【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年2月10日(2010.2.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物の同定アッセイ
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオアッセイに関し、特に、ｍＲＮＡの安定性への影響を持つ生物的に活性した化合物の同定のためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の細胞でのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現は高度に制御されている。従来は、遺伝子が転写レベルで制御されている解明メカニズムがより重要視されてきた。しかしながら、ｍＲＮＡの安定レベルは半減期または分解率にも依存している。ｍＲＮＡ安定性の変化は、多くの真核生物の遺伝子の発現レベルの調節に重要な役割を果たし、ｍＲＮＡ代謝回転の制御に関して異なったメカニズムが提案されてきた（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｙｅｎ、１９８９、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．１：１２１；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０：１９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：３２０；Ｒｏｓｓ、Ｊ．１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：４２３；  Ｓａｃｈｓ、Ａ．Ｂ．、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７４：４１３；Ｓｔａｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１７；Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：２３７）。しかしながら、ｍＲＮＡ安定性の制御は複雑である。制御は、ｍＲＮＡ自体の配列要素、ヌクレアーゼの活性、並びに、トランス活性化因子とｍＲＮＡ安定性配列の決定要因との相互作用に究極的に影響を及ぼす複雑なシグナル伝達経路の関与を含み得る。
【０００３】
近年、ＲＮＡ半減期の制御が、遺伝子発現の厳密な制御に、重要な役割を果たしていること、およびｍＲＮＡ分解が高度に調節されたプロセスであることが、ますます明らかになっている。ＲＮＡ不安定性は、転写速度の変化に対するｍＲＮＡ転写レベルの迅速な上方制御または下方制御を可能にする。多くの臨界的に重要な細胞因子、例えば、ｃ−ｍｙｃなどの転写因子、またはサイトカインなどの宿主免疫応答に関与する遺伝子生成物は、通常の機能を遂行するために、一時的にのみ存在することが求められる。これらの因子をコードするｍＲＮＡの一時的な安定化は、これらのメッセージの蓄積および翻訳が、必要に応じて所望の細胞因子を発現するのを可能にし、一方非安定化正常条件の下では、これらのｍＲＮＡの急速代謝回転速度は、細胞因子の発現を効果的に制限し、「スイッチオフ」する。従って、異常なｍＲＮＡ代謝回転は通常、タンパク質レベルの変化へとつながり、これは細胞の特性を著しく変更し得る。
【０００４】
ｍＲＮＡの安定化は、炎症性のサイトカイン、成長因子、およびいくつかの癌原遺伝子の発現に関与する主な制御メカニズムであると考えられる。疾病状態では、ｍＲＮＡ安定化により、ｍＲＮＡ半減期および疾患関連因子のレベルは有意に上昇する（Ｒｏｓｓ、Ｊ．１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：４２３；Ｓａｃｈｓ、Ａ．  Ｂ．、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７４：４１３；Ｓｔａｔｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｊ．Ｍｏｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２５：１７；Ｗｉｌｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：２３７）。転写速度およびｍＲＮＡ安定性は、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓなどの一時的に発現した遺伝子とＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに対し、しばしば密接的に、かつ協調的に、制御される。加えて、ｍＲＮＡ安定化の異常な制御は、所望でない細胞の形質転換、例えば、瘍形成または不適当で組織を損傷する炎症応答を引き起こす不必要な細胞因子の発達へと導くことができる。
【０００５】
ｍＲＮＡ安定性を制御するメカニズムの理解はまだまだである一方、配列領域は、多くのｍＲＮＡにおいて同定されており、これは、これらを含むｍＲＮＡに不安定性を付与すると考えられる。これらの配列領域を、本明細書中では「ｍＲＮＡ不安定配列」と呼ぶ。例えば、代表的なｍＲＮＡ不安定配列は、ＡＲＥ（アデニレート／ウリジレート（ＡＵ）リッチエレメント）であり、これは多くの前初期遺伝子および炎症サイトカイン、例えば、ＩＬ−ｌβおよびＴＮＦαをコードする遺伝子を含むいくつかの遺伝子の３'ＵＴＲ（３'非翻訳領域）において見出される。特徴が最も知られているＡＵ−リッチエレメントは、ショウ−カメン  ボックス（Ｓｈａｗ−Ｋａｍｅｎ  ｂｏｘ）またはＡＵＵＵＡモチーフと呼ばれている（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ、  １９８６、  Ｃｅｌｌ  ４６：６５９）。複数のＡＵＵＵＡ配列（近接またはタンデムの関係にある）、またはＡＵに富む領域が、ｍＲＮＡ不安定性と関係づけられている。例えば、下記に示す参照文献に記述があるｍＲＮＡ不安定配列は、例えば、ＡＵＵＵＡ；  ＵＡＵＵＵＡＵ；  ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）、およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡから選択される配列モチーフの１つ以上のコピーを含む。不安定性の決定要因として機能するためには、典型的にＡＵＵＵＡモチーフはタンデムに並び、少なくとも１つのＵＵＡＵＵＵＡＵ／ＡＵ／Ａエレメントを形成すべきである（Ｌａｇｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７９８４）。
【０００６】
以下の文献は、ｍＲＮＡ不安定配列およびＡＲＥ、これらが含む配列モチーフおよびｍＲＮＡ不安定化に対する（最小）配列要求並びに多くのｍＲＮＡ不安定配列およびこれらを含む遺伝子の同定の広範囲な議論を含む：
【０００７】
Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，  Ｃｅｌｌ，１９８６，４６：６５９−６６７（ＧＭ−ＣＳＦ）；
Ｓｈｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  &  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９１，１５：２２１−２３１（ｃ−ｆｏｓ）；
Ｓａｃｈｓ，  Ｃｅｌｌ，１９９３，７４：４１３−４２１  （論評"Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ"）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４：４１６−４２６  （ｃ−ｆｏｓ）；
Ａｋａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９４，８３：３１８２−３１８７（ＧＭ−ＣＳＦ  ｅｔｃ．）；
Ｎａｎｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４：４９２０−４９２０（ｕＰＡ）；
Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：２８５９１−２８５９７（ＩＬ−３）；
Ｌａｇｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４：７９８４−７９９５（一般）；
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５：２２３１-２２４４（酵母）；
Ｚｕｂｉａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５：２２１９−２２３０  （一般）；
Ｗｉｎｓｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５：３７９６−３８０４（ｃ−ｆｏｓ，ＧＭ−ＣＳＦ）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５：５７７７−５７８８  （ｃ−ｆｏｓ，ＧＭ−ＣＳＦ）；
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ，１９９５，２０：４６５−４７０（論評）；
Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２７４６−２７５３（ＶＥＧＦ）；
Ｋａｓｔｅｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１９９６，８：７５１−７６１；
Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：２１１２０−２１１２７（ＴＮＦα）；
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１８：４６１１−４６２１（一般）；
Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３：３２２３−３２２９（ヒトβ２−アドレナリン性受容体）；
Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３：１３７８１−１３７８６（ＴＮＦα）；
Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｙ．ａｎｄ  Ｓｈｙｕ，Ａ．−Ｂ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４：８４７１-８４８２；および
Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７２：１９-２８．
【０００８】
この背景情報は、申請者が信じる公知の情報を、本発明に対し関連性の可能を有する情報とする目的で提供されている。いかなる先行情報が本発明に対する従来技術を構成することを必ずしも意図していないし、解釈されるべきでもない。  
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物を同定するアッセイを提供することである。本発明の一態様によれば、検出可能なシグナルを有する１つ以上のタンパク質のコード配列を含む第１のＤＮＡ配列、該コード配列に機能的に関連している１つ以上の３’ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列、および該３’ＵＴＲ配列中へ挿入された、１つ以上の天然の遺伝子由来の１つ以上のｍＲＮＡ不安定性配列に対応する第２のＤＮＡ配列を含む異種性の不安定性配列ＤＮＡ、を含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、検出可能なシグナルを有する第１のタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列、該第１のＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の３'ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列、および前記３'ＵＴＲ配列中へ挿入された異種性の不安定配列ＤＮＡで、その不安定配列ＤＮＡが１つ以上の天然の遺伝子由来の１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応する第２のＤＮＡ配列と、検出可能なシグナルを有する第２のタンパク質をコードする対照ＤＮＡ配列、および該対照ＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の３'ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列を含む対照ＤＮＡ発現ベクター、を含む安定に形質移入された細胞株を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡ安定性に影響する１つ以上の化合物のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験化合物の不在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現でき、ここで前記発現ベクターから転写され、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡが異種性のｍＲＮＡ不安定性配列の少なくとも１つのコピーを含む、ＤＮＡ発現ベクターを提供し、
ｉｉ）該ＤＮＡ発現ベクターを、少なくとも１つの試験化合物と接触させ、それにより、前記試験化合物の不在下で、該ＤＮＡ発現システムが検出可能なシグナルを有する該タンパク質を発現し、
ｉｉｉ）該検出可能なシグナルを測定し、
ｉｖ）該検出可能なシグナルの測定値を対照と比較する、
工程を含み、該対照と比較しての、検出可能なシグナルの測定値の低下は、ｍＲＮＡ安定性を減少させた化合物の存在を示し、検出可能なシグナルの測定値の上昇した場合は、ｍＲＮＡ安定性を高める化合物の存在を示す、前記スクリーニング方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、２つ以上の化合物によって誘導されるｍＲＮＡ分解の程度を比較する方法であって、
ｉ）試験化合物の不在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現でき、ここで前記発現ベクターから転写され、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡが異種性のｍＲＮＡ不安定性配列の少なくとも１つのコピーを含む、ＤＮＡ発現ベクターを提供し、
ｉｉ）該ＤＮＡ発現ベクターを個別に２つ以上の試験化合物と接触させ、それにより、試験化合物の不在下で、該ＤＮＡ発現システムが検出可能なシグナルを有する該タンパク質を発現でき、
ｉｉｉ）各試験化合物の存在下において、該検出可能なシグナルを測定し、
ｉｖ）検出可能なシグナルの測定値を比較し、検出可能なシグナルの測定値の低下がより一層のｍＲＮＡ分解を示す、
工程を含む前記方法を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡを不安定化させる化合物をスクリーニングするアッセイシステムであって、
ｉ）検出可能なシグナルを有する第１のタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の３’ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列、および前記３’ＵＴＲ配列中へ挿入された異種性の不安定配列ＤＮＡで、その不安定配列ＤＮＡが１つ以上の天然の遺伝子由来の１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応する第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベクターと、
ｉｉ）検出可能なシグナルを有する対照タンパク質をコードする対照ＤＮＡ配列、および該対照ＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の３’ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列を含む対照ＤＮＡ発現ベクター、
を含むアッセイシステムを提供する。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡの安定性へ影響する化合物を同定するための化合物ライブラリーをスクリーニングするハイスループット方法であって、
ｉ）試験化合物の不在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現でき、ここで前記発現ベクターから転写され、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡが異種性のｍＲＮＡ不安定性配列の少なくとも１つのコピーを含む、ＤＮＡ発現ベクターを含む、安定に形質移入した細胞株を提供し、
