(57)【要約】  本発明は、移植可能なコラーゲン含有医療機器を製造する方法であって、前記方法はコラーゲン含有医療機器を金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆する工程を含み、コラーゲン含有医療機器を被覆する前記工程は超音波処理工程であり、前記コラーゲン含有医療機器は、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療機器と比較して、移植時に抗菌及び抗炎症活性を示す方法に関する。
2022500146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能なコラーゲン含有医療機器を製造する方法であって、前記方法はコラーゲン含有医療機器を金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆する工程を含み、コラーゲン含有医療機器を被覆する前記工程は超音波処理工程であり、前記コラーゲン含有医療機器は、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療機器と比較して、移植時に抗菌及び抗炎症活性を示す、方法。
【請求項２】
前記金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子は、銀及び銅又はその組合せからなる群から選択される金属を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲン含有医療機器はコラーゲン含有膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲン含有医療機器は宿主生物の内部に送達されるか、in vitroで使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主生物はヒト又は動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被覆は前記機器の少なくとも一部を覆う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被覆は、天然ポリマー、合成ポリマー、金属、金属酸化物、酸化物、金属窒化物、ホウ酸塩、セラミック、ジルコニア、同種移植用硬組織、同種移植用軟組織、異種移植用硬組織、異種移植用軟組織、カーボンナノ構造、炭素、ガラス、天然材料、生体適合材料をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子のサイズは、約０．５ｎｍ〜約５００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被覆は、感染の処置、感染の防止、炎症の処置、炎症の防止、細胞接着の促進、バイオフィルム形成の防止、バイオフィルム形成の阻害、細胞増殖の促進、生体系若しくは非生体系との結合の促進、細胞機能の増加若しくは減少、薬物及び／若しくは生物活性剤の送達、又は、材料の宿主組織とのより良い一体化の確保、の少なくとも１つを実現することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記被覆は金属マイクロ粒子及び金属ナノ粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記被覆は金属ナノ粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記被覆は金属ナノ粒子及び／又は金属マイクロ粒子の１つ以上の層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の層は銀のナノ粒子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記医療機器は、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、獣医学用補綴材料、足場又は組織工学のマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記整形外科用インプラントは、股関節インプラント、膝関節インプラント又は肩関節インプラントである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記歯科用インプラントは、アバットメントである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
インプラントにおけるバイオフィルム形成を阻害する方法であって、前記方法は、バイオフィルムの形成及び／又は細菌の増殖を防ぐために、銀のナノ粒子で被覆されたコラーゲン含有膜で前記インプラントを覆う工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記バイオフィルムは、細菌、真菌又は原生動物のバイオフィルムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インプラントは、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、足場又は組織工学のマトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
医療機器又はインプラントにおける微生物のコロニー形成を阻害する方法であって、前記方法は、微生物のコロニー形成を防ぐために、銀のナノ粒子で被覆されたコラーゲン含有膜で前記機器又はインプラントを覆うことを含む、方法。
【請求項２１】
銀のナノ粒子で被覆されたコラーゲン含有医療機器を含む包装物であって、前記銀のナノ粒子は超音波処理によって適用されており、前記機器は気密容器又は真空パックされた容器に密封されている、包装物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌及び抗炎症活性を有する金属ナノ粒子被覆コラーゲン材料に関する。本発明は製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、何百万ものインプラントがヒトや動物を含む生物の内部に配置されている。これらのインプラントのほとんどは、組織置換、機械的サポート、組織の生成、化粧の強化、四肢の完全又は部分的な交換、関節置換、歯の置換、脊椎の再建、除細動／ペースメーカー並びに電極及びワイヤーを含むがこれらには限定されない複雑な役割を果たす。
【０００３】
ほとんどのインプラントは、金属、金属酸化物、高分子材料又は動物若しくはヒトから得られた組織成分で作られている。インプラントは人体で複雑な機能を果たす必要があり、宿主組織との結合は重要であることから、多くの用途において、インプラントの生体適合性が制約をもたらす。例えば、歯科用インプラントは顎の骨に強力に密着する必要がある。インプラント表面におけるバイオフィルム形成は、これが感染やインプラントの失敗につながるため、その防止又は低減も重要である。さらに、股関節又は膝関節置換術に使用するインプラントは、骨と密接かつ強力に一体化する必要がある。これらの要件を満たすために、インプラントは、チタン、高分子材料又はセラミック材料などの生体適合材料で組み立てられている。それでも、そのような材料の比較的多くが、毎年、患者によって拒絶されており、ほとんどの場合、その理由は、インプラント表面と骨／組織との一体化の不十分さ、及び、インプラント表面での細胞の成長と密着に関連している。さらに、多くのインプラントは、インプラント表面でのバイオフィルムの増殖によって引き起こされる感染症のために生体から取り除かれる。
【０００４】
歯科用インプラントは、無歯顎患者の抜け歯を処置するための効果的で一般的な治療法である（Pye et al., Journal of Hospital infection, 2009, 72(2): p. 104-110）。歯科用インプラントの成功は、インプラントと歯槽骨の間のしっかりとした固定と一体化に依存しているため、歯槽骨の適切な骨量を維持することが重要である（Semb, Alveolar bone grafting in Cleft Lip and Palate. 2012, Karger Publishers. p. 124-136；Simon et al., Journal of Periodontology, 2000. 71(11): p. 1774-1791）。しかし、抜歯及び外傷はしばしば歯槽堤の劣化につながる可能性があり、その後の感染と炎症はこの劣化をさらに加速させる可能性があるので（Allegrini et al. Alveolar ridge sockets preservation with bone grafting-review. in Annales Academiae Medicae Stetinensis. 2008; Cordaro et al., Clinical oral implants research, 2002. 