(57)【要約】静脈血管芽細胞誘導培地を使用して幹細胞から静脈血管芽細胞の集団を作製する方法；ならびに、任意で、当該静脈血管芽細胞を含む細胞集団からCD34+集団を単離する方法であって、例えばCD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬を、任意でCD73アフィニティ試薬と共にまたは該試薬なしで使用する、方法；ならびに、当該静脈血管芽細胞をインビトロでさらに分化させてSEC-LCを作製し、かつ/またはインビボでさらに分化させてSECを作製する方法が、本明細書中で開示される。細胞および細胞を含む組成物の使用も記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）を作製する方法であって、
幹細胞または血管芽細胞を準備する工程；および
SEC-LCが作製される条件の下で該幹細胞または血管芽細胞を培養する工程であって、該条件が、
（a）bFGFの存在下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養すること；または
（b）血管内皮増殖因子（VEGF）-Aの存在下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養して内皮細胞を作製し、続いて、TGFβシグナリング阻害剤、サイクリックAMP（cAMP）シグナリングアゴニスト、VEGF-Cの存在下で該内皮細胞を培養すること；または
（c）低酸素条件下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養すること
を含む、工程
を含み、それによってSEC-LCを作製する、方法。
【請求項２】
前記SEC-LCが肝SEC-LCである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または胚様体である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、BMP4、bFGF、および/またはCHIRの存在下で培養される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、Notch阻害剤もしくはMEK阻害剤、bFGF、および/または静脈血管芽細胞指定濃度のVEGF（静脈血管芽細胞誘導培地）の存在下で培養される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
Notch阻害剤の存在下で前記幹細胞または血管芽細胞を培養することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記血管芽細胞が、静脈血管芽細胞または動脈血管芽細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記cAMPシグナリングアゴニストが、cAMP、8-Br-cAMP、フォルスコリン、および/またはIBMXである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記TGFβシグナリング阻害剤がSB431542である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記低酸素条件が、5％ CO2 / 5％ O2の存在下での培養、または低酸素誘導因子（HIF）プロリルヒドロキシラーゼ（PHD）阻害剤（HIF-PHDI）の存在下での培養を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記HIF-PHDIが三環式トリアゾール化合物である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記HIF-PHDIが、ダプロデュスタット（Daprodustat）、モリデュスタット（Molidustat）、ロキサデュスタット（Roxadustat）、バダデュスタット（Vadadustat）、およびデシデュスタット（Desidustat）より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記SEC-LCが、TGFβシグナリング阻害剤の存在下、cAMPシグナリングアゴニストの存在下、かつ/またはVEGF-C欠損下で培養される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記SEC-LCが第VIII因子を発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
第VIII因子の存在について前記SEC-LCをモニタリングする工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記SEC-LCを単離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
請求項1記載の方法によって作製された、SEC-LC細胞の集団。
【請求項１８】
肝SEC-LCによる結合および取り込みについて試験化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項15記載のSEC-LCを試験化合物と接触させる工程、および
該SEC-LCが該試験化合物に結合してそれを取り込むか否かを判定する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
クリアランスまたは除去の速度を決定する工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記試験化合物が治療用抗体である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記試験化合物が、モノクローナル抗体、サイトカイン、または低分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
肝疾患に罹患している個体を処置する方法であって、請求項15記載のSEC-LCを該個体に導入する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（脂肪肝疾患もしくはNASH）、進行性硬変性疾患もしくは障害、血友病A、または肝細胞癌（HCC）である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
投与が、肝臓への直接投与である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
投与が全身投与である、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年9月18日に出願された米国出願第62/732,934号に基づく優先権を主張する。この先行出願の開示は、本願の開示の一部と見なされ、その全体が本願に組み入れられる。
【０００２】
分野
本発明は、静脈内皮系統細胞を作製する方法に関し、特に、類洞内皮細胞様細胞、当該細胞を含む組成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
緒言
肝疾患を含む、移植を必要とする疾患は、多くの人々に影響を与えており、死体器官の移植は、ドナーの利用可能性によって妨げられている。組織工学は、実験室で設計されたドナー組織という希望を提供するが、それは、機能的な細胞型が構築において使用されることを必要とするか、または、少なくとも、治療的に適切な組織へ成熟することができる機能的な前駆細胞を必要とする。例えば、正常肝組織には、複数の型の内皮細胞型が存在し、ヘパトサイトと身体の残りの部分との間の相互作用表面を表している。主として、この相互作用は、篩板状に配置された動的に調節された細胞通過性の有窓構造を通して、肝類洞内皮細胞（LSEC）を介した類洞血管ネットワークにおいて起こる（Wisse et al., 1985）。LSECに加えて、骨髄類洞内皮細胞（BSEC）、脾類洞内皮細胞（SSEC）、および下垂体前葉類洞内皮細胞（APSEC）を含む、種々の類洞内皮細胞（SEC）が存在する。SECは、他の内皮サブタイプと多くの機能的特徴（高いエンドサイトーシス能、剪断応力および炎症に対する応答性）を共有しているが、それを大型血管内皮および他の微小血管床から区別する独特の類洞特徴（高い除去能（CD32B、STAB2、LYVE1、CD14、MRC1によって媒介される）、および動的に応答性の篩板構造の有窓構造）も有する（Braet and Wisse,2002；Deleve,2013a；Elvevold et al., 2008）。
【０００４】
内皮細胞の型の間の機能的な違いは、発達的に調節された指定（specification）機序（例えば、動脈、静脈、心内膜、リンパ系への指定）および毛細血管型：連続型（脳、肺、骨格筋）、有窓型（腎臓、腸、脈絡叢）、洞様型（肝臓、骨髄、脾臓、下垂体前葉）のような解剖学的/組織関連指定の両方に関連している。解剖学的な肝組織に関連したシグナリングは、完全には理解されていないが、Martinezは、単離された肝類洞内皮細胞の構造および機能に対する酸素圧の影響を証明している（Martinez et al., 2008）。
【０００５】
（Ditadi et al., 2015）、（Zhang et al., 2017）は、VEGF、bFGF、Notch、およびシグナリングが、hPSC分化培養物における血管の運命の指定において役割を果たすことを示している。
【発明の概要】
【０００６】
概要
一つの局面において、類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）を作製する方法が提供される。当該方法は、典型的には、幹細胞または血管芽細胞を準備する工程；およびSEC-LCが作製される条件の下で該幹細胞または血管芽細胞を培養する工程であって、該条件が（a）bFGFの存在下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養すること；または（b）血管内皮増殖因子（VEGF）-Aの存在下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養して内皮細胞を作製し、続いて、TGFβシグナリング阻害剤、サイクリックAMP（cAMP）シグナリングアゴニスト、VEGF-Cの存在下で該内皮細胞を培養すること；または（c）低酸素条件下で該幹細胞もしくは血管芽細胞を培養することを含む、工程を含み、それによって、SEC-LCを作製する。
【０００７】
いくつかの態様において、SEC-LCは、肝SEC-LCである。いくつかの態様において、幹細胞は、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または胚様体である。血管芽細胞は、静脈血管芽細胞または動脈血管芽細胞であり得る。
【０００８】
いくつかの態様において、幹細胞は、BMP4、bFGF、および/またはCHIRの存在下でさらに培養される。いくつかの態様において、幹細胞は、Notch阻害剤もしくはMEK阻害剤、bFGF、および/または静脈血管芽細胞指定濃度のVEGF（静脈血管芽細胞誘導培地）の存在下で培養される。いくつかの態様において、方法は、Notch阻害剤（例えば、GSI）の存在下で幹細胞または血管芽細胞を培養する工程をさらに含む。いくつかの態様において、SEC-LCは、TGFβシグナリング阻害剤の存在下、cAMPシグナリングアゴニストの存在下、かつ/またはVEGF-C欠損下で培養される。
【０００９】
いくつかの態様において、cAMPシグナリングアゴニストは、cAMP、8-Br-cAMP、フォルスコリン、および/またはIBMXである。いくつかの態様において、TGFβシグナリング阻害剤は、SB431542である。いくつかの態様において、低酸素条件は、5％ CO2 / 5％ O2の存在下での培養または低酸素誘導因子（HIF）プロリルヒドロキシラーゼ（PHD）阻害剤（HIF-PHDI）の存在下での培養を含む。代表的なHIF-PHDIには、非限定的に、三環式トリアゾール化合物（例えば、IOX2、IOX4、またはDMOG）が含まれる。付加的な代表的なHIF-PHDIには、非限定的に、ダプロデュスタット（Daprodustat）、モリデュスタット（Molidustat）、ロキサデュスタット（Roxadustat）、バダデュスタット（Vadadustat）、またはデシデュスタット（Desidustat）が含まれる。
【００１０】
いくつかの態様において、SEC-LCは、第VIII因子を発現する。いくつかの態様において、方法は、第VIII因子の存在についてSEC-LCをモニタリングする工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、SEC-LCを単離する工程をさらに含む。
【００１１】
別の局面において、本明細書中に記載される方法によって作製されたSEC-LC細胞の集団が、提供される。
【００１２】
さらに別の局面において、肝SEC-LCによる結合および取り込みについて試験化合物をスクリーニングする方法が、提供される。そのような方法は、典型的には、本明細書中に記載されるように作成されたSEC-LCを試験化合物と接触させる工程、およびSEC-LCが試験化合物に結合して（例えば、細胞表面上または細胞内に）それを取り込む（除去する）か否かを判定する工程を含む。いくつかの態様において、そのような方法は、クリアランスまたは除去の速度を決定する工程をさらに含む。
【００１３】
いくつかの態様において、試験化合物は、治療用抗体である。代表的な試験化合物には、非限定的に、モノクローナル抗体、サイトカイン、または低分子が含まれる。
【００１４】
さらに別の局面において、肝疾患に罹患している個体を処置する方法が、提供される。そのような方法は、本明細書中に記載されるように作成されたSEC-LCを個体へ導入する工程を含む。いくつかの態様において、投与は、肝臓への直接投与である。いくつかの態様において、投与は、全身投与である。
【００１５】
代表的な肝疾患には、非限定的に、非アルコール性脂肪性肝炎（脂肪肝疾患もしくはNASH）、進行性硬変性疾患もしくは障害、血友病A、または肝細胞癌（HCC）が含まれる。
【００１６】
本開示の一局面は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団が得られるまで、Notch阻害剤もしくはMEK阻害剤、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGF、および/またはbFGFを含む静脈血管芽細胞培地においてKDR+CD56+CD34-中胚葉を培養する工程を含み、任意で、単独で、またはCD73アフィニティ試薬と組み合わせて、任意で、CD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬を使用して、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団からCD34+集団を単離する工程を任意で含む、静脈血管芽細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１７】
一つの態様において、方法は、静脈内皮細胞の集団を作製するための方法であり、本明細書中に記載される静脈血管芽細胞の集団を準備する工程、および、単離されたCD34+集団を静脈内皮誘導培地において培養して静脈内皮細胞を作製する工程を含み、任意で、静脈内皮細胞はPDGFRβ-CD73+静脈内皮細胞を含む。
【００１８】
さらなる局面は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む集団を得る工程であって、任意で、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞が集団の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％を構成する、工程；およびSEC-LCを得るため、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞をインビトロで分化させる工程を含む、類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）を作製する方法を含む。
【００１９】
