(57)【要約】  モノエステルを含む白血球エステラーゼの基質組成物であって、前記モノエステルは、α−アミノ酸エステルまたはα−ヒドロキシ酸エステルのうちの１つであって、白血球エステラーゼに特異的であり、前記モノエステルは、レドックス反応に関与するための第１の部分、およびアミン保護基またはアルコール保護基を備えた第２の部分を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノエステルを含む白血球エステラーゼの基質組成物であって、
前記モノエステルは、α−アミノ酸エステルまたはα−ヒドロキシ酸エステルのうちの１つであって、白血球エステラーゼに特異的であり、
前記モノエステルは、レドックス反応に関与するための第１の部分、およびアミン保護基またはアルコール保護基を備えた第２の部分を有することを特徴とする基質組成物。
【請求項２】
前記基質組成物は、下記式で表される一般的な構造を有する請求項１に記載の基質組成物。
2022502059.tif 000017
ここで、前記第１の部分Ｂは、４−ヒドロキシフェニル（
2022502059.tif 000018
）を含み、Ａは酸素またはＮＲａを含み、ここでＲａはＨ、または置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または任意に置換されたアルキル基であり（Ａが酸素の場合、Ｒ３は存在しない）、Ｒ４は置換または非置換の複素環またはヘテロアリールである。
【請求項３】
前記Ｒ４は、ピリジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、キノリル、イソキノリル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、インドリル、ベンイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、トリアジニル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、プリニル、１−オキソイソインドリル、１，２，４−トリザイニル、１，３，４−トリアジニル、イソインドリル、 ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、テトラヒドロキノリル、ジヒドロキノリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ジヒドロイソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ベンゾフリル、フロピリジニル、ピロロピリジミジニル、またはアザインドリルのうちの１つである請求項２に記載の基質組成物。
【請求項４】
前記Ｒ４は、置換または非置換極性基の付加を伴う、または伴わないピリジンである請求項３に記載の基質組成物。
【請求項５】
前記Ｒ４は、以下に示すように、ピリジン（１）、メトキシピリジン（２）、および（メトキシカルボニル）ピリジン（３）のうちの１つから選択されるピリジンである請求項４に記載の基質組成物。
2022502059.tif 000019
【請求項６】
前記Ｒ４は、（メトキシカルボニル）ピリジン（３）である請求項５に記載の基質組成物。
【請求項７】
前記モノエステルは、４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネートである請求項１に記載の基質組成物。
【請求項８】
前記モノエステルは、下記式の構造を有する請求項１に記載の基質組成物。
2022502059.tif 000020
【請求項９】
請求項１に記載の基質組成物を有する基質を含むことを特徴とする、白血球エステラーゼを検出するための電気化学的装置。
【請求項１０】
前記基質組成物が電極センサ上にスクリーン印刷される、請求項９に記載の電気化学的装置。
【請求項１１】
電気化学的アッセイにおいて白血球エステラーゼ酵素の存在を検出することを含む、感染のリスクのある患者をスクリーニングする方法であって、
請求項１に記載の基質組成物を含むスクリーン印刷された電極センサーストリップに生物学的サンプルを適用または接触させる工程と、
電位差測定またはボルタンメトリーリーダーを使用して、前記電極を流れる電流または電圧を測定する工程と、
前記電気化学的アッセイにおける電流または電圧に基づいて白血球エステラーゼの活性レベルを決定する工程と、
前記活性レベルに基づいて感染の可能性を決定する工程と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプルは、尿、唾液、滑液、胸水、心嚢水、腹水、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液のうちの１つを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性レベルが、感染を示す、前記サンプル中の活性化された白血球の存在を示す請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記感染症が、人工関節周囲感染症（ＰＪＩ）、天然関節感染症、尿路感染症（ＵＴＩ）、細菌性腹膜炎、髄膜炎、および子宮内膜炎のうちの１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
下記式で表される一般的な構造を有することを特徴とする組成物。
2022502059.tif 000021
ここで、前記第１の部分Ｂは、４−ヒドロキシフェニル（
2022502059.tif 000022
）を含み、Ａは酸素またはＮＲａを含み、ここでＲａはＨ、または置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または任意に置換されたアルキル基であり（Ａが酸素の場合、Ｒ３は存在しない）、Ｒ４は置換または非置換の複素環またはヘテロアリールである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１８年９月２７日に出願された米国特許出願第１６／１４５，０１４号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、試験サンプル内の白血球細胞の活性を決定するための電気化学的アッセイの新規な適用に関する。より具体的には、本開示は、感染症を発症するリスクのある患者において、活性白血球細胞、特に白血球エステラーゼおよびヒト好中球エラスターゼによって放出される酵素の活性を決定するための新規の方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
尿中の異常に多数の白血球細胞の存在は、一般的に使用される感染過程の指標である。歴史的に、技術者は顕微鏡下で手作業による視覚的カウントに依存してきたが、この視覚的手法は、泌尿生殖器感染症を検出するためのディップスティックアッセイに大きく取って代わられた。このような市販の「ディップスティック」アッセイの大多数において、酵素白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）の活性が、活性白血球細胞の存在の代用として使用されている。ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）のアッセイも、男性の尿道感染症の診断に高い感度を示すことが報告されている。
【０００４】
既知のＬＥのアッセイは、色の変化に基づいて酵素活性の存在が報告されるという点で、発色する。通常、カラーテストストリップは、３０ｎｇ／ｍＬから１５００ｎｇ／ｍＬを超えるＬＥ濃度を表す、色の強度が３〜４ずつ増加するカラーチャート（なしから２＋／３＋）に一致させることができる。ただし、比色型のアッセイには明らかな欠点がある。利用可能な色強度の増分が３〜４しかないため、白血球エステラーゼ濃度の違いを決定するのが非常に難しい場合がある。さらに、そのような色の増分を分類する際の評価者間および評価者内の信頼性さえも不十分である可能性がある。これは、ディップスティックの結果があまり明確でない場合（トレースまたは１＋）に特に当てはまる。このような場合、検査結果は治療の決定を下すには信頼性が低すぎる可能性がある。したがって、ディップスティックの結果の有用性は、白血球エステラーゼ活性が非常に高い場合に限定される。さらに、尿の色を変える物質（ニトロフラントイン、フェナゾピリジンなど）もディップスティックの測定値に影響する。
【０００５】
近年、白血球エステラーゼ試験を、関節、肺、腹部、さらには中耳の滲出液等の漿液に使用する用途に医師の関心が注がれている。結果は人工関節周囲感染症（ＰＪＩ）の診断に非常に有望であるが、血液や破片が存在するため、比色検査はサンプルの１７〜２９％で実用的ではない。他の体腔では、吸引によって必ずしも透明な液体が得られるとは限られないため、同じことが他の体腔にも当てはまる。さらに、比色白血球エステラーゼ試験は血清サンプルでテストすることができない。
【０００６】
より最近では、乳酸エステル基質がＬＥアッセイの感度と速度の点で改善されていることが実証されている。アルコール部分はヒドロキシルピロール化合物として放出され、次にジアゾニウム塩と反応して紫色のアゾ染料を生成する。しかしながら、そのようなアッセイは、血性または濁った流体状態での有用性が限られており、正確で定量的な測定を提供するために高価な光学センサーを必要とするであろう。したがって、サンプル中の白血球および白血球酵素を検出するための改善された基質およびアッセイが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
以下に、本発明のいくつかの態様の基本的な理解を提供するために、本発明の簡略化された要約を提示する。この要約は、本発明の広範な概要ではない。本発明の必須の手段／重要な要素を特定すること、または本発明の範囲を描写することを意図するものではない。その唯一の目的は、後で提示される、より詳細な説明の前置きとして、本発明のいくつかの概念を簡略化された形で提示することである。
【０００８】
一態様では、本開示は、感染のリスクがある患者または感染に関連する症状をすでに示している患者における感染をスクリーニング、検出、および確認するための方法に向けられている。一実施形態では、この方法は、必要とする対象からサンプルを取得し、サンプル中の白血球マーカーの存在または不在を検出し、サンプル中の白血球マーカーの程度および存在に基づいて治療法を決めるステップに従う。
