(57)【要約】  本開示は、単一ステップの培養方法および下流の感度検出を通じて、食品サンプルおよび環境サンプルを含む範囲内のサンプルからのサルモネラ菌の汚染などの少量の存在の標的グラム陰性菌を検出するための迅速で便利かつ高感度の手段を提供する。【選択図】図１
2022502087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ菌または大腸菌を選択的に培養するため、任意選択で、検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌または大腸菌を培養するための方法であって、培地の中で前記検査サンプルの中に存在する微生物を培養するステップを含み、前記培地は、式Ｉの薬剤を含み、
【化１】
2022502087.tif 000024
式中、Ａは以下から選択され、
【化２】
2022502087.tif 000025
Ｒは、任意選択で置換されたＣ５〜２０アリールから選択されるが、ただし、Ａが２ＰＹである場合、Ｒは１，３−ジメチルフェニルではなく、任意選択で、
式中、Ａは２ＰＹ、３ＰＹ、４ＰＹ  ＰＺ  ＱＮまたはＨＤであり、Ｒは以下からなる群から選択され、
【化３−１】
2022502087.tif 000026
【化３−２】
2022502087.tif 000027
任意選択で、
式中、Ａは２ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｈ、ａｉ、ａｊ、ａｌ、またはｃｊから選択され、
式中、Ａは３ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｙ、ｃｃ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
式中、Ａは４ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｍ、ｃｂ、ｃｃ、ｃｊ、ｃｏ、またはｃｑから選択され、
式中、ＡはＨＤであり、Ｒはｃｄ、ｃｅ、ｃｆ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
式中、ＡはＰＺであり、Ｒはｃｂまたはｃｊから選択され、
式中、ＡはＱＮであり、Ｒはｃａである、方法。
【請求項２】
前記式Ｉの薬剤が、３ＰＹａｆ、４ＰＹａｆ、４ＰＹａｍ、４ＰＹｃｂ、４ＰＹｃｏ、４ＰＹｃｑ、４ＰＹｅｈ、ＨＤｃｂ、ＨＤｃｅ、ＨＤｃｆおよびＨＤｄｂからなる群から選択され、任意選択で前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式Ｉの薬剤が以下の濃度で前記培地に存在する、
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
任意選択で５ｍｇ／Ｌ、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌が、大腸菌を産生する志賀毒素であり、任意選択で、前記大腸菌が以下の株、すなわちＯ１５７、Ｏ１０４：Ｈ４、Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１４５、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１０３、およびＯ４５から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が１つ、２つ、３つ、または４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、任意選択でセフスロジンおよび／またはノボビオシンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が１つ、２つ、３つ、または４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、任意選択でセフスロジンおよび／またはノボビオシンを含み、任意選択で塩化第二鉄および／または亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培地がさらに、
ａ）次の濃度のセフスロジン：
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、
８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）次の量のノボビオシン：
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
１０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｃ）次の濃度の塩化第二鉄：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｄ）以下の濃度の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物、
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ、
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検査サンプルが、サルモネラ菌または大腸菌の細胞以外の少なくとも１つまたは複数の細胞を含むか、または含むと予想されるサンプルであり、
任意選択で、前記検査サンプルが、以下である少なくとも１つまたは複数の細胞を含むことが予想される：
グラム陽性菌の細胞、および／または
真菌細胞、任意選択で酵母細胞、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記検査サンプルが、
食品、任意選択で肉、ミンチを含む肉製品、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、
治療用製品、例えばワクチン、麻酔薬、薬理学的に活性な薬剤、造影剤、または尿サンプル、プロバイオティクスなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面の環境スワブ、例えば床、ドア、食品加工機器、壁；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ、または  非微生物材料を含むサンプルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記検査サンプルがグラム陰性菌の純粋な培養物ではなく、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の純粋な培養物ではない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が単一の培養ステップを含み、任意選択で単一の温度である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検査サンプルが、
ａ）約１０〜２８時間、例えば１２〜２６時間、例えば１４〜２４時間、例えば１６〜２２時間、例えば１８〜２０時間、例えば１６時間または２０時間、および／または
ｂ）２４時間未満、任意選択で２２時間未満、任意選択で２０時間未満、任意選択で１８時間未満、任意選択で１６時間未満にわたり培地で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検査サンプルが、
３０℃から４４℃、任意選択で３７℃から４２℃、任意選択で３７．５℃から４１．５℃、任意選択で３８℃から４１℃、任意選択で３８．５℃から４０．５℃、任意選択で３９℃から４０℃、任意選択で３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で１６時間、または
３０℃から４４℃、任意選択で３７℃から４２℃、任意選択で３７．５℃から４１．５℃、任意選択で３８℃から４１℃、任意選択で３８．５℃から４０．５℃、任意選択で３９℃から４０℃、任意選択で３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で２０時間、前記培地で培養され、
任意選択で、
前記サンプルが環境サンプルである場合、前記サンプルは、３０℃から４４℃、任意選択で３７℃から４２℃、任意選択で３７．５℃から４１．５℃、任意選択で３８℃から４１℃、任意選択で３８．５℃から４０．５℃、任意選択で３９℃から４０℃、任意選択で３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で１６時間培養され、
前記サンプルが食品サンプルである場合、前記サンプルは、３０℃から４４℃、任意選択で３７℃から４２℃、任意選択で３７．５℃から４１．５℃、任意選択で３８℃から４１℃、任意選択で３８．５℃から４０．５℃、任意選択で３９℃から４０℃、任意選択で３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で２０時間培養される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地が、
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン、
のいずれか１つ、いずれか２つ、またはすべてを含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の選択的な増殖のための培地であって、請求項１または２に記載の式Ｉの薬剤および少なくとも１つのさらなる薬剤を含む、培地。
【請求項１６】
前記式Ｉの薬剤が、
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満、または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、または
ｃ）５ｍｇ／Ｌ、
の濃度で前記培地に存在する、請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
前記培地が１つ、２つ、３つまたは４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、任意選択でセフスロジンおよび／またはノボビオシンを含み、任意選択で以下を含む、
ａ）以下の濃度のセフスロジン：
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、
任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）ノボビオシンを以下の量で含む、
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
１０ｍｇ／Ｌ、
任意選択で、前記培地が約１０ｍｇ／Ｌ、任意選択で１０ｍｇ／Ｌの濃度のノボビオシンを含み、また、約８ｍｇ／Ｌ、任意選択で８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジンを含む、請求項１５または１６に記載の培地。
【請求項１８】
前記培地が、塩化第二鉄および／または亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムをさらに含み、任意選択で、前記塩化第二鉄の濃度が以下であり：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または前記亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムの前記濃度が以下である、
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１９】
前記培地が、
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン、
のいずれか１つ、いずれか２つ、またはすべてを含まない、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の培地を調製する際に使用するための組成物。
【請求項２１】
請求項１または２のいずれかに定義されている式Ｉの薬剤と、セフスロジンおよびノボビオシンを含む群から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤とを含む組成物であって、任意選択で、前記組成物がセフスロジンおよびノボビオシンを含む組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、塩化第二鉄および／または亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ａ）前記式Ｉの薬剤の濃度は、１．００ｍｇ／ｍｌと１．５０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．１０ｍｇ／ｍｌと１．４０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．２０ｍｇ／ｍｌと１．３０ｍｇ／ｍｌの間であり、任意選択で濃度は１．１２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、前記式Ｉの薬剤が７０％ｖ：ｖエタノールに溶解されており、
ｂ）前記ノボビオシンの濃度は、２．００ｍｇ／ｍｌと３．００ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．１０ｍｇ／ｍｌと２．９０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．２０ｍｇ／ｍｌと２．８０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．３０ｍｇ／ｍｌと２．７０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．４０ｍｇ／ｍｌと２．６０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、前記濃度は２．７ｍｇ／ｍｌまたは２．２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．２５ｍｇ／ｍｌであり得、例えば前記ノボビオシンが７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解されており、
ｃ）前記セフスロジンの濃度は、１．４ｍｇ／ｍｌと２．０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．５ｍｇ／ｍｌと１．９ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．６ｍｇ／ｍｌと１．８ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．７ｍｇ／ｍｌと１．７ｍｇ／ｍｌの間であり、任意選択で濃度が１．８ｍｇ／ｍｌであり、任意選択で前記セフスロジンが７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解されており、
ｄ）前記塩化第二鉄の濃度は、約１０ｍｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間、例えば１００ｍｇ／Ｌと５ｇ／Ｌの間、１ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間であり、
ｅ）亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムの濃度は、約５ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間、例えば、１０ｇ／Ｌと４０ｇ／Ｌの間、または２０ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌの間である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
検査サンプルのサルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在もしくは不在を検出するための方法であって、選択的に、前記検査サンプルの中に存在する微生物細胞を培養し、任意選択で、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の微生物細胞を培養し、前記サルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在もしくは不在を検出することを含む方法。
【請求項２６】
前記検査サンプルが、
食品、任意選択で肉、ミンチを含む肉製品、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、ワクチン、麻酔薬、薬理学的活性剤、造影剤または尿サンプルなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面の環境スワブ、例えば床、ドア、食品加工機器、および壁；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、または
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ、である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養された微生物細胞が、前記検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理され、
任意選択で、前記処理が、微生物細胞の加熱、任意選択で約６０℃から約１００℃、任意選択で６５℃から１００℃、任意選択で７０℃から１００℃、任意選択で７５℃から１００℃、任意選択で８０℃から１００℃、任意選択で８５℃から１００℃、任意選択で９０℃から１００℃、任意選択で９５℃から１００℃に加熱することを含み、
任意選択で、培養された微生物細胞を約３０秒から約３０分間、任意選択で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または約２５分間、任意選択で１５から２０分加熱することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記定量化および／または検出が、前記培養された微生物細胞または前記処理された培養された微生物細胞の前記細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露し、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらすことを含み、
任意選択で、曝露することは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に生じ、任意選択で、
前記捕捉メンバーは、抗体または抗体フラグメント、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、前記抗体または抗体フラグメントは、任意選択で、アプタマーまたはアフィマーであり、任意選択で、前記捕捉メンバーは、前記サルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有し、任意選択で、前記捕捉メンバーは、サルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記捕捉メンバーが、
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、
からなる群から選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露することをさらに含み、任意選択で、検出メンバーへの前記曝露が、前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖が洗浄液に曝露された後に起こり、任意選択で前記洗浄液は、
ａ）一価イオンであって、前記洗浄液中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭ、または１００から７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００から６５０ｍＭの間であり、任意選択で、前記洗浄液中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００、または８００ｍＭ、任意選択で４７１ｍＭ、５１３．３ｍＭ、または５９９ｍＭであり、
任意選択で、前記洗浄液中の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、一価イオン、
または
ｂ）二価イオンおよび／または塩であって、前記洗浄液中の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間、１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間、任意選択で６と１２ｍＭの間、任意選択で８．４ｍＭ、６．６ｍＭ、１３ｍＭ、または２６ｍＭであり、
任意選択で、ステップ（ｖｉ）における前記洗浄液中の前記二価イオンおよび／または塩は、マグネシウムまたはカルシウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、前記二価の塩は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である、二価イオンおよび／または塩、を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出メンバーが前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して検出複合体を形成し、任意選択で前記検出メンバーが抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で前記検出メンバーが前記サルモネラ菌または大腸菌に対する特異性を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出メンバーが、
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、からなる群から選択される抗体である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出メンバーへの前記曝露が、
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
である一価のイオンおよび／または塩のモル濃度で行われ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の選択的な培養のためのキットであって、任意選択で、前記培養が請求項１〜１４のいずれか１項に従って行われ、前記キットは、
請求項１または２で定義される式Ｉの薬剤、および
セフスロジンおよび／またはノボビオシン、を含み、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、キット。
【請求項３５】
検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の選択的な培養のためのキットであって、任意選択で、前記培養が請求項１〜１４のいずれか１項に従って行われ、前記キットは、
ａ）請求項１または２のいずれかに定義されている式Ｉの薬剤、およびセフスロジン、ノボビオシン、塩化第二鉄、または亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムのいずれか１つまたは複数、
任意選択で、式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、
ｂ）請求項１または２のいずれかで定義される式Ｉの薬剤、セフスロジン、およびノボビオシン、
また、任意選択で塩化第二鉄および／または亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムをさらに含み、
任意選択で、式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、または
ｃ）請求項１または２のいずれかで定義される式Ｉの薬剤、セフスロジン、ノボビオシン、塩化第二鉄、および任意選択で亜硫酸カリウムの亜硫酸化合物、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、
を含む、キット。
【請求項３６】
検査サンプルの中のサルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在もしくは不在を検出する方法で使用するためのキットであって、任意選択で、サルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在もしくは不在を検出する前記方法は、請求項２５〜３３のいずれか１項に従って実行され、前記キットは、
ａ）請求項１または２で定義された式Ｉの薬剤、任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、
ｂ）セフスロジンおよび／またはノボビオシン、
ｃ）存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように微生物細胞を処理する薬剤、任意選択でアルコールまたは水ベースの緩衝液である、
ｄ）捕捉メンバー、
任意選択で、前記捕捉メンバーが抗体または抗体フラグメントであり、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、前記抗体または抗体フラグメントがアプタマーまたはアフィマーであり、
任意選択で、前記捕捉メンバーがグラムサルモネラ菌または大腸菌に特異的であり、任意選択で、前記捕捉メンバーがサルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体であり、
任意選択で、前記捕捉メンバーが基質または固体表面に固定化され、任意選択で中間結合パートナーを介して基質または固体表面に固定化され、任意選択で、前記中間結合パートナーがビオチンおよびストレプトアビジンを含む結合である、
ｅ）検出メンバー、任意選択で
検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントである、および／または
前記捕捉メンバーは、グラムサルモネラ菌または大腸菌に特異的である、および／または
検出メンバーは、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成する、および／または
前記検出メンバーは、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６からなる群から選択される抗体であるか、
またはＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号：
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、である、
ｆ）洗浄液の中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭ、または１００と７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００と６５０ｍＭの間である一価イオンを含む水溶液、
ｇ）二価イオンおよび／または塩を含む洗浄液、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間である、
ｈ）請求項１５〜１９のいずれかに定義されている培地、
ｉ）前記検出メンバーに特異性のある抗体、任意選択で、前記抗体は酵素結合抗体であり、任意選択でＨＲＰ結合抗体である、
ｊ）ストレプトアビジンアッセイプレート、ウェルの内面は、サルモネラ菌またはその微生物フラグメントに特異的なビオチン化ポリクローナル抗体でコーティングされている、
ｋ）本開示の第１、第２および第３の態様の方法を実施するための説明書、
ｌ）塩化第二鉄、および／または
ｍ）硫酸カリウム、
のいずれか２つ以上を含む、キット。
【請求項３７】
式Ｉの薬剤、任意選択で４ＰＹｃｑ、セフスロジンおよびノボビオシンを含む第１の組成物を含み、さらに、塩化第二鉄および亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムを含む第２の組成物を含み、任意選択で、前記第２の組成物は培地であるか、または凍結乾燥培地である、キット。
【請求項３８】
微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルの中のサルモネラ菌の細胞または大腸菌の細胞の存在を検出するための方法であって、任意選択で、前記サンプルは培養された微生物細胞のサンプルであり、
前記方法はイムノアッセイを含み、前記イムノアッセイは、検出メンバーの使用を含み、前記サンプルまたは微生物細胞は、以下の塩濃度で前記検出メンバーに曝露され、
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、前記一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、前記一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、方法。
【請求項３９】
微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルの中のサルモネラ菌または大腸菌の細胞の存在を検出するための方法であって、任意選択で、前記サンプルは培養された微生物細胞のサンプルであり、
前記方法は、イムノアッセイを含み、前記イムノアッセイは、
ａ）任意選択で、微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理されるよう、サンプルまたは培養された微生物細胞を処理すること、
ｂ）処理された培養された微生物細胞のサンプルまたは培養された微生物細胞または細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露することであって、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらし、
任意選択で、曝露することは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に生じ、任意選択で、
前記捕捉メンバーは、抗体または抗体フラグメント、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、前記抗体または抗体フラグメントは、任意選択で、アプタマーまたはアフィマーであり、任意選択で、前記捕捉メンバーは、サルモネラまたは大腸菌に対して特異性を有し、任意選択で、前記捕捉メンバーは、サルモネラに対して産生されたヒツジポリクローナル抗体であり、
任意選択で、捕捉メンバーは
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７であること、および
ｃ）前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露することであって、前記検出メンバーは、前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成し、任意選択で、前記検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、前記検出メンバーがサルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有し、任意選択で、前記検出メンバーは、
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、からなる群から選択され、
かつ
前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は、
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
の塩濃度で検出メンバーに曝されること、を含み
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、微生物検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は、本質的に生物学的なものであるため、様々な汚染微生物の増殖を促すことが可能である。米国では、毎年推定７６００万件の食中毒が発生し、６５億ドルから３４９億ドルの医療費がかかり、生産性が失われている（Ｂｕｚｂｙ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９７；Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。欧州では、サルモネラ菌の経費および医療費は６億２０００万ユーロから３０億ユーロの間であると推定されている（Ｄａｖｉｄ  Ｂｙｒｎｅ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｕｍｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２０００）。
【０００３】
サルモネラ菌、リステリア菌、カンピロバクター菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、赤痢菌は、食中毒の症例の大多数の原因である。例えば、サルモネラ菌とリステリア菌だけで、食品関連の死亡の３１％と２８％をそれぞれが占め（Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、日本では、１９８１年から１９９５年の間に発生した食中毒の総数の１４％以上をサルモネラ症が占めていた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。実際、細菌は入院を必要とする食中毒の症例の６０％もの原因物質であると推定されている。結果として、微生物の汚染に関する製品の検査が非効率的で遅いことによって、遅れが生じていることが、無駄に対する最大の原因の１つになっている。様々な検査方法で、製造業者は微生物のインキュベーションの結果を３〜７日待たなければならない。このような遅れから生じるコストは重大である。供給チェーンの効率が低下し、在庫が残り続け、腐敗が増す。
【０００４】
不適切または不十分な検査の犠牲は、それ以上のことはないにしても、コストがかかる可能性がある。例えば、Ｓａｒａ  Ｌｅｅは、１９９９年に、食品がリステリア菌の発生に関連付けられた後、Ｂｉｌ  Ｍａｒ  Ｆｏｏｄｓユニットでの３，５００万ポンドのホットドッグとデリミートのリコールに関連して、推定７，６００万ドルの費用を費やした。「Ｔｈｅ  Ｓｃｏｔｓｍａｎ」によると、２００６年にチョコレートがサルモネラ菌に汚染されたため、Ｃａｄｂｕｒｙ  Ｓｃｈｗｅｐｐｅｓは、リコール費用、広告、収益の損失、およびその後の製造業務の改善に、推定２，０００万ポンドの費用を費やした。さらに最近では、２００９年にＰｅａｎｕｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（２００８年に推定２５００万ドルの売り上げを上げている会社）が、米国のピーナッツにおける大規模なサルモネラ菌の発生源として特定された後、破産を申請した。
【０００５】
したがって、食品、飼料、環境サンプル中のサルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、およびリステリア菌などの病原性微生物の存在を検出することは、経済的に非常に重要である。しかし、そのような微生物を検出するための従来の培養方法は、労働集約的であり、時間がかかる。多くの場合、このような方法は、５０年以上使用されている標準的なプロセスに依存している。
【０００６】
さらに、病原性微生物は、「生存可能であるが培養できない（ＶＮＣ）」または「すぐに培養できない（ＮＩＣ）」として知られる重度のストレス状態の環境で長期間存続する可能性がある。このような重度のストレスを受けた微生物は、頻繁に検出の限界で弱い代謝活性しか示さず、非選択的なプレーティング培地でコロニーを形成したり、非選択的なブロス培地で増殖したりする能力を失う（Ｒｅｉｓｓｂｒｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。しかし、そのような培養不可能なコロニーが食物や動物の飼料に存在する場合、それらは摂取された場合でも依然病気を引き起こす可能性がある。このようなストレスを受けた微生物は、検出されるほど十分に復活しない可能性があり、偽陰性の結果をもたらす可能性があるため、これは検出に関して特定の問題を提起する。
【０００７】
