に提示される選択的接着の方法を使用してＣＴＣを単離することができる。
図１Ｄは、単層カーボンナノチューブの走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。直径が約１ｎｍ、長さが１μｍのＨｉＰＣｏカーボンナノチューブを使用した。ナノチューブは、真空濾過プロセスを用いてガラス表面に転写される。ＳＥＭ（図１Ｄ）とＡＦＭ（図１Ｅ）の両方に見られるカーボンナノチューブは、ランダム配置を示す。図２Ｃは、７６素子アレイからなるウエハー全体を示す。この図の挿入図は、３ｍｍ×３ｍｍである単一デバイスの一実施形態を示す。２番目の挿入図には、単一の血液滴が示される。デバイスの４つ全ての側面は、疎水性による液滴局在を可能にする３０μｍ厚のＳＵ８層を有する。図１Ｈは、ＲＢＭモード（２７５ｃｍ-1）、小さなＤバンド（１３３６ｃｍ-1）、大きなＧバンド（１５９１ｃｍ-1）および顕著な２ＤバンドまたはＧ’バンド（２６５６ｃｍ-1）を示すカーボンナノチューブ膜のラマンスペクトルを示す。大きなＧ／Ｄバンド比は、高品質カーボンナノチューブを示す。
【００２８】
カーボンナノチューブ（ＣＴＮ）チップを用いた単一細胞の追跡
血液試料中の標的細胞は、重力により直ちに沈降し始め、密度勾配は、細胞（例えば、ＲＢＣ）がＣＴＣとともに裸のナノチューブ基質表面と接触し、相互作用する細胞をもたらす。癌細胞スパイクされた血液試料液滴の光学顕微鏡上の最初の観察は、沈降プロセスの一部としてスパイクされた癌細胞およびＲＢＣが、ＲＢＣと同じ様式で沈降しないＷＢＣと比較してデバイスの底部に移動する傾向があることを示した。ＲＢＣの傾向は、比較的大きな密度をもたらす鉄含有に起因して、他の細胞型よりも速く沈降する傾向がある。
【００２９】
個々の細胞を追跡するために、レンチウイルスにより形質導入され緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカーを能動的に発現するＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；ＥｐＣＡＭ−）を用いた。典型的には、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）などのＣＴＣ技術は、血液細胞からＣＴＣを区別するために上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を使用する。ＣＴＣは高度に不均一で、それらの形状、形態を積極的に変化させ、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の間にＥｐＣＡＭを下方制御さえする。このように、ＥｐＣＡＭベースの方法はＣＴＣを捕捉できず、または他には検出することができず、したがって、臨床的意思決定には不十分である。
ＧＦＰ形質導入トリプルネガティブ乳癌細胞を血液試料にスパイクし、蛍光顕微鏡下で観察した。これらの実験のために、血液を１０％に希釈し、液滴中のＧＦＰ＋細胞の追跡を可能にした。図９Ａは、異なる焦点深度におけるＧＦＰ追跡細胞の蛍光画像を示す。図９Ｂは、試料において観察されたＧＦＰ＋細胞と比較したスパイクされた細胞数を示す。図９Ｃは、血液中の１、１０、１００、および１０００個のスパイクされたＧＦＰ＋細胞について、血液中のスパイクされた細胞カウントを示す。ＧＦＰ細胞の８７％〜１００％の捕捉が観察された。細胞カウントのわずかな誤差は、血球計を用いて細胞をカウントした結果である。図１０は、矢印で記されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ細胞を有する液滴の画像である。
【００３０】
スパイク実験において、血液の液滴をナノチューブデバイス表面上に設置した場合、癌細胞およびＲＢＣは、沈降プロセスの一部として試料ウェルの底部（すなわち、ナノチューブが位置である）に進むことが観察された。ＲＢＣは、ほとんどのナノチューブ表面を覆っており、比較的稀なＣＴＣを捕捉または検出するために選択的細胞接着戦略を用いる場合には望ましくない。細胞をナノチューブ表面に曝露することは、それがナノチューブマトリックスへの細胞固定を可能にするため、望ましい。多くの機械生物学研究において、特定の寸法を有する微細加工されたトポグラフィー特徴は、インビトロで細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構造および配向を模倣する。ナノチューブ表面は、表面上のナノメートルスケールチューブの回収のために、細胞付着のためのトポグラフィー異方性を可能にする。このようなトポグラフィー特徴に基づくＣＴＣ単離については、これにより標的細胞のナノチューブ表面へのさらなる曝露が可能になるため、ＲＢＣ溶解が必要である。本明細書に提示された開示は、ＲＢＣ溶解が、非官能化カーボンナノチューブ表面上の生存可能で高品質のＣＴＣの捕捉を可能にすることを示している。さらに、ＲＢＣ溶解なしでは、ＣＴＣ捕捉、ナノチューブ表面への付着、および繁殖培養の効率は有意に低減される。図１１Ａは、ＲＢＣ溶解プロトコールを示す。図１１Ｂは、溶解前後の対照血液（健常ボランティア由来）の光学画像である。ＷＢＣは溶解後に観察されるが、ＲＢＣは観察されない。図１１Ｃは、ＲＢＣ溶解プロトコールを用いて、ナノチューブ表面に付着した細胞を非接着細胞と比較する。
