【事件の表示】
　特許第３４２９７６５号「芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去」の請求項１ないし１０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３４２９７６５号の請求項１ないし８に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３４２９７６５号の請求項１〜８に係る発明についての出願は、平成５年１２月９日に特許出願され、平成１５年５月１６日にその特許の設定登録がなされ、その後、異議申立人池野耕司より特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１７年１０月２６日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
　
（１）訂正事項
　
ａ）訂正事項１
　請求項１の「大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体は共通経路酵素種をコードする外因性DNA配列を包含し、当該酵素種は、次の酵素、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼからなるものである、芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法。」という記載を、「大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体は共通経路酵素種をコードする外因性DNA配列を包含し、当該酵素種は、次の酵素、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼからなるものである、芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法。」と訂正する。
　
ｂ）訂正事項２
　請求項２を削除する。
　
ｃ）訂正事項３
　請求項３〜６をそれぞれ請求項２〜５とするとともに、引用する請求項の番号をこれに合わせて訂正する。
　
ｄ）訂正事項４
　請求項７を削除する。
　
ｅ）訂正事項５
　請求項８〜１０をそれぞれ請求項６〜８と訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正のうち、訂正事項１は、請求項１の記載が、特許法第３６条第５項第２号及び第６項の規定に違反するとの異議申立の理由に対応したものであり、不明瞭な記載の釈明を目的とするものであると認められる。
　訂正事項２及び４は、請求項の削除を目的とするものである。
　訂正事項３及び５は、訂正事項２及び４の請求項の削除に伴い、請求項の番号を整合させるものであり、明瞭でない記載の釈明を目的とした明細書の訂正を目的とするものであると認められる。
　また、これらの訂正は、本件特許明細書に記載された事項の範囲内のものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（３）むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　なお、以下において、請求項の番号は訂正後のものを用いる（訂正後の請求項１、２〜５，６〜８は、それぞれ訂正前の請求項１、３〜６、８〜１０に相当する）。
　
３　特許異議の申立てについての判断
　
（１）申立ての理由の概要
　申立人は、以下の理由１〜３により、本件特許を取り消すべきであると主張している。
　
理由１：
　請求項１〜８に係る発明は、以下の甲第１〜８号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものである。
　
甲第１号証（米国特許第５１６８０５６号明細書）
甲第２号証（FEBS Lett. 1986, 200(1), p.11-17）
甲第３号証（J. Bacteriol., 1986, 165(1), p.233-239）
甲第４号証（Biochem. J. 1986, 234(1), p.49-57）
甲第５号証（FEBS Lett. 1984, 170, p.59-63）
甲第６号証（J. Gen. Microbiol. 1990, 136, p.353-358）
甲第７号証（米国特許第４６８１８５２号明細書）
甲第８号証（J. Am. Chem. Soc. 19+90, 136, p.353-358）
　
理由２：
　請求項１〜３、７に係る発明については、本件特許明細書の発明の詳細な説明に、当業者が容易にその実施をすることができる程度に、発明の目的、構成及び効果が記載されていないから、本件特許は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
　
理由３：
　請求項１〜３、７には、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみが記載されていないから、本件特許は、特許法第３６条第５項第２号及び第６項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
　
（２）理由１について
　
（ａ）訂正明細書の請求項１に係る発明
　訂正明細書の請求項１に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものと認められる。（以下、「本件発明」という。）
「大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体は共通経路酵素種をコードする外因性DNA配列を包含し、当該酵素種は、次の酵素、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼからなるものである、芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法。」
　
（ｂ）甲各号証の記載
甲第１号証には、以下の事項が記載されている。
（１−１）「８．宿主細胞の芳香族共通経路への炭素の流れを増加させる方法であって、前記宿主細胞をtkt 遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換して、野生型宿主細胞に比べて増加したレベルでトランスケトラーゼを発現させることを含む方法
９．さらに、前記宿主細胞に、芳香族共通経路の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子から選ばれる遺伝子を移入することを含む第８項に記載の方法
１０．前記遺伝子がＤＡＨＰシンターゼ又はＤＨＱシンターゼをコードする第９項記載の方法
１１．前記遺伝子がａｒｏＦまたはａｒｏＢである第１０項記載の方法
１２．宿主細胞が大腸菌の菌株である第１１項記載の方法…
１４．宿主細胞の芳香族共通経路に由来する化合物の生合成的生産を増加させる方法であって、野生型宿主細胞に比べてトランスケトラーゼの発現を増加させることを含む方法」（特許請求の範囲第８〜１２項、第１４項）
（１−２）「コリスミ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、メラニン、ユビキノン、メナキノン、プレフェン酸（抗生物質パチリシンの製造に用いられる）及びエンテロケリンのような芳香族化合物の生産に導く生合成経路の中間体であり、コリスミ酸に依存する生合成経路が多数あるために、コリスミ酸を産生するための、生物が利用する生合成経路は『芳香族共通経路』とよく呼ばれる。芳香族共通経路（シキミ酸がこの経路の最初に特定された中間体であるため、『シキミ酸経路』と呼ばれることがある）は、一般的にＤＡＨＰシンターゼにより触媒される。３−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）を生成し、コリスミ酸の産生を終わらせる、前駆物質エリスロース−４−リン酸及びホスホエノールピルビン酸の縮合により始まると考えられている。」(第1欄第７〜３０行)。
（１−３）「トランスケトラーゼに加えて、芳香族共通経路の各ステップを触媒する、あるいは該芳香族共通経路に流入する化合物の産生を触媒する酵素を全細胞で過剰発現させて、炭素の変換効率及び前記芳香族共通経路の生合成スループットを増加させることができる。」(第1欄第６１〜６７行)。
（１−４）「本発明の好適な態様では、（トランストケラーゼのような）芳香族共通経路に流入する化合物の前駆体を産生する酵素、及び芳香族共通経路の各生合成ステップを触媒する一又はそれ以上の酵素は、宿主細胞に移入される一又はそれ以上のプラスミド上にコードされる。」(第２欄第６〜１２行)。
　
甲第２号証には、エシェリヒア・コリＫ１２株の３−デヒドロキネートシンターゼをコードする遺伝子ａｒｏＢのヌクレオチド配列及びそれによってコードされる同酵素の全アミノ酸配列が記載されている（図４)。
　
甲第３号証には、エシエリヒア・コリK-12のａｒｏＬ遺伝子を含むａｒｏＬＭオペロン及びそれによってコードされるシキメート・キナーゼのアミノ酸配列が記載されている（図２）。
