(57)【要約】  ピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアントは、配列番号１の野生型のピキア・パストリスのＡＯＸ１プロモータ中の指定された改変の少なくとも１つを含むことにより特徴づけられ、該プロモータバリアントは、ａ）ヌクレオチド９４〜１１０（−８４７〜−８３１）、ヌクレオチド１４１〜１６０（−８００〜−７８１）、ヌクレオチド３１２〜３３０（−６２９〜−６１１）、ヌクレオチド３５５〜３８０（−５８６〜−５６１）、ヌクレオチド５０１〜５２１（−４４０〜−４２０）；ヌクレオチド６４０〜６５８（−３０１〜−２８３）、ヌクレオチド６７４〜６９３（−２６７〜−２４８）及びヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の内部の任意の位置でのＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組み込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列又はこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；ｂ）ヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の間の任意の位置でのＡｃａ１又はＡｃａ２  ＴＦＢＳの組み込み、特に「ＧＣＣＴＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ」ヌクレオチド配列又はこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；ｃ）ヌクレオチド９４〜６９３（−８４７〜−２４８）の内部における、配列番号２により指定される変異、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含み、かつ、ＡＯＸ１プロモータバリアントは更に、上記野生型ＡＯＸ１プロモータと比較したとき、その高まった強さ及び誘導能力によって特徴づけられる。
2022502018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの変異を野生型のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータ（配列番号１）のヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の内部に含み、エタノールおよびメタノールによる誘導条件のもとにあるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアント。
【請求項２】
プロモータバリアントを設計する方法であって、ピキア・パストリスのアルコールオキシド（ＡＯＸ１）プロモータがさらに、
ａ）ヌクレオチド９４〜１１０（−８４７〜−８３１）、ヌクレオチド１４１〜１６０（−８００〜−７８１）、ヌクレオチド３１２〜３３０（−６２９〜−６１１）、ヌクレオチド３５５〜３８０（−５８６〜−５６１）、ヌクレオチド５０１〜５２１（−４４０〜−４２０）；ヌクレオチド６４０〜６５８（−３０１〜−２８３）、ヌクレオチド６７４〜６９３（−２６７〜−２４８）およびヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の内部の任意の位置におけるＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組み込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列またはこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；
ｂ）ヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の間の任意の位置におけるＡｃａ１またはＡｃａ２  ＴＦＢＳの組み込み、特に「ＧＣＣＴＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ」ヌクレオチド配列またはこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；
ｃ）ヌクレオチド９４〜６９３（−８４７〜−２４８）の内部における、配列番号２により指定される変異、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含む、方法。
【請求項３】
ヌクレオチドが、欠失、置換、挿入および／または逆位によって変異させられる、請求項２に記載のプロモータバリアント構築方法。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＡＯＸ１プロモータバリアントを含み、かつ、タンパク質（ペプチド）または機能的ヌクレオチドをコードする核酸分子を少なくとも含む発現カセットであって、該プロモータバリアントおよび核酸分子が１コピー型または多コピー型の発現カセットを形成する、発現カセット。
【請求項５】
前記プロモータおよび前記核酸が一緒に機能的に連結されることによって特徴づけられる、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】
請求項１、２または３のいずれかに記載のピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアントと、少なくとも請求項４に記載の核酸分子とを含むベクター。
【請求項７】
請求項１、２または３のいずれかに記載の少なくとも１つのピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアント、および少なくとも請求項４に記載の発現カセット、または少なくとも請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
前記細胞が、真核細胞、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくは、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属およびトルプロシス（Ｔｏｒｕｐｌｏｓｉｓ）属からなる群から選択される酵母細胞、とりわけピキア・パストリス細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現方法であって、下記の工程：
