(57)【要約】本明細書では、インスリンとは無関係に血中グルコースクリアランスを増大させる過去に特性化されていない遺伝子及び遺伝子産物が開示される。また、分泌及び膜結合タンパク質を転写するｍＲＮＡを濃縮するための方法論、ならびに標識されたＳＥＣ６１ｂタンパク質を発現する非ヒト動物が記載されている。本開示のいくつかの態様は、対象における血中グルコースレベルの上昇に関連する障害を治療または予防する方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物（本明細書では時にＥＲｓｅｑ０８とも称される）のレベルまたは活性を増大させる有効量の薬剤を前記対象に投与することを含む、方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血中グルコースレベルの上昇に関連する障害を治療または予防する方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる有効量の薬剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を増大させる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を増大させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む、請求項１〜４の方法。
【請求項６】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項１〜５の方法。
【請求項７】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項１〜６の方法。
【請求項８】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項１〜７の方法。
【請求項９】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分を含む、請求項１〜８の方法。
【請求項１０】
前記薬剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１〜９の方法。
【請求項１１】
追加の抗糖尿病治療剤の投与をさらに含む、請求項１〜１０の方法。
【請求項１２】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、血中グルコースクリアランスを改善する、請求項１〜１１の方法。
【請求項１３】
前記薬剤の血中グルコースクリアランス特性は、インスリン活性とは無関係である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、低血糖を引き起こさない、請求項１〜１３の方法。
【請求項１５】
前記対象は、糖尿病を有する、請求項１〜１４の方法。
【請求項１６】
前記対象は、ヒトまたはマウスである、請求項１〜１５の方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、配列番号２のＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項１８】
前記機能的部分は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記機能的部分は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記機能的部分は、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。請求項１７の方法。
【請求項２１】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なるグリコシル化、リン酸化、または多量体化を有するＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質を含む、請求項１〜２０の方法。
【請求項２２】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、前記核酸は、配列番号１の配列またはその一部を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２３】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、前記核酸は、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列またはその一部を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２４】
前記薬剤は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２５】
前記薬剤は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２６】
前記薬剤は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２７】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を発現する細胞を含む、請求項１〜１６の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、β細胞である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記β細胞は、幹細胞由来である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記細胞は、マイクロカプセルに封入されている、請求項２７〜２９の方法。
【請求項３１】
前記薬剤の投与は、前記Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の異常な発現または活性を引き起こす前記対象における遺伝子欠陥を修正する、請求項１の方法。
【請求項３２】
対象に投与された場合、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる薬剤。
【請求項３３】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる、請求項３２の薬剤。
【請求項３４】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を増大させる、請求項３２の薬剤。
【請求項３５】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を増大させる、請求項３２の薬剤。
【請求項３６】
前記薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む、請求項３２〜３５の薬剤。
【請求項３７】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項３２〜３６の薬剤。
【請求項３８】
前記異なる翻訳後修飾は、異なるグリコシル化及び異なるリン酸化から選択される、請求項３７の薬剤。
【請求項３９】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項３２〜３８の薬剤。
【請求項４０】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む、請求項３２〜３９の薬剤。
【請求項４１】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分を含む、請求項３２〜４０の薬剤。
【請求項４２】
薬学的担体をさらに含む、請求項３２〜４１の薬剤。
【請求項４３】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を発現する細胞を含む、請求項３２〜４２の薬剤。
【請求項４４】
前記細胞は、β細胞である、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記β細胞は、幹細胞由来である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記細胞は、マイクロカプセルに封入されている、請求項４３〜４５の方法。
【請求項４７】
追加の抗糖尿病治療剤をさらに含む、請求項３２〜４６の薬剤。
【請求項４８】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、血中グルコースクリアランスを改善する、請求項３２〜４７の薬剤。
【請求項４９】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、低血糖を引き起こさない、請求項３２〜４８の薬剤。
【請求項５０】
前記対象は、糖尿病を有する、請求項３２〜４９の薬剤。
【請求項５１】
前記対象は、ヒトまたはマウスである、請求項３２〜５０の薬剤。
【請求項５２】
前記薬剤は、配列番号２のＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項５３】
前記機能的部分は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む、請求項５２の薬剤。
【請求項５４】
前記機能的部分は、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。請求項５２の薬剤。
【請求項５５】
前記機能的部分は、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的バリアントを含む。請求項５２の薬剤。
【請求項５６】
前記薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なるグリコシル化、リン酸化、または多量体化を有するＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質を含む、請求項３２〜５５の薬剤。
【請求項５７】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、前記核酸は、配列番号１の配列またはその一部を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項５８】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、前記核酸は、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列またはその一部を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項５９】
前記薬剤は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項６０】
前記薬剤は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項６１】
前記薬剤は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする核酸を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項６２】
前記薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を発現する細胞を含む、請求項３２〜５１の薬剤。
【請求項６３】
前記細胞は、β細胞である、請求項６２の薬剤。
【請求項６４】
前記β細胞は、幹細胞由来である、請求項６３の薬剤。
【請求項６５】
前記細胞は、マイクロカプセルに封入されている、請求項６２〜６４の薬剤。
【請求項６６】
前記薬剤は、前記対象に投与された場合、前記Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の異常な発現または活性を引き起こす前記対象における遺伝子欠陥を修正する、請求項３２の薬剤。
【請求項６７】
試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、前記試験個体から得られたサンプルにおけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルを決定することを含み、正常個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルと比較して前記試験個体において増大または減少したＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害を示す、前記方法。
【請求項６８】
前記Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、血液サンプルにおいて検出される、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルが正常個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルと比較して前記試験個体において増大した場合、そのときは前記試験個体は、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を有するものとして診断される、請求項６７〜６８の方法。
【請求項７０】
前記Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害は、糖尿病である、請求項６７〜６９の方法。
【請求項７１】
試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、前記試験個体をＣ１ＯＲＦ１２７における変異についてスクリーニングすることを含む、前記方法。
【請求項７２】
前記Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害は、糖尿病である、請求項７１の方法。
【請求項７３】
Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストのためのスクリーニング方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物に対して反応性の細胞を試験薬剤と接触させることと、細胞反応を測定することと、を含み、前記細胞が反応した場合、そのときは前記試験薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストとして特定される、前記方法。
【請求項７４】
前記細胞反応は、グルコース取り込みである、請求項７３の方法。
【請求項７５】
前記細胞は、インスリン受容体アンタゴニストとさらに接触される、請求項７３〜７４の方法。
【請求項７６】
分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する方法であって、
ａ）標識を含む小胞体（ＥＲ）トランスロコンを含む細胞を提供することと、
ｂ）前記細胞の細胞内分画を実施し、前記標識を含有するＥＲ画分を単離することと、
ｃ）前記標識を含む前記単離されたＥＲ画分に含有されるｍＲＮＡを単離し、シーケンシングすることと、
を含む、前記方法。
【請求項７７】
ＥＲトランスロコン成分ＳＥＣ６１ｂが、前記標識を含む、請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記標識は、蛍光標識である、請求項７６〜７７の方法。
【請求項７９】
ｂ）は、前記細胞をタンパク質合成阻害因子と接触させることと、細胞原形質膜を可溶化することと、前記ＥＲを免疫沈降させることと、を含む、請求項７６〜７８の方法。
【請求項８０】
前記ＥＲは、前記標識に特異的な抗体を用いて免疫沈降される、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記タンパク質合成阻害因子は、シクロヘキサミドである、請求項７９〜８０の方法。
【請求項８２】
前記細胞原形質膜は、段階的濃度の洗浄剤で可溶化される、請求項７９〜８１の方法。
【請求項８３】
前記洗浄剤は、ジギトニンである、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記ｍＲＮＡは、次世代シーケンシングによってシーケンシングされる、請求項７６〜８３の方法。
【請求項８５】
前記細胞は、ベータ細胞である、請求項７６〜８４の方法。
【請求項８６】
前記細胞は、誘導された幹細胞であり、または誘導された幹細胞から分化されている、請求項７６〜８５の方法。
【請求項８７】
前記細胞は、疾患細胞であり、または異常な状態を示す、請求項７６〜８６の方法。
【請求項８８】
前記細胞は、ストレス反応を受けている、請求項７６〜８７の方法。
【請求項８９】
前記細胞は、刺激に対して反応している、請求項７６〜８８の方法。
【請求項９０】
対照細胞上の分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する前記方法を実施することと、前記細胞から単離された前記ｍＲＮＡを前記対照細胞から単離された前記ｍＲＮＡと比較することと、をさらに含む、請求項７６〜８９の方法。
【請求項９１】
標識されたＳＥＣ６１ｂタンパク質を発現することが可能な非ヒト動物。
【請求項９２】
前記標識されたタンパク質の発現が誘導可能である、請求項９１の非ヒト動物。
【請求項９３】
前記標識されたタンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性発現を有する、請求項９２の非ヒト動物。
【請求項９４】
前記非ヒト動物は、ベータ細胞において標識されたＳＥＣ６１ｂタンパク質を発現することが可能である、請求項９１〜９３の非ヒト動物。
【請求項９５】
前記標識は、蛍光タンパク質である、請求項９１〜９４の非ヒト動物。
【請求項９６】
前記動物は、マウスである、請求項９１〜９５の非ヒト動物。
【請求項９７】
前記非ヒト動物は、糖尿病のためのモデルである、請求項９１〜９５の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２１日に出願された米国仮出願第６２／７３４，９８１号の利益を主張するものである。上記の出願の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国家科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって授与された許可番号２０１４１８２３４９下の政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関によると、世界における４億２，２００万人超が糖尿病を有する。内分泌学会（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）は、２０２１年までに米国における糖尿病のコスト負担が５１２０億ドルになると推定している。糖尿病を治療するための現在の方策は、インスリン注射、内因性インスリン分泌の増強、グルコース吸収の増大、またはグルコース排出の増大を含む。
【０００４】
糖尿病は、複数の原因因子から誘導され、かつ絶食状態における血漿グルコースのレベルの上昇（高血糖）を特徴とする疾患である。２つの主要な形態の糖尿病が存在する：（１）インスリン依存性または１型糖尿病（若年性糖尿病としても知られている）及び（２）非インスリン依存性またはＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭとしても知られている）。
【０００５】
１型糖尿病は、典型的にはランゲルハンス島の自己免疫性破壊の結果として、膵臓ベータ細胞の喪失から生じるインスリン欠乏によって引き起こされる。よって、１型糖尿病に罹患している患者において、膵島細胞によって生成されるインスリンの量は非常に低く、血中グルコースレベルの上昇（高血糖）をもたらす。１型糖尿病を有する患者は一般に、生涯にわたるインスリン治療を必要とするが、インスリンの頻繁な日々の注射を用いても、血中グルコースレベルを適正に制御することは困難である。
【０００６】
２型糖尿病患者では、肝臓及び筋肉細胞は、正常な血中インスリンレベルに対して反応するそれらの正常な能力を喪失し（インスリン抵抗性）、高い血中グルコースレベルをもたらす。また、ＩＩ型糖尿病患者は、ベータ細胞の機能の喪失及びベータ細胞のアポトーシスの増大を示し、経時的に総ベータ細胞質量の減少を引き起こす。最終的に、外因性インスリンの投与が２型糖尿病患者では必要になる。
【０００７】
糖尿病を治療するための従来の方法は、１型糖尿病の場合は輸液及びインスリンの投与ならびにＩＩ型糖尿病では様々な血糖降下剤の投与を含んでいる。残念ながら、既知の血糖降下剤の多くは、望ましくない副作用及び毒性を示す。よって、１型及び２型糖尿病の両方にとって、新たな治療様式が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、血中グルコースクリアランスを増大させる過去に特性化されていない遺伝子及び遺伝子産物が開示される。驚くべきことに及び予想外にも、この遺伝子産物（Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物）は、インスリンとは無関係に血中グルコースを低下させ、低血糖を引き起こさない。
【０００９】
Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子は、７３ｋＤａの分子量を有する６８４アミノ酸のタンパク質をコードすることが予測される。それは、脊椎動物にしか存在しない高度に保存されたタンパク質である。予測された配列は、分泌または膜挿入のための標準的シグナルを欠く。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、脊椎動物において高度に保存された２１５アミノ酸のＮ末端ドメインを有する。このドメインの中に、２つの予測されるグリコシル化部位、１つの予測されるリン酸化部位、５つの保存されたシステイン残基、及び推定エンドペプチダーゼ切断部位（プロホルモン転換酵素２様、ＰＣ２）がある。よって、ホルモンを制御する他のグルコースのように、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、グルコース低下活性を有する今までに特定されていないより小さなタンパク質断片に処理され得る。システインは、タンパク質フォールディングまたは多量体化に関与し得る。
【００１０】
遺伝子産物及びその活性の特定は、糖尿病及び血中グルコースクリアランスが関与する他の疾患を治療するための新たな方法、ならびに血中グルコースクリアランスが関与する疾患の原因及び作用の理解への新たな道を提供する。また、本明細書では、排出及び膜結合タンパク質を転写するｍＲＮＡを濃縮するための方法論が記載されている。
【００１１】
本開示のいくつかの態様は、対象における血中グルコースレベルの上昇に関連する障害を治療または予防する方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物（本明細書では時にＥＲｓｅｑ０８とも称される）のレベルまたは活性を増大させる有効量の薬剤を前記対象に投与することを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物アゴニストである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、フーリン切断部位を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＣ２切断部位を有さないＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、フーリン切断部位を有し、ＰＣ２切断部位を有さないＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、追加の抗糖尿病治療剤の投与をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、膵島細胞またはベータ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、治療を必要とする対象に対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞由来である。いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞は、幹細胞由来ベータ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マイクロカプセルまたは半透膜に包まれている。
【００１５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、血中グルコースクリアランスを改善する。いくつかの実施形態では、薬剤の血中グルコースクリアランス特性は、インスリン活性とは無関係である。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、低血糖を引き起こさない。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース増感因子活性を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース代謝回転の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、解糖を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グリコーゲン合成の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルカゴン様活性を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたはマウスである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号２のＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸分子を含み、核酸は、配列番号１の配列またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、核酸は、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列またはその一部を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の異常な発現または活性を引き起こす対象における遺伝子欠陥を修正する。
【００１９】
本開示のいくつかの態様は、対象に投与された場合、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる薬剤を対象とする。
【００２０】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を増大させる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、薬剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、追加の抗糖尿病治療剤の投与をさらに含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、血中グルコースクリアランスを改善する。いくつかの実施形態では、薬剤の血中グルコースクリアランス特性は、インスリン活性とは無関係である。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、低血糖を引き起こさない。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース増感因子活性を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース代謝回転の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、解糖を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グリコーゲン合成の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルカゴン様活性を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたはマウスである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号２のＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、核酸は、配列番号１の配列またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、核酸は、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列またはその一部を含む。