ｉｉ）増殖培地を含む１つ以上のマルチ−ウェルプレートのウェルに前記細胞株を接種させ、
ｉｉｉ）前記１つ以上のマルチ−ウェルプレートを、前記細胞株の細胞が、検出可能なシグナルを有する前記タンパク質を増殖し発現できる条件下に維持し、
ｉｖ）その細胞を１つ以上の試験化合物と接触させ、
ｖ）前記検出可能なシグナルを測定し、
ｖｉ）その検出可能なシグナルの測定値を対照と比較する工程を含み、
検出可能なシグナルの測定値が前記対照と比べ減少した場合は、ｍＲＮＡ安定性を減少させた化合物の存在を示し、検出可能なシグナルの測定値が前記対照と比べ上昇した場合は、ｍＲＮＡ安定性を増強する化合物の存在を示す、ハイスループット方法。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、ｍＲＮＡを不安定化させる化合物をスクリーニングするアッセイシステムを含有するキットを提供し、前記アッセイシステムは、
ｉ）検出可能なシグナルを有するタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列を含む１つ以上のＤＮＡ発現ベクター、該第１のＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の  ３’ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列、および前記３’ＵＴＲ配列中へ挿入された異種性の不安定配列ＤＮＡで、その不安定配列ＤＮＡが１つ以上の天然の遺伝子由来の１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応する第２のＤＮＡ配列と、  
ｉｉ）検出可能なシグナルを有する第２のタンパク質をコードする対照ＤＮＡ配列を含む対照ＤＮＡ発現ベクター、該対照ＤＮＡ配列と機能的に関連する１つ以上の  ３’ＵＴＲ配列および１つ以上の発現調節配列と、あるいは任意に
ｉｉｉ）使用説明書、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列および任意に不安定性ｍＲＮＡに隣接する配列に対応するＤＮＡに関連するレポーター遺伝子を含むＤＮＡ発現システムを提供する。このＤＮＡは、「不安定配列ＤＮＡ」または「ｉｓＤＮＡ」と呼ばれ、典型的に、３'ＵＴＲまたはいくつかの天然の遺伝子（「ソース遺伝子（ｓｏｕｒｃｅ  ｇｅｎｅｓ）」）のコード領域に存在するヌクレオチド配列を含み、ソース遺伝子から転写されたｍＲＮＡの安定性に影響を与えることで知られている。従って、本発明の発現システムへ取り込まれるｉｓＤＮＡは、ソース遺伝子の全ての３'ＵＴＲ、または３'ＵＴＲの実質的な部分、または３'ＵＴＲの１つ以上の断片に対応する配列を含み得る。ｉｓＤＮＡは、単一のソース遺伝子、または複数のソース遺伝子由来の１つ以上の不安定配列（および、任意にこれらのフランキング領域）を含む。本発明の発現システムは典型的に、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む適切な３'および５'遺伝子フランキング配列と一緒のレポーター遺伝子を含む。本発明の発現システムにおいて、ｉｓＤＮＡをレポーター遺伝子に関連する３'ＵＴＲ中へ挿入する。従って、ｉｓＤＮＡは、レポーター遺伝子に関連する３'ＵＴＲのＤＮＡと異種である。
【００１７】
本発明はさらに、ｍＲＮＡ安定性に影響する化合物を同定するアッセイでのＤＮＡ発現システムの用途を提供する。従って、本発明は、ｍＲＮＡ安定性に影響する化合物の同定方法において、試験化合物の不存在下で検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現することができ、ＤＮＡ発現システムが試験化合物と接触し、検出可能なシグナルを試験化合物の存在下で測定し、対照と比較する、前記方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲＮＡの不安定性を促進する化合物の同定に適合している。レポーター遺伝子アッセイを用いて、個別の化合物およびコンビナトリアル化合物ライブラリーを含む化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。レポーター遺伝子アッセイを、ファーストライン（ｆｉｒｓｔ  ｌｉｎｅ）スクリーニングアッセイとして用いて、リード化合物を同定し、レポーター遺伝子アッセイを用いて、化合物の活性を促進するｍＲＮＡ不安定性を比較するかまたは定量する、例えば、医学的化学先導最適化／誘導体化プログラムから生成した化合物を比較することができる。
【００１９】
ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲＮＡの不安定性を促進する化合物は、対象においてそのようなｍＲＮＡの分解の誘導に利用でき、従って、不適切なｍＲＮＡ蓄積を防止または逆転させ、これにより所望でないタンパク質発現、例えば、サイトカイン発現を減少または予防する。そのような化合物は、不適切なｍＲＮＡ安定化および蓄積と得られた所望でないタンパク質発現に関与する疾病または医学的症状の予防および／または治療のために、薬学的に有用である。
【００２０】
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同一の意味を有する。全般的に、本明細書で使用する命名法、および以下に記述する細胞培養、分子生物、スクリーニング方法、核酸化学、および化合物同定の検査法は、当業界で周知であり一般的に使用されるものである。ベクター、核酸組換え方法、細胞培養、および形質転換の準備には、標準技術を典型的に用いた。
【００２１】
技術および手順は、当業界での従来の方法および種々の一般的な参考文献（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｄ  ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照、蛍光技術に関しては、Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｊ．Ｒ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）を参照）に従って全般的に行われる。化学合成、化学解析、およびバイオアッセイには、標準技術を用いた。この開示文書で用いられるように、他に指示しない限り、以下の用語は以下の意味を有すると理解されたい。
【００２２】
定義
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得るヌクレオチドの配列を指す。
【００２３】
本明細書中で使用する「レポーター遺伝子」なる用語は、検出可能なタンパク質をコードする遺伝子を指す。レポーター遺伝子によってコードされた検出可能なタンパク質は、例えば、蛍光タンパク質であり得、または適切な基質もしくは他の物質と反応し、検出可能なシグナルを付与することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する「検出可能なシグナル」なる用語は、直接的または間接的に検出できるシグナルを指す。典型的には、検出可能なシグナルは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段で検出できる。検出可能なシグナルは直接的に生成されるか、または好適な「抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」（例えば、基質、抗体、リガンドおよび同等のもの）との反応もしくは相互作用で間接的に生成される。  
【００２５】
本明細書中で使用する「試験化合物」なる用語は、本発明のアッセイおよび方法に基づいて、試験の実施が可能な化合物を指し、有機金属化合物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、有機化合物、金属、遷移金属錯体および小型分子（例えば、非ペプチド性および非オリゴマーの化合物）を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
「不安定配列」なる用語は、ｍＲＮＡの安定性を調節できるヌクレオチド配列を指す。
本発明に関して、「不安定配列」は、正常な生理的条件下でｍＲＮＡに不安定性を付与するヌクレオチド配列、生理的な異常またはストレス条件下でｍＲＮＡに不安定性を付与するヌクレオチド配列、並びに通常の生理的条件下ではｍＲＮＡの安定性への影響がほとんどないまたは全くないが、特定のストレス条件下ではｍＲＮＡの安定性を高めるヌクレオチド配列を含む。生理的な異常またはストレス条件は全般的に、正常な生理的条件に比べての調節因子の不在、存在または変化に関与する。
【００２７】
「調節因子」なる用語は、酸素、温度および光を含むが、これらに限らない、変更可能な因子を指す。
【００２８】
本明細書中で使用する「対応する」なる用語は、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の関係を表し、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列が互いに対をなす直接の対応物であり、即ち、この２つの配列は、ＤＮＡ配列のＴ塩基が、カウンターパートのＲＮＡ配列ではＵ塩基に置き換わることを例外として、同一である。例えば、ＲＮＡ配列「ＵＡＵＡＣ」はＤＮＡ配列「ＴＡＴＡＣ」に対応する。同様に、ＤＮＡ配列「ＧＴＴＣＡ」はＲＮＡ配列「ＧＵＵＣＡ」に対応する。
【００２９】
本明細書中で使用する遺伝子に関しての「天然」は、自然界において遺伝子が見出される事実を指す。例えば、生物体に存在する遺伝子（ウイルスを含む）で、自然界においてソースから単離でき、人為的に実験室で意図的に修飾されていないものは天然である。
本明細書で使用する「約」なる用語は、名目値から＋／−１０％の差異を指す。このような差異は、これに関する言及の有無に係わらず、ここでのいかなる値に含まれることを理解されたい。
【００３０】
本明細書での他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（ｅｄ．Ｐａｒｋｅｒ、Ｓ．、１９８５、  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に例示され、参照によって本明細書に援用されるように、当業界での従来的使用に基づいて使用する。
【００３１】
１．ＤＮＡの表現システム
本発明のＤＮＡ発現システムは、少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡ、即ち、不安定配列ＤＮＡ（ｉｓＤＮＡ）に関連するレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子および関連するｉｓＤＮＡは典型的に、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する手段を提供するのに適切な細胞株を形質転換するために用いる好適なベクター中に含まれる。単一細胞株は、１つのベクターで、またはベクターの組み合わせで形質転換できる。後者の場合、その細胞株が後にｍＲＮＡの安定性への化合物の影響を同定するアッセイで使えるように、各ベクターは異なるレポーター遺伝子およびｉｓＤＮＡを取り込むことができる。  
【００３２】
１．１  ｉｓＤＮＡ配列
本発明の発現システムに含まれるｉｓＤＮＡは、１つ以上のソース遺伝子に由来する少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡを含む。ｉｓＤＮＡはさらに、天然のソース遺伝子中のｍＲＮＡ不安定配列に隣接する領域またはその領域から転写されたｍＲＮＡに対応するＤＮＡを含む。従って、本発明の一実施形態では、ｉｓＤＮＡの長さは約１０〜約１５００ヌクレオチドである。
【００３３】
１．１．１  ソース遺伝子
本発明によれば、ｉｓＤＮＡは１つ以上のソース遺伝子、即ち、この遺伝子から転写されたｍＲＮＡの安定性に影響する配列を含むと知られている遺伝子に由来する１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡを含む。上記に示したように、ｍＲＮＡ不安定配列は、多くの一過性に発現する遺伝子のＵＴＲでも特に３’ＵＴＲ中で同定されており、これらの遺伝子にはサイトカイン、ケモカイン、核転写因子、プロトオンコジーン、前初期遺伝子、細胞周期調節遺伝子、オキシゲナーゼ、アポトーシスに関与する遺伝子、およびアポトーシスを調節する遺伝子が含まれる。従って、そのような遺伝子は、本発明の目的のためのソース遺伝子として作用することができる。ｍＲＮＡ不安定配列が派生できる特定のソース遺伝子の非限定的な例には、ＡＰＰ、ＶＥＧＦ、ｂｃｌ−２α、ＧＭ−ＣＳＦ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｋｒｏｘ−２０、ｎｕｒ−７７、ｚｉｆ２６８、ｂｃｌ−２、β−ＩＦＮ、ｕＰＡ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＮＦα、ｓｙｎｌ、β２−ＡＲ、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｇｒｏ−α（メラノーマ成長刺激活性アルファ）、Ｇｒｏ−β（ＭＩＰ−２α）、Ｇｒｏ−γ（ＭＩＰ−２β）、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、コラゲナーゼ、Ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ）、ＭＲＰ、Ｐγｈ１（ｐｆ  ｍｄｒ）、ＣＯＸＩＩ、内皮リパーゼ、コレステリルエステル伝達タンパク質、βアドレナリン受容体、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、Ｂ−細胞抑制αの中のκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子（ＮＦＫＢＩＡ）、ＩＦＮγ誘導性タンパク質１０ｋＤ（ＩＰ−１０）、シクロフィリン  Ｆ、ＩＬ−１０  受容体α、ＡＵＦ１、トリステトラプロリン、およびユビキチン特異プロテアーゼ１８の遺伝子コードが挙げられる。
【００３４】
加えて、いくつかの遺伝子のコード領域内で不安定配列が同定されている。例えば、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの安定性に影響する２つの不安定配列領域が見出されている；１つは３’ＵＴＲ中に見出されたＡＵに富むエレメントで、もう１つはコード領域中に見出されたおよそ２５０の長さのヌクレオチド領域で、コード領域不安定性決定因子（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ：ＣＲＤ）と呼ばれている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、  １９９２、６：６４２−６５４を参照）。従って、本発明の目的のために、ｃ−ｍｙｃ  遺伝子は少なくとも２つの異なる不安定配列のソースとして作用するであろう。
【００３５】
本発明の一実施形態では、１つ以上のＡＲＥ（ＡＵ−リッチエレメント）含むｍＲＮＡ不安定配列を含有するソース遺伝子を選ぶ。ＡＲＥの例には、ＡＵＵＵＡ；ＵＡＵＵＵＡＵ；ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的に好適なＡＲＥを含むソース遺伝子の非限定的な例を表１に示す。これらの遺伝子で見出されるＡＲＥは、表１に示すように、基礎的なＡＵＵＵＡ  五ヌクレオチド反復共通配列の配置および数がそれぞれに異なる。
【００３６】
別の実施形態では、コード領域決定因子（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ：ＣＲＤ）を含むソース遺伝子が選択される。この実施形態によれば、ソース遺伝子も１つ以上のＡＲＥを含み得る。
【００３７】
関心のある疾病に結びつけられるタンパク質をコードするソース遺伝子を選択してもよい。従って、例えば、特定の疾患プロセスの病因論に関与するサイトカインまたは癌遺伝子をコードするソース遺伝子由来のｍＲＮＡ不安定配列を選択できる。これらのｍＲＮＡ不安定配列に対応するｉｓＤＮＡを含む発現システムは、サイトカインまたは癌遺伝子ｍＲＮＡを不安定化させ、従って、関連する疾患プロセスの治療に役立つ化合物の同定に有用である。例えば、関節リウマチまたは変形性関節症などのＩＬ−１仲介疾患の治療のためのリード化合物は、ＩＬ−１ｍＲＮＡ不安定配列を有するＤＮＡ発現システムを用いて検出される。特定のソース遺伝子からのｍＲＮＡの安定性の上昇に随伴する疾患は表１のとおりである。
【００３８】
【表１】
2007530058.tif 000001
【００３９】
１．１．２  ｍＲＮＡ不安定配列