　
甲第４号証には、ｓｅｒＣ−ａｒｏＡオペロンのクローニング、５−エノールビルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼをコードするａｒｏＡ遺伝子のサブクローニングの方法、及び、ｓｅｒＣ−ａｒｏＡオペロンのヌクレオチド配列が記載されている（図４）。
　
甲第５号証には、エシェリヒア・コリの5-エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼをコードするａｒｏＡ遺伝子の全ヌクレオチド配列、及び相当するＥＳＰＳシンターゼのアミノ酸配列が記載されている（図３）。
　
甲第６号証には、サルモネラ・チフィ及びエシェリヒア・コリのコリスミ酸シンターゼをコードするａｒｏＣ遺伝子のヌクレオチド配列、それによってコードされるコリスミ酸シンターゼのアミノ酸配列が開示されている（３５５頁表１）。
　
甲第７号証には、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ及びコリスミ酸ムターゼP−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭＰ−ＰＤＨ）、並びにシキメート・キナーゼの産生が改変されたエシェリヒア・コリの菌株（特許請求の範囲第１項及び第２項)、このような菌株として、前記酵素を産生する構造遺伝子を持つマルチコピープラスミドを持つ菌株(特許請求の範囲第８項)、及び、これらの菌株を用いてフェニルアラニンを製造する方法（特許請求の範囲第１０項）が記載されている。
　
甲第８号証には、トランスケトラーゼ及びＤＡＨＰシンターゼをコードするプラスミドｐＫＤ１３０Ａに、律速酵素である３−デヒドロキネート（ＤＨＱ）シンターゼをコードするａｒｏＢ遺伝子を導入したプラスミドｐＫＤ１３６で形質転換されたエシェリヒア・コリＡＢ２８３４　ａｒｏＥを用いて、培地中のＤＨＳの濃度を調べたこと、及び、培地に加えた炭素源から芳香族アミノ酸の生合成に流れた量についての考察が記載されている（第３６３１頁左欄第１３行~右欄第９行）。
　
（ｃ）　対比・判断
　訂正後の本件特許の請求項１に係る発明（以下「本件発明」という）と甲第１号証に記載の発明とを対比すると、両者は、
  　
大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体は共通経路酵素種をコードする外因性DNA配列を包含するものである、芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法、
　
である点で一致しており、
　
用いる酵素種が、後者では、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）と、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ａｒｏＦ）又は３−デヒドロキネート・シンターゼ（ａｒｏＢ）との組み合わせであるのに対し、前者では、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ａｒｏＦ）、３−デヒドロキネート・シンターゼ（ａｒｏＢ）、シキメート・キナーゼ（ａｒｏＬ）、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）、およびコリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）からなるものである点、
　
で相違している。
　
　この相違点について検討する。
　甲第２〜６号証には、本件発明で用いられている３−デヒドロキネート・シンターゼ（ａｒｏＢ）、シキメート・キナーゼ（ａｒｏＬ）、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）、およびコリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）をコードするＤＮＡ配列が記載されており、また、甲第７号証には、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けないシキメート・キナーゼを生産する大腸菌の菌株が、甲第８号証には、３−デヒドロキネート・シンターゼをコードするＤＮＡ配列で形質転換した大腸菌で、生産されたデヒドロキナーゼシンターゼ（ＤＨＳ）の濃度を調べたことが記載されている。
　しかし、甲各号証のいずれにも、大腸菌に、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼからなる酵素をコードする外因性ＤＮＡ配列を包含させることにより、芳香族化合物の増加した産生を得ることができるという、本願発明の技術思想については記載も示唆もされていない。
　
　異議申立人は、甲第１、７及び８号証には、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネート・シンターゼ、及びシキメート・キナーゼが芳香族アミノ酸の生産の増強に有効であることが記載されており、また、３−デヒドロキネート・シンターゼ及びコリスミ酸シンターゼが律速段階であることが知られていたのであるから、これらの酵素を除く残る３種の酵素の中から５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼを選択することに格別の意義はないと主張している。
　しかし、甲第１号証は、芳香族アミノ酸合成経路において上流側に位置するトランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼの発現を増強することによる、芳香族アミノ酸合成経路における中途生成物である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート（ＤＡＨ）及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）合成に対する影響を評価しているものにすぎない。甲第８号証も同様に、芳香族アミノ酸合成経路において、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼの次の段階に位置する３−デヒドロキネート・シンターゼの発現増強による、芳香族アミノ酸合成経路における中途生成物である３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）の量を確認しているものにすぎない。また、甲第７号証は、生産された芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けない大腸菌変異株に関する文献であり、本件発明とはその前提が異なるものである。
　そして、本件特許明細書の第３Ａ図のデータからも分かるように、一連の合成経路の中途の産物の量が増加したからといって、その合成経路の末端の最終産物の生産量が増加することが明らかであるとはいえないから、甲第１、７及び８号証のいずれにも、これらの酵素の発現増強により芳香族アミノ酸の生産が増強されることが記載されているということはできない。
　また、律速段階酵素については、本件特許明細書には、３−デヒドロキネート・シンターゼ及びシキメート・デヒドロゲナーゼが、芳香族アミノ酸生合成共通経路における律速段階であると同定されていたと記載され（本件特許公報１２欄１２〜１８行）、また、コリスミ酸シンターゼが律速段階であることが示唆されていたと記載されている（本件特許公報１４欄４７行〜１５欄３行）。
　しかし、本件特許明細書の第３Ｂ図に記載されたデータによれば、トランスケトラーゼ及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼの過剰発現をさせた場合において、さらに３−デヒドロキネート・シンターゼを過剰発現させた場合（２）は、そうでない場合（１）と比較して効果に差異はない。さらにシキメート・デヒドロゲナーゼを過剰発現させた場合（３）やコリスミ酸シンターゼを過剰発現した場合（８）は、そうでない場合（２）と比較して、効果が劣っている。すなわち、律速段階とされている酵素の発現を増強したとしても、芳香族アミノ酸の生産が増強されるとは限らない。
　以上のことから、芳香族アミノ酸生合成共通経路における各酵素の発現の増強と最終産物の生産の増強との関係は予測が困難なものと認められ、本件発明の効果は甲第１〜８号証の記載からは予期できない顕著なものと認められる。
　したがって、本件発明が上記甲第１〜８号証に記載のものから容易に発明をすることができたものとはいえない。
　また、本件発明をさらに限定した請求項２に係る発明、本件発明と実質的に同一の構成を有する請求項５に係る発明、及び本件発明の方法に用いる形質転換体又はプラスミドベクターに関する請求項３、４、６〜８に係る発明についても同様である。
（３）理由２及び理由３について