【０００９】
いくつかの実施形態において、白血球マーカーは、サイトカイン、ケモカイン、酸素および窒素ラジカル、白血球エラスターゼ、白血球エステラーゼ、好中球エラスターゼ、ゲラチナーゼ、ＩＬ−１β、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシンＡおよびカテプシンＢ等のカテプシン、例えば、ホスホリパーゼＡおよびホスホリパーゼＢ等のホスホリパーゼ等のマーカーの１つまたは任意の組み合わせであり得る。
【００１０】
一態様では、本開示は、白血球酵素または具体的には好中球酵素基質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）を含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、ＬＥ基質を含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）を含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、ＨＮＥ基質を含む。代替の実施形態では、組成物は、ＬＥ基質とＨＮＥ基質の両方を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、ＬＥおよびＨＮＥ以外の他の酵素またはバイオマーカーに特異的な追加の基質を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、基質は、ＬＥまたはＨＮＥに対する特異性を示す。一実施形態では、基質はモノエステルを含み、モノエステルは、白血球エステラーゼに特異性を有する、アラニンエステルなどのα-アミノ酸エステル、または乳酸エステルなどのα-ヒドロキシ酸エステルの１つであり、モノエステルは、レドックス反応に参加するための第１の部分と、官能基（すなわち、アミンまたはアルコール）をマスクして望ましくない化学反応性を防止するアミンまたはアルコール保護基を含む第２の部分と、を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、基質は、以下に示すような式１で表すことができる。
2022502059.tif 000002
式1
ここで、Ａはエーテル基（すなわち−Ｏ−）またはアミン基（すなわちＮＲａ、ＲａはＨまたは任意に置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基である）を含み、Ｂはレドックス反応に関与することができる部分を含み、Ｃはアルコールまたはアミン保護基を含む。いくつかの実施形態において、Ａはアミノ基を含む。いくつかの実施形態において、Ａはエーテル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｂはレドックス活性アルコール中間体を含む。いくつかの実施形態において、Ｂはフェノールを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは置換フェノールを含む。いくつかの実施形態において、Ｃはトシル保護基を含む。いくつかの実施形態において、式１の酸素と結合するＢは、アミノ基で置換される。さらなる実施形態において、Ｂはアミノフェニルを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは置換アミノフェニルを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、以下の式２に記載されるような化合物を含む。
2022502059.tif 000003
式２
【００１４】
Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲａである。ＲａはＨ、アルキルまたはアリール基である。Ｘ１およびＸ２はいずれも酸素、またはいずれもＮＲａにすることができる。あるいは、Ｘ１およびＸ２の一方は酸素で、他方はＮＲａである。
【００１５】
Ｙ１およびＹ２は、独立して、ＯまたはＮＲａである。Ｒａは上記の通りである。Ｙ１およびＹ２はいずれも酸素、またはいずれもＮＲａにすることができる。あるいは、Ｙ１およびＹ２の一方は酸素で、他方はＮＲａである。
【００１６】
Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキルまたはアリール基または置換アルキル、置換アリールまたは保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はいずれもメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はトシルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２はトシルであり得る。
【００１７】
Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキル、保護基、またはペプチド部分である。保護基としては、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］、カルボベンジルオキシ、およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルが含まれる。一実施形態では、Ｒ４はトシルであり得る。ペプチド部分は、天然および／または非天然アミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。
【００１８】
環上のＲ５のそれぞれは、独立してハロゲン原子；ヒドロキシル基；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ２−Ｃ６アルケニル基；Ｃ２−Ｃ６アルキニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基（トリフルオロＣ１−Ｃ６アルキルを含む）；Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基；Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基；Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキル基；Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルオキシ基；Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシ基；Ｃ２−Ｃ６アルキニルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１ーＣ６アルキルスルフィニル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル基；アミノ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ基；モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基；ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基；ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基；シアノＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基；シアノＣ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アシル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシイミノＣ１−Ｃ６アルキル基；カルボキシル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；カルバモイル基；モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基；ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基；ニトロ基；またはシアノ基である。ｎは０、１、２、３または４である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネートを含む。いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、４−（（（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノエートを含む。いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネートおよび４−（（（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノエートのうちの一方のフェニレンジアミン変異体を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＨＮＥ基質は、以下の式３に記載されるような化合物を含む。
2022502059.tif 000004
式３
【００２１】