【００２６】
本開示のいくつかの態様は、試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、前記試験個体から得られたサンプルにおけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルを決定することを含み、正常個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルと比較して前記試験個体において増大または減少したＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害を示す、方法に関する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、血液サンプルにおいて検出される。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、抗体を用いて検出される。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害は、糖尿病である。
【００２７】
本開示のいくつかの態様は、試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、試験個体をＣ１ＯＲＦ１２７における変異についてスクリーニングすることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害は、糖尿病である。
【００２８】
本開示のいくつかの態様は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストのためのスクリーニング方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物に対して反応性の細胞を試験薬剤と接触させることと、細胞反応を測定することと、を含み、細胞が反応した場合、そのときは試験薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストとして特定される、方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞反応は、グルコース取り込みである。いくつかの実施形態では、細胞は、インスリン受容体アンタゴニストとさらに接触される。
【００２９】
本開示のいくつかの態様は、分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する方法であって、ａ）標識を含む小胞体（ＥＲ）トランスロコンを含む細胞を提供することと、ｂ）細胞の細胞内画分化を実施し、標識を含有するＥＲ画分を単離することと、ｃ）標識を含有する単離されたＥＲ画分に含有されるｍＲＮＡを単離し、シーケンシングすることと、を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＥＲトランスロコン成分ＳＥＣ６１ｂは、標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、ｂ）は、細胞をタンパク質合成阻害因子と接触させることと、細胞原形質膜を可溶化することと、ＥＲを免疫沈降させることと、を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲは、標識に特異的な抗体を用いて免疫沈降される。いくつかの実施形態では、タンパク質合成阻害因子は、シクロヘキサミドである。いくつかの実施形態では、細胞原形質膜（または細胞原形質膜、続いてＥＲ膜）は、段階的濃度の洗浄剤で可溶化される。いくつかの実施形態では、洗浄剤は、ジギトニン、ＤＤＭ、またはその両方である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、次世代シーケンシングによってシーケンシングされる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞は、ベータ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、誘導された幹細胞であり、または誘導された幹細胞から分化されている。いくつかの実施形態では、細胞は、疾患細胞であり、または異常な状態を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質合成阻害因子と接触された場合、ストレス反応を受けている。いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質合成阻害因子と接触された場合、刺激に対して反応している。
【００３１】
いくつかの実施形態では、対照細胞上の本明細書に記載される分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する方法を実施することと、細胞から単離されたｍＲＮＡを対照細胞から単離されたｍＲＮＡと比較することと、をさらに含む。
【００３２】
本発明のいくつかの態様は、標識されたＳＥＣ６１ｂタンパク質を発現することが可能な非ヒト動物を対象とする。いくつかの実施形態では、標識されたタンパク質の発現が誘導可能である。いくつかの実施形態では、標識されたタンパク質は、Ｃｒｅ依存性発現を有する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ベータ細胞において標識されたＳＥＣ１６ｂタンパク質の誘導可能な発現を有する。標識は限定されず、当該技術分野における任意の好適な標識であり得る。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、糖尿病のモデル（例えば、１型糖尿病のＮＯＤモデル、１型糖尿病のモデル）である。
【００３３】
本発明のこれらの及び他の特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより十分に理解される。特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要求及び必要な手数料の支払いにより庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｃ１ＯＲＦ１２７が、インスリン作用とは無関係にグルコースクリアランスを改善することを示している。グルコース耐性試験（ＧＴＴ−２．０ｍｇ／ｄｌグルコースボーラス）を流体力学的尾静脈注射（ＨＴＶ）の後３日目に実施した。Ａ：ＩＣＲ非近交系マウスにおけるＨＴＶ注射の後３日目でのＧＴＴは、Ｃ１ＯＲＦ１２７が対照よりも早く循環からグルコースを排除し得ることを実証した。Ｂ：インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１が投薬されたＣ５７Ｂｌ６動物におけるＨＴＶ注射の後３日目でのＧＴＴ。Ａと比較したＢにおける血中グルコースレベルの上昇、及び対照と比較した６０分の時点で開始したＣ１ＯＲＦ１２７で処置された動物における血中グルコースレベルの強力な減少に留意されたい。示されていない実験において、Ｃ１ＯＲＦ１２７によって媒介されるグルコースの減少は、グルコース注射の１５分後に早くも開始する。
【図２】ＧＦＰ−ＳＥＣ６１βを発現するｈＰＳＣ細胞株の生成を示している。Ａ：ＧＦＰタグをＳＥＣ６１βの細胞質ドメインに修飾導入して、ＥＲ膜でのリボソーム／トランスロコン複合体の単離を容易化した。Ｂ：ＣＡＡＧＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β導入遺伝子のＡＡＶＳ１遺伝子座へのＴＡＬＥＮ媒介ノックインのための策略及びｈＰＳＣにおけるＧＦＰの核周囲発現。Ｃ：インスリン遺伝子の最後のエキソンへのＧＦＰ−ＳＥＣ６１βのＣＲＩＳＰＲ媒介ノックインのための方策。Ｂ〜２の下部のパネルは、この細胞株を使用して分化したＳＣ−β細胞におけるＧＦＰ発現を示している。
【図３−１】ＥＲ−Ｓｅｑがトランスロコン複合体及び関連するリボソームの成分を濃縮することを示している。細胞質、ＥＲ及び核成分の段階的単離のための連続的生化学分画アプローチ。ＥＲ画分をリボソーム／トランスロコン複合体及び関連するＲＮＡの免疫精製に供する。
【図３−２】ＥＲ−Ｓｅｑがトランスロコン複合体及び関連するリボソームの成分を濃縮することを示している。生化学的分画の後の複数の細胞内画分におけるＳｅｃ６１β、ＧＦＰ及びリボソームタンパク質Ｌ１３ａのウェスタンブロット。
【図３−３】ＥＲ−Ｓｅｑがトランスロコン複合体及び関連するリボソームの成分を濃縮することを示している。１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡサブユニットのＲＮＡゲル及び特定。
【図３−４】ＥＲ−Ｓｅｑがトランスロコン複合体及び関連するリボソームの成分を濃縮することを示している。トランスロコン複合体に関連するタンパク質のプロテオミクスをベースとする特定。ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＩＤ、全長タンパク質のペプチドカバー率及び特定されたペプチドの数が列挙されている。Ｔ：合計；Ｃｙ：細胞質画分；Ｎｕ：核画分；Ｕｎ：免疫沈降後の未結合ＥＲ画分；ＩＰ：免疫精製されたＥＲ画分。
【図４−１】自己再生するヒト胚幹細胞においてＥＲ関連プロセスに関与する因子をコードするｍＲＮＡの選択的濃縮を示している。ＩＰ及び未分画細胞抽出物で検出された遺伝子のｌｏｇ正規化マイクロアレイシグナル強度の散布プロット。各ドットは遺伝子を表す。相違的に発現した遺伝子は淡灰色で着色されている。候補の分泌またはトランスロコン関連因子は標識され、赤色で着色されている。
【図４−２】自己再生するヒト胚幹細胞においてＥＲ関連プロセスに関与する因子をコードするｍＲＮＡの選択的濃縮を示している。ＩＰ濃縮遺伝子の予測された細胞内局在化のパイチャート。
【図４−３】自己再生するヒト胚幹細胞においてＥＲ関連プロセスに関与する因子をコードするｍＲＮＡの選択的濃縮を示している。ＩＰ濃縮遺伝子の上位の遺伝子存在ターム。
【図５−１】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。インスリン発現β細胞においてＧＦＰ−ＳＥＣ６１βを発現するトランスジェニックｈＰＳＣ細胞株の図。
【図５−２】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。ＩＮＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β細胞株を使用するＳＣ−β細胞の生成のための指向分化プロトコル。
【図５−３】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。ＩＰ及び総未分画ＲＮＡで検出された遺伝子のｌｏｇ１０正規化発現の散布プロット。候補遺伝子は標識され、赤色で着色されている。相違的に発現した遺伝子は淡灰色で着色されている。
【図５−４】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。ＩＰ濃縮遺伝子の予測された局在化のパイチャート（合計に対して倍数変化＞２）。
【図５−５】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。総未分画ＲＮＡと比較したセクレトームまたは細胞質／核（ＣｙｔｏＮｕｃ）の一部であると予測される遺伝子のＬｏｇ２濃縮。総ＲＮＡに対するＩＰ発現の濃縮が示されている。
【図５−６】ＥＲ−ｓｅｑが、ＳＣ−β細胞において発現した分泌因子のｍＲＮＡを濃縮することを示している。ＩＰ濃縮遺伝子の上位の遺伝子オントロジーターム。
【図６−１】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。ＳＣ−β細胞の指向分化プロトコル及びｈＰＳＣ細胞株の各々が使用された関連段階の図。
【図６−２】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。分化の複数の段階にわたるＥＲ−ｓｅｑによって特定された相違的に発現した遺伝子のヒートマップ。
【図６−３】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。ＳＣ−β細胞において優先的に発現される遺伝子の遺伝子オントロジー分析及び生物学的プロセス（図６Ｃ）及び細胞成分（図６Ｄ）のための上位ターム。
【図６−４】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。ＳＣ−β細胞において優先的に発現される遺伝子の遺伝子オントロジー分析及び生物学的プロセス（図６Ｃ）及び細胞成分（図６Ｄ）のための上位ターム。
【図６−５】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。β細胞特異的発現パターンを示す分化のすべての段階にわたる内分泌特異的（図６Ｅ）及びアノテーションされていない（図６Ｆ）遺伝子のヒートマップ。
【図６−６】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。β細胞特異的発現パターンを示す分化のすべての段階にわたる内分泌特異的（図６Ｅ）及びアノテーションされていない（図６Ｆ）遺伝子のヒートマップ。
【図６−７】トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターンを示している。ＳＣ−ベータ細胞において未知の機能を有する遺伝子のヒートマップ。
【図７−１】グルコース低下活性としてのＣ１ＯＲＦ１２７の特定を示している。流体力学的尾静脈注射スクリーンからの結果。
【図７−２】グルコース低下活性としてのＣ１ＯＲＦ１２７の特定を示している。５５ｍｇ／ｄｌ未満の絶食時血中グルコースレベルを有する動物はさらなる分析から除去された。
【図７−３】グルコース低下活性としてのＣ１ＯＲＦ１２７の特定を示している。Ｃ１ＯＲＦ１２７（赤色線）は、試験された他の作用よりも早く循環からグルコースを排除する。
【図７−４】グルコース低下活性としてのＣ１ＯＲＦ１２７の特定を示している。明確性の目的のため、すべての他の治療を平均し、灰色で示した。インスリンＨＴＶを注射した動物（紫色）は、陽性対照として機能し、また、強固なグルコース低下活性を示す。
【図７−５】グルコース低下活性としてのＣ１ＯＲＦ１２７の特定を示している。グルコース低下作用の定量は、差が統計的に有意であることを示している。
【図８−１−１】Ｃ１ＯＲＦ１２７が、脊椎動物の中で十分に保存されていることを示している。タンパク質アライメントは、進化中のこのタンパク質の高度な保存を明らかにしている。
【図８−１−２】Ｃ１ＯＲＦ１２７が、脊椎動物の中で十分に保存されていることを示している。タンパク質アライメントは、進化中のこのタンパク質の高度な保存を明らかにしている。
【図８−２】Ｃ１ＯＲＦ１２７が、脊椎動物の中で十分に保存されていることを示している。ヒトＣ１ＯＲＦ１２７とそのマウスオルソログであるＧｍ５７２とのアライメント。赤色棒、免疫蛍光分析及びウェスタンブロットのために使用されるＣ１ＯＲＦ１２７抗体（市販の抗体）を生成するために使用されたペプチド領域。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、シグナルペプチドを欠く高度に保存された７３ｋＤａタンパク質である。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、ＳＣ−ベータ細胞及び内分泌系統の開始から発達中のマウス膵臓において発現される。Ｃ１ＯＲＦ１２７はまた、成人ヒト及びマウスベータ細胞において発現される。
【図９−１】Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子発現を示している。死体ヒト膵島では、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、ベータ細胞において主に発現される。
【図９−２】Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子発現を示している。ＳＣ−ベータでは、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、より後の分化段階でＳＣ−ベータ細胞によって主に発現される。
【図１０−１】Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子発現を示している。ＳＣ−ベータ分化プロトコルの後の段階でのｔ−ＳＮＥ投影。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、ＳＣ−ベータ細胞、ＳＣ−クロム親和性細胞によって、及び内分泌前駆細胞において共発現される。
【図１０−２】Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子発現を示している。Ｃ１ＯＲＦ１２７のマウスオルソログであるＧｍ５７２は、内分泌前駆細胞によって発現される。
【図１１】Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子発現を示している。ヒト死体膵島に由来する公開された単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータの分析は、Ｃ１ＯＲＦ１２７がベータ細胞によって主に発現されるが、それはまたソマトスタチン発現細胞によって発現されることを実証している。ｔ−ＳＮＥプロット。
【図１２】Ｃ１ＯＲＦ１２７の免疫蛍光及びウェスタンブロット分析を示している。上部の免疫蛍光、Ｃ１ＯＲＦ１２７に対する市販の抗体を使用して、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、ヒト死体に由来する膵島におけるベータ細胞によって発現されることが示されている。インスリン染色での高い共局在化及びグルカゴン発現細胞での非存在に留意されたい。下部、ウェスタンブロット、ＳＣ−ベータ細胞からの抽出物は、Ｃ１ＯＲＦ１２７をその予測された分子量で発現する。
【図１３−１】Ｃ１ＯＲＦ１２７を発現する他のヒト組織を示している。ＧＴＥｘコンソーシアムからの遺伝子発現分析は、小脳及び筋肉における発現を示している。
【図１３−２】Ｃ１ＯＲＦ１２７を発現する他のヒト組織を示している。免疫蛍光染色によって両方の発現部位を確認している。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、筋肉におけるラミニン及び小脳におけるＴｕｊ１と共に共局在化する。
【図１４】Ｓ９６１モデル検証を示している。インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１の急性投与は、マウスを高血糖にするのに十分である。Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００８から適応した。
【図１５】Ｃ１ＯＲＦ１２７は、インスリン作用とは無関係に血中グルコースを低下させる。Ｓ９６１をグルコース注射の２時間前にグルコースと共に、及びグルコース注射の４５分後に注射した。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、Ｓ９６１の存在下でさえ血中グルコースを排除した。１．５ｍｇ／ｄｌグルコースボーラス。
【図１６】Ｃ１ＯＲＦ１２７は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病モデルにおいてＥＲ−ｓｅｑ０８の効果によって示されるようにインスリン作用とは無関係にグルコースクリアランスを改善する。マウスをＳＴＺの投与によって糖尿病にした（流体力学的尾静脈注射、ＨＴＩの前の高血糖に留意されたい）。Ｃ１ＯＲＦ１２７を過剰発現する糖尿病マウスは、対照と比較して血中グルコースレベルの顕著な減少を有していた。
【図１７】Ｃ１ＯＲＦ１２７は、２型糖尿病の高脂肪食肥満モデルにおいて血中グルコースを低下し得ることを示している。ＤＩＯ食餌誘導肥満マウス。フーリン切断部位を有するＦ−ＩＮＳ−インスリンでトランスフェクトされたＦ−ＩＮＳ−ＤＩＯマウス。肝臓によって分泌されたインスリン。
【図１８】ＥＲ−ｓｅｑ０８が、グルコースクリアランスを改善し、低血糖を引き起こさないことを示している。Ａ：ＩＣＲ非近交系マウスにおけるＨＴＶ注射の後３日目でのＧＴＴは、ＥＲ−ｓｅｑ０８が対照よりも早く循環からグルコースを排除し得ることを実証した。すべての時点が有意に異なる。Ｂ：Ａからの曲線下面積の測定結果は、対照と比べて、ＥＲ−ｓｅｑ０８を注射したマウスにおけるグルコースクリアランスの有意な改善を実証している。Ｃ：１６時間の絶食の前及び後のＥＲ−ｓｅｑ０８を注射した動物における血中グルコースレベルであり、対照と比べて血中グルコースレベルの有意な変化はないことに留意されたい。
【図１９】Ｃ１ＯＲＦ１２７がペプチドホルモンの一次構造の特徴を有することを示している。Ａ：紫色棒：未知の機能の進化保存ドメイン；ＰＣ２部位：ペプチドホルモン（すなわち、インスリン、グルカゴン、及びアミリン）において一般的に存在する推定エンドペプチダーゼ切断部位；赤色棒：赤色の領域に対して生成されたカスタムウサギポリクローナル抗体は全長タンパク質（７３ｋＤａ）及び約５７ｋＤａのタンパク質を認識する、を有するＣ１ＯＲＦ１２７一次構造。この５７ｋＤａ種は、仮定的ＰＣ２切断部位と相関する。Ｂ：ウェスタンブロットである：総タンパク質抽出物を非糖尿病（ＮＤ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者に由来するヒト死体膵島から作製した。抗体特異性は、ウサギを免疫するために使用されたペプチドとの競合によって決定した。Ｃ１ＯＲＦ１２７のグルコース低下活性は、未知の機能の保存ドメイン（紫色のボックス）に存在することが予期されるが、活性は、残りの部分（５７ｋＤａ領域）に存在し得る。Ｃ１ＯＲＦ１２７はまた、ランゲルハンスの膵島ならびに筋肉及び小脳におけるデルタ及びガンマ細胞によって発現される。Ｃ１ＯＲＦ１２７のグルコース低下活性は、ベータ細胞に特有であることが推測されるが、他のＣ１ＯＲＦ１２７発現デポもまた、グルコース調節活性を有し得る。
【図２０】インスリンまたはＣ１ＯＲＦ１２７抗体での成体マウス分泌の免疫蛍光染色を示している。我々が驚いたことに、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、インスリンを発現していないベシクルによって発現されるようである。６３０Ｘ挿入図における重複の欠如に留意されたい。この点において、我々は、Ｃ１ＯＲＦ１２７がいくつかのインスリン含有ベシクルでも発現され得ることを排除することはできない。これは、ベータ細胞からのＣ１ＯＲＦ１２７の分泌が、インスリンのそれとは無関係に調節される可能性があり、Ｃ１ＯＲＦ１２７分泌を排他的に促進する新しいクラスの薬物の発見につながる可能性があることを示唆している。
【図２１】Ｃ１ＯＲＦ１２７（すなわち、ＥＲｓｅｑ０８）は、ベータ細胞除去マウスにおいてグルコースホメオスタシスの強力な調節因子であることを示している。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病は、１型糖尿病の一般的なマウスモデルである。すべての動物は、自由に給餌された場合に糖尿病になる（給餌）。Ｏ／Ｎ絶食の後、血中グルコースレベルは低下する。この後にグルコースが注射される。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、対照動物（赤色蛍光タンパク質が注射された）よりも早く循環からグルコースを排除することができる。驚くべきことに、Ｃ１ＯＲＦ１２７の作用により、動物は正常血糖値の範囲となる。これらの結果は、Ｃ１ＯＲＦ１２７が、インスリン作用とは無関係に機能していることを示唆している。結果はまた、Ｃ１ＯＲＦ１２７がグルカゴン様活性を有することを示唆している。
【図２２】Ｃ１ＯＲＦ１２７を発現する腫瘍は、インスリン作用とは無関係に高血糖を抑制することを示している。Ｃ１ＯＲＦ１２７（ＥＲｓｅｑ８０）または対照蛍光タンパク質（ｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する安定的にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞株をＳｃｉｄ／ｂｅｉｇｅマウスの腎臓被膜下に移植し、腫瘍を１ヶ月間成長させた。インスリン受容体（ＩＮＳ‐Ｒ）アンタゴニストＳ９６１の存在下で４時間の絶食後にグルコース耐性試験を実施した。対照マウスは、即座に高血糖になり、実験の継続期間中高血糖を保持したことに留意されたい。Ｃ１ＯＲＦ１２７は、この高血糖エクスカーションを抑制する。
【図２３】ＨＥＰＧ２細胞がＣ１ＯＲＦ１２７タンパク質を発現することを示している。市販のＣ末端抗体を使用して、Ｃ１ＯＲＦ１２７を発現する安定的にトランスフェクトしたＨＥＰＧ２細胞からの抽出物または対照についてイムノブロット分析を実施した。予期された約７３ｋＤａ産物が容易に検出された。
【図２４】Ｃ１ＯＲＦ１２７を認識するペプチド断片に対して上昇したウサギポリクローナル抗体でのイムノブロットを示している（上側の図で赤色棒）。およそ３４ｋＤａの特定のタンパク質バンドが健康な膵島及び２型糖尿病膵島の両方で見られ、抗体がブロッキングペプチドと共にインキュベートされた場合に消失する。ハウスキーピングタンパク質であるビンクリンが比較のために示されている。これはＲＮＡ発現データと一貫している。２型糖尿病膵島は、より多くのＣ１ＯＲＦ１２７を有するようである。ウサギポリクローナル抗体は、Ｎ末端とＰＣ２切断部位との間に位置するＣ１ＯＲＦ１２７の保存ドメインの部分に対して上昇した。
【図２５−１】緑色ＥＲマウスレポーターを示している。ｍＥＳ標的化のために使用されたコンストラクト。ｌｏｘｐカセットの除去及びＥＲのマーキングを示すためにｍＥＳ陽性クローンにＣｒｅ−ウイルスを感染させた。
【図２５−２】緑色ＥＲマウスレポーターを示している。普遍的レポーターと交配された緑色ＥＲマウスに由来する尾先端線維芽細胞。典型的なＥＲ染色に留意されたい。
【図２５−３】緑色ＥＲマウスレポーターを示している。ベータ細胞緑色−ＥＲマウスは、インスリン産生細胞における組織特異的組換え及び適切な細胞内局在化を実証している。
【図２６】ＨＴＶｉの後にＧＦＰが形質導入されたマウス肝臓を示している。
【図２７】Ｃ１ＯＲＦ１２７がインスリン作用とは無関係に除去マウスにおける血中グルコースを低下させたことを示している。Ａ：Ｃ１ＯＲＦ１２７が尾静脈注射されたストレプトゾトシン（ＳＴＺ）除去動物における血中グルコースレベル。これらの動物を一晩絶食させ、グルコースを投与し、次いでそれらの血中グルコースレベルをモニタリングした。このより大きなコホートは、先と同じグルコースクリアランス表現型を示した。Ｂ：８週間後、同じコホートにＣ１ｏｒｆ１２７（ＥＲｓｅｑ０８）またはｔｄＴｏｍａｔｏのいずれかを再度尾静脈注射した。３日後、これらのマウスを一晩絶食させ、グルコース注射の２時間前及びグルコース注射時にＳ９６１で処置した。それらの血中グルコースレベルをモニタリングした。ストレプトゾトシン除去は、マウスにおいて重度の糖尿病を引き起こすのに十分であるが、インスリン産生ベータ細胞の小さな集団が残る。除去動物のＳ９６１インスリン−アンタゴニスト処置は、残存インスリンが、グルコースクリアランス表現型に関与しないことを示している。注：いずれの実験も、先の最大６００ｍｇ／ｄｌの代わりに７５０ｍｇ／ｄｌの最大読み取りを有するグルコースメーターを利用した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書に記載の発明の実施形態は、小胞体に関連し、したがって分泌タンパク質をコードしている可能性が高いｍＲＮＡを濃縮する新規な方法から生じる。ベータ細胞でこの方法を実施した場合、過去に特性化されていないｍＲＮＡが単離された。このｍＲＮＡの遺伝子産物（Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物）をコードする核酸配列がマウスにおいて発現された場合、マウスは、インスリンとは無関係に血中グルコースクリアランスを改善した。そのため、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、血中グルコースクリアランスが関与する疾患及び病態、例えば、糖尿病の治療のために新たな方法論を提供する。
【００３６】
血中グルコースレベルの上昇に関連する障害を治療または予防する方法
【００３７】