ｉｓＤＮＡは、１つのｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡ、または２つ以上の不安定配列に対応するＤＮＡを含むことができる。本発明の一実施形態によれば、ｉｓＤＮＡは、１個から約１２個の間のｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡを含む。この不安定配列はＡＲＥまたはＡＲＥの一部（例えば、通常、ＡＵ−リッチモチーフからの少なくとも４つの連続するヌクレオチドを含む）でもよく、適切な近位に存在し、通常例えば、タンデムリピートとして、または他の、例えば、介在するヌクレオチド配列と共に存在する。あるいは、不安定配列はＣＲＤまたはＣＲＤの断片でもよい。さらに、ｉｓＤＮＡ配列は、１つ以上のＡＲＥおよび１つ以上のＣＲＤの両方を、フランキング配列の有無に係わらず含むことができる。一実施形態では、ｉｓＤＮＡは不安定配列をコードするＡＲＥと合わせて、ＣＲＤの１つ以上の断片を含むことができる。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも１つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも２つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも３つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも４つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくと５つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも６つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも７つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも８つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも９つのＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも１０のＡＲＥを含む。  本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも１１のＡＲＥを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は１２のＡＲＥを含む。
【００４１】
本発明の代替実施形態では、この不安定配列は、ソース遺伝子の少なくとも１つのＣＲＤを、関連のあるフランキング領域と共に含む。本発明の別の実施形態では、この不安定配列は、フランキング領域なしに、少なくとも１つのＣＲＤを含み得る。別の実施形態では、この不安定配列は、フランキング配列の有無に係わらず、ＣＲＤの１つ以上の断片を含み得る。
【００４２】
典型的に、ｉｓＤＮＡ由来のｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも約１０〜約５０までの近接するヌクレオチドを含む。従って、本発明の一実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも１０個の近接するヌクレオチドを含む。本発明の別の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも２０個の近接するヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも３０個の近接するヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも４０個の近接するヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は少なくとも５０個の近接するヌクレオチドを含む。
【００４３】
前述したように、ｉｓＤＮＡは、１つ以上のソース遺伝子由来の少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡを含み、長さにして約１０ヌクレオチドから約１５００ヌクレオチドであり得る。本発明の一実施形態では、ｉｓＤＮＡのヌクレオリドの長さは約２０〜約１２００である。当業者は、ｉｓＤＮＡの長さは、含まれる不安定配列の数とタイプによるということを容易に理解するであろう。従って、本発明の別の実施形態では、ｉｓＤＮＡのヌクレオチドの長さは約２０〜約２００である。本発明の別の実施形態では、ｉｓＤＮＡのヌクレオチドの長さは約２０〜約５００である。代替実施形態では、ｉｓＤＮＡのヌクレオチドの長さは約５００〜約１５００である。さらなる実施形態では、ｉｓＤＮＡのヌクレオチドの長さは約５００〜約１２００である。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、ｍＲＮＡ不安定配列は、ＡＵＵＵＡ；ＵＡＵＵＵＡＵ；ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）、ＡＵＵＵＡＵＵＵＡの群から選択された、同一のモチーフまたは異なったモチーフの組み合わせの配置を含む。
【００４５】
上記で示しているように、本発明が意図する不安定配列は、正常の生理的条件下ではｍＲＮＡの安定性に影響をほとんど与えないか、または影響を与えないが、特定のストレス条件下ではｍＲＮＡの安定性を高めるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヒトＶＥＧＦ遺伝子の３’ＵＴＲで見出されたＶＥＧＦ低酸素領域は、低濃度酸素条件において、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの安定性を高め、結果としてそのｍＲＮＡを安定化させるよう作用するＡＲＥである（参照、Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１９９８、９：４６９−４８１）。本発明の一実施形態では、ｉｓＤＮＡはＶＥＧＦ低酸素領域の全てまたは一部を含む。
【００４６】
本発明のｉｓＤＮＡは、３’ＵＴＲまたは適切なソース遺伝子のコード領域由来の制限断片として、または１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列を含む新規合成ヌクレオチド配列、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって産生された配列として派生する。ｉｓＤＮＡは、適切なソース遺伝子配列の３’ＵＴＲ全体にわたり対応する配列を含むことができ、これは１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列を関連する隣接領域と共に含む、あるいはｉｓＤＮＡは、ソース遺伝子の３’ＵＴＲの実質的な部分、またはソース遺伝子の３’ＵＴＲの１つ以上の断片を含むことができる。同様に、ｉｓＤＮＡがソース遺伝子からの１つ以上のＣＲＤを含む際、ｉｓＤＮＡは１つ以上のＣＲＤを関連するフランキング配列と共に含むコード配列の実質的な部分を含むことができる、あるいは、関連するフランキング配列の有無に係わらず、全体のＣＲＤを含む一層小さな部分のコード領域を含むことができる、あるいはフランキング配列の有無に係わらず、ＣＲＤの断片を含むコード領域の一部分を含むことができる。
【００４７】
本発明の一実施形態では、発現システムは、ＡＰＰ、ｂｃｌ−２α、ｃ−ｍｙｃ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、およびＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの群から選択された１つ以上のソース遺伝子の３'ＵＴＲ由来、またはコード領域由来の１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応するｉｓＤＮＡ配列を含む。別の実施形態では、上記の１つ以上のソース遺伝子はヒト遺伝子である。ヒトＡＰＰ、ｂｃｌ−２α、ｃ−ｍｙｃ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＶＥＧＦ、およびヒトＶＥＧＦ低酸素領域の３'ＵＴＲの部分に対応する代表的な配列を表２の配列番号１、２、３、４、５、６、７および８に示す。従って、本発明の別の実施形態では、発現システムに含まれるｉｓＤＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８の何れか１つに記載の全配列を含む。本発明のさらなる実施形態では、発現システムに含まれるｉｓＤＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８の何れか１つに記載の配列の断片を含む。本発明のさらなる実施形態では、発現システムに含まれるｉｓＤＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８の何れか１つに記載の、少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００４８】
【表２−１】
2007530058.tif 000002
【００４９】
【表２−２】
2007530058.tif 000003
【００５０】
【表２−３】
2007530058.tif 000004
【００５１】
１．１．３  フランキング配列
ＡＲＥおよびＣＲＤフランキング配列のユニークさを考慮することにより、異なった不安定配列結合タンパク質の存在を通して、ＡＵ−リッチモチーフに係わる細胞プロセスを選択できる。細胞質のｍＲＮＡ−結合タンパク質は、ＡＲＥと相互に作用し、制御トランス因子として作用すると考えられる。ｍＲＮＡとのこれらの結合は、安定化または不安定化効果を示す。
【００５２】
前述に基づき、当業者は、ｍＲＮＡ安定性に影響を与える化合物の同定のためのＤＮＡ発現システムの準備において、不安定配列の長さと同じようにモチーフの数も検討し得ると理解するであろう。当業者はさらに、フランキング配列が、隣接する配列の特性によって、コード配列または非コード配列を含み得ると理解するであろう。従って、本発明は、１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列に対応しているＤＮＡを、天然のソース遺伝子またはｍＲＮＡにおいてｍＲＮＡに隣接する配列とともに含むｉｓＤＮＡを意図している。
それらのフランキング配列を含有するｉｓＤＮＡを含む発現システムは、不安定配列およびフランキング配列が由来するソース遺伝子／ｍＲＮＡの特異性に関して化合物をスクリーニングするのに用い得る。
【００５３】
フランキング配列は、ソース遺伝子の全ての３’ＵＴＲ配列から、または３’ＵＴＲ配列の実質的な部分からｉｓＤＮＡ配列を派生させることにより、本発明の発現システムに含むことができる。さらに、全てのまたは実質的な部分の３’ＵＴＲに加えて、ｉｓＤＮＡは、同じまたは異なるソース遺伝子のコード領域からの１つ以上のＣＲＤまたはＣＲＤの断片を含み得る。
全体にわたる３’ＵＴＲ配列は典型的に、約終止コドンからポリアデニル化された配列までを含む領域を意味する一方、３’ＵＴＲの実質的な部分は、約１０から約６００の長さのヌクレオチドを有する配列を含み得るが、これらに限定されるものではない。従って、本発明の他の実施形態では、３’ＵＴＲの実質的な部分は、約終止コドンからポリアデニル化された配列までまたは該配列を含む領域中の、約１０から約１００、または約１０から約２００、または約２０から約１００、または約２０から約２００、または約２０から約６００のヌクレオチドの長さを有する配列を含む。  
【００５４】
同様に、ｉｓＤＮＡコード領域は、１つ以上のＣＲＤとともに、コード領域の「実質的な部分」を含くことができる。コード領域は、遺伝子の開始コドンから終止コドンの間の領域と定義する。コード領域の実質的な部分は、少なくとも１つのＣＲＤを取り込む、長さにして約１０から約６００までのヌクレオチドを含有する配列を含み得るが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、コード領域の実質的な部分は少なくとも１つのＣＲＤを取り込む、約１０から約１００ヌクレオチドを有する配列である。他の実施形態では、コード領域の実質的な部分は１つ以上のＣＲＤを取り込む、約１０から約２００ヌクレオチド、または約２０から約１００ヌクレオチド、または約２０から約２００ヌクレオチド、約２０から約６００ヌクレオチドを含む配列である。
【００５５】
上に記述した３’ＵＴＲの断片およびコード配列はまた、本発明の範囲である。従って、本発明の一実施形態では、断片は少なくとも８つの近接するヌクレオチドを含む。本発明の他の実施形態では、断片は少なくとも１０以上、または１５以上、または２０以上、または２５以上、または３０以上、または３５以上、または４０以上、または４５以上、または５０以上の近接するヌクレオチドを含む。
【００５６】
当業者は、天然の遺伝子に見出されるそれらと実質的に同一であるフランキング配列がなお、ｍＲＮＡ不安定配列に特異性を付与すると理解するであろう。従って、本発明は、断片が１つ以上のｍＲＮＡ不安定配列を含むことを条件として、ソース遺伝子の３’ＵＴＲの領域と実質的に同一である３’ＵＴＲ断片を意図する。従って、発明の一実施形態では、断片が少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列を含むことを条件として、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの少なくとも１０％から少なくとも９０％の配列の長さを有する。別の実施形態では、本発明のヌクレオチド断片は、ソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも１０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片は、ソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも２０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片は、ソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも３０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも４０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも５０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも６０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも７０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも８０％の配列の長さを有する。さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド断片はソース遺伝子の３’ＵＴＲの長さの少なくとも９０％の配列の長さを有する。
【００５７】
本発明の他の実施形態では、断片が、不安定配列に隣接する配列と共に、少なくとも１つの不安定配列を含むことを条件として、本発明の断片は、３’ＵＴＲまたはコード領域の配列と、少なくとも６０％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９７．５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００５８】
１．２  不安定配列の有効性
以上の知見に基づき、当業者は、不安定化化合物を同定する本発明のＤＮＡ発現ベクター中で用いるための特定の３’ＵＴＲ不安定配列を容易にデザインできるだろう。そのような不安定配列は、少なくとも１つのｍＲＮＡ不安定配列と、場合によっては、ｍＲＮＡ不安定配列に隣接し、化合物結合の特異性を付与する配列を含む。
【００５９】
本発明の３’ＵＴＲ不安定配列の有効性を試験するために、遺伝子発現検査を含む解析が意図される。加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクション、ドットブロット解析またはスロットブロット解析、およびマイクロアレイ法に基づく技術を例とする、当業者にとって馴染みのある他の解析法が理解される。他の解析法はさらに、ｍＲＮＡ不安定性を引き起こす能力が知られている化合物との試験を含み得る。例えば、本発明の３’ＵＴＲの特性を把握するために、異常なｍＲＮＡ不安定性を引き起こすことが知られている化合物を、遺伝子発現（ＳＡＧＥ）検査の一連の解析において用いることができる。ｍＲＮＡ安定性に影響を与えられる化合物は、デキサメタゾン、トコフェロール、レチノイン酸、サリドマイド、シクロスポリンＡ、およびラジシコール類似体Ａ（ＲＡＡ）を含む。ＲＡＡは、それらの３’ＵＴＲにＳｈａｗ−Ｋａｍｅｎ  ｂｏｘまたはＡＵＵＵＡモチーフを有する癌原遺伝子を含む多くのｍＲＮＡの分解を促進するように見える。  
【００６０】
１．３  レポーター遺伝子
本発明の発現システムでは、そのレポーター遺伝子が検出可能なタンパク質をコードするということを条件として、多様なレポーター遺伝子を用いることができる。本発明によれば、検出可能なタンパク質は、検出可能なシグナルを、直接的に生成できるか（例えば、蛍光シグナル、吸光度の変化、リン光シグナル、薬剤耐性または薬剤感受性、栄養素要求（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｓｍ）および同等のもの）、または、好適な「抱合体」（例えば、基質、抗体、リガンド、および同等のもの）との反応または相互作用によって生成できるタンパク質である。必要であれば、抱合体を標識化し、検出可能とすることもできる。
