(57)【要約】【課題】アフリカ豚熱ウイルスワクチンに関する。【解決手段】本発明は、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え核酸分子に関する。本発明はさらに、該組換え核酸分子を含むウイルス粒子、およびアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子に関する。本発明はさらに、本発明の組換え分子および／または本発明のウイルス粒子を、免疫応答を誘導するのに有効な量でブタに投与することを含む、ブタにおける免疫応答を刺激する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む、組換え核酸分子、好ましくは組換えＤＮＡ分子であって、前記Ｔ細胞抗原が、プロテアソーム切断のためのシグナルを含むスペーサーによって、好ましくは、１〜１０個のアミノ酸残基のスペーサーによって分離されている、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記コードされたポリエピトープが、Ｔ細胞抗原として２〜５０個のペプチドを含む、請求項１に記載の組換え分子。
【請求項３】
前記コードされたポリエピトープが、Ｔ細胞抗原として２〜５０個のノナペプチド、好ましくは表１に示されるようにノナペプチド１〜１３個および１５〜２０個を含み、約１〜５個のアミノ酸残基のスペーサー、好ましくは表２に示されるようにスペーサー配列１〜１１によって分離されている、請求項１または２に記載の組換え分子。
【請求項４】
ユニバーサルＴ細胞エピトープをさらにコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え分子。
【請求項５】
ユビキチンのためのヌクレオチド配列を、好ましくは前記ポリエピトープの５’末端にさらに含み、前記組換え分子が、好ましくは図１Ｂに示される前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子を含む、ウイルス粒子。
【請求項７】
マーカータンパク質をさらに含む、請求項６に記載のウイルス粒子。
【請求項８】
ブタにおける免疫応答を刺激する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子、および／または請求項６もしくは７に記載のウイルス粒子を、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子と組み合わせて、免疫応答を誘導するのに有効な量で前記ブタに投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記組換え分子および／または前記ウイルス粒子が、非経口的に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え分子および／または前記ウイルス粒子が、２〜４回、好ましくは約２週間の間隔で投与され、前記組換え分子および／または前記ウイルス粒子の前記投与の少なくとも１つが、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／もしくはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされる、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え分子および／または前記ウイルス粒子の前記投与の少なくとも１つが、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来の合成Ｔ細胞抗原の投与と組み合わされる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ブタにおけるアフリカ豚熱ウイルスの感染および／もしくは伝播を予防または改善するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子、および／または請求項６もしくは７に記載のウイルス粒子を少なくとも１匹のブタに投与することを含み、前記組換え分子および／または前記ウイルス粒子の前記投与が、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされる、方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子を含むウイルス粒子と、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とを含む、ウイルス粒子のセット。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子を含むウイルス粒子と、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とを含む、パーツキット。
【請求項１５】
アフリカ豚熱ウイルスによる続発性感染症からブタを保護する方法で使用するための、請求項１３に記載のウイルス粒子のセット。
【請求項１６】
アフリカ豚熱ウイルスによる続発性感染症からブタを保護する方法で使用するための、請求項１４に記載のパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの分野、より具体的には、アフリカ豚熱ウイルス（ＡＳＦＶ）の分野に関する。本発明は、ＡＳＦＶによる感染から保護するワクチンを生成するための方法、ならびにブタにおけるアフリカ豚熱ウイルスの感染および／または伝播を予防または改善するためのそのようなワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフリカ豚熱（ＡＳＦ）は、ブタおよびイノシシだけが感染しやすいウイルス性疾病である。最初の感染後、症状が現れるまでに２〜１０日かかる場合がある。ウイルスの病原性によって、感染した動物の３０％〜１００％が死亡する。一般的な症状には、食欲不振、脱力、皮膚の赤み、眼粘膜の炎症、嘔吐、血性下痢、発熱が含まれる。また、皮膚が青くなり、皮膚の部分が死んで（黒い染み）、出血が起こることがあり得る。さらに、この疾病は妊娠中の雌ブタに自然流産を引き起こす場合がある。事前に目立った症状が全くなく、突然死することもあり得る。ＡＳＦの症状は、豚熱の症状に似ている。
【０００３】
ブタは急性期を生き延びて回復したように見えるが、ウイルスの長期保菌者（数ヶ月から全寿命にわたり）になるだけで、ウイルスを再び排泄して他の動物に感染させる。
【０００４】
このウイルスは、動物から動物へ直接伝播し、糞便、豚肉、その他の豚製品などの汚染物質、サシバエやダニ、特に、ウイルスが増殖するヒメダニの１種であるＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａを通じて伝播する。感染したブタの食品廃棄物や臓物にも、このウイルスの伝播に寄与するＡＳＦが含有する可能性がある。さらなる疾病の蔓延を防ぐために、国際的な対策や養豚場への警戒の維持などの試みが行われている。２００７年以降、東ヨーロッパ、中国、ロシアでＡＳＦが数回大流行している。ＡＳＦは最近、ベルギーにおいてイノシシ個体群で診断された。
【０００５】
ＡＳＦは、Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ科に属する大型の二本鎖ＤＮＡウイルスによって引き起こされる。ＤＮＡゲノムは、分離株によって１６０〜２１０ｋｂｐの長さの大幅な変動を示す。ゲノムは、１５０と１６７の間のオープンリーディングフレームを包含し、ＡＳＦＶ粒子の５４の構造タンパク質と、１００を超える感染タンパク質とを特定する［Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １７３：３−１４］。これまでに、血清型１型〜８型と命名された８つの血清型が特定されているが、さらに存在する可能性がある。このウイルスの複雑性および可変性により、ＡＳＦ感染から保護するワクチンの生成を複雑にしてきた。不活化ワクチン、サブユニットワクチン、弱毒生ワクチン、組換え型弱毒生ワクチンなど、いくつかの異なるアプローチが使用されている［Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ５，３５；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖａｃｃｉｎｅｓ５０４００３５］。
【０００６】
不活化ワクチンは、アジュバントの存在下でさえ、保護をもたらさないことが判明した［Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７．Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  ２８：４７５−４８１、Ｂｌｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２：３８７９−３８８２］。
【０００７】
