(57)【要約】  本発明はタンパク質コンジュゲートの分野のものである。より詳細には、本発明は、代謝障害または症状の治療に用いる、共有結合したＦｃモノマーポリペプチドをもつオリゴマー伸長インスリン、およびそのようなオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを生成する方法に関する。  本発明はまた、本発明のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートの合成過程における、新規のＦｃ断片、中間生成物、およびそのような中間生成物の使用に関する。  そして本発明は、本発明のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、代謝障害または症状に関連する病状の治療または予防に対するかかる組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される、インスリン−Ｆｃコンジュゲートであって、
【化１】
2022502467.tif 000038
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、前記インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である、インスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【請求項２】
Ｉｎｓが、アミノ酸置換Ｂ１６Ｈまたはアミノ酸置換Ｂ１６Ｅをさらに含むインスリン類似体を表す、請求項１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【請求項３】
Ｉｎｓが、［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン、［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン、および［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリンから選択されるインスリン類似体を表す、請求項１または２のいずれか一項に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【請求項４】
前記オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートが、
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート
【化２】
2022502467.tif 000039
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート
【化３】
2022502467.tif 000040
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートから選択される、請求項１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【化４】
2022502467.tif 000041
【請求項５】
中間体化合物Ｉｎｓ−（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）−ＫＰであって、
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、前記インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である、中間体化合物。
【請求項６】
前記インスリン類似体が、アミノ酸置換Ｂ１６ＨまたはＢ１６Ｅをさらに含む、請求項５に記載の中間体化合物。
【請求項７】
式ＩＩの中間体化合物であって、
【化５】
2022502467.tif 000042
式中、
ＬＧ１は、第一級アミノ基に対して反応する脱離基を表し、
ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す、中間体化合物。
【請求項８】
前記中間体化合物が、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートである、請求項７に記載の中間体化合物。
【化６】
2022502467.tif 000043
【請求項９】
式ＩＩＩの中間体化合物であって、
【化７】
2022502467.tif 000044
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、前記インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）であり、
各ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す、中間体化合物。
【請求項１０】
前記インスリン類似体が、アミノ酸置換Ｂ１６ＨまたはＢ１６Ｅをさらに含む、請求項９に記載の中間体化合物。
【請求項１１】
２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）である、中間体化合物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲートと、１つ以上の薬剤的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
医薬として使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【請求項１４】
ヒトを含めた生体動物体の疾患もしくは障害もしくは症状の治療または緩和に用いる、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴマー伸長インスリンＦｃコンジュゲートであって、疾患、障害または症状は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質代謝異常、肥満症、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム硬化症、心筋梗塞、脳卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、胃腸障害または胃潰瘍に関連する疾患、障害または症状から選択され得る、請求項１〜４のいずれかに記載のインスリンＦｃコンジュゲート。
【請求項１５】
ヒトを含めた生体動物体の代謝疾患もしくは障害もしくは症状を治療、予防または緩和する方法であって、治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載のインスリンＦｃコンジュゲートを、それを必要とする生体動物体に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質コンジュゲートの分野のものである。より詳細には、本発明は、代謝障害または症状の治療に用いる、共有結合したＦｃモノマーポリペプチドをもつオリゴマー伸長インスリン、およびそのようなオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを生成する方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、本発明のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートの合成過程における、中間生成物およびそのような中間生成物の使用に関する。
【０００３】
そして本発明は、本発明のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを含む医薬組成物を提供し、代謝障害または症状に関連する病状の治療または予防に対するかかる組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
オリゴマー伸長インスリンは、オリゴマー（アミノ酸残基で構成された）を用いてインスリンのＡ鎖および／またはＢ鎖を伸長することによって生成されるインスリンである。
【０００５】
Ｆｃ融合タンパク質（ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれる場合もある）は、典型的には、生物学的に活性なポリペプチドをイムノグロブリンＧの結晶形成断片領域（Ｆｃドメイン）と融合する（すなわち、もともと別個のタンパク質をコードした２つ以上の遺伝子を結合する）ことによって産生されるキメラタンパク質であり、融合タンパク質は多くの場合、例えば新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへの結合による長い血清半減期というＩｇＧ様の特性である、それらの構成部分の特性を組み合わる。
【０００６】
一方、タンパク質コンジュゲートは、合成リンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）を介して治療的ポリペプチドに共有結合された、「大きな」、典型的には組換え体である、エフェクター分子（例えば、ＩｇＧ−Ｆｃまたはアルブミンなど）を有する化合物である。タンパク質コンジュゲートは複数の状況で有用であり、ますます複雑になる生物学的治療化合物の特定および開発が、こうした化合物を調製するための魅力的な方法への注目を高めている。タンパク質が従来の化学成分ほど安定していないため２つ以上のタンパク質を結合させることに付随して困難が生じ、タンパク質の損傷なしに従来の反応化学を適用することができない。さらに、２つ以上のタンパク質を結合させることは、選択性の問題によって複雑化する。
【０００７】
タンパク質およびペプチドの半減期は、Ｆｃへの融合によって延長され得る。しかしながら、インスリンは二鎖ポリペプチドであって、単鎖類似体として発現後に、酵素的処理することによって得られる二鎖ポリペプチドであるため、インスリンはタンパク質融合には理想的ではない。さらに、融合はＮ末端および／またはＣ末端に限定される。したがって、例えばＦｃの作用によってインスリンの半減期を延長するためには、化学的な結合が必要である。
【０００８】
２つのタンパク質を結合させる場合、リンカーの特性が重要である。短いリンカーは、各タンパク質の活性に影響を与える場合がある。２つのタンパク質を近づけすぎると、分子の生物物理学的な安定性に影響を及ぼす可能性がある。この影響を与える可能性があるリンカー特性としては、例えば、２つめの分子上における結合の位置、リンカーの長さ、リンカーの柔軟性、リンカーの極性があり得る。一部の事例では、柔軟なリンカーが好ましく、他の事例では硬いリンカーが必要となる。分子／タンパク質を２つめの分子と結合させることが、コンジュゲートの生物物理学的特性に悪影響を及ぼす可能性があるが、これはリンカー特性によって解決され得る。
【０００９】
ＷＯ２０１１／１２２９２１には、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ持続時間を有するインスリンコンジュゲートが記載されており、コンジュゲートは、両端に反応性基（例えば、プロピオンアルデヒドとしてのアルデヒド官能性）を有する、所謂ホモ二官能性リンカーの、親水性非ペプチジル（例えば、ＰＥＧ）リンカーを介してインスリンをイムノグロブリンＦｃ領域と共有結合させることによって調製される。使用されるＰＥＧリンカーは、多分散型であり、サイズが約３．４ＫＤａ〜１０ＫＤａであるため、多分散リンカーの使用により、最終産物の合成および分析に関して課題が生じる。
【００１０】
ＷＯ２０１６／１７８９０５には、ペプチドリンカーの使用を通してヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合したインスリン受容体作動薬を含む融合タンパク質が記載されている。
【００１１】
ＷＯ２０１６／１９３３８０には、薬剤物質の半減期および安定性を改善するために、主として極性のアミノ酸残基の配列を用いて伸長させた新規のインスリンまたはインスリン類似体が記載されている。
【００１２】
タンパク質とペプチド、小分子ポリマー、またはプロトラクターポリマーとの間で部位特異的コンジュゲートを得る最も一般的な方法は、反応性ハンドルとして、Ｎ末端アミノ酸にあるＣｙｓのチオールおよび第一級アミノ基ならびにＬｙｓ側鎖のイプシロン−ＮＨ２がもつ固有の求核性を利用することである。リジンは通常、タンパク質中に豊富にあり（Ｆｃは３０個以上のリジン残基を含む）、化学的ハンドルとしてのリジンの使用を制限する。しかしながら、インスリンの場合、リジンは１つのみ存在する（すなわち、Ｂ２９位に）。一方、システインの場合は、タンパク質における発見頻度が低く、さらにはジスルフィド架橋の形成に通常関与する。システインは遺伝子操作によって導入できる。しかしながら、インスリンの場合、この修飾は、特に低い発現収率および様々なフォールディングの問題に起因して、困難であることが証明されている。
【００１３】
また、２つのタンパク質を一緒に、それらそれぞれのＣｙｓ、Ｎ末端アミノ基、またはＬｙｓ残基を介して、部位特異的に結合することも困難である。ヘテロ二官能性リンカーの使用により、この目的を果たすことができる。またそれによって、還元されたジスルフィド結合に由来する硫黄原子の両方を介して１つのタンパク質が連結されることとなる２つのタンパク質を結合するというタスクを、さらに困難なものにする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートは、同様の非結合のおよび非伸長の類似体と比較して、インスリン受容体親和性が低いことを示す。インスリンは内部に取り入れられて、受容体活性化によって分解されるため、このようにインスリン受容体親和性が低いことが、循環血中でインスリン−Ｆｃコンジュゲートを保護することに寄与する。そのため、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートのクリアランスが低減される。このインスリン受容体親和性が低いことは、例えば標準のＨｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｅｍｉｃ−ｅｕｇｌｙｃａｅｍｉｃ  ｃｌａｍｐ法で測定されるように、効力の損失を引き起こさないものであり、高いＦｃＲｎ結合と低インスリン受容体親和性との組み合わせが、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの長期間にわたる作用を得るのに有益と考えられる。
【００１５】
したがって、本発明は、その第１の態様では、式Ｉで表される新規のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを提供し、
