【手続補正書】
【提出日】平成22年6月29日(2010.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
〔発明の背景〕
〔発明の分野〕
本発明は、一般的に免疫学の分野に関する。特に、本発明は、NKT細胞を刺激するか又は疾患若しくは障害に対する免疫応答を高めるのに有用な組成物及び方法に関する。
〔緒言〕
脂質種は、全ての真核生物膜及び病原性微生物の遍在する構成要素である。生体系内の多量の脂質にかかわらず、抗-脂質免疫応答は抗-ペプチド応答と同程度には研究されていない。例えば、脂質抗原の非トール様(non-toll-like)受容体(非-TLR)認識の現象についてはほとんど未知である。ペプチド抗原と異なり、脂質は、β2ミクログロブリン関連分子のCD1ファミリーによってプロセシングされ、かつ免疫系に提示される。ペプチド抗原をそれぞれCD8+及びCD4+T細胞に提示するクラスI及びクラスIIの主要組織適合複合体(MHC)分子と対照的に、CD1分子は進化してT細胞の特定サブセットへの表示のため外来及び自己の両脂質抗原を捕獲かつプロセシングしている。
異なる構造を有する種々の脂質が、CD1分子の2つの各疎水性結合ポケット(A'とF)内で脂肪酸鎖を蓄積するユニークな様式でCD1分子に結合することが分かっている。CD1分子と結合できる脂質種として、ミコール酸、ジアシルグリセロール、スフィンゴ脂質、ポリイソプレノインド、リポペプチド、ホスホミコケチド(phosphomycoketide)及び小型疎水性化合物が挙げられる。
CD1の提示経路は、2つの相補的なCD1-制限T細胞サブセット；アジュバント機能を果たすNKT細胞、及びヘルパー又は細胞溶解機能が可能な非-NKT T細胞を活性化することによって、生得免疫応答と適応免疫応答の両方を誘発する。
マウスではナチュラルキラー(NK)細胞表面マーカーと保存型の半-インバリアントT-細胞受容体(TCR)、Vα14-Jα18/Vβ8の両方及びヒトではVα24-Jα18/Vβ11を発現するNKT細胞は、自己脂質の反応性と迅速なエフェクター応答によって特徴づけられる。従って、NKT細胞は、抗菌応答、抗腫瘍免疫性及び耐性と自己免疫性とのバランスの調節といった多くの免疫機能で重要な役割を果たす。
NKT細胞の明白な多分化能は、樹状細胞(DC)と相互作用してT細胞応答のTH1又はTH2極性を決定し、かつ適切な状況内でT細胞アネルギーを惹起するその能力に特異的に依存する。その機能にとってDC細胞の成熟及び補充プロセスが中心である。実際、DCは、静止状態及び低代謝活性から、抗原の活発な摂取、分化シグナルを受信後のプロセシングと組織移動へ迅速に進行させることができる。
多くの天然及び合成脂質分子はDCによってプロセシングされ、CD1分子によってNKT細胞に提示される。NKT細胞のin vitro及びin vivo活性化を研究するために使用される原型化合物はKRN7000、海綿Agelas mauritianus由来のα-ガラクトシルセラミド(「αGalCer」)である。さらなるアゴニストとして、内因性スフィンゴ糖脂質であるイソグロボトリヘキシルセラミド(「iGb3」又は「PBS-47」)、並びに微生物由来のα-グリクロノシルセラミド(glycuronosylceramide)クラスのメンバーが挙げられる。しかし、抗-脂質応答に関しては一般的にほとんど解明されていない。特にワクチン接種の文脈では
、脂質のアジュバント活性の機構についてはさらに少ししか知られていない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例８  アジュバントの能力の分析
その全体を参照によってここに引用したものとするFujii et al., J. Exp. Med. 198: 267-279 (2003)及びHermans et al., J. Immunol. 171: 5140-5147 (2003)のプロトコルと同様のプロトコルに従って、微量タンパク質抗原、卵白アルブミンと併用したPBS-31及びPBS-32の潜在的なアジュバント活性を導いた。卵白アルブミンを単独又は1μgのPBS-31、PBS-32若しくはPBS-57と併用して静脈内注射した。図9は代表的実験の結果を示す。MHCクラスII応答の後に続くために働く四量体の非存在下では、CD8+応答とB細胞応答だけを評価した。
注射後7日で抹消血内のH-2Kb/ova257-264四量体ポジティブ細胞を数え、かつCD8+T細胞プール中のH-2Kb/ova257-264ポジティブ細胞のパーセンテージとして表すことによってCD8+T細胞応答を評価した。注射後7日で、PBS-32注射群では抗原特異性H-2Kb/ova257-264四量体ポジティブ細胞が約3%まで増加したが、α-GalCer処置群ではそれらがほとんど6%まで拡大した(図9A)。両群で、IgG抗-卵白アルブミン応答は、抗-IgG特異性二次抗体を用いてELISAで測定した場合にコントロール群に比し、用量依存様式で劇的に増強された(図9B)。これらの強力なIgG応答は、卵白アルブミン特異性CD4+Tヘルパー画分の有意な増強も同様に間接的に反映しうる。
