(57)【要約】  本開示は、ＡＬＫ５阻害剤を含む、抗体−薬物コンジュゲート、およびその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞表面分子に結合する抗体または抗原結合性断片に作動可能に連結されたＡＬＫ５阻害剤を含む、抗体−ＡＬＫ５阻害剤コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２】
前記ＡＬＫ５阻害剤のＩＣ５０が、少なくとも２０ｎＭである、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール系化合物、ピラゾール系化合物、またはチアゾール系化合物である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、またはチアゾール系化合物である、請求項３に記載のＡＤＣ。
【請求項５】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、非切断可能リンカーまたは切断可能リンカーを介して、前記抗体またが抗原結合性断片に連結されている、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項６】
Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート、マレイミドカプロイル、またはメルカプトアセトアミドカプロイルリンカーである非切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、請求項５に記載のＡＤＣ。
【請求項７】
ジペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーである切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、請求項５に記載のＡＤＣ。
【請求項８】
前記リンカーが、プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンジペプチドリンカー、グルタチオン感受性ジスルフィドリンカー、または酸感受性ジスルフィドリンカーである、請求項７に記載のＡＤＣ。
【請求項９】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のシステイン残基、または、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のリジン残基を介してコンジュゲートされ、任意で前記ＡＬＫ５阻害剤が、リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１０】
抗体または抗原結合性断片分子当たりのＡＬＫ５阻害剤分子の平均数が、２〜８の範囲である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化である、請求項１１に記載のＡＤＣ。
【請求項１３】
前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１４】
前記抗原結合性断片が、ヒトまたはヒト化抗体の抗原結合性断片である、請求項１３に記載のＡＤＣ。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１８４、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞表面分子が、エンドソームを通して再循環することが可能なＴ細胞表面分子である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５またはＣＤ７である、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
請求項１に記載のＡＤＣ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１に記載のＡＤＣを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記がんが、
（ａ）免疫原性がんであるか；
（ｂ）免疫性浸潤を含む、充実性腫瘍であるか；
（ｃ）免疫療法により処置可能である、充実性腫瘍であるか；または
（ｄ）ＡＬＫ５阻害剤により処置可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが、腫瘍抗原を発現する充実性腫瘍である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、免疫療法により処置可能であり、前記免疫療法が、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、またはＴ細胞チェックポイント阻害剤療法である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＤＣが、単独療法として、または併用療法レジメンの一部として投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．背景
サイトカインのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバーは、正常な組織の発達の間ならびに疾患状態の両方で、多種多様の生物学的プロセスを調節する、多機能性タンパク質である。ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、炎症、創傷治癒、細胞外マトリックスの蓄積、骨形成、組織の発達、細胞分化、心臓弁リモデリング、組織線維化、および腫瘍進行などに関与している。（Barnard et al., 1990, Biochim Biophys Acta. 1032:79-87、Sporn et al., 1992, J Cell Biol 119:1017-1021、Yingling et al., 2004, Nature Reviews, 3:1011-1022、Janssens et al., 2005, Endocr Rev., 26(6):743-74）。３つの哺乳動物イソ型が、これまでに同定されている：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３（Massague, 1990, Annu Rev Cell Biol 6:597-641）。トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーの他のメンバーとして、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質、増殖および分化因子、ならびにミュラー阻害物質が挙げられる。
【０００２】
ＴＧＦ−βΙは、２つの高度に保存された単一の膜貫通セリン／トレオニンキナーゼ受容体、Ｉ型（ＡＬＫ５）およびＩＩ型のＴＧＦ−β受容体を介して、シグナルを変換する。リガンド誘導性結合およびオリゴマー化が起こると、ＩＩ型受容体は、ＡＬＫ５のＧＳ領域において、セリン／トレオニン残基をリン酸化し、これにより、ＡＬＫ５の活性化、および新規のＳＭＡＤ導入部位の生成が生じる。ＳＭＡＤは、細胞外環境から細胞の核へのＴＧＦ−βのシグナルを変換するのに特化する、細胞内タンパク質である。活性化すると、ＡＬＫ５は、Ｃ末端ＳＳＸＳモチーフで、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３をリン酸化するので、受容体からのそれらの解離およびＳｍａｄ４との錯体の形成をもたらす。次いで、Ｓｍａｄ錯体は、核内に移動し、細胞特異的ＤＮＡ結合補因子と集合して、細胞の成長、分化、および発生を調節する遺伝子の発現を修飾する。
【０００３】
アクチビンは、ＴＧＦ−βと同様の方法で、シグナルを変換する。アクチビンは、セリン／トレオニンキナーゼ、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）と結合し、活性化したＩＩ型受容体は、ＡＬＫ４のＧＳ領域において、セリン／トレオニン残基を高リン酸化する（hyperphosphorylate）。活性化したＡＬＫ４は、順次、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３をリン酸化する。結果としてＳｍａｄ４とのヘテロＳｍａｄ複合体を形成することにより、アクチビンに誘導された遺伝子転写の調節が生ずる。
【０００４】
ＴＧＦ−βシグナル伝達は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、ＮＫ細胞、ならびに樹状細胞のような抗原提示細胞を含む、先天性および適応性免疫細胞の両方を調節することにより、免疫ホメオスタシスを維持するのに必須である。ＴＧＦ−βは、一般に、胸腺でのＴ細胞の発生、ならびに末梢性寛容を維持するのに必須の役割を担う、免疫抑制性サイトカインとみなされる。ＴＧＦ−βは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖、サイトカインの産生、細胞毒性、ならびにＴヘルパーサブセットへの分化を阻害する（Li et al., 2008, Cell 134:392-404）。ＴＧＦ−βはまた、胸腺で生じる天然の制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の発生、ならびに、炎症およびがんのような様々な疾患に応答して末梢で発生する誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）において重要な役割を担う（Tran et al., 2012, J Mol Cell Bio 4:29-37, 2012）。ｎＴｒｅｇは、典型的にはＣＤ２５＋  ＦｏｘＰ３＋であり、末梢性Ｔ細胞寛容を維持する助けとなるＴ細胞の活性化を積極的に抑制する、少ない割合のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットである。ＴＧＦ−βは、末梢におけるｎＴｒｅｇの生存および膨張に重要である（Marie et al., 2005, J Exp Med 201:1061-67）。適切な炎症性条件の下、ＴＧＦ−βは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＦｏｘＰ３＋  ｉＴｒｅｇに転換して、局所的な組織常在Ｔ細胞を抑制する。高レベルのｉＴｒｅｇは、多くの場合、腫瘍自身の中で、Ｔ細胞媒介性腫瘍クリアランスを防ぐことが見出されている（Whiteside, 2014, Expert Opin Biol Ther 14:1411-25）。
【０００５】
一般的に、高レベルのＴＧＦ−β発現は、臨床予後を不良にするのに関連している。多くの場合、腫瘍は、ＴＧＦ−β経路を組み入れ、それを利用してＴ細胞媒介性腫瘍クリアランスを避ける（Yang et al., Trends Immunol 31:220-7, 2010、Tu et al., Cytokine Growth Factor Rev 25:423-35, 2014）。これは、２通りで起こる。１つ目は、ＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、サイトカインの産生、ならびに腫瘍細胞死を直接的に阻害することである。２つ目は、ＴＧＦ−βが、ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの生存および／または転換にそれぞれ重要であり、これもまた、免疫媒介性腫瘍クリアランスを抑制する。多数の前臨床マウスモデルにおいて、ＴＧＦ−βの中和により、Ｔ細胞媒介性腫瘍クリアランスの増加に起因して腫瘍負荷が低下することが実証されている。重要なことに、優性ネガティブＴＧＦ−βＲＩＩの発現を介するか、または可溶性ＴＧＦ−β受容体を用いた、Ｔ細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果的な免疫媒介性腫瘍クリアランスを回復するのに十分である。Gorelik et al., 2001, Nat Med 7:1118-22、Thomas et al., 2005, Cancer Cell 8:369-80。
【０００６】
免疫系に対するその効果以外に、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、腫瘍発生において、重要であるが複雑な役割を担う。前臨床研究では、ＴＧＦ−βが、腫瘍自身に対する逆説的な効果、および周囲の間質細胞に対する交絡効果を有することが示されている。がん進行の初期段階では、ＴＧＦ−βは、細胞周期メディエーターの調節を介して、腫瘍の増殖および膨張を阻害する。しかし、後期段階では、ＴＧＦ−βは、その増殖阻害特性を喪失し、上皮−間葉移行（ＥＭＴ）の誘導を介して、ならびに、間質性線維芽細胞、血管形成、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）での影響を介して、腫瘍転移を促進する（Connolly et al., 2012, Int J Bio 8:964-78）。誤った段階で送達された場合、ＴＧＦ−βシグナル伝達の広域スペクトルの阻害には、腫瘍転移を促進する危険性、および／または、非腫瘍性間質細胞集団を阻害し、腫瘍進行を間接的に悪化させる危険性がある（Cui et al., 1996, Cell 86:531-、Siegel et al., 2003, PNAS 100:8430-35、Connolly et al., 2011, Cancer Res 71:2339-49、Achyut et al., 2013, PLOS Genetics 9:1-15）。ＴＧＦ−β阻害剤により、意図した増殖阻害効果の代わりに、腫瘍は、より侵襲的になり、転移性になる可能性がある。
【０００７】
腫瘍自身に対する逆説的な効果、およびＴＧＦ−β受容体の広範な発現にもかかわらず、がん治療としてのＴＧＦ−β経路の阻害は、長い間注目されている。阻害剤は、ＴＧＦ−β中和抗体、ＴＧＦ−β２アンチセンスＲＮＡ、および小分子ＡＴＰ競合ＡＬＫ５キナーゼ阻害剤を含む。開発されている古典的なＡＬＫ５阻害剤のいくつかは、ピラゾール系、イミダゾール系、およびトリアゾール系である（Bonafoux et al., 2009, Expert Opin Ther Patents 19:1759-69、Ling et al., 2011, Current Pharma Biotech 12:2190-2202）。多くのＡＬＫ５阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏマウス異種移植および同系腫瘍モデルの両方で試験されており、有意な効能が実証されている（Neuzillet et al., 2015, Pharm & Therapeutics 147:22-31）。しかし、ＴＧＦ−β受容体が偏在的に発現されるので、宿主毒性の問題、および腫瘍の増殖を意図せず促進する恐れから、ＴＧＦ−β阻害剤の多く、とりわけＡＬＫ５阻害剤は、前臨床の発見段階のままである。例えば、ラットにおける前臨床の毒性学研究において、２つの異なるシリーズのＡＬＫ５阻害剤では、出血、炎症、変性、および弁の間質細胞の増殖を特徴とする心臓弁の病変が認められた（Anderton et al., 2011, Tox Path 39:916-24）。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、心臓組織で観察されるもののような宿主組織の毒性を最小限にしながら、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害が治療的に有用である細胞種に対してＡＬＫ５阻害剤を標的とする必要性がある。
【０００９】
２．概要
標的とする宿主毒性を避け、ならびにＡＬＫ５阻害剤療法による腫瘍進行の意図しない悪化を防ぐために、発明者は、治療利益をもたらすこれら細胞にのみ化合物を指向させるための新規のアプローチを開発した。
【００１０】
がんの処置のために、本アプローチは、ＡＬＫ５阻害剤をＴ細胞区画に抗体を介して指向させて、Ｔ細胞媒介性腫瘍クリアランスを促進し、全身毒性をもたらすことなく長期的な緩解を確実に行うことを包含する。理論により拘束されるものではないが、Ｔ細胞内のＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害が、Ｔ細胞媒介性クリアランスを直接向上させるだけでなく、Ｔ細胞を誘導性Ｔｒｅｇに転換することを阻害し、腫瘍内の天然のＴｒｅｇの生存率を下げると考えられる。ゆえに、Ｔ細胞内のＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を回復させるだけでなく、Ｔ細胞でのＴｒｅｇ「ブレーキ」を除去して、免疫系を効果的に再連結させる。より重要なことには、Ｔ細胞内のみのＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害は、腫瘍の観点ならびに宿主組織の毒性の両方から、広域スペクトルのＴＧＦ−β阻害より安全である。
【００１１】
したがって、本開示は、薬物がＡＬＫ５阻害剤である、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。ＡＤＣの抗体成分は、Ｔ細胞表面分子に結合する抗体または抗原結合性断片であり得る。第４．２節は、本開示のＡＤＣで使用することができる、例示的な抗体成分を記載する。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、またはチアゾール系化合物である。例示的なＡＬＫ５阻害剤は、第４．３節、および表１〜３に記載される。
【００１２】
ＡＬＫ５阻害剤は、抗体成分と直接、コンジュゲートすることができるか、またはリンカーにより抗体成分に連結することができる。リンカーは、非切断可能リンカーであるか、または好ましくは、切断可能リンカーであり得る。例示的な非切断可能リンカーおよび切断可能リンカーは、第４．４節に記載されている。抗体または抗原結合性断片ごとに結合したＡＬＫ５阻害剤分子の平均数は、様々であり得、一般に、抗体または抗原結合性断片ごとに２から８個のＡＬＫ５阻害剤分子の範囲である。薬物搭載は、第４．５節に詳述されている。
【００１３】
本開示は、本開示のＡＤＣを含む、医薬組成物をさらに提供する。本開示のＡＤＣを含む、医薬組成物を製剤化するのに使用することができる、例示的な医薬添加剤は、第４．６節に記載されている。
【００１４】
本開示は、本開示のＡＤＣまたは本開示の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法をさらに提供する。本開示のＡＤＣおよび医薬組成物は、単独療法として、または併用療法の一部として投与することができる。本開示のＡＤＣおよび医薬組成物で処置することができる例示的ながん、ならびに例示的な併用療法は、第４．７節に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＧＦ−βの効果を示す。腫瘍進行の間、腫瘍およびＴ細胞自身の両方に由来し得るＴＧＦ−βは、サイトカイン産生、増殖、およびＴｈ分化のようなＣＤ４＋Ｔ細胞の機能を阻害する。同時に、ＴＧＦ−βはまた、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞中のグランザイムおよびパーフォリンの発現を阻害することにより、腫瘍死を阻害する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方を阻害することで、Ｔ細胞媒介性腫瘍クリアランスを完全に抑制する。
【図２】腫瘍進行の間のＴｒｅｇ細胞でのＴＧＦ−βの効果を示す。腫瘍進行の間、ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇ細胞は、典型的には、腫瘍の中に見出され、ｉｎ  ｓｉｔｕのＴ細胞媒介性機能を制御する。ＴＧＦ−βは、ｎＴｒｅｇ細胞生存率、およびｉＴｒｅｇ細胞の転換を促進して、Ｔ細胞媒介性腫瘍クリアランスを抑制する。腫瘍部位でのＴｒｅｇ細胞の増加により、腫瘍に浸潤するＴ細胞がまた腫瘍を取り除くことも防ぐことが確実となる。
【図３】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞での本開示のＡＤＣの作用機序を示す。ＴＧＦ−βシグナル伝達のＴ細胞標的化阻害は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性、およびＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性腫瘍死を回復する。
【図４】Ｔｒｅｇ細胞での本開示のＡＤＣの作用機序を示す。ＴＧＦ−βシグナル伝達のＴ細胞標的化阻害はまた、ｉｎ  ｓｉｔｕの免疫媒介性腫瘍クリアランスのＴｒｅｇ媒介性抑制を遮断する。
【図５Ａ−Ｂ】化合物Ａ〜Ｂによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴＧＦ−β誘導性ルシフェラーゼ活性の阻害を示す。図５Ａ：化合物Ａ、図５Ｂ：化合物Ｂ。
【図５Ｃ−Ｄ】化合物Ｃ〜Ｄによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴＧＦ−β誘導性ルシフェラーゼ活性の阻害を示す。図５Ｃ：化合物Ｃ、図５Ｄ：化合物Ｄ
【図６Ａ】化合物Ａ〜Ｄに対するＭＴＳ増殖アッセイデータを示す。化合物Ａ〜Ｃは、ＴＧＦ−β処置したＣＤＣ４＋Ｔ細胞における増殖を回復する。図６Ａ：化合物Ａ〜Ｄに対するデータ。図６Ａにおいて、「ＴＧＦ−βなし」の上の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、および「Ｄ」と標識したバーは、ＴＧＦ−βを含まずに１００ｎＭで化合物を使用して実施した実験の結果を示す。図６Ｂ：化合物Ｂに対するデータ、図６Ｃ：化合物Ｃに対するデータ。
【図６Ｂ−Ｃ】化合物Ａ〜Ｄに対するＭＴＳ増殖アッセイデータを示す。化合物Ａ〜Ｃは、ＴＧＦ−β処置したＣＤＣ４＋Ｔ細胞における増殖を回復する。図６Ｂ：化合物Ｂに対するデータ、図６Ｃ：化合物Ｃに対するデータ。
【図７】本開示の例示的なＡＤＣ（ＡＤＣ２）に対するＬＣ−ＭＳデータを示す。図７Ａ：ＡＤＣ重鎖に対するＬＣ−ＭＳデータ、図７Ｂ：ＡＤＣ軽鎖に対するＬＣ−ＭＳデータ。
【図８】ＳＥＣにより精製した、Ｓ−４ＦＢ／Ａｂ比を６で調製したＡＤＣ２のクロマトグラムである。精製したＡＤＣ２のＳＥＣ解析では、凝集が５％未満であることが示されている。
【図９Ａ−Ｂ】本開示の例示的な抗体（抗トランスフェリン受容体抗体Ｒ１７２１７）が、初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞で、抗体の標的であるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の内在化を誘導することを示す。図９Ａ：抗トランスフェリン受容体抗体を含まない対照、図９Ｂ：抗トランスフェリン受容体抗体での１５分のインキュベーション。
【図９Ｃ−Ｄ】本開示の例示的な抗体（抗トランスフェリン受容体抗体Ｒ１７２１７）が、初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞で、抗体の標的であるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の内在化を誘導することを示す。図９Ｃ：抗トランスフェリン受容体抗体での３０分のインキュベーション、図９Ｄ：抗トランスフェリン受容体抗体での６０分のインキュベーション。
【図９Ｅ−Ｆ】本開示の例示的な抗体（抗トランスフェリン受容体抗体Ｒ１７２１７）が、初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞で、抗体の標的であるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の内在化を誘導することを示す。図９Ｅ：抗トランスフェリン受容体抗体での１８０分のインキュベーション、図９Ｆ：３時間の時間経過にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図１０】本開示の例示的なＡＤＣ（ＡＤＣ１）による、マウスＣＴＬＬ２細胞での増殖のＴＧＦ−β媒介性阻害の逆転を示す。
【図１１】本開示の例示的なＡＤＣ（ＡＤＣ１）による、ＴＧＦ−βで活性化した初代ＣＤ８＋Ｔ細胞でのグランザイムＢ発現の抑制解除を示す。ＡＤＣ１は、遊離ＡＬＫ５阻害剤に匹敵してグランザイムＢ発現を部分的に回復する。
【図１２】本開示の例示的なＡＤＣ（ＡＤＣ１）が、１００ｍＭの遊離ＡＬＫ５阻害剤と同様に、ｉＴｒｅｇ生成を低下させることを示す。
【図１３Ａ−Ｂ】ＣＤ５（図１３Ａ）ならびにＣＤ２（図１３Ｂ）の、活性化した初代マウスＣＤ３＋Ｔ細胞への内在化を示す。
【図１３Ｃ−Ｄ】ＣＤ５（図１３Ｃ）ならびにＣＤ２（図１３Ｄ）の、活性化した初代マウスＣＤ３＋Ｔ細胞への内在化を示す。
【図１４】Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５の存在下で、活性化したマウスＣＤ３＋Ｔ細胞の３６時間のインキュベーションに続いて、グランザイム（ＧｚｍＢ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを示す。
【図１５】Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５の存在下で、活性化したマウスＣＤ３＋Ｔ細胞の３６時間のインキュベーションに続く、分泌したＩＬ２のレベルを示す。
【図１６】Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５の存在下で、活性化したマウスＣＤ３＋Ｔ細胞の３６時間のインキュベーションに続く、分泌したＩＦＮ−γのレベルを示す。
【図１７】Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５の存在下で、活性化したマウスＣＤ３＋Ｔ細胞の７２時間のインキュベーションに続く、Ｔ細胞増殖の量を示す。
【図１８】ＣＤ７の活性化した初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞への内在化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
４．詳細な説明
本開示は、がんを処置するのに有用な抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、直接的に、またはリンカーを通してＡＬＫ５阻害剤と共有結合した抗体成分を含む、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本開示のＡＤＣの概説は、第４．１節に表す。ＡＤＣの抗体成分は、完全な抗体またはその断片であり得る。本開示のＡＤＣで使用することができる抗体は、第４．２節に詳述されている。本開示のＡＤＣで使用することができるＡＬＫ５阻害剤は、第４．３節に詳述されている。本開示のＡＤＣは、典型的には、抗体とＡＬＫ５阻害剤の間にリンカーを含有する。本開示のＡＤＣで使用することができる例示的なリンカーは、第４．４節に詳述されている。本開示のＡＤＣは、抗体当たり様々な数のＡＬＫ５阻害剤部分を含有することができる。薬物搭載は、第４．５節に詳述されている。本開示は、本開示のＡＤＣを含む、医薬製剤をさらに提供する。ＡＤＣを含む医薬製剤は、第４．６節に記載されている。本開示は、本開示のＡＤＣを使用して様々ながんを処置する方法をさらに提供する。がんの処置のために単独療法として、または併用療法の一部として本開示のＡＤＣを使用する方法は、第４．７節に記載されている。
【００１７】
４．１．抗体薬物コンジュゲート
本開示のＡＤＣは、一般に、共有結合が抗体の標的への結合に干渉しないように、典型的にはリンカーを介して、抗体と共有結合したＡＬＫ５阻害剤で構成される。
【００１８】
薬物を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該技術分野に周知されている（例えば、Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53（Robinson et al., eds., 1987）、Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58、Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123、およびZhou, 2017, Biomedicines 5(4):E64を参照）。ＡＬＫ５阻害剤は、好ましくは、部位に特異的なコンジュゲーションを介して、本開示のＡＤＣ中の抗体成分と結合する。例えば、ＡＬＫ５阻害剤は、１つもしくは複数の天然もしくは操作されたシステイン、リジン、もしくはグルタミン残基、１つもしくは複数の非天然アミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、もしくはセレノシステイン（Ｓｅｃ））、１つもしくは複数のグリカン（例えば、フコース、６−チオフコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、もしくはシアル酸（ＳＡ））、または、４〜６個のアミノ酸の１つもしくは複数の短いペプチドタグを介して、抗体成分とコンジュゲートすることができる。例えば、Zhou, 2017, Biomedicines 5(4):E64を参照し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
一例において、抗体またはその断片は、別のタンパク質（またはその部分、例えば、タンパク質の少なくとも１０個、２０個、または５０個のアミノ酸部分）のアミノ酸配列に対して、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して、抗体のＮ末端もしくはＣ末端を通して、または内部で、融合させる。抗体、またはその断片は、他のタンパク質と、抗体の定常ドメインのＮ末端で連結することができる。組換えＤＮＡ手順は、このような融合体を作製するのに使用することができ、例えば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット、および欧州特許出願公開第０３９２７４５号明細書に記載されている。別の例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる、および／または、上皮性関門を通過した、免疫系への抗体の送達を向上することができる。この種の好適なエフェクター分子の例として、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、またはアルブミン結合化合物が挙げられ、例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／１１７９８４号パンフレットに記載されているものである。
