(57)【要約】  本発明は、アルギナーゼ１に由来する新規なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物に関する。本発明はまた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物の使用に関する。【選択図】  図１
2022501046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
【化１】
2022501046.tif 000015
ｇ．前記ポリペプチドが、置換がされていない対応する配列からなるポリペプチドと比較して、アルギナーゼ１に対する有意に低減した免疫原性を示さないならば、最大３個のアミノ酸が保存的置換によって置き換えられている、ａ．〜ｆ．のいずれかに記載の配列；または
ｈ．場合によりベクター内に含まれる、ａ．〜ｇ．のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
のいずれか１つからなる、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｃ末端アミノ酸が、対応するアミドに置き換えられている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびアジュバントを含む、組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、イミダゾキニリン、およびモンタニドＩＳＡアジュバントからなる群から選択される、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
疾患または病態が、アルギナーゼの不適当なもしくは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とする、および／または前記疾患または病態が癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾患または病態が癌であり、場合により、方法が、併用の癌療法、好ましくは抗体の同時投与または逐次投与をさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌もしくは前立腺癌、または黒色腫、または白血病、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アルギナーゼ１特異的Ｔ細胞を刺激する方法であって、細胞を請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
細胞が、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、場合により、腫瘍サンプル中に存在する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルギナーゼ１に由来する新規なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物に関する。本発明はまた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルギナーゼは、アミノ酸Ｌ−アルギニンをＬ−オルニチンおよび尿素に変換する反応を触媒する酵素である。これは、アルギニンの微小環境を枯渇させ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の抑制をもたらす。アルギナーゼ活性の増大が、乳癌、肺癌、結腸癌または前立腺癌を有する患者の癌細胞において検出されている。ラットアルギナーゼ遺伝子をトランスフェクトしたマウスマクロファージは、共培養された腫瘍細胞の増殖を促進することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で示されている。さらに、マクロファージによるアルギナーゼ発現の誘導は、ポリアミン合成を介した腫瘍血管新生を増大させることが示されている。マウス肺癌モデルの結果から、高レベルのアルギナーゼを発現する成熟腫瘍関連骨髄性細胞の亜集団が存在したことが示された。これらの腫瘍関連骨髄性細胞は、細胞外Ｌ−アルギニンを枯渇させ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗原特異的増殖を阻害した。アルギナーゼ阻害剤の注入により、マウスにおける肺癌の成長が遮断された。これは、腫瘍細胞および腫瘍関連骨髄性細胞におけるアルギナーゼ発現の誘導が、ＴＩＬに対する負の効果を介した抗腫瘍免疫応答の抑制によって、どのように腫瘍成長を促進し得るかを示すものである。
【０００３】
ＭＤＳＣ（骨髄由来免疫抑制細胞）は、エフェクターＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化、増殖、および細胞傷害性を阻害するとともに、Ｔｒｅｇの分化および増殖を誘導する。癌細胞およびＭＤＳＣの両方とも、酵素の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）およびアルギナーゼを介したＬ−アルギニン代謝を操作することによって、Ｔ細胞を抑制し得る。多くの腫瘍は、アルギナーゼおよび誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）の発現の亢進を示し、腫瘍微小環境からのアルギニン枯渇をもたらす。いくつかの研究が、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の抑制におけるこの変化した腫瘍アルギニン代謝の重要性を強調しており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球がＴ細胞増殖および造血幹細胞を阻害するアルギナーゼ依存的能力を示すことが、最近実証された。さらに、アルギナーゼおよびｉＮＯＳ阻害剤は、ＡＭＬの抑制活性を低減させる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、免疫原性に関する「ホットスポット」であるアルギナーゼ１の５０アミノ酸領域を以前に同定した。この領域は、全長ヒトアルギナーゼ１（配列番号１０）の１６１〜２１０位に相当する。この領域およびそれに由来するペプチドは、ＷＯ２０１８０６５５６３に記載されている（用語「アルギナーゼ１(Arginase 1)」、「Ａｒｇ１」、「アルギナーゼ１(Arginase1)」は、本明細書において互換的に使用されることに留意されたい）。
【０００５】
本発明者らは今回、この領域に由来するポリペプチドの特異的なサブセットが、免疫応答を刺激するのに特に有効であることを同定した。このため、本発明のポリペプチドは、アルギナーゼ１およびアルギナーゼ１発現細胞に対する有益な免疫応答を刺激するのに特に有効であることが期待される。癌に対する新規な免疫療法の開発には、病因に関与する分子とともに、免疫系によって認識される特異タンパク質の完全な理解が必要である。臨床現場において、アルギナーゼ特異的免疫応答の誘導は、癌細胞の死滅に加えて、一般に、アルギナーゼ発現細胞、特にＭＤＳＣおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の免疫抑制機能を抑制することによって、抗癌免疫応答を支持し得る。したがって、アルギナーゼ発現細胞は、例えば、本発明のポリペプチドのワクチン接種により、骨髄性樹状細胞を標的とする他の免疫療法アプローチの所望の効果と拮抗するため、結果として、さらなる抗癌免疫療法と高度に相乗的となるであろう。
【０００６】
本発明は、
以下のアミノ酸配列：
【化１】
2022501046.tif 000003
のいずれか１つからなる単離されたポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、場合によりベクター内に含まれる、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤、および場合によりアジュバントを含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、長鎖Ａｒｇ１由来ペプチドに対する応答を示す。  ４例の健常ドナー（ＨＤ）由来のＰＢＭＣＳにおけるＡｒｇＬｏｎｇ、ＡｒｇＬｏｎｇ２およびＡｒｇＬｏｎｇ３ペプチドに対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答。バーは、ウェルあたりのスポットの平均数＋平均の標準誤差を表す。また、各ドナーに対するペプチドの添加あり、および添加なしの、対応するＥＬＩＳＰＯＴウェル画像を示す。実験は、５×１０５ＰＢＭＣ／ウェルで三重反復にて行った。ＴＮＴＣは、測定不能多数を意味する。＊は、分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法によると、ｐ≦０．０５であったことを意味する。
【図２】図２は、２０−ｍｅｒペプチドと比較したＡｒｇＬｏｎｇ２に対する応答を示す。  １９例の健常ドナー（上）および１６例の癌患者（下）におけるＡｒｇ１７１−１９０、Ａｒｇ１８１−２００、Ａｒｇ１９１−２１０およびＡｒｇＬｏｎｇ２に対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答。各ドットは、単一の患者／ドナーに対するペプチド特異的スポットの平均数を表す。応答は、ペプチド刺激ウェルにおける平均スポット数から対照ウェルにおける平均スポット数を減じることによって、算出した。実験は、健常ドナーに対しては４．５〜５×１０５ＰＢＭＣ／ウェルで、癌患者に対しては２．２〜５×１０５ＰＢＭＣ／ウェルで、三重反復または二重反復にて行った。ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する応答は、６例の健常ドナーおよび２例の癌患者において測定不能多数（ＴＮＴＣ）であり、５００超のスポットに設定した。
【図３Ａ】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。  ３Ａは、２例の健常ドナーおよび１例の乳癌患者に由来するＰＢＭＣの細胞内染色におけるＣＤ４＋（左）およびＣＤ８＋（右）Ｔ細胞におけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答を示す。ＰＢＭＣは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの前に１週間、ＡｒｇＬｏｎｇ２および低用量ＩＬ−２で刺激した。
【図３Ｂ】図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。  ３Ｂは、前刺激なしの２例の癌患者（ＢＣ−乳癌、ＭＭ−悪性黒色腫）に由来するＰＢＭＣの細胞内染色におけるＣＤ４＋（左）およびＣＤ８＋（右）Ｔ細胞におけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対するｅｘ  ｖｉｖｏ応答を示す。