本明細書中に記載される方法に従って作製された細胞、該細胞を含む組成物およびキット、ならびに/または該細胞を作成するための成分、ならびにそれらの使用も、提供される。
【００２０】
本開示の他の特色および利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本開示の本旨および範囲に含まれる様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者に明白になるため、詳細な説明および具体例は、本開示の態様を示すが、例示のために与えられるに過ぎないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本開示の態様を、図面に関連して、以下に説明する。
【００２２】
【図１】VEGFAおよびbFGFのモジュレーションによる中胚葉hPSCの血管芽細胞への分化。（1A）EBベースのhPSCの静脈血管芽細胞への分化の模式図。（1B）0〜8日目のバルクEB集団、および（1A）のような静脈分化（4〜8日目、10ng/ml VEGFA、30ng/ml bFGF、10μm GSI）後の8日目のCD34+MACS濃縮血管芽細胞の動的遺伝子発現プロファイルを比較するヒートマップ。発現レベルの高低（濃淡）が、各遺伝子について示されている。（1C）4日目のKDR+CD56+CD235a-中胚葉細胞およびMACS濃縮の前後の8日目のCD34+CD31low静脈血管芽細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（1D）CD34+細胞のCD184+CD73low動脈血管芽細胞またはCD184-CD73high静脈血管芽細胞へのバイアスを含む、VEGFA（0〜100ng/ml）およびbFGF（0〜100ng/ml）の異なる4〜6日目処理条件の下で指定された6日目のCD34+血管芽細胞の代表的なフローサイトメトリーおよび定量化（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、示されているVEGFAおよびbFGFの用量の間ならびに同定されたCD34+亜集団の間）。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図２】動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞の指定。（2A）EBベースのhPSCに由来する4日目の中胚葉の動脈血管芽細胞または静脈血管芽細胞への分化（4〜8日目）およびその後の単層内皮細胞への分化（8〜12日目）の模式図。（2B〜2H）MACS精製の前後の8日目の動脈血管芽細胞（4〜8日目：100ng/ml VEGFA；V100）および静脈血管芽細胞（4〜8日目：10ng/ml VEGFAおよび10μM GSI；V10G）の代表的なフローサイトメトリー分析および定量化、ならびに精製された血管芽細胞からの内皮細胞の成長（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、示されているCD34+集団の間、およびCD34+亜集団の間）。（2I）12日目の動脈内皮細胞および静脈内皮細胞（全CD34+）のCD73平均蛍光強度（MFI）のフローサイトメトリー分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されている通り）。（2J〜2L）動脈内皮運命、静脈内皮運命、および一般内皮運命のマーカー（2J）、Notchシグナリング（2K）、ならびにリンパ系およびLSECのマーカー（2L）の発現について、8日目および12日目の精製されたCD34+細胞またはCD34+CD31+細胞を比較するヒートマップ（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、所定の遺伝子についての所定の日における動脈集団と静脈集団との間）。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図３】静脈血管芽細胞からのLSEC-LCの指定。（3A）EBベースのhPSCに由来する4日目の中胚葉の、静脈血管芽細胞、内皮細胞、およびLSEC様細胞（LSEC-LC）への分化の模式図。（3B）異なる濃度の8-Br-cAMP（cAMP；0、0.1、0.3、1.0mM）、SB-431542（SB；0、6、18μM）、およびVEGFC（0、100ng/ml）による4日間の処理の後の16日目の培養物における、LSECマーカーおよび関連遺伝子の、TBP対照遺伝子に対する相対的な遺伝子発現を比較するヒートマップ。各ヒートマップスケールは、示されている遺伝子に対して相対的なものである（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、所定のSB/VEGFC用量における示されている条件対0mM cAMP、+p＜0.05、++p＜0.01、+++p＜0.001、所定のcAMP用量における示されている条件対0μM SB/0ng/ml VEGFC）。（3C）12〜16日目の1mM cAMP、6μM SBによる処理の後の16日目の静脈LSEC-LCにおける、CD31+細胞の蛍光活性化細胞選別（FACS）によって媒介された精製、ならびに発現されたLSECマーカーおよび内皮遺伝子のqRT-PCR分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、示されている通り）。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図４】動脈血管芽細胞からのLSEC-LCの指定。（4A）EBベースのhPSCに由来する4日目の中胚葉の動脈血管芽細胞、内皮細胞、およびLSEC様細胞（LSEC-LC）への分化の模式図。（4B）異なる濃度の8-Br-cAMP（cAMP；0、0.1、0.3、1.0mM）、SB-431542（SB；0、6、18μM）、およびVEGFC（0、100ng/ml）による6〜8日間の処理の後の18〜20日目の培養物における、LSECマーカーおよび関連遺伝子の、TBP対照遺伝子に対して相対的な遺伝子発現を比較するヒートマップ。各ヒートマップスケールは、示されている遺伝子に対して相対的なものである（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、所定のSB/VEGFC用量における示されている条件対0mM cAMP、+p＜0.05、++p＜0.01、+++p＜0.001、所定のcAMP用量における示されている条件対0μM SB/0ng/ml VEGFC）。（4C）12〜20日目の1mM cAMP、6μM SBによる処理の後の18〜20日目の動脈LSEC-LCにおける、示されている集団（Pop.）からのCD31+/LYVE1+細胞の蛍光活性化細胞選別（FACS）によって媒介される精製。所定の集団のqRT-PCR分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されている集団と集団8との比較）。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図５】静脈血管芽細胞におけるLSEC-LC指定は、低酸素において増強される。（5A）標準的なLSEC誘導条件（6μM SB、1mM cAMP、30ng/ml bFGF）および明確な酸素条件の下での、EBベースのhPSCに由来する4日目の中胚葉の、動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞、内皮細胞、ならびにLSEC様細胞（LSEC-LC）への分化の模式図。（5B〜5C）低酸素条件（5％ O2）および正常酸素条件（21％ O2）の下でのLSEC-LC誘導中（12〜20日目）の動脈および静脈のCD31およびLYVE1の発現プロファイルの代表的なフローサイトメトリー分析および定量化（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されている日と動脈低酸素12日目との比較）。（5D〜5E）低酸素条件および正常酸素条件の下でのLSEC-LC誘導中のLYVE1およびCD32の発現についての動脈および静脈のCD31+細胞の代表的なフローサイトメトリー分析および定量化（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、所定の酸素圧および細胞型の示されている日と12日目との比較、#p＜0.05、示されている日における低酸素で培養された動脈細胞および静脈細胞と対応する日との比較、$p＜0.05、細胞型内の示されている日における低酸素および正常酸素と対応する日との比較）。（5F〜5H）低酸素および正常酸素で培養された動脈および静脈のLSEC-LC培養物のLSECマーカーについてのqRT-PCR分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、細胞型内の示されている日における低酸素および正常酸素と対応する日との比較、#p＜0.05、示されている日における低酸素で培養された動脈細胞および静脈細胞と対応する日との比較）。（5I）14〜16日目におけるCD31+細胞についてFACSによって精製された動脈内皮細胞および静脈内皮細胞から誘導された低酸素で培養されたLSEC-LCのqRT-PCR分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されている細胞型内のCD31+とCD31-との比較、#p＜0.05、動脈起源の細胞型と静脈起源の細胞型との間のCD31+の比較）。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図６】CD32B発現は低酸素/HIF1aシグナリングによって制御される。（6A）IOX2の添加を含む標準的なLSEC誘導条件（6μM SB、1mM cAMP、30ng/ml bFGF）および明確な酸素条件の下での、EBベースのhPSCに由来する4日目の中胚葉の、動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞、内皮細胞、ならびにLSEC様細胞（LSEC-LC）への分化の模式図。（6B）DMSOまたは増加する用量のIOX2によって処理（12〜16日目）された正常酸素で培養されたCD31+動脈LSEC-LCの代表的なフローサイトメトリー分析。（6C）4日間、DMSOまたは増加するIOX2用量によって処理された正常酸素条件下で培養された16日目の動脈LSEC-LCおよび静脈LSEC-LCにおけるLSECマーカーのqRT-PCR分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、所定のIOX2用量における動脈細胞と静脈細胞との比較）。（6D）IOX2を含む場合およびIOX2を含まない場合の正常酸素条件および低酸素条件の下で培養された16日目の動脈CD31+LSEC-LCおよび静脈CD31+LSEC-LCの代表的なフローサイトメトリー分析。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図７】hPSCに由来する血管芽細胞は、新生仔肝臓に生着し、ヒトLSECマーカーを発現するよう成熟する。（7A）新生仔肝臓内移植モデル、8日目のCD34+血管芽細胞または14〜16日目のCD31+LSEC-LCに由来するhPSC由来LSECの単離および精製の模式図。（7B）示されている集団を移植された個々のマウスからの、経時的な、単離可能な非実質細胞（NPC）画分内のtdRFP（RFP）陽性hESC由来細胞の生着。図12Bに見られる上昇した循環FVIIIレベルに関連している、有効な生着（＞1％RFP）の頻度が、レジェンドの右に図示されている。（7C〜7F）インビボで77日間成熟した8日目の静脈血管芽細胞に由来するNSGマウス肝臓の内皮生着領域の代表的な組織学的分析。ヒト特異的な核染料およびLSECマーカー染料は、示されている通りである。60μmスケールバーは、全ての画像に当てはまる。（7G）移植された動脈血管芽細胞もしくは静脈血管芽細胞または動脈LSEC-LCもしくは静脈LSEC-LCからのNPC試料の代表的なフローサイトメトリー分析および定量化（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されているCD31+画分の間、および示されているCD32+/LYVE1+画分の間）。（7H）インビボで成熟した8日目の静脈血管芽細胞に由来する移植片のFACSによって単離された画分におけるLSECマーカーの分析のqRT-PCR。CD31-、CD31+CD32-LYVE1-、CD31+CD32+LYVE1-、CD31+CD32+LYVE1+のいずれかであるRFP+細胞と、FACSによって単離された初代ヒトLSEC（生存、CD45-、CD68-、CD31+、CD32+）との比較（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、RFP+CD31-細胞と示されている試料との間、またはさらに示されているようにRFP+CD31+画分の間）。入手可能であった場合には、初代ヒトLSEC発現レベルが、遺伝子名の下に示されている。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図８】H1-GFP hESCによるLSECプログラムの複製。（8A）図1Aと同様の誘導後の4日目のKDR+CD56+CD235a low-中胚葉細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（8B）4日目〜8日目の100ng/ml VEGFA（動脈）ならびに10ng/ml VEGFAおよび10μM GSI（静脈）という条件に応答した、動脈指定（CD184+CD73low）および静脈指定（CD184-CD73high）を含むCD34 MACS濃縮後の8日目のCD34+CD31low動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。（8C）12日目における6μM SBおよび1mM cAMPの添加に応答した、LYVE1+細胞内のCD32の発現のためのCD31+動脈LSEC-LCおよび静脈LSEC-LCの誘導の代表的なフローサイトメトリー分析。（8D）GFP+hESC由来LSECを単離し、定量化し、回収するための、8日目の静脈移植マウスからのNPC細胞回収の模式図。（8E〜8H）GFP+細胞回収、GFP+％定量化、GFP+画分のCD31+％定量化、GFP+CD31+細胞のLYVE1+/CD32+定量化の代表的なフローサイトメトリー分析。（8I）存在する場合、およそ100nmの有窓構造を可視化するために50,000倍の倍率で画像化された、示されている選別された集団からFACS精製され、一晩培養され、固定され、処理された細胞の代表的な走査型電子顕微鏡像。画像化条件およびスケールバーは、各画像に示されている。（8J）CD31-、CD31+CD32-LYVE1-、CD31+CD32+LYVE1-、CD31+CD32+LYVE1+のいずれかであったGFP+細胞の、FACSによって単離された初代ヒトLSEC（生存、CD45-、CD68、CD31+、CD32+）との比較（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、GFP+CD31-細胞と示されている試料との間、またはさらに示されているようにGFP+CD31+画分の間）。入手可能であった場合には、初代ヒトLSEC発現レベルが、遺伝子名の下に示されている。全てのqRT-PCR分析について、発現値は、ハウスキーピング遺伝子TBPのレベルに対して正規化されたものである。エラーバーはSEMを表す。
【図９】hPSC-血管芽細胞由来細胞は、インビボ成熟の後、主にヒトゾーン2/3LSECである。8日目の静脈血管芽細胞を新生仔NSGマウスに肝臓内移植し、77日間成熟させた後、未分画のDAPI-RFP+細胞を単離し、それを単細胞RNA-seqのために処理した。（9A）死細胞のミトコンドリア排除、ダブレット排除、正規化、および標準的な処理の後、5951を、発現プロファイルに基づく5つのクラスタ（クラスタ0、1、2、3、4）に分類した。（9B）高発現細胞（最も濃い灰色）、中発現細胞、低発現、および発現検出不可（最も淡い灰色）を図示する、LSECおよび関連細胞に関連した候補遺伝子の発現パターンが示されている。（9C）クラスタ0〜4における優勢な発現パターンは、クラスタ2および4における線維芽細胞マーカー発現と共に、クラスタ0、1、および3におけるLSECマーカー発現の上昇（淡色）を示す。（9D）200の肝内皮を定義する遺伝子（MacParlandの3つの内皮クラスタおよび1つの線維芽細胞/星細胞クラスタからの最も特徴的な各50）を使用した相関分析を、MacParland et al.2018によって以前に生成された確立された初代ヒト肝臓scRNA-seqデータと、クラスタ0〜4を比較するために使用した。群間比較を可能にするために、R2値がヒートマップとして図示され、有意な正（淡）または負（濃）の相関が、FDR補正後のp値＜0.05に基づき、「*」によって示されている。