【００２０】
代謝プロセスまたは代謝反応は、酵素プロセス、例えばＡＤＣのペプチドリンカーのタンパク分解性切断、または、官能基、例えばヒドラゾン、エステル、もしくはアミドの加水分解であり得る。細胞内代謝物として、限定されないが、細胞への侵入、拡散、取込み、または輸送の後に、細胞内切断される、抗体および遊離薬物が挙げられる。
【００２１】
用語「細胞内で切断される」および「細胞内切断」とは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞内での代謝プロセスまたは代謝反応を指し、これにより、薬物部分（Ｄ）と抗体（Ａｂ）との間の共有結合、すなわちリンカーが破壊され、その結果、細胞内に抗体から解離した遊離薬物をもたらす。ゆえに、ＡＤＣの切断した部分は、細胞内代謝物である。
【００２２】
４．２．抗体成分
本開示は、抗体成分がＴ細胞表面分子に結合する、抗体薬物コンジュゲートを提供する。別段指示されない限り、用語「抗体」（Ａｂ）とは、特定の抗原と特異的に結合するか、または免疫学的に反応する、免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作した抗体、および他の修飾した形態の抗体が挙げられ、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体（bispecific antibody）、二重特異性抗体（diabody）、三重特異性抗体、および四重特異性抗体）、ならびに、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、およびｓｃＦｖ断片を含む抗体の抗原結合断片が挙げられる。さらに、別段指示されない限り、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、タンパク質に特異的に結合することが可能である、完全な分子、ならびに抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）の両方を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、完全な抗体のＦｃ断片が欠如しており、動物または植物の循環からより迅速に取り除かれ、完全な抗体より少ない非特異的組織結合を有し得る（Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316）。
【００２３】
用語「ｓｃＦｖ」とは、従来の抗体由来の重鎖および軽鎖の可変ドメインを結合して１本の鎖を形成する、一本鎖Ｆｖ抗体を指す。
【００２４】
「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する、糖タンパク質である。抗体が、特異的な標的に対する結合特異性を呈するのに対し、免疫グロブリンは、抗体、および標的特異性が欠如している、他の抗体様分子の両方を含む。天然の抗体および免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各重鎖は、アミノ末端で、可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、アミノ末端での可変ドメイン（ＶＬ）と、カルボキシ末端での定常ドメインを有する。
【００２５】
細胞内のＡＬＫ５阻害剤の最適な送達のために、抗体は、好ましくは、内在化する。内在化抗体は、細胞表面でそれらの標的分子に結合した後、結合の結果として、細胞により内在化される。この効果は、ＡＤＣが細胞により取り込まれることである。抗原に結合した後、抗体の内在化の決定を可能にするプロセスは、当業者に知られており、例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０７０５３８号パンフレットの８０頁、および以下の第５．１１節に記載されている。内在化されると、例えば第４．４節に記載されるように、切断可能リンカーを使用してＡＬＫ５阻害剤が抗体に結合する場合、ＡＬＫ５阻害剤は、リソソームでの切断により、または他の細胞機構により、抗体から放出することができる。
【００２６】
用語「抗体断片」とは、全長抗体の部分、一般に標的結合または可変領域を指す。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片が挙げられる。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識および結合部位を含有する、最小限の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変ドメインの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。この構造中で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。多くの場合、６つのＣＤＲは、抗体に対する標的結合特異性を与える。しかし、いくつかの例において、単一の可変ドメイン（または、標的に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）は、標的を認識し、結合する能力を有することができる。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、１本のポリペプチド鎖において、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが標的結合に対する所望の構造を形成することが可能である、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。「単一ドメイン抗体」は、ＴＮＦ−αに対する十分な親和性を呈する、単一のＶＨまたはＶＬドメインで構成される。具体的な実施形態において、単一ドメイン抗体は、ラクダ抗体である（例えば、Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38を参照）。
【００２７】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で、いくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片と相違する。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断により産生される。抗体断片のさらなる化学結合は、当業者に知られている。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それを産生する方法は含まない。本開示と関連して有用であるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む、当該技術分野に公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。本開示の抗体として、キメラ、霊長類化（primatized）、ヒト化、またはヒト抗体が挙げられる。
【００２９】
本開示の抗体は、キメラ抗体であり得る。本明細書で使用される用語「キメラ」抗体とは、ラットまたはマウス抗体のような非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、および、ヒト免疫グロブリンテンプレートから典型的には選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野に知られている。例えば、Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7、Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221、Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202、米国特許第５，８０７，７１５号明細書、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、および米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本開示の抗体は、ヒト化され得る。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の標的結合サブドメイン）である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでＣＤＲ領域の全て、または実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て、または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン共通配列のものを含むことができる。抗体のヒト化の方法は、当該技術分野に知られている。例えば、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7、Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第６，１８０，３７０号明細書、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、ＰＣＴ公開の国際公開第９１／０９９６７号パンフレット、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、欧州特許出願公開第５９２１０６号明細書、欧州特許出願公開第５１９５９６号明細書、Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-49８、Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照し、その全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本開示の抗体は、ヒト抗体であり得る。完全「ヒト」抗体は、ヒトの患者の治療的な処置に対して望ましくあり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、または１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から分離され、内在性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ方法を含む、当該技術分野に公知の様々な方法により作製することができる。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および米国特許第４，７１６，１１１号明細書、ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、国際公開第９１／１０７４１パンフレットを参照し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒト抗体はまた、機能性内因性免疫グロブリンを発現することは不可能であるが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる、トランスジェニックマウスを使用して産生することができる。例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、米国特許第５，４１３，９２３号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８８５，７９３号明細書、米国特許第５，９１６，７７１号明細書、および米国特許第５，９３９，５９８号明細書を参照し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎ．Ｙ．）のような企業に、上述と同様の技術を使用して選択した抗原に対して指向させたヒト抗体を提供させることができる。選択したエピトープを認識する、完全ヒト抗体は、「誘導選択（guided selection）」と称する技術を使用して生成することができる。このアプローチにおいて、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903）。
【００３２】
本開示の抗体は、霊長類化され得る。用語「霊長類化抗体」とは、サル可変領域およびヒト定常領域を含む、抗体を指す。霊長類化抗体を産生するための方法は、当該技術分野に知られている。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号明細書、米国特許第５，６８１，７２２号明細書、および米国特許第５，６９３，７８０号明細書を参照し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本開示の抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、限定はしないが、誘導体化抗体は、典型的には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結（抗体コンジュゲートの考察については第４．１節を参照）などにより修飾される。数多くの化学的な修飾のいずれかは、限定されないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、公知の技術により行うことができる。加えて、誘導体は、例えばａｍｂｒｘ技術を使用して、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含有することができる（例えば、Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2を参照）。
【００３４】
本開示のさらに別の実施形態において、抗体またはその断片は、相当する野生型配列に対して少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクターの機能を改変するためにその配列を修飾した、抗体または抗体断片であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体を修飾して、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクターの機能を低下させることができ、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）またはＣ１ｑに対する結合を低下させることができる。ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合は、ＦｃγＲまたはＣ１ｑ相互作用に必要な特定の領域で、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることにより低下し得る（例えば、Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491、Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662、Lo. et al., 2017, J Biol Chem 292: 3900-08、Wang et al., 2018, Protein Cell 9:63-73を参照）。
【００３５】
抗体のＦｃγＲ結合能の低下はまた、ＦｃγＲ相互作用に依存している別のエフェクター機能、例えばオプソニン作用、食作用および抗体依存性細胞毒性（「ＡＤＣＣ」）も低減する場合があるが、Ｃ１ｑ結合の低下は、補体依存性細胞毒性（「ＣＤＣＣ」）を低減し得る。ゆえに、エフェクター機能の低下または排除により、本開示のＡＤＣにより標的化されるＴ細胞が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して破壊されることを防ぎ得る。したがって、いくつかの実施形態において、抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ部分の選択的突然変異により修飾され、その結果、抗原特異性および内在化能力を維持するが、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能は排除する。
【００３６】
ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合を低下させる数多くの突然変異が、当該技術分野で記載されており、このような突然変異は、本開示のＡＤＣに含まれ得る。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書では、位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、または４３９での単一位置のＦｃ領域アミノ酸修飾により、ＦｃγＲＩＩへの結合およびＦｃγＲＩＩが低下する結果となることが開示されている。米国特許第９，７９０，２６８号明細書では、アミノ酸位置２９８でのアスパラギン残基、およびアミノ酸位置３００でのセリンまたはトレオニン残基が、ＦｃγＲ結合を低下させることが開示されている。ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／１９０４４１号パンフレットでは、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ：Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋ突然変異を有するＦｃγＲ結合が低下した、修飾したＦｃドメインが記載されており、ここで、セミコロンに先行する突然変異の一式は、第一のＦｃポリペプチド中にあり、セミコロンに続く突然変異は、Ｆｃ二量体の第二のＦｃポリペプチド中にある。ＦｃγＲ受容体結合ならびにＣ１ｑ結合を低減することができる突然変異として、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、およびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ａが挙げられる（Lo. et al., 2017, J Biol Chem 292: 3900-08、Wang et al., 2018, Protein Cell 9:63-73）。
【００３７】
エフェクター機能を低下させるために定常領域を変異させる、例えば上述のＦｃドメインを変異させるのに代えて、エフェクター機能は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片）を利用することにより排除することができる。
【００３８】
本開示の他の実施形態において、抗体またはその断片を修飾して、非修飾抗体に対して少なくとも１つの定常領域媒介性の生物学的エフェクターの機能を獲得または改善することができ、例えば、ＦｃγＲ相互作用を向上させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号明細書を参照）。例えば、本開示の抗体は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＡを、相当する野生型定常領域より高い親和性で結合する、定常領域を有することができる。
【００３９】
ゆえに、本開示の抗体は、オプソニン作用、食作用またはＡＤＣＣの低減をもたらす生物活性の変化を有し得る。このような変化は、当該技術分野に知られている。例えば、ＡＤＣＣ活性を低減する抗体における修飾は、米国特許第５，８３４，５９７号明細書に記載されている。
【００４０】
さらに別の態様において、抗体またはその断片は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることにより、修飾して、胎児性Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するその結合親和性を高めるか、または低減する抗体またはその断片であり得る（例えば、国際公開第２００５／１２３７８０号パンフレットを参照）。このような突然変異は、ＦｃＲｎへの抗体の結合を高めることができ、抗体を分解から保護し、その半減期を延長させる。
【００４１】
さらに他の態様において、抗体は、例えば、Jung and Pluckthun, 1997, Protein Engineering 10(9):959-966、Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9、および米国特許出願公開第２００７／０２８０９３１号明細書に記載される通り、その超可変領域の１つまたは複数に挿入された、１つまたは複数のアミノ酸を有する。
【００４２】
抗体の標的は、ＡＤＣの所望の治療用途に依存する。典型的には、標的は、ＡＬＫ５阻害剤を送達するのに望ましい細胞、例えばＴ細胞の表面に存在する分子であり、抗体は、好ましくは、標的に結合すると内在化される。内在化抗体は、例えば、Franke et al., 2000, Cancer Biother. Radiopharm. 15:459 76、Murray, 2000, Semin. Oncol. 27:64 70、Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998に記載されている。
【００４３】
ＡＤＣがＴＧＦ−β活性を低減することにより免疫系を刺激することが意図される用途について、Ｔ細胞表面分子に結合する抗体を生成することが望ましい。理論に制約されることなく、Ｔ細胞へのＡＬＫ５阻害剤の送達が、とりわけ、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を活性化し、制御性Ｔ細胞活性を阻害することができ、その両方が、腫瘍の免疫寛容に寄与すると考えられる。したがって、本開示のＡＤＣでのＴ細胞表面分子に結合する抗体の使用は、例えば、以下の第４．７節に記載される様々ながんの処置に有用である。様々な実施形態において、抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＲＥＧ細胞、または前述の任意の組合せに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、汎Ｔ細胞表面分子に結合する。標的化するのに好適なＴ細胞表面分子の例として、限定されないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１８４、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１が挙げられる。Ｔ細胞表面分子に結合し、内在化すると考えられている抗体の例として、ＯＫＴ６（抗ＣＤ１、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８０２０）、ＯＫＴ１１（抗ＣＤ２、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８０２７）、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８００１）、ＯＫＴ４（抗ＣＤ４、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８００２）、ＯＫＴ８（抗ＣＤ８、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８０１４）、７Ｄ４（抗ＣＤ２５、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６９８）、ＯＫＴ９（抗ＣＤ７１、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８０２１）、ＣＤ２８．２（抗ＣＤ２８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５６６２０）、ＵＣＨＴ１（抗ＣＤ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ番号ＢＥ０２３１）、Ｍ２９０（抗ＣＤ１０３、ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ番号ＢＥ００２６）、およびＦＲ７０（抗ＣＤ７０、ＢｉｏＸＣｅｌｌカタログ番号ＢＥ００２２）が挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、標的化したＴ細胞表面分子は、エンドソームを通して、内在化の後に細胞表面へと再循環することが可能なＴ細胞表面分子である（Goldenring, 2015 Curr. Opin. Cell Biol., 35:117-22を参照）。エンドソームを介して再循環することが可能であると考えられている例示的なＴ細胞表面分子として、ＣＤ５およびＣＤ７が挙げられる。理論に制約されることなく、エンドソームを通して再循環することができるＴ細胞表面分子を標的化することは、ＡＬＫ５がまたエンドソームを通して再循環することができることから、ＡＬＫ５阻害剤のＡＬＫ５への送達を促進することができると考えられる。ゆえに、エンドソームを通して再循環することができるＴ細胞表面分子を標的化することは、ＡＬＫ５阻害剤をＡＬＫ５に近接させる助けとなり得る。
【００４５】
４．３．ＡＬＫ５阻害剤
本開示のＡＬＫ５阻害剤は、好ましくは、競合的、可逆的に、ＡＬＫ５受容体の細胞質キナーゼドメインでＡＴＰ結合部位と結合し、下流のＲ−Ｓｍａｄリン酸化を防ぐ、小分子である。
【００４６】
ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５対他のＴＧＦ−βファミリー受容体、例えば、ＡＬＫ４および／もしくはＡＬＫ７ならびに／またはＴＧＦ−β受容体ＩＩに対して、特異的または選択的であり得るが、必ずしもその必要はない。いくつかの実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５およびＴＧＦ−β受容体ＩＩの両方に対して活性を有する。ＡＬＫ５阻害剤が、ＢＭＰ  ＩＩ受容体に対する限定的な阻害活性を有するのが好ましい一方、これは、本開示のＡＤＣはＢＭＰ  ＩＩ活性が最小限であるか、またはないＴ細胞に標的化されることから必要ではない。
【００４７】
少なくとも３名の対象、少なくとも５名の対象、または少なくとも１０名の対象由来のＴ細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで測定される場合、本開示のＡＬＫ５阻害剤のＩＣ５０は、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下、最も好ましくは２０ｎＭ以下である。例示的な細胞アッセイは、以下の第５．６節で説明する。ＡＤＣが、マウスＴ細胞表面分子ではなくヒトを標的とする場合、マウス細胞の代わりにヒト細胞、ならびにマウスＣＤ２８およびＣＤ３の代わりにヒトを認識する抗体を使用することができる。
【００４８】
本開示の抗体−薬物コンジュゲートでの使用に好適なＡＬＫ５阻害剤の具体例として、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、およびチアゾール系化合物が挙げられる。
【００４９】
本開示の一態様にしたがって、イミダゾール−ベンゾジオキソール系ＡＬＫ５阻害剤は、下記の式を有する。
【００５０】
【化１】
2022500486.tif 000003
【００５１】
式中、Ｒ１は、水素、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ２は、水素、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ３は、アミド、ニトリル、１〜約３個の炭素原子を有するアルキニル、カルボキシル、または１〜約５個の炭素原子を有するアルカノールであり、Ａは、直接結合、または１〜約５個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｂは、直接結合、または１〜約５個の炭素原子を有するアルキルである。本開示の別個の好ましい実施形態において、Ｒ２は、水素またはメチルであり、Ａは、１個の炭素原子を有し、Ｂは、ベンジル基への直接結合であり、Ｒ３は、アミドである。本開示の組み合わせた好ましい実施形態において、Ｒ２は、水素またはメチルであり、Ａは、１個の炭素原子を有し、Ｂは、ベンジル基への直接結合である。
【００５２】
本開示の別の態様にしたがって、イミダゾール−キノキサリン系ＡＬＫ５阻害剤は、下記の式を有する。
【００５３】
【化２】
2022500486.tif 000004
【００５４】
式中、Ｒ１は、水素、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ２は、水素、ハロゲン、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ３は、アミド、ニトリル、１〜約３個の炭素原子を有するアルキニル、カルボキシル、または１〜約５個の炭素原子を有するアルカノールであり、Ａは、直接結合、または１〜約５個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｂは、直接結合、または１〜約５個の炭素原子を有するアルキルである。本開示の別個の好ましい実施形態において、Ｒ２は、水素またはメチルであり、ハロゲンは、フッ素または塩素を含み、Ａは、１個の炭素原子を有し、Ｂは、ベンジル基への直接結合であり、Ｒ３は、アミドである。本開示の組み合わせた好ましい実施形態において、Ｒ２は、水素またはメチルであり、Ａは、１個の炭素原子を有し、Ｂは、ベンジル基への直接結合である。
【００５５】
本開示の別の態様にしたがって、ピラゾール系ＡＬＫ５阻害剤は、下記の式を有する。
【００５６】
【化３】
2022500486.tif 000005
【００５７】
式中、Ｒ２は、水素、ハロゲン、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ４は、水素、ハロゲン、１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキル、１〜約５個の炭素原子を有するアルコキシ、ハロアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキルエステル、ニトリル、アルキルアミン、または下記の式を有する基である。
