(57)【要約】  高分子プロドラッグであって、その中でカンプトテシン類似体が、生理学的条件下で不安定なエステル結合を介してポリマーに共有結合している高分子プロドラッグが提供される。癌、特に神経芽細胞腫を、高分子プロドラッグを用いて治療する方法も提供される。【選択図】図１
2022501341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子プロドラッグであって、その中のカンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子が、生理学的条件下で不安定なエステル結合を介してポロキサマーポリマーに共有結合している、高分子プロドラッグ。
【請求項２】
高分子プロドラッグであって、その中のＳＮ２２類似体の少なくとも２つの分子が、生理学的条件下で不安定なエステル結合を介してＰＥＧポリマーに共有結合している、高分子プロドラッグ。
【請求項３】
高分子プロドラッグであって、その中のカンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子が、生理学的条件下で不安定なエステル結合を介してポリマーに共有結合しており、少なくとも１つのカンプトテシン類似体が、少なくとも１つのＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドで官能基化されている、高分子プロドラッグ。
【請求項４】
前記カンプトテシン類似体が、ＳＮ２２（７−エチル−カンプトテシン）、ＳＮ３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、又はこれらの組み合わせである、請求項１又は３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項５】
前記ポリマーが、ポロキサマーポリマーである、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項７】
前記ポリマーが、マルチアームＰＥＧポリマーである、請求項２又は３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項８】
前記カンプトテシン類似体の２つの分子が、前記ポリマーに共有結合している、上記で定義された高分子プロドラッグ。
【請求項９】
前記カンプトテシン類似体の４つの分子が、前記ポリマーに共有結合している、上記で定義された高分子プロドラッグ。
【請求項１０】
前記カンプトテシン類似体の２〜４つの分子が、前記ポリマーに共有結合している、上記で定義された高分子プロドラッグ。
【請求項１１】
前記ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドが、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介して、前記カンプトテシン類似体に共有結合している、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１２】
前記カンプトテシン類似体が、ＳＮ−３８である、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１３】
前記ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドが、ベンジルグアニジン（ＢＧ）である、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１４】
前記ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドが、フェネチルグアニジン又はチラミンである、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１５】
前記ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドと前記カンプトテシン類似体とのエステル結合が、オキシヘキサノイルエステルである、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１６】
前記ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドと前記カンプトテシン類似体とのエステル結合が、オキシエトキシプロパノイル又はオキシエトキシエトキシプロパノイルエステルである、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１７】
ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２である、請求項１に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１８】
ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４である、請求項２に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項１９】
［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８である、請求項３に記載の高分子プロドラッグ。
【請求項２０】
前記エステル結合が、オキシ酢酸エステル結合である、上記で定義された高分子プロドラッグ。
【請求項２１】
上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、神経芽細胞腫を治療する方法
【請求項２２】
上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、固形腫瘍を有する被験体を治療する方法。
【請求項２３】
上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、脳腫瘍を有する被験体を治療する方法。
【請求項２４】
上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２５】
前記被験体がヒトである、上記で定義された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照（Ｓ）
本出願は、２０１８年９月１７日に提出された米国仮出願第６２／７３２，１９９号の出願日の利益を主張しており、その内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
カンプトテシン類似体が、生理学的条件下で不安定なエステル結合を介してポリマーに共有結合している高分子プロドラッグが提供される。高分子プロドラッグを用いて、癌、特に神経芽細胞腫を治療する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
神経芽細胞腫（ＮＢ）は、依然として小児の最も一般的で致命的な固形腫瘍であり、すべての小児癌の８〜１０％、及び小児の癌による死亡の１５％を占めている。他の小児新生物の治癒率は改善されているが、ＮＢ患者の生存率の改善は遅れている。
【０００４】
現在、臨床の場で使用されている集中的な多様式な治療は、患者の半数以上で失敗し（患者の５０〜６０％が再発を経験し、治癒的救済治療の選択肢がない）、最も手ごわい治療上の課題が、「超高」リスクカテゴリーとして定義されている非応答患者サブグループによって提示された。非常に多様な病因と生物学的に好ましくない変種が蔓延している高リスクＮＢは、現在、一次治療としてカンプトテシンファミリー（トポテカン及びイリノテカン）のトポイソメラーゼＩ阻害剤を含む強力な抗癌剤が試みられている。しかし、進行性疾患の状況でのこれらの臨床使用は依然として最適ではなく、用量制限副作用及び後天性薬剤耐性のために、再発又は難治性のＮＢ患者における結果は芳しくない。重要なことに、これらの患者の治療の失敗は、ＮＢ細胞の増殖を効果的に抑制するために必要な閾値薬物レベルの１〜３桁の上昇と関連しており、臨床的に達成できない値に達していることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、難治性のＮＢと戦うために、全身曝露を上昇させることなく、腫瘍内送達を著しく増強し治療的に有効な薬物レベルで薬物の存在を拡大することができる代替的治療アプローチが必要である。本明細書に記載の実施態様は、このニーズに対応している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
第１の実施態様において、その中のカンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子が、生理学的条件下（例えば２２℃、ｐＨ＝７．２）で不安定なエステル結合を介してポロキサマーポリマーに共有結合している、高分子プロドラッグが提供される。
【０００７】
第２の実施態様において、その中のＳＮ２２類似体の少なくとも２つの分子が、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してＰＥＧポリマーに共有結合している、高分子プロドラッグが提供される。
【０００８】
第３の実施態様において、その中のカンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子が生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してポリマーに共有結合しており、少なくとも１つのカンプトテシン類似体が少なくとも１つのＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドで官能基化されている、高分子プロドラッグが提供される。
【０００９】
別の実施態様において、カンプトテシン類似体は、ＳＮ２２（７−エチル−カンプトテシン）、ＳＮ３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、又はこれらの組み合わせである。
【００１０】
別の実施態様において、ポリマーはポロキサマーポリマーである。
別の実施態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。
別の実施態様において、ポリマーはマルチアームＰＥＧポリマーである。
【００１１】
別の実施態様において、カンプトテシン類似体の２つの分子はポリマーに共有結合している。
別の実施態様において、カンプトテシン類似体の４つの分子はポリマーに共有結合している。
別の実施態様において、カンプトテシン類似体の２〜８つの分子はポリマーに共有結合している。
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドは、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してカンプトテシン類似体に共有結合している。
別の実施態様において、カンプトテシン類似体はＳＮ−３８である。
【００１２】
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドは、ベンジルグアニジン（ＢＧ）である。