・請求項４に記載の発現カセット、または、請求項１、２もしくは３のいずれかに記載のＡＯＸ１プロモータバリアントと、請求項４もしくは５のいずれかに記載のタンパク質、ペプチドもしくは機能的核酸分子をコードする核酸分子とを含む請求項６に記載のベクターを提供する工程、
・請求項７または８のいずれかに記載の前記細胞を前記ベクターまたは核酸分子により形質転換する工程、
・前記形質転換された細胞を好適な培地で培養する工程、
・好ましくは、前記タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子を誘導発現する工程、
・前記産生させたタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子を単離する工程
を含む方法。
【請求項１０】
前記細胞が、酵母、請求項７または８のいずれかに記載の酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくは、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびトルプロシス属からなる群から選択される酵母細胞、とりわけピキア・パストリス細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子の産生方法であって、請求項４に記載の発現カセット、請求項６に記載のベクター、または請求項７もしくは８のいずれかに記載の細胞を使用することを特徴とする、産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモータ工学設計によって強化されている、またはエタノールを唯一の炭素源かつエネルギー源として使用する再設計された調節機構をプロモータ工学設計によって有する独創的なアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子プロモータバリアントに関する。
【背景技術】
【０００２】
既知の最先端技術（先行技術）
製造プロセスの生産性は工業的生物工学応用における重要な判断基準である。宿主微生物が所望の組換えタンパク質を産生することができる能力は、プロモータ構造に依存している。プロモータ遺伝子は、組換えタンパク質合成の開始および継続をプロモータ構造の内部においてもたらし、かつ、タンパク質発現のための必要な上流側のＤＮＡエレメントであるＤＮＡヌクレオチド配列である。プロモータ遺伝子において利用可能である転写因子結合部位の数、性質、機能的位置、ならびにこれらの位置に結合する転写因子、およびそれらの間での相互作用は、プロモータ構造の基本的な構成要素である。プロモータ遺伝子の強さにより、宿主細胞の組換えタンパク質産生能が決定される。理想的な組換えタンパク質産生システムは、高収率で、かつ制御された様式での産生を、強力な、かつ調節されたプロモータ遺伝子のもとで行うシステムである。調節されたプロモータは、細胞成長期と、ｒ−タンパク質産生期とを互いに分けることを可能にし、それによりプロセスの制御可能性を高める。そのうえ、バイオリアクターにおける組換えタンパク質の蓄積が細胞の成長およびその生存率に及ぼす負の影響もまた、これら２つの時期を分けることによって防止される。
【０００３】
酵母のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）による工業的な組換えタンパク質産生が１９８１年に開始されており、この１０年間において、この酵母は、大多数の研究が行われている酵母である。飼料業界で使用されるフィターゼ（Ｐｈｙｔｅｘ、Ｓｈｅｒｉｄａｎ、ＩＮ、米国）、プロテオミクス研究のためのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）、水分析および水処理のための硝酸レダクターゼ（Ｔｈｅ  Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｏ．、Ｌａｋｅ  Ｌｉｎｄｅｎ、ＭＩ、米国）、植物油の脱ガムにおいて使用されるホスホリパーゼＣ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国／ＤＳＭ、オランダ）、健康研究において、また、皮膚充填物として使用されるコラーゲン（Ｆｉｂｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）、ならびにプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって先行技術により以前から製造されている組換えタンパク質である（非特許文献１）。最初の生物製剤製造物、すなわち、ＦＤＡ（米国）によって承認されたＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）（エカランチド）が、２００９年に販売について許可され、現在に至っている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて製造され続けているＪｅｔｒｅａ（登録商標）もまた、ＦＤＡおよびＥＭＡ（ＥＵ）によって承認されている。生物製剤の新しい製造方法を開発するための研究、およびその承認申請が引き続き行われている。
【０００４】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓはメチロトローフ酵母であり、メタノールを唯一の炭素源として使用することによって成長することができる。そのメチロトローフ性のために、メタノール利用経路における遺伝子は大量に発現しており、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの最も一般に使用されている強力なＡＯＸ１プロモータ、すなわち、ＰＡＯＸ１が、メタノール利用経路から得られている。ＡＯＸ１酵素は、メタノール利用の最初の段階であるメタノールのフロムアルデヒド（ｆｒｏｍａｌｄｅｈｙｄｅ）への酸化を触媒する。ＡＯＸ１プロモータ（ＰＡＯＸ１）はメタノールの存在下で強く誘導され、異なる炭素源（例えば、エタノール、グルコースおよびグリセロールなど）により抑制される。しかしながら、有毒なアルコールであるメタノールによるＰＡＯＸ１の誘導はバイオプロセス操作における様々な危険性の原因となっており、また、食品業界および製薬業界のために製造された組換えタンパク質にメタノールが残留しているかもしれないという恐れにより、このプロモータの使用は制限されている。食品業界における高い純度レベルを有していない粗酵素の広まった使用は、メタノールの使用を、食品業界で使用されることになる組換えタンパク質製造物における増大する精製コストのために制限している。国立労働安全衛生研究所（ＮＩＯＳＨ）（米国）の作業環境におけるメタノールについて認められる限界閾値（ＴＬＶ）は２００ｐｐｍであるが、エタノールについてはこの値が１０００ｐｐｍである。そのうえ、メタノールの致死量は０．３〜１ｇ／ｋｇであるが、エタノールの致死量は７．０６０ｇ／ｋｇである。エタノールは、人類の歴史において製造される主要な伝統的な生物工学的製造物の１つである。一方で、エタノールは、化学業界、製薬業界および食品業界では長年にわたって使用されているために、また、安全なプロセス応用の観点から特別な注意を必要としないために安全であることが知られている。
