(57)【要約】同じ個体内の複数のクローン細胞集団の集団サイズを測定するための、例えば、同じ個体内でクローンとして独立した複数の腫瘍の腫瘍サイズを測定するための組成物および方法が提供されている。対象の方法は、（ａ）接触した組織内で遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を発生させるために、個体を遺伝性であり、互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させること、（ｂ）遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在する複数の細胞マーカーの少なくとも２つの量を検出および測定し、それにより測定値のセットを生じること、ならびに（ｃ）測定値のセットを使用して、（遺伝性であると標識された細胞の該識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて）存在する遺伝性であると標識された細胞の数を計算することを含む。
2022502063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ組織内の複数のクローン細胞集団の集団サイズを測定する方法であって、
（ａ）生物学的組織を、遺伝性で互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触した組織内で遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を作製することと、
（ｂ）遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在する前記複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定し、一連の測定値を生成することと、
（ｃ）前記一連の測定値を入力として使用して、遺伝性であると標識された細胞の識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された細胞の数を計算することと
を含む、方法。
【請求項２】
接触した組織内での遺伝性であると標識された細胞が、腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織は、ステップ（ａ）の前に腫瘍細胞および／または腫瘍を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）の検出および測定することが、前記組織から収集された生物学的試料に対して実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の検出および測定することが、前記接触した組織の組織試料に対して実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の細胞マーカーの各細胞マーカーは、遺伝性であると標識された細胞の系列の公知の細胞遺伝子型に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させることは、遺伝性であると標識された細胞を作製するために、前記組織の細胞を遺伝的に変化させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
同じ組織の複数の腫瘍の腫瘍サイズを測定する方法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組織を接触させるステップは、腫瘍細胞を誘導することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞マーカーは、腫瘍細胞形成および／または腫瘍形成を誘導する薬剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出および測定することが、接触させることの結果として、接触された組織内に腫瘍が形成されるために十分な時間が経過した後に実行される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の細胞マーカーは、バーコード付き核酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出および測定することは、検出された各バーコードのハイスループット配列決定、および配列読み取りの数の定量化を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の細胞マーカーは、腫瘍細胞形成を誘導するバーコード付き核酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バーコード付き核酸は、腫瘍細胞形成を誘導し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つまたは複数の癌遺伝子をコードする核酸、１つまたは複数の野生型タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数の突然変異タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、１つまたは複数の短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、および１つまたは複数のゲノム編集タンパク質をコードする核酸、のうちの１つまたは複数を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、およびメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バーコード付き核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バーコード付き核酸が、プラスミド、合成された核酸断片、およびミニサークルから選択される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バーコード付き核酸は、ＲＮＡ分子である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記バーコード付き核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織は、無脊椎動物の組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織は、脊椎動物の組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織は、哺乳動物または魚の組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織は、生きている動物の一部である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織は、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟部組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、および性器系から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が、少なくとも１回の分裂を経るためにに十分な時間が経過した後、