本開示のいくつかの態様は、対象における血中グルコースレベルの上昇に関連する障害を治療または予防する方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を調節する有効量の薬剤を前記対象に投与することを含む、方法に関する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、血中グルコースレベルの上昇に関連する障害は、対象が血中グルコースレベルの上昇を有する任意の障害である。いくつかの実施形態では、障害は、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病）、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、または肥満である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、げっ歯類、家庭用動物またはゲーム動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、サル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルを含む。げっ歯類は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターを含む。家庭用及びゲーム動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えば、家庭用ネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、及び魚、例えば、トラウト、ナマズ及びサケを含む。患者または対象は、前述の任意のサブセット、例えば、１つ以上の群または種、例えば、ヒト、霊長類またはげっ歯類を除く上記のすべてを含む。所定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「患者」、「個人」及び「対象」は、本明細書で互換的に使用される。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、動物モデル、例えば、糖尿病の動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。また、本明細書に記載の方法は、家庭用動物及び／またはペットを治療するために使用され得る。対象は、雄または雌であり得る。
【００４０】
対象は、治療を必要とする病態（例えば、糖尿病）またはそのような病態に関連する１つ以上の合併症に罹患しているまたはを有するものとして過去に診断されているまたは特定されており、任意に、病態または病態に関連する１つ以上の合併症のための治療をまだ受ける必要がないものであり得る。代替的には、対象はまた、治療を必要とする病態またはそのような病態に関連する１つ以上の合併症を有するものとして過去に診断されていないものであり得る。むしろ、対象は、病態の１つ以上のリスク要因または病態に関連する１つ以上の合併症を示すものを含み得る。特定の病態のための治療を「必要とする対象」は、その病態を有する、その病態を有すると診断された、または所与の参照集団に対してその病態を発症するリスクが増大した対象であり得る。
【００４１】
用語「薬剤」は、本明細書で使用される場合、限定されないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「薬剤」は、限定されないが、合成及び天然に存在するタンパク質性及び非タンパク質性の実体を含む任意の化学物質、実体または部位であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸、アミノ酸、または炭水化物のオリゴマー（限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーを含む）、ならびにそれらの改変型及び組み合わせなどである。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸、小分子、ポリペプチド、及びペプチドからなる群から選択される。所定の実施形態では、薬剤は、化学的部位を有する小分子である。例えば、化学的部位は、マクロライド、レプトマイシン及び関連する天然産物またはそれらのアナログを含む、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部位を含んでいた。化合物は、所望の活性及び／または特性を有することが知られている場合があり、または多様な化合物のライブラリから選択され得る。
【００４２】
「小分子」は、１０ｋＤ未満、典型的には２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する分子として定義される。小分子は、無機分子、有機分子、無機成分を含有する有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体、及び抗体模倣体を含むがこれらに限定されない。治療剤として、小分子は、大分子よりも、細胞に対してより透過性であり、分解に対する感受性が低く、免疫反応を誘発する傾向が低い場合がある。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、隣接する残基のアルファアミノとカルボキシ基との間のペプチド結合によって他方に接続された一連のアミノ酸残基を指定するために使用される。用語「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能にかかわらず、改変されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸アナログを含むタンパク質アミノ酸のポリマーを指す。用語「ペプチド」はしばしば、小さなペプチドに関して使用されるが、当該技術分野におけるこの用語の利用は、「タンパク質」または「ポリペプチド」と重複する。例示的なポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等物、ならびに前述のものの天然及び非天然の両方で生じるバリアント、断片、及びアナログを含む。
【００４４】
用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に使用され、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチド、及び部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。核酸はしばしば、ホスホジエステル結合によって連結された天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡに典型的に見られる標準的ヌクレオチド（改変物、例えば、メチル化核酸塩基を含み得る）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、様々な実施形態で天然に存在するまたは天然に存在しない場合がある（すなわち、人工；自然に見られない）１つ以上の非標準ヌクレオチドを含み得、及び／または改変された糖または改変された骨格連結を含有し得る。核酸改変物（例えば、塩基、糖、及び／または骨格改変物）、非標準ヌクレオチドまたはヌクレオシドなど、例えば、研究または治療目的のためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アプタマー、ＣＲＩＳＰＲ技術、ポリペプチド産生、再プログラミング、またはアンチセンスベースの分子の文脈において有用であるものとして当該技術分野で知られているものは、様々な実施形態で組み込まれ得る。そのような改変物は、例えば、安定性（例えば、ヌクレアーゼによる切断に対する感受性を減少させることによって）を増大させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでクリアランスを減少させ、細胞取り込みを増大させ、または翻訳、効力、有効性、特異性を改善する他の特性を付与し、またはそうでなければ核酸を意図された使用のためにより好適なものとし得る。核酸改変物の様々な非限定的な例は、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ＧＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍ．２００９；３９：１６．３．１−１６．３．２２；Ｃｒｏｏｋｅ，ＳＴ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８；Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＲＳＣ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８；米国特許番号４，４６９，８６３；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，６３７，６８３；５，６３７，６８４；５，７００，９２２；５，７１７，０８３；５，７１９，２６２；５，７３９，３０８；５，７７３，６０１；５，８８６，１６５；５，９２９、２２６；５，９７７，２９６；６，１４０，４８２；６，４５５，３０８及び／またはＰＣＴ出願公開ＷＯ００／５６７４６及びＷＯ０１／１４３９８に記載されている。異なる改変物は、二本鎖核酸の２つの鎖において使用され得る。核酸は、均一に、またはその一部に対してのみ改変され得、及び／または複数の異なる改変を含有し得る。核酸または核酸領域の長さがヌクレオチド（ｎｔ）の数の観点から与えられる場合、数は、別段示されない限り、一本鎖核酸また���二本鎖核酸の各鎖におけるヌクレオチドの数を指すことが理解されるべきである。「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い核酸、典型的には約５〜約１００ｎｔ長である。
【００４５】
用語「Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルまたは活性を調節する」は、遺伝子産物（例えば、Ｃ１ＯＲＦ１２７タンパク質）のレベル、活性または機能の上方制御（活性化または活性の増大）または下方制御（阻害）を指す。一実施形態では、調節は、遺伝子産物の活性を直接的に増大または阻害することによって、すなわち、遺伝子産物との直接的な物理的相互作用を介して生じる。一実施形態では、遺伝子産物の活性は、例えば、シグナル伝達において、遺伝子産物活性の上流エフェクターを活性化または阻害することによって間接的に調節される。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のアゴニストである。
【００４６】
用語「低下する」、「減少する」、「減少した」、「減少」、「低下する」、及び「阻害する」はすべて、参照と比べて統計的に有意な量の減少を意味するために一般に使用される。しかしながら、疑念を避けるために、「減少する」、「減少」または「低下する」または「阻害する」は典型的には、参照レベルと比較して少なくとも１０％の低下を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の減低下を含み得、最大で、例えば、参照レベルと比較して所与の実体またはパラメータの完全な非存在、または所与の治療の非存在と比較して１０〜９９％の任意の低下を含む。
【００４７】
用語「増大した」、「増大する」または「増強する」または「活性化する」はすべて、統計的に有意な量の増大を一般に意味するために本明細書で使用される；疑念を避けるために、用語「増大した」、「増大する」または「増強する」または「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増大、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の増大を意味し、または最大で、参照レベルと比較して１００％の増大または１０〜１００％の間の任意の増大、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍の増大、または２倍〜１０倍またはそれ以上の間の任意の増大を含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患、障害または医学的病態に関して使用される場合、目的が症状または病態の進行または重症度を逆転させる、緩和する、好転させる、阻害する、遅延させるまたは停止することである病態のための療法的治療を指す。用語「治療すること」は、病態の少なくとも１つの有害作用または症状を減少または軽減させることを含む。治療は通常、１つ以上の症状または臨床マーカーが減少した場合、有効である。代替的には、治療は、病態の進行が減少または停止した場合、「有効」である。すなわち、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予期されるであろう症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延も含む。
【００４９】
本明細書に記載の方法は、障害の１つ以上の症状の重症度の減少または軽減につながり得る。糖尿病の症状は、例えば、絶食時血中グルコースレベルの上昇、１４０／９０ｍｍ／Ｈｇまたはそれを超える血圧；異常な血中脂肪レベル、例えば、３５ｍｇ／ｄＬまたはそれ未満の高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、または２５０ｍｇ／ｄＬ（ｍｇ／ｄＬ＝１デシリットルの血液当たりのミリグラム）またはそれを超えるトリグリセリドを含む。糖尿病の他の症状は、例えば、頻尿、過度の口渇、極度の空腹、普通でない体重減少、疲労の増大、易刺激性、または視界不良を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、糖尿病の発症を遅延させる。対象における糖尿病の発症を遅延させることは、糖尿病の１つ以上の症状、例えば、高血糖、低インスリン血症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心臓血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化症、及び高血圧を含む）、ニューロパシー、自律神経機能障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはそれらの組み合わせの開始の少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年またはそれ以上の遅延を指し、対象の生存期間全体を含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「予防する」は、疾患、障害または医学的病態に関して使用される場合、疾患、障害または医学的病態の発症の可能性を減少または排除することを指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、作用部位への送達をもたらす方法または経路による本明細書に開示される薬剤の対象の中への配置を指す。薬剤は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。よって、静脈内経路を介した投与が特に企図される。しかしながら、適切な製剤を用いると、例えば、鼻腔内、動脈内、投冠動脈内、動脈；経口、吸入により、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または当業者に知られている他の手段を含む他の経路が企図される。薬剤は、投薬製剤に適合した手法で、かつ治療的有効量で投与される。投与される量及びタイミングは、治療される対象、活性成分を利用する対象のシステムの容量、及び所望とされる治療効果の程度に依存する。
【００５３】
「治療的有効量」は、例えば、血中グルコースクリアランスの統計的に有意な測定可能な変化をもたらすのに十分な薬剤の量である。そのような有効量は、臨床試験及び動物研究で評価され得る。治療は、その用語が本明細書で使用される場合、徴候または症状の１つまたはすべてが、例えば、本明細書に記載される薬剤での治療後に少なくとも１０％改善または好転した場合に「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しない（すなわち、疾患の進行が停止される）ことによって測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者には知られている。
【００５４】
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む。特定の態様では、所望の薬剤（例えば、化合物）は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物（例えば、Ｃ１ＯＲＦ１２７タンパク質）のレベルまたは活性を（例えば、発現及び／または分泌を増大させることによって）増大させる。好適な化合物／薬剤は、化学的化合物及び化学的化合物の混合物、例えば、小有機または無機分子；サッカリド；オリゴ糖；多糖類；生物学的巨大分子、例えば、ペプチド、タンパク質、及びペプチドアナログ及び誘導体；ペプチド模倣体；核酸；核酸アナログ及び誘導体；生物学的物質、例えば、細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織から作製された抽出物；天然に存在するまたは合成組成物；ペプチド；アプタマー；ならびに抗体、またはその断片を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
化合物／薬剤は、核酸ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。例示的な核酸化合物は、タンパク質活性化因子または阻害因子（例えば、転写活性化因子または阻害因子）をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸アナログ（例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、擬似相補的ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）など）、アンチセンス分子、リボザイム、小阻害性または活性化核酸配列（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
タンパク質及び／またはペプチド薬剤は、遺伝子発現またはタンパク質活性を調節する任意のタンパク質であり得る。非限定的な例は、変異タンパク質；治療タンパク質及び切断タンパク質、例えば、タンパク質が通常、標的細胞において存在しない、またはより低いレベルで発現されるものを含む。タンパク質はまた、遺伝子修飾されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ、ミニボディ、トリアボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変されたタンパク質及びそれらの断片から選択される。遺伝子の発現を増大させる、または遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルまたは活性を増大させる化合物または薬剤は、活性化因子または活性化化合物としても知られている。遺伝子の発現を減少させる、または遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルまたは活性を減少させる化合物または薬剤は、阻害性因子または阻害化合物としても知られている。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチド薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的バリアントまたは機能的断片であり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する：
【００５８】
ＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＴＧＣＴＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＧＧＡＧＧＴＣＴＴＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＴＴＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴＴＣＣＧＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＣＧＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＡＧＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＴＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＡＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＣＧＣ。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、配列番号１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有する：
【００６１】
ＭＧＬＥＲＳＤＲＹＩＭＫＣＰＭＬＲＳＲＬＧＱＥＳＶＨＣＧＰＭＦＩＱＶＳＲＰＬＰＬＷＲＤＮＲＱＴＰＷＬＬＳＬＲＧＥＬＶＡＳＬＥＤＡＳＬＭＧＬＹＶＤＭＮＡＴＴＶＴＶＱＳＰＲＱＧＬＬＱＲＷＥＶＬＮＴＳＡＥＬＬＰＬＷＬＶＳＧＨＨＡＹＳＬＥＡＡＣＰＰＶＳＦＱＰＥＳＥＶＬＶＨＩＰＫＱＲＬＧＬＶＫＲＧＳＹＩＥＥＴＬＳＬＲＦＬＲＶＨＱＳＮＩＦＭＶＴＥＮＫＤＦＶＶＶＳＩＰＡＡＧＶＬＱＶＱＲＣＱＥＶＧＧＴＰＧＴＱＡＦＹＲＶＤＬＳＬＥＦＡＥＭＡＡＰＶＬＷＴＶＥＳＦＦＱＣＶＧＳＧＴＥＳＰＡＳＴＡＡＬＲＴＴＰＳＰＰＳＰＧＰＥＴＰＰＡＧＶＰＰＡＡＳＳＱＶＷＡＡＧＰＡＡＱＥＷＬＳＲＤＬＬＨＲＰＳＤＡＬＡＫＫＧＬＧＰＦＬＱＴＡＫＰＡＲＲＧＱＴＳＡＳＩＬＰＲＶＶＱＡＱＲＧＰＱＰＰＰＧＥＡＧＩＰＧＨＰＴＰＰＡＴＬＰＳＥＰＶＥＧＶＱＡＳＰＷＲＰＲＰＶＬＰＴＨＰＡＬＴＬＰＶＳＳＤＡＳＳＰＳＰＰＡＰＲＰＥＲＰＥＳＬＬＶＳＧＰＳＶＴＬＴＥＧＬＧＴＶＲＰＥＱＤＰＡＫＳＰＧＳＰＬＬＬＲＧＬＳＳＧＤＶＡＡＰＥＰＩＭＧＥＰＧＱＡＳＥＥＦＱＰＬＡＲＰＷＲＡＴＬＡＡＥＥＬＶＳＨＲＳＰＧＥＰＱＥＴＣＳＧＴＥＶＥＲＰＲＱＴＧＰＧＬＰＲＥＧＡＲＧＨＭＤＬＳＳＳＥＰＳＱＤＩＥＧＰＧＬＳＩＬＰＡＲＤＡＴＦＳＴＰＳＶＲＱＰＤＰＳＡＷＬＳＳＧＰＥＬＴＧＭＰＲＶＲＬＡＡＰＬＡＶＬＰＭＥＰＬＰＰＥＰＶＲＰＡＡＬＬＴＰＥＡＳＳＶＧＧＰＤＱＡＲＹＬＥＳＡＰＧＷＰＶＧＱＥＥＷＧＶＡＨＴＳＳＰＰＳＴＱＴＬＳＬＷＡＰＴＧＶＬＬＰＳＬＶＥＬＥＹＰＦＱＡＧＲＧＡＳＬＱＱＥＬＴＥＰＴＬＡＬＳＡＥＳＨＲＰＰＥＬＱＤＳＶＥＧＬＳＥＲＰＳＲ。
【００６２】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的部分もしくは機能的バリアントの保存ドメインを含む。いくつかの実施形態では、保存ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有する：
【００６４】
ＫＣＰＭＬＲＳＲＬＧＱＥＳＶＨＣＧＰＭＦＩＱＶＳＲＰＬＰＬＷＲＤＮＲＱＴＰＷＬＬＳＬＲＧＥＬＶＡＳＬＥＤＡＳＬＭＧＬＹＶＤＭＮＡＴＴＶＴＶＱＳＰＲＱＧＬＬＱＲＷＥＶＬＮＴＳＡＥＬＬＰＬＷＬＶＳＧＨＨＡＹＳＬＥＡＡＣＰＰＶＳＦＱＰＥＳＥＶＬＶＨＩＰＫＱＲＬＧＬＶＫＲＧＳＹＩＥＥＴＬＳＬＲＦＬＲＶＨＱＳＮＩＦＭＶＴＥＮＫＤＦＶＶＶＳＩＰＡＡＧＶＬＱＶＱＲＣＱＥＶＧＧＴＰＧＴＱＡＦＹＲＶＤＬＳＬＥＦＡＥＭＡＡＰＶＬＷＴＶＥＳＦＦＱＣ
【００６５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号４に相当する保存ドメインの一部またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む：
【００６６】
ＧＳＹＩＥＥＴＬＳＬＲＦＬＲＶＨＱＳＮＩＦＭＶＴＥＮＫＤＦＶＶＶＳＩＰＡＡＧＶＬＱＶＱＲＣＱＥＶＧＧＴＰＧＴＱＡＦＹＲＶＤＬＳＬＥＦＡＥＭＡＡＰＶＬＷＴＶＥＳＦＦＱＣ
【００６７】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的部分もしくは機能的バリアントの切断によって生成されたおよそ５７ｋＤａのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、およそ５７ｋＤａのタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有する：
【００６８】
ＧＳＹＩＥＥＴＬＳＬＲＦＬＲＶＨＱＳＮＩＦＭＶＴＥＮＫＤＦＶＶＶＳＩＰＡＡＧＶＬＱＶＱＲＣＱＥＶＧＧＴＰＧＴＱＡＦＹＲＶＤＬＳＬＥＦＡＥＭＡＡＰＶＬＷＴＶＥＳＦＦＱＣＶＧＳＧＴＥＳＰＡＳＴＡＡＬＲＴＴＰＳＰＰＳＰＧＰＥＴＰＰＡＧＶＰＰＡＡＳＳＱＶＷＡＡＧＰＡＡＱＥＷＬＳＲＤＬＬＨＲＰＳＤＡＬＡＫＫＧＬＧＰＦＬＱＴＡＫＰＡＲＲＧＱＴＳＡＳＩＬＰＲＶＶＱＡＱＲＧＰＱＰＰＰＧＥＡＧＩＰＧＨＰＴＰＰＡＴＬＰＳＥＰＶＥＧＶＱＡＳＰＷＲＰＲＰＶＬＰＴＨＰＡＬＴＬＰＶＳＳＤＡＳＳＰＳＰＰＡＰＲＰＥＲＰＥＳＬＬＶＳＧＰＳＶＴＬＴＥＧＬＧＴＶＲＰＥＱＤＰＡＫＳＰＧＳＰＬＬＬＲＧＬＳＳＧＤＶＡＡＰＥＰＩＭＧＥＰＧＱＡＳＥＥＦＱＰＬＡＲＰＷＲＡＴＬＡＡＥＥＬＶＳＨＲＳＰＧＥＰＱＥＴＣＳＧＴＥＶＥＲＰＲＱＴＧＰＧＬＰＲＥＧＡＲＧＨＭＤＬＳＳＳＥＰＳＱＤＩＥＧＰＧＬＳＩＬＰＡＲＤＡＴＦＳＴＰＳＶＲＱＰＤＰＳＡＷＬＳＳＧＰＥＬＴＧＭＰＲＶＲＬＡＡＰＬＡＶＬＰＭＥＰＬＰＰＥＰＶＲＰＡＡＬＬＴＰＥＡＳＳＶＧＧＰＤＱＡＲＹＬＥＳＡＰＧＷＰＶＧＱＥＥＷＧＶＡＨＴＳＳＰＰＳＴＱＴＬＳＬＷＡＰＴＧＶＬＬＰＳＬＶＥＬＥＹＰＦＱＡＧＲＧＡＳＬＱＱＥＬＴＥＰＴＬＡＬＳＡＥＳＨＲＰＰＥＬＱＤＳＶＥＧＬＳＥＲＰＳＲ
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、またはその機能的部分もしくは機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド、またはその機能的部分もしくは機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７またはＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物（例えば、Ｃ１ＯＲＦ１２７タンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物である。そのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化（例えば、Ｏ連結オリゴ糖、Ｎ連結オリゴ糖など）、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも１、２、３、４、または５つ少ないシステインを有する。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、または５つ少ないシステインは、配列番号３に示される保存されたシステインに対応する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なるようにリン酸化されている。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも１つ少ないリン酸化を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも１つ多いリン酸化を有する。いくつかの実施形態では、異なるリン酸化は、配列番号４または配列番号５に相当するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の部分に（例えば、配列番号４または配列番号５における推定リン酸化部位に）存在する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なるようにグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも１つ少ないグリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも２つ少ないグリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも１つ多いグリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも２つ多いグリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、異なるグリコシル化は、配列番号４または配列番号５に相当するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の部分に（例えば、配列番号４または配列番号５における推定グリコシル化部位に）存在する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、二量体、三量体、または多量体である。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、ホモ二量体、ホモ三量体、またはホモ多量体である。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然に存在するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる多量体化状態で存在する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる組成、活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、またはそれ以上の血中グルコースクリアランス活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物よりも約１％、２．５％、５％、７．５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以下の血中グルコースクリアランス活性を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分（すなわち、機能的断片）を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に相当するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的断片、または配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、薬剤は、フーリン切断部位を含むＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＣ２切断部位（例えば、配列番号２におけるＬＶＫＲＧ）を有さないＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、フーリン切断部位を有し、ＰＣ２切断部位を有さないＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、膵島細胞またはベータ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、膵臓デルタ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、治療を必要とする対象に対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞由来である。いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞は、幹細胞由来ベータ細胞である。ベータ細胞を誘導する方法は当該技術分野で教示されている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年１月８日に公開されたＷＯ２０１５／００２７２４を参照されたい。いくつかの実施形態では、細胞は、マイクロカプセルまたは半透膜に包まれている。