【００３１】
ＣＮＴチップ上でスパイクされた癌細胞の選択的接着
選択的接着とは、ＣＴＣがナノチューブ表面に選択的に付着するが、ＷＢＣを含む他の血液成分は接着しないという概念を指す。例えば、不均一な発現および転移特性を有するＣＴＣのナノ粗面化ガラス表面接着ベースの捕捉が、血液試料中でスパイクされたＥｐＣＡＭ＋（ＭＣＦ−７、ＳＵＭ−１４９、Ａ５４９）およびＥｐＣＡＭ−（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）癌細胞株の両方について＞８０％の捕捉収率で報告されている。カーボンナノチューブにおけるこの効果は、現在記載されているマイクロアレイにおいて実証されており、捕捉効率は、部分的にはＲＢＣ溶解による非常に高い純度（５対数の枯渇）でより実質的である。
【００３２】
スパイクされた癌細胞がＲＢＣ溶解プロセスで生存するかどうかを決定するために、ＧＦＰ陽性、ＥｐＣＡＭ−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞をマウス血液中にスパイクし、溶解プロトコールを使用した。１、１０、１００、５００、および１０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を含有する５つの試料を、５つの異なる１．５マイクロ遠心チューブ中の野生型マウス由来の１０μｌ血液中にスパイクした。各試料を溶解した後、細胞を培養培地に再懸濁し、６個のＣＮＴチップ（各１０μｌ）に分割した。３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内での液滴の乾燥を止めるために、ＰＢＳを含有する無菌培養皿内にそれらを保存した。４８時間後、インキュベーターから試料を取り出し、液滴を除去し、第２のデバイスに移して、第２のデバイスからの非接着細胞数をカウントした。次に、最初のデバイスをＰＢＳで洗浄し、一次デバイスと二次デバイスの両方を蛍光顕微鏡下で検査して、各デバイス上の細胞をカウントした。一次デバイス上の細胞数は「接着」とラベル付けされ、二次デバイス上の細胞は「非接着」とラベル付けされた。
【００３３】
図３Ａは、全てのスパイク濃度において、標的細胞の８７〜１００％が一次デバイス上のＣＮＴに接着したことを示す。アレイからの２つのデバイスを使用することにより、接着細胞と非接着細胞の両方を捕捉するかまたは全てのスパイク細胞を追跡した。図３Ｂは、全てのスパイク濃度にわたって各液滴中でカウントされた細胞数を示す。現在記載されている方法は、標準体積を有する液滴、およびアレイ上の標準数のデバイスを用いて細胞を計数する新しい方法を含む。体積が非常に小さいため、高精度のカウントを保証することができる。標準６液滴はまた、６つの異なるマーカーで細胞を染色するために使用することができ、捕捉された細胞の複数のマーカー分析を可能にする。
【００３４】
図３Ｃは、スパイクされた血液実験におけるＲＢＣ溶解および選択的付着後の捕捉された細胞の蛍光画像を示す。同じ表面上に付着したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞対ＷＢＣ（ＤＡＰＩのみ）の違いが観察される。蛍光画像に示されるように、付着した細胞は、細長い／機械的に伸びた形状および形態を変化させた。静的インビトロ細胞接着のプロセスを特徴付ける段階は、細胞体のナノチューブマトリックスへの付着、平坦化および拡散、ならびに細胞とナノチューブの間の焦点接着の形成を伴うアクチン骨格ネットワークの組織化を含む。変形、機械的伸縮、および平坦化は、図３Ｃに観察される。しかしながら、細胞接着についてより理解するために、電子顕微鏡研究を行った。表１は、スパイクされた血液中の捕捉された癌細胞の数、ＷＢＣの数、およびＷＢＣの１０対数の枯渇を示す。これらの少量の体積におけるほぼ４対数の枯渇が得られ、これは高レベルの純度を示している。
【００３５】
【表１】
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ＷＢＣ汚染および対数の枯渇の計算には、１マイクロリットルあたりのＷＢＣ中央値７，５００個を使用した。健常血液中のＷＢＣは、１マイクロリットルあたり４，０００〜１１，０００個である。
【００３６】
カーボンナノチューブ表面上の単一細胞接着の電子顕微鏡
付着した単一細胞の電子顕微鏡研究を行って、癌細胞がナノチューブ表面にどのように付着するかを調べた。図４Ａは、ＣＮＴデバイス上で４８時間インキュベートされた付着ＳＫＢＲ３細胞の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。顕著な画像は、癌細胞が形態を変化させ、強い焦点接着を引き起こすナノチューブ表面上に広がることを示している。細胞の本体からのフィラメントは、ナノチューブ表面まで伸長する。このようなフィラメントの多くは、個々のナノチューブ／束に直接付着することが観察される。これらのフィラメントの平均直径は約１５０〜２００ｎｍであり、光学顕微鏡では観察することができない。ＳＥＭ下でこれらのフィラメントのいくつかを曝露すると、このようなフィラメントの数千本がナノチューブマトリックスに結合することが示される。インテグリン受容体は、静的なインビトロ細胞接着および拡散において不可欠である。特異的インテグリン結合は、細胞内アクチン細胞骨格とナノチューブマトリックスとの間の機械的連結を提供する。電子顕微鏡研究により、腫瘍由来の上皮細胞が個々のＣＮＴ束を含むＣＮＴ表面にしっかりと付着し、活発な動態を示すことが確認される。