（ｉ）遺伝性であると標識された細胞のバイオマーカーを検出することおよび／または測定することと、
（ｉｉ）前記バイオマーカーを検出することおよび／または測定することの結果に基づいて、遺伝性であると標識された細胞を分類することと
をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞増殖状態、細胞型、発生細胞系列、細胞死、および細胞シグナル伝達状態のうちの１つまたは複数のバイオマーカーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞マーカーが、ウイルスベクターを介して組織に送達される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
同じ組織のクローンとして独立した複数の腫瘍の腫瘍サイズを測定する方法であって、
（ａ）組織を複数のバーコード付き核酸細胞マーカーと接触させて、接触した組織内で遺伝性であると標識された腫瘍細胞の複数の識別可能な系列を作製することと、
（ｂ）遺伝性であると標識された腫瘍細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、ハイスループット核酸配列決定を実行して接触した組織内に存在するバーコード付き核酸細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定し、一連の測定値を生成することと、
（ｃ）前記一連の測定値を入力として使用して、遺伝性であると標識された腫瘍細胞の識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された腫瘍細胞の数を計算することと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記組織は、ステップ（ａ）の前に腫瘍細胞および／または腫瘍を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｂ）のハイスループット核酸配列決定が、前記組織から収集された生物学的試料に対して実行される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）のハイスループット核酸配列決定が、前記接触した組織の組織試料に対して実行される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数のバーコード付き核酸細胞マーカーの各バーコード付き核酸細胞マーカーは、遺伝性であると標識された腫瘍細胞の系列の公知の細胞遺伝子型に対応している、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
接触させることは、遺伝性であると標識された腫瘍細胞を作製するために、前記組織の細胞を遺伝的に変化させることを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記バーコード付き核酸は、腫瘍細胞形成を誘導する、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記バーコード付き核酸は、腫瘍細胞形成を誘導し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つまたは複数の癌遺伝子をコードする核酸、１つまたは複数の野生型タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数の突然変異タンパク質をコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、およびゲノム編集タンパク質をコードする核酸、のうちの１つまたは複数を含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、およびメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バーコード付き核酸は、線状または環状ＤＮＡ分子である、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記バーコード付き核酸は、プラスミド、合成された核酸断片、およびミニサークルから選択される、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記バーコード付き核酸は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組織は、無脊椎動物の組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組織は、脊椎動物の組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組織は、哺乳動物または魚の組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記組織は、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類組織、またはヒト組織である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織は、生きている動物の一部である、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組織は、動物の体外で成長した操作された組織である、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織が、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟部組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、および性器系から選択される、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
遺伝性であると標識された腫瘍細胞の少なくとも一部が、少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、
（ｉ）遺伝性であると標識された腫瘍細胞のバイオマーカーを検出することおよび／または測定することと、