　異議申立人は、請求項１に記載された酵素遺伝子で形質転換することにより、芳香族アミノ酸生合成の共通経路の終点へと炭素の流れのサージを確実に向けるという効果を得るためには、当該共通経路への炭素の流れの増加をもたらすことが必須であるが、そのために必要なトランスケトラーゼ及びＤＡＨＰシンターゼ、またはそのいずれかが記載されていない請求項１〜３、７に係る発明は、前記効果を得ることができず、各発明を当業者が理解することができないから、各発明について、本件特許明細書の発明の詳細な説明には、当業者が容易にその実施をすることができる程度に、発明の目的、構成及び効果が記載されていない、と主張する（理由２）。また、異議申立人は、請求項１〜３、７に記載された事項は、各請求項に係る発明の構成に欠くことができない事項である、トランスケトラーゼ及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼのうちの一方又は双方を欠いているから、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみが記載されていない、とも主張する。
　しかしながら、訂正後の請求項１及び２には、使用する形質転換体がトランスケトラーゼ及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼをコードする外因性ＤＮＡを包含することが特定されており、異議申立人の主張はその前提を欠くこととなった。
　また、請求項３に係る大腸菌形質転換体は、本件特許明細書に記載されたトランスケトラーゼ及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＫＤ１３０Ａ（第２図）で形質転換して、請求項４に係る大腸菌形質転換体を得るためのものである。さらに、請求項７に係るプラスミド・ベクターは、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ及びデヒドロキネート・シンターゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＫＤ１３６（第２図）と共に大腸菌を形質転換して、請求項４に係る大腸菌形質転換体を得るためのものである。したがって、請求項３に係る大腸菌形質転換体及び請求項７に係るプラスミド・ベクターは、最終生成物に対する中間体に相当するものであり、最終生成物として効果を奏するために必要な構成が全て各請求項に記載されていないからといって、本件特許明細書の発明の詳細な説明に、当業者が容易に各請求項に係る発明を実施をすることができる程度に発明の目的、構成及び効果が記載されていないとも、各請求項に、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみが記載されていないとも、いうことはできない。
　さらに、異議申立人は、請求項１を引用する請求項２において更に酵素種を追加していることなどを理由に、請求項１記載の「からなる」が「のみからなる」を意味するものか否かが、不明瞭であるとも主張する。しかし、訂正により請求項２は削除され、また、本件特許明細書の発明の詳細な説明の記載からみて、請求項１には本件発明の目的を達成し効果を奏するために必要なすべての酵素種について発明の構成に欠くことができない事項として記載されることとなったから、この点において請求項１の記載が不明瞭であるということはできない。
　
４　むすび
 　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては本件請求項１〜８に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１〜８に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去
【発明の詳細な説明】
技術分野
　本発明は生合成反応の効率向上に関する。より詳細には、本発明はホスト細胞中の共通経路における芳香族化合物の生合成能を向上させる方法に関するものであって、この方法は、前記経路中の律速反応段階を同定するとともにホスト細胞を遺伝子工学的に操作してこれらの律速段階を効果的に阻害除去（デブロッキング）することによって行うものである。
背景技術、産業上の利用可能性及び発明の開示
　シキミ酸経路とも呼ばれる芳香族アミノ酸生合成の共通経路は、細菌や植物中の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを生産する。これらの芳香族アミノ酸に至る経路は、コリスメート分子で終わる共通経路と、ここから分岐してフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンにいたる三つの別個の末端経路とからなる。芳香族アミノ酸は、これらの化合物を合成する能力を欠くヒトや動物の栄養における必須成分である。これらはまた多くの興味深いかつ商業的に重要な分子、たとえば２、３例を挙げると、合成甘味料であるアスパルテーム、よく知られた染料であるインジゴ、およびパーキンソン病の症状に抗するために用いられる薬であるＬ−ＤＯＰＡなどの前駆体でもある。
　グルコースや他の糖類などの容易に入手しうる炭素源から、芳香族アミノ酸群やそれらの誘導体を過剰に生産する生体触媒的ルートの成否の鍵はホスト生物の経路を経由して炭素量急増（サージ）を指向する力による。経路中で代謝阻止剤（代謝ブロック）に遭遇することによって、その後の生体触媒的転換で生じる生成物の収率や純度が影響を受けることがある。
　芳香族生合成の共通経路における生産効率を増加させる従前の試みは、１９９１年２月８日に出願された米国特許出願第０７／６５２９３３号に対し１９９２年１２月１日に許可された米国特許第５１８６０５６号に記載されており、その記載をここに本明細書を構成する一部として援用する。この特許はＤＡＨＰシンターゼとトランスケトラーゼの生体内触媒活性を増加させることによって経路内への炭素の流れを増加させるという関連発明を記載している。その特許明細書は、共通経路において各段階の反応を触媒するその他の酵素が、主要標的であるトランスケトラーゼおよびＤＡＨＰシンターゼと共に過発現され得ることを述べているが、この共通経路を指向する炭素流は、基質中間体が生産される速度とほぼ等しい速度で中間体を触媒転換させることができない一以上の経路酵素が存在した場合にはもはや炭素流の増加をもたらさないことが判明している。つまりこの生合成経路には一種の律速段階があり、経路上の反応段階の進行を阻害するように作用する。本発明はそのような阻害を除去するものである。
　核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲ）を用いた大腸菌株Ｄ２７０４（ｐｈｅＡ−、ｔｙｒＡ−、ΔｔｒｐＥ−Ｃ）の培養上清の分析から、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート−３−フォスフェート・シンターゼ、およびコリスメート・シンターゼが、芳香族アミノ酸生合成の共通経路における律速酵素として同定された。ａｒｏＬ（シキメート・キナーゼ）、ａｒｏＡ（ＥＰＳＰシンターゼ）、およびａｒｏＣ（コリスメート・シンターゼ）をコードする遺伝子フラグメントを含有するプラスミドとプラスミドｐＫＤ１３６（これは芳香族アミノ酸生合成の共通経路への炭素の増量をもたらすことが分かっている）とを大腸菌株Ｄ２７０４に挿入すると、培養ブロスから律速酵素の多くの基質を除去できるとともに最終産物生成において顕著な増収がもたらされた。
図面の簡単な説明
　図１は、芳香族アミノ酸の生合成における共通経路を示す。
　図２は、ｐＫＤ１３０ＡとｐＫＤ１３６のプラスミド地図である。
　図３Ａと３Ｂは、大腸菌株Ｄ２７０４の共通経路における各中間体の濃度と、この菌株のフェニルアラニンおよびフェニル乳酸の平均濃度を示す棒グラフである。
　図４は、プラスミドｐＩＡ３２１とｐＳＵ１８からプラスミドｐＫＤ２８を構築する様子を示す。
　図５は、図４と同様、プラスミドｐＫＡＤ３１の構築を示す。
　図６Ａ、６Ｂ、６ＣはａｒｏＥａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３４の製造を示す。
　図７−１３は、図４−７に類似のものであって、それぞれプラスミドｐＫＡＤ３８、ｐＫＡＤ４３、ｐＫＡＤ３９、ｐＫＡＤ５０、ｐＫＡＤ４４、ｐＫＡＤ５１、およびｐＫＡＤ４２の構築を示す。
　図１４は、本発明の大腸菌形質転換体の培養基における、フェニルアラニン、フェニル乳酸、及びプレフェンの総蓄積量を示す棒グラフである。
発明を実施するための最良の形態
　本発明は、共通経路を経由してホスト細胞中での芳香族化合物の生合成能を向上させる方法を提供する。その経路においては、代謝されうる炭素源は、多段階反応シーケンスで中間体である芳香族化合物に転換されるが、このシーケンスは、中間体基質に作用する酵素の種類によって異なる。本発明方法の一態様は前記経路において律速段階を同定する方法を開発することを包含し、この方法はホスト細胞の培養上清を分析して蓄積した共通経路中間体、すなわち経路における酵素に仲介された律速段階のための基質、を同定することを含むものである。律速段階が同定されると、ホスト細胞は、経路の律速反応段階における同定された蓄積中間体基質に作用する酵素種をコードするＤＮＡを含有するリコンビナントＤＮＡで形質転換され、ホスト細胞中の酵素種の発現を増加させる。加えて律速段階に関与する酵素種の高度の発現はまた、本分野で受け入れられている方法を用いて内因性コントロール配列を修正するかあるいは既存の発現コントロール配列の抑制解除に変化を起こすことによってホスト細胞を遺伝子工学的に操作し、そのような酵素種に対する内因性遺伝子を過発現することによっても達成される。
