(57)【要約】不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラット細胞およびラット、ならびにこのようなラット細胞およびラットを作製および使用する方法が提供される。不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットはＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）をモデル化する。推定Ｃ３Ｇ治療剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むこのようなラットを使用するための方法が提供される。本発明は、例えば、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットを提供する。
2022500047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット。
【請求項２】
前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンが変異または欠失している、請求項１に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項３】
前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンが欠失している、請求項２に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項４】
前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソンにおけるコード配列が欠失している、請求項３に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項５】
前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のイントロンにおけるスプライスドナー部位が欠失している、請求項４に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項６】
前記ラットが雄である、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項７】
前記ラットが雌である、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項８】
前記ラットが、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座に対してホモ接合性である、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項９】
前記ラットが、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の１つまたは複数の症状を有する、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１０】
野生型ラットと比較して低下した循環Ｃ３レベルを有する、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１１】
前記循環Ｃ３レベルが、約２００μｇ／ｍＬ未満である、請求項１０に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１２】
前記循環Ｃ３レベルが、約１００μｇ／ｍＬ未満である、請求項１１に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１３】
約７週齢から約１７週齢の間で、前記野生型ラットと比較して低下した循環Ｃ３レベルを有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１４】
野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、または増加した尿中アルブミンレベルを有する、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１５】
野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、および増加した尿中アルブミンレベルを有する、請求項１４に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１６】
前記血中尿素窒素レベルが、約１０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約２０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約３０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約４０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約５０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約６０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約７０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約８０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約９０ｍｇ／ｄＬを超えるか、または約１００ｍｇ／ｄＬを超える、請求項１４または１５に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１７】
前記血清中シスタチンＣレベルが、約１０００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１１００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１２００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１３００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１４００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１５００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１６００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１７００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１８００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１９００ｎｇ／ｍＬを超えるか、または約２０００ｎｇ／ｍＬを超える、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１８】
（Ｉ）１日当たりの前記尿中アルブミンが、約１０００μｇ／日を超えるか、約２０００μｇ／日を超えるか、約３０００μｇ／日を超えるか、約４０００μｇ／日を超えるか、約５０００μｇ／日を超えるか、約６０００μｇ／日を超えるか、約７０００μｇ／日を超えるか、約８０００μｇ／日を超えるか、約９０００μｇ／日を超えるか、もしくは約１００００μｇ／日を超える；および／または
（ＩＩ）尿中アルブミンの尿中クレアチニンに対する比が、約１００μｇ：ｍｇを超えるか、約２００μｇ：ｍｇを超えるか、約３００μｇ：ｍｇを超えるか、約４００μｇ：ｍｇを超えるか、約５００μｇ：ｍｇを超えるか、約６００μｇ：ｍｇを超えるか、約７００μｇ：ｍｇを超えるか、約８００μｇ：ｍｇを超えるか、約９００μｇ：ｍｇを超えるか、約１０００μｇ：ｍｇを超えるか、約１１００μｇ：ｍｇを超えるか、約１２００μｇ：ｍｇを超えるか、約１３００μｇ：ｍｇを超えるか、約１４００μｇ：ｍｇを超えるか、約１５００μｇ：ｍｇを超えるか、約１６００μｇ：ｍｇを超えるか、約１７００μｇ：ｍｇを超えるか、約１８００μｇ：ｍｇを超えるか、約１９００μｇ：ｍｇを超えるか、または約２０００μｇ：ｍｇを超える、
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項１９】
約７週齢から約１７週齢の間で、前記野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、または増加した尿中アルブミンレベルを有する、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２０】
野生型ラットと比較して腎臓におけるＣ３沈着が増加している、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２１】
約７週齢から約１７週齢の間で、前記野生型ラットと比較して前記腎臓におけるＣ３沈着が増加している、請求項２０に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２２】
野生型ラットと比較して前記腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着が増加している、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２３】
約７週齢から約１７週齢の間で、前記野生型ラットと比較して前記腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着が増加している、請求項２２に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２４】
野生型ラットと比較して増加した糸球体病理を有する、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２５】
前記増加した糸球体病理が、前記野生型ラットと比較して、増加した糸球体基底膜厚、増加した有足細胞足突起幅、または減少した有足細胞足突起数を含む、請求項２４に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２６】
前記増加した糸球体病理が、前記野生型ラットと比較して、増加した糸球体基底膜厚、増加した有足細胞足突起幅、および減少した有足細胞足突起数を含む、請求項２５に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２７】
（Ｉ）糸球体基底膜厚の増加が、前記野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍である、および／または
（ＩＩ）前記遺伝子改変ラットの糸球体における平均糸球体基底膜厚が、少なくとも約０．２ミクロン、少なくとも約０．３ミクロン、少なくとも約０．４ミクロン、少なくとも約０．５ミクロン、少なくとも約０．６ミクロン、少なくとも約０．７ミクロン、少なくとも約０．８ミクロン、少なくとも約０．９ミクロン、少なくとも約１．０ミクロン、少なくとも約１．１ミクロン、少なくとも約１．２ミクロン、少なくとも約１．３ミクロン、少なくとも約１．４ミクロン、少なくとも約１．５ミクロン、少なくとも約１．６ミクロン、少なくとも約１．７ミクロン、もしくは少なくとも約１．８ミクロンである、
請求項２５または２６に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２８】
（Ｉ）有足細胞足突起幅の増加が、前記野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍である、および／または
（ＩＩ）前記遺伝子改変ラットの糸球体における足突起幅の平均が、少なくとも約０．４ミクロン、少なくとも約０．５ミクロン、少なくとも約０．６ミクロン、少なくとも約０．７ミクロン、少なくとも約０．８ミクロン、少なくとも約０．９ミクロン、少なくとも約１．０ミクロン、少なくとも約１．５ミクロン、少なくとも約２．０ミクロン、もしくは少なくとも約２．５ミクロンである、
請求項２５から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項２９】
（Ｉ）有足細胞足突起数の減少が、前記野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、もしくは少なくとも約３．８倍である、および／または
（ＩＩ）前記遺伝子改変ラットにおける１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数の平均が、約２．５未満、約２未満、約１．５未満、約１未満、約０．９未満、もしくは約０．８未満である、
請求項２５から２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項３０】
約７週齢から約１７週齢の間で、前記野生型ラットと比較して増加した糸球体病理を有する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項３１】
野生型ラットと比較して減少した寿命を有する、いずれかの先行する請求項に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項３２】
前記遺伝子改変ラットの寿命の中央値が、約１５０日未満である、請求項３１に記載の遺伝子改変ラット。
【請求項３３】
Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の処置において使用するための薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ治療有効性を評価する方法であって、
（ａ）前記薬剤を、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラットに投与するステップと、
（ｂ）前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおけるＣ３Ｇの１つまたは複数の症状を、前記薬剤を投与されていない対照遺伝子改変ラットと比較して評価するステップと
を含む、方法。
【請求項３４】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）循環Ｃ３レベル、
（ｉｉ）血中尿素窒素レベル、
（ｉｉｉ）血清中シスタチンＣレベル、
（ｉｖ）尿中アルブミンレベル、
（ｖ）腎臓におけるＣ３沈着、
（ｖｉ）前記腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着、
（ｖｉｉ）糸球体基底膜厚、
（ｖｉｉｉ）有足細胞足突起幅、
（ｉｘ）有足細胞足数、
（ｘ）寿命、または
（ｘｉ）これらの組合せ
を評価するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子改変ラットの年齢が、約７週齢から約１７週齢の間である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）が、循環Ｃ３レベルを評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける循環Ｃ３レベルの増加が、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）が、血中尿素窒素レベルを評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける血中尿素窒素レベルの低下が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、血清中シスタチンＣレベルを評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける血清中シスタチンＣレベルの低下が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）が、尿中アルブミンレベルを評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける尿中アルブミンレベルの低下が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）が、前記腎臓におけるＣ３沈着を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける前記腎臓におけるＣ３沈着レベルの低下が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）が、前記腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける前記腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着レベルの低下が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）が、糸球体基底膜厚を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける糸球体基底膜厚の減少が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）が、有足細胞足突起幅を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける有足細胞足突起幅の減少が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｂ）が、有足細胞足突起数を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける有足細胞足突起数の増加が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）が、寿命を評価するステップを含み、前記対照遺伝子改変ラットに対する、前記薬剤を投与された前記遺伝子改変ラットにおける寿命の増加が、前記推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）ラット胚性幹（ＥＳ）細胞中に、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、前記ヌクレアーゼ剤が前記第１の標的配列を切断して、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットＥＳ細胞を生じる、ステップと、
（ｂ）前記遺伝子改変ラット（ＥＳ）細胞をラット宿主胚中に導入するステップと、
（ｃ）前記ラット宿主胚を代理母に懐胎させるステップであって、前記代理母が、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップと
を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラットを作製する方法。
【請求項４７】
（ａ）ラット１細胞期胚中に、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、前記ヌクレアーゼ剤が前記第１の標的配列を切断して、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット１細胞期胚を生じる、ステップと、
（ｂ）前記遺伝子改変ラット１細胞期胚を代理母に懐胎させるステップであって、前記代理母が、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップと
を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変ラットを作製する方法。
【請求項４８】
前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソン、第１のイントロン、または５’ＵＴＲ中に存在する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１の標的配列が、配列番号１２または１３を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ａ）が、前記ラットＥＳ細胞または前記ラット１細胞期胚中に、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の最後から２番目のイントロン、最後から２番目のエクソン、最後のイントロン、最後のエクソン、または３’ＵＴＲ中に存在する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の標的配列が、配列番号１４または１５を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ａ）が、前記ラットＥＳ細胞または前記ラット１細胞期胚中に、前記第１の標的配列とは異なる前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の標的配列および前記第２の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンに隣接している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記第１のエクソンまたは前記５’ＵＴＲ中に存在し、前記第２の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記第１のエクソンまたは前記第１のイントロン中に存在する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１の標的配列が配列番号１２を含み、前記第２の標的配列が配列番号１３を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ａ）が、前記ラットＥＳ細胞または前記ラット１細胞期胚中に、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、前記第３および第４のヌクレアーゼ剤が、それぞれ、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記停止コドンに近接する第３および第４の標的配列を標的とし、前記第３および第４の標的配列が異なる、ステップをさらに含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第３および第４の標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記最後から２番目のイントロン、前記最後から２番目のエクソン、前記最後のイントロン、前記最後のエクソン、または前記３’ＵＴＲ中に存在する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第３および第４の標的配列が、それぞれ、配列番号１４および１５を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ａ）が、前記ラットＥＳ細胞または前記ラット１細胞期胚中に、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームおよび前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外因性ドナー核酸を導入するステップであって、前記外因性ドナー核酸が前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンを変異または欠失させるように設計されている、ステップをさらに含む、請求項４６から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記５’標的配列および前記３’標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記開始コドンに隣接している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記５’標的配列および前記３’標的配列が、前記内因性Ｃｆｈ遺伝子座の前記コード配列に隣接している、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット細胞。
【請求項６５】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットゲノム。
【請求項６６】
ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する標的遺伝子改変を含む前記ラットＣｆｈ遺伝子。
【請求項６７】
ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する際に使用するためのヌクレアーゼ剤であって、前記Ｃｆｈ遺伝子のヌクレアーゼ標的部位を標的とし、切断する、ヌクレアーゼ剤。
【請求項６８】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット細胞を作製する方法であって、ラット細胞中に、前記内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤を導入するステップを含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記標的配列を切断して、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む前記遺伝子改変ラット細胞を生じる、方法。
【請求項６９】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットゲノムを作製する方法であって、ラットゲノムを、前記内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤と接触させるステップを含み、前記ヌクレアーゼ剤が前記標的配列を切断して、前記不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む前記遺伝子改変ラットゲノムを生じる、方法。
【請求項７０】
不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子を作製する方法であって、ラットＣｆｈ遺伝子を、前記内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤と接触させるステップを含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記標的配列を切断して、前記不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子を生じる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１３日に出願された米国出願第６２／７３０，６９０号の利益を主張し、これはあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳウェブによりテキストファイルとして提出された配列表への言及
【０００２】
ファイル５３６６５８ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書かれた配列表は２９４キロバイトであり、２０１９年９月６日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）は、Ｃ３腎炎因子および／または補体遺伝子の変異の結果としての副経路（alternative  pathway）（ＡＰ）補体活性化の過剰活性化によって特徴付けられる。患者のおよそ５０％は、診断から１０年以内に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を発症する。腎移植後の再発率はおよそ８０〜９０％である。現在、Ｃ３Ｇに対するＦＤＡに承認された処置は存在せず、Ｃ３Ｇの原因を攻撃する治療も存在しない。
【０００４】
Ｃ３Ｇの根底にある機序を理解するために、補体因子Ｈ欠損（Ｃｆｈ−／−）マウスが実験的研究のために使用されてきた。しかし、ＥＳＲＤはＣｆｈ−／−マウスにおいて顕在化するのに数カ月かかることがあり、新たな治療法を評価するのに長期にわたる前臨床研究が必要とされる。より良いＣ３Ｇモデルが必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラット、ラット細胞、およびラットゲノム、ならびにこのようなラット、ラット細胞、およびラットゲノムを作製および使用する方法が提供される。ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する標的遺伝子改変（targeted  genetic  modification）を含むラットＣｆｈ遺伝子、Ｃｆｈ遺伝子のヌクレアーゼ標的部位を標的とし、切断する、ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する際に使用するためのヌクレアーゼ剤、およびこのようなラットＣｆｈ遺伝子を作製する方法も提供される。
【０００６】
一態様では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットが提供される。必要に応じて、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンが変異または欠失している。必要に応じて、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンが欠失している。必要に応じて、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソンにおけるコード配列が欠失している。必要に応じて、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座において、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のイントロンにおけるスプライスドナー部位が欠失している。