【００７８】
本開示の態様は、本明細書に記載の単離された細胞、例えば、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的バリアントもしくは機能的断片を発現する細胞の集団を含むマイクロカプセルを含む。マイクロカプセルは当該技術分野でよく知られている。マイクロカプセルの好適な例は文献に記載されている（例えば、Ｊａｈａｎｓｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  β−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ：Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１１；Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２４７９５９；Ｏｒｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１３），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１３．０７．００９；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０；６２：７１１−７３０；Ｍｕｒｕａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８；１３２：７６−８３；及びＺａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２；１６０：３−１３）。マイクロカプセルは、様々な手法で製剤化され得る。例示的なマイクロカプセルは、外側アルギネート膜によって覆われたポリカチオン層によって囲われたアルギネートコアを含む。ポリカチオン膜は、安定性及び生体適合性を付与する半透膜を形成する。ポリカチオンの例は、限定されないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、キトサン、ラクトース改変キトサン、及び光重合生物物質を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）を有する共有結合したオリゴペプチドを有するアルギネートコアを含む骨格を生成するために改変される。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、増強された安定性の化学酵素的に修飾されたアルギネートを有する共有結合で強化されたマイクロカプセルを生成するために改変される。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、アクリレート官能化リン脂質の現場重合によって組み立てられた膜模倣フィルムを生成するために改変される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを���用して酵素的に改変されたアルギネートから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接層間に共有結合を含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部位と結合されたアルギネートを含むふるい内サイズのカプセルを含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、アルギネート−アガロースを含む骨格を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、アルギネート内に封入される前にＰＥＧで改変される。いくつかの実施形態では、単離された細胞の集団は、光反応性リポソーム及びアルギネートに封入される。マイクロカプセルに採用されるアルギネートは、限定されないが、ＰＥＧ、キトサン、ＰＥＳ中空ファイバー、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＧＤを有するデキストラン、ＥＨＤ及びＰＥＧＤＡ、ＰＭＢＶ及びＰＶＡ、ＰＧＳＡＳ、アガロース、ゼラチンを有するアガロース、ＰＬＧＡ、及びこれらの多層実施形態を含む他の好適な生物物質に置き換えられ得ると理解されるべきである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、薬剤は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤さらに含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、薬学的投与と適合性のある任意の及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張化及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。好適な担体は、当分野で標準的参考文献テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最も最近の版（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、固定油も使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、薬剤／組成物におけるそれらの使用が企図される。補充活性化合物はまた、薬剤／組成物に組み込まれ得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１つ以上の追加の抗糖尿病治療剤（例えば、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、アルビグルチド（Ｔａｎｚｅｕｍ）、アログリプチン（Ｎｅｓｉｎａ）、アログリプチン及びメトホルミン（Ｋａｚａｎｏ）、アログリプチン及びピオグリタゾン（Ｏｓｅｎｉ）、メシル酸ブロモクリプチン（Ｃｙｃｌｏｓｅｔ、Ｐａｒｌｏｄｅｌ）、カナグリフォジン（Ｉｎｖｏｋａｎａ）、カナグリフロジン及びメトホルミン（Ｉｎｖｏｋａｍｅｔ）、ダパグリフロジン（Ｆａｒｘｉｇａ）、ダパグリフロジン及びメトホルミン（Ｘｉｇｄｕｏ  ＸＲ）、デュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ）、エンパグリフロジン（Ｊａｒｄｉａｎｃｅ）、エンパグリフロジン及びリナグリプチン（Ｇｌｙｘａｍｂｉ）、エンパグリフロジン及びメトホルミン（Ｓｙｎｊａｒｄｙ）、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、グリブリド（ＤｉａＢｅｔａ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリブリド及びメトホルミン（Ｇｌｕｃｏｖａｎｃｅ）、インスリンアスパルト（ＮｏｖｏＬｏｇ）、インスリンデグルデック（Ｔｒｅｓｉｂａ）、インスリングラルギン（Ｂａｓａｇｌａｒ、Ｌａｎｔｕｓ、Ｔｏｕｊｅｏ）、インスリンイソファン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｎ、Ｎｏｖｏｌｉｎ  Ｎ）、インスリンイソファン／通常のインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ７０／３０、Ｎｏｖｏｌｉｎ７０／３０）、インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ）、リナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ）、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ）、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ロシグリタゾン及びグリメピリド（Ａｖａｎｄａｒｙｌ）、ロシグリタゾン及びメトホルミン（Ａｖａｎｄａｍｅｔ）、サキサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ）、セマグルチド（Ｏｚｅｍｐｉｃ）、またはシタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ））の対象への投与をさらを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、血中グルコースクリアランスを改善する。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、血中グルコースレベルを病的レベルから非病的レベルに（例えば、高血糖状態から正常状態に）戻す。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、血中グルコースレベルを約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、またはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、血中グルコースレベルを約１４０ｍｇ／ｄＬ未満、約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約６０〜９０ｍｇ／ｄＬ、または約７０〜８０ｍｇ／ｄＬまで減少させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、対象において低血糖（例えば、約７０ｍｇ／ｄＬ未満の血糖、約６０ｍｇ／ｄＬ未満の血糖、または対象が低血糖の徴候を示さない血糖レベル）を引き起こさない。いくつかの実施形態では、薬剤の血中グルコースクリアランス特性は、インスリン活性とは無関係である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース増感因子活性を有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、インスリン活性、産生または分泌を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、インスリン活性、産生または分泌を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、インスリン活性、産生または分泌を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、５倍、１０倍、５０倍、またはそれ以上増大させる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルコース代謝回転の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、グルコース代謝回転を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、グルコース代謝回転を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、５倍、１０倍、５０倍、またはそれ以上増大させる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、解糖を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、解糖の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、解糖を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、解糖を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、５倍、１０倍、５０倍、またはそれ以上増大させる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グリコーゲン合成の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グリコーゲン合成の速度を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、グリコーゲン合成を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、グリコーゲン合成を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、５倍、１０倍、５０倍、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、グルカゴン様活性を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病）、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、または肥満を有する。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、Ｃ１ＯＲＦ１２７の変異またはバリアント形態を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、以下のうちの１つである：１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１０１５１６５＿Ａ＿Ｇ、１＿１１００８１０２＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００９６７９＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００７８８１＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００８７７８＿Ｔ＿Ａ，Ｃ、１＿１１００８７９９＿Ｇ＿Ｃ、１＿１１００８４１７＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００８１２７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９７０３＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８５９４＿Ａ＿Ｔ、１＿１１００７９９７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１０２４２７１＿Ｇ＿Ｔ，Ａ、１＿１１００８６８５＿Ｔ＿Ｃ、１＿１１００９７１６＿Ｃ＿Ｇ、１＿１１００９８４４＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００８４１７＿Ｇ＿Ａ、１＿１１０３６２４８＿Ｇ＿Ａ、１＿１１０２４２７１＿Ｇ＿Ｔ，Ａ、１＿１１００９８４４＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００８７９９＿Ｇ＿Ｃ、１＿１１００８７７８＿Ｔ＿Ａ，Ｃ、１＿１１００８６８５＿Ｔ＿Ｃ、１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９７１６＿Ｃ＿Ｇ、１＿１１００８１０２＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００７８９５＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００８１２７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９７０３＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８５９４＿Ａ＿Ｔ、１＿１１００９６７９＿Ｇ＿Ａ、１＿１１０１４１２７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８８４４＿Ｃ＿Ｇ，Ｔ、１＿１１０１５１６５＿Ａ＿Ｇ、１＿１１００９７０３＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９６７９＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００８５９４＿Ａ＿Ｔ、１＿１１００８１０２＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００９８４４＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００７８９５＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００８１２７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８４１７＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００７７２４＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１０２４２７１＿Ｇ＿Ｔ，Ａ、１＿１１００８７７８＿Ｔ＿Ａ，Ｃ、１＿１１００９７１６＿Ｃ＿Ｇ、１＿１１０１５１６５＿Ａ＿Ｇ、１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８７９９＿Ｇ＿Ｃ、１＿１１００７８８１＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００８６８５＿Ｔ＿Ｃ、１＿１１００７９９７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１０１５１６５＿Ａ＿Ｇ、１＿１１００８１０２＿Ｇ＿Ａ、１＿１１００８６８５＿Ｔ＿Ｃ、１＿１１００８７９９＿Ｇ＿Ｃ、１＿１１００８１２７＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９６７９＿Ｇ＿Ａ、１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００９７０３＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００７７２４＿Ｃ＿Ｔ、１＿１１００８５９４＿Ａ＿Ｔ、１＿１１００９７１６＿Ｃ＿Ｇ、１＿１１００７８９５＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００７８８１＿Ｇ＿Ｔ、１＿１１００８７７８＿Ｔ＿Ａ，Ｃ、１＿１１０２４２７１＿Ｇ＿Ｔ，Ａ、または１＿１１００７９９７＿Ｃ＿Ｔ。
【００８７】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７バリアントは、糖尿病及び高ＢＭＩに関連する。いくつかの実施形態では、糖尿病及び高ＢＭＩに関連するＣ１ＯＲＦ１２７バリアントは、１＿１１０３３４１５＿Ｇ＿Ａである。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７バリアントは、絶食時グルコースレベルの上昇に関連する。いくつかの実施形態では、絶食時グルコースレベルの上昇に関連するＣ１ＯＲＦ１２７バリアントは、１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔである。いくつかの実施形態では、バリアントは、１型糖尿病に関連する。いくつかの実施形態では、バリアントは、２型糖尿病に関連する。いくつかの実施形態では、バリアントは、高ＢＭＩに関連する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の異常な発現または活性を引き起こす対象における遺伝子欠陥を修正する。いくつかの実施形態では、遺伝子欠陥は、本明細書で特定されるＣ１ＯＲＦ１２７バリアントである。いくつかの実施形態では、遺伝子欠陥は、バリアント１＿１１０３３４１５＿Ｇ＿Ａである。いくつかの実施形態では、遺伝子欠陥は、バリアント１＿１１０１４１１８＿Ｃ＿Ｔである。いくつかの実施形態では、薬剤は、標的可能なヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヌクレアーゼを遺伝子欠陥に標的化するｇＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、標的可能なヌクレアーゼによる欠陥部位でのＤＮＡ切断の発生後に相同配向修復（ＨＤＲ）によって欠陥を修正するためのドナー核酸をさらに含む。
【００８９】
標的可能なヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ）は、選択された標的部位でゲノムにおけるＤＮＡ切断を発生させ、正確なゲノム改変をもたらすために使用され得る。ＤＮＡ切断、例えば、二重鎖ＤＮＡ切断は、様々なＤＮＡ修復経路によって修復され得る。相同組換え（ＨＲ）媒介修復（相同配向修復（ＨＤＲ）とも称される）は、切断を修復するためのテンプレートとして相同性ドナーＤＮＡを使用する。ドナーＤＮＡの配列がゲノム配列とは異なる場合、このプロセスは、ゲノムへの配列変化の導入につながる。ゲノムへの正確な改変は、適切な配列を含むドナーＤＮＡを提供することによって作製され得る。標的可能なヌクレアーゼを使用して生成され得る改変は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはゲノムにおける選択された位置において外因性ＤＮＡセグメント、例えば、発現カセット（発現されるべき配列及び適切な発現制御要素、例えば、細胞においてその配列を発現させるためのプロモーターを含む核酸）またはタグを導入することを含む。
【００９０】
現在、使用されている４つの主要な種類の標的可能なヌクレアーゼが存在する：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ先導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩＩ型システムのＣａｓタンパク質、及び修飾されたメガヌクレアーゼ。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、選択されたＤＮＡ配列にタンパク質を標的化するように適切に設計された部位特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した制限酵素ＦｏｋＩ（またはその修飾されたバリアント）のヌクレアーゼドメインを含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＢＤを含む。ＴＡＬＥＮの場合、部位特異的ＤＢＤは、植物病原性細菌、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種に見られる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーである転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）によって採用されるＤＮＡ認識コードに基づいて設計される。クラスター化反復短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムは、ゲノム修飾のためのＲＮＡ先導エンドヌクレアーゼ技術として使用するために改変された細菌適応免疫システムである。その細菌システムは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの内因性細菌ＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに対して部分的相補性を有し、それとの複合体を形成する。Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって標的配列に先導され、ｃｒＲＮＡ配列と標的における相同配列との間でＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。ゲノム改変における使用の場合、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ成分はしばしば、単一のキメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）に組み合わされ、この場合、ｃｒＲＮＡの標的特異性及びｔｒａｃｒＲＮＡの特性が単一の転写産物に組み合わされ、その転写産物は、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断し得るようにＣａｓタンパク質を標的配列に局在化させる。ｓｇＲＮＡはしばしば、所望の標的配列に相補的なおよそ２０ヌクレオチドのガイド配列と、それに続く約８０ｎｔのハイブリッドｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当業者は、ガイドＲＮＡが、標的配列と完全に相補的である必要はないことを理解する。例えば、いくつかの実施形態では、それは１つまたは２つのミスマッチを有し得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列（例えば、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、天然に存在するＲＮＡ配列、改変されたＲＮＡ配列（例えば、１つ以上の改変された塩基を含むＲＮＡ配列）、合成ＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせである。本明細書で使用される場合、「改変されたＲＮＡ」は、１つ以上の改変（例えば、１つ以上の非標準及び／または天然に存在しない塩基及び／または骨格、ヌクレオシド間結合（複数可）及び／または糖に対する改変を含むＲＮＡ）を含むＲＮＡである。ＲＮＡの塩基を改変する方法は当該技術分野でよく知られている。そのような改変された塩基の例は、ヌクレオシド５−メチルシチジン（５ｍＣ）、シュードウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン、２’０−メチルウリジン、２−チオウリジン、Ｎ−６メチルアデノシン、ヒポキサンチン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、及び７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に含有されるものを含む。ＲＮＡ配列における塩基、糖、または骨格結合の任意の数は、様々な実施形態で改変され得ることが留意されるべきである。異なる改変の組み合わせが使用され得ることがさらに理解されるべきである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−拘束エチル（２’−ｃＥｔ）、２’−ＯＭｅ３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、及び２’−ＯＭｅ３−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）改変から選択される１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＲＮＡを安定化し得、及び／または相補的配列に対するその結合親和性を増大させ得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列は、少なくとも１つのロック核酸（ＬＮＡ）単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８ＬＮＡ単位、例えば、約３〜７もしくは４〜８ＬＮＡ単位、または３、４、５、６もしくは７ＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列のヌクレオチドのすべてがＬＮＡである。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列は、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、及び以下のＬＮＡ単位のうちの１つ以上の両方を含み得る：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、及び／またはＥＮＡ（ベータ−Ｄまたはアルファ−Ｌ構成のいずれか）またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、すべてのＬＮＡシトシン単位は、５’メチル−シトシンである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列は、モルホリノである。モルホリノは典型的には、長さが約２５塩基の合成分子であり、標準的な核酸塩基対合によってＲＮＡの相補的配列に結合する。モルホリノは標準的な核酸塩基を有するが、それらの塩基は、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合しており、ホスフェートの代わりにホスホロジアミダート基を介して連結されている。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが約８塩基対（ｂｐ）〜約２００ｂｐで変化し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列の各々は、長さが約９〜約１９０ｂｐ；約１０〜約１５０ｂｐ；約１５〜約１２０ｂｐ；約２０〜約１００ｂｐ；約３０〜約９０ｂｐ；約４０〜約８０ｂｐ；約５０〜約７０ｂｐであり得る。
