(57)【要約】本出願は、中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症の増強を特徴とする状態を処置するための方法及び組成物に関する。この方法は、ＣＮＳにおける増強された炎症の治療を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。本発明の組成物は、炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関し、この組成物は、哺乳動物のＣＮＳへの直接投与用に処方される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症の増強を特徴とする状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、前記ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする前記状態が、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性脱髄疾患、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ウイルス感染、脊髄損傷、視神経損傷、及び脳性麻痺、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする前記状態が、炎症性脱ミエリン化疾患である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症性脱ミエリン化疾患が自己免疫性脳炎である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＮＳに存在する前記炎症性細胞が、ミクログリア、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＮＳに存在する前記炎症性細胞がミクログリアである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
阻害される前記アミノ酸トランスポーターが、大型アミノ酸トランスポーターの小サブユニット１（ＬＡＴ１）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が全身投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
全身投与の経路が、静脈内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、髄腔内、皮下及び経鼻からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が前記ＣＮＳに局所投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の前記投与により、前記対象の前記ＣＮＳ内におけるオリゴデンドロサイトの再ミエリン化オリゴデンドロサイトへの分化の増加がもたらされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の前記投与により、前記対象の前記ＣＮＳにおけるニューロンの再ミエリン化の増加がもたらされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の前記投与により、神経ジストロフィーの減少または神経変性の減少がもたらされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の前記投与により、前記対象の前記ＣＮＳにおける炎症の減少がもたらされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の前記投与により、前記ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるｍＴＯＲシグナル伝達が選択的に阻害される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が２回以上投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物であって、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）への投与用に処方される、前記組成物。
【請求項２０】
阻害される前記アミノ酸トランスポーターが、大型アミノ酸トランスポーターの小サブユニット１（ＬＡＴ１）である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩である、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象の中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症の増強の影響を前処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、前記ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記対象が、アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の投与前に、前記ＣＮＳにおける炎症を誘発することが知られている損傷に罹患している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤の投与前に、前記ＣＮＳにおける炎症のいかなる症状も呈していない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記損傷が、がん治療後の放射線誘発損傷、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ウイルス感染、脊髄損傷、及び視神経損傷、からなる群から選択されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、前記損傷から約４８時間以内に前記対象に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、前記損傷後１時間未満で前記対象に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、前記対象に２回以上投与される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が最初に前記対象に投与されたときに、前記対象が前記ＣＮＳにおけるニューロンの脱ミエリン化の症状を呈していない、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
阻害される前記アミノ酸トランスポーターが、大型アミノ酸トランスポーターの小サブユニット１（ＬＡＴ１）である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩である、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が全身投与される、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
全身投与の経路が、静脈内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、髄腔内、皮下及び経鼻からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸トランスポーターの前記阻害剤が前記ＣＮＳに局所投与される、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が哺乳動物である、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府が後援する研究開発に関する声明