さらに、スパイス、香料、ハーブなどの一部の特定のサンプルから、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌などの微生物を回収および検出することは、少なくとも部分的には、これらのサンプルが有している化合物の一部の増殖阻害性のために、より困難になる可能性がある。これらのサンプルタイプから微生物を回収する現在の方法は、通常、サンプルを希釈して、サンプルの望ましくない成分、すなわち、ニンニクやタマネギなどのスパイス／香料／ハーブのサンプルの増殖阻害成分、クローブのオイゲノールなど、スパイスに含まれるエッセンシャルオイルに見出せるフェノール化合物を希釈することによって実行される（図１７は、一部のハーブやスパイスに見出せる抗菌化合物の一部を示している）。例えば、クローブにおけるサルモネラ菌を検出するためのＦＤＡ承認の標準的なＢＡＭ法では、２５ｇのサンプルに対して、２５リットルの濃縮前ブロスが必要であり、この方法は実用的ではない。
【０００８】
以下は、いくつかのハーブとスパイスのＢＡＭの基準の方法に準拠するために必要な希釈因子を示している。
・黒胡椒、白胡椒、セロリシードまたはフレーク、チリパウダー、クミン、パプリカ、パセリフレーク、ローズマリー、ゴマ種子、タイム、野菜のフレーク
・ＴＳＢによる標準的な１０分の１の濃縮
【０００９】
・オニオンフレーク、オニオンパウダー、ニンニクフレーク。
・０．５％のＫ２ＳＯ３を含むＴＳＢによる標準的な１０分の１の濃縮
【００１０】
・オールスパイス、シナモン、クローブ、およびオレガノ。
・通常１：１００から１：１０００の非毒性レベルへの培地の希釈が必要である（クローブの場合）
【００１１】
ＡＦＮＯＲやＡＯＡＣなどの一部の基準の方法では、５ｇ／Ｌの濃度の亜硫酸カリウムを使用して、タマネギとニンニクに存在するアリシンを中和する。
【００１２】
スパイスは、微生物汚染の頻度が高いことで有名であり、米国とヨーロッパでのサルモネラ菌の発生の原因となっている。例えば、米国への輸入用に提供された積み荷のスパイスは、サルモネラ菌で汚染されていることが判明している。例えば、検査されたコリアンダーの粉砕サンプルの１８％、検査されたオレガノのサンプルの１０％、検査された挽いた白胡椒のサンプルの６％がサルモネラ菌で汚染されていることが判明した（Ｒｉｓｋ  Ｐｒｏｆｉｌｅ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｌｔｈ  ｉｎ  Ｓｐｉｃｅｓ（２０１７）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
【００１３】
スパイスは季節のサラダや調理済み食品に生で添加されることが多いため、スパイスの中のサルモネラ菌を検出できることは、サルモネラ菌の発生を防ぐために不可欠である。
【００１４】
標準的なＢＡＭ法ではまた、回収と検査のために採取される希釈されるサブサンプルに十分な微生物細胞が存在するように、適切に高い初期接種レベルの微生物が必要である。少なくともこの理由から、スパイス、香料、ハーブからサルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌などの微生物を回収および検出する現在の方法は、信頼性が低く、不正確であり、日常的なハイスループットで迅速な検査には適していない。
【００１５】
サルモネラ菌を検出するための標準的なＢＡＭ法では、液体培養で最初に２４時間インキュベーションし、続いて固体寒天培地で少なくとも２４時間インキュベーションし、その後、特定の生化学的特性を特定するように設計された様々な培地でさらに培養し、サルモネラ細胞が存在していることを判断するのを可能にする。したがって、ＢＡＭ法では、短期間で明確な結果を得ることができず、少なくとも数日間は結果が得られない。
【００１６】
歴史的に、シングル・ステップの培養法は１９７３年のＥｄｅｌ＆Ｋａｍｐｅｌｍａｃｈｅｒの独創的な論文に記載されているように、サルモネラ菌などのグラム陰性菌の回収率が低くなっていた（Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．１９７３；４８（２）：１６７−１７４））。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２４８１０００／この観点から、さらなる培養、プレーティング、および検出の前にそのような細胞を復活させることを目的としたいずれかの診断方法では、追加の細胞培養ステップが必要であることが広く受け入れられた。したがって、非選択的な培地での事前の濃縮化は、従来の方法の重要な要素である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。例えば、サルモネラ菌の検出には、多くの場合、５日間にも及ぶいくつかの段階の培養の速さが必要である。濃縮ステップは、「病の」細菌を復活させるための分析に含まれることが多く、検出は、そのような濃縮ブロスおよび培養物の能力によって制限されることがよくある。
【００１７】
したがって、臨床検体、食品、環境検査サンプル、および細菌の不均一な集団を潜在的に収容するその他の製品からグラム陰性菌などの微生物を回収するために、３つの一般的なタイプの培地が利用可能である：（１）一次分離用の非選択な培地、（２）濃縮ブロス、および（３）選択的および／または差次的寒天。
【００１８】
このような培地の処方は一般に複雑で、特定の細菌種の増殖を阻害するだけでなく、すなわち選択的であるだけでなく、検体に存在する微生物の予備的同定を行う上で重要ないくつかの生化学的特性を検出する成分を含む。つまり、それらは区別している。合理的な選択を行うために、微生物学者は、各処方物の組成と、含まれる各化合物の目的と相対濃度を知っていなければならない。残念ながら、利用可能な培地は頻繁に過度に複雑であり、様々な成分の効果と量は、一般にほとんど理解されていない。多くの場合、使用される媒体は、数十年にわたって使用されてきたものと同じであり、元々まったく異なる生物のために開発されていた可能性がある。例えば、これらの非効率性のために、サルモネラ菌の現在の検出率は１５日以内に５０％未満、２８日以内に９０％未満である（Ｋｉｎｇ，２００９）。
【００１９】
英国特許出願公開第２４６３３６９号明細書は、微生物から特定の材料を検出するためのアッセイ方法、ならびにその検出を可能にするそのような微生物の急速な増殖のための組成物および方法も開示している。
【００２０】
しかし、サルモネラ菌や大腸菌など、非常に少数で不均一な微生物叢環境で見られることが多いＧＧｒａｍ陰性菌の分離および／または同定を可能にする、精度と速度の向上した、新規でより優れた検出方法が、依然として必要とされている。さらに、いずれかのそのような方法は、化粧品、冷凍、凍結乾燥および液体製品を含む様々な食品、尿、便、または血液サンプルなどの臨床サンプル、および環境サンプルなどの様々な源から、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌を確実に検出できるべきである。
【００２１】
明確に定義され、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌の回収にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない、あるいは否定的な影響を与える可能性があり、ストレスを受けた微生物さえもの増殖と迅速な培養に最適な、余剰の成分を含まない培地が必要とされている。そのような培地は、二次／追加の培養ステップの必要性を否定するはずである。
【発明の概要】
【００２２】
本開示は、サンプルから、例えば、粒子状物質を含むサンプルから、例えば、食品サンプルから、グラム陰性菌、例えばサルモネラ細胞または大腸菌細胞、特に低存在量のグラム陰性菌、例えば低存在量のサルモネラ細胞または大腸菌細胞を培養するための改善された方法、培地、組成物、およびキットを提供する。これらの細胞は頻繁にストレスを受け、選択培地で回収するのが困難である。つまり、一般的に非選択的な前培養ステップが使用される。従来技術の方法は、頻繁に、ブリリアントグリーン（ＢＧ）などの化合物を利用してグラム陽性菌を阻害し、グラム陰性のサルモネラ菌（および他のグラム陰性菌または他の微生物）を検出可能なレベルまで選択的に成長させる。しかし、標的細胞、例えばサルモネラ細胞、特に低存在量および／またはストレス下のターゲットまたはサルモネラ細胞を回収するためのこれらの方法の能力が大幅に変動することにより、特に上記のサルモネラ菌の汚染を早期に確実に検出することが重要であるという観点から、これらの方法は、理想より劣ったものになっている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、対象となる特定の細菌のＬＰＳ（Ｏ抗原、コア多糖（オリゴ糖）、脂質Ａ）の一般的な構造を示し、種特異的抗体結合エピトープを含むＳサルモネラ菌ＬＰＳモノマーの詳細な図を示している。
【図２−１−２−２】ＩＳＯ検査と本開示の検査の両方に対して一次濃縮ブロスから得られたＥＬＩＳＡの値である。図２は、４１．５℃で、ＩＳＯの２ステップ濃縮プロトコルまたはセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥シングル・ステップ培養のいずれかを使用して濃縮された低レベルの複数のサルモネラ血清型を人工的に接種した様々な食品サンプルから生成されたＥＬＩＳＡ緩衝ペプトン水の光学密度（４５０ｎｍ）を示しており、ＯＤ（４５０）≧０．２０は推定上陽性の結果である。両方の場合のＥＬＩＳＡの読み取り値は、２０時間後および本推奨のＥＬＩＳＡシステムで検査した熱処理後に採取したＢＰＷサンプルを表したものである。補充されていないＢＰＷと比較して、新規の選択的濃縮ステップで光学密度が向上していることに留意されたい。２２５ｍｌのＢＰＷに、補充物（Ａｂｔｅｋ  ＲＫ２６ＳおよびＳＢ２９Ｓ）１ｍｌを追加。ＢＰＷを４１．５℃（２０時間）で補充した。食品サンプルを接種し、４℃で４８時間放置した後、培地の添加／ストーミング／インキュベートが４１．５℃で２０時間なされた。
【図３−１−３−２】図３は、複数の食品カテゴリと、競合する微生物叢を含むサンプルマトリックスとの内的方法比較研究データを示している。この対になっていない研究では、これらのサンプルに複数のサルモネラ菌の血清型（１〜５コロニー形成単位）を人工的に接種し、ＩＳＯの２ステップ濃縮プロトコル；選択的なセフスロジン、ノボビオシン、ブリリアントグリーン凍結乾燥シングル・ステップ培養；または選択的なセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥シングル・ステップ培養いずれかを使用して濃縮した。このデータは、食品マトリックスの存在下でもサルモネラ菌の増殖と回収に対するブリリアントグリーン補充の潜在的な阻害効果を示しており、基準のＩＳＯ２ステップ濃縮プロトコル、および４ＰＹｃｑを使用した本代替補充よりもパフォーマンスが劣る結果となっている。これは、ＩＳＯと４ＰＹｃｑベースの補充とを比較して、ブリリアントグリーンの補充で見られた５つの陰性の結果によって示されている。対照的に、様々な食品カテゴリ内で、４ＰＹｃｑの補充は、ブリリアントグリーンの補充よりも優れたパフォーマンスを示し、少なくともＩＳＯの基準の方法と同等のパフォーマンスを示す。
【図４−１−４−２】図４は、複数のサルモネラ菌の血清型を、緩衝液ペプトン水（ＢＰＷ）自体、またはオートミール食品マトリックスの非存在下または存在下で実行された選択的なセフスロジン、ノボビオシン、ブリリアントグリーン凍結乾燥補充、またはオートミール食品マトリックスの非存在下で実行される選択的なセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥補充のいずれかで濃縮させたＢＰＷのいずれかに、人工的に接種した、包括性研究データを示している。このデータは、ブリリアントグリーン補充の潜在的な毒性効果と、サルモネラ血清型の大部分の増殖を可能にする食品マトリックスの必要性を示している。対照的に、４ＰＹｃｑの補充は、グラム陽性菌を阻害することで優れたパフォーマンスを示し、オートミール食品マトリックスがなくてもサルモネラ菌の自由な増殖を可能にする。
【図５】図５は、複数の非サルモネラ菌種を、検査前に２０時間インキュベートして、ブレインハートインフュージョンブロスに高濃度で人工的に接種した独占研究データを示している。このデータは、候補のサルモネラ・ワン検査が非常に特異的であり、グラム陰性菌種の多様な配列と交差反応しないことを示している。
【図６−１−６−２】図６は、複数のサルモネラ菌の血清型を、選択的なセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥補充を低濃度で濃縮したＢＰＷに人工的に接種した包括性研究データを示している。このデータは、サルモネラ・ワン候補検査がサルモネラ菌に対して非常に特異的であり、選択的なセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥補充がサルモネラ菌の自由な増殖を可能にすることを示している。
【図７−１−７−３】図７は、複数の食品カテゴリと、競合する微生物叢を含むサンプルマトリックスとの内的方法比較研究データを示している。これらのサンプルには、複数のサルモネラ菌の血清型を人工的に接種し、ＩＳＯの２ステップ濃縮プロトコルまたは選択的なセフスロジン、ノボビオシン、４ＰＹｃｑ凍結乾燥シングル・ステップの培養のいずれかを使用して濃縮する。このデータは、多様なサンプルマトリックス内で本開示の検査が、少なくともＩＳＯ基準法と同様に行われていることを示しており、候補検査法および代替の培養確認法で検出できるレベルまでサルモネラ菌の増殖を可能にしていることを示している。また、ほとんどの場合、サルモネラ菌は選択的ＢＰＷからの初代継代培養で検出された。これは、ＥＬＩＳＡの陽性の基本的な確認が２４時間以内に行われ得ることを意味する。
【図８】ＢＰＷ培地のみでの様々なスパイスおよび香料からのサルモネラ菌の回収。
【図９Ａ−９Ｂ】一般的なスパイスと香料のサンプル分析−スパイス中和剤の効果。
【図１０】一般的なスパイスと香料のサンプル分析−部分的な接種レベルでの「スパイス中和剤」の効果。「スパイス中和剤」の存在下では、異なるＢＡＭ基準法（１０〜１００ｇ／１：１０〜１：１００の濃縮）とＳｏｌｕｓワン・サルモネラ菌検査法（すなわち、ワンステップ培養法）（２５ｇ／１：１０の濃縮）の間で同等性が観察される。ＢＡＭ基準法を使用したタンドリーマサラではサルモネラ菌は検出されなかったが、スパイス中和剤を使用したＳｏｌｕｓ検査法では検出が示された。これは、実験のばらつきが原因である可能性がある。これは、部分的接種レベル（２〜８ｃｆｕ）であった。したがって、「スパイス中和剤」補充を使用する方法は、サルモネラ菌が部分的なレベルで存在する場合でも、スパイス／ハーブ／香料サンプルからサルモネラ菌を検出することができる。
【図１１】一般的なスパイスと香料のサンプル分析−フルストレングスとハーフストレングスのＳｏｌｕｓ補充（４ＰＹｃｑ、ノボビオシンおよびセフスロジン）の比較。フルストレングス：５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、８ｍｇ／Ｌのセフスロジンおよび１０ｍｇ／Ｌのノボビオシン、ハーフストレングスの２．５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、４ｍｇ／Ｌのセフスロジンおよび５ｍｇ／Ｌのノボビオシン、フルストレングスとハーフストレングスのＳｏｌｕｓ補充には同等性がある。「スパイス中和剤」の補充の存在下では、異なるＢＡＭ基準法（１０〜１００ｇ／１：１０〜１：１００の濃縮）とＳｏｌｕｓワン・サルモネラ菌検査法（すなわち、ワンステップ培養法）（２５ｇ／１：１０の濃縮）の間で同等性が観察される。スパイクのないサンプルは、低いバックグラウンドを返す。これは高い接種レベル（４０〜９２ｃｆｕ）であった。
【図１２】Ｓｏｌｕｓワン・サルモネラ菌検査法における単一ストレングスと二重ストレングスでの「スパイス中和剤」の比較  このデータは、補充のストレングスの半分（ハーフストレングスの２．５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、４ｍｇ／Ｌのセフスロジン、５ｍｇ／Ｌのノボビオシン）と「スパイス中和剤」（塩化第二鉄と亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物）、オニオンパウダー、ガーリックパウダー、およびシナモンからのサルモネラ菌の回収と検出は良好であることを、やはり示している。ただし、２倍のストレングスの「スパイス中和剤」の補充が存在する場合でも、クローブとオレガノからの回収は、やはり困難である。
【図１３】個々のスパイス中和剤成分の関連性。
【図１４】ＢＡＭ基準法。
【図１５】亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物および塩化第二鉄を用いた標準的な２ステップの培養プロトコルを、塩化第二鉄、亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物、および４ＰＹｃｑ、ノボビオシンおよびセフスロジンを含む選択的補充を同様に含む本開示の単一培養法と比較した検証データ。
【図１６】該当記載なし。
【図１７】一般的なハーブやスパイスのいくつかの阻害成分の化学構造。
【図１８】条件。
【図１９】この表は、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＵＨＴ乳からの非選択的および選択的ＢＰＷからのストレスを受けたサルモネラ菌の増殖を示している。Ｓｏｌｕｓワン・サルモネラの補充はサルモネラ菌を回収させるが、非サルモネラ菌を抑制し、一方でブリリアントグリーンの補充は抑制効果を示している。
【図２０−１−２０−２】本開示による方法を使用して培養された大腸菌Ｏ１５７の検出に際したデータ。Ｓｏｌｕｓワン・大腸菌Ｏ１５７の濃縮では、ＢＰＷとトリプル補充（ＣーＸ、ノボビオシン、セフスロジン）を使用している。この例では、ハーフストレングスの補充が使用される（リットルＢＰＷブロスあたり２．２２ｍＬの組み合わせ補充、つまり２．５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、４ｍｇ／Ｌのセフスロジン、および５ｍｇ／Ｌのノボビオシン）。データは、部分的な回収である７５％の回収を示している。この補充により、２ｃｆｕの大腸菌Ｏ１５７接種が１．６８Ｅ＋０８のグラム陰性のバックグラウンドに対して通過することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
開示された１つの方法は、サンプルからのすべてのグラム陰性細胞の選択的な培養において有用であると考えられている。いくつかの実施形態において、選択的な培養は、例えばサンプルに存在するグラム陽性菌の増殖を制限することによって、サンプルの中に存在するグラム陰性菌種の増殖が妨げられない、またはほとんど妨げられずに増殖することを可能にする一方で、グラム陰性ではない細胞に対して陰性またはより重大にも陰性の増殖効果を発揮することを意味することを含む。培養の目的に応じて、例えばサルモネラ菌または大腸菌の検出では、ＥＬＩＳＡの検査でサルモネラ菌または大腸菌特異的抗体を使用するなどのことをして、下流の検出ステップを各標的細菌種に合わせて調整できる。開示された培養法は、信頼性があり、サンプルから十分なグラム陰性菌を培養するのに一貫しているので、必要に応じて、それぞれまたは標的の種の存在を後で特定することができる。したがって、標的の種は、例えば、同定または検出ステップなどの下流の処理ステップによって、同定または定量化されるべき１つまたは複数のグラム陰性菌種という意味を含む。本明細書に記載の培養方法で使用されるサンプルは、１つまたは複数の標的グラム陰性種を含み得る。
【００２５】
グラム陰性菌とは、特定のサンプルに存在する可能性のあるいずれかのグラム陰性菌という意味を含む。本開示は、少量のストレス状態から回収することが頻繁に困難であるグラム陰性菌の培養において特に有用性がある。本開示は、グラム陰性菌の培養および検出の迅速かつ高感度の手段を提供するので、本開示はまた、感染の早期かつ信頼できる確認、または環境サンプル中の細菌種の存在が非常に望まれている病原性グラム陰性菌の培養および後続的な検出において特に有用性がある。例えば、前述のように、サルモネラ菌の汚染は重要な問題である。大腸菌の病原性株、例えばＯ１５７株などの志賀毒素を産生する株の迅速で信頼性の高い検出をする。したがって、グラム陰性菌には、以下のサルモネラ種および大腸菌、例えば大腸菌株のＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ４、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１４５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ２６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１０３、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ４５という意味が含まれる。
【００２６】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＢＧおよびマラカイトグリーン（ＭＧ）などの増殖阻害染料が、サンプルの中に存在するデブリ、例えば食品粒子に異なる程度で結合すると考える。これにより、例えばグラム陽性菌の増殖を阻害するために利用できる遊離ＢＧまたはＭＧの量が異なる。これは少なくとも２つの結果をもたらす可能性がある。第１に、サンプル中の食品またはその他のデブリがＢＧまたはＭＧなどに結合する能力が高い場合、例えば、遊離のＢＧまたはＭＧの量は、グラム陽性菌の抑制を可能にするのに十分ではない可能性がある。サンプルの中に存在するサルモネラ菌細胞や大腸菌細胞などの任意のグラム陰性菌は、他の微生物に打ち負かされるに至り、偽陰性サンプルにつながる。逆に、サンプル中の食品またはその他のデブリがＢＧまたはＭＧなどに結合する能力が低い場合、培養中に遊離のＢＧまたはＭＧが過剰に存在する可能性があるが、これはグラム陽性菌の抑制の観点からは有益であり、また、サルモネラ細胞や大腸菌細胞などのグラム陰性菌、特にストレスを受けた細胞に毒性があり得る。この場合、サルモネラ細胞や大腸菌細胞などの低存在量のグラム陰性細胞のサンプル、および／または細胞にストレスがかかっているサンプルは、存在する少数の細胞が死滅するため、またはそれらの成長がＢＧまたはＭＧによって抑制されるため、偽陰性の影響を特に受けやすいと考えられる。
【００２７】
したがって、食品サンプル、臨床サンプル、またはスワブなどのサンプルからサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞を培養する方法で一般的に使用されるグラム陽性阻害剤の使用は、特に競合する微生物叢が豊富に存在する場合、および／または存在するサルモネラ細胞や大腸菌細胞などのグラム陰性菌が少量存在する場合、および／またはストレスを受けた細胞である場合には理想的ではないと考えられる。
【００２８】
本発明者らは、例えば、以下の式Ｉによって定義される特定の化合物、４ＰＹｃｑを特定した。これは、グラム陽性菌に対して有効であるが、当該の問題の影響を受けにくく、これに加えて、少量のストレスを受けた細胞を検出可能なレベルまで迅速に培養することができる。
したがって、本開示の第１の態様は、サルモネラ菌または大腸菌を含むグラム陰性菌を選択的に培養するための方法であって、例えば検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を培養するための方法を提供し、この方法は、培地の中で検査サンプルの中に存在する微生物を培養するステップを含み、培地は、式Ｉの薬剤を含み、
【００２９】
【化１】
2022502087.tif 000003
【００３０】
式中、Ａは以下から選択され、
【００３１】
【化２】
2022502087.tif 000004
【００３２】
Ｒは、任意選択で置換されたＣ５〜２０アリールから選択されるが、ただし、Ａが２ＰＹである場合、Ｒは、任意選択で、１，３−ジメチルフェニルではない。
一実施形態では、Ａは２ＰＹ、３ＰＹ、４ＰＹ  ＰＺ  ＱＮまたはＨＤであり、Ｒは以下からなる群から選択される。
【００３３】
【化３−１】
2022502087.tif 000005
【化３−２】
2022502087.tif 000006
【化３−３】
2022502087.tif 000007
【００３４】
さらなる実施形態において、式Ｉの薬剤は、以下のようなものである。
Ａは２ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｈ、ａｉ、ａｊ、ａｌ、またはｃｊから選択され、
Ａは３ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｙ、ｃｃ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
Ａは４ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｍ、ｃｂ、ｃｃ、ｃｊ、ｃｏ、またはｃｑから選択され、
ＡはＨＤであり、Ｒはｃｄ、ｃｅ、ｃｆ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
ＡはＰＺであり、Ｒはｃｂまたはｃｊから選択され、
式中、ＡはＱＮであり、Ｒはｃａである。
【００３５】
またさらなる実施形態では、式Ｉの薬剤が、３ＰＹａｆ、４ＰＹａｆ、４ＰＹａｍ、４ＰＹｃｂ、４ＰＹｃｏ、４ＰＹｃｑ、４ＰＹｅｈ、ＨＤｃｂ、ＨＤｃｅ、ＨＤｃｆおよびＨＤｄｂからなる群から選択される。
【００３６】
一実施形態では、式Ｉの薬剤は４ＰＹｃｑである。
【００３７】
【化４】
2022502087.tif 000008
【００３８】
これらの化合物のさらなる選好は、国際公開公報第２００６０７５１５９号Ａ１に見出すことができる。これらの化合物に関連する国際公開公報第２００６０７５１５９号Ａ１の教示は、参考文献、特に国際公開公報第２００６０７５１５９号Ａ１公開文書の６〜２０ページに具体的に組み込まれている。
【００３９】
式Ｉの薬剤は、国際公開公報第２００６０７５１５９号Ａ１に記載されており、グラム陰性菌と比較してグラム陽性菌に対して好ましい活性を有することが示されたが、国際公開公報第２００６０７５１５９号Ａ１で実施された検査は、微生物の純粋な培養物で実施された。例えば食品サンプルまたはプロバイオティクスサンプルに存在するような不均一な微生物叢における微生物間の相互作用は複雑であり、ただ１つの異なる微生物の存在が特定の化合物に対する別の微生物の挙動に影響を及ぼし得ることが知られている。例えば、Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ４４、Ａｎｇｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００６、Ｍｉｋｅｓｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９５：８６１−８７０、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７ＰＮＡＳ  １１４：１０４６７−１０４７２、およびＰａｒｊｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｎａｃｋｅｒｓ  ２０１８  ＩＳＭＥ  １２：２０６１−２０７５を参照されたい。
【００４０】
本開示以前は、式Ｉの薬剤が、サルモネラ菌または大腸菌の検査といったグラム陰性菌の検査などの商業的な細菌検査の間に直面するであろう様々な微生物の存在下でさえ、または、均質化された食品マトリックスの存在下などでさえ、活性を維持すると考える理由はなかった。本発明者らは、驚くべきことに、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑが活性を維持し、微生物叢の環境の変動による影響を受けないように見えることを発見した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、式Ｉの薬剤が、培養物中のデブリの存在、例えば、食物粒子の存在によって影響されないことを発見した。
【００４１】
上記の式Ｉの薬剤の設定は、本明細書で説明するすべて態様に適用される。
一実施形態では、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑは、以下の濃度の培地に存在する：
【００４２】
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
または、上記の２つの値のいずれかの範囲。
【００４３】
一実施形態では、式Ｉの薬剤は、約５ｍｇ／Ｌ、任意選択で５ｍｇ／Ｌの濃度で培地中に存在する。または、培地に約２．５ｍｇ／Ｌ、任意選択で２．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００４４】
培地はまた、サルモネラ細胞または大腸菌細胞などの所望のグラム陰性細胞のさらなる選択的増殖を可能にするために他の抗菌剤を含み得ることが理解されるであろう。例えば、一実施形態では、培地は、１つ、２つ、３つ、または４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、例えば、セフスロジンおよび／またはノボビオシンをさらに含む。
【００４５】
同じまたは異なる実施形態において、培地はまた、塩化第二鉄および／または亜硫酸化合物、例えば亜硫酸カリウムまたは亜硫酸ナトリウムを含み得る。この実施形態は、必須ではないが、スパイス、ハーブおよび香料を含む食品からサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を回収するために特に有用であると考えられている。
【００４６】
したがって、一実施形態では、本開示は、検査サンプルがスパイス、ハーブまたは香料である、検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を選択的に培養するための方法を提供する。
【００４７】
タマネギやニンニクに含まれるアリシンの抗菌性を阻害するのは、亜硫酸カリウムの亜硫酸成分であると考えられている。したがって、亜硫酸化合物には、亜硫酸カリウムや亜硫酸ナトリウムなどの亜硫酸化合物の意味が含まれる（Ｊ．Ｍｉｌｋ  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．３９．Ｎｏ．７，Ｐａｇｅｓ  ４６４−４６６  １９７６  Ｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒｓ  ｏｆ  Ｓｐｉｃｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＣＬＹＤＥ  Ｒ．ＷＩＬＳＯＮ  ａｎｄ  ＷＡＬＬＡＣＥ  Ｈ．ＡＮＤＲＥＷＳを参照）。実施形態では、亜硫酸化合物は亜硫酸カリウムである。
【００４８】
ノボビオシンはグラム陽性菌に対して有効であるが、グラム陰性菌、例えばプロテウス属および一部の大腸菌群に対していくらかの毒性があると考えられている。セフスロジンは緑膿菌に対して特に効果的である。培地は他のそのような薬剤を含み得る。
【００４９】
予期せぬことに、両方の薬剤共グラム陽性菌を標的とすると考えられているにもかかわらず、式Ｉの薬剤とノボビオシンの両方の薬剤の存在下で微生物細胞を培養することが特に有益であると考えられている。
一実施形態では、培地は、例えば、式Ｉの薬剤およびノボビオシンに加えて、緑膿菌、および／または他のシュードモナス菌の増殖を阻害するかまたは殺傷する薬剤を含むか、またはさらに含み、例えば、セフスロジンを含む。一実施形態における培地中のセフスロジンの濃度は、以下のとおりである：
【００５０】
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
【００５１】
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
【００５２】
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
【００５３】
８ｍｇ／Ｌ。
上記のように、いくつかの実施形態では、培地はノボビオシンを含み、例えば、以下の濃度のノボビオシンを含む：
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
【００５４】
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
【００５５】
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または、または
【００５６】
１０ｍｇ／Ｌ。
上記のように、培地は塩化第二鉄を含み得る。また、上記のように、これは、サンプルがスパイス、香料、またはハーブを含む場合に特に有用であると考えられているが、検査サンプルがスパイス、香料、ハーブは含まない方法で使用できる。一実施形態では、培地中の塩化第二鉄の濃度は次のとおりである：
約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
【００５７】
少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ。
【００５８】
特定の例では、培地中の塩化第二鉄の濃度は、約１．００ｍｇ／Ｌと１．５０ｍｇ／Ｌの間、例えば、１．１０ｍｇ／Ｌと１．４０ｍｇ／Ｌの間、１．２０ｍｇ／Ｌと１．３０ｍｇ／Ｌの間である。さらに特定の例では、培地中の塩化第二鉄の濃度は約１．３３ｍｇ／Ｌであり、例えば、１．３３ｍｇ／Ｌである。別の特定の実施形態では、培地中の塩化第二鉄の濃度は、１．３７ｍｇ／Ｌである。
【００５９】
当業者は、培地の塩化第二鉄の実際の濃度が、ストックの塩化第二鉄中のわずかな不純物のために、培地の引用された塩化第二鉄の濃度とわずかに異なるものになる可能性があることを理解するであろう。したがって、一実施形態では、上記の濃度は、培地中の塩化第二鉄の実際の濃度である。したがって、一実施形態では、培地中の塩化第二鉄の実際の濃度は、１．３３ｍｇ／Ｌであり、９７％純度である１．３７ｍｇ／Ｌの塩化第二鉄を含む培地を提供することによって達成される。
上記のように、培地は、亜硫酸カリウムまたは亜硫酸ナトリウム、ならびに塩化第二鉄または塩化第二鉄の代わりを含み得る。上記のように、これは、サンプルがスパイス、香料、またはハーブを含む場合に特に有用である、ただし必須ではない、と考えられているが、検査サンプルがスパイス、香料、ハーブは含まない方法で使用できる。一実施形態では、培地中の亜硫酸カリウムの濃度は次のとおりである：
約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
【００６０】
少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ。
【００６１】
特定の例では、培地中の亜硫酸カリウムの濃度は、約０．５０ｇ／Ｌと１．５０ｇ／Ｌの間、例えば、０．７５ｇ／Ｌと１．４０ｇ／Ｌの間、１．００ｍｇ／Ｌと１．３０ｇ／Ｌの間、１．１０ｇ／Ｌと１．２０ｇ／Ｌの間である。さらに特定の例では、培地中の亜硫酸カリウムの濃度は約１．００ｇ／Ｌ（０．１％ｗ／ｖ）であり、例えば、１．００ｇ／Ｌ（０．１％ｗ／ｖ）である。別の特定の実施形態では、培地中の亜硫酸カリウムの濃度は１．１１ｇ／Ｌである。
【００６２】
当業者は、培地の亜硫酸カリウムの実際の濃度が、ストックの亜硫酸カリウムのわずかな不純物のために、培地の引用された亜硫酸カリウムの濃度と非常にわずかになる可能性があることを理解するであろう。したがって、一実施形態では、上記の濃度は、培地中の亜硫酸カリウムの実際の濃度である。したがって、一実施形態では、培地の亜硫酸カリウムの実際の濃度は１．００ｇ／Ｌであり、９０％純度である１．１１ｇ／Ｌの亜硫酸カリウムを含む培地を提供することによって達成される。
【００６３】
一実施形態では、培地は以下を含む：
ａ）例えば次の濃度の式Ｉの薬剤
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
または、上記の２つの値のいずれかの範囲、
および／または
ｂ）次の濃度のセフスロジン：
ａ）１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ；および／または
ｃ）２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
ｄ）８ｍｇ／Ｌおよび／または
ｃ）濃度のノボビオシン
ａ）４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｃ）３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
