(57)【要約】  本発明は、末端に窒素含有官能基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が置換されたカルベン化合物、カルベン化合物と金属ナノ粒子が結合したカルベン‐金属ナノ粒子複合体、その製造方法およびこれを用いたバイオセンサに関する。
2022502470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端に窒素含有官能基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が置換された下記化学式１または２で表されるカルベン化合物。
【化１】
2022502470.tif 000015
【化２】
2022502470.tif 000016
前記化学式１および２中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数２〜３０のヘテロアリール基であるか、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基、炭素数２〜３０のヘテロアリール基または下記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合して炭化水素環を形成し、
Ｒ３およびＲ４の少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造であり、
Ｒ７〜Ｒ１０の少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合して炭化水素環を形成する場合、前記炭化水素環を形成する炭素に結合した水素のうち少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造で置換され、
【化３】
2022502470.tif 000017
前記化学式３中、
ｎは、括弧内の単位の繰り返し数として、１〜３０の整数であり、
Ａは、窒素（Ｎ）原子を含む炭素数１〜２０のアルキル基または窒素（Ｎ）原子を含む炭素数２〜３０のヘテロアリール基である。
【請求項２】
前記窒素含有官能基は、アジド（ａｚｉｄｅ）、フタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）およびアミン（ａｍｉｎｅ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１に記載のカルベン化合物。
【請求項３】
前記Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つおよび前記Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つは、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数２〜３０のヘテロアリール基である、請求項１に記載のカルベン化合物。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のカルベン化合物が金属ナノ粒子と結合しているカルベン‐金属ナノ粒子複合体。
【請求項５】
前記金属ナノ粒子の粒子径が、１ｎｍ〜４０ｎｍである、請求項４に記載のカルベン‐金属ナノ粒子複合体。
【請求項６】
前記金属は、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、ビスマス（Ｂｉ）、銀（Ａｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、クロム（Ｃｒ）、インジウム（Ｉｎ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、鉛（Ｐｂ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、レニウム（Ｒｅ）、ロジウム（Ｒｈ）、アンチモン（Ｓｂ）、タンタル（Ｔａ）、チタン（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）、バナジウム（Ｖ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項４に記載のカルベン‐金属ナノ粒子複合体。
【請求項７】
一末端にチオール基を含み、他の末端に窒素含有官能基を含むポリエチレングリコールと金属ナノ粒子を混合し、硫黄‐金属ナノ粒子を製造するステップと、
前記硫黄‐金属ナノ粒子と請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のカルベン化合物を混合するステップとを含む、カルベン‐金属ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項８】
前記硫黄‐金属ナノ粒子と前記カルベン化合物を混合するステップは、前記金属ナノ粒子の表面に存在する金属‐硫黄結合を金属‐カルベン結合に置換するステップを含む、請求項７に記載のカルベン‐金属ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項９】
バイオプローブ部が、クリック反応（ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により固定化している、請求項４に記載のカルベン‐金属ナノ粒子複合体を含むバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルベン化合物、カルベン‐金属ナノ粒子複合体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金は、実生活だけでなく、産業分野においてもその価値が非常に高く、その大きさと形状によって、様々な分野（半導体メモリ素子、有機化学反応触媒、次世代エネルギー、現場診断用ＬＦＡ（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙ）およびバイオセンサ分野など）において、独特の物理的および化学的性質を示している。最近、ナノ科学の発展によって、金ナノの製造など、金の加工法の開発に伴いその活用範囲がより様々になっている。