【０００７】
一部のこのようなラットでは、ラットは雄である。他のこのようなラットでは、ラットは雌である。一部のこのようなラットでは、ラットは、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座に対してホモ接合性である。他のこのようなラットでは、ラットは、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座に対してヘテロ接合性である。
【０００８】
一部のこのようなラットは、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の１つまたは複数の症状を有する。一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して低下した循環Ｃ３レベルを有する。必要に応じて、循環Ｃ３レベルは、約２００μｇ／ｍＬ未満である。必要に応じて、循環Ｃ３レベルは、約１００μｇ／ｍＬ未満である。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して低下した循環Ｃ３レベルを有する。
【０００９】
一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して増加した血中尿素窒素レベルを有する。一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、または増加した尿中アルブミンレベルを有する。一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、および増加した尿中アルブミンレベルを有する。必要に応じて、血中尿素窒素レベルは、約１０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約２０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約３０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約４０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約５０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約６０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約７０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約８０ｍｇ／ｄＬを超えるか、約９０ｍｇ／ｄＬを超えるか、または約１００ｍｇ／ｄＬを超える。必要に応じて、血清中シスタチンＣレベルは、約１０００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１１００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１２００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１３００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１４００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１５００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１６００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１７００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１８００ｎｇ／ｍＬを超えるか、約１９００ｎｇ／ｍＬを超えるか、または約２０００ｎｇ／ｍＬを超える。必要に応じて、１日当たりの尿中アルブミンは、約１０００μｇ／日を超えるか、約２０００μｇ／日を超えるか、約３０００μｇ／日を超えるか、約４０００μｇ／日を超えるか、約５０００μｇ／日を超えるか、約６０００μｇ／日を超えるか、約７０００μｇ／日を超えるか、約８０００μｇ／日を超えるか、約９０００μｇ／日を超えるか、または約１００００μｇ／日を超える。必要に応じて、尿中アルブミンの尿中クレアチニンに対する比は、約１００μｇ：ｍｇを超えるか、約２００μｇ：ｍｇを超えるか、約３００μｇ：ｍｇを超えるか、約４００μｇ：ｍｇを超えるか、約５００μｇ：ｍｇを超えるか、約６００μｇ：ｍｇを超えるか、約７００μｇ：ｍｇを超えるか、約８００μｇ：ｍｇを超えるか、約９００μｇ：ｍｇを超えるか、約１０００μｇ：ｍｇを超えるか、約１１００μｇ：ｍｇを超えるか、約１２００μｇ：ｍｇを超えるか、約１３００μｇ：ｍｇを超えるか、約１４００μｇ：ｍｇを超えるか、約１５００μｇ：ｍｇを超えるか、約１６００μｇ：ｍｇを超えるか、約１７００μｇ：ｍｇを超えるか、約１８００μｇ：ｍｇを超えるか、約１９００μｇ：ｍｇを超えるか、または約２０００μｇ：ｍｇを超える。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して増加した血中尿素窒素レベルを有する。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して、増加した血中尿素窒素レベル、増加した血清中シスタチンＣレベル、または増加した尿中アルブミンレベルを有する。
【００１０】
一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して、腎臓におけるＣ３沈着が増加している。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して腎臓におけるＣ３沈着が増加している。一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着が増加している。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着が増加している。
【００１１】
一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して増加した糸球体病理を有する。必要に応じて、増加した糸球体病理は、野生型ラットと比較して、増加した糸球体基底膜厚、増加した有足細胞足突起幅、または減少した有足細胞足突起数を含む。必要に応じて、増加した糸球体病理は、野生型ラットと比較して、増加した糸球体基底膜厚、増加した有足細胞足突起幅、および減少した有足細胞足突起数を含む。必要に応じて、糸球体基底膜厚の増加は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍である、および／または遺伝子改変ラットの糸球体における平均糸球体基底膜厚は、少なくとも約０．２ミクロン、少なくとも約０．３ミクロン、少なくとも約０．４ミクロン、少なくとも約０．５ミクロン、少なくとも約０．６ミクロン、少なくとも約０．７ミクロン、少なくとも約０．８ミクロン、少なくとも約０．９ミクロン、少なくとも約１．０ミクロン、少なくとも約１．１ミクロン、少なくとも約１．２ミクロン、少なくとも約１．３ミクロン、少なくとも約１．４ミクロン、少なくとも約１．５ミクロン、少なくとも約１．６ミクロン、少なくとも約１．７ミクロン、もしくは少なくとも約１．８ミクロンである。必要に応じて、有足細胞足突起幅の増加は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍である、および／または遺伝子改変ラットの糸球体における足突起幅の平均は、少なくとも約０．４ミクロン、少なくとも約０．５ミクロン、少なくとも約０．６ミクロン、少なくとも約０．７ミクロン、少なくとも約０．８ミクロン、少なくとも約０．９ミクロン、少なくとも約１．０ミクロン、少なくとも約１．５ミクロン、少なくとも約２．０ミクロン、もしくは少なくとも約２．５ミクロンである。必要に応じて、有足細胞足突起数の減少は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、もしくは少なくとも約３．８倍である、および／または遺伝子改変ラットの１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数の平均は、約２．５未満、約２未満、約１．５未満、約１未満、約０．９未満、もしくは約０．８未満である。必要に応じて、遺伝子改変ラットは、約７週齢から約１７週齢の間で、野生型ラットと比較して増加した糸球体病理を有する。
【００１２】
一部のこのようなラットは、野生型ラットと比較して減少した寿命を有する。必要に応じて、遺伝子改変ラットの寿命の中央値は、約１５０日未満である。
【００１３】
別の態様では、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の処置において使用するための薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ治療有効性を評価する方法が提供される。一部のこのような方法は、（ａ）薬剤を、上記遺伝子改変ラットのいずれかに投与するステップと、（ｂ）薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおけるＣ３Ｇの１つまたは複数の症状を、薬剤を投与されていない対照遺伝子改変ラットと比較して評価するステップとを含む。必要に応じて、ステップ（ｂ）は、以下のうちの１つまたは複数またはすべてを評価するステップを含む：（ｉ）循環Ｃ３レベル、（ｉｉ）血中尿素窒素レベル、（ｉｉｉ）腎臓におけるＣ３沈着、（ｉｖ）腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着、および（ｖ）寿命。必要に応じて、ステップ（ｂ）は、（ｉ）循環Ｃ３レベル、（ｉｉ）血中尿素窒素レベル、（ｉｉｉ）腎臓におけるＣ３沈着、（ｉｖ）腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着、（ｖ）寿命、または（ｖｉ）これらの組合せを評価するステップを含む。必要に応じて、ステップ（ｂ）は、（ｉ）循環Ｃ３レベル、（ｉｉ）血中尿素窒素レベル、（ｉｉｉ）血清中シスタチンＣレベル、（ｉｖ）尿中アルブミンレベル、（ｖ）腎臓におけるＣ３沈着、（ｖｉ）腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着、（ｖｉｉ）糸球体基底膜厚、（ｖｉｉｉ）有足細胞足突起幅、（ｉｘ）有足細胞足数（podocyte  foot  number）、（ｘ）寿命、または（ｘｉ）これらの組合せを評価するステップを含む。必要に応じて、遺伝子改変ラットの年齢は、約７週齢から約１７週齢の間である。
【００１４】
一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、循環Ｃ３レベルを評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける循環Ｃ３レベルの増加は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、血中尿素窒素レベルを評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける血中尿素窒素レベルの低下は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、血清中シスタチンＣレベルを評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける血清中シスタチンＣレベルの低下は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、尿中アルブミンレベルを評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける尿中アルブミンレベルの低下は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、腎臓におけるＣ３沈着を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける腎臓におけるＣ３沈着レベルの低下は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着レベルの低下は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、糸球体基底膜厚を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける糸球体基底膜厚の減少は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、有足細胞足突起幅を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける有足細胞足突起幅の減少は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、有足細胞足突起数を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける有足細胞足突起数の増加は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。一部のこのような方法では、ステップ（ｂ）は、寿命を評価するステップを含み、対照遺伝子改変ラットに対する、薬剤を投与された遺伝子改変ラットにおける寿命の増加は、推定Ｃ３Ｇ治療剤の治療効果を示す。
【００１５】
別の態様では、上記遺伝子改変ラットのいずれかを作製する方法が提供される。一部のこのような方法は、（ａ）ラット胚性幹（ＥＳ）細胞中に、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤が第１の標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットＥＳ細胞を生じる、ステップと、（ｂ）遺伝子改変ラット（ＥＳ）細胞をラット宿主胚中に導入するステップと、（ｃ）ラット宿主胚を代理母に懐胎させるステップであって、代理母が、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップとを含む。一部のこのような方法は、（ａ）ラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤が第１の標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット１細胞期胚を生じる、ステップと、（ｂ）遺伝子改変ラット１細胞期胚を代理母に懐胎させるステップであって、代理母が、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップとを含む。
【００１６】
一部のこのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソン、第１のイントロン、または５’ＵＴＲ中に存在する。必要に応じて、第１のヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。必要に応じて、第１の標的配列は、配列番号１２または１３を含む。
【００１７】
一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む。一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞またはラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む。必要に応じて、第２の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の最後から２番目のイントロン、最後から２番目のエクソン、最後のイントロン、最後のエクソン、または３’ＵＴＲ中に存在する。必要に応じて、第２の標的配列は、配列番号１４または１５を含む。
【００１８】
一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、第１の標的配列とは異なる内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む。一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞またはラット１細胞期胚中に、第１の標的配列とは異なる内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む。必要に応じて、第１の標的配列および第２の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに隣接している。必要に応じて、第１の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソンまたは５’ＵＴＲ中に存在し、第２の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソンまたは第１のイントロン中に存在する。必要に応じて、第１の標的配列は配列番号１２を含み、第２の標的配列は配列番号１３を含む。必要に応じて、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、第３および第４のヌクレアーゼ剤が、それぞれ、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第３および第４の標的配列を標的とし、第３および第４の標的配列が異なる、ステップをさらに含む。必要に応じて、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞またはラット１細胞期胚中に、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、第３および第４のヌクレアーゼ剤が、それぞれ、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第３および第４の標的配列を標的とし、第３および第４の標的配列が異なる、ステップをさらに含む。必要に応じて、第３および第４の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の最後から２番目のイントロン、最後から２番目のエクソン、最後のイントロン、最後のエクソン、または３’ＵＴＲ中に存在する。必要に応じて、第３および第４の標的配列は、それぞれ、配列番号１４および１５を含む。
【００１９】
一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームおよび内因性Ｃｆｈ遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外因性ドナー核酸を導入するステップであって、外因性ドナー核酸が内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異または欠失させるように設計されている、ステップをさらに含む。一部のこのような方法では、ステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞またはラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームおよび内因性Ｃｆｈ遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外因性ドナー核酸を導入するステップであって、外因性ドナー核酸が内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異または欠失させるように設計されている、ステップをさらに含む。必要に応じて、５’標的配列および３’標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに隣接している。必要に応じて、５’標的配列および３’標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列に隣接している。
【００２０】
別の態様では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットが提供される。別の態様では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットゲノムが提供される。提供される別の態様では、ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する標的遺伝子改変を含むラットＣｆｈ遺伝子が提供される。別の態様では、ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する際に使用するためのヌクレアーゼ剤であって、Ｃｆｈ遺伝子のヌクレアーゼ標的部位を標的とし、切断する、ヌクレアーゼ剤が提供される。別の態様では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット細胞を作製する方法であって、ラット細胞中に、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤を導入するステップを含み、ヌクレアーゼ剤は標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット細胞を生じる、方法が提供される。別の態様では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットゲノムを作製する方法であって、ラットゲノムを、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤と接触させるステップを含み、ヌクレアーゼ剤は標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットゲノムを生じる、方法が提供される。別の態様では、不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子を作製する方法であって、ラットＣｆｈ遺伝子を、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する標的配列を標的とするヌクレアーゼ剤と接触させるステップを含み、ヌクレアーゼ剤は、標的配列を切断して、不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子を生じる、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａ（縮尺通りではない）は、ラットＣｆｈ遺伝子座を標的とするための標的化スキームの概略図である。ガイドＲＮＡ  ＧＵ１、ＧＵ２、ＧＤ２、およびＧＤ３に対するガイドＲＮＡ標的配列の位置が、エクソン１、２１、および２２、ならびにＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンの位置と一緒に示される。ＥＳ細胞クローンＡＢ５、ＡＥ１、ＡＡ８、ＢＢ７、ＢＥ６、およびＨＧ６において欠失した領域の描写も示される。
【００２２】
【図１Ｂ】図１Ｂ（縮尺通りではない）は、標的ラットＣｆｈ遺伝子座をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）アッセイの概略図である。ＬＯＡアッセイのためのプライマーおよびプローブには、ｒＴＵＦ、ｒＴＵＰ、ｒＴＵＲ、ｒＴＵ２Ｆ、ｒＴＵ２Ｐ、およびｒＴＵ２Ｒが含まれ、ＮＧＳプライマーには、ＡｍｐＦ１、ＡｍｐＦ２、ＡｍｐＲ１、およびＡｍｐＲ２が含まれた。
【００２３】
【図２】図２は、雄および雌のＣｆｈノックアウトラットの経時的な生存パーセントを示すグラフである。
【００２４】
【図３】図３は、７週齢の雄および雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける循環Ｃ３レベルを示すグラフである。
【００２５】
【図４】図４は、雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットからの凍結腎臓切片におけるＣ３およびＣ５ｂ−９に関する染色を示す写真である。パネルＡ〜Ｃは、それぞれ、１８週齢、１７週齢、および１７週齢の雌の野生型ラットからの試料である。パネルＤ〜Ｆは、それぞれ、１２週齢、１７週齢、および９週齢の雌のＣｆｈノックアウトラットからの試料である。
【００２６】
【図５】図５は、１５週齢の雌の野生型ラットならびにそれぞれ、１２週齢、１３週齢、および１５週齢の３匹の雌のＣｆｈノックアウトラット（ＣＦＨ  ＫＯラット１、ＣＦＨ  ＫＯラット２、およびＣＦＨ  ＫＯラット３）からの腎臓試料の髄質および皮質組織の過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色を示す写真である。
【００２７】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、７週齢から開始し、各Ｃｆｈノックアウトラットが死亡するまでの雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図６Ａ）ならびに７週齢から開始し、各Ｃｆｈノックアウトラットが死亡するまでの雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図６Ｂ）における血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを示すグラフである。ベースラインには、１０匹の雄の野生型ラット、８匹の雄のＣｆｈノックアウトラット、９匹の雌の野生型ラット、および７匹の雌のＣｆｈノックアウトラットが存在した。
【００２８】
【図７】図７は、古典経路およびレクチン経路ならびに副経路を含む補体経路の概略図である。
【００２９】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、７週齢から開始し、各Ｃｆｈノックアウトラットが死亡するまでの雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図８Ａ）ならびに雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図８Ｂ）における血清中シスタチンＣ（ｓＣｙｓＣ）を示すグラフである。
【００３０】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、雄および雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける尿中アルブミンの測定値を示すグラフである。図９Ａは、雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける１日当たりの尿中アルブミンを示し、図９Ｂは、雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける、尿中クレアチニンに対して正規化した尿中アルブミンを示し、図９Ｃは、雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける１日当たりの尿中アルブミンを示し、図９Ｄは、雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおける、尿中クレアチニンに対して正規化した尿中アルブミンを示す。
【００３１】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、野生型ラット由来の糸球体の糸球体毛細血管係蹄（図１０Ａ）および糸球体間質（図１０Ｂ）の電子顕微鏡写真である（１２，０００倍）。
【００３２】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｃｆｈノックアウトラット由来の糸球体の糸球体毛細血管係蹄の電子顕微鏡写真である。図１１Ａは、１２，０００×の倍率であり、図１１Ｂは、図１１Ａよりも高倍率である。
【００３３】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｃｆｈノックアウトラット由来の糸球体の糸球体間質の電子顕微鏡写真である。図１２Ａは、１２，０００倍の倍率であり、図１２Ｂは、図１２Ａよりも高倍率である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本明細書において交換可能に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、コードおよび非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。この用語は、改変ペプチド主鎖を有するポリペプチドなどの改変されたポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドのいずれかの部分を指す。
【００３５】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終止部に関する。
【００３６】
本明細書において交換可能に使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらのアナログもしくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらは、一本鎖、二本鎖、および多重鎖（multi-stranded）のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００３７】