【００９５】
ガイドＲＮＡ（ガイド配列）を合成する化学的改変及び方法は当該技術分野で知られている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１６／１６４３５６を参照されたい。
【００９６】
各ガイド配列が相補的または相同性である各ゲノム配列の部分（例えば、対象となる標的配列、対象となる遺伝子、遺伝子欠陥）もサイズが変化し得る。特定の態様では、各ガイド配列が相補的または相同性である各ゲノム配列の部分は、長さが約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、８１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または１００ヌクレオチド（連続ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、各ガイド配列は、各ゲノム配列の部分と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％などの同一、相補的または類似し得る。いくつかの実施形態では、各ガイド配列は、各ゲノム配列と完全にまたは部分的に同一、相補的または類似する。例えば、各ガイド配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などのヌクレオチドだけゲノム配列の部分との完全な相補性または相同性とは異なり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイド配列は、ゲノム配列の少なくとも約１０〜約２５（例えば、約２０）ヌクレオチドにわたって完全に相補的または相同性（１００％）である。
【００９７】
ゲノム標的配列（例えば、対象となるゲノム遺伝子座、対象となる遺伝子、対象となる標的配列、遺伝子欠陥）はまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直後にあるべきである。ＰＡＭ配列は、ＤＮＡ標的配列に存在するが、ガイド配列には存在しない。Ｃａｓタンパク質は、標的配列とそれに続くＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡに配向される。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質が誘導された細菌の種に依存して変化する。いくつかの実施形態では、標的可能なヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来するＣａｓ９が使用され得る。これらのＣａｓ９タンパク質のためのＰＡＭ配列は、それぞれ、ＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。多数の部位特異的ヌクレアーゼの修飾されたバリアントが開発されており、所定の実施形態で使用され得る。例えば、Ｃａｓ９及びＦｏｋ１の修飾されたバリアントが当該技術分野で知られている。さらに、生物学的に活性な断片またはバリアントが使用され得ることが理解される。他の類型は、ハイブリッドの標的可能なヌクレアーゼの使用を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ先導ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）タンパク質のアミノ末端に融合される。ＲＦＮは、二量体として作用し、２つのガイドＲＮＡを利用する（Ｔｓａｉ，ＱＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２（６）：５６９−５７６）。一本鎖ＤＮＡの切断をもたらす部位特異的ヌクレアーゼもゲノム編集のために使用される。時に「ニッカーゼ」と称されるそのようなヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを含む標的可能なヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣａｓタンパク質など）の２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つにおける重要な触媒的残基で変異（例えば、アラニン置換）を導入することによって生成され得る。そのような変異の例は、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＨ８４０Ａまたは他のＣａｓ９タンパク質における相同位置におけるものを含む。ニックは、いくつかの細胞型ではより低い効率でＨＤＲを刺激し得る。互いに近くかつ反対の鎖上にある配列の対に標的化される２つのニッカーゼは、各鎖上で一本鎖切断を生じさせ（「二重ニッキング」）、ＤＳＢを有効に生成し得、これはドナーＤＮＡテンプレートを使用してＨＤＲによって修復され得る（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １５４，１３８０−１３８９（２０１３）。
【００９８】
用語「ドナー核酸」または「ドナー」は、外因性核酸セグメントであって、細胞に提供された場合、例えば、標的可能なヌクレアーゼと一緒に、相同組換えによるＤＮＡ修復のためのテンプレートとして使用され、これにより部位特異的ゲノム改変（時に「ゲノム編集」と称される）を引き起こし得るものを指す。改変は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはゲノムにおける選択された位置において外因性ＤＮＡセグメント、例えば、発現カセットまたはタグを導入することを含み得る。ドナー核酸は典型的には、ゲノム改変がなされるゲノムの領域と相同性を有する配列を含む。ドナーは、それが相同組換え修復を可能とするのに十分な相同性を有する限り、ゲノム配列に対して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、または他の変更を含有し得る。本発明において、ドナー核酸は、相同アームによって挟まれたレポーター遺伝子及びＷＰＲＥを含む核酸配列である。相同アームは、挿入がなされるべきゲノムＤＮＡにおける位置（例えば、ＤＮＡ切断部）を挟むゲノム配列に対して相同である。当業者はまた、相同性がＤＮＡ切断部まで伸長する必要はないことを理解する。例えば、いくつかの実施形態では、相同性は、切断部から１００ｂｐ以下離れて、例えば、１〜１００ｂｐ離れて、例えば、切断部から１〜５０ｂｐ離れて、例えば、１〜１５ｂｐ離れて開始する。
【００９９】
ドナー核酸は、例えば、ＤＮＡプラスミド、ＰＣＲ産物、または化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの形態で提供され得、様々な実施形態において二本鎖または一本鎖であり得る。ドナー核酸のサイズは、約４０塩基対（ｂｐ）ほどの小さなものから約１０キロ塩基（ｋｂ）またはそれ以上まで変化し得る。いくつかの実施形態では、ドナー核酸は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ長である。
【０１００】
当業者は、標的可能なヌクレアーゼを使用して部位特異的ゲノム改変を実施するための方法を認識しており、そのような方法を本明細書に教示されるようにＣ１ＯＲＦ１２７の異常な発現または活性に関連する遺伝子欠陥を修復するために適用することができる。当業者は、例えば、ゲノムにおける選択された位置でＤＮＡ切断を生成するための適切なガイドＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮを設計し得、標的可能なヌクレアーゼによって生じたＤＮＡ切断部においてＨＤＲを促進するための標的化ベクター（例えば、相同アームを含む）を設計し得、標的可能なヌクレアーゼ、及び適切な場合には、ドナー核酸、及び／またはガイドＲＮＡを細胞内に導入するために使用され得る適切な方法を認識している。標的可能なヌクレアーゼは、ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡの適切な設計によって哺乳動物細胞のゲノムにおける独自の部位に標的化され得る。ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡは、それをコードする核酸を細胞内に導入することによって細胞内に導入され得る。標準的な方法、例えば、プラスミドＤＮＡトランスフェクション、ウイルスベクター送達、合成ｍＲＮＡ（例えば、キャップ付きポリアデニル化ｍＲＮＡ）でのトランスフェクション、またはマイクロインジェクションが使用され得る。ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡが導入される場合、コード配列は、発現のための適切な制御要素、例えば、プロモーター及び末端シグナルに機能的に連結されるべきである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６またはｔＲＮＡプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードする配列は、同じ核酸（例えば、プラスミド）から転写される。いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡが同じプラスミドまたは異なるプラスミドから転写され、またはそうでなければ細胞内に導入される。複数のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９をゲノムにおける異なる標的配列に向かわせ、多重ゲノム編集を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ）を含み得、または含むように改変され得る。ヌクレアーゼタンパク質は、例えば、タンパク質形質導入を使用して、細胞内に導入され得る。ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方は、マイクロインジェクションを使用して導入され得る。例えば、ゲノム編集を実施するために、標的可能なヌクレアーゼを使用する方法は、多数の刊行物、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｄｏｕｄｎａ  ＪＡ，Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ  ＥＪ．（ｅｄｓ），Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，ＺＦＮｓ，ａｎｄ  ＴＡＬＥＮｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１４，Ｖｏｌ．５４６（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４．８３：４０９−３９、及びこれらのいずれかにおける参考文献に記載されている。また米国特許公開番号２０１４００６８７９７、２０１４０１８６９１９、２０１４０１７０７５３及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７（ＷＯ／２０１４／１７２４７０）も参照されたい。これら参考文献の各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１０１】
薬剤及び組成物
【０１０２】
本開示のいくつかの態様は、対象に投与された場合、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる薬剤に関する。薬剤は、本明細書に記載される任意の薬剤であり得る。Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物は、本明細書に記載される任意のＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物のレベルまたは活性を増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の発現を調節する（例えば、増大または減少させる）。薬剤は、任意の量によって発現を増大または減少させ得、限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤は、発現を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、５倍、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、約１％、２．５％、５％、７．５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、５００％、またはそれ以上発現を増大させ、または発現を減少させる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、内因性Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の分泌を調節する（例えば、増大または減少させる）。薬剤は、任意の量によって分泌を増大または減少させ得、限定されない。いくつかの実施形態では、薬剤は、分泌を約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、５倍、またはそれ以上増大させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、約１％、２．５％、５％、７．５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、５００％、またはそれ以上分泌を増大させ、または分泌を減少させる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、薬剤は、小分子、タンパク質、または核酸を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる少なくとも１つの翻訳後修飾を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物と比べて少なくとも１つの置換、欠失、または付加されたアミノ酸を有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物とは異なる活性または活性レベルを有するＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の機能的部分を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、薬剤は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤さらに含む。薬学的に許容可能な担体または賦形剤は限定されず、本明細書に記載の任意の薬学的に許容可能な担体または賦形剤であり得る。
【０１０６】
少なくとも１つの薬剤を含有する治療組成物は、例えば、単位用量で従来のように投与され得る。用語「単位用量」は、治療組成物に関して使用される場合、対象に独自の投薬量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要とされる生理的に許容可能な希釈剤、すなわち、担体、またはビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の既定量を含有する。
【０１０７】
薬剤の投薬量範囲は、効力に依存し、所望の効果をもたらすのに、例えば、血中グルコースクリアランスを改善するのに十分に多い量である。投薬量は、許容できない有害な副作用を引き起こすほど多量であるべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、及び性別によって異なり、当業者によって決定され得る。投薬量はまた、任意の合併症が生じた場合、個々の医師によって調整され得る。典型的には、投薬量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。一実施形態では、用量範囲は、５μｇ／ｋｇ体重〜３０μｇ／ｋｇ体重である。
【０１０８】
上記の用量の投与は繰り返され得る。いくつかの実施形態では、用量は、１日１回、または１日複数回、例えば、限定されないが、１日３回提供され得る。いくつかの実施形態では、上記の用量は、数週間または数か月間、毎日投与される。治療の継続期間は、対象の臨床的進行及び療法に対する反応性に依存する。
【０１０９】
投与に必要とされる活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。しかしながら、全身性適用のための好適な投薬量範囲は、本明細書に開示されており、投与経路に依存する。投与のための好適なレジームはまた可変性であるが、初期投与と、それに続く後の投与による１つ以上の間隔での繰り返し用量に代表される。代替的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ療法に特異的な範囲内の血液中濃度を維持するのに十分な連続的静脈内注入が企図される。いくつかの実施形態では、投薬量範囲は、正常な健康なヒト対象の集団の血液に見られる範囲内の血液中の濃度を維持するのに十分である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、薬剤は、追加の抗糖尿病治療剤を含む。追加の抗糖尿病治療剤は限定されず、本明細書に記載の任意の抗糖尿病治療剤であり得る。追加の抗糖尿病治療剤は、一緒にまたは別々に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の抗糖尿病治療剤は、単一の投薬形態である。いくつかの実施形態では、追加の抗糖尿病治療剤は、別々の投薬形態である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、血中グルコースクリアランスを改善する。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に投与された場合、低血糖を引き起こさない。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病）、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、または肥満を有する。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたはマウスである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、配列番号２のＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物またはその機能的部分もしくは機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分、または機能的バリアントをコードする核酸を含み、核酸は、配列番号１の配列またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物、その機能的部分または機能的バリアントをコードする核酸を含み、核酸は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する配列またはその一部を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の異常な発現または活性を引き起こす対象における遺伝子欠陥を修正する。いくつかの実施形態では、薬剤は、本明細書に記載される標的可能なヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ガイドＲＮＡ及び、任意に、本明細書に記載されるドナー核酸を含む。
【０１１５】
診断する方法
【０１１６】
本開示のいくつかの態様は、試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、前記試験個体から得られたサンプルにおけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルを決定することを含み、正常個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルと比較して前記試験個体において増大または減少したＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害を示す、方法を対象とする。試験個体は、任意の本明細書に記載の対象であり得る。
【０１１７】
Ｃ１ＯＲＦ１２７関連病態を示すＣ１ＯＲＦ１２７のレベルは、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害がないことが知られている個体に由来するサンプルにおけるＣ１ＯＲＦ１２７レベルに対する、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害を有することが知られている個体に由来するサンプルに存在するレベルの減少として定義され得る。Ｃ１ＯＲＦ１２７のレベルは、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害を有する個体に由来するサンプルにおいて、例えば、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５．０倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍または１００倍以上または以下であり得る。
【０１１８】
Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物（例えば、タンパク質）は、多数のよく認識されている免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；及び第４，８３７，１６８号参照）を使用してサンプルにおいて検出及び／または定量される。一般的なイムノアッセイのレビューのために、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｓａｉ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．（１９９１）も参照されたい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、サンプルにおけるＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物はまた、イムノブロット（ウェスタンブロット）分析を使用して検出され、定量化され得る。イムノブロットは一般に、分子量に基づいてゲル電気泳動によってサンプルタンパク質を分離することと、分離されたタンパク質を好適な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルター）に移すことと、サンプルをＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物を特異的に結合させる抗体と共にインキュベートすることと、を含む。抗Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物抗体は、固体支持体上でＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物に特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識され得、または代替的には、抗Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物抗体に特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を使用して後に検出され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物の定量アッセイは、測定されたＣ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルが、対照サンプルについて測定されたまたは知られているレベル（例えば、正常な健康な個体について知られているまたは測定されたレベルまたは同じ個体について異なる時点で決定された「ベースライン／参照」レベルのいずれか）よりも高いまたは低い場合に良好な結果、例えば、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルの上昇または減少を示すとみなされる。特定の好ましい実施形態では、アッセイは、サンプルと「対照」との間の差が統計的に有意（例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の信頼レベル）である場合に良好な結果を示すとみなされる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物レベルは、血液サンプルにおいて検出される。血液サンプルを得て処理する方法は、当該技術分野で知られており、本明細書において限定されない。
【０１２２】
本開示のいくつかの態様は、試験個体におけるＣ１ＯＲＦ１２７関連障害またはＣ１ＯＲＦ１２７関連障害を発症するリスクの増大を診断する方法であって、試験個体をＣ１ＯＲＦ１２７における変異についてスクリーニングすることを含む、方法を対象とする。遺伝子変異を検出する方法は、当該技術分野で知られており、限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃ１ＯＲＦ１２７関連障害は、糖尿病である。
