(57)【要約】  本発明は、1つ以上のデアミナーゼ（例えばアデノシンデアミナーゼ）とnCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドを送達するための組成物および方法を提供し、ここで、第1のポリヌクレオチドは、分割インテイン対のインテイン-Nに融合されたnCas9のN末端断片をコードし、第2のポリヌクレオチドは、分割インテイン対のインテイン-Cに融合されたnCas9のC末端断片をコードする。これらの断片をsgRNAと共に細胞に送達（例えばAAV送達）するための方法も提供され、これらの断片は分割インテイン系によって一緒に連結され、それによって細胞中で機能的な塩基編集系を再構成する。
2022500017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項２】
(a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項３】
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、ここでCas9の前記C末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項４】
(a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、ここでCas9の前記C末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項５】
Cas9の前記N末端断片が、配列番号2における番号付けでアミノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、473、576、588、または589までを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Cas9の前記C末端断片またはCas9の前記N末端断片が、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基におけるAla/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
前記第1および第2のポリヌクレオチドが連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第1および第2のポリヌクレオチドが別々に発現される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記デアミナーゼが野生型TadAまたはTadA7.10である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記デアミナーゼがTadA二量体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記TadA二量体が野生型TadAおよびTadA7.10を含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記融合タンパク質が核局在化シグナル（NLS）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片がNLSに連結されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記NLSが二部分NLSである、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
Cas9の前記N末端断片と前記融合タンパク質とが連結されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータンパク質を形成する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
Cas9の前記C末端断片と前記融合タンパク質とが連結されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータンパク質を形成する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記SpCas9はニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活性である、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質およびCas9のN末端断片を含む組成物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質およびCas9のC末端断片を含む組成物。
【請求項２２】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片とデアミナーゼとがリンカーによって連結される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の第1および第2のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターがプロモーターを含む、請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記プロモーターは構成的プロモーターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
前記構成的プロモーターはCMVまたはCAGプロモーターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物または請求項２４〜３０のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を含むCas9ドメインを含む、再構成されたA→G塩基エディタータンパク質。
【請求項３３】
前記変異が、SpCas9のアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基におけるものである、請求項３２に記載の再構成された塩基エディタータンパク質。
【請求項３４】
(a) Cas9のN末端断片であって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合されている、N末端断片、および
(b) Cas9のC末端断片であって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合されている、C末端断片
をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３５】
(a) Cas9のN末端断片であって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のアミノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、473、576、588または589で終結する連続配列であり、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合されている、N末端断片、および
(b) Cas9のC末端断片であって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のアミノ酸303、310、313、355、456、460、463、466、472、474、577、589または590で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合されている、C末端断片
をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３６】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片が核局在シグナル（NLS）に連結されている、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
Cas9の前記N末端断片およびCas9の前記C末端断片の両方がNLSに連結されている、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記NLSが二部分NLSである、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
Cas9の前記N末端断片とCas9の前記C末端断片が連結されてSpCa9を形成する、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活性である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項３４〜４０のいずれか一項の(a)におけるCas9のN末端断片と(b)におけるCas9のC末端断片とを含む、組成物。
【請求項４２】
請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４３】
前記ベクターがプロモーターを含む、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記構成的プロモーターがCMVまたはCAGプロモーターである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４７】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の組成物または請求項４２〜４７のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を含むCas9バリアントポリペプチド。
【請求項５１】
アミノ酸303、310、313、355、456、460、463、466、472または474にCys残基を含む、Cas9バリアントポリペプチド。
【請求項５２】
細胞を、
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および
(c) 単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチド
に接触させることを含む、
塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法。
【請求項５３】
細胞を、
(a) Cas9のN末端断片を含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとをコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および
(c) 単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチド
に接触させることを含む、
塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法。
【請求項５４】
細胞を、
(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、
(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記C末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および
(c) 単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチド
に接触させることを含む、
塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法。
【請求項５５】
細胞を、
(a) Cas9のN末端断片を含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、
(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとをコードする第2のポリヌクレオチドであって、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、ここで、Cas9の前記C末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および
(c) 単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチド
に接触させることを含む、
塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法。
【請求項５６】
前記sgRNAは標的ポリヌクレオチドに対して相補的である、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的ポリヌクレオチドが生物のゲノム中に存在する、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記生物が動物、植物、または細菌である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第1のポリヌクレオチド、前記第2のポリヌクレオチド、および／または前記をコードするポリヌクレオチドが、ベクターを介して前記細胞に接触される、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
Cas9の前記C末端断片またはCas9の前記N末端断片が、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基においてAla/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を含む、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記デアミナーゼがTadAまたはそのバリアントである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記デアミナーゼが野生型TadAまたはTad7.10である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記デアミナーゼがTadA二量体である、請求項５２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記TadA二量体が野生型TadAおよびTadA7.10を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片がNLSを含む、請求項５２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
Cas9の前記N末端断片およびCas9の前記C末端断片の両方がNLSを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記NLSが二部分NLSである、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
Cas9の前記N末端断片とCas9の前記C末端断片が連結されてSpCa 9を形成する、請求項５２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活性である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質はデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７４】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質はデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のF445〜K483の位置で終結する連続配列であり、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質はデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9の前記N末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9の前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７６】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、ここで、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７７】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、ここで、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のF445〜K483の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７８】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、ここで、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７９】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、ここで、Cas9の前記C末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9の前記C末端断片のN末端残基はAla、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9の前記C末端断片は、分割インテイン-Cに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項８０】
Cas9の前記C末端断片またはCas9の前記N末端断片が、Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys変異を含む、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記変異が、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基におけるものである、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである、請求項７３〜８１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
前記デアミナーゼはTadAまたはそのバリアントである、請求項８２記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記デアミナーゼは野生型TadAまたはTad7.10である、請求項８３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記融合タンパク質は、互いに連結された2つのデアミナーゼを含む、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記融合タンパク質が野生型TadAおよびTadA7.10の両方を含む、請求項８５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記融合タンパク質がNLSを含む、請求項７３〜８６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記NLSは二部分NLSである、請求項８７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片がSpCas9のアミノ酸配列を含む、請求項７３〜８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
Cas9の前記N末端断片またはCas9の前記C末端断片が、ヌクレアーゼ活性の低減に関連する1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項７３〜８９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
アミノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、または473までが、分割されたインテイン-Nに融合されたものを含む、Cas9タンパク質のN末端断片。
【請求項９２】
Cas9タンパク質のC末端タンパク質断片であって、前記C末端断片のN末端アミノ酸は、アミノ酸303、310、313、355、456、460、463、466、472または474におけるCys置換であり、かつ分割インテイン-Cに融合されている、C末端タンパク質断片。
【請求項９３】
A→G塩基エディター融合タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は1つ以上のデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項９４】
A→G塩基エディター融合タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は1つ以上のデアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合される、ポリヌクレオチド。
【請求項９５】
A→G塩基エディター融合タンパク質のタンパク質断片であって、前記融合タンパク質は1つ以上のデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、前記N末端断片は分割インテイン-Nに融合されている、タンパク質断片。
【請求項９６】
A→G塩基エディター融合タンパク質のタンパク質断片であって、前記融合タンパク質は1つ以上のデアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、前記C末端断片は分割インテイン-Cに融合されている、タンパク質断片。
【請求項９７】
1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれがコードする第1および第2のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記第1のポリヌクレオチドは、Cas9のN末端断片が分割インテイン-Nに融合されたものをコードし、前記第2のポリヌクレオチドは、Cas9のC末端断片が分割インテイン-Cに融合されたものをコードする、組成物。
【請求項９８】
1つ以上のデアミナーゼとSpCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質のN末端断片およびC末端断片を含む組成物であって、前記N末端断片は、SpCas9の断片が分割インテイン-Nに融合されたものを含み、前記C末端断片は、SpCas9の残部が分割インテイン-Cに融合されたものを含む、組成物。
【請求項９９】
細胞に塩基エディターシステムを送達するための方法であって、1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドに細胞を接触させることを含み、ここで、前記第1のポリヌクレオチドは、Cas9のN末端断片が分割インテイン-Nに融合されたものをコードし、前記第2のポリヌクレオチドは、Cas9のC末端断片が分割インテイン-Cに融合されたものをコードし、前記第1または第2のポリヌクレオチドのどちらかが、単一ガイドRNAをコードする、方法。
【請求項１００】
細胞に塩基エディターシステムを送達するための方法であって、1つまたは複数のデアミナーゼとSpCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質のN末端断片およびC末端断片、ならびにガイドRNAに細胞を接触させることを含み、ここで、前記N末端断片は、SpCas9の断片が分割インテイン-Nに融合されたものを含み、前記C末端断片は、SpCas9の残部が分割インテイン-Cに融合されたものを含む、方法。
【請求項１０１】
1つまたは複数のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドに細胞を接触させる工程であって、ここで、前記第1のポリヌクレオチドは、Cas9のN末端断片が分割インテイン-Nに融合されたものをコードし、前記第2のポリヌクレオチドは、Cas9のC末端断片が分割インテイン-Cに融合されたものをコードし、前記第1または第2のポリヌクレオチドのどちらかが単一ガイドRNAをコードする、工程と、
前記コードされたタンパク質および単一ガイドRNAを細胞中で発現させる工程と
を含む、細胞中の標的ポリヌクレオチドを編集するための方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年9月7日に出願された米国仮特許出願第62/728,703号及び2018年12月13日に出願された米国仮特許出願第62/779,404号の利益を主張するものであり、これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）の発見は、分子生物学の分野に革命をもたらした。この熱狂の多くは、CRISPR/Cas9がヒトの疾患を治療しヒトゲノムを編集する臨床的可能性に集中している。疾患を引き起こす突然変異は、CRISPRあるいはCRISPRベースのシステムを用いて修復される可能性がある。この目標を達成するための1つの課題は、ゲノム編集のために必要な要素を送達することである。例えば、CRISPR/Cas9に関して、SpCas9およびsgRNAがDNAプラスミドベクター中にコードされ、アデノ随伴ウイルス(AAV) を介して送達され得る。しかしながら、AAVはパッケージング能力が小さいため、細胞へのCRISPR/Cas9成分の送達を達成するのを助け、および/または所望の遺伝子編集目的を満たすために他のエレメント（例えばポリペプチドドメイン、プロモーター、レポーター、蛍光タグ、複数のsgRNA、またはHDRのためのDNAテンプレートなど）を含めさせることは、困難である。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの態様において、 (a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割（split）インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００４】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００５】
いくつかの態様において、 (a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００６】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端断片をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、および (b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとを含む融合タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で開始し、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチドを含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片は、配列番号2における番号付けでアミノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、473、576、588、または589までを含む。いくつかの実施形態において、Cas9のC末端断片またはCas9のN末端断片は、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基においてAla/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys突然変異を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、第1および第2のポリヌクレオチドは連結される。ある態様において、第1および第2のポリヌクレオチドは別々に発現される。ある態様において、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、野生型TadAまたはTadA7.10である。ある態様において、デアミナーゼは、TadA二量体である。いくつかの実施形態において、TadA二量体は、野生型TadAおよびTadA 7.10を含む。ある態様において、融合タンパク質は、核局在化シグナル（NLS）を含む。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片は、NLSと連結される。いくつかの実施形態において、NLSは二部分（bipartite）NLSである。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片および融合タンパク質は連結されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータンパク質を形成する。ある態様において、Cas9のC末端断片および融合タンパク質は連結されて、デアミナーゼおよびSpCas9を含む塩基エディタータンパク質を形成する。いくつかの態様において、SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活である。
【０００８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される融合タンパク質とCas9のN末端断片とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様において、本明細書に開示される融合タンパク質とCas9のC末端断片とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片とデアミナーゼとは、リンカーによって連結される。ある態様において、リンカーは、ペプチドリンカーである。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書に開示される第1および第2のポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。ある態様において、ベクターはプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある態様において、構成的プロモーターは、CMVまたはCAGプロモーターである。ある態様において、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。ある態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。
【００１０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物または本明細書に開示されるベクターを含む、細胞が本明細書で提供される。ある態様において、細胞は哺乳動物細胞である。
【００１１】
いくつかの態様において、本明細書では、Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys突然変異を含むCas9ドメインを含む、再構成されたA→G塩基エディタータンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、突然変異は、SpCas9のアミノ酸S303, T310, T313, S355, A456, S460, A463, T466, S469, T472, T474, C574, S577, A589, またはS590に対応する残基にある。
【００１２】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、分割インテイン-Nに融合される、Cas9のN末端断片と、(b) 配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、分割インテイン-Cに融合される、Cas9のC末端断片とをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
【００１３】
いくつかの態様において、 (a) Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のアミノ酸302, 309, 312, 354, 455, 459, 462, 465, 471, 473, 576, 588, または589で終結する連続配列であり、分割インテイン-Nに融合される、Cas9のN末端断片と、(b) 配列番号2における番号付けでCas9の303, 310, 313, 355, 456, 460, 463, 466, 472, 474, 577, 589, または590で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、分割インテイン-Cに融合される、Cas9のC末端断片とをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片は、核局在シグナル (NLS) と連結される。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片およびCas9のC末端断片は両方ともNLSに連結される。いくつかの実施形態において、NLSは、二部分NLSである。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片およびCas9のC末端断片は、連結されてSpCa9を形成する。いくつかの態様において、SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活である。
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書で開示される(a) においてCas9のN末端断片を、 (b) においてCas9のC末端断片を含む組成物が本明細書で提供される。
【００１６】
いくつかの態様において、本明細書で開示される1以上のポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。ある態様において、ベクターはプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある態様において、構成的プロモーターは、CMVまたはCAGプロモーターである。ある態様において、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。ある態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００１７】
いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物または本明細書に開示されるベクターを含む、細胞が本明細書で提供される。ある態様において、細胞は哺乳動物細胞である。
【００１８】
いくつかの態様において、Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys突然変異を含むCas9バリアントポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの態様において、本明細書では、アミノ酸303, 310, 313, 355, 456, 460, 463, 466, 472, または474においてCys残基を含むCas9バリアントポリペプチドが提供される。
【００１９】
いくつかの態様において、本明細書では、細胞に塩基エディターシステムを送達するための方法が提供され、この方法は、細胞を、(a) デアミナーゼとCas9のCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および(c) 単一ガイドRNA (sgRNA) またはそれをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
【００２０】
いくつかの態様において、本明細書では、細胞に塩基エディターシステムを送達するための方法が提供され、この方法は、細胞を、(a) Cas9のN末端断片を含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、 (b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとをコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および(c) 単一ガイドRNA (sgRNA) またはそれをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
【００２１】
いくつかの態様において、塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞を、(a) デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、(b) Cas9のC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基がAla、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および(c) 単一ガイドRNA (sgRNA) またはそれをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
【００２２】
いくつかの態様において、塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞を、(a) Cas9のN末端断片を含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドであって、ここで、Cas9のN末端断片はCas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される、第1のポリヌクレオチド、(b) Cas9のC末端断片とデアミナーゼとをコードする第2のポリヌクレオチドであって、ここでCas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基はAla、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される、第2のポリヌクレオチド、および(c) 単一ガイドRNA（sgRNA）またはそれをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
【００２３】
ある態様において、sgRNAは、標的ポリヌクレオチドに相補的である。ある態様において、標的ポリヌクレオチドは、生物のゲノム中に存在する。ある態様において、生物は、動物、植物、または細菌である。いくつかの実施形態において、第1のポリヌクレオチド、第2のポリヌクレオチド、および/またはこれらをコードするポリヌクレオチドは、ベクターを介して細胞と接触される。ある態様において、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。ある態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、Cas9のC末端断片またはCas9のN末端断片は、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基においてAla/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys突然変異を含む。ある態様において、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、TadAまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは野生型TadAまたはTad7.10である。ある態様において、デアミナーゼは、TadA二量体である。いくつかの実施形態において、TadA二量体は、野生型TadAおよびTadA7.10を含む。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片はNLSを含む。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片およびCas9のC末端断片は両方ともNLSを含む。いくつかの実施形態において、NLSは二部分NLSである。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片およびCas9のC末端断片は、連結されてSpCa9を形成する。いくつかの態様において、SpCas9は、ニッカーゼ活性を有するか、または触媒的に不活である。
【００２４】
いくつかの態様において、本明細書では融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される。いくつかの態様において、本明細書では融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のF445〜K483の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される。いくつかの態様において、本明細書では融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、Cas9のN末端断片は、Cas9のN末端で始まり、配列番号2における番号付けでCas9のE565〜T637の位置で終結する連続配列であり、Cas9のN末端断片は分割インテイン-Nに融合される。いくつかの態様において、本明細書では融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される。いくつかの態様において、本明細書では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のF445〜K483の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される。ある態様において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のE565〜T637の位置で始まりCas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片は分割インテイン-Cに融合される。ある態様において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供され、ここで、融合タンパク質は、デアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、Cas9のC末端断片は、配列番号2における番号付けでCas9のA292〜G364、F445〜K483、またはE565〜T637の位置で始まり、Cas9のC末端で終結する連続配列であり、Cas9のC末端断片のN末端残基は、Ala、Ser、またはThrを置換したCysであり、Cas9のC末端断片は分割インテインCに融合される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、Cas9のC末端断片またはCas9のN末端断片は、Ala/Cys、Ser/Cys、またはThr/Cys突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、配列番号2における番号付けでアミノ酸S303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、またはS590に対応する残基にある。ある態様において、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、TadAまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは野生型TadAまたはTad7.10である。ある態様において、融合タンパク質は、互いに連結された2つのデアミナーゼを含む。ある態様において、融合タンパク質は、野生型TadAおよびTadA7.10の両方を含む。ある態様において、融合タンパク質は、NLSを含む。ある態様において、NLSは、二部分NLSである。ある態様において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片は、SpCas9のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9のN末端断片またはCas9のC末端断片は、ヌクレアーゼ活性の減少に関連する1つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、本明細書では、アミノ酸302、309、312、354、455、459、462、465、471、または473までを含むCas9タンパク質のN末端断片が分割インテイン-Nに融合されたものが提供される。いくつかの態様において、本明細書では、Cas9タンパク質のC末端タンパク質断片が提供され、ここで、C末端断片のN末端アミノ酸は、アミノ酸303, 310, 313, 355, 456, 460, 463, 466, 472, または474におけるCys置換であり、分割インテイン-Cに融合される。いくつかの態様において、本明細書では、A→G塩基エディター融合タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドが提供され、融合タンパク質は、1つ以上のデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、該N末端断片は分割インテイン-Nに融合されている。いくつかの態様において、本明細書では、A→G塩基エディター融合タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドが提供され、融合タンパク質は、1つ以上のデアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、該C末端断片は分割インテイン-Cに融合されている。いくつかの態様において、本明細書では、A→G塩基エディター融合タンパク質のタンパク質断片が提供され、融合タンパク質は、1つ以上のデアミナーゼとCas9のN末端断片とを含み、該N末端断片は分割インテイン-Nに融合されている。いくつかの態様において、本明細書では、A→G塩基エディター融合タンパク質のタンパク質断片が提供され、融合タンパク質は、1つ以上のデアミナーゼとCas9のC末端断片とを含み、該C末端断片は分割インテイン-Cに融合されている。
【００２７】
いくつかの態様において、それぞれが1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をコードする第1および第2のポリヌクレオチドを含む組成物が本明細書で提供され、ここで、第1のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Nに融合されたCas9のN末端断片をコードし、第2のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Cに融合されたCas9のC末端断片をコードする。いくつかの態様において、1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質のN-およびC末端断片を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、N末端断片は、分割インテイン-Nに融合されたSpCas9の断片を含み、C末端断片は、分割インテイン-Cに融合されたSpCas9の残部を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、細胞に塩基エディターシステムを送達するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞を、1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、第1のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Nに融合されたCas9のN末端断片をコードし、第2のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Cに融合されたCas9のC末端断片をコードし、そして第1または第2のポリヌクレオチドのどちらかが、単一ガイドRNAをコードする。いくつかの態様において、塩基エディターシステムを細胞に送達するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞を、1つ以上のデアミナーゼとSpCas9とを含むA→G塩基エディター融合タンパク質のN-およびC末端断片、ならびにガイドRNAと接触させることを含み、ここで、該N末端断片は、分割インテイン-Nに融合されたSpCas9の断片を含み、C末端断片は、分割インテイン-Cに融合されたSpCas9の残部を含む。いくつかの態様において、細胞中の標的ポリヌクレオチドを編集するための方法が本明細書で提供され、この方法は、細胞を、1つ以上のデアミナーゼとCas9とを含むA→G Base Editor融合タンパク質の断片をそれぞれコードする第1および第2のポリヌクレオチドと接触させること（ここで、第1のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Nに融合されたCas9のN末端断片をコードし、第2のポリヌクレオチドは、分割インテイン-Cに融合されたCas9のC末端断片をコードし、第1または第2のポリヌクレオチドのいずれかが単一ガイドRNAをコードする）、および、コードされたタンパク質および単一ガイドRNAを細胞中で発現させることを含む。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３０】
［定義］
別段の定義がされない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下においてそれらに宛てがわれる意味を有する。
【００３１】
「アデノシンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシンへの加水分解脱アミノ化またはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸 (DNA) 中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、遺伝子操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化されたアデノシンデアミナーゼ）は、例えば細菌など、任意の生物由来のものであり得る。ある態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物由来の天然デアミナーゼのバリアントである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然には存在しないものである。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼに対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75% 少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、例えばE. coli、S. aureus、S. typhi、S. putrefaciens、H. influenzae、またはC. crescentusなどの、細菌に由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadAデアミナーゼである。ある態様において、TadAデアミナーゼは、E. coli TadA（ecTadA）デアミナーゼまたはその断片である。
【００３２】
例えば、切詰め型（truncated）のecTadAは、全長ecTadAと比較して1つ以上のN末端アミノ酸を欠失していてもよい。いくつかの実施形態において、切詰め型ecTadAは、全長ecTadAと比較して1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, または20のN末端アミノ酸残基を欠失していてもよい。いくつかの実施形態において、切詰め型ecTadAは、全長ecTadAと比較して1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, または20のC末端アミノ酸残基を欠失していてもよい。いくつかの実施形態において、ecTadAデアミナーゼは、N末端メチオニンを含まない。いくつかの実施形態において、TadAデアミナーゼは、N末端切詰め型のTadAである。特定の実施形態において、TadAは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2017/045381に記載されているTadAのいずれかで１つある。
【００３３】
特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPT AHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKT GAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD
これは「TadA参照配列」と呼ばれる。
【００３４】
或る実施態様では、TadAデアミナーゼは全長E. coli TadAデアミナーゼである。例えば、特定の実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む：
MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEG WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIG RVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEI KAQKKAQSSTD
【００３５】
しかしながら、本願において有用なさらなるアデノシンデアミナーゼは、当業者には明らかであり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、tRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（AD AT）のホモログであり得る。例示的なAD ATホモログには、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
【００３６】
Staphylococcus aureus TadA: 
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAH AEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCS GS LMNLLQQS NFNHRAIVDKG VLKE AC S TLLTTFFKNLRANKKS TN  
【００３７】
Bacillus subtilis TadA: 
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGC S GTLMN LLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE  
【００３８】
Salmonella typhimurium (S. typhimurium) TadA: 
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEG WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIG RVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIK ALKKADRAEGAGPAV  
【００３９】
Shewanella putrefaciens (S. putrefaciens) TadA: 
MDE YWMQVAMQM AEKAEAAGE VPVGA VLVKDGQQIATGYNLS IS QHDPT AHAEI LCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGT VVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE
【００４０】
Haemophilus influenzae F3031 (H. influenzae) TadA: 