サブユニットワクチンは、保護を全くもたらさなかったか、または部分的な保護のみをもたらした。これは、コード化されたタンパク質の数が多い（約１６０）こと、および関連するタンパク質を選択することが難しいことに一部起因し得る。さらに、多数のＡＳＦＶタンパク質の配列は、既知のタンパク質に似ておらず［Ｄｕｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１７：１１９−１３２］、これらのタンパク質の機能を予測することを困難にする。
【０００８】
弱毒生ワクチンは、毒性株またはＯＵＲＴ８８／３などの本来の低毒性株から得られる［Ｂｏｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：２１７７−２１８７］およびＮＨ／６８［Ｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５３：１８４５−１８５４］。これらの弱毒生ワクチンは、多くの場合、同種株に対して最大１００％の保護をもたらすが、異種株に対しては部分的な交差保護しかもたらさない。さらに、それらは多くの場合、肺炎、運動障害、壊死巣、流産、さらには死などの容認できない副作用を誘発する［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８．Ｖｅｔ  Ｊ  ２３３：４１−４８、Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ５，３５；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖａｃｃｉｎｅｓ５０４００３５］。
【０００９】
最近、最も有望な結果が、許容可能なレベルの安全性および有効性を達成するために、遺伝子欠失または遺伝子欠失の組み合わせが導入されている組換え型弱毒生ワクチンで得られている。種々のレベルの残留病原性の組み合わせであったが、使用された個々の菌株によって、特定の分離株に対する保護が観察された［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８．Ｖｅｔ  Ｊ  ２３３：４１−４８、Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ５，３５；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖａｃｃｉｎｅｓ５０４００３５］。これらの欠失変異株の長期的な遺伝的安定性は、現場条件でのより大規模な試験の結果であるので、知られていない。
【００１０】
したがって、効果的かつ安全であり、多数の異なるＡＳＦＶ株による感染に対する保護をもたらすワクチンを提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
したがって、本発明は、組換え核酸分子、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子であって、Ｔ細胞抗原がプロテアソーム切断のためのシグナルを含むスペーサーによって、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基のスペーサーによって分離されている、組換え核酸分子を提供する。該ポリエピトープは、好ましくは、Ｔ細胞抗原として２〜５０個のノナペプチド、好ましくは、表１に示すようにノナペプチド１〜１３個および１５〜２０個を含み、これらは、約１〜５個のアミノ酸残基のスペーサーによって、好ましくは表２に示すようにスペーサー配列１〜１１によって分離されている。
【００１２】
本発明の組換え分子は、ユニバーサルＴ細胞エピトープをさらにコードし得る。本発明の該組換え分子は、好ましくはポリエピトープの５’末端に、ユビキチンのためのヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の組換え分子を含むウイルス粒子を提供する。該ウイルス粒子は、マーカータンパク質をさらに含み得る。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の組換え分子および／または本発明のウイルス粒子を投与することを含む、ブタにおける免疫応答を刺激する方法を提供する。該投与は、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子と組み合わせて、免疫応答を誘導するのに有効な量でのブタへの投与であることが好ましい。該組換え分子は、好ましくは非経口的に、好ましくは筋肉内および／または皮内に、好ましくは免疫エレクトロポレーションによって投与される。該組換え分子および／またはウイルス粒子は、２〜４回、好ましくは約２週間の間隔で投与されることが好ましい。組換え核酸分子および／またはウイルス粒子の投与の少なくとも１つは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来の合成Ｔ細胞抗原の投与と組み合わされることが好ましい。組換え分子および／またはウイルス粒子の反復投与の少なくとも１つは、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされる。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の組換え核酸分子、および／または本発明のウイルス粒子、ならびに獣医学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の組換え分子、および／または本発明のウイルス粒子、ならびに獣医学的に許容される賦形剤を含む組成物の有効免疫量を含むワクチンを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の組換え分子および／または本発明のウイルス粒子を少なくとも１匹のブタに投与することを含む、ブタにおけるアフリカ豚熱ウイルスの感染および／または伝播を予防または改善するための方法を提供する。組換え分子および／またはウイルス粒子の該投与は、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされることが好ましい。
【００１８】
本発明はさらに、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子のセットおよびパーツキットを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子を含むウイルス粒子と、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とを含むウイルス粒子のセットを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の組換え分子を含むウイルス粒子と、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とを含むパーツキットを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の組換え分子を含むウイルス粒子と、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来の合成Ｔ細胞抗原とを含むパーツキットを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスの続発性感染症からブタを保護する方法で使用するために、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子、またはアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子のセットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】配列
【図１Ａ】ユビキチンおよびＴ細胞のエピトープを示す、組換え核酸分子の挿入。
【図１Ｂ】ＡＳＦＤＶＡＣ２の挿入。表１に示されるように、太字で示されるのは、ユビキチンアミノ酸配列、ならびにＴ細胞抗原１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１９、２０、１１、および１８である。イタリック体は、ＰＡＤＲＥアミノ酸配列およびＣｐＧ核酸配列を示す。
【図１Ｃ】ＭＶＡ−ｐ３０＋Ｂ６０２Ｌ核酸配列（３１０６ｂｐ）。５’末端から大文字のＳｗａＩ部位、ＴＫの左隣接部、太字で下線付きのＭＶＡ１３．５Ｌプロモーター、コザック配列、太字のＥ７５株からのｐ３０遺伝子のコード配列、下線付きのＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のｍＨ５からの終止配列、太字で下線付きのｍＨ５初期／後期プロモーター配列、コザック配列、太字のＢＡ７１Ｖ−Ｂ６０２Ｌ（９ＲＬ）のコード配列、下線付きのトリプルＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のＣ１１Ｒからの終止配列、ＴＫの右隣接部、および大文字のＳｗａＩ部位を示す。