本発明の開発中に実施された研究の一部では、国立衛生研究所助成金番号５Ｒ２１ＮＳ０９１８９０−０２及び１Ｒ０１ＮＳ１０７５２３−０１の下で米国政府の資金を利用した。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症の増強を特徴とする状態を処置するための方法及び組成物に関する。方法及び組成物は、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤の使用に関連している。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脱ミエリン化、軸索損傷、及び進行性神経変性を特徴とするＣＮＳの慢性炎症性障害である。興味深いことに、疾患の初期ステージでは、オリゴデンドロサイトは自発的に再生し、損傷後にミエリンを回復することができる。「再ミエリン化」と呼ばれるこのプロセスは、成人のＣＮＳに豊富であり広く分布しているオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が損傷領域に移動し、オリゴデンドロサイトに分化し、以前に脱ミエリン化した軸索の周りでミエリンを再生することができるために可能である。しかし、疾患の進行ステージでは、再ミエリン化はますます非効率的になり、最終的に再ミエリン化はできない。ミエリンを再生することができないことにより、軸索機能の障害及び進行性神経変性が生じ、患者に不可逆的な障害の蓄積がもたらされる。
【０００４】
ＣＮＳへの末梢免疫細胞浸潤を標的とする現在の免疫調節療法は、再発寛解型の疾患における再発及び疾患の重症度を軽減するのに有効であり得る。しかし、これらの治療法は、ＣＮＳ炎症が閉鎖された血液脳関門の後ろの脳区画内に「閉じ込められている」ように見える進行型の疾患ではほとんど効果がない。確かに、末梢における炎症と比較して、ＣＮＳにおいて発生する炎症には明確な違いがある。例えば、ＣＮＳ炎症は、ミクログリア／マクロファージ及びＴ細胞リンパ球の活性化を伴うが、末梢炎症は循環する単球／マクロファージ及びリンパ球の活性化を伴う。
【０００５】
一次進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び二次進行性ＭＳ（ＳＰＭＳ）などの進行型のＭＣでは、ミクログリア／マクロファージ活性化による病変の緩徐拡大を特徴とするくすぶり型炎症が、疾患の進行に寄与する。確かに、進行性ＭＳ患者からの死後の脳切片の分析によって、高度の炎症、活性脱ミエリン化、不完全な再ミエリン化、及び深刻な軸索喪失を呈する緩徐に拡大するプラークが明らかになる。ＭＳの進行期に再ミエリン化ができない正確な理由は、十分に理解されていないままである。ＭＳにおいて再ミエリン化が損なわれる理由にはいくつかの可能性があり、高齢、制御不能な炎症、非効率的な細胞／ミエリン残屑クリアランス、軸索ジストロフィー、またはＯＰＣの分化不能を含む。
【０００６】
いくつかの以前の研究は、ＣＮＳ炎症が、すなわち、ミクログリア／マクロファージ活性化を介して、再ミエリン化の成功において重要な役割を果たすことを実証している。例えば、脱髄のマウスモデルへのクロドロネート−リポソームまたはミノサイクリンの注射によるマクロファージの枯渇は、病変におけるオリゴデンドロサイト系統細胞の進行を妨げることによって再ミエリン化を著しく阻害する。さらに、慢性的に脱ミエリン化した軸索において炎症が誘発されることにより、ＯＰＣの分化及び再ミエリン化が引き起こされる。逆説的に、炎症はまた、再ミエリン化ができないことに関係している。特に、高悪性度または慢性炎症が、不十分な成熟オリゴデンドロサイト及び再ミエリン化を示す進行性ＭＳ病変において頻繁に観察されている。さらに、脱ミエリン化マウスＣＮＳにＭＳ患者からのリンパ球を移植すると、ミクログリア／マクロファージの活性化が増強され、ＯＰＣ増殖がもたらされるが、再ミエリン化のためにオリゴデンドロサイトに分化することはできないことが示されている。確かに、慢性ＭＳ病変は、脱ミエリン化損傷に応答して病変に動員された豊富なＯＰＣを示すが、炎症が未収束である環境下では再ミエリン化オリゴデンドロサイトに分化できなかった可能性がある。まとめると、これらの研究は、ＯＰＣが結集して病変へ動員され、病変において増殖する際に炎症の有益な効果があるにもかかわらず、効率的なオリゴデンドロサイト系統細胞の進行及び再ミエリン化を確実にするために炎症を最終的に収束させなければならないことを示唆している。
【発明の概要】
【０００７】
本出願は、ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態を処置するための方法および組成物に関する。この方法は、ＣＮＳにおける炎症の増強の処置を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。
【０００８】
本出願はまた、炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関し、この組成物は、哺乳動物のＣＮＳへの直接投与用に処方される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＣＮＳ病変の免疫細胞におけるＳｌｃ７ａ５の発現を示す。
【図２】実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が誘発されたマウスへの腹腔内注射による、ＪＰＨ２０３の５日間の連続投与を示す。
【図３】ＣＮＳ病変におけるＪＰＨ２０３によるＳｌｃ７ａ５の薬理学的阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
当技術分野において多くの場合「未収束の炎症」と呼ばれる炎症の増強は、急性炎症の２つの相対立する経路、すなわち、抗炎症経路と炎症誘発性経路との間の不均衡であり、免疫システムの全体的な保護特性の破壊をもたらす。「炎症の増強」及び「未収束の炎症」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。持続性の未収束の炎症によって慢性炎症が生じる可能性があり、それによりまた合併症または病状が生じる可能性がある。当業者は、本明細書で使用される未収束の炎症または炎症の増強という用語を容易に理解するであろう。
【００１１】
しかし、炎症は、抗炎症性応答及び炎症誘発性応答の場所に応じて、異なる形態をとることがある。したがって、未収束の炎症及び慢性炎症もまた、炎症の部位に応じて異なる形態をとることがある。例えば、ＣＮＳ内の炎症には、ＣＮＳ中にのみ見られる別個の免疫細胞であるミクログリアが関与する。一方、ミクログリアはＣＮＳ中にのみ見られるため、ＣＮＳ外の炎症にはミクログリアが関与することはできない。
【００１２】
ミクログリアは、ＣＮＳの「常在免疫細胞」であり、ＣＮＳ外では見られない。ミクログリアは、ＣＮＳ外の他のタイプの免疫細胞と表現型及び機能が異なっている。例えば、ミクログリアは通常、ＣＮＳ外の他のマクロファージ集団において典型的に発現するｍＲＮＡ転写物を、発現しないか、または低レベルで発現する。しかし、ミクログリアは通常、酸化的代謝に関連する遺伝子に関してｍＲＮＡが異常に高い発現レベルを示す。参照により組み込まれる、Ｐｅｒｒｙ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｔｅｅｌｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  ３５（５）：  ６０１−６１２  （２０１３）を参照のこと。
【００１３】