【図４】図４は、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞はメモリーＴ細胞で有ることを示す。  ４Ａは、４例の健常ドナー（ＨＤ）および２例の癌患者（ＢＣ−乳癌、ＭＭ−悪性黒色腫）におけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対するｅｘ  ｖｉｖｏ応答を示す。実験は、１〜５×１０５細胞／ウェルで三重反復にて行った。  ４Ｂは、４例の健常ドナーおよび２例の癌患者（乳癌および悪性黒色腫）のＰＢＭＣ由来の選別されたＣＤ４＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。実験は、１〜３×１０５細胞／ウェルで三重反復にて行った。  ４Ｃは、２例の健常ドナーのＰＢＭＣ由来の選別されたＣＤ８＋メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。実験は、１×１０５細胞／ウェルで二重反復で、または１回行った。  バーは、ペプチド刺激ウェルおよび対照ウェルにおける平均スポット数＋ＳＥＭを表す。
【図５】図５は、ＩＬ−４刺激はＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞を活性化することを示す。  Ａは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−２で１週間刺激した黒色腫患者のＰＢＭＣにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２応答に対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。非刺激ＰＢＭＣを対照として使用した。重ね合わせたバーは、対照ウェルおよびペプチド刺激ウェルの平均スポット数＋ＳＥＭを示す。実験は、３×１０５細胞／ウェルで三重反復にて行った。Ｂは、ＩＬ−２（１２０Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後の６例の健常ドナー（ＨＤ）および２例の癌患者（ＢＣ−乳癌、ＭＭ−悪性黒色腫）に由来するＰＢＭＣにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２特異的応答を示す。サイトカイン刺激なしの細胞を、対照として使用した。応答は、ＥＬＩＳＰＯＴにおけるペプチド刺激ウェルと対照ウェルとの間の平均スポット数の差として算出した。実験は、３×１０５細胞／ウェルで三重反復または二重反復にて行った。
【図６】図６は、免疫化後にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて開始されたＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＩＦＮγ免疫応答を示す。  ４匹のマウスに対してＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドをワクチン接種し、ペプチドに対して生じた免疫応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって７日後に評価した。脾臓由来の細胞および個々のマウス由来の流入領域リンパ節を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供した。バーは、スポットの平均数を表す。ＥＬＩＳＰＯＴは、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドの添加の有無別で三重反復にて行った。「ＴＮＴＣ」は、測定不能多数を意味する。＊＊は、分布によらないリサンプリング法（ＤＦＲ）によると、ｐ＜０．０１であったことを意味する。
【図７】図７は、ＡｒｇＬｏｎｇ２ワクチン接種はＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を誘導することを示す。  ０日目に、０．５×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を、３０匹のマウスの右側腹部に皮下接種した。同日に、ワクチン接種を開始した。処置群の１５匹のマウスを、モンタニドを含有するエマルション中の１００μｇのＡｒｇＬｏｎｇ２で処置し、対照群の１５匹のマウスを、モンタニドを含有するエマルション中のＨ２Ｏで処置した。混合効果分析によると、ｐ＝０．０３０であった。
【図８】図８は、ＡｒｇＬｏｎｇ２ワクチン接種はＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を誘導することを示す。  ０日目に、０．５×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を、３０匹のマウスの右側腹部に皮下接種した。同日に、ワクチン接種を開始した。処置群の１５匹のマウスを、モンタニドを含有するエマルション中の１００μｇのＡｒｇＬｏｎｇ２で処置し、対照群の１５匹のマウスを、モンタニドを含有するエマルション中のＨ２Ｏで処置した。３回のワクチン接種の後、処置を中止した。腫瘍容積が８６４ｍｍ３を超えた場合、マウスを安楽死させた。
【図９Ａ】図９は、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞クローンはアルギナーゼ１発現ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。  ＡおよびＢは、アルギナーゼ１発現が、細胞内サイトカイン染色によって定量化されたＴｈ２サイトカインにより誘導された際、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＣＤ４  Ｔ細胞クローンが、ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。Ｃは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１３前刺激がアルギナーゼ１発現を誘導することを示すｑＰＣＲデータである。
【図９Ｂ】図９は、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞クローンはアルギナーゼ１発現ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。  ＡおよびＢは、アルギナーゼ１発現が、細胞内サイトカイン染色によって定量化されたＴｈ２サイトカインにより誘導された際、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＣＤ４  Ｔ細胞クローンが、ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。Ｃは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１３前刺激がアルギナーゼ１発現を誘導することを示すｑＰＣＲデータである。
【図９Ｃ】図９は、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞クローンはアルギナーゼ１発現ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。  ＡおよびＢは、アルギナーゼ１発現が、細胞内サイトカイン染色によって定量化されたＴｈ２サイトカインにより誘導された際、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＣＤ４  Ｔ細胞クローンが、ＴＨＰ−１細胞を認識することを示す。Ｃは、ＴＨＰ−１細胞のＩＬ−１３前刺激がアルギナーゼ１発現を誘導することを示すｑＰＣＲデータである。
【図１０】図１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサイトカイン刺激のみが、ＡｒｇＬｏｎｇ２エピトープに対するＴ細胞応答を拡大するのに十分であることを示す。  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによってＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量化する前に、ＰＢＭＣを、アルギナーゼ１誘導Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４／ＩＬ−１３）またはＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドのいずれかで７日間処置した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号１〜９はそれぞれ、全長ヒトアルギナーゼ１またはマウスアルギナーゼ１の１６１〜２１０位に相当する領域に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号１０および１１はそれぞれ、全長ヒトアルギナーゼ１およびマウスアルギナーゼ１のアミノ酸配列である。
【００１３】
配列番号１２は、全長ヒトアルギナーゼ１の１６１〜２１０位に相当する領域のアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号１３は、全長マウスアルギナーゼ１の１６１〜２１０位に相当する領域のアミノ酸配列である。
【００１５】
発明の詳細な説明
開示される製品および方法の異なる適用が、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【００１６】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容によって別途明確に規定されない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ポリペプチド(a polypeptide)」に対する言及は、「複数のポリペプチド(polypeptides)」などを含む。
【００１７】
本明細書において、「ポリペプチド」は、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣体の化合物を指すように使用される。よって、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列と、より長いポリペプチドおよびタンパク質も包含する。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体の両方を含む、天然および／もしくは非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれか、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を指す。
【００１８】
用語「患者」および「対象」は、互換的に使用され、通常はヒトを指す。
【００１９】
上記または下記を問わず、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。
【００２０】
本発明者らは、免疫原性に関する「ホットスポット」であるヒトおよびマウスアルギナーゼ１の５０アミノ酸領域を以前に同定した。この領域は、全長ヒトアルギナーゼ１（配列番号１０）または全長マウスアルギナーゼ１（配列番号１１）の１６１〜２１０位に相当する。この領域およびそれに由来するペプチド断片は、ＷＯ２０１８０６５５６３に記載されている。本発明者らは今回、驚くべきことに、この領域の特異的な連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、同じ領域からの他のアミノ酸配列と比較して免疫原性であることを同定した。