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドは、フェネチルグアニジン又はチラミンである。
【００１３】
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドとカンプトテシン類似体とのエステル結合は、オキシヘキサノイルエステルである。
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドとカンプトテシン類似体とのエステル結合は、オキシエトキシプロパノイル又はオキシエトキシエトキシプロパノイルエステルである。
【００１４】
別の実施態様において、高分子プロドラッグは［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８である。
別の実施態様において、高分子プロドラッグはＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２である。
別の実施態様において、高分子プロドラッグはＰＥＧ−［ＳＮ２２］４である。
別の実施態様において、エステル結合はオキシ酢酸エステル結合である。
【００１５】
別の実施態様において、上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、神経芽細胞腫を治療する方法が提供される。
別の実施態様において、上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、固形腫瘍を有する被験体を治療する方法が提供される。
別の実施態様において、上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、脳腫瘍を有する被験体を治療する方法が提供される。
別の実施態様において、上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、癌を治療する方法が提供される。
【００１６】
別の実施態様において、必要とする被験体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２プロドラッグ対、プルロニックＦ−１０８（１００ｎＭのＳＮ２２に相当する用量）有り又は無しのＳＮ２２による、化学療法抵抗性ＮＢ細胞［ＢＥ（２）Ｃ］の増殖阻害。未処理の細胞又はそのままの化学修飾されていないプルロニックＦ−１０８で処理した細胞を対照として含めた。試験した曝露時間は２４時間と３０分であった（それぞれＡとＢ）。細胞増殖は経時的に生物発光によって追跡した。結果は平均±ＳＤとして表される。
【図２】その臨床的に使用されている水溶性前駆体であるイリノテカンとして投与されたＳＮ３８と比較した、ポロキサマーベースのプロドラッグとして送達されたＳＮ２２の腫瘍内レベル（４時間〜３日間）。分析は、難治性ＮＢの同所性異種移植モデルで実施した。無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝５）に、２０％プルロニックＦ−１２７（５０μｌ）に懸濁したＢＥ（２）Ｃ細胞（１匹あたり１０６個）を副腎脂肪組織に接種した。腫瘍は、生物発光イメージングの制御下で１．０±０．４ｃｍ３のサイズまで拡大させた。ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２又はイリノテカン（１２０μｌ）は、尾静脈注射によってそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ２２又はＳＮ３８に相当する用量で投与された。腫瘍を採取し、秤量し、４、２４、及び７２時間目に腫瘍内薬物レベルについてＨＰＬＣで分析した。重量で標準化した薬物濃度を、２つの群の平均±ＳＤとして比較して示す。
【図３】難治性の高リスクＮＢの同所性モデルにおけるＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の治療効果。［４４］に記載されている手順に従って、マウスにルシフェラーゼを安定して発現する１０６個のＢＥ（２）Ｃ細胞を接種した。ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２による治療は、１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ２２に相当する用量で週１回、４週間静脈内投与して実施した。１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８で週２回投与されたイリノテカンを陽性対照として含めた。生理食塩水又は化学修飾されていないプルロニックＦ−１０８を陰性対照として使用した。腫瘍に関連するシグナルは、定量的生物発光によって追跡した（０〜５週に撮影された代表的な画像を（Ａ）に示す）。（Ｂ）にグラフで示した定量的データは平均±ＳＤとして表される。この試験の５週間にわたる各動物群の生存曲線を（Ｃ）に示す。
【図４】ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２プロドラッグと、ブランクのプルロニックＦ−１０８有り又は無しの遊離ＳＮ２２の抗増殖効果の試験。治療に対する応答を、化学療法未経験の表現型を示すＮＢ細胞と化学療法抵抗性の表現型を示すＮＢ細胞（それぞれ、ＩＭＲ３２（Ａ）とＢＥ（２）Ｃ（Ｂ））間で、曝露時間（０．５、４、及び２４時間）と用量（ウェルあたり２０、４０、８０ｎｇのＳＮ２２に相当）の関数として比較した。応答は、処理後７日目の増殖阻害％（平均±ＳＤ）として示されている。
【図５】ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２（４時間〜３日間）として送達されたＳＮ２２の臓器分布と腫瘍内レベル。分析は、生物発光イメージングの制御下で１．０±０．４ｃｍ３のサイズに拡大させた同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植片で実施した。プロドラッグは、１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ２２に相当する用量で尾静脈注射によって投与した。分析は、蛍光測定によって実施した。薬物量は、臓器あたりの注射用量％として示され、平均±ＳＤとして表される。
【図６】化学療法未経験のＭＹＣＮ増幅ＮＢの同所性モデルにおけるＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の治療有効性。マウスに１０６個のルシフェラーゼ発現ＩＭＲ−３２細胞を接種した。イリノテカン又はＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２（１ｋｇあたり１０ｍｇの薬剤、週２回及び１回でそれぞれ４週間）による治療は、接種の３週間後に開始された（Ａ）。あるいは、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２は、週１回で３週間にわたって、１０倍大きいＮＢ腫瘍を有する動物に投与された（Ｂ）。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した。定量的データは平均±ＳＤとして表される。
【図７】ＮＬＦ及びトランスフェクトされたクローンのＡＢＣＧ２の発現と増殖。（Ａ）ＮＬＦ及び３つの単一細胞クローンについてアクチン対照と比較して、ウエスタン分析を、ＡＢＣＧ２抗体（Santa Cruz）を使用して実施した。クローン１、２、及び３は、それぞれ微量、低レベル、及び中レベルのＡＢＣＧ２発現を示した。（Ｂ）ＳＮ３８又はＳＮ２２（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でのＮＬＦ及びＡＢＣＧ２発現クローンの増殖。４日目の増殖を示す。
【図８】同所性ＮＢモデルの治療。化学療法抵抗性のルシフェラーゼをトランスフェクトしたＳＫＮＢＥ（２）Ｃ細胞（１０７）を、ヌードマウスの腎周囲脂肪組織に注射した。マウスを５つの群に分けた：無治療群、又はブランクＰＥＧ治療群、ＣＰＴ−１１治療群、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４治療群、又はＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療群（１群あたり動物１０匹）。腫瘍が約０．２ｃｍ３に達したときに治療を開始した。ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４又はＰＥＧ−［ＳＮ２２］４のいずれかによる治療は腫瘍の退縮を引き起こしたが、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療のみが完全な腫瘍消失を引き起こした。
【図９】ＴＨ−ＭＹＣＮトランスジェニックマウスモデルにおけるＰＥＧ−［ＳＮ２２］４及びＰＥＧ−［ＳＮ３８］４の有効性。マウスを生理食塩水（Ｎ＝８）、ＣＰＴ−１１（１５ｍｇ／ｋｇ／用量；Ｎ＝７）、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量；Ｎ＝６）、又はＰＥＧ−［ＳＮ２２］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量；Ｎ＝６）の尾静脈ＩＶにより、週１回で４週間治療した。治療は、マウスが約５週齢で、腫瘍サイズが約１〜２ｃｍ３のときに開始された。腫瘍の負荷により苦痛の兆候を示したマウスを試験から除外した。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４は急速な腫瘍退縮を示し、１８０〜２００日の剖検では腫瘍は発見されなかった。
【図１０】ＰＥＧ［ＳＮ２２］４で治療されたＥＷＳ及びＲＭＳ異種移植片の生存。マウスを生理食塩水、ＣＰＴ−１１（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）、又はＰＥＧ−［ＳＮ２２］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）（すべてについてＮ＝１０）の尾静脈ＩＶにより、週１回で４週間治療した。左：ＥＷＳ細胞株ＴＣ−７１（化学療法抵抗性）の脇腹異種移植片を有する動物の、４週間治療後の生存。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４動物はいずれも再発しなかった。右：肺胞（融合陽性）ＲＭＳ細胞株Ｒｈ３０の脇腹異種移植片を有する動物の、４週間治療後の生存。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４で治療された動物のうち２匹は再発が遅く、１匹は小さく増殖の遅い腫瘍を有したが、他の７匹は１８０〜２００日間腫瘍がなかった。