１個のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向で、その近隣の３’酸素に結合するような様式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されていない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合であっても、５’および３’末端を有すると言うことができる。直鎖状または環状のいずれかのＤＮＡ分子において、別々のエレメントは、「上流」もしくは５’または（of）「下流」もしくは３’エレメントであると称される。
【００３８】
用語「ゲノムに組み込まれた」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム内に組み込まれるように、細胞内に導入された核酸を指す。いずれかのプロトコールを、細胞のゲノム内への核酸の安定した組込みのために使用することができる。
【００３９】
用語「標的化ベクター」は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または他のいずれかの組換え手段によって、細胞のゲノム内の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。
【００４０】
用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子内へのパッケージングに十分なまたは許容的なエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、細胞中にＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を移入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多数の形態が公知である。
【００４１】
用語「野生型」は、正常な（変異体、罹患した、変更された、などと対比して）状態または文脈において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することが多い。
【００４２】
用語「内因性配列」は、ラット細胞またはラット内に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、ラットの内因性Ｃｆｈ配列は、ラットにおけるＣｆｈ遺伝子座に天然に存在するネイティブＣｆｈ配列を指す。
【００４３】
「外因性」分子または配列は、当該形態で細胞に通常存在しない分子または配列を含む。通常の存在は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在を含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなどの、細胞内における対応する内因性配列の変異したバージョンを含むことができるか、または細胞内における内因性配列に対応するが、異なる形態の（すなわち、染色体内にない）配列を含むことができる。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下での特定の発生段階で特定の細胞に当該形態で通常存在する分子または配列を含む。
【００４４】
用語「異種」は、核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合、核酸またはタンパク質が同じ分子内に天然では一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、用語「異種」は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関連して使用される場合、核酸またはタンパク質が、天然には互いに同じ関係（例えば、一緒に結合する）で見出されない、２つまたはそれよりも多いサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、別の核酸分子内のまたはそれに結合した、天然には他の分子と会合した状態で見出されない核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然にはコード配列と会合した状態で見出されない配列と隣接したコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、別のペプチド分子内にまたはそれに結合した、天然には他のペプチド分子と会合した状態で見出されないアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きのタンパク質）。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
【００４５】
用語「遺伝子座」は、遺伝子（または有意な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列の特定の位置、または生物のゲノムの染色体上の配置を指す。例えば、「Ｃｆｈ遺伝子座」は、Ｃｆｈ遺伝子、Ｃｆｈ  ＤＮＡ配列、ＣＦＨコード配列の特定の位置、またはこのような配列が存在する箇所について特定された生物のゲノムの染色体上のＣｆｈ配置を指し得る。「Ｃｆｈ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはこれらの組合せを含む、Ｃｆｈ遺伝子の調節エレメントを含み得る。
【００４６】
用語「遺伝子」は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードし、非コードイントロンにより中断されるコード領域ならびに遺伝子が全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように、５’末端と３’末端の両方におけるコード領域に隣接して位置する配列を含む、染色体中のＤＮＡ配列を指す。用語「遺伝子」は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、インスレーター配列、およびマトリックス結合領域を含む他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域の近くにあっても（例えば、１０ｋｂ以内）、遠隔部位にあってもよく、遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
【００４７】
用語「対立遺伝子」は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する種々の異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２個の対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特異的遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２個の同一対立遺伝子が存在する場合ホモ接合性として、２個の対立遺伝子が異なる場合ヘテロ接合性として記載される。
【００４８】
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列に関する適切な転写開始部位において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させることが可能なＴＡＴＡボックスを通常含む、ＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含む。本明細書に開示されているプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示されている細胞型（例えば、ラット細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）のうち１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
【００４９】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結」していることは、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分のうち少なくとも１つが、他方の構成成分のうち少なくとも１つに発揮される機能を媒介し得る可能性を許容するように、２つまたはそれよりも多い構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）を並置することを含む。例えば、プロモーターが、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いに連続しているか、またはトランスで作用する（例えば、調節配列は、コード配列の転写を制御するために、ある距離で作用することができる）このような配列を含み得る。
【００５０】
用語「バリアント」は、集団内で最も普及している配列とは異なる（例えば、１つのヌクレオチドで）ヌクレオチド配列、または集団内で最も普及している配列とは異なる（例えば、１つのアミノ酸で）タンパク質配列を指す。
【００５１】
用語「断片」は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、またはそれよりも少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。用語「断片」は、核酸に言及する場合、全長核酸よりも短いか、またはそれよりも少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端側の端の部分の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端側の端の部分の除去）、または内部断片であってもよい。
【００５２】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウに対して最大一致のためにアラインされた場合に同じである２つの配列における残基を指す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に言及して使用される場合、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる場合が多く、この保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は同様の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりに使用され、したがって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は上向きに調整されて、置換の保存的性質を修正することができる。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を為すための手段は周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしての保存的置換のスコアリングに関与し、これにより、パーセンテージ配列同一性を増加させる。よって、例えば、同一アミノ酸をスコア１とし、非保存的置換をスコアゼロとする場合、保存的置換はゼロから１の間のスコアとする。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行される通りに計算される。
【００５３】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに対して２つの最適にアラインされた配列（最大数の完璧にマッチした残基）を比較することによって決定される値を含み、この比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両方の配列において同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する配置数を決定し、マッチした配置数を得て、マッチした配置数を比較のウィンドウにおける総配置数で除し、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、パーセンテージが計算される。別段に指定されていなければ（例えば、短い方の配列は連結された異種配列を含む）、比較ウィンドウは比較されている２つの配列のうちの短い方の全長である。
【００５４】
別段に記述されていなければ、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメーターを使用するＧＡＰバージョン１０を使用して得られる値を含む：ギャップウエイト５０および長さウエイト３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列に関する％同一性および％類似性；ギャップウエイト８および長さウエイト２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列に関する％同一性および％類似性；またはこれらの任意の等価プログラム。「等価プログラム」は、問題のいずれか２つの配列に関して、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアライメントと比較した場合に、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチおよび同一パーセント配列同一性を有するアライメントを生成する、いずれかの配列比較プログラムを含む。
【００５５】
用語「保存的アミノ酸置換」は、配列に通常存在するアミノ酸の、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基に代えての置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の、別の残基に代えての置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別の塩基性残基に代えての置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の、別の酸性残基に代えての置換は、保存的置換の追加例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基に代えての置換、および／または極性残基の、非極性残基に代えての置換が挙げられる。典型的なアミノ酸分類を以下にまとめる。
【００５６】
【表１】
2022500047.tif 000003
【００５７】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、公知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、公知の参照配列と同一であるかまたは実質的に類似するかのいずれかである配列を含む。相同配列は、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を含み得る。相同遺伝子は、例えば、典型的には、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを経て、共通祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソロガス」遺伝子は、種分化によって共通祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子を含む。オルソログは、典型的には、進化の過程において同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の重複に関連する遺伝子を含む。パラログは、進化の過程において新たな機能を進化させ得る。
【００５８】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工的環境および人工的環境（例えば、試験管）内で起こるプロセスまたは反応を含む。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、天然の環境（例えば、細胞または生物または身体）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を含む。用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、個体の身体から除去された細胞、およびこのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。
【００５９】
用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結したレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含有する（またはこれを含有するように作製することができる）細胞中に導入される場合に、容易かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、以下に限定されないが、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００６０】
用語「蛍光レポータータンパク質」は、本明細書で使用される場合、蛍光に基づき検出可能であるレポータータンパク質を意味し、この場合、蛍光は、レポータータンパク質に直接的に由来するか、蛍光原基質におけるレポータータンパク質の活性に由来するか、または蛍光タグ付けされた化合物に結合するための親和性を有するタンパク質に由来し得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、および細胞中におけるその存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる、任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
【００６１】
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主として、２つの保存されたＤＮＡ修復経路を介して起こる：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kasparek  &  Humphrey  (2011)  Seminars  in  Cell  &  Dev.  Biol.  22:886-897を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報交換のいずれかのプロセスを含み得る。
【００６２】
用語「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報交換のいずれかのプロセスを含み、いずれかの機序によって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とすることができ、「ドナー」分子を「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の修復のための鋳型として使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入を導く核酸修復の形態を含む。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、このような移入は、切断された標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性の鎖アニーリング、および／または関連するプロセスに関与し得る。一部の事例では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡ中に組み込まれる。そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wang  et  al.  (2013)  Cell  153:910-918；Mandalos  et  al.  (2012)  PLoS  ONE  7:e45768:1-9；およびWang  et  al.  (2013)  Nat  Biotechnol.  31:530-532を参照されたい。
【００６３】
ＮＨＥＪは、相同鋳型の必要がない、互いへの、または外因性配列への、切断末端の直接的ライゲーションによる核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非連続配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断部位の付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、外因性ドナー核酸の末端と切断末端の直接的ライゲーションによって外因性ドナー核酸の標的組込み（targeted  integration）をもたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。このようなＮＨＥＪ媒介性標的組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分にしか実施しない細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。さらに、相同組換え修復と対照的に、切断部位に隣接している配列同一性の大きな領域に関する知識は必要とされず、このことは、ゲノム配列について限られた知識しかないゲノムを有する生物への標的挿入を試みる際に有益となり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列におけるヌクレアーゼ剤によって生成されたものと適合性のオーバーハングに挟まれた外因性ドナー核酸を使用して、粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行し得る。例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびMaresca  et  al.  (2013)  Genome  Res.  23(3):539-546を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、標的および／またはドナーの切除が、断片結合に必要とされるマイクロホモロジーの領域の生成に必要とされる場合があり、これは、標的配列において望まれない変更を生じ得る。
【００６４】
１種または複数種の記載されたエレメントを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他のエレメントを含んでもよい。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、タンパク質を、単独でまたは他の成分と組み合わせて含有してもよい。移行句「から本質的になる」は、請求項の範囲が、その請求項に記載された具体的エレメントならびに請求されている発明の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないエレメントを包含するものと解釈されるべきであることを意味する。よって、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されることを意図しない。
【００６５】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、発生してもしなくてもよいこと、ならびにその記載が、事象または状況が発生する実例およびそれが発生しない実例を含むことを意味する。
【００６６】
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を定義するすべての整数、および範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
【００６７】
別段に文脈から明らかでない限り、用語「約」は、記述された値の標準測定誤差範囲（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【００６８】
用語「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せと共に、二者択一（「または」）において解釈された場合には組合せの欠如を指し、これを包含する。
【００６９】
用語「または」は、特定のリストのうちのいずれか１つのメンバーを指し、当該リストのメンバーの任意の組合せも含む。
【００７０】
単数形の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「それ（ｔｈｅ）」は、別段に文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「１つのタンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含んでもよい。
【００７１】
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
【００７２】
不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットゲノム、ラット細胞、およびラットならびにこのようなラット細胞およびラットを使用する方法が本明細書に開示されている。ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する標的遺伝子改変を含むラットＣｆｈ遺伝子、およびＣｆｈ遺伝子のヌクレアーゼ標的部位を標的とし、切断する、ラットＣｆｈ遺伝子を不活性化する際に使用するためのヌクレアーゼ剤も本明細書に開示される。本明細書に開示されるラットは、自然死（spontaneous  death）の割合が高い傾向にあり、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）に非常に似ている生理学的、形態学的、および組織学的症状を呈する。このように、本明細書に開示されるラットを使用して、Ｃ３Ｇの処置のための候補化合物または薬剤の治療有効性を評価することができる。
【００７３】
Ｃ３Ｇは、Ｃ３糸球体腎炎およびデンスデポジット病を包含する障害の範囲である。後天性または遺伝子の欠陥の結果として副経路（ＡＰ）補体活性化が調節されないことが、Ｃ３Ｇ病理の根底にある原因である。後天的欠陥には、Ｃ３腎炎因子および副経路のＣ３転換酵素を安定化する自己抗体の発生が含まれる。遺伝子欠陥には、Ｃ３転換酵素の構成成分、補体成分Ｃ３および補体因子Ｂ、または例えば、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、ＣＦＨ関連１、２、３および５、補体因子Ｉ、ＣＤ４６などの調節タンパク質のいずれかの変異が含まれる。Ｃ３Ｇ患者の約５０％（about  50%  percent）が、極めて少ない処置選択肢しか有さず、診断後１０年以内に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）まで進行する。
【００７４】
組織学的には、Ｃ３Ｇ患者の腎臓は、糸球体間質マトリックスの拡大、ならびにいくつかの症例では半月体形成を伴う膜性および管内増殖を含む一連の病理学的特色を有する免疫グロブリンの非存在下での優勢な糸球体Ｃ３沈着を示す。膜侵襲複合体（ＭＡＣ）であるＣ５ｂ−９の腎臓沈着についての組織学的エビデンスも存在し、終末補体成分Ｃ５の活性化を示唆する。しかし、Ｃ５遮断モノクローナル抗体であるエクリズマブによる、完全な臨床応答はＣ３Ｇ患者において観察されておらず、新規治療戦略に対する必要性が示唆される。
【００７５】
ＣＦＨは、副経路の重大な負の調節因子である。ＣＦＨは、副経路のＣ３転換酵素２の形成を減少させることおよびその解離を増加させることの両方によって補体活性化を制御する。その機能の喪失または欠損をもたらすＣＦＨ変異がＣ３Ｇ患者で報告された。Ｃ３レベルは、補体活性化が制御されないことによってこれらの患者において枯渇している。ＣＦＨにおける自然変異もブタにおいて特定され、その欠損および致死性のＣ３Ｇ様表現型をもたらした。
【００７６】
補体因子Ｈ欠損（Ｃｆｈ−／−）マウスは、Ｃ３Ｇの根底にある機序を理解するためのツールであった。ヒト患者と同様に、Ｃｆｈ−／−マウスは調節されない副経路補体活性化ならびに最小限の免疫グロブリンしか有さないＣ３およびＭＡＣ沈着と一致する糸球体病理、ならびに細胞過形成、糸球体間質マトリックスの拡大、および高電子密度沈着物を呈する。しかし、Ｃｆｈ−／−マウスは早期死亡を示さず、ＥＳＲＤの発症が顕在化するのに数カ月を要する場合もあり、新たな治療法を評価するために長期の前臨床研究が必要とされる。よって、代替のＣ３Ｇモデルが必要とされる。
【００７７】
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して開発されたＣｆｈ−／−ラットが本明細書に開示される。全体として、本発明者らのデータは、Ｃｆｈ−／−ラットが、循環Ｃ３レベルの低下（副経路による補体の過剰活性化を原因とするＣ３の消費を示唆する）、血中尿素窒素および血清中シスタチンＣの上昇（腎不全を示唆する）、尿中アルブミン（アルブミン尿）の上昇、糸球体におけるＣ３およびＣ５ｂ−９の沈着、糸球体硬化、尿細管萎縮、ならびに尿細管における蛋白様円柱を含むＣ３Ｇの分子および病理学的特色を呈したことを示す。さらに、本発明者らのデータは、Ｃｆｈ−／−ラットが、有足細胞の消失および歪み（足突起幅の増加およびより少ない足突起によって測定される上皮の消失）、細胞介在および高電子密度沈着物を伴う糸球体基底膜（ＧＢＭ）の肥厚、糸球体間質の拡大、および窓の喪失を伴う内皮の腫脹を含む顕著な糸球体病理を呈したことを示す。しかし、Ｃｆｈ−／−マウスとは異なり、Ｃｆｈ−／−ラットの大多数はＥＳＲＤに陥り、雄では５２日齢および雌では１０３日齢の中央値で死亡し、それによって、新たな治療法を評価するためのより短い前臨床研究が可能となる。
ＩＩ．不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラット
【００７８】
本明細書に開示されるラット細胞およびラットは、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含む。このようなラットは、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の表現型を再現し、既存のＣ３Ｇモデルに対して有利である。
Ａ．補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体副（ＡＣ）経路、およびＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）
【００７９】
本明細書に記載のラット細胞およびラットは、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含む。補体因子Ｈ（ＣＦＨ；因子Ｈ、補体成分因子Ｈ、血小板補体因子Ｈ、補体阻害因子Ｈ、およびアドレノメジュリン結合タンパク質−１としても公知）は、Ｃｆｈ遺伝子（Ｆｈ、Ａｍｂｐ−１、およびＡｍｂｐ１としても公知）によってコードされている。補体因子Ｈは、因子ＩによるＣ３ｂの不活性化における補因子として機能し、補体副経路においてＣ３ｂＢｂ複合体（Ｃ３転換酵素）および（Ｃ３ｂ）ＮＢＢ複合体（Ｃ５転換酵素）の解離速度も増加させる。因子Ｈは、補体活性化ファミリーの調節因子のメンバーであり、補体制御タンパク質である。因子Ｈは、血漿中を循環する大きな可溶性糖タンパク質であり、その主要な機能は、補体系の副経路を調節することであり、補体系が病原体または他の危険物を対象とし、宿主組織に損傷を与えないことを保証する。因子Ｈは、因子Ｉに媒介されるＣ３ｂ切断に関する補因子活性と、副経路のＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂに対する崩壊促進活性の両方を有することによって、自己細胞および表面における補体活性化を調節する。因子Ｈは、自己細胞および自己表面において保護作用を発揮するが、細菌やウイルスの表面では発揮しない。これは、より低いまたはより高い活性を有するいずれかの異なる立体構造をとる能力を有する因子Ｈの結果であり得る。より低い活性の立体構造は溶液中で優勢な形態であり、流体相増幅を制御するのに十分である。因子Ｈが、一般的に宿主細胞上に存在するが、通常は病原体表面には存在しないグリコサミノグリカンおよび／またはシアル酸に結合する場合、より活発な立体構造が誘導されると考えられ、自己表面は保護されるが、補体は外来表面で衰えることなく進行することを保証する。
【００８０】
ラットＣｆｈをラット第１３染色体の１３ｑ１３（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １５５０１２；アセンブリーＲｎｏｒ＿６．０（ＧＣＦ＿０００００１８９５．５）；位置ＮＣ＿００５１１２．４（５６９７９１５５．．５７０８０５４０、補体））上にマッピングする。この遺伝子は、２２個のエクソンを有することが報告されている。例示的なラットＣｆｈゲノム遺伝子座の配列を配列番号１に示す。ラットＣｆｈゲノム遺伝子座への言及には、野生型形態（配列番号１）ならびに対立遺伝子形態とアイソフォームが含まれる。ラットＣｆｈゲノム遺伝子座の任意の他の形態は、野生型形態との最大アライメントに対して番号を付けられたヌクレオチドを有し、アラインされたヌクレオチドは同じ番号で指定されている。他のラットＣｆｈゲノム遺伝子座配列は、配列番号１に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一なホモログまたは対立遺伝子形態またはアイソフォームであってもよい。野生型ラットＣＦＨタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ５ＸＪＷ６、Ｇ３Ｖ９Ｒ２、Ｆ１Ｍ９８３、およびＱ９１ＹＢ６ならびにＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿５６９０９３．２（配列番号３に示される）を割り当てられている。ラットＣＦＨタンパク質への言及には、野生型形態（ＮＰ＿５６９０９３．２；配列番号３）ならびに対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。ラットＣＦＨの任意の他の形態は、野生型形態との最大アライメントに対して番号を付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で指定されている。他のラットＣＦＨタンパク質配列は、配列番号３に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一なホモログまたは対立遺伝子形態またはアイソフォームであってもよい。ＮＰ＿５６９０９３．２をコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿１３０４０９．２（配列番号１６に示される）を割り当てられている。他のラットＣｆｈ  ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列は、配列番号１６に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一なホモログまたは対立遺伝子形態またはアイソフォームであってもよい。ラットＣＦＨタンパク質に対する例示的なコード配列は、配列番号２に示されている。他のラットＣｆｈコード配列は、配列番号２に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一なホモログまたは対立遺伝子形態またはアイソフォームであってもよい。ラットＣｆｈ  ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）およびコード配列への言及には、野生型形態（それぞれ配列番号１６および２）ならびに対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。ラットＣｆｈ  ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）およびコード配列の任意の他の形態は、野生型形態との最大アライメントに対して番号を付けられたヌクレオチドを有し、アラインされたヌクレオチドは同じ番号で指定されている。
【００８１】
補体系は、複数の機序によって侵入してくる病原体に対する宿主防御に寄与する自然免疫の重要な構成成分であり、主にアナフィラトキシンＣ５ａを介して媒介される作用であるオプソニン作用、細胞溶解、および炎症細胞動員を含む。補体活性化は、膜結合タンパク質および流体相タンパク質の複合体群によって調節される。補体系は、３つの相互に関連する経路、古典経路、レクチン経路、および副経路を含む。図７を参照されたい。しかし、後者の調節不全はＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の特徴である。
【００８２】
補体の副経路（ＡＰ）は固有である。第１に、他の経路とは異なり、副経路は特定の誘発タンパク質を必要とせず、ティックオーバーとして公知のプロセスによって連続的に活性なままである。最初の副経路タンパク質であるＣ３は、加水分解によって自然に活性化され、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）を形成する。ティックオーバーは、副経路の一定の低レベルの活性化の原因である。永続的な補体活性から自己組織を制御および保護するタンパク質の重要性を強調するのはこの特色である。
【００８３】
活性化されたＣ３は、補体因子Ｂ（ＦＢ）、次いで因子Ｄ（ＦＤ）を動員する。ＦＤはＣ３（Ｈ２Ｏ）に結合したＦＢを切断してＢｂとし、Ｂａを放出し、有効なセリンプロテアーゼである副経路Ｃ３転移酵素［Ｃ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂ］を形成する。このプロテアーゼは、副経路の別の固有の特色である増幅として公知のプロセスを促進する。増幅の結果として、転移酵素はさらなるＣ３を指数関数的に切断してＣ３ｂおよびＣ３ａとし、より多くのＣ３転移酵素（Ｃ３ｂＢｂ）を生じる。副経路は、古典経路とレクチン経路の両方のエフェクターアームとして機能する。これらの経路のいずれかから開始した活性は、副経路によって増幅される。
【００８４】
さらなるＣ３ｂ分子がＣ３転移酵素複合体と会合することにより、終末経路酵素であるＣ５転移酵素（Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ）が生じる。Ｃ５転移酵素はＣ５を切断して、終末補体複合体の第１の構成成分であるＣ５ｂ、およびＣ５ａとする。Ｃ５ｂはＣ６およびＣ７と会合し、次にＣ８との相互作用によっていくつかのＣ９ユニットとの結合を誘導して、膜侵襲複合体とも称される溶解性複合体Ｃ５ｂ−Ｃ９（Ｃ５ｂ−９）を形成する。この溶解性複合体は、標的細菌の補体媒介性殺滅の基礎を形成する。最後に、終末補体複合体の産生に加えて、補体活性化の間のＣ３ａおよびＣ５ａアナフィラトキシンの生成は副経路の免疫の役割を増加させる。両方のアナフィラトキシンは、補体媒介性炎症の中心的役割を果たす。
【００８５】
いくつかの補体制御タンパク質が同定されている。副経路（および間接的には終末補体経路）の活性を制御するために作用するものとしては、補体因子Ｈ（ＦＨ）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、補体受容体１（ＣＲ１）、および補体因子Ｉ（ＦＩ）が挙げられる。補体制御は、連続的に活性な補体系、または自然免疫トリガーによって誘発された副経路からの有害な宿主細胞損傷を制限するのに必要である。因子Ｈは、補体活性化の副経路を阻害する豊富に存在する血清中補体調節タンパク質である。因子Ｈは、副経路Ｃ３転換酵素複合体（Ｃ３ｂＢｂ）の阻害および活性化されたＣ３（Ｃ３ｂと称される）の因子Ｉ媒介性タンパク質分解に関する補因子としての作用を含むいくつかの機序によってこれを達成する。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣ３活性化の調節剤としてのその決定的な重要性が、副経路活性化が妨げられずに進行し、著しく低下したＣ３レベルをもたらす、因子Ｈ欠損個体において報告された補体プロファイルによって例証されている。
【００８６】
Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）は、共通した腎生検病理（電子顕微鏡法での免疫蛍光によりＣ３沈着が優勢であることから疾患の細分類が可能になる）によって定義される様々な糸球体疾患を記載している。Ｃ３Ｇは現在、２つの主要な電子顕微鏡法による亜型：デンスデポジット病（ＤＤＤ）およびＣ３糸球体腎炎（Ｃ３ＧＮ）に細分されている。２０１３年以前は、Ｃ３Ｇ患者の一部は、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）またはメサンギウム増殖性糸球体腎炎の診断を有していた。これらと同じ患者は現在、その糸球体の顕微鏡像に基づいてＣ３Ｇ患者と呼ばれている。疾患の遺伝的および後天的駆動因子の研究によって支持されている因果関係である、補体調節不全は、観察された病理の根底にある。補体系は、適切に機能する場合に、細菌およびウイルスなどの侵入者と闘う免疫系を助ける（補足する）血中のタンパク質の集合である。しかし、Ｃ３Ｇにおけるように、補体系が異常に活性化されると、Ｃ３などの正常な補体タンパク質は分解され得る。Ｃ３の分解産物が腎臓に沈殿する（lodged）ようになり、糸球体を傷つける反応を引き起こす。損傷した糸球体は血液をあまり上手く濾過することができず、尿生成が低減する。これが続けば、毒素が血中に蓄積し、より多くの腎組織が損傷を受ける可能性があり、他の重要な機能を実行する腎臓の能力が低下する場合がある。Ｃ３Ｇのいくつかの一般的症状には、尿中の血液（血尿）、尿中の過剰なタンパク質（タンパク尿）、糸球体濾過率の低下（ＧＦＲ；血液を濾過し、尿素を作る腎臓の能力の低下）、クレアチニンの上昇、疲労、ならびに手、足、および足首の腫脹（浮腫）が挙げられる。他の症状には、循環Ｃ３レベルの低下、血中尿素窒素レベルの増加、腎臓におけるＣ３沈着の増加、腎臓におけるＣ５ｂ−９膜侵襲複合体沈着の増加、および寿命（自然死亡率（spontaneous  mortality））の減少が挙げられる。
【００８７】
腎生検におけるＣ３優位性および腎組織学におけるＣ３ＧＮパターンを有するマウスモデルを、ＣＦＨの標的破壊によって作り出した。このモデルは、今日Ｃ３Ｇを研究するために使用される主なモデルである。しかし、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）はＣｆｈ−／−マウスにおいて顕在化するのに数カ月かかる場合もあり、新たな治療法を評価するのに長期にわたる前臨床研究が必要とされる。Ｃ３ＧおよびＥＳＲＤをより迅速かつ一貫して発症する、より良いＣ３Ｇモデルが必要とされる。
Ｂ．不活性化されたＣｆｈ遺伝子座
【００８８】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座または不活性化されたＣｆｈ遺伝子は、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）タンパク質を産生しないか、または機能的ＣＦＨタンパク質を産生しないＣｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子である。ＣＦＨの機能には、副経路Ｃ３転換酵素複合体（Ｃ３ｂＢｂ）の阻害および活性化されたＣ３（Ｃ３ｂ）の因子Ｉ媒介性タンパク質分解に関する補因子としての作用が含まれる。機能的ではないＣＦＨタンパク質は、副経路Ｃ３転換酵素複合体（Ｃ３ｂＢｂ）を阻害することができず、活性化されたＣ３（Ｃ３ｂ）の因子Ｉ媒介性タンパク質分解に関する補因子として作用することもできない。
【００８９】
一例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座または不活性化されたＣｆｈ遺伝子は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座もしくはＣｆｈ遺伝子の開始コドンが欠失しているか、または開始コドンがもはや機能的ではないように破壊されているかもしくは変異しているものであってもよい。例えば、開始コドンは、開始コドン内の欠失または挿入によって破壊されていてもよい。あるいは、開始コドンは、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの置換によって変異していてもよい。
【００９０】
別の例として、内因性Ｃｆｈ遺伝座もしくはＣｆｈ遺伝子の開始コドンは欠失していてもよく、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座もしくはＣｆｈ遺伝子の第１のエクソンにおけるコード配列は欠失していてもよい。具体例として、開始コドンおよび第１のエクソンにおけるコード配列は欠失していてもよく、第１のイントロンにおけるスプライスドナー部位は欠失していてもよい。
【００９１】
別の例として、内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子におけるコード配列の一部、ほとんど、またはすべては欠失していてもよい。例えば、エクソン１、エクソン１〜２、エクソン１〜３、エクソン１〜４、エクソン１〜５、エクソン１〜６、エクソン１〜７、エクソン１〜８、エクソン１〜９、エクソン１〜１０、エクソン１〜１１、エクソン１〜１２、エクソン１〜１３、エクソン１〜１４、エクソン１〜１５、エクソン１〜１６、エクソン１〜１７、エクソン１〜１８、エクソン１〜１９、エクソン１〜２０、エクソン１〜２１、またはエクソン１〜２２におけるコード配列は欠失していてもよい。具体例では、エクソン１〜２１またはエクソン１〜２２におけるコード配列は欠失していてもよい。あるいは、開始コドンを含む内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子におけるコード配列の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は欠失していてもよい。別の例では、内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子におけるコード配列のすべては欠失している。
【００９２】
内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子を不活性化させるために内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子から欠失した配列の具体例は、配列番号５に示される配列、または配列番号１に示されるラットＣｆｈゲノム遺伝子座配列と最適にアラインされた場合に配列番号１のヌクレオチド９７〜２４２（すなわち、配列番号５）に対応する配列（例えば、配列番号５に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一な相同配列）である。不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座またはＣｆｈ遺伝子の具体例は、配列番号４に示される配列、または配列番号１と最適にアラインされた場合に配列番号１に対して配列番号４における欠失に対応する欠失を有する配列（例えば、配列番号４に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一な相同配列）である。
Ｃ．不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットゲノム、ラット細胞、およびラット
【００９３】
本明細書の他の箇所に記載されているように、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座または不活性化されたＣｆｈ遺伝子を含むラットゲノム、ラット細胞およびラットが提供される。ゲノム、細胞、またはラットは雄であっても雌であってもよい。ラットゲノム、ラット細胞、またはラットは、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座に対してヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよい。好ましくは、本明細書に開示される方法において使用されるものなどのゲノム、細胞、またはラットは、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座に対してホモ接合性である。二倍体生物は、各遺伝子座に２個の対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特異的遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２個の同一対立遺伝子が存在する場合ホモ接合性として、２個の対立遺伝子が異なる場合ヘテロ接合性として記載される。
【００９４】
本明細書において提供されるラットゲノム、ラット細胞、およびラットは、例えば、Ｃｆｈ遺伝子座を含む任意のラットゲノム、ラット細胞、またはラットであってもよい。ラット細胞は、未分化状態または分化状態のいずれの型であってもよい。例えば、ラット細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞などのラット多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、２つ以上の分化細胞型に発生する能力を有する未分化細胞を含む。このような多能性および／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であってもよい。ＥＳ細胞としては、胚への導入の際に発生中の胚のあらゆる組織に寄与することが可能である胚由来の全能性または多能性細胞が挙げられる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から誘導することができ、脊椎動物の３つの胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化することが可能である。
【００９５】
本明細書において提供される細胞は、胚細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂コンピテント細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂コンピテント細胞または減数分裂不活性細胞であってもよい。同様に、細胞は初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、胚細胞、生殖母細胞、や未分化幹細胞でもないいずれかの細胞を含む。例えば、細胞は腎細胞であってもよい。
【００９６】
本明細書において提供される好適な細胞は、初代細胞を含んでもよい。初代細胞は、生物、臓器、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず、不死でもない細胞を含む。これらは、組織培養を以前に経ていなかったか、または組織培養を以前に経たことがあるが組織培養を無期限に経ることが不可能である生物、臓器、または組織から得られた任意の細胞を含む。このような細胞は従来の技法によって単離することができ、例えば、腎細胞を含む。
【００９７】
本明細書において提供される他の好適な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常は無期限に増殖しないが、変異または変更によって、正常細胞の老化を回避し、代わりに分裂し続ける多細胞生物由来の細胞を含む。このような変異または変更は、天然に生じてもよく、または意図的に誘導されてもよい。多数の種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、典型的には、組換え遺伝子またはタンパク質を培養するかまたは発現させるために使用される細胞を含む。
【００９８】
本明細書において提供される細胞は、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞または接合体）も含む。このような１細胞期胚は、任意の遺伝的バックグラウンドに由来してもよく、新鮮であっても凍結されていてもよく、かつ自然繁殖またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精から得てもよい。本明細書において提供される細胞は、正常で、健康な細胞であってもよく、または罹患した細胞もしくは変異を有する細胞であってもよい。
【００９９】
本明細書に記載されているように、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットは、本明細書の他の箇所に記載された方法によって作製され得る。ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｈｅｒラット系統を含む任意のラット系統に由来してもよい。ラットはまた、上記の２つまたはそれより多くの系統の異種交配から誘導された系統から得られてもよい。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してもよい。ＡＣＩラット系統は、白い腹部および足ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプと共に黒アグーチを有するとして特徴付けられる。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給元から入手可能である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有するとして特徴付けられる。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む種々の供給元から入手可能である。一部の好適なラットは、同系交配のラット系統に由来し得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
【０１００】
具体例では、Ｃｆｈ遺伝子は、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ系統の胚性幹細胞において不活性化される。具体例では、これらのＥＳ細胞は、その後、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット宿主胚中に導入されて、キメラを生じる。次いで、キメラは、例えば、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットと交配されて、Ｆ１動物を生じることができ、次いで、これが同系交配されて、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を有するラット系列を確立し得る。例えば、最終のラットＣｆｈノックアウト系列は、５０％のＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉと５０％のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙであってもよい。
【０１０１】
不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、本明細書の他の箇所に開示されているように、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の１つまたは複数の症状を有する。用語「症状」は、医師によって観察されるような疾患の客観的エビデンスを指す。
【０１０２】
一例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して低下した循環補体成分３（Ｃ３）タンパク質レベルを有していてもよい。例えば、循環Ｃ３レベルは、約２００μｇ／ｍＬ未満または約１００μｇ／ｍＬ未満であってもよい。例えば、循環Ｃ３レベルは、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で、約２００μｇ／ｍＬ未満または約１００μｇ／ｍＬ未満であってもよい。例えば、循環Ｃ３レベルは、約２５から約２００μｇ／ｍＬの間、約２５から約１７５μｇ／ｍＬの間、約２５から約１５０μｇ／ｍＬの間、約２５から約１２５μｇ／ｍＬの間、約２５から約１００μｇ／ｍＬの間、または約２５から約７５μｇ／ｍＬの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１０３】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ３沈着が増加していてもよい。別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ；または終末補体複合体Ｃ５ｂ−９）沈着が増加していてもよい。
【０１０４】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して増加した血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを有していてもよい。例えば、増加したＢＵＮレベルは、少なくとも約１０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約１０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約２０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約２０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約３０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約３０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約４０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約４０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約５０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約５０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約６０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約６０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約７０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約７０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約８０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、少なくとも約９０ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約９０ｍｇ／ｄＬを超えてもよく、または少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬであるかもしくは約１００ｍｇ／ｄＬを超えてもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、ＢＵＮレベルは、約１０から約４００ｍｇ／ｄＬの間、約１０から約３５０ｍｇ／ｄＬの間、約１０から約３００ｍｇ／ｄＬの間、約１０から約２５０ｍｇ／ｄＬの間、約１０から約２００ｍｇ／ｄＬの間、約２０から約４００ｍｇ／ｄＬの間、約２０から約３５０ｍｇ／ｄＬの間、約２０から約３００ｍｇ／ｄＬの間、約２０から約２５０ｍｇ／ｄＬの間、約２０から約２００ｍｇ／ｄＬの間、約３０から約４００ｍｇ／ｄＬの間、約３０から約３５０ｍｇ／ｄＬの間、約３０から約３００ｍｇ／ｄＬの間、約３０から約２５０ｍｇ／ｄＬの間、約３０から約２００ｍｇ／ｄＬの間、約４０から約４００ｍｇ／ｄＬの間、約４０から約３５０ｍｇ／ｄＬの間、約４０から約３００ｍｇ／ｄＬの間、約４０から約２５０ｍｇ／ｄＬの間、約４０から約２００ｍｇ／ｄＬの間、約５０から約４００ｍｇ／ｄＬの間、約５０から約３５０ｍｇ／ｄＬの間、約５０から約３００ｍｇ／ｄＬの間、約５０から約２５０ｍｇ／ｄＬの間、または約５０から約２００ｍｇ／ｄＬの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１０５】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラットと比較して減少した寿命を有していてもよい。例えば、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットまたはラット集団の寿命または寿命の中央値は、約３００日未満、約２５０日未満、約２００日未満、約１５０日未満、約１４０日未満、約１３０日未満、約１２０日未満、約１１０日未満、約１００日未満、約９０日未満、約８０日未満、約７０日未満、約６０日未満、または約５０日未満であってもよい。具体例では、寿命の中央値は、約１５０日未満または約１１０日未満である。具体例では、寿命は、約２５０日未満、約１５０日未満、または約１３０日未満である。例えば、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットまたはラット集団の寿命または寿命の中央値は、約２５日から約７５日の間、約３０日から約７０日の間、約３５日から約６５日の間、約４０日から約６０日の間、約４５日から約５５日の間、約５０日から約５５日の間、約７５日から約１２５日の間、約８０日から約１２０日の間、約８５日から約１１５日の間、約９０日から約１１０日の間、約９５日から約１０５日の間、約１００日から約１０５日の間、約２５日から約１２５日の間、約３０日から約１２０日の間、約３５日から約１１５日の間、約４０日から約１１０日の間、約４５日から約１０５日の間、または約５０日から約１０５日の間であってもよい。
