(57)【要約】鞘翅目、鱗翅目、及び半翅目の害虫種に対して毒性活性を示す、ＰｉｒＡ、ＰｉｒＢ、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の殺虫性タンパク質クラスが開示されている。ＰｉｒＡ、ＰｉｒＢ、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有するＤＮＡ構築物が提供される。ＰｉｒＡ、ＰｉｒＢ、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有する、鞘翅目、鱗翅目、及び半翅目の侵入に耐性があるトランスジェニックの植物、植物細胞、種子、及び植物の一部が提供される。生物試料にて本発明の組換え核酸配列またはタンパク質の存在を検出する方法、及びＰｉｒＡ、ＰｉｒＢ、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質を用いて鞘翅目種、鱗翅目種、及び半翅目種の害虫を防除する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸分子であって、
ａ．前記殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、もしくは１５７のアミノ酸配列を含む；または
ｂ．前記殺虫性タンパク質は、
ｉ．配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは
ｉｉ．       配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは
ｉｉｉ．配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５、及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；または
ｉｖ．       配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは
ｖ．配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは
ｖｉ．       配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは
ｖｉｉ．配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは
ｖｉｉｉ．配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは
ｉｘ．       配列番号１３５に対して少なくとも９９％の同一性；もしくは
ｘ．配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または
ｃ．前記ポリヌクレオチドセグメントは、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、もしくは１５８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する、前記組換え核酸分子。
【請求項２】
ａ．前記組換え核酸分子が、植物にて前記殺虫性タンパク質を発現するように機能する配列を含む、または
ｂ．前記組換え核酸分子が、植物細胞で発現され、殺虫で有効量の殺虫性タンパク質を産生する、または
ｃ．前記組換え核酸分子がベクターに操作可能に連結され、前記ベクターが、プラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌もしくは酵母の人工染色体から成る群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
宿主細胞内に存在すると定義され、前記宿主細胞が細菌細胞及び植物細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
前記細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａから成る群から選択される細菌の属に由来する、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓがＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、または前記ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項４に記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
前記植物細胞が双子葉植物または単子葉植物である、請求項３に記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
前記植物宿主細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ブラッシカ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、ネギ、レタス、ロブロリーパイン、キビ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞用植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ハトエンドウ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、サフラワー、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、スイートポテト、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギの植物細胞から成る群から選択される、請求項６に記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
前記殺虫性タンパク質が鞘翅目の昆虫に対して活性を示す、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
前記昆虫が、西洋トウモロコシ根切り虫、南部トウモロコシ根切り虫、北部トウモロコシ根切り虫、メキシコ型トウモロコシ根切り虫、ブラジル型トウモロコシ根切り虫、コロラダハムシ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａから成るブラジル型トウモロコシ根切り虫複合体、アブラナ科ノミハムシ、縞模様ノミハムシ、または西洋クロノミハムシである、請求項８に記載の組換え核酸分子。
【請求項１０】
前記殺虫性タンパク質が、鱗翅目の昆虫種に対して活性を示す、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項１１】
前記昆虫が、タマナヤガ、アメリカタバコガ、コナガ、欧州アワノメイガ、ツマジロクサヨトウ、南部ヨトウムシ、ダイズルーパー、南西部アワノメイガ、オオタバコガ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｂｕｄｗｏｒｍ）、ベルベットビーンキャタピラー、サトウキビボーラー、レッサーコーンストークボーラー、クロヨトウムシ、シロイチモジヨトウ、オオタバコガ（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ、またはピンクボールワームである、請求項１０に記載の組換え核酸分子。
【請求項１２】
前記殺虫性タンパク質が、半翅目の昆虫種に対して活性を示す、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項１３】
前記昆虫がミナミアオカメムシ、亜熱帯性クサギカメムシ、アカシマカメムシ、クロトゲアオハラカメムシ種、チャバネカメムシ、クサギカメムシ、ミドリカメムシ、クサギカメムシ、西洋サビイロメクラガメ、またはサビイロメクラガメである、請求項１２に記載  の組換え核酸分子。
【請求項１４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む植物またはその一部。
【請求項１５】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１６】
前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ブラッシカ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、ロブロリーパイン、キビ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞用植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ハトエンドウマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、サフラワー、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、スイートポテト、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギから成る群から選択される、請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１７】
前記種子が前記組換え核酸分子を含む、請求項１４に記載の植物の種子。
【請求項１８】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物。
【請求項１９】
さらに、前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、及び補助タンパク質から成る群から選択される、請求項１９に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の１以上の害虫種に対して活性を示す、請求項１９に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃ変異型、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａ変異型、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ  及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５，ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異型、ＩＰ３及びその変異型、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７  ＤＩＧ−１１、Ｃｒｙ７１Ａａ１、Ｃｒｙ７２Ａａ１、ＰＨＩ−４変異型、ＰＩＰ−７２変異型、ＰＩＰ−４５変異型、ＰＩＰ−６４変異型、ＰＩＰ−７４変異型、ＰＩＰ−７５変異型、ＰＩＰ−７７変異型、Ａｘｍｉ４２２、Ｄｉｇ−３０５、Ａｘｍｉ４４０、ＰＩＰ−４７変異型、Ａｘｍｉ２８１、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、及びＣｒｙ１  ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖから成る群から選択されるタンパク質である、請求項２１に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２３】
さらに、前記組換え核酸分子を発現する植物細胞を含むと定義される、請求項１８に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項２４】
商品生産物が、検出可能な量の前記組換え核酸分子またはそれによってコードされる殺虫性タンパク質を含む、請求項１４に記載の植物またはその一部から生産される商品生産物。
【請求項２５】
穀物取扱業者によって袋詰めされた商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアル、等、全粒綿実または加工された綿実、綿油、リント、飼料または食品用に加工された種子及び植物の一部、繊維、紙、バイオマス、及び綿油由来の燃料または綿繰り機廃棄物由来のペレットのような燃料製品、全粒ダイズ種子または加工されたダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、及びダイズ植物とダイズ植物の一部を用いて製造される燃料製品から成る群から選択される請求項２４に記載の商品生産物。
【請求項２６】
種子を生産する方法であって、
ａ．請求項１７に従って少なくとも第１の種子を植えることと；
ｂ．前記種子から植物を生育させることと；
ｃ．前記植物から種子を収穫することとを含み、前記収穫された種子が、前記組換え核酸分子を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記植物の前記細胞が請求項１に記載の組換え核酸分子を含む、昆虫の侵入に耐性がある植物。
【請求項２８】
鞘翅目種、鱗翅目種、または半翅目種の害虫または害虫の侵入を防除する方法であって、
ａ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７に記述されているような殺虫で有効量の殺虫性タンパク質に前記害虫を接触させること；
ｂ．または
ｉ．配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは
ｉｉ．       配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは
ｉｉｉ．配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５、及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは
ｉｖ．       配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは
ｖ．配列番号６及び５０と少なくとも８６％の同一性；もしくは
ｖｉ．       配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは
ｖｉｉ．配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは
ｖｉｉｉ．配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは
ｉｘ．       配列番号１３５に対して少なくとも９９％の同一性；もしくは
ｘ．配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、殺虫で有効量の１以上の殺虫性タンパク質と前記害虫を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２９】
植物ゲノムＤＮＡを含む試料にて請求項１に記載の組換え核酸分子の存在を検出する方法であって、
ａ．ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成し、そのようなハイブリッド形成条件下では請求項１に記載の組換え核酸分子を含まない他の同質遺伝子植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成しない核酸プローブに前記試料を接触させること、その際、前記プローブが配列番号４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、もしくは１５８に相同性もしくは相補性である、または請求項１に記載の核酸分子、または
ｉ．配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは
ｉｉ．       配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは
ｉｉｉ．配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５、及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは
ｉｖ．       配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは
ｖ．配列番号６及び５０と少なくとも８６％の同一性；もしくは
ｖｉ．       配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは
ｖｉｉ．配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは
ｖｉｉｉ．配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは
ｉｘ．       配列番号１３５に対して少なくとも９９％の同一性；もしくは
ｘ．配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列であることと；
ｂ．前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリッド形成条件に供することと；
ｃ．前記プローブの前記試料のＤＮＡとのハイブリッド形成を検出することとを含む、前記方法。
【請求項３０】
タンパク質を含む試料にて殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であって、前記殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７のアミノ酸配列を含む；または、前記殺虫性タンパク質が、
ｉ．配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは
ｉｉ．       配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは
ｉｉｉ．配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５、及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは
ｉｖ．       配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは
ｖ．配列番号６及び５０と少なくとも８６％の同一性；もしくは
ｖｉ．       配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは
ｖｉｉ．配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは
ｖｉｉｉ．配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは
ｉｘ．       配列番号１３５に対して少なくとも９９％の同一性；もしくは
ｘ．配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；
前記方法が、
ｘｉ．       前記試料を免疫反応性抗体と接触させことと；
ｘｉｉ．前記抗体の前記殺虫性タンパク質またはその断片との結合を検出することとを含み、その際、結合は前記タンパク質の存在を示す、前記方法。
【請求項３１】
検出する前記工程がＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年９月２５日出願の米国仮出願第６２／７３６，２３６号の利益を主張するものであり、この仮出願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
２０１９年９月２４日に、コンピューターで読み取り可能な形式の配列表を含有する「ＭＯＮＳ４６５ｗｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられたファイルが作成された。このファイルは４５６キロバイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、電子提出（米国特許庁ＥＦＳ−Ｗｅｂファイリングシステムを用いて）によって同時に出願され、参照によってその全体がこの出願に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に、昆虫阻害タンパク質の分野に関する。作物植物及び種子の農業関連の害虫に対して昆虫阻害活性を示す新規のクラスのタンパク質が開示されている。特に、開示されているタンパク質は、作物植物及び種子の農業関連の害虫、特に鞘翅目及び鱗翅目の害虫種に対して殺虫活性がある。開示されている毒素タンパク質の１以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物の一部、及び種子が提供される。
【背景技術】
【０００４】
とりわけ、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、イネ、コムギ、野菜、ワタを含む農業上重要な植物からの収穫量を改善することがますます重要になっている。増加する人口に食料を供給し、衣服を着せ、エネルギーを提供する農産物の必要性の高まりに加えて、気候関連の影響及び農業慣行以外の土地を使用するという増加する人口からの圧力は、農業用に利用可能な耕作可能地の量を減らすと予測される。これらの要因は、特に植物のバイオテクノロジー及び農学慣行に大きな改善がない場合に、食料安全保障の厳しい予測につながってきた。これらの圧力に照らして、技術、農業技術、及び害虫管理における環境的に持続可能な改善は、農業に利用できる限られた量の耕作可能地で作物生産を拡大するための欠かせないツールである。
【０００５】
昆虫、特に鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目内の昆虫は、畑作物への被害の主な原因と考えられており、それによって、蔓延している地域での収穫量が減少する。歴史的に、合成化学殺虫剤の集中的な適用は農業における害虫駆除剤として当てにされていた。新たな耐性の問題に加えて、環境及びヒトの健康への懸念が生物殺虫剤の研究開発を刺激した。この研究努力は、細菌を含む種々の昆虫病原性微生物種の進歩的な発見と使用につながった。
【０００６】
昆虫病原性細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の可能性が発見され、生物学的害虫駆除剤として開発されると、生物的防除のパラダイムが変化した。細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）の菌株は、Ｂｔ菌株が特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されて以来、殺虫性タンパク質の供給源として使用されてきた。Ｂｔ株は、胞子形成の開始時及び定常増殖期に傍胞子結晶封入体内に局在するデルタ内毒素を産生することが知られており（例えば、Ｃｒｙタンパク質）、分泌された殺虫性タンパク質を産生することも知られている。感受性の高い昆虫が摂取すると、デルタ内毒素と同様に分泌毒素が中腸上皮の表面で効果を発揮し、細胞膜を破壊し、細胞の破壊と死をもたらす。殺虫性タンパク質をコードする遺伝子はまた、他のＢａｃｉｌｌｕｓ及び、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（以前Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして知られていた「Ｌｓ」）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓのような追加の細菌種の多様性を含む、Ｂｔ以外の細菌種においても同定されている。
【０００７】
結晶性及び分泌型の可溶性殺虫性毒素は、宿主に高い特異性があり、化学殺虫剤の代替品として世界中で受け入れられている。例えば、殺虫性毒素タンパク質は、農業上重要な植物を昆虫の侵入から保護し、化学殺虫剤の適用の必要性を減らし、収量を増やすために種々の農業用途で採用されてきた。殺虫性毒素タンパク質は、種々の細菌株を含有する微生物製剤を植物表面に分散させるための噴霧のような機械的方法によって、及び遺伝子形質転換技術を用いて殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニックの植物及び種子を生産することによって、作物植物の農業関連の害虫を防除するために使用される。
【０００８】
殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物の使用は世界的に適応されてきた。例えば、２０１２年には、２，６１０万ヘクタールに、Ｂｔ毒素を発現するトランスジェニック作物が植えられた（Ｊａｍｅｓ，Ｃ．，Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＭ  Ｃｒｏｐｓ：２０１２．ＩＳＡＡＡ．Ｂｒｉｅｆ  Ｎｏ．４４）。  トランスジェニック昆虫保護作物の世界的な使用及びこれらの作物で使用される限られた数の殺虫性毒素タンパク質は、現在利用されている殺虫性タンパク質に耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子についての選択圧を作り出している。
【０００９】
殺虫性毒素タンパク質に対する標的害虫での耐性の発達は、殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニック作物に対する昆虫耐性の上昇を管理するのに有用である新しい形態の殺虫性毒素タンパク質の発見及び開発の継続的なニーズを生み出す。有効性が改善され、感受性の高い昆虫種のさらに広いスペクトルに対する防除を示す新しいタンパク質毒素は、耐性対立遺伝子を発生させることができる生き残った昆虫の数を減らすであろう。加えて、同じ害虫に対して毒性があり、異なる作用機序を示す２以上のトランスジェニック殺虫性毒素タンパク質の１つの植物での使用は、単一の標的昆虫種における耐性の可能性を低下させる。
【００１０】
したがって、本発明者らは本明細書において、標的の鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目の害虫種に対して殺虫活性を示す類似の毒素タンパク質、変異型タンパク質、及び例示的な組換えタンパク質と共にＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ及びＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓに由来するタンパク質毒素ファミリーを開示する。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書で開示されているのは、作物植物の１以上の害虫に対して阻害活性を呈することが示される、本明細書でＰｉｒＡＢ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ昆虫関連）タンパク質毒素と呼ばれる昆虫阻害活性を持つ殺虫性タンパク質（毒素タンパク質）の群である。ＰｉｒＡＢタンパク質毒素クラスのタンパク質は単独で、またはＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢ細胞タンパク質の融合体として、または他の殺虫性タンパク質及び毒剤と組み合わせて製剤及び  植物体にて使用することができるので、農業システムで現在使用されている殺虫性タンパク質及び殺虫剤化学物質への代替を提供する。
【００１２】
一実施形態では、本出願で開示されているのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸分子であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７のアミノ酸配列を含み；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の    同一性；または（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、または１５８ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する；または（ｄ）前記組換え核酸分子はベクターと操作可能に連結され、前記ベクターはプラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌もしくは酵母の人工染色体から成る群から選択��れる。組換え核酸分子は、植物において殺虫性タンパク質を発現するように機能する配列を含むことができ、または、植物細胞で発現して殺虫で有効量の殺虫性タンパク質を生産する。
【００１３】
本出願の別の実施形態では、本出願の組換え核酸分子を含む宿主細胞であり、その際、宿主細胞は細菌細胞及び植物細胞から成る群から選択される。企図される宿主細胞には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａが挙げられる。特定の実施形態では、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、または前記ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。企図される植物宿主細胞には、双子葉植物細胞及び単子葉植物細胞が挙げられる。さらに企図される植物宿主細胞には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ブラッシカ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、白菜、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐ．）、ウリ、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、ネギ、レタス、ロブロリーパイン、キビ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞用植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ハトエンドウ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、サフラワー、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、スイートポテト、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギの植物細胞が挙げられる。
【００１４】
さらに別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、西洋トウモロコシ根切り虫、西部トウモロコシ根切り虫、北部トウモロコシ根切り虫、メキシコ型トウモロコシ根切り虫、ブラジル型トウモロコシ根切り虫、コロラドハムシ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａから成るブラジル型トウモロコシ根切り虫複合体、アブラナ科ノミハムシ、縞模様ノミハムシ、西洋クロノミハムシを含む鞘翅目昆虫に対して活性を示す。
【００１５】
別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、クロヨトウムシ、アメリカタバコガ、コナガ、欧州アワノメイガ、ツマジロクサヨトウ、南部ヨトウムシ、ダイズルーパー、南西部アワノメイガ、オオタバコガ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｂｕｄｗｏｒｍ）、ベルベットビーンキャタピラー、サトウキビボーラー、モロコシマダラメイガ、クロアワヨトウ、シロイチモジヨトウ、オオタバコガ（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、ハスモンヨトウ、またはピンクボールワームを含む鱗翅目昆虫に対して活性を示す。
【００１６】
さらに別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ミナミアオカメムシ、亜熱帯性クサギカメムシ、ミナミアオカメムシ、亜熱帯性クサギカメムシ、アカシマカメムシ、クロトゲアオハラカメムシ種、チャバネカメムシ、クサギカメムシ、ミドリカメムシ、クサギカメムシ、西洋サビイロメクラガメまたはサビイロメクラガメ含む半翅目の昆虫種に対して活性を示す。
【００１７】
本出願において企図されるのはまた、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに操作可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む植物であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７のアミノ酸配列を含む；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５、及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントは、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６もしくは１５８のヌクレオチド配列の相補体とハイブリッド形成する；または（ｄ）前記植物が検出可能な量の前記殺虫性タンパク質を提示する。特定の実施形態では、殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７を含む。一実施形態では、植物は単子葉植物または双子葉植物のいずれかである。別の実施形態では、植物は、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ブラッシカ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、白菜、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、ネギ、レタス、ロブロリーパイン、キビ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞用植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ハトエンドウマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、サフラワー、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、スイートポテト、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギから成る群から選択される。
【００１８】
さらなる実施形態では、組換え核酸分子を含む種子が開示される。
【００１９】
