(57)【要約】  本発明は、インターロイキン−２受容体−発現細胞を標的化するための方法、特に、インターロイキン−２受容体を発現する細胞に影響を及ぼし得る生物学的に活性な分子に結合されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）変異体を使用することによって、このような細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型のＩＬ−２と比較して、その受容体サブユニットとの相互作用が減少している、ＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３に９０％相同である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項３】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９５％相同である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項４】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９８％相同である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項５】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９９％相同である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項６】
前記ＩＬ−２は、１つ以上の水溶性ポリマーに抱合されている、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項７】
少なくとも１つの前記水溶性ポリマーは、少なくとも１つの前記天然にコードされていないアミノ酸に連結されている、請求項６に記載のＩＬ−２。
【請求項８】
前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、請求項７に記載のＩＬ−２。
【請求項９】
前記ＰＥＧは、１０〜５０の分子量を有する、請求項８に記載のＩＬ−２。
【請求項１０】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位の残基からなる群から選択される位置での置換、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項１１】
前記ＩＬ−２は、野生型ＩＬ−２と比較して、そのＩＬ２Ｒα受容体サブユニットに対する前記ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を調節する１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１２】
前記ＩＬ−２は、前記ＩＬ−２の安定性または溶解性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１３】
前記ＩＬ−２は、組み換え宿主細胞におけるまたはインビトロで合成された前記ＩＬ−２ポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１４】
天然にコードされていないアミノ酸は、残基３、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６１、６２、６４、６５、６８、７２、および１０７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置で置換されている、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１５】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、前記ポリペプチド中の２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性を有する、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１６】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１７】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む、請求項１６に記載のＩＬ−２。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２は、生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、水溶性ポリマー、または免疫刺激剤に連結されている、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項１９】
抱合された前記ＩＬ−２は、１つ以上の水溶性ポリマーに結合されている、請求項１８に記載のＩＬ−２。
【請求項２０】
前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、リンカーによって前記ＩＬ−２に連結されている、請求項１８に記載のＩＬ−２。
【請求項２１】
前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、切断可能または切断不可能なリンカーによってＩＬ−２に連結されている、請求項１８に記載のＩＬ−２。
【請求項２２】
前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、前記ＩＬ−２中の前記天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上に直接抱合されている、請求項１８に記載のＩＬ−２。
【請求項２３】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【化１】
2022500035.tif 000064
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、請求項１０に記載のＩＬ−２。
【請求項２４】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む、請求項２３に記載のＩＬ−２。
【請求項２５】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む、請求項２３に記載のＩＬ−２。
【請求項２６】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む、請求項２３に記載のＩＬ−２。
【請求項２７】
前記天然にコードされていないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む、請求項２３に記載のＩＬ−２。
【請求項２８】
前記天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド基を含む、請求項２３に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２９】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【化２】
2022500035.tif 000065
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在しておらず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項３０】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む、請求項２９に記載のＩＬ−２。
【請求項３１】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構成を有し：
【化３】
2022500035.tif 000066
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項３２】
前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項７に記載のＩＬ−２。
【請求項３３】
前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有する、請求項３２に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３４】
アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基は、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結されている、請求項１６に記載のＩＬ−２。
【請求項３５】
カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される、請求項１９に記載のＩＬ−２。
【請求項３６】
前記ＩＬ−２は、グリコシル化されている、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項３７】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、前記天然にコードされていないアミノ酸を介してポリペプチドに連結されたリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子をさらに含む、請求項１に記載のＩＬ−２。
【請求項３８】
前記ＩＬ−２ポリペプチドは、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子が、糖部分を介して前記ポリペプチドに連結されている、請求項３７に記載のＩＬ−２。
【請求項３９】
請求項１に記載のＩＬ−２を作製する方法であって、前記方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたＩＬ−２ポリペプチドを、前記天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記ポリマーは、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル部分を含み、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分は、アミド結合を介して前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン部分を含み、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、アジド部分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、アジド部分を含み、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、アルキン部分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分である、請求項７に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリ（エチレングリコール）部分は、分岐または多分岐ポリマーである、請求項４６に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１０に記載のＩＬ−２と薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物。
【請求項４９】
前記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ＩＬ−２によって調節される障害を有する患者を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の請求項４２に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
薬学的に受容可能な担体を有する生物学的に活性な分子に結合された請求項１０に記載のＩＬ−２を含む、組成物。
【請求項５２】
リンカーと、薬学的に許容可能な担体との抱合物とをさらに含む、請求項１０に記載のＩＬ−２を含む組成物。
【請求項５３】
天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２を作製する方法であって、前記方法は、セレクターコドン、直交ＲＮＡシンセターゼ、および直交ｔＲＮＡを含むＩＬ−２ポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む細胞を、天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程と；前記ポリペプチドを精製する工程とを含む、方法。
【請求項５４】
ＩＬ−２ポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する方法であって、前記方法は、前記ポリペプチド中の任意の１つ以上の天然に存在するアミノ酸を、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸と置換する工程を含む、方法。
【請求項５５】
組み換え宿主細胞におけるＩＬ−２ポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、ＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項５６】
少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、前記ポリペプチド中にリボソーム的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を介して前記ポリペプチドに結合されている、ポリペプチド。
【請求項５７】
１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸に結合したリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記天然にコードされていないアミノ酸は、予め選択された部位で前記ポリペプチドにリボソーム的に組み込まれている、ＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項５８】
癌と診断されたヒトにおける腫瘍細胞の数を減少させるための方法であって、このような減少を必要とするヒトに、請求項５６に記載のＰＥＧ−ＩＬ−２を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５９】
抱合物は、約０．１μ／ｋｇ〜約５０μ／ｋｇの用量で投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項１〜３８、４６〜４７、５５〜５７のいずれかに記載のＩＬ−２であって、前記ＩＬ−２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３の残基からなる群から選択される１つ以上の位置での少なくとも１つの天然アミノ酸置換をさらに含む、ＩＬ−２。
【請求項６１】
請求項３９〜４５、５３〜５４、５８〜５９のいずれかに記載の方法、または請求項４８〜４９のいずれかに記載の組成物であって、前記方法または組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３の残基からなる群から選択される１つ以上の位置での少なくとも１つの天然アミノ酸置換をさらに含む、方法または組成物。
【請求項６２】
前記天然アミノ酸置換は、３８位、４６位、および／または６５位にある、請求項６０に記載のＩＬ−２、請求項６１に記載の方法または組成物。
【請求項６３】
前記天然アミノ酸置換は、３８位および４６位にある、請求項６０に記載のＩＬ−２、請求項６１に記載の方法または組成物。
【請求項６４】
前記天然アミノ酸置換は、３８位および６５位にある、請求項６０に記載のＩＬ−２、請求項６１に記載の方法または組成物。
【請求項６５】
３８位の天然アミノ酸置換は、アラニンである、請求項６２〜６４のいずれかに記載のＩＬ−２または方法または組成物。
【請求項６６】
４６位の天然アミノ酸置換は、ロイシンまたはイソロイシンである、請求項６２〜６３のいずれかに記載のＩＬ−２または方法または組成物。
【請求項６７】
６５位の天然アミノ酸置換は、アルギニンである、請求項６２または６４のいずれかに記載のＩＬ−２または方法または組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の参照〕
本出願は２０１８年９月１１日および２０１９年３月８日にそれぞれ出願された、それぞれ「Interleukin-2 Polypeptide Conjugates and Their Uses」という名称の米国仮出願第６２／７２９，９２５号および第６２／８１５，９６４号の利益を主張し、そのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔配列表〕
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年９月１１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は、AMBX_0227_PCT_ST25.txtであり、サイズは２７，７２９バイトである。
【０００３】
〔発明の分野〕
本発明は、インターロイキン−２受容体と相互作用するＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列中の位置でポリマーに抱合された（conjugated）インターロイキン−２（ＩＬ−２）変異体を使用することによって、インターロイキン−２の生物学的活性を調節するための方法、および、特に、特異的受容体相互作用を調節するための方法を提供する。
【０００４】
〔発明の背景〕
癌は、最も重大な健康状態の１つである。米国では、癌は、死亡率で心疾患に次ぎ、死亡者の４人に１人を占めている。米国の人口が高齢化することにつれて、癌の発生率は増加すると広く予想されており、この状態の影響はさらに増大する。１９７０年代および１９８０年代に確立された癌の現在の治療レジメンは、劇的には変化していない。これらの治療には、化学療法、放射線療法、およびより新しい標的療法を含む他の治療法が含まれ、特に、これらの治療法は主に腫瘍のバルクを標的とするため、ほとんどの進行したステージの一般的な癌に利用した場合、全生存の恩恵は限られていることが示されている。
【０００５】
より具体的には、従来の癌診断および治療法では、しばしば主に増殖の速い腫瘍細胞（すなわち、腫瘍のバルクを形成する細胞）を選択的に検出し、根絶することが試みられてきた。標準的な腫瘍学的レジメンは、主に過度の毒性なしに最高用量（すなわち、しばしば「最大耐量（maximum tolerated dose）」（ＭＴＤ）または「無毒性量（no observed adverse effect level）」（ＮＯＡＥＬ）と呼ばれる）の照射または化学療法薬を投与するように設計されている。多くの従来の癌化学療法（例えば、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤、およびビンクリスチンなどの植物アルカロイド）および従来の照射療法は、細胞増殖およびＤＮＡ複製に関与する細胞機構を妨げることによって、主に癌細胞に対してその毒性効果を発揮する。また、化学療法プロトコルには、しばしば治療の有効性を高めるために、化学療法薬の組み合わせの投与が含まれる。多種多様な化学療法剤が利用可能であるにもかかわらず、これらの治療は多くの欠点を有する。例えば、化学療法剤は、正常であろうと悪性であろうと、増殖の速い細胞に対する非特異的な副作用のために、悪名高い毒性がある；例えば、化学療法薬は、骨髄抑制、免疫抑制、および胃腸障害などを含む、重大で、しばしば危険な副作用を引き起こす。
【０００６】
〔癌幹細胞〕
癌幹細胞は、腫瘍の特有の亜集団（しばしば０．１〜１０％程度）を含み、腫瘍の残りの９０％程度（すなわち、腫瘍のバルク）と比較して、腫瘍形成性が高く、比較的増殖が遅いか、または静止しており、しばしば腫瘍のバルクよりも比較的化学療法抵抗性が高い。従来の治療法およびレジメンは、大部分が急速に増殖する細胞（すなわち、腫瘍のバルクを構成するそれらの癌細胞）を攻撃するように設計されてきたことを考えると、しばしば増殖が遅い癌幹細胞は、従来の治療法およびレジメンに対する腫瘍のバルクの増殖が速い場合よりも、比較的抵抗性が高い可能性がある。癌幹細胞は、多剤耐性および抗アポトーシス経路などの、それらを相対的に化学耐性にする他の特徴を発現し得る。前述のことは、標準的な腫瘍治療レジメンがほとんどの進行したステージの癌患者において長期的な利益、すなわち癌幹細胞を適切に標的化し根絶できないことを保証するのに失敗する重要な理由となるのであろう。ある場合には、癌幹細胞は、腫瘍の創始細胞（すなわち、腫瘍のバルクを含む癌細胞の前駆体）である。
【０００７】
ＩＬ−２は、腎細胞癌および転移性黒色腫などのいくつかの癌の治療に使用されている。市販のＩＬ−２  Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、グリコシル化されておらず、除去されたアラニン−１およびシステイン−１２５をセリン−１２５によって置換された残基を有する組み換えタンパク質である（Whittington et al., 1993）。ＩＬ−２は、癌治療において最も初期にＦＤＡが承認したサイトカインであるが、高用量で使用した場合にＩＬ−２が重度の副作用を示すことが示されている。これにより、潜在的な患者へのその適用は大幅に制限された。重度の副作用の根底にある機構は、ＩＬ−２がそのレセプターの１つであるＩＬ−２Ｒαに結合することに起因している。一般に、ＩＬ−２は、３つのレセプターのすべてが組織内に存在する場合、ＩＬ−２Ｒα（またはＣＤ２５）、ＩＬ−２Ｒβ（またはＣＤ１２２）およびＩＬ−２Ｒγ（またはＣＤ１３２）を含むそのレセプターとヘテロ三量体錯体を形成することができるだけでなく、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγとヘテロ二量体錯体を形成することができる。臨床現場では、ＩＬ−２を高用量で使用すると、ＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞の主要な受容体型であるＩＬ−２αβγに結合し始める。Ｔｒｅｇ細胞の抑制効果は、ガン免疫療法におけるＩＬ−２適用の望ましくない効果を引き起こす。ＩＬ−２の副作用を軽減するために、多くのアプローチが以前に採用されてきた。ＩＬ−２の１つの形態は、Ｎｅｋｔａｒによって作製され、６個のＰＥＧ化リジンを使用してＩＬ−２表面上のＩＬ２Ｒα結合領域をマスクする（Charych et al., 2016）。ＰＥＧ化ＩＬ−２のこの形態は、半減期が延長され、単一および複数のＰＥＧ化形態の混合物を含み、非常に多量のＰＥＧを含むが、副作用の改善も示した。しかしながら、活性研究の結果は、この不均質な６−ＰＥＧ化ＩＬ−２混合物中のＰＥＧ化ＩＬ−２の有効形態が単一のＰＥＧ化形態のみであることを示した。したがって、ＩＬ−２の副作用を調節する製品の均質で明確に定義された組成を有する、より有効なＰＥＧ化ＩＬ−２が必要とされる。
【０００８】
遺伝的にコードされていないアミノ酸をタンパク質に組み込む能力は、化学官能基の導入を可能にし、例えば、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの天然に存在する官能基の貴重な代替物を提供することができる。特定の化学官能基は、２０個の共通の遺伝的にコードされたアミノ酸に見られる官能基に対して不活性であるが、きれいにかつ効率的に反応して安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、触媒量の銅の存在下、水性状態でヒュスゲン（Huisgen）［３＋２］環状付加反応を受けることが当該技術分野で公知である。例えば、Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599を参照のこと。アジド部分をタンパク質構造に導入することによって、例えば、タンパク質中に見られるアミン基、スルフヒドリル基、カルボン酸基、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性である官能基を組み込むことができるが、また、アセチレン部分と円滑かつ効率的に反応して、環化付加生成物を形成する。重要なことに、アセチレン部分の非存在下では、アジドが他のタンパク質の側鎖の存在下および生理学的条件下で、化学的に不活性かつ非反応性のままである。
【０００９】
本発明は、とりわけ、ＩＬ−２ポリペプチド抱合物（conjugates）の活性および産生に関連する問題に対処し、また、改善された生物学的または薬理学的特性（例えば、腫瘍に対する増強された活性および／または改善された抱合および／または改善された治療半減期）を有するＩＬ−２ポリペプチドの産生に対処する。本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、三量体ＩＬ−２受容体（アルファ、ベータ、およびガンマ）を発現することが知られているＴｒｅｇ細胞、ならびにＩＬ−２受容体のベータおよびガンマ二量体を主に発現するＣＤ８細胞の両方を標的とする。本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞のアルファ受容体への結合を減少させ、ＣＤ８細胞のベータおよびガンマ二量体への偏った結合を促進し、それによって、ＩＬ−２受容体アルファが高度に発現される疾患または状態に対する改善された治療適用および改善された予後を提供する。
【００１０】
〔発明の概要〕
本発明は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有するインターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドに関する。本発明はさらに、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸とのＩＬ−２ポリペプチド抱合物に関する。本発明はさらに、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーが、ＩＬ−２変異体内の１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を介してＩＬ−２変異体に抱合されているＩＬ−２ポリペプチド抱合物に関する。本発明はさらに、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸および１つ以上の天然のアミノ酸置換体を有するＩＬ−２ポリペプチド抱合物に関する。本発明はさらに、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸および１つ以上の天然アミノ酸置換体および１つ以上のＰＥＧ分子を有するＩＬ−２ポリペプチド抱合物に関する。
【００１１】
本発明は、本発明のＩＬ−２ポリペプチドの受容体相互作用を調節する方法を提供する。本発明は、本発明のＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチドを用いて、ＰＥＧ化ＩＬ−２と三量体ＩＬ−２受容体のＩＬ２Ｒαサブユニットとの相互作用を阻害または低減する方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２はモノペグ化されている。一実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２はジペグ化されている。一実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２には２つ以上のポリ（エチレン）グリコール分子が結合している。本発明の別の実施形態は、免疫系の細胞の活性を調節するために本発明のＰＥＧ−ＩＬ−２ポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００１３】
本発明の本実施形態または任意の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２は、ＰＥＧポリマーに連結された全長の成熟した（シグナルペプチドを欠く）ヒトインターロイキン−２を含むことができる。本発明の本実施形態または任意の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２は、共有結合によってＰＥＧポリマーまたは他の生物学的に活性な分子に連結された全長の成熟した（シグナルペプチドを欠く）、ヒトインターロイキン−２を含むことができる。いくつかの実施形態では、生物学的に活性な分子は修飾され、非限定的な例として、生物学的に活性な分子は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み得る。
【００１４】
ＰＥＧ−ＩＬ２抱合物において、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーは、ＩＬ−２タンパク質に、もしくは生物学的に活性な分子に直接、またはリンカーを介して抱合されることができる。適切なリンカーには、例えば、切断可能および切断不可能なリンカーが含まれる。
【００１５】
本発明は、哺乳動物、例えば、以下の状態：固形腫瘍、血液腫瘍、結腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、膠芽腫、および白血病のうちの１つ以上を有するものを含むがこれらに限定されない哺乳動物における癌を、有効量のＰＥＧ−ＩＬ−２ポリペプチドを投与することによって治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は高レベルのＴｒｅｇ細胞によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、癌はＩＬ−２受容体アルファの高発現によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＩＬ−２ポリペプチドを含む組成物の有効量を被験体に投与することによって、癌または状態または疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＩＬ−２組成物の有効量を患者に投与することによって遺伝性疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、状態または疾患がＩＬ−２受容体アルファの高発現によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、状態または疾患は、高レベルのＴｒｅｇ細胞によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、癌、状態、または疾患は、ＩＬ−２受容体アルファの発現を減少させるか、ブロックするか、またはサイレンシングすることによって治療される。いくつかの実施形態では、癌、状態、または疾患は、治療されるべき癌、状態、または疾患におけるＴｒｅｇ細胞の増殖の減少をもたらすＴｒｅｇ細胞の表面上のＩＬ−２受容体アルファの結合を減少させることによって治療される。
【００１６】
本明細書で使用されるように、インターロイキン２またはＩＬ−２は、（ａ）ＩＬ−２突然変異タンパク質、成熟したＩＬ−２配列（すなわち、分泌リーダー配列を欠く）、および本出願の配列番号１、２、３、５、または７に開示されるＩＬ−２を含む、ＩＬ−２の既知の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、（ｂ）天然または野生型のＩＬ−２に共通の少なくとも１つの生物学的活性を有するタンパク質として定義される。本発明の目的のために、グリコシル化（例えば、酵母またはＣＨＯ細胞などの真核細胞において産生される）および非グリコシル化（例えば、大腸菌において化学的に合成または産生される）ＩＬ−２の両方は同等であり、交換可能に使用され得る。また、ＩＬ−２の生物学的活性を保持するウイルスＩＬ−２を含む他の突然変異体および他のアナログが含まれる。
【００１７】
本発明は、ＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチドが他の薬剤または生物学的に活性な分子にも連結され、ＩＬ−２ポリペプチドが１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む、１つ以上の水溶性ポリマーに抱合されたＩＬ−２ポリペプチドを提供する。本発明はまた、ＩＬ−２ポリペプチドの単量体および二量体を提供する。本発明はまた、ＩＬ−２ポリペプチドの三量体を提供する。本発明は、ＩＬ−２ポリペプチドの多量体を提供する。本発明はまた、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２二量体を提供する。本発明は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２多量体を提供する。本発明は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む均質なＩＬ−２多量体であって、各ＩＬ−２ポリペプチドは、同じアミノ酸配列を有する、均質なＩＬ−２多量体を提供する。本発明は、不均一なＩＬ−２多量体であって、ＩＬ−２ポリペプチドの少なくとも１つは、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含み、多量体中のＩＬ−２ポリペプチドのいずれかまたは各々は、異なるアミノ酸配列を有し得る、不均一なＩＬ−２多量体を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドは、１つ以上の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドは、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２単量体は均質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２二量体は均質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２多量体は、１つの水溶性ポリマーに抱合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２多量体は、２つの水溶性ポリマーに抱合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２多量体は、３つの水溶性ポリマーに抱合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２多量体が３つを超える水溶性ポリマーに抱合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドが、二量体の形成を可能にするのに十分な長さのリンカーに連結される場合。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドが、三量体の形成を可能にするのに十分な長さのリンカーに連結される場合。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドが、多量体の形成を可能にするのに十分な長さのリンカーに連結される場合。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー、または少なくとも１つのさらなるＩＬ−２ポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドが１つ以上の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドは、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、リンカーで水溶性ポリマーに連結されるか、または水溶性ポリマーに結合される。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、二官能性ポリマーは、第２のポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＩＬ−２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、天然にコードされていないアミノ酸である。
【００２０】
一実施形態では、本発明のＩＬ−２またはＰＥＧ−ＩＬ−２は、免疫調節剤などの治療薬に連結される。免疫調節剤は、ＩＬ−２、ＰＥＧ−ＩＬ−２、またはＩＬ−２変異体への抱合のための治療剤として使用され得る、免疫細胞に対して治療効果を発揮する任意の薬剤であり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、１つの天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位に組み込まれるか、またはタンパク質のカルボキシル末端に付加されるか、およびそれらの任意の組み合わせである（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１つ以上の生物学的に活性な分子は、ＩＬ−２変異体に直接抱合される。いくつかの実施形態では、１つ以上の生物学的に活性な分子は、ＩＬ−２ポリペプチド中の１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸に抱合される。いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ−２変異体は、リンカーに連結される。いくつかの実施形態では、リンカーに連結されたＩＬ−２変異体は、生物学的に活性な分子をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＩＬ−２リンカーは、天然にコードされていないアミノ酸に連結されている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３２位、３５位、３７位、３８位、４２位、４３位、４４位、４５位、４８位、４９位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、７６位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸の位置）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３５位、３７位、４２位、４５位、４９位、６１位、または６５位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：４５位、６１位、および６５位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：４５位および６５位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、または７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の３位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の３２位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の３５位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の３７位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の３８位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４１位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４２位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４３位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４４位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４５位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４８位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の４９位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の６１位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の６２位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の６４位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の６５位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の６８位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の７２位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の７６位に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、本発明のＩＬ−２またはその変異体の１０７位に組み込まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、以下のように、ＩＬ−２またはその変異体における二次構造または特定のアミノ酸に対応する以下の領域のうちの１つ以上の任意の位置に組み込まれる：疎水性相互作用の部位；ＩＬ２Ｒαを含むＩＬ−２受容体サブユニットとの相互作用の部位またはその近接；アミノ酸の３位または３５位〜４５位内；最初の１０７Ｎ末端アミノ酸内；アミノ酸６１位〜７２位内；配列番号２の各々、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置に組み込まれる：配列番号２の１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、およびそれらの任意の組み合わせ、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置に組み込まれる：配列番号２の４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、もしくはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、薬剤または他の生物学的に活性な分子に連結されており、これらの位置としては、限定されないが、タンパク質の１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、薬剤または他の生物学的に活性な分子に連結されており、これらの位置としては、限定されないが、疎水性相互作用の部位；ＩＬ２Ｒαを含むＩＬ−２受容体サブユニットとの相互座用の部位またはその近接；アミノ酸の３位または３５位〜４５位内；最初の１０７Ｎ末端アミノ酸内；アミノ酸６１位〜７２位内；配列番号２の各々、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、薬剤または他の生物学的に活性な分子に連結されており、これらの位置としては、限定されないが、配列番号２の１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、およびそれらの任意の組み合わせ、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、薬剤または他の生物学的に活性な分子に連結されており、これらの位置としては、限定されないが、配列番号２の４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、１つ以上のＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）に組み込まれ、薬剤または他の生物学的に活性な分子に連結されている。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、リンカーに連結されており、これらの位置としては、限定されないが、１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子にさらに連結されているリンカーに連結されており、これらの位置としては、限定されないが、１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置に組み込まれており、水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子にさらに連結されているリンカーに連結されており、位置としては、限定されないが、３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のこれらの位置で天然に存在しないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されており、これらの位置としては、限定されないが、１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置に組み込まれており、水溶性ポリマーにさらに連結されているリンカーに連結されており、位置としては、限定されないが、３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）が挙げられる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、ＩＬ−２受容体サブユニットまたはその変異体に対するＩＬ−２の親和性を調節する置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、ＩＬ−２受容体または結合パートナー（限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、脂質、脂肪酸、小分子、または核酸を含む）に対するＩＬ−２またはその変異体の親和性を調節する置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２の安定性と比較した場合に、ＩＬ−２の安定性を調節する置換、付加、または欠失を含む。安定性および／または溶解性は、当業者に公知の多数の異なるアッセイを使用して測定され得る。このようなアッセイには、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２の免疫原性と比較した場合に、ＩＬ−２の免疫原性を調節する置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２の血清半減期または循環時間と比較した場合に、ＩＬ−２の血清半減期または循環時間を調節する置換、付加、または欠失を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体の水溶解度と比較した場合に、ＩＬ−２の水溶解度を増加させる置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体の溶解度と比較した場合に、宿主細胞において産生されるＩＬ−２またはその変異体の溶解度を増加させる置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体の発現または合成と比較した場合に、宿主細胞でのＩＬ−２の発現を増加させるか、またはインビトロでの合成を増加させる置換、付加、または欠失を含む。この置換を含むＩＬ−２またはその変異体は、アゴニスト活性を保持し、宿主細胞における発現レベルを保持または改善する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体のプロテアーゼ耐性と比較した場合に、ＩＬ−２またはその変異体のプロテアーゼ耐性を増加させる置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体との相互作用のときの受容体の活性と比較した場合に、ＩＬ−２受容体のシグナル伝達活性を調節する置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２の結合と比較した場合に、受容体などの他の分子へのその結合を調節する置換、付加、または欠失を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＥＧ−ＩＬ−２および少なくとも１つの追加の治療剤または診断剤を用いて、増殖状態、癌、腫瘍、または異形成などの前癌状態を治療するための方法を提供する。追加の治療薬は、例えば、ＩＬ−１２、インターフェロン−アルファ、または抗上皮成長因子受容体、ドキソルビシン、エピルビシン、抗葉酸などのサイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えば、メトトレキサートまたはフルオルウラシル（fluoruracil）イリノテカン、シクロホスファミド、放射線療法、ホルモンまたは抗ホルモン療法、例えば、アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、フルタミド、またはジエチルスチルベストロール、手術、タモキシフェン、イホスファミド、ミトラクトール、アルキル化剤、例えば、メルファランまたはシス−プラチン、エトポシド、ビノレルビン、ビンブラスチン、グルココルチコイド、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、血管新生阻害剤、放射線、放射線増感剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、細胞周期阻害剤、
例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、チェックポイント阻害剤、免疫調節剤、免疫賦活剤、他の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体と生物学的に活性な分子との複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞、例えば、樹状細胞療法であり得る。ワクチンは、例えば、可溶性タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸として提供され得る（例えば、Le, et al., supra; Greco and Zellefsky (eds.) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro and Recht (2001) New Engl. J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331:996-1004; Naylor and Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Kudelka, et al. (1998) New Engl. J. Med. 338:991-992; van Netten, et al. (1996) New Engl. J. Med. 334:920-921を参照のこと)。
【００３２】
また、癌の髄外造血（ＥＭＨ）を治療する方法も提供される。ＥＭＨは記載されている（例えば、Rao, et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane, et al. (2002) J. Cutan. Pathol. 29:608-612）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体の受容体または受容体サブユニットの結合活性と比較して、その受容体または受容体サブユニットの結合を調節する置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応するＩＬ−２またはその変異体の受容体または受容体サブユニットの結合活性と比較して、受容体または受容体サブユニットの結合に関連するその活性を阻害する置換、付加、または欠失を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、置換、付加、または欠失のない対応する野生型ＩＬ−２の相溶性と比較した場合に、ＩＬ−２またはその変異体と医薬防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との相溶性を増加させる置換、付加、または欠失を含む。この増加した相溶性は、保存中のタンパク質の生理化学的特性および生物学的活性を維持する保存医薬製剤の調製を可能にし得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の設計された結合は、１つ以上の非天然アミノ酸を用いて作製される。分子内結合は、多くの方法によって作製されてもよい。このような方法としては、限定されないが、適切な条件下におけるタンパク質中の２つのアミノ酸間の反応（１つまたは両方のアミノ酸は、非天然アミノ酸であってもよい）；適切な条件下における２つのアミノ酸（これらの各々は、天然にコードされているものであってもよいし、または天然にコードされていないものであってもよい）とのリンカー、ポリマー、または他の分子との反応などが挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸との置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸との置換であってもよいが、少なくとも１つの置換が天然にコードされていないアミノ酸との置換である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸との置換であってもよく、さらに、少なくとも１つの置換は、天然にコードされていないアミノ酸との置換である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、任意の天然に存在するアミノ酸との置換であってもよく、天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換を伴っていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然アミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置で置換され得る：１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、または７における対応するアミノ酸位置）。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然アミノ酸置換は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置であり得る：４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸と、天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、少なくとも２つの天然に存在するアミノ酸と、天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換とを有していてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然に存在するまたはコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸のいずれかであり得る。２０の共通アミノ酸としては、限定されないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸置換は、ＩＬ−２またはその変異体の以下の位置：３８位、４６位、または６５位にあってもよい。いくつかの実施形態では、天然に存在するアミノ酸置換は、ＩＬ−２またはその変異体の３８位にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の３８位の天然に存在するアミノ酸置換は、２０個の共通天然アミノ酸のいずれかから選択され得る。２０個の共通天然アミノ酸としては、限定されないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の３８位の天然に存在するアミノ酸置換は、アラニン置換であってもよい。いくつかの実施形態では、天然に存在するアミノ酸置換は、ＩＬ−２またはその変異体の４６位にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の４６位の天然に存在するアミノ酸置換は、２０個の共通天然アミノ酸のいずれかから選択され得る。２０個の共通天然アミノ酸としては、限定されないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の４６位の天然に存在するアミノ酸置換は、ロイシン置換またはイソロイシン置換であってもよい。いくつかの実施形態では、天然に存在するアミノ酸置換は、ＩＬ−２またはその変異体の６５位にあってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の６５位の天然に存在するアミノ酸置換は、２０個の共通天然アミノ酸のいずれかから選択され得る。２０個の共通天然アミノ酸としては、限定されないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体の６５位の天然に存在するアミノ酸置換は、アルギニン置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位、４６位、または６５位における天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位における天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、４６位における天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、６５位における天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および／または４６位および／または６５位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸との少なくとも１つの置換であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位の天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体の４２位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および４６位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の４２位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および６５位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の４２位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位、４６位、および６５位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の４２位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位の天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体の４５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸、（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および４６位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の４５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および６５位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の４５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸、（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位、４６位、および６５位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその
変異体の４５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位の天然に存在するアミノ酸置換、およびＩＬ−２またはその変異体の６５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体におけるアミノ酸置換は、３８位および４６位における天然に存在するアミノ酸置換、ならびにＩＬ−２またはその変異体の６５位に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）であってもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、天然にコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【００３９】
【化１】
2022500035.tif 000002
【００４０】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【００４３】
【化２】
2022500035.tif 000003
【００４４】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在しておらず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【００４６】
【化３】
2022500035.tif 000004
【００４７】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＩＬ−２アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、天然にコードされていないアミノ酸、および１つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含む。
【００４９】
本発明はまた、配列番号１、２、３、５、または７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供し、本発明は、配列番号１、２、３、５、または７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含む、配列番号１、２、３、５、または７として示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。本発明はまた、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有する配列番号１、２、３、５、または７として示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。多数の異なるポリヌクレオチドが本発明の任意のポリペプチドをコードし得ることは、当業者に容易に明らかである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークなコドン、希少なコドン、５塩基のコドン、および４塩基のコドンからなる群から選択される。
【００５１】
本発明はまた、生物学的に活性な分子に連結されたＩＬ−２またはその変異体を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたＩＬ−２またはその変異体を、天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む生物学的に活性な分子と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しない生物学的に活性な分子に対して反応性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、生物学的に活性な分子に連結された２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子に連結されたＩＬ−２またはその変異体は、カルボニル含有アミノ酸を含むＩＬ−２またはその変異体を、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含む水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態では、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基は、アミド結合を介して生物学的に活性な分子に連結されている。いくつかの実施形態では、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基は、カルバメート結合を介して水溶性ポリマーまたは生物学的に活性な分子に連結されている。
【００５３】
本発明はまた、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２抱合物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたＩＬ−２−生物学的に活性な分子の抱合物を、天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２抱合物に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２抱合物に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性を有する。