ここで、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４は酵素活性部位として機能するコアテトラペプチド足場配列を表し、Ｂはレドックス反応に関与できる部分を含み、Ｃはアシル基を含む。いくつかの実施形態では、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４はＡＡＰＶ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１は保存的置換を有する。いくつかの実施形態において、Ｂはレドックス活性アルコール中間体を含む。いくつかの実施形態では、Ｂはフェノールの誘導体を含む。Ｂはキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂはヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは置換キノンまたは置換ヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、ＣはＮ−メチオキシスクシニルを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＨＮＥ基質は、３−｛［（１Ｓ）−１−｛［（２Ｓ）−１−（５−｛［（１Ｓ）−１−（｛４−［（２Ｓ）−２−（｛１−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（３−カルボキシプロパナミド）プロパナミド］プロパノイル］ピロリジン−２−イル｝ホルムアミド）−３−メチルブタナミド］フェニル｝カルバモイル）−２−メチルプロピル］カルバモイル｝イミダゾリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル］カルバモイル｝エチル］カルバモイル｝プロパン酸を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、アッセイに含まれる。いくつかの実施形態において、アッセイは、電気化学的アッセイを含む。代替の実施形態では、アッセイは、電気化学的アッセイと組み合わせた比色ステップを含み得る。いくつかの実施形態において、電気化学的アッセイは、内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。いくつかの実施形態において、電気化学的アッセイは、本開示の白血球基質および電気化学的測定装置を含む。いくつかの実施形態では、電気化学的測定装置は、作用電極、参照電極、および補助電極を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本開示は、サンプル中の白血球酵素の存在を検出し、治療計画を決める方法に関する。いくつかの実施形態において、サンプル中の白血球酵素の存在は、サンプル中の白血球の存在を示す。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、ＬＥを含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、ヒト好中球エラスターゼＨＮＥを含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、酵素を酵素の基質と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、基質は、本開示の任意のＬＥ基質である。いくつかの実施形態において、基質は、本開示の任意のＨＮＥ基質である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する白血球酵素の量が定量化される。いくつかの実施形態において、サンプル中の白血球の存在は、感染を示している。いくつかの実施形態において、感染症は、尿路感染症（「ＵＴＩ」）を含む。いくつかの実施形態において、感染症は、人工関節周囲感染症（「ＰＪＩ」）を含む。いくつかの実施形態において、感染症は、特発性細菌性腹膜炎（「ＳＢＰ」）を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは生物学的サンプルを含む。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、尿、唾液、滑液、胸水、心嚢水、腹水、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液のうちの１つを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、アッセイにおいて白血球酵素を基質と接触させることにより、サンプル中の白血球酵素の存在を検出するステップに続いて、感染症を発症するリスクのある患者をスクリーニングする方法を含む。いくつかの実施形態において、アッセイは、電気化学的アッセイを含む。いくつかの実施形態において、電気化学的アッセイは、内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、電気化学的アッセイにおいて白血球酵素の存在を検出する方法は、白血球酵素の反応物または生成物の第１のアリコートを白血球酵素の基質に添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、電解質溶液中にある。いくつかの実施形態において、この方法は、電気化学的アッセイの電極を流れる電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、白血球酵素の反応物または生成物の少なくとも１つの追加のアリコートを白血球酵素の基質に加えるステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、電気化学アッセイの電極を流れる電流を２度目に測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、白血球酵素を白血球酵素の基質に添加するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学アッセイの電極を流れる電流を３度目に測定するステップを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、白血球酵素の第１のアリコートを白血球酵素の基質に添加するステップを含むプロセスに続く電気化学的アッセイにおいて、白血球酵素の存在を検出することによって、感染した患者をスクリーニングする方法。いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、電解質溶液中にある。いくつかの実施形態において、この方法は、電気化学的アッセイの電極を流れる電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、白血球酵素の少なくとも１つの追加のアリコートを白血球酵素の基質に加えるステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、電気化学アッセイの電極を流れる電流を２度目に測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、白血球酵素の生成物または反応物を白血球酵素の基質に添加するステップを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、電気化学アッセイの電極を流れる電流を３度目に測定するステップを含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、適切な基質、結果を最適化するための方向、および任意選択で、観察された結果に基づいて患者固有の治療法を提供するためのキットを対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、最初のヒドロキノン基質および第１のエステル加水分解ステップを表す。
【００３１】
【図２】図２は、セミキノン中間体および第２のエステル加水分解ステップを表す。
【００３２】
【図３】図３は、最終的なベンゾキノン酸化生成物を表す。
【００３３】
【図４】図４は、内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（ＩＣＥＣＥＡ）において４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネート（「ＴＡＰＴＡ」）を使用した結果を表す。
【００３４】
【図５】図５は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネート（「ＴＡＰＴＡ」）のＮＭＲを表す。
【００３５】
【図６】図６は、本発明のモノエステルの実施形態の切断機構の概略図である。
【００３６】
【図７】図７は、本発明の基質の一実施形態でスクリーン印刷された電極について、より高いＬＥ濃度で増加する減少ピークを示すボルタモグラムである。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「および」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。
【００３８】
本明細書で使用される、「白血球」は、任意の白血球（「ＷＢＣ」）を指し得る。白血球は、感染症や病原体の侵入から体を保護することに関与する免疫系の細胞である。すべての白血球／ＷＢＣは、互いに区別する形態学的特徴に基づいて５つのクラスに分類される。それらには、好中球、好酸球、好塩基球、単球、およびリンパ球が含まれる。好中球は白血球の約４０〜７５％を構成し、好酸球は白血球の約１〜６％を構成し、好塩基球は白血球の１％未満を構成し、単球は白血球の約２〜１０％を構成し、リンパ球（Ｂリンパ球やＴリンパ球など）は白血球の約２０〜４５％を構成する。
【００３９】
本明細書で使用される「患者」という用語は、治療を施すことができる生物学的システムを指し得る。生物学的システムは、例えば、個々の細胞、細胞のセット（例えば、細胞培養物）、器官、組織、または多細胞生物を含み得る。「患者」は、ヒト患者または非ヒト患者を指すことができる。好ましい実施形態では、患者はヒト患者である。
【００４０】
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療された対象において医学的に望ましい結果を生み出すことができる化合物または薬剤の量を指し得る。治療法は、単独で、または他の薬物または治療法と組み合わせて、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で実施することができる。治療有効量は、１回または複数回の投与、塗布、または投薬量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。
【００４１】
疾患を「治療すること」または疾患の「治療」という用語は、疾患の徴候または症状を軽減するために、患者（ヒトまたはその他）に１つまたは複数の薬物を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。緩和は、病気の兆候や症状が現れる前、および現れた後に発生する可能性がある。したがって、「治療すること」または「治療」には、疾患を「予防すること」または疾患の「予防」が含まれる。「予防する」または「予防すること」という用語は、予防的および／または予防的手段を指し、その目的は、標的とされる病的状態または障害を予防または減速することである。