CD1d-l-マウスに同プロトコルに従って注射した場合、抗-卵白アルブミンIgG又は抗-卵白アルブミンCD8+T細胞のどちらの増加も気づかなかった(データ示さず)。これらの結果は、PBS-32は、精製タンパク質抗原と併用した場合にアジュバント活性を有することを確証した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
【図１】本明細書ではPBS-32とも称するスルホグルコシルセラミド(SuGC)に適した合成スキームを示す。
【図２】PBS-32並びにPBS-31(フィトセラミド)、PBS-46、PBS-41(スルファチド)、PBS-36、PBS-58、PBS-35及びPBS-40と命名された修飾セラミド化合物を含む、本明細書で言及するいくつかの化合物の構造式を示す。
【図３】脂質伝達糖タンパク質であるサポシンBの存在下及び非存在下におけるCD1d分子のPBS-31、PBS-32、PBS-41、PBS-46、PBS-36、PBS-58、PBS-35及びPBS-40による負荷を示す等電点電気泳動ゲルの写真である。
【図４】PBS-32、PBS-31、αGalCer及びビヒクルによるVα14 NKT細胞ハイブリドーマDN32.D3の差動活性化及び用量応答性を示すグラフである。
【図５】PBS-47、PBS-32、PBS-31及びαGalCerによる脾細胞の24時間の刺激後にIFN-γ、IL-10、IL-4及びGM-CSFの生産量を測定するエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)の結果を示すグラフである。
【図６】PBS-32-CD1d複合体の組換えVα14/2CβTCRへの結合性の表面プラズモン共鳴(SPR)測定の結果を示すグラフである。
【図７】αGalCer、PBS-47、PBS-32及びPBS-31の濃度を減らすことによって波動する、相同性DCによるヒトNKT細胞系の活性化を示すグラフであり、NKT細胞の活性化をIFN-γ及びIL-4についてELISAで測定した。
【図８】PBS-31、PBS-32、αGalCer及びビヒクルの注射後24時間での脾臓のDC(CD11c+、CD8a+及びCD11c+/CD8a-)によるCD40、CD80、CD86及びMHCクラスIIの細胞表面発現についての蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting)(FACS)分析の結果を示すグラフである。
【図９Ａ】卵白アルブミン微量抗原を投与した場合のPBS-32がアジュバントとして作用する能力を示すグラフであり、ビヒクルのみ、OVAのみ、 OVA+PBS-57及びOVA+PBS-32の投与後のH-2Kb/ova257-264応答性CD8+T-細胞(四量体染色及びFACS分析によって示した場合)のパーセンテージを示す。
【図９Ｂ】卵白アルブミン微量抗原を投与した場合のPBS-32がアジュバントとして作用する能力を示すグラフであり、ELISAで測定した場合の抗-卵白アルブミンIgG抗体の相対量を示す。
【図１０】LCMV抗原及び抗原提示細胞による5時間のin vitro波動後のIFN-γ-産生性CD8+及びCD4+T-細胞についてのFACS染色の結果を示すグラフである。
【図１１Ａ】脂質伝達タンパク質(LBP、CD14、ApoH、NPC-2、GM2A又はサポシンBのどれか)及びαGalCerと組み合わせたGM3による二週間の免疫化後、ELISAで測定した場合のIgM及びIgG抗-GM3抗体濃度を示すグラフであり(各棒は個々の採血を示す)、hGM2aとmNPC2を用いた場合である。
【図１１Ｂ】脂質伝達タンパク質(LBP、CD14、ApoH、NPC-2、GM2A又はサポシンBのどれか)及びαGalCerと組み合わせたGM3による二週間の免疫化後、ELISAで測定した場合のIgM及びIgG抗-GM3抗体濃度を示すグラフであり(各棒は個々の採血を示す)、mSapBとmCD14を用いた場合である。
【図１１Ｃ】脂質伝達タンパク質(LBP、CD14、ApoH、NPC-2、GM2A又はサポシンBのどれか)及びαGalCerと組み合わせたGM3による二週間の免疫化後、ELISAで測定した場合のIgM及びIgG抗-GM3抗体濃度を示すグラフであり(各棒は個々の採血を示す)、hLBPとhApoHを用いた場合である。
【図１２】リポソーム被覆ガラズビーズのELISA及びFACS分析によって測定した場合の脂質で免疫化されたマウスによって産生された抗-GM3モノクロナール抗体の特異性を示すグラフである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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