(57)【要約】  本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ１９を二重標的とするキメラ抗原受容体、並びにその使用に関するものである。具体的に、本発明は、（１）抗ＢＣＭＡおよび抗ＣＤ１９一本鎖抗体をコードする配列、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域をコードする配列、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする配列、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインをコードする配列、ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする配列、及び、任意の、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメントをコードする配列を順番に連結したポリヌクレオチド配列、及び、（２）（１）に記載のポリヌクレオチド配列の相補配列、から選択されるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明は、関連する融合タンパク質、前記コード配列を含むベクター、及び、前記融合タンパク質、コード配列、ベクターの使用を更に提供する。本発明で調製されたＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、特異的腫瘍細胞に対して強力な殺傷機能を有し、ＣＤ１０７ａの発現およびＩＦＮγの分泌が比較的に高く、エフェクター／ターゲット比が５：１の場合、標的細胞に対する殺傷率が８０％程度に達する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）抗ＢＣＭＡおよび抗ＣＤ１９一本鎖抗体をコードする配列、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域をコードする配列、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする配列、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインをコードする配列、ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする配列、及び、任意の、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメントをコードする配列を順番に連結したポリヌクレオチド配列、及び、
（２）（１）に記載のポリヌクレオチド配列の相補配列、
から選択されるポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体をコードする配列の前にある前記シグナルペプチドをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１〜６３に示され、及び／又は
前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の軽鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列６４〜３９６に示され、及び／又は
前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の重鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列４４２〜７９２に示され、及び／又は
前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列８５３〜１２１２に示され、及び／又は
前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１２６７〜１５８７に示され、及び／又は
前記ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１５８８〜１６２３に示され、及び／又は
前記ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１６２７〜１７０７に示され、及び／又は
前記ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１７０８〜１８３３に示され、及び／又は
前記ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１８３４〜２１６９に示され、
前記ＥＧＦＲのフラグメントは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ、細胞外ドメインＩＶ、及び膜貫通ドメインを含有し、或いは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ、細胞外ドメインＩＶ、及び膜貫通ドメインから構成され、より好ましくは、前記フラグメントのポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列２３１４〜３３１８に示され、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナルペプチドをコードする配列をさらに含有し、前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナルペプチドは、前記ＥＧＦＲのフラグメントのＮ末端に設定され、好ましくは、前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナルペプチドのポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列２２４８−２３１３に示される、ことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
（１）抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体、抗ＣＤ１９一本鎖抗体、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメイン、及びヒトＣＤ３ζの細胞内ドメイン、及び、任意の、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメントを順番に連結した融合タンパク質、及び、
（２）（１）に限定されたアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または追加され、且つ活性化Ｔ細胞の活性を保持する、（１）に由来する融合タンパク質、から選択される融合タンパク質であって、
好ましくは、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体は、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３であり、
好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｃ１１Ｄ５．３である、融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し、
前記融合タンパク質は前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体のＮ末端にシグナルペプチドを更に含有し、好ましくは、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜２１に示され、
前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２２〜１３２に示され、
前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１４８〜２６４に示され、
前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２８５〜４０４に示され、
前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸４２３〜５２９に示され、
前記ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸５３０〜５４１に示され、
前記ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸５３２〜５６９に示され、
前記ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸５７０〜６１１に示され、
前記ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６１２〜７２３に示され、
前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナルペプチドと前記ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインとを連結するリンカー配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列７５０〜７７１に示され、及び／又は
前記ＥＧＦＲのフラグメントをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列７７２〜１１０６に示される、
ことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列を含有し、
好ましくは、前記核酸構築物はベクターであり、
より好ましくは、前記核酸構築物は、レトロウイルスベクターであり、複製の開始点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列を含有する、核酸構築物。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸構築物を含有し、好ましくは、前記ベクターを含有し、より好ましくは、前記レトロウイルスベクターを含有する、レトロウイルス。
【請求項７】
遺伝子改変Ｔ細胞又は当該遺伝子改変Ｔ細胞を含有する医薬組成物であって、