ｄ）１０ｍｇ／Ｌ。
【００６４】
一実施形態では、培地は以下を含む：
ａ）例えば次の濃度の式Ｉの薬剤
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
または、上記の２つの値のいずれかの範囲、
および／または
ｂ）次の濃度のセフスロジン：
ａ）１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ；および／または
ｃ）２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
ｄ）８ｍｇ／Ｌおよび／または
ｃ）濃度のノボビオシン
ａ）４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｃ）３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
ｄ）１０ｍｇ／Ｌ；
および／または
ｃ）次の濃度の塩化第二鉄
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｅ）次の濃度の亜硫酸カリウム
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【００６５】
検査サンプルは、１つまたは複数のサルモネラ細胞または１つまたは複数の大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞を含み得る任意のサンプルであり得る。サンプルは、サルモネラ菌細胞や大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞がないことがわかっているサンプル、または陰性対照としてよく使用されるグラム陰性菌細胞がないと予想されるサンプルでもよい。
【００６６】
検査サンプルは、典型的にはグラム陰性菌細胞以外の、例えばサルモネラ細胞または大腸菌細胞以外の少なくとも１つ以上の細胞を含むか含むと予想される、あるいは、１つまたは複数の他の微生物細胞、例えば細菌細胞、例えばグラム陽性菌細胞、および／または真菌細胞、任意選択で酵母細胞を含むと予想されるサンプルである。本開示は、そのようなサンプルでの使用に特に有利であると考えられる。同じまたは異なる実施形態において、サンプルは、少量の存在のグラム陰性菌、または標的の少量の存在の特定のグラム陰性菌、例えば、少量の存在のサルモネラ細胞または少量の存在の大腸菌細胞を含むと予想されるサンプルである。
【００６７】
一実施形態では、検査サンプルは、不均一な微生物叢環境を含むか、または含むと予想される。したがって、一実施形態では、検査サンプルは、グラム陰性菌の純粋な培養物ではなく、またはいずれか１つの特定の標的グラム陰性菌種の純粋な培養物でもない、例えば、サルモネラ菌または大腸菌の純粋な培養物ではない。当業者は不均一な微生物叢環境が何を意味するかを理解し、通常、複数の種の微生物を含む、例えば、２つ以上の種の細菌、または例えば２つ以上のクラスの微生物の存在を含む、例えば、細菌および真菌を含み得る、環境を示す。
【００６８】
一実施形態では、サンプルは、不均一な微生物叢環境を含むかまたは含むと予想され、また、少量の存在の総微生物、および／または少量の存在の標的微生物、例えば、サルモネラ菌または大腸菌細胞を含むサンプルである。
【００６９】
検査サンプルは、いくつかの実施形態では、典型的には、１つまたは複数のグラム陰性細胞を含むと予想され得る任意のサンプルである。このようなサンプルの場合、特定の標的グラム陰性菌が存在するかどうかを知る必要がある。本開示の方法を使用した培養に続いて、サルモネラ菌または大腸菌細胞などのいずれかのグラム陰性細胞の存在量が増加し、特定の標的の種を下流で検出することが可能になる。本開示は、他の非微生物材料を含むサンプルからのグラム陰性菌の培養において、例えば、微生物の純粋な培養物ではないが、食品のデブリ、哺乳動物などの細胞の液体、または鳥類の細胞の液体、微生物培養物の細胞材料ではない細胞材料などの追加の材料も含むサンプルにおいて、特に有利であり、例えば、細胞材料には、唾液、生検サンプル、血液などが含まれる。
【００７０】
したがって、一実施形態では、サンプルは、以下を含む、または含むと予想されるサンプルである：
ａ）不均一な微生物叢環境、
ｂ）低存在量の総微生物、および／またはサルモネラ菌や大腸菌細胞などの低存在量の標的微生物、および
ｃ）食品のデブリなどの非微生物物質、哺乳動物などの細胞の液体、または鳥類の細胞の液体、微生物培養物の細胞材料ではない細胞材料、例えば、細胞材料には、唾液、生検サンプル、血液などが含まれる。
検査サンプルは次のとおりであってよい：
食品、例えば肉、肉製品、例えばミンチ、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料産物、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、
治療用製品、例えばワクチン、麻酔薬、薬理学的に活性な薬剤、造影剤、または尿サンプル、プロバイオティクスなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面のスワブ、例えば床、食品加工機器、ドア、および壁；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、例えば、処理ラインの機器を洗浄するために使用される水（食品の粒子を含む可能性がある）などの処理水、または野菜や肉などの生の製品を洗浄するために使用される水、これはやはり食品の粒子を含む、および／または
非微生物材料を含むサンプル。
【００７１】
食品は、あらゆる生物、例えばあらゆる哺乳類、例えば人間の食する製造物という意味を含む。一実施形態では、食品は人間用の食品である。別の実施形態では、食品は、獣医用食品、例えば、犬または猫用の食品である。
【００７２】
スパイスは通常、タマネギ、ニンニク、セロリなど、伝統的に食物とみなされてきた物質を除く、全体、粉砕された、または挽いた形のいずれかの芳香性の植物物質とみなされ、食物におけるその重要な機能は、名が表しているように、栄養ではなく調味料であり、いずれかの揮発性油またはその他の香料の原則の一部が除去されていないものである（連邦規則集によるＦＤＡの定義、［Ｔｉｔｌｅ  ２１，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｒｅｖｉｓｅｄ  ａｓ  ｏｆ  Ａｐｒｉｌ  １，２０１８−２１−−ＦＯＯＤ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧＳ；ＣＨＡＰＴＥＲ  Ｉ−−ＦＯＯＤ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＡＤＭＩＮＩＳＴＲＡＴＩＯＮ；ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＨＥＡＬＴＨ  ＡＮＤ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＶＩＣＥＳ；ＳＵＢＣＨＡＰＴＥＲ  Ｂ−−ＦＯＯＤ  ＦＯＲ  ＨＵＭＡＮ  ＣＯＮＳＵＭＰＴＩＯＮ；ＰＡＲＴ  １０１−−ＦＯＯＤ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ；
Ｓｕｂｐａｒｔ  Ｂ−−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）。
【００７３】
スパイスには、次の非限定的な例が含まれる。
【００７４】
オールスパイス、アニス、バジル、ベイリーフ、キャラウェイシード、カルダモン、セロリシード、チャービル、シナモン、クローブ、コリアンダー、クミンシード、ディルシード、フェンネルシード、フェヌグリーク、ジンジャー、西洋わさび、メイス、マジョラム、マスタードフラワー、ナツメグ、オレガノ、パプリカ、パセリ、黒コショウ、白コショウ、赤コショウ、ローズマリー、サフラン、セージ、セイボリー、スターアニス、タラゴン、タイム、ターメリック、およびパプリカ。
【００７５】
例えば、スパイスという用語には、種子、果物、根、樹皮、または主に食品の風味付け、着色、または保存に使用されるその他の植物性物質が含まれる。
【００７６】
ハーブは通常、風味付けや付け合わせに使用される植物の葉、花、または茎とみなされる。
【００７７】
スパイス、ハーブ、または香料産物には、例えば、パケットミックス調味料ミックス；乾燥ディルなどの乾燥ハーブ；新鮮なハーブ；エルブドプロバンスなどの混合ハーブ；シナモン、乾燥ペッパーコーン、ウルシなどの乾燥させた個々のスパイス；タンドリーマサラ、ガラムマサラ、バーレット調味料などのミックススパイス；乾燥タマネギや乾燥ニンニクなどの乾燥させた製品；チリパウダー、ジンジャー・パウダー、パプリカパウダー、ガーリックパウダーなどのパウダー；クミンシード、マスタードシード、フェヌグリーク種子、グリーンカルダモンポッド、またはペッパーコーン全体などの種子全体；ガーリックペーストやジンジャー・ピューレなどの液体、ペースト、ピューレが含まれる。
【００７８】
一実施形態では、スパイス、ハーブまたは香料産物は、サルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌などの微生物の増殖を阻害する、例えば、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌のような微生物の増殖を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または９０％阻害する、またはサルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌などの微生物の増殖を、約５％と９０％の間、約１０％と８０％の間、１５％と７５％の間、２０％と７０％の間、２５％と６５％の間、３０％と６０％の間、３５％と５５％の間、４０％と５０％の間、約４５％に阻害する、ある量のハーブまたはスパイスを含む製品である。
【００７９】
一実施形態では、スパイス、ハーブまたは香料産物は、標準的な培養条件下で、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌などの増殖を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または９０％阻害する、またはサルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌などの微生物の増殖を、約５％と９０％の間、約１０％と８０％の間、１５％と７５％の間、２０％と７０％の間、２５％と６５％の間、３０％と６０％の間、３５％と５５％の間、４０％と５０％の間、約４５％に阻害する。
【００８０】
「純粋な」スパイスまたはハーブ、例えばクミンの粉末のみを含むと思われるパケットとみなされるスパイス、ハーブ、または香料に加えて、スパイス、ハーブ、または香料産物は、スパイス、ハーブまたは香料がすでに添加されている、例えば、カレー例えば即席のカレーであり得る、液状の形態であり得る、などの食品に対するものであってよい。カレーは、通常、上記で定義した「スパイス製品」とはみなされない場合があるが、「スパイシー製品」、つまりスパイスが添加された製品とみなすことができる。上記のように、クローブやクミンなどの「純粋な」スパイスの抗菌因子を希釈するためには大規模な希釈因子が必要なため、カレーなどの食品に添加されるある量のスパイス、ハーブ、または香料の量に対する食品の比率は、スパイス、ハーブ、または香料において食品に添加された抗菌因子を希釈するのに十分大きいことは、期待されていない。したがって、一実施形態では、検査サンプルは「スパイシーな製品」または「味付けされた製品」であり、すなわち、大部分がスパイスおよび／またはハーブで構成されているとはみなされないが、存在する微生物がハーブおよび／またはスパイス由来の増殖阻害効果を経るのに十分なスパイスおよび／またはハーブを含むものである。いくつかの実施形態におけるスパイシーな製品は、即席のカレー、即席のカレーソースなどの食品を含む。したがって、一実施形態では、サンプルは、１つまたは複数のスパイス、ハーブ、または香料を含む食品である。
【００８１】
一実施形態では、スパイス、ハーブ、または香料産物は、スパイス、および／またはハーブ、および／または香料の少なくとも１０％ｗ／ｗとみなされるもの、例えば、スパイスおよび／またはハーブおよび／または香料の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％ｗ／ｗ、または少なくとも６０％ｗ／ｗ、または少なくとも６５％ｗ／ｗ、または少なくとも７０％ｗ／ｗ、または少なくとも７５％ｗ／ｗ、または少なくとも８０％ｗ／ｗ、または少なくとも８５％ｗ／ｗ、または少なくとも９０％ｗ／ｗ、または少なくとも９２％ｗ／ｗ、または少なくとも９４％ｗ／ｗ、または少なくとも９６％ｗ／ｗ、または少なくとも９８％ｗ／ｗ、または少なくとも９９％ｗ／ｗまたは１００％ｗ／ｗとみなされるものを含む。
【００８２】
塩化第二鉄および亜硫酸カリウムの添加は、検査サンプルがスパイス、ハーブまたは香料産物である食品である場合に有益であると考えられるので、一実施形態では、検査サンプルは、スパイス、ハーブまたは香料産物である食品ではない場合、培地は塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムを含まない。しかし、いかなる理論にも拘束されることなく、検査サンプルがスパイス、ハーブまたは香料産物ではなく、培地が塩化第二鉄および亜硫酸カリウムを含む場合、本明細書に記載の方法に有害な影響はないと考えられる。したがって、培地は、検査サンプルがスパイス、ハーブまたは香料産物を含むか、またはスパイス、ハーブまたは香料産物を含まないかにかかわらず、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムを含み得る。
【００８３】
検査サンプルは、サンプル全体であっても、均質化されたサンプルであってもよい。
【００８４】
サンプルは、任意の密度のサルモネラ細胞または大腸菌細胞などの任意の密度のグラム陰性細胞を含み得る。サンプルはまた、競合する微生物叢などの他の微生物細胞の任意の密度を含み得る。
【００８５】
サンプルは、一般に低密度のグラム陰性菌とみなされるものを含み得るか、またはサルモネラ菌または大腸菌細胞などの低密度の標的グラム陰性菌、例えば１００ｃｆｕ（一般にグラム陰性菌、またはサルモネラ菌や大腸菌などの標的細胞）／２５ｇ未満の材料を有するとみなされ得る。ここでのｃｆｕとは、グラム陰性ｃｆｕ、またはサルモネラ菌ｃｆｕや大腸菌ｃｆｕなどの標的細胞ｃｆｕ、すなわちグラム陰性菌、サルモネラ菌細胞、または大腸菌細胞を意味する。例えば、サンプルは、低密度のサルモネラ細胞を含むが、全体的に高密度のグラム陰性菌細胞を含むと予想され得る。
【００８６】
材料には、上記のように、スパイスやハーブを含む食品マトリックス、スワブ、臨床サンプル、化粧品などの、あらゆる種類のサンプルという意味が含まれる。例えば、サンプルは、９０ｃｆｕ（一般にグラム陰性菌などの標的細胞、または例えば、サルモネラ菌または大腸菌）／２５ｇ材料未満、例えば、８０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば、７０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば、６０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば、５０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば、４０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ以下、例えば３０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば２５ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば２０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば１５ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば１０ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば５ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば４ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば３ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば２ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料以下を含み得る。例えば、サンプルは、１ｃｆｕ（標的細胞）／２５ｇ材料よりも低い密度のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞を含み得、例えば、サンプルは、１ｃｆｕ（標的細胞）／５０ｇ材料、または例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／１００ｇ材料よりも低い密度のサルモネラ菌細胞、または例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／２００ｇ材料よりも低い密度のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／３７５ｇ材料よりも低い密度のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞、または例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／５００ｇ材料よりも低い密度のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞を含み得る。
【００８７】
サンプルが液体サンプルであろうと、食品、臨床または環境スワブなどの固体サンプルであろうと、サンプルが培地に入れられると、培養前に得られる培養物は、１ｃｆｕ（一般のグラム陰性菌、例えばサルモネラ菌または大腸菌などの標的細胞）／１０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／１０００ｍｌ培地の間、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／２０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／９００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／３０ｍｌ培地と１（標的細胞）ｃｆｕ／８００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／４０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／７００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／５０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／６００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／６０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／５００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／７０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／４００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／８０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／３００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／９０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／２００ｍｌ培地、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／１００ｍｌ培地の間を含み得る。
【００８８】
実施形態では、培養物は液体培養物である。しかし、開示された方法、培地、および組成物はまた、寒天培養物などの固体培養物での使用に適切であると考えられる。
【００８９】
実施形態では、本開示による培養方法は、ストレスを受けたサルモネラ菌細胞またはストレスを受けた大腸菌細胞などのストレスを受けたグラム陰性細胞の増殖を可能にし、好ましくは、非選択的培地でのストレスを受けたグラム陰性菌／サルモネラ菌／大腸菌細胞の増殖レベルに対するストレスを受けたサルモネラ菌細胞またはストレスを受けた大腸菌細胞などのストレスを受けたグラム陰性細胞の増殖の影響がないか、または実質的にない。
【００９０】
本開示のサルモネラ菌の検出方法で使用するためのサルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性細胞の適切な密度は、１０４〜１０６ｃｆｕ／ｍｌである。したがって、一実施形態では、培養方法は、少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ／ｍｌの（例えば、サルモネラ菌や大腸菌など）の標的細胞密度の結果になる。これにより、培養サンプルを、例えば、細胞をさらに濃縮するために遠心分離することを必要とせずに、本明細書に記載の検出方法で直接使用することができる。
【００９１】
本培養法は、例えば、本明細書に記載の検出方法を使用する検出を介して、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性種を検出可能なレベルまで迅速に培養することを可能にする。一実施形態では、本培養法は、培養の約１６時間、例えば培養の２０時間後に少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ例えば、一般にグラム陰性菌などの標的細胞、または例えばサルモネラまたは大腸菌）の細胞密度の結果になり、例えば培養の約１６時間後、例えば培養の２０時間後に、少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ（標的細胞）／ｍｌの細胞密度に、低い初期接種レベルから、例えば、５０ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、４５ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、４０ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、３５ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、３０ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、２５ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、２０ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、１５ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、１０ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、５ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、４ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、３ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば、２ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌ未満から、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／２２５ｍｌから至る。
【００９２】
約１６時間、例えば培養の２０時間の培養後に、は、少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ（標的細胞）／ｍｌの細胞密度に至る初期接種レベルは、１ｃｆｕ（標的細胞）／１０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／１０００ｍｌ培地の間、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／２０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／９００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／３０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／８００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／４０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／７００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／５０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／６００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／６０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／５００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／７０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／４００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／８０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／３００ｍｌ培地の間、１ｃｆｕ（標的細胞）／９０ｍｌ培地と１ｃｆｕ（標的細胞）／２００ｍｌ培地の間、例えば１ｃｆｕ（標的細胞）／１００ｍｌ培地を含み得る。
【００９３】
一実施形態では、検査サンプルは、グラム陰性菌の純粋な培養物ではなく、またはいずれか１つの特定のグラム陰性菌種の純粋な培養物でもない、任意選択で、サルモネラ菌または大腸菌の純粋な培養物ではない。そのような純粋な培養物は、標的細菌細胞のみを含むか、またはそれのみを実質的に含む培養物を含む。例えば、一実施形態では、本開示による方法は、サルモネラ菌または大腸菌などの単一種のグラム陰性菌の培養物を培地に接種することを含まない。
【００９４】
本培養法の利点は、これが、単一ステップでの１０４〜１０６ｃｆｕ（標的細胞）／ｍｌの密度などの、検出可能な密度で、例えばサルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌を含む培養物を提供することである。従来技術の培養法の多くは、サルモネラ菌または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞を回収させて増殖を開始させるための初期の非選択的濃縮培養を伴う。これにより、時間のかかるさらなる培養ステップが追加されるだけでなく、培養から検出までのアッセイ全体がより複雑になる。
【００９５】
一実施形態における本開示の培養法は、単一の培養ステップ、例えば、単一の温度での単一の培養ステップを含む。
【００９６】
一実施形態では、検査サンプルの中に存在する微生物は、３０℃と４４℃の間、例えば３７℃と４２℃の間、例えば３７．５℃と４１．５℃の間、例えば３８℃と４１℃の間、例えば、３８．５℃と４０．５℃の間、例えば３９℃と４０℃の間、例えば３９．５℃の温度で培地で培養される。実施形態では、微生物は、４１．５℃の温度で、例えば、単一の培養ステップで培養される。
【００９７】
培養法の一実施形態では、検査サンプルの中に存在する微生物は、培地中で約１０〜２８時間、例えば１２〜２６時間、例えば１４〜２４時間、例えば１６〜２２時間、例えば１８〜２０時間、例えば１６時間または２０時間培養される。
【００９８】
同じまたは別の実施形態において、検査サンプルに存在する微生物は、培地中で２４時間未満、例えば２２時間未満、例えば２０時間未満、例えば１８時間未満、例えば１６時間以下培養される。
【００９９】
他の実施形態では、検査サンプルの中に存在する微生物は、培地中で、３０℃から４４℃、例えば３７℃から４２℃、例えば３７．５℃から４１．５℃、例えば３８℃から４１℃、例えば３８．５℃から４０．５℃、例えば３９℃から４０℃、例えば３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で１６時間；または、３０℃から４４℃、例えば３７℃から４２℃、例えば３７．５℃から４１．５℃、例えば３８℃から４１℃、例えば３８．５℃から４０．５℃の間、例えば３９℃から４０℃、例えば３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で２０時間培養される。サンプルが環境サンプルである一実施形態では、サンプルは、３０℃と４４℃の間、例えば３７℃と４２℃の間、例えば３７．５℃と４１．５℃の間、例えば３８℃と４１℃の間、例えば、３８．５℃と４０．５℃の間、例えば３９℃と４０℃の間、例えば３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で１６時間培養される。別の実施形態では、サンプルが食品サンプルである場合、サンプルは、３０℃と４４℃の間、例えば３７℃と４２℃の間、例えば３７．５℃と４１．５℃の間、例えば３８℃と４１℃の間、例えば、３８．５℃と４０．５℃の間、例えば３９℃と４０℃の間、例えば３９．５℃、好ましくは４１．５℃の温度で２０時間培養される。当業者は、特定の状況、例えば食品またはサンプルの種類に応じて、培養に最適な温度および時間の長さを決定することができるであろう。
【０１００】
任意の適切な培地が本開示での使用に適切であることを理解されたい。当業者は、どの培地がサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌の培養に適しているかを理解するであろう。一実施形態では、検査サンプルの中に存在する微生物は、ペプトン、トリプトン、栄養ブロス、Ｌブロス、グラム陰性ブロス、酵母を含むトリプシン大豆ブロス、改変トリプチン大豆ブロス、および緩衝ペプトン水からなる群から選択されるベースブロスを含む栄養培地で培養される。
【０１０１】
特定の実施形態では、培地は緩衝ペプトン水を含む。
【０１０２】
ベースブロスまたは基本培地は、基本的に最小限の追加成分で細菌を補助する単純な培地である。一般に、このようなベースブロスは、まさに、エネルギー源を提供し、正しい浸透圧、ペプトン、トリプトン、栄養ブロス（ペプトン、肉抽出物、任意選択で酵母エキスと塩化ナトリウム）、Ｌ−ブロス（トリプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム）、グラム陰性用ブロス、トリプトン大豆ブロス、酵母を含むトリプトン大豆ブロス、および改変トリプトン大豆ブロスは、当技術分野で知られている適切な基本成分を維持する必要がある。ペプトンは、消化中に、酸または酵素によってタンパク質が部分的に加水分解されることによって得られる様々な水溶性タンパク質誘導体である。トリプトン大豆ブロスは、一般に、例えば、トリプトン（カゼインの膵臓消化物）、大豆ペプトン（大豆ミールの膵臓消化物）、および塩化ナトリウムを含む。
【０１０３】
改変トリプシン大豆ブロスは、デキストロース、胆汁酸塩、およびリン酸二カリウムをさらに含み得る。特に、ベースブロスは、トリプトン、栄養ブロス、Ｌブロス、グラム陰性用ブロス、ペプトン、トリプトン大豆ブロス、酵母を含むトリプトン大豆ブロス、および改変トリプトン大豆ブロスからなる群から選択される。より具体的には、ベースブロスは、ペプトン、トリプシン大豆ブロス、酵母改変トリプシン大豆ブロスおよび緩衝ペプトン水を含むトリプシン大豆ブロスからなる群から選択される。緩衝ペプトン水は、ストレスを受けたサルモネラ菌の回収に特に適していると考えられている。
【０１０４】
Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＶａｓｓｉｌｉａｄｉｓＳｏｙａ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｂｒｏｔｈ（ＲＶＳ）は、サルモネラ属菌の培養および／または検出のためにＩＳＯ規格（６５７９−１：２０１７）で使用されている。ＲＶＳブロスは、本開示のいくつかの態様に関連して有用な場合があるが、他の実施形態では、培地は、ＲＶＳブロスではない。ＲＶＳブロスは次のように処方される：
典型的な処方  ｇ／リットル
大豆ペプトン４．５
塩化ナトリウム７．２
リン酸二水素カリウム１．２６
リン酸水素二カリウム０．１８
無水塩化マグネシウム１３．５８
マラカイトグリーン０．０３３
【０１０５】
一実施形態では、培地はＲＶＳではないことが好ましい。別のまたは同じ実施形態では、培地がマグネシウムイオンおよび／または塩、例えば塩化マグネシウム、および／またはマラカイトグリーンを含まない場合が好ましい。
【０１０６】
別の実施形態では、培地は、以下のいずれか１つ、任意の２つ、またはそれらのすべてを含まない。
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン。
【０１０７】
本発明者らは、驚くべきことに、バンコマイシンとノボビオシンが特定の状況下で互いに反応する可能性があることを発見した。例えば、状況によっては、バンコマイシンとノボビオシンの両方を培地に加えると、ゼラチン状の沈殿物が生じる。したがって、培地がノボビオシンを含む一実施形態で、それはバンコマイシンを含まない。
【０１０８】
別の実施形態では、培地は、以下のいずれか１つ、任意の２つ以上、またはすべてを含まない：
ａ）胆汁酸塩、任意選択でデオキシコール酸、
ｂ）チオ硫酸ナトリウム、
ｃ）テルギトール４、
ｄ）亜セレン酸ナトリウム、
ｅ）塩化マグネシウム、
ｆ）クリスタルバイオレット、
ｇ）クエン酸ビスマスアンモニウム、および
ｈ）酸性フクシン。
【０１０９】
本開示のこの態様および他の任意の態様について、ある態様からの特定の特徴に対する任意の特定の選好を、同じまたは異なる態様における別の特徴に対する他の任意の特定の選好と組み合わせることができる。例えば、本開示による培養の方法は、以下を含み得る：
ａ）少なくとも５ｍｇ／Ｌの濃度で、４ＰＹｃｑなどの式Ｉの薬剤；８ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間の濃度のノボビオシン；６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間の濃度のセフスロジンを含む培地で、乳製品サンプルに存在する微生物を、３０℃〜４４℃で１４〜２４時間の単一培養ステップで培養するが、ＢＧを含まない。
【０１１０】
同様に、培養法は以下を含み得る：
ｂ）５ｍｇ／Ｌ  ４ＰＹｃｑ；１０ｍｇ／Ｌの濃度のノボビオシン；８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジンを含む培地でワークトップ／カウンターから採取したスワブに存在する微生物を、４１．５℃で１６時間または４１．５℃で２０時間の単一培養ステップで培養し、任意選択でＢＧを含まない、および／または任意選択でＭＧを含まない、および／または任意選択でバンコマイシンを含まない。
【０１１１】
一実施形態では、培地はバンコマイシンを含む。
【０１１２】
バンコマイシンは、本開示の式Ｉの薬剤と同様の選択的作用をグラム陽性菌に対して有すると考えられるので、本開示の実装は、式Ｉの薬剤の代わりに、またはそれに加えて、バンコマイシンでうまく機能し得ると考えられる。したがって、本開示はまた、本明細書に開示されるすべての態様および実施形態を提供するが、それにおいて式Ｉの薬剤がバンコマイシンで置き換えられている。ただし、バンコマイシンは現在、ラストチャンスの抗生物質と考えられ、その使用は、耐性微生物の出現を防ぐために一般に推奨されておらず、そのため、バンコマイシンよりむしろ式Ｉ、例えば４ＰＹｃｑの薬剤を含む本方法および組成物ならびに培地が有利であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、培地および方法は、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑの使用を含み、バンコマイシンの使用を含まない。