13(1): p. 103-111）、歯のインプラントの前に、しばしば歯槽堤の再建が必要である（Jensen & Terheyden, International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 2009. 24; Roccuzzo et al., Clinical oral implants research, 2007. 18(3): p. 286-294）。その方法は、伝統的に代用骨を歯槽に充填し、骨の形成を開始する（Zitzmann et al., International Journal of Periodontics & Restorative Dentistry, 2001. 21(3)）。代用骨は十分に開発されているが、歯肉のような急速に成長する結合組織は移植穴の内部に浸潤し、新しい骨の形成を損なう可能性がある（Donos et al., Clinical Oral Implants Research, 2002. 13(2): p. 203-213；Donos et al., Clinical Oral Implants Research, 2002. 13(2): p. 185-191）。さらに、元の歯の微小環境は、しばしば、移植片の排除、さらには骨髄炎発症を高める可能性のある感染が生じやすい（Kesting et al. International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 2008. 23(1)；Shnaiderman-Shapiro et al., Head and neck pathology, 2015. 9(1): p. 140-146）。したがって、骨の再生を誘導し、歯科用インプラントにおいて軟組織の内部成長を防ぐ能力を有する抗菌性及び抗炎症性のバリアに対する高い需要がある。
【０００５】
生体適合性に優れた天然素材であるコラーゲンは、臨床で広く利用されている（Shen et al., Acta biomaterialia, 2008. 4(3): p. 477-489；Donzelli et al., Archives of oral biology, 2007. 52(1): p. 64-73；Lee et al., Journal of Orthopaedic Research, 2003. 21(2): p. 272-281）。コラーゲン生体材料は、組織の再生を促進及び調節することが示されている（Ma et al., Biomaterials, 2003. 24(26): p. 4833-4841；Ferreira et al., Acta biomaterialia, 2012. 8(9): p. 3191-3200；Prescott et al., Journal of endodontics, 2008. 34(4): p. 421-426）。具体的には、コラーゲンの足場は、骨において、骨再生誘導法（ＧＢＲ）に対する適性を示している（Behring et al., Odontology, 2008. 96(1): p. 1-11）。コラーゲンの優れたＧＢＲ特性にもかかわらず、コラーゲンインプラントの大半は局所的な抗菌及び抗炎症効果を有していない。
【０００６】
したがって、インプラント表面でのバイオフィルムの増殖によって引き起こされる感染症に対する耐性を有し、付着、細胞成長促進の優れた特性を有するインプラントを開発する継続的な必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書の実施の形態には、方法、デバイス、組成物、キット、材料、ツール、機器、試薬、製品、化合物、医薬品、アレイ、コンピュータプログラム及びコンピュータ実装方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００８】
ある側面では、移植可能なコラーゲン含有医療機器を製造する方法であって、前記方法はコラーゲン含有医療機器を金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆する工程を含み、コラーゲン含有医療機器を被覆する前記工程は超音波処理工程であり、前記コラーゲン含有医療機器は、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療機器と比較して、移植時に抗菌及び抗炎症活性を示す方法を提供する。
【０００９】
ある態様では、医療機器は、ヒト又は動物のような宿主生物の内部に送達することができるか、又はin vitroで使用することができる。前記医療機器は、プラスミド、遺伝子、核酸又はＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスを含んでいてもよい。
【００１０】
別の態様では、被覆は、前記機器の少なくとも一部を覆う。金属マイクロ及び／又はナノ粒子の被覆は、天然ポリマー、合成ポリマー、金属、金属酸化物、酸化物、金属窒化物、ホウ酸塩、セラミック、ジルコニア、同種移植用硬組織、同種移植用軟組織、異種移植用硬組織、異種移植用軟組織、カーボンナノ構造、炭素、ガラス、天然材料、生体適合材料をさらに含むことができる。前記被覆は、感染の処置；感染の防止；細胞接着の促進；バイオフィルム形成の防止；バイオフィルム形成の阻害；細胞増殖の促進；生体系若しくは非生体系との結合の促進；細胞機能の増加若しくは減少；薬物及び／若しくは生物活性剤の送達、又は、宿主組織への材料のより良い一体化の確保の少なくとも１つを実行することができる。
【００１１】
他の態様では、コーティングは、ナノ粒子及び／又はマイクロ粒子の１つ以上の層を含む。さらに別の態様では、前記１つ以上の層は、１種類のナノ粒子及び／若しくはマイクロ粒子、又は２種類以上のナノ粒子及び／若しくはマイクロ粒子の組合せを含む。さらに、１つ以上の層は銀のナノ粒子を含む。別の態様では、１つ以上の層は、金属、ナノ粒子、金属酸化物、カーボンナノチューブ、ポリマーナノ粒子、セラミック、リン酸カルシウム、コラーゲン及び／又はヒドロキシアパタイトナノ粒子の組合せを含む。他の態様では、前記被覆は生分解性及び／又は生体適合性であり、ナノ粒子は、各層が分解するにつれて前記ナノ粒子組成物から放出されてもよい。他の態様では、薬物、成長因子及び／又は生物活性剤は、少なくとも１つの層の内部及び／又は前記被覆の表面の層の上に含めることができる。他の態様では、前記ナノ粒子は、金、銀、金属、酸化物、カーボンナノ構造物（単層、二重、多層ナノチューブ、グラフェン、フラーレン、ナノファイバー）、ヒドロキシアパタイト、ジルコニア、天然若しくは合成ポリマー、セラミック又は金属酸化物を含む。
【００１２】
他の態様では、医療機器は、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、獣医学用補綴材料、組織工学のマトリックス、同種移植用硬組織又は同種移植用軟組織である。前記整形外科用インプラントは、股関節インプラント、膝関節インプラント、肩関節インプラント、プレート、ピン、スクリュー、ワイヤー又はロッドである。前記歯科用インプラントは、アバットメント、ヒーリングスクリュー又はカバースクリューである。前記獣医学用補綴材料は、インプラント、ピン、スクリュー、プレート又はロッドである。
【００１３】
他の態様では、被覆は、１つ以上のタンパク質、アミノ酸、酵素、核酸、生物活性剤、成長因子、薬物、抗生物質、核酸、ホルモン、抗体又はバイオフィルム形成を阻害し層が分解するにつれて放出される可能性のある薬剤を含有する１つ以上の層を含む。さらなる態様では、前記成長因子は、機器の表面に隣接した部位又は機器の表面において骨形成を促進することができる骨形成タンパク質である。別の態様では、前記生物活性剤は、医療機器の表面被覆の中又は上にあり、少なくとも１つ以上の骨形成、タンパク質合成、遺伝子、発現、細胞増殖、有糸分裂、ＤＮＡ転写、ホルモン産生、酵素産生、細胞死、遺伝子送達又は薬物送達において、隣接する組織又は細胞に影響を及ぼす。さらに別の態様では、前記生物活性剤は、前記ナノ粒子に結合していてもよく、前記結合は、共有結合、イオン結合、水素結合、ジスルフィド結合又は極性の共有結合であってもよい。
【００１４】
別の側面では、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療用インプラントと比較して、移植時の医療用インプラントが抗菌及び抗炎症活性を示すように、超音波処理によって前記医療用インプラントを金属マイクロ粒子及び／又はナノ粒子で被覆する工程を含む、コラーゲン含有医療用インプラント上でのバイオフィルム形成を阻害する方法を提供する。
【００１５】
医療用インプラント上でのバイオフィルム形成を阻害する方法において使用するための、超音波処理によって金属マイクロ粒子及び／又はナノ粒子で被覆されたコラーゲン含有医療用インプラントであって、移植時の医療用インプラントが、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療用インプラントと比較して、抗菌活性及び抗炎症活性を有しているインプラントも提供する。
