(57)【要約】  本発明は、新規なＧＬＰ−１融合タンパク質及びその複合体、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの血糖値又は体重の低下、中でも、糖尿病、特に、２型糖尿病の治療における用途に関する。
2022501405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１受容体作動薬及びそれに連結されているｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させる融合パートナー（ＦＰ）を含む、ＧＬＰ−１受容体作動薬の融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、前記融合パートナーに直接的に又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
さらに好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）；
ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）；  
ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）から選ばれる融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、全長型、短縮型又は変異型のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体、例えば、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド、リキシセナチド、アビグルチド、デュラグルチド又はセマグルチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合パートナー（ＦＰ）は、全長型、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリンであり、好ましくは、前記Ｆｃセグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃセグメントであり、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインから選ばれる１つ〜４つのドメインからなることが好ましく、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであることも好ましく、ＩｇＧ  Ｆｃセグメントであることがより好ましく、前記Ｆｃセグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであることがさらに好ましく、さらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃセグメントは低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果及び／又はＦｃＲｎ受容体との増強された結合親和性を有することが好ましい、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合パートナー（ＦＰ）は、さらに、ソルターゼ認識部位を含むアミノ酸配列ＳＴに直接的に又は第２のリンカーＬ２を介して連結されており、前記ソルターゼは、例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂであり、好ましくは、前記ＳＴは、ソルターゼ  Ａのコア認識部位ＬＰＸＴＧを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、ＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、前記ＳＴは、さらに、ソルターゼ認識配列に連結されている親和性タグを含むことも好ましく、このようなＳＴ配列は、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫであり、
ここで、前記第２のリンカーＬ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
さらに好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）；
ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＧＬＰ−１−Ｌ１−ＦＰ−Ｌ２−ＳＴで表される構造を有し、式中
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体作動薬を示し、且つＧＬＰ−１受容体作動薬、Ｌ１、Ｌ２、ＦＰ及びＳＴは、請求項４と同じ定義を有し、ここで、Ｌ１及びＬ２のいずれか１つ又は２つは、存在しなくてもよい、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子が請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質の末端に連結され、好ましくは、ペプチド転移反応により前記ソルターゼ認識部位に連結され、特に、前記融合タンパク質がモノマー又はダイマーであってもよい複合体。
【請求項７】
前記１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子は、それぞれ独立して、多糖及びポリアルキレングリコール、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選ばれ、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えば、メトキシ基によってエンドキャップされ、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールは、直鎖又は分岐鎖であり、例えば、前記ポリアルキレングリコールは、分岐鎖であり、例えば、分岐鎖ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基によってエンドキャップされた分岐鎖ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記のいずれか２つの間の値であり、好ましくは、前記親水性ポリマー分子の分子量は、２０ｋＤａ又は４０ｋＤａである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をソルターゼ（例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂ）及び親水性ポリマー分子と接触させることを含む請求項６又は７に記載複合体を調製する方法であって、前記親水性ポリマー分子の一端は、ソルターゼによってアミド化できるアミノ基を有する方法。
【請求項９】
前記親水性ポリマー分子の一端は、ポリＧｌｙ、例えば、ＧＧＧＡＡを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質及び／又は請求項６又は７に記載の複合体、及び任意に選択できる薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
血糖値又は体重を低下させるために、例えば、糖尿病を治療するために、より具体的には、１型糖尿病及び／又は２型糖尿病患者を治療する、特に２型糖尿病を治療するために使用される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
液体製剤形態又は凍結乾燥製剤形態である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項６又は７に記載の複合体の、血糖値又は体重を低下させるための医薬品の調製における用途であって、例えば、前記医薬品は、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に２型糖尿病を治療するために使用される用途。
【請求項１４】
血糖値又は体重を低下させる方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項６又は７に記載の複合体を、それを必要とする対象に投与し、例えば、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に、２型糖尿病を治療するために使用されることを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６又は７に記載の複合体、及び／又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び任意に選択できる取扱説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１８年９月２６日に中国特許庁へ提出された、発明の名称が「ＧＬＰ１−Ｆｃ融合タンパク質及びその複合体」である中国特許出願２０１８１１１２５７６２．９に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に全体として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が延長された生物学的に活性なポリペプチド融合タンパク質及びそれらのポリマー複合体、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が延長されたＧＬＰ−１受容体作動薬、それらを含む医薬組成物、それらの血糖低下（糖尿病、特に、２型糖尿病の治療）及び体重制御における用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
経済及び社会の発展、人口の平均寿命の延長、ライフスタイルの変化に伴い、糖尿病は、世界中の国々で主要なヘルスケアの問題になっている。先進国でも発展途上国でも、糖尿病の発生率は急激に上昇している。２００７年には、世界中で約２億４６００万人の糖尿病患者があり、世界中で１０秒ごとに１人の糖尿病患者が死亡し、２０２５年までに、世界中の糖尿病患者は、３億３３００万人に達すると推定されている。中国は、糖尿病の「深刻な被災地」になり、現在、４０００万人の糖尿病患者があり、糖尿病の発生率は約５％であり、世界で２番目に糖尿病の多い国（１番目はインド）になる。糖尿病患者は、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）及び非インスリン依存性糖尿病（２型糖尿病患者）という２つのタイプに分けられる。その中で、２型糖尿病患者は、糖尿病患者の９０％以上を占める。２型糖尿病患者は、インスリンの分泌又は作用不足及びβ細胞の機能不全を特徴とし、脂肪、炭水化物及びタンパク質の代謝障害を引き起こし、慢性的な高血糖をもたらし、最終的に様々な微小血管、大血管及び様々な臓器の合併症を引き起こす。現在、糖尿病を制御する医薬は、以下の２種類がある。即ち、１）インスリン分泌促進薬、例えば、スルホニル尿素類、メグリチニド類、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、ＧＬＰ−１類似体；２）非インスリン分泌促進薬、例えば、インスリン、α−グルコシダーゼ阻害薬、ビグアニド類、チアゾリジンジオン類、インスリン類似体など。現在、臨床的に常に使用されている伝統的な糖尿病治療薬は、いずれも２型糖尿病患者に治療効果がなく、膵臓β細胞の進行性の悪化を抑制したり、血中のグリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のレベルを低減させたり、糖尿病の合併症、例えば、心臓病、腎不全を予防したりすることができなく、且ついずれも異なる程度の毒性・副作用を伴う。従って、新たな２型糖尿病患者治療薬を研究する必要がある。
１９８５年に腸ホルモンのグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１、ＧＬＰ−１）が発見され、食事後にプログルカゴン遺伝子によって発現され、主に腸粘膜Ｌ−細胞から分泌される産物であり、膵臓β細胞を刺激してインスリンを分泌することができ（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、  ４７、  ４１２８−４１３４、  ２００４）、血糖値の安定化に重要な役割を果たす。ＧＬＰ−１の外因性投与は、２型糖尿病患者の血糖値を正常化することができる（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、  １５、  ２７０−２７６、  １９９２；  Ｌａｎｃｅｔ、  ３５９、  ８２４−８３０、  ２００２；  Ｅｎｄｏｅｒ．  Ｒｅｖ、  １６、  ３９０−４１０、  １９９６；  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、  ２８、  ５６５−５７３、  １９８５）。ＧＬＰ−１は、膵臓β細胞にグルコース依存的に作用し、インスリン遺伝子の転写を促進し、インスリンの生合成及び分泌を増加させ、β細胞の増殖及び分化を刺激し、β細胞のアポトーシスを阻害して膵臓β細胞数を増加させ、グルカゴンの分泌を阻害し、末梢細胞のインスリン受容体の感受性を高め、ＨｂＡ１ｃを低下させ、食欲及び食物摂取を阻害し、胃内容物の排出を延長させるという機能がある（Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄ、  １８、  １４４−１４９、  ２００１；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、  ５１、  １４４３−１４５２、  ２００２；  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、  ４５、  １２６３−１２７３、  ２００２；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、  ５０、  ５２５−５２９、  ２００１；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、  ５０、  ７２５、  ２００１；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、  ５２、  ３６５−３７１、  ２００３；  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍｎｅ  Ｒｅｓ．  ５６、  ３７７−３９９、  ２００１；  Ｄｉｓｂｅｔｏｌｏｇｉａ、  ３９、  １５４６−１５５３、  １９９６；  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｃｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ、  ２８１、  Ｅ２４２−２４７、  ２００１；  Ｕ．Ｓ．  ｐａｔｅｎｔ  ４７７９６７、  ４７８０１７、  ４７８４２５；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、  ２２、  ４０３−４０８、  １９９９；  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、  ８８、  ３０８２−３０８９、  ２００３；  Ｄｉａｂｅｔｅｓ、  ４４、  １２９５、  １９９５）。しかし、ＧＬＰ−１は、生体内でジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰＩＶ）によって分解されやすく、半減期が２分間未満であり、ほとんど効果的な抗糖尿病薬にならない。
ポリペプチド類医薬は、一般的にｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短く、物理的及び化学的安定性が低く、生体内での様々なプロテアーゼによって分解されやすいなどの特性のために、１日以内に複数回の注射を必要とする。患者の体、心理及び経済に大きな負担をもたらし、患者のコンプライアンスを制限する。従って、血漿サイクルを延長させ全身的薬物曝露（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｒｕｇ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を増加させるため、当分野で新たな構造を持つ医薬が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
発明者は、長年の研究及び長期実験を行ったところ、ポリペプチド（タンパク質）は半減期を延長できる融合パートナー（例えば、Ｆｃフラグメント、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリン）と融合し、さらに親水性ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール、特に、ＰＥＧ）と複合化する手段によれば、生物学的に活性なポリペプチド的ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を効果的に向上させ、医薬品の治療効果を高めることを発見しているため、本発明に達している。
第一側面では、本発明は、ＧＬＰ−１受容体作動薬及びそれに連結されているｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加できる融合パートナー（ＦＰ）を含む、ＧＬＰ−１受容体作動薬の融合タンパク質であって、ここで、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、前記融合パートナーに直接的に又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である融合タンパク質を提供し、
さらに好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）；
ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）；  
ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）から選ばれる。