【００５８】
【化４】
2022500486.tif 000006
【００５９】
式中、Ｒ５は、１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキル、ハロゲン、またはモルホリノであり、Ｒ６は、ピロール、シクロヘキシル、モルホリノ、ピラゾール、ピラン、イミダゾール、オキサン、ピロリジニル、またはアルキルアミンであり、Ａは、直接結合、または１〜約５個の炭素原子を有するアルキルである。
【００６０】
本開示の別の態様にしたがって、ピラゾール−ピロロ系ＡＬＫ５阻害剤は、下記の式を有する。
【００６１】
【化５】
2022500486.tif 000007
【００６２】
式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキル、アルカノール、モルホリノ、またはアルキルアミンであり、Ｒ２は、水素、ハロゲン、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ８は、水素、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、または下記の式を有する基である。
【００６３】
【化６】
2022500486.tif 000008
【００６４】
式中、Ｒ５は、ピペラジニルであり、Ｒ６は、モルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル、アルコキシ、ヒドロキシル、オキサン、ハロゲン、チオアルキル、またはアルキルアミンであり、Ａは、１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルである。
【００６５】
本開示の別の態様にしたがって、チアゾール系ＡＬＫ５阻害剤は、下記の式を有する。
【００６６】
【化７】
2022500486.tif 000009
【００６７】
式中、Ｒ９は、水素、ハロゲン、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルであり、Ｒ１０は、水素、または１〜約５個の炭素原子を有する低級アルキルである。
【００６８】
ある特定の実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、以下の表１でＡ〜Ｎと指定された化合物のいずれかから選択される。
【００６９】
【表１−１】
2022500486.tif 000010
【００７０】
【表１−２】
2022500486.tif 000011
【００７１】
【表１−３】
2022500486.tif 000012
【００７２】
さらに具体的な実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、以下の表２で１〜２８３と指定された化合物のいずれかから選択される。
【００７３】
【表２−１】
2022500486.tif 000013
【００７４】
【表２−２】
2022500486.tif 000014
【００７５】
【表２−３】
2022500486.tif 000015
【００７６】
【表２−４】
2022500486.tif 000016
【００７７】
【表２−５】
2022500486.tif 000017
【００７８】
【表２−６】
2022500486.tif 000018
【００７９】
【表２−７】
2022500486.tif 000019
【００８０】
【表２−８】
2022500486.tif 000020
【００８１】
【表２−９】
2022500486.tif 000021
【００８２】
【表２−１０】
2022500486.tif 000022
【００８３】
【表２−１１】
2022500486.tif 000023
【００８４】
【表２−１２】
2022500486.tif 000024
【００８５】
【表２−１３】
2022500486.tif 000025
【００８６】
【表２−１４】
2022500486.tif 000026
【００８７】
【表２−１５】
2022500486.tif 000027
【００８８】
【表２−１６】
2022500486.tif 000028
【００８９】
【表２−１７】
2022500486.tif 000029
【００９０】
【表２−１８】
2022500486.tif 000030
【００９１】
ＡＬＫ５阻害剤の調製および使用は、科学文献および特許文献において、周知であり、十分に実証されている。ＰＣＴ公開の国際公開第２０００／６１５７６号パンフレット、および米国特許出願公開第２００３／０１４９２７７号明細書では、トリアリールイミダゾール誘導体、およびＡＬＫ５阻害剤としてのその使用が開示されている。ＰＣＴ公開の国際公開第２００１／６２７５６パンフレットでは、ピリジニルイミダゾール誘導体、およびＡＬＫ５阻害剤としてのその使用が開示されている。ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０５５０７７パンフレットでは、ＡＬＫ５阻害剤としてのイミダゾリル環状アセタール誘導体の使用が開示されている。ＰＣＴ公開の国際公開第２００３／０８７３０４パンフレットでは、トリ置換ヘテロアリール、ならびにＡＬＫ５および／またはＡＬＫ４阻害剤としてのその使用が開示されている。国際公開第２００５／１０３０２８号パンフレット、米国特許出願公開第２００８／０３１９０１２号明細書、および米国特許第７，４０７，９５８号明細書では、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ４阻害剤としての２−ピリジル置換イミダゾールが開示されている。代表的な化合物の１つ、ＩＮ−１１３０は、いくつかの動物モデルにおいて、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ４阻害剤活性を示す。以下の特許および特許公開は、ＡＬＫ５阻害剤の追加例を提供し、例示的な合成スキーム、およびＡＬＫ５阻害剤を使用する方法を提供する：米国特許第６，４６５，４９３号明細書、米国特許第６，９０６，０８９号明細書、米国特許第７，３６５，０６６号明細書、米国特許第７，０８７，６２６号明細書、米国特許第７，３６８，４４５号明細書、米国特許第７，２６５，２２５号明細書、米国特許第７，４０５，２９９号明細書、米国特許第７，４０７，９５８号明細書、米国特許第７，５１１，０５６号明細書、米国特許第７，６１２，０９４号明細書、米国特許第７，６９１，８６５号明細書、米国特許第７，８６３，２８８号明細書、米国特許第８，４１０，１４６号明細書、米国特許第８，４１０，１４６号明細書、米国特許第８，４２０，６８５号明細書、米国特許第８，５１３，２２２号明細書、米国特許第８，６１４，２２６号明細書、米国特許第８，７９１，１１３号明細書、米国特許第８，８１５，８９３号明細書、米国特許第８，８４６，９３１号明細書、米国特許第８，９１２，２１６号明細書、米国特許第８，９８７，３０１号明細書、米国特許第９，０５１，３０７号明細書、米国特許第９，０５１，３１８号明細書、米国特許第９，０７３，９１８号明細書、ならびにＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０６５３９２号パンフレット、国際公開第２００９／０５０１８３号パンフレット、国際公開第２００９／１３３０７０号パンフレット、国際公開第２０１１／１４６２８７号パンフレット、および国際公開第２０１３／００９１４０号パンフレット。前述の特許および特許公開は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００９２】
いくつかのＡＬＫ５阻害剤は、市販されており、ＳＢ−５２５３３４（ＣＡＳ  ３５６５５９−２０−１）、ＳＢ−５０５１２４（ＣＡＳ  ６９４４３３−５９−５）、ＳＢ−４３１５４２（ＣＡＳ  ３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−２０２４７４（ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＬＹ−３６４９４７（ＣＡＳ  ３９６１２９−５３−６）、ＩＮ−１１３０、ＧＷ−７８８３８８、およびＤ４４７６（ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。
【００９３】
本明細書に記載されるＡＬＫ５阻害剤の構造および名称は、抗体および／またはリンカーへの結合前の分子を指す。
【００９４】
好ましいＡＬＫ５阻害剤は、遊離ＮＨまたはＮＨ２基、好ましくはアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリール基に結合するＮＨもしくはＮＨ２基、またはアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリール基のＮＨもしくはＮＨ２基部分を介して、リンカーに結合することができるものである（例えば、表２に示される化合物１〜２３、２６−２９、３１、３５、３７、３９、４０、４２、４３、４５〜４８、５０〜８５、８７〜９０、９３、９６、９８〜１０４、１０６、１０８、１０９、１１１、１１２、１１４、１１６〜１２０、１３２、１４６、１４９、１５６、１８４、１８７、１９３、２１８、２６０−２７７、２８２、および２８３）。ＡＬＫ５阻害剤を誘導体化して、遊離ＮＨまたはＮＨ２基を添加することができる。誘導体化したＡＬＫ５阻害剤の設計は、好ましくは、活性は経験的に決定することもできるが、ＮＨまたはＮＨ２基を加える場合に阻害剤活性を無効にする可能性を減らすために、阻害剤の構造活性相関（ＳＡＲ）を考慮に入れるべきである。表１に示されるいくつかの化合物の例示的な誘導体化した対応物質は、以下の表３に示される。
【００９５】
【表３】
2022500486.tif 000031
【００９６】
４．４．リンカー
典型的には、ＡＤＣは、ＡＬＫ５阻害剤と抗体との間のリンカーを含む。リンカーは、共有結合を含む部分、または抗体を薬物部分に共有結合する原子の鎖である。様々な実施形態において、リンカーとして、アルキルジイル、アリールジイル、ヘテロアリールジイルのような二価基、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−、アルキルオキシ（例えばポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（例えばポリエチレンアミノ、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標））の繰返し単位のような部分、ならびにコハク酸塩、スクシンアミド、ジグリコール酸塩、マロン酸塩、およびカプロアミドを含む二酸エステルおよびアミドが挙げられる。
【００９７】
リンカーは、ストレッチャーおよびスペーサー部分のような１つまたは複数のリンカー成分を含み得る。例えば、ペプチジルリンカーは、２つ以上のアミノ酸、ならびに、任意で１つまたは複数のストレッチャーおよび／またはスペーサー部分のペプチジル成分を含むことができる。様々なリンカー成分は、当該技術分野に知られており、そのいくつかは、以下に記載する。
【００９８】
リンカーは、細胞内の薬物の放出を促進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー（例としてヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例としてペプチターゼ感受性）リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., 1992, Cancer Research 52:127-131、米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を、使用することができる。
【００９９】
当該技術分野に公知のリンカーおよびリンカー成分の例として、アレイミドカプロイル（ｍｃ）；マレイミドカプロイル−ｐ−アミノベンジルカルバメート；マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメートリンカー、例えば、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン−ｐ−アミノベンジルカルバメート、およびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエートまたはＳＰＰとしても知られる）；４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−２−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）；２−イミノチオラン；Ｓ−アセチル無水コハク酸；ジスルフィドベンジルカルバメート；カルボネート；ヒドラゾンリンカー；Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル；Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＭＡＳ）；Ｎ［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド（ＳＰＤＰ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート−）（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＥＧＳ）；ジスクシンイミジルタル���レート（ＤＳＴ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；チオ尿素リンカー；およびオキシム含有リンカーが挙げられる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内または細胞外の条件下で切断可能であるので、リンカーの切断により、適切な環境において抗体からＡＬＫ５阻害剤が放出される。さらに他の実施形態において、リンカーは、切断可能ではなく、薬物は、例えばリソソームでの抗体の分解により放出される（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書を参照し、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
本開示のＡＤＣで使用することができる非切断可能リンカーの例として、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン１−カルボキシレート、マレイミドカプロイル、またはメルカプトアセトアミドカプロイルリンカーが挙げられる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームもしくはエンドソーム、またはカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能である。リンカーは、例えば、限定されないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む、細胞内ペプチターゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長、または少なくとも３アミノ酸長、またはそれ以上である、ペプチジル成分を含む。
【０１０３】
切断剤は、限定されないが、カテプシンＢおよびＤ、およびプラスミンを含み得るが、これらの全ては、標的細胞内で活性薬物を放出するジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られている（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照）。例えば、ペプチジルリンカーは、チオール依存性プロテアーゼカテプシンＢ（例えば、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）により切断可能である。このようなリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載されており、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能であるペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーでのドキソルビシンの合成を記載する、米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照）。
【０１０５】
他の実施形態において、切断可能リンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、ある特定のｐＨ値での加水分解に感受性がある。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能である、酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を、使用することができる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号明細書、米国特許第５，８２４，８０５号明細書、米国特許第５，６２２，９２９号明細書、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123、Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661を参照）。このようなリンカーは、血液中のような中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのｐＨに近いｐＨ５．５または５．０未満で不安定である。ある特定の実施形態において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤と結合するチオエーテル）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号明細書を参照）。
【０１０６】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーは、当該技術分野に知られており、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ））ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン）−、ＳＰＤＢ、ならびにＳＭＰＴを使用して形成することができるものを含む。（例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931、Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987を参照。また米国特許第４，８８０，９３５号明細書も参照）
【０１０７】
他の実施形態において、リンカーは、マロン酸リンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12）である。
【０１０８】
多くの場合、リンカーは、細胞外環境に実質的に感受性ではない。本明細書で使用される場合、リンカーの文脈における「細胞外環境に実質的に感受性ではない」とは、ＡＤＣのサンプルにおいて約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または約１％以下のリンカーが、ＡＤＣが細胞外環境（例えば血漿）に存在する場合に切断されることを意味する。
【０１０９】
リンカーが細胞外環境に実質的に感受性ではないかどうかは、例えば、血漿でＡＤＣを所定の時間（例えば２、４、８、１６、または２４時間）インキュベートし、次いで血漿に存在する遊離薬物の量を定量化することにより決定することができる。
【０１１０】
互いに排他的ではない他の実施形態において、リンカーは、細胞内在化を促進することができる。ある特定の実施形態において、リンカーは、治療剤とコンジュゲートされる場合（すなわち、本明細書に記載されるＡＤＣのリンカー−治療剤部分の環境において）、細胞内在化を促進する。さらに他の実施形態において、リンカーは、ＡＬＫ５阻害剤および抗体の両方とコンジュゲートされる場合に細胞内在化を促進する。
【０１１１】
多くの実施形態において、リンカーは、自己犠牲型である。本明細書で使用される場合、用語「自己犠牲」とは、間隔をあけた２つの化学部分と共有結合させて安定な三連分子にすることができる二官能化学部分を指す。それは、第一の部分へのその結合が切断される場合、第二の化学部分から自発的に分離する。例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５９４０４号パンフレット、国際公開第２００６／１１０４７６号パンフレット、国際公開第２００５／１１２９１９号パンフレット、国際公開第２０１０／０６２１７１号パンフレット、国際公開第２００９／０１７３９４号パンフレット、国際公開第２００７／０８９１４９号パンフレット、国際公開第２００７／０１８４３１号パンフレット、国際公開第２００４／０４３４９３号パンフレット、および国際公開第２００２／０８３１８０号パンフレットを参照し、これらは、薬物および切断可能物質が任意で自己犠牲リンカーを通して連結する、薬物−切断可能物質コンジュゲートを対象とし、その全てが明白に参照により組み込まれる。自己犠牲リンカーを生成するのに使用することができる自己犠牲スペーサー単位の例は、以下の式Iに記載される。
【０１１２】
本組成物および方法で使用することができる様々な例示的なリンカーは、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０１０９５７号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書、および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書に記載される（その各々は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１３】
本開示のＡＤＣは、以下の式Ｉであり得、ここで抗体（Ａｂ）は、任意のリンカー（Ｌ）を介して１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤の薬物部分（Ｄ）とコンジュゲートされる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ    Ｉ
【０１１４】
したがって、抗体は、直接的に、またはリンカーを介してのいずれかで、薬物とコンジュゲートすることができる。式Ｉにおいて、ｐは、抗体当たりの薬物（すなわちＡＬＫ５阻害剤）部分の平均数であり、これは、例えば、抗体当たり約１から約２０個の薬物部分の範囲であり得、ある特定の実施形態においては、抗体当たり２から約８個の薬物部分であり得る。薬物搭載のさらなる詳細は、以下の第４．５節に記載される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、リンカー成分は、例えばシステイン残基を介して、別のリンカー成分または薬物部分に抗体を連結する、「ストレッチャー」を含み得る。例示的なストレッチャーは、以下に示される（式中、左の波線は、抗体への共有結合の部位を示し、右の波線は、別のリンカー成分または薬物部分への共有結合の部位を示す）。
【０１１６】
【化８】
2022500486.tif 000032
米国特許第９，１０９，０３５号明細書、Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13を参照。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、リンカー成分は、アミノ酸単位を含み得る。このような一実施形態において、アミノ酸単位は、プロテアーゼによるリンカーの切断を許容し、それにより、リソソーム酵素のような細胞内プロテアーゼに曝露されると、ＡＤＣからの薬物の放出が促進される。例えば、Doronina et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:778-784を参照。例示的なアミノ酸単位として、限定されないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとして、バリン−シトルリン（ＶＣもしくはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ＡＦもしくはａｌａ−ｐｈｅ）、フェニルアラニン−リジン（ＦＫまたはｐｈｅ−ｌｙｓ）、またはＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）が挙げられる。トリペプチドの例として、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸単位は、天然に生じるアミノ酸残基、ならびに少数のアミノ酸、および非天然アミノ酸類似体を含み得、例えば、シトルリンアミノ酸単位が、特定の酵素、例えばカテプシンＢ、Ｃ、およびＤ、またはプラスミンプロテアーゼにより、酵素切断に対する選択において設計し最適化することができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、リンカー成分は、直接的に、またはストレッチャーおよび／もしくはアミノ酸単位のいずれかにより、抗体を薬物部分に連結する、「スペーサー」単位を有し得る。スペーサー単位は、「自己犠牲」または「非自己犠牲」であり得る。「非自己犠牲」スペーサー単位は、一部または全てのスペーサー単位がＡＤＣの酵素（例えばプロテアーゼ）切断時に薬物部分に結合し続けるものである。非自己犠牲スペーサー単位の例として、限定されないが、グリシンスペーサー単位およびグリシン−グリシンスペーサー単位が挙げられる。「自己犠牲」スペーサー単位は、別個の加水分解ステップを行わずに、薬物部分の放出が可能である。ある特定の実施形態において、リンカーのスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジル単位を含む。このような一実施形態において、ｐ−アミノベンジルアルコールは、アミド結合を介してアミノ酸単位と結合し、カルバミン酸塩、メチルカルバミン酸塩、または炭酸塩は、ベンジルアルコールと細胞毒性剤との間で作製される。例えば、Hamann et al., 2005, Expert Opin. Ther. Patents 15:1087-1103を参照。一実施形態において、スペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。ある特定の実施形態において、ｐ−アミノベンジル単位のフェニレン部分は、Ｑｍで置換され、ここでＱは、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シアノであり、ｍは、０〜４の範囲の整数である。自己犠牲スペーサー単位の例として、限定されないが、ｐ−アミノベンジルアルコールと電子的に類似する芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０号明細書を参照）、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237）、およびオルト−またはパラ−アミノベンジルアセタールがさらに挙げられる。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド（Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223）、適切に置換したビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Storm et al., 1972, Amer. Chem. Soc. 94:5815）、ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867）のような、アミド結合の加水分解時に環形成を行うスペーサーを使用することができる。グリシンのａ位置で置換されるアミン含有薬物の排除（Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447）もまた、ＡＤＣに有用な自己犠牲スペーサーの例である。
【０１１９】
一実施形態において、スペーサー単位は、以下に記載される分岐ビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これを使用して複数の薬物を組み込み、放出することができる。
【０１２０】
【化９】
2022500486.tif 000033
（式中、ＡｂおよびＤは、式Ｉについて上記で定義されており、Ａは、ストレッチャーであり、ａは、０から１の範囲の整数であり、Ｗは、アミノ酸単位であり、ｗは、０から１２の範囲の整数であり、Ｑは、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロ、または−シアノであり、ｍは、０〜４の範囲の整数であり、ｎは、０または１であり、ｐは、１から約２０の範囲である）
【０１２１】
リンカーは、上記のリンカー成分の任意の１つまたは複数を含み得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、以下のＡＤＣの式において、括弧内に示される：
Ａｂ−（−［Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ］−Ｄ）ｐ    ＩＩ
（式中、Ａｂ、Ａ、ａ、Ｗ、ｗ、Ｄ、およびｐは、先の段落で定義されており、Ｙは、スペーサー単位であり、ｙは、０、１、または２である）。このようなリンカーの例示的な実施形態は、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書に記載され、それは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
例示的なリンカー成分およびその組合せは、式ＩＩのＡＤＣの文脈で下記に示される：
【０１２３】
【化１０】
2022500486.tif 000034
【０１２４】
ストレッチャー、スペーサー、およびアミノ酸単位を含む、リンカー成分は、当該技術分野に公知の方法、例えば米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書に記載されるものにより合成することができる。
【０１２５】
４．５．薬物搭載