【００６１】
様々なレポーター遺伝子が当業界で知られている（参照例、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、ｅｄ．    ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９；  ｖａｒｉｏｕｓ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９および更新版）。好適なレポーター遺伝子の例は、キナーゼ、ホスファターゼ（アルカリホスファターゼ（ＡＰおよび分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ））を含む）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レダクターゼ、シンターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、グルコース酸化酵素、シンセターゼなどのコード化酵素、および緑色蛍光タンパク質、それらの誘導体（例えば、赤色蛍光タンパク質、珊瑚礁由来の蛍光タンパク質、高感度蛍光タンパク質、不安定化蛍光タンパク質）などのコード化蛍光タンパク質、またはリン光タンパク質があるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
レポーター遺伝子が酵素をコードする際、酵素自体が検出可能であるか、または酵素の活性が酵素レベルの測定に間接的に用いられる。
【００６３】
本発明の一実施形態では、レポーター遺伝子は酵素をコードする。本発明の別の実施形態では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼタンパク質またはβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする。ルシフェラーゼは当業界で知られており、北アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、細菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）などの生物から誘導できる。
【００６４】
１．４  発現ベクター
分子生物学分野の当業者は、多岐にわたる発現ベクターが、本発明のＤＮＡ発現システムの提供に用いられることを理解するだろう。例えば、細胞の安定な形質移入に好適な多数のベクターが公に利用可能であり（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌを参照）、そのような細胞株の構築方法も公に利用可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。そのようなベクターは、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列を含む、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のウイルスＤＮＡを含むが、これらに限られるものではない。しかしながら、宿主内において複製可能で生存可能であれば、他のベクターまたはプラスミドを用い得る。
【００６５】
適切なＤＮＡ配列が、様々な手順で、ベクターに挿入され得る。一般的に、ＤＮＡ配列は、当業界で知られている手順で適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中へ挿入される。そのような手順およびその他は、当業者の範囲内と見なされる。  
本発明の発現ベクターは、ｍＲＮＡ合成を指示するための適切な発現調節配列に操作的に結び付いたレポーター遺伝子を含む。そのようなプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの中の遺伝子の発現を調節することで知られるその他のプロモーターが挙げられる。ベクターはまた、発現を増幅する適切な配列を含み得る。
【００６６】
本発明はさらに、検出可能なシグナルを有するタンパク質の発現をコードする遺伝子を含むレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムであって、この遺伝子が、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域、およびｉｓＤＮＡ配列を有する適切な発現調節を含む、関連する５’および３’ＵＴＲ配列と共に、タンパク質のアミノ酸配列のＤＮＡコードを含む、前記システムを提供する。プロモーター／エンハンサー配列および他の発現調節配列の適切な選択は、十分当業者の範囲内にある事項であり、本発明の本質的な要素を形成しない。従って、例えば、哺乳類細胞における発現には、ＳＶ４０、ＣＭＶまたはＨＳＶ−Ｉプロモーターなどのウイルスプロモーターを用いることができる。
【００６７】
加えて、発現ベクターは  、形質転換した宿主細胞の選択のための、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシンＢもしくは真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性などの表現型形質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｔｒａｉｔ）を提供する遺伝子を含み得る。  
【００６８】
ｉｓＤＮＡは典型的に、レポーター遺伝子の３'ＵＴＲに挿入される。従って、例えば、ｉｓＤＮＡ配列はレポーター遺伝子の３'ＵＴＲの好適な制限部位に挿入される。レポーター遺伝子３'ＵＴＲへのｉｓＤＮＡの挿入を可能とするために、当業界で知られる標準的技術を使って、適切な制限酵素部位は、３'ＵＴＲ配列および／またはｉｓＤＮＡ配列に導入されることもある。
【００６９】
１．５  宿主細胞
宿主細胞は、本発明の発現ベクターとともに遺伝子操作（伝達、形質転換、形質移入）され得る。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターの活性または形質転換体の選択に適するように修飾された従来の栄養培地で培養できる。温度、ｐＨおよび同等のものなどの培養状態は、選択された宿主細胞に前もって用いられた状態で、当業者にとって明白であるだろう。ＤＮＡ発現システムは、安定に形質転換された細胞株のような、都合のいいことに、適切に形質転換された細胞株の形態である細胞ベースの発現システムであり得る。宿主細胞は、真核生物のまたは原核生物の宿主細胞であり得る。
【００７０】
適切な宿主の代表的な例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの細菌性細胞；ストレプトマイセス；酵母などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等が挙げられる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲であると見なされる。
【００７１】
宿主細胞は、不安定化させたいｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現する細胞と同じ一般的な細胞タイプであり得る。従って、例えば、もし本発明のアッセイを用いて、サイトカインをコードするｍＲＮＡを不安定化させる化合物を同定する場合、用いられる宿主細胞は、対象のサイトカインを通常、産生する細胞と同じまたは類似の細胞タイプである細胞または細胞株であり得る。例えば、単球または単球のような細胞株（ＴＨＰ−１など）は、例えば、ＩＬ−１βのようなサイトカインｍＲＮＡを不安定化する化合物のアッセイ用の宿主細胞として用い得る。癌細胞および他の癌に関連した遺伝子ｍＲＮＡ不安定性アッセイに有用な細胞株には、例えば、ＣＯＬＯ  ２０５、ＫＢ−３１、ＫＢ−８５１１、ＤＵ１４５、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７／ＡＤＲ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＴＯがある。例えば、ＩＬ−１βのようなサイトカインｍＲＮＡを不安定化させる化合物の同定のための本発明のアッセイにて宿主細胞として用いる細胞株は、ＴＨＰ−１細胞株（例えば、Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．、１９９１、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４７：２２−３０で記述されているように）、および、例えば、ヒト白血病のような同様の単球の細胞株である。
【００７２】
これにおけるｍＲＮＡ不安定化のメカニズムおよびこのメカニズムにおけるｍＲＮＡ不安定配列の役割は完全に解明されてないが、不安定化化合物およびｍＲＮＡ不安定配列以外の別の要因の存在が、例えば、先に記した文献で議論されているように、ｍＲＮＡ不安定化が発生するために必要であることが明らかである。そのため、本発明の一実施形態では、そのような別の因子を提供し、化合物およびｍＲＮＡ不安定配列との相互作用を補完、または完成させ、ｍＲＮＡの不安定化を生じる宿主細胞が選択される。形質転換した宿主細胞は、ｍＲＮＡ不安定化を増強するために刺激するかまたは他の方法で活性し、例えば、ｍＲＮＡ不安定化に必要な細胞因子のレベルまで増強させることができる。例えば、分化し、形質転換した宿主細胞を使用する場合、本発明のアッセイにおいてより良い結果が得られうる。例えば、形質転換したＴＨＰ−１細胞の場合、その形質転換したＴＨＰ−１細胞が成長し、分化し、γＩＦＮとＬＰＳで刺激を受けた場合、ＴＨＰ−１細胞には正常なように、例えば、以下に、実施例にて記述されているように、良い結果が得られる。
【００７３】
２．ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物の同定アッセイおよび手法
本発明の別の実施形態では、上記で定義されたレポーター遺伝子ＤＮＡ発現システム、および検出可能なシグナルを有する前記タンパク質の発現をコードする遺伝子を有する対照ＤＮＡ発現システムを含むアッセイシステムで、前記遺伝子が、適切な発現調節エレメントを有するが機能的なｍＲＮＡ不安定配列を欠如する、関連する５’および３’ＵＴＲ配列と一緒の前記タンパク質のアミノ酸配列のＤＮＡコードを有する、ｍＲＮＡを不安定化させる化合物の同定のアッセイシステムを提供する。
【００７４】
レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムと対照ＤＮＡ発現システムの両方は、安定に形質移入された細胞株の形態であり得る。
あるいは、レポーター遺伝子発現システムは試験化合物の存在下および不在下で試験され、試験化合物の不存在下での試験は対照実験として用いられる。本発明の別の実施形態では、対照ＤＮＡ発現システムは、レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムと同じ細胞株中に存在し得る。この場合の対照ＤＮＡ発現システムは、レポーター遺伝子発現システムによってコードされたタンパク質とは違う、検出可能なタンパク質をコードし、従来どおりに、対照ＤＮＡ発現システムはいかなる機能的なｍＲＮＡ不安定配列を欠乏している。
【００７５】
本発明のアッセイでは、ｍＲＮＡを不安定化する化合物の存在は、対照と比較しての化合物の存在下での発現システムから生成したタンパク質が付与する検出可能なシグナルの規模の低下により示される；レポーター遺伝子ｍＲＮＡの化合物による不安定化により、タンパク質の発現の低下および従ってシグナルの規模の減少に至る。本発明のアッセイの利用に好適な対照は、レポーター遺伝子ＤＮＡ発現システムに対応するＤＮＡ発現システムを含み、即ち、検出可能なタンパク質の発現の配列コードを含むが、ｍＲＮＡ不安定配列に対応する配列を含まない。対照ＤＮＡ発現システムは、ｍＲＮＡ不安定配列に対応するＤＮＡが除去、削除、または他の方法でｍＲＮＡ不安定配列として無能にされてあること以外、レポーター遺伝子発現システムと同一である。対照ＤＮＡ発現システムはまた、形質転換した細胞株の形態であり、典型的には、レポーター遺伝子形質転換細胞株と同一の宿主細胞株、例えば、ＴＨＰ−１細胞株由来の安定に形質転換された細胞株である。
【００７６】
本発明のＤＮＡ発現システムを用いて、ｍＲＮＡを不安定化できる化合物をスクリーニングできる。従って、本発明の一実施形態では、化合物を、前記化合物の不在下において検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現できるＤＮＡ発現システムと接触させ、ここで前記タンパク質をコードし前記発現システムから転写された前記ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピーを有し、試験化合物の存在下で検出可能なシグナルを測定し、対照から得られる結果と比較し、ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の同定およびスクリーニング方法を提供する。
【００７７】
例えば、ｍＲＮＡを不安定化できる化合物は、本発明のＤＮＡ発現ベクターを安定に形質移入した細胞を、マルチウェル形式で、培養することによって同定できる。一晩のインキュベーションの後、ｍＲＮＡの不安定化能力をスクリーニングした化合物を、適正な濃度、または異なる濃度の範囲のウェルに、および、化合物の存在下で好適な期間（例えば、およそ４〜１６時間の間）インキュベートした処置細胞に添加する。インキュベーションの後、ＤＮＡ発現システムのレポーター遺伝子によって生成されたシグナルを検出するのに必要な試薬をウェルに添加し、各ウェルで生成されたシグナルの量を測定する（例えば、適切な検出器と組み合わせてのマルチプレート読み取り装置の利用）。その後、対照に関して、試験化合物の有効性を決定するために、シグナルの量、例えば、溶質または培地で処置された細胞、を対照と比較する。
【００７８】
当業者は、通常の生理条件下ではｍＲＮＡの安定性に影響を与えないが、特定のストレス条件下では安定性を高める不安定配列を含むそれらの発現システムに対して、試験化合物の添加に先立ち、発現システムを含む細胞をストレス状態にさらさなければならないと理解する。従って、例えば、ＶＥＧＦ低酸素領域を含む発現システムに対しては、試験化合物の添加に先立ち、細胞を低酸素条件にさらさなければならなく、即ち、化合物のｍＲＮＡ不安定化能力の試験に先立ち、調節因子（酸素）を減らさなければならない。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、化合物の不在下において検出可能なシグナルを有するタンパク質を発現できるＤＮＡ発現システムを、化合物と別々に接触させ、ここで前記タンパク質をコードし前記発現システムから転写される前記ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ不安定配列の少なくとも１つのコピーを有し、各試験化合物の存在下での検出可能なシグナルを測定し、得られたシグナルを比較し、ｍＲＮＡ分解を誘導する化合物の比較方法を提供する。この方法は、２つ以上の化合物によって誘導されたｍＲＮＡ分解の程度を、ｍＲＮＡ分解をより一層誘発し検出可能なシグナルの測定値を減少させる化合物によるｍＲＮＡ分解と比較する。
【００８０】
レポーター遺伝子によって生成される検出可能なシグナルの検出および／または測定の方法は、当業界でよく知られており、広範囲にわたり、関連文献に記述されている。用いられる方法は、選択されるレポーター遺伝子により、適切な方法の選択は、当業者の範囲内である。上記に示しているように、検出可能なシグナルは、レポーター遺伝子にコードされたタンパク質によって直接的または間接的に生成され得る。
【００８１】
当業者は、直接的に  検出可能なシグナルの検出を可能とするためには、それらのシグナルに、基質、トリガー試薬、光、および同等のもののような追加的な成分が必要であり得ると理解するであろう。間接的な検出可能なシグナルは、典型的に、検出可能なタンパク質に特異的に結合し、直接的に検出可能な標識に付着した、または、共役する、「抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」の利用を含む。そのような抱合体の合成のためのカップリング化学は、当業界でよく知られている。検出可能なタンパク質と抱合体の結合は一般的に、自然界において化学的または物理的である。
そのような結合ペアの例には、抗原および抗体；アビジン／ストレプトアジンおよびビオチン；ハプテンおよびハプテンに特異的な抗体；レセプターおよびレセプター基質；酵素および酵素補因子／基質、および同等のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。必要に応じては、抱合体は、さらに、既知の技術を用いて、アフィニティマトリックスに付着する。  
【００８２】
