【手続補正書】
【提出日】平成21年11月17日(2009.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
ａ）ＲＮＡの試料を取得し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを作製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得する工程、
ｂ）３’末端の後方となるポリヌクレオチドテールで転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）１対のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅する工程を特徴とし、第１の（３’）プライマーが、ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーが、ポリヌクレオチドテールの上流部およびｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’ポリＡテールおよびポリＡテールの上流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的である、プライマーが、逆転写に用いられ、ならびに／あるいは、第１の増幅プライマーが、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’ポリＡテールに相補的である、ｃＤＮＡの５’ポリＴ配列、および５’ポリＴ配列の下流にある次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
３’末端のテール付加が、末端トランスフェラーゼを用いて行われることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
増幅がＰＣＲによって行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、増幅産物がその長さにしたがって分離される、好ましくはゲル電気泳動、好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、パルスフィールド電気泳動、アガロースゲル電気泳動、ＰＡＧＥまたはパルスフィールドキャピラリー電気泳動によって分離される追加工程を含む方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、増幅産物の同一性または配列を決定する、好ましくはチップ上の自動工程によって決定する追加工程を含む方法。
【請求項７】
試料が、ある標本由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、好ましくは精製ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する、請求項１〜６記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
高厳密度条件が、逆転写および／または増幅の工程に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
逆転写および／または増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応の選択性が、トレハロース、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、シュウ酸テトラメチルアンモニウム、ホルムアミドおよびオリゴ遮断剤の利用、またはポリメラーゼ連鎖反応中のジメチルスルホキシドの利用により増加させることによって、ミスプライミングの発生を減少させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
逆転写が、モロニーマウス白血病ウィルス、ＡＭＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２に由来する逆転写酵素（ＲＴ）によって行われ、ここで、該ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ活性が、存在するか、減少するかまたは存在しないところの、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
逆転写または増幅に用いられるプライマーが、ウォブル置換を有し、好ましくはｄＴが、その３’末端上の１または２個の塩基、好ましくは最終ヌクレオチドの２〜４個上流の位置で、ｄＧ、ｄＡもしくはｄＣによって置換され、またはその逆の置換を起こし、ウォブル塩基が、好ましくは、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣなどの任意の正規核酸塩基と塩基対を形成しうるユニバーサル塩基、好ましくはデオキシイノシン、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシドによる置換を表している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プライマーおよびＲＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド間のミスマッチに反応するポリメラーゼを用いる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、該ポリメラーゼが、ミスマッチしたエキソヌクレアーゼ耐性プライマーを伸長させず、該プライマーが、特に好ましくはホスホロチオエート修飾または固定された核酸により、エキソヌクレアーゼに耐性であるところの、方法。
【請求項１３】
逆転写中に鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて、オリゴｄＣの３’配列、好ましくは１〜６個のｄＣヌクレオチドの長さを有するｃＤＮＡを生成する請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法であって、オリゴｄＣのキャップ依存的３’配列が、増幅中にオリゴｄＣ配列に特異的な第２プライマーにより完全に転写されたｃＤＮＡを単離するために用いられる、方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡの３’末端のテール付加が、ｄＣが存在しないことを特徴とするポリヌクレオチド配列を用いて行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆ１  ＤＮＡポリメラーゼ、ａＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅまたはＫｌｅｎｔａｑならびに／あるいはＰＦＵ、Ｕｌｔｍａ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ＰＷＯおよびＴｌｉの各ポリメラーゼまたはイー・コリエキソヌクレアーゼＩＩＩから選択される、プルーフリーディング活性を有する酵素である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試料中のＲＮＡまたはｃＤＮＡが、ＰＣＲによって前増幅されるか、あるいはＲＮＡ試料が、規格化またはサブトラクトされる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅反応に用いられるプライマーが、一般式ｄＰｘｄＧｙＨＮｚ（式中：Ｐｘは、３’末端のｃＤＮＡに付加した配列に相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは、好ましくは２〜５の整数であり、Ｈは、ｄＴまたはｄＡまたはｄＣのいずれかであり、Ｎは、長さｚを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは、０〜１０、好ましくは０〜５の整数である）によって特徴付けられる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
増幅がＰＣＲにより行われ、ＰＣＲプライマーが、ｃＤＮＡの３’または５’オリゴヌクレオチド末端配列の末端に適切に配置することを可能とする、アンカー配列を含有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
増幅プライマーまたは逆転写プライマーが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含有し、プロモーターが、Ｔ７またはＴ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによって転写を促進する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
増幅プライマーおよび／または増幅産物が、レポーター基、好ましくは蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは放射性同位体によって標識化され、該レポーター基が、ＤＮＡを検出するために用いられる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