前記細胞は請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列を含有し、または請求項５に記載の核酸構築物を含有し、または請求項６に記載のレトロウイルスに感染され、または請求項３または４に記載の融合タンパク質及び任意の、細胞外ドメインＩＩＩ、細胞外ドメインＩＶ、及び任意の膜貫通ドメインを含むＥＧＦＲのフラグメントを安定して発現することを特徴とする、遺伝子改変Ｔ細胞又は当該遺伝子改変Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
【請求項８】
活性化Ｔ細胞の調製における、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列、請求項３または４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸構築物、または請求項６に記載のレトロウイルスの使用。
【請求項９】
ＢＣＭＡにより媒介される疾患を治療する医薬の調製における、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列、請求項３または４に記載の融合タンパク質、請求項５に記載の核酸構築物、請求項６に記載のレトロウイルス、或いは、請求項７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞又はその医薬組成物の使用であって、
前記ＢＣＭＡにより媒介される疾患は多発性骨髄腫である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療の分野に関し、具体的に、ＢＣＭＡ及びＣＤ１９を二重標的とするキメラ抗原受容体、並びにその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体−Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔ  ｃｅｌｌ，ＣＡＲ−Ｔ細胞）とは、遺伝子改変された後、特定の標的抗原をＭＨＣ非拘束性で認識し、かつ活性化と増殖を続けることができるＴ細胞である。２０１２年の国際細胞治療学会の年次総会では、生物学的免疫細胞療法が、手術、放射線治療、化学療法に加えて、第４種類の腫瘍治療の手段となり、そして、将来的には腫瘍治療に不可欠な手段になると報告された。ＣＡＲ−Ｔ細胞再注入療法は、現在の腫瘍治療において最も明確に効果的な免疫療法である。多くの研究により、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍抗原を効果的に認識し、特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、患者の生存状況を大幅に改善できることが示されている。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＡＲ−Ｔのコアであり、Ｔ細胞に、ＨＬＡに依存せずに腫瘍抗原を認識させる機能を与える。これにより、天然のＴ細胞表面受容体ＴＣＲと比べて、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞はより広範囲の標的を認識できる。ＣＡＲの基本設計には、一つの腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＴＡＡ）結合ドメイン（通常はモノクローナル抗体抗原結合ドメインのｓｃＦＶセグメントに由来する）、一つの細胞外ヒンジドメイン、一つの膜貫通ドメイン、および一つの細胞内シグナルドメインが含まれる。標的抗原の選択は、ＣＡＲの特異性、有効性、および遺伝子組み換えＴ細胞自体の安全性のいずれに対して、、重要な決定要因である。
【０００４】
ＣＤ１９はＢ細胞の表面にある９５ｋＤａの糖タンパク質であり、発達の初期から形質細胞に分化するまでＢ細胞に発現される。ＣＤ１９は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞表面シグナル伝達複合体の構成要素の一つとして、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達プロセスの調節に関与する。ＣＤ１９欠損のマウスモデルでは、末梢リンパ組織におけるＢ細胞の数が明らかに減少し、ワクチンおよびマイトジェンへの応答も低下し、それとともに血清Ｉｇレベルが低下する。通常、ＣＤ１９の発現は、多能性造血幹細胞の表面ではなく、Ｂ細胞系列（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ）のみに限定されると考えられている。ＣＤ１９は、さらに、ほとんどのＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＬＬｓ、ＣＬＬｓ、有毛細胞白血病および一部の急性骨髄性白血病細胞の表面にも発現される。したがって、白血病／リンパ腫の治療において、ＣＤ１９は非常に価値がある免疫治療の標的である。重要なことに、ＣＤ１９は、Ｂ細胞以外の、多能性造血幹細胞を含むほとんどの正常細胞の表面に発現されない。その特徴によって、ＣＤ１９は、安全な治療標的となり、患者の自己免疫疾患や骨髄の不可逆的な毒性損傷が発生するリスクを最小限に低減する。現在、抗ＣＤ１９抗体またはｓｃＦｖフラグメントは既に開発されており、かつそれらの応用の見通しが、マウスモデルおよびヒト／霊長類動物において証明された。
【０００５】
近年、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の分野での競争が激しく、一部の大手製薬会社は研究機関と協力関係を確立している。ＣＤ２８または４−１ＢＢを発現するＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた後、小児および成人の再発または難治性の急性Ｂ細胞リンパ腫の完全奏効率は約９０％である。最近、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または慢性リンパ腫における全奏効率は５０％〜１００％である。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、多発性骨髄腫患者の治療において臨床的な利点があり、これは、最終分化した形質細胞がＣＤ１９を発現せず、悪性Ｂ細胞前駆細胞が継続的に悪性形質細胞を産生するからである。
【０００６】
ＣＤ１９はＢ細胞のライフサイクルの大部分に発現するが、Ｂ細胞の最終段階、つまり形質細胞の表面での発現が少ないため、ＭＭ治療標的の最優先の選択ではない。ＣＤ２６９とも称するＢ細胞成熟抗原（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ，ＢＣＭＡ）は、１８４個のアミノ酸残基で構成され、その細胞内ドメインには８０個のアミノ酸残基が含まれ、細胞外ドメインは、配列が短く、Ｂ細胞表面分子として一つの炭水化物認識ドメインのみが含まれる。ＢＣＭＡは、シグナルペプチドを欠くＩ型膜貫通シグナルタンパク質に属し、腫瘍壊死因子受容体ファミリー（ＴＮＦＲ）のメンバーである。ＢＣＭＡは、それぞれ、リガンドとしての、Ｂ細胞活性化因子（Ｂ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｇａｎｄ，ＡＰＲＩＬ）両方に結合することができる。正常組織では、ＢＣＭＡが成熟Ｂ細胞及び形質細胞の表面に発現される。ＢＣＭＡ遺伝子ノックアウトマウスは、正常な免疫系機能、正常な脾臓構造、正常なＢリンパ球の発達を示すが、形質細胞の数が明らかに減少する。これは、ＢＣＭＡが形質細胞の生存を維持する点で重要な役割を果たすことを証明する。そのメカニズムには、主に、ＢＣＭＡがＢＡＦＦタンパク質に結合し、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１及びＢｃｌｗなどの抗アポトーシス遺伝子をアップレギュレートして細胞増殖を維持することが含まれる。同様に、当該メカニズムは、骨髄腫細胞にも機能し、骨髄腫細胞の悪性増殖を促進する点で重要な役割を果たす。研究によると、ＢＣＭＡは多発性骨髄腫細胞株に遍在的に発現され、多発性骨髄腫患者の検体からも一致する結果が得られる。Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒらは、既知の報告に基づいて、Ｑ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、および免疫組織化学方法を更に併用してＢＣＭＡの発現プロファイルを真剣に研究した。その結果として、ＢＣＭＡは成熟Ｂ細胞と形質細胞以外の正常なヒト組織における発現がなく、かつＣＤ３４＋造血細胞における発現もないことを確認した。また、ＢＣＭＡ欠損は、モデルマウスのＢ細胞数に影響を与えず、マウスの場合、致命的ではない。上記の理由を鑑みて、ＢＣＭＡは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的の一つとして多発性骨髄腫の細胞免疫療法に用いても良い。
【０００７】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲと抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを併用してＭＭを治療することは、昔から臨床診療に行われている。２０１７年１２月９〜１２日に開催された米国血液学会（ＡＳＨ）の年次総会で、蘇州大学第一付属病院血液学部のＦｕ  Ｃｈｅｎｇ  Ｃｈｅｎｇ教授は、研究チームによる「ｒ／ｒ  ＭＭを治療するためのＣＤ１９およびＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の併用注入の初期の安全性と有効性に関する報告」を発表した。抗ＣＤ１９および抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の併用注入を受けた１０人の患者の中で、客観的奏効率（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ，ＯＲＲ）は１００％であり、部分奏効率（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＰＲ）は９０％であり、ＶＧＰＲ以上の奏効率は３０％である。ＣＲＳは制御可能であり、８人の患者でグレード１〜２のＣＲＳが発生され、２人の患者でグレード３のＣＲＳが発生され、すべてのＣＲＳが１０日以内に制御され、再発することはない。期間中央値が２３週間（４〜３２週間）であるフォローアップ期間中、すべての患者が生存し、１人の患者は７か月間のより厳格な完全奏効（ｓＣＲ）状態であるが、ＰＦＳ期間の期間中央値に達していない。