【０００５】
１つの実施形態において、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、全長型、短縮型又は変異型のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体であり、例えば、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド、リキシセナチド、アビグルチド、デュラグルチド又はセマグルチドである。
他の実施形態において、前記融合パートナー（ＦＰ）は、全長型、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリンであり、前記Ｆｃセグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃセグメントであることが好ましく、好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインから選ばれる１つ〜４つのドメインからなり、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであることも好ましく、ＩｇＧ  Ｆｃセグメントであることがより好ましく、前記Ｆｃセグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであることがさらに好ましく、さらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃセグメントは低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果及び／又はＦｃＲｎ受容体との増強された結合親和性を有することが好ましい。
【０００６】
更に他の実施形態において、前記融合パートナー（ＦＰ）は、さらに、ソルターゼ認識部位を含むアミノ酸配列ＳＴに直接的に又は第２のリンカーＬ２を介して連結されており、前記ソルターゼは、例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂであり、好ましくは、前記ＳＴは、ソルターゼ  Ａのコア認識部位ＬＰＸＴＧを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、ＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、前記ＳＴは、さらに、ソルターゼ認識配列に連結されている親和性タグを含むことも好ましく、このようなＳＴ配列は、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫであり、
ここで、前記第２のリンカーＬ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
さらに好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）；
ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）から選ばれる。
【０００７】
他の実施形態において、前記融合タンパク質は、ＧＬＰ−１−Ｌ１−ＦＰ−Ｌ２−ＳＴで表される構造を有し、式中
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体作動薬を示し、且つＧＬＰ−１受容体作動薬、Ｌ１、Ｌ２、ＦＰ及びＳＴは、前記実施形態と同じ定義を有し、ここで、Ｌ１及びＬ２のいずれか一方又は両方は、存在しなくてもよい。
具体的な実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７又は２２で表され、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８又は２３で表される核酸配列によってコードされる。
本発明の第二側面では、複合体であって、１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子が第一側面に記載の融合タンパク質の末端に連結され、好ましくは、ペプチド転移反応により前記ソルターゼ認識部位に連結され、特に、前記融合タンパク質がモノマー又はダイマーであってもよい複合体を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、前記１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子は、それぞれ独立して、多糖及びポリアルキレングリコール、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選ばれ、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えば、メトキシ基によってエンドキャップされ、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールは、直鎖又は分岐鎖であり、例えば、前記ポリアルキレングリコールは、分岐鎖であり、例えば、分岐鎖ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基によってエンドキャップされた分岐鎖ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記のいずれか２つの間の値であり、好ましくは、前記親水性性ポリマー分子の分子量は、２０ｋＤａ又は４０ｋＤａである。
本発明の第三側面は、第一側面に記載の融合タンパク質をソルターゼ（例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂ）及び親水性ポリマー分子と接触させることを含む、第二側面に記載の複合体を調製する方法において、前記親水性ポリマー分子の一端は、ソルターゼによってアミド化できるアミノ基を有する方法を提供する。
１つの実施形態において、其中前記親水性ポリマー分子の一端は、ポリＧｌｙを有し、例えば、ＧＧＧＡＡを有する。
【０００９】
本発明の第四側面は、有効量の第一側面の融合タンパク質及び／又は第二側面に記載の複合体、及び任意の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
１つの実施形態において、前記医薬組成物は、血糖値又は体重を低下させるために、例えば、糖尿病を治療するために、より具体的には、１型糖尿病及び／又は２型糖尿病患者を治療する、特に２型糖尿病を治療するために使用される。
他の実施形態において、前記医薬組成物は、液体製剤形態又は凍結乾燥製剤形態である。
本発明の第五側面は、第一側面に記載の融合タンパク質又は第二側面に記載の複合体の、血糖値又は体重を低下させるための医薬品の調製における用途、例えば、前記医薬品は、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に２型糖尿病を治療するために使用される。
【００１０】
本発明の第六側面は、血糖値又は体重を低下させる方法であって、第一側面に記載の融合タンパク質又は第二側面に記載の複合体をそれを必要とする対象に投与し、例えば、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に、２型糖尿病を治療するために使用されることを含む、方法を提供する。
本発明の第七側面は、第一側面に記載の融合タンパク質、第二側面に記載の複合体、及び／又は第四側面に記載の医薬組成物、及び任意に選択できる取扱説明書を含むキットを提供する。
出願人は、驚くべきことに、本発明のＧＬＰ−１−Ｆｃ複合体が、より長期の血糖降下作用を提供できるだけでなく、既存の類似する薬物よりも、血糖降下薬の服用によって引き起こされる急速な体重減少を有意に低減できるため、そのような薬物の臨床的安全性は極大に改善されるので、大きな臨床応用価値があることを発見している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、ＧＬＰ−１融合タンパク質真核生物発現ベクター的構造を示し、図１Ｂは、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−３Ｇ３Ｃ２）の発酵中の成長曲線及び細胞生存率の検出結果を示す。
【図２】図２は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−３Ｇ３Ｃ２）の発酵中の異なる時点の顕微鏡検査結果を示す。図２Ａは、培養５日目の細胞を示し、図２Ｂは、サンプル収集（１３日目）の細胞を示す。
【図３】図３は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−３Ｇ３Ｃ２）の発酵中の培養上清中のグルコース代謝を示す。
【図４】図４は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−３Ｇ３Ｃ２）の発酵中の培養上清のＮＨ４＋及びラクトース（Ｌａｃ）代謝を示す。
【図５】図５は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質の非還元（左側Ｍ／１／２／３）及び還元（右側４／５／６／Ｍ）電気泳動結果（１及び６は末端発酵ブロス上清、３及び４は精製後のサンプル、２及び５は１０日目の発酵ブロスサンプルである）。
【図６】図６は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質が精製されたＳＤＳ電気泳動（Ａ）及びＳＥＣ分析（Ｂ）の検出結果を示す。
【図７】図７は、ＳＤＳ電気泳動及びＲＰＣ分析による２つのタンパク質の架橋度の検出結果を示す。Ａ及びＣは、それぞれＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質が２０ｋＤａ及び４０ｋＤａ  ＰＥＧを架橋しているＳＤＳ検出結果を示し、Ｂ及びＤは、それぞれＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質が２０ｋＤａ及び４０ｋＤａＰＥＧを架橋しているＲＰＣ検出結果を示し、Ｅは、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴタンパク質が４０ｋＤａ  ＰＥＧを架橋しているＲＰＣ検出結果を示す。
【図８】図８は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ架橋後のサンプルの陰イオン交換クロマトグラム（Ａ）及びＲＰＣ検査（Ｂ）の結果を示す。
【図９】図９は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴがそれぞれ２０ｋＤａ  ＰＥＧ及び４０ｋＤａ  ＰＥＧと架橋された活性測定結果を示す。デュラグルチドと比較しては、非架橋基質（ＧＬＰ１−Ｆｃ）の相対活性は、９８．１０％である。ＰＥＧ架橋後、活性はいずれも低下し、２０ｋＤａ  架橋産物（ＰＥＧ  （２０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ  ）の相対活性は、４０．３８％であり、４０ｋＤａ  架橋産物（ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ）の相対活性は、３２．８５％である。
【図１０−１】図１０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの投与終了後２４ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後２４ｈの影響を示し、図１０Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与終了後１４４ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後１４４ｈの影響を示し、
【図１０−２】図１０Ｅは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与終了後１６８ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｆは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後１６８ｈの影響を示し、図１０Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与終了後１９２ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｈは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後１９２ｈの影響を示し、
【図１０−３】図１０Ｉは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与終了後２１６ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｊは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後２１６ｈの影響を示し、図１０Ｋは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与終了後２４０ｈ以上の耐糖能試験曲線を示し、図１０Ｌは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与終了後２４０ｈの影響を示し、
【図１０−４】図１０Ｍは、投与終了後のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重変化を示す。
【図１１】図１１は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−Ｐ１３２Ｃ７）のフィードバッチ発酵中の成長曲線及び細胞生存率的検出結果を示す。
【図１２】図１２は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−Ｐ１３２Ｃ７）のフィードバッチ発酵中の異なる時点の顕微鏡検査結果を示す。図１２Ａは、培養５日目の細胞を示し、図１２Ｂは、サンプル収集（１３日目）の細胞を示す。
【図１３】図１３は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−Ｐ１３２Ｃ７）のフィードバッチ発酵中の培養上清中のグルコース代謝を示す。
【図１４】図１４は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−Ｐ１３２Ｃ７）の１５Ｌバイオリアクターでのフィードバッチ発酵中のｐＨ変化傾向を示す。
【図１５】図１５は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質的１５Ｌフィードバッチ発酵上清の目的とするタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示し、レーン１は、精製後のサンプルであり、レーン２は、タンパク質Ｍａｒｋｅｒであり、レーン３、４及び５は、順に１２日目、１３日目及び１４日目の発酵ブロス上清である。
【図１６】図１６は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質が精製されたＳＤＳ電気泳動（Ａ）及びＳＥＣ分析（Ｂ）の検出結果を示す。
【図１７】図１７は、ＳＤＳ電気泳動及びＲＰＣ分析による２つのタンパク質の架橋度の検出結果を示す。Ａは、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質が４０ｋＤａ  ＰＥＧを架橋しているＳＤＳ検査であり、Ｂは、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質が４０ｋＤａＰＥＧを架橋しているＲＰＣ検査である。
【図１８】図１８は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３が架橋されたサンプルの陰イオン交換クロマトグラム（Ａ）及びＳＥＣ検査（Ｂ、Ｃ）の結果を示す。
【図１９】図１９は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３が４０ｋＤａ  ＰＥＧと架橋された活性測定結果を示す。デュラグルチドと比較して、非架橋基質（ＧＬＰ１−Ｆｃ）の相対活性は、１１２．２４％である。ＰＥＧ架橋後に、活性は低下し、４０ｋＤａ  架橋ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３産物（ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ）の相対活性は、２１．５１％である。
【図２０】図２０Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血糖曲線下面積（ＡＵＣ）への投与後１〜８日の影響を示し、図２０Ｂは、投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重変化を示す。
【図２１】図２１Ａは、ＳＴＺ誘導２型糖尿病マウス血糖への投与後１〜１２日の影響を示し、図２１Ｂは、投与後の２型糖尿病マウスの体重変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本願で使用される用語は、従来の技術における該用語と同じ意味がある。使用される用語の意味を明確に説明するために、以下、本願における幾つかの用語の具体的な意味を示す。本明細書での定義が該用語の通常の意味と矛盾する場合には、本明細書での定義を基準とする。
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体、並びにそれらの全てのＤ及びＬ立体異性体を含む。非天然アミノ酸は、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジペート、３−アミノアジペート、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノ基ピメリン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ピペコリン酸、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、２−ピペコリン酸及びチオプロリンを含むが、これらに限定されない。アミノ酸類似体は、そのＣ−末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基又はその側鎖基が可逆的または不可逆的に化学的に封止されるか、又は別の官能基として化学的に修飾される天然アミノ酸及び非天然アミノ酸、例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド及びＳ−（カルボキシメチル）−システインスルホンを含む。