【００１６】
ある態様では、バイオフィルムは、細菌、真菌又は原生動物のバイオフィルムである。別の態様では、医療用インプラントは、整形外科用若しくは歯科用インプラント、移植物、骨材料、足場、同種移植用硬組織、同種移植用軟組織又は組織工学のマトリックスである。
【００１７】
別の側面では、微生物のコロニー形成を防ぐ超音波処理によって、コラーゲン含有医療機器又はインプラントを金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒で被覆することを含む、前記機器又はインプラントにおける微生物のコロニー形成を阻害する方法を提供する。
【００１８】
医療機器又はインプラント上での微生物のコロニー形成を阻害する方法において使用するための、超音波処理によって金属マイクロ粒子及び／又はナノ粒子で被覆されたコラーゲン含有医療機器又はインプラントであって、前記金属マイクロ粒子及び／又はナノ粒子が微生物のコロニー形成を防ぐ医療機器又はインプラントも提供する。
【００１９】
ある態様では、コラーゲン含有機器又はインプラントは、歯科用インプラント、整形外科用インプラント、獣医学用インプラント、足場又は組織工学のマトリックスである。
【００２０】
別の側面では、銀のナノ粒子を含むコラーゲン含有インプラントがあり、前記銀ナノ粒子は、前記インプラントの少なくとも１つの表面を被覆する。ある態様では、前記インプラントは歯科用インプラント又は歯科用インプラントのアバットメントである。
【００２１】
別の側面では、コラーゲン含有金属ナノ粒子被覆医療機器をエチレンオキシド又はガンマ線に暴露することを含む、前記医療機器を滅菌する方法を提供する。
【００２２】
別の側面では、コラーゲン含有金属ナノ粒子被覆医療機器を含む包装物であって、前記機器が気密容器又は真空パックされた容器に密封されている包装物を提供する。ある態様では、前記医療機器は、歯科用インプラント、歯科用インプラントのアバットメント又は他の医療機器である。
【００２３】
別の側面では、(a) コラーゲン含有膜の表面に金属ナノ粒子を堆積させて表面コーティングを作成すること；及び (b) 前記表面で骨芽細胞を培養することを含む、骨細胞の成長を促進するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１はＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の特徴を示す。Ａは被覆膜及び非被覆膜の両面の光学顕微鏡画像である。
【図１−２】Ｂは異なる濃度のＡｇＮＰ溶液で超音波処理したＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜及びスパッタリングで被覆したＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。ＳＥＭ画像（×１２０Ｋ）は、非被覆及びＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜を示した。
【図１−３】Ｃは被覆したコラーゲン膜におけるＡｇＮＰ量（ｍｇ）を示す。
【図２−１】図２は黄色ブドウ球菌及び緑膿菌に対するＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の抗菌効果を示す。Ａ及びＣは、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌に対するＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の抗菌効果を示す。Ｂ及びＤは、膜の面積に対する抗菌面積の比率に基づく定量結果を示す（ｎ＝３；平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。
【図２−２】同上。
【図３−１】図３はin vitroにおける細胞毒性の評価及びＡｇＮＰ放出試験を示す。Ａは、超音波処理及びスパッタリングによるＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜並びに非被覆コラーゲン膜上で培養したＣ３Ｈ１０細胞の３日間のＭＴＳ試験を示す。Ｂは、ＡｇＮＰ被覆膜上のＣ３Ｈ１０細胞のＬＤＨ漏出アッセイの結果を示す。
【図３−２】Ｃは、被覆膜の重量に対する割合としてＡＡＳで求めた水相に放出されたＡｇＮＰ量を示す。Ｄは、被覆されていないコラーゲン膜上で培養されたＣ３Ｈ１０細胞の放出ＡｇＮＰについてのＭＴＳ試験の結果を示す。  ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜上の細胞の成長と増殖はＣＬＳＭ（Ｆ-アクチンで示される細胞骨格、緑色蛍光で示されるＡｇＮＰ被覆又は非被覆膜、及びＤＡＰＩで示される細胞核）で可視化した。
【図４】図４はＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の抗炎症効果を示す。Ａ及びＢはＬＰＳ刺激後のＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ-６及びＴＮＦα遺伝子の発現、Ｃ及びＤはＬＰＳ刺激後のＲＡＷ２６４．７のＩＬ-６及びＴＮＦαの分泌を示す（ｎ＝３；平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５）。
【図５】図５はＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜上での細胞の分化を示す。３日、６日及び９日間培養後のＣ３Ｈ１０細胞の骨形成マーカー発現（ＲＵＮＸ２、ＡＬＰ及びＯＰＮ）、ＡｇＮＰ被覆群において３日目及び６日目に発現が有意に増加したことを示す（ｎ＝３；平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書が提供する方法、材料及び機器は、コラーゲン含有インプラントの表面に適用することができるナノ粒子（ＮＰ）又はマイクロ粒子の金属被覆に関する。以下に説明するように、より具体的には、表面被覆は医療用又は歯科用インプラントなどのコラーゲン含有インプラントに適用することができ、前記被覆は生体適合性で場合によっては生分解性であり、インプラント表面に隣接する細胞及び／又はインプラント表面の細胞の表面への密着及び増殖を促進する。表面被覆は、インプラント表面での細胞増殖及び骨石灰化の増加につながる可能性のある薬物及び／又は生物活性剤を送達することもできる。表面被覆は、バイオフィルムの増殖を減少及び防止することができ、炎症の治療及び／又は予防を促進することもできる。
【００２６】
本明細書におけるすべての専門用語は、細胞生物学、生化学、分子生物学及びナノテクノロジーの分野で一般的に使用される用語であり、本発明が属する技術分野の当業者はこれを理解することができる。これらの専門用語は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al., Cold Spring Harbor)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos eds.)及びCurrent Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. eds., Wiley & Sons)の最新版で理解することができる。細胞生物学、タンパク質化学及び抗体技術は、Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons)；Current Protocols in Cell Biology (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons)及びCurrent Protocols in Immunology (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons.)で理解することができる。試薬、クローニングベクター及びキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech及びSigma-Aldrich Co.などから入手できる。
【００２７】
細胞培養法は、一般に、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (R. I. Freshney ed., Wiley & Sons)；General Techniques of Cell Culture (M. A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press)及びEmbryonic Stem Cells: Methods and Protocols (K. Turksen ed., Humana Press)の最新版に記載されている。他の図書には、Creating a High Performance Culture (Aroselli, Hu. Res. Dev. Pr. 1996)及びLimits to Growth (D. H. Meadows et al., Universe Publ. 1974)がある。組織培養用品及び試薬は、Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.及びICN Biomedicalsなどから入手できる。