【０００８】
臨床試験によると、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴで治療された多発性骨髄腫患者は実際にＣＤ１９発現が陽性であることが分かる。微量のＣＤ１９発現も患者の再発を引き起こす。抗ＢＣＭＡ−ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲＴ細胞は、患者のＣＤ１９残存による再発または難治性のＭＭを効果的に治療することができる。
【０００９】
本願発明は、ＣＤ１９及びＢＣＭＡを二重標的とするＣＡＲ成分を採用する。抗ＣＤ１９−ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的細胞に対して強力な殺傷効果を示し、臨床試験および臨床治療に堅実な基礎を築く。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第１の態様は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１１】
（１）抗ＢＣＭＡおよび抗ＣＤ１９一本鎖抗体をコードする配列、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域をコードする配列、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする配列、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインをコードする配列、ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする配列、及び、任意の、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメントをコードする配列を順番に連結したポリヌクレオチド配列、及び、
（２）（１）に記載のポリヌクレオチド配列の相補配列。
【００１２】
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体をコードする配列の前にある前記シグナルペプチドをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１〜６３に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の軽鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列６４〜３９６に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の重鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列４４２〜７９２に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列８５３〜１２１２に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１２６７〜１５８７に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域をコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１５８８〜１６２３に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１６２７〜１７０７に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記ヒト４１ＢＢの細胞内ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１７０８〜１８３３に示される。１つまたは複数の実施形態において、前記ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインをコードする配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列１８３４〜２１６９に示される。
【００１３】
本発明の第２の態様は、以下から選択される融合タンパク質を提供する。
【００１４】
（１）抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体および抗ＣＤ１９一本鎖抗体、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメイン、及びヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインを順番に連結した融合タンパク質、及び、
（２）（１）に限定されたアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または追加され、且つ活性化Ｔ細胞の活性を保持する、（１）に由来する融合タンパク質。
【００１５】
好ましくは、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体は、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３である。
【００１６】
好ましくは、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｃ１１Ｄ５．３である。
【００１７】
本発明の第３の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。
【００１８】
１つまたは複数の実施形態において、前記核酸構築物はベクターである。１つまたは複数の実施形態において、前記核酸構築物は、複製の開始点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、及び任意のマーカーを含むレトロウイルスベクターである。
【００１９】
本発明の第４の態様は、レトロウイルスを提供し、前記レトロウイルスは、本明細書に記載の核酸構築物を含有し、好ましくは、前記ベクターを含有し、より好ましくは、前記レトロウイルスベクターを含有する。
【００２０】
本発明の第５の態様は、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明の第６の態様は、活性化Ｔ細胞の調製における、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、融合タンパク質、核酸構築物、またはレトロウイルスの使用を提供する。
【００２２】
本発明の第７の態様は、ＢＣＭＡにより媒介される疾患を治療する医薬の調製における、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、融合タンパク質、核酸構築物、レトロウイルス、或いは、遺伝子改変Ｔ細胞又はその医薬組成物の使用を提供する。
【００２３】
１つまたは複数の実施形態において、ＢＣＭＡにより媒介される疾患は多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＲＶ−ＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚレトロウイルス発現ベクターの概略図である。
【図２】図２は、フローサイトメトリーで検出されたレトロウイルスに７２時間感染されたＴ細胞におけるＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚ  ＣＡＲＴの発現効率を示す。
【図３】図３は、フローサイトメトリーで検出された標的細胞ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９の表面でのＣＤ１９の発現を示す。
【図４】図４は、調製後５日目のＢＣＭＡ−ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞と各標的細胞と５時間共培養した後のＣＤ１０７ａの発現を示す。
【図５】図５は、調製後５日目のＢＣＭＡ−ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞と各標的細胞と５時間共培養した後のＩＮＦ−γの分泌を示す。
【図６】図６は、調製後５日目のＢＣＭＡ−ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞と各標的細胞と５時間共培養した後の腫瘍細胞に対する殺傷効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ＢＣＭＡ及びＣＤ１９を二重標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。当該ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体および抗ＣＤ１９一本鎖抗体、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメイン、ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメイン、及び、任意の、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメントを順番に連結した構成を含有する。
【００２６】
本発明に適用された抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体は、当該技術分野で周知の各種の抗ＢＣＭＡノクローナル抗体に由来するものであることができる。
【００２７】
本発明に適用された抗ＣＤ１９一本鎖抗体は、当該技術分野で周知の各種の抗ＣＤ１９ノクローナル抗体に由来するものであることができる。
【００２８】
任意的に、前記軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、リンカー配列によって連結され得る。ある実施形態において、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２２〜１３２に示される。他の実施形態において、前記抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基１４８〜２６４に示される。ある実施形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２８５〜４０４に示される。他の実施形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基４２３〜５２９に示される。