【００５４】
本発明はまた、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２またはその変異体を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたＩＬ−２またはその変異体を、天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２またはその変異体は、カルボニル含有アミノ酸を含むＩＬ−２またはその変異体を、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態では、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基は、カルバメート結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００５６】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２またはその変異体は、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２またはその変異体は、アルキン含有アミノ酸を含むＩＬ−２を、アジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態では、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００５８】
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＩＬ−２またはその変異体は、アジド含有アミノ酸を含むＩＬ−２またはその変異体を、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態では、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、１ｋＤａ〜２５ｋＤａ、または２〜２２ｋＤａ、または５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する。例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａであり得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａであり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、２０Ｋの２つに枝分かれしたＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、線状の５ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、線状の１０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、線状の２０ＫのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、平均分子量である。特定の実施形態では、平均分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）である。平均分子量は、ＧＰＣまたはＳＥＣ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、質量分析、またはキャピラリー電気泳動を使用して決定または測定され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、または１０７位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における以下の位置：３５位、３７位、４２位、４５位、４９位、６１位、または６５位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６１位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４９位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４２位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３７位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、線状の２０Ｋのポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、枝分かれポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子の枝分かれポリマーの各枝は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子の枝分かれポリマーの各枝は、１ｋＤａ〜２５ｋＤａ、または２〜２２ｋＤａ、または５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する。例えば、ポリ（エチレングリコール）分子の枝分かれポリマーの各枝の分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａであり得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）分子の枝分かれポリマーの各枝の分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａであり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、２０Ｋの２つに枝分かれしたＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、２０Ｋの４つに枝分かれしたＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの分子量は、平均分子量である。特定の実施形態では、平均分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）である。平均分子量は、ＧＰＣまたはＳＥＣ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、質量分析、またはキャピラリー電気泳動を使用して決定または測定され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、または１０７位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における以下の位置：３５位、３７位、４２位、４５位、４９位、６１位、または６５位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６１位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４９位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４２位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３７位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの２つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における１つ以上の以下の位置：３５位、３７位、４２位、４５位、４９位、６１位、または６５位、およびそれらの任意の組み合わせ（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の６１位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４９位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の４２位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３７位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の３５位（配列番号２の、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置）に組み込まれており、ＩＬ−２またはその変異体は、２０Ｋの４つに枝分かれしたポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、カルボニル部分を含み、水溶性ポリマーは、アミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、アルキン部分を含み、水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド部分を含み、水溶性ポリマーは、アルキン部分を含む。
【００６２】
本発明はまた、天然にコードされていないアミノ酸および薬学的に許容可能な担体を含む、ＩＬ−２またはその変異体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
【００６３】
本発明はまた、セレクターコドンを含むＩＬ−２またはそのＩＬ−２変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ−２に天然にコードされていないアミノ酸を置換するための直交ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交ｔＲＮＡを含む。
【００６４】
本発明はまた、セレクターコドンを含むＩＬ−２またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ−２またはその変異体に天然にコードされていないアミノ酸を置換するための直交ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交ｔＲＮＡを含む。
【００６５】
本発明はまた、天然にコードされていないアミノ酸を含むＰＥＧ−ＩＬ−２、ＩＬ−２またはそれらの任意の変異体を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ−２、直交ＲＮＡシンセターゼ、および／または直交ｔＲＮＡをコードする１つのポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む細胞を、ＩＬ−２またはその変異体の発現を可能にする条件下で培養する工程と；細胞および／または培養培地からＩＬ−２またはその変異体を精製する工程とを含む。
【００６６】
本発明はまた、ＩＬ−２またはその変異体の治療半減期、血清半減期、または循環時間を増加させる方法を提供する。本発明はまた、ＩＬ−２またはその変異体の免疫原性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然に存在するＩＬ−２もしくはその変異体における任意の１つ以上のアミノ酸を、天然にコードされていないアミノ酸と置換する工程、および／またはＩＬ−２もしくはその変異体を、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結する工程を含む。本発明の一実施形態では、リンカーは、柔軟性を可能にし、二量体形成を可能にするのに十分に長い。本発明の一実施形態では、リンカーが二量体形成を可能にするように、長さが少なくとも３アミノ酸、または１８原子である。
【００６７】
本発明はまた、有効量の本発明のＰＥＧ−ＩＬ−２抱合物またはその変異体を用いて、このような治療を必要とする患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸および薬学的に許容可能な担体を含む、ＰＥＧ−ＩＬ−２またはその変異体を含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与する工程を包む。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸および天然のアミノ酸置換を含むＰＥＧ−ＩＬ−２またはその変異体と、薬学的に許容可能な担体とを含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２またはその変異体は、グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２またはその変異体は、グリコシル化されていない。
【００６８】
本発明はまた、このような治療を必要とする患者を、有効量の本発明のＩＬ−２またはＩＬ−２変異体分子を用いて治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、天然にコードされていないアミノ酸および薬学的に許容可能な担体を含むＩＬ−２またはＩＬ−２変異体分子を含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸および１つ以上の天然アミノ酸置換を含むＩＬ−２またはその変異体と、薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態では、天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、グリコシル化されていない。いくつかの実施形態では、治療を必要とする患者は、限定されないが、ＩＬ−２受容体アルファの高発現によって特徴付けられる、癌、状態、または疾患を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明のＩＬ−２組成物を被験体に投与することによって、癌または状態または疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明のＩＬ−２組成物を患者に投与することによって、遺伝性疾患を治療する方法を提供する。本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、高いＩＬ−２受容体アルファの発現を有する細胞における疾患または状態の治療における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、癌、状態、または疾患は、ＩＬ−２受容体アルファの発現を減少させるか、ブロックするか、またはサイレンシングすることによって治療される。本発明のＩＬ−２ポリペプチドまたは変異体は、高いＩＬ−２受容体アルファの発現に関連する癌、疾患、または状態を治療するための医薬の製造における使用のためのものである。本発明のＩＬ−２ポリペプチドまたは変異体は、癌を治療するための医薬の製造における使用のためのものである。本発明のＩＬ−２ポリペプチドまたは変異体は、遺伝性疾患を治療するための医薬の製造における使用のためのものである。
【００６９】
本発明はまた、少なくとも１つのアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸によって置換されていることを除いて、配列番号１、２、３、５、もしくは７、または任意の他のＩＬ−２配列に示される配列を含むＩＬ−２を提供する。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態では、天然にコードされないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む。
【００７０】
本発明はまた、薬学的に許容可能な担体と、配列番号１、２、３、５、もしくは７、または任意の他のＩＬ−２配列に示される配列を含むＰＥＧ−ＩＬ−２またはその天然の変異体とを含む薬学的組成物であって、少なくとも１つのアミノ酸は、天然にコードされないアミノ酸によって置換される薬学的組成物を提供する。本発明はまた、薬学的に許容可能な担体と、配列番号１、２、３、５、または７に示される配列を含むＩＬ−２またはその天然の変異体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、糖部分を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、糖部分を介してＩＬ−２またはその天然の変異体に連結されている。いくつかの実施形態では、リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、糖部分を介してＩＬ−２またはその天然の変異体に連結されている。
【００７１】
本発明はまた、単一のアミノ酸でＩＬ−２に共有結合によって連結された水溶性ポリマーを含むＩＬ−２またはその天然の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーに共有結合したアミノ酸は、ポリペプチド中に存在する天然にコードされていないアミノ酸である。
【００７２】
本発明は、少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２またはその変異体であって、当該リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、ポリペプチドにリボソーム的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに結合される、ＩＬ−２またはその変異体を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、モノＰＥＧ化されている。本発明はまた、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸に結合したリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２またはその変異体であって、当該天然にコードされていないアミノ酸は、予め選択された部位でポリペプチドにリボソーム的に組み込まれているＩＬ−２またはその変異体を提供する。
【００７３】
本発明の範囲には、ＩＬ−２、またはその変異体リーダー、またはＩＬ−２コード領域に結合したシグナル配列、ならびにＩＬ−２コード領域に結合した異種のシグナル配列が包含される。選択される異種のリーダー配列またはシグナル配列は、例えば宿主細胞の分泌系によって認識され、プロセスされて、宿主細胞によって分泌し、場合によってはシグナルペプチダーゼによって切断されるものであるべきである。本発明のＩＬ−２を用いて状態または障害を治療する方法は、シグナルペプチドまたはリーダーペプチドを有するかまたは有さないＩＬ−２またはその変異体を用いた治療を含意することが意図されている。
【００７４】
他の実施形態では、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含むＩＬ−２またはその変異体と、他の分子（限定されないが、ＰＥＧが挙げられる）との抱合は、非天然アミノ酸への抱合に利用されるユニークな化学反応に起因して実質的に精製されたＩＬ−２を提供する。１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２またはその変異体と、ＰＥＧなどの別の分子と抱合は、実質的に純粋なＩＬ−２またはその変異体を提供するために、抱合工程の前または後に実施される他の精製技術を用いて実施されてもよい。
【００７５】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＩＬ−２ＲαおよびそのＩＬ−２との界面の構造で標識された潜在的な受容体相互作用部位を備えるＩＬ−２ポリペプチドの外観を示すモデル。
【００７６】
〔図２〕大腸菌におけるＩＬ−２発現のための発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【００７７】
〔図３Ａ〕大腸菌におけるＩＬ−２タンパク質の発現のウェスタンブロット分析を示す。
【００７８】
〔図３Ｂ〕大腸菌におけるＩＬ−２変異体の力価を示す。
【００７９】
〔図４Ａ〕ＣＤ２５に対するＩＬ−２野生型についての、結合動態センサグラムおよびモデルフィッティングライン、ならびに計算された測定値を示す。
【００８０】
〔図４Ｂ〕哺乳動物細胞におけるＩＬ−２の発現のための発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【００８１】
〔図５〕ＵＰＦ１ゲノムＤＮＡ配列、およびＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ部位の設計を示す。
【００８２】
〔図６〕ＵＰＦ１ノックアウト細胞株の配列検証を示す。
【００８３】
〔図７Ａ〕哺乳動物細胞における種々のＩＬ−２変異体の一過性発現を示す。
【００８４】
〔図７Ｂ〕哺乳動物細胞で産生された野生型ＩＬ−２およびＩＬ−２変異体のウェスタンブロット分析を示す。
【００８５】
〔図８〕ＩＬ−２のＦ４２変異体のＣＴＬＬ−２増殖アッセイを示す。
【００８６】
〔図９〕ＣＴＬＬ−２増殖アッセイによるＩＬ−２変異体のスクリーニングを示す。
【００８７】
〔図１０Ａ〕ＩＬ−２野生型およびＦ４２変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【００８８】
〔図１０Ｂ〕Ｋ３５およびＹ４５変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【００８９】
〔図１０Ｃ〕Ｔ３７およびＰ６５変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【００９０】
〔図１１〕ＩＬ−２受容体二量体化アッセイの説明。
【００９１】
〔図１２〕エキソビボ  ｐＳＴＡＴ５アッセイの説明。
【００９２】
〔図１３〕グリコシル化または非グリコシル化ＩＬ−２の存在下におけるＣＴＬＬ−２細胞のクローン増殖および長期増殖を示す。
【００９３】
〔図１４〕対応する野生型ＩＬ−２またはその選択された変異体の安定なプールの生成前後の力価の比較を示す。
【００９４】
〔図１５Ａ〕Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体を発現する哺乳動物細胞における力価を示す。
【００９５】
〔図１５Ｂ〕Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体のＣＴＬＬ−２結合アッセイを示す。
【００９６】
〔図１５Ｃ〕Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体についての結合動態センサグラムを示す。
【００９７】
〔定義〕
本発明は、本明細書中に記載される特定の手法、プロトコル、細胞株、コンストラクト、および試薬に限定されるものではなく、変更され得ることが理解するべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解するべきである。
【００９８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のものを示していない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「ＩＬ−２」、「ＰＥＧ−ＩＬ−２」、「ＰＥＧ−ＩＬ−２抱合物」、および様々な大文字の形態、ハイフンで繋げられた形態、およびハイフンで繋げられていない形態を参照することは、１つ以上のこのようなタンパク質を参照することであり、当業者に知られているそれらの均等物などを含む。
【００９９】
特に定義されない限り、本明細書に用いられた全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置および材料と同等または類似の任意のものを、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をこれから記載する。
【０１００】
本明細書において言及された全ての刊行物および特許文献は、目下のところ記載している発明に関連して使用されることがある、この刊行物に記載されたコンストラクトおよび手法などを記載および開示するために、参照として本明細書に援用される。本明細書において検討された刊行物は、本出願の出願日よりも前の開示のみを提供するものである。本明細書では、先行する発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明者らが、このような開示よりも先行しているという資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【０１０１】
用語「実質的に精製された」は、ＩＬ−２またはその変異体が、タンパク質が天然に存在する環境（すなわち、組み換え的に製造されるＩＬ−２の場合、ネイティブな細胞または宿主細胞）において見られるような、タンパク質と通常は同伴または相互作用する成分から、実質的にまたは本質的に遊離し得ることをいう。細胞内の物質から実質的に遊離されているであろうＩＬ−２は、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の不純なタンパク質を有する、タンパク質の調製物を含む。ＩＬ−２またはその変異体が宿主細胞によって組み換え的に製造される場合、当該タンパク質は、細胞の乾燥重量で約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％、あるいはそれ以下で存在し得る。ＩＬ−２またはその変異体が宿主細胞によって組み換え的に製造される場合、当該タンパク質は、細胞の乾燥重量で約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ、あるいはそれ以下で、培養培地中に存在し得る。したがって、本発明の方法によって製造された場合、「実質的に精製された」ＩＬ−２は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度、具体的には少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度を有していてもよく、より具体的には少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度を有していてもよい。このような純度は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定されるようなものである。
【０１０２】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、例えば、直接的な取込、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作製する、当該技術分野にて公知の他の方法といった挿入方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチドを包む細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドは、組み込みまれないベクター（例えばプラスミド）として維持されていてもよいし、宿主のゲノムに組み込まれていてもよい。
【０１０３】
本明細書において用いられる場合、用語「培地（medium）」または「培地（media）」としては、任意の宿主細胞を支持し得るか、または含み得る任意の培養培地、溶液、固体、半固体、または剛性の支持体が挙げられる。任意の宿主細胞としては、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳動物の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の宿主細胞、大腸菌、またはシュードモナス宿主細胞、および細胞含有物が挙げられる。したがって、この用語には、宿主細胞が増殖した培地、例えば、ＩＬ−２が分泌された培地を包含し得る。このような培地は、増殖工程の前または後の培地を含む。当該用語はまた、例えば、ＩＬ−２が細胞内において産生され、宿主細胞が溶解または破壊されてＩＬ−２を放出する場合、宿主細胞の溶解物を含有するバッファーまたは試薬を包含し得る。
【０１０４】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書において用いられる場合、「還元剤」は、スルヒドリル基を還元状態にて維持し、分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させる任意の化合物または物質として定義される。適切な還元剤としては、限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。多種多様な還元剤が本発明の方法および組成物における使用に適していることは、当業者にとって容易に明らかである。
【０１０５】
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書において用いられる場合、「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、任意の化合物または物質として定義される。適切な酸化剤としては、限定されないが、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤が本発明の方法における使用に適していることは、当業者にとって容易に明らかである。
【０１０６】
本明細書において用いられる場合、「変性剤（Denaturing agent）」または「変性剤（denaturant）」は、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こすであろう任意の化合物または物質として定義される。変性剤または変性剤の強さは、特定の変性剤または変性剤の性質および濃度の両方によって決定されるであろう。適切な変性剤または変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはこのような剤の２つ以上の組み合わせであり得る。適切なカオトロープとしては、限定されないが、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、限定されないが、強力な界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチレンエーテル（例えばＴｗｅｅｎもしくはＴｒｉｔｏｎ）など）、サルコシル（Sarkosyl）、穏やかな非イオン性の界面活性剤（例えばジギトニン）、穏やかな陽イオン性の界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、穏やかなイオン性の界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム）、あるいは双性イオン界面活性剤（限定されないが、スルホベタイン（Zwittergent）、３−（３−クロルアミドプロピル（chlolamidopropyl））ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる）が挙げられ得る。アセトニトリル、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４アルカノール（エタノールもしくはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４アルカンジオール（エチレングリコールなど）などの有機の水混和性溶媒は、変性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、天然に存在するリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなど）、または合成のリン脂質の誘導体もしくは変異体（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）であり得る。
【０１０７】
本明細書において用いられる場合、「リフォールディング」は、ジスルフィド結合に関して、ジスルフィド結合を含有するポリペプチドを不適切に折り畳まれた状態または折り畳まれていない状態から、ネイティブな立体配座または適切に折り畳まれた立体配座へと変換する、任意のプロセス、反応、または方法を表す。
【０１０８】
本明細書において用いられる場合、「コフォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折り畳まれていないかまたは不適切に折り畳まれたポリペプチドを、ネイティブな適切に折り畳まれたポリペプチドへと変換する、リフォールディングのプロセス、反応、または方法のことを特にいう。
【０１０９】
本明細書中において用いられる場合、「インターロイキン−２」、「ＩＬ−２」、ならびにそれらのハイフンで繋げられた形態およびハイフンで繋げられていない形態としては、少なくとも１つのＩＬ−２の生物学的活性を有するそれらのポリペプチドおよびタンパク質、ならびに、それらの、ＩＬ−２アナログ、ＩＬ−２突然変異タンパク質、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−２アイソフォーム、ＩＬ−２模倣物、ＩＬ−２フラグメント、ハイブリッドＩＬ−２タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、ホモログ、グリコシル化パターン変異体、変異体、スプライス変異体、および突然変異体が挙げられるものとし、それらの生物学的活性にかかわらず、さらに、限定されないが、組み換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の形態の核酸から産生されるかどうかにかかわらず）、インビトロ、インビボ、核酸分子のマイクロインジェクション、合成、トランスジェニック、および遺伝子活性化方法が挙げられる。用語「ＩＬ−２」、「ＩＬ−２」、「ＩＬ−２変異体」、および「ＩＬ−２ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含むＩＬ−２を包含する。
【０１１０】
リーダー配列を欠き、Ｎ末端にメチオニンを有さないＩＬ−２の配列については、本明細書中の配列番号２を参照のこと。リーダー配列を有さず、Ｎ末端にメチオニンを有するＩＬ−２の配列については、配列番号３、５、または７を参照のこと。いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ−２またはその変異体は、配列番号２、３、５、もしくは７、またはＩＬ−２の任意の他の配列と実質的に同一である。突然変異体ＩＬ−２および他の変異体を含むＩＬ−２をコードする核酸分子、ならびにこれらのポリペプチドを発現および精製する方法は、当技術分野で公知である。
【０１１１】
用語「ＩＬ−２」はまた、天然に存在するＩＬ−２の、薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグ、ならびに当該塩のプロドラッグ、多形、水和物、溶媒和物、生物学的に活性なフラグメント、生物学的に活性な変異体、および立体異性体、ならびに天然に存在するＩＬ−２のアゴニスト、模倣物、およびアンタゴニストの変異体、ならびにそれらのポリペプチドの融合体を含む。
【０１１２】
種々の参考文献において、ポリマーの抱合またはグリコシル化による、ポリペプチドの修飾が開示されている。用語「ＩＬ−２」は、ＰＥＧなどのポリマーに抱合されたポリペプチドを含み、システイン、リジン、または他の残基のさらなる誘導体化を１つ以上含んでいてもよい。さらに、ＩＬ−２は、リンカーまたはポリマーを含んでいてもよく、リンカーまたはポリマーが抱合されたアミノ酸は、本発明に係る非天然アミノ酸であってもよいし、リジンまたはシステインに連結させるなどの当該技術分野において公知の技術を利用して、天然にコードされているアミノ酸に抱合されていてもよい。
【０１１３】
用語「ＩＬ−２ポリペプチド」はまた、グリコシル化されたＩＬ−２を含み、例えば限定されないが、任意のアミノ酸の位置においてグリコシル化されたポリペプチド、Ｎ結合型またはＯ結合型のグリコシル化ポリペプチドである。単一のヌクレオチドの変更を含んでいる変異体も、ＩＬ−２ポリペプチドの生物学的に活性な変異体としてみなされる。さらに、スプライスも含まれる。
【０１１４】
用語「ＩＬ−２」はまた、任意の１つ以上のＩＬ−２、または任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド、もしくは任意の種類の他の生物学的に活性な分子の、化学的手段によって連結されたか、または融合タンパク質として発現された、ＩＬ−２のヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、またはホモマルチマー、ならびに、例えば、特定の欠失または他の修飾を含むが、それでもなお生物学的活性を維持している、ポリペプチド類似体を含む。
【０１１５】
本明細書中において用いられる場合、「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」は、生物学的に活性な分子に抱合されているか、ポリエチレングリコールに抱合されているか、または非抱合物形態であるかにかかわらず、ホモ二量体を形成するために非共有結合で連結された２つのサブユニットを含むタンパク質である。本明細書中において用いられる場合、「インターロイキン−２」および「ＩＬ−２」は、「ｈＩＬ−２」または「ｍＩＬ−２」とも呼ばれるヒトＩＬ−２またはマウスＩＬ−２を指すことができる。
【０１１６】
用語「ペグ化ＩＬ−２」、「ＰＥＧ化ＩＬ−２」、または「ＰＥＧ−ＩＬ−２」は、結合を安定にするように、リンカーを介してＩＬ−２タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基に共有結合している１つ以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ−２分子である。用語「モノペグ化ＩＬ−２」および「モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−２」は、１つのポリエチレングリコール分子がリンカーを介してＩＬ−２二量体の１つのサブユニット上の単一のアミノ酸残基に共有結合していることを意味する。ＰＥＧ部分の平均分子量は、好ましくは約５，０００〜約５０，０００ダルトンである。ＩＬ−２へのＰＥＧ結合の方法または部位は、重要ではないが、好ましくはペグ化が生物学的に活性な分子の活性を変化させないか、または最小限にしか変化させない。好ましくは、半減期の増加が生物学的活性のいかなる減少よりも大きい。
【０１１７】
本明細書に記載のＩＬ−２におけるアミノ酸位置への言及はすべて、特に明記しない限り（すなわち、比較が配列番号３、５、もしくは７、または他のＩＬ−２に基づくと述べられている場合）、配列番号２における位置に基づく。当業者は、配列番号２における位置に対応するアミノ酸位置が、配列番号３、５、または７などの任意の他のＩＬ−２において容易に同定され得ることを理解するであろう。当業者は、配列番号２、３、５、もしくは７、または任意の他のＩＬ−２配列の位置に対応するアミノ酸位置が、例えば、ＩＬ−２融合体、変異体、フラグメントなどの任意の他のＩＬ−２分子において容易に同定され得ることを理解するであろう。例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントプログラムを使用して、配列番号２、３、５、もしくは７、または他のＩＬ−２配列中の位置に対応するタンパク質中の特定の位置をアラインメントし、同定することができる。配列番号２、３、５、もしくは７、または他のＩＬ−２配列を参照して本明細書中に記載されるアミノ酸の置換、欠失、または付加はまた、本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知であるＩＬ−２融合体、変異体、フラグメントなどにおける対応する位置における置換、欠失、または付加を指すことが意図され、本発明によって明示的に包含される。
【０１１８】
ＩＬ−２（ＩＬ３）：当該分野で公知の任意の形態のＩＬ−２は、本明細書中に記載される組成物において使用され得る。実験研究のためには、ＩＬ−２のマウスの形態が特に有用である。当業者は、ＩＬ２中のアミノ酸残基のいくつかが、その活性に影響を及ぼすことなく変化し得ること、およびＩＬ２のこれらの修飾形態もまた、担体に結合され得、本明細書中に記載される方法において使用され得ることを認識するであろう。
【０１１９】
用語「ＩＬ−２」または「ＩＬ−２」は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含むＩＬ−２を包含する。本発明のＩＬ−２は、１つ以上の非天然アミノ酸修飾と組み合わせた１つ以上の天然アミノ酸による修飾から構成されていてもよい。天然に存在するＩＬ−２ポリペプチドにおける多種多様なアミノ酸位置における例示的な置換が記載されており、これには、限定されないが、薬学的安定性を調節し、ＩＬ−２ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を調節する置換（例えば、限定されないが、アゴニスト活性の増加、ポリペプチドの溶解度の増加、プロテアーゼ感受性の減少、ポリペプチドのアンタゴニストへの変換などが挙げられる）が挙げられ、用語「ＩＬ−２ポリペプチド」に包含される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２アンタゴニストがＩＬ−２分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーに連結された、天然にコードされていないアミノ酸を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２またはその変異体は、ＩＬ−２または変異体ポリペプチドの生物学的活性を調節する付加、置換、または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または変異体は、癌の１つ以上の症状における治療または緩和などの研究を通して知られ、実証されたＩＬ−２の特性を調節する付加、置換、または欠失をさらに含む。例えば、付加、置換または欠失は、ＩＬ−２またはその変異体の１つ以上の性質または活性を調節し得る。例えば、付加、置換または欠失は、ＩＬ−２受容体または当該受容体の１つ以上のサブユニットに対する親和性を調節し得るか、循環半減期を調節し得るか、治療半減期を調節し得るか、ポリペプチドの安定性を調節し得るか、プロテアーゼによる切断を調節し得るか、用量を調節し得るか、放出またはバイオアベイラビリティを調節し得るか、精製を促進し得るか、あるいは、投与の特定の経路を改善または変更し得る。同様に、ＩＬ−２または変異体は、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（限定されないが、ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓが挙げられる）、あるいは他の親和性に基づく配列（限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられる）、あるいはポリペプチドの検出（限定されないが、ＧＦＰが挙げられる）、精製、または他の特性を改善する、連結された分子（限定されないが、ビオチンが挙げられる）を含んでいてもよい。
【０１２１】
用語「ＩＬ−２ポリペプチド」はまた、連結された、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、およびヘテロマルチマーを包含する。これらの連結された、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、およびヘテロマルチマーとしては、限定されないが、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して直接的に連結されているもの、同一のもしくは異なる天然にコードされていないアミノ酸の側鎖に直接的に連結されているもの、または天然にコードされたアミノ酸の側鎖に直接的に連結されているもの、あるいはリンカーを介して間接的に連結されているものが挙げられる。典型的なリンカーとしては、限定されないが、小さい有機化合物、様々な長さの水溶性ポリマー（ポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストランなど）、または様々な長さのポリペプチドが挙げられる。
【０１２２】
本明細書中において用いられる場合、用語「本発明の抱合物」、「ＩＬ−２−生物学的に活性な分子の抱合物」、または「ＰＥＧ−ＩＬ−２」は、生物学的に活性な分子、その一部、またはそのアナログに抱合されたインターロイキン−２受容体またはそのサブユニットに結合するインターロイキン−２またはその一部、アナログまたは誘導体を指し、別段の指示がない限り、用語「本発明の化合物」および「本発明の組成物」は、用語「本発明の抱合物」の代替物として使用される。
【０１２３】
本明細書中において用いられる場合、用語「細胞毒性剤」は、ＩＬ−２、ＰＥＧ−ＩＬ−２、またはＩＬ−２変異体と組み合わせて使用するための治療剤として使用され得る、癌細胞または活性化免疫細胞に対して治療効果を発揮する任意の薬剤であり得る（例えば、ＷＯ２００４／０１０９５７号、"Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease"を参照のこと）。本発明で使用するための細胞毒性剤または免疫抑制剤のクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シス−プラチン、モノ（白金）、ビス（白金）、および三核白金錯体、およびカルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸塩、抗代謝物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。
【０１２４】
個々の細胞毒性剤または免疫抑制剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン（5-fluordeoxyuridine）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン（procarbizine）、ストレプトゾトシン、テノポシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６、およびＶＭ−２６が挙げられる。
【０１２５】
いくつかの典型的な実施形態では、治療薬は、細胞毒性剤である。適切な細胞傷害剤としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィジン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモライド、エリューテロビン、ならびにミトキサントロンが挙げられる。
【０１２６】
「天然にコードされていないアミノ酸」は、２０個の共通アミノ酸、またはピロリジンもしくはセレノシステインの１つでないアミノ酸をいう。用語「天然にコードされていないアミノ酸」と同義的に用いてもよい他の用語は、「非天然アミノ酸」、「天然でないアミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンで繋げられたバージョン、およびハイフンで繋げられていないバージョンである。また、用語「天然にコードされていないアミノ酸」としては、限定されないが、天然にコードされたアミノ酸（限定されないが、２０個の共通アミノ酸またはピロリジンおよびセレノシステインが挙げられる）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるが、それら自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸が挙げられる。このような天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられる。
【０１２７】
「アミノ末端を修飾する基」は、ポリペプチドのアミノ末端に結合することができる任意の分子をいう。同様に、「カルボキシ末端を修飾する基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に結合することができる任意の分子をいう。末端を修飾する基としては、限定されないが、種々の水溶性ポリマー、ペプチドもしくはタンパク質（血清アルブミンなど）、またはペプチドの血清半減期を増加させる他の部分が挙げられる。
【０１２８】
用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学的に反応性の基」、および「化学的に反応性の部分」は、分子の明確に定義できる一部またはユニットを指すために当該技術分野および本明細書において用いられる。当該用語は、化学の技術分野においてある程度同義であり、いくつかの機能または活性を発揮し、かつ他の分子と反応する、分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
【０１２９】
用語「結合」または「リンカー」は、通常は、化学反応の結果として形成された基または結合を指すために本明細書において用いられており、典型的には、共有結合である。加水分解に安定な結合は、結合が実質的に水中において安定であり、有用なｐＨ値（限定されないが、長期間（ことによると無期限）の生理的条件下を含む）において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定な結合または加水分解によって分解可能な結合は、結合が水中または水溶液中（例えば血液中が挙げられる）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定な結合または酵素によって分解可能な結合は、結合が１つ以上の酵素によって分解され得ることを意味する。当該技術分野において理解されているように、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、ポリマーの主鎖、またはポリマーの主鎖とポリマー分子の末端の１つ以上の官能基との間のリンカー基に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化されたＰＥＧカルボン酸と生物学的に活性な剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物学的に活性な剤を放出する。他の加水分解によって分解可能な結合としては、限定されないが、カーボネート結合；アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合；アルコールとリン酸基との反応によって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル結合；（限定されないが、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド結合；および（限定されないが、ポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、用語「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」、または「生物学的に活性な剤」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用の任意の物理学的性質または生物化学的性質に影響を与えることができる任意の物質を意味する。生物としては、限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、菌類、植物、動物、およびヒトが挙げられる。特に、本明細書で用いられる場合、生物学的に活性な分子としては、限定されないが、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療、または予防、あるいは、そうでなければ、ヒトまたは動物の身体的または精神的な健康状態の増強を意図した任意の物質が挙げられる。生物学的に活性な分子の例としては、限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子の薬剤、ワクチン、免疫原、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または無機分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、トキソイド、生物学的に活性な分子、原核細胞、真核細胞、ウイルス、ポリ糖、核酸およびその一部（ウイルス、細菌、昆虫、動物、または任意の他の細胞もしくは細胞型から得られたか、あるいはこれらに由来するもの）、リポソーム、微粒子、ならびにミセルが挙げられる。本発明と一緒に使用するに適した生物学的に活性な剤のクラスとしては、限定されないが、薬剤、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、胆汁酸樹脂、ナイアシン、および／またはスタチン（statins）、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心臓血管作用薬、抗不安剤、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、および細菌由来の生物学的に活性な分子などが挙げられる。また、生物学的に活性な薬剤としては、特許出願公開番号２００８０２２１１１２、Ｙａｍａｍｏｒｉらに記載されているようなアミド化合物が挙げられる。当該アミド化合物は、本発明のＩＬ−２ポリペプチドと、前投与、後投与、および／または同時投与されてもよい。
【０１３１】
「二官能性ポリマー」は、他の部分（限定されないが、アミノ酸の側鎖の基が挙げられる）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる２つの分離した官能基を含んでいるポリマーをいう。一方の官能基が特定の生物学的に活性な成分における基と反応し、他方の基が第２の生物学的な成分における基と反応する二官能性リンカーは、第１の生物学的に活性な成分、二官能性リンカー、および第２の生物学的に活性な成分を含む抱合物を形成するために使用され得る。種々の化合物をペプチドに結合させるための多くの手法およびリンカー分子は知られている。例えば、欧州特許出願公開第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、米国特許第４，６５９，８３９号、米国特許第４，４１４，１４８号、米国特許第４，６９９，７８４号、米国特許第４，６８０，３３８号、および米国特許第４，５６９，７８９号を参照のこと（これらは参照として本明細書に援用される。）。「多官能性ポリマー」は、他の部分（限定されないが、アミノ酸の側鎖の基が挙げられる）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる２つ以上の分離した官能基を含んでいるポリマーをいう。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さまたは分子量であってもよく、ＩＬ−２に連結している１つ以上の分子と、その受容体またはＩＬ−２との間に特定の所望の空間または立体配座をもたらすように、選択されてもよい。
【０１３２】
置換基が、左から右に書かれたそれらの従来の化学式によって明記されている場合、当該置換基は、構造を右から左へと書くことから生じ得る化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−と同等である。
【０１３３】
用語「置換基」としては、限定されないが、「干渉しない置換基」が挙げられる。「干渉しない置換基」は、安定な化合物をもたらすそれらの基である。適切な干渉しない置換基またはラジカルとしては、限定されないが、ハロ（halo）、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ１−Ｃ１２のアルカリル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル（xylenyl）、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ｍは１〜８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（各ｍは１〜８である）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。ここで使用される各Ｒは、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキル、またはアルカリルである。
【０１３４】
用語「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が挙げられる。
【０１３５】
単独でのまたは他の置換基の一部としての用語「アルキル」は、特に明記しない限り、炭素原子の数が指定され（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は、１〜１０個の炭素を意味する）、完全飽和、一不飽和または多不飽和であり得、二価の基および多価のラジカルを包含し得る、直鎖の、枝分かれ鎖の、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、および、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどのホモログおよびアイソマーなどの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重結合または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高級ホモログおよびアイソマーが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、以下にてより詳細に定義されるアルキルのそれらの誘導体（「ヘテロアルキル」など）を含むことを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【０１３６】
単独でのまたは他の置換基の一部としての用語「アルキレン」は、アルカンから誘導された二価のラジカルを意味し、限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２−およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−の構造によって例示され、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下にて記載されるそれらの基が挙げられる。典型的には、アルキル基（またはアルキレン基）は、１〜２４個の炭素原子を有しており、１０個以下の炭素原子を有するこれらの基は、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態である。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に、８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基である。
【０１３７】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ（またはチオアルコキシ）」は、それらの従来の意味で使用されており、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に結合するアルキル基をいう。
【０１３８】
単独でのまたは他の用語と組み合わせたときの用語「ヘテロアルキル」は、特に明記しない限り、記載された数の炭素原子および少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定な直鎖のもしくは枝分かれ鎖の、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味する。ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群より選択される。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて４級化されていてもよい。ヘテロ原子であるＯ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部に結合する位置に配置されていてもよい。例えば、限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、およびＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。２以下のヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３およびＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、連続していてもよい。同様に、単独でのまたは他の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルから誘導された二価のラジカルを意味し、限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−およびＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示される。また、ヘテロアルキレン基について、同一のまたは異なるヘテロ原子は、鎖の末端のどちらか一方または両方を占有していてもよい（限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの連結基について、連結基の向きは、連結基の式が記載された方向によって示されていない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’およびＲ’Ｃ（Ｏ）２の両方を表す。
【０１３９】
単独でのまたは別の用語と組み合わせたときの用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、特に明記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルとしては、飽和した環の結合、部分的に不飽和した環の結合、および完全に不飽和した環の結合が挙げられる。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部に結合している位置を占有し得る。シクロアルキルの例としては、限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、上記用語は、二環または三環の環構造を包含する。同様に、単独でのまたは他の置換基の一部としての用語「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキルから誘導された二価のラジカルを意味し、単独でのまたは他の置換基の一部としての用語「シクロアルキレン」は、シクロアルキルから誘導された二価のラジカルを意味する。
【０１４０】
本明細書において用いられる場合、用語「水溶性ポリマー」は、水性の溶媒に溶解する任意のポリマーをいう。水溶性ポリマーをＩＬ−２に連結することによって、限定されないが、修飾されていない形態と比べたときの血清半減期の増加または調節、修飾されていない形態と比べたときの治療半減期の増加または調節、免疫原性の調節、物理学的な会合特性（凝集およびマルチマーの形成など）の調節、受容体への結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および受容体のダイマー化またはマルチマー化の変更を含む、変化がもたらされ得る。水溶性ポリマーは、それ自体が独自の生物学的活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。水溶性ポリマーは、ＩＬ−２を他の物質（限定されないが、１つ以上のＩＬ−２または１つ以上の生物学的に活性な分子が挙げられる）に結合するためのリンカーとして利用されてもよい。適切なポリマーとしては、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、それらのモノＣ１−Ｃ１０のアルコキシまたはアリールオキシの誘導体（参照として本明細書に援用される米国特許第５，２５２，７１４に記載されている）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストランの誘導体（デキストランサルフェートが挙げられる）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンのフラグメント、多糖、オリゴ糖、グリカン、セルロースおよびセルロースの誘導体（限定されないが、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）、デンプンおよびデンプンの誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、ならびにアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）など、あるいは、それらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例としては、限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
【０１４１】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体をいう。用語「ポリアルキレングリコール」は、線状のポリマーおよび枝分かれポリマーの両方を包含し、０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａの平均分子量を包含する。他の典型的な実施形態は、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications」(2001)など）に列挙されている。
【０１４２】
用語「アリール」は、特に明記しない限り、共に融合したまたは共有結合によって連結した単環または多環（限定されないが、１〜３の環が挙げられる）であり得る、多価不飽和の芳香族炭化水素の置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される、１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）をいう。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、窒素原子は、必要に応じて４級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に結合され得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上述のアリールおよびヘテロアリールの環系のそれぞれのための置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。