ＣＮＳ炎症におけるミクログリアの役割は十分には理解されておらず、ＣＮＳ炎症中のミクログリアの有益または有害な効果に関する矛盾するデータがある。例えば、Ｙｉｎ，  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  ２０１７，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５１５０６７８，  （ｄｏｉ：  １０．１１５５／２０１７／５１５０６７８）は、最近の総説の中で、活性化ミクログリアがＭＳの際に神経保護効果をもたらすことがあると報告している。Ｂｏｇｉｅ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏ−Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，  １２８（２）：１９１−２１３  （２０１４）を参照のこと。一方、活性化ミクログリアは、ＭＳの進行中に神経毒性作用を及ぼす可能性もある。現時点では、ミクログリアの活性を阻害するとＣＮＳ内の炎症に罹患している患者に治療的緩和がもたらされるのか、またはミクログリアの増殖及び／または活性化を促進するとＣＮＳ内の炎症に罹患している患者に治療的緩和がもたらされるのかは、不明なままである。
【００１４】
本出願は、ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態を処置するための方法（治療法）及び組成物に関する。治療法は、ＣＮＳにおける炎症の増強の処置を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。１つの特定の実施形態では、治療法は、ＣＮＳにおける炎症の増強の処置を必要とする対象に、ミクログリア細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。
【００１５】
一実施形態では、ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態は、ＣＮＳの白質または灰白質のいずれかにおけるニューロンの脱ミエリン化を特徴とする。脱ミエリン化のプロセスは当技術分野では周知であり、ニューロンを取り囲むミエリン鞘の分解、損傷、または完全性の喪失に関連する病状である。一実施形態では、脱ミエリン化は、正常で健康なミエリンが、その完全性を喪失する、及び／または化学毒素、ウイルスもしくは細菌感染、または免疫系の不均衡などであるがこれらに限定されない傷害によって破壊される脱ミエリン化ミエリン破壊性疾患である。脱ミエリン化ミエリン破壊性疾患のいずれにおいても、少なくとも最初は炎症反応が存在し、この炎症は、次に、未収束となり、または増強して、より広範囲の脱ミエリン化をもたらす。
【００１６】
選択された実施形態では、本発明の方法を使用して処置され得る、脱ミエリン化が起こるＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態としては、限定されないが、臨床的単一症発症型（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＩＳ）、再発性進行性ＭＳ、一次進行性ＭＳ、二次進行性ＭＳ、腫瘤形成性ＭＳ、空洞性病変を伴うＭＳ、脊髄皮質（ｍｙｅｌｏｃｏｒｔｉｃａｌ）ＭＳ、デビック病、バロ同心性硬化症、シルダーびまん性硬化症、及びマールブルグＭＳ、を含む、ＭＳが挙げられる。
【００１７】
本発明の方法を使用して処置され得る、脱ミエリン化が起こるＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする他の状態としては、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、視神経脊髄炎スペクトル障害（ＮＭＯＳＤ）、自己免疫性脳炎、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体関連脱髄（Ａｎｔｉ−ＭＯＧ）、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ）、横断性脊髄炎、慢性再発性炎症性視神経炎（ＣＲＩＯＮ）、及び参照により組み込まれる、Ｈｏｆｔｂｅｒｇｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｌａｓｓｍａｎｎ，  Ｈ．，    “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ”    ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｏｖａｃｓ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ａｌａｆｕｚｏｆｆ，  Ｉ．，  Ｅｄｓ．，  Ｖｏｌ  １４５，  ｐｐ．  ２６３−２８３  （２０１８）、において考察されている他の炎症性脱ミエリン化疾患、などであるが、これらに限定されない炎症性脱ミエリン化疾患を含む。
【００１８】
本発明の方法を使用して処置され得る、ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする他の状態としては、限定されないが、がん治療後の放射線誘発損傷、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ウイルス感染、脊髄損傷、視神経損傷、及び脳性麻痺、などであるが、これらに限定されない、脱ミエリン化が必ずしも起こらない状態が挙げられる。もちろん、脱ミエリン化は、ＣＮＳにおける潜在的炎症のために列挙された状態のいずれかにおいて発生する場合がある。
【００１９】
本発明はまた、対象のＣＮＳにおける炎症の増強の影響を低減する方法（予防的方法）に関する。予防的方法は、ＣＮＳにおける炎症の増強の影響を低減するための処置を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。１つの特定の実施形態では、予防的方法は、ＣＮＳにおける炎症の増強の影響を低減するための処置を必要とする対象に、ミクログリア細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。
【００２０】
本発明はさらに、対象のＣＮＳにおける炎症を軽減する方法；ＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態を有する対象のＣＮＳにおけるニューロンの再ミエリン化を増加させる方法；及びＣＮＳにおける炎症の増強を特徴とする状態を有する対象のＣＮＳにおいて、オリゴデンドロサイトの再ミエリン化オリゴデンドロサイトへの分化を増加させる方法、に関する。これらの方法は、本発明の実施形態に従って、対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。
【００２１】
追加の実施形態では、治療法及び／または予防的方法は、は、ＣＮＳにおける炎症の増強の処置を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する他のタイプの炎症性細胞、例として、これらに限定されないが、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び内皮細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。ＣＮＳに存在するこれらのタイプのマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び内皮細胞は、それらの表現型及び機能に関して当業者によって容易に識別可能である。
【００２２】
特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ミクログリア細胞においてのみアミノ酸トランスポーターを阻害する。別の特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ミクログリア、ならびにマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び内皮細胞などであるがこれらに限定されない、ＣＮＳに存在する少なくとも１つの他のタイプの炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターを阻害する。別の特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＮＳに存在するミクログリアならびにマクロファージにおけるアミノ酸トランスポーターを阻害する。別の特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＮＳに存在するミクログリアならびにＴ細胞におけるアミノ酸トランスポーターを阻害する。別の特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＮＳに存在するミクログリアならびにＢ細胞におけるアミノ酸トランスポーターを阻害する。別の特定の実施形態では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＮＳに存在するミクログリアならびに内皮細胞におけるアミノ酸トランスポーターを阻害する。