抱合体と一緒に用いられ得る、直接的に検出可能な標識の例には、蛍光成分（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）（フルオレセインとその誘導体、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンを含む蛍光色素、または、蛍光色素を含むビーズもしくは微粒子）、高電子密度の部分、化学発光成分（例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオンルミノール、ルミノールを含む）、磁性粒子、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ）、核酸干渉物質（例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲグリーン）、熱量測定標識（例えば、コロイド金、または色ガラスもしくはプラスティックビーズ）があるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
シグナル検出は、分光学的、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光熱的、または化学的な方法、目視検査、または、色、大きさ、電荷または親和性に基づき分子を追跡する他の方法を含む、多様な既知の１つの方法で進行できる。従って、例えば、シグナルが蛍光成分による場合、適切な光の波長での蛍光色素の励起、および、例えば、顕微鏡、目視検査、写真のフィルムを通して、例えば、デシタルカメラ、電荷結合素子（ＣＣＤｓ）または光電子増倍管および光電管、および同等のものなどの電子検出器の使用による、得られた蛍光の検出によって検出できる。同様の方法を、シンチレーション測定を含む発光の検出に用いることができる。シグナルが放射標識の場合、検出方法にはシンチレーションカウンターおよびオートラジオグラフィーがある。
【００８４】
２．１  ｍＲＮＡ分解を誘導できる化合物
ｍＲＮＡ不安定配列を含むｍＲＮＡの不安定性を促進する化合物は、本発明のアッセイを利用して、同定することが可能である。このような化合物は、ｍＲＮＡ分解を誘導し、これにより不適切なｍＲＮＡの蓄積を防止または逆転させ、これにより、サイトカインのようなタンパク質発現を減少させるかまたは防止することができる。このような化合物は、疾病または医学的症状の予防または治療のために、潜在的に薬学的に有益であり、この疾病または医学的症状の予防または治療は不適切なｍＲＮＡの安定化および蓄積、並びに得られた所望でないタンパク質発現に関与する。
【００８５】
従って、本発明は、本発明の方法によって、または、本発明に従ってのＤＮＡ発現システムの利用、またはアッセイシステムによって同定可能なｍＲＮＡを不安定化させる化合物を提供する。
【００８６】
３．ＤＮＡ発現システムの応用
３．１  ハイスループット解析
当業者は、スクリーニング工程で使われる技術が、ハイスループット解析に容易に適合できることを理解するであろう。ハイスループットスクリーニングは、多数のサンプルを同時に処理し、多くのサンプルをスクリーンするのに必要な時間を著しく短縮する利点を提供する。従って、本発明は、ｍＲＮＡの安定性に影響する化合物を同定するための化合物ライブラリーのスクリーニングのためのハイスループット方法の利用を意図する。
【００８７】
ハイスループットスクリーニングでは、反応成分は普通、マルチウェルマイクロタイタープレートなどのマルチコンテナキャリア、またはプラットフォームに収容され、これらのマルチコンテナキャリアまたはプラットフォームでは、それぞれが異なった試験サンプルを含み、多数の反応を同時にモニターできる。本発明はまた、スクリーニングプロセスの効率を高めるための高度に自動化されたハイスループットスクリーンを意図する。適切な検出器における試料および試薬ピペッティング、液体分注、タイムドインキュベーション、マイクロアレイ中への試料のフォーマット、マイクロプレートサーモサイクリングおよびマイクロプレートリーディングなどの多くの手順の自動化性能がそうであるかのように、多くのハイスループットスクリーニングまたはアッセイシステムが現在、商業的に入手可能であり、結果としてスループット時間が非常に短縮している。
【００８８】
３．２  製剤／キット
本発明のＤＮＡ発現システム、またはアッセイを含む製剤／キットは、当業界で知られている技術で調製される。本発明は追加的に、ｍＲＮＡを不安定化させる化合物の同定に利用されるレポーター遺伝子アッセイを含むキットを提供する。キットの中身は凍結乾燥が可能で、キットは追加的に、凍結乾燥された成分の再構成のための好適な溶媒を含むことができる。キットの各成分は、異なった容器にパッケージされ、そのような容器には使用説明のリストが付随される。
【００８９】
３．３  医薬組成物
本発明の手法、または本発明に従ってＤＮＡ発現システムまたはアッセイシステムの利用によって同定された化合物は、疾病または医学的症状の予防または治療に対し潜在的に有益な医薬品であり、この疾病または医学的症状の予防または治療は、不適切なｍＲＮＡ安定化および得られた所望でないタンパク質の発現／蓄積に関与する。従って、本発明は、１つ以上の同定された化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００９０】
本発明の医薬組成物および薬物は、従来の無毒性で薬学的に受容可能なキャリア、補助剤、および媒体を含む剤形で、投与経路には、経口、局所、非経口、吸入、スプレー、直腸がある。本明細書で使われる非経口なる用語は、皮下注射、静脈、筋肉、胸骨内注射、または点滴の方法を含む。薬学的に活性な化合物または塩類は、従って、１つ以上の無毒性で薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤および／または補助剤、および必要に応じて他の活性成分に付随して存在する。
【００９１】
医薬組成物は経口に好適な形状であり得、例えば、錠剤、トローチ剤、ドロップ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、水性または油性懸濁剤、分散し得る散剤または顆粒剤、乳剤性の硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤。経口使用を意図される組成物は、医薬組成物の製造者の当業者に周知である方法に従って調製され、薬学的にエレガントで美味な製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤の群から選択される１つ以上の剤を含み得る。錠剤は、好適な無毒性で薬学的に受容可能な賦形剤との混合物における活性成分を含有し、賦形剤の例として、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸などの粒化剤および崩壊剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、消化管での分解および消化を遅らせるために既知の技術でコーティングされていてもよく、従って、より長い期間にわたって継続する作用をもたらす。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒａｔｅ）などの、時間遅延物質を用い得る。
【００９２】
経口投与用の医薬組成物は、活性成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性な固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水、または、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油などの油の溶媒と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としても提示しえる。
【００９３】
経口投与用の医薬組成物は、活性成分が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性な固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水、または、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油などの油の溶媒と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としても提示しえる。
【００９４】
水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、およびアカシアガムなどの懸濁剤、天然のホスファチド（例えば、レシチン）などの分散剤または湿潤剤、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチエン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｅｎｅ  ｓｔｅａｒａｔｅ））、またはエチレンオキシドと長鎖の脂肪族アルコロールの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（ｈｅｐｔａ−ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ））、または、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、または、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトール（ｈｅｘｉｔｏｌ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）由来の部分エステルとの縮合物（例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））を含む好適な賦形剤と混合された活性化合物を含有する。水性懸濁剤はまた、例えば、エチルもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１種以上の保存剤、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤、またはショ糖もしくはサッカリンなどの１種以上の甘味剤を含有し得る。
【００９５】
油性懸濁剤は、例えば、落花生油、オリーブ油、ごま油、ココナッツ油などの植物油、または流動パラフィンのような鉱物油に活性成分を懸濁させて製剤化し得る。油性懸濁剤は、例えば、蜜蝋、ハードパラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含有し得る。上記に示したような甘味剤、および／または  香味剤を加えて、味のよい経口製剤を提供してもよい。これの組成物は、アスコルビン酸のような酸化防止剤の添加によって保存され得る。
【００９６】
水の添加による水性懸濁剤の調製に好適な分散し得る散剤および顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１種以上の保存剤との混合物内の活性成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、すでに上記で例示されている。例えば、甘味剤、香味剤、着色剤のような追加の賦形剤も存在し得る。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、水中油乳剤の形態でもあり得る。油相は、例えば、オリーブ油もしくは落花生油などの植物油、または流動パラフィンのような鉱物油、またはそれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、例えば、アカシアガム、またはトラガカントゴムのような天然のゴム、例えば、大豆レシチンのような天然のリン脂質、または、例えば、モノオレイン酸ソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）のような脂肪酸および無水ヘキシトール由来の部分エステル由来のエステルまたは部分エステル、および例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）のような該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物であり得る。乳剤は、甘味剤および香味剤も含み得る。
【００９８】
シロップ剤およびエリキシル剤は、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、またはショ糖のような甘味剤と製剤化され得る。そのような製剤は、粘滑薬、保存剤、香味剤、着色剤も含み得る。
【００９９】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤の形態であり得る。この懸濁剤は、上記に示されているような好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、既知技術にしたがって、製剤化し得る。無菌の注射可能な製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール溶液のような、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、または懸濁剤でもあり得る。用い得る許容される媒体および溶媒は、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、および生理食塩液を含むが、これらに限定されるものではない。その他の例には、従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる無菌の不揮発性油、および例えば、合成モノ−またはジグリセリドなどの種々の口当たりのよい不揮発性油を含む。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の製剤に有用性がある。
【０１００】
他の医薬組成物および医薬組成物の調製方法は、当業界で周知であり、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」  （旧題名「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  &  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２０００）のような参照文献中に記述されている。
【０１０１】
本明細書中で記述される本発明の理解を深めるため、以下の実施例は示される。これらの実施例は、単にあくまで例示を目的としたものである。そのため、これらは、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【０１０２】
実施例
本発明者等は、前に（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９６、８：７５１−７６１）、ラジシコール類似体Ａ（下記に示す化合物）が、ｍＲＮＡ不安定性を受ける遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中に位置するＡＲＥ（ＡＵ−リッチエレメント）モチーフを通してｍＲＮＡ不安定性を付与することを実証した。実施例１−５では、全てのＡＲＥを含むＩＬ−１βの３’ＵＴＲのセグメントを除去し、得られたＩＬ−１β−ＡＵ  ｃＤＮＡを、発現ベクター中へとサブクローンした。このコンストラクトを含む安定に形質移入したＴＨＰ−１細胞を、リボヌクレアーゼプロテクション法（Ｋａｓｔｅｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．同上）により解析し、ラジシコール類似体Ａに対するＡＵ欠損誘導化（ＡＵ−ｌｅｓｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ）ＲＮＡの耐性を示した。
【０１０３】
ＩＬ−１β  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、３つがタンデムにある（図１参照）合計６つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの構築には、我々は、３つのタンデム繰り返しを含む図１に示す配列（下線部）を含む断片のみを用いた。
【０１０４】
【化１】
2007530058.tif 000005
【実施例１】
【０１０５】
ｐＧＬ２  Ｎｅｏ３０  および安定発現株の構築