【０００５】
様々なプロモータ遺伝子が、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムにおける遺伝子配列の機能を明らかにすることによって特定されており、野生型または改変型のプロモータ遺伝子配列がそれらの産業上の可能性のために特許を得ている。
【０００６】
先行技術の特許文献１には、メタノールおよび／またはメチルアミンにより誘導されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモータが開示されている。上記特許において、ＦＬＤ１プロモータは、ＰＡＯＸ１と同等のレベルでの産生を果たすことができるために、ＰＡＯＸ１の代替となり得ることが示唆される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの翻訳伸長因子（ＴＥＦ）プロモータ遺伝子およびこの構成的プロモータを用いる組換えタンパク質産生法が特許文献２により保護されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＡＤＨ１遺伝子およびこの遺伝子を用いる組換えタンパク質産生プロセスが特許文献３により特許を得ている。酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの調節されたＧＵＴ１（グリセロールキナーゼ）プロモータ遺伝子が特許文献４により特許を得ている。
【０００７】
先行技術の特許文献５には、欠失、挿入または置換の変異によって形成されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの高親和性グルコース輸送体（ＧＴＨ１）遺伝子プロモータ（ｐＧ１）バリアント（ｐＧ１−ｘ）が記載される。
【０００８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＤＡＳプロモータバリアントが特許文献６により特許を得ている。これらのバリアントは、いくつかのプロモータ遺伝子領域の欠失、またはプロモータ内部に位置するいくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ）遺伝子エレメントの挿入によって得られている。
【０００９】
様々な変異型ＡＯＸ１プロモータが特許文献７により特許を得ている。この研究では、プロモータ遺伝子に位置する、Ｈａｐ１、Ｈｓｆ、Ｈａｐ２３４、ａｂａＡ、Ｓｔｒｅ、Ｒａｐｔ、Ａｄｒ１、Ｍａｔ１  ＭＣ、Ｇｃｒ１およびＱＡ−１Ｆの転写因子結合部位が特定されており、これらの配列が、野生型ＡＯＸ１プロモータの６％〜１６０％の割合で活性を示すＡＯＸ１変異体を作出するために欠失または重複化されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，７３０，４９９号（Ｂ１）明細書
【特許文献２】米国特許第７８１６５０９号（Ｂ２）明細書
【特許文献３】米国特許第８２２２３８６号（Ｂ２）明細書
【特許文献４】米国特許第８７８５６１３号（Ｂ２）明細書
【特許文献５】国際公開第２０１７／０２１５４１号（Ａ１）パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１１０１２９８７４号（Ａ１）明細書
【特許文献７】米国特許第９２７９１２９号（Ｂ２）明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｈｍａｄ，Ｍ．，Ｈｉｒｚ，Ｍ．，Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｈ．，＆Ｓｃｈｗａｂ，Ｈ．（２０１４）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９８（１２），５３０１−５３１７．
【非特許文献２】Ｈａｒｔｎｅｒ，Ｆ．Ｓ．，Ｒｕｔｈ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｎｅｇｇｅｒ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｙｋａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６（１２），ｅ７６−ｅ７６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、増強されている、または改変された調節機構を有する独創的なアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子プロモータバリアントに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の簡単な説明およびその目的
本発明の主たる目的は、制御されたバイオプロセス条件のもとでの高収率の組換えタンパク質産生を工業的生物工学応用において可能にするための遺伝子ツールを提供することである。高収率のバイオプロセスを達成するための最も重要な遺伝子ツールは、強力なプロモータである。本発明の対象であるプロモータバリアントは、野生型ＰＡＯＸ１との比較において、強化された産生能をメタノール誘導条件およびエタノール誘導条件の両方のもとでもたらす独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントである。
【００１４】
本発明の対象であるプロモータバリアントの根本的な利点が、本発明の対象であるプロモータバリアントは強力な、かつ調節されたシステムであるということである。これに加えて、本発明の対象であるＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）バリアントおよびＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）バリアントは、通常は野生型ＡＯＸ１プロモータのリプレッサーであるエタノールにより誘導される。エタノールは安価な炭素源であり、かつ、製造プロセスにおいて作業する人々に対する毒性の危険性をもたらさないため、エタノールは様々な重要な利点を食品業界および製薬業界に提供する。
【００１５】