【０１１３】
上記から、本開示は、培地、例えば、態様１の方法での使用に適した培地も提供することが明らかであろう。したがって、第２の態様では、本開示は、態様１の方法で使用するのに適した培地を提供する。第１の態様に関連して説明されている特徴の選好は、第２の態様に適用される。
【０１１４】
したがって、一実施形態は、グラム陰性細胞の選択的増殖のための培地、例えば、サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の増殖、例えば、検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の増殖のための培地を提供し、これにおいて培地は本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤、および少なくとも１つのさらなる薬剤を含む。
【０１１５】
一実施形態では、式Ｉの薬剤は４ＰＹｃｑである。
【０１１６】
培地の別の実施形態では、式Ｉの薬剤は、以下の濃度で培地に存在する：
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満、または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
または約５ｍｇ／Ｌ。
【０１１７】
実施形態では、式Ｉの薬剤は、約５ｍｇ／Ｌ、例えば５ｍｇ／Ｌの濃度で培地に存在する。
【０１１８】
本開示の第１の態様に関連して記載されるように、本開示の培地は、１つ、２つ、３つまたは４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み得、例えば、セフスロジンおよび／またはノボビオシンを含み得る。
【０１１９】
別の実施形態では、培地は、緑膿菌の増殖を阻害するか、または殺傷する薬剤、および／または他のシュードモナス菌をさらに含み、任意選択でセフスロジンを含む。
【０１２０】
一実施形態では、培地は、以下の濃度のセフスロジンをさらに含む：
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
任意選択で８ｍｇ／Ｌ。
【０１２１】
別の実施形態において、培地は、以下の量のノボビオシンを含み得る：
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または、または
１０ｍｇ／Ｌ。
【０１２２】
培地は、特にサンプルがスパイス、香料またはハーブを含む場合、上記のように塩化第二鉄を含み得る。一実施形態では、培地中の塩化第二鉄の濃度は次のとおりである：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ。
【０１２３】
培地は、特にサンプルがスパイス、香料またはハーブを含む場合、上記のような亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含み得る。一実施形態では、培地中の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物の濃度は次のとおりである：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０１２４】
一実施形態では、培地は、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムを含まず、例えば、以下の濃度の塩化第二鉄を含まない：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または以下の濃度の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含まない：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０１２５】
特定の実施形態では、培地は、約１０ｍｇ／Ｌの濃度、例えば１０ｍｇ／Ｌのノボビオシンを含み、また、約８ｍｇ／Ｌ、例えば８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジンを含む。
【０１２６】
さらなる実施形態において、培地は、約１０ｍｇ／Ｌ、例えば１０ｍｇ／Ｌの濃度のノボビオシンを含み、約８ｍｇ／Ｌ、例えば８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジンを含み、１．３３ｍｇ／Ｌの濃度の塩化第二鉄を含み、１．００ｇ／Ｌの濃度の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む。
【０１２７】
一実施形態では、培地は、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑを含まず、ノボビオシンおよびセフスロジンを含まない。この実施形態では、培地は、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含み、例えば、以下の濃度の塩化第二鉄を含む：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、および／または
亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を次の濃度で含む：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０１２８】
この実施形態による培地は、オートクレーブにかけ、即席で保存することができ、必要に応じて式Ｉの薬剤、ノボビオシンおよび／またはセフスロジンを加えることができるので、そのような培地は有用であると考えられる。
【０１２９】
本開示の第１の態様に関しては、ベースの培地は、当業者が認識している任意の適切な培地であり得る。一実施形態では、培地は、ペプトン、トリプトン、栄養ブロス、Ｌブロス、グラム陰性ブロス、酵母を含むトリプシン大豆ブロス、改変トリプチン大豆ブロス、および緩衝ペプトン水からなる群から選択されるベースブロスを含む。
【０１３０】
特定の実施形態では、培地は緩衝ペプトン水を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本開示による培地は、以下のいずれか１つ、任意の２つ、または、またはすべてを含まない。
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン。
【０１３２】
培地がノボビオシンを含むいくつかの実施形態では、それはバンコマイシンを含まない。
【０１３３】
本開示による培地は、いくつかの実施形態では、以下のいずれか１つ、任意の２つ以上、またはすべてを含まなくてもよい。
ａ）胆汁酸塩、任意選択でデオキシコール酸、
ｂ）チオ硫酸ナトリウム、
ｃ）テルギトール４、
ｄ）亜セレン酸ナトリウム、
ｅ）塩化マグネシウム、
ｆ）クリスタルバイオレット、
ｇ）クエン酸ビスマスアンモニウム、および
ｈ）酸性フクシン。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、培地は、ＲＶＳ、またはマグネシウムイオンおよび／または塩、例えば、塩化マグネシウム、および／またはマラカイトグリーンを含む培地ではないことが好ましい。
【０１３５】
一実施形態では、培地は液体培地である。
【０１３６】
別の実施形態において、培地は、固体またはゲル培地であり、任意選択で寒天を含む。
【０１３７】
この場合も、第１の態様に関しては、ある態様からの特定の特徴に対する任意の特定の選好を、同じまたは異なる態様における別の特徴に対する他の任意の特定の選好と組み合わせることができる。したがって、一実施形態では、培地は、ペプトンベースブロス、４ＰＹｃｑ、セフスロジンおよびノボビオシンを含む。別の実施形態では、培地は、ペプトン緩衝水、５ｍｇ／Ｌの濃度の４ＰＹｃｑ、８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジン、および１０ｍｇ／Ｌの濃度のノボビオシン、ならびにさらなる抗グラム陽性菌の薬剤を含む。
【０１３８】
第３の態様では本開示は、本開示の第２の態様による培地の調製に使用するのに適切な組成を提供する。
【０１３９】
本開示による組成物は、上で定義された式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、およびセフスロジンおよびノボビオシンを含む群から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤を含む。
【０１４０】
実施形態では、組成物は、セフスロジンおよびノボビオシンを含む。
【０１４１】
実施形態では、組成物は、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、セフスロジン、およびノボビオシンを含む。
【０１４２】
別の実施形態では、本開示による組成物は、上で定義された式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、およびセフスロジンおよびノボビオシンを含む群から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤を含み、また、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む。
【０１４３】
サンプルがスパイス、ハーブまたは香料産物、スパイシーまたは味付けされた製品である場合、またはサンプルが１つまたは複数のスパイス、ハーブまたは香料を含む場合に特に有利であると考えられる別の実施形態では、組成物は、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、ならびにセフスロジン、ノボビオシン、塩化第二鉄、亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む。
【０１４４】
別の実施形態では、本開示は、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む、または本質的になる、またはそれらからなる組成物を可能にする。例えば、本開示は、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなるが、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、セフスロジン、およびノボビオシンのいずれか１つ、２つ、またはすべてを含まない組成物を可能にする。
【０１４５】
さらなる実施形態において、本開示は、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含まない組成物を提供し、例えば、以下の濃度の塩化第二鉄を含まない：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または
以下の濃度の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含まない：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０１４６】
当業者は、そのような組成物が濃縮ストック形態で供給されることが多く、その結果、組成物が培地に添加されると、正しい作動濃度が達成されることを理解するであろう。
【０１４７】
一実施形態では、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、および／またはノボビオシン、および／またはセフスロジン、および／または塩化第二鉄、および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物の濃度は、例えば培地での以下の希釈が、結果として生じる次のである濃度である：
ｉ）式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑは次のとおりである：
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
ｉｉ）ノボビオシンは次のようである：
ａ）４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｃ）３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
１０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｉｉｉ）セフスロジンは次のようである：
ａ）１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ；および／または
ｃ）２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｄ）塩化第二鉄は次のようである：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｅ）亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物は次のようである：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０１４８】
本開示による組成物の一実施形態では、以下の濃度である：
ａ）式Ｉの薬剤の濃度は１．００ｍｇ／ｍｌと１．５０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．１０ｍｇ／ｍｌと１．４０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．２０ｍｇ／ｍｌと１．３０ｍｇ／ｍｌの間であり、任意選択で濃度は１．１２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、式Ｉの薬剤が７０％ｖ：ｖエタノールに溶解されており、
ｂ）ノボビオシンの濃度は２．００ｍｇ／ｍｌと３．００ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．１０ｍｇ／ｍｌと２．９０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．２０ｍｇ／ｍｌと２．８０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．３０ｍｇ／ｍｌと２．７０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．４０ｍｇ／ｍｌと２．６０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、濃度は２．７ｍｇ／ｍｌまたは２．２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．２５ｍｇ／ｍｌであり得、例えばノボビオシンは７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解しており、
ｃ）セフスロジンは、１．４ｍｇ／ｍｌと２．０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．５ｍｇ／ｍｌと１．９ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．６ｍｇ／ｍｌと１．８ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．７ｍｇ／ｍｌと１．７ｍｇ／ｍｌの間で、任意選択で濃度が１．８ｍｇ／ｍｌであり、任意選択でセフスロジンが７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解しており、
ｄ）塩化第二鉄は約１０ｍｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間、例えば１００ｍｇ／Ｌと５ｇ／Ｌの間、１ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間であり、
および／または
ｅ）亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物は次のようである：
ｅ）約５ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間、例えば、１０ｇ／Ｌと４０ｇ／Ｌの間、または２０ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌの間である。
【０１４９】
一実施形態では、本開示は２つの組成物を可能にし、第１の組成物は、式Ｉの薬剤、ノボビオシンおよびセフスロジンを含み、第２の組成物は、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む。
【０１５０】
別の実施形態において、本開示は、式Ｉの薬剤、ノボビオシンおよびセフスロジンを含む組成物を可能にし、また、培地が塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む培地を提供する。各薬剤の濃度の選好は上記の通りである。
【０１５１】
本開示による１つまたは複数の組成物は、任意の形態で、例えば、液体または粉末として供給され得る。実施形態では、組成物は凍結乾燥される。本発明者らは、特に組成物が式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、ノボビオシンおよびセフスロジンを含む、凍結乾燥の形態の組成物に関連する驚くべき利点を特定した。
【０１５２】
一実施形態では、凍結乾燥の組成物は、式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑ、ノボビオシンおよびセフスロジンをＣーＸ：ノボ：セフの比率が１：２：１．６の比率で含み、例えば、組成物は５ｍｇの式Ｉの薬剤、例えば４ＰＹｃｑと１０ｍｇのノボビオシンと８ｍｇのセフスロジンを、例えば凍結乾燥の組成物において含み得る。
【０１５３】
上で論じたように、ある態様からの特定の特徴に対する任意の特定の選好を、同じまたは異なる態様における別の特徴に対する他の任意の特定の選好と組み合わせることができる。
【０１５４】
改良された培養方法により、細胞が最初は存在量が少ない、および／またはストレス状態にある場合でも、サルモネラ菌や大腸菌などのグラム陰性菌を検出可能なレベルまで確実かつ迅速に培養できる。したがって、本開示の第４の態様は、検査サンプル中のサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を定量化または存在または不在を検出するための方法、または例えば、検査サンプル中のサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の存在または不在を検出するための方法を提供しており、それにおいて方法は、本開示の第１の態様に従って検査サンプルに存在する微生物細胞を選択的に培養すること、および後続的にグラム陰性菌の存在または不在を検出すること、例えば、標的グラム陰性菌の存在または不在を検出すること、例えば、サルモネラ菌または大腸菌細胞の存在または不在を検出することを含む。
【０１５５】
当業者は、サルモネラ菌や大腸菌などの標的のグラム陰性種の存在または不在を検出することは、任意の適切な手段、例えばサルモネラ菌または大腸菌に特異的な核酸などが増幅および検出されるＰＣＲまたは増幅に基づくアッセイ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光法、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡの方法などで行えることを理解するであろう。本明細書に記載の培養法は、陽性のサンプルからサルモネラ菌または大腸菌細胞などの十分な標的グラム陰性菌細胞を確実に生成し、これらの方法のいずれかによる高感度の検出を可能にすると考えられる。
【０１５６】
例えば、ＢＧまたはマラカイトグリーンを含む従来の方法について、本発明者らは、特に、例えば、少量の存在量のストレスを受けたまたはストレスを受けていないサルモネラ菌または大腸菌細胞のサンプル、および／または競合する微生物叢を含む食品サンプルから得たサルモネラ菌および大腸菌などのグラム陰性細胞の一次選択的濃縮のための信頼できない選択剤であり、ＥＬＩＳＡベースの方法などの抗体ベースの方法による感度の高い検出などの高感度の検出を可能にすることができないと考えている。
【０１５７】
アッセイ方法は、直接的または間接的であり得る。「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる直接結合または非競合アッセイ（直接または間接）では、コアオリゴ糖が表面に結合し、抗体などの結合メンバーが、対象の微生物の任意のコアオリゴ糖と反応する。
【０１５８】
競合アッセイでは、検査サンプルのコアオリゴ糖は、結合メンバーへの結合について標識されたコアオリゴ糖と競合する。次に、コアオリゴ糖に結合した標識結合メンバーの量を測定する。この方法では、応答はサンプルの中のコアオリゴ糖の濃度に反比例する。これは、応答が大きいほど、「不明」または検査サンプルのコアオリゴ糖が、標識されたコアオリゴ糖と競合するために利用できなくなるためである。
【０１５９】
直接結合または非競合アッセイは、競合アッセイよりも様々な食品サンプルタイプにわたって信頼性が高い可能性があると考えられている。
【０１６０】
検査サンプルは、対象の微生物のコアオリゴ糖に対する結合特異性を有する少なくとも１つの結合メンバーに曝露される。
検査サンプルは、上で論じたような任意の検査サンプルであり得る。一実施形態では、前述のように、検査サンプルは、以下のものであり得る：
食品、任意選択で肉、肉製品、例えばミンチ、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料産物、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、ワクチン、麻酔薬、薬理学的活性剤、造影剤または尿サンプルなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面のスワブ、例えば食品加工工場の床、ドア、壁など；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ。
【０１６１】
典型的には、検査サンプルは、例えば、検査サンプル内に存在する任意の微生物からのＬＰＳから１つまたは複数のコアオリゴ糖を十分に放出するように処理される。しかし、本明細書に記載の捕捉および／または結合メンバーは、そのような処理なしでコアオリゴ糖および／またはＬＰＳに結合できると考えられるので、アッセイはまた、微生物を処理せずに機能して、１つまたは複数のコアオリゴ糖を放出すると考えられる。したがって、そのような治療ステップは任意である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、検査サンプルは、微生物の細胞膜からの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）および／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすのに適した任意の方法で処理され得る。検査サンプルを処理する方法は、英国特許出願公開第２４６３３６９号明細書Ｂ号に記載されている。
【０１６３】
検査サンプル中のサルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌の有無を定量化または検出する方法の一実施形態では、培養された微生物細胞を処理して、検査サンプル内に存在する任意の微生物から細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を放出させる。当業者は、これをいかにして達成できるかを理解する。例えば、一実施形態では、前記処理することは、微生物細胞を加熱すること、例えば、約６０℃〜約１００℃、例えば６５℃〜１００℃、例えば７０℃〜１００℃、例えば７５℃〜１００℃、例えば８０℃〜１００℃、例えば８５℃〜１００℃、例えば９０℃〜１００℃、例えば９５℃〜１００℃に加熱することを含む。一実施形態では、培養された微生物細胞を約３０秒から約３０分間、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または約２５分間、例えば１５から２０分加熱する。
【０１６４】
別の実施形態において、微生物細胞（例えば、培養培地の中）は、９０〜１００℃で２０分間、水に浸して煮立つまで加熱される。
【０１６５】
特定の実施形態において、微生物細胞（例えば、培養培地の中）は、８５℃と１００℃の間で１５〜２０分加熱される。
【０１６６】
培地の加熱は、サルモネラ菌の検出を高めると考えられている。
【０１６７】
リポ多糖（ＬＰＳ）
ＬＰＳは、すべてのグラム陰性菌および一部のグラム陽性菌の外膜に不可欠な成分である。それらは、そのような細菌に感染した患者の炎症反応に関与する主要な薬剤であると考えられている。グラム陰性菌の例には、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、カンピロバクター菌が含まれる。リステリアはグラム陽性菌である。
【０１６８】
特性決定されたＬＰＳのほとんどは、同じ主要構造を有している。ＬＰＳの構造は、脂質Ａ領域、コアオリゴ糖、ｏ−多糖鎖の３つの異なる領域で構成されていると判断されている（図１）。この構造は、ＬＰＳの脂質Ａと内核部分で特に保存されている。この構造的保存のため、脂質Ａ領域への抗体などの結合メンバーは、特定の種に特異的ではない可能性があり、いずれかの分子検出ステップで偽陽性を引き起こし得る。さらに、例えばコア領域への複数の結合メンバーの使用は、そのような結合メンバーが同じエピトープをめぐって競合する可能性があるため、またはエピトープが近接しているために互いのそれぞれの結合反応を妨げる可能性があるため、不十分である。したがって、従来技術の検出方法は、例えばサルモネラ菌の細胞表面またはべん毛に特異的な結合メンバーに依存していた。なぜなら、これらが容易にアクセス可能であるからである。
【０１６９】
ＬＰＳは通常、水性フェノールでの抽出とそれに続く精製によって、細菌から分離される。次に、単離されたＬＰＳは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析およびＮＭＲによって特性決定することができる（Ｒａｅｔｚ，１９９６）。本発明者らは、界面活性剤を利用する迅速な方法の使用および熱の適用を通じて、例えば抗体結合技術によって、コアオリゴ糖領域が放出されるか、アクセス可能または検出可能になり得ることを発見した。界面活性剤は脂質と相互作用し、結合メンバーが反応する可能性のある脂質Ａエピトープを破壊するまたは乱すことが知られているため、このような簡素な方法の使用は、例えば細胞表面の抗原またはべん毛の検出には適していない。洗剤のみを使用することもできるが、熱を使用すると、ＬＰＳが検出可能なモノマーに分解され、病原菌を殺すという追加の利点があるため、さらに有利になる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、細胞が処理されると、本開示による方法は、培養された微生物細胞または処理された培養された微生物細胞の細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露し、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらすことを含み、例えば、このステップは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在する任意の微生物から得た細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に、実施され得る。
【０１７１】
一実施形態では、捕捉メンバーは、抗体または抗体のフラグメントであり、任意選択で、ビオチン化抗体または抗体のフラグメントであり、例えば、捕捉メンバーは、サルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体であり得、またはモノクローナル抗体であり得、例えば、捕捉メンバーは、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６抗体のいずれかであり得る。
【０１７２】
実施形態で、捕捉メンバーが基質または固体表面に固定化され、例えば中間結合パートナーを介して基質または固体表面に固定化され、例えば、中間結合パートナーがビオチンおよびストレプトアビジンを含む結合である。これにより、培養された微生物細胞または細菌のＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖が表面に固定化される。
【０１７３】
他の実施形態、例えば競合アッセイでは、検査サンプルは、既知または標準量のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーがすでに固定化されている表面に適用されるか、または接触される。既知または標準の両方からのコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、少なくとも１つの結合メンバーへの結合について、検査サンプル由来のコアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーと競合する。コアオリゴ糖、ＬＰＳまたはモノマーは、例えば、非共有疎水性相互作用によって、または上記のように間接的に、前記表面に直接固定化することができる。
【０１７４】
検査サンプルは、少なくとも１つの捕捉メンバーに十分な時間さらされて、培養された微生物細胞または細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖が、少なくとも１つの結合メンバーに結合して、複合体、例えばコアオリゴ糖／捕捉メンバー複合体を形成することを可能にする。適切な時間は、約１分から約４時間、特に約３０分から約２時間、特に約４５分、１時間および１．５時間を含む。
【０１７５】
一実施形態では、少なくとも１つの捕捉結合メンバーは、抗体、コンジュゲートまたは他のリンケージなどの中間結合パートナーを介して基質または表面に固定化される。
【０１７６】
一実施形態では、中間結合パートナーは、ビオチンおよびストレプトアビジンを含むリンケージである。
【０１７７】
実施形態では、第１の捕捉メンバーは、ビタミンビオチンとコンジュゲートされ、次いで、ストレプトアビジンプレートにコンジュゲートされる。
【０１７８】
本発明者らは、中間結合パートナーの使用は、捕捉結合メンバー、例えば抗体のより効果的な提示をもたらし、例えば最大ｌｏｇ１０５ＣＦＵ／ｍｌから１０４ＣＦＵ／ｍｌのより良好な分析の感度が得られることを見出した。さらに、このフォーマットでは、使用する抗体の量が少なくなり、特徴的に低いバックグラウンドシグナルが得られる。
【０１７９】
コアオリゴ糖、ＬＰＳおよび／または他の微生物フラグメントが結合する表面または基質（例えば、第１の捕捉メンバーおよび中間結合パートナーを介して）は、当技術分野で知られている材料、例えば、有機ポリマー、例えばプラスチック、ガラス、セラミックなどであり得る。特定の有機ポリマーには、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース、およびニトロセルロースが含まれる。適切なポリマーは、ポリスチレン、より具体的にはガンマ線照射ポリスチレンであり得る。表面自体は、シート、マイクロプレートまたはマイクロタイタープレート、トレイ、膜、ウェル、ペレット、ロッド、スティック、チューブ、ビーズなどの形態または一部であり得る。
【０１８０】
一実施形態では、検査サンプルは、ラテラルフローイムノアッセイ検査でアッセイすることができる。
【０１８１】
実施形態では、培養された微生物細胞または細菌ＬＰＳおよび／または処理された培養された微生物細胞のコアオリゴ糖は、例えば上記のように、抗体、コンジュゲートまたは他のリンケージなどの中間結合メンバーを使用することにより、表面に固定化される。
【０１８２】
一実施形態では、捕捉メンバーは、微生物に特異的であり、例えば、細菌に特異的であり、例えば、グラム陰性菌に特異的である。好ましくは、捕捉メンバーは、サルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有する。
【０１８３】
一実施形態では、捕捉メンバーは、以下からなる群から選択される：
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６抗体のいずれか、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７。
【０１８４】
本開示による１つの方法のさらなる実施形態では、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は、検出メンバーに曝露される。例えば、いくつかの実施形態では、検出メンバーへの前記曝露は、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳ／および／またはコアオリゴ糖が洗浄液にさらされた後に起こる。当業者は、サンプルからいずれかの結合していない捕捉メンバーを洗浄する必要性を理解するであろう。一実施形態では、洗浄液は、以下を含む：
ａ）洗浄液の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭである一価イオン、または１００から７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００から６５０ｍＭの間、任意選択で、洗浄液に存在する一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００、または８００ｍＭ、任意選択で４７１ｍＭ、５１３．３ｍＭ、または５９９ｍＭである、
任意選択で、前記洗浄液の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、
または
ｂ）二価イオンおよび／または塩、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間、１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間、任意選択で６と１２ｍＭの間、任意選択で８．４ｍＭ、６．６ｍＭ、１３ｍＭ、または２６ｍＭである、
任意選択で、洗浄液の二価イオンおよび／または塩は、マグネシウムまたはカルシウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、二価の塩は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である。
【０１８５】
一実施形態では、洗浄緩衝液は、上記のモル濃度に到達するように添加された追加の一価イオンおよび／または塩を含むトリス緩衝液を含み得る。
【０１８６】
洗浄緩衝液は、洗剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、例えば１〜１０ｍＭ、例えば３〜５ｍＭ、例えば４ｍＭを、含み得る。
【０１８７】
一実施形態では、洗浄液中の一価のイオンおよび／または塩のモル濃度は、７００と８００ｍＭの間、例えば７５０ｍＭである。
【０１８８】
さらなる実施形態では、洗浄液中の一価のイオンおよび／またはモル濃度は、５５０と６５０ｍＭの間、例えば５９９ｍＭである。
【０１８９】
一実施形態では、洗浄液中の一価のイオンおよび／または塩のモル濃度は、５００と５５０ｍＭの間、例えば５１３．３ｍＭである。
【０１９０】
一実施形態では、洗浄液中の一価のイオンおよび／または塩のモル濃度は、４５０と４８０ｍＭの間、例えば４７１ｍＭである。
【０１９１】
一実施形態では、洗浄液中の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムのイオンおよび／または塩である。
【０１９２】
一実施形態では、洗浄液に存在する一価の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌである。
【０１９３】