薬物搭載は、ｐで表され、分子中の抗体当たりのＡＬＫ５阻害剤部分の平均数である。平均数は、多くの場合、分数または小数であるが、薬物搭載（「ｐ」）は、抗体当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の部分（Ｄ）であり得る。一般に、ＡＬＫ５阻害剤搭載は、平均すると抗体当たり２から８個の薬物部分、より好ましくは抗体当たり２から４個の薬物部分、または抗体当たり５から７個の薬物部分となる。
【０１２６】
当業者に理解される通り、多くの例において、ＡＤＣに対する言及は、（ときに医薬組成物の文脈において）ＡＤＣ分子の集団または集合の省略表現であり、各分子は、１つまたは複数のＡＬＫ５阻害剤部分に共有結合した抗体で構成され、個別の分子基部での比が集団においてＡＤＣ分子ごとに変化し得るが、薬物搭載比は、集団または集合の平均薬物搭載を表す。いくつかの実施形態において、集団または集合は、１〜３０個の薬物部分のいずれの場所に、いくつかの実施形態においては１〜２０個、１〜１５個、２〜１２個、または２〜８個の薬物部分のいずれかの場所に共有結合する抗体を含む、ＡＤＣ分子を含有する。好ましくは、集団における平均は、先の段落に記載されており、例えば、抗体当たり２〜８個の薬物部分、より好ましくは抗体当たり４〜８個の薬物部分、または抗体当たり５〜７個の薬物部分である。
【０１２７】
いくつかのＡＤＣ集団は、本明細書に記載されるＡＤＣ、および薬物部分が欠如する抗体分子、例えば、ＡＬＫ５抗体との結合が失敗した抗体を含む組成物の形態であり得る。
【０１２８】
コンジュゲート反応からのＡＤＣの調製における、抗体当たりのＡＬＫ５阻害剤部分の平均数は、質量分光法およびＥＬＩＳＡアッセイのような従来の手段により特徴付けられる。
【０１２９】
ｐに関してＡＤＣの定量分配もまた決定することができる。いくつかの例において、均一なＡＤＣの分離、精製、および特徴付けは、ｐが他のＡＬＫ５阻害剤搭載を伴うＡＤＣからのある特定の値であるが、電気泳動のような手段により達成することができる。
【０１３０】
いくつかの抗体−薬物コンジュゲートに対して、ｐは、抗体上の結合部位の数により限定され得る。例えば、結合が、システインチオールである場合、上記の例示的な実施形態において、抗体は、１つもしくは複数のシステインチオール基のみを有し得るか、または、リンカーを結合させることができる、十分な反応性の１つもしくは複数のチオール基のみを有し得る。ある特定の実施形態において、より高い薬物搭載、例えばｐ＞５では、ある特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞浸透性の低下が起こり得る。ある特定の実施形態において、本開示のＡＤＣに対する薬物搭載は、１〜約８、約２〜約６、約３〜約５、約３〜約４、約３．１〜約３．９、約３．２〜約３．８、約３．２〜約３．７、約３．２〜約３．６、約３．３〜約３．８、または約３．３〜約３．７の範囲である。実際に、ある特定のＡＤＣに対して、抗体当たりの薬物部分の最適比が、８未満であり得、約２〜約５であり得ることが示されている。米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、理論上の最大値未満の薬物部分が、コンジュゲート反応の間、抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下で論ずる通り、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しない、リジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結することができる多くの遊離性反応性システインチオール基を含有せず、実際に、抗体内の多くのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある特定の実施形態において、抗体を、部分的または全体的な還元条件下、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）のような還元化剤で還元して、反応性システインチオール基を生成することができる。ある特定の実施形態において、抗体を変性条件にさらして、リジンまたはシステインのような反応性求核性基を現す。
【０１３２】
ＡＤＣの搭載（薬物／抗体比）は、様々な手法、例えば、（ｉ）抗体に対する薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲート反応の時間または温度を制限すること、（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的な還元条件または還元条件を制限すること、（ｉｖ）システイン残基の数および位置を、リンカー−薬物結合（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０３４４８８号パンフレット（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるようなチオＭａｂまたはチオＦａｂ）の数および／または位置を制御するために修飾するように、組換え技術により抗体のアミノ酸配列を操作することによって制御することができる。
【０１３３】
２つ以上の求核性基が、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応し、続いて薬物部分試薬と反応する場合、次いで、得られる生成物が、抗体に結合した１つまたは複数の薬物部分の分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であることは理解すべきである。抗体当たりの薬物の平均数は、デュアルＥＬＩＳＡ抗体アッセイにより混合物から計算することができ、これは、抗体に特異的であり、薬物に特異的である。個別のＡＤＣ分子は、質量分光法により混合物内で同定され、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、単一の搭載値を有する均一なＡＤＣは、電気泳動またはクロマトグラフィーにより複合混合物から単離することができる。
【０１３５】
４．６．製剤および投与
ＡＤＣの投与の好適な経路として、限定されないが、経口、非経口、直腸、経粘膜、腸内投与、髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、体腔内、腹腔内、または腫瘍内注射が挙げられる。投与の好ましい経路は、非経口であり、より好ましいのは静脈内である。あるいは、全身ではなく局所的な方法において、例えば、固体または血液腫瘍への化合物の直接的な注射を介して、化合物を投与することができる。
【０１３６】
免疫コンジュゲートは、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法にしたがって製剤化することができ、それにより、ＡＤＣは、混合物を薬学的に有用な添加剤と組み合わせる。滅菌性のリン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に有用な添加剤の一例である。他の有用な添加剤は、当業者に周知されている。例えば、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms And Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、およびGennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)、ならびにその改訂版を参照。
【０１３７】
好ましい実施形態において、ＡＤＣは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）；およびピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を使用して、Ｇｏｏｄの生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）で製剤化される。より好ましい緩衝液は、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲、より好ましくは約２５ｍＭの濃度でのＭＥＳまたはＭＯＰＳである。最も好ましいのは、ｐＨ６．５での２５ｍＭのＭＥＳである。製剤は、添加剤として２５ｍＭのトレハロース、および０．０１％ｖ／ｖのポリソルベート８０をさらに含み、添加した添加剤の結果として、最終緩衝液濃度が２２．２５ｍＭに調整される。保管の好ましい方法は、コンジュゲートの凍結乾燥製剤としてであり、−２０℃〜２℃の範囲の温度で保管され、最も好ましくは２℃〜８℃で保管される。
【０１３８】
ＡＤＣは、例えば、ボーラス注射、緩慢な注入、または連続注入を介して、静脈内投与用に製剤化することができる。好ましくは、ＡＤＣは、約４時間未満、より好ましくは約３時間未満にわたって注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇは、３０分以内、好ましくは１５分ちょうどで注入し、残りは、次の２〜３時間にわたって注入する。注射用の製剤は、添加した保存剤を伴う単位剤形で、例えば、アンプルまたは多用量容器で提供され得る。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳剤のような形態を取り得、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散化剤のような製剤化剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば滅菌性のパイロジェンを含まない水で構成するための粉末形態であり得る。
【０１３９】
さらなる薬学的な方法を利用して、ＡＤＣの作用の期間を制御することができる。制御放出の調製物は、ＡＤＣを複合体にするかまたは吸着するポリマーの使用を通して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとして、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックス、およびステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。Sherwood et al., 1992, Bio/Technology 10:1446。このようなマトリックスからのＡＤＣの放出速度は、ＡＤＣの分子量、マトリックス内のＡＤＣの量、および分散粒子のサイズに依存する。Saltzman et al., 1989, Biophys. J. 55:163、Sherwood et al.、上記参照。他の固体剤形は、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms And Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、およびGennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)、ならびにその改訂版に記載されている。
【０１４０】
一般に、ヒトに投与されるＡＤＣの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および過去の病歴のような因子によって異なる。約０．３ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量のＡＤＣを単回の静脈内注入としてレシピエントに提供することが望ましい場合があるが、状況に応じてこれよりも低い投与量または高い投与量が投与される場合もある。例えば、７０ｋｇの患者に対する０．３〜５ｍｇ／ｋｇの投与量は、２１〜３５０ｍｇであり、これは１．７ｍの患者に対する１２〜２０６ｍｇ／ｍ２の投与量でもある。投与量は、必要に応じて、例えば、２〜１０週間にわたり週に１回、８週間にわたり週に１回、または４週間にわたり週に１回、繰り返すことができる。維持療法で必要に応じて、より少ない頻度で、例えば、数か月間にわたり１週おきに、または数か月間にわたり月に１回もしくは３か月に１回、与えることもできる。好ましい投与量として、限定されないが、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、および５．０ｍｇ／ｋｇが挙げられ得る。より好ましい投与量は、１週間の投与に対して０．６ｍｇ／ｋｇであり、より低い頻度での投与に対しては１．２ｍｇ／ｋｇである。０．３〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量を使用することができる。投与量は、好ましくは、１週間に１回、複数回投与される。４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間、またはそれより長い期間の最小投与量のスケジュールを使用することができ、その投与頻度は、血液毒性に最も関連する、有害な副作用およびそれからの回復に依存する。投与のスケジュールは、（ｉ）週に１回；（ｉｉ）１週おき；（ｉｉｉ）１週間の療法と、続く２週間、３週間、または４週間の休止；（ｉｖ）２週間の療法と、続く１週間、２週間、３週間、または４週間の休止；（ｖ）３週間の療法と、続く１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間の休止；（ｖｉ）４週間の療法と、続く１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間の休止；（ｖｉｉ）５週間の療法と、続く１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間の休止；および（ｖｉｉｉ）月に１回からなる群から選択されるサイクルでの、週に１回または２回の投与を含み得る。サイクルは、２回、４回、６回、８回、１０回、または１２回、またはそれ以上繰り返すことができる。
【０１４１】
あるいは、ＡＤＣは、２週または３週ごとに１投与量で、合計で少なくとも３投与量を繰り返して、投与することができる。または、４〜６週間にわたり、週に２回である。投与量は、１週おきに１回、またはさらにより低い頻度で投与することができるので、患者は、いかなる薬物関連毒性からも回復することができる。あるいは、投与量スケジュールは、短縮することができる、すなわち、２〜３か月間にわたり２週または３週ごとである。投与スケジュールは、任意で、他の間隔で繰り返すこともでき、投与量は、用量およびスケジュールを適切に調節することで、様々な非経口経路を通して投与することができる。
【０１４２】
４．７．処置の方法
本開示のＡＤＣは、様々ながんの処置に使用することができる。ＡＤＣは、例えば、標準ケアの薬剤またはレジメンで、単独療法として、または併用療法レジメンの一部として使用することができる。がんの処置のためのＡＤＣに含めるのに好適な抗体は、Ｔ細胞の表面抗原を標的化するものである。例示的な抗体は、第４．２節に記載される。
【０１４３】
本開示のＡＤＣを使用して処置することができるがんの例として、限定されないが、膵がん、神経膠芽細胞腫、骨髄異形成症候群、前立腺がん、肝がん（例えば肝細胞癌）、黒色腫、乳がん、および尿路上皮がん（例えば膀胱がん、尿道がん、および尿管がん）が挙げられる。
【０１４４】
ＢＲＡＦ突然変異を担持する黒色腫の処置のために、本開示のＡＤＣは、ベヌラフェニブ（venurafenibm）、ダブラフェニブ、およびトラメチニブのようなＢＲＡＦ突然変異を特異的に標的化する薬物と組み合わせて使用することができる。
【０１４５】
悪性黒色腫の処置のために、本開示のＡＤＣは、イピリムマブまたはニボルマブまたはペムブロリズマブのようなチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【０１４６】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置のために、本開示のＡＤＣは、含まれるシスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、またはビンブラスチンのような標準ケアの化学療法の処置と組み合わせて使用することができる。加えて、ＡＤＣは、ベバシズマブまたはＥｒｂｉｔｕｘのような標的療法と組み合わせて使用することができる。
【０１４７】
膀胱がんの処置のために、本開示のＡＤＣは、シスプラチン、マイトマイシンＣ、カルボプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、５−ＦＵ、メトトレキセート、ビンブラスチン、イホスファミド、およびペメトレキセドを含むが、限定されない標準ケアの処置と組み合わせて使用することができる。
【０１４８】
腎がんの処置のために、本開示のＡＤＣは、標準ケアの処置、例えば、血管形成および／または特異的チロシンキナーゼを遮断する薬剤、例として、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、パゾパニブ、およびアキシチニブと組み合わせて使用することができる。
【０１４９】
乳がんの処置のために、本開示のＡＤＣは、アンスラサイクリン（ドキソルビシンまたはエピルビシン）、およびタキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）、ならびにフルオロウラシル、シクロホスファミド、およびカルボプラチンのような、標準ケアの化学療法剤と組み合わせて使用することができる。加えて、本開示のＡＤＣは、標的療法と組み合わせて使用することができる。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍に対する標的療法として、トラスツズマブおよびペルツズマブが挙げられ、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性腫瘍に対する標的療法として、タモキシフェン、トレミフェン、およびフルベストラントが挙げられる。
【０１５０】
膵がんに対して、本開示のＡＤＣは、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、パクリタキセル、カペシタビン、シスプラチン、またはドセタキセルのような、標準ケアの化学療法剤と組み合わせて使用することができる。加えて、ＡＤＣは、ＥＧＦＲを阻害するエルロチニブのような、標的療法と組み合わせて使用することができる。
【０１５１】
神経膠芽細胞腫に対して、本開示のＡＤＣは、カルボプラチン、シクロホスファミド、エトポシド、ロムスチン、メトトレキセート、またはプロカルバジンのような、標準ケアの化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【０１５２】
前立腺がんに対して、本開示のＡＤＣは、ドセタキセルを含み、任意で、ステロイドであるプレドニゾン、またはカバジタキセルを含む、標準ケアの化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
【実施例】
【０１５３】
以下の略語は、実施例を通して見られる。
Ｂｏｃ  −  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ  −  ジクロロメタン
ＤＭＡ  −  ジメチルアミン
ＤＭＦ  −  ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ  −  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＥｔＯＡｃ  −  酢酸エチル
ＥｔＯＨ  −  エタノール
Ｆｍｏｃ  −  フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ  −  ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭｅＯＨ  −  メタノール
ＮａＨＭＤＳ  −  ナトリウムヘキサメチルジシルアジド
ＲＴ  −  室温、およそ２１℃
ＴＢＴＵ  −  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＥＡ  −  トリエチルアミン
ＴＨＦ  −  テトラヒドロフラン
ＴＦＡ  −  トリフルオロ酢酸
ＴＭＳ−イミダゾール  −  １−（トリメチルシリル）イミダゾール
【０１５４】
５．１．
[実施例１]
４−（６−メチルピリジン−２−イル）−５−（１，５−ナフチリジン−２−イル）−１，３−チアゾール−２−アミン（化合物Ａ）の合成
化合物Ａを、以下のスキーム１における一般的方法にしたがって調製した。
【０１５５】
【化１１】
2022500486.tif 000035
【０１５６】
５．１．１．  ２−メチル−１，５−ナフチリジン（Ａ１）
濃硫酸（２．５ｍｌ）、ｍ−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（２．０８ｇ、９．２４ｍｍｏｌ）、ボロン酸（４４５ｍｇ、７．２１ｍｍｏｌ）、および硫酸第一鉄七水和物（１６７ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で撹拌した。グリセロール（１．５ｍｌ）を、続いて５−アミノ−２−メチルピリジン（Ａ−ＳＭ）（５００ｍｇ、４．６２ｍｍｏｌ）および水（２．５ｍｌ）を、反応混合物に添加し、１３５℃で１８時間加熱した。ＴＬＣにより測定した反応完了後、反応混合物をおよそ２１℃に冷却し、４ＮのＮａＯＨを使用して塩基化し、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、水（２００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、粗化合物Ａ１を得た。粗体を、（２％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡褐色結晶質固体として化合物Ａ１（２００ｍｇ、３０％）を得た。
【０１５７】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.92 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.35 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 8.5, 4.5 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 2.8 (s, 3H)
【０１５８】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  １４５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１５９】
５．１．２．  １−（６−メチルピリジン−２−イル）−２−（１，５−ナフチリジン−２−イル）エタン−１−オン（Ａ２）
Ａ１（２００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）およびメチル６−メチルピコリネート（２０９ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）中の溶液を、Ｎ２雰囲気下に置き、−７８℃に冷却した。カリウムビス（トリメチルシリル）アミド（トルエン中に０．５Ｍ、６．９ｍｌ、３．４７ｍｍｏｌ）を、５分間にわたって滴下添加した。反応混合物を、−７８℃で１時間撹拌し、次いでおよそ２１℃に加温し、２０時間維持した。反応完了後（ＴＬＣにより測定）、反応混合物を、飽和塩化アンモニウム溶液（２０ｍｌ）でクエンチした。水性層をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、水（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、粗化合物Ａ２を得た。粗物質を、カラムクロマトグラフィー（１％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、橙黄色固体として化合物Ａ２（１１０ｍｇ、３０．５％）を得た。
【０１６０】
1H NMR (400 MHz, CDCl3: エノール型):δ 15.74 (brs,-OH), 8.69 (t, J = 3.6, 1H), 8.12 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.4, 4.4 Hz, 2H), 7.82 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 1H)  7.45 (d,  J= 9.6 Hz,1H), 7.3 (dd,  J = 7.6, 4.0 Hz, 1H), 7.16 ( s, 1H), 2.75(s, 3H)
【０１６１】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２６４［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１６２】
５．１．３．  ４−（６−メチルピリジン−２−イル）−５−（１，５−ナフチリジン−２−イル）−１，３−チアゾール−２−アミン（化合物Ａ）
Ａ２（１１０ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１０ｍｌ）中の溶液を、臭素（０．０２５ｍｌ、０．５０１ｍｍｏｌ）で処理した。得られた反応混合物を、およそ２１℃で１時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮して、粗Ａ３（１２０ｍｇ）を得て、これをさらに精製することなく次のステップで用いた。粗Ａ３（１２０ｍｇ）を、エタノール（１５ｍｌ）に溶解させた。次いで、チオ尿素（３．５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、（出発物質の完全な消費がＴＬＣにより観察されるまで）７８℃で４時間加熱した。反応混合物を、およそ２１℃に冷却し、アンモニア溶液（２５％、１．５ｍｌ）を穏やかに撹拌しながら添加した。溶媒を蒸発させ、次いで残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍｌ）に溶解させ、水（５０．０ｍｌ）で洗浄した。次いで、分離した有機層を、１ＮのＨＣｌ（３０ｍｌ×２）で洗浄した。合わせた水性層を３５％の水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）で塩基化し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、粗化合物Ａを得た。粗化合物Ａをアセトニトリル（２ｍｌ）から再結晶させて、黄色結晶質固体として精製した化合物Ａ（３５ｍｇ、２ステップにわたって４９％の収率）を得た。
【０１６３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.86 (dd, J = 4.4, 1.6 Hz, 1H), 8.29 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.2 Hz,1H),  7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60-7.55 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 7.6, 1H), 5.32 (brs,  2H), 2.57 (s,  3H)
【０１６４】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３２０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１６５】
ＵＰＬＣ純度：９７．６％
【０１６６】
５．２．
[実施例２]
Ｎ−メチル−２−（４−｛４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝フェノキシ）エタン−１−アミン（化合物Ｂ）の合成
化合物Ｂを、以下のスキーム２における一般的方法にしたがって調製した。
【０１６７】
【化１２】
2022500486.tif 000036
【０１６８】
５．２．１．  ｔｅｒｔ−ブチル（２−クロロエチル）（メチル）カルバメート（Ｂ７）
Ｂｏｃ−無水物（１．７ｍｌ、７．３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍｌ）中の撹拌溶液に、同時に、Ｂ６（１ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）の水（４ｍｌ）中の溶液、およびＴＥＡ（１ｍｌ、７．６９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍｌ）中の溶液を、１時間にわたって添加した。得られた混合物を、およそ２１℃で１６時間撹拌した。反応混合物を、飽和ＮａＣｌ溶液（２０ｍｌ）で希釈し、ＤＣＭ（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮して、粗化合物を得て、これを１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色液体として化合物Ｂ７（１ｇ、５．１８ｍｍｏｌ、７１％）を得た。
【０１６９】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.58-3.52 (m, 4H), 2.93 (s, 3H), 1.46 (s, 9H)
【０１７０】
５．２．２．  ｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバメート（Ｉｎｔ−Ｂ）
４−ヒドロキシフェニルボロン酸ピナコールエステル（７８９ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１３ｍｌ）中の撹拌溶液に、Ｂ７（９００ｍｇ、４．６６ｍｍｏｌ）、ＫＩ（１８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、およびＣｓ２ＣＯ３（２．５７ｇ、７．８８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で添加した。反応混合物を、６５℃に加熱し、１６時間撹拌した。反応混合物を、水（２０ｍｌ）に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、減圧下で濃縮して粗体を得て、これを７％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体としてＩｎｔ−Ｂ（５８０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ、４３％）を得た。