【００２１】
本明細書における「免疫原性」とは、好ましくは、アルギナーゼ１タンパク質が、アルギナーゼ１タンパク質を発現する細胞内または細胞上に存在する場合に、ポリペプチドがアルギナーゼ１タンパク質に対する免疫応答を誘発できることを意味する。言い換えれば、ポリペプチドは、アルギナーゼ１に対して免疫原性であると説明され得る。あるいは、ポリペプチドは、アルギナーゼ１の免疫原性断片として説明され得る。免疫応答は、好ましくは、Ｔ細胞応答である。免疫応答は、個体（または個体から採取したサンプル）に対するポリペプチドの投与後、少なくとも１つの個体（または前記サンプル）において検出され得る。
【００２２】
ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を含む任意の適切な方法を用いて、免疫原性であると同定することができる。例えば、ペプチドは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴のうち少なくとも１つを有する場合、免疫原性であると同定することができる：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定された場合、健常対象および／または癌患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ−γ産生細胞を誘発することができる；および／または
（ｉｉ）アルギナーゼ１と反応性であるＣＴＬの腫瘍組織のサンプルにおいてｉｎ  ｓｉｔｕで検出することができる；および／または
（ｉｉｉ）特異的Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長を誘導することができる。
ポリペプチドが免疫原活性であるかどうかを決定するのに適切な方法も、以下の実施例の項で説明される。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、以下からなってもよい：
−  全長ヒトアルギナーゼ１の１６９〜２０６位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてＡｒｇＬｏｎｇ２とも称する。その配列は、配列番号１として提供される。
−  全長マウスアルギナーゼ１の１６９〜２０６位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇ２とも称する。その配列は、配列番号２として提供される。
−  全長ヒトアルギナーゼ１の１６９〜２００位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてＡｒｇＬｏｎｇ３とも称する。その配列は、配列番号３として提供される。
−  全長マウスアルギナーゼ１の１６９〜２００位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇ３とも称する。その配列は、配列番号４として提供される。
−  全長ヒトアルギナーゼ１の１６９〜２１０位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてＡｒｇＬｏｎｇとも称する。その配列は、配列番号５として提供される。
−  全長マウスアルギナーゼ１の１６９〜２１０位に相当するアミノ酸配列。このポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇとも称する。その配列は、配列番号６として提供される。
【００２４】
ポリペプチドは、好ましくは、ヒトまたはマウスの全長アルギナーゼ１の１６９〜２０６位に相当するアミノ酸配列からなる、すなわち、それは、配列番号１または２のアミノ酸配列からなる。すなわち、ポリペプチドは、好ましくは、ＡｒｇＬｏｎｇ２またはｍＡｒｇＬｏｎｇ２である。
【００２５】
ポリペプチドは、最も好ましくは、全長ヒトアルギナーゼ１の１６９〜２０６位に相当するアミノ酸配列からなる、すなわち、それは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。すなわち、ポリペプチドは、好ましくは、ＡｒｇＬｏｎｇ２である。
【００２６】
本明細書に記載の任意のポリペプチドにおいて、修飾配列を有するポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、アルギナーゼ１に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、アミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個、または５個（すなわち、最大５個）の付加、欠失または置換によって修飾されてもよい。「同等」とは、修飾配列のポリペプチドが、非修飾配列のポリペプチドと比較して、アルギナーゼ１に対する有意に低減した免疫原性を示さないことであると理解されるべきである。配列間の免疫原性のいずれの比較も、同じアッセイを使用して実施すべきである。特に断りのない限り、ポリペプチド配列に対する修飾は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換では、アミノ酸が、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸と置き換えられる。導入されたアミノ酸は、置き換わるアミノ酸と、類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換では、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は、当技術分野で周知であり、下記の表Ａ１に定義される２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択してもよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２におけるアミノ酸側鎖に関する疎水性親水性指標を参照することによって、決定することができる。
【００２７】
【表１】
2022501046.tif 000004
【００２８】
【表２】
2022501046.tif 000005
【００２９】
本明細書に開示される任意のポリペプチドにおいて、ポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、アルギナーゼ１に対する同等または増大した免疫原性を示すならば、生理化学的特性（例えば、安定性）を改善するために、以下の修飾のうちいずれか１つ以上を行ってもよい：
ａ）Ｃ末端アミノ酸の対応するアミドとの置換（カルボキシペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｂ）Ｎ末端アミノ酸の対応するアシル化アミノ酸との置換（アミノペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｃ）１つ以上のアミノ酸の対応するメチル化アミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）；
ｄ）１つ以上のアミノ酸のＤ−立体配置の対応するアミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）。
（ｃ）および（ｄ）のタイプの修飾に関して、好ましい例は、配列番号１の２９位に相当する位置のＴｙｒ残基の修飾である（例えば、Ｎ−メチル（Ｔｙｒ）との置換またはＤ立体配置Ｔｙｒとの置換）。その理由は、Ｔｙｒは、２８位のＬｙｓ残基の直後に出現するため、トリプシン様プロテアーゼ（通常は、Ｌｙｓの後を切断する）によるタンパク質分解のための潜在的な部位にあるからである。
【００３０】
本明細書に開示される任意のポリペプチドは、前記ポリペプチドが、さらなる部分を欠くポリペプチドと比較して、アルギナーゼ１に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、溶解性、安定性を改善するため、および／または製造／単離の一助となるために、少なくとも１つの付加的な部分をＮおよび／またはＣ末端に付着させてもよい。適切な部分としては、親水性アミノ酸が挙げられる。例えば、アミノ酸配列ＫＫ、ＫＲまたはＲＲを、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加させてもよい。他の適切な部分としては、アルブミンまたはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が挙げられる。
【００３１】
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の適切な手段によって製造することができる。例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的な技法、例えば、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学または液相ペプチド合成を使用して、直接合成してもよい。あるいは、ポリペプチドは、細胞、通常は細菌細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターで形質転換することによって、製造してもよい。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびベクターを提供する。本発明はまた、このような核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３２】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの限定されない例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲の培地からのポリペプチドの実質的な、しかし完全ではない単離があり得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、それらの使用目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、例えば、発現ベクターにおける適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的で、このような核酸配列としては、限定されるものではないが、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡ由来のゲノム配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)における例により説明されるように、当技術分野で周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入配列に動作可能に連結された調節配列を含み、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける本発明のポリペプチドの発現を可能とする発現カセットの形態で提供され得る。次に、これらの発現カセットは、通常は、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。このような発現カセットは、宿主対象に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを用いて調製および／または投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運び、本発明のポリペプチドの発現を可能とすることができる任意のベクターであり得る。