一実施形態では、検査サンプルおよび少なくとも１つの第２の結合メンバーは洗浄液に曝露され、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌのモル濃度は、少なくとも１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、５００ｍＭ、５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、５７５ｍＭ、６００ｍＭ、６２５ｍＭ、６５０ｍＭ  ６７５ｍＭ、７００ｍＭ、７２５ｍＭ、７５０ｍＭ、７７５ｍＭ、８００ｍＭ、８２５ｍＭ、または８５０ｍＭである。
【０１９４】
一実施形態では、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌ洗浄液のモル濃度は７００ｍＭと８００ｍＭの間、例えば７５０ｍＭである。
【０１９５】
さらなる実施形態において、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌ洗浄液のモル濃度は５５０ｍＭと６５０ｍＭの間、例えば５９９ｍＭ（３．５％ＮａＣｌ）である。
【０１９６】
一実施形態において、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌ洗浄液のモル濃度は５００ｍＭと５５０ｍＭの間、例えば５１３．３ｍＭ（３％ＮａＣｌ）である。
【０１９７】
一実施形態では、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌ洗浄液中の濃度は４５０〜４８０ｍＭ、例えば４７１ｍＭ（２．７５％ＮａＣｌ）である。
【０１９８】
４７１ｍＭと５９９ｍＭの間、例えば５１３．３ｍＭのモル濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌおよび／またはＬｉＣｌを含む洗浄液は、例えば家禽サンプルから生じる偽陽性シグナルの頻度を低減するのに適している（例５に示すように）。
【０１９９】
一実施形態では、洗浄緩衝液中のＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌの４５０と４８０ｍＭの間、例えば４７１ｍＭのモル濃度は、検出メンバーが、コアオリゴ糖に特異性を有するマウスモノクローナル抗体である、例えば３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、Ｔ６と呼ばれる抗体であるか、またはサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異性を有する同様の市販のモノクローナル抗体；または大腸菌に特異性を有する抗体であるとき、検査サンプル中のサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性種を検出するのに適している。
【０２００】
一実施形態では、検査サンプルおよび少なくとも１つの検出メンバーは、二価イオンおよび／または塩の洗浄液に曝露され、この場合二価イオンおよび／または塩のモル濃度は１と３０ｍＭの間、例えば５と１５ｍＭの間、例えば１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間である。
【０２０１】
一実施形態では、洗浄緩衝液は、二価イオンおよび／または塩が添加されたトリス緩衝液を含み得る。
【０２０２】
洗浄緩衝液は、洗剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、例えば１〜１０ｍＭ、例えば３〜５ｍＭ、例えば４ｍＭを含み得る。
【０２０３】
一実施形態では、洗浄液に存在する二価イオンおよび／または塩のモル濃度は、２０ｍＭ〜３０ｍＭ、例えば２６ｍＭ（０．２５％ＭｇＣｌ２）である。
【０２０４】
一実施形態では、洗浄液に存在する二価イオンおよび／または塩のモル濃度は、１０ｍＭと２０ｍＭの間、例えば１３ｍＭ（０．１２％ＭｇＣｌ２）である。
【０２０５】
一実施形態では、洗浄液に存在する二価イオンおよび／または塩のモル濃度は、５ｍＭ〜１０ｍＭ、例えば６．６ｍＭ（０．０６２％ＭｇＣｌ２）である。
【０２０６】
一実施形態では、洗浄液に存在する二価イオンおよび／または塩のモル濃度は、７ｍＭ〜１０ｍＭ、例えば８．４ｍＭ（０．０８％ＭｇＣｌ２）である。
【０２０７】
一実施形態では、洗浄液中の二価イオン／塩は、マグネシウムまたはカルシウムのイオン／塩である。
【０２０８】
別の実施形態では、二価の塩はＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である。
【０２０９】
一実施形態では、検査サンプルおよび検出メンバーは、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２の洗浄液に曝露され、この場合二価ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２のモル濃度は１と３０ｍＭの間、例えば５と１５ｍＭの間、例えば１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間である。
【０２１０】
一実施形態において洗浄液のＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２のモル濃度は、２０ｍＭと３０ｍＭの間、例えば２６ｍＭ（０．２５％ＭｇＣｌ２）である。
【０２１１】
一実施形態において洗浄液のＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２のモル濃度は、１０ｍＭと２０ｍＭの間、例えば１３ｍＭ（０．１２％ＭｇＣｌ２）である。
【０２１２】
一実施形態において洗浄液のＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２のモル濃度は、５ｍＭと１０ｍＭの間、例えば６．６ｍＭ（０．０６２％ＭｇＣｌ２）である。
【０２１３】
一実施形態において、洗浄液のＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２のモル濃度は、７ｍＭと１０ｍＭの間、例えば８．４ｍＭ（０．０８％ＭｇＣｌ２）である。
【０２１４】
一実施形態では、洗浄緩衝液中のＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２の２６ｍＭ、１３ｍＭ、６．６ｍＭ、および８．４ｍＭのモル濃度は、検出メンバーが、コアオリゴ糖に特異性を有するマウスモノクローナル抗体である、例えば３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、Ｔ６と呼ばれる抗体であるか、またはサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異性を有する同様の市販のモノクローナル抗体；または大腸菌に特異性を有する抗体であるとき、検査サンプル中のサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性種を検出するのに適している。
【０２１５】
本開示のこの態様は、偽陽性の結果の頻度を以下によって減らすことができるという発明者の驚くべき観察を反映している：
ａ）洗浄緩衝液中に存在する一価イオンおよび／または塩のレベルの増加；または
ｂ）洗浄緩衝液中に存在する低レベルの二価イオンおよび／または塩の存在。
【０２１６】
上記のように、捕捉された細胞または細菌のＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は、検出メンバーが捕捉された複合体と結合するのに十分な時間、検出メンバーに曝されるべきである。例えば、適切な時間は、約１分から約４時間、特に約３０分から約２時間、特に約４５分、１時間および１．５時間を含む。
【０２１７】
検出メンバーが、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合したら、検出複合体が形成される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、検出メンバーは、微生物に特異的であり、例えば、細菌に特異的であり、例えば、グラム陰性菌に特異的である。好ましくは、検出メンバーは、サルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有する。
いくつかの実施形態では、検出メンバーは、以下からなる群から選択される抗体である：
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６抗体のいずれか、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７。
【０２２０】
当業者は、抗体が生理学的塩の濃度で最適に機能する傾向があることを理解するであろうが、本発明者らは、サンプルが驚くほど低い塩の濃度、つまり当業者がアッセイの最適化の一部として定期的にテストするものを超える濃度で、検出メンバーに曝露されるとき、驚くべきことに感度が１０倍増加することを見出した。例えば、一実施形態では、前記検出メンバーへの前記曝露が、以下である一価のイオンおよび／または塩のモル濃度で行われる：
【０２２１】
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０２２２】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、２００ｍＭ以下、例えば、１５０または１３７または１２０または１００または５０または４０ｍＭ未満である、例えば、２０と１２０ｍＭの間または２０と８０ｍＭの間または２０と５０ｍＭの間、例えば３４ｍＭ（例えば０．２％ＮａＣｌ）または６８ｍＭ（例えば０．４％ＮａＣｌ）である。
【０２２３】
例えば、０．２％のＮａＣｌでは、例えば０％のＮａＣｌまたは０．４％のＮａＣｌよりも強い信号が得られる可能性があると考えられるが、これらは０．６％または０．８％の（またはそれより高い）ＮａＣｌよりも依然強い場合がある。例えば、抗体３Ｄ１１  ＨＲＰコンジュゲートを使用する。同様の結果は、他の同様の抗体、例えば、Ｇ７などと呼ばれるサルモネラコアオリゴ糖に特異性を有する抗体、または以下でさらに論じられるサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異性を有する同様の市販のモノクローナル抗体；および／または、例えば以下でさらに議論されるようなサルモネラ菌の検出に有用である可能性のある他の抗体で得ることができる。
【０２２４】
また、同様の結果は、ＫＣｌ、例えば、さらなる一価の塩でも得られる可能性がある。
【０２２５】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝す間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、生理学的な塩の濃度よりも低い。
【０２２６】
生理学的な塩の濃度は約１３７ｍＭ（０．８％ＮａＣｌ）と考えられている。一実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝す間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、１３７ｍＭ（０．８％ＮａＣｌ）よりも低い。
【０２２７】
さらなる実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、１００ｍＭと１１０ｍＭの間、例えば１０２．７ｍＭ（０．６％ＮａＣｌ）である。
【０２２８】
さらなる実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、６０ｍＭと７０ｍＭの間、例えば６８．４ｍＭ（０．４％ＮａＣｌ）である。
【０２２９】
さらなる実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する間に得られる一価イオンおよび／または塩のモル濃度は、３０ｍＭと４０ｍＭの間、例えば３４．２ｍＭ（０．２％ＮａＣｌ）である。
【０２３０】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムおよび／またはカリウムイオンおよび／または塩である。
【０２３１】
実施形態では、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に存在する一価の塩は、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０２３２】
実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する際の固定化検査サンプルおよび第２の結合メンバーは、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１０５ｍＭ、１１０ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１３５ｍＭ、１４０ｍＭ、１４５ｍＭ、または１５０ｍＭ以下の生じるモル濃度のＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌに曝露される。典型的には、それらは、０、１５または２０ｍＭと１３７、１２０、１１０、１００、８０、７０または６０ｍＭの間、例えば３０から４０ｍＭ、例えば３４ｍＭの結果として生じるモル濃度のＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌに曝露される。
【０２３３】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露している間に得られるＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌの生理学的濃度と同等またはそれ以下である。
【０２３４】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に存在するＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌの結果として生じるモル濃度は、１３７ｍＭ未満である。
【０２３５】
さらなる実施形態において、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に得られるＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、１３０ｍＭと１４０ｍＭの間、例えば、１３７ｍＭである。
【０２３６】
さらなる実施形態において、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に存在する結果として生じるＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、１００ｍＭと１１０ｍＭの間、例えば、１０２．７ｍＭである。
【０２３７】
さらなる実施形態において、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に存在する結果として生じるＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、６０ｍＭと７０ｍＭの間、例えば、６８．４ｍＭである。
【０２３８】
さらなる実施形態において、捕捉された検査サンプルの検出メンバーへの曝露中に存在する結果として生じるＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、３０ｍＭと４０ｍＭの間、例えば、３４．２ｍＭである。
【０２３９】
一実施形態では、捕捉された検査サンプルを検出メンバーに曝露する間に得られる、約１３７ｍＭ、１０２．７ｍＭ、６８．４ｍＭまたは３４．２ｍＭ以下のＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌのモル濃度は、検出メンバーが、コアオリゴ糖に特異性を有するマウスモノクローナル抗体である、例えば３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、Ｔ６と呼ばれる抗体であるか、またはサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異性を有する同様の市販のモノクローナル抗体である場合；および／またはサルモネラ菌の検出に有用な検出メンバーが存在する場合、検査サンプル中のサルモネラ菌を検出するのに適している。
【０２４０】
上記のように、本発明者らは、驚くべきことに、検出メンバーとのインキュベーションのための緩衝液中の一価イオンおよび／または塩、例えばナトリウム、リチウムおよびカリウムイオンおよび／または塩のレベルの低下が、アッセイの感度を著しく改善することを見出した。出願人の知る限り、検査サンプルの少なくとも１つの検出メンバーとインキュベーションする最中に存在する、より低いレベルの一価イオンおよび／または塩が、アッセイの感度を改善し得ることを教示する当技術分野の兆候は、存在していない。
【０２４１】
さらに、出願人は、驚くべきことに、ステップ（ｉｖ）中に３４．２ｍＭ（０．２％ｗ／ｖ）の結果のモル濃度のＮａＣｌ（例である）が、より高い結果のＮａＣｌのモル濃度、例えば６８．４ｍＭ、１０２．７ｍＭ、または１３７ｍＭよりも大きな信号対雑音比を、サルモネラ菌株が１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ（実施例３を参照）などの低濃度で存在する場合、生成することを発見した。さらに、ＮａＣｌは、得られるモル濃度が低いと、アッセイの感度が向上するため、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどサルモネラ菌の菌株を、１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌまでの濃度で検出できる。
【０２４２】
抗体は通常、生理学的塩濃度以上でアッセイされ、生理学的濃度よりも低い結果の塩のモル濃度を選択することは、当技術分野での通例の慣行ではないことに留意することが重要である。出願人は、より低い塩濃度を含むコンジュゲート緩衝液が、アッセイの感度に対して予想外の技術的に有利な効果をもたらすことを示した。
【０２４３】
代替の実施形態では、第２の結合メンバーの緩衝液は、マグネシウムイオンおよび／または塩を含み得る。
【０２４４】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本開示による１つの培養法は、サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの十分な数の標的グラム陰性細胞の迅速な培養および産生を可能にし、ＰＣＲおよび他の分子ベースの方法などの多くの方法による検出を可能にする。本明細書に記載されるように、検出法がＥＬＩＳＡの方法を含む場合、それは特定の利点を有する。本開示による培養法がなければ、標準的なＥＬＩＳＡアッセイは、例えば１６から２０時間の短い培養期間の後に、サルモネラ細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞を検出するのに十分な感度がないと考えられる。定量化または検出の方法の感度は、サンプルを検出メンバーに曝露する際に低い塩の濃度を採用することによって大幅に向上する。したがって、本開示による培養法と、低い塩の濃度での検出メンバーを用いた検出／定量化の方法との組み合わせは、感度に相乗的なプラスの効果をもたらすと考えられる。
この場合も、当業者は、検出メンバーへの曝露に続いて、結合していないいずれかの検出メンバーを除去する必要があることを理解するであろう。したがって、一実施形態では、開示された方法はさらに、検出複合体を、以下を含む洗浄液に曝露することを含む：
ａ）洗浄液の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭである一価イオン、または１００から７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００から６５０ｍＭの間、任意選択で、洗浄液に存在する一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００、または８００ｍＭ、任意選択で４７１ｍＭ、５１３．３ｍＭ、または５９９ｍＭである、
任意選択で、前記洗浄液の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、
または
ｂ）二価イオンおよび／または塩、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間、１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間、任意選択で６と１２ｍＭの間、任意選択で８．４ｍＭ、６．６ｍＭ、１３ｍＭ、または２６ｍＭである、
任意選択で、洗浄液の二価イオンおよび／または塩は、マグネシウムまたはカルシウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、二価の塩は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である。
【０２４５】
検出メンバーの検出は、元の検査サンプル中のサルモネラ細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在の指標であることが理解されよう。したがって、方法の一実施形態では、サルモネラ細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在または不在の前記検出、またはサルモネラ細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の定量化は、検出メンバーの存在または不在の検出などを含み、検出メンバーの存在または不在の前記検出は、上記のように、洗浄液への曝露後に起こる。
【０２４６】
当業者は、例えば、検出メンバーの検出を可能にするために利用可能な様々な手段を理解するであろう。検出メンバーの存在または不在の前記検出は、検出メンバーに特異性を有する抗体への曝露を含み得、任意選択で、抗体は、酵素結合抗体、任意選択で、ＨＲＰ結合抗体である。好ましくは、酵素は観察可能な色の変化をもたらし、任意選択で、酵素基質の添加時に観察可能な色の変化をもたらす。
【０２４７】
方法は、例えば、実施例、例えば実施例５に記載されているのと同様の方法で実施することができる。通常、検査サンプルは、９０〜１００℃で１５〜２０分間加熱し、アッセイ前に室温まで冷却することができる。さらなる実施形態では、マイクロプレートの内面は、捕捉メンバー、例えば、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体でコーティングされている。さらなる実施形態において、第１の捕捉結合メンバーは、中間結合メンバーを介してアッセイプレートに結合される。次に、検査サンプルを吸引し、ウェルを洗浄緩衝液、例えば５９９ｍＭ（３．５％）のＮａＣｌまたは８．４ｍＭ（０．０８％）のＭｇＣｌ２、次にサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異的なＨＲＰコンジュゲート抗体などの検出メンバーに曝露し、３７±１℃で３０分間インキュベートした。別の実施形態では、第２の結合メンバーは、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、Ｔ６と呼ばれる抗体、またはサルモネラ菌のコアオリゴ糖に特異性を有する同様の市販のモノクローナル抗体である。別の実施形態では、捕捉された検査サンプルはまた、他の微生物成分に特異性を有するＨＲＰ結合抗体などの別の第２の結合メンバーに曝露される。次に、ウェルの内容物を吸引し、例えば５９９ｍＭ（３．５％）のＮａＣｌまたは８．４ｍＭ（０．０８％）のＭｇＣｌ２含む洗浄緩衝液にてウェルを洗浄し得る。別の実施形態では、コンジュゲート抗体の結合は、比色エンドポイント検出システムによって検出される。例として、次いで例えば、ＨＲＰの基質を添加し、続いて、インキュベーションおよび停止溶液（例えば、０．１ＭのＨ２ＳＯ４）を、例えば実施例４で説明されているように、必要に応じて添加できる。
【０２４８】
実施形態では、検出方法は、サルモネラ菌１コロニー形成単位（ｃｆｕ）を、スワブごとに、１０８〜１０９ｃｆｕもの別の微生物、例えば大腸菌などの出発サンプルなどにおいて、検出／区別することができるべきである。特定の検出限界は、サンプルのサイズ（ｍｇ、ｇなど）、または体積（ｍｌ、Ｌなど）の単位当たり１０４〜１０６ｃｆｕ度である。
【０２４９】
上で説明したように、本開示のこの態様および他の任意の態様について、ある態様からの特定の特徴に対する任意の特定の選好を、同じまたは異なる態様における別の特徴に対する他の任意の特定の選好と組み合わせることができる。
一実施形態は、検査サンプル中のサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌を定量化または存在または不在を検出するための方法を提供し、この方法は以下を含む：
ａ）検査サンプル中の微生物細胞を培養すること、任意選択で、微生物細胞は、本開示の第１の態様の方法に従って培養される、
ｂ）任意選択で、培養された微生物細胞を、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理すること、
ｃ）培養された細胞または処理された培養検査サンプルの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露し、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらすこと、任意選択で、捕捉メンバーはヒツジポリクローナル抗体であるか、またはサルモネラ菌に対して産生された３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６抗体のいずれかなどのモノクローナル抗体である、
ｄ）捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露して、検出複合体を形成すること、この場合検出メンバーは、サルモネラ菌に特異的な抗体であり、前記検出メンバーへの前記曝露は、以下の一価のイオンおよび／または塩のモル濃度で行われる：
ｉ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｉｉ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｉｉｉ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０２５０】
ｆ）検出複合体の存在または不在を検出すること、任意選択で、前記検出は、検出メンバーに特異性を有する酵素結合抗体、任意選択でＨＲＰ結合抗体または他の適切に標識された抗体、例えば、フルオロフォア標識抗体に対する検出複合体の曝露を含む、
この場合、検出複合体の存在の検出は、最初の検査サンプルの中のサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性細胞の存在を示す。
【０２５１】
捕捉メンバーおよび検出メンバー
典型的には、アッセイにおいて様々な方法で使用される１つ以上の捕捉メンバーおよび検出メンバーは、抗体、より具体的にはアフィニティー精製抗体、さらにより具体的にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。本開示によるアッセイで使用するための抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。そのような抗体は一本鎖からなり得るが、少なくとも軽鎖または重鎖からなるであろう。しかし、コアオリゴ糖または抗体が結合特異性を有する微生物汚染物質などの標的に結合するために、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が必要であることが理解されるであろう。
【０２５２】
一実施形態では、捕捉メンバーまたは検出メンバーは、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌のコアオリゴ糖または微生物フラグメントに結合特異性を有する。したがって、例えば、１つまたは複数の捕捉メンバーおよび／または１つまたは複数の検出メンバーは、サルモネラ菌または大腸菌のコアオリゴ糖または微生物フラグメントに結合特異性を有し得る。通常、１つ以上の捕捉メンバーは、１つ以上の検出メンバーとは異なる場合がある。例えば、捕捉メンバーおよび検出結合メンバーは、異なる方法で調製され得、および／または異なるエピトープに結合するとみなされ得る（捕捉メンバーおよび検出メンバーによって認識されるエピトープの間にいくらかの重複がある場合でも）。
【０２５３】
一実施形態では、少なくとも１つの捕捉メンバーは、体細胞およびべん毛に基づくサルモネラ菌の抗原の結合特異性を有する。
【０２５４】
一実施形態では、少なくとも１つの捕捉メンバーは、ヒツジポリクローナル抗体である。一実施形態では、精製された捕捉メンバーはビオチン化されている。
【０２５５】
別の実施形態では、検出メンバーは、サルモネラ菌または大腸菌などの他のグラム陰性菌の広大な大部分の場所に存在する、保存されたＬＰＳ／コアオリゴ糖エピトープを有さない可能性があるサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌に存在する１つまたは複数の抗原に対する結合特異性を有する。このような抗原は、サルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌に固有ではない場合があるが、特にサルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌に特異的であり得る最初の捕捉抗体を使用する場合に、保存されたサルモネラ菌または大腸菌ＬＰＳ／コアエピトープを持たない可能性のあるサルモネラ菌または大腸菌の検出に有用である。例えば、検出メンバーなどのうちの１つ以上は、Ｏ抗原の特定の形態に対する結合特異性、またはサルモネラ菌または大腸菌の他の亜種、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ａｒｉｚｏｎａｅに対する特異性を有することができる。そのような検出メンバーは、特定の形態のＯ抗原を有さない可能性がある他のサルモネラ菌または大腸菌に対して結合特異性を有するさらなる１つまたは複数の第２の検出メンバー（例えば）と一緒に使用され得る。抗体は、例えば、特定の弱く反応するサルモネラＯエピトープに親和性を有するポリクローナル抗体であり得る。別の実施形態では、１つまたは複数の検出メンバーは、サルモネラ菌のべん毛に特異的であり得る。
【０２５６】
一実施形態では、検出メンバーは、特定の形態のＯ抗原のサルモネラ菌に対する特異性を有するウサギポリクローナル抗体である。別の実施形態において、検出メンバーは、サルモネラ菌のべん毛ベースの抗原と反応し得るウサギポリクローナル抗体であり得る。
【０２５７】
特定の実施形態において、および本開示の方法の任意のステップにおいて、複合体は、少なくとも１つの検出メンバーに対して結合特異性を有する二次結合メンバーに曝露される（二次結合メンバーが二次複合体、例えばコアオリゴ糖／結合メンバー（例えば、第２の結合メンバー）／二次結合メンバー複合体を形成することを可能にするのに十分な時間）。
【０２５８】
抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。例えば、ポリクローナル抗体が望まれる場合、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマなどの選択された哺乳動物は、細菌内毒素などの選択された抗原で免疫化され得る。次に、免疫された動物からの血清が収集され、処理されて、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーによって抗体が得られる。例えば、抗体は、不溶性のサルモネラ菌抗原に結合したＣＮＢｒセファロースカラムを使用して精製される親和性があってもよい。
【０２５９】
モノクローナル抗体は、当技術分野で知られている方法によって産生することができ、少なくともいくつかの成分については、一般に好ましい可能性がある。ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論はよく知られている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）を参照されたい）。
【０２６０】
本明細書で言及される抗体は、ＣＤＲなどのエピトープ結合領域からなるべきである。抗体は、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、特にＩｇＧを含む任意の適切なクラスのものであり得る。これらの抗体の様々なサブクラスも想定されている。本明細書で使用される場合、「抗体結合フラグメント」という用語は、特に、抗体、または抗体の結合特異性を保持する抗体に由来するポリペプチドのフラグメントを指す。このようなフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどの抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されず、これらはすべて、エピトープに結合することができる。
「抗体」という用語はまた、利用可能な様々な天然および人工の抗体および抗体由来タンパク質のいずれか、ならびにそれらの誘導体、例えば、
限定することなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単一ドメイン抗体、抗体全体、抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有ヘテロダイマー）、一本鎖抗体、例えば一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、オリゴボディ、二量体または三量体抗体フラグメントまたは構築物、アプタマーおよびアフィマーなどに及ぶ。「抗体」という用語は、いずれかの特定の起源を意味するものではなく、ファージディスプレイなどの非従来型のプロセスを通じて得られた抗体を含む。本開示の抗体は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわちａ、ｙ、またはｐ、重鎖）であり得、Ｋ（カッパ）またはＡ（ラムダ）軽鎖を有し得る。
【０２６１】
したがって、全体を通しての抗体または抗体フラグメントへの言及は、様々なタイプの抗体または抗体フラグメント、例えばアプタマーまたはアフィマーの意味を包含することを意図している。
【０２６２】
本開示は、したがって、本発明で使用するためのコアオリゴ糖への結合特異性を有する抗体および抗体由来の結合フラグメントの使用にまで及ぶ。
【０２６３】
「特異的に結合する」または「結合特異性」という用語は、抗体またはそのフラグメントが、非標的エピトープに結合するよりも高い親和性で標的微生物病原体に結合する能力を指す。例えば、標的エピトープへの抗体の結合は、非標的エピトープに対する結合親和性よりも少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍大きい結合親和性をもたらし得る。特定の実施形態において、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって判定される。代替の実施形態において、親和性は、ＢｌＡｃｏｒｅアッセイによって判定される。
【０２６４】
あるいは、結合親和性は、速度論的方法によって判定され得る。
【０２６５】
特定の実施形態では、抗体などの捕捉メンバー（１つまたは複数の捕捉メンバー）を表面に固定化することができ、任意の洗浄ステップの後、目的のコアオリゴ糖または微生物汚染物質を含み得る検査サンプルは、結合が起こるのに十分な時間、表面結合抗体に曝露し、表面結合した第１の（捕捉）結合メンバー−コア複合体を形成することができる。次に、アッセイは、表面に結合した第１の捕捉メンバー−コア複合体を、発光のための手段、例えば、アクリジニウムエステルと共有結合し得る抗体などの１つまたは複数の検出メンバーに曝露するステップを含み得る。このような場合、検出メンバーは、コアオリゴ糖または微生物汚染物質に存在するエピトープに対して結合特異性を有するため、生成されるシグナルの量は、一次および二次結合メンバーによって結合されるコアオリゴ糖または微生物汚染物質の量に対応する。
【０２６６】
典型的には、抗体は凝集を減らすために精製され得る。
【０２６７】