【化１】
2022502467.tif 000002
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、中間体化合物Ｉｎｓ−（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）−ＫＰを提供し、
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、式ＩＩの中間体化合物を提供し、
【化２】
2022502467.tif 000003
式中、
ＬＧ１は、第一級アミノ基に対して反応する脱離基を表し、
ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、式ＩＩＩの中間体化合物を提供し、
【化３】
2022502467.tif 000004
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）であり、
各ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す。
【００１９】
第５の態様では、本発明は、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）である中間体化合物を提供する。
【００２０】
第６の態様では、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートと、１つ以上の薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２１】
第７の態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートを提供する。
【００２２】
第８の態様では、本発明は、ヒトを含めた生体動物体の疾患または障害または症状の治療または緩和で使用するための、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートを提供し、疾患、障害または症状は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質代謝異常、肥満症、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム硬化症、心筋梗塞、脳卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、胃腸障害または胃潰瘍に関連する、疾患、障害または症状から選択され得る。
【００２３】
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、改善された薬物動態および／または薬力学のプロファイルを示す。
【００２４】
本発明の一態様では、本発明の化合物は、薬力学的効力の増加を示す。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明の化合物は、現時点で市販されている長時間作用性インスリンと比較して少なくとも２倍増加した薬力学的効力を示す。
【００２６】
本発明の別の態様では、本発明の化合物は長い生体内半減期を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例５．１、５．２および５．３の血糖低下効果を示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【図２】図２は、実施例５．１、５．２および５．３のベースライン補正した血糖低下効果を示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【図３】図３は、実施例５．１、５．２および５．３の薬物動態プロファイルを示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【図４】図４は、実施例５．１、５．２および５．３の血糖低下効果を示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でストレプトゾトシン処置Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【図５】図５は、実施例５．１、５．２および５．３のベースライン補正した血糖低下効果を示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でストレプトゾトシン処置Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【図６】図６は、実施例５．１、５．２および５．３の薬物動態プロファイルを示す。化合物を、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でストレプトゾトシン処置Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに供給するために皮下投与した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
我々は本明細書において、式Ｉで表される、新規のオリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートを提供し、
【化４】
2022502467.tif 000005
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である。
【００２９】
インスリン類似体
ヒトインスリンは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、Ａ鎖（２１個のアミノ酸ペプチド、配列番号１）およびＢ鎖（３０個のアミノ酸ペプチド、配列番号２）からなり、それぞれは、２つのシステインのジスルフィド架橋によって相互連結される。第３の鎖内スルフィド架橋はＡ鎖内に存在する。
【００３０】
本明細書では、インスリンという用語は、例えばヒトインスリンなどの天然インスリンのみならずその類似体におよぶ。インスリン類似体、インスリンならびにＡ鎖およびＢ鎖におけるアミノ酸位置の番号付けは、ヒトインスリンとの比較で行われる。
【００３１】
本明細書では、インスリン類似体という用語は、天然インスリン中で発生する１つ以上のアミノ酸残基を欠失および／もしくは置換（置き換え）することによって、ならびに／または１つ以上のアミノ酸残基を付加することによって、例えばヒトインスリンである天然インスリンの構造より正式に引き出すことが可能である分子構造を持つ、改変ヒトインスリンポリペプチドにおよぶ。
【００３２】
一実施形態では、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比較して、１０個未満のアミノ酸修飾（置換、欠失、付加（挿入を含む）、およびこれらの任意の組み合わせ）、代替的にはヒトインスリンと比較して、９、８、７、または６個未満の修飾を含む。これらの修飾に加えて、本発明のＦｃ−インスリンコンジュゲートは、インスリンＡ鎖Ｃ末端に融合された組換え伸長を含む。本明細書では、組換え伸長は、インスリン類似体の一部として定義されていない。
【００３３】
本明細書では、Ａ１、Ａ２、Ａ３などの用語は、Ｎ末端から数えた場合の、インスリンのＡ鎖内の１位、２位および３位をそれぞれ示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３などの用語は、Ｎ末端から数えた場合の、インスリンのＢ鎖内の１位、２位および３位をそれぞれ示す。アミノ酸について確立された一文字コードを使用した、Ａ２１Ａ、Ａ２１ＧおよびＡ２１Ｑなどの用語は、Ａ２１位におけるアミノ酸がそれぞれＡ、ＧおよびＱであることを示す。アミノ酸について確立された三文字コードを使用した、これらに対応する表現は、それぞれＡｌａＡ２１、ＧｌｙＡ２１、およびＧｌｎＡ２１である。
【００３４】
本明細書では、ｄｅｓＢ３０などの用語は、Ｂ３０のアミノ酸残基を欠いているインスリン類似体を示す。
【００３５】
Ａ２２という用語は、Ａ２１よりＣ末端にあるアミノ酸の位置を示す。この手法で、Ａ２３という用語は、Ａ２２よりＣ末端にある一番目のアミノ酸の位置を示す。したがって、Ａ２４は、Ａ２３よりＣ末端にあるアミノ酸の位置を示すなどである。この手法で、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇは、Ａ２１位よりＣ末端であるグリシン（Ｇ）残基と、それに続けてＡ２２（Ａ２２Ｇ）位のグリシン（Ｇ）残基よりもＣ末端に位置したグリシン（Ｇ）残基とによって、Ａ鎖のＣ末端が伸長しているということを示す。
【００３６】
本発明によるインスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体であり、そのインスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明のインスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体であり、そのインスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、アミノ酸置換Ｂ１６Ｈまたはアミノ酸置換Ｂ１６Ｅもさらに含む。
【００３８】
さらなる実施形態では、本発明に従って使用するためのインスリン類似体は、以下の例から選択される。
［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン（配列番号３のＡ鎖、配列番号４のＢ鎖）、
［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン（配列番号３のＡ鎖、配列番号５のＢ鎖）、および
［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン（配列番号３のＡ鎖、配列番号６のＢ鎖）。
【００３９】
オリゴマー伸長インスリン類似体
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、組換え伸長を含み、その伸長は、アミノ酸配列ＧＱＥＰ、続いてＧＱＥＫＰおよびＧＱＥＰＫＰの群から選択されるアミノ酸配列の反復から構成される。
【００４０】
本発明による組換え伸長は、インスリンＡ鎖Ｃ末端に融合された伸長であり、その伸長は、アミノ酸配列（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）−ＫＰを有し、式中、（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である。
【００４１】
一実施形態では、伸長は、（ＧＱＥＰ）１２−ＫＰおよび（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥＫＰから選択される。
【００４２】
一実施形態では、伸長は、（ＧＱＥＰ）１２−ＫＰである。
【００４３】
別の実施形態では、伸長は、（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥＫＰである。
【００４４】
本発明に従って導入された伸長は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートに関して観察される長期にわたる半減期を意図したわけではなくまた該半減期に有意に貢献するものではないが、本発明の文脈において、図らずも、伸長は適切に離間する基／リンカーを提供し、それによってインスリン類似体の遮蔽を回避し、そして伸長がより良好な（改善された）溶解性および／または改善された糖動態性能にも寄与するということに留意されたい。
【００４５】
オリゴマー伸長融合インスリン類似体の命名法
本発明の文脈では、オリゴマー伸長インスリン類似体は、アミノ酸の欠失、置換、挿入、および伸長の仕様によってヒトインスリンとの比較で命名される。
【００４６】
この手法で、実施例１．１の化合物は、ヒトインスリン類似体（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０）を表すものであって、Ａ鎖のＡ１４位およびＡ２１位に位置する天然のアミノ酸残基が、グルタミン酸（Ｅ）およびグリシン（Ｇ）でそれぞれ置換されており、かつ、Ｂ２５位およびＢ２９位に位置する天然のアミノ酸残基が、ヒスチジン（Ｈ）およびアルギニン（Ｒ）でそれぞれ置換され、Ｂ３０位が欠失しており、上記類似体は、４つのアミノ酸残基（ＧＱＥＰ）の１２個の反復を特定の順で形成することで合計４８個のアミノ酸残基（（ＧＱＥＰ）１２）と命名される）とそれに続くＫＰとからなる伸長を形成する伸長によって、アミノ酸Ａ２２位で開始されるＡ鎖のＣ末端側への伸長がなされている。伸長全体は、（ＧＱＥＰ）１２−ＫＰと命名してもよい（またこのためリジンはＡ７０Ｋと呼ばれる）。
【００４７】
この類似体はまた、Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１０のＡ鎖および配列番号４のＢ鎖）と命名することもあり、この化合物を、以下の化学式１に示す。すなわち、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２は、Ａ２１に付加した（ＧＱＥＰ）１２である伸長を示すものであって、該伸長の一番目のアミノ酸（すなわち、この例においてはＧである、Ａ２１に付加したアミノ酸）が、Ａ２２位、すなわちこの例においてはＡ２２Ｇに相当する。
【化５】
2022502467.tif 000006
【００４８】
リンカー
本発明の文脈では、リンカーは、関心のタンパク質を共有結合するために使用される化学部分または残基である。リンカーがタンパク質と反応すると、リンカーラジカルが形成される。そのため、「リンカー」という用語は、インスリン−Ｆｃコンジュゲートの化学的単位を意味することを意図するが、これはタンパク質コンジュゲートのポリペプチドの各々のアミノ酸残基と共有結合している。
【００４９】
本発明によれば、リンカーは、インスリン類似体のＦｃドメインとの結合に使用される。当該Ｆｃドメインは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を含む共有結合および／または非共有結合によって通常一緒に保持される２つのポリペプチドからなる。従来的な二価リンカーを使用した共有結合であれば、タンパク質はＦｃポリペプチドのうちの１つのみと結合することになる。しかしながら、本発明による三価リンカー（三分岐リンカーとも呼ぶ）を用いると、２つのＦｃポリペプチド鎖の両方がインスリン類似体と結合しているタンパク質コンジュゲートが得られる。
