(57)【要約】一つの観点における本発明は、発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列をアデノウイルスのゲノム内に含む宿主細胞において複製且つ溶解することができる複製能力ある組換えアデノウイルスに関する。本発明はまた、とりわけ、発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列を用いて、好ましくはアデノウイルスの文脈において、癌の処置をする手段及び方法に関する。この研究は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ２０２０研究及びイノベーションプログラム、Ｍａｒｉｅ  Ｓｋｌｏｄｏｗｓｋａ−Ｃｕｒｉｅ認可番号６４３１３０によって一部、資金提供された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列をアデノウイルスのゲノム内に含む複製能力ある組換えアデノウイルス。
【請求項２】
腫瘍細胞において該アデノウイルスの優先的複製を可能にする改変を含む、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
前記改変が、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子又は両方の遺伝子における変異を含む、請求項２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
前記改変が、Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂの腫瘍特異的発現の為のプロモーターを含む、請求項２又は３に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記改変が、Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂの組織又は細胞型特異的発現のプロモーターを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
Ｅ３領域における核酸配列の改変を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
前記アデノウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
前記ＧＳＫ３タンパク質がＧＳＫ３ベータタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３タンパク質が、構成的に活性である変異タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
前記ＧＳＫ３タンパク質が、位置９でのセリン残基が、別のアミノ酸残基、好ましくはアラニン残基、によって置換されているＧＳＫ３ベータタンパク質である、請求項９に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
個体において癌を処置する方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列を含む核酸分子を、該処置を必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記癌が、活性なＧＳＫ３、好ましくはＧＳＫ３ベータ、を発現しない又は過剰発現しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列を含む核酸配列を含む組換えウイルスを投与することを含み、好ましくは、該組換えウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノウイルスが、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌細胞を殺す方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列を含む核酸分子を癌細胞に与えることを含む、前記方法。
【請求項１６】
許容細胞において、複製能力ある組換えアデノウイルスの複製速度を高める方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を該細胞において発現する為に、該コード配列を前記アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、前記方法。
【請求項１７】
複製能力ある腫瘍溶解性組換えアデノウイルスの腫瘍溶解特性を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を発現する為に、該コード配列を前記アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、前記方法。
【請求項１８】
複製能力ある組換えアデノウイルスの腫瘍における複製及び伝播の速度を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を前記腫瘍の細胞において発現する為に、該コード配列を腫瘍溶解性ウイルスに与えることを含む、前記方法。
【請求項１９】
発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列の使用方法であって、組換えアデノウイルスの複製速度を高める為に該コード配列を発現する為に、該コード配列を用いる方法。
【請求項２０】
更なる導入遺伝子、好ましくは、ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、及び／又はＴＮＦ−アルファー、のコード領域をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２１】
請求項１〜１０及び２０のいずれか１項に記載のアデノウイルスと、更なる医薬とを含む組み合わせ。
【請求項２２】
前記更なる医薬が、抗体、好ましくは二重特異的抗体、を含む、請求項２１に記載の組み合わせ。
【請求項２３】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法又は該方法の為のアデノウイルスベクターであって、同時的又は逐次的な放射線療法、抗体療法、化学療法、細胞療法、免疫療法、又は他の抗癌介入若しくは処置の施与を更に含む、前記方法又はアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３：Glycogen  synthase  kinase-3）は、多様な細胞過程、例えば、細胞増殖、アポトーシス、神経機能、代謝、胚発生及びインスリンシグナル伝達、に関与する多機能酵素である（１、２）。このタンパク質の下記の２つの既知のアイソフォームがある；ＧＳＫ３−アルファー及びＧＳＫ３−ベータ。該酵素は、様々な残基におけるリン酸化を通じて活性化又は不活性化される。該２つのアイソフォームは、類似した構造を有するが、細胞機能が異なり且つ異なる遺伝子によってコードされている（３）。
【０００２】
該タンパク質の活性化及び不活性化の１つの様式は、チロシン（Ｙ）残基及びセリン（Ｓ）残基の翻訳後リン酸化を通じて生じる。ＧＳＫ３−アルファー及びＧＳＫ３−ベータは、刺激されていない休止細胞において活性があると考えられている。両方のアイソフォームがまた、ＧＳＫ３−アルファーにおけるＹ２７９残基及びＧＳＫ３−ベータにおけるＹ２１６残基を自己リン酸化することができる。これらの位置でのリン酸化は、該タンパク質の触媒活性を増加させることが知られている。ＧＳＫ３−アルファーのＳ２１及びＧＳＫ３−ベータのＳ９のリン酸化は、夫々のタンパク質を不活性化することができる；これらのリン酸化された残基は、基質結合部位をブロックし、それによって、ＧＳＫ３機能性を阻害することができる（４、５）。
【０００３】
ＧＳＫ３の脱制御は、種々の疾病に結びつけられている。注目すべきは、神経変性障害、糖尿病、及び癌のうちの幾つかである（１、２）。その過剰発現、及び腫瘍促進又は抑制におけるその関与が報告されてきているが、細胞型及びリン酸化状態に依存しうる（６〜８）。
【０００４】
ＧＳＫ３の過剰発現は、幾つかの型の腫瘍において記載されており、ここで、それは、生存、細胞成長及び血管形成を促進する腫瘍プロモーターとして働きうる（９、１０）。ＧＳＫ３は、多形神経膠芽腫、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、白血病及び卵巣癌における癌プロモーターであると考えられている（５）。
【０００５】
ＧＳＫ３−ベータの不活性化は、多くの癌の型において報告されている。ＧＳＫ３−ベータは、皮膚癌、乳癌、口腔癌及び肺癌における腫瘍抑制因子であると考えられている（５、１１〜１３）。
【０００６】
構成的活性型のＧＳＫ３−ベータを産生する一つの方法は、位置９においてセリンをアラニンに置き換えること（Ｓ９Ａ−ＧＳＫ３−ベータ）によるものであり、これは、該タンパク質を不活性化することができるその位置でのリン酸化セリンの形成を防止する。幾つかのグループが、ＧＳＫ３が腫瘍化促進性であることが知られているそれらの癌においてＧＳＫ３−ベータ活性を阻害する為の小分子を設計している（１４〜１６）。
【０００７】
複製能力あるアデノウイルス（Replication  competent  adenoviruses）は、近年、癌治療における腫瘍溶解剤（oncolytic  agents）として新たな関心を集めている。現在のアプローチは、正常細胞とは対照的に、腫瘍細胞において優先的なウイルス複製を促進するアデノウイルスゲノムにおける改変を用いる。この観点において、アデノウイルス変異体「ＯＮＹＸ−０１５」及びＤｅｌｔａ２４アデノウイルスが原型としての役割を果たすことができる。該ＯＮＹＸ−０１５ウイルスは、Ｅ１Ｂ  ５５ｋＤａタンパク質をコードする領域において欠失を有する。結果として、該ウイルスは、効率的なウイルス複製に必要であるｐ５３活性を下方制御することができない。該Ｄｅｌｔａ２４ウイルスは、ＲＢタンパク質を結合することに関与する領域を包含するウイルスＥ１Ａ遺伝子における欠失を有する。ＲＢの結合は、ＲＢ含有細胞における効率的な複製に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＧＳＫ３がアデノウイルスの複製及び／又はその腫瘍溶解特性を促進する為に用いられる最初のものである。これは、本発明において、例えば、感染した腫瘍細胞を殺すことを促進する為に且つ癌の処置の為に用いられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、発現調節配列（expression  control  sequence）に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列をアデノウイルスのゲノム内に含む複製能力ある組換えアデノウイルスを提供する。
【００１０】
本発明のアデノウイルスを、癌を処置する方法を必要とする個体に投与することを含む、該個体において癌を処置する方法がまた提供される。
【００１１】
癌を有する個体の処置における使用の為の本発明のアデノウイルスが更に提供される。該癌細胞を含む腫瘍に本発明のアデノウイルスを提供することを含む、癌細胞を殺す方法が更に提供される。
【００１２】
許容細胞において、複製能力ある組換えアデノウイルスの複製速度を高める方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を該細胞において発現する為に、該コード配列を該アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、上記方法がまた提供される。
【００１３】
複製能力ある腫瘍溶解性組換えアデノウイルスの腫瘍溶解特性を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を発現する為に、該コード配列を前記アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、上記方法が更に提供される。
【００１４】
更なる観点において、複製能力ある組換えアデノウイルスの腫瘍における複製及び伝播の速度を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を前記腫瘍の細胞において発現する為に、該コード配列を腫瘍溶解性ウイルスに与えることを含む、上記方法が提供される。
【００１５】
発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列の使用方法であって、組換えアデノウイルスの複製速度を高める為に該コード配列を発現する為に、該コード配列を用いる方法がまた提供される。
【００１６】
本発明のアデノウイルスと、更なる医薬、好ましくは癌用薬物、とを含む組み合わせが更に提供される。
【００１７】