（ｉｉ）前記バイオマーカーの検出することおよび／または測定することの結果に基づいて、遺伝性であると標識された腫瘍細胞を分類することと
をさらに含む、請求項３２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
細胞増殖状態、細胞型、発生細胞系列、細胞死、および細胞シグナル伝達状態のうちの１つまたは複数の前記バイオマーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞マーカーが、ウイルスベクターを介して前記組織に送達される、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターから選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数のクローン細胞集団に対する処置の効果を試験する方法であって、
（ａ）標識された細胞を作製するために組織を核酸細胞マーカーと接触させることと、
（ｂ）識別可能な系列を有する遺伝性であると標識されたクローン細胞集団を作製するために前記組織内の標識された細胞を成長させることと、
（ｃ）前記組織内のクローン細胞集団を療法へ供することと、
（ｄ）前記組織内の識別可能な系列を有する遺伝性であると標識された細胞を測定することと
を含む、方法。
【請求項５６】
前記細胞マーカーが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ボカウイルスベクター、およびフォーミーウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターとともに送達される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞マーカーが、ウイルスでコードされた固有ＤＮＡ配列である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞マーカーは、発現済みリーディングフレームの３’末端に付加された固有のＲＮＡ配列を有するウイルスでコードされた発現可能な遺伝子を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞マーカーはさらに、任意選択で活性化突然変異を有する腫瘍促進遺伝子を含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記マーカーは、任意選択で腫瘍抑制因子である、目的遺伝子を標的とするｇＲＮＡをさらに含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞マーカーは、複数の腫瘍促進遺伝子を含み、かつ前記細胞マーカーは、前記腫瘍促進遺伝子を同定するバーコードを含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞マーカーは、複数の腫瘍促進遺伝子を含み、前記細胞マーカーは、ａ）前記腫瘍促進遺伝子を同定するポリヌクレオチドバーコード配列と、ｂ）前記個々の核酸および前記個々の核酸から成長するクローンを同定する、ポリヌクレオチドの固有分子識別子（ＵＭＩ）配列とを含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記組織が動物内にあり、療法が全身投与される、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記組織が動物内にあり、療法が組織特異的様式で投与される、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
療法が、小分子、放射線、化学療法、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、および生物製剤からなる群から選択される、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
測定することは、核酸を前記組織から単離することと、前記細胞マーカーを増幅することと、配列決定によって前記細胞マーカーを定量化することとを含む、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
５’から３’の
（ａ）終止コドンによって分離された２つのハイブリッドＴＡＴＡ／ＦＲＴ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと、
（ｂ）ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームと、
（ｃ）遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）と
を含む核酸であって、
前記プロモーターが、ＲＮＡ遺伝子をコードする前記オープンリーディングフレームに使用可能に連結され、前記ＵＣＯＥが、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに使用可能に連結されており、ここで、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）による組換えで、前記ＲＮＡの発現が活性化される、核酸。
【請求項６８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、３型プロモーターＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵ６  ＲＮＡプロモーターである、請求項６７に記載の核酸。
【請求項６９】
前記ハイブリッドＴＡＴＡ／ＦＲＴ配列は、配列番号８（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）である、請求項６７または６８に記載の核酸。
【請求項７０】
前記ＵＣＯＥは、ヘテロクロマチンタンパク質のメチル化非含有島に由来する、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７１】
前記ＵＣＯＥは、ＣＢＸ１のメチル化非含有島に由来する、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７２】
前記ＵＣＯＥは、配列番号９である、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７３】
さらに、前記ＲＮＡ遺伝子を同定するためのバーコードを含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７４】
前記ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７５】