【００４２】
本開示は、活性白血球細胞によって放出される白血球酵素、特に白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）およびヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）等の活性白血球細胞によって放出される酵素の迅速な検出（相対的活性の決定を含む）のための組成物および方法に関する。
【００４３】
本開示の少なくとも１つの態様では、感染について対象をスクリーニングする方法が記載され、この方法は、（ａ）感染を発症するリスクのある対象から組織または体液のサンプルを取得するステップと、（ｂ）サンプルを検出器デバイスに適用し、検出器デバイスは、ＬＥ、および／またはＨＮＥの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの基質を含み、少なくとも１つの基質は、ＬＥおよび／またはＨＮＥの少なくとも１つの閾値レベルを検出するように適合され、閾値レベルは感染の存在と関連するステップと、（ｃ）サンプル中に存在するＬＥおよび/またはＨＮＥの閾値レベルを確認し、ＬＥおよび/またはＨＮＥのそれぞれの濃度が閾値レベルを超える場合、さらにそのような測定は感染の陽性スクリーニングであるステップと、を含む。
【００４４】
本開示は、感染症が人工関節周囲感染症（ＰＪＩ）である方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＪＩの検出のための白血球エステラーゼ（ＬＥ）の閾値レベルは、滑液サンプル中の少なくとも約２０ｐｇ／ｍｌの白血球エステラーゼである。
【００４５】
迅速な検出のための組成物および方法は、ＬＥおよびＨＮＥ等の白血球酵素を検出するための、ＬＥ基質およびＨＮＥ基質と呼ばれる特定の基質を利用する。迅速な検出のための組成物および方法は、白血球酵素を検出するための電気化学的アッセイ、特に、内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（「ＩＣＥＣＥＡ」）を利用し得るが、必ずしもそのように限定されない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、基質はＬＥを検出することができる。このような基質はＬＥによって容易に加水分解されてレドックス中間体を生成し、検出可能な電気化学的応答を提供することができる。いくつかの実施形態において、ＬＥを検出するための基質（すなわち、「ＬＥ基質」）は、以下の式１で示される。
2022502059.tif 000005
式１
【００４７】
ここで、Ａは、白血球エステラーゼに対する酵素特異性を有するエステル切断部位にある、例えば、アラニンまたは乳酸塩等のアシル基の同一性を決定し、Bは、電気化学アッセイを使用して（例えば、ＩＣＥＣＥＡまたはスクリーン印刷された電気化学センサーを使用することによって）検出できるレドックス反応に関与することができる部分である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ａは、アミノ基（すなわち、ＲａがＨまたは任意選択で置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基である−ＮＲａ）を含み、または、Ａは、エーテル基（すなわち、−Ｏ−）を含む。
【００４９】
Ａによって定義されるアシル基は、任意の有効なアミンまたはアルコール保護基Ｃ（例えば、トシル基）を使用して保護される。エステラーゼによる加水分解時に放出されるエステルのアルコール中間体である部分Bは、レドックス基質であり、レドックス反応に関与する。さらに、式１の酸素が結合するＢは、−ＮＨ結合部分で置換されてもよく（すなわち、式１で提示されたエステル基は、アミド基で置換されてもよく）、それでも本開示の範囲内である。
【００５０】
アミンまたはアルコール保護基Ｃは、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メチオキシメチル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、メチルチオメチル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（Ｔｒ）、シリー（例えばＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳなど）、メチル、およびエトキシエチル（ＥＥ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、アリールスルホニル、またはアルキルスルホニル（例えば、ノシル）のいずれかを含み得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、レドックス部分Ｂは、そのヒドロキシル基を介してエステルを形成し得るフェノールの誘導体である。このような中間体は、酸化を受けて電子を放出し得る。例えば、必ずしも限定されないが、１つのフェノール誘導体であるヒドロキノンは、パラコンフォメーションで２つのヒドロキシル基を含む。各ヒドロキシル基は結合して、独立して白血球エステラーゼの基質である別個の乳酸エステルを形成することができる（図１）。得られた二本鎖基質は、白血球エステラーゼ活性の２つの潜在的な標的部位を有し、基質の分解は段階的となる。最初の標的での白血球エステラーゼによるエステル加水分解は、活性部位の分子障害のために比較的ゆっくりと起こるが、その後の２番目の活性部位の加水分解はより迅速に起こる。非特異的加水分解がカスケードを開始する可能性が低いため、これは電気化学的アッセイの特異性を効果的に改善する可能性がある。最初のエステル加水分解ステップの後、酸化反応は、水素原子を除去して電子を放出し、セミキノン乳酸塩エステル中間体を形成することができる（図２）。続いて残りのエステルを加水分解した後、キノンベースの中間体が放出され、さらに酸化してパラベンゾキンを形成することができる。パラベンゾキンは低電位で還元され、サンプル内の他のレドックス活性種からの干渉を最小限に抑え、アッセイの選択性を向上させ得る。最終製品を図３に示す。
【００５２】
他の態様では、ＬＥおよびＨＮＥの陽性の兆候を有する患者を治療する方法が記載されている。一実施形態では、グラム陽性菌によって引き起こされる重篤な感染症は、これらの病原体の多くが現在、標準的な抗菌剤に耐性があるため、現在、治療が困難である。そのために、本開示の少なくとも１つの側面は、感染のリスクを最小限に抑えるために、侵襲的手術の前に患者を予防的に治療することである。 少なくとも１つの実施形態において、感染症に罹患していると同定された患者は、活動性感染症対策において、ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルホプリスチンおよびダルババンシンなどの抗菌剤の投与を含む包括的な治療計画を開始することができる。他の実施形態では、薬剤耐性グラム陽性菌およびグラム陰性菌による感染症の治療に有用なものを開発することにより、ＰＪＩのリスクをスクリーニングまたは検出する方法である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、Ｂはキノンを含む。いくつかの実施形態において、Ｂはフェノールを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、置換キノンまたは置換フェノールを含む。いくつかの実施形態において、Ｃは、トシル保護基を含む。いくつかの実施形態において、式２の酸素が結合するＢは、アミノ基で置換されている。さらなる実施形態において、Ｂはアミノフェニルを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、置換アミノフェニルを含む。
【００５４】
式１の範囲内にある白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）を検出するための基質の２つの特定の、明示的に非限定的な例には、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネート（以下の化合物Ａ）および４−（（（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノエート（以下の化合物Ｂ）が含まれる。化合物Ａは、本明細書では「ＴＡＰＴＡ」とも呼ばれる。化合物ＡのＮＭＲは、図５に示され、トシル部分の構造とその結合が示される。化合物Ａおよび化合物Ｂのフェニルエチレンジアミン変異体（すなわち、パラ酸素がＮＨリンカーで置き換えられている）もまた、本開示の範囲内で考慮されるべきであり、同様に、本開示の電気化学的アッセイ（例えば、ＩＣＥＣＥＡ）に含めるのに適している。
2022502059.tif 000006
化合物A
2022502059.tif 000007
化合物B
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＬＥ基質は、以下の式２に記載されるような組成物を含む。
2022502059.tif 000008
式２
【００５６】
Ｘ1およびＸ2は、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲａである。Ｒａは、Ｈ、アルキルまたはアリール基である。Ｘ1およびＸ2は、いずれも酸素、またはいずれもＮＲａとすることができる。あるいは、Ｘ1およびＸ2の一方は酸素で、他方はＮＲａである。
【００５７】
Ｙ1およびＹ2は、独立してＯ、Ｓ、またはＮＲａである。Ｒａは、上記の通りである。Ｙ1およびＹ2は、いずれも酸素、またはいずれもＮＲａとすることができる。あるいは、Ｙ1およびＹ2の一方は酸素で、他方はＮＲａである。
【００５８】
Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキルまたはアリール基または置換アルキル、置換アリールまたは保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒ１またはＲ２、もしくはこれらのいずれもメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１またはＲ２、もしくはこれらのいずれもトシルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２はトシルである。