別の実施形態では、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物が企図される。昆虫阻害組成物はさらに、前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。少なくとも１つの他の殺虫剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、及び補助タンパク質から成る群から選択される。昆虫阻害組成物における少なくとも１つの他の殺虫剤は、鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の１以上の害虫種に対して活性を示す。昆虫阻害組成物における少なくとも１つの他の殺虫剤は、一実施形態では、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃ変異型、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａ変異型、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５，ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異型、ＩＰ３及びその変異型、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７  ＤＩＧ−１１、Ｃｒｙ７１Ａａ１、Ｃｒｙ７２Ａａ１、ＰＨＩ−４変異型、ＰＩＰ−７２変異型、ＰＩＰ−４５変異型、ＰＩＰ−６４変異型、ＰＩＰ−７４変異型、ＰＩＰ−７５変異型、ＰＩＰ−７７変異型、Ａｘｍｉ４２２、Ｄｉｇ−３０５、Ａｘｍｉ４４０、ＰＩＰ−４７変異型、Ａｘｍｉ２８１、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、及びＣｒｙ１  ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖから成る群から選択される。
【００２０】
本出願で開示されている検出可能な量の組換え核酸分子を含む商品生産物が企図される。そのような商品生産物には、穀物取扱業者によって袋詰めされた商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアル等、及び対応するワタ商品生産物、例えば、飼料または食品、繊維、紙、バイオマスのために加工される全粒綿実または加工された綿実、綿油、リント、種子や植物の一部、及び綿油由来の燃料または綿繰り機廃棄物由来のペレットのような燃料製品、及び対応するダイズ商品生産物、例えば、全粒ダイズ種子または加工されたダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、及びダイズ植物及びダイズ植物の一部を用いて生産された燃料製品、及び対応するイネ、コムギ、ソルガム、ハトエンドウ、ピーナッツ、果実、メロン、及び該当する場合、本出願の検出可能な量のそのようなポリヌクレオチド及びまたはポリペプチドを含有するそのような商品生産物のジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード、及び他の食用形態を含む植物性商品生産物が挙げられる。
【００２１】
本出願において企図されるのはまた、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む種子を生産する方法である。該方法は、本出願で開示されている組換え核酸分子を含む種子の少なくとも１つを植えることと、種子から植物を育てることと、植物から種子を収穫することとを含み、その際、収穫された種子は本出願における組換え核酸分子を含む。
【００２２】
別の実例となる実施形態では、昆虫の侵入に耐性のある植物が提供され、その際、前記植物の細胞は、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、もしくは１５７に記述されたような殺虫で有効量の殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５に対して少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本出願において開示されているのはまた、鞘翅目または鱗翅目の種の害虫を防除する方法、及び植物、特に作物植物の鞘翅目または鱗翅目の種の害虫の侵入を防除する方法である。方法は、一実施形態では、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７に記述されたような殺虫で有効量の１以上の殺虫性タンパク質と害虫を接触させることを含む；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５に対して少なくとも８０％の同一性及び１５７；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本明細書でさらに提供されるのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む組換え核酸分子の存在を検出する方法であり、その際、（ａ）前記殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７のアミノ酸配列を含む；または（ｂ）前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、もしくは１５８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。本発明の一実施形態では、方法は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、本明細書で提供される殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するが、そのようなハイブリッド形成条件下ではセグメントを含まない他の同質遺伝子の植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成しない核酸プローブに核酸の試料を接触させることを含み、その際、プローブは、配列番号４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、または１５８に対して相同性もしくは相補性であり、または（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列に対して相同性もしくは相補性である。方法はさらに、（ａ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリッド形成条件に供することと、（ｂ）プローブと試料のＤＮＡとのハイブリッド形成を検出することとを含んでもよい。
【００２５】
本発明によって提供されるのはまた、タンパク質を含む試料にて殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であり、その際、前記殺虫性タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７のアミノ酸配列を含む；または、前記殺虫性タンパク質は、（ｉ）配列番号４４、４６、４８、１２３、１２７、１２９、１３１、１３３、及び１４５に対して少なくとも６５％の同一性；もしくは（ｉｉ）配列番号１０９、１２１、及び１２５に対して少なくとも７０％の同一性；もしくは（ｉｉｉ）配列番号１２、１８、２４、３６、４２、６２、６８、７４、８０、８６、９８、１１３、１１７、１１９、１４７、１４９、１５３、１５５及び１５７に対して少なくとも８０％の同一性；もしくは（ｉｖ）配列番号３０、９２、１１１、１１５、及び１５１に対して少なくとも８２％の同一性；もしくは（ｖ）配列番号６及び５０に対して少なくとも８６％の同一性；もしくは（ｖｉ）配列番号１３７及び１４１に対して少なくとも９４％の同一性；もしくは（ｖｉｉ）配列番号４、２６、及び３２に対して少なくとも９７％の同一性；もしくは（ｖｉｉｉ）配列番号２、２８、３４、１０２、及び１０２に対して少なくとも９８％の同一性；もしくは（ｉｘ）配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性；もしくは（ｘ）配列番号８、１０、１４、１６、２０、２２、３８、４０、５８、６０、６４、６６、７０、７２、７６、７８、８２、８４、８８、９０、９４、９６、１００、１０５、１０７、１３９、及び１４３との１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この方法は、（ａ）試料を免疫反応性抗体と接触させることと、（ｂ）抗体と殺虫性タンパク質またはその断片との結合を検出することとを含み。その際、結合はタンパク質の存在を示す。いくつかの実施形態では、検出する工程はＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む。
【００２６】
配列の簡単な説明
配列番号１はＴＩＣ４７７１  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＩＳＢ０００００２株から得られた核酸配列である。
【００２７】
配列番号２は、ＴＩＣ４７７１  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号３はＴＩＣ４７７２  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＩＳＢ０００００２株から得られた核酸配列である。
【００２９】
配列番号４はＴＩＣ４４７２  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号５はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ４７７１及びＴＩＣ４７７２のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０をコードする核酸配列である。
【００３１】
配列番号６はＴＩＣ６８８０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号７はＴＩＣ７５７５  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８２３株から得られた核酸配列である。
【００３３】
配列番号８はＴＩＣ７５７５  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号９はＴＩＣ７５７６  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８２３株から得られた核酸配列である。
【００３５】
配列番号１０はＴＩＣ７５７６  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１１はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７５７６のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３１６をコードする核酸配列である。
【００３７】
配列番号１２はＴＩＣ９３１６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１３はＴＩＣ７６６０  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｃａｂａｎｉｌｌａｓｉｉの８５９０８株から得られた核酸配列である。
【００３９】
配列番号１４はＴＩＣ７６６０  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１５はＴＩＣ７６６１  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｃａｂａｎｉｌｌａｓｉｉの８５９０８株から得られた核酸配列である。
【００４１】
配列番号１６はＴＩＣ７６６１  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１７はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７６６１のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３１７をコードする核酸配列である。
【００４３】
配列番号１８はＴＩＣ９３１７  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１９はＴＩＣ７６６２  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８８７株から得られた核酸配列である。
【００４５】
配列番号２０はＴＩＣ７６６２  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号２１はＴＩＣ７６６３  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８８７株から得られた核酸配列である。
【００４７】
配列番号２２はＴＩＣ７６６３  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２３はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６２及びＴＩＣ７６６３のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３１８をコードする核酸配列である。
【００４９】
配列番号２４はＴＩＣ９３１８  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２５はＴＩＣ７６６４  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｐｏｉｎａｒｉｉの８６１９８株から得られた核酸配列である。
【００５１】
配列番号２６はＴＩＣ７６６４  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２７はＴＩＣ７６６５  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｐｏｉｎａｒｉｉの８６１９８株から得られた核酸配列である。
【００５３】
配列番号２８はＴＩＣ７６６５  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２９はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６４及びＴＩＣ７６６５のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３１９をコードする核酸配列である。
【００５５】
配列番号３０はＴＩＣ９３１９  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号３１はＴＩＣ７６６６  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９７株から得られた核酸配列である。
【００５７】
配列番号３２はＴＩＣ７６６６  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３３はＴＩＣ７６６７殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９７株から得られた核酸配列である。
【００５９】
配列番号３４はＴＩＣ７６６７  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３５はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６６及びＴＩＣ７６６７のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３２２をコードする核酸配列である。
【００６１】
配列番号３６はＴＩＣ９３２２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３７はＴＩＣ７６６８  ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９４株から得られた核酸配列である。
【００６３】
配列番号３８はＴＩＣ７６６８  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３９はＴＩＣ７６６９  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９４株から得られた核酸配列である。
【００６５】
配列番号４０はＴＩＣ７６６９  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号４１はインフレーで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６８及びＴＩＣ７６６９のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３２０をコードする核酸配列である。
【００６７】
配列番号４２はＴＩＣ９３２０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号４３はＴＩＣ７９３９殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするマイクロバイオーム内に含まれる未知の細菌株から得られた核酸配列である。
【００６９】
配列番号４４はＴＩＣ７９３９  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号４５はＴＩＣ７９４０  ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質の配列をコードするマイクロバイオーム内に含まれる未知の細菌株から得られた核酸配列である。
【００７１】
配列番号４６はＴＩＣ７９４０  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号４７はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７９３９及びＴＩＣ７９４０のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３２１をコードする核酸配列である。
【００７３】
配列番号４８はＴＩＣ９３２１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号４９はＴＩＣ６８８０ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列であり、ＴＩＣ４７７１タンパク質をコードする断片の開始メチオニンコドンの直後に追加のアラニンコドンが挿入されている。
【００７５】
配列番号５０はＴＩＣ６８８０ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号５１はＴＩＣ９３１６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００７７】
配列番号５２はＴＩＣ９３１７  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００７８】
配列番号５３はＴＩＣ９３１８  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００７９】
配列番号５４はＴＩＣ９３１９  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００８０】
配列番号５５はＴＩＣ９３２０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００８１】
配列番号５６はＴＩＣ９３２２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【００８２】
配列番号５７はＴＩＣ１０３５７殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｖｉｏｌａｃｅａのＤＳＳ１２株から得られた核酸配列である。
【００８３】
配列番号５８はＴＩＣ１０３５７  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号５９はＴＩＣ１０３６６殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｖｉｏｌａｃｅａのＤＳＳ１２株から得られた核酸配列である。
【００８５】
配列番号６０はＴＩＣ１０３６６  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号６１はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３５７及びＴＩＣ１０３６６のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３７５をコードする核酸配列である。
【００８７】
配列番号６２はＴＩＣ１０３７５  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号６３はＴＩＣ１０３５８殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｌａｕｍｏｎｄｉｉＴＴＯ１株から得られた核酸配列である。
【００８９】
配列番号６４はＴＩＣ１０３５８  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９０】
配列番号６５はＴＩＣ１０３６７殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｌａｕｍｏｎｄｉｉＴＴＯ１株から得られた核酸配列である。
【００９１】
配列番号６６はＴＩＣ１０３６７  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９２】
配列番号６７はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３５８及びＴＩＣ１０３６７のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３７６をコードする核酸配列である。
【００９３】
配列番号６８は、ＴＩＣ１０３７６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００９４】
配列番号６９は、ＴＩＣ１０３６０殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａから得られた核酸配列である。
【００９５】
配列番号７０はＴＩＣ１０３６０  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号７１はＴＩＣ１０３６９殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａから得られた核酸配列である。
【００９７】
配列番号７２はＴＩＣ１０３６９  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号７３はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６０及びＴＩＣ１０３６９のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３７７をコードする核酸配列である。
【００９９】
配列番号７４はＴＩＣ１０３７７  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号７５はＴＩＣ１０３６１殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐのＮＢＡＩＩＸｅｎＳａ０４株から得られた核酸配列である。
【０１０１】
配列番号７６はＴＩＣ１０３６１  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号７７はＴＩＣ１０３７０殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐのＮＢＡＩＩＸｅｎＳａ０４株から得られた核酸配列である。
【０１０３】
配列番号７８はＴＩＣ１０３７０  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１０４】
配列番号７９はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６１及びＴＩＣ１０３７０のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３７８をコードする核酸配列である。
【０１０５】
配列番号８０はＴＩＣ１０３７８  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１０６】
配列番号８１はＴＩＣ１０３６２殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＹｅｒｓｉｎｉａ  ａｌｄｏｖａｅの６７０−８３株から得られた核酸配列である。
【０１０７】
配列番号８２はＴＩＣ１０３６２ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号８３はＴＩＣ１０３７１殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＹｅｒｓｉｎｉａ  ａｌｄｏｖａｅの６７０−８３株から得られた核酸配列である。
【０１０９】
配列番号８４はＴＩＣ１０３７１  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１１０】
配列番号８５はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６２及びＴＩＣ１０３７１のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３７９をコードする核酸配列である。
【０１１１】
配列番号８６はＴＩＣ１０３７９  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１１２】
配列番号８７はＴＩＣ１０３６３殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｄｏｕｃｅｔｉａｅのＦＲＭ１６株から得られた核酸配列である。
【０１１３】
配列番号８８はＴＩＣ１０３６３  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１１４】
配列番号８９はＴＩＣ１０３７２殺虫性ＰｉｒＢ細胞タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｄｏｕｃｅｔｉａｅのＦＲＭ１６株から得られた核酸配列である。
【０１１５】
配列番号９０はＴＩＣ１０３７２ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１１６】
配列番号９１はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６３及びＴＩＣ１０３７２のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３８０をコードする核酸配列である。
【０１１７】
配列番号９２は、ＴＩＣ１０３８０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１１８】
配列番号９３はＴＩＣ１０３６４殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードする  Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｇｒｉｆｆｉｎｉａｅのＢＭＭＣＢ株から得られた核酸配列である。
【０１１９】
配列番号９４はＴＩＣ１０３６４  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２０】
配列番号９５はＴＩＣ１０３７３殺虫性ＰｉｒＢ細胞タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｇｒｉｆｆｉｎｉａｅのＢＭＭＣＢ株から得られる核酸配列である。
【０１２１】
配列番号９６はＴＩＣ１０３７３  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号９７はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４及びＴＩＣ１０３６４のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０３８１をコードする核酸配列である。
【０１２３】
配列番号９８はＴＩＣ１０３８１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２４】
配列番号９９はＴＩＣ１０３５９殺虫性ＰｉｒＡタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａから得られた核酸配列である。
【０１２５】
配列番号１００はＴＩＣ１０３５９  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２６】
配列番号１０１はＴＩＣ１０３６８殺虫性ＰｉｒＢ細胞タンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａから得られた核酸配列である。
【０１２７】
配列番号１０２はＴＩＣ１０３６８  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号１０３はコード配列ＴＩＣ１０３５９及びＴＩＣ１０３６８から構成されるオペロンをコードする核酸配列である。
【０１２９】
配列番号１０４はＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８殺虫性ＰｉｒＡタンパク質配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのＨｍ株から得られた核酸配列である。
【０１３０】
配列番号１０５はＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８  ＰｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号１０６は、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９殺虫性ＰｉｒＢタンパク質配列をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのＨｍ株から得られた核酸配列である。
【０１３２】
配列番号１０７はＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号１０８はインフレームで操作可能に連結されたＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８及びＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１０４３４をコードする核酸配列である。
【０１３４】
配列番号１０９はＴＩＣ１０４３４  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号１１０はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６５のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１２１０をコードする核酸配列である。
【０１３６】
配列番号１１１はＴＩＣ１１２１０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号１１２はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６７のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１２１１をコードする核酸配列である。
【０１３８】
配列番号１１３はＴＩＣ１１２１１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号１１４はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６２及びＴＩＣ７６６５のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１２１２をコードする核酸配列である。
【０１４０】
配列番号１１５はＴＩＣ１１２１２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号１１６はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６１のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１３０１をコードする核酸配列である。
【０１４２】
配列番号１１７はＴＩＣ１１３０１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号１１８はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７５７６のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１３０２をコードする核酸配列である。
【０１４４】
配列番号１１９はＴＩＣ１１３０２ｆ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号１２０はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ４７７１、ＴＩＣ４７７１、及びＴＩＣ４４７２のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４０をコードする核酸配列である。
【０１４６】
配列番号１２１は、ＴＩＣ１１４４０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１４７】
配列番号１２２はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７５７６のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４１をコードする核酸配列である。
【０１４８】
配列番号１２３は、ＴＩＣ１１４４１ｆ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号１２４はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ４７７１、及びＴＩＣ４４７２のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４２をコードする核酸配列である。
