【手続補正書】
【提出日】平成22年5月17日(2010.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIgG1 Fcポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであって、Fcポリペプチドがヒンジ領域内にシステイン残基の置換または欠失を含み、置換または欠失を受けるシステイン残基が野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基であり、かつFcポリペプチドが、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基にすぐ隣接したアスパラギン酸残基の置換または欠失をさらに含む、該融合ポリペプチドが免疫細胞の免疫応答性を変化させる、融合ポリペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO：2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも85％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO：11に示された配列に対して少なくとも95％同一なアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO：11の33、41および114位に対応する位置にあるシステイン残基が保たれている、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択される少なくとも1つのサイトカインの産生が阻害される、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
Fcポリペプチドが、グリコシル化部位を除去するための少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
融合ポリペプチドがIgG Fc受容体と結合する能力が低下するように、ヒトIgG1 Fcポリペプチドが、（a）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸；（b）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも2つのアミノ酸残基、または（c）FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも3つのアミノ酸残基の置換をさらに含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
免疫細胞の免疫応答性を変化させることが、（a）細胞遊走を変化させること；（b）TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること；（c）樹状細胞の成熟を阻害すること；（d）ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること；（e）SIRP-αを細胞表面に発現する免疫細胞の活性化を阻害すること；（f）ケモカインの産生を阻害すること；および（g）免疫細胞による炎症誘発性応答を抑制することのうち少なくとも1つを含む、請求項1〜6記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項1〜6記載の融合ポリペプチドを生産するための製造方法。
【請求項９】
（a）CD47と特異的に結合する、ならびに（b）CD47リガンドの（i）CD47との、および（ii）ウイルスCD47様ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項9記載の抗体を発現する宿主細胞。
【請求項１１】
以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定するための方法：
（a）（i）候補作用物質；（ii）ウイルスCD47様ポリペプチド；および（iii）CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；
（b）候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階；
（c）（i）候補作用物質；（ii）CD47リガンド；および（iii）CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階；ならびに
（d）候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、CD47リガンドと免疫細胞との候補作用物質の存在下における結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
サイトカインのレベルは、ELISA、ELISPOTおよびフローサイトメトリー（細胞内サイトカインを測定するための）を含む、本明細書に記載され、当技術分野で実施されている方法に従って決定することができる。免疫応答の抗原特異的な誘発または刺激に起因する免疫細胞の増殖およびクローン性増殖は、脾細胞またはリンパ節由来の細胞などのリンパ球を単離して、細胞を抗原で刺激し、サイトカイン産生、細胞増殖および/または細胞生存性を、例えばトリチウム化チミジンの取り込みまたはMTTアッセイなどの非放射性アッセイなどによって測定することにより、決定することができる。Th1免疫応答とTh2免疫応答とのバランスに対する本明細書に記載した融合ポリペプチドの影響は、例えば、IFN-γ、IL-12、IL-2およびTNF-βなどのTh1サイトカイン、ならびにIL-4、IL-5、IL-9、IL-10およびIL-13などの2型サイトカインのレベルを決定することによって調べることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
実施例
実施例1
ヒトCD47-Fcポリペプチドによる、ヒト樹状細胞において黄色ブドウ球菌COWAN株（SAC）により誘導されるサイトカイン産生の阻害
本明細書に記載したように、CD47のコグネイトリガンドは、シグナル調節因子タンパク質α（Sirp-α）である（同じく、例えば、Latour et al., J. Immunol. 167:2547-54 (2001)も参照のこと）。本実施例では、huCD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド構築物が、ヒト単球由来の樹状細胞において黄色ブドウ球菌細胞（SAC）により誘導されるサイトカイン産生を阻害する能力について述べる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
各上清中のTNF-α、IL-12p70、IL-6およびMIP-1αの存在を、市販の調製キットを製造元（R&D Systems, Minneapolis, MN）によって提供されたプロトコールに従って用いるELISAによって決定した。データは図3に提示されている。hCD47-Fc構築物は、SACにより誘導されるTNF-αおよびIL-12p70の産生を用量依存的な様式で減少させ、IC50は6ng/ml未満であった。ヒトIgG対照はSACにより誘導されるTNF-α産生に影響を及ぼさず、IL-12産生に対する影響は限定的であり、このことはCD47-Fc融合ポリペプチドのCD47ドメインが、SACに応じたDCのサイトカイン分泌を阻害することを示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