本発明はまた、処置の方法、又は該処置における使用の為の本発明のアデノウイルスであって、ここで、該処置は、同時的又は逐次的な放射線療法、抗体療法、化学療法、細胞療法、免疫療法、又は他の抗癌介入若しくは処置の施与を更に含む、上記方法又はアデノウイルスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＧＳＫ３−アルファーはまた、名称、例えば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３アルファー；セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＧＳＫ３Ａ；ＧＳＫ３アルファー；及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３アルファー、で知られている。ＧＳＫ３アルファーについての参照配列は、以下のアクセッション番号により見出すことができる：ＨＧＮＣ：４６１６；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２９３１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０５７２３；ＯＭＩＭ：６０６７８４、又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４９８４０。ＧＳＫ３−ベータがまた、名称、例えば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ；セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＧＳＫ３Ｂ；ＧＳＫ３ベータ；グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３ベータ；及びＧＳＫ３ベータアイソフォームで知られている。ＧＳＫ３ベータについての参照配列は、以下のアクセッション番号により見出すことができる：ＨＧＮＣ：４６１７；Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２９３２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００８２７０１；ＯＭＩＭ：６０５００４；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４９８４１。該参照配列は、該遺伝子を特定する為だけに与えられている。該遺伝子が、必ずしも、データベースにおいてそれぞれのアクセッションコードについて示されているものと同じ配列を正確に有することは意図されていない。該配列の天然及び組換え変異体（recombinant  variants）が該遺伝子名によって包含されている。
【００１９】
本明細書に記載されているアデノウイルスによってコードされているＧＳＫ３タンパク質は好ましくは、ＧＳＫ３−ベータタンパク質である。該ＧＳＫ３タンパク質は好ましくは、構成的に活性である変異タンパク質である。その点において、該ＧＳＫ３タンパク質は好ましくは、位置９でのセリン残基が、別のアミノ酸残基、好ましくはアラニン残基、によって置換されているＧＳＫ３−ベータタンパク質である。
【００２０】
ＧＳＫ３のコード配列は典型的に、該遺伝子のｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡは典型的に、ゲノム配列より短く、及びより短い配列は、組換えウイルスにおいて好ましい。他方、細胞における発現は典型的に、１以上のイントロンの存在によって高められる。そのようなイントロンは、ＧＳＫ３遺伝子の天然イントロンでありうる。好ましくは、該イントロンは、人工イントロンであり、好ましくは、コード領域を含むプレｍＲＮＡの５’−非コード領域に導入される人工イントロン、である。
【００２１】
該コード領域は好ましくは、発現調節配列、例えばプロモーター、に作動可能に連結されている。プロモーターは典型的に、エンハンサー配列に連結されている。プロモーター及びエンハンサーの組み合わせはしばしば、まとめてプロモーターと言われる。該プロモーターは、腫瘍細胞において活性であるプロモーターである。好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はハウスキーピング遺伝子プロモーター、例えばＰＧＫプロモーター、である。該発現調節配列はまた、内因性ウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス血清型５（serotype  5）の内因性主要後期プロモーター（ＭＬＰ：major  late  promoter）、であることができる。この場合、該コード配列は、例えばアデノウイルス血清型４０ロングファイバー遺伝子のスプライス受容部位と類似する、挿入されたスプライス受容部位への選択的スプライシングによって、該ＭＬＰに作動可能に連結されることができる(Carette  et  al.,  J  Gene  Med.  2005  Aug;7(8):1053-62)。
【００２２】
本発明は、プロモーターに作動可能に連結されたＧＳＫ３−ベータコード領域を含む核酸分子を含む組換えウイルスを提供する。該組換えウイルスは好ましくは、アデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：herpes  simplex  virus）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：vesicular  stomatitis  virus）、セムリキフォレストウイルス（semliki  forest  virus）、セネカウイルス、又はマラバウイルス（maraba  virus）である。該ウイルスは好ましくは、複製能力あるウイルス（replication  competent  virus：複製コンピテントウイルス）である。複製能力あるウイルス、例えば本明細書に記載されている複製能力ある組換えアデノウイルス、は癌細胞において複製し、且つ癌細胞を溶解することができる。本発明の文脈において複製能力ある（Replication  competent：複製コンピテント）とは、許容細胞において複製する為に必要な機構を全て所有するウイルスを云う。複製受容能（Replication  competence）は、例としてアデノウイルスを用いて更に例示される。同じ原理が、他のウイルスに適用される。該複製能力あるアデノウイルスは、パッケージング細胞において追加のアデノウイルスタンパク質の補助を必要としない。例えば、Ｅ１欠失型複製欠損アデノウイルスは、効率的な複製の為に、トランスで（in  trans）Ｅ１タンパク質を与える補完細胞（complementing  cell）を必要とする。多くの複製能力あるアデノウイルスは、正常細胞においてよりも、癌細胞においてより効率的に複製する。そのようなウイルスへの関心は、癌細胞における優先的な複製（preferential  replication）を高める為に改変された最初の組換えアデノウイルスと共に増加した。該改変は、癌細胞においてではなく、正常細胞における該アデノウイルスの効率的な複製に必要である１以上の部分が、正常細胞において発現しないように改変され、除去され、又は別の方法で操作されているような、ウイルスゲノムの改変を含む。癌細胞において優先的に複製するアデノウイルスはまた、「腫瘍溶解性ウイルス」とも呼ばれる。本明細書に用いられる腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞と比較して、癌細胞を優先的に殺すアデノウイルスを意味する。好ましい実施態様において、本明細書に記載されている複製能力あるアデノウイルスは、腫瘍細胞において該アデノウイルスの優先的な複製を可能にするウイルスゲノムにおける改変を含む。該改変は好ましくは、該ウイルスゲノムにおける変異である。該変異は好ましくは、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ４領域、又はそれらのうちの１以上の組み合わせにおいてである。多くの腫瘍溶解性ウイルスは、１以上のこれらの領域において変異を含む。本発明に従うアデノウイルスは好ましくは、Ｅ１Ａ領域、好ましくは、Ｅ１ＡのＣＲ２ドメインの少なくとも一部を包含するＥ１Ａ領域、における変異、好ましくはＥ１Ａのアミノ酸１２２〜１２９（ＬＴＣＨＥＡＧＦ）を包含する欠失、を有する。そのような欠失は、デルタ２４欠失と呼ばれる。示されたＥ１ａ−デルタ２４変異を有するＥ１Ａの例は、配列番号５の位置１５５１〜２５１２に示される。遺伝子又は領域という語は、本明細書で用いられる場合、例えば、エンハンサー領域、プロモーター領域、及びイントロン又はエキソン���列を含む、遺伝子の発現に必要とされる完全なゲノム領域を含む。腫瘍細胞における優先的な複製を可能にする別の変異は、タンパク質Ｅ１ｂ−５５Ｋ又は少なくともその発現の排除である。Ｅ１ｂ−５５Ｋは、ｐ５３を不活性化して、感染細胞において、細胞周期のＳ期への移入を誘導し、且つ細胞アポトーシスを阻止する。Ｅ１ｂ−５５Ｋにおいて変異したアデノウイルスは、Ｏｎｙｘ−０１５として知られている。このウイルスは、ｐ５３において欠陥のある腫瘍を処置する為に用いられている。前に言及されたデルタ２４変異を有するアデノウイルスは、異なる様式で腫瘍における選択的複製を達成する。該デルタ２４変異は、Ｅ１ａの保存領域２（ＣＲ２）に影響する。このＥ１ａ領域は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）ファミリーのタンパク質との結合を媒介する。ｐＲｂタンパク質は、細胞周期のＧｏ／Ｇ１期からＳ期への移行をブロックし、Ｅ２Ｆと共に複合型転写阻害剤を形成する。Ｅ１ａがｐＲｂと結合した場合、ｐＲｂ−Ｅ２Ｆ複合体のＥ２Ｆ転写因子が遊離され、Ｅ２Ｆが、Ｓ期に進むことに関与する遺伝子、及びウイルス遺伝子、例えばＥ２、の転写活性化因子として働く。従って、Ｅ２Ｆの遊離は、該アデノウイルスの複製における重要な工程である。腫瘍細胞において、細胞周期は制御不能であり、これは、ｐＲｂが存在せず、又は過剰リン酸化によって不活性化されており、且つＥ２Ｆが遊離であるからである。これらの細胞において、Ｅ１ａによるｐＲｂの不活性化は、もはや必要ではない。従って、ＣＲ２における変異を有するアデノウイルスは、Ｅ２Ｆが遊離である細胞、例えば多くの癌細胞、において増殖し、機能性ｐＲｂを有する正常細胞においては、はるかにより低い効率で複製する。
【００２３】
優先的な複製はまた、ウイルスプロモーターを腫瘍選択的プロモーターに置き換えることによって達成することができる。この実施態様において、該改変は、Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂの組織又は細胞型特異的発現のプロモーターを含む。例は、Ｅ１ａプロモーターが別のプロモーターに置き換えられている改変である。様々なプロモーターが、この効果に用いられており、例えば、アルファー−フェトプロテインプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：prostatic-specific  antigen）プロモーター、カリクレインプロモーター、ムチン１プロモーター、又はオステオカルシンプロモーターである。そのようなアデノウイルスは、（特定の）腫瘍細胞においてより効率的に複製するが、該置換プロモーターの不完全な遮断の結果として、正常細胞においていくらかの複製もある。最近では、１超の初期領域プロモーターが腫瘍細胞選択的プロモーターによって置き換えられている組換えアデノウイルスが存在する。様々なウイルス遺伝子の調節が、各ウイルス遺伝子について異なるプロモーターで行うことができ、例えば、Ｅ１ａについてＥ２Ｆ１プロモーター、及びＥ４についてテロメラーゼプロモーターである。この場合、該２つのプロモーターは、腫瘍溶解性効力が多くの腫瘍細胞において保持されるようにウイルス複製を可能にする好適なレベルで発現しなければならない。代替的には、２つのウイルス遺伝子は、同じプロモーターによって調節されることができ、例えば、腫瘍溶解性ウイルスＯｎｙｘ  ４１１において、Ｅ１ａ及びＥ４がＥ２Ｆ１プロモーターによって制御される。
【００２４】
幾つかの実施態様において、優先的複製は、複製必須ウイルス遺伝子（replication  essential  viral  gene）についてのウイルスプロモーターを腫瘍選択的プロモーターに置き換えることによって達成される。本発明の特定の実施態様は、Ｅ１Ａプロモーターの全部又は一部をＥ２Ｆ（例えば、Ｅ２Ｆ１）応答プロモーターに置き換えることによって、アデノウイルスＥ１タンパク質、好ましくはＥ１Ａタンパク質、を選択的に発現することにより、複製が、脱制御されたｐ１６／Ｒｂ経路を有する細胞に制限される、腫瘍溶解性ウイルスベクターを含む。好ましい実施態様において、Ｅ１Ａ遺伝子は、Ｅ２Ｆ１プロモーターに作動可能に連結されている。優先的な複製はまた、選択性を達成する為の１以上の異なる手段を組み合わせることによって達成されることができる。好ましい組み合わせは、デルタ２４変異と共に該Ｅ１Ａ遺伝子を制御するＥ２Ｆ１プロモーターである（Majem  et  al.,  Cancer  Gene  Ther.  2006  Jul;13(7):696-705及びAlonso  et  al.,  Cancer  Res.  2007  Sep  1;67(17):8255-63）。
【００２５】