【００３４】
したがって、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で慣例的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、例えば、本発明のペプチドの発現を可能とするために、必要であり得る、および正確な方向で位置するポリアデニル化シグナルの使用が関与し得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかであろう。この点に関するさらなる例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照する。
【００３５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように改変されている細胞を含む。このような細胞は、通常は、細菌細胞、例えば大腸菌などの原核細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを製造するために、慣用的な方法を用いて培養してもよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。本発明のポリペプチドは、使用目的を妨げない担体、保存剤、もしくは希釈剤（以下で考察する）、および／またはアジュバント（これも以下で考察する）と混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、本発明のポリペプチドは、一般に、製剤中に少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％のタンパク質を含む。
【００３７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体、保存剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。あるいは、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体、保存剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。担体、保存剤および賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、および組成物が投与される対象にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。通常は、すべての成分および最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、好ましくは、アジュバントを含み得る。
【００３８】
アジュバントは、組成物へのその混合が、組成物により誘発される免疫応答を増大またはそうでなければ修飾する、任意の物質である。広く定義されるアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。アジュバントはまた、投与部位からの有効薬剤の緩徐かつ持続した放出ももたらすという点で、好ましくは、デポ効果を有し得る。アジュバントに関する一般的な考察は、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986) 61-63頁において提供されている。
【００３９】
アジュバントは、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ノル−ＭＤＰともいう）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥともいう）、２％スクアレン／ツイーン−８０．ＲＴＭ．エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含むリポ多糖およびその種々の誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、およびブルセラ属のメンバーに認められる物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ５８７６７および５，５５４，３７２を参照のこと）、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１からなる群から選択され得る。種々のサポニン抽出物も、免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）も、アジュバントとして使用してもよい。
【００４０】
本発明とともに使用される好ましいアジュバントとしては、油／界面活性剤ベースのアジュバント、例えば、モンタニドアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ社、ベルギーから入手可能）、好ましくは、モンタニドＩＳＡ−５１が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントである。さらに他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、例えば、ポリＩ：Ｃである。ＧＭ−ＣＳＦおよびイミダゾキニリンも、好ましいアジュバントの例である。
【００４１】
アジュバントは、最も好ましくは、モンタニドＩＳＡアジュバントである。モンタニドＩＳＡアジュバントは、好ましくは、モンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０である。
【００４２】
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986)61-63頁において、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が不十分な場合、免疫原性担体へのカップリングが推奨されることも記載されている。したがって、本発明のポリペプチドを、担体にカップリングしてもよい。担体は、アジュバントと独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、活性もしくは免疫原性を増大させるため、安定性を付与するため、生物活性を増大させるため、または血清中半減期を増大させるために、ポリペプチド断片の分子量を増加させることであり得る。さらに、担体は、ポリペプチドまたはその断片をＴ細胞に提示する助けとなり得る。したがって、組成物において、ポリペプチドは、以下に記載するような担体と会合し得る。
【００４３】
担体は、当業者に公知の任意の適切な担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）であり得る。担体タンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン等）、またはホルモン（インスリン等）またはパルミチン酸が挙げられる。あるいは、担体タンパク質は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドであり得る。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。担体は、ヒトに対して生理学的上許容可能であり、安全でなければならない。
【００４４】
組成物が賦形剤を含む場合、賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、およびそのレシピエントにとって有害ではないという意味で、「薬学上許容可能」でなければならない。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが、賦形剤中に存在してもよい。これらの賦形剤および補助物質は、一般に、組成物を投与される個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与することができる医薬品である。薬学上許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノール等の液体が挙げられる。薬学上許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も含まれ得る。薬学上許容可能な賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の完全な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手可能である。
【００４５】
適切な組成物の処方は、標準的な医薬処方化学および方法（これらはすべて、当業者にとって容易に入手可能である）を用いて、実施することができる。このような組成物は、ボーラス投与または連続投与にとって適切な形態で、調製、包装、または販売され得る。注射用組成物は、単位投与形、例えば、アンプルまたは場合により保存剤を含有する多回投与容器で、調製、包装、または販売され得る。組成物としては、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および埋込み型徐放性製剤または生分解性製剤が挙げられる。組成物の一つの実施形態において、有効成分は、再構成された組成物の投与前に、適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するために、乾燥（例えば、粉末または顆粒）形態で提供される。組成物は、無菌注射用の水性または油性の懸濁液または溶液の形態で、調製、包装、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って処方され得、有効成分に加えて、本明細書に記載のアジュバント、賦形剤および補助物質等の追加の成分を含み得る。このような無菌注射用製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤および溶媒としては、限定されるものではないが、リンゲル液、等張食塩水、および、合成モノまたはジグリセリド等の固定油が挙げられる。有用な他の組成物としては、微結晶形で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として、有効成分を含む組成物が挙げられる。徐放または埋込みのための組成物は、薬学上許容可能なポリマー性または疎水性材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩を含み得る。あるいは、組成物の有効成分は、カプセル化され得る、粒子状担体に吸着され得る、または粒子状担体と会合し得る。適切な粒子状担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来する担体、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に由来するＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。他の微粒子系およびポリマー、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンなどのポリマー、およびこれらの分子のコンジュゲートも使用することができる。