【００２３】
一実施形態では、本発明の治療的及び／または予防的方法は、ＣＮＳに存在する炎症性細胞にアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含み、対象または患者は哺乳動物である。本明細書では、対象及び患者という用語は、交換可能に使用される。１つの特定の実施形態では、本発明の治療的及び／または予防的方法は、ＣＮＳに存在する炎症性細胞にアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含み、対象または患者は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌまたはネコである。アミノ酸トランスポーターの阻害剤が投与される非ヒト対象は、一般に、動物モデル研究において炎症が誘発された動物である。
【００２４】
本発明の治療的及び／または予防的方法は、ＣＮＳに存在する炎症性細胞にアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、阻害されるアミノ酸トランスポーターは、大型アミノ酸トランスポーターの小サブユニット１（ＬＡＴ１）である。
【００２５】
ＬＡＴ１タンパク質は、Ｓｌｃ７ａ５遺伝子によってコードされる、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、アルギニン、及びトリプトファンなどの「大型」中性アミノ酸のナトリウム非依存性の高親和性トランスポーターである。参照により組み込まれているワールドワイドウェブ上のｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０１６５０で入手可能なＵｎｉＰｒｏｔレコードＱ０１６５０を参照のこと。ＬＡＴ１タンパク質は、「成人の肺、肝臓、脳、骨格筋、胎盤、骨髄、精巣、静止リンパ球、単球、及び胎児の肝臓」において豊富に発現している。ＵｎｉＰｒｏｔレコードＱ０１６５０。ＬＡＴ１タンパク質はまた、「胸腺、角膜、網膜、末梢白血球、脾臓、腎臓、結腸、及びリンパ節」においてはるかに少ない程度で発現している。ＵｎｉＰｒｏｔレコードＱ０１６５０。ＬＡＴ１タンパク質はオリゴデンドロサイトにおいては発現しておらず、ミクログリアにおけるＬＡＴ１タンパク質の発現を実証する既知の報告またはデータは、現在存在しない。さらに、ＣＮＳに位置するマクロファージ、Ｔ細胞、またはＢ細胞におけるＬＡＴ１タンパク質の発現を実証する既知の報告は、存在しない。
【００２６】
もちろん、本治療法及び／または予防的方法を非ヒト哺乳動物で実施する場合、その方法は、ヒトＬＡＴ１のオルソログの阻害剤を投与することを含む。
【００２７】
一実施形態では、治療または予防を必要とする対象に投与されるアミノ酸トランスポーターの阻害剤は、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩である。ＪＰＨ２０３化合物は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−（（５−アミノ−２−フェニルベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）メトキシ）−３，５−ジクロロフェニル）プロパン酸であり、Ｃ２３Ｈ１９Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４である。ＪＰＨ２０３化合物は、塩酸塩の形態で発生する可能性もある。一実施形態では、治療を必要とする対象に投与されるアミノ酸トランスポーターの阻害剤は、ＪＰＨ２０３である。一実施形態では、治療を必要とする対象に投与されるアミノ酸トランスポーターの阻害剤は、ＪＰＨ２０３塩である。１つの特定の実施形態では、治療を必要とする対象に投与されるアミノ酸トランスポーターの阻害剤は、ＪＰＨ２０３塩酸塩である。本明細書で使用される場合、「ＪＰＨ２０３」という用語は、化合物またはその医薬塩を意味すると理解される。
【００２８】
本発明の治療法及び／または予防的方法で使用される化合物またはその塩は、ＣＮＳに全身または局所投与することができる。１つの特定の実施形態では、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩は、ＣＮＳに全身または局所投与される。化合物またはその薬学的に許容される塩を全身投与する場合、本発明の方法は、静脈内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、髄腔内、皮下、及び経鼻を含むがこれらに限定されない投与経路を介して、化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。１つの特定の実施形態では、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩は、静脈内、経口、腹腔内、筋肉内、皮内、髄腔内、皮下、及び経鼻を含むがこれらに限定されない投与経路を介して全身投与される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、ＣＮＳにおける炎症またはその少なくとも１つの検出可能な症状の改善を指す。あるいは、「処置」または「処置すること」は、ニューロンの脱ミエリン化などであるがこれに限定されない、ＣＮＳにおける炎症によってもたらされる、患者によって必ずしも認識可能ではない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「処置」または「処置すること」は、物理的、例えば、認識可能な症状の安定化、生理学的、例えば、物理的パラメータの安定化のいずれかにより、またはその両方により、疾患または障害の進行を阻害することを指す。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＮＳにおける炎症の影響に対する予防措置として、患者、例えばヒトに投与される。本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、ＣＮＳにおける炎症に関連するので、活性化合物を対象に投与して影響を少なくとも部分的に阻害するか、または対象がＣＮＳにおける炎症の影響を受ける可能性を低減することを示す。もちろん、「予防する」という用語はまた、ＣＮＳの炎症に関連する症状の出現が検出可能に現れることを完全に妨げることを包含する。
【００３１】
化合物（複数可）を治療目的で対象に投与する場合、対象は、ＣＮＳにおける炎症、例えば、ＭＳを特徴とする状態とすでに診断されている。治療法は、ＣＮＳにおける炎症の進行またはＣＮＳにおける炎症の影響を少なくとも緩徐させることを目的としている。ＣＮＳにおける炎症に関連する「進行を緩徐させる」という句は、ＣＮＳにおける炎症の１つまたは複数の症状をすでに呈している患者における１つまたは複数の症状の検出可能な出現を少なくとも部分的に阻害するように設計された手順を意味するために使用され、すでに存在する、ＣＮＳにおける炎症の症状が、対象において悪化するのを少なくとも部分的に阻害することを意味するためにも使用される。もちろん、本発明の治療方法はまた、ＣＮＳにおける炎症の進行またはＣＮＳにおける炎症の影響を停止させまたは逆転さえさせることも目的とすることができる。