【図１０】scRNA-seqによって選択された遺伝子。高発現細胞（最も濃い灰色）、中発現細胞、低発現、および発現検出不可（最も淡い灰色）を図示する、LSECに関連した付加的な候補遺伝子の発現パターンが示されている。（10A）PTPRC（CD45）の発現が造血細胞型のマーカーとして示されている。（10B〜10D）候補線維芽細胞/平滑筋/間葉系マーカーの発現が示されている。（10E）示されているような図示された状態を有する全細胞の予測細胞周期状態の発現に基づく分析。（10F〜10G）候補細胞周期進行関連マーカーの発現。（10H〜10K）アドレノメデュリンシグナリング経路の受容体および共受容体の発現。（10L〜10S）確立されているLSECマーカーおよび新規LSECマーカーの発現。
【図１１】hPSC由来のインビボで成熟したLSECは、有窓構造を有し、大腸菌（E. coli）生体粒子を除去する。（11A）新鮮な固定された肝組織の切断面において画像化された初代ヒトインサイチュー血管系の代表的な走査型電子顕微鏡像。有窓構造の存在（白色矢印によって示されている）または欠如の比較のため、LSEC、終末門脈内皮、および肝動脈内皮が示されている。（11B）8日目の静脈血管芽細胞に由来し、インビボで成熟し、示されているマーカーパネルに基づいてFACS単離され、一晩培養され、有窓構造（白色矢印）を刺激する0.1μg/mlラトランクリンAによってまたはラトランクリンAなしで30分間処理され、固定され、SEMのために処理された細胞の、代表的な走査型電子顕微鏡像。画像化条件およびスケールバーは、各画像に示されている。（11C）有窓構造を有する細胞（10個より多くの有窓構造が明確な篩板クラスタ状に配置されている）、内皮細胞（線維芽細胞様の接着がない血管新生側芽を有する滑らかな輪郭の細胞）、非内皮細胞（線維芽細胞様細胞および円形細胞）の定量化を、全部で少なくとも4回の独立の反復から、示されている数の細胞において手動で実施し、データをプールした。標準的な多数のドナーに由来するHUVECに加えて、18日目にCD31+CD32+LVYE1+として選別され、再播種され、さらに10日間培養された静脈LSEC-LCを含む、比較のためのインビトロで得られた細胞も、ラトランクリンA刺激の存在下および非存在下で定量化した。（11D〜11E）（11C）インサイチュー初代ヒトLSEC（黒色）、ラトランクリンA刺激の存在下（白）および非存在下（灰色）での静脈血管芽細胞に由来し、インビボで成熟し、単離されたLSECにおける有窓構造のサイズ（最長直径）の定量化。（11E）ラトランクリン刺激の前後の有窓構造によってカバーされたLSECの表面積の定量化。エラーバーはSEMを表す。（11F〜11G）新生仔移植後72〜99日目に単離された示されている静脈血管芽細胞由来集団によるヒトIgGの存在下での大腸菌生体粒子結合の代表的なフローサイトメトリー分析（ANOVAおよびボンフェローニ検定、*p＜0.05、示されている群間）。エラーバーはSEMを表す。
【図１２】hPSC由来血管芽細胞は、モノクロタリンによって損傷を受けた成体肝臓に生着し、ヒトLSECマーカーを発現するよう成熟する。（12A）モノクロタリンによって損傷を受けた（150mg/kg；IP）成体NSGマウスの脾臓内移植モデルの模式図。移植から4〜6週間後に、肝臓消化によって非実質細胞（NPC）画分を放出させ、ヒトLSECマーカーhuCD31、CD32、huLYVE1に基づく定量的細分画を含む、hPSC由来RFP+細胞のFACSによって媒介される単離を容易にする。（12B）移植されていないNSGマウス、新生仔肝臓内HUVEC移植NSGマウス、新生仔肝臓内hPSC由来細胞移植NSGマウス、および成体脾臓内hPSC-血管芽細胞移植NSGマウスの血中の循環ヒト特異的FVIII抗原。新生仔hPSC由来細胞移植マウスを、ヒト生着レベル（NPC画分のRFP％）に従って分類した。成体移植マウスは、移植の31〜41日後に、短い生着タイムラインにも関わらず、低い治療範囲（およそ2〜4％正常ヒトレベル）のマウスによるFVIIIレベルを示す。（12C〜12F）41日間のインビボ成熟の後の静脈血管芽細胞生着成体マウスの代表的な組織学的分析。ヒト特異的な核マーカー（KU80）およびLSECマーカー（CD31、CD32B、LYVE1、STAB2）を、示されているように、探索した。60μmスケールバーは、全ての画像に当てはまる。（12G）8日目の静脈血管芽細胞または動脈血管芽細胞を脾臓内移植された成体マウスからのNPC画分の代表的なフローサイトメトリー分析および定量化。（12H）生着効率（NPCのRFP％、最大生着はNPCのおよそ60〜70％である）、内皮寄与（％CD31）、LSEC寄与（％CD32およびLYVE1発現パターン）を含む、成体移植マウスにおけるLSEC生着の定量化（t検定、*p＜0.05、示されている％RFP+間）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
様々な態様の説明
本発明者らは、静脈内皮前駆細胞が濃縮されており、インビトロで類洞内皮細胞様細胞を生成するために使用され得る血管芽細胞を作成する方法を開発した。これらの前駆細胞は、インビトロおよびインビボで分化し、肝臓へ移植されると機能的な類洞細胞の特徴を示すことができる。本発明者らは、例えば、低VEGFAの指定培地を使用することによって、かつ/または、例えば、1日以上（例えば、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、もしくは12日、もしくはそれ以上）低VEGFAによって処理した後、例えば、血管芽細胞からCD34+画分を単離することによって、増加した数のSEC-LCを作製するために分化することができ、頑強に生着することができる静脈血管芽細胞の集団が作製されることを見出した。
【００２４】
定義
他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、前後関係によってそうでないことが必要とされない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。例えば、「細胞（a cell）」という用語には、単一の細胞のみならず、複数の細胞または細胞の集団も含まれる。一般に、本明細書中に記載される細胞および組織の培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して利用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである（例えば、Green and Sambrook,2012を参照すること）。
【００２５】
「約」、「実質的に」、および「およそ」のような程度の用語は、本明細書中で使用されるように、最終結果が有意に変化しないような、修飾された用語の合理的な量の偏差を意味する。修飾された用語の少なくとも±5％の偏差が、それが修飾する単語の意味を無効にしない場合、これらの程度の用語は、この偏差を含むと解釈されるべきである。
【００２６】
「多能性幹細胞」という用語は、本明細書中で使用されるように、3つの胚細胞層の細胞へ分化する能力を有する細胞をさす。多能性は、胚性幹（ES）細胞マーカーの発現（例えば、POU5F1+、SOX2+、NANOG+、SSEA3+、SSEA4+、およびSSEA5+）によっても立証される。本明細書において使用するために適当な多能性細胞には、例えば、中胚葉細胞（例えば、ヒト中胚葉細胞、例えば、KDR+CD56+CD34-を発現するもの）のような胚性幹細胞（ESC；例えば、ヒトESC）、誘導多能性幹（iPS）細胞（例えば、ヒトiPS細胞）、または胚様体由来細胞（例えば、ヒト胚様体由来細胞）が含まれる。
【００２７】
「血管芽細胞」とは、本明細書中で使用されるように、血管が発生するための前駆細胞である、中胚葉から分化する細胞をさす。血管芽細胞は、以下のマーカー（またはそれらの欠如）によって同定され得る：CD34+、KDR+、CD31-/low、およびCD144-/low。例えば、静脈血管芽細胞は、CD34+CD73+CD184-として同定され得、動脈血管芽細胞は、CD34+CD73low CD184+として同定され得る。
【００２８】
典型的には、静脈系統を有する細胞は、NRP2、ALPNR、CD73、EPHB4、およびNR2F2の発現によって同定され、動脈系統を有する細胞は、EFNB2、CXCR4、NRP1、およびNRP2の発現によって同定される。
【００２９】
「類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）」という用語は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に記載される方法を使用して作製され、図3Aに記載される13日目以降の細胞に相当し、例えば、CD31、LYVE1、FCGR2B/CD32B、STAB2、PLVAP、F8、CD36、および/またはGATA4のうちの1つまたは複数を発現する、インビトロで作製された細胞または集団をさす。それらは、対象へ導入された後のインビトロで作製された細胞もさすことができる。
【００３０】
肝SEC（LSEC）は、篩板状に配置された動的に調節された細胞通過性の有窓構造によって同定され得る（Wisse et al., 1985）。LSECに加えて、一般内皮マーカー（CD31、CD144）の発現、制限隔膜を欠く細胞通過性の有窓構造の存在によって定義され、30〜40μmの断面に広がっている、骨髄類洞内皮細胞（BSEC）、脾類洞内皮細胞（SSEC）、および下垂体前葉類洞内皮細胞（APSEC）を含む、他の型の類洞内皮細胞（SEC）が存在する。解剖学的には、これらのSECサブタイプは、それらが由来する器官によって主として定義される。
【００３１】
「静脈血管芽細胞誘導培地」という用語は、本明細書中で使用されるように、静脈血管芽細胞へ分化するよう中胚葉細胞を誘導するために適当な培地をさす。静脈血管芽細胞誘導培地は、基本培地と、Notch阻害剤および/もしくはMEK阻害剤、bFGF（もしくは等価なFGF）、ならびに/または静脈血管芽細胞指定濃度のVEGFA等の1つまたは複数の静脈指定成分とを含む。例えば、基本培地は、例えば、そのまま使用されるか、またはITS-X（ThermoFisher Scientific、51500056）、付加的なグルタミン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、およびトランスフェリンがさらに補足されたIMDM（ThermoFisher Scientific、12200036）によって部分的に希釈される、市販のStemPro34（ThermoFisher Scientific、10639011）であり得る。実施例1に記載されるように、5ng/mLの濃度のbFGFおよび0〜30ng/mL、好ましくは、0〜20ng/mLの濃度のVEGFAの存在下での中胚葉の培養は、増加した数の静脈血管芽細胞を作製した。他の補助剤を任意で含む、GMEM、DMEM、およびRPMI等の他の基本培地も、使用され得る。VEGFAおよび/またはFGF等の成分の最適濃度は、経験的に決定され得、例えば、内因的に産生される成分の濃度に依る。VEGFAおよびFGFは、内因的に産生され得る。外因性VEGFAの添加は、CD34+の収率を向上させ得る。外因性FGFの添加は、産生される内因性FGFを補足し、細胞数を持続させることができる。例えば、5〜30ng/mlの濃度が使用され得る。上昇したFGFレベルは、主として、8日目まで血管芽細胞を持続させ、全ての細胞を成長させ続ける（即ち、全細胞数を維持する）ためのものである。静脈血管芽細胞誘導培地は、Zhang et al,2017のように、MEK阻害剤、レスベラトロール等のNotchアゴニスト、例えば、Ditadi et al,2015において使用された濃度のPI3K阻害剤、BMPまたはBMPアゴニスト、インスリン、TGFβシグナリング阻害剤、PDGF-BB、LDL、L690（Impase阻害剤）、イノシトール、レスベラトロール（Notchアゴニスト）のうちの1つまたは複数も含み得る。
【００３２】
「VEGFAの静脈血管芽細胞指定濃度」という用語は、本明細書中で使用されるように、例えば、本明細書中に記載されるように調製された、中胚葉に適用されたときに、静脈血管芽細胞の発達を促進するVEGFAの濃度を意味する。これは、例えば、約0〜約30ng/mLのVEGFA、例えば、約0〜約20ng/mLの任意の濃度であり得、最も適当な濃度は、例えば、実施例1に記載されたものに類似した、滴定実験において決定される。
【００３３】
「阻害剤」という用語は、本明細書中で使用されるように、同定された活性を阻害することができる化学的化合物、薬物、生体分子、もしくは組成物、またはそれらの混合物をさす。例えば、「Notch阻害剤」という用語は、本明細書中で使用されるように、例えば、転写因子CSLレベルを検出することによって測定されるNotch活性の低下をもたらす、Notch受容体リガンド結合、Notch細胞外ドメイン切断、γセクレターゼによるエンドシトーシス後のNotch細胞内切断等を阻害することができる任意のそのような物質を意味し、例えば、L-685,458のようなγセクレターゼ阻害剤（GSI）を含む（Tocris,Bristol UK）。さらに、「TGFβシグナリング阻害剤」という用語は、本明細書中で使用されるように、（例えば、TGFβリガンド分泌の阻害を介して）TGFβシグナリングの機能的な活性化を阻害するか、（例えば、TGFβ結合抗体を介して）溶液からの放出されたTGFβリガンドの隔離を阻害するか、（例えば、受容体活性化を防止する阻止抗体または低分子を介して）TGFβ受容体を阻害するか、（例えば、SMAD基質を活性化するキナーゼシグナリングの阻止を介して（例えば、SB-431542の作用機序））下流シグナリングの受容体活性化を阻害することができる任意のそのような物質を意味する。阻害剤は、阻害剤によって処理されていない試料と比べて、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の低下をもたらし得る。
【００３４】
「静脈内皮誘導培地」という用語は、本明細書中で使用されるように、内皮系統細胞へ分化するよう血管芽細胞を誘導するために適当な培地をさす。静脈内皮誘導培地は、基本培地と、bFGF（もしくは等価なFGF）および/または内皮指定濃度のVEGFA等の1つまたは複数の内皮指定成分とを含む。例えば、基本培地は、例えば、そのまま使用されるか、またはITS-X（ThermoFisher Scientific、51500056）、付加的なグルタミン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、およびトランスフェリンがさらに補足されたIMDM（ThermoFisher Scientific、12200036）によって部分的に希釈される市販のStemPro34（ThermoFisher Scientific、10639011）であり得る。実施例1に記載されるように、CD34濃縮8日目血管芽細胞を10ng/mLの濃度のVEGFAと共に培養することによって、図2Jに示されているように、100ng/mlのVEGF-の存在下で培養された血管芽細胞と比較して、増加したレベルの静脈遺伝子（例えば、NRP2、ALPNR、CD73、EPHB4、NR2F2）および低いレベルの動脈遺伝子（例えば、EFNB2、CXCR4、NRP1、およびNRP2）を発現する細胞の集団が作製された。他の補助剤を任意で含む、GMEM、DMEM、およびRPMI等の他の基本培地も、静脈内皮細胞を増大させるために使用され得る。図2Aに示されている方法において、例えば、8〜12日目に使用される培地は、GSIまたはその他のNotch阻害剤を欠く。
【００３５】