【図１１】８アーム（４０ｋＤａ）ＰＥＧを担体として使用し、ＢＧを標的リガンドとして使用して設計された、ＮＥＴ標的化高分子プロドラッグとして送達されたＳＮ−３８の腫瘍内レベル（［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８）。分析は、難治性ＮＢの同所性異種移植モデルで実施した。無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝５）の副腎脂肪組織に、２０％プルロニックＦ−１２７（５０μｌ）に懸濁したＢＥ（２）Ｃ細胞（動物１匹あたり１０６個）を接種した。腫瘍は、生物発光イメージングの制御下で１．０±０．４ｃｍ３のサイズに拡大させた。［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８は、尾静脈注射によってＳＮ−３８の１０ｍｇ／ｋｇに相当する用量で投与された。腫瘍を採取し、秤量し、ＨＰＬＣで分析した。体重で標準化された薬物濃度は、平均±ＳＤとして表される。
【図１２】難治性の高リスクＮＢの同所性モデルにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の治療有効性。無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、ルシフェラーゼを安定して発現するＢＥ（２）Ｃ細胞（１０６個）を接種した。［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８による治療は、１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量を週２回で４週間静脈内投与して実施した。１５ｍｇ／ｋｇで週２回投与したイリノテカンが陽性対照として含めた。生理食塩水（無治療）を投与したマウスの群を陰性対照として使用した。追加の群では、プロドラッグを同じ処方を使用して、腫瘍サイズを１０倍（２．０ｃｍ３、「大きな腫瘍」）まで拡大させた動物に投与した。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した。（Ａ）にグラフで示されているデータは、平均±ＳＤとして表される。１９０日間にわたる各動物群の生存曲線を（Ｂ）に示す。
【図１３】化学療法抵抗性ＮＢ細胞であるＢＥ（２）Ｃにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８及びＳＮ−３８（それぞれ（Ａ）及び（Ｂ））の抗増殖活性に対するボリノスタット（vorinostat）の増強効果の評価。６時間でピークに達すると報告されたボリノスタット誘発ＮＥＴ発現に従って、６時間の曝露期間を本実験のために選択した。ＢＥ（２）Ｃ細胞を、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８又はＳＮ−３８とともにＳＮ−３８の２５〜１００ｎＭに相当する濃度で、ボリノスタット（１．２５〜５．０μＭ）有り／無しでインキュベートした。細胞増殖は生物発光によって測定した。治療後６日目のＢＥ（２）Ｃ細胞生存データを、超加法性について、モデルｚ＝ｚ０＋Ａ・ｘ＋Ｂ・ｙ＋Ｃ・［ｘ・ｙ］を適用し、交互作用項Ｃの有意性を決定することにより分析した。
【図１４】ＮＥＴを発現する化学療法抵抗性のＮＢ細胞であるＢＥ（２）Ｃに対する［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８プロドラッグの抗増殖効果。細胞増殖動態への影響を、ＢＧによる官能基化を欠く遊離ＳＮ−３８又は２成分［ＰＥＧ−ＳＮ３８］８と比較して試験した（Ａ）。細胞は、１２５ｎＭのＳＮ−３８に対応する同等濃度の化合物に４時間曝露した。追加の実験（Ｂ）では、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８による治療に対する応答を、ＨＤＡＣ１特異的阻害剤であるエンチノスタット（entinostat）（０〜５μＭ）有り／無しで調べた。プロドラッグの用量は０〜１００ｎＭ  ＳＮ−３８に相当する範囲内で変化し、曝露時間は６時間に固定された。細胞増殖は生物発光によって追跡した。応答は、処理後６日目の細胞生存％（平均±ＳＤ）として示される。実験データは、超加法性について、モデルｚ＝ｚ０＋Ａ・ｘ＋Ｂ・ｙ＋Ｃ・［ｘ・ｙ］を適用し、交互作用項Ｃの有意性を決定することにより分析した。
【図１５】化学療法未経験のＭＹＣＮ増幅ＮＢの同所性異種移植モデルにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の治療有効性。マウスに１０６個のルシフェラーゼ発現ＩＭＲ−３２細胞を接種した。ＳＮ−３８の水溶性前駆体（イリノテカン）又は［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８を１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量で、週２回で４週間にわたる治療を、接種の２１日後に開始した。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した。（Ａ）中のデータは平均±ＳＤとして表される。各群の代表的な生物発光画像は（Ｂ）に含まれている。
【図１６】難治性の高リスクＮＢの同所性モデルにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の治療有効性。無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、ルシフェラーゼを安定して発現するＢＥ（２）Ｃ細胞（１０６個）を接種した。［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８による治療は、１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量で、週２回で４週間の静脈内により実施した。比較のために、週２回投与されるイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）と同等用量の２成分［ＰＥＧ−ＳＮ３８］４を含めた。ブランクＰＥＧ又は生理食塩水（無治療）のいずれかを投与されたマウスの群を陰性対照として使用した（Ａ）。「レスキュー」実験では、最初にイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ、２回／週）で治療された動物に、同じ処方を使用してプロドラッグを投与したが、その腫瘍は２週間で２．０ｃｍ３に達していた（Ｂ）。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した。データは平均±ＳＤとして表される。
【図１７】化学療法未経験のＭＹＣＮ増幅ＮＢの同所性異種移植モデルにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の治療有効性。マウスに１０６個のルシフェラーゼ発現ＩＭＲ−３２細胞を接種した。ＳＮ−３８の水溶性前駆体（イリノテカン）又は１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量の［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８で、週２回４週間にわたる治療を、接種の２１日後に開始した。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した。（Ａ）中のデータは平均±ＳＤとして表される。代表的な画像は（Ｂ）に含まれている。
【図１８】転移性の難治性ＮＢのモデルにおける［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の治療有効性。マウスに、尾静脈を介して１０６個のルシフェラーゼ発現ＢＥ（２）Ｃ細胞を注射した。治療は、２５日目にイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又は［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８を、１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量（４週間、２回／週）で開始した。腫瘍関連シグナルは、定量的生物発光によって追跡した（（Ａ）、データは平均±ＳＤとして表される）。代表的な画像は（Ｂ）に含まれている。
【図１９】ＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧプロドラッグ対２成分（非標的化）ＰＦ６８−ＳＮ３８、及び対照としての遊離ＳＮ−３８の抗増殖効果。１５分の曝露後に獲得ＭＤＲ［ＢＥ（２）Ｃ］を示すＮＢ細胞の応答は、増殖曲線（Ａ）として及び処理後６日目の増殖阻害％（Ｂ）として、ＳＮ−３８同等用量（０〜２５ｎＭ）の関数として示される。細胞増殖は生物発光によって追跡した。結果は平均±ＳＤとして表される。
【図２０】化学療法抵抗性ＮＢ細胞であるＢＥ（２）Ｃに対するＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧの抗増殖作用のＮＥＴ選択性。細胞増殖は、ＮＥＴ阻害有り／無しで、ニソキセチン（nisoxetin）（１μＭ）を使用して、ＢＧによる官能基化を欠く２成分ＰＦ６８−ＳＮ３８と比較して調べた（Ａ）。細胞を同等濃度の化合物に１５分間曝露した。治療後６日目の実験データを、テューキー事後検定（Tukey post-hoc test）を用いる分散分析によって分析した。
【図２１】難治性ＮＢモデルにおけるＮＥＴ指向送達の治療有効性。マウスの副腎脂肪組織に１０６個のルシフェラーゼ発現ＢＥ（２）Ｃ細胞を接種した。治療は、イリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又は１０ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８に相当する用量の２成分及び３成分構築物（４週間、２回／週、（Ａ））のいずれかで開始した。あるいは、治療を開始する前に、腫瘍を２ｃｍ３まで拡大させた（Ｂ）。疾患の進行は、定量的な生物発光によって追跡した。腫瘍増殖データは平均±ＳＤとして表される。
【図２２】化学療法抵抗性のルシフェラーゼをトランスフェクトしたＳＫＮＢＥ（２）Ｃ細胞（１０７個）を、ヌードマウスの腎周囲脂肪組織に注射し、腫瘍の発生を追跡した。マウスを５つの群に分けた：無治療群、又はブランクＰＥＧ治療群、ＣＰＴ−１１治療群、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療群、又はＰＥＧ−［ＳＮ３８］４治療群（１群あたり動物１０匹）。腫瘍が約０．２ｃｍ３に達したときに治療を開始した。腫瘍サイズは２つの対照群で２週間にわたって急速に増加し、増殖はＣＰＴ−１１によってわずかに遅れただけであった。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４又はＰＥＧ−［ＳＮ３８］４のいずれかによる治療は増殖を遅らせ、腫瘍を退縮させた。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療のみが完全な腫瘍消失を引き起こした。（（Ａ）＝イメージング；（Ｂ）＝定量化）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
第１の実施態様