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQS DPT ΑΗ AEIIALRNG AKNIQN YRLLNS TLY VTLEPCTMC AG AILHS RIKRLVFG AS D YK TGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSD K  
【００４１】
Caulobacter crescentus (C. crescentus) TadA: 
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAH DPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADD PKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI  
【００４２】
Geobacter sulfurreducens (G. sulfurreducens) TadA: 
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSN DPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDP KGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP  
【００４３】
TadA7.10
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
【００４４】
「薬剤（agent）」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００４５】
「改変」とは、本明細書に記載されるような標準技術の公知の方法によって検出されるような、遺伝子またはポリペプチドの構造、発現レベルまたは活性の変化を意味する。本明細書で使用される場合、改変（例えば増加または減少）は、発現レベルの10%の変化、25%の変化、40%の変化、50%以上の発現レベルの変化を含む。
【００４６】
「アナログ」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を少なくともいくらか保持しながら、天然ポリペプチドと比較してそのアナログの機能を増強させる特定の配列改変を有する。そのような改変は、例えばポリヌクレオチド結合活性を変化させることなく、アナログのプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。別の例では、ポリヌクレオチドアナログは、天然ポリヌクレオチドと比べてアナログの機能を増強させるある種の改変を有しながら、対応する天然ポリヌクレオチドの生物学的活性を保持する。そのような改変は、ポリヌクレオチドのDNAに対する親和性、半減期、および/またはヌクレアーゼ耐性を増加させ得、アナログは、非天然のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００４７】
「塩基エディター（BE）」あるいは「核酸塩基エディター（NBE）」とは、ポリヌクレオチドに結合して核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。一実施形態において、該薬剤は、塩基編集活性を有するドメイン、すなわち、核酸分子（例えばDNA）内の塩基（例えばA、T、C、G、U）を改変することができるドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA分子内の塩基を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA内のシトシン (C) またはアデノシンを脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、DNA内のシトシン (C) およびアデノシン (A) を脱アミノ化することができる。ある態様において、塩基エディターは、シチジン塩基エディター (CBE) である。一部の実施形態では、塩基エディターはアデノシン塩基エディター (ABE) である。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター (ABE) およびシチジン塩基エディター (CBE) である。ある態様において、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）である。いくつかの実施形態において、Cas9は、循環置換体（circular permutant）のCas9（例えばspCas9またはsaCas9）である。循環置換体Cas9は当該分野で公知であり、例えば、Oakes et al., Cell 176, 254-267, 2019に記載されている。いくつかの態様において、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子、例えばUGIドメインに融合される。ある態様において、融合タンパク質は、デアミナーゼと、UGIドメインのような塩基除去修復の阻害因子に融合されたCas9ニッカーゼを含む。他の実施形態では、塩基エディターは脱塩基塩基エディターである。
【００４８】
塩基エディター系の核酸塩基成分およびポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合成分は、互いに共有結合的または非共有結合的により結合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインが、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインと非共有結合的に相互作用または結合することによって、デアミナーゼドメインを標的ヌクレオチド配列にターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部をなすさらなる異種部分またはドメインと相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる、さらなる異種部分またはドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、ステリルαモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【００４９】
塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチド成分をさらに含むことができる。塩基エディターシステムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組合せを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。ある態様において、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基エディター系の核酸塩基編集成分、例えばデアミナーゼ成分は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えばポリヌクレオチドモチーフ) と相互作用し、結合し、または複合体を形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分またはドメイン(例えばRNAまたはDNA結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン)は、デアミナーゼドメインに融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリペプチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合し、相互作用し、会合し、またはポリヌクレオチドと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2コートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【００５０】
ある態様において、塩基エディターシステムは、1以上のタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、塩基エディターシステムは、デアミナーゼとnapDNAbpのN末端断片とを含む融合タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド、および、napDNAbpのC末端断片をコードする第2のポリヌクレオチドを含み得る。例えば、特定の実施形態では、napDNAbpのN末端断片とC末端断片とが再構成されて塩基エディタータンパク質を形成するように、napDNAbpのN末端断片がインテイン-Nに融合され、napDNAbpのC末端断片がインテイン-Cに融合され得る。
【００５１】
ある実施形態において、塩基エディターシステムは、塩基除去修復（BER）コンポーネントの阻害因子をさらに含むことができる。ある実施形態において、塩基エディターシステムは、塩基除去修復（BER）コンポーネントの阻害因子をさらに含むことができる。塩基エディターシステムの構成要素は、共有結合、非共有結合的相互作用、またはそれらの結合および相互作用の任意の組み合わせを介して互いに結合され得ることが理解されるべきである。BER成分の阻害因子は、塩基除去修復阻害因子を含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害因子 (UGI) であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、イノシン塩基除去修復阻害因子であり得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害因子と非共有結合的に相互作用するか、または塩基除去修復の阻害因子と会合することによって、塩基除去修復の阻害因子を標的ヌクレオチド配列へとターゲティングすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復成分の阻害因子は、ポリヌクレオチドプログラミング可能なヌクレオチド結合ドメインの一部であるさらなる異種部分またはドメインと相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメインを含み得る。ある態様において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドにより標的ヌクレオチド配列にターゲティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、塩基除去修復の阻害因子は、ガイドポリヌクレオチドの一部またはセグメント(例えば、ポリヌクレオチドモチーフ)と相互作用、会合、または複合体形成し得るさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)を含み得る。いくつかの実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのさらなる異種部分またはドメイン(例えば、RNAまたはDNA結合タンパク質のようなポリヌクレオチド結合ドメイン)は、塩基除去修復の阻害因子に融合または連結され得る。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合、相互作用、会合、または複合体形成することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーに結合することができる。追加の異種部分は、タンパク質ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、追加の異種部分は、K相同(KH) ドメイン、MS2��ートタンパク質ドメイン、PP7コートタンパク質ドメイン、SfMu Comコートタンパク質ドメイン、無菌アルファモチーフ、テロメラーゼKu結合モチーフおよびKuタンパク質、テロメラーゼSm7結合モチーフおよびSm7タンパク質、またはRNA認識モチーフであり得る。
【００５２】
「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に変化させるように作用することを意味する。一実施形態では、第1の塩基が第2の塩基に変換される。別の実施形態では、塩基がポリヌクレオチドから切り出される。一実施形態において、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的C・GをT・Aに変換する活性である。別の実施形態において、塩基編集活性は、アデノシンデアミナーゼ活性であり、例えば、A・TをG・Cに変換する活性である。
【００５３】
用語「Cas9」または「Cas9ドメイン」は、Cas9タンパク質またはその断片（例えばCas9の活性、不活性、または部分的に活性なDNA切断ドメイン、および/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質）を含むRNA誘導ヌクレアーゼを指す。Cas9ヌクレアーゼは、casn1ヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼと呼ばれることもある。CRISPRは、可動遺伝要素（ウイルス、転移因子、接合プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動要素に相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。CRISPRクラスターは転写され、CRISPR RNA（crRNA）にプロセシングされる。II型CRISPRシステムでは、pre‐crRNAの正しいプロセシングはトランスコード小RNA（tracrRNA）、内因性リボヌクレアーゼ3（rnc）、およびCas9タンパク質を必要とする。tracrRNAはリボヌクレアーゼ3によるpre-crRNAのプロセシングのガイドとなる。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAが、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼで切断する。crRNAに相補的でない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切断され、次にエキソヌクレアーゼ的に3’-5’にトリムされる。crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように、単一ガイドRNA（「sgRNA」、あるいは単に「gRNA」）を作製することができる。例えばJinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照されたい（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ（PAMあるいはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己を区別することを助ける。Cas9ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者によく知られている（例えば“Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); “CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); および “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”  Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。）。Cas9オーソログは、限定されるものではないが、S. pyogenesおよびS. thermophilusを含む種々の種において記述されてきた。さらなる適切なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのようなCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座由来のCas9配列を含む。その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
ヌクレアーゼ不活性化Cas9タンパク質は、互換的に「dCas9」タンパク質（nuclease-“dead” Cas9の意）または触媒的に不活なCas9とも称され得る。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9タンパク質（又はその断片）を生成する方法は公知である（例えばJinek et al, Science. 337:816-821(2012); Qi et al, “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression”(2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照（各内容は参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、HNHヌクレアーゼサブドメインとRuvC1サブドメインという2つのサブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断し、RuvC1サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S. pyogenes Cas9 のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al, Science. 337:816-821(2012); Qi et al, Cell. 28;152(5): 1173-83 (2013)）。ある態様において、Cas9ヌクレアーゼは、不活性な（例えば不活化された）DNA切断ドメインを有し、すなわち、Cas9は、「nCas9」タンパク質（「nickase」Cas9の意）と呼ばれるニッカーゼである。ある態様において、Cas9の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下の2つのCas9ドメインのうちの1つを含む：(1) Cas9のgRNA結合ドメイン;(2) Cas9のDNA切断ドメイン。ある態様において、Cas9またはその断片を含むタンパク質は、「Cas9バリアント」と称される。Cas9バリアントは、Cas9またはその断片と相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの実施形態において、Cas9変異体は、野生型Cas9と比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。いくつかの実施形態において、Cas9バリアントは、Cas9の断片 (例えばgRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含み、その断片は、野生型Cas9の対応する断片と少なくとも約70%同一であり、少なくとも約80%同一であり、少なくとも約90%同一であり、少なくとも約95%同一であり、少なくとも約96%同一であり、少なくとも約97%同一であり、少なくとも約98%同一であり、少なくとも約99%同一であり、少なくとも約99.5%同一であり、または少なくとも約99.9%同一である。ある態様において、断片は、対応する野生型Cas9のアミノ酸長の少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。
【００５５】
ある実施形態において、断片は、長さが少なくとも100アミノ酸である。ある実施形態において、断片は、少なくとも100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, または少なくとも 1300アミノ酸の長さである。ある態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenes由来のCas9に対応する（NCBI参照配列：NC_17053.1、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は以下の通り）。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA （配列番号１）
2022500017.tif 000003
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００５６】
ある実施形態において、野生型Cas9は、以下のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA
2022500017.tif 000004
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００５７】
いくつかの実施形態において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenesからのCas9に対応する（NCBI参照配列：NC_002737.2（以下のヌクレオチド配列）；およびUniprot参照配列：Q99ZW2（以下のアミノ酸配列）。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA
2022500017.tif 000005
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００５８】
いくつかの実施形態において、Cas9は、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense (NCBI Ref:  NC_021846.1); Streptococcus iniae(NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquisI (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1), Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1), Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1) もしくは Neisseria. meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1)由来のCas9、または任意の他の生物由来のCas9を指す。
【００５９】
いくつかの実施形態において、dCas9は、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1以上の突然変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはその一部もしくは全体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、D10AおよびH840A突然変異または別のCas9における対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、dCas9は、以下のdCas9（D10AおよびH840A）のアミノ酸配列を含む：
2022500017.tif 000006
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン）
【００６０】
いくつかの実施形態において、Cas9ドメインはD10A突然変異を含み、一方、上記で提供したアミノ酸配列における位置840における残基、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する位置における残基は、ヒスチジンのままである。
【００６１】
他の実施形態において、例えばヌクレアーゼ不活性化Cas9 (dCas9) をもたらす、D10AおよびH840A以外の突然変異を有するdCas9バリアントが提供される。このような突然変異は、例えば、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換(例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび/またはRuvC1サブドメインにおける置換)を含む。ある態様において、dCas9のバリアントまたはホモログであって、少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%の同一性を有するものが提供される。ある態様において、約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸またはそれ以上だけ短いまたは長いアミノ酸配列を有するdCas9のバリアントが提供される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるCas9融合タンパク質は、Cas9タンパク質の全長アミノ酸配列、例えば、本明細書に提供されるCas9配列の1つを含む。しかしながら、他の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、全長Cas9配列を含まず、その1つ以上の断片のみを含む。
【００６３】
好適なCas9ドメインおよびCas9断片の例示的アミノ酸配列が本明細書に提供され、Cas9ドメインおよび断片のさらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。
【００６４】
いくつかの実施態様において、Cas9は、Corynebacterium ulcerans (NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); Corynebacterium diphtheria (NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); Spiroplasma syrphidicola (NCBI Ref: NC_021284.1); Prevotella intermedia (NCBI Ref: NC_017861.1); Spiroplasma taiwanense(NCBI Ref:  NC_021846.1); Streptococcus iniae (NCBI Ref: NC_021314.1); Belliella baltica (NCBI Ref: NC_018010.1); Psychroflexus torquisI (NCBI Ref: NC_018721.1); Streptococcus thermophilus (NCBI Ref: YP_820832.1); Listeria innocua (NCBI Ref: NP_472073.1); Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1); またはNeisseria. meningitidis (NCBI Ref: YP_002342100.1)由来のCas9を指す。
【００６５】
追加的なCas9タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ不活（dead）Cas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性Cas9）は、そのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内にあることが理解されるべきである。例示的なCas9タンパク質は、限定されるものではないが、下記に提供されるものを含む。ある態様において、Cas9タンパク質は、ヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）である。ある態様において、Cas9タンパク質は、Cas9ニッカーゼ（nCas9）である。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質はヌクレアーゼ活性Cas9である。
【００６６】
例示的な触媒不活性Cas9（dCas9）：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD  
【００６７】
例示的な触媒的Cas9ニッカーゼ（nCas9）：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD  
【００６８】
例示的な触媒的活性Cas9：
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
【００６９】
ある態様において、Cas9は、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌(例えばナノアーキア)由来のCas9を指す。ある態様において、Casタンパク質は、例えば、Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21に記載されているCasXまたはCasYを指し、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを用いて、生命の古細菌ドメインにおいて最初に報告されたCas9を含め、多くのCRISPR‐Cas系が同定された。この分岐Cas9タンパク質は、ほとんど研究されていないナノアーキアにおいて、活性CRISPR‐Cas系の一部として発見された。細菌では、それまで知られていなかった二つの系、CRISPR-CasXとCRISPR-CasYが発見され、それらは、これまでに発見された中でも最もコンパクトな系に入る。いくつかの実施形態において、Cas9は、CasXまたはCasXのバリアントを表す。いくつかの実施形態において、Cas9は、CasYまたはCasYのバリアントを表す。核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質（napDNAbp：nucleic acid programmable DNA binding protein）として他のRNA誘導DNA結合タンパク質も使用され得、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、napDNAbpは、Cas9ドメインであり、例えばヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ不活性Cas9（dCas9）である。核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質の非限定的な例としては、Cas9（例えばdCas9およびnCas9）、タイプII Casエフェクタータンパク質、タイプV Casエフェクタータンパク質、タイプVI Casエフェクタータンパク質、CARF、DinG、それらのホモログ、またはそれらの改変もしくは遺伝子操作バージョンが挙げられる。他の核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質もまた、本開示に具体的に列記されていないとしても、本開示の範囲内である。例えばMakarova et al. “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?” CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al., “Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems” Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271参照（それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかの核酸プログラム可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、CasXまたはCasYタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasXタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、天然に存在するCasXまたはCasYタンパク質である。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、本明細書に記載されるいずれかのCasXまたはCasYタンパク質に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のCasXおよびCasYもまた、本開示に従って使用され得ることを理解されたい。
【００７２】
CasX (uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) 
>tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR-associated Casx protein OS = Sulfolobus islandicus (strain HVE10/4) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTG SKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG
【００７３】
>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR associated protein, Casx OS = Sulfolobus islandicus (strain REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG
【００７４】
CasY (ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)
>APG80656.1 CRISPR-associated protein CasY [uncultured Parcubacteria group bacterium] 
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKN IKVLGQMKKI
【００７５】
用語「CRISPR-Casドメイン」または「CRISPR-Cas DNA結合ドメイン」は、CRISPR関連（Cas）タンパク質またはその断片を含むRNA誘導型タンパク質（例えば、Casタンパク質の活性、不活性、または部分的に活性なDNA切断ドメイン、および/またはCasタンパク質のgRNA結合ドメインを含むタンパク質）を指す。CRISPRクラスターは転写されてCRISPR RNA（crRNA）にプロセスされる。CRISPRクラスターは転写されてCRISPR RNA（crRNA）にプロセスされる。いくつかのCRISPRシステムでは、pre-crRNAの正しいプロセシングにトランスコード化小RNA（tracrRNA）、内因性リボヌクレアーゼ3（rnc）およびCasタンパク質が必要とされる。このtracrRNAは、リボヌクレアーゼ3に補助されるpre-crRNAのプロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNAおよび/またはtracrRNAが、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。自然界では、DNA結合と切断のために両方のRNAを必要とし得る。しかし、crRNAおよびtracrRNAの両方の側面を単一のRNA種に組み込むように単一ガイドRNA（「sgRNA」あるいは単に「gNRA」）を遺伝子操作することができる。例えばJinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Casタンパク質はCRISPR反復配列中の短いモチーフ（PAMあるいはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識し、自己と非自己を区別することを助ける。CRISPR-Casタンパク質としては、Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、およびC2c3またはそれらの活性断片が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切なCRISPR-Casタンパク質および配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。
【００７６】
ヌクレアーゼ不活性化されたCRISPR-Casタンパク質は、互換的に「dCas」タンパク質（ヌクレアーゼ「dead」Casの意）または触媒的に不活性なCasと呼ばれ得る。不活性なDNA切断ドメインを有するCasタンパク質（またはその断片）を生成する方法は既知である（例えばJinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28;152(5):1173-83参照。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインという2つのサブドメインを含むことが知られている。HNHサブドメインはgRNAに相補的な鎖を切断する一方、RuvC1サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性を抑制する。例えば、突然変異D10AおよびH840Aは、S. pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)）。ある実施形態において、Casヌクレアーゼは不活性な（例えば不活性化された）DNA切断ドメインを有し、すなわちCasは「nCas」タンパク質と呼ばれるニッカーゼである（「nickase」Casの意）。Casバリアントは、CRISPR-Casタンパク質またはその断片と相同性を共有する。例えば、Casバリアントは、野生型CRISPR-Casタンパク質に対して少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約96%の同一性、少なくとも約97%の同一性、少なくとも約98%の同一性、少なくとも約99%の同一性、少なくとも約99.5%の同一性、または少なくとも約99.9%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、Casバリアントは、野生型CRISPR-Casタンパク質と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個またはそれ以上のアミノ酸変化を有し得る。いくつかの実施形態において、Casバリアントは、その断片が野生型CRISPR-Casタンパク質の対応する断片に対して少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約96%の同一性、少なくとも約97%の同一性、少なくとも約98%の同一性、少なくとも約99%の同一性、少なくとも約99.5%の同一性、または少なくとも約99.9%の同一性を有するようにCRISPR-Casタンパク質の断片（例えばgRNAプログラミング可能DNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン）を含む。ある態様において、該断片は、対応する野生型CRISPR-Casタンパク質のアミノ酸長の少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95% identical、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。ある態様において、断片は、長さが少なくとも100アミノ酸である。ある態様において、断片は、長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、または少なくとも1300アミノ酸である。
【００７７】
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、および「有する（having）」等は米国特許法に規定される意味を有することができ、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得、「〜から本質的に成る（consisting essentially of）」または「本質的に成る（consists essentially）」も同様に、米国特許法に規定される意味を有し、該用語はオープンエンドであって、記載されたものの基本的または新規な特性が、その記載されたものより他の存在によって変えられない限り、記載されたものより他の存在を許容するが、ただし先行技術の実施態様を除外する。
【００７８】
「シチジンデアミナーゼ」とは、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。1つの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシルに、または5-メチルシトシンをチミンに変換する。Petromyzon marinus由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1、「PmCDA1」）、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のAID（活性化誘導シチジンデアミナーゼ; AICDA）、およびAPOBECは、例示的シチジンデアミナーゼである。
【００７９】
PmCDA1の塩基配列およびアミノ酸配列、ならびにヒトAIDのCDSの塩基配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
【００８０】
>tr|A5H718|A5H718_PETMA Cytosine deaminase OS=Petromyzon marinus OX=7757 PE=2 SV=1
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSG
TERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLK
IWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKT
LKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV
【００８１】
>EF094822.1 Petromyzon marinus isolate PmCDA.21 cytosine deaminase mRNA, complete cds
TGACACGACACAGCCGTGTATATGAGGAAGGGTAGCTGGATGGGGGGGGGGGGAATACGTTCAGAGAGGA
CATTAGCGAGCGTCTTGTTGGTGGCCTTGAGTCTAGACACCTGCAGACATGACCGACGCTGAGTACGTGA
GAATCCATGAGAAGTTGGACATCTACACGTTTAAGAAACAGTTTTTCAACAACAAAAAATCCGTGTCGCA
TAGATGCTACGTTCTCTTTGAATTAAAACGACGGGGTGAACGTAGAGCGTGTTTTTGGGGCTATGCTGTG
AATAAACCACAGAGCGGGACAGAACGTGGAATTCACGCCGAAATCTTTAGCATTAGAAAAGTCGAAGAAT
ACCTGCGCGACAACCCCGGACAATTCACGATAAATTGGTACTCATCCTGGAGTCCTTGTGCAGATTGCGC
TGAAAAGATCTTAGAATGGTATAACCAGGAGCTGCGGGGGAACGGCCACACTTTGAAAATCTGGGCTTGC
AAACTCTATTACGAGAAAAATGCGAGGAATCAAATTGGGCTGTGGAACCTCAGAGATAACGGGGTTGGGT
TGAATGTAATGGTAAGTGAACACTACCAATGTTGCAGGAAAATATTCATCCAATCGTCGCACAATCAATT
GAATGAGAATAGATGGCTTGAGAAGACTTTGAAGCGAGCTGAAAAACGACGGAGCGAGTTGTCCATTATG
ATTCAGGTAAAAATACTCCACACCACTAAGAGTCCTGCTGTTTAAGAGGCTATGCGGATGGTTTTC
【００８２】
>tr|Q6QJ80|Q6QJ80_HUMAN Activation-induced cytidine deaminase OS=Homo sapiens OX=9606 GN=AICDA PE=2 SV=1
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
【００８３】
>NG_011588.1:5001-15681 Homo sapiens activation induced cytidine deaminase (AICDA), RefSeqGene (LRG_17) on chromosome 12
AGAGAACCATCATTAATTGAAGTGAGATTTTTCTGGCCTGAGACTTGCAGGGAGGCAAGAAGACACTCTG
GACACCACTATGGACAGGTAAAGAGGCAGTCTTCTCGTGGGTGATTGCACTGGCCTTCCTCTCAGAGCAA
ATCTGAGTAATGAGACTGGTAGCTATCCCTTTCTCTCATGTAACTGTCTGACTGATAAGATCAGCTTGAT
CAATATGCATATATATTTTTTGATCTGTCTCCTTTTCTTCTATTCAGATCTTATACGCTGTCAGCCCAAT
TCTTTCTGTTTCAGACTTCTCTTGATTTCCCTCTTTTTCATGTGGCAAAAGAAGTAGTGCGTACAATGTA
CTGATTCGTCCTGAGATTTGTACCATGGTTGAAACTAATTTATGGTAATAATATTAACATAGCAAATCTT
TAGAGACTCAAATCATGAAAAGGTAATAGCAGTACTGTACTAAAAACGGTAGTGCTAATTTTCGTAATAA
TTTTGTAAATATTCAACAGTAAAACAACTTGAAGACACACTTTCCTAGGGAGGCGTTACTGAAATAATTT
AGCTATAGTAAGAAAATTTGTAATTTTAGAAATGCCAAGCATTCTAAATTAATTGCTTGAAAGTCACTAT
GATTGTGTCCATTATAAGGAGACAAATTCATTCAAGCAAGTTATTTAATGTTAAAGGCCCAATTGTTAGG
CAGTTAATGGCACTTTTACTATTAACTAATCTTTCCATTTGTTCAGACGTAGCTTAACTTACCTCTTAGG
TGTGAATTTGGTTAAGGTCCTCATAATGTCTTTATGTGCAGTTTTTGATAGGTTATTGTCATAGAACTTA
TTCTATTCCTACATTTATGATTACTATGGATGTATGAGAATAACACCTAATCCTTATACTTTACCTCAAT
TTAACTCCTTTATAAAGAACTTACATTACAGAATAAAGATTTTTTAAAAATATATTTTTTTGTAGAGACA
GGGTCTTAGCCCAGCCGAGGCTGGTCTCTAAGTCCTGGCCCAAGCGATCCTCCTGCCTGGGCCTCCTAAA
GTGCTGGAATTATAGACATGAGCCATCACATCCAATATACAGAATAAAGATTTTTAATGGAGGATTTAAT
GTTCTTCAGAAAATTTTCTTGAGGTCAGACAATGTCAAATGTCTCCTCAGTTTACACTGAGATTTTGAAA
ACAAGTCTGAGCTATAGGTCCTTGTGAAGGGTCCATTGGAAATACTTGTTCAAAGTAAAATGGAAAGCAA
AGGTAAAATCAGCAGTTGAAATTCAGAGAAAGACAGAAAAGGAGAAAAGATGAAATTCAACAGGACAGAA
GGGAAATATATTATCATTAAGGAGGACAGTATCTGTAGAGCTCATTAGTGATGGCAAAATGACTTGGTCA
GGATTATTTTTAACCCGCTTGTTTCTGGTTTGCACGGCTGGGGATGCAGCTAGGGTTCTGCCTCAGGGAG
CACAGCTGTCCAGAGCAGCTGTCAGCCTGCAAGCCTGAAACACTCCCTCGGTAAAGTCCTTCCTACTCAG
GACAGAAATGACGAGAACAGGGAGCTGGAAACAGGCCCCTAACCAGAGAAGGGAAGTAATGGATCAACAA
AGTTAACTAGCAGGTCAGGATCACGCAATTCATTTCACTCTGACTGGTAACATGTGACAGAAACAGTGTA
GGCTTATTGTATTTTCATGTAGAGTAGGACCCAAAAATCCACCCAAAGTCCTTTATCTATGCCACATCCT
TCTTATCTATACTTCCAGGACACTTTTTCTTCCTTATGATAAGGCTCTCTCTCTCTCCACACACACACAC
ACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACACACCCCGCCAACCAAGGTGCATGTAAAAAGA
TGTAGATTCCTCTGCCTTTCTCATCTACACAGCCCAGGAGGGTAAGTTAATATAAGAGGGATTTATTGGT
AAGAGATGATGCTTAATCTGTTTAACACTGGGCCTCAAAGAGAGAATTTCTTTTCTTCTGTACTTATTAA
GCACCTATTATGTGTTGAGCTTATATATACAAAGGGTTATTATATGCTAATATAGTAATAGTAATGGTGG
TTGGTACTATGGTAATTACCATAAAAATTATTATCCTTTTAAAATAAAGCTAATTATTATTGGATCTTTT
TTAGTATTCATTTTATGTTTTTTATGTTTTTGATTTTTTAAAAGACAATCTCACCCTGTTACCCAGGCTG
GAGTGCAGTGGTGCAATCATAGCTTTCTGCAGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTTGG
CCTCCCAAAGTGTTGGGATACAGTCATGAGCCACTGCATCTGGCCTAGGATCCATTTAGATTAAAATATG
CATTTTAAATTTTAAAATAATATGGCTAATTTTTACCTTATGTAATGTGTATACTGGCAATAAATCTAGT
TTGCTGCCTAAAGTTTAAAGTGCTTTCCAGTAAGCTTCATGTACGTGAGGGGAGACATTTAAAGTGAAAC
AGACAGCCAGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCGCTT
GAGCCCTGGAGTTCAAGACCAGCCTGAGCAACATGGCAAAACGCTGTTTCTATAACAAAAATTAGCCGGG
CATGGTGGCATGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTAGGGGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTGGAGCCCAGGAGG
TCAAGGCTGCACTGAGCAGTGCTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGGACCAGACCTTGCCTCA
AAAAAATAAGAAGAAAAATTAAAAATAAATGGAAACAACTACAAAGAGCTGTTGTCCTAGATGAGCTACT
TAGTTAGGCTGATATTTTGGTATTTAACTTTTAAAGTCAGGGTCTGTCACCTGCACTACATTATTAAAAT
ATCAATTCTCAATGTATATCCACACAAAGACTGGTACGTGAATGTTCATAGTACCTTTATTCACAAAACC
CCAAAGTAGAGACTATCCAAATATCCATCAACAAGTGAACAAATAAACAAAATGTGCTATATCCATGCAA
TGGAATACCACCCTGCAGTACAAAGAAGCTACTTGGGGATGAATCCCAAAGTCATGACGCTAAATGAAAG
AGTCAGACATGAAGGAGGAGATAATGTATGCCATACGAAATTCTAGAAAATGAAAGTAACTTATAGTTAC
AGAAAGCAAATCAGGGCAGGCATAGAGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAGAGGCCACGTGGGAA
GATTGCTAGAACTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAAACTCCATTCTCCACAAAAATGG
GAAAAAAAGAAAGCAAATCAGTGGTTGTCCTGTGGGGAGGGGAAGGACTGCAAAGAGGGAAGAAGCTCTG
GTGGGGTGAGGGTGGTGATTCAGGTTCTGTATCCTGACTGTGGTAGCAGTTTGGGGTGTTTACATCCAAA
AATATTCGTAGAATTATGCATCTTAAATGGGTGGAGTTTACTGTATGTAAATTATACCTCAATGTAAGAA
AAAATAATGTGTAAGAAAACTTTCAATTCTCTTGCCAGCAAACGTTATTCAAATTCCTGAGCCCTTTACT
TCGCAAATTCTCTGCACTTCTGCCCCGTACCATTAGGTGACAGCACTAGCTCCACAAATTGGATAAATGC
ATTTCTGGAAAAGACTAGGGACAAAATCCAGGCATCACTTGTGCTTTCATATCAACCATGCTGTACAGCT
TGTGTTGCTGTCTGCAGCTGCAATGGGGACTCTTGATTTCTTTAAGGAAACTTGGGTTACCAGAGTATTT
CCACAAATGCTATTCAAATTAGTGCTTATGATATGCAAGACACTGTGCTAGGAGCCAGAAAACAAAGAGG
AGGAGAAATCAGTCATTATGTGGGAACAACATAGCAAGATATTTAGATCATTTTGACTAGTTAAAAAAGC
AGCAGAGTACAAAATCACACATGCAATCAGTATAATCCAAATCATGTAAATATGTGCCTGTAGAAAGACT
AGAGGAATAAACACAAGAATCTTAACAGTCATTGTCATTAGACACTAAGTCTAATTATTATTATTAGACA
CTATGATATTTGAGATTTAAAAAATCTTTAATATTTTAAAATTTAGAGCTCTTCTATTTTTCCATAGTAT
TCAAGTTTGACAATGATCAAGTATTACTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTT
TGGTCTTGTTGCCCATGCTGGAGTGGAATGGCATGACCATAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTC
AAGCAAAGCTGTCGCCTCAGCCTCCCGGGTAGATGGGATTACAGGCGCCCACCACCACACTCGGCTAATG
TTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGAGG
ATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGATGTAGGCCACTGCGCCCGGCCAAGTATTGC
TCTTATACATTAAAAAACAGGTGTGAGCCACTGCGCCCAGCCAGGTATTGCTCTTATACATTAAAAAATA
GGCCGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCAAGGCGGGCAGAACACCCGAGGT
CAGGAGTCCAAGGCCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACCCCGTCTCTATTAAAAATACAAACATTACCTGG
GCATGATGGTGGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCCGCGGAGCCTGGCA
GATCTGCCTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTACAGTAAGCCAAGATCATGCCAGTATACTTCAGCCTGGGCG
ACAAAGTGAGACCGTAACAAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAGAAATTTAGATCAAGATCCAACTGTAAAA
AGTGGCCTAAACACCACATTAAAGAGTTTGGAGTTTATTCTGCAGGCAGAAGAGAACCATCAGGGGGTCT