【０１２３】
スクリーニングする方法
【０１２４】
本開示のいくつかの態様は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストのためのスクリーニング方法であって、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物に対して反応性の細胞を試験薬剤と接触させることと、細胞の反応を測定することと、を含み、細胞が反応した場合、そのときは試験薬剤は、Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子産物受容体アゴニストとして特定される、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、細胞反応は、グルコース取り込みである。いくつかの実施形態では、細胞は、インスリン受容体アンタゴニストとさらに接触される。いくつかの実施形態では、インスリン受容体アンタゴニストは、Ｓ９６１である。いくつかの実施形態では、その細胞を有する動物（例えば、本明細書に記載される対象）が使用される。
【０１２５】
分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮するための方法
【０１２６】
本開示のいくつかの態様は、分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する方法であって、標識を有する小胞体（ＥＲ）トランスロコンを含む細胞を提供することと、細胞の細胞内分画を実施し、標識を含有するＥＲ画分を単離することと、標識を含有する単離されたＥＲ画分に含有されるｍＲＮＡを単離し、シーケンシングすることと、を含む、方法を対象とする。
【０１２７】
標識を有するＥＲトランスロコンの成分は限定されない。いくつかの実施形態では、標識されたＥＲトランスロコン成分は、Ｓｅｃ６１、オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体、ＴＲＡＰ複合体、または膜タンパク質ＴＲＡＭである。いくつかの実施形態では、ＥＲトランスロコン成分ＳＥＣ６１ｂは、標識を有する。
【０１２８】
標識をＥＲトランスロコン成分に加える方法は限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスロコン成分と共に標識を発現するように遺伝子改変される。細胞の遺伝子改変の方法は限定されず、当該技術分野で知られている任意のものである。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される標的可能なヌクレアーゼを遺伝子的に使用している。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または赤外蛍光タンパク質である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、標識は、一過性に、または所定の細胞条件でのみ発現される。いくつかの実施形態では、所定の条件は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ）の存在である。例えば、標識は、ＬｏｘＰによって挟まれた停止コドンと共にゲノムに加えられ得る。Ｃｒｅの活性化または添加により、停止コドンは組換え中に除去され、標識はトランスロコン成分と一緒に発現されるであろう。
【０１３０】
用語「部位特異的リコンビナーゼ」（本明細書では単に「リコンビナーゼ」とも称される）は、ＤＮＡ分子における特定の配列間のＤＮＡの組換えを認識し、触媒し得るタンパク質を指す。そのような配列は、特定のリコンビナーゼのための「組換え配列」または「組換え部位」と称され得る。チロシンリコンビナーゼ及びセリンリコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼの２つの主要なファミリーである。部位特異的リコンビナーゼシステムの例は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム（Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ間の組換えを媒介する）、Ｆｌｐ／Ｆｒｔシステム（Ｆｌｐリコンビナーゼは、ＦＲＴ部位間の組換えを媒介する）、及びＰｈｉＣ３１システム（ＰｈｉＣ３１リコンビナーゼは、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位として知られている配列におけるＤＮＡ組換えを媒介する）を含む。Ｃｒｅに類似するリコンビナーゼシステムは、Ｄｒｅ−ｒｏｘ、ＶＣｒｅ／ＶｌｏｘＰ、及びＳＣｒｅ／ＳｌｏｘＰシステムを含む（Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ  ２（９−１０）：５０８−５１５；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｅ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍ（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（８）：ｅ４９。リコンビナーゼシステムに対する言及は、リコンビナーゼ及び組換え部位の様々な修飾及び変異形態ならびに当該技術分野で知られているコード配列のコドン最適化形態を包含することが意図されていることが理解されるべきである。２つのｌｏｘＰ部位間に配置されたＤＮＡは、「フロックスされた」と呼ばれる。遺伝子は、Ｃｒｅ媒介組換えを介してフロックスされた遺伝子セグメントの切除を可能とする２つのｌｏｘＰ部位の挿入によって改変され得る。いくつかの実施形態では、Ｃｒｅの発現は、細胞型特異的、細胞状態特異的、または誘導可能な発現制御要素（例えば、細胞型特異的、細胞状態特異的、または誘導可能なプロモーター）の制御下であり得、またはＣｒｅ活性は小分子によって制御され得る。例えば、Ｃｒｅは、その活性が受容体リガンドによって制御され得るように、受容体（例えば、ステロイドホルモン受容体）のリガンド結合ドメインに融合され得る。ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の変異型リガンド結合ドメインとＣｒｅとの間の融合タンパク質を含むＣｒｅ−ＥＲ（Ｔ）またはＣｒｅ−ＥＲ（Ｔ２）リコンビナーゼが使用され得、その活性は、例えば、４−ヒドロキシ−タモキシフェンによって誘導され得る。Ｌｏｘ配列を適切に配置することにより、様々なゲノム操作が可能となる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、方法の工程ｂ）は、細胞をタンパク質合成阻害因子と接触させることと、細胞原形質膜を可溶化することと、ＥＲを免疫沈降させることと、を含む。
【０１３２】
タンパク質合成阻害因子は限定されず、ＥＲに関連する標識されたトランスロコンを維持する任意の好適なタンパク質合成阻害因子であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質合成阻害因子は、翻訳伸長を遮断する。いくつかの実施形態では、タンパク質合成阻害因子は、Ｃｈａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ，ＲＮＡ  ２００４．１０：５２８−５４３において特定されているものである。いくつかの実施形態では、タンパク質合成阻害因子は、シクロヘキサミドである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、細胞原形質膜は、段階的濃度の洗浄剤で可溶化される。いくつかの実施形態では、血漿膜に続いてＥＲ膜が段階的手法で可溶化される。当該技術分野で知られている任意の好適な洗浄剤または洗浄剤の組み合わせが使用され得、限定されない。血漿膜を可溶化する方法は、当業者によって実施され得る。いくつかの実施形態では、洗浄剤は、ジギトニン及び／またはｎ−ドデシル−Ｂ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）である。
【０１３４】
免疫沈降の方法もまた限定されず、当該技術分野で知られている任意の好適な方法によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲは、標識または標識されたトランスロコン成分に特異的な抗体で免疫沈降される。いくつかの実施形態では、標識は、ＧＦＰであり、抗体は、抗ＧＦＰ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、磁性粒子または他の基材に結合される。
【０１３５】
ｍＲＮＡをシーケンシングする方法は限定されず、当該技術分野で知られている任意の好適な方法であり得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、次世代シーケンシングによってシーケンシングされる。
【０１３６】
本明細書に記載の方法及び組成物の細胞は限定されず、任意の好適な細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、胚幹細胞、哺乳動物胚幹細胞、ヒト胚幹細胞、マウス胚幹細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞は、体細胞、幹細胞、有糸分裂もしくは有糸分裂後細胞、ニューロン、線維芽細胞、または接合子を含む。幹細胞は、分化全能性、万能性、多能性、寡能性及び分化単能性幹細胞を含み得る。幹細胞の具体的な例は、胚幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む（例えば、米国出願公開第２０１０／０１４４０３１号、第２０１１／００７６６７８号、第２０１１／００８８１０７号、第２０１２／００２８８２１号（これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
【０１３８】
体細胞は、初代細胞（非不死化細胞）、例えば、動物から新たに単離されたものであり得、または培養において長期増殖（例えば、３ヶ月よりも長い間）または無限増殖（不死化細胞）が可能な細胞株から誘導され得る。成体体細胞は、個体、例えば、ヒト対象から得られ、当業者に利用可能な標準的細胞培養プロトコルに従って培養され得る。本発明の態様において使用される体細胞は、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞などの哺乳動物細胞を含む。それらは、様々な器官、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、胸、生殖器官、筋肉、血液、膀胱、腎臓、尿道及び他の泌尿器官など、通常は生存体細胞を含有する任意の器官または組織からよく知られている方法によって得られ得る。様々な実施形態において有用な哺乳動物の体細胞は、例えば、繊維芽細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵臓細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ベータ細胞である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、細胞は、疾患細胞であり、または病的状態を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞に由来する分化した細胞である。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、対象となる疾患または病態を有する対象から誘導される。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、糖尿病または糖尿病を発症するリスクを有する対象に由来する。
【０１４０】
疾患及び病態は限定されない。いくつかの実施形態では、疾患または病態は、代謝疾患、心臓血管疾患、循環または血管疾患、神経学的疾患、胃腸疾患（例えば、炎症性腸疾患、クローン病）、及び加齢に関連する疾患から選択される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞は、ストレス反応（例えば、低酸素症、高血糖、低血糖、低酸素症／再かん流）を受けている。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質合成阻害因子と接触された場合、刺激に対して反応している。いくつかの実施形態では、刺激は、ホルモン（例えば、インスリン）である。いくつかの実施形態では、刺激は、環境条件（例えば、低酸素、再かん流）である。いくつかの実施形態では、刺激は、インスリンである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、対照細胞上の分泌及び膜結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを濃縮する方法を実施することと、細胞から単離されたｍＲＮＡを対照細胞から単離されたｍＲＮＡと比較することと、をさらに含む。
【０１４４】
ＥＲ−ｓｅｑの適用：
【０１４５】
１．ＥＲ−ｓｅｑは、分泌タンパク質をコードするＲＮＡを特異的に単離し、２つの試験群間でそれらを比較することによって新たな疾患バイオマーカーを見出すために非糖尿病及び糖尿病患者由来のｉｎ−ｖｉｔｒｏで生成されたベータ細胞を比較するために使用され得る。
【０１４６】
２．ＥＲ−ｓｅｑは、機能不全のベータ細胞によって生成される分泌ペプチドバイオマーカーを特定するために使用され得る。
【０１４７】
３．ベータ細胞機能不全のためのバイオマーカーを特定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでストレス反応を誘導する
【０１４８】
４．ストレスを受けた分泌タンパク質の排除を調べるアッセイを生成することによって、Ｔ１Ｄの開始時にベータ細胞を保護する方法を見出し得る。
【０１４９】
５．他の細胞をマークし、分泌タンパク質のそれらの相補体を発見する。
【０１５０】
非ヒト動物
【０１５１】
本発明のいくつかの態様は、標識されたＳＥＣ６１ｂタンパク質を発現することが可能な非ヒト動物を対象とする。いくつかの実施形態では、標識されたタンパク質の発現が誘導可能である。いくつかの実施形態では、標識されたタンパク質は、Ｃｒｅ依存性発現を有する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ベータ細胞において標識されたＳＥＣ１６ｂタンパク質の誘導可能な発現を有する。標識は限定されず、当該技術分野における任意の好適な標識であり得る。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、糖尿病のモデル（例えば、１型糖尿病のＮＯＤモデル、１型糖尿病のモデル）である。
【０１５２】
本発明の実施は典型的には、別段示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来の技術を採用する。これらの技術の所定の非限定的な例は、以下の刊行物に見られる：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｌｌ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｆ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５。治療剤及びヒト疾患に関する非限定的な情報は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００５，Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ；１０ｔｈ  ｅｄ．（２００６）または１１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２００９）に見られる。遺伝子及び遺伝子障害に関する非限定的な情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．：Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８（１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）またはより最近のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ＯＭＩＭ（商標）．ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）２０１０年５月１日時点でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／及びｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌの遺伝子、動物種（ヒト及びマウス以外）における遺伝性障害及び形質のデータベースであるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ）に見られる。本明細書に挙げられているすべての特許、特許出願、及び他の刊行物（例えば、科学記事、書籍、ウェブサイト、及びデータベース）は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書と組み込まれた参考文献のいずれかとの間に矛盾がある場合、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得るその任意の修正を含む）が優先するものとする。本明細書では、別段示されない限り、当該技術分野で許容されている標準的な用語の意味が使用される。本明細書では、様々な用語のための標準的な略語が使用される。
【０１５３】
本明細書に開示される発明の所定の態様の具体的な例は、以下の実施例に示されている。
【０１５４】
当業者は、本発明が、目的を遂行し、記述された目的及び利点、ならびにそこに内在するものを得るために十分に適合されることを容易に理解する。本明細書の説明の詳細及び例は、所定の実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていない。それにおける改変及び他の使用が当業者に想起される。これらの改変は本発明の趣旨に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される発明に対して様々な置換及び改変がなされ得ることは当業者に容易に理解される。
【０１５５】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書及び特許請求の範囲において本出願で使用される場合、明らかに逆に示されない限り、複数の参照を含むことが理解されるべきである。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または明細書は、逆に示されない限り、または別段文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、複数、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、またはそうでなければ関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明はまた、群のメンバーの複数、すべてが、所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、別段示されない限り、または矛盾もしくは不整合が生じであろうことが当業者に明らかでない限り、列挙された請求項の１つ以上からの１つ以上の限定、要素、条項、記述用語などが、同じ（または、関連する任意の他の請求項と同じ）ベースの請求項に従属する別の請求項に導入されるすべての類型、組み合わせ、及び順列を提供することを理解されたい。本明細書に記載のすべての実施形態は、適切な場合、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。また、実施形態または態様のいずれも、適切な場合はいつでも、１つ以上の他のそのような実施形態または態様と自由に組み合わされ得ることが企図される。要素がリストとして、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示されている場合、要素の各副次的群も開示されており、任意の要素（複数可）が群から除去され得ることを理解されたい。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むものとして言及されている場合、本発明または本発明の態様の所定の実施形態は、そのような要素、特徴などからなる、または本質的になることが理解されるべきである。簡略化の目的のため、それらの実施形態は、すべての場合において、本明細書で非常に多くの言葉で具体的に説明されていない。また、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書に記述されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。例えば、任意の１つ以上の核酸、ポリペプチド、細胞、生物の種または種類、障害、対象、またはそれらの組み合わせが除外され得る。
【０１５６】
特許請求の範囲または明細書が物質の組成物、例えば、核酸、ポリペプチド、細胞、または非ヒトトランスジェニック動物に関する場合、別段示されない限り、または矛盾もしくは不整合が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、本明細書に開示される方法のいずれかに従って物質の組成物を使用する作製するまたは使用する方法、及び本明細書に開示される目的のいずれかのために物質の組成物を使用する方法は、本発明の態様であると理解されたい。特許請求の範囲または明細書が方法に関する場合、例えば、別段示されない限り、または矛盾もしくは不整合が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、方法を実施するのに有用な組成物を作製する方法、及びその方法に従って生成された製品は、本発明の態様であると理解されたい。
【０１５７】
本明細書で範囲が与えられる場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、及び一方の端点が含まれ、他方が除外される実施形態を含む。別段示されない限り、両方の端点が含まれると想定されるべきである。さらに、別段示されない限り、または文脈及び当業者の理解から別段明らかでない限り、範囲として表現されている値は、文脈が明らかに示していない限り、本発明の異なる実施形態において、範囲の下限の単位の１０分の１まで、記述された範囲内の任意の特定の値または副次的範囲を想定し得ることを理解されたい。また、本明細書で一連の数値が記述されている場合、本発明は、その一連における任意の２つの値によって定義される任意の介在する値または範囲に類似して関連する実施形態を含むこと、及び最も低い値が最小として解釈され得、最も高い値が最大として解釈され得ることが理解される。数値は、本明細書で使用される場合、百分率として表される値を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付けられている本発明の任意の実施形態については、本発明は、正確な値が記述されている実施形態を含む。数値の前に「約」または「およそ」が付けられていない本発明の任意の実施形態については、本発明は、値の前に「約」または「およそ」が付けられている実施形態を含む。「およそ」または「約」は一般に、別段記述されない限りまたは別段文脈から明らかでない限り、１％の範囲内、いずれかの方向（数より大きいまたは小さい）で数の５％の範囲内のいくつかの実施形態もしくは数の１０％の範囲内のいくつかの実施形態に入る数を含む（そのような数が、可能な値の１００％を許容不可能に超えるであろう場合を除く）。逆に明確に示されない限り、複数の行為を含む本明細書で請求されている任意の方法において、方法の行為の順序は、必ずしも方法の行為が記述されている順序に限定されるものではないが、本発明は、順序がそのように限定されている実施形態を含むことが理解されるべきである。また、別段示されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の任意の製品または組成物は、「単離された」とみなされ得ることが理解されるべきである。
＊＊＊
【実施例】
【０１５８】
実施例１
【０１５９】
研究目標：糖尿病を治癒するための新規ホルモンを見出すこと
【０１６０】
ヒト胚または人工多能性幹細胞の機能的インスリン発現ベータ細胞への分化を指示するためのプロトコルは以前に開発されている１。これらの幹細胞由来ベータ細胞（ＳＣ−ベータ）は、ベータ細胞の発生、ベータ細胞の機能及び生理機能を研究するために使用され得、それらは、細胞移植によって糖尿病を治療するための潜在性を有する。
【０１６１】
インスリンを含むホルモンは、代謝、細胞分化、及び疾患を制御する上で強力な役割を有する分泌タンパク質である。分泌または膜貫通タンパク質をコードするｍＲＮＡは粗面小胞体を通過する。新規な分泌及び膜貫通タンパク質を特定するために、小胞体の表面で積極的に翻訳するリボソームを物理的に単離することによって分泌／膜貫通タンパク質のＲＮＡを濃縮する小胞体シーケンシング（ＥＲ−ｓｅｑ）と呼ばれる技術が開発されてきた。グルコース代謝を制御する新規なホルモンを見出すために、ＥＲ−ｓｅｑ法をＳＣ−ベータ細胞及び関連するシーケンシングされたｍＲＮＡに適用した。
【０１６２】
次に、差次的遺伝子及び遺伝子オントロジー分析を実施して、ＳＣ−ベータ細胞におけるすべての既知の分泌作用を見出した。そのように行うことで、多くの他の分泌タンパク質の中で、インスリン遺伝子を特定することによってその技術を検証した。割り当てられた機能もアノテーションもない８種の遺伝子を分析した。これらの新規遺伝子は、ＳＣ−ベータ細胞によって作製され、分泌タンパク質をコードし得るので、インスリンのように、これらの新規遺伝子の一部は、代謝の役割を有する可能性があると理由付けられた。
【０１６３】
これらの８種の遺伝子を、プラスミドＤＮＡの流体力学的尾静脈（ＨＴＶ）注射によってマウスの肝臓において高レベルでプラスミドＤＮＡから一過性発現させた２。これらの８種の遺伝子のいずれかがグルコースホメオスタシスに影響を及ぼしたかどうかを評価するために、注射の３日後に、肝臓からの高発現時に、グルコース耐性試験を実施した。
【０１６４】
注射された８種のヒト遺伝子のうちの１種であるＣ１ＯＲＦ１２７は、対照よりも早く血液循環からグルコースを排除した（図１Ａ）。グルコースレベルの減少は、有意かつ再現性である：これまでに、５０匹を超えるマウスにおいて成功裏に試験されたＣ１ＯＲＦ１２７グルコース低下活性であった。また、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、２型糖尿病のモデルである食餌誘導肥満マウスにおいて血中グルコースレベルを減少させることができることが見出された。
【０１６５】
Ｃ１ＯＲＦ１２７は、インスリンを生成するベータ細胞において発現されるので、そのグルコース低下活性がインスリン作用に依存したかどうかが問われた。この点を試験するために、強力かつ特異的ペプチド阻害因子、及びインスリン受容体のアンタゴニストであるＳ９６１３を使用した。Ｓ９６１がマウスに急性投与された場合、それらは急激に高血糖になる。すなわち、インスリン受容体を阻害し、筋肉及び脂肪へのグルコース取り込みを防止する上でのＳ９６１の有効性を実証しており、これにより循環におけるグルコースの正味蓄積がもたらされる。Ｃ１ＯＲＦ１２７及び対照ＤＮＡのＨＴＶ注射及び３日目にグルコース耐性試験を実施した。この実験のため、Ｓ９６１を２つの時点で添加した；１回目は、グルコースの注射の２時間前；２回目は、試験の開始時のグルコースボーラスと共にである。図１Ｂで分かるように、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、対照よりも早く循環からグルコースを排除した。このデータは、Ｃ１ＯＲＦ１２７が、インスリン作用とは無関係に循環からグルコースを除去することを強く示唆している。注目すべきことに、これらの実験では、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、インスリン分泌を促進するように機能するすべての既知の薬物の問題である低血糖を引き起こさずに、血中グルコースレベルを低下させる（図１Ａにおける時間０分及び図１Ｂにおける絶食したＤ３）。
【０１６６】