【００５０】
本発明のリンカーは、以下の化学式２によって示される。
【化６】
2022502467.tif 000007
式中、＃は、インスリンの組換え伸長におけるリジン（Ｋ）残基のイプシロンアミノ基への結合点を示し、＊は、Ｆｃ成分の２２９位のシステイン（Ｃ）残基の硫黄原子への結合点、すなわち、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）を示す。
【００５１】
抗体Ｆｃ成分
Ｆｃ領域は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域であり、これは長期間にわたる半減期をもたらすリサイクリングを含む、様々な機能を受けるＦｃ受容体への結合に関与している。Ｆｃ部分は典型的にはＩｇＧに由来し、コンジュゲート部分は多くの場合、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合部位を含むイムノグロブリン配列の部分を含む。ＦｃＲｎ、サルベージ受容体は、イムノグロブリンのリサイクルリングと、血液中で血液循環にそれらを戻すこととに関与する。特定の性能を得るため、例えば、ＦｃＲｎに対する親和性の増加を得るため、長期間にわたる半減期を得るため、または、他の受容体への結合を増加もしくは低減させるため、免疫エフェクター機能の低減もしくは増加を得るために、イムノグロブリンＦｃ領域の突然変異を導入することがよくある。
【００５２】
抗体アイソタイプＩｇＧは、それらのアミノ酸重鎖配列中におけるさらなるわずかな相違に基づいて、サブクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）にさらに分類される。
【００５３】
本発明の文脈では、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」または「Ｆｃドメイン」という用語は、抗体の結晶化可能断片を指す。Ｆｃ領域は、抗体の尾部である。ＩｇＧ抗体については、Ｆｃ領域は、重鎖の第２および第３の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）をいずれも含む２つの同一のポリペプチドを含む（すなわち、ホモ二量体である）。Ｆｃドメインはまた、ヒンジシステインがジスルフィド結合を形成し得るときに、非共有結合的に相互作用しおそらく共有結合的にも相互作用する２つのＦｃポリペプチドとして、ダイマーとも呼ばれ得る。本発明の文脈では、Ｆｃドメインの１つのＦｃ（単量体の）ポリペプチドを、「Ｆｃモノマー」または「Ｆｃポリペプチド」と呼ぶ。本発明の文脈において、Ｆｃドメインのタンパク質配列はまた、「Ｆｃポリペプチド」と呼び、少なくともＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【００５４】
このヒンジ領域は、抗体の定常領域のＣＨ１とＣＨ２との間のタンパク質セグメントである。ヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付けに従って、ＩｇＧ１の場合は２１６〜２３８位に対応し、ＩｇＧ４−Ｆｃの場合は２１９〜２３８位に対応する。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のそれぞれの場合、２１６〜２２５位および２１９〜２２５位に対応する上部ヒンジ領域にさらに分割され得る。コアヒンジ領域は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方の場合に２２６〜２３１位と呼ばれ、下部ヒンジ領域は、２３２〜２３８位と呼ばれる。
【００５５】
ヒト抗体のＦｃ領域はグリコシル化されており、グリコシル化はＣ１ｑ相互作用に関与すると考えられているため、Ｃ１ｑ結合はグリコシル化を除去することによって低減され得る。さらに、アグリコシル化Ｆｃは、それぞれＦｃガンマ受容体Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂおよびＩＩＩａに対して減少したまたは弱い結合を有するが、これもまた、低度の抗体依存性細胞媒介性細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を許容する。
【００５６】
グリコシル化は、酵素的に除去されてもよい。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるＦｃの産生が、アグリコシル化Ｆｃをもたらす。イムノグロブリンＦｃ領域のこうした配列誘導体の調製のための技術は、当技術分野で既知であり、例えばＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に開示されている。
【００５７】
本発明のＩｇＧ由来Ｆｃ断片は、アグリコシル化したｈＩｇＧ４  Ｆｃ断片であってもよく、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩへの弱い結合を自然に有する。
【００５８】
本発明によるＦｃ成分は、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）（配列番号７）である。
【００５９】
Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域が１つのみの（ネイティブ）システイン（Ｃ）残基を含むように、Ｆｃ成分が修飾される。これは、本発明のＦｃポリペプチド配列をコアヒンジ位置２２６で開始し、ネイティブシステイン（Ｃ）残基を２２６位で置換することによって達成された。第１のＦｃモノマーのこのシステインは、例えば、以下の化学式３に示されるように、元の（ホモダイマー）Ｆｃポリペプチドの第２のモノマー上に位置する同様のシステイン残基とのジスルフィド結合を形成する能力を有する。したがって、ＦｃドメインのＦｃポリペプチドは、ジスルフィド架橋によって共有結合されてもよく、または代替的に非共有結合されてもよい。
【化７】
2022502467.tif 000008
【００６０】
本発明のＦｃポリペプチドへの結合は、上記のように、Ｆｃポリペプチド中のシステイン残基由来の硫黄原子（−Ｓ−）を介して起こる。
【００６１】
ネイティブヒトＩｇＧ４のヒンジコア配列（２２６−２３１位）は、ＣＰＳＣＰＡ（配列番号８）である。
【００６２】
本発明のヒンジコア配列は、以下の残基の余分な切断なしに、初期Ｍｅｔの効率的な除去を介して均質な産物として発現されるＦｃ領域を作製するように修飾されている。本発明によるヒンジコア配列は、ＡＧＰＣＰＡ（配列番号９）である。したがって、本発明による使用のためのＩｇＧ４由来Ｆｃドメインは、アミノ酸修飾２２６Ａ、２２７Ｇおよび２２８Ｐを含む。
【００６３】
定常領域は、分子を安定化するように、かつ例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、および／もしくは抗原依存性細胞障害活性、またはそれらの欠如などであるその機能特性の１つ以上が変わるように修飾される。さらに、Ｆｃ領域は、そのグリコシル化を変更するように、さらに抗体の１つ以上の機能特性を変えるように、化学的に修飾されてもよい（例えば、１つ以上の化学的部分をＦｃ部分に付加できる）。
【００６４】
本発明による使用のためのＩｇＧ４由来Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ｋを含み、特定のＦｃガンマ受容体に対する親和性の減少をもたらすことになる。
【００６５】
Ｆｃドメインの化学的安定性を改善するために、アミド分解が発生しやすいアスパラギンを、グルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換してもよい。本発明のＦｃ成分は、Ｎ２９７Ｅ、Ｎ３１５ＱおよびＮ３８４Ｑ置換を含む。
【００６６】
Ｆｃドメインの物理的安定性を改善するために、本発明のＦｃ成分は、Ｌ２３５Ｋ置換を含む。
【００６７】
さらに、ＩｇＧのＣ末端リジンはヒト血液中で生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）切断され、ヒト血液から単離された内因性ＩｇＧは、非常に低いレベルでＣ末端リジンを含有する。したがって、４４７位のＣ末端リジンは欠失し、例えば、本発明のＦｃ成分は、ｄｅｓ４４７を含む。
【００６８】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス
（Ｋａｂａｔ）ＥＵ番号付け法は、配列のアライメントに基づいて開発された一貫した方法により抗体内の残基を番号付けするための広く採用されている標準である。本出願の文脈では、Ｆｃ鎖内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されている）に従って行われる。
【００６９】
本発明によれば、２２６位で開始され４４７位で終了するヒトＩｇＧ４−Ｆｃのネイティブ配列を、ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）と命名する。Ｆｃは２つの同一のポリペプチドからなるため、１つのポリペプチドの配列のみを与える。２２８位のセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）に変異すれば、類似体は２２８Ｐ  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）と命名される。同様に、２２６位のシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）に変異し、２２７位のプロリン（Ｐ）がグリシン（Ｇ）に変異し、２２８位のセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）に変異した場合、この生成物は、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）と命名される。
【００７０】
上述のように、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、上述のリンカーを介してインスリンと共有結合した２つのモノマーＦｃポリペプチドとして記述できる。
【００７１】
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲート
本発明の文脈において、インスリン−Ｆｃコンジュゲートは、インスリン類似体と、リンカーを介して共有結合した２つのＦｃモノマーとを含む化合物を表す。
【００７２】
本発明は、式Ｉで表される新規のインスリン−Ｆｃコンジュゲートを提供し、
【化８】
2022502467.tif 000009
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である。
【００７３】
さらなる実施形態では、本発明によるインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、以下の例から選択される。
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート（実施例５．１の化合物）、
（Ａ１４Ｅ，Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート（実施例５．２の化合物）、およびＡ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート（実施例５．３の化合物）。
【００７４】
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの命名法
本発明の文脈において、また情報の容易性のため、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、結合基の仕様に加えて、本発明のコンジュゲートを構成するペプチド成分部分（すなわち、インスリン成分およびイムノグロブリンＦｃ成分）に従って命名される。
【００７５】
この手法で、実施例５．１のインスリン−Ｆｃコンジュゲート（以下に化学式４として提示）は、Ａ鎖Ｃ末端伸長を介して結合されたコンジュゲートを表し、（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートと命名されてもよく、化合物が、三価結合基３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルを介して結合された、インスリン成分（すなわち、Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）およびＦｃ成分（すなわち、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））から構成されること、ならびにリンカーが、インスリン成分のリジンＡ７０Ｋのイプシロンアミノ基を−Ｃ（Ｏ）−に架橋し、Ｆｃ成分ポリペプチドのＣｙｓ２２９のチオールの各々を−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−に架橋することを示している。
【００７６】
Ａ７０Ｋ＾は、リンカーのインスリンへの結合点を示すことに留意されたい。したがって、＾は、リンカーが結合している伸長インスリン類似体内の位置を示す。
【化９】
2022502467.tif 000010
【００７７】
化学式４では、両方のＦｃポリペプチド配列の最初の３つのアミノ酸（すなわち、Ａ−Ｇ−Ｐ）が示され、４番目のアミノ酸（すなわち、Ｃｙｓ）が拡大して示されている。Ｆｃポリペプチドの残りの部分（すなわち、２３０〜４４７位）における置換および欠失は、角括弧内に示されている［例えば、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７］。
【００７８】
中間生成物
さらなる態様において、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの製造に使用する中間体化合物を提供する。
【００７９】
オリゴマー伸長インスリン類似体
オリゴマー伸長インスリン類似体は、例えば、ＷＯ２０１６／１９３３８０に記載されるように、当技術分野で既知の方法によって得られ得る。
【００８０】
本発明によると、オリゴマー伸長インスリン構築物の配列全体は、１つのリジン（Ｋ）残基のみを含有する。
【００８１】