TCAGCATGGGAATGGCATGGTGCACCTGGTTTTTGTGAGATCATGGTGGTGACAGTGTGGGGAATGTTAT
TTTGGAGGGACTGGAGGCAGACAGACCGGTTAAAAGGCCAGCACAACAGATAAGGAGGAAGAAGATGAGG
GCTTGGACCGAAGCAGAGAAGAGCAAACAGGGAAGGTACAAATTCAAGAAATATTGGGGGGTTTGAATCA
ACACATTTAGATGATTAATTAAATATGAGGACTGAGGAATAAGAAATGAGTCAAGGATGGTTCCAGGCTG
CTAGGCTGCTTACCTGAGGTGGCAAAGTCGGGAGGAGTGGCAGTTTAGGACAGGGGGCAGTTGAGGAATA
TTGTTTTGATCATTTTGAGTTTGAGGTACAAGTTGGACACTTAGGTAAAGACTGGAGGGGAAATCTGAAT
ATACAATTATGGGACTGAGGAACAAGTTTATTTTATTTTTTGTTTCGTTTTCTTGTTGAAGAACAAATTT
AATTGTAATCCCAAGTCATCAGCATCTAGAAGACAGTGGCAGGAGGTGACTGTCTTGTGGGTAAGGGTTT
GGGGTCCTTGATGAGTATCTCTCAATTGGCCTTAAATATAAGCAGGAAAAGGAGTTTATGATGGATTCCA
GGCTCAGCAGGGCTCAGGAGGGCTCAGGCAGCCAGCAGAGGAAGTCAGAGCATCTTCTTTGGTTTAGCCC
AAGTAATGACTTCCTTAAAAAGCTGAAGGAAAATCCAGAGTGACCAGATTATAAACTGTACTCTTGCATT
TTCTCTCCCTCCTCTCACCCACAGCCTCTTGATGAACCGGAGGAAGTTTCTTTACCAATTCAAAAATGTC
CGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGACCTACCTGTGCTACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCT
TTTCACTGGACTTTGGTTATCTTCGCAATAAGGTATCAATTAAAGTCGGCTTTGCAAGCAGTTTAATGGT
CAACTGTGAGTGCTTTTAGAGCCACCTGCTGATGGTATTACTTCCATCCTTTTTTGGCATTTGTGTCTCT
ATCACATTCCTCAAATCCTTTTTTTTATTTCTTTTTCCATGTCCATGCACCCATATTAGACATGGCCCAA
AATATGTGATTTAATTCCTCCCCAGTAATGCTGGGCACCCTAATACCACTCCTTCCTTCAGTGCCAAGAA
CAACTGCTCCCAAACTGTTTACCAGCTTTCCTCAGCATCTGAATTGCCTTTGAGATTAATTAAGCTAAAA
GCATTTTTATATGGGAGAATATTATCAGCTTGTCCAAGCAAAAATTTTAAATGTGAAAAACAAATTGTGT
CTTAAGCATTTTTGAAAATTAAGGAAGAAGAATTTGGGAAAAAATTAACGGTGGCTCAATTCTGTCTTCC
AAATGATTTCTTTTCCCTCCTACTCACATGGGTCGTAGGCCAGTGAATACATTCAACATGGTGATCCCCA
GAAAACTCAGAGAAGCCTCGGCTGATGATTAATTAAATTGATCTTTCGGCTACCCGAGAGAATTACATTT
CCAAGAGACTTCTTCACCAAAATCCAGATGGGTTTACATAAACTTCTGCCCACGGGTATCTCCTCTCTCC
TAACACGCTGTGACGTCTGGGCTTGGTGGAATCTCAGGGAAGCATCCGTGGGGTGGAAGGTCATCGTCTG
GCTCGTTGTTTGATGGTTATATTACCATGCAATTTTCTTTGCCTACATTTGTATTGAATACATCCCAATC
TCCTTCCTATTCGGTGACATGACACATTCTATTTCAGAAGGCTTTGATTTTATCAAGCACTTTCATTTAC
TTCTCATGGCAGTGCCTATTACTTCTCTTACAATACCCATCTGTCTGCTTTACCAAAATCTATTTCCCCT
TTTCAGATCCTCCCAAATGGTCCTCATAAACTGTCCTGCCTCCACCTAGTGGTCCAGGTATATTTCCACA
ATGTTACATCAACAGGCACTTCTAGCCATTTTCCTTCTCAAAAGGTGCAAAAAGCAACTTCATAAACACA
AATTAAATCTTCGGTGAGGTAGTGTGATGCTGCTTCCTCCCAACTCAGCGCACTTCGTCTTCCTCATTCC
ACAAAAACCCATAGCCTTCCTTCACTCTGCAGGACTAGTGCTGCCAAGGGTTCAGCTCTACCTACTGGTG
TGCTCTTTTGAGCAAGTTGCTTAGCCTCTCTGTAACACAAGGACAATAGCTGCAAGCATCCCCAAAGATC
ATTGCAGGAGACAATGACTAAGGCTACCAGAGCCGCAATAAAAGTCAGTGAATTTTAGCGTGGTCCTCTC
TGTCTCTCCAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCGCTACATCTCGGACTGGGACCTAGACCC
TGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCC
GACTTTCTGCGAGGGAACCCCAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTGAGGACC
GCAAGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGTGCAAATAGCCATCATGACCTTCAA
AGGTGCGAAAGGGCCTTCCGCGCAGGCGCAGTGCAGCAGCCCGCATTCGGGATTGCGATGCGGAATGAAT
GAGTTAGTGGGGAAGCTCGAGGGGAAGAAGTGGGCGGGGATTCTGGTTCACCTCTGGAGCCGAAATTAAA
GATTAGAAGCAGAGAAAAGAGTGAATGGCTCAGAGACAAGGCCCCGAGGAAATGAGAAAATGGGGCCAGG
GTTGCTTCTTTCCCCTCGATTTGGAACCTGAACTGTCTTCTACCCCCATATCCCCGCCTTTTTTTCCTTT
TTTTTTTTTTGAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGTAGAAAACCACGAAAGAACTTTCAAAGCC
TGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCAGTTCGTCTCTCCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGGTAAGGGGCT
TCCTCGCTTTTTAAATTTTCTTTCTTTCTCTACAGTCTTTTTTGGAGTTTCGTATATTTCTTATATTTTC
TTATTGTTCAATCACTCTCAGTTTTCATCTGATGAAAACTTTATTTCTCCTCCACATCAGCTTTTTCTTC
TGCTGTTTCACCATTCAGAGCCCTCTGCTAAGGTTCCTTTTCCCTCCCTTTTCTTTCTTTTGTTGTTTCA
CATCTTTAAATTTCTGTCTCTCCCCAGGGTTGCGTTTCCTTCCTGGTCAGAATTCTTTTCTCCTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAACAAACAAAAAACCCAAAAAAACTCTTTCCCAATTTACTTTCTT
CCAACATGTTACAAAGCCATCCACTCAGTTTAGAAGACTCTCCGGCCCCACCGACCCCCAACCTCGTTTT
GAAGCCATTCACTCAATTTGCTTCTCTCTTTCTCTACAGCCCCTGTATGAGGTTGATGACTTACGAGACG
CATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGCAACTTCCAGGAATGTCACACACGATGAAATATCTCTGCTGAAG
ACAGTGGATAAAAAACAGTCCTTCAAGTCTTCTCTGTTTTTATTCTTCAACTCTCACTTTCTTAGAGTTT
ACAGAAAAAATATTTATATACGACTCTTTAAAAAGATCTATGTCTTGAAAATAGAGAAGGAACACAGGTC
TGGCCAGGGACGTGCTGCAATTGGTGCAGTTTTGAATGCAACATTGTCCCCTACTGGGAATAACAGAACT
GCAGGACCTGGGAGCATCCTAAAGTGTCAACGTTTTTCTATGACTTTTAGGTAGGATGAGAGCAGAAGGT
AGATCCTAAAAAGCATGGTGAGAGGATCAAATGTTTTTATATCAACATCCTTTATTATTTGATTCATTTG
AGTTAACAGTGGTGTTAGTGATAGATTTTTCTATTCTTTTCCCTTGACGTTTACTTTCAAGTAACACAAA
CTCTTCCATCAGGCCATGATCTATAGGACCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGATTGTGACCCCAAACCAT
CTCTCCAAAGCATTAATATCCAATCATGCGCTGTATGTTTTAATCAGCAGAAGCATGTTTTTATGTTTGT
ACAAAAGAAGATTGTTATGGGTGGGGATGGAGGTATAGACCATGCATGGTCACCTTCAAGCTACTTTAAT
AAAGGATCTTAAAATGGGCAGGAGGACTGTGAACAAGACACCCTAATAATGGGTTGATGTCTGAAGTAGC
AAATCTTCTGGAAACGCAAACTCTTTTAAGGAAGTCCCTAATTTAGAAACACCCACAAACTTCACATATC
ATAATTAGCAAACAATTGGAAGGAAGTTGCTTGAATGTTGGGGAGAGGAAAATCTATTGGCTCTCGTGGG
TCTCTTCATCTCAGAAATGCCAATCAGGTCAAGGTTTGCTACATTTTGTATGTGTGTGATGCTTCTCCCA
AAGGTATATTAACTATATAAGAGAGTTGTGACAAAACAGAATGATAAAGCTGCGAACCGTGGCACACGCT
CATAGTTCTAGCTGCTTGGGAGGTTGAGGAGGGAGGATGGCTTGAACACAGGTGTTCAAGGCCAGCCTGG
GCAACATAACAAGATCCTGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAGAGAGGGCCGGGCGTGGTG
GCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGCCGGGCGGATCACCTGTGGTCAGGAGTTTGAGA
CCAGCCTGGCCAACATGGCAAAACCCCGTCTGTACTCAAAATGCAAAAATTAGCCAGGCGTGGTAGCAGG
CACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCA
GTAAGCTGAGATCGTGCCGTTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCTGTCTCAGAAAAAAAAA
AAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAACAATATTTGGGAGAGAAGGATGGGGAAGCATTGCAAGGAAAT
TGTGCTTTATCCAACAAAATGTAAGGAGCCAATAAGGGATCCCTATTTGTCTCTTTTGGTGTCTATTTGT
CCCTAACAACTGTCTTTGACAGTGAGAAAAATATTCAGAATAACCATATCCCTGTGCCGTTATTACCTAG
CAACCCTTGCAATGAAGATGAGCAGATCCACAGGAAAACTTGAATGCACAACTGTCTTATTTTAATCTTA
TTGTACATAAGTTTGTAAAAGAGTTAAAAATTGTTACTTCATGTATTCATTTATATTTTATATTATTTTG
CGTCTAATGATTTTTTATTAACATGATTTCCTTTTCTGATATATTGAAATGGAGTCTCAAAGCTTCATAA
ATTTATAACTTTAGAAATGATTCTAATAACAACGTATGTAATTGTAACATTGCAGTAATGGTGCTACGAA
GCCATTTCTCTTGATTTTTAGTAAACTTTTATGACAGCAAATTTGCTTCTGGCTCACTTTCAATCAGTTA
AATAAATGATAAATAATTTTGGAAGCTGTGAAGATAAAATACCAAATAAAATAATATAAAAGTGATTTAT
ATGAAGTTAAAATAAAAAATCAGTATGATGGAATAAACTTG
【００８４】
アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒ポリペプチド様（APOBEC：Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like）は、進化的に保存されたシチジンデアミナーゼファミリーである。このファミリーのメンバーはCからUへの編集酵素である。APOBEC様タンパク質のN末端ドメインは触媒ドメインであり、C末端ドメインは偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジン脱アミノ化のために重要である。APOBECファミリーメンバーには、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D（今では「APOBEC3E」がこれを指す）、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、および活性化誘導型（シチジン）デアミナーゼが含まれる。限定するものではないが、SaBE3、SaKKH-BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、VRER-BE3、VRER-BE3、YE1-BE3、EE-BE3、YE2-BE3、およびYEE-BE3を含む多数の改変シチジンデアミナーゼが市販されており、これらはAddgene社から入手可能である（プラスミド85169、85170、85171、85172、85173、85174、85175、85176、85177）。
【００８５】
本開示の態様に従ってCas9に融合され得る他の例示的デアミナーゼが、以下に提供される。いくつかの実施形態において、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナル（核局在化配列、核外搬出シグナル、細胞質局在化シグナル）を伴わないドメインが使用され得ることが理解されるべきである。
【００８６】
Human AID:
2022500017.tif 000007
（下線：核局在化配列；二重下線：核外搬出シグナル）
【００８７】
Mouse AID:
2022500017.tif 000008
（下線：核局在化配列；二重下線：核外搬出シグナル）
【００８８】
Canine AID:
2022500017.tif 000009
（下線：核局在化配列；二重下線：核外搬出シグナル）
【００８９】
Bovine AID:
2022500017.tif 000010
（下線：核局在化配列；二重下線：核外搬出シグナル）
【００９０】
Rat AID
2022500017.tif 000011
（下線：核局在化配列；二重下線：核外搬出シグナル）
【００９１】
Mouse APOBEC-3
2022500017.tif 000012
（斜体：核酸編集ドメイン）
【００９２】
Rat APOBEC-3 :
2022500017.tif 000013
（斜体：核酸編集ドメイン）
【００９３】
Rhesus macaque APOBEC-3 G:
2022500017.tif 000014
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【００９４】
Chimpanzee APOBEC-3 G:
2022500017.tif 000015
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【００９５】
Green monkey APOBEC-3G:
2022500017.tif 000016
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【００９６】
Human APOBEC-3G:
2022500017.tif 000017
（斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在化シグナル）
【００９７】
Human APOBEC-3F:
2022500017.tif 000018
（斜体：核酸編集ドメイン）
【００９８】
Human APOBEC-3B:
2022500017.tif 000019
（斜体：核酸編集ドメイン）
【００９９】
Rat APOBEC-3B:
MQPQGLGPNAGMGPVCLGCSHRRPYSPIRNPLKKLYQQTFYFHFKNVRYAWGRKNNFLCYEVNGMDCALPVPLRQGVFRKQGHIHAELCFIYWFHDKVLRVLSPMEEFKVTWYMSWSPCSKCAEQVARFLAAHRNLSLAIFSSRLYYYLRNPNYQQKLCRLIQEGVHVAAMDLPEFKKCWNKFVDNDGQPFRPWMRLRINFSFYDCKLQEIFSRMNLLREDVFYLQFNNSHRVKPVQNRYYRRKSYLCYQLERANGQEPLKGYLLYKKGEQHVEILFLEKMRSMELSQVRITCYLTWSPCPNCARQLAAFKKDHPDLILRIYTSRLYFWRKKFQKGLCTLWRSGIHVDVMDLPQFADCWTNFVNPQRPFRPWNELEKNSWRIQRRLRRIKESWGL
【０１００】
Bovine APOBEC-3B: 
DGWEVAFRSGTVLKAGVLGVSMTEGWAGSGHPGQGACVWTPGTRNTMNLLREVLFKQQFGNQPRVPAPYYRRKTYLCYQLKQRNDLTLDRGCFRNKKQRHAERFIDKINSLDLNPSQSYKIICYITWSPCPNCANELVNFITRNNHLKLEIFASRLYFHWIKSFKMGLQDLQNAGISVAVMTHTEFEDCWEQFVDNQSRPFQPWDKLEQYSASIRRRLQRILTAPI
【０１０１】
Chimpanzee APOBEC-3B: 
MNPQIRNPMEWMYQRTFYYNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIRRGHSNLLWDTGVFRGQMYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLSAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAKFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYNEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEIIRHLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRHQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGQVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQVRASSLCMVPHRPPPPPQSPGPCLPLCSEPPLGSLLPTGRPAPSLPFLLTASFSFPPPASLPPLPSLSLSPGHLPVPSFHSLTSCSIQPPCSSRIRETEGWASVSKEGRDLG
【０１０２】
Human APOBEC-3C:
2022500017.tif 000020
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０３】
Gorilla APOBEC3C
2022500017.tif 000021
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０４】
Human APOBEC-3A:
2022500017.tif 000022
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０５】
Rhesus macaque APOBEC-3A:
2022500017.tif 000023
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０６】
Bovine APOBEC-3A:
2022500017.tif 000024
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０７】
Human APOBEC-3H:
2022500017.tif 000025
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１０８】
Rhesus macaque APOBEC-3H: 
MALLTAKTFSLQFNNKRRVNKPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGHLKNKKKDHAEIRFINKIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCPSCAGELVDFIKAHRHLNLRIFASRLYYHWRPNYQEGLLLLCGSQVPVEVMGLPEFTDCWENFVDHKEPPSFNPSEKLEELDKNSQAIKRRLERIKSRSVDVLENGLRSLQLGPVTPSSSIRNSR
【０１０９】
Human APOBEC-3D:
2022500017.tif 000026
（斜体：核酸編集ドメイン）
【０１１０】
Human APOBEC-1 : 
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR
【０１１１】
Mouse APOBEC-1 : 
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK
【０１１２】
Rat APOBEC-1 : 
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK
【０１１３】
Human APOBEC-2: 
MAQKEEAAVATEAASQNGEDLENLDDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPANFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQGKGGQVQASRGYLEDEHAAAHAEEAFFNTILPAFDPALRYNVTWYVSSSPCAACADRIIKTLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYVWQNFVEQEEGESKAFQPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０１１４】
Mouse APOBEC-2: 
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEVQSKGGQAQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０１１５】
Rat APOBEC-2: 
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYLWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０１１６】
Bovine APOBEC-2: 
MAQKEEAAAAAEPASQNGEEVENLEDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPAHYFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQASRGYLEDEHATNHAEEAFFNSIMPTFDPALRYMVTWYVSSSPCAACADRIVKTLNKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALRKLKEAGCRLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
【０１１７】
Petromyzon marinus CDA1 (pmCDAl) 
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSFMIQVKILHTTKSPAV  
【０１１８】
Human APOBEC3G D316R D317R 
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKFNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHFMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTC FTSWSPCFSCAQEMAKFISKKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN   
【０１１９】
Human APOBEC3G chain A 
MDPPTFTFNFNNEPWWGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISF TYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLD EHSQDLSGRLRAILQ  
【０１２０】
Human APOBEC3G chain A D120R D121R 
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQ  
【０１２１】
用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質またはその断片を指す。
【０１２２】
「検出する」とは、検出されるべき分析物の存在、不在または量を同定することを指す。一実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける配列変化が検出される。別の実施形態では、インデル（indel）の存在が検出される。
【０１２３】
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結されたときに、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介してそれを検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えばELISAで一般的に使用されるもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【０１２４】
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。特定の実施形態において、本発明の組成物による治療に適した疾患は、点突然変異、スプライシング事象、未熟終止コドン、またはミスフォールディング事象と関連する。
【０１２５】
「DNA結合タンパク質ドメイン」とは、DNAに結合するポリペプチドまたはその断片を意味する。いくつかの実施形態において、DNA結合タンパク質ドメインは、配列特異的DNA結合活性を有するジンクフィンガーまたはTALEドメインである。他の実施形態において、DNA結合タンパク質ドメインは、DNAに結合するCRISPR-Casタンパク質のドメインであり（例えばCas9）、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) に結合するものを含む。ある態様において、DNA結合タンパク質ドメインは、ポリヌクレオチド(例えば、単一ガイドRNA)と複合体を形成し、その複合体が、gRNAおよびプロトスペーサー隣接モチーフによって特定されるDNA配列に結合する。ある態様において、DNA結合タンパク質ドメインは、ニッカーゼ活性を含むか（例えばnCas9）、または触媒的に不活性である（例えばdCas9、ジンクフィンガードメイン、TALE）。さらに他の実施形態において、DNA結合タンパク質ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの触媒的に不活性なバリアント、またはTALEタンパク質AvrBs4のDNA結合ドメインである。例えばGabsalilow et al., Nucleic Acids Research, Volume 41, Issue 7, 1 April 2013, Pages e83参照。ある態様において、DNA結合タンパク質ドメインは、触媒活性を有するドメイン（例えばFokI、MutH）に融合される。特定の実施形態において、ジンクフィンガードメインは、エンドヌクレアーゼFokIの触媒ドメインに融合される。他の実施形態において、TALEが、部位特異的DNAニッキング活性を含むMutHに融合される。
【０１２６】
本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な、生物学的に活性な薬剤の量を指す。特定の実施形態において、有効量は、プラスミドでトランスフェクトされた細胞において活性塩基編集系を発現するのに十分な、塩基エディターシステムの部分を含む2つ以上のプラスミドの量である。当業者には理解されるように、薬剤（例えば融合タンパク質）の有効量は、例えば望まれる生物学的応答、例えば編集されるべき特定のアリル、ゲノム、または標的部位、標的化される細胞または組織、および使用される薬剤など、様々な因子に応じて変動し得る。
【０１２７】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【０１２８】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。たとえば、アデニンとチミンは相補的な核酸塩基で、水素結合を形成して対を形成する。
【０１２９】
用語「塩基修復の阻害因子」または「IBR」とは、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を指す。ある態様において、IBRは、イノシン塩基除去修復の阻害因子である。塩基修復の阻害因子の例としては、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGGl、hNEILl、T7 Endol、T4 PDG、UDG、hSMUGLおよびhAAGの阻害因子が挙げられる。ある実施形態では、IBRは、Endo VまたはhAAGの阻害因子である。ある実施形態では、IBRは、触媒的に不活性なEndoVまたは触媒的に不活性なhAAGである。
【０１３０】
「インテイン（intein）」は、それ自身を切り出してそして残った断片（エクステイン（extein））をタンパク質スプライシングとして知られるプロセスにおいてペプチド結合で連結することができるタンパク質の断片である。インテインは「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。インテインがそれ自身を切り出し、タンパク質の残りの部分を連結するプロセスは、本明細書において、「タンパク質スプライシング」または「インテイン媒介タンパク質スプライシング」と呼ばれる。ある態様において、前駆体タンパク質（インテイン媒介タンパク質スプライシングの前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、二つの遺伝子に由来する。そのようなインテインは、本明細書では分割（split）インテインと呼ばれる（例えば、分割インテイン-Nおよび分割インテイン-C）。たとえば、シアノバクテリアでは、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットaであるDnaEは2つの別々の遺伝子dnaE-nおよびdnaE-cによってコードされている。dnaE-n遺伝子によってコードされるインテインは本明細書において「インテインN」と称され得る。dnaE-c遺伝子によってコードされるインテインは本明細書において「インテインC」と称され得る。
【０１３１】
他のインテイン系も使用され得る。例として、dnaEインテイン、すなわちCfa-N（例えば分割インテイン-N）およびCfa-C（例えば分割インテイン-C）のインテイン対に基づく合成インテインが記述されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるStevens et al., J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24; 138(7):2162-5）。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例としては、Cfa DnaEインテイン、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン、Rma DnaBインテイン、およびCne Prp8インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,394,604号に記載のようなもの）が挙げられる。
【０１３２】
インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【０１３３】
DnaEインテイン-N DNA：TGCCTGTCATACGAAACCGAGATACTGACAGTAGAATATGGCCTTCTGCC AATCGGGAAGATTGTGGAGAAACGGATAGAATGCACAGTTTACTCTGTCG ATAACAATGGTAACATTTATACTCAGCCAGTTGCCCAGTGGCACGACCGG GGAGAGCAGGAAGTATTCGAATACTGTCTGGAGGATGGAAGTCTCATTAG GGCCACTAAGGACCACAAATTTATGACAGTCGATGGCCAGATGCTGCCTA TAGACGAAATCTTTGAGCGAGAGTTGGACCTCATGCGAGTTGACAACCTT CCTAAT
【０１３４】
DnaEインテイン-N タンパク質：CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDR GEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNL PN
【０１３５】
DnaEインテイン-C DNA：ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGA TATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAG CTTCTAAT
【０１３６】
インテイン-C: MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN
【０１３７】
Cfa-N DNA: 
TGCCTGTCTTATGATACCGAGATACTTACCGTTGAATATGGCTTCTTGCC TATTGGAAAGATTGTCGAAGAGAGAATTGAATGCACAGTATATACTGTAG ACAAGAATGGTTTCGTTTACACACAGCCCATTGCTCAATGGCACAATCGC GGCGAACAAGAAGTATTTGAGTACTGTCTCGAGGATGGAAGCATCATACG AGCAACTAAAGATCATAAATTCATGACCACTGACGGGCAGATGTTGCCAA TAGATGAGATATTCGAGCGGGGCTTGGATCTCAAACAAGTGGATGGATTG CCA
【０１３８】
Cfa-Nタンパク質：
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNR GEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGL P
【０１３９】
Cfa-C DNA： 
ATGAAGAGGACTGCCGATGGATCAGAGTTTGAATCTCCCAAGAAGAAGAG GAAAGTAAAGATAATATCTCGAAAAAGTCTTGGTACCCAAAATGTCTATG ATATTGGAGTGGAGAAAGATCACAACTTCCTTCTCAAGAACGGTCTCGTA GCCAGCAAC
【０１４０】
Cfa-Cタンパク質：MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLV ASN 
【０１４１】
分割Cas9のN末端部と分割Cas9のC末端部とを接合するために、インテインNおよびインテインCをそれぞれ分割Cas9のN末端部および分割Cas9のC末端部に融合させ得る。例えば、いくつかの実施形態において、インテイン-Nが、分割されたCas9のN-末端部分のC-末端に融合され、すなわち、N--[分割Cas9のN末端部分]-[インテイン-N]--Cの構造を形成する。いくつかの実施形態において、インテイン-Cが、分割されたCas9のC-末端部分のN-末端に融合され、すなわち、N-[インテイン-C]--[分割Cas9のC末端部分]-Cの構造を形成する。インテインが融合されたところのタンパク質（例えば分割Cas9）を連結するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるShah et al., Chem Sci. 2014; 5(1):446-461に記載されているように、当該技術分野において公知である。インテインを設計および使用する方法は当該技術分野で公知であり、例えばWO2014004336、WO2017132580、US20150344549およびUS20180127780によって記載されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態で見出される場合に通常それに付随する成分が、様々な程度まで除去されている物質を指す。「単離」は、元の入手源又は周囲環境からの分離の程度を示す。「精製」は、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり他の有害な結果を引き起こさないように、他の物質が十分に除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生された場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含まない場合、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体その他の化学物質を実質的に含まない場合には、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質については、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【０１４３】
「単離ポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムにおいて当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えばDNA)を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれた；自律的に複製するプラスミドやウイルスに組み込まれた；原核生物や真核生物のゲノムDNAに組み込まれた；または他の配列とは独立した別の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびに、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【０１４４】
「単離ポリペプチド」とは、天然状態で付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然状態で会合しているタンパク質および天然有機分子から重量で少なくとも60%フリーである場合に、単離されている。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、そして最も好ましくは少なくとも99%が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現；または化学的にタンパク質を合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
【０１４５】
本明細書で使用される用語「リンカー」は、2つの分子または部分（例えば融合タンパク質の2つのドメイン）を連結する結合（例えば共有結合）、化学基、または、分子を指す。ある実施形態において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを含む、RNAプログラミング可能ヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを繋げる。ある態様において、リンカーは、dCas9と核酸編集タンパク質とを繋げる。典型的には、リンカーは、2つの基、分子、または他の部分の間に配置されるか、またはそれらによって隣接され、共有結合を介して各々に連結され、かくしてそれら2つのものを連結する。ある態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。ある態様において、リンカーは、有機の分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜200アミノ酸であり、例えば長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、35、45、50、55、60、60、65、70、70、75、80、85、90、90、95、100、101、102、103、104、105、110、120、130、140、150、160、175、180、190、または200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーも企図される。ある態様において、リンカーは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含む。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSを含む。ある態様において、リンカーは、(SGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS) n、(G)n、(EAAAK)n、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES、もしくは(XP)nモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ここで、nは独立して1〜30の整数であり、Xは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、核酸塩基エディターのドメインは、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS、またはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGSのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される。いくつかの実施形態において、核酸塩基エディターのドメインは、XTENリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。ある態様において、リンカーは、長さが24アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESを含む。ある態様において、リンカーは、長さが40アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSを含む。ある態様において、リンカーは、長さが64アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGS SGGSを含む。ある態様において、リンカーは、長さが92アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、アミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSを含む。
【０１４７】
「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、配列内、例えば核酸もしくはアミノ酸配列内の残基が、別の残基により置換されること、または配列内の1以上の残基の欠失もしくは挿入をいう。変異は、本明細書中において典型的には、元の残基を同定し、次いで配列内の残基の位置を同定し、そして新たに置換された残基を同定することによって、記載される。本明細書中に提供されるアミノ酸置換 (変異) を作製するための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供されている。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」とは、核酸塩基および酸性部分を含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーをいう。典型的には、ポリマー核酸、例えば3つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、隣接するヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結されている直鎖分子である。ある態様において、「核酸」は、個々の核酸残基(例えばヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を指す。ある態様において、「核酸」は、三つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー(例えば少なくとも3つのヌクレオチドの鎖)を指すために交換可能に使用され得る。ある態様において、「核酸」は、RNAならびに一本鎖および/または二本鎖DNAを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子との関連において、天然に存在し得る。他方、核酸分子は、例えば非天然に存在する分子、組換えDNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、または非天然に存在するヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含む、非天然に存在する分子であり得る。さらに、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および/または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。核酸は、天然源から精製される、組換え発現系を用いて産生され必要に応じて精製される、化学的に合成される、等が可能である。化学的に合成された分子の場合、核酸は、適切な場合には、例えば、化学的に修飾された塩基または糖、および骨格修飾を有するアナログなどのヌクレオシドアナログを含み得る。核酸配列は、特に示されない限り、5’〜3’方向に示される。ある態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアニン、O(6)-メチルグアニン、および2-チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的に修飾された塩基（例えばメチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および/または修飾リン酸基（例えばホスホロチオエートおよび5’-N-ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
【０１５０】
「核局在化配列」、「核局在化シグナル」または「NLS」という用語は、タンパク質の細胞核への移入を促進するアミノ酸配列を意味する。核局在化配列は当該技術分野において公知であり、例えば、2000年11月23日に出願され2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された国際PCT出願PCT/EP 2000/011690のPlank et al.に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み入れられる。他の実施形態では、NLSは、例えばKoblan et al., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172によって記載された、最適化されたNLSである。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列KRTADGSEFESPKKKRKV、KRPAATKKAGQAKKKK、KKTELQTTNAENKTKKL、KRGINDRNFWRGENGRKTR、RKSGKIAAIVVKRPRK、PKKKRKV、またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。
【０１５１】
用語「核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質」あるいは「napDNAbp」は、napDNAbpを特定の核酸配列に誘導するガイド核酸などの核酸（例えばDNAまたはRNA）と会合するタンパク質を表す。例えば、Cas9タンパク質は、そのCas9タンパク質をガイドRNAに相補的な特異的DNA配列へと誘導するガイドRNAと結合し得る。いくつかの実施形態において、napDNAbpは、Cas9ドメインであり、例えば、ヌクレアーゼ活性Cas9、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ不活Cas9（dCas9）である。核酸プログラミング可能なDNA結合タンパク質の例としては、Cas9（例えばdCas9およびnCas9）、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、およびC2c3が挙げられるが、これらに限定されない。他の核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質も、本開示に具体的に列記されていないとしても本開示の範囲内である。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「薬剤を取得する」におけるような「取得する」は、その薬剤を合成すること、購入すること、または他の方法で獲得することを含む。
【０１５３】
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、疾患または障害と診断されている、またはそれらを有するかもしくは生ずる疑いがある、例えば哺乳動物対象などの対象を指す。ある態様において、用語「患者」は、疾患または障害を生ずる可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)および本明細書に開示される治療から利益を得ることができる他の哺乳動物であり得る。例示的なヒト患者は、男性および/または女性であり得る。「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では、疾患または障害を有すると診断されたまたはその疑いがある患者として言及される。
【０１５４】
用語「RNAプログラム可能なヌクレアーゼ」および「RNA誘導ヌクレアーゼ」は、切断の標的ではない一つ以上のRNAをとともに使用される(例えば、それに結合または付随する)。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、RNAと複合体である場合、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称され得る。典型的には、結合したRNAはガイドRNA (gRNA) と呼ばれる。gRNAは2個以上のRNAの複合体として存在することもあれば、1個のRNA分子として存在することもある。単一のRNA分子として存在するgRNAは、単一ガイドRNA（sgRNA）と呼ばれることがあるが、 「gRNA」は、単一の分子として、または2つ以上の分子の複合体として存在するガイドRNAを指すために互換的に使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、(1) 標的核酸と相同性を共有するドメイン（例えば、標的へのCas9複合体の結合を指示する）；および(2) Cas9タンパク質に結合するドメインという二つのドメインを含む。ある態様において、ドメイン (2) は、tracrRNAとして知られる配列に対応し、ステム-ループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン (2) は、Jinek et al., Science 337:816-821(2012)（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる）に提供されるようなtracrRNAと同一または相同である。gRNA (例えばドメイン2を含むもの)の他の例は、「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」と題され2013年9月6日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,682および「Delivery System For Functional Nucleases」と題され2013年9月6日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,746に見出され得、それら各々の全内容が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施形態において、gRNAは、ドメイン (1) および (2) の二つ以上を含み、「伸長されたgRNA」と称され得る。例として、伸長されたgRNAは、本明細書に記載されるように、例えば二つ以上のCas9タンパク質と結合し、二つ以上の異なる領域における標的核酸と結合する。gRNAは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが上記標的部位へのヌクレアーゼ/RNA複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：RNA複合体の配列特異性を提供する。ある態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連システム) Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、Streptococcus pyogenes由来のCas9 (Csnl) である（例えば、"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)参照）。
【０１５５】
タンパク質または核酸に関連して本明細書中で使用される用語「組み換え体」とは、自然界には存在しないが、人間の工学の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、いくつかの実施形態において、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、または少なくとも7つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【０１５６】
「減少する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【０１５７】