【００２９】
本発明に適用されたヒトＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸５３０〜５４１に示される。
【００３０】
本発明に適用されたヒトＣＤ２８膜貫通ドメインは、当該技術分野で通常にＣＡＲに使用される各種のヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン配列であり得る。ある実施形態において、前記ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸５３２〜５６９に示される。
【００３１】
本発明に適用される４１ＢＢは、当該技術分野で既知の、ＣＡＲに使用される各種の４１ＢＢであり得る。例示的な例として、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列５７０〜６１１に示される４１ＢＢを使用する。
【００３２】
本発明に適用されるヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインは、当該技術分野で通常にＣＡＲに使用される各種のヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインであり得る。ある実施形態において、前記ヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６１２〜７２３に示される。
【００３３】
抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４１ＢＢ及びヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインなどの、本発明の融合タンパク質を形成する上記の各部分は、互いに直接連結されてもよく、またはリンカー配列を介して連結されてもよい。リンカー配列は、当該技術分野で周知の、抗体に適用されるリンカー配列、例えば、Ｇ及びＳを含むリンカー配列であり得る。通常、リンカーは１つまたは複数の繰り返されるモチーフを含む。例えば、このモチーフは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＳＳＧ、ＧＳＧＳＡ及びＧＧＳＧＧであり得る。好ましくは、このモチーフは、リンカー配列において互いに隣接し、それらの繰り返される部分の間にアミノ酸残基が挿入されない。リンカー配列は、１、２、３、４、または５つの繰り返されるモチーフを含んでも良い。リンカーの長さは、３〜２５アミノ酸残基、例えば、３〜１５、５〜１５、１０〜２０アミノ酸残基であり得る。ある実施形態において、リンカー配列は、ポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列におけるグリシン残基の数は、特に限定されなく、通常２〜２０個、たとえば２〜１５、２〜１０、２〜８個である。リンカーは、グリシンとセリンに加えて、例えば、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）などの他の既知のアミノ酸残基を含有しても良い。ある実施形態において、本発明の抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間は、（ＧＧＧＧＳ）ｎによって連結されて、ここで、ｎは１〜５の整数である。
【００３４】
ある実施形態において、本発明のＣＡＲのアミノ酸配列には、後述のような、細胞外ドメインＩＩＩおよび細胞外ドメインＩＶを含むＥＧＦＲのフラグメント、そのシグナルペプチド及びリンカー配列を更に含む。
【００３５】
遺伝子のクローニング操作では、一般的に、適切な酵素切断部位を設計する必要があるので、発現されたアミノ酸配列の末端に１つまたは複数の無関係な残基を必然的に導入するが、それらの残基は目的配列の活性に影響を与えないことを理解すべきである。融合タンパク質を構築し、組換えタンパク質の発現を促進し、自発的に宿主細胞の外部へ分泌される組換えタンパク質を獲得し、または組換えタンパク質の精製を有利にするために、通常、組換えタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、或いはこのタンパク質内の他の適切な領域内には、いくつかのアミノ酸を添加する必要がある。上記のいくつかのアミノ酸は、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長ペプチドなどを含むが、これらに限定されない。したがって、本発明の融合タンパク質（即ち、ＣＡＲ）は、Ｎ末端またはＣ末端に、タンパク質タグとして１つまたは複数のポリペプチドフラグメントをさらに含有しても良い。本発明では、任意の適切なタグを使用しても良い。例えば、上記のタグはＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ−Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、Ｐｏｌｙ−Ａｒｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ及びＴｙ１であり得る。これらのタグは、タンパク質の精製に使用されても良い。
【００３６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列２２〜７２３に示されるＣＡＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列１〜７２３に示されるＣＡＲ又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるＣＡＲの変異体を更に含む。これらの変異体は、このＣＡＲと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、かつこのＣＡＲの生物学的活性（例えば、活性化Ｔ細胞）を保持するアミノ酸配列を含む。配列同一性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｐを使用して対比しようとする２つの配列の間の配列同一性を計算し得る。
【００３７】
変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２２〜７２３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の１〜７２３に示されるアミノ酸配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列において、１つまたは複数の突然変異（挿入、欠失または置換）を有し、同時にこのＣＡＲの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を更に含む。前記複数の突然変異は通常１〜１０個以内、例えば１〜８個、１〜５個または１〜３個を指す。置換は、好ましくは保守的な置換である。例えば、当該技術分野では、特性が近いまたは類似のアミノ酸で保守的な置換が行われる場合、タンパク質またはポリペプチドの機能を通常変化させない。「特性が近いまたは類似のアミノ酸」は、例えば、類似の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーを含む。これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明のポリペプチドにおいて、１つまたはいくつかのサイトを、同じ側鎖類における別のアミノ酸残基で置換することは、ポリペプチドの活性に実質的に影響を与えない。
【００３８】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡはコード鎖または非コード鎖であり得る。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の縮重変異体、すなわち、同じアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチド配列が異なるヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３９】
本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、通常、ＰＣＲ増幅法によって得られる。具体的には、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計し、且つ市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に知られている常法によって調製されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、増幅して、関連する配列が得られる。配列が長い場合、通常、２つ以上のＰＣＲ増幅を行う必要がある。その後、増幅された各フラグメントを正しい順序でアセンブルする。例えば、ある実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド６４〜２１６９に示され、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜２１６９に示される。
【００４０】
本発明は、更に、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、およびこれらの配列と操作的に連結された１つまたは複数の調節配列を含む核酸構築物に関する。本発明に記載のポリヌクレオチド配列は、上記の融合タンパク質（ＣＡＲ）の発現を保証するために様々な方式で操作されることができる。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの違いまたは要求に応じて核酸構築物を操作しうる。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチド配列を変更する技術は、当該技術分野で知られている。
【００４１】