一実施形態では、本発明による使用のための中間体化合物は、インスリンＡ鎖Ｃ末端に融合された極性組換え伸長を含むインスリン類似体であり、伸長は、アミノ酸配列（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）−ＫＰを有し、式中、ａａ１は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）であり、インスリンは、ヒトインスリンの類似体であり、そのインスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含む。
【００８２】
さらなる実施形態において、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ｂ１６ＨまたはＢ１６Ｅをさらに含む。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明による使用のための中間体化合物は、以下の例から選択される。
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．１の化合物）、
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．２の化合物）、および
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．３の化合物）。
【００８４】
Ｆｃ断片
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートは、リンカーを介してインスリンと共有結合した２つのモノマーＦｃポリペプチドの使用を含む。
【００８５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの製造において中間体化合物として使用するＦｃポリペプチドを提供する。
【００８６】
本発明による使用のためのＦｃポリペプチドは、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）である。
【００８７】
結合基
別の態様において、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの製造に使用する中間体化合物を提供する。
【００８８】
三分岐リンカーであって、第１の末端が、式Ｉのインスリン成分のリジン残基のイプシロンアミノ基と安定に共有結合を形成する能力があり、当該末端が、チオールによる、またはタンパク質内のその他の任意の残基による影響を受けないままであるような三分岐リンカーを提供する。
【００８９】
リンカーの第２および第３の末端は同一であり、式ＩのＦｃ成分のチオール部分（すなわち、−ＳＨ）と安定に共有結合を形成する能力を有する（「Ｃｙｓ−反応性末端（複数可）」と呼ぶ）。第１の結合事象が生じた後（すなわち、第１の末端のリジンとの結合）、Ｃｙｓ−反応性末端は、直接（例えば、ブロモアセトアミドもしくはヨードアセトアミド、Ｍｉｃｈａｅｌ受容体を用いて、反応することができ、または、第２のタンパク質のチオールに対して反応性をもたせることとなり（例えば、クロロアセトアミドからヨードアセトアミドに変える）、それによって連続する二段階の手法で一般式Ｉの所望のインスリン−Ｆｃコンジュゲートをもたらすような、化学的変換を受け入れ可能である。
【００９０】
それぞれがｓｐ２混成の炭素Ｃ原子、ＣＨ２基およびハロゲン（Ｈｌｇ）原子を含む２つの反応性末端（（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｈｌｇと表す）を含有する、本発明のリンカーの特定の設計は、他の鎖内ジスルフィドを妨害することなく、Ｆｃ断片の鎖間ジスルフィドを簡単かつ選択的に遊離チオールに還元させながら、Ｆｃ断片の鎖間ジスルフィドを結合するのに特に適している。
【００９１】
本発明の中間生成物は、複素官能性リンカーによる効率的なタンパク質−タンパク質結合を可能にする三分岐リンカーを表す。異なる脱離基を使用することによって、反応物質の連結を制御することができ、また中間体は特に、２つ以上のタンパク質を順序通りに共有結合するための合成方法で有用であり、異なるタンパク質をリンカーの各末端に付加させることができるようにする。
【００９２】
本発明による使用のための中間体化合物は、以下の一般式ＩＩによって特徴付けられ得、
【化１０】
2022502467.tif 000011
式中、
ＬＧ１（Ｌｙｓ反応性末端と命名することもあり得る）は、第一級アミノ基に対して反応性をもつ脱離基を表し、
ＬＧ２（Ｃｙｓ反応性末端と命名することもあり得る）は、チオール反応性基の脱離基を表す。
【００９３】
本発明の文脈では、ＬＧ１は、通常使用される活性エステルなどの第一級アミノ基に対して反応性をもつ脱離基を表す。かかる脱離基には、従来ペプチド合成で用いられる活性エステルを含むものであって、以下に限定されるものではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホ−ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェノール（ＰＦＰ）エステル、ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステルおよびエチル（ヒドロキシイミノ）シアノ酢酸エステル（Ｏｘｙｍａ）を含む。
【００９４】
一実施形態では、「Ｌｙｓ反応性末端」（ＬＧ１）は、スクシンイミドエステル（ＯＳｕエステル）活性化カルボン酸部分で表され、「Ｃｙｓ反応性末端」ＬＧ２は各々、ヨウ化物−、臭化物−または塩化物で表される。インスリンの伸長の末端部分（すなわち、第１のタンパク質）に位置するＬｙｓのイプシロンアミノ基とＯＳｕエステルとの反応、および適切な精製後、得られたコンジュゲートは、直接、鎖間ジスルフィドの還元により形成されたＦｃ断片（すなわち、第２および第３のタンパク質）のチオールと反応させるか、またはクロロアセトアミドの場合には、高濃度のヨウ化物イオンに曝露した後で、所謂「フィンケルシュタイン反応」をもたらし、該反応は、クロロからヨードへの変換をもたらし、それによってビス−ヨードアセトアミド部分を生成する。最終的な結果物は、関心の２つのタンパク質間の共有結合性部位特異的コンジュゲート、すなわち一般式Ｉのインスリン−Ｆｃコンジュゲートの形成である。
【００９５】
さらなる実施形態では、中間生成物は、化学式５に示される（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートである。
【化１１】
2022502467.tif 000012
【００９６】
結合基を含むオリゴマー伸長インスリン類似体
一実施形態では、本発明による中間体化合物は、以下の一般式ＩＩＩによって特徴付けられる化合物であり、
【化１２】
2022502467.tif 000013
式中、
Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）であり、
各ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す。
【００９７】
さらなる実施形態では、各ＬＧ２は、Ｂｒを表す。
【００９８】
中間生成物の調製方法
本発明により使用するリンカーは、例えば、以下の実施例に記載されるように、標準技術によって製造されてもよい。
【００９９】
結合しようとするタンパク質同士およびリンカーは、別個に調製および精製されてもよい。
【０１００】
一態様では、リンカーの一端は第一級アミノ基の反応性基であり、他端は２つのチオール反応性基を有する。
【０１０１】
第３の実施形態において、インスリンの第一級アミノ基は、リンカーと反応し、それに次いで、２つの遊離システインを有するＦｃと反応する。
【０１０２】
さらなる実施形態において、Ｆｃは、還元されたジスルフィド結合由来の両硫黄原子を介して連結する。
【０１０３】
インスリン−Ｆｃコンジュゲートの調製方法
さらなる態様では、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの調製方法を提供する。
【０１０４】
本発明の方法は、以下の（連続的な）ステップを含む。
Ａ）式ＩＩの中間体化合物を調製すること、
Ｂ）オリゴマー伸長インスリン類似体構築物を式ＩＩの中間体に結合して、式ＩＩＩの中間体化合物を得ること、
Ｃ）Ｆｃの鎖間ジスルフィド結合を還元することにより、それぞれが遊離システインを保持する２つのＦｃモノマーを得ること、および
Ｄ）２つのＦｃモノマーを式ＩＩＩの中間体に結合して、式Ｉのインスリン−Ｆｃコンジュゲートを得ること。
【０１０５】
概して、個々の成分、すなわち、オリゴマー伸長インスリン類似体成分、Ｆｃ成分、およびリンカーは、別個に生成されて、適切な反応条件下で一緒に結合される。
【０１０６】
本発明によるインスリン−Ｆｃコンジュゲートに組み込むためのインスリン成分は、従来のインスリン、インスリン類似体およびインスリン誘導体の調製方法、例えばＷＯ２００８／０３４８８１またはＷＯ２０１６／１９３３８０に概説されるような従来の方法で得てもよい。
【０１０７】
Ｆｃドメインは、ヒトもしくは他の動物から単離された完全長抗体から取得されてもよく、または組換えで製造して、形質転換された哺乳類細胞もしくは微生物から獲得してもよい。Ｆｃドメインを得るための複数の技術が当技術分野で既知である。
【０１０８】
Ｆｃドメインは、パパインまたはペプシンなどのタンパク質分解酵素を用いた消化によって完全長抗体から製造することができる。アフィニティクロマトグラフィーおよびＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、結果得られるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２を、Ｆｃドメインから分離することができる。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析に基づいて、Ｆｃ断片の純度を確認することができる。
【０１０９】
組換え法を使用する場合、所望のポリペプチドを発現させ、その後Ｆｃドメインを精製することが可能である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、形質転換された微生物または哺乳類細胞から得られたヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインなどのヒト由来のＦｃドメインである。
【０１１０】
加えて、本発明のＦｃ断片は、天然型と比較して増加した糖鎖もしくは天然型と比較して減少した糖鎖である、天然糖鎖を有する形態であってもよく、または、アグリコシル化した形態であってもよい。Ｆｃ断片の糖鎖の増加、減少または除去は、化学的方法または酵素法などの当技術分野で知られている方法によって達成され得る。そうでなければ、天然グリコシル化部位である２９７位のアスパラギンを、分子工学によって、例えばアラニンに突然変異させることができる。組換えＤＮＡ技術法が微生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用している場合、生成したＦｃはアグリコシル化されていることとなる。
【０１１１】
本明細書に記載の方法は、結合しようとするタンパク質の少なくとも１つが遊離システインを含む場合にタンパク質コンジュゲートを調製するのに適している。遊離システインは、チオール反応性結合を介して結合化できるシステイン残基である。遊離Ｃｙｓは通常、タンパク質内ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基である。遊離システインは、遊離Ｃｙｓを有するタンパク質が、他の硫黄含有分子、通常はタンパク質が生成および精製されたときに細胞抽出物中に存在する小さな有機分子と、混合ジスルフィドを形成することができるように、結合化反応の前に遊離している必要がある。
【０１１２】
遊離システインはまた、既にあるジスルフィド結合を還元させることによって生成されてもよく、これは、ＴＣＥＰ、ＢＳＰＰなどのトリアルキルホスフィンを含む還元剤を使用して、またはＤＴＴ、メルカプトエタノールなどのチオールとともに、２つの遊離システインを利用可能にさせることとなる。
【０１１３】
一実施形態では、２つの等価なシステインは、Ｆｃドメインの２つのモノマーポリペプチドを隣接させるジスルフィド結合を含むＦｃドメインの還元によって生成され得る。
【０１１４】
さらなる実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、ＩｇＧ１−ＦｃポリペプチドまたはＩｇＧ４−Ｆｃポリペプチド断片の２２９位における、Ｆｃドメインのヒンジ領域における単一の鎖間ジスルフィド結合を含む。こうした断片は、本明細書に記述した方法を使用して、三価リンカーの２つのアームと連結されてもよい。結果として得られるタンパク質コンジュゲート（またはコンジュゲート中間体）は、Ｆｃドメイン（Ｆｃポリペプチド）との二官能性の対称的結合と、インスリン成分［Ｉｎｓ−（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ（ａａ１）ＫＰ］と結合した第３のアームとを有することとなる。
【０１１５】
本明細書に記載されるように、リンカーは、リジンのイプシロンアミノ基を介してインスリン類似体と共有結合する。リジンは通常、タンパク質に豊富に含まれ、したがって選択的結合に適していない。しかしながら、本発明により使用するインスリン類似体は、１つのリジン残基のみを保持する。
【０１１６】
一実施形態では、Ａ鎖伸長のＣ末端配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（ＫＰ）の末端に位置するリジン残基が、結合部位として使用される。
【０１１７】
医薬組成物
本発明は、医薬として有用なインスリン−Ｆｃコンジュゲートに関し、特に代謝疾患もしくは障害もしくは症状の治療、予防または緩和のために使用される。
【０１１８】
本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートまたは薬剤的に許容可能な塩、アミド、またはそのエステルおよび薬剤的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の方法に従って調製されてもよい。
【０１１９】
したがって、別の態様では、本発明は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの治療有効量を、随意に１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体および／または希釈剤と共に含んだ、新規の医薬組成物を提供する。
【０１２０】
