(57)【要約】本発明は、ペプチドのＣ-末端に位置する第１の疎水性ドメイン及びペプチドのＮ-末端に位置する第２の疎水性ドメインを有するペプチド、特に、細胞透過性ペプチド、及びこのような細胞透過性ペプチドの治療用分子との複合体に係る。本発明は、さらに、治療法における又は薬物としての、特に、遺伝性疾患、とりわけ、筋疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における当該ペプチド又は複合体の使用に係る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基４０個以下の全長を有するペプチドであって、１個以上のカチオン性ドメイン；及び各々、アミノ酸残基少なくとも３個を含んでなる２個以上の疎水性ドメインを含んでなり、疎水性ドメインの１個は、ペプチドのＣ-末端に位置し、疎水性ドメインの１個は、ペプチドのＮ-末端に位置することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
疎水性ドメインの１個は、ペプチドのＣ-末端を形成し、疎水性ドメインの１個は、ペプチドのＮ-末端を形成する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
各疎水性ドメインは、アミノ酸３〜６個の長さを有し、好ましくは、各疎水性ドメインは、アミノ酸５個の長さを有する請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
各疎水性ドメインは、多数の疎水性のアミノ酸残基を含んでなり、好ましくは、各疎水性ドメインは、疎水性のアミノ酸少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、100％を含んでなる請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、及びグルタミンの残基を含んでなり、好ましくは、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、及び／又はグルタミンの残基からなる請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
疎水性ドメイン２個を含んでなる請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
疎水性ドメインは、次の配列：YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）又はその各種の組み合わせの１つを含んでなり、好ましくは、疎水性ドメインは、次の配列：YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）又はその各種の組み合わせの１つからなる請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、アミノ酸残基５〜２０個の長さ、好ましくは、アミノ酸残基９〜１４個の長さを有する請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％を含んでなる請求項１〜８のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１０】
カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、多数のカチオン性のアミノ酸を含んでなり、好ましくは、カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、カチオン性のアミノ酸少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を含んでなる請求項１〜９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、アルギニン、β-アラニン、及び／又はアミノヘキサン酸の残基を含んでなり、好ましくは、カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、アルギニン、β-アラニン、及び／又はアミノヘキサン酸の残基からなる請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１２】
カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、アルギニンリッチであり、好ましくは、カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、アルギニン残基少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％を含んでなる請求項１〜１１のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１３】
カチオン性ドメイン１個を含んでなる請求項１〜１２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】
カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、次の配列RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB（配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）、又はその各種の組み合わせの１つを含んでなり、好ましくは、カチオン性ドメイン又は各カチオン性ドメインは、次の配列：RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB（配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）、又はその各種の組み合わせの１つからなる請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１５】
コアドメインに隣接する疎水性のアームドメインを含んでなり、好ましくは、カチオン性ドメイン１個を含んでなる請求項１〜１４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１６】
カチオン性ドメイン１個及び疎水性ドメイン２個からなり、好ましくは、疎水性のアームドメイン２個が隣接するカチオン性のコアドメイン１個からなる請求項１〜１５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１７】
各々が、YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）から選ばれる配列を含んでなる疎水性のアームドメイン２個に隣接する、RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB（配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）から選ばれる配列を含んでなるカチオン性のコアドメイン１個からなる請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１８】
次の配列：YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI（配列番号１９）、YQFLIRBRRBRBRBRRBYQFLI（配列番号２４）及びYQFLIRBRRBRBRBBRXRBYQFLI（配列番号２６）の１つからなる請求項１〜１７のいずれに記載のペプチド。
【請求項１９】
治療用分子に共有結合した請求項１〜１８のいずれかに記載のペプチドを含んでなる複合体。
【請求項２０】
さらに、リンカーを含んでなり、好ましくは、リンカーは、複合体を治療用分子に結合させる請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
リンカーが、G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BX、及びXBから選ばれるものである請求項１９又は２０に記載の複合体。
【請求項２２】
治療用分子は、核酸、ペプチド核酸、アンチセンスオリゴヌクレトチド（例えば、PNA、PMO）、短い干渉RNA、マイクロRNA、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、薬剤、薬物から選ばれるものであり、好ましくは、治療用分子はアンチセンスオリゴヌクレトチドである請求項１９〜２１のいずれかに記載の複合体。
【請求項２３】
薬剤としての使用のための請求項１９〜２２のいずれかに記載の複合体。
【請求項２４】
神経筋系又は筋骨格系の疾患、好ましくは、神経筋系又は筋骨格系の遺伝子性疾患、好ましくは、神経筋系又は筋骨格系の遺伝性の遺伝子性疾患、好ましくは、神経筋系又は筋骨格系の遺伝性のＸ連鎖遺伝子病の治療における請求項２３による使用のための複合体。
【請求項２５】
DMDの治療における請求項２３又は２４による使用のための複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、特に、細胞透過性ペプチド、及びこのような細胞透過性ペプチドの治療用分子との複合体に係る。本発明は、さらに、治療法における又は薬物としての、特に、遺伝性疾患、とりわけ、筋疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療における当該ペプチド又は複合体の使用に係る。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬は、ヒトのヘルスケアを変化させる可能性を有するゲノム医薬品である。学術調査は、このような治療法は、神経筋系疾患を含む広範囲の疾患領域にわたる適用を有することを示している。神経筋系疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）におけるプレ-mRNAスプライシングを調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド法の適用は、この単一遺伝子障害を、プレシジョン・メディシンにおける進歩の最先端に置いている。
【０００３】
しかし、これらの将来有望なアンチセンス医薬の治療的発展は、不十分な細胞透過性及び乏しい分布特性によって妨げられており、チャレンジは、さらに、DMDにおける筋組織基材の多容積及び分散された性質によって強調される。
【０００４】
DMDは、新生男児3500人に１人の割合で発症する。この過酷なＸ連鎖劣性疾患は、ジストロフィン・タンパク質をコードするDMD遺伝子における変異に起因する。疾患は、呼吸器不全及び心臓合併症の発生とともに、進行性の筋肉変性によって特徴付けられ、究極的に早死につながる。DMDを強調する変異の多くは、ジストロフィン・タンパク質の不在との結果をもたらす、オープンリーディングフレームにおける早期のトランケーションを含むゲノムのカットオブフレーム欠失である。
【０００５】
エクソンスキッピング療法は、DMD複写物の特異的な領域を標的とするために、スプライス・スイッチング・アンチセンス・オリゴヌクレオチド（SSOs）を利用して、個々のエクソンの排除を惹起し、異常なリーディングフレームの修復を導き、及び内部欠損しているが、なお部分的に機能性のジストロフィン・タンパク質の生産を結果として生ずる。DMDに関するアンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピング療法の疑う余地のない可能性にもかかわらず、このアプローチの良好な適用は、現在、他の罹患した組織、例えば、心臓に対する一本鎖オリゴヌクレオチドの不適切な標的化とともに、骨格筋の比較的不十分な標的化によって制限されている。