さらに、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７６】
第１の目的遺伝子のノックアウトを第２の目的遺伝子の条件付きＣＲＩＳＰＲターゲティングと組み合わせて有する細胞を作製するためのシステムであって、
（ａ）（ｉ）第１のリコンビナーゼが標的とする組換え部位によって５’末端および３’末端上で隣接した目的遺伝子、ならびに（ｉｉ）リガンド誘導系の制御下にあるフリッパーゼ（Ｆｌｐ）リコンビナーゼ、を含む真核細胞と、
（ｂ）さらに前記第１のリコンビナーゼを含む、請求項６７に記載の核酸を含むウイルスベクターと、を含むシステムであり、
ＲＮＡは、第２の遺伝子に対して指向されるｇＲＮＡであり、
前記ウイルスベクターによる前記真核細胞が接触されると、前記第１の目的遺伝子が不活性化され、リガンドが投与されると、前記ｇＲＮＡの発現が、前記第２の目的遺伝子内で配列を開裂させるよう活性化される、
システム。
【請求項７７】
前記リガンド誘導性システムは、エストロゲン受容体（ＥＲ）のＦｌｐへの融合である、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
前記第１のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼである、請求項７６または７７に記載のシステム。
【請求項７９】
前記第１のリコンビナーゼはＣｒｅであり、前記組換え部位はＬｏｘＰ部位である、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８０】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ボカウイルスベクター、またはフォーミーウイルスベクターである、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８１】
前記リガンド誘導性システムは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、またはプロゲステロン誘導性プロモーターの制御下にあるＦｌｐである、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８２】
複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含む、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８３】
複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含み、前記複数の別個のｇＲＮＡ配列が、前記組織に内在する複数の遺伝子に対して指向される、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８４】
複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含む、システムであって、前記複数の別個のｇＲＮＡ配列が、組織に内在する単一の遺伝子に対して指向される、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８５】
複数のクローン細胞集団を含有する動物であって、前記複数のクローン細胞集団は、細胞マーカーと接触した組織から成長した識別可能な系列を有する遺伝性とバーコードされた細胞をさらに含む、動物。
【請求項８６】
前記複数のクローン細胞集団は、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、または５００個の細胞集団である、請求項８５に記載の動物。
【請求項８７】
前記クローン細胞集団は、複数の別個の腫瘍原性ゲノム変化を含む、請求項８５または８６に記載の動物。
【請求項８８】
前記遺伝性バーコードは、前記個々の腫瘍原性ゲノム変化を同定する固有の配列を含む、請求項８７に記載の動物。
【請求項８９】
前記遺伝性バーコードは、前記組織に接触した細胞マーカーの前記個々の分子を同定する固有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む、請求項８８に記載の動物。
【請求項９０】
前記遺伝性バーコードは、ゲノムＤＮＡ内の非転写配列である、請求項８８または８９に記載の動物。
【請求項９１】
前記遺伝性バーコードは、前記細胞マーカーと共に前記細胞に導入された発現可能な遺伝子の転写された部分内にある、請求項８８または８９に記載の動物。
【請求項９２】
前記複数の腫瘍原性ゲノム変化は、癌遺伝子内に少なくとも１つの活性化突然変異を含む、請求項８７に記載の動物。
【請求項９３】
前記活性化突然変異は、内在性癌遺伝子内にある、請求項９２に記載の動物。
【請求項９４】
前記活性化突然変異が、前記内在性癌遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡと共に導入される、請求項９３に記載の動物。
【請求項９５】
前記ｓｇＲＮＡは、前記内在性癌遺伝子のイントロンを標的とする、請求項９４に記載の動物。
【請求項９６】
前記内在性癌遺伝子はＫｒａｓであり、前記ｓｇＲＮＡはＫｒａｓのイントロン２を標的とする、請求項９５に記載の動物。
【請求項９７】
前記活性化突然変異は、癌遺伝子である導入遺伝子内にある、請求項９２に記載の動物。
【請求項９８】
前記複数のゲノム変化は、腫瘍抑制遺伝子内の少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む、請求項８７に記載の動物。
【請求項９９】
前記腫瘍抑制遺伝子内の前記遺伝子変化を不活性化することは、少なくとも、機能に必要な前記遺伝子または前記遺伝子の一部を切除することである、請求項９８に記載の動物。
【請求項１００】
前記腫瘍抑制遺伝子内の前記遺伝子変化を不活性化することは、前記遺伝子の転写を無効にする、または前記遺伝子の早期終止を結果的にもたらすフレームシフト突然変異を引き起こす、少なくとも１つのインデルである、請求項９８に記載の動物。
【請求項１０１】
前記複数のゲノム変はが、癌遺伝子内の少なくとも１つの活性化突然変異、および腫瘍抑制遺伝子内での少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む、請求項８７に記載の動物。
【請求項１０２】
前記複数の腫瘍原性ゲノム変化は、癌遺伝子内の複数の活性化突然変異、および複数の腫瘍抑制遺伝子内の少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む、請求項８７に記載の動物。
【請求項１０３】
前記癌遺伝はが、少なくともＨｒａｓ、Ｋｒａｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ、Ｒａｆ、またはｍｙｃである、請求項９２〜９４、１０１、または１０２のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１０４】