【０１５０】
配列番号１２５はＴＩＣ１１４４２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１５１】
配列番号１２６はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７５７５、及びＴＩＣ７５７６コード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４３をコードする核酸配列である。
【０１５２】
配列番号１２７はＴＩＣ１１４４３    ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１５３】
配列番号１２８は、インフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７５７６のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４４をコードする核酸配列である。
【０１５４】
配列番号１２９はＴＩＣ１１４４４  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１５５】
配列番号１３０はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、及びＴＩＣ７６６３コード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４５をコードする核酸配列である。
【０１５６】
配列番号１３１はＴＩＣ１１４４５  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１５７】
配列番号１３２はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６０、及びＴＩＣ７６６１コード配列から構成される融合タンパク質、ＴＩＣ１１４４６をコードする核酸配列である。
【０１５８】
配列番号１３３はＴＩＣ１１４４６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１５９】
配列番号１３４はＴＩＣ１１５０５殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＭＤＩ−００３５７７７株から得られた核酸配列である。
【０１６０】
配列番号１３５はＴＩＣ１１５０５  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６１】
配列番号１３６はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４及びＴＩＣ１１５０５のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１５０６をコードする核酸配列である。
【０１６２】
配列番号１３７はＴＩＣ１１５０６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６３】
配列番号１３８はＴＩＣ１１５１０殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｂｏｖｉｅｎｉｉのＭＤＩ−００３５８０８株から得られた核酸配列である。
【０１６４】
配列番号１３９はＴＩＣ１１５１０  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６５】
配列番号１４０はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４及びＴＩＣ１１５１０のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１５１２をコードする核酸配列である。
【０１６６】
配列番号１４１はＴＩＣ１１５１２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６７】
配列番号１４２はＴＩＣ１１５１１殺虫性ＰｉｒＢタンパク質の配列をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＡＮ６  ／  １株から得られた核酸配列である。
【０１６８】
配列番号１４３はＴＩＣ１１５１１  ＰｉｒＢタンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６９】
配列番号１４４はインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４及びＴＩＣ１１５１１のコード配列から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１５１３をコードする核酸配列である。
【０１７０】
配列番号１４５はＴＩＣ１１５１３  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１７１】
配列番号１４６はＴＩＣ１０３７６ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列であり、ＴＩＣ１０３５８タンパク質をコードする断片の開始メチオニンコドンの直後に追加のアラニンコドンが挿入されている。
【０１７２】
配列番号１４７はＴＩＣ１０３７６ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１７３】
配列番号１４８はＴＩＣ１０３７８ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列であり、ＴＩＣ１０３６１タンパク質をコードする断片の開始メチオニンコドンの直後に追加のアラニンコドンが挿入されている。
【０１７４】
配列番号１４９はＴＩＣ１０３７８ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１７５】
配列番号１５０はＴＩＣ１０３８０ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞における発現に使用される合成コード配列であり、ＴＩＣ１０３６３タンパク質をコードする断片の開始メチオニンコドンの直後に追加のアラニンコドンが挿入されている。
【０１７６】
配列番号１５１はＴＩＣ１０３８０ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１７７】
配列番号１５２はＴＩＣ１０３８１ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列であり、ＴＩＣ１０３６４タンパク質をコードする断片の開始メチオニンコドンの直後に追加のアラニンコドンが挿入されている。
【０１７８】
配列番号１５３はＴＩＣ１０３８１ＰＬ  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１７９】
配列番号１５４は操作可能に連結されたＴＩＣ７６６１及びＴＩＣ７６６０のコード配列から構成されるＴＩＣ１１１０３  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【０１８０】
配列番号１５５はＴＩＣ１１１０３  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１８１】
配列番号１５６は操作可能に連結されたＴＩＣ７６６３及びＴＩＣ７６６２のコード配列から構成されるＴＩＣ１１１０４  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【０１８２】
配列番号１５７はＴＩＣ１１１０４  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１８３】
配列番号１５８はＴＩＣ１１３０２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする植物細胞での発現に使用される合成コード配列である。
【０１８４】
配列番号１５９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現され、タンパク質の精製に使用されるコード配列に操作可能に連結されているヒスチジンタグをコードする合成コード配列である。
【０１８５】
配列番号１６０はヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１８６】
農業害虫駆除の技術分野における問題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広いスペクトルの毒性を示し、望ましくない農業問題を引き起こすことなく植物で発現することができ、且つ植物で商業的に使用されている現在の毒素と比べて代替の作用機序を提供する新しい毒素タンパク質の必要性として特徴付けることができる。
【０１８７】
本明細書で開示されているのは、鞘翅目、半翅目及び鱗翅目の害虫に耐性を提供するＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ４７７１、ＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６４、ＴＩＣ７６６６、ＴＩＣ７６６８、ＴＩＣ７９３９、ＴＩＣ１０３５７、ＴＩＣ１０３５８、ＴＩＣ１０３６０、ＴＩＣ１０３６１、ＴＩＣ１０３６２、ＴＩＣ１０３６３、ＴＩＣ１０３６４、ＴＩＣ１０３５９、及びＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８（まとめて、「ＰｉｒＡタンパク質」）；ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ７９４０、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＴＩＣ１０３６８、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５０５、ＴＩＣ１１５１０、及びＴＩＣ１１５１１（まとめて、「ＰｉｒＢタンパク質」）；ならびにＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１２１２、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１１４４０、ＴＩＣ１１４４１、ＴＩＣ１１４４２、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５０６、ＴＩＣ１１５１２、ＴＩＣ１１５１３、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、及びＴＩＣ１１１０４（まとめて、「ＰｉｒＡＢ融合タンパク質」）によって例示される新規のＰｉｒＡＢ殺虫性タンパク質のクラスである。
【０１８８】
開示されているのはまた、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２をコードする、植物細胞での発現のために設計された合成コード配列である。さらに開示されているのは、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質のうちの１以上をコードするコード配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む組換え核酸分子である。
【０１８９】
本出願における「ＰｉｒＡタンパク質」、「ＰｉｒＡタンパク質毒素」、「ＰｉｒＡ毒素タンパク質」、「ＰｉｒＡ殺虫性タンパク質」、「ＰｉｒＡ関連毒素」、または「ＰｉｒＡ関連毒素タンパク質」等への言及は、鞘翅目害虫、半翅目害虫及び鱗翅目害虫に対する活性を付与し、そのようなタンパク質のＰｉｒＡタンパク質のいずれかとの配列比較が約２０〜約１００パーセントの画分比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば殺虫活性または昆虫阻害活性を示す任意のタンパク質を含む、ＴＩＣ４７７１（配列番号２）、ＴＩＣ７５７５（配列番号８）、ＴＩＣ７６６０（配列番号１４）、ＴＩＣ７６６２（配列番号２０）、ＴＩＣ７６６４（配列番号２６）、ＴＩＣ７６６６（配列番号３２）、ＴＩＣ７６６８（配列番号３８）、ＴＩＣ７９３９（配列番号４４）、ＴＩＣ１０３５７（配列番号５８）、ＴＩＣ１０３５８（配列番号６４）、ＴＩＣ１０３６０（配列番号７０）、ＴＩＣ１０３６１（配列番号７６）、ＴＩＣ１０３６２（配列番号８２）、ＴＩＣ１０３６３（配列番号８８）、ＴＩＣ１０３６４（配列番号９４）、ＴＩＣ１０３５９（配列番号１００）、及びＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８（配列番号１０５）の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質の配列及びそれらの殺虫性セグメントまたは昆虫阻害性セグメントまたはそれらの組み合わせを含む、それから成る、それと実質的に相同である、それに類似するまたはそれに由来する任意の新規の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指す。
【０１９０】
本出願における「ＰｉｒＢタンパク質」、「ＰｉｒＢタンパク質毒素」、「ＰｉｒＢ毒素タンパク質」、「ＰｉｒＢ殺虫性タンパク質」、「ＰｉｒＢ関連毒素」、または「ＰｉｒＢ関連毒素タンパク質」等への言及は、鞘翅目害虫、半翅目害虫及び鱗翅目害虫に対する活性を付与し、そのようなタンパク質のＰｉｒＢタンパク質のいずれかとの配列比較が約２４〜約１００パーセントの画分比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば殺虫活性または昆虫阻害活性を示す任意のタンパク質を含む、ＴＩＣ４７７２（配列番号４）、ＴＩＣ７５７６（配列番号１０）、ＴＩＣ７６６１（配列番号１６）、ＴＩＣ７６６３（配列番号２２）、ＴＩＣ７６６５（配列番号２８）、ＴＩＣ７６６７（配列番号３４）、ＴＩＣ７６６９（配列番号４０）、ＴＩＣ７９４０（配列番号４６）、ＴＩＣ１０３６６（配列番号６０）、ＴＩＣ１０３６７（配列番号６６）、ＴＩＣ１０３６９（配列番号７２）、ＴＩＣ１０３７０（配列番号７８）、ＴＩＣ１０３７１（配列番号８４）、ＴＩＣ１０３７２（配列番号９０）、ＴＩＣ１０３７３（配列番号９６）、ＴＩＣ１０３６８（配列番号１０２）、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９（配列番号１０７）、ＴＩＣ１１５０５（配列番号１３５）、ＴＩＣ１１５１０（配列番号１３９）、及びＴＩＣ１１５１１（配列番号１４３）の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質の配列及びそれらの殺虫性セグメントまたは昆虫阻害性セグメントまたはそれらの組み合わせを含む、それから成る、それと実質的に相同である、それに類似するまたはそれに由来する任意の新規の殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指す。
【０１９１】
「ＰｉｒＡＢ融合タンパク質」という用語は本出願において、ＰｉｒＢタンパク質に隣接するＰｉｒＡタンパク質の双方を含むタンパク質を記載するのに使用される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、細胞内で発現されると、ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質の双方を含む融合タンパク質を生成するようにＰｉｒＢタンパク質をコードするコード配列とインフレームで操作可能に連結されたＰｉｒＡタンパク質をコードするコード配列を含むことができる。ＰｉｒＡＢタンパク質は、同じ細菌オペロンに由来するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質から構成することができ、または代わりに、異なる細菌オペロンに由来するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質から構成することができる。ＰｉｒＡタンパク質がＰｉｒＢタンパク質と隣接している例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質を表１に提供する。
表１．ＰｉｒＢタンパク質に隣接するＰｉｒＡタンパク質から構成される例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質及びその中に含まれる対応するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質。
2022501035.tif 000002
【０１９２】
「ＰｉｒＡＢ融合タンパク質」という用語はまた、本出願において、ＰｉｒＡタンパク質に隣接するＰｉｒＢタンパク質を含むタンパク質を記載するのに使用される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、細胞内で発現されると、ＰｉｒＢタンパク質及びＰｉｒＡタンパク質の双方を含む融合タンパク質を生成するようにＰｉｒＡタンパク質をコードするコード配列とインフレームで操作可能に連結されたＰｉｒＢタンパク質をコードするコード配列を含むことができる。ＰｉｒＢタンパク質は、同じ細菌オペロンに由来するＰｉｒＢタンパク質及びＰｉｒＡタンパク質から構成することができ、または代わりに、異なるオペロンに由来するＰｉｒＢタンパク質及びＰｉｒＡタンパク質から構成することができる。ＰｉｒＢタンパク質がＰｉｒＡタンパク質と隣接している例示的なタンパク質を表２に提供する。
表２．ＰｉｒＡタンパク質に隣接するＰｉｒＢタンパク質から構成される例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質及びその中に含まれる対応するＰｉｒＢタンパク質及びＰｉｒＡタンパク質。
2022501035.tif 000003
【０１９３】
「ＰｉｒＡＢ融合タンパク質」という用語はまた、本出願において、ＰｉｒＢタンパク質に隣接する２つのＰｉｒＡタンパク質を含むタンパク質を記載するのに使用される。この種類のＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、細胞内で発現するとＰｉｒＡタンパク質と別のＰｉｒＡタンパク質とＰｉｒＢタンパク質とを含む融合タンパク質が生成するようにＰｉｒＢタンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結された、同じＰｉｒＡタンパク質または異なるＰｉｒＡタンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結されたＰｉｒＡタンパク質をコードするコード配列を含むことができる。ＰｉｒＢタンパク質に隣接する２つのＰｉｒＡタンパク質を含む例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質を表３に提供する。
表３．別のＰｉｒＡタンパク質に隣接し、且つＰｉｒＢタンパク質に隣接するＰｉｒＡタンパク質から構成される例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質及びその中に含まれる対応するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質。
2022501035.tif 000004
【０１９４】
「ＰｉｒＡＢ融合タンパク質」という用語はまた、本出願において、互いに隣接する複数のＰｉｒＡタンパク質及び／または複数のＰｉｒＢタンパク質を含むタンパク質を記載するのに使用される。複数のＰｉｒＡタンパク質及び／またはＰｉｒＢタンパク質は、複製されたＰｉｒＡタンパク質またはＰｉｒＢタンパク質であることができ、または異なるＰｉｒＡタンパク質またはＰｉｒＢタンパク質であることができる。融合タンパク質としての複数のＰｉｒＡタンパク質及び／またはＰｉｒＢタンパク質の組み合わせは、特定の標的害虫種に対する活性を高めることができ、または活性が存在する害虫種の範囲を増やしてもよい。
【０１９５】
「セグメント」または「断片」という用語は本出願において、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質の１つを記載する完全なアミノ酸配列または核酸配列よりも短い連続するアミノ酸配列または核酸配列を記載するのに使用される。昆虫阻害活性を示すセグメントまたは断片は、そのようなセグメントまたは断片と、配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、または１０５に記述されたＰｉｒＡタンパク質；配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０７、１３５、１３９、または１４３に記述されたＰｉｒＢタンパク質；または配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５０、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３７、１４１、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、または１５７に記述されたＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連するファミリーメンバーの殺虫性タンパク質の対応する区分との配列比較がセグメントまたは断片と並べたタンパク質の対応する区分との間で約６５〜約１００パーセントの同一性の配列比較を生じるのであれば、本出願でも開示されている。本明細書に記載されているＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質のうちの１つのセグメントまたは断片は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質のうちの１つの少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７５個の連続するアミノ酸、少なくとも約１００個の連続するアミノ酸、少なくとも約１２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２００個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約３００個の連続するアミノ酸、少なくとも約３５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４００個の連続するアミノ酸、少なくとも約４５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５００個の連続するアミノ酸、少なくとも約５５０個の連続するアミノ酸、または少なくとも約６００個の連続するアミノ酸を含んでもよい。本明細書に記載されているＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質のうちの１つのセグメントまたは断片は塩基配列の活性を示してもよい。
【０１９６】
本出願における「活性がある」または「活性」、「殺虫活性」または「殺虫性」または「殺虫活性」、「昆虫阻害性」または「殺虫性」という用語への言及は、有効量のＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１以上を含有する特定の作物にて阻害すること（成長、摂食、繁殖力、または生存能力を阻害すること）、抑制すること（成長、摂食、繁殖力、または生存能力を抑制すること）、防除すること（害虫の侵入防除すること、害虫の摂食活動を防除すること）におけるタンパク質毒素のような毒剤の有効性を指す。これらの用語は、害虫が毒性タンパク質にさらされると、病的状態、大量死、繁殖力の低下、または発育阻害をもたらす、殺虫で有効な量の毒性タンパク質を害虫に提供した結果を含むことが意図される。これらの用語には、殺虫で有効な量の毒性タンパク質を植物の中または上に提供した結果としての、植物、植物の組織、植物の一部、種子、植物細胞に由来する害虫、または植物が成長していてもよい特定の地理的位置由来の害虫の反発作用も含まれる。一般に、殺虫活性は、成長、発達、生存率、摂食行動、交尾行動、繁殖力を阻害することで有効である、または鱗翅目、鞘翅目もしくは半翅目の昆虫を含むが、これらに限定されない特定の標的害虫のこのタンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドに対する昆虫の摂食によって引き起こされる悪影響の測定可能な減少で有効である毒性タンパク質の能力を指す。毒性タンパク質は、植物によって生成され得る、または植物に、もしくは植物が位置する場所内の環境に適用され得る。「生物活性」、「効果的な」、「有効な」という用語またはそれらの変形はまた、標的害虫に対する本発明のタンパク質の効果を記載するのにも本出願において交換可能に利用される用語である。
【０１９７】
殺虫で有効な量の毒剤は、標的の害虫の餌で提供されると、毒剤が害虫に接触したときに殺虫活性を示す。毒剤は殺虫性タンパク質または当該技術分野で知られている１以上の化学薬品であることができる。殺虫性または殺虫性の化学薬品及び殺虫性または殺虫性のタンパク質薬剤は、単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。化学薬品には、標的害虫の抑制のために特定の遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子、有機塩素化合物、有機リン酸塩、カルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、これらに限定されない。殺虫性または殺虫性のタンパク質薬剤には、本出願に記述されているタンパク質毒素、と同様に鞘翅目、鱗翅目、半翅目、総翅目、または双翅目の害虫種を標的とするものを含む他のタンパク性毒剤が挙げられる。
【０１９８】
「Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ昆虫関連」タンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質は、一部の昆虫に対して殺虫活性を持つ二成分毒素である。一部のＰｉｒＡＢタンパク質は、昆虫の血体腔に注入すると鱗翅目活性を有することが示されている。しかしながら、昆虫食で提示された場合、ＰｉｒＡＢタンパク質の経口投与はほとんどまたはまったく活性を示さなかった（例えば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７），ＰｉｒＡＢ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ  ＨＢ３１０  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  ｂｉｎａｒｙ  ｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ，１４８：４３−５０；Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＰｉｒＡＢ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｌｅｔｔ，３５６：２３−３１；Ｗｕ及びＹｕｎｈｏｎｇ，（２０１６），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３４９９６；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３４９９６；ならびにＺｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ＸａｘＡＢ−ｌｉｋｅ  ｂｉｎａｒｙ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｔｈ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３５０：４８−５６）を参照のこと）。鱗翅目に対するＰｉｒＡＢタンパク質の経口活性が報告されているが、それらの研究は、昆虫の餌で提供される精製毒素ではなく、ＰｉｒＡＢタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌を含む餌を昆虫が摂取することに依存している（例えば、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｔｈｅ  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  Ｐｉｒ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｒｅ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｕｔ  ｓｈｏｗ  ｎｏ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，２４５：４７−５２及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ  ｍｏｔｈ  （Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）  ｔｏ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｉｒ  ｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ．Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  ｅｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ，１２１：３１−３７を参照のこと）。全く対照的に、本明細書では、実施例に記載されているように、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質のタンパク質調製物は昆虫餌バイオアッセイで提供された。鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目の害虫に対する経口活性が観察され、実施例にて提示されている。加��て、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、及びＴＩＣ９３１８を発現している植物に由来するリーフディスクを、鱗翅目害虫種である欧州アワノメイガ及び南西部アワノメイガ（ＳＷＣＢ）に対する活性を実証する経口昆虫摂食試験で使用した。さらに、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、及びＴＩＣ１０３８１を発現している植物に由来するリーフディスクはＳＷＣＢに対して活性を示した。また、実施例に記載されているように、ＴＩＣ９３１５及びＴＩＣ１１３０２は安定して形質転換された植物において西洋トウモロコシ根切り虫害虫に対して活性を示した。
【０１９９】
害虫、特に作物の害虫への言及は、作物の害虫、特にＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢタンパク質、関連するファミリーの殺虫性タンパク質、またはそれらのセグメントまたは断片の少なくとも１つによって防除される害虫を意味することが意図される。
【０２００】
実施例に記載されているように、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢタンパク質の１以上は、成虫、蛹、幼虫、及び新生子を含む鞘翅目、半翅目、及び鱗翅目の害虫種由来の害虫に対して殺虫活性を示す。
【０２０１】
鱗翅目の昆虫には、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のヨトウムシ（ａｒｍｙｗｏｒｍ）、ヨトウムシ（ｃｕｔｗｏｒｍ）、ルーパー、及びヘリオチン、例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シロイチモジヨト（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、クロヨトウムシ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｅｍｐｔａ）、ベルタヨトウムシ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、南部アワヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、キャベツルーパー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ダイズルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、顆粒状カットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、ヨトウムシ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、西洋根切り虫（Ａｇｒｏｔｉｓ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）；Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科のボーラー、ケイスベアラ、ウェブワーム、コーンワーム、キャベツムシ及びスケリトナイザー、例えば、欧州アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ネーブルオレンジワーム（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓのｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ソッドウェブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヒマワリガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、レサーコーンストークボーラー（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキムシ、バッドワーム、シードワーム、及びフルーツワーム、例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、グレープベリーモス（Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、ヒマワリバッドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）；ならびに他の多くの経済的に重要な鱗翅目、例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ピンクボールワーム（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）    が挙げられるが、これらに限定されない。鱗翅目の他の害虫には、例えば、オオタバコガ（Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、フルーツツリーハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、欧州ハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ）及び他のＡｒｃｈｉｐｓ種（Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、アジアのズイムジ、またはニカメイガ）、イネハマキムシ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ブルーグラスウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サーガルケーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、とげのあるボールワーム（Ｅａｒｉａｓ  ｉｎ��Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、ダイズポッドワーム及びワタオオタバコガとしても知られる）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ソッドウェブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、西洋ビーン根切り虫（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ  ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、欧州グレープバインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ）、シトラスリーフマイナー（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、小型モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ、輸入されたアオムシとしても知られている）、タバコ根切り虫（クラスターキャタピラーとしても知られているＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、及びトマトキバガ（Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。
