【手続補正書】
【提出日】平成22年9月17日(2010.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）スルホチロシンである第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、
（ｄ）該当蛋白質をコードする核酸を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡと前記スルホチロシンと配列番号４、６、８又は１０のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記スルホチロシンで優先的にアミノアシル化し、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される翻訳系。
【請求項２】
（ａ）前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される；
（ｂ）前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される；
（ｃ）前記第１のＯ−ＲＳが配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体を含む；
（ｄ）前記第１のＯ−ＲＳが配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含み、かつ該保存変異体が配列番号４、６、８又は１０のいずれか１つと少なくとも９０％一致する；
（ｅ）前記第１のＯ−ＲＳが配列番号２の保存変異体であるアミノ酸配列を含み、該保存変異体が配列番号２と少なくとも９０％一致し、かつＴｙｒ３２に相当する位置のロイシン、Ｌｅｕ６５に相当する位置のプロリン、Ｇｌｎ１５５に相当する位置のグルタミン酸、Ａｓｐ１５８に相当する位置のグリシン、Ｉｌｅ１５９に相当する位置のシステイン又はスレオニン、及びＬｅｕ１６２に相当する位置のリシンよりなる群から選ばれた２種以上のアミノ酸を含む；或いは
（ｆ）前記第１のＯ−ＲＳが配列番号５、７、９又は１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる；
請求項１の翻訳系。
【請求項３】
前記系が前記第１のＯ−ＲＳと前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む宿主細胞を含み、
（ａ）前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸を含む；
（ｂ）前記宿主細胞が真性細菌細胞である；
（ｃ）前記宿主細胞が大腸菌である；
（ｄ）前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む；
（ｅ））前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む；或いは
（ｆ）前記宿主細胞が前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせを含む；
請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）スルホチロシンである第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（なお、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１のＯ−ｔＲＮＡと前記スルホチロシンと配列番号４、６、８又は１０のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記スルホチロシンで優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を準備する段階と；
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込んだ前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項５】
（ａ）翻訳系を準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む；
（ｂ）翻訳系を準備する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを準備する段階を含む；
（ｃ）翻訳系を準備する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを準備する段階を含む；
（ｄ）翻訳系を準備する前記段階が配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体を含むＯ−ＲＳを準備する段階を含む；
（ｅ）翻訳系を準備する前記段階が配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むＯ−ＲＳを準備する段階を含み、該保存変異体が配列番号４、６、８又は１０のいずれか１つと少なくとも９０％一致する；
（ｆ）翻訳系を準備する前記段階が配列番号２の保存変異体であるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを準備する段階を含み、該保存変異体が配列番号２と少なくとも９０％一致し、かつＴｙｒ３２に相当する位置のロイシン、Ｌｅｕ６５に相当する位置のプロリン、Ｇｌｎ１５５に相当する位置のグルタミン酸、Ａｓｐ１５８に相当する位置のグリシン、Ｉｌｅ１５９に相当する位置のシステイン又はスレオニン、及びＬｅｕ１６２に相当する位置のリシンよりなる群から選ばれた２種以上のアミノ酸を含む；
（ｇ）翻訳系を準備する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを準備する段階を含む；
（ｈ）翻訳系を準備する前記段階が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は該配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを準備する段階を含む；
（ｉ）翻訳系を準備する前記段階が宿主細胞を準備する段階を含み、該宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む；
（ｊ）翻訳系を準備する前記段階が細胞抽出液を準備する段階を含む；或いは
（ｋ）翻訳系を準備する前記段階が前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかの組み合わせを含む；
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）宿主細胞を準備する前記段階が真正細菌宿主細胞を準備する段階を含む；
（ｂ）宿主細胞を準備する前記段階が大腸菌宿主細胞を準備する段階を含む；
（ｃ）宿主細胞を準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を準備する段階を含む；
（ｄ）宿主細胞を準備する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を準備する段階を含み、前記ポリヌクレオチドが配列番号５、７、９又は１１に記載の配列を含む；或いは
（ｅ）宿主細胞を準備する前記段階が前記（ａ）〜（ｄ）の組み合わせを含む；
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む；
（ｂ）配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含み、該保存変異体が配列番号４、６、８又は１０に記載のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％一致する；或いは
（ｃ）配列番号２の保存変異体であるアミノ酸配列をＯ−ＲＳを含み、該保存変異体が配列番号２と少なくとも９０％一致し、かつＴｙｒ３２に相当する位置のロイシン、Ｌｅｕ６５に相当する位置のプロリン、Ｇｌｎ１５５に相当する位置のグルタミン酸、Ａｓｐ１５８に相当する位置のグリシン、Ｉｌｅ１５９に相当する位置のシステイン又はスレオニン、及びＬｅｕ１６２に相当する位置のリシンよりなる群から選ばれた２種以上のアミノ酸を含む；
ポリペプチドを含有する組成物。
【請求項８】
前記保存変異体ポリペプチドが前記Ｏ−ｔＲＮＡと前記非天然アミノ酸と配列番号４、６、８又は１０のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）請求項７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号５、７、９又は１１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；を含む組成物。