前記導入された突然変異の活性化が、前記癌遺伝子の少なくとも３、５、８、もしくは１０個のコドンのウォッブル塩基内へと導入されたバーコードを介して、または前記癌遺伝子のイントロン内へと導入されたバーコードを介して同定される、請求項９３に記載の動物。
【請求項１０５】
前記腫瘍抑制遺伝子は、ｐ５３、Ｌｋｂ１、Ｓｅｔｄ２、Ｒｂ１、Ｐｔｅｎ、Ｎｆ１、Ｎｆ２、Ｔｓｃ１、Ｒｎｆ４３、Ｐｔｐｒｄ、Ｆｂｘｗ７、Ｆａｔ１、Ｌｒｐ１ｂ、Ｒａｓａ１、Ｌａｔｓ１、Ａｒｈｇａｐ３５、Ｎｃｏａ６、Ｎｃｏｒ１、Ｓｍａｄ４、Ｋｅａｐ、Ｕｂｒ５、Ｍｇａ、Ｃｌｃ、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｇａｔａ３、Ｒｂｍ１０、Ｃｍｔｒ２、Ａｒｉｄ１ａ、Ａｒｉｄ１ｂ、Ａｒｉｄ２、Ｓｍａｒｃａ４、Ｄｎｍｔ３、Ｔｅｔ２、Ｋｄｍ６ａ、Ｋｍｔ２ｃ、Ｋｍｔ２ｄ、Ｄｏｔ１ｌ、Ｅｐ３００、Ａｔｒｘ、Ｂｒｃａ２、Ｂａｐ１、Ｅｒｃｃ４、Ｐｏｌｅ、Ａｔｍ、Ｗｍ、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｄｋｎ２ｃ、またはＳｔａｇ２である、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１０６】
前記細胞のゲノムは、前記腫瘍抑制遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをさらに含む、請求項９８、１００、１０１、または１０２のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１０７】
前記細胞のゲノムは、（ａ）前記ガイドＲＮＡを同定するバーコード配列と、（ｂ）前記細胞マーカー分子を同定する固有分子識別子（ＵＭＩ）配列とをさらに含む、請求項１０６に記載の動物。
【請求項１０８】
前記細胞のゲノムは、前記腫瘍抑制遺伝子またはその重要な断片に隣接するリコンビナーゼ部位を含み、前記腫瘍原性変化は、少なくとも前記腫瘍抑制遺伝子またはその重要な断片のリコンビナーゼ介在性切除である、請求項９８、９９、または１０１のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１０９】
前記細胞は、前記導入遺伝子の転写を防止する前記癌遺伝子ＯＲＦの５’にあるリコンビナーゼ部位に隣接する終止コドンを含有する活性化突然変異を有する癌遺伝子導入遺伝子を含み、前記腫瘍原性変化は、少なくとも前記リコンビナーゼによる前記終止コドンの切除であり、その結果、前記導入遺伝子の発現を活性化する、請求項９０または９３に記載の動物。
【請求項１１０】
前記リコンビナーゼ部位は、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼのリコンビナーゼ部位である、請求項１０８または１０９に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ゲノム配列決定では、ゲノム全体のレベルでヒトの癌の体細胞変化のカタログを作成し、多くの潜在的に重要な遺伝子（例えば、推定上の腫瘍サプレッサー遺伝子、推定上の癌遺伝子、処置抵抗性または処置感受性につながる可能性がある遺伝子）を同定してきた。しかしながら、ゲノム変化の識別は、癌における該ゲノム変化の機能の重要性を必ずしも示すものではなく、遺伝子の不活性化または変化の影響は、単独で、または他の遺伝子変化（体細胞または生殖細胞系列のいずれか）もしくは微小環境の違いと組み合わせて、癌ゲノム配列決定データのみから収集することは依然として困難である。
【発明の概要】
【０００２】
腫瘍の成長に対する遺伝子変化の分子レベルおよび細胞レベルの影響は、細胞株および遺伝的に操作されたマウスモデル系においてノックダウン、ノックアウト、および過剰発現の研究を使用して直接調査されてきた。過去数十年にわたって、培養中の癌細胞株における遺伝子機能の分析は、癌の多くの局面への見識を提供してきた。
【０００３】
しかしながら、培養中の癌細胞株のほぼ最適な成長、広範な既存の遺伝的および後成的変化、ならびに自生の微小環境の欠如は、これらのシステムが、異なる遺伝子がインビボで表現型をどのように制約または推進するかについての見識を提供するという能力を制限している（例：癌の成長、転移、療法応答）。対照的に、ヒトの癌の遺伝的に操作されたマウスモデルは、正常な成熟細胞への規定した遺伝子変化の導入を促進し、その結果、該変化の自然なインビボでの設定内で腫瘍の発症および成長をもたらす。多くの経路がインビボでの腫瘍の微小環境の特性に影響されるので、このことは特に重要である。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく遺伝子ターゲティングなどのインビボでの系は、インビトロでのおよびインビボでの機能的分析の規模を拡大させてきたが、インビボでの系は、腫瘍の成長の比較的粗い測定に依存し続けてきたので、最も劇的な効果を有する遺伝子の分析に該系を応用することを制限してきた。インビボで遺伝子機能を分析するための厳密に定量化する系の欠如は、腫瘍の成長を推進もしくは制約する経路、または発癌の他の重要な局面のいずれかに影響を与える経路（例えば、腫瘍抑制経路）の幅広い理解を妨げてきた。
【０００５】
複数のクローン細胞集団（例えば、複数の識別可能な細胞系列であって、別個の、識別可能な腫瘍、または腫瘍内の別個の識別可能な部分クローンのいずれかである）を有する個体におけるクローン集団サイズ（例えば、各腫瘍サイズ、各腫瘍または部分クローンにおける腫瘍細胞の数など）の正確な定量を容易にする組成物および方法が必要である。本開示の組成物および方法は、この必要性に対処し、異なる個々の遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子、癌遺伝子）または遺伝子変化（例えば、挿入、欠失、点突然変異）、あるいは遺伝子および／または遺伝子変化の組み合わせであるか否かを明らかにする能力を提供し、細胞集団の成長（例えば、腫瘍の成長）、および重要な他の表現型（例えば、腫瘍の進化、進行、転移傾向）に異なる全体的な影響を及ぼす。本開示の組成物および方法はまた、試料間の変動性（例えば、動物間の変動性）によって導入されるエラーを劇的に低減させる、同じ組織内で（例えば、同じ個体内で）複数の異なるクローン細胞集団（例えば、類似の遺伝子型からなるが開始事象が異なる複数の腫瘍、異なる遺伝子型を有する複数の腫瘍など）の成長に及ぼす可能性がある治療薬、例えば、放射線、化学療法、絶食、薬物、生物製剤などの化合物の作用を試験する能力も提供している。これらの方法はまた、合理的な薬物の組み合わせの開発および試験を容易にする。
【０００６】