【００３７】
図４Ｂは、接着時間と捕捉された細胞数を相関させる。５０個のＭＤＡ−ＭＢ−２３ｌ−ＧＦＢ−Ｌｕｃ細胞を含有する３つの異なる試料を、１．５ｍｌチューブ内の１０μｌの野生型マウス血液と混合し、溶解した。３つの試料の各々の１０μｌ液滴を３つの別々のＣＮＴデバイス上に設置し、１２、２４、および４８時間インキュベートした。液滴をＣＮＴデバイスから取り出し、次に、新たなＣＮＴデバイス上にさらに７２時間設置して、非付着細胞のいずれかが、新しいＣＮＴデバイスの表面に付着され得るかどうかを観察した。１２時間インキュベートした最初の試料については、３０％未満の細胞が最初のステップでＣＮＴデバイスに付着した。７２時間後、さらに５０％が付着された。しかしながら、最初のインキュベーション時間を４８時間まで増加させた場合、９０％を超える細胞が付着し、経時的に接着強度が増加することを示した。細胞のナノチューブマトリックスへの接着の強度は、インキュベーション時間の長さに比例する。接着時間が短いことの利点は、７個のＷＢＣ（０．００５％未満）のみが最初のＣＮＴデバイスに接着したことである。第２の試料については、５２個の癌細胞のうち４２個（８０％）が２４時間後にＣＮＴ表面に接着した。４８時間後に４個の細胞が二次デバイスに接着し、６個の細胞（１１％）は捕捉されなかった。３番目の試料については、４９個の細胞のうち４５個（９２％）がＣＮＴ膜に接着した。接着していない細胞もまた、第２のデバイスに接着しなかった。第２および第３の試料では、それぞれ２１および２４個のＷＢＣ（０．０２％）がＣＮＴ表面に接着した。これらの実験から、４８時間が、無視できるほどのＷＢＣ捕捉で最大の捕捉効率を有するのに最適なインキュベーション時間であると結論づけられた。
【００３８】
全ての実験がＧＦＰ＋  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ細胞を使用したが、この技術は特定の癌タイプに限定されず、したがって、本明細書に提示される方法を使用して、任意のタイプの上皮癌（例えば、乳房、結腸、肺、および前立腺）細胞を捕捉する可能性が潜在的にある。さらに、本明細書に開示される新規な方法は、同一チップ上の接着性細胞と非接着性細胞の両方を追跡する唯一の方法である。したがって、本方法は、試料中の全ての細胞を効果的に追跡し、これは、特に、細胞（例えば、ＣＴＣ）数が僅かであり得る早期癌ではＣＴＣ捕捉において高い価値を有するタスクである。ＨｅＬａ（子宮頸部）、Ｕ−２５１（神経膠芽腫）、ＭＣＦ７（乳房）、ＬＮ−２９１（脳）を含む他の上皮癌細胞株もまたこの方法を用いて試験され、接着の収率はまた９０％を超えた。図１２Ａは、ＤＡＰＩおよびＥＧＦＲについて染色された脳腫瘍細胞の代表的な画像である。図１２Ｂは、ＣＮＴ膜への接着後にＣＤ５９で染色された接着したＨｅＬａ細胞を示す。適切な官能化プロトコールを用いて、リンパ腫および肉腫細胞などの非上皮細胞を捕捉することもできる。
【００３９】
ＣＴＮチップ上のコラーゲン接着マトリックスを用いた選択的付着
現在開示されているカーボンナノチューブ上の癌細胞付着戦略を、ＣＴＣの捕捉のためのコラーゲン接着マトリックス（ＣＡＭ）足場のそれと比較した。ＣＡＭ戦略（Ｖｉｔａアッセイ）を用いたＣＴＣの捕捉は固有の戦略であり、接着の方法である。腫瘍細胞がコラーゲンマトリックスに侵入する能力は、転移の特徴の１つである。過去において、コラーゲンマトリックスに接着し、侵入するＣＴＣの集団は侵襲性であり、インビボで転移を受ける自然な傾向を示すと仮定された。
【００４０】
図５Ａおよび５Ｂは、ＣＡＭ戦略のための各デバイスについての全体的な捕捉効率および細胞数（接着と非接着の両方）を示す。ＣＡＭ戦略の接着効率はわずか５０％であることが観察され、これは以前に報告されたものと一致する（Ｊ  Ｌｕら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１０年、１２６巻、６６９〜６８３頁）。細胞の５０％は、４８時間のインキュベーション後でさえ一次ＣＡＭデバイスに接着しなかったが、全ての細胞（すなわち、接着細胞と非接着細胞の両方）は、二次デバイスにおいて細胞数をカウントすることによって追跡された。これらの実験を同様の捕捉率値で３回繰り返した。ＣＡＭデバイスは、細胞がコラーゲンを消化するためにより多くの時間を必要とする可能性があるが、いくつかの細胞がＣＡＭに付着しない可能性があることに留意されたい。第Ｉ〜ＩＩＩ病期の乳癌（Ｖｉｔａ−アッセイ）におけるＣＡＭ被覆チューブに基づく研究では、患者５４人中２８人（すなわち、５２％の感受性）でのみＣＴＣが検出された。ＣＡＭ戦略は、ＣＮＴチップに対してコラーゲン型、沈着技術、および濃度に関して最適化が必要である。この方法は、現在開示されているマイクロアレイを用いて、選択的接着のための同じ条件下で裸の単層ＣＮＴ膜と比較して低い収率を有する。
【００４１】
臨床研究：ＣＮＴチップを用いた乳癌患者からのＣＴＣの捕捉