（表１）hCD47-Fcによる、ヒト単球由来の樹状細胞におけるPBS-SACを介したサイトカイン産生の阻害
2009537145.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
SACとヒト血清（HuS-SAC）とのインキュベーションは、ヒトDCにおいてSACにより誘導されるTNF-αおよびIL-23の産生を増加させた。熱失活させたヒト血清（健常ドナープールから調製）（100μl）を、同容積の12％ SACとともに1時間インキュベートし、PBSで洗浄して、続いてPBS中に再懸濁させて、最終濃度を1.2％ SACとした。PBS-SACまたはFBS（ウシ胎仔血清）-SACの調製後に、ヒト血清の代わりにそれぞれPBSまたはFBSを添加することにより、同じプロトコールを行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
SACとヒト血清とのインキュベーションは、ヒトDCにおいてSACにより誘導されるTNF-αおよびIL-23の産生を増加させた。hCD47-FcはHuS-SACにより誘導されるTNF-αおよびIL-23の産生を阻害し、IC50は0.16μg/ml未満であり、一方、Fc-Stub対照はサイトカイン分泌に対して何ら影響を及ぼさなかった。理論に拘束されることは望まないが、ヒト血清中に存在するヒトIgGは、SAC上のプロテインA結合部位を飽和させて、Fc-受容体を介したサイトカイン分泌の強化を誘発すると考えられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
その結果は図6に提示されている。ロバIgGの存在（図6の右側）は、プレートに結合したIgGの非存在下におけるDCと比較して（図6の左側）、TLR2リガンドであるFSL-1に応じたヒトDCによるTNF-α産生のおよそ6倍の増加をもたらした。hCD47-Fcは、Fc-Stub対照と比較して、IgGを介したTNF-α産生の増加を用量依存的な様式で阻害した。hCD47-Fcは、プレートに結合したIgGの非存在下においてFSL-1により誘導されるサイトカイン産生に対しては何ら影響を及ぼさず、このことはhCD47-Fc融合ポリペプチドのCD47部分がFc-受容体を介したDCの活性化を阻害したことを示している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
その結果は図7に提示されている。hCD47-Fcと同様に、hCD47-Hacは、マウスIgGの非存在下におけるFSL-1に応じたDCによるTNF-α分泌に対して何ら影響を及ぼさなかったが、hCD47-Hacは免疫複合体により誘導されるTNF-α産生を阻害した。対照構築物gluc-HacはFc-受容体を介したサイトカイン産生に影響を及ぼさず、このことから構築物のCD47部分がFc-受容体を介したDCの活性化をブロックすることが裏づけられた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
その結果は図8に提示されている。マウスCD47-Fcは、BMDCにおいてIgG2a-SACにより誘導されるIL-12p70およびTNF-αの産生を用量依存的な様式で阻害したが、一方、IgG2a対照抗体はIgG2a-SACにより誘導されるサイトカイン分泌を減少させなかった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
【図１】細胞表面に発現されたヒトCD47および細胞表面に発現されたウイルスCD47様ポリペプチドの模式図を提示している。
【図２】ヒトCD47（SEQ ID NO：9）（GenBankアクセッション番号NP_001768.1）と小痘瘡ウイルス由来のvCD47（SEQ ID NO：3）とのアラインメントを提示している。アスタリスク（*）は配列間のアミノ酸同一性を示し、「:」はアミノ酸類似性を示す。分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太字体で示されている。凡例（key）は各ポリペプチドのシグナルペプチドのアミノ酸がイタリック体で表記され；Igドメインのシステインループは一重下線で示され；膜貫通部分（グレーの陰影が施されている）の細胞内部分および細胞質内尾部は二重下線によって示され；ならびに、CD47およびウイルスCD47様ポリペプチドの膜貫通部分の細胞外部分は太い下線によって示されていることを示している。
【図３】ヒトCD47細胞外ドメイン-Fc融合ポリペプチド（CD47-hFc）が、ヒト樹状細胞における、黄色ブドウ球菌Cowan株（SAC）により誘導されるTNF-α（TNF-α）（図3A）およびIL-12p70（図3B）の産生を阻害することを示している。3人のドナーからの8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびヒトIgG（IgG）により処理した。続いて、樹状細胞を0.01％SACで刺激した。18時間後に細胞から取り出した上清中のTNF-αおよびIL-12p70の濃度を決定した。
【図４】HuS-SAC（ヒト血清-SAC）で刺激したDCからの上清中のTNF-αの濃度を図示している。8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびhFc-Stubにより処理した。続いて、DCを0.01％PBS-SACまたは0.01％HuS-SACで刺激した。18時間後に培養物から取り出した上清中のTNF-αを測定した。
【図５】HuS-SAC（ヒト血清-SAC）で刺激したDCからの血清中のIL-23の濃度。8日齢のヒト単球由来DC（2×104個/96ウェル）を、IFN-γの存在下で、指定濃度のhCD47-FcおよびhFc-Stub（CD47部分を欠く）により処理した。続いて、DCを0.01％FBS（ウシ胎仔血清）-SACまたは0.01％HuS-SACで刺激した。18時間後に培養物から取り出した上清中のIL-23を測定した。
【図６】ヒトCD47細胞外ドメイン-Fcポリペプチド融合ポリペプチド（hCD47-Fc）が、ヒト樹状細胞におけるIgGを介したTNF-α産生を阻害したことを図示している。ヒト樹状細胞を、抗ヒトFcロバIgGを事前にコーティングした96ウェルプレート中でhCD47-FcもしくはhFc-Stubと組み合わせるか（右側：固定化hCD47-Fc）、またはヒト樹状細胞をロバIgGの非存在下でhCD47-FcもしくはhFc-Stubと組み合わせた（左側：可溶性hCD47-Fc）。樹状細胞を0.1ng/mlのFSL-1で刺激して、細胞上清中のTNF-αの存在を測定した。