「VEGFAの静脈内皮指定濃度」という用語は、本明細書中で使用されるように、静脈内皮細胞の静脈マーカー発現の喪失なしに発達および増殖を促進するVEGFAの濃度を意味する。これは、例えば、約0〜約30ng/mLのVEGFA、例えば、約0〜約20ng/mLの任意の濃度であり得、最も適当な濃度は、例えば、実施例1に記載されるものに類似した滴定実験において決定される。
【００３６】
「SEC誘導培地」という用語は、本明細書中で使用されるように、前駆内皮系統細胞を類洞内皮細胞および/または類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）へ分化するよう誘導するために適当な培地をさす。SEC誘導培地は、基本培地と、bFGF（もしくは等価なFGF）（例えば、0〜30ng/ml）および/またはVEGFA（例えば、0〜30ng/ml、好ましくは、0〜20ng/mL）のような1つまたは複数のSEC指定成分および/または内皮持続成分とを含み、例えば、30ng/ml bFGFおよび0ng/ml VEGFAを含む。VEGFAは、含まれていてもよいし、または排除されていてもよく、濃度は内皮指定濃度にのみ含まれる。SEC指定成分には、TGFβシグナリング阻害剤およびcAMPシグナリングアゴニストが含まれ得る。例えば、基本培地は、例えば、そのまま使用されるか、またはITS-X（ThermoFisher Scientific、51500056）、付加的なグルタミン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、およびトランスフェリンがさらに補足されたIMDM（ThermoFisher Scientific、12200036）によって部分的に希釈される市販のStemPro34（ThermoFisher Scientific、10639011）であり得る。任意で、他の補助剤を含む、GMEM、DMEM、およびRPMIのようなその他の基本培地も、使用され得る。
【００３７】
「cAMPアゴニスト」または「cAMPシグナリングアゴニスト」という用語は、本明細書中で使用されるように、cAMPを含む、任意のcAMP類似体および/または活性化剤（例えば、シグナリングアゴニストまたはcAMP分解阻害剤）を意味する。例示的なcAMP類似体には、ジブチリルcAMP、8-ブロモ-cAMP、およびSp-8-Br-cAMPS（8-ブロモアデノシン-3',5'-サイクリックモノホスホロチオエート、Sp異性体）、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的なcAMP活性化剤には、フォルスコリン、IBMX（およびcAMPを増加させるその他のキサンチン誘導体）、およびロリプラム等、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００３８】
LSECマーカーは、肝臓由来SECにおいて検出されるSECマーカーであるため、「LSECマーカー」および「SECマーカー」という用語は、交換可能に使用され得る。異なるSEC型は、例えば、移植前に、インビトロで、特定の器官に関して特異的な遺伝子を発現し得るが、これらのマーカーは、類洞内皮系統細胞を同定するために使用され得る。SECマーカーには、本明細書中で同定されたマーカーのみならず、それらの組み合わせ、またはSECに関連したその他のマーカーも含まれ得る。
【００３９】
本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性の任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤等を含むものとする。適当な担体は、参照によって本明細書中に組み入れられる、この領域における標準的な参考書、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の例には、任意で、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミン、およびウシ血清アルブミン（BSA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
方法および組成物
静脈血管芽細胞が濃縮された血管芽細胞を作成する方法、および単離された該細胞の集団が、本明細書において提供される。
【００４１】
従って、一つの局面は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団が得られるまで、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGFAを含む静脈血管芽細胞培地において、KDR+CD56+CD34-中胚葉を培養する工程を含む、静脈血管芽細胞が濃縮された集団を作製する方法を含む。
【００４２】
例えば、一つの態様において、インビトロで類洞内皮細胞（例えば、肝類洞内皮細胞）を形成し、インビボでより頑強に生着する、増強された能力を有する血管芽細胞の集団を作製する方法であって、動脈血管芽細胞と比較して静脈血管芽細胞に富む（濃縮された）血管芽細胞の集団を生成するために十分なNotch阻害剤および/またはMEK阻害剤ならびに有効量のVEGFAおよび/またはbFGFを含む濃縮培地（例えば、静脈血管芽細胞培地）において、KDR+CD56+CD34-中胚葉を培養する工程を含む方法。ここで、静脈血管芽細胞は、CD34+CD73+CD184-である細胞である。このように生成された静脈血管芽細胞の集団は、例えば、TGFβシグナリング阻害環境の存在下でインビトロで類洞内皮細胞を生成することができ、例えば、インビトロで類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）を生成する向上した能力を有し、かつ/またはインビボでより頑強に生着することができる。SEC-LCを生成する能力の向上は、実施例において示されているように、例えば、増加した量のVEGFAを使用して得られるもののような、より大きな割合の動脈血管芽細胞を有する集団、および/または未選別の血管芽細胞と比べたものであり得る。
【００４３】
静脈血管芽細胞培地は、VEGFAが静脈血管芽細胞指定濃度で提供されている、血管芽細胞指定成分を含む任意の培地であり得る。
【００４４】
一つの態様において、VEGFAの静脈血管芽細胞指定濃度は、約0〜約30ng/mL、任意で、約0〜20ng/mL、または0.1ng/mLから29.9ng/mLまで0.1ng/mLずつ増加した濃度である。別の態様において、VEGFAの静脈血管芽細胞指定濃度は、0ng/mLであり、即ち、VEGFAは提供されない。
【００４５】
一つの態様において、指定を受けた細胞は、例えば、本明細書中に記載されるマーカーに基づき、選別されたCD34+集団において50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、または10％未満の動脈系統細胞を有する。
【００４６】
動脈血管芽細胞が望まれる場合には、VEGFAのより高い濃度、例えば、30ng/mL超、例えば、200ng/mLまで、好ましくは、100ng/mLが、使用され得る。
【００４７】
VEGFAの適当な濃度は、実施例1に記載された0〜100ng/mLの滴定に類似した1つまたは複数の滴定を実施することによって決定され得る。
【００４８】
静脈血管芽細胞培地は、1つまたは複数の血管芽細胞指定成分を含む。血管芽細胞指定成分には、例えば、bFGFのようなFGF成分、およびγセクレターゼ阻害剤（GSI）のようなNotch阻害剤、またはPD0325901のようなMEK阻害剤が含まれ得る。実施例1、3、および4において示されているように、静脈血管芽細胞培地は、静脈指定濃度のVEGFAに加えて、bFGFおよびGSIを含み得る。
【００４９】
FGF成分は、好ましくは、（FGF2とも呼ばれる）bFGFであるが、血管芽細胞指定を促進する任意のFGFまたはFGF類似体であり得る。FGF成分は、bFGFである場合、約10ng/ml〜約100ng/ml、例えば、約0.1ng/mL〜約100ng/mL、または0.1ng/mLから99.9ng/mLまで0.1ng/mLずつ増加した濃度、好ましくは、約1ng/mL〜約30ng/mL、任意で、約5ng/mLで提供され得る。
【００５０】
Notch阻害剤は、GSIであり得る。GSIは、例えば、L-685,458であり得、例えば、約0.1μM〜約100μM、または0.1μMから100μMまで0.1μMずつ増加した濃度、例えば、約30μM未満、任意で、約10μMで提供される。GSIは、インビトロでNotchシグナリングを妨害する低分子である。GSIは、Notchシグナリングを天然に媒介するNotch受容体を切断する酵素を阻止する。Notch経路を妨害する目的は、静脈血管芽細胞の適切な指定を増強することであり、静脈血管芽細胞は、次いで、静脈内皮細胞になり、最終的には、静脈内皮由来LSEC-LCになる。Notch阻害剤が使用されない場合には、動脈血管芽細胞が、より多く作製されるが、動脈血管芽細胞は、本明細書中に記載されるように、LSEC-LCになる効率がより低い。
【００５１】
他の血管芽細胞指定成分および濃度が使用されてもよい。例えば、MEK阻害剤が、Notch阻害剤に加えて、またはNotch阻害剤の代わりに使用され得る。適当な血管芽細胞指定成分には、例えば、TGFβシグナリング阻害剤が含まれる。
【００５２】
例示的なTGFβシグナリング阻害剤には、任意で、約1〜約50μM、好ましくは、2〜40μM、さらに好ましくは、2〜10μMの濃度範囲で提供される、SB431542 [4-(4-(ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-5-(ピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-2-イル)ベンズアミド]（Tocris,Bristol UK）および/またはA83-01 [3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド]（Tocris,Bristol UK）が含まれる。
【００５３】
他のTGFβシグナリング阻害剤は、当技術分野において公知であり、市販されている。例には、E-616452 [2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン]；SB 505124 [2-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-2-(1,1-ジメチルエチル)-1H-イミダゾール-5-イル]-6-メチル-ピリジン]；GW 788388 [4-[4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-2-ピリジニル]-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-ベンズアミド]；およびSB 525334 [6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン]が含まれる。
【００５４】
添加され得る、動脈および静脈の指定に影響を及ぼすために使用されている他の因子には、例えば、MEK阻害剤、Notchアゴニスト、PI3K阻害剤（例えば、Ditadi et al 2015）および/またはBMP、インスリン、TGFβシグナリング阻害剤、PDGF-BB、LDL、L690（Impase阻害剤）、イノシトール、レスベラトロール（Notchアゴニスト）（例えば、Zhang et al,2017）が含まれる。
【００５５】
例えば、Ditadi et al 2015およびZhang et al 2017に記載された基本培地および/または成分も、胚様体分化法、単層分化法、または組み合わせ分化法のいずれが好ましいかに関わらず、使用され得る。
【００５６】
適当な成分を含む例示的な培地は、実施例3および4に提供される。
【００５７】
一つの態様において、細胞集団が、例えば、選別または選択的増殖の方法の前に、少なくとももしくは約5％、少なくとももしくは約6％、少なくとももしくは約7％、少なくとももしくは約8％、少なくとももしくは約9％、少なくとももしくは約10％、少なくとももしくは約11％、少なくとももしくは約12％、少なくとももしくは約13％、少なくとももしくは約14％、少なくとももしくは約15％、少なくとももしくは約16％、少なくとももしくは約17％、少なくとももしくは約18％、少なくとももしくは約19％、もしくは少なくとももしくは約20％、またはそれ以上のCD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含み、例えば、選別および/または選択的増殖の後に、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、少なくとももしくは約90％、またはそれ以上のCD34+CD73+静脈内皮細胞を含むようになるまで、KDR+CD56+CD34-中胚葉が静脈血管芽細胞培地において培養される。例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、細胞がEBにおいて培養された場合には、およそ10〜20％の静脈血管芽細胞を得ることが可能であり、単層系においては、それ以上、例えば、20％を超える静脈血管芽細胞を得ることが可能である。
【００５８】
一つの態様において、静脈血管芽細胞誘導培地における培養は、少なくとも約1日間、任意で、約30日間まで（例えば、1〜18日間、1〜8日間、または1〜30日間（両端の値を含み得る）の任意の日数）である。例えば、培養は、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、または約10日間であり得る。
【００５９】
図1Aを参照すると、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団が得られるまでの、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGFAを含む静脈血管芽細胞培地におけるKDR+CD56+CD34-中胚葉の培養は、4〜8日目に相当する。図1Bに見られるように、細胞は、CD34および内皮前駆細胞マーカーETV2、ならびに減少したレベルのPou5F1を発現し始める。これらの遺伝子のうちの1つまたは複数の発現は、CD34+CD73+CD184-集団の出現についてモニタリングするために使用され得る。
【００６０】
KDR+CD56+CD34-中胚葉は、胚様体細胞を、例えばBMP4、bFGF、およびCHIRを添加して培養することによって、任意で図1Aに示されているように培養することによって、得ることができる。使用され得る方法は、実施例4に記載されている。KDR+CD56+CD34-中胚葉を作製する他の方法が使用されてもよく、例えば、心原性中胚葉に類似して設計された特殊濃度のBMP/アクチビン、またCHIR添加なし、および例えば2日目のTGFβシグナリング阻止によって作製された中胚葉が使用されてもよい。
【００６１】
ヒト多能性幹細胞を培養することによって、胚様体細胞を得ることができる。ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞であり得る。
【００６２】
誘導多能性幹細胞（即ち、非多能性細胞、典型的には、成体体細胞から人工的に得られた（例えば、誘導された、または完全に逆戻りした）多能性幹細胞）を作成する方法は、公知である。例えば、（以下に制限されるわけではないが、SOX2（遺伝子ID；6657）、KLF4（遺伝子ID；9314）、cMYC（遺伝子ID；4609）、NANOG（遺伝子ID；79923）、LIN28/LIN28A（遺伝子ID；79727）と組み合わせられた、POU4F1/OCT4（遺伝子ID；5460）を含む）1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導することによるiPSC。
【００６３】
いくつかの態様において、出発集団、例えば、多能性幹細胞、中胚葉等は、蛍光マーカーのようなマーカーを発現する細胞を含む。他の態様において、出発集団、例えば、多能性幹細胞、中胚葉等は、安全機序として、遺伝学的にコードされた自殺系を発現する細胞を含む。
【００６４】
一つの態様において、方法は、CD34+集団を単離する工程をさらに含む。
【００６５】