【００１３】
本明細書で使用される「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって互いに連結されている１つの配列あたり少なくとも２つのアミノ酸残基を指し、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであってもよい。さらに、本発明に係る「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、その変異体又は類似体、即ち、１つ又は複数の置換、欠失、挿入、融合、短縮型又はそれらの任意の組み合わせによりアミノ酸配列が異なるポリペプチドも含まれる。変異型ポリペプチドは、完全に機能しているか、又は１つ又は複数の活性機能を欠いていることができる。完全機能型変異体は、例えば、保存的な変化のみ、又は重要でない残基または重要でない領域の変更を含んでもよい。機能性変異体は、類似するアミノ酸の置換を含むことができ、その結果、機能が変化していないか、又は大きく変化していない。機能に重要なアミノ酸は、当分野で知られている方法によって同定されることができ、前記方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発又はグリシン走査突然変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｂ．及びＷｅｌｌｓ、Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５、１９８９）。例えば、構造分析、例えば、結晶、核磁気共鳴又は光親和性標識によりポリペプチドの活性に重要な部位を特定することができる（Ｓｍｉｔｈ、Ｌ．など、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４：８９９−９０４、１９９２；ｄｅ  Ｖｏｓ、  Ａ．など、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：３０６−３１２、１９９２）。
本明細書で使用される「複合体」という用語とは、ポリペプチド又はポリペプチド変異体を本明細書に記載の修飾基と共有又は非共有結合して形成される産物を指す。
一般的に、本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、当業者で理解される意味を有し、特に明記しない限り、ポリマー自体でもその末端が修飾された誘導体でも含む。
さらに、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールは、その分子量を特定する種々の方法がある。ポリマーは、一定の分布範囲内で重合度が異なる分子からなるため、一般的に、平均分子量でポリマーの分子量を表すために使用され、具体的に、数平均分子量又は重量平均分子量である。ポリマーの重合度が多く異なる場合には、数平均分子量及び重量平均分子量に多少のずれが生じる可能性があるが、分布範囲が狭いポリマーは、両方が等しくなる傾向がある。特に明記しない限り、本明細書に係るポリマー、例えば、ポリエチレングリコールは、その分子量を言及する場合に、重量平均分子量であってよく数平均分子量であってもよい。
【００１４】
ＧＬＰ−１受容体作動薬
グルカゴン様ペプチド（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）を含み、両方はいずれもプログルカゴン（Ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）に由来し、プログルカゴンは、１５８個のアミノ酸からなり、異なるペプチド鎖に切断されることができ、ＧＬＰ−１は、インスリン分泌の促進、膵臓β細胞の保護、グルカゴン分泌の阻害、胃内容物の排出の抑制、食欲減退の薬理学的効果があるため、２型糖尿病及び肥満症の治療に臨床的に使用することができ、ＧＬＰ−２は、腸の成長を促進し、細胞のアポトーシスを阻害し、胃内容物排出を促進し、食欲を増進させるという薬理学的効果を持つ栄養因子であり、短腸症候群の治療に臨床的に使用できる。人体内で生物学的に活性なＧＬＰ−１は、主にＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）であり、天然ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって迅速に加水分解されて不活性化される（半減期５ｍｉｎ未満）ことは容易であるため、臨床的に使用されることが困難になる。
「ＧＬＰ−１受容体作動薬」という用語は、ＧＬＰ−１受容体を活性化できる分子、例えば、ヒト又は動物などの異なる供給源に由来することができる天然に存在するＧＬＰ−１を指し、天然ＧＬＰ−１受容体作動薬（例えば、ＧＬＰ−１及びｅｘｅｎｄｉｎ−４）野生型配列と比較して１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）アミノ酸置換、欠失及び／又は追加を有するアミノ酸配列で形成される機能性変異体、フラグメント及び類似体、例えば、リラグルチド、リキシセナチド、アビグルチド、デュラグルチド、セマグルチドなどを含む。
【００１５】
ＧＬＰ−１融合タンパク質
ＧＬＰ−１受容体作動薬（例えば、ＧＬＰ−１及びその機能性変異体並びにフラグメント）は、半減期を増加できる融合パートナー（例えば、ヒト免疫グロブリンのＦｃセグメント）と連結されて融合タンパク質を形成し、前記融合タンパク質は、本発明において「ＧＬＰ−１受容体作動薬活性を有する融合タンパク質」又は「ＧＬＰ−１融合タンパク質」と称される。
ヒト免疫グロブリンＩｇＧは、ジスルフィド結合によって共有結合された４つのポリペプチド（軽鎖及び重鎖の２つの同じコピー）からなる。パパインによるＩｇＧ分子のタンパク質加水分解により、２つのＦａｂフラグメント及び１つのＦｃセグメントが生成される。前記Ｆｃセグメントは、ジスルフィド結合によって結合された２つのポリペプチドで構成される。それぞれのポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインで構成される。前記Ｆｃセグメントの構造は、ヒト免疫グロブリンのすべてのサブタイプでほぼ同じである。ＩｇＧは、ヒトの血液中に最も豊富に含まれるタンパク質の１つであり、ヒトの血清中の全免疫グロブリンの７０〜７５％を構成する。
循環中のＩｇＧの半減期は、５つのタイプの免疫グロブリンの全ての中で最も長く、２１日間に達することができる。ＩｇＧのＦｃ区域を他のタンパク質（例えば、各種のサイトカイン及び可溶性受容体）と結合して融合タンパク質を形成することが報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−５３１、１９８９；Ｃｈａｍｏｗら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：５２−６０、１９９６；米国特許Ｎｏ．５，１１６，９６４及び５，５４１，０８７を参照）。典型的な融合タンパク質は、ダイマータンパク質であり、ＩｇＧ  Ｆｃヒンジ領域のシステイン残基を介してタンパク質に連結され、ＩｇＧと類似するが、ＣＨ１領域及び軽鎖を欠いた分子を形成する。構造の相同性のために、Ｆｃ融合タンパク質が現れるｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物動態特性は、アイソタイプのヒトＩｇＧと非常に類似する。従って、ヒトＩｇＧタンパク質のＦｃ領域に連結されているｈＧＨ融合タンパク質を産生するのは、ｈＧＨの循環半減期を延長させ、及び／又はその生物学的活性を向上させるのに役立つ。
【００１６】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、体内で代謝される生分解性ポリペプチドであるので、薬物担体として安全に使用でき、さらに、免疫グロブリン分子全体と比較しては、免疫グロブリンのＦｃ領域は、分子量が比較的に小さいため、複合体の調製、精製及び生産に有利である。免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｆａｂ  フラグメント（そのアミノ酸配列は、抗体サブクラスにより異なるため、非常に不均一である）を含まないため、免疫グロブリンＦｃ領域は物質の均一性を極大に高めて低い抗原性を有することが期待できる。
本発明で使用される「免疫グロブリンのＦｃ領域」という用語とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質である。また、重鎖定常領域でのヒンジ領域を含むこともできる。さらに、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖及び軽鎖の可変領域に加えて、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含有するＦｃ領域の一部又は全部を含むことができ、天然タンパク質と基本的に類似するか又はさらによい生理機能があればよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３のアミノ酸配列の比較的長い部分に欠失があるフラグメントであってもよい。即ち、本発明の的免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；３）ＣＨ１ドメインおよＣＨ３ドメイン；４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；５）１つ又は複数のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、並びに６）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の各ドメインのダイマーであってもよい。
なお、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然アミノ酸配列及びその配列誘導体（突変異体）を含む。一個又はそれ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はその組み合わせにより、アミノ酸配列誘導体は、天然アミノ酸配列と異なる配列を有する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃでは、結合に重要であることが知られている２１４番目〜２３８番目、２９７番目〜２９９番目、３１８番目〜３２２番目又は３２７番目〜３３１番目のアミノ酸残基を修飾される適合な標的として使用される。さらに、他の多種の誘導体であってもよい、ジスルフィド結合を形成できる領域が欠失されたり、天然Ｆｃ型のＮ−末端の幾つかのアミノ酸残基が欠失されたり、又は天然Ｆｃ型のＮ−末端にメチオニン残基が追加された誘導体を含む。さらに、エフェクター機能を削除するために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位およＡＤＣＣ部位で欠失することができる。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を調製するための技術は、ＷＯ  ９７／３４６３１ＷＯ  ９６／３２４７８に開示されている。
【００１７】
タンパク質及びペプチドで一般的に分子活性を変化させないアミノ酸置換は、当技術分野で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９を参照）。最も一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙであり、両方向で利用可能である。
必要に応じて、Ｆｃ領域は、リン酸化、硫酸化、アクリレート化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化、アミド化などにより修飾することができる。
上記Ｆｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を有するか、又は構造安定性（例えば、熱、ｐＨなどに対する構造安定性）が改善された誘導体である。
なお、これらのＦｃ領域は、ヒト、その他、ウシ、ヤギ、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットを含む他の動物から分離された天然の形態として取得できるか、又は形質転換された動物細胞又は微生物に由来する組換え体又は誘導体であってもよい。本明細書では、ヒト又は動物の有機体から完全の免疫グロブリンを分離してタンパク質加水分解酵素で処理することにより天然の免疫グロブリンから取得することができる。パパインで天然免疫グロブリンをＦａｂ領域及びＦｃ領域に消化するが、ペプシン処理によりｐＦｃ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの生成をもたらす。例えば、これらのフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにかけてＦｃ又はｐＦｃ’を分離することができる。
【００１８】
なお、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然糖鎖よりも増加したか又は減少した糖鎖を有する形態であってもよく、脱グリコシル化形態であってもよい。免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少又は除去は、当技術分野で一般的に使用される方法、例えば、化学法、酵素的方法及び微生物を使用する遺伝子工学的方法によって達成することができる。Ｆｃフラグメントから糖鎖を除去すると、補体（Ｃ１ｑ）との結合親和性の明らかな低下、及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害又は補体依存性細胞毒性の低下又は喪失をもたらすため、不要なｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答が誘発されない。これを考慮して、脱グリコシル化又は非グリコシル化の免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の目的により適して医薬品として使用される。
本発明で使用される「脱グリコシル化」という用語とは、Ｆｃ領域から糖部分を酵素的に除去することを意味するが、「非グリコシル化」という用語とは、Ｆｃ領域が非グリコシル化で（例えば、哺乳動物細胞のような真核細胞又は大腸菌のような原核生物中）生成されることを意味する。
なお、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＦｃ領域に由来するか、又はそれらの組み合わせ又はハイブリッドにより調製されてなる。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭ（ヒトの血液中で最も豊富なタンパク質の１つ）に由来し、最も好ましくは、ＩｇＧ（リガンド結合タンパク質の半減期を延長することが知られている）に由来する。
本発明で使用される「組み合わせ」という用語とは、同一供給源からの一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる供給源からの一本鎖ポリペプチドに連結されてダイマー又はポリマーを形成する。即ち、ダイマー又はポリマーは、ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント、ＩｇＡ  Ｆｃセグメント、ＩｇＭ  Ｆｃセグメント、ＩｇＤ  Ｆｃセグメント及びＩｇＥ  Ｆｃセグメントから選ばれる２つ又はそれ以上のフラグメントから形成されることができる。
【００１９】
他の実施形態において、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質は、ホモ二量体として存在する。
他の実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質は、さらに、ソルターゼ認識部位を含むフラグメント（即ち、本発明に記載の「ＳＴ」フラグメント）に連結されている。
「ソルターゼ」という用語は、ソルターゼ  Ａ、ソルターゼ  Ｂを含み、細菌の表面タンパク質を細胞壁に固定する機能を持つことを最初に発見した。同定したところ、表面タンパク質の「識別シグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）」は、ＬＰＸＴＧ配列、疎水性配列及びほとんど正に帯電した残基のテールという３つの重要な部分で構成され、ここで、ＬＰＸＴＧ配列は、非常に保存的であり、ソルターゼで認識できることを確認している。そして、トランスペプチダーゼのシステイン（Ｃｙｓ）は、求核性基として攻撃し、基質（例えば、表面タンパク質）のＣ末端のモチーフのＬＰＸＴＧのスレオニンとグリシンの間でのペプチド結合に作用し、切断させて（アシル化）、さらにアシラーゼ中間体が発生される。次いで、ポリペプチドを細胞壁又は線毛のサブユニットに共有結合して機能する（脱アシル化）。
本発明の一実施形態において、ソルターゼＡを使用してＰＥＧの部位特異的カップリングを行う。１つの具体的な実施形態において、ソルターゼＡのコア認識部位ＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ、ＬＰＥＴＧＧＧを使用する。他の具体的な実施形態において、部位を認識した後に異なる親和性タグ、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ、ＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫなどを追加することもできる。
【００２０】