「参照」とは、標準または対照の条件を意味する。一実施形態において、参照は、インテイン依存性再構築のためのインテインを含む断片において発現される核酸塩基エディターと同じ条件下で同じ細胞内で、単一プラスミドにおいて発現される、全長核酸塩基エディターの活性である。
【０１５８】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義済み配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット又は全体であり得る；例えば、完全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAまたは遺伝子配列。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、少なくとも約20アミノ酸、少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドまたはそれらの周辺もしくはそれらの間の任意の整数である。
【０１５９】
用語「一塩基多型 (SNP)」は、ゲノム中の特定の位置で起こる単一ヌクレオチドの変異であり、ここで、各変異は集団内で認識できるある程度(例>1%)まで存在する。たとえば、ヒトゲノムの特定の塩基位置では、ほとんどの個体でCヌクレオチドが出現しうるが、少数の個体ではその位置がAで占められている。これは、この特定の位置にSNPがあり、CまたはAという2つのヌクレオチドのバリエーションがこの位置のアリルであるという。SNPは疾患に対する感受性の差の根底にある。病気の重症度や治療に対する体の反応も、遺伝的バリエーションの表れである。SNPは、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、または遺伝子間領域(遺伝子と遺伝子の間の領域)に存在しうる。ある態様において、コード配列内のSNPは、遺伝子コードの縮重のために、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。コード領域のSNPには、同義SNPと非同義SNPの2種類がある。同義SNPはタンパク質配列に影響しないが、非同義SNPはタンパク質のアミノ酸配列を変化させる。非同義SNPにはミスセンスとナンセンスの2種類がある。タンパク質をコードする領域にないSNPは、遺伝子のスプライシング、転写因子の結合、メッセンジャーRNAの分解、または非コードRNAの配列に影響を与えることがある。この種のSNPによって影響を受ける遺伝子発現はeSNP (発現SNP)と呼ばれ、遺伝子の上流または下流にあり得る。一塩基バリアント (SNV) は、頻度に制限のない一塩基のバリエーションであり、体細胞で生じ得る。体細胞一塩基バリエーションは一塩基改変とも呼ばれ得る。
【０１６０】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドおよび/または核酸分子を認識および結合するが、試料（例えば生物学的試料）中の他の分子を実質的に認識および結合しない核酸分子、ポリペプチド、もしくはそれらの複合体（例えば、核酸プログラム可能なDNA結合ドメインおよびガイド核酸）、化合物、または分子を意味する。
【０１６１】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を示す。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子)の間、またはその一部の間に二本鎖分子を形成する対をなすことを意味する。(例えばWahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。
【０１６２】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750 mM未満 NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500 mM未満 NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250 mM未満 NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤 (例えば、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ) の濃度、および担体DNAの含入または排除などの様々な追加のパラメーターは、当業者によく知られている。必要に応じてこれら様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウムおよび1% SDS中で起こる。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミドおよび100. μg/ml変性サケ精子DNA (ssDNA) 中で起こる。別の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、42℃において、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中で起こる。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１６３】
ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM未満NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約15 mM未満 NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウムである。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。一実施形態において、洗浄工程は、25℃で、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、42℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、68℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行われる。これらの条件のさらなるバリエーションは、当業者には容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によくしられており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記述されている。
【０１６４】
「分割（split）」とは、2つ以上の断片に分割されることを意味する。
【０１６５】
「分割されたCas9タンパク質」あるいは「分割Cas9」とは、二つの別個のヌクレオチド配列によってコードされるN末端断片およびC末端断片として提供されるCas9タンパク質をいう。Cas9タンパク質のN末端部分およびC末端部分に対応するポリペプチドは、スプライスされて「再構成」Cas9タンパク質を形成することができる。特定の実施形態において、Cas9タンパク質は、例えば、Nishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014に記載されるように、またはJiang et al. (2016) Science 351: 867-871.  PDB file:  5F9Rに記載されるように（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、タンパク質の非秩序的な領域内で2つの断片に分割される。非秩序的領域は、X線結晶学、NMR分光法、電子顕微鏡法（例えばクライオEM）、および/またはin silicoタンパク質モデリングを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の1以上のタンパク質構造決定技術によって決定され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、SpCas9のおよそアミノ酸A292-G364、F445-K483、もしくはE565-T637の間の領域内の任意のC、T、A、もしくはSにおいて、または任意の他のCas9、Cas9バリアント（例えばnCas9、dCas9）、もしくは他のnapDNAbpにおける対応位置において、二つの断片に分割される。ある態様において、タンパク質は、SpCas9 T310、T313、A456、S469、またはC574において2つの断片に分割される。いくつかの実施形態において、タンパク質を2つの断片に分割するプロセスは、タンパク質を「分割（スプリッティング）する」と称される。
【０１６６】
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ)または核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。一実施形態において、そのような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60%、80%または85%、90%、95%または99%までもの同一性を有する。
【０１６７】
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および/または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムを使用することができ、e -3とe -100の間の確率スコアが密接に関連した配列を示す。
【０１６８】
「対象」とは、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコなどのヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。対象は、家畜、労働力を生じ食料などの商品を供給するために飼育される飼育動物を含み、ウシ、ヤギ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウサギ、およびヒツジを含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
用語「標的部位」とは、核酸分子内の配列であって、核酸塩基エディターによって改変される配列をいう。一実施形態において、標的部位は、デアミナーゼまたはそれを含む融合タンパク質（例えば、シチジンまたはアデニンデアミナーゼ）によって脱アミノ化される。
【０１７０】
RNAプログラム可能なヌクレアーゼ(例:Cas9)は、DNA切断部位を標的とするためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するので、これらのタンパク質は、原理的に、ガイドRNAによって指定されるあらゆる配列を標的とすることができる。部位特異的切断のためにCas9のようなRNAプログラム可能なヌクレアーゼを使用する方法(例えばゲノムを改変するために)は、当該技術分野において公知である(例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照。これらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１７１】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値についての省略形であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, または 50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、またはサブ範囲を含むと理解される。
【０１７２】
本明細書中で使用される、用語「治療する(treat)」、「治療する(treating)」、「治療(treatment)」 などは、障害および/またはそれに関連する症状を軽減もしくは改善することを指す。障害または状態を治療することは、関連する障害、状態または症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう（完全な除去が除外されるわけでもない）。
【０１７３】
用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「UGI」は、本明細書中で使用される場合、ウラシル-DNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。ある態様において、UGIドメインは、野生型UGIまたはその改変版を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるUGIタンパク質は、UGIの断片、およびUGIまたはUGI断片と相同的なタンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態において、UGIドメインは、下記に提供されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの実施形態において、UGI断片は、本明細書に提供される例示的UGI配列の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%を含むアミノ酸配列を含む。ある態様において、UGIは、本明細書において下記に提供するアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列、または本明細書において下記に提供するアミノ酸配列の断片と相同的なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、UGIもしくはUGIの断片、またはUGIもしくはUGIの断片のホモログを含むタンパク質は、「UGIバリアント」と称される。UGIバリアントは、UGI又はその断片と相同性を有する。例えば、UGIバリアントは、野生型UGIまたは本明細書に記載のUGIに対して少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、少なくとも99%の同一性、少なくとも99.5%の同一性、または少なくとも99.9%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、UGIバリアントは、UGIの断片を含み、その断片は、野生型UGIまたは下記に提供されるUGIの対応する断片に対して、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも96%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、少なくとも99%の同一性、少なくとも99.5%の同一性、または少なくとも99.9%の同一性を有する。ある態様において、UGIは、以下のアミノ酸配列を含む：
>splP14739IUNGI_BPPB2 Uracil-DNA glycosylase inhibitor 
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS NGENKIKML
【０１７４】
特に述べない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用されるところの「または」という用語は、包括的であると理解される。特に述べない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるところの用語「a」、「an」および「the」は、単数または複数であると理解される。
【０１７５】
特に述べない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるところの用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均値の2標準偏差内にあると理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内と理解され得る。文脈から特に明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【０１７６】
本明細書における可変因子の定義における化学基のリストの記載は、いずれかの単一の基またはリストされた基の組合せとしてのその可変因子の定義を含む。本明細書における可変因子または態様に関する実施形態の記載は、いずれかの単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせられた、その実施形態を含む。
【０１７７】
本明細書に提供される組成物または方法は、本明細書に提供される他の任意の組成物および方法の1つ以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図1は、2つのアデノシンデアミナーゼドメインである野生型 (wt) TadAおよび進化 (evo) 型のTadAが、C末端二部分核局在化シグナル (NLS) を有するS. pyogenes (Sp) Cas9ニッカーゼ (nCas9) に融合されたものを含む、A→G塩基エディター (ABE) 融合タンパク質核酸塩基エディターの模式図である。この模式図はまた、分割インテイン系を用いて再構成され得るN-およびC末端断片に融合タンパク質が分割され得る（すなわち、インテイン-Nおよびインテイン-CをそれぞれN末端断片およびC末端断片に融合して）、構造化されていないCas9タンパク質の3つの領域を同定している。
【０１７９】
【図２】図2は、図1に記載された融合タンパク質を再現し、スプライスされたnCas9を含む核酸塩基エディター融合タンパク質（すなわちABE）を含む塩基編集システムの塩基編集活性を定量化する3つのグラフを提供する。ABEは示されたアミノ酸位置で分割された（例えば、SpCas9アミノ酸配列に関してT310、T313、A456、S469、およびC574）。ABEのN‐及びC‐末端断片をそれぞれインテイン‐N及びインテイン‐Cに融合した。これらの断片および示されたガイドRNAは、それぞれ、5882G>A突然変異を有するABCA4遺伝子を有するタンパク質を発現する培養HEK293細胞中の別々のプラスミド上で発現された。ABCA4 5882A>G標的に対する、再構成されたABEの塩基編集活性を、対照ABEの活性と比較した。塩基編集活性は、ABEのN末端断片およびC末端断片の両方の存在に依存していた。ABEのN末端断片またはC末端断片のうちの一方のみが発現された場合には、塩基編集活性は観察されなかった。
【０１８０】
【図３】図3は、図2で説明した21 ntガイドによる塩基編集活性を確認するグラフである。図3の実験は、図2の実験とは異なるフォーマットで行われたことに留意されたい。再構成された全てのABEは良好な塩基編集活性を示した。この活性は、nCas9のN‐およびC‐末端断片の両方の存在に依存した。nCas9のN‐またはC‐末端断片のみを発現した場合、活性は観察されなかった。再構成ABEの活性を、対照ABE7.09およびABE7.10融合タンパク質の活性と比較した。
【０１８１】
【図４】図4は、図2で説明した塩基編集活性を定量化するグラフである。図4において、ハンマーリボザイム (HRz) を含む20ヌクレオチド (nt) ガイドRNAを使用した。種々の再構成ABEの活性を対照ABE7.09およびABE7.10融合タンパク質の活性と比較した。
【０１８２】
【図５】図5A〜5Dは、ARPE-19細胞のAAV2共感染についての感染多重度 (MOI) の決定を示す。図5Aは、種々のウイルス負荷 (vg/細胞) におけるAAV2/CMV-mCherryおよびAAV2/CMV-EmGFPの1:1同時感染を示すグラフである。図5Bは、EmGFP (左) およびmCherry (中央) を検出する蛍光画像、ならびにEmGFPとmCherryの共局在を示す重ね合わせ画像 (右) を示す。図5Cは、AAV2/CMV-mCherryで感染された場合の様々なウイルス負荷 (vg/細胞) における、mCherryを発現する細胞の割合を示すグラフである。図5Dは、AAV2/EmGFPで感染された場合の様々なウイルス負荷 (vg/細胞)における、EmGFPを発現する細胞の割合を示すグラフである。
【０１８３】
【図６】図6は、二重AAV2感染を介するARPE-19細胞への分割エディターの送達が、ABCA4 5882Aにおいて高いA>G変換率を生じることを示す一連のグラフである。20,000 vg/細胞（左上）；30,000 vg/細胞（右上）；40,000 vg/細胞（左下）；6万 vg/細胞（右下）の二重感染の感染多重度（MOI）が示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１８４】
以下に説明するように、本発明は、塩基編集システムを送達するための組成物および方法を提供する。本発明は、AからGへの核酸塩基エディター (ABE) が、分割インテインを用いて「分割」され再構成され得るという発見に少なくとも部分的に基づく。分割インテイン対のインテイン-Nおよびインテイン-Cにそれぞれ融合されたABEのN-およびC末端断片をコードするポリヌクレオチドが、別々のベクター上で、単一ガイドRNAと共に細胞に送達された。コードされたABE断片は、一緒にスプライシングされて、核酸配列の標的化された編集のためにとりわけ有用な機能的な核酸塩基エディター融合タンパク質を再構成した。
【０１８５】
［インテイン］
インテイン（intervening protein）は、多種多様な生物に見出される自己プロセシングドメインであり、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスを行うものである。タンパク質スプライシングは、ペプチド結合の切断と形成の両方からなる多段階の生化学的反応である。タンパク質スプライシングの内因性基質は、インテインを含む生物に見出されるタンパク質であるが、インテインはまた、実質的にあらゆるポリペプチド骨格を化学的に操作するために使用することもできる。
【０１８６】
タンパク質スプライシングでは、インテインは、二つのペプチド結合を切断することによって一前駆体ポリペプチドから自身を切り出し、それによって、隣接するエクステイン（外部タンパク質）配列を、新しいペプチド結合の形成を介して連結する。この転位は翻訳後に起こる（翻訳と同時に起こる可能性もある）。インテイン媒介性タンパク質スプライシングは自発的に起こり、インテインドメインの折りたたみだけを必要とする。
【０１８７】
インテインの約5%が分割インテインであり、これらはN-インテインとC-インテインという二つの別々のポリペプチドとして転写され翻訳され、その各々が一つのエクステインに融合している。翻訳の際に、インテイン断片は、自発的にかつ非共有結合的に標準インテイン構造へとアセンブルし、トランスにタンパク質スプライシングを行う。タンパク質スプライシングの機序には一連のアシル転移反応が関わっており、これが、インテイン-エキステイン接合部における2つのペプチド結合の切断と、N-エキステインとC-エキステインの間の新しいペプチド結合の形成とをもたらす。このプロセスは、N‐エクステインとインテインのN‐末端とを繋げるペプチド結合の活性化によって開始される。事実上すべてのインテインは、N末端にシステインまたはセリンを有し、これがN-エクステインのC末端残基のカルボニル炭素を攻撃する。このNからO/Sへのアシル基の移動は、保存されたトレオニンとヒスチジン（TXXHモチーフと呼ばれる）、および一般的に見出されるアスパラギン酸によって促進され、直鎖状 (チオ)エステル中間体の形成をもたらす。次に、この中間体は、システイン、セリン、またはトレオニンであるC-エクステインの最初の残基 (+1) の求核攻撃によってトランス-(チオ)エステル化される。生成した分枝 (チオ)エステル中間体は、インテインの高度に保存されたC末端アスパラギンの環化というユニークな変換によって、解消される。この過程は、ヒスチジン（高度に保存されたHNFモチーフに見出されるもの）と最後から2番目のヒスチジンによって促進され、アスパラギン酸も関与し得る。このスクシンイミド生成反応は、反応複合体からインテインを切除し、非ペプチド結合を介して結合されたエクステインを残す。この構造は、インテイン非依存的態様で迅速に転位し、安定なペプチド結合になる。
【０１８８】
［アデノシンデアミナーゼ］
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、アデノシンデアミナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは、DNAのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼは、任意の適切な生物（例えば大腸菌）に由来することができる。ある態様において、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される突然変異のいずれか（例えばecTadAにおける突然変異）に対応する一つ以上の突然変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、例えば配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA対する相同性を有するもの）において、本明細書に記載された突然変異のいずれか（例えば、ecTadAにおいて同定される突然変異のいずれか）に対応する突然変異を生成することができる。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌由来である。
【０１８９】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、TadA7.10に連結された野生型TadAを含み、それがCas9ニッカーゼに連結される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一のTadA7.10ドメイン（例えば、モノマーとして提供されるもの）を含む。他の実施形態では、ABE7.10エディターは、ヘテロダイマーを形成することができるTadA7.10およびTadA (wt) を含む。関連する配列は以下のとおりである：
【０１９０】
TadA(wt):
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD
【０１９１】
TadA7.10:
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
【０１９２】
いくつかの実施態様において、TadA（例えば、二本鎖基質活性を有するもの）またはTadA7.10は、ホモ二量体またはモノマーとして提供される。
【０１９３】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることが理解されるべきである。本開示は、特定のパーセント同一性を有するデアミナーゼドメインが加えて本明細書に記載される突然変異のいずれかまたはその組合せを含むものを提供する。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、当該技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108G、D108N、D108V、D108A、またはD108Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。しかしながら、さらなるデアミナーゼを同様にアラインメントして、本明細書に提供されるように変異させることができる相同的なアミノ酸残基を同定し得ることが理解されるべきである。
【０１９５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０１９６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE155X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE155D、E155G、またはE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０１９７】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD147X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD147Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０１９８】
本明細書に提供される突然変異(例えば、TadA参照配列のecTadAアミノ酸配列に基づくもの)のいずれも、黄色ブドウ球菌TadA (saTadA) などの他のアデノシンデアミナーゼ、またはその他のアデノシンデアミナーゼ(例えば、細菌のアデノシンデアミナーゼ)に導入することができることが理解されるべきである。ecTadA中の変異残基にいかに相同的であるかは当業者に明らかであろう。従って、ecTadA中に同定された突然変異のいずれも、相同的アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼにおいて作製され得る。また、本明細書に提供される突然変異のいずれも、ecTadAまたは別のアデノシンデアミナーゼにおいて、個々にまたは任意の組合せで作製され得ることも理解されるべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108N、A106V、E155V、および/またはD147Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み得る。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列における以下の突然変異群(変異のグループは「；」で分けられる)、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む：D108NおよびA106V；D108NおよびE155V；D108NおよびD147Y；A106VおよびE155V；A106VおよびD147Y；E155VおよびD147Y；D108N、A106V、およびE55V；D108N、A106V、およびD147Y；D108N、E55V、およびD147Y；A106V、E55V、およびD147Y；ならびにD108N、A106V、E55V、およびD147Y；ただし、ここで提供される対応する突然変異の任意の組合せがアデノシンデアミナーゼ(例えばecTadA)において作製され得ることを理解されたい。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、T17X、L18X、W23X、L34X、W45X、R51X、A56X、E59X、E85X、M94X、I95X、V102X、F104X、A106X、R107X、D108X、K110X、M118X、N127X、A138X、F149X、M151X、R153X、Q154X、I156X、および/またはK157X突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含み、ここで、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に関連するH8Y、T17S、L18E、W23L、L34S、W45L、R51H、A56E、またはA56S、E59G、E85K、またはE85G、M94L、1951、V102A、F104L、A106V、R107C、またはR107H、またはR107P、D108G、またはD108N、またはD108A、D108Y、K110I、M118K、N127S、A138V、F149Y、M151V、R153C、Q154L、I156D、および/またはK157R突然変異のうちの1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０２００】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、および/またはN127X突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、および/またはN127S突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、R26X、M61X、L68X、M70X、A106X、D108X、A109X、N127X、D147X、R152X、Q154X、E155X、K161X、Q163X、および/またはT166X突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R26W、M61I、L68Q、M70V、A106T、D108N、A109T、N127S、D147Y、R152C、Q154HもしくはQ154R、E155GもしくはE155VもしくはE155D、K161Q、Q163H、および/もしくはT166P突然変異の1つ以上、または他のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、N127X、D147X、R152X、およびQ154Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、M61X、M70X、D108X、N127X、Q154X、E155X、およびQ163Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、N127X、E155X、およびT166Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、H8X、A106X、D108X、別のアデノシンデアミナーゼにおける突然変異（複数可）からなる群から選択される1、2、3、4、5、または6個の突然変異を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、R126X、L68X、D108X、N127X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8X、D108X、A109X、N127X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、D147Y、R152C、およびQ154Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、M61I、M70V、D108N、N127S、Q154R、E155GおよびQ163Hからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、E155V、およびT166Pからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、A106T、D108N、N127S、E155D、およびK161Qからなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R126W、L68Q、D108N、N127S、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つの突然変異、または他のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、A109T、N127S、およびE155Gからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含む。
【０２０４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼにおいて一つ以上の対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてD108N、D108G、もしくはD108V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおいて対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106VおよびD108N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107CおよびD108N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、N127S、D147Y、およびQ154H突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、R24W、D108N、N127S、D147Y、およびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるD108N、D147Y、およびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH8Y、D108N、およびS127S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA106V、D108N、D147YおよびE155V突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列におけるS2X、H8X、I49X、L84X、H123X、N127X、I156Xおよび/またはK160X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS2A、H8Y、I49F、L84F、H123Y、N127S、I156Fおよび/またはK160S突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。
【０２０６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、L84X突然変異アデノシンデアミナーゼを含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるL84F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２０７】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH123X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH123Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２０８】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるI157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるI157F突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２０９】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、L84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X、およびI156Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、tadA参照配列においてS2X、I49X、A106X、D108X、D147X、およびE155Xからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8X、A106X、D108X、N127X、およびK160Xからなる群より選択される1、2、3、4、または5個の突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異（複数可）を含み、ここでXは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を示す。
【０２１０】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156Fからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列において、S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y、およびE155Vからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの突然変異を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてH8Y、A106T、D108N、N127S、およびK160Sからなる群より選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異もしくは突然変異を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列においてE 25 X、R 26 X、R 107 X、A 142 X、および/またはA 143 X突然変異のうちの1以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含み、Xの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA基準配列においてE25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R07K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q および/または A143R突然変異のうちの1以上、または他のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列に対応する本明細書に記載の突然変異のうちの1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異のうちの1つ以上を含む。
【０２１３】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE25X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるE25M、E25D、E25A、E25R、E25V、E25S、またはE25Y突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２１４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR26X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR26G、R26N、R26Q、R26C、R26L、またはR26K突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２１５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107H、またはR107S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２１６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142N、A142D、A142G突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２１７】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA143X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA143D、A143G、A143E、A143L、A143W、A143M、A143S、A143Qおよび/またはA143Rの突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36X、N37X、P48X、I49X、R51X、M70X、N72X、D77X、E134X、S146X、Q154X、K157X、および/またはK161X突然変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1つ以上の対応する突然変異を含み、ここでXの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36L、N37T、N37S、P48T、P48L、I49V、R51H、R51L、M70L、N72S、D77G、E134G、S146R、S146C、Q154H、K157N、および/またはK161T突然変異の1以上、または別のアデノシンデアミナーゼにおける1以上の対応する突然変異を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。いくつかの実施形態において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるH36L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２０】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるN37X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるN37TまたはN37S突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２１】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48TまたはP48L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２２】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR51X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR51HまたはR51L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２３】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS146X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるS146RまたはS146C突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２４】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるK157X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるK157N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２５】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるP48S、P48T、またはP48A突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２６】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、Xは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるA142N突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２７】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるW23X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるW23RまたはW23L突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２８】
ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR152X突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含み、ここでXは、野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、TadA参照配列におけるR152PまたはR52H突然変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する突然変異を含む。
【０２２９】
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、突然変異H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nを含むことができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、tadA基準配列に関連する突然変異の以下の組合せを含み、ここで、組合せの各突然変異は「_」によって分離され、突然変異の各組合せは括弧内にある：
(A106V_D108N), (R107C_D108N), 
(H8Y_D108N_S 127S_D 147Y_Q154H), (H8Y_R24W_D108N_N127S_D147Y_E155V), (D108N_D147Y_E155V), (H8Y_D108N_S 127S), (H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H), (A106V D108N D147Y E155V) (D108Q D147Y E155V) (D108M_D147Y_E155V), (D108L_D147Y_E155V), (D108K_D147Y_E155V), (D108I_D147Y_E155V),
(D108F_D147Y_E155V), (A106V_D108N_D147Y), (A106V_D108M_D147Y_E155V),
(E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V), (E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), (D103A_D014N), 
(G22P_D 103 A_D 104N), (G22P_D 103 A_D 104N_S 138 A) , (D 103 A_D 104N_S 138A),
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I15
6F), (E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I15 6F), (R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I15 6F), (R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), (L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F), 
(R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I15 6F), 
(R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F),
(A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V), 
(R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V), 
(E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V), 
(A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V), 
(A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V), 
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N),
(N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F),
(N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F), 
(N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146R_D147Y_E155V_I156F), 
(H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F), 
57N), 
(H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146R_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N), 
(D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E),
(H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146T_D147Y_E155V_I156F), 
(Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F), 
(E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L), 
(L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F), 
(P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), 
(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S 146C_D147Y_E155V_I156F
_K157N), (N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T),
(L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F), 
(R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F_K161T), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T),
(L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E), (R74Q
L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F), 
(L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F), 
(P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F), (P48S_A142N),
(P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N),
(P48T_I49V_A142N), 
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_A142N_D147Y_E155V_I156F (H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S 146C_D147Y_E155V_ I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_A142N_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146R_D147Y_E155V_I156F _K161T), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_R152H_E155V_I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_R152P_E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S 146C_D147Y_E155 V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S 146C_D147Y_R152P _E155V_I156F _K157N), 
(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146R_D147Y_E155V_I156F _K161T), 
(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S 146C_D147Y_R152P_E155V _I156F _K157N), 
(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S 146C_D147Y_R152P_E155 V_I156F _K157N).