任意で、CD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬を使用して、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団からCD34+集団を単離する工程をさらに含む、静脈血管芽細胞の集団を作製する方法も、提供される。
【００６６】
CD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬は、単独で使用されてもよいし、CD73アフィニティ試薬と共に、またはCD73アフィニティ試薬なしに使用されてもよい。
【００６７】
実施例1において示されているように、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGFを使用して、静脈血管芽細胞に指定した後、CD34+細胞集団を単離することによって、CD184-CD73+細胞が増加しており、動物へ導入されると容易に生着し、類洞内皮細胞を頑強に作製する、細胞の集団が単離される。これらの細胞は、インビトロでSEC様細胞へ分化することもできる。図1Bに示されているように、単離されたCD34+細胞は、KDR、SOX17、PECAM1（CD31）、およびNFATCの増加したレベルを示し、図1C、2Eに示されているように、CD34+集団は、全8日目集団の約10.4+/-0.9％に相当する。この集団をCD34陽性細胞について選別することによって、CD73+CD184-内皮細胞の高度に濃縮された静脈集団が提供される。例えば、CD31および/またはCD144を含む、他のマーカーが、この集団を得るために使用されてもよい。
【００６８】
CD34アフィニティ試薬は、CD34抗体がコンジュゲートされたビーズであり得、CD31アフィニティ試薬は、CD31抗体がコンジュゲートされたビーズであり得、CD144アフィニティ試薬は、CD144抗体がコンジュゲートされたビーズであり得、CD73アフィニティ試薬は、CD73抗体がコンジュゲートされたビーズであり得る。
【００６９】
一つの態様において、ビーズは、細胞の磁気ベースの分離のための磁性ビーズ、任意で、超常磁性であるポリスチレン球状ビーズである。
【００７０】
いくつかの態様において、1つまたは複数の濃縮工程が実施される。
【００７１】
濃縮または単離の他の方法も使用され得る。例えば、細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）精製によって単離され得る。
【００７２】
一つの態様において、単離されたCD34+集団は、少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約80％、少なくとももしくは約85％、または少なくとももしくは約90％のCD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む。
【００７３】
いくつかの態様において、方法は、静脈血管芽細胞からの静脈内皮細胞の作製に関する。図2Aに示されているように、内皮指定濃度での1日以上のCD34+静脈血管芽細胞の培養は、1つまたは複数のSECマーカーを発現する細胞の集団を作製する。
【００７４】
従って、提供される別の局面は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団が得られるまで、例えば、Notch阻害剤もしくはMEK阻害剤、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGF、および/またはbFGFを含む静脈血管芽細胞誘導培地において、KDR+CD56+CD34-中胚葉を培養する工程；CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団からCD34+集団を単離する任意の工程であって、CD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬を、任意でCD73アフィニティ試薬と共にまたは該試薬なしで使用する、工程；ならびに、静脈内皮指定濃度のVEGFAを含む静脈内皮誘導培地において、単離されたCD34+集団を培養して、静脈内皮細胞を作製する工程を含む、静脈内皮細胞の集団を作製する方法であり、ここで、任意で、静脈内皮細胞は、PDGFRβ陰性CD73陽性静脈内皮細胞を含む。
【００７５】
図2Dを参照すると、この方法を使用して作製された静脈集団は、CD34+CD31+細胞およびCD34-CD31-細胞の混合集団を含むことが分かる。静脈集団は、CD73を発現する。（一般にCD31+である）CD34+細胞は、静脈内皮系統細胞を含み、（一般に、CD31-でもあり、PDGFRβを発現する）CD34-細胞は、例えば、間葉系細胞および/または線維芽細胞を含む。
【００７６】
一つの態様において、単離されたCD34+集団は、単層で培養される。単層での培養は、血管芽細胞から内皮細胞への移行を促進することができる。
【００７７】
CD73+静脈内皮細胞を含む静脈内皮細胞は、例えば、NRP1、EFNB2のような動脈マーカーのアップレギュレーションなしに、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞と比較して、減少しているが持続されたNRP2および/またはAPLNRの発現、ならびに上昇したCD34およびCD31/PECAM1の発現を有する。
【００７８】
図2Jにおいて証明されるように、静脈集団は、静脈内皮誘導培地において4日間培養された場合、動脈に指定された細胞と比較して増加したNRP2、ALPNR、CD73、EPHB4、NR2F2、CD34、およびSTAB2のような静脈運命マーカーの発現、ならびに減少した動脈マーカーの発現を示す。例えば、培養されている細胞のある量を取り出し、リストされた遺伝子のうちの1つまたは複数の発現レベル（転写物またはタンパク質のレベル）を査定することによって、例えば、分化が予想通りに進行していることを確認するため、図2Jにリストされたマーカーのうちの任意のものが、使用され得る。
【００７９】
一つの態様において、VEGFAの静脈内皮指定濃度は、約0〜約30ng/mL、任意で、約0〜20ng/mL、または0.1ng/mLから29.9ng/mLまで0.1ng/mLずつ増加した濃度である。別の態様において、VEGFAの静脈内皮指定濃度は、0ng/mLであり、即ち、外因性VEGFAは提供されず、その代わりに、内因的に産生されたVEGFに頼る。
【００８０】
方法において使用されるVEGFAの静脈内皮指定濃度は、VEGFAの静脈血管芽細胞指定濃度と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００８１】
一つの態様において、静脈内皮誘導培地における培養は、少なくとも約1日、任意で、約1〜約18日（例えば、1〜約8日、または1〜18日の間の任意の日数）である。例えば、実施例1および図7は、6〜8日間（例えば、PSCから出発する分化方法の14〜16日目）静脈内皮誘導培地において培養された細胞が、生着することができ、移植後40〜100日間、検出可能であったことを示す。
【００８２】
さらに、これらの細胞は、SECマーカーのレベルの増加も示し始める。実施例1において示されているように、これらの内皮細胞は、SEC様細胞を作製するため、SEC誘導培地においてさらに培養され得る。
【００８３】
従って、さらなる局面は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む集団を得る工程；およびSEC-LCを得るため、インビトロでCD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を分化させる工程を含む、類洞内皮細胞様細胞（SEC-LC）を作製する方法を含む。
【００８４】
一つの態様において、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞は、集団の少なくとももしくは約50％、少なくとももしくは約60％、少なくとももしくは約70％、少なくとももしくは約80％、または少なくとももしくは約90％を構成する。実施例1において証明されるように、本発明者らは、約88％CD73+およびCD184-である細胞の集団を、8日目に単離することができた（図2G）。
【００８５】
前記の方法および成分は、SEC-LCを作製するために利用され得る。例えば、前記のように、例えば、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞が得られるまで、静脈血管芽細胞指定濃度のVEGFを有する静脈血管芽細胞誘導培地において、KDR+CD56+CD34-中胚葉を培養し、任意で、CD73アフィニティ試薬と共に、またはCD73アフィニティ試薬なしで、任意で、CD34アフィニティ試薬、CD31アフィニティ試薬、および/またはCD144アフィニティ試薬を使用して、CD34+集団を単離することによって、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む集団を得ることができる。従って、いくつかの態様において、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む集団は、本明細書中に記載される方法に従って得られる。
【００８６】
一つの態様において、分化は、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞と比較して減少したNRP2および/またはALPRの発現を有するPDGFRβ陰性CD73陽性静脈内皮細胞を含む静脈内皮細胞を生成するための、静脈内皮指定濃度のVEGFAを含む静脈内皮誘導培地における、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞を含む細胞集団の培養（任意で、細胞集団は単層系において培養される）；ならびにSEC-LCを得るための、SEC誘導培地における、PDGFRβ陰性CD73陽性静脈内皮細胞を含む静脈内皮細胞の培養を含む。
【００８７】
SEC誘導培地におけるPDGFRβ陰性CD73陽性静脈内皮細胞を含む静脈上皮細胞の培養は、少なくとも約1日、任意で、約1〜約18日、好ましくは、1〜約8日、または1〜18日の間の任意の日数であり得る。
【００８８】
図3を参照すると、SEC誘導培地において約4日間培養された静脈内皮細胞は、1つまたは複数のSECマーカーを発現することが示されている。
【００８９】
従って、いくつかの態様において、静脈内皮細胞は、1つまたは複数のSECマーカー（SECに関連した表面受容体、分泌型タンパク質、または転写因子）が誘導されるまで、SEC誘導培地において培養される。そのようなSECマーカーには、とりわけ、非限定的に、LYVE1、CD14、CD32B（FCGR2B）、CD36、CD54（ICAM1）、CD73、CD144、CD206（MRC1）、STAB1、STAB2、CLEC1B、PLAVP、GATA4、およびF8が含まれ、かつ/またはCD31（PECAM1）、CD34、CD105、CD309（KDR）、およびVWFのような血管マーカーは、低下する。
【００９０】
一つの態様において、静脈内皮細胞は、LYVE1、STAB2、CD32B/FCGR2B、およびF8のうちの1つまたは複数が発現されるまで、SEC誘導培地において培養される。
【００９１】
図3Bは、TGFβシグナリング阻害剤を含むSEC誘導培地が、1つまたは複数のSECマーカーの発現を誘導することを証明する。
【００９２】
一つの態様において、SEC誘導培地は、TGFβシグナリング阻害剤を含む。一つの態様において、TGFβシグナリング阻害剤は、SB431542（Tocris Bristol UK）である。類似した特異性（例えば、類似したIC50およびTGFシグナリング結合プロファイル）を共有する他のTGFβシグナリング阻害剤（例えば、SB-505124、SB525334、LY2109761、LY2157299、LY580276、LY364947、またはGW788388のようなキナーゼ阻害剤）が使用されてもよい。
【００９３】
SEC誘導培地は、他のSEC指定成分を含んでいてもよい。
【００９４】
本明細書中に記載される様々な成分が毎日培地へ添加されてもよいし、かつ/または成分を含む培地が毎日補充されてもよい。他の態様において、成分または成分を含む培地は、2日毎に、または、例えば、6日までの特定の培養期間に1回のみ、細胞に添加される。
【００９５】
例えば、成分の添加は、培地中の細胞への直接の添加によってもよいし、または成分を含有する新たな培地への培地交換によってもよい。成分は、例えば、1〜3日目に毎日交換され、4日目以降は2日毎に交換されてよい。
【００９６】
方法は、例えば、全ての培地を除去し、分化の段階に依って特定の成分を含む培地に交換することを含み得る。例えば、SEC誘導培地における培養は、2日毎に全ての培地を除去し、30ng/ml bFGF、6μM SB-431542、および1mM cAMPのような成分を含むSEC誘導培地に交換することを含む。
【００９７】
cAMPアゴニストがインビトロでのSEC細胞の指定を増加させ得ることも、本明細書中で証明される。従って、いくつかの態様において、SEC誘導培地はcAMPアゴニストを含む。
【００９８】
一つの態様において、SEC誘導培地は、TGFβシグナリング阻害剤およびcAMPアゴニストを含み、任意で、VEGFCが欠損している。
【００９９】
SEC-LCは、例えば、CD31アフィニティ剤を使用して単離され得る。従って、いくつかの態様において、方法は、CD31+SEC-LCを単離することをさらに含む。
【０１００】
他の方法において、例えば、出発集団が動脈内皮集団または混合集団である場合、cAMPおよびcAMPアゴニストは、SEC細胞への指定を増加させるであろうと予想される。
【０１０１】
従って、さらなる局面は、動脈内皮細胞および/または静脈内皮細胞を得るため、血管芽細胞を培養する工程；ならびにSEC-LCを作製するため、cAMPアゴニストの存在下で、動脈内皮細胞および/または静脈内皮細胞を分化させる工程を含む、SEC-LCを作製する方法を含む。
【０１０２】
血管芽細胞は、例えば、動脈血管芽細胞、静脈血管芽細胞、または動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞の混合集団であり得る。
【０１０３】
一つの態様において、動脈血管芽細胞および/または静脈血管芽細胞は、本明細書中に記載される方法に従って得られた静脈血管芽細胞の単離された集団であり得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、cAMPアゴニストは、cAMP、または8-Br-cAMP、ジブチリルcAMP、もしくはSp-8-Br-cAMPSのようなcAMP類似体である。他の態様において、cAMPアゴニストは、フォルスコリン、IBMX、および/またはロリプラムのようなcAMP活性化剤であり、任意で、フォルスコリンおよびIBMXである。いくつかの態様において、cAMPアゴニストは、cAMP類似体およびcAPM活性化剤、または複数のcAMP類似体および/もしくは活性化剤である。
【０１０５】
実施例においてさらに記載され、図3Aに示されているように、静脈SEC-LCは、12日目に、TGFβシグナリング阻害剤、SB-431542、およびcAMP類似体を含む培地において誘導される。SEC-LCは、13日目に出現し始め、14〜22日目に存在することが確認され、ピーク純度は、PSCによる開始から14〜16日目であった。動脈SEC-LCは、例えば、14〜22日目の同一の範囲の間に様々な純度で観察されたが、そのピーク純度は、静脈SEC-LCについての14〜16日目に対して、およそ16〜18日目であることが見出された。
【０１０６】
従って、SEC-LCを得るための、SEC誘導培地におけるPDGFRβ陰性CD73陽性静脈内皮細胞を含む静脈内皮細胞の培養、ならびに/またはSEC-LCを作製するための、cAMPアゴニストの存在下での動脈内皮細胞および/もしくは静脈内皮細胞の分化は、例えば、少なくとも1日〜18日、またはそれ以上、任意で、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、または1日〜18日（両端の値を含む）の任意の日数および/もしくはその一部を含み得る。
【０１０７】