本発明の対象であるプロモータバリアントに関しては、組換えタンパク質を、業界においてメタノールを使用して開発されるバイオプロセスのための野生型ＡＯＸ１プロモータに基づくシステムよりも高い収率で産生させることができる。効率的なプロセス制御を、プロモータの活性な（オン）状態および不活性な（オフ）状態を異なる炭素源により調節することによって提供することは、様々なプロセス要件（例えば、高い生成物収率、生成物安定性、および細胞に対する毒性タンパク質の産生など）を提供することを可能にする。本発明は、コストおよび時間の両方の利点を工業的生物工学プロセスにおいて提供する可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＡＯＸ１−ｗｔを用いて構築される細胞におけるｅＧＦＰ発現に対しての、およびＰＡＯＸ１−ｗｔを用いて構築された細胞との比較のための、独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントを用いて構築されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の、異なる炭素源での正規化されたｅＧＦＰ発現（％）Ｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも１つの変異を野生型のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータ（配列番号１）のヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の内部に含み、エタノールおよびメタノールによる誘導条件のもとにあるピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアントに関する。
【００１８】
本発明の対象であるＡＯＸ１プロモータバリアントは、自然界においてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＡＯＸ１プロモータに見出されない転写因子結合部位を、ＡＯＸ１プロモータの機能的に標的化された領域に位置するヌクレオチドの置換によって組み込むプロセス工程を含む方法によって構築される。
【００１９】
本発明のために要求される２つの局面が、
（ｉ）転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）改変の設計、および
（ｉｉ）機能分析を介したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモータに対する組み込み位置の選択
である。
【００２０】
プロモータバリアントのピキア・パストリスのアルコールオキシド（ＡＯＸ１）プロモータを設計する方法はさらに、ａ）ヌクレオチド９４〜１１０（−８４７〜−８３１）、ヌクレオチド１４１〜１６０（−８００〜−７８１）、ヌクレオチド３１２〜３３０（−６２９〜−６１１）、ヌクレオチド３５５〜３８０（−５８６〜−５６１）、ヌクレオチド５０１〜５２１（−４４０〜−４２０）；ヌクレオチド６４０〜６５８（−３０１〜−２８３）、ヌクレオチド６７４〜６９３（−２６７〜−２４８）およびヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の内部の任意の位置におけるＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組み込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列またはこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；ｂ）ヌクレオチド１〜８４０（−９４０〜−１００）の間の任意の位置におけるＡｃａ１またはＡｃａ２  ＴＦＢＳの組み込み、特に「ＧＣＣＴＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ」ヌクレオチド配列またはこの配列との少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組み込み；ｃ）ヌクレオチド９４〜６９３（−８４７〜−２４８）の内部における、配列番号２により指定される変異、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される変異を含む。
【００２１】
プロモータバリアントの構築は、欠失、置換、挿入および/または逆位であるヌクレオチド変異によって行われる。
【００２２】
製造プロセスの効率は工業的生物工学応用における重要な判断基準である。宿主微生物が所望の組換えタンパク質を産生することができる能力は、プロモータ構造に依存している。理想的な産生システムは、強力な、かつ調節されたプロモータ遺伝子による制御された様式での高収率の産生を可能にするシステムである。調節されたプロモータは、細胞成長期と、組換えタンパク質産生期とを互いに分けることを可能にし、それによりプロセスの制御可能性を増大させる。そのうえ、これら２つの時期を分けることによって、細胞の成長および生存率に対する組換えタンパク質蓄積の影響もまた防止さる。
【００２３】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでは、ＡＯＸ１プロモータシステムのＰＡＯＸ１が一般に使用される。ＰＡＯＸ１が使用されるとき、有毒アルコールのメタノールをバイオリアクターに供給しなければならないことは様々な危険性ももたらす。食品業界および製薬業界のために製造された組換えタンパク質にメタノールが残留しているかもしれないという恐れにより、この方法の使用は制限されている。エタノールは、人類の歴史において製造されてきた主要な伝統的な生物工学的製造物の１つである。エタノールは、化学業界、製薬業界および食品業界では長年にわたって使用されているために、また、安全なプロセス応用の観点から特別な注意を必要としないために無害であることが知られている。ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）およびＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）は、本発明の対象となるものであり、エタノールを代わりに使用することによって、メタノール誘導の野生型ＰＡＯＸ１の産生能の１３０％および７４％をそれぞれもたらすことができる。言い換えれば、野生型ＰＡＯＸ１はエタノールにより抑制され、活性を何ら示さないが、本発明の対象であるプロモータバリアントのＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）およびＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）は、エタノールを用いた組換えタンパク質産生を果たすことができる。エタノールが、ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）およびＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）である本発明の対象であるプロモータバリアントの誘導剤となるため、このことは、エタノールが安価であり、また、無毒かつ無害な性質を有するので、本発明の対象であるバリアントの産業上の重要性を増大させている。