【００２８】
本明細書は、技術文献を参考に当業者へのガイダンスを提供するが、単なる参照は、この技術文献が先行技術であることを認めるものではない。
【００２９】
本発明の広範な側面では、移植可能なコラーゲン含有医療機器を製造する方法であって、前記方法はコラーゲン含有医療機器を金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆する工程を含み、コラーゲン含有医療機器を被覆する前記工程は超音波処理工程であり、前記コラーゲン含有医療機器は、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆されていない医療機器と比較して、移植時に抗菌及び抗炎症活性を示す方法を提供する。
【００３０】
金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子の目的は、細菌感染を予防及び／若しくは治療すること、並びに／又は、炎症を予防及び／若しくは治療することである。したがって、以前に抗菌活性及び／又は抗炎症活性を有することが示された金属が本発明に含まれる。好ましくは、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子は、銀及び銅又はその組合せからなる群から選択される金属を含む。
【００３１】
本明細書において使用するコラーゲンという用語は、処理されたもの又は他の方法で修飾されたものを含むすべてのコラーゲンを指す。好ましいコラーゲンは、免疫原性のテロペプチド領域を除去するために処理され（「アテロペプチドコラーゲン」）、可溶性で、線維状に再構成される。
【００３２】
コラーゲン含有医療機器は、マトリックス、膜、マイクロビーズ、フリース、糸若しくはゲル、及び／又はその混合物を含むことができる。いくつかの態様では、コラーゲン含有医療機器は、Ｉ／ＩＩＩ型コラーゲンマトリックス（ACI Matrix（登録商標））、小腸粘膜下組織（Vitrogen（登録商標））又はコラーゲン膜（CelGro（登録商標））を含む。
【００３３】
コラーゲン含有膜という用語は、当該技術分野において公知の方法で製造され、例えば、米国特許第9,096,688号に開示されたコラーゲン含有組織の破片（piece）又はセグメントを指す。コラーゲン含有膜は幾何学的形状であってもよいが、通常、実質的に平面で、所定の位置で下表面又は上表面の形状に一致していてもよい。
【００３４】
コラーゲン含有膜は、好ましくは以下の性質を有する：
a) 組織との一体化及び血管新生を促進するような方法で相互に接続する細孔；
b) 最終的にコラーゲン含有膜が正常組織に置き換わるような生分解性及び／又は生体吸収性；
c) 細胞の付着、増殖及び分化を促進する表面の化学的性質；
d) 強度と柔軟性、並びに
e) 低い免疫原性。
【００３５】
コラーゲン含有膜は、通常、哺乳動物に見られる高密度の結合組織を含む「コラーゲン含有組織」から調製又は製造される。用語「コラーゲン含有組織」は、コラーゲンを含む哺乳類から単離することができる皮膚、筋肉等を意味する。用語「コラーゲン含有組織」は、コラーゲン又はコラーゲン含有材料が体外で組み立て又は製造された、「合成的に」生成された組織も含む。
【００３６】
いくつかの態様では、コラーゲン含有組織は、ヒツジ、ウシ、ブタ又はヒトを含むがこれらには限定されない哺乳動物から単離される。他の態様では、コラーゲン含有組織はヒトから単離される。
【００３７】
いくつかの態様では、コラーゲン含有組織は「自己」、すなわち、治療を必要とする患者の体から単離される。
【００３８】
いくつかの態様では、コラーゲン含有膜は８０％以上のＩ型コラーゲンを含む。他の態様では、コラーゲン含有膜は少なくとも８５％のＩ型コラーゲンを含む。さらに別の態様では、コラーゲン含有膜は９０％以上のＩ型コラーゲンを含む。
【００３９】
コラーゲン含有膜は、当該技術分野において公知の方法、ただし、１つの好ましい方法は、以下の(i)〜(iv) の工程を含む：
(i) コラーゲン含有組織を分離し、エタノール溶液中で組織をインキュベートする；
(ii) 含まれている非コラーゲン性タンパク質を変性させるために、無機塩及び陰イオン性界面活性剤を含む第１の溶液中で、工程(i)のコラーゲン含有組織をインキュベートする；
(iii) 無機酸を含む第２の溶液中で、工程(ii)で得たコラーゲン含有組織を前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートする；並びに
(iv) 無機酸を含む第３の溶液中で、工程(iii)で得たコラーゲン含有組織を、前記組織内のコラーゲン束が整列することを可能にするのに十分な時間、同時機械的刺激とともにインキュベートする、ここで、前記機械的刺激は、コラーゲン含有組織に周期的に張力を加えることを含む
によって製造してもよい。
【００４０】
第１の溶液として、ルイス酸と錯体を形成することができる無機塩を使用できることが理解される。いくつかの態様では、無機塩は、塩化トリメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、過塩素酸塩及びトリフルオロメタンスルホナートからなる群から選択される。他の態様では、無機塩は塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である。
【００４１】
第１の溶液として、任意の陰イオン性界面活性剤を使用することができるが、いくつかの態様では、前記陰イオン性界面活性剤は、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩及びアルキルアリールスルホン酸塩からなる群から選択される。特に有用な陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキル硫酸塩を含む。
【００４２】
いくつかの態様では、第１の溶液は、約１％（v/v）のＳＤＳと約０．２％（v/v）のＬｉＣｌを含む。
【００４３】
いくつかの態様では、第２の溶液中の無機酸は約０．５％（v/v）のＨＣｌを含み、第３の溶液中の無機酸は約１％（v/v）のＨＣｌを含む。
【００４４】
各工程におけるインキュベーションの時間は、(i) コラーゲン含有組織の種類；(ii) 無機塩／酸、及び／又は陰イオン性界面活性剤の種類；(iii) 使用する各無機塩／酸、及び／又は陰イオン性界面活性剤の強度（濃度）、並びに (iv) インキュベーションの温度、に応じて変化することが当業者に理解される。いくつかの態様では、工程(i)のインキュベーション時間は少なくとも８時間である。他の態様では、工程(ii)のインキュベーション時間は６０分未満であり、他の態様では、工程(iii)のインキュベーション時間は少なくとも２０時間である。
【００４５】
いくつかの態様では、工程(ii)のインキュベーションは約４℃で行う。他の態様では、工程(ii)のインキュベーションは少なくとも１２時間行う。
【００４６】
いくつかの態様では、第２の溶液は約０．５％（v/v）のＨＣｌを含む。
【００４７】
いくつかの態様では、工程(iii)のインキュベーションは約３０分間行う。他の態様では、工程(iii)のインキュベーションは振とうしながら行う。いくつかの態様では、第３の溶液は、約１％（v/v）のＨＣｌ溶液を含む。
【００４８】
いくつかの態様では、工程(iv)のインキュベーションは、約１２〜３６時間、好ましくは約２４時間行う。他の態様では、工程(iv)のインキュベーションは振とうしながら行う。
【００４９】
いくつかの態様では、この方法は、工程(iii)と工程(iv)の間に中和工程をさらに含み、ここでは、前記コラーゲン含有組織と約０．５％（v/v）ＮａＯＨのインキュベーションを含む。
【００５０】
いくつかの態様では、この方法は、工程(iv)のコラーゲン含有組織をアセトンと共にインキュベートし、次いでコラーゲン含有組織を乾燥させることを含む工程(v)をさらに含む。
【００５１】
いくつかの態様では, この方法は、脂肪及び／又は血管の除去を可視化及び促進するために、工程(ii)と(iii)の間、及び／又は工程(iii)と工程(iv)の間に、コラーゲン含有組織とグリセロールを接触させる工程をさらに含む。
【００５２】
グリセロールは、脂肪及び／又は血管の除去を容易にする時間、コラーゲン含有組織と接触させてもよい。いくつかの態様では、接触時間は少なくとも１０分である。
【００５３】