【００３２】
化合物（複数可）を、予防目的で対象に投与する場合、化合物（複数可）を、脱ミエリン化の検出可能な症状の発症前に、一般に投与する。したがって、ＣＮＳに存在する炎症誘発性細胞にアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することにより、対象を「前処置」することができる。したがって、本発明はまた、対象のＣＮＳにおける炎症の増強の影響を前処置する方法であって、ＣＮＳにおける炎症の増強の前処置を必要とする対象に、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することを含む、方法に関する。
【００３３】
本発明の前処置方法は、一般に、対象がＣＮＳにおける炎症の症状を呈していない場合に、アミノ酸トランスポーターの阻害剤、例えば、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。選択された実施形態では、アミノ酸トランスポーターの阻害剤、例えば、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩の投与は、対象がＣＮＳにおける炎症を誘発することが知られている損傷に罹患した後に起こり得る、すなわち、アミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与する前に、対象は、ＣＮＳにおける炎症を誘発することが知られている損傷に罹患している。
【００３４】
前処置方法の選択された実施形態では、ＣＮＳにおいて炎症を誘発することが知られている損傷は、がん治療後の放射線誘発損傷、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ウイルス感染、脊髄損傷、および視神経損傷、のうちの１つであり得る。
【００３５】
前処置方法の選択された実施形態では、アミノ酸トランスポーターの阻害剤、例えば、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を、損傷から約７日以内に対象に投与する。より具体的な実施形態では、アミノ酸トランスポーターの阻害剤、例えば、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を、損傷から約６日以内、損傷から約５日以内、損傷から約４日以内、損傷から約３日以内、損傷から約４８時間以内、損傷から約３６時間以内、損傷から約２４時間以内、損傷から約１２時間以内、損傷から約６時間以内、損傷から約２時間、または損傷から約１時間以内に、対象に投与する。
【００３６】
ＪＰＨ２０３またはその塩の作用機序は、本発明の処置及び／または前処置方法にとって重要ではない。しかし、１つの特定の実施形態では、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩は、ＣＮＳにおける炎症の処置または前処置を必要とする対象に投与される場合、ＣＮＳに存在する炎症性細胞におけるｍＴＯＲ（ラパマイシンの機械的標的）シグナル伝達を選択的に阻害する。しかし、１つの特定の実施形態では、ＪＰＨ２０３またはその塩は、ＣＮＳにおける炎症の処置または前処置を必要とする対象に投与される場合、ミクログリアにおけるｍＴＯＲシグナル伝達を選択的に阻害する。当業者が認識しているように、ｍＴＯＲは、細胞周期、増殖、及び細胞生存の調節に関与するキナーゼである。ｍＴＯＲの活性化の効果は細胞タイプに特異的であるが、ｍＴＯＲの活性化にはアミノ酸が必要である。
【００３７】
したがって、１つの特定の実施形態では、本発明の処置及び／または前処置方法は、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置を必要とする対象において、ＣＮＳに存在する炎症細胞におけるｍＴＯＲキナーゼの活性を阻害することを含む。より具体的な実施形態では、本発明の方法は、ＪＰＨ２０３またはその塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置を必要とする対象において、ＣＮＳのミクログリアにおけるｍＴＯＲキナーゼの活性を阻害することを含む。追加の特定の実施形態では、本発明の方法は、ＪＰＨ２０３またはその塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置を必要とする対象において、ＣＮＳのマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／または内皮細胞におけるｍＴＯＲキナーゼの活性を阻害することを含む。
【００３８】
処置または前処置を必要とする対象に、ＣＮＳの炎症性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤を投与することによって、対象のＣＮＳ内のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）（またはオリゴデンドロサイト前駆体細胞）の再ミエリン化オリゴデンドロサイトへの分化が増加または促進され得る。オリゴデンドロサイト細胞は、当業者に周知であり、神経軸索を覆うミエリンの生成に関与する細胞である。オリゴデンドロサイトの大部分は胚形成中に形成されるが、成人ではＯＰＣがＣＮＳにおける病変に動員され、より成熟したミエリン産生オリゴデンドロサイトに分化する可能性がある。
【００３９】
しかし、慢性炎症または持続性の未収束の炎症の場合、ＯＰＣは、それらが病変に動員されたとしても、ミエリン産生オリゴデンドロサイトに分化することができないことがある。ＣＮＳに存在する活性化ミクログリアまたは他の活性化炎症細胞は、ＯＰＣが成熟オリゴデンドロサイトへ分化するのをブロックするように見える。したがって、１つの特定の実施形態では、本発明の方法は、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置を必要とする対象において、ＣＮＳにおける再ミエリン化オリゴデンドロサイトへのＯＰＣの分化を促進することを含む。
【００４０】
したがって、本発明の処置及び／または前処置方法はまた、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置を必要とする対象において、ＣＮＳにおけるニューロンの再ミエリン化を促進することを含み得るということになる。脳及び脊髄のミエリン含有量を測定または視覚化することとしては、ミエリン水画分、磁化伝達比（ＭＴＲ）、制限的プロトン画分ｆ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆ）（定量的ＭＴＲから取得）、拡散テンソルイメージング（ＤＴＩ）メトリック、及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングが挙げられるが、これらに限定されない。脱ミエリン化及び／または再ミエリン化のレベル及び程度を評価するという観点から、ミエリン含有量を測定するためのこれらの技術は、当技術分野において周知である。参照により組み込まれている、Ｍａｌｌｉｋ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，  ８５：１３９６−１４０４  （２０１４）  （ｄｏｉ：  １０．１１３６／ｊｎｎｐ−２０１４−３０７６５０）を参照のこと。
【００４１】
当技術分野において周知であるように、神経軸索の再ミエリン化により、神経ジストロフィーが減少し、及び／または神経変性が減少する。したがって、１つの特定の実施形態では、本発明の処置及び／または前処置方法は、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することによって、ＣＮＳにおける炎症の処置または前処置を必要とする対象において、ＣＮＳにおける神経ジストロフィーを減少させること及び／または神経変性を減少させることを含む。
【００４２】