乳癌患者から高純度でＣＴＣを単離するＣＮＴチップの能力を調べた。同定されなかった８．５ｍｌの血液試料を、ＩＲＢ（ＩＲＢ＃１８．０８２８）の下でルイビル大学から入手した。同定されていない４ｍｌの血液試料もまたＵＭＡＳＳ組織バンクから入手して、異なる供給源から得られ、ＣＮＴチップを用いて異なる体積を有する試料から捕捉されたＣＴＣの数を決定した。
【００４２】
図６は、健常対照におけるＣＴＣの捕捉なしと比較した、乳癌患者におけるＣＴＣ同定および捕捉の代表的な画像である。ＣＴＣは、光学顕微鏡下で明瞭に視認でき、癌性細胞形態を有し、核染色ＤＡＰＩ陽性、ＣＫ陽性（８／１８）、およびＣＤ４５陰性である細胞として同定およびスコア化された。ＣＴＣはＷＢＣより大きくないことが多く、ＷＢＣは核を有するため、スコアリングする目的でＣＴＣとＷＢＣの間を区別することは重要である。リンパ球共通抗原ＣＤ４５は全ての白血球に発現し、したがって、ＷＢＣは光学顕微鏡下で明瞭に視認でき、リンパ球抗原ＣＤ４５陽性、ＣＫ８／１８陰性、および核染色ＤＡＰＩ陽性である細胞として同定される。ＣＴＣは、白血球よりも大きい必要はない。上皮ＣＴＣが白血球よりもはるかに大きいという仮定に基づいてＣＴＣを捕捉するサイズ選択技術は、全てのＣＴＣを捕捉し得るわけではない。ＣＮＴチップは、サイズバイアスなし、または抗原発現に依存することなくＣＴＣの捕捉を可能にし、それによって、試料中の全ての（またはほぼ全ての）ＣＴＣを捕捉する。
【００４３】
図７は、４ｍｌおよび８．５ｍｌの血液中の複数の抗原マーカーを用いて患者に捕捉された代表的なＣＴＣである。ＣＴＣは、全患者試料（ｎ＝７／７）で捕捉され、１００％の感受性が示唆された。健常対照（ｎ＝２／２）は、血液中にＣＴＣの存在を示さなかった。患者からの全ての光学画像および重ね合わせ画像を図１３に示す。異なる表現型のＣＴＣを、ＣＫ８／１８＋、Ｈｅｒ２＋、およびＥＧＦＲ＋発現に基づいて捕捉した。健常対照１と２の両方は、ＣＫ８／１８−、ＣＤ４５＋、およびＤＡＰＩ＋であった。患者由来のＣＴＣは、ＣＫ（８／１８）＋／Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋、ＣＤ４５−、およびＤＡＰＩ＋であった。
【００４４】
表２は、腫瘍節転移（ＴＮＭ）の病期分類ならびにＣＮＴチップを用いて捕捉されたＣＴＣおよび異種ＣＴＣの数を示す。
【表２】
2022501592.tif 000004
【００４５】
患者１（第４病期）は、（血小板凝集のため）溶解手順が最初は成功せず、１回を超えて行われたため、外れ値であった。しかしながら、Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲを発現する８個のＣＴＣは依然として捕捉された（図１３）。最初の患者を除く全てについて、全血安定化剤（チロフィバン；０．５μｇ／ｍｌ）を４℃で出荷する前に添加した。最初の患者を除く全てについて、プロトコールは全試料で均一であった。表４が示唆するように、１試料あたり８〜２３８個の範囲のＣＴＣを４ｍｌおよび８．５ｍｌの血液中に捕捉した。ＣＴＣは、リンパ節陽性および陰性の患者で捕捉された。一般的に、ＴＮＭの病期分類およびカウントされたＣＴＣ数を用いて、第１〜３病期の患者（患者２、患者３、患者５、および患者６）は、病期４の癌患者よりもＣＴＣ数が少なかった（血液４ｍｌおよび８．５ｍｌ中、４〜３９個のＣＴＣ、または１ｍｌあたり０．５〜１０個のＣＴＣ）ことが類推された。例えば、患者４は、処置前に第４病期の乳癌であり、ＣＴＣのレベルが上昇していた（８．５ｍの血液中２３８個または１ｍｌあたり２８個のＣＴＣ）。ＣＴＮチップを使用すると、早期（第１〜３病期）と進行期（第４病期）の間にＣＴＣカウントの明らかな拡がりがある。ＣＴＣは、Ｈｅｒ２とＥＧＦＲの両方に対して陽性であり、侵攻性疾患を示唆した。２つのＨｅｒ２＋／ＥＦＧＲ＋クラスターもまた患者４において観察された。最後に、患者７において、血液は、放射線療法後にのみ得られた（ただし、患者は化学療法未経験であった）。驚くべきことに、わずか９個のＣＴＣが８．５ｍｌの血液（１ＣＴＣ／ｍｌ）中に捕捉され、これは、放射線照射後、この第４病期の患者でＣＴＣ数が減少した可能性を示している。第４病期の患者、患者７（放射線療法）と患者４（処置未経験）とを比較すると、ＣＮＴチップはＣＴＣの計数に基づいて治療反応を予測する。
【００４６】
患者試料におけるＣＴＣ純度
さらなるゲノム特徴付けを可能にするために、高純度のＣＴＣを捕捉することが重要である。純度は、汚染白血球を含有する試料中のＣＴＣを捕捉するデバイスの能力を記載する。純度は、臨床試料から測定することができる測定基準である。ＣＴＮチップを用いて、捕捉されたＷＢＣ数に基づく各患者のｌｏｇ  １０−枯渇を確立した。ＣＴＣ純度を評価するために使用した対数の枯渇の式は以下の通りである。
枯渇＝ｌｏｇ10 初期ＷＢＣ数
最終ＷＢＣ数
【００４７】
この式を用いて、患者および対照試料の各々におけるＷＢＣの対数の枯渇を評価した。表２は、ＷＢＣの４〜５対数の枯渇を示す。患者１は、上で説明したように、１回を超えて行われる溶解手順による外れ値である。両健常対照者は同じ対数の枯渇を示し、プロセスの高い制御性および均一性を示した。対数の枯渇の範囲は４．６〜５．３であり、この数値は日常の臨床現場でプロセス制御のための較正マーカーとして使用することができることを示している。この分布を狭くすることにより、複数の癌タイプ間の比較が可能となる。