【０１７１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 4.16-4.06 (m, 2H), 3.65-3.59 (m, 2H), 2.97 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.33 (s, 12H)
【０１７２】
５．２．３．  ２−（２−ブロモピリジン−４−イル）−１−（ピリジン−２−イル）エタン−１−オン（Ｂ２）
２−ブロモ−４−メチルピリジン（Ｂ１）（２ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍｌ）中の撹拌溶液に、アルゴン下の−７８℃で、ＮａＨＭＤＳ（ＴＨＦ中の２Ｍ、１２．７ｍｌ、２５．５８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した。黄色溶液を、−７８℃で３０分間撹拌した。次いで、ピコリン酸エチル（１．７２ｍｌ、１２．７９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）中の溶液を添加し、反応混合物を、およそ２１℃に加温し、１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残留物をジエチルエーテルで粉砕し、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。次いで、固体を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（３０ｍｌ）で希釈し、水性相をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として化合物Ｂ２（２．０６ｇ、７．４６ｍｍｏｌ、６４．３％）を得た。
【０１７３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 8.75 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.32 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89 (t, J =7.6 Hz 1H), 7.56-7.51(m, 2H), 7.28-7.25 (m, 1H), 4.55 (s, 2H)
【０１７４】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２７７［Ｍ］＋
【０１７５】
５．２．４．  ２−ブロモ−４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン（Ｂ３）
Ｂ２（８５０ｍｇ、３．０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（３．４ｍｌ）中の溶液を、アルゴン下で、ＤＭＦ中の氷酢酸（０．４５ｍｌ、７．３９ｍｍｏｌ）で処理した。ＤＭＡ（０．６ｍｌ、４．６１ｍｍｏｌ）を滴下添加し、混合物をおよそ２１℃で２時間、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン一水和物（１．１５ｍｌ、２３．０９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた混合物を、５０℃で３時間加熱し、およそ２１℃で１６時間加熱した。反応混合物を、水（３０ｍｌ）に注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×３０ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗化合物を得た。粗生成物を、３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として化合物Ｂ３（５６０ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ、６０．６％）を得た。
【０１７６】
1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 8.74 (brs, 1H), 8.34 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.83 (brs, 1H), 7.81 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39-7.84 (m, 1H), 7.31-7.26 (m, 1H)
【０１７７】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３０１［Ｍ］＋
【０１７８】
５．２．５．  ２−ブロモ−４−（３−（ピリジン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン（Ｂ４）
Ｂ３（５００ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のアセトン（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．３７ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）およびトリチルクロリド（４６４ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、反応混合物を、加熱還流し、２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）と水（１０ｍｌ）との間で分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗固体を、２％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｂ４（４０２ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
【０１７９】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.53 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.75-7.05 (m, 2H), 7.56 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.35-7.32 (m, 9H), 7.25-7.22 (m, 8H)
【０１８０】
５．２．６．  ｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（４−（４−（３−（ピリジン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバメート（Ｂ５）
Ｂ４（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）のトルエン（２ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＥｔＯＨ（０．７５ｍｌ）中のＩｎｔ−Ｂ（１８５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を、続いて２ＭのＮａ２ＣＯ３溶液（０．４５ｍｌ）を、アルゴン雰囲気下で添加した。反応混合物を、アルゴンで２０分間脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）４（１６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加し、３時間還流した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、水に注ぎ入れ、トルエン（３×１５ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗生成物を得て、これを３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、無色固体として化合物Ｂ５（７０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、５３％）を得た。
【０１８１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.53 (s, 1H), 8.49 (d, J= 4.8 Hz, 1H),7.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H) 7.74-7.76 (m, 3H), 7.60 (s, 1H), 7.40-7.34 (s, 8H), 7.31-7.30 (m, 2H), 7.24-7.19 (m, 4H), 7.12- 7.10 (m, 1H), 6.93(d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.19-4.12 (m, 2H), 3.66-3.58 (m, 2H), 2.98 (s, 3H), 1.46 (s, 9H)
【０１８２】
５．２．７．  Ｎ−メチル−２−（４−（４−（３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エタン−１−アミン塩酸塩（化合物Ｂ）
Ｂ５（７０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）中の撹拌溶液に、１，４−ジオキサン（０．５ｍｌ）中の４ＮのＨＣｌを０℃で添加した。反応混合物を、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗化合物を得て、これをｎ−ペンタン（２×１ｍｌ）で粉砕し、乾燥させて、無色固体として化合物ＢのＨＣｌ塩を得た（２５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、６９％）。
【０１８３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 8.94 (brs, 2H), 8.62-8.56 (m, 3H), 8.30 (brs, 1H), 8.03-7.96 (m, 3H), 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H),7.69 (brs, 1H), 7.49 (dd, J =7.2, 5.6 Hz, 1H), 7.29 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.36 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.39-3.35 (m, 2H), 2.67-2.63 (m, 3H)
【０１８４】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３７２［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１８５】
５．３．
[実施例３]
Ｎ−メチル−２−（４−｛４−［３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝フェノキシ）エタン−１−アミン（化合物Ｃ）の合成
化合物Ｃを、以下のスキーム３における一般的方法にしたがって調製した。
【０１８６】
【化１３】
2022500486.tif 000037
【０１８７】
５．３．１．  ２−（２−ブロモピリジン−４−イル）−１−（６−メチルピリジン−２−イル）エタン−１−オン（Ｃ２）
２−ブロモ−４−メチルピリジン（Ｂ１）（１ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）中の撹拌溶液に、アルゴン下の−７８℃で、ＮａＨＭＤＳ（ＴＨＦ中の２Ｍ、６．３９ｍｌ、１２．８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した。黄色溶液を、−７８℃で３０分間撹拌した。次いで、６−メチルピコリン酸メチルエステル（１．１９ｍｌ、８．７２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７ｍｌ）中の溶液を添加し、反応混合物を、最大でおよそ２１℃に加温し、１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残留物をジエチルエーテルで粉砕し、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。次いで、固体を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２０ｍｌ）で希釈し、水性相をＥｔＯＡｃ（２×１５０ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として化合物Ｃ２（１．１ｇ、３．７９ｍｍｏｌ、６５．４％）を得た。
【０１８８】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.30 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.36  (d, J = 8 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 2.64 (s, 3H)
【０１８９】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２９１［Ｍ］＋
【０１９０】
５．３．２．  ２−ブロモ−４−［３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン（Ｃ３）
Ｃ２（３００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）中の溶液を、アルゴン下で、ＤＭＦ中の氷酢酸（０．１４ｍｌ、２．４８ｍｍｏｌ）で処理した。ＤＭＡ（０．２ｍｌ、１．５５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、混合物をおよそ２１℃で１時間、アルゴン雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３７ｍｌ、７．７５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた混合物を、５０℃で３時間加熱し、およそ２１℃で１６時間加熱した。反応混合物を、水（２０ｍｌ）に注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗Ｃ３を得た。粗Ｃ３を、２％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として精製したＣ３（１７２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、５３％）を得た。
【０１９１】
1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 11.40 (brs, 1H), 8.37 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.58 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.60 (s, 3H)
【０１９２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３１５［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１９３】
５．３．３．  ２−ブロモ−４−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン（Ｃ４）
Ｃ３（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のアセトン（２ｍｌ）中の撹拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（５３ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）およびトリチルクロリド（５３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、反応混合物を、加熱還流し、２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）と水（５ｍｌ）との間で分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗固体を、２％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｃ４（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、４１％）を得た。
【０１９４】
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 8.22 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.59 (s, 3H), 7.39-7.35 (m, 9H), 7.31 (s, 1H), 7.28-7.25 (m, 6H), 7.24 (d, J = 12 Hz, 1H), 2.53 (s, 3H)
【０１９５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５５８［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１９６】
５．３．４．  ｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（４−（４−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバメート（Ｃ５）
Ｃ４（１５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＥｔＯＨ（１ｍｌ）中のＩｎｔ−Ｂ（１５２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、続いて２ＭのＮａ２ＣＯ３溶液（０．７ｍｌ）を、アルゴン雰囲気下で添加した。反応混合物を、アルゴンで２０分間脱気し、次いでＰｄ（ＰＰｈ３）４（２５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を添加し、６時間還流した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、水に注ぎ入れ、トルエン（３×１０ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗Ｃ５を得て、これを３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、褐色固体として精製したＣ５（５１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、２６％）を得た。
【０１９７】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.48 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 7.74 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.56 (d, J  = 15.2Hz, J = 7.6Hz, 2H), 7.35-7.33 (m, 8H), 7.28-7.27 (m, 6H), 7.08 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.16-4.08 (m, 2H), 3.63-3.58 (m, 2H), 2.98 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 1.46 (s, 9H)
【０１９８】
５．３．５．  Ｎ−メチル−２−（４−｛４−［３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝フェノキシ）エタン−１−アミン（化合物Ｃ）
Ｃ５（５１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）中の撹拌溶液に、１，４−ジオキサン（０．３ｍｌ）中の４ＮのＨＣｌを０℃で添加した。次いで、反応混合物を、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗化合物Ｃを得た。次いで、粗化合物Ｃをｎ−ペンタン（２×１ｍｌ）で粉砕し、乾燥させて、褐色固体として化合物ＣをＨＣｌ塩として得た（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、７４％）
【０１９９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 8.93 (brs, 2H), 8.61 (d, J = 5.6 Hz, 1H),8.56 (brs, 1H), 8.33 (brs, 1H), 8.03 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.88 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.78-7.74 (m,1H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.36 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.66-2.63 (m, 3H), 2.50-2.46 (m, 3H)
【０２００】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３８６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２０１】
５．４．
[実施例４]
（Ｚ）−Ｎ−エチル−３−（（（４−（Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）メチルスルホンアミド）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキサミド（化合物Ｄ）の合成
化合物Ｄを、以下のスキーム４における一般的方法にしたがって調製した。
【０２０２】
【化１４】
2022500486.tif 000038
【０２０３】
５．４．１．  メチル１−アセチル−２−オキソインドリン−６−カルボキシレート（Ｄ２）
メチル２−オキソインドリン−６−カルボキシレート（Ｄ１）（２．０ｇ、１０．４７ｍｍｏｌ）の無水酢酸（１６ｍｌ）中の撹拌溶液を、１３０℃に、不活性雰囲気下で６時間加熱した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、およそ２１℃に冷却した。沈殿物を濾過し、ｎ−ヘキサン（２×５０ｍｌ）で洗浄し、真空で乾燥して、黄色固体として化合物Ｄ２（１．５ｇ、６１．５％）を得た。
【０２０４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 8.66 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.91 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.57 (s, 3H)
【０２０５】
５．４．２．  メチル（Ｚ）−１−アセチル−３−（ヒドロキシ（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキシレート（Ｄ３）
化合物Ｄ２（１．５ｇ、６．４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＴＢＴＵ（２．６９ｇ、８．３６ｍｍｏｌ）、安息香酸（９０３ｍｇ、７．４０ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２．２ｍｌ）を、不活性雰囲気下の０℃で添加した。反応混合物を、およそ２１℃に加温し、１６時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、氷冷水（３０ｍｌ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×４０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、粗生成物Ｄ３を得て、これを８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として化合物Ｄ３（９００ｍｇ、４２％）を得た。
【０２０６】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 14.01 (brs, 1H), 8.93 (s, 1H), 7.76-7.70 (m, 3H), 7.67-7.63 (m, 1H), 7.59-7.56 (m, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.83 (s, 3H)
【０２０７】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３３８．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２０８】
５．４．３．  （Ｚ）−３−（ヒドロキシ（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボン酸（Ｄ４）
化合物Ｄ３（９００ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍｌ）中の撹拌溶液に、１ＮのＮａＯＨ水溶液（１５ｍｌ）をおよそ２１℃で添加した。反応混合物を、１００℃に加熱し、６時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、およそ２１℃に冷却し、１ＮのＨＣｌ水溶液（１３ｍｌ）でクエンチし、３０分間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで洗浄して、オフホワイトの固体として化合物Ｄ４（５８０ｍｇ、７７％）を得て、これをさらに精製することなく次のステップで用いた。
【０２０９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 12.76 (brs, 1H), 11.61 (brs, 1H), 7.77-7.50 (m, 8H), 7.13 (brs, 1H)
【０２１０】
５．４．４．  （Ｚ）−Ｎ−エチル−３−（ヒドロキシ（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキサミデレート（carboxamidelate）（断片Ａ）
化合物Ｄ４（５８０ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、ＴＢＴＵ（７２９ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３０６ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．９ｍｌ、１０．３２ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下のおよそ２１℃で添加した。３０分後、ＴＨＦ（２．１ｍｌ、４．１２ｍｍｏｌ）中の２Ｎのエチルアミンを、０℃で添加し、１時間撹拌した。次いで、反応混合物を、およそ２１℃に加温し、さらに１６時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、揮発物を、真空で除去した。残留物を水（１５ｍｌ）で希釈し、濾過し、２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２×１０ｍｌ）で洗浄し、粗生成物を得て、これを１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、オフホワイトの固体として断片Ａ（４１０ｍｇ、６４．５％）を得た。
【０２１１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 13.62 (brs, 1H), 11.39 (brs, 1H), 8.35-8.33 (m, 1H), 7.76-7.52 (m, 5H), 7.44-7.36 (m, 3H), 3.29-3.22 (m, 2H), 1.10 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
【０２１２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３０７．１（Ｍ−Ｈ＋）
【０２１３】
５．４．５．  Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（Ｄ８）
化合物Ｄ７（８００ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）のアセトン（１５ｍｌ）中の撹拌溶液に、炭酸カリウム（１．３２ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（１１０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、および化合物Ｂ６（７９９ｍｇ、５．５５ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下の０℃で添加した。反応混合物を、５０℃に加熱し、２０時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、揮発物を、真空で除去した。残留物を、水（２０ｍｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×４０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、粗生成物を得て、これを５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｄ８（４６０ｍｇ、４３％）を得た。