【図７】ヒトCD47細胞外ドメイン-Hacポリペプチド（非免疫グロブリン）融合ポリペプチド（hCD47-Hac）が、ヒト樹状細胞におけるIgGを介したTNF-α産生を阻害したことを示している。ヒト樹状細胞を、マウスIgGを事前にコーティングした96ウェルプレート中でhCD47-Hacもしくは対照構築物（gluc-Hac：ガウシアルシフェラーゼ-Hac）と組み合わせるか（右側：50μg/mlマウスIgG）、またはヒト樹状細胞をマウスIgGの非存在下でhCD47-Hacもしくはgluc-Hacと組み合わせた（左側：マウスIgGなし）。樹状細胞を0.1ng/ml FSL-1で刺激し、細胞上清中のTNF-αの存在を測定した。
【図８】刺激されたマウス樹状細胞のサイトカイン産生に対するマウスCD47細胞外ドメイン-マウスFcポリペプチド融合タンパク質の影響を提示している。9日齢の骨髄由来DC（2×104個/ウェル）をIFN-γ（1000 U/ml）で一晩活性化した後に、細胞を指定濃度のmCD47-FcおよびmIgG2aにより1時間処理した。続いて、DCを0.01％ IgG2a-SACで刺激した。18時間後に細胞から取り出した上清中のTNF-αおよびIL-12のレベルを決定した。
【図９】コラーゲン抗体誘発性関節炎（CAIA）のマウスモデルにおけるmCD47-Fcの効果を提示している。PBS、mIgG（500μg）またはmCD47-mFc（500μg）を雄性DBA/1Jマウスに対して第0、2、4、6および8日に静脈内投与した。4mgのArthitoMAB（商標）抗体混合液を第0日に静脈内投与した。マウスに対して第6および13日に50μgのLPSの腹腔内追加投与を行った。個々のマウスに関する第8、13および18日の総合疾患スコアを示している。
【図１０】図10は、個々のマウスに関する第8、13および18日の総合疾患スコアを示している。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８７】
本発明の特定の態様を例示の目的で説明してきたが、前述のことからみて、さまざまな変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなしに加えることができる。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の態様の等価物を認識しうる、またはルーチン的な範囲にとどまる実験を用いて確認しうると考えられる。そのような等価物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
[請求項1001]
ヒトIgG1 Fcポリペプチドと融合したCD47の細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであって、Fcポリペプチドがヒンジ領域内にシステイン残基の置換または欠失を含み、置換または欠失を受けるシステイン残基が野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基であり、かつFcポリペプチドが、野生型ヒトIgG1免疫グロブリンのFc部分のヒンジ領域のアミノ末端の最も近位にあるシステイン残基にすぐ隣接したアスパラギン酸残基の置換または欠失をさらに含む、該融合ポリペプチドが免疫細胞の免疫応答性を変化させる、融合ポリペプチド。
[請求項1002]
SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも85%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1003]
SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1004]
SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1005]
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO:1の15、23および96位に対応する位置にあるシステイン残基が保たれている、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1006]
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列を含む、請求項1005記載の融合ポリペプチド。
[請求項1007]
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:11に示された配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、SEQ ID NO:11の33、41および114位に対応する位置にあるシステイン残基が保たれている、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1008]
ヒトCD47の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:11に示されたアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1009]
免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害することができる、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1010]
サイトカインIL-23の産生が阻害される、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1011]
IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択される少なくとも1つのサイトカインの産生が阻害される、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1012]
Fcポリペプチドが、グリコシル化部位を除去するための少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1013]
Fcポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項1012記載の融合ポリペプチド。
[請求項1014]
FcポリペプチドとCD47の細胞外ドメインとの間にポリペプチドスペーサーをさらに含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1015]
ポリペプチドスペーサーが、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンから独立に選択される5〜100個のアミノ酸残基を含む、請求項1014記載の融合ポリペプチド。
[請求項1016]
ポリペプチドスペーサーが5〜20個のアミノ酸残基を含む、請求項1015記載の融合ポリペプチド。
[請求項1017]
ポリペプチドスペーサーが(Gly4Ser)nを含み、式中、n=1〜12である、請求項1015記載の融合ポリペプチド。
[請求項1018]
融合ポリペプチドがIgG Fc受容体と結合する能力が低下するように、ヒトIgG1 Fcポリペプチドが、(a)FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも1つのアミノ酸;(b)FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも2つのアミノ酸残基、または(c)FcポリペプチドのCH2ドメイン内の少なくとも3つのアミノ酸残基の置換をさらに含む、請求項1001記載の融合ポリペプチド。