低酸素条件が、動脈CD31+LYVE1+集団および静脈CD31+LYVE1+集団の両方において、CD32B/FCGR2Bの発現を増加させ得ることも、本明細書中で証明される；しかしながら、発現のアップレギュレーションは、静脈細胞において、動脈細胞より2〜4日早く起こった（図5Dおよび5E）。
【０１０８】
従って、いくつかの態様において、培養工程のうちの1つまたは複数は、低酸素条件下で実施される。例えば、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞、静脈内皮細胞、SEC-LC、または単離されたCD31+SEC-LCのうちの1つまたは複数は、低酸素条件下で培養され、ここで、任意で、低酸素条件は、5％ CO2 / 5％ O2の細胞培養インキュベータ環境および/または低酸素誘導因子（HIF）プロリルヒドロキシラーゼ（PHD）阻害剤（HIF-PHDI）の添加である。
【０１０９】
様々なHIF-PHDIが公知である。一つの態様において、HIF-PHDIは、三環式トリアゾール化合物、任意で、IOX2、IOX4、DMOG、またはHIF1aシグナリングを増強する類似の化合物である。別の態様において、HIF-PHDIは、ダプロデュスタット（2-[(1,3-ジシクロヘキシル-2,4,6-トリオキソ-1,3-ジアジナン-5-カルボニル)アミノ]酢酸）、モリデュスタット（2-(6-モルホリン-4-イルピリミジン-4-イル)-4-(トリアゾール-1-イル)-1H-ピラゾール-3-オン）、ロキサデュスタット（2-[(4-ヒドロキシ-1-メチル-7-フェノキシイソキノリン-3-カルボニル)アミノ]酢酸）、バダデュスタット（2-([5-(3-クロロフェニル)-3-ヒドロキシピリジン-2-カルボニル]アミノ)酢酸）、およびデシデュスタット（2-[[1-(シクロプロピルメトキシ)-4-ヒドロキシ-2-オキソキノリン-3-カルボニル]アミノ]酢酸）より選択される。
【０１１０】
別の局面は、動脈血管芽細胞、動脈内皮細胞等を作製する方法に関する。そのような方法において、CD34集団は、例えば、Notchシグナリングの阻害なしに血管芽細胞指定の後に単離され、動脈指定増殖濃度のVEGFAが、静脈指定濃度の代わりに使用される。
【０１１１】
いくつかの態様において、方法は、例えば、本明細書中に記載される細胞表面発現パターンに基づく、1回または複数回の精製、例えば、1回または複数回のFACS精製を含む。
【０１１２】
一つの態様において、集団は、単離された集団および/またはインビトロで作製された集団である。例えば、一局面は、インビトロで作製されたSEC-LC、インビトロで作製された静脈血管芽細胞のような、本明細書中に記載される方法に従ってインビトロで作製された細胞を含む。
【０１１３】
さらなる局面は、任意で、単離されている、インビトロで作製されたSEC-LC、および/またはインビトロで作製された静脈血管芽細胞、および/または本明細書中に記載されるその他の細胞を含む細胞集団を含む。
【０１１４】
本明細書中で証明されるように、記載された方法に従って作製されたSEC-LC細胞は、インビボのSECとの類似性を共有する。注目すべきことに、インビトロで得られたSECは、インビボのSECと比較して、減少したF8レベルおよびその他の違いを有する。
【０１１５】
一態様において、集団は、本明細書中に記載される1つまたは複数のマーカーを発現する細胞を少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％含む。
【０１１６】
さらなる局面は、例えば、本明細書中に記載される静脈血管芽細胞、静脈内皮細胞、および/またはSEC-LCを含む、本明細書中に記載されるインビトロで作製された細胞を含む組成物を含む。
【０１１７】
当該組成物は、例えば、希釈剤または担体を含み得る。
【０１１８】
適当な希釈剤には、例えば、血清、血清代用物、もしくは血清補助剤、および/またはジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロールメチルセルロース、もしくはポリビニルピロリドンのような適当な凍結保護剤を含有する、適当な培養培地または凍結培地が、例えば、含まれる。いくつかの態様において、希釈剤は無菌である。
【０１１９】
一つの態様において、担体は、薬学的に許容される担体である。
【０１２０】
インビトロで作製された細胞または細胞集団は、無菌バイアルのようなバイアルに含まれていてよい。
【０１２１】
別の局面は、本明細書中で作製された細胞もしくは細胞集団のうちの1つもしくは複数、または細胞もしくは細胞集団を含むバイアル、本明細書中に記載される細胞を作製するための1つもしくは複数の誘導成分もしくは指定成分、および/または本明細書中に記載される1つもしくは複数の細胞を作製するための説明書を含むキットを含む。
【０１２２】
キットは、例えば、任意で、凍結培地中にあり、ドライアイスまたは液体窒素のような冷却剤にパッケージされた、本明細書中で作製された細胞のうちの1つまたは複数、マトリゲルまたは等価なECMによってコーティングされたスクリーニングプレート、基本成長培地、本明細書中に記載される1つまたは複数の成分（例えば、bFGF、VEGF）、SEC誘導成分（例えば、bFGF、cAMP、SB、IOX2）、例えば、FACにおいて使用するための、単離抗体および/または定量化抗体を含み得る。
【０１２３】
使用
他の局面において、インビトロおよびインビボでの使用も提供される。
【０１２４】
静脈血管芽細胞、静脈内皮前駆細胞、およびSEC-LCを含む、本明細書中に記載されるインビトロで作製された細胞は、候補薬物をプレスクリーニングするためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【０１２５】
従って、一つの局面は、本明細書中に記載される方法に従って作製された細胞集団を試験化合物と接触させること；ならびに、媒体対照によって処理された細胞と比較して、試験化合物を除去する細胞の能力および/もしくは速度、ならびに/または試験化合物の細胞に対する毒性のような所望のリードアウトを測定することを含むスクリーニングアッセイである。
【０１２６】
LSEC-LC（またはFCGR2Bおよびその他のLSECマーカーを発現するが、例えば、成熟F8遺伝子発現レベルを欠くものとして定義される、部分的に成熟したLSEC-LC）は、例えば、ヒトLSEC様細胞による除去可能性およびヒトLSEC様細胞に対する毒性について化合物（例えば、薬物候補）を試験するため、インビトロで使用され得る。そのようなスクリーニング法は、純粋なもしくはプールされたヒトPSC由来背景において使用され得、集団もしくは民族に特異的な薬理学試験および有害薬物反応の防止を可能にし；かつ/または生物学的薬物候補（例えば、モノクローナル抗体（例えば、治療用抗体）、サイトカイン、低分子等）を、LSECに関連した結合特徴および除去特徴について試験し、（例えば、改善されたかつ/もしくは所望の体内分布および循環半減期を達成するため）最適化するために使用され得る。そのようなアッセイは、最小のまたは低下したLSECとの結合またはLSECによる除去を示す試験化合物、あるいは増加したLSECとの結合またはLSECによる除去を示す試験化合物を同定することを目標として、実施され得る。肝臓外で作用することが意図される治療薬（例えば、乳癌を処置するための治療用化合物）については、一般に、肝SEC-LCによるそのような化合物の除去を最小化することが望まれる。化合物を肝臓に集中させることが望ましいケース（例えば、ヘパトサイト増殖薬、肝線維症阻止薬、肝細胞癌を標的とする癌治療薬等）においては、SEC-LCによる除去機序の増強が望ましい。従って、そのようなスクリーニング法は、肝臓によってインビボで適切に除去される化合物または除去されない化合物の同定において主要な役割を果たし得る。LSECによって除去され得る生体分子の表については、例えば、Sorensenら（2015,Compr.Physiol.,5(4):1751-74）を参照すること。重要なことに、LSECが結合する分子の多様性のため、それらは、不要のもしくは予想外の除去機序を回避するため、または除去機序を活用し、治療薬を肝臓へターゲティングするため、極めて有益なスクリーニングプラットフォームである。
【０１２７】
インビボで成熟したSEC-LCを含む動物モデルは、インビボ薬物試験のためのヒト化モデルとして使用され得る。従って、別の局面は、本明細書中に記載されるインビトロで作製された細胞、任意で、本明細書中に記載される方法に従って作製された静脈血管芽細胞、本明細書中に記載される方法に従って作製された静脈内皮細胞、および/またはSEC-LCが生着しているヒト化動物モデルを提供する。いくつかの態様において、インビトロで作製された細胞は、動物モデルにおけるインビトロで作製されたヒト細胞を追跡するため、蛍光マーカー、発光マーカー等のようなマーカーを含む、ヒト出発細胞（例えば、CD34+CD73+CD184-静脈血管芽細胞、KDR+CD56+CD34-中胚葉、胚様体細胞、または多能性幹細胞）から作製される。動物は、例えば、マウスまたはラットのような齧歯類である。
【０１２８】
一つの態様において、動物モデルは、本明細書中に記載される方法に従って作製された細胞が、マウスの肝臓に注射され、生着させられた、ヒト化肝臓血管系を有するマウスである。ヒト化血管系マウスは、薬物の毒性およびADME/TOXを試験するために使用され得る。それらは、ヒト血管を含むため、より適当なモデルを提供し得る。
【０１２９】
別の態様において、重要な血液凝固因子を欠く動物モデルが作製される（例えば、F8またはVWFは既存のマウスモデルである）。疾患モデルマウスは、標準的なマウス系統（NSG、NOD-Scid、Nu/Nu、RAG1-/-等）との交配によって、または免疫調節治療薬カクテルの投与によって免疫低下状態にされる。免疫低下疾患モデルマウスは、新生仔への肝臓内注射によって、成体への脾臓注射を介して、または異所性移植部位において、移植を受けることができる。生着させられた疾患モデルマウスは、十分な生着によって、矯正された疾患表現型（正常化された血液凝固時間、循環凝固因子レベル）を有すると予想され、細胞ベースの治療の証拠を提供するのみならず、治療レベル以下のF8/VWFを治療範囲へ増強するため、他の薬理学的治療を試験する方法も提供する。
【０１３０】
一つの態様において、動物モデルは、線維芽細胞によって媒介される硬変性肝疾患状態をhPSC由来非内皮成長物によってモデル化することができる、免疫低下非疾患マウスである。そのようなモデルにおいては、線維症を引き起こすため、本明細書中に記載される静脈血管芽細胞および/またはその他の集団が、マウスに注射され（そのような細胞が生着させられ）、モデルは、可能性のある肝疾患処置についてスクリーニングするかまたは試験するために使用される。このようにして、新規の治療戦略を、ヒト線維性肝疾患を減速させるか、逆転させるか、または治癒させる能力について調査することができる。
【０１３１】
別の局面において、細胞療法も提供される。インビトロで作製された細胞は、薬学的組成物として作製および調製され得る。
【０１３２】
一つの態様において、方法は、本明細書中に記載される方法に従ってインビトロで作製された細胞（例えば、静脈血管芽細胞、静脈内皮細胞、単離されたCD34+、SEC-LC、単離されたCD31+等）の集団、または該細胞を含む組成物を、それを必要とする対象へ導入する工程を含む。一つの態様において、細胞集団または組成物は、注射によって対象へ導入される。別の態様において、細胞集団または組成物は、免疫単離（immunoisolation）デバイス、血管生着デバイス、またはViaCyteによるEncaptra（登録商標）細胞送達システム等の多細胞移植デバイス等のデバイスに含まれる。
【０１３３】
一つの態様において、集団または組成物は、対象の肝臓、骨髄、脾臓、または下垂体前葉（他のSEC含有組織の代表例）に導入される。
【０１３４】
実施例において証明されるように、インビトロで作製された血管芽細胞、内皮細胞、およびSEC-LCは、生着後に、血友病Aにおいて欠損している凝固因子F8の増加したレベルを産生する。一つの態様において、細胞療法は、血友病Aのような肝疾患を処置するためのものである。この治療は、肝臓、体内のその他のSEC含有組織への細胞の直接注射として送達されてもよいし、または生物学的封じ込め免疫単離デバイスを含むかもしくは含まない異所性移植デバイスによって送達されてもよい。F8の中程度の産生ですら、患者転帰を改善したため、生着した細胞からの治療範囲は広い。予想される転帰には、自然出血エピソードの減少、外傷における出血時間の短縮、および全死亡率の減少が含まれる。
【０１３５】
別の態様において、細胞療法は、（F8欠損に類似した）VWF疾患、任意で、薬物性肝損傷による肝毒性からの、急性および慢性の肝傷害、アルコール性および非アルコール性の脂肪性肝炎（脂肪肝疾患もしくはNASH）、またはその他の進行性硬変性疾患もしくは障害のためのものである。
【０１３６】
いくつかの事例において、本明細書中に記載されるSEC-LCは、肝細胞癌（HCC）等の肝疾患を処置するために使用され得る。肝臓癌巣周囲のLSECは、発現パターンが変化（LYVE1、STAB1、STAB2、CD32Bが減少）しており、それは、スカベンジャー活性の低下、およびLSECが毛細血管化される時の有窓構造の喪失をもたらす。従って、これらの変質したLSECは、「正常な」LSECと同様には、治療薬を癌領域に送達しない。変質したLSECが、機能的なLSEC（例えば、化学療法薬をより効率的に送達するLSEC）に置き換えられるかまたは補足された場合、処置は、より有効になり得る。
【０１３７】
細胞療法は、支持的な細胞療法であってもよい。例えば、本明細書中に記載される細胞は、肝細胞（例えば、ヘパトサイトおよび/もしくは胆管細胞）ならびに/または造血細胞と共に投与され、肝臓へ導入され得る。同様に、これらの細胞は、造血細胞型、内分泌細胞型、およびもしくは間質細胞型、または誘導体と共に投与されてもよく、それぞれ、骨髄、脾臓、または下垂体前葉へ投与されてもよい。
【０１３８】
本明細書中に記載されるSEC-LCは、（F8遺伝子から発現された）第VIII因子を産生する。いくつかの事例において、F8の発現について、または第VIII因子の存在について、SEC-LCをモニタリングすることが望ましいかもしれない。そのようなモニタリングは、培養物中で（例えば、インビトロで）行われてもよいし、またはそのような細胞の対象への投与の後、インビボで行われてもよい。例えば、Affinity Biologicals Inc.からのELISA（カタログ番号FVIII-AG）が、FVIIIタンパク質を検出するために使用され得る。
【実施例】
【０１３９】
実施例1
PSCからの動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞の指定
これらの研究のため、造血系誘導体の生成のために最適化された、以前に記載された胚様体（EB）ベースのプロトコルを使用して、hPSCを分化させた（Sturgeon et al., 2014）。このプロトコルによると、図1Aに示されているように、BMP4（0〜4日目）、bFGF（1〜8日目）、およびCHIR（2〜4日目）のEB培養物への添加を通して、中胚葉が誘導される。分化の4日目に、BMP4およびCHIRが培養物から除去され、VEGFに交換される。これらの条件の下で、POU5F1（OCT4）発現が減少するにつれ、T（ブラキュリー）およびMESP1のアップレギュレーション（図1B）によって定義される原始線条集団が、分化の2日目までに検出され、KDR+CD56+CD34-中胚葉が、4日目までに誘導される（図1C）。この中胚葉は、CD235a/bを高発現せず、このことは、それが二次造血を生じさせる集団の等価物を表すことを示していた。4日目における内皮前駆細胞マーカーETV2のピーク発現と同時の、内因性VEGFAアップレギュレーションは、5日目におけるKDR+CD34+血管芽細胞の開始を特徴付けた（図1B）。分化の8日目までに、血管遺伝子KDR、SOX17、およびNFATCを発現するCD34+CD31low集団が出現した（図1B）。
【０１４０】