任意のヌクレオチド、好ましくは１〜３個のヌクレオチドが、転写後であるが（例えば、ポリＡ）テール付加の前にＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’末端に付加され、逆転写および／またはＰＣＲ用のプライマーが、任意配列に対応するウォブルを有する配列を含有するところの、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物が、生成され、異なる長さを有し、異なる５’もしくは３’末端配列のＲＮＡまたは全長ｃＤＮＡを認識する異なるプライマーを用いることによって、ＲＮＡと比較してその５’および／または３’末端の所定数のヌクレオチドまで特異的に増大する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリＡテールまたはテール配列を有しない、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ試料が用いられ、好ましくはポリヌクレオチドテール、特に好ましくはポリＡテールが、逆転写前に合成的に付加される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
２種のｃＤＮＡプール、好ましくは２種の試料間の対応するプール間の相違点の検出が、増幅工程中またはその終わりに、好ましくはリアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
５’プライマーまたは３’プライマーまたは５’−３’プライマー対が、固体支持体上にスポットおよび／または結合し、好ましくはスポットまたは固体支持体が、所定の２次元または３次元領域に局在し、好ましくはかかる領域が、領域に局在されるプライマーまたはプライマー対の同一性を解読する情報を含有するところの、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
逆転写および増幅の工程が一工程で行われる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
末端トランスフェラーゼによって付加されるポリヌクレオチドテールが、鋳型ＲＮＡまたはｍＲＮＡの５’キャップに応じて、逆転写中に生成される、好ましくは１〜６個のｄＣヌクレオチドの長さを有する、オリゴｄＣの３’配列の後方にあるリボヌクレオチド、好ましくは２〜６個のリボヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはチミジンからなり、第２の増幅プライマー（５’プライマー）が、リボヌクレオチドおよびオリゴｄＣおよびオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
テールが、好ましくはキャップ依存的手法において、逆転写酵素の鋳型交換能によりｃＤＮＡに付加され、第２の増幅プライマー（５’プライマー）が、そのように付加されたテールおよびオリゴｄＣおよびオリゴｄＣ配列の上流にある１〜１０ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とするメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを測定する方法であって、増幅産物の分離および／または同定を含む方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法に用いるキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、逆転写酵素または異種ポリメラーゼの混合物、ポリメラーゼが必要とする補因子または金属イオン、好ましくはＭｇ２＋およびＭｎ２＋の塩、ｃＤＮＡの３’末端またはＲＮＡの対応する５’末端に選択的である、好ましくはＲＮＡまたはｃＤＮＡの第１、第２、第３、第４および／または第５の末端ヌクレオチドに選択的である、式ｄＰｘｄＧｙｄＴＮｚ、ｄＰｘｄＧｙｄＡＮｚおよびｄＰｘｄＧｙｄＣＮｚ（式中：ｄＰｘはｃＤＮＡの３’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは、好ましくは２〜５の整数であり、Ｎは、長さｚを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは、０〜１０、好ましくは０〜５の整数である）、およびｃＤＮＡの５’末端またはＲＮＡの対応する３’末端に選択的であるプライマーを含む少なくとも３種のプライマー、ならびに末端トランスフェラーゼおよびさらなる緩衝物質を含む、キット。
【請求項３１】
所定の領域、好ましくはスポット中に少なくとも２個、好ましくは少なくとも９個、特に好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも６０個の、異なる５’プライマーおよび３’プライマーまたはプライマー対を含み、５’プライマーが、３’ポリヌクレオチドテールの上流部および３’ポリヌクレオチドテールの上流の隣の１〜１０個のヌクレオチドに特異的であり、式ｄＰｘｄＧｙｄＴＮｚ、ｄＰｘｄＧｙｄＡＮｚおよびｄＰｘｄＧｙｄＣＮｚ（式中：ｄＰｘはｃＤＮＡの３’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは、好ましくは２〜５の整数であり、Ｎは、長さｚを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは、０〜１０、好ましくは０〜５の整数である）を含む固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップ。
【請求項３２】
所定の領域、好ましくはスポット中に少なくとも２個、好ましくは少なくとも９個、特に好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも６０個の、一般式ｄＰｘｄＧｙｄＴＮｚ、ｄＰｘｄＧｙｄＡＮｚおよびｄＰｘｄＧｙｄＣＮｚ（式中：ｄＰｘはｃＤＮＡの３’末端テールに相補的なヌクレオチドを表し、ｄＧはデオキシグアニレートであり、ｙは、好ましくは２〜５の整数であり、Ｎは、長さｚを有するヌクレオチド配列であって、その構成ヌクレオチドは、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧまたはｄＴから独立して選択され、ｚは、０〜１０、好ましくは０〜５の整数である）またはその相補体を含む異なる５’プライマーおよび３’プライマーを含み、好ましくは以下の配列：ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＣ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＧＴ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＣＡ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＡＧ、ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＡ、ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＴＴＡの１つを含むプライマーから選択されるところの、固体表面、好ましくはチップ、特に好ましくはガラスチップ。
【請求項３３】
試料中のポリヌクレオチド分子のプールを増幅する方法であって、
ａ）ＲＮＡの試料を取得し、ＲＮＡ分子全体を逆転写することにより、全長ｃＤＮＡを作製するか、または全長ｃＤＮＡの試料を取得する工程、
ｂ）３’末端の後方にあるポリヌクレオチドテールで転写ｃＤＮＡの３’末端にテール付加する工程、
ｃ）該ｃＤＮＡを１対のプライマーを用いて増幅する工程を特徴とし、第１の（３’）プライマーが、ｃＤＮＡの５’末端に特異的であり、第２の（５’）プライマーが、ポリヌクレオチドテールの上流部およびｃＤＮＡの３’ポリヌクレオチドテールの上流にある次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であり、さらに、１〜１００ヌクレオチド範囲内の上流部にある、非特異的なウォブルヌクレオチドも含み、少なくとも１個のヌクレオチドが、ｃＤＮＡのヌクレオチドに特異的である方法であるところの、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡの３’テール（付加されていてもよい３’テール）またはｍＲＮＡ（好ましくは内因性３’ポリＡテール）および３’テールの上流にある、次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチドに特異的である、プライマーが逆転写に用いられ、ならびに／あるいは、第１の増幅プライマーが、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの３’テールに相補的である、ｃＤＮＡの５’テール、および５’テールの下流にある、次の１〜１００ヌクレオチド、好ましくは次の１〜５０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜２０ヌクレオチド、特に好ましくは次の１〜１０ヌクレオチドに特異的であることを特徴とする、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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