Ｃ１ＯＲＦ１２７遺伝子は、６８４アミノ酸のタンパク質（ＭＷ７３ｋＤａ）をコードすることが予測される。それは、分泌または膜挿入のための標準的シグナルを欠く脊椎動物の中で高度に保存された転写産物である。その発現は、免疫蛍光顕微鏡法によってＳＣ−ベータ細胞及び死体ヒト膵島で確認されている。内部発現データベースを使用して、Ｃ１ＯＲＦ１２７は、主にベータ細胞において及びソマトスタチン発現（膵臓デルタ）細胞においてより低いレベルで発現されることが見出された。ヒトでは、Ｃ１ＯＲＦ１２７はまた、筋肉及び小脳において発現される。そのマウスオルソログであるＧｍ５７２は、ベータ及びデルタ（ソマトスタチン）発現細胞においてのみ発現される。ウェスタンブロットにより、そのタンパク質は、ＳＣ−ベータ及び死体ヒト膵島において予測された分子量で発現されることが見出される。その上、２型糖尿病知識ポータル（キュレートされた疾患リスクレポジトリ）は探索であり、２型糖尿病の発症または進行に重要である可能性があるＣ１ＯＲＦ１２７における変異を特定した４。
【０１６７】
参考文献
【０１６８】
１．Ｐａｇｌｉｕｃａ  ＦＷ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｍａｎ  ＪＲ，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：４２８−３９
【０１６９】
２．Ｃｈｅｎ  ＣＡ，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（９）：ｅ４４６００．
【０１７０】
３．Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ｌ，ｅｔ．ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００８  Ｎｏｖ  １４；３７６（２）：３８０−３．
【０１７１】
４．Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｐｏｒｔａｌ．２０１８−０９−１０  ｗｗｗ．ｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｐｏｒｔａｌＨｏｍｅ
【０１７２】
実施例２
【０１７３】
ホルモンの生合成は、トランスロコン複合体においてそれらのｍＲＮＡを積極的に翻訳する小胞体（ＥＲ）局在化リボソームによって指示される（Ｍａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。新たな分泌因子及びホルモンを特定するほとんどの研究は、標準的トポジェニックシグナルを予測するアルゴリズムに依存している（Ｄｉｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｅｉｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらのコンピュータ予測は、情報量が多いが、この機能的クラスの一部である遺伝子の有意な画分を効率的に把握するものではない（Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。分泌因子のｍＲＮＡの相補性を特性化する最近の取り組みは、ＥＲ局在化リボソームの生化学的単離に依存していた（Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｆａｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９；Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、これらの取り組みは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵母及びがん細胞に限られている（Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｆａｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９；Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ここでは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）及び分化した子孫におけるリボソーム／トランスロコン複合体の生化学的単離のためのＥＲ−ｓｅｑと呼ばれるプロトコルが記載されている。このプロトコルをＳＣ−β細胞を適用し、インスリン作用とは無関係にグルコースクリアランスを促進する過去に特性化されていない遺伝子、すなわち、Ｃ１ＯＲＦ１２７を特定した。
【０１７４】
リボソーム−トランスロコン複合体の単離のための生化学的分画方法の開発
【０１７５】
分泌因子及びホルモンの生合成は、ＥＲ局在化リボソーム／トランスロコン複合体において生じるため、トランスロコン関連ｍＲＮＡの単離は、分泌因子のｍＲＮＡを有効に濃縮し、細胞におけるそれらの発現の代替物として機能し得ることが理由付けられた（Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。トランスロコン複合体を単離するために、構成的にまたはインスリン発現β細胞においてＧＦＰに融合したトランスロコン複合体のサブユニットであるＳｅｃ６１βを発現するｈＰＳＣ細胞株を生成した（図２Ａ）。ｈＰＣＳ及び分化した子孫において普遍的かつ構成的発現を達成するために、ＴＡＬＥＮ媒介ゲノム編集技術を使用して、普遍的に発現される人工的に修飾したＣＡＡＧＳプロモーターの制御下でＧＦＰ−ＳＥＣ６１β融合タンパク質をＡＡＶＳ１遺伝子座にノックインした（ＣＡＡＧＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β；図２Ｂ）。同様に、インスリンを発現するβ細胞においてこの導入遺伝子を発現させるために、ＣＲＩＳＰＲを使用して、ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β融合導入遺伝子を内因性インスリン遺伝子の最後のエキソンにノックインした（ＩＮＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β；図２Ｃ）。ｈＰＳＣ及びＳＣ−β細胞において、導入遺伝子の発現は、ＥＲ局在化タンパク質について予期されたように核周囲であった（図２Ｂ〜２Ｃ）。
【０１７６】
段階的手法で血漿及びＥＲ膜を透過化するために細胞膜の異なる溶解性に依存するプロトコルを開発した（図４．２Ａ）。最初に、ジギトニンを使用して血漿膜を透過化し、細胞質性画分を回収した。不溶性画分に、ｎ−ドデシル−Ｂ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を低張性緩衝液に添加して、ＥＲ膜及び内腔成分を透過化し、これはＥＲ分画と呼ばれる（Ｎｉｃｈｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ＥＲ透過化の後、ＥＲ画分を抗ＧＦＰ磁性粒子を用いる免疫沈降に供して、リボソーム／トランスロコン複合体及び関連するｍＲＮＡを精製した（図３Ａ）。このプロトコルを自己再生するｈＰＣＳに適用し、ウェスタンブロットによってアッセイされたように、未分画細胞抽出物と比べて、免疫精製された（ＩＰ）画分においてＳｅｃ６１β及びＧＦＰタンパク質発現の有意な濃縮を検出した（図３Ｂ）。重要なことに、リボソームタンパク質サブユニットＬ１３ａ及びリボソームＲＮＡサブユニット２８Ｓ及び１８Ｓも共精製した（図３Ｂ〜Ｃ）。免疫精製されたＥＲ画分を質量分析に供し、トランスロコンサブユニットＳＥＣ６１α、トランスロコン関連タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）及び複数のリボソームタンパク質サブユニットのペプチドを検出した（図３Ｄ）。すべてにおいて、生化学的プロトコルにより、リボソーム／トランスロコン複合体の強固かつ有効な濃縮が可能となる。
【０１７７】
ＥＲ−ｓｅｑは、ｈＰＳＣ及びＳＣ−β細胞において分泌因子のｍＲＮＡを強固に濃縮する。
【０１７８】
このアプローチが、分泌因子及び膜タンパク質をコードするｍＲＮＡを有効に濃縮するかどうかを決定するために、ｈＰＳＣから精製されたトランスロコン関連ｍＲＮＡに対するマイクロアレイ分析を実施した。総未分画細胞抽出物から収集されたｍＲＮＡと比較して、ＥＲ因子Ｓｅｃ６１α及びＤＤＯＳＴならびに分泌因子、例えば、とりわけ、ＢＭＰ７、ＤＬＬ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１をコードするｍＲＮＡの濃縮を検出した（図４Ａ）。総ｍＲＮＡと比べてＩＰ画分で濃縮された３１７４種の遺伝子のうち、標準的トポジェニックシグナルペプチド予測に基づいて、分泌因子または膜タンパク質であると予測される９８９種の遺伝子（３１．１％）を検出した（図４Ｂ）。ＩＰ画分に濃縮された遺伝子の遺伝子オントロジー分析に基づいて、ＩＰ画分における細胞内膜系、ベシクル及び細胞外成分の一部の遺伝子の有意な濃縮が存在する（図４Ｃ）。アノテーションされておらず、予測された局在化シグナルを有さないＩＰ画分に濃縮された６５０種の遺伝子も検出された。ほとんどの細胞型で発現されるすべての遺伝子のおよそ１０％が分泌されることが予測されているので（Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、コンピュータ分析は、このアプローチが、ｈＰＳＣで発現される分泌因子のｍＲＮＡを有効に濃縮することを示唆している。
【０１７９】
高度に分泌性のβ細胞において分泌因子をコードするｍＲＮＡを濃縮する場合のＥＲ−ｓｅｑプロトコルの有効性を次に決定した。この目的のため、ＩＮＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β細胞株を使用してｈＰＳＣからＳＣ−β細胞を生成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ配向分化プロトコル（Ｐａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用した（図５Ａ〜Ｂ）。これにより、細胞型の異種混合物においてβ細胞からのリボソーム／トランスロコン複合体の単離及びトランスロコン関連ｍＲＮＡに対するＲＮＡシーケンシングが可能となった。プロトコルをＳＣ−β細胞に適用し、トランスロコン関連ｍＲＮＡのＲＮＡシーケンシングによって、ホルモン、例えば、インスリン及びアミリン（ＩＡＰＰ）、血管新生因子ＶＥＧＦＡ及びＶＧＦ、ならびにインスリン分泌に関与する他の遺伝子、例えば、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、セクレトグラニン（ＳＣＧ２、ＳＣＧ３、ＳＣＧ５）、及びシナプトフィジン（ＳＹＰ）の有意な濃縮を特定した（図５Ｃ）。総未分画ＲＮＡと比較してＩＰ画分で濃縮された（倍数変化＞２）２，７３２種の遺伝子を特定した。この遺伝子のセットのうち８７４種（３２％）は、コンピュータトポジェニックシグナル予測（Ｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に基づいて分泌因子または膜タンパク質であると予測される（図５Ｄ）。ＩＰ濃縮遺伝子のうち１７％は、予測された細胞内局在化パターンを有さず、核、細胞質性、分泌または膜局在化としてアノテーションされなかった。細胞のセクレトームの一部であることが予測された因子のうち、総ＲＮＡ（図５Ｅ）と比べてＩＰ画分におけるそれらのｍＲＮＡの強固な濃縮が検出された。核及び／または細胞質性としてアノテーションされた遺伝子をＩＰ画分において枯渇させた（図５Ｅ）。したがって、ＩＰ濃縮遺伝子の遺伝子オントロジー分析は、細胞の細胞内膜系、ＥＲ及び細胞外部分の一部である因子の濃縮を示唆している（図５Ｆ）。全体として、コンピュータ分析は、ＥＲ−ｓｅｑによる分泌因子のｍＲＮＡの有効な濃縮及び定量を示唆している。
【０１８０】
トランスロコン関連ｍＲＮＡの段階特異的発現パターン
【０１８１】
ＳＣ−β細胞におけるトランスロコン関連ｍＲＮＡの分析は、ＳＣ−β細胞で発現される新規な分泌因子を表し得る遺伝子の有意な数の濃縮を明らかにした。β細胞で優先的に発現されるトランスロコン関連遺伝子を特定するために、β細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の複数の段階で細胞にＥＲ−ｓｅｑプロトコルを適用した。それを行うために、ＣＡＡＧＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β細胞株におけるＧＦＰ−ＳＥＣ６１βの構成的発現は、分化の早期段階にあるｈＰＳＣ及びそれらの分化子孫におけるトランスロコン関連ｍＲＮＡを単離することに依存していた（図６Ａ）。分化の最後の段階において、ＩＮＳ：：ＧＦＰ−ＳＥＣ６１β細胞株を使用して、インスリン発現ＳＣ−β細胞におけるトランスロコン関連ｍＲＮＡを単離した（図６Ａ）。トランスロコン関連ｍＲＮＡを分化のすべての段階でシーケンシングし、段階特異的遺伝子発現シグネチャーを特定した（図６Ｂ）。分化のすべての段階にわたって相違的に発現される６０１種の遺伝子を特定した。１３９種の遺伝子を含むＳＣ−β細胞に特異的であった遺伝子発現シグネチャーが見出され、そのうち４４種は分泌因子と予測される。ＳＣ−β細胞濃縮遺伝子の遺伝子オントロジー分析は、インスリン分泌、グルコースホメオスタシス、細胞外空間、分泌性顆粒、ならびに分泌及び膜標的化プロセスに相関する他のカテゴリーに関与する因子の有意な濃縮を示した（図６Ｃ〜Ｄ）。内分泌細胞で優先的に発現されるインスリン分泌に関与する遺伝子は、分化のより早期の段階と比較してＳＣ−β細胞において有意に上方制御される（図６Ｅ）。興味深いことに、ＳＣ−β細胞に特異的な発現パターンも示す１１種のアノテーションされていない遺伝子（図６Ｆ）を特定した。すべてにおいて、この分析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＳＣ−β細胞の分化と相関する遺伝子発現シグネチャーを解読し、この細胞型で優先的に発現される遺伝子のセットを特定した。
【０１８２】
実施例３
【０１８３】
緑色ＥＲレポーターマウス
【０１８４】
上述したＡｃＧＦＰ−ＳＥＣ６１ｂ融合タンパク質を有するマウスＣｒｅ依存性レポーター導入遺伝子（ＲＯＳＡ−ｆｌｏｘｅｄ−ＳＴＯＰ−ｆｌｏｘｅｄ−ＡｃＧＦＰ−ＳＥＣ６１ｂ）は、ここで開発され、緑色ＥＲレポーターと呼ばれる。このマウスをインスリン−Ｃｒｅマウスと交配して、小胞体が緑色蛍光を発するβ細胞を生成し、上述したＥＲ−ｓｅｑ技術の適用を可能にした。このβ細胞特異的緑色ＥＲ系統は、１型糖尿病のＮＯＤモデルに交配され、研究者は、疾患の過程において分泌バイオマーカーを見出すことが可能となる。
【０１８５】
また、１型及び２型糖尿病に一般的なストレス因子の一部は類似し得るので、この系統は、２型糖尿病のモデル、例えば、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂモデルに交配され得る。
【０１８６】
マウスＥＲ−ｓｅｑの場合、遺伝子的要素は、ＥＲトランスロコンの統合成分であるＳｅｃ６１ｂに融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＲＯＳＡ遺伝子座への標的化である。ここで、ＧＦＰ−Ｓｅｃ６１ｂ融合タンパク質を、フロックスされた挟まれた転写停止シグナルの後ろに配置した。したがって、ＣＲＥ−リコンビナーゼの存在下でのみ、転写停止カセットが除去され、ＧＦＰ−Ｓｅｃ６１ｂは緑色蛍光でＣＲＥ発現細胞のＥＲをマークして発現される。生化学的要素は、細胞内分画を実施して、ｍＲＮＡ−リボソーム−トランスロコン相互作用を維持するＥＲ−ミクロソームを作製するための方法の開発を伴う。次いでこの複合体を沈降させるためにＧＦＰに特異的な抗体を使用して免疫沈降を実施した。分子生物学的要素は、複合体からトランスロコン関連ｍＲＮＡを抽出すること及びＲＮＡシーケンシングによりこれらのｍＲＮＡの転写分析を実施することに依存する。
【０１８７】
図２５Ａは、標的化ベクター及びＣＲＥウイルスで感染させた正に標的化されたマウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）コロニーを示しており、導入遺伝子が高い忠実度でＥＲをマークし得ることを示している。このコロニーをＲｏｓａ−ｆｌｏｘｅｄ−ＳＴＯＰ−ｆｌｏｘｅｄ：：緑色−ＥＲ（「緑色−ＥＲ」レポーター）と名づけられた我々の創設者のレポーターマウス系統を作製するために使用した。
【０１８８】
図２５Ｂは、レポーター策略のｉｎ  ｖｉｖｏ検証を示している。緑色−ＥＲレポーターマウス系統を普遍的ＣＲＥ発現マウス（ＣＭＶ−Ｃｒｅ）と交配した。尾部先端の線維芽細胞をＣＭＶ−ＣＲＥ／緑色−ＥＲ子孫（普遍的緑色−ＥＲマウス）から生成し、すべての細胞におけるＧＦＰシグナルがＥＲに特異的であることが示されている（この画像では黄色の疑似色）。
【０１８９】
図２５Ｃは、緑色−ＥＲレポーターマウス系統とベータ細胞ＣＲＥ発現マウス（Ｉｎｓ２−Ｃｒｅ）との交配の子孫に由来する膵臓切片を示している。この系統をベータ細胞緑色−ＥＲマウスと命名した。組換えは膵島ベータ細胞に限定され、レポーター発現はＥＲに特異的である。
【０１９０】
実施例４−方法
【０１９１】
トランスジェニック細胞株の生成
【０１９２】
すべての実験は、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉＰＳ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得られたヒト胚幹細胞株ＨＵＥＳ８を使用して実施した。インスリンゲノム領域のためのｇＲＮＡ配列をｅＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ７１８１４）またはＬｂＣｐｆ１（Ａｄｄｇｅｎｅ  ８４７４２）のいずれかのＣＲＩＳＰＲプラスミドにライゲーションした。インスリン遺伝子の最後のエキソンにおける停止コドンの上流及び下流の約７５０ｂｐを挟む相同アームを、この領域を挟むプライマーを用いてＰＣＲによって生成した。５’及び３’相同アームを２Ａ−Ｓｅｃ６１β−ＧＦＰ導入遺伝子及びピューロマイシン抗生物質選択マーカーにライゲーションした。ＣＡＡＧＳ：：Ｓｅｃ６１β−ＧＦＰ細胞株の生成のため、ＴＡＬＥＮコンストラクトをセーフハーバーＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするように設計した。５’及び３’相同アームを２Ａ−ＰＵＲＯ（ピューロマイシン抵抗遺伝子）、リンカー及びＳｅｃ６１β−ＧＦＰ導入遺伝子の発現を駆動するＣＡＡＧＳプロモーターにライゲーションした。ＨＵＥＳ８細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して単一細胞に分散させ、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して標的化ベクターでトランスフェクトした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を１μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンで７日間処置して単一コロニーを得た。エレクトロポレーションの１８〜２１日後頃に顕微鏡でコロニーを９６ウェルプレートに採取し、展開した。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ  ９６  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔを使用して９６ウェルプレートからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、５’及び３’相同アームの挿入をＰＣＲで確認した。Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによるカリオタイプ分析によって核型的に正常として確認されたクローンをベータ細胞に向けての配向分化のために使用した。
【０１９３】
ＳＣ−β細胞の分化
【０１９４】
３７℃のインキュベーターにおいて、５％ＣＯ２、及び１００％の湿度で７０ｒｐｍに設定した撹拌プレート（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ）上で５００ｍＬのスピナーフラスコ内でｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を維持した。ＳＣ−β細胞への分化は、先に記載されたプロトコル（Ｐａｇｌｉｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に従って以下のように実施した：ＨＵＥＳ８細胞をｍＴｅＳＲ１及び１０μｍのＹ２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に６×１０５細胞／ｍＬで播種した。培地を４８時間後に交換し、細胞を播種した７２時間後に分化を開始させた。培地交換は以下のとおりである：
【０１９５】
段階１胚体内胚葉：１日目にＳ１＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋３μＭのＣｈｉｒ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及び２日目にＳ１＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ
【０１９６】
段階２腸管内胚葉：４、６日目：Ｓ２＋５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。
【０１９７】
段階３膵臓前駆細胞１：７、８日目：Ｓ３＋５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ＋０．２５μＭのＳａｎｔ１（Ｓｉｇｍａ）＋２μＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ）＋２００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（７日目のみ）（Ｓｉｇｍａ）＋５００ｎＭのＰｄＢＵ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
【０１９８】
段階４膵臓前駆細胞２：９、１１、１３日目：Ｓ３＋５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ＋０．２５μＭのＳａｎｔ１＋１００ｎＭのＲＡ＋１０μｍのＹ２７６３２＋５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ。
【０１９９】
段階５内分泌前駆細胞：１４、１６日目：Ｓ５＋０．２５μＭのＳａｎｔ１＋１００ｎＭのＲＡ＋１μＭのＸＸＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋１０μＭのＡｌｋ５ｉＩＩ（Ａｘｘｏｒａ）＋１μＭのＴ３（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋２０ｎｇ／ｍＬのＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。１８、２０日目：Ｓ５＋２５ｎＭのＲＡ＋１μＭのＸＸＩ＋１０μＭのＡｌｋ５ｉＩＩ＋１μＭのＴ３＋２０ｎｇ／ｍＬのＢｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ。
【０２００】
段階６β細胞：１日おきにＳ３培地交換。最終段階において、段階６の分化を開始してから７〜２１後に細胞を分析した。
【０２０１】
生化学分画プロトコル
【０２０２】
およそ１００×１０６細胞を分化スピナーフラスコから収集した。リボソームを失速させるために、１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を添加し、１０分間インキュベートした。後続の分画工程のすべてを１００μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを含有する溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて実施した。細胞クラスターをＰＢＳ／ＣＨＸ中で洗浄した。４ｍＬのアキュターゼ／ＣＨＸを細胞クラスターの懸濁液に添加し、７分間室温でインキュベートした。次いでクラスターをピペットを使用して機械的解離によって解離させ、ＰＢＳ／ＣＨＸに再懸濁し、細胞を２３０ｒｃｆで室温で５分間の遠心分離でペレット化した。ペレットを１１０ｍＭの酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５ｍＭの塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１５％のジギトニン、１．０ｍＭのジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００μｇ／ｍｌのＣＨＸ、１ＸのｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害因子カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び５００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害因子（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する３ｍＬの細胞質性緩衝液に懸濁し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞懸濁液を８４５ｒｃｆで４℃で５分間遠心分離し、上清（細胞質画分）を後の分析のために−８０℃で保存した。ペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４２ＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５％のグリセロール、２％のｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、１．０ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＣＨＸ及び１ＸのｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害因子カクテル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び５００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害因子（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び５０ｕＬの磁性アガロース結合制御ビーズ（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を含有する１ｍＬのＥＲ透過化低張性緩衝液に再懸濁し、頭尾回転させながら４℃で１時間インキュベートした。ＧＦＰ−ＭＡ−ＴＲＡＰビーズ（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を１％のＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中で少なくとも３０分間氷上でブロッキングした。細胞抽出物をＷｈｅａｔｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して、乳棒をゆっくりと上下に１５回動かすことによってホモジナイズした。抽出物を４℃で８５０ｒｃｆで５分間遠心分離した。ブロッキングされたＧＦＰ−ＭＡ−ＴＲＡＰビーズを有するチューブをＤｙｎａＭａｇ−２磁性ストランド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に挿入し、溶液を廃棄した。次いで上清をＧＦＰ−ＭＡ−ＴＲＡＰビーズスラリーに添加し、頭尾回転させながら４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを磁性スタンド内に挿入して、未結合画分を収集し、その後、ビーズを５００μＬのＥＲ透過化緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、５００ｕｌのＴｒｉｚｏｌをビーズに添加し、−８０℃で保存した。
【０２０３】
ＲＮＡ抽出、ライブラリ調製及びシーケンシング
【０２０４】
ＴＲＩｚｏｌ試薬に保存された細胞内画分を、使用した１ｍＬのＴＲＩＺｏｌ試薬当たり０．２ｍＬのクロロホルムと組み合わせ、２〜３分間インキュベートし、続いて４℃で１２，０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。ＲＮＡを含有する水相を、使用した１ｍＬのＴＲＩＺｏｌ試薬当たり０．５ｍＬのイソプロパノールと組み合わせた。氷上で１０分間インキュベートした後、ＲＮＡを１２，０００×ｇで４℃で１０分間沈殿させた。ペレットを１ｍＬの７５％エタノール中で洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させた。ＲＮＡを後の分析のためにＲＮＡ保存溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で−８０℃で保存した。