上記のプロドラッグの第１の実施態様において、カンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子は、生理学的条件下（例えば２２℃、ｐＨ＝７．２）で不安定なエステル結合を介して、ポロキサマーポリマーに共有結合している。
【００１９】
カンプトテシン類似体は、当技術分野でトポイソメラーゼ阻害剤としてよく知られている。カンプトテシン自体は、（Ｓ）−４−エチル−４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］−キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオンである。「カンプトテシン類似体」という用語には、カンプトテシンを含む。好ましいカンプトテシン類似体には、ＳＮ２２（７−エチル−カンプトテシン）、ＳＮ３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００２０】
ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポリオキシエチレン鎖の総数は２〜１３０の範囲であり得る。オキシプロピレン単位の数は１５〜６７の範囲であり得る。好ましくはポロキサマーの分子量は、糸球体濾過の閾値（３０〜５０ｋＤａ）未満である。これらのポリマーは、ヒトで安全に使用されてきた歴史があり、医薬品グレードの材料（Kolliphor（登録商標）P）として入手可能である。多くのポロキサマーは、賦形剤としてＦＤＡによって承認されており、現在種々の用途で臨床使用されている。これらのポロキサマーはすべて、本明細書に記載されている実施態様に適している。
【００２１】
分子サイズや親水性／親油性バランスなどのポロキサマーの生物学的に関連する特性は、親水性（Ａ）ブロックと疎水性（Ｂ）ブロックの長さ［Ａ＝ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）及びＢ＝ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）］、及びこれらの分子比を調整することによって制御される。化学的に均質なポリ（エチレンオキシド）とは異なり、中間のＰＰＯブロックの中間の長さと比較的高い親水性／親油性のバランス値を組み合わせたＡＢＡトリブロックポロキサマーは、細胞膜と安定して結合することができ、これは腫瘍の浸透と腫瘍内の存在を拡張する有効なメカニズムを提供する。ポロキサマーの例には、Kolliphor（登録商標）P188、P338、及びP407が含まれる。
【００２２】
カンプトテシン類似体は、生理学的条件下（例えば２２℃、ｐＨ＝７．２）で不安定なエステル結合を介してポロキサマーポリマーに共有結合している。１つの実施態様において、エステル結合はオキシ酢酸エステル結合である。カンプトテシン類似体は、好ましくはカンプトテシンの２０位に対応する位置のヒドロキシル基を介してポロキサマーポリマーに結合している。
【００２３】
別の実施態様において、カンプトテシン類似体の２つの分子はポロキサマーポリマーに共有結合している。好適な実施態様において、高分子プロドラッグはＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２であり、これは以下の構造によって表される：
【化１】
2022501341.tif 000003
【００２４】
第２の実施態様
上記プロドラッグの第２の実施態様において、ＳＮ２２類似体の少なくとも２つの分子は、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してＰＥＧポリマーに共有結合している。
【００２５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは当技術分野でよく知られている。ＰＥＧポリマーは線状であり、式Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨで表される。別の実施態様において、ＰＥＧポリマーはマルチアームポリマーである。マルチアームＰＥＧポリマーは、中央のコア基から出ている３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。４つのＰＥＧ鎖が特に好ましい。好ましい中央のコア基には、ペンタエリスリトール基及びトリペンタエリスリトール基が含まれる。ＰＥＧポリマーの分子量は１，０００〜１００，０００ダルトンであり、２，０００、５，０００、１０，０００、２５，０００、３５，０００、５０，０００、７５，０００、及び８５，０００ダルトンを含むすべての値とそのサブ範囲が含まれる。
【００２６】
別の実施態様において、ＳＮ２２の２つの分子は線状ＰＥＧポリマーに共有結合している。別の実施態様において、ＳＮ２２の４つの分子は、４つのＰＥＧ鎖を有するマルチアームＰＥＧポリマーに共有結合している。別の実施態様において、４つより多い最大８つのＳＮ２２の分子は、マルチアームＰＥＧポリマーに共有結合している。好ましくはＳＮ２２の分子は、これらの実施態様のＰＥＧ鎖のそれぞれに共有結合している。
【００２７】
ＳＮ２２部分は、生理学的条件下（２２°Ｃ、ｐＨ＝７．２など）で不安定なエステル結合を介してＰＥＧポリマーに共有結合している。１つの実施態様において、エステル結合はオキシ酢酸エステル結合である。カンプトテシン類似体は、好ましくはカンプトテシンの２０位に対応する位置のヒドロキシル基を介してＰＥＧポリマーに結合している。
【００２８】
好適な実施態様において、高分子プロドラッグは、以下の構造によって表されるＰＥＧ−［ＳＮ２２］４である： 
【化２】
2022501341.tif 000004
【００２９】
別の実施態様において、患者は、経口化学療法薬であるテモゾロミド（Temozolomide、ＴＭＺ）で予備治療することができる。このような予備治療は相加効果を提供し得るが、プロドラッグの腫瘍浸透を高める可能性がある。テモゾロミドは、２０〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日のＰＯの経口で数日間、たとえば５日間投与でき、その後、たとえば７日目から開始されるプロドラッグ治療を実施することができる。１００ｍｇ／ｋｇ／日の経口投与が好ましい。
【００３０】
第３の実施態様
上記のプロドラッグの第３の実施態様において、カンプトテシン類似体の少なくとも２つの分子は、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してポリマーに共有結合しており、ここで、少なくとも１つのカンプトテシン類似体は、少なくとも１つのＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドで官能基化される。
【００３１】
カンプトテシン類似体は、ＳＮ２２（７−エチル−カンプトテシン）、ＳＮ３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、又はこれらの組み合わせでもよい。ＳＮ３８が特に好ましい。
【００３２】
別の実施態様において、カンプトテシン類似体の２〜８分子はポリマーに共有結合している。この範囲には、カンプトテシン類似体の２、３、４、５、６、７分子など、すべての特定の値とその間のサブ範囲が含まれる。ポリマーに共有結合したカンプトテシン類似体の８分子が特に好ましい。
【００３３】
ポリマーは、上記のようなポロキサマーポリマー又はＰＥＧポリマーであり得る。マルチアームＰＥＧポリマーが好ましい。この実施態様において、マルチアームＰＥＧポリマーは、中央のコア基から出ている３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。４〜８つのＰＥＧ鎖が特に好ましく、８つのＰＥＧ鎖が特に好ましい。好ましい中央のコア基は、ペンタエリスリトール基及びトリペンタエリスリトール基を含む。トリペンタエリスリトール基は、中央のコア基として特に好ましい。
【００３４】
カンプトテシン類似体は、生理学的条件下（例えば２２℃、ｐＨ＝７．２）で不安定なエステル結合を介してポロキサマーポリマーに共有結合している。１つの実施態様において、エステル結合はオキシ酢酸エステル結合である。カンプトテシン類似体は、好ましくはカンプトテシンの２０位に対応する位置のヒドロキシル基を介してポロキサマーポリマーに結合している。
【００３５】
この実施態様において、少なくとも１つのカンプトテシン類似体は、ノルエピネフリン（ＮＥ）トランスポーターの少なくとも１つのリガンド、すなわちＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドで官能基化されている。１つの実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドは、フェネチルグアニジン、ベンジルグアニジン（ＢＧ）、又はチラミンである。ベンジルグアニジンが特に好ましい。
【００３６】
別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドは、生理学的条件下で不安定であるエステル結合を介してカンプトテシン類似体に共有結合している。好適な実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドとカンプトテシン類似体とのエステル結合は、オキシヘキサノイルエステルである。別の実施態様において、ＮＥトランスポーター（ＮＥＴ）リガンドとカンプトテシン類似体とのエステル結合は、オキシエトキシプロパノイル又はオキシエトキシエトキシプロパノイルエステルである。
【００３７】
好適な実施態様において、高分子プロドラッグは［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８であり、これは以下の構造によって表される：
【化３】
2022501341.tif 000005
【００３８】
治療法
上記のように、高分子プロドラッグは、有効量の高分子プロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することにより、神経芽細胞腫を治療する方法において使用することができる。
【００３９】
上記の高分子プロドラッグは、有効量の高分子プロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することにより、固形腫瘍を有する被験体を治療する方法においても使用することができる。
【００４０】
上記の高分子プロドラッグは、有効量の高分子プロドラッグを、それを必要とする被験体に投与することにより、脳腫瘍を有する被験体を治療する方法においても使用することができる。
【００４１】
上記の高分子プロドラッグはまた、上記で定義された高分子プロドラッグの有効量を、それを必要とする被験体に投与することにより、癌を治療する方法においても使用することができる。
【００４２】
これらの実施態様において、それを必要とする被験体は好ましくは哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。
【００４３】
高分子プロドラッグは、当技術分野で一般的に使用される任意の方法によって投与することができる。投与方法には、非経口（静脈内、筋肉内、及び皮下）、経口、鼻内、眼内、経粘膜（頬、膣、及び直腸）、及び経皮投与経路が含まれる。