特定の実施形態では、表面は、例えば、従来の設計のマイクロタイタープレートであるが、例えば、暗くされた側壁および白色または透明な部分（例えば、基部）を有する改変された表面を使用することによって、化学発光アッセイが使用されている場合、利点が得られることがある。これにより、生成される任意の信号が強まり、測定時の背景光が減少し得る。白い部分は、光の反射が、生成された信号を強めることを可能にする。したがって、特定の実施形態では、表面は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートであり、各ウェルのベースは透明または実質的に透明であるが、ウェルの壁は不透明であるか、または暗くされ、光の通過を防ぐ、または、光がそこを通過できるようにするウェルの基部の部分とのコントラストを設けるために着色される。
【０２６８】
さらにより具体的には、抗体（例えば、第１の捕捉抗体；または第２の検出抗体）は、種特異的抗体、例えば、種特異的モノクローナル抗体である。「種特異的」という用語の使用は、そのような抗体が、交差反応がほとんどまたは一切なしで、サルモネラ菌、赤痢菌および他のグラム陰性菌などを区別することを意味することを意図している。しかし、１つまたは複数の第１の（捕捉）抗体が種特異的である場合、１つまたは複数の検出メンバー、例えば、抗体が種特異的である必要はない場合がある。したがって、例えば、Ｏ抗原（種特異的ではない）の形態に結合する検出メンバー／抗体は、例えば、第１の（捕捉）結合メンバーが、サルモネラ菌に特異的である、および／またはすべてではないがほとんどのサルモネラ菌血清型に結合できる可能性のある別の第２の（検出体）結合メンバーと並ぶ種と考えられる場合に有用であり得る。Ｏ抗原指向の第２の（検出体）結合メンバーは、メインの第２の（検出器）結合メンバーによって結合されない可能性のある血清型への結合を支援する可能性がある。
特定の実施形態では、捕捉メンバーまたは検出メンバー（例えば、１つまたは複数の第２の（検出体）結合メンバー）は、以下と相互作用し、結合することができる：
【０２６９】
【化５】
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【０２７０】
ＬＰＳコアオリゴ糖のエピトープ。このエピトープは、一般に、非限定的な例として、赤痢菌、リステリア菌、大腸菌などのような他のほとんどの細菌からサルモネラ菌を区別し、種特異的である。特定の実施形態では、アッセイ法は、標的グラム陰性菌、例えばサルモネラ菌や大腸菌の定量的検出のための方法である。アッセイ法はまた、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の存在または不在を検出するために利用され得る。特定の実施形態では、検出メンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、化学発光または蛍光化合物などの酵素標識へのコンジュゲーションによって標識された標識結合メンバーである。
【０２７１】
このような第２の結合メンバーの例には、サルモネラ菌のコアリポ多糖抗原に特異性を有する、Ｓｏｌｕｓ抗体３Ｄ１１と呼ばれるマウスモノクローナル抗体、または市販されている同様の抗体が含まれる。
【０２７２】
他の例には、以下で述べるような抗体が含まれる：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｒｏｓｔａｔ−ｉｎｃ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐａｇｅ／ｃａｔａｌｏｇ／ｋｅｙｗｏｒｄ／Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ？ｋｅｙｗｏｒｄ＝Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
【０２７３】
適切な抗体のさらなる例は、Ｍ１８１（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４）７８，６８−７１；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２５，３６９−３８１）およびＴ６モノクローナル抗体（Ｎｇ  １９９６  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６  Ｊｕｌ；６２（７）：２２９４−３０２）であり得る。
【０２７４】
さらなる実施形態において、捕捉結合メンバーは、ＬＰＳの「Ｏ」側鎖ならびに他の多くの細胞成分に特異的であり得るポリクローナルＡｂである。
【０２７５】
異なる結合メンバー、例えば抗体は、例えば、当業者によって決定され得るように、例えば、受動的に固定化するか、またはストレプトアビジンを使用するかどうかなど、異なる、有用な、または最適な配置を有し得る。
【０２７６】
検出
開示された方法は、対象の微生物のコアオリゴ糖または微生物汚染物質への少なくとも１つの検出メンバーのいずれかの結合を検出することをさらに含むが、開示された方法は、特定の検出方法に限定されないものとする。
【０２７７】
例えば、検出法は、比色分析、蛍光測定、フローサイトメトリー、化学発光など、当技術分野で知られている任意の適切な方法によるものであり得る。一実施形態では、結合の検出は、発光シグナル、例えば、化学発光化合物によって生成される化学発光の光の測定／検出によるものである。適切な化学発光化合物には、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウム、１，２−ジオキセタン、ルミノール、または化学発光基質などを触媒する酵素が含まれる。
【０２７８】
実施形態では、比色エンドポイント検出システムは、特に食品検査環境で、サルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌を検出するために使用される。
【０２７９】
特定の実施形態では、検出メンバーは、検出可能な部分に直接結合され得る。
【０２８０】
適切な検出可能な部分は、当技術分野において周知である。
【０２８１】
一実施形態では、基質は、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ．ｐｈｐ？ｒｅｆ＝４０６＆ｖａｒｎｏｍｂｒｅ＝２５＆ｖａｒ０＝１＆ｌｉｍｉｔｅ＝５０で、独自のソリューションとして購入することができる。
【０２８２】
別の実施形態では、基質を触媒する酵素は、例えば、０．１ＭのＨ２ＳＯ４で、一定期間後に停止できる。
【０２８３】
一実施形態では、検出可能な部分は発光部分である。特定の実施形態では、検出メンバーは、発光標識として作用するアクリジニウムエステル分子またはアクリジニウムスルホンアミドなどのアクリジニウム化合物またはその誘導体にコンジュゲートされている。抗体または結合フラグメントがアクリジニウムエステルまたはアクリジニウムスルホンアミドに結合している実施形態では、アッセイ方法は、検査サンプルにＡＭＰＰＤを添加するステップをさらに含み得る。
【０２８４】
ＡＭＰＰＤは、同義語：３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル１−１，２−ジオキセタン；３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン）−３，２−トリシクロ（３．３．１．１（３，７））デカン）−４−イル）フェニルホスフェート；４−メトキシ−４−（３−ホスフェートフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン）−３，２’−アダマンタンで既知である場合もある。
【０２８５】
特定のさらなる実施形態において、抗体（または他の検出メンバー）は、発光部分と間接的に関連し得、例えば、アクリジニウムエステル分子は、一次抗体に結合することができる二次抗体にコンジュゲートされ得る。
【０２８６】
特定の実施形態において、１つ以上の発光または蛍光部分は、アビジン／ストレプトアビジンに結合され得、これは、次に、抗体に化学的に結合されたビオチンに結合され得る。特定のさらなる実施形態において、レクチン（タンパク質Ａ／Ｇ／Ｌ）は、抗体または他のタンパク質複合体にも結合され得る発光または蛍光分子に結合され得る。
【０２８７】
一実施形態では、部分は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【０２８８】
検出可能な信号を生成するための刺激は、例えば、特定の波長の光、例えば、ＵＶ光であり得るか、または電気的または放射性刺激、化学的または酵素基質反応などの他の刺激であり得る。
【０２８９】
他の実施形態では、検出メンバー、例えば、コアオリゴ糖またはサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の微生物フラグメントに対する結合特異性を有する抗体は、そのような発光部分と間接的に関連し得、例えば、アクリジニウムエステル分子は、第２の結合メンバーに結合することができるさらなる結合メンバーにコンジュゲートされ得る。
【０２９０】
特定の実施形態では、アッセイ方法は定性的または定量的であり得、標準的なコントロールを実行して、生成された平均シグナルを所与の量のコアオリゴ糖などに関連付けることができる。
【０２９１】
代替の実施形態では、アッセイ方法は、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の存在または不在を検出するのに適している可能性がある。
【０２９２】
特定の実施形態では、開示されている方法は、複数のコアオリゴ糖または微生物汚染物質のサンプルの測定に、使用することができ、これは、それぞれが異なるエピトープまたは微生物汚染物質に対して結合特異性を有する抗体などの複数の結合メンバーを提供することによって、達成される。
【０２９３】
方法の各段階の間または各段階で、任意の洗浄、乾燥、および／またはインキュベーションのステップが含まれ得ることは、明らかであるはずである。この方法はまた、任意選択で、方法の１つまたは複数のステップ間の「ブロッキングステップ」を含み得、これにおいては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインなどの非相互作用性のタンパク質の濃縮溶液が、例えば、マイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加される。また、特定の遮断剤には、粉乳などの溶液が含まれる。このようなタンパク質は、プレートへの他のタンパク質の非特異的吸着をブロックし、アッセイの感受を妨げる可能性のある「バックグラウンド」のアーティファクトを低減するのに役立つ可能性がある。
【０２９４】
洗浄ステップは、「高塩」洗浄ステップであり得る。例えば、検査サンプルを吸引し、次いで、本開示の態様として上で論じたように、高濃度の塩を含む洗浄液でウェル／複合体を洗浄することを含む。
【０２９５】
別の実施形態では、洗浄ステップは、検査サンプルを吸引し、次いで、本開示の態様として上で論じたように、ＭｇＣｌ２を含む洗浄液でウェル／複合体を洗浄することを含み得る。
【０２９６】
本開示は、典型的には、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の特異的検出のためにコアオリゴ糖に結合特異性を有する結合メンバーを利用する。
【０２９７】
本明細書に記載の方法、組成物、および使用を実行するために必要な様々な構成要素が、キットまたは部品のキットの形で提供され得ることは当業者には明らかであろう。例えば、本開示のさらなる態様は、サルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌、任意選択で検査サンプルの中に存在する可能性のあるサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌の選択培養用であり、任意選択で、培養が本開示の第１の態様の方法に従って行われるか、または本明細書に記載の方法のいずれかを実行するためのキットが提供されるものであり、キットは以下を含む：
本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤、および
セフスロジンおよび／またはノボビオシン、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
【０２９８】
本開示はまた、サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞を定量または存在または不在を検出する方法において使用するためのキットを提供するものであり、任意選択で、検査サンプル中のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在または非存在を検出し、任意選択で、サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞定量化または存在または不在を検出する方法が、本開示の第１の態様による選択培養の方法を含み、この場合、キットは以下のいずれか２つ以上が含まれる：
ａ）本開示の第１の態様で定義された式Ｉの薬剤、任意選択で、式Ｉの薬剤は４ＰＹｃｑである、
ｂ）セフスロジンおよび／またはノボビオシン、
ｃ）存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように微生物細胞を処理する薬剤、任意選択でアルコールまたは水ベースの緩衝液である、
ｄ）捕捉メンバー、
任意選択で、捕捉メンバーが抗体または抗体フラグメントであり、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、
任意選択で、捕捉メンバーが微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的であり、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に特異的であり、任意選択で、捕捉メンバーがサルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体である。
【０２９９】
任意選択で、前記捕捉メンバーが基質または固体表面に固定化され、任意選択で中間結合パートナーを介して基質または固体表面に固定化され、任意選択で、前記中間結合パートナーがビオチンおよびストレプトアビジンを含む結合である、
ｅ）検出メンバー、任意選択で
検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントである、および／または
捕捉メンバーは、微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的であり、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に特異的であり、および／または
検出メンバーは、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成する、および／または
検出メンバーは、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１およびＴ６からなる群から選択される抗体であり、
またはＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号：
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、
ｆ）洗浄液の中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭ、または１００と７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００と６５０ｍＭの間である一価イオンを含む水溶液、
ｇ）二価イオンおよび／または塩を含む洗浄液、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間である、
ｈ）本開示の前の態様で定義された培地、
ｉ）検出メンバーに特異性のある抗体、任意選択で、抗体は酵素結合抗体であり、任意選択でＨＲＰ結合抗体である、
ｊ）ストレプトアビジンアッセイプレート、それにおいてウェルの内面は、サルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌またはその微生物フラグメントに特異的なビオチン化ポリクローナル抗体でコーティングされている、
ｋ）本開示の第１、第２および第３の態様の方法を実施するための説明書、
ｌ）塩化第二鉄、および／または
ｍ）亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物。
一実施形態では、キットは以下を含む：
本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、ノボビオシン（ｂ）、塩化第二鉄（ｌ）、または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）のいずれか１つまたは複数、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
一実施形態では、キットは、本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、およびノボビオシン（ｂ）、および任意選択で、塩化第二鉄（ｌ）および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）を含む、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
【０３００】
別の実施形態では、キットは、本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、およびノボビオシン（ｃ）、および塩化第二鉄（ｌ）および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）を含む、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
【０３０１】
さらに別の実施形態では、キットは、本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）およびノボビオシン（ｃ）を含む組成物を含み、さらに、本開示の前の態様に関連して上で説明したように、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む第２の組成物を含む。いくつかの実施形態では、第２の組成物は、培地であるか、または塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む凍結乾燥培地である。
【０３０２】
キットが、スパイス、ハーブ、または香料であるサンプル中のサルモネラ菌や大腸菌などの標的グラム陰性菌を定量化または存在および不在を検出する方法で使用する場合、キットが、塩化第二鉄（ｌ）と亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）が含んでいる、または、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む組成物を含む場合に、有利であるとみなされる。
【０３０３】
一実施形態では、キットは、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含まない。
【０３０４】
本開示の主な用途は工業用食品および環境検査であると予想されるが、サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌を、単独で、または、本明細書に記載のサルモネラ細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞を検出または定量化する方法と組み合わせて選択的に培養する改良された方法は、例えば、サルモネラ菌感染の改善されたより迅速な検出などにおいて、医学的用途を有する。したがって、本開示はまた、対象をサルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌に感染していると診断する方法を提供し、この方法は、本開示の第１の態様に従ってサンプルの微生物細胞を培養すること、または本開示の後の態様による、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌の存在または不在を検出することを含む。
【０３０５】
本開示はまた、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌に感染していると診断された対象を治療するための方法を提供し、診断は、本明細書に記載の方法または組成物のいずれかに従って実行されるか、またはそれらを含む。
【０３０６】
本開示はまた、サルモネラ菌または大腸菌などの標的グラム陰性菌に感染していると診断された対象を治療する際に使用するための抗サルモネラ菌療法または抗大腸菌療法などの抗グラム陰性菌療法を提供し、診断は、本明細書に記載の方法または組成物のいずれかに従って実行されるか、またはそれらを含む。
【０３０７】
さらなる態様では、上記のように、本発明者らは、驚くべきことに、検出メンバーとのインキュベーションのための緩衝液中の一価イオンおよび／または塩、例えばナトリウム、リチウムおよびカリウムイオンおよび／または塩のレベルの低下が、アッセイの感度を改善することを見出した。したがって、本開示はまた、微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプル中のサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在を検出するための方法を提供し、任意選択で、サンプルは、サルモネラ菌細胞や大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞を培養する手段とは独立した培養された微生物細胞のサンプルである。
本開示は、微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルのサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在を検出するための方法を提供し、任意選択で、サンプルは培養された微生物細胞のサンプルであり、
方法はイムノアッセイを含み、イムノアッセイは、検出メンバーの使用を含み、サンプルまたは微生物細胞は、以下の塩濃度で検出メンバーに曝露され、
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３０８】
本開示はまた、微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルのサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などの標的グラム陰性細胞の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、イムノアッセイを含み、イムノアッセイは以下を含む：
ａ）任意選択で、微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理されるよう、サンプルまたは培養された微生物細胞を処理すること、
ｂ）処理された培養された微生物細胞のサンプルまたは培養された微生物細胞または細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露すること、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらし、
任意選択で、曝露することは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に生じ、任意選択で、
捕捉メンバーは、抗体または抗体フラグメント、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、捕捉メンバーは、サルモネラ菌に対して特異性を有し、任意選択で、捕捉メンバーは、サルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体であり、
任意選択で、捕捉メンバーは
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６抗体、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、および
ｃ）捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露すること、この場合、検出メンバーは、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成し、任意選択で、検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、検出メンバーがサルモネラ菌に対して特異性を有し、任意選択で、検出メンバーは、以下からなる群から選択される：
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、またはＴ６抗体、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、
および
捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は次の塩濃度で検出メンバーに曝される：
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３０９】
本開示のこれらの態様の選好は、本開示の前の態様について上で説明したとおりである。
【０３１０】
上で論じたように、特定の特徴に対する任意の特定の選好を、別の特徴に対する他の任意の特定の選好と組み合わせることができる。
【０３１１】
本開示はまた、本開示の以下の番号付けされた態様および実施形態を提供する：
１）サルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を選択的に培養するための方法であって、任意選択で、検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ菌または大腸菌などのグラム陰性菌を培養するためであり、培地の中で前記検査サンプルの中に存在する微生物を培養するステップを含む方法であって、前記培地は、式Ｉの薬剤を含み、
【０３１２】
【化６】
2022502087.tif 000010
【０３１３】
式中、Ａは以下から選択され、
【０３１４】
【化７】
2022502087.tif 000011
【０３１５】
Ｒは、任意選択で置換されたＣ５〜２０アリールから選択されるが、ただし、Ａが２ＰＹである場合、Ｒは、任意選択で、１，３−ジメチルフェニルではない。
【０３１６】
２）Ａは２ＰＹ、３ＰＹ、４ＰＹ  ＰＺ  ＱＮまたはＨＤであり、Ｒは以下からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【０３１７】
【化８−１】
2022502087.tif 000012
【化８−２】
2022502087.tif 000013
【０３１８】
３）
式中、Ａは２ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｈ、ａｉ、ａｊ、ａｌ、またはｃｊから選択され、
式中、Ａは３ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｙ、ｃｃ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
式中、Ａは４ＰＹであり、Ｒはａｆ、ａｍ、ｃｂ、ｃｃ、ｃｊ、ｃｏ、またはｃｑから選択され、
式中、ＡはＨＤであり、Ｒはｃｄ、ｃｅ、ｃｆ、ｃｊ、またはｃｌから選択され、
式中、ＡはＰＺであり、Ｒはｃｂまたはｃｊから選択され、
式中、ＡはＱＮであり、Ｒはｃａである、実施形態１または２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
４）式Ｉの薬剤が、３ＰＹａｆ、４ＰＹａｆ、４ＰＹａｍ、４ＰＹｃｂ、４ＰＹｃｏ、４ＰＹｃｑ、４ＰＹｅｈ、ＨＤｃｂ、ＨＤｃｅ、ＨＤｃｆおよびＨＤｄｂからなる群から選択される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０３２０】
５）式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６）式Ｉの薬剤が以下の濃度で培地に存在する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法：
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満、または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、
任意選択で約５ｍｇ／Ｌ。
【０３２１】
７）式Ｉの薬剤が、約５ｍｇ／Ｌ、任意選択で５ｍｇ／Ｌの濃度で培地に存在する、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
８）培地が１つ、２つ、３つ、または４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、任意選択でセフスロジンおよび／またはノボビオシンを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０３２３】
８ａ）培地が、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物をさらに含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０３２４】
９）培地は、緑膿菌の増殖を阻害するか、または殺傷する薬剤、および／または他のシュードモナス菌をさらに含み、任意選択でセフスロジンを含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【０３２５】
１０）培地が以下の濃度のセフスロジンをさらに含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法：
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
８ｍｇ／Ｌ。
【０３２６】
１１）培地が以下の量のノボビオシンを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法：
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または、または
１０ｍｇ／Ｌ。
【０３２７】
１１ａ）培地が以下の量の塩化第二鉄を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
１１ｂ）培地が、以下の量の亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む、実施形態１〜１１ａのいずれか１つに記載の方法：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０３２８】
１２）検査サンプルが、サルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞以外の少なくとも１つまたは複数の細胞、例えば１つまたは複数の他の微生物細胞を含むか、または含むと予想されるサンプルである、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法であり、
任意選択で、検査サンプルは、以下である少なくとも１つまたは複数の細胞を含むことが予想される：
グラム陽性菌細胞である細菌細胞、および／または
真菌細胞、任意選択で酵母細胞。
【０３２９】
１３）検査サンプルが不均一な微生物叢環境を含むか、または含むと予想される、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３３０】
１４）検査サンプルが以下である、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法：
食品、任意選択で肉、肉製品、例えばミンチ、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料産物、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、
治療用製品、例えばワクチン、麻酔薬、薬理学的に活性な薬剤、造影剤、または尿サンプル、プロバイオティクスなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面のスワブ、例えば床、ドア、および壁；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、または
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ。
【０３３１】
１５）検査サンプルは、グラム陰性菌の純粋な培養物ではなく、またはいずれか１つの特定のグラム陰性菌種の純粋な培養物でもない、任意選択で、サルモネラ菌または大腸菌の純粋な培養物ではない、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３３２】
１６）培養物が液体培養物である、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３３３】
１７）サルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのストレスを受けたグラム陰性細胞の増殖を可能にし、任意選択で、非選択的培地でのストレスを受けたグラム陰性菌、例えばサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞の増殖レベルに対するサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞などのストレスを受けたグラム陰性細胞の増殖の影響がないか、または実質的にない、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３３４】
１８）少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ（標的細胞、例えばグラム陰性菌全般、または例えばサルモネラ菌や大腸菌）／ｍｌの細胞密度に至る、任意選択で少なくとも１０４〜１０６ｃｆｕ（標的細胞、例えばグラム陰性菌全般、または例えばサルモネラ菌や大腸菌）／ｍｌの細胞密度に培養の１６時間以上後、任意選択で培養の２０時間後に至る、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３３５】
１９）方法が単一の培養ステップを含み、任意選択で単一の温度である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０３３６】
２０）検査サンプルが、３０℃から４４℃、任意選択で３７℃から４２℃、任意選択で４１．５℃の温度で培地で培養される、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３３７】
２１）検査サンプルが、培地中で約１０〜２８時間、例えば、１２〜２６時間、例えば、１４〜２４時間、例えば、１６〜２２時間、例えば１８〜２０時間、例えば１６時間または２０時間培養される、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０３３８】
２２）検査サンプルは、培地で２４時間未満、任意選択で２２時間未満、任意選択で２０時間未満、任意選択で１８時間未満、任意選択で１６時間以下培養される実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０３３９】
２３）検査サンプルを培地で４１．５℃で１６時間、または４１．５℃で２時間培養し、任意選択で、
サンプルが環境サンプルである場合、サンプルは４１．５℃で１６時間培養され、
サンプルが食品サンプルである場合、サンプルは４１．５℃で２０時間培養される、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３４０】
２４）検査サンプルが、ペプトン、トリプトン、栄養ブロス、Ｌブロス、グラム陰性ブロス、酵母を含むトリプシン大豆ブロス、改変トリプチン大豆ブロス、および緩衝ペプトン水からなる群から選択されるベースブロスを含む栄養培地で培養される、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０３４１】
２５）培地が緩衝ペプトン水を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６）培地が以下のいずれか１つ、任意の２つ、または、またはすべてを含まない、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法：