調節配列は適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は通常、発現されるタンパク質をコードする配列に操作的に連結されている。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり得る。上記のプロモーターは、変異、短縮、またはハイブリッドプロモーターを含み、そして、その宿主細胞と同源または異源の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。調節配列はまた、適切な転写ターミネーター配列であってもよく、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である。ターミネーター配列は、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作的に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターは、本発明で使用することができる。調節配列も宿主細胞に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域を翻訳する、適切なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターは、本発明で使用することができる。
【００４２】
ある実施形態において、前記核酸構築物はベクターである。通常、本発明のポリヌクレオチド配列をプロモーターに操作可能に連結され、そして構築物を発現ベクターに組み込むことによって、本発明のポリヌクレオチド配列の発現が達成される。このベクターは、真核細胞の複製および組み込みに適したものである。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するために用いられる転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチド配列は、様々なタイプのベクター内にクローンされることができる。例えば、プラスミド、ファージ、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミド内にクローンされることができる。さらに、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして用いられるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
一般に、適切なベクターは、少なくとも１種類の生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、および１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ  ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）を含む。
【００４５】
例えば、ある実施形態において、本発明は、レトロウイルスベクターを使用する。このレトロウイルスベクターは、複製の開始点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、及び任意の選択可能なマーカーを含有する。
【００４６】
適切なプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターである。このプロモーター配列は、それに操作可能なに連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかし、他の構成的プロモーター配列を使用しても良い。上記他の構成的プロモーター配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルス前初期プロモーター、ルース肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。上記のヒト遺伝子プロモーターは、例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、誘導性プロモーターを使用しても良い。誘導性プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、望ましい発見をする時に誘導性プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、望ましくない発現をする時に発見をオフにすることができる。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入された発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか一方または両方を更に含むことにより、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染される細胞群において発現細胞を同定および選択することができる。一方、選択可能なマーカーは、単独のＤＮＡ配列上に運ばれてコトランスフェクションに用いられる。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方の隣接領域には、宿主細胞において発現されるように、適切な調節配列を有することができる。有用な選択可能なマーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【００４８】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞の同定に使用され、及び調節配列の機能の評価に使用される。ＤＮＡが受容細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現が適切な時期に測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含んでも良い。適切な発現システムは公知であり、かつ既存の技術を使用して調製し、または商業的に入手することができる。
【００４９】
遺伝子を細胞に導入する方法、及び遺伝子を細胞内で発現させる方法は、当該技術分野で周知のものである。ベクターは、当該技術分野での任意の方法によって、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞などの宿主細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段を使用して宿主細胞に移されることができる。
【００５０】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション法、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターを使用することを含む。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散システム、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質によるシステムを含む。
【００５１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを使用することを含み、これは、既に、ヒト細胞などの哺乳動物細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来するものであり得る。哺乳動物細胞へ遺伝子の導入に使用するために、多くの、ウイルスによるシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子伝達システムに用いられる便利なプラットフォームを提供する。当該技術分野で知られている技術を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入されて、レトロウイルス粒子にパッケージングされることができる。次に、この組換えウイルスは単離され、インビボ又はエクスビボの目的細胞に伝達されるができる。多くのレトロウイルスシステムは当該技術分野で知られているものである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多くのアデノウイルスベクターは、当該技術分野で知られているものである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
【００５２】
したがって、ある実施形態において、本発明は、活性化Ｔ細胞に使用されるレトロウイルスを更に提供し、当該ウイルスは、本明細書に記載のレトロウイルスベクターおよび対応するパッケージング遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｖｓｖｇを含む。
【００５３】
本発明に適用されるＴ細胞は、様々な供給源からの様々なタイプのＴ細胞であり得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の患者のＰＢＭＣに由来するものであり得る。
【００５４】
ある実施形態において、Ｔ細胞が得られた後、適量（例えば３０〜８０ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ｎｇ／ｍｌ）のＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激し活性化させ、次に適量（例えば３０〜８０ＩＵ／ｍｌ、例えば５０ＩＵ／ｍｌ）のＩＬ２を含む培地に培養される。
【００５５】
したがって、ある実施形態において、本発明は、遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。当該遺伝子改変Ｔ細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含有し、または本明細書に記載のレトロウイルスベクターを含有し、または本明細書に記載のレトロウイルスに感染され、または本明細書に記載の調製方法によって得られ、または本明細書に記載の融合タンパク質を安定して発現する。
【００５６】
本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞は、安定した生体内のＴ細胞増殖を経て、血液および骨髄中で高レベルで長期間持続し、そして特異的メモリーＴ細胞を形成し得る。具体的な理論に拘束されることなく、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原の代替物を発現する標的細胞に遭遇してから、それを排除した後、生体内でセントラルメモリー状態に分化することができる。
【００５７】