【００４８】
ＣＴＮチップを用いた乳癌患者からの様々な表現型のＣＴＣの捕捉：
患者研究の目的の１つは、種々の表現型（Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋  ＣＴＣサブクローン）の単一ＣＴＣの存在を調べることであった。受容体のＥＧＦＲファミリーは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１、ヒトにおいてはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４）で構成される。近年、乳癌腫におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の過剰発現のために、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２に強い関心が寄せられている。ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）シグナル伝達は、腫瘍の進行および転移をもたらす異なる経路を介して上皮間葉移行（ＥＭＴ）を誘導する。全患者の分析では、ＣＫ（８／１８）＋細胞を除いて、第１〜３病期の癌で強くＥＧＦＲ陽性であった２〜３細胞が捕捉された。このことは、様々な表現型のＣＴＣが早期癌でさえも患者に存在することを示している。しかしながら、進行期の癌患者（例えば、患者４）は、多数のＣＴＣ（２３８）を伴うＨｅｒ２とＥＧＦＲ陽性ＣＴＣの両方を示した。このことは、ＣＴＣ数とＣＴＣの不均一性の組合せが乳癌の侵攻性を決定することを示している。図１４は、複数の表現型（ＥＧＦＲとＣＫ（８／１８陽性）の両方）を示す画像の下部にある単一のＣＴＣを示し、一方、ＣＴＣの大部分はＣＫ８／１８に対してのみ陽性であった。このことは、転移性またはＥＭＴ表現型を有する原発腫瘍ＣＴＣには小さなクローンが存在することを示唆する。問題は、このような小さなサブクローン（受容体のＥＧＦＲファミリーを発現する）が化学療法に抵抗性を示し、処置後の数年で進行性の疾患および転移をもたらすかどうかである。循環中のＣＴＣの存在は、患者の生存と負の関係にある可能性がある。脳転移性乳癌（ＢＭＢＣ）は、Ｈｅｒ２とＥＧＦＲの両方を発現することができ、このような集団は転移性疾患のリスクが高いことを示している。高いＣＴＣ数およびＨｅｒ２とＥＧＦＲの両方の病理学的特徴の存在は、ＥＭＴ、転移を誘発し、将来の生存を決定し得る。このように、ＣＮＴチップは、これらの小さなサブクローンを捕捉し、疾患の進行に関するより良い洞察を可能にする。
【００４９】
異なる表現型のＣＴＣ間を区別するために、異なるタイプのＣＴＣが同じ患者試料中に存在するかどうかを調べた。図８は、患者５から捕捉されたＣＴＣの上皮および間葉の状態の動的考察を提供する。図８Ａでは、ＷＢＣ（ＤＡＰＩのみ）、上皮ＣＴＣ（ＣＫ８／１８に対してのみ陽性）、およびＥＭＴ関連ＣＴＣ（ＣＫ８／１８およびＥＧＦＲ）が試料中に存在する。図８Ｂ〜８Ｄは、同じ試料からの異なるＣＴＣを示す。図８Ｂにおいて、ＥＧＦＲとＣＫ８／１８発現の両方を有する紡錘細胞は、ＥＭＴプロセスの活性化を示す。ＣＴＣはしばしば、ＥＭＴ活性化時に形態を変化させ、ＥＧＦＲの存在およびＣＴＣの形態は陽性の確認となり得る。図８Ｃおよび８Ｄにおいて、上皮と間葉ＣＴＣの両方の存在が観察される。上皮ＣＴＣはＣＫ８／１８に対してのみ陽性であったが、より侵攻性の間葉状態はまたＥＧＦＲに対しても強く陽性であり、ＣＫ８／１８の発現は存在しなかった（図８Ｃ）。全体として、３個のＥＧＦＲ＋  ＣＴＣおよび２６個のＣＫ８／１８＋  ＣＴＣが患者５において観察され、ＣＮＴチップが単一細胞レベルで種々の表現型のＣＴＣを追跡することができることを示した。図１５は、上皮＋、間葉＋、およびＥＭＴ＋  ＣＴＣの間の違いを示す。表現型の不均一性の分析は、主にＣＫ（８／１８）、Ｈｅｒ２、およびＥＧＦＲの３つのマーカーに焦点を当てており、利用可能な処置選択肢に関する意思決定が利用可能であることを知らせることができる。全体として、ＣＴＮチップは、乳癌患者において、ＣＴＣの分析、ＣＴＣ計数、不均一なＣＴＣの捕捉、ならびに上皮、間葉、およびＥＭＴ関連ＣＴＣ間を区別する能力において高いレベルの成功を可能にした。
【００５０】
ＣＮＴチップと既存のＣＴＣ捕捉技術の比較
表４は、いくつかの既存のＣＴＣ捕捉方法を本開示のＣＮＴチップの方法と比較する。ＥｐＣＡＭ抗原依存性捕捉および免疫磁気濃縮に基づくＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）技術が市場に初めて登場した。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）に基づくＣＴＣ捕捉に関する１０年間の研究では、わずかな結果しか得られていない。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システムを用いた最近のドイツのＳＵＣＣＥＳＳ研究では、化学療法前および原発腫瘍の外科的切除後の２０２６人の乳癌患者を対象に、患者の２１．５％のみにＣＴＣが検出された（ｎ＝４３５人／２０２６人）。転移性癌腫を有する患者における循環腫瘍細胞検出のためのＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）およびＩＳＥＴ（濾過システム）を比較した研究では、一貫した結果が得られた。ＣＴＣは、乳癌患者の５５％（２０例中１１例）、前立腺癌患者の６０％（２０例中１２例）、および肺癌患者の２０％（２０例中４例）でのみ検出された。検出されたＣＴＣ数に関する技術間の相違が観察された。