【０００６】
2016年９月に、食品医薬品局（FAD）は、「エテプリルセン」（エクソン51のスプライシングを調節するための一本鎖オリゴヌクレオチド）に関する迅速承認を許諾した。これは、米国において、初めて許可されたスプライシングを調節するオリゴヌクレオチドを告知するものであるが、ジストロフィンの修復のレベルは、正常なジストロフィンレベル約１％と失望させるものであった。対立遺伝子障害ベッカー型筋ジストロフィーとの比較及びmdxマウスにおける実験は、運動誘発損傷に対して筋肉を保護するためには、野生型の少なくとも〜１５％の同種筋細胞膜ジストロフィン発現が要求されることを表している。
【０００７】
それ故、破壊的な遺伝性疾患、例えば、DMDのための、より効果的な治療法を提供するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を改善することについて、強力且つ緊急の要求がある。
【０００８】
送達ビヒクルとしてのウイルスの使用が提案されたが、しかし、これは、ウイルスコートタンパク質の免疫毒性のため、使用が制限される。代わりに、広範な非ウイルス性送達ベクターが開発されており、その中でも。ペプチドは、小さいサイズ、標的化特異性、及び大型バイオカーゴの経毛細管性送達の能力のため、最良の有望性を示している。単独で又はバイオカーゴを保有して、細胞を透過する能力について、いくつかのペプチドが報告されている。
【０００９】
数年間、細胞透過性ペプチド（CPPs）は、SSOs（特に、電荷的中性のホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMO）及びペプチド核酸（PNA））と複合化されており、細胞膜を通って、SSOsを効果的に運搬し、細胞核におけるそれらのプレ-mRNA標的サイトに到達するようにことによって、細胞送達を増大させている。特定のアルギニンリッチCPPs（ペプチド-PMOs又はP-PMOsとして知られている）と複合化されたPMO治療薬は、DMDのmdxマウスモデルにおいて、骨格筋におけるジストロフィンの生産を富化し、続いて、全身投与を可能にすることが示された。
【００１０】
特に、PNA/PMO内部移行ペプチド（Pips）が開発されており、これは、中央の短い疎水性配列によって分離された２つのアルギニンリッチ配列からなるアルギニンリッチCPPsである。これらの「Pip」ペプチドは、血漿安定性を改善するとともに、一方では、初めはPNAへの到着によって、エクソンスキッピングの高レベルを維持するようにデザインされている。さらに、これらのペプチドの更なる誘導体が、PMOsの複合体としてデザインされ、これらは、マウスにおいて、重要なことには、心臓を含む全身性の骨格筋ジストロフィン生産、続く全身投与につながることを示した。これらのペプチドは有効であるにもかかわらず、その治療的適用は、高用量及び従って、それに伴う毒性についての要求によって妨げられていた。
【００１１】
単一アルギニンリッチドメイン、例えば、R6Glyを有する他の細胞透過性ペプチドも製造されている。これらのCPPsは、毒性が低減されたペプチド複合体を生成するために使用されているが、このケースでは、複合体は、Pipペプチドと比べて低い効力を示した。
【００１２】
従って、現在利用可能なCPPsが、DMDのような疾患についてのヒト治療に適することは、未だ証明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
細胞透過性ペプチド技術の分野では、毒性を増大させることなく、効力を改善するチャレンジがなされている。発明者らは、少なくともこの課題に対処する本発明による特殊な構造を有する多数の改良されたCPPsを同定し、合成し、テストしてきた。
【００１４】
これらのペプチドは、インビトロ及びインビボで、カーゴ治療用分子とともにテストする際、骨格筋において良好な効力レベルを維持する。さらに、本発明のペプチドは、インビトロ及びインビボで、カーゴ治療用分子とともにテストする際、骨格筋において改善された効力レベルを有する。同時に、これらのペプチドは、複合体の形で使用される際、治療用カーゴ分子が細胞を透過することを可能にし、従来利用可能な細胞透過性ペプチドとの複合体よりも驚くほど少ない用量で効果的に作用する。低用量での改善された効力は、本発明のペプチドが、毒性の原因となる高レベルで投与される必要がないことを意味する。従って、本発明のペプチドは、従来利用可能なペプチドよりも、ヒトの治療のための治療用複合体における使用について、改善された適合性を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、アミノ酸残基４０個以下の全長を有するペプチドであって、１個以上のカチオン性ドメイン及び２個以上の疎水性ドメイン（各々、少なくとも３個のアミノ酸残基を含んでなる）を含んでなり、疎水性ドメインの１つは、ペプチドのＣ−末端に位置し、疎水性ドメインの１つは、ペプチドのＮ−末端に位置することを特徴とするペプチドが提供される。
【００１６】
本発明の第２の態様によれば、治療用分子に共有結合した、第１の態様のペプチドを含んでなる複合体が提供される。
【００１７】
本発明の第３の態様によれば、イメージング分子に共有結合した第１の態様のペプチドを含んでなる複合体が提供される。
【００１８】
本発明の第４の態様によれば、第２の態様の複合体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明の第５の態様によれば、薬剤としての使用のための第２の態様による複合体が提供される。
【００２０】
第５の態様の１具体例では、薬剤としての使用のための第４の態様による医薬組成物が提供される。
【００２１】
本発明の第６の態様によれば、患者における疾患を治療する方法であって、患者に、第２の態様の複合体を、治療上有効な量で投与することを含んでなる治療法が提供される。
【００２２】
第６の態様の１具体例では、患者における疾患を治療する方法であって、患者に、第４の態様の医薬組成物を、治療上有効な量で投与することを含んでなる治療法が提供される。
【００２３】
本発明の第７の態様によれば、第１の態様のペプチド又は第２の態様の複合体又は第３の態様の複合体をコードする単離核酸が提供される。
【００２４】
本発明の第８の態様によれば、第７の態様の核酸配列を含んでなる発現ベクターが提供される。
【００２５】
本発明の第９の態様によれば、第８の態様の発現ベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ネステッドRT-PCR（エラーバー：標準偏差ｎ≧３）のデンシトメトリー分析によって測定して、H2K-mdx細胞において、0.25μM、０.５μM及び１μMで、アンチセンス治療用分子に結合されたDPEP2シリーズのペプチドのいくつかのインビトロエクソン23スキッピング効率を示すグラフである。
【図２】（Ａ）前脛骨筋、（Ｂ）横隔膜、及び（Ｃ）心筋におけるアンチセンス治療用分子に結合されたDPEP2シリーズのペプチドのいくつかのインビボ効率を、同じ治療用分子に結合された現在利用可能なペプチドと比較して示すグラフである。mdxマウスに１０mg/kgシングル静脈内投与し、ジストロフィン・タンパク質の修復を、ウエスタンブロットによって評価し、エクソンスキッピングをqRTPCR（エラーバー：標準偏差ｎ＝３）によって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明者らは、治療用分子を細胞に送達するために、細胞透過性ペプチドとしての使用に適する一連のペプチドを生成した。
【００２８】
驚くべきことには、発明者らは、ペプチドのＮ及びＣ末端に位置する限定された長さの少なくとも１のカチオン性ドメイン及び少なくとも２の疎水性ドメインを有する１群のペプチドであって、現在利用可能な細胞透過性ペプチドと比べて、増大された分子への細胞透過性を提供するペプチドを見出し、本発明に至った。この効果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬との複合体として細胞に送達される際、又はインビボで投与される際に観察される。
【００２９】
疾患DMDという観点から、好適な治療用分子と結合した本発明のペプチドによる増大された細胞透過は、複写物内における特殊なエクソン排除によって示される。好適な配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの方向付けは、結果として、エクソンの強制的なスキッピング、オープンリーディングフレームの修正、及び内部欠損したが、なお部分的に機能性のジストロフィンのアイソフォームの修復を生ずる。
【００３０】
ジストロフィン遺伝子を標的とするようにデザインされたアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬との複合体として使用される際には、本発明のペプチドが、高レベルのエクソン排除及びジストロフィン・タンパク質の修復を有することが、ここに示された。
【００３１】
インビボでは、ここに記載する結果は、現在利用可能な細胞透過性ペプチドと複合化された同一のアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬のエクソンスキッピングの結果と比べて、本発明のペプチド複合体を使用する際には、エクソンスキッピング及び機能性ジストロフィンの発現における増大を示す。これは、このようなペプチドキャリヤーの、神経筋系疾患が効力を及ぼす筋肉細胞を透過する効力における顕著な改善である。
【００３２】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、発明者らは、末端疎水性ドメインの存在が、治療用カーゴを細胞に送達するために、ペプチドの送達特性をブーストする効果を有すると考えている。これは、増大された細胞透過性は、治療用分子の送達を増大させること及び増大された治療効果を意味するため、有利である。さらに、これらの利点は、より低い用量で提供され、これにより、細胞透過性ペプチドの毒作用の可能性を低減させる
【００３３】
このようなペプチドの構造が、治療用分子カーゴ、例えば、オリゴヌクレオチドを筋肉に輸送するとのアルギニンリッチ細胞透過性ペプチドの能力を増大させることは、全く予期せぬことであった。
【００３４】
このような輸送が増大されることによって、ここで証明されるように、各種の異なる筋肉において、治療用分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、エクソンスキッピング及び機能性ジストロフィン・タンパク質の生産をうまく増大させることは予想外のことであった。
【００３５】
疑義を回避するため、及び本明細書の解釈の仕方を明確にするために、次に、本発明に従って使用される用語を、さらに定義する。
【００３６】
本発明は、記載する態様及び特徴の各種の組み合わせを包含するが、ただし、このようなく組み合わせが、明らかに、容認できない又は明らかに回避される場合を除く。
【００３７】
ここで使用する節の見出しは、組織的な目的のためのみのものであり、記載の主題を制限するものとして解釈されてはならない。
【００３８】
あらゆる場所における「X」は、各種の形の非天然アミノ酸及びアミノヘキサン酸を表す。
