【手続補正書】
【提出日】平成22年7月2日(2010.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有するキナーゼセンサー、またはその互変異性体、立体異性体、もしくは塩：
2009542229.tif 000001
式中、Ｒ１はＨ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ２はフルオロフォア、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ３はフルオロフォア、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ４はフルオロフォア、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ５はフルオロフォア、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、かつ
Ｒ６はフルオロフォア、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ＳＯ３Ｈ、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の少なくとも１つはフルオロフォアであり、
Ｒ７はＨ、アルキル、置換アルキル、カルボニル、ペプチド、または保護基であり、かつ
Ｒ８はＨ、アルキル、置換アルキル、カルボニル、ペプチド、または保護基であり、
Ｌはリンカーであり、かつ
ＹはペプチドまたはＨであり、
ｎは１から５である。
【請求項２】
Ｒ４がフルオロフォアである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項３】
前記フルオロフォアが、ダンシル、キサンテン、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジン、またはその誘導体である、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項４】
前記フルオロフォアが、クマリン、キサンテン、またはその誘導体である、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項５】
前記フルオロフォアが以下の式である、請求項１記載のキナーゼセンサー：
2009542229.tif 000002
式中、Ｒ９およびＲ１０は各々独立にハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、置換スルホニル、またはＨである。
【請求項６】
Ｌが共有結合である、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項７】
ＹがＨである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項８】
Ｒ１がヒドロキシである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項９】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が全てＨである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１０】
Ｒ７がＨまたはＦＭＯＣである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１１】
Ｒ８がＨである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１２】
Ｙがペプチドである、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１３】
前記ペプチドが、キナーゼ認識部位と、キナーゼによりリン酸化されるセリン、トレオニン、またはチロシンから選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを含む、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１４】
2009542229.tif 000003
の結合で示される位置が、Ｓ型立体配置である、請求項１記載のキナーゼセンサー。
【請求項１５】
マグネシウムである、請求項１記載のキナーゼセンサーの塩。
【請求項１６】
以下の式を有するキナーゼセンサー、またはその互変異性体、立体異性体、もしくは塩：
2009542229.tif 000004
式中、Ｒ７はＨまたは保護基であり、
Ｒ９はハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、置換スルホニル、またはＨであり、
Ｒ１０はハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、置換スルホニル、またはＨであり、
Ｌはリンカーであり、かつ
ＹはペプチドまたはＨである。
【請求項１７】
Ｌが共有結合である、請求項１６記載のキナーゼセンサー。
【請求項１８】
ＹがＨである、請求項１６記載のキナーゼセンサー。
【請求項１９】
Ｒ９およびＲ１０の両方がフッ素である、請求項１６記載のキナーゼセンサー。
【請求項２０】
Ｒ７がＨである、請求項１６記載のキナーゼセンサー。
【請求項２１】
ｄ）金属キレータ、１つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含むキナーゼセンサーの蛍光を測定する工程であって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位を含む、工程と、
ｅ）Ｍｇ２＋、リン酸源、およびキナーゼと、前記キナーゼセンサーとを接触させ、前記キナーゼセンサーの蛍光を測定する工程と、
ｆ）前記キナーゼセンサーの、非接触状態と接触状態との間の蛍光の差異を測定する工程と
を含むキナーゼ活性の検出方法であって、蛍光の差異がキナーゼ活性の存在を示す、方法。
【請求項２２】
測定される前記蛍光が、蛍光の強度、励起もしくは放出波長、分布、蛍光の寿命、蛍光偏光、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ａ）キナーゼ酵素を含むサンプルを準備する工程と、
ｂ）前記サンプルを、金属キレータ、１つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含む非蛍光性のキナーゼセンサーと接触させる工程であって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位とを含む、工程と、
ｃ）接触させた前記サンプルと前記キナーゼセンサーとを、キナーゼが反応するのに十分な時間インキュベートし、インキュベートサンプルを形成させる工程と、
ｄ）前記インキュベートサンプルを適当な波長で照射し、照射サンプルを形成させる工程と、
ｅ）前記照射サンプルを観察する工程であって、前記キナーゼ活性が、観察可能な蛍光シグナルの存在により検出される工程と
を含む、キナーゼ活性の検出方法。
【請求項２４】
金属キレータ、１つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含むキナーゼセンサーを含むキットであって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位とを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の更なる実施形態を、以下の詳細な説明において提供する。
[請求項101]
金属キレータ、1つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含むキナーゼセンサーであって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方が前記キノリン基とコンジュゲートしている、前記キナーゼセンサー。
[請求項102]
前記1つまたは複数のアミノ酸がキナーゼ基質を含む、請求項101記載のキナーゼセンサー。
[請求項103]
前記キノリン基が、ヒドロキシ基、アミノ基、アミド基、スルホンアミド基、またはチオール基により置換されている、請求項101記載のキナーゼセンサー。