【０２０２】
鞘翅目の昆虫には、特に害虫が西洋トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）である場合、Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｔｏｍａｒｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｔｉｂｉａｌｉｓ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｕｒｃｕｌｉｏ  ｓｐｐ．、Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｐ．、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｅｍｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｏｒｙｃａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｈｌｙｃｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｓｐｐ．、Ｓｃａｒａｂｅｉｄａｅ、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ  ｓｐｐ．、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、及びＴｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．、北方型トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、メキシコ型トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｚｅａｅ、ＭＣＲ）、ブラジル型トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｌｔｅａｔａ、ＢＺＲ）、南方型トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、ブラジル型トウモロコシ根切り虫複合体（ＢＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａから成る）、アブラナノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒ）Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ）、縞模様ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ）及び西洋クロノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｐｕｓｉｌｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。）
【０２０３】
半翅目の昆虫には、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科のカメムシ：Ｃｈｉｎａｖｉａ属のミドリカメムシ（Ｃｈｉｎａｖｉａ  ｈｉｌａｒｉｓ、Ｃｈｉｎａｖｉａ  ｍａｒｇｉｎａｔａ、及びＣｈｉｎａｖｉａ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ属のカメムシ（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｇｒａｎｕｌｏｓｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｋａｎｅｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｌｉｇａｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｌｉｎｅａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｒｏｓｓｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｓａｙｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｕｈｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｂｅｌｆｒａｇｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｆａｃｅｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｏｓｂｏｒｎｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｓａｕｃｉａ、及びＣｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ  ｓｅｎｉｌｉｓ）、サザンミドリカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）、Ｅｄｅｓｓａ属のカメムシ（Ｅｄｅｓｓａ  ｍｅｄｉｔａｂｕｎｄａ、Ｅｄｅｓｓａ  ｂｉｆｉｄａ、及びＥｄｅｓｓａ  ｆｌｏｒｉｄａ）、亜熱帯クサギカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ）、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ属のカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｃｏｎｓｐｅｒｓｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｃｒｅｎａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｅｇｇｌｅｓｔｏｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｉｃｔｅｒｉｃｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｉｎｆｌａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｌａｔｉｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｏｂｓｃｕｒｅｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｐｏｌｉｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｑｕａｄｒａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｖｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｔｒｅｎｕｏｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、及びＥｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ）、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ）、カタアカカメムシ（Ｔｈｙａｎｔａ  ａｃｃｅｒｒａ）、Ｔｈｙａｎｔａ属のカメムシ（Ｔｈｙａｎｔａ  ｃａｌｃｅａｔａ、Ｔｈｙａｎｔａ  ｃｕｓｔａｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ  ｐａｌｌｉｄｏｖｉｒｅｎｓ、Ｔｈｙａｎｔａ  ｐｅｒｄｉｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ  ｍａｃｕｌａｔｅ、及びＴｈｙａｎｔａ  ｐｓｅｕｄｏｃａｓｔａ）、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ属のミドリハラカメムシ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ）及び他のカメムシ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ａｖｉｌａｐｉｒｅｓｉ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｄｉｍｉｄａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｆｕｒｃｉｆｒｏｎｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｌｏｂａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｍｉｒｉａｍａｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｎｉｇｒｕｍ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｐｅｒｕａｎｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｐｈｏｅｎｉｘ、及びＤｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｓａｌｔｅｎｓｉｓ）、アカシマカメムシ（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ  ｇｕｉｌｄｉｎｎｉ）と同様にＰｉｅｚｏｄｏｒｕｓ  ｌｉｔｕｒａｔｕｓ；及びＰｌａｔａｓｐｉｄａｅ科の昆虫、��えば、タイワンマルカメムシ（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ  ｃｒｉｂｒａｒｉａ）、西洋ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、及びミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または同等の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で存在する、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味するように意図される。例えば、生物のゲノムのＤＮＡ内に自然に見いだされるコード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等のような核酸要素は、要素が生物のゲノム内にあり、それが天然に見いだされるゲノム内の位置にある限り、「単離された」とは見なされない。しかしながら、これらの要素のそれぞれ、及びこれらの要素の下位区分は、要素が生物のゲノム内になく、それが天然に見いだされるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離」されることになる同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の任意の天然に存在する殺虫性変異体をコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする配列が天然に見いだされる細菌のＤＮＡ内になかった限りにおいて、単離されたヌクレオチド配列であるということになる。天然に存在する殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的のために単離されたと見なされる。本開示の目的のために、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物または細菌の細胞のゲノムに挿入された、または染色体外ベクターに存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それがプラスミドまたは細胞を形質転換するために使用される同様の構造内に存在してもしなくても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在してもしなくても、または植物もしくは細菌に由来する組織、子孫、生物試料または商品生産物に検出可能な量で存在してもしなくても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。
【０２０５】
本明細書でさらに記載されているように、ＰｉｒＡタンパク質、ＴＩＣ４７７１（配列番号１）及びＰｉｒＢ細胞タンパク質、ＴＩＣ４７７２（配列番号３）をコードする２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むオペロンは、それぞれ配列番号２及び配列番号４として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＩＳＢ０００００２株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ６８８０（配列番号５）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号６として提示されるＴＩＣ６８８０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ４７７１を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種のアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、ＣＥＷ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、ＤＥＭ）、欧州アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ＥＣＢ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ＶＢＣ）、及び南方ヨトウムシ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ、ＳＡＷ）；鞘翅目種のコロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）；及び半翅目種のミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、ＴＰＢ）に対して活性を示した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ４７７２を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＶＢＣ及び半翅目種、ＴＰＢに対して活性を示した。ＴＩＣ４７７１とＴＩＣ４７７２から構成される、微生物宿主細胞由来のＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ６８８０を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ＦＡＷ）、ＣＥＷ、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、ＳＷＣＢ）、ＤＢＭ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種  ＣＰＢ及び西洋トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）；半翅目種のミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、ＴＰＢ）、西洋ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  Ｈｅｓｐｅｒｕｓ、ＷＴＰ）、南方ミドリカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ、ＳＧＢ）、及び亜熱帯クサギカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ、ＮＢＳＢ）、及び双翅目種のネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、ＹＦＭ）に対して活性を示した。
【０２０６】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５（配列番号７）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６（配列番号９）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンが、それぞれ、配列番号８及び配列番号１０として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８２３株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３１６（配列番号１１）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号１２として提示されるＴＩＣ９３１６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７５７６を用いたバイオアッセイは、アッセイで調べた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ７５７５とＴＩＣ７５７６から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１６を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、ＢＣＷ）、ＳＡＷ、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ＴＢＷ）、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＴＰＢ、ＷＴＰ、ＳＧＢ、及びＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２０７】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６０（配列番号１３）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６１（配列番号１５）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号１４及び配列番号１６として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｃａｂａｎｉｌｌａｓｉｉの８５９０８株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３１７（配列番号１７）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号１８として提示されるＴＩＣ９３１７  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７６６１を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ７６６０とＴＩＣ７６６１から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１７を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、半翅目種、ＴＰＢ、ＷＴＰ、及びＳＧＢに対して活性を示した。
【０２０８】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６２（配列番号１９）とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６３（配列番号２１）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号２０及び配列番号２２として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｅｈｌｅｒｓｉｉの８５８８７株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３１８（配列番号２３）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号２４として提示されるＴＩＣ９３１８  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６２及びＴＩＣ７６６３を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ７６６２とＴＩＣ７６６３から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１８を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＢＣＷ、ＴＢＷ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、及び半翅目種、ＴＰＢ、ＷＴＰ、ＳＧＢ、及びＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２０９】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６４（配列番号２５）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６５（配列番号２７）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｐｏｉｎａｒｉｉの８６１９８株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３１９（配列番号２９）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号３０として提示されるＴＩＣ９３１９  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６４を用いたバイオアッセイは鞘翅目種のＣＰＢに対して活性を示した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６５を用いたバイオアッセイは鱗翅目種のＴＢＷに対して活性を示した。ＴＩＣ７６６４とＴＩＣ７６６５３から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１９を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＢＣＷ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＴＰＢ、ＷＴＰ、及びＳＧＢに対して活性を示した。
【０２１０】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６６（配列番号３１）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６７（配列番号３３）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号３２及び配列番号３４として示されるタンパク質毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９７株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３２２（配列番号３５）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号３６として提示されるＴＩＣ９３２２  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６６を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６７を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢに対して活性を示した。ＴＩＣ７６６６とＴＩＣ７６６７から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３２２を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＴＰＢに対して活性を示した。
【０２１１】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６８（配列番号３７）とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６９（配列番号３９）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号３８及び配列番号４０として提示されるタンパク質毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの８６１９４株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いてＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３２０（配列番号４１）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号４２として提示されるＴＩＣ９３２０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７６６８及びＴＩＣ７６６９を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ７６６８とＴＩＣ７６６９から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３２０を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、及び半翅目種、ＴＰＢ、ＳＧＢ、及びＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２１２】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７９３９（配列番号４３）とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７９４０（配列番号４５）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４６として提示されるタンパク質毒素をコードするマイクロバイオーム内に含まれる未知の細菌種から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ９３２１（配列番号４７）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号４８として提示されるＴＩＣ９３２１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２１３】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３５７（配列番号５７）とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６６（配列番号５９）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号５８及び配列番号６０として提示されるタンパク質毒素をコードするＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｖｉｏｌａｃｅａから得られたＤＮＡで発見された。２つのオープンリーディングフレームを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ１０３７５（配列番号６１）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号６２として提示されるＴＩＣ１０３７５  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２１４】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３５８（配列番号６３）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６７（配列番号６５）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号６４及び配列番号６６として提示されるタンパク質毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｌａｕｍｏｎｄｉｉＴＴＯ１株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ１０３７６（配列番号６７）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号６８として提示されるＴＩＣ１０３７６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ１０３５８及びＴＩＣ１０３６７を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ１０３５８とＴＩＣ１０３６７から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１０３７６を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＳＷＣＢ及び鞘翅目種、北方トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）及びＷＣＲに対して活性を示した。