「賦形剤」という用語は、広く、活性治療成分以外の任意の成分を指す。賦形剤は、非活性物質、不活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であってもよい。
【０１２１】
従来の技術を用いて、注射可能な組成物を調製してもよく、通常、所望の最終産物を得るのに適した成分を、必要であれば等張剤、防腐剤および／または緩衝液を追加して、溶解および混合することと、必要であれば例えば塩酸である酸、または例えば水酸化ナトリウム水溶液である塩基を使用して、溶液のｐＨ値を調節することとを含む。最後に、溶液の体積を、水で調節して、所望の濃度の成分をもたらしてもよい。
【０１２２】
組成物は安定化された製剤でもよい。「安定化された製剤」という用語は、物理的安定性および／または化学的安定性が増加した、好ましくはこの両方が増加した製剤を指す。概して、製剤は、有効期限に到達するまで、使用中および保管中（推奨される使用条件および保管条件に準拠した）において安定していなければならない。
【０１２３】
溶液または懸濁剤は、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートを水性溶媒中に溶解することによって作製され得る。
【０１２４】
治療方法
本発明は、治療用途の薬物に関する。より具体的には、本発明は、ヒトを含めた生体動物体の代謝疾患もしくは障害もしくは症状の治療または予防のための本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの使用に関し、この方法は、それを必要とするかかる生体動物体に、治療有効量の本発明によるインスリン−Ｆｃコンジュゲートを投与するステップを含む。
【０１２５】
一実施形態では、本発明は、糖尿病に関連する病状を治療または緩和する方法を提供する。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、ヒトを含めた生体動物体の疾患もしくは障害もしくは症状を治療または緩和する方法を提供するものであって、疾患、障害または症状は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質代謝異常、肥満症、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム硬化症、心筋梗塞、脳卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、胃腸障害もしくは胃潰瘍に関連する、疾患、障害または症状から選択され得、上記方法は、治療有効量の本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０１２７】
第３の実施形態では、本発明は、ヒトを含めた生体動物体の疾患もしくは障害もしくは症状を治療または緩和する方法を提供するものであって、疾患、障害または症状は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質代謝異常、肥満症もしくはメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）に関連する、疾患、障害または症状から選択され得る。
【０１２８】
第４の実施形態では、本発明は、ヒトを含めた生体動物体の疾患もしくは障害もしくは症状を治療または緩和する方法を提供するものであって、疾患、障害または症状は、糖尿病、特に１型糖尿病または２型糖尿病に関連する、疾患、障害または症状から選択され得る。
【０１２９】
特定の実施形態
本発明は、本発明の以下の非限定的実施形態によってさらに説明される：
１．以下の式Ｉで表される、インスリン−Ｆｃコンジュゲートであって、
【化１３】
2022502467.tif 000014
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である、インスリン−Ｆｃコンジュゲート。
２．（ａａ１）が存在しない、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
３．（ａａ１）が存在しない、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
４．Ｉｎｓが、インスリン類似体［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリンである、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
５．Ｉｎｓが、アミノ酸置換Ｂ１６Ｈまたはアミノ酸置換Ｂ１６Ｅをさらに含むインスリン類似体を表す、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
６．Ｉｎｓが、［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン、［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリン、および［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリンから選択されるインスリン類似体を表す、実施形態５に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
７．Ｉｎｓが、Ｂ１６Ｈ置換をさらに含むインスリン類似体を表す、実施形態６に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
８．Ｉｎｓが、インスリン類似体［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリンである、実施形態７に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
９．Ｉｎｓが、Ｂ１６Ｅ置換をさらに含むインスリン類似体を表す、実施形態６に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
１０．Ｉｎｓが、インスリン類似体［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０］ヒトインスリンである、実施形態９に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
１１．オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートが、
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート、
（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲート、および
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートから選択される、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
１２．オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートが、（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートである、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【化１４】
2022502467.tif 000015
１３．オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートが、（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートである、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【化１５】
2022502467.tif 000016
１４．オリゴマー伸長インスリン−Ｆｃコンジュゲートが、（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートである、実施形態１に記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
【化１６】
2022502467.tif 000017
１５．中間体化合物Ｉｎｓ−（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）−ＫＰであって、
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）である、中間体化合物。
１６．（ａａ１）が存在しない、実施形態１５に記載の中間体化合物。
１７．（ａａ１）がプロリン（Ｐ）である、実施形態１５に記載の中間体化合物。
１８．インスリン類似体が、アミノ酸置換Ｂ１６ＨまたはＢ１６Ｅをさらに含む、実施形態１５〜１７のいずれか１つに記載の中間体化合物。
１９．中間体化合物が、
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．１の化合物）、
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．２の化合物）、および
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．３の化合物）の群から選択される、実施形態１５〜１８のいずれか１つに記載の中間体化合物。
２０．式ＩＩの中間体化合物であって、
【化１７】
2022502467.tif 000018
式中、
ＬＧ１は、第一級アミノ基に対して反応する脱離基を表し、
ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す、中間体化合物。
２１．中間体化合物が、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートである、実施形態２０に記載の中間体化合物。
【化１８】
2022502467.tif 000019
２２．式ＩＩＩの中間体化合物であって、
【化１９】
2022502467.tif 000020
式中、Ｉｎｓは、ヒトインスリンの類似体を表し、インスリン類似体は、Ａ鎖およびＢ鎖を含む二鎖インスリン分子であり、インスリン類似体は、アミノ酸置換Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、および欠失ｄｅｓＢ３０を含み、
（ＧＥＱＰ）１１−ＧＱＥ−（ａａ１）は、インスリンＡ鎖のＣ末端に融合された組換え伸長であり、
（ａａ１）は存在しないか、またはプロリン（Ｐ）であり、
各ＬＧ２は、チオール反応性基の脱離基を表す、中間体化合物。
２３．インスリン類似体が、アミノ酸置換Ｂ１６ＨまたはＢ１６Ｅをさらに含む、実施形態２２に記載の中間体化合物。
２４．各ＬＧ２がＢｒを表す、実施形態２２または２３のいずれか１つに記載の中間体化合物。
２５．中間体化合物が、
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２０】
2022502467.tif 000021
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２１】
2022502467.tif 000022
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの群から選択される、実施形態２２に記載の中間体化合物。
【化２２】
2022502467.tif 000023
２６．２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）である、中間体化合物。
２７．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲートと、１つ以上の薬剤的に許容可能な担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
２８．医薬として使用するための実施形態１〜１４のいずれかに記載のインスリン−Ｆｃコンジュゲート。
２９．ヒトを含めた生体動物体の疾患もしくは障害もしくは症状の、治療または緩和に用いる、実施形態１〜１４のいずれかに記載のインスリンＦｃコンジュゲートであって、疾患、障害または症状は、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質代謝異常、肥満症、メタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）、高血圧症、認知障害、アテローム硬化症、心筋梗塞、脳卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、胃腸障害または胃潰瘍に関連する、疾患、障害または症状から選択され得る、実施形態１〜１４のいずれかに記載のオリゴマー伸長インスリンＦｃコンジュゲート。
３０．ヒトを含めた生体動物体の代謝疾患もしくは障害もしくは症状を治療、予防または緩和する方法であって、方法が、治療有効量の実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のインスリンＦｃコンジュゲートを、それを必要とするかかる生体動物体に投与するステップを含む、方法。
【実施例】
【０１３０】
この発明について、以下の実施例を参照しながらさらに説明するが、決して請求される本願発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１３１】
以下の実施例および全般的手順は、本明細書および合成スキームで特定された中間体化合物および最終産物に言及する。本発明の化合物の調製について、以下の実施例を使用して詳細に記載しているが、記載の化学反応は、本発明の化合物の調製に対するそれらの一般的適用可能性に関して開示されている。
【０１３２】
時には、本発明の開示された範囲内に含まれる各化合物に対して、反応が記載どおりには適用可能でないこともあり得る。これが生じる化合物は、当業者によって容易に認識されるであろう。これらの場合、当業者に既知の従来の修正によって、すなわち、干渉する基の適切な保護、他の従来の試薬への変更、または反応条件の通例の修正によって、反応を首尾よく実行することができる。代替的には、本明細書に開示される他の反応または別の従来の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されることとなる。すべての調製方法では、すべての出発物質は既知であるか、または既知の出発物質から容易に調製され得る。
【０１３３】