本出願はまた、炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物に関し、この組成物は、哺乳動物のＣＮＳへの投与用に処方される。１つの特定の実施形態では、ＣＮＳの炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーターの阻害剤は、ＪＰＨ２０３またはその薬学的に許容される塩である。本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、ＪＰＨ２０３などのアミノ酸トランスポーターの活性阻害剤、及びその薬学的に許容される塩を意味するために使用される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＣＮＳへの投与」という句は、ＣＮＳへの活性化合物の直接の局所投与を意味することができ、または活性化合物が血液脳関門を通過してＣＮＳにはいることができるという条件で、化合物の全身投与を意味することもできる。例えば、ＪＰＨ２０３及びその薬学的に許容される塩は、血液脳関門を通過することができる。
【００４４】
投与経路に関係なく、本発明の活性化合物の好適な投与量範囲は、一般に、体重１キログラムあたり約０．０００１ミリグラム〜２０００ミリグラムの本発明の化合物である。１つの特定の実施形態では、用量は、体重１キログラムあたり約０．００１ミリグラム〜約１５００ミリグラム、より具体的には、体重１キログラムあたり約０．０１ミリグラム〜約１０００ミリグラム、より具体的には、体重１キログラムあたり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラム、さらにより具体的には、体重１キログラムあたり約１ミリグラム〜約１００ミリグラム、である。
【００４５】
本発明の化合物及び組成物はまた、任意の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与してもよく、それらは別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局所的であり得る。種々の送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入が知られており、これらを使用して本発明の化合物または組成物を投与することができる。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数の化合物または組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、例えば、限定としてではなく、硬膜外注射などの局所注入によって；皮膚または粘膜層を通って吸収され得る局所適用；カテーテルなどを介した注射によって；座薬によって；またはインプラントによって達成することができ、インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の材料であり、これには、シラスティック膜などであるがこれに限定されない膜、または繊維が含まれる。
【００４７】
経肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブライザー、及びエアロゾル化剤を用いた製剤の使用によって、またはフルオロカーボンもしくは合成肺サーファクタントにおける灌流を介して使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、従来の結合剤及びビヒクル、例としてトリグリセリド、を用いて、座薬として処方することができる。
【００４８】
本組成物は、好適な量の薬学的に許容されるビヒクルと共に、治療有効量のＪＨＰ２０３またはその薬学的に許容される塩などのアミノ酸トランスポーターの阻害剤を含有して、患者への適切な投与のための形態を提供する。
【００４９】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、より詳細にはヒトにおいて使用するために、連邦または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または一般に認められている他の薬局方に列挙されていることを意味する。「ビヒクル」という用語は、それと共に本発明の化合物を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。そのような薬学的ビヒクルは、例として、水、及び石油、動物、植物または合成油由来のものを含む油、例として、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、もしくはごま油など、の液体であり得る。薬学的ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤を使用してもよい。患者に投与する場合、本発明の化合物及び薬学的に許容されるビヒクルは、好ましくは減菌である。本発明の化合物を静脈内投与する場合、滅菌水はビヒクルとなり得る。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射液のための液体ビヒクルとして使用することができる。好適な薬学的ビヒクルとしてはまた、賦形剤、例えばスターチ、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【００５０】
本製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、粉末、徐放性製剤、座薬、エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に好適な任意の他の形態をとることができる。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の化合物及び／または組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、定型的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための本発明の化合物及び／または組成物は、減菌水性等張緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤を含むこともできる。静脈内投与のための組成物は、注射部位で痛みを緩和するために、リグノカインなどの局所麻酔剤を任意に含み得る。一般に、本発明の製剤の成分は、単位剤形で、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの気密封止容器内に乾燥した凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別々に供給されるか、あるいは一緒に混合されて供給される。本発明の化合物を注入によって投与する場合、それは、例えば、減菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注することができる。本発明の化合物を注射によって投与する場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５２】
１つの特定の実施形態では、本発明の組成物は、経口投与することができる。経口送達のための製剤は、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、顆粒、粉末、エマルション、カプセル、シロップ、またはエリキシルの形態であり得る。経口投与される組成物は、薬学的に口当たりの良い製剤を提供するために、１つまたは複数の任意の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリーなどの香料添加剤；着色剤；および保存剤を含有してもよい。さらに、錠剤または丸剤の形態では、組成物は、胃腸管における崩壊及び吸収を遅らせるためにコーティングされてもよく、それにより長期間にわたって持続作用を提供する。浸透圧活性駆動化合物を取り囲む選択的透過性膜も、本発明の経口投与化合物に好適である。１つの特定のプラットフォームでは、カプセルを取り囲む環境からの流体が推進化合物によって吸収され、駆動化合物は膨潤して、薬剤または薬剤組成物を開口部を通って移動させる。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤のスパイクプロファイルとは対照的に、本質的にゼロ次送達プロファイルを提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールのような時間遅延材料を使用することもできる。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なビヒクルを含むことができる。