本発明は、細胞療法を更に含む。当該細胞療法は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するようにＴ細胞は遺伝子改変されること、及びＣＡＲ−Ｔ細胞を必要するレシピエントに対してＣＡＲ−Ｔ細胞を注入することを含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺すことができる。抗体療法とは違い、ＣＡＲ−Ｔ細胞は生体内で複製でき、腫瘍を持続的に制御し得る長期的な持続性が得られる。
【００５８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞による抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答または受動免疫応答であり得る。なお、ＣＡＲにより媒介される免疫応答は養子免疫療法のステップの一部であり、中で、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲにおける抗原結合部分に対する特異的免疫応答を誘導する。
【００５９】
したがって、本発明のＣＡＲ、それをコードする配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルスおよびＣＡＲ−Ｔ細胞を利用して治療できる疾患は、ＢＣＭＡにより媒介される疾患であることを好ましい。
【００６０】
本発明のＣＡＲ−修飾Ｔ細胞は、単独で、または医薬組成物の形態で希釈剤および／または関連するサイトカインまたは細胞群のような他の成分と組み合わせて使用することができる。簡単に言うと、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞と、１種または複種の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせを含んでも良い。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、硫酸塩緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含んでも良い。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適した方法で投与することができる。投与の量と頻度は、患者の病状、患者の疾患の種類と重症度などの要因によって決定される。
【００６２】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍−抑制有効量」または「治療的有効量」について、本明細書に記載の組成物を投与する正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および疾患の個人差を考慮して、医師によって決定され得る。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９個細胞／ｋｇ体重の投与量で、好ましくは１０５〜１０６個細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得る。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で知られている注入技術（例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇなど、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８参照）を使用することにより投与されることができる。特定の患者に対する最適な投与量と治療計画は、患者の疾患の兆候をモニターし、それに応じて治療を調整することにより、医療分野の当業者によって容易に決定することができる。
【００６３】
対象組成物の投与は、スプレー、注射、経口投与、点滴静脈内注射、植入、または移植を含む任意の便利な方法で行われる。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射または腹腔内注射によって患者に投与されることができる。１つの実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。他の実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接的に注入され得る。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞またはその組成物は、当該技術分野で知られている他の療法と組み合わせることができる。前記療法は、化学療法、放射線療法、および免疫抑制剤を含むが、これらに限定されなく、例えば、当該技術分野で知られているＢＣＭＡにより媒介される疾患を治療するための放射線療法または化学療法の製剤と組み合わせて行われることができる。
【００６５】
本明細書において、「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、期望される寿命の増加、またはがんに関連する各生理学的症状の改善で示す生物学的効果を指す。
【００６６】
「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書では交換して使用されることができ、免疫応答を誘導しうる例えば哺乳動物のような生物を指す。例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、および対応するトランスジェニック種が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の有益な効果は以下の通りである。本発明は、ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ＋ＣＤ１９ｓｃＦＶ遺伝子配列を採用し、また、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、ヒト４１ＢＢ細胞内ドメイン、およびヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインの遺伝子配列情報を検索して、キメラ抗原受容体ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ−ＣＤ１９ｓｃＦＶ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの遺伝子断片を全遺伝子合成により合成してから、レトロウイルスベクターＲＶに挿入される。それは、目的の核酸配列、つまりＣＡＲをコードする配列を組み換えて導入することに用いられることができる。組換えプラスミドは、２９３Ｔ細胞にウイルスをパッケージングし、Ｔ細胞に感染させて、Ｔ細胞にキメラ抗原受容体を発現させる。本発明の１つの実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子によって改変されたＴリンパ球の転換は、レトロウイルスベースの転換方法により達成される。この方法は、高い転換効率、外因性遺伝子の安定な発現、かつインビトロでＴリンパ球数を臨床レベルの量までに培養する時間の短縮などの利点がある。このトランスジェニックＴリンパ球の表面では、転換された核酸が転写と翻訳によって発現される。本発明で得られた、ＣＡＲを発現するレトロウイルスは、レトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）法に従って、ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製する。調製後３日のＣＡＲ−Ｔ細胞は、フローサイトメトリーで、ＣＡＲの感染効率を検出する。調製後５日のＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビトロで、ＣＤ１９陽性またはＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）と５時間共培養した後、ＣＤ１０７ａの発現とＩＦＮγの分泌を検出する。調製後５日のＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビトロで、ＣＤ１９またはＢＣＭＡまたは二重陽性腫瘍細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）と５時間共培養した後、腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的殺傷効果（細胞毒性）を検出する。したがって、本発明に記載のＣＤ１９−ＢＣＭＡ−ＢＢｚ  ＣＡＲＴは、多発性骨髄腫の治療に適用することができる。
【００６８】
以下の実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するのに用いられるだけで、別に断らない限り、限定されるものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、本明細書で提供される教示により明らかになるすべての変更を含むと解釈されるべきである。実施例で使用される方法および試薬は、別に断らない限り、当該技術分野における従来の方法および試薬である。
【００６９】
実施例１：ＢＣＭＡ  ｓｃＦＶ−ＣＤ１９ｓｃＦＶ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ遺伝子配列の決定
【００７０】
１．１  ＮＣＢＩのウェブサイトのデータベースにおいて、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒト４１ＢＢの細胞内ドメイン、およびヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインの遺伝子配列を検索する。抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体のクローン番号はＣ１１Ｄ５．３であり、抗ＣＤ１９一本鎖抗体のクローン番号はＦＭＣ６３である。これらの配列はｈｔｔｐ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅでコドン最適化され、コードされるアミノ酸配列が変更されない場合、ヒト細胞でのより良い発現を確保した。
【００７１】
各アミノ酸および遺伝子配列の情報は、ＳＥＱＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ（ＳＥＱＵＮＣＥ  ＩＤ  ＮＯ．１−２）を参照する。