【００４６】
使用方法
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法において使用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法における使用のための薬剤の製造において使用され得る。方法は、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドまたは前記組成物を前記対象に投与することを含む。投与は、治療上または予防上有効な量の前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドまたは前記組成物を、それを必要とする対象に投与するものであり得る。
【００４７】
疾患または病態は、アルギナーゼ１の不適切なまたは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とし得る。疾患または病態は、癌、好ましくは、アルギナーゼ１を発現する、および／またはアルギナーゼ１の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能と関連する癌であり得る。癌は、乳癌、肺癌、結腸癌もしくは前立腺癌であり得るか、または白血病、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり得るか、または黒色腫であり得る。
【００４８】
方法は、併用する癌療法との同時投与または逐次投与を含み得る。併用する癌療法は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質、遺伝子療法、または抗体から選択され得る。
【００４９】
抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシズマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、ドゥリゴツマブ、デュピルマブ、ドゥシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルピリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（＝トレメリムマブ）、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ（＝アトリズマブ）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブまたはゾリモマブアリトクスであり得る。
【００５０】
好ましい抗体としては、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アレファセプト、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、エクリズマブ、オマリズマブ、カナキヌマブ、メポリズマブ、レスリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブおよびベドチンが挙げられる。
【００５１】
本発明の方法において使用され得る特に好ましい抗体としては、ダラツムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブおよびオファツムマブが挙げられる。ダラツムマブが特に好ましい。
【００５２】
併用する癌療法は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンからなる群から選択され得る。
【００５３】
本発明の組成物のポリペプチドは、細胞を前記ポリペプチドまたは組成物に接触させることを含む、アルギナーゼ１特異的Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を刺激する方法においても使用され得る。方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行ってもよい。細胞は、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、例えば、腫瘍サンプル中に存在し得る。
【００５４】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、保護の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。前述の説明および以下の実施例に開示される特徴は、両方とも別々に、またその任意の組合せにおいて、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【００５５】
実施例１
材料と方法
患者材料
健常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）での密度勾配分離を用いて単離し、１０％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳ中にて−１５０℃で凍結保存した。癌患者由来のＰＢＭＣは、すべての抗癌療法の終了から最低４週後に、血液サンプルから単離した。プロトコールは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｃａｐｉｔａｌ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋにより承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従って実施した。患者からの書面によるインフォームドコンセントを、試験登録前に取得した。
【００５６】
ペプチド
ペプチドを、標準的な方法により合成し、ＤＭＳＯに溶解してストック濃度１０ｍＭを得た。これらの実験に使用したペプチドの配列については、その全長を相互のアラインメントとして示し、また、「配列」という表題の項目においても説明する。ペプチドは、配列番号、名称、またはアルギナーゼ１の全長配列における各ペプチド配列の開始および終了位置によって示される。それぞれ互換的に使用され得る。例えば、配列番号１のペプチドは、一方で名称ＡｒｇＬｏｎｇ２という場合もあり、または、一方でＡｒｇ１６９−２０６（１６９の開始位置および２０６の終了位置を示す）という場合もある。各例における意図する参照は、文脈から明らかとなるであろう。
長いペプチド配列：
【化２】
2022501046.tif 000006
【００５７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＰＯＴのために、癌患者および健常ドナーに由来するＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用する前に、２４ウェルプレート中で２０μＭのアルギナーゼ１由来ペプチドおよび１２０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２で７日間パルスした。細胞を、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＩＰ  Ｎ４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に播種した。アルギナーゼペプチドを加え、終濃度５μＭとし、プレートを３７℃で１４〜１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗い流し、二次ビオチン化Ａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３４２０−６−１０００）を、室温で２時間加えた。非結合二次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３３１０−１０）を、室温で１時間加えた。非結合コンジュゲート酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６５０−１０）を加えることにより、アッセイを展開した。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェアｖ５．１を用いたＣＴＬ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ６  Ｕｌｔｉｍａｔｅ−Ｖアナライザーで分析した。応答は、アルギナーゼ１で刺激したウェルおよびペプチド添加なしのウェル中の平均数間の差として報告した。
【００５８】
ＩＬ−４誘導Ａｒｇ１応答を確認するために、ＰＢＭＣを、上記のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて設定する前に、ＩＬ−４（１００または５０Ｕ／ｍＬ）および／またはＩＬ−２（１２０または６０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した。
【００５９】
細胞内染色
ＰＢＭＣを、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ペプチド刺激の最初の１時間の後に加えた）の存在下で、アルギナーゼ由来ペプチドで５時間刺激した後に、細胞培養物の細胞内染色を行った。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に対する蛍光標識抗体で染色し、その後、固定／透過処理および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００−５１２３−４３）を用いて、製造業者の説明書に従って透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。以下の抗体：ＩＦＮγ−ＡＰＣ（カタログ番号３４１１１７）、ＴＮＦα−４５５  ＢＶ４２１（カタログ番号５６２７８３）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（カタログ番号３４７４１３）、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７４）、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７（カタログ番号５６０２７５）（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）、死細胞染色−ＦＶＳ５１０（５６４４０６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造業者の説明書に従って使用した。
【００６０】
メモリーＴ細胞のソーティング
磁気ビーズソーティングキット：Ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ヒト（カタログ番号１３０−０９１−８９３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）およびＣＤ８＋  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ヒト（カタログ番号１３０−０９４−４１２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞を、新鮮解凍健常ドナーまたは癌患者ＰＢＭＣサンプルからソーティングした。単離細胞の純度を、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）に対する染色により評価し、死細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色した。