　律速酵素種の発現を高めるために用いられる正確なメカニズムが何であれ、それは典型的にはホスト細胞へのリコンビナント遺伝子エレメントの移行によって影響もしくは仲介されるのではないかということが考えられる。ここでいう遺伝子エレメントとは、共通経路において律速酵素を発現させるかまたは発現を調整する産物、特に酵素等のタンパク、アポタンパク、またはアンチセンスＲＮＡなどの産物、を発現可能なコード配列を有する核酸（通常ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。発現されたタンパクは酵素として機能することができ、酵素活性を抑制もしくは抑制解除し、または酵素の発現をコントロールする。これらの発現可能な配列をコードするリコンビナントＤＮＡは、染色体内（例えば相同組換えによってホスト細胞染色体に組み込まれたもの）または染色体外（例えばプラスミド、コスミド、および目的とする形質転換を起こすことが可能なその他のベクターによって担持されるもの）のいずれのものでもよい。
　本発明におけるホスト細胞を転換するために用いられるリコンビナントＤＮＡは、構造遺伝子の他に、タンパク、アポタンパク、またはアンチセンスＲＮＡに対するコード配列の発現や抑制解除をコントロールするエンハンサー、プロモーター、およびリプレッサーを含む発現コントロール配列を包含することができる。たとえばそのようなコントロール配列を野性型のホスト細胞に挿入して、ホスト細胞ゲノム中に既にコードされた選択酵素の過発現を促進したり、あるいはそれらを用いて染色体外でコードされた酵素の合成をコントロールするために用いることができる。
　リコンビナントＤＮＡは、プラスミド、コスミド、ファージ、イースト人工染色体、その他、ホスト細胞中への遺伝子エレメントの移入の仲介を行うベクターによってホスト細胞へと導入される。これらのベクターは、ベクターおよびベクターに担持される遺伝子エレメントの複製をコントロールするｃｉｓ−作用コントロールエレメントとともに複製起点を有することができる。ベクター上には選択可能なマーカーが存在してもよく、これは遺伝子エレメントが導入されたホスト細胞の同定に役立つ。そのような選択可能なマーカーの例として、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはネオマイシンなどの特定の抗生物質に耐性を与える遺伝子が挙げられる。
　ホスト細胞に遺伝子エレメントを導入する好ましい手段は、本発明による遺伝子エレメントが挿入された染色体外マルチコピープラスミドベクターを用いるものである。ホスト細胞への遺伝子エレメントのプラスミドによる導入にあたっては、まず制限酵素でプラスミドベクターを切断し、本発明による標的酵素種をコードする遺伝子エレメントと当該プラスミドとを連結する。連結されたプラスミドが再環化したら、感染（例えばλファージ中へのパッケージング）その他のプラスミド伝達メカニズム（例えば電気穿孔法、マイクロインジェクションなど）を利用してプラスミドをホスト細胞に伝達させる。ホスト細胞に遺伝子エレメントを挿入するのに適当なプラスミドの例としてはｐＢＲ３２２およびその誘導体であるｐＡＴ１５３、ｐＸｆ３、ｐＢＲ３２５、およびｐＢＲ３２７、ｐＵＣベクター群、ｐＡＣＹＣおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１およびその誘導体、およびＣｏｌＥ１が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　本発明において好適に使用されるホスト細胞は、希望する芳香族化合物の工業的生合成的生産に使用可能な属（ｇｅｎｕｓ）に属するものである。従って、ホスト細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ブレヴィバクテリウム）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（アルスロバクター）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトマイセス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカス）、およびＳｅｒｒａｔｉａ（セラチア）の各属に属する原核生物を包含する。真核ホスト細胞も使用できるが、イースト類またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロマイセス）属やＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（シゾサッカロマイセス）属が好ましい。
　より具体的には原核ホスト細胞はたとえば次の種から誘導されるがこれらに限定されるものではない：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテリウム・グルタミカム）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｒｃｕｌｉｓ（コリネバクテリウム・ヘルキュリス）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ（ブレヴィバクテリウム・ディヴァリカタム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ブレヴィバクテリウム・ラクトフェルメンタム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ（ブレヴィバクテリウム・フラヴァム）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ（バチルス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（バチルス・セレウス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ（バチルス・サーキュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス・コアギュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リシェニフォルミス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（バチルス・メガテリウム）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ（バチルス・メセンテリカス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｉｓ（バチルス・ピュミリス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サブチリス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エルジノーサ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｎｇｕｌａｔａ（シュードモナス・アングラータ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレッセンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔａｂａｃｉ（シュードモナス・タバシ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ（ストレプトマイセス・オーレオファシエンス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（ストレプトマイセス・アヴァーミチリス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ストレプトマイセス・コエリコロール）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グリセウス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｓｕｇｅｎｓｉｓ（ストレプトマイセス・カスゲンシス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ（ストレプトマイセス・ラヴェンジュレ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｍａｎｉｉ（ストレプトマイセス・リプマニ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（ストレプトマイセス・リヴィダンス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ（スタフィロコッカス・エピデルミス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ（スタフィロコッカス・サプロフィチカス）、およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（セラチア・マルセッセンス）。