【０２１５】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６０（配列番号６９）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６９（配列番号７１）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号７０及び配列番号７２として提示されるタンパク質毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａから得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列、ＴＩＣ１０３７７（配列番号７３）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号７４として提示されるＴＩＣ１０３７７  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２１６】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６１（配列番号７５）及びＰｉｒＢ細胞タンパク質ＴＩＣ１０３７０（配列番号７７）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７８として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ．のＮＢＡＩＩＸｅｎＳａ０４株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列ＴＩＣ１０３７８（配列番号７９）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号８０として提示されるＴＩＣ１０３７８  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２１７】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６２（配列番号８１）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７１（配列番号８３）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号８２及び配列番号８４として提示されるタンパク質毒素をコードするＹｅｒｓｉｎｉａ  ａｌｄｏｖａｅの６７０−８３株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列ＴＩＣ１０３７９（配列番号８５）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号８６として提示されるＴＩＣ１０３７９  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２１８】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６３（配列番号８７）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７２（配列番号８９）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ配列番号８８及び配列番号９０として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｄｏｕｃｅｔｉａｅのＦＲＭ１６株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列ＴＩＣ１０３８０（配列番号９１）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号９２として提示されるＴＩＣ１０３８０  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ１０３６３及びＴＩＣ１０３７２を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ１０３６３とＴＩＣ１０３７２から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１０３８０を用いたバイオアッセイは、鱗翅目種、ＦＡＷ、鞘翅目種、ＮＣＲとＷＣＲ、及び半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２１９】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６４（配列番号９３）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７３（配列番号９５）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号９４及び配列番号９６として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｇｒｉｆｆｉｎｉａｅのＢＭＭＣＢ株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列ＴＩＣ１０３８１（配列番号９７）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号９８として提示されるＴＩＣ１０３８１  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ１０３６４及びＴＩＣ１０３７３を用いたバイオアッセイは、アッセイで用いた昆虫に対する活性を示さなかった。しかしながら、ＴＩＣ１０３６４とＴＩＣ１０３７３から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１０３７８を用いたバイオアッセイは、鞘翅目、ＮＣＲとＷＣＲ、及び半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２２０】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３５９（配列番号９９）及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６８（配列番号１０１）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ、配列番号１００及び配列番号１０２として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａから得られたＤＮＡで発見された。ＴＩＣ１０３５９とＴＩＣ１０３６８の双方を含むオペロン配列は配列番号１０３として提示されている。
【０２２１】
ＰｉｒＡタンパク質ＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８（配列番号１０４）及びＰｉｒＢタンパク質ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９（配列番号１０６）をコードする２つのＯＲＦを含有するオペロンは、それぞれ配列番号１０５及び配列番号１０７として提示されるタンパク質毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのＨｍ株から得られたＤＮＡで発見された。２つのＯＲＦを用いて、ＤＮＡ配列ＴＩＣ１０４３４（配列番号１０８）をコードするＰｉｒＡＢ融合タンパク質を作製し、その際、２つのコード配列はインフレームで操作可能に連結され、配列番号１０９として提示されるＴＩＣ１０３７８ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。ＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８及びＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９から構成される、微生物宿主細胞由来のＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１０４３４を用いたバイオアッセイは、鞘翅目種、ＮＣＲ及びＷＣＲに対して活性を示した。
【０２２２】
ＴＩＣ１１５０５（配列番号１３４）をコードするＰｉｒＢタンパク質のＯＲＦを含有するオペロンは、配列番号１３５として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＭＤＩ−００３５７７７株から発見された。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１０５６のコード配列（配列番号１３６）は、ＴＩＣ１１５０５コード配列にインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４コード配列を含んで、配列番号１３７として提示されるＴＩＣ１１５０６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２２３】
ＴＩＣ１１５１０（配列番号１３８）をコードするＰｉｒＢタンパク質のＯＲＦを含有するオペロンは、配列番号１３９として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＭＤＩ−００３５７７７株から発見された。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１５１２のコード配列（配列番号１４０）は、ＴＩＣ１１５０５コード配列にインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４コード配列を含んで、配列番号１４１として提示されるＴＩＣ１１０５６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２２４】
ＴＩＣ１１５１１（配列番号１４２）をコードするＰｉｒＢタンパク質のＯＲＦを含有するオペロンは、配列番号１４３として提示されるタンパク質毒素をコードするＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａのＭＤＩ−００３５７７７株から発見された。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１５１３のコード配列（配列番号１４４）は、ＴＩＣ１１５１３コード配列にインフレームで操作可能に連結されたＴＩＣ１０３６４コード配列を含んで、配列番号１４５として提示されるＴＩＣ１１０５６  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質を生成した。
【０２２５】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、及びＴＩＣ１１３０１は、それぞれＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、及びＴＩＣ７６６１を含んでいた。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１２は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６２及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６５を含むＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１３０２は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６０及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６を含む。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１０及びＴＩＣ１１２１１は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ及び半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１３０１及びＴＩＣ１１３０２は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＷＣＲ、及び半翅目種、ＮＢＳＢ及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０２２６】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ１１１０３及びＴＩＣ１１１０４は、ＰｉｒＡタンパク質と一致するＰｉｒＢタンパク質を含んでいた。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１１０３はＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６１とＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６０から構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＴＩＣ１１１０４はＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６３とＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６２から構成される。
【０２２７】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１１４０はＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ４７７１とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４４７２の複製から構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１１４１はＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６の複製から構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１１４２はＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ４７７１とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４７７２とから構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１４４３は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７５７５とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６とから構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１４４４は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６０とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６１とから構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１４４５は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７６６２とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６３とから構成される。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１４４６は、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６２及びＴＩＣ７６６０とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６１とから構成される。細菌宿主細胞由来のＴＩＣ１１４４２は半翅目害虫種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。細菌宿主細胞由来のＴＩＣ１１４４４は鱗翅目種、ＳＷＣＢ及び半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２２８】
実施例に記載されているように、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０ＰＬ（配列番号４９）、ＴＩＣ９３１６（配列番号５１）、ＴＩＣ９３１７（配列番号５３）、ＴＩＣ９３１８（配列番号５５）、ＴＩＣ９３２０（配列番号５７）、ＴＩＣ９３２２（配列番号５９）、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ（配列番号１４６）、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ（配列番号１４８）、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ（配列番号１５０）、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ（配列番号１５２）、ＴＩＣ１１１０３（配列番号１５４）、ＴＩＣ１１１０４（配列番号１５６）、及びＴＩＣ１１３０２（配列番号１５８）をコードする合成ＤＮＡ配列は植物細胞での発現のために設計された。ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、及びＴＩＣ９３１８を発現するバイナリー形質転換プラスミド構築物で形質転換したトウモロコシ植物は、害虫種である欧州アワノメイガ及び南西部アワノメイガに対して活性を示した。
【０２２９】
植物細胞での発現については、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質は、細胞質ゾルに存在するように発現させることができ、または植物細胞の種々の細胞小器官を標的とするように発現させることができる。例えば、タンパク質を葉緑体に対して標的指向化することは、オフ表現型の発生を防ぎながら、トランスジェニック植物で発現されるタンパク質のレベルの上昇を生じてもよい。標的指向化はまた、トランスジェニック事象における害虫耐性の有効性の増大も生じてもよい。標的ペプチドまたは輸送ペプチドは、核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム及び原形質膜を含む細胞内の特定の領域へのタンパク質の輸送を指図する短い（３〜７０のアミノ酸長）ペプチド鎖である。一部の標的ペプチドはタンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体を標的とするために、タンパク質は約４０〜５０アミノ酸である輸送ペプチドを含有する。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第５，１８８，６４２号及び同第５，７２８，９２５号を参照のこと。多くの葉緑体に局在するタンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的指向化される。そのような単離された葉緑体タンパク質の例には、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、エノールピルビルシキメートホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、及び米国特許第７，１９３，１３３号に記載されている輸送ペプチドの小サブユニット（ＳＳＵ）に関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。非葉緑体タンパク質は、異種ＣＴＰとのタンパク質融合を使用することによって葉緑体に標的指向化されてもよく、ＣＴＰは葉緑体に対してタンパク質を標的指向化するのに十分であることが生体内及び試験管内で実証されている。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ＣＴＰ２）（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２１０：４３７−４４２，１９８７を参照のこと）またはＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ  ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（ＣＴＰ４）（ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：６８７３−６８７７，１９８６を参照のこと）のような好適な葉緑体輸送ペプチドの組込みは、トランスジェニック植物にて葉緑体に対して異種ＥＰＳＰＳタンパク質配列を標的指向化することが示されている  （米国特許第５，６２７，０６１号；同第５，６３３，４３５；号；及び同第５，３１２，９１０号；及びＥＰ０２１８５７１；ＥＰ１８９７０７；ＥＰ５０８９０９；及びＥＰ９２４２９９を参照のこと）。葉緑体に対してＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを標的指向化するために、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を、植物細胞での最適な発現のために設計されているＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つをコードする合成コード配列に対して操作可能な連結且つインフレームで５’に配置する。
【０２３０】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質に関連する追加の毒素タンパク質配列は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列を用いてアミノ酸配列レベルでの差異を新規アミノ酸配列変異体に統合し、変異体をコードする組換え核酸配列への適切な変更を行うことによって作り出すことができることが企図される。
【０２３１】
この開示はさらに、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の改良された変異体が、当該技術分野で知られている種々の遺伝子編集法を使用することによって植物体において操作され得ることを企図する。ゲノム編集に使用されるそのような技術には、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのゲノム編集法を用いて、植物細胞内で形質転換された毒素タンパク質コード配列を異なる毒素コード配列に変更することができる。具体的には、これらの方法を介して、新しいタンパク質アミノ酸配列を操作するために毒素コード配列内の１以上のコドンが変更される。あるいは、コード配列内の断片を置換するもしくは欠失させる、または追加のＤＮＡ断片をコード配列に挿入して、新しい毒素コード配列を操作する。新しいコード配列は、害虫に対する高い活性またはスペクトルのような新しい特性を持つ毒素タンパク質をコードすることができると共に、元の昆虫毒素タンパク質に対して耐性が発達している害虫種に対して活性を提供することができる。当該技術分野で既知の方法によって、遺伝子編集された毒素コード配列を含む植物細胞を用いて、新しい毒素タンパク質を発現する植物全体を生成することができる。
【０２３２】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質に類似するタンパク質は、当該技術分野で知られている種々のコンピューターに基づくアルゴリズムを用いて互いに比較することによって同定することができる。例えば、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質に関連するタンパク質のアミノ酸配列同一性は、次のデフォルトパラメーター：重量マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップ開口ペナルティ：１０．０、ギャップ拡張ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基固有のギャップペナルティ：オンを用いたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列比較を用いて分析することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０）。アミノ酸同一性パーセントはさらに、１００％に（アミノ酸同一性／対象タンパク質の長さ）を乗じた積によって算出される。他の配列比較アルゴリズムも当該技術分野で利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ配列比較を用いて得られたものと同様の結果を提供する。
【０２３３】
鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すタンパク質は、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７９３９との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも６５％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７６６４もしくはＴＩＣ７６６６との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも９７％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ４７７１の配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも９８％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６８、ＴＩＣ１０３５７、ＴＩＣ１０３５８、ＴＩＣ１０３６０、ＴＩＣ１０３６１、ＴＩＣ１０３６２、ＴＩＣ１０３６４、ＴＩＣ１０３５９、またはＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質の間で１００％の同一性を示す場合、ＰｉｒＡタンパク質に関することが意図される。
【０２３４】
鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すタンパク質は、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７９４０との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも６５％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ４７７２との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも９７％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、もしくはＴＩＣ１０３６８の配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも９８％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；または、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５１０、またはＴＩＣ１１５１１との配列比較が、クエリタンパク質と主題のタンパク質との間で１００％のアミノ酸配列同一性を示す場合、ＰｉｒＢタンパク質に関することが意図される。
【０２３５】
鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すタンパク質は、そのようなクエリタンパク質とＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ１１４１１、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５１３との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも６５％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；またはそのようなクエリタンパク質のＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１４４０、もしくはＴＩＣ１１４４２との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも７０％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；またはそのようなクエリタンパク質のＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、もしくはＴＩＣ１１１０４との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも８０％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；またはそのようなクエリタンパク質のＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１２、もしくはＴＩＣ１０３８０ＰＬとの配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも８２％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；またはそのようなクエリタンパク質のＴＩＣ６８８０もしくはＴＩＣ６８８０ＰＬとの配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも８６％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合；またはそのようなクエリタンパク質のＴＩＣ１１５０６またはＴＩＣ１１５１２との配列比較がクエリタンパク質と主題のタンパク質との間で約９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（またはこの範囲の比率の任意の一部）であるクエリタンパク質の長さに沿って少なくとも９４％〜約１００％のアミノ酸同一性を示す場合、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質に関することが意図される。
【０２３６】
例示的なＰｉｒＡタンパク質、ＴＩＣ４７７１、ＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６４、ＴＩＣ７６６６、ＴＩＣ７６６８、ＴＩＣ７９３９、ＴＩＣ１０３５７、ＴＩＣ１０３５８、ＴＩＣ１０３６０、ＴＩＣ１０３６１、ＴＩＣ１０３６２、ＴＩＣ１０３６３、ＴＩＣ１０３６４、ＴＩＣ１０３５９、及びＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて互いに並べた。表４及び５に報告されているように、完全長タンパク質のそれぞれについてのアミノ酸配列同一性パーセントのペアごとのマトリクスを作成した。
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【０２３７】
例示的なＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、及びＴＩＣ７９４０はＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて互いに並べた。表６及び７に報告されているように、完全長タンパク質のアミノ酸配列同一性パーセントのペアごとのマトリクスを作成した。
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【０２３８】
例示的なＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１２１２、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１１４４０、ＴＩＣ１１４４１、ＴＩＣ１１４４２、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５０６、ＴＩＣ１１５１２、ＴＩＣ１１５１３、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、及びＴＩＣ１１１０４はＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて互いに並べた。表８、９、１０、及び１１に報告されているように、完全長タンパク質のそれぞれについてアミノ酸配列同一性パーセントのペアごとのマトリクスが作成された。
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【０２３９】
同一性パーセントに加えて、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質は、一次構造（保存されたアミノ酸モチーフ）によって、長さ（ＰｉｒＡについては約１３３〜約１４１アミノ酸、ＰｉｒＢについては約４１４〜約４２８アミノ酸、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質については約５４９〜約５６６アミノ酸）によって、及びその他の特性によって関連付けることができる。ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の特性を表１２で報告する。
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【０２４０】
本出願の実施例でさらに記載されているように、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードする組換え核酸分子の配列は植物で使用するために設計された。植物で使用するために設計された植物で最適化された例示的な組換え核酸分子配列は、配列番号４９、５１、５２、５３、５４、５５、５６、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、及び１５８として提示されている。
【０２４１】
これらの組換え核酸分子の配列を含有する発現カセット及びベクターは、当技術分野で既知の形質転換の方法及び技法に従って、構築し、トウモロコシ、ダイズ、ワタまたは他の植物の細胞に導入することができる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在性形の形質転換は、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５Ａ１（ダイズ）、２００８／０２８０３６１Ａ１（ダイズ）、２００９／０１４２８３７Ａ１（トウモロコシ）、２００８／０２８２４３２（ワタ）、２００８／０２５６６７（ワタ）、２００３／０１１０５３１（コムギ）、２００１／００４２２５７Ａ１（テンサイ）、米国特許第５，７５０，８７１号（キャノーラ）、同第７，０２６，５２８号（コムギ）、及び同第６，３６５，８０７号（イネ）、及びＡｒｅｎｃｉｂｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．７：２１３−２２２（サトウキビ）に記載されており、そのすべては参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。形質転換細胞は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、またはＴＩＣ９３２２を発現する形質転換植物に再生することができる。殺虫活性を調べるために、実施例に記載されているように、形質転換植物から得られた植物リーフディスクを用いて、鱗翅目害虫の幼虫の存在下でバイオアッセイを実施する。鞘翅目害虫に対する殺虫活性を調べるために、以下の例で記載するようにＲ０及びＦ１の世代の形質転換植物が根切り虫アッセイにおいて使用される。半翅目害虫に対する殺虫活性を調べるために、実施例に記載されているように、植物から取り出された組織または植物に残っている組織のいずれかからの形質転換植物の鞘、トウモロコシの穂または葉をアッセイに使用する。
【０２４２】