【０２０５】
沈殿したＲＮＡを、公開されたプロトコル（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）に従って逆転写を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ増幅に供した。逆転写プライマーは、アンカー付きポリＴ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ小ＲＮＡキットの５’Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及びＴ７プロモーターを用いて設計した。ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ）を改変された逆転写プライマーと共に使用した（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ＲＮＡキットのプロトコルに従って、５０ｎｇのＲＮＡ及び２５ｎｇ／ｕＬの増幅プライマーを用いて反応を実施した。磁性粒子単離、８０％のＥｔＯＨでのクリーンアップによってＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてｃＤＮＡクリーンアップを実施し、続いてＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ＲＮＡキットのプロトコルに従って１３時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。ＲＮＡを２００ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート［ｐＨ  ８．１］、５００ｍＭのＫＯＡｃ、１５０ｍＭのＭｇＯＡｃ中で断片化し、氷上に配置することによって反応を停止させ、１０分の１の体積の０．５ＭのＥＤＴＡを添加し、続いてＲＮＡクリーンアップを行った。ＲＮＡの質及び収率をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してアッセイした。Ｉｌｌｕｍｉｎａの指向性ＲＮＡシーケンシングプロトコルを使用し、３’Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターのみをライゲーションした。伸長時間３０秒で合計で１２サイクルのＰＣＲを実施した。ライブラリを標準的プロトコルに従ってＮｅｘｔＳｅｑ  ５００  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してシーケンシングした。ペアエンドシーケンシングを実施し、リード１については少なくとも１５塩基、リード２については５０塩基、及びＩｌｌｕｍｉｎａバーコードを読み取った。
【０２０６】
トランスクリプトーム分析
【０２０７】
リードをＣｕｔａｄａｐｔ  ｖ１．８．１を用いてユニバーサルイルミナアダプター及びポリＡ配列についてトリミングし、Ｆａｓｔｑｃ  ｖ０．１１．５を使用して質制御について評価した。リードをＴｏｐｈａｔ  ｖ２．１．１を用いてデフォルトパラメータを使用してヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）に対してアライメントした。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．２．１を用いて下流転写産物の定量及び区別的遺伝子発現分析を実施した（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。相違的に発現した遺伝子をクフディフ（ｃｕｆｆｄｉｆｆ）アルゴリズムを使用して、調整された０．０５未満のｐ値を有するものとして定義した。
【０２０８】
遺伝子オントロジー分析
【０２０９】
相違的に発現した遺伝子（調整されたｐ値＜０．０５）をＷｅｂＧｅｓｔａｌｔ  ＧＳＡＴ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１７）及びｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ−ｐａｔｈｗａｙ−ａｎａｌｙｓｉｓ））を使用する遺伝子オントロジー分析に使用した。Ｐ値＜０．０５を有する遺伝子オントロジーターム及び濃縮された経路を、相違的に発現した遺伝子が濃縮されているとみなした。
【０２１０】
分泌因子の予測
【０２１１】
候補転写産物から翻訳されたタンパク質配列をＰｈｏｂｉｕｓアルゴリズムに供して、隠れＭａｒｋｏｖモデル（Ｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を使用してシグナルペプチドを予測した。予測されたシグナルペプチドを有するが、予測された膜貫通トポロジーを有さない転写産物を細胞のセクレトームの一部として分類した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ＩＰＡ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ−ｐａｔｈｗａｙ−ａｎａｌｙｓｉｓ）も使用して、細胞質または核として候補転写産物を分類した。
【０２１２】
ウェスタンブロット分析
【０２１３】
上述したようにＲＮＡ抽出のために水相を除去した後、使用した１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬当たり１．５ｍＬのイソプロパノールにフェノール−エタノールを再懸濁し、１０分間インキュベートした。１２，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離した後、使用した１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬当たり９５％エタノール中０．３Ｍのグアニジン塩酸塩２ｍＬ中でペレットを洗浄し、室温で２０分間インキュベートし、続いて５分間７５００ｇで４℃で遠心分離した。この工程を２回繰り返した。最後に、使用した１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ当たり２ｍＬの１００％エタノールを添加し、２０分間インキュベートした。４℃で７５００ｇでの５分間の遠心分離後、ペレットを５〜１０分間空気乾燥させ、２００ｕＬの１％ＳＤＳ緩衝液に再懸濁した。タンパク質濃縮物をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。５〜１０ｕｇのタンパク質抽出物をＡｎｙＫＤ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。膜を３％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０のＴＢＳ中で３０分間室温でブロッキングし、次いで以下の一次抗体と４℃で一晩インキュベートした：マウス抗Ｓｅｃ６１β（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−３９３６３３）、ヒヨコ抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ、ＧＦＰ１０２０）、ウサギ抗リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２７６５）。洗浄後、膜をＨＲＰがコンジュゲートされた二次抗体と１時間室温でインキュベートし、次いでシグナル検出及び展開のために化学発光ＥＣＬ検出試薬（ＶＷＲ）中でインキュベートした。
【０２１４】
４．５．９  動物研究
【０２１５】
すべての動物の治療、飼育、手順は、組織動物ケア標準に従って行った。すべてのプロトコルは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの組織動物ケア及び使用委員会によって承認された。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られたＩＣＲマウスを使用して尾静脈注射によってＥＲ−ｓｅｑ候補の初期スクリーニングを実施した。Ｓ９６１実験を含むｃ１ｏｒｆ１２７の特性化のための追加の尾静脈注射は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用して実施した。ストレプタサトジン誘導糖尿病マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られたＣ５７ＢＬ／６マウスであり、ＳＴＺ注射は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって実施された。
【０２１６】
候補クローニング
【０２１７】
スクリーニングされたＥＲ−Ｓｅｑ候補のための発現プラスミドは、まず幹細胞由来ベータ細胞のｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ増幅によって得た；プライマーは、ゲートウェイクローニング部位を加えるように設計した。Ｃ１ｏｒｆ１２７を増幅することの困難性のため、ＤｈａｒｍａｃｏｎからＯＲＦのクローンを購入し、ゲートウェイ部位を追加するように増幅した。ＰＣＲアンプリコンをＰＤｏｎｏｒゲートウェイベクターに加えた。次いでＯＲＦをＣａＧ高発現ベクター（尾静脈注射の場合）及びレンチウイルス生成ベクター（細胞株生成）に移入した。ＥＲ−Ｓｅｑ候補に加えて、細胞質ＧＦＰ、核ＴＤ−Ｔｏｍａｔｏ、フーリン開裂性インスリン、及びナノルシフェラーゼを含む対照を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからゲートウェイ部位を有するカスタム遺伝子として購入した。次いで対照を同じベクターにクローニングした。
【０２１８】
尾静脈注射
【０２１９】
マウスを１．２５％アバチン溶液の２３ｕｌ／ｇ体重の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔したマウスの尾をヒートランプ下で温め、尾静脈を拡張した。麻酔したマウスに、３５ｕｇの発現ベクターＤＮＡを有する生理食塩水の８０ｕｌ／ｇ体重をおよそ７秒にわたって尾静脈内注射を受けさせた。尾静脈注射したマウスを伴う実験について、注射の４８〜７２時間後にマウスを試験した。
【０２２０】
標準グルコース耐性試験
【０２２１】
マウスを一晩絶食させた（午後５時から午前９時まで）。血中グルコースの測定結果は、絶食前及びグルコース注射の直前に得た。マウスにグルコースの腹腔内注射を２ｇ／ｋｇ体重で受けさせた。次いで血中グルコースの測定結果を注射の１５、３０、４５、６０及び９０分後に得た。時折、血中グルコースが正常レベル未満（＜２５０ｍｇ／ｄｌ）に低下していない場合は１２０分の時点で収集した。
【０２２２】
Ｓ９６１グルコース耐性試験
【０２２３】
マウスを一晩絶食させた（午後５時から午前９時まで）。血中グルコースの測定結果は、絶食前、初期Ｓ９６１注射の直前及びグルコース注射後に得た。マウスに４５ｕＭのＳ９６１の１０ｕｌ／ｇ体重の腹腔内注射を受けさせた。この初期注射の２時間後、マウスに３０ｕＭのＳ９６１の１０ｕｌ／ｇ体重、１５％のＤ−グルコース（１．５ｇ／ｋｇグルコース）の腹腔内注射を受けさせた。次いで血中グルコースの測定結果を注射の１５、３０、４５、６０、９０、１２０分後に得、次いで測定を値が正常未満（＜２５０ｍｇ／ｄｌ）に低下するまで毎時得た。
【０２２４】
ＳＴＺグルコース耐性試験
【０２２５】
血中グルコースの測定結果は、尾静脈注射前、絶食前及びグルコース注射の直前に得た。初期に重度の高血糖（＞４００ｍｇ／ｄｌ）を有するマウスのみを使用した。マウスを一晩絶食させた（午後５時から午前９時まで）。マウスに１．５ｇ／ｋｇグルコースの腹腔内注射を受けさせた。次いで血中グルコースの測定結果を注射の１５、３０、４５、６０、９０、１２０分後に得、次いで測定を値が正常未満（＜２５０ｍｇ／ｄｌ）に低下するまで毎時得た。
【０２２６】
統計的分析
【０２２７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計的分析を実施した。グルコース耐性比較を個々の時点の両方についてｔ検定を使用して行った。ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較試験を使用して、曲線下面積を比較した。
【０２２８】
参考文献
【０２２９】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．（２０１８）８．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１８．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ４１，Ｓ７３−Ｓ８５．Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２７，４４５−４５６．
【０２３０】
Ｂｅｎｎｉ，Ｊ．＆  Ｐａｔｉｌ，Ｐ．（２０１６）．Ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｅｒｇｅｏｎｎｅａｕ，Ｃ．，Ｋａｓｓａｉ，Ｂ．，Ｅｒｐｅｌｄｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕｅｙｆｆｉｅｒ，Ｆ．，Ｃｏｒｎｕ，Ｃ．（２０１１）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ａｌｌ  ｃａｕｓｅ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅａｔｈ，ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌｓ．ＢＭＪ  ３４３，ｄ４１６９．
【０２３１】
Ｂｏｕｓｓａｇｅｏｎ，Ｒ．，Ｂｅｊａｎ−Ａｎｇｏｕｌｖａｎｔ，Ｔ．，Ｓａａｄａｔｉａｎ−Ｅｌａｈｉ，Ｍ．，Ｌａｆｏｎｔ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ａ．，Ｃａｒｏｌａｎ，Ｐ．Ｊ．，＆  Ａｎｎｅｓ，Ｊ．Ｐ．（２０１２）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ４４６００．
【０２３２】
Ｄｉｅｈｎ，Ｍ．，Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．，＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．（２０００）．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５，５８−６２．
【０２３３】
Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｌｏｃａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｕｓｉｎｇ  ＴａｒｇｅｔＰ，ＳｉｇｎａｌＰ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｏｌｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２，９５３−９７１．
【０２３４】
Ｆａｚａｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｈａｎ，Ｓ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｋａｅｗｓａｐｓａｋ，Ｐ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｂｏｅｔｔｉｇｅｒ，Ａ．Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｗ．，＆  Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．（２０１９）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＡＰＥＸ−Ｓｅｑ．Ｃｅｌｌ  １７８，１−１８．
【０２３５】
Ｇｅｐｔｓ，Ｗ．（１９６５）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｉｎ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １４，６１９−６３３．
【０２３６】
Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．＆  Ｙａｎａｉ  Ｉ．（２０１２）ＣＥＬ−Ｓｅｑ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２，６６６−６７３．
【０２３７】
Ｊａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｃ．，＆  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＥＲ  ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，１２５７５２１．
【０２３８】
Ｋａｌｌ，Ｌ．，Ｋｒｏｇｈ，Ａ．，＆  Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．（２００５）Ａｎ  ＨＭＭ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｄｅｃｏｄｅｒ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１，ｉ２５１−ｉ２５７．
【０２３９】
Ｋａｌｌ，Ｌ．，Ｋｒｏｇｈ，Ａ．，Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．（２００４）Ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８，１０２７−１０３６．
【０２４０】
Ｍａｎｄｏｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｔｒｕｅｍａｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｒ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｒｏｕｇｈ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．５，ａ０１３３４２．
【０２４１】
Ｍｅｉｎｋｅｎ，Ｊ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．，＆  Ｍｉｎ，Ｘ．（２０１５）．ＭｅｔａｚＳｅｃＫＢ：ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．Ｄａｔａｂａｓｅ，ｂａｖ０７７．
【０２４２】
Ｏｇｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．（１９９５）ＳＲＰ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｃｈａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ａｔ  ａ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｓｔｅｐ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ８１，１０７５−１０８４．
【０２４３】
Ｐａｇｌｉｕｃａ，Ｆ．，Ｍｉｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｕｒｔｌｅｒ，Ｍ．，Ｓｅｇｅｌ，Ｍ．，Ｖａｎ  Ｄｅｒｖｏｒｔ，Ａ．，Ｒｙｕ，Ｊ．Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｑ．Ｐ．，Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ  Ｄ．Ａ．（２０１４）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  １５９，４２８−４３９．
【０２４４】
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｎ．，Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．（２０１１）ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，７８５−７８６．
【０２４５】
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【０２４６】
Ｐｉｐｅｌｅｅｒｓ，Ｄ．，Ｌｉｎｇ，Ｚ．（１９９２）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  ８，２０９  −２２７．
【０２４７】
Ｒｅｉｄ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｔａｙ，Ａ．Ｓ．Ｌ．，Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｓ．，＆  Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ，Ｃ．Ｖ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｃｅｌｌ  １５８，１３６２−１３７４．
【０２４８】
Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｌ，Ｂｒａｎｄ，Ｃ．Ｌ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｂ．Ｆ．，Ｒｉｂｅｌ，Ｕ．，Ｓｈａｗ，Ａ．Ｃ．，Ｓｌａａｂｙ，Ｒ．，＆  Ｓｔｕｒｉｓ，Ｊ．（２００８）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３７６，３８０−３．
【０２４９】
Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｂ．Ｍ．，Ｌｉｎｄｓｋｏｇ，Ｃ．，Ｏｋｓｖｏｌｄ，Ｐ．，Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ，Ａ．，Ｓｉｖｅｒｔｓｓｏｎ，Å．，Ｋａｍｐｆ，Ｃ．，Ｓｊｏｓｔｅｄｔ．Ｅ．，Ａｓｐｌｕｎｄ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，１２６０４１９．
【０２５０】
実施例５
【０２５１】
代替的サンプルＥＲ−ｓｅｑプロトコル
【０２５２】
透過化緩衝液ストック（細胞質性抽出緩衝液を作製するため）
５０ｍｌの場合
【０２５３】
１１０ｍＭ  ＫＯＡｃ  ３Ｍの１．８３ｍｌ
【０２５４】
２５ｍＭ  Ｋ−ＨＥＰＥＳ７．２  ２．５ｍｌの０．５Ｍ
【０２５５】
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １Ｍの７５０μｌ
【０２５６】
４ｍＭ  ＣａＣｌ２  １Ｍの２００μｌ
【０２５７】
ＲＮＡｓｅ非含有水  ４４．７２ｍｌ
【０２５８】
低張性緩衝液ストック（５０ｍＬ；ＥＲ透過化緩衝液を作製するため）
【０２５９】
ヌクレアーゼ非含有水  ３２．２ｍＬ
【０２６０】
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １Ｍの１ｍＬ
【０２６１】
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １Ｍの７５ｕＬ
【０２６２】
０．４２Ｍ  ＮａＣｌ  ５Ｍの４．２ｍＬ
【０２６３】
０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．５Ｍの２０ｕＬ
【０２６４】
２５％（ｖ／ｖ）グリセロール  １００％の１２．５ｍＬ
【０２６５】
細胞質性緩衝液（２ｍＬ）
【０２６６】
透過化ストック  ９５１．５μｌ×２
【０２６７】
０．０１５％  ジギトニン  １％の３０μｌ
【０２６８】
１．０ｍＭ  ＤＴＴ  １００ｍＭの２０μｌ
【０２６９】
１００μｇ／ｍｌ  ＣＨＸ  １００ｍｇ／ｍｌの２．０μｌ
【０２７０】
１ＸプロテアーゼＩｎｈカクテル  １０Ｘの２０．０μｌ
【０２７１】
５００Ｕ／ｍｌ  ＲＮＡｓｉｎ      ４０Ｕ／μｌの２５．０μｌ
【０２７２】
ＥＲ透過化緩衝液（４ｍＬ）
【０２７３】
低張性緩衝液ストック  ３．０６６ｍＬ
【０２７４】
２％  ＤＤＭ  １０％の８００ｕＬ
【０２７５】
１．０ｍＭ  ＤＴＴ  １００ｍＭの４０μｌ
【０２７６】
１００μｇ／ｍｌ  ＣＨＸ  １００ｍｇ／ｍｌの４．０μｌ
【０２７７】
プロテアーゼＩｎｈカクテル  １０Ｘの４０．０μｌ
【０２７８】
５００Ｕ／ｍｌ  ＲＮＡｓｉｎ  ４０Ｕ／μｌの５０．０μｌ
【０２７９】
ＣＨＸ／ＰＢＳ：１００μｇ／ｍｌのＣＨＸ（３０ｍｌのＰＢＳｗ／ｏカチオン中の３０μｌの１００ｍｇ／ｍのＣＨＸ）
【０２８０】
ＣＨＸ／アキュターゼ（８ｍｌ）：４ｍｌのＰＢＳ＋４ｍＬのアキュターゼへの８μｌのＣＨＸ
【０２８１】
ＧＦＰ−ＭＡ  ＴＲＡＰ磁性粒子（２Ｘ）：１００ｕＬのビーズ＋１００ｕＬのＢＳＡ＋４００ｕＬの透過化ストック（我々は、６０ｘ１０６細胞のために５０ｕＬのビーズを使用している）
【０２８２】
１０Ｘプロテアーゼ阻害因子カクテル：１ｍｌのＤＭＳＯ中１つのタブレット
【０２８３】
プロトコルに対する改変：
【０２８４】
２つのＳｔ５ｄ７スピナーフラスコから１３０ｍＬを収集する（３×５０ｍＬチューブ）
【０２８５】
クラスターを５分間静置する（１０ｍＬを除きすべて除去する）
【０２８６】
１０ｕＬのＣＨＸ（１００ｕｇ／ｍＬ）を添加する
【０２８７】
５分間ロッカー内でインキュベートする
【０２８８】
１０ｍＬのＰＢＳ／ＣＨＸ中でクラスターを５分間静置する
【０２８９】
４ｍＬのＣＨＸ／アキュターゼを添加し、２分毎に軽く振盪しながら７分間インキュベートする。
【０２９０】
５分間２００ｒｃｆで遠心分離する
【０２９１】
３ｍＬの細胞質性緩衝液に再懸濁し、２つの１．５ｍＬのチューブに分け、２０分間インキュベートする
【０２９２】
冷蔵室の遠心分離機で８４５ｇで５分間遠心分離する。
【０２９３】
１ｍＬのＥＲ透過化緩衝液及び５０ｕＬのＧＦＰ結合対照ビーズを各サンプルに添加する。
【０２９４】
１時間インキュベートし、記載したように透過化及びプルダウンを進行してから、Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用してホモジナイズする（乳棒を上下に１５回ゆっくり動かす）。
【０２９５】
抽出物を新たな１．５ｍＬの遠心分離チューブに移し、冷蔵室の遠心分離機で３０００ｒｐｍで５分間回転させる
【０２９６】
上清を事前にブロッキングしたＧＦＰ−ＭＡ−ＴＲＡＰビーズスラリーに添加する（ペレットは核画分である）。
【０２９７】
ビーズスラリーを冷蔵室で頭尾回転させながら３０分間インキュベートする。
【０２９８】
冷蔵室からチューブを取り出し、磁石を少なくとも１分間適用する。結合した画分はトランスロコン関連ｍＲＮＡを含有する。上清を１５ｍｌの円錐チューブ内に収集する。これはトランスロコン枯渇膜画分である。落射蛍光分析のためのトランスロコン枯渇膜画分から２μｌを確保する。２．５ｍｌのトリゾールを添加し、−８０Ｃで凍結する。
【０２９９】
５００μｌのＥＲ透過化緩衝液でビーズを２回洗浄する。新しいチューブに移す。落射蛍光分析のためのトランスロコン濃縮画分から２μｌを確保する。磁気を適用し、上清を廃棄する。５００ｕｌのトリゾールをビーズに添加する。ボルテックスし、−８０℃で凍結させる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１−１】
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【図８−１−２】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2022501374.tif 000048
【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
2022501374.tif 000052
【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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