【０１４３】
すなわち、他の用語と組み合わせて用いられるときの用語「アリール」（限定されないが、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルが挙げられる）としては、上記で定義したアリール環およびヘテロアリール環の両方が挙げられる。したがって、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基に結合している基を包含することを意味し、限定されないが、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる。アリールアルキルには、炭素原子が例えば酸素原子によって置換されたアルキル基（限定されないが、メチレン基が挙げられる）が包含される（限定されないが、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる）。
【０１４４】
上述の用語（限定されないが、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」が挙げられる）の各々は、示されたラジカルの置換された形態および置換されていない形態の両方を含むことを意図されている。各々の種類のラジカルのための典型的な置換基を以下に示す。
【０１４５】
アルキルおよびヘテロアルキルのラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されるそれらの基が挙げられる）のための置換基は、限定されないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、およびＮＯ２から選択される種々の基の１つ以上であり得る。置換基の数は、０〜（２ｍ’＋１）の範囲であり、ｍ’はこのようなラジカルにおける炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基（限定されないが、１〜３のハロゲンで置換されたアリール基が挙げられる）、置換または非置換のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、あるいはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物がＲ基を１つよりも多く含む場合、例えば、Ｒ基が１つよりも多く存在しているとき、Ｒ基の各々は、Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基のように独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と結びついて、５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図される。置換基についての上述の議論から、当業者は、用語「アルキル」は、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基（ハロアルキル（限定されないが、−ＣＦ３およびＣＨ２ＣＦ３が挙げられる）、ならびにアシル（限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、およびＣ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる）など）を含むことを意図されることを理解するであろう。
【０１４６】
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基のための置換基は多様であり、限定されないが、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよびＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択される。上記置換基の数は、０〜芳香環系のオープンバレンス（open valences）の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される。本発明の化合物がＲ基を１つよりも多く含む場合、例えば、Ｒ基が１つよりも多く存在しているとき、Ｒ基の各々は、Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基、およびＲ’’’’基のように独立して選択される。
【０１４７】
本明細書において用いられる場合、用語「調節された血清半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾されたＩＬ−２の循環半減期における正の変化または負の変化を意味する。血清半減期は、ＩＬ−２を投与した後の種々の時点における血液試料を採取して、各試料における分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間との相関によって、血清半減期を計算することができる。血清半減期の増加は、少なくとも約２倍であることが望ましい。しかし、それよりも少ない増加は、例えば、十分な投薬のレジメンを可能にするか、または毒性効果を回避する場合、有用であり得る。いくつかの実施形態では、増加は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
【０１４８】
本明細書で用いられる場合、用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、ＩＬ−２の治療的に有効な量の半減期の正の変化または負の変化を意味する。治療半減期は、投与後の種々の時点における上記分子の薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を測定することによって測定される。増加した治療半減期は、特定の有利な投薬のレジメンもしくは特定の有利な総用量を可能にするか、または望ましくない効果を回避することが望ましい。いくつかの実施形態では、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合性の増加もしくは減少、酵素（プロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少、修飾されていない分子の作用の別のパラメータもしくは機構の増加もしくは減少、または受容体に媒介される分子の排除の増加もしくは減少に起因する。
【０１４９】
用語「単離された」は、核酸またはタンパク質に対して適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態において会合する細胞内の成分の少なくともいくつかから遊離しているか、核酸またはタンパク質が、インビボまたはインビトロの産物の濃度よりも高いレベルに濃縮されていることを示す。それは、均質な状態であってもよい。単離された物質は、乾燥状態または半乾燥状態のいずれかであってもよいし、溶液（限定されないが、水溶液が挙げられる）中であってもよい。それは、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいる薬学的組成物の成分であってもよい。純度および均質性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの化学的分析技術を用いて決定される。タンパク質が、調製物中に存在する大部分を占める種である場合、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、当該遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動のゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じさせることを示す。特に、当該用語は、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋であるか、少なくとも９０％純粋であるか、少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９９％純粋であるか、またはそれ以上純粋であることを意味していてもよい。
【０１５０】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの１本鎖または２本鎖の形態のポリマーをいう。具体的に限定されない限り、当該用語は、参照の核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。また、特に具体的に限定されない限り、当該用語は、オリゴヌクレオチドのアナログ（ＰＮＡ（ペプチド核酸）が挙げられる）、アンチセンス技術に使用されるＤＮＡのアナログ（ホスホロチオエートおよびホスホロアミダートなど）もいう。また、特に断りのない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変異体（限定されないが、縮重コドンの置換体が挙げられる。）および相補的配列、ならびに明確に示された配列も、暗黙的に包含する。具体的には、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を作製することによって、縮重コドンの置換体が得られ得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【０１５１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書において交換可能に使用される。すなわち、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、逆もまた同様である。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸のポリマーだけでなく、１個以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸のポリマーにも適用される。本明細書において用いられる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、任意の長さのアミノ酸鎖（全長のタンパク質が挙げられる）が包含される。
【０１５２】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同じように機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ピロリジン、およびセレノシステインである。アミノ酸アナログは、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどの、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している）を有する化合物をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基を有しているか（ノルロイシンなど）、または修飾されたペプチドの主鎖を有しているが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸についての言及は、例えば、天然に存在するタンパク新生のＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸（アミノ酸の変異体および誘導体など）；天然に存在する非タンパク新生のアミノ酸（β−アラニン、オルニチンなど）；およびアミノ酸の特徴であると当該技術分野において知られている性質を有する化学的に合成された化合物を含む。天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定されないが、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン）、余分なメチレンを側鎖に有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、および側鎖におけるカルボン酸の官能基がスルホン酸基と置換されたアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられる。非天然アミノ酸（合成のネイティブでないアミノ酸、置換されたアミノ酸、または１つ以上のＤ−アミノ酸が挙げられる）を本発明のタンパク質に組み込むことは、多くの異なる方法において有利であり得る。Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸を含有する対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおける増加した安定性を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込むというペプチドのコンストラクションなどは、細胞内でのより高い安定性が望まれるか、必要とされる場合、特に有用であり得る。より具体的には、このような特性が望ましいときに、Ｄ−ペプチドなどは、内因性のペプチダーゼおよびプロテアーゼに対して耐性を示すため、分子のバイオアベイラビリティを改善し、インビボにおける寿命を延長する。さらに、Ｄ−ペプチドなどは、ヘルパーＴ細胞への、主要組織適合複合体のクラスＩＩ拘束性の提示のために、効率良くプロセスされることができない。それゆえ、Ｄ−ペプチドなどは、全生物において体液性免疫反応を誘導する可能性が低い。
【０１５３】
本明細書においてアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推薦する一般的に知られた３文字表記または１文字表記のどちらかによって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
【０１５４】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードするそれらの核酸のことか、または核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。このため、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの何れかへコドンを変化させることができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の１種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列は、核酸のサイレント変異として可能性のある全てのものを表している。当業者は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンが修飾され得ることを理解するであろう（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧは除く）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【０１５５】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の１つのアミノ酸または数％のアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸との置換を生じる「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的な置換の表は、当業者に公知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の、多型の変異体、種間のホモログ（interspecies homologs）、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを排除するものではない。
【０１５６】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存的な置換の表は、当業者に公知である。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)を参照のこと）。
【０１５７】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一性」または「同一性」の百分率は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることをいう。配列を比較ウィンドウまたは指定された領域に対して最大限に対応するように対比および整列させ、以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、または手動で整列させて目視によって検査して測定した場合に、配列が同じであるアミノ酸の残基またはヌクレオチドを所定の百分率で有するとき（すなわち、特定の領域に渡って約６０％の同一性、約６５％の同一性、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）、配列は「実質的に同一」である。また、この定義は、試験配列の相補体をいう。同一性は、アミノ酸またはヌクレオチドの長さが少なくとも約５０である領域に渡って、あるいはアミノ酸またはヌクレオチドの長さが少なくとも７５〜１００である領域に渡って、あるいは、特定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列全体に渡って存在し得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ヒト以外の種からのホモログを含む）は、本発明のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下においてライブラリーをスクリーニングする工程と、当該ポリヌクレオチド配列を含む全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程とを含むプロセスによって得られ得る。このようなハイブリダイゼーションは、当業者に周知である。
語句「〜に対する選択的な（または特異的な）ハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（限定されないが、全細胞、またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡが挙げられる）に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下における、特定のヌクレオチド配列に対してのみへの分子の結合、２本鎖の形成、またはハイブリダイズをいう。
【０１５８】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、当該技術分野において知られているような低イオン強度および高温度の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または他の核酸模倣物、あるいはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションをいう。典型的に、ストリンジェントな条件下において、プローブは、核酸の複合混合物（限定されないが、全細胞、またはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡが挙げられる）中のプローブが標的とするサブ配列とハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なるであろう。配列がより長くなるほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【０１５９】
本明細書において用いられる場合、用語「真核生物」は、動物（限定されないが、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などが挙げられる）、繊毛虫類、植物（限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などが挙げられる）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、ならびに原生生物などの、系統学的ドメイン（phylogenetic domain）の真核生物（Eucarya）に属する生物をいう。
【０１６０】
本明細書において用いられる場合、用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物をいう。例えば、真核生物ではない生物は、真正細菌（限定されないが、Escherichia coli、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermophilus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putidaなどが挙げられる。）の系統学的ドメイン、または古細菌（限定されないが、Methanococcus jannaschii、Methanobacterium thermoautotrophicum、Halobacterium（Haloferax volcanii and Halobacteriumの種のNRC-1）、Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、Aeuropyrum pernixなどが挙げられる）の系統学的ドメインに属し得る。
【０１６１】
本明細書において用いられる場合、用語「被験体」は、治療、観察、または実験の対象である動物をいい、いくつかの実施形態では哺乳動物であり、他の実施形態ではヒトである。動物は、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
【０１６２】
本明細書において用いられる場合、用語「有効な量」は、投与される修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの量であって、治療される疾患、状態、または障害の１つ以上の症状をある程度軽減する量をいう。本明細書に記載の修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含む組成物は、予防的処置、増強するための処置、および／または治療的処置のために投与され得る。
【０１６３】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果を効力または持続時間のいずれかについて、増加または延長することを意味する。したがって、治療剤の効果の増強に関し、「増強」は、系における他の治療剤の効果を、効力または持続時間のいずれかについて、増加または延長する能力をいう。本明細書において用いられる場合、「増強に有効な量」は、所望の系における他の治療剤の効果の増強に十分な量をいう。患者に使用される場合に、この使用のための有効な量は、疾患、障害、または状態の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬剤に対する反応性、ならびに治療担当医の判断に依存する。
【０１６４】
本明細書において用いられる場合、用語「修飾された」は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列の変更、化学構造、同時翻訳修飾、または翻訳後修飾の変更などの、所定のポリペプチドになされた任意の変更をいう。「（修飾された）」の形態の用語は、検討されているポリペプチドが任意に修飾されていること、すなわち、検討中のポリペプチドが修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよいことを意味する。
【０１６５】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然のアミノ酸がペプチド鎖に組み込まれた後に、このようなアミノ酸に生じる任意の修飾をいう。当該用語には、ほんの一例として、インビボの同時翻訳修飾、インビトロの同時翻訳修飾（例えば、無細胞翻訳系における）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾が包含される。
【０１６６】
予防的な適用において、ＩＬ−２を含む組成物は、特定の疾患、障害、または状態にかかりやすいか、またはそうでなければその状態の危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防的に有効な量」であると定義される。また、この使用において、正確な量は、患者の健康状態および体重などに依存する。このような予防的に有効な量が定石の実験（例えば、用量を増加させる臨床試験）によって決定されることは、当業者に周知の範囲であると考えられる。
【０１６７】
治療的な適用において、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含む組成物は、疾患、状態、または障害に既に罹患した患者に、当該疾患、状態、または障害の症状を治癒するか、少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的に有効な量」であると定義され、疾患、障害、または状態の重症度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬剤に対する反応性、ならびに治療担当医の判断に依存する。このような治療的に有効な量が定石の実験（例えば、用量を増加させる臨床試験）によって決定されることは、当業者に周知の範囲であると考えられる。
【０１６８】
用語「治療する」は、予防的処置および／または治療的処置のいずれか指すために使用される。
【０１６９】
本明細書に示された天然にコードされていないアミノ酸のポリペプチドは、１つ以上の原子が、天然に通常見られる原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子によって置換されたものである、同位体で標識された化合物を含んでいてもよい。本化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、および塩素の同位体が挙げられ、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどである。本明細書に記載の特定の同位体で標識された化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）は、薬剤および／または基質の組織分布アッセイに有用であり得る。さらに、重水素（すなわち、２Ｈ）などの同位体での置換は、より優れた代謝安定性から生じる特定の治療上の利点をもたらすことができる（例えば、インビボの半減期の増加、または必要な用量の減少）。
【０１７０】
全ての異性体（限定されないが、ジアステレオマー、エナンチオマー、およびそれらの混合物が挙げられる）が本明細書に記載の組成物の一部としてみなされる。追加のまたはさらなる実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸のポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果が挙げられる）を引き起こすために使用される代謝産物を産生する必要がある生物に投与されると、代謝される。さらなるまたは追加の実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸のポリペプチドの活性代謝産物である。
【０１７１】
いくつかの状況において、天然にコードされていないアミノ酸のポリペプチドは、互変異性体として存在し得る。さらに、本明細書に記載の天然にコードされていないアミノ酸のポリペプチドは、非溶媒和の形態、および薬学的に許容可能な溶媒（例えば、水およびエタノールなど）との溶媒和の形態にて存在し得る。溶媒和の形態も本明細書に開示されているとみなされる。当業者は、本明細書の化合物のいくつかが、数種の互変異性体の形態にて存在し得ることを認識する。このような互変異性体の形態の全ては、本明細書に記載の組成物の一部としてみなされる。
【０１７２】
他に示さない限り、当該技術分野の範囲における、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来の方法が使用される。
【０１７３】
〔詳細な説明〕
＜Ｉ．序論＞
少なくとも１つの天然でないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２分子は、本発明において提供される。本発明のある実施形態では、少なくとも１つの天然でないアミノ酸を有するＩＬ−２は、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾は、特定の反応性基に適し、当業者に公知である化学的手法を利用して、第２の反応性基を含んでいる分子（限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬剤、アフィニティー標識、フォトアフィニティー標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ、抗体もしくは抗体フラグメント、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属を含有する部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基、光でケージ化する（photocaged）部分、化学線によって励起可能な部分、光によって異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンアナログ、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、延長された側鎖、炭素に結合される糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体で標識された部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性の基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子を捕獲する剤、またはこれらの任意の組み合わせ、または任意の他の所望の化合物もしくは物質が挙げられる）を、第１の反応性基を含んでいる天然でないアミノ酸の少なくとも１つに結合すること含む。例えば、第１の反応性基はアルキニル部分（限定されないが、天然でないアミノ酸であるｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基はアセチレン部分と称されることもある）が挙げられる）であり、第２の反応性基はアジド部分であり、［３＋２］の付加環化の化学的手法が利用される。別の例では、第１の反応性基はアジド部分（限定されないが、天然でないアミノ酸であるｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンまたはｐＡＳ（本明細書で称されることもある）が挙げられる）であり、第２の反応性基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＩＬ−２のある実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる少なくとも１つの天然でないアミノ酸（限定されないが、ケト官能基を含む天然でないアミノ酸が挙げられる）は、少なくとも１つの翻訳後修飾が糖部分を含む場合、使用される。ある実施形態において、翻訳後修飾は、真核細胞内においてインビボにて行われるか、または非真核細胞内にて行われる。リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー、または他の分子は、分子をポリペプチドに結合させてもよい。さらなる実施形態では、ＩＬ−２に結合されるリンカーは、二量体の形成を可能にするのに十分な長さである。分子はまた��ポリペプチドを直接的に連結されてもよい。
【０１７４】
ある実施形態において、ＩＬ−２タンパク質は、ある宿主細胞によってインビボにおいて行われる翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでおり、当該翻訳後修飾は、別の宿主細胞種によって普通は行われないものである。ある実施形態において、タンパク質は、真核細胞によってインビボにおいて行われる翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでおり、当該翻訳後修飾は、普通は非真核細胞によって行われないものである。翻訳後修飾の例としては、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが挙げられる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、または糖脂質結合修飾のための１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化のための１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、または糖脂質結合修飾のための１つ以上の天然にコードされたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化のための１つ以上の天然にコードされたアミノ酸を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化を増強する１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチドのグリコシル化を増強する１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の異なるアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の異なるアミノ酸におけるグリコシル化を増強する１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の天然にコードされていないアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の天然にコードされたアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の異なるアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされたアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の天然にコードされたアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、ポリペプチド内の天然にコードされていないアミノ酸におけるグリコシル化を増強する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の付加および／または置換を含む。
【０１７７】
一実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンの結合による、アスパラギンに対するオリゴ糖の結合を含む（限定されないが、オリゴ糖が、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを含む場合などが挙げられる）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニンの結合による、セリンまたはトレオニンに対するオリゴ糖の結合を含んでいる（限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる）。ある実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化の配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを含む。分泌シグナル配列の例としては、限定されないが、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌での発現のために５’が最適化された真核生物の分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクタートリアーゼの分泌シグナル配列、Ｏｍｐ  Ａの分泌シグナル配列、およびファージの分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩおよびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられる。任意のこのような配列は、ポリペプチドに所望の結果を与えるように修飾されていてもよい（限定されないが、あるシグナル配列を異なるシグナル配列と置換すること、リーダー配列を異なるリーダー配列と置換することなどが挙げられる）。
【０１７８】
目的のタンパク質またはポリペプチドは、天然でないアミノ酸を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個、またはそれ以上含み得る。天然でないアミノ酸は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の異なる天然でないアミノ酸を含む、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の異なる部位がタンパク質に存在し得る。ある実施形態では、天然に存在するバージョンのタンパク質における特定のアミノ酸の少なくとも１つ（しかし、全てより少ない）が、天然でないアミノ酸で置換されている。
【０１７９】
本発明は、少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２に基づく、方法および組成物を提供する。ＩＬ−２に少なくとも１つの天然にコードされていないアミノ酸を導入することによって、特異的な化学反応を包含する抱合の化学作用を活用することができる（限定されないが、２０個の一般的に存在するアミノ酸と反応しないが、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸と反応することが挙げられる）。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２は、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に連結されている。本発明は、ＰＥＧ誘導体によるタンパク質の選択的修飾のための効率の高い方法を提供する。当該方法は、遺伝的にコードされていないアミノ酸（限定されないが、２０個の天然に組み込まれるアミノ酸に見出されない官能基または置換基（限定されないが、ケトン、アジド、またはアセチレンの部分が挙げられる）を含んでいるアミノ酸が挙げられる）の、セレクターコドンに応じたタンパク質への選択的組み込み、および次いで、適切に反応するＰＥＧ誘導体によるこれらのアミノ酸の修飾を包含している。一旦、組み込めば、天然にコードされていないアミノ酸に存在する特定の官能基または置換に適した、当業者に公知の化学的手法を利用することによって、アミノ酸の側鎖を修飾することができる。多種多様な公知の化学的手法は、タンパク質に水溶性ポリマーを組み込むために、本発明において好適に使用される。このような手法としては、限定されないが、例えば限定されないがアセチレンまたはアジドの誘導体のそれぞれとの、ヒュスゲン［３＋２］の付加環化反応が挙げられる（例えば、Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109；および、Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176を参照のこと）。
【０１８０】
ヒュスゲン［３＋２］の付加環化の方法は、求核置換反応というよりもむしろ付加環化に関するものであるので、タンパク質を極めて高い選択性で修飾することができる。反応混合物に触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を添加することによって、反応を優れた位置選択性（１，４＞１，５）で水性条件において室温で実施することができる。例えば、Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064；および、Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599；および、ＷＯ０３／１０１９７２号を参照のこと。［３＋２］の付加環化を介して本発明のタンパク質に付加され得る分子としては、適切な官能基または置換基を有する実質的に任意の分子（限定されないが、アジドまたはアセチレンの誘導体が挙げられる）が挙げられる。これらの分子はそれぞれ、アセチレン基を有する天然でないアミノ酸（限定されないが、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンが挙げられる）、またはアジド基を有する天然でないアミノ酸（限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンが挙げられる）に付加され得る。
【０１８１】
ヒュスゲン［３＋２］の付加環化から生じる５員環は、還元性の環境において一般に可逆ではなく、水性の環境において長期間、加水分解に対して安定である。したがって、多種多様な物質の物理学的特性および化学的特性を、本発明の活性ＰＥＧ誘導体を用いて、要求される水性条件下において修飾することができる。さらに重要なことに、アジドおよびアセチレンの部分は互いに特異的であるため（そして、例えば、２０個の共通の遺伝的にコードされたアミノ酸と反応しないため）、タンパク質を極めて高い選択性で１つ以上の特異的な部位において修飾できる。
【０１８２】
また、本発明は、アセチレンまたはアジドの部分を１つ以上有し、水溶性であり、加水分解に安定な、ＰＥＧ誘導体の誘導体および関連する親水性ポリマーを提供する。アセチレン部分を含んでいるＰＥＧのポリマーの誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に導入されたアジド部分との連結に対して高い選択性を有する。同様に、アジド部分を含んでいるＰＥＧのポリマーの誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に導入されたアセチレン部分との連結に対して高い選択性を有する。
【０１８３】
より具体的には、アジド部分は、限定されないが、アルキルアジド、アリールアジド、およびこれらのアジドの誘導体を含む。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレンに対する特異的な反応性が維持される限り、他の置換基を含んでいてもよい。アセチレン部分は、アルキルアセチレン、アリールアセチレン、およびこれらの誘導体を含んでいる。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジドに対する特異的な反応性が維持される限り、他の置換基を含んでいてもよい。
【０１８４】
本発明は、多種多様な官能基、置換基、または部分を有する物質と他の物質（限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬剤；アフィニティー標識；フォトアフィニティー標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ；抗体もしくは抗体フラグメント；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド：ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；阻害性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属を含有する部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基；光でケージ化する部分；化学線によって励起可能な部分；光で異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンアナログ、重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素に結合される糖；酸化還元活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体で標識された部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性の基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性ヌクレオチド；放射性伝達物質；中性子を捕獲する剤、またはこれらの任意の組み合わせ、または任意の他の所望の化合物もしくは物質が挙げられる）との抱合物を提供する。また、本発明は、アジドまたはアセチレンの部分を有する物質と、対応するアセチレンまたはアジドの部分を有する、ＰＥＧのポリマーの誘導体との抱合物を含む。例えば、アジド部分を含んでいるＰＥＧのポリマーは、アセチレン基を有する遺伝的にコードされていないアミノ酸を含んでいるタンパク質内の位置で生物学的に活性な分子に連結され得る。ＰＥＧと生物学的に活性な分子とを連結する結合としては、限定されないが、ヒュスゲン［３＋２］の付加環化の産物が挙げられる。
【０１８５】
ＰＥＧを用いて生体材料の表面を修飾できることは当該技術分野において十分に確立されている（例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号；Mehvar, R., J. Pharm Sci., 3(1):125-136 (2000)を参照のこと）。また、本発明は、反応性のアジドまたはアセチレンの部位を１つ以上有する表面と、ヒュスゲン［３＋２］の付加環化の結合を介して、表面に連結された本発明のアジドまたはアセチレンを含んでいるポリマーの１つ以上とを含んでいる生体材料を含む。また、生体材料および他の物質は、アジドまたはアセチレンの結合以外の結合を介して（カルボン酸、アミン、アルコール、またはチオールの部分を含む結合などを介して）、アジドまたはアセチレンで活性化されたポリマーの誘導体に連結されて、その後の反応に利用可能なアジドまたはアセチレンの部分を残してもよい。
【０１８６】
本発明は、本発明のアジドを含んでいるポリマーおよびアセチレンを含んでいるポリマーを合成する方法を含む。アジドを含んでいるＰＥＧ誘導体の場合、アジドはポリマーの炭素原子に直接的に結合されていてもよい。また、アジドを含んでいるＰＥＧ誘導体は、得られるポリマーがその末端においてアジド部分を有するように、アジド部分を一方の末端に有する連結剤を、従来の活性化されたポリマーに結合することによって調製されてもよい。アセチレンを含んでいるＰＥＧ誘導体の場合、アセチレンはポリマーの炭素原子に直接的に結合されていてもよい。また、アセチレンを含んでいるＰＥＧ誘導体は、得られるポリマーがその末端においてアセチレン部分を有するように、アセチレン部分を一方の末端に有する連結剤を、従来の活性化されたポリマーに結合することによって調製されてもよい。
【０１８７】
より具体的には、アジドを含んでいるＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは、反応を受けて、より反応性のある部分（メシレート、トレシレート（tresylate）、トシレート、またはハロゲンの脱離基など）を有する置換されたポリマーを生成する。スルホニルの酸ハロゲン化物、ハロゲン原子、および他の脱離基を含んでいるＰＥＧ誘導体の調製および使用は、当業者に公知である。次いで、得られた置換されたポリマーは、反応を受けて、ポリマーの末端においてより反応性のある部分をアジド部分と置換する。また、活性のある求核性部分または求電子性部分を少なくとも１つ有する水溶性ポリマーは、一方の末端においてアジドを有する連結剤との反応を受けて、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合を形成し、アジド部分がポリマーの末端に配置される。求核性部分および求電子性部分（アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、およびチオエステルなどが挙げられる）は、当業者に公知である。
【０１８８】
より具体的には、アセチレンを含んでいるＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは、反応を受けて、アセチレン部分を含んでいる前駆体からハロゲンまたは他の活性化された脱離基を移動させる。また、活性のある求核性部分または求電子性部分を少なくとも１つ有する水溶性ポリマーは、一方の末端においてアセチレンを有する連結剤との反応を受けて、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合を形成し、アセチレン部分がポリマーの末端に配置される。有機合成の文脈におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核性部分、および求電子性部分の使用、ならびにＰＥＧ誘導体の調製および使用は、当業者に十分に確立されている。
【０１８９】
また、本発明は、他の物質（限定されないが、水溶性ポリマー（アジドまたはアセチレンの部分を含んでいるＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体など）が挙げられる）を修飾されたタンパク質に付加する、タンパク質の選択的な修飾方法を提供する。アジドを含んでいるＰＥＧ誘導体、およびアセチレンを含んでいるＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解度、および免疫原性の欠乏が重要である場合、表面および分子の特性を修飾するために使用され得る一方、同時に、当該技術分野において以前から知られていたＰＥＧ誘導体をタンパク質に結合させる手段よりも選択的な手段を提供する。
【０１９０】
＜ＩＩ．本発明で使用するための一般的な核酸の組み換え方法＞
本発明の多数の実施形態では、目的のＩＬ−２をコードする核酸は、単離され、クローン化され、そしてしばしば組み換え方法を用いて変更される。このような実施形態は、限定されないが、タンパク質発現のために、または変異体、誘導体、発現カセット、もしくはＩＬ−２に由来する他の配列の作製の間に、使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種プロモーターに作働可能に連結される。
【０１９１】
成熟したヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列を以下の表１に示す。
【０１９２】
【表１】
2022500035.tif 000005
【０１９３】
2022500035.tif 000006
【０１９４】
天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２をコードするヌクレオチド配列は、親のポリペプチド（限定されないが、配列番号１、２、３、５、または７に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる）のアミノ酸配列に基づいて合成され、次いで、関連のあるアミノ酸残基を導入（すなわち、組み込みもしくは置換）または除去（すなわち、欠失もしくは置換）するために当該ヌクレオチド配列を変更してもよい。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従った部位特異的突然変異誘発法によって好都合に修飾され得る。また、ヌクレオチド配列は、化学的な合成（限定されないが、オリゴヌクレオチド合成機を用いることによる化学的な合成）によって調製され得る。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に有利に働くコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、ライゲーション、またはライゲーション連鎖反応によってアセンブルしてもよい。例えば、本明細書中に参照として援用される、Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991)；米国特許第６，５２１，４２７号を参照のこと。
【０１９５】
ｐＫＧ０２６９発現プラスミドにクローニングされた合成のヒトＩＬ−２遺伝子のＤＮＡ配列を、配列番号４として上記表１に示す。このＤＮＡ配列は、大腸菌のコドンを最適化したものである。
【０１９６】
本発明は、組み換え遺伝学の分野における定石の技術を利用する。本発明に使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が挙げられる。
【０１９７】
また、本発明は、直交性のｔＲＮＡ／ＲＳのペアを介して天然でないアミノ酸をインビボで組み込むための、真核生物の宿主細胞、非真核生物の宿主細胞、および生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクト（限定されないが、本発明のベクターが挙げられ、例えば、クローニングベクターであってもよいし、発現ベクターであってもよい）を用いて遺伝的に操作される（限定されないが、形質転換されること、形質導入されること、トランスフェクションされることが挙げられる）。
【０１９８】
目的の核酸を細胞内に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、これらの方法の何れかを本発明において使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含んでいる細菌のプロトプラストと受容細胞との融合、エレクトロポレーション、プロジェクタイルボンバードメント（projectile bombardment）、およびウイルスベクターによる感染（以下にてさらに検討する）などが挙げられる。細菌の細胞を用いて、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでいるプラスミドの数を増幅させることができる。細菌を対数増殖期まで増殖させ、細菌内のプラスミドを当該技術分野において公知の種々の方法によって単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。さらに、細菌からプラスミドを精製するためのキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭおよびＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ（両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ならびにＱＩＡｐｒｅｐＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ製）を参照のこと）。次いで、単離され精製されたプラスミドは、他のプラスミドを製造するためにさらに操作され、細胞にトランスフェクションするために使用されるか、または生物に感染させるための関連したベクターに組み込まれる。典型的なベクターは、特定の目的の核酸の発現の調節に有用な、転写ターミネーター、翻訳ターミネーター、転写開始配列、翻訳開始配列、およびプロモーターを含む。ベクターは、必要に応じて、少なくとも１つの、独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物またはそれらの両方においてカセットの複製を可能にする配列（限定されないが、シャトルベクターが挙げられる）、ならびに原核生物の系および真核生物の系の両方のための選択マーカーを含む、包括的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、またはそれらの両方における複製および組み込みに適している。Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)（全て上述した）を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって提供されている（例えば、ＡＴＣＣによって発行されたThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)）。また、シークエンシング、クローニング、および分子生物学の他の態様についてのさらなる基本的な手法、ならびに基礎を成す理論的考察は、Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYに見られる。さらに、本質的に任意の核酸（および実質的に任意の標識された核酸）は（標準のものであろうと標準外のものであろうと）、種々の商業的供給業者（the Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)(World Wide Webのmcrc.comにて利用できる)、The Great American Gene Company (Ramona, CA)(World Wide Webのgenco.comにて利用できる)、ExpressGen Inc. (Chicago, IL)(World Wide Webのexpressgen.comにて利用できる)、Operon Technologies Inc. (Alameda, CA)など）から、特別に注文して得られたものであってもよいし、標準的に注文して得られたものであってもよい。
【０１９９】
＜セレクターコドン＞
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンとしては、限定されないが、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（終止コドンなど（限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン、もしくはオパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられる））、天然でないコドン、４塩基以上のコドン、または希少なコドンなどが挙げられる。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数は広範である（限定されないが、ＩＬ−２の少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチドにおいて１個以上、２個以上、３個以上、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上が挙げられる）ことは当業者に容易に明白である。
【０２００】
一実施形態では、本方法は、インビボにおいて１つ以上の天然でないアミノ酸を組み込むための終止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、終止コドン（限定されないが、ＵＡＧが挙げられる）を認識するＯ−ｔＲＮＡが製造され、Ｏ−ＲＳによって所望の天然でないアミノ酸でアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に存在する宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによって認識されない。従来の部位特異的突然変異誘発法は、終止コドン（限定されないが、ＴＡＧが挙げられる）を、目的のポリペプチドにおける目的の部位に導入するために使用することができる。例えば、Sayers, J.R., et al. (1988), 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802を参照のこと。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および目的のポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合わせられると、天然でないアミノ酸はＵＡＧコドンに応じて組み込まれ、特定された位置に天然でないアミノ酸を含んでいるポリペプチドが得られる。
【０２０１】
インビボにおける天然でないアミノ酸の組み込みは、真核生物の宿主細胞を顕著に乱すことなくなされ得る。例えば、ＵＡＧコドンに関する抑圧効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡが挙げられる）と真核生物の放出因子（限定されないが、ｅＲＦが挙げられる）（終止コドンと結合し、成長しているペプチドのリボソームからの放出を開始するものである）との間の競合に依存するので、抑圧効率は、限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルの増加によって調節され得る。
【０２０２】
また、天然でないアミノ酸は、希少なコドンによってコードされ得る。例えば、インビトロでのタンパク質の合成反応においてアルギニンの濃度が低減した場合、希少なアルギニンコドンであるＡＧＧは、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが証明されている。例えば、Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993)を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、Escherichia coliに少数の種として存在する天然に存在するｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生物は、３塩基を全て使用しない。Micrococcus luteusにおいて割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳の抽出物におけるアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)を参照のこと。本発明の成分は、インビボにおいてこれらの希少なコドンを使用するために作製され得る。
【０２０３】
また、セレクターコドンは、延長されたコドン（限定されないが、４塩基以上のコドン（例えば、４塩基、５塩基、６塩基、またはそれ以上のコドン）が挙げられる）を含む。４塩基のコドンの例としては、限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基のコドンの例としては、限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特徴は、フレームシフト抑圧に基づく、延長されたコドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは、限定されないが、同じタンパク質に１つまたは複数の天然でないアミノ酸を挿入することができる。例えば、アンチコドンループを有する（例えば、少なくとも８〜１０ｎｔのアンチコドンループを有する）突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（限定されないが、特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡが挙げられる）の存在下において、４塩基以上のコドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、限定されないが、少なくとも４塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン、または少なくとも６塩基のコドン、またはそれ以上を解読することができる。２５６通りの可能な４塩基が存在するので、４塩基以上のコドンを用いて、複数の天然でないアミノ酸を同一の細胞にコードすることができる。Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244, (2002); Magliery, Expanding the Genetic Code:  Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769, (2001)を参照のこと。
【０２０４】
例えば、４塩基のコドンは、インビトロの生合成方法を用いたタンパク質への天然でないアミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、Ma et al., Biochemistry, 32:7939, (1993)；およびHohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121:34, (1999)を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロで、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体とを同時に組み込むために使用された。例えば、Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121:12194, (1999)を参照のこと。Ｍｏｏｒらは、インビトロの研究において、ＵＡＧＮコドン（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ、またはＣであり得る）を抑圧するというＮＣＵＡのアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べ、ＵＣＵＡのアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによって、４塩基のＵＡＧＡが、０または１フレームにおける解読がほとんどなく、１３〜２６％の効率で解読され得ることを発見した。Moore et al., J. Mol. Biol., 298:195, (2000)を参照のこと。一実施形態において、希少なコドンまたはナンセンスコドンに基づく延長されたコドンは、本発明において使用されることができ、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルー、およびフレームシフトの抑制を減少することができる。
【０２０５】
また、所定の系に関し、内因性の系が天然の塩基のコドンを使用しない（または稀にしか使用しない）場合、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの１つを含むことができる。例えば、これは、天然の３塩基のコドンを認識するｔＲＮＡが欠如している系、および／または３塩基のコドンが希少なコドンである系を含む。