【０００３】
金ナノプローブ（ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ナノロッド（ｎａｎｏｒｏｄ）など）の大量生産技術の開発に伴い、バイオ産業分野において疾病の診断および治療に活用されているが、金ナノプローブでは、特に、金表面処理技術が性能に及ぼす影響が非常に大きい。かかる金表面処理のために、従来、アルキルアミン（ａｌｋｙｌａｍｉｎｅ）、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（デカン酸、クエン酸など）、チオール（ｔｈｉｏｌ）、アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ）などを用いた処理方法が、水または有機溶媒への分散性、バイオプローブ部の付着容易性などの利点から、広く活用されている。
【０００４】
中でも、チオールは、金（Ａｕ）との高い結合強度を有する。また、チオール‐金結合は、高い塩濃度溶液および酸／塩基溶液の下でその表面が不安定で凝集現象が発生し、特に、６０℃以上および０℃以下で凝集現象が非常にひどく製品の貯蔵性に深刻な限界を有している。例えば、現場診断用ＬＦＡに使用される製品である金ナノプローブは、表面がチオールで囲まれて水分散が可能であるように発売されており、必ず冷蔵保管をするようになっているが、金ナノ粒子にバイオプローブ部（例えば、抗体、ＤＮＡなど）を固定化すると、製品を冷蔵保管できず、直ちに使用しなければならないという欠点がある。また、ＬＦＡ製品の特性上、アフリカのような高温の地域にも頻繁に納品されるため、高温に耐えられる高い安定性を有する金ナノプローブが必ず必要である。
【０００５】
上記のような問題を解決するために、カルベン化合物と金原子との反応性が高く、強固な結合が可能であるという利点から、従来、イミダゾリウム塩（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）を金イオンと反応させて有機金属錯体を形成し、その後、還元反応を通じてカルベン金ナノ粒子を製造する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１５，１３７，７９７４‐７９７７）が使用されていたが、金ナノ粒子の形状または大きさに均一性がないようで、ベンゾイミダゾリウム塩（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）を金イオン（ａｕｒａｔｅ  ｉｏｎ）にアニオン変換し、有機金属錯体形成と還元反応を同時に低温（０．６℃）で行って均一な形態の金ナノ粒子を合成（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１５，２７，４１４‐４２３）していたが、有機溶媒で合成することで水では分散されず、これをバイオセンサに適用または応用できないという欠点がある。また、何よりも、従来のカルベン金ナノ粒子は、末端基に何らの機能性官能基がなく、バイオセンサなどへの適用が不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国公開特許公報２００６／０１００３６５号（２００６．０５．１１．）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＬＦＡのようなバイオセンサなどの分野において利用可能であるように、末端基に機能性官能基を含むカルベン化合物を合成し、結論的に、カルベン‐金属ナノ粒子の表面を安定化し、高濃度の塩（ｓａｌｔ）溶液、強酸または強塩基、高温および超極低温（ｕｌｔｒａ‐ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の様々な環境でも、化学的および物理的に安定性を有するカルベン金ナノ粒子複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、末端に窒素含有官能基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が置換された下記化学式１または２で表されるカルベン化合物を提供する。
【化１】
2022502470.tif 000003
【化２】
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前記化学式１および２中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数２〜３０のヘテロアリール基であるか、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基、炭素数２〜３０のヘテロアリール基または下記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合して炭化水素環を形成し、
Ｒ３およびＲ４の少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造であり、
Ｒ７〜Ｒ１０の少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合して炭化水素環を形成する場合、前記炭化水素環を形成する炭素に結合した水素のうち少なくとも一つは、下記化学式３で表される構造で置換され、
【化３】
2022502470.tif 000005
前記化学式３中、
ｎは、括弧内の単位の繰り返し数として、１〜３０の整数であり、
Ａは、窒素（Ｎ）原子を含む炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素基または窒素（Ｎ）原子を含む炭素数２〜３０の芳香族炭化水素基である。
【０００９】
また、本発明は、上述のカルベン化合物が金属ナノ粒子と結合したカルベン‐金属ナノ粒子複合体を提供する。
【００１０】