【０２１４】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ 8.27 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.13 (s, 3H), 2.31 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.12 (s, 6H)
【０２１５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２８８．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１６】
５．４．６．  Ｎ−（４−アミノフェニル）−Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）メタンスルホンアミド（断片Ｂ）
化合物Ｄ８（４６０ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（４０ｍｇ）を添加し、水素雰囲気（バルーン圧）下のおよそ２１℃で３時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通して濾過し、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空で濃縮して、粗生成物を得て、これを１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体として断片Ｂ（３００ｍｇ、７３％）を得た。
【０２１７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.25 (s, 2H), 3.55 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.91 (s, 3H), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.12 (s, 6H)
【０２１８】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２５８．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１９】
５．４．７．  （Ｚ）−３−（（（４−（Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）メチルスルホンアミド）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）−Ｎ−エチル−２−オキソインドリン−６−カルボキサミド（Ｄ５）
断片Ａ（２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、断片Ｂ（５００ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ）およびＴＭＳ−イミダゾール（４５５ｍｇ、３．２４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）中の溶液を、マイクロ波の下、１７０℃に１時間加熱した。出発物質の消費（ＴＬＣおよびＬＣ−ＭＳによりモニタリング）後、揮発物を、真空で除去した。残留物を水（１０ｍｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２５ｍｌ）で抽出して、粗生成物を得て、これを分取ＨＰＬＣにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｄ５（１５０ｍｇ、４２％）を得た。
【０２２０】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 12.14 (s, 1H), 10.91 (s, 1H), 8.17 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.64-7.57 (m, 3H), 7.53-7.51 (m, 2H), 7.34 (s, 1H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.23-3.20 (m, 2H), 2.93 (s, 3H), 2.13 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.90 (s, 6H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
【０２２１】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５４８．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２２２】
５．４．８．  （Ｚ）−Ｎ−エチル−３−（（（４−（Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）メチルスルホンアミド）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキサミド（化合物Ｄ）
化合物Ｄ５（７０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の乾燥トルエン（３ｍｌ）中の撹拌溶液に、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルクロリド（０．０４ｍｌ、０．１９ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下のおよそ２１℃で添加した。反応混合物を、還流温度（１２０℃）に加熱し、１６時間維持した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、およそ２１℃に冷却し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ水溶液（１５ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、モノ脱メチル化し、ジ−ｔｒｏｃ保護化した化合物（４０ｍｇ）を得た。
【０２２３】
上記の反応由来の粗生成物を、酢酸（３ｍｌ）に溶解させ、亜鉛粉末（９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下のおよそ２１℃で添加した。反応混合物を、５０℃に加熱し、８時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、およそ２１℃に冷却し、揮発物を、真空で除去した。残留物を、水（２０ｍｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗化合物Ｄを得て、これを５〜６％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、８３％のＨＰＬＣ純度の１２ｍｇの化合物Ｄを得た。
【０２２４】
反応物を６０ｍｇのスケールで繰り返し、得られた粗生成物を上記バッチと組み合わせ、分取ＨＰＬＣにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｄ（８．０ｍｇ、６．３％）を得た。
【０２２５】
1H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 7.65-7.59 (m, 3H), 7.52.7.50 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.95 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39-3.32 (m, 2H), 3.05 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.93 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
【０２２６】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５３４．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２２７】
ＵＰＬＣ純度：９９．１８％
【０２２８】
５．５．
[実施例５]
（Ｚ）−Ｎ−エチル−３−（（（４−（Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）メチルスルホンアミド）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキサミド（化合物Ｄ）の代替合成
化合物Ｄをまた、以下のスキーム５における一般的方法にしたがって調製した。
【０２２９】
【化１５】
2022500486.tif 000039
【０２３０】
５．５．１．  Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ−（４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（Ｄ９）
化合物Ｄ７（１．０ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、水酸化ナトリウム（鉱油中に６０％、３２０ｍｇ、７．９９ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下の０℃で添加し、およそ２１℃で３０分間撹拌した。この混合物に、１，２−ジブロモエタン（２．１８ｇ、１１．６０ｍｍｏｌ）を、およそ２１℃で添加した。混合物を、９０℃に加熱し、２４時間撹拌した。反応物をＴＬＣによりモニタリングした。反応混合物をおよそ２１℃に冷却し、氷冷水（３０ｍｌ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×４０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、粗生成物を得て、これを５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、４０％の未反応出発物質を含有する混合物として１．２ｇのＤ９を得た。得られた混合物を、さらに精製することなく次の反応に直接用いた。
【０２３１】
1H NMR (500 MHz, CDCl3):δ 8.29 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.01 (s, 3H)
【０２３２】
５．５．２．  Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（Ｄ１０）
化合物Ｄ９（１．２ｇ、不純）のＴＨＦ（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、トリエチルアミン（１．６ｍｌ）およびメチルアミン（ＴＨＦ中の２Ｍ、９．３ｍｌ、１８．６３ｍｍｏｌ）を、封管中で、不活性雰囲気下のおよそ２１℃で添加した。反応混合物を、８０℃に加熱し、１６時間維持した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、およそ２１℃に冷却し、減圧下で濃縮して、粗Ｄ１０を得た。粗Ｄ１０を、１５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、黄色固体として化合物Ｄ１０（５００ｍｇ、２ステップにわたって３９％の全収率）を得た。
【０２３３】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ 8.94 (brs, 1H), 8.31 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.15 (s, 3H), 3.00 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H)
【０２３４】
５．５．３．  ｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（Ｎ−（４−ニトロフェニル）メチルスルホンアミド）エチル）カルバメート（Ｄ１１）
Ｄ１０（５００ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中の撹拌溶液に、トリエチルアミン（０．４ｍｌ、２．６１ｍｍｏｌ）および無水Ｂｏｃ（６５９ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下のおよそ２１℃で添加し、５時間維持した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、揮発物を、真空で除去して、粗生成物を得て、これを５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、無色の濃厚なシロップとしてＤ１１（３２０ｍｇ、４７％）を得た。
【０２３５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.28-3.25 (m, 2H), 3.07 (s, 3H), 2.72-2.70 (m, 3H), 1.33-1.27 (m, 9H)
【０２３６】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２７４．２（Ｍ＋−Ｂ℃）
【０２３７】
５．５．４．  ｔｅｒｔ−ブチル（２−（Ｎ−（４−アミノフェニル）メチルスルホンアミド）エチル）（メチル）カルバメート（断片ＢのＢｏｃ変異体）
化合物Ｄ１１（２５０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍｌ）中の溶液に、ラネー−Ｎｉ（４０ｍｇ）を添加し、水素雰囲気（バルーン圧）下のおよそ２１℃で１時間撹拌した。出発物質の完全な消費後（ＴＬＣによりモニタリング）、反応混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通して濾過し、ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）で洗浄した。合わせた濾液を真空で濃縮して、粗生成物を得て、これを１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色固体として断片ＢのＢｏｃ変異体（１８０ｍｇ、７７％）を得た。
【０２３８】
H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 7.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.53 (d, J = 8.4 HZ, 2H), 5.24 (s, 2H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.18 (t, J = 6.4 HZ, 2H), 2.88 (s, 3H), 2.75-2.71 (m, 3H), 1.36-1.33 (m, 9H)
【０２３９】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ２４４．２（Ｍ＋−Ｂ℃）
【０２４０】
５．５．５．  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｚ）−（２−（Ｎ−（４−（（（６−（エチルカルバモイル）−２−オキソインドリン−３−イリデン）（フェニル）メチル）アミノ）フェニル）メチルスルホンアミド）エチル）（メチル）カルバメート（Ｄ１０）
断片Ａ（７０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、断片ＢのＢｏｃ変異体（１５５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）およびＴＭＳ−イミダゾール（１５９ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍｌ）中の溶液を、マイクロ波の下、１７０℃に１６０分間加熱した。出発物質の消費（ＴＬＣおよびＬＣ−ＭＳによりモニタリング）後、揮発物を、真空で除去して、残留物を得て、これを分取ＨＰＬＣにより精製して、淡黄色固体として化合物Ｄ１０（５０ｍｇ、３６％）を得た。
【０２４１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 12.13 (brs, 1H), 8.01 (brs, 1H), 7.61-7.51 (m, 3H), 7.44-7.41 (m, 3H), 7.13-7.11 (m, 2H), 6.98 (d, J = 8.4 HZ, 1H), 6.75 (d, J = 8.4 HZ, 2H), 5.96-5.91 (m, 2H), 3.74-3.71 (m, 2H), 3.49-3.41 (m, 2H), 3.30-3.27 (m, 2H), 2.80 (s, 6H), 1.40-1.36 (m, 9H), 1.19 (t, J = 7.2 HZ, 3H)
【０２４２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６３４．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２４３】
５．５．６．  （Ｚ）−Ｎ−エチル−３−（（（４−（Ｎ−（２−（メチルアミノ）エチル）メチルスルホンアミド）フェニル）アミノ）（フェニル）メチレン）−２−オキソインドリン−６−カルボキサミド塩酸塩（ＨＣｌ塩としての化合物Ｄ）
化合物Ｄ１０（２０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（３ｍｌ）中の撹拌溶液に、１，４−ジオキサン（０．３ｍｌ）中の４ＮのＨＣｌを、不活性雰囲気下の０℃で添加した。反応混合物を、およそ２１℃で１時間撹拌した。出発物質の完全な消費（ＴＬＣによりモニタリング）後、揮発物を、真空で除去して、粗生成物を得て、これをｎ−ペンタン（２×４ｍｌ）で粉砕して、淡黄色固体として、ＨＣｌ塩としての化合物Ｄ（１２ｍｇ、７１％）を得た。
【０２４４】
1H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 7.65-7.59 (m, 3H), 7.52.7.50 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.95 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.39-3.32 (m, 2H), 3.05 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.93 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
【０２４５】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ５３４．７［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２４６】
ＵＰＬＣ純度：９６．２６％
【０２４７】
５．６．
[実施例６]
化合物Ａ〜Ｄの活性を試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
５．６．１．  Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ−（４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド（２）
化合物Ａ〜Ｄを試験して、これらが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴＧＦ−β誘導性ルシフェラーゼ活性を阻害できるかどうかを決定した。
【０２４８】
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェル白色平底プレートに終夜、播種した。次の日、ウェル当たり１００ｎｇのＳＭＡＤルシフェラーゼのレポータープラスミドを、リポフェクトアミンを使用して、２４時間、細胞内にトランスフェクトした。次の日、細胞を、化合物Ａ〜Ｄおよび１００ｐＭのＴＧＦβで２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。アッセイは、化合物Ａ、Ｂ、およびＤに対しては２回行い、化合物Ｃに対しては３回行った。結果を表４に示す。
【０２４９】
【表４】
2022500486.tif 000040
【０２５０】
実験１の活性データを図５に示す。
【０２５１】
化合物Ａ〜Ｃは、最大の阻害活性を示した。
【０２５２】
５．６．２．  ＭＴＳ増殖アッセイ
化合物Ａ〜Ｄを試験して、これらが、初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害できるかどうかを決定した。
【０２５３】
初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）細胞分離システム（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｃ５７／Ｂ６マウスの脾臓から分離した。０．５μｇ／ｍｌのハムスター抗マウスＣＤ３ｅ抗体（１４５−２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、９６ウェル平底プレート上に終夜、コーティングした。１×１０５個の精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌの可溶性のハムスター抗マウスＣＤ２８抗体（３７．５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｎＭのＴＧＦ−β１、および化合物Ａ〜Ｄの８倍連続希釈液でインキュベートした。７２時間後、細胞増殖を、製造会社の説明書にしたがって、ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。結果を表５に示す。
【０２５４】
【表５】
2022500486.tif 000041
【０２５５】
実験１のデータを図６に示す。
【０２５６】
２つの異なる実験において、ＩＣ５０値は、化合物Ｄでは得られなかった。化合物Ａもまた、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞において一貫した効果を示さなかった。しかし、化合物ＢおよびＣは、Ｔ細胞増殖のＴＧＦ−β媒介性阻害を逆転した。
【０２５７】
２つのアッセイに基づいて、化合物Ｃが、ＡＤＣにコンジュゲートするのに選択された。
【０２５８】
５．７．
[実施例７]
４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２Ｈ−ピロール−１（５Ｈ）−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジルメチル（２−（４−（４−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバメートの合成
化合物Ｃを、以下のスキーム６における一般的方法にしたがって、バリン−シトルリンリンカーに連結させた。
【０２５９】
【化１６】
2022500486.tif 000042
【０２６０】
Ｌ１（１２２ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＴＥＡ（５２μｌ、０．３７５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、化合物Ｃ（５８ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍｌ）中の溶液に、０℃で添加し、反応混合物をおよそ２１℃で２時間撹拌して、粗ＡＤＣ−１を得た。粗ＡＤＣ−１を、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として精製したＡＤＣ−１（３４ｍｇ、２４％の収率）を得た。
【０２６１】
５．８．
[実施例８]
抗体薬物コンジュゲート１（ＡＤＣ１）の生成
抗マウストランスフェリン受容体抗体Ｒ１７２１７、およびラット抗マウスＩｇＧ２Ａアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を、複合緩衝液（２５ｍＭのホウ酸ナトリウム／２５ｍＭのＮａＣｌ、および０．３ｍＭのＥＤＴＡ、最終ｐＨ７．４）中に終夜透析した。抗体を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して、還元率１０〜３０で２時間還元した。ＡＤＣ−１を、１０ｍＭの最終濃度までＤＭＳＯ中に溶解し、次いで、１５％のＤＭＳＯの存在下、複合比５〜３０で抗体にコンジュゲートした。全ての反応は、およそ２１℃で行った。いくつかの薬物抗体比（ＤＡＲ）に対して、５０％のプロピレングリコールを、コンジュゲートのステップの間、有機溶媒として使用した。最終ＡＤＣを、ＰＢＳ中で終夜透析し、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過し、ＨＰＬＣ−ＨＩＣを介して分析してＤＡＲを決定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを介して分析して凝集のレベルを決定した。ＨＰＬＣ−ＨＩＣに対して、サンプルを、流速０．５ｍｌ／分で、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ブチル−ＮＰＲカラム上で実行した。相Ａは、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、およびｐＨ６．９５での１．５Ｍの硫酸アンモニウムであった一方、相Ｂは、ｐＨ６．９５での７５％の２５ｍＭのリン酸ナトリウム、および２５％のイソプロピルアルコールであった。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析に対して、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、流速０．２５ｍｌ／分、２８０ｎＭで２５分間使用した。
【０２６２】
５．９．
[実施例９]
ジスルフィドリンカーに連結した化合物Ｃ（ＡＤＣ−２）の合成
化合物Ｃを、以下のスキーム７Ａ〜Ｂにおける一般的方法にしたがって、ジスルフィドリンカーに連結させた。
【０２６３】
【化１７】
2022500486.tif 000043
【０２６４】
【化１８】
2022500486.tif 000044
【０２６５】
５．９．１．  中間体Ａの合成
２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｌ２）（４ｇ、４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２×４０ｍｌ）で洗浄し、５０ｍｌのＤＣＭ内で１０分間膨潤させ、次いで排出させる。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｌ３）（７．０３ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、４０ｍｌのＤＣＭに溶解し、２−クロロトリチルクロリド樹脂を含有する容器に添加する。８．７ｍｌのＤＩＰＥＡ（６．８ｍｌ、４０ｍｍｏｌ）を容器に添加し、混合物をおよそ２１℃で２時間かき混ぜる。次いで、１０ｍｌのメタノールを混合物に添加し、３０分間かき混ぜる。次いで、得られた樹脂（Ｌ４）を排出させ、ＤＭＦで５回洗浄する。次いで、樹脂Ｌ４を脱保護して、ＤＭＦ中のおよそ４０ｍｌの２０％のピペリジンを樹脂Ｌ４に添加し、混合物を振とうし、次いで樹脂から液体を排出することにより、樹脂Ｌ５を生成する。ＤＭＦ中の別の４０ｍｌの２０％のピペリジンを、樹脂に添加し、１５分間振とうする。次いで、樹脂Ｌ５を、液体から排出させ、ＤＭＦ（６×４０ｍｌ）で洗浄する。
【０２６６】
Ｆｍｏｃ−アミノ酸の溶液は、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（４．９３ｇ、１２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（４．９３ｇ、１２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．７９ｇ、１２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（４．９３ｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（５．１ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ（４．５５ｇ、１２ｍｍｏｌ／１．６２ｇ、１２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）と別々に組み合わせて調製する。
【０２６７】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液を、樹脂Ｌ５に添加し、６０分間振とうして、樹脂Ｌ６を生成する。樹脂Ｌ６をＤＭＦ（６×４０ｍｌ）で洗浄し、次いで上記の通り、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで脱保護する。次いで、樹脂Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０を、Ｆｍｏｃ−アミノ酸溶液を使用する連続カップリングを実行することにより作製し、同じ手順を使用して、樹脂Ｌ５から樹脂Ｌ６を作製する。
【０２６８】