他の実施形態において、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質は、組換え方法により発生され、例えば、適切な原核生物または真核生物の宿主細胞に発現され、その後、通常の技術で本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を単離する。例えば、まず、化学合成的方法で前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し、次いで、前記配列を適切な発現ベクターにクローンして適切なプロモーターの制御で発現することができる。或いは、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発などの突然変異誘発法を使用し、野生型ＧＬＰ−１からＧＬＰ−１をコードするヌクレオチド配列を取得し、次いで前記配列及び融合タンパク質を構築するための他の要素の配列を適切な発現ベクターにクローンし、適切なプロモーターの制御下で発現することもできる。これらの技術は、完全に当業者の能力の範囲内であり、且つ先行技術には多くの教えがある。
適切な真核生物の宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ及びＨｅｐＧ２である。前記細胞は、好ましくは、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を発現するのに適した条件下で成長させる。本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質を生成または単離するために使用される試薬および条件は、特別な制限はなく、当技術分野で知られているまたは市販されている任意のシステムを使用することができる。好ましい実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質は、当技術分野で記載された方法によって得られる。
ＧＬＰ−１融合タンパク質の作製に利用できるための様々な発現ベクターが存在し、真核生物および原核生物の発現ベクターから選択することができる。原核生物発現ベクターは、例えば、プラスミド、例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ及びｐＢＡＤなどを含むことができ、使用できるプロモーターは、例えば、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ又はａｒａＢＡＤなどを含む。真核生物発現ベクターは、（ｉ）酵母で発現するためのベクター、例えば、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ（ここで、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用できる）；（ｉｉ）昆虫細胞で発現するためのベクター、例えば、ｐＭＴ、ｐＡｃ［ｄｅｌｔａ］、ｐｌＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなど、（ここで、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐｌＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用できる）；及び（ｉｉｉ）哺乳動物細胞で発現するためのベクター、例えば、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなど、その他、ウイルス系に由来するベクター、例えば、ワクチンウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなど（ここで、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ及びβアクチンなどのプロモーターを使用できる）。好ましい実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質は、原核生物または真核生物の細胞系で発現し、且つコドン最適化コード配列を使用する。好ましい実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質を発現するための配列はリーダーペプチド及び／又はシグナルペプチドを含むことで、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質が細胞から細胞外へ分泌され、分離精製されるのに寄与する。他の好ましい実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質を発現するための配列は、リーダーペプチド及び／又はシグナルペプチドを含まず、細胞外に分泌されず、細胞を溶解することによって分離および精製される。
【００２１】
他の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質では、ＧＬＰ−１タンパク質はＦｃセグメントに直接的に連結され、他の実施形態において、ＧＬＰ−１タンパク質はＦｃセグメントに第１のリンカーＬ１を介して連結され、更に他の実施形態において、Ｆｃセグメントは、ソルターゼ認識配列を含むフラグメントに直接的に連結され、他の実施形態において、Ｆｃセグメントは、ソルターゼ認識配列を含むフラグメントに第２のリンカーＬ（２）を介して連結されている。
好ましい実施形態において、前記第１及び／又は第２のリンカーＬ１及び／又はＬ２は、１、２又は３つ以上の異なるアミノ酸からなるペプチド断片である。より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１及び／又はＬ２は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ｎは、１〜５０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
例えば、前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）；
ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）；  
ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）から選ばれる。
また、例えば、前記第２のリンカーＬ２は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）；
ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）から選ばれる。
【００２２】
ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体
本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質は、１つ又は複数のポリマー基と複合化し、ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を形成することができ、ここで、前記ポリマーは、融合タンパク質の末端、例えば、Ｎ末端又はＣ末端に複合化されている。本明細書で使用される「ポリマー」は、好ましくは生理学的に許容され、水溶液又は懸濁液に可溶化であり、且つ該ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を薬学的に有効な量で投与した後に哺乳動物に副作用のような悪影響を及ぼさないポリマーを含む。本発明で使用されるポリマーは、特に限定されない。前記ポリマーは、通常、２から約３０００個の繰り返し単位を有することが好ましい。該ポリマーは、天然又は合成ポリマーから選ばれ、その実例として、例えば、多糖、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ））、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリビニルアルコールなど又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質複合体は、１つ又は複数のＰＥＧ基を使用して複合化修飾を行う。
本発明では、前記ポリマーは、特定の構造に限定されなく、線状（例えば、アルコキシ基ＰＥＧ又は二官能性ＰＥＧ）、分岐状又はマルチアーム（例えば、分岐ＰＥＧ又はポリオールコアに連結されたＰＥＧ）、樹枝状であってもよく、又は分解可能な結合を有してもよい。さらに、ポリマーの内部構造は、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互ターポリマー、ランダムターポリマー及びブロックターポリマーなどから選ばれる任意の数の異なるモデルの構成であってもよい。前記ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリマレイン酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−アラニン）などを含むこともできる。
幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体、例えば、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。本明細書では、特に明記されていない限り、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、末端基がヒドロキシル基であるタイプ以外は、末端基が他の基であるタイプも含まれる。前記他の基は、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アルケニル基、アリールオキシ基又はアラルキルオキシ基を含むが、これらに限定されない。これらのＰＥＧ分子のタイプは、いずれも先行技術で知られており、且つポリペプチドの修飾で通常に使用されている。ＰＥＧ側鎖は、線状、分枝、分岐、樹枝状であるか、又はマルチアームからなり、異なるポリエチレングリコールは、異なるポリマー鎖長及びポリマー構造を持つことができる。
【００２３】
本発明では、使用されるＰＥＧの分子量は、特に限定されず、その分子量範囲は、０．１〜２００ｋＤａ、例えば、１〜１５０ｋＤａ、２〜１００ｋＤａ、３〜８０ｋＤａ又は４〜５０ｋＤａであってもよく、５〜４０ｋＤａであってもよい。他の有用なＰＥＧ分子は、例えば、ＷＯ０３／０４０２１１、ＵＳ６，５６６，５０６、ＵＳ６，８６４，３５０及びＵＳ６，４５５，６３９に開示されているものが含まれる。特に、前記ＰＥＧは、一般式ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨを有し、ここで、ｎの範囲は、約５〜４０００である。上記のように、本発明のＰＥＧは、他の末端基を有するＰＥＧ、例えば、メトキシＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、樹枝状ＰＥＧなどを含む。適切な分岐ＰＥＧは、米国特許Ｎｏ．５，９３２，４６２に記載されるように調製されることができ、該特許全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記樹枝状ＰＥＧとは、ポリマー鎖の一端近くに分岐があるＰＥＧであり、樹枝状ＰＥＧの主鎖は、直鎖又は分岐鎖であってもよい。
ポリマー基が複合化された生物学的に活性な分子において、前記ポリマー基の分子量の増加に伴い、該複合体分子の生物学的活性が徐々に減少することは、当業者にとって知られている（Ｂａｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ、  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ：  Ａ  ４０ｋＤａ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  α  −２ａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２００１  ；  １２  ：  １９５  −２０２；  Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｔｅｉｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９９；  ２７：  ４２５  −３２；Ｂａｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００９；  ６：  １−１６）。前記ポリマー基の分子量の増加に伴い、該複合体分子の生物学的半減期及び／又は血漿半減期が徐々に増加することも当業者には知られている。
長期間安定した治療効果を提供し、また投与頻度を減らして患者のコンプライアンスを改善するために、有意なＧＬＰ−１受容体作動薬活性を保持しながら、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の生物学的半減期をできるだけ延長させた。従って、１つの実施形態において、本発明は、延長された生物学的半減期及び有意なＧＬＰ−１受容体作動薬活性のＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を提供する。
【００２４】
具体的な実施形態において、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質複合体では、前記１つ又は複数のポリマー基（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記のいずれか２つの間の値である。ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体にポリマー基を複合化した分子量を説明する場合には、該複合体に複数の複合化ポリマー基があると、特に指定のない限り、該複合体に複合化されたポリマー基の分子量の合計を計算する。
本発明で使用されるポリマーは、先行技術において知られているものであり、多種の方法で得ることができ、例えば、ＣａｒｂｏＭｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙなどの市販品、又は当分野で知られている方法、例えば、ＥＰ１２４５６０８に記載のような方法によって調製されるものを含む。本発明は、特定の方法のよって製造されたポリマーに限定されない。
複合化反応後、適切な方法により複合体を単離することができる。適切な方法は、例えば、限外濾過、透析法又はクロマトグラフィーなどが含まれ、これらは、全て当業者の能力範囲内である。
【００２５】
医薬組成物
本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体は、例えば、血糖を低下させるための使用を含む、様々な用途を有することができる。従って、本発明は、治療有効量の本発明の融合タンパク質又は複合体、及び任意に選択できる薬学的に許容される担体を含む、血糖を低下させるための医薬組成物をさらに提供する。前記医薬組成物は、糖尿病の治療に使用されることが好ましく、１型糖尿病及び／又は２糖尿病の治療に使用されることがより好ましく、２型糖尿病の治療に使用されることが特に好ましい。
本発明の融合タンパク質又は複合体の治療有効量は、投与経路、被験者のタイプ及び考慮された具体的な哺乳動物の身体的特徴に依存する。これらの要因及びそれらの量の決定との関係は、医療分野の当業者によく知られている。その量及び投与方法は、ペプチドを被験者に送達するための最適な効果を達するように調整できるが、当業者によく知られている要因、例えば、体重、食事、併用薬、その他の要因に依存する。
本発明の医薬組成物は、併用療法で投与されることができ、即ち、１つ又は複数の他の薬剤と併用され、ここで、前記治療剤は、一緒に投与されるか又は順次に投与される。他の幾つかの実施形態では、前記他の薬剤は、１つ又は複数の本発明の融合タンパク質又は複合体又はその医薬組成物の投与前、投与中又は投与後に投与されることができる。本発明で使用できる前記他の薬剤は、例えば、インスリン、インスリン類似体、デキストリンアゴニスト及びコレシストキニンのような血糖を低下させるための薬剤、及び／又は他の疾病治療用化合物又は組成物が含まれる。好ましくは、このような併用薬は、組み合わせひいては相乗効果を達成することができる。
本明細書で使用される「薬学的に許容されるベクター」、「薬学的に許容される担体」又は「生理学的に許容されるベクター」は、互換的に使用でき、任意の生理学的適合性塩、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などの１つ又は複数を含む。幾つかの実施形態において、前記ベクターは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入）に適している。投与経路に応じて、該治療剤を酸及び他のその治療剤を不活性化する可能な天然条件の作用から保護するために、前記治療剤を特定の材料でコーティングする。
【００２６】
投与される場合には、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容される用量で薬学的に許容される組成物にて投与されることができる。「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。このような製剤は、通常、含有塩、緩衝液、防腐剤、適合性担体、及び任意に選択できる他の治療剤、例えば、アジュバント、ケモカインおよびサイトカインを含む補足免疫増強剤などを含む。医薬品に使用される場合には、前記塩は、薬学的に許容し得るものであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために都合よく使用されることができれば、本発明の範囲から除外されない。
必要に応じて、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトなどの哺乳動物への投与に適した、１つ又は複数の適合性固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質である。「担体」という用語は、有機又は無機、天然又は合成の成分を意味し、適用を容易にするために活性成分と組み合わせる。医薬組成物の成分は、所望の薬物の治療効果を著しく破壊する可能性のある相互作用がない形態でブレンドすることができる。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、緩衝系を含むことができ、好ましくは、前記緩衝系は、ｐＨが約３．０〜約６．０の醋酸塩緩衝溶液、又はｐＨが約５．０〜約９．０のリン酸塩緩衝溶液である。幾つかの具体的な実施形態において、適切な緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩及びリン酸塩を含む。