【００２４】
本発明の対象であるプロモータバリアントの重要かつ新規な特徴が、本発明の対象であるプロモータバリアントはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＡＯＸ１プロモータ（ＰＡＯＸ１−ｗｔ）よりも強力であり、かつ、結果として、より大量の組換えタンパク質産生を果たすことができるということである。本発明の対象であるプロモータバリアントはメタノール誘導のもとでＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＰＡＯＸ１との比較において３８％〜９７％より多い組換えタンパク質産生をもたらすことができる。野生型ＰＡＯＸ１により制御されたメタノール誘導下での組換えタンパク質産生が１９８１年以降、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉを用いて行われている。本発明の対象であるプロモータバリアントのすべてが、すなわち、ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）およびＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）が野生型ＰＡＯＸ１との比較において、より大きい組換えタンパク質産生能をメタノール誘導条件のもとで有する。プロモータ工学設計により開発されている強化されたＡＯＸ１プロモータバリアントは、産業界が長年の経験および技術的知識を有するメタノール型バイオプロセス応用においてより高い産生能を有するので、著しい利点をもたらす。高収率かつ効果的なプロセス制御応用により果たすことができる製造応用は、様々な利点を費用節約および時間節約の両方の面でもたらす可能性を有している。
【００２５】
本発明の対象であるプロモータバリアントは、９４０ヌクレオチドの配列からなる。ヌクレオチドの位置が５’末端における最初のヌクレオチドから数えられるとき、ヌクレオチドの位置は正の数の値により表される。しかしながら、プロモータにおけるヌクレオチドはまた、プロモータの末端に位置するコード配列の開始に基づいて定めることができ、そのような場合には、プロモータの３’末端における最初のヌクレオチド（本発明者らの場合にはヌクレオチドＧ）が「−１」に位置し、ヌクレオチド位置はプロモータ遺伝子の５’末端に向かって減少し続け、該遺伝子の５’末端における最初のヌクレオチド（本発明者らの場合にはヌクレオチドＡ）が−９４０塩基対（ｂｐ）の位置に位置する。
【００２６】
本発明の対象であるＡＯＸ１プロモータバリアントを設計するとき、方法として、自然界においてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＡＯＸ１プロモータに見出されないＴＦＢＳ遺伝子モチーフが、ヌクレオチドの置換によって、機能的に決定された位置に対して組み込まれている。本発明において、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）、ＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）およびＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）の各バリアントは、転写因子のＣａｔ８およびＡｄｒ１がサッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（伝統的な生物工学における重要なエタノール（エチルアルコール）産生酵母）のエタノール利用経路遺伝子の重要な活性化因子としてであることが知られているので、Ｃａｔ８転写因子結合配列（ＴＦＢＳ）である「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）、Ａｄｒ１  ＴＦＢＳである
【化１】
2022502018.tif 000003
（コア配列が太字の下線付き文字によって表される）（Ｃｈｅｎｇ  ｖｄ．、１９９４）を組み込むことによって、また、エタノール利用に関わるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＤＨ２プロモータにおいて特定されるＡｃａ１／Ａｃａ２  ＴＦＢＳを形成する配列「ＧＣＣＴＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ」を組み込むことによって設計され、構築されている。
【００２７】
本発明の対象である独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントでは、独創的かつ新規な戦略的方法による組換えタンパク質産生プロセスのためのバイオリアクター操作条件の設計が可能となる。プロモータの誘導特性および抑制特性を使用することによって、独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントのもとで調節できるバイオリアクター供給戦略を開発することが可能である。バイオリアクター操作の第１段階において、プロモータを抑制するグルコースまたはグリセロールを供給することによって、それにより組換えタンパク質産生を停止させることは、高い細胞密度の培養をもたらし、第２段階において、エタノールまたはメタノールを増大する濃度で供給することにより、高い細胞密度の組換えタンパク質産生プロセスのための著しいプロモータ誘導および効果的な制御がもたらされることが可能である。効果的なプロセス制御機構を提供すること、および産生期を細胞成長期から分けることは、産生させられる異種タンパク質の特徴に依存して具体的な場合において著しい様々な利点を有する。これらの利点として、高いタンパク質収率がプロセス終了時に得られること、高まった生成物安定性、および発現させられるタンパク質が有毒である場合における組換えタンパク質産生が挙げられる。
【００２８】
本発明の対象であるＡＯＸ１プロモータバリアントの詳細な説明が下記において提供されている。