　好ましい真核ホスト細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレヴィシエ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（サッカロマイセス・カールスベルゲンシス）が挙げられる。
　コリスメート（芳香族アミノ酸など）からの一次代謝物を工業的に生産するためには、代謝生合成経路において一以上の酵素をフィードバック阻害しない上述の種の非調整（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）突然変異株が好ましい。そのような株はランダムまたは特異的突然変異によって生成されるかあるいは商業的に入手可能である。ＤＡＨＰシンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、あるいはコリスミ酸ムターゼのフィードバック阻害を除去した大腸菌の例は、Ｔｒｉｂｅ（トライブ）に許可された米国特許第４６８１８５２号およびＢｅｃｋｍａｎ（ベックマン）に許可された米国特許第４７５３８８３号に記載されており、これらの開示を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
　本発明の好ましい実施態様においては、ホスト細胞中の律速酵素種の高発現がホスト細胞の形質転換によって達成されるが、この形質転換は次の酵素種、すなわち３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）、をコードするＤＮＡを含有するプラスミドベクターによってなされる。より好ましくは、形質転換ベクターはさらにコリスミ酸シンターゼをコードするＤＮＡを含有する。本発明方法における最も好ましい実施態様においては、大腸菌株は、次の酵素をコードするＤＮＡを含有するリコンビナントＤＮＡで形質転換されてホスト細胞中のそれら酵素の発現を増加させる：トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）、３−デヒドロキネート・シンターゼ（ＤＨＱシンターゼ）、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼ。
　典型的には、リコンビナントＤＮＡは、上記酵素種をコードするＤＮＡを含有する一以上のリコンビナントプラスミドベクターの一部としてホスト細胞中に導入される。
　本発明の他の実施例には、本発明方法によって調製される細胞形質転換体および、そのような細胞形質転換体を用いて炭素源から芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法が含まれる。この方法は、炭素源の存在下、共通経路において当該炭素源を利用しうる本発明の細胞形質転換体を、経路における炭素源の使用を助成する条件下において培養する段階を包含するものである。本発明のその他の実施態様には、共通芳香族生合成経路の２以上の律速酵素に対する構造遺伝子を包含するプラスミド構造体が含まれる。例えば、好ましい構造体としてシキメート・キナーゼとＥＰＳＰシンターゼに対する構造遺伝子を含有するものが挙げられ、より好ましくはコリスミ酸シンターゼに対する構造遺伝子も含有される。そのようなプラスミド構造体で形質転換された微生物もまた本発明に含まれる別の一態様である。
　すでに述べたように、ホスト細胞中の共通経路から導かれる化合物の生合成能を高めるために、その経路上での反応を促進するタンパクの発現を増加させることが従前なされてきた。本発明は、共通経路を経由してホスト細胞中の芳香族化合物を生成するにあたりその生成効率を目ざましく改善するものである。これまでの報告では、共通経路のトランスケトラーゼ単独もしくはトランスケトラーゼと他の酵素、例えばＤＡＨＰシンターゼ、ＤＨＱシンターゼさらにはシキミ酸シンターゼとの組み合わせでの濃度を高めることによって経路の上流端（反応シーケンス開始点）への炭素の流れを増加させることができることが知られている。しかし、律速酵素種が同定できること、および、この同定結果を利用してホスト細胞を形質転換して律速酵素種を過発現させ芳香族経路中の炭素流の顕著な増加をもたらしうること、についてはなんらの示唆もなされていない（このことは形質転換ホスト細胞の培養基中の「プロセス内」芳香族代謝産物の濃度によってわかる）。このように本発明は共通経路から得られる化合物の生合成収率を向上させるという従前なされてきた努力をさらにつぎの（１）、（２）のように改善するものと見ることができる：（１）前記経路における律速反応段階を同定すること、および（２）その経路において同定された律速段階を触媒するタンパクの発現を増大させること。本発明においては、発現の増大は、好ましくはホスト細胞を形質転換して当該タンパク触媒（酵素）をコードする構成的外因性遺伝子を発現させ、これによってホスト細胞中のタンパクの濃度を増加させることによって達成される。本発明による改良点が特に顕著に現れるのは、ホスト細胞が、シキミ酸キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼおよびコリスミ酸シンターゼに対する遺伝子を包含する外因性構造遺伝子を発現するように形質転換された大腸菌の菌株の場合である。
　ｐｈｅＡ−、ｔｙｒＡ−、およびΔｔｒｐＥ−Ｃである大腸菌株、Ｄ２７０４は、理論的にはコリスミ酸が生成可能なはずである。なぜならフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンへと続く末端経路がそれぞれ阻害（ブロック）されているからである（図１）。この株を用いて、経路に炭素流の急増が起こったとき、大腸菌中で芳香族アミノ酸生合成の共通経路の阻害を除去することを計画した。ここで阻止の指標としてコリスメートの蓄積増加を用いた。富化した培地中でＤ２７０４細胞を成長させた後、最小塩蓄積培地中への再懸濁で、ほとんどもしくは全くコリスメートが蓄積しなくなり、一方フェニルアラニンのレベルが目ざましく向上した。フェニルアラニンの生成は、非酵素的なコリスミ酸からプレフェン酸へのクライゼン再転位の後、フェニルピルビン酸を生成する脱水工程を経ることで説明される。酵素であるコリスミ酸ムターゼはコリスメートからプレフェネートへの転換を３７℃で２ｘ１０６倍加速するが、この反応は酵素の不存在下でも起こりうる。報告によれば、プレフェン酸は通常の細胞培養において創出されるような温和な酸性条件下で非酵素的にフェニルピルベートを生成する。フェニルピルビン酸の生成と共に微生物は、ｔｙｒＢでコードされた完全アミノトランスフェラーゼによって、フェニルアラニンを合成できるはずである。しかしながら非常に多量のフェニルラクテートが培養上清の幾つかに観察された。
　ｔｙｒＢでコードされた芳香族アミノトランスフェラーゼは、窒素供与体としてグルタメートを、コエンザイムとしてピリドキサルリン酸を用いて芳香族ケト酸アミノ酸をアミノ基転移させる［Ｍａｖｒｉｄｅｓ，Ｃ．Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；アカデミック社：サンディエゴ、１９８７年、１４２、２５３−２６７ページ］。フェニル乳酸の生成は、細胞中のグルタメート供給が不十分でフェニルピルビン酸を完全にアミノ基転移できないことによるものであろう。フェニルピルビン酸のフェニル乳酸への還元が起こって、細胞内のＮＡＤ＋の供給を再びもたらす可能性がある。また、酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ［Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｊ．；Ｌｉｌｊａｓ，Ａ．；Ｓｔｅｉｎｄｅｌ，Ｓ．Ｓ．；Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．編；アカデミック・プレス：ニューヨーク、１９７５；第１１巻、第４章］によって触媒される、ピルベートから乳酸への同様な還元が嫌気条件下で起こり、ＮＡＤ＋の供給を再び起こして解糖機能を継続させることが知られている。