【図１Ｄ】ＭＶＡ−ｐ５４＋ＥＰ４０２Ｒ＋Ｋ２０５Ｒ核酸配列（３３０９ｂｐ）。５’末端から大文字のＳｗａＩ部位、ＴＫの左隣接部、太字で下線付きのＭＶＡ１３．５Ｌプロモーター、コザック配列、太字のｐ５４遺伝子のコード配列、下線付きのＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のｍＨ５からの終止配列、ｍＨ５初期／後期プロモーター配列、太字のＢＡ７１Ｖ−Ｂ６０２Ｌ（９ＲＬ）のコード配列、下線付きのトリプルＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のＣ１１Ｒからの終止配列、太字で下線付きのＬＥＯプロモーター配列、コザック配列、太字のＢＡ７１Ｖ−Ｋ２０５Ｒ遺伝子のコード配列、下線付きのＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のＭ２Ｌからの終止配列、ＴＫの右隣接部、および大文字のＳｗａＩ部位を示す。
【図１Ｅ】ＭＶＡ−ｐ７２＋Ａ１０４Ｒ核酸配列（２９９２ｂｐ）。５’末端から大文字のＳｗａＩ部位、ＴＫの左隣接部、太字で下線付きのＭＶＡ１３．５Ｌプロモーター、コザック配列、太字のｐ７２遺伝子のコード配列、下線付きのＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のｍＨ５からの終止配列、太字で下線付きのｍＨ５初期／後期プロモーター配列、コザック配列、太字のＢＡ７１Ｖ−Ａ１４０Ｒのコード配列、下線付きのＦＬＡＧタグ配列、イタリック体の終止コドン、大文字のＣ１１Ｒからの終止配列、ＴＫの右隣接部、および大文字のＳｗａＩ部位を示す。
【図２】組換え核酸構築物によるワクチン接種の結果
【図２Ａ】生存率曲線。
【図２Ｂ】チャレンジ後の示された日数（ＤＰＣ）での群ごとの臨床スコア。白い列は死亡した動物を示す。
【図２Ｃ】ＥＬＩＳＰＯＴは、示されたＤＰＣでブタから分離された末梢血単核細胞から生じる。示されるように、細胞を培地、ウイルスおよびペプチド（ワクチン）で刺激した。
【図３】ウイルス構築物によるワクチン接種の結果
【図３Ａ】生存率曲線。
【図３Ｂ】異なる群のブタの平均病的状態指数。
【図３Ｃ】３つの治療群の細胞性免疫応答。末梢血単核細胞は、チャレンジ後の示された日数でブタから分離された（Ｘ軸：ＤＰＣ）。Ｙ軸：ＥＬＩＳＰＯＴで測定されたインターフェロンγ生成。示されるように、細胞を培地（陰性対照）、ウイルス（ＡＶＰ）およびペプチドで刺激した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１  定義
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞エピトープ」または「Ｔ細胞抗原」という用語は、抗原の細胞内プロセシング後に免疫系によって認識され得るエピトープを指す。プロセシング後、Ｔ細胞エピトープは少なくとも１つのＭＨＣ分子と結合し、抗原提示細胞の表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体として発現する。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、通常、長さが８〜１１個のアミノ酸であるのに対し、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、長さが約１２〜２５個のアミノ酸、好ましくは約１３〜１７個のアミノ酸のペプチドを提示し得る。例えば、タンパク質の両親媒性プロファイル、配列モチーフ、定量的マトリックス、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、定量的構造活性相関、分子ドッキングシミュレーションに基づいて、タンパク質内の潜在的なＴ細胞エピトープを予測することができるソフトウェアプログラムが利用可能である［Ｄｅｓａｉ  ａｎｄ  Ｋｕｌｋａｒｎｉ−Ｋａｌｅ，２０１４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８４：３３３−６４］。これらのプログラムには、ＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ＥＬＩＳｐｏｔ（ＰｅｐＳｃａｎ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＲＡＮＫＰＥＰ  ［Ｒｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５６：４０５−１９］、ｎＨＬＡＰｒｅｄ  ［Ｂｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ，２００７．Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  ３２：３１−４２］、およびＮｅｔＭＨＣ［Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ５０９−１２］が含まれる。
【００２６】
この用語はこの用途で使用されるので、好ましいＴ細胞エピトープ、またはＴ細胞抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープとも呼ばれるＭＨＣクラスＩエピトープであり、８〜１１個のアミノ酸残基、好ましくは約９個のアミノ酸残基を含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ポリエピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープ、好ましくはＭＨＣクラスＩエピトープなどの複数のエピトープを有する生体分子、好ましくはペプチドまたはタンパク質を指す。該個々のエピトープは、好ましくは、リンカー配列によって分離される。該リンカー配列は、柔軟性を可能にし、ポリエピトープの個々のエピトープへのプロセシングに関与することができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、該カセット内に存在する１つ以上のオープンリーディングフレームの発現をもたらす核酸分子を指す。発現カセットは、プロモーター配列、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、好ましくはポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域とを含むことが好ましい。発現カセットは、エンハンサー配列、１つ以上の転写後調節エレメント、および／または１つ以上のイントロン配列をさらに含み得る。真核細胞での発現の場合、該転写後調節エレメントおよび／または１つ以上のイントロン配列は、発現カセットの転写産物、すなわちメッセンジャーＲＮＡの核外輸送を増強して、細胞質内のＲＮＡの翻訳を可能にし得る。該発現カセットは、好ましくは、ブタにおける発現のために最適化される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２〜５０個のアミノ酸残基を含むタンパク質性分子を指す。ペプチドは、タンパク質を個々のペプチドにプロセシングする前に、より大きなタンパク質中に存在し得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、５０個を超えるアミノ酸残基を含むタンパク質性分子を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ノナペプチド」という用語は、９個のアミノ酸残基を含むペプチドを指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、ポリエピトープの個々のエピトープの間に存在し、プロテアソームによるエピトープの柔軟性およびプロセシング、ならびにＭＨＣによる個々のエピトープの提示を可能にする小さなペプチド、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基を指す。好適なスペーサーのアミノ酸配列は、例えば、ＵＳ２０１３００１１４２４、およびＴｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１−１２に示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＴ細胞エピトープ」という用語は、多くの異なるＭＨＣ分子によって結合および表示されるペプチド配列を指し、したがって、多くの個体の免疫系を活性化すると想定される。該ユニバーサルＴ細胞エピトープは、好ましくは、Ｔヘルパー細胞エピトープとも呼ばれるＭＨＣクラスＩＩエピトープである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ユビキチンのためのヌクレオチド配列」という用語は、ユビキチンをコードするヌクレオチド分子を指す。ユビキチンは７６個のアミノ酸タンパク質であり、その配列は無脊椎動物から哺乳類への進化を通じて高度に保存される。ユビキチンはＡＴＰ依存性の非リソソームタンパク質分解に関与する。該ヌクレオチド配列は、好ましくは、アミノ酸配列Ｎ−ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧを発現する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ウイルス粒子」という用語は、弱毒化され、自主的に伝播することができない感染性ウイルス粒子またはウイルス様粒子を指す。