【００５９】
Ｒ３およびＲ４は、独立して、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］、カルボベンジルオキシ、およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルのようなアルキル、保護基、またはペプチド部分である。一実施形態では、Ｒ４はトシルである。ペプチド部分は、天然および／または非天然アミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。
【００６０】
Ｒ２およびＲ４はまた、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メチオキシメチル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、メチルチオメチル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（Ｔｒ）、シリー（例えば、ＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳ）、メチル、エトキシエチル（ＥＥ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、アリールスルホニル、またはアルキルスルホニル（例えば、ノシル、Ｎｐｓ等）を含み得る。一実施形態では、保護基は、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］、カルボベンジルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルのいずれか１つであり得る。
【００６１】
環上のＲ５のそれぞれは、独立してハロゲン原子；ヒドロキシル基；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ２−Ｃ６アルケニル基；Ｃ２−Ｃ６アルキニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基（トリフルオロＣ１−Ｃ６アルキルを含む）；Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基；Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基；Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキル基；Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルオキシ基；Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシ基；Ｃ２−Ｃ６アルキニルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基；Ｃ１ーＣ６アルキルスルフィニル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル基；アミノ基；Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ基；モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基；ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基；ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基；シアノＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基；シアノＣ１−Ｃ６アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ６アシル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシイミノＣ１−Ｃ６アルキル基；カルボキシル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；カルバモイル基；モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基；ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基；ニトロ基；またはシアノ基である。ｎは０、１、２、３または４である。少なくとも１つの実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、独立して、ＯまたはＮＲａである。Ｒａは、Ｈ、アルキル、アリール、またはアラルキル基である。Ｘ１およびＸ２は、いずれも酸素、またはいずれもＮＲａとすることができる。あるいは、Ｘ１およびＸ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。さらに別の実施形態では、Ｙ１およびＹ２は、独立してＯまたはＮＲａである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、基質は、ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）を検出する。いくつかの実施形態において、ＨＮＥを検出するための基質（すなわち、「ＨＮＥ基質」）は、以下に示されるような、式３で表すことができる。
2022502059.tif 000009
式３
【００６３】
Ａ１からＡ４（すなわち、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４）は、酵素活性部位（すなわち、ヒト好中球エラスターゼ／ＨＮＥの活性部位）として機能するコアテトラペプチド足場配列を表す。Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（ＡＡＰＶ）のテトラペプチド配列（配列番号1）が最も一般的であるが、ＨＮＥの基質感受性を改善するために、４つのペプチド部位のいずれかで天然または非天然アミノ酸を置換することができる。例えば、保存的置換を配列番号１に対して行うことができ、それでも本開示の範囲内にある。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。
【００６４】
式３のＢは、上記の式１に表されたＬＥ基質と同様のレドックス部分を表す。例えば、Ｂは、そのヒドロキシル基、例えば、レドックス活性アルコール中間体を介してエステルを形成し得るフェノールの誘導体を含み得る。これは、例えば、ヒドロキノン中間体またはヒドロキノンベースのレドックス基を含み得る。式３のＣは、アシル基、例えば、Ｎ−メチオキシスクシニルを表す。アシル基は、ＨＮＥの基質感受性を改善するのに役立つ可能性があり、いくつかのアシル基、例えば、Ｎ−メトキシスクシニルもまた、基質の溶解度を増加させる可能性がある。
【００６５】
式３の範囲内にあるＨＮＥを検出するための基質の特定の、明示的に非限定的な例には、３−｛［（１Ｓ）−１−｛［（２Ｓ）−１−（５−｛［（１Ｓ）−１−（｛４−［（２Ｓ）−２−（｛１−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（３−カルボキシプロパナミド）プロパナミド］プロパノイル］ピロリジン−２−イル｝ホルムアミド）−３−メチルブタナミド］フェニル｝カルバモイル）−２−メチルプロピル］カルバモイル｝イミダゾリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル］カルバモイル｝エチル］カルバモイル｝プロパン酸である、以下の化合物Ｃが含まれる。
2022502059.tif 000010
化合物Ｃ
【００６６】
図１および図２の実施形態および式２および式３に関連して上記したように、白血球エステラーゼによる切断のために得られる二本鎖基質が２つの潜在的な標的部位を有するので、（２つの対称または非対称のα−アミノまたはα−ヒドロキシ酸エステルからなる）ジエステルがより効果的な基質であると信じる理由があった。さらに、基質の分解は段階的である可能性が高く、最初の活性部位での白血球エステラーゼによるエステル加水分解は、二重基質によって引き起こされる立体障害のために、より遅く、またはより意図的になると予想された。非特異的加水分解は段階的加水分解のカスケードを開始する可能性が低いため、最初はこれが電気化学的アッセイの特異性を改善する可能性があると考えられた。しかし、驚くべきことに、出願人は、ジエステルがモノエステルよりも効果が低いことを発見した。モノエステルが非常に低濃度（例えば、約１％）で存在するジエステルとモノエステルの混合物においてさえ、モノエステルの有効性が優勢であり、組成物全体の有効性を決定した。実際、モノエステルの有効性は、ジエステル組成物がモノエステルの濃度が１％未満に低下する点まで精製されるまで発見されなかった。その時点で、ジエステル組成物の有効性は急激に低下し、それにより、モノエステルが白血球エステラーゼ酵素と反応するためのより効果的な基質であったことを示している。
【００６７】
したがって、一実施形態では、本発明の基質は、モノエステルを含み、モノエステルは、白血球エステラーゼに対する特異性を備えた、アラニンエステル等のα−アミノ酸エステル、または乳酸エステル等のα−ヒドロキシ酸エステルのうちの１つである。モノエステルは、レドックス反応に参加するための第１の部分と、アミンまたはアルコール遮断基を含む第２の部分とを有する。
【００６８】
一実施形態において、組成物は、式Ｉに示されるモノエステルを含み、ここで、Ａは、酸素（Ｏ）またはＮＲａを含み、ここで、Ｒａは、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基であり、それにより、前記モノエステルがα−ヒドロキシ酸エステル（すなわち、乳酸エステル）である場合に、ＡはＯであり、または前記モノエステルがα−アミノ酸エステル（すなわち、アラニンエステル）である場合に、ＡはＮＲａであるという点で、Ａはエステルのアシル基の同一性を決定する。Ｂは最初の部分で、Ｃは2番目の部分である。