従来の形質転換法の代替として、導入遺伝子、発現カセット（複数可）等のようなＤＮＡ配列を、部位特異的な組込みを介して植物または植物細胞のゲノム内の特定の部位または遺伝子座に挿入してもよく、または組み込んでもよい。したがって、本開示の組換えＤＮＡの構築物（複数可）及び分子（複数可）は、植物または植物細胞のゲノムに挿入するための少なくとも１つの導入遺伝子、発現カセット、または他のＤＮＡ配列を含むドナーテンプレート配列を含んでもよい。部位特異的組込みのためのそのようなドナーテンプレートはさらに、挿入配列（すなわち、植物ゲノムに挿入される配列、導入遺伝子、カセット等）に隣接する１または２の相同性アームを含んでもよい。本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）はさらに、部位特異的ヌクレアーゼ及び／または部位特異的組込みを実行するための任意の関連タンパク質をコードする発現カセット（複数可）を含んでもよい。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、ドナーテンプレートと同じ分子またはベクター（シス）または別の分子またはベクター（トランス）に存在してもよい。ゲノムＤＮＡを切断して、所望のゲノム部位または遺伝子座で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを生成する様々なタンパク質（またはタンパク質の複合体及び／またはガイドＲＮＡ）を含む部位特異的組込みのためのいくつかの方法が当該技術分野で知られている。当該技術分野で理解されるように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復する過程の間に、ドナーテンプレートＤＮＡはＤＳＢまたはニックの部位でゲノムに組み込まれるようになってもよい。挿入事象は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して発生してもよいが、ドナーテンプレートにおける相同性アーム（複数可）の存在は、相同組換えを介した修復過程の間での植物ゲノムへの挿入配列の導入及び標的指向化を促進してもよい。使用されてもよい部位特異的ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたまたはネイティブのメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、及びＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）が挙げられる。ＲＮＡ誘導部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を使用する方法については、組換えＤＮＡ構築物（複数可）はまた、植物ゲノム内の所望の部位にヌクレアーゼを向けるための１以上のガイドＲＮＡをコードする配列も含むであろう。
【０２４３】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子組成物が企図される。例えば、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する殺虫性タンパク質は、タンパク質をコードするＯＲＦを伴うポリヌクレオチド分子が、例えば、プロモーター、及び構築物が意図されるシステムでの発現に必要な他の調節要素のような遺伝子発現要素に操作可能に連結されている組換えＤＮＡ構築物で発現させることができる。非限定的な例には、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２または植物におけるタンパク質の発現のための配列をコードする関連ファミリーメンバーの殺虫性タンパク質に操作可能に連結された植物で機能的なプロモーター、またはＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８のようなＰｉｒＡタンパク質、もしくはＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ７９４０、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＴＩＣ１０３６８、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５０５、ＴＩＣ１１５１０及びＴＩＣ１１５１１；もしくはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１２１２、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１１４４０、ＴＩＣ１１４４１、ＴＩＣ１１４４２、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５０６、ＴＩＣ１１５１２、ＴＩＣ１１５１３、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、及びＴＩＣ１１１０４；または、Ｂｔ細菌もしくは他のＢａｃｉｌｌｕｓ種におけるタンパク質の発現のための配列をコードする関連する殺虫性タンパク質に操作可能に連結されたＢｔで機能的なプロモーターが挙げられる。エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コードされたタンパク質不動化タグ（ＨＩＳタグ）、転座ペプチド（すなわち、プラスチド輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位、及びＲＮＡｉ標的部位を含むが、これらに限定されない他の要素は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８、ＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ７９４０、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＴＩＣ１０３６８、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５０５、ＴＩＣ１１５１０、及びＴＩＣ１１５１１、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１２１２、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１１４４０、ＴＩＣ１１４４１、ＴＩＣ１１４４２、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５０６、ＴＩＣ１１５１２、ＴＩＣ１１５１３、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、及びＴＩＣ１１１０４、または、関連殺虫性タンパク質コード配列に操作可能に連結することができる。
【０２４４】
本明細書で提供されている例示的な組換えポリヌクレオチド分子には、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、及び配列番号１５７に記述されたようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、及び配列番号１５８のようなポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。異種プロモーターはまた、色素体を標的とするＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２、または標的としないＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４及びＴＩＣ１１３０２または関連する殺虫性タンパク質をコードする合成ＤＮＡコード配列に操作可能に連結することもできる。本明細書で開示されているタンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンは、同義のコドン（当該技術分野ではサイレント置換として知られている）で置き換えることができる。
【０２４５】
本明細書で使用されるとき、「組換え」という用語は、通常は自然界には見られず、ヒトの介入によって作り出された非天然のＤＮＡ、タンパク質、または生物を指す。「組換えＤＮＡ分子」は、天然には一緒に存在しないであろう、且つヒトの介入の結果であるＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、導入遺伝子を含むＤＮＡ分子及び導入遺伝子に隣接する植物ゲノムＤＮＡのような、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせから構成されるＤＮＡ分子は組換えＤＮＡ分子である。
【０２４６】
本明細書で使用されるとき、「異種」という用語は、そのような組み合わせが通常自然界に見られない場合の２以上のＤＮＡ分子の組み合わせを指す。例えば、２つのＤＮＡ分子は、異なる種に由来してもよく、及び／または２つのＤＮＡ分子は、異なる遺伝子、例えば、同じ種に由来する異なる遺伝子または異なる種に由来する同じ遺伝子に由来してもよい。したがって、調節要素は、そのような組み合わせが通常自然界に見られない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が調節要素に操作可能に連結して天然に存在しない場合、操作可能に連結された転写可能ＤＮＡ分子に関して異種である。
【０２４７】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する殺虫性タンパク質のコード配列を含む組換えＤＮＡ構築物はさらに、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する殺虫性タンパク質、昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子、または補助タンパク質をコードするＤＮＡ配列と同時に発現するまたは共発現するように構成することができる１以上の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡの領域を含むことができる。補助タンパク質には、補因子、酵素、結合相手、または、例えば、その発現を助け、植物におけるその安定性に影響を与え、オリゴマー化のために自由エネルギーを最適化し、その毒性を増強し、且つその活性のスペクトルを増大することによって昆虫阻害剤の有効性に役立つように機能する他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。補助タンパク質は、例えば、１以上の昆虫阻害剤の取り込みを促進してもよく、または毒剤の毒性効果を増強してもよい。
【０２４８】
すべてのタンパク質またはｄｓＲＮＡ分子が１つのプロモーターから発現されるように、または各タンパク質またはｄｓＲＮＡ分子が別個のプロモーターの制御下にあるように、またはそれらの何らかの組み合わせのであるように、組換えＤＮＡ構築物を構築することができる。本発明のＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、及び関連タンパク質は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連タンパク質の１以上が、選択した発現系の種類に応じて、他のオープンリーディングフレーム及びプロモーターも含有する共通のヌクレオチドセグメントから発現される多重遺伝子発現系から発現させることができる。例えば、細菌の多重遺伝子発現系は、単一のプロモーターを利用して、単一のオペロン内からの多重結合／タンデムオープンリーディングフレームの発現（すなわち、ポリシストロン性発現）を駆動することができる。別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、それぞれが異なるタンパク質または１以上のｄｓＲＮＡ分子のような他の薬剤を発現する、多重に連結されていない発現カセットを利用することができる。
【０２４９】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連するファミリーメンバータンパク質をコードする配列を含む組換え核酸分子または組換えＤＮＡ構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターによって宿主細胞に送達することができる。そのようなベクターを用いて、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または宿主細胞における関連タンパク質コード配列の安定した発現もしくは一過性の発現、またはコードされたポリペプチドのその後の発現を達成することができる。タンパク質をコードする配列を含み、宿主細胞に導入される外因性の組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物は、本明細書では「導入遺伝子」と呼ばれる。
【０２５０】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連するタンパク質をコードする配列のいずれか１以上を発現する組換えポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック植物の一部。「細菌細胞」または「細菌」という用語は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍの細胞を含むことができるが、これらに限定されない。「植物細胞」または「植物」という用語は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞を含むことができるが、これらに限定されない。企図される植物及び植物細胞には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ブラッシカ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、ネギ、レタス、ロブロリーパイン、キビ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞用植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、ハトエンドウ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、サフラワー、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、スイートポテト、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、コムギの植物細胞または植物が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、トランスジェニック植物細胞から再生されたトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物の一部が提供される。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、植物から一部を切断する、折る、粉砕する、または他の方法で分離することによって、トランスジェニック種子から得ることができる。特定の実施形態では、植物の一部は、種子、朔果、葉、花、茎、根、またはそれらの任意の部分、またはトランスジェニック植物の一部の再生不可能な部分であることができる。この文脈で使用されるとき、トランスジェニック植物の一部の「再生不可能な」部分は、植物全体を形成するように誘導できない部分、または有性生殖及び／または無性生殖が可能な植物全体を形成するように誘導できない部分である。特定の実施形態では、植物の一部の再生不可能な部分は、トランスジェニック植物の種子、朔果、葉、花、茎、または根の一部である。
【０２５１】
昆虫、鞘翅目または鱗翅目または半翅目を阻害する量のＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２または関連するタンパク質を含むトランスジェニック植物の製造方法が提供される。そのような植物は、本出願で提供されている任意のＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２、または関連タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入することと、昆虫、鞘翅目、鱗翅目、または半翅目を阻害する量のタンパク質を発現する前記植物細胞に由来する植物を選択することとによって作製することができる。植物は、再生、種子、花粉、または分裂組織の形質転換技術によって植物細胞から導出することができる。植物を形質転換するための方法は当該技術分野で既知である。
【０２５２】
加工製品が検出可能な量のＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２、または関連するタンパク質、その昆虫阻害性のセグメントまたは断片を含む加工植物製品またはその任意の特徴的な部分もまた、本出願において開示されている。特定の実施形態では、加工製品は、植物の一部、植物バイオマス、油、粗びき粉、砂糖、動物飼料、コムギ粉、フレーク、ふすま、糸くず、外皮、加工種子、及び種子から成る群から選択される。特定の実施形態では、加工製品は再生不可能である。植物製品は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部に由来する商品または商業の他の製品を含むことができ、商品または他の製品は、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２；または関連タンパク質の特徴的な部分をコードするまたは含むヌクレオチドセグメントまたは発現されたＲＮＡまたはタンパク質を検出することによって商業を介して追跡することができる。
【０２５３】
ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２、または関連タンパク質を発現している植物は、他の毒性タンパク質を発現する、及び／または除草剤耐性遺伝子、収量またはストレス耐性形質等を付与する遺伝子等のような他のトランスジェニック形質を発現するトランスジェニック事象と交配することによって交配することができ、または形質がすべて連鎖されるようにそのような形質を単一のベクターで組み合わせることができる。
【０２５４】
実施例でさらに記載されているように、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２をコードする配列は植物で使用するために設計された。これらの合成ヌクレオチド配列または人工ヌクレオチド配列を含有する発現カセット及び発現ベクターは、当該技術分野で知られている形質転換の方法及び技法に従って、構築され、トウモロコシ、ワタ、及びダイズの植物細胞に導入することができる。形質転換細胞は、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２を発現していることが観察される形質転換植物に再生される。殺虫活性を調べるために、鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目の害虫の存在下でバイオアッセイが実施される。
【０２５５】
実施例にさらに記載されているように、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２または関連するタンパク質をコードする配列、及びこれらのタンパク質に対して実質的な比率の同一性を有する配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅及びハイブリッド形成のような当業者に既知の方法を用いて同定することができる。例えば、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質または関連タンパク質は、関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生させるのに使用することができ、且つ密接に関連している他のタンパク質メンバーを選抜する及び見つけるために使用することができる。
【０２５６】
さらに、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質、または関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、スクリーニング用のプローブ及びプライマーとして使用して、熱サイクル増幅法または等温増幅法及びハイブリッド形成法を用いてクラスの他のメンバーを同定することができる。例えば、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、及び配列番号１５８として記述されている配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、商品生産物に由来するデオキシリボ核酸試料におけるＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質または関連タンパク質の導入遺伝子の存在または非存在を決定することができる。オリゴヌクレオチドを使用する特定の核酸検出法の感度を考えると、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６及び配列番号１５８として記述されている配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、商品生産物の一部のみが、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、または配列番号１５８を含有するトランスジェニック植物に由来するプールされた供給源に由来する商品生産物にてＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２の導入遺伝子を検出できることが期待される。そのようなオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、または配列番号１５８にてヌクレオチド配列の変異を導入することができることがさらに認識されている。そのような「突然変異誘発」オリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物宿主細胞における様々な昆虫阻害活性または多様な発現を示すＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２、または関連するアミノ酸配列変異体の同定に有用である。
【０２５７】
ヌクレオチド配列の相同体、例えば、ハイブリッド形成条件下にて、本出願で開示されている配列のそれぞれまたはいずれかとハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされる殺虫性タンパク質もまた本発明の実施形態である。本発明はまた、第２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する第１のヌクレオチド配列を検出する方法を提供し、その際、第１のヌクレオチド配列（またはその逆相補性配列）は、殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードし、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で第２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。そのような場合、第２のヌクレオチド配列はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、及び配列番号１５８から成る群から選択されるヌクレオチド配列であることができる。ヌクレオチドコード配列は、適切なハイブリッド形成条件下で互いにハイブリッド形成し、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、他のタンパク質のいずれか１つに対して生じた抗血清と交差反応する。本明細書で定義されるようなストリンジェントなハイブリッド形成条件は、少なくとも４２℃でのハイブリッド形成と、それに続く２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる室温でのそれぞれ５分間の２回の洗浄と、それに続く０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける６５℃でのそれぞれ３０分間の２回の洗浄とを含む。一層さらに高い温度での洗浄は一層さらにストリンジェントな条件、例えば、６８℃でのハイブリッド形成条件、それに続く０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣにおける６８℃での洗浄を構成する。
【０２５８】
当業者は、遺伝暗号の冗長性のために、他の多くの配列がＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質に関連するタンパク質をコードすることができ、且つそれらの配列は、それらがＢａｃｉｌｌｕｓ株または植物細胞のいずれかで殺虫性タンパク質を発現するように機能する程度まで、多くのそのような冗長なコード配列がこれらの条件下で、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードするネイティブのＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓまたはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ配列とハイブリッド形成しないことを当然認識している本発明の実施形態であることを認識するであろう。本出願は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連するタンパク質をコードする配列及びそれに対して実質的な比率の同一性を有する配列を同定するための、当業者に既知のこれら及び他の同定方法の使用を企図する。
【０２５９】
ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質または関連タンパク質によって昆虫、特に鱗翅目、鞘翅目、または半翅目による作物の侵入を防除する方法も本出願で開示されている。そのような方法は、昆虫、鞘翅目、または鱗翅目または半翅目を阻害する量のＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２、または関連する毒素タンパク質を含む植物を成長させることを含むことができる。特定の実施形態では、そのような方法はさらに、（ｉ）ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質、または関連する毒素タンパク質を含むまたはコードする任意の組成物を植物または植物を生じさせる種子に適用すること；及び（ｉｉ）ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質、または関連する毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドで植物または植物を生じさせる植物細胞を形質転換すること、のいずれか１以上をさらに含むことができる。一般に、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２タンパク質、または関連する毒素タンパク質を、組成物で提供して、微生物で提供して、またはトランスジェニック植物で提供して、または鱗翅目、鞘翅目または半翅目の昆虫に対する昆虫阻害活性を付与することができることが企図される。
【０２６０】
特定の実施形態では、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する毒素タンパク質の組換え核酸分子は、発現に好適な条件下でＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質または関連する毒素タンパク質の１つを発現するように形質転換された組換えＢａｃｉｌｌｕｓまたは任意の他の組換え細菌細胞を培養することによって調製される昆虫阻害性組成物の殺虫活性成分である。そのような組成物は、前記組換えポリペプチドを発現／産生するそのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製することができる。そのようなプロセスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞浮遊液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットを生じることができる。そのように生成された組換えポリペプチドを得ることによって、組換えポリペプチドを含む組成物は、細菌細胞、細菌胞子、及び傍胞子封入体を含むことができ、農業昆虫阻害スプレー製品または食餌バイオアッセイにおける昆虫阻害製剤としてを含む種々の用途のために製剤化することができる。
【０２６１】
一実施形態では、耐性発生の可能性を低減するために、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質または関連タンパク質の１つを含む昆虫阻害組成物はさらに、同じ鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、またはＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する毒素タンパク質とは異なる当業者に既知の少なくとも１つの追加のポリペプチドを含むことができる。そのような組成物のための考えられる追加のポリペプチドには、昆虫阻害タンパク質及び昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子が挙げられる。害虫を防除するためのそのようなリボヌクレオチド配列の使用の一例は、Ｂａｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，（米国特許公開２００６／００２１０８７  Ａ１）に記載されている。
【０２６２】
鱗翅目害虫の防除のためのそのような追加のポリペプチドは、例えば、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許公開番号１０／５２５，３１８）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄａ及びそれらの変異型、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号；同第６，９６２，７０５号；及び同第６，７１３，０６３号）、例えば、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、及びＴＩＣ１１００（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９１（Ａ２））、ＴＩＣ２１６０（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９２（Ａ２））のような、しかし、これらに限定されないＣｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ１−型キメラ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５、ＡＮＤ  ＡＸＭＩ−０４５（米国特許公開２０１３−０１１７８８４  Ａ１）、ＡＸＭＩ−５２、ＡＸＭＩ−５８、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００（米国特許公開２０１３−０３１０５４３  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５（米国特許公開２０１３−０１０４２５９  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１５０（米国特許公開２０１０−０１６０２３１  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９（米国特許公開２０１１−００３００９６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４−０２４５４９１  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ、ＡＸＭＩ−２２５ｚ（米国特許公開２０１４−０１９６１７５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２３８（米国特許公開２０１４−００３３３６３  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７０（米国特許公開２０１４−０２２３５９８  Ａ１）、ＡＸＭＩ−３４５（米国特許公開２０１４−０３７３１９５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−３３５（国際出願公開ＷＯ２０１３／１３４５２３（Ａ２））、ＤＩＧ−３（米国特許公開２０１３−０２１９５７０  Ａ１）、ＤＩＧ−５（米国特許公開２０１０−０３１７５６９  Ａ１）、ＤＩＧ−１１（米国特許公開２０１０−０３１９０９３  Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ａ及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１  Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ｂ及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１  Ａ１）、ＰＩＰ−１ＡＰＩＰ−１Ｂ（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許公開２０１４−���００７２９２  Ａ１）、ＡＥＣＦＧ−５９２７４０（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＤＩＧ−６５７（国際出願公開ＷＯ２０１５／１９５５９４（Ａ２））、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許公開２０１４−０００７２９２  Ａ１）、ＧＳ−１３５及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１２−０２３３７２６  Ａ１）、ＧＳ１５３及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０  Ａ１）、ＧＳ１５４及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０  Ａ１）、ＧＳ１５５及びそれらの誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０Ａ１）、米国特許公開２０１２−０１６７２５９  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１２−００４７６０６  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１１−０１５４５３６  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１１−０１１２０１３  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１０−０１９２２５６  Ａ１に記載されているような配列番号２及び４及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０７  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０８  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２００９−０３１３７２１  Ａ１に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許公開２０１０−０２６９２２１  Ａ１に記載されているような配列番号２または４及びそれらの誘導体、米国特許第７，７７２，４６５（Ｂ２）に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、ＷＯ２０１４／００８０５４  Ａ２に記載されているようなＣＦ１６１＿００８５及びそれらの誘導体、米国特許公開ＵＳ２００８−０１７２７６２  Ａ１、ＵＳ２０１１−００５５９６８  Ａ１、及びＵＳ２０１２−０１１７６９０  Ａ１に記載されているような鱗翅目毒性タンパク質及びそれらの誘導体；ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、米国特許第７８１２１２９（Ｂ１）に記載されているような配列番号２及びそれらの誘導体、Ｃｒｙ７１Ａａ１及びＣｒｙ７２Ａａ１（ＵＳ特許公開ＵＳ２０１６−０２３０１８７  Ａ１）、Ａｘｍｉ４２２（ＵＳ特許公開ＵＳ２０１６−０２０１０８２  Ａ１）、Ａｘｍｉ４４０（ＵＳ特許公開ＵＳ２０１６−０１８５８３０  Ａ１）、Ａｘｍｉ２８１（ＵＳ特許公開２０１６−０１７７３３２  Ａ１）、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８及びそれらの変異型（ＷＯ２０１６−０９４１５９  Ａ１）、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７及びそれらの変異型（ＷＯ２０１６−０９４１６５  Ａ１）、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、Ｃｒｙ１  ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖ（ＷＯ２０１６−０６１２０８  Ａ１）；等のような、しかし、これらに限定されない昆虫阻害タンパク質から成る群から選択されてもよい。