【０２３０】
［シチジンデアミナーゼ］
1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼを含む。ある態様において、本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは5-メチルシトシンを脱アミノ化してウラシルまたはチミンにすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるシトシンデアミナーゼは、DNA中のシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の適切な生物に由来することができる。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、天然に存在するシチジンデアミナーゼが本明細書に提供される突然変異のいずれかに対応する1つ以上の突然変異を含むところのものである。当業者は、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質中の対応する残基を同定することができる。従って、当業者は、本明細書に記載された突然変異のいずれかに対応する突然変異を、任意の天然に存在するシチジンデアミナーゼにおいて生じさせることができる。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、原核生物由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、細菌由来である。ある態様において、シチジンデアミナーゼは、哺乳動物（例えばヒト）由来である。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるシチジンデアミナーゼは、一つ以上の突然変異(例えば、本明細書に提供される突然変異のいずれか)を含み得ることを理解されたい。本開示は、特定のパーセント同一性を有する任意のデアミナーゼドメインに、本明細書に記載される突然変異またはその組合せのいずれかが加えられたものを提供する。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に提供されるいずれかのシチジンデアミナーゼと比較して、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50個またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シチジンデアミナーゼは、当技術分野において既知であるかまたは本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、または少なくとも170個の同一の連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
本発明の融合タンパク質は、核酸編集ドメインを含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、CからUへの塩基変化を触媒することができる。ある態様において、核酸編集ドメインは、デアミナーゼドメインである。ある態様において、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC) ファミリーデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEClデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC 2デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Eデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Fデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ (AID) である。ある態様において、デアミナーゼは、脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、無脊椎動物デアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトデアミナーゼである。ある態様において、デアミナーゼは、ラットデアミナーゼ、例えば、rAPOBEC1である。ある態様において、デアミナーゼは、Petromyzon marinusシチジンデアミナーゼ1 (pmCDAl) である。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片である。ある態様において、デアミナーゼは、D316R D317R突然変異を含むヒトAPOBEC3Gバリアントである。ある態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gの断片であり、D316R D317R突然変異に対応する突然変異を含む。ある態様において、核酸編集ドメインは、本明細書に記載される任意のデアミナーゼのデアミナーゼドメインに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%) 、または少なくとも99.5%の同一性である。
【０２３３】
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を改善する1つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が低下したCas9ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン (dCas9) 、またはCas9ニッカーゼ (nCas9) と呼ばれる、二本鎖DNA分子の1鎖を切断するCas9ドメインを有し得る。
【０２３４】
［その他の核酸塩基エディター］
本発明は、本発明に係る融合タンパク質におけるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼのドメインが、当技術分野で知られる実質的にあらゆる核酸塩基エディターで置き換えられた核酸塩基エディター融合タンパク質を提供する。
【０２３５】
いくつかの態様において、核酸プログラミング可能DNA結合タンパク質 (napDNAbp) は、Cas9ドメインである。非限定的な例示的Cas9ドメインが本明細書で提供される。Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性Cas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼであり得る。ある態様において、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Cas9ドメインは、二本鎖核酸の両方の鎖（例えば二本鎖DNA分子の両方の鎖）を切断するCas9ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３６】
ある態様において、Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメイン(dCas9) である。例えば、dCas9ドメインは、二本鎖核酸分子のいずれの鎖も切断することなく、二本鎖核酸分子に結合し得る（例えばgRNA分子を介して）。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書中に記載されたアミノ酸配列のD10X突然変異およびH840X突然変異、または本明細書中に提供されたアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、Xは任意のアミノ酸変化である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本明細書に記載のアミノ酸配列のD10A突然変異およびH840A突然変異、または本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。一例として、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインは、クローニングベクターpPlatTET-gRNA2（アクセス番号BAV54124）に記載の以下のアミノ酸配列を含む：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
（Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.” Cell. 2013; 152(5):1173-83参照。その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。）。
【０２３７】
さらなる適切なヌクレアーゼ不活性dCas9ドメインは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかとなり、本開示の範囲内である。このようなさらなる例示的な適切なヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインには、限定されるものではないが、D10A/H840A、D10A/D839A/H840A、およびD10A/D839A/H840A/N863A突然変異体ドメインが含まれる(例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照されたい (その全内容は参照により本明細書に組み込まれる))。いくつかの実施形態において、dCas9ドメインは、本明細書に提供されるdCas9ドメインのいずれかに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれかと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50またはそれ以上の突然変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれかと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200の同一の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３８】
ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子(例えば二本鎖DNA分子)の一方の鎖のみを切断することができるCas9タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成している（相補的である）鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、D10A突然変異を含み、位置840にヒスチジンを有する。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的、非塩基編集鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対を形成していない鎖を切断することを意味する。ある態様において、Cas9ニッカーゼは、H840A突然変異を含み位置10にアスパラギン酸残基を有するか、または対応する突然変異。いくつかの実施形態において、Cas9ニッカーゼは、本明細書に提供されるCas9ニッカーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。さらなる適切なCas9ニッカーゼは、本開示および当該分野における知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
【０２３９】
［PAM排他性が低減されたCas9ドメイン］
1つの特定の実施形態において、本発明は、2つの断片に分割されたCas9ドメインを含む核酸塩基エディターを特徴とし、2つの断片の各々が末端インテインを有し、すなわち、N末端断片はそのC末端においてインテイン系の1つのメンバーに融合され、C末端断片はそのN末端においてインテイン系のメンバーを有する。
【０２４０】
典型的には、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」の「N」はアデノシン (A) 、チミジン (T) またはシトシン (C) であり、Gはグアノシンである。これは、ゲノム内の所望の塩基を編集する能力を制限し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な位置、例えばPAMの上流にある標的塩基を含む領域に配置することが必要になり得る。例えばKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)参照（これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、標準的（例えばNGG）PAM配列を含まないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含み得る。非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは本技術分野において記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015); およびKleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。下記表１に、いくつかのPAMバリアントを記載する。
【０２４１】
表１．Cas9タンパク質および対応するPAM配列
【表１】
2022500017.tif 000027
【０２４２】
いくつかの実施形態において、PAMはNGCである。いくつかの実施形態において、NGC PAMはCas9バリアントによって認識される。いくつかの実施形態において、NGC PAMバリアントは、D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335EおよびT1337R（合わせて「MQKFRAER」と呼ばれる）から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０２４３】
ある態様において、Cas9ドメインは、Staphylococcus aureus由来のCas9ドメイン(SaCas9)である。ある態様において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SaCas9、ヌクレアーゼ不活性SaCas9 (SaCas9d) 、またはSaCas9ニッカーゼ (SaCas9n) である。いくつかの実施形態において、SaCas9は、N579A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができ、いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、NNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781X、N967X、およびR1014X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、およびR1014H突然変異のうちの1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける1つ以上の対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメインは、E781K、N967K、またはR1014H突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２４５】
例示的なSaCas9配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
下線を引いて太字にした上記残基N579は、変異されて（例えばA579に）SaCas9ニッカーゼを生じることができる。
【０２４６】
例示的なSaCas9n配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
上記残基A579は、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じることができ、下線、太字で示されている。
【０２４７】
例示的なSaKKH Cas9
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.
上記残基A579は、N579から変異されてSaCas9ニッカーゼを生じることができ、下線、太字で示されている。上記残基K781、K967、およびH1014は、E781、N967、およびR1014から変異されてSaKKH Cas9を生じることができ、下線、斜体で示されている。
【０２４８】
ある態様において、Cas9ドメインは、Streptococcus pyogenes由来のCas9ドメインである (SpCas9)。ある態様において、SpCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpCas9、ヌクレアーゼ不活性SpCas9 (SpCas9d) 、またはSpCas9ニッカーゼ (SpCas9n) である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9X突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXはD以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、NGG、NGAまたはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134X、R1334X、およびT1336X突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134E、R1334Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134E、R1334Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134X、R1334X、およびT1336X突然変異のうちの1つ以上、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134V、R1334Q、およびT1336R突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134V、R1334Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134X、G1217X、R1334X、およびT1336X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載されるCas9ポリペプチドに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。
【０２５０】
例示的SpCas9
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０２５１】
例示的SpCas9n
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０２５２】
例示的SpEQR Cas9
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
上記の残基E1134、Q1334、およびR1336は、D1134、R1334、およびT1336から変異されてSpEQR Cas9を生じさせることができ、下線、太字で示されている。
【０２５３】
例示的SpVQR Cas9
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
上記の残基V1134、Q1334、およびR1336は、D1134、R1334、およびT1336から変異されてSpVQR Cas9を生じることができ、下線、太字で示されている。
【０２５４】
例示的SpVRER Cas9
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
上記の残基V1134、R1217、Q1334、およびR1336は、D1134、G1217、R1334、およびT1336から変異されてSpVRER Cas9を生じることができ、下線、太字で示されている。
【０２５５】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、正準PAM配列に結合するdCas9ドメインおよび非正準PAM配列（例えば、表1で特定された非正準PAM）に結合するnCas9ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、正準PAM配列に結合するnCas9ドメインおよび非正準PAM配列（例えば、表1で特定された非正準PAM）に結合するdCas9ドメインを含む。
【０２５６】
［高忠実度Cas9ドメイン］
本開示のいくつかの態様は、高忠実度Cas9ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、高忠実度Cas9ドメインは、対応する野生型Cas9ドメインと比較して、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の静電相互作用を減少させる1つ以上の突然変異を含む人工Cas9ドメインである。特定の理論に縛られることを望まないが、DNAの糖-リン酸骨格との静電相互作用を減少させた高忠実度Cas9ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有し得る。ある態様において、Cas9ドメイン(例えば、野生型Cas9ドメイン)は、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を低減させる一つ以上の突然変異を含む。ある態様において、Cas9ドメインは、Cas9ドメインとDNAの糖-リン酸骨格との間の結合を少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、または少なくとも70%だけ低減させる一つ以上の突然変異を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497X、R661X、Q695X、および/またはQ926X突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCas9融合タンパク質のいずれかは、N497A、R661A、Q695A、および/またはQ926A突然変異の1以上、または本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Cas9ドメインは、D10A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。高い忠実度を有するCas9ドメインは当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高い忠実度を有するCas9ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. “High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.” Nature 529, 490-495 (2016); およびSlaymaker, I.M., et al. “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.” Science 351, 84-88 (2015)に記述されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５８】
Cas9に対する高忠実度Cas9ドメイン変異を太字、下線で示している。
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０２５９】
Cas9ヌクレアーゼはRuvCとHNHという二つの機能性エンドヌクレアーゼ領域をもっている。Cas9は標的DNAに結合するとコンホメーション変化を起こし、これがヌクレアーゼドメインを位置付け、標的DNAの反対側の鎖を切断させる。Cas9を介したDNA切断の最終結果は、標的DNA内の二本鎖切断 (DSB) である(PAM配列の約3〜4ヌクレオチド上流)。生じたDSBは、次の二つの一般的修復経路のうちの一つにより修復される: (1) 効率的だが誤りがちな非相同末端結合 (NHEJ) 経路；または (2) 効率は低いが忠実度の高い相同性誘導修復 (HDR) 経路。
【０２６０】
非相同末端結合 (NHEJ) および/または相同性指向修復 (HDR) の「効率」は、任意の簡便な方法によって計算することができる。例えば、ある場合には、効率は、成功したHDRのパーセンテージで表すことができる。例えば、検査用ヌクレアーゼ分析を用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてパーセンテージを計算することができる。たとえば、HDRが成功した結果として新たに組み込まれた制限配列を含むDNAを直接切断する測量用ヌクレアーゼ酵素を使用することができる。切断される基質が多いほどHDRの割合が高かった(HDRの効率がより高かった)ことを示す。例示的な例として、HDRの割合 (パーセンテージ) は、以下の式を用いて計算することができる[(切断産物)/(基質+切断産物)] （例えば、 (b+c) / (a+b+c) ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である。)。
【０２６１】
場合によっては、効率はNHEJの成功率で表すことができる。例えば、T7エンドヌクレアーゼIアッセイを用いて切断産物を生成し、基質に対する産物の比を用いてNHEJのパーセンテージを計算することができる。T7エンドヌクレアーゼIは、野生型および突然変異体DNA鎖(NHEJは最初の切断部位に小さなランダムな挿入や欠失 (インデル) を生じる)のハイブリダイゼーションから生じるミスマッチのヘテロ二本鎖DNAを切断する。切断が多いほどNHEJの割合が高いこと(NHEJの効率が高いこと)を示す。例示的な例として、NHEJの割合 (パーセンテージ) は、式(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2) ×100を用いて計算することができ、ここで、「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断生成物である（Ran et. al., 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; および Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308）。
【０２６２】
NHEJ修復経路は最も活性な修復機構であり、DSB部位での小ヌクレオチド挿入または欠失 (インデル) を頻繁に引き起こす。NHEJ媒介DSB修復のランダム性は、Cas9およびgRNAまたはガイドポリヌクレオチドを発現する細胞集団が多様な突然変異のアレイをもたらし得るので、重要な実際的意味を有する。ほとんどの場合、NHEJは標的DNAに小さなインデルを生じさせ、その結果、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム (ORF) 内に未熟な終止コドンをもたらすアミノ酸欠失、挿入、またはフレームシフト突然変異が生じる。理想的な最終結果は、標的遺伝子内の機能喪失型変異である。
【０２６３】
NHEJ媒介DSB修復はしばしば遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するが、相同性指向修復 (HDR) は単一ヌクレオチド変化からフルオロフォアまたはタグの付加のような大きな挿入までの範囲の特異的ヌクレオチド変化を生成するために使用できる。
【０２６４】
HDRを遺伝子編集に利用するために、所望の配列を含むDNA修復テンプレートを、gRNAおよびCas9またはCas9ニッカーゼと共に目的の細胞型に送達することができる。修復テンプレートは、所望の編集ならびにその標的のすぐ上流および下流(左右相同アームと呼ばれる)にさらなる相同配列を含むことができる。各相同アームの長さは導入される変化の大きさに依存し得、より大きな挿入はより長い相同アームを必要とする。修復鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖DNAプラスミドであり得る。HDRの効率は、Cas9、gRNAおよび外因性修復テンプレートを発現する細胞においても、一般的に低い(10%未満の修正アリル)。HDRは細胞周期のS期とG2期の間に起こるので、細胞を同調させることによってHDRの効率を高めることができる。NHEJに関与する遺伝子を化学的または遺伝的に阻害することもHDR頻度を増加させ得る。
【０２６５】
いくつかの実施態様において、Cas9は、修飾Cas9である。所与のgRNA標的配列は、ゲノム全体にわたり、部分的な相同性が存在するさらなる部位を有し得る。これらの部位はオフターゲットと呼ばれ、gRNAを設計する際に考慮する必要があるが、gRNAの設計を最適化することに加えて、Cas9を修飾することによってCRISPRの特異性を高めることもできる。Cas9は2つのヌクレアーゼドメイン、RuvCおよびHNHの組合せ活性を介して二本鎖切断 (DSB) を生成する。SpCas9のD10A変異体であるCas9ニッカーゼは1つのヌクレアーゼドメインを保持し、DSBではなくDNAニックを生成する。特異的遺伝子編集のためのHDR媒介遺伝子編集にニッカーゼを組み合わせることもできる。
【０２６６】
ある場合には、Cas9はバリアントCas9タンパク質である。バリアントCas9ポリペプチドは、野生型Cas9タンパク質のアミノ酸配列と比較して、一アミノ酸単位で異なる(例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する)アミノ酸配列を有する。いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、Cas9ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化(例えば欠失、挿入、または置換)を有する。例えば、いくつかの例において、バリアントCas9ポリペプチドは、対応する野生型Cas9タンパク質のヌクレアーゼ活性の50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満を有する。ある場合には、バリアントCas9タンパク質は実質的なヌクレアーゼ活性をもたない。対象Cas9タンパク質が、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないバリアントCas9タンパク質である場合、それは「dCas9」と称され得る。
【０２６７】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はヌクレアーゼ活性を低下させる。例えば、バリアントCas9タンパク質は、野生型Cas9タンパク質（例えば野生型Cas9タンパク質）のエンドヌクレアーゼ活性の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.1%未満を示す。
【０２６８】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、RuvCドメインの機能を低下させる突然変異(アミノ酸置換)を有することができる。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、D10A (アミノ酸位置10におけるアスパラギン酸からアラニン)を有し、したがって、二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖標的核酸を切断するとき、二本鎖切断 (DSB) の代わりに一本鎖切断 (SSB) を生じる) (例えばJinek et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21参照)。
【０２６９】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低下している。例えば、バリアントCas9タンパク質は、HNHドメインの機能を低下させる変異(アミノ酸置換)を有することができる(RuvC/HNH/RuvCドメインモチーフ)。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、バリアントCas9タンパク質は、H840A (アミノ酸位置840におけるヒスチジンからアラニン)突然変異を有し、したがって、ガイド標的配列の非相補的ストランドを切断することができるが、ガイド標的配列の相補的ストランドを切断する能力が低下している(したがって、このバリアントCas9タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断すると、DSBの代わりにSSBが生じる)。このようなCas9タンパク質は、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)を切断する能力が低下しているが、ガイド標的配列(例えば一本鎖ガイド標的配列)に結合する能力を保持している。
【０２７０】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、ある場合には、バリアントCas9タンパク質は、D10AおよびH840A突然変異の両方を有し、その結果、ポリペプチドは、二本鎖標的DNAの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
【０２７１】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、W476AおよびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。
【０２７２】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNAを切断する能力を低下しているが(例えば一本鎖標的DNA)、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。
【０２７３】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、D10A、W476A、およびW1126A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。いくつかの実施形態において、バリアントCas9は、Cas9 HNHドメインの位置840における触媒的His残基が回復されている(A840H)。
【０２７４】
別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下させるが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持する。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNAを切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1127A変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基を変異させ得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
【０２７５】
ある態様において、低減された触媒活性を有するバリアントCas9タンパク質（例えばCas9タンパク質がD10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987突然変異、例えばD10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、および/またはD986Aを有する場合）は、それがガイドRNAと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的様式で標的DNAに結合することができる（ガイドRNAによって標的DNA配列に誘導されるからである）。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、バリアントCasタンパク質は、spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9 (sp)、saCas9, saCas9-KKH、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK、またはspCas9-LRVSQLであり得る。
【０２７７】
S. pyogenes Cas9の代替としては、哺乳動物細胞において切断活性を示すCpf1ファミリー由来のRNA誘導エンドヌクレアーゼが挙げられ得る。PrevotellaおよびFrancisella 1由来のCRISPR (CRISPR/Cpf1) は、CRISPR/Cas9システムに類似したDNA編集技術である。Cpf1はクラスII CRISPR/Cas系のRNA誘導エンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構はPrevotellaやFrancisella細菌に見られる。Cpf1遺伝子はCRISPR遺伝子座に関連しており、ウイルスDNAを見出して切断するためにガイドRNAを用いるエンドヌクレアーゼをコードしている。Cpf1はCas9より小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9系の制限のいくつかを克服する。Cas9ヌクレアーゼとは異なり、Cpf1を介したDNA切断の結果は、短い3'突出を伴う二本鎖切断である。Cpf1の互い違いの切断パターンは、伝統的な制限酵素クローニングに類似した、方向性のある遺伝子導入の可能性を開くことができ、これは遺伝子編集の効率を高め得る。上述したCas9のバリアントおよびオーソログと同様に、Cpf1は、CRISPRが標的とすることができる部位の数を、SpCas9が好むNGG PAM部位を欠くATに富む領域またはATに富むゲノムに拡大することもできる。Cpf1遺伝子座はα/β混合ドメイン、RuvC‐Iとそれに続くらせん領域、RuvC‐IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含む。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに類似したRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1はHNHエンドヌクレアーゼ領域をもたず、Cpf1のN末端はCas9のαヘリックス認識ローブをもたない。Cpf1 CRISPR‐Casドメイン構成は、Cpf1が機能的にユニークであり、クラス2、タイプV CRISPRシステムとして分類されることを示した。Cpf1遺伝子座は、II型系よりもI型およびIII型に類似したCas1、Cas2およびCas4タンパク質をコードしていた。機能的Cpf1はトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA) を必要としない;したがって、CRISPR (crRNA) だけを要する。Cpf1はCas9より小さいだけでなく、より小さいsgRNA分子(Cas9の約半分の数のヌクレオチド)を有するので、これはゲノム編集に有益である。Cas9が標的とするGリッチPAMとは対照的に、Cpf1-crRNA複合体は、モチーフ5'-YTN-3'に隣接するプロトスペーサーの同定によって標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドの突出を有するスティッキーエンド様のDNA二本鎖切断を導入する。
【０２７８】
［プロトスペーサ隣接モチーフ］
用語「プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)」あるいはPAM様モチーフは、CRISPR細菌適応免疫系においてCas9ヌクレアーゼによって標的化されるDNA配列の直後の2〜6塩基対DNA配列を指す。いくつかの実施形態では、PAMは5’PAM（すなわちプロトスペーサの5’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態では、PAMは3’PAM（すなわちプロトスペーサの5’末端の下流に位置する）であり得る。
【０２７９】
PAM配列は標的結合のために必須であるが、その正確な配列はCasタンパク質の種類に依存する。
【０２８０】
本明細書で提供される塩基エディターは、標準的または非標準的プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列を含むヌクレオチド配列に結合することができるCRISPRタンパク質由来ドメインを含むことができる。PAM部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接するヌクレオチド配列である。本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCRISPRタンパク質の全部または一部を含む塩基エディターを提供する。例えば、S. pyogenes由来のCas9 (spCas9) などのCas9タンパク質は、典型的に、特定の核酸領域に結合するために標準的なNGG PAM配列を必要とし、ここで「NGG」中の「N」はアデニン (A) 、チミン(T) 、グアニン (G) 、またはシトシン (C) であり、Gはグアニンである。PAMはCRISPRタンパク質特異的であり得、異なるCRISPRタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なり得る。PAMは標的配列の5’または3’にあり得る。PAMは、標的配列の上流または下流にあり得る。PAMは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。多くの場合、PAMは2〜6ヌクレオチドの長さである。いくつかのPAMバリアントが表１に記載されている。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、SpCas9は、PAM核酸配列5'-NGC-3'または5'-NGC-3'に対する特異性を有する。上記態様の様々な実施形態において、SpCas9は、Cas9または表1に列挙されたCas9バリアントである。上記態様の種々の実施形態において、改変SpCas9は、spCas9-MQKFRAERである。いくつかの実施形態において、バリアントCasタンパク質は、spCas9、spCas9-VRQR、spCas9-VRER、xCas9 (sp)、saCas9、saCas9-KKH、SpCas9-MQKFRAER、spCas9-MQKSER、spCas9-LRKIQK、またはspCas9-LRVSQLであり得る。1つの特定の実施形態では、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337Rを含み（SpCas9-MQKFRAER）改変されたPAM 5'-NGC-3'に対する特異性を有する改変SpCas9が使用される。
【０２８２】
一部の実施形態では、PAMはNGTである。一部の実施形態では、NGT PAMはバリアントである。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、一つまたは複数の残基1335、1337、1135、1136、1218、および/または1219における標的化変異を通じて作製される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、一つ以上の残基1219、1335、1337、1218における標的化変異を通じて作製される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、一つ以上の残基1135、1136、1218、1219、および1335における標的化変異を通じて作製される。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、下記の表2および3に提供される標的化変異のセットから選択される。
【０２８３】
表２：残基1219、1335、1337、1218におけるNGT PAMバリアント変異
【表２】
2022500017.tif 000028
【０２８４】
表３：残基1135、1136、1218、1219、および1335におけるNGT PAMバリアント変異
【表３】
2022500017.tif 000029
【０２８５】
いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、表2および3のバリアント5、7、28、31、または36から選択される。いくつかの実施形態では、バリアントは改善されたNGT PAM認識を有する。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、残基1219、1335、1337、および/または1218に変異を有する。いくつかの実施形態において、NGT PAMバリアントは、下記表4に提供されるバリアントからの、認識を改善するための突然変異を伴って選択される。
【０２８７】
表４：残基1219、1335、1337、および1218におけるNGT PAMバリアント変異
【表４】
2022500017.tif 000030
【０２８８】
いくつかの実施形態では、NGT PAMは、下記表5に提供されるバリアントから選択される。
【０２８９】
表５：NGT PAMバリアント
【表５】
2022500017.tif 000031
【０２９０】
ある態様において、Cas9ドメインは、Streptococcus pyogenes由来のCas9ドメインである (SpCas9)。ある態様において、SpCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpCas9、ヌクレアーゼ不活性SpCas9 (SpCas9d) 、またはSpCas9ニッカーゼ (SpCas9n) である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9X突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXはD以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9は、D9A突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。ある態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメインまたはSpCas9nドメインは、NGG、NGAまたはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135E、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、R1335X、およびT1336X突然変異のうちの1つ以上、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1336R突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135X、G1217X、R1335X、およびT1336X突然変異の1以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異の1つ以上、または本明細書に提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。いくつかの実施形態において、SpCas9ドメインは、D1135V、G1217R、R1335Q、およびT1336R突然変異、または本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異を含む。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載されるCas9ポリペプチドに対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%の同一性であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかのCas9ドメインは、本明細書に記載される任意のCas9ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。
【０２９３】
いくつかの例において、本明細書に開示される塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインによって認識されるPAMは、塩基エディターをコードするインサート(例えばAAVインサート)とは別個のオリゴヌクレオチド上で細胞に提供され得る。そのような実施形態では、、別個のオリゴヌクレオチド上にPAMを提供することは、さもなくば標的配列と同じポリヌクレオチド上に隣接するPAMが存在しないために切断することができない標的配列の切断を可能にする。
【０２９４】
一実施形態において、S. pyogenes Cas9 (SpCas9) を、ゲノム工学のためのCRISPRエンドヌクレアーゼとして使用することができる。ただし、他のものも使用され得る。いくつかの実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを用いて特定のゲノム標的を標的化することができる。いくつかの実施形態では、非NGG PAM配列を有する合成SpCas9由来バリアントを使用することができる。さらに、様々な種からの他のCas9オルソログが同定されており、これらの 「非SpCas9」は、本開示でも有用になり得る種々のPAM配列に結合し得る。例えば、比較的大きなサイズのSpCas9（約4キロベース（kb）のコード配列）は、細胞内で効率的に発現することができないSpCas9 cDNAプラスミドをもたらすこともあり得る。逆に、Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) のコード配列は、SpCas9よりも約1キロ塩基短いので、細胞内で効率的に発現させ得る。SpCas9と同様に、SaCas9エンドヌクレアーゼは、in vitroの哺乳類細胞およびin vivoのマウスにおいて標的遺伝子を修飾する能力がある。ある実施形態では、Casタンパク質は異なるPAM配列を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、Cas9 PAM、例えば、5’-NGGに隣接し得る。他の実施形態では、他のCas9オーソログは異なるPAM要件を有し得る。例えば、S. thermophilus のもののようなPAM（CRISPR1の場合は5’-NNAGAA、CRISPR3の場合は5’-NGGNG）およびNeisseria meningiditis のもの（5’-NNNNGATT）のような他のPAMも標的遺伝子に隣接して見出され得る。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、S. pyogenes系について、標的遺伝子配列は、5’-NGG PAMの前(すなわち、その5’側)にあり得、20 ntガイドRNA配列が、反対側の鎖と塩基対を形成して、PAMに隣接するCas9切断を媒介することができる。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）3塩基対上流であり得る。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）10塩基対上流であり得る。ある実施形態では、隣接切断は、PAMの（約）0〜20塩基対上流であり得る。例えば、隣接切断は、PAM上流の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30塩基対の隣であり得る。隣接切断はPAMの1〜30塩基対下流でもあり得る。以下はPAM配列に結合することができる例示的SpCas9タンパク質の配列である：
【０２９６】
例示的なPAM結合SpCas9のアミノ酸配列は以下の通り：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
【０２９７】
例示的なPAM結合SpCas9nのアミノ酸配列は以下の通り：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
【０２９８】
例示的なPAM結合SpEQR Cas9のアミノ酸配列は以下の通り：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
この配列において、D1135、R1335、およびT1337から変異されてSpEQR Cas9を生じることができる残基E1135、Q1335、およびR1337は、下線、太字で示される。
【０２９９】
例示的なPAM結合SpVQR Cas9のアミノ酸配列は以下の通り：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
この配列において、D1135、R1335、およびT1336から変異されてSpVQR Cas9を生じることができる残基V1135、Q1335、およびR1336は、下線、太字で示されている。
【０３００】
例示的なPAM結合SpVRER Cas9のアミノ酸配列は以下の通り：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０３０１】
ある態様において、Cas9ドメインは、組換えCas9ドメインである。ある態様において、組換えCas9ドメインは、SpyMacCas9ドメインである。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpyMacCas9、ヌクレアーゼ不活性SpyMacCas9 (SpyMacCas9d) 、またはSpyMacCas9ニッカーゼ(SpyMacCas9n) である。いくつかの実施形態において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非標準PAMを有する核酸配列に結合することができる。いくつかの実施形態において、SpyMacCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、NAA PAM配列を有する核酸配列に結合することができる。
【０３０２】
例示的SpyMacCas9
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEIQTVGQNGGLFDDNPKSPLEVTPSKLVPLKKELNPKKYGGYQKPTTAYPVLLITDTKQLIPISVMNKKQFEQNPVKFLRDRGYQQVGKNDFIKLPKYTLVDIGDGIKRLWASSKEIHKGNQLVVSKKSQILLYHAHHLDSDLSNDYLQNHNQQFDVLFNEIISFSKKCKLGKEHIQKIENVYSNKKNSASIEELAESFIKLLGFTQLGATSPFNFLGVKLNQKQYKGKKDYILPCTEGTLIRQSITGLYETRVDLSKIGED.