　芳香族アミノトランスフェラーゼの活性もまた、Ｄ２７０４におけるｐｈｅＡ突然変異の存在によって制限される可能性がある。ｐｈｅＡによってコードされる、二機能性の酵素であるコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼは、フェニルピルベートの存在下で芳香族アミノトランスフェラーゼと反応し、大腸菌内で複合体を形成する［Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７９年、５６８、４６７−４７４］。Ｄ２７０４はｐｈｅＡであるので、これは複合体形成に必要なコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロラターゼ酵素を生成できないはずである。酵素−酵素間の相互反応の役割は判明していないが、複合体を形成できないことがアミノトランスフェラーゼ活性に影響し、細胞内でフェニルピルビン酸の蓄積をもたらす可能性がある。この仮説はもっともらしく聞こえるが、フェニルラクテートの蓄積の理由は未だに実験的には解明されていない。しかしながら、フェニルラクテートの蓄積が共通経路からの阻害が除去されたグルコース等価物を表すとみることには問題はない。よって芳香族アミノ酸生合成の共通経路から代謝阻害がうまく除去できたときの除去量を、以下に記す研究によってフェニルアラニンとフェニル乳酸の総蓄積の和として測定した。培養上清における共通経路中間体の蓄積を利用して、共通経路を下る炭素流中の律速段階である酵素を同定したが、これは蓄積中間体が律速酵素の基質であるという考えに基づくものであった。
　適切な薬剤を含有するＬＢ培地を用いて各株５ミリリットルの出発培養を１０時間生育した。容積４リットルのエルレンマイヤー・フラスコにＬＢ培地１リットルを入れ、さらに必要に応じてイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、およびアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えたものに上記出発培養を接種した。培養（１リットル）を３７℃で１２時間、攪拌しながら生育させた（２５０ＲＰＭ）。細胞を収穫し（３０００ｇ、５分、４℃）、Ｍ９塩で３回洗浄した［Ｍ９塩は１リットル当たりＮａ２ＨＰＯ４を６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を３ｇ、ＮａＣｌを０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌを１ｇ含有する］（各サンプルを３００ｍｌで洗浄）。グルコース（１０ｇ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、およびチアミン（３０ｍｇ）を含有させた１リットルのＭ９蓄積培地を４リットルのエルレンマイヤー・フラスコにいれ、さらに必要な場合にはこれにクロラムフェニコール、アンピシリン、およびＩＰＴＧを添加し、これに細胞沈殿物を再懸濁した。細胞は、さらに４８時間の間、３７℃で攪拌しながら蓄積培地中でインキュベートした（２５０ＲＰＭ）。分割量（２５ｍｌ）を２４時間および４８時間の間隔で取り出して遠心分離した（６０００ｇ；５分；４℃）。分離された上清１０ミリリットルを各サンプルから集め、真空下で水分を除去した。サンプルを重水で二回交換し、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。３−（トリメチルシリル）プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸のナトリウム塩を内部標準として用いて中間体と蓄積過程で生成した産物を定量した。全培養は三重に用意して生育させ、蓄積した分子の平均値およびその標準偏差を得た。
　芳香族アミノ酸生合成の共通経路を通る炭素サージを起こすためには、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）を含有するプラスミド及び３ーデオキシ−Ｄ−アラビノーヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）のチロシン感受性アイソザイム（ａｒｏＦ）を用いた。トランスケトラーゼは、芳香族アミノ酸の生産において細胞が利用できるエリスローズ４−リン酸のレベルを増大させることが知られている一方、ＤＡＨＰシンターゼは経路における最初の不可逆的段階である。ｔｋｔ、ａｒｏＦプラスミドｐＫＤ１３０Ａ（図２）、アンピシリン耐性完全遺伝子を有するｐＢＲ３２５誘導体、および複製起点ｐＭＢ１は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）、シキメート、およびシキメート−３−リン酸という共通経路中間体を蓄積した。総フェニルアラニンおよびフェニル乳酸蓄積量は、Ｄ２７０４へ導入されたとき５．６＋／−０．７ｍＭであった（図３）。４８時間のインキュベーションの後、ＤＡＨＰに関する１Ｈ−ＮＭＲ共鳴を測定した結果は次の通りである：δ１．７９（ｄｄ、１３、１３Ｈｚ、１Ｈ）、δ２．２０（ｄｄ、１３、５Ｈｚ、１Ｈ）、δ３．４６（ｄｄ、９、９Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ３．８３（ｍ、２Ｈ）。培地中のシキメートの存在は、共鳴によってδ４．４１（ｄｄ、４、４Ｈｚ、１Ｈ）およびδ６．４７（ｍ、１Ｈ）において示される。シキメートーフォスフェートの共鳴はδ６．４７（ｍ、１Ｈ）にある。フェニルアラニンの共鳴はδ３．１４（ｄｄ、１４、８Ｈｚ、１Ｈ）、δ３．２９（ｄｄ、１４、５Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ７．３０−７．４９（ｍ、５Ｈ）に見いだされる。フェニル乳酸の共鳴はδ４．２７（ｄｄ、８、４Ｈｚ、１Ｈ）およびδ７．３０−７．４９（ｍ、５Ｈ）で観察される。ＤＨＳは２４〜４８時間の間に蓄積培地から消失する。培養上清中のＤＡＨＰ、ＤＨＳ、シキメート、およびシキメート−３−フォスフェートの蓄積から、３−デヒドロキネート・シンターゼ（ＤＨＱシンターゼ）、シキメート・デヒドロゲナーゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）のそれぞれが律速酵素であるといえる。ＤＨＱシンターゼとシキメート・デヒドロゲナーゼは従前共通経路における律速段階であると同定されていたが［Ｄｒａｔｈｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｆｒｏｓｔ，Ｊ．Ｗ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０年、１１２、９３６０−９６３２；Ｄｒａｔｈｓ，Ｋ．Ｍ．Ｐｈ．Ｄ．、スタンフォード大学論文、１９９１年６月］、シキメート・キナーゼとＥＰＳＰシンターゼが律速段階であるとの同定はこれまでに文献記載がない。
　培養上清からＤＡＨＰの蓄積をなくするために、Ｄ２７０４にｔｋｔ、ａｒｏＦ、ａｒｏＢプラスミドｐＫＤ１３６（図２）が導入された。ｐＫＤ１３６を用いるとＤＡＨＰが培養上清から成功裏に取り除かれＤＨＳ、シキメート、およびシキメート−３−リン酸の蓄積増加をもたらしたが、フェニルアラニンおよびフェニルラクテートは増加しなかった（図３）。図３Ａは最小培地中で２４時間生育させた後のＤ２７０４株中に蓄積した共通経路中間体の濃度を示す。図３Ｂは最小培地中で２４時間および４８時間生育させた後のＤ２７０４株中に蓄積したフェニルアラニンとフェニルラクテートの総蓄積量を示す。本実験に使用した株は次のものを含む：１）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３０Ａ；２）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６；３）Ｄ２７０４／ｐＫ１３６／ｐＫＤ２８；４）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３４；５）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３１；６）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３８；７）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３；８）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３９；９）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５１；１０）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４４；１１）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０。このように、経路から律速段階を取り除いても、最終産物の蓄積増加は観察されなかった。