【０２６３】
鞘翅目害虫を防除するためのそのような追加のポリペプチドは、例えば、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号）、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４  Ａ１）ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２０５（米国特許公開２０１４−０２９８５３８  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２０７（米国特許公開２０１３−０３０３４４０  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ（米国特許公開２０１４−０１９６１７５  Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７９（米国特許公開２０１４−０２２３５９９  Ａ１）、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びその変異型（米国特許公開２０１０−０１９７５９２  Ａ１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ−１０（米国特許公開２０１０−０３１９０９２  Ａ１）、ｅＨＩＰ（米国特許出願公開番号２０１０／００１７９１４）、ＩＰ３及びその変異型（米国特許公開２０１２から０２１０４６２Ａ１）、ｖ−Ｈｅｘａｔｏｘｉｎ−Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開２０１４−０３６６２２７  Ａ１）、ＰＨＩ−４変異型（米国特許出願公開２０１６−０２８１１０５  Ａ１）、ＰＩＰ−７２変異型（ＷＯ２０１６−１４４６８８  Ａ１）、ＰＩＰ−４５変異型、ＰＩＰ−６４変異型、ＰＩＰ−７４変異型、ＰＩＰ−７５変異型、及びＰＩＰ−７７変異型（ＷＯ２０１６−１４４６８６  Ａ１）、ＤＩＧ−３０５（ＷＯ２０１６１０９２１４  Ａ１）、ＰＩＰ−４７変異型（米国特許公開２０１６−０１８６２０４  Ａ１）、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９（ＷＯ２０１６−０５７１２３  Ａ１）、ＤＩＧ−３０３（ＷＯ２０１６−０７００７９  Ａ１）；等のような、しかし、これらに限定されない昆虫阻害タンパク質から成る群から選択されてもよい。
【０２６４】
半翅目害虫を防除するためのそのような追加のポリペプチドは、ＴＩＣ１４１５（米国特許公開２０１３−００９７７３５  Ａ１）、ＴＩＣ８０７（米国特許番号８６０９９３６）、ＴＩＣ８５２及びＴＩＣ８５３（米国特許公開２０１０−００６４３９４  Ａ１）、ＴＩＣ８３４及びその変異型（米国特許公開２０１３−０２６９０６０  Ａ１）、ＡＸＭＩ−０３６（米国特許公開２０１０−０１３７２１６  Ａ１）、及びＡＸＭＩ−１７１（米国特許公開２０１３−００５５４６９  Ａ１）、Ｃｒｙ６４Ｂａ及びＣｒｙ６４Ｃａ（Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ（２０１８），Ｃｒｙ６４Ｂａ  ａｎｄ  Ｃｒｙ６４Ｃａ，Ｔｗｏ  ＥＴＸ／ＭＴＸ２−Ｔｙｐｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ  Ｐｅｓｔｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８４（３）：１−１１）のような、しかし、これらに限定されない半翅目に活性があるタンパク質から成る群から選択されてもよい。
【０２６５】
他の実施形態では、そのような組成物／製剤はさらに、本発明の他の昆虫阻害タンパク質によって阻害されない昆虫に対する阻害活性を示して得られる昆虫阻害のスペクトルを拡大する少なくとも１つの追加のポリペプチド、例えば、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａｎｓに対して昆虫阻害活性を示す追加のポリペプチドを含むことができる。
【０２６６】
昆虫が特定の殺虫剤に対する耐性を発達させる可能性は当該技術分野で文書化されている。虫害耐性管理戦略の１つは、異なる作用機序を介して作動する２つの異なる昆虫阻害剤を発現するトランスジェニック作物を採用することである。したがって、昆虫阻害剤のいずれか１つに耐性のある昆虫は他の昆虫阻害剤によって防除することができる。別の虫害耐性管理戦略は、対象となる鞘翅目または鱗翅目の害虫種に対して保護されていない植物を用いて、そのような保護されていない植物の避難を提供することである。１つの特定の例は、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，５５１，９６２号に記載されている。
【０２６７】
種子処理製剤、スプレーオン製剤、ドリップオン製剤、またはワイプオン製剤でタンパク質とともに使用される、本明細書で開示されているタンパク質によっても防除される害虫を防除するために設計されている局所適用殺虫剤の化学作用のような他の実施形態は、土壌に直接適用することができ（土壌灌注）、本明細書で開示されているタンパク質を発現する成長している植物に適用することができ、または開示されているタンパク質の１以上をコードする１以上の導入遺伝子を含有する種子に適用されるように製剤化することができる。種子処理で使用するためのそのような製剤は、当該技術分野で知られている種々の粘着剤及び粘着付与剤と共に適用することができる。そのような製剤は、開示されているタンパク質と作用様式において相乗的である殺虫剤を含有することができるので、製剤殺虫剤は様々な作用様式を介して作用して、開示されているタンパク質によって防除され得る同じまたは類似の害虫を防除する、またはそのような殺虫剤はＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質、または関連する殺虫性タンパク質の１つによって効果的に防除されていない、さらに広い宿主範囲または植物の害虫種の範囲内で害虫を防除するように作用する。
【０２６８】
前述の組成物／製剤はさらに、餌、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイド懸濁液、水溶液、Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子／結晶調製物、種子処理、１以上のタンパク質を発現するように形質転換された組換え植物細胞／植物組織／種子／植物、または１以上のタンパク質を発現するように形質転換された細菌のような農業的に許容される担体をさらに含むことができる。組換えポリペプチドに固有の昆虫阻害または殺虫性阻害のレベル及び植物または食餌アッセイに適用される製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は、種々の重量での量の組換えポリペプチド、例えば、０．０００１重量％〜０．００１重量％〜０．０１重量％〜１重量％〜９９重量％の組換えポリペプチドを含むことができる。
【実施例】
【０２６９】
前述を考慮して当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様にて変更を行なうことができ、それでも同様のまたは類似する結果を得ることができることを十分に理解するべきである。したがって、本明細書で開示されている具体的な構造的及び機能的詳細は、限定的であると解釈されるべきではない。本明細書で引用された各参考文献の開示全体は本出願の開示の範囲内に組み込まれることが理解されるべきである。
【０２７０】
実施例１
ＰｉｒＡタンパク質とＰｉｒＢタンパク質の発見及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の構築
この実施例では、殺虫性ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ４７７１、ＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６４、ＴＩＣ７６６６、ＴＩＣ７６６８、ＴＩＣ７９３９、ＴＩＣ１０３５７、ＴＩＣ１０３５８、ＴＩＣ１０３６０、ＴＩＣ１０３６１、ＴＩＣ１０３６２、ＴＩＣ１０３６３、ＴＩＣ１０３６４、ＴＩＣ１０３５９、及びＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８（まとめて「ＰｉｒＡタンパク質」）、ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ７９４０、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＴＩＣ１０３６８、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５０５、ＴＩＣ１１５１０、及びＴＩＣ１１５１１（まとめた「ＰｉｒＢタンパク質」）の発見、ならびにＰｉｒＡＢ融合タンパク質、ＴＩＣ６８８０、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２１、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７５、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７７、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３７９、ＴＩＣ１０３８０、ＴＩＣ１０３８１、ＴＩＣ１０４３４、ＴＩＣ１１２１０、ＴＩＣ１１２１１、ＴＩＣ１１２１２、ＴＩＣ１１３０１、ＴＩＣ１１３０２、ＴＩＣ１１４４０、ＴＩＣ１１４４１、ＴＩＣ１１４４２、ＴＩＣ１１４４３、ＴＩＣ１１４４４、ＴＩＣ１１４４５、ＴＩＣ１１４４６、ＴＩＣ１１５０６、ＴＩＣ１１５１２、ＴＩＣ１１５１３、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、及びＴＩＣ１１１０４（まとめて「ＰＩｓＡＢタンパク質）の作出を説明する。
【０２７１】
Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒａｂｄｕｓのＰｉｒＡＢ殺虫性タンパク質をコードする配列を、独自の収集及び公開配列情報から特定し、合成し、クローニングし、配列決定し、及び昆虫バイオアッセイで調べた。細菌のオペロンは、Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒａｂｄｕｓの種から同定し、各オペロンはＰｉｒＡ及びＰｉｒＢのコード配列を含む。殺虫性ＰｉｒＡタンパク質、ＴＩＣ４７７１、ＴＩＣ７５７５、ＴＩＣ７６６０、ＴＩＣ７６６２、ＴＩＣ７６６４、ＴＩＣ７６６６、ＴＩＣ７６６８、ＴＩＣ７９３９、ＴＩＣ１０３５７、ＴＩＣ１０３５８、ＴＩＣ１０３６０、ＴＩＣ１０３６１、ＴＩＣ１０３６２、ＴＩＣ１０３６３、ＴＩＣ１０３６４、ＴＩＣ１０３５９、及びＰｉｒＡ＿ＡＢＥ６８８７８；ならびにＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ４７７２、ＴＩＣ７５７６、ＴＩＣ７６６１、ＴＩＣ７６６３、ＴＩＣ７６６５、ＴＩＣ７６６７、ＴＩＣ７６６９、ＴＩＣ７９４０、ＴＩＣ１０３６６、ＴＩＣ１０３６７、ＴＩＣ１０３６９、ＴＩＣ１０３７０、ＴＩＣ１０３７１、ＴＩＣ１０３７２、ＴＩＣ１０３７３、ＴＩＣ１０３６８、ＰｉｒＢ＿ＡＢＥ６８８７９、ＴＩＣ１１５０５、ＴＩＣ１１５１０、及びＴＩＣ１１５１１は、表１３で列記されているＰｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒａｂｄｕｓの種から単離した。タンパク質ＴＩＣ７９３９及びＴＩＣ７９４０に関しては、オペロンはマイクロバイオーム試料から同定され、それが由来した細菌種はまだ不明である。
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【０２７２】
Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒａｂｄｕｓのＰｉｒＡ及びＰｉｒＢ殺虫性タンパク質をコードする配列は、独自の収集及び公開配列情報から特定し、合成し、クローニングし、配列を確認し、及び昆虫バイオアッセイで調べた。細菌のオペロンを同定し、表１３に列記されている各Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ及びＸｅｎｏｒａｂｄｕｓ種の配列決定に由来するコンティグに基づいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーを設計した。各タンパク質毒素の完全長コード配列のアンプリコンは、表１３に列記されている各種から単離された全ＤＮＡを用いて作り出した。アンプリコンのそれぞれは、当該技術分野で既知の方法を用いて、Ｂｔで発現可能なプロモーターと操作可能に連結したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）の発現ベクターにクローニングした。
【０２７３】
ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質を含む融合タンパク質は当該技術分野で既知の方法を用いて作製した。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質をコードするコード配列は、操作可能に連結されたＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質のコード配列を含むので、細胞で発現されると、互いに隣接するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質を含むタンパク質が作り出された。ＰｉｒＢタンパク質に隣接するＰｉｒＡタンパク質から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質を表１に提示する。表１に提示したＰｉｒＡＢ融合タンパク質は、同じ細菌オペロンに由来するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質、または異なる細菌オペロンに由来するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質から構成される。ＰｉｒＡタンパク質に隣接するＰｉｒＢタンパク質から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質を表２に提示する。表２のＰｉｒＡＢ融合タンパク質は、同じ細菌オペロンに由来するＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質から構成される。別のＰｉｒＡタンパク質と隣接し、次にＰｉｒＢタンパク質と隣接するＰｉｒＡタンパク質から構成されるＰｉｒＡＢ融合タンパク質を表３に提示する。表３に提示したＰｉｒＡＢ融合タンパク質のＰｉｒＡタンパク質成分は、重複ＰｉｒＡタンパク質または異なるＰｉｒＡタンパク質であることができる。
【０２７４】
実施例２
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質は昆虫バイオアッセイにて鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目に対する活性を示す
この実施例は、鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目の種々の種に対するＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質によって示される阻害活性を説明する。
【０２７５】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質はＢｔ及びＥ．ｃｏｌｉで発現させ、鱗翅目、鞘翅目、半翅目、及び双翅目の種々の種に対する毒性についてアッセイした。各毒素の調製物は、鱗翅目害虫種、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ＦＡＷ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ、（ＣＥＷ）、ダイズポッドワーム及びオオタバコガとしても知られる）、南西部のアワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、ＳＷＣＢ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、ＤＢＭ）、欧州アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ＥＣＢ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ＶＢＣ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ、ＢＣＷ）、南部ヨトウムシ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄａｎｉａ、ＳＡＷ）、ダイズルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ＳＢＬ）、及びオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ＴＢＷ）；鞘翅目の害虫種、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、北部トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、南部トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、及び西部トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）；半翅目種、南部アオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ、ＳＧ）、亜熱帯性クサギカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ、ＮＢＳＢ）、ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、ＴＰＢ）、及び西部ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  Ｈｅｓｐｅｒｕｓ、ＷＴＰ）；ならびに双翅目種、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、ＹＦＭ）に対してアッセイした。 
【０２７６】
ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質を発現する形質転換されたＢｔ及びＥ．ｃｏｌｉを増殖させ、胞子または可溶化タンパク質をアッセイ用の昆虫餌に加えた。大量死と発育阻害は、ＰｉｒＡタンパク質、ＰｉｒＢタンパク質、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１以上を含有する食餌での昆虫の成長と発達を、未処理の対照飼育の食餌での昆虫と比較することによって評価した。鱗翅目、鞘翅目、半翅目、及び双翅目の害虫の活動を観察した。各タンパク質で観察されたバイオアッセイの活性を表１４（鱗翅目）及び１５（鞘翅目、半翅目、双翅目）に提示するが、その際、「＋」は活性を示し、空のセルは活性が観察されなかったことを示し、「ＮＴ」は毒素がその特定の害虫に対して分析されなかったことを示す。
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【０２７７】
表１４及び１５に見られるように、ほとんどの場合、ＰｉｒＡ毒素タンパク質及びＰｉｒＢ毒素タンパク質だけでは殺虫活性を示さなかった。しかしながら、各オペロン由来のＰｉｒＡタンパク質とＰｉｒＢタンパク質とを含む融合タンパク質は、鱗翅目、鞘翅目、半翅目、及び双翅目の害虫種に対して広いスペクトルの活性を示した。ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質のいくつかは、個々の能力で調べると経口活性を示した。例えば、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ４７７１は、鱗翅目種、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＶＢＣ、ＳＡＷ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＴＰＢに対して活性を示した。ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ４７７２は、鱗翅目種、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＶＢＣ、ＳＡＷ、及び半翅目種、ＴＰＢに対して活性を示した。ＴＩＣ４７７１タンパク質及びＴＩＣ４７７２タンパク質をＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０と組み合わせると、鱗翅目活性に対するほとんどの活性が保持された（ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ）。ＳＡＷに対する活性は失われたが、さらに２種の昆虫種ＦＡＷ及びＳＷＣＢに対する活性は見られた。ＴＩＣ６８８０はまた、鞘翅目及び半翅目の害虫種に関して、個々のＴＩＣ４４７１及びＴＩＣ４７７２と比較して追加の活性を示した。鞘翅目に関しては、ＴＩＣ６８８０はＣＰＢに対する活性を保持し、ＷＣＲに対する活性を追加した。半翅目に関しては、ＴＩＣ６８８０はＴＰＢに対する活性を保持し、ＳＧＢ、ＮＢＳＢ、及びＷＴＰに対して観察された活性を追加した。ＴＩＣ６８８０はまた、ＴＩＣ４７７１またはＴＩＣ４７７２では見られなかった双翅目種、ＹＦＭに対しても活性を示した。
【０２７８】
ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７５７６は、それぞれ、アッセイした昆虫に対して昆虫阻害活性を示さなかった一方で、対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ９３１６は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、ＶＢＣ、ＢＣＷ、ＳＡＷ、及びＴＢＷに対して活性を示した。ＴＩＣ９３１６は、鞘翅目種、ＣＰＢ及び半翅目種、ＳＧＢ、ＮＢＳＢ、ＴＰＢ、及びＷＴＰに対しても活性を示した。
【０２７９】
ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ７６６０及びＴＩＣ７６６１はそれぞれ活性を示さなかった。しかしながら、対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ９３１７は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、ならびに半翅目種、ＳＧＢ、ＴＰＢ、及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０２８０】
ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ７６６２及びＴＩＣ７６６３はそれぞれ活性を示さなかった。しかしながら、対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ９３１８は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、ＶＢＣ、ＢＣＷ、及びＴＢＷ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、ならびに半翅目種、ＳＧＢ、ＮＢＳＢ、ＴＰＢ、及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０２８１】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６４は鞘翅目、ＣＰＢに対して活性を示した。ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６５は鱗翅目種、ＴＢＷに対して活性を示した。対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ９３１９は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、ＶＢＣ、及びＢＣＷ、鞘翅目種、ＣＰＢ及びＷＣＲ、及び半翅目種、ＳＧＢ、ＴＰＢ、及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０２８２】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７６６６は昆虫阻害活性を示さなかった。ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７６６７は鱗翅目種、ＳＷＣＢに対して活性を示した。対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ９３２２は鱗翅目種、ＦＡＷ、ＣＥＷ、ＳＷＣＢ及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＴＰＢに対して活性を示した。
【０２８３】
ＰｉｒＡタンパク質及びＰｉｒＢタンパク質、ＴＩＣ７６６８及びＴＩＣ７６６９はそれぞれ活性を示さなかった。対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３２０は、鱗翅目種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目種、ＣＰＢ、及び半翅目種、ＳＧＢ、ＮＢＳＢ、及びＴＰＢに対して活性を示した。
【０２８４】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３２１は鞘翅目の害虫、ＣＰＢに対して活性を示した。
【０２８５】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３５７、ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６６、及び対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１０３７５は、アッセイされた限られた数の鱗翅目に対して活性を示さなかった。
【０２８６】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３５８及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６７はそれぞれ、アッセイした昆虫種に対して活性を示さなかった。しかしながら、対応するＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ１０３７６は、鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢ及び鞘翅目害虫種、ＮＣＲ及びＷＣＲに対して活性を示した。
【０２８７】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６０及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３６９はそれぞれ、アッセイされた限られた数の鱗翅目害虫種に対して活性を示さなかった。
【０２８８】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６１及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７０は、それぞれ、アッセイされた限られた数の鱗翅目害虫種に対して活性を示さなかった。しかしながら、対応する融合タンパク質であるＴＩＣ１０３７８は、鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢ、鞘翅目害虫種、ＮＣＲとＷＣＲ、及び半翅目害虫種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２８９】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６２及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７１はアッセイされた限られた数の鱗翅目害虫種に対して活性を示さなかった。
【０２９０】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６３はアッセイされた限られた数の害虫種に対して活性を示さなかった。ＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７２は鱗翅目昆虫種、ＳＷＣＢに対して活性を示した。対応する融合タンパク質であるＴＩＣ１０３８０は、鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢに対する活性を保持し、鞘翅目害虫種、ＮＣＲ及びＷＣＲと半翅目害虫種、ＮＢＳＢとに対する活性を追加した。
【０２９１】
ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ１０３６４及びＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ１０３７３はアッセイされた限られた数の害虫種に対して活性を示さなかった。対応する融合タンパク質ＴＩＣ１０３８１は、鞘翅目の害虫種ＮＣＲとＷＣＲ、及び半翅目害虫種ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２９２】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質であるＴＩＣ１０４３４は、鞘翅目害虫種、ＮＣＲ及びＷＣＲに対して活性を示した。
【０２９３】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１１０３は鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢに対して活性を示した。
【０２９４】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１０４は半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２９５】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１０は鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢとＢＣＷ、及び半翅目害虫種ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２９６】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１１は鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢ及び半翅目種、ＮＢＳＢに対して活性を示した。
【０２９７】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１２１２は鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢに対して活性を示した。
【０２９８】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１３０１は、鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目害虫種、ＮＣＲ及びＷＣＲ、及び半翅目害虫種、ＮＢＳＢ及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０２９９】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ１１３０２は、鱗翅目害虫種、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＶＢＣ、鞘翅目害虫種、ＷＣＲ、ならびに半翅目害虫種、ＮＢＳ及びＷＴＰに対して活性を示した。
【０３００】
実施例３
ＰｉｒＡ、ＰｉｒＢの混合物、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の混合物は昆虫バイオアッセイにて鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目に対する活性を示す。