前記医薬組成物は、適切な防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロ−ｔｅｒｔ−ブタノール、パラオキシ安息香酸エステル類及びチメロサールを任意選択して含むこともできる。
前記医薬組成物は、単位用量で都合よく存在し、医薬分野における任意の既知の方法によって調製することができる。全ての方法は、前記活性剤を１つ又は複数の添加剤を含む担体と組み合わせるステップを含む。通常、前記活性化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、又は以上の両方と密接に組み合わせて前記組成物を調製させ、必要に応じて製品を成形する。
【００２７】
非経口投与用医薬組成物は、１つ又は複数の融合タンパク質又は複合体を含む無菌水性又は非水性製剤であってもよい。幾つかの実施形態において、前記製剤は、被験者の血液と等張である。この製剤は、既知の方法に従って適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して調製される。前記無菌注射製剤は、非毒性・非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用できる許容されるベクター及び溶媒は、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液を含む。また、無菌の非揮発性油は、通常、溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の温和な非揮発性油を使用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤に使用されることができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体配方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、  Ｅａｓｔｏｎ、  ＰＡに開示されている。
本発明の融合タンパク質又は複合体は、急速放出からそれを保護する担体を用いて調製することができ、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤が挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する多くの方法が先行技術で知られており、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、  ｅｄ．、  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、  Ｉｎｃ．、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  １９７８などを参照する。
本発明の医薬組成物は、注射または経時的な漸進的注入を含む、任意の通常の投与経路により投与することができる。例えば、前記投与は、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、腔内、腫瘍内、又は経皮的であり得る。
本発明の医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、本明細書で提供される任意の融合タンパク質又は複合体の用量を指し、単独で、またはさらなる用量及び／又は他の治療剤とともに所望の応答（例えば、被験者で血糖のレベルを低下させる）。これは、糖尿病の発症を一時的に遅らせることを含むか、又は幾つかの実施形態において、糖尿病の発症を永久に停止させることも含まれる。
【００２８】
そのような用量は、治療されている特定の疾患、疾患の重症度、個々の患者のパラメーター（年齢、体調、身長及び体重を含む）、治療期間、同時治療の性質（もしあれば）、具体的な投与経路及び医療従事者の知識の範囲内で類似する要因に依存することはもちろんである。これらの要因は当業者によく知られており、日常的な実験を使用することによってのみ知ることができる。一般に、各成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、合理的な医学的判断に基づく最高の安全用量を使用することが好ましい。しかしながら、当業者は、患者が医学的理由、心理的理由、または基本的に他の理由のために、より低い用量または許容用量を必要とする可能性があることを理解することができる。
前述の方法で使用される医薬組成物は、血糖値の低下など、望ましい応答を生み出すように、無菌で、患者への投与に適した重量単位または体積単位で含有有効量の単独又は与別の製剤と組み合わせる融合タンパク質又は複合体あることが好ましい。
被験者に投与される融合タンパク質又は複合体の用量は、異なるパラメーターに従って、特に、使用される投与モードおよび被験者の状態に従って選択することができる。その他の要因は、必要な治療期間を含む。適用された初期用量で被験者の応答えが不十分である場合に、より高い用量（又は異なる、より局所的な送達経路を通じて達成される効果的なより高い用量）を患者の許容範囲に適用することができる。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、０．２０ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質を含み、及び／又は４ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を含み、好ましくは、０．２０ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質を含み、及び／又は４ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を含み、より好ましくは、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質を含み、及び／又は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ  ＧＬＰ−１融合タンパク質複合体を含む。一般的に、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の用量範囲は、約１０  μｇ／ｋｇ患者体重〜約１００、０００  μｇ／ｋｇ患者体重であり。幾つかの実施形態において、前記用量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり。他の幾つかの実施形態において、前記用量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである。他の幾つかの実施形態において、前記用量範囲は、約１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。他の幾つかの実施形態において、前記用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態において、前記用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇである。前記組成物に基づいて、前記用量は、連続的に（例えば、連続ポンプを介して）送達されるか、又は周期的な間隔で送達される。幾つかの実施形態において、静脈内投与される場合には、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の用量は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ又はその中の任意の値であってもよい。特定の組成物の複数回投与の理想的な時間間隔は、過度の実験なしに当業者によって決定することができる。提供される組成物の他の投与方案は、当業者に知られているものであり、用量、投与スケジュール、投与部位、投与モデルなどは、前述のものと異なることができる。１つの実施形態において、前記用量は、静脈内投与される。他の実施形態において、薬剤投与方案は、単回静脈内投与である。
ＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体（例えば、医薬組成物中）及び取扱説明書を含むキットも本発明の範囲にある。前記キットは、少なくとも１つの他の試薬、例えば、１つ又は複数の他の血糖降下剤を含む。他の実施形態において、キットは、区画化された担体を含み得、その中に１つまたは複数の容器装置または一連の容器装置（例えば、試験管、管、フラスコ、ボトル、シリンジなど）をしっかりと収納する。前記キットの成分は、水性媒体中にパッケージ化されるか、又は凍結乾燥形態とすることができる。
【００３０】
本明細書で提供される組成物は、凍結乾燥形態又は水性媒体で提供され得る。
前記被験者は、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが最も好ましいが、他の動物、例えば、飼養動物（例えば、犬、猫など）、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、豚、馬など）又は実験動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ウサギ子、モルモットなど）である。
本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質及び／又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体は、単独で投与されることができるが、好ましくは、投与方案に応じて選ばれる適切な医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物として投与される。それは、任意の適切な方法で治療を必要とする患者／被験者に適用することができる。正確な用量は、該ＧＬＰ−１融合タンパク質及びＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の正確な性質を含む複数の要因に依存する。
幾つかの適切な投与方式は、経口、直腸、鼻、局部（口腔内及び舌下を含み）、皮下、膣又は非経口（包括皮下、筋肉内、静脈、皮内、髄腔内及び硬膜外）投与が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、等張性調整剤及び／又は防腐剤を含み、好ましくは、前記等張性調整剤は、スクロース、マンニトール、塩化ナトリウム及びグリセロールの１つ又は複数であり、前記防腐剤は、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート及びブチルｐ−ヒドロキシベンゾエートから選択される。当業者は、例えば、生理塩水、リンゲル液又は乳酸加リンゲル液などの等張賦形剤を使用することにより、本発明のＧＬＰ−１融合タンパク質又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の適当な溶液をよく調製することができる。必要に応じて、さらに安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を加えることができる。経口投与用医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉剤又は経口液剤などの形態であってもよい。錠剤は、固体担体、例えば、ゼラチン又はアジュバントを含むことができる。液体医薬組成物は、通常、液体担体、例えば、水、石油、動物又は植物油、鉱物油又は合成油を含む。生理食塩水溶液、グルコース、他の糖溶液又はグリコール類、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含むこともできる。幾つかの実施形態において、前記医薬組成物は、液体製剤及び／又は凍結乾燥製剤であり、好ましくは、前記凍結乾燥製剤は凍結乾燥保護剤を含み、より好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は、スクロース、ラクトース、マンニトール、トレハロースなどの糖を含む。
【００３１】
本明細書に係るＧＬＰ−１融合タンパク質及び／又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体は、「治療有効量」又は「有効量」で被験者に投与されることが好ましい。前記組成物は、「治療有効量」で被験者に投与されることが好ましく、前記治療有効量又は有効量は、前記被験者にその利点を示すのに十分である。投与の実際量、投与速度及び時間経過は、治療される患者自体の状態及び重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量の決定など）は医療スタッフによって決定され、且つ治療される疾患、患者自体の状態、送達部位、投与方法及び医師に知られている他の要因を通常に考慮されている。
幾つかの実施形態において、前記ＧＬＰ−１融合タンパク質及び／又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体の用量範囲は、３０ｍｇ／ｋｇ体重／日〜０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は３ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日、又は０．３ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。
本発明は、さらに、治療有効量のＧＬＰ−１融合タンパク質及び／又はＧＬＰ−１融合タンパク質複合体をそれを必要とする被験者に投与することを含む、疾患を治療するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記疾患は、食後ダンピング症候群、食後高血糖、耐糖能障害、肥満、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、糖尿病、及び高血糖症から選ばれる。好ましい実施形態において、前記疾患は、２型糖尿病である。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、いかなる方式においてもこれらに限定されることを解釈されるべきではない。本願で引用された全ての参考文献の全内容（記事の参考文献、付与された特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）は、いずれも援引として本明細書に明示的に組み込まれる。以下の実施例では、特に明記されていない限り、使用される試薬及び材料は、少なくとも分析用純度または同等レベルの市販の製品である。
【実施例】
【００３２】
実施例１    ＧＬＰ−１融合タンパク質の調製
１．  ＧＬＰ−１融合タンパク質の真核生物発現ベクターの構築
本実施例で構築されるＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１−Ｌ１−Ｆｃ−Ｌ２−ＳＴという構造的特徴を持つ。式中、ＧＬＰ−１は、様々な形態のＧＬＰ−１又はその類似体を表し、好ましくは、ＧＬＰ−１配列は、デュラグルチド（デュラグルチド、  ＴｒｕｌｉｃｉｔｙＴＭ）と一致し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ第１及び第２のリンカー配列を表し、Ｌ１の配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡであり、Ｌ２の配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ又はＬ２なしであり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域を表し、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２（本発明ではＦｃ２で表される）又はＩｇＧ４（本発明ではＦｃ４で表される）に由来し、好ましくは、Ｆｃ領域は、デュラグルチド（デュラグルチド、  ＴｒｕｌｉｃｉｔＴＭ）と一致し、ヒトＩｇＧ４の変異体（Ｆｃ４）であり、ＳＴは、ソルターゼ  Ａ認識部位を表し、ＳＴ配列は、ＬＰＥＴＧ又はＬＰＥＴＧＧＧである。
異なるＧＬＰ−１融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＣＨＯ細胞のコドン優先度に従ってヌクレオチド配列に逆翻訳された。ＧＬＰ−１融合タンパク質の全長型ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ増幅法と組み合わせた全遺伝子合成により得られ、両端ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限部位を介して真核生物発現ベクターｐＦＲＬ−ＤＨＦＲにクローン化された。ベクターｐＦＲＬ−ＤＨＦＲには、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡ、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）などの要素が含まれ、真核細胞における外来遺伝子の効率的かつ安定した発現を支援した（図面１Ａ）。
表１には、実施例で具体的に構築された異なるＧＬＰ−１融合タンパク質を示した。
【００３３】
【表１】
2022501405.tif 000003
１．  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−ＳＴアミノ酸の配列
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−ＳＴヌクレオチド配列：
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）
２．  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴアミノ酸配列