【００２９】
プロモータバリアント−１の設計：ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）（配列番号２）
【００３０】
ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）プロモータバリアントをプロモータ工学の原理により設計しているとき、本バリアントが、エタノール誘導において重要であるＴＦＢＳを、通常はメタノールにより誘導されるプロモータの機能的に非常に重要な点に対して組み込むことによって構築され、結果として、プロモータの調節機構がメタノールからエタノールに変換される。同時に、本発明の対象であるＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）プロモータバリアントはメタノール誘導可能な特徴を維持しており、そのうえ、メタノールにより誘導されるときには野生型ＡＯＸ１プロモータよりもおよそ２倍多い産生をもたらすことさえできる。ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）の設計において、野生型ＡＯＸ１プロモータにおける７つの異なるヌクレオチド範囲が改変されている。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのために最適化されるＡｄｒ１  ＴＦＢＳが３つの異なる位置に対して組み込まれており、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのために最適化されるＣａｔ８  ＴＦＢＳが３つの異なる位置に対して組み込まれており、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型ＡＤＨ２プロモータにおいて特定されるＡｃａ１／Ａｃａ２  ＴＦＢＳが１つの位置に対して組み込まれている。ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）遺伝子配列は、野生型のＰＡＯＸ１遺伝子配列との８９％の同一性を示す。ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）の配列が配列番号２により与えられており、組み込まれたＴＦＢＳが、Ｃａｔ８  ＴＦＢＳ、Ａｄｒ  １ＴＦＢＳ、およびＡｃａ１  ＴＦＢＳである。野生型ＡＯＸ１プロモータはエタノールにより抑制され続けるが、より高い組換えタンパク質産生能が、メタノール誘導の野生型ＰＡＯＸ１により得られる組換えタンパク質産生レベルと比較した場合、設計されたＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）バリアントにより、エタノール誘導のもとで達成されることが可能である。これに加えて、ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）プロモータは、メタノール誘導可能な性質を依然として持続させており、メタノールにより、野生型ＡＯＸ１プロモータよりも９７％多い産生を果たすことができる。
【００３１】
プロモータバリアント−２の設計：ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）（配列番号３）
【００３２】
ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）プロモータバリアントの設計において、野生型ＡＯＸ１プロモータにおけるプロモータ遺伝子の開始位置から３番目のところに位置するＭｘｒ１（メタノール発現調節因子１）ＴＦＢＳが、Ｃａｔ８  ＴＦＢＳ配列により置換されている。上記プロモータバリアントは野生型ＡＯＸ１プロモータとの比較において、８０％より多い組換えタンパク質産生をメタノール発酵において果たすことができる。
【００３３】
プロモータバリアント−３の設計：ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）（配列番号４）
【００３４】
ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）プロモータバリアントは、野生型ＡＯＸ１プロモータにおけるプロモータ遺伝子の開始位置から５番目のところに位置するＭｘｒ１  ＴＦＢＳをＣａｔ８  ＴＦＢＳ配列により置換することによって構築されている。ＡＯＸ１プロモータの調節が１つだけの遺伝子領域における改変により変化している。ＰＡＯＸ１はエタノールにより抑制されるが、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）は、メタノールを用いてＰＡＯＸ１によって示される産生能の７４％を、エタノールを代わりに使用して果たすことができる。これに加えて、本バリアントは、メタノールにより調節されるその能力を失っておらず、ＰＡＯＸ１との比較においてメタノール誘導のもとで６９％より多い産生をもたらすことができる。
【００３５】
プロモータバリアント−４の設計：ＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）（配列番号５）
【００３６】
プロモータバリアントＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）は、自然界において野生型ＡＯＸ１プロモータに見出されないＡｃａ１／２ＴＦＢＳの組み込みにより設計されている。ＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）はＰＡＯＸ１との比較において、メタノール誘導による３８％より多い産生を果たすことができる。
【実施例】
【００３７】
実施例１
材料および方法
【００３８】
実施例１．１
ＡＯＸ１プロモータバリアントの設計およびレポータｅＧＦＰ遺伝子と一緒でのクローニング
【００３９】
２工程の重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法をＡＯＸ１プロモータバリアントの構築のために使用した。下記の表に示される設計されたプライマーを使用して、ＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）およびＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）の各プロモータバリアントを構築している。
【００４０】
【表１】
2022502018.tif 000004
【００４１】