【０１０６】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して増加した血清中シスタチンＣレベルを有していてもよい。例えば、血清中シスタチンＣレベルは、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１０００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１１００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１１００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１２００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１２００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１３００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１３００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１４００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１４００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１５００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１５００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１６００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１６００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１７００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１７００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１８００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１８００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、少なくとも約１９００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約１９００ｎｇ／ｍＬを超えてもよく、または少なくとも約２０００ｎｇ／ｍＬであるかもしくは約２０００ｎｇ／ｍＬを超えてもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、血清中シスタチンＣレベルは、約１０００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１０００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１０００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１０００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、約１０００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間、約１１００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１１００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１１００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１１００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、約１１００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間、約１２００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１２００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１２００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１２００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、約１２００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間、約１３００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１３００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１３００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１３００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、約１３００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間、約１４００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１４００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１４００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１４００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、約１４００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間、約１５００から約５０００ｎｇ／ｍＬの間、約１５００から約４５００ｎｇ／ｍＬの間、約１５００から約４０００ｎｇ／ｍＬの間、約１５００から約３５００ｎｇ／ｍＬの間、または約１５００から約３０００ｎｇ／ｍＬの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１０７】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、野生型ラット（例えば、約７週齢から約１７週齢の）と比較して増加した尿中アルブミンレベル（アルブミン尿）を有していてもよい。例えば、増加した尿中アルブミンは、１日当たりの尿中アルブミンで測定されるかまたはクレアチニンに対して正規化されたものであってもよい。例えば、１日当たりの尿中アルブミンは、例えば、少なくとも約１０００μｇであるかもしくは約１０００μｇを超えてもよく、少なくとも約２０００μｇであるかもしくは約２０００μｇを超えてもよく、少なくとも約３０００μｇであるかもしくは約３０００μｇを超えてもよく、少なくとも約４０００μｇであるかもしくは約４０００μｇを超えてもよく、少なくとも約５０００μｇであるかもしくは約５０００μｇを超えてもよく、少なくとも約６０００μｇであるかもしくは約６０００μｇを超えてもよく、少なくとも約７０００μｇであるかもしくは約７０００μｇを超えてもよく、少なくとも約８０００μｇであるかもしくは約８０００μｇを超えてもよく、少なくとも約９０００μｇであるかもしくは約９０００μｇを超えてもよく、または少なくとも約１００００μｇであるかもしくは約１００００μｇを超えてもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、１日当たりの尿中アルブミンは、例えば、約１０００から約４００００μｇの間、約２０００から約４００００μｇの間、約３０００から約４００００μｇの間、約４０００から約４００００μｇの間、または約５０００から約４００００μｇの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、尿中クレアチニンに対して正規化された尿中アルブミン（すなわち、尿中アルブミンの尿中クレアチニンに対する比）は、例えば、少なくとも約１００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約２００μｇ：ｍｇであるかもしくは約２００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約３００μｇ：ｍｇであるかもしくは約３００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約４００μｇ：ｍｇであるかもしくは約４００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約５００μｇ：ｍｇであるかもしくは約５００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約６００μｇ：ｍｇであるかもしくは約６００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約７００μｇ：ｍｇであるかもしくは約７００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約８００μｇ：ｍｇであるかもしくは約８００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約９００μｇ：ｍｇであるかもしくは約９００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１０００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１０００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１１００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１１００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１２００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１２００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１３００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１３００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１４００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１４００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１５００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１５００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１６００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１６００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１７００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１７００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１８００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１８００μｇ：ｍｇを超えてもよく、少なくとも約１９００μｇ：ｍｇであるかもしくは約１９００μｇ：ｍｇを超えてもよく、または少なくとも約２０００μｇ：ｍｇであるかもしくは約２０００μｇ：ｍｇを超えてもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、尿中クレアチニンに対して正規化された尿中アルブミン（すなわち、尿中アルブミンの尿中クレアチニンに対する比）は、例えば、約１００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約２００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約３００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約４００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約５００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約１０００から約６０００μｇ：ｍｇの間、約１００から約５０００μｇ：ｍｇの間、約２００から約５０００μｇ：ｍｇの間、約３００から約５０００μｇ：ｍｇの間、約４００から約５０００μｇ：ｍｇの間、約５００から約５０００μｇ：ｍｇの間、または約１０００から約５０００μｇ：ｍｇの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１０８】
別の例として、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットは、有足細胞の消失および歪み（足突起幅の増加およびより少ない足突起によって測定される上皮の消失）、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の肥厚（例えば、細胞介在および高電子密度沈着物を伴う）、糸球体間質の拡大、および／または窓の喪失を伴う内皮の腫脹を含む著しい糸球体病理を呈してもよい（例えば、約７週齢から約１７週齢で）。
【０１０９】
一例として、ＧＢＭ厚の増加は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体におけるＧＢＭ厚の平均は、少なくとも約０．２ミクロンの長さ、少なくとも約０．３ミクロンの長さ、少なくとも約０．４ミクロンの長さ、少なくとも約０．５ミクロンの長さ、少なくとも約０．６ミクロンの長さ、少なくとも約０．７ミクロンの長さ、少なくとも約０．８ミクロンの長さ、少なくとも約０．９ミクロンの長さ、少なくとも約１．０ミクロンの長さ、少なくとも約１．１ミクロンの長さ、少なくとも約１．２ミクロンの長さ、少なくとも約１．３ミクロンの長さ、少なくとも約１．４ミクロンの長さ、少なくとも約１．５ミクロンの長さ、少なくとも約１．６ミクロンの長さ、少なくとも約１．７ミクロンの長さ、または少なくとも約１．８ミクロンの長さであってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体におけるＧＢＭ厚の平均は、約０．２から約２．５ミクロンの間の長さ、約０．５から約２．５ミクロンの間の長さ、約１．０から約２．５ミクロンの間の長さ、約１．１から約２．５ミクロンの間の長さ、約１．２から約２．４ミクロンの間の長さ、約１．３から約２．３ミクロンの間の長さ、約１．４から約２．２ミクロンの間の長さ、約１．５から約２．１ミクロンの間の長さ、約１．６から約２．０ミクロンの間の長さ、または約１．７から約１．９ミクロンの間の長さであってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体におけるＧＢＭ厚の平均は、約１．８ミクロンの長さであってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１１０】
別の例として、有足細胞足突起幅の増加は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体における足突起幅の平均は、少なくとも約０．４ミクロン、少なくとも約０．５ミクロン、少なくとも約０．６ミクロン、少なくとも約０．７ミクロン、少なくとも約０．８ミクロン、少なくとも約０．９ミクロン、少なくとも約１．０ミクロン、少なくとも約１．１ミクロン、少なくとも約１．２ミクロン、少なくとも約１．３ミクロン、少なくとも約１．４ミクロン、少なくとも約１．５ミクロン、少なくとも約１．６ミクロン、少なくとも約１．７ミクロン、少なくとも約１．８ミクロン、少なくとも約１．９ミクロン、少なくとも約２．０ミクロン、少なくとも約２．１ミクロン、少なくとも約２．２ミクロン、少なくとも約２．３ミクロン、少なくとも約２．４ミクロン、または少なくとも約２．５ミクロンであってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体における足突起幅の平均は、約０．５から約５．５ミクロンの間、約１．０から約５．５ミクロンの間、約１．５から約５．５ミクロンの間、約０．５から約３．５ミクロンの間、約１．０から約３．５ミクロンの間、約１．５から約３．５ミクロンの間、約２．０から約３．５ミクロンの間、約２．０から約３．０ミクロンの間、約２．１から約２．９ミクロンの間、約２．２から約２．８ミクロンの間、約２．３から約２．７ミクロンの間、または約２．４から約２．６ミクロンの間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、糸球体における足突起幅の平均は、約２．５ミクロンであってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
【０１１１】
別の例として、有足細胞足突起数の減少は、野生型ラットと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約３．８倍、または少なくとも約４倍であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数の平均（例えば、糸球体における毛細血管係蹄を覆う足突起数の平均）は、約２．５未満、約２未満、約１．５未満、約１．４未満、約１．３未満、約１．２未満、約１．１未満、約１未満、約０．９未満、または約０．８未満であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数の平均は、約０．４から約２．５の間、約０．４から約２．０の間、約０．４から約１．５の間、約０．４から約１．４の間、約０．４から約１．３の間、約０．４から約１．２の間、約０．４から約１．１の間、約０．４から約１．０の間、約０．４から約０．９の間、約０．４から約０．８の間、約０．５から約２．５の間、約０．５から約２．０の間、約０．５から約１．５の間、約０．５から約１．４の間、約０．５から約１．３の間、約０．５から約１．２の間、約０．５から約１．１の間、約０．５から約１．０の間、約０．５から約０．９の間、約０．５から約０．８の間、約０．６から約２．５の間、約０．６から約２．０の間、約０．６から約１．５の間、約０．６から約１．４の間、約０．６から約１．３の間、約０．６から約１．２の間、約０．６から約１．１の間、約０．６から約１．０の間、約０．６から約０．９の間、または約０．６から約０．８の間であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。例えば、１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数の平均は、約０．７であってもよい（例えば、約７週齢、約８週齢、約９週齢、約１０週齢、約１１週齢、約１２週齢、約１３週齢、約１４週齢、約１５週齢、約１６週齢、または約１７週齢で）。
ＩＩＩ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで推定Ｃ３Ｇ治療剤の有効性を評価するために不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを使用する方法
【０１１２】
本明細書の他の箇所に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで推定Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）治療剤の有効性を評価するために、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを使用するための様々な方法が提供される。このような方法は、候補薬剤（すなわち、化合物または治療用分子）を同定するかまたはＣ３Ｇの処置において使用するための候補薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性を評価するための方法であってもよい。これらの方法は、本明細書に開示される不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかを利用する。このような方法では、候補化合物をＣ３Ｇの症状を呈するラットに直接投与して、薬剤または化合物がＣ３Ｇの１つまたは複数の症状を低減することができるかどうかを決定することができる。
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで推定Ｃ３Ｇ治療剤の有効性を試験する方法
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、薬剤または化合物（例えば、推定Ｃ３Ｇ治療剤）のＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）治療活性を評価するための様々な方法が提供される。このような方法は、薬剤または化合物を不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットに投与するステップと、ラットにおける薬剤化合物のＣ３Ｇ治療活性を評価するステップとを含んでもよく、またはこれらは、推定Ｃ３治療剤を不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットに投与するステップと、ラットにおける推定Ｃ３治療剤の活性を評価するステップとを含んでもよい。例えば、このような方法は、Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の処置において使用するための薬剤または化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療有効性を評価するためのものであってもよい。このような方法は、例えば、薬剤または化合物を不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットに投与するステップと、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおけるＣ３Ｇの１つまたは複数の症状を、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットと比較して評価するステップとを含んでもよい。
【０１１４】
薬剤または化合物は、任意の生物学的または化学的薬剤であってもよい。推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【０１１５】
このような化合物または薬剤は、本明細書の他の箇所により詳細に開示されている任意の送達方法（例えば、注射、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路によって投与されてもよい。治療用分子を送達する方法および投与経路は、本明細書の他の箇所により詳細に開示されている。
【０１１６】
推定Ｃ３Ｇ治療剤の活性を評価するまたは薬剤もしくは化合物のＣ３Ｇ治療活性を評価するための方法は周知であり、本明細書の他の箇所に提供される。このような評価するステップは、補体副（ＡＣ）経路の活性の読み出しを評価するステップまたは腎機能を評価するステップを含んでもよい。例えば、このような方法は、以下のもののうちの１つまたは複数またはすべてなどの任意のＣ３Ｇ症状を評価するステップを含んでもよい：（ｉ）循環Ｃ３タンパク質レベル（Ｃ３Ｇにおいて減少）、（ｉｉ）血中尿素窒素レベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、（ｉｉｉ）腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ３沈着のレベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、（ｉｖ）腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ５ｂ−９沈着のレベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、および（ｖ）ラットの寿命（Ｃ３Ｇにおいて減少）。別の例として、このような方法は、以下のもののうちの１つまたは複数またはすべてを評価するステップを含んでもよい：（ｉ）循環Ｃ３タンパク質レベル（Ｃ３Ｇにおいて減少）、（ｉｉ）血中尿素窒素レベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、（ｉｉｉ）腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ３沈着のレベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、（ｉｖ）腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ５ｂ−９沈着のレベル（Ｃ３Ｇにおいて増加）、（ｖ）血清中シスタチンＣレベル（Ｃ３Ｇのような糸球体疾患において増加）、（ｖｉ）尿中アルブミン（アルブミン尿）（Ｃ３Ｇのような糸球体疾患において増加）、（ｖｉｉ）糸球体基底膜（ＧＢＭ）厚（Ｃ３Ｇのような糸球体疾患において増加）、（ｖｉｉｉ）有足細胞足突起幅（Ｃ３Ｇのような糸球体疾患において増加）、（ｉｘ）有足細胞足突起数（Ｃ３Ｇのような糸球体疾患において減少）、および（ｘ）ラットの寿命（Ｃ３Ｇにおいて減少）。本明細書に記載されている糸球体疾患に関連する任意の他の症状も使用され得る。薬剤または化合物は、候補薬剤も化合物も投与されていない対照ラットと比較して、Ｃ３Ｇの１つまたは複数の症状を改善または処置することができる。用語「改善する」または「処置する」は、Ｃ３Ｇに関連する１つまたは複数の症状（one  or  more  r  symptoms）を排除するか、その発症を遅延させるか、またはその蔓延、頻度、もしくは重症度を低減させることを意味する。
【０１１７】
評価される１つまたは複数の症状には、Ｃ３循環レベルの低下が含まれてもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける循環Ｃ３タンパク質レベルを評価するステップを含み得る。循環Ｃ３レベルは、例えば、約２週齢から約１７週齢の間、約２週齢から約１２週齢の間、約３週齢から約１１週齢の間、約４週齢から約１０週齢の間、約５週齢から約９週齢の間、または６週齢から約８週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。具体例では、循環Ｃ３レベルは、約７週齢で評価されてもよい。あるいは、循環Ｃ３レベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける循環Ｃ３タンパク質レベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける循環Ｃ３タンパク質レベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対する循環Ｃ３タンパク質レベルの増加は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補薬剤または化合物による循環Ｃ３レベルの低下の改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで循環Ｃ３レベルの低下を改善する（例えば、循環Ｃ３レベルを増加させる）ことができる。循環Ｃ３レベルを評価するステップは、任意の数の周知の方法を使用して達成することができる。