【００５３】
ＣＮＳにおける炎症の処置に有効である本発明の化合物の量は、炎症の性質または程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロまたはインビボアッセイを使用して、最適な投与量範囲を特定することができる。本発明の製剤に使用される正確な用量はまた、投与経路及び状態の程度に依存し、投薬は、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。本発明の特定の実施形態では、ＣＮＳの炎症誘発性細胞におけるアミノ酸トランスポーター（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ）の阻害剤の経口用量は少なくとも、体重１キログラムあたり約０．０１ミリグラム〜約１００ミリグラム、または体重１キログラムあたり約０．１ミリグラム〜約５０ミリグラム、または体重１キログラムあたり約０．５ミリグラム〜約２０ミリグラム、または体重１キログラムあたり約１ミリグラム〜約１０ミリグラムである。
【００５４】
非経口投与、例えば、静脈内投与のための活性化合物の好適な投与量範囲は、体重１キログラムあたり０．０１ミリグラム〜１００ミリグラム、体重１キログラムあたり０．１ミリグラム〜３５ミリグラム、及び体重１キログラムあたり１ミリグラム〜１０ミリグラムであり得る。鼻腔内投与ための活性化合物の好適な投与量範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。座薬は、一般に、体重１キログラムあたり、０．０１ミリグラム〜５０ミリグラムの本発明の活性化合物を含有する。局所投与ための活性化合物の好適な用量は、化合物が投与される領域に応じて、０．００１ミリグラム〜１ミリグラムの範囲である。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験システムから得られた用量反応曲線から推定することができる。そのような動物モデル及びシステムは、当該技術分野において周知である。
【００５５】
本発明はまた、本発明の活性化合物を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器（複数可）に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用、または販売の政府機関による承認を表す。
【実施例】
【００５６】
［実施例１−ＬＡＴ１をコードするｍＲＮＡの発現］
局所脱ミエリン化を、いずれかの性別の８〜１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスの前索に、１％リゾレシチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射することによって誘発した。病変後（ｄｐｌ）５日及び１０日目に、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｓｉｇｍａ）を、マウスの心臓内に灌流させた。
【００５７】
損傷及び非損傷脊髄切片におけるＳｌｃ７ａ５  ｍＲＮＡの発現を定量するために、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＡＣＤ，  Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１１４０４．３の配列を標的とするように設計された特定のプローブによって標識したｓｌｃ７ａ５  ｍＲＮＡを検出した。固定凍結組織切片のＲＮＡｓｃｏｐｅ  マルチプレックス蛍光アッセイを、製造元の指示（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＡＣＤ，  Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ）に従って実施した。要約すると、損傷脊髄の厚さ１２．５μｍの冠状切片（５及び１０ｄｐｌで収集）を含有するスライドを、沸騰した１×標的賦活化緩衝液（ＡＣＤ）中に５〜１０分間浸し、続いてプロテアーゼＩＩＩ処理（ＡＣＤ）を４０℃にて３０分間行った。ハイブリダイゼーション及びシグナル増幅ステップのためのＡＣＤプロトコルに続いて、スライドを、Ｔ細胞（ＣＤ−３）及びミクログリア／マクロファージ（ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰ）−特異的マーカーを用いたその後の免疫組織化学（ＩＨＣ）に供した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡を使用して画像を取得した。ｍＲＮＡ蛍光輝点は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して定量化した。
【００５８】
ＩＨＣを実施するために、マウスを４％ＰＦＡ（シグマ）により灌流固定した。脊髄を切開し、４℃にて４％ＰＦＡ中で３０分間、後固定し（ｐｏｓｔｆｉｘｅｄ）、ＰＢＳ中の２０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ）中で一晩凍結保護した後、ドライアイスの表面上のＯ．Ｃ．Ｔ．中で凍結した。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１９００）を使用して、厚さ１２マイクロメートルの脊髄切片を切り取り、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔＰｌｕｓスライド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に収集し、３０分間乾燥させた後、−８０℃で保存した。ＩＨＣ用に、切片をブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００及び１０％ＦＢＳ）中で、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、４℃で一晩適用した。蛍光色素コンジュゲート二次抗体はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、製造元の指示に従って使用した。
【００５９】
図１は、分析の結果を示す。図１Ａは、Ｓｌｃ７ａ５  ｍＲＮＡの定量化を示しており、対側の非病変白質と比較して、５ｄｐｌ及び１０ｄｐｌで病変の密度が増加していることを示している（ｎ＝２）。図１Ｂ及び１Ｃは、５ｄｐｌでのＳｌｃ７ａ５転写産物との共免疫染色を示し、ＣＮＳ病変内の（１Ｂ）ＣＤ−３＋Ｔ細胞及び（１Ｃ）Ｃｘ３ｃｒ１−ＧＦＰ＋ミクログリア／マクロファージにおけるＳｌｃ７ａ５の検出を示している。図１Ｄは、隣接する非病変組織における静止ミクログリアにおいて検出されたＳｌｃ７ａ５蛍光輝点が非常に少ないことを示している。スケールバーは１０μｍである。
【００６０】
［実施例２−実験動物モデルにおけるＪＰＨ２０３投与の分析］