いくつかの態様では、この方法は、工程(ii)と(iii)の間、及び／又は工程(iii)と(iv)の間で、コラーゲン含有組織の洗浄工程をさらに含む。工程(ii)と(iii)の間に行う洗浄工程の目的は、変性タンパク質の除去である。したがって、変性タンパク質を除去することができる洗浄溶液を使用することができる。いくつかの態様では、工程(ii)と(iii)の間に使用する洗浄溶液はアセトンである。
【００５４】
アセトンによる洗浄後、コラーゲン含有組織を滅菌水でさらに洗浄する。
【００５５】
いくつかの態様では、コラーゲン含有組織は、ＮａＯＨ：ＮａＣｌ溶液でさらに洗浄する。コラーゲン含有組織をＮａＯＨ：ＮａＣｌで洗浄する場合、さらに滅菌水で洗浄することが好ましい。
【００５６】
いくつかの態様では、工程(iv)の後、コラーゲン含有組織を第１の溶液でさらに洗浄する。
【００５７】
本明細書に記載の方法で用いる用語「同時機械的刺激」は、コラーゲン含有組織の化学処理中にコラーゲン含有組織を引き延ばす工程を指す。前記コラーゲン含有組織は、静的及び／又は周期的な引き延ばしを受けてもよい。したがって、いくつかの態様では、同時機械的刺激は
(i) コラーゲン含有組織の所定の期間の引き延ばし；
(ii) コラーゲン含有組織の所定の期間の弛緩；並びに
(iii) 工程(i)及び(ii)のｎ回の繰り返し（ｎは１以上の整数）
を含んでいてもよい。
【００５８】
機械的刺激でコラーゲン含有組織を引き延ばす場合、コラーゲン含有組織は、好ましくはその長軸に沿って引き延ばす。
【００５９】
いくつかの態様では、同時機械的刺激は、コラーゲン含有組織に張力を周期的に加えることを含み、前記張力の周期性は、約１０秒〜約２０秒の引き延ばし時間及び約１０秒の弛緩時間を含み、それから生じるひずみは約１０％で、コラーゲン含有組織内のコラーゲン束が本明細書に記載されるように整列するまで、機械的刺激を続ける。
【００６０】
得られたコラーゲン含有組織は編目構造のコラーゲンの繊維又は束を含む。本明細書において、用語「編目構造」は、第１のグループの繊維又は束が主に第１の方向に伸び、第２のグループの繊維又は束が主に第２の方向に伸びる繊維又は束の第１及び第２のグループを含む構造を指し、第１及び第２の方向は互いに異なり、第１のグループの繊維又は束は、第２のグループの繊維又は束と交互に配置されるか、さもなければ織り込まれる。前記方向の相違は約９０°であってもよい。
【００６１】
好ましい方法によって作製されたコラーゲン含有組織は、２０Ｎを超える「最大引張荷重強度」を有する。いくつかの態様では、本発明のコラーゲン含有組織は、２５Ｎ、４０Ｎ、６０Ｎ、８０Ｎ、１００Ｎ、１２０Ｎ又は１４０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する。
【００６２】
さらに、コラーゲン含有組織の実施形態における編目構造は、コラーゲン含有パッチの係数を増加させながら、最大負荷時の伸びの減少を示すと考えられている。
【００６３】
本明細書において、用語「係数」はヤング率を意味し、応力とひずみの比として求められる。これは、コラーゲン含有組織及び／又はパッチの剛性の尺度である。
【００６４】
いくつかの態様では、コラーゲン含有組織の係数は１００ＭＰａを超える。他の態様では、コラーゲン含有組織の係数は２００ＭＰａ、３００ＭＰａ、４００ＭＰａ又は５００ＭＰａを超える。
【００６５】
本明細書において、用語「最大負荷時の伸び」は、無負荷状態でのコラーゲン含有組織の元の長さを基準とした最大引張荷重強度でのコラーゲン含有組織の伸長を意味する。これは、より大きくなる最大拡張とは対照的である。
【００６６】
いくつかの態様では、コラーゲン含有組織の最大負荷時の伸びは元の長さの８５％未満である。
【００６７】
コラーゲン含有組織を生成した後に、使用するコラーゲン含有膜を成形してもよい。いくつかの態様では、前記コラーゲン含有膜は膜の形状とされ、in situでの操作性がよくなる。
【００６８】
好ましくは、本発明のコラーゲン含有膜は細胞を支持するのに十分な厚さであるが、コラーゲン含有膜のin situでの操作性が損なわれるほど厚くない。したがって、いくつかの態様では、コラーゲン含有膜の厚さは２５μｍ〜２００μｍである。いくつかの態様では、コラーゲン含有膜の厚さは３０μｍ〜１８０μｍである。他の態様では、コラーゲン含有膜の厚さは３５μｍ〜１７０μｍである。さらに別の態様では、コラーゲン含有膜の厚さは４０μｍ〜１６０μｍである。さらに別の態様では、コラーゲン含有膜の厚さは４５μｍ〜１５０μｍである。さらに別の態様では、コラーゲン含有膜の厚さは５０μｍ〜１４０μｍである。さらに別の態様では、コラーゲン含有膜の厚さは５０μｍ〜１００μｍである。また、いくつかの態様では、コラーゲン含有膜の厚さは約５０μｍである。
【００６９】
コラーゲン含有膜は、コラーゲン含有医療機器として使用しても、医療機器に組み込んでもよい。例えば、コラーゲン含有膜を使用して、医療機器の表面の一部又は全部を覆うことができる。前記医療機器は、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、獣医学用補綴材料、足場又は組織工学のマトリックスである可能性がある。
【００７０】
コラーゲン含有医療機器は、超音波処理によって金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子で被覆する。超音波とは、２０ｋＨｚを超える音波を指す。本明細書に記載の方法は、２０ｋＨｚ、３０ｋＨｚ、４０ｋＨｚ、５０ｋＨｚ、６０ｋＨｚ、７０ｋＨｚ、８０ｋＨｚ、９０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ、１１０ｋＨｚ、１２０ｋＨｚ、１３０ｋＨｚ、１４０ｋＨｚ、１５０ｋＨｚ、１６０ｋＨｚ、１７０ｋＨｚ、１８０ｋＨｚ、１９０ｋＨｚ、２００ｋＨｚ、若しくはこれ以上、又はその組合せの範囲の超音波で処理してもよい。
【００７１】
ある態様では、コラーゲン含有医療機器は、水とエチレングリコール（１０：１ v/v）溶液中の、Ａｕ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｌ又はＺｎなどの無機金属と接触させる。反応混合物をＡｒでパージし、Ａｒ-Ｈ２混合物（９５：５）の流れの下、超音波浴（例えば、Sweep 200 H超音波浴（SweepZone（登録商標）Technology）、５０〜６０ｋＨｚで作動）中で高強度の超音波を照射する。
【００７２】
超音波処理の最初の数分間に、反応にアンモニア水溶液（ＮＨ４ＯＨ／ＡｇＮＯ３ モル比＝２：１）を加えてもよい。超音波処理中、温度は通常、室温付近から約３０℃に保つ。超音波処理に続いて、被覆されたコラーゲン含有医療機器を蒸留水で洗浄し、撹拌して残留金属溶液を除去する。その後、前記コラーゲン含有医療機器は室温で乾燥させることができる。
【００７３】
理論に拘束されることを望むものではないが、ナノ粒子は、少なくとも１つの方向の寸法が０．５ｎｍ〜１００ｎｍの粒子を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、マイクロ粒子は、少なくとも１つの方向の寸法が１００ｎｍ〜１０００ｎｍの粒子を指す。しかし、当業者によって理解されるように、これらのサイズ分布には重なりがあってもよい。したがって、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子のサイズは、約０．５ｎｍ、１ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ若しくはこれらの値の±１０％、又はこれらの組合せの範囲であってもよい。
【００７４】
ある態様では、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子のサイズは約０．５ｎｍ〜約５００ｎｍであってもよい。ある態様では、金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子のサイズは約７０ｎｍであってもよい。
【００７５】
マイクロ微粒子及び／又はナノ粒子のサイズは顕微鏡、例えば電子顕微鏡によって測定することができる。
【００７６】
いくつかの態様では、コラーゲン含有医療機器は、天然ポリマー、合成ポリマー、金属、金属酸化物、酸化物、金属窒化物、ホウ酸塩、セラミック、ジルコニア、同種移植用硬組織、同種移植用軟組織、異種移植用硬組織、異種移植用軟組織、カーボンナノ構造、炭素、ガラス、天然材料、生体適合材料によりさらに被覆されている。
【００７７】
金属マイクロ粒子及び／又は金属ナノ粒子の被覆は、感染の処置；感染の防止；炎症の処置；炎症の防止；細胞接着の促進；バイオフィルム形成の防止；バイオフィルム形成の阻害；細胞増殖の促進；生体系若しくは非生体系との結合の促進；細胞機能の増加又は減少；薬物及び／若しくは生物活性剤の送達、又は、宿主組織への材料のより良い一体化の確保、の少なくとも１つを実行することができる。
【００７８】
移植可能なコラーゲン含有医療機器は、当該技術分野において公知の適切な方法によって宿主生物に送達することができる。例えば、移植可能なコラーゲン含有医療機器は、直接外科的に配置するか又は局所に適用することによって送達することができるが、決してこれらに限定されるものではない。送達は、哺乳動物の任意の細胞型又は組織に対して行うことができる。