【００３９】
あらゆる場所における「B」は、天然ではあるが、非遺伝子的にコード化されたアミノ酸残基β−アラニンを表す。
【００４０】
あらゆる場所における「Ac」は、関連あるペプチドのアセチル化を表す。
【００４１】
あらゆる場所における「Hyp」は、関連ある遺伝子的にコード化されたアミノ酸ヒドロキシプロリンを表す。
【００４２】
あらゆる場所における他の大文字は、承諾されたアミノ酸コードによる関連ある遺伝子的にコード化されたアミノ酸残基を表す。
【００４３】
カチオン性ドメイン
本発明は、カチオン性ドメイン少なくとも１個が存在する特殊な構造を有する短い細胞透過性ペプチドに係る。
【００４４】
ここにおける「カチオン性」は、生理的pHにおいて、総体的に正の電荷を有するアミノ酸及びアミノ酸のドメインを表す。
【００４５】
好適には、ペプチドは、４個以下のカチオン性ドメイン、３個以下のカチオン性ドメイン、２個以下のカチオン性ドメインを含んでなる。
【００４６】
好適には、ペプチドにおける各カチオン性ドメインは、同一又は相違するものである。好適には、ペプチドにおける各カチオン性ドメインは相違する。
【００４７】
好適には、ペプチドはカチオン性ドメイン１個を含んでなる。
【００４８】
好適には、各カチオン性ドメインは、アミノ酸残基５〜２０個の長さ、好適には、アミノ酸残基９〜１４個の長さを有する。
【００４９】
好適には、各カチオン性ドメインは、アミノ酸残基９、１０、１１、１２、１３、又は１４個の長さを有する。
【００５０】
好適には、各カチオン性ドメインは同様の長さであり、好適には、各カチオン性ドメインは同じ長さである。
【００５１】
好適には、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸を含んでなり、また、極性及び／又は非極性のアミノ酸を含有できる。
【００５２】
非極性のアミノ酸は、アラニン、β-アラニン、プロリン、グリシン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンから選ばれる。好適には、非極性のアミノ酸は、負の電荷を持たない。
【００５３】
極性のアミノ酸は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選ばれる。好適には、選ばれる極性のアミノ酸は、負の電荷を持たない。
【００５４】
カチオン性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンから選ばれる。好適には、カチオン性アミノ酸は、生理的pHにおいて正の電荷を有する。
【００５５】
好適には、各カチオン性ドメインは、アニオン性又は負電荷をもつアミノ酸残基を含まない。
【００５６】
好適には、各カチオン性ドメインは、アルギニン、アミノヘキサン酸、ヒスチジン、β-アラニン、ヒドロキシプロリン及び／又はセリン残基を含んでなる。
【００５７】
好適には、各カチオン性ドメインは、アルギニン、アミノヘキサン酸、及び／又はβ-アラニン残基を含んでなる。
【００５８】
好適には、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％を含んでなる。
【００５９】
好適には、各カチオン性ドメインは、大多数のカチオン性アミノ酸からなる。好適には、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を含んでなる。
【００６０】
好適には、各カチオン性ドメインは、少なくとも７.５、少なくとも８.０、少なくとも８.５、少なくとも９.０、少なくとも９.５、少なくとも10.0、少なくとも10.5、少なくとも11.0、少なくとも11.5、少なくとも12.0の等電点（Ip）を有する。
【００６１】
好適には、各カチオン性ドメインは、少なくとも10.0の等電点（Ip）を有する。
【００６２】
好適には、各カチオン性ドメインは、11.0〜13.0の等電点（Ip）を有する。
【００６３】
１具体例では、各カチオン性ドメインは、12.3〜12.7の等電点（Ip）を有する。
【００６４】
好適には、カチオン性ドメインの等電点は、生理的pHにおいて、当技術分野において利用可能な各種の好適な手段、好適には、IPC（www.isoelectric.org）（Lukasz Kozlowskiによって開発されたウエブ系アルゴリズム；Biol Direct. 2016; 11: 55. DOI: 10.1186/s13062-016-0159-9）を使用することによって算定される。
【００６５】
好適には、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸少なくとも４個、好適には、カチオン性アミノ酸４〜８個を含んでなる。
【００６６】
好適には、各カチオン性ドメインはアルギニンリッチである。
【００６７】
「アルギニンリッチ」は、カチオン性ドメインの少なくとも４０％が前記残基で形成されていることを意味する。
【００６８】
好適には、各カチオン性ドメインは、大多数がアルギニン残基からなる。
【００６９】
好適には、カチオン性ドメインは、アルギニン残基少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％を含んでもよい。
【００７０】
好適には、カチオン性ドメインは、アルギニン残基計４〜８個を含んでなる。
【００７１】
好適には、所定のカチオン性ドメインにおけるカチオン性アミノ酸の全てがアルギニンであってもよい。
【００７２】
好適には、各カチオン性ドメインは、β-アラニン残基１個以上を含んでなる。好適には、各カチオン性ドメインは、β-アラニン残基計３〜７個、好適には、β-アラニン残基計４〜６個を含んでいてもよい。
【００７３】
好適には、各カチオン性ドメインは、アミノヘキサン酸残基１個以上を含んでなる。
【００７４】
好適には、各カチオン性ドメインは、β-アミノヘキサン酸残基計１〜４個、好適には、アミノヘキサン酸残基計１〜３個を含んでいてもよい。
【００７５】
好適には、各種のアミノ酸残基、例えば、4-アミノヘキサン酸、5-アミノヘキサン酸、又は6-アミノヘキサン酸の残基が使用される。好適には、6-アミノヘキサン酸が使用される。
【００７６】
好適には、カチオン性ドメインは、１個以上のヒスチジン、ヒドロキシプロリン残基又はセリン残基を含んでなることができる。
【００７７】
１具体例では、ペプチドは、アルギニンリッチカチオン性ドメイン１個を含んでなる。
【００７８】
好適には、各カチオン性ドメインは、３個以下の近接するアルギニン残基、２個以下の近接するアルギニン残基を含んでなる。
【００７９】
好適には、各カチオン性ドメインは、アルギニン、アミノヘキサン酸、及び／又はβ-アラニンの残基を含んでなることができる。好適には、各カチオン性ドメインは、大部分が、アルギニン、アミノヘキサン酸、及び／又はβ-アラニンの残基を含んでなる。好適には、各カチオン性ドメインにおけるアミノ酸残基の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％が、アルギニン、アミノヘキサン酸、及び／又はβ-アラニンの残基である。好適には、各カチオン性ドメインは、アルギニン、アミノヘキサン酸、及び／又はβ-アラニンの残基からなる。
【００８０】
好適には、ペプチドは、カチオン性ドメイン１個を含んでなり、このカチオン性ドメインは、ペプチドのコアを形成する。好適には、カチオン性ドメインは、ペプチドの中央に位置する。従って、好適には、カチオン性ドメインは、カチオン性コアドメインとして知られる。
【００８１】
１具体例では、ペプチドは、アルギニンリッチのカチオン性ドメイン１個を含んでなる。
【００８２】
好適には、各カチオン性ドメインは、下記の中から選ばれるアミノ酸残基を含んでなる：
R、X、B、RR、BB、XX、RX、XR、RB、BR、BX、XB、RBR、RBB、BBR、BRR、BRB、RBX、RXB、RBX、XRB、XRR、RRX、RXR、BXB、XBX、又はその各種の組み合わせ。
【００８３】
好適には、各カチオン性ドメインは、下記の配列のいずれかを含んでなる：
RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB（配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）、又はその各種の組み合わせ。
【００８４】
好適には、各カチオン性ドメインは、下記の配列のいずれかからなる：
RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB（配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）、又はその各種の組み合わせ。
【００８５】
好適には、各カチオン性ドメインは、下記の配列の１からなる：
RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号１１）。
【００８６】
好適には、ペプチダーゼにおける各カチオン性ドメインは、同一又は異なるものである。好適には、ペプチドにおける各カチオン性ドメインは、異なるものである。
【００８７】
疎水性ドメイン
本発明は、特定の長さを有する疎水性ドメイン少なくとも２個が存在する特殊な構造を有する短い細胞透過性ペプチドに係り、疎水性ドメインは、ペプチドの各末端に位置する。
【００８８】
ここで、「疎水性」は、水をはじく能力を有する及び／又は水と混合しないアミノ酸又はアミノ酸のドメインを表す。
【００８９】
好適には、ペプチドは、疎水性ドメイン４個以下、疎水性ドメイン３個以下を含んでなる.
【００９０】
好適には、ペプチドは、疎水性ドメイン２個を含んでなる。
【００９１】
上記で定義したように、ペプチドは、それぞれが、アミノ酸残基少なくとも３個の長さを有する疎水性ドメイン２個以上を含んでなる。
【００９２】
好適には、各カチオン性ドメインは、アミノ酸３〜６個の長さを有する。好適には、各疎水性ドメインは、アミノ酸５個の長さを有する。
【００９３】
好適には、各疎水性ドメインは、非極性、極性、及び疎水性のアミノ酸残基を含んでなることができる。
【００９４】
疎水性のアミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、及びトリプトファンから選ばれる。
【００９５】
非極性のアミノ酸残基は、アラニン、β-アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、グリシン、システインから選ばれる。
【００９６】
極性のアミノ酸残基は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選ばれる。
【００９７】
好適には、疎水性ドメインは、親水性のアミノ酸残基を含んでなることはない。
【００９８】
好適には、各疎水性ドメインは、大部分は、疎水性のアミノ酸残基からなる。好適には、各疎水性ドメインは、疎水性のアミノ酸残基少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、100％を含んでなる。
【００９９】
好適には、各疎水性ドメインは、すくなくとも０.３、すくなくとも0.35、すくなくとも０.４、すくなくとも0.45の疎水度を有する。
【０１００】
好適には、各疎水性ドメインは、０.４〜１.４の疎水度を有する。
【０１０１】
１具体例では、各疎水性ドメインは、0.45〜0.48の疎水度を有する。
【０１０２】