例示的な合成において、乾燥樹脂Ｌ１０（８ｇ）をフラスコに添加し、８０ｍｌの切断溶液を添加した（ＴＦＡ：ＴＥＳ：ＥＤＴ：Ｈ２Ｏ＝９０：５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。反応を１．５時間進行させた。次いで、樹脂を、加圧下で、濾過により反応混合物から分離した。次いで、樹脂をＴＦＡで２回洗浄した。濾液を合わせ、１０倍の体積の冷ＭＴＢＥを滴下添加した。次いで、沈殿したペプチド（中間体Ａ）を遠心分離し、冷ＭＴＢＥで４回洗浄した。次いで、中間体Ａを減圧下で乾燥し、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として１．１ｇの中間体Ａ（３７％の収率）を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７５２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２６９】
５．９．２．  ２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチルメチル（２−（４−（４−（４−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバメート（Ｌ１２）
化合物Ｃ（４０ｍｇ、０．１０３８ｍｍｏｌ）および４−ニトロフェニル２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチルカルバメート（Ｌ１１）（８０ｍｇ、０．２２７２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍｌ）およびＨＯＢｔ（１４ｍｇ、０．１０３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＮ２下のおよそ２１℃で１６時間撹拌して、Ｌ１２を生成した。粗Ｌ１２を、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として３５ｍｇの精製したＬ１２（５６％の収率）を得た。
【０２７０】
５．９．３．  （２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１９Ｓ）−１９−アミノ−５，８，１４−トリス（カルボキシメチル）−１１−（３−グアニジノプロピル）−２−（（（２−（メチル（２−（４−（４−（４−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバモイルオキシ）エチル）ジスルファニル）メチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキソ−３，６，９，１２，１５−ペンタアザイコサン−１，２０−二酸（Ｌ１３）
Ｌ１２（３５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（５ｍｌ／５ｍｌ）中の溶液に、中間体Ａ（８０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下で添加した。混合物をおよそ２１℃で１６時間撹拌して、Ｌ１３を生成した。粗Ｌ１３を、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として２３ｍｇの精製したＬ１３（３１％の収率）を生成した。
【０２７１】
５．９．４．  （２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１９Ｓ）−１９−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセトアミド）−５，８，１４−トリス（カルボキシメチル）−１１−（３−グアニジノプロピル）−２−（（（２−（メチル（２−（４−（４−（４−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバモイルオキシ）エチル）ジスルファニル）メチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキソ−３，６，９，１２，１５−ペンタアザイコサン−１，２０−二酸（Ｌ１５）
Ｌ１３（３２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）中の溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）アセテート（Ｌ１４）（２８ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を、続いてＴＥＡ（０．５ｍｌ）を添加した。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下のおよそ２１℃で１６時間撹拌して、Ｌ１５を生成した。粗Ｌ１５を、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として１２ｍｇの精製したＬ１５（３３％の収率）を生成した。
【０２７２】
５．９．５．  （２Ｒ，５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１９Ｓ）−１９−（２−（アミノオキシ）アセトアミド）−５，８，１４−トリス（カルボキシメチル）−１１−（３−グアニジノプロピル）−２−（（（２−（メチル（２−（４−（４（４−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピリジン−２−イル）フェノキシ）エチル）カルバモイルオキシ）エチル）ジスルファニル）メチル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキソ−３，６，９，１２，１５−ペンタアザイコサン−１，２０−二酸（ＡＤＣ−２）
Ｌ１５（１２ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍｌ）中の混合物に、ＴＦＡ（１ｍｌ）を添加した。混合物を、およそ２１℃で３０分間撹拌して、ＡＤＣ−２を生成した。粗ＡＤＣ−２を濃縮し、分取ＨＰＬＣにより精製して、白色固体として３．５ｍｇの精製したＡＤＣ−２（３１％の収率）を生成した。
【０２７３】
５．１０．
[実施例１０]
抗体薬物コンジュゲート２（ＡＤＣ２）の生成
ＡＤＣ−２を、以下のスキーム８における一般的方法にしたがって、抗体リジン残基を介して、抗ＴｆＲ抗体に結合した。
【０２７４】
【化１９】
2022500486.tif 000045
【０２７５】
ヘテロ二官能性重合体リンカーＳ−４ＦＢを、Ｓｏｌｕｌｉｎｋより購入した。ラット抗マウスＩｇＧ２ａ、および抗マウストランスフェリン受容体抗体Ｒ１７２１７を、ｐＨ７．４でＰＢＳ中で透析した。Ｓ−４ＦＢを、異なるモル比で、ｐＨ７．４でＰＢＳ中の抗体に添加し、およそ２１℃で３時間インキュベートした。Ｓ−４ＦＢ修飾した抗体溶液を、２−ヒドラジノピリジン溶液（１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液中に０．５ｍＭ、ｐＨ５．０）と合わせて、５〜５０の範囲の様々な複合比で、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｓ４ＦＢ／Ａｂモル置換比を、Ａ３５４でＵＶ−Ｖｉｓにより決定した。修飾した抗体を、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に交換した緩衝液を使用して精製し、次いで、リンカー−Ｓ−Ｓ−薬物ＡＤＣ−２（ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ）と、異なるモル比で、３７℃で２４時間混合して、ＡＤＣ２を生成した。次の日、ＡＤＣ２サンプルを、ＰＢＳに対して終夜透析した。サンプルを濾過し、次いでＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＬＣ−ＭＳを介して試験した。Ｓ−４ＦＢ／Ａｂ比６およびＡＤＣ−２／Ａｂ比２０で調製したＡＤＣ２に対する例示的なＬＣ−ＭＳデータは、図７に示す。図７は、試験したＡＤＣ２サンプルが平均でＤＡＲ４．９９であり、重鎖のＤＡＲが１．９７であり、軽鎖のＤＡＲが０．５３であることを示す。
【０２７６】
５％におけるＡＤＣ２凝集が、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより検出される場合、凝集した成分は、ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬ）を備えたＡＫＴＡにより分離し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより再び分析した。凝集体を除去するためにＳＥＣにより精製したＡＤＣ２のクロマトグラムは、図８に示す。
【０２７７】
５．１１．
[実施例１１]
抗体誘導性受容体の内在化アッセイ
９６ウェル平底プレートを、抗マウスＣＤ３ｅ抗体で終夜、４℃でコーティングした。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）細胞分離システム（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスの脾臓から分離した。およそ２×１０５個の細胞を、３７℃で２４〜４８時間、可溶性抗ＣＤ２８抗体を伴うウェルごとにプレーティングした。活性化されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を収集し、洗浄し、３７℃での示した時点で、５μｇ／ｍｌの一次（抗トランスフェリン受容体）抗体で再びプレーティングして、内在化を誘導した。反応を、氷冷染色緩衝液で停止し、氷上に維持して、内在化を停止させた。アッセイの終了時点で、細胞を、氷冷染色緩衝液で２回洗浄して、未結合抗体を除去した。細胞をペレット化し、次いでＰＥで染色し、ヤギ抗ラット二次抗体とコンジュゲートし、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で洗浄し、次いでＦＡＣＳを介する発現を分析した。図９に示す通り、ＴｆＲ発現は、１時間以内に初代ＣＤ４＋Ｔ細胞で内在化し始め、３時間以内に、ＴｆＲの７０％超が、抗トランスフェリン受容体抗体、Ｒ１７２１７により内在化される。
【０２７８】
５．１２．
[実施例１２]
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
５．１２．１．増殖アッセイ
マウスＣＴＬＬ２細胞を、０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ２中、細胞１×１０５個／ウェルで培養した。１ｎＭのＴＧＦ−βで示される各ウェルに、１μｇ／ｍｌのＡＤＣ、および／または１００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤化合物Ｃを、２４時間ウェルに添加した。増殖を、各ウェルにＢｒｄＵ試薬（Ａｂｃａｍ）をさらに１２時間添加することにより定量化し、次いでＥＬＩＳＡにより分析した。
【０２７９】
図１０で示す通り、ＴＧＦ−βでのＣＴＬＬ２細胞の処置により、およそ６０％の増殖が阻害された。しかし、ＡＤＣ１（ＤＡＲ２−４、４−６、または６−８）を追加することにより、ＡＬＫ５阻害剤単独での細胞の処置と同様に、ＴＧＦ−β阻害はほぼ完全に逆転し、ＣＴＬＬ２増殖は回復した。ラット抗マウスＩｇＧ２ＡアイソタイプコントロールＡＬＫ５  ＡＤＣで処置された細胞は、ＣＴＬＬ２増殖は回復しなかった。ＴＧＦ−βを伴わないＡＤＣ１で処置されるか、または裸のＴｆｒ抗体単独で処置される細胞において、増殖の阻害は起こらず、これは、ＴＧＦ−βが存在しない限り、ＡＤＣ１は増殖に影響を及ぼさないことを示した（データは示さず）。
【０２８０】
５．１２．２．グランザイムＢ発現アッセイ
マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＴ細胞分離キット（ネガティブ選択）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスの脾臓から精製した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３ｅ、および可溶性抗ＣＤ２８を使用する前に、４８時間活性化した。Ｔ細胞を、洗浄し、５％の血清および１ｎＭのＴＧＦ−β  −／＋ＡＤＣを含む培地に再びプレーティングした。
【０２８１】
ゴルジストップ試薬を、最後の４時間添加し、次いで細胞を、表面のＣＤ８（ＢＤ）および細胞内のＧｚｍＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対して免疫染色し、フローサイトメトリーを介して分析した。グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により腫瘍細胞を死滅させるために放出される、セリンプロテアーゼである。ゆえに、ＧｚｍＢの発現の増加は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞活性を示す。
【０２８２】
図１１に示す通り、ＴＧＦ−βが、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧｚｍＢ発現を抑制するが、３つのＤＡＲ、２−４、４−６、および６−８の全てのＡＤＣ１での処置はまた、ＡＬＫ５化合物と同等に、ＧｚｍＢ発現を回復することができた。加えて、ラット抗マウスＩｇＧ２ＡアイソタイプコントロールＡＬＫ５  ＡＤＣは、ＧｚｍＢ発現を回復しなかった。
【０２８３】
５．１２．３．ｉＴｒｅｇ転換アッセイ
ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、ネガティブ選択キットを使用して、分離したマウス脾臓細胞から分離した。細胞密度を、細胞０．４×１０６個／ｍｌに調節し、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、および１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８を、細胞懸濁液に添加した。
【０２８４】
１０μｇ／ｍｌでの抗マウスＣＤ３抗体を、２４ウェルプレート上にコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。次いで、抗体をプレートから吸引した。１ｍｌの細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。３μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌでのＡＤＣ１（ＤＡＲ４−６）、抗トランスフェリン受容体抗体、ラット抗マウスＩｇＧ２ＡアイソタイプコントロールＡＬＫ５  ＡＤＣ、ならびに１００ｎＭおよび１μＭでのＡＬＫ５阻害剤化合物Ｃを、２４ウェルプレートの別個のウェルに添加した。次いで、細胞を７２時間培養した。ＴｆＲ発現を、４８時間の時点で試験した（データは示さず）。細胞をＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３染色緩衝液）で染色し、７２時間の時点でＦＡＣＳにより選別した。
【０２８５】
図１２に示す通り、５μｇ／ｍｌでのＡＤＣ１（＋ＣＤ７１−ＡＬＫ５  ＡＤＣ）は、１００ｎＭの遊離ＡＬＫ５阻害剤単独（＋ＡＬＫ５  ｉｎｈ  １００ｎＭ）と同様に、生成されるｉＴｒｅｇの量を適度に減少させる。対照的に、コントロールＡＬＫ５  ＡＤＣ（＋Ｉｓｏ−ＡＬＫ５  ＡＤＣ）および裸の抗ＴｆＲ抗体（＋抗ＣＤ７１）は、ｉＴｒｅｇ  ＦｏｘＰ３発現に効果がなかった。
【０２８６】
５．１３．
[実施例１３]
化合物Ｎの合成および特徴付け
化合物Ｎを、以下のスキーム９における一般的方法にしたがって合成した。
【０２８７】
【化２０】
2022500486.tif 000046
【０２８８】
化合物Ｎを、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、化合物Ｃと比較した。組換えキナーゼアッセイにおけるそのＩＣ５０活性およびそのＫｉ値の概要は、表６に示す。表６はまた、ヒトＨＥＫ細胞およびマウスＴ細胞における、化合物ＣのＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害活性も示す。化合物Ｃは、組換えアッセイにおいて、化合物Ｎより１０倍強力であることが分かった。
【０２８９】
【表６】
2022500486.tif 000047
【０２９０】
５．１４．
[実施例１４]
Ｔ細胞へのＣＤ２およびＣＤ５の内在化
２つの異なる内在化研究を実施して、それぞれ、抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ５抗体でのＴ細胞のインキュベーションに続く、ＣＤ２およびＣＤ５の内在化を測定した。
【０２９１】
５．１４．１．研究１：抗体ウォッシュアウトなし
マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）で３６時間活性化した。細胞を洗浄し、１μｇ／ｍｌのラット抗マウスＣＤ２抗体（クローン１２−１５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１５２５）、ラット抗マウスＣＤ５抗体（クローン５３−７．３、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１５４７）、または、ラットアイソタイプコントロール抗体で、示された時点（０、１５分、または０．５、１、３、もしくは６時間）、３７℃でインキュベートした。各時点で、アッセイを、氷上に細胞を配置することにより停止させた。ＣＤ２およびＣＤ５の発現を、蛍光的にコンジュゲートした二次抗体を使用して検出した。
【０２９２】
６時間の時点で、ＣＤ５の６０％超、およびＣＤ２の５０％超が、マウスＣＤ３＋Ｔ細胞内で内在化した（それぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
【０２９３】
５．１４．２．研究２：抗体ウォッシュアウト
研究１を、遊離抗体を４℃で３０分間、細胞でインキュベートした以外を繰り返して、細胞表面の受容体全てを飽和した。上澄みに残る抗体を、時間経過を開始する前に洗い流した。
【０２９４】
６時間の時点で、ＣＤ５のほぼ９０％、およびＣＤ２の５０％超が、マウスＣＤ３＋Ｔ細胞内で内在化した（それぞれ図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。
【０２９５】
５．１４．３．考察
研究１において、新規で再循環した受容体は、存在する場合、時間経過の間、細胞表面に近づき、培地の遊離抗体と結合することができた。研究２において、時間経過を開始する時点で存在する、その受容体の内在化のみをモニタリングできるために、未結合抗体を時間経過を開始する前に洗い流した。ＣＤ２に対して、研究１および研究２の結果は、類似しており、ＣＤ２が、迅速に反転しないことを示唆している。ＣＤ５に対して、ウォッシュアウト研究（研究２）において内在化が約２０％増加し、これは新規の受容体が、６時間の時間経過にわたって、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成により再循環するか、または増加するかのいずれかだったことを示している。大量のｄｅ  ｎｏｖｏ合成が、６時間の時間経過にわたって予測されないので、再循環が可能性の高い選択肢であると考えられる。ゆえに、研究１および研究２の結果により、ＣＤ５が、ＣＤ２より多く細胞表面へと再循環する可能性があることを示唆している。
【０２９６】
５．１５．
[実施例１５]
ＡＤＣ標的化ＣＤ２およびＣＤ５の生成および特徴付け
５．１５．１．実施例１５：ＡＤＣの生成
本実施例においてＴ細胞標的ＴＧＦ−βアンタゴニスト（Ｔ３Ａ）と称する、４つのＡＬＫ５−ＡＤＣを、ラット抗マウスＣＤ２抗体（クローン１２−１５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１５２５）、およびラット抗マウスＣＤ５抗体（クローン５３−７．３、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１５４７）を使用して作製した。２つのリンカー−ＡＬＫ５阻害剤ペイロードを使用して、Ｔ３Ａを作製したが、そのうちの１つは、ＡＬＫ５−化合物Ｃに結合した切断可能Ｖａｌ−Ｃｉｔ（ＶＣ）リンカーを含み、もう１つは、化合物Ｎに結合した非切断可能マレイミドカプロイル（ＭＣ）リンカーを含む。
【０２９７】
４つのＴ３Ａの抗体、リンカー、およびＡＬＫ５ペイロードの組合せは、表７に示す。
【０２９８】
【表７】
2022500486.tif 000048
【０２９９】
Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、薬物抗体比を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により計算した。Ｔ３Ａ  ＃２〜＃５のそれぞれに対する％凝集、％未結合抗体、およびＤＡＲ値は、表８に示す。
【０３００】
【表８】
2022500486.tif 000049
【０３０１】
５．１５．２．ＡＤＣの特徴付け
逆転するＴＧＦ−β媒介性免疫抑制におけるＴ３Ａ  ＃２〜５の効能を決定するために、マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を、脾臓から精製し、１ｎＭのＴＧＦ−β、および小分子ＡＬＫ５阻害剤化合物Ｃ（陽性対照）、Ｔ３Ａ  ＃２〜５、またはアイソタイプコントロールＴ３Ａ（陰性対照）の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で３６〜７２時間活性化した。３６時間後、グランザイム（ＧｚｍＢ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを、細胞毒性のマーカーとして測定し（図１４）、分泌したサイトカインＩＬ２のレベル（図１５）およびＩＦＮ−γのレベル（図１６）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。最終的に、７２時間後、Ｔ細胞増殖の量を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した（図１７）。これらのアッセイの全ては、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍クリアランスに関連がある。
【０３０２】
活性化Ｔ細胞に関連して観察される機能の量（１００％に設定）は、図１４〜図１７のそれぞれに示す。Ｔ３Ａ  ＃５は、ＧｚｍＢ発現およびＴ細胞増殖を回復したが、ＩＦＮ−γ発現を部分的にのみ回復した。ＩＬ２発現への効果は観察されなかった。
【０３０３】
５．１５．３．考察
上記の実施例のデータは、Ｔ細胞での標的発現のレベルが、初代Ｔ細胞アッセイでの効能に重要であることを示す。ＣＤ２およびＣＤ５の両方は、活性Ｔ細胞の２０〜５０％で高発現されるのみであるＣＤ７１と異なり、ナイーブＴ細胞および活性化Ｔ細胞の両方の８５％超で、高発現される。しかし、ＣＤ２およびＣＤ５の両方が、Ｔ細胞で高発現されるが、ＣＤ５標的化ＡＤＣは、ＣＤ２標的化ＡＤＣより高い効能を有することが観察された。実施例１４において、ＣＤ２およびＣＤ５で観察される受容体内在化のパターンに基づいて、６時間の時点で、初代マウスＴ細胞に、ＣＤ５の約８５％は内在化されたが、ＣＤ２の５３％のみが内在化された。加えて、ＣＤ５は、ＣＤ２より早く内在化を開始すると思われた。このデータは、内在化の量も効能に影響を及ぼすことを示す。
【０３０４】
データはまた、ＡＬＫ５阻害剤を抗体に結合させるリンカー、および放出機構が、両方とも効能に重要であることも示す。抗ＣＤ５抗体（Ｔ３Ａ  ＃５）と組み合わせたカテプシンＢ切断可能ＶＣリンカーは、最も有効なＴ３Ａだった。しかし、抗ＣＤ５抗体（Ｔ３Ａ  ＃４）リンカーと組み合わせた非切断可能ＭＣは、同様に抗ＣＤ５抗体と結合する場合、いくつかの活性を有した。
【０３０５】
初代マウスＴ細胞での試験に基づいて、Ｔ３Ａは、以下の通り、効能をランク付けることができる：１）Ｔ３Ａ  ＃５、２）Ｔ３Ａ  ＃４、３）Ｔ３Ａ  ＃３、および４）Ｔ３Ａ  ＃２。
【０３０６】
理論に制約されるものではないが、高いＡＤＣ活性に対して、ＡＤＣは、ナイーブＴ細胞および活性化Ｔ細胞にわたり広範囲で発現し（例えば、７０％以上の細胞で発現）、迅速に内在化し、確立した細胞内放出機構（例えばタンパク質分解プロセシング）を有する、Ｔ細胞標的を標的化すべきであると考えられる。
【０３０７】
５．１６．
[実施例１６]
Ｔ細胞へのＣＤ７の内在化
内在化研究を実施して、２つの異なる抗ＣＤ７抗体でのＴ細胞のインキュベーションに続く、ＣＤ７の内在化を測定した。
【０３０８】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）で４０時間活性化した。細胞を洗浄し、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ７抗体（クローン１２４−Ｄ１および４Ｈ９、Ｃａｐｒｉｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはラットアイソタイプコントロール抗体で、４℃で３０分間インキュベートして、細胞表面の受容体全てを飽和した。上澄みに残る抗体を洗い流し、次いで細胞を３７℃で０〜６時間インキュベートした。各時点（５、１５、３０、６０、１８０、および３６０分）で、アッセイを、氷上に細胞を配置することにより停止させた。ＣＤ７の発現を、蛍光的にコンジュゲートした二次抗体を使用して検出した。
【０３０９】
６時間の時点で、ＣＤ７のほぼ７０〜８０％を内在化した（図１８）。内在化の量をＣＤ２およびＣＤ５と同等に、ＡＤＣ標的としてＣＤ７の適合性が示された。
【０３１０】
６．具体的な実施形態
本開示は、以下の具体的な実施形態により例示される。
１．Ｔ細胞表面分子に結合する抗体または抗原結合性断片に作動可能に連結されたＡＬＫ５阻害剤を含む、抗体−ＡＬＫ５阻害剤コンジュゲート（ＡＤＣ）。
２．ＡＬＫ５阻害剤のＩＣ５０が、少なくとも２０ｎＭである、実施形態１に記載のＡＤＣ。
３．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール系化合物、ピラゾール系化合物、またはチアゾール系化合物である、実施形態１または実施形態２に記載のＡＤＣ。
４．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
５．ＡＬＫ５阻害剤が、ピラゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
６．ＡＬＫ５阻害剤が、チアゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
７．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、またはイミダゾール−キノキサリン化合物である、イミダゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
８．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物である、実施形態７に記載のＡＤＣ。
９．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−キノキサリン化合物である、実施形態７に記載のＡＤＣ。
１０．ＡＬＫ５阻害剤が、ピラゾール−ピロロ化合物である、ピラゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
１１．ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、またはチアゾール系化合物である、実施形態３に記載のＡＤＣ。
１２．ＡＬＫ５阻害剤が、リンカーを介して、抗体または抗原結合性断片に連結されている、実施形態１から１１のいずれかに記載のＡＤＣ。
１３．リンカーが、非切断可能リンカーである、実施形態１２に記載のＡＤＣ。
１４．非切断可能リンカーが、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート、マレイミドカプロイル、またはメルカプトアセトアミドカプロイルリンカーである、実施形態１３に記載のＡＤＣ。
１５．非切断可能リンカーが、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン１−カルボキシレートリンカーである、実施形態１４に記載のＡＤＣ。
１６．非切断可能リンカーが、マレイミドカプロイルリンカーである、実施形態１４に記載のＡＤＣ。
１７．非切断可能リンカーが、メルカプトアセトアミドカプロイルリンカーである、実施形態１４に記載のＡＤＣ。
１８．リンカーが、切断可能リンカーである、実施形態１２に記載のＡＤＣ。
１９．切断可能リンカーが、ジペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーである、実施形態１８に記載のＡＤＣ。
２０．切断可能リンカーが、ジペプチドリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２１．切断可能リンカーが、ジスルフィドリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２２．切断可能リンカーが、ヒドラゾンリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２３．リンカーが、プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンジペプチドリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２４．リンカーが、グルタチオン感受性ジスルフィドリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２５．リンカーが、酸感受性ジスルフィドリンカーである、実施形態１９に記載のＡＤＣ。
２６．ＡＬＫ５阻害剤が、部位特異的コンジュゲーションを介して、抗原または抗原結合性断片にコンジュゲートされる、実施形態１から２５のいずれかに記載のＡＤＣ。
２７．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数のシステイン、リジン、またはグルタミン残基を介してコンジュゲートされる、実施形態２６に記載のＡＤＣ。
２８．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数のシステイン残基を介してコンジュゲートされる、実施形態２７に記載のＡＤＣ。
２９．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数のリジン残基を介してコンジュゲートされる、実施形態２７に記載のＡＤＣ。