　ｐＫＤ１３６へのａｒｏＥの挿入に関して好便なユニーク制限部位がないことにより、残る阻害除去実験においては二つのプラスミド系を使うことになった。この系はｐＫＤ１３６および、ｐＳＵ２７１８／ｐＳＵ２７１９［Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅ．；Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，Ｂ．；ｄｅ　ｌａ　Ｃｒｕｚ、Ｆ．Ｇｅｎｅ、１９８８年、６８、１５９−１６２］から誘導されたプラスミドであるｐＳＵ１８とｐＳＵ１９（これはクロラムフェニコール耐性を有する）、ｌａｃプロモーター、および複製起点ｐ１５Ａからなるものであり、これに残りの阻害除去遺伝子を挿入した。ｐＳＵ１８に基づくａｒｏＥプラスミドであるｐＫＤ２８［Ｄｒａｔｈｓ，Ｋ．Ｍ．Ｐｈ．Ｄ．スタンフォード大学論文、１９９１年６月］を作成したが、これはｐＩＡ３２１［Ａｎｔｏｎ，Ｉ．Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８８年、２４９、３１９−３２６］からのａｒｏＥ遺伝子およびｔａｃプロモーターを含有する１．６ｋｂのフラグメントを単離し、さらに図４に示すｐＳＵ１８へと連結することによって行った。Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ２８はＤＨＳ蓄積レベルを低下させない一方、培養上清から中間体を完全には除去しなかった。シキメートとシキメート−３−リン酸は培養ブロスに存在し続けた。フェニルアラニンとフェニルラクテートの総生産は生育４８時間後で２．１＋／−０．９ｍＭへと減少した（図３）が、これはａｒｏＥでの阻害除去による炭素流の増加によって最終物質がそれ以上蓄積することがなかったことを意味している。
　シキメート・キナーゼの律速特性を除去するため、ａｒｏＬとａｒｏＥａｒｏＬの両プラスミドを構築した。ａｒｏＬは、機能が未知の遺伝子であるａｒｏＭ［ＤｅＦｅｙｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｐｉｔｔａｒｄ，Ｊ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８６年、１６５、２２６−２３２］を有する転写ユニットに位置している。この転写ユニットを含む２．７ｋｂのフラグメントは既に単離されており、これはｐＢＲ３２２にクローニングされてプラスミドｐＭＵ３７１［ＤｅＦｅｙｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｐｉｔｔａｒｄ，Ｊ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８６年、１６５、２２６−２３２］を形成する。ａｒｏＬを含有するｋＢフラグメントをプラスミドｐＭＵ３７１から単離し、ベクターｐＳＵ１９に挿入して３．３ｋｂのａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３１（図５）を製作する。４．９ｋｂのａｒｏＥａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３４をｐＫＤ２８からのａｒｏＥ遺伝子のフランキング制限部位の操作によって得たのち、それを単離してｐＫＡＤ３１のユニークなＸｂａＩおよびＢａｍＨ部位へと連結する（図６）。
　ａｒｏＥａｒｏＬ構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）であるＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３４はＤＨＳとシキメートを培養上清から完全に除去することができ、蓄積された共通経路中間体としてシキメート−３−リン酸を残すのみである。フェニルアラニンとフェニル乳酸の総生産は３．４＋／−０．２ｍＭであった。これはＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ２８という最終産物からのわずかな上昇にとどまったが、なおＤ２７０４／ｐＫＤ１３０ＡとＤ２７０４／ｐＫＤ１３６の両者で観察されるフェニルアラニンとフェニルラクテートよりもまだ顕著に少ないものであった（図３）。
　ａｒｏＬ構成体であるＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３１もまたＤＨＳとシキメートを培養ブロスから完全に除去することができ、ただ一つの過生産された遺伝子を有するシキメート・デヒドロゲナーゼおよびシキメート・キナーゼ両者の律速特性をから解放している。したがってシキメート・デヒドロゲナーゼの律速特性はシキメート蓄積の人為結果（アーティファクト）であると思われる。シキメート・デヒドロゲナーゼの律速特性において培養基からシキメートを除去することの重要性は、シキメートが酵素に対して何らかの阻害効果を有するかも知れないことを示唆するものである。シキメート−３−リン酸の蓄積はなお観察され、またフェニルアラニンとフェニルラクテートの総生産は５．６＋／−０．５ｍＭであることが判明した。これは、Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３０ＡおよびＤ２７０４／ｐＫＤ１３６で最初に観察された最終産物生成レベルである（図３）。このようにＤＨＱシンターゼ、シキメート・デヒドロゲナーゼ、およびシキメート・キナーゼの代謝阻止を除去した時、経路の最終産物の総蓄積量は、理由不明の阻害除去されたグルコース同等物を別として顕著な増加はなかった。
　ＥＰＳＰはＥＰＳＰシンターゼの前進反応の阻害剤であることが報告されており［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｌｅｗｅｎｄｏｎ，Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、１９８４年、１６５、１２１−１２７］、これは当該酵素が律速特性を遵守することに対する一説明を示唆するものである。シキメート−３−リン酸を培養上清から除去するために、ａｒｏＡプラスミドおよびａｒｏＡａｒｏＬプラスミドを構築した。ａｒｏＡ遺伝子は、セリンの生合成経路酵素である３−フォスフォセリン・アミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣを有するオペロン上に存在する。ｓｅｒＣａｒｏＡオペロンをコードする４．７ｋｂのフラグメントを単離し配列決定した［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８６年、２３４、４９−５７；Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｌｅｗｅｎｄｏｎ，Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、１９８４年、１７０、５９−６３］。４．７ｋｂのａｒｏＡプラスミドｐＫＡＤ３８を作成するために、２．４ｋｂのａｒｏＡフラグメントをプラスミドｐＫＤ５０１から単離し［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８６年、２３４、４９−５７］、外部ｌａｃプロモーターの直後にあるベクターｐＳＵ１８に連結した（図７）。ｓｅｒＣａｒｏＡの転写ユニットからのａｒｏＡの除去は、発現のために外部プロモーターの後ろにそれが配置されることを必要とする。ｓｅｒＣとａｒｏＡ遺伝子の間に位置しａｒｏＡの発現を自然に減衰させると信じられている、ｒｈｏと独立の転写ターミネーターは、２．４ｋｂのａｒｏＡフラグメント上に完全な形で残存するが、この理由は、除去に好都合な制限部位がないからである。外部ｌａｃプロモーターの後方の転写ターミネーターでのトランケートされたａｒｏＡ遺伝子はなおあるレベルのＥＰＳＰシンターゼの過発現をもたらす。５．７ｋｂのａｒｏＡａｒｏＬプラスミドであるｐＫＡＤ（図８）は２．４ｋｂのａｒｏＡ遺伝子をフランキングＰｓｔＩと平滑末端化部位による単離および等価な部位を有するように操作されたｐＫＡＤ３１ベクターへの連結によって作成された。
　Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ３８株の評価の結果、総フェニルアラニンおよびフェニルラクテート生産量の顕著な増加が判明した。この生産量は４８時間蓄積後で７．９＋／−１．３ｍＭであった（図３）。上清に蓄積した経路の中間体はＤＨＳ、シキメート、およびシキメート−３−リン酸であった。Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３株は９．７＋／−０．３ｍＭのフェニルアラニンとフェニルラクテートを生産したが、唯一の共通経路中間体、シキメート−３−リン酸が蓄積したのみであった。ａｒｏＡプラスミドが阻害除去されたグルコース等価物から最終産物への転換が成功したことを最初に示した。ａｒｏＡ遺伝子がシキメート−３−リン酸蓄積を完全に取り除くことができないことは、ＥＰＳＰシンターゼによって触媒される反応の可逆性から来るものと考えられえる。