同じ組織内（例えば、同じ個体内）または異なる組織内の複数のクローン細胞集団について集団サイズを測定するための組成物および方法が提供されている。一例として、いくつかの場合において、対象の方法は、同じ組織内の（例えば、同じ個体内の）、クローンとして独立した複数の腫瘍細胞集団（例えば、異なる腫瘍）についての腫瘍サイズを測定する方法である。
【０００７】
実例となる例として、作用例において後で説明するように、本発明者らは、細胞バーコード付与（例えば、腫瘍バーコード付与）およびハイスループット配列決定（作用例では「Ｔｕｂａ−ｓｅｑ」と称する）を、ヒト癌に関して遺伝的に操作されたマウスモデルと組み合わせて、前例がない解像度で腫瘍の成長を定量した。個々の腫瘍サイズを正確に定量化することで、異なる腫瘍抑制遺伝子（例えば、公知の腫瘍抑制遺伝子）を不活性化することの影響を明らかにすることができた。さらに、本発明者らは、これらの方法を、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集と統合し、このことによって、推定腫瘍抑制遺伝子のパネルの並行した不活性化および機能的な定量が可能となり、この方法は、機能的肺腫瘍抑制因子の同定につながった。この方法は、インビボでの癌の成長に対する遺伝的変化の影響を研究するための、迅速で多重化した非常に定量的なプラットフォームである。
【０００８】
また、後の作用例に説明するように、本発明者らは、バーコード付き相同性指向型修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートを用いた多重体細胞ＨＤＲを使用して、個々のマウス内での、遺伝子が多様であるバーコード付き腫瘍（例えば、規定した遺伝子において遺伝子が多様である点突然変異を有する腫瘍）を生じ、定量的に腫瘍分析（ハイスループット配列決定を使用）を採用して、複数の正確な突然変異（例えば、規定した点突然変異）の機能を同じ動物内で同時に迅速かつ定量的に調査した。
【０００９】
いくつかの実施形態では、対象の方法は、組織（例えば、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器系および性器系、例えば、精巣、生殖組織など）を、遺伝性でありかつ互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触した組織内での遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を生じるステップを含む。いくつかの実施形態において、組織を接触させるために使用される細胞マーカーは、バーコード付き核酸（例えば、ＲＮＡ分子、またはプラスミド、天然もしくは合成の一本鎖もしくは二本鎖核酸フラグメント、およびミニサークルなどの環状もしくは線状ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では（例えば、細胞マーカーがバーコード付き核酸である場合）、細胞マーカーは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクター）を介して組織に送達されることができる。いくつかの場合では、接触する組織にはすでに、細胞マーカーと接触させることに先立って、腫瘍細胞が含まれている。いくつかの場合では、細胞マーカーは、腫瘍細胞形成および／または腫瘍形成を誘導することができる。いくつかの場合では、細胞マーカーに連結された成分は、腫瘍細胞形成および／または腫瘍形成を誘導することができる。いくつかの場合では、細胞マーカーは、腫瘍細胞形成および／または腫瘍形成を誘導することができるバーコード付き核酸である（例えば、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、ゲノム編集タンパク質（複数可）をコードする核酸、癌遺伝子をコードする核酸、タンパク質（複数可）、例えば、野生型タンパク質（複数可）および／もしくは突然変異タンパク質（複数可）をコードする核酸［例えば、成長／増殖以外の何らかの方法で、例えば腫瘍に有害であるタンパク質をコードする野生型および／または突然変異ｃＤＮＡ］、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ；短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、他のゲノム編集システムのためのターゲティング成分をコードする核酸など）。
【００１０】
対象の方法はまた、（遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後）、接触した組織内に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定し、それにより、例えば、標識された細胞と遺伝可能に関係する、接触した組織内に残っている細胞マーカーの同一性および量を表す一連の測定値を生成するステップも含むことができる。いくつかの場合では（例えば、細胞マーカーがバーコード付き核酸であるとき）、検出することおよび測定することは、ハイスループット配列決定および検出された各バーコードについての配列読み取り数の定量化を含む方法を介して実行することができる。
【００１１】
いくつかの場合では、生成された測定値のセットは、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された細胞の数（例えば、検出された識別可能な遺伝性であると標識された細胞の系列の少なくとも２、少なくとも３，少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００について）を（例えば、いくつかの場合では、遺伝性であると標識された細胞の検出された識別可能な系列の１０〜１，０００，０００、１０〜１００，０００、１０〜１０，０００、または１０〜１，０００の範囲で）（例えば、コンピュータを使用して）計算するための入力として使用される。遺伝性であると標識された細胞の計算された数は、絶対数（例えば、存在すると決定された細胞の実際の数）または相対数であることができる（例えば、遺伝性であると標識された細胞の第１の系列についての集団サイズは、いずれかの系列中に存在する細胞の実際の数を必ずしも決定することなく、遺伝性であると標識された細胞の第２の系列について集団サイズに対して決定することができる）。
【００１２】