【００４４】
高分子プロドラッグは、本明細書に記載されている状態を治療するのに有効な任意の用量で投与することができる。高分子プロドラッグの投与量は、１回の用量あたり０．５〜２００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【実施例】
【００４５】
実施例１
ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２
１．  ２工程のプロドラッグ合成
２２〜２５°ＣのＴＨＦ中のジョーンズ試薬（ＣｒＯ３／Ｈ２ＳＯ４）によるポロキサマーの酸化は、ポリマーの末端ＣＨ２ＯＨを末端アルコキシアセテートカルボン酸基に変換し、これは次に、加水分解性エステル結合を介して種々のヒドロキシル含有薬物の可逆的共有結合に使用することができる。上記の条件下のプルロニックＦ−１０８（Kolliphor P338）の酸化は、ＯＣＨ２ＣＯプロトンのシグナルにより１Ｈ ＮＭＲを使用して測定すると、０．１８ｍｍｏｌ／ｇのカルボキシル基を含むポリマーの結果を得た。同様に、プルロニックＦ−６８の酸化は、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの末端カルボン酸基を含むポリマーを与えた。カルボキシル基の活性化剤として１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、触媒として４−ジメチルアミノピリジントシレート（ＤＰＴＳ）、そして溶媒としてＣＨ２Ｃｌ２を使用して、カルボキシル化プルロニックＦ−１０８をＳＮ２２とさらに結合させると、０．１３ｍｍｏｌ／ｇ又は４．８重量％の薬物を含むポリマー結合体が形成された。１Ｈ ＮＭＲは、ＳＮ−２２が、カルボキシル化プルロニックのカルボキシル基とＳＮ２２分子の２０−ＯＨとのエステル結合を介して、ポリマーに共有結合していることを示した。Kolliphorグレードのプルロニック（表１）及びＳＮ２２（純度：≧９７％、ＨＰＬＣ）を、それぞれSigma-Aldrich (St. Louis, MO) 及び AK Scientific (Union City, CA)から購入した。
【００４６】
カルボキシル化プルロニックを用いてＳＮ３８のプロドラッグを調製するために、まずＳＮ３８（純度：≧９７％、AstaTech , Bristol, PA）のフェノール性１０−ＯＨが、Ｎ−メチルピロリドン中のイミダゾールの存在下でｔｅｒｔ−ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ）の作用により、１０−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）基を用いて保護される。実行可能性実験では、得られた１０−ＴＢＤＰＳ保護ＳＮ３８（収率９７％で得られた）を上記のようにカルボキシル化プルロニックＦ−６８と反応させて、次の脱保護（ＣＨ２Ｃｌ２中のフッ化ピリジニウムを用いる）後に目的の結合体が得られ、これは、１Ｈ ＮＭＲによると、エステル結合を介して２０−ＯＨにより共有結合された０．１７ｍｍｏｌ／ｇ又は６．６重量％のＳＮ３８を含有した。
【表１】
2022501341.tif 000006
【００４７】
２．  ポロキサマー−ＳＮ２２プロドラッグは化学療法抵抗性ＮＢ細胞の増殖を阻害する
難治性ＮＢは、ＮＢ細胞の増殖を阻害するために必要な薬物閾値レベルのシフトを特徴としている。導入治療中と治療前の診断時の進行性疾患の同じ患者に由来する、試験されたすべての細胞株の対で示されるこのシフトは、異なる化学的及び薬理学的ファミリーからの化学療法剤への応答に、同時に影響を与える。医薬品グレードのプルロニックＦ−１０８（kolliphor P338）とＳＮ２２から構築されたプロドラッグであるＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２を、コドン１３５上のＴＰ５３変異の獲得とｐ５３機能の喪失に関連する薬剤耐性表現型を示すＢＥ（２）Ｃ細胞株に対して試験した。
【００４８】
２４時間の曝露後、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２は７日間にわたってＢＥ（２）Ｃ細胞の増殖を効果的に阻害し、ＳＮ２２単独と又は化学修飾されていないプルロニックＦ−１０８との組み合わせ（ＰＦ１０８＋ＳＮ２２）と同様の効力を示し、一方、薬剤なしで適用されたプルロニックＦ−１０８では細胞増殖の阻害は観察されなかった（図１Ａ）。曝露が３０分に制限された場合（図１Ｂ）、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の効果は顕著に低下し、プロドラッグがこの時間スケールでほとんど無傷のままであることを示唆している。
【００４９】
比較すると、化学療法未経験のＮＢ細胞（ＩＭＲ−３２）に対して試験した場合、プロドラッグは、ＳＮ２２の２０〜８０ｎＭに対応する用量範囲と３０分〜２４時間の曝露時間内で均一に有効であり、顕著なＩＭＲ−３２細胞増殖の阻害を引き起こした（図４Ａを参照）。これは、以前に治療を受けていない患者に由来するこの細胞株における固有の耐性の欠如と一致しており、実質的に低いレベルで存在する活性ＳＮ２２の抗増殖効果に対して応答するようにしている。重要なことに、遊離ＳＮ２２は細胞培養実験の陽性対照として含まれていたが、これは医薬的に許容し得るビヒクルとは適合しない。
【００５０】
３．  ポロキサマープロドラッグとしてのＳＮ２２送達は、同所性ＢＥ（２）Ｃ腫瘍中の長期曝露を達成する
化学放射線療法後の再発時に由来するＢＥ（２）Ｃ細胞と、診断時の同じ患者に由来するＢＥ（１）細胞との比較により、細胞増殖阻害を達成するために必要なカンプトテシン類似体ＳＮ３８の濃度が、桁違いに９０％（それぞれ２５対２ｎｇ／ｍｌ）上昇することが証明された。重要なことに、ＳＮ３８の対応する腫瘍内レベルは、その前駆体であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１）による従来の治療を使用しては維持できないことが示された。最大許容量を超えずに有効な局所薬物レベルを維持できないことが、再発性及び難治性の高リスクＮＢの状況で、臨床的に使用されるカンプトテシン及び他の化学療法剤の効かない主な原因である。これらの報告と一致して、これらの結果は、イリノテカン（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与後それぞれ２４時間及び７２時間に、大きな（≧１ｃｍ３）ＢＥ（２）Ｃ同所性異種移植片で２５ｎｇ／ｇ及び２ｎｇ／ｇ未満のＳＮ３８を示している。比較すると、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２と同等の用量で送達されたＳＮ２２は、腫瘍内に数倍高いレベルで安定して存在し、４、２４、７２時間目にそれぞれ２１８０±８５０ｎｇ／ｇ、２１４０±５２０ｎｇ／ｇ、及び１５７０±５８０ｎｇ／ｇ（図２）であり、ポロキサマープロドラッグベースの送達が、ＳＮ２２の安定した治療上有効なレベルを維持できることを示唆し、従って持続的なＮＢ腫瘍増殖抑制の必要性に対処している。
【００５１】
４．  ポロキサマー−ＳＮ２２プロドラッグは腫瘍増殖を強力に抑制し、薬剤耐性ＮＢ中の生存期間を延長する
１．５μｇ／ｇを超える腫瘍内レベルでの持続的な存在に一致して、ポロキサマーベースのプロドラッグとして週に１回処方及び投与されたＳＮ２２は、腫瘍の退縮を引き起こし、同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植片の再増殖を強力に抑制した（図３Ａ及びＢ）。これは、著しく延長された動物の生存期間を意味し（図３Ｃ）、この試験で２倍頻繁に投与されたイリノテカンではわずかな抗腫瘍効果しかなかったこととは対照的である。このＮＢモデルにおけるイリノテカンのわずかな効果（図３）は、攻撃的で難治性のヒトＮＢの状況で持続的な治療応答を達成する上で重要な課題を再現する前臨床評価アプローチの妥当性を示している。特に、イリノテカンとは異なり、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２は腫瘍の縮小と疾患の安定化の両方を引き起こすことができ、週１回の投与を４週間（ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の最終投与は２１日目；図３Ｂに示される）のみからなる治療期間中及びそれ以降の進行は観察されなかった。ポロキサマー−ＳＮ２２プロドラッグの顕著な抗癌作用は、下痢、皮膚テンティング（脱水症による）、皮膚潰瘍、食欲不振、悪液質、又は体重増加遅延などの全身毒性の兆候を伴っていなかった。
【００５２】
５．  ポロキサマー−ＳＮ２２プロドラッグ：ＭＹＣＮ増幅ＮＢ細胞に対する抗増殖効果の定量的試験
独特の（化学療法未経験対化学療法抵抗性）表現型を有するＮＢ細胞に対する高分子プロドラッグの抗増殖効果を比較研究する実行性を証明するために、治療開始前と集中的な化学放射線療法後の再発時の、攻撃的なＭＹＣＮ増幅疾患を表す２つの細胞株（それぞれＩＭＲ−３２及びＢＥ（２）Ｃ）に対するＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の効果を比較した。
【００５３】
化学療法未経験細胞と化学療法抵抗性細胞との間で応答パターンに大きな違いが観察された：ＩＭＲ−３２の増殖は、試験した全用量及び曝露の持続範囲内で高い効力で均一に阻害されたが（図４Ａ）、ＢＥ（２）Ｃ細胞は、ウェルあたり４０ｎｇ以下の用量で又は４時間以下の曝露時間で、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２による限られた増殖阻害のみを示した。特に、化学修飾されていないプルロニックＦ−１０８の有無にかかわらず、遊離ＳＮ２２に対するこれらの細胞の応答も、ＩＭＲ−３２と比較して、より高用量でより長い曝露時間に強くシフトし、以前の試験で示されているように、ｐ５３機能の喪失と異なるファミリーの化学療法剤に対する感受性の低下を示すＢＥ（２）Ｃの化学療法抵抗性表現型と一致していた。
【００５４】
６．  ポロキサマープロドラッグとして処方されたＳＮ２２の腫瘍取り込みと保持の比較
ポロキサマーベースのプロドラッグを使用する送達アプローチの有効性は、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２結合体として投与されたＳＮ２２の急速な腫瘍取り込みと持続的な腫瘍内保持を示すデータによって証明される（図２及び５）。ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２は、化学療法抵抗性ＮＢ細胞の増殖を抑制するのに必要な報告された有効局所濃度よりも約２桁高いレベルで、同所性ＮＢ腫瘍における薬物存在時間の延長を達成する。
【００５５】