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン。
【０３４２】
２７）培地が以下のいずれか１つ、任意の２つ以上、またはすべてを含まない、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の方法：
ａ）胆汁酸塩、任意選択でデオキシコール酸、
ｂ）チオ硫酸ナトリウム、
ｃ）テルギトール４、
ｄ）亜セレン酸ナトリウム、
ｅ）塩化マグネシウム、
ｆ）クリスタルバイオレット、
ｇ）クエン酸ビスマスアンモニウム、および
ｈ）酸性フクシン。
【０３４３】
２８）検査サンプルに存在し得るサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞の選択的増殖、任意選択で、実施形態１〜５のいずれかで定義される式Ｉの薬剤および少なくとも１つのさらなる薬剤を含む、検査サンプルに存在し得るサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性細胞の増殖のための培地。
【０３４４】
２９）式Ｉの薬剤が以下の濃度で培地に存在する、実施形態２８に記載の培地：
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満、または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、または
ｃ）５ｍｇ／Ｌ。
【０３４５】
３０）式Ｉの薬剤が約５ｍｇ／Ｌ、任意選択で５ｍｇ／Ｌの濃度で培地に存在する、実施形態２８または２９のいずれかに記載の培地。
【０３４６】
３１）培地が１つ、２つ、３つ、または４つ、またはそれより多い抗菌剤をさらに含み、任意選択でセフスロジンおよび／またはノボビオシンを含む、実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載の培地。
【０３４７】
３１ａ）培地が、塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物をさらに含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の培地。
【０３４８】
３２）培地は、緑膿菌の増殖を阻害するか、または殺傷する薬剤、および／または他のシュードモナス菌をさらに含み、任意選択でセフスロジンを含む、実施形態２８〜３１のいずれかに記載の培地。
【０３４９】
３３）培地が以下の濃度のセフスロジンをさらに含む、実施形態２８〜３２のいずれかに記載の培地：
１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
任意選択で８ｍｇ／Ｌ。
【０３５０】
３４）培地が以下の量のノボビオシンを含む、実施形態２８〜３３のいずれか１つに記載の培地：
４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
１０ｍｇ／Ｌ。
【０３５１】
３４ａ）培地が以下の量の塩化第二鉄を含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法、または実施形態２８〜３４のいずれかに記載の培地。
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ。
【０３５２】
３４ｂ）培地が、亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を以下の量で含む、実施形態１〜２７のいずれか１つまたは実施形態２８〜３４ａのいずれかに記載の培地の方法：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０３５３】
３５）培地が約１０ｍｇ／Ｌの濃度のノボビオシンを含み、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、また、約８ｍｇ／Ｌ、任意選択で８ｍｇ／Ｌの濃度のセフスロジンを含み、
任意選択で、１．３３ｍｇ／Ｌの濃度の塩化第二鉄を含み、および／または任意選択で亜硫酸化合物などの亜硫酸カリウムを１．００ｇ／Ｌの濃度で含む、実施形態２８〜３４ｂのいずれか１つに記載の培地。
【０３５４】
３６）培地が緩衝ペプトン水を含む、実施形態２８〜３５のいずれかに記載の培地。
【０３５５】
３７）培地は、ペプトン、トリプトン、栄養ブロス、Ｌブロス、グラム陰性ブロス、酵母を含むトリプシン大豆ブロス、改変トリプチン大豆ブロス、および緩衝ペプトン水からなる群から選択されるベースブロスを含む、実施形態２８〜３６のいずれかに記載の培地。
【０３５６】
３８）培地が、以下のいずれか１つ、任意の２つ、または、またはすべてを含まない、実施形態２８〜３７のいずれか１つに記載の培地：
ａ）バンコマイシン、
ｂ）ブリリアントグリーン、および
ｃ）マラカイトグリーン。
【０３５７】
３９）培地が、以下のいずれか１つ、任意の２つ以上、または、またはすべてを含まない、実施形態２８〜３８のいずれか１つに記載の培地：
ａ）胆汁酸塩、任意選択でデオキシコール酸、
ｂ）チオ硫酸ナトリウム、
ｃ）テルギトール４、
ｄ）亜セレン酸ナトリウム、
ｅ）塩化マグネシウム、
ｆ）クリスタルバイオレット、
ｇ）クエン酸ビスマスアンモニウム、および
ｈ）酸性フクシン。
【０３５８】
４０）培地が液体培地である、実施形態２８〜３９のいずれかに記載の培地。
【０３５９】
４１）培地が固体またはゲルの培地であり、任意選択で寒天を含む、実施形態２８〜３９のいずれかに記載の培地。
【０３６０】
４１ａ）塩化第二鉄および亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムを含み、任意選択で塩化第二鉄の濃度が、
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
また、亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムの濃度は、
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０３６１】
４１ｂ）培地が塩化第二鉄および亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムを含み、塩化第二鉄および亜硫酸化合物の濃度は、再懸濁時に塩化第二鉄の濃度が以下であるようにする、凍結乾燥培地：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
また、亜硫酸化合物、任意選択で亜硫酸カリウムの濃度は、
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ、
任意選択で、凍結乾燥粉末の再懸濁は、０．１ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間、または０．５ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌの間、１ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間で起こる。
【０３６２】
４２）実施形態２８〜４１ｂのいずれかによる培地の調製に使用するための組成物。
【０３６３】
４３）実施形態１〜５のいずれかで定義される式Ｉの薬剤と、セフスロジンおよびノボビオシンを含む群から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤とを含む組成物。
【０３６４】
４４）組成物がセフスロジンおよびノボビオシンを含む、実施形態４２または４３のいずれかに記載の組成物。
【０３６５】
４４ａ）組成物が塩化第二鉄および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む、実施形態４２〜４４のいずれかに記載の組成物。
【０３６６】
４５）式Ｉの薬剤、および／またはノボビオシン、および／またはセフスロジン、および／または塩化第二鉄、および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物の濃度は、以下の希釈が、結果として生じる次の濃度である、実施形態４２〜４４のいずれかに記載の組成物：
ｉ）式Ｉの薬剤は次のとおりである：
ａ）０．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ超、例えば、少なくとも０．７５ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８．５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８、７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．２５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９．７５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０．００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、および／または、
ｂ）１５ｍｇ／Ｌ未満、例えば１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０．００ｍｇ／Ｌ未満、または９．７５ｍｇ／Ｌ未満、または９．５０ｍｇ／Ｌ未満、または９．２５ｍｇ／Ｌ未満、または９．０ｍｇ／Ｌ未満、または８．７５ｍｇ／Ｌ未満、または８．５ｍｇ／Ｌ未満、または８．２５ｍｇ／Ｌ未満、または８．０ｍｇ／Ｌ未満、または７．７５ｍｇ／Ｌ未満、または７．５０ｍｇ／Ｌ未満、または７．２５ｍｇ／Ｌ未満、または７．０ｍｇ／Ｌ未満、または６．７５ｍｇ／Ｌ未満、または６．５０ｍｇ／Ｌ未満、または６．２５ｍｇ／Ｌ未満、または６．０ｍｇ／Ｌ未満、または５．７５ｍｇ／Ｌ未満または５．２５ｍｇ／Ｌ未満、または５．０ｍｇ／Ｌ未満、または４．７５ｍｇ／Ｌ未満、または４．５０ｍｇ／Ｌ未満、または４．２５ｍｇ／Ｌ未満、または４．０ｍｇ／Ｌ未満、または３．７５ｍｇ／Ｌ未満、または３．５ｍｇ／Ｌ未満、または３．２５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、または２．７５ｍｇ／Ｌ未満、または２．５０ｍｇ／Ｌ未満、または２．２５ｍｇ／Ｌ未満、または２．０ｍｇ／Ｌ未満、または１．７５ｍｇ／Ｌ未満、または１．５０ｍｇ／Ｌ未満、または１．２５ｍｇ／Ｌ未満、または１．０ｍｇ／Ｌ未満、または
ｃ）５ｍｇ／Ｌ、
ｉｉ）ノボビオシンは次のようである：
ａ）４０ｍｇ／Ｌと２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３５ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３０ｍｇ／Ｌと７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２５ｍｇ／Ｌと９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１５ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌ、または１１ｍｇ／Ｌ、または１２ｍｇ／Ｌ、または１３ｍｇ／Ｌ、または１４ｍｇ／Ｌ、または１５ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、任意選択で少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、および／または
ｃ）３５ｍｇ／Ｌ未満、任意選択で３０ｍｇ／Ｌ未満、または２５ｍｇ／Ｌ未満、または２２ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満、１９ｍｇ／Ｌ未満、１８ｍｇ／Ｌ未満、１７ｍｇ／Ｌ未満、１６ｍｇ／Ｌ未満、１５ｍｇ／Ｌ未満、１４ｍｇ／Ｌ未満、１３ｍｇ／Ｌ未満、１２ｍｇ／Ｌ未満、１１ｍｇ／Ｌ未満、１０ｍｇ／Ｌ未満、９ｍｇ／Ｌ未満、８ｍｇ／Ｌ未満、７ｍｇ／Ｌ未満、６ｍｇ／Ｌ未満、５ｍｇ／Ｌ未満、４ｍｇ／Ｌ未満、３ｍｇ／Ｌ未満、２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、または
１０ｍｇ／Ｌ、
ｉｉｉ）セフスロジンは次のようである：
ａ）１ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌの間、任意選択で２ｍｇ／Ｌと１９ｍｇ／Ｌの間、任意選択で３ｍｇ／Ｌと１８ｍｇ／Ｌの間、任意選択で４ｍｇ／Ｌと１７ｍｇ／Ｌの間、任意選択で５ｍｇ／Ｌと１６ｍｇ／Ｌの間、任意選択で６ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌの間、任意選択で７ｍｇ／Ｌと１４ｍｇ／Ｌの間、任意選択で８ｍｇ／Ｌと１３ｍｇ／Ｌの間、任意選択で９ｍｇ／Ｌと１２ｍｇ／Ｌの間、任意選択で１０ｍｇ／Ｌと１１ｍｇ／Ｌの間、任意選択で約８ｍｇ／Ｌの濃度、任意選択で８ｍｇ／Ｌ、および／または
ｂ）少なくとも１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２０ｍｇ／Ｌ；および／または
ｃ）２０ｍｇ／Ｌ未満、または１９ｍｇ／Ｌ未満、または１８ｍｇ／Ｌ未満、または１７ｍｇ／Ｌ未満、または１６ｍｇ／Ｌ未満、または１５ｍｇ／Ｌ未満、または１４ｍｇ／Ｌ未満、または１３ｍｇ／Ｌ未満、または１２ｍｇ／Ｌ未満、または１１ｍｇ／Ｌ未満、または１０ｍｇ／Ｌ未満、または９ｍｇ／Ｌ未満、または８ｍｇ／Ｌ未満、または７ｍｇ／Ｌ未満、または６ｍｇ／Ｌ未満、または５ｍｇ／Ｌ未満、または４ｍｇ／Ｌ未満、または３ｍｇ／Ｌ未満、または２ｍｇ／Ｌ未満、または１ｍｇ／Ｌ未満、
ｉｖ）塩化第二鉄は次のようである：
ａ）約０．５ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌの間、または例えば０．７５ｍｇ／Ｌと３．５ｍｇ／Ｌの間、１．０ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの間、１．２５ｍｇ／Ｌと２．７５ｍｇ／Ｌの間、１．５０ｍｇ／Ｌと２．５０ｍｇ／Ｌの間、１．７５ｍｇ／Ｌと２．２５ｍｇ／Ｌの間、または２．００ｍｇ／Ｌの間、および／または
ｂ）４ｍｇ／Ｌ未満、３．５ｍｇ／Ｌ未満、３．０ｍｇ／Ｌ未満、２．７５ｍｇ／Ｌ未満、２．５０ｍｇ／Ｌ未満、２．２５ｍｇ／Ｌ未満、２．００ｍｇ／Ｌ未満、１．７５ｍｇ／Ｌ未満、１．５０ｍｇ／Ｌ未満、１．２５ｍｇ／Ｌ未満、１．００ｍｇ／Ｌ未満、０．７５ｍｇ／Ｌ未満、０．５０ｍｇ／Ｌ未満、または０．２５ｍｇ／Ｌ未満、および／または
ｃ）少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５０ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．００ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、１．５０ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、２．００ｍｇ／Ｌ、２．２５ｍｇ／Ｌ、２．５０ｍｇ／Ｌ、２．７５ｍｇ／Ｌ、３．００ｍｇ／Ｌ、３．２５ｍｇ／Ｌ、３．７５ｍｇ／Ｌ、４．００ｍｇ／Ｌ、または
ｄ）１．３３ｍｇ／Ｌ、または
ｅ）１．３７ｍｇ／Ｌ、
および／または
ｖ）亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物は次のようである：
ａ）約０．５ｇ／Ｌと４ｇ／Ｌの間、例えば０．７５ｇ／Ｌと３．５ｇ／Ｌの間、１．０ｇ／Ｌと３．０ｇ／Ｌの間、１．２５ｇ／Ｌと２．７５ｇ／Ｌの間、１．５０ｇ／Ｌと２．５０ｇ／Ｌの間、１．７５ｇ／Ｌと２．２５ｇ／Ｌの間、または２．００ｇ／Ｌ、および／または
ｂ）４．００ｇ／Ｌ未満、３．５ｇ／Ｌ未満、３．０ｇ／Ｌ未満、２．７５ｇ／Ｌ未満、２．５０ｇ／Ｌ未満、２．２５ｇ／Ｌ未満、２．００ｇ／Ｌ未満、１．７５ｇ／Ｌ未満、１．５０ｇ／Ｌ未満、１．２５ｇ／Ｌ未満、１．００ｇ／Ｌ未満、０．７５ｇ／Ｌ未満、または０．５０ｇ／Ｌ未満；および／または
ｃ）少なくとも０．５ｇ／Ｌ、０．７５ｇ／Ｌ、１．００ｇ／Ｌ、１．２５ｇ／Ｌ、１．５０ｇ／Ｌ、１．７５ｇ／Ｌ、２．００ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ、２．７５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／Ｌ、または
ｄ）１．００ｇ／Ｌ、または
ｅ）１．１１ｇ／Ｌ。
【０３６７】
４６）以下の濃度である、実施形態４２〜４５のいずれかに記載の組成物：
ａ）式Ｉの薬剤の濃度は１．００ｍｇ／ｍｌと１．５０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．１０ｍｇ／ｍｌと１．４０ｍｇ／ｍｌの間、例えば１．２０ｍｇ／ｍｌと１．３０ｍｇ／ｍｌの間であり、任意選択で濃度は１．１２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、式Ｉの薬剤が７０％ｖ：ｖエタノールに溶解されており、
ｂ）ノボビオシンの濃度は２．００ｍｇ／ｍｌと３．００ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．１０ｍｇ／ｍｌと２．９０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．２０ｍｇ／ｍｌと２．８０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．３０ｍｇ／ｍｌと２．７０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．４０ｍｇ／ｍｌと２．６０ｍｇ／ｍｌの間、例えば２．５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、濃度は２．７ｍｇ／ｍｌまたは２．２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．２５ｍｇ／ｍｌであり得、例えば前記ノボビオシンは７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解しており、
ｃ）セフスロジンは、１．４ｍｇ／ｍｌと２．０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．５ｍｇ／ｍｌと１．９ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．６ｍｇ／ｍｌと１．８ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１．７ｍｇ／ｍｌと１．７ｍｇ／ｍｌの間で、任意選択で濃度が１．８ｍｇ／ｍｌであり、任意選択で前記セフスロジンが７０％ｖ／ｖのエタノールに溶解し、
ｄ）塩化第二鉄は約１０ｍｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間、例えば１００ｍｇ／Ｌと５ｇ／Ｌの間、１ｇ／Ｌと３ｇ／Ｌの間であり、
および／または
ｅ）亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物は次のようである：
ｅ）約５ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌの間、例えば、１０ｇ／Ｌと４０ｇ／Ｌの間、または２０ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌの間である。
【０３６８】
４７）組成物が凍結乾燥されている、実施形態４２〜４６のいずれかに記載の組成物。
【０３６９】
４８）標的グラム陰性菌を定量化または存在または不在を検出するための方法であって、任意選択で、検査サンプルのサルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在または不在を検出するための方法であり、選択的に、実施形態１〜２７のいずれかによる検査サンプルの中に存在する微生物細胞を培養し、標的グラム陰性細胞を定量化または存在または不在を検出し、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在または不在を検出する、方法。
４９）検査サンプルが以下である、実施形態４８に記載の方法：
食品、任意選択で肉、肉製品、例えばミンチ、卵、チーズ、牛乳、野菜、チョコレート、菓子、ピーナッツバターなど、加工、乾燥、冷凍または冷蔵させた食品を含む、スパイス、ハーブまたは香料産物、
臨床サンプル、例えば生検サンプル、糞便、唾液、水分補給液、栄養液、血液、血液製剤、組織抽出物、ワクチン、麻酔薬、薬理学的活性剤、造影剤または尿サンプルなど、
スワブ、例えば、皮膚スワブ、盲腸スワブ、糞便スワブ、総排出腔スワブまたは直腸スワブ；表面のスワブ、例えば床、ドア、および壁；動物の死骸のスワブを含む食品のスワブ、
化粧品サンプル、例えばファンデーションメイクアップ、リップクリーム、ローション、クリーム、シャンプーなど、
食品やスワブなどのサンプルが懸濁された液体のサンプル、または
生肉または生鶏肉のサンプル、または生肉または生鶏肉から採取したスワブ。
【０３７０】
５０）培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理される、実施形態４８および４９のいずれかに記載の方法、
任意選択で、前記処理が、微生物細胞の加熱、任意選択で約６０℃から約１００℃、任意選択で６５℃から１００℃、任意選択で７０℃から１００℃、任意選択で７５℃から１００℃、任意選択で８０℃から１００℃、任意選択で８５℃から１００℃、任意選択で９０℃から１００℃、任意選択で９５℃から１００℃に加熱することを含み、
任意選択で、培養された微生物細胞を約３０秒から約３０分間、任意選択で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または約２５分間、任意選択で１５から２０分加熱する。
５１）定量化および／または検出が、培養された微生物細胞または処理された培養された微生物細胞の前記細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露し、捕捉細胞または捕捉細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらすことを含み、
任意選択で前記曝露することは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に生じる、実施形態４８〜５０のいずれかに記載の方法
５２）捕捉メンバーが抗体または抗体フラグメントであり、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、
任意選択で、捕捉メンバーは、サルモネラに対して産生されたヒツジポリクローナル抗体である、実施形態５１に記載の方法。
【０３７１】
５３）捕捉メンバーが基質または固体表面に固定化され、任意選択で中間結合パートナーを介して基質または固体表面に固定化され、任意選択で、中間結合パートナーがビオチンおよびストレプトアビジンを含む結合である、実施形態５１および５２のいずれかに記載の方法。
【０３７２】
５４）捕捉メンバーが微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的であり、任意選択で標的グラム陰性菌種に特異的である、実施形態５１〜５３のいずれかに記載の方法。
【０３７３】
５５）捕捉メンバーがサルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有する、実施形態５１〜５４のいずれかに記載の方法。
【０３７４】
５６）捕捉メンバーが以下からなる群から選択される、実施形態５１〜５４のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、またはＴ６抗体、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７。
【０３７６】
５７）前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露することをさらに含み、任意選択で、検出メンバーへの前記曝露が、前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖が洗浄液に曝露された後に起こり、任意選択で前記洗浄液は、以下を含む、実施形態４８〜５６のいずれかに記載の方法：
ａ）洗浄液の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭである一価イオン、または１００から７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００から６５０ｍＭの間、任意選択で、洗浄液に存在する一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００、または８００ｍＭ、任意選択で４７１ｍＭ、５１３．３ｍＭ、または５９９ｍＭである、
任意選択で、前記洗浄液の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、
または
ｂ）二価イオンおよび／または塩、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間、１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間、任意選択で６と１２ｍＭの間、任意選択で８．４ｍＭ、６．６ｍＭ、１３ｍＭ、または２６ｍＭである、
任意選択で、ステップ（ｖｉ）の前記洗浄液の前記二価イオンおよび／または塩は、マグネシウムまたはカルシウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、前記二価の塩は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である。
【０３７７】
５８）検出メンバーが前記捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して検出複合体を形成し、任意選択で前記検出メンバーが抗体または抗体フラグメントである、実施形態５７に記載の方法。
【０３７８】
５９）検出メンバーが微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的である、実施形態５７および５８のいずれかに記載の方法。
【０３７９】
６０）検出メンバーが、標的グラム陰性菌種に対する特異性、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に対する特異性を有する、実施形態５７〜５９のいずれかに記載の方法。
【０３８０】
６１）検出メンバーが、以下からなる群から選択される抗体である、実施形態５７〜６０のいずれかに記載の方法：
サルモネラ菌のＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１、またはＴ６抗体、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７。
【０３８１】
６２）前記検出メンバーへの前記曝露が、以下である一価のイオンおよび／または塩のモル濃度で行われる、実施形態５７〜６１のいずれか１つに記載の方法：
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３８２】
６３）方法が、検出複合体を、以下を含む洗浄液に曝露することをさらに含む、実施形態５７〜６２のいずれかに記載の方法：
ａ）洗浄液の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭである一価イオン、または１００から７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００から６５０ｍＭの間、任意選択で、洗浄液に存在する一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００、または８００ｍＭ、任意選択で４７１ｍＭ、５１３．３ｍＭ、または５９９ｍＭである、
任意選択で、前記洗浄液の一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである、
または
ｂ）二価イオンおよび／または塩、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間、１２と１４ｍＭの間、または５と８ｍＭの間、任意選択で６と１２ｍＭの間、任意選択で８．４ｍＭ、６．６ｍＭ、１３ｍＭ、または２６ｍＭである、
任意選択で、ステップ（ｖｉ）の前記洗浄液の前記二価イオンおよび／または塩は、マグネシウムまたはカルシウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、前記二価の塩は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２である。
【０３８３】
６４）標的グラム陰性菌、任意選択でサルモネラ菌細胞または大腸菌の細胞の存在または不在の前記検出、または標的グラム陰性菌、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の定量化は、検出メンバーの存在または不在の検出を含み、任意選択で検出メンバーの存在または不在の前記検出は、実施形態６０による洗浄液への曝露後に起こる、実施形態５７〜６３のいずれかに記載の方法。
【０３８４】
６５）検出メンバーの存在または不在の前記検出は、検出メンバーに特異性を有する抗体への曝露を含み、任意選択で、抗体は酵素結合抗体であり、任意選択でＨＲＰ結合抗体である、実施形態６４に記載の方法。
【０３８５】
６６）酵素が観察可能な色の変化をもたらし、任意選択で、酵素基質の添加時に観察可能な色の変化をもたらす、実施形態６５に記載の方法。
【０３８６】
６７）検出複合体の存在の検出が、最初の検査サンプル中の標的グラム陰性菌、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在を示す、実施形態６４から６６のいずれかに記載の方法。
６８）検査サンプル中の標的グラム陰性菌種、任意選択で、サルモネラ菌または大腸菌を定量化または存在または不在を検出するための方法であって、以下を含む方法：
ａ）検査サンプル中の微生物細胞を培養すること、任意選択で、微生物細胞は、実施形態１〜２７のいずれか１つの方法に従って培養される、
ｂ）培養された微生物細胞を、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理する、
ｃ）培養された細胞または処理された培養検査サンプルの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露し、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらすこと、任意選択で、捕捉メンバーはヒツジポリクローナル抗体であるか、またはサルモネラ菌に対して産生される、
ｄ）捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露して、検出複合体を形成すること、この場合検出メンバーは、標的グラム陰性菌種に特異的な抗体であり、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に特異的な抗体であり、前記検出メンバーへの前記曝露は、以下の一価のイオンおよび／または塩のモル濃度で行われる：
ｉ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｉｉ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｉｉｉ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３８７】
ｅ）検出複合体を、以下を含む洗浄液に曝露すること：
ｉ）洗浄液の中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭ、または１００と７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００と６５０ｍＭの間である一価イオン、
ｉｉ）二価イオンおよび／または塩、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間である、
ｆ）検出複合体の存在または不在を検出すること、任意選択で、前記検出は、検出メンバーに特異性を有する酵素結合抗体、任意選択でＨＲＰ結合抗体の曝露を含む、
この場合、検出複合体の存在の検出は、最初の検査サンプルの中の標的グラム陰性細胞、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在を示す。
【０３８８】
６９）サルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌、任意選択で検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞の選択的な培養のためのキットであって、任意選択で、培養は実施形態１〜２７のいずれかに従って行われ、以下を含むキット：
実施形態１〜５のいずれかで定義される式Ｉの薬剤、そして
セフスロジンおよび／またはノボビオシン、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
【０３８９】
６９ａ）サルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞、任意選択で検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞の選択的な培養のためのキットであって、任意選択で、培養は実施形態１〜２７のいずれかに従って行われ、以下を含むキット：
ａ）本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、ノボビオシン（ｂ）、塩化第二鉄（ｌ）、または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）のいずれか１つまたは複数、
任意選択で、式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑであり、
ｂ）本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、およびノボビオシン（ｂ）、および任意選択で、塩化第二鉄（ｌ）および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）を含む、
任意選択で、式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、または
ｂ）本開示の第１の態様で定義される式Ｉの薬剤（ａ）、セフスロジン（ｂ）、およびノボビオシン（ｂ）、および、塩化第二鉄（ｌ）および／または亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物（ｍ）を含む、
任意選択で、前記式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである。
６９ａ）サルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞、任意選択で検査サンプルの中に存在し得るサルモネラ細胞または大腸菌細胞などのグラム陰性菌細胞の選択的な培養のためのキットであって、任意選択で培養は実施形態１〜２７のいずれかに従って行われ、以下を含むキット：
式Ｉの薬剤を任意選択で４ＰＹｃｑ（ａ）、セフスロジン（ｂ）およびノボビオシン（ｃ）を含む第１の組成物、
さらに、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む第２の組成物を含み、任意選択で、第２の組成物は培地であり、任意選択で、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物を含む凍結乾燥培地である。
【０３９０】
７０）標的グラム陰性細胞、任意選択でサルモネラ菌細胞または大腸菌を定量化または存在もしくは不在を検出する方法において使用するためのキットであり、任意選択で、検査サンプルの標的グラム陰性菌細胞、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在または非存在を検出し、任意選択で、標的グラム陰性細胞、任意選択でサルモネラ菌細胞または大腸菌細胞を定量化または存在もしくは不在を検出する方法が、実施形態４８〜６８のいずれかに従って実行され、キットは以下のいずれか２つ以上が含まれる：