ウイルス粒子のゲノムは、好ましくは、感染細胞からの該粒子の脱落に関連する遺伝子の欠失を含む。該遺伝子の欠失により、本発明によるＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープをコードする発現カセットを含む、例えば組換えＤＮＡ分子をコードする外来遺伝子の挿入のための空間を提供する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ブタ」という用語は、偶蹄類のＳｕｉｄａｅ科の動物を指す。ブタという用語には、家畜化ブタとその祖先、一般的なユーラシアブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、パラワンイノシシ、ボルネオヒゲイノシシ、オオクチイノシシまたはベトナムイボイノシシ、ビザヤンヒゲイノシシ、セレベスヒゲイノシシ、フローレスイボイノシシ、ミンドロイボイノシシ、フィリピンヒゲイノシシ、スンダイボイノシシ、バビルサ、ワルトグ、およびイボイノシシが含まれる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、アフリカ豚熱ウイルスを有するブタの続発性感染症に影響を与える、本発明による組換え分子および／または本発明による１つ以上のウイルス粒子の量を意味する。
【００３８】
２  組換え核酸分子
本発明は、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え核酸分子であって、Ｔ細胞抗原がプロテアソーム切断のためのシグナルを含むスペーサーによって、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基のスペーサーによって分離されている、組換え核酸分子を提供する。
【００３９】
該核酸分子、好ましくはＲＮＡまたはＤＮＡは、当業者に知られているように、ポリメラーゼ、制限酵素、およびリガーゼの使用を含む組換え技術によって生成されることが好ましい。あるいは、該核酸は、人工遺伝子合成によって、例えば、部分的にもしくは完全に重複するオリゴヌクレオチドの合成によって、または当業者に知られているように、有機化学および組換え技術の組み合わせによって提供される。該核酸は、好ましくは、ワクチン接種されたブタにおけるポリエピトープをコードする発現カセットの発現を増強するためにコドン最適化される。さらなる最適化には、隠れたスプライス部位の除去、隠れたポリＡテールの除去、および／またはｍＲＮＡの好ましくない折り畳みを引き起こす配列の除去が含まれ得る。スプライス部位に隣接するイントロンの存在により、感染細胞の核からの輸送が促進され得る。
【００４０】
一実施形態では、該核酸分子は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、および好ましくは自己複製ＲＮＡを含むＲＮＡである。該自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、麻疹ウイルスおよび／またはフラビウイルスに由来するような、ＲＮＡ分子の増幅のためのウイルス系に基づくことができる。該ＲＮＡは、ナノ粒子、ポリエチレンイミン、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）などの合成カチオン性脂質を含むカチオン性脂質、リポフェクタミン、ＳＡＩＮＴ（登録商標）、および／またはキトサンなどの分子と複合体を形成し得る、あるいはこれらの分子とともに縮合され得る。
【００４１】
発現カセットは、好ましくは、例えばウイルス起源（例えば、ヒトサイトメガロウイルス）の強力なプロモーターまたはブタ細胞などの細胞で高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターなどの高発現レベルのための手段を含む（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，２００４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２０、８８０−８８９；米国特許第５８８８８０９号）。
【００４２】
本発明による発現カセットを含む、組換え核酸分子を含む宿主細胞がさらに提供される。該宿主細胞は、本発明による組換え核酸分子の将来の生成のために増殖または保存され得る。該細胞は、好ましくは、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００４３】
核酸は、好ましくは、ブタへの投与前に、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液に可溶化される。投与は、好ましくは、動物あたり合計１μｇ〜１ｍｇの核酸を含む。
【００４４】
ポリエピトープをコードする発現カセットを含む該組換え核酸分子は、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来の２〜５０個のＴ細胞抗原、好ましくは５〜３０個のＴ細胞抗原、より好ましくは、１８個のＴ細胞抗原、１９個のＴ細胞抗原、２０個のＴ細胞抗原および２１個のＴ細胞抗原などの約２０個のＴ細胞抗原を発現する。好適なＴ細胞抗原は、好ましくは、利用可能なソフトウェアプログラムを使用して予測される。好ましいＴ細胞抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ結合親和性を有する。好適なＴ細胞抗原の分析に含まれる好ましいソフトウェアプログラムは、ＮｅｔＭＨＣと呼ばれ［Ａｎｄｒｅａｔｔａ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ、２０１６。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３２：５１１−７］、アラインメント内の挿入と削除を可能にする人工ニューラルネットワークに基づく。異なるＭＨＣ分子の長さプロファイルを学ぶことができる。自己ペプチドは、自己免疫疾病を引き起こす可能性があるため、好適なＴ細胞抗原として選択されないことが好ましい。
【００４５】
該２〜５０個のＴ細胞抗原は、プロテアソーム切断ためのシグナルを含むスペーサーによって、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基のスペーサーによって分離されている、６〜１５個のアミノ酸残基、好ましくは８個および１１個のアミノ酸残基、より好ましくは約９個のアミノ酸残基のペプチドである。好ましいＴ細胞抗原は、アフリカ豚熱ウイルスタンパク質ＭＧＦ＿５０５−７Ｒ、ＮＰ１４５０Ｌ、Ｇ１３４０Ｌ、Ｂ３８５Ｒ、Ｇ１２１１Ｒ、Ｅ４２３Ｒ、ＮＰ１４５０Ｌ、ＭＧＦ＿５０５９Ｒ、Ｅ３０１Ｒ、Ｃ７１７Ｒ、ＥＰ４２４Ｒ、Ｆ７７８Ｒ、ＣＰ５３０Ｒ、Ｒ２９８Ｌ、ＣＰ２４７５Ｌ、Ｏ１７４Ｌ、ＭＧＦ＿３６０−２Ｌ、ＮＰ１４５０Ｌ、Ｍ１２４９Ｌ、および／またはＭＧＦ＿３６０−１ｌに由来する。
【００４６】
好ましいＴ細胞抗原は、表１に示すペプチドから選択される。
【表１】
2022500050.tif 000002
【００４７】
本発明による発現カセットを含む好ましい組換え核酸分子は、好ましくは表１のペプチド１〜２０、より好ましくは、ペプチド１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、より好ましくは、ペプチド１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１９、２０、１１、１８をＮ末端から、この順序でコードする。
【００４８】
該スペーサーは、好ましくは約１〜５個のアミノ酸残基、例えば、２個のアミノ酸残基、３個のアミノ酸残基、および４個のアミノ酸残基である。好ましいスペーサーには、表２に示すペプチドが含まれる。
【表２】
2022500050.tif 000003
【００４９】
本発明による発現カセットを含む好ましい組換え核酸分子は、好ましくは、ユニバーサルＴ細胞エピトープをコードする。該ユニバーサルＴ細胞エピトープは、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのＴ細胞エピトープの前、したがって、これらのＴ細胞エピトープに対してＮ末端に位置する。このようなユニバーサルＴ細胞エピトープの例は、Ｋｈａｔｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：４２３３−４２５４に記載されている。好ましいユニバーサルＴ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥと名付けられた非天然のパンＤＲエピトープによって提供され、アミノ酸配列ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａＺＣ（ＸはＬ−シクロヘキシルアラニンを表し、Ｚはアミノカプロン酸を表す）を有する（（Ａｌｅｘａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１６２５−１６３３）。発現の目的で、配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＡＲＹを有する誘導体が好ましくは使用される。