【００７２】
上記の配列を順番に連結して、各配列の連結位置で異なる酵素切断部位を導入して、完全なＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚ遺伝子配列情報を形成する。
【００７３】
１．２  組換えプラスミドのシークエンシング
組換えプラスミドは、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社によりシークエンスされた。シークエンスされた結果と、合成しようとするＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚ配列とを比較することによって、配列が正確であるかどうかと確認する。シークエンシングのプライマーは以下の通りである。
フォワード：ＡＧＣＡＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴＣ（ＳＥＱＵＮＣＥ  ＩＤ  ＮＯ．３）
リバース：ＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＡＴＡＣＡＣ（ＳＥＱＵＮＣＥ  ＩＤ  ＮＯ．４）
【００７４】
本実施例で構築されたプラスミドプロファイルは、図１に示される。
【００７５】
実施例２：ＣＡＲ分子の核酸配列を含むウイルスベクターの構築
実施例１で調製したＣＡＲ分子のヌクレオチド配列を、ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）およびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で二重酵素切断し、次いで、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）によってレトロウイルスＲＶベクターのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩのサイトに挿入した。ベクターは、コンピテント状態のＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に転換され、シークエンシングを実施することにより、それは正確であることを確認した後、Ｑｉａｇｅｎ社のプラスミド精製キットを使用してプラスミドを抽出・精製した。精製されたプラスミドは、リン酸カルシウム法により２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされてから、レトロウイルスのパッケージング実験を行った。
【００７６】
実施例３：レトロウイルスのパッケージング
１．  １日目：２９３Ｔ細胞は、２０継代未満であり、コンフルエントになりすぎないようにするはずである。０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌでプレーティングし、１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を１０ｃｍの皿に加え、細胞を均一になるまでよく混合し、３７℃で一晩培養した。
【００７７】
２．  ２日目：２９３Ｔ細胞のコンフルエントは９０％程度に達した時点でトランスフェクションを実施した（通常、プレーティング後約１４〜１８ｈ）。プラスミド複合体を用意し、各プラスミドの量は以下の通りである。ＲＶ−ＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚは１２．５μｇであり、Ｇａｇ−ｐｏｌは１０μｇであり、ＶＳＶｇは６．２５μｇであり、ＣａＣｌ２は２５０μｌであり、Ｈ２Ｏは１ｍｌであり、総体積は１．２５ｍｌである。プラスミド複合体と同体積のＨＢＳを別のチューブに加え、プラスミド複合体を加えながら２０ｓボルテックスミックスした。混合物を容器の壁に沿って２９３Ｔの皿に穏やかに加え、３７℃で４ｈ培養し、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、予熱した新鮮な培地を改めて加えた。
【００７８】
３．  ４日目：４８時間トランスフェクションした後、上澄み液を収集し、０．４５ｕｍフィルターでろ過した後、分注して−８０℃で保存し、予熱した新鮮なＤＭＥＭ培地を加え続ける。
【００７９】
実施例４：ヒトＴ細胞のレトロウイルス感染
１．ＣＤ３＋Ｔ細胞をＦｉｃｃｏｌ分離溶液（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏｙａｎｇ社）により分離し、比較的に純粋なＣＤ３＋Ｔ細胞を獲得し、５％ＡＢ血清含有Ｘ−ＶＩＶＯ（ＬＯＮＺＡ）培地を用いて、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整した。５０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔ＆Ｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社）及び５０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔ＆Ｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社）で予処理したプレートにおいて、細胞を１ｍｌ／ウェルで接種し、次に１００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＳＬ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  社）を加えて、刺激下で４８時間培養した後、細胞をウイルスに感染させた。
【００８０】
２．Ｔ細胞の活性化と培養の翌日に、ＰＢＳで最終濃度１５μｇ／ｍｌに希釈したレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ）を、２５０μｌ／ウェルで、２４ウェルのｎｏｎ−ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒｅａｔｅｄ（ｃｏｒｎｉｎｇ）培養プレートにコーティングし、４℃で一晩暗所に置いた。
【００８１】
３．Ｔ細胞の活性化と培養の２日後、２枚のコーティングされた２４ウェルプレートを取り出し、コーティング溶液を吸引して廃棄し、２％ＢＳＡを含むＨＢＳＳを加えて室温で３０ｍｉｎブロックした。ブロッキング溶液の容積は５００μｌ／ウェルであり、ブロッキング溶液を吸引して廃棄し、プレートを２．５％ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで２回洗浄した。
【００８２】
４．ウイルス溶液はウェルに加えられ、各ウェルに２ｍｌのウイルス溶液を加え、３２℃、２０００ｇで、２ｈ遠心分離した。
【００８３】
５．上澄み液を廃棄し、１×１０６個の活性化されたＴ細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの容量で加えた。培地は２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２をＴ細胞培地に添加してなるものである。３０℃、１０００ｇで、１０ｍｉｎ遠心分離した。
【００８４】
６．遠心分離した後、培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００８５】
７．感染後２４ｈで、細胞懸濁液を吸引し、１２００ｒｐｍ、４℃で、７ｍｉｎ遠心分離した。
【００８６】
８．細胞が感染された後、毎日細胞の密度を観察し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含むＴ細胞培地を適時に補充して、Ｔ細胞の密度を５×１０５／ｍｌ程度に維持して細胞を増殖させた。
【００８７】
実施例５：フローサイトメトリーによる感染後のＴリンパ球の表面でのＣＡＲタンパク質の発現の検出
感染後７２時間のＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ＢＢｚ細胞をそれぞれ遠心分離で回収し、ＰＢＳで１回洗浄した後、上澄み液を廃棄して、対応する抗体を添加し、暗所で３０ｍｉｎ置いた後、ＰＢＳで洗浄して再懸濁し、そして、フローサイトメトリーで検出した。ＣＡＲ＋は、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）抗体を使用して検出された。
【００８８】
本実施例の結果を図２に示し、ＢＣＭＡ−ＣＤ１９−ｔＥＧＦＲ  ＣＡＲＴの陽性率は５０％以上である。
【００８９】
実施例６：標的細胞におけるＣＤ１９およびＢＣＭＡの発現の検出
標的細胞ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９はＣＤ１９とＢＣＭＡの両方を発現する細胞であり、本社が分子生物学の方法で構築されたものである。
【００９０】
本実施例の結果を図３に示し、ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９は９９．６％の効率でＣＤ１９を発現した。
【００９１】
実施例７：ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞との共培養によるＣＤ１０７ａの発現の検出
１．Ｖ底９６ウェルプレートを取り、各ウェルにＣＡＲＴ／ＮＴ細胞２×１０５個、及び標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）／対照細胞（Ｋ５６２）２×１０５個を添加した。ＩＬ−２を含有しないＸ−ＶＩＶＯ完全培地２００μｌに再懸濁し、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ｍｏｎｅｓｉｎを含み、培地１ｍｌあたりにＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ  １μｌを加える）を加え、各ウェルに、ＣＤ１０７ａ抗体（１：５０）２μｌを加え、３７℃で４時間インキュベートし、細胞を収集した。
【００９２】
２．サンプルを遠心分離して培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、各チューブに適切な量の特異的表面抗体ＣＡＲおよびＣＤ３を加え、体積１００μｌに再懸濁し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。
【００９３】