[請求項1019]
2つの融合ポリペプチド単量体の二量体を形成し、二量体が2つの各融合ポリペプチド単量体の各細胞外CD47ドメイン部分間にジスルフィド結合を含む、請求項1001〜1018のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
[請求項1020]
各細胞外ドメイン部分間のジスルフィド結合が各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基の間に形成され、各細胞外CD47ドメイン部分のシステイン残基がアミノ末端の最も近位にある、請求項1019記載の融合ポリペプチド。
[請求項1021]
CD47細胞外ドメイン変異体が、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される少なくとも1つのCD47リガンドと結合する能力を保っている、請求項1020記載の融合ポリペプチド。
[請求項1022]
(a)少なくとも1つのCD47リガンドと細胞の細胞表面に発現されるCD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害し、かつ(b)ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を競合的に阻害する、請求項1020記載の融合ポリペプチド。
[請求項1023]
少なくとも1つのCD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1022記載の融合ポリペプチド。
[請求項1024]
少なくとも1つのCD47リガンドとの結合によって、少なくとも1つのCD47リガンドと細胞CD47ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、請求項1023記載の融合ポリペプチド。
[請求項1025]
免疫細胞の免疫応答性を変化させることが、(a)細胞遊走を変化させること;(b)TNF-α、IL-12、IL-23、IFN-γ、GM-CSFおよびIL-6から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること;(c)樹状細胞の成熟を阻害すること;(d)ナイーブT細胞のTh1エフェクター細胞への発生を損なわせること;(e)SIRP-αを細胞表面に発現する免疫細胞の活性化を阻害すること;(f)ケモカインの産生を阻害すること;および(g)免疫細胞による炎症誘発性応答を抑制することのうち少なくとも1つを含む、請求項1020記載の融合ポリペプチド。
[請求項1026]
免疫細胞がSIRP-αを細胞表面に発現し、免疫細胞の免疫応答性を変化させることが、(a)免疫細胞における、TNF-α、IL-12およびIL-23から選択される少なくとも1つのサイトカインの産生を阻害すること;(b)免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害すること;および(c)少なくとも1つのケモカインMIP-1αの産生を阻害することのうち少なくとも1つを含む、請求項1001〜1020のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
[請求項1027]
免疫細胞が樹状細胞である、請求項1026記載の融合ポリペプチド。
[請求項1028]
融合ポリペプチドが組換え融合ポリペプチドである、請求項1020記載の融合ポリペプチド。
[請求項1029]
組換え融合ポリペプチドが、Fcポリペプチドとインフレームに融合したCD47の細胞外ドメインを含む、請求項1028記載の融合ポリペプチド。
[請求項1030]
請求項1029記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[請求項1031]
発現制御配列と機能的に連結された請求項1030記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現構築物。
[請求項1032]
請求項1031記載の組換え発現構築物によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[請求項1033]
真核細胞である、請求項1032記載の宿主細胞。
[請求項1034]
請求項1020記載の融合ポリペプチドと薬学的に適した担体とを含む組成物。
[請求項1035]
対象に対して請求項1034記載の組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
[請求項1036]
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を抑制する段階を含む、請求項1035記載の方法。
[請求項1037]
免疫細胞を請求項1020記載の融合ポリペプチドと、免疫細胞および融合ポリペプチドが相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む、免疫細胞を活性化する方法。
[請求項1038]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1037記載の方法。
[請求項1039]
CD47リガンドがSIRP-αである、請求項1038記載の方法。
[請求項1040]
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1037記載の方法。
[請求項1041]
Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階が、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1040記載の方法。
[請求項1042]
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1037記載の方法。
[請求項1043]
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項1037記載の方法。
[請求項1044]
免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する方法であって、免疫細胞を請求項1020記載の融合ポリペプチドと、免疫細胞における免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害するのに十分な条件下および時間で接触させる段階を含む、方法。
[請求項1045]
免疫細胞が細胞表面にCD47リガンドを発現する、請求項1036記載の方法。
[請求項1046]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1045記載の方法。
[請求項1047]
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項1044記載の方法。
[請求項1048]
免疫細胞が樹状細胞であり、CD47リガンドがSIRP-αである、請求項1044記載の方法。
[請求項1049]