【００５１】
ＣＴＣ−チップ、Ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅチップ、およびＣＴＣ−ｉＣｈｉｐなどのマイクロ流体技術は、流体プラットフォームである。マイクロポストを備えたＣＴＣ−チップは、そのマイクロポストの表面を製造および官能化することが困難であり、このデバイスを使用してＣＴＣクラスターを捕捉しなかった（Ｍ．Ｍ．Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、２０１６年、１０巻：３７４〜３９４年）。ＣＴＣを回収することが困難な平面デバイスであるＨｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅチップは、わずか２つのクラスターを生成した。ＣＴＣ  ｉＣｈｉｐはＷＢＣ汚染が低いことを示し、ＣＴＣ抗原依存的または独立的に捕捉することができる。しかし、ｉＣｈｉｐ上に２０μｍのギャップを有するアレイは、ＣＴＣクラスターを捕捉することができず、このようにサイズ依存の捕捉に低減する。したがって、非対称性およびサイズベースの分離を有する新しいデバイスが開発されつつある。ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ、ＭＯＦＦ、およびＩＳＥＴなどの濾過およびサイズベースの技術の大部分はＣＴＣを単離する。しかしながら、赤血球（ＲＢＣ）の飽和および閉塞は、これらのデバイスが有する問題である。同様に、微細加工されたフィルターもまたＣＴＣを単離する。ほとんどのサイズベースの技術の問題は、ＣＴＣが化学的に固定されない限り高度に変形可能であり、ＥＭＴ関連ＣＴＣがしばしば、保持されないことである。
【００５２】
これらの技術と比較して、ＣＮＴチップは明らかな利点を有する。ＣＮＴチップは、ナノチューブ表面への付着を可能にする腫瘍細胞の機械生物学に基づく、新規の抗原非依存性およびサイズ非依存性の捕捉技術である。選択的接着戦略は５対数のＷＢＣ枯渇を可能にし、これは他のＣＴＣ捕捉技術と比較して好ましい。捕捉収率は、低レベルのスパイクされたトリプルネガティブ乳癌細胞（１、１０、１００）に対して１００％であり、これは、ＲＢＣ溶解および癌細胞のナノチューブ表面への選択的付着が非常に効果的な戦略であることを示唆する。ＣＮＴチップは、異なる病期の乳癌を有する患者由来の４ｍｌおよび８．５ｍｌ試料中に存在する不均一なＣＴＣ捕捉に成功裏に使用された。単一のマイクロアレイにおいて、ＣＮＴチップは、進行疾患、高いＣＴＣ数、ＣＴＣ病理学的特徴、および複数の表現型を有する単一のＣＴＣを追跡する能力の間に相関を示した。
【００５３】
材料および方法
細胞培養
製造業者が提案するプロトコールに従って、乳腺癌細胞株ルシフェラーゼ／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）二重標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＲＰＭＩ−１６４０増殖培地で培養し、ＭＣＦ７乳癌細胞をＥＭＥＭ増殖培地で培養し、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞をＭｃＣｏｙの５ａ増殖培地で培養し、子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａを低グルコースＤＭＥＭ増殖培地で培養し、脳癌腫細胞株ＨｅＬａを低グルコースＤＭＥＭ増殖培地で培養し、および脳癌細胞株Ｕ２５１、Ｕ−３４３、ＬＮ−２２９を低グルコースＤＭＥＭ増殖培地で培養した。全ての培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する。細胞株を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．２５％ＥＤＴＡ−トリプシン溶液を用いて細胞を再懸濁した。
【００５４】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）膜加工
超純小径Ｕｎｉｄｙｍ（商標）ＨｉＰＣＯシングルウォールカーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）を商業的ベンダーから購入した。１００μｇのＳＷＣＮＴ粉末を１００ｍｌのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中に分散させた。２４時間の超音波処理後、分散させたＳＷＣＮＴは、真空濾過を用いた、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した、直径９０ｍｍの２２０ｎｍの孔径の混合セルロースエステルフィルターメンブレン上で濾過された。真空濾過法は、ＣＮＴネットワークの生成を自己調節し、均一に分布したＣＮＴを有する膜を生成する。次に、メンブレン上のＣＮＴ膜を厚さ５００μｍの４’’ガラスウエハー上にプレスした。アセトン浴を用いて、フィルターメンブレンを除去し、ガラスウエハー上に透明なＣＮＴ膜（直径７５ｍｍ）を残留させた。