３．各チューブに３ｍＬのＰＢＳで細胞を１回洗浄し、４００ｇで、５分間遠心分離した。上澄み液を注意深く取り除いた。
【００９４】
適量のＰＢＳに再懸濁した後、ＣＡＲ、ＣＤ３、ＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーで検出した。
【００９５】
本実施例の結果を図４に示し、ＣＤ１９−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、単一標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ）と共培養すると、８０％程度のＣＤ１０７ａを発現し、二重標的細胞（ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）と共培養すると、８０％程度のＣＤ１０７ａを発現し、対照細胞（Ｋ５６２）と共培養すると、ＣＤ１０７ａの発現はほとんどない。単一標的細胞ＭＭ．１Ｓ及びＫ５６２−ＣＤ１９に対するＢＣＭＡ−ＣＤ１９二重標的ＣＡＲＴのインビトロ活性は、単一標的ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴまたはＣＤ１９ＣＡＲＴのＣＤ１０７ａの発現量に匹敵する。
【００９６】
実施例８：ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞を共培養した後のＩＦＮγの分泌の検出
１．調製したＣＡＲ−Ｔ細胞をＬｏｎｚａ培地に再懸濁し、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整した。
【００９７】
２．試験グループの各ウェルには、標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ、ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）又は陰性対照細胞（Ｋ５６２）２×１０５個、ＣＡＲ−Ｔ／ＮＴ細胞２×１０５個、ＩＬ−２を含有しないＬｏｎｚａ培地２００μｌを含む。均一になるまでによく混合してから、９６ウェルプレートに加える。ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ｍｏｎｅｓｉｎを含み、培地１ｍｌ当たりにＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ  １μｌを加える）を加え、均一になるまでによく混合してから、３７℃で５時間インキュベートした。細胞を収集して試験グループとする。
【００９８】
３．各チューブに１ｍＬのＰＢＳで細胞を１回洗浄し、３００ｇで、５分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、各チューブに適切な量の特異的表面抗体ＣＡＲ、ＣＤ３を加え、体積１００μｌに再懸濁し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。
【００９９】
４．細胞をＰＢＳで洗浄した後、２５０μｌ／ＥＰチューブのＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加入し、４℃で２０分間インキュベートして細胞を固定し、細胞膜を破壊した。細胞を１×ＢＤ  Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈＴＭｂｕｆｆｅｒで、１ｍＬ／回で２回洗浄した。
【０１００】
５．細胞を細胞内サイトカインで染色し、適量のＩＦＮ−γサイトカイン蛍光抗体または陰性対照を取り、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈＴＭｂｕｆｆｅｒで５０μｌに希釈した。この抗体希釈溶液で固定および膜破壊後の細胞をよく再懸濁し、４℃で暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、細胞を１×ＢＤ  Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈＴＭｂｕｆｆｅｒで、１ｍＬ／回で２回洗浄してから、ＰＢＳで再懸濁した。
【０１０１】
６．フローサイトメトリーによるＣＡＲ、ＣＤ３、ＩＦＮ−γの検出
【０１０２】
本実施例の結果を図５に示し、ＣＤ１９−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、単一標的細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９、ＭＭ．１Ｓ）と共培養すると、７０％程度のＩＦＮ−γを発現し、二重標的細胞（ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９）と共培養すると、７０％程度のＩＦＮ−γを発現し、対照細胞（Ｋ５６２）と共培養すると、ＩＦＮ−γの発現はほとんどない。単一標的細胞ＭＭ．１Ｓ及びＫ５６２−ＣＤ１９に対するＢＣＭＡ−ＣＤ１９二重標的ＣＡＲＴのインビトロ活性は、単一標的ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴまたはＣＤ１９ＣＡＲＴのＩＦＮ−γの発現量に匹敵する。
【０１０３】
実施例９：ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞を共培養した後の腫瘍特異的細胞の殺傷効果の検出
１．Ｋ５６２細胞（ＣＤ１９又はＢＣＭＡを含有しない陰性対照細胞）を無血清培地（１６４０）に再懸濁し、細胞濃度を１×１０６／ｍｌに調整し、最終濃度が５μＭになるように蛍光色素ＢＭＱＣ（２，３，６，７−テトラヒドロ−９−ブロモメチル−１Ｈ，５Ｈ−キノリジノ（９，１−ｇｈ）クマリン）を加えた。
【０１０４】
２．均一に混合し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
【０１０５】
３．室温、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を廃棄し、細胞を細胞毒性培地（フェノールレッドを含まず、１６４０＋５％ＡＢ血清）に再懸濁し、３７℃で６０ｍｉｎインキュベートした。
【０１０６】
４．細胞を新鮮な細胞毒性培地で２回洗浄し、新鮮な細胞毒性培地に再懸濁した。密度は１×１０６／ｍｌである。
【０１０７】
５．ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９細胞（ＣＤ１９及びＢＣＭＡを発現する標的細胞）を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁し、１×１０６／ｍｌの濃度に調整した。
【０１０８】
６．最終濃度が１μＭになるように蛍光色素ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を加えた。
【０１０９】
７．均一に混合し、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートした。
【０１１０】
８．インキュベーション終了後、細胞懸濁液の容積と同じ容積のＦＢＳを加え、室温で２分間インキュベートして標識反応を終了した。
【０１１１】
９．細胞を洗浄し、新鮮な細胞毒性培地に再懸濁した。密度は１×１０６／ｍｌである。
【０１１２】
１０．エフェクターＴ細胞を洗浄し、細胞毒性培地に懸濁して、濃度を５×１０６に調整した。
【０１１３】
１１．すべての実験において、ＣＤ１９−ＢＣＭＡ−ＢＢｚ  ＣＡＲに感染されたエフェクターＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の細胞毒性を、感染されていない陰性対照エフェクターＴ細胞（ＮＴ細胞）の細胞毒性と比較し、これらのエフェクターＴ細胞が同じ患者に由来するものである。
【０１１４】
１２．ＣＤ１９−ＢＣＭＡ−ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔおよび陰性対照エフェクターＴ細胞は、Ｔ細胞：標的細胞＝５：１、１：１の比率で、５ｍｌの滅菌試験管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において培養した。各共培養グループに、標的細胞は１００，０００個（５０μｌ）であり、陰性対照細胞は１００，０００個のＫ５６２細胞（５０μｌ）である。それとともに、標的細胞とＫ５６２陰性対照細胞のみを含むグループを設定した。
【０１１５】
１３．共培養した細胞を３７℃で５ｈインキュベートした。
【０１１６】
１４．インキュベーション終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、すぐに説明書に薦められた濃度で７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ、７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）を速やかに加え、氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。
【０１１７】
１５．細胞を洗浄せずにフローサイトメーターに直接ロードし、Ｆｌｏｗ  Ｊｏを使用してデータを分析した。
【０１１８】
１６．分析は、７ＡＡＤ陰性生細胞でゲーティングされ、Ｔ細胞と標的細胞との共培養後の生標的細胞と生陰性対照細胞の比率を測定した。
【０１１９】
細胞毒性殺傷細胞％＝（１−（エフェクター細胞の存在下での生標的細胞の数／エフェクター細胞の存在下での生Ｋ５６２細胞の数）／（エフェクター細胞の非存在下での生標的細胞の数／エフェクター細胞の非存在下での生Ｋ５６２細胞の数））×１００％
本実施例の結果を図６に示し、エフェクター／ターゲット比Ｅ：Ｔが５：１の場合、標的細胞ＭＭ．１Ｓ−ＣＤ１９に対するＣＤ１９−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴの殺傷率は全て８０％超である。
【図１】
2022501067.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2022501067000001.app
【国際調査報告】
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2022501067.tif 000009
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