[請求項104]
前記キノリン基がマグネシウムをキレート化する、請求項101記載のキナーゼセンサー。
[請求項105]
前記フルオロフォアが、ダンシル、キサンテン、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジン、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項101記載のキナーゼセンサー。
[請求項106]
前記フルオロフォアが、クマリン、キサンテン、またはその誘導体である、請求項105記載のキナーゼセンサー。
[請求項107]
前記キナーゼ基質がペプチドである、請求項101記載のキナーゼセンサー。
[請求項108]
前記ペプチドが、キナーゼ認識部位と、キナーゼによりリン酸化されるセリン、トレオニン、またはチロシンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基とを含む、請求項107記載のキナーゼセンサー。
[請求項109]
以下の式を有するキナーゼセンサー、またはその互変異性体、立体異性体、もしくは塩:
2009542229.tif 000005
式中、R1はH、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
R2はフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
R3はフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
R4はフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
R5はフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、かつ
R6はフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり、
R2、R3、R4、R5、およびR6の少なくとも1つはフルオロフォアであり、
R7はH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、ペプチド、または保護基であり、かつ
R8はH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、ペプチド、または保護基であり、
Lはリンカーであり、かつ
YはペプチドまたはHであり、
nは1から5である。
[請求項110]
R4がフルオロフォアである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項111]
前記フルオロフォアが、ダンシル、キサンテン、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジン、またはその誘導体である、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項112]
前記フルオロフォアが、クマリン、キサンテン、またはその誘導体である、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項113]
前記フルオロフォアが以下の式である、請求項109記載のキナーゼセンサー:
2009542229.tif 000006
式中、R9およびR10は各々独立にハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHである。
[請求項114]
Lが共有結合である、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項115]
YがHである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項116]
R1がヒドロキシである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項117]
R2、R3、R5、およびR6が全てHである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項118]
R7がHまたはFMOCである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項119]
R8がHである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項120]
Yがペプチドである、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項121]
前記ペプチドが、キナーゼ認識部位と、キナーゼによりリン酸化されるセリン、トレオニン、またはチロシンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基とを含む、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項122]
2009542229.tif 000007
の結合で示される位置が、S型立体配置である、請求項109記載のキナーゼセンサー。
[請求項123]
マグネシウムである、請求項109記載のキナーゼセンサーの塩。
[請求項124]
以下の式を有するキナーゼセンサー、またはその互変異性体、立体異性体、もしくは塩:
2009542229.tif 000008
式中、R7はHまたは保護基であり、
R9はハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり、
R10はハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり、
Lはリンカーであり、かつ
YはペプチドまたはHである。
[請求項125]
Lが共有結合である、請求項124記載のキナーゼセンサー。
[請求項126]
YがHである、請求項124記載のキナーゼセンサー。
[請求項127]
R9およびR10の両方がフッ素である、請求項124記載のキナーゼセンサー。
[請求項128]
R7がHである、請求項124記載のキナーゼセンサー。
[請求項129]
d)金属キレータ、1つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含むキナーゼセンサーの蛍光を測定する工程であって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位を含む、工程と、
e)Mg2+、リン酸源、およびキナーゼと、前記キナーゼセンサーとを接触させ、前記キナーゼセンサーの蛍光を測定する工程と、
f)前記キナーゼセンサーの、非接触状態と接触状態との間の蛍光の差異を測定する工程と
を含むキナーゼ活性の検出方法であって、蛍光の差異がキナーゼ活性の存在を示す、方法。
[請求項130]
測定される前記蛍光が、蛍光の強度、励起もしくは放出波長、分布、蛍光の寿命、蛍光偏光、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項129記載の方法。
[請求項131]
a)キナーゼ酵素を含むサンプルを準備する工程と、
b)前記サンプルを、金属キレータ、1つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含む非蛍光性のキナーゼセンサーと接触させる工程であって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位とを含む、工程と、
c)接触させた前記サンプルと前記キナーゼセンサーとを、キナーゼが反応するのに十分な時間インキュベートし、インキュベートサンプルを形成させる工程と、
d)前記インキュベートサンプルを適当な波長で照射し、照射サンプルを形成させる工程と、
e)前記照射サンプルを観察する工程であって、前記キナーゼ活性が、観察可能な蛍光シグナルの存在により検出される工程と
を含む、キナーゼ活性の検出方法。
[請求項132]
金属キレータ、1つまたは複数のアミノ酸、およびフルオロフォアを含むキナーゼセンサーを含むキットであって、前記キレータがキノリン基を含み、前記フルオロフォアおよびアミノ酸の両方がキノリン基とコンジュゲートし、前記アミノ酸がキナーゼ認識部位とリン酸化部位とを含む、キット。