【００５０】
本発明による発現カセットを含む好ましい組換え核酸分子は、好ましくは、好ましくは、ポリエピトープの５’末端にユビキチンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。Ｔ細胞抗原を含むポリエピトープへのユビキチンの融合により、プロテアソームへのターゲティングが増強され、ポリエピトープのプロセシングの改善、Ｔ細胞応答の増強になる。
【００５１】
好ましい組換え核酸分子は、図１Ｂに示すヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
３  ウイルス粒子
本発明はさらに、本発明によるアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え核酸分子を含むウイルス粒子を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を発現する組換え核酸分子を含むウイルス粒子を提供する。該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ（ｐＥＰ４０２Ｒ）、Ａ１０４Ｒ（ｐＡ１０４Ｒ）および／またはＢ６０２Ｌ（ｐＢ６０２Ｌ）から選択される。当業者は、「タンパク質ＥＰ４０２Ｒ」という用語がｐＥＰ４０２Ｒを指し、「タンパク質Ａ１０４Ｒ」という用語がｐＡ１０４Ｒを指し、「タンパク質Ｂ６０２Ｌ」という用語がｐＢ６０２Ｌを指すことを理解するであろう。該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌのアミノ酸配列を含み、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌの実質的に完全なアミノ酸配列を含む。このようなアミノ酸配列の例として、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３４２０４（Ｐ３０＿ＡＳＦＢ７）によるＢａｄａｊｏｚ  １９７１株由来のリン酸化タンパク質ｐ３０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６５１９４によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来の外被タンパク質ｐ５４、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２２７７６によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来の主要カプシドタンパク質ｐ７０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８９５０１によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来のＣＤ２ホモログＥＰ４０２Ｒ、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ６８７４２によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来のウイルスヒストン様タンパク質Ａ１０４Ｒ、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６５１６９によるＢｏａｄａｊｏｚ１９７１株由来のタンパク質Ｂ６０２Ｌが提供される。
【００５４】
該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、例えば、ｐ３０とＢ６０２Ｌ、ｐ７２とＡ１０４Ｒ）および／もしくはｐ５４とＥＰ４０２Ｒの発現のためのタンデム発現カセット、または例えば、ｐ５４とＥＰ４０２ＲとＫ２０５Ｒ）の発現のためのトリプル発現カセットを使用して発現される。Ｂ細胞抗原をコードするＤＮＡ構築物は、当業者に知られているように、合成的に生成され得、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得られる。Ｂ細胞抗原をコードする領域は、好ましくは、これらの遺伝子の発現を促進するために、異なるＭＶＡプロモーターおよび転写終結配列とともにクローン化される。さらに、該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、タンパク質発現の検出を可能にするために配列タグを備える。好適なタグには、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，２００６．Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７，３５３−３５８に記載されるように、６ｘＨｉｓタグ、ｃ−ｍｙｃドメイン（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ヘマグルチニンタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧタグペプチド、ビオチン受容体ペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチド、およびカルモジュリン結合ペプチドが含まれる。好ましいタグは、ＦＬＡＧタグである。該タグは、好ましくは、Ｂ細胞抗原のＣ末端に存在する。
【００５５】
該組換え核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子の伝達のためのベクターとして使用することができるウイルス粒子には、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、脾臓フォーカス形成ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、もしくはＳＦＧガンマレトロウイルス（Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．ＰＮＡＳ  ９２：６７３３−６７３７）などのレトロウイルスベースベクター、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ；Ｍａｃｋｏｗｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ａｄｖ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  ４１：５７１−５８３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０：ｅ１６３８）、もしくはカナリア痘ウイルス、アレナウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス［Ｋｏｒｔｅｋａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：２２７１−２２７６）などのポックスウイルス、および／またはリフトバレー熱ウイルスなどのブニヤウイルス（Ｗｉｃｈｇｅｒｓ  Ｓｃｈｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８：１０８８３−１０８９３）に基づく粒子が含まれる。
【００５６】
好ましいウイルス粒子は、ポックスウイルスに基づく。該ウイルス粒子は、好ましくは、Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０：ｅ１６３８）に記載されているような改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベースの粒子である。ＭＶＡにおける好ましい発現カセットは、例えば、ＵＳ２０１５／０２９９２６７に記載されるように、ＭＶＡ１３．５プロモーター配列を含む。発現カセットは、好ましくは、当業者に知られている手順に従って、細菌人工染色体（ＢＡＣ）組換え工学法（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって、ＭＶＡ（弱毒天然痘）ワクチンベクターのＴＫ遺伝子に挿入される。
【００５７】