　コリスミ酸シンターゼは不可逆的であってかつ恐らくは律速酵素であろうということが示唆されている［Ｐｉｔｔａｒｄ，Ａ．Ｊ．Ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．、Ｉｎｈｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．、ｌｏｗ，Ｋ．Ｂ．、Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｂ、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，Ｍ、Ｕｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、編、アメリカ微生物学会：ワシントンＤ．Ｃ．、１９８７年；ｖｏｌ．、第４章］。もし蓄積されたＥＰＳＰが引き続きＥＰＳＰシンターゼによってシンターゼ−３−リン酸へと転換されるならば、コリスミ酸シンターゼの律速特性によって、シキメート−３−リン酸は引き続き存在するであろう。培養上清からシキメート−３−リン酸を完全に除去するために、ａｒｏＡａｒｏＣａｒｏＬプラスミドを構築した。まずｐＧＭ６０２からの平滑末端化部位とＳａｌＩによってフランキングされたａｒｏＣフラグメントの単離によってａｒｏＣプラスミドを構築した［Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｊ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８８年、２５１、３１３−３２２］。これはコリスミ酸シンターゼをコードする１．６９ｋｂのフラグメントを含有するプラスミドである。ｐＳＵ１９のユニークなＳａｌＩおよびＳｍａＩ部位への連結によって４ｋｂのプラスミドｐＫＡＤ３９を作成した（図９）。７．４ｋｂのａｒｏＣａｒｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５０を作成するために、１．６９ｋｂのａｒｏＣフラグメントをｐＫＡＤ３９からＳａｌＩ／平滑末端化フラグメントとして単離し、等価な末端を有するように操作されたｐＫＡＤ４３ベクターへと連結した（図１０）。
　Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株は１２．３＋／−２．２ｍＭのフェニルアラニンとフェニルラクテートを産生したが、これはＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３のＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３と比べて最終物質生産量において目ざましい増加である（図３）。Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０はなおいくらかのシキメート−３−リン酸を蓄積したが、その総蓄積量はＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３より少なかった。４８時間後のＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０蓄積をＮＭＲにより測定すると、δ３．２９（ｄｄ、１４、５Ｈｚ、１Ｈ）、δ４．０（ｄｄ、８、５Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ７．２５−７．４９（ｍ、５Ｈ）における共鳴でフェニルアラニンの存在が示される。フェニル乳酸の共鳴は、δ２．８８（ｄｄ、１４、８Ｈｚ、１Ｈ）、δ４．２７（ｄｄ、８、４Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ７．２５−７．４９（ｍ、５Ｈ）である。少量のＤＨＳもまた培養ブロス中に存在し、これはδ６．４（ｄ、３Ｈｚ、１Ｈ）での共鳴で示される。阻害除去プラスミドにａｒｏＣを加えた時に観察された最終産物の増収は、蓄積されたＥＰＳＰがシキメート−３−リン酸に転換される可能性を仮定すると、律速酵素としてのコリスミ酸シンターゼの作用であるといえる。
　さらに良くコリスミ酸シンターゼの役割を理解するために、ａｒｏＣ（ｐＫＡＤ３９；図９）、ａｒｏＡａｒｏＣ、およびａｒｏＣａｒｏＬをＤ２７０４／ｐＫＤ１３６中に構築し、評価した。６．３９ｋｂのａｒｏＣａｒｏＡプラスミドｐＫＡＤ４４（図１１）を、フランキングＰｓｔＩおよび平滑末端部位を有するａｒｏＡフラングメントを単離することにより製作し、次いで等価な平滑末端部位を含有するように操作したｐＫＡＤ３９ベクター中に連結した。５ｋｂのａｒｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５１（図１２）はＳａｌＩ平滑末端フラグメントとしてａｒｏＣを単離し、等価な部位を含有するように操作したｐＫＡＤ３１ベクター中に連結した。図３から明らかなように、ｐＫＡＤ３９、ｐＫＡＤ４４、ｐｋＡＤ５１は、ａｒｏＡａｒｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５０がＤ２７０４／ｐＫＤ１３６へと挿入された時の最終物質蓄積レベルに至らなかった。従ってＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株が最終産物の生産量を最大にする最適な株であることが決定された。
　この最適なＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株中のトランスケトラーゼの役割を決定するために、ＢａｍＨＩによる分解でプラスミドｐＫＡＤ１３６から遺伝子を除去し、次いで再連結してａｒｏＦｔｋｔプラスミドｐＫＡＤ４２を製作した（図１３）。Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０の培養の結果、多量のアセテートとラクテートが蓄積したがこれは細胞死を招いた。この問題に対して蓄積培地のｐＨを４８時間のインキュベーションの間モニターし、必要なときには５ＮのＮａＯＨで中和した。中性ｐＨに保持することによって、Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０の２４時間および４８時間の両時点でプレフェン酸が高度に蓄積したが、この理由は恐らく中性ｐＨでのフェニルピルベートへの転位能が低いことによるものであろう。このように、Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０とＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０とで共通経路末端に成功裏にもたらされる炭素流の量を比較するために、フェニルアラニン、フェニル乳酸、およびプレフェン酸の総量を考察した。
　図１４に示すように、Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株によって生産される最終産物の量はＤ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０株によって生産される量よりも遥に多い。このことは、芳香族アミノ酸およびその誘導体へと炭素サージをうまく向わせるためには、共通経路で利用可能な炭素レベルを上昇させＤＡＨＰシンターゼ、ＤＨＱシンターゼ、シキメート・キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を増加させるためにトランスケトラーゼの染色体コピーが余分に必要とされ、その結果意図する最終産物へのサージを成功裏に指向することができることを示している。
　ＮＭＲスペクトルによる細胞上清の分析の結果、ＤＨＱシンターゼ、シキメート・キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼが芳香族アミノ酸生合成の共通経路における代謝阻害剤であることが判明した。従前、シキメート・デヒドロゲナーゼが代謝阻害剤であるとして同定されていたが、これは培地中でのシキメートの蓄積による人為結果であると考えられる。生物触媒的過程によって生産される芳香族アミノ酸およびその誘導体の収率および純度の両者を、大腸菌の２つのプラスミド系の利用によって向上させることができる。プラスミドｐＫＡＤ１３６またはその機能上の等価物は芳香族アミノ酸生合成の共通経路への炭素流増加をもたらす必須要件であって、一方プラスミドｐＫＡＤ５０またはその機能上の等価物は当該共通経路の終点へと炭素流のサージを確実に向けるための必須要件である。阻害除去遺伝子ａｒｏＢ、ａｒｏＬ、ａｒｏＡ、およびａｒｏＣの導入時に観察される最終産物の純度の向上は、Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３０ＡおよびＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０のＮＭＲデータにおいて容易に識別することができる。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体は、共通経路酵素種をコードする外因性ＤＮＡ配列を包含し、当該酵素種は、次の酵素、
トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、
　
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