別の観点において、該改変は、Ｅ３領域における核酸配列の変異又はＥ３領域全体の欠失を含む。Ｅ３領域における変異は、複製能力あるアデノウイルスの腫瘍溶解効果を高めることができる。１つのそのような変異は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保留ドメイン（endoplasmic  reticulum  retention  domain）における変異である。Ｅ３−１９Ｋタンパク質は、細胞膜上のＭＨＣ−Ｉの存在を調節することが知られている。該タンパク質の１つの機能は、ＭＨＣ−Ｉとの結合に関し、及び、別の機能は、Ｅ３−１９タンパク質及びそれと結合したＭＨＣ−Ｉの小胞体における保留に関する。細胞におけるＥ３−１９ｋの発現は、ＭＨＣ−Ｉの形質膜への移行、及びＭＨＣ−Ｉと会合した抗原の提示を阻止する。従って、Ｅ３−１９Ｋの発現は、アデノウイルス感染細胞に対する低下された免疫応答に関連付けられている。他方、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保留を阻止する、Ｅ３−１９Ｋにおける変異が、該アデノウイルスの腫瘍溶解能を増加できることが見出された。一つの実施態様において、本発明のアデノウイルスは、改変されたＥ３領域を含む。該改変は、Ｅ３領域の１以上の部分又は全体の欠失であることができる。一つの実施態様において、該改変は、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保留を阻止する、該Ｅ３−１９Ｋタンパク質における変異を含む。特に、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端ドメインが、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保留を阻止するように、及びその形質膜への移行を引き起こすように除去又は改変される。複製し且つこのＥ３−１９Ｋの特定の変異を含むアデノウイルスは、感染細胞からより効率的に放出される。このより多くの放出は、より高い腫瘍溶解効果を引き起こす。この増強された腫瘍溶解効果は、癌を処置する為に有用である。Ｅ３−１９Ｋにおける好ましい変異は、参照によって本明細書中に組み入れられている国際公開第２００８／１１０５７９号パンフレットに記載されている。好適なＥ３変異が記載され、そこでは、配列番号１、２、４及び５によって例示されている。該配列は、本明細書において、配列番号１、２、３及び４として改めて表示されている。本発明の複製的アデノウイルスは好ましくは、配列番号４を有するカルボキシ末端部を含むＥ３−１９Ｋを発現する。本発明の別の実施態様において、該複製的アデノウイルスは、少なくともヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号５及び配列番号６を含む。一つの実施態様における本発明の複製的アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端部を含むＥ３−１９Ｋを発現し、（配列番号６の位置１６４８〜１６５６に定義された）ファイバータンパク質におけるＲＧＤモチーフの挿入；及び腫瘍細胞における該アデノウイルスの選択的複製を与える制御領域を有し、該制御領域が、（配列番号５の位置３６７〜１０９５に定義された）ＤＭ１インスレーター、（配列番号５の位置１２８２〜１５４５に定義された）Ｅ２Ｆ１プロモーターの断片、（配列番号５の位置１５４６〜１５５０に定義された）ｃｃａｃｃコザック配列、及び（配列番号５の位置１５５１〜２５１２に定義された）アデノウイルスＥ１ａ−デルタ２４変異体遺伝子に存在する。本発明の別の目的は、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保留を阻止する、Ｅ���−１９Ｋの小胞体保留ドメインにおける変異を含む複製的アデノウイルスであり、該アデノウイルスがヌクレオチド配列の配列番号１を含む。本発明の別の観点において、該複製的アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端部を含むＥ３−１９Ｋを発現する。一つの実施態様において、該複製的アデノウイルスは、Ｄｏｎｇ，Ｗ等（2014,  Human  Gene  Therapy  25:  897-904）に記載されているＯＲＣＡ−１０である。ＧＳＫ３ベータコード領域は好ましくは、図５又は図６に示されている通り、ｃＤＮＡとして挿入される。該ＧＳＫ３ベータは好ましくは、構成的活性型のＧＳＫ３ベータである。該構成的活性型のＧＳＫ３ベータは好ましくは、位置９でのセリン残基が別のアミノ酸残基によって置き換えられているＧＳＫ３ベータである。ＧＳＫ３ベータ変異体は好ましくは、Ｓ９Ａ変異体であり、ここで、Ｓはセリンであり、Ａはアラニンである。
【００２６】
本発明に従うアデノウイルスは、その複製潜在性を増加させる改変、例えば、Ｅ３領域の保留（Suzuki  et  al.，  Clin.  Cancer  Res.  8(2002):3348-3359）若しくはＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子の欠失（Sauthoff  et  al.  Hum.  Gene  Ther.  11(2000):379-388）、又はある特定の型の細胞についての複製選択性を増加させる改変、例えば、非限定的に、癌細胞における初期領域遺伝子の選択的発現を促進する為の改変、又は免疫原性（すなわち、動物身体へ導入された時、免疫応答を誘導するそれらの能力）を低下させるか、若しくは高める改変、例えば、Ｅ１Ｂ領域の保留（Wang  et  al.,  Nature  Biotechnol.  21(2003):1328-1335）を含みうる。
【００２７】
腫瘍療法は、腫瘍細胞を選択的に殺す薬物及び処置に基づく。そのような処置は、できる限り、正常な「健康」細胞を残すことを目指す。該腫瘍細胞は、とりわけ該ウイルスの内部複製によって引き起こされる細胞変性効果の結果として、追加として導入された遺伝子の発現の結果として、該腫瘍細胞及び／又は他の原因（例えば、非限定的に、該ウイルスに関連付けられた追加の１以上の毒物）への免疫応答の結果として、死ぬことができる。腫瘍の溶解は腫瘍溶解と呼ばれる。腫瘍において選択的に複製するアデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスと呼ばれる。腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞において優先的に複製するように開発されている複製能力あるアデノウイルスである。該ウイルスが、癌細胞が生じた同じ細胞型に由来した健康細胞においてよりも、該癌細胞において２０％、好ましくは、３０％、４０％、５０％、８０％、より好ましくは１００％、速く複製する場合、複製は該癌細胞について優先的である。
【００２８】
本発明は更に、個体において癌を処置する方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）タンパク質のコード配列をアデノウイルスのゲノム内に含む複製能力ある組換えアデノウイルスを、該処置を必要とする個体に投与することを含む、該方法を提供する。
【００２９】
癌という語は、悪性原発性及び／又は転移性癌を云う。癌の例は、癌腫；肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、又は骨髄腫を包含するが、それらに限定されない。該癌は好ましくは、骨癌、脳癌、眼癌、乳癌、皮膚癌、例えば黒色腫、頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ：head  and  neck  squamous  carcinoma）、膀胱癌、肺癌、尿管癌、尿道癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、唾液腺癌、腎癌、前立腺癌、子宮頚癌、卵巣癌、及び精巣癌を包含する生殖系癌、子宮内膜癌、血液／血液系癌、又は胃腸組織内の癌、例えば結腸癌、である。好ましい実施態様において、該癌は、前立腺癌、皮膚癌、肺癌、又は膵癌である。宿主細胞は好ましくは、癌細胞である。該癌細胞は好ましくは、悪性原発性及び／又は転移性癌細胞である。癌細胞は、癌腫細胞；肉腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、黒色腫細胞、又は骨髄腫細胞であることができる。癌細胞はまた、骨癌細胞、脳癌細胞、眼癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、例えば黒色腫細胞若しくはＨＮＳＣＣ細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、尿管癌細胞、尿道癌細胞、甲状腺癌細胞、副甲状腺癌細胞、唾液腺癌細胞、腎癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞及び精巣癌細胞を包含する生殖系癌細胞、子宮内膜癌細胞、血液／血液系癌細胞、又は胃腸組織内の癌細胞であることができる。腫瘍は、典型的に、癌性細胞、及び支持細胞、例えば間質細胞、血管細胞、血液及び／又は免疫細胞、を含む。癌細胞という語は、癌性細胞を指し、支持細胞を云わない。該複製能力あるアデノウイルスはまた、支持細胞において感染且つ複製しうる。腫瘍及び癌という語は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００３０】
該癌細胞は好ましくは、ＧＳＫ３を発現せず又はＧＳＫ３を過剰発現しない癌細胞である。発現せず又は過剰発現しないＧＳＫ３は好ましくは、ＧＳＫ３ベータである。
【００３１】
本発明のアデノウイルスにおけるＧＳＫコード領域は、構成的活性型のＧＳＫ３を含むことが好ましい。該構成的活性型のＧＳＫ３は好ましくは、ＧＳＫ３アルファーの位置Ｓ２１、又はＧＳＫ３ベータの位置Ｓ９での活性化変異を有する変異体である。該活性化変異は好ましくは、（それぞれ、位置２１又は位置９での）セリン残基のコドンの、該示された位置でのアラニン残基のコドンによる置き換えである。
【００３２】
本発明はまた、許容細胞において、複製能力ある組換えアデノウイルスの複製速度を高める方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を該細胞において発現する為に、該コード配列を前記アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、該方法を提供する。該複製速度についての尺度は、アデノウイルス感染細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ：cytopathic  effect）を示すのにかかる時間である。該複製速度はまた、感染後のある特定の時点において産生される感染性粒子の数を測定することによって測定することができる。複製速度は典型的に、別のアデノウイルスと相対的に評価される。２つの異なるウイルスが、他の点では同一の状況下で並行して試験される場合に、産生された感染性ウイルス粒子の数の最も速い増加、又はＣＰＥの最も速い誘導を示すウイルスが、より高い複製速度を有する。細胞は、それが、本明細書に記載されている複製能力あるアデノウイルスの複製を支援するならば、許容細胞（permissive  cell）である。
【００３３】
本発明はまた、複製能力ある腫瘍溶解性組換えアデノウイルスの腫瘍溶解特性を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を発現する為に、該コード配列を前記アデノウイルスのゲノムに与えることを含む、該方法を提供する。
【００３４】
本発明は更に、複製能力ある組換えアデノウイルスの腫瘍における複製及び伝播の速度を増加させる方法であって、発現調節配列に作動可能に連結されたＧＳＫ３タンパク質のコード配列を前記腫瘍の細胞において発現する為に、該コード配列を腫瘍溶解性ウイルスに与えることを含む、該方法を提供する。
【００３５】
本明細書に記載されているアデノウイルスは、更なる導入遺伝子の１以上のコード領域を有することができる。好適な更なる導入遺伝子の例は、ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−アルファーである。他の好適な導入遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【００３６】
ヒトアデノウイルスは、現在、７種（Ａ〜Ｇ）及び５７の異なる（血清）型に細分されることができる。
【００３７】
該異なる血清型は、現在、下記の通りに分類されている：
Ａ種：血清型１２、１８、３１；
Ｂ種：血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５；
Ｃ種：血清型１、２、５、６、５７；
Ｄ種：血清型８〜１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４９、５１、５３、５４、５６；
Ｅ種：血清型４；
Ｆ種：血清型４０、４１；及び
Ｇ種：血清型５２
【００３８】
本発明のアデノウイルスは好ましくは、Ｂ、Ｃ、又はＤアデノウイルスであり、好ましくはＢ又はＣアデノウイルス、である。該アデノウイルスは好ましくは、Ｃ種アデノウイルスである。該アデノウイルスは好ましくは、血清型１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２〜３０、３２、３３、３４、３５、３６〜３９、４２〜４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、又は５７のアデノウイルスである。好ましい実施態様において、該アデノウイルスは、１、２、３、５、６、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５、又は５７のアデノウイルスである。該アデノウイルスは好ましくは、１、２、５、６、又は５７のアデノウイルス、好ましくは２又は５のアデノウイルスである。１つのアデノウイルス血清型由来の部分、及び別の血清型由来の別の部分を含むキメラアデノウイルスを作製することはそれほど難しくない。同じ種の血清型の部分を含むキメラアデノウイルスは、知られている。例えば、キメラ血清型２と５のウイルス。１つの血清型の初期遺伝子及び別の血清型の後期遺伝子を含むキメラウイルスがまた、企図される。キメラアデノウイルスタンパク質を含むアデノウイルスがまた、知られている。例えば、アデノウイルス５ウイルスのファイバーシャフト及びノブドメインが、アデノウイルス３、アデノウイルス１１、又はアデノウイルス３５由来の対応するドメインに遺伝的に置き換えられている、キメラアデノウイルスファイバータンパク質は、Ｍｕｒａｋａｍｉ等（2010，  Prostate  Vol  70(4):pp  362-376）に記載されている。これらの特定のキメラアデノウイルスは、アデノウイルス５と比較された場合に、改変された標的細胞指向性を有する。
【００３９】