すべての温度は摂氏温度で表されており、別段の指示がない限り、収率に言及する場合すべての部および割合は重量によるものであり、また溶媒および溶離液に言及する場合すべての部は体積によるものである。
【０１３４】
材料および方法
略語リスト
ＡＯＣ：曲線上面積
ＡＵＣ：曲線下面積
ＢＧ；血糖
ＢＨＫ：ベビーハムスター腎臓
ＢＳＰＰ：ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩
ＣＶ：カラム容量
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＣＤ：エクトドメイン
ＥＤＣ：Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＥＡ：エタノールアミン
ＥｔＯＨ：エタノール
ＨＥＰＥＳ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＨＩ：ヒトインスリン
ＨＭＷＰ：高分子量生成物
ＨＡＳ：ヒト血清アルブミン
ＩＧＦ−１Ｒ：インスリン成長因子１受容体
ＩＲ：インスリン受容体
ＩＲ−Ａ：インスリン受容体アイソタイプＡ
ＩＲ−Ｂ：インスリン受容体アイソタイプＢ
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＬＯＱ：定量下限
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭＱ：ＭｉｌｉＱ水
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ：薬力学
ＰＫ：薬物動態学
Ｒｔ：保持時間
ＲＴ：室温
ＲＰ：逆相
Ｓ．ｃ．：皮下
ＳＰ：スルホ−プロピル
ＳＰＡ：シンチレーション近接アッセイ
ＳＴＺ：ストレプトゾトシン
ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＩＶ：総イオン数
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、または２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール
ＷＧＡ：コムギ胚芽凝集素
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
【０１３５】
全般的な検出および特徴づけの方法
ＬＣＭＳ法１
システム：アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１２９０  ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ
ＵＰＬＣカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  ｗｉｄｅｐｏｒｅ  ３，６μ  Ｃ４  ５０ｘ２，１ｍｍ
検出器：アジレント・テクノロジー株式会社  ＬＣ／ＭＳＤ  ＴＯＦ  ６２３０（Ｇ６２３０Ａ）；
検出器セットアップ：イオン化法：アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）Ｊｅｔ  Ｓｔｒｅａｍソース  スキャン範囲：ｍ／ｚ最小１００、ｍ／ｚ最大３２００  直線リフレクター  モード  ポジティブモード
条件：ステップグラジエント：Ｂを５％〜９０％、グラジエント実行時間：１０分：０〜１分でＢを５〜２０％、１〜７分でＢを２０〜９０％、７〜８分でＢを９０％、８〜８．５分でＢを９０〜５％、８．５〜１０分でＢを５％
流量：０．４０ｍＬ／分固定  カラム温度：４０℃
溶離液：溶媒Ａ：９９．９０％のＨ２Ｏ、０．０２％のＴＦＡ  溶媒Ｂ：９９．９０％のＣＨ３ＣＮ、０．０２％のＴＦＡ  溶媒Ｃ：該当せず
【０１３６】
ＬＣＭＳ法２
システム：ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラス  ＳＱＤ２  ２０００
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  １．７μ  Ｃ１８  １００Å  ２．１×５０ｍｍ。部品番号：１８６００２３５０
検出器：ＵＶ：ＰＤＡ、ＳＱＤ  ２０００
検出器セットアップ：イオン化法：ＥＳ＋スキャン範囲：５００〜２０００  コーン電圧：６０Ｖ  スキャン時間：０．５
条件：直線グラジエント：Ｂを１０％〜８０％グラジエント実行時間：２．５０分  合計実行時間：４分  流量：０．３ｍＬ／分（０〜２．５１分）および０．８ｍＬ／分（２．５１〜４．００分）
カラム温度：４０℃  ＰＤＡ：２１０〜４００ｎｍ
溶離液：溶媒Ａ：９９．９０％のＨ２Ｏ、０．１％のＴＦＡ  溶媒Ｂ：９９．９０％のＣＨ３ＣＮ、０．１％のＴＦＡ  溶媒Ｃ：ＮＡ
【０１３７】
ＬＣＭＳ法３
ＬＣ−システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈクラス
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍｘ５０ｍｍ
検出器：ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏｆ
検出器セットアップ：イオン化法：ＥＳスキャン範囲：５０〜４０００ａｍｕ
操作モード：ＭＳレゾリューションモード  ポジティブ／ネガティブ：ポジティブモード  電圧：キャピラリー
３．００ｋＶ；試料コーン  ８０Ｖ、ソース  ６０Ｖ  温度：ソース  １５０℃、脱溶媒  ５００℃、スキャン時間  ０．５００秒  インタースキャンディレイ（Ｉｎｔｅｒｓｃａｎｄｅｌａｙ）：０．０１４秒
条件：直線グラジエント：Ｂを５％〜９５％  グラジエント実行時間：４．０分  合計実行時間：７．０分  流量：０．４ｍＬ／分、カラム温度：４０℃
溶離液：溶媒Ａ：９９．９０％のＭＱ水、０．１％のギ酸  溶媒Ｂ：９９．９０％のアセトニトリル、０．１％のギ酸  溶媒Ｃ：９９．９９％のＭＱ水、０．０１％のＴＦＡ
グラジエント：Ａ  ９０〜０％、Ｂ  ５〜９５％、Ｃ  ５％
【０１３８】
結果の仕様と検証：化合物の実測質量（Ｍａｓｓ  ｆｏｕｎｄ）はＭ／ｚであり、これは化合物の検出された分子イオン（（Ｍ＋ｚ）／ｚ）である。計算した質量は、所望の化合物の分子量である。計算Ｍ／ｚは、所望の化合物の分子量（Ｍ＋ｚ）／ｚである。純度：システムソフトウェアによって報告された、溶媒ピークを除外した合計ＡＵＣの割合における分析物ピークの全イオン電流値（ＴＩＣ）のＡＵＣ。同定：各分析対象物の質量ピークの質量は、最大から最小までｍ／ｚで表される。スキャン範囲は、使用する方法でスキャンされる範囲である。検出方法は例えば、直線リフレクターである。
【０１３９】
［実施例１］  ［本発明のオリゴマー伸長インスリン化合物の調製］
本発明により使用するオリゴマー伸長融合インスリン化合物は、例えば、ＷＯ２０１６／１９３３８０（Ａ１）パンフレットに記載されるように、当技術分野で既知の様々な技術によって製造されてもよい。
【０１４０】
［実施例１．１］  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの調製］、Ｂ２９Ｒ、Ｂ２５Ｈ、Ａ７１Ｐ、Ａ７０Ｋ、１２Ａ２２（ＧＱＥＰ）、［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ
表題化合物は、（ＧＱＥＰ）１２−ＫＰのＣ末端Ａ鎖伸長を有するインスリン類似体Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１０のＡ鎖、配列番号４のＢ鎖）である。
【０１４１】
インスリンコードＤＮＡを、組換え伸長のＤＮＡコードと融合した。このＤＮＡを酵母にクローニングし、インスリンを発現および収集した。伸長したインスリンを、二鎖伸長インスリンに切断される単鎖前駆体として発現した。
【０１４２】
ＳＰセファロースでの前駆体の捕捉：
ＳＰカラム（約２００ｍＬ）を０．５ＭのＮａＯＨで再生し、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５で平衡化した。捕捉ラン（カチオン交換）を２０℃で行った。酵母上清を、水で１：１に希釈し、１０〜２０ｍＬ／分の流量で充填した。０，１Ｍのクエン酸、ｐＨ３，５での洗浄、および６０％のＥｔＯＨでの洗浄を実施した。類似体を０，２ＭのＮａ−酢酸塩ｐＨ５，５／４０％ＥｔＯＨで溶出した。ＳＰプール（約６００ｍＬ）を水で２回希釈し、５０ｍＭのグリシンを加えた。ｐＨを９．３に調節し、インスリン１グラム当たり３〜５ｍｇのトリプシンを加えた。ＵＰＬＣで反応を追跡した。３時間後、クエン酸を加え、ｐＨを３．５に調節して、５０ｍｍの１５μ  Ｇｅｍｉｎｉカラムで精製した。
カラム：１０μｍ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８  ５０×２５０ｍｍ  ２００Å、４７７ｍＬ
緩衝液：Ａ：１０ｍＬのギ酸／５Ｌの１０％ｗ／ｗアセトニトリル
Ｂ：７０％  ｗ／ｗアセトニトリル
グラジエント：１０〜５０％Ｂ緩衝液。
グラジエント時間：１２０分。
流量：８０ｍＬ／分。
ＬＣＭＳによって（ＬＣＭＳ法１を使用して）決定されたインタクトな質量：
計算平均質量１０７９５．０；実測平均質量１０７９６．０
【０１４３】
［実施例１．２］  ［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの調製］
表題化合物は、（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥＫＰのＣ末端Ａ鎖伸長を有するインスリン類似体Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである。
【０１４４】
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１１のＡ鎖、配列番号５のＢ鎖）を、実施例１．１に記載される手順に従って調製した。
ＬＣＭＳによって（ＬＣＭＳ法１を使用して）決定されたインタクトな質量：
計算平均質量１０６７２．０；実測平均質量１０６７３．０
【０１４５】
［実施例１．３］  ［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの調製］
表題化合物は、（ＧＱＥＰ）１１−ＧＱＥＫＰのＣ末端Ａ鎖伸長を有するインスリン類似体Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである。
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１１のＡ鎖、配列番号６のＢ鎖）を、実施例１．１に記載される手順に従って調製した。
ＬＣＭＳによって（ＬＣＭＳ法１を使用して）決定されたインタクトな質量：
計算平均質量１０６６４．４；実測平均質量１０６６５．０
【０１４６】
［実施例２］  ［Ｆｃ成分の調製］
２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）の調製
ＭＡＧＰ−ＩｇＧ４  Ｆｃアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（２２５Ｍ、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７、ＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））を、Ｔ７プロモーターの制御下で修飾ベクター（ｐＥＴ−１１ベース）に挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）由来宿主株に形質転換した。
（ＡＧＰＣＰＡＰＥＡＫＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＥＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＱＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＱＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ）
次いで、２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）（配列番号７）を、封入体としてＥ．ｃｏｌｉから高レベルで生成した。この封入体を蒸留水を用いて２回洗浄し、６Ｍ尿素、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０中で１０ｍｇ／ｍＬで可溶化した。可溶化された封入体を、リフォールディング溶液（２０ｍＭ  ＥＡ、ｐＨ１０．０、３．３Ｍ尿素、０．１２５ｍＭシステイン、０．１２５ｍＭシステイン、ｐＨ８．５）に素早く希釈し、一晩で最終濃度１ｍｇ／ｍＬにした。リフォールディングしたタンパク質を、ＡＩＥＸ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用して捕捉した
緩衝液：Ａ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、Ｂ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５
グラジエント：１５〜３０％、１５ＣＶ
第２のカラム陰イオン交換Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ
緩衝液：Ａ：２０ｍＭのＨｉｓ、ｐＨ６．２、Ｂ：２０ｍＭのＨｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５
グラジエント：１０〜４０％、２０ＣＶ
精製されたＦｃ分子を、最終的に１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ中で可溶化した。
ＬＣＭＳによって（ＬＣＭＳ法１を使用して）決定されたインタクトな質量：
計算平均質量４９５８３．３；実測平均質量４９５８５．０
【０１４７】
［実施例３］  ［インスリン類似体の誘導体化のためのリンカーの調製］
（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートの合成
【化２３】
2022502467.tif 000024