【００６１】
結果
アルギナーゼ１ペプチド長は、Ｔ細胞刺激の効率を決定する
以前に同定されたアルギナーゼ１の１６１〜２１０位の５０アミノ酸長Ａｒｇ１ホットスポット領域に基づき、この領域の主要部分を網羅した３個の異なるペプチドを選択し、これはまた、アルギナーゼ１の１６８位のシステイン（製造性、溶解性および安定性を改善することが期待される）を除外したものであった。その３個のペプチドとは、４２−ｍｅｒ  ＡｒｇＬｏｎｇ（１６９〜２１０位）、３８−ｍｅｒ  ＡｒｇＬｏｎｇ２（１６９〜２０６位）および３２−ｍｅｒ  ＡｒｇＬｏｎｇ３（１６９〜２００位）であった。
【００６２】
これらのペプチドがアルギナーゼ１応答を同定するのに使用できるかどうかを試験するために、６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおける応答に関して選別した。ＰＢＭＣは、ＥＬＩＳＰＯＴの前に１週間、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドおよび低用量ＩＬ−２で刺激した。配列の類似性にもかかわらず、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドは、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおいてＴ細胞応答の刺激に優れているようであった。図１に示されるように、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する高い応答が６例中４例のドナーに認められ、一方、ＡｒｇＬｏｎｇおよびＡｒｇＬｏｎｇ３ペプチドに対しては、低い応答が存在したか、または全く応答が認められなかった。
【００６３】
ＡｒｇＬｏｎｇ２は、ＡｒｇＬｏｎｇより４アミノ酸短く、ＡｒｇＬｏｎｇ３より６アミノ酸長いのみである。このことは、ペプチド長および配列は、アルギナーゼペプチドの最適なプロセシングおよび提示を確実にするための重要な役割を果たし得ることを示唆している。結果として、それは、このようなペプチドがＡｒｇ１特異的Ｔ細胞を活性化する能力に対する効果を有し得る。
【００６４】
ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドが、以前に記載された同じ配列を網羅する個々の２０−ｍｅｒペプチド（ＷＯ２０１８０６５５６３の実施例１、２および３を参照のこと）に匹敵するかどうかを決定するために、１９例の健常ドナーおよび１６例の癌患者（黒色腫８例、多発性骨髄腫６例、乳癌１例および腎細胞癌１例）由来のＰＢＭＣを、３個の２０−ｍｅｒペプチドおよび３８−ｍｅｒ  ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する応答に関して選別した。癌患者および健常ドナーの両方において、ＡｒｇＬｏｎｇ２は、全３個の２０−ｍｅｒペプチドと比較して最も強い応答をもたらした（図２を参照のこと）。ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する強い応答が、１９例中１４例の健常ドナーおよび１６例中８例の癌患者に認められた。応答は２０−ｍｅｒペプチドに対しても認められたが、これらは数が少なく、程度が低いものであった。要約すると、Ａｒｇ１７１−１９０は、３例の健常ドナーおよび３例の癌患者において応答を示し、Ａｒｇ１８１−２００は、４例の健常ドナーおよび６例の癌患者において応答を示し、Ａｒｇ１９１−２１０は、７例の健常ドナーおよび３例の癌患者において応答を示した。
【００６５】
アルギナーゼ１に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答
以前に記載された２０−ｍｅｒ  Ａｒｇ１ペプチドに対するＴ細胞応答は、主に癌患者および健常ドナーにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示している（ＷＯ２０１８０６５５６３の実施例２を参照のこと）。ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドは、より効率的に処理され、その後Ｔ細胞によって認識されると思われたため、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対するＴ細胞応答の種類を細胞内染色によって検討した。
【００６６】
以前にＥＬＩＳＰＯＴにおいてＡｒｇＬｏｎｇ２に対する強い応答を示していた２例の健常ドナー（ＨＤ３８４、ＨＤ４００）および１例の乳癌患者（ＢＤ３０）由来のＰＢＭＣを、ＡｒｇＬｏｎｇ２および低用量ＩＬ−２によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の１週間後に、細胞内染色によって試験した。注目すべきことに、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方が、癌患者および健常ドナーにおいて同定された。ＣＤ４＋応答（図３Ａの左のパネル）およびＣＤ８＋応答（図３Ａの右のパネル）の両方が、１例の健常ドナーおよび乳癌患者のＰＢＭＣにおいて検出された。他方の健常ドナーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のみを示した。
【００６７】
興味深いことに、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する検出可能なＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答も、ペプチド前刺激なしのＰＢＭＣの細胞内染色において認められた。２例の癌患者（悪性黒色腫（ＭＭ２７）１例および乳癌（ＢＣ３０）１例）由来のＰＢＭＣを解凍し、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞内染色におけるＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する応答に関して直接試験した。本発明者らは、両癌患者由来のＰＢＭＣにおけるｅｘ  ｖｉｖｏ  ＣＤ４＋応答（図３Ｂ、左）および乳癌患者のＰＢＭＣにおけるｅｘ  ｖｉｖｏ  ＣＤ８＋応答（図３Ｂ、右）を検出することができた。
【００６８】
アルギナーゼ１に対するメモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答
ＡｒｇＬｏｎｇ２に対して認められた強い応答は、Ａｒｇ１特異的Ｔ細胞の頻度は、いずれのペプチド前刺激も行わなかったＰＢＭＣにおいてより一般に検出可能であったことを示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＰＯＴにおいて強い応答を示していた４例の健常ドナーおよび２例の癌患者（乳癌１例および悪性黒色腫１例）由来のＰＢＭＣを、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する応答に関して直接試験した。本発明者らは、全６例のドナーにおいて有意な自発的応答を見出した（図４Ａを参照のこと）。
【００６９】
健常ドナーおよび癌患者のＰＢＭＣにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する強い自発的なｅｘ  ｖｉｖｏ応答の存在は、アルギナーゼ１特異的細胞が、免疫系の自然の部分であることを示唆するものであった。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて強い自発的免疫応答を示していた癌患者および健常ドナーのＰＢＭＣから、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞がソーティングされたことを試験するために、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおける磁気ビーズソーティングおよび設定を用いて、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞を、４例の健常ドナーおよび２例の癌患者のＰＢＭＣからソーティングした。メモリーＴ細胞の単離の純度を、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に対するフローサイトメトリー分析により確認したところ、９５％超であった。本発明者らは、２例の癌患者および３例の健常ドナーにおいて、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対するＣＤ４＋メモリー応答を見出した（図４Ｂを参照のこと）。明らかなＣＤ８＋メモリー応答が、２例の健常ドナーにおいて検出することができた（図４Ｃを参照のこと）。
【００７０】
ＩＬ−４によりアップレギュレートされたアルギナーゼ１発現は、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対するＴ細胞応答を増大させる
Ａｒｇ１特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞は、癌患者および健常ドナーの両方において存在するため、これらのＴ細胞が、アップレギュレートされたＡｒｇ１発現に応答する免疫調節に関与する可能性があるかどうかを試験した。Ａｒｇ１は、ＩＬ−４に応答して骨髄性細胞においてアップレギュレートされることが、以前に記載されている。
【００７１】
最初に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対して強い自発的応答を以前に示していた１例の黒色腫患者由来のＰＢＭＣを試験した。ＰＢＭＣを、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する応答に関してＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおいて試験する前に、解凍し、ＩＬ−４（５０Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−２（１２０Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ−４およびＩＬ−２ａの組合せ（それぞれ５０Ｕ／ｍＬおよび６０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した。非刺激細胞を対照として使用した。強い有意な応答が、すべてのＩＬ−４刺激群において認められ、刺激なしまたはＩＬ−２単独での刺激と比較して、最も強い応答がＩＬ−４刺激群に対して認められたことから、Ａｒｇ１特異的Ｔ細胞は、アップレギュレートされたＡｒｇ１発現に応答して活性化されることが示唆された。図５Ａを参照のこと。
【００７２】