該アデノウイルスは好ましくは、アデノウイルス血清型５、アデノウイルス血清型２４、アデノウイルス血清型３５、若しくはアデノウイルス血清型５１に基づくウイルス、又は、キメラアデノウイルス、例えば、血清型５ファイバーの一部を血清型３５のファイバーの一部で置き換えることによる血清型３５指向性を有する血清型５に基づくキメラアデノウイルス、である。該アデノウイルスは更に、治療用導入遺伝子、例えば、好ましくはｐ５３、腫瘍抗原、又は分泌タンパク質、例えば増殖因子、サイトカイン、若しくはケモカイン、の発現を与える。該アデノウイルスは、複製可能であり（replication  competent）、特に腫瘍溶解性、である。該アデノウイルスは、ヒト及び霊長類細胞の感染及びそれらにおける複製の為のヒト又は霊長類アデノウイルスである。該アデノウイルスは、別の哺乳類アデノウイルス、例えば、イヌ細胞又はウマ細胞、それぞれの感染及びそれぞれにおける複製の為のイヌ又はウマアデノウイルス、である。
【００４０】
本発明に従う好ましいアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス、好ましくは血清型５のヒトアデノウイルス、である。
【００４１】
複製能力あるアデノウイルスは、動物身体における多くの異なる細胞において複製することができ、ただし、それらが、正しい種指向性を有するアデノウイルスに由来していること、及び該細胞が該アデノウイルスについての表面受容体を発現することが条件である。複製能力あるアデノウイルスを包含する組換えアデノウイルスによる特異的な細胞表面認識は、当業者に知られている通り、シュードタイピング（pseudotyping）又はターゲティング（targeting）によって変化させることができる。
【００４２】
本発明は更に、薬物としての使用の為の、本発明に従うアデノウイルスを提供する。本発明は更に、癌の処置の為の薬物としての使用の為の、本発明に従うアデノウイルスを提供する。アデノウイルスは、アデノウイルス学及びアデノウイルスベクターの分野における標準方法に従って増殖される。増殖の好ましい方法は、アデノウイルスの複製を可能にする好適な細胞株に感染させることによるものである。アデノウイルスを作製する方法の例は、ウイルス産生を示す細胞変性効果を細胞が示すときに、該細胞を集める工程、及び該細胞を凍結融解して、細胞抽出物を生成する工程を更に含みうる。該ウイルスは、標準技術、例えば、塩化セシウム勾配におけるバンド形成、及び、透析、例えばリン酸緩衝食塩水−１０％グリセロールに対する透析、を用いて、該細胞抽出物から精製されることができる。ＣｓＣｌの代替物は、Ｖｉｖａｐｕｒｅウイルス精製キット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。透析された及び／又は精製されたウイルスは、分注されて、そして−８０℃で貯蔵されうる。プラークを形成するアデノウイルス粒子及び単位の数の定量化は、標準プロトコールに従って実施される。１０％グリセロールを含むリン酸緩衝食塩水は、アデノウイルスの貯蔵の為の標準製剤である。
【００４３】
該アデノウイルスは、インビボ（in  vivo）で細胞に感染するように動物又は人体に投与されることができる。投与は、腫瘍、又は該腫瘍が位置する体腔への局所領域的注射、血液循環への注射、吸入、及びある特定の身体エリアの表面への塗布を包含する幾つかの経路を介して行われることができるが、該経路はそれらに限定されない。感染後、該複製能力あるアデノウイルスは、該感染細胞が該組換えアデノウイルスの複製を支援するという条件下で、複製し、且つ他の細胞へ伝播することができる。従って、該複製能力あるアデノウイルスは、新しい細胞に再感染させて、該複製能力あるアデノウイルスを更に増殖させる及び拡大させる為に使用されることができる。
【００４４】
該アデノウイルスは好ましくは、生物体へ直接的に投与することができるウイルス粒子の保存の為の水性媒体又は溶液媒体中へ製剤化される。該製剤は好ましくは、薬学的に許容される塩及び添加剤（excipients）、例えば、ヒト血清アルブミン、糖、例えばスクロース及びマンニトール、並びに／又は表面活性物質、例えば１級ヒドロキシル基で終わる二官能性ブロックコポリマー表面活性物質（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（商標））を含む。
【００４５】
一つの実施態様において、本発明に従う複製能力あるアデノウイルスは、１以上の小さい又は非タンパク質コードＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、の発現を媒介する１以上の発現カセットを更に含みうる。小さい又は非タンパク質コードＲＮＡ分子は、細胞におけるｐ５３アンタゴニスト及び／又はｐ５３経路の阻害剤又はそれらの組み合わせに特異的であることができる。
【００４６】
以前、本発明者らは、感染癌細胞からのアデノウイルス子孫の腫瘍溶解性及び放出が、該癌細胞において、ｐ５３機能を回復させることによって加速できることを見出した（参照によって本明細書中に組み入れられている、van  Beusechem  et  al.,  Cancer  Res.  62(2002):6165-6171；国際公開第０３／０５７８９２号パンフレット）。該ｐ５３機能の回復は、該癌細胞において、回復因子、すなわち、ｐ５３依存性アポトーシス経路の機能因子を発現することによって行われ、該ｐ５３の機能は該癌細胞において発現されず、又は不十分に発現され、該回復因子は好ましくは、タンパク質を含む（国際公開第０３／０５７８９２号パンフレット）。このように、該回復因子は、該ｐ５３依存性アポトーシス経路の必須の正の成分（positive  component）である。
【００４７】
ｐ５３の正常な機能の喪失は、プログラム細胞死に対する抵抗性、インビトロ（in  vitro）での細胞形質転換、及びインビボ（in  vivo）での癌の発生に関連付けられている。ヒト癌のおよそ５０％において、ｐ５３をコードする遺伝子は、欠失又は変異により非機能性である（Levine  et  al,  Nature  351(1991):453-456；  Hollstein  et  al,  Science  253(1991):49-53；  Chang  et  al,  J.  Clin.  Oncol.  13(1995):1009-1022）。野生型ｐ５３タンパク質を発現する他の５０％の癌細胞の多くにおいて、ｐ５３機能は、ｐ５３アンタゴニストの作用によってなお妨害されている。ｐ５３アンタゴニストの例は、ＭＤＭ２である。腫瘍抑制タンパク質ｐ１４ＡＲＦの喪失又はＭＤＭ２タンパク質の過剰発現は、該ＭＤＭ２タンパク質との結合及びその後の分解によってｐ５３の機能不活性化をもたらすことができる。加えて、たとえｐ５３機能自体が無傷であったとしても、ｐ５３依存性細胞死は、ｐ５３から下流の該ｐ５３経路へ作用する抗アポトーシスタンパク質、例えば抗アポトーシスｂｃｌ−２及びＩＡＰファミリーメンバー並びにＢＩ−１、の過剰発現によって妨害されることができる。別の例は、ｐ７３ＤｅｌｔａＮであり、それは、ｐ５３と競合するｐ５３応答性プロモーターと結合し、それによって、ｐ５３依存性細胞死をアンタゴナイズする（Kartasheva  et  al,  Oncogene  21(2002):4715-4727）。細胞における１以上のｐ５３アンタゴニスト及び／又は該ｐ５３経路の阻害剤又はそれらの組み合わせに特異的である１以上のＲＮＡｉ媒介性分子の発現は、機能性ｐ５３を含む標的細胞において溶原活性を高めるであろう。
【００４８】
該アンタゴニスト及び／又は該ｐ５３経路の阻害剤は好ましくは、シノビオリン、ＭＤＭ２、Ｐｉｒｈ２、ＣＯＰ１、Ｂｒｕｃｅ、ＨＰＶ−Ｅ６、ヘルペスウイルス８  ＬＡＮＡ、Ｐａｒｃ、モルタリン、Ｐｌｋ−１、ＢＩ−１、ｐ７３ＤｅｌｔａＮ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘＬ、ｂｃｌ−ｗ、ｂｆｌ−１、ｂｒａｇ−１、ｍｃｌ−１、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ｃＩＡＰ３、ＸＩＡＰ及びサバイビンから選択される。該発現カセットは更に、該宿主細胞において機能する１以上の発現調節配列、例えば該１以上のＲＮＡｉ媒介性分子に作動可能に連結されているエンハンサー／プロモーター及びターミネーター、を含む。代替物として、該１以上のｐ５３アンタゴニスト及び／又は該ｐ５３経路の阻害剤又はそれらの組み合わせの発現は、該宿主細胞において、標的遺伝子の発現を低下させるのに機能するサイレンシング因子をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列の発現を媒介する調節エレメントに作動可能に連結されている。癌細胞は１超のｐ５３アンタゴニスト及び／又はｐ５３経路の阻害剤を含むことが見出されている。そのような細胞は、それらが、ｐ５３アンタゴニスト及び／又は該ｐ５３経路の阻害剤のうちの少なくとも２つに対してＲＮＡｉによって与えられる場合に、より効果的に溶解される。
【００４９】
更なる実施態様において、本発明に従う複製能力あるアデノウイルスは更に、該宿主細胞において機能する１以上の発現調節エレメントに作動可能に連結された、該宿主細胞において、該ｐ５３依存性アポトーシス経路を回復するのに機能する少なくとも１つの回復因子をコードするＤＮＡ配列を含む。該回復因子は好ましくは、ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス死促進性遺伝子、例えばｂａｘ、ｂａｋ、ｂａｄ、ｂｉｄ、ｂｉｋ、ｂｉｍ、ｂｏｋ、ｂｌｋ、ｈｒｋ、ｐｕｍａ、ｎｏｘａ、及びｂｃｌ−ｘＳ（Miyashita  and  Reed,  Cell  80(1995):293-299；  Han  et  al.,  Genes  Dev.  10(1996):461-477；  Zoernig  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta  1551(2001):F1-F37）、並びに／又はｐ５３又はその機能性部分若しくは誘導体から選択される。該ｐ５３依存性アポトーシス経路を回復するのに機能する好ましい回復因子はｐ５３である。
【００５０】
該複製能力あるアデノウイルスは更に、該癌細胞において、ＰＯＴ１の発現及び／又は活性を低下させるのに機能するサイレンシング因子をコードするＤＮＡ配列を含みうる。該サイレンシング因子は好ましくは、アンチセンスＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ又はスプライス調節性オリゴヌクレオチド（splice  modulating  oligonucleotide）、である。技術者は、該癌細胞において、ＰＯＴ１の発現を低下させる為の好適なＲＮＡに基づいたサイレンシング因子を設計する能力が十分にある。ＰＯＴ１の場合、該癌及び／又は癌細胞は前立腺癌であることが好ましい。該前立腺癌の処置が更に、該癌を照射することを含むことは更に好ましい。
【００５１】
ウイルスベクターは、複製欠損であり、且つ複製を可能にする補完的な遺伝子を与えるパッケージング細胞を必要とする。
【００５２】
本明細書において用いられるアデノウイルスゲノムは、構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及びアデノウイルスの機能／生活環に関係したエレメントを意味する。
【００５３】
本明細書において定義されている複製能力あるアデノウイルスは、そのゲノムの一部として、該宿主細胞において複製される機能を含むアデノウイルスであり、ここで、複製は、該宿主細胞の内因性細胞機構と組み合わせた、該ウイルスによって提供される複製機能に依存する。それ故に、該宿主細胞のゲノムは、ウイルス複製に必要である因子をコードする外因性配列を有する必要はない。語「内因性」は、この関連において、ウイルス複製に必要な該細胞機構（それ故に、該コード配列を含む）が、自然に存在する機構であり、例えば、人による操作技術によって該細胞に導入されていないことを意味する。後者は、「外因性」と定義される。定義されている通り、複製機能は、該宿主細胞における該ウイルスの複製に必要な、該ウイルスによってコードされる因子、例えばタンパク質、であり、本明細書ではまた、ウイルス複製因子とも呼ばれる。これらの因子が該ウイルスゲノムによってコードされ、且つ外因性因子によって補完される必要がないことに留意することは重要である。従って、複製が１以上の複製機能に依存し、該ウイルスから除去され、しかし該宿主細胞に導入されているウイルスは、複製欠損であると定義され、それ故に、本発明の一部ではない。請求されている本発明は、複製能力あるウイルス（replication  competent  viruses）、すなわち、該宿主細胞におけるウイルス複製の調節に必須であるウイルス複製因子をコードするウイルス遺伝子が該ウイルスゲノム上に存在するウイルスに関する。該宿主細胞は典型的に、癌細胞又は癌様細胞である。
【００５４】
明瞭さ及び簡潔な説明の為に、特徴は、同じ又は別々の実施態様の部分として本明細書において記載されており、しかしながら、本発明の範囲は、記載された特徴の全部又は一部の組み合わせを有する実施態様を包含しうることは認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、インビトロ（in  vitro）でヒト癌細胞の成長を阻害するが、インビトロ（in  vitro）で初代非悪性ヒト細胞を阻害しない。図１Ａ：ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、インビトロ（in  vitro）で癌細胞増殖を阻害する。ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルス（ａｄＧＳＫ３ｂ）は、４つの黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＪＵＳＯ、ＭＥＬ５７、及びＷＭ９）の成長を阻害する。対照として、ルシフェラーゼ発現アデノウイルス（ａｄＬｕｃ）が用いられた。細胞は感染させられ、そして培養中、８日間、追跡調査された：ウェルの写真がＩｎｃｕＣｙｔｅによって４時間ごとに撮影された。