該ウイルス粒子は、好ましくは真核細胞において生成される。該真核細胞は、好ましくは、例えば、酵母細胞およびニワトリ線維芽細胞など、当業者に知られている標準的な方法を使用して容易に感染および／またはトランスフェクトすることができる細胞である。該真核細胞は、好ましくは、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。好適な昆虫細胞には、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）卵巣細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞およびＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ  Ｃ６／３６細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞には、例えば、ベイビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ２９３および浮遊性ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのヒト胎児腎細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａおよびＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕ、ＦＪｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１９１７）が含まれる。好ましい細胞は、ＨＥＫ２９３およびフリースタイルＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞などのヒト胎児腎細胞である。
【００５８】
一実施形態では、該ウイルス粒子は、マーカータンパク質をさらに含む。該マーカータンパク質は、本発明によるウイルス粒子を投与されたブタの識別を可能にする。該マーカータンパク質は、ワクチン接種されたブタを野生型ＡＳＦＶに感染したブタから識別することを可能にする。該マーカータンパク質は、好ましくは、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼおよび／または分泌型アルカリホスファターゼである。マーカータンパク質が本発明のウイルス粒子を投与された細胞において発現されるので、該マーカータンパク質のコード配列が本発明によるウイルス粒子のゲノムに存在することを当業者は理解するであろう。
【００５９】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子のセットを提供する。
【００６０】
本発明はさらに、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子を含むウイルス粒子と、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とのセットを提供する。
【００６１】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子を含むパーツキットを提供する。
【００６２】
該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択される。該Ｂ細胞抗原は、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌのアミノ酸配列を含み、好ましくは、タンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはアフリカ豚熱ウイルスのＢ６０２Ｌの実質的に完全なアミノ酸配列を含む。このようなアミノ酸配列の例として、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３４２０４（Ｐ３０＿ＡＳＦＢ７）によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来のリン酸化タンパク質ｐ３０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６５１９４によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来の外被タンパク質ｐ５４、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２２７７６によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来の主要カプシドタンパク質ｐ７０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８９５０１によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来のＣＤ２ホモログＥＰ４０２Ｒ、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ６８７４２によるＢａｄａｊｏｚ１９７１株由来のウイルスヒストン様タンパク質Ａ１０４Ｒ、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６５１６９によるＢｏａｄａｊｏｚ１９７１株由来のタンパク質Ｂ６０２Ｌが提供されている。
【００６３】
本発明はさらに、ウイルス粒子と、本発明によるアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え分子と、好ましくは本発明によるアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含む１つ以上のウイルス粒子とを含む、パーツキットを提供する。
【００６４】
本発明はさらに、ウイルス粒子と、本発明によるアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え分子と、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来の合成Ｔ細胞抗原とを含む、パーツキットを提供する。
【００６５】
４  ブタの免疫応答を刺激する方法
本発明はブタにおける免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は本発明の組換え分子、および／または本発明のウイルス粒子を、免疫応答を誘導するのに有効な量でブタに投与することを含む。
【００６６】
本発明はブタにおける免疫応答を刺激する方法を提供し、方法は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え分子、および／または請求項６もしくは７に記載のウイルス粒子を、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子と組み合わせて、免疫応答を誘導するのに有効な量でブタに投与することを含む。
【００６７】
本発明の組換え分子、および／または本発明のウイルス粒子は、好ましくは、組成物、好ましくは医薬組成物で提供される。
【００６８】
組換え核酸分子および／またはウイルス粒子は、当業者に知られている任意の方法、例えば注射、局所受動拡散またはイオントフォレーシスのためのパッチ、エレクトロポレーション、熱マイクロポレーション、経鼻スプレー、エアロゾル上気道および肺吸入、ソノポレーション、化学物質、機械摩耗、ならびに動的／弾道送達［Ｗｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３６：４２７−４３７］によってブタに投与され得る。
【００６９】
好ましくは、組換え核酸分子および／またはウイルス粒子は、注射などによって非経口的に投与される。本発明による組換え核酸分子および／またはウイルス粒子は、好ましくは、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに調製される。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内もしくは真皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内および頭蓋内の注射または注入技術を含む。
【００７０】
本発明による組換え核酸分子は、より好ましくはエレクトロポレーションによって、より好ましくは筋肉内／皮内エレクトロポレーションによってブタに投与される。エレクトロポレーションは、例えば、１．５ｍｍの間隔での直径０．４３ｍｍの金メッキトロカール針のアレイ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）（５０μＬのプラスミド製剤のＭａｎｔｏｕｘ送達よって、および２５Ｖの１００ｍｓパルスを適用することによって形成された皮膚小疱上に押される）と；ポータブルパルスジェネレーター（ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ；Ｎｅｐａ  Ｇｅｎｅ，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｊａｐａｎ）およびピンセット電極（出力電流３００〜６００ｍＡで１０ミリ秒の６パルス）と；ハンドルに取り付けられた無針マイクロパッチ丸型電極を備え、それぞれ６０、７０、または８０Ｖで６つの方形波パルスが適用され、パルス持続時間が６０ミリ秒、パルス間隔が２００ミリ秒、および３パルス後、極性が反転するＢＴＸＥＣＭ８３０パルスジェネレーター（モデルＭＰ３５）（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とからなる電極アレイを使用して行うことができる。
【００７１】