好適には、疎水度は、White and Wimley: W.C. Wimley and S.H. White, 「膜境界のタンパク質について実験的に測定された疎水度スケール」, Nature Struct Biol, 3:842 (1996)によって測定される。
【０１０３】
好適には、各疎水性ドメインは、疎水性のアミノ酸残基少なくとも３個、すくなくとも４個を含んでなる。
【０１０４】
好適には、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、及びグルタミンの残基を含んでなる。好適には、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、及びグルタミンの残基からなる。
【０１０５】
好適には、ペプチドは、疎水性ドメイン２個を含んでなる。好適には、疎水性ドメインは、ペプチドのＮ-末端及びＣ-末端、好適には、ペプチドのいずれかの末端に位置する。好適には、ペプチドのＮ-末端及びＣ-末端には、他の基、例えば、末端修飾、リンカー及び／又は治療用分子を除き、更なるアミノ酸又はドメインは存在しない。疑義を回避するため、ここに記載し及び特許請求する「ペプチド」に加えて、このような他の基は存在してもよい。従って、好適には、各疎水性ドメインは、ペプチドの末端を形成する。好適には、これは、ここに記載するように、更なるリンカー基の存在を排除しない。
【０１０６】
好適には、疎水性ドメインは、コアドメインに隣接する。好適には、疎水性ドメインは、アームドメインと考えられる。好適には、コアドメインは、１個以上のカチオン性ドメイン及び１個以上の更なる疎水性ドメインを含んでなることができる。好適には、コアドメインは、１個のカチオン性ドメインを含んでなる。
【０１０７】
１具体例では、ペプチドは、コアドメインに隣接する２個の疎水性アームドメインを含んでなり、コアドメインは、１個のカチオン性ドメインを含んでなる。
【０１０８】
１具体例では、ペプチドは、コアドメインに隣接する２個の疎水性アームドメインからなり、コアドメインは、１個のカチオン性ドメインを含んでなる。
【０１０９】
好適には、疎水性ドメイン又は各疎水性ドメインは、下記の配列の１を含んでなる：
YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）又はその各種の組み合わせ。
【０１１０】
好適には、疎水性ドメイン又は各疎水性ドメインは、下記の配列の１からなる：
YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）又はその各種の組み合わせ。
【０１１１】
好適には、疎水性ドメイン又は各疎水性ドメインは、配列YQFLI（配列番号１３）からなる。
【０１１２】
好適には、ペプチドにおける各疎水性ドメインは、同一の配列又は異なる配列を有する。
【０１１３】
ペプチド
本発明は、医学的状態の治療における治療用カーゴ分子の輸送に使用される短い細胞透過性ペプチドに係る。
【０１１４】
ペプチドは、隣接する単一分子を有する。好適には、ペプチドは、Ｎ-末端とＣ-末端との間に、いくつかのドメインを、直線状に含んでなる。好適には、ドメインは、上記のカチオン性ドメイン及び疎水性ドメインから選ばれる。好適には、ペプチドは、カチオン性ドメイン及び疎水性ドメインからなり、ドメインは、上記の定義の通りである。
【０１１５】
各ドメインは、上記の適切な章に記載したように、共通の配列特性を有するが、各ドメインの正確な配列は、変形及び修飾が可能である。このように、各ドメインについて、一定範囲の配列が可能である。各可能なドメイン配列の組み合わせは、一定範囲のペプチド構造を生じ、その各々が本発明の物を形成する。ペプチド構造の特徴は、下記に記載する。
【０１１６】
好適には、カチオン性ドメインは各疎水性ドメインを分離する。好適には、各カチオン性ドメインは、そのいずれかの側部において疎水性ドメインと隣接している。
【０１１７】
好適には、疎水性ドメインは、他の疎水性ドメインとは隣接しない。
【０１１８】
１具体例では、ペプチドは、下記の配列で、２個の疎水性ドメインと隣接する１個のカチオン性ドメインを含んでなる：
［疎水性ドメイン］−［カチオン性ドメイン］−［疎水性ドメイン］
【０１１９】
それ故、好適には、カチオン性ドメインは、コアドメインとして知られ、疎水性ドメインの各々は、アームドメインとして知られている。好適には、疎水性のアームドメインは、そのいずれかの側部でカチオン性ドメインと隣接している。
【０１２０】
１具体例では、ペプチドは、１個のカチオン性ドメイン及び２個の疎水性ドメインからなる。
【０１２１】
１具体例では、ペプチドは、２個の疎水性ドメインが隣接する１個のカチオン性コアドメインからなる。
【０１２２】
１具体例では、ペプチドは、各々が、YQFLI（配列番号１３）、FQILY（配列番号１４）、ILFQY（配列番号１５）から選ばれる配列を含んでなる２の疎水性アームドメインと近接する、RBRXRBRXB（配列番号１）、RBRXRBRXBRXRB（配列番号２）、RBRXRBRXBR（配列番号３）、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRXRBRBRXRB（配列番号５）、RBRXRBRBRBRB（配列番号６）、RBRBRBRBRBRB （配列番号７）、RBRXRBRBRXR（配列番号８）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRXBRXRB（配列番号１０）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号11）、RBRRBRBRBBRBRB（配列番号１２）から選ばれる配列を含んでなる１個のカチオン性コアドメインからなる。
【０１２３】
１具体例では、ペプチドは、各々が、YQFLI（配列番号１３）の配列を含んでなる２の疎水性アームドメインと近接する、RBRRXRBRXBRXRB（配列番号４）、RBRRBRBRBRRB（配列番号９）、RBRRBRBRBBRXRB（配列番号11）から選ばれる配列を含んでなる１個のカチオン性コアドメインからなる。
【０１２４】
このような具体例のいずれにおいても、更なる基、例えば、リンカー、末端修飾及び／又は治療用分子が存在できる。
【０１２５】
好適には、ペプチドは、Ｎ-末端修飾される。
【０１２６】
好適には、ペプチドは、Ｎ-アセチル化、Ｎ-メチル化、Ｎ-トリフルオロアセチル化、Ｎ-トリフルオロメチルスルホニル化、又はＮ-メチルスルホニル化される。好適には、ペプチドは、Ｎ-アセチル化される。
【０１２７】
任意に、ペプチドのＮ-末端は修飾されなくてもよい。
【０１２８】
１具体例では、ペプチドは、Ｎ-アセチル化される。
【０１２９】
好適には、ペプチドは、Ｃ-末端修飾される。
【０１３０】
好適には、ペプチドは、カルボキシ-、チオ酸-、アミノオキシ-、ヒドラジノ-、チオエステル-、アジド、歪みアルキン、歪みアルケン、アルデヒド-、チオ又はハロアセチル-基から選ばれるＣ-末端修飾を含んでなる。
【０１３１】
有利には、Ｃ-末端修飾は、ペプチドの治療用分子への結合手段を提供する。
【０１３２】
従って、Ｃ-末端修飾はリンカーを含むことができ、含んでいなくてもよい。
【０１３３】
好適には、Ｃ-末端修飾はリンカーからなり、又はリンカーからなっていなくてもよい。好適なリンカーは、ここに又はどこかよそに記載されている。
【０１３４】
好適には、ペプチドは、Ｃ-末端カルボキシル基を含んでなる。
【０１３５】
好適には、Ｃ-末端カルボキシル基は、グリシン又はβ-アラニン残基によって提供される。
【０１３６】
１具体例では、Ｃ-末端カルボキシル基は、β-アラニン残基によって提供される。
【０１３７】
好適には、Ｃ-末端β-アラニン残基はリンカーである。
【０１３８】
好適には、それ故、各疎水性ドメインは、さらに、Ｎ又はＣ末端修飾を含むことができる。好適には、Ｃ末端の疎水性ドメインは、Ｃ-末端修飾を含んでなる。好適には、Ｎ末端の疎水性ドメインは、Ｎ-末端修飾を含んでなる。好適には、Ｃ末端の疎水性ドメインは、リンカー基を含んでなり、好適には、Ｃ末端の疎水性ドメインは、Ｃ-末端β-アラニンを含んでなる。好適には、Ｎ末端の疎水性ドメインは、Ｎ-アセチル化される。
【０１３９】
本発明のペプチドは、アミノ酸残基４０個以下の全長を有するものとして定義される。それ故、ペプチドは、オリゴペプチドと見なされる。好適には、ペプチドは、１０〜３５個のアミノ酸残基、好ましくは、アミノ酸残基１２〜３３個、アミノ酸残基１５〜３０個、アミノ酸残基１７〜２７個、アミノ酸残基２０〜２５個の全長を有する。
【０１４０】
好適には、ペプチドは、アミノ酸残基すくなくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個の全長を有する。
【０１４１】
好適には、ペプチドは、細胞を透過できる。それ故、ペプチドは、細胞透過性ペプチドと見なされる。
【０１４２】
好適には、ペプチドは、治療用分子への接着用である。好適には、ペプチドは、治療用分子を標的細胞へ輸送するためのものである。好適には、ペプチドは、治療用分子を標的細胞へ送達するためのものである。それ故、ペプチドは、キャリヤーペプチドと見なされる。
【０１４３】
好適には、ペプチドは、細胞及び組織、好適には、細胞の核に透過できる。好適には、筋肉組織に透過できる。
【０１４４】
好適には、ペプチドは、下記の配列の中から選ばれる：
YQFLIRBRXRBRXBYQFLI         （配列番号１６）
YQFLIRBRXRBRXBRXRBYQFLI     （配列番号１７）
YQFLIRBRXRBRXBRYQFLI        （配列番号１８）
YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI    （配列番号１９）
YQFLIRBRXRBRBRXRBYQFLI      （配列番号２０）
YQFLIRBRXRBRBRBRBYQFLI      （配列番号２１）
YQFLIRBRBRBRBRBRBYQFLI      （配列番号２２）
YQFLIRBRXRBRBRXRYQFLI       （配列番号２３）
YQFLIRBRRBRBRBRRBYQFLI      （配列番号２４）
YQFLIRBRRBRBRXBRXRBYQFLI    （配列番号２５）
YQFLIRBRRBRBRBBRXRBYQFLI    （配列番号２６）
YQFLIRBRRBRBRBBRBRBYQFLI    （配列番号２７）
FQILYRBRRBRBRBBRBRBFQILY    （配列番号２８）
YQFLIRBRRXRBRXBRXRBFQILY    （配列番号２９）
【０１４５】
好適には、ペプチドは、下記の配列の１からなる：
YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI    （配列番号１９）
YQFLIRBRRBRBRBRRBYQFLI      （配列番号２４）
YQFLIRBRRBRBRBBRXRBYQFLI    （配列番号２６）
【０１４６】
１具体例では、ペプチドは、下記の配列：
YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI    （配列番号１９）
からなる。
【０１４７】
複合体
本発明のペプチドは、複合体を提供するため、治療用分子に共有結合される。
【０１４８】
治療用分子は、病気を治療するための各種の分子である。治療用分子は、核酸、ペプチド核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、PNA、PMO）、短い干渉RNA、マイクロRNA、mRNA、gRNA（例えば、CRISPR/Cas9技術の使用において）、アンタゴミルRNA、ペプチド、環状ペプチド、タンパク質、薬剤、薬物、又はナノ粒子から選ばれる。