ａ）任意選択で、式Ｉの薬剤が４ＰＹｃｑである、実施形態１〜５のいずれかで定義される式Ｉの薬剤、
ｂ）セフスロジンおよび／またはノボビオシン、
ｃ）存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように微生物細胞を処理する薬剤、任意選択でアルコールまたは水ベースの緩衝液である、
ｄ）捕捉メンバー、
任意選択で、捕捉メンバーが抗体または抗体フラグメントであり、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、
任意選択で、捕捉メンバーが微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的であり、任意選択でサルモネラ菌に特異的であり、任意選択で、捕捉メンバーがサルモネラ菌に対して産生されたヒツジポリクローナル抗体である、
任意選択で、前記捕捉メンバーが基質または固体表面に固定化され、任意選択で中間結合パートナーを介して基質または固体表面に固定化され、任意選択で、前記中間結合パートナーがビオチンおよびストレプトアビジンを含む結合である、
ｅ）検出メンバー、任意選択で
検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントである、および／または
捕捉メンバーは、微生物に特異的であり、任意選択で細菌に特異的であり、任意選択でグラム陰性菌に特異的であり、任意選択で標的グラム陰性菌種に特異的であり、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に特異的であり、および／または
検出メンバーは、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成する、および／または
検出メンバーは、３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６からなる群から選択される抗体であり、
またはＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号：
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、
ｆ）洗浄液の中の一価イオンおよび／または塩のモル濃度が少なくとも１００、１３７、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または６５０ｍＭ、または１００と７００ｍＭまたは７５０ｍＭまたは８００ｍＭの間、または３００と６５０ｍＭの間である一価イオンを含む水溶液、
ｇ）二価イオンおよび／または塩を含む洗浄液、洗浄液の二価イオンおよび／または塩のモル濃度が、１と３０ｍＭの間、任意選択で５と１５ｍＭの間である、
ｈ）実施形態４８〜５３のいずれかで定義される培地、
ｉ）検出メンバーに特異性のある抗体、任意選択で、抗体は酵素結合抗体であり、任意選択でＨＲＰ結合抗体である、
ｊ）ストレプトアビジンアッセイプレート、ウェルの内面は、サルモネラ菌またはその微生物フラグメントに特異的なビオチン化ポリクローナル抗体でコーティングされている、
ｋ）本開示の第１、第２および第３の態様の方法を実施するための説明書、
ｌ）塩化第二鉄、および／または
ｍ）硫化カリウム。
【０３９１】
７１）対象を  標的グラム陰性菌種に感染していると診断する方法、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に感染していると診断する方法であって、実施形態１〜２７のいずれかに従って検査サンプルの微生物を培養すること、および／または実施形態４８〜６８のいずれか１つの方法による、標的グラム陰性菌種、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在または不在を検出することを含む、方法。
【０３９２】
７２）標的グラム陰性菌種に感染している、任意選択で抗サルモネラ菌または抗大腸菌剤、任意選択で診断が実施形態７１に従って行われるサルモネラ菌または大腸菌に感染していると診断された対象の治療に使用するための抗グラム陰性菌剤。
７３）微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルの中の標的グラム陰性菌種、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在を検出するための方法であって、任意選択で、サンプルは培養された微生物細胞のサンプルであり、
方法はイムノアッセイを含み、イムノアッセイは、検出メンバーの使用を含み、サンプルまたは微生物細胞は、以下の塩濃度で検出メンバーに曝露され、
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３９３】
７４）微生物細胞を含む、または含むと予想されるサンプルの中の  標的グラム陰性菌種、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌の存在を検出するための方法であって、任意選択で、サンプルは培養された微生物細胞のサンプルであり、
イムノアッセイを含み、イムノアッセイは、以下を含む方法：
ａ）任意選択で、微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理されるよう、サンプルまたは培養された微生物細胞を処理すること、
ｂ）処理された培養された微生物細胞のサンプルまたは培養された微生物細胞または細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を捕捉メンバーに曝露すること、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖をもたらし、
任意選択で、曝露することは、培養された微生物細胞が、検査サンプル内に存在するいずれかの微生物からの細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖の放出を引き起こすように処理された後に生じ、任意選択で、
捕捉メンバーは、抗体または抗体フラグメント、任意選択でビオチン化抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、捕捉メンバーは、標的グラム陰性菌に対して特異性を有し、任意選択で、サルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有し、任意選択で、捕捉メンバーは、サルモネラに対して産生されたヒツジポリクローナル抗体である。
任意選択で、捕捉メンバーは
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、および
ｃ）捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖を検出メンバーに曝露すること、この場合、検出メンバーは、捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖に結合して、検出複合体を形成し、任意選択で、検出メンバーは、抗体または抗体フラグメントであり、任意選択で、検出メンバーが標的グラム陰性菌、任意選択でサルモネラ菌または大腸菌に対して特異性を有し、任意選択で、検出メンバーは、以下からなる群から選択される：
サルモネラ菌の前記ＬＰＳまたはコアオリゴ糖に特異的なモノクローナル抗体、任意選択で３Ｄ１１、Ｇ７、Ｍ１８１またはＴ６、
ＶｉｒｏＳｔａｔ製品番号、
サルモネラ属、６３７１〜６３９４、６３０１〜６３４７、６３０１−べん毛、６３２１−べん毛、６３３１−ネズミチフス菌、６３９２−共通コア、６３９３、６３９４、６３９１、６３８１、６３７１、
サルモネラパラチフスＡ６３４７−ＬＰＳ、または
サルモネラチフス６３０１、６３２１、６３４５、６３３１、６３４７、
および
捕捉された細胞または捕捉された細菌ＬＰＳおよび／またはコアオリゴ糖は次の塩濃度で検出メンバーに曝される：
ａ）２００ｍＭ以下、任意選択で２００ｍＭ未満、任意選択で１７５ｍＭ未満、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で１２５ｍＭ未満、任意選択で１００ｍＭ未満、任意選択で９０ｍＭ未満、任意選択で８０ｍＭ未満、任意選択で７０ｍＭ未満、任意選択で６０ｍＭ未満、任意選択で５０ｍＭ未満、任意選択で４０ｍＭ未満、任意選択で３５ｍＭ未満、任意選択で３０ｍＭ未満、任意選択で２５ｍＭ未満、任意選択で２０ｍＭ未満、任意選択で１５ｍＭ未満、任意選択で１０ｍＭ未満、任意選択で５ｍＭ、および／または
ｂ）５ｍＭと２００ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと１９０ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと１８０ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭと１７０ｍＭの間、任意選択で２５ｍＭと１６０ｍＭの間、任意選択で３０ｍＭと１５０ｍＭの間、任意選択で３５ｍＭと１４０ｍＭの間、任意選択で４０ｍと１３０ｍＭの間、任意選択で４５ｍＭと１２０ｍＭの間、任意選択で５０ｍＭと１１０ｍＭの間、任意選択で５５ｍＭと１００ｍＭの間、任意選択で６０ｍＭと９０ｍＭの間、任意選択で７０と８０ｍＭの間、
ｃ）５ｍＭと３０ｍＭの間、任意選択で６ｍＭと２９ｍＭの間、任意選択で７ｍＭと２８ｍＭの間、任意選択で８ｍＭと２７ｍＭの間、任意選択で９ｍＭと２６ｍＭの間、任意選択で１０ｍＭと２５ｍＭの間、任意選択で１１ｍＭと２４ｍＭの間、任意選択で１２ｍＭと２３ｍＭの間、任意選択で１３ｍＭと２２ｍＭの間、任意選択で１４ｍＭと２１ｍＭの間、任意選択で１５ｍＭと２０ｍＭの間、任意選択で１６ｍＭと１９ｍＭの間、任意選択で１７ｍＭと１８ｍＭの間、任意選択で２０ｍＭ、
任意選択で、一価イオンおよび／または塩は、リチウム、ナトリウムまたはカリウムイオンおよび／または塩であり、任意選択で、一価の塩はＬｉＣｌ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。
【０３９４】
本開示は以下の非限定的な実験例を参照してさらに理解されるであろう。
【実施例】
【０３９５】
実施例１−ブリリアントグリーンに対する微生物細胞の感度は、食物の存在と食物の種類に影響される
本発明者らは、驚くべきことに、サルモネラ菌を培養する標準的な先行技術の方法は、比較的遅く、現在の検査の必要性には不十分であることを見出した（図２）。
【０３９６】
様々な食品のバックグラウンドから培養された様々なサルモネラ菌株の培養から得られた検出信号の強度は、２ステップの培養である標準的な現在のＩＳＯ法を使用して細胞が培養された場合、ＢＧではなく４ＰＹｃｑなどの式Ｉの薬剤の使用と、単一の培養ステップが含まれる本開示の方法と比較してはるかに変動した（図３）。バックグラウンドの汚染物質（例えば、食品のデブリ）またはサルモネラ菌株がいずれであっても、サルモネラ菌の存在を検出する特定の方法の能力の変動が減少することは、本開示の特定の利点である。
【０３９７】
実施例２−４ＰＹｃｑを使用した培養では、サルモネラ菌を少量の存在のサンプルから検出可能なレベルまで２０時間で増殖させることができるが、ＢＧを用いた培養ではできない
さらに、８ｍｇ／ＬのＢＧを含む純粋なサルモネラ菌の培養物の低から中程度の接種レベルでの２０時間の培養は、本明細書に記載のＥＬＩＳＡ法を使用した検出に対してサルモネラの不十分な回収をもたらした（図４）。ただし、５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑを使用した２０時間の培養では、本明細書に記載のアッセイで使用されたものと同じ濃度であり、同じ接種の乳製品やプロバイオティクス食品など、様々なサンプルタイプからの競合する微生物叢が十分に抑制されるに至り、サルモネラ菌の存在の陽性の識別をもたらしている。
【０３９８】
実施例３−検出メンバーへのサンプルの曝露中に塩分レベルが低下すると、感度が大幅に向上する
【０３９９】
【表１】
2022502087.tif 000014
【０４００】
【表２】
2022502087.tif 000015
【０４０１】
表２および表３は、低い塩レベルがコンジュゲート緩衝液に存在する場合に、感度の増加が見られることを示している。特に、０．２％のＮａＣｌ（３４．２ｍＭ）のコンジュゲート緩衝液は、低濃度のＳ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌの検出に最適である。使用したＥＬＩＳＡプレートは、ポリクローナル抗サルモネラ菌抗体で直接コーティングされていた。
【０４０２】
【表３】
2022502087.tif 000016
【０４０３】
表４は、低レベルの塩、例えば０．２％ＮａＣｌ（３４．２ｍＭ）が、サルモネラ菌の様々な菌株の検出シグナルを大幅に強化することを示している。この例では、塩分レベルの低下とともにバックグラウンドシグナルが増加し、フックタイプの影響の証拠が存在した。
【０４０４】
実施例４−Ｓｏｌｕｓワン・サルモネラ菌キットの説明書
例示的な方法を以下に詳述する。
【０４０５】
この方法は、翌日食品中のサルモネラ菌を検出するためのものである。この方法は、運動性と非運動性の両方のすべてのサルモネラ菌の検出に適合している。
【０４０６】
１．緒言
Ｓｏｌｕｓワン・サルモネラ菌は、２２時間以内の単一の濃縮ステップから、陰性または推定陽性の結果を提供する。そのうちイムノアッセイは２時間である。
【０４０７】
２．使用目的
検査法には、実験施設に加えて、資格のある訓練を受けた要員が必要である。基本的なトレーニングは、初めての使用者に推奨され、Ｓｏｌｕｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄによって提供される。この方法の使用には、Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＥＮ  ＩＳＯ  ７２１８を参照）への準拠が含まれる。
【０４０８】
３．提供される試薬
キットのコンポーネントは安定して供給され、作業濃度で即席で使用できる。Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡｃｔｉｖａｔｏｒとＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ試薬のみ、希釈が必要である。活性剤を最初に１４４０ｍｌの脱イオン（ＤＩ）水に溶解し、次にこの溶液に６０ｍｌの濃縮洗浄緩衝液試薬を添加する必要がある。
【０４０９】
各キットには、５ｘ９３の測定に十分な材料と対照が含まれている。
【０４１０】
キットの有効期限は、各製品ラベルに表示されている。
【０４１１】
・５ｘ９６ウェルマイクロプレート（壊れやすいストリップ形式）。ウェルはサルモネラ属菌に対する抗体でコーティングされている。
【０４１２】
・陰性対照（グリーンラベル）。作動希釈液で１０ｍｌ。希釈剤が
防腐剤と共に含まれている。
【０４１３】
・陽性対照（赤いラベル）。作動希釈液で１０ｍｌ。防腐剤を含む希釈剤で熱殺菌したサルモネラ菌が含まれている。
【０４１４】
・コンジュゲート（オレンジラベル）。作動希釈液で６０ｍｌ。西洋ワサビペルオキシダーゼ−抗体コンジュゲートを防腐剤と共に希釈剤で含む。
【０４１５】
・基質（青いラベル）。作動希釈液で６０ｍｌ。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、過酸化水素、安定剤が含まれている。溶液は透明またはわずかにかすかな青色であるべきである。
【０４１６】
・停止液（黄色のラベル）。作動希釈液で６０ｍｌ。１０％の硫酸が含まれている。
【０４１７】
・洗浄緩衝液濃縮液（２５ｘ）。５ｘ６０ｍｌ。
・Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ。５ｘ１  Ｓａｃｈｅｔ
【０４１８】
４．材料および機器
必須であるが提供されず
・２〜８℃の冷蔵庫
・脱イオン水または蒸留水
・ＩＳＯ  ６５７９に準拠した緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）
・ＳＡＬＳＵＰＰＩＩ−Ｓｏｌｕｓワン・サルモネラ補充
・７０％ｖ：ｖエタノール
・２５０ｍｌまたは１Ｌのメスシリンダー
・フィルターバッグ（ストマッカーなど）
・選択的濃縮培養に適した滅菌済みの１０ｍｌ試験管
・ストマッカー（または同様の装置）とバッグ
・３ｍｌのトランスファーピペット（滅菌済み）
・サンプル沸騰用の試験管（例えば、５ｍｌポリプロピレンリムレス試験管１２ｘ７５ｍｍ）
・ボルテックスミキサー
・タイマー
・４１．５±１℃のインキュベーターまたはウォーターバス
・加熱ブロックまたはウォーターバス（８５〜１００℃に加熱可能）
・ピペットとチップ（１ｍｌ；０．１ｍｌ）
・マイクロプレートウォッシャーまたはスクイズボトル
・４５０ｎｍフィルター付きマイクロプレートリーダー
・サンプルの除染用オートクレーブ
【０４１９】
５．試薬の調製
５．１．洗浄緩衝液：
清潔な２リットルの容器で以下を調製する
５．１．１  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｓａｃｈｅｔの内容物を１４４０ｍｌのＤＩまたは蒸留水に加え、アクティベーターが完全に溶解するまで混合する。
【０４２０】
５．１．２  １４４０ｍｌの溶解した活性剤溶液が入っている容器に６０ｍｌの濃縮洗浄緩衝液を加える。
【０４２１】
５．１．３  保管ボトルに移し、必要に応じて溶液にラベルを付ける。
【０４２２】
５．２．培養液（増殖培地）：製造元の指示に従って、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）ＩＳＯ６５７９を調製する。検査で使用する前に、室温まで冷却。
【０４２３】
５．３．１５ｍｌの７０％ｖ：ｖエタノールを加えてＳｏｌｕｓワン・サルモネラ菌の補充物を調製する。内容物を溶液に溶かせ、これは通常、室温で約３０分る。ＢＰＷの１Ｌあたり４．４４ｍｌ補充物（２２５ｍｌあたり１ｍｌ）を追加する。（いくつかの実施形態では、例えば、サンプルがスパイスまたはスパイス製品である、または標的細胞が大腸菌、例えば大腸菌０１５７であるいくつかの状況において、ハーフストレングスの補充を使用することが可能である。このような状況では、１ＬのＢＰＷあたり２．２２ｍｌの補充を使用）。
【０４２４】
６．サンプルの調製および濃縮−標準的な方法
２２５ｍｌの補充用のＢＰＷで２５ｇのサンプルをホモジナイズし、４１．５±１℃で２０〜２２時間インキュベートする。
【０４２５】
ＮＦ  ＶＡＬＩＤＡＴＩＯＮのコンテキストでは、２５ｇを超える重量の検査する部分は検査されていない。一部の食品の根源的な懸濁液の特定の調製については、ＥＮ  ＩＳＯ６５７９を参照。
【０４２６】
補充されたＢＰＷ接種サンプルのベンチ処理時間を最小限に抑え、できるだけ早く４１．５℃のインキュベーターに移すことを確認する。これは、競合する生物の広範な増殖を回避するために重要である。
【０４２７】
補充用ＢＰＷでのインキュベーション期間が完了したら、粒子状物質や脂肪性の物質を避けて１ｍｌを慎重に取り除き（この目的にはフィルターバッグの使用を強く勧める）、ガラスまたはポリプロピレンの試験管に入れる。
【０４２８】
試験管内でアリコートを８５〜１００℃に１５〜２０分間加熱する。加熱後、サンプルを室温まで冷却する。これは、試験管を冷水に５分間置くことで加速できる。
【０４２９】
煮沸後、一部のサンプルには凝固したタンパク質と脂肪が含まれている可能性があり、Ｄｙｎｅｘ機器でピペッティングの問題が発生する可能性がある。機器の誤差を避けるために、沸騰している管にフリットを追加し、液体の表面の下にフリットをそっと押し込む。
【０４３０】
煮沸されていない補充されたＢＰＷサンプルは、イムノアッセイの結果が得られるまで検証のために保管するべきである。イムノアッセイ検査をイムノアッセイ検査の前に２時間以内、または最大７２時間の間２〜８℃で実施する場合は、これらのサンプルを４１．５±１℃に保つことができる。
【０４３１】
７．イムノアッセイの手順
７．１．成分が室温に達するまで、使用の１時間前に２〜８℃で保管してからテストキットを取り出す。検査に必要なウェルの数を決める。ポーチから必要な数のストリップを取り出し、供給されたフレームに合わせる。未使用のストリップはポーチに戻し、２〜８℃で保管する必要がある。
【０４３２】
７．２．セクション５．１で説明されているように洗浄緩衝液を調製する。
【０４３３】
７．３．ストリップの最初のウェルを空のままにしておき、基質の吸光度を測定するための「ブランク」として機能させる。
【０４３４】
７．４．０．１ｍｌの陰性対照（緑色のラベル）を２番目のウェルにピペットで入れる。
【０４３５】
７．５．０．１ｍｌの陽性対照（赤いラベル）を３番目のウェルにピペットで入れる。
【０４３６】
７．６．煮沸／冷却した各サンプル０．１ｍｌを別々にストリップの連続したウェルにピペットで入れる。検査のストリップの終わりにウェルが残っている場合は、陽性対照または陰性対照を繰り返すことができる。
【０４３７】
７．７．プレート（ストリップを含む）を３７±１℃で３０分間（±５分間）インキュベートする。
【０４３８】
７．８．インキュベーション後、ウェルの内容物を吸引し、可能な限り多くの液体を除去する。洗浄緩衝液でウェルを５〜７回洗浄し、各洗浄サイクルを通じてウェルが完全に満たされ、空になるようにする。洗浄テクニックはアッセイの能力にとって重要であるため、マイクロプレートウォッシャーの使用を推奨する。
【０４３９】
７．９．「ブランク」を除くすべてのウェルに０．１ｍｌのコンジュゲート（オレンジラベル）をピペットで入れる。
【０４４０】
７．１０．プレートを３７±１℃で３０分間（±５分間）インキュベートする。
【０４４１】
７．１１．セクション７．９で詳述されているように洗浄サイクルを繰り返す。
【０４４２】
７．１２．０．１ｍｌのＴＭＢ基質（青いラベル）を「ブランク」ウェルを含むすべてのウェルにピペットで入れる。
【０４４３】
７．１３．プレートを室温で３０分間インキュベートする。（±５分）。
【０４４４】
７．１４．インキュベーション後、「ブランク」のウェルを含むすべてのウェルに０．１ｍｌの停止液（黄色のラベル）を加えて反応を停止する。停止液を使用すると、ウェルの青色が黄色に変わる。
【０４４５】
７．１５．４５０ｎｍフィルターを使用してプレートリーダーで１０分以内に光学濃度を読み取る。気泡がないか読み取る前にウェルを検査し、存在する場合は針で破裂させる。他のウェルが読み取られる前に、「ブランク」のウェルに対してリーダーをゼロにする。
【０４４６】
７．１６．参照フィルターは使用しないように。
【０４４７】
８．結果の解釈
結果は、マイクロプレートリーダーを使用した光学密度（ＯＤ４５０）測定値として表される。他のすべての結果からブランクウェル（通常はＡ１）のＯＤ値を引く。
【０４４８】
【表４】
2022502087.tif 000017
【０４４９】
ＯＤ４５０の読み取り値が０．２００未満のサンプルは陰性とみなされ、その場合、分析が完了し、結果が報告でき、補充されたＢＰＷブロスの対応する非煮沸アリコートが地域の規制／ガイドラインに従って廃棄され得る。
【０４５０】
ＯＤ４５０≧０．２００のサンプルウェルは、サルモネラ菌に対し推定陽性とみなされる。推定陽性の結果は、認められた培養法を使用して検証する必要がある。
９．サルモネライムノアッセイからの陽性の結果の確認
【０４５１】
ＯＤが０．２００以上のサンプルは、サルモネラ菌陽性とみなされる。
【０４５２】
別の方法で陽性と識別されたすべてのサンプルは、次のいずれかの方法で確認する必要がある。
【０４５３】
確認ステップは、４１．５℃または２〜８℃で保存された（煮沸されていない）補充されるＢＰＷサンプルから開始する必要がある。
【０４５４】
１枚の寒天プレート（ＸＬＤまたはＣｈｒｏｍａｇａｒから得るＣｏｌｏｒｅｘサルモネラなどのサルモネラ用発色寒天）上に補充されるＢＰＷサンプルをストリークする。標準的なサルモネラ培養プロトコルで指定されているように寒天をインキュベートし、確認テストを実行する。例えば、ＭｉｃｒｏｇｅｎラテックステストＦ４２または生化学的同定ギャラリーを精製ステップなしで直接分離コロニーで実行するか、標準化された方法（ＣＥＮまたはＩＳＯ）で説明されているテストを実行する。Ｆ４２ラテックステストは、ポリクローナル抗体を使用してべん毛抗原を検出する。これは、非運動性サルモネラ菌の検出には適していない。
【０４５５】
またはさらに、補充されるＢＰＷサンプル（０．１ｍｌ＋１０ｍｌ）を４１．５℃＋／−１℃で２４時間＋／−３時間インキュベートしたＲＶＳブロスで継代培養する。ＸＬＤまたはＣｈｒｏｍａｇａｒから得るＣｏｌｏｒｅｘサルモネラなどのサルモネラ用発色寒天上にストリークする。標準的なサルモネラ培養プロトコルで指定されているように寒天をインキュベートしてから、精製ステップなしで、または標準化された方法（ＣＥＮまたはＩＳＯ）で説明されているテストを実行することにより、ＭｉｃｒｏｇｅｎラテックステストＦ４２または生化学的同定ギャラリーなどの確認テストを分離コロニーで直接実行する。
【０４５６】
結果が一致しない場合（ＥＬＩＳＡの推定陽性の結果、上記の手段の１つ、特にラテックステストで確認されていない場合）、検査室は必要な手順に従って、得られた結果の有効性を確認する必要がある。
【０４５７】
実施例５  偽陽性の検出に対する洗浄液中の塩の影響
以下のコンポーネント／ステップを使用できるが、他のコンポーネント／ステップも可能である。
【０４５８】
材料
培地：
ストレプトアビジンプレート：
９４ウェルストレプトアビジンプレートのウェルは、２μｇ／ｍｌのビオチン化捕捉抗体でコーティングされている。
【０４５９】
コンジュゲート緩衝液：
０．１５μｇ／ｍｌのコンジュゲート３Ｄ１１  ＨＲＰ
０．０６μｇ／ｍｌの他のサルモネラ成分に対して結合親和性を持つＨＲＰコンジュゲート抗体
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ
３４．２２ｍＭのＮａＣｌ
ＢＳＡ  １％
０．１％ｗ／ｖのＰｒｏｃｌｉｎ  ９５０
フェリシアン化カリウム０．００１％
ウシガンマグロブリン０．１％
コンジュゲート緩衝液に界面活性剤を補充することが適切な場合もある。
【０４６０】
高塩分洗浄緩衝液：
４．０７３ｍＭのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０
５９９ｍＭのＮａＣｌ
トリス
基質：
これは独自の溶液として購入できる。例えば、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ  ＴＭＢ基質製品コードＵＰ６６４７８２である。
【０４６１】
停止液：
０．１ＭのＨ２ＳＯ４
【０４６２】
方法
検査サンプルは、５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑおよび１０ｍｇ／Ｌのノボビオシンおよび８ｍｇ／Ｌのセフスロジンを含む培地で培養された。培地を４１．５℃で２０時間インキュベートした。検査サンプルのアリコートを８５〜１００℃で１５〜２０分間加熱し、アッセイ前に室温まで冷却した。アリコートした検査サンプル１００μｌをサンプルウェルに加えた。サンプルを３７±１℃で３０分間、穏やかに攪拌しながら最初の５分間インキュベートした。すべてのウェルを高塩分洗浄緩衝液で５〜７回洗浄する。１００μｌの０．１５μｇ／ｍｌのコンジュゲート３Ｄ１１ＨＲＰおよび０．０６μｇ／ｍｌの、他のサルモネラ成分に対して結合親和性を持つＨＲＰコンジュゲート抗体を、サンプルウェルと陽性および陰性対照ウェルに加え、３７±１℃で３０分間インキュベートする。ウェルを高塩分洗浄緩衝液で５〜７回洗浄する。次に、１００μｌの基質をウェルに加え、３７±１℃で３０分間インキュベートした後、１００μｌの停止液を加えた。光学密度（ＯＤ）は、サンプルウェルと陽性および陰性対照から記録し、プレートリーダーを使用して、停止液を添加してから１０分以内に４５０ｎｍフィルターを使用し、ブランクウェルに対して較正した。
【０４６３】
ＯＤ４５０の読み取り値が０．２００未満のサンプルは陰性とみなされ、その場合、分析が完了し、結果が報告でき、補充されたＢＰＷブロスの対応する非煮沸アリコートが廃棄され得る。
【０４６４】
【表５】
2022502087.tif 000018
【０４６５】
【表６】
2022502087.tif 000019
【０４６６】
表５は、ＮａＣｌが生理学的レベル（０．８％）で添加された場合、洗浄緩衝液に補充のＮａＣｌが存在すると、洗浄緩衝液と比較して偽陽性のシグナルが減少したことを示している。
【０４６７】
【表７】
2022502087.tif 000020
【０４６８】
表６は、ＭｇＣｌ２を洗浄緩衝液に添加して、偽陽性シグナルを低減できるが、サルモネラ菌を含むサンプルではシグナル損失がいくらか観察されたことを示している。
【０４６９】
【表８】
2022502087.tif 000021
【０４７０】
表８は、洗浄緩衝液に補充のＫＣｌを追加した場合の効果が、偽陽性シグナルの低減に対するＮａＣｌの効果と同様の効果があることを示している。このアッセイで、ＭｇＣｌ２サンプル添加物５０μｌがインキュベーションの前に１００μｌのサンプルに添加された。
【０４７１】
実施例６−ストレプトアビジンでコーティングされたアッセイプレートの好ましい使用
【０４７２】
【表９】
2022502087.tif 000022
【０４７３】
表７は、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートに結合したビオチン化ポリクローナル捕捉抗体を使用すると、ポリスチレンプレートに受動的に結合した同じ捕捉抗体と比較して、サルモネラ菌を含むサンプルのシグナルが増加し、アッセイの特異度も向上することを示している。
【０４７４】
実施例７−サルモネラ菌を検出するための代替モノクローナル抗体の使用
【０４７５】
【表１０】
2022502087.tif 000023
【０４７６】
表９は、サルモネラ細胞を検出するために３Ｄ１１と同様のモノクローナル抗体を本開示で使用できることを示している。
【０４７７】
サルモネラ菌の選択的増殖
ＩＳＯ緩衝ペプトン水
処方  ｇ／Ｌ
カゼインの酵素消化物  １０
塩化ナトリウム  ５．０
無水リン酸水素二ナトリウム  ３．６
リン酸二水素カリウム  １．５
【０４７８】
上記の培地は、サルモネラ菌のより制限のない増殖を可能にする競合するフローラによる濃縮の異常増殖を防ぐために選択的に作られる。
【０４７９】
選択的補充  ｍｇ／Ｌ
４ＰＹｃｑ  ５．０
ノボビオシン  １０．０
セフスロジン  ８
図３を参照されたい
【０４８０】
実施例８−スパイス、ハーブ、香料を含む検査サンプルからのサルモネラ菌の回収と検出
サルモネラ菌などの微生物は、一部にはスパイス、香料、ハーブに存在するフェノール化合物が原因で、スパイス、香料、ハーブのサンプルから回収するのが難しいことで有名である。回収は通常、サンプルからスパイスと香料を希釈することによって実行される。これは、回収と検査のために採取される希釈されるサブサンプルに十分な微生物細胞が存在するように、適切に高い初期接種レベルの微生物が必要である。少なくともこの理由から、スパイス、香料、ハーブからサルモネラ菌などの微生物を回収および検出する現在の方法は、信頼性が低く、不正確であり、日常的なハイスループットで迅速な検査には適していない。
【０４８１】
図８は、様々なスパイス、香料、およびハーブからのサルモネラ菌細胞をＢＰＷ培地のみで、本明細書に記載されているように単一のステップで培養することは、可能なければ困難であることを示している。
【０４８２】
しかし、図９Ａは、本明細書に記載の５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、８ｍｇ／Ｌのセフスロジンおよび１０ｍｇ／Ｌのノボビオシンを含む選択的な補充を含めることを示しており、様々な異なるスパイス、ハーブおよび香味料からのサルモネラ菌細胞の回収を可能にする。しかし、ニンニク顆粒とシナモンに存在するサルモネラ菌を１回の培養ステップで回収するだけでは、検出には不十分であった。
【０４８３】
本発明者らは、驚くべきことに、４ＰＹｃｑ／セフスロジン／ノボビオシンの補充に加えて、塩化第二鉄および亜硫酸カリウムなどの亜硫酸化合物のさらなる２つの薬剤を含めることで、これらのサンプルからサルモネラ菌を回収できるだけでなく（４ＰＹｃｑ／セフスロジン／ノボビオシンの補充で達成される）、ＢＡＭ基準法（１０〜１００ｇ／１：１０〜１：１００の濃縮）から得られた結果と同等であることを示す結果をもたらすことを見出した。図９Ａおよび９Ｂを参照されたい。
【０４８４】
図９Ａおよび９Ｂに示されているデータは、比較的高レベルのサルモネラ菌を接種したサンプルから得られたものである（図９Ａ−７７−１１４ｃｆｕ、図９Ｂ−３８ｃｆｕ）。
【０４８５】
図１０は、部分接種レベル（２〜８ｃｆｕ）から得られたデータを示している。この例では、細胞は４ＰＹｃｑ／セフスロジン／ノボビオシンの補充で、以前に使用された濃度の半分、つまり２．５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、４ｍｇ／Ｌのセフスロジン、および５ｍｇ／Ｌのノボビオシンの作動濃度で培養される。標準濃度（５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、８ｍｇ／Ｌのセフスロジン、および１０ｍｇ／Ｌのノボビオシン）、および半分の濃度（２．５ｍｇ／Ｌの４ＰＹｃｑ、４ｍｇ／Ｌのセフスロジン、および５ｍｇ／Ｌのノボビオシン）の両方は、スパイス、ハーブ、香料からサルモネラ菌を回収する能力が同等であることが示されている（図１１を参照）。
【０４８６】
図１０は、部分接種レベルでも、塩化第二鉄と亜硫酸カリウム（「スパイス中和剤」の補充）を含めることにより、スパイス、ハーブ、香料からサルモネラ菌を回収して検出することができる。
【０４８７】
しかし、クローブとオレガノからのサルモネラ菌の回収と検出は、より困難であり、より高い初期接種レベルが必要になる場合がある。これは、「スパイス中和剤」組成物が２倍の強度で使用されている場合でも当てはまる（図１２）。
【０４８８】
図１３は、「スパイス中和剤」の各成分（塩化第二鉄と亜硫酸カリウム）の関連性を示している。
【０４８９】
ネギ科のスパイス／香料を使用すると、サルモネラ菌の回収には、Ｓｏｌｕｓの「スパイス中和剤」のカリウム塩成分で十分である。
【０４９０】
タマネギだけを含む香料や純粋な製品の場合、Ｓｏｌｕｓ補充の存在で十分である。
【０４９１】
タンドリーマサラなどの様々なスパイスの場合、サルモネラ菌を効果的に回収するには、完全な「スパイス中和剤」において、鉄塩とカリウム塩の両方が必要である。例えば、図１０を参照されたい。タンドリーマサラからの回収は、「スパイス中和剤」の両方の薬剤の存在下、つまり塩化第二鉄と亜硫酸カリウムの存在下で培養した場合に良好であることを示している。
【０４９２】
図１５は、亜硫酸カリウムと塩化第二鉄を使用した標準的な２段階の培養プロトコルを、塩化第二鉄、亜硫酸カリウム、および４ＰＹｃｑ、ノボビオシン、セフスロジンを含む選択的な補充を含む、本開示による単一培養法と比較した検証データを示している。
【０４９３】
図１７は、いくつかのスパイスのいくつかの抗菌成分の構造を示している。
【０４９４】
実施例９−本開示による方法および組成物は、サルモネラ菌以外のグラム陰性菌の培養および検出に適している。
【０４９５】
ＢＰＷのハーフストレングスの補充を使用して、３７５ｇの牛肉サンプル（牛挽肉と生の牛肉トリム）／１：４の濃縮から大腸菌Ｏ１５７を培養した。わずか８〜１０時間後の培養は、現在利用可能ないくつかの分子的な方法の一部と同等であることを示している。図２０を参照されたい。
【図１】
2022502087.tif 000028
【図２−１】
2022502087.tif 000029
【図２−２】
2022502087.tif 000030
【図３−１】
2022502087.tif 000031
【図３−２】
2022502087.tif 000032
【図４−１】
2022502087.tif 000033
【図４−２】
2022502087.tif 000034
【図５】
2022502087.tif 000035
【図６−１】
2022502087.tif 000036
【図６−２】
2022502087.tif 000037
【図７−１】
2022502087.tif 000038
【図７−２】
2022502087.tif 000039
【図７−３】
2022502087.tif 000040
【図８】
2022502087.tif 000041
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【国際調査報告】
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