【０２０６】
セレクターコドンは、天然でない塩基対を必要に応じて含む。これらの天然でない塩基対は、存在する遺伝子アルファベットをさらに拡張する。塩基対を１つ追加することによって、３塩基のコドンの数が６４から１２５まで増加する。第３の塩基対の性質としては、安定かつ選択的な塩基対の形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の天然でない塩基対の合成後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。本方法および本組成物に適合し得る天然でない塩基対の説明としては、例えば、Hirao, et al., An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182, (2002).  See, also, Wu, Y., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630, (2002)が挙げられる。他の関連する刊行物を以下に列挙する。
【０２０７】
インビボにおける使用に関して、天然でないヌクレオシドは膜透過性であり、かつリン酸化されて対応する３リン酸塩を形成する。また、増加した遺伝情報は安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒ他による以前の試みは、標準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの対における水素結合の様式とは異なる水素結合の様式を利用し、その最も注目すべき例は、イソ−Ｃ：イソ−Ｇの対である。例えば、Switzer et al., J. Am. Chem. Soc., 111:8322, (1989)；およびPiccirilli et al., Nature, 343:33, (1990); Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, (2000)を参照のこと。これらの塩基は、通常、ある程度に天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に複製され得ない。Ｋｏｏｌおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, (2000)；およびGuckian and Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825, (1998)を参照のこと。上述した要件のすべてを満たす天然でない塩基対を開発するために、Schultz, Romesbergおよび共同研究者は、一連の天然でない疎水性塩基を体系的に合成し、研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳという自己の対は、天然塩基対よりも安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6, (1999)；およびOgawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:3274, (2000)を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮという自己の対は、生物学的に機能するのに十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:8803, (2000)を参照のこと。しかしながら、両方の塩基は、さらなる複製に対してチェーンターミネーターとして作用する。近年、ＰＩＣＳの自己の対を複製するために使用され得る突然変異体のＤＮＡポリメラーゼが進化されている。さらに、７ＡＩの自己の対は複製され得る。例えば、Tae et al., J. Am. Chem. Soc., 123:7439, (2001)を参照のこと。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されている。Meggers et al., J. Am. Chem. Soc., 122:10714, (2000)を参照のこと。延長されたコドンおよび天然でないコドンは、天然コドンに対して本来的に直交性であるので、本発明の方法は、この性質を活かして、それらのための直交性のｔＲＮＡを作製することができる。
【０２０８】
また、翻訳を迂回する系は、所望のポリペプチドに天然でないアミノ酸を組み込むために使用され得る。翻訳を迂回する系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、タンパク質に翻訳されない。当該配列は、リボソームに当該配列を跳び越えさせ、かつ挿入の下流で翻訳を再開させる合図として機能する構造を含む。
【０２０９】
ある実施形態では、本発明の方法および／または組成物における目的のタンパク質またはポリペプチド（あるいはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。通常、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個またはそれ以上のセレクターコドンを含む。
【０２１０】
目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、天然でないアミノ酸の組み込みのための１つ以上のセレクターコドンを含めるために、当業者に公知の方法および本明細書に記載の方法を用いて、突然変異誘発され得る。例えば、目的のタンパク質のための核酸は、１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異誘発され、１つ以上の天然でないアミノ酸の組み込みを提供する。本発明は、例えば、少なくとも１つの天然でないアミノ酸を含む任意のタンパク質の、任意の変異体（限定されないが、突然変異体、バージョンが挙げられる）を含む。同様に、本発明は、対応する核酸（すなわち、１つ以上の天然でないアミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有する核酸）を含む。
【０２１１】
ＩＬ−２などの目的のタンパク質をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入するために容易に突然変異されてもよい。システインは、反応性の分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、目的のタンパク質に導入するために、広く使用される。ポリペプチドの所望の位置にシステインを組み込むために好適な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号に記載される方法、および標準の突然変異誘発技術など、当業者に知られている。
【０２１２】
＜ＩＩＩ．天然にコードされていないアミノ酸＞
非常に広範な天然にコードされていないアミノ酸は、本発明における使用に好適である。任意の数の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２に導入され得る。一般的に、導入された天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通の遺伝的にコードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）に対して実質的に、化学的に不活性である。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、２０個の共通アミノ酸に見られない官能基と効率的かつ選択的に反応して安定な抱合物を形成する側鎖官能基（限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド、およびアミノオキシ基が挙げられる）を含む。例えば、アジド官能基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２は、ポリマー（限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、または代替可能に、アルキン部分を含有する第２のポリペプチドが挙げられる）と反応して、ヒュスゲン［３＋２］付加環化産物を形成するためのアジド官能基およびアルキン官能基の選択的な反応によって生じる安定な抱合物を形成し得る。
【０２１３】
アルファ−アミノ酸の一般的な構造は、以下の式Ｉのように示される。
【０２１４】
【化４】
2022500035.tif 000007
【０２１５】
天然にコードされていないアミノ酸は、典型的に、上述の式を有する構造のいずれかであり（式中、Ｒ基は、２０個の天然アミノ酸に使用されるもの以外の任意の置換基である）、本発明における使用に好適であり得る。本発明の天然にコードされていないアミノ酸が、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と典型的に異なるので、天然にコードされていないアミノ酸は、それらが天然に存在するポリペプチドにおいて形成される同じ様式において、他のアミノ酸（限定されないが、天然アミノ酸または天然にコードされていないアミノ酸が挙げられる）とアミド結合を形成する。しかしながら、天然にコードされていないアミノ酸は、それらを天然のアミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など、またはこれらの組み合わせを、任意に含む。本発明における使用に好適であり得る他の所定の天然に存在しない目的のアミノ酸としては、限定されないが、光で活性化される架橋を含んでいるアミノ酸、スピン標識されたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属に結合するアミノ酸、金属を含んでいるアミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有的あるいは非共有的に相互作用するアミノ酸、光でケージ化するおよび／あるいは光で異性化可能なアミノ酸、ビオチンあるいはビオチン誘導体を含むアミノ酸、グリコシル化されたアミノ酸（糖で置換されたセリンなど）、他の炭水化物によって修飾されたアミノ酸、ケトを含んでいるアミノ酸、ポリエチレングリコールあるいはポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子で置換されたアミノ酸、化学的に切断可能なおよび／あるいは光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて延長された側鎖（限定されないが、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（限定されないが、約５個もしくは約１０個を越える炭素が挙げられる）が挙げられる）を有するアミノ酸、炭素に連結される糖を含んでいるアミノ酸、酸化還元的に活性なアミノ酸、アミノチオ酸を含んでいるアミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が挙げられる。
【０２１６】
本発明における使用に好適であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である例示的な天然にコードされていないアミノ酸としては、限定されないが、カルボニル反応性基、アミノオキシ反応性基、ヒドラジン反応性基、ヒドラジド反応性基、セミカルバジド反応性基、アジド反応性基、およびアルキン反応性基を有するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸は、糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸と糖との間に天然に存在するＮ型またはＯ型結合が、通常は天然に見られない共有結合（限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、およびアミドなどが挙げられる）によって置換されている場合の例が挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどの、天然に存在するタンパク質に通常は見られない糖が挙げられる。
【０２１７】
本明細書に規定される天然にコードされていないアミノ酸の多くは、市販されている（例えば、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)、Novabiochem (a division of EMD Biosciences, Darmstadt, Germany)、またはPeptech (Burlington, MA, USA)）。市販されていない天然にコードされていないアミノ酸は、本明細書に規定されるように、または当業者にとって公知の標準的な方法のように任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass, (1982)；Advanced Organic Chemistry by March Third Edition, Wiley and Sons, New York, (1985)；およびAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg, Third Edition, Parts A and B, Plenum Press, New York, (1990)を参照のこと。また、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号および米国特許第７，０８３，９７０号を参照のこと。新規な側鎖を含む天然でないアミノ酸に加えて、本発明における使用に好適であり得る天然でないアミノ酸は、修飾された骨格構造（限定されないが、式ＩＩおよびＩＩＩ：
【０２１８】
【化５】
2022500035.tif 000008
【０２１９】
の構造によって示されるような構造が挙げられる）を任意に含む。式中、Ｚは、典型的に、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’であり；同じであるかまたは異なり得るＸおよびＹは、典型的に、ＳまたはＯであり、任意に同じであるかまたは異なるＲおよびＲ’は、水素だけでなく式Ｉを有する天然でないアミノ酸に関して上述したＲ基にとっての置換基の同じリストから典型的に選択される。例えば、本発明の天然でないアミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって示されるようなアミノ基またはカルボキシル基において置換基を任意に含む。この種の天然でないアミノ酸としては、限定されないが、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる（限定されないが、共通の２０個の天然アミノ酸に対応する側鎖または天然でない側鎖を有する）。さらに、α−炭素における置換基としては、限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノブチル酸などの、Ｌ、Ｄ、またはα−α−２置換アミノ酸が任意に挙げられる。他の構造的な代替物としては、環状アミノ酸（プロリンアナログ、ならびに３員環、４員環、６員環、７員環、８員環、および９員環のプロリンアナログなど）、βアミノ酸およびγアミノ酸（置換β−アラニンおよびγ−アミノブチル酸など）が挙げられる。
【０２２０】
多くの天然でないアミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明における使用に好適である。チロシンアナログとしては、限定されないが、パラ位置換チロシン、オルト位置換チロシン、およびメタ位置換チロシンが挙げられ、置換チロシンは、限定されないが、ケト基（限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０の直鎖状もしくは分枝状の炭化水素、飽和もしくは不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはアルキニル基などを含む。さらにまた、多置換アリール環が意図される。本発明における使用に好適なグルタミンアナログとしては、限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本発明における使用に好適なフェニルアラニンアナログの例としては、限定されないが、パラ位置換フェニルアラニン、オルト位置換フェニルアラニン、およびメタ位置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基は、限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル、またはアルキニル基などを含む。本発明における使用に好適な天然でないアミノ酸の具体的な例としては、限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明における使用に好適な天然でないアミノ酸の変形の構造の例は、例えば、ＷＯ２００２／０８５９２３号（発明の名称「In vivo incorporation of unnatural amino acids」）に記載されている。また、付加的なメチオニンアナログに関しては、参照として本明細書に組み込まれる、Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, (2002)を参照のこと。参照として本明細書に組み込まれる国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号（発明の名称「Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non- natural Amino Acids and Polypeptides」）には、芳香族アミン部分（限定されないが、ｐ−アミノ−フェニルアラニンが挙げられる）の還元性アルキル化、および還元性アミン化について記載されている。
【０２２１】
本発明の別の実施形態では、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有するＩＬ−２ポリペプチドは、共有結合的に修飾される。生物学的な系の多様な機能性に直交する選択的化学反応は、化学生物学における重要なツールとして認識されている。合成化学のレパートリーの相対的なニューカマーとして、これらの生体直交反応は、化合物ライブラリー合成、タンパク質工学、機能的プロテオミクス、および細胞表面の化学的リモデリングのための新しい戦略を刺激した。アジドは、生体共役反応のための特有の化学的ハンドルとして顕著な役割を確保している。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションは、細胞糖抱合物に代謝的に導入されたアジド糖にタグを付けるために、ホスフィンと共に使用されてきた。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションは、生理学的な有害性なく、生きている動物において実施することができる；それにもかかわらず、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応は、責任なしではない。必要なホスフィンは、空気酸化を受けやすく、改善された水溶性および増加した反応速度のためのそれらの最適化は、合成的に困難であることが証明されている。
【０２２２】
アジド基は、生物直交反応度の代替様式：ヒュスゲンによって記載されたアルキンとの［３＋２］環化付加を有する。その古典的な形態では、この反応は、妥当な反応速度のために高い温度（または圧力）を要件とするために、生物学的な系における適用性が制限されている。Sharplessおよび共同研究者らは、生理的温度および豊富に機能化された生物学的環境において容易に進行する、「クリック化学」と呼ばれる銅（Ｉ）触媒バージョンの開発でこの障害を克服した。この発見は、複雑な組織溶解物からのウイルス粒子、核酸、およびタンパク質の選択的修飾を可能にした。残念ながら、強制的な銅触媒は、細菌細胞および哺乳類細胞の両方に対して毒性であるため、細胞が生存可能なままでなければならない適用を排除する。電子吸引置換基によって活性化されたアルキンの無触媒ヒュスゲン付加環化は、周囲温度で起こることが報告されている。しかしながら、これらの化合物は、生物学的求核試薬とマイケル反応を起こす。
【０２２３】
一実施形態では、天然でないアミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど）を含んでいるＩＬ−２の組成物が提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを含んでいる種々の組成物（限定されないが、タンパク質および／または細胞が挙げられる）が提供される。一態様では、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを含んでいる組成物は、直交性のｔＲＮＡをさらに含む。天然でないアミノ酸は、直交性のｔＲＮＡに対して（限定されないが、共有結合的に）結合され得る（限定されないが、アミノアシル結合を介して直交性のｔＲＮＡに対して共有結合的に結合される、直交性のｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに対して共有結合的に結合されるなどが挙げられる）。
【０２２４】
タンパク質に組み込まれ得る天然でないアミノ酸を介する化学部分は、タンパク質の種々の利点および操作を提供する。例えば、ケト官能基の固有の反応性は、インビボおよびインビトロにおける、多くのヒドラジンを含有する試薬またはヒドロキシルアミンを含有する試薬のいずれかを用いた、タンパク質の選択的な修飾を可能にする。重原子の天然でないアミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データの位相合わせに有用であり得る。また、天然でないアミノ酸を用いた重原子の部位特異的な導入は、重原子にとっての位置の選択に選択性および自由度を提供する。光反応性の天然でないアミノ酸（限定されないが、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（限定されないが、フェニルアジドが挙げられる）側鎖を有するアミノ酸が挙げられる）は、例えば、タンパク質のインビボおよびインビトロにおける効率的な光架橋を可能にする。光反応性の天然でないアミノ酸の例としては、限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。次いで、光反応性の天然でないアミノ酸を有するタンパク質は、光反応性基を供給する一時的な制御の励起によって、自由自在に架橋され得る。１つの例において、天然でないアミノ酸のメチル基は、局所的な構造および動態のプローブとして、放射線標識されたもの（限定されないが、メチル基が挙げられる）に置換され得る（限定されないが、核磁気共鳴および振動顕微鏡の使用を伴うことが挙げられる）。アルキニル官能基またはアジド官能基は、例えば、［３＋２］付加環化反応を介したタンパク質の選択的な修飾を可能にする。
【０２２５】
アミノ末端においてポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０個の天然のアミノ酸に用いられる官能基以外の任意の置換基であるＲ基、およびα−アミノ酸に通常に存在するＮＨ２基とは異なる第２の反応性基から構成され得る（式Ｉを参照のこと）。類似の非天然アミノ酸は、カルボキシル末端において、α−アミノ酸に通常に存在するＣＯＯＨ基と異なる第２の反応性基を用いて、組み込まれ得る（式１を参照のこと）。
【０２２６】
本発明の天然でないアミノ酸は、２０個の天然アミノ酸において有効ではない付加的な特性を与えるために、選択され得るか、または設計され得る。例えば、天然でないアミノ酸は、タンパク質（例えば、それらが組み込まれる）の生物学的特性を修飾するために、任意に設計され得るか、または選択され得る。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、溶解性、安定性（例えば、熱、加水分解、酸化、酵素的分解に対する耐性など）、精製および処理の容易さ、構造性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、他の分子と反応する（例えば、共有結合的に、または非共有結合的に）能力などは、タンパク質への天然でないアミノ酸の包含によって任意に修飾され得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明がオキシム結合によって水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に連結されたＩＬ−２を提供する。天然にコードされていないアミノ酸の多くの種類は、オキシム結合の形成に適切である。これらとしては、限定されないが、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含んでいる天然にコードされていないアミノ酸が挙げられる。そのようなアミノ酸は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号、およびＷＯ２００６／０６９２４６号（発明の名称「Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides」）に記載されている。また、天然にコードされていないアミノ酸は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８３，９７０号および米国特許第７，０４５，３３７号に記載されている。
【０２２８】
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の位置においてアミノ酸パラアセチルフェニルアラニンを用いて置換されている、ＩＬ−２ポリペプチドを使用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって組み込まれる「Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。他の、カルボニルを含んでいるアミノ酸またはジカルボニルを含んでいるアミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の限定しない例示的な合成は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号の図４、２４〜３４、および３６〜３９に示されている。
【０２２９】
求電子性反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加反応を介して分子を連結するための多様な反応を可能にする。そのような求電子性反応性基としては、カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と類似の反応性を有し、カルボニル基と構造的に類似している）、マスクされたカルボニル基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）に容易に変えられ得る）、または保護されたカルボニル基（脱保護によってカルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と同様の反応性を有する）が挙げられる。そのようなアミノ酸としては、式（ＩＶ）：
【０２３０】
【化６】
2022500035.tif 000009
【０２３１】
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２３２】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｊは、
【０２３３】
【化７】
2022500035.tif 000010
【０２３４】
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、もしくは保護基であるか、または２つ以上のＲ’’基が存在する場合に、２つのＲ’’はヘテロシクロアルキルを任意に形成し；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４、もしくは２つのＲ３基は、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを任意に形成するか；
あるいは−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、二環式または三環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成するか；
あるいは−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、単環式または二環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成し；
Ａがフェニレンであり、Ｒ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−であり、Ｒ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；ＡおよびＢが存在せず、Ｒ３のそれぞれがＨである場合に、Ｒはメチルではないという条件を有する。
【０２３５】
さらに、式（Ｖ）の構造を有するものが挙げられる。
【０２３６】
【化８】
2022500035.tif 000011
【０２３７】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ａがフェニレンである場合に、Ｂは存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；ＡおよびＢが存在しない場合に、Ｒはメチルでないという条件を有する。
【０２３８】
さらに、式（ＶＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２３９】
【化９】
2022500035.tif 000012
【０２４０】
式中：
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択される。
【０２４１】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２４２】
【化１０】
2022500035.tif 000013
【０２４３】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護基であるか、カルボキシル保護されているか、またはそれらの塩である。さらに、以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２４４】
さらに、式（ＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２４５】
【化１１】
2022500035.tif 000014
【０２４６】
式中、
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択され；ｎは０〜８であり；
Ａが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件を有する。
【０２４７】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２４８】
【化１２】
2022500035.tif 000015
【０２４９】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とがなされているか、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２５０】
さらに、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２５１】
【化１３】
2022500035.tif 000016
【０２５２】
式中、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０２５３】
さらに、式（ＩＸ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０２５４】
【化１４】
2022500035.tif 000017
【０２５５】
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
式中、Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択される。
【０２５６】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２５７】
【化１５】
2022500035.tif 000018
【０２５８】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とがなされているか、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２５９】
さらに、式（Ｘ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０２６０】
【化１６】
2022500035.tif 000019
【０２６１】
式中、Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択され；ｎは０〜８である。
【０２６２】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２６３】
【化１７】
2022500035.tif 000020
【０２６４】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とがなされているか、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２６５】
モノカルボニル構造に加えて、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル基、ジカルボニル様基、マスクされたジカルボニル基、および保護されたジカルボニル基などの基を含み得る。
【０２６６】
例えば、式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２６７】
【化１８】
2022500035.tif 000021
【０２６８】
式中、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０２６９】
さらに、式（ＸＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２７０】
【化１９】
2022500035.tif 000022
【０２７１】
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択される。
【０２７２】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２７３】
【化２０】
2022500035.tif 000023
【０２７４】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とがなされているか、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２７５】
さらに、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２７６】
【化２１】
2022500035.tif 000024
【０２７７】
式中、Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、およびＳ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）からなる群より選択され；ｎは０〜８である。
【０２７８】
さらに、以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２７９】
【化２２】
2022500035.tif 000025
【０２８０】
ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とがなされているか、またはそれらの塩である。さらに、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のいずれかは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２８１】
さらに、式（ＸＩＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２８２】
【化２３】
2022500035.tif 000026
【０２８３】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０２８４】
さらに、式（ＸＩＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２８５】
【化２４】
2022500035.tif 000027
【０２８６】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０２８７】
さらに、式（ＸＩＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２８８】
【化２５】
2022500035.tif 000028
【０２８９】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０２９０】
さらに、式（ＸＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２９１】
【化２６】
2022500035.tif 000029
【０２９２】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群より選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る。
【０２９３】
さらに、式（ＸＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２９４】
【化２７】
2022500035.tif 000030
【０２９５】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群より選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る。
【０２９６】
さらに、式（ＸＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２９７】
【化２８】
2022500035.tif 000031
【０２９８】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群より選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る。
【０２９９】
さらに、式（ＸＶＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０３００】
【化２９】
2022500035.tif 000032
【０３０１】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０３０２】
さらに、式（ＸＶＩ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０３０３】
【化３０】
2022500035.tif 000033
【０３０４】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０３０５】
さらに、式（ＸＶＩ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０３０６】
【化３１】
2022500035.tif 000034
【０３０７】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）、またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
【０３０８】
さらに、式（ＸＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０３０９】
【化３２】
2022500035.tif 000035
【０３１０】
式中：
Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｍは、
【０３１１】
【化３３】
2022500035.tif 000036
【０３１２】
であり（式中、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、またはＲ３およびＲ４、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する）；Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。
【０３１３】
さらに、式（ＸＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０３１４】
【化３４】
2022500035.tif 000037
【０３１５】
式中：
Ｍは、
【０３１６】
【化３５】
2022500035.tif 000038
【０３１７】
であり（式中、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、またはＲ３およびＲ４、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する）；Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；Ｒａのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２、もしくは３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、およびＳ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選択される。
【０３１８】
さらに、式（ＸＩＸ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０３１９】
【化３６】
2022500035.tif 000039
【０３２０】
式中：
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、Ｏ、またはＳである。
【０３２１】
さらに、式（ＸＸ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
【０３２２】
【化３７】
2022500035.tif 000040
【０３２３】
式中：
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである。
【０３２４】
さらに、式（ＸＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３２５】
【化３８】
2022500035.tif 000041
【０３２６】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基またはジカルボニル官能基を生成する。例えば、抱合反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ基およびヒドロキシル基を有する官能基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端セリンまたはトレオニン（通常に存在し得るか、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化的切断条件下における、アルデヒド官能基の生成に使用され得る。例えば、Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)を参照のこと。しかしながら、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に対して限定される。
【０３２７】
本発明において、隣接するヒドロキシル基およびアミノ基を有する非天然アミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに対して隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位における酸化を防ぐための穏やかな条件下において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含む。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝溶液に対して、約１．５モル濃度過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における１０分間にわたるインキュベーションを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照のこと。
【０３２８】
カルボニル官能基またはジカルボニル官能基は、穏やかな条件の下に水溶液においてヒドロキシルアミンを含んでいる試薬と選択的に反応して、生理学的条件下において安定な対応するオキシム結合を形成し得る。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)を参照のこと。さらに、カルボニル基またはジカルボニル基の固有の反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997)を参照のこと。
【０３２９】
〔カルボニル反応性基〕
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ求核付加反応またはアルドール縮合反応を介して、分子（限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性分子が挙げられる）を連結するための種々の反応を可能にする。
【０３３０】
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【０３３１】
【化３９】
2022500035.tif 000042
【０３３２】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純なアルキル（すなわち、メチル、エチル、またはプロピル）であり、ケトン部分はアルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
【０３３３】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン、およびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって、同様に調製され得る。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性カルボニル官能基を生成する。例えば、抱合反応に有用なアルデヒド官能基は、隣接するアミノ基およびヒドロキシル基を有する官能基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（これは、通常に存在し得るか、または化学的もしくは酵素的消化を介して曝露され得る）を使用して、過ヨウ素酸塩を使用する穏和な酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生成し得る。例えば、Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定される。
【０３３５】
本発明において、隣接するヒドロキシル基およびアミノ基を有する天然にコードされていないアミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的には穏和な条件下でのモル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含み、ポリペプチド内の他の部位での酸化を回避する。酸化反応のｐＨは、典型的には約７．０である。典型的な反応は、約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムをポリペプチドの緩衝溶液に対して添加し、続いて暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号を参照のこと。これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３６】
カルボニル官能基は、水溶液中、穏和な条件下で、ヒドラジン含有試薬、ヒドラジド含有試薬、ヒドロキシルアミン含有試薬、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件下で安定な、対応するヒドラゾン結合、オキシム結合、またはセミカルバジド結合を形成することができる。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)を参照のこと。さらに、カルボニル基の独特の反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997)を参照のこと。
【０３３７】
〔Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド反応性基〕
ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジドなどの求核性基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、種々の求電子性基との反応を可能にし、抱合物（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない）を形成する。
【０３３８】
例示的なヒドラジン含有、ヒドラジド含有、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【０３３９】
【化４０】
2022500035.tif 000043
【０３４０】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在しない；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しない；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、ＸはＮである。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、酸素原子はアリール環上のalphatic基に対してパラ位に位置する。
【０３４２】
ヒドラジド含有、ヒドラジン含有、およびセミカルバジド含有アミノ酸は、商業的な販売元から入手可能である。例えば、Ｌ−グルタミン酸−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号を参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４３】
ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド官能基を有する天然にコードされていないアミノ酸を含有するポリペプチドは、アルデヒド、または同様の化学的反応性を有する他の官能基を含有する種々の分子と効率的かつ選択的に反応し得る。例えば、Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジド官能基の独特の反応性は、２０個の共通アミノ酸上に存在する求核性基（セリンもしくはトレオニンのヒドロキシル基、またはリジンのアミノ基、およびＮ末端を含むが、これらに限定されない）と比較して、アルデヒド、ケトン、および他の求電子性基に対して、それらを有意により反応性にする。
【０３４４】
〔Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸類〕
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる）基を含有する天然にコードされていないアミノ酸は、種々の求電子性基との反応を可能にし、抱合物（ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを含むが、これらに限定されない）を形成する。ヒドラジン、ヒドラジド、およびセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の増強された求核性は、アルデヒド、または同様の化学的反応性を有する他の官能基を含有する種々の分子と効率的かつ選択的に反応し得る。例えば、Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)を参照のこと。しかしながら、ヒドラジン基との反応の結果は対応するヒドラゾンであるのに対して、オキシムは、一般的に、アミノオキシ基と、ケトンなどのカルボニル含有基との反応から生じる。
【０３４５】
アミノオキシ基を含有する例示的なアミノ酸は、以下のように表すことができる：
【０３４６】
【化４１】
2022500035.tif 000044
【０３４７】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在しない；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在しない；ｍは、０〜１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）、または存在しない；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在する。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
【０３４８】
アミノオキシ含有アミノ酸は、利用可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン、およびスレオニン）から、容易に調製され得る。例えば、M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)を参照のこと。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などの、特定のアミノオキシ含有アミノ酸は、天然の供給源から単離されている（Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって、調製され得る。
【０３４９】
〔Ｄ．アジドおよびアルキン反応性基〕
アジドおよびアルキン官能基の独特の反応性は、それらを、ポリペプチドおよび他の生物学的分子の選択的修飾のために極めて有用にする。有機アジド、特にalphaticアジド、およびアルキンは一般的に、通常の反応性化学的条件に対して安定である。特に、アジドおよびアルキン官能基の両方は、天然に存在するポリペプチド中に見られる２０個の共通アミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して、不活性である。しかし、近接させると、アジド基およびアルキン基の「バネ負荷」性が露わになり、それらは、選択的かつ効率的に反応し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)を参照のこと。
【０３５０】
Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含む（例えば、Padwa, A., in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, ed. Trost, B. M., (1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, ed. Padwa, A., (1984) , p. 1-176を参照のこと）ので、アジドおよびアルキン含有側鎖を有する天然にコードされていないアミノ酸の組み込みは、得られるポリペプチドが天然にコードされていないアミノ酸の位置で選択的に修飾されることを可能にする。アジドまたはアルキン含有ＩＬ−２を含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、触媒量にてＣｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態を含むが、これに限定されない）を加えることによって、そのまま、水溶液状態、室温にて、行うことができる。例えば、Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002)を参照のこと。例示的な還元剤は、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、および電位印加を含むが、これらに限定されない。
【０３５１】
アジドとアルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が所望される場合には、ＩＬ−２は、アルキン部分を含む天然にコードされていないアミノ酸を含み、アミノ酸に結合される水溶性ポリマーは、アジド部分を含む。あるいは、逆反応（すなわち、アミノ酸上のアジド部分と、水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分との反応）も行われ得る。
【０３５２】
アジド官能基はまた、アリールエステルを含有する水溶性ポリマーと選択的に反応させ、アリールホスフィン部分で適切に官能化して、アミド結合を生成することもできる。アリールホスフィン基は、その場でアジドを還元し、得られたアミンは、続いて近傍のエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。例えば、E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸を含むが、これに限定されない）、またはアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
【０３５３】
アリールエステルおよびホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができる：
【０３５４】
【化４２】
2022500035.tif 000045
【０３５５】
式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、または存在せず；Ｐｈは、フェニルであり；Ｗは、水溶性ポリマーであり；Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリール基であり得る。例示的なＲ基は、以下を含むが、これらに限定されない：−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮおよび−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１−３個のハロゲン置換アリールを含むが、これに限定されない）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が１つより多いＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基それぞれは、これらの基のうちの１つ以上が存在する場合、独立して、それぞれＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基として、選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に結合する場合、それらは、窒素原子によって結合し、５、６または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル、および４−モルホリニルを含むことを意味するが、これらに限定されない。置換基についての上記の議論から、用語「アルキル」は、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含むが、これらに限定されない）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むが、これらに限定されない）などの、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを、当業者は理解するであろう。
【０３５６】
アジド官能基はまた、チオエステルを含有する水溶性ポリマーと選択的に反応させ、アリールホスフィン部分で適切に官能化して、アミド結合を生成することもできる。アリールホスフィン基は、その場でアジドを還元し、得られたアミンは、続いてチオエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。チオエステルおよびホスフィン部分を含有する例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表すことができる：
【０３５７】
【化４３】
2022500035.tif 000046
【０３５８】
式中、ｎは１〜１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、または存在せず；Ｐｈは、フェニルであり；Ｗは、水溶性ポリマーである。
【０３５９】
例示的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【０３６０】
【化４４】
2022500035.tif 000047
【０３６１】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する（すなわち、Ｏ−プロパルギルチロシン）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン（proparylglycine））。
【０３６２】
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って、調製され得る。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えばDeiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003)に記載されているようにして、合成することができ、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)に記載されるようにして、合成することができる。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって、調製され得る。
【０３６３】
例示的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表すことができる：
【０３６４】
【化４５】
2022500035.tif 000048
【０３６５】
式中、ｎは０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。いくつかの実施形態において、ｎは０〜４であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
【０３６６】
アジド含有アミノ酸は、商業的な販売元から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）から得ることができる。市販されていないアジド含有アミノ酸については、適切な脱離基（ハロゲン化物、メシレート、トシレートを含むが、これらに限定されない）の置換を介して、または、適切に保護されたラクトンの開環を介して、を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の標準的な方法を使用して、アジド基が比較的容易に調製され得る。例えば、Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)を参照のこと。
【０３６７】
〔Ｅ．アミノチオール反応性基〕
β−置換アミノチオール官能基の独特の反応性は、それらを、チアゾリジンの形成を介してアルデヒド基を含有するポリペプチドおよび他の生物学的分子の選択的修飾のために極めて有用にする。例えば、J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc., 117 (14) 3893-3899, (1995)を参照のこと。いくつかの実施形態において、β−置換アミノチオールアミノ酸をＩＬ−２ポリペプチドに対して組み込み、次いでアルデヒド官能基を含む水溶性ポリマーと反応させることができる。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー、薬物抱合物、または他のペイロードは、チアゾリジンの形成を介して、β−置換アミノチオールアミノ酸を含むＩＬ−２に結合され得る。
【０３６８】
〔Ｆ．追加の反応基〕
本発明のＩＬ−２ポリペプチドに組み込むことができる、追加の反応性基、およびｐ−アミノ−フェニルアラニンを含むがこれに限定されない天然にコードされていないアミノ酸は、以下の特許出願に記載されており、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許公開第２００６／０２１７２８９号、米国仮特許第６０／７５５，３３８号；米国仮特許第６０／７５５，７１１号；米国仮特許第６０／７５５，０１８号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号；ＷＯ２００６／０６９２４６号；米国仮特許第６０／７４３，０４１号；米国仮特許第６０／７４３，０４０号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号；米国仮特許第６０／８８２，８１９号；米国仮特許第６０／８８２，５００号；米国仮特許第６０／８７０，５９４号。これらの出願はまた、ＰＥＧまたは他のポリマー上に存在し得る反応性基（抱合のためのヒドロキシルアミン（アミノオキシ）基を含むが、これらに限定されない）も議論する。