いくつかの実施形態では、対象の方法は、試験化合物（例えば、薬物）を組織に（例えば、個体への投与を介して、類器官などの合成エクスビボ組織に接触させることを介してなど）、例えば、細胞マーカーを導入した後に、例えば、組織を複数の細胞マーカーと接触させることを介して腫瘍細胞（または部分クローン）を誘導するステップの後に、投与するステップを含む。いくつかのこのような場合では、試験化合物を投与するステップの後に、複数の標識された細胞系列／細胞集団についての集団サイズ（例えば、腫瘍サイズ、各腫瘍内での腫瘍細胞の数）を測定するステップが続く。同じ組織内のでの（例えば同じ動物内で）明確かつ識別可能な標識された細胞系列について複数の細胞集団を測定することができる（例えば、複数の腫瘍サイズを測定することができる）ので、薬物応答の試料間のばらつき（例えば、動物間のばらつき）によるエラーのリスクは、大幅に低減させることができる。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示は、（ａ）組織を核酸細胞マーカーと接触させて、標識された細胞を作製すること、（ｂ）標識された細胞を組織内で成長させて、識別可能な系列を有する遺伝可能に標識したクローン細胞集団を作製すること、（ｃ）組織内のクローン細胞集団を療法に供すること、および（ｄ）識別可能な系列を有する遺伝性であると標識された細胞を組織内で測定することを含む、複数のクローン細胞集団に及ぼす処置の効果を試験する方法を準備する。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ボカウイルスベクター、およびフォーミーウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターとともに送達される。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、ウイルスでコードされた固有のＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、ウイルスでコードされた発現可能な遺伝子の発現済みリーディングフレームの３’末端に付加された固有のＲＮＡ配列を有する該遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞マーカーはさらに、活性化突然変異を場合により有する腫瘍促進遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞マーカーはさらに、目的遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、該遺伝子は、場合により腫瘍抑制因子である。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、複数の腫瘍促進遺伝子を含み、細胞マーカーは、腫瘍促進遺伝子を同定するバーコードを含む。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、複数の腫瘍促進遺伝子を含み、この中で、細胞マーカーは、ａ）腫瘍促進遺伝子を同定するポリヌクレオチドバーコード配列と、ｂ）個々の核酸および個々の核酸から成長するクローンを同定する、ポリヌクレオチドの固有分子識別子（ＵＭＩ）配列とを含む。いくつかの実施形態では、組織は動物内にあり、療法は全身投与される。いくつかの実施形態では、組織は動物内にあり、療法は組織特異的様式で投与される。いくつかの実施形態では、療法は、小分子、放射線、化学療法、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、および生物製剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、測定することは、核酸を組織から単離することと、細胞マーカーを増幅することと、配列決定によって細胞マーカーを定量化することとを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、５’→３’で、（ａ）終止コドンによって分離された２つのハイブリッドＴＡＴＡ／ＦＲＴ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、（ｂ）ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム、および（ｃ）遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）を含む核酸を準備し、この中で、プロモーターは、ＲＮＡ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームに使用可能に連結され、ＵＣＯＥは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに使用可能に連結されており、ここで、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）による組換えで、ＲＮＡの発現が活性化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、３型プロモーターＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵ６  ＲＮＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドＴＡＴＡ／ＦＲＴ配列は、配列番号８（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）である。いくつかの実施形態では、ＵＣＯＥは、ヘテロクロマチンタンパク質のメチル化非含有島に由来する。いくつかの実施形態では、ＵＣＯＥは、ＣＢＸ１のメチル化非含有島に由来する。いくつかの実施形態では、ＵＣＯＥは、配列番号９である。いくつかの実施形態では、核酸はさらに、ＲＮＡ遺伝子を同定するためのバーコードを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸はさらに、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を含む。
【００１５】
いくつかの態様では、本開示は、第１の目的遺伝子のノックアウトを第２の目的遺伝子の条件付きＣＲＩＳＰＲターゲティングと組み合わせて有する細胞を作製するためのシステムであって、（ａ）（ｉ）第１のリコンビナーゼが標的とする組換え部位によって５’末端および３’末端上で隣接した目的遺伝子ならびに（ｉｉ）リガンド誘導系の制御下にあるフリッパーゼ（Ｆｌｐ）リコンビナーゼ、を含む真核細胞と、（ｂ）さらに第１のリコンビナーゼを含む、請求項６７に記載の核酸を含むウイルスベクターとを含むシステムを準備しており、ＲＮＡは、第２の遺伝子を指向するｇＲＮＡであり、ウイルスベクターによる真核細胞が接触されると、第１の目的遺伝子は不活性化され、リガンドが投与されると、ｇＲＮＡの発現は、第２の目的遺伝子内で配列を開裂させるよう活性化される。いくつかの実施形態では、リガンド誘導性システムは、エストロゲン受容体（ＥＲ）のＦｌｐへの融合である。いくつかの実施形態では、第１のリコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、第１のリコンビナーゼはＣｒｅであり、組換え部位はＬｏｘＰ部位である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ボカウイルスベクター、またはフォーミーウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、リガンド誘導性システムは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、またはプロゲステロン誘導性プロモーターの制御下にあるＦｌｐである。いくつかの実施形態では、システムは、複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含み、複数の別個のｇＲＮＡ配列は、組織に内在する複数の遺伝子を指向する。いくつかの実施形態では、システムは、複数の別個のｇＲＮＡ配列を有する複数のウイルスベクターを含み、複数の別個のｇＲＮＡ配列は、組織に内在する単一の遺伝子を指向する。
