【手続補正書】
【提出日】平成22年9月8日(2010.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
優れたダイナミックレンジを有する、ハイスループットの多重免疫分析を行うための方法であって、
前記方法は、
（ａ）細胞抽出物を、該細胞抽出物中の一つ又は複数の分析物に特異的な複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｂ）該複数の捕捉された分析物を、対応する該分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、該検出抗体が、
（１）促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、及び
（２）シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体、を含んでいる、工程；
（ｃ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を、前記シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートして、増幅されたシグナルを生成する工程；及び
（ｄ）前記シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された前記増幅されたシグナルを検出する工程、
を備え、
前記捕捉抗体は固相担体に拘束されており、
前記促進部分は酸化剤を生成し、該酸化剤は前記シグナル増幅対の第一の構成因子に向けられ且つ該シグナル増幅対の第一の構成因子と反応する、ことを特徴とする免疫分析方法。
【請求項２】
前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の免疫分析方法。
【請求項３】
前記細胞が免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、ことを特徴とする請求項２に記載の免疫分析方法。
【請求項４】
前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の免疫分析方法。
【請求項５】
前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３又は４に記載の免疫分析方法。
【請求項６】
前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子によって刺激される、ことを特徴とする請求項３乃至５の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項７】
前記単離された細胞が、増殖因子による刺激の前に、抗癌剤とインキュベートされる、ことを特徴とする請求項６に記載の免疫分析方法。
【請求項８】
前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の免疫分析方法。
【請求項９】
前記単離された細胞を、増殖因子による刺激の後に溶解して、前記細胞抽出物を作製する、ことを特徴とする請求項６乃至８の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１０】
前記一つ又は複数の分析物が、複数のシグナル伝達分子を含む、ことを特徴とする請求項１乃至９の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１１】
前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１２】
前記活性状態非依存抗体がさらに、検出可能な部分を備える、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１３】
前記検出可能な部分が、フルオロフォアである、ことを特徴とする請求項１２に記載の免疫分析方法。
【請求項１４】
前記検出可能な部分の量が、前記一つ又は複数の分析物の量と相関関係にある、ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の免疫分析方法。
【請求項１５】
前記活性状態非依存抗体が、チャネリング部分で直接標識されている、ことを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１６】
前記活性状態非依存抗体に共役されたオリゴヌクレオチドと、チャネリング部分に共役された相補オリゴヌクレオチドと、の間のハイブリダイゼーションを介して前記活性状態非依存抗体が該チャネリング部分で標識されている、ことを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１７】
前記活性状態依存抗体が、前記シグナル増幅対の第一の構成因子で直接標識されている、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１８】
前記活性状態依存抗体に共役された結合対の第一の構成因子と、前記シグナル増幅対の第一の構成因子に共役された前記結合対の第二の構成因子と、の間の結合を介して前記活性状態依存抗体が前記シグナル増幅対の第一の構成因子で標識されている、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項１９】
前記結合対の第一の構成因子がビオチンである、ことを特徴とする請求項１８に記載の免疫分析方法。
【請求項２０】
前記結合対の第二の構成因子がストレプトアビジンである、ことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の免疫分析方法。
【請求項２１】
チャネリング部分がグルコースオキシダーゼである、ことを特徴とする請求項１乃至２０の何れか１項に記載の免疫分析方法。
【請求項２２】
前記酸化剤が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、ことを特徴とする請求項２１に記載の免疫分析方法。
【請求項２３】
前記シグナル増幅対の第一の構成因子がペルオキシダーゼである、ことを特徴とする請求項２２に記載の免疫分析方法。
【請求項２４】
前記ペルオキシダーゼが西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、ことを特徴とする請求項２３に記載の免疫分析方法。
【請求項２５】
前記シグナル増幅対の第二の構成因子がチラミド試薬である、ことを特徴とする請求項２３又は２４に記載の免疫分析方法。
【請求項２６】
前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、ことを特徴とする請求項２５に記載の免疫分析方法。
【請求項２７】
前記増幅されたシグナルが、活性型チラミドを生じる前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、ことを特徴とする請求項２６に記載の免疫分析方法。
【請求項２８】
前記活性型チラミドが直接検出される、ことを特徴とする請求項２７に記載の免疫分析方法。
【請求項２９】
前記活性型チラミドが、シグナル検出試薬の添加によって検出される、ことを特徴とする請求項２７に記載の免疫分析方法。
【請求項３０】
前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、ことを特徴とする請求項２９に記載の免疫分析方法。
【請求項３１】
前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組み合わせである、ことを特徴とする請求項２９に記載の免疫分析方法。
【請求項３２】
前記発色試薬が、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、ことを特徴とする請求項３１に記載の免疫分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
他の態様では、本発明は、優れたダイナミックレンジを有するハイスループットの多重免疫分析を行うための方法を提供し、この方法は：
（ａ）細胞抽出物を、細胞抽出物中の１つ又は複数の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｂ）複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程；