【図１Ｂ】ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、インビトロ（in  vitro）でヒト癌細胞の成長を阻害するが、インビトロ（in  vitro）で初代非悪性ヒト細胞を阻害しない。図１Ｂ：ＧＳＫ３−ベータ発現は、正常初代線維芽細胞の成長に影響しない。ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、非形質転換型初代ヒト線維芽細胞の成長を阻害しない。対照として、癌細胞株ＪＵＳＯが一緒に行われ、それは成長阻害される。
【図１Ｃ】ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、インビトロ（in  vitro）でヒト癌細胞の成長を阻害するが、インビトロ（in  vitro）で初代非悪性ヒト細胞を阻害しない。図１Ｃ：ａｄ．ＬＵＣ又はａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの感染後６日目における初代線維芽細胞の写真。
【図２Ａ】ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入による異なる黒色腫細胞株における細胞アポトーシスの誘発。図２Ａ：Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染した癌細胞は、１日目において目に見えるほど影響され、細胞死の開始を示す、より丸みを帯びた表現型を有する。３日目、カスパーゼ（Caspase）３／７陽性細胞（緑色）の数が増加する。６日目、ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３ｂを有する癌細胞は大部分、アポトーシスマーカーが陽性であり、一方、対照ウイルスを形質導入された癌細胞は、何らかのアポトーシス細胞もほとんど示していない。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞株データは例として示されている。
【図２Ｂ１】ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入による異なる黒色腫細胞株における細胞アポトーシスの誘発。図２Ｂ：ａｄ．ＬＵＣを形質導入された細胞の効果対ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入された細胞の効果を比較する、異なる時点における異なる黒色腫細胞株の相対的アポトーシス。Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータは、Ａｄ．ＬＵＣより早くアポトーシスを誘発し、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスに黒色腫細胞を感染させることの腫瘍溶解効果を実証している。
【図２Ｂ２】ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入による異なる黒色腫細胞株における細胞アポトーシスの誘発。図２Ｂ：ａｄ．ＬＵＣを形質導入された細胞の効果対ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入された細胞の効果を比較する、異なる時点における異なる黒色腫細胞株の相対的アポトーシス。Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータは、Ａｄ．ＬＵＣより早くアポトーシスを誘発し、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスに黒色腫細胞を感染させることの腫瘍溶解効果を実証している。
【図２Ｂ３】ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入による異なる黒色腫細胞株における細胞アポトーシスの誘発。図２Ｂ：ａｄ．ＬＵＣを形質導入された細胞の効果対ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入された細胞の効果を比較する、異なる時点における異なる黒色腫細胞株の相対的アポトーシス。Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータは、Ａｄ．ＬＵＣより早くアポトーシスを誘発し、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスに黒色腫細胞を感染させることの腫瘍溶解効果を実証している。
【図２Ｂ４】ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入による異なる黒色腫細胞株における細胞アポトーシスの誘発。図２Ｂ：ａｄ．ＬＵＣを形質導入された細胞の効果対ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入された細胞の効果を比較する、異なる時点における異なる黒色腫細胞株の相対的アポトーシス。Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータは、Ａｄ．ＬＵＣより早くアポトーシスを誘発し、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスに黒色腫細胞を感染させることの腫瘍溶解効果を実証している。
【図３】ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、初代黒色腫腫瘍懸濁物において選択的に癌細胞死を誘発する。
【図４Ａ】ＧＳＫ３−ベータの発現はアデノウイルス複製を高める。図４Ａは、感染していない９１１細胞及びそれらの成長する動態を示し、３日目にコンフルエンシーに達している。
【図４Ｂ】ＧＳＫ３−ベータの発現はアデノウイルス複製を高める。図４Ｂは、１  ＭＯＩでのａｄ．ＬＵＣに感染した９１１細胞を示し、３．５日目（感染から８４時間後）に完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じた。
【図４Ｃ】ＧＳＫ３−ベータの発現はアデノウイルス複製を高める。ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルス（ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ）は、感染後１日目において完全なＣＰＥを生じた（図４Ｃ）。
【図５】Ｄｏｎｇ等（2014，  Human  Gene  Therapy  25:  897-904）に記載されたＯＲＣＡ−１０ウイルスをコードするＤＮＡ構築物の概略図、ＣＭＶプロモーターの制御下のＧＳＫ３ベータＳ９Ａのコード領域を含む相同組換え構築物の概略図；及びＣＭＶプロモーターの制御下のＧＳＫ３ベータＳ９Ａのコード領域を有するＯＲＣＡ−１０ウイルスを含む組換え構築物の概略図。
【図６】Ｄｏｎｇ等（2014，  Human  Gene  Therapy  25:  897-904）に記載されたＯＲＣＡ−１０ウイルスをコードするＤＮＡ構築物の概略図、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＧＳＫ３ベータＳ９Ａのコード領域を含む相同組換え構築物の概略図；及びＳＶ４０プロモーターの制御下のＧＳＫ３ベータＳ９Ａのコード領域を有するＯＲＣＡ−１０ウイルスを含む組換え構築物の概略図。
【図７】Ｄｏｎｇ等（2014，  Human  Gene  Therapy  25:  897-904）に記載されたＯＲＣＡ−１０ウイルスをコードするＤＮＡ構築物の概略図、ＣＭＶプロモーターの制御下のｒＬｕｃのコード領域、ルシフェラーゼコード領域を含む相同組換え構築物の概略図；及び言及されたＣＭＶプロモーターの制御下のｒＬｕｃのコード領域を有するＯＲＣＡ−１０ウイルスを含む組換え構築物の概略図。
【００５６】
実施例
図及び実施例において、同じウイルスを示す為に異なる名前が用いられている。ＧＳＫ３−ベータＳ９Ａコード領域を有するアデノウイルスは、ａｄＧＳＫ３ｂ；ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ；Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ；及びａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ  Ｓ９Ａ等と呼ばれている。参照ルシフェラーゼコード領域を有するアデノウイルスは、ａｄ．ＬＵＣ；Ａｄ．ＬＵＣ、及びＡｄ．Ｌｕｃ等と呼ばれている。
【００５７】
実施例１．ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、インビトロ（in  vitro）で、ヒト癌細胞の成長を阻害するが、非悪性初代ヒト細胞を阻害しない。
ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスの癌細胞及び非悪性細胞への効果を評価する為に、本発明者らは、４つの異なる黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＪＵＳＯ、ＭＥＬ５７、及びＷＭ９）、及び健康な皮膚から新鮮に単離された皮膚由来初代線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）を培養した。
【００５８】
細胞は、完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱失活ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンナトリウム、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び５０ｕＭ  ベータ−メルカプトエタノールを補充されたＲＰＭＩ  ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミン培地（Ｌｏｎｚａ））中で培養された。細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＪＵＳＯ、ＭＥＬ５７、ＷＭ９、又はＦｉｂｒｏ）は、９６ウェルプレートに播種された（ウェルあたり１００００細胞）。播種から２４時間後、細胞は、５００感染効率（ＭＯＩ）のＡｄ．ＬＵＣ（Ａｄ５Ｌｕｃ１、（ｒｅｆ  １７）  Krasnykh  et  al.  J.  of  Virology,  75  (2001):4176-4183）又はＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ（Kim  et  al.  （ｒｅｆ  １８）  J.  of  Bio.  Chemistry,  277  (2002):  41888-41896）のいずれかに感染させた。細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍ（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートされ、そして培養中の８日間、追跡調査された。該ウェルの写真が、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ｚｏｏｍによって４時間ごとに撮影された。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍソフトウェアが、該ウェルを分析する為に用いられ、コンフルエンスマスクが、異なる測定時点におけるウェルあたりのコンフルエンスのパーセンテージを得る為に該ソフトウェアによって適用された。コンフルエンシーデータは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ上にプロットされた。
【００５９】
ウイルスの感染力価が、Ａｄｅｎｏ−Ｘ高速力価測定キット(rapid  titration  kit)（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて９１１細胞におけるウイルスの力価測定によって決定された。５００ＭＯＩは、Ａｄｅｎｏ−Ｘ高速力価測定キットを用いるウイルス力価測定によって決定された場合の細胞あたりの５００個の感染性ウイルス粒子を云う。
【００６０】
結果は、ＧＳＫ３−ベータ発現ウイルスに感染した癌細胞が、成長阻害されること、及び細胞の数が、感染から３〜４日後に減少し始めること（細胞死を示す）を実証した（図１Ａ）。対照的に、ルシフェラーゼを発現するウイルスは、該癌細胞の成長を阻害せず、該ウェルは、およそ４日目にコンフルエントになる。図１Ｂ及び１Ｃに示されている通り、これは、特異的な抗癌効果であり、初代ヒト線維芽細胞が、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータの感染によって成長阻害されないからである。
【００６１】
総合すれば、これらのデータは、構成的活性型のＧＳＫ−ベータのアデノウイルス強制的発現が、癌細胞を殺し、一方、それは、初代線維芽細胞へいかなる影響も示さないことを実証している。
【００６２】
実施例２．Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータでの形質導入によるヒト黒色腫細胞株におけるアポトーシスの誘発
ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータが癌細胞死を誘発することができることを実証する為に、１０，０００個の黒色腫細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＪＵＳＯ、Ｍｅｌ５７、又はＷＭ９）が、９６ウェルプレートにおいて完全ＲＰＭＩ培地に播種された。播種から２４時間後、該細胞は、５００ＭＯＩのＡｄ．ＬＵＣ又はＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに１：１０００  ＦＩＴＣカスパーゼ３／７試薬（ＩｎｃｕＣｙｔｅ）と共に製造会社の手順に従って、感染させた。細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍにおいて、３７℃及び５％ＣＯ２で８日間、インキュベートされた。該ウェルの写真が、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって４時間ごとに撮影された。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍソフトウェアが、データを分析する為に用いられ、コンフルエンスマスク及び緑色コンフルエンスマスクが、それぞれ、ウェルあたりのコンフルエンスのパーセンテージ及び該ウェルにおける緑色シグナルのパーセンテージを得る為に該ソフトウェアによって適用された。アポトーシス細胞の割合は、異なる時点での緑色マスク値をコンフルエンス値で割ることによって決定された。
【００６３】
６日間に渡って、カスパーゼ３／７陽性細胞（アポトーシス細胞）のパーセンテージが、Ａｄ．ＬＵＣで感染させた培養物と比較して、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染させた培養物において、より迅速に増加した（図２Ａ及び図２Ｂ）。１日目において、対照ウイルス（Ａｄ．ＬＵＣ）とは対照的に、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染した場合のＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の形態への明らかな効果がある（図２Ａ）。３日目、（緑色標識で示された）幾つかのカスパーゼ３／７陽性染色細胞が、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを有する培養物において観察することができる。６日目、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入されたＳＫ−ＭＥＬ−２８は大部分、アポトーシスマーカーが陽性であり、一方、該対照ウイルスを形質導入された癌細胞は、何らかのアポトーシス細胞もほとんど示していない。
【００６４】
これらのデータは、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータのアデノウイルス強制的発現が癌細胞のアポトーシスを促進することを実証した。
【００６５】
実施例３．ＧＳＫ３−ベータを発現するアデノウイルスは、転移性黒色腫腫瘍懸濁物において選択的癌細胞死を誘発する
アデノウイルスで送達されたＧＳＫ３−ベータの抗腫瘍効果を実証する為に、転移性黒色腫腫瘍細胞懸濁物が、Ａｄ．ＬＵＣ又はＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染させた。
【００６６】
生存腫瘍組織が、黒色腫患者から入手された。その後、試料は外科用メスで刻まれ、そして０．１％ＤＮａｓｅ  Ｉ型及び０．１４％コラゲナーゼ  Ｉ型（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＨＢＳＳ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で解離させた。次に、単一細胞懸濁物は、１ｍＬあたり１５００〜２０００万個の細胞のアリコートで、速度制御フリーザーにおいて１０％ＤＭＳＯと共に凍結され、そして使用まで液体窒素中で貯蔵された。
【００６７】
黒色腫細胞懸濁物が解凍され、そして１，２００，０００個の転移性黒色腫腫瘍細胞が、６ウェルプレートにおいて完全ＲＰＭＩ中で培養され、そして４時間後、５００ＭＯＩのＡｄ．ＬＵＣ又はＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染させた。次に、細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で５日間、インキュベートされた。５日後、試料は集められ（１５６０ｒｐｍで５分間の遠心分離）、そして０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充されたＰＢＳ、並びにＰＢＳ中０．０２％アジ化ナトリウム及び０．１％ＢＳＡ（ＦＡＣＳバッファー）で洗われ、そして１５６０ｒｐｍで５分間、遠心分離された。次に、およそ５０マイクロリットルの上清中の細胞ペレットを残して、上清が除去された。細胞は、残存する上清中に再懸濁され、そして表面マーカーＣＤ４５（ＡＦ７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＭＣＳＰ（ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ）で、４℃で３０分間、染色された。インキュベーション後、抗体の過剰が、ＦＡＣＳバッファーでの洗浄によって除去された。試料は、フローサイトメーターＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＫａｌｕｚａ分析ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって分析された。
【００６８】
この分析の結果が、図３に示されている。細胞は、腫瘍微小環境（tumor  microenvironment）において、黒色腫細胞を健康な免疫細胞から区別する為に該ＣＤ４５マーカーで染色された。（紫色でゲーティングされる）免疫細胞は、ＣＤ４５が陽性であり、一方、腫瘍細胞は陰性である。加えて、癌細胞と健康な非免疫細胞（例えば、線維芽細胞）を実際に識別する為に、ＭＣＳＰマーカーが加えられた。ＭＣＳＰは、既知の黒色腫マーカーであり、それ故に、黒色腫細胞は、（オレンジ色でゲーティングされる）ＭＣＳＰ＋ＣＤ４５−細胞であろう。それにも関わらず、（青色でゲーティングされる）該ＭＣＳＰ−ＣＤ４５−細胞画分が、健康な非免疫細胞だけでなく、おそらく該ＭＣＳＰマーカーを発現しない幾つかの黒色腫細胞も含まれている可能性があることに留意されることが重要である（全ての黒色腫細胞が同じマーカーに対して陽性であるとは限らず、この点においてドナー変動性がある）。
【００６９】
該黒色腫細胞懸濁物がＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータを形質導入された場合、５日後の黒色腫細胞の相対的パーセンテージは、１．７２％であった。対照的に、Ａｄ．ＬＵＣ感染黒色腫懸濁物において、生存する黒色腫細胞の相対的パーセンテージは２１．６５％であった。更に、該免疫細胞は、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータの存在によって影響されないままであるように思われ、Ａｄ．ＬＵＣに関して５０．７７％生存率及びＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに関して６４．２９％であり、Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータの腫瘍特異性を更に実証した。他の細胞（ＣＤ４５−ＭＣＳＰ−、線維芽細胞のようなほとんどが健康な非免疫細胞、）がまた、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータをコードするアデノウイルスでの形質導入によって影響されなかった。
【００７０】
該結果は、特異的な癌細胞死を誘発する為に、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータのアデノウイルス送達を利用する可能性を示す。
【００７１】
実施例４．ＧＳＫ３−ベータの発現はアデノウイルス複製を高める
Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ及びＡｄ．ＬＵＣは、複製欠損アデノウイルスベクターである。複製能力あるアデノウイルスの文脈において構成的活性型のＧＳＫ３−ベータの効果を検証する為に、９１１細胞（アデノウイルス複製の為に複製欠損アデノウイルスを補完する細胞株）における実験が実施された（図４）。
【００７２】
複製欠損Ａｄ．ＬＵＣ又はＡｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータが、９１１細胞（アデノウイルス複製を補完する細胞株）において増幅された。９１１細胞（Fallaux  FJ  et  al.  Hum  Gene  Ther.,  (1992):  215-22）は、完全ＲＰＭＩ中で培養された。１日目、９１１細胞は、９６ウェルプレートに播種され（１００００細胞／ウェル）、６時間後、ＭＯＩ  １でのａｄ．ＬＵＣ又はａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータに感染させた。陰性感染対照として、感染していない９１１細胞が用いられた。細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍにおいて３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートされ、５日間、追跡調査された。該ウェルの写真が、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって異なる間隔で撮影された。結果は、Ａｄ．ＬＵＣが、感染後およそ３日目に、目に見えるＣＰＥ（cytopathic  effect：細胞変性効果）を誘発し（図４Ｂ）、一方、ＧＳＫ３−ベータ発現ウイルス（Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ）はすでに１日目においてＣＰＥを示す（図４Ｃ）ことを実証し、ＧＳＫ３−ベータと複製能力あるアデノウイルスの相乗細胞毒性効果を実証している。この実験で用いられたＭＯＩは、細胞あたり１個の感染性ウイルス粒子（１  ＭＯＩ）であった。それ故に、最も確実性が高いことには、全細胞が、その接種からのウイルス粒子に感染したわけではない。Ａｄ．ＣＡ．ＧＳＫ３−ベータ感染細胞における細胞増殖の欠損と合わせて考えれば、これは、構成的活性型のＧＳＫ３−ベータの存在が、腫瘍溶解性ウイルス療法にとって望ましい特徴である、ウイルス複製又はウイルス放出を加速させることを示す。
【００７３】
実施例５．ＧＳＫ３−ベータを発現する複製能力あるアデノウイルスを構築する方法
アデノウイルスゲノムのＥ４と右側ＩＴＲとの間にＧＳＫ３ｂを含む複製能力あるアデノウイルスが、異なるクローニング工程において、以下の通り作製されることができる。ＧＳＫ３ｂ発現カセットを有するアデノウイルスシャトルベクターが作製される。第２の工程において、このシャトルベクターが直線化され、完全長の直線化されたアデノウイルスＤＮＡ（例えば、ＯＲＣＡ−０１０；すなわち、Ｅ１Ａデルタ２４、Ｔ１変異、及びファイバーＲＧＤ挿入を有する腫瘍溶解性ウイルス）と組換えられた。ＧＳＫ３−ベータ  ＤＮＡ配列は、位置９におけるセリンからアラニンへの変異、及びＣ末端領域でのＨＡ（ヘマグルチニン）タグ配列を含むであろう。
【００７４】
ＧＳＫ３−ベータ発現カセット
ＧＳＫ３−ベータ発現カセットは、下記の配列を含む。該発現カセットは、ＤＮＡ合成（ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって作製される。該発現カセットは、ｐＭＫクローニングベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内にＥｃｏＲＩ制限部位を用いてクローニングされる。
【００７５】
ＣＭＶ−ＧＳＫ３−ベータＨＡ−ｐＡ
【００７６】
ＥｃｏＲＩ部位
GAATTC-
【００７７】
ＳｐｅＩ部位
ACTAGT-
【００７８】
ＣＭＶエンハンサー
GACATTGATTATTGACAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG-
【００７９】
ＣＭＶプロモーター
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT-
【００８０】
Ｉ−ＣｅｕＩ制限部位を含む配列
CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAA-
【００８１】
ＨＡタグ付きＧＳＫ３ベータ配列（ＨＡタグ配列はイタリック体で且つ下線が引かれている）
【化１】
2022500013.tif 000002
【００８２】
ポリＡ
TGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGATATGGCTGAT-
【００８３】
ＳｐｅＩ部位
ACTAGT
【００８４】
ＥｃｏＲＩ部位
GAATTC-
【００８５】
ＧＳＫ３−ベータ発現カセットを有するシャトルベクターの構築
シャトルベクターバックボーンとして、ｐＥｎｄＫ／Ｓｐｅｌベクター（Ｒ．Ａｌｅｍａｎｙ博士、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃａｔａｌａ  ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎによって提供された）が用いられる。ｐＥｎｄＫ／Ｓｐｅｌは、ベクターｐＴＧ３６０２（Chartier  et  al.,  J.  Virol,  70(1996):4805-4810）のＫｐｎＩ消化並びにＡｄ５マップ単位０〜７及び９３〜１００を含む該ベクター断片の再ライゲーションによって作製されて、ｐＥｎｄＫを生じた。Ｓｐｅｌ部位は、部位特異的変異誘発によってＡｄ５ヌクレオチド３５８１３をＡからＴへ変化させることによって、ｐＥｎｄＫ内に導入されて、ｐＥｎｄＫ／Ｓｐｅｌを生じた。ｐＥｎｄＫ／Ｓｐｅｌは、該２つのＡｄ５  ＩＴＲに隣接するＰａｃＩ制限部位を有する。