本発明は、チオール基を含むポリエチレングリコールと金属ナノ粒子を混合するステップと、前記チオール基を含むポリエチレングリコールが結合した金属ナノ粒子と上述のカルベン化合物を混合するステップとを含むカルベン‐金属ナノ粒子複合体の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、上述のカルベン‐金属ナノ粒子複合体を含むバイオセンサを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のカルベン化合物は、安定性に優れ、これを金属に結合したカルベン‐金属ナノ粒子複合体は、従来の金属ナノプローブに比べて、様々な種類の溶媒、様々な範囲のｐＨや温度でも、金属ナノ粒子からカルベン化合物が分離し難く、これにより、本発明のカルベン‐金属ナノ粒子複合体を用いると、バイオプローブ部（生体物質）をより強固に固定することができ、バイオセンサなどに有用に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態によるカルベン金ナノ粒子複合体を用いたＬＦＡの模式図を示す図示である。
【図２】本発明の実験例１によるｐＨ安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図３】本発明の実験例２の＜１＞による塩安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図４】本発明の実験例２の＜２＞による溶媒安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図５】本発明の実験例３の＜１＞による温度安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図６】本発明の実験例３の＜２＞による金ナノ粒子の温度安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図７】本発明の実験例４によるマラリア診断キットに関する実験結果を示す図示である。
【図８】本発明の実験例５によるｐＨ安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図９】本発明の実験例６による高温安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図１０】本発明の実験例７による低温安定性に関する実験結果を示す図示である。
【図１１】本発明の製造例１によって製造されたカルベン化合物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図示である。
【図１２】本発明の製造例３によって製造されたカルベン化合物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図示である。
【図１３】本発明の製造例４によって製造されたカルベン化合物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図示である。
【図１４】本発明の製造例５によって製造されたカルベン化合物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図示である。
【図１５】本発明の製造例６によって製造されたカルベン化合物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す図示である。
【図１６】本発明の一実施形態によるカルベン‐金属ナノ粒子複合体のＴＥＭイメージを示す図示である。
【図１７】金‐硫黄結合と金‐カルベン結合の結合エネルギー／結合長さを比較した図示である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
１．カルベン化合物
本発明は、末端に窒素含有官能基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が置換された前記化学式１または化学式２で表されるカルベン化合物を提供する。
【００１６】
前記カルベン化合物は、末端に窒素含有官能基が置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をカルベン化合物に導入して製造され得る。
【００１７】
前記カルベン化合物は、末端部位にポリエチレングリコール基を導入することで水分散性を高め、前記ポリエチレングリコールの末端に窒素含有官能基を導入することで、今後のクリック反応（ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により窒素含有官能基にバイオプローブ部（例えば、抗体、ＤＮＡ、アプタマー、プライマーなど）の付着が容易になるように機能化したものであってもよい。したがって、ＬＦＡなどにおいて、通常、バイオプローブ部が金属ナノ粒子間の静電気的な引力によって結合することとは異なり、クリック反応による強固な化学的共有結合で固定され得るという利点がある。
【００１８】
前記窒素含有官能基は、アジド（ａｚｉｄｅ）、フタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）またはアミン（ａｍｉｎｅ）であってもよい。
【００１９】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基または炭素数６〜３０のアリール基であってもよい。
【００２０】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素または炭素数１〜２０のアルキル基であってもよい。
【００２１】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、イソプロピルまたはベンジルであってもよい。
【００２２】
前記Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つおよび前記Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つは、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキル基または炭素数６〜３０のアリール基であってもよい。