増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子が、ＡＯＸ１プロモータバリアントのもとでの遺伝子発現レベルを求めるためのレポータとして使用されている。ｅＧＦＰ遺伝子と、ＡＯＸ１プロモータバリアントの遺伝子と、上記の表に示されるプライマーを使用するＯＥ−ＰＣＲ法によって増幅した。プロモータ遺伝子配列とｅＧＦＰ遺伝子配列との間でのいかなるヌクレオチド付加も防止した。増幅されたプロモータバリアント遺伝子フラグメントおよびｅＧＦＰ遺伝子フラグメントを、好適な制限酵素を使用することによって消化し、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子およびＡＯＸ１転写ターミネータモジュールを有するベクターに対して連結反応によりクローン化した。
【００４２】
構築されたプラスミドによる形質転換を、塩化カルシウム法により調製されている化学的コンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に対して行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１）。推定される陽性クローンを、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）を含有する選択的ＬＢ寒天培地を使用して選択し、プラスミド単離の後、構築された組換えベクターを遺伝子配列決定分析によって確認した。
【００４３】
実施例１．２
プロモータバリアントを有する組換えベクターによる酵母ピキア・パストリスの形質転換およびプロモータバリアントの発現能の評価
【００４４】
ＡＯＸ１プロモータバリアント遺伝子およびｅＧＦＰレポータ遺伝子を含有する組換えベクターを製造者の提案に従ってＢｇｌＩＩ制限酵素により線状化し、塩化リチウム法により調製されるコンピテントなＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｘ３３細胞を線状化遺伝子フラグメントによりトランスフェクションした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０００）。再生後、形質転換体を選択的なＺｅｏｃｉｎ（商標）含有ＹＰＤ寒天培地に接種した。形質転換後、プロモータバリアント遺伝子およびｅＧＦＰレポータ遺伝子を含む発現カセットを有する推定クローンをコロニーＰＣＲにより確認し、少なくとも１０個体をそれぞれの菌株から選択し、プロモータバリアントの産生能を評価するために使用した。
【００４５】
発現カセットは、少なくとも１つのＡＯＸ１プロモータバリアントを含み、かつ、タンパク質（ペプチド）または機能的ヌクレオチドをコードする核酸分子を少なくとも含み、上記プロモータバリアントおよび核酸分子は１コピー型または多コピー型の発現カセットを形成する。これらの核酸分子およびプロモータは一緒に機能的に連結される。
【００４６】
Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子およびＡＯＸ１転写ターミネータモジュールを有するベクターは、ピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアントと、少なくとも核酸分子とを発現カセットに含む。
【００４７】
ピキア・パストリス細胞をＹＰ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン）において２５℃で２０時間、２８０ｒｐｍで前培養し、その後、産生培地に移した。前培養が終了したとき、細胞を遠心分離によって集め、産生培地に移した。プロモータバリアントの発現能を評価するために、５つの異なる炭素源を別々に含む最小培地（６．３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４；０．８ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；０．４９ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；２．６４ｇ／ＬのＫＣｌ；０．０５３５ｇ／ＬのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ；２２ｇ／Ｌのクエン酸一水和物；１．４７ｍｌ／ＬのＰＴＭ１；２ｍｌ／Ｌのビオチン（０．２ｇ／Ｌ）；２０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２５％））を使用した。産生試験で使用される異なる基質および適用される産生パラメータが、下記の表に与えられるものであった。ｍ２ｐキット多糖２５％（ｖ／ｖ）および０．７％（ｖ／ｖ）酵素（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）の混合物を含む産生培地をグルコース制限条件については使用した。
【００４８】
【表２】
2022502018.tif 000005
【００４９】
細胞を２４深底ウエルプレート（２４深底ウエルプレート、Ｗｈａｔｍａｎ、英国））において、２８０ｒｐｍの混合速度および２５℃の温度で２０時間、異なる炭素源を含む２ｍｌの産生培地で培養した。２０時間目が終了したとき、ピキア・パストリス細胞を０．４のＯＤ６００値にリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。
【００５０】
細胞内ｅＧＦＰ産生値を、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）（ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ）フローサイトメトリーを使用して単位細胞あたりの平均ｅＧＦＰ蛍光を測定することによって求めた。フローサイトメトリーにおいて、ｅＧＦＰを４８８ｎｍで刺激し、放射値を５２５ｎｍで集めた。１０，０００個の細胞からの蛍光シグナルを、ＦＳＣ値およびＳＳＣ値を使用してそれぞれの測定において考慮に入れ、酵母クラスターをグラフにおいて規定する細胞を選択し、ＦＳＣ−Ｈ値およびＦＳＣ−Ａの値に関して線形回帰を示す細胞についてゲート設定して、単一細胞を選択した。細胞体積に基づく蛍光強度と、ゲート設定集団の幾何平均とを、細胞の特異的なｅＧＦＰ合成レベルを求めるためのｅＧＦＰ蛍光計算において使用した。相対的なｅＧＦＰ発現レベルを、１％（ｖ／ｖ）メタノールにおける野生型ＰＡＯＸ１−ｗｔのもとでのｅＧＦＰ発現と比較して計算した。
【００５１】
