【手続補正書】
【提出日】平成22年2月12日(2010.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度制御された発酵により低い平均分子量を有するヒアルロン酸の製造方法であって、
（ａ）ヒアルロナンシンターゼコード配列に対して外来性のプロモーター配列に作用可能に連結されるヒアルロナンシンターゼコード配列を含んで成る核酸構造体を含んで成る組換えバチルス宿主細胞を、その増殖の助けとなる第１温度で培養し；
（ｂ）次に、段階（ａ）の組換えバチルス宿主細胞を、ヒアルロン酸の生成のために適切な条件下で、段階（ａ）の第１温度よりも高い第２温度で培養し、ここで、当該第２の温度は40℃〜52℃の範囲内にあり、そして前記第１の温度より少なくとも１℃高く、それにより、300〜400 kDa、400〜500 kDa、500〜600 kDa、600〜700 kDa、及び700〜800 kDaからなる分子量範囲の群から選択される範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸を生成し；そして
（ｃ）前記ヒアルロン酸を回収する；
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記ヒアルロナンシンターゼコード配列が、グループIヒアルロナンシンターゼをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロナンシンターゼコード配列が、グループIIヒアルロナンシンターゼをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸の前駆体糖が、バチルス宿主細胞に供給されるか又はその細胞により生成される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体糖が、内因性遺伝子により、非内因性遺伝子により、又は内因性及び非内因性遺伝子の組み合わせにより、バチルス宿主細胞においてコードされる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸構造体がさらに、ヒアルロン酸の前駆体糖の生合成における酵素をコードする１又は複数の遺伝子を含んで成るか、又は前記バチルス宿主細胞がさらに、ヒアルロン酸の前駆体糖の生合成における酵素をコードする１又は複数の遺伝子を含んで成る１又は複数の第２核酸構造体を含んで成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１又は複数の遺伝子が、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ遺伝子、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記UDP−グルコース６−デヒドロゲラーゼ遺伝子が、hasB遺伝子又はtuaD遺伝子；又はその相同体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記UDP−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子が、hasC遺伝子又はgtaB遺伝子；又はその相同体である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記UDP−N−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子が、hasD遺伝子又はgcaD遺伝子；又はその相同体である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子が、hasE遺伝子又はその相同体である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前駆体糖をコードする前記１又は複数の遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼコード配列として同じか又は異なったプロモーターの制御下にある請求項６〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記同じか又は異なったプロモーター配列が、タンデムプロモーター中の個々のプロモーターがヒアルロナンシンターゼコード配列に作用可能に連結されているタンデムプロモーターである請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸構造体がさらに、プロモーター配列の下流に及びヒアルロナンシンターゼコード配列の上流に位置するmRNAプロセッシング/安定化配列を含んで成る請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸構造体がさらに、前記前駆体糖の生合成における酸素をコードする１又は複数の遺伝子の１つの異なったプロモーター又は複数の異なったプロモーターの下流に、及び前記１又は複数の遺伝子の上流に位置するmRNAプロセッシング/安定化配列を含んで成る請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記バチルス宿主細胞が、バチルス・アガラドヘレンス（Bacillus agaradherens）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から成る群から選択され；好ましくは前記バチルス宿主細胞がバチルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスである請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸構造体が、“-35”領域のための配列TTGACA及び“-10”領域のためのTATAATを有するamyQの短い“コンセンサス”プロモーターに作用可能に連結される、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ遺伝子、及びUDP−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子を含んで成る請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記バチルス宿主細胞が、中断されるか又は欠失されたcypX及び/又はyvmC遺伝子を含む請求項１〜17のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記第１温度が、30℃-40℃の範囲であり、そして前記第２温度が40℃-52℃の範囲である請求項１〜18のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記第２温度が、第１温度よりも少なくとも2℃高い請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２温度での培養段階が、合計培養時間の少なくとも20％を必要とする請求項１〜20のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２温度が、300〜350 kDa、350〜400 kDa、400〜450 kDa、450〜500 kDa、500〜 550 kDa、550〜600 kDa、600〜650 kDa、650〜700 kDa、700〜750 kDa及び750〜800 kDaから成る分子量範囲の群から選択された範囲の所望する平均分子量を有するヒアルロン酸のバチルス宿主細胞による生成を可能にするために、第１温度よりも十分に高い請求項１〜21のいずれか１項記載の方法。