【００２３】
前記Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つおよび前記Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つは、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、イソプロピルまたはベンジルであってもよい。
【００２４】
前記Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜２０のシクロアルキル基、炭素数６〜３０のアリール基、炭素数２〜３０のヘテロアリール基または前記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合し、炭化水素環を形成してもよい。
【００２５】
前記Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、互いに同一もしくは異なっており、それぞれ独立して、水素または前記化学式３で表される構造であるか、Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合し、炭化水素環を形成してもよい。
【００２６】
前記Ｒ７〜Ｒ１０のうち互いに隣接した二つ以上の置換基が結合して炭化水素環を形成する場合、前記炭化水素環を形成する炭素に結合した水素のうち少なくとも一つは、前記化学式３で表される構造で置換され得る。
【００２７】
前記Ｒ３およびＲ４の少なくとも一つは、前記化学式３で表される構造であってもよい。また、前記Ｒ７〜Ｒ１０の少なくとも一つは、前記化学式３で表される構造であってもよい。
【００２８】
前記ｎは、括弧内の単位の繰り返し数として１〜３０の整数であってもよく、好ましくは１〜１０であってもよい。前記ｎが１未満の場合、カルベン化合物の水分散性が低下し、ｎが３０超の場合、長いポリエチレングリコールの鎖のため、バイオプローブ部間の距離が遠くなり、逆にバイオセンシング効率が減少する。
【００２９】
前記Ａは、窒素（Ｎ）原子を含む炭素数１〜２０のアルキル基または窒素（Ｎ）原子を含む炭素数２〜３０のヘテロアリール基である。具体的には、前記Ａは、アジド（ａｚｉｄｅ）、フタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）またはアミン（ａｍｉｎｅ）であってもよい。
【００３０】
本発明において、「隣接した」基は、当該置換基が置換された原子と直接連結された原子に置換された置換基、当該置換基と立体構造的に最も近く位置した置換基、または当該置換基が置換された原子に置換された他の置換基を意味し得る。例えば、ベンゼン環でオルト（ｏｒｔｈｏ）位置に置換された２個の置換基および脂肪族環で同一炭素に置換された２個の置換基は、互いに「隣接した」基として解釈され得る。
【００３１】
前記アルキル基は、直鎖または分岐鎖であってもよく、炭素数１〜２０であってもよく、好ましくは炭素数１〜１０であってもよい。より好ましくは炭素数１〜６であってもよい。前記アルキル基の具体的な例としては、メチル、エチル、プロピル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ブチル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチル、ｓｅｃ‐ブチル、１‐メチルブチル、１‐エチルブチル、ペンチル、ｎ‐ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ‐ペンチル、ヘキシル、ｎ‐ヘキシル、１‐メチルペンチル、２‐メチルペンチル、４‐メチル‐２‐ペンチル、３，３‐ジメチルブチル、２‐エチルブチル、ヘプチル、ｎ‐ヘプチル、１‐メチルヘキシル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、オクチル、ｎ‐オクチル、ｔｅｒｔ‐オクチル、１‐メチルヘプチル、２‐エチルヘキシル、２‐プロピルペンチル、ｎ‐ノニル、２，２‐ジメチルヘプチル、１‐エチルプロピル、１，１‐ジメチルプロピル、イソヘキシル、４‐メチルヘキシル、５‐メチルヘキシル、ベンジルなどがあるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
前記シクロアルキル基は、炭素数３〜２０であってもよく、好ましくは炭素数３〜１０であってもよい。前記シクロアルキル基の具体的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、３‐メチルシクロペンチル、２，３‐ジメチルシクロペンチル、シクロヘキシル、３‐メチルシクロヘキシル、４‐メチルシクロヘキシル、２，３‐ジメチルシクロヘキシル、３，４，５‐トリメチルシクロヘキシル、４‐ｔｅｒｔ‐ブチルシクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
前記アリール基は、炭素数６〜３０であってもよく、好ましくは炭素数６〜１０であってもよい。前記アリール基は、単環式アリール基または多環式アリール基であってもよい。前記単環式アリール基の具体的な例としては、フェニル基、ビフェニル基、テルフェニル基などがあり、前記多環式アリール基の具体的な例としては、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントリル基、ピレニル基、ペリレニル基、クリセニル基、フルオレニル基、トリフェニレン基などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