ＴＨＰ−１細胞への安定な組み込みのためのベクターを得るために、ｐＭＣ１ｎｅｏＰｏｌｙＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来のｎｅｏ耐性遺伝子（アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼを発現する）のＸｈｏＩ−ＳａＩＩ断片を、ｐＧＬ２−対照（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａＩＩ部位中にサブクローンした。得られたプラスミドを、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏと呼んだ。２つの相補的な合成オリゴヌクレオチド（図２参照）のアニーリングによって得られた３０ｂｐ断片（３つのタンデムＡＵＵＵＡモチーフおよびフランキングＩＬ−１β３’ＵＴＲ配列を含む）を、ＰｆｌＭＩ制限部位を用いて、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ中にサブクローンした。この結果、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０（図３Ａ）が得られた。図２は、ｐＧＬ２＿ＮｅｏのＰｆＩＭＩ部位中への連結に用いる３つのタンデムＡＵＵＵＡモチーフを含むＩＬ−１β  ３’ＵＴＲ配列を示す。発現ベクターｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ（図３Ｂ）は、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０およびｐＧＬ２＿Ｎｅｏ中のルシフェラーゼ遺伝子と同一のプロモーター（ＳＶ４０）により駆動されるｌａｃＺ  遺伝子を有するが、プラスミドｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼは、ｍＲＮＡ不安定配列を含まない。ｌａｃＺ遺伝子を、ｐＳＶ−ｂｅｔａ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限消化より得て、ｐＧＬ２−対照（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位中にサブクローンした。
【０１０６】
続いて、ＴＨＰ−１細胞を、ｐＧＬ２＿ＮｅｏおよびｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼベクター（対照細胞株を産生するため）、またはｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０およびｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼベクターと、電気穿孔で同時形質移入した。１．３ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７．３６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．４４ｍＭのＫＣｌ、１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、９．６４μＭのＭｇＣｌ２  および１６μＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．２中の１０７  個の細胞／ｍｌ  をバイオラッドジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（２５０Ｖ、６９０μＦおよび不定の抵抗）中の２０μｇのＤＮＡで、０．４ｃｍ  キュベットを用いて形質移入した。細胞をその後、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ（Ｌ−グルタミン）、５０μＭの２−メルカプトタノールおよび６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネテシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１０７】
ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０およびｐＧＬ２＿ＮｅｏのＴＨＰ−１細胞中への形質移入の後、Ｇ４１８耐性安定発現株を、Ｇ４１８についての選択により得て、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。同時形質移入した細胞株は、内部対照として作用することができるβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした（実施例５参照）。各形質移入の１つの細胞株を、さらなる解析のために選択した；ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０／ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ細胞株を、クローン番号６３と呼び、ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ／ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ細胞株をクローン番号５３と呼ぶ。内因性ルシフェラーゼ活性は、正常なＴＨＰ−１細胞においては検出できなかった。
組織培養およびルシフェラーゼ活性測定を、以下に記述するようにして実施した。
【０１０８】
組織培養：
形質移入したヒト単球性白血病細胞株であるクローン番号５３および６３を、１１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、および２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３を補足したＲＰＭＩ培地中で成長させた。使用前には、熱処理したＦＢＳ（５％）を添加した。細胞を５ｘ１０５／ｍｌの密度に成長させ、１００Ｕ／ｍｌ（最終濃度）γＩＦＮでの分化を誘導した。３時間後、１０μｌのＬＰＳ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）を添加した。この時点を、時間０とした。ＬＰＳ添加の後、本明細書で示す通りに、化合物を種々の時間において添加した。
【０１０９】
ルシフェラーゼ活性測定：
システムを９６ウェルプレートの使用に適合させるために、細胞を、フェノールレッド（ＡＭＩＭＥＤ）を欠くＲＰＭＩ培地中のパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）平坦底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．６００５１８０）中で成長させた。細胞を、５ｘ１０４／ウェルで蒔いた。細胞の処理後、ルシフェラーゼを、パッカードルクライト（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｌｕｃ  Ｌｉｔｅ）システム（Ｃａｔ．Ｎｏ．６０１６９１  １）を用いて、製造者の指示に従い２０５μｌの最終容積に計量した。要するに、５ｘ１０５  細胞／ｍｌの細胞懸濁に、γＩＦＮ（１０００Ｕ／ｍｌ  ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）Ｎｏ．１０５０４９４）を最終濃度１００  Ｕ／ｍｌに、および０．２５％（ｖ／ｖ）のルクライトエンハンサー（Ｌｕｃ  Ｌｉｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ）を添加した。３時間のインキュベーションの後、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌのＳｉｇｍａ  Ｌ−８２７４）を添加し、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。次に、細胞を、５ｘ１０４／１００μｌ／ウェル平坦底白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６００５１８０）中に蒔き、１６時間インキュベートした。次に、５μｌの化合物溶液または対照媒体を添加し、細胞を、本明細書で示している通りにさらにインキュベートした。１００  μｌのルシフェラーゼ基質溶液を添加し、プレートを、トップシール（ＴｏｐＳｅａｌ）−Ａプレスオン接着密着フィルム（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．６００５１８５）で覆い、その後、２２ｏＣでパッカードトップカウントシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）で発光を測定した。ルシフェラーゼシグナルは少なくとも９０分間安定であった。
【０１１０】
２つの細胞株、番号５３（Ａ）および６３（Ｂ）におけるルシフェラーゼ活性の分化依存性の誘導を試験し、得られた結果を図４ＡおよびＢに示す。両方のクローンにおいて、ルシフェラーゼ発現の明白な誘導を観察することができ、アッセイの時間にわたり高いレベルの活性を維持した。ルシフェラーゼの発現のこの高いかつ一定の発現を、ｍＲＮＡ不安定性を誘導する化合物の影響を解析する際に、念頭に置くべきである。ｍＲＮＡ分解は、新規の転写と一定の競合状態にあり、これとは異なり、野生型ＴＨＰ−１細胞の状態は、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡの場合であり、最高のレベルがＬＰＳ添加の１６時間後に得られた。ルシフェラーゼの場合では、ラジシコール類似体Ａの場合に観測されたように転写が高いままであるため、ｍＲＮＡ不安定化薬剤の一層弱い影響を観測することが予想される。以下を参照。
【実施例２】
【０１１１】
ルシフェラーゼｍＲＮＡおよびタンパク質の半減期
ルシフェラーゼタンパク質活性を用いてｍＲＮＡ分解を測定するためには、ルシフェラーゼ酵素の半減期を知って、潜在的なｍＲＮＡ不安定化薬剤をルシフェラーゼタンパク質安定性によりアッセイするための最適時間を決定することが重要である。タンパク質の長い半減期のために、ｍＲＮＡが分解され、高い酵素活性が持続するという可能性もある。そのため、本発明者等は、転写阻害剤アクチノマイシンＤ（ａｃｔ．  Ｄ）または翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の添加後のルシフェラーゼ活性を解析した。  図５は、２０μｇ／ｍｌのａｃｔ．Ｄの存在下で、および２０μＭのＣＨＸの存在下で、ルシフェラーゼ活性が急速に低下し、８時間のインキュベーションの後には、ラジシコール類似体Ａ（１μＭ）により達成された阻害に匹敵するレベルに達することを示す。ルシフェラーゼ酵素のこの比較的短い半減期を考えて、化合物の添加後８時間後という早期にｍＲＮＡ分解の活性に対して物質を評価することは、差し支えない。
【実施例３】
【０１１２】
ラジシコール類似体Ａの効果
ＴＨＰ−１細胞株、クローン番号６３および５３を成長させ、γＩＦＮで分化させ、通常のＴＨＰ−１細胞と同一のＬＰＳによって刺激した。ラジシコール類似体を、ＬＰＳの添加から１６時間後に添加し、次いで細胞抽出液を８時間後、または本明細書で示す通りに摂取した。ルシフェラーゼ活性を、平均で５０％＋／−１７％の１μＭのラジシコール類似体Ａにより阻害し、いくつかの場合において阻害は９３％程度に大きく、一方、５×１０−６Ｍのラジシコール類似体Ａは、対照クローン番号５３に対して影響を与えなかった、図６（黒色棒はクローン番号５３、白色棒はクローン番号６３を示す）。
【０１１３】
興味深いことに、１μのラジシコール類似体Ａで処理した場合、未分化クローン番号６３（白色棒）は、ルシフェラーゼ活性の限定的な低下を示し（図７、黒色棒はクローン番号５３を示す）、これは、ルシフェラーゼの一層低い発現のためであるか、またはＡＵ−リッチエレメントにより媒介されたｍＲＮＡ分化プロセスにおける、異なって発現したかまたは修飾された成分の関与を示す。事実、リボプローブとしてのＩＬ−１βのＡＵに富む３’ＵＴＲの２４１ｂｐを用いるゲル遅延実験は、γＩＦＮ誘導分化または修飾（示していない）を有する追加のタンパク質の結合を示した。
【０１１４】
分化クローン番号６３におけるルシフェラーゼ活性の濃度依存性阻害を図８に示す。５×１０−６  Ｍより高いラジシコール類似体Ａの濃度はまた、転写への細胞障害活性または阻害活性のために、対照クローン（番号５３）を阻害した。  
【実施例４】
【０１１５】
多数の選択物質に対するアッセイの適用
多数の選択された物質を、実施例３（分化した細胞について）に実質的に記述したように、アッセイにおいてこれらの活性について試験した。得られた結果を以下の表３に示す。ラジシコール（以下の式ＩＩ参照）およびラジシコール類似体Ａは、ｍＲＮＡ安定性に対して明白な影響を示し、試験した他の化合物は、用いたアッセイにおいて活性を示さなかった。
【０１１６】
【化２】
2007530058.tif 000006
【０１１７】
【表３】
2007530058.tif 000007
【実施例５】
【０１１８】
単細胞株を使ったアッセイの適用
前の実施例において、試験化合物を、２つの異なった細胞株（クローン番号５３および６３）におけるこれらの活性を比較することにより、アッセイした。しかし、クローン６３を２つの異なるプラスミドで同時形質移入した：一方のプラスミド（ｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０）は、ＳＶ４０プロモーターにより駆動された３０ｂｐ不安定配列を有するルシフェラーゼ遺伝子を含み、他方のプラスミド（ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼ、図３Ｂ）は、ＳＶ４０プロモーターに駆動されたｌａｃＺ遺伝子を含むが、ｍＲＮＡ不安定配列を含まない。この細胞株のβ−ガラクトシダーゼ活性は、ｍＲＮＡ不安定配列を通してｍＲＮＡ不安定性を促進する化合物に対する細胞の暴露により影響されるべきではない。この結果、単に、刺激されていない細胞と刺激されている細胞のルシフェラーゼ活性を比較することにより、そして、これらの同じ細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を比較することにより、ｍＲＮＡ不安定性活性を有する化合物をスクリーニングできる。そのため、クローン６３（刺激したおよび刺激していない細胞）におけるルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性に対するラジシコール類似体Ａの影響を、クローン６３およびクローン５３の刺激したおよび刺激していない細胞についてのラジシコール類似体Ａの影響と比較した。アッセイを、前の実施例で記述したように実施した。表４は、クローン６３および５３の、γＩＦＮ／ＬＰＳ刺激した細胞および刺激していない細胞における、ラジシコール類似体Ａの種々の濃度のルシフェラーゼ活性を示す。活性は対照の％で示し、細胞の数について制御された３つの独立した実験に基づく。表５は、クローン６３および５３の刺激したおよび刺激していない細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。活性は対照の％で示し、細胞の数について制御された３つの独立した実験に基づく。データから、表４および表５のアッセイが、共にラジシコール類似体Ａを活性化合物として同定したことが明らかである。
【０１１９】
【表４】
2007530058.tif 000008
【０１２０】
【表５】
2007530058.tif 000009
【実施例６】
【０１２１】
ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクターの構築
実施例７〜１４で概要を述べるように、プラスミドｐＧＬ２＿Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、種々の不安定配列のクローニングを促進させる目的で、追加の制限酵素領域を含有させるため以下のとおりに修飾した。
【０１２２】
２つの非リン酸化のオリゴヌクレオチド、Ｎ／Ｎ−ＴＫ５Ｐ：
【化３】
2007530058.tif 000010
【０１２３】
およびＮ／Ｎ−ＴＫ３Ｐ：
【化４】
2007530058.tif 000011
【０１２４】
をアニールし、制限酵素ＰｆｌＭ１によって直線化したｐＧＬ２＿Ｎｅｏにライゲートした。アニールしたオリゴヌクレオチドはＮｏｔＩ（太字、イタリック体で示す）およびＮｄｅＩ（太字、イタリック体、下線で示す）のための制限酵素部位を含む小さなマルチクローニングサイトを形成した。この小さなマルチクローニングサイトは、追加のユニークな制限部位を含むために拡大できることに留意されたい。得られたプラスミド、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／ＮのＮｏｔＩ／ＮｄｅＩマルチクローニングサイトの配向をＤＮＡ配列決定にて検証した。  
【実施例７】
【０１２５】
ヒトＡＰＰ不安定配列の構築
本実施例で用いるＡＰＰ配列は、アルツハイマー病（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｙ００２６４、ｌｏｃｕｓ：  ＨＳＡＦＰＡ４）に対応するアミロイドＡ４前駆体のためのヒトｍＲＮＡ由来である。アミロイドＡ４前駆体配列の３’ＵＴＲは５つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。ヒト多組織ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ、Ｋ１４２０−１、ソース（ｓｏｕｒｃｅ）：脳）を、３’プライマー、ＴＫ−ＡＰＰ−３Ｐ、５’プライマー、ＴＫ−ＡＰＰ−５Ｐ、およびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１２６】
ＴＫ−ＡＰＰ−３Ｐ：
【化５】