IL-23、IL-12、IL-6およびTNF-αから選択される少なくとも1つのサイトカインの産生が阻害される、請求項1044記載の方法。
[請求項1050]
融合ポリペプチドが免疫複合体と免疫細胞との結合を阻害する、請求項1044記載の方法。
[請求項1051]
免疫学的疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して請求項1034記載の組成物を投与する段階を含む、方法。
[請求項1052]
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項1051記載の方法。
[請求項1053]
自己免疫性または炎症性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患、移植片対宿主病、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項1052記載の方法。
[請求項1054]
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項1053記載の方法。
[請求項1055]
免疫学的疾患または障害が、免疫複合体と免疫細胞との結合によって引き起こされるか、または増悪する、請求項1052記載の方法。
[請求項1056]
免疫細胞が樹状細胞である、請求項1055記載の方法。
[請求項1057]
請求項1020記載の融合ポリペプチドを生産するための製造方法。
[請求項1058]
(a)CD47と特異的に結合する、ならびに(b)CD47リガンドの(i)CD47との、および(ii)ウイルスCD47様ポリペプチドとの結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1059]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1058記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1060]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1059記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1061]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1058記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1062]
免疫細胞によるFcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害する、請求項1058記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1063]
Fcを介したサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害することが、免疫細胞による免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生またはケモカイン産生を阻害することを含む、請求項1062記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1064]
免疫細胞が樹状細胞であり、サイトカインがIL-12、IL-6、IL-23およびTNF-αから選択される、請求項1062または請求項1063のいずれか記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1065]
ケモカインがMIP-1αである、請求項1063記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1066]
抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項1058記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1067]
モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体およびハムスターモノクローナル抗体から選択される、請求項1066記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1068]
抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項1058記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[請求項1069]
請求項1058記載の抗体と特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、単離された抗体。
[請求項1070]
抗イディオタイプ抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項1069記載の抗体。
[請求項1071]
請求項1058または請求項1069のいずれか記載の抗体を発現する宿主細胞。
[請求項1072]
ハイブリドーマ細胞である、請求項1071記載の宿主細胞。
[請求項1073]
F(ab')2、Fab'、Fab、FdおよびFvから選択される、請求項1058または請求項1069のいずれか記載の抗原結合フラグメント。
[請求項1074]
ヒト、マウス、ニワトリまたはウサギ由来である、請求項1073記載の抗原結合フラグメント。
[請求項1075]
一本鎖Fv(scFv)である、請求項1058記載の抗原結合フラグメント。
[請求項1076]
CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドと少なくとも1つのCD47リガンドとの結合を阻害する作用物質。
[請求項1077]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1076記載の作用物質。
[請求項1078]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡CD47様ポリペプチドである、請求項1076記載の作用物質。
[請求項1079]
少なくとも1つのCD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1076記載の作用物質。
[請求項1080]
低分子;アプタマー;およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項1076記載の作用物質。
[請求項1081]
請求項1058〜1068のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学的に適した担体とを含む組成物。
[請求項1082]
請求項1076〜1080のいずれか一項記載の作用物質と薬学的に適した担体とを含む組成物。
[請求項1083]
以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定するための方法:
(a)(i)候補作用物質;(ii)ウイルスCD47様ポリペプチド;および(iii)CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階;