前記ヘテロアリール基は、異種原子として、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｉおよびＳｅから選択される１個以上を含む芳香族環基であり、炭素数は２〜３０であってもよく、好ましくは炭素数２〜２０であってもよい。前記ヘテロアリール基の具体的な例としては、チオフェン基、フラン基、ピロール基、イミダゾール基、チアゾール基、オキサゾール基、オキサジアゾール基、トリアゾール基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジン基、トリアゾール基、アクリジル基、キノリニル基、キナゾリン基、キノキサリニル基、フタラジニル基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾチアゾール基、ベンゾカルバゾール基、ベンゾチオフェン基、ジベンゾチオフェン基、ベンゾフラニル基などがあるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
また、前記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基または炭化水素環は、また、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基で置換または非置換されてもよい。
【００３６】
２．カルベン‐金属ナノ粒子複合体およびその製造方法
本発明は、上述のカルベン化合物が金属ナノ粒子と結合したカルベン‐金属ナノ粒子複合体を提供する。
【００３７】
前記金属ナノ粒子の粒子径は、１ｎｍ〜４０ｎｍであってもよい。前記金属ナノ粒子の粒子径が１ｎｍ未満の場合、金属ナノ粒子の表面に、必要な水準のカルベン化合物を導入することが難しくバイオセンサとしての効率が低下し、前記金属ナノ粒子の粒子径が４０ｎｍ超の場合、カルベン‐金属ナノ粒子複合体が均一ではなく、バイオセンサの効率および再現性が低下し得る。すなわち、４０ｎｍを超えると、小さな環境の変化だけでも金属ナノ粒子の凝集現象が発生する可能性が高くなる。
【００３８】
前記金属ナノ粒子は、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、ビスマス（Ｂｉ）、銀（Ａｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、クロム（Ｃｒ）、インジウム（Ｉｎ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、鉛（Ｐｂ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、レニウム（Ｒｅ）、ロジウム（Ｒｈ）、アンチモン（Ｓｂ）、タンタル（Ｔａ）、チタン（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）、バナジウム（Ｖ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）およびこれらの組み合わせ（例えば、二元金属ナノ粒子（ｂｉｍｅｔａｌｌｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ））からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。好ましくは、前記カルベン‐金属ナノ粒子複合体が適用されるバイオセンサの様々な環境での安定性、結晶性およびカルベン化合物と金属ナノ粒子の表面との結合力を考慮すると、前記金属は、金（Ａｕ）であってもよい。
【００３９】
前記カルベン‐金属ナノ粒子複合体は、図１６のＴＥＭイメージに示されているように、均一な形態を有することができ、カルベン‐金属ナノ粒子複合体が均一な形態を有することから、水分散性に優れる。
【００４０】
また、本発明は、一末端にチオール基を含み、他の末端に窒素含有官能基を含むポリエチレングリコールと金属ナノ粒子を混合し、硫黄‐金属ナノ粒子を製造するステップと、前記硫黄‐金属ナノ粒子と上述のカルベン化合物を混合するステップとを含むカルベン‐金属ナノ粒子複合体の製造方法を提供する。
【００４１】
具体的には、前記一末端にチオール基を含み、他の末端に窒素含有官能基を含むポリエチレングリコールと金属ナノ粒子を混合する場合、チオール基の硫黄が金属表面で金属‐硫黄結合を媒介にして、金属ナノ粒子の表面に、末端に窒素含有官能基を含むポリエチレングリコールが導入され得る。このように形成された硫黄‐金属ナノ粒子に、本発明による上述のカルベン化合物を導入すると、金属ナノ粒子の表面に存在する金属‐硫黄結合が、金属‐カルベン結合に置換され、最終的に、カルベン‐金属ナノ粒子複合体が形成され得る。
【００４２】
この際、前記金属ナノ粒子の表面に存在する金属‐硫黄結合を金属‐カルベン結合に置換する反応は、常温（２０℃〜３０℃）で行われることができる。周知のとおり、金属‐カルベン結合が金属‐硫黄結合よりも結合力が強いことから、常温で１〜１０時間放置するだけでも置換反応が起こり得る。特に、図１７によると、前記金属が金（Ａｕ）の場合に、金‐硫黄結合（結合エネルギー：‐１４．３６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、結合長さ：２．６０Å）よりも金‐カルベン結合の（結合エネルギー：‐６３．５５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ、結合長さ：２．０３Å）強度がより強いため、前記のように常温でも金属‐硫黄結合の金‐カルベン結合への置換が容易であり得る（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１７  Ａｐｒ  １８;４６（８）:２０５７‐２０７５参照）。
【００４３】
前記カルベン‐金属ナノ粒子複合体は、上記のように、末端に窒素基が露出した状態で存在することことから、以降、バイオプローブ部（生体物質）をより容易に結合することができるという利点がある。特に、金属‐硫黄結合とは異なり、金属‐カルベン結合の安定性によって、高濃度の塩（ｓａｌｔ）条件、強酸または弱塩基条件、高温および超極低温（ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の様々な環境でも金属‐カルベン結合を維持することで、カルベン‐金属ナノ粒子複合体の凝集現象が生じないという効果がある。
【００４４】
３．バイオセンサ
本発明は、上述のカルベン‐金属ナノ粒子複合体を含むバイオセンサを提供する。
