【手続補正書】
【提出日】平成22年8月24日(2010.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの活性を測定するための方法であって、
ａ）配列番号１を含む単離タンパク質を含むサンプルを提供し；
ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
ｃ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして
ｄ）該生成物ピークを定量する
工程を含む、方法。
【請求項２】
配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを該サンプルに添加する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該ペプチド基質が配列番号２である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ペプチド基質が配列番号５である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
該ペプチド基質が配列番号６である、請求項３記載の方法。
【請求項７】
該Ｃ末端生成物ピークが、約２１０ｎｍで収集される吸光度データを用いて定量される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
該Ｃ末端生成物ピークが、約３５０ｎｍ励起／約４９０ｎｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量される、請求項５記載の方法。
【請求項９】
該Ｎ末端生成物ピークが、約４４０ｎｍ励起／約５２０ｎｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼの調節剤を同定するための方法であって、
ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルを提供し；
ｂ）供試化合物を該サンプルに添加し；
ｃ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａについてＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
ｄ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして
ｅ）該生成物ピークを定量する
工程を含む、方法。
【請求項１１】
該サンプルおよび供試化合物に配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
供試化合物が、ＮＳ３プロテアーゼの活性またはＮＳ４Ａ補因子の活性を修飾するか否かを決定する方法であって、
ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプルを提供し；
ｂ）供試化合物を該サンプルに添加し；
ｃ）ＮＳ４Ａ補因子ペプチドを添加し；
ｄ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａについてＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質を添加し；
ｅ）該基質および生成物を逆相ＨＰＬＣカラムで分離し；そして、該生成物ピークを定量することにより、生成物の第一の量を測定し；そして
ｆ）生成物の第一の量を、ＮＳ４Ａ補因子ペプチド不含有にて測定される生成物の第二の量と比較する
工程を含む、方法。
【請求項１４】
該ＮＳ４Ａ補因子ペプチドが配列番号４を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、請求項１３または１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ａ）配列番号１を含むタンパク質を含むサンプル、および
ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１ａのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づくペプチド基質
を含む、キット。
【請求項１７】
配列番号４を含むＮＳ４Ａ補因子ペプチドをさらに含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
該ペプチド基質が、配列番号２、配列番号５および配列番号６、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６または１７記載のキット。
【請求項１９】
１種以上の公知のＮＳ３プロテアーゼの調節剤をさらに含む、請求項１６、１７または１８記載のキット。
【請求項２０】
１種以上の公知のＮＳ４Ａ補因子の調節剤をさらに含む、請求項１７、１８または１９記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
さらに別の態様において、該基質は配列番号２を含み、該生成物ピークは、２１０ｎｍで収集される吸光度データを用いて定量される。Ｃ末端生成物ピークはまた、該基質が配列番号５を含むとき、約３５０ｎｍ励起／約４９０ｎｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量され得る。該基質が配列番号６であるとき、該Ｎ末端生成物ピークは、約４４０ｎｍ励起／約５２０ｎｍ発光で収集される蛍光データを用いて定量され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
基質はまた、切断により検出され得る発色性基質を含む標識でもあり得る。例えば、Ｃ−末端のカルボキシル基は、Zhang et al., Analytical Biochemistry, 270:268−75, 1999に記載の通り、３−または４−ニトロフェノール、７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリンおよび４−フェニルアゾフェノールを含む発色性アルコールとエステル化され得る。切断した基質は、分光光度法で検出される。例えば、３−ニトロフェノールおよび７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリンは３４０ｎｍで、４−フェニルアゾフェノールは３７０ｎｍで、そして４−ニトロフェノールは４００ｎｍで検出され得る。他の発色性基質も使用され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインの発現コンストラクトを、ＢＬ２１／ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ 大腸菌細胞（Stratagene）中に形質変換した。新たに形質転換した細胞を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＢＨＩ培地（Difco Laboratories）中、３７℃にて、６００ｎｍでの光学密度が０．７５まで増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導を、２４℃で４時間行った。細胞ペーストを遠心により集め、タンパク質精製前に−８０℃で新鮮に冷凍した。全ての精製工程を、４℃で行った。次に、１００ｇの細胞ペーストを、１．５Ｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に溶解し、３０分間撹拌した。溶解物をMicrofluidizer（Microfluidics, Newton, Mass.）を用いてホモジナイズし、次いで、５４，０００×ｇで４５分間超遠心した。５ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで予め平衡化した２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共に、イミダゾールを５ｍＭの終濃度になるまで上清に添加した。混合物を３時間振とうし、５ｍＭイミダゾールを添加した緩衝液Ａを２０カラム容量用いて洗浄した。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。溶出液を濃縮し、緩衝液Ａで予め平衡化したHi−Load 16／60 Superdex 200カラム上に充填した。適当な画分の精製ＨＣＶタンパク質を集め、−８０℃で貯蔵した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＳＭＳＹ生成物は、microbore分離装置を用いて基質およびＫＫ４Ａから分離された。用いた装置は、Ｇ１３２２Ａ脱気装置、Ｇ１３１２ＡバイナリポンプまたはＧ１３１１Ａクォータナリポンプの何れか、Ｇ１３１３Ａ自動サンプルラー、Ｇ１３１６Ａカラム恒温チャンバーおよびＧ１３１５Ａダイオードアレイ検出器を備えるAgilent 1100であった。カラムは、流速０．２ｍＬ／分の、Phenomenex Jupiter、５μｍ Ｃ１８、３００Å、１５０×２ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｆ−４０５３−Ｂ０であった。該カラム恒温装置は、４０℃であった。移動相は、ＨＰＬＣグレードＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）であった。ＳＭＳＹ生成物ピークは、２１０ｎＭで収集したデータを用いて定量した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
ＮＳ３・４Ａタンパク質を、ニッケル−ＮＴＡ金属親和性クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。２Ｍ母液、ｐＨ８．０からのイミダゾール溶液を、イミダゾールの最終濃度が１０ｍＭであるように、集めた上清に添加した。該上清を、溶解緩衝液＋１０ｍＭイミダゾールで予め平衡化したニッケル−ＮＴＡ親和性樹脂を用いて、４℃で一晩、バッチ式でインキュベートした。５μｇの期待量のＮＳ３−４Ａ当たり、１ｍＬの樹脂を用いた。次に、該樹脂を重力または５００×ｇで５分間の遠心により沈殿させた。該樹脂を重力流カラム中に注ぎ、１０またはそれ以上のカラム容量のニッケル洗浄緩衝液（溶解緩衝液＋０．１％ラウリルマルトシド＋１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。該カラムを、３ないし４カラム容量のニッケル溶出緩衝液（ニッケル洗浄緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。該溶出画分を氷上で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価した。ＮＳ３・４Ａのタンパク質分解を避けるため、１００μＭ ＤＦＰプロテアーゼ阻害剤をゲルサンプルに添加し、次いで、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、煮沸した。ピーク画分を集め、タンパク質濃度を、２８０ｎｍで吸光度を測定して吸光係数（ｅ）（ＮＳ３・４Ａについては、１．０１である。）で割ることにより決定した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
酵素活性を、逆相ＨＰＬＣを用いて基質および生成物を分離することにより評価した。用いた装置は、Ｇ１３２２Ａ脱気装置、Ｇ１３１２ＡバイナリポンプまたはＧ１３１１Ａクォータナリポンプの何れか、Ｇ１３１３Ａ自動サンプルラー、Ｇ１３１６Ａカラム恒温チャンバー、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器およびＧ１３１５Ａダイオードアレイ検出器を備えるAgilent 1100であった。カラム恒温器は４０℃であった。基質ＮＳ５ＡＢについて、カラムは、移動相としてＨＰＬＣグレードＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を流速０．２ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Jupiter、５μｍ Ｃ１８、３００Å、１５０×２ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｆ−４０５３−Ｂ０であった。Ｃ−末端生成物ピーク（ＮＨ２−ＳＭＳＹ−ＣＯＯＨ）を、２１０ｎｍで収集した吸光度データを用いて定量した。基質ＮＳ５ＡＢ−ＥＤＡＮＳについて、カラムは、移動相としてＨＰＬＣグレードＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を流速１．０ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Aqua、５μｍ Ｃ１８、１２５Å、５０×４．６ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｂ−４２９９−Ｅ０であった。Ｃ−末端生成物ピーク（ＮＨ２−ＳＭＳＹＴ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−ＫＫＫ−ＣＯＯＨ）を、３５０ｎｍ励起／４９０ｎｍ発光で収集した蛍光データを用いて定量した。基質ＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１について、カラムは、移動相として、ＨＰＬＣグレードＨ２Ｏ（溶媒Ａ）中、１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０、およびＨＰＬＣグレードＨ２Ｏ（溶媒Ｂ）中、６５％ＨＰＬＣグレードＣＨ３ＣＮ／３５％１０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．０を流速１．０ｍＬ／分で用いる、Phenomenex Prodigy、５μｍ ＯＤＳ（２）、１２５Å、５０×４．６ｍｍ、Ｐ／Ｏ ００Ｂ−３３００−Ｅ０であった。Ｎ−末端生成物ピーク（ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＥＤＶＶ−（α）Ａｂｕ−Ｃ−ＣＯＯＨ）を、４４０ｎｍ励起／５２０ｎｍ発光で収集した蛍光データを用いて定量した。あるいは、非反応ＦＩＴＣ−ＮＳ５ＡＢ−１基質に対するＮ−末端生成物の比は、Caliper LabChip 3000を用いて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｂｒｉｊ−３５、および０．１％（ｖ／ｖ）ＣＲ−３のチップ緩衝液を用いて、４８８ｎｍ励起／５３０ｎｍ発光で検出して決定した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
実施例７  化合物有効性の決定
見かけのＫｉ値を評価するために、供試化合物および基質以外のすべての構成要素を、５ないし１０分間、室温でプレインキュベーションした。その後、ＤＭＳＯ中に溶解した供試化合物を混合物に添加し、１５分または６０分のいずれかの間、３０℃でインキュベートした。そのままのＤＭＳＯを阻害剤なしの対照としてインキュベートした。切断反応を、Ｋｍと等しいか、またはＫｍと等しいないし半分の濃度でペプチド基質を添加することにより開始し、３０℃で２０分間継続した。反応の終了時に、混合物をクエンチし、反応進行度を上記の通りに決定した。１１種の化合物濃度を用いて、阻害のための酵素活性を滴定した。活性 対 阻害剤濃度データ点を、非線形回帰を用いて競合的強力結合酵素阻害を表すモリソン式（Sculley MJ and Morrison JF. Biochim. Biophys. Acta. 1986, 874, 44−53）に当てはめた。