【００７９】
以下に方法の具体例を示す。それらは代表的なものあって、限定するものではない。
【実施例】
【００８０】
実施例１  銀被覆コラーゲン膜の調製
歯科用骨再生誘導法でＣＥマークが承認されているCelGro（登録商標）コラーゲン膜をOrthocell Ltd, Australiaから入手した。銀の７０ｎｍナノ粒子濃縮溶液はSuzhou ColdStones Technology Co., Ltd.（Jiangsu, China）から購入した。
【００８１】
超音波被覆
７０ｎｍ銀ナノ粒子を含有するＡｇＮＰ濃縮溶液（濃度２０ｍｇ／ｍＬ）を、０．６、０．８、１．０及び１．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。以下の試験に応じて、コラーゲン膜を１．０、１．５又は２．０ｃｍの正方形に切り取った。化学用のすべての試薬はSigma-Aldrich（Steinheim, Germany）から購入し、精製することなく使用した。
【００８２】
いくつかのパラメーターについて、銀のナノ粒子をコラーゲン膜に被覆するための最良の条件を得た：超音波の出力、溶液温度、反応時間及び試薬濃度。代表的な実験の結果は以下のとおりである。コラーゲン膜を、１００ｍＬ超音波処理用フラスコ内の０．０２Ｍ ＡｇＮＯ３溶液（溶媒：水とエチレングリコール（１０：１v/v））に加えた。次いで、反応混合物にＡｒを１時間パージして微量のＯ２／空気を除去し、Ａｒ-Ｈ２混合物（９５：５）の流れの下で、高強度の超音波を２時間照射した（Sweep 200 H超音波浴（SweepZone（登録商標）Technology）、５０〜６０ｋＨｚで作動）。
【００８３】
超音波処理の最初の１０分間に、２５wt％のアンモニア水溶液（ＮＨ４ＯＨ／ＡｇＮＯ３ モル比＝２：１）を反応スラリーに添加した。超音波処理中、３０℃に保った冷却浴に超音波処理用フラスコを入れた。超音波処理後、被覆した試料を蒸留水に浸し、手で２０秒間撹拌して、残った銀の溶液をすべて除去した。次に、試料を室温で２４時間風乾した。
【００８４】
スパッタリング被覆
スパッタリングによるＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、高周波マグネトロンスパッタリング（Hummer BC-20 DC/RF Sputter System, AnatechUSA）による直接堆積によって製造した。高純度の銀（９９．９９％、Ezzi Vision Pty Ltd, Australia）を銀のソースとして使用した。コラーゲン膜は、スパッタリング槽内の試料台に両面テープで固定して、スパッタリング中の安定性を確保した（Jiang et al., Surface and Coatings Technology, 2010. 204(21-22): p. 3662-3667；Song et al., Thin Solid Films, 2011. 519(20): p. 7079-7085）。スパッタリングの前に、スパッタリング槽を一晩（約１０時間）真空シールし３．０×１０−７Ｔｏｒｒとした。スパッタリング中に、流量２０ｓｃｃｍのＡｒガス（純度９９．９９％）をスパッタリング槽にパージした。スパッタリングは、１００ＷのＤＣ電力を１０分間印加して、１７℃、１×１０−２Ｔｏｒｒで行った。コラーゲン膜と銀の間の距離は１２ｃｍであった。
【００８５】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用の試料を、目的のサイズ（３×３ｍｍ）に切り取り、スタブに取り付けた。次いで試料に白金の層をスパッタリングし、その後、Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia (CMCA-UWA)においてZeiss55を使用して加速電圧１５ｋＶでＳＥＭ画像を取得した。
【００８６】
光学顕微鏡画像は、コラーゲン二分子膜の構造的特徴：よく配向されたコラーゲン繊維からなる「滑らかな」面とランダムに整列したコラーゲン繊維を含む「粗い」面、を明確に示した（図１Ａ）。ＡｇＮＰは、超音波処理ではコラーゲン膜の両面に均一に被覆されたが、スパッタリングでは片面のみが被覆された（図１）。ＳＥＭ画像は、超音波による被覆中、高濃度のＡｇＮＰはより多くのＡｇＮＰ沈着をコラーゲン繊維にもたらすことを明らかにしたのに対し、スパッタリングによる被覆ではコラーゲン繊維上に大きくて不均一な量のＡｇＮＰが見られた。スパッタリングによる被覆は超音波による被覆と比較して、はるかに多くのＡｇＮＰがコラーゲン膜に付着したこと、及びＡｇＮＰは被覆溶液の濃度の増加とともに増加したことを、ＡＡＳは示した。
【００８７】
被覆されたコラーゲン膜のＡｇＮＰの量を測定するために、試料を同じ大きさ（１ｃｍ２）に切り取り、１％硝酸に浸してコラーゲンを溶解した。硝酸溶液中のＡｇＮＰの濃度を原子吸光分析（ＡＡＳ）で測定した。
【００８８】
ＡｇＮＰ放出試験では、ＡｇＮＰで被覆されたコラーゲン膜の重量を記録し、膜を６ｍＬの１×ＰＢＳ溶液に浸した。２４時間後、３ｍＬの溶液を取り出して保存し、被覆された膜を含む元の溶液に３ｍＬの新しいＰＢＳ溶液を加えた。次いで混合物を振とうした。３ｍＬの銀−ＰＢＳ溶液を取り出し、毎回３ｍＬの新しいＰＢＳ溶液と交換するという、これらの２つの工程を６日間連続して繰り返した。７日目に、被覆された膜をＰＢＳ溶液から取り出した。放出されたＡｇＮＰ量はＡＡＳで試験した。校正溶液としてＰＢＳ溶液中に０、０．５、１．０、１．５、２．０及び３．０ｐｐｍの銀イオンを含む溶液を使用した。中空陰極（ＨＣ）ランプ、重水素（Ｄ２）ランプ及びフレームを最大の吸収感度に調整した後、校正溶液を試験し、銀濃度を記録した（Kulthong et al., 2010, Particle and fibre toxicology, 7(1): p. 8）。ＰＢＳ中に放出されたＡｇＮＰの濃度は、被覆された膜の重量に対する割合として計算した。培養培地（１日目）中の放出されたＡｇＮＰのピーク濃度を選択し、このＡｇＮＰ含有培養培地を細胞毒性試験に使用した。
【００８９】
実施例２  金属被覆コラーゲン膜の試験
抗菌活性試験
試験生物と適切な培養液の混合物を用いて、０．５〜１０．０のマクファーランド濁度標準を調製した。目で比較した後、抗菌試験のために０．５マクファーランド濁度標準を選択した。寒天プレートを調製するために、各ペトリ皿に１５ｍｌの溶原培地（ＬＢ）寒天を注ぎ、固化させた。１００μｌの黄色ブドウ球菌（株：ATCC 6538P）又は緑膿菌（株：ATCC 9027）の細菌懸濁液を固体ＬＢ寒天培地の表面に均一に分散し、沈降させた。異なる銀濃度を有する超音波ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜とスパッタリングＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜を、直径５ｍｍの円形に切り取り、細菌懸濁液で覆われたＬＢ寒天培地の表面に置いた。被覆されていないコラーゲン膜を対照とした。ＬＢ寒天−細菌−ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜のプレートを３７℃で９６時間インキュベートし、２４時間ごとに、阻害ゾーンを各膜の周囲に細菌の増殖がない面積（ｍｍ２）として測定した。
【００９０】
異なる濃度のＡｇＮＰを使用して超音波処理で作成したＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜又はスパッタリングで作成したＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜を、細菌を接種したプレートに置き、抗菌活性を試験した。黄色ブドウ球菌及び緑膿菌に対するＡｇＮＰの抗菌効果は、被覆コラーゲン膜を囲む増殖阻害ゾーンの定量化によって測定した（図２）。４日間の培養後、超音波処理によって製造されたＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、ＡｇＮＰ含量０．６ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬにおいて抗菌効果が増加した。興味深いことに、１．０ｍｇ／ｍＬ及び１．２ｍｇ／ｍＬのＡｇＮＰ溶液を使用して超音波処理で被覆した膜は、スパッタリングで被覆したものと同様の抗菌効果を示した（図２）。
【００９１】
細胞培養
Ｃ３Ｈ１０１／２細胞を細胞毒性と生存率を試験するために使用し、ＲＡＷ２６４．７細胞をサイトカイン放出を測定するために使用した。両方の細胞株を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。Ｃ３Ｈ１０１／２細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Gibco（登録商標））並びに１％ストレプトマイシン及びペニシリン混合物を添加した最小必須培地（ＭＥＭα、Gibco（登録商標））で培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Gibco（登録商標））並びに１％ストレプトマイシン及びペニシリン混合物を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ＋GlutaMAX（登録商標）-I）で培養した。