【０１１８】
評価される１つまたは複数の症状は、腎臓における（特にネフロンにおける（例えば、糸球体における））Ｃ３沈着も含み得る。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおいて、腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ３沈着のレベルを評価するステップを含み得る。Ｃ３沈着は、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、腎臓におけるＣ３沈着のレベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおけるＣ３沈着のレベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおけるＣ３沈着のレベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対するＣ３沈着レベルの低下は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補薬剤または化合物による腎臓Ｃ３沈着の改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで腎臓Ｃ３沈着を改善する（例えば、腎臓Ｃ３沈着を減少させる）ことができる。腎臓Ｃ３タンパク質沈着の決定は、以下に限定されないが、免疫組織化学、免疫蛍光、および電子顕微鏡法（免疫電子顕微鏡法を含む）を含む任意の数の公知の手段によって分析され得る。
【０１１９】
評価される１つまたは複数の症状は、腎臓における（例えば、糸球体における）Ｃ５ｂ−９膜侵襲複合体沈着も含み得る。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおいて、腎臓における（例えば、腎臓の糸球体における）Ｃ５ｂ−９沈着のレベルを評価するステップを含み得る。Ｃ５ｂ−９沈着は、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、腎臓におけるＣ５ｂ−９沈着のレベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおけるＣ５ｂ−９沈着のレベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおけるＣ５ｂ−９沈着のレベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対するＣ５ｂ−９沈着レベルの低下は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおける、統計的に有意な量での、候補薬剤または化合物による腎臓におけるＣ５ｂ−９膜侵襲複合体形成および沈着の改善がある。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで腎臓におけるＣ５ｂ−９膜侵襲複合体形成および沈着を改善する（例えば、Ｃ５ｂ−９沈着レベルを減少させる）ことができる。腎臓におけるＣ５ｂ−９膜侵襲複合体形成および沈着の決定は、以下に限定されないが、免疫組織化学、免疫蛍光（例えば、免疫蛍光的に標識された抗Ｃ９抗体）、および電子顕微鏡法（免疫電子顕微鏡法を含む）を含む任意の数の公知の手段によって分析され得る。
【０１２０】
評価される１つまたは複数の症状は、血清中の血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを含んでもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける血中尿素窒素レベルのレベルを評価するステップを含み得る。血中尿素窒素レベルは、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、血中尿素窒素レベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける血中尿素窒素レベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける血中尿素窒素レベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対する血中尿素窒素レベルの低下は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、上昇した血漿または血清中の血中尿素窒素レベルの候補薬剤または化合物による改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで血漿または血清中の血中尿素窒素レベルの上昇を改善する（例えば、血漿または血清中の血中尿素窒素レベルを低下させる）ことができる。ＢＵＮの血清および／または血漿中レベルを評価するステップは、任意の数の周知の方法を使用して達成することができる。
【０１２１】
評価される１つまたは複数の症状は、血清中の血清中シスタチンＣレベルを含んでもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける血清中シスタチンＣレベルを評価するステップを含み得る。血清中シスタチンＣレベルは、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、血清中シスタチンＣレベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける血清中シスタチンＣレベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける血清中シスタチンＣレベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対する血清中シスタチンＣレベルの低下は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、上昇した血漿または血清中シスタチンＣレベルの候補薬剤または化合物による改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで上昇した血漿または血清中シスタチンＣレベルを改善する（例えば、血漿または血清中シスタチンＣレベルを低下させる）ことができる。血清中シスタチンＣの血清および／または血漿中レベルを評価するステップは、任意の数の周知の方法を使用して達成することができる。
【０１２２】
評価される１つまたは複数の症状は、尿中アルブミンレベル（アルブミン尿）を含んでもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける尿中アルブミンレベルを評価するステップを含み得る。尿中アルブミンレベルは、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、尿中アルブミンレベルは、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける尿中アルブミンレベルは、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける尿中アルブミンレベルに対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対する尿中アルブミンレベルの低下は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、上昇した尿中アルブミンレベルの候補薬剤または化合物による改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで上昇した尿中アルブミンレベルを改善する（例えば、尿中アルブミンレベルを低下させる）ことができる。尿中アルブミンレベルを評価するステップは、任意の数の周知の方法を使用して達成することができ、例えば、１日当たりとして、または尿中クレアチニンに対して正規化して定量することができる。
【０１２３】
評価される１つまたは複数の症状は、糸球体基底膜（ＧＢＭ）厚、有足細胞足突起幅、および有足細胞足突起数などの糸球体病理を含んでもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける糸球体病理を評価するステップを含み得る。糸球体病理は、例えば、約７週齢から約１７週齢の間、約８週齢から約１７週齢の間、または約９週齢から約１７週齢の間のラットにおいて評価されてもよい。あるいは、糸球体病理は、約７週齢から約１７週齢の間、約７週齢から約１６週齢の間、約７週齢から約１５週齢の間、約７週齢から約１４週齢の間、約７週齢から約１３週齢の間、約７週齢から約１２週齢の間、約７週齢から約１１週齢の間、約７週齢から約１０週齢の間、約７週齢から約９週齢の間、または約７週齢から約８週齢の間で評価されてもよい。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットにおける糸球体病理は、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける糸球体病理と比較して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対するＧＢＭ厚の減少、有足細胞足突起幅の減少、または有足細胞足突起数の増加（例えば、１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足数の増加）は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、ＧＢＭ厚の増加、有足細胞足突起幅の増加、または有足細胞足突起数の減少の候補薬剤または化合物による改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで、ＧＢＭ厚の増加、有足細胞足突起幅の増加、または有足細胞足突起数の減少を改善する（例えば、ＧＢＭ厚を減少させる、有足細胞足突起幅を減少させる、または有足細胞足突起数を増加させる）ことができる。糸球体病理を評価するステップは、本明細書に記載のものを含む任意の数の周知の方法を使用して達成することができる。
【０１２４】
評価される１つまたは複数の症状は、自然死（すなわち、寿命）を含んでもよい。このような方法は、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットの寿命を評価するステップを含み得る。例えば、薬剤または化合物を投与された遺伝子改変ラットの寿命は、薬剤も化合物も投与されていない対照遺伝子改変ラットにおける寿命に対して評価されてもよく、対照遺伝子改変ラットに対する寿命の増加は薬剤または化合物の治療効果を示す。例えば、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、自然死の発生の候補薬剤または化合物による改善は統計的に有意であり得る。例えば、候補薬剤または化合物は、本明細書に記載されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットのいずれかにおいて、候補化合物や薬剤で処置されていない対照ラットと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかで自然死の発生を改善する（例えば、寿命を増加させる）ことができる。
【０１２５】
上記例における対照遺伝子改変ラットは、薬剤や化合物で処置されていない以外は、薬剤または化合物で処置されているラットとその他の点では同一のラットであり得る。例えば、対照ラットは同じ不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を有していてもよい、処置されているラットと同じ系統であってもよい、処置されているラットと同じ性別であってもよい、および／または処置されているラットと同じ年齢であってもよい。対照ラットは、例えば、処置されていなくても、治療効果を有さない対照物質（例えば、プラセボ）で処置されていてもよい。
【０１２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を評価するために上記で提供される様々な方法を使用して、推定Ｃ３Ｇ治療剤の活性を評価することもでき、または本明細書の他の箇所に記載されているようにｅｘ  ｖｉｖｏでの化合物のＣ３Ｇ治療活性を評価するために上記で提供された様々な方法を使用することもできる。
Ｂ．候補Ｃ３Ｇ治療剤
【０１２７】
任意の候補Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）治療剤または化合物を本明細書に開示されるラット細胞およびラットにおいて試験することができる。このような推定治療剤は、本明細書の他の箇所に記載されているようにＣ３Ｇと関連する１つまたは複数の症状を防止または緩和するために設計した、または適合させた任意の薬剤であってもよい。このような推定治療剤は小分子であってもよく、あるいは抗体、抗原結合性タンパク質、または核酸もしくはタンパク質などの生物製剤であってもよい。候補治療剤または化合物は、例えば、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
【０１２８】
一例として、推定Ｃ３Ｇ治療剤は、補体阻害剤であるように設計されてもよい。補体阻害剤の例としては、エクリズマブ（様々な補体媒介性腎疾患（非典型溶血性尿毒症症候群、ａＨＵＳ）に対して承認されたヒト化抗補体Ｃ５モノクローナル抗体；Ｃ５の切断を遮断し、それによってＣ５ｂ−９の形成とアナフィラトキシンＣ５Ａの生成の両方を妨げる）、可溶性補体受容体１（ＣＲ１）、Ｃｐ４０（ペプチド性Ｃ３阻害剤）などのＣ３阻害剤、Ｃ５に対するｓｉＲＮＡ剤、ＦＢおよびＦＤ阻害剤などのＣ５阻害剤、ならびにＣ５ａ受容体遮断剤が挙げられる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nester  and  Smith  (2016)  Seminars  in  Immunology  28:241-249を参照されたい。
【０１２９】
別の例として、推定Ｃ３Ｇ治療剤は、Ｃ３Ｇからの腎損傷のプロセスを遅らせるように設計された薬剤であってもよい。このような薬剤としては、例えば、コルチコステロイド（例えば、補体系が属する対象の免疫系を鎮め、対象の免疫系が糸球体を攻撃するのを停止させるために使用される）、免疫抑制薬（例えば、Ｃ３Ｇにおける腎損傷の原因となる対象の免疫系の機能を阻害するために使用される）、ＡＣＥ阻害剤およびＡＲＢ（例えば、タンパク質損失を減少させ、血圧を制御するために使用される血圧の薬）、食事の変更（例えば、腎臓における老廃物の負荷を軽減するために塩分（ナトリウム）およびタンパク質を減らすこと）、ならびに補体阻害剤を挙げることができる。
【０１３０】
任意の他の公知のまたは推定のＣ３Ｇ治療剤の活性は、本明細書に開示されるラットを使用して評価することもできる。同様に、任意の他の分子は、本明細書に開示されるラットを使用して、Ｃ３Ｇ治療活性についてスクリーニングされ得る。
Ｃ．推定Ｃ３Ｇ治療剤をラットまたはラット細胞に投与するステップ
【０１３１】
本明細書に開示される方法は、ラットまたはラット細胞中に、核酸、タンパク質、核酸−タンパク質複合体、ペプチド模倣体、抗原結合性タンパク質、または小分子を含む様々な薬剤または化合物（例えば、抗体または小分子などの推定Ｃ３Ｇ治療剤）を導入するステップを含み得る。「導入するステップ」は、分子（例えば、核酸またはタンパク質または小分子）がラット細胞の内側またはラット内の細胞の内側にアクセスできるように、その分子をラット細胞またはラットに提示するステップを含む。導入するステップは、任意の手段によって達成され得る。複数の成分が導入される場合、これらは同時に導入されても、いずれかの組合せで逐次的に導入されてもよい。さらに、成分のうちの２つまたはそれより多くは、同じ送達方法または異なる送達方法によってラット細胞またはラット中に導入され得る。同様に、成分のうちの２つまたはそれより多くは、同じ投与経路または異なる投与経路でラット中に導入され得る。
【０１３２】
ラットまたはラット細胞中に導入された薬剤または化合物は、導入された分子の安定性を増加させる（例えば、所与の保存条件下で（例えば、−２０℃、４℃、または周囲温度）、分解産物が出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満のように閾値未満のままである期間を延長する；またはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中で提供され得る。このような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート（lipid  cochleate）、および脂質微小管が挙げられる。
【０１３３】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物のラット細胞またはラットへの導入を可能にする様々な方法および組成物が本明細書において提供される。薬剤を様々な細胞型中に導入するための方法は公知であり、例えば、安定なトランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介方法を含む。
【０１３４】
トランスフェクションプロトコールおよび薬剤を細胞中に導入するためのプロトコールは変更されてもよい。非限定的なトランスフェクション方法は、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Graham  et  al.  (1973)  Virology  52(2):456-467、Bacchetti  et  al.  (1977)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  74(4):1590-1594、およびKriegler,  M  (1991).  Transfer  and  Expression:  A  Laboratory  Manual.  New  York:  W.  H.  Freeman  and  Company.  pp.  96-97）；デンドリマー；またはＤＥＡＥデキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション方法を含む。非化学的方法としては、電気穿孔、ソノポレーション（Sono-poration）、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションは、遺伝子銃の使用、または磁石支援トランスフェクション（Bertram  (2006)  Curr.  Pharm.  Biotechnol.  7(4):  277-285）を含む。ウイルス方法をトランスフェクションに使用することもできる。
【０１３５】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の細胞への導入は、電気穿孔、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによっても媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質が細胞質のみならず核膜を通って核内に送達されるのを可能にする、改善された電気穿孔技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔よりもはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、通常の電気穿孔による７百万個と比較して、わずか約２百万個）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して実施される。
【０１３６】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の細胞（例えば、接合体）への導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。接合体（すなわち、１細胞期胚）において、マイクロインジェクションは、母性および／もしくは父性前核中に、または細胞質中になされ得る。マイクロインジェクションを実行するための方法は周知である。例えば、Nagy  et  al.  （Nagy  A,  Gertsenstein  M,  Vintersten  K,  Behringer  R.,  2003,  Manipulating  the  Mouse  Embryo.  Cold  Spring  Harbor,  New  York:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press）を参照されたい；また、Meyer  et  al.  (2010)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  107:15022-15026およびMeyer  et  al.  (2012)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  109:9354-9359も参照されたい。
【０１３７】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物をラット細胞またはラット中に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過ペプチド媒介性送達、または移植型デバイス媒介性送達を挙げることができる。具体例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体中で、ラット細胞またはラット中に導入することができる。ラットへの送達の一部の具体例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
【０１３８】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物のラット細胞またはラットへの導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。流体力学的送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達では、必須ＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射する必要があり、現在のウイルスおよび合成ベクターに関連する安全上の懸念が排除される。血流中に注射されると、ＤＮＡは、血液にアクセス可能な異なる組織における細胞に到達することが可能である。流体力学的送達は、循環における非圧縮性血液への大容量の溶液の急速注射によって生成される力を利用して、大型で膜不透過性の化合物が実質細胞に進入するのを防止する内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassa  et  al.  (2011)  Pharm.  Res.  28(4):694-701を参照されたい。
【０１３９】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の導入は、ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスを含む。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる。ウイルスは、宿主ゲノム中に組み込むことができるか、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれない。このようなウイルスは、低下した免疫を有するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有し得るか、または複製欠損であり得る（例えば、さらなる回数のビリオン複製および／またはパッケージングに必要な１種または複数種の遺伝子を欠損する）。ウイルスは、一過性発現、持続性発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１カ月、２カ月、または３カ月）、または永続的発現を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
【０１４０】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。脂質製剤は、その細胞取り込みを改善しつつ、分解から生体分子を保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらは、マイクロスフェア（単層および多重層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルションにおける分散相、ミセル、または懸濁物における内部相を含む。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局部、鼻腔内、または筋肉内を含むいずれかの好適な経路によるものであってもよい。全身投与様式は、例えば、経口および非経口的経路を含む。非経口的経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が挙げられる。具体例は、静脈内注入である。点鼻および硝子体内注射は、他の具体例である。局所的投与様式は、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻中への）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域中への）、側頭皮質、扁桃、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、視蓋、被蓋、または黒質への局在化された実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下（subconjuctival）、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路を含む。有意により少ない量の成分（全身的アプローチと比較して）は、局所的に（例えば、実質内または硝子体内）投与された場合に、全身的に（例えば、静脈内）投与された場合と比較して、効果を発揮することができる。局所的投与様式は、治療有効量の成分が全身的に投与された場合に発生し得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低下または排除することもできる。特定の例では、投与経路は、皮下または静脈内である。
【０１４２】
推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物を含む組成物は、１種または複数種の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に応じて変更され得る。用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって実質的に有害ではないことを意味する。
【０１４３】
投与の頻度および投薬の回数は、とりわけ、推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の半減期および投与の経路に依存し得る。ラット細胞またはラットへの推定Ｃ３Ｇ治療剤または化合物の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回実施することができる。
ＩＶ．不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを作製する方法
【０１４４】
本明細書の他の箇所に開示されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを作製するための様々な方法が提供される。同様に、不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座を作製するため、または本明細書の他の箇所に開示されている不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットゲノムもしくはラット細胞を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変ラットを作製するための任意の慣習的な方法またはプロトコールは、このような遺伝子改変ラットを作製するのに好適である。例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Cho  et  al.  (2009)  Current  Protocols  in  Cell  Biology  42:19.11:19.11.1-19.11.22およびGama  Sosa  et  al.  (2010)  Brain  Struct.  Funct.  214(2-3):91-109を参照されたい。このような遺伝子改変ラットは、例えば、標的Ｃｆｈ遺伝子座における遺伝子ノックアウトによって作製され得る。
【０１４５】