この実施例は、種々の濃度にてＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６０をＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６及びＴＩＣ７６６１と混合することによって、と同様にＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１６とＴＩＣ９３１７；ＴＩＣ９３１６とＴＩＣ１１３０１；及びＴＩＣ９３１７とＴＩＣ１１３０２とを混合することによって示される阻害活性を説明する。
【０３０１】
種々の濃度でのＰｉｒＡタンパク質とＰｉｒＢタンパク質の混合物、及びＰｉｒＡＢ融合タンパク質の混合物を昆虫餌で提示し、鱗翅目害虫種、ＢＣＷ、ＳＷＣ、及びＶＢＣ、鞘翅目害虫種、ＷＣＲ及びＮＣＲ、ならびに半翅目害虫種、ＮＢＳＢに対する活性についてアッセイした。混合物は様々な濃度の毒素タンパク質を含んでいた。以下の表１６は各混合物で活性が観察された昆虫種を示している。
2022501035.tif 000024
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【０３０２】
表１６に見られるように、ＰｉｒＡタンパク質ＴＩＣ７５７５及びＴＩＣ７６６０とＰｉｒＢタンパク質ＴＩＣ７５７６及びＴＩＣ７６６１の混合物は、対応する融合タンパク質ＴＩＣ９３１６及びＴＩＣ９３１７と同様の活性を提供した。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１６とＴＩＣ９３１７；ＴＩＣ９３１６とＴＩＣ１１３０１；ＴＩＣ９３１７とＴＩＣ１１３０２の混合物は、融合タンパク質の一方または双方と同様の活性を示した。
【０３０３】
実施例４
植物細胞での発現のためのＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２をコードする合成コード配列の設計
植物におけるＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２の発現に使用するために合成または人工のコード配列を構築した。これらの合成コード配列をバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、植物細胞を形質転換するのに使用した。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物のポリアデニル化配列のような特定の非現実的な問題配列を回避して、米国特許第５，５００，３６５号に一般的に記載されている方法に従って合成核酸配列を合成した。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、及びＴＩＣ１１３０２の合成コード配列を表１７に提示する。ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、及びＴＩＣ１０３８１ＰＬをコードするコード配列は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質コード配列内の対応するＰｉｒＡコード配列部分の開始メチオニン残基の直後に追加のアラニンコドンを含有していた。
2022501035.tif 000026
【０３０４】
ＴＩＣ１１１０３及びＴＩＣ１１１０４の合成コード配列及び対応するタンパク質配列を以下の表１８に提示する。
2022501035.tif 000027
【０３０５】
実施例５
植物細胞におけるＰｉｒＡＢ融合タンパク質の発現のための発現カセット
種々の植物発現カセットが表１７に記述されている配列で設計された。そのような発現カセットは植物プロトプラストにおける一過性発現または植物細胞の形質転換に有用である。典型的な発現カセットは植物細胞内のタンパク質の最終的な配置に関して設計される。色素体を標的とするタンパク質については、合成ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２殺虫性タンパク質コード配列が葉緑体を標的とするシグナルペプチドのコード配列とインフレームで操作可能に連結される。得られた植物形質転換ベクターは、リーダーに５’で操作可能に連結され、イントロンに５’で操作可能に連結され（または任意でイントロンなし）、色素体を標的とするまたは標的としないＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、及びＴＩＣ１１３０２タンパク質をコードする合成コード配列に５’で操作可能に連結され、次に３’ＵＴＲに５’で操作可能に連結される構成的プロモーターを含む殺虫性タンパク質の発現のための第１の導入遺伝子カセットと、グリホサートまたは抗生物質の選択を用いて形質転換された植物細胞を選択するための第２の導入遺伝子カセットとを含む。上記に記載されている要素はすべて、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーション非依存性クローニング部位のような発現カセットの構築のために提供される追加の配列と共に連続して配置されることが多い。
【０３０６】
実施例６
ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、及びＴＩＣ１０３８１を発現しているトランスジェニックトウモロコシ植物は、鱗翅目害虫種に対する活性を示す
この実施例は、トランスジェニックトウモロコシ植物で発現させ、鱗翅目害虫種に対してアッセイした場合の、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、及びＴＩＣ１０３８１の阻害活性を説明する。
【０３０７】
ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、またはＴＩＣ１０３８１を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングした。植物形質転換ベクターは、リーダーに５’で操作可能に連結され、イントロンに５’で操作可能に連結され、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、またはＴＩＣ１０３８１をコードする合成コード配列に５’で操作可能に連結され、３’ＵＴＲに５’で操作可能に連結される植物で発現可能なプロモーターを含むＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、またはＴＩＣ１０３８１殺虫性タンパク質を発現するための第１の導入遺伝子カセットと、グリホサートを用いて形質転換植物細胞を選択するための第２の導入遺伝子カセットとを含んでいた。得られたベクターを用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換法を用いてトウモロコシ植物を安定して形質転換した。形質転換された細胞は当該技術分野で既知の方法によって植物を形成するように誘導した。植物のリーフディスクを使用するバイオアッセイは、米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に実施した。形質転換されていないトウモロコシ植物を用いて、陰性対照として使用される組織を得た。各バイナリーベクターからの複数の形質転換事象を、鱗翅目害虫種、ＦＡＷ、ＣＥＷ、ＳＷＣＢ、ＥＣＢ、及びＢＣＷに対して評価した。
【０３０８】
ＴＩＣ９３１６を発現するいくつかの形質転換された事象はＳＷＣＢ及びＥＣＢに対して良好から中程度の阻害活性を示した。同様に、ＴＩＣ９３１７を発現する形質転換事象もＳＷＣＢ及びＥＣＢに対して良好から中程度の阻害活性を示した。ＴＩＣ９３１８を発現する形質転換事象はＳＷＣＢ及びＥＣＢに対して良好から優れた阻害活性を示した。ＴＩＣ１０３７６、ＴＩＣ１０３７８、ＴＩＣ１０３８０、及びＴＩＣ１０３８１を発現する形質転換事象はＳＷＣＢに対して良好から中程度の活性を示した。
【０３０９】
実施例７
安定して形質転換されたトウモロコシ植物で発現された場合の鞘翅目トウモロコシ根切り虫害虫に対するＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ
この実施例は、トウモロコシの根を常食とする様々な鞘翅目種に対するＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２の阻害活性を説明する。
【０３１０】
色素体を標的とする及び標的としないＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２の双方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、それらは表１７及び１８に示されるような配列を含む。得られたベクターを用い、当該技術分野で既知の方法を用いてトウモロコシ植物を安定して形質転換する。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択し、増殖させる。殺虫活性は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物の根を常食とする鞘翅目害虫、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＷＣＲに対してアッセイする。
【０３１１】
Ｒ０の安定して形質転換された植物を用いて、鞘翅目耐性ついてアッセイし、同様にＦ１子孫を生成する。各バイナリーベクターの形質転換から複数の単一コピー事象を選択する。バイナリーベクターの形質転換から生じる事象の一部をＲ０鞘翅目アッセイで使用する一方で、事象の別の部分を用いてさらなる試験のためにＦ１子孫を生成する。
【０３１２】
Ｒ０アッセイ植物を８インチのポットに移植する。植物に、ＷＣＲ、ＮＣＲ、またはＳＣＲの卵を接種する。卵は接種前に約１０日間インキュベートし、接種後４日で孵化が起こり、十分な数の幼虫が確実に生き残るようにし、トウモロコシの根を攻撃することができる。形質転換された植物はおよそＶ２〜Ｖ３のステージで接種される。植物は侵入後およそ２８日間生育させる。ポットから植物を取り出し、根を慎重に洗浄し、すべての土を取り除く。根への損傷は、表１９に提示するように１〜５の損傷評価尺度を用いて評価する。陰性対照とも比較を行ってアッセイが適正に実施されていることを保証する。各バイナリーベクターの形質転換のための複数のＲ０の事象を鞘翅目アッセイに使用する。低い根の損傷スコアは、調べた鞘翅目害虫に対する調べたＰｉｒＡＢ融合タンパク質によって付与された耐性を示す。
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【０３１３】
各バイナリーベクターの形質転換から生じるＲ０の安定して形質転換された事象の一部はＦ１子孫を作り出すために使用される。Ｒ０の安定して形質転換された植物は自家受精させて、Ｆ１子孫を作り出す。Ｆ１種子が植えられる。ヘテロ接合性植物は、当該技術分野で既知の分子的方法によって同定され、鞘翅目の害虫に対するアッセイ、と同様に毒素タンパク質のＥＬＩＳＡ発現測定に使用される。各事象に由来するヘテロ接合性のＦ１子孫の一部を昆虫アッセイに使用する一方で、別の部分は毒素タンパク質の発現を測定するのに使用する。
【０３１４】
ＷＣＲ、ＮＣＲ、またはＳＣＲからの卵は接種後４日以内に孵化できるように約１０日間インキュベートする。ＷＣＲについては、各ポットに約２，０００個の卵が接種される。ＮＣＲについては、この種の卵の入手可能性が低いため、使用する卵が少なくてもよい。植物はほぼＶ２〜Ｖ３のステージで接種される。植物は侵入後およそ２８日間生育させる。ポットから植物を取り出し、根を慎重に洗浄し、すべての土を取り除く。根への損傷は、表２０に提示するように０〜３の損傷評価尺度を用いて評価する。陰性対照と比較を行ってアッセイが適正に実施されていることを保証する。低い根の損傷スコアは、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２によって付与された鞘翅目の害虫に対する耐性を示す。
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【０３１５】
実施例８
安定して形質転換されたトウモロコシ、ダイズまたはワタ植物で発現された場合の鱗翅目害虫に対するＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ。
この実施例は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する安定して形質転換されたトウモロコシ、ダイズまたはワタ植物由来の組織を摂食した種々の鱗翅目害虫種に対する活性のアッセイを説明する。
【０３１６】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の色素体を標的とする型及び標的としない型の双方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、表１７及び１８に提示されるコード配列を含む。
【０３１７】
トウモロコシ、ダイズ、またはワタは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換法を用いて上記に記載されているバイナリー形質転換ベクターで形質転換される。形質転換された細胞は、当該技術分野で既知の方法によって植物を形成するように誘導される。植物のリーフディスクを使用するバイオアッセイは米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に実施される。形質転換されていないトウモロコシ、ダイズ、またはワタの植物を用いて陰性対照として使用する組織を得る。各バイナリーベクターからの複数の形質転換事象を、ＢＣＷ、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、ＴＢＷ、及びＶＢＣのような、しかし、これらに限定されない鱗翅目害虫に対して評価する。昆虫バイオアッセイにて発育阻害及び／または大量死を示すこれらの昆虫は、調べたＰｉｒＡＢ融合タンパク質の影響を受けやすいと判定されている。
【０３１８】
実施例９
安定的して形質転換されたキャノーラ植物で発現された場合のノミハムシ害虫に対するＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ
この実施例は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現するトランスジェニックキャノーラ植物全体またはトランスジェニックキャノーラ植物に由来する組織を常食とさせた場合のノミハムシの種々の種に対する活性のアッセイを説明する。
【０３１９】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の色素体を標的とする型及び標的としない型の双方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、表１７及び１８に提示されるコード配列を含む。
【０３２０】
得られたバイナリー形質転換ベクターを用い、当該技術分野で既知の方法を用いてキャノーラ植物細胞を安定して形質転換する。形質転換された細胞は植物を形成するように誘導される。植物のリーフディスクを使用するバイオアッセイは、野外で収集されたノミハムシを用いた米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に実行される。形質転換されていないキャノーラ植物を用いて陰性対照として使用する組織を得る。各バイナリーベクターからの複数の形質転換事象は、例えば、アブラナ科ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、縞模様ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ）、西洋クロノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｐｕｓｉｌｌａ等）のような、しかし、これらに限定されない鞘翅目のノミハムシ害虫に対して評価される。ノミハムシが摂食し続けるので、ノミハムシの大量死を毎日判定する。リーフディスクは１２日間にわたって２日〜３日ごとに交換し、ノミハムシが摂食のために新鮮な材料を利用できるようにし、試料中のタンパク質分解の影響を減らす。
【０３２１】
あるいは、形質転換されたキャノーラ植物は、ノミハムシの蔓延が存在する畑に植えることができる。土壌から出てきたノミハムシが実験区画から逃げるのを防ぐために、植物をテントに収容することができる。キャノーラの葉の損傷評価を利用して、どの植物がさらに少ない損傷を経験し、ノミハムシに対する耐性を示したかを判定することができる。
【０３２２】
実施例１０
安定して形質転換されたダイズ植物における半翅目害虫に対する  ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ
この実施例は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現するように安定して形質転換されたダイズ植物における半翅目害虫に対する活性のアッセイを説明する。
【０３２３】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つの色素体を標的とする型及び標的としない型の双方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、表１７及び１８に提示されるコード配列を含む。ダイズ植物は、バイナリー植物形質転換ベクターを用いて形質転換される。形質転換されたダイズ植物細胞は植物全体を形成するように誘導される。半翅目害虫に対する活性のアッセイは、半翅目害虫の種及びその害虫の好ましい標的組織に依存する種々の技術を用いて実施される。例えば、カメムシの半翅目害虫種は通常、ダイズ植物の発育中の種子や鞘を常食とする。カメムシに対する活性をアッセイするために、Ｒ５ステージの鞘をＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現するトランスジェニックダイズ植物から収穫し、寒天または湿った紙の層を含有するカバー付きペトリ皿または大型マルチウェルプレートに入れて摂食環境に湿度を提供する。２齢のカメムシの幼虫をペトリ皿または大型マルチウェルプレートに入れる。乾燥を防ぎながら酸素交換を提供するカバーを摂食環境の上に置く。カメムシの幼虫は数日間摂食できるようにする。発育阻害及び大量死の測定を行い、形質転換されていないダイズ植物由来の鞘を常食としているカメムシの幼虫と比較する。
【０３２４】
あるいは、活性のアッセイは、安定して形質転換された植物全体で実施することもできる。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する形質転換植物は栽培箱または温室で生育させる。Ｒ５ステージでは、植物は通気性のあるプラスチック製の「受粉」シート（Ｖｉｌｕｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）から作られたケージに封入する。シートスリーブは、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）タイを用いて土壌表面のすぐ上の主幹に固定する。各植物には特定の数の２齢のカメムシの幼虫が付く。幼虫はケージ側の小さなスリットから個々のケージに放され、昆虫が逃げないようにケージをしっかりと閉じる。幼虫は数日から１週間以上ダイズの鞘を摂食できるようにする。毎日観察を利用して発育阻害と大量死の測定値を決定する。摂食期間の終了時に、生きている幼虫と死んだ幼虫を回収する。植物をケージの下で切り取り、実験室に移し、そこで各植物の昆虫を回収する。ケージを開ける前に、植物を激しく振って、確実にすべての昆虫が摂食部位からケージの底に落ちるようにする。次に、ケージの底を開け、すべての植物材料を取り出し、黒いシート上に置く。昆虫は、吸引器または他の手段を用いて回収することができる。昆虫の数とその発育段階を各植物について記録する。また、死んだ幼虫の数と発達段階も記録する。これらの測定値を、陰性対照の形質転換されていない植物から得られた測定値と比較する。
【０３２５】
カメムシの幼虫の発育の遅れ（発育阻害）または大量死は、形質転換されていない対照と比較した場合に有意差があれば、毒性の指標として解釈される。
【０３２６】
実施例１１
安定して形質転換されたトウモロコシ植物における半翅目害虫に対するＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ
この実施例は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現するように安定して形質転換されたトウモロコシ植物における半翅目害虫に対する活性のアッセイを説明する。
【０３２７】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つの色素体を標的とする型及び標的としない型の双方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、表１７及び１８に提示されるコード配列を含む。トウモロコシ植物はバイナリー植物形質転換ベクターを用いて形質転換される。形質転換されたトウモロコシ植物細胞は植物全体を形成するように誘導される。半翅目害虫に対する活性のアッセイは、半翅目害虫の種及びその害虫の好ましい標的組織に依存する種々の技術を用いて実施される。例えば、カメムシの半翅目害虫種は通常、春の終わりまたは初夏に若いトウモロコシ植物を常食とし、その結果、葉に穴を開け、ひどい場合は植物を変形させる。夏の終わりに、カメムシは通常、穂自体を常食とし、穀粒を直接破壊する。
【０３２８】
カメムシに対する活性をアッセイする１つの方法は、大型マルチウェルプレートにてＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する安定して形質転換されたトウモロコシ植物に由来するリーフディスクにカメムシの幼虫を曝露することである。２齢期のカメムシの幼虫を、安定して形質転換されたトウモロコシ植物に由来するリーフディスクと共に大型マルチウェルプレートに入れ、数日間摂食させる。発育阻害と大量死の測定を行い、形質転換されていないトウモロコシのリーフディスクを摂食したカメムシの幼虫と比較する。
【０３２９】
あるいは、形質転換された植物全体を用いてカメムシに対する活性をアッセイすることができる。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する安定して形質転換されたトウモロコシ植物は、実施例４のダイズ植物について記載されたのと同様の方法でケージに封入する。２齢の幼虫をＶ３ステージのトウモロコシ植物に導入し、数日〜１週間摂食させる。所定の摂食期間の後、生きている幼虫及び死んだ幼虫を回収する。発育阻害と大量死の測定値を形質転換されていない対照植物と比較する。
【０３３０】
安定して形質転換されたトウモロコシの穂を用いてカメムシに対する活性をアッセイするために、Ｖ３ステージの植物で分析するのと同様のアプローチを利用することができる。ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する安定して形質転換されたトウモロコシ植物の発育中のトウモロコシの穂は、カメムシの幼虫の逃亡を防ぎながら空気の自由な交換を可能にする材料のシートを用いて被包する。被包した穂には、２齢期のカメムシの幼虫がはびこり、数日〜１週間、発達中の穂の穀粒を常食にさせる。発育阻害と大量死の測定値を形質転換されていない対照植物の穂と比較する。
【０３３１】
実施例１２
安定的して形質転換されたワタ植物における半翅目害虫に対するＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性のアッセイ
この実施例は、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現するように安定して形質転換されたワタ植物における半翅目害虫に対する活性のアッセイを説明する。
【０３３２】
ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つの色素体を標的とする型及び標的としない型の双方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターは、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングし、表１７及び１８に提示されるコード配列を含む。ワタ植物はバイナリー植物形質転換ベクターを用いて形質転換される。形質転換されたワタ植物細胞は植物全体を形成するように誘導される。半翅目害虫に対する活性のアッセイは、半翅目害虫の種及びその害虫の好ましい標的組織に依存する種々の技術を用いて実施される。例えば、カメムシの半翅目害虫種は通常、種子を食べる虫なので、ワタの朔果への損傷が主な懸念事項である。それらは主に朔果に穴を開けて種子を食べることによってワタを損傷する。それらの摂食活動は、摂食が起こった大きな朔果の外側に直径約１／１６インチの暗斑を生じることができる。種子の摂食は摂食部位の近くで綿毛の生成を減らし、綿毛を汚す可能性がある。そのサイズのために、成虫と４齢及び５齢の幼虫とは朔果に損傷を与える可能性が最も高く、したがって、幼虫の初期段階で昆虫を殺傷することが重要である。Ｌｙｇｕｓ属の半翅目害虫種は、主にスクエアと若い朔果を常食とする。幼虫はより貪欲な食べる虫であり、最も深刻な被害を引き起こす傾向がある。スクエアを常食にするとき、Ｌｙｇｕｓは発達中の葯を標的にし、その結果、スクエアが縮んで植物から落下することが多い。朔果に発展するそれらのスクエアについては、朔果は花粉、未受精の種子、及び空の小室を形成することができない葯を有してもよい。朔果を常食とするとき、Ｌｙｇｕｓは発育中の種子を標的にし、朔果の外側に小さな黒いくぼんだ斑点を生じる。
【０３３３】
安定して形質転換されたワタ植物におけるＰｉｒＡＢ融合タンパク質の活性をアッセイする１つの方法は、昆虫バイオアッセイでスクエアを使用することである。スクエアは、ＴＩＣ６８８０ＰＬ、ＴＩＣ９３１６、ＴＩＣ９３１７、ＴＩＣ９３１８、ＴＩＣ９３１９、ＴＩＣ９３２０、ＴＩＣ９３２２、ＴＩＣ１０３７６ＰＬ、ＴＩＣ１０３７８ＰＬ、ＴＩＣ１０３８０ＰＬ、ＴＩＣ１０３８１ＰＬ、ＴＩＣ１１１０３、ＴＩＣ１１１０４、またはＴＩＣ１１３０２を発現している形質転換ワタ植物から回収される。スクエアをペトリ皿に入れることができ、または各スクエアを大型ウェルプレートのウェルに入れることができる。若い新生子のＬｙｇｕｓまたはカメムシの幼虫をペトリ皿または大型ウェルプレートに入れ、所定の時間摂食させる。発育阻害と大量死の測定を、摂食の時間経過にわたって行い、形質転換されていないワタ植物に由来するスクエアがアッセイに使用される対照と比較する。
【０３３４】
あるいは、活性のアッセイは形質転換されたワタ植物全体で実施することができる。例えば、Ｌｙｇｕｓ種に対してアッセイするために、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する植物に由来するＲ１種子を１０インチのポットに播種する。形質転換されていないワタ植物、好ましくは形質転換された植物と同じ品種からのものが陰性対照として使用される。植物は、摂氏３２度で１６時間の明期と摂氏２３度で８時間の暗期の光周期、及び８００〜９００マイクロアインシュタインの間の光強度での環境室内で維持される。植え付け後４０日から４５日で、個々の植物を通気性のあるプラスチックの「受粉」シート（Ｖｉｌｕｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）で作られたケージに封入する。シートスリーブはＶｅｌｃｒｏ（登録商標）タイを用いて土壌表面のすぐ上の主幹に固定される。実験室飼育からの性的に成熟したオスとメスのＬｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓまたはＬｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓの成虫（６日齢）の２つのペアを、１４ミリリットルの丸底プラスチック試験管（Ｂａｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に回収し、各植物に使用する。成虫はケージ側の小さなスリットから個々のケージに放され、昆虫が逃げないようにケージをしっかりと閉じる。昆虫を交尾させ、植物を２１日間ケージで保持する。
【０３３５】
２１日後、植物をケージの下で切り取り、実験室に移し、そこで各植物の昆虫を回収し、数える。ケージを開ける前に、植物を激しく振って、確実にすべての昆虫が摂食部位からケージの底に落ちるようにする。次に、ケージの底を開け、すべての植物材料を取り出し、黒いシート上に置く。吸引器を用いて昆虫を回収する。その後、植物を十分に検査して、残っている昆虫を回収する。回収した昆虫の数とその発育段階を各植物について記録する。Ｌｙｇｕｓの成熟度：３齢、４齢、５齢までの幼虫及び成虫に基づいて昆虫の総数をいくつかの群に分ける。
【０３３６】
カメムシ種に対してアッセイするために、ＰｉｒＡＢ融合タンパク質の１つを発現する植物に由来するＲ１種子を上記に記載されているようにポットに播種し、増殖させてケージに入れる。形質転換されていないワタ植物も陰性対照として使用される。２齢のカメムシの幼虫を用いて植物に侵入させ、数日または数週間、スクエア及び朔果を摂食させる。ケージに入れられた植物を上記に記載されているように回収し、回収されたカメムシを、記録された幼虫の成熟度と同様に、大量死についても調べ、スコア化する。次いで、これらのスコアを陰性対照植物と比較する。
【０３３７】
実施例１３
安定して形質転換されたトウモロコシ植物で発現した場合ＴＩＣ９３１８及びＴＩＣ１１３０２は西洋トウモロコシ根切り虫害虫に対する活性を実証する
この実施例は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物における西洋トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）に対するＴＩＣ９３１８及びＴＩＣ１１３０２の阻害活性を説明する。
【０３３８】
トウモロコシ植物は、ＴＩＣ９３１８またはＴＩＣ１１３０２のいずれかの発現のための発現カセットを含むバイナリー植物形質転換構築物で形質転換された。バイナリー植物形質転換ベクターは、ＴＩＣ９３１８及びＴＩＣ１１３０２を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含み、当該技術分野で既知の方法を用いてクローニングされた。植物形質転換ベクターは  、リーダーに５’で操作可能に連結され、イントロンに５’で操作可能に連結され、ＴＩＣ９３１８またはＴＩＣ１１３０２をコードする合成コード配列に５’で操作可能に連結され、３’ＵＴＲに５’で操作可能に連結される植物で発現可能なプロモーターを含む、ＴＩＣ９３１８またはＴＩＣ１１３０２殺虫性タンパク質の発現のための第１の導入遺伝子カセットと、グリホサートを用いて形質転換植物細胞を選択するための第２の導入遺伝子カセットとを含んだ。得られたベクターを用い、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換法を用いてトウモロコシ植物を安定して形質転換した。形質転換された細胞は、当該技術分野で知られている方法によって植物を形成するように誘導された。
【０３３９】
Ｒ０の安定して形質転換された植物を用いてＷＣＲ耐性についてＴＩＣ１１３０２をアッセイし、同様にＦ１の子孫を生成した。各バイナリーベクターの形質転換から複数の単一コピー事象を選択した。各バイナリーベクター形質転換から生じる事象の一部はＲ０のＷＣＲアッセイに使用した。
【０３４０】
Ｒ０のアッセイ植物を８インチのポットに移植した。植物にＷＣＲ由来のそれぞれ約２，０００個の卵が接種した。十分な数の幼虫が確実に生き残るように接種前に卵を約１０日間インキュベートして、接種後４日で孵化させ、トウモロコシの根を攻撃することができた。各ポットに約２，０００個のＷＣＲの卵を接種した。形質転換された植物にほぼＶ２〜Ｖ３のステージで接種した。植物は侵入後約２８日間生育させた。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して、すべての土を取り除いた。根への損傷は実施例１７の表１９に提示するように、１〜５の損傷評価尺度を用いて評価した。アッセイが適切に行われたことを保証するために、陰性対照との比較も行った。各ＴＩＣ１１３０２バイナリーベクター形質転換のための複数のＲ０事象をＷＣＲアッセイで使用した。
【０３４１】
ＴＩＣ９３１８とＴＩＣ１１３０２の各バイナリーベクター形質転換から生じるＲ０の安定して形質転換された事象の一部を用いてＦ１子孫を生成した。Ｒ０の安定して形質転換された植物を自家受精させてＦ１子孫を生成した。Ｆ１種子を８インチのポットに播種した。ヘテロ接合性植物は、当該技術分野で既知の分子的方法を介して同定し、ＷＣＲに対するアッセイに使用した。ＷＣＲ卵の接種は、上記に記載されているようにＲ０の安定して形質転換された事象について記載された通りであった。根への損傷は、実施例７の表２０に提示されるように０〜３の損傷評価尺度を用いて評価した。アッセイが適切に行われたことを保証するために陰性対照と比較を行った。各構築物の平均根損傷評価（ＲＤＲ）を以下の表２１に提示するが、その際、「ＮＴ」は調べられていないことを示す。
2022501035.tif 000030
【０３４２】
上記の表２１に見られるように、ＴＩＣ９３１８とＴＩＣ１１３０２は双方とも、陰性対照と比較した場合に西洋トウモロコシ根切り虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）に対する耐性を示した。
【０３４３】
本明細書で開示され、請求されている組成物のすべては、本開示の観点で過度の実験を行うことなく行い、実行することができる。本発明の組成物は前述の説明に役立つ実施形態という点で記載されてきたが、本発明の真の概念、精神、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物に対して変形、変化、改変及び変更が適用されてもよいことが当業者には明らかであろう。さらに具体的には、同一または類似の結果が達成される一方で、化学的及び生理学的の双方に関連する特定の作用物質が、本明細書に記載されている作用物質に置換されてもよいことが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換及び改変はすべて、添付のクレームによって定義される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【０３４４】
刊行物及び公開された特許はすべて、各個々の刊行物または特許出願が、参照によって具体的かつ個々に組み込まれることが指示されたかのようにと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2022501035000001.app
【国際調査報告】
2022501035.tif 000031
2022501035.tif 000032
2022501035.tif 000033