当グループ（Ditadi et al., 2015）およびその他（Zhang et al., 2017）からの以前の研究は、VEGFシグナリング、bFGFシグナリング、Notchシグナリングが、hPSC分化培養物における動脈血管および静脈血管の運命の指定において役割を果たすことを示した。動脈および静脈の発達の促進におけるVEGFシグナリングの効果を査定した。これに取り組むため、異なる濃度のVEGF（0〜100ng/ml）を、少量のbFGF（5ng/ml）を含有する4日目の培養物へ添加し、CD34+CD31+血管細胞、ならびに、それぞれ、動脈運命および静脈運命に指定された前駆細胞を含有することを本発明者らが以前に示したCD184+CD73lowCD34+集団およびCD184-CD73+CD34+集団の存在について、得られた6日目の集団を分析した。VEGF濃度の増加は、CD34+細胞の頻度の有意な用量依存的な増加をもたらした（図1D）。さらに、より多量のVEGFは、VEGFを受容していないかまたは10ng/mL VEGFを受容した培養物において検出されたCD184-CD73+静脈様集団から、100ng/mlによって処理された培養物において優勢であったCD184+CD73low動脈様集団へ、細胞を偏向させた。多量のVEGF（100ng/ml）を含有する培養物におけるbFGF濃度（30ng/mlまで）の操作は、全CD34+集団のサイズの中程度の増加（分化の4〜6日目）、CD34+CD184+CD73low亜集団のサイズの減少、およびCD34+CD184-CD73-亜集団のサイズの増加をもたらした（図1D）。外因性bFGFは、種々の内皮集団の発達に対して劇的な効果を及ぼさなかったが、この経路を通したシグナリング（30ng/ml）は、さらなる濃縮のため、CD34頻度を持続させるために必要とされ、有益である。
【０１４１】
推定的な動脈集団および静脈集団をさらに特徴決定するため、これらの血管細胞型においてディファレンシャルに発現されることが公知の遺伝子の発現パターンを分析した。これらの研究のため、以前に記載されたように（Ditadi et al., 2015；Zhang et al., 2017）、高濃度のVEGF（100ng/ml）による中胚葉の指定によって、CD34+CD184+CD73low細胞として同定される動脈前駆細胞を生成し、より低い濃度のVEGF（10ng/ml）および分化の4〜8日目のGSIの添加によるNotch経路の阻害によって、CD34+CD184-CD73+静脈前駆細胞を指定した（図2A〜C、E〜G）。8日目に、両方のCD34+血管芽細胞集団をMACSによって単離し、さらに4日間、単層として培養し、CD34+CD31+内皮細胞を生成するための増殖的な血管形成を可能にした（図2D）。この培養期間中、動脈集団の大半が、CD34およびCD31の発現、ならびにアップレギュレートされたCD184発現を保持した（図2H）。対照的に、静脈集団のおよそ40％は、この時間枠において、CD34およびCD31の発現、ならびに間葉マーカーPDGFRβのアップレギュレートされた発現を失った。これらのPDGFRβ陽性細胞は、間葉/線維芽細胞である。持続したCD34+CD31+集団は、CD73発現の高いレベルを保持し、CD184をアップレギュレートしたが（図2I）、そのパターンは、インビボの遊走性の静脈先端血管細胞に見出される、静脈に由来する、VEGFAによって誘導された、Notchによって媒介された血管形成に類似している（Hasa et al., 2017）。qRT-PCR発現分析（図2J〜2L）は、8日目の動脈血管芽細胞が、対応する8日目の静脈集団より高いレベルの動脈マーカーEFNB2、CXCR4、NRP1、DLL1、およびNotchシグナリング経路の成分HEY1、HEY2、およびHES5を発現していることを明らかにした。静脈血管芽細胞は、動脈集団より高いレベルの静脈運命に関連したマーカー（EPHB4、CD73、NRP2、NR2F2、APLNR、STAB2）を発現した。これらの細胞は、より高いレベルのKDRおよびFLT4も発現したが、リンパ系マーカー（PROX1、PDPN）、またはLSECマーカー（LYVE1、CD32B、F8）の初期発現は発現しなかった。動脈集団は、4日間の増大培養の後にEFNB2、CXCR4、NRP1、HES5、およびHEY1の発現の上昇したレベルを維持したが、培養された静脈集団は、この期間に、静脈マーカーEPHB4、CD73、NRP2、NR2F2、APLNR、STAB2を発現した。総合すると、これらの所見は、VEGFシグナリング経路およびNotchシグナリング経路の段階特異的なモジュレーションを通して、動脈血管細胞および静脈血管細胞を生成することが可能であることを確認する。
【０１４２】
インビトロでの動脈内皮系統および静脈内皮系統からのLSEC-LCの指定
内皮細胞のLSEC様細胞（LSEC-LC）への指定は、TGFβ（Arai et al., 2011；Koui et al., 2017）、アドレノメデュリン/cAMP（Arai et al., 2011）を含み、インビボではVEGFC/VEGFR3（Ding et al., 2010）を含む、多数のシグナリング経路を含むことが示唆されている。hPSC由来LSECの指定におけるこれらの経路の役割を調査するため、静脈血管芽細胞に由来する集団を、異なる濃度の8-Br-cAMP（0、0.1、0.3、1.0mM）、TGFβシグナリング阻害剤SB431542（0、6、18μM）、およびVEGFC（0、100ng/ml）によって、2日毎に4日間処理した（図3A）。得られたバルク集団を、RT-qPCRによって、LSEC関連マーカーの発現について分析した（図3B）。ヒト肝臓の免疫蛍光研究（Strauss et al., 2017）、フローサイトメトリー研究（Fomin et al., 2013）、バルクRNA-seq研究（Shahani et al., 2014）、および最近の単細胞RNA-seq研究（MacParland et al., 2018）に基づき、ヒトLSECは、とりわけ、LYVE1、CD14、CD32B（FCGR2B）、CD36、CD54（ICAM1）、CD73、CD144、CD206（MRC1）、STAB1、STAB2、CLEC1B、PLAVP、GATA4、およびF8を含む、表面受容体、分泌型タンパク質、および転写因子の同時発現によって区別される。さらに、それらは、門脈の動脈内皮細胞および静脈内皮細胞より低いレベルのCD31（PECAM1）、CD34、CD105、CD309（KDR）、およびVWFのような基準血管マーカーを発現する。候補マーカーセットとして、本発明者らは、スカベンジャー受容体LYVE1、STAB2、CD32B/FCGR2B、F8、およびVWFの発現に分析の焦点を当てた。cAMP単独の添加は、LYVE1、STAB2、およびFCGR2Bの発現のアップレギュレーションをもたらし、TGFβ単独の阻害は、STAB2およびFCGR2Bの発現を誘導したが、LYVE1の発現を誘導しなかった（図3B）。これらの2つの経路の調節剤の組み合わせは、これらの遺伝子の最も高い発現レベルを誘導し、第VIII因子（F8）のそれも誘導した。VEGFCの添加は、いくつかのLSECマーカーの発現を中程度に増強することが見出されたが、それは、リンパ系マーカーPROX1およびFLT4の発現も増加させた。このことから、本発明者らは、下記の研究では、LSEC様運命を誘導するためにSB（6μM）およびcAMP（1mM）の組み合わせを使用した。
【０１４３】
SBおよびcAMPによって4日間誘導された場合、12日目の静脈由来細胞は、CD31+LYVE1+亜集団およびCD31-LYVE1-亜集団の両方を含有する集団を生成した。分子分析は、CD31+LYVE1+細胞がCD31-LYVE1-細胞より有意に高いレベルのLYVE1、STAB2、FCGR2B、およびF8を発現することを明らかにし、このことは、この二重陽性亜集団がhPSC由来LSEC様細胞を含有することを示していた（図3C）。LYVE1、STAB2、およびFCGR2Bは、単離された初代ヒトLSECと比較可能なレベルに誘導され（LYVE1 47±19；STAB2 80±27；FCGR2B 88±31；F8 13±4）、F8レベルは、160倍以上低かった。SBおよびcAMPの組み合わせは、動脈由来内皮集団におけるLSEC遺伝子の発現も誘導した（図3および図4）。
【０１４４】
成熟した血液を輸送する肝血管系は、酸素を多く含む動脈および酸素が枯渇した静脈および類洞血管の両方を含む。以前の研究は、門脈および肝静脈が、それぞれ、7.22kPa O2および6.70kPa O2という酸素含有量を有することを見出し、それは、5％ CO2 / 5％ O2平衡化細胞培養インキュベータ環境について記録された7.39kPa O2とよく適合していた。同様に、肝動脈は、18.46kPa O2（Martinez et al., 2008）という5％ CO2 / 95％空気インキュベータ培地含量と相関する20.9kPa O2を含有することが観察された。酸素圧が内皮のLSEC運命への指定に影響するか否かを判定するため、本発明者らは、培養の8日目以降、低酸素条件（5％ O2）または正常酸素条件（21％ O2）の下で動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞を培養した。LSEC運命を誘導するため、培養の12日目に、SBおよびcAMPを添加した（図5A）。フローサイトメトリー分析は、低酸素条件または正常酸素条件のいずれかの下で培養された動脈集団および静脈集団の両方において、CD31+LYVE1+集団の存在を明らかにした（図5B、C）。低酸素は、動脈および静脈の両方のCD31+LYVE1+集団においてCD32B/FCGR2Bの発現を誘導した；しかしながら、発現のアップレギュレーションは、静脈細胞において、動脈細胞より2〜4日早く起こった（図5D、E）。全集団のqRT-PCRに基づく発現分析は、CD32Bの低酸素によって誘導されたアップレギュレーションを示すフローサイトメトリー分析を確認した。さらに、これらの分析は、低酸素がSTAB2の発現のアップレギュレーションをもたらすこと、この効果が静脈集団に制限されることを示した（図5F〜H）。低酸素で培養された単離されたCD31+LYVE1+集団の分子分析は、静脈細胞が、動脈細胞より有意に高いレベルのSTAB2およびCD32Bを発現することを明らかにした（図5I）。
【０１４５】
LSECマーカー発現に対する酸素の役割をさらに調査するため、本発明者らは、次に、EC遺伝子発現の可能性のある機序制御因子としてHIF1aシグナリング経路を調べた。上昇したシグナリングを媒介するHIF1aを安定化する特異的なPHD阻害剤IOX2の適用は、上昇した酸素条件の下で培養されたCD31+LYVE1+動脈ECにおいてCD32タンパク質の用量依存的なアップレギュレーションをもたらした（図6A、B）。HIF1aシグナリングの作動は、動脈ECおよび静脈ECの両方において、LYVE1を有意にダウンレギュレートし、FCGR2BおよびF8の発現をアップレギュレートし、STAB2発現は変化させなかった（図6C）。さらに、低酸素条件下で培養された細胞へのIOX2の4日間の適用は、16日目までにCD31+ECのLYVE1+CD32+LSEC-LCへの高度に効率的な変換をもたらした。この低酸素応答は、動脈ECおよび静脈ECの両方において観察されたが、その効果は、静脈細胞においてより顕著であり、このことは、HIF1aシグナリングに対する過感受性を示した（図6D）。
【０１４６】
本発明者らのインビトロ分化プロトコルは、頑強なスカベンジャー受容体発現を有するLSEC様集団の発達を促進するが、F8のレベルは例外的に低い。インビボ環境が真のhPSC由来LSECの発達を支持するか否かを判定するため、本発明者らは、8日目のCD34+血管芽細胞または14〜16日目のCD31+LSEC-LCを、1〜4日齢の照射済みNSG新生仔マウスの肝臓へ移植した（図7A）。生後の初期の成長期間は、器官が未熟な胎児様状態から成熟肝臓へ移行する間、肝臓量が増加する期間であるため、このモデルを選択した。この発達ウインドウは、内因性の肝細胞の増殖および分化の両方を支持し、外因性のより未熟なhPSC由来細胞誘導体も支持する可能性がある。ヒト由来細胞の同定および回収を容易にするため、移植された細胞は、tdRFPを構成的に発現するよう改変されたHES2 hESCから生成された（Irion et al., 2007）。非実質細胞（NPC）画分内のtdRFP+細胞の頻度のモニタリングは、全てのhPSC由来の移植された細胞集団が、検出可能なレベルの生着を示すことを示した（図7B）。8日目の静脈血管芽細胞は、動脈血管芽細胞および両方のLSEC-LC集団と比較して有意に高いレベルの生着を示した。対照的に、HUVECは、NSG肝臓に安定的に生着することができなかった（＜0.001％hCD31+、N＝5、移植後73〜80日目；図7B）。
【０１４７】
長期生着成体マウスの組織学的調査は、tdRFP+生着の百分率とヒト細胞（KU80+）を含有するNSG肝臓の領域の観察との間の密接な相関を見出した（図7C〜7F）。これらの区域は、CD32B、LYVE1、およびSTAB2を同時発現するCD31+細胞を含有した。線維芽細胞または星様（stellate like）細胞をおそらく表すCD31-細胞も検出された。これらのヒト由来内皮/LSECマーカー陽性領域は、肝臓の中心静脈および周囲の類洞血管領域と一貫して関連しており、このことは、少なくとも細胞のある程度の画分が、hESC由来LSECであることを示唆した。
【０１４８】
生着したhPSC由来細胞の特徴決定を容易にするため、本発明者らは、マウスLSEC混入がない単純化されたFACSベースの単離戦略を考案した。即ち、tdRFP+回収によるヒト細胞の単離、その後のヒト特異的CD31による内皮分画、ならびにCD32およびヒト特異的LYVE1による内皮細胞の細分画（図7A、G）。この単離方法は、移植片組成の定量化、および同様に精製された初代ヒトLSEC（生存細胞、CD45-、CD68-、CD31+、CD32+）との比較のためのhPSC由来細胞集団の回収を容易にした。4つの移植されたhPSC由来細胞集団は、全て、異なる速度であったが、NSG肝臓に生着することができたため、本発明者らは、移植された細胞が生着バイアスを示すか否かを判定するため、細胞単離中に移植片組成をモニタリングした。8日目の静脈血管芽細胞由来細胞は、他の移植された細胞集団と比較して、有意に上昇した、主にCD32+LYVE1+細胞であったCD31+内皮細胞集団を示した（図7G）。LSECマーカーへのこの有意な組成バイアスのため、本発明者らは、細分画された集団のさらなる分析の焦点を8日目の静脈血管芽細胞由来細胞に当てた（図7H）。CD31、CD32、およびLYVE1を発現するhESC由来内皮は、他の細画分には見られない多数のLSECマーカー（LYVE1、STAB2、F8、CD14、MRC1、RAMP3）の独特のアップレギュレーションおよび大型血管内皮マーカー（PECAM1、VWF、CALCRL）の低い発現を示した。対照的に、CD32およびLYVE1について陰性であったhESC由来CD31+細胞（tdRFP+CD31+CD32-LYVE1-）は、最も高いレベルのPECAM1、VWF、CALCRLを発現したが、LSECマーカーの発現は欠いていた。hESC由来CD31-細胞（tdRFP+CD31-）は、LSECマーカーを発現しなかったが、その代わりに、ACTA2、PDGFRB、DDR2、およびMGPの上昇した発現を示し、このことは、インビトロ由来CD31-細胞に類似した平滑筋、線維芽細胞、または間葉系細胞誘導体の混合物を示唆した。CD31+CD32+LYVE1+LSECおよびその他の細胞画分のこれらの遺伝子サインは、H1-GFP hESC株に由来する静脈血管芽細胞由来LSECにおいても複製され（図8）、それらは、注目すべきことにインビトロでは存在しなかった成体レベルのF8遺伝子発現を含む、精製された初代ヒトLSECと比較可能なLSECマーカー発現レベルを同様に示した（図5I、7H）。さらに、これらのデータは、単離戦略をバリデートし、インビボで成熟した静脈血管芽細胞インビトロ中間段階を通して生成されたhESC由来LSECが、単離された初代ヒトLSEC（hLSEC）と比較可能な遺伝子発現レベルを有することを示唆する。
【０１４９】
