【手続補正書】
【提出日】平成21年12月17日(2009.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リボザイムリボスイッチ、コンフォメーション依存性標識で標識した基質、および化合物を接触させる工程であって、該基質が該リボザイムリボスイッチによる切断のための基質である、工程；ならびに
（ｂ）蛍光変化を検出する工程であって、蛍光変化が該リボザイムリボスイッチによる該基質の切断を示す、工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記基質の切断は、前記化合物が前記リボザイムリボスイッチに結合することを示すか；前記基質の切断は、前記化合物が前記リボザイムリボスイッチを活性化することを示すか；前記基質の切断は、前記化合物が前記リボザイムリボスイッチと相互作用することを示すか；前記基質の切断は、前記化合物が前記リボザイムリボスイッチのコンフォメーション変化を誘導することを示すか；前記基質の切断は、前記化合物が前記リボザイムリボスイッチのトリガー分子であることを示すか；蛍光変化は、前記化合物が基質の切断を調節することを示すか；または組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コンフォメーション依存性標識が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）標識である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数の異なる化合物を使用して複数回並行して、好ましくは少なくとも、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、９６回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３８４回、または４００回並行して行われ、該化合物のうちの１つの存在下における前記基質の切断は、該化合物が前記リボザイムリボスイッチを活性化することを示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数回並行して、複数回連続して、好ましくは少なくとも、３回、５回、１０回、１５回、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、または４００回連続して行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法がハイスループットシステムを使用して行われ、前記リボザイムリボスイッチがｇｌｍＳリボスイッチであるか、前記リボザイムリボスイッチが天然に存在するか、前記リボザイムリボスイッチが操作されているか、または組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リボザイムリボスイッチが、前記切断部位を含むセグメントが除去された、自己切断する、天然に存在するリボザイムリボスイッチであるか；前記基質が前記除去されたセグメントに置き換わるか；前記リボザイムリボスイッチがキメラであるか；前記キメラが、リボザイム、好ましくはハンマーヘッドリボザイムに融合したリボスイッチ、好ましくはグアニンリボスイッチを含むか；前記リボザイムが、前記リボザイムの前記切断部位を含むセグメントが除去された、自己切断するリボザイムであるか；前記基質が前記除去されたセグメントに置き換わるか；前記化合物がタンパク質またはペプチドであるか；前記化合物が有機低分子であるか、または有機低分子を含むか；あるいは組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）リボスイッチ、蛍光トリガー分子、および化合物を接触させる工程；ならびに
（ｂ）蛍光変化を検出する工程であって、蛍光変化が、該リボスイッチからの該トリガー分子の転置を示す、工程、
を含む、方法。
【請求項９】
前記化合物を前記リボスイッチおよびトリガー分子と接触させる前に、該リボスイッチおよびトリガー分子を接触させるか；前記トリガー分子が天然に蛍光性であるか；前記トリガー分子が蛍光標識を含むか；前記リボスイッチからの前記トリガー分子の転置は、前記化合物が該リボスイッチに結合することを示すか；前記リボスイッチからの前記トリガー分子の転置は、前記化合物が該リボスイッチを不活性化または遮断することを示すか；前記リボスイッチからの前記トリガー分子の転置は、前記化合物が該リボスイッチと相互作用することを示すか；前記リボスイッチからの前記トリガー分子の転置は、前記化合物が該リボスイッチのコンフォメーション変化を誘導することを示すか；または組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数の異なる化合物を使用して複数回並行して行われ、該化合物のうちの１つの存在下における前記リボスイッチからの前記トリガー分子の転置は、該化合物が該リボスイッチを不活性化または遮断することを示す、