【００４５】
前記バイオセンサは、特に、金属ナノ粒子の粒子径、材質、形状、周辺環境によって色が変わり、これによって金属ナノ粒子の表面プラズモンバンド（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｂａｎｄ）が変化することを用いるナノバイオセンサであってもよいが、これに限定されるものではなく、携帯が容易に製造された現場診断用ＬＦＡ（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙ）診断キットであってもよく、その他にも、ＳＥＲＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ‐Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）ベースのバイオセンサ、Ｄａｒｋ  ｆｉｅｌｄベースのバイオセンサなどが適用され得る。
【００４６】
この際、バイオセンサは、分析しようとする生体物質と特異的に結合するバイオプローブ部（例えば、抗体、ＤＮＡ、アプタマー、プライマーなど）を基板または金属ナノ粒子に固定化することが重要である。
【００４７】
前記バイオセンサで、本発明のカルベン‐金属ナノ粒子複合体は、バイオプローブ部を固定化する役割を果たすことができる。具体的には、本発明のカルベン‐金属ナノ粒子複合体は、末端に窒素含有官能基を含んでおり、クリック反応（ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて、窒素含有官能基にバイオプローブ部（例えば、抗体、ＤＮＡ、アプタマー、プライマーなど）が付着され得る。これによって、通常、バイオプローブ部が金属ナノ粒子と静電気的な引力によって結合することとは異なり、バイオプローブ部が、金属ナノ粒子に、より強固な化学的結合で固定化され得ることから、これをバイオセンサなどの分野に適用する場合、製品の優れた貯蔵性および保管容易性、且つ様々な環境への適用性も高めることができるという利点がある。
【００４８】
以下、好ましい実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
【００４９】
しかし、これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲はこれによって限定されるものではない。
【００５０】
＜製造例＞カルベン化合物の製造
＜製造例１＞
【化４】
2022502470.tif 000006
【００５１】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物１を製造した。
【００５２】
図１１にカルベン化合物１の１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果を示した。
【００５３】
＜製造例２＞
【化５】
2022502470.tif 000007
【００５４】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物２を製造した。
【００５５】
＜製造例３＞
【化６】
2022502470.tif 000008
【００５６】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物３を製造した。
【００５７】
図１２にカルベン化合物３の１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果を示した。
【００５８】
＜製造例４＞
【化７】
2022502470.tif 000009
【００５９】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物４を製造した。
【００６０】
図１３にカルベン化合物４の１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果を示した。
【００６１】
＜製造例５＞
【化８】
2022502470.tif 000010
【００６２】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物５を製造した。
【００６３】
図１４にカルベン化合物５の１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果を示した。
【００６４】
＜製造例６＞
【化９】
2022502470.tif 000011
【００６５】
上記のような反応式にしたがって、カルベン化合物６を製造した。
【００６６】
図１５にカルベン化合物６の１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果を示した。
【００６７】
＜実施例＞カルベン金ナノ粒子複合体の製造
＜実施例１＞
【化１０】
2022502470.tif 000012
【００６８】
先ず、末端にアジドが導入されたチオール‐ＰＥＧ化合物を有機溶媒に分散した金ナノ粒子に入れ、金‐硫黄結合で製造された金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｔｈｉｏｌ）を製造した。
【００６９】
以降、製造例１で製造したカルベン化合物１を入れ、金‐硫黄結合を金‐カルベン結合に置換し、カルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）を製造した。
【００７０】
＜比較例１＞
下記の構造のような金ナノ粒子複合体を準備した。
【化１１】
2022502470.tif 000013
【００７１】
＜比較例２＞
下記の構造のような金ナノ粒子複合体を準備した。
【化１２】
2022502470.tif 000014
【００７２】
＜実験例＞
＜実験例１＞ｐＨ安定性実験
ｐＨ１〜１２の溶液をそれぞれ準備し、実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｔｈｉｏｌ）を浸漬し、溶液の色の変化を観察し、その結果を図２に示した。
【００７３】
＜実験例２＞塩安定性実験