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴヌクレオチド配列：
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
３．  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ  アミノ酸配列
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ  ヌクレオチド配列：
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
４．  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴ  アミノ酸配列  
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴヌクレオチド配列：
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＧＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
５．  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３  アミノ酸配列：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２）
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３  ヌクレオチド配列：
ＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３）
【００３４】
２．  安定した細胞株のスクリーニング及び発酵
２．１  安定した細胞株のスクリーニング
上記構築されたプラスミドは、エレクトロトランスフェクションの方法で宿主細胞−ＣＨＯ  ＤＧ４４にトランスフェクトされた。トランスフェクトされる際に細胞密度を６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、体積０．８ｍＬ、プラスミド用量４０μｇで、プラスミドと細胞を均一に軽く混合した後、エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４ｍｍ）に加えて、エレクトロポレーターは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＸＣＥＬＬ）であり、電気伝達パラメーターは、電圧２９０Ｖ、パルス持続時間２０ｍｓである。
電気穿孔後、細胞を１５ｍＬの回復用培地を含む培養皿に移し、４８時間培養後、９６ウェルプレートに接種し、培地を５０ｎＭ  ＭＴＸを含むスクリーニング培地に交換した。クローンのコンフルエンスが５０％以上に達する場合には、ドットブロッティング法を使用して高発現クローンの細胞株をスクリーニングした。抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃであり。スクリーニングされた発現量が比較的高いクローンを、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ２５細胞培養フラスコ及び細胞培養振とうフラスコに順に移して増殖させた。
融合タンパク質の生成量を向上させるために、ＭＴＸ濃度を段階的に増加させながら加圧する方法により細胞を培養した。ＭＴＸによってＤＨＦＲ遺伝子を阻害し、ＤＨＦＲ遺伝子及び融合タンパク質遺伝子の同時増幅が実現された。
２．２  発酵
１５Ｌ  バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｂｉｏｂｕｎｄｌｅ  １５Ｌ）は、接種体積が８Ｌであり、接種密度が０．８〜１．６×１０６個の細胞／ｍＬである。培養パラメーターを次のように設定し、即ち、ｐＨ  ６．９５±０．１５、ＤＯ  ４５％、大気泡換気及び酸素供給、回転速度８０〜１４０ｒｐｍである。培養５日目、細胞密度が約１０〜１２×１０６個の細胞／ｍＬである場合には、３３℃まで降温されて培養された。培養４日目から養分の追加を開始し、毎日残留糖分をチェックし、冷却前に毎日３ｇ／Ｌ、冷却後に毎日４ｇ／Ｌまで糖分を追加した。発酵中、細胞数及び生存率を毎日検出した。１３日目、細胞生存率が９０％程度である場合にサンプルを収集した。
図１Ｂ〜図４は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ安定細胞株（クローン番号：Ｐ１−３Ｇ３Ｃ２）の発酵中の成長曲線、細胞生存率、顕微鏡検査結果、及び各項プロセスパラメーターを示した。図１Ｂから、発酵９日目に、細胞密度が最も高くなり、２０．５×１０６個の細胞／ｍＬであり、１３日目にサンプルを収集する場合には、細胞密度が１５．５×１０６個の細胞／ｍＬであり、生存率が８６．６％である。細胞形態の顕微鏡検査は良好であり、明らかな死細胞はなく（図２Ａ及び図２Ｂ）。図３及び図４は、発酵中の糖、ＮＨ４＋及び乳酸（Ｌａｃ）の代謝を示した。
図１１〜図１４は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３のフィードバッチ発酵中の成長曲線、細胞生存率、顕微鏡検査結果、及び各項プロセスパラメーターを示した。図１１Ｂから、発酵８日目に、細胞密度が最も高くなり、１９．９×１０６個の細胞／ｍＬであり、１４日目にサンプルを収集する場合には、細胞密度が１６．０×１０６個の細胞／ｍＬであり、生存率が９２％である。細胞形態の顕微鏡検査は良好であり、明らかな死細胞はなく（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。図１３及び図１４は、発酵中のグルコース代謝及びｐＨ変化を示した。
分子間相互作用装置（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｑｋｅ）により発酵上清中のＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質の含有量が１．８ｇ／Ｌ、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３の含有量が１．１９ｇ／Ｌであることを検出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ分子の完全性を検査し、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴは、二本鎖Ｆｃ融合タンパク質であり、その完全な分子量は６１．６ｋＤａ（糖を含まない）である。図５に示すように、非還元及び還元状態下で、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ分子量は、理論分子量と基本的に同じである。同時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質の変化を検査すると（図１５）、発酵１２日目〜１４天目のタンパク質の生成量は明らかに増加しなく、上清液中での目的とするタンパク質は、主成分であり、不純なタンパク質の含有量が少なく。発現したタンパク質は、ＥＬＩＳＡ実験により同定されたところ、陽性を示した。
２．３  精製及び検査
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ及びＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３発酵ブロス上清は、アフィニティークロマトグラフィー（Ｕｎｉ  ｍａｂ、ナノ・マイクロ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＱＨＰ、ＢＸＫ）の２つのステップで精製された。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ（サイズ除外クロマトグラフィー）によって検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図６Ａ及び図１６Ａ）より、目的とするタンパク質のサイズは基本的に理論分子量と同じであり、ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｂｉｏ  ＳＥＣ  ３００Ａ、２．７μｍ、７．８＊３００ｍｍカラムを使用し、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ＋１０％アセトニトリル、ｐＨ７．０でアイソクラティック溶出をかけた（カラム温度３０℃、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、サンプラー温度４．０℃、サンプル量５０  μｇ、サンプル分析時間３５ｍｉｎ）。図６Ｂより、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質の保持時間は、１４．６ｍｉｎであり、２階段精製後の純度は９７．２％であることを示し、図１６Ｂより、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質の保持時間は１４．４９ｍｉｎであり、２階段精製後の純度は９８．４１２％であることを示した。
【００３５】
実施例２  ２０ｋＤａ  ＰＥＧ及び４０ｋＤａ  ＰＥＧとＧＬＰ１−Ｆｃ融合タンパク質との連結
構築された全てのＧＬＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｃ末端にソルターゼ  Ａ酵素コア認識配列−ＬＰＥＴＧを含むため、ソルターゼ  Ａ酵素によって特異的に認識された。ソルターゼ  Ａ酵素の作用下で、ＴとＧの間のアミド結合が切断され、Ｔはソルターゼの１８４位Ｃのスルフヒドリル基と反応してチオエステル結合中間体を形成し、次にＮ末端にポリＧｌｙを持つＧＧＧＡＡ−ＰＥＧによって攻撃され、最後に異なる分子量のＰＥＧがタンパク質のＣ末端に連結された。
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴとＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴタンパク質のＰＥＧ化反応系は以下の通りである。即ち、２０ｋＤａ−又は４０ｋＤａ  ＧＧＧＡＡ−ＰＥＧ（ＧＧＧＡＡは、上海吉爾生化有限公司から購入され、２０ｋＤａ−又は４０ｋＤａ  ＧＧＧＡＡ−ＰＥＧは、北京鍵凱科技有限公司から合成される）を緩衝液で溶解させてｐＨを８．０に調整し、その後、タンパク質をそれぞれ１：１５及び１：１０の仕込み比で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０緩衝系に加え、さらにソルターゼ  Ａ酵素及び１０  ｍＭ  ＣａＣｌ２を加え、それぞれ反応の異なる時点でサンプリングし、９０ｍｉｎ後にＥＤＴＡを加えて反応を終了させた。
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質のＰＥＧ化反応系は、以下の通りである。即ち、４０ｋＤａ  ＧＧＧＡＡ−ＰＥＧ（ＧＧＧＡＡは、上海吉爾生化有限公司から購入され、４０ｋＤａ  ＧＧＧＡＡ−ＰＥＧは、北京鍵凱科技有限公司から合成される）を緩衝液で溶解させてｐＨを７．０に調整し、次にタンパク質とＰＥＧを１：１５（モル比）の仕込み比で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０緩衝系に加え、さらにソルターゼ  Ａ酵素及びＣａＣｌ２（１０ｍＭ）を加え、ここで、目的とするタンパク質１ｍｇあたり５０ＩＵ前記酵素を加え、前記目的とするタンパク質の最終濃度は、６ｍｇ／ｍＬである。３０ｍｉｎ後にＥＤＴＡを加えて反応を終了させた。
上記連結生成物は、連結率（架橋度）がＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって検出され、ここで、単一架橋とは、融合タンパク質二量体の１つのモノマーのみがＰＥＧ分子に連結されることを意味し、二重架橋とは、融合タンパク質二量体の両方のモノマーは、いずれもＰＥＧ分子に連結された。逆相クロマトグラフィー検査は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  Ｃ４、３．５  μｍ、４．６＊２５０ｍｍカラムを使用し、０．１％ＴＦＡ水及び０．１％ＴＦＡアセトニトリルでアイソクラティック溶出をかけ、カラム温度５０℃、検出波長２８０ｎｍ、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、サンプラー温度４．０℃、注入量２０μｇ、サンプルの分析時間５０ｍｉｎである。ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ及びＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴタンパク質の検出結果は、図７に示し、反応時間の延長に伴い、２０ｋＤａ及び４０ｋＤａのＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ化生成物は、徐々に増加し、９０ｍｉｎでＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ化生成物は、最大になり、反応を終了させ、この時点でＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴタンパク質２０ｋＤａの総架橋度は、７５．６２％であり、単一架橋は、５５．５７％であり、二重架橋は、２０．０５％であり、４０ｋＤａの総架橋度は４０．１５％であり、単一架橋は、３６．３６％、二重架橋は、３．７９％であり、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴタンパク質４０ｋＤａの総架橋度は６０．８３％であり、単一架橋度は、４８．４６％であり、二重架橋度は、１２．３７％であり。４０ｋＤａ  ＰＥＧ架橋の結果より示すように、同じ反応系において、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−ＳＴの架橋効率は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴよりもはるかに高いことが分かった。
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質の検出結果は、図１７に示した。反応時間の延長に伴い、４０ｋＤａのＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ化生成物は、徐々に増加し、３０ｍｉｎでＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ化生成物は、最大になり、反応を終了させ、この時点でＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３タンパク質が４０ｋＤａＰＥＧを架橋された総架橋度は、８０．８６％であり、単一架橋は、４４．０８７％であり、保持時間は、１０．５４３ｍｉｎであり、二重架橋は、３６．７８２％であり、保持時間は、９．６９８ｍｉｎである。
架橋後の精製及び検査
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴは、４０ｋＤａ  ＰＥＧで架橋された後、サンプルをＢｕｔｙｌ  ＨＰ疎水性クロマトグラフィーにかけて未反応のＧＧＧＡＡ−ＰＥＧ、ソルターゼ  Ａ酵素を除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて未架橋の基質タンパク質を除去し、基質の残留量を１％以内に制御した。図８Ａに示すように、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴが４０ｋＤａ  ＰＥＧで架橋された後、サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけてＰ１、Ｐ２という２つのピークに分離した。ＲＰＣ検出結果（図８Ｂ）は、Ｐ１ピークが主に二重架橋生成物（二重架橋９０．８４％、単一架橋８．４％、基質０．１５％）であり、Ｐ２ピークは、主に単一架橋生成物（二重架橋８．５６％、単一架橋９０．１２％、基質０．７３％）である。非架橋ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴの保持時間は、１７．３ｍｉｎであり、単一、二重架橋生成物の保持時間は、それぞれ２２．５及び２３．２ｍｉｎである。
ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３は、４０ｋＤａ  ＰＥＧで架橋された後、サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒＱ  ５ＰＷ、ＴＯＳＯＨ）にかけて単一、二重架橋及び基質を分離し、クロマトグラムを図１８Ａに示した。ＳＥＣ検出結果（図１８Ｂ及びＣ）は、Ｐ１ピークは、主に二重架橋生成物（二重架橋９７．１７２％、単一架橋２．７６６％、基質０％）であり、Ｐ２ピークは、主に単一架橋生成物（二重架橋１９．７２２％、単一架橋７９．７５４％、基質０．１５８％）である。単一、二重架橋生成物の保持時間は、それぞれ１０．６３及び９．８ｍｉｎである。
【００３６】
実施例３  ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ架橋タンパク質の活性検査
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に結合し、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を活性化し、ｃＡＭＰを生成し、さらに、ｃＡＭＰ依存性転写因子ｃＡＭＰ  応答エレメント結合タンパク質（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＥＢ）を活性化し、後者は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ、ＣＲＥ）と結合した後に下流遺伝子転写を活性化した。