【００８６】
ＤＮＡ合成によって作製されたＧＳＫ３−ベータ発現カセットは、ｐＥｎｄＫ／ＳｐｅＩ内にＳｐｅＩ制限部位を用いてクローニングされ、ｐＥｎｄＫ／ＳｐｅＩ−ＧＳＫ３ベータを生じる。正しいｐＥｎｄＫ／ＳｐｅＩ−ＧＳＫ３−ベータクローンは、該ベクター内に存在する異なる制限酵素を用いる制限分析によって同定されることができる（例えば、Ｉ−ＣｅｕＩ固有の制限部位）。
【００８７】
ＧＳＫ３−ベータを有する完全長アデノウイルスゲノムを作製する為の組換え
プラスミドｐＥｎｄＫ／ＳｐｅＩ−ＧＳＫ３ベータは、ＫｐｎＩで直線化される。該直線化されたプラスミドは、複製能力ある完全長アデノウイルスＤＮＡ（例えば、ＯＲＣＡ−０１０）と細菌（例えば、ＢＪ５１８３）又は酵母（例えば、ＹＰＨ８５７）において組換えられることができる。
【００８８】
該完全長アデノウイルスＤＮＡは、アデノウイルス粒子から単離されることができ、又は、代替的に、完全長アデノウイルスＤＮＡ挿入断片を有するプラスミドから制限酵素消化によって遊離されることができる。
【００８９】
相同組換えは、完全長アデノウイルスゲノムを有するプラスミドを生成し、該プラスミドにおいて、該ＧＳＫ３−ベータ発現カセットが、該Ｅ４領域と該右側ＩＴＲとの間に挿入される。この方法に従うと、該ＧＳＫ３ｂ発現カセットを挿入する為に、任意の複製能力あるアデノウイルスが使用されることができることは注目されるべきであり、該任意の複製能力あるアデノウイルスは、追加の改変、例えば、Ｅ３欠失、高められた腫瘍選択性若しくは腫瘍溶解能、変化された指向性、又は導入遺伝子挿入、を有する組換えアデノウイルスを包含する。しかしながら、該複製能力ある完全長アデノウイルスゲノムはそのゲノムにおいてＰａｃＩ制限部位を含まないことが好ましい。
【００９０】
ウイルス作製
引き続き、挿入されたＧＳＫ３ｂ発現カセットを有する複製能力あるアデノウイルスゲノムは、ＰａｃＩ消化によって該プラスミドから遊離される。このＤＮＡは、ヒト細胞、例えば、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地中で培養されたＡ５４９、内へ、例えばリポフェクタミン試薬を用いて、トランスフェクションされる。本発明に従う、結果として生じた複製能力ある組換えアデノウイルスは、単離され、そして当技術分野において知られている標準細胞培養方法且つウイルス学方法に従って更に増殖及び精製される。
【００９１】
実施例６．ＧＳＫ３−ベータを発現する複製能力あるアデノウイルスを構築する方法
実施例５と同様に、該ＧＳＫ３−ベータ発現カセットは下記の配列を有する。
【００９２】
ＳＶ４０−ＧＳＫ３−ベータＨＡ−ｐＡ
【００９３】
ＥｃｏＲＩ部位
GAATTC-
【００９４】
ＳｐｅＩ部位
ACTAGT-
【００９５】
ＳＶ４０プロモーター
GGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA-
【００９６】
Ｉ−ＣｅｕＩ制限部位を含む配列
CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAA-
【００９７】
ＨＡタグ付きＧＳＫ３ベータ配列（ＨＡタグ配列はイタリック体で且つ下線が引かれている）
【化２】
2022500013.tif 000003
【００９８】
ポリＡ
TGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGATATGGCTGAT-
【００９９】
ＳｐｅＩ部位
ACTAGT
【０１００】
ＥｃｏＲＩ部位
GAATTC-
【０１０１】
実施例７．ルシフェラーゼを発現する複製能力あるアデノウイルスを構築する方法
対照として、ルシフェラーゼを発現する条件的に複製能力ある（conditionally  replication  competent）腫瘍溶解性ウイルスが作製されることができる。方法論は実施例５又は６と同様であり、該発現カセット内の、ＤＮＡ合成されたＨＡタグ付きＧＳＫ３−ベータ配列が、下記のルシフェラーゼ配列によって置き換えられている。
【０１０２】
ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ配列
ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGGATGATAACTGGTCCGCAGTGGTGGGCCAGATGTAAACAAATGAATGTTCTTGATTCATTTATTAATTATTATGATTCAGAAAAACATGCAGAAAATGCTGTTATTTTTTTACATGGTAACGCGGCCTCTTCTTATTTATGGCGACATGTTGTGCCACATATTGAGCCAGTAGCGCGGTGTATTATACCAGACCTTATTGGTATGGGCAAATCAGGCAAATCTGGTAATGGTTCTTATAGGTTACTTGATCATTACAAATATCTTACTGCATGGTTTGAACTTCTTAATTTACCAAAGAAGATCATTTTTGTCGGCCATGATTGGGGTGCTTGTTTGGCATTTTATTATAGCTATGAGCATCAAGATAAGATCAAAGCAATAGTTCACGCTGAAAGTGTAGTAGATGTGATTGAATCATGGGATGAATGGCCTGATATTGAAGAAGATATTGCGTTGATCAAATCTGAAGAAGGAGAAAAAATGGTTTTGGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGCATATCTTGAACCATTCAAAGAGAAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACATTATCATGGCCTCGTGAAATCCCGTTAGTAAAAGGTGGTAAACCTGACGTTGTACAAATTGTTAGGAATTATAATGCTTATCTACGTGCAAGTGATGATTTACCAAAAATGTTTATTGAATCGGACCCAGGATTCTTTTCCAATGCTATTGTTGAAGGTGCCAAGAAGTTTCCTAATACTGAATTTGTCAAAGTAAAAGGTCTTCATTTTTCGCAAGAAGATGCACCTGATGAAATGGGAAAATATATCAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAAATGAACAATAA
【０１０３】
実施例８．ＧＳＫ３−ベータを発現する複製能力あるアデノウイルスの腫瘍溶解効力を評価する方法
実施例５及び６で作製されたＧＳＫ３−ベータを発現する複製能力あるアデノウイルスの腫瘍溶解効力が、（プロモーターに基づく）その関連対照である、実施例７で作製されたルシフェラーゼを発現する複製能力あるアデノウイルスと比較される。代替的には、ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーター下でルシフェラーゼを発現する他の既に入手可能な条件的に複製能力ある完全長アデノウイルスがまた、使用されることができる。
【０１０４】
異なるウイルスの腫瘍溶解効力を比較する為に、ヒト癌細胞株における細胞毒性アッセイが実施される。異なる癌細胞株（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ、Ａ５４９、Ｕ２ＯＳ、ＨＣＴ  １１６、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ａ、ＬＮＣａＰ、ＮＰ９、ＤＵ−１４５、ＵＭ−ＳＣＣ−１１Ｂ、ＵＭ−ＳＣＣ−１４Ｃ、ＰＣ−３、ＶＵ１１３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及び／又はＦａＤｕ）が該アッセイの為に使用されることができる。細胞毒性アッセイは、実施例５、６及び７において作製されたウイルスを用いて、Ｄｏｎｇ等（Human  Gene  Therapy  25  (2014):  897-904）に従って実施される。
【０１０５】
この研究は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ２０２０研究及びイノベーションプログラム、Ｍａｒｉｅ  Ｓｋｌｏｄｏｗｓｋａ−Ｃｕｒｉｅ認可番号６４３１３０によって一部、資金提供された。
【０１０６】
引用文献
2022500013.tif 000004
2022500013.tif 000005
【０１０７】
幾つかの配列
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
<210>  1
<211>  484
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus
serotype 5
<400>  1
atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa       60
aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc      120
accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa      180
attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt      240
acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg      300
tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg      360
gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt      420
accctactct atattaaata caaaaagcag acgcagcttt attgaggaaa agaaaatgcc      480
ttaa                                                                   484
<210>  2
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Fragment of mutated carboxy-terminal fragment of protein E3-19K 
of human adenovirus type 5
<400>  2
Lys Lys Gln Thr Gln Leu Tyr 
1               5           
<210>  3
<211>  483
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus
type 5
<400>  3
atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa       60
aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc      120
accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa      180
attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt      240
acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg      300
tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg      360
gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt      420
accctactct atattaaata caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaag cagcatgcct      480
taa                                                                    483
<210>  4
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Fragment of mutated carboxy-terminal fragment of protein E3-19K 
of human adenovirus type 5
<400>  4
Lys Ser Arg Arg Ser Pro Ile Glu Glu Ser Ser Met Pro 
1               5                   10              
<210>  5
<211>  2512
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Sequence with the regulatory regions DM1 insulator (from position
367 to 1095); a fragment of the E2F1 promoter (from position 1282
to 1545); the ccacc kozak sequence (from position 1546  to 1550);