【０３０３】
ある場合には、バリアントCas9タンパク質はH840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、D1218Aの突然変異を有し、その結果、標的DNAまたはRNAを切断する能力が低下している。このようなCas9タンパク質は、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力は低下しているが、標的DNA (例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力は保持している。別の非限定的な例として、いくつかの場合において、バリアントCas9タンパク質は、D10A、H840A、P475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A突然変異を有し、その結果、ポリペプチドは、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力が低下している。そのようなCas9タンパク質は、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)を切断する能力を低下しているが、標的DNA(例えば一本鎖標的DNA)に結合する能力を保持している。バリアントCas9タンパク質がW476AおよびW1126A変異を有する場合、またはバリアントCas9タンパク質がP475A、W476A、N477A、D1125A、W1126A、およびD1218A変異を有する場合、バリアントCas9タンパク質はPAM配列に効率的に結合しない。したがって、このような場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いると、この方法はPAM配列を必要としない。換言すれば、ある場合には、このようなバリアントCas9タンパク質を結合の方法に用いる場合、この方法はガイドRNAを含み得るが、この方法は、PAM配列の非存在下で行うことができる(したがって、結合の特異性はガイドRNAの標的セグメントによってもたらされる)。上記の効果を達成するために、他の残基が変異され得る(すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する)。非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987を変更(すなわち置換)することができる。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
【０３０４】
ある態様において、塩基エディターのCRISPRタンパク質由来ドメインは、標準的PAM配列(NGG) を有するCas9タンパク質の全部または一部を含み得る。他の実施形態では、塩基エディターのCas9由来ドメインは、非標準的PAM配列を用いることができる。そのような配列は本技術分野で記述されており当業者には明らかであろう。例えば、非標準的PAM配列に結合するCas9ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature, 523, 481-485 (2015); および Kleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition”Nature Biotechnology, 33, 1293-1298 (2015)に記述されており、それぞれの全内容を参照によりここに組み込む。
【０３０５】
［核局在化配列 (NLS) を含む融合タンパク質］
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合タンパク質は、一つ以上 (例:2, 3, 4, 5) の核ターゲティング配列、例えば、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。一実施形態では、二部分（bipartite）NLSが使用される。いくつかの態様において、NLSは、NLSを含むタンパク質の細胞核中への輸入(例えば核輸送によるもの)を促進するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、核局在化配列 (NLS) をさらに含む。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは融合タンパク質のC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはCas9ドメインのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはnCas9ドメインまたはdCas9ドメインのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSはデアミナーゼのC末端に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、1つ以上のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。ある態様において、NLSは、リンカーなしで融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態において、NLSは、本明細書において提供または参照されるNLS配列のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。さらなる核局在化配列は当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列は、Plank et al., PCT/EP2000/011690に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み込まれる。ある態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKV, KRTADGSEFESPKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, KKTELQTTNAENKTKKL, KRGINDRNFWRGENGRKTR, RKSGKIAAIVVKRPRKPKKKRKV, またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCを含む。いくつかの実施形態において、NLSはリンカー中に存在するか、またはNLSはリンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーによって隣接される。いくつかの実施形態において、N末端またはC末端NLSは、二部分NLSである。二部分NLSは、比較的短いスペーサー配列によって分離される二つの塩基性アミノ酸クラスターを含む（それゆえにbipartite、2部分と呼ばれ、一部分（monopartite）NLSは異なる）。ヌクレオプラスミンのNLSであるKR[PAATKKAGQA]KKKKは遍在的な二部分シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の二つのクラスターが約10アミノ酸のスペーサーによって隔てられたものである。例示的な二部分NLSの配列は、PKKKRKVEGADKRTADGSEFES PKKKRKVである。
【０３０６】
いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。ある態様において、1以上のドメインまたはタンパク質の間にリンカー配列が存在する。
【０３０７】
本開示の融合タンパク質は、1つ以上のさらなる特徴を含み得ることが理解されるべきである。例えば、いくつかの態様において、融合タンパク質は、阻害因子、細胞質局在化配列、核輸出配列などの輸出配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含むことができる。本明細書において提供される適切なタンパク質タグには、限定されるものではないが、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータグ (BCCP) タグ、myc-タグ、カルモジュリンタグ、FLAG-タグ、ヘマグルチニン (HA) -タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはHis-タグとも呼ばれる）、マルトース結合タンパク質 (MBP) -タグ、nus-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST) -タグ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) -タグ、チオレドキシンタグ、S-タグ、ソフタグ(例えばSoftag1、Softag3)、ストレプトタグ、ビオチンリガーゼタグ、FLAsHタグ、V5タグ、およびSBP-タグが含まれる。さらなる適切な配列は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、1つ以上のHisタグを含む。
【０３０８】
［リンカー］
ある実施形態において、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかを連結するためにリンカーが使用され得る。リンカーは、共有結合のように単純であり得、またはそれは、多原子の長さであるポリマーリンカーであり得る。リンカーはペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態では、リンカーはUV切断可能なリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーはポリヌクレオチドリンカー、例えばRNAリンカーであり得る。ある実施形態において、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づくものである。他の実施形態において、リンカーはペプチド様ではない。ある実施形態において、リンカーは、共有結合（例えば、炭素-炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合、等）である。ある実施形態において、リンカーは、アミド連結の炭素-窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状又は非環状、置換又は非置換、分枝又は非分枝の脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである。ある実施形態において、リンカーは、ポリマー（例えばポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステル、その他）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある実施形態において、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸、等）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸 (Ahx) のモノマー、ダイマー又はポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、炭素環部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分 (PEG) を含む。他の実施形態において、リンカーはアミノ酸を含む。ある態様において、リンカーはペプチドを含む。ある実施形態において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある実施形態において、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからの求核剤（例えばチオール、アミノ）がリンカーに結合することを促進するための官能化部分を含み得る。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用することができる。例示的な求電子剤としては、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
ある実施形態において、リンカーは、一アミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、結合（例えば共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。ある実施形態において、リンカーは、長さが約3〜約104（例えば5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、61、62、63、64、65、70、75、80、85、90、95、または100）アミノ酸である。
【０３１０】
［ガイドRNAを伴うCas9複合体］
本開示のいくつかの側面は、本明細書で提供された融合タンパク質のいずれかを含む複合体を提供し、核酸塩基エディターの活性のための最適な長さを達成するために、ガイドRNAが利用され得る（例えば、(GGGS)n、(GGGGS)n、および(G)nの形態の非常に柔軟なリンカーから、(EAAAK)n、(SGGS)n、SGSETPGTSESATPESの形態のより剛性の高いリンカーまで（例えばGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照。その全内容は参照によりここに組み込まれる）、および (XP)n）。いくつかの実施態様において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である。ある実施形態において、リンカーは、(GGS)nモチーフを含み、ここで、nは、1、3、または7である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質のCas9ドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含むリンカーを介して融合される。
【０３１１】
ある態様において、ガイド核酸(例えばガイドRNA)は、15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続するヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、標的配列に相補的な15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の連続したヌクレオチドの配列を含む。ある態様において、標的配列はDNA配列である。ある態様において、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物または動物のゲノムにおける配列である。ある態様において、標的配列は、ヒトのゲノムにおける配列である。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、標準PAM配列 (NGG) にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、非標準PAM配列（例えば表１に列挙されている配列）にすぐ隣接している。ある態様において、ガイド核酸（例えばガイドRNA）は、疾患または障害に関連する配列に相補的である。
【０３１２】
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの局面は、DNA分子を、本明細書中に提供される融合タンパク質のいずれか、および少なくとも一つのガイドRNAと接触させることを含む方法を提供し、ここで、ガイドRNAは、約15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、AGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN、または5’ (TTTV) 配列にすぐ隣接している。
【０３１３】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、目的の標的に変異誘発するために使用される。これらの変異は標的の機能に影響を及ぼし得る。例えば、核酸塩基エディターを使用して調節領域を標的とすると、調節領域の機能が変化し、下流のタンパク質の発現が減少する。
【０３１４】
それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。たとえば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものとでは番号付けが異なることがあり、種ごとの配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、当業者に周知の方法、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を同定することができる。
【０３１５】
本明細書に開示された融合タンパク質のいずれかを標的部位、例えば、編集される突然変異を含む部位にターゲティングするためには、融合タンパク質をガイドRNAと共に共発現させることが典型的に必要であることは当業者には明らかであろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にするtracrRNAフレームワークと、Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドRNAおよびtracrRNAは、2つの核酸分子として別々に提供され得る。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。ガイド配列は典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための適切なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような適切なガイドRNA配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの50ヌクレオチド以内の上流または下流内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供された融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書に提供される。
【０３１６】
［シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびCas9ドメインを含む融合タンパク質を使用する方法］
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの局面は、DNA分子を、本明細書中に提供される融合タンパク質のいずれか、および少なくとも一つのガイドRNAと接触させることを含む方法を提供し、ここで、ガイドRNAは、約15〜100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的である少なくとも10個の連続したヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、正準PAM配列 (NGG) に直接隣接する。いくつかの実施形態において、標的配列の3'末端は、正準PAM配列 (NGG) に直接隣接していない。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、AGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列にすぐ隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列の3’末端は、NGA、NGCG、NGN、NNGRRT、NNNRRT、NGCG、NGCN、NGTN、NGTN、NGTN、または5’ (TTTV) 配列にすぐ隣接している。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、目的の標的に変異誘発するために使用される。特に、本明細書に記載されるマルチエフェクター核酸塩基エディターは、標的配列内に複数の突然変異を作製することができる。これらの変異は標的の機能に影響を及ぼし得る。例えば、マルチエフェクター核酸塩基エディターを使用して調節領域を標的とすると、調節領域の機能が変化し、下流のタンパク質の発現が減少する。
【０３１８】
それぞれの配列における特定の位置または残基の番号付けは、使用される特定のタンパク質および番号付けスキームに依存することが理解されるであろう。たとえば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質そのものとでは番号付けが異なることがあり、種ごとの配列の違いが番号付けに影響することがある。当業者は、当業者に周知の方法、例えば、配列アラインメントおよび相同的残基の決定によって、任意の相同的タンパク質およびそれぞれのコード核酸中のそれぞれの残基を同定することができる。
【０３１９】
本明細書に開示された、Cas9ドメインとシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質のいずれかを標的部位、例えば、編集される突然変異を含む部位にターゲティングするためには、融合タンパク質をガイドRNA、例えばsgRNAと共に共発現させることが典型的に必要であることは当業者には明らかであろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を可能にするtracrRNAフレームワークと、Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドRNAおよびtracrRNAは、2つの核酸分子として別々に提供され得る。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。ガイド配列は典型的には20ヌクレオチド長である。Cas9:核酸編集酵素/ドメイン融合タンパク質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための適切なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような適切なガイドRNA配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの50ヌクレオチド以内の上流または下流内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。提供された融合タンパク質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに適したいくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書に提供される。
【０３２０】
［塩基エディターの効率性］
本発明の融合タンパク質は、著しい割合のインデルを生成することなく特定のヌクレオチド塩基を改変することにより、塩基エディター効率を改善させる。本明細書において使用されるところの「インデル（indel）」は、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。このような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内でフレームシフト突然変異を引き起こす可能性がある。いくつかの実施形態において、核酸において多数の挿入または欠失（すなわちインデル）を生じることなく、核酸内の特定のヌクレオチドを効率的に改変（例えば変異）する塩基エディターを生成することが望ましい。特定の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかが、インデルと比べて意図された改変（例えば突然変異）のより大きな割合を生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、1:1より大きい、意図された突然変異対インデルの比を生成することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも1.5:1、少なくとも2:1、少なくとも2.5:1、少なくとも3:1、少なくとも3.5:1、少なくとも4:1、少なくとも4.5:1、少なくとも5:1、少なくとも5.5:1、少なくとも6:1、少なくとも6.5:1、少なくとも7:1、少なくとも7.5:1、少なくとも8:1、少なくとも10:1、少なくとも12:1、少なくとも15:1、少なくとも20:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも100:1、少なくとも200:1、少なくとも300:1、少なくとも400:1、少なくとも500:1、少なくとも600:1、少なくとも700:1、少なくとも800:1、少なくとも900:1、もしくは少なくとも1000:1、またはそれ以上の、意図される突然変異対インデルの比を生じることができる。意図する突然変異およびインデルの数は、任意の適切な方法を用いて決定することができる。
【０３２１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限することができる。ある態様において、その領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドのところにあるか、または塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド以内の領域である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターのいずれかは、核酸の領域においてインデルの形成を1%未満、1.5%未満、2%未満、2.5%未満、3%未満、3.5%未満、4%未満、4.5%未満、5%未満、6%未満、7%未満、8%未満、9%未満、10%未満、12%未満、15%未満、または20%未満に制限することができる。核酸領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝される時間の量に依存し得る。いくつかの実施形態において、インデルの数または割合は、核酸（例えば細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝してから少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも14日後に決定される。
【０３２２】
本開示のいくつかの態様は、本明細書で提供されるいずれかの塩基エディターが、有意な数の非意図的突然変異を生成することなく、核酸（例えば対象のゲノム内の核酸）において意図された突然変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、その意図される突然変異を生ずるように特に設計されたgRNAに結合した特異的塩基エディターによって生成される突然変異である。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、停止コドン、例えば、遺伝子のコード領域内の未熟停止コドンを生成する突然変異である。いくつかの実施形態において、意図される突然変異は、終止コドンを除去する突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、遺伝子のスプライシングを変化させる突然変異である。ある態様において、意図される突然変異は、遺伝子の調節配列（例えば遺伝子プロモーターまたは遺伝子リプレッサー）を変化させる突然変異である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるいずれかの塩基エディターは、意図された突然変異対意図されていない突然変異の比（例えば、意図した突然変異：意図しない突然変異）を1:1より大きくすることができるいくつかの実施形態において、本明細書で提供されるいずれかの塩基エディターは、意図された突然変異対意図されていない突然変異の比を、少なくとも1.5:1、少なくとも2:1、少なくとも2.5:1、少なくとも3:1、少なくとも3.5:1、少なくとも4:1、少なくとも4.5:1、少なくとも5:1、少なくとも5.5:1、少なくとも6:1、少なくとも6.5:1、少なくとも7:1、少なくとも7.5:1、少なくとも8:1、少なくとも10:1、少なくとも12:1、少なくとも15:1、少なくとも20:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも100:1、少なくとも150:1、少なくとも200:1、少なくとも250:1、少なくとも500:1、または少なくとも1000:1にすることができる。本明細書の「塩基エディターの効率性」の節に記載される塩基エディターの特徴は、本明細書に提供される融合タンパク質、または融合タンパク質を使用する方法のいずれにも適用され得ることが理解されるべきである。
【０３２３】
［核酸を編集する方法］
本開示のいくつかの態様は、核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸の核酸塩基（例えば二本鎖DNA配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの実施形態において、本方法は、a) 核酸（例えば二本鎖DNA配列）の標的領域を、塩基エディターおよびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させる工程と、b) 前記標的領域の鎖分離を誘導する工程と、c) 標的領域の一本鎖における前記標的核酸塩基対の第一の核酸塩基を第二の核酸塩基に変換する工程と、d) nCas9を使用して、前記標的領域の、一本を超えない数の鎖を切断する工程とを含み、ここで、第一の核酸塩基に相補的な第三の核酸塩基が、第二の核酸塩基に相補的な第四の核酸塩基によって置き換えられる。ある実施形態において、本方法は、核酸において20%未満のインデル形成をもたらす。一部の実施形態では、工程bが省略されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、本方法は、19%未満、18%未満、16%未満、14%未満、12%未満、10%未満、8%未満、6%未満、4%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.2%未満、または0.1%未満のインデル形成をもたらす。いくつかの実施態様において、本方法は、第二の核酸塩基を、第四の核酸塩基に相補的な第五の核酸塩基で置き換え、それによって意図された編集塩基対（例えばG・CからA・T）を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。
【０３２４】
ある実施形態において、標的ヌクレオチドにおける意図された生成物対意図されない生成物の比は、少なくとも2:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも20:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも60:1、少なくとも70:1、少なくとも80:1、少なくとも90:1、少なくとも100:1、もしくは少なくとも200:1、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、意図された突然変異対インデル形成の比は、1:1超、10:1超、50:1超、100:1超、500:1超、もしくは1000:1超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、切断された一本鎖（ニック鎖）が、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖とは反対の鎖である。一部の実施形態では、塩基エディターはdCas9ドメインを含む。いくつかの実施形態において、塩基エディターは、編集されていない鎖を保護または結合する。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の上流にある。ある実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の下流にある。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。いくつかの実施形態において、本方法は、正準（例えばNGG）PAMサイトを必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターはリンカーを含む。ある態様において、リンカーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある実施形態において、リンカーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。一実施形態において、リンカーは、長さが32アミノ酸である。別の実施形態では、「長いリンカー（long linker）」は、長さが少なくとも約60アミノ酸である。他の実施形態において、リンカーは、長さが約3〜100アミノ酸である。一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある実施形態において、標的ウィンドウは、1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的ウィンドウは、長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、標的ウィンドウ内にある。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、意図される編集塩基対を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかを用いて実施される。
【０３２５】
いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、二本鎖DNA配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、a) 二本鎖DNA配列の標的領域を、塩基エディターおよびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、ここで、標的領域が標的核酸塩基対を含む、工程と、b) 上記標的領域の鎖分離を誘導する工程と、c) 標的領域の一本鎖における前記標的核酸塩基対の第一の核酸塩基を第二の核酸塩基に変換する工程と、d) 前記標的領域の一本を超えない数の鎖を切断する工程と、を含み、ここで、第一の核酸塩基に相補的な第三の核酸塩基が、第二の核酸塩基に相補的な第四の核酸塩基によって置き換えられ、第二の核酸塩基が、第四の核酸塩基に相補的な第五の核酸塩基によって置き換えられ、それによって、意図された編集塩基対を生成し、ここで意図された塩基対を生成する効率は少なくとも5%である。一部の実施形態では、工程bは省略されることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの実施形態では、意図された塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。いくつかの態様において、本方法は、19%未満、18%未満、16%未満、14%未満、12%未満、10%未満、8%未満、6%未満、4%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、0.2%未満、または0.1%未満のインデル形成を引き起こす。ある実施形態において、標的ヌクレオチドにおける意図された生成物対意図されない生成物の比は、少なくとも2:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも20:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも60:1、少なくとも70:1、少なくとも80:1、少なくとも90:1、少なくとも100:1、もしくは少なくとも200:1、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、意図された突然変異対インデル形成の比は、1:1超、10:1超、50:1超、100:1超、500:1超、もしくは1000:1超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、切断された一本鎖が、ガイド核酸にハイブリダイズされる。いくつかの実施態様において、切断された一本鎖は、第一の核酸塩基を含む鎖とは反対の鎖である。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の上流にある。ある実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の下流にある。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にある。いくつかの実施形態において、本方法は、正準（例えばNGG）PAMサイトを必要としない。ある態様において、リンカーは、長さが1〜25アミノ酸である。ある態様において、リンカーは、長さが5〜20アミノ酸である。ある実施形態において、リンカーは、長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。一部の実施形態では、標的領域は標的ウィンドウを含み、標的ウィンドウは標的核酸塩基対を含む。ある実施形態において、標的ウィンドウは���1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的ウィンドウは、長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。ある態様において、標的ウィンドウは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、意図される編集塩基対は、標的ウィンドウ内で起こる。いくつかの実施態様において、標的ウィンドウは、意図される編集塩基対を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基エディターは、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかである。
【０３２６】
［宿主細胞における融合タンパク質の発現］
本発明の融合タンパク質は、当業者に知られるルーチンの方法を用いて、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物細胞を含むがこれらに限定されない実質的にあらゆる目的宿主細胞において発現され得る。核酸塩基修飾活性を有する一つ以上のドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ）をコードする一つ以上のポリヌクレオチドを、napDNAbpをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結して、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製することにより、融合タンパク質が生成される。
【０３２７】
本明細書中に記載されるタンパク質ドメインをコードするDNAは、例えばDNA鎖を化学的に合成することによる方法、PCRによる方法、またはGibsonアセンブリ法による方法など、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。化学合成またはPCR法の組み合わせまたはGibsonアセンブリ法によって全長DNAを構築する利点は、コドンを最適化して、融合タンパク質が宿主細胞において高レベルで発現されることを確実にできることである。最適化されたコドンは、上総DNA研究所のホームページに開示されている遺伝子コード使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いて選択することができる。一旦得られれば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに組み込まれる。
【０３２８】
適切な発現ベクターとしては、Escherichia coli由来プラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13）；Bacillus subtilis由来プラスミド（例えばpUB110、pTP5、pC194）；酵母由来のプラスミド（例えばpSH19、pSH15）；昆虫細胞での発現に適したプラスミド（例えばpFast-Bac）；哺乳動物細胞における発現に適したプラスミド（例えばpA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；そしてラムダファージなどのバクテリオファージが挙げられ、使用され得る他のベクターとしては、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例えばBmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど、哺乳類細胞での発現に適したウイルスベクターが挙げられる。
【０３２９】
ポリヌクレオチドをコードする融合タンパク質は、典型的には、所望の宿主細胞における発現のために有用な適切なプロモーターの制御下で発現される。例えば、宿主が動物細胞である場合には、SRアルファプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV (サイトメガロウイルス) プロモーター、RSV (ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV (モロニーマウス白血病ウイルス) LTR、HSV-TK (単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ)プロモーター等が用いられる。一実施形態において、プロモーターはCMVプロモーターまたはSRアルファプロモーターである。宿主細胞が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、ラムダP.sub.Lプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーター等のいずれかのプロモーターを使用することができる。宿主がバチルス属である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等のいずれかのプロモーターを使用することができる。宿主が酵母の場合には、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等のいずれかのプロモーターを用いることができる。宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター等を用いてもよい。宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーター等のいずれかのプロモーターを用いることができる。
【０３３０】
所望であれば、発現ベクターは、エンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリA付加シグナル、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等）、または複製起点のいずれか一つ以上も含む。
【０３３１】
本明細書に記載されるタンパク質ドメインをコードするRNAは、例えば、インビトロ転写系においてmRNAを転写することによって調製することができる。
【０３３２】