臓器分布の分析により、プロドラッグとして送達されたＳＮ２２の急速な蓄積と延長された保持が確認され、細網内皮系の臓器である肝臓や脾臓によって取り込まれる薬物量は比較的少なかった。ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２として投与されたＳＮ２２のかなりの量が、投与後４時間及び２４時間目の血中で測定され、この時間内の腫瘍における薬物蓄積の進行と一致した（図５）。これは、末梢器官、脾臓、肺、及び腎臓で観察された急速な薬物排出とは対照的である。重要なことに、トポイソメラーゼＩ阻害剤は、サイクリング細胞に非常に特異的（Ｓ期依存性）であり、活発な複製がなくても細胞毒性が高い他の化学療法剤とは異なっている。
【００５６】
ポロキサマープロドラッグベースの送達で観察される限定された分布及び末梢器官からの迅速な薬物クリアランスとともに、薬理学的に選択的な作用様式は、急性の全身毒性症状（下痢、潰瘍形成、食欲不振、悪液質、又は体重減少）の欠如に一致して、顕著な全身毒性のリスクをさらに低下させる可能性がある。
【００５７】
７．  ポロキサマー−ＳＮ２２プロドラッグは、イリノテカンに対する一過性の応答を示す大小のＮＢ腫瘍の収縮を引き起こし、再増殖を抑制する
大小のＮＢ腫瘍に対して持続的な抗癌効果を提供するポロキサマーベースのプロドラッグ戦略の有効性は、ＰＦ１０８−（ＳＮ２２）２の週１回の投与処方で実験的に証明された（同所性ＩＭＲ−３２異種移植モデル、図６）。特に、化学療法を受けていない表現型にもかかわらず、ＭＹＣＮ増幅ＩＭＲ−３２細胞で確立された同所性ＮＢ腫瘍は、イリノテカンに対して一過性の応答しか示さなかった（週に２回投与）。難治性疾患のＢＥ（２）Ｃ異種移植モデルにおけるプロドラッグアプローチの有効性を示す結果（図３）とともに、これは、従来の化学療法に対して限定的な応答を示すか又は応答しない高リスクＮＢの状況におけるポロキサマープロドラッグベースの送達を支持する強力な証拠を提供する。
【００５８】
実施例２
ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４
１．  ＰＥＧの合成−［ＳＮ２２］４
カルボキシル基の活性化剤として１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、触媒として４−ジメチルアミノピリジントシレート（ＤＰＴＳ）、そして溶媒としてＣＨ２Ｃｌ２を使用して、カルボキシル化４−アーム−ＰＥＧ（JenKem Technology、Ｍｎ＝２０，５５３Ｄａ）をＳＮ２２と結合させると、０．１７ｍｍｏｌ／ｇ又は６．４重量％の薬物を含むポリマー結合体が形成された。１Ｈ ＮＭＲは、ＳＮ−２２がカルボキシル化ポリマーのカルボキシル基とＳＮ２２の２０−ＯＨとのエステル結合によってポリマーに共有結合していることを示した。
【００５９】
２．  実験結果
ＡＢＣＧ２流出に対するＳＮ３８及びＳＮ２２の感受性を評価するために、ＡＢＣＧ２ヌルＮＢ細胞株であるＮＬＦが同定された。ＮＬＦにＡＢＣＧ２発現ベクターをトランスフェクトした後、痕跡レベル、低レベル、及び中レベルのＡＢＣＧ２発現を有する単一細胞クローンを選択した（図７Ａ）。次に、異なる濃度のＳＮ３８又はＳＮ２２に対するＮＬＦ及びＡＢＣＧ２発現クローンの感受性と、IncuCyte（登録商標）S3生細胞分析システムを使用して継続的に追跡した増殖を評価した。高レベルのＡＢＣＧ２を有するクローンは、ＳＮ３８に対する耐性が上昇したが、ＳＮ２２に対しては完全に感受性のままであった（図７Ｂ）。これは、攻撃的なＮＢ及びＮＢ幹細胞を特徴付ける内因性ＡＢＣＧ２発現が、イリノテカン／ＳＮ３８、及びおそらくＡＢＣＧ２流出に感受性の他の化学療法剤に対する薬剤耐性に寄与することを示唆している。
【００６０】
インビボでのＮＢにおけるＳＮ２２の異なるスケジュールを調べるために、免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスにおける化学療法未経験のＳＨ−ＳＹ５ＹＮＢ株のサブクローンであるＮＢ脇腹異種移植マウスモデルを使用して試験した。予備実験において、週２回で４週間ＩＶ投与したＣＰＴ−１１（２５ｍｇ／ｋｇ／用量）と比較したＰＥＧ−［ＳＮ２２］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）の２つの異なる治療スケジュールを評価した。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４は、週２回で２週間、又は週１回で４週間投与された（各４回投与）。２．５倍高い用量のＣＰＴ−１１が、２倍の回数投与されたが、寛解を誘導し生存期間を延長するのにＰＥＧ−［ＳＮ２２］４は、はるかに効果的であった。
【００６１】
次に、化学療法抵抗性のＮＢ株ＳＫＮＢＥ（２）Ｃを有するＮＢ同所性異種移植マウスモデルにおけるＰＥＧ−［ＳＮ２２］４、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４、及びＣＰＴ−１１。ＢＥ（２）Ｃ細胞にルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクトして、生物発光イメージングを可能にした。マウスを、週１回で４週間にわたって、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）、又はＣＰＴ−１１（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）のいずれかで治療した。この化学療法抵抗性モデルでは、ＣＰＴ−１１は効果がなかったが、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４とＰＥＧ−［ＳＮ３８］４の両方は腫瘍を縮小するのに極めて効果的であった（図８）。ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４で治療したマウスでは、治療を中止すると腫瘍が急速に再増殖したが、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４の治療では、腫瘍が完全に消失し、治療期間を超えて腫瘍の増殖が持続的に阻害され、［ＳＮ２２］４が難治性疾患に対して優れた有効性を有することが示唆され、これは、おそらく後天的な薬剤耐性を克服する能力のためと考えられる。
【００６２】
ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４はまた、ＴＨ−ＭＹＣＮトランスジェニックマウスモデルにおける新規（de novo）ＮＢを治療するのに使用された。４〜５週までに導入遺伝子の２つのコピーを有するほとんどすべてのマウスで、自然発生腫瘍が傍脊柱神経節又は副腎に発生する。腫瘍が触知可能になったとき（４〜５週間）マウスを４つの群に分けた：対照の未治療群、ＣＰＴ−１１治療群（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４群（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）、又はＰＥＧ−［ＳＮ２２］４群（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）。マウスは週１回で４週間治療された。未治療マウスで腫瘍が急速に進行し、ＣＰＴ−１１治療では腫瘍の増殖はわずかに遅れた。腫瘍の負担により症状が現れたときにマウスを殺処分した。しかし、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療ではすべての腫瘍が退縮し、治療の１〜２週間以内に触知できなくなった（図９）。これらは、ＳＮ２２治療の開始後１８０日以上にわたって、すべてのマウスで触知できないままであった。これらのマウスのうち数匹を殺処分し、腫瘍の部位を肉眼と顕微鏡で調べたが、どのマウスにも腫瘍の証拠は見られなかった。これらのデータは、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４が、免疫無防備状態マウスで発生する自然発生腫瘍に対して極めて効果的であり、週１回で４週間の投与でさえ、すべてのマウスで長期寛解と治癒をもたらすのに十分であることを示唆している。
【００６３】
同様の方法で、異種移植片として増殖している２つの代表的な肉腫を治療するのに、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４を使用した。化学療法抵抗性のユーイング肉腫（ＥＷＳ）株ＴＣ−７１及び肺胞（融合陽性）横紋筋肉腫（ＲＭＳ）株Ｒｈ３０を治療した。１８０日後、すべてのＥＷＳマウスには触知可能な腫瘍がなかったが、ＲＭＳ異種移植片を有する２匹のマウスは約１５０日後に腫瘍が再増殖し、殺処分しなければならなかった（図１０）。これらのマウスは単剤の週１回で４週間の投与のみで治療されたため、より長い治療期間又は別の薬剤との併用により、これらの再発を回避できた可能性がある。それにもかかわらず、ＥＷＳ及びＲＭＳによるこれらの結果は、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４の有効性がＮＢに限定されないか又はＮＢに固有ではなく、他の固形腫瘍に適用されることを証明している。
【００６４】
上に示した結果は、ＮＢ異種移植片から及び免疫無防備状態トランスジェニック動物で生じる自発的ＮＢからの腫瘍の根絶における、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４のかなりの有効性を示している。ほとんどの動物は、治療開始から１８０〜２００日間の無再発生存期間（ＥＦＳ）で規定されているように「治癒」された。単一の化学療法抵抗性ＥＷＳ株と単一の融合陽性ＲＭＳ株を脇腹異種移植片として治療する場合にも、同様の結果が得られた。従ってＰＥＧ−［ＳＮ２２］４は、攻撃的な小児固形腫瘍の及び本明細書に記載されている他の状態のこれらの動物モデルで、長期ＥＦＳを得る際の単一の薬剤として有効である。
【００６５】
細胞株。高リスクＮＢの主要な遺伝子型（ＭＹＣＮ増幅、１ｐ３６欠失、ＡＬＫ変異）、及び化学療法未治療腫瘍と化学療法抵抗性腫瘍（ＳＹ５Ｙ、ＩＭＲ５、ＮＬＦ、ＳＫＮＢＥ２Ｃ）の両方を表す４つのＮＢ細胞株のパネルを、すべてのインビトロ及びインビボ試験に使用することができる。細胞を１０％ウシ胎児血清（Cellgro）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Gibco）で増殖させ、９５％空気と５％ＣＯ２の加湿雰囲気で維持する。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．０２％Ｎａ４ＥＤＴＡを用いて細胞を採取する。使用するＲＭＳ株はＲＨ１８とＲＨ３０（胚、肺胞）であり、ＥＷＳ株はＴＣ３２及びＴＣ７１（診断、再発）であり、ＯＳ株はＵ２ＯＳとＳＡＯＳ２である。
【００６６】
マウス。Jackson Laboratoriesの６週齢のＦｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ（ＪＡＸストック＃００７８５０）マウスを使用する。マウスは、湿度と温度が制御された条件下で、１２時間間隔で設定された明暗サイクルで維持される。これらのマウスは１２９−ＳｖＪバックグラウンドにある。トランス遺伝子についてホモ接合性のマウスは、一般に４〜５週間以内に腫瘍を発症する。