and the E1a- 24 gene (from position 1551 to 2512).
<400>  5
catcatcaat tataccttcc attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt       60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt      120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg      180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag      240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga      300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tctctagcat cgatgtcgag      360
gatccctcga gaccctgaaa ctgtcttcga ctccggggcc ccgttggaag actgagtgcc      420
cggggcacgg cacagaagcc gcgcccaccg cctgccagtt cacaaccgct ccgagcgtgg      480
gtctccgccc agctccagtc ctgtgatccg ggcccgcccc ctagcggccg gggagggagg      540
ggccgggtcc gcggccggcg aacggggctc gaagggtcct tgtagccggg aatgctgctg      600
ctgctgctgg ggggatcaca gaccatttct ttctttcggc caggctgagg ccctgacgtg      660
gatgggcaaa ctgcaggcct gggaaggcag caagccgggc cgtccgtgtt ccatcctcca      720
cgcaccccca cctatcgttg gttcgcaaag tgcaaagctt tcttgtgcat gacgccctgc      780
tctggggagc gtctggcgcg atctctgcct gcttactcgg gaaatttgct tttgccaaac      840
ccgctttttc ggggatcccg cgcccccctc ctcacttgcg ctgctctcgg agccccagcc      900
ggctccgccc gcttcggcgg tttggatatt tattgacctc gtcctccgac tcgctgacag      960
gctacaggac ccccaacaac cccaatccac gttttggatg cactgagacc ccgacattcc     1020
tcggtattta ttgtctgtcc ccacctagga cccccacccc cgaccctcgc gaataaaagg     1080
ccctccatct gcccctcgag tctagagatg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac     1140
atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca     1200
aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa     1260
catttctcta tcgataggta ccatccggac aaagcctgcg cgcgccccgc cccgccattg     1320
gccgtaccgc cccgcgccgc cgccccatct cgcccctcgc cgccgggtcc ggcgcgttaa     1380
agccaatagg aaccgccgcc gttgttcccg tcacggccgg ggcagccaat tgtggcggcg     1440
ctcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggccgggac     1500
tttgcaggca gcggcggccg ggggcggagc gggatcgagc cctcgccacc atgagacata     1560
ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg gaccagctga     1620
tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc     1680
acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag gcggtttcgc     1740
agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc     1800
cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc     1860
agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatccaccca     1920
gtgacgacga ggatgaagag ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc     1980
acggttgcag gtcttgtcat tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt     2040
cgctttgcta tatgaggacc tgtggcatgt ttgtctacag taagtgaaaa ttatgggcag     2100
tgggtgatag agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt ttaattttta cagttttgtg     2160
gtttaaagaa ttttgtattg tgattttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga     2220
gcccgagcca gaaccggagc ctgcaagacc tacccgccgt cctaaaatgg cgcctgctat     2280
cctgagacgc ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga     2340
ctccggtcct tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa     2400
accagttgcc gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct     2460
taacgagcct gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aa             2512
<210>  6
<211>  1773
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Sequence codifying the fiber of the human adenovirus type 5 (from
position 1 to 1638; and position 1666 to 1773) containing an 
insertion of the peptide RGD  (from position 1639 to 1665) 
containing the RGD motif (from 1648 to 1656).
<400>  6
atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa       60
accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa      120
gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc      180
atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc      240
caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa      300
atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta      360
atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc      420
aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa      480
acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct      540
ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat      600
ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg      660
accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact      720
ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg      780
attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac      840
caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat      900
attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag      960
gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca     1020
ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa     1080
attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc     1140
cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact     1200
ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa agatgctaaa     1260
ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc agttttggct     1320
gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct tattataaga     1380
tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt     1440
agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt tatgcctaac     1500
ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt cagtcaagtt     1560
tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacga tcacactaaa cggtacacag     1620
gaaacaggag acacaacttg tgactgccgc ggagactgtt tctgcccatc tgcatactct     1680
atgtcatttt catgggactg gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc     1740
tcttacactt tttcatacat tgcccaagaa taa                                  1773
【図１Ａ】
2022500013.tif 000006
【図１Ｂ】
2022500013.tif 000007
【図１Ｃ】
2022500013.tif 000008
【図２Ａ】
2022500013.tif 000009
【図２Ｂ１】
2022500013.tif 000010
【図２Ｂ２】
2022500013.tif 000011
【図２Ｂ３】
2022500013.tif 000012
【図２Ｂ４】
2022500013.tif 000013
【図３】
2022500013.tif 000014
【図４Ａ】
2022500013.tif 000015
【図４Ｂ】
2022500013.tif 000016
【図４Ｃ】
2022500013.tif 000017
【図５】
2022500013.tif 000018
【図６】
2022500013.tif 000019
【図７】
2022500013.tif 000020
【配列表】
2022500013000001.app
【国際調査報告】
2022500013.tif 000021
2022500013.tif 000022
2022500013.tif 000023