【００５５】
カーボンナノチューブ膜の特徴付け
ＣＮＴ膜をガラスウエハーに転写した後、ＣＮＴ膜を特徴付けるために複数の方法を利用した。Ｈｏｒｉｂａ  ＸｐｌｏＲａ  Ｒａｍａｎ分光計を用いて、緑色レーザー（５３２ｎｍの励起レーザ線）により周囲環境でＲａｍａｎ分光測定を行った。１００×対物レンズを用いてＣＮＴ膜上にレーザビームを集束させ、試料を損傷しないように、測定は１２００ｇ／ｍｍ格子、１％中性密度（ＮＤ）フィルター、および０．２ｍＷレーザーパワーで行われた。較正には、５２０ｃｍ-1におけるシリコン基板からのフォノンモードを使用した。約１４６ｋＨｚのカンチレバー共振周波数でタッピングモードにおいてＮａｉｏＡＦＭ（Ｎａｎｏｓｕｒｆ  Ｉｎｃ）を用いて原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を取得した。ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−７０００Ｆ機器を用いて、１０ｋＶおよび超高真空（１０-5Ｐａ）下でＣＮＴ膜の走査電子顕微鏡画像を得た。
ＣＮＴチップマイクロアレイ加工：
ボストン大学のクリーンルームでＣＮＴチップを加工した。７６素子のアレイチップの加工は、他の箇所で詳述される。
【００５６】
マウス血液に癌細胞をスパイクする：
細胞を約８０％コンフルエンスに達するまで増殖させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｂｃｏ（商標）トリプシン−ＥＤＴＡ（カタログ番号２５２０００５６）を用いて培養皿から分離させた。次に、遠心分離し、特定の培養培地体積に懸濁し、血球計を用いて細胞をカウントし、各チューブ中のそれらの濃度を計算した。デバイスの捕捉効率をカウントおよび計算するために蛍光顕微鏡を使用して血液中の細胞を追跡することができるようにするために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＧＦＰ細胞をほとんどのスパイク実験のために使用した。１０μｌの野生マウス血液を、１．５ｍｌチューブ中の必要な数の細胞を含有する１０μｌの培養培地と混合した。血液中で標的細胞を混合した後、赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。遠心分離後、血清および溶解したＲＢＣを含有する上清を除去し、チューブの底部のペレットを培養培地中に再懸濁し、ＣＮＴデバイス表面に移した。
【００５７】
スパイク実験のための赤血球（ＲＢＣ）溶解：
低張ＮａＣｌ溶液をＲＢＣ溶解に使用した。マウスモデルから回収された血液または血液中のスパイクされた細胞を、３００×ｇで４℃にて８分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を、４℃の滅菌水中の０．２ｗｔ％ＮａＣｌ溶液の５００μｌ中に再懸濁し、２分間穏やかに混合した。次に、４℃の滅菌水中の１．６ｗｔ％ＮａＣｌ溶液の５００μｌを添加し、１分間穏やかに混合した。溶液を３００×ｇで４℃にて８分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を４℃の培養培地の１ｍｌに再懸濁し、３００×ｇ（４℃）で８分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を６０μｌの培養培地に再懸濁し、処理された試料の１０μｌを６つの異なるチップに移した。
【００５８】
選択的付着研究：
いくつかの実験は、ナノチューブ表面へのＣＴＣ付着の最適化時間を決定するために設計された。５０個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＢ−Ｌｕｃ細胞を含有する３つの異なる試料を、１．５ｍｌチューブ内で１０μｌの野生型マウス血液と混合し、溶解した。これら３つの試料の各々を、１０μｌ液滴として３つの別々のＣＮＴデバイス上に設置し、１２、２４、および４８時間インキュベートした。この時間後、次に、除去された液滴を別の新しいＣＮＴデバイス表面上に設置し、合わせたインキュベーションの合計時間が７２時間に達するまでインキュベートした。第２のステップは、非付着細胞が新しいＣＮＴデバイス表面に付着され得るかどうかを決定するために行われた。
【００５９】
コラーゲン接着マトリックスを用いた選択的付着：