【００６９】
一実施形態において、第１および／または第２の部分を連結する任意の酸素連結基を窒素連結基で置換することができ、窒素連結基を酸素連結基で置換することができる。
【００７０】
一実施形態において、第１の部分（Ｂ）は、フェノールの置換または非置換誘導体、置換または非置換ヒドロキシアントラセン、置換または非置換アミノフェノール、または置換または非置換ヒドロキシフェナントロリンのうちの１つを含む。
【００７１】
一実施形態において、第２の部分（Ｃ）は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メチオキシメチル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、メチルチオメチル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（Ｔｒ）、シリー（例えば、ＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳ）、メチル、エトキシエチル（ＥＥ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、アリールスルホニル、またはアルキルスルホニル（例えば、ノシル、Ｎｐｓ等）のうちの１つを含む。
【００７２】
一実施形態において、第２の部分は、置換または非置換の複素環またはヘテロアリール環を有するスルホニル基である。
【００７３】
一実施形態では、式１は、式４に示される一般的な構造にさらに精製される。
2022502059.tif 000011
式４
ここで、第１の部分Ｂは、４−ヒドロキシフェニル（
2022502059.tif 000012
）を含み、Ａは酸素またはＮＲａを含み、ここでＲａはＨまたは任意選択で置換されたアルキル、アリール、またはアラルキル基であり、それによりＡはエステルのアシル基の同一性を決定し、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して水素または任意に置換されたアルキル基であり（Ａが酸素の場合、Ｒ３は存在しない）、Ｒ４は置換または非置換の複素環またはヘテロアリールである。
【００７４】
一実施形態において、Ｒ４は、ピリジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、キノリル、イソキノリル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、インドリル、ベンイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、トリアジニル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、プリニル、１−オキソイソインドリル、１，２，４−トリザイニル、１，３，４−トリアジニル、イソインドリル、 ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、テトラヒドロキノリル、ジヒドロキノリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ジヒドロイソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ベンゾフリル、フロピリジニル、ピロロピリジミジニル、またはアザインドリルのうちの１つである。
【００７５】
一実施形態において、Ｒ４は、置換または非置換極性基の付加を伴う、または伴わないピリジンである。
【００７６】
一実施形態では、Ｒ４は、以下に示すように、ピリジン（１）、メトキシピリジン（２）、および（メトキシカルボニル）ピリジン（３）のうちの１つから選択されるピリジンである。
2022502059.tif 000013
１つの特定の実施形態において、Ｒ４は（メトキシカルボニル）ピリジン（３）である。
【００７７】
特定の実施形態において、モノエステル基質の組成は、４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネートである。
【００７８】
さらに別の特定の実施形態において、モノエステルの組成は式５で示されるる。
2022502059.tif 000014
式５
【００７９】
図６を参照すると、式５の切断メカニズムが示されている。具体的には、白血球エステラーゼ（ＬＥ）は、エステルの加水分解時に酸素部位でモノエステル基質を切断する。
【００８０】
一実施形態において、白血球エステラーゼ酵素の基質は、既知の市販の技術および材料を使用して、電極センサーストリップの表面にスクリーン印刷される。
【００８１】
本明細書に記載されるように、白血球は、本開示の電気化学的アッセイ（すなわち、ＩＣＥＣＥＡ）によって検出および／または定量化することができる白血球酵素を産生することができる。
【００８２】
白血球酵素は、例えば、ＷＯ２０１０／０３６９３０に記載されているものを含み得、これは、例えば、ＩＬ−１β、白血球エラスターゼ、白血球エステラーゼ、および／またはゼラチナーゼＢ、ならびにヒト好中球エラスターなど、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）は、白血球（白血球）によって産生されるエステラーゼである。ＬＥは、例えば、白血球／ＷＢＣWBCおよび感染に関連する他の異常の存在についての尿検査の対象である。ヒト白血球エラスターゼ（「ＨＬＥ」）としても知られるヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）は、セリンプロテアーゼである。キモトリプシンと同じファミリーに属し、幅広い基質活性を持っている。ＨＮＥは、本明細書に記載されている５つの分類の白血球のうちの２つである好中球およびマクロファージによって分泌される。ＨＮＥは２１８アミノ酸の長さで、２つのアスパラギン結合炭水化物鎖を有している。ＨＮＥには、ＩＩａとＩＩｂとの２つの形式がある。
【００８３】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、インビボまたはインビトロで得られた生物学的組織または流体起源のサンプルを含む生物学的サンプルを指し得る。生物学的サンプルは、体液（例えば、漿液、血液、血漿、血清、または尿）、臓器、組織、画分、および例えば、ヒトを含む哺乳動物から単離された細胞であり得るが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織を含む生物学的サンプルのセクションを含み得る。生物学的サンプルはまた、生物学的サンプル、例えば、生物学的流体（例えば、血液、血清、腹水、および／または尿）からの抽出物を含み得る。特に興味深いが、明らかに非限定的であるのは、尿、喀痰（例えば、嚢胞性線維症と診断された患者）、腹水（例えば、肝硬変および腹水症の患者）、および他の漿液であり、例えば、滑液、胸水、心嚢水、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、白血球の存在、すなわち、生物学的サンプル中に存在する白血球酵素（例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ）の量を検出および／または定量化することによって決定される場合、対象における感染の存在を示し得る。そのような実施形態は、電気化学的アッセイ、特に本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡにおいて、本開示のＬＥおよび／またはＨＮＥ基質を利用することができる。例えば、尿中のＬＥおよび／またはＨＮＥの存在は、対象が尿路感染症（「ＵＴＩ」）を有することを示し得る。同様に、滑液中のＬＥおよび／またはＨＮＥの存在は、例えば、必ずしも限定されないが、人工関節周囲感染症（「ＰＪＩ」）などの関節感染症を有するとして対象を示し得る。感染の存在を示すこれらの例は、本開示の基質の単なる例示的な使用であり、電気化学的アッセイ、例えば、ＩＣＥＣＥＡで利用されてもされなくてもよいので、それ自体に限定されない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、対象が人工関節周囲感染症（ＰＪＩ）を有することを示すために使用される。ＰＪＩは、関節全置換術後の壊滅的な合併症であり、診断と治療との両方で外科医にとって課題となっている。ＰＪＩの正確でタイムリーな診断を確立することは、治療法の決定を行う上で非常に重要である。痛みを伴うプロテーゼを提示している患者の場合、感染の存在を除外または診断するための精密検査を完了することが重要である。ほとんどの場合、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）やＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）等の血清学的検査が、最初に選択されるスクリーニング検査である。血清学的マーカーが上昇している患者、または感染の疑いが高い患者では、次のステップは滑液の検査のために関節吸引を行うことである。従来から、滑液の細菌培養は、ＰＪＩの診断を行うために使用されてきた。細菌培養自体は十分な感度がなく、感染症の３０％が培養陰性であるため、整形外科医は血清学的検査の結果、滑液の白血球数と多形核の割合、および組織学的分析を考慮して診断を下す。しかしながら残念なことに、細菌培養と従来の滑液検査では、結果が出るまでに数日から１週間以上かかる場合がある。
【００８６】
したがって、いくつかの実施形態では、痛みを伴う関節から吸引された滑液は、本開示の酵素基質を使用して、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性について試験されるであろう。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡアッセイを使用することによって達成することができる。そのような実施形態では、ＬＥおよび／またはＨＮＥの活性は、絶対濃度の連続測定として報告されるであろう。これは、オフィスまたは手術室で実行して、ポイントオブケアの意思決定のために数分で結果を出すことができる。
【００８７】