さらに好ましい方法では、右大腿部の約３ｃｍ離れた２つの部位に、注射部位あたり０．２５ｍＬの容量での筋肉内投与が用いられる。注射の直後に、Ｃｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ（ＩＧＥＡ）を使用するインビボエレクトロポレーション方法を、線形／六角形の針電極で注射部位に適用することができる。針間の間隔は、好ましくは約２ｃｍであり、エレクトロポレーターは好ましくは１００Ｖに設定される。０．６Ａの平均アンペア数を維持するために５０Ｖ／ｃｍの電流が使用される。約５〜５０ミリ秒、好ましくは約２０ミリ秒の２〜２０パルス、好ましくは５〜１０パルス、好ましくは約８パルスが５０〜５００ミリ秒、好ましくは約２００ミリ秒の間隔で適用される。
【００７２】
該投与は、組換え分子および／またはウイルス粒子が合計２〜４回投与されるように、１〜３回繰り返されることが好ましい。反復投与は、約２週間の間隔で行われることが好ましい。
【００７３】
防御免疫応答には、細胞性免疫と血清学的免疫の両方を必要とする場合がある。したがって、ブタにおける免疫応答を刺激する好ましい方法において、組換え分子および／またはウイルス粒子の投与の少なくとも１つは、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含む、好ましくは２〜５０個のペプチド、より好ましくは約１０〜３０個のペプチド、例えば、１８個のペプチド、１９個のペプチド、２０個のペプチド、および２１個のペプチドなどの約２０個のペプチドを含む合成ペプチドの投与と組み合わされる。
【００７４】
Ｔ細胞抗原を含む該ペプチドは、好ましくは６〜１５個のアミノ酸残基、好ましくは８個および１１個のアミノ酸残基、より好ましくは約９個のアミノ酸残基のペプチドである。好ましいペプチドは、表１に示すペプチドから選択される。
【００７５】
該ペプチドは、好ましくは注射などによって、より好ましくは筋肉内注射によって投与される。
【００７６】
ブタにおける免疫応答を刺激する好ましい方法において、組換え分子および／またはウイルス粒子の投与の少なくとも１つは、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされる。
【００７７】
ブタに投与される本発明のウイルス粒子の量は、一般に、動物あたり１，０００〜１，０００，０００，０００の感染性ウイルス粒子の範囲である。感染性粒子の量は、例えば、用量反応曲線などの当業者に知られている標準的な技術を使用して決定することができる。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の組換え分子および／またはウイルス粒子を含む組成物、好ましくは獣医学的に許容される組成物、および獣医学的に許容される賦形剤を提供する。
【００７９】
該組成物は、好ましくは、水性または油性の懸濁液である。この懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）および懸濁剤を使用して、当技術分野で知られている技術に従って調製することができる。用いられ得る、許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化されたものと同様に、好適な組成物の調製に有用である。これらの油性溶液もしく油懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅａ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａに記載されるものと同様のアルコールも含み得る。
【００８０】
本発明はさらに、本発明の組換え分子および／またはウイルス粒子を含む有効な免疫量の組成物、および獣医学的に許容される賦形剤を含むワクチンを提供する。該ワクチンは、好ましくは、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子をさらに含み、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択される。
【００８１】
本発明のウイルス粒子を含む組成物は、好ましくは、インターフェロンγなどのサイトカイン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性核酸配列、リポソーム、ウイルス様粒子、ヘキサデシルアミンなどの界面活性剤、ピランおよびデキストラン硫酸などのポリアニオンを含むアジュバントをさらに含む。
【００８２】
国際特許出願第ＷＯ２００２／０２６２５５Ａ１号に記載されるように、好ましいアジュバントはＩＳＣＯＭである。ＩＳＣＯＭテクノロジーには、他のアジュバントに対する利点がいくつかある。ＩＳＣＯＭは、液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を刺激する。ＩＳＣＯＭは非常に効率的なアジュバントであり、本発明による不活化またはその一部の量のさらなる削減を可能にする。好ましいＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭ  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍである。
【００８３】
別の好ましいアジュバントはＢＬＰである。ＢＬＰは、不活化Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ細菌に由来する自己アジュバントワクチン送達ビヒクルである。Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、チーズやプロバイオティクス飲料の製造など、食品業界で一般的に使用される安全な細菌である。ＢＬＰは、単純な熱酸処理によって生成され、主にペプチドグリカン表面からなる強力なセル形状のマトリックスになる。該ペプチドグリカンは、好ましくは、ＷＯ２０１０／０３３０３１に記載されるように、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞壁加水分解酵素ＡｃｍＡのＣ末端ペプチドグリカン結合ドメインＬｙｓＭを含む。この表面は、疾病の原因となる病原体からの保護に必要な長期的な免疫を誘導する。ＢＬＰ粒子の非生物的性質により、播種のリスクなしに正確な投薬が可能になる。
【００８４】
ＢＬＰはまた、選択した特定の抗原、例えば、アフリカ豚熱ウイルスのＴ細胞抗原および／またはＢ細胞抗原を含む本発明の１つ以上のウイルス粒子を効率的に負荷することができる安全で多用途の骨格を提供する。ＷＯ２０１０／０３３０３１に記載されるように、非共有結合技術を使用することにより、ＢＬＰに抗原を完全に負荷することが達成される。この技術により、抗原融合とＢＬＰの単純な混合が可能になり、その結果、抗原が粒子の表面に強力かつ即時に結合する。得られた抗原で覆われたＢＬＰは、好ましくは、注射を必要とせずに、鼻部（スプレー）または口腔（カプセル）の粘膜層を介してブタに送達される。
【００８５】
本発明はさらに、ブタにおけるアフリカ豚熱ウイルスの感染および／または伝播を予防または改善するための方法を提供し、方法は、アフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含む組換え分子、および／または該組換え分子を含むウイルス粒子を少なくとも１匹のブタに投与することを含む。組換え分子および／またはウイルス粒子の該投与は、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒおよび／またはＢ６０２Ｌから選択されるアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子の投与と組み合わされることが好ましい。
【００８６】
該方法は、野生型の病原性のあるアフリカ豚熱ウイルスによる続発性感染症に対する保護を提供する。保護は、疾病の臨床症状の生存と不在、および水平および垂直方向の伝播を含むあらゆる伝染経路による野生型ウイルスの前方への伝播の減少として定義される。保護の開始までの時間および長期にわたる保護は、ワクチンの有効性の一部である。さらに、異なるウイルス種または血清型に対する広範な保護も、本発明によるワクチンの有効性の一部である。
【００８７】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスによる続発性感染症からブタを保護する方法で使用するための、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含むＴ細胞抗原もしくはアフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原を含むウイルス粒子、またはアフリカ豚熱ウイルスのＴ細胞抗原およびＢ細胞抗原を含むウイルス粒子のセットを提供する。
【００８８】
本発明はさらに、アフリカ豚熱ウイルスによる続発性感染症からブタを保護する方法で使用するための、好ましくはアフリカ豚熱ウイルスのタンパク質由来のＴ細胞抗原を含むポリエピトープをコードする発現カセットを含むＴ細胞抗原と、アフリカ豚熱ウイルスのＢ細胞抗原とを含むウイルス粒子を含むパーツキットを提供する。
【００８９】