本実施例での検査は、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−Ｌｕｃ／  ＧＬＰ１Ｒ細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入、＃Ｍ００５６２）を対数増殖期まで培養し、トリプシン処理して完全培地に再懸濁し、細胞密度が１×１０６個／ｍＬになるように調整し、白色９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで加え、デュラグルチド及び被験物を完全培地で４００ｎｇ／ｍＬに希釈し、合計９つの勾配で４倍希釈し、細胞を５０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％ＣＯ２で５ｈインキュベートし、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルあたり１００μＬ加え、暗所で１０ｍｉｎ発色させた。フルバンド蛍光マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、２００ＰＲＯ）を使用し、蛍光値を測定することを含む。
標準品及び被験物の蛍光値を縦軸とし、濃度の対数を横軸とし、Ｓｏｆｔｍａｘ分析ソフトウェアを使用して４つのパラメーターの方程式をフィッティングし、データを処理した。次の式に従ってサンプルの相対活性を算出した。
【数１】
2022501405.tif 000004
図９は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴがそれぞれ２０ｋＤａ  ＰＥＧ及び４０ｋＤａ  ＰＥＧと架橋された活性測定結果を示した。デュラグルチドと比較して、非架橋基質（ＧＬＰ１−Ｆｃ）の相対活性は、９８．１０％である。ＰＥＧは架橋後に活性がいずれも低下し、２０ｋＤａ架橋生成物（図ではＰＥＧ  （２０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃを示す）の相対活性は、４０．３８％であり、４０ｋＤａ架橋生成物（図ではＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃを示す）の相対活性は、３２．８５％である。
図１９は、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３及び４０ｋＤａ  ＰＥＧと架橋された生成物の活性測定結果を示す。ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴのＰＥＧ複合化生成物と類似して、デュラグルチドと比較して、ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３は、４０ｋＤａ  ＰＥＧで複合化された生成物（図ではＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃを示す）は、活性がある程度低下し、相対活性が２１．５１％である。
【００３７】
実施例４  ＧＬＰ−１融合タンパク質又はそのＰＥＧ複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ血糖降下作用
Ｃ５７ＢＬ／６（北京維通利華有限公司から購入）マウスを各ケージで５匹飼育し、通常のマウス成長用飼料を与え、自由に飲水させた。光照射時間１２ｈ（０８：００ａｍ−２０：００ｐｍ）、暗い時間１２ｈ（２０：００ｐｍ−０８：ａｍ）である。
（１）ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴの実験結果：
６〜８週齢の健康な雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス４０匹を５群に分け、各群あたり８匹である。それぞれ、（１）ＧＬＰ１−Ｆｃ群（架橋前ＧＬＰ−１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ基質）；（２）デュラグルチド群；（３）４０ｋＤａＰＥＧ  ＧＬＰ１−Ｆｃ  群（ＧＬＰ−１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ架橋４０ｋＤａ  ＰＥＧ）；（４）２０ｋＤａ  ＰＥＧ  ＧＬＰ１−Ｆｃ群（ＧＬＰ−１−Ｌ１−Ｆｃ２−Ｌ２−ＳＴ架橋２０ｋＤａ  ＰＥＧ  ）；（５）対照群である。ここで、（１）〜（４）群では３ｍｇ／ｋｇで投与され、対照群で生理食塩水を投与した。それぞれ投与後２４、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０ｈにＩＰＧＴＴ実験を行い、実験手順は、マウスを６ｈ絶食させ、血糖値、体重を測定し、絶食期間で自由に飲水させ、６時間後に２．０ｇ／ｋｇグルコース溶液を腹腔内投与し、体積は１０ｍｌ／ｋｇであり、グルコース負荷後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎの血糖値を検出し、耐糖能曲線をプロットし、血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、データは、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表され、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ７．０統計ソフトウェアを使用してデータを分析し、Ｍａｎｎ−ｗｈｉｔｅｎｅｙを使用して有意差を統計的に分析することである。
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆに示すように、単回投与後６日以内に、各実験群マウス血糖及び耐糖能試験曲線下面積（ＡＵＣ）は、いずれも対照群よりも有意に低下した。７日後、デュラグルチド及びＧＬＰ１−Ｆｃ群は対照群よりも有意差はなく、ＧＬＰ１−Ｆｃ及びデュラグルチドの薬効は６日間維持することができ、図１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉ、１０Ｊ、１０Ｋ及び１０Ｌに示すように、ＰＥＧ  （２０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは、単回投与後８日目でも有意な耐糖能効果があり、９日後、耐糖能試験曲線下面積（ＡＵＣ）は、対照群よりも差がなく、薬効を８日間維持することができ、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは、単回投与後９日目でも有意な耐糖能効果があり、１０日後にも、耐糖能試験曲線下面積（ＡＵＣ）は、対照群よりも差がなく、薬効を９日間維持することができる。
図１０Ｍは、投与後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの毎日の体重変化を示した。対照群と比較しては、各群の体重は２４時間以内に低下した。中でも、デュラグルチド及び非架橋ＰＥＧのＧＬＰ１−Ｆｃ群体は、顕著に低下した。ＰＥＧ  （２０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−ＦｃでもＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃでも薬物による急速な体重減少のリスクを顕著に低減できることは注目に値し、ＰＥＧ化修飾がそのような薬物の臨床応用の副作用を顕著に改善でき、より良い安全性を有することを示した。
（２）ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３の実験結果：
８〜１０週齢の健康な雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス１８匹を３群に分け、各群あたり６匹である。それぞれ、（１）対照群；（２）デュラグルチド群；（３）ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ群（ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３架橋４０ｋＤａ  ＰＥＧ）である。ここで、（２）及び（３）群では同等の活性で投与し（即ち、図１９でｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出された活性に基づく質量換算）、デュラグルチドの用量は、０．７６ｍｇ／ｋｇであり、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃの用量は、３．５ｍｇ／ｋｇであり、対照群では生理食塩水を投与した。それぞれ、投与後１、５、６、７、８日目にＩＰＧＴＴ実験を行い、実験手順は、マウスを６ｈ絶食させ、血糖値、体重を測定し、絶食期間で自由に飲水させ、６時間後に２．０ｇ／ｋｇグルコース溶液を腹腔内投与し、体積は１０ｍｌ／ｋｇであり、グルコース負荷後１０、３０、６０、９０、１２０ｍｉｎの血糖値を検出し、血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、データは、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表され、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ７．０統計ソフトウェアを使用してデータを分析し、Ｍａｎｎ−ｗｈｉｔｅｎｅｙを使用して有意差を統計的に分析することである。
図２０Ａに示すように、単回投与後５日以内に、各実験群のマウスの血糖及び耐糖能試験曲線下面積（ＡＵＣ）は、対照群よりも有意に低下した。５日間後、デュラグルチド群は、対照群よりも有意差はなく、デュラグルチドの薬効を５日間維持できることを示し、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは、単回投与後７日目でも有意な耐糖能効果があり、８日後に耐糖能試験曲線下面積（ＡＵＣ）は、対照群よりも差がなく、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃの薬効が７日間維持できることを示した。
図２０Ｂは、投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重変化を示した。対照群よりも、両方の体重は、２４時間以内に低下した。中でも、デュラグルチド群の体重は顕著に低下した。ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは、薬剤による急激な体重減少のリスクも顕著に低減できることは注目に値し、さらに、ＰＥＧ化修飾がそのようなＧＬＰ−１受容体作動薬類医薬品の臨床応用の副作用を有意に改善できることを示した。
【００３８】
実施例５  ＳＴＺ誘導２型糖尿病マウスのｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３架橋生成物の血糖降下作用の検出
２型糖尿病マウスモデルの構築
Ｃ５７ＢＬ／６（北京維通利華有限公司から購入）マウスを各ケージで５匹飼育し、通常のマウス成長用飼料を与え、自由に飲水させた。光照射時間１２ｈ（０８：００ａｍ−２０：００ｐｍ）、暗い時間１２ｈ（２０：００ｐｍ−０８：００ａｍ）。８〜１０週齢の健康な雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス３０匹を６０ｍｇ／ｋｇ  ＳＴＺで誘導し、４日間連続投与し、２週間後に血糖値を測定し、非空腹時血糖値≧１６．７ｍｍｏｌ／Ｌでは、２型糖尿病マウスの誘導に成功する。
手順
２型糖尿病マウス２４匹を４群に分け、各群あたり６匹である。それぞれ、（１）対照群；（２）デュラグルチド−１ｍｇ／ｋｇ群；（３）ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ  （ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３架橋４０ｋＤａ  ＰＥＧ）−１ｍｇ／ｋｇ  群；（４）ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ（ＧＬＰ１−Ｌ１−Ｆｃ４−Ｌ２−ＳＴＧ３架橋４０ｋＤａ  ＰＥＧ）−３ｍｇ／ｋｇ  群である。ここで、デュラグルチドの用量は、１ｍｇ／ｋｇであり、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃの用量は、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇであり、対照群では、生理食塩水を投与した。それぞれ、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日目に血糖値を検出し、体重を秤量し、絶食させなく、自由に飲水させ、データは均数±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表され、采用Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ７．０統計ソフトウェアを使用してデータを分析し、Ｍａｎｎ−ｗｈｉｔｅｎｅｙを使用して有意差を統計的に分析した。
結果
図２１Ａに示すように、単回投与後、各実験群のマウスの血糖は、対照群よりも有意に低下した。６日目に、デュラグルチド−１ｍｇ／ｋｇ群は対照群よりも、血糖差が依然として有意であるが（Ｐ＝０．００２２）、７日目になる時に、血糖値は対照群よりも有意差がなく（Ｐ＝０．９６５４）。これは、デュラグルチドの血糖降下作用が最大６日間維持できることを示した。
逆に、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ−１ｍｇ／ｋｇを単回投与した後でも、１０日目に有意な血糖降下作用があり（Ｐ＝０．０３８１）、１１日目まで対照群に近いが（Ｐ＝０．１１４３）、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ−３ｍｇ／ｋｇは、単回投与後１１日目でも有意な血糖降下作用があり（Ｐ＝０．０３８１）、１２日目まで対照群よりも有意差がない（Ｐ＝０．０７６２）。以上の結果より、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは有意に優れた長期血糖降下作用を有し、２型糖尿病の治療に効果的に使用できることを示した。
さらに、投与後の糖尿病マウスの体重変化も観察され、図２１Ｂに示すように、対照群よりも、全ての実験群マウスの体重は、いずれも低下した。中でも、デュラグルチド群の体重は、顕著に低下し、対照群よりもマウスの体重は最大で２．５ｇ減少し、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃの２つの用量群は、体重への影響が有意に小さくなり、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃ−１ｍｇ／ｋｇ群のマウスの体重は、対照群よりも最大０．３ｇ減少し、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−３ｍｇ／ｋｇ群のマウスの体重は、対照群よりも最大１．１ｇ減少した。それにより、さらに、ＰＥＧ  （４０ｋＤａ）−ＧＬＰ１−Ｆｃは、各用量で糖尿病の治療に使用される場合に、同様に薬物による急速な体重減少を顕著に改善できることを示し、ＰＥＧ化修飾がそのような薬物の臨床的応用の副作用を顕著に改善させるとともに、患者のコンプライアンスを効果的に向上させることができることを示した。
【００３９】
以上、ＰＥＧ化ＧＬＰ１−Ｆｃは、膵臓β細胞によるインスリンの分泌を促進し、外因性グルコース摂取による一時的な血糖値上昇を抑制し、グルコース利用を促進することができ、ＰＥＧ修飾後、ＧＬＰ１−Ｆｃタンパク質は、より長く持続する血糖値低下効果を示し、且つ薬物の副作用がより小さく、ＧＬＰ−１類ダイエット薬による急激な体重減少の問題を回避し、良好な臨床応用の見通しがある。
本発明は、各々の具体的な実施例によって説明している。しかし、当業者は、本発明が各々の具体的な実施例に限定されなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の範囲内で様々な変更または改良を加えることができることを理解すべきである。これらの変更及び改良は、いずれも本発明の範囲内にある。
【図１】
2022501405.tif 000005
【図２】
2022501405.tif 000006
【図３】
2022501405.tif 000007
【図４】
2022501405.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
2022501405.tif 000011
【図８】
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【図９】
2022501405.tif 000013
【図１０−１】
2022501405.tif 000014
【図１０−２】
2022501405.tif 000015
【図１０−３】
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【図１０−４】
2022501405.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2022501405.tif 000021
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
2022501405000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月24日(2021.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子がＧＬＰ−１受容体作動薬融合タンパク質の末端に連結された複合体であって、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬融合タンパク質は、ＧＬＰ−１受容体作動薬及びｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させる融合パートナー（ＦＰ）を含み、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬と前記融合パートナーとは直接的に又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、前記第１のリンカーＬ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、前記第１のリンカーＬ１は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは１〜５０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、複合体。