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数回並行して、好ましくは少なくとも、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、９６回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３８４回、または４００回並行して；または複数回連続して、好ましくは少なくとも３回、５回、１０回、１５回、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、または４００回連続して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法がハイスループットシステムを使用して行われるか；前記リボスイッチがＦＭＮリボスイッチであるか、および／または前記リボスイッチが天然に存在するか；前記トリガー分子が蛍光活性フラビンモノヌクレオチドであるか；前記リボスイッチが操作されているか；前記化合物がタンパク質またはペプチドであるか；前記化合物が有機低分子であるか、あるいは有機低分子を含むか；あるいは組み合わせである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）リボスイッチおよび化合物を接触させる工程であって、該リボスイッチがコンフォメーション依存性標識を含む、工程；ならびに
（ｂ）蛍光変化を検出する工程であって、蛍光変化が、該リボスイッチのコンフォメーション変化を示す、工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、前記化合物が該リボスイッチに結合することを示すか；前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、前記化合物が該リボスイッチを活性化することを示すか；前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、前記化合物が該リボスイッチと相互作用することを示すか；前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、前記化合物が該リボスイッチのコンフォメーション変化を誘導することを示すか；前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、前記化合物が該リボスイッチのトリガー分子であることを示すか；前記コンフォメーション依存性標識が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）標識であるか；あるいは組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数の異なる化合物を使用して複数回並行して行われ、該化合物のうちの１つの存在下における前記リボスイッチのコンフォメーション変化は、該化合物が該リボスイッチを活性化することを示す、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）および工程（ｂ）が、複数回並行して、好ましくは少なくとも、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、９６回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、３８４回、または４００回並行して；または複数回並行して、好ましくは少なくとも、３回、５回、１０回、１５回、２０回、３０回、４０回、５０回、７５回、１００回、１５０回、２００回、２５０回、３００回、または４００回連続して行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法がハイスループットシステムを使用して行われるか；前記リボスイッチがｐｒｅＱ１リボスイッチであるか、および／または前記リボスイッチがグアニン反応性リボスイッチであるか；前記リボスイッチがグリシン反応性リボスイッチであるか；前記リボスイッチが、コンフォメーション依存性標識を付加した天然に存在するものであるか；前記リボスイッチが操作されているか；前記リボスイッチがキメラであるか；前記化合物がタンパク質またはペプチドであるか；前記化合物が有機低分子であるか、または有機低分子を含むか；あるいは組み合わせである、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【図１】図１は、実施例１の方法１によるハイスループットスクリーニングの設計を示す。Ａ）天然のシス切断ｇｌｍＳリボザイムが、Ｇｌｎ６Ｐの存在下において、矢印で示す部位で切断する。Ｂ）Ｇｌｎ６Ｐの新規の機能類似体または擬態の結合を感知する二分子ｇｌｍＳリボザイム。
【図２】図２は、図１Ｂに示すｇｌｍＳリボザイムにより検出されたＧｌｎ６Ｐの結合を示す。