【０１４９】
１具体例では、治療用分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１５０】
好適には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（PMO）からなる。
【０１５１】
或いは、オリゴヌクレオチドは、修飾PMO、又は他の電荷的中性のオリゴヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（PNA）、化学修飾PNA（例えば、γ-PNA（Bahal, Nat.Comm. 2016））、オリゴヌクレオチドホスホルアミデート（ホスフェートの非架橋酸素は、アミン又はアルキルアミン、例えば、国際公開第2016/028178号に記載されたものによって置換される）、又は他の部分的又は完全に電荷的に中和されたオリゴヌクレオチドである。
【０１５２】
治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、入手可能なものから選ばれ、例えば、DMDにおけるエクソンスキッピング用のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、https://research-repository.uwa.edu.au/en/publications/antisense-oligonucleotide-induced-exon-skipping-across-the-human-に記載され、SMAの治療のためのISSN1又はIN7配列と相補的な治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Zhou, HGT, 2013；Hammond ら, 2016；及びOsmanら, HMG, 2014に記載されている。
【０１５３】
好適には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、DMDの治療での使用のための、エクソンスキッピングを惹起するためのものである。
【０１５４】
好適には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、DMDの治療での使用のための、ジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを惹起するためのものである。好適には、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、１又は多数のエクソンのエクソンスキッピングを惹起できる。
【０１５５】
１具体例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、DMDの治療での使用のための、ジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングを惹起するためのものである。好適には、単一エクソンは、DMDに関連する各種のエクソンから選ばれ、ジストロフィン遺伝子における各種のエクソン、例えば、エクソン45、51、又は53である。
【０１５６】
いずれかの配列のPMOオリゴヌクレオチドは、購入可能である（例えば、Gene Tools Inc.（米国）から）。
【０１５７】
１具体例では、複合体の治療用分子は、遺伝子標的のプレ- mRNAに相補的なオリゴヌクレオチドである。
【０１５８】
好適には、遺伝子標的のプレ-mRNAに相補的なオリゴヌクレオチドは、プレ-mRNAを変性する立体ブロッキング現象を起こし、変性mRNA、これにより、変性した配列のタンパク質を導く。好適には、遺伝子標的はジストロフィン遺伝子である。
【０１５９】
好適には、立体ブロッキング現象は、エクソン封入又はエクソンスキッピングである。１具体例では、立体ブロッキング現象は、エクソンスキッピング、好適には、ジストロフィン遺伝子の単一エクソンのエクソンスキッピングである。
【０１６０】
任意に、水溶性を改善するために、ペプチドへの付着前に、治療用分子（例えば、PMO又はPNA）の一方の端又は両端に、リジン残基が付加される。
【０１６１】
好適には、治療用分子は、5,000 Da以下、3,000 Da以下、又は1,000 Da以下の分子量を有する。
【０１６２】
好適には、ペプチドは、Ｃ-末端で、治療用分子に共有結合される。
好適には、ペプチドは、必要であれば、リンカーを経て、治療用分子に共有結合される。リンカーは、ペプチド配列を治療用分子から離すためのスペーサーとして作用する。１具体例では、複合体はリンカーを含んでなる。
【０１６３】
リンカーは、各種の好適な配列から選ばれる。
【０１６４】
好適には、リンカーは、ペプチド又は治療用分子の一部である。好適には、リンカーは、ペプチドと治療用分子との間に存在する。
【０１６５】
１具体例では、複合体は、リンカーを介して、治療用分子に共有結合される。１具体例では、複合体は、下記の構造を含んでなる：
［ペプチド］−［リンカー］−［治療用分子］
【０１６６】
１具体例では、複合体は、下記の項配列からなる：
［ペプチド］−［リンカー］−［治療用分子］
【０１６７】
本発明による複合体では、ここに示されたペプチドのいずれかが使用される。１具体例では、複合体は、次の配列：YQFLIRBRRXRBRXBRXRBYQFLI（配列番号１９）、YQFLIRBRRBRBRBRRBYQFLI（配列番号２４）、及びYQFLIRBRRBRBRBBRXRBYQFLI（配列番号２６）の１から選ばれるペプチドを含んでなる。
【０１６８】
好適には、いずれのケースでも、ペプチドは、さらに、上述のようにＮ-末端修飾を含むことができる。
【０１６９】
好適なリンカーは、例えば、ジスルフィド、チオエーテル、又はチオ−ル−マレイミド結合の形成を許容するＣ-末端システイン残基、オキシムを形成するＣ-末端アルデヒド（カルボキサミド結合を形成するための、ペプチド上の塩基性アミノ酸又はアミノ基に共有結合したペプチド上のカルボン酸モイエティーとのモルホリン結合のクリック反応又は形成）を含む。
【０１７０】
好適には、リンカーは、アミノ酸１〜５個の長さである。好適には、リンカーは、当分野で公知の各種のリンカーである。
【０１７１】
好適には、リンカーは、次の配列：G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BX、及びXBから選ばれるいずれかである。
【０１７２】
好適には、リンカーは、ポリマー、例えば、PEGでもよい。
【０１７３】
１具体例では、リンカーはβ-アラニンである。
【０１７４】
１具体例では、ペプチドは、カルボキサミド結合を経て治療用分子に結合される。
【０１７５】
複合体のリンカーは、ペプチドが結合する治療用分子の一部を形成できる。或いは、治療用分子の付着は、ペプチドのＣ-末端に直接結合される。好適には、このような具体例では、リンカーは要求されない。
【０１７６】
或いは、ペプチドは、治療用分子に化学的に結合される。化学結合は、例えば、ジスルフィド、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、アミド、カルボキサミド、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジン、オキシム、スルフェート、ホスホルアミデート、チオホスフェート、ボラノホスフェート、イミノホスフェート、又はチオール−マレイミド結合を介するものである。
【０１７７】
任意に、治療用分子のＮ-末端において、ペプチドへのジスルフィド結合の形成を可能にするために、システインが付加され、又はＮ-末端は、ペプチドへのチオエーテル結合のためのブロモアセチル化を受けることができる。
【０１７８】
本発明のペプチドは、複合体を形成するために、等しく、イメージング分子に共有結合される。
【０１７９】
好適には、イメージング分子は、複合体の可視化を可能にする各種の分子である。好適には、イメージング分子は、複合体の位置を、好適には、インビトロ又はインビボでの複合体の位置を表示できる。好適には、イメージング分子を含んでなる複合体の位置を監視する方法であって、対象の複合体を投与すること、及び対象を画像処理して、複合体の位置を示すことを含んでなる方法が提供される。
【０１８０】
イメージング分子の例としては、検出用分子、対比用分子、又は増強用分子が含まれる。好適なイメージング分子は、放射線核種；フルオロフォア；ナノ粒子（例えば、ナノシェル）；ナノカーゴ；発色剤（例えば、酵素）；放射性同位体、染料、放射線不透過性物質、蛍光化合物、及びその組み合わせから選ばれる。
【０１８１】
好適には、イメージング分子は、イメージングテクノロジー（これらは、細胞イメージングテクノロジー又は医用イメージングテクノロジーである）を使用して可視化される。好適な細胞イメージングテクノロジーとしては、例えば、細胞画像解析、蛍光顕微鏡検査、位相差顕微鏡観察、SEM、TEMが含まれる。好適な医用イメージングテクノロジーとしては、例えば、Ｘ線、蛍光透視法、MRI、シンチグラフィー、SPECT、PET、CT、CAT、FNRIが含まれる。
【０１８２】
いくつかのケースでは、イメージング分子は、診断用分子と見なされる。好適には、診断用分子は、複合体を使用して、病気の診断を可能にする。好適には、病気の診断は、イメージング分子を使用して、複合体の位置を測定することを通して達成される。好適には、病気の診断法が提供され、該方法は、イメージング分子を含んでなる複合体の有効量を対象に投与すること及び複合体の位置をモニターすることを含んでなる。
【０１８３】
好適には、イメージング分子を含んでなる複合体の結合のような更なる詳細は、治療用分子を含んでなる複合体に関する上記と同じである。
【０１８４】
好適には、本発明のペプチドは、複合体を提供するため、治療用分子及びイメージング分子に共有結合される。
【０１８５】
好適には、複合体は、細胞及び組織、好適には、細胞の核に透過できる。
【０１８６】
医薬組成物
本発明の複合体は、医薬組成物に調剤される。
【０１８７】
好適には、医薬組成物は、本発明の複合体を含んでなる。
【０１８８】
好適には、医薬組成物は、さらに、薬学上許容される希釈剤、アジュバント、又はキャリヤーを含むことができる。
【０１８９】
好適な薬学上許容される希釈剤、アジュバント、及びキャリヤーは、当分野において公知である。
【０１９０】
ここで使用するように、表現「薬学上許容される」は、適切な医学的良識の範囲内において、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、又は他の問題又は困難な事態を伴うことなく、妥当な利益／リスク比に見合ったリガンド、物質、処方、及び／又は剤形をいう。
【０１９１】
ここで使用するように、表現「薬学上許容されるキャリヤー」は、複合体を、身体の１の器官又は部分から身体の他の器官又は部分へ運搬又は輸送することに関与する薬学上許容される物質、又はビヒクル、例えば、液体又は固体のフィラー、希釈剤、添加剤、溶媒又はカプセル化物質をいう。各細胞透過性ペプチドは、組成物の他の成分、例えば、ペプチド及び治療用分子と適合性であり、ヒトに対して有害であってはならないとの意味において「安全」でなければならない。凍結乾燥した組成物（元に戻され、投与される）も、本発明の組成物の範囲内である。
【０１９２】