（ｃ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子とインキュベートして、増幅されたシグナルを生成する工程；及び
（ｄ）シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程、を備え、捕捉抗体が固相担体に拘束されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
さらに他の態様では、本発明は、優れたダイナミックレンジを有するハイスループットの多重免疫分析を行うための方法を提供し、この方法は：
（ａ）細胞抽出物を、細胞抽出物中の１つ又は複数の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｂ）複数の捕捉された分析物を、それに対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、
前記検出抗体は、
（１）促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、と
（２）シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体と、を含んでいる、工程；
（ｃ）複数の検出可能な捕捉された分析物を、シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートして、増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｄ）シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された増幅シグナルを検出する工程と、を備え、
捕捉抗体は固相担体に拘束されており、
促進部分は酸化剤を生成し、酸化剤はシグナル増幅対の第一の構成因子に向けられ且つそれと反応する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明はまた、上記の抗体に基づくアレイ法を行うためのキットを提供し、本キットは：（ａ）固相担体に拘束された複数の希釈系列の捕捉抗体；及び（ｂ）複数の検出抗体を備える。このキットはさらに、任意に、例えばシグナル増幅対の第一及び第二の構成因子のような他の試薬を備えてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
本明細書中で引用された全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願それぞれが、特異的に及び個々に参照によって取り込まれると示されるように、本明細書中で参照として取り込まれる。上述の発明は、理解の明確化の目的のため、図示及び例によって、多少詳しく述べられているが、この発明の示唆を踏まえて、添付の請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく任意の変化及び改変がそれになされてもよいことは、当業者には容易に明らかである。
以下に本発明とその実施態様をまとめて記載する。
１．優れたダイナミックレンジを有する、ハイスループットの多重免疫分析を行うための方法であって、
前記方法は、
（ａ）細胞抽出物を、該細胞抽出物中の一つ又は複数の分析物に特異的な複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｂ）該複数の捕捉された分析物を、対応する該分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、該検出抗体が、
（１）促進部分で標識された複数の活性状態非依存抗体、及び
（２）シグナル増幅対の第一の構成因子で標識された複数の活性状態依存抗体、を含んでいる、工程；
（ｃ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を、前記シグナル増幅対の第二の構成因子とインキュベートして、増幅されたシグナルを生成する工程；及び
（ｄ）前記シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生成された前記増幅されたシグナルを検出する工程、
を備え、
前記捕捉抗体は固相担体に拘束されており、
前記促進部分は酸化剤を生成し、該酸化剤は前記シグナル増幅対の第一の構成因子に向けられ且つ該シグナル増幅対の第一の構成因子と反応する、ことを特徴とする。
２．前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む、ことを特徴とする上記１に記載の免疫分析方法。
３．前記細胞が免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、上記２に記載の免疫分析方法。
４．前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３に記載の免疫分析方法。
５．前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３又は４に記載の免疫分析方法。
６．前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子によって刺激される、上記３乃至５の何れか１項に記載の免疫分析方法。
７．前記単離された細胞が、増殖因子による刺激の前に、抗癌剤とインキュベートされる、上記６に記載の免疫分析方法。
８．前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記７に記載の免疫分析方法。
９．前記単離された細胞を、増殖因子による刺激の後に溶解して、前記細胞抽出物を作製する、上記６乃至８の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１０．前記一つ又は複数の分析物が、複数のシグナル伝達分子を含む、上記１乃至９の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１１．前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記１乃至１０の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１２．前記活性状態非依存抗体がさらに、検出可能な部分を備える、上記１乃至１１の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１３．前記検出可能な部分が、フルオロフォアである、上記１２に記載の免疫分析方法。
１４．前記検出可能な部分の量が、前記一つ又は複数の分析物の量と相関関係にある、上記１２又は１３に記載の免疫分析方法。
１５．前記活性状態非依存抗体が、チャネリング部分で直接標識されている、上記１乃至１４の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１６．前記活性状態非依存抗体に共役されたオリゴヌクレオチドと、チャネリング部分に共役された相補オリゴヌクレオチドと、の間のハイブリダイゼーションを介して前記活性状態非依存抗体が該チャネリング部分で標識されている、上記１乃至１４の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１７．前記活性状態依存抗体が、前記シグナル増幅対の第一の構成因子で直接標識されている、上記１乃至１６の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１８．前記活性状態依存抗体に共役された結合対の第一の構成因子と、前記シグナル増幅対の第一の構成因子に共役された前記結合対の第二の構成因子と、の間の結合を介して前記活性状態依存抗体が前記シグナル増幅対の第一の構成因子で標識されている、上記１乃至１６の何れか１項に記載の免疫分析方法。
１９．前記結合対の第一の構成因子がビオチンである、上記１８に記載の免疫分析方法。
２０．前記結合対の第二の構成因子がストレプトアビジンである、上記１８又は１９に記載の免疫分析方法。
２１．チャネリング部分がグルコースオキシダーゼである、上記１乃至２０の何れか１項に記載の免疫分析方法。
２２．前記酸化剤が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、上記２１に記載の免疫分析方法。