【０３６９】
〔非天然アミノ酸を有するポリペプチド〕
非天然アミノ酸の組み込みは、以下を含むがこれらに限定されない、種々の目的のために行われ得る：タンパク質とその受容体、またはその受容体の１つ以上のサブユニットとの相互作用を調節すること；タンパク質における構造および／または機能の変化を調整すること；サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の近接可能性を変化させること；部分（タンパク質アレイを含むが、これに限定されない）への標的化、；生物学的に活性な分子を添加すること；ポリマーを付着させること；放射性核種を付着させること；血清半減期を調節すること；組織浸透（例えば、腫瘍）を調節すること；活性輸送を調節すること；組織、細胞または器官特異性または分布を調節すること；免疫原性を調節すること；プロテアーゼ耐性を調節すること；など。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された、または全く新しい、触媒的もしくは生物物理学的特性を有し得る。例えば、以下の特性は、タンパク質へ非天然アミノ酸を包含させることによって、任意に改変される：受容体結合；毒性；生体分布；構造特性；分光特性；化学的および／または光化学的特性；触媒能；半減期（血清半減期を含むが、これに限定されない）；共有結合的または非共有結合的を含むがこれらに限定されない、他の分子と反応する能力；など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下を含むがこれらに限定されないものに有用である：新規治療薬、診断薬、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（抗体を含むが、これに限定されない）、およびタンパク質構造および機能の研究。例えば、Dougherty, Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652, (2000)を参照のこと。
【０３７０】
本発明の一態様において、組成物は、少なくとも１つのタンパク質を含み、当該タンパク質は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つ以上を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する。非天然アミノ酸は、同一であってもよく異なってもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上の異なる部位が存在し得るが、これらに限定されない。別の態様において、組成物は、タンパク質を含み、当該タンパク質は、当該タンパク質中に存在する、少なくとも１つであるが、すべてではない特定のアミノ酸が、非天然アミノ酸により置換されている。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質について、非天然アミノ酸は、同一であってもよく異なっていてもよい（タンパク質は、２つ以上の異なる型の非天然アミノ酸を含み得るか、または２つの同じ非天然アミノ酸を含み得るが、これらに限定されない）。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質について、非天然アミノ酸は、同じであってもよく異なっていてもよく、または同じ種類の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸との組み合わせであってもよい。
【０３７１】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質またはポリペプチドが、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物および方法を用いて産生された、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドまたはタンパク質も含む。賦形剤（薬学的に許容可能な賦形剤を含むが、これに限定されない）もまた、タンパク質と共に存在し得る。
【０３７２】
真核細胞において少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質またはポリペプチドを産生することによって、タンパク質またはポリペプチドは、典型的には真核生物的な翻訳後修飾を含むことになる。特定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸と、真核生物細胞によってインビボで行われる少なくとも１つの翻訳後修飾とを含むが、当該翻訳後修飾は、原核細胞によっては行われない。例えば、翻訳後修飾は、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などを含むが、これらに限定されない。
【０３７３】
非天然アミノ酸の利点の１つは、それが付加的な分子を付加するために用いることができる付加的な化学部分を与えることである。これらの修飾は、真核細胞または非真核細胞においてインビボで、またはインビトロで行うことができる。したがって、特定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されているほとんどの反応は、α−ハロケトンとヒスチジンまたはシステイン側鎖との反応を含むがこれらに限定されない、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間の共有結合形成を含む。これらの場合の選択性は、タンパク質中の求核性残基の数および近接可能性によって、決定される。本発明のタンパク質において、非天然のケトアミノ酸とヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応などの、より選択的な他の反応が、インビトロおよびインビボで使用され得る。例えば、Cornish, et al.,  J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151, (1996); Mahal, et al., Science, 276:1125-1128, (1997); Wang, et al., Science 292:498-500, (2001); Chin, et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027, (2002); Chin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024, (2002); Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61, (2003); Zhang, et al., Biochemistry, 42:6735-6746, (2003);および, Chin, et al., Science, 301:964-7, (2003)を参照のこと。これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。これは、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体および細胞毒性分子を含む多数の試薬を用いて、宿主の実質的に任意のタンパク質を選択的に標識することを可能にする。「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」という題名の米国特許第６，９２７，０４２号を参照のこと。これは、参照により本明細書に組み込まれる。アジドアミノ酸を介するものを含むがこれに限定されない翻訳後修飾は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション（トリアリールホスフィン試薬を用いるものを含むがこれに限定されない）を介して行うこともできる。例えば、Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, (2002)を参照のこと。
【０３７４】
〔ＩＶ．天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２のインビボ生成〕
本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、天然に存在するシステムにおいてコードされていないアミノ酸に付加するか、またはそれを置換するために、改変されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素を使用して、インビボで生成され得る。
【０３７５】
天然に存在するシステムにおいてコードされていないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素を生成する方法は例えば、米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号に記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法は、翻訳システムに内因性の合成酵素およびｔＲＮＡとは独立して機能する翻訳機構を生成することを包含する（したがって、「直交」と呼ばれることもある）。典型的には、翻訳システムは、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的には、Ｏ−ＲＳは、翻訳システムにおいて、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、システムにおいて他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。したがって、翻訳システムは、コードされたセレクターコドンに応答し、天然にコードされていないアミノ酸をシステムにおいて産生されるタンパク質に対して挿入し、それによって、コードされたポリペプチド中のある位置でアミノ酸を「置換」する。
【０３７６】
特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するための多種多様な直交ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、当技術分野で記載されており、概ね本発明での使用に適している。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003)およびZhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)に記載されている。例示的なＯ−ＲＳ、またはその部分は、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号に開示されるアミノ酸配列を含む。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ−ＲＳと共に使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号に記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のペアのさらなる例は、ＷＯ２００５／００７８７０、ＷＯ２００５／００７６２４；およびＷＯ２００５／０１９４１５に記載されている。
【０３７７】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素システムの例は、Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅのための例示的なＯ−ＲＳ配列は、米国特許第７，０８３，９７０号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、ヌクレオチド配列、配列番号１４〜１６および２９〜３２、ならびにアミノ酸配列、配列番号４６〜４８および６１〜６４を含むが、これらに限定されない。本発明における使用に適切な例示的なＯ−ｔＲＮＡ配列は、米国特許第７，０８３，９７０号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、ヌクレオチド配列、配列番号１〜３を含むが、これらに限定されない。特定の天然にコードされていないアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素のペアの他の例は、米国特許第７，０４５，３３７号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）においてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込むＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡは、Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003)に記載されている。
【０３７８】
いくつかの他の直交ペアが報告されている。グルタミニル（例えば、Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785を参照のこと）、アスパルチル（例えば、Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286を参照のこと）、およびチロシル（例えば、Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124:1065-1068;および, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273を参照のこと）システムは、Ｓ．セレビシエのｔＲＮＡおよび合成酵素に由来し、大腸菌における非天然アミノ酸の潜在的な取り込みについて記述されている。大腸菌由来の系である、グルタミニル（例えば、Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273）、およびチロシル（例えば、Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641を参照のこと）合成酵素は、Ｓ．セレビシエにおける使用について、記載されている。大腸菌のチロシルシステムは、哺乳動物細胞におけるインビボでの３−ヨード−Ｌ−チロシンの取り込みのために用いられている。Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699を参照のこと。
【０３７９】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の使用は、天然にコードされていないアミノ酸をコードする特異的コドン（セレクターコドン）の選択を包含する。任意のコドンが使用され得るが、一般的には、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が発現されている細胞においてほとんど、または全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、例示的なコドンは、終止コドン（アンバー、オーカー、およびオパール）、４つ以上の塩基コドン、および、まれにしか使用されない、または使用されない他の天然の３塩基コドン、などのナンセンスコドンが含まれる。
【０３８０】
特異的なセレクターコドンは、当技術分野で公知の突然変異導入法（部位特異的突然変異導入、カセット突然変異導入、制限選択突然変異導入などを含むが、これらに限定されない）を使用して、ＩＬ−２コード配列中の適切な位置に導入することができる。
【０３８１】
〔Ｖ．ＩＬ−２における天然に存在しないアミノ酸の位置〕
本発明は、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸のＩＬ−２への組み込みを検討する。１つ以上の天然に存在しないアミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込まれ得る。これは、「保存的」置換を作製することによって達成され得る。「保存的」置換は、以下を含むが、これらに限定されない：疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換すること；かさ高いアミノ酸をかさ高いアミノ酸で置換すること；親水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換すること；および／または、活性に必要ない位置において天然に存在しないアミノ酸を挿入すること。
【０３８２】
種々の生化学的および構造的アプローチを採用して、ＩＬ−２内に、天然にコードされていないアミノ酸で置換するための所望の部位を選択することができる。ポリペプチド鎖の任意の位置が、天然にコードされていないアミノ酸を組み込むための選択に適しており、選択は合理的な設計に基づくか、または、任意のもしくは特別でない所望の目的のためのランダムな選択に基づくことができることは、当業者には容易に理解できる。所望の部位の選択は、任意の所望の特性または活性を有するＩＬ−２分子を産生するためであり得る。任意の所望の特性または活性は、受容体結合、またはその受容体、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合モジュレーター、受容体活性モジュレーター、ダイマーもしくはマルチマー形成のうちの１つ以上のサブユニットへの結合を調節すること、天然分子と比較して活動もしくは特性を変化させないこと、または、溶解性、凝集性、もしくは安定性などのポリペプチドの任意の物理的もしくは化学的特性を操作することを含むが、これらに限定されない。例えば、ＩＬ−２の生物学的活性に必要なポリペプチド中の位置は、点突然変異分析、アラニンスキャニング、飽和突然変異および生物学的活性についてのスクリーニング、または当技術分野で公知のホモログスキャニング法を使用して、同定され得る。ＩＬ−２の改変のための残基を同定するために、以下の他の方法が使用され得るが、これらに限定されない：配列プロファイリング（Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)）；ロータマーライブラリー選択（Dahiyat and Mayo, Protein Sci 5(5): 895-903 (1996); Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82-7 (1997); Desjarlais and Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995); Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244-255 (1994); Hellinga and Richards, PNAS USA 91: 5803-5807 (1994)）；および、残基対ポテンシャル（Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（登録商標）技術を用いた合理的設計（米国特許第６，１８８，９６５号；第６，２６９，３１２号；第６，４０３，３１２号；国際公開第９８／４７０８９号を参照のこと）。アラニンまたはホモログスキャニング突然変異によって生物学的活性に重要であると同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に応じて、天然にコードされていないアミノ酸での置換のための良好な候補であり得る。あるいは、生物学的活性に重要であると同定された部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性にさらに応じて、天然にコードされていないアミノ酸での置換のための良好な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖上の各位置において、天然にコードされていないアミノ酸での連続置換を単純に行い、ポリペプチドの活性に対する効果を観測することである。非天然アミノ酸を用いた任意のポリペプチドへの置換のための位置を選択するための任意の手段、技術、または方法が、本発明における使用に適していることが、当業者には容易に理解できるであろう。
【０３８３】
欠失を含むＩＬ−２ポリペプチドの変異体の構造および活性もまた試験され得、天然にコードされていないアミノ酸による置換に耐える可能性があるタンパク質の領域を決定することができる。同様に、プロテアーゼ消化およびモノクローナル抗体を使用して、ＩＬ−２受容体への結合を担うＩＬ−２の領域を同定することができる。天然にコードされていないアミノ酸による置換に対して耐えない可能性がある残基が除去されたら、残りの位置それぞれにおける提案された置換の影響を調べることができる。したがって、天然にコードされていないアミノ酸により置換され得るアミノ酸の位置を、当業者は容易に同定し得る。
【０３８４】
ＩＬ−２のこのような分析により、タンパク質の三次構造内部に埋もれているアミノ酸残基と比較して、どのアミノ酸残基が表面に露出しているかを決定することが可能になることを、当業者は認識する。したがって、本発明の一実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸で、表面露出残基であるアミノ酸を置き換えることである。
【０３８５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２における以下の位置のうちの１つ以上に組み込まれる：１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボキシル末端に加えられるか、およびそれらの組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）である。
【０３８６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体における以下の位置のうち１つ以上に組み込まれる：３位、３５位、３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、７２位、および１０７位、ならびにそれらの任意の組み合わせ（配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸）。
【０３８７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、以下のように、ＩＬ−２またはその変異体における二次構造または特定のアミノ酸に対応する以下の領域のうちの１つ以上の任意の位置に組み込まれる：疎水性相互作用の部位；ＩＬ２Ｒαを含むＩＬ−２受容体サブユニットとの相互作用部位またはその近傍；アミノ酸位置３、または３５〜４５内；最初の１０７個のＮ末端アミノ酸内；アミノ酸位置６１〜７２内；配列番号２、または配列番号３、５、もしくは７における対応するアミノ酸位置のそれぞれ。いくつかの実施形態において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の以下の位置のうちの１つ以上に組み込まれる：配列番号２の１位より前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、およびそれらの任意の組み合わせ、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸。いくつかの実施形態において、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２またはその変異体の以下の位置のうちの１つ以上に組み込まれる：４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、またはタンパク質のカルボシキル末端に加えられるか、または配列番号３、５、もしくは７の対応するアミノ酸。
【０３８８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドはアゴニストであり、これらの領域のうちの１つ以上における天然に存在しないアミノ酸は、以下を含むがこれらに限定されない水溶性ポリマーに連結している：３、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６１、６２、６４、６５、６８、７２、および１０７。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドはアゴニストであり、これらの領域のうちの１つ以上における天然に存在しないアミノ酸は、以下を含むがこれらに限定されない水溶性ポリマーに連結している：３、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６１、６２、６４、６５、６８、７２、および１０７の近傍。
【０３８９】
多種多様な天然にコードされていないアミノ酸は、ＩＬ−２における所定の位置にて置換され得るか、または組み込まれ得る。一般に、特定の天然にコードされていないアミノ酸を、その受容体と共にＩＬ−２ポリペプチドまたは他のＩＬ−２ファミリーメンバーの三次元結晶構造を試験するか、保存的置換（すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシンなどのアリールベースの天然にコードされていないアミノ酸）に対する選択、およびＩＬ−２に対して導入されることが望まれる特異的抱合化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化、またはアリールエステルを有する水溶性ポリマーとのアミド結合形成を達成し、次いでホスフィン部分を組み込むことが所望される場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、組み込むために選択する。
【０３９０】
一実施形態において、方法は、タンパク質に対して第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を組み込むこと、および第２の反応性基を含む分子とタンパク質とを接触させることをさらに含む。第２の反応性基を含む分子は、以下を含むがこれらに限定されない：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、バイオマテリアル、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、化学線励起可能部分、光異性化部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチンアナログ、重原子組み込み部分、化学的開裂可能部分、光開裂可能部分、延長された側鎖、炭素結合糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性基、化学発光性基、電子緻密基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性ヌクレオチド、放射性トランスミッター、中性子捕捉剤、もしくは上記の任意の組み合わせ、または任意の他の所望の化合物もしくは物質。第１の反応性基は、第２の反応性基と反応し、［３＋２］付加環化を介して、非天然アミノ酸に分子を付加する。一実施形態において、第１の反応性基はアルキニルまたはアジド部分であり、第２の反応性基はアジドまたはアルキニル部分である。例えば、第１の反応性基はアルキニル部分（非天然アミノ酸におけるｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを含むが、これに限定されない）であり、第２の反応性基はアジド部分である。別の例においては、第１の反応性基はアジド部分（非天然アミノ酸におけるｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含む、がこれに限定されない）であり、第２の反応性基はアルキニル部分である。
【０３９１】
いくつかの場合において、天然にコードされていないアミノ酸置換は、ＩＬ−２ポリペプチドの他の生物学的形質に影響を及ぼすために、ＩＬ−２内の他の付加、置換または欠失と組み合わされ得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＩＬ−２の安定性（タンパク質分解に対する耐性を含むが、これに限定されない）を増加させるか、またはＩＬ−２の受容体に対する親和性を増加させ得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＩＬ−２の医薬安定性を増加させ得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、腫瘍阻害および／または腫瘍減少のためのＩＬ−２の活性を増強し得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ＩＬ−２または変異体の溶解度（大腸菌または他の宿主細胞において発現される場合を含むが、これらに限定されない）を増加させ得る。いくつかの実施形態において、付加、置換または欠失は、大腸菌または他の組み換え宿主細胞における発現後のＩＬ−２の溶解度を増加させ得る。いくつかの実施形態において、部位は、大腸菌または他の組み換え宿主細胞における発現後のポリペプチド溶解度の増加をもたらす非天然アミノ酸の組み込みのための別の部位に加えて、天然にコードされるアミノ酸または非天然のアミノ酸による置換のために部位が選択される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、別の付加、置換または欠失を含む。当該別の付加、置換または欠失は、ＩＬ−２受容体、結合タンパク質、もしくは関連するリガンドに対する親和性を調節するか、ＩＬ−２受容体への結合後にシグナル伝達を調節するか、循環半減期を調節するか、放出もしくは生物学的利用性を調節するか、精製を容易にするか、または特定の投与経路を改善もしくは変更する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、その受容体に対するＩＬ−２変異体の親和性を増加させる付加、置換または欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２は、ＩＬ−２−Ｒ１および／またはＩＬ−２−Ｒ２に対するＩＬ−２変異体の親和性を増加させる付加、置換または欠失を含む。同様に、ＩＬ−２ポリペプチドは、化学的切断配列もしくは酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓを含むが、これらに限定されない）、または他の親和性ベース配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない）、または結合分子（ビオチンを含むが、これに限定されない）を含み得る。当該結合分子は、検出（ＧＦＰを含むが、これらに限定されない）、精製、組織もしくは細胞膜を通した輸送、プロドラッグ放出または活性化、ＩＬ−２サイズ減少、またはポリペプチドの他の形質を改善する。
【０３９２】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸の置換は、ＩＬ−２アンタゴニストを生成する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、受容体結合に関与する領域において、置換または付加される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２アンタゴニストは、ＩＬ−２をアンタゴニストとして作用させる少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２アンタゴニストは、ＩＬ−２分子の受容体結合領域に存在する、水溶性ポリマーに結合した天然にコードされていないアミノ酸を含む。
【０３９３】
いくつかの場合において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸で置換される。いくつかの場合において、ＩＬ−２は、天然に存在するアミノ酸に対する、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ−２における１つ以上の残基は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸で置換される。いくつかの場合において、１つ以上の天然にコードされていない残基は、１つ以上のより低い分子量の直鎖状または分枝状ＰＥＧに連結し、それによって、単一のより高い分子量のＰＥＧに付加したものと比較して、結合親和性および類似の血清半減期を増強する。
【０３９４】
〔ＶＩ．非真核生物および真核生物における発現〕
クローニングされたＩＬ−２ポリヌクレオチドの高レベルの発現を達成するために、１つの典型としては、転写を指示する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および、タンパク質をコードする核酸については翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターに対して、本発明のＩＬ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらにおいて記載されている。
【０３９５】
本発明のＩＬ−２を発現するための細菌発現系は、大腸菌、バシルス属（Bacillus sp）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルジノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、およびサルモネラ（Salmonella）（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)）において利用可能であるが、これらに限定されない。このような発現系のためのキットは、商業的に入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は当業者に公知であり、そしてまた商業的に入手可能でもある。直交ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（上記）が本発明のＩＬ−２ポリペプチドを発現するために使用される場合、発現のための宿主細胞は、直交成分を使用するそれらの能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞は、グラム陽性細菌（Ｂ．ブレビス（B.brevis）、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）、またはストレプトミセス（Streptomyces）を含むが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（大腸菌、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルジノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ならびに酵母および他の真核細胞を含む。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞は、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０３９６】
本発明の真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、大量の有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成する能力を提供する。一態様において、組成物は、非天然アミノ酸を含むタンパク質を、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、もしくはそれ以上、またはインビボタンパク質産生方法で達成できる量を、任意に含むが、これらに限定されない（組み換えタンパク質産生および精製に関する詳細は、本明細書にて提供される）。別の態様において、タンパク質は組成物中に、以下を含むがこれらに限定されない濃度にて：リットル当たり少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、リットル当たり少なくとも１ミリグラムのタンパク質、もしくはリットル当たり少なくとも１０ミリグラム以上のタンパク質、またはそれ以上；以下を含むがこれらに限定されないものにおいて：細胞溶解物、緩衝液、医薬緩衝液、または他の液体懸濁液（限定されるものではないが、約１ｎｌ〜約１００Ｌ、またはそれ以上の体積を含む）；任意に存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞におけるタンパク質の大量産生（インビトロ翻訳を含むがこれらに限定されない他の方法で典型的に可能なものより多いものを含むがこれに限定されない）は、本発明の特徴である。
【０３９７】
本発明の真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、大量の有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含むタンパク質は、細胞抽出物、細胞溶解物、培地、緩衝液、および／または同等物中で、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、もしくは少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル、それ以上を含むが、これらに限定されないタンパク質の濃度で産生され得る。
【０３９８】
ＩＬ−２の発現に適した多くのベクターが商業的に入手可能である。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターを含むが、これらに限定されない。このようなベクターは、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）＼Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）、およびｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を含む。ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａを含む大腸菌由来のプラスミド、ＲＰ４などのより広い宿主域プラスミド、ファージＤＮＡ、例えばファージラムダ、例えばＮＭ９８９の多数の誘導体、およびＭ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージのような細菌性プラスミドが使用され得る。２μプラスミドおよびその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号。参照により組み込まれる。）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996に記載されている）、およびｐＰＩＣＺ  Ａ、ＢまたはＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、酵母宿主細胞と共に使用され得る。昆虫細胞の場合、ベクターは、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685 98 (1986)））、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５、およびｐＭｅｌｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０３９９】
ＩＬ−２またはその変異体をコードするヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが発現される細胞から分泌される場合に存在する。このようなシグナルペプチドは、任意の配列であり得る。シグナルペプチドは、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89 104は、哺乳動物細胞において使用するためのシグナルペプチド（マウスＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド）を記載している。他のシグナルペプチドは、以下を含むが、これらに限定されない：Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）由来のα因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号。参照により本明細書に組み込まれる。）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646）、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０。参照により本明細書に組み込まれる。）、および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137を参照のこと）。
【０４００】
適切な哺乳動物宿主細胞の例は、当業者に公知である。このような宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、グリーンサル細胞（ＣＯＳ）（例えば、ＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２、またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、ならびに組織培養中の植物細胞であり得る。これらの細胞株およびその他は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄなどの公的寄託機関から入手可能である。ＩＬ−２ポリペプチドの改善されたグリコシル化を提供するために、哺乳動物宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、１，６−シアリルトランスフェラーゼ）を発現するように改変され得る（例えば、米国特許第５，０４７，３３５号に記載されるように。これは、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４０１】
哺乳動物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のための方法は、以下を含むが、これらに限定されない：カルシウムホスファレ（phosphare）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルスベクター、ならびに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を使用するＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫに記載されているトランスフェクション法、およびＦｕＧＥＮＥ６を使用するＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡに記載されているトランスフェクション法。これらの方法は当技術分野で公知であり、Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば（Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA and Harrison Mass. and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997）に記載されているような、従来の方法にしたがって、行われ得る。
【０４０２】
〔Ｉ．大腸菌、シュードモナス種、および他の原核生物〕
細菌発現技術は、当業者に公知である。多種多様なベクターが、細菌宿主における使用のために利用可能である。ベクターは、単一コピー、または、低級もしくは高級多重コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニングおよび／または発現のために役立つことができる。ベクターに関する十分な文献、多くのベクターの商業的入手可能性、ならびにベクターおよびそれらの制限マップおよび特性を記載するマニュアルまでも考慮すると、ここでは広範な議論は必要とされない。よく知られているように、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、当該マーカーは、細胞毒性剤耐性、原栄養性または免疫性を提供し得る。異なる特性を提供する複数のマーカーが存在することもある。
【０４０３】
細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）のｍＲＮＡへの転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有し得る。この転写開始領域は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターは、オペレーターとよばれる第二のドメインも有し得る。オペレーターは、ＲＮＡ合成が始まる隣接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複することがある。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害することがあるので、オペレーターは負の調節（誘導）転写を可能にしている。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で生じ得る。さらに、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近傍（５’）に通常存在する場合には、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列によって正の調節が行われることがある。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、カタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、大腸菌においてｌａｃオペロンの転写開始を補助する（Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173）。したがって、調節された発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強または減少させ得る。
【０４０４】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）、（Chang et al., NATURE (1977) 198:1056）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）、（Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731；米国特許第４，７３８，９２１；欧州公開第０３６  ７７６および第１２１  ７７５。これらは、参照により本明細書に組み込まれる）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)）、バクテリオファージラムダＰＬ（Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号。これは参照により本明細書に組み込まれる）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモーターのような強力なプロモーターを利用して、ＩＬ−２ポリペプチドを高レベルで誘導する。このようなベクターの例は、当業者に公知であり、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリーズ、およびＷＯ９９／０５２９７（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているｐＰＯＰベクターを含む。このような発現系は、宿主細胞の生存率または増殖パラメーターを損なうことなく、宿主において高レベルのＩＬ−２ポリペプチドを産生する。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、当技術分野で公知の別のベクターである。
【０４０５】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合させて、合成ハイブリッドプロモーターを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号。これは、参照により本明細書に組み込まれる。）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサーによって調節されるｔｒｐプロモーターおよびｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21）。さらに、細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合し転写を開始する能力を有する非細菌由来の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌由来の天然に存在するプロモーターもまた、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現を産生するために、適合性ＲＮＡポリメラーゼと抱合させることができる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、抱合プロモーター系の例である（Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよび大腸菌オペレーター領域（欧州公開第２６７８５１）からも構成され得る。
【０４０６】
機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位は、原核生物における外来遺伝子の発現にも有用である。大腸菌において、リボソーム結合部位はＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Shine et al., NATURE (1975) 254:34）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列および３’と大腸菌１６ＳｒＲＮＡとの間の塩基対形成によって、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)）。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させること（Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989）。
【０４０７】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他の転写ＤＮＡの受容体として使用され得るか、または使用された細菌に言及する。当該用語は、トランスフェクションされた元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。偶発的または意図的な突然変異に起因して、単一の親細胞の子孫は、形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体的に、必ずしも元の親と完全に同一ではない可能性があることが理解される。ＩＬ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在のように、関連する特性によって特性付けられる、親に十分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
【０４０８】
ＩＬ−２ポリペプチドの発現に適した宿主細菌を選択することは、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、良好な封入体（inclusion body）形成能力、低いタンパク質分解活性、および全体的な堅牢性を有することが示された宿主を含み得る。細菌宿主は一般に、以下を含むがこれらに限定されない、多様な供給源から入手可能である：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）；およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（”ＡＴＣＣ”）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。工業的／薬学的発酵は一般的に、Ｋ株（例えば、Ｗ３１１０）由来の細菌、またはＢ株（例えば、ＢＬ２１）由来の細菌を使用する。これらの株は、それらの増殖パラメーターが非常によく知られており、そして頑強であるので、特に有用である。さらに、これらの株は、非病原性である。このことは、安全上および環境上の理由から商業的に重要である。適切な大腸菌宿主の他の例は、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ、またはそれらの誘導体の株を含むが、これらに限定されない。本発明の方法の別の実施形態において、大腸菌宿主は、ＯＭＰ−およびＬＯＮ−を含むがこれらに限定されない、プロテアーゼマイナス株である。宿主細胞株は、以下を含むがこれらに限定されないシュードモナス種であり得る：シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルジノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）。指定株ＭＢ１０１であるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ｂｉｏｖａｒ１は、組み換え産生に有用であることが知られており、治療用タンパク質産生プロセスに利用可能である。シュードモナス発現系の例には、宿主株としてＴｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから利用可能な系（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｔ  ｄｏｗ．ｃｏｍで入手可能）が含まれる。
【０４０９】
組み換え宿主細胞株が一度株化される（すなわち、発現構成体が宿主細胞に導入され、適切な発現構築物を有する宿主細胞が単離される）と、組み換え宿主細胞株はＩＬ−２ポリペプチドの産生に適当な条件下で培養される。当業者に明らかであるが、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現構築物の性質および宿主細胞の同一性に依存する。組み換え宿主株は通常、当業者に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、典型的には炭素、窒素、および無機塩の同化可能な供給源を含有し、任意にビタミン、アミノ酸、成長因子、および当業者に公知の他のタンパク質性培養補助剤を含有する、液体培地中で培養される。宿主細胞の培養のための液体培地は、所望されない微生物の増殖を防ぐための抗生物質もしくは抗真菌剤、および／または化合物（発現ベクターを含む宿主細胞について選択するための抗生物質を含むが、これらに限定されない）を任意に含み得る。
【０４１０】
組み換え宿主細胞は、細胞収集（ＩＬ−２ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合には）、またはバッチもしくは連続形式のいずれかでの培養上清収集のいずれかにて、バッチまたは連続形式で培養され得る。原核生物宿主細胞における産生のためには、バッチ培養および細胞収集が好ましい。
【０４１１】
本発明のＩＬ−２ポリペプチドは通常、組み換え系における発現後に精製される。ＩＬ−２ポリペプチドは、当技術分野で公知の種々の方法によって宿主細胞または培養培地から精製され得る。細菌宿主細胞中で産生されるＩＬ−２ポリペプチドは、（封入体の形態で）難溶性または不溶性であり得る。本発明の一実施形態において、アミノ酸置換は、本明細書に開示される方法を利用して、組み換え産生タンパク質の溶解度を増加させる目的で選択されるＩＬ−２ポリペプチドにおいて、当技術分野で公知のものと同様に、容易に行われ得る。不溶性タンパク質の場合、タンパク質は遠心分離によって宿主細胞溶解物から収集され得、そして細胞の均質化がさらに続き得る。難溶性タンパク質の場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むがこれに限定されない化合物を添加して、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を誘導することができる。次いで、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって簡便に収集され得る。組み換え宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法を使用して、細胞内から封入体を放出するために破壊または均質化され得る。宿主細胞の破壊または均質化は、酵素的細胞破壊、超音波処理、ダウンス均質化、または高圧放出破壊を含むがこれらに限定されない公知の技術を使用して実施され得る。本発明の方法の一実施形態において、高圧放出技術は、大腸菌宿主細胞を破壊し、ＩＬ−２ポリペプチドの封入体を放出するために使用される。ＩＬ−２ポリペプチドの封入体を取り扱う場合、可溶化、機械的剪断またはタンパク質分解などの要因による損失なく封入体の収率を最大化するために、均質化時間の繰り返しを最小化することが有利であり得る。
【０４１２】
次いで、不溶性または沈殿したＩＬ−２ポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の数の適切な可溶化剤を使用して、可溶化され得る。ＩＬ−２ポリペプチドは、尿素または塩酸グアニジンを用いて、可溶化することができる。可溶化されたＩＬ−２ポリペプチドの体積は、簡便に取扱い可能なバッチサイズを使用して大きなバッチを製造することができるように、最小化すべきである。この要素は、組み換え宿主を数千リットルの容量のバッチにおいて増殖させることができる大規模な商業的環境においては、重要であろう。さらに、特にヒトの医薬用途のために、大規模な商業的環境においてＩＬ−２ポリペプチドを製造する場合、機械および容器、またはタンパク質産物自体を損傷し得る過酷な化学物質の回避は、可能であれば回避されるべきである。本発明の方法において、より過酷な変性剤であるグアニジン塩酸塩の代わりに、より穏和な変性剤である尿素を使用して、ＩＬ−２ポリペプチド封入体を可溶化することができることが示された。尿素の使用は、ＩＬ−２ポリペプチド封入体を効率的に可溶化しながら、ＩＬ−２ポリペプチドの製造および精製プロセスにおいて利用されるステンレス鋼装置に対する損傷のリスクを有意に減少させる。
【０４１３】
可溶性ＩＬ−２タンパク質の場合、ＩＬ−２は、ペリプラズム空間中へ、または培養培地中へ、分泌され得る。さらに、可溶性ＩＬ−２が宿主細胞の細胞質中に存在することもある。精製工程を行う前に可溶性ＩＬ−２を濃縮することが望ましい場合がある。当業者に公知の標準的な技術を使用して、例えば細胞溶解物または培養培地から、可溶性ＩＬ−２を濃縮し得る。さらに、当業者に公知の標準的な技術を使用して、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質またはペリプラズム空間から、可溶性ＩＬ−２を放出し得る。
【０４１４】
一般に、発現したポリペプチドを変性させ、還元し、次いで、ポリペプチドを好ましい立体構造にリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンを、目的の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性、および再生する方法は、当業者に公知である（上記の参考文献、ならびにDebinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585;およびBuchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270を参照のこと）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、酸化グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含むがこれらに限定されない酸化還元緩衝液中でリフォールディングされ得る。リフォールディング試薬は、１つ以上のポリペプチドまたは他の発現産物と接触するように流され得るか、またはそうでなければ移動され得るか、またはその逆であり得る。
【０４１５】
ＩＬ−２ポリペプチドの原核生物産生の場合、このように産生されたＩＬ−２ポリペプチドは、ミスフォールディングされ得、したがって生物学的活性を欠くか、または減少した生物学的活性を有する。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」によって回復させることができる。一般に、ミスフォールディングされたＩＬ−２ポリペプチドは、可溶化（ＩＬ−２ポリペプチドも不溶性である場合）、例えば１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を使用するアンフォールディングおよびポリペプチド鎖の還元によって、リフォールディングされる。適度な濃度のカオトロープで、酸化剤（例えば、酸素、シスチンまたはシスタミン）を添加し、ジスルフィド結合の再形成を可能にする。ＩＬ−２ポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的な方法（例えば、米国特許第４，５１１，５０２号、第４，５１１，５０３号、および第４，５１２，９２２号に記載される方法。これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、リフォールディングされ得る。ＩＬ−２ポリペプチドはまた、他のタンパク質とコフォールディングされて、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成し得る。
【０４１６】
リフォールディング後、ＩＬ−２をさらに精製することができる。ＩＬ−２の精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど、またはこれらの任意の組み合わせを含む、当業者に公知の様々な技術を使用して、達成され得る。さらなる精製はまた、精製されたタンパク質の乾燥または沈殿の工程を含み得る。
【０４１７】
精製後、ＩＬ−２は異なる緩衝液に交換され得、および／または、ダイアフィルトレーションおよび透析を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって濃縮され得る。単一の精製タンパク質として提供されるＩＬ−２は、凝集および沈殿に供され得る。
【０４１８】
精製されたＩＬ−２は、少なくとも９０％純粋（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、測定される場合）、または少なくとも９５％純粋、または少なくとも９６％純粋、または少なくとも９７％純粋、または少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％以上純粋であり得る。ＩＬ−２の純度の正確な数値にかかわらず、ＩＬ−２は医薬品として使用するために、またはＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合などのさらなる処理のために、十分に純粋である。
【０４１９】
特定のＩＬ−２分子は他の活性成分もしくはタンパク質（賦形剤、担体、および安定剤、血清アルブミンなどを除く）の非存在下で治療薬として使用され得るか、または、それらは別のタンパク質またはポリマーと複合化され得る。
【０４２０】
これまでに、所望のアンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを添加することによって、インビトロで非天然アミノ酸をタンパク質に部位特異的に組み込むことができることが示されている。これらのアプローチを使用して、特定のアミノ酸に対して栄養要求性の株を使用して、２０個の共通アミノ酸の多くを、近い構造ホモログ（例えば、フェニルアラニンの代わりにフルオロフェニルアラニン）で置換することができる。例えば、Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G.  A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992);および、Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)を参照のこと。
【０４２１】
例として、終止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが調製された。従来の部位特異的突然変異導入を使用して、タンパク質遺伝子の目的部位に終止コドンＴＡＧが導入された。例えば、Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと変異遺伝子とをインビトロ転写／翻訳系で組み合わせると、非天然アミノ酸は、ＵＡＧコドンに応答して取り込まれ、特定の位置にそのアミノ酸を含むタンパク質を与えた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験、およびα−ヒドロキシ酸を用いた実験は、ＵＡＧコドンにより特定される位置には所望のアミノ酸のみが取り込まれ、このアミノ酸は他のいずれの部位にも取り込まれていないことが示された。例えば、Noren, et al、上記；Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432;および, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)を参照のこと。
【０４２２】
ｔＲＮＡは、化学的または酵素的アミノアシル化を含むがこれらに限定されない任意の方法または技術によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