【００６７】
脇腹異種移植片。マウスの右脇腹に、０．１ｍｌのマトリゲル（Corning, Tewksbury, MA）に懸濁した１×１０７個のＮＢ細胞を皮下注射する。腫瘍は、キャリパーを使用して２次元（ｍｍ）で用手法で週２回測定する。体積（ｃｍ３）は次のように計算される：［（０．５２３×Ｌ×Ｗ２）／１０００）］、ここで、Ｌ＞Ｗ。体重は週２回取得され、体重の変化が１０％を超える場合は治療用量が調整される。マウス（１群あたりｎ＝１０）は、腫瘍体積が０．２ｃｍ３に達したら、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４を週１回で４週間尾静脈注射して治療される（２）。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４は１０ｍｇ／ｋｇ／用量で投与される。ＣＰＴ−１１（ＣＰＴ−１１；１５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルのみは、陽性対照及び陰性対照として使用される。
【００６８】
同所性異種移植片。ルシフェラーゼを安定して発現するＮＢ細胞を、１匹あたり１０６個の細胞で、無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの副腎脂肪組織に移植する。腫瘍を確認し、その後、Xenogen IVIS イメージングシステム（Perkin Elmer, Santa Clara, CA）にLiving Image ソフトウェア（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA）を組み合わせた生物発光イメージングにより、腫瘍量を週２回追跡する。腫瘍サイズが１ｃｍ３に達した後（接種後約２８日目）、担癌マウスをランダムに１０匹ずつの動物の群に分け、上記のように１２０μｌ用量のＰＥＧ−（ＳＮ２２）４、ＣＰＴ−１１、又はビヒクルを単回ＩＶ投与する。
【００６９】
ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４及びＣＰＴ−１１の薬物動態分析。脇腹異種移植片を有するマウス（１群あたり、１時点あたりｎ＝３）に、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−［ＳＮ２２］４又は１５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ−１１を尾静脈から単回ＩＶ投与する。ＣＰＴ−１１は肝臓による活性ＳＮ３８への変換を必要とするプロドラッグであるため、用量はより少ない。眼窩後部及び末端出血によって血液を得て、ヘパリンナトリウム（ＢＤ）を含む２ｍｌの採血管に採取する。冷食塩水で心臓を灌流してから４．１２、２４、４８、及び７２時間後に、殺処分後、組織（腫瘍、肺、肝臓、脾臓、腎臓）を採取し、CHOP Pharmacology Coreによって分析される。マウス血液（水で１：１に希釈）中及び組織ホモジネート中のＳＮ３８、ＳＮ２２、及びＣＰＴ−１１の合計レベルは、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析される。
【００７０】
実施例３
［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８
１．  ３成分ポリマーベースのプロドラッグ合成
本明細書に記載のプロドラッグは、インサイチュで切断可能なエステル結合を介して、それぞれマルチアーム又は線形ＰＥＧ担体に結合した８つ又は２つの薬物−リガンドハイブリッド分子を有する。これらの加水分解不安定性及び活性化率は、アルコキシアセチル基の強い電子置換効果のために、通常の（アシル）エステルのものと比較して上昇している。
【００７１】
まず、Ｎ−Ｂｏｃ保護されたアミノメチルフェノキシヘキサン酸を、触媒として４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジントシレート（ＤＰＴＳ）を、カルボキシル基の活性化剤として１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を、及び溶媒としてジクロロメタン使用して、ＳＮ−３８（AstaTech , Bristol, PA）に収率８５％で結合させた。保護基を、トリフルオロ酢酸を用いて除去し、結合体をテトラヒドロフランとジクロロメタンの１：１混合物中で、グアニジニル化剤として１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−（トリフルオロメチルスルホニル）グアニジンと反応させた（収率：７５％）。次に、加水分解により切断可能な６−ヘキサノイルスペーサーを介して結合されたＢｏｃ保護ＢＧとＳＮ−３８の小分子結合体を、同じくＤＰＴＳ、ＤＣＣ、及びジクロロメタンをそれぞれ触媒、活性剤、及び溶媒として使用して、カルボキシル化８アームＰＥＧ（JenKem Technology、Ｍｎ＝３７３９０Ｄａ、ＰＤＩ＝１．０６）に結合させた。
【００７２】
精製のために、ポリマーをベンゼン中の溶液からジエチルエーテルで沈殿させ、残留ＤＰＴＳを硫酸ナトリウム水溶液（２１％ｗ／ｗ）で洗浄することにより除去した。移動性化合物が存在しないことを、この工程でＴＬＣ分析（シリカゲル、クロロホルム−アセトニトリル、７：３）により確認した。最後に、グアニジン成分から、トリフルオロ酢酸で処理することにより保護基を除去した。得られた［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８ポリマーをジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。生成物の構造及び官能基化効率を１Ｈ ＮＭＲによって分析したところ、０．１８ｍｍｏｌ／ｇ（７．１重量％）のＳＮ−３８及びポリマーに結合した等量のＢＧが示された。純度は、ＴＬＣ及び１Ｈ ＮＭＲ分析の両方によって確認された。
【００７３】
２．  標的化腫瘍治療への取り込み
１ｋｇあたり１０ｍｇのＳＮ−３８に相当する同等用量で、８アームのＰＥＧベースの及びＢＧ官能基化プロドラッグ［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８として送達されたＳＮ−３８は、腫瘍内に何倍も高濃度（１時間、４時間、２４時間目にそれぞれ２．８２±０．５３μｇ／ｇ、４．４６±１．５９μｇ／ｇ、２．６３±０．８５μｇ／ｇ（図１１））で安定して存在しており、標準的な治療に応答しない難治性腫瘍の増殖を抑制するために必要な安定な治療上有効な薬物レベルを提供できることを示唆した。
【００７４】
薬剤耐性ＮＢ細胞株ＢＥ（２）Ｃについて報告されている治療閾値２５ｎｇ／ｍｌよりも２桁大きいレベルでのＳＮ−３８の持続的な腫瘍内存在に一致して、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８として配合され投与された薬物は、急速な腫瘍退縮を引き起こし、大小の同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植片の再増殖を強力に抑制した（図１２Ａ）。プロドラッグの持続的な抗癌効果は、動物の無再発生存期間を著しく延長（ｔ５０％生存率は、未処理の動物の１２日に対して、それぞれ１３０日と８８日（図１２Ｂ））し、これは、この試験で同等の用量で投与されたイリノテカンによるわずかな治療効果と生存期間の延長（ｔ５０％生存率は２０日）とは対照的であった。
【００７５】
重要なことに、このモデルにおけるイリノテカンのわずかな効果は、攻撃的で難治性のヒトＮＢの設定において、持続的で臨床的に意味のある応答を達成する上で治療上の課題を再現している前臨床評価アプローチの妥当性を示している。同時に［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８は、急速な腫瘍縮小を引き起こし、疾患を安定させることができ、８回の投与（最後の投与は２４日目に投与された）からなる治療期間中及びそれ以降に進行は観察されなかった。注目すべきことに［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８プロドラッグによる治療中に、下痢、皮膚テンティング（脱水症による）、皮膚潰瘍、食欲不振、悪液質、又は体重増加遅延などの全身毒性の兆候は観察されなかった。
【００７６】
３．  ＮＥＴ発現増強剤は、取り込み−１標的化プロドラッグの性能をさらに改善することができる
トポイソメラーゼＩ阻害剤とほとんど重複しない毒性プロフィールを有する強力な汎ＨＤＡＣ阻害剤であるボリノスタットは、ＤＮＡ切断修復酵素の発現を阻害し、ＤＮＡ損傷により誘発されるアポトーシスを促進することにより、ＮＢ腫瘍におけるＮＥＴ発現を実質的に増加させ、腫瘍細胞をカンプトテシン薬に感作させることが示され［４４］、どちらの効果も、ＳＮ−３８のＢＧ官能基化プロドラッグによる神経内分泌腫瘍の標的化療法の強化に関連している。［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８対ＳＮ−３８によるＢＥ（２）Ｃ細胞増殖阻害に対するボリノスタットの増強効果を調べた。
【００７７】
ボリノスタットは、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の抗増殖効果を著しく増強した（ｚ＝ｚ０＋Ａ・ｘ＋Ｂ・ｙ＋Ｃ・［ｘ・ｙ］の交互作用項Ｃについてｐ＜０．０００１、図１３Ａ）が、化学修飾されていないＳＮ−３８とも適度に相乗作用を示した（ＣについてＰ＝０．０８７、図１３Ｂ）。これは、ボリノスタットによって示される、ＮＥＴ発現関連及び非関連の薬物増強のメカニズムの組合せと一致しており、ＢＧ官能基化プロドラッグによるＮＢ細胞増殖阻害のより大きな増強を追加している。特に、ボリノスタットがプロドラッグの作用を強力に増強した低マイクロモル濃度範囲（１〜５μＭ）では、それ自体のＢＥ（２）Ｃ細胞増殖の阻害効果は中程度であり（図１３Ａ）、ＮＢの前臨床モデルにおけるボリノスタットの適度な単一薬剤活性と一致していた。
【００７８】
４．  化学療法抵抗性ＮＢ細胞のプロドラッグを介する増殖阻害とその薬理学的増強
プロドラッグ構造に組み込まれた標的リガンドの特異的寄与を評価するために、ＮＥＴを発現する化学療法抵抗性ＮＢ細胞に対する［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の細胞増殖阻害活性を、同様に構築されたがＢＧ部分を含まない対照分子［ＰＥＧ−ＳＮ３８］８と比較した。さらにＮＢ細胞及び腫瘍異種移植片において、ＮＥＴ発現をアップレギュレートし取り込み−１を増強することが示された汎ＨＤＡＣ阻害剤が、ＮＥＴ発現ＮＢ細胞に対する［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８の抗増殖効果を強力に増強する（図１３）ことが確立されたため、ＨＤタイプ１サブファミリーに特異的な選択的ＨＤＡＣ阻害剤（エンチノスタット）も［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８と相乗作用するという仮説が取り上げられた。
【００７９】