３０．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数のグルタミン残基を介してコンジュゲートされる、実施形態２７に記載のＡＤＣ。
３１．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる、実施形態２６に記載のＡＤＣ。
３２．１つまたは複数の非天然アミノ酸残基が、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を含む、実施形態３１に記載のＡＤＣ。
３３．１つまたは複数の非天然アミノ酸残基が、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）を含む、実施形態３１に記載のＡＤＣ。
３４．１つまたは複数の非天然アミノ酸残基が、セレノシステイン（Ｓｅｃ）を含む、実施形態３１に記載のＡＤＣ。
３５．ＡＬＫ５阻害剤が、抗体または抗原結合性断片上の１つまたは複数のグリカンを介してコンジュゲートされる、実施形態２６に記載のＡＤＣ。
３６．１つまたは複数のグリカンが、フコースを含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
３７．１つまたは複数のグリカンが、６−チオフコースを含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
３８．１つまたは複数のグリカンが、ガラクトースを含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
３９．１つまたは複数のグリカンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
４０．１つまたは複数のグリカンが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
４１．１つまたは複数のグリカンが、シアル酸（ＳＡ）を含む、実施形態３５に記載のＡＤＣ。
４２．ＡＬＫ５阻害剤が、リンカーを介してコンジュゲートされる、実施形態２６から４１のいずれかに記載のＡＤＣ。
４３．抗体または抗原結合性断片分子当たりのＡＬＫ５阻害剤分子の平均数が、２〜８の範囲である、実施形態１から４２のいずれかに記載のＡＤＣ。
４４．抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１から４３のいずれかに記載のＡＤＣ。
４５．抗体が、ヒトまたはヒト化である、実施形態４４に記載のＡＤＣ。
４６．抗体が、ヒトである、実施形態４５に記載のＡＤＣ。
４７．抗体が、ヒト化である、実施形態４５に記載のＡＤＣ。
４８．抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片である、実施形態１から４７のいずれかに記載のＡＤＣ。
４９．抗原結合性断片が、Ｆａｂである、実施形態４８に記載のＡＤＣ。
５０．抗原結合性断片が、Ｆａｂ’である、実施形態４８に記載のＡＤＣ。
５１．抗原結合性断片が、Ｆ（ａｂ’）２である、実施形態４８に記載のＡＤＣ。
５２．抗原結合性断片が、Ｆｖ断片である、実施形態４８に記載のＡＤＣ。
５３．抗原結合性断片が、ヒトまたはヒト化抗体の抗原結合性断片である、実施形態４８から５２のいずれかに記載のＡＤＣ。
５４．抗原結合性断片が、ヒト抗体の抗原結合性断片である、実施形態５３に記載のＡＤＣ。
５５．抗原結合性断片が、ヒト化抗体の抗原結合性断片である、実施形態５３に記載のＡＤＣ。
５６．抗体を含む、実施形態１から４７のいずれかに記載のＡＤＣ。
５７．抗原結合性断片を含む、実施形態１から５５のいずれかに記載のＡＤＣ。
５８．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１８４、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１である、実施形態１から５７のいずれかに記載のＡＤＣ。
５９．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６０．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ２である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６１．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ３である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６２．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ４である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６３．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６４．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ６である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６５．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ７である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６６．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ８である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６７．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ２５である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６８．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ２８である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
６９．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ７０である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７０．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ７１である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７１．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１０３である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７２．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１８４である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７３．Ｔ細胞表面分子が、Ｔｉｍ３である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７４．Ｔ細胞表面分子が、ＬＡＧ３である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７５．Ｔ細胞表面分子が、ＣＴＬＡ４である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７６．Ｔ細胞表面分子が、ＰＤ１である、実施形態５８に記載のＡＤＣ。
７７．Ｔ細胞表面分子が、エンドソームを通して再循環することが可能なＴ細胞表面分子である、実施形態１から５７のいずれかに記載のＡＤＣ。
７８．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５またはＣＤ７である、実施形態７７に記載のＡＤＣ。
７９．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５である、実施形態７８に記載のＡＤＣ。
８０．Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ７である、実施形態７８に記載のＡＤＣ。
８１．エフェクター機能を低下させる、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む、実施形態１から８０のいずれかに記載のＡＤＣ。
８２．１つまたは複数の置換が、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ：Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａ、またはＬ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む、実施形態８１に記載のＡＤＣ。
８３．１つまたは複数の置換が、Ｎ２９７Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８４．１つまたは複数の置換が、Ｎ２９７Ｑを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８５．１つまたは複数の置換が、Ｎ２９７Ｇを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８６．１つまたは複数の置換が、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８７．１つまたは複数の置換が、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８８．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３５Ｅを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
８９．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９０．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９１．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ：Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９２．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９３．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９４．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９５．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９６．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９７．１つまたは複数の置換が、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋ：Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む、実施形態８２に記載のＡＤＣ。
９８．実施形態１から９７のいずれかに記載のＡＤＣ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
９９．がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１から９７のいずれかに記載のＡＤＣ、または実施形態９８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
１００．がんが、免疫原性がんである、実施形態９９に記載の方法。
１０１．がんが、腫瘍抗原を発現する充実性腫瘍である、実施形態１００に記載の方法。
１０２．腫瘍抗原が、ｇｐ１００、メランＡ、またはＭＡＧＥ  Ａ１である、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．腫瘍抗原が、ｇｐ１００である、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．腫瘍抗原が、メランＡである、実施形態１０２に記載の方法。
１０５．腫瘍抗原が、ＭＡＧＥ  Ａ１である、実施形態１０２に記載の方法。
１０６．がんが、免疫性浸潤を含む充実性腫瘍である、実施形態９９に記載の方法。
１０７．がんが、免疫療法により処置可能である、実施形態９９から１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．免疫療法が、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、またはＴ細胞チェックポイント阻害剤療法である、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．免疫療法が、サイトカイン療法である、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．免疫療法が、養子Ｔ細胞療法である、実施形態１０８に記載の方法。
１１１．免疫療法が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法である、実施形態１０８に記載の方法。
１１２．免疫療法が、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤療法である、実施形態１０８に記載の方法。
１１３．Ｔ細胞チェックポイント阻害剤が、ＰＤ１、ＰＤＬ１、またはＣＴＬＡ４の阻害剤である、実施形態１０８または実施形態１１２に記載の方法。
１１４．Ｔ細胞チェックポイント阻害剤が、ＰＤ１の阻害剤である、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．Ｔ細胞チェックポイント阻害剤が、ＰＤＬ１の阻害剤である、実施形態１１３に記載の方法。
１１６．Ｔ細胞チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ４の阻害剤である、実施形態１１３に記載の方法。
１１７．がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肝がん、尿路上皮がん、腎がん、乳がん、または黒色腫である、実施形態９９から１１６のいずれかに記載の方法。
１１８．がんが、ＮＳＣＬＣである、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．がんが、肝がんである、実施形態１１７に記載の方法。
１２０．肝がんが、肝細胞癌である、実施形態１２０に記載の方法。
１２１．がんが、尿路上皮がんである、実施形態１１７に記載の方法。
１２２．がんが、膀胱がんである、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．がんが、腎がんである、実施形態１１７に記載の方法。
１２４．がんが、乳がんである、実施形態１１７に記載の方法。
１２５．がんが、黒色腫である、実施形態１１７に記載の方法。
１２６．がんが、ＡＬＫ５阻害剤により処置可能である、実施形態９９から１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．ＡＤＣまたは医薬組成物が、単独療法として投与される、実施形態９９から１２６のいずれかに記載の方法。
１２８．ＡＤＣまたは医薬組成物が、併用療法レジメンの一部として投与される、実施形態９９から１２６のいずれかに記載の方法。
１２９．ＡＤＣまたは医薬組成物が、標準ケアの療法または治療レジメンと組み合わせて投与される、実施形態１２８に記載の方法。
【０３１１】
様々な具体的な実施形態が例示および記載されるが、本開示の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変化がなされ得ることが理解されよう。
【０３１２】
７．参照文献の引用
本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文献は、各刊行物、特許、特許出願、または他の文献が、個別に、全ての目的に対して参照により組み込まれると示されるのと同様の程度まで、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および本開示に組み込まれる参照文献の１つまたは複数の教示の間に不一致がある場合、本明細書の教示が意図される。
【図１】
2022500486.tif 000050
【図２】
2022500486.tif 000051
【図３】
2022500486.tif 000052
【図４】
2022500486.tif 000053
【図５Ａ−Ｂ】
2022500486.tif 000054
【図５Ｃ−Ｄ】
2022500486.tif 000055
【図６Ａ】
2022500486.tif 000056
【図６Ｂ−Ｃ】
2022500486.tif 000057
【図７】
2022500486.tif 000058
【図８】
2022500486.tif 000059
【図９Ａ−Ｂ】
2022500486.tif 000060
【図９Ｃ−Ｄ】
2022500486.tif 000061
【図９Ｅ−Ｆ】
2022500486.tif 000062
【図１０】
2022500486.tif 000063
【図１１】
2022500486.tif 000064
【図１２】
2022500486.tif 000065
【図１３Ａ−Ｂ】
2022500486.tif 000066
【図１３Ｃ−Ｄ】
2022500486.tif 000067
【図１４】
2022500486.tif 000068
【図１５】
2022500486.tif 000069
【図１６】
2022500486.tif 000070
【図１７】
2022500486.tif 000071
【図１８】
2022500486.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】令和3年7月6日(2021.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞表面分子に結合する抗体または抗原結合性断片に作動可能に連結されたＡＬＫ５阻害剤を含む、抗体−ＡＬＫ５阻害剤コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２】
前記ＡＬＫ５阻害剤のＩＣ５０が、少なくとも２０ｎＭである、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ｎ−メチル−２−（４−｛４−［３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝フェノキシ）エタン−１−アミンである、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール系化合物、ピラゾール系化合物、またはチアゾール系化合物である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項５】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、またはチアゾール系化合物である、請求項４に記載のＡＤＣ。
【請求項６】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、非切断可能リンカーまたは切断可能リンカーを介して、前記抗体またが抗原結合性断片に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項７】
Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート、マレイミドカプロイル、またはメルカプトアセトアミドカプロイルリンカーである非切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、請求項６に記載のＡＤＣ。
【請求項８】
ジペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーである切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、請求項６に記載のＡＤＣ。
【請求項９】
前記リンカーが、プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンジペプチドリンカー、グルタチオン感受性ジスルフィドリンカー、または酸感受性ジスルフィドリンカーである、請求項８に記載のＡＤＣ。
【請求項１０】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のシステイン残基、または、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のリジン残基を介してコンジュゲートされ、任意で前記ＡＬＫ５阻害剤が、リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１１】
抗体または抗原結合性断片分子当たりのＡＬＫ５阻害剤分子の平均数が、２〜８の範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１２】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１３】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化である、請求項１２に記載のＡＤＣ。
【請求項１４】
前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１５】
前記抗原結合性断片が、ヒトまたはヒト化抗体の抗原結合性断片である、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１８４、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞表面分子が、エンドソームを通して再循環することが可能なＴ細胞表面分子である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５またはＣＤ７である、請求項１７に記載のＡＤＣ。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＣ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
がんを処置するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む、組成物。
【請求項２２】
前記がんが、
（ａ）免疫原性がんであるか；
（ｂ）免疫性浸潤を含む、充実性腫瘍であるか；
（ｃ）免疫療法により処置可能である、充実性腫瘍であるか；または
（ｄ）ＡＬＫ５阻害剤により処置可能である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記がんが、腫瘍抗原を発現する充実性腫瘍である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記がんが、免疫療法により処置可能であり、前記免疫療法が、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、またはＴ細胞チェックポイント阻害剤療法である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＡＤＣが、単独療法として、または併用療法レジメンの一部として投与される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＡＤＣの、がんを処置するための医薬の製造における使用。
【請求項２７】
前記がんが、
（ａ）免疫原性がんであるか；
（ｂ）免疫性浸潤を含む、充実性腫瘍であるか；
（ｃ）免疫療法により処置可能である、充実性腫瘍であるか；または
（ｄ）ＡＬＫ５阻害剤により処置可能である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記がんが、腫瘍抗原を発現する充実性腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記がんが、免疫療法により処置可能であり、前記免疫療法が、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、またはＴ細胞チェックポイント阻害剤療法である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記医薬が、単独療法として、または併用療法レジメンの一部として投与される、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
７．参照文献の引用
本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文献は、各刊行物、特許、特許出願、または他の文献が、個別に、全ての目的に対して参照により組み込まれると示されるのと同様の程度まで、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および本開示に組み込まれる参照文献の１つまたは複数の教示の間に不一致がある場合、本明細書の教示が意図される。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．Ｔ細胞表面分子に結合する抗体または抗原結合性断片に作動可能に連結されたＡＬＫ５阻害剤を含む、抗体−ＡＬＫ５阻害剤コンジュゲート（ＡＤＣ）。
２．前記ＡＬＫ５阻害剤のＩＣ５０が、少なくとも２０ｎＭである、請求項１に記載のＡＤＣ。
３．前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール系化合物、ピラゾール系化合物、またはチアゾール系化合物である、上記１に記載のＡＤＣ。
４．前記ＡＬＫ５阻害剤が、イミダゾール−ベンゾジオキソール化合物、イミダゾール−キノキサリン化合物、ピラゾール−ピロロ化合物、またはチアゾール系化合物である、上記３に記載のＡＤＣ。
５．前記ＡＬＫ５阻害剤が、非切断可能リンカーまたは切断可能リンカーを介して、前記抗体またが抗原結合性断片に連結されている、上記１に記載のＡＤＣ。
６．Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート、マレイミドカプロイル、またはメルカプトアセトアミドカプロイルリンカーである非切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、上記５に記載のＡＤＣ。
７．ジペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーである切断可能リンカーを介して、前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体または抗原結合性断片に連結されている、上記５に記載のＡＤＣ。
８．前記リンカーが、プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンジペプチドリンカー、グルタチオン感受性ジスルフィドリンカー、または酸感受性ジスルフィドリンカーである、上記７に記載のＡＤＣ。
９．前記ＡＬＫ５阻害剤が、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のシステイン残基、または、前記抗体もしくは抗原結合性断片上の１つもしくは複数のリジン残基を介してコンジュゲートされ、任意で前記ＡＬＫ５阻害剤が、リンカーを介してコンジュゲートされる、上記１に記載のＡＤＣ。
１０．抗体または抗原結合性断片分子当たりのＡＬＫ５阻害剤分子の平均数が、２〜８の範囲である、上記１に記載のＡＤＣ。
１１．前記抗体が、モノクローナル抗体である、上記１に記載のＡＤＣ。
１２．前記抗体が、ヒトまたはヒト化である、上記１１に記載のＡＤＣ。
１３．前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片である、上記１に記載のＡＤＣ。
１４．前記抗原結合性断片が、ヒトまたはヒト化抗体の抗原結合性断片である、上記１３に記載のＡＤＣ。
１５．前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ１０３、ＣＤ１８４、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１である、上記１に記載のＡＤＣ。
１６．前記Ｔ細胞表面分子が、エンドソームを通して再循環することが可能なＴ細胞表面分子である、上記１に記載のＡＤＣ。
１７．前記Ｔ細胞表面分子が、ＣＤ５またはＣＤ７である、上記１６に記載のＡＤＣ。
１８．上記１に記載のＡＤＣ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１９．がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、上記１に記載のＡＤＣを投与することを含む、方法。
２０．前記がんが、
（ａ）免疫原性がんであるか；
（ｂ）免疫性浸潤を含む、充実性腫瘍であるか；
（ｃ）免疫療法により処置可能である、充実性腫瘍であるか；または
（ｄ）ＡＬＫ５阻害剤により処置可能である、上記１９に記載の方法。
２１．前記がんが、腫瘍抗原を発現する充実性腫瘍である、上記２０に記載の方法。
２２．前記がんが、免疫療法により処置可能であり、前記免疫療法が、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、またはＴ細胞チェックポイント阻害剤療法である、上記２０に記載の方法。
２３．前記ＡＤＣが、単独療法として、または併用療法レジメンの一部として投与される、上記１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2022500486.tif 000073