＜１＞水、ＮａＣｌ濃度１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１，０００ｍＭの水溶液を準備し、実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｔｈｉｏｌ）を浸漬し、溶液の色の変化を観察し、その結果を図３に示した。
【００７４】
＜２＞高濃度塩イオン水溶液での安定性を確認するために、１，０００ｍＭのＮａＣｌ水溶液に実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、比較例２の金ナノ粒子複合体を浸漬し、溶液の色の変化を観察し、その結果を図４に示した。
【００７５】
＜実験例３＞温度安定性実験
＜１＞実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）が混合された−２０℃の低温および−７８℃の極低温の水溶液を準備し、常温で放置した後、１日後、３日後、５日後、７日後の溶液の色の変化を観察し、その結果を図５に示した。
【００７６】
＜２＞５ｎｍの金ナノ粒子（Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０ｎｍの金ナノ粒子（ＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を準備して水溶液を製造した後、それぞれ−２０℃で冷却し、また、常温で５日間放置して水溶液の変化を観察し、その結果を図６に示した。
【００７７】
＜実験例４＞マラリア診断キット
実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）にマラリア抗体をクリック反応（ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で導入し、マラリア診断キット（ＬＦＡ）を製造した。
【００７８】
１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌのマラリア抗原試料を用いて診断テストを実施し、その結果を図７に示した。
【００７９】
＜実験例５＞ｐＨ安定性実験
ｐＨ１〜１２の溶液をそれぞれ準備し、実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、比較例１の金ナノ粒子複合体を浸漬し、溶液の色の変化を観察し、その結果を図８に示した。
【００８０】
＜実験例６＞高温安定性実験
実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、比較例１の金ナノ粒子複合体が入った水溶液をそれぞれ準備し、１００℃で６時間放置した後、溶液の色の変化を観察し、その結果を図９に示した。
【００８１】
＜実験例７＞低温安定性実験
実施例１のカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）、比較例１の金ナノ粒子複合体が入った水溶液をそれぞれ準備し、−２０℃で６時間放置した後、溶液の色の変化を観察し、その結果を図１０に示した。
【００８２】
前記実験例１および実験例５によると、チオール‐ＰＥＧが結合した金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｔｈｉｏｌ）および金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰｓ）は、強酸、強塩基の条件で、金ナノ粒子に結合したリガンドが離れることによって金ナノ粒子の凝集現象で紫色を示す一方、本発明によるカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）は、ｐＨ全領域で金ナノ粒子が凝集せず安定して維持されること（ｐＨ全領域で色の変化なし）を確認することができた。
【００８３】
前記実験例２の＜１＞および＜２＞によると、チオール‐ＰＥＧが結合した金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｔｈｉｏｌ）および金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰｓ）は、それぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭの濃度付近から金ナノ粒子に結合したリガンドが離れることによって金ナノ粒子の凝集現象で赤黒い色を示す一方、本発明によるカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）は、ＮａＣｌ塩の全濃度領域（０〜１，０００ｍＭ）で金ナノ粒子が凝集せず安定して維持されることを確認することができた。
【００８４】
実験例３の＜１＞、実験例６、実験例７によると、金‐硫黄結合で導入された金ナノ粒子は、高温（７０℃）および低温（−２０℃）で金ナノ粒子に結合したリガンドが離れることによって金ナノ粒子の凝集現象で紫色を示す一方、本発明によるカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）は、高温（１００℃）、低温（−２０℃）、極低温（−７８℃）でも金ナノ粒子が凝集せず安定して維持されることを確認することができた。
【００８５】
一方、実験例３の＜２＞によると、対照群として金ナノ粒子の場合、低温（−２０℃）では、数分から数時間内に金ナノ粒子が凝集して沈殿する現象を確認することができた。
【００８６】
実験例４によると、本発明によるカルベン金ナノ粒子複合体（Ａｕ  ＮＰｓ  Ｃａｒｂｅｎｅ）を適用したマラリア診断キットで、１０ｎｇ／ｍｌの低い濃度でも診断が可能であることを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2022502470.tif 000028
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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