３，５−ジアミノ安息香酸（０．５ｇ）を５ｍＬ無水ＤＭＦ中に溶解した。反応物を氷上で冷却し、一方、ＤＭＦ（１．８ｍＬ）中に溶解したブロモ酢酸無水物（１．８ｇ）を＋５℃で反応物に滴下した。氷浴を除去し、反応物を室温で４時間撹拌した。反応物に５０ｍＬの氷冷水を加え、灰色の沈殿物を形成した。混合物を冷蔵庫内で一晩保存した。沈殿物を濾過し、水で洗浄した。沈殿物を２−メチル−テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。残渣に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４１６ｍｇ）およびＤＩＣ（１．０ｍＬ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、混合物を減圧濃縮した。アセトニトリル（２０ｍＬ）を加え、尿素を濾過した。濾液を、約５ｍＬまで減圧下で減少させた。ジエチルエーテルから析出させた。析出物を洗浄し、遠心分離を２回行った。単離された化合物を窒素気流下で減圧乾燥した。
ＬＣＭＳ法３：ｍ／１：計算値４９２．１；実測値４９１．９。
【０１４８】
［実施例４］  ［インスリン誘導体の調製］
オリゴマー伸長インスリン類似体と連結基とを含む代表的なインスリン誘導体の調製が、実施例４．１に与えられる。実施例４．２〜４．３のインスリン誘導体は、別段の記載がない限り、実施例４．１で提供する方法により調製される。 
【０１４９】
［実施例４．１］［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成］
【化２４】
2022502467.tif 000025
０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（１０ｍＬ）およびアセトニトリル（２ｍＬ）中のＡ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．１）（４００ｍｇ）の溶液を、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ１１．１に調節した。ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中に溶解した実施例３の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエート（４５ｍｇ）を激しい撹拌下で滴下した。ｐＨを１１．１に再調節した。２０分後、ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中の追加の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエート（１８ｍｇ）を添加した。４０分後、ｐＨをＴＦＡで２．０に調節し、水を最大４０ｍＬ添加した。ＲＰクロマトグラフィーで精製した。
カラム：フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ、ＡＸＩＡ、５μ、Ｃ１８、１１０Å、３０×２５０ｍｍ
緩衝液：Ａ：水中０．１％のＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
グラジエント：４０分間にわたってＢを２０〜５０％
生成物プールを凍結乾燥して、表題化合物を２７％の収率で得た。
ＬＣＭＳ法２：計算質量：１１１７１．５；実測質量：１１１７０．０、Ｒｔ  １．３１分
【０１５０】
［実施例４．２］  ［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成］
【化２５】
2022502467.tif 000026
表題化合物を、Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．２）、および実施例３の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートから、実施例４．１に記載される通常のリンカーとのインスリン結合手順にならって調製した。
ＬＣＭＳ法２：計算質量：１１０４８．４；実測質量：１１０４８．０、Ｒｔ  １．２６分
【０１５１】
［実施例４．３］  ［Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成］
【化２６】
2022502467.tif 000027
表題化合物を、Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（実施例１．３）、および実施例３の（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾエートから、実施例４．１に記載される通常のリンカーとのインスリン結合手順にならって調製した。
ＬＣＭＳ法２：計算質量：１１０４０．４；実測質量：１１０４１．０、Ｒｔ  １．３１分
【０１５２】
［実施例５］  ［インスリン−Ｆｃコンジュゲートの調製］
代表的なインスリン−Ｆｃコンジュゲートの調製は、実施例５．１に与えられる。実施例５．２〜５．３のインスリンコンジュゲートを、別段の記載がない限り、実施例５．１で提供する方法により調製した。
【０１５３】
［実施例５．１］  ［（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ＾、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートの調製］
【化２７】
2022502467.tif 000028
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（６０ｍＬ）中７．３５ｍｇ／ｍＬの実施例２の２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）（４４１ｍｇ）に、ＥＤＴＡ（１２５ｍｇ）を添加した。水中（１ｍＬ）に溶解したＢＳＰＰ（３８ｍｇ）を添加し、室温で１８時間、穏やかに撹拌した。４１２ｍＬのＧ−２５  ｆｉｎｅ  ｓｅｐｈａｄｅｘ脱塩カラムを使用して、混合物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５にバッファー交換した。ｐＨ７．６の溶出プール（９５ｍＬ）に、水（５ｍＬ）に溶解し、室温でアセトニトリル（１ｍＬ）を滴下した実施例４．１のＡ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１２、Ａ７０Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７１Ｐ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（１００ｍｇ）を添加した。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで７．６に調節し、室温で一晩撹拌した。反応物を水（１００ｍＬ）で希釈し、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで８．９に、導電率３．０５ｍＳ／ｃｍに調節し、陰イオン交換により精製した。
Ａ緩衝液：ｐＨ９．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（１，５ｍＳ／ｃｍ）
Ｂ緩衝液：ｐＨ９．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（４３ｍＳ／ｃｍ）
流量：３５ｍＬ／分
グラジエント、ステップ：１ＣＶにわたってＢを０〜３０％、１ＣＶにわたってＢを３０％、４ＣＶにわたってＢを３０〜７０％Ｂ、３ＣＶにわたってＢを７０〜９０％
化合物プールを水にバッファー交換し、続いて、凍結乾燥した。
カラム：脱塩カラム、４００ｍＬ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｆｉｎｅ
生成物プールを凍結乾燥した。収率４３％。
ＬＣＭＳ法１：計算質量：６０５９５．０；実測質量：６０５９６．３
【０１５４】
［実施例５．２］［（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートの調製］
【化２８】
2022502467.tif 000029
表題化合物を、実施例４．２のＡ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、および実施例２の２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）から、実施例５．１に記載される通常のインスリンＦｃ結合手順にならって、合成した。
ＬＣＭＳ法１：計算質量：６０４７１．９；実測質量：６０４７３．１
【０１５５】
［実施例５．３］  ［（Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ＾、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン）／（２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７））３，５−ビス［（２−アセチル）アミノ］ベンゾイルコンジュゲートの調製］
【化２９】
2022502467.tif 000030
表題化合物を、実施例４．３のＡ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２（ＧＱＥＰ）１１、Ａ６６Ｇ、Ａ６７Ｑ、Ａ６８Ｅ、Ａ６９Ｋ（Ｎ（ｅｐｓ）−３，５−ビス［（２−ブロモアセチル）アミノ］ベンゾイル）、Ａ７０Ｐ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、および実施例２の２２６Ａ、２２７Ｇ、２２８Ｐ、２３４Ａ、２３５Ｋ、２９７Ｅ、３１５Ｑ、３８４Ｑ、ｄｅｓ４４７  ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（２２６−４４７）から、実施例５．１に記載される通常のインスリンＦｃ結合手順にならって、合成した。
ＬＣＭＳ法１：計算質量：６０４６３．８；実測質量：６０４６５．９
【０１５６】
［実施例６］  ［可溶化受容体上で測定されたインスリン受容体親和性］
ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する本発明のインスリン誘導体の相対的結合親和性を、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）における競合結合（Ｇｌｅｎｄｏｒｆ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，４７４３−４７５１に従うもの）によって決定する。表１の結果を参照されたい。インスリン受容体Ａに対するヒトインスリンの親和性（１００％）に対する親和性が、報告されている。
【０１５７】
簡潔には、ヒトインスリン標準および試験されるインスリン類似体の希釈系列を９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、その後、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＮａＣＩ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０からなる結合緩衝液中、［１２５Ｉ−Ａ１４Ｙ］−ヒトインスリン、抗ＩＲマウス抗体８３−７、可溶化ヒトＩＲ−Ａ（ＩＲ−Ａホロ受容体を過剰発現するベビーハムスター１５腎臓（ＢＨＫ）細胞由来の小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーにより半精製されたもの）、およびＳＰＡビーズ（抗マウスポリビニルトルエンＳＰＡビーズ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加する。プレートを、穏やかに振盪しながら２２°Ｃで２２〜２４時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計数する。
【０１５８】
ＳＰＡからのデータを、４パラメータロジスティックモデル（Ｖｏｌｕｎｄ  Ａ（１９７８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ３４  ３５７−３６５）に従って分析し、類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準の結合親和性と比較して計算する。
【表１】
2022502467.tif 000031
【０１５９】
データは、本発明の試験された化合物のすべてが、ヒトインスリンと比べて０．４〜４．５％の範囲でインスリン受容体に結合することを示す。これらの親和性は、インビボ投与後に血糖低下を促進するのに十分であると考えられる。
【０１６０】
［実施例７］  ［膜関連受容体上で測定されるインスリンおよびインスリン様成長因子−１受容体親和性］
膜関連ヒトＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒを、ヒトＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ、またはＩＧＦ−ＩＲインサートのいずれかを含むｐＺｅｍ２１９Ｂベクターで安定的にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から精製する。ＢＨＫ細胞を収集し、氷冷緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＣａＣＩ２、および１ｍＭ  ＭｇＣＩ２、２５０ｍｇ／Ｌバシトラシン、０．１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ）中でホモジナイズする。ホモジネートを４１％（ｗ／ｖ）のスクロースクッション上に層状にし、４°Ｃおよび９５０００ｇで７５分間遠心分離する。原形質膜を収集し、緩衝液（上述のもの）で１：５に希釈し、４°Ｃおよび４００００ｇで４５分間再度遠心分離する。ペレットを最小緩衝液体積中で再懸濁し、針（サイズ２３）を通して３回引き抜いた後に、使用するまで−８０°Ｃで保管する。膜関連ヒトＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ、またはＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対する相対的結合親和性を、ＳＰＡ設定での競合結合によって決定する。ＩＲアッセイを、９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、二連で行う。膜タンパク質を、穏やかに撹拌しながら、全体積２００ｐＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ１８８７）中５０ｐＭの［１２５ＩＡ１４Ｙ］−ヒトインスリン、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤）、５０μｇの小麦胚芽凝集（ＷＧＡ）コーティングＰＶＴミクロスフェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および増加濃度のリガンドと２５°Ｃで１５０分間インキュベートする。アッセイを、プレートを２０００ｒｐｍでの２分間の遠心分離によって終了し、結合放射能を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計数することによって定量する。