【図３】図３は、結合を検出するための、リボスイッチ／リボザイムの融合に基づくハイスループットスクリーニングの設計を示す。エフェクターの非存在下では、リボザイムが主に不活性型に折りたたまれる。グアニンまたは機能類似体の結合によって、折りたたみが変わり活性型リボザイムとなる（切断部位は矢印で示す）。図１と同様のフルオロフォア−クエンチャーの対により、エフェクターの結合が蛍光で読み取られる。
【図４】図４は、ＦＭＮアプタマーに結合するＦＭＮの新規の類似体または擬態のハイスループットスクリーニング方法を示す。
【図５】図５は、エフェクターの結合の検出に構造敏感な蛍光性プローブを使用した例を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ｇｌｍＳリボザイムの配列と構造を示す図である。Ａ）枯草菌由来の一分子ｇｌｍＳリボザイム（５’末端〜３’末端。配列番号１〜８）。矢印はＧｌｃＮ６Ｐの刺激を受けたリボザイム媒介切断部位を示す（Ｗｏｌｆｓｏｎ，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００６；  １３：  １−３）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｇｌｍＳリボザイムの配列と構造を示す図である。Ｂ）黄色ブドウ球菌由来の二分子ｇｌｍＳリボザイム構成体（５’末端〜３’末端。配列番号９〜１８）。この構成体は、Ｐ１ステムを切断し、１５ヌクレオチド基質ＲＮＡ（灰色で示す；配列番号９および１０）を使用しているため、野生型ｇｌｍＳリボザイムとは異なる。基質は５’末端のＣｙ３ＴＭアクセプター、３’末端の５／６−ＦＡＭドナーで標識されている。
【図７】図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、二分子ｇｌｍＳリボザイムのＲＮＡ切断活性を示す。Ａ）基質切断に関する見かけ上のｋｏｂｓ（０．１ｎＭ、５’３２Ｐ放射標識）を、リボザイム濃度の関数として測定した図である。Ｂ）４０μＭ  ＧｌｃＮ６Ｐ（上方の黒色の線）の存在下において、二分子のリボザイム基質複合体の切断を、ＦＲＥＴ対の蛍光増加によりモニタリングした図である。リボザイム（灰色）またはＧｌｃＮ６Ｐ（下方の黒色の線）の非存在下では活性が認められなかった。Ｃ）２００μＭ  ＧｌｃＮ６Ｐの存在下において６８時間にわたり３８４ウェルプレート内で基質およびリボザイムＲＮＡをそれぞれ１０ｎＭ培養した後の蛍光変化を示す図である。エラーバーは８回反応を繰り返して得たそれぞれの値の標準偏差を示す。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、リボザイム活性を誘導するＧｌｃＮ６Ｐ類似体の同定を示す。Ａ）ｇｌｍＳ切断を活性化する機能について検査したＧｌｃＮ６Ｐの構造である。Ｂ）各類似体の追加から２１時間または４４時間後（０時間（左軸）を基準）の蛍光により、どの化合物が切断を活性化するのかを示す図である。比較として、リガンドを含まない場合（ＮＬ）の相対的な蛍光は、２１時間で０．８、４４時間で０．９であったのに対し、２００μＭ  ＧｌｃＮ６Ｐ（Ｗｏｌｆｓｏｎ，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００６；  １３：  １−３）の追加後の相対的な蛍光は、２１時間で３．５、４４時間で３．４であった。また比較として、ＰＡＧＥ分析では、数字を円で囲んだ化合物がいずれもｇｌｍＳリボザイムを活性化し、見かけ上の親和性がＧｌｃＮ６Ｐの１０倍以内であったことが明らかにされている。
【図９Ａ】図９Ａは、９６０化合物パイロットｇｌｍＳ活性スクリーニングの結果を示す。Ａ）３つの内のプレート１は、３８４個のウェルで蛍光反応を示している。カラム１および２は基質鎖のみを含む。カラム２３（最後から２番目）は基質鎖およびリボザイム鎖を含み、カラム２４（最後）はリボザイム鎖および基質鎖のほかに、８０μＭ  ＧｌｃＮ６Ｐを含む。蛍光反応がリガンド非含有対照を上回る１０個の標準偏差よりも大きいウェルは、反転標識されている（グルコサミン、１５、１４および１６）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、９６０化合物パイロットｇｌｍＳ活性スクリーニングの結果を示す。Ｂ）プレート１の各対照反応およびヒット化合物の平均蛍光反応を示す。エラーバーは１つの標準偏差を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、９６０化合物パイロットｇｌｍＳ活性スクリーニングの結果を示す。Ｃ）９６０種類の化合物のスペクトルコレクションのスクリーニングから、４４時間後に２．３倍以上の蛍光の増大を示した５件のヒットが同定された。
【図９Ｄ】図９Ｄは、９６０化合物パイロットｇｌｍＳ活性スクリーニングの結果を示す。Ｄ）第二の分析により、Ｃで同定された５種類の化合物がいずれも、時間に依存した蛍光の増大を示すことが判明した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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