化学療法抵抗性ＮＢ細胞の増殖を抑制する能力の大きな違いが、３成分プロドラッグとＢＧリガンドなしで組み立てられた２成分対照構築物との間で観察された。ＮＥＴを発現するＢＥ（２）Ｃ細胞の増殖は、薬物−細胞の直接接触のインビトロ条件下で、遊離ＳＮ−３８に匹敵する高い効力で［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８により阻害されたが、２成分構築物［ＰＥＧ−ＳＮ３８］８は著しく効果が低く（図１４Ａ）、抗増殖応答の増強における３成分設計の重要性とＢＧの役割を示している。別の試験では、プロドラッグを介するＮＢ細胞増殖抑制に対する強力な増強効果が、ＨＤＡＣ１特異的遮断薬であるエンチノスタットで証明された（図１４Ｂ、交互作用項Ｃについてｐ＜０．００１）。興味深いことに、この知見は、エピジェネティックな作用機序を有する高度に選択的な非化学療法剤であるエンチノスタットが、化学的に異なる汎ＨＤＡＣ阻害剤であるボリノスタットと同様に、おそらくはこれらの取り込みを増強することにより、ＢＧ官能基化治療薬と相乗作用できることを示唆している。
【００８０】
５．  ＮＥＴ標的化プロドラッグとして配合されたＳＮ−３８の腫瘍取り込みと保持の比較
プロドラッグベースの治療戦略の有効性は、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８３成分プロドラッグとして送達されたＳＮ−３８の急速な腫瘍取り込みと持続的な腫瘍内保持を示す試験で証明された（図１１及び表２）。その臨床的に使用される薬理学的に不活性な前駆体（イリノテカン）の形で投与されたＳＮ−３８とは対照的に、プロドラッグベースの送達は、化学療法抵抗性ＮＢ細胞であるＢＥ（２）Ｃの増殖を抑制するために必要な報告されたＳＮ−３８の濃度よりも約２桁高いレベルで、ＳＮ−３８の局在化と持続的な腫瘍内存在を達成する。この分析は、ＨＰＬＣアッセイを使用して、大きな同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植片（１．０±０．４ｃｍ３、ｎ＝５）で行われた。
【表２】
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【００８１】
６．  ［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８プロドラッグは腫瘍の退縮を引き起こし、従来の治療に対して一過性の応答のみを示す攻撃的なＮＢモデルにおいて「治癒」を達成する
攻撃的なＮＢ腫瘍に対して持続的な抗癌効果を提供することにおける３成分プロドラッグ戦略の有効性は、同所性ＩＭＲ−３２異種移植モデルで実験的に証明された（図１５）。週２回で４週間にわたって投与された［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８は、化学療法を受けていないＭＹＣＮ増幅疾患のモデルでは、その後の再増殖を伴わずに急速な腫瘍縮小を引き起した。これは、ＳＮ−３８前駆体であるイリノテカンで治療された動物群で治療中止直後に腫瘍が再増殖し始めるのとは対照的である（図１５Ａ、Ｂ）。難治性疾患のＢＥ（２）Ｃ異種移植モデルにおけるプロドラッグアプローチの有効性を示す結果（図１２）とともに、これは、従来の化学療法に対して限定された応答を示すか又は応答を示さない高リスクＮＢの状況で、３成分プロドラッグベースの送達を支持する強力な証拠を提供する。
【００８２】
７．  ３成分構築物は、多剤耐性で高リスクの神経芽細胞腫の治療法としての可能性を示す
ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）を標的としたポリマー結合プロドラッグとして配合され４週間（週２回）にわたって投与されたＳＮ−３８は、急速な腫瘍退縮を引き起こし、化学療法抵抗性の同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植片の再増殖を完全に抑制し、無再発生存期間を著しく延長した（＞１４週間、図１６Ａ）。これは、このモデルにおいて抗腫瘍効果を持たないイリノテカンとは対照的であり、治療期間中のみ腫瘍増殖のみを阻害した２成分対照［ＰＥＧ−ＳＮ３８］４に対して劇的な改善でもある（図１６Ａ）。さらに、イリノテカンで治療中に急速に大きな腫瘍（２ｃｍ３）を発症した動物を［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８に切り替えると、腫瘍が縮小し、１２週間以上検出されないままであった（「レスキュー試験」、図１６Ｂ）。
【００８３】
重要なことに、超高リスクＮＢ患者に見られる応答の欠如と同様に、イリノテカンによって示される抗腫瘍効果の欠如は、前臨床モデルが難治性ＮＢの臨床挙動を忠実に再現していることを示している。注目すべきことに、［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８で見られた持続的で大きな治療効果は、全身毒性の兆候（下痢、皮膚のテンティング又は潰瘍、食欲不振、悪液質、又は体重増加の遅延）を伴わなかった。
【００８４】
それほど治療が困難ではない化学療法未経験の疾患をモデル化した実験環境で試験した場合、イリノテカンは治療期間中（４週間）腫瘍の増殖を阻害できたが、同じ期間に投与された［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８は、ＮＢ腫瘍を完全に排除した（３０週間後に再増殖は検出されなかった、図１７）。これらの結果は、高分子担体結合プロドラッグによるＮＥＴ標的化送達を最適化して、攻撃的なＭＹＣＮ増幅ＮＢの様々な段階（新たに診断又は再発）をうまく治療できるという証拠を提供する。
【００８５】
８．  ［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８プロドラッグは、転移性の薬剤耐性ＮＢモデルにおいて、播種性腫瘍沈着物の退縮を引き起こし、再増殖を抑制する
播種性化学療法抵抗性ＮＢに対する持続的な治療効果を達成することにおける３成分プロドラッグベースのＮＥＴ標的化薬剤送達の有効性を、転移性で難治性疾患のマウスモデルで評価した（図１８）。４週間にわたって投与された［ＰＥＧ−ＳＮ３８−ＢＧ］８は、確立された多発性腫瘍沈着物を急速に排除し、１５週間を超えて検出可能な再増殖は見られなかった。対照的に、１５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回投与されたイリノテカンは、疾患の進行に有意な影響を及ぼさなかった（図１８Ａ、Ｂ）。同所性の難治性腫瘍に対するＮＥＴ標的化３成分プロドラッグの実験的に証明された有効性（図１６）と合わせると、これらの結果は、プロドラッグ設計戦略の理論的根拠と、従来の治療法に応答しない局所的及び播種性の両方の高リスク疾患に対するその治療可能性を強く支持する。
【００８６】
９．  ＭＹＣＮで増幅された多剤耐性ＮＢ細胞のプロドラッグを介する増殖阻害
化学療法抵抗性のＮＢ細胞［ＢＥ（２）Ｃ］を、ＮＥＴ標的化３成分プロドラッグ（ＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧ）で治療したときと、非標的化２成分対照（ＰＦ６８−ＳＮ３８）及び遊離ＳＮ−３８で治療したときに、応答パターンに大きな違いが観察された。ｐ５３機能の喪失を示すＢＥ（２）Ｃの化学療法抵抗性の表現型に一致して、ＢＥ（２）Ｃ細胞の増殖は遊離ＳＮ−３８によってわずかに阻害された。これはまた、ＰＦ６８−ＳＮ３８に対しては限定的かつ一時的な応答を示した。ブランクのプルロニックＦ−６８は細胞増殖に影響を与えなかった。しかし、５ｎＭ以上の用量のＳＮ−３８でＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧに１５分間曝露すると、強力で持続的な抗増殖効果が得られた（図１９）。
【００８７】
プロドラッグ設計に組み込まれたＮＥＴ親和性の特異的寄与を評価するために、ＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧのＢＥ（２）Ｃ増殖阻害活性を、特異的ＮＥＴブロッカー（ニソキセチン、１μＭ）有り／無しで試験した。対照として含まれた２成分ＰＦ６８−ＳＮ３８は、２０ｎＭ以下の用量のＳＮ−３８で最も低い増殖阻害活性を示した。３成分ＰＦ６８−ＳＮ３８−ＢＧの効果は著しく強かった（Ｐ＝０．０２０）が、ＮＥＴ遮断によって部分的に可逆的であり（図２０）、ＮＥＴ標的化の役割が確認された。
【００８８】
これらの結果と一致して、プルロニックＦ−１０８を使用して同様に合成され、４週間（週２回）にわたって投与された３成分ＮＥＴ標的化プロドラッグは、同所性ＢＥ（２）Ｃ異種移植腫瘍の急速な退縮を引き起こし、これは、難治性ＮＢのこのモデルにおけるイリノテカンのわずかな効果とは対照的であった（図２１Ａ、２０Ａ）。また、２成分ＰＦ１０８−ＳＮ３８とは異なり、３成分プロドラッグは疾患を安定させ、治療期間全体にわたって進行することはなかった。さらに、エンドポイントに急速に近づいている動物は、プロドラッグで治療されたときに顕著な腫瘍縮小を示した（「レスキュー」試験、図２１Ｂ）。
【００８９】
１０．  同所性ＮＢ異種移植片におけるＰＥＧ−［ＳＮ２２］４とＰＥＧ−［ＳＮ３８］４の比較
同所性ＮＢ異種移植片において、化学療法抵抗性ＮＢ株ＳＫＮＢＥ（２）Ｃを用いて、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４をＰＥＧ−［ＳＮ３８］４と比較した。ＢＥ（２）Ｃ細胞にルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクトして、生物発光イメージングを可能にした。マウスを週１回で４週間、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４（１０ｍｇ／ｋｇ／用量）、又はＣＰＴ−１１（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）のいずれかで治療した。この化学療法抵抗性モデルでは、ＣＰＴ−１１はほとんど効果がなかったが、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４とＰＥＧ−［ＳＮ３８］４はどちらも腫瘍の縮小に極めて効果的であった（図２２）。ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４治療では、２〜３週間で腫瘍が完全に消失したが、ＰＥＧ−［ＳＮ３８］４治療マウスでは小さな腫瘍が見られたままであった。これは、ＰＥＧ−［ＳＮ２２］４が、このヒトＮＢ異種移植マウスモデルにおいて優れた有効性を有することを示唆している。
【００９０】
本発明は、特定の実施態様を参照して例示及び説明されているが、本発明は、上記の詳細に限定されることを意図するものではない。むしろ、特許請求の範囲及びその同等物の範囲内で、本発明から逸脱することなく、詳細な様々な修正を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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