次に、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対するｅｘ  ｖｉｖｏでの強い自発的応答を以前に示していた２例の癌患者（ＢＣ３０（乳癌）、ＭＭ２７（悪性黒色腫））および６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、低用量のＩＬ−２（１２０Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍＬ）のいずれかで７日間刺激した。非刺激細胞を対照として使用した。培養７日後、ＰＢＭＣを、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにおけるＡｒｇＬｏｎｇ２に対する反応性に関して試験した。８個中６個の培養物が、非刺激対照およびＩＬ−２刺激対照と比較して、ＩＬ−４刺激培養物においてＡｒｇＬｏｎｇ２に対する増大した応答を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡｒｇ１特異的Ｔ細胞活性化の潜在的な共通機序がさらに確認された。図５Ｂを参照のこと。
【００７３】
考察
Ａｒｇ１特異的Ｔ細胞の存在は、以前に記載されている。このようなＴ細胞は、免疫調節タンパク質を標的とするそれらの役割から、「抗Ｔｒｅｇ」と呼ばれ得る。他の免疫調節タンパク質、例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＩＤＯに対する抗Ｔｒｅｇ応答も、記載されている。上記の実験は、ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する応答が、単離されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞集団において認められたため、アルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇは、癌患者および健常ドナーにおいて自然に存在するだけでなく、メモリーＴ細胞のレパートリーの一部としても存在することを示している。
【００７４】
免疫バランスを保つために、調節性免疫細胞、例えば、Ｔｒｅｇ、異なる樹状細胞サブタイプ、骨髄由来免疫抑制細胞、およびＭ２マクロファージが、免疫応答を抑制するまたは終了させる。この調節群は、自己抗原に対する不応答性または寛容を確実にする。調節性免疫細胞は、多数の異なる細胞性因子および細胞外因子を介して免疫を抑制する。対照的に、細胞内分解抗原から生じるＨＬＡ制限由来エピトープを認識する特異的抗Ｔｒｅｇは、調節性免疫細胞を直接排除することができる。さらに、抗Ｔｒｅｇは、エフェクターサイトカインの分泌によって、局所免疫活性化を増大させることができる。
【００７５】
ＴＨ２駆動肺炎症は、骨髄性細胞におけるアルギナーゼ１発現を増大させる。特に、マクロファージＭ２表現型のプロトタイプの誘導因子であるＩＬ−４は、アルギナーゼ１のアップレギュレーションを誘導した。ここで、アルギナーゼ１特異的Ｔ細胞は、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４に応答して活性化されることが示されている。したがって、このことは、アルギナーゼ１特異的ＴＨ１細胞が、ＩＬ−４が増大した環境に浸潤し、免疫応答をＴＨ１経路に戻すように駆動することを示唆するものであり、これは、免疫抑制の制御および炎症の促進におけるアルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇの重要な役割である可能性がある。しかしながら、アルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇ自体は、アルギナーゼ１発現調節性免疫細胞の抑制効果によって妨害される。このため、免疫調節ネットワークにおいて、アルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇは、アルギナーゼ１＋調節性免疫細胞の機能を抑制し、逆もまた同様である。それ故、正常な生理学的条件下では、免疫の活性化と抑制との間の平衡が、免疫ホメオスタシスを維持するために必要であり得る。
【００７６】
ＩＬ−４に応答して増殖する、健常人におけるアルギナーゼ１に対して特異的なメモリーＴ細胞の所見は、ＩＤＯおよびＰＤ−Ｌ１特異的抗Ｔｒｅｇに関する以前の所見と一致する。検出は、癌を有する患者における検出程頻繁ではなかったが、循環するＩＤＯ−またはＰＤ−Ｌ１特異的抗Ｔｒｅｇは、健常ドナーにおいて存在すると同定されている。さらに、ＩＤＯおよびＰＤ−Ｌ１を誘導することで知られる炎症性サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γは、さらなる刺激なくヒトＰＢＭＣにおけるＩＤＯ−またはＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の集団を増殖させることが見出されている。
【００７７】
免疫抑制性骨髄細胞による腫瘍微小環境におけるアルギナーゼ１の発現は、Ｌ−アルギニン枯渇を介して抗腫瘍Ｔ細胞応答を阻害する。アルギナーゼ１陽性環境において、Ｔ細胞は増殖することができず、このため、有望な治療戦略は、炎症促進性アルギナーゼ１特異的Ｔ細胞の活性化による適応免疫応答を再構成することである。ペプチドワクチン接種によるアルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇの活性化は、癌における特異的な免疫抑制機序を標的とする新規なアプローチをもたらす。
【００７８】
癌治療における新規な免疫療法アプローチの開発は、共通の抑制機序を標的とする場合に、最も有効かつ万能である可能性が高い。これらの実験に示されるように、アルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇは、免疫系の自然の部分として存在し、癌における免疫抑制から離れるようにバランスを傾けるために容易に利用され得る。
【００７９】
以前に記載されたアルギナーゼ１ホットスポット領域の大部分を網羅するペプチドＡｒｇＬｏｎｇ２は、異なる長さの類似のペプチドと比較して、アルギナーゼ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激するのに特に有効であることが示されている。したがって、ＡｒｇＬｏｎｇ２は、腫瘍微小環境においてエフェクター機能およびヘルパー機能の両方を発揮し得るアルギナーゼ１特異的抗Ｔｒｅｇを刺激するその潜在能力を考慮すると、ワクチン接種の状況において成功する可能性が特に高い。
【００８０】
実施例２  −  さらなるペプチドの設計
マウスにおけるワクチン接種実験における使用に適切な、また、ヒトにおいて機能的でもあり得るペプチドを設計するために、マウスアルギナーゼ１の配列（配列番号１１）を、配列番号１０のヒトアルギナーゼ１配列と比較した。類似性のレベルは、配列番号１の１６１〜２１０位に相当するヒトアルギナーゼ１のホットスポット領域において特に高い。この領域のアラインメントおよびマウスアルギナーゼ１における対応する領域を、以下に示す：
【化３】
2022501046.tif 000007
【００８１】
太字および下線で示す通り、５０残基のうち２残基のみが異なっている。ヒト配列におけるロイシンは、マウスにおける非常に類似した脂肪族アミノ酸であるイソロイシンに置換されており、ヒト配列におけるアルギニンは、マウスにおける同様に塩基性のリシンに置換されている。両変化とも保存的である。したがって、ホットスポット領域は、ヒトとマウスとの間で高度に保存されている。したがって、本発明のポリペプチドは、ホットスポット領域からの特定のヒト配列からなるポリペプチドであって、対応するマウス配列への置換がなされているポリペプチドを含む。例えば、配列番号２は、配列番号１に相当するが、上記のロイシン−イソロイシン置換およびアルギニン−リシン置換の両方を有する。配列番号２からなるポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇ２という場合がある。同様に、配列番号４は、配列番号３に相当するが、上記のロイシン−イソロイシン置換を有する。配列番号２からなるポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇ３という場合がある。同様に、配列番号６は、配列番号５に相当するが、上記のロイシン−イソロイシン置換およびアルギニン−リシン置換の両方を有する。配列番号６からなるポリペプチドは、本明細書においてｍＡｒｇＬｏｎｇという場合がある。マウスペプチドは、それらのヒト対応物に対するワクチンとして同様の可能性を有することが期待される。
【００８２】
実施例３  −  マウス腫瘍モデルにおけるヒトＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験
ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドを用いたワクチン接種の治療可能性を実証するために、マウスモデルを開発した。マウスにおける対応するＡｒｇＬｏｎｇ２配列は、２個のアミノ酸のみが異なるため、ヒトＡｒｇＬｏｎｇ２配列をその後の実験に用いた。ヒトＡｒｇＬｏｎｇ２配列とマウスＡｒｇＬｏｎｇ２配列の比較を以下に示す：
【化４】
2022501046.tif 000008
【００８３】
材料と方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのペプチドワクチン接種
動物に対し、不完全モンタニドＩＳＡ５１ＶＧを含有する１：１エマルション中のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中のペプチド１００μｇを皮下ワクチン接種した。モンタニドＩＳＡ５１ＶＧ＋ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏは、対照ワクチンとして接種した。ＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチドに対する免疫応答のその後の分析のために、マウスを７日目に屠殺し、脾臓および流入領域リンパ節（ｄＬＮ）をＥＬＩＳＰＯＴの設定のために回収した。
【００８４】
ペプチド特異的応答のＥＬＩＳＰＯＴ分析
マウス免疫細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。セルストレーナーを通過させることによって、脾臓またはｄＬＮから単一細胞懸濁液を調製した。赤血球の溶解後、０．６〜０．８×１０６細胞／ウェルを、抗ＩＦＮγ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。目的のペプチドを指定のウェルに加え、細胞をペプチドとともに一晩インキュベートした。翌日、細胞を除去し、プレートを洗浄し、ビオチン化検出抗体でインキュベートした。最後に、ストレプトアビジン−ＡＬＰおよび基質を加えた後、目に見えるスポットが出現する。各スポットは、個々のＩＦＮγ産生細胞に対応する。プレートを免疫スポットアナライザーで分析し、プロットした。
【００８５】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１５〜１６／１７〜２０週齢、１５匹／群の腫瘍ワクチン接種
各動物に対し、１００μＬ培地中の０．５×１０６個の同系腫瘍細胞を右側腹部に皮下接種した。同系Ｂ１６  Ｆ１０メラノーマ細胞株および同系ＭＣ３８結腸腺癌細胞株の両方を使用した。ワクチン接種を０日目に開始し、週１回繰り返した（７日目および１４日目）。ペプチドおよび対照のワクチン接種を、上記のように行った。