母集団データの蓄積に基づいて、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活動のレベルを追加の測定基準と組み合わせて、感染が存在する可能性を予測することができる。追加の測定基準には、関節の種類、以前の感染歴、および血清学的検査の結果（ＥＳＲおよびＣＲＰ）が含まれる得る。外科医は、感染が存在する可能性を考慮して、患者にとって最も適切な治療アルゴリズムを決定することができる。感染の可能性が高い場合は、感染の程度などに基づいて、プロテーゼの抜去や抗生物質スペーサーの配置、切開や創面切除、長期的な抗生物質の抑制など、ＰＪＩの治療を検討することができる。最後に、感染の存在の可能性が低い場合、または感染がほとんど除外されている場合には、痛みを伴うプロテーゼの他の病因を考慮することができる。
【００８８】
感染の初期診断を行うことに加えて、現在の開示の基質、例えば、アッセイ（例えば、ＩＣＥＣＥＡ等）は、新しいプロテーゼの再移植の正しいタイミングを決定することを目的として、ＰＪＩの解像度を確立するために使用することができる。血清学的マーカーおよび他の滑液試験に加えて、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性のレベルを使用して、上記で論じたような治療の成功を決定することができる。ＬＥおよび/またはＨＮＥが持続的に上昇している患者の場合、外科医は抗生物質の静脈内投与を継続するか、抗生物質スペーサーの交換を試みて、感染の完全な解決の見通しを改善することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、対象が特発性細菌性腹膜炎（ＳＢＰ）を有することを示すために使用される。ＳＢＰは、肝硬変や腹水症の患者に相対的によく見られる、深刻で生命を脅かす合併症である。この合併症のある患者にとって、抗生物質の迅速な診断と早期投与は生存のために重要であり、院内死亡率は２０％にもなる可能性がある。腹水症の患者にとって、発熱の症状、精神状態の変化、および腹部の圧痛は、ＳＢＰの頻繁な兆候である。このような場合、診断用穿刺が行われ、２５０細胞／ｍｍ３を超える好中球の絶対数および/または細菌培養に基づいて診断が行われる。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態において、診断用穿刺から得られた腹腔液は、本開示の酵素基質を使用して、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性について試験されるであろう。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡアッセイを使用することによって達成することができる。ＩＣＥＣＥＡアッセイを使用すると、ＬＥまたはＨＮＥの活性は、絶対濃度の連続測定として報告される。多くの患者から収集された母集団データの蓄積に基づいて、ＬＥおよび／またはＨＮＥの絶対濃度を絶対的基準の診断基準と比較して、ＳＢＰが存在する確率の計算を提供する。感染の可能性は、最も適切な治療アルゴリズムについて治療する医師に知らせるために使用することができる。ＬＥまたはＨＮＥの測定レベルも重要な予後情報を提供することができ、レベルが高いほど予後が悪いことを示す。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、尿生殖器感染症としても知られている尿路感染症（ＵＴＩ）を有するものとして対象を示すために使用される。排尿障害や頻尿などの古典的なＵＴＩ症状があり、膣分泌物や刺激がない健康な女性の場合、UTIの診断は通常、臨床症状のみで行うことができます。一方、症状が明確に定義されていない女性、無症候性の妊婦、高齢患者、および子供は、ＵＴＩの検査前の確率がはるかに低くなる。本開示は、ＵＴＩについて女性を検査することに限定されない。ＵＴＩの診断の絶対的基準は、中間の尿培養（＞１０３〜１０５個の微生物）または膿尿（１ｍｌあたり１０４個を超える白血球）である。
【００９２】
したがって、いくつかの実施形態において、症候性患者の中間尿は、本開示の酵素基質を使用して、白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）および／またはヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）活性について試験されるであろう。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡアッセイを使用することによって達成することができる。人口データに基づいて、感染の可能性は、ＬＥおよび/またはＨＮＥ活性の測定と、特定の症状の存在や患者の特徴（年齢、性別、妊娠など）などの追加の要因の両方に基づいて決定することができる。感染の可能性に応じて、医師は経口抗生物質を投与するかどうかを決定することができる。
【００９３】
本開示の臨床応用のための集団データ（すなわち、例えば、ＰＪＩ、ＳＢＰ、および／またはＵＴＩに限定されないが、感染を有するとして患者を示すことにおいて）は、感染の存在の予測可能性に対するＬＥおよび/またはＨＮＥ活性の測定値を変換するために使用され得る。テストデバイス自体は、そのような母集団ベースのデータを収集および配布するための媒体として使用することができる。例えば、スマートフォン（または同様のデバイス）に接続された電気化学バイオセンサーにより、医師は選択した情報を一元化されたデータベースに提供でき、感染の可能性の計算を継続的に改善するために使用することができる。バイオセンサーはまた、ＬＥおよび/またはＨＮＥ活性、および治療アルゴリズムを磨くために使用できる追加の測定基準に基づいて、個々の患者の感染の可能性を外科医に報告し得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、白血球酵素を検出するための基質、例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ基質は、アッセイに組み込まれる。そのようなアッセイは、例えば、電気化学的アッセイを含み得る。電気化学アッセイは費用効果が高く、感度が高く、キャリブレーションプロセスを簡素化する。さらに、そのような方法は、血性または濁った液体でも同様に効果的である。好ましい電気化学的アッセイは、内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。ＩＣＥＣＥＡにおける本開示のＬＥ基質（「ＴＡＰＴＡ」）の使用は、以下の実施例１に記載されている。ＩＣＥＣＥＡは、一般にＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７１３およびＵＳ２０１６／００４０２０９に開示されており、その開示内容の全体がここに組み込まれる。ＩＣＥＣＥＡは、連続実験において、酵素を含まないプレアッセイキャリブレーションと電気化学的酵素アッセイの統合を利用する。これにより、ＬＥやＨＮＥ等の酵素の選択的かつ高感度な測定を可能にする独自の形状のアンペロメトリックトレースが得られると考えられる。
【００９５】
ＩＣＥＣＥＡは、一般に、ＵＳ２０１６／００４０２０９に記載されている以下の方法に従う。最初に、酵素基質（例えば、本開示のＬＥおよび／またはＨＮＥ基質）が、バックグラウンド電解質に配置される。次に、酵素の酵素反応の反応物または生成物が、第１の酵素基質／バックグラウンド電解質に添加され、これは、「第１のアッセイ混合物」と呼ばれるものを作り出す。電気化学アッセイの電極を流れる電流は、第１のアッセイ混合物が形成された後に測定される。次に、酵素（例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ）を「第１のアッセイ混合物」に加えて、「第２のアッセイ混合物」を作成し、電流を所定の期間にわたって再度測定する。酵素活性は、酵素の添加によって引き起こされる経時的な電流の変化に基づいて決定される。最適には、反応物／生成物が酵素基質に添加された後に酵素が添加されるが、順序を切り替えることができる。すなわち、酵素が最初に基質に添加され、次に反応物／生成物が添加される。
【００９６】
ＩＣＥＣＥＡには、電気化学測定装置が含まれている。電気化学測定装置は、作用電極、参照電極、および補助電極を含む。電流は作用電極を通して測定される。作用電極は、貴金属電極、金属酸化物電極、炭素同素体で作られた電極、または修飾電極であり得る。補助電極は白金線であり得る。参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ／ＮａＣｌまたは他の任意の参照電極であり得る。電気化学的アッセイシステムは、作用電極と参照電極のみで構成することもできる。電流の変化を測定するには、電流のアンペロメトリックトレースを収集する。
【００９７】
一般に、ＩＣＥＣＥＡにおいて、電気化学アッセイシステムの酵素基質（電解質中）に反応物／生成物を追加するには、次の手順が含まれる。最初に、反応物／生成物の最初のアリコートが酵素基質（電解質中）に加えられる。電気化学アッセイシステムの電極を流れる電流は、最初のアリコートが追加された後に測定される。反応物／生成物の１つまたは複数の追加のアリコートが混合物に加えられ、電気化学アッセイシステムの電極を通って流れる電流が再び測定される。好ましくは、酵素が混合物に添加される前に、反応物／生成物の少なくとも３つのアリコートが（電解質中の）酵素基質に添加される。あるいは、酵素が混合物に添加された後、反応物／生成物のアリコートが（電解質中の）基質に添加される。
【００９８】
酵素の酵素活性は、反応物/生成物が基質に添加された後（酵素が添加される前、またはその逆）に電気化学アッセイシステムの作用電極を流れる電流を所定の期間にわたって所定の間隔で測定することから作成された線の傾きから決定することができる。この方法の利点は、（電解質中の）基質への反応物/生成物の添加および酵素の添加が、同じ電極を使用して同じ容器内で行われることである。
【００９９】
少なくとも１つの実施形態において、バックグラウンド電解質中の酵素基質および他の必要な反応物の溶液、酵素反応のレドックス活性成分の溶液、およびアッセイされた酵素の溶液を含むカスタマイズされたキットが記載されている。このように、アンペロメトリー測定は、アンペロメトリー法を備えた任意の電気化学測定装置と、酵素基質を含む溶液に浸漬された作動電極、参照電極、および対向電極を備えた従来の電気化学セルを使用して行われる。作用電極は、電位Ｅ対参照電極の電位に保持される。電位Ｅは、酵素反応のレドックス活性成分を含む溶液中に存在する化学種の酸化または還元のいずれかに適している。実験は、レドックス活性含有溶液の１つまたは複数の既知のアリコート、続いてアッセイされた酵素を含む溶液の１アリコートを、酵素基質および他の必要な反応物を含む攪拌溶液にスパイクし、作用電極を流れる電流を測定することによって行われる。