薬学上許容されるキャリヤーは、例えば、添加剤、ビヒクル、希釈剤、及びその組み合わせである。例えば、組成物が経口投与される場合、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、又はシロップとして処方され；非経口投与用では、注射、点滴、又は坐剤として処方される。これらの組成物は、一般的な手段で調製され、必要に応じて、活性化合物（すなわち、複合体）は、各種の一般的な添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味薬、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、被覆剤、又はその組み合わせと混合される。
【０１９３】
本明細書に記載の医薬組成物は、さらに、医薬用途において、個々に記載の疾患、不調、及び状態を緩和し、仲介し、及び治療するために追加の公知の治療薬、薬剤、化合物のプロドラッグへの修飾、等を含むことができると理解されなければならない。好適には、医薬組成物は、薬剤としての使用、好適には、複合体についてここに記載したと同じ様式での薬剤としての使用のためのものである。複合体を使用する治療に関してここに記載したすべての特徴は医薬組成物に当てはまる。
【０１９４】
従って、本発明の他の態様では、薬剤としての使用に係る第４の態様による医薬組成物が提供される。更なる態様では、疾病状態の患者を治療する方法が提供され、該方法は、第４の態様による医薬組成物の有効量を患者に投与することを含んでなる。
【０１９５】
医学的用途
本発明のペプチドを含んでなる複合体は、疾患の治療用の薬剤として使用される。
【０１９６】
薬剤は、上記で定義したように医薬組成物の形である。
【０１９７】
疾病状態の治療を必要とする患者又は対象の治療方法も提供され、該方法は、患者又は対象に、複合体の治療上有効な量を投与する工程を含んでなる。
【０１９８】
好適には、医療は、治療用分子の細胞、好適には、細胞の核への送達を必要とする。
【０１９９】
治療すべき疾患としては、治療用分子による細胞及び／又は核膜の改善された通過が改善された治療効果につながる各種の疾患が含まれる。
【０２００】
好適には、複合体は、神経筋系の疾患の治療における使用のためのものである。
【０２０１】
本発明のペプチドを含んでなる複合体は、神経筋系の遺伝性疾患の治療に適している。本発明のペプチドを含んでなる複合体は、遺伝性の神経筋系疾患の治療に適している。好適な具体例では、神経筋系の遺伝性疾患の治療における使用のための第２の態様による複合体が提供される。好適には、複合体は、遺伝性の疾患の治療に使用されるものである。好適には、複合体は、遺伝性の神経筋系疾患の治療に使用されるものである。好適には、複合体は、神経筋系の遺伝性のＸ連鎖遺伝病の治療に使用されるものである。好適には、複合体は、神経筋系の遺伝性のＸ連鎖神経筋系疾患の治療に使用されるものである。
【０２０２】
好適には、複合体は、スプライシング欠損を原因とする疾患の治療に使用されるものである。このような具体例では、治療用分子は、スプライシング欠損を防止又は矯正できる及び／又は正しくスプライスされたmRNA分子を増大させることができるオリゴヌクレオチドを含んでなることができる。
【０２０３】
好適には、複合体は、次の疾患いずれかの治療における使用のためのものである：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、Bucher筋ジストロフィー（BMD）、メンケス病、 βサラセミア、痴呆、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症（SMA）、筋緊張性ジストロフィー（DM）、ハンチントン病、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、血管拡張性失調症、又は癌。
【０２０４】
１具体例では、複合体は、DMDの治療における使用のためのものである。
【０２０５】
１具体例では、DMDの治療おける使用のための第２の態様による複合体が提供される。
【０２０６】
好適には、このような具体例では、複合体の治療用分子は、ジストロフィン・タンパク質の発現を増大させるように作用できる。好適には、このような具体例では、複合体の治療用分子は、機能性ジストロフィン・タンパク質の発現を増大させるように作用できる。
【０２０７】
好適には、複合体は、ジストロフィンの発現を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％増大させる。好適には、複合体は、ジストロフィンの発現を５０％まで増大させる。
【０２０８】
好適には、複合体は、ジストロフィンの発現を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。好適には、複合体は、ジストロフィンの発現を５０％まで回復させる。
【０２０９】
好適には、複合体は、ジストロフィン・タンパク質の機能を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％回復させる。好適には、複合体は、ジストロフィン・タンパク質の機能を５０％まで増大させる。
【０２１０】
好適には、複合体の治療用分子は、ジストロフィンの転写の間に、１以上のエクソンのスプライシングを生じさせることによって、そうするように作用できる。
【０２１１】
好適には、複合体は、ジストロフィン遺伝子の１以上のエクソンの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％のスプライシングを引き起こす。好適には、複合体は、ジストロフィン遺伝子の１以上のエクソンの５０％までのスプライシングを引き起こす。
【０２１２】
好適には、治療を受ける患者又は対象は、各種の動物又はヒトである。好適には、治療を受ける患者又は対象は、非ヒト哺乳類である。治療を受ける患者又は対象は、雄又は雌である。１具体例では、対象は雄である。
【０２１３】
好適には、治療を受ける患者又は対象は、各種の年齢である。好適には、治療を受ける患者又は対象は、０〜４０歳、好適には、０〜３０歳、好適には、０〜２５歳、好適には、０〜２０歳である。
【０２１４】
好適には、複合体は、全身的に、例えば、髄内ルート、髄腔内ルート、脳室内ルート、経腸ルート、非経口ルート、静脈内ルート、動脈内ルート、筋肉内ルート、腫瘍内ルート、皮下ルート、経口ルート、又は経鼻ルートによって、対象に投与されるためのものである。
【０２１５】
１具体例では、複合体は、対象に静脈内投与されるためのものである。１具体例では、複合体は、注射により対象に静脈内投与されるためのものである。
【０２１６】
好適には、複合体は、「治療上有効な量」で対象に投与されるためのものであり、「治療上有効な量」とは、量が、個人において利益を示すに十分であることを意味する。投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、治療される疾患の性質及び重篤性に左右される。用量の決定は、一般的開業医又は医師の責任の範囲内である。技術及びプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, ２０版, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins発行に見られる。
【０２１７】
例示的な用量は、0.01〜５０mg/kg、0.05〜４０mg/kg、０.１〜３０mg/kg、０.５〜１８mg/kg、１〜１６mg/kg、２〜１５mg/kg、５〜１０mg/kg、１０〜２０mg/kg、１２〜１８mg/kg、１３〜１７mg/kgである。
【０２１８】
有利には、本発明の複合体の用量は、治療用分子単独からいずれかの効果を認めるに必要な用量程度又はそれよりも低い程度であり、現在利用可能な細胞透過性ペプチドよりも低い。
【０２１９】
核酸及び宿主
本発明のペプチドは、各種の標準的なタンパク質合成法、例えば、化学合成、半化学合成、発現系の使用を介することによって生成される。
【０２２０】
従って、本発明は、ペプチドをコードするDNAを含んでなる又はからなるヌクレオチド配列、発現系、例えば、発現及び発現の制御に必要な配列を伴う前記配列を含んでなるベクター、及び宿主細胞及び前記発現系によって形質転換された宿主生物にも係る。
【０２２１】
従って、本発明によるペプチドをコードする核酸も提供される。
【０２２２】
好適には、核酸は、単離された又は精製された形で提供される。
【０２２３】
本発明によるペプチドをコードする核酸を含んでなる発現ベクターも提供される。
【０２２４】
好適には、ベクターはプラスミドである。
【０２２５】
好適には、ベクターは、本発明によるペプチドをコードする核酸に作用可能に結合する制御配列、例えば、プロモーターを含んでなる。好適には、発現ベクターは、好適な細胞、例えば、哺乳類、細菌又は真菌細胞に遺伝子導入される際、ペプチドを発現できる。
【０２２６】
本発明の発現ベクターを含んでなる宿主細胞も提供される。
【０２２７】
発現ベクターは、本発明の核酸が挿入される宿主細胞に応じて選択される。宿主細胞のこのような形質転換は、一般的な技術、例えば、Sambrookらにより教示されたもの（Sambrook, J., Russell, D. (2001), 分子クローニング：実習用マニュアル, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA）を含む。好適なベクターの選択は、当業者の技能の範囲内である。好適なベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、及びウイルスが含まれる。
【０２２８】
生成されたペプチドは、単離され、各種の好適な方法、例えば、沈殿又はクロマトグラフィー分離、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって宿主から精製される。
【０２２９】
好適なベクター、宿主及び遺伝子組み換え技術は、当分野においてよく知られている。
【０２３０】
この明細書において、用語「作用可能に結合された」は、選択されたヌクレオチド配列及び制御ヌクレオチド配列が、制御配列の制御の下で、核酸コード化配列の発現を行うことができるように共有結合され、そのため、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全部を形成するヌクレオチドコード化配列の転写を生ずることができる状況を含む。必要に応じて、ついで、達成された転写は、所望のタンパク質に翻訳される。
【０２３１】
次に、本発明の特定の具体例を、添付図面及び表を参照して記載する。
【０２３２】
本明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲を通して、用語「含んでなる」及び「含む」及びそれらの変形は、「含むが、限定されない」を意味し、それらは、他のモイエティー、添加物、成分、整数、又は工程を排除することを意図しない（排除しない）。本明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲を通して、単数は、内容が他に要求しない限り、複数を含む。特に、不定冠詞を使用する所では、明細書は、内容が他に要求しない限り、単数とともに複数を考慮するものとして理解されなければならない。
【０２３３】