１０〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を７日間馴化させた後、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発させた。ＥＡＥを、ＥＡＥキット（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：ＥＫ−２１１０）を使用して、Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓプロトコル（ワールドワイドウェブ上のｈｏｏｋｅｌａｂｓ．  ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｅａｅＡＩ＿Ｃ５７ＢＬ６．ｈｔｍｌ）に従って誘発させた。要約すると、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＭＯＧ３５−５５のエマルションを２つの部位に皮下注射してマウスを免疫し（０日目）、続いて百日咳毒素（ＰＴＸ）を最初に免疫付与の日（０日目）に、次に翌日（１日目）に再び、腹腔内投与した。２回のＰＴＸ投与のそれぞれに、およそ１１５ｎｇのＰＴＸを使用した。
【００６１】
Ｈｏｏｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのプロトコルに従って、ＥＡＥ７日目から少なくともＥＡＥ３０日目まで、マウスを盲検的にかつ毎日スコア化した。使用したスコア化システムは、以下のとおりであった：０．０＝運動機能に明白な変化はない；０．５＝尾の先端はだらりとしている；１．０＝だらりとした尾；１．５＝だらりとした尾、及び後肢抑制；２．０＝だらりとした尾、及び後肢の衰弱、または頭部傾斜の兆候；２．５＝だらりとした尾、及び後肢の引きずり、または強い頭部傾斜；３．０＝だらりとした尾、及び後肢の完全な麻痺、または一方の前脚及び一方の後肢の麻痺を伴うだらりとした尾。３．５＝だらりとした尾、及び後肢の完全な麻痺、加えてマウスを横にすると起き上がることができなくなる；４．０＝だらりとした尾、後肢の完全な麻痺、及び前脚の部分的な麻痺、マウスの動きは最小限であるが、警戒しているように見え、餌は食べる；４．５＝後肢の完全な麻痺、及び前脚の部分的な麻痺、ケージ内の周りでの動きなし、マウスは警戒していない；５．０＝麻痺によりマウスが死亡しているのが見つかる、または重度の麻痺によりマウスを安楽死させる。
【００６２】
マウスの臨床スコア及び体重を、実験が終了するまで毎日記録した。ＥＡＥから自発的に回復したマウス、またはスコア３．０に達しなかったマウスは、治療研究の分析では考慮されなかった。各実験について、各群からの８〜１０匹のマウスを分析した。
【００６３】
ＥＡＥマウスを、スコア１．０及び３．０で開始して、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）阻害剤ＪＰＨ２０３二塩酸塩で処置した。図２を参照のこと。ＰＢＳ中に溶解したＪＰＨ２０３二塩酸塩を、２５ｍｇ／ｋｇの用量、２００ｕｌ／動物の注入量で、腹腔内注射により５日間毎日投与した。対照群は、同量の１×ＰＢＳで処置した。各群からの動物の臨床スコアを、最初の注射から１〜７日後に記録した。
【００６４】
ＪＰＨ２０３の処置有効性を、臨床スコア３．０で開始してマウスにおいて試験した（図２Ａ）。ＪＰＨ２０３の予防有効性を、臨床スコア１．０で開始してマウスにおいて試験した（図２Ｂ）。両スコアで、ＪＰＨ２０３の投与によって、ＰＢＳ対照と比較して運動回復がもたらされた（群あたりｎ＝６）。さらに、ＪＰＨ２０３予防的処置は、スコア１．０で開始して、スコア３．０以上に進行したＰＢＳ対照と比較して、ＥＡＥがより高いスコアに進行するのを阻止した（図２Ｂ）。
【００６５】
［実施例３−ＣＮＳ病変におけるＪＰＨ２０３の薬理学的効果］
１％リゾレシチンを注射することによって局所脱ミエリン化を誘発し、ＪＰＨ２０３またはＰＢＳ対照に、５〜９ｄｐｌで腹腔内を介して注射した。４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた心臓内灌流により、マウスを１０ｄｐｌで犠死させた。ＩＨＣを、先に記載したように実施した。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１９００）を使用して、厚さ１２マイクロメートルの固定脊髄切片を切り取り、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔＰｌｕｓスライド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に収集し、３０分間乾燥させた後、−８０℃で保存した。ＩＨＣ用に、切片をブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００及び１０％ＦＢＳ）中で、室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、４℃で一晩適用した。一次抗体の供給元及び希釈率は以下のとおりである：ウサギ抗Ｏｌｉｇ２（１：３００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＣＣ１（１：２００；Ｓｉｇｍａ）。蛍光色素コンジュゲート二次抗体はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、製造元の指示に従って使用した。
【００６６】
Ｏｌｉｇ２に対して抗原賦活化を使用し、ＣＣ１に対して、Ｍ．Ｏ．Ｍ．（商標）キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてマウスオンマウス抗原賦活化を使用した。ＤＡＰＩ核対比染色を使用した後、フルオロマウント−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて切片をマウントした。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して、Ｏｌｉｇ２＋ＣＣ１＋細胞を定量化した。
【００６７】
図３は、ＰＢＳ対照（３Ａ）と比較して、ＪＰＨ２０３注射が病変における成熟オリゴデンドロサイトの数の増加をもたらした（３Ｂ）ことを示している。図３Ｃはまた、オリゴデンドロサイトの２倍の増加の定量化を示し、図３Ｄは、多数の活性化Ｉｂａ１＋ｉＮＯＳ＋ミクログリア／マクロファージを含有するＰＢＳ処置病変を示している。図３Ｅは、炎症誘発性ｉＮＯＳ発現の劇的な低下を示すＪＰＨ２０３処置病変を示している。高倍率では、（３Ｆ）対照病変では、ｉＮＯＳ＋マクロファージは、丸みを帯びたアメーバ／泡沫状の外観を呈していたが、ＪＰＨ２０３処置病変（３Ｇ）では、マクロファージは、ｉＮＯＳ標識をほとんど示しておらず、より分岐した外観を呈しており、これは、炎症活性の低下を示していた（１処置群につきｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５
【００６８】
［実施例４］
炎症及び再ミエリン化に対するＳｌｃ７ａ５阻害の効果を特徴決定するために、脱ミエリン化前（予防的アプローチ）対脱ミエリン化後（治療的アプローチ）のＪＰＨ２０３の全身投与を実施する。さらに、Ｓｌｃ７ａ５はオリゴデンドロサイト系統細胞では発現しないため、このアプローチでは、オリゴデンドロサイト系統細胞に影響を与えることなく、ＣＮＳ病変のミクログリア／マクロファージを選択的に標的とすることにより、ＪＰＨ２０３が再ミエリン化を促進するかどうかを判断することができる。予防的処置のために、ＪＰＨ２０３（群１）またはビヒクル（群２）を、リゾレシチン誘発性脱ミエリン化の前に２日間連続して腹腔内注射によって野生型マウスに送達し、脱ミエリン化後、３日間連続して野生型マウスに送達し、その後１０ｄｐｌで犠死させる。治療的処置のために、ＪＰＨ２０３（群３）またはビヒクル（群４）を、脱ミエリン化後５〜９ｄｐｌで腹腔内注射によって送達し、１０ｄｐｌで犠死させる。１０ｄｐｌの時点を選択して、ＪＰＨ２０３がオリゴデンドロサイトの分化を促進するかどうかを決定する。マウスはまた、病変の同定及び分析のためにニュートラルレッド（ＮＲ）注射を受け、その２時間後にマウスを犠死させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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