【０４２３】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって、または、リボザイムを含むがこれらに限定されない他の酵素分子によって、達成され得る。用語「リボザイム」は、「触媒ＲＮＡ」と互換的である。Ｃｅｃｈおよび協働者ら（Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226）は、触媒として作用する天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在を実証した。しかしながら、これらの天然ＲＮＡ触媒は開裂およびスプライシングのためにリボ核酸基質に作用することのみが示されているが、リボザイムの人工的進化の最近の発展は、触媒作用のレパートリーを種々の化学反応にまで拡張した。研究により、それ自体で（２’）３’−末端でアミノアシル−ＲＮＡ結合を触媒することができるＲＮＡ分子（Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647）、および、１つのＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子へとアミノ酸を転移させることができるＲＮＡ分子（Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444）が同定された。
【０４２４】
米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）は、リボザイムを構築するための方法、および天然にコードされるアミノ酸および天然にコードされていないアミノ酸を用いたｔＲＮＡのアミノアシル化における、それらの使用を記載する。リボザイムを含むがこれに限定されないｔＲＮＡをアミノアシル化することができる酵素分子の基質固定化形態により、アミノアシル化産物の効率的な親和性精製が可能にされ得る。適切な基質の例は、アガロース、セファロースおよび磁気ビーズを含む。アミノアシル化のための基質固定化形態のリボザイムの製造および使用は、Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084、および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２５】
化学的アミノアシル化の方法は、以下により紹介されるものを含むがこれらに限定されない：Ｈｅｃｈｔおよび協働者（Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) and by Schultz, Chamberlin, Dougherty and others (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34）。これらは、参照により本明細書に組み込まれ、アミノアシル化における合成酵素の使用を避ける。このような方法または他の化学的アミノアシル化の方法を使用して、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化し得る。
【０４２６】
触媒ＲＮＡを生成する方法は、ランダム化されたリボザイム配列の別々のプールを生成すること、プール上で指向性進化を行うこと、所望のアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングすること、および所望のアミノアシル化活性を示すこれらのリボザイムの配列を選択することを含み得る。
【０４２７】
再構成された翻訳系も使用することができる。精製された翻訳因子の混合物もまた、開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（αまたはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、または停止因子のような精製された翻訳因子を補充した溶解物または溶解物の組み合わせと同様に、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するために首尾よく使用されている。無細胞系もまた、転写／翻訳系に連結され得、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９３、これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、そしてｍＲＮＡが翻訳される。真核生物転写系において転写されるＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または５’末端キャップ（７−メチルグアノシン）、および３’末端ポリＡ尾部成熟ｍＲＮＡの形態であり得、これは一定の翻訳系において有利であり得る。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、網状赤血球溶解物系において高い効率で翻訳される。
【０４２８】
〔ＩＸ．ＩＬ−２ポリペプチドに結合した高分子ポリマー〕
本明細書中に記載される非天然アミノ酸ポリペプチドに対する種々の改変は、本明細書中に記載される組成物、方法、技術および計画を使用して、達成され得る。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分への、以下を含むがこれらに限定されないさらなる官能基の組み込みが含まれる：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、バイオマテリアル、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージ化部分、化学線励起可能部分、光異性化部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチンアナログ、重原子組み込み部分、化学的開裂可能部分、光開裂可能部分、延長された側鎖、炭素結合糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性基、化学発光性基、電子緻密基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性ヌクレオチド、放射性トランスミッター、中性子捕捉剤、もしくは上記の任意の組み合わせ、または任意の他の所望の化合物もしくは物質。本明細書中に記載される組成物、方法、技術、および計画の例示的で非限定的な例として、以下の記載は、非天然アミノ酸ポリペプチドへの高分子ポリマーの添加に焦点を当てる。これは、そのために記載される組成物、方法、技術、および計画もまた、上記に列挙されるものを含むがそれらに限定されない他の官能基の添加にも適用可能（必要であれば、当業者が本明細書中の開示を用いて行うことができる、適切な改変を伴う）であるという理解の下である。
【０４２９】
多種多様な高分子ポリマーおよび他の分子が、本発明のＩＬ−２ポリペプチドに連結され得、ＩＬ−２ポリペプチドの生物学的特性を調節し、および／またはＩＬ−２分子に新しい生物学的特性を提供し得る。これらの高分子ポリマーは、天然にコードされるアミノ酸を介して、天然にコードされていないアミノ酸を介して、または天然もしくは非天然アミノ酸の任意の機能的置換基を介して、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加される任意の置換基もしくは官能基を介して、ＩＬ−２ポリペプチドに連結され得る。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない広い範囲であってよい。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってよく、以下を含むがこれらに限定されない：１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａ。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマーの分子量がは、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４３０】
本発明は、ポリマー：タンパク質抱合物の実質的に均質な調製物を提供する。「実質的に均質である」とは、本明細書中で使用される場合、ポリマー：タンパク質抱合分子が全タンパク質全体の半分よりも大きいことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質抱合物は、生物学的活性を有し、本明細書中に提供される本発明の「実質的に均質である」ＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチド調製物は、均質な調製物の利点、例えばロット間薬物動態の予測可能性における臨床応用の容易さ、を示すために十分に均質なものである。
【０４３１】
ポリマー：タンパク質抱合分子の混合物を調製することを選択することもでき、本明細書中で提供される利点は、混合物中に含まれるモノポリマー：タンパク質抱合物の割合を選択し得ることである。したがって、所望の場合、種々の数のポリマー部分が結合した（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−など）種々のタンパク質の混合物を調製し、前記抱合物を、本発明の方法を使用して調製されたモノポリマー：タンパク質抱合物と組み合わせ、所定の割合のモノポリマー：タンパク質抱合物との混合物を有してもよい。
【０４３２】
選択されたポリマーは、それが結合したタンパク質が水性環境、例えば生理学的環境、において沈殿しないように、水溶性であり得る。ポリマーは、分枝状であってもよく、非分枝状であってもよい。最終生成物調製物の治療的使用のために、ポリマーは、薬学的に許容可能である。
【０４３３】
ポリマーの例は、以下を含むがこれらに限定されない：ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシキャップアナログ（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、およびそのメトキシまたはエトキシキャップアナログ、特にポリオキシエチレングリコール、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られる）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエステル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン、およびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、およびその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびそのアナログ；親水性ペプチド配列；多糖類およびその誘導体（デキストランおよびデキストラン誘導体、例えばカルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストラン、アミノデキストランを含むがこれらに限定されない）；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチンおよびその誘導体、例えばキトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸およびその誘導体；澱粉；アルギン酸塩；コンドロイチン硫酸；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸、およびその誘導体、例えばポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド；スチレン無水マレイン酸コポリマー、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸コポリマーなどの無水マレイン酸コポリマー；ポリビニルアルコール；これらのコポリマー；これらのターポリマー；これらの混合物；ならびにこれらの誘導体。
【０４３４】
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の割合は、反応混合物中のそれらの濃度と同様に、変化し得る。一般に、最適な比率（最小限の余分な未反応タンパク質またはポリマーが存在するという点での反応効率に関して）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量および有効な有効な反応基の数によって、決定され得る。分子量に関して、典型的には、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合し得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、ポリマーの分枝もこれらのパラメーターを最適化する場合には考慮に入れるべきである。一般に、分子量が高いほど（または分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率は高くなる。
【０４３５】
本明細書中で使用される場合、そしてＰＥＧ：ＩＬ−２ポリペプチド抱合物を検討する場合、用語「治療有効量」は、患者に所望の利益を与える量に言及する。当該量は個体ごとに異なり得、患者の全体的な身体状態および処置される状態の根本的な原因を含む、多くの因子に依存し得る。治療のために使用されるＩＬ−２ポリペプチドの量は、許容可能な変化速度を与え、有益なレベルで所望の応答を維持する。本発明の組成物の治療有効量は、公的に利用可能な材料および手順を使用して、当業者によって容易に確認され得る。
【０４３６】
水溶性ポリマーは、直線状、フォーク状または分枝状を含むがこれらに限定されない任意の構造形態であってよい。典型的には水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーも使用することができる。例として、ＰＥＧが、本発明の特定の実施形態を記載するために使用される。
【０４３７】
ＰＥＧは公知の水溶性ポリマーであり、市販されているか、または当業者に公知の方法（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）によるエチレングリコールの開環重合によって調製することができる。用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたは末端の修飾に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、ＩＬ−２ポリペプチドに連結されるように、式により表すことができる：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
式中、ｎは２〜１０，０００であり、Ｘは、Ｈ、または、Ｃ１〜４のアルキル、保護基、もしくは末端官能基を含むがこれらに限定されない末端修飾である。
【０４３８】
いくつかの場合において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終端する、すなわち、ＸはＨもしくはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。代替的には、ＰＥＧは反応性基を終端とすることができ、それによって二官能性ポリマーを形成することができる。典型的な反応性基は、以下と反応するために一般的に使用される官能基：２０個の共通アミノ酸に見られる官能基（マレイミド基、活性化カーボネート（ｐ−ニトロフェニルエステルを含むがこれに限定されない）、活性化エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含むがこれらに限定されない）、およびアルデヒドを含むがこれらに限定されない）；ならびに、２０個の共通アミノ酸に対して不活性であるが、天然にコードされていないアミノ酸において存在する相補的官能基（アジド基、アルキン基を含むが、これらに限定されない）と特異的に反応する官能基と反応する官能基、を含み得る。ＰＥＧの他端は、上記の式においてＹによって示され、天然に存在するアミノ酸または天然にコードされていないアミノ酸を介してＩＬ−２ポリペプチドに直接的、または間接的の何れかで結合し得ることに留意されたい。例えば、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（リジンのεアミンまたはＮ末端を含むがこれらに限定されない）へのアミド、カルバメート、または尿素結合であり得る。代替的には、Ｙは、チオール基（システインのチオール基を含むがこれに限定されない）へのマレイミド結合であってもよい。代替的には、Ｙは、２０個の共通のアミノ酸を介する一般的に接近可能でない残基への結合であってもよい。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をＩＬ−２ポリペプチド上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成することができる。代替的には、ＰＥＧ上のアルキン基を、天然にコードされていないアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、類似の生成物を形成することができる。いくつかの実施形態において、強い求核試薬（ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含むがこれらに限定されない）を、天然にコードされていないアミノ酸中に存在するアルデヒドまたはケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成することができ、場合によっては、適切な還元剤で処理することによってさらに還元することができる場合がある。代替的には、強い求核試薬が天然にコードされていないアミノ酸を介してＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれ得、水溶性ポリマー中に存在するケトンまたはアルデヒド基と優先的に反応するために使用され得る。
【０４３９】
ＰＥＧのための任意の分子量が、約１００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ以上（時には０．１〜５０ｋＤａ、または１０〜４０ｋＤａを含むことがあるが、これに限定されない）を含むがこれに限定されない、実際に所望されるとおりに使用することができる。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれに限定されない広範囲のものであってよい。ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであり、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。１〜１００ｋＤａ(１〜５０ｋＤａまたは５〜２０ｋＤａを含むが、これらに限定されない）の範囲のＭＷをそれぞれ有する鎖を有するＰＥＧ分子を含むがこれらに限定されない、分枝鎖ＰＥＧを使用することもできる。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含み得るが、これに限定されない。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであり得、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約２０��０００Ｄａである。広範囲のＰＥＧ分子が記載されており、ｔｈｅ  Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４０】
一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、天然にコードされていないアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキンおよびアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書中に記載されるように、ＰＥＧを天然にコードされていないアミノ酸に結合させることができる。天然にコードされていないアミノ酸がアジドを含む場合、ＰＥＧは典型的には、［３＋２］付加環化生成物の形成をもたらすアルキン部分、または、アミド結合の形成をもたらすホスフィン基を含む活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カーボネート）のいずれかを含み得る。代替的には、天然にコードされていないアミノ酸がアルキンを含む場合、ＰＥＧは典型的には、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化生成物の形成をもたらすアジド部分を含み得る。天然にコードされていないアミノ酸がカルボニル基を含む場合、ＰＥＧは典型的には、対応するヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバゾン結合の形成をそれぞれもたらすために、強い求核試薬（ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド機能を含むが、これらに限定されない）を含む。他の代替として、上記の反応性基の位置の逆を使用することができ、すなわち、天然にコードされていないアミノ酸中のアジド部分を、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。
【０４４１】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＩＬ−２ポリペプチド変異体は、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応する化学官能基を含む。
【０４４２】
本発明は、いくつかの実施形態において、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格を含むアジド−およびアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかしながら、ポリ（エチレン）グリコール、ならびにポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）を含む他の関連するポリマーを含むがこれらに限定されない広範囲の水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適しており、用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、このような分子すべてを包含し、含むことが意図されることを理解されたい。用語ＰＥＧは、以下を含む、任意のその形態のポリ（エチレングリコール）を含むがこれらに限定されない：二官能性ＰＥＧ、多腕ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、ペンダント状ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格にぶら下がる１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、または分解性結合を有するＰＥＧ。
【０４４３】
ＰＥＧは典型的には、透明、無色、無臭、水溶性であり、熱に対して安定であり、多くの化学剤に対して不活性であり、加水分解または劣化せず、一般に無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であると考えられ、すなわち、ＰＥＧは、害を及ぼすことなく、生きている組織または生物と共存することができる。より具体的には、ＰＥＧは実質的に非免疫原性であり、すなわち、ＰＥＧは体内で免疫応答を生じる傾向がない。生物学的に活性な薬剤のような、体内で何らかの望ましい機能を有する分子に結合した場合、ＰＥＧは当該薬剤をマスクする傾向があり、生物が薬剤の存在に耐え得るように、任意の免疫応答を低減または除去することができる。ＰＥＧ抱合物は、実質的な免疫応答を生じないか、または凝固もしくは他の望ましくない効果を引き起こさない傾向がある。−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−の式を有し、式中、ｎは約３〜約４０００、典型的には約２０〜約２０００であるＰＥＧは、本発明における使用に適している。約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは、本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない広い範囲のものであってよい。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってよく、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４４４】
ポリマー骨格は、直線状または分枝状であり得る。分枝ポリマー骨格は、当技術分野において一般に知られている。典型的には、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分と、中央分枝コアに連結した複数の直線ポリマー鎖とを有する。ＰＥＧは一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシド付加によって調製され得る分枝形態にて、使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸に由来し得る。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般的な形態で表すことができ、式中、Ｒはグリセリン、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトールなどのコア部分に由来し、ｍは腕の数を表す。米国特許第５，９３２，４６２号；第５，６４３，５７５号；第５，２２９，４９０号；第４，２８９，８７２号；米国特許出願２００３/０１４３５９６号；ＷＯ９６／２１４６９；およびＷＯ９３／２１２５９（これらは、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような多腕ＰＥＧ分子もまた、ポリマー骨格として使用され得る。
【０４４５】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎによって表されるフォーク状ＰＥＧの形態であってもよく、式中、Ｙは連結基であり、Ｚは決まった長さの原子鎖によってＣＨに連結した活性化末端基である。
【０４４６】
また別の分枝形態であるペンダントＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応性基を有する。
【０４４７】
これらの形態のＰＥＧに加えて、ポリマーはまた、骨格中に弱い結合または分解性の結合を有するように調製され得る。例えば、ＰＥＧは、ポリマー骨格中にエステル結合を有し、加水分解を受けるように調製され得る。以下に示すように、この加水分解は、より低い分子量の断片へのポリマーの開裂をもたらす：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ  →  ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語は、本明細書に開示されているものを含むがこれに限定されない当技術分野で公知のすべての形態を表すか、または含むことが、当業者には理解される。
【０４４８】
多くの他のポリマーもまた、本発明における使用に適している。いくつかの実施形態において、水溶性であり２〜約３００個の末端を有するポリマー骨格が、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例には、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、それらのコポリマー（エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない）、それらのターポリマー、それらの混合物などが含まれるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化し得るが、典型的には約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの範囲であり、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲であることもある。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであってもよく、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０４４９】
実質的に水溶性である骨格についての前述のリストは決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであり、上記の特性を有するすべてのポリマー材料が、本発明における使用に適していると考えられることを、当業者は認識するであろう。
【０４５０】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリマー誘導体は「多官能性」であり、これは、ポリマー骨格が、官能基で官能化または活性化された、少なくとも２つの末端、そしておそらくは約３００個もの末端を有することを意味する。多官能性ポリマー誘導体には、２つの末端を有する直線状ポリマーが含まれるが、これらに限定されず、各末端は同じであっても異なっていてもよい官能基に結合している。
【０４５１】
一実施形態において、ポリマー誘導体は、
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
の構造を有する：
式中：
Ｎ＝Ｎ＝Ｎは、アジド部分である；
Ｂは、存在しても存在しなくてもよい連結部分である；
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーである；
Ａは、存在しても存在しなくてもよく、Ｂと同じであっても異なっていてもよい連結部分である；
Ｘは、第２の官能基である。
ＡおよびＢの連結部分の例には、１８個までを含むがこれに限定されない多官能化アルキル基が含まれ、１〜１０個の炭素原子を含有してもよい。窒素、酸素、または硫黄などのヘテロ原子がアルキル鎖に含まれていてもよい。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子にて分枝していてもよい。ＡおよびＢの連結部分の他の例には、１０個までを含むがこれに限定されない多官能化アリール基が含まれ、５〜６個の炭素原子を含有してもよい。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素、酸素、または硫黄原子で置換されていてもよい。適切な連結基の他の例には、米国特許第５，９３２，４６２号；第５，６４３，５７５号；および、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号（これらは、その各々が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているそれらの連結基が含まれる。連結部分についての前述のリストは決して網羅的なものではなく、単に例示的なものであり、上記の特性を有するすべての連結部分が、本発明における使用に適していると考えられることを、当業者は認識するであろう。
【０４５２】
Ｘとして使用するために適した官能基の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステルなどの活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなどの活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトン、およびアジド。当業者によって理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないように、アジド基と適合性であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよく、これは、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がアジド部分でもあることを意味し、あるいは、ヘテロ二官能性であってもよく、これは、第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０４５３】
用語「保護された」は、特定の反応条件下で化学反応性官能基の反応を妨げる保護基または保護部分の存在に言及する。保護基は、保護される化学反応性基のタイプに応じて、変化し得る。例えば、化学反応性基がアミンまたはヒドラジドである場合、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の基から選択することができる。化学反応性基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学反応基がブタン酸またはプロピオン酸などのカルボン酸、または水酸基である場合、保護基は、ベンジル基、または、メチル、エチル、もしくはｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基であり得る。当技術分野で公知の他の保護基もまた、本発明において使用され得る。
【０４５４】
本文献中の末端官能基の具体例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、第５，４６８，４７８号を参照のこと）、アミン（例えば、Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)を参照のこと）、ヒドラジド（例えば、Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)を参照のこと）、スクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート（例えば、Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997を参照のこと；米国特許第５，６７２，６６２号も参照のこと）、スクシンイミジルスクシネート（例えば、Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)およびJoppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979)を参照のこと）、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号を参照のこと）、ベンゾトリアゾールカーボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)を参照のこと）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985)；およびSartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)を参照のこと）、アルデヒド（例えば、Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）、マレイミド（例えば、Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)),およびKogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)を参照のこと）、オルソピリジル−ジスルフィド（例えば、Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)を参照のこと）、アクリロール（acrylol）（例えば、Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)を参照のこと）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照のこと）。上記の参考文献および特許文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４５５】
本発明の特定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
という構造を有するポリマー骨格を含む：
式中：
Ｘは、上記のような官能基であり、
ｎは、約２０〜約４０００である。
別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
という構造を有するポリマー骨格を含む：
式中：
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を含む脂肪族または芳香族リンカー部分である；
ｎは、約２０〜約４０００である；
Ｘは、上記のような官能基である。ｍは、１〜１０である。
【０４５６】
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当技術分野で公知、および／または本明細書中に開示されている様々な方法によって、調製され得る。以下に示す１つの方法において、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第１の官能基に結合した第１の末端と適切な脱離基に結合した第２の末端とを有するポリマー骨格を、アジドアニオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどを含む多数の適切な対イオンのいずれかと組み合わせてもよい）と反応させる。脱離基は求核置換を受けてアジド部分によって置換され、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーを与える。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されるように、本発明において使用するために適切なポリマー骨格は、Ｘ−ＰＥＧ−Ｌの式を有し、式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。適切な官能基の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護アミン、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン、およびビニルピリジン、ならびにケトン。適切な脱離基の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレート。
【０４５７】
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の別の調製方法において、アジド官能基を有する架橋剤を、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格と接触させる。ここで、当該架橋剤は、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応し得る化学官能基を有し、アジド含有ポリマー誘導体生成物を形成し、ここで、アジドは連結基によってポリマー骨格から離れている。
【０４５８】
例示的な反応スキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ  →  ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
式中：
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基または上記のような官能基であり、
Ｍは、アジド官能基とは反応しないが、Ｎ官能基とは効率的かつ選択的に反応し得る官能基である。
【０４５９】
適切な官能基の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｎがアミンである場合、Ｍはカルボン酸、カーボネートまたは活性エステルであり；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分である場合、Ｍはケトンであり；Ｎが求核試薬である場合、Ｍは脱離基である。
【０４６０】
粗生成物の精製は、必要に応じて、生成物の沈殿、続くクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない公知の方法によって、達成され得る。
【０４６１】
ＰＥＧジアミンの場合の、より具体的な例を以下に示す。ここでは、アミンの１つがｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分によって保護され、得られたモノ保護ＰＥＧジアミンがアジド官能基を有する連結部分と反応する：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この場合、アミン基は、塩化チオニルまたはカルボジイミド試薬などの活性化剤、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを使用して、カルボン酸基に結合され得、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を生成することができる。アミド結合の形成に成功した後、得られたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ保護アジド含有誘導体は、生物活性分子を修飾するために直接使用することができ、または、他の有用な官能基を導入するためにさらに仕上げることができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ官能基は、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成するために、強酸を用いて処理することにより、加水分解され得る。得られたアミンは、有用なヘテロ二官能性試薬を生成するために、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどの他の有用な官能基を導入するための合成ハンドルとして、使用することができる。
【０４６２】
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたい場合に、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カーボネートなどの活性化求電子性基を有する分子を、ＰＥＧの一方の末端に結合させ、アセチレン基を有する分子をＰＥＧの他方の末端に結合させることを可能にし得る。
【０４６３】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
の構造を有する：
式中：
Ｒは、Ｈ、またはアルキル、アルケン、アルキオキシ、またはアリールもしくは置換アリール基のいずれかであり得る；
Ｂは、存在しても存在しなくてもよい連結部分である；
ＰＯＬＹは、水溶性非抗原性ポリマーである；
Ａは、存在しても存在しなくてもよく、Ｂと同じであっても異なっていてもよい連結部分である；
Ｘは、第２の官能基である。
【０４６４】
ＡおよびＢの連結部分の例には、１８個までを含むがこれに限定されない多官能化アルキル基が含まれ、１〜１０個の炭素原子を含有してもよい。窒素、酸素、または硫黄などのヘテロ原子がアルキル鎖に含まれていてもよい。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子にて分枝していてもよい。ＡおよびＢの連結部分の他の例には、１０個までを含むがこれに限定されない多官能化アリール基が含まれ、５〜６個の炭素原子を含有してもよい。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素、酸素、または硫黄原子で置換されていてもよい。適切な連結基の他の例には、米国特許第５，９３２，４６２号および第５，６４３，５７５号；および、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号（これらは、その各々が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているそれらの連結基が含まれる。連結部分について前述のリストは決して網羅的なものではなく、単に例示的なものが意図され、上記の特性を有する広範囲の連結部分が、本発明において有用であると考えられることを、当業者は認識するであろう。
【０４６５】
Ｘとして使用するために適した官能基の例には、以下が含まれる：ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステルなどの活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなどの活性カーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護アミン、ヒドラジド、保護ヒドラジド、保護チオール、カルボン酸、保護カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ケトン、およびアセチレン。当業者によって理解されるように、選択されたＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないように、アセチレン基と適合性であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよく、これは、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がアセチレン部分でもあることを意味し、あるいは、ヘテロ二官能性であってもよく、これは、第２の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０４６６】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
の構造を有するポリマー骨格を含む：
式中：
Ｘは、上記のような官能基である；
ｎは、約２０〜約４０００である；
ｍは、１〜１０である。
ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーそれぞれの具体例を以下に示す。
【０４６７】
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知の方法、および／または本明細書中に開示されている方法を使用して、調製され得る。１つの方法において、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する水溶性ポリマー骨格であって、第１の官能基に結合した第１の末端と適切な求核性基に結合した第２の末端とを有するポリマー骨格）を、アセチレン官能基、およびＰＥＧ上の求核性基との反応に適した脱離基の両方を有する化合物と反応させる。求核性部分を有するＰＥＧポリマーと脱離基を有する分子とを組み合わせると、脱離基は求核置換を受けて求核部分によって置換され、所望のアセチレン含有ポリマーを与える。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されるように、反応に使用するための好ましいポリマー骨格は、Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕの式を有し、式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核性部分であり、ＸはＮｕ、Ｌまたはアセチレン官能基と反応しない官能基である。
【０４６８】
Ｎｕの例には、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、主にＳＮ２型機構を介して反応し得るアミノキシ基が含まれるが、これらに限定されない。Ｎｕ基のさらなる例には、主に求核付加反応を介して反応し得る官能基が含まれる。Ｌ基の例には、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレート、ならびに、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β不飽和カルボニル基、カーボネートと同様に求核置換を受けることが予想される他のグループ、ならびに求核剤による付加を受けることが予想される他の求電子性基が含まれる。
【０４６９】
本発明の別の実施形態において、Ａは、１〜１０個の炭素原子の脂肪族リンカー、または６〜１４個の炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、適切な脱離基である。
【０４７０】
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の別の調製方法において、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有し、一方の末端に保護官能基またはキャッピング剤のいずれかを有し、他方の末端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーを、アセチレンアニオンによって、接触させる。
【０４７１】
例示的な反応スキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
式中：
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基または上記のような官能基などのキャッピング基である；
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基、または置換アルキル、置換アルコキシル、置換アリールもしくは置換アリールオキシ基のいずれかである。
【０４７２】
上記の例において、脱離基Ｌは十分な濃度のアセチレンアニオンと接触したときにＳＮ２型置換を受けるために十分に反応性であるべきである。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換を達成するために必要な反応条件は、当業者に公知である。
【０４７３】
粗生成物の精製は通常、必要に応じて、生成物の沈殿、続くクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法によって、達成され得る。
【０４７４】
水溶性ポリマーは、本発明のＩＬ−２ポリペプチドに連結され得る。水溶性ポリマーは、ＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸、または天然にコードされていないもしくは天然にコードされているアミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、または天然にコードされていないもしくは天然にコードされているアミノ酸に付加された任意の官能基もしくは置換基を介して、連結されていてもよい。代替的には、水溶性ポリマーは、天然に存在するアミノ酸（システイン、リジンまたはＮ末端残基のアミン基を含むが、これらに限定されない）を介して、天然にコードされていないアミノ酸を組み込むＩＬ−２ポリペプチドに連結される。いくつかの場合において、本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の非天然アミノ酸を含み、ここで、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマー（ＰＥＧおよび／またはオリゴ糖を含むが、これらに限定されない）に連結される。いくつかの場合において、本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の天然にコードされているアミノ酸をさらに含む。いくつかの場合において、本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結された１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸、および水溶性ポリマーに連結された１つ以上の天然に存在するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本発明において使用される水溶性ポリマーは、非抱合形態と比較して、ＩＬ−２ポリペプチドの血清半減期を増大させる。
【０４７５】
本発明のＩＬ−２ポリペプチドに連結される水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、変化した（増加または減少を含むが、これらに限定されない）薬理学的、薬物動態学的または薬力学的特性（インビボ半減期など）を提供するように、調節され得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２の半減期は、未修飾ポリペプチドの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍増加する。
【０４７６】
〔強い求核性基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体〕
本発明の一実施形態において、カルボニル含有の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に直接連結された末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。
【０４７７】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａである）である。
【０４７８】
いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意でカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、存在しても存在しなくてもよい。
【０４７９】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である。
【０４８０】
本発明の別の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に連結される末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。
【０４８１】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
の構造を有する：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａである）である。
【０４８２】
いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
の構造を有する：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意でカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、存在しても存在しなくてもよい。
【０４８３】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
の構造を有する：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である。
【０４８４】
本発明の別の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０〜４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５〜２０ｋＤａであり得る。
【０４８５】
本発明の別の実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ヒドラジンまたはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意でカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、存在しても存在しなくてもよい。
【０４８６】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド基含有ＰＥＧ誘導体は、
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意でＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である。
【０４８７】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン基含有ＰＥＧ誘導体は、
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意でＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である。
【０４８８】
水溶性ポリマーがＩＬ−２ポリペプチドに結合する程度および部位は、ＩＬ−２ポリペプチドのＩＬ−２受容体への結合を調節することができる。いくつかの実施形態において、当該結合は、約４００ｎＭ以下のＫｄ、１５０ｎＭ以下のＫｄでＩＬ−２ポリペプチドがＩＬ−２受容体に結合するように設定され、いくつかの場合においては、１００ｎＭ以下のＫｄでＩＬ−２ポリペプチドがＩＬ−２受容体に結合するように設定される。ここで、Ｋｄは、Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：７８６２−７８６７（１９８８）に記載されるように、平衡結合アッセイによって測定される。
【０４８９】
ポリマーの活性化ならびにペプチドの抱合のための方法および化学は、文献に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般的に使用される方法は、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハライド、トリクロロトリアジンなどを用いた官能基の活性化を含むが、これらに限定されない（R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991を参照のこと）。
【０４９０】
ＰＥＧの官能化および抱合に関するいくつかのレビューおよびモノグラフが利用可能である。例えば、Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)を参照のこと。
【０４９１】
ポリマーの活性化のための方法は、以下に見られ：ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８、およびＷＯ９３／１５１８９；活性化ポリマーと以下を含むがこれらに限定されない酵素との間の結合のための方法が、以下に見られる：凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)）。引用された参考文献および特許のすべてが、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４９２】
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、任意の好都合な方法によって、行われる。例えば、ＩＬ−２ポリペプチドは、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体を用いて、ＰＥＧ化される。簡単に述べると、過剰量の固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨを、撹拌しながら、室温でｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ含有ＩＬ−２ポリペプチドの水溶液に添加する。典型的には、水溶液は、反応が行われるｐＨ付近（一般に約ｐＨ４〜１０）のｐＫａを有する緩衝液を用いて、緩衝される。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例には、例えば、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳが含まれるが、これらに限定されない。ｐＨを連続的にモニターし、必要に応じて調整する。反応は、典型的には約１〜４８時間継続される。
【０４９３】
次いで、反応生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、ＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチド変異体を、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨおよびペグ化ＩＬ−２ポリペプチドの任意の高分子量複合体（これは、ブロックされていないＰＥＧが分子の両端で活性化される場合に形成され得る）から分離する。それによって、ＩＬ−２ポリペプチド変異体分子を架橋する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの間の状態は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムを通って流れるが、一方で、架橋されたＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチド変異体複合体は、１つ以上のＰＥＧ基に抱合された１つのＩＬ−２ポリペプチド変異体分子を含む所望の形態の後に溶出するような状態である。適切な条件は、所望の抱合物に対する架橋複合体の相対的なサイズに応じて変化し、当業者によって容易に決定される。所望の抱合物を含む溶出液を限外濾過により濃縮し、ダイアフィルトレーションにより脱塩する。
【０４９４】
実質的に精製されたＰＥＧ−ＩＬ−２は、上記に概説された溶出方法を使用して生成され得、生成されたＰＥＧ−ＩＬ−２は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％、またはそれ以上の純度レベルを有する。当該純度は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって、決定される。必要であれば、疎水性クロマトグラフィーから得られるＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチドは、以下を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の１つ以上の手順によって、さらに精製され得る：アフィニティークロマトグラフィー；アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥを使用するものを含むがこれに限定されない）；シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５を使用するものを含むがこれに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマトフォーカシング；置換クロマトグラフィー；電気泳動手順（分取等電点電気泳動を含むがこれに限定されない）；示差溶解度（硫酸アンモニウム沈殿を含むがこれに限定されない）；または抽出。見かけの分子量は、球状タンパク質標準（Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306）と比較することによって、ＧＰＣにより推定することができる。ＩＬ−２−ＰＥＧ抱合物の純度は、タンパク質分解（トリプシン切断を含むが、これに限定されない）と、続く質量分析とによって評価することができる。Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001)。
【０４９５】
本発明のＩＬ−２ポリペプチドのアミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、限定されることなく、さらに誘導体化または置換され得る。
【０４９６】
〔アジド含有ＰＥＧ誘導体〕
本発明の別の実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分と反応し得るアジド部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１〜１００ｋＤａの範囲、いくつかの実施形態においては１０〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有し得る。
【０４９７】
いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａである）である。
【０４９８】
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
の構造を有し得る：
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａである）である。
【０４９９】
本発明の別の実施形態において、アルキン含有アミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、末端アジド部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０〜４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５〜２０ｋＤａであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意でＯ、Ｎ、Ｓ、またはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、存在しても存在しなくてもよい。
【０５００】
〔アルキン含有ＰＥＧ誘導体〕
本発明の別の実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応し得るアルキン部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。
【０５０１】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａである）である。
【０５０２】
本発明の別の実施形態において、アルキン含有の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に連結される末端アジドまたは末端アルキン部分を含むＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。
【０５０３】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である。
【０５０４】