例えば、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを作製する方法は、（１）不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップと、（２）不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変多能性細胞をラット宿主胚中に導入するステップと、（４）宿主胚を代理母に移植し、懐胎させるステップとを含み得る。あるいは、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットを作製する方法は、（１）不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップと、（２）不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変多能性細胞をラット宿主胚中に導入するステップと、（４）宿主胚を代理母に懐胎させるステップとを含み得る。必要に応じて、改変多能性細胞（例えば、ラットＥＳ細胞）を含む宿主胚は、代理母に移植および懐胎させる前に、胚盤胞期までインキュベートして、Ｆ０ラットを作製することができる。次いで、代理母は、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むＦ０世代のラットを作製することができる。
【０１４６】
本方法は、改変標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を特定するステップをさらに含み得る。様々な方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を特定することができる。
【０１４７】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実行され得る。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含み得る。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングの論理を逆転させ、変異が向けられたネイティブ遺伝子座のコピー数を定量する。正しく標的化された細胞クローンでは、２つのネイティブ対立遺伝子（Ｘ染色体上にもＹ染色体上にもない遺伝子について）の一方がＬＯＡアッセイによって検出され、他方の対立遺伝子は標的化された改変によって破壊される。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用して、特に参照遺伝子と比較して、ゲノムＤＮＡ試料におけるＤＮＡ鋳型のコピー数を定量することができる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい）。参照遺伝子は、標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）と同じゲノムＤＮＡにおいて定量される。したがって、２つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅（各々がそれぞれのプローブを有する）が実施される。一方のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル）を決定する一方で、他方のプローブは標的化の成功（すなわち、ＬＯＡアッセイ）によって置き換えられる標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）の領域のＣｔを決定する。Ｃｔは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブのそれぞれに対する出発ＤＮＡの量を反映する量であり、すなわち、あまり豊富ではない配列は、閾値サイクルに達するためにより多くのＰＣＲサイクルを必要とする。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のための鋳型配列のコピー数を半分に減らすことによって、約１Ｃｔ単位の増加がもたらされる。標的遺伝子（複数可）または遺伝子座（複数可）の１つの対立遺伝子が相同組換えによって置き換えられた細胞におけるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応によって、非標的化細胞由来のＤＮＡと比較した場合に、参照遺伝子に対するＣｔを増加させずに、標的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応に対する１Ｃｔの増加をもたらす。
【０１４８】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）に対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「大規模並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と称される場合もある。本明細書に開示される方法では、選択マーカーを使用して、標的化細胞をスクリーニングする必要はない。例えば、本明細書に記載のＭＯＡ（例えば、ＬＯＡ）およびＮＧＳアッセイは、選択カセットを使用しなくても信頼できる。
【０１４９】
好適な多能性細胞の例は、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。改変された多能性細胞は、例えば、（ａ）細胞中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座における５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含む１つまたは複数の標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸を導入するステップであって、外因性ドナー核酸または標的化ベクターが内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異もしくは欠失させるか、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座におけるコード配列のすべてもしくは一部（必要に応じて開始コドンを含む）を欠失させるように設計されている、ステップによる組換えにより生成され得る。同様に、改変されたラット１細胞期胚は、例えば、（ａ）１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座における５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含む１つまたは複数の標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸を導入するステップであって、外因性ドナー核酸または標的化ベクターが内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異もしくは欠失させるか、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座におけるコード配列のすべてもしくは一部（必要に応じて開始コドンを含む）を欠失させるように設計されている、ステップによる組換えにより生成され得る。同様に、改変されたラットゲノムまたは不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座は、例えば、（ａ）ラットゲノムまたはラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座を、内因性Ｃｆｈ遺伝子座における５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含むより多くの標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸と接触させるステップであって、外因性ドナー核酸または標的化ベクターが内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異もしくは欠失させるか、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座におけるコード配列のすべてもしくは一部（必要に応じて開始コドンを含む）を欠失させるように設計されている、ステップによる組換えにより生成され得る。必要に応じて、５’および３’相同性アームは、例えば、レポーター遺伝子または選択マーカーを含むインサート核酸に隣接することができ、特定するステップは、そのゲノム内に、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたインサート核酸を含む少なくとも１つの細胞を特定するステップを含み得る。あるいは、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞中に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する１つまたは複数のヌクレアーゼ剤を導入するステップと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、標的核酸の欠失）を含む少なくとも１つの細胞を特定するステップとによって生成することができる。同様に、改変されたラット１細胞期胚は、（ａ）ラット１細胞期胚中に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する１つまたは複数のヌクレアーゼ剤を導入するステップと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、標的核酸の欠失）を含む少なくとも１つの細胞を特定するステップとによって生成することができる。同様に、改変されたラットゲノムまたは不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座は、例えば、ラットゲノムまたはＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座を１つまたは複数のヌクレアーゼ剤と接触させるステップであって、ヌクレアーゼ剤が、ラットＣｆｈ遺伝子または遺伝子座における標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する、ステップによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞は、（ａ）細胞へと、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する１つまたは複数のヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ標的配列に十分に近接して位置する５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含む１つまたは複数の標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸を導入するステップと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に所望の改変を含む少なくとも１つの細胞を特定するステップとによって生成することができる。同様に、改変されたラット１細胞期胚は、（ａ）ラット１細胞期胚へと、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する１つまたは複数のヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ標的配列に十分に近接して位置する５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含む１つまたは複数の標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸を導入するステップと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に所望の改変を含む少なくとも１つの細胞を特定するステップとによって生成することができる。同様に、改変されたラットゲノムまたは不活性化されたラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座は、例えば、ラットゲノムまたはラットＣｆｈ遺伝子もしくは遺伝子座を、（ｉ）ラットＣｆｈ遺伝子または遺伝子座における標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導する１つまたは複数のヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ標的配列に十分に近接して位置する５’および３’標的配列に対応する５’および３’相同性アームを含む１つまたは複数の標的化ベクターまたは外因性ドナー核酸と接触させることによって生成することができる。所望の標的配列中にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはこのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
【０１５０】
具体例では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットを作製する方法は、（ａ）ラット胚性幹（ＥＳ）細胞中に、内因性Ｃｆｈゲノム遺伝子座の開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤が第１の標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラットＥＳ細胞を生じる、ステップと、（ｂ）遺伝子改変ラット（ＥＳ）細胞をラット宿主胚中に導入するステップと、（ｃ）ラット宿主胚を代理母に懐胎させるステップであって、代理母が不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップとを含む。別の具体例では、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むラットを作製する方法は、（ａ）ラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈゲノムの遺伝子座の開始コドンに近接する第１の標的配列を標的とする第１のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤が第１の標的配列を切断して、不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含む遺伝子改変ラット１細胞期胚を生じる、ステップと、（ｂ）遺伝子改変ラット１細胞期胚を代理母に懐胎させるステップであって、代理母が不活性化された内因性Ｃｆｈ遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変ラットを生じる、ステップとを含む。第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的配列は、例えば、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の、第１のエクソン中、第１のエクソンの上流（例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）中）、または第１のエクソンの下流（例えば、第１のイントロン中）に存在してもよい。例えば、標的配列は、開始コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、または約１０００ヌクレオチド内に存在してもよい。具体例として、標的配列は、開始コドンの約１００ヌクレオチド内に存在してもよい。必要に応じて、第１のヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡの形態で送達されてもよく、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で送達されてもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡの両方は、ＤＮＡの形態で送達されてもよい。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号６を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる場合がある。Ｃａｓ９タンパク質配列は、配列番号７を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる場合がある。必要に応じて、第１の標的配列は、配列番号１２または１３を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ配列は、配列番号８または９を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ヌクレアーゼ剤は第１の標的配列を切断することができ、これは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されてもよく、開始コドンを破壊する標的ゲノム遺伝子座におけるさらなる欠失および／または挿入（インデル）を生じる。
【０１５１】
このような方法におけるステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含み得る。同様に、このような方法におけるステップ（ａ）は、ラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含む。第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的配列は、例えば、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の最後から２番目のイントロン中、最後から２番目のエクソン中、最後のエクソン中、最後のエクソンの上流（例えば、最後のイントロン）、または最後のエクソンの下流（例えば、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ））に存在してもよい。例えば、標的配列は、停止コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００ヌクレオチド、約２０００、約３０００、約４０００、または約５０００ヌクレオチド内に存在してもよい。具体例では、標的配列は、停止コドンの約２００ヌクレオチド内に、または停止コドンの約３０００ヌクレオチド内に存在してもよい。必要に応じて、第２のヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡの形態で送達されてもよく、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で送達されてもよい。必要に応じて、第２の標的配列は、配列番号１４または１５を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ配列は、配列番号１０または１１を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。第１および第２のヌクレアーゼ剤は、それぞれ第１および第２の標的配列を切断することができ、これらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されて、第１の標的配列と第２の標的配列との間の配列を欠失し、それによって、内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列の一部またはすべてを欠失し得る。
【０１５２】
あるいは、このような方法におけるステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、第１の標的配列とは異なる内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含み得る。同様に、このような方法におけるステップ（ａ）は、ラット１細胞期胚中に、第１の標的配列とは異なる内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに近接する第２の標的配列を標的とする第２のヌクレアーゼ剤を導入するステップをさらに含み得る。第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的配列は、例えば、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソン中または第１のエクソンの上流（例えば、５’ＵＴＲ中）にあってもよく、第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソン中または第１のエクソンの下流（例えば、第１のイントロン中）にあってもよい。例えば、標的配列は、開始コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、または約１０００ヌクレオチド内に存在してもよい。具体例では、標的配列は、開始コドンの約１００ヌクレオチド内に存在してもよい。必要に応じて、第２のヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡの形態で送達されてもよく、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で送達されてもよい。必要に応じて、第１および第２の標的配列は、開始コドンに隣接している。必要に応じて、第１の標的配列は配列番号１２を含むか、それから本質的になるか、またはこれからなり、第２の標的配列は配列番号１３を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡ配列は、配列番号８を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、第２のガイドＲＮＡ配列は、配列番号９を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。第１および第２のヌクレアーゼ剤は、それぞれ第１および第２の標的配列を切断することができ、これらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されて、第１の標的配列と第２の標的配列との間の配列を欠失し、それによって、開始コドンを欠失し得る。
【０１５３】
このような方法におけるステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤が、それぞれ、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第３および第４の標的配列を標的とし、第３および第４の標的配列が異なる、ステップをさらに含み得る。同様に、このような方法におけるステップ（ａ）は、ラット１細胞期胚中に、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、第３のヌクレアーゼ剤および／または第４のヌクレアーゼ剤が、それぞれ、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の停止コドンに近接する第３および第４の標的配列を標的とし、第３および第４の標的配列が異なる、ステップをさらに含み得る。第３および／または第４の標的配列は、例えば、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の最後から２番目のイントロン中、最後から２番目のエクソン（例えば、エクソン２１）中、最後のエクソン（例えば、エクソン２２）中、最後のエクソンの上流（例えば、最後のイントロン中）、または最後のエクソンの下流（例えば、３’ＵＴＲ中）に存在してもよい。例えば、標的配列は、停止コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００ヌクレオチド、約２０００、約３０００、約４０００、または約５０００ヌクレオチド内に存在してもよい。具体例では、標的配列は、停止コドンの約２００ヌクレオチド内に、または停止コドンの約３０００ヌクレオチド内に存在してもよい。必要に応じて、第３および／または第４のヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡの形態で送達されてもよく、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で送達されてもよい。必要に応じて、第３の標的配列および／または第４の標的配列は、それぞれ、配列番号１４および／または１５を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。必要に応じて、第３のガイドＲＮＡおよび／または第４のガイドＲＮＡは、それぞれ、配列番号１０および／または１１を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。第１および／または第２のヌクレアーゼ剤は、それぞれ第１および／または第２の標的配列を切断することができ、第３および／または第４のヌクレアーゼ剤は、それぞれ、第３および／または第４の標的配列を切断することができ、これらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されて、第１の標的配列と第２の標的配列、第１の標的配列と第３の標的配列、第１の標的配列と第４の標的配列、第２の標的配列と第３の標的配列、または第２の標的配列と第４の標的配列との間の配列を欠失し、それによって内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列のほとんどまたはすべてを欠失し得る。
【０１５４】
このような方法におけるステップ（ａ）は、ラットＥＳ細胞中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームおよび内因性Ｃｆｈ遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外因性ドナー核酸または標的化ベクターを導入するステップであって、外因性ドナー核酸または標的化ベクターが、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異もしくは欠失させるように設計されているか、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列（必要に応じて、開始コドンを含む）の一部もしくはすべてを欠失させるように設計されている、ステップをさらに含み得る。同様に、このような方法におけるステップ（ａ）は、ラット１細胞期胚中に、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームおよび内因性Ｃｆｈ遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームを含む外因性ドナー核酸または標的化ベクターを導入するステップであって、外因性ドナー核酸または標的化ベクターが、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンを変異もしくは欠失させるように設計されているか、または内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列（必要に応じて、開始コドンを含む）の一部もしくはすべてを欠失させるように設計されている、ステップをさらに含み得る。あるいはまたはさらに、外因性ドナー核酸または標的化ベクターは、インサート配列（５’および３’相同性アームに隣接している）を開始コドン中または内因性Ｃｆｈ遺伝子座中に挿入することによって、開始コドンを破壊するように設計され得る。このような方法では、外因性ドナー核酸または標的化ベクターは、相同組換え修復によって標的遺伝子座と組み換えることができるか、またはＮＨＥＪ媒介性挿入によって挿入されて、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を生成することができる。例えば、外因性ドナー配列または標的化ベクターは、５’標的配列と３’標的配列との間のゲノム配列を欠失させて、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を生成するために機能することができる。一例では、５’および３’標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の開始コドンに隣接し得る。別の例では、５’および３’標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座の第１のエクソンに隣接し得る。さらに別の例では、５’および３’標的配列は、内因性Ｃｆｈ遺伝子座のコード配列の一部またはすべてに隣接し得る。
【０１５５】
ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖系列を介して遺伝子改変を伝達することが可能な後代が生成される。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【０１５６】
あるいは、本明細書の他の箇所に記載のラットを作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するために、上記方法を使用して、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）遺伝子改変された胚を代理母に移植し、懐胎させるステップとを含み得る。あるいは、本明細書の他の箇所に記載のラットを作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するために、上記方法を使用して、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）遺伝子改変された胚を代理母に懐胎させるステップとを含み得る。生殖系列を介して遺伝子改変を伝達することが可能な後代が作製される。