【００８６】
腫瘍成長をモニタリングし、腫瘍をおよそ２日毎に測定した。腫瘍容積は、Ｖ［ｍｍ３］＝Ｌ×Ｗ２／２（式中、Ｌは最長径であり、ＷはＬに垂直である）で算出した。マウスを安楽死させる前の最大腫瘍サイズは、８６４ｍｍ３（Ｌ＝１２ｍｍ、Ｗ＝１２ｍｍ）であった。
【００８７】
結果
ＡｒｇＬｏｎｇ２は、単一回のワクチン接種後に検出されたワクチン特異的Ｔ細胞応答が高頻度であったことから、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて強く免疫原性であることが認められた（図６）。
【００８８】
腫瘍の試験において、ＡｒｇＬｏｎｇ２のワクチン接種は、対照のワクチン接種と比較して、腫瘍成長を有意に遅延させた。腫瘍成長の遅延は、結腸腺癌に関するＭＣ３８モデル（図７）および黒色腫に関するＢ１６モデル（図８）の両方において認められた。
【００８９】
実施例４  −  ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞クローンは、アルギナーゼ１発現ＴＨＰ−１細胞を認識する
材料と方法
ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞クローンの生成
以下のように標準的な急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）に従って、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的細胞に富むＴ細胞培養物からＡｒｇＬｏｎｇ２クローン培養物を生成した：ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的細胞を、ＴＮＦα産生Ｔ細胞の磁気ビーズソーティングによって分離し、約１細胞／ウェルの９６ウェルプレートにおける制限希釈クローニングに使用した。各ウェルは、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞の成長を促進するために、２００μＬのＲＥＰ混合物（３つの異なるバフィーコートの照射フィーダー細胞、αＣＤ３抗体および６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２）を含有していた。
【００９０】
ｑＰＣＲによるＴＨＰ−１細胞中のアルギナーゼ１  ｍＲＮＡの定量
ＴＨＰ−１細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１３（ＴｒｉＣｈｅｍ社）で４８時間刺激した。細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、３００ｇで５分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを氷上で維持し、３５０μＬのＲＬＴ  Ｐｌｕｓ−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）に再懸濁させた。ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮＡｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、３０μＬのＲＮＡフリー水中で最終溶出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【００９１】
全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写した。各反応につき、１０００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ＲＴ−ｑＰＣＲのために、ｃＤＮＡを１：５に希釈し、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでのＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いたＲＴ−ｑＰＣＲ分析に供した。ＲＴ−ｑＰＣＲを四重反復にて実施し、データは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯおよび対照サンプルの発現レベルに対して正規化したｄｄＣＴ法を用いて、分析した。増幅しなかった低濃度サンプルについては、Ｃｔを４０に設定した。逆転写酵素なしの対照（逆転写酵素なしでｃＤＮＡ反応を開始）は、特異的増幅の対照として使用された。Ａｒｇ１ヒトプライマーは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社から購入した（配列非開示、製品番号Ｈｓ００１６３６６０＿ｍ１）。
【００９２】
ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞によるＴＨＰ−１細胞認識の測定
無処置およびＩＬ−４／ＩＬ−１３処置ＴＨＰ−１細胞を洗浄し、２群に分けた：ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱ／ＤＰ遮断抗体（クローンＴｕｅ３９）を、１０μｇ／ｍＬの濃度で、第１の群に３７℃で２０分間添加した。ＴＨＰ−１細胞の第２の群は、無処置のままとした。２０分後、ＨＬＡ−ＩＩ遮断ＴＨＰ−１細胞を洗浄した。次に、ＩＬ−４／ＩＬ−１３（ＨＬＡ−ＩＩ遮断ありまたはなし）で処置したＴＨＰ−１細胞を、エフェクター：標的比２：１でＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチド特異的Ｔ細胞と混合し、次いで、標準的な細胞内サイトカイン染色プロトコールに従って処理した。
【００９３】
結果
ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞の機能性をさらに評価するために、Ｔ細胞クローンを、強いＡｒｇＬｏｎｇ２応答を示すと予め同定された健常ドナーから生成しており、アルギナーゼ１発現標的を特異的に認識するそれらの能力を調べた。
【００９４】
ＩＬ−４またはＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインは、骨髄性細胞におけるＡＲＧ１発現をアップレギュレートすることで知られる。ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞が、Ｔｈ２サイトカイン処置骨髄性細胞を特異的に認識するかどうかを試験するために、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ−１３（２０Ｕ／ｍＬ）のいずれかで４８時間前刺激したＨＬＡ適合単球性ＴＨＰ−１細胞株を認識するＡｒｇＬｏｎｇ２  Ｔ細胞クローンの能力を試験した。
【００９５】
Ｔｈ２−サイトカイン処置ＴＨＰ−１は、アルギナーゼ１の発現の亢進を示した。この点において、図９Ｃは、ＩＬ−１３で前処置した場合、アルギナーゼ１の発現がＴＨＰ−１細胞において誘導され、それにより、これらの細胞の表面でのアルギナーゼ１由来ペプチドエピトープの提示が増大することを示している。
【００９６】
ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的ＣＤ４  Ｔ細胞クローンは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３処置ＴＨＰ−１細胞を認識することが示されたが、このことは、無処置ＴＨＰ−１と比較して、これらの細胞に対するＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生が増大したことによって示されている（図９Ａ）。ＨＬＡクラスＩＩ分子の遮断は、ＩＬ−４またはＩＬ−１３処置ＴＨＰ−１細胞の認識増大を抑制し、このことは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３処置ＴＨＰ−１細胞の認識増大は、ＡＲＧ１ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ提示に依存的であることを示している。図９Ｂは、ドットプロット形式で図９Ａからの代表的なデータを例示したものであり、ＨＬＡクラスＩＩ遮断ありまたはなしのＩＬ−４およびＩＬ−１３処置ＴＨＰ−１細胞に応答したＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生を示している。
【００９７】
別の実験において、ＰＢＭＣ培養物におけるアルギナーゼ１由来ペプチドの提示を増大させ、それにより、ＰＢＭＣにおいて存在する内因性ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞を刺激するために、健常ドナー（ＨＤ２２、ＡｒｇＬｏｎｇ２に対する既存のｅｘ  ｖｉｖｏ応答を有することで知られる）由来のＰＢＭＣを、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ−１３（２０Ｕ／ｍＬ）で７日間処置した。ＩＬ−４またはＩＬ−１３での刺激の７日後、ＰＢＭＣをＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析し、ＡｒｇＬｏｎｇ２特異的Ｔ細胞の頻度の変化を確認した。
【００９８】
無処置対照と比較して、ＩＬ−４およびＩＬ−１３処置ＰＢＭＣ培養物において、ＡｒｇＬｏｎｇ２応答の増大が認められた。ＩＬ−１３刺激ＡｒｇＬｏｎｇ２応答の大きさは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｒｇＬｏｎｇ２ペプチド刺激後に認められた応答に匹敵し、Ｔｈ２サイトカイン条件下でのアルギナーゼ１特異的細胞の強い活性化が示唆された。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
＊  ヒトアルギナーゼ１の対応する領域と比較して、少なくとも１つの差を含むマウスアルギナーゼ１由来の配列を示す。対応するヒト配列と同一ではない残基は、太字および下線で示している。マウスおよびヒトアルギナーゼ１は同じ長さであるため、開始位置および終了位置は同じである。
【０１０１】
【化５】
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免疫原性に関してホットスポットであると同定された領域は、太字および下線で示している。
【０１０２】
【化６】
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免疫原性に関してホットスポットであると同定された領域は、太字および下線で示している。
【０１０３】
【化７】
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【０１０４】
【化８】
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対応するヒト配列と同一ではない残基は、太字および下線で示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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