発明の特別な態様、具体例、又は実施例と併せて記載する特徴、整数、特性、化合物、化学モイエティー又は基は、不適合とならない限り、ここに記載の他の態様、具体例、又は実施例と適用可能であると理解されなければならない。この明細書（特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に記載する特徴の全て、及び／又は記載された各種方法の工程の全ては、このような特徴の及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的であるような組み合わせを除き、いかなる組み合わせとしても組み合わされる。
【０２３４】
本発明は、各種の先の具体例の詳細に限定されない。本発明は、この明細書（特許請求の範囲、要約、及び図面を含む）に開示された特徴のいずれか新規の１又はいずれか新規の組み合わせ、又は開示されたいずれかの方法の工程のいずれか新規の１又はいずれか新規の組み合わせに拡張される。読者の注目は、この出願に係る明細書と同時に又は先立って提出され、この明細書とともに縦覧のために公開された全ての論文及び文献に向けられ、このような全ての論文及び文献の内容は、参照して、ここに組み込まれる。
【０２３５】
［実施例］
１．材料及び方法
１.１  P-PMOの合成及び調製
9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）保護L-アミノ酸、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム（PyBOP）、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、及びFmoc-β-Ala-OH充填済みWang樹脂（0.19又は0.46 mモル/g）を、Merck（ホーエンブルン、独国）から得た。HPLC等級アセトニトリル、メタノール、及び合成等級N-メチル-2-ピロリドン（NMP）を、Fisher Scientific（ラフバラー、英国）から購入した。ペプチド合成等級N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）及びジエチルエーテルを、VWR（レスターシャ―、英国）から得た。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（TFA）を、Alfa Aesar（ヘイシャム、イングランド）から得た。PMOをGene Tools Inc.（フィロマス、米国）から購入した。ニワトリ胚抽出物及びウマ血清をSera Laboratories International Ltd（ウエスト・サセックス、英国）得た。インターフェロンをRoche Applied Science（ペンツベルグ、独国）から得た。全ての試薬を、他に述べない限り、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から得た。Voyager DE Pro BioSpectrometryワークステーションを使用して、MALDI-TOF質量分析を行った。マトリックスとして、５０％アセトニトリル水溶液におけるα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸又はシナピン酸１０mg/mlのストック溶液を使用した。エラーバー：標準偏差は±０.１％である。
【０２３６】
１.２  H2k mdx細胞におけるスクリーニング用のP-PMOペプチドの合成
ａ）ペプチド変異体のライブラリーの調製
Fmoc-β-Ala-OH充填済みWang樹脂（0.19又は0.46 mモル/g、Merck Millipore）を使用し、標準のFmoc化学を適用し、製造者の推奨に従うことによって、Intavis Parallelペプチド・シンセサイザーを使用して、１０μモルスケールで、又はCEM Liberty Blue（商標名）ペプチド・シンセサイザー（バッキンガム、英国）を使用して、100μモルスケールで、ペプチドを調製した。Intavis Parallelペプチド・シンセサイザーを使用するケースでは、PyBOP/NMMカップリング混合物とともに、ダブルカップリング工程を使用し、各工程後に、無水酢酸カップリングを行った。CEM Liberty Blueペプチド・シンセサイザーを使用する合成については、アルギニンを除くすべてのアミノ酸について、単一基準カップリングを行ない、ダブルカップリングによって実行した。カップリングは、アルギニン残基を除き、６０Wマイクロ波電力において、７５℃、５分間で１回行い、それぞれ、二度カップリングした。各脱保護反応を、３５Wマイクロ波電力において、７５℃で、２回、そのうち１回目は３０秒間、ついで、３分間行った。合成が完了した時点で、樹脂をDMFにて洗浄し（３×５０ml）、固体相結合ペプチドのＮ-末端を、DIPEAの存在下、室温において、無水酢酸によってアセチル化した。Ｎ-末端のアセチル化の後、ペプチド樹脂を、DMFにて（３×２０ml）及びDCMにて（３×２０ml）洗浄した。トリフルオロ酢酸（TFA）：H2O：トリイソプロピルシラン（TIPS）からなる分裂用カクテル（９５％：２.５％：２.５％；３〜１０ml）による、室温における、３時間の処理によって、ペプチドを固体支持体から分裂させた。ペプチドの遊離後、過剰のTFAを、窒素でのスパージングによって除去した。粗製のペプチドを、冷たいジエチルエーテルの添加（合成のスケールに応じて１５〜４０ml）によって沈殿させ、3200 rpmで５分間、遠心分離した。粗製のペプチドペレットを、冷たいジエチルエーテルにて３回洗浄し（３×１５ml）、445-LCスケールアップモジュール及び440-LCフラクションコレクターを装着したVarian 940-LC HPLCシステムを使用するRP-HPLCによって精製した。０.１％TFA/H2OにおけるCH3CNの直線勾配を流速１５ml/分で使用して、RP-C18カラム（１０×250 mm、Phenomenex Jupiter）上でのセミ分取HPLCによって精製した。検出を、220 nm及び260 nmにおいて行った。所望のペプチドを含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して、ペプチドを白色の固体として得た（収率については、表２を参照）。
【０２３７】
表１  各実施例において合成された、Ｎ-末端アセチル化及びＣ-末端β-アラニンリンカーを有するペプチド（Ｘは6-アミノヘキサン酸である。）
【表１】
2022502347.tif 000002
【０２３８】
表２  複合体用に合成されたペプチドの収率
【表２】
2022502347.tif 000003
【０２３９】
ｂ）PMO-ペプチド複合体のライブラリーの合成
マウスジストトロフィンエクソン-23用の25-merPMOアンチセンス配列（GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT（配列番号３０））を使用した。ペプチドを、そのＣ-末端カルボキシル基を介して、PMOの3’-末端に結合させた。これを、DIPEA２.５当量の存在下、NMPにおいて、PyBOP及びHOAtを、それぞれ、２.５及び２当量使用して行い、DMSOに溶解したPMOの２.５倍過剰量のペプチドを使用した。いくつかの実施例では、ペプチドのＣ-末端カルボキシル基の活性化のため、PyBOPの代わりにHBTU２当量を使用した。一般に、N-メチルピロリドン（NMP、８０μl）におけるペプチド（2500 nモル）溶液に、PyBOP（０.３M NMP溶液19.2μl）、HOAt（０.３M NMP溶液16.7μl）、DIPEA（１.０μl）、及びPMO（１０mM DMSO溶液100μl）を添加した。混合物を４０℃に２.５時間放置し、０.１％TFA水溶液（300μl）を添加することによって、反応をクエンチした。この溶液を、逆Gilson HPLCシステムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。PMO-ペプチド複合体を、２０％CH3CNを含有する硫酸ナトリウム緩衝液（２５mM、pH７.０）の直線勾配を使用するイオン交換カラム（Resource S４ml、GE Healthcare）上で精製した。塩化ナトリウム溶液（１M）を使用して、流速４l/分で、複合体をカラムから溶出した。所望の化合物を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して、ペプチド-PMO誘導体を白色の固体として得た。過剰の塩のペプチド-PMO複合体からの除去を、Amicon（登録商標）ultra-15 3K延伸フィルター装置を使用する、イオン交換後に集めたフラクションの濾過を介して行った。複合体を凍結乾燥し、MALDI-TOFによって分析した。複合体を、殺菌した水に溶解し、使用前に、0.22μmの酢酸セルロース膜を通して濾過した。ペプチド−PMOの濃度を、０.１N HCl溶液中、265 nmにおいて、モル吸光によって測定した（収率については、表３参照）。
【０２４０】
表３  細胞培養用のP-PMO複合体の収率（収率は、凍結乾燥し、精製したP-PMOの乾燥質量に基づく。P-PMOについての純度は、220 nm及び260 nmにおいて順相HPLCによって確認して、９５％より大である。）
【表３】
2022502347.tif 000004
【０２４１】
１.３  細胞培養
マウスのH2k筋芽細胞を、ゼラチン（0.01％）被覆フラスコ内において、２０％熱不活化ウシ胎児血清（FBS Gold；PAA laboratories）、２％ニワトリ胚抽出物（Seralab）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン抗生物質混合物（PSN；Gibco）、及び３pg/μl γ-インターフェロン（Roche）を補足したダルベッコイーグル改変培地（DMEM；PAA laboratories）中、３３℃において、１０％CO2の下で培養した。細胞を、ゼラチン（0.01％）被覆２４ウエルプレートに、密度２×１０５細胞/mlで播州し、３３℃において、１０％CO2の下で、２日間放置した。筋管に分化させるために、細胞を、さらに、５％ウマ血清（Sigma）及び１％PSNを補足したDMEMにおいて、３７℃で、５％CO2の下、２日間生育した。
【０２４２】
１.４  細胞の遺伝子導入
細胞を、血清フリーのOpti-MEMにおいて調合した、上述のように調製したペプチド−PMOとともにインキュベートし、350μlを各ウエルに正副１組として添加し、３７℃で、４時間インキュベートした。ついで、遺伝子導入培地を、５％ウマ血清及び１％PSNを補足したDMEMと交換し、細胞を、３７℃で、さらに２０時間インキュベートした。細胞をPBSにて洗浄し、TRI RNA（Sigma）単離剤０.５mlを各ウエルに添加した。細胞を−８０℃において、１時間凍結した。
１.５  RNAの採取及びネステッドRT-PCR分析
エタノールによる追加の沈殿とともに、TRI試薬を使用して、総細胞内RNAを抽出した。Nanodrop（登録商標）ND-1000（Thermo Scientific）を使用して、精製したRNAを定量した。RNA（400 ng）を、OneStep RT-PCR Kit（Roche、インディアナポリス、米国）を使用するRT-PCR用のテンプレートとして使用した。プライマー配列については表５を参照する。初期逆転写に関するサイクル条件は、１サイクルについて、５０℃で３０分間及び９４℃で７分間、続いて、９４℃で２０秒間、５５℃で４０秒間及び６８℃で８０秒間の３０サイクルであった。RT-PCR生成物１μlを、第２のPCR工程用のテンプレートとして使用した。９４℃で３０秒間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間での２５サイクルにおいて、SuperTAQ０.５Uを使用して、増幅を行った。１.５％アガロースゲルを使用する電気泳動によって、生成物を分離した。アガロースゲルの画像を、Molecular Imager ChemiDoc（商標名） XRS+イメージングシステム（BioRad、英国）上で得て、Image Lab（V4.1）を使用して、画像を分析した。エクソンスキッピングのアッセイデータを分析し及びブロットするために、Microsoft Excelを使用し、最後３回の独立した実験からのエクソン-23スキッピングの百分率として表した。