コラーゲン接着マトリックス（ＣＡＭ）をＣＮＴの表面に置き、血液中の細胞スパイク実験を行った。これらの試験の間、センサーの表面をコラーゲンで覆って、コラーゲンを消化することによる転移性浸潤と同様に、表面への標的細胞の接着を改善し、加速した。ウシ皮膚Ｉ型コラーゲン（０．１Ｍ酢酸中の０．１％溶液）を無菌処理し、細胞培養に適したものを用いた。製造業者が示唆するプロトコールに基づき、コラーゲン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｃ８９１９）を用いて、６〜１０μｇ／ｃｍ2で、１０μｌの液滴を用いてデバイスを被覆した。デバイス上のＣＡＭ液滴を４℃に一晩保持して、タンパク質をＣＮＴと結合させた。余分な液滴を翌日に被覆表面から除去した。デバイスを一晩乾燥させ、同時に滅菌バイオセーフティキャビネット内でＵＶ光に曝露することにより滅菌させた。翌日、デバイスを使用する前に、それをＰＢＳですすいだ。
１、１０、１００、４００、および１０００細胞を含有する５つの試料を、５つの異なる１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中の１０ｍｌ野生マウス血液にスパイクした。各試料を溶解した後、細胞を培養培地に再懸濁し、６個のＣＮＴチップ間に分割し、各チップは１０ｍｌの試料を受け入れた。インキュベーション条件および時間は、以前のスパイク実験と同じであった。同じカウント戦略を用いて、ＣＡＭ戦略に基づいて、一次デバイスに接着され、二次デバイスに接着されなかった細胞をカウントした。
【００６０】
患者試料：
同定されなかった血液試料をＢＤ−バキュテイナナトリウムヘパリン血液チューブ（緑色キャップ）で回収した。ルイビル大学癌センターで回収された血液の体積は８．５ｍｌであり、ＵＭＡＳＳ組織およびバイオバンクで回収された血液体積は４ｍｌであった。血液を回収した後、血液試料の各１ｍｌに０．５μｇのチロフィバンを添加した。試料は、使用または出荷前に、生物学的危険性のある検体輸送バッグ内で４℃の冷蔵庫に保持した。出荷中、血液試料は、ナノクールボックス内で２〜８℃で保存した。各試料を処理する前に、スライドガラス上の塗抹血液試料をギムザ染色（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃ＧＳ５００）で染色し、血液試料の詳細な検査を行った。
【００６１】
患者血液試料処理
回収した血液試料を元のチューブから１５ｍｌ遠心チューブに移し、３００×ｇで５分間遠心分離した。血漿を上清から除去した。各細胞ペレットを１２ｍｌの溶解緩衝液（Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃７８６６５０）に再懸濁した。３分間混合した後、チューブを１３０×ｇで５分間遠心分離した。溶解した試料の上清を廃棄チューブに移した。１ｍｌの培養培地を用いて、ペレット化された溶解細胞を再懸濁し、１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。細胞を１３０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄ボトルに移した。残った細胞を１２０μｌの培養培地に再懸濁し、１２個のＣＮＴデバイス（ＣＮＴデバイスあたり１０μｌの試料）の間で分割した。デバイスを、ＰＢＳを含有するペトリ皿中で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。４８時間後、デバイス上の液滴を除去し、デバイスをＰＢＳで１回洗浄した。次に、デバイス上の単離された細胞を免疫蛍光研究のために使用した。
【００６２】
免疫蛍光分析：
捕捉細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。試料をＰＢＳで洗浄し、次に、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＦＸシグナルエンハンサーおよび免疫蛍光ロッキング緩衝液（細胞シグナル＃１２４１１）で各１時間、室温でブロックした。試料を、製造業者が示唆する濃度に基づいて希釈した一次抗体で覆い、４℃で一晩インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体を１μｇ／ｍｌに希釈し、試料を暗い容器内で室温で１時間覆った。試料をＤＡＰＩで染色した。ＣＴＣの数は８．５ｍｌまたは４ｍｌの血液あたり８〜２３８個のＣＴＣであり；第１ｃ病期から第４病期の癌の７人の患者中７人がＣＴＣを有した。ＷＢＣ数は、患者ではＷＢＣの５対数〜６対数の枯渇；８．５ｍＬ中に３１〜６５２個のＷＢＣまたは１ｍＬあたり３．６〜７５個であった。
【００６３】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および公開された参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の上記される実施形態は、単に、本開示の原理を明確に理解するために記載された実施の単なる可能な例であることを強調すべきである。本開示の精神および原理から実質的に逸脱することなく、上記される実施形態に多くの変形および修飾を加えることができる。上記に開示された他の特徴および機能のいくつか、またはそれらの代替物は、望ましくは、他の多くの異なるシステムまたは応用に組み合わせることができることが理解され得る。このような修飾および変形は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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