【０１００】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
本明細書に開示される刊行物は、本発明の出願日の前のそれらの開示のためにのみ提供される。さらに、提供される発行日は、個別に確認する必要がある実際の発行日とは異なる場合がある。
【０１０２】
このテキストで引用されている各出願および特許、ならびに各出願および特許で引用されている各文書または参照、特許または非特許文献（発行された各特許の審査中を含む、「出願引用文書」）、およびこれらの出願および特許のいずれかに対応するおよび／または優先権を主張するＰＣＴおよび外国の出願または特許のそれぞれ、ならびに各出願引用文書で引用または参照される各文書の全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。より一般的には、文書または参考文献は、このテキストで引用され、本明細書で引用された参考文献（製造業者の仕様、指示などを含む）のそれぞれで引用された各文書または参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１０３】
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するのに役立つ。
６．   実施例
【０１０４】
1.     内部で較正された電気化学的連続酵素アッセイ（ＩＣＥＣＥＡ）での４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネートの使用
【０１０５】
基質４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネート、以下の化合物Ａ（「ＴＡＰＴＡ」とも呼ばれる）を基質として使用して、内部で較正された電気化学連続酵素アッセイ（ＩＣＥＣＥＡ）での白血球エステラーゼ（ＬＥ）の活性を測定した。測定結果を、図４に示す。
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化合物 A
ＩＣＥＣＥＡは、ＵＳ２０１６／００４０２０９および上記の詳細な説明に一般的に記載されているように実施した。簡単に説明すると、プレアッセイ段階では、酵素基質（「ＴＡＰＴＡ」）および必要な反応物の溶液に酵素反応のレドックス活性成分の溶液をスパイクすることにより、３つの異なるキャリブレーションステップを実行した。これらの３つの別個の較正ステップは、図４において太字の「ａ」によって示されている。キャリブレーション後、アッセイ酵素（ＬＥ）の１つのアリコートを酵素基質溶液にスパイクすることにより、アッセイ段階を開始した。このステップは、図４において太字の「ｂ」で示されている。酵素反応に続いて、作用電極を流れる電流を測定した。酵素アッセイは、０〜２５０μｇ／Ｌの範囲のＬＥ濃度に対して較正された。ＬＥの酵素活性は、ＬＥ濃度に対して線形応答を示し、感染を予測した。
２．   式５のモノエステルの合成
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実施例２ａ．   ４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネート（モノエステル）は、１，４−フェニレンビス（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネート（Hanson et al, Chembiochem 2018, 19, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29679431に記載されている化合物IIIの手順の変更により合成）の部分加水分解により調製することができる。適切な塩基には、アルカリ水酸化物、アルカリ土類水酸化物、アンモニア、アミンなどが含まれる。
実施例２ｂ．   NaOHによる加水分解    １，４−フェニレンビス（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネート（２１ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ（０．０４５ｍＬ、１３９ｍｏｌ％）で３０℃で４日間処理した。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメタンに溶解し、１Ｍ ＨＣｌでリンスし、その後、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、無色のガラスとしての生成物を得た。
実施例２ｃ．   トリエチルアミンによる加水分解 １，４−フェニレンビス（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネート（９８ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）およびトリエチルアミン（２８ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ、１８４ｍｏｌ％）に溶解した。水（６２ｍｇ）を加え、不均一混合物を３０℃で３日間撹拌した。その後、１Ｍ ＨＣｌを加えｐＨ１にした。次に、層を分離し、水層をジクロロメタンで２回抽出した。有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させてピンク色の泡を得た。ジクロロメタン−酢酸エチル（７０：３０）を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーにより、白色結晶性固体としての４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネート（３６ｍｇ、収率６３％、融点：１１３〜１１６℃）を得た。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １．３７ （３Ｈ，ｄ）、３．９１（３Ｈ，ｓ）、４．３１（１Ｈ，ｑ）、６．６８（４Ｈ，Ａｂｑ）、８．５９（１Ｈ，ｔ）、８．９６（１Ｈ，ｂｒ）、９．１８（１Ｈ，ｄ）、９．２２（１Ｈ，ｄ）、９．４７（１Ｈ，ｓ）；ｍｓ＋３８１（Ｍ＋Ｈ）＋；ｍｓ−３７９（Ｍ−Ｈ）−。
実施例２ｄ．   Ｌ−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルまたはＬ−アラニンベンジルエステルからの４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネートの合成 Ｌ−アラニンｔｅｒｔ−ブチルエステルを、トリエチルアミンの存在下でメチル５−（クロロスルホニル）ピリジン−３−カルボキシレートと縮合させた。ジクロロメタン中のＨＣｌ（ｇ）で処理することによりｔｅｒｔ−ブチル基を除去して、Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニンを得た。この中間体はまた、Ｌ−アラニンベンジルエステルをメチル５−（クロロスルホニル）ピリジン−３−カルボキシレートと縮合させた後、Ｐｄ／Ｃ上でＥｔＯＡｃ中で水素化することによって調製した。
Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニンを、ＤＣＣおよびＤＭＡＰの存在下でアセトニトリル中で過剰のヒドロキノンと縮合させて、ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニンを得た。あるいは、Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニンをヒドロキノンモノベンジルエーテルまたはモノ−ＢＯＣ−ヒドロキノン［ｔｅｒｔ−ブチル４−（ヒドロキシフェニル）カーボネート］と縮合させた後、酢酸中のパラジウム上での水素化またはＨＣＬ（ｇ）による加水分解により、それぞれ４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニン酸塩が得られた。
【０１０６】
３．スクリーン印刷された電極での４−ヒドロキシフェニル（Ｎ−（３−（メトキシカルボニル）ピリジン−５−スルホニル）−Ｌ−アラニネートの使用
【０１０７】
図７を参照すると、スクリーン印刷された電極ストリップ上で本発明の基質を使用することの有効性が実証されている。具体的には、電極ストリップを、式５に示されるような構造を有する基質でスクリーン印刷した。ストリップを、様々な濃度のＬＥ（すなわち、０．１２５Ｕ／ｍｌ〜０．３５Ｕ／ｍｌのＬＥ）と接触させた。
【０１０８】
プロットは、約−０．１７Ｖに有意な還元ピークを明確に示しており、これは、エステル活性部位での白血球エステラーゼによるモノエステルの切断時に放出されるヒドロキノン分子のレドックス反応に対応する。さらに、還元ピークは用量依存的にサンプル内のＬＥ活性に直接関連していることがわかったため、スクリーン印刷された電極ストリップは、ＬＥの存在を検出することが確認されただけでなく、モノエステルの酵素切断に直接対応するサンプル中のＬＥの活性レベルまたは濃度に関する定量的測定値を提供することもできる。この測定されたレベルに基づいて、患者のＬＥのレベルが感染を示すのに十分高いかどうかを判断することができる。
【０１０９】
前述の例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義される本開示を限定するものとしてではなく、例示として解釈されるべきである。容易に理解されるように、上記の特徴の多数の変形例および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本開示から逸脱することなく利用することができる。そのようなバリエーションは、開示の範囲からの逸脱とは見なされず、そのようなすべてのバリエーションは、以下の範囲に含まれることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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