融合タンパク質をコードする発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養することにより、本発明の融合タンパク質を発現させることができる。本発明において有用な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。
【０３３３】
Escherichia属には、Escherichia coli K12.cndot.DH1［Proc. Natl. Acad. USA, 60, 160 (1968)］、Escherichia coli JM103［Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)］、Escherichia coli JA221［Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)］、Escherichia coli HB101［Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)］、Escherichia coli C600［Genetics, 39, 440 (1954)］等が含まれる。
【０３３４】
Bacillus属には、Bacillus subtilis M1114 [Gene, 24, 255 (1983)]、Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] 等が含まれる。
【０３３５】
本発明の融合タンパク質を発現するために有用な酵母としては、Saccharomyces cerevisiae AH22、AH22R.sup.-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、Schizosaccharomyces pombe NCYC1913、NCYC2036、Pichia pastoris KM71等が用られる。
【０３３６】
融合タンパク質は、例えばAcNPVのようなウイルスベクターを用いて昆虫細胞で発現される。昆虫宿主細胞としては、ヨトウガ幼虫由来樹立株（Spodoptera frugiperda細胞；SF細胞）、Trichoplusianiの中腸由来MG1細胞、High Five、Trichoplusianiの卵由来の細胞、Mamestra brassicae由来細胞、Estigmena acrea由来細胞等のいずれかの細胞株が用いられる。ウイルスがBmNPVの場合には、Bombyx mori由来株の細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）等を用いる。Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf 21細胞［上記すべて、In Vivo, 13, 213-217 (1977)］等が挙げられる。
【０３３７】
昆虫に関しては、Bombyx moriの幼虫、Drosophila、コオロギなどを用いて融合タンパク質が発現される[Nature, 315,592 (1985)]。
【０３３８】
融合タンパク質を発現するために哺乳動物細胞株が使用され得る。このような細胞株としては、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが挙げられる。ヒトその他の哺乳動物のiPS細胞、ES細胞などの多能性幹細胞、および種々の組織から調製された初代培養細胞が使用される。また、ゼブラフィッシュ胚、Xenopus卵母細胞などを用いることもできる。
【０３３９】
当業者によく知られる方法を用いて植物細胞が培養物中に維持され得る。植物細胞培養には、様々な植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、トマト、キュウリ、ナス、カーネーション、Eustoma russellianum、タバコ、Arabidopsis thaliana）から調製される、懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉断片、根断片等が関わる。
【０３４０】
上記の宿主細胞は全て、ハプロイド（一倍体）または倍数体（例えば二倍体、三倍体、四倍体など）であり得る。
【０３４１】
本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターは、任意のトランスフェクション法を用いて宿主細胞に導入される（例えばリゾチーム、PEG、CaCl2共沈法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子銃、リポフェクション、アグロバクテリウム等を使用して）。トランスフェクション方法は、トランスフェクションされるべき宿主細胞に基づいて選択される。Escherichia coliは、例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)等に記載された方法に従って形質転換され得る。バチルス属で形質導入する方法は、例えば、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) に記載されている。
【０３４２】
酵母細胞は、例えばMethods in Enzymology, 194, 182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) 等に記載された方法を用いて形質導入され得る。
【０３４３】
昆虫細胞は、例えばBio/Technology, 6, 47-55 (1988)等に記載された方法を用いてトランスフェクトされる。
【０３４４】
哺乳動物細胞は、例えば、Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995)（Shujunsha刊行）、およびVirology, 52, 456 (1973) に記載されている方法を用いてトランスフェクトされる。
【０３４５】
本発明の発現ベクターを含む細胞は、宿主に応じて変わる公知の方法に従って培養される。
【０３４６】
例えば、Escherichia coliまたはBacillus属細胞を培養する場合、液体培地が使用される。培地は、好ましくは、炭素源、窒素源、無機物質、および形質転換体の成長に必要な他の成分を含む。炭素源の例としては、グルコース、デキストリン、可溶性デンプン、スクロースなどが挙げられる。窒素源の例としては、アンモニウム塩、硝酸塩、コーンスティープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆ケーキ、ジャガイモエキス等のような無機又は有機物質が挙げられ、無機物質としては、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培地はまた、酵母エキス、ビタミン、成長促進因子などを含有してもよい。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。
【０３４７】
Escherichia coliを培養するための培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM 9培地が用いられる［Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972］。Escherichia coliは通常約15〜約43℃で培養される。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
【０３４８】
Bacillus属は一般に約30〜約40°Cで培養する。必要に応じて曝気及び攪拌が行われる。
【０３４９】
酵母の培養に適した培地の例としては、バークホルダー最少培地［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)］、0.5%カザミノ酸含有SD培地［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)］等が挙げられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、一般に約20℃〜約35℃で行う。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
【０３５０】
昆虫細胞や昆虫を培養するための培地としては、不活化10%ウシ血清の添加剤を含有するグレース昆虫培地（Nature, 195, 788 (1962)）等が用いられる。培地のpHは好ましくは約6.2〜約6.4である。細胞は約27℃で培養される。必要に応じて通気および撹拌を行ってもよい。
【０３５１】
哺乳動物細胞は、例えば、約5〜約20%のウシ胎児血清を含有する最小必須培地 (MEM)（Science, 122, 501 (1952)）、Dulbecco改変イーグル培地 (DMEM)（Virology, 8, 396 (1959)）、RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)）、199培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)）等のいずれかで培養される。培地のpHは好ましくは約6〜約8である。培養は、約30℃〜約40℃で行われる。必要に応じて通気および撹拌を行ってもよい。
【０３５２】
植物細胞を培養するための培地としては、例えば、MS培地、LS培地、B5培地等が用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、一般に約20℃〜約30℃で行われる。必要に応じて曝気及び攪拌を行ってもよい。
【０３５３】
融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター（重金属イオンによって誘導される）、熱ショックタンパク質プロモーター（熱ショックによって誘導される）、Tet-ON/Tet-OFF系プロモーター（テトラサイクリンまたはその誘導体の追加または除去によって誘導される）、ステロイド応答性プロモーター（ステロイドホルモンまたはその誘導体によって誘導される）等）を用いて調節することができ、誘導剤が適切な段階で培地に添加されて（または培地から除去されて）融合タンパク質の発現を誘導する。
【０３５４】
大腸菌などの原核細胞は誘導プロモーターを利用することができる。誘導性プロモーターの例としては、lacプロモーター（IPTGによって誘導される）、cspAプロモーター（寒冷ショックによって誘導される）、araBADプロモーター（アラビノースによって誘導される）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５５】
［核酸塩基エディターの、核酸に基づく送達］
本開示による核酸塩基エディターをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法により、または本明細書に記載されるように、対象に投与され得、または細胞（例えば細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物の細胞）に送達され得る。例えば、核酸塩基エディターは、例えばベクター（例えばウイルス性または非ウイルス性ベクター）、ベクターに基づかない方法（例えば、裸のDNAまたはDNA複合体の使用）、またはそれらの組合せによって送達することができる。
【０３５６】
核酸塩基エディターをコードする核酸は、例えばトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、裸のDNAまたはRNAとして細胞（例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物細胞）に直接送達され得るか、または標的細胞による取り込みを促進させる分子（例えばN-アセチルガラクトサミン）にコンジュゲート化され得る。ベクターのような核酸ベクターも使用され得る。
【０３５７】
核酸ベクターは、本明細書中に記載される融合タンパク質のドメインをコードする1以上の配列を含むことができる。ベクターはまた、タンパク質をコードする配列に付随する（例えば、挿入されているか、融合されている）シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のためのもの）をコードする配列も含むことができる。一例として、核酸ベクターは、一つ以上の核局在化配列（例えばSV40からの核局在化配列）を含むCas9コード配列と、一つ以上のデアミナーゼを含むことができる。
【０３５８】
核酸ベクターはまた、任意の適切な数の調節/制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Kozakコンセンサス配列、または内部リボソームエントリー部位 (IRES) を含むことができる。これらのエレメントは当技術分野でよく知られている。
【０３５９】
本開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは、本明細書中で上記した。当技術分野で知られる他のウイルスベクターも使用することができる。さらに、ウイルス粒子を用いて、核酸および/またはペプチドの形態のゲノム編集システム成分を送達することができる。例えば、「空の」ウイルス粒子は、任意の適切なカーゴを含有するようにアセンブルされ得る。ウイルスベクターおよびウイルス粒子はまた、標的化リガンドを組み込んで標的組織特異性を変化させるように操作することができる。
【０３６０】
ウイルス性ベクターに加えて、本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達するために非ウイルス性ベクターを使用することもできる。非ウイルス性核酸ベクターの1つの重要なカテゴリーは、有機または無機であり得るナノ粒子のものである。ナノ粒子は当技術分野でよく知られており、任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素またはそのような構成要素をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば、脂質および/またはポリマー）ナノ粒子が、本開示の特定の実施形態において送達ビヒクルとしての使用のために適切となり得る。ナノ粒子製剤、および/または遺伝子導入において使用するための例示的な脂質を、表６（下記）に示す。
【０３６１】
【表６】
2022500017.tif 000032
【０３６２】
表７は、遺伝子移入および／またはナノ粒子製剤における使用のための例示的なポリマーを列記する。
【表７】
2022500017.tif 000033
【０３６３】
表８は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための送達方法を要約する。
【表８】
2022500017.tif 000034
【０３６４】
ある態様において、本開示は、例えばウイルスベクターを使用した、融合タンパク質のウイルス性送達に関する。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター(例えばMaloney murine leukemia virus, MML-V)、アデノウイルスベクター(例えばAD 100)、レンチウイルスベクター(HIVおよびFIVベースのベクター)、ヘルペスウイルス(例えばHSV-2)、およびアデノ関連ウイルスベクターが挙げられる。
【０３６５】
［アデノ随伴ウイルスベクター］
AAVはパルボウイルスファミリーに属する小さな一本鎖DNA依存性ウイルスである。4.7 kbの野生型 (wt) AAVゲノムは、それぞれ四つの複製タンパク質および三つのキャプシドタンパク質をコードする二つの遺伝子からなり、両側に145 bpの逆方向末端反復配列 (ITR) がある。ビリオンは三つのキャプシドタンパク質Vp1、Vp2およびVp3から成り、これらは同じオープンリーディングフレームから1:1:10比で産生されるが、異なるスプライシング (Vp1) および選択的翻訳開始部位(Vp2とVp3のそれぞれ)から産生される。Vp3はビリオン中に最も豊富に存在するサブユニットであり、ウイルスの指向性を規定する細胞表面での受容体認識に関与する。ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインがVp1のユニークなN末端に同定されている。
【０３６６】
組換えAAV (rAAV) は、wt AAVと同様に、ベクター導入遺伝子カセットを挟むシス作用性145 bp ITRを利用し、外来DNAのパッケージングのために最大4.5 kbを提供する。感染後、rAAVは本発明の融合タンパク質を発現することができ、環状の頭・尾コンカテマーの状態のエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続することができる。このシステムを用いたrAAVの成功例は数多くあるが、in vitroおよびin vivoでは、パッケージング能力が限られているため、遺伝子のコード配列の長さがwt AAVゲノムの長さ以上である場合にAAV媒介遺伝子送達の使用が制限されている。
【０３６７】
AAVベクターの小さいパッケージング能力は、このサイズを超える多数の遺伝子の送達および/または大きな生理学的調節エレメントの使用を困難にする。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を2つ以上の断片に分割することによって対処することができ、ここで、N末端断片を分割インテイン-Nに融合し、C末端断片を分割インテイン-Cに融合する。そしてこれらの断片を2つ以上のAAVベクターにパッケージングする。一実施形態では、AAVキャプシドタンパク質上にグラフトされる核酸塩基エディタータンパク質の断片または部分が、インテインを利用して繋げられる。本明細書中で使用される場合、「インテイン」とは、隣接するN末端エクステインおよびC末端エクステイン（例えば、連結されるべき断片）をライゲートする自己スプライシングタンパク質イントロン（例えばペプチド）を指す。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)に記載されている。例えば、インテインIntNおよびIntCは、別々のタンパク質断片に融合された場合、互いを認識して、自身をスプライスして排出し、それと同時に、融合している上記タンパク質断片の隣接するN-およびC-末端エクステインをライゲートして、それによってそれによって2つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成する。他の適切なインテインは当業者に明らかであろう。
【０３６８】
本発明の融合タンパク質の断片は、長さを変えることができる。ある態様において、タンパク質断片は、長さが2アミノ酸〜約1000アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約5アミノ酸〜約500アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約20アミノ酸〜約200アミノ酸の範囲である。ある態様において、タンパク質断片は、長さが約10アミノ酸〜約100アミノ酸の範囲である。他の長さの適切なタンパク質断片は、当業者には明らかであろう。
【０３６９】
ある態様において、ヌクレアーゼの一部または断片（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼのようなデアミナーゼの断片、またはCas9の断片）がインテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのN末端またはC末端に融合され得る。ある態様において、融合タンパク質の一部または断片は、インテインに融合され、AAVキャプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼおよびキャプシドタンパク質は、任意の配置(例えば、ヌクレアーゼ-インテイン-キャプシド、インテイン-ヌクレアーゼ-キャプシド、キャプシド-インテイン-ヌクレアーゼなど)で一緒に融合され得る。いくつかの実施形態において、インテインのN末端は融合タンパク質のC末端に融合され、インテインのC末端はAAVキャプシドタンパク質のN末端に融合される。
【０３７０】
一実施形態では、大きな導入遺伝子発現カセットを二つの別々の半分(5’および3’末端、またはヘッドおよびテール)に分割することによって二重AAVベクターが生成され、カセットの各半分が単一のAAVベクター(5 kb未満)内にパッケージングされる。次いで、両方の二重AAVベクターによる同一細胞の同時感染に続いて、(1) 5’および3’ゲノム（二重AAV重複ベクター）間の相同組換え (HR)；(2) ITRを介した5′及び3′ゲノム(二重AAVトランススプライシングベクター)の尾・頭コンカテマー化；または (3) それら二つのメカニズムの組み合わせ(二重AAVハイブリッドベクター)により、完全長トランスジーン発現カセットの再構築が達成される。in vivoでの二重AAVベクターの使用は完全長タンパク質の発現をもたらす。二重AAVベクタープラットフォームの使用は、>4.7 kbの大きさの導入遺伝子のための効率的で実行可能な遺伝子導入戦略を表す。
【０３７１】
［核酸塩基エディターのスクリーニング］
「分割された」および再構築されたCas9を含む核酸塩基エディター融合タンパク質の適合性は、本明細書中に記載されるような様々なスクリーニングアプローチにおいて評価することができる。試験される融合タンパク質の各断片は、レポーター（例えばGFP）をコードする少量のベクターと共に目的の単一細胞（例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、または動物細胞）に送達される。これらの細胞は、例えば293T、K562またはU20Sなどのヒト細胞株において不死化することができる。あるいは、初代ヒト細胞を使用することができる。そのような細胞は、最終的な細胞標的に関連し得る。
【０３７２】
送達は、ウイルスベクターを用いて実施され得る。一実施形態において、トランスフェクションは、脂質トランスフェクション(LipofectamineやFugeneなど)を用いて、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。トランスフェクション後、GFPの発現を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーのいずれかによって測定して、一貫した高レベルのトランスフェクションを確認することができる。最も高い活性を与えるエディターの組み合わせを決定するために、これらの予備的なトランスフェクションは異なる複数の核酸塩基エディターを含むことができる。
【０３７３】
核酸塩基エディターの活性は、本明細書に記載のように、すなわち細胞のゲノムの配列決定をして標的配列の変化を検出することによって評価される。サンガー配列決定のためには、精製されたPCRアンプリコンをプラスミド骨格中にクローン化し、形質転換し、ミニプレップし、単一のプライマーで配列決定する。配列決定はまた、次世代配列決定技術を用いて実施されてもよい。次世代配列決定を使用する場合、アンプリコンは、意図された切断部位が非対称に配置された300〜500 bpであり得る。PCRに続いて、次世代配列決定のアダプターおよびバーコード(たとえば、Illumina multiplexアダプターとインデックス)をアンプリコンの末端に付加し得る（例えば高スループット配列決定(例えばIllumina MiSeq上でのもの)で使用するために）。
【０３７４】
最初の試験で最大レベルの標的特異的改変を誘導する融合タンパク質を、さらなる評価のために選択し得る。
【０３７５】
特定の実施形態では、核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的化する。一実施形態では、核酸塩基エディターを用いて、スプライス部位、エンハンサー、および転写調節エレメントを含むがこれらに限定されない調節配列を標的化する。次いで、その調節エレメントにより制御される遺伝子の発現に対する該改変の影響を、当該技術分野で知られる任意の方法を用いてアッセイする。
【０３７６】
他の実施形態では、本発明の核酸塩基エディターを用いて、相補性決定領域（CDR）をコードするポリヌクレオチドを標的化し、それによって、発現されるCDRにおける改変を生じさせる。次いで、CDR機能に対するこれらの改変の効果を、例えば抗原に対するCDRの特異的結合を測定することによって、アッセイする。
【０３７７】
さらに他の実施形態では、本発明の核酸塩基エディターを用いて、生物（例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物）のゲノム内の目的のポリヌクレオチドを標的化する。一実施形態において、本発明の核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の様々な配列をタイル状にカバーするために使用されるガイドRNAのライブラリと共に細胞に送達され、それによってゲノム全体に渡って配列を系統的に改変する。
【０３７８】
［核酸塩基エディターのアプリケーション］
核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的とし、タンパク質発現を改変する変化を作り出すことができる。一実施形態では、核酸塩基エディターは、スプライス部位、エンハンサー、および転写調節エレメントを含むがこれらに限定されない非コード配列または調節配列を改変するために使用される。次いで、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、その調節エレメントによって制御される遺伝子の発現に対する当該改変の影響をアッセイする。特定の実施形態において、核酸塩基エディターは、調節配列を実質的に変化させて、それによって、遺伝子発現を調節するその能力を消失させることができる。有利なことに、これは、他のRNAプログラミング可能ヌクレアーゼとは対照的に、ゲノム標的配列に二本鎖切断を生じることなく行うことができる。
【０３７９】
核酸塩基エディターを用いて、目的のポリヌクレオチドを標的とし、タンパク質活性を改変する変化を作り出すことができる。例えば、突然変異誘発の文脈において、核酸塩基エディターは、エラープローンPCRおよび他のポリメラーゼベースの方法と比べて多くの利点を有する。ポリヌクレオチド全体にわたってランダムな変化を誘導するエラープローンPCRとは異なり、本発明の核酸塩基エディターは、対象タンパク質の規定された領域内の特定のアミノ酸を標的化するために使用できる。
【０３８０】
他の実施形態において、本発明の核酸塩基エディターは、生物のゲノム内の目的のポリヌクレオチドを標的化するために使用される。一実施形態において、生物は、微生物叢の細菌（例えばBacteriodetes、Verrucomicrobia、Firmicutes；ガンマプロテオバクテリア、アルファプロテオバクテリア、Bacteriodetes、Clostridia、Erysipelotrichia、Bacilli；Enterobacteriales、Bacteriodales、Verrucomicrobiales、Clostridiales、Erysiopelotrichales、Lactobacillales；Enterobacteriaceae、Bacteroidaceae、Erysiopelotrichaceae、Prevotellaceae、Coriobacteriaceae、およびAlcaligenaceae；Escherichia、Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Clostridium、Lactobacillus）である。別の実施形態では、生物は農業上重要な動物（例えば牛、羊、山羊、馬、鶏、七面鳥）または植物（例えば大豆、小麦、トウモロコシ、綿、アブラナ、米、タバコ、リンゴ、ブドウ、モモ、プラム、チェリー）である。一実施形態において、本発明の核酸塩基エディターは、細胞のゲノム内の種々の配列をタイル状にカバーするために使用されるガイドRNAのライブラリーと共に細胞に送達され、それによってゲノム全体に渡る配列を系統的に変化させる。
【０３８１】
突然変異を、種々のタンパク質のいずれかにおいて作製して、構造-機能分析を促進ささせ、またはタンパク質の内因性活性を変化させ得る。突然変異は、例えば、酵素（例えばキナーゼ、ホスファターゼ、カルボキシラーゼ、ホスホジエステラーゼ）または酵素基質、受容体またはそのリガンド、ならびに抗体およびその抗原において作製され得る。一実施形態では、核酸塩基エディターは、酵素の活性部位、受容体のリガンド結合部位、または抗体の相補性決定領域 (CDR) をコードする核酸分子を標的とする。酵素の場合、活性部位に変異を導入すると、酵素活性が増加、減少、または消失し得る。酵素に対する突然変異の影響は、当技術分野で知られるおよび/または当業者には明らかである多くのアッセイのいずれかを含む、酵素活性アッセイにおいて特徴付けされる。受容体の場合、リガンド結合部位に生成された変異は、リガンドに対する受容体の親和性を増加、減少、または消失させ得る。このような突然変異の効果は、当技術分野で知られるおよび/または当業者には明らかである多くのアッセイのいずれかを含む、受容体/リガンド結合アッセイにおいてアッセイされる。CDRの場合、CDR内に生成された突然変異は、抗原への結合を増加、減少、または消失させ得る。あるいは、CDR内に生成された突然変異は、抗原に対する抗体の特異性を変化させ得る。次いで、例えばその抗原に対するCDRの特異的結合を測定することによって、または任意の他の種類のイムノアッセイにおいて、CDR機能に対するこれらの改変の影響がアッセイされる。
【０３８２】
本開示は、本明細書に提供される塩基エディターシステムによって補正することができる遺伝子変異（遺伝子変換を含む）、スプライシングに影響を及ぼす（例えば、スプライスドナーまたはアクセプター部位を変化させる）点突然変異、点突然変異に起因する異常タンパク質もしくはミスフォールドタンパク質に関連するかまたはそれらによって引き起こされる疾患と診断された対象の治療のための方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、そのような疾患（例えば遺伝子変換または他の遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患）を有する対象に、その疾患関連遺伝子における突然変異と直接的または間接的に関連するヌクレオシド塩基を編集する有効量の核酸塩基エディター（例えば1つまたは複数のDNA結合タンパク質ドメインを含む、アデノシンデアミナーゼ塩基エディターまたはシチジンデアミナーゼ塩基エディター）を投与することを含む方法が提供される。特定の態様において、追加の疾患または障害、例えばデアミナーゼ媒介遺伝子編集によって補正または改善することができる点突然変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または障害の治療のための方法が提供される。いくつかのそのような疾患が本明細書に記載されており、本明細書に提供される戦略および融合タンパク質で治療することができるさらなる適切な疾患は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。
【０３８３】
［医薬組成物］
本開示の他の態様は、本明細書に記載される塩基エディター、融合タンパク質、または融合タンパク質-ガイドポリヌクレオチド複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」は、本明細書中で使用される場合、薬学的使用のために処方される組成物を指す。いくつかの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。ある態様において、薬学的組成物は、さらなる薬剤（例えば特異的送達、半減期の延長のためのもの、または他の治療化合物）を含む。
【０３８４】
ここで使用されるところの用語「薬学的に許容される担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、あるいはステアリン酸)、または溶媒カプセル化材料などの、身体のある部位(例えば送達部位)から別の部位(例えば器官、組織または身体の一部)への化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合し、対象の組織に有害でないという意味で許容される(例えば生理的適合性、無菌性、生理的pH等)。
【０３８５】
薬学的に許容される担体として役立つことができる物質のいくつかの非限定的な例は、以下を含む: (1) ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖;(2) コーンスターチ、ジャガイモでん粉等のでん粉;(3) セルロース及びその誘導体 (カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース等);(4) トラガント末;(5) モルト;(6)ゼラチン;(7) ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の潤滑剤;(8) ココアバター、坐剤用ワックス等の添加剤;(9) 落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油等の油;(10) プロピレングリコール等のグリコール;(11) ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール (PEG); (12) エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;(13) 寒天;(14) 水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤;(15) アルギン酸;(16) パイロジェンフリー水;(17) 生理食塩液;(18) リンガー液;(19)エチルアルコール;(20) pH緩衝液;(21) ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物;(22) ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤 (23) エタノールのような血清アルコール;及び (23) 製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、風味料、香料、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在させることができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【０３８６】
薬学的組成物は、約5.0〜約8.0の範囲などの生理学的pHを反映する所定のレベルに製剤のpHを維持するために、一つ以上のpH緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤で使用されるpH緩衝化合物は、アミノ酸またはヒスチジンなどのアミノ酸の混合物、またはヒスチジンおよびグリシンなどのアミノ酸の混合物であり得る。あるいは、pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベル、例えば約5.0〜約8.0の範囲に維持し、カルシウムイオンをキレートしない剤であることが好ましい。このようなpH緩衝化合物の典型的な例としては、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベルに維持するのに適した任意の量で存在し得る。
【０３８７】
薬学的組成物はまた、一つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、処方物の浸透圧特性(例えば、等張性、オスモラリティ、および／または浸透圧)をレシピエント個体の血流および血液細胞にとって許容可能なレベルに調節する化合物を含有することができる。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する当業者に公知または入手可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の処方における使用のための所定の浸透圧調節剤の適合性を経験的に決定することができる。適切なタイプの浸透圧調節剤の例示的な例としては、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムのような塩；スクロース、デキストロース、マンニトールなどの糖;グリシンなどのアミノ酸;これらの薬剤および/または薬剤タイプの1つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在し得る。
【０３８８】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象への送達のために、例えば遺伝子編集のために製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物を投与する適切な経路は、限定されるものではないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内投与を含む。
【０３８９】
いくつかの態様において、本明細書に記載される薬学的組成物は、患部(例えば腫瘍部位)に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料であり、例えば、シアラスティック膜、または繊維などの膜を含む。
【０３９０】
他の態様において、本明細書に記載される薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる(例えばLanger, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。(例えばMedical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105.)。他の制御放出システムは、例えば、上記Langerに記載されている。
【０３９１】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適合された組成物として、ルーチンの手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、可溶化剤としての無菌等張使用の溶液および注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬である。一般に、成分は、単位投与形態、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットのような密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは一緒に供給される。薬剤が注入によって投与される場合には、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いてそれを分注することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３９２】
全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば滅菌生理食塩水、乳酸化リンゲル液またはハンク液であり得る。さらに、医薬組成物は、固体形態であって、使用の直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた考えられる。医薬組成物は、非経口投与にも適した、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内に含有することができる。粒子は、組成物がその中に含まれる限り、単ラメラまたは複数ラメラのような任意の適切な構造であり得る。化合物は、融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低量(5-10モル%)のカチオン性脂質を含み、ポリエチレングリコール (PEG) コーティングにより安定化された、「安定化プラスミド脂質粒子」(SPLP)中に捕捉され得る (Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47)。このような粒子および小胞には、N-[l-(2,3-ジオレオイルキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アモニウムメチル硫酸塩、あるいは「DOTAP」のような正電荷脂質が特に好ましい。このような脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016;および4,921,757号参照（その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３９３】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、単位用量として投与または包装することができる。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単一用量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（例えば担体、またはビヒクル）と合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０３９４】
さらに、この薬学的組成物は、 (a) 凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器、および (b) 本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈のために使用される、薬学的に許容される希釈剤 (例えば無菌のもの) を含有する第2の容器を含む薬学的キットとして提供することができる。必要に応じて、そのような容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された様式の通知であって、人に投与するための製造、使用又は販売の機関による承認を反映するものとすることができる。
【０３９５】
別の態様では、上記疾患の治療に有用な材料を含む製品が含まれる。いくつかの実施態様において、製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、容器は、本明細書に記載される疾患を治療するために有効である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたは容器に付随するラベルは、選択される疾患を治療するために組成物が使用されることを示す。製品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用説明書付き添付文書を含め、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質を含むことができる。
【０３９６】
いくつかの態様において、本明細書に記載される融合タンパク質、gRNA、および/または複合体のいずれかは、薬学的組成物の一部として提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、gRNAおよびカチオン性脂質と複合体を形成するRNA-ガイドヌクレアーゼ(例えばCas9)を含むリボ核タンパク質複合体を含む。ある態様において、薬学的組成物は、gRNA、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、場合により、1つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。
【０３９７】