【０１５７】
核移入技法を使用してラットを作製することもできる。簡潔には、核移入の方法は、以下のステップを含み得る：（１）卵母細胞を除核するか、または除核卵母細胞を提供するステップと、（２）除核卵母細胞と組み合わせるべきドナー細胞または核を単離または提供するステップと、（３）細胞または核を除核卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成するステップと、（４）再構成細胞を動物の子宮に移植して、胚を形成するステップと、（５）胚を発生させるステップ。このような方法では、卵母細胞は、一般的に、死亡した動物から回収されるが、これらは、生きた動物の卵管および／または卵巣からも単離され得る。卵母細胞は、除核の前に、種々の周知の培地中で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、いくつかの周知の方法で実施され得る。再構成細胞を形成するための、ドナー細胞または核の除核卵母細胞への挿入は、融合前に、ドナー細胞の透明帯下でのマイクロインジェクションによるものであってもよい。融合は、接触／融合面を超えるＤＣ電気パルスの印加（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはＳｅｎｄａｉウイルスなどの不活化されたウイルスによって、誘導されてもよい。再構成細胞は、核ドナーおよびレシピエント卵母細胞の融合前、その間、および／または後に、電気的および／または非電気的手段により活性化され得る。活性化法は、電気パルス、化学的誘導された衝撃、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルを増加させること、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化を低減させること（キナーゼ阻害剤によるものとして）を含む。活性化再構成細胞、または胚は、周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移入することができる。例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【０１５８】
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子改変Ｆ０ラットの作製を可能にし、遺伝子改変Ｆ０ラットの細胞は、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含む。遺伝子改変Ｆ０ラット細胞は、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座に対してヘテロ接合性であってもよく、不活性化されたＣｆｈ遺伝子座に対してホモ接合性であってもよい。
【０１５９】
上記または下記のすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各個々の条項が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時間で受託番号に関連する場合、本出願の有効出願日における受託番号に関連するバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日または該当する場合の受託番号を参照する優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの出版物、ウェブサイトなどが、異なる時に出版されている場合、別段に指示されていなければ、その出願の有効出願日に最も直近で公開されたバージョンを意味する。特に別段に示されていなければ、本発明の任意の特色、ステップ、要素、実施形態、または態様は、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解のための例証および実施例により、幾分か詳しく記載されているが、ある特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。
配列の簡単な説明
【０１６０】
添付の配列表に列挙されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略語、およびアミノ酸についての３文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で開始することと、前方へ（すなわち、各行で左から右に）３’末端に進むこととの標準的な規則に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示されている鎖へのいずれかの言及により含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が与えられる場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも与えられることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から開始することおよび前方へ（すなわち、各行で左から右に）カルボキシ末端に進むことの標準的な規則に従う。
【０１６１】
【表２】
2022500047.tif 000004
【実施例】
【０１６２】
（実施例１）
不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットの作製
ノックアウトラットＣｆｈ対立遺伝子を生成するために、ガイドＲＮＡを、Ｃｆｈ遺伝子の末端で切断してコード配列を崩壊（欠失）させるように設計するか、または開始コドンに隣接している部位で切断して開始コドンを欠失させるように設計した。標的化ベクターは使用しなかった。内因性ラットＣｆｈ遺伝子座（エクソン１からエクソン２２まで）を配列番号１に示す。ラットＣｆｈコード配列を配列番号２に示す。ラットＣＦＨタンパク質配列を配列番号３に示す。
【０１６３】
４つのガイドＲＮＡ（それぞれ、ｒＧＵ１、ｒＧＵ２、ｒＧＤ２、およびｒＧＤ３に関する配列番号１２〜１５に示されるガイドＲＮＡ標的配列）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分をＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉラット胚性幹細胞中に導入した。具体的には、２×１０６個のラットＥＳ細胞（Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ系統ＤＡ２Ｂ）を以下：Ｃａｓ９発現プラスミド５μｇ（配列番号６に示されるＣａｓ９コード配列）；ならびに以下のｇＲＮＡをコードする各ＤＮＡ  ５μｇ：ｒＧＵ１、ｒＧＵ２、ｒＧＤ２、およびｒＧＤ３（それぞれ配列番号１２〜１５に示されるラットＣｆｈ配列を標的とする、それぞれ配列番号８〜１１に示されるガイドＲＮＡ配列）を用いて電気穿孔した。ｒＧＤ２標的配列は、配列番号１に示されるラットＣｆｈゲノム配列において注記された標的配列と１つのヌクレオチドの差異（残基１７における「Ａ」の代わりに「Ｃ」）を有する。この差異の理由は、ガイドＲＮＡがＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ株の配列（使用されるラットＥＳ細胞の株）に対して特異的であり、一方ゲノム配列がＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ株（ラットゲノムをシーケンスするために使用した株）に由来することである。Ａ／Ｃバリアントは、Ｄａｒｋ  ＡｇｏｕｔｉとＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙとの間のＳＮＰである。電気穿孔の条件は以下の通りであった：４００Ｖの電圧；１００ｍＦの静電容量；および０Ｗの抵抗。コロニーをピックアップし、増やし、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子喪失アッセイによってスクリーニングして、内因性ラットの対立遺伝子喪失を検出した。図１Ｂを参照されたい。対立遺伝子喪失アッセイのためのプライマーおよびプローブを表３に示す。
【０１６４】
【表３】
2022500047.tif 000005
【０１６５】
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）については、例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびFrendewey  et  al.  (2010)  Methods  Enzymol.  476:295-307に記載されている。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングの論理を逆転させ、変異が向けられたネイティブ遺伝子座のゲノムＤＮＡ試料におけるコピー数を定量する。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞クローンでは、２つのネイティブ対立遺伝子（Ｘ染色体上にもＹ染色体上にもない遺伝子について）の一方がＬＯＡアッセイによって検出され、他方の対立遺伝子は標的化された改変によって破壊される。
【０１６６】
６つのクローンをスクリーニングし、図１Ａおよび以下の表４に示す。Ｃｆｈの１つの対立遺伝子を崩壊させたコロニーを特定した。エクソン１（ＡＴＧ開始コドンを含有する）のみが欠失したコロニーも特定した。Ｃｆｈノックアウトラット系列はクローンＡＡ８を使用して確立し、クローンＡＡ８は、ＡＴＧ開始コドンを欠失しているエクソン１、エクソン１コード配列、およびイントロン１のスプライスドナー部位においてヘテロ接合性の１４６ｂｐの欠失を有した。欠失した配列を配列番号５に示し、クローンＡＡ８における改変Ｃｆｈゲノム遺伝子座を配列番号４に示す。陽性クローンＡＡ８を解凍し、増やし、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって再確認した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってＡＡ８も確認した。
【０１６７】
【表４】
2022500047.tif 000006
【０１６８】
そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、ＷＯ２０１４／１３０７０６、およびＷＯ２０１４／１７２４８９に記載されている方法を使用して、Ｆ０およびＦ１を作製した。確認したヘテロ接合性標的ラットＥＳ細胞クローンＡＡ８（Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ）をＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）胚盤胞中にマイクロインジェクションし、次いで、標準的技法を使用して懐胎のために偽妊娠レシピエント雌（ＳＤレシピエント雌）に移入した。キメラを毛色で特定し、雄Ｆ０キメラを同じ系統の雌野生型ラット（ＳＤ雌）と交配させた。次いで、ホモ接合性改変対立遺伝子の存在について、生殖系（例えば、ａｇｏｕｔｉ）Ｆ１子の遺伝子型を決定した。ホモ接合性Ｆ１  Ｃｆｈノックアウトラットは、５０％のＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉと５０％のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙであった。
（実施例２）
不活性化されたＣｆｈ遺伝子座を含むラットの特徴付け
【０１６９】
ＣｆｈノックアウトラットがＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の表現型を再現するかどうかを評価するために、補体副経路の活性化、腎臓病理、および死亡率に関する様々な読み出しを評価した。Ｃ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）は、Ｃ３腎炎因子および／または補体遺伝子の変異の結果としての副経路（ＡＰ）補体活性化の過剰活性化によって特徴付けられる。患者のおよそ５０％は診断の１０年以内に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を発症するため、雄および雌のＣｆｈノックアウトラット（２０匹の雄ラット、１８匹の雌ラット）の生存率を評価した。図２に示されているように、雄のＣｆｈノックアウトラットが死亡した年齢の中央値は５２日（約１．７カ月）であり、雌のＣｆｈノックアウトラットが死亡した年齢の中央値は１０３日（約３．４カ月）であった。最後の雄のＣｆｈノックアウトラットは１２２日（約４カ月）で死亡し、最後の雌のＣｆｈノックアウトラットは２４７日（約８．１カ月）で死亡した。雌と雄との間で差が観察された。雌マウスの補体活性は雄マウスにおけるよりも低く、同様の性差はラットにおいても存在し得る。この自然死亡率はＣｆｈノックアウトラットの寿命の極初期に起こり、野生型実験室ラットの平均３年の寿命よりも劇的に短い。さらに、Ｃｆｈノックアウトラットにおいて観察された自然死は、８カ月後の死亡率が２３％しかないことが報告されたＣｆｈノックアウトマウスにおいて観察された自然死亡率よりもかなり劇的かつ急速な表現型である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pickering  et  al.  (2002)  Nat.  Genet.  31(4):424-428を参照されたい。
【０１７０】
野生型のカウンターパートと比較して、より低い循環Ｃ３レベルも雄と雌の両方のＣｆｈノックアウトラットにおいて観察された。ＡＢＣＡＭからのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、７週齢の雄および雌の野生型（ＷＴ）ラットおよびＣｆｈノックアウトラットにおいて循環Ｃ３レベルを測定した。試料および標準物質を希釈し、結合したＣ３抗体を含むプレートに添加した。インキュベーション後にプレートを洗浄し、別のＣ３抗体を添加した。さらなるインキュベーション後に、検出抗体に対する二次抗体を使用し、次いで、ＴＭＢ溶液に曝露して測定可能な色を生じさせた。酸で反応を停止させ、４５０ｎｍでシグナルを測定した。補体Ｃ３を不断に加水分解させ、後にＣ３のより多くの分子を切断する流体相Ｃ３転換酵素を形成することができる。ＣＦＨは副経路の内因性の負の調節因子であり、Ｃ３活性化／切断を阻害する必要がある。ＣＦＨがなければ、Ｃ３は連続的に消費され、図３に示されるようにより低い循環レベルをもたらす。
【０１７１】
ヒトＣ３Ｇ患者において観察されたものと一致して、野生型カウンターパートと比較して、Ｃｆｈノックアウトラットの腎臓では、Ｃ３およびＣ５ｂ−９沈着の増加も観察された。例えば、そのそれぞれがあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Barbour  et  al.  (2013)  Semin.  Nephrol.  33(6):493-507およびVivarelli  et  al.  (2012)  N.  Engl.  J.  Med.  366(12):1163-1165を参照されたい。Ｃ３およびＣ５ｂ−９の沈着は、それぞれ１８週齢、１７週齢、および１７週齢の３匹の雌の野生型ラット、ならびにそれぞれ１２週齢、１７週齢、および９週齢の３匹の雌のＣｆｈノックアウトラット由来の腎臓試料において測定された。１：３３３．３のＣｙ５−コンジュゲートロバ抗ウサギ（Jackson  Immunoresearch  711-605-152）の希釈物と一緒に、１：５０の蛍光コンジュゲートヤギ抗Ｃ３（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  番号５５１９１）の希釈物および１：１００のウサギ抗Ｃ５ｂ−９（Ａｂｃａｍ  ａｂ５５８１１）の希釈物を使用して、ラット腎臓の凍結切片に関して免疫組織化学を行った。結果を図４に示す。Ｃｆｈノックアウトラットは、野生型ラットにおいて観察されるものをはるかに超過したＣ３およびＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）タンパク質の自然沈着を示す。
【０１７２】
いくつかの糸球体硬化症、尿細管萎縮、および蛋白様円柱も、野生型カウンターパートと比較してＣｆｈノックアウトラットにおいて観察された。タンパク尿が存在する場合（タンパク質が尿中に漏出する場合）、円柱が発生する。円柱は、腎尿細管の内腔においてタンパク質が凝固した結果である。腎臓試料は、１５週齢の１匹の野生型雌ラットから、ならびにそれぞれ、１２週齢、１３週齢、および１５週齢の３匹の雌のＣｆｈノックアウトラット（ＣＦＨ  ＫＯラット１、ＣＦＨ  ＫＯラット２、およびＣＦＨ  ＫＯラット３）から得た。腎臓試料を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色により染色した。簡潔には、スライドを１％の過ヨウ素酸中での酸化後にＳｃｈｉｆｆ試薬で染色し、次いで、ヘマトキシリンで対比染色した。図５に示されているように、Ｃｆｈノックアウトラットは、糸球体間質細胞マトリックスおよび糸球体係蹄サイズの劇的な拡大、ならびに腎尿細管の顕著な拡張を示した。この病理は、Ｃｆｈノックアウトマウスにおいて観察された病理よりも、より重篤である。Ｃｆｈノックアウトマウスに関して公開されたデータでは尿細管病理については示されていないようであるが、Ｃｆｈノックアウトラットが尿細管病理を有することは明らかである。Ｃｆｈノックアウトラットは、Ｃｆｈノックアウトマウスについて公開されたデータと比較して、より多くの糸球体硬化も有しているようである。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pickering  et  al.  (2002)  Nat.  Genet.  31(4):424-428を参照されたい。これらの知見は、腎機能の喪失および死亡率上昇と一致する。
【０１７３】
血中尿素窒素（ＢＵＮ）、糸球体濾過マーカーも、野生型カウンターパートと比較してＣｆｈノックアウトラットにおいて上昇し、これは、糸球体濾過率の低下を示唆した。雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図６Ａ）ならびに雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図６Ｂ）において、７週齢から開始し、すべてのＣｆｈノックアウトラットが死亡するまで毎週、血中尿素窒素レベルを測定した。血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルについて使用したアッセイキットは、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのものであった。このアッセイは、尿素と着色複合体を形成する色素原試薬を利用するＪｕｎｇ法を使用する。これを達成するために、血清を５倍まで希釈し、５μＬの体積でプレーティングした。標準物質を添加した。１：１の比で、２００μＬの試薬ＡおよびＢをプレートに添加した。２０分後に、４３０ｎｍでシグナルを読み取った。血中尿素窒素（ＢＵＮ）は腎機能のマーカーである。腎不全が始まると、ＢＵＮが血中に蓄積し始める。循環中に増加したＢＵＮは、雌と雄の両方のＣｆｈノックアウトラットにおいて観察されたように、腎機能の低下を意味する。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。この表現型は、Ｃｆｈノックアウトマウスよりもさらに劇的である。ＣｆｈノックアウトマウスではＢＵＮレベルは測定されなかったが、腎機能の別のマーカーである血清中クレアチニンのレベルは測定され、Ｃｆｈノックアウトマウスと野生型マウスとの間に差はなかった。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pickering  et  al.  (2002)  Nat.  Genet.  31(4):424-428を参照されたい。
【０１７４】
糸球体濾過マーカーである血清中シスタチンＣ（ｓＣｙｓＣ）も、Ｃｆｈノックアウトラットおよび野生型カウンターパートにおいて測定した。雄の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図８Ａ）ならびに雌の野生型ラットおよびＣｆｈノックアウトラット（図８Ｂ）において、７週齢から開始し、すべてのＣｆｈノックアウトラットが死亡するまで毎週、製造業者のプロトコール（Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ  番号ＲＤ３９１００９２００Ｒ）に従って、血清中シスタチンＣレベルを測定した。血清中シスタチンＣも、野生型カウンターパートと比較してＣｆｈノックアウトラットにおいて上昇し、糸球体濾過率の低下を示唆した。図８Ａおよび８Ｂを参照されたい。
【０１７５】
次に、採尿ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ  Ｉｎｃ．）を使用して、野生型またはＣｆｈノックアウトラットから１６〜１８時間採尿した。尿中アルブミンおよび尿中クレアチンを、Ｅｘｏｃｅｌｌ（それぞれ、カタログ番号ＮＲ００２および１０１２）からのキットを製造業者のプロトコールに従って使用して測定した。尿中アルブミンは１日当たりとして、または尿中クレアチニンに対して正規化して定量し、雄と雌の両方のラットにおいて測定した。図９Ａ〜９Ｄに示されているように、１日当たりまたはクレアチニンに対して正規化した尿中アルブミンは、野生型カウンターパートと比較して、雄（図９Ａおよび９Ｂ）と雌（図９Ｃおよび９Ｄ）の両方のＣｆｈノックアウトラットにおいて上昇した。アルブミン尿は腎傷害のマーカーであり、漏出性糸球体を示唆する。
【０１７６】
次に、本発明者らは、Ｃｆｈノックアウトラットにおいて、電子顕微鏡法によって糸球体傷害を評価した。研究したラットは、５匹の野生型対照（７週齢）および７匹のＣｆｈノックアウトラット（７週齢）を含んだ。皮質腎臓組織試料をグルタルアルデヒド中で固定した。固定した組織を電子顕微鏡法のために切片化および染色処理し、単一の時点から得られた組織中の糸球体を電子顕微鏡法で評価した。組織学的評価には、有足細胞足突起消失、糸球体基底膜厚（ＧＢＭ）、他のＧＢＭの病理学的変化（明らかな場合）、糸球体内皮細胞異常の定量的評価、ならびにいずれかの糸球体高電子密度沈着物の存在および位置の測定が含まれた。
【０１７７】
糸球体疾患は以下の基準で評価した：（１）有足細胞足突起消失の測定、（２）糸球体基底膜厚の測定、ならびに（３）糸球体内皮細胞異常、沈着物の存在および位置または他の超微細構造異常の定量的評価。有足細胞足突起消失の測定では、毛細血管長１μｍ当たりの突起プロファイル数を直接計数することによって、足突起消失について糸球体を評価した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓイメージングソフトウェアの線形測定ツールを使用して、突起幅の平均も計算した。データは分析時点の群に従って整理した。糸球体基底膜厚の測定では、イメージ分析によって糸球体基底膜厚を測定した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアの較正された測定ツールを使用して、各画像の基底膜長に沿った直線軸に対して垂直に５つの別々の測定を行った。データは分析時点の群に従って整理した。
【０１７８】
野生型ラット由来の糸球体は、有足細胞が均一かつ規則正しい足突起の指状構造（interdigitation）および幅、ＧＢＭの一貫した厚み、ならびに毛細血管係蹄の典型的な内皮層を有する正常な超微細構造を示した。Ｃｆｈノックアウトラットは、構造全体にわたる糸球体基底膜（ＧＢＭ）厚の著しい増加、細胞の介在、および高電子密度沈着物を含む実質的な超微細構造病理を示した。有足細胞は、不規則な輪郭に関して消失（足突起の広幅化）を示した。糸球体間質は拡大され、高電子密度沈着物を含有した。内皮は、窓の喪失と共に空砲を有し、腫脹することが多かった（定量されていない）。結果を図５に示す。これらのデータから導き出される結論は、Ｃｆｈノックアウトラットが、有足細胞の消失および歪み、細胞の介在および高電子密度沈着物を伴うＧＢＭの肥厚化、糸球体間質の拡大、ならびに窓の喪失を伴う内皮の腫脹を含む著しい糸球体病理を有するということである。
【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
これらの知見の代表的なイメージは、図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、および１２Ｂに示される。図１０Ａおよび１０Ｂは、野生型ラット由来の糸球体の糸球体毛細血管係蹄（図１０Ａ）および糸球体間質（図１０Ｂ）の電子顕微鏡写真を示す（１２，０００倍）。毛細血管係蹄は、有足細胞が、無傷の糸球体基底膜の外側面に配置された規則正しく指状嵌入する足突起を有する正常な超微細構造を示す（図１０Ａ、挿入図中のより高い倍率）。毛細血管の内皮層は、正常に配置された窓を示す。糸球体間質（図１０Ｂ）は、細胞が低密度のマトリックスを占有する外観において正常である。
【０１８１】
図１１Ａは、上記と同じ倍率で、Ｃｆｈノックアウトラット由来の糸球体の糸球体毛細血管係蹄の電子顕微鏡写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａのより高倍率を示す。毛細血管係蹄は、著しく肥厚した糸球体基底膜上にある有足細胞足突起が消失した異常な超微細構造を示す。ＧＢＭは、構造の全層にわたって変化する密度の沈着物を含有するが、内皮下および上皮下の位置において最も強力である。細胞突起の介在も、ＧＢＭに埋め込まれて観察される（矢印）。内皮は、窓の喪失により腫脹している。図１１Ｂに示されているように、毛細血管の内皮層は窓の喪失を示す。
【０１８２】
図１２Ａは、図１０Ｂと同じ倍率におけるＣｆｈノックアウトラットの糸球体からの糸球体間質の電子顕微鏡写真を示す。図１２Ｂは、図１２Ａのより高倍率を示す。糸球体間質は、マトリックスが増加し、高電子密度沈着物と共に埋め込まれている異常な超微細構造を示す。
【０１８３】
野生型（ＷＴ）−ビヒクル（群Ａ）ラット由来の糸球体は、有足細胞が均一かつ規則正しい足突起の指状構造および幅、ＧＢＭの均一な厚み、および毛細血管係蹄の典型的な内皮層を示す正常な超微細構造を示した。Ｃｆｈノックアウトラット（群Ｂ）の糸球体は、著しく肥厚したＧＢＭならびに増加した幅およびより少ない足突起によって測定された上皮の消失を有した。表６を参照されたい。
【０１８４】
【表６】
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【０１８５】
次いで、ＧＢＭ厚をイメージ分析によって評価した。野生型ラットの糸球体の平均ＧＢＭ厚を０．１８２ミクロン（１８２ｎｍ）で測定した。マトリックス、高電子密度沈着物、および細胞の介在の増加により、平均厚みが１．８ミクロンに達したＣｆｈノックアウトラットの糸球体におけるＧＢＭ厚は１０倍に増加した。２つの群間の差異は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。表７を参照されたい。
【０１８６】
【表７】
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【０１８７】
次いで、有足細胞足突起幅をイメージ分析によって評価した。野生型ラットの糸球体における足突起の平均幅を０．３６９ミクロン（３６９ｎｍ）で測定した。平均幅が２．５６４ミクロンに達したＣｆｈノックアウトラットの糸球体における足突起幅はおよそ７倍に増加した。２つの群間の差異は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。表８を参照されたい。
【０１８８】
【表８】
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【０１８９】
次いで、１ミクロンの長さ当たりの有足細胞足突起数をイメージ分析によって評価した。野生型ラットの糸球体における足突起の平均数を１ミクロンの長さ当たり２．６７で測定した。１ミクロンの長さ当たり０．７０８の足突起の平均が測定されたＣｆｈノックアウトラットの糸球体における毛細血管係蹄を覆う足突起数はおよそ３．８分の１に低減した。２つの群間の差異は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。表９を参照されたい。
【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
まとめると、ラットの寿命の非常に早期に起こる自然死亡率がＣｆｈノックアウトラットにおいて観察された。ＣｆｈノックアウトラットにおけるＣ３レベルがより低いことは、制御されていない補体副経路活性化による消費を示唆する。Ｃｆｈノックアウトラットの腎組織病理は、Ｃ３およびＣ５ｂ−９沈着、ならびに糸球体硬化および尿細管病理と一致する。血中尿素窒素および血清中シスタチンＣは、その両方がＧＦＲマーカーであり、Ｃｆｈノックアウトラットにおいて上昇し、腎不全を示唆した。さらに、Ｃｆｈノックアウトラットでは尿中アルブミンが上昇した。まとめると、これらの表現型は、ＣｆｈノックアウトラットがＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）様疾患を提示し、新たな潜在的Ｃ３Ｇ治療法を評価するのにより効率的かつ有効な前臨床研究を可能とする急速進行性の疾患経過を示すことを実証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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