2007530058.tif 000012
【０１２７】
は、ＮｏｔＩ制限部位を含む追加の５’配列を含む。太字部分は、ヒトＡＰＰ配列の第３３０９位〜第３３３１位と同一の配列を示す。潜在的ポリＡシグナル配列は第３０８１位〜第３０８６位および第３０９０位〜第３０９５位に位置する。
【０１２８】
ＴＫ−ＡＰＰ−５Ｐ：
【化６】
2007530058.tif 000013
【０１２９】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分は、ヒトＡＰＰ配列の第２２４０位〜第２２６４位と同一の配列を示す。
【０１３０】
得られたＤＮＡ断片を図９（配列番号１）に示す。このＤＮＡ断片は、第２２４０位から（終止コドンは第２２３５位に位置する）第３３３１位以下の、ヒトアミロイドＡ４前駆体タンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの１０９３ヌクレオチドを表し、これは、第３の推定ポリＡシグナル配列（第３３３２位〜第３３３７位）の直ぐ上流に位置する。この断片は５つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。この断片を、シャトルベクターとして用いるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端クローン化した。ＮｏｔＩ  断片を消化しシャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローン化した。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ヒトアミロイドＡ４前駆体タンパク質遺伝子の、５つのＡＵＵＵＡモチーフを含み、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ中で用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中に挿入された３’ＵＴＲを含む。
【実施例８】
【０１３１】
ヒトｂｃｌ−２α  ロング不安定配列の構築
本実施例で用いるｂｃｌ−２−アルファ配列は、白血病／リンパ腫疾患（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ１３９９４、ｌｏｃｕｓ：ＨＵＭＢＣＬ２Ａ）に対応するＢ−ｃｅｌｌ  ２（ｂｃｌ−２）癌原遺伝子のためのヒトｍＲＮＡ由来である。ｂｃｌ−２−アルファ配列の３’ＵＴＲは８つのＡＵＵＵＡモチーフを含み、そのうち３つがタンデムにある。ヒトＨＬ−６０細胞（急性前骨髄球性白血病）からの全ＲＮＡを、３’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ３ＰＬおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、得られた一本鎖合成ｃＤＮＡを、３’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ３ＰＬ、５’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３２】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＬ：
【化７】
2007530058.tif 000014
【０１３３】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトｂｃｌ−２−アルファ配列の第３０４１位〜第３０６１位と同一の配列を示す。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは極めて長く、第５０８６位まで伸長する。
【０１３４】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ：
【化８】
2007530058.tif 000015
【０１３５】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分は、ヒトｂｃｌ−２−アルファ配列の第２１７６位〜第２１９４位と同一の配列を示す。終止コドンは第２１７６位に位置する。
【０１３６】
得られたＤＮＡ断片を図１０（配列番号２）に示す。このＤＮＡ断片は、第２１７６位  （終止コドンは第２１７６位に位置する）から第３０６１位以下の、ｂｃｌ−２−アルファ  タンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの８８９の長さのヌクレオチドである。この断片は６つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。この断片を、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅した。この生成物は３’Ａ  オーバーハングを有し、この生成物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローンし、シャトルベクターとして用いた。ＮｏｔＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、制限酵素ＮｏｔＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ中で用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入された最初の６つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトｂｃｌ−２−アルファ  タンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例９】
【０１３７】
ヒト  ｂｃｌ−２α  ショート不安定配列の構築
本実施例で用いるｂｃｌ−２−アルファ配列は、白血病／リンパ腫疾患（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ１３９９４、ｌｏｃｕｓ：ＨＵＭＢＣＬ２Ａ）に対応するＢ−ｃｅｌｌ  ２（ｂｃｌ−２）癌原遺伝子のためのヒトｍＲＮＡ由来である。ｂｃｌ−２−アルファ配列の３’ＵＴＲは８つのＡＵＵＵＡモチーフを含み、そのうち３つはタンデムである。ヒトＨＬ−６０細胞（急性前骨髄球性白血病）からの全ＲＮＡを、３’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ３ＰＳおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。得られた一本鎖合成ｃＤＮＡを、３’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ３ＰＳ、５’プライマー、ｈｂｃｌ２ａ−ＴＫ５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３８】
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ３ＰＳ：
【化９】
2007530058.tif 000016
【０１３９】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトｂｃｌ−２−アルファ配列の第２８４８位〜第２８７８位と同一の配列を示す。
【０１４０】
このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは極めて長く、第５０８６位まで伸長する。
ｈｂｃｌ２．ａ−ＴＫ５Ｐ：
【化１０】
2007530058.tif 000017
【０１４１】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトｂｃｌ−２−アルファ配列の第２１７６位〜第２１９４位と同一の配列を示す。終止コドンは第２１７６位に位置する。
【０１４２】
得られたＤＮＡ断片を図１１（配列番号３）に示す。このＤＮＡ断片は、第２１７６位  （終止コドンは第２１７６位に位置する）から第２８７８位以下のｂｃｌ−２−アルファ  タンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの６９６の長さのヌクレオチドを表す。断片は５つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。この断片を、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で増幅した。この生成物は３’Ａオーバーハングを有し、この生成物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローンし、シャトルベクターとして用いた。ＮｏｔＩ断片を消化しシャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎで用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入された最初の５つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトｂｃｌ−２−アルファタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１０】
【０１４３】
ヒトｃ−ｍｙｃ不安定配列の構築
本実施例で用いるｃ−ｍｙｃ配列は、ｐ６７およびｐ６４  ｍｙｃタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ：Ｄ１０４９３およびＤ９０４６７、ｌｏｃｕｓ：ＨＵＭＭＹＣＫＯＢ）のためのヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子由来である。ヒトｃ−ｍｙｃのゲノム構築は、ｐ６７とｐ６４が、４つの単離のＡＵＵＵＡ配列を含有する共通の３’ＵＴＲを有することを示す。両方のタンパク質（ヌクレオチド第６６２８位〜第７１９０位）の最終エクソンは、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等が記述している（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１９９２、６、６４２−６５２）、コード領域不安定性決定因子（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ：ＣＲＤ）として知られる第７００８位〜終止コドン（第７１９０位）までの６０アミノ酸ドメインを含む。ヒトＨＬ−６０細胞（急性前骨髄球性白血病）からの全ＲＮＡは、３’プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３ＰおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。得られた一本鎖合成ｃＤＮＡは、３’プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３Ｐ、５’プライマー、ｈｃｍｙｃ−ＴＫ５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。  
【０１４４】
ｈｃｍｙｃ−ＴＫ３Ｐ：
【化１１】
2007530058.tif 000018
【０１４５】
は、ＮｄｅＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分は、ヒトｃ−ｍｙｃ配列の第７６３６位〜第７６５８位と同一の配列を示す。２つのポリＡシグナル配列は、第７４８５位〜第７４９０位および第７６２６位〜第７６３１位に位置する。
【０１４６】
ｈｃｍｙｃ−ＴＫ５Ｐ：
【化１２】
2007530058.tif 000019
【０１４７】
はＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分は、ｃｍｙｃ配列の第６９８４位〜第７００５位と同一の配列を示す。
【０１４８】
得られたＤＮＡ断片を図１２（配列番号４）に示す。このＤＮＡ断片は、第６９８４位から第７６５８位以下の、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの６７５の長さのヌクレオチドを表す。この断片は４つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。断片は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で増幅した。この生成物は３’Ａオーバーハングを有し、この生成物をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へクローンし、シャトルベクターとして用いた。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎで用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入される４つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトｃ−ｍｙｃタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１１】
【０１４９】
ヒト  ＴＮＦα不安定配列の構築
本実施例で用いるＴＮＦα  ｍＲＮＡ配列は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ  スーパーファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  ２）（ＴＮＦ）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０００５９４、ｌｏｃｕｓ：ＴＮＦ）由来である。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは９つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。ヒトＴＨＰ−１細胞（γＩＦＮ／ＬＰＳで分化）からの全ＲＮＡを単離し、３’プライマー、ＴＫＨＴ３ＰおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、得られた一本鎖合成ｃＤＮＡを、３’プライマー、ＴＫＨＴ３Ｐ、５’プライマー、ＴＫＨＴ５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。  
【０１５０】
ＴＫＨＴ３Ｐ：
【化１３】
2007530058.tif 000020
【０１５１】
はＮｄｅＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトＴＮＦα配列の第１６４０位〜第１６６０位と同一の配列を示す。潜在的ポリＡシグナル配列は第１６４７位〜第１６５２位に位置する。ポリＡテールの付加が第１６６６位または第１６６９位で生じる。
【０１５２】
ＴＫＨＴ５Ｐ：
【化１４】
2007530058.tif 000021
【０１５３】
はＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトＴＮＦα配列の第８６９位〜第８９０位の同一の配列を示す。
【０１５４】
得られたＤＮＡ断片を図１３（配列番号５）に示す。このＤＮＡ断片は、第８６９位〜第１６６０位以下の、ヒトＴＮＦαタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの７９２の長さのヌクレオチドを表す。断片は９つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。断片を、シャトルベクターとして用いるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端クローン化した。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ  発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ中で用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入される９つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトＴＮＦαタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１２】
【０１５５】
ヒトＩＬ−１β不安定配列の構築
本実施例で用いるＩＬ−１β  ｍＲＮＡ配列は、プロインターロイキン１β（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｘ０４５００、ｌｏｃｕｓ：ＨＳＩＬ１Ｂ）にためのヒト遺伝子由来である。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは６つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。ヒトＴＨＰ−１細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  γＩＦＮ／ＬＰＳ）からの全ＲＮＡを単離し、３’プライマー、ＨＩＬ１Ｂ３およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、得られた一本鎖合成ｃＤＮＡを、３’プライマー、ＨＩＬ１Ｂ３、５’プライマー、ＨＩＬ１Ｂ５およびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１５６】