(b)候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階;
(c)(i)候補作用物質;(ii)CD47リガンド;および(iii)CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階;ならびに
(d)候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定し、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、CD47リガンドと免疫細胞との候補作用物質の存在下における結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階。
[請求項1084]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1083記載の方法。
[請求項1085]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示された配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1084記載の方法。
[請求項1086]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1083記載の方法。
[請求項1087]
対象に対して請求項1081記載の組成物を投与し、それによって対象の免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
[請求項1088]
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を抑制する段階を含む、請求項1087記載の方法。
[請求項1089]
対象に対して請求項1082記載の組成物を投与し、それによって対象における免疫応答を変化させる段階を含む、対象における免疫応答を変化させる方法。
[請求項1090]
免疫応答を変化させる段階が、免疫応答を強化する段階を含む、請求項1089記載の方法。
[請求項1091]
対象に対して請求項1081記載の組成物を投与する段階を含む、対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法。
[請求項1092]
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項1091記載の方法。
[請求項1093]
免疫学的疾患または障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、血管炎または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項1092記載の方法
[請求項1094]
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項1093記載の方法。
[請求項1095]
対象における免疫学的疾患または障害を治療するための方法であって、対象に対して、(a)薬学的に適した担体;および(i)CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または(ii)CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかを含む組成物を投与する段階を含む、方法。
[請求項1096]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1095記載の方法。
[請求項1097]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1096記載の方法。
[請求項1098]
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント;低分子;アプタマー;およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項1095〜1097のいずれか一項記載の方法。
[請求項1099]
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項1098記載の方法。
[請求項1100]
対象における細胞遊走、細胞増殖および細胞分化のうち少なくとも1つの変化と関連のある疾患または障害を治療する方法であって、対象に対して、薬学的に適した担体と、(a)CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質、または(b)CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を特異的に損なわせる作用物質のいずれかとを投与する段階を含む、方法。
[請求項1101]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1100記載の方法。
[請求項1102]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1101記載の方法。
[請求項1103]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1100記載の方法。
[請求項1104]
疾患または障害が、免疫学的疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、代謝性疾患もしくは障害、または増殖性疾患もしくは障害である、請求項1103記載の方法。
[請求項1105]
免疫学的疾患または障害が自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項1104記載の方法。
[請求項1106]
免疫学的疾患または障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、抗体介在性性の炎症性もしくは自己免疫性疾患もしくは障害、敗血症、糖尿病、乾癬、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、進行性全身性硬化症、強皮症、急性冠症候群、虚血再灌流、クローン病、子宮内膜症、糸球体腎炎、重症筋無力症、特発性肺線維症、喘息、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、血管炎、または炎症性自己免疫性筋炎である、請求項1105記載の方法。
[請求項1107]
脊椎関節症が、強直性脊椎炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患に伴う腸疾患性関節炎、乾癬性関節炎、孤発性急性前部ブドウ膜炎、未分化型脊椎関節症、ベーチェット症候群および若年性特発性関節炎から選択される、請求項1106記載の方法。
[請求項1108]
心血管疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、心内膜炎、高血圧または末梢性虚血性疾患である、請求項1104記載の方法。
[請求項1109]