【０１６１】
膜関連ＩＧＦ−１Ｒおよび５０ｐＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ３１］−ヒトＩＧＦ−１を用いたことを除いて、ＩＧＦ−１ＲアッセイをＩＲ結合アッセイについて本質的に行う。ＳＰＡからのデータを、４パラメータロジスティックモデル（Ｖｏｌｕｎｄ  Ａ（１９７８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ３４  ３５７−３６５）に従って分析し、試験される類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準の結合親和性と比較して計算する。
【０１６２】
本発明の化合物のＩＲ（Ａアイソフォーム）、ＩＲ（Ｂアイソフォーム）、およびＩＧＦ−１Ｒ結合データを以下の表２に示す。
【０１６３】
データは、本発明の試験された化合物のすべてが、ヒトインスリンと比べて０．６〜３．１％の範囲でインスリン受容体ＡおよびＢに結合することを示す。これらの親和性は、インビボ投与後に血糖低下を促進するのに十分であると考えられる。さらに、データは、本発明の化合物が、ＩＲ−ＡおよびＩＲ−ＢよりもＩＧＦ１Ｒに低い親和性（０．３％〜０．９％）で結合することを示す。
【表２】
2022502467.tif 000032
【０１６４】
［実施例８］  ［ラット脂肪細胞における脂質生成］
本発明のインスリンコンジュゲートのインビトロ効力の尺度として、脂質生成を使用することができる。初代ラット脂肪細胞を精巣上体脂肪パッドから単離し、例えば、０．１％の脂肪を含まないＨＳＡおよび標準（ヒトインスリン、ＨＩ）または本発明のインスリンコンジュゲートのいずれかを含有する緩衝液中３Ｈ−グルコースとインキュベートする。標識グルコースを用量依存的方法で抽出可能な脂質に変換し、完全用量反応曲線を得る。結果を、標準（ＨＩ）と比較した本発明のインスリンの９５％信頼限界での相対的効力（％）として表す。
【０１６５】
データを以下の表３に示す。
データは、本発明の試験された化合物のすべてが、ヒトインスリンと比べて０．６〜２．９％の範囲で脂質生成に対する効力を有することを示す。これらの親和性は、インビボ投与後に血糖低下を促進するのに十分であると考えられる
【表３】
2022502467.tif 000033
【０１６６】
［実施例９］  ［インビボＰＫ／ＰＤ試験］
インスリン−Ｆｃコンジュゲートを、正常およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットへの皮下（ｓ．ｃ．）投与によりインビボで試験した。正常ラットは、投与時に約３００ｇの体重を有した。ＳＴＺ処置ラットは、投与時に約４００ｇの体重を有し、インスリン−Ｆｃコンジュゲート投与の４日前に糖尿病を誘発するために、４０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｎｏ．Ｓ０１３０）で静脈内処置した。
【０１６７】
ラットに、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのインスリン−Ｆｃコンジュゲートを用いて頸部領域に皮下投与した。血糖および血漿のインスリン分析のための血液試料を、投与後１０日まで舌静脈から採取した。インスリン−Ｆｃ濃度を免疫測定法（ＬＬＯＱ＝１０００ｐＭ）により測定し、皮下投与後の得られた半減期値を表４に示す。正常ラットについてのＰＫプロファイルを図３に、ストレプトゾトシン処置ラットについてのＰＫプロファイルを図６に示す。Ｂｉｏｓｅｎ  Ｓ  Ｌｉｎｅ（ＥＫＦ）を使用して血糖（ＢＧ）を測定し、正常ラットについてのＢＧおよびベースライン補正ＢＧプロファイルを図１および２に、ストレプトゾトシン処置ラットについてのＢＧおよびベースライン補正ＢＧプロファイルを図４および５にそれぞれ示す。さらに、１０日間のベースライン補正ＢＧプロファイル（ＡＯＣＢＧ）の曲線上面積を表５に示す。
【表４】
2022502467.tif 000034
【表５】
2022502467.tif 000035
【０１６８】
データは、本発明の試験された化合物が、正常ラットでは長期間（４〜７日間）、およびストレプトゾトシン処置ラットでは少なくとも１０日間まで、血糖を非常に強く低下させることができたことを示す。
データは、本発明のインスリン−Ｆｃコンジュゲートすべてが、正常ラットおよびストレプトゾトシン処置ラットに投与された場合に、非常に長いＰＫプロファイルを呈することを示す。
【０１６９】
［実施例１０］  ［安定性試験］
安定性試験用の試料の調製
安定性試験用の試料を、８〜１０ｍｇの凍結乾燥材料を秤量することによって調製した。凍結乾燥材料を、予め作製した溶液Ａ（５ｍＭのホスファート（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、および７０ｐｐｍのポリソルベート２０）中で１００μＭに可溶化した。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）および理論的吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を使用して決定した。溶液Ａに希釈して、３０μｍの最終濃度に達した。
【０１７０】
陰イオン交換クロマトグラフィーによる純度
陰イオン交換クロマトグラフィーを、蛍光検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＦＬＲ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＵｌｔｒａ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ）上で実施した。３０℃に保持したＡｇｉｌｅｎｔ製の寸法５０×４．６ｍｍのＢｉｏ  ＳＡＸカラムを、グラジエント溶出モードで使用した。移動相Ａは、２５ｍＭのＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンを有する５／９５（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／水、ｐＨ７．３であり、移動相Ｂは、２５ｍＭのＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンおよび３５０ｍＭのＮａＣｌを有する５／９５（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／水、ｐＨ７．３であった。注入体積は３ｕＬであった。流量を、３分間で１０〜４７％のＢの線形グラジエント、その後、３０分間で４７〜５５％ＢのＢの線形グラジエントで０．５ｍＬ／分に維持した。３３１ｎｍの放射波長および２８０ｎｍの励起波長を用いてピークを検出し、Ｗａｔｅｒｓ製のＥＭＰＯＷＥＲ  ３ソフトウェアを用いてデータ処理を実施する。試料を、他のすべての種に対するパーセントＡＰＩとしての純度について分析した。
△純度％＝純度％（５℃）−純度％（３０℃）として報告する。
【０１７１】
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子量生成物
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ／Ｖｉｓ検出器）を備えたＨｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）上で実施した。３０℃に保持した寸法７．８×３００ｍｍのＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ  ２００Å、３．５μｍカラムを使用した。移動相は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコール（ｖ／ｖ）であった。注入体積は５ｕＬであった。流量を０．５ｍＬ／分に保持した。２１５ｎｍでの吸光度を使用してピークを検出し、Ｗａｔｅｒｓ製のＥＭＰＯＷＥＲ  ３ソフトウェアを用いてデータ処理を実施する。試料を、主ピーク前に溶出する材料の総積分を主単量体ピークと関連付けることによって、高分子量生成物（ＨＭＷＰ）について分析した。すべてのクロマトグラムにおいて、完全なベースライン分離が観察された。
△ＨＭＷＰ％＝ＨＭＷＰ％（５℃）−ＨＭＷＰ％（３０℃）として報告する。
【０１７２】
安定性試験の結果
Ｆｃ−インスリン類似体の安定性を、５℃（対照）対３０℃（熱誘発ストレス）における陰イオン交換クロマトグラフィーからの純度および高分子量生成物（ＨＭＷＰ）の形成を比較することによって評価した。結果は表６に見られる。純度は、対照よりも、ストレスを受けた試料において３〜７％低いことが観察された。ＨＭＷＰの量は、対照と比較して、ストレスを受けた試料において０．５〜２％減少した。すなわち、３０℃でのインキュベーション中に一部の凝集物質が解離した。
【表６】
2022502467.tif 000036
【０１７３】
［実施例１１］  ［ｈＦｃＲｎ  ＥＣＤの結合のＳＰＲ分析］
実施例５．１、５．２および５．３のインスリン−Ｆｃコンジュゲートの粉末を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ８５３７を使用して５ｍｇ／ｍＬで溶解し、次いで、ｐＨ６．０および２５℃の３つのインスリン−Ｆｃコンジュゲート試料についてのｈＦｃＲｎエクトドメインの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００機器を使用して測定した。
【０１７４】
最初に、１０ｕｇ／ｍＬで希釈した３つのインスリン−Ｆｃ試料、および１０ｍＭの酢酸ナトリウム中３０ｕｇ／ｍＬで希釈した野生型ｈＩｇＧ４  Ｆｃ（ＨＥＫ２９３細胞中で生成、すなわち、グリコシル化した）（ｐＨ４．５）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）を、泳動用緩衝液として使用した１ｘＨＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ７．４）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６９）とのアミン結合を介して、使用した各フローセルにおいてスポット２または４、７０〜９０ＲＵで、ＣＭＤ５０Ｌセンサーチップ（ＸａｎＴｅｃ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）上で固定化した。野生型ｈＩｇＧ４  Ｆｃを対照試料として使用した。使用した各フローセルにおいて、固定化前に等体積で混合し、固定化後に１Ｍのエタノールアミン塩酸塩−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）によって遮断した、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および４００ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）によって、スポット２、３および４を活性化した。ＮＨＳ、ＥＤＣ、およびエタノールアミンを、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、タイプ２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６３３）から得た。
【０１７５】
次に、２倍連続希釈で４０００ｎＭにおいて希釈したｈＦｃＲｎエクトドメインを、使用した各フローセルを通して６０秒間注入して、センサーチップ上で固定化したインスリン−Ｆｃコンジュゲートおよび野生型ｈＩｇＧ４  Ｆｃ試料へのｈＦｃＲｎエクトドメインの結合を可能にし、その後、１８０秒間解離した。１ｘＰＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ６．０）を、ｈＦｃＲｎエクトドメインのための希釈緩衝液、および３０ｕＬ／分の流量の各結合サイクルにおける泳動用緩衝液として使用した。各結合サイクルの後、センサーチップを、３０ｕｌ／分の流量の１ｘＰＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ７．４）の６０秒注入で再生した。１ｘＰＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ７．４）緩衝液を、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５７５０３８）を３ｍＭで、１ｘＰＢＳ−Ｐ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８９９５０８４）に希釈することによって調製した。約１０ＭのＨＣｌを使用して１ｘＰＢＳ−ＥＰ＋緩衝液のｐＨを７．４〜６．０に調節することによって、１ｘＰＢＳ−ＥＰ＋（ｐＨ６．０）緩衝液を調製した。親和性（平衡解離定数、ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：１結合モデルを使用して、結合曲線の定常状態フィッティングを介して決定した。
結果を表７に示す。結果は、本発明の化合物の結合が、野生型ｈＩｇＧ４−Ｆｃに匹敵することを示す。
【表７】
2022502467.tif 000037
【０１７６】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2022502467.tif 000049
【図６】
2022502467.tif 000050
【配列表】
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【国際調査報告】
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2022502467.tif 000053
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