【請求項２】
前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；
ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；  
ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
から選ばれる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、全長型、短縮型又は変異型のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体、好ましくは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド、リキシセナチド、アビグルチド、デュラグルチド又はセマグルチドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記融合パートナー（ＦＰ）は、全長型、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリンであり、好ましくは、前記Ｆｃセグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃセグメント由来であり、前記Ｆｃセグメントは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなる群より選ばれる１つ〜４つのドメインからなることが好ましく、前記Ｆｃセグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであることが好ましく、ＩｇＧ  Ｆｃセグメントであることがより好ましく、前記Ｆｃセグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであることがさらに好ましく、さらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃセグメントは低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又はＦｃＲｎ受容体との増強された結合親和性を有することが好ましい、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記融合パートナー（ＦＰ）は、さらに、ソルターゼ認識部位を含むアミノ酸配列ＳＴに直接的に又は第２のリンカーＬ２を介して連結されており、前記ソルターゼは、例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂであり、好ましくは、前記ＳＴは、ソルターゼ  Ａのコア認識部位ＬＰＸＴＧを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、前記ＳＴは、例えば、ＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、前記ＳＴは、さらに、ソルターゼ認識配列に連結されている親和性タグを含むことも好ましく、このようなＳＴ配列は、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫであり、
ここで、前記第２のリンカーＬ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記第２のリンカーＬ２は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；
ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）から選ばれる、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記融合タンパク質はＧＬＰ−１−Ｌ１−ＦＰ−Ｌ２−ＳＴで表される構造を有し、Ｌ１及びＬ２のいずれか１つ又は２つは存在しなくてもよい、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、モノマー又はダイマーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子は、それぞれ独立して、多糖及びポリアルキレングリコール、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選ばれ、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えば、メトキシ基によってエンドキャップされ、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールは、直鎖又は分岐鎖であり、例えば、前記ポリアルキレングリコールは、分岐鎖であり、例えば、分岐鎖ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基によってエンドキャップされた分岐鎖ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記のいずれか２つの間の値であり、好ましくは、前記親水性ポリマー分子の分子量は、２０ｋＤａ又は４０ｋＤａである、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
前記融合タンパク質をソルターゼ（例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂ）及び親水性ポリマー分子と接触させることを含む請求項５に記載の複合体を調製する方法であって、前記親水性ポリマー分子の一端は、ソルターゼによってアミド化できるアミノ基を有する方法。
【請求項１１】
前記親水性ポリマー分子の一端は、ポリＧｌｙ、例えば、ＧＧＧＡＡを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
有効量の請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の複合体、及び任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
血糖値又は体重を低下させるために、例えば、糖尿病を治療するために、より具体的には、１型糖尿病及び／又は２型糖尿病患者を治療する、特に２型糖尿病を治療するために使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
以上、ＰＥＧ化ＧＬＰ１−Ｆｃは、膵臓β細胞によるインスリンの分泌を促進し、外因性グルコース摂取による一時的な血糖値上昇を抑制し、グルコース利用を促進することができ、ＰＥＧ修飾後、ＧＬＰ１−Ｆｃタンパク質は、より長く持続する血糖値低下効果を示し、且つ薬物の副作用がより小さく、ＧＬＰ−１類ダイエット薬による急激な体重減少の問題を回避し、良好な臨床応用の見通しがある。
本発明は、各々の具体的な実施例によって説明している。しかし、当業者は、本発明が各々の具体的な実施例に限定されなく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の範囲内で様々な変更または改良を加えることができることを理解すべきである。これらの変更及び改良は、いずれも本発明の範囲内にある。
本発明は以下の態様を含む。
＜１＞  ＧＬＰ−１受容体作動薬及びそれに連結されているｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させる融合パートナー（ＦＰ）を含む、ＧＬＰ−１受容体作動薬の融合タンパク質であって、前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、前記融合パートナーに直接的に又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
さらに好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）；
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）；
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）；
ＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）；
ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）；  
ＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７）及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）から選ばれる融合タンパク質。
＜２＞  前記ＧＬＰ−１受容体作動薬は、全長型、短縮型又は変異型のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体、例えば、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（１−３６）、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド、リキシセナチド、アビグルチド、デュラグルチド又はセマグルチドである、前記＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞  前記融合パートナー（ＦＰ）は、全長型、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、ＸＴＥＮ又はトランスフェリンであり、好ましくは、前記Ｆｃセグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃセグメントであり、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインから選ばれる１つ〜４つのドメインからなることが好ましく、前記免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであることも好ましく、ＩｇＧ  Ｆｃセグメントであることがより好ましく、前記Ｆｃセグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであることがさらに好ましく、さらに、前記ＩｇＧ  Ｆｃセグメントは低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果及び／又はＦｃＲｎ受容体との増強された結合親和性を有することが好ましい、前記＜１＞又は＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞  前記融合パートナー（ＦＰ）は、さらに、ソルターゼ認識部位を含むアミノ酸配列ＳＴに直接的に又は第２のリンカーＬ２を介して連結されており、前記ソルターゼは、例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂであり、好ましくは、前記ＳＴは、ソルターゼ  Ａのコア認識部位ＬＰＸＴＧを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、ＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、前記ＳＴは、さらに、ソルターゼ認識配列に連結されている親和性タグを含むことも好ましく、このようなＳＴ配列は、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫであり、
ここで、前記第２のリンカーＬ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド断片であり、より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、Ａ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳを含む柔軟性ペプチド断片、例えば、（ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、１〜５０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
さらに好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、
ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８）；
ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）から選ばれる、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
＜５＞  ＧＬＰ−１−Ｌ１−ＦＰ−Ｌ２−ＳＴで表される構造を有し、式中
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体作動薬を示し、且つＧＬＰ−１受容体作動薬、Ｌ１、Ｌ２、ＦＰ及びＳＴは、前記＜４＞と同じ定義を有し、ここで、Ｌ１及びＬ２のいずれか１つ又は２つは、存在しなくてもよい、前記＜４＞に記載の融合タンパク質。
＜６＞  １つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子が前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質の末端に連結され、好ましくは、ペプチド転移反応により前記ソルターゼ認識部位に連結され、特に、前記融合タンパク質がモノマー又はダイマーであってもよい複合体。
＜７＞  前記１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子は、それぞれ独立して、多糖及びポリアルキレングリコール、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選ばれ、前記ポリアルキレングリコールは、末端がエンドキャップされてもよく、例えば、アルコキシ基、例えば、メトキシ基によってエンドキャップされ、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールは、直鎖又は分岐鎖であり、例えば、前記ポリアルキレングリコールは、分岐鎖であり、例えば、分岐鎖ポリエチレングリコール、特に、メトキシ基によってエンドキャップされた分岐鎖ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量は、１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記のいずれか２つの間の値であり、好ましくは、前記親水性ポリマー分子の分子量は、２０ｋＤａ又は４０ｋＤａである、前記＜６＞に記載の複合体。
＜８＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質をソルターゼ（例えば、ソルターゼ  Ａ又はソルターゼ  Ｂ）及び親水性ポリマー分子と接触させることを含む前記＜６＞又は＜７＞に記載複合体を調製する方法であって、前記親水性ポリマー分子の一端は、ソルターゼによってアミド化できるアミノ基を有する方法。
＜９＞  前記親水性ポリマー分子の一端は、ポリＧｌｙ、例えば、ＧＧＧＡＡを有する、前記＜８＞に記載の方法。
＜１０＞  有効量の前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質及び／又は前記＜６＞又は＜７＞に記載の複合体、及び任意に選択できる薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
＜１１＞  血糖値又は体重を低下させるために、例えば、糖尿病を治療するために、より具体的には、１型糖尿病及び／又は２型糖尿病患者を治療する、特に２型糖尿病を治療するために使用される、前記＜１０＞に記載の医薬組成物。
＜１２＞  液体製剤形態又は凍結乾燥製剤形態である、前記＜１０＞又は＜１１＞に記載の医薬組成物。
＜１３＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質又は前記＜６＞又は＜７＞に記載の複合体の、血糖値又は体重を低下させるための医薬品の調製における用途であって、例えば、前記医薬品は、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に２型糖尿病を治療するために使用される用途。
＜１４＞  血糖値又は体重を低下させる方法であって、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質又は前記＜６＞又は＜７＞に記載の複合体を、それを必要とする対象に投与し、例えば、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、特に、２型糖尿病を治療するために使用されることを含む、方法。
＜１５＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の融合タンパク質、前記＜６＞又は＜７＞に記載の複合体、及び／又は前記＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の医薬組成物、及び任意に選択できる取扱説明書を含むキット。
【国際調査報告】
2022501405.tif 000029
2022501405.tif 000030
2022501405.tif 000031
2022501405.tif 000032
2022501405.tif 000033
2022501405.tif 000034
2022501405.tif 000035
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