【０２４３】
１.６  H2k mdxマウスにおけるテスト用のPMO−ペプチド複合体の合成
ａ）ペプチド変異体の合成
製造者の推奨に従いCEM Liberty Blue（商標名）マイクロウエーブ・ペプチド・シンセサイザー（バッキンガム、英国）及びFmoc化学を使用して、100μモルスケールで、ペプチドを合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に対して不安定であり、DIPEAの存在下、PyBOP（５倍過剰）を使用して活性化された５倍過剰量のFmoc-保護アミノ酸（0.25 mモル）を使用して、ペプチドを合成した。N-Fmoc保護基を除去するために、ピペリジン（２０％（v/v）DMF溶液）を使用した。アルギニン残基を除き、６０Wマイクロ波電力において、７８℃、５分間でカップリングを１回行い、２回ずつカップリングした。各脱保護反応を、３５Wマイクロ波電力において、７５℃で２回、その内１回は３０秒間及びついで１回は３分間で行った。合成が完了した時点で、樹脂をDMFにて洗浄し（３×５０ml）、固体相結合ペプチドのＮ-末端を、DIPEAの存在下、室温において、無水酢酸によってアセチル化した。Ｎ-末端のアセチル化の後、ペプチド樹脂をDMFにて（３×２０ml）及びDCMにて（３×２０ml）洗浄した。トリフルオロ酢酸（TFA）：H2O：トリイソプロピルシラン（TIPS）からなる分裂用カクテル（９５％：２.５％：２.５％；１０ml）による、室温における、３時間の処理によって、ペプチドを固体支持体から分裂させた。過剰のTFAを、窒素でのスパージングによって除去した。分裂したペプチドを、氷冷したジエチルエーテルの添加によって沈殿させ、3000 rpmで５分間、遠心分離した。粗製のペプチドペレットを、冷たいジエチルエーテルにて３回洗浄し（３×４０ml）、445-LCスケールアップモジュール及び440-LCフラクションコレクターを装着したVarian 940-LC HPLCシステムを使用するRP-HPLCによって精製した。０.１％TFA/H2OにおけるCH3CNの直線勾配を流速１５ml/分で使用して、RP-C18カラム（１０×250 mm、Phenomenex Jupiter）上でのセミ分取HPLCによって精製した。検出を、220 nm及び260 nmにおいて行った（収率については、表４を参照）。
【０２４４】
表４：複合化用に、より大きいスケールで合成されたペプチドの収率
【表４】
2022502347.tif 000005
【０２４５】
ｂ）  PMO−ペプチド複合体の合成
マウスジストトロフィンエクソン-23用の25-merPMOアンチセンス配列（GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT（配列番号３０））を使用した。ペプチドを、そのＣ-末端カルボキシル基を介して、PMOの3’-末端に結合させた。これを、DIPEA２.５当量の存在下、NMPにおいて、PyBOP及びHOAtを、それぞれ、２.５及び２倍当量を使用して行い、DMSOに溶解したPMOの２.５倍過剰量のペプチドを使用した。いくつかの実施例では、ペプチドのＣ-末端カルボキシル基の活性化のため、PyBOPの代わりにHBTU（２当量）を使用した。一般に、N-メチルピロリドン（NMP、100μl）におけるペプチド（１０μモル）溶液に、HBTU（０.３M NMP溶液76.6μl）、HOAt（０.３M NMP溶液66.7μl）、DIPEA（４.０μl）、及びPMO（１０mM DMSO溶液400μl）を添加した。混合物を４０℃に２時間放置し、０.１％TFA水溶液（１ml）を添加することによって、反応をクエンチした。カチオン交換クロマトグラフィーカラム（Resource S ６mlカラム、GE Healthcare）において、２５％アセトニトリルを含有する２５mM硫酸ナトリウム緩衝液（pH７.０）を使用して、反応混合物を精製した。塩化ナトリウム溶液（１M）を使用して、流速６ml/分で、複合体をカラムから溶出した。Amicon（登録商標）ultra-15 3K遠心分離フィルター装置を使用して、過剰の塩のペプチド−PMO複合体からの除去を、イオン交換後に集めたフラクションの濾過を介して行った。複合体を凍結乾燥し、MALDI-TOFによって分析した。使用前に、複合体を、殺菌した水に溶解し、0.22μmの酢酸セルロース膜を通して濾過した。ペプチド-PMOの濃度を、０.１N HCl溶液中、265 nmにおいて、複合体のモル吸光によって測定した。全体収率はPMOに基づき２９〜４６％であった（表５）。
【０２４６】
表５  インビボ分析用に大きいスケールで合成されたP-PMO複合体の収率（収率は、凍結乾燥し、精製したP-PMOの乾燥質量に基づくものである。P-PMOの純度は、220 nm及び260 nmにおいて順相HPLCによって確認して、９５％より大である。）
【表５】
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【０２４７】
１.７  P-PMOによるジストロフィンの修復のインビボアッセイ
実験を、オックスフォード大学生物化学ユニットにおいて、ホーム・オフィス・プロジェクト・ライセンス認定の下、施設内レビューに従って行った。マウスを最少疾病施設において飼育した。環境的には、温度制御し、１２時間毎の明−暗サイクルとした。全ての動物に、自由に、市販の齧歯動物用飼料及び水をとらせた。
実験を、年齢１０〜１２週の雌mdxマウスにおいて行った。P-PMO１０mg/kgの単回の尾静脈注射の前に、mdxマウスを拘束した。注射から１週間後、動物を犠牲にし、TA、心臓及び横隔膜筋を取り出し、ドライアイス冷却イソペンタン内で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２４８】
１.８  ウエスタンブロット分析
シングル投与後のジストロフィンの修復の期間を査定するために、筋肉（TA及び横隔膜について）の１／３又は厚さ７μmの横断凍結切片（心臓について）９０個を、緩衝液300μｌ（５０mM Tris（pH８）、 150 mM NaCl、１％NP40、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％SDS及びプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤）中で溶解し、続いて、13000 rpm（Heraeus、#3325B）で１０分間遠心分離した。上澄液を集め、100℃で３分間加熱した。タンパク質をBCAによって定量し、タンパク質／サンプル４０μｇを、既に記載されている（19）ように、NuPAGE３〜８％Tris-Acetateゲル中で分解した。タンパク質を、３０Vで１時間、続いて、100 Vで１時間、孔サイズ0.45μmのPVDF膜に移し、既に記載されている（37）ように、モノクロナール抗-ジストロフィン抗体（１：200、NCL-DYS1、Novocastra）及び抗-ビンキュリン抗体（ローディングコントロール、１：100000、hVIN-1、Sigma）にて探索した。第２の抗体（IRDye 800CWヒツジ抗-マウス）を希釈度１：20000（LiCOR）で使用した。
P-PMO処理mdxマウスにおけるジストロフィンの修復レベルを、C57BL/10野生型コントロールマウス（100％と仮定する）との相対比として表示した。このため、P-PMO処置マウスと並行して、５連続C57BL/10タンパク質希釈を含めて、標準曲線を作成した。希釈シリーズは次の通りである：１レーンについて負荷した４０μg総タンパク質の７５％、４０％、１５％、５％又は０％は、C57BL/10タンパク質溶解物からのものであり、残りは、未処置mdxタンパク質溶解物からのものである。これらの基準物を定量し、処置したmdxサンプルと並行して、ウエスタンブロットにおいて使用した。全ての標準及び処置サンプルについて、ジストロフィン強度の定量をFluorescence Odysseyイメージングシステムによって行い、全てのサンプルにおいて、ビンキュリン蛍光強度に対する割合を算定することによって正規化した。標準の正規化値を、既知のジストロフィン濃度に対してブロットして、最良適合の数式を得て、P-PMO処置mdxマウスの各サンプルの正規化値を内挿するため、この式を使用した。
【０２４９】
１.９  インビボDMDエクソン23スキッピングのRT-qPCR分析
ペプチド−PMOにて処置した骨格筋及び心筋組織について、マウスDMD転写からのエクソン23の排除の定量化を行った。簡単には、Trizol系抽出法を使用して、ホモジナイズした組織からRNAを抽出し、ランダムプライマーを使用して、cDNAを合成した。プライマー／プローブをIntegrated DNA Technologiesによって合成し、スキッピングしていない生成物（mDMD23-24、表６参照）を表す、エクソン23-24に及ぶ領域を増幅する、又はエクソン22及び24の境界に及ぶプローブ（mDMD22-24）を使用して、特異的に、転写欠損エクソン23を増幅するようにデザインした。各転写のレベルを、公知の転写量を使用して調製した標準曲線への較正によって測定し、スキッピング率を、［スキップ］／［スキップ＋アンスキップ］によって得た。
【０２５０】
表６：ネステッドRT-PCR法又は定量RT-PCR法によるエクソン23スキッピングの定量のためのプライマー配列及びプローブ配列
【表６】
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【０２５１】
２.結果
ここに示す結果は、ここで調製したペプチド−PMO複合体の、細胞内でのエクソンスキッピング活性における明らかな用量応答効果を証明している（図１）。また、これは、DPEP2シリーズのペプチド、すなわち、本発明のペプチドの全てが、細胞における十分な細胞浸透力を有しており、治療用と考えられることを強調している。
ここに示す結果は、さらに、適切な疾患のマウスモデルにおける、本発明のペプチド−PMO複合体のインビボ活性を強調している（図２）。全体として、結果は、本発明のペプチド複合体の活性は、前脛骨筋において最大であり、＞横隔膜＞心筋であることを示唆している。これらの結果は、本発明のDPEPsが良好なインビボエクソンスキッピング活性を有し、ジストロフィンのインビボ発現の増大を提供することを証明している。さらに、本発明のDPEPsは、同じ複合体において使用される際、少なくとも骨格筋においては、従来の細胞透過性ペプチド、例えば、「PIP」ペプチド及びR6Glyと比べて遜色がない。本発明のペプチド複合体の全てが、同じ複合体で使用される際の公知のR6Glyコンパレーターよりも高い活性を有することは注目に値する。
それ故、本発明のDPEP2ペプチドは、ヒトの神経筋系疾患の治療のための治療用複合体の効力を改善するための有望な細胞透過性ペプチドを提供する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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