本発明の別の実施形態において、アジド含有アミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドは、末端アルキン部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体を用いて修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０〜４０ｋＤａの範囲のＭＷを有し、５〜２０ｋＤａであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
式中、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意でＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない。
【０５０５】
〔ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体〕
本発明の別の実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、天然にコードされていないアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分と反応し得るアリールホスフィン基をさらに含む活性官能基（エステル、カーボネートを含むが、これらに限定されない）を含むＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１〜１００ｋＤａの範囲、いくつかの実施形態においては１０〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有し得る。
【０５０６】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
【０５０７】
【化４６】
2022500035.tif 000049
【０５０８】
式中、ｎは１〜１０であり；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであり得るか、または存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。
【０５０９】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有し得る：
【０５１０】
【化４７】
2022500035.tif 000050
【０５１１】
式中、ＸはＯ、Ｎ、Ｓであり得るか、または存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキルおよび置換アリール基であり得る。例示的なＲ基には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（１〜３個のハロゲン、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基で置換されたアリールを含むが、これらに限定されない）、またはアリールアルキル基である。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、これらの基のうちの１つ以上が存在する場合に、Ｒ基の各々はそれぞれ独立して、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基として選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に結合する場合、それら窒素原子を用いて結合され得、５、６または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味するが、これらに限定されない。用語「アルキル」は、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含むがこれらに限定されない）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含むがこれらに限定されない）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを、置換基についての上記の議論から当業者は理解するであろう。
【０５１２】
（他のＰＥＧ誘導体および一般的なペグ化技術）
ＩＬ−２ポリペプチドに連結され得る他の例示的なＰＥＧ分子だけでなく、ペグ化の方法としては、限定されないが、例えば、本明細書において参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０００１８３８号；米国特許出願公開第２００２／００５２００９号；米国特許出願公開第２００３／０１６２９４９号；米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号；米国特許出願公開第２００３／０２２８２７４号；米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号；米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号；米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号；米国特許出願公開第２００３／０１０５２７５号；米国特許出願公開第２００３／０１０５２２４号；米国特許出願公開第２００３／００２３０２３号；米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号；米国特許出願公開第２００２／００９９１３３号；米国特許出願公開第２００２／００８６９３９号；米国特許出願公開第２００２／００８２３４５号；米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号；米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号；米国特許出願公開第２００２／００４００７６号；米国特許出願公開第２００２／００３７９４９号；米国特許出願公開第２００２／０００２２５０号；米国特許出願公開第２００１／００５６１７１号；米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号；米国特許第６，６４６，１１０号；米国特許第５，８２４，７７８号；米国特許第５，４７６，６５３号；米国特許第５，２１９，５６４号；米国特許第５，６２９，３８４号；米国特許第５，７３６，６２５号；米国特許第４，９０２，５０２号；米国特許第５，２８１，６９８号；米国特許第５，１２２，６１４号；米国特許第５，４７３，０３４号；米国特許第５，５１６，６７３号；米国特許第５，３８２，６５７号；米国特許第６，５５２，１６７号；米国特許第６，６１０，２８１号；米国特許第６，５１５，１００号；米国特許第６，４６１，６０３号；米国特許第６，４３６，３８６号；米国特許第６，２１４，９６６号；米国特許第５，９９０，２３７号；米国特許第５，９００，４６１号；米国特許第５，７３９，２０８号；米国特許第５，６７２，６６２号；米国特許第５，４４６，０９０号；米国特許第５，８０８，０９６号；米国特許第５，６１２，４６０号；米国特許第５，３２４，８４４号；米国特許第５，２５２，７１４号；米国特許第６，４２０，３３９号；米国特許第６，２０１，０７２号；米国特許第６，４５１，３４６号；米国特許第６，３０６，８２１号；米国特許第５，５５９，２１３号；米国特許第５，７４７，６４６号；米国特許第５，８３４，５９４号；米国特許第５，８４９，８６０号；米国特許第５，９８０，９４８号；米国特許第６，００４，５７３号；米国特許第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７号、ＥＰ２２９，１０８号、ＥＰ４０２，３７８号、ＷＯ９２／１６５５５号、ＷＯ９４／０４１９３号、ＷＯ９４／１４７５８号、ＷＯ９４／１７０３９号、ＷＯ９４／１８２４７号、ＷＯ９４／２８０２４号、ＷＯ９５／００１６２号、ＷＯ９５／１１９２４号、ＷＯ９５／１３０９０号、ＷＯ９５／３３４９０号、ＷＯ９６／０００８０号、ＷＯ９７／１８８３２号、ＷＯ９８／４１５６２号、ＷＯ９８／４８８３７号、ＷＯ９９／３２１３４号、ＷＯ９９／３２１３９号、ＷＯ９９／３２１４０号、ＷＯ９６／４０７９１号、ＷＯ９８／３２４６６号、ＷＯ９５／０６０５８号、ＥＰ４３９  ５０８号、ＷＯ９７／０３１０６号、ＷＯ９６／２１４６９号、ＷＯ９５／１３３１２号、ＥＰ９２１  １３１号、ＷＯ９８／０５３６３号、ＥＰ８０９  ９９６号、ＷＯ９６／４１８１３号、ＷＯ９６／０７６７０号、ＥＰ６０５  ９６３号、ＥＰ５１０  ３５６号、ＥＰ４００  ４７２号、ＥＰ１８３  ５０３号、およびＥＰ１５４  ３１６号に記載されるものが挙げられる。本明細書に記載されるＰＥＧ分子のいずれも、任意の形態（これらに限定されないが、単鎖、枝分かれ鎖、多腕鎖、単官能性、二官能性、多官能性、またはこれらの組み合わせが挙げられる）において使用され得る。
付加的なポリマー、および、これに限定されるものではないが、ヒドロキシルアミン（アミノオキシ）ＰＥＧ誘導体を含むＰＥＧ誘導体は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる以下の特許出願：米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号、米国仮特許出願第６０／７５５，３３８号；米国仮特許出願第６０／７５５，７１１号；米国仮特許出願第６０／７５５，０１８号；国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号；ＷＯ２００６／０６９２４６号；米国仮特許出願第６０／７４３，０４１号；米国仮特許出願第６０／７４３，０４０号；国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号；米国仮特許出願第６０／８８２，８１９号；米国仮特許出願第６０／８８２，５００号；および米国仮特許出願第６０／８７０，５９４号に説明されている。
【０５１３】
〔Ｘ．ＩＬ−２ポリペプチドのグリコシル化〕
本発明は、糖の残基を有する天然にコードされていないアミノ酸を１つ以上組み込んでいる、ＩＬ−２ポリペプチドを含む。糖の残基は、天然（限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンが挙げられる）、または非天然（限定されないが、３−フルオロガラクトースが挙げられる）のいずれかであり得る。糖は、Ｎ型もしくはＯ型のグリコシド結合（限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンが挙げられる）、あるいは非天然の結合（限定されないが、オキシムまたは対応するＣ型もしくはＳ型のグリコシドが挙げられる）のいずれかによって、天然にコードされていないアミノ酸に対して連結され得る。
【０５１４】
糖（限定されないが、グリコシルが挙げられる）部分は、インビボまたはインビトロにおいて、ＩＬ−２ポリペプチドに対して付加され得る。本発明のいくつかの実施形態では、カルボニルを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドは、アミノオキシ基で誘導体化された糖を用いて修飾されて、オキシム結合を介して対応するグリコシル化されたポリペプチドを生成する。天然にコードされていないアミノ酸に結合されると、糖は、ＩＬ−２ポリペプチドに結合されるオリゴ糖を生成するためのグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素を用いた処理によって、さらに合成され得る。例えば、H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)を参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態では、カルボニルを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製される所望の構造を有するグリカンを用いて、直接的に修飾される。当業者は、他の官能基（アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドが挙げられる）が、糖を天然にコードされていないアミノ酸に連結にするために使用され得ることを認識する。本発明のいくつかの実施形態では、アジドまたはアルキニルを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドは、次いで、限定されないが、それぞれアルキニル誘導体またはアジド誘導体を用いた、限定されないが、ヒュスゲン［３＋２］付加環化反応によって、修飾され得る。この方法は、タンパク質が非常に高い選択性で修飾されることを可能にする。
【０５１５】
〔ＸＩ．ＩＬ−２ダイマーおよびマルチマー〕
また、本発明は、ＩＬ−２およびＩＬ−２アナログの組み合わせ（例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマー（すなわち、トリマー、テトラマーなど））を提供する。ここで、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２は、別のそのＩＬ−２変異体、またはそのＩＬ−２変異体ではない任意の他のポリペプチドに、ポリペプチド骨格に直接的にか、またはリンカーを介して結合されている。モノマーと比べて増大した分子量に起因して、ＩＬ−２のダイマーまたはマルチマーの抱合物は、新たなまたは所望の特性（限定されないが、モノマーのＩＬ−２と比べて、異なる薬理学的、薬物動態学的、薬力学特性、調節された治療半減期、もしくは調節された血清中半減期が挙げられる）を示し得る。いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ−２のダイマーは、ＩＬ−２受容体のシグナル伝達を調節し得る。他の実施形態では、本発明のＩＬ−２のダイマーまたはマルチマーは、ＩＬ−２受容体のアンタゴニスト、アゴニストまたは調節因子として作用し得る。
【０５１６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２を含んでいるダイマーまたはマルチマー中に存在する１つ以上のＩＬ−２分子は、水溶性ポリマーに連結された天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチドは、限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介して、直接的に連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ポリペプチド、および／または連結された非ＩＬ−２分子は、二量体化を容易にするために異なる天然にコードされていないアミノ酸を含み得る（限定されないが、第１のＩＬ−２ポリペプチドの１つの天然にコードされていないアミノ酸におけるアルキンおよび第２の分子の第２の天然にコードされていないアミノ酸におけるアジドは、ヒュスゲン［３＋２］付加環化を介して抱合され得ることが挙げられる）。代替可能に、ケトンを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２、および／または連結された非ＩＬ−２分子は、ヒドロキシルアミンを含んでいる天然にコードされていないアミノ酸を含んでいる第２のポリペプチドに抱合され得る。ポリペプチドは、対応するオキシムの形成を介して反応させられる。
【０５１７】
代替可能に、２つのＩＬ−２ポリペプチド、および／または非ＩＬ−２分子は、リンカーを介して連結される。任意のヘテロ−またはホモ−二官能性リンカーが使用されて、同じか、または異なる１次配列を有し得る２つの分子、および／または非ＩＬ−２分子を連結する。いくつかの場合では、ＩＬ−２、および／または連結された非ＩＬ−２分子を繋ぐためにともに使用されるリンカーは、二官能性のＰＥＧ試薬であり得る。リンカーは、広範囲の分子量または分子長を有し得る。より高分子量またはより低分子量のリンカーは、ＩＬ−２と連結された全体との間、またはＩＬ−２とその受容体との間、またはもしあれば連結された全体とその結合パートナーとの間における所望の空間的関係ならびに立体配置を提供するために使用され得る。また、より長い分子長または短い分子長を有するリンカーは、ＩＬ−２と連結された全体との間、またはもしあれば連結された全体とその結合パートナーとの間における所望の空間または柔軟性を提供するために使用され得る。
【０５１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にアジド、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはカルボニルを含んでいる部分；およびｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも１つの第２の官能基を含むダンベル構造を有する水溶性の二官能性のリンカーを提供する。第２の官能基は、第１の官能基と同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の官能基は、第１の官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、本発明は、枝分かれ分子構造の少なくとも１つのアームを含む水溶性化合物を提供する。例えば、枝分かれ分子構造は、樹状であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
を有する水溶性活性化ポリマーとの反応によって形成される１つ以上のＩＬ−２ポリペプチドを含んでいるマルチマーを提供する。ここで、ｎは約５〜３０００であり、ｍは２〜１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、またはカルボニルを含んでいる部分であり得、Ｒは、Ｘと同じであるか、または異なるキャッピング基、官能基、もしくは脱離基である。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネート、１−ベンゾイミダゾリルカルボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、およびケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
【０５１９】
〔ＸＩＩ．ＩＬ−２受容体に対するＩＬ−２ポリペプチド活性およびＩＬ−２ポリペプチドの親和性の測定〕
ＩＬ−２ポリペプチド活性は、標準的なまたは公知のインビトロもしくはインビボのアッセイを用いて測定され得る。ＰＥＧ−ＩＬ−２は、当該分野において公知の好適な方法によって生物学的活性について分析され得る。そのようなアッセイとしては、限定されないが、ＩＬ−２応答性遺伝子の活性化、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイ、細胞変性作用阻害アッセイ、抗増殖性アッセイ、免疫調節性アッセイ、およびＭＨＣ分子の誘導をモニターするアッセイが挙げられる。
【０５２０】
ＰＥＧ−ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２感受性シグナル伝達経路を活性化するそれらの能力について分析され得る。一例は、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）アッセイである。ＩＬ−２受容体を恒常的に発現する細胞を、ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼベクター（ｐＩＳＲＥ−ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で一過性にトランスフェクションする。トランスフェクション後、細胞をＩＬ−２ポリペプチドで処理する。多数のタンパク質濃度（例えば、０．０００１〜１０ｎｇ／ｍＬ）を試験して、投与−応答曲線を生成する。ＩＬ−２ポリペプチドが結合し、ＩＬ−２受容体を活性化すると、得られたシグナル伝達カスケードはルシフェラーゼ発現を誘導する。ルミネセンスは、ＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭまたはＦｕｓｉｏｎＴＭマイクロプレートリーダーおよびＳｔｅａｄｙ−ＧｌｏＲルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって、多数の方法で測定できる。
【０５２１】
ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２受容体に結合する能力について分析され得る。非天然アミノ酸を含んでいる非ＰＥＧ化またはＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチドについて、その受容体に対するＩＬ−２の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することによって測定され得る。適切な結合アッセイとしては、限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)）およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）が挙げられる。
【０５２２】
ＩＬ−２ポリペプチドを作製するためにどの方法が使用されるかにかかわらず、ＩＬ−２ポリペプチドは、生物学的活性についてのアッセイに供される。一般に、生物学的活性の試験は、生物学的活性の増加または減少（修飾されたＩＬ−２と比較して）、異なる生物学的活性（修飾されたＩＬ−２と比較して）、受容体もしくは結合パートナーの親和性分析、ＩＬ−２自体もしくはその受容体の立体配座もしくは構造の変化（修飾されたＩＬ−２と比較して）、または血清半減期分析などの所望の結果についての分析を提供すべきである。
【０５２３】
〔ＸＩＩＩ．力価、機能的インビボ半減期および薬物動態パラメータの測定〕
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのポリペプチドの抱合を有するまたは有さないＩＬ−２ポリペプチドのコンストラクションによって得られる延長された生物学的半減期である。ＩＬ−２ポリペプチド血清濃度の急速な投与後の減少は、抱合されたおよび抱合されていないＩＬ−２ポリペプチドおよびその変異体を用いた治療に対する生物学的応答を評価することを重要にした。本発明の抱合されたおよび抱合されていないＩＬ−２ポリペプチドおよびその変異体は、例えば、皮下または静脈内（i.v.）投与による投与後にも、延長された血清半減期を有し得、例えば、ＥＬＩＳＡ法または一次スクリーニングアッセイによって測定することを可能にする。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの市販のＥＬＩＳＡまたはＲＩＡキットを使用してもよい。インビボの生物学的半減期の測定は、本明細書中に記載されるように行われる。
【０５２４】
天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドの効力および機能的なインビボの半減期は、当業者に公知のプロトコルに従って決定され得る。
【０５２５】
天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドの薬物動態パラメータは、通常のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（治療群当たりＮ＝５匹の動物）において評価することができる。動物は、２５ｕｇ／ラット静脈内または５０ｕｇ／ラット皮下（sc）のいずれかの単回用量を受け、約５〜７個の血液サンプルが予め定義された時間経過に従って採取され、一般に、水溶性ポリマーに抱合されていない天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドについては約６時間、天然にコードされていないアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに抱合されているＩＬ−２ポリペプチドについては約４日カバーする。天然にコードされていないアミノ酸を有していないＩＬ−２についての薬物動態データは、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＩＬ−２ポリペプチドについて得られたデータと直接比較することができる。
【０５２６】
〔ＸＩＶ．投与および薬学的組成物〕
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（限定されないが、ＩＬ−２、シンセターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質などが挙げられる）は、任意に、治療用途（限定されないが、適切な薬学的担体との組み合わせが挙げられる）に使用される。このような組成物は、例えば、治療有効量の化合物、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。そのような担体または賦形剤としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。製剤は、投与様式に適合するように作製される。一般に、タンパク質を投与する方法は当業者に公知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。組成物は、薬学的に許容される塩として存在するような水溶性形態であってもよく、これは酸付加塩および塩基付加塩の両方を含むことを意味する。
【０５２７】
本発明の１つ以上のポリペプチドを含んでいる治療組成物は、当業者に公知の方法に従って、疾患の１つ以上の適切なインビトロおよび／またはインビボの動物モデルにおいて任意に試験され、効力、組織代謝を確認し、投薬量を推定する。特に、投与量は、最初に、天然アミノ酸ホモログに対する本明細書中の非天然アミノ酸の活性、安定性、または他の適切な尺度（限定されないが、１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＩＬ−２ポリペプチドと天然アミノ酸ＩＬ−２ポリペプチドとの比較、および１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＩＬ−２ポリペプチドと現在利用可能なＩＬ−２処置との比較が挙げられる）によって、すなわち、関連するアッセイにおいて決定され得る。
【０５２８】
投与は、血液または組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、任意の適切な様式で、任意に、１つ以上の薬学的に許容可能な担体とともに投与される。本発明の文脈において、このようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であり、２つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、しばしば別の経路よりもより迅速かつより有効な作用または反応を提供し得る。
【０５２９】
薬学的に許容可能な担体は、部分的には投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の広範な適切な製剤が存在する。
【０５３０】
本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドに適切な任意の従来の経路（限定されないが、非経口、例えば、注射（限定されないが、皮下もしくは静脈内、または任意の他の形態の注射もしくは注入が挙げられる）が挙げられる）によって投与され得る。ポリペプチド組成物は、多くの経路（限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸手段が挙げられる）によって投与され得る。また、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、リポソームを介して投与され得る。このような投与経路および適切な製剤は、当業者に一般的に知られている。ＩＬ−２ポリペプチドは、単独で、または他の適切な成分（薬学的担体など）と組み合わせて使用され得る。ＩＬ−２ポリペプチドは、他の剤または治療薬と組み合わせて使用され得る。
【０５３１】
また、非天然アミノ酸を単独で、または他の適切な成分と組み合わせて含むＩＬ−２ポリペプチドは、吸入を介して投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧化」され得る）に作製され得る。エアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴射剤に入れることができる（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）。
【０５３２】
例えば、関節内（intraarticular）（関節内（in the joints））、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適した製剤としては、水溶性および非水溶性の等張性の滅菌注射溶液が挙げられる。溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水溶性および非水溶性の滅菌懸濁液を含み得る。ＩＬ−２の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量密の密封容器中にあり得る。
【０５３３】
非経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。特に、天然アミノ酸ホモログ治療に既に使用されている投与経路（限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、例えばＩＬ−２、インターロイキン、抗体、ＦＧＦ、および／または任意の他の薬学的に送達されるタンパク質に典型的に使用されるものが挙げられる）は、現在使用されている製剤と共に、本発明のポリペプチドのための好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０５３４】
本発明の文脈において、患者に投与される用量は、用途に依存して、経時的な患者における有益な治療応答、または他の適切な活性を有するのに十分である。用量は、特定のベクターまたは製剤の効力、および使用される非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性、または血清半減期、および患者の状態、ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定される。また、用量のサイズは、特定の患者における特定のベクター、製剤などの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
【０５３５】
疾患（限定されないが、好中球減少症、再生不良性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、Ｃｈｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄線維症など）の治療または予防において投与されるベクターまたは製剤の有効量の決定において、医師は、循環血漿レベル、製剤毒性、疾患の進行、および／または関連する場合は抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０５３６】
例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、典型的には現在使用されている治療用タンパク質の用量と同等の範囲であり、関連する組成物の変化した活性または血清半減期について調整される。本発明のベクターまたは薬学的製剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、生物学的応答修飾因子などを含む、任意の公知の従来の治療によって、治療状態を補うことができる。
【０５３７】
投与について、本発明の製剤は、関連する製剤のＬＤ−５０またはＥＤ−５０によって決定される速度で、および／または非天然アミノ酸ポリペプチドの任意の副作用の観察によって、様々な濃度で投与される（限定されないが、患者の体重および全体的な健康に適用されるものが挙げられる）。投与は、単回用量または分割用量を介して達成され得る。
【０５３８】
製剤の注入を受けている患者が発熱、悪寒、または筋肉痛を発現した場合、適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の疼痛／発熱制御薬を投与される。発熱、筋肉痛、悪寒などの注入に対する反応を経験する患者には、アスピリン、アセトアミノフェン、または限定されないが、ジフェンヒドラミンのいずれかを今後の注入の３０分前に前投薬する。メペリジンは、解熱薬および抗ヒスタミン薬にすぐに反応しない、より重度の悪寒および筋肉痛に用いられる。細胞注入は、反応の重篤度に依存して、遅くされるか、および中断される。
【０５３９】
本発明のヒトＩＬ−２ポリペプチドは、哺乳動物被験体に直接投与され得る。投与は、ＩＬ−２ポリペプチドを被験体に導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の実施形態に係るＩＬ−２ポリペプチド組成物には、経口、直腸、局所、吸入（限定されないが、エアロゾルを介するものが挙げられる）、口腔（限定されないが、舌下が挙げられる）、膣、非経口（限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、inracerebral、動脈内、または静脈内が挙げられる）、局所（すなわち、皮膚および気道表面を含む粘膜表面の両方）、肺、眼内、鼻腔内、および経皮投与が含まれるが、任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療される状態の性質および重篤度に依存し得る。投与は、局所または全身のいずれかであり得る。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器中にあり得る。本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体との単位投薬の注射可能な形態（限定されないが、溶液、懸濁液、またはエマルジョンが挙げられる）の混合物において調製され得る。また、本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、連続注入（限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプが挙げられる）、単一ボーラス、または徐放性デポー製剤によって投与され得る。
【０５４０】
投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁液を含み得る水性および非水性溶液、等張性の滅菌溶液を含む。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０５４１】
凍結乾燥は、目的のタンパク質調製物から水を除去するのに役立つタンパク質を与えるために一般に使用される技術である。凍結乾燥（Freeze-drying）または凍結乾燥（lyophilization）は、乾燥される材料が最初に凍結され、次いで氷または凍結溶媒が真空環境中での昇華によって除去されるプロセスである。凍結乾燥プロセス中の安定性を高めるため、および／または貯蔵時の凍結乾燥された製品の安定性を改善するために、賦形剤は、予め凍結乾燥された製剤に含まれていてもよい。Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)およびArakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)。
【０５４２】
医薬の噴霧乾燥もまた、当業者に公知である。例えば、Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)を参照のこと。Ｉｎｄ．。Ｐｈａｒｍ，１８（１１および１２），１１６９−１２０６（１９９２）。小分子医薬に加えて、種々の生物学的物質が噴霧乾燥されており、これらには、酵素、血清、血漿、微生物、および酵母が含まれる。噴霧乾燥は、液体医薬調製物を、１工程のプロセスで、微細な、粉塵のない、または凝集した粉末に変換することができるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの工程：ａ）スプレーへの供給溶液の霧化；ｂ）噴霧−空気接触；ｃ）噴霧の乾燥；およびｄ）乾燥させた生成物の乾燥空気からの分離を含む。本明細書中に参照として組み込まれる米国特許第６，２３５，７１０号および米国特許第６，００１，８００号には、噴霧乾燥による組み換えエリスロポエチンの調製が記載されている。
【０５４３】
本発明の医薬組成物および製剤は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含み得る。薬学的に許容可能な担体は、部分的には投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物（任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含む）の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)を参照のこと）。
【０５４４】
好適な担体としては、限定されないが、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩、他の有機酸を含んでいる緩衝剤；抗酸化剤（限定されないが、アスコルビン酸が挙げられる）；低分子量ペプチド（限定されないが、約１０残基未満のペプチド）；タンパク質（限定されないが、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンが挙げられる）；親水性ポリマー（限定されないが、ポリビニルピトリドンが挙げられる）：アミノ酸（限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、またはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸塩、またはリジンが挙げられる）；単糖類、二糖類、他の炭水化物（限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデト酸二ナトリウムが挙げられる）；二価金属イオン（限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅が挙げられる）；糖アルコール(限定されないが、マンニトールまたはソルビトールが挙げられる）；塩形成対イオン（限定されないが、ナトリウムおよび塩化ナトリウム）；充填剤（微晶質のセルロース、ラクトース、トウモロコシ、および他のデンプンなど）；結合剤；甘味料および他の香味剤；着色剤；ならびに／または非イオン性界面活性剤（限定されないが、ＴｗｅｅｎＴＭ（Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）が挙げられる）、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、および他のプルロニック酸（限定されないが、プルロニック酸Ｆ６８（ポロキサマー（poloxamer）１８８）、またはＰＥＧが挙げられる）が挙げられる。好適な界面活性剤としては、例えば、限定されないが、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（すなわち、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ））、もしくはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、またはそれらの組み合わせをベースとするポリエーテルが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、Ｒ−ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ、およびＲ−ＴｅｔｒｏｎｉｃｓＴＭ（BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.）という商品名で市販されており、さらに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２０，３５２号に記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、適切な界面活性剤であり得る。１つ以上のストレス（限定されないが、攪拌から生じるストレスが挙げられる）に対してＰＥＧ化ＩＬ−２を安定化させるために、界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを使用してもよい。上記のいくつかは、「増量剤」と呼ばれ得る。いくつかは「張性修飾剤」とも呼ばれ得る。抗菌防腐剤はまた、製品の安定性および抗菌有効性のために適用することができる；適切な防腐剤としては、限定されないが、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン、クレゾール、およびフェノール、またはそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書中に参照によって組み込まれる米国特許第７，１４４，５７４号には、本発明の医薬組成物および製剤ならびに他の送達調製物において適切であり得るさらなる材料が記載されている。
【０５４５】
本発明のＩＬ−２ポリペプチド（ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されたものを含む）はまた、持続性放出系によって、またはその一部として投与され得る。持続性組成物としては、限定されないが、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス（限定されないが、フィルムまたはマイクロカプセルが挙げられる）が挙げられる。持続性放出マトリックスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)、エチレン酢酸ビニル（Langer et al.、上記）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）、ポリ乳酸（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１号）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコグリコリド（酪酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなど）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンなどの生体適合性材料が含まれる。持続性組成物はまた、リポソーム的に捕捉された化合物を含む。化合物を含んでいるリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１号；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；ＥＰ５２，３２２号；ＥＰ３６，６７６号；米国特許第４，６１９，７９４号；ＥＰ１４３，９４９号；米国特許第５，０２１，２３４；日本国特許出願８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４号。引用された全ての参考文献および特許文献は、本明細書中に参照として組み込まれる。
【０５４６】
リポソーム的に捕捉されたＩＬ−２ポリペプチドは、例えば、ＤＥ３，２１８，１２１号；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；ＥＰ５２，３２２号；ＥＰ３６，６７６号；米国特許第４，６１９，７９４号；ＥＰ１４３，９４９号；米国特許第５，０２１，２３４号；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４号に記載されている方法によって調製され得る。リポソームの組成およびサイズは、周知であるか、または当業者によって経験的に容易に決定され得る。リポソームのいくつかの実施例は、例えば、Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)に記載されている。引用された全ての参考文献および特許文献は、本明細書中に参照として組み込まれる。
【０５４７】
本発明の文脈において、患者に投与される用量は、経時的に被験体に有益な応答を引き起こすのに十分であるべきである。一般に、用量当たり非経口的に投与される本発明のＩＬ−２ポリペプチドの総薬学的効果的な量は、患者体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは治療の裁量に従う。この実施形態の特定の態様において、抱合物は、１日当たり４μｇ／ｋｇ超〜１日当たり約２０μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。さらに他の態様では、抱合物は、１日当たり４μｇ／ｋｇ超〜１日当たり約９μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。さらに他の態様において、抱合物は、１日当たり約４μｇ／ｋｇ〜１日当たり約１２．５μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。特定の態様では、抱合物は、過度の毒性なしに許容される最大用量である用量以下で投与され得る。さらに、抱合物は、週に少なくとも２回投与され得るか、または抱合物は、週に少なくとも３回、週に少なくとも４回、週に少なくとも５回、週に少なくとも６回、もしくは週に７回投与され得る。特定の態様では、抱合物が２回以上投与される場合、抱合物が毎回１日当たり４μｇ／ｋｇを超える用量で投与され得る。特に、抱合物は、２週間以上の期間にわたって投与され得る。特定の態様では、インターロイキン−２受容体の発現細胞の増殖は、参照サンプル（すなわち、本発明の抱合物と接触しない細胞のサンプル）と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％まで、または少なくとも９９％まで阻害され得る。この実施形態の特定の態様では、抱合物は、１日当たり約５．３μｇ／ｋｇの用量で、または１日当た当たり約７．１μｇ／ｋｇの用量で、または１日当たり約９．４μｇ／ｋｇの用量で、または約１日当たり約１２．５μｇ／ｋｇの用量で投与され得る。また、投薬の頻度は、治療の裁量に従い、ヒトにおける使用のために認可された市販のＩＬ−２ポリペプチド製品よりもより頻繁であり得るか、またはより頻度が少なくあり得る。一般に、本発明のＩＬ−２ポリペプチド、ＰＥＧ化ＩＬ−２ポリペプチド、抱合ＩＬ−２ポリペプチド、またはＰＥＧ化抱合ＩＬ−２ポリペプチドは、上述の投与の経路のいずれかによって投与され得る。
【０５４８】
〔ＸＶ．本発明のＩＬ−２ポリペプチドの治療的使用〕
本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、広範囲の障害を治療するのに有用である。また、本発明は、ＩＬ−２、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激、および／またはＩＬ−２製剤に応答する癌の危険性がある、癌を有する、および／または癌を有している哺乳動物を治療する方法を含む。ＩＬ−２ポリペプチドの投与は、短期間の効果、すなわち観察されるいくつかの臨床パラメータに対する即時の有益な効果をもたらし得、これは投与から１２または２４時間であり得、一方、長期間の効果、腫瘍増殖の進行の有益な遅延、腫瘍の大きさの減少、ならびに／または循環ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルの増加ももたらし得、本発明のＩＬ−２ポリペプチドは、当業者に公知の任意の手段によって投与され得、有益には、注入（例えば、所望の薬理学的効果を得るために充分な用量で、動脈、腹腔内、または静脈内の注射および／もしくは注入）によって投与され得る。
【０５４９】
ＩＬ−２ポリペプチドの用量は、治療当たり体重１ｋｇ当たり１０〜２００ｍｇ、または４０〜８０ｍｇのＩＬ−２ポリペプチドの範囲であり得る。例えば、投与されるＩＬ−２ポリペプチドの用量は、ボーラス注射として、および／または臨床的に必要な期間（例えば、数分〜数時間（例えば、２４時間まで））の注入として与えられる、体重１ｋｇ当たり約２０〜１００ｍｇのＩＬ−２ポリペプチドであり得る。必要であれば、ＩＬ−２ポリペプチドの投与を１回または数回繰り返してもよい。ＩＬ−２ポリペプチドの投与は、化学療法剤などの他の医薬品の投与と組み合わせてもよい。さらに、本発明は、それを必要とする被験体に有効量のＩＬ−２ポリペプチドを投与することを含む、癌の予防および／または治療のための方法に関する。
【０５５０】
ＩＬ−２の平均量は、様々であってよく、特に、資格のある医師の推奨および処方に基づくべきである。ＩＬ−２の正確な量は、治療される状態の正確なタイプ、治療される患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの因子に従う選好の問題である。本発明はまた、治療有効量の別の活性剤の投与を提供する。与えられるべき量は、ＩＬ−２を用いた治療に基づいて当業者によって容易に決定され得る。
【０５５１】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明を説明するために提示されるが、特許請求の範囲に記載の発明を制限するものではない。
【０５５２】
実施例１−非天然アミノ酸を組み込むためにアンバー終止コドンに変異させるＩＬ−２中の残基位置の決定。
【０５５３】
ＩＬ−２は、腎細胞癌および転移性黒色腫などのいくつかの癌の治療に使用されている。商業的に入手可能なＩＬ−２であるＡｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、グリコシル化されていない組み換えタンパク質であり、除去されたアラニン−１、およびセリン−１２５によって置換された残基システイン−１２５を有する（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら、Ｄｒｕｇｓ、４６（３）：ｐｐ：４４６−５１４（１９９３））。ＩＬ−２は癌治療において最も初期にＦＤＡに承認されたサイトカインであるが、高用量で使用された場合にＩＬ−２は重度の副作用を示すことが示されている。これにより、潜在的な患者への適用は大幅に制限された。重度の副作用の根底にある機構は、ＩＬ−２がその受容体の１つであるＩＬ−２Ｒαに結合することに起因している。一般にＩＬ−２は、３つの受容体すべてが組織中に存在する場合には、ＩＬ−２Ｒα（またはＣＤ２５）、ＩＬ−２Ｒβ（またはＣＤ１２２）およびＩＬ−２Ｒγ（またはＣＤ１３２）を含むその受容体とのヘテロ三量複合体を形成することができるだけでなく、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγとのヘテロ二量複合体を形成することもできる。臨床状況において、高用量のＩＬ−２が使用されると、ＩＬ−２はＩＬ−２αβγに結合し始めるが、これはＴｒｅｇ細胞の主要な受容体の形態である。Ｔｒｅｇ細胞の抑制効果は、癌免疫療法におけるＩＬ−２適用の望ましくない効果を引き起こす。ＩＬ−２の副作用を軽減するために、多くのアプローチがこれまで採用されてきた。主要なブレークスルーの１つは、６個のＰＥＧ化リジンを使用してＩＬ−２表面上のＩＬ２Ｒα結合領域をマスクする、Ｎｅｋｔａｒからの発明である（Ｃｈａｒｙｃｈら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２２（３）：ｐｐ：６８０−９０（２０１６））。ＰＥＧ化ＩＬ−２は、半減期が延長されているだけでなく、劇的に減少した副作用も示した。しかしながら、活性研究からの結果は、この不均質な６−ＰＥＧ化ＩＬ−２混合物におけるＰＥＧ化ＩＬ−２の有効な形態は、単一のＰＥＧ化形態のみであることを示した。したがって、均一な産物を有するより有効なＰＥＧ化ＩＬ−２が必要とされる。
【０５５４】
本出願において、組み込まれた非天然アミノ酸は、ＩＬ−２ＰＥＧ化において使用される独特の抱合部位を提供する。得られたＰＥＧ化ＩＬ−２突然変異タンパク質は、Ｎｅｋｔａｒからのこれまでは不均一であった６−ＰＥＧ化ＩＬ−２ではなく、均一な産物を有する。
【０５５５】
ＩＬ−２突然変異タンパク質の生成に使用される部位は、ＩＬ−２およびそのヘテロ三量受容体の既存の結晶構造を分析することによって、選択することができる。具体的には、ＩＬ−２ＲαおよびそのＩＬ−２との界面の構造を詳細に調べた（図１）。界面は、疎水性中心および分極領域を含む２つの領域に分割されている。疎水性中心は、ＩＬ−２Ｒαの残基Ｌｅｕ−２α、Ｍｅｔ−２５α、Ｌｅｕ−４２α、およびＴｙｒ−４３αと、ＩＬ−２の残基Ｐｈｅ−４２ＩＬ−２、Ｐｈｅ−４４ＩＬ−２、Ｔｙｒ−４５ＩＬ−２、Ｐｒｏ−６５ＩＬ−２、およびＬｅｕ−７２ＩＬ−２との間に形成される。分極領域は、Ｌｙｓ−３８α／Ｇｌｕ−６１ＩＬ−２、Ａｒｇ−３６α／Ｇｌｕ−６２ＩＬ−２、Ｇｌｕ−１α／Ｌｙｓ−３５ＩＬ−２、Ａｓｐ−６α／Ａｒｇ−３８ＩＬ−２、およびＧｌｕ−２９α／Ｌｙｓ−４３を含むＩＬ−２ＲαとＩＬ−２との５つのイオン対の間に形成される。さらに、静電マッピングは、いくつかの他の残基がＩＬ−２ＲαとＩＬ−２との間の相互作用を媒介する役割を果たし得ることを示唆した。これらの残基は、Ｔｈｒ−３７ＩＬ−２、Ｔｈｒｅ−４１ＩＬ−２、Ｌｙｓ−６４ＩＬ−２、Ｇｌｕ−６８ＩＬ−２、およびＴｙｒ−１０７ＩＬ−２である。したがって、使用できる部位は、Ｐｈｅ−４２ＩＬ−２、Ｐｈｅ−４４ＩＬ−２、Ｔｙｒ−４５ＩＬ−２、Ｐｒｏ−６５ＩＬ−２、Ｌｅｕ−７２ＩＬ−２、Ｇｌｕ−６１ＩＬ−２、Ｇｌｕ−６２ＩＬ−２、Ｌｙｓ−３５ＩＬ−２、Ａｒｇ−３８ＩＬ−２、Ｌｙｓ−４３ＩＬ−２、Ｔｈｒ−３７ＩＬ−２、Ｔｈｒ−３ＩＬ−２、Ｌｙｓ−６４ＩＬ−２、Ｇｌｕ−６８ＩＬ−２、およびＴｙｒ−１０７ＩＬ−２である。非天然アミノ酸を有する突然変異タンパク質を産生するために使用されるタンパク質配列のリストを、以下の表２に列挙する：
【０５５６】
【表２】
2022500035.tif 000051
【０５５７】
実施例２：ヒトＩＬ−２発現系
この項では、非天然アミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドに使用される発現方法を記載する。宿主細胞は、直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、およびＩＬ−２ポリペプチドをコードする配列番号４、６もしくは８にあるようなポリヌクレオチド、またはセレクターコドンを含む、配列番号１、２、３、５、７、および９〜２３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのための構築物を用いて、形質転換される。
【０５５８】
大腸菌発現ベクター構築および配列検証：この実施例は、大腸菌における、天然にコードされていないアミノ酸を含むヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のクローニングおよび発現を詳述する。すべてのヒトＩＬ−２発現プラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用する組み換えベースのクローニング方法によって、または、以下に記載するように、大腸菌ＮＥＢ５αクローニング株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）においてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用することによって、のいずれかにより、構築された。大腸菌発現プラスミドを図２に示す。
【０５５９】
Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ドナー断片を含む様々な目的遺伝子（ＧＯＩ）を増幅するためのプライマーは、その５’末端に、相同組み換えのためのアクセプターベクター配列との約１８〜２４塩基対（ｂｐ）の重複配列を有し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で合成された。ＰＣＲ断片は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼミックス、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号：６００８５２、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、増幅された。ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ１制限酵素（ＮＥＢ＃Ｒ０１７６Ｌ）を用いて、３７℃で２時間消化され、プラスミドバックグラウンドを除去し、次いでＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラム精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ；＃２８１０４）を使用してカラム精製され、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量された。アクセプターベクターは、業者の推奨温度で３〜５時間、ベクター内に特有の制限酵素（ＮＥＢ、ＭＡ）を用いて消化することによって直鎖化し、ＰＣＲカラムで精製し、定量した。ドナー挿入物および適切に調製されたアクセプターベクターは、３：１のモル比で混合され、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｋｉｔ（ＮＥＢ＃Ｅ２６１１Ｓ）を使用して、５０℃で１５分間インキュベートされ、次いで大腸菌ＮＥＢ５α株（ＮＥＢ＃２９８７）への形質転換に使用された。
【０５６０】
組み換え物は、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙミックスをプレーティングすることによって回収した。翌日、４〜６ウェルで単離された単一コロニーを５ｍＬのＬＢ＋５０μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号Ｋ０２５４）培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。ＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＃２７１０４）を使用して組み換えプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により検証した。完全なＧＯＩ領域＋１００ｂｐ上流および１００ｂｐ下流配列を、遺伝子特異的配列決定プライマーを使用することにより、検証した。
【０５６１】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  （ＱＣＭ）：ＴＡＧ終止コドンを含有するすべてのアンバー変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃２０１５１９）を使用して、作製した。ＱＣＭオリゴヌクレオチドはすべて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計され、ＩＤＴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から注文された。ＱＣＭ  ＰＣＲミックスは、５μｌの１０×緩衝液、２．５μｌのｄＮＴＰミックス、１μｌ（１００ｎｇ）のプラスミド鋳型、１μｌのオリゴミックス（各濃度１０ｕＭ）、１μｌのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ酵素、２．５μｌのＱｕｉｃｋ溶液、および３７μｌの蒸留水（ＤＷ）を含有した。ＤＮＡを、キットによって推奨されるＰＣＲプログラムを使用して、１８サイクルのみ増幅した。
【０５６２】
ＰＣＲ反応の完了後、混合物を、キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に付属のＤｐｎＩ酵素を用いて、３７℃で２〜３時間消化し、ゲル上で泳動して、増幅されたＰＣＲ産物の存在を確認した。その後、２．５〜５μｌのＰＣＲ産物を大腸菌ＮＥＢ５α株に形質転換した。次いで、４〜６個のコロニーからの組み換えプラスミドを単離し、上記Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙの項に記載されたようにして、配列を検証した。
【０５６３】
発現株（ＡＸＩＤ）構築および検証：ＡＸＩＤ産生株を調製するために、化学的に形質転換受容性の大腸菌Ｗ３１１０Ｂ６０宿主細胞を、配列が検証されたプラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ）を用いて形質転換し、組み換え細胞を、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｋ０２５４）を含有する２×ＹＴ＋１％グルコース寒天プレート上で選択し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、新鮮な形質転換プレートからの単一コロニーを、５０μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンを含有する２×ＹＴ＋１％グルコース寒天プレート上で、連続した三回のストリーキングおよび３７℃で一晩のインキュベートにより３回増殖させた。最後に、３回目にストリーキングしたプレートからの単一のコロニーを、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｋ０２５４）を含有する２０ｍＬのＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ−ＯｐｔｉｇｒｏｗＴＭ、＃ＢＰ１４３２−１０Ｂ１）に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次いで、一晩培養した培養物をグリセロールで希釈して、最終的なグリセロール濃度を２０％（ｗ／ｖ）にした（ＫＩＣ、Ｒｅｆ＃６７７９０−ＧＬ９９ＵＫ）。次いで、この細胞懸濁液を、１ｍｌのアリコートに分注して、いくつかのクライオバイアルに入れ、ＡＸＩＤ産生株バイアルとして−８０℃で凍結した。
【０５６４】
上記のようにしてＡＸＩＤ産生株のグリセロールバイアルを作製した後、それらをＤＮＡ配列決定および抗生物質耐性マーカーの表現型特性決定によって、さらに検証した。ＡＸＩＤ産生株バイアルが産生宿主中に正しいプラスミドを有することを確認するために、プラスミドの配列を検証した。５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを含有する２０ｍＬのＬＢに、ＡＸＩＤクローンのグリセリンバイアルからのスタブを接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（＃２７１０４）を使用してプラスミドＤＮＡを単離し、単離したプラスミドにおける完全なＧＯＩ  ＯＲＦの存在を、ＤＮＡ配列決定（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）によって、確認した。
【０５６５】
ＡＸＩＤ産生株の株遺伝子型をさらに検証するために、同じバイアルからの細胞を、ＬＢの４つの別々のプレート上にストリーキングした：５０ｕｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを含有するＬＢ、１５ｕｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ、３４ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ、および７５ｕｇ／ｍＬのトリメトプリムを含有するＬＢ。次いで、Ｗ３１１０Ｂ６０産生宿主株の株遺伝子型で期待されるように、これらのプレートのすべてで正増殖を確認した。
【０５６６】
発現系：アミノ酸および大腸菌−コドンを最適化したｈＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列を表１および２に示す。直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を含む導入翻訳系を用いて、天然にコードされていないアミノ酸を含むｈＩＬ−２を発現させる（プラスミドマップｐＫＧ０２６９；図２を参照のこと）。Ｏ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸を用いて、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。次いで、翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応答して、天然にコードされていないアミノ酸をＩＬ−２またはＩＬ−２変異体に挿入する。適切なＯ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡ配列は、以下に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されたＷＯ２００６／０６８８０２、および「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されたＷＯ２００７／０２１２９７。
【０５６７】
修飾されたＩＬ−２変異体ポリヌクレオチド配列および直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡペア（所望の天然にコードされていないアミノ酸に特異的）を含有するプラスミドを用いた大腸菌の形質転換は、ＩＬ−２ポリペプチドへの天然にコードされていないアミノ酸の部位特異的組み込みを可能にする。ＩＬ−２変異体ポリペプチドの発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、そして培地中のアラビノースの添加によって誘導される（プラスミドマップｐＫＧ０２６９；図２を参照のこと）。
【０５６８】
パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を用いた抑制：ＩＬ−２ポリペプチド発現のためのプラスミドをＷ３１１０Ｂ６０大腸菌細胞に形質転換する。パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を細胞に添加し、アラビノースの添加によってタンパク質発現を誘導する。ＩＬ−２ポリペプチドの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、ＩＬ−２ポリペプチドを観察する。レーンを、元々の野生型ＩＬ−２ポリペプチド間の比較のため；およびｐＡＦ置換ＩＬ−２ポリペプチド、例えば、特定のアミノ酸残基でパラ−アセチルフェニルアラニン置換されたＩＬ−２について、実行する。Ｔ７ポリメラーゼの発現は、アラビノース誘導性Ｔ７バクテリオファージプロモーターの制御下にある。パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を細胞に添加し、アラビノース（最終的に０．２％）の添加によって、タンパク質発現を誘導する。培養物を３７℃で数時間（３〜５時間）、インキュベートする。
【０５６９】
大腸菌におけるｈＩＬ−２発現を増加させるための追加の構築物：大腸菌におけるｈＩＬ−２の産生を増加させるために、ＤＮＡ配列最適化に加えて、本明細書に報告された大腸菌コドンの使用に基づいて、以下の発現パラメータをさらに最適化することができた：アラビノースＢ（ａｒａＢ）、ｐＴｒｃおよびバクテリオファージＴ５プロモーターなどのＴ７バクテリオファージプロモーター以外の異なるプロモーターの試験；ｈＩＬ−２ｍＲＮＡの安定化；標準Ｗ３１１０Ｂ６０株以外の異なる大腸菌宿主株のスクリーニング；温度、培地、誘導剤濃度などの産生プロセスパラメーター最適化；開始および終止コドン、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーターなどの転写および翻訳制御要素最適化；プラスミドコピー数およびプラスミド安定性最適化；翻訳開始領域（ＴＩＲ）最適化。
【０５７０】
実施例３−この実施例は、大腸菌振盪フラスコ発現試験および高細胞密度発酵を詳述する。
【０５７１】
振盪フラスコ発現試験：上記のＡＸＩＤ産生株を使用して、振盪フラスコ実験におけるｈＩＬ−２発現について試験した。簡単に述べると、ＡＸＩＤグリセロールバイアルからの接種材料を、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を含む５ｍＬのＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ−ＯｐｔｉｇｒｏｗＴＭ、＃ＢＰ１４３２−１０Ｂ１）培地に入れ、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩培養した物を、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を含むＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ−ＯｐｔｉｇｒｏｗＴＭ、＃ＢＰ１４３２−１０Ｂ１）培地中で１：１００に希釈し、振盪しながら３７℃で増殖させた。培養物密度が０．６〜０．８のＯＤ６００に達したとき、それを０．２％アラビノースで誘導し、ｐＡＦを添加し、続いて数時間（通常３〜５時間）の産生後に採取した。採取した細胞からアリコートを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｈＩＬ−２の最適な発現は、温度、誘導の持続時間および誘導剤濃度を変化させることによって標準化した。ｈＩＬ−２に対する標準モノクローナル抗体を有する粗抽出物の免疫ブロットにより、ｈＩＬ２発現を分析するために使用される以下のウェスタンアッセイにしたがって、ｈＩＬ−２の発現をさらに確認した（図３Ａ）：採取した細胞ペレットを、ＯＤ６００が５になるように正規化し、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ１（１Ｕ／ｍｌ）を有するＢ−ＰＥＲ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の計算量に溶解した。ペレットを、高速で２〜５分間ボルテックスし、混合物を３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートすることによって、混合した。サンプルを、製造業者によって提供されたサンプル緩衝液（４×）およびサンプル還元剤（１０×）と混合し、最終濃度を１×に調整した。合計２０μｌのサンプルを、ｈＩＬ２標準（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と共にプレキャストポリアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上にロードし、電気泳動分離を１×ＭＥＳ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で行った。ｉＢｌｏｔ装置およびゲル転写スタックを用いて、タンパク質サンプルをニトロセルロース膜上に転写した。ｈＩＬ２を、ヤギ抗ヒトＩＬ−２抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって捕捉し、ｏｐｔｉ４ＣＮ比色基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＨＲＰ抱合抗ヤギＩｇＧ二次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。
【０５７２】
高細胞密度発酵：ｈＩＬ−２の産生のための発酵プロセスは、２つの段階からなる：（ｉ）接種材料調製、および（ｉｉ）発酵槽産生。接種材料は、単一のグリセロールバイアルから開始し、解凍し、２５０ｍＬバッフル付き三角フラスコ中で、５０ｍＬの規定種培地中で１：１０００（ｖ／ｖ）に希釈し、３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートする。使用前に、発酵槽を洗浄し、オートクレーブ処理する。特定量の基本培地を発酵槽に添加し、蒸気滅菌する。接種前に、特定量の硫酸カナマイシン溶液、フィード培地およびＰ２０００消泡剤を基本培地に添加する。オートクレーブ処理後に発酵槽に添加されたすべての溶液は、０．２μｍで濾過されるか、または無菌添加の前にオートクレーブ処理される。
【０５７３】
発酵槽を、炭素源としてグリセロールを利用する４Ｌの既知組成培地でバッチ処理する。種培養物を、初期ＯＤ６００ｎｍが０．００５になるまで発酵槽に添加する。溶解酸素を、４８０〜１２００ｒｐｍの撹拌、ならびに６ｐｓｉｇのヘッド圧および５ｓｌｐｍの空気流での酸素富化を使用して、３０％空気飽和に維持する。温度およびｐＨは、それぞれ３７℃および７．０に制御する。培養物が３５±５のＯＤ６００ｎｍに達するとき、０．２５ｍＬ／Ｌ／ｍｉｎの速度で供給を開始する。その結果、Ｌ−Ａｌａ−ｐＡｃＦ（Ｌ−Ａｌａ−ｐＡＦともいう）のジペプチドが０．４ｇ／Ｌで添加される。ジペプチドの添加の１５分後、培養物を、最終濃度２ｇ／ＬのＬ−アラビノースで誘導する。誘導の６時間後に培養物を回収する。
【０５７４】
逆相ＨＰＬＣ力価分析：１．０ｍＬの大腸菌発酵サンプル（細胞ペースト）を最初に乾燥させ、秤量して、サンプル調製のための質量を決定した。Ｌｙｓｏｎａｓｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃７１２３０）およびＢｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃７０６６４）それぞれを、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃７０５８４）中で１：５００に希釈し、細胞ペーストの化学的溶解に使用した。１．０ｍＬのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ−Ｌｙｓｏｎａｓｅ−Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ混合物を１．０ｍＬの乾燥細胞ペーストに添加し、得られた混合物を激しくボルテックスした。次いで、混合物を、１０００ｒｐｍで振盪しながら、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ振盪機上に２２℃で２０分間置いた。インキュベート後、細胞溶解物を１６，０５０ｒｃｆで５分間遠心分離して、細胞破片をペレット化した。次いで、細胞溶解物上清の２００μＬアリコートを、０．２２μｍのＰＶＤＦ遠心フィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃  ＵＦＣ３０ＧＶＮＢ）に通して、１６，０５０ｒｃｆで１分間濾過した。次いで、濾過生成物を逆相クロマトグラフィーによって分析し、発酵サンプル中に存在するｈＩＬ２の量を決定した。３．５μｍ粒子を充填した４．６×１５０ｍｍのＺｏｒｂａＸ  ３００ＳＢ−Ｃ３（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＃８６３９７３−９０９）逆相カラムを使用して、宿主細胞タンパク質汚染物質からｈＩＬ２を分離した。水中に０．１％トリフルオロ酢（trifluoroacetic）を含有する移動相Ａを使用して、ｈＩＬ２を結合させた。アセトニトリル中に０．１％トリフルオロ酢酸を含有する移動相Ｂを使用して、カラムからｈＩＬ２を溶出させた。サンプル中のｈＩＬ２の量は、精製ｈＩＬ２を用いて生成された標準曲線から得られた直線式に対して、固定された注入体積からの観察された面積カウントを比較することによって、決定された。図３Ｂに例示されるように、試験されたいくつかのＩＬ−２アンバー変異体は、高細胞密度大腸菌発酵において、約６５〜１５０ｍｇ／Ｌの範囲の高力価発現を示した。
【０５７５】
実施例４−この実施例は、封入体調製、リフォールディング、精製およびＰＥＧ化を詳述する。
【０５７６】
封入体調製および可溶化：高細胞密度発酵から採取した細胞ペーストを、最終的に１０％固形物になるように、４℃において、封入体（ＩＢ）緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；４℃）に混合することによって、再懸濁する。細胞は、再懸濁された物質をマイクロフルイダイザーに合計２回通すことによって、溶解される。次いで、サンプルを遠心分離（１４，０００ｇ；１５分；４℃）し、上清をデカントする。封入体ペレットを、追加容量のＩＢ緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；４℃）に再懸濁することによって洗浄し、再懸濁された物質を、マイクロフルイダイザーに合計２回通す。次いで、サンプルを遠心分離（１４，０００ｇ；１５分；４℃）し、上清をデカントする。封入体ペレットをそれぞれ、１容量の緩衝液ＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４℃）に再懸濁する。サンプルを遠心分離（１４，０００ｇ；１５分；４℃）し、上清をデカントする。封入体ペレットを１／２容量の緩衝液ＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４℃）に再懸濁する。次いで、封入体を適切な容器にアリコートする。サンプルを遠心分離（１４，０００ｇ；１５分；４℃）し、上清をデカントした。封入体は、さらなる使用まで、可溶化されるか、または−８０℃で保存された。
【０５７７】
封入体を、１０〜１５ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように、可溶化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；８Ｍ  グアニジン；１０ｍＭ  β−ＭＥ）に可溶化する。次いで、可溶化封入体を、室温で、一定の混合下で、１時間、または完全に可溶化するまでインキュベートする。次いで、サンプルを遠心分離（１０，０００ｇ；２０分；４℃）し、任意の未可溶化物質を除去する。次いで、タンパク質濃度が高かった場合、各サンプルのタンパク質濃度を、追加の可溶化緩衝液を用いて希釈することによって、調節する。
【０５７８】
リフォールディングおよび精製：リフォールディングは、最終的なタンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように、サンプルを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；６０％  スクロース；４℃中に希釈することにより、行う。リフォールディングは、４℃で５日間、放置される。リフォールディングした物質を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを用いて、１：１に希釈する。物質を０．２２μｍ  ＰＥＳフィルターを通して濾過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）で平衡化されたブルーセファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする。上向流で、カラムを５カラム容量の３０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；２Ｍ  ＮａＣｌ；５０％エチレングリコール）を用いて洗浄する。１０カラム容量の１００％緩衝液Ｂを用いてカラムを洗浄することによって、ＩＬ−２ポリペプチドを溶出する。
【０５７９】
ＰＥＧ化およびＰＥＧ化後精製：ＩＬ−２プールを採取し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍に希釈する。５０％氷酢酸を用いて、各サンプルのｐＨを４．０に調節する。サンプルを、〜１．０ｍｇ／ｍＬにまで濃縮する。１：１２モル過剰の活性化ＰＥＧ（ヒドロキシルアミンＰＥＧ）を各サンプルに添加する。次いで、サンプルを２７℃で４８〜７２時間インキュベートする。サンプルを採取し、水（＜８ｍ／Ｓ）を用いて８〜１０倍に希釈し、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ６．０；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３〜１４）で平衡化されたＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする。ＩＬ−２ポリペプチドを、５カラム容量の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ６．０；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）で溶出する。ＩＬ−２の画分をプールし、ＩＬ−２貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ５．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイジングカラム上で泳動する。ＰＥＧ化物質を収集し、４℃で保存する。
【０５８０】
実施例５−この実施例は、大腸菌および哺乳動物発現系からのＩＬ−２精製を詳述する。この実施例はまた、ＰＥＧ化、部位特異的抱合、およびＰＥＧ−ＩＬ−２精製プロセスを開示する。
【０５８１】
大腸菌封入体調製からの調製：ＩＬ−２封入体を、一連の洗浄工程を通して単離した。凍結細胞ペーストを、１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように、洗浄緩衝液Ｉ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１Ｍ  尿素、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に再懸濁し、４℃でホモジナイズし、続いて遠心分離（１５，０００ｇ、３０分、４℃）した。上清を捨て、封入体ペレットを洗浄緩衝液ＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１Ｍ  尿素、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。再懸濁封入体を１５，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、封入体ペレットを洗浄緩衝液ＩＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０；デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。再懸濁封入体を１５，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、封入体ペレットを水に再懸濁し、続いて１５，０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。洗浄した封入体を、さらなる使用まで、−８０℃で保存した。
【０５８２】
リフォールディング：ＩＬ−２封入体を、水に再懸濁し、混合物のｐＨをｐＨ１２．２に調節することによって、可溶化した。不溶性物質は、遠心分離（１２，０００ｇ、１５分）によって除去した。可溶化ＩＬ−２は、ｐＨをｐＨ８．８±０．２にまで調節することによってリフォールディングした。リフォールディング反応物に５０μＭ  シスチンを添加することによって、適切なジスルフィド結合形成を促進した。リフォールディング反応物を、室温で１６〜２２時間、静置した。宿主細胞汚染物質は、塩酸を用いてリフォールディング反応物をｐＨ６．８に調節することによって、沈殿させた。沈殿物を遠心分離（１２，０００ｇ、１５分）によって除去し、清澄化した上清を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．８に調整し、０．２２μｍで濾過した。
【０５８３】
カラム精製：リフォールディングしたＩＬ−２を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．８）で平衡化されたＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ  Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上にロードした。ロード後、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．８）を用いてカラムを洗浄し、２０カラム容量にわたる１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ４．０）への線形ｐＨ勾配を使用して、カラムからＩＬ−２を溶出した。ＩＬ−２を含有する画分を収集し、１０％酢酸を用いてｐＨを４．０に調節し、次いで２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、２．５％  トレハロース、ｐＨ４．０に緩衝液交換した。ＩＬ−２を１〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２２μＭで濾過し、−８０℃で保存した。
【０５８４】
真核生物発現系からのＩＬ−２の精製：Ｈｉｓタグ化ＩＬ−２を含有する細胞培養培地を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．８に調節し、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．８で平衡化されたＮｉ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。ロード後、カラムを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．８）を用いて洗浄し、続いて洗浄緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．０Ｍ  塩化ナトリウム、３０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．８）を用いて洗浄して、宿主細胞汚染物質を除去した。溶出緩衝液（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．８）を用いてカラムからＩＬ−２を溶出させ、ＩＬ−２を含有する画分をプールした。ＩＬ−２をプールした物質を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．８）で平衡化されたＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ  Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上にロードした。ロード後、カラムを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．８）を用いて洗浄し、２０カラム容量にわたる１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ４．０）への線形ｐＨ勾配を使用して、カラムからＩＬ−２を溶出した。ＩＬ−２を含有する画分を収集し、１０％酢酸を用いてｐＨを４．０に調節し、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、２．５％  トレハロース、ｐＨ４．０に緩衝液交換した。ＩＬ−２を１〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２２μＭで濾過し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０５８５】
部位特異的抱合およびＰＥＧ−ＩＬ−２精製：非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）であるパラ−アセチルフェニルアラニンを含むＩＬ−２変異体を、抱合緩衝液（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）に緩衝液交換し、１〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終的に１００ｍＭの酢酸ヒドラジドを反応物に添加し、続いて１０モル過剰のアミノオキシ官能化ＰＥＧを添加した。抱合反応物を２５〜３０℃で１８〜２０時間、インキュベートした。抱合の後、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０を用いて、ＰＥＧ化ＩＬ−２を１：１０に希釈し、Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  Ｉｍｐｒｅｓカラム上にロードした。ロード後、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０）を用いてカラムを洗浄し、２０カラム容量にわたる１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１．０Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）への線形勾配を使用して、カラムからＰＥＧ化ＩＬ−２を溶出した。ＰＥＧ化ＩＬ−２を含有する画分を収集し、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２．５％  トレハロース、ｐＨ７．０に緩衝液交換した。ＩＬ−２を１〜２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２２μＭで濾過し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０５８６】
バイオレイヤー干渉法によるＩＬ−２／ＣＤ−２５結合アッセイ：ＩＬ−２／ＣＤ２５マルチ濃度結合動態実験を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６（ＰＡＬＬ／ＦｏｒｔｅＢｉｏ）装置で３０℃にて、行った。抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサ（ＰＡＬＬ／ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０６３）に、１×ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００８−２７）中の精製されたＣＤ２５−Ｆｃ融合タンパク質をロードした。０．８ｎｍ〜１．０ｎｍの固定化レベルに達した。ロードされたバイオセンサを１×ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を用いて洗浄し、結合していない任意のタンパク質を除去した後、会合および解離動態を測定した。会合相モニタリングのために、ＩＬ−２検体サンプルを１×ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を用いて希釈し、固形ブラック９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、カタログ番号６５５２０９）に移した。ＩＬ−２サンプルを放置し、ＣＤ２５−Ｆｃがロードされたバイオセンサに６０秒間、結合させた。解離相を、１×ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を含有する固形ブラック９６ウェルプレートのウェルにおいて、９０秒間記録した。対応する緩衝液ブランクの減算を用いてデータを参照し、ベースラインをｙ軸にアラインさせ、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアバージョン１０．０（ＰＡＬＬ／ＦｏｒｔｅＢｉｏ）のＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターによって平滑化した。１：１の結合化学量論を説明するＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用して、処理された動態センサグラムを全体的にフィッティングした（図４Ａ）。
【０５８７】
実施例６−この実施例は、哺乳動物系において天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２のクローニングおよび発現を詳述する。この実施例はまた、修飾ＩＬ−２の生物学的活性を評価するための方法を記載する。
【０５８８】
哺乳動物細胞におけるＩＬ−２変異体の調製。天然ヒトＩＬ−２は、Ｔｈｒ−３上にＯ結合グリコシル化を有するグリコシル化タンパク質である（Conradt et al., Eur J Biochem, 153(2): pp: 255-61 (1985)）。非グリコシル化ＩＬ−２はグリコシル化ＩＬ−２と同様の活性を有することが示されているが、グリコシル化ヒトＩＬ−２は活性化されたヒトＴ細胞のクローン増殖および長期増殖の観点で、より良好な活性を有することが示された。天然ＩＬ−２がより高い比活性を有することを示唆する報告もいくつかある。哺乳動物細胞におけるＩＬ２の発現は、大腸菌におけるそれらの発現を上回る利点を有することも示唆される（Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14(4), 810-815 (2004)）。本発明において、野生型ＩＬ−２および上記で設計されたその種々の突然変異タンパク質（それぞれ、表１および表２）は、ＣＨＯ細胞において産生され得る（本明細書の実施例に記載される）。
【０５８９】
所望の位置に非天然アミノ酸を含むＩＬ−２突然変異タンパク質を産生するために、各突然変異タンパク質は、設計された直交ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ合成酵素ペア（Tian et al.,  Proc Natl Acad Sci U S A, 111(5): pp: 1766-71 (2014)、およびＰＣＴ／２０１８ＵＳ／０３５７６４：その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含むトランスフェクションされたプラットフォーム細胞株に由来する安定なプールまたは安定な細胞株のいずれかにおいて、産生される。簡単に述べると、ＣＨＯ細胞中のＩＬ−２などの治療用タンパク質への非天然アミノ酸、例えばｐＡＦの効率的な組み込みのために、独自の直交ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）およびその同系のアンバー抑制ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を安定に発現するプラットフォーム細胞株となるように、ＣＨＯＫ１細胞を設計した。次いで、プラットフォーム細胞株を、バイオリアクターへの迅速な発達のために、懸濁液増殖に予め適合させた。プラットフォーム細胞株は、改善された非天然アミノ酸取り込み効率およびクローン選択効率で十分に特性付けられ、進化した。プラットフォーム細胞株を親細胞として用いて、初期段階の研究用途のために、１００ｍｇ／Ｌを超える力価を有する迅速かつ効率的な一過性発現によって、非天然アミノ酸組み込み治療用タンパク質を産生する。候補分子の発現を評価し、リード分子を同定するための機能的アッセイのための物質を提供するために、一過性のトランスフェクションおよび安定なプール生成を行う。ＧＳ発現系における目的遺伝子を含むアンバーナンセンスコドンをプラットフォーム細胞株に対してトランスフェクトすることによって、非天然アミノ酸組み込みＩＬ−２タンパク質を産生するための産生細胞株を生成する。プラットフォーム細胞株を親細胞として用いて、３〜４ヶ月で５〜１０ＰＣＤを有し、６ヶ月で２０〜３０ＰＣＤを有する産生細胞株を得るための安定な細胞株開発戦略を実施する。
【０５９０】
本発明において、天然シグナルペプチド配列を有するヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００５８６．３）を合成し、ＧＳ選択マーカーを含む哺乳動物発現ベクター（図４Ｂ）に対してクローニングした。表１に示すように、クローン化された野生型ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡは、各アミノ酸の元々のＤＮＡ配列を突然変異なしに保持している。対照的に、ＩＬ−２変異体の生成の間（表２）、１５個の突然変異タンパク質それぞれは、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）に突然変異された独特の位置を有し、これは、ｎｎＡＡ含有タンパク質を産生するための設計された細胞において抑制および発現され得る。
【０５９１】
ＩＬ−２変異体発現のために使用される、設計されたＣＨＯ細胞の株化。設計されたＣＨＯ細胞は、予め株化された独自のプラットフォーム細胞の遺伝子ノックアウトに由来した（ＰＣＴ／２０１８ＵＳ／０３５７６４、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に述べると、ウェブベースの標的発見ツール、ＣＲＩＳＰｙを用いて、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞中のゼロオフ標的を有する前生エキソン中に、ｇＲＮＡ標的配列を迅速に同定した。ｇＲＮＡを、ＣＨＯコドン最適化バージョンのＣａｓ９と共発現する哺乳動物発現ベクターｐＧＮＣＶに対して、クローン化した。産生細胞株にタンパク質発現ベクターをトランスフェクションして細胞プールを生成した後、クローニングを行い、遺伝子ノックアウトを有する単一細胞分離物を同定した。複数の計画の複合的な結果からのインデル（ｉｎｄｅｌ）（挿入／欠失）頻度は、細胞プールおよび単一細胞分離株について、それぞれ３０〜９０％および５０〜８０％であった。ＣＲＩＳＰＲを用いてＣＨＯ細胞における標的遺伝子をノックアウトした。具体的には、ＩＬ−２のｍＲＮＡ安定性を高めるために、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＵＰＦ１遺伝子をノックアウトした。ノックアウトにおいて使用されたｇＲＮＡを図５に示す。１９２クローニングをスクリーニングした後、２つのＵＰＦ１−ＫＯ細胞株を得て、配列決定によりＵＰＦ１ノックアウトを有することを検証した（図６）。次いで、得られたＵＰＦ１−ＫＯ細胞株を用いて、ＩＬ−２変異体を一過性に発現させた。
【０５９２】
設計されたＣＨＯ細胞におけるＩＬ−２の一過性発現。ＩＬ−２変異体は、上記の実施例に開示されたようにして得られたＵＰＦ１−ＫＯ細胞株において、一過性に発現された。トランスフェクションは、懸濁細胞用のＡｍａｘａキット（Ｌｏｎｚａ）を用いたエレクトロポレーションで行った。６ｕｇのプラスミドを、上記の実施例に開示されるようにして調製し、２×１０６の設計されたＣＨＯ細胞に対してトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を３７℃で４日間インキュベートし、その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からの市販キットを用いたＥＬＩＳＡにより、力価の分析を行った。図７Ａおよび７Ｂに示すように、一過性発現の間、変異体Ｆ４２は１５の変異体の中で最も高い発現レベルを示す。
【０５９３】
ＣＴＬＬ−２細胞におけるＩＬ−２変異体のＴ細胞増殖試験。トランスフェクションされた設計されたＣＨＯ細胞由来の一過性発現されたＦ４２変異体上清を使用して、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを実施した。細胞増殖アッセイの間、野生型ＩＬ−２を１００％増殖のコントロールとして使用した（図８に示す）。変異体Ｆ４２を、１０ｎｇ／ｍＬ、３．３３ｎｇ／ｍＬ、１．１１ｎｇ／ｍＬ、０．３７ｎｇ／ｍＬ、０．１２ｎｇ／ｍＬ、および０．０４ｎｇ／ｍＬの一連の希釈度に調製した。細胞増殖は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を用いて行った。発光シグナルをＴＥＣＡＮ  ｇｅｎｉｏｓ  ｐｒｏ上で読み取った。図８に示すように、Ｆ４２は野生型コントロールと比較して機能の９５％を保持しながら、約０．２４ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を示した。本発明のＩＬ−２変異体を研究するための一般的な手順を以下に示す。
【０５９４】
【表３】
2022500035.tif 000052
【０５９５】
実施例７−ＣＴＬＬ−２細胞増殖によるＩＬ−２変異体のスクリーニング
実施例に開示されるようなＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを利用して、１６個の独自に選択された部位（野生型が含まれる）および当技術分野で公知の４個のさらなる部位（Ｋ３２、Ｋ４８、Ｋ４９、Ｋ７６）（Charych, D., et al., PLoS One, 12(7): p. e0179431, 2017）を含む、２０個の異なるＩＬ−２変異体をスクリーニングした。図９および表３に示すように、ほとんどの変異体は、突然変異誘発後にそれらの活性を保持した。ＩＬ−２Ｒαの残存発現を有するＣＴＬＬ−２細胞の性質のために、ＣＴＬＬ２細胞への結合が最も少ない突然変異誘発を有する変異体は、ＩＬ−２Ｒαへのいくらかの固有の結合を依然として示したが、それは最小であった。例えば、ＩＬ−２Ｒαへの結合が最も少ないＰ６５ＩＬ−２変異体は、ＩＬ−２Ｒαへのいくらかの固有の偏った結合を示すことが観察された。同定された変異体を、ＰＥＧ化後のそれらの結合能力について、さらに分析した。
【０５９６】
【表４】
2022500035.tif 000053
【０５９７】
実施例８  インビトロ結合アッセイを用いた選択された変異体の分析
選択された変異体Ｐ６５、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｆ４２、Ｋ３５、Ｋ４９およびＴ３７の分析を、上記の実施例に記載されるように、インビトロ結合アッセイ、バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して行った。変異体それぞれを、それぞれの特異的部位で２０Ｋ  ＰＥＧと抱合させた。次いで、ＰＥＧ化変異体を、実施例の他の箇所に記載されるＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法）アッセイによって分析した。図１０Ａ〜１０Ｃに示すように、ＰＥＧ化変異体を、ＩＬ−２Ｒαへのそれらの結合について、Ｏｃｔｅｔで試験した。アッセイにおけるポジティブコントロールとして、野生型ＩＬ−２を使用した。ＰＥＧ化後、ほとんどの変異体は、９２．９％〜９９．９％の、ＩＬ−２Ｒαへの劇的に減少した結合を示した。試験したＰＥＧ化変異体の中で、Ｐ６５およびＹ４５は、９９％を超えてブロックされた活性を示した（表４）。
【０５９８】
【表５】
2022500035.tif 000054
【０５９９】
実施例９−ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイを用いた選択された変異体の分析
ＰＥＧの抱合のための最良の部位を見出すために、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）によって開発されたＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイを使用した。一般に、アッセイシステムは、外因的に発現されたＩＬ−２受容体を使用し、当該ＩＬ−２受容体は、酵素の相補的結合ドメインを有するように設計されており、添加されたＩＬ−２分子による二量体化後に、予め分離された受容体が活性化されると、化学発光シグナルを生じる（図１１）。Ｕ２ＯＳ細胞において、２つの細胞株を生成した。１つの細胞株は、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγの３つの受容体を発現した。他の細胞株は、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγを発現した。それぞれの変異体の結合ＥＣ５０値の比（ＥＣ５０−βγ／ＥＣ５０−αβγ）を使用して、それらの相対的に保持された結合能力を推定した。表５に示すように、最も見込みのある変異体は１の値を有し、これは、それらのβγ結合活性の１００％が保持されている一方で、α結合が１００％ブロックされていることを意味する。記載したように、変異体Ｙ４５−ＢＲ４（抱合された２０Ｋの４分岐ＰＥＧを有する変異体Ｙ４５）、およびＰ６５−ＰＥＧ２０Ｋ（抱合された２０Ｋの直鎖ＰＥＧを有する変異体Ｐ６５）は最低値を示し、これらの２つのＰＥＧ化変異体がさらなる評価のための最良の候補であり得ることを示した。
【０６００】
【表６】
2022500035.tif 000055
【０６０１】
表６に示すように、実施したさらなる実験において、変異体Ｙ４５−ＢＲ４およびＰ６５−ＰＥＧ２０Ｋに加えて、変異体Ｐ６５−ＢＲ４（抱合された２０Ｋの４分岐ＰＥＧを有する変異体Ｐ６５）およびＰ６５−ＢＲ２（抱合された２０Ｋの２分岐ＰＥＧを有する変異体Ｐ６５）も、さらなる評価のための候補として選択した。
【０６０２】
【表７】
2022500035.tif 000056
【０６０３】
実施例１０−ＩＬ−２変異体のＥｘ  ｖｉｖｏ  ｐＳＴＡＴ５アッセイ
ＰＥＧ化変異体のインビトロでの機能をさらに評価するために、ＰＢＭＣを用いたエキソビボアッセイを用いた。図１２に示すように、ＩＬ−２がその受容体に結合すると、ＳＴＡＴ５の増強されたリン酸化（ｐＳＴＡＴ５）が誘発された。したがって、ｐＳＴＡＴ５レベルを検出することは、ＩＬ−２変異体の内因性ＩＬ−２受容体への結合の指標となり得る。Ｙ４５−ＢＲ２（抱合された２０Ｋの２分岐ＰＥＧを有する変異体Ｙ４５）、Ｙ４５−ＢＲ４（抱合された２０Ｋの４分岐ＰＥＧを有する変異体Ｙ４５）、およびＰ６５−ＰＥＧ２０Ｋ（直鎖２０ＫのＰＥＧを有する変異体Ｐ６５）などの選択されたＰＥＧ化変異体を用いて、ヒト全ＰＢＭＣを処理し、続いて２つの集団、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞へ分けた。表７に示すように、３つの変異体はすべて、それらの保持されたβγ結合能力およびブロックされたα結合活性に対して、はるかに改善された活性を示した。これらの結果は、表８に示す追加のｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて試験された変異体によって、さらに裏付けられた。このｐＳＴＡＴ５アッセイからの結果（表８）は、Ｔｒｅｇ細胞に結合する能力が低下し、ＣＤ８＋細胞への結合は比較的維持されるという点で、複数の変異体が劇的に改善された活性を有することを示した。ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇの算出された比率は、変異体のランキングを示すために、表８において使用され、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒアッセイの結果は、似たランキングシステムによるｐＳＴＡＴ５アッセイ結果と直接比較され得る。
【０６０４】
【表８】
2022500035.tif 000057
【０６０５】
【表９】
2022500035.tif 000058
【０６０６】
実施例１１−ＣＨＯ哺乳動物細胞において産生されたグリコシル化ＩＬ−２の存在下と、大腸菌において産生された非グリコシル化ＩＬ−２の存在下との、ＣＴＬＬ−２細胞のクローン増殖および長期増殖。
【０６０７】
天然ヒトＩＬ−２はＴｈｒ−３上にＯ結合グリコシル化を有するグリコシル化タンパク質であることが報告されている（Conradt et al., Eur J Biochem 153(2): 255-261 (1985)）。非グリコシル化ＩＬ−２と比較して、このグリコシル化の機能は、生理学的ｐＨでのより高い溶解性、インビボでのより遅いクリアランス、および癌治療におけるより少ない免疫原性に関連している（Robb et al., Proc Natl Acad Sci U S A 81(20): 6486-6490 (1984); Goodson et al., Biotechnology (NY) 8(4): 343-346 (1990)）。さらに重要なことに、グリコシル化ＩＬ−２は、非グリコシル化ＩＬ−２よりも、アロ活性化ヒトＴ細胞のクローン増殖および長期増殖の促進に優れていることが示されており（Pawelec et al., Immunobiology 174(1): 67-75 (1987)）、グリコシル化ＩＬ−２が治療用途においてより良い選択肢であることが示唆される。
【０６０８】
グリコシル化ＩＬ−２および非グリコシル化ＩＬ−２の生物学的機能をさらに分析するために、ＣＴＬＬ−２細胞のクローン増殖速度および長期増殖周波数を分析する実験を行った（図１３）。γ線照射ＣＦ１−ＭＥＦ（マウス胚性線維芽細胞）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、カタログ番号Ａ３４１８０）の予めコーティングされた支持細胞層を備えた９６ウェルプレートに、単一ＣＴＬＬ−２細胞を入れた。種々の濃度（０．００５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、および５ｎＭ）の、ＣＨＯ細胞または大腸菌から産生された野生型ＩＬ−２での一回の処理での１９日間の増殖の間に、増殖したコロニー数の割合、および、１９日間のインキュベートの終わりにおいて生存していたコロニーの割合を計数し、分析した。図１３に示すように（一例として、０．５ｎＭ処理を用いる）、グリコシル化ＩＬ−２は、非グリコシル化ＩＬ−２よりも、クローン成長を促進する上で優れた活性を示した。平均して、クローン増殖を促進するグリコシル化ＩＬ−２の能力は、０．５ｎＭのＩＬ−２濃度の存在下では、非グリコシル化ＩＬ−２よりも２倍高く、これは、ＣＴＬＬ−２細胞増殖に最適な細胞培養条件である。長期インキュベート（〜１９日）後、グリコシル化ＩＬ−２処理からのコロニー生存率は、非グリコシル化ＩＬ−２処理よりも４倍高かった。当該データは、グリコシル化ＩＬ−２がＩＬ−２応答細胞のクローン増殖および長期増殖を促進する上で優れた活性を有することを明確に示し、さらにその有望な治療用途を支持する。
【０６０９】
実施例１２−新規の安定な宿主ＣＨＯ細胞株におけるＩＬ−２発現の力価改善
ＣＨＯ細胞における野生型ＩＬ−２およびその変異体の発現を増加させるために、多くのアプローチが当技術分野で試みられている（例えば、Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14(4), 810-815 (2004)を参照のこと）。しかしながら、工業において非天然アミノ酸含有タンパク質の発現を増加させることは、哺乳動物細胞における比較的低い収率によって挑戦されてきた。本発明においてこの問題に対処するために、ＰＣＴ／２０１８ＵＳ／０３５７６４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような、タンパク質力価の産生を改善するための真核細胞株における独自の技術が利用され、ＩＬ−２およびその変異体の安定なプール細胞を生成し、安定なＩＬ−２細胞株を生成するために使用されている。
【０６１０】
簡単に述べると、Ｂａｘ／Ｂａｋノックアウトを発現する５つの異なる世代のプラットフォーム細胞株は、ＩＬ−２のタンパク質発現を劇的に改善し、親細胞株よりも約４０％までＩＬ−２タンパク質の産生を増加させることが見出された。Ｂａｘ／Ｂａｋノックアウトを介したこれらの細胞におけるアポトーシスの阻害に加えて、ＵＰＦ１ノックアウトは、ＩＬ−２の発現をさらに改善することが見出された。
【０６１１】
野生型ＩＬ−２およびその変異体（Ｆ４２、Ｙ４５およびＰ６５）の両方を、それらの安定なプールを生成することによって、試験している。図１３に示すように、野生型ＩＬ−２を含む、３つのＩＬ−２変異体Ｆ４２、Ｙ４５およびＰ６５の安定なプールは、それぞれの安定なプールの生成後、当技術分野におけるものと比較して（例えば、Kim et. al., J Microbiol Biotechnol., 14(4), 810-815, (2004)を参照のこと）、野生型では約７４０ｍｇ／Ｌまで；およびＦ４２変異体では１２０ｍｇ／Ｌまで（図１４に示す）、著しく増加した発現レベルを有する。当該データは、非天然アミノ酸が効率的に組み込まれた新しいＣＨＯ細胞株を生成することによって、ＩＬ−２タンパク質の産生または収率を改善または増加させることができることを示す。それはまた、発現レベルおよび機能性が部位特異的に関連していることを示唆する。
【０６１２】
実施例１３−ＩＬ−２変異体Ｆ４２−Ｒ３８Ａは、ＩＬ−２Ｒアルファ結合の完全なブロックを示した。
【０６１３】
本明細書中に開示されるように、天然にコードされていないアミノ酸置換は、ＩＬ−２内の他の付加、置換、または欠失と組み合わされ得、ＩＬ−２ポリペプチドの他の生物学的形質に対して、以下を含むがこれらに限定されない影響を及ぼす：ＩＬ−２の安定性（タンパク質分解に対する耐性を含むが、これに限定されない）の増加、または受容体に対するＩＬ−２の親和性の増加；ＩＬ−２の薬学的安定性の増加；腫瘍阻害および／または腫瘍減少に対するＩＬ−２の活性の増強；ＩＬ−２または変異体の溶解性（大腸菌または他の宿主細胞において発現される場合を含むが、これらに限定されない）の増加；大腸菌または他の組み換え宿主細胞における発現後のＩＬ−２溶解性の増加；大腸菌または他の組み換え宿主細胞における発現後のポリペプチド溶解性の増加；ＩＬ−２受容体、結合タンパク質、または関連するリガンドに対する親和性の調節、ＩＬ−２受容体への結合後のシグナル伝達の調節、半減期循環の調節、放出または生物学的利用可能性の調節、精製の容易化、または特定の投与経路の改善または変更；受容体に対するＩＬ−２変異体の親和性の増加；ＩＬ−２−Ｒベータおよび／またはＩＬ−２−Ｒガンマに対するＩＬ−２変異体の親和性の増加。
【０６１４】
したがって、変異体Ｆ４２の機能を改善するために、追加の変異Ｒ３８Ａを有する新しい変異体をＣＨＯ細胞中で調製した。図１５Ａに示すように、安定な細胞株の生成の間、安定なプール中のＩＬ−２変異体Ｆ４２における非天然アミノ酸および天然アミノ酸置換の組み合わせで、力価は１１８ｍｇ／Ｌにまで増加した。変異体Ｆ４２のタンパク質発現レベルは、維持されただけでなく、Ｒ３８Ａ変異の存在下では２０％の増加を示した。ＰＥＧ化Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体の機能を試験するために、ＣＴＬＬ−２細胞結合アッセイを行った。表９に示すように、Ｆ４２−Ｒ３８Ａの２０Ｋ  ２分岐ＰＥＧ（変異体Ｆ４２−Ｒ３８−ＢＲ２）抱合物は、３．６ｎＭのＥＣ５０を示し結合ブロック能が４倍を超えて増加したＦ４２とは対照的に、１５．９ｎＭのＥＣ５０を示した（図１５Ｂ）。野生型ＩＬ−２の０．０２５ｎＭのＥＣ５０に基づくと、結合ブロック能は９９．９％を超える。この変異体は、その高いタンパク質発現レベルおよびＩＬ−２Ｒアルファへの結合をブロックする効率の観点で、その治療用途に大きな可能性を示した。
【０６１５】
【表１０】
2022500035.tif 000059
【０６１６】
ＩＬ−２Ｒアルファへの結合に対するＲ３８Ａ変異の効果を決定するために、Ｆ４２ｐＡＦ変異体、Ｒ３８Ａ−Ｆ４２ｐＡＦ変異体（非天然アミノ酸および点変異を含む）、およびＦ４２−Ｒ３８Ａ−ＰＥＧ２０Ｋ−ＢＲ２の結合動態を、ＢＬＩによって評価した。図１５Ｃは、３つの構築物についての結合センサグラムを示し、関連する結合定数（ＫＤ）を表１０に示す。表１０に見られるように、ＩＬ−２−Ｆ４２ｐＡＦは、２０ｎＭのＩＬ−２Ｒアルファ結合ＫＤを有する。追加されたＲ３８Ａ変異により、ＩＬ−２−Ｆ４２−Ｒ３８ＡｐＡＦは、２３３ｎＭのＩＬ−２Ｒアルファ結合ＫＤを有し、これは、ＩＬ−２Ｒアルファ結合の１２倍の減少に相当する。ＩＬ−２−Ｒ３８Ａ−Ｆ４２ｐＡＦと２０Ｋの２分岐ＰＥＧ分子との抱合により、ＩＬ−２Ｒアルファ結合は阻害された。当該結果は、追加の変異が、Ｆ４２−Ｒ３８Ａのその受容体ＩＬ−２Ｒαへの結合を効果的にブロックしたことを明確に示した。
【０６１７】
【表１１】
2022500035.tif 000060
【０６１８】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示の目的のみのためのものであり、それらに照らした種々な修正または変更は、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本出願において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれるように個々に示されたかのように、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０６１９】
本発明は、以下の番号が付された実施形態によってさらに説明される。
【０６２０】
１．１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型のＩＬ−２と比較して、その受容体サブユニットとの相互作用が減少している、ＩＬ−２ポリペプチド。
【０６２１】
２．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３に９０％相同である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６２２】
３．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９５％相同である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６２３】
４．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９８％相同である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６２４】
５．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号２に少なくとも９９％相同である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６２５】
６．前記ＩＬ−２は、１つ以上の水溶性ポリマーに抱合されている、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６２６】
７．少なくとも１つの前記水溶性ポリマーは、少なくとも１つの前記天然にコードされていないアミノ酸に連結されている、実施形態６に記載のＩＬ−２。
【０６２７】
８．前記水溶性ポリマーは、ＰＥＧである、実施形態７に記載のＩＬ−２。
【０６２８】
９．前記ＰＥＧは、１０〜５０の分子量を有する、実施形態８に記載のＩＬ−２。
【０６２９】
１０．前記天然にコードされていないアミノ酸は、１位の前（すなわち、Ｎ末端）、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位の残基からなる群から選択される位置での置換、またはタンパク質のカルボキシル末端への付加、およびそれらの任意の組み合わせ、およびそれらの任意の組み合わせである、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６３０】
１１．前記ＩＬ−２は、野生型ＩＬ−２と比較して、そのＩＬ２Ｒα受容体サブユニットに対する前記ＩＬ−２ポリペプチドの親和性を調節する１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３１】
１２．前記ＩＬ−２は、前記ＩＬ−２の安定性または溶解性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３２】
１３．前記ＩＬ−２は、組み換え宿主細胞におけるまたはインビトロで合成された前記ＩＬ−２ポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３３】
１４．天然にコードされていないアミノ酸は、残基３、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４５、６１、６２、６４、６５、６８、７２、および１０７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置で置換されている、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３４】
１５．前記天然にコードされていないアミノ酸は、前記ポリペプチド中の２０個の共通アミノ酸のいずれかに対して反応しないリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に対して反応性を有する、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３５】
１６．前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３６】
１７．前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基を含む、実施形態１６に記載のＩＬ−２。
【０６３７】
１８．前記ＩＬ−２は、生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、水溶性ポリマー、または免疫刺激剤に連結されている、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６３８】
１９．抱合された前記ＩＬ−２は、１つ以上の水溶性ポリマーに結合されている、実施形態１８に記載のＩＬ−２。
【０６３９】
２０．前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、リンカーによって前記ＩＬ−２に連結されている、実施形態１８に記載のＩＬ−２。
【０６４０】
２１．前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、切断可能または切断不可能なリンカーによってＩＬ−２に連結されている、実施形態１８に記載のＩＬ−２。
【０６４１】
２２．前記生物学的に活性な分子、細胞毒性剤、または免疫刺激剤は、前記ＩＬ−２中の前記天然にコードされていないアミノ酸の１つ以上に直接抱合されている、実施形態１８に記載のＩＬ−２。
【０６４２】
２３．前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【０６４３】
【化４８】
2022500035.tif 000061
【０６４４】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、実施形態１０に記載のＩＬ−２。
【０６４５】
２４．前記天然にコードされていないアミノ酸は、アミノオキシ基を含む、実施形態２３に記載のＩＬ−２。
【０６４６】
２５．前記天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジド基を含む、実施形態２３に記載のＩＬ−２。
【０６４７】
２６．前記天然にコードされていないアミノ酸は、ヒドラジン基を含む、実施形態２３に記載のＩＬ−２。
【０６４８】
２７．前記天然にコードされていないアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む、実施形態２３に記載のＩＬ−２。
【０６４９】
２８．前記天然にコードされていないアミノ酸残基は、アジド基を含む、実施形態２３に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【０６５０】
２９．前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構造を有し：
【０６５１】
【化４９】
2022500035.tif 000062
【０６５２】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、もしくは置換アリールであるか、または存在しておらず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６５３】
３０．前記天然にコードされていないアミノ酸は、アルキン基を含む、実施形態２９に記載のＩＬ−２。
【０６５４】
３１．前記天然にコードされていないアミノ酸は、以下の構成を有し：
【０６５５】
【化５０】
2022500035.tif 000063
【０６５６】
式中、ｎは、０〜１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであるか、または存在しておらず；ｍは、０〜１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６５７】
３２．前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、実施形態７に記載のＩＬ−２。
【０６５８】
３３．前記水溶性ポリマーは、約０．１ｋＤａ〜約５０ｋＤａの分子量を有する、実施形態３２に記載のＩＬ−２ポリペプチド。
【０６５９】
３４．アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基は、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結されている、実施形態１６に記載のＩＬ−２。
【０６６０】
３５．カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド基を含む天然にコードされていないアミノ酸を含むポリペプチドと反応させることによって作製される、実施形態１９に記載のＩＬ−２。
【０６６１】
３６．前記ＩＬ−２は、グリコシル化されている、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６６２】
３７．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、前記天然にコードされていないアミノ酸を介してポリペプチドに連結されたリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子をさらに含む、実施形態１に記載のＩＬ−２。
【０６６３】
３８．前記ＩＬ−２ポリペプチドは、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子が、糖部分を介して前記ポリペプチドに連結されている、実施形態３７に記載のＩＬ−２。
【０６６４】
３９．実施形態１に記載のＩＬ−２を作製する方法であって、前記方法は、天然にコードされていないアミノ酸を含む単離されたＩＬ−２ポリペプチドを、前記天然にコードされていないアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子と接触させる工程を含む、方法。
【０６６５】
４０．前記ポリマーは、水溶性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０６６６】
４１．前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０６６７】
４２．前記天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル部分を含み、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含む、実施形態３９に記載の方法。
【０６６８】
４３．アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分は、アミド結合を介して前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子に連結されている、実施形態３９に記載の方法。
【０６６９】
５４．ＩＬ−２ポリペプチドの血清半減期または循環時間を調節する方法であって、前記方法は、１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を、前記ポリペプチド中の任意の１つ以上の天然に存在するアミノ酸と置換する工程を含む、方法。
【０６７０】
５５．組み換え宿主細胞におけるＩＬ−２ポリペプチドの発現を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、ＩＬ−２ポリペプチド。
【０６７１】
５６．少なくとも１つのリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記リンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子は、前記ポリペプチド中にリボソーム的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸の官能基を介して前記ポリペプチドに結合されている、ポリペプチド。
【０６７２】
５７．１つ以上の天然にコードされていないアミノ酸に結合したリンカー、ポリマー、または生物学的に活性な分子を含むＩＬ−２ポリペプチドであって、前記天然にコードされていないアミノ酸は、予め選択された部位で前記ポリペプチドにリボソーム的に組み込まれている、ＩＬ−２ポリペプチド。
【０６７３】
５８．癌と診断されたヒトにおける腫瘍細胞の数を減少させるための方法であって、このような減少を必要とするヒトに、実施形態５６に記載のＰＥＧ−ＩＬ−２を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【０６７４】
５９．抱合物は、約０．１μ／ｋｇ〜約５０μ／ｋｇの用量で投与される、実施形態５８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０６７５】
【図１】ＩＬ−２ＲαおよびそのＩＬ−２との界面の構造で標識された潜在的な受容体相互作用部位を備えるＩＬ−２ポリペプチドの外観を示すモデル。
【図２】大腸菌におけるＩＬ−２発現のための発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図３Ａ】大腸菌におけるＩＬ−２タンパク質の発現のウェスタンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】大腸菌におけるＩＬ−２変異体の力価を示す。
【図４Ａ】ＣＤ２５に対するＩＬ−２野生型についての、結合動態センサグラムおよびモデルフィッティングライン、ならびに計算された測定値を示す。
【図４Ｂ】哺乳動物細胞におけるＩＬ−２の発現のための発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図５】ＵＰＦ１ゲノムＤＮＡ配列、およびＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ部位の設計を示す。
【図６】ＵＰＦ１ノックアウト細胞株の配列検証を示す。
【図７Ａ】哺乳動物細胞における種々のＩＬ−２変異体の一過性発現を示す。
【図７Ｂ】哺乳動物細胞で産生された野生型ＩＬ−２およびＩＬ−２変異体のウェスタンブロット分析を示す。
【図８】ＩＬ−２のＦ４２変異体のＣＴＬＬ−２増殖アッセイを示す。
【図９】ＣＴＬＬ−２増殖アッセイによるＩＬ−２変異体のスクリーニングを示す。
【図１０Ａ】ＩＬ−２野生型およびＦ４２変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【図１０Ｂ】Ｋ３５およびＹ４５変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【図１０Ｃ】Ｔ３７およびＰ６５変異体についての、結合動態センサグラムを示す。
【図１１】ＩＬ−２受容体二量体化アッセイの説明。
【図１２】エキソビボ  ｐＳＴＡＴ５アッセイの説明。
【図１３】グリコシル化または非グリコシル化ＩＬ−２の存在下におけるＣＴＬＬ−２細胞のクローン増殖および長期増殖を示す。
【図１４】対応する野生型ＩＬ−２またはその選択された変異体の安定なプールの生成前後の力価の比較を示す。
【図１５Ａ】Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体を発現する哺乳動物細胞における力価を示す。
【図１５Ｂ】Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体のＣＴＬＬ−２結合アッセイを示す。
【図１５Ｃ】Ｆ４２−Ｒ３８Ａ変異体についての結合動態センサグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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