バイアスなしに移植片組成を調査し、初代ヒト肝血管細胞との直接比較を容易にするため（MacParland 2018（印刷中））、本発明者らは、8日目の静脈血管芽細胞を初期に移植された77日目の生着マウスから単離されたNPC画分からFACS精製された生存tdRFP+細胞をプロファイル決定するため、scRNA-seqを利用した。scRNAseqによってプロファイル決定された5,951のtdRFP+細胞のうち、5,258（88.4％）が、クラスタ0、1、および3の一部としてのPECAM1+内皮細胞であった。クラスタ2および4は、残りの693（11.6％）のPECAM1陰性細胞を含有した（図9A〜C）。最も多数のPECAM1+集団、クラスタ0は、スカベンジャー受容体およびF8を含む機能的なLSEC遺伝子の高い発現によって定義された。3801細胞を含むクラスタ0は、全tdRFP+集団の64％を占め、LYVE1、STAB1、STAB2、FCGR2B、CD14、MRC1、CLEC1B、およびDNASE1L3の上昇した発現、PECAM1、CD34、およびVWFのより低い発現または発現の欠如を特徴としていた（図9B、C、および図10）。2番目に大きい内皮クラスタ（1005細胞、tdRFP+細胞の17％）、クラスタ1は、クラスタ0において見られたスカベンジャー発現遺伝子の発現をほとんどまたは全く有しておらず、その代わりに、上昇したPECAM1、CD34、VWF、PLVAP、およびAQP1を有していた。クラスタ3は、クラスタ0および1からの発現パターンの混合物を有する、452のPECAM1+細胞（tdRFP+の7.6％）を含有する内皮クラスタであった。G2Mにおける高い細胞周期スコア、ならびにMKI67、CDK1、CDKN3、PCNA、CCNB1、およびID1の上昇した発現（図10）に基づき、クラスタ3は、マウスにおいて記載された（Ding et al., 2010）ものに類似している増殖性LSECである可能性が高い。PECAM1陰性細胞の大半を表すクラスタ2（592細胞；10％）および4（101細胞、1.7％）は、線維芽細胞、平滑筋細胞、および一般的な間葉系誘導体を示唆する、複数のコラーゲン、ACTA2、PDGFRβ、DDR2、POSTN、TGFB1、DES、およびその他の発現の上昇という共通のパターンを有していた（図10）。本発明者らは、次に、これらの発現パターンを、初代ヒト肝組織における内皮クラスタおよび線維芽細胞様クラスタと比較した（図9D）。この比較は、標的集団を簡潔に定義するため、3つの内皮クラスタおよび1つの線維芽細胞/間葉クラスタにおいてMacParlandらによって定義されたディファレンシャルに発現される遺伝子の上位50を利用した（MacParland et al., 2018）。この分析は、クラスタ0と、中心静脈関連ゾーン2/3ヒトLSECとの間の有意な強力な正の相関を示した（R2 0.65、p＝7e-19）。門脈領域/ゾーン1ヒトLSECとの有意な相関は、観察されなかった（R2 -0.03、p＝0.7）。クラスタ1は、肝臓の門脈領域/ゾーン1のLSEC様内皮細胞（R2 0.48、p＝1e-9）および一般内皮細胞（R2 0.18、p＝3e-2）と有意に相関したが、中心静脈関連ゾーン2/3ヒトSLECとは有意に相関しなかった（R2 -0.14、p＝9e2-）。クラスタ3は、LSEC増殖クラスタとしての予測された同一性に適合する中心静脈LSEC集団と相関した（R2 0.49、p＝4e-10）。クラスタ2は、線維芽細胞/星細胞集団（R2 0.71、p＝1e-23）との有意な正の相関を示し、3つの内皮比較クラスタの全てとの有意な負の相関を示した。クラスタ4は、初代細胞型と有意に相関しなかったが、それは、観察された細胞の数が少なかったためである可能性が高い。注目すべきことに、LSECと多くのマーカーを共有するCD68+マクロファージを含む造血細胞（PTPRC；CD45陽性細胞）は、ほとんど���察されなかった（図10A）。総合すると、これらのデータは、hESCに由来する血管芽細胞およびLSEC-LCが、新生仔NSG肝臓に生着することができ、増殖および成熟の内因性ドライバーに応答して、成体ヒトLSECに類似している遺伝子サインを有するヒトLSECを形成することができることを示唆している。
【０１５０】
成熟LSECの中心的な機能的特徴は、篩板として公知の内皮細胞表面の動的に制御された区域においてクラスタ化された細胞通過性の有窓構造の存在である（Braet and Wisse,2002；DeLeve,2013b）。これらの有窓性の篩板は、類洞内皮細胞を、肝門脈および動脈内皮から区別し（図11A）、より重要なことに、連続型、一般的な有窓型、および洞様型の毛細血管サブタイプも区別する。制御された有窓構造の存在について試験するため、本発明者らは、図7において調査された4つの細画分を単離し、一晩培養し、次いで、アクチン脱重合剤ラトランクリンA（Braet et al., 1998）によって、またはラトランクリンAなしで30分間処理し、次いで、走査型電子顕微鏡法のため、それらおよび対照細胞集団を処理した。ラトランクリン刺激の非存在下では、tdRFP+CD31+CD32+LYVE1+細胞のみが、篩板状に配置された有窓構造を天然に有し、それらは、細胞表面のおよそ8％をカバーし、インサイチューで初代ヒトLSECにおいて観察されたものに類似して、一般に、90〜110nmのサイズであった（図11B、D、F）。ラトランクリンによって刺激した場合、tdRFP+CD31+CD32+LYVE1+細胞およびtdRFP+CD31+CD32+LYVE1-細胞の両方が、篩板状に配置された有窓構造を有することが見出された（図11B）。tdRFP+CD31+CD32+LYVE1+細胞において、刺激された有窓構造は、細胞表面のおよそ40％をカバーし、その増加は、急性刺激がない場合には、より稀に観察された、より小さいおよそ60nmの有窓構造によるものであった（図11B、E、F）。重要なことに、HUVEC、および当技術分野における標準的な内皮細胞となっているtdRFP+CD31+CD32+LYVE1+延長培養静脈LSEC-LC、およびインビトロで得られた静脈SEC-LCは、それぞれ、天然には有窓型ではなく、ラトランクリン処理によって有窓構造を形成するよう誘導することもできなかった。これは、hPSC由来血管芽細胞の有窓型LSECへのインビボ成熟が、現在のインビトロ培養系においては不完全に再現されることを示唆している。
【０１５１】
細胞療法オプションとして有用であるためには、血管芽細胞の生着およびLSEC成熟が、新生仔移植モデルまたは全身照射の必要性に制限されるべきではない。これらの制約を解決するため、本発明者らは、照射モデルをモノクロタリン前処理モデルに変化させた成体NSGマウスにおける外科的移植アプローチを採用した。ここで、成体（16週齢超）NSGマウスを、モノクロタリン（150mg/kg、IP）によって1回処理して、内皮肝損傷を誘導した。損傷誘導の24時間後に、新生仔研究において使用されるような、8日目の動脈血管芽細胞または静脈血管芽細胞を、開腹術によって媒介される脾臓内注射スタイル移植過程を介して外科的に送達した。このようにして、血管芽細胞を、肝臓の外科的な妨害なしに、ネイティブの肝血管系を介して、傷害を受けた肝臓へ注入した（図12A）。成体マウスにおける生着が効果的に起こったか否かを判定するため、屠殺前に、複数のマウス試料の血中の循環ヒト特異的FVIIIレベルを査定した（図12B）。非移植NSGマウスおよび新生仔肝臓内HUVEC移植マウスは、検出可能なヒトFVIIIを有していなかった。hPSC由来の血管芽細胞集団および内皮集団を移植された新生仔マウスは、検出可能なFVIIIレベルを示したが、それは、上昇した生着レベルを有することが確証されたマウスにおいてのみであった（NPC画分の＞1％RFP）。最もよく生着した新生仔マウスに類似して、脾臓内血管芽細胞移植後の成体NSGマウスのみが、新生仔研究のおよそ半分であった移植後の短い期間（移植の30〜41日後）にも関わらず、上昇したFVIIIレベルを示し、このことは、成体マウスにおける効率的な生着を示唆した。
【０１５２】
成熟中の機能的なhPSC由来LSECが成体マウスに実際に生着したか否かを判定するため、組織学的分析を実施した。8日目の静脈血管芽細胞を生着させられた成体マウスは、ヒト特異的LSECマーカー（CD31、CD32B、LYVE1、およびSTAB2）も発現しているKU80陽性ヒト細胞が生着した類洞空間の大きい面積を示した（図12C〜12F）。NPC組成の定量分析は、動脈血管芽細胞および静脈血管芽細胞の両方が、成体NSG肝臓に生着することができ（マウスの100％が＞1％RFP+であった；図12G）、静脈血管芽細胞が、NPC試料における肝血管系コンパートメントの完全なヒト化に近い、改善された生着効率を有する（66％ものNPCがRFP+であった）ことを明らかにした（図12H）。成体移植研究からの動脈血管芽細胞由来集団および静脈血管芽細胞由来集団の両方の組成が、内皮細胞画分に強く偏向し、新生仔研究において見られたものに類似しているCD31+CD32+LYVE1+中心静脈関連hPSC由来成熟LSECにさらに強く偏向していた。この成体移植研究は、新生仔肝臓は、生着を許容するが、MCTによって損傷を受けた成体肝臓より最適ではないことを示唆し、多様な肝損傷モデルの下で生着させ成熟させるための静脈血管芽細胞集団の広い機能的有用性をさらに示唆する。
【０１５３】
さらなる方法の詳細は、実施例3および4で提供される。
【０１５４】
実施例2
肝臓は多くの機能的な細胞型を含有し、その全てが、解剖学的に独特の血管系によって灌流されており、肝動脈血および門脈血の両方が、類洞内皮において混合され、次いで、中心静脈へ流出する。除去機能に加えて、肝類洞内皮細胞（LSEC）は、動的な応答性のサイトカイン産生によって再生応答および線維症応答を調整することによって、肝臓ホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす。将来の細胞工学を容易にし、ヒト肝血管系の発達を明らかにするため、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞（hPSC）から血管芽細胞を生成し、機能的なLSECを形成するための発達能力をインビトロおよびインビボで調査した。最初に、hPSCを、一般的な血管原性中胚葉を通して分化させ、次いで、VEGFシグナリング、bFGFシグナリング、およびNotchシグナリングのモジュレーションによって、血管芽細胞へ指定した。インビトロで、精製されたCD34+血管芽細胞は、接着培養時に増殖性内皮細胞（EC）運命を受け、LSECマーカーのアップレギュレーションによって、TGFβシグナリング阻害、cAMPシグナリングアゴニスト、および酸素圧に応答した。機能的なLSEC発達に関連した生理学的信号を送達するため、新生仔肝臓内移植モデルを適用した。移植されたhPSC由来細胞の回収は、変異した場合に臨床的に血友病Aに関連するF8を含む、成熟LSECマーカーの発現を、単離された初代ヒトLSECにおいて見られるレベルで明らかにした。さらに、回収された細胞のscRNA-seqは、LSECゾーネーション（zonation）を含む初代LSECに近い転写プロファイルを示した。回収されたhPSC由来LSECの機能分析は、ラトランクリンA処理によるアクチン脱重合に対して動的に応答性であった、高度の正確なサイズの有窓構造を明らかにした。総合すると、この研究は、ヒト肝血管系を有するマウスによる毒物学において、または血友病Aの細胞療法として、将来的に使用される、機能的なLSECへインビボで成熟することができるhPSC由来静脈血管系前駆細胞のインビトロ分化を記載する。
【０１５５】
実施例3
単純性および実用性のため、分化タイムラインを通して同一の培地を利用することができる。実施例1および2において、基本培地は、1:10,000 ITS-X、L-グルタミン（2mM）、アスコルビン酸（1mM）、モノチオグリセロール（MTG、4×10-4M；Sigma）、トランスフェリン（150μg/mL）が補足された25％v/v StemPro34、75％v/v IMDMからなっていた。期によって、適宜、以下のものが、この培地に補足された。-1日目〜0日目、1ng/ml BMP4。0日目〜1日目、10ng/ml BMP4。1日目〜2日目、10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF。2日目〜4日目、10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、3μM CHIR99021。4日目〜8日目、10または100ng/ml VEGFA、30ng/ml bFGF、0または10μM GSI。8日目、10または100ng/ml VEGFA、30ng/ml bFGF、10μM Y-27632。9日目〜12日目、10または100ng/ml VEGFA、30ng/ml bFGF。12日目〜22日目、30ng/ml bFGF、6μM SB、1mM 8-Br-cAMP。全ての増殖因子がR&D systemsから、低分子はTocrisから、cAMPはBiologからであった。
【０１５６】
他の基本培地または組み合わせが使用されてもよい。市販のStemPro34（ThermoFisher Scientific、10639011）が、そのまま使用されてもよいし、またはITS-X（ThermoFisher Scientific、51500056）、付加的なグルタミン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、およびトランスフェリンがさらに補足されたIMDM（ThermoFisher Scientific、12200036）によって部分的に希釈されてもよい。GMEM、DMEM、およびRPMIも、ITS-Xまたはその他の補助剤と共に使用され得る。
【０１５７】
実施例4
PSCからの胚様体の調製から8日目分化まで
HES2-tdRFPおよびH1-GFPのようなhESC株、またはヒトiPS細胞株MSC-iPS1を使用することができる。それらの細胞は、以前に記載されたように（Lancrin C,et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.Nature.2009;457:892-895）、hESC培地において、照射済みマウス胚線維芽細胞上に維持され得る。-1日目に、胚様体分化のため、85〜95％コンフルエントなhPSCを、単細胞に解離させ（TrypLE、ThermoFisher）、オービタルシェーカー（5％ CO2、5％ O2、90％ N2）上で18時間、1ng/ml BMP4、10μM Y-27632を含む基本培地（25％StemPro34、75％IMDM、および補助剤）において、EBを形成するよう再凝集させた。図1Aに見られるように、0日目に、多能性EBを10ng/ml BMP4を含む基本培地に移すことによって中胚葉へ誘導した。1日目に、10ng/ml BMP4を補充し、5ng/ml bFGFを添加するため、基本培地をEBおよび0日目培地に添加した。2日目に、原始線条を経たEBを、10ng/ml BMP4、5ng/ml bFGF、3μM CHIR99021を含有する新鮮な基本培地に移した。4日目の中胚葉EBを、10μM（静脈）GSIと共に30ng/ml bFGFおよび10ng/ml（静脈）または100ng/ml（動脈）のVEGFAを含有する基本培地に移した。指定を8日目まで継続させるため、6日目に、血管芽細胞を含有するEBを、新鮮な4日目培地に移した。8日目に、よく指定された血管芽細胞を含有するEBを、トリプシンEDTA（5分、37℃）およびコラゲナーゼ1型（Sigma、60分、37℃）の連続的な添加によって解離させ、その後、軽い物理的粉砕を行った。その後、100μlの体積で10μlのCD34-mag抗体によって500万細胞を染色するために修飾された製造業者によって推奨されたプロトコルに従って、MACS（Miltenyi 130-146-702）によって、CD34+血管芽細胞について単細胞懸濁液を濃縮した。
【０１５８】
参考文献
2022501066.tif 000002
【図１】
2022501066.tif 000003
【図２】
2022501066.tif 000004
【図３】
2022501066.tif 000005
【図４】
2022501066.tif 000006
【図５】
2022501066.tif 000007
【図６】
2022501066.tif 000008
【図７】
2022501066.tif 000009
【図８】
2022501066.tif 000010
【図９】
2022501066.tif 000011
【図１０】
2022501066.tif 000012
【図１１】
2022501066.tif 000013
【図１２】
2022501066.tif 000014
【国際調査報告】
2022501066.tif 000015
2022501066.tif 000016
2022501066.tif 000017
2022501066.tif 000018
2022501066.tif 000019