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント;低分子;アプタマー;およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項1100記載の方法。
[請求項1110]
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項1100記載の方法。
[請求項1111]
免疫細胞を(a)CD47と特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとのの結合を損なわせる作用物質、または(b)CD47リガンドと特異的に結合して、ウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を損なわせる作用物質のいずれかと、免疫細胞および作用物質が相互作用するのを可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階であって、CD47リガンドが免疫細胞の細胞表面に存在し、その結果として免疫細胞を活性化する段階を含む、免疫細胞を活性化する方法。
[請求項1112]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1111記載の方法。
[請求項1113]
CD47リガンドがSIRP-αである、請求項1111記載の方法。
[請求項1114]
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1111記載の方法。
[請求項1115]
Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階が、免疫複合体により誘導されるサイトカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1114記載の方法。
[請求項1116]
免疫細胞を活性化する段階が、Fcを介したケモカイン産生を阻害する段階を含む、請求項1111記載の方法。
[請求項1117]
免疫細胞が樹状細胞、単球、顆粒球または骨髄幹細胞である、請求項1111記載の方法。
[請求項1118]
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント;低分子;アプタマー;およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項1111記載の方法。
[請求項1119]
CD47リガンドと特異的に結合する作用物質が、CD47リガンドに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントであり、リガンドがSIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンである、請求項1118記載の方法。
[請求項1120]
以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を抑制する作用物質を生産するための製造方法:
(a)以下の段階を含む、免疫細胞の免疫応答性を変化させる作用物質を同定する段階:
(I)(i)候補作用物質;(ii)ウイルスCD47様ポリペプチド;および(iii)CD47リガンドを、CD47リガンドとウイルスCD47様ポリペプチドとの相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階;および
(II)候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合のレベルの減少は、候補作用物質がウイルスCD47様ポリペプチドとCD47リガンドとの結合を阻害することを示す、段階;
(III)(i)候補作用物質;(ii)CD47リガンド;および(2)CD47を発現する免疫細胞を、CD47リガンドとCD47との相互作用を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる段階;および
(IV)候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを決定して、候補作用物質の非存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルを比較する段階であって、候補作用物質の存在下におけるCD47リガンドと免疫細胞との結合のレベルの減少は、候補作用物質が免疫細胞の免疫応答性を変化させることを示す、段階;ならびに
(b)段階(a)で同定された作用物質を生産する段階。
[請求項1121]
ウイルスCD47様ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1120記載の方法。
[請求項1122]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示されたアミノ酸配列を含む痘瘡ウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1121記載の方法。
[請求項1123]
CD47リガンドが、SIRP-α、SIRP-β2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンおよびα2β1インテグリンから選択される、請求項1120記載の方法。
[請求項1124]
作用物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント;低分子;アプタマー;およびペプチド-Fc融合ポリペプチドから選択される、請求項1120記載の方法。
[請求項1125]
作用物質が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1120記載の方法。
[請求項1126]
抗体またはその抗原結合フラグメントが、SIRP-α、SIRP-β-2、トロンボスポンジン-1、αvβ3インテグリンまたはα2β1インテグリンと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、請求項1125記載の方法。
[請求項1127]
請求項1058〜1068のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを生産するための製造方法。
[請求項1128]
Fcポリペプチドと融合したウイルスCD47ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、融合ポリペプチド。
[請求項1129]
ウイルスCD47ポリペプチドがポックスウイルスCD47様ポリペプチドである、請求項1128記載の融合ポリペプチド。
[請求項1130]
ポックスウイルスCD47様ポリペプチドが、粘液腫、オルソポックスウイルス、コルドポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス(suipoxvirus)、ヤタポックスウイルスおよびシカポックス(deerpox)ウイルスから選択される、請求項1129記載の融合ポリペプチド。
[請求項1131]
FcポリペプチドがヒトIgG1 Fcポリペプチドまたはその変異体である、請求項1128記載の融合ポリペプチド。