明確さおよび簡潔な説明の目的で、本明細書では特徴を同じ実施形態または別々の実施形態の一部として記載しているが、しかしながら本発明の範囲は、記載される特徴のすべてまたはいくつかの組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解されよう。
【実施例】
【００９０】
実施例１：ＡＳＦＶ  Ｔ細胞エピトープの発現に基づくＤＮＡワクチン接種
方法：
既知のＡＳＦ分離株の全ゲノム配列およびブタのゲノム配列に基づいて、エピトープ予測プログラムＮｅｔＭＨＣｐａｎを使用して、ウイルス株またはブタの品種に依存しないＴ細胞エピトープのリストを用意した（表１を参照）。上位１９のＴ細胞エピトープを使用して、ポリエピトープ合成ＤＮＡワクチンを生成した。ＤＮＡ配列は、プロテアソーム切断およびさらなるプロセシングのためのシグナルを含む３〜５アミノ酸のスペーサーによって分離された１９個のノナペプチドエピトープをコードした（図１Ａを参照）。エピトープ１４は、正しいプロセシングを妨げる可能性があるため、使用しなかった。また、いわゆるＰＡＤＲＥユニバーサルＴ細胞エピトープ配列がこの目的のために含まれていた（図１Ｂを参照）。プロテアソーム分解を促進するために、ユビキチンのためのヌクレオチド配列を合成遺伝子の５’末端に付加した。これにより、プロテアソームによるより効率的な分解と、宿主Ｔ細胞へのエピトープの提示の改善がもたらされる。最終に、ＣｐＧアジュバント配列を合成遺伝子の３’ＵＴＲに付加した。合成遺伝子のコドン最適化したものを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで化学的に合成し、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してプラスミドｐＣＶＩ（ＣｌａＩ制限フラグメントを除去することによって得られるｐＣＩ−ｎｅｏ［Ｐｒｏｍｅｇａ］の派生物）のＣＭＶプロモーターの後ろにクローン化した。得られたプラスミドをｐＣＶＩ−ＡＳＦＤＶＡＣ２と名付けた。
【００９１】
各々６匹のブタからなる３つの群をワクチン接種チャレンジ試験に使用した。１群の動物にｐＣＶＩ−ＡＳＦＤＶＡＣ２を３回ワクチン接種した。２群の動物にも３回ワクチン接種したが、３回目のＤＮＡワクチン接種と同時に、合成遺伝子のＴ細胞エピトープに対応する合成ノナペプチドの混合物による追加免疫も投与した。対照群（３群）の動物に空のプラスミドｐＣＶＩを３回ワクチン接種した。ブタに２週間の間隔でワクチン接種した。ワクチンは、Ｃｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置（ＩＧＥＡ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｃａｒｐｉ，Ｉｔａｌｙ）を使用して免疫エレクトロポレーションによって筋肉内／皮内に適用した。エレクトロポレーション装置によって生成された電気パルスは、周囲の組織によりＤＮＡの取り込みを改善する。ペプチドを筋肉内ワクチン接種で適用した。最終ワクチン接種から２週間後、ブタにＡＳＦＶ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ８６株を投与した（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｂｉｏｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｔｅｒｐｓｔｒａ  ａｎｄ  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，１９８６．Ｔｉｊｄｓｃｈｒｉｆｔ  ｖｏｏｒ  ｄｉｅｒｇｅｎｅｅｓｋｕｎｄｅ  １１１：３８９−３９２を参照）。この菌株はブタ肺胞マクロファージにおいて増殖した。感染したブタを、臨床症状について２週間超にわたり経過観察した。血中のウイルスレベルをＰＣＲによって決定した。抗体応答を抗原として全ウイルスを使用するＥＬＩＳＡによって調べた。ＩＦＮ−γ分泌細胞のレベルは、ウイルスまたは２０個のノナペプチドのカクテルによるインビトロ刺激後にＥＬＩＳＰＯＴで決定した。
【００９２】
結果：
非ワクチン接種対照群（群３）のチャレンジ感染は４０％の生存率であった。ワクチン接種により、１群および２群では約８３％の生存率であった（図２Ａを参照）。２群のブタは、他の群のブタよりも総臨床スコアが有意に低かった（図２Ｂ）。この群のブタはまた、最初のワクチン接種後（ｐ．ｖ．）４２日目（チャレンジから［ｐ．ｃ．］０日目）から実験の終了まで、ノナペプチドのカクテルに対して著しいＩＦＮ−γ分泌細胞応答を示した（図２Ｃを参照）。２群のブタは、ｐ．ｖ．４９日目（ｐ．ｃ．７日目）からノナペプチドのカクテルに対して著しいＩＦＮ−γ分泌細胞応答を示した。ノナペプチドのカクテルに対するＩＦＮ−γ分泌細胞応答は、対照群では観察されなかった。すべての群は、ｐ．ｖ．５６日目にウイルスに対して著しいＩＦＮ−γ分泌細胞応答を示した。（ｐ．ｃ．１４日目）群間で血中のウイルスＤＮＡレベルに有意差は見られなかった。ＡＳＦ抗体ＥＬＩＳＡのブロッキング率のレベルに有意差は観察されなかった。
【００９３】
実施例２：ＡＳＦＶ  Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープを発現するＭＶＡベクターを使用するワクチン接種
方法：
ポリエピトープＤＮＡワクチンの有望な結果に基づいて、合成ＡＳＦＤＶＡＣ２遺伝子にＭＶＡ  １３．５プロモーター配列を付加し、公開された手順（Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ，２０１２．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８９０：３７−５７）に従ってＢＡＣ組換え工学法によってＭＶＡ（弱毒天然痘）ワクチンベクターのＴＫ遺伝子に挿入した。得られたウイルスをＭＶＡ−ＶＡＣ２と名付けた。ＭＶＡ−ＶＡＣ２の挿入部分は、５’末端から、ＴＫの左隣接部、ＭＶＡ  １３．５Ｌプロモーター、コザック配列、合成ＡＳＦＤＶＡＣ２遺伝子、ｍＨ５からの終止配列、およびＴＫの右隣接部を含む。
【００９４】
さらに、ＢＡＣリオンビニアリング（ｒｅｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して、６種のよく知られた主要なＡＳＦＶ  Ｂ細胞抗原（ｐ３０、ｐ５４、ｐ７２、ＥＰ４０２Ｒ、Ａ１０４Ｒ、およびＢ６０２Ｌ）をコードする遺伝子をタンデム（ｐ３０＋Ｂ６０２Ｌ；ｐ７２＋Ａ１０４Ｒ）、またはトリプル（ｐ５４＋ＥＰ４０２Ｒ＋Ｋ２０５Ｒ）遺伝子発現カセット（それぞれ、ＭＶＡ−ｐ３０／Ｂ６０２Ｌ、ＭＶＡ−ｐ７２／Ａ１０４Ｒ、およびＭＶＡ−ｐ５４／ＥＰ４０２Ｒ／Ｋ２０５Ｒを使用してＭＶＡベクターに挿入した。この目的のために、合成ＤＮＡ構築物を生成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、タンパク質コード領域にこれらの遺伝子の発現を促進するためのさまざまなＭＶＡプロモーターおよび転写終結配列を組み込んだ。さらに、タンパク質発現の検出を可能にするために、タンパク質コード領域の各々に、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ配列を組み込んだ。
【００９５】
各々１０匹のブタからなる３つの群をワクチン接種チャレンジ実験に使用した。１群の動物には、１０８のＴＣＩＤ５０ＭＶＡ−ＶＡＣ２を使用して筋肉内に２回ワクチン接種した。２群の動物には、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを発現する４つのすべてのＭＶＡ組換え体の組み合わせ（各々１０８のＴＣＩＤ５０）を２回ワクチン接種した。３群からの非ワクチン接種動物を対照とした。２回目のワクチン接種から２週間後、動物にＡＳＦＶ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ８６株を投与した。
【００９６】
結果：
非ワクチン接種動物（３群）のチャレンジ感染は、０％の生存率をもたらした（図３Ａを参照）。４つのＭＶＡ組換え体すべての組み合わせでワクチン接種した（２群）１０匹のブタのうち９匹が生存し、わずか数日間、軽度の病的状態のみを示した。ＭＶＡ−ＶＡＣ２のみをワクチン接種した１群の動物では、４匹のブタが生存した。この１群の動物は、２群の動物と比較して、病的状態をより多くかつより長い期間にわたり示した（図３Ｂを参照）。これらの結果は、Ｔ細胞ノナペプチドエピトープまたはＡＳＦＶ抗原全体のカクテルに対するＩＦＮ−γ分泌細胞応答で測定された細胞性免疫（ＣＭＩ）とよく対応する（図３Ｃ）。
【００９７】
結論：
この試験では、ＡＳＦＶ  Ｔ細胞ならびにＢ細胞エピトープを発現するＭＶＡベクターウイルスからなる混合ワクチンを使用することにより、ＡＳＦＶワクチンの開発に有望な結果が得られた。混合ワクチンは、チャレンジ後の死亡および臨床疾病に対する保護をもたらした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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