いくつかの態様において、本明細書に記載される融合タンパク質、gRNA、システム、および/または複合体のいずれかは、薬学的組成物の一部として提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供されるシステムまたは複合体のいずれかを含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、gRNAおよびカチオン性脂質と複合体を形成するRNA-ガイドヌクレアーゼ（例えばCas9）またはその断片を含むリボ核タンパク質複合体を含む。ある態様において、薬学的組成物は、複数のプログラミング可能DNA結合タンパク質（例えば、Cas9、ジンクフィンガー、TALE、TALE-Nタンパク質またはそれらの断片）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。プログラミング可能DNA結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性、もしくはニッカーゼ活性を含み得、またはヌクレアーゼ活性を含まなくてもよい。ある態様において、薬学的組成物は、gRNA、核酸プログラム可能DNA結合タンパク質、カチオン性脂質、および薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書に記載される薬学的組成物は、場合により、1つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。
【０３９８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物は、対象内で標的化されたゲノム改変を行うために、対象、例えばヒト対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象から細胞が取得され、本明細書中に提供される医薬組成物のいずれかと接触される。いくつかの実施形態において、対象から取り出されて医薬組成物とex vivoで接触された細胞は、任意で、所望のゲノム改変が細胞内で行われたかまたは検出された後に、対象に再導入される。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を送達する方法は公知であり、例えば米国特許第6,453,242号、6,503,717号、6,534,261号、6,599,692号、6,607,882号、6,689,558号、6,824,978号、6,933,113号、6,979,539号、7,013,219号、および7,163,824号に記載されており、それらの全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主として、ヒトへの投与に適した医薬組成物に向けられているが、当業者には、そのような組成物が、あらゆる種類の動物または生物への投与に一般的に適していることが理解される。種々の動物への投与に適した組成物を与えるための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、もし必要だとしても単に通常の実験で、そのような改変を設計および/または実施することができる。薬学的組成物の投与が意図される対象には、限定されるものではないが、ヒトおよび/または他の霊長類;哺乳動物、家畜、ペット、およびウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および/またはラットなどの商業的に関連のある哺乳動物;ニワトリ、カモ、ガチョウ及び/又は七面鳥のような商業的に関連のある鳥類が含まれる。
【０３９９】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つ以上の他の補助成分と会合させ、次いで、必要および/または所望であれば、製品を所望の単回または複数回投与単位に成形および/または包装する工程を含む。
【０４００】
薬学的製剤はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、それは、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適した、溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などのいずれかおよび全てを含む。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示する。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を製造するためのさらなる適切な方法、試薬、賦形剤および溶媒については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPCT出願PCT/US2010/055131(2010年11月2日出願、公開番号WO2011053982 A8)も参照のこと。あらゆる従来の賦形剤媒体は、望ましくない生物学的効果を生じさせること、または他のかたちで医薬組成物の何らかの他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用が本開示の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明による組成物は、多様な疾患、障害、および／または状態のいずれかの処置のために使用され得る。
【０４０１】
［キット、ベクター、細胞］
本開示の種々の態様は、デアミナーゼと、2つの断片に「分割」されたSpnCas9ドメイン（N末端断片がインテイン系の1つのメンバーを含み、C末端断片がおよびインテイン系の別のメンバーを含む）と、NLSとを含む核酸塩基エディター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含むキットを提供し、ここで、該ヌクレオチド配列は、融合タンパク質の発現を駆動する異種プロモーターの制御下にある。
【０４０２】
本開示のいくつかの態様は、本明細書に提供される核酸塩基エディター／融合タンパク質のいずれかを含む細胞（例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、および動物細胞）を提供する。ある態様において、細胞は、本明細書に提供されるヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む。
【０４０３】
本発明の実施は、別段の表示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を利用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis”(Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)などの文献で詳しく説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、したがって、本発明の製造および実施において考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技術は、以下のセクションで論じられる。
【０４０４】
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をいかに作って使用するかの完全な開示および説明を提供するために記載されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０４０５】
［実施例１：分割され再構成されたCas9は塩基編集システムにおける機能と活性を保持する］
ウイルスベクターは、魅力的な送達システムを提供するが、現在の技術は、より大きなポリヌクレオチドを送達する能力に限界がある。塩基編集系に関連するこれらの課題を検討するために、N末端からC末端の順で、野生型アデノシンデアミナーゼであるTadA、それに融合された進化型のTadA、それに融合されたnCas9、それに融合された二部分NLSを含む融合タンパク質を作製した。該融合タンパク質は、SpCas9の非構造化領域内でN末端断片とC末端断片に分割され、ガイドRNAをコードする第3のプラスミドとともに2つのベクターにおいて送達された。nCas9のN末端断片およびC末端断片はそれぞれインテイン-Nおよびインテイン-Cに融合された。これらのインテインをコードするアミノ酸配列は以下の通りである。
【０４０６】
融合体におけるCfa-N インテイン：
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４０７】
融合体におけるCfa(GEP)-C インテイン：
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNC
【０４０８】
これらのインテインをコードするポリヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０４０９】
融合体におけるCfa-N インテイン：
TGCCTGAGCTACGATACCGAGATCCTGACCGTGGAATACGGCTTCCTGCCTATCGGCAAGATCGTCGAGGAACGGATCGAGTGCACAGTGTACACCGTGGATAAGAATGGCTTCGTGTACACCCAGCCTATCGCTCAGTGGCACAACAGAGGCGAGCAAGAGGTGTTCGAGTACTGCCTGGAAGATGGCAGCATCATCCGGGCCACCAAGGACCACAAGTTTATGACCACCGACGGCCAGATGCTGCCCATCGACGAGATCTTTGAGAGAGGCCTGGACCTGAAACAGGTGGACGGACTGCCT
【０４１０】
融合体におけるCfa(GEP)-C インテイン：
ATGGTCAAGATCATCAGCAGAAAGAGCCTGGGCACCCAGAACGTGTACGATATCGGAGTGGGCGAGCCCCACAACTTTCTGCTCAAGAATGGCCTGGTGGCCAGCAACTGC
【０４１１】
spCas9の3つの領域が選択され、そこでABE融合タンパク質が、SpCas9の選択された領域内のAla、Ser、ThrまたはCys残基においてN‐およびC‐末端断片に分割された。これらの領域はCas9結晶構造解析によって同定されたループ領域に相当する。各断片のN末端がインテイン-Nに融合され、各断片のC末端が、図2〜4に示されるアミノ酸位置、すなわち、下記の配列において太字の大文字で示されるS303、T310、T313、S355、A456、S460、A463、T466、S469、T472、T474、C574、S577、A589、およびS590でインテインCに融合された。
2022500017.tif 000035
【０４１２】
HEK 293細胞をプラスミドでトランスフェクトした。培養細胞でN末端断片とC末端断片が発現され一緒に連結されたときに、分割インテイン系を用いた融合タンパク質の再構成が起こり、そこでそれらはガイドRNAと結合し、それによって機能的な核酸塩基編集系を生成した。使用されたガイドRNAの配列は以下の通りである。
【０４１３】
20-ntガイドプロトスペーサー（PAM: AGG）
5’-TGTCGAAGTTCGCCCTGGAG-3’
【０４１４】
ハンマーヘッド型リボザイム（下記配列）が、上記のプロトスペーサーの5’末端に融合されている。
5’-GTCGACACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC-3’
【０４１５】
21-nt ABCA4ガイドプロトスペーサー（PAM: AGG）
5’-GTGTCGAAGTTCGCCCTGGAG-3’
【０４１６】
HEK2ガイドプロトスペーサー（PAM: GGG）
5’-GAACACAAAGCATAGACTGC-3’
【０４１７】
完全ガイド配列は、プロトスペーサー配列が以下の配列の5’-側に直接付加されたものである。
5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’
【０４１８】
完全ガイド写産物は、20 ntガイドの場合はハンマーヘッド切断前で、以下の通りである。
【０４１９】
20-ntガイド
5’-GTCGACACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTCTGTCGA AGTTCGCCCTGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’
【０４２０】
21-ntガイド
5’-GTGTCGAAGTTCGCCCTGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’
【０４２１】
HEK2ガイド
5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT-3’
【０４２２】
塩基編集活性は、ABCA4遺伝子の変化を検出することによってアッセイした。塩基編集後の配列変化は、ハイスループットシークエンシング (HTS) を用いて検出した。再構成したABEの活性を、同じ細胞型で発現されたがただし単一プラスミドベクターを用いて送達されたABE7.10の活性と比較した。これらの実験の結果を図2-4に示す。
【０４２３】
図2は、Cas9の第1の領域内、アミノ酸292〜365内でABEを2つの断片に分割することが、再構成された融合タンパク質の塩基編集活性に与える影響を示す。驚くべきことに、再構成された塩基エディターは、21ヌクレオチド、20ヌクレオチド、およびHEK 2ガイドRNAの存在下で、単一ベクターで発現された対照塩基エディターと同等の活性を示した。
【０４２４】
SpCas9のF445〜K483およびE565〜T637の領域内のアミノ酸においてABEを2つの断片に分割することが、再構成された融合タンパク質の塩基編集活性に与える影響を図3に示す。ABEが分割される位置に関わらず、インテイン系を用いて融合タンパク質が再構成された場合には、それはABE7.10と同等の活性を示した。断片化融合タンパク質のN-またはC-末端部分のみを発現した場合には、塩基編集活性は観察されなかった。このように、編集はCas9のN末端断片とC末端断片の両方の存在に依存していた。図4に示すように、分割インテイン系を用いて再構成された融合タンパク質は、20ヌクレオチドガイドRNAがハンマーヘッドリボザイムを含んだ場合にも活性を示した。図2の実験は図3および図4とは異なるフォーマットで行われた。
【０４２５】
ここに報告された結果は、以下の方法および材料を用いて実施された。
【０４２６】
塩基編集システムを、5882G>A変異を含むレンチウイルス組み入れABCA4ポリヌクレオチドを含む培養HEK 293T細胞（HEK/ABCA4/5882G>A細胞）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクトされるDNAのμg当たり1.5μLのリポフェクタミン2000を用いて行った。塩基編集システムは、野生型アデノシンデアミナーゼであるTadA、それに融合されたTadAの進化バージョン、それに融合されたSpCas9、それに融合されたC末端二部分NLSを含む融合タンパク質、ABE7.10を含む。
【０４２７】
ABE7.10のN末端およびC末端断片をそれぞれpCAGプラスミドにクローン化し、そこでそれらの発現はCAGプロモーターによって駆動された。参照として、CMVプロモーター制御下のABE7.10をHEK 293T細胞に発現させた。前記核酸配列の各々はコドンを最適化されたものである。インテイン-Nに融合されたABE7.10のN末端断片をコードする第1のプラスミド、インテイン-Cに融合されたABE7.10のC末端断片をコードする第2のプラスミド、およびガイドRNAを発現するプラスミドという、3つのプラスミドで細胞をトランスフェクトした。塩基エディターをコードする2つのプラスミドは等モル比でトランスフェクトした（各半部分を9.05×10-14モル；863 ngの全エディターDNA）。ガイドに関しては、127 ngのガイドプラスミド（9.05×10^-14モル）を各トランスフェクションで使用した。
【０４２８】
対照：二部分NLS（C末端）およびGeneArtコドン最適化を有するpCMV-ABE7.10を490 ng（9.05×10-14モル）+ pNMG-B8（哺乳動物細胞では発現せず、トランスフェクトされるDNAの量をノーマライズするために使用された無関係のプラスミド）。
【０４２９】
図2〜図4に示された全長ABE7.10およびABE7.10「分割」Cas9をコードするポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０４３０】
完全ABE7.10：
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【０４３１】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S303C:
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【０４３２】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T310C:
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【０４３３】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T313C:
ATGAGCGAGGTGGAATTCAGCCACGAGTACTGGATGCGGCACGCCCTGACACTGGCCAAAAGAGCTTGGGACGAGAGGGAAGTGCCTGTGGGAGCTGTGCTGGTGCACAACAACAGAGTGATCGGCGAAGGCTGGAACAGACCCATCGGCAGACACGATCCTACAGCTCACGCCGAGATCATGGCCCTGAGACAAGGCGGACTGGTCATGCAGAACTACCGGCTGATCGACGCCACACTGTACGTGACCCTGGAACCTTGCGTGATGTGTGCCGGCGCTATGATCCACAGCAGAATCGGCAGAGTGGTGTTCGGCGCCAGAGATGCCAAAACAGGCGCTGCCGGAAGCCTGATGGATGTGCTGCATCACCCCGGCATGAACCACAGAGTGGAAATCACCGAGGGCATCCTGGCCGATGAATGTGCCGCTCTGCTGAGCGACTTCTTCCGGATGCGGCGGCAAGAGATCAAGGCCCAGAAGAAGGCCCAGTCCAGCACAGATAGCGGCGGATCTAGCGGAGGCAGCTCTGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACACCTGAAAGTTCTGGCGGTTCTTCTGGCGGCAGCAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACTATCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCTACTTCTTTAGAATGCCCAGACAGGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCTGCCTGAGCTACGATACCGAGATCCTGACCGTGGAATACGGCTTCCTGCCTATCGGCAAGATCGTCGAGGAACGGATCGAGTGCACAGTGTACACCGTGGATAAGAATGGCTTCGTGTACACCCAGCCTATCGCTCAGTGGCACAACAGAGGCGAGCAAGAGGTGTTCGAGTACTGCCTGGAAGATGGCAGCATCATCCGGGCCACCAAGGACCACAAGTTTATGACCACCGACGGCCAGATGCTGCCCATCGACGAGATCTTTGAGAGAGGCCTGGACCTGAAACAGGTGGACGGACTGCCTTGA
【０４３４】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S355C:
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【０４３５】
ABE7.10_Cfa-N_Split_A456C:
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【０４３６】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S460C:
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【０４３７】
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【０４３８】
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【０４４０】
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【０４４２】
ABE7.10_Cfa-N_Split_C574C:
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【０４４３】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S577C:
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【０４４４】
ABE7.10_Cfa-N_Split_A589C:
ATGAGCGAGGTGGAATTCAGCCACGAGTACTGGATGCGGCACGCCCTGACACTGGCCAAAAGAGCTTGGGACGAGAGGGAAGTGCCTGTGGGAGCTGTGCTGGTGCACAACAACAGAGTGATCGGCGAAGGCTGGAACAGACCCATCGGCAGACACGATCCTACAGCTCACGCCGAGATCATGGCCCTGAGACAAGGCGGACTGGTCATGCAGAACTACCGGCTGATCGACGCCACACTGTACGTGACCCTGGAACCTTGCGTGATGTGTGCCGGCGCTATGATCCACAGCAGAATCGGCAGAGTGGTGTTCGGCGCCAGAGATGCCAAAACAGGCGCTGCCGGAAGCCTGATGGATGTGCTGCATCACCCCGGCATGAACCACAGAGTGGAAATCACCGAGGGCATCCTGGCCGATGAATGTGCCGCTCTGCTGAGCGACTTCTTCCGGATGCGGCGGCAAGAGATCAAGGCCCAGAAGAAGGCCCAGTCCAGCACAGATAGCGGCGGATCTAGCGGAGGCAGCTCTGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACACCTGAAAGTTCTGGCGGTTCTTCTGGCGGCAGCAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACTATCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCTACTTCTTTAGAATGCCCAGACAGGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCACCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATTGCCTGAGCTACGATACCGAGATCCTGACCGTGGAATACGGCTTCCTGCCTATCGGCAAGATCGTCGAGGAACGGATCGAGTGCACAGTGTACACCGTGGATAAGAATGGCTTCGTGTACACCCAGCCTATCGCTCAGTGGCACAACAGAGGCGAGCAAGAGGTGTTCGAGTACTGCCTGGAAGATGGCAGCATCATCCGGGCCACCAAGGACCACAAGTTTATGACCACCGACGGCCAGATGCTGCCCATCGACGAGATCTTTGAGAGAGGCCTGGACCTGAAACAGGTGGACGGACTGCCTTGA
【０４４５】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S590C:
ATGAGCGAGGTGGAATTCAGCCACGAGTACTGGATGCGGCACGCCCTGACACTGGCCAAAAGAGCTTGGGACGAGAGGGAAGTGCCTGTGGGAGCTGTGCTGGTGCACAACAACAGAGTGATCGGCGAAGGCTGGAACAGACCCATCGGCAGACACGATCCTACAGCTCACGCCGAGATCATGGCCCTGAGACAAGGCGGACTGGTCATGCAGAACTACCGGCTGATCGACGCCACACTGTACGTGACCCTGGAACCTTGCGTGATGTGTGCCGGCGCTATGATCCACAGCAGAATCGGCAGAGTGGTGTTCGGCGCCAGAGATGCCAAAACAGGCGCTGCCGGAAGCCTGATGGATGTGCTGCATCACCCCGGCATGAACCACAGAGTGGAAATCACCGAGGGCATCCTGGCCGATGAATGTGCCGCTCTGCTGAGCGACTTCTTCCGGATGCGGCGGCAAGAGATCAAGGCCCAGAAGAAGGCCCAGTCCAGCACAGATAGCGGCGGATCTAGCGGAGGCAGCTCTGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGAGCGCCACACCTGAAAGTTCTGGCGGTTCTTCTGGCGGCAGCAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACTATCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCTACTTCTTTAGAATGCCCAGACAGGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCACCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCTGCCTGAGCTACGATACCGAGATCCTGACCGTGGAATACGGCTTCCTGCCTATCGGCAAGATCGTCGAGGAACGGATCGAGTGCACAGTGTACACCGTGGATAAGAATGGCTTCGTGTACACCCAGCCTATCGCTCAGTGGCACAACAGAGGCGAGCAAGAGGTGTTCGAGTACTGCCTGGAAGATGGCAGCATCATCCGGGCCACCAAGGACCACAAGTTTATGACCACCGACGGCCAGATGCTGCCCATCGACGAGATCTTTGAGAGAGGCCTGGACCTGAAACAGGTGGACGGACTGCCTTGA
【０４４６】
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【０４４７】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S-32C:
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【０４４８】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S303C:
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【０４４９】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T310C:
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【０４５０】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T313C:
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【０４５１】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S355C:
ATGGTCAAGATCATCAGCAGAAAGAGCCTGGGCACCCAGAACGTGTACGATATCGGAGTGGGCGAGCCCCACAACTTTCTGCTCAAGAATGGCCTGGTGGCCAGCAACTGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGTGA
【０４５２】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_A456C:
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【０４５３】
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【０４５４】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_A463C:
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【０４５５】
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【０４５６】
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【０４５７】
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【０４５８】
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【０４６０】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S577C:
ATGGTCAAGATCATCAGCAGAAAGAGCCTGGGCACCCAGAACGTGTACGATATCGGAGTGGGCGAGCCCCACAACTTTCTGCTCAAGAATGGCCTGGTGGCCAGCAACTGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGTGA
【０４６１】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_A589C:
ATGGTCAAGATCATCAGCAGAAAGAGCCTGGGCACCCAGAACGTGTACGATATCGGAGTGGGCGAGCCCCACAACTTTCTGCTCAAGAATGGCCTGGTGGCCAGCAACTGCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGTGA
【０４６２】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S590C:
ATGGTCAAGATCATCAGCAGAAAGAGCCTGGGCACCCAGAACGTGTACGATATCGGAGTGGGCGAGCCCCACAACTTTCTGCTCAAGAATGGCCTGGTGGCCAGCAACTGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGTGA
【０４６３】
完ABE7.10:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４６４】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S303C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLCLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４６５】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T310C:
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【０４６６】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T313C:
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【０４６７】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S355C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQCLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４６８】
ABE7.10_Cfa-N_Split_A456C:
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【０４６９】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S460C:
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【０４７０】
ABE7.10_Cfa-N_Split_A463C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFCLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４７１】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T466C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMCLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４７２】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S469C:
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【０４７３】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T472C:
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【０４７４】
ABE7.10_Cfa-N_Split_T474C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETICLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４７５】
ABE7.10_Cfa-N_Split_C574C:
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【０４７６】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S577C:
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【０４７７】
ABE7.10_Cfa-N_Split_A589C:
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【０４７８】
ABE7.10_Cfa-N_Split_S590C:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNACLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
【０４７９】
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【０４８０】
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【０４８１】
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【０４８２】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S355C:
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【０４８３】
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【０４８４】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S460C:
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【０４８５】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_A463C:
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【０４８６】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T446C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４８７】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T469C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４８８】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T472C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４８９】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_T474C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４９０】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_C574C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４９１】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S577C:
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【０４９２】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_A589C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCSLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４９３】
ABE7.10_Cfa(GEP)-C_Split_S590C:
MVKIISRKSLGTQNVYDIGVGEPHNFLLKNGLVASNCLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDEGADKRTADGSEFESPKKKRKV
【０４９４】
［実施例２：二重AAV感染を介した分割A→G塩基エディター（ABE）の送達は高度なA>G変換をもたらす］
インテイン-Nおよびインテイン-Cに融合させた分割A→G塩基エディターのAAV送達を、同時感染細胞において再会合して塩基編集活性を再構成する分割ABEの能力を含め、評価した。初期研究は、網膜細胞におけるAAV2同時感染のための最適な感染多重度 (MOI) を決定するために蛍光レポーター構築物を用いて行った。CMV-mCherryおよびCMV-EmGFPを含有するAAV2発現ベクターを用いて、同時感染をモニターした。フローサイトメトリーにより、ARPE-19細胞におけるAAV2同時感染のための最適MOIは60,000〜100,000 vg/細胞であることが明らかになった（図5A）。60,000 vg/細胞での共感染後3日目の蛍光顕微鏡観察は、EmGFPとmCherryの共局在を示した（図5B）。単感染でも、CMV-mCherry（図5C）とCMV-EmGFP（図5D）の両方について50,000 vg/細胞で蛍光レポーター発現を有する多数の細胞を示した（>95%）。蛍光細胞のパーセンテージは総ウイルス負荷に依存していた。
【０４９５】
二重AAV 2感染を介したARPE-19網膜細胞への分割エディターの送達は、ABCA4 5882Aにおいて高度なA>G変換を生じた（図6）。この実験では、Cas9 T310において分割されたABE（Cas9アミノ酸位置N309でインテイン-Nに融合されたN末端、およびCas9アミノ酸位置T310でインテインCに融合されたC末端）を評価した。AAVパッケージングのための通常の方法に従って（ウイルスベクターコア、マサチューセッツ大学医学部）、以下の構築物をAAV2ベクター中にパッケージ化した。
AAV2-N:  AAV2/ PCMV Split_ABE7.10N(T310)-IntN-rGpA | PU6sgRNA
AAV2-C:  AAV2/ PCMV IntC-Split_ABE7.10C(T310)-rGpA
網膜ARPE-19細胞を、両方のAAVベクターで共感染させるか、各AAVベクター単独で感染させるか、または未処置とした。20,000〜60,000 vg/細胞の様々なMOI（二重感染）で示されているように、ABCA4 5882AにおいてA>G変換が観察された。二重感染のMOIの増加とともにA>G変換は増加した（20,000 vg/細胞で約13%〜60,000 vg/細胞で約30%）。A>G変換は、低いレベルの（<0.1%）インデル形成を伴っていた。N-またはC-末端断片のみで感染した細胞および未処置細胞では、標的部位でのA>G変換は観察されなかった。
【０４９６】
［他の実施形態］
上述の説明から、種々の用途および条件に適用するために、本明細書に記載する本発明に変形および修正を加えることができることが明らかであろう。そのような実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
【０４９７】
本明細書における変数の定義における要素のリストの記載は、単一要素としての、またはリストされた要素の組合せ(またはサブコンビネーション)としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の説明は、単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはその一部と組み合わせての、その実施形態を含む。
【０４９８】
本明細書で言及されているすべての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2022500017.tif 000036
【図２】
2022500017.tif 000037
【図３】
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【図４】
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【図５−１】
2022500017.tif 000040
【図５−２】
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【図６】
2022500017.tif 000042
【配列表】
2022500017000001.app
【国際調査報告】
2022500017.tif 000043
2022500017.tif 000044
2022500017.tif 000045
2022500017.tif 000046
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