２３．前記シグナル増幅対の第一の構成因子がペルオキシダーゼである、上記２２に記載の免疫分析方法。
２４．前記ペルオキシダーゼが西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、上記２３に記載の免疫分析方法。
２５．前記シグナル増幅対の第二の構成因子がチラミド試薬である、上記２３又は２４に記載の免疫分析方法。
２６．前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、上記２５に記載の免疫分析方法。
２７．前記増幅されたシグナルが、活性型チラミドを生じる前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、上記２６に記載の免疫分析方法。
２８．前記活性型チラミドが直接検出される、上記２７に記載の免疫分析方法。
２９．前記活性型チラミドが、シグナル検出試薬の添加によって検出される、上記２７に記載の免疫分析方法。
３０．前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、上記２９に記載の免疫分析方法。
３１．前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組み合わせである、上記２９に記載の免疫分析方法。
３２．前記発色試薬が、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、上記３１に記載の免疫分析方法。
３３．細胞抽出物中の一つ又は複数の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体を含む、優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、前記捕捉抗体が固相担体に拘束されている、ことを特徴とする。
３４．前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む、上記３３に記載のアレイ。
３５．前記細胞が、免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、上記３４に記載のアレイ。
３６．前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３５に記載のアレイ。
３７．前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３５に記載のアレイ。
３８．前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子で刺激される、上記３５に記載のアレイ。
３９．前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の前に、抗癌剤とインキュベートされる、上記３８に記載のアレイ。
４０．前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３９に記載のアレイ。
４１．前記単離された細胞を、増殖因子の刺激の後に溶解して、前記細胞抽出物を作製する、上記３８に記載のアレイ。
４２．前記一つ又は複数の分析物が、複数のシグナル伝達分子を含む、上記３３に記載のアレイ。
４３．前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記３３に記載のアレイ。
４４．各希釈系列が少なくとも３つの下降する捕捉抗体濃度から構成される、上記３３に記載のアレイ。
４５．各希釈系列が少なくとも６つの下降する捕捉抗体濃度から構成される、上記３３に記載のアレイ。
４６．各希釈系列における前記捕捉抗体が少なくとも２倍で連続的に希釈される、上記３３に記載のアレイ。
４７．前記一つ又はそれ以上の分析物が、約１つの細胞中で検出される、上記３３に記載のアレイ。
４８．優れたダイナミックレンジを有し、ハイスループットの多重免疫分析を行うための方法であって、
前記方法は、
（ａ）細胞抽出物を、前記細胞抽出物中の一つ又は複数の分析物に特異的な、複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｂ）前記複数の捕捉された分析物を、前記対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程；
（ｃ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を、前記シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子とインキュベートして、増幅されたシグナルを生成する工程；及び
（ｄ）前記シグナル増幅対の第一及び第二の構成因子から生じた増幅されたシグナルを検出する工程、
を備え、前記捕捉抗体が固相担体に拘束されている、ことを特徴とする。
４９．前記細胞抽出物が、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む、上記４８に記載の免疫分析方法。
５０．前記細胞が、免疫磁気分離法によって患者試料から単離される、上記４９に記載の免疫分析方法。
５１．前記患者試料が、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記５０に記載の免疫分析方法。
５２．前記単離された細胞が、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記５０に記載の免疫分析方法。
５３．前記単離された細胞が、インビトロにおいて増殖因子によって刺激される、上記５０に記載の免疫分析方法。
５４．前記単離された細胞が、増殖因子の刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、上記５３に記載の免疫分析方法。
５５．前記抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記５４に記載の免疫分析方法。
５６．前記単離された細胞を、増殖因子の刺激の後に溶解して、前記細胞抽出物を作製する、上記５３に記載の免疫分析方法。
５７．前記一つ又はそれ以上の分析物が、複数のシグナル伝達分子を含む、上記４８に記載の免疫分析方法。
５８．前記固相担体が、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記４８に記載の免疫分析方法。
５９．前記検出抗体が、結合対の第一の構成因子から構成される、上記４８に記載の免疫分析方法。
６０．前記結合対の第一の構成因子がビオチンである、上記５９に記載の免疫分析方法。
６１．前記シグナル増幅対の第一の構成因子が、前記結合対の第二の構成因子から構成される、上記４８に記載の免疫分析方法。
６２．前記結合対の第二の構成因子が、ストレプトアビジンである、上記６１に記載の免疫分析方法。
６３．前記シグナル増幅対の第一の構成因子がペルオキシダーゼである、上記６１に記載の免疫分析方法。
６４．前記ペルオキシダーゼが西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、上記６３に記載の免疫分析方法。
６５．前記シグナル増幅対の第二の構成因子がチラミド試薬である、上記６３に記載の免疫分析方法。
６６．前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、上記６５に記載の免疫分析方法。
６７．前記増幅されたシグナルが、活性型チラミドを生じる前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、上記６６に記載の免疫分析方法。
６８．前記活性型チラミドが直接検出される、上記６７に記載の免疫分析方法。
６９．前記活性型チラミドが、シグナル検出試薬の添加で検出される、上記６７に記載の免疫分析方法。
７０．前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、上記６９に記載の免疫分析方法。
７１．前記シグナル検出試薬が、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ及び発色試薬の組み合わせである、上記６９に記載の免疫分析方法。
７２．前記発色試薬が、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、上記７１に記載の免疫分析方法。