ＨＩＬ１Ｂ３：
【化１５】
2007530058.tif 000022
【０１５７】
は、ＮｄｅＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトＩＬ−１β配列の第８９１７位〜第８９３６位と同一の配列を示す。潜在的ポリＡシグナル配列は第８９２５位〜第８９３０位に位置する。
【０１５８】
ＨＩＬ１Ｂ５：
【化１６】
2007530058.tif 000023
【０１５９】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はヒトＩＬ−１β配列の第８３３７位〜第８３５７位と同一の配列を示す。
【０１６０】
得られたＤＮＡ断片を、図１４（配列番号６）に示す。このＤＮＡ断片は、第８３３７位から第８９３６位までを含むヒトＩＬ−１βタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの６００の長さのヌクレオチドを表す。断片は６つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。この断片を、シャトルベクターとして用いるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端クローン化した。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎ  ルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎで用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入された６つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトＩＬ−１βタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１３】
【０１６１】
ヒトＶＥＧＦ不安定配列の構築
本実施例で用いる血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦのためのヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ０２２３７５）由来である。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは８つのＡＵＵＵＡモチーフを有し、全てが単一コピーで存在する。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡはまた、３’ＵＴＲ（Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：４６９−４８１）に、既報告の低酸素誘導性ｍＲＮＡ安定性領域を有する。ヒト多組織ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ、Ｋ１４２０−１、ソース：胎盤）を、３’プライマー、ＴＫ−ＶＡＵ−３Ｐ、５’プライマー、ＴＫ−ＶＡＵ−５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１６２】
ＴＫ−ＶＡＵ−３Ｐ：
【化１７】
2007530058.tif 000024
【０１６３】
は、ＮｄｅＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はＶＥＧＦ配列の第３１２４位〜第３１４６位と同一の配列を示す。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、極めて長く、第３１６６位まで伸長する。第３１５５位で始まるポリＡテールおよび第３１３９位〜第３１４４位に位置する潜在的ポリＡ付加配列の存在が考えられる。
【０１６４】
ＴＫ−ＶＡＵ−５Ｐ：
【化１８】
2007530058.tif 000025
【０１６５】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はＶＥＧＦ配列の第２０６２位〜第２０８５位と同一の配列を示す。終止コドンは第１２７５位に位置する。
【０１６６】
得られたＤＮＡ断片を図１５（配列番号７）に示す。このＤＮＡ断片は、第２０６２位  （終止コドンは第１２７５位に位置する）から第３１４６位以下の、ヒトＶＥＧＦタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの１０８７の長さのヌクレオチドを表す。断片は７つのＡＵＵＵＡモチーフを含む。この断片を、シャトルベクターとして用いるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端クローン化した。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎで用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入される７つのＡＵＵＵＡモチーフを有するヒトＶＥＧＦタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１４】
【０１６７】
ヒトＶＥＧＦ低酸素領域不安定配列の構築
本実施例で用いる血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ０２２３７５）のためのヒト遺伝子由来である。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、８つのＡＵＵＵＡモチーフを含み、全ては、単一コピーで存在する。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡはまた、３’ＵＴＲに位置する既報告の低酸素誘導ｍＲＮＡ安定性領域を有する（Ｃｌａｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９：４６９−４８１）。ヒト多組織ｃＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ、Ｋ１４２０−１、ソース：胎盤）は、３’プライマー、ＴＫ−Ｖ−３Ｐ、５’プライマー、ＴＫ−Ｖ−５ＰおよびＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１６８】
ＴＫ−Ｖ−３Ｐ：
【化１９】
2007530058.tif 000026
【０１６９】
は、ＮｄｅＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分はＶＥＧＦ配列の第１７３０位〜第１７５２位と同一の配列を示す。このｍＲＮＡの３’ＵＴＲは極めて長く、第３１６６位まで伸長する。第３１５５位で始まるポリＡテールおよび第３１３９位〜第３１４４位では潜在的ポリＡ付加配列の存在が考えられる。
【０１７０】
ＴＫ−Ｖ−５Ｐ：
【化２０】
2007530058.tif 000027
【０１７１】
は、ＮｏｔＩ制限部位を有する追加の５’配列を含む。太字部分は、ＶＥＧＦ配列の第１６０１位〜第１６２２位と同一の配列を示す。終止コドンは第１２７５位に位置する。
【０１７２】
得られたＤＮＡ断片を図１６（配列番号８）に示す。このＤＮＡ断片は、第１６０１位（終止コドンは第１２７５位に位置する）から第１７５２位以下の、ヒトＶＥＧＦタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの１５２の長さのヌクレオチドを表す。断片は既報告の低酸素領域を含む。この断片は、シャトルベクターとして用いるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端クローン化した。ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩ断片を消化し、シャトルベクターから切り出し、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによって直線化したｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎルシフェラーゼ発現ベクター中へサブクローンした。得られたＤＮＡ発現ベクターは、ｐＧＬ２ＮｅｏＮ／Ｎで用いたルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ中へ挿入される既報告の低酸素領域を有するヒトＶＥＧＦタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【実施例１５】
【０１７３】
対照プラスミドを付与するβ−ガラクトシダーゼハイグロマイシンＢの構築
対照プラスミドを調製するために、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した、ｐＴＫ−Ｈｙｇプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  Ｕ４０３９８）を修飾し、ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子および調節エレメントに隣接するユニークな制限部位を導入した。このハイグロマイシンカセットを、第２のプラスミド、ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼのＳａｌＩ部位中へクローンすることから、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、Ｈｙｇｒ  遺伝子およびＴＫポリＡシグナルを有するＨＳＶ断片を隣接させるために、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限部位を選択した。２つのプライマー、ＴＫＳＦおよびＴＫＳＲをアニールし、ＰｆｌＭＩによって直線化したｐＴＫ−Ｈｙｇ（第２８７９位および第２９２８位に存在するＰｆｌＭＩ部位）へ連結した。
【０１７４】
ＴＫＳＦ：
【化２１】
2007530058.tif 000028
【０１７５】
は、太字で示されるＳａｌＩ制限部位を含む。
【０１７６】
ＴＫＳＲ：
【化２２】
2007530058.tif 000029
【０１７７】
は、太字で示されるＳａｌＩ制限部位を含む。
【０１７８】
得られたｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、子牛腸ホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：  ＣＩＰ）で脱リン酸化した。２つのプライマー、ＴＫＸＦ３
【化２３】
2007530058.tif 000030
【０１７９】
およびＴＫＸＲ３
【化２４】
2007530058.tif 000031
【０１８０】
をアニールし、ＨｉｎｄＩＩＩによって直線化したｐＴＫ−Ｈｙｇ／ＳａｌＩ（オリジナルのｐＴＫ−Ｈｙｇベクターの第１０３７位に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位）へと連結した。得られたプラスミドを、ｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩ／ＸｈｏＩと同定した。
【０１８１】
ＴＫＸＦ３：
【化２５】
2007530058.tif 000032
【０１８２】
は、太字で示されるＸｈｏＩ認識部位を含む。
【０１８３】
ＴＫＸＲ３：
【化２６】
2007530058.tif 000033
【０１８４】
は、太字で示されるＸｈｏＩ認識部位を含む。
【０１８５】
ｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼプラスミド（図３Ｂ参照）を調製するために、カセット（およそ３７３１ｂｐ）を付与し、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限消化から得られた、β−ガラクトシダーゼを主鎖プラスミドおよびＡｍｐｒ、ｆ１  ｏｒｉおよびＳＶ４０プロモーター配列を有するｐＧＬ２−対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＣＩＰ処理された、およそ３１０４ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片中へとクローンした。
【０１８６】
ｐＴＫ−Ｈｙｇ−ＳａｌＩ／ＸｈｏＩプラスミドを、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで直線化した。カセットを付与するハイグロマイシンを含むおよそ１８４０ｂｐ  ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＳａｌＩによって直線化し脱リン酸化したｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼプラスミドへと連結した。ｐＧＬβｇａｌ−ＴＫｈｙｇＳＸ（８６８３ｂｐ）と同定された、得られた対照プラスミド（図１７）を制限消化およびＤＮＡ配列により検証した。
【０１８７】
本明細書において参照された、公開特許出願を含む全ての特許、出版物、およびデータベースエントリーの開示は、そのような個々の特許、出版物およびデータベースエントリーそれぞれが、明確かつ個々に参照により援用されることを示されるのと同等の程度で、これらの内容全体を参照によって明確に援用したものとする。  
【０１８８】
記述されている本発明の実施形態は従って、同一のことが、多くの方法において変更されることが明らかとなる。そのような種々の変更は、本発明の精神および範囲からの離脱とみなされるものではなく、当業者に明確であるように、そのような全ての修正は以下のクレームの範囲内に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１はＩＬ−１β  ３’ＵＴＲのＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は実施例１のｍＲＮＡ不安定配列として用いる３０ｂｐ断片を示す。
【図３Ａ】図３ＡはｐＧＬ２＿Ｎｅｏ３０とｐＧＬ２−対照のプラスミド図を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはｐＧＬ２−β−ガラクトシダーゼのプラスミド図を示す。
【図４】図４はクローン番号５３（Ａ）とクローン番号６３（Ｂ）についての分化の時間にわたるルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図５】図５はラジシコール類似体Ａ（ＲＡＡ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔ  Ｄ．）およびシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で処理したクローン番号５３とクローン番号６３についての化合物の添加後４時間および８時間におけるルシフェラーゼ半減期のグラフである。
【図６】図６は種々の濃度のラジシコール類似体Ａ（ＲＡＡ）で処理したクローン番号５３  （黒色棒）およびクローン番号６３（白色棒）のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図７】図７はラジシコール類似体Ａ（ＲＡＡ）で８時間処理した未分化および分化クローン番号５３（黒色棒）とクローン番号６３（白色棒）のルシフェラーゼ活性示すグラフである。
【図８】図８はラジシコール類似体Ａ（ＲＡＡ）で８時間処理した分化クローン番号６３におけるルシフェラーゼ活性の濃度依存性阻害のグラフである。
【図９】図９はヒトＡＰＰ  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１０】図１０はヒトｂｃｌ−２αロング  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１１】図１１はヒトｂｃｌ−２αショート  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１２】図１２はヒトｃ−ｍｙｃ  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１３】図１３はヒトＴＮＦα  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１４】図１４はヒトＩＬ−１β  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１５】図１５はヒトＶＥＧＦ  ３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１６】図１６はヒトＶＥＧＦ低酸素領域３’ＵＴＲ由来のｃＤＮＡコンストラクトを示す。
【図１７】図１７は対照プラスミドｐＧＬβｇａｌ−ＴＫｈｙｇＳＸを示す。