これらの細胞は、少なくとも１つのピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータバリアントと、少なくとも発現カセットと、少なくともベクターとを含む。上記細胞は、真核細胞、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくは、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属およびトルプロシス（Ｔｏｒｕｐｌｏｓｉｓ）属からなる群から選択される酵母細胞、とりわけピキア・パストリス細胞である。
【００５２】
組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸が、下記の工程によって発現させられる：
・ＡＯＸ１プロモータバリアントの作製、
・ｅＧＦＰレポータ遺伝子を加えた発現カセットの作製、
・組換えベクタープロモータバリアントの作製、
・真核細胞、とりわけ酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくは、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびトルプロシス属からなる群から選択される酵母細胞、とりわけピキア・パストリス細胞の組換えベクターによる形質転換、ならびに形質転換細胞を好適な培地で培養すること、
・好ましくは、上記タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子の誘導発現、
・産生させたタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子の単離。
【００５３】
実施例２
結果
【００５４】
本発明の対象であるプロモータバリアントのもとでの組換えタンパク質（ｅＧＦＰ）産生を振とうフラスコのバイオリアクター実験により調べた。設計されたプロモータバリアントの産生能を、一般に使用されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＰＡＯＸ１−ｗｔと比較した。結果を表３に示す。プロモータバリアントの活性に対する異なる炭素源の影響、したがって組換えタンパク質産生の効率を、３つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ生物学的複製物により評価した。プロモータバリアントの産生性を下記の表に示す。１％（ｖ／ｖ）メタノールによる誘導のもとでのＰＡＯＸ１−ｗｔによるｅＧＦＰ産生を１００ユニットとして求め、バリアントの産生性をこの値に対して関連づけた。
【００５５】
【表３】
2022502018.tif 000006
【００５６】
独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントの組換えタンパク質（ｅＧＦＰ）産生能が、メタノールが供給される定義された最小培地において野生型ＡＯＸ１プロモータとの比較で有意に増大している。ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ２（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ２）、ＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）、ＰＡＯＸ１−Ａｃａ（ＰＡＯＸ１／Ａｃａ２）およびＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）の各プロモータバリアントは、メタノール発酵においてＰＡＯＸ１−ｗｔとの比較で、８０％超、６９％超、３８％超および９７％超のｅＧＦＰ産生をそれぞれ果たした。これに加えて、エタノールはＰＡＯＸ１−ｗｔを抑制し、したがって組換えタンパク質産生を抑制するという事実からみれば、本発明の対象である独創的なプロモータバリアントのＰＡＯＸ１−Ｃａｔ３（ＰＡＯＸ１／Ｃａｔ８−Ｌ３）およびＰＡＯＸ１−ｍｏｄ（ＰｍＡＯＸ１）はエタノール誘導性であり、代わりにエタノールを炭素源かつエネルギー源として使用することによって、メタノール誘導ＰＡＯＸ１−ｗｔの７４％および１３０％の産生能をそれぞれ果たすことができる。設計されたプロモータバリアントは、ＰＡＯＸ１−ｗｔとの比較においてエタノール誘導またはメタノール誘導のもとで有意に高い産生能に達することができるが、グルコースおよびグリセロールの存在下で抑制されることによってそれらの制御された性質を依然として持続させている。実験室規模の条件のもとで行われる組換えタンパク質産生実験により、生物工学的プロセスにおける独創的なＡＯＸ１プロモータバリアントの産業上の可能性および重要性が明らかにされる。
【００５７】
参考文献
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Ｈａｒｔｎｅｒ、Ｆ．Ｓ．，Ｒｕｔｈ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｎｅｇｇｅｒ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｙｋａ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６（１２），ｅ７６−ｅ７６．
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Ｒｏｔｈ，Ｓ．，Ｋｕｍｍｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ｊ．（２００４）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  Ｃａｔ８  ａｎｄ  Ｓｉｐ４  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４５（３），１２１−１２８．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）´´Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｍａｎｕａｌ´´，３ｒｄｅｄｎ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【図１−１】
2022502018.tif 000007
【図１−２】
2022502018.tif 000008
【図１−３】
2022502018.tif 000009
【図１−４】
2022502018.tif 000010
【図１−５】
2022502018.tif 000011
【図１−６】
2022502018.tif 000012
【配列表】
2022502018000001.app
【国際調査報告】
2022502018.tif 000013