【００９２】
Ｃ３Ｈ１０細胞をＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜に播種し、細胞増殖と細胞膜の完全性を、それぞれＭＴＳ試験と乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出アッセイで評価した。２４時間の培養後、ＡｇＮＰの用量に依存して細胞数の減少が見られたが、１日目以降の増殖率は同様であった（図３）。一方、スパッタリング法で銀を被覆したコラーゲンは細胞増殖が深刻に阻害され、このコーティング技術は、細胞増殖においてＡｇＮＰ−コラーゲン構造の製造には適していないことを示唆する（図３Ａ）。細胞膜の完全性は、ＬＤＨ漏出アッセイで評価した。２４時間の培養後、コラーゲン膜の被覆に使用したＡｇＮＰの濃度と相関する漏出したＬＤＨ量の増加があり、１．０と１．２ｍｇ／ｍＬの超音波処理群の間に有意差があるので、ＡｇＮＰが細胞膜に損傷を与える可能性があることを示す（図３Ｂ）。抗菌活性と最小限の細胞毒性を考慮して、１．０ｍｇ／ｍＬのＡｇＮＰ溶液を用いたＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜を以下の試験の用量として選択した。
【００９３】
コラーゲン膜から放出されたＡｇＮＰが細胞毒性を引き起こす可能性があるかどうかを決定するために、１．０ｍｇ／ｍＬで超音波被覆したコラーゲン膜から放出されたＰＢＳ中のＡｇＮＰをＡＡＳで測定した（図３Ｃ）。ＡｇＮＰの最大放出は２４時間で生じ（１．８６×１０−６ｍｇ／ｍＬ）、放出された銀ナノ粒子の量は、被覆コラーゲン膜の０．０２wt％未満であった。放出された銀のナノ粒子は２４時間以降、徐々に減少した。放出されたＡｇＮＰの細胞毒性を評価するために、放出された銀の最高濃度を選択して、ＡｇＮＰを添加した培地（ＡＡＳによる最終濃度は１．８６×１０−６ｍｇ／ｍＬ）で細胞増殖を試験し、ＭＴＳで調べた。細胞増殖の阻害は観察されなかった（図３Ｄ）。
【００９４】
ＡｇＮＰを被覆していないコラーゲン膜に播種した細胞と被覆したコラーゲン膜に播種した細胞は明らかな形態学的な差異を示さなかったことが、共焦点レーザー走査型顕微鏡の画像から明らかとなった。
【００９５】
ＭＴＳ試験及びＬＤＨ放出アッセイ
この実験では、Ｃ３Ｈ１０細胞を用い細胞増殖及び細胞生存率を試験した（Vangsness et al., Clinical orthopaedics and related research, 1997, 337: p. 267-271）。ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜から放出されたＡｇＮＰの細胞毒性を評価するために、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜（直径１ｃｍ）にＣ３Ｈ１０細胞を３×１０３細胞の密度で播種し、２４時間インキュベートして付着させた。超音波で被覆した膜から放出されたＡｇＮＰの細胞毒性を評価するために、ＡｇＮＰを被覆していないコラーゲン膜（直径１ｃｍ）にＣ３Ｈ１０細胞を３×１０３細胞の密度で播種し、最終濃度１．８６×１０−６ｍｇ／ｍＬのＡｇＮＰが補充された培地で培養した。
【００９６】
ＭＴＳ試験を、CellTiter（登録商標）96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit（Promega, USA）を用いて行った。このキットは、基質である3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニ)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム（ＭＴＳ）を、代謝的に活性な細胞内のデヒドロゲナーゼ酵素によって茶色のホルマザンに生物学的に還元することに基づく（Cory et al., Cancer communications, 1991. 3(7): p. 207-212；Salih et al., Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2000, 11(10): p. 615-620；Salgado et al., Materials Science and Engineering, 2002, 20(1): p. 27-33）。２４時間のインキュベーション後、各ウェルにＭＴＳ溶液を添加した。続いて、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、暗所、３７℃でさらに３時間インキュベートし、その後、９６ウェルプレートリーダー（Bio-Rad, Model 680, USA）を使用し、光学密度（ＯＤ）を波長４９０ｎｍで測定した。
【００９７】
Ｃ３Ｈ１０細胞によるＬＤＨ放出アッセイで細胞膜の完全性を評価した。ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜に細胞を播種した。CytoTox 96（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxiciy Assay Kit（Promega USA）の説明書に従い、２４時間培養後に、放出されたＬＤＨを測定した。収集した培地のＯＤを９６ウェルプレートリーダー（Bio-Rad, Model 680, USA）で４９０ｎｍの波長で読み取った。
【００９８】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を使用した。細胞をＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜に播種し、２４時間かけて付着させた。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激し、細胞培養物の上清を０、２、４及び８時間目に収集して分析した。被覆及び非被覆膜に播種した細胞であってＬＰＳで刺激していない細胞を対照とした。ＴＮＦα及びインターロイキン６（ＩＬ-６）の産生を、マウスＴＮＦα ＥＬＩＳＡキット及びマウスＩＬ-６ ＥＬＩＳＡキット（Novex（登録商標）, ThermoFisher Scientific, USA）で測定した。簡潔に述べると、標準液及び試料をアッセイ希釈液で希釈した。標準、試料及び対照（各１００μｌ）を適切なウェルに追加した。プレートを密封し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、検出抗体（１００μｌ、MS Biotin Conjugate溶液）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、各プレートにストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬（１００μｌ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに安定化させたクロモゲン（１００μｌ）を添加し、暗所、室温で３０分間インキュベートした。停止溶液（５０μｌ）を用いて各ウェルの反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００９９】
ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の抗炎症効果を、ｑ-ＰＣＲとＥＬＩＳＡによってさらに調査した。ＬＰＳで刺激しなかった場合、コラーゲン膜に播種したＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ-６及びＴＮＦαの遺伝子発現に、ＡｇＮＰの被覆の有無で有意差はなかった（図４Ａ、Ｂ）。ＬＰＳで刺激した場合、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜上のＩＬ-６遺伝子の発現は、ＬＰＳ刺激の１時間及び２時間後では、被覆していない群と比較して低かったが、ＴＮＦαの発現は１時間後にのみ抑制された（図４Ａ、Ｂ）。ＥＬＩＳＡの結果は、放出されたＩＬ-６及びＴＮＦαがＬＰＳ刺激の２、４及び８時間後にさらに抑制されることを明らかにした（図４Ｃ、Ｄ）。
【０１００】
ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜のin vitroでの骨形成の影響を調べるために、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜にＣ３Ｈ１０細胞を播種し、ｑ-ＰＣＲで骨形成プロファイルを試験した。図５に示すように、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜はＣ３Ｈ１０細胞の骨形成分化を誘導した。ＲＵＮＸ、ＡＬＰ及びＯＰＮを含む骨形成マーカーの初期の発現は、３日目及び６日目では、ＡｇＮＰを被覆していない膜と比較して被覆した膜上で培養した細胞において著しく高かったが、細胞を９日目まで培養した場合、有意差は認められなかった（図５）。
【０１０１】
実施例３  定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ-ＰＣＲ）
PureLinkTM RNA Mini Kit（Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA）を製造元の指示に従って使用し、培養したＣ３Ｈ１０１／２細胞から全ＲＮＡを単離した。QuantiTec Reverse Transcription kit（Qiagen）を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。iQTM SYBR（登録商標）Green Supermixを製造元の指示に従って使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。骨形成遺伝子（ＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、ＯＰＮ）の相対的な発現量を、ハウスキーピング遺伝子（３６Ｂ４）に対して正規化することによって得た。炎症性サイトカイン遺伝子発現試験では、１、２及び４時間前に、ＡｇＮＰ被覆膜に播種したＲＡＷ２６４．７細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びｑ-ＰＣＲを上述したように行った。ＴＮＦα及びＩＬ-６の発現量を得、ハウスキーピング遺伝子（３６Ｂ４）に対して正規化した。選択した遺伝子のプライマーを表１に示す。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
共焦点レーザー走査型顕微鏡分析
ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜上の付着細胞の成長及び増殖は、共焦点レーザー走査顕微鏡画像で可視化した。Ｃ３Ｈ１０１／２細胞を、９６ウェルプレート中のＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜に、３．０×１０４生細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種した。２４時間のインキュベーション後、膜をＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。細胞の固定には４％パラホルムアルデヒドを使用し（室温で２０分）、続いてＰＢＳで３回洗浄した。ローダミンファロイジン（５単位／ｍＬ；Biotium, USA）を用い、細胞骨格を暗所で３０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、Hoechst（分子プローブ、Eugene, USA）を用い、核を暗所で１５分間染色し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。すべての標本は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ；Nikon A1, Nikon, Japan）を使用して可視化した。
【０１０４】
統計分析
すべてのデータを平均±標準偏差として表示する。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、群間の有意差を求め、ｐ＜０．０５である場合に有意であると見なした。
【０１０５】
考察
骨との一体化と感染の予防は、歯槽骨の再建において最も重要である。この実験では、抗菌活性及び抗炎症活性を組み合わせた２種のバリア膜を開発し、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜を生成する２種の被覆方法の有効性を評価した。ＡｇＮＰ溶液によるコラーゲン膜の超音波処理は、均一な分布と制御可能な沈着を備えた膜を効果的に生成することが見出された。抗菌効果と細胞毒性を検討することで被覆濃度を確定した。この実験で開発されたＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、骨再生を誘導する可能性、黄色ブドウ球菌及び緑膿菌に対する優れた抗菌効果を示し、効果的な抗炎症及び骨形成誘導能を実証した。
【０１０６】
超音波による被覆は高放射の超音波によって行われ、浮遊したＡｇＮＰがコラーゲン膜に浸透することを可能にした。スパッタリングによる被覆は、純粋な銀とのアルゴンガス衝突を引き起こし、銀からのＡｇＮＰの放出をもたらし、コラーゲン膜に向けられた。超音波処理ではＡｇＮＰ溶液の濃度の制御が可能で、コラーゲン膜へのＡｇＮＰの沈着を制御することができた。これとは対照的に、沈着が非常に速く進行し、ＡｇＮＰの濃度制御に関する主な制限のためにＡｇＮＰ堆積が多すぎるので、スパッタリングによる被覆は制御が困難であった。一般に、超音波処理とスパッタリングの両者で、コラーゲン膜へのＡｇＮＰの被覆に成功したことをＳＥＭは示した。
【０１０７】
黄色ブドウ球菌（グラム陽性）及び緑膿菌（グラム陰性）は、感染症における２種の一般的な病原体で、黄色ブドウ球菌は術後の歯槽骨インプラントの病原体で一定の割合を占める。この実施例において、超音波処理又はスパッタリングのいずれかによって作製された被覆されたコラーゲン膜は、これらの２つの菌株に対して優れた抗菌効果を示した。興味深いことに、抗菌効果は特定の濃度範囲のＡｇＮＰに依存し、被覆濃度が１．０ｍｇ／ｍｌのときに最大に達した。超音波による被覆で最小限の機能的な被覆を達成できることが示された。
【０１０８】
超音波処理の群では、２４時間以内に最初の細胞膜損傷が生じたのみで、細胞増殖率に対する影響は３日間認められなかったことが示された。しかし、スパッタリングによるＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、非常に高い細胞増殖阻害を示した。２４時間以内に生じる細胞膜構造の損傷は、ＡｇＮＰ被覆表面への細胞の接着による可能性があると推測した。さらに、被覆コラーゲン膜から放出される少量のＡｇＮＰの細胞毒性は無視することができ、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の局所投与は周囲の組織に悪影響を及ぼさないことが示された。最高の抗菌効果と低い細胞毒性を達成するために、１．０ｍｇ／ｍＬの超音波によるコーティングを被覆の条件として選択した。正常な細胞形態及び細胞クラスターは、共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化でき、組織がＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜の内部で成長する可能性が示された。
【０１０９】
代用骨の配置後、感染又は骨移植によって誘発された炎症が骨との一体化を不十分にし、最終的に歯のインプラントの成功の信頼性が低下する傾向がある。ＴＮＦαやＩＬ-６のような炎症性サイトカインの長期的な存在は、マトリックスメタロプロテイナーゼの過剰活性につながる可能性があり、細胞外マトリックスの分解をもたらす。ＩＬ-６は線維芽細胞増殖の強力な刺激因子で、外因性のＩＬ-６が瘢痕形成に関与している可能性があることを示唆する証拠があり、骨との一体化に悪影響を及ぼす可能性がある。敗血症及び感染症における全身反応の主要なメディエーターであるＴＮＦαは、過剰に産生されると組織損傷を引き起こす可能性がある。まとめると、感染又は骨の移植に対する宿主の反応によって引き起こされた過度の炎症は、術後に悪影響を及ぼす可能性がある。ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、遺伝子発現とタンパク質放出の両者でＴＮＦαとＩＬ-６を有意に阻害することがｑ-ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによって示され、その抗炎症活性が示された。したがって、過剰な炎症を伴う多くの感染状態において、ＡｇＮＰ被覆コラーゲンは、感染症と闘い、同時に炎症を和らげる二つの効果があり、これにより、歯槽骨再建後の感染症や移植による炎症のリスクを減らすことが可能となる。
【０１１０】
さらに、ＡｇＮＰ被覆コラーゲン膜は、被覆されていない膜と比較して、骨形成分化を誘導する優れた能力を有した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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