【００１６】
いくつかの態様では、本開示は、複数のクローン細胞集団を含有する動物を準備し、複数のクローン細胞集団はさらに、細胞マーカーと接触した組織から成長した識別可能な系列を有する遺伝性とバーコードを付与された細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数のクローン細胞集団は、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、または５００個の細胞集団である。いくつかの実施形態では、クローン細胞集団は、複数の別個の腫瘍原性ゲノム変化を含む。いくつかの実施形態では、遺伝性バーコードは、個々の腫瘍原性ゲノム変化を同定する固有の配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝性バーコードは、組織に接触した細胞マーカーの個々の分子を同定する固有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝性バーコードは、ゲノムＤＮＡ内の非転写配列である。いくつかの実施形態では、遺伝性バーコードは、細胞マーカーと共に細胞に導入された発現可能な遺伝子の転写された部分内にある。いくつかの実施形態では、複数の腫瘍原性ゲノム変化は、癌遺伝子内に少なくとも１つの活性化突然変異を含む。いくつかの実施形態では、活性化突然変異は、内在性癌遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、活性化突然変異は、内在性癌遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡと共に導入される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、内在性癌遺伝子のイントロンを標的とする。いくつかの実施形態では、内在性癌遺伝子はＫｒａｓであり、ｓｇＲＮＡはＫｒａｓのイントロン２を標的とする。いくつかの実施形態では、活性化突然変異は、癌遺伝子である導入遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、複数のゲノム変化は、腫瘍抑制遺伝子内に少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子内の遺伝子変化を不活性化することは、少なくとも、機能に必要な遺伝子または遺伝子の一部の切除である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子内の遺伝子変化を不活性化することは、遺伝子の転写を無効にするか、または遺伝子の早期終止を結果的にもたらすフレームシフト突然変異を引き起こす、少なくとも１つのインデルである。いくつかの実施形態では、複数のゲノム変化は、癌遺伝子内の少なくとも１つの活性化突然変異、および腫瘍抑制遺伝子内の少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、複数の腫瘍原性ゲノム変化は、癌遺伝子内の複数の活性化突然変異、および複数の腫瘍抑制遺伝子内の少なくとも１つの遺伝子変化を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、少なくともＨｒａｓ、Ｋｒａｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ、Ｒａｆ、またはｍｙｃである。いくつかの実施形態では、導入された突然変異の活性化は、癌遺伝子の少なくとも３、５、８、もしくは１０個のコドンのウォッブル塩基内へと導入されたバーコードを介して、または癌遺伝子のイントロン内へと導入されたバーコードを介して同定される。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、ｐ５３、Ｌｋｂ１、Ｓｅｔｄ２、Ｒｂ１、Ｐｔｅｎ、Ｎｆ１、Ｎｆ２、Ｔｓｃ１、Ｒｎｆ４３、Ｐｔｐｒｄ、Ｆｂｘｗ７、Ｆａｔ１、Ｌｒｐ１ｂ、Ｒａｓａ１、Ｌａｔｓ１、Ａｒｈｇａｐ３５、Ｎｃｏａ６、Ｎｃｏｒ１、Ｓｍａｄ４、Ｋｅａｐ、Ｕｂｒ５、Ｍｇａ、Ｃｌｃ、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｇａｔａ３、Ｒｂｍ１０、Ｃｍｔｒ２、Ａｒｉｄ１ａ、Ａｒｉｄ１ｂ、Ａｒｉｄ２、Ｓｍａｒｃａ４、Ｄｎｍｔ３、Ｔｅｔ２、Ｋｄｍ６ａ、Ｋｍｔ２ｃ、Ｋｍｔ２ｄ、Ｄｏｔ１ｌ、Ｅｐ３００、Ａｔｒｘ、Ｂｒｃａ２、Ｂａｐ１、Ｅｒｃｃ４、Ｐｏｌｅ、Ａｔｍ、Ｗｍ、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｄｋｎ２ｃ、またはＳｔａｇ２である。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムはさらに、腫瘍抑制遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムはさらに、（ａ）ガイドＲＮＡを識別するバーコード配列と、（ｂ）細胞マーカー分子を識別する固有分子識別子（ＵＭＩ）配列とを含む。いくつかの実施形態では、細胞のゲノムは、腫瘍抑制遺伝子またはその重要な断片に隣接するリコンビナーゼ部位を含み、腫瘍原性変化は、少なくとも腫瘍抑制遺伝子またはその重要な断片のリコンビナーゼ介在性切除である。いくつかの実施形態では、細胞は、導入遺伝子の転写を防止する癌遺伝子のＯＲＦの５’にあるリコンビナーゼ部位に隣接する終止コドンを含有する活性化突然変異を有する癌遺伝子導入遺伝子を含み、腫瘍原性変化は、少なくともリコンビナーゼによる終止コドンの切除であり、その結果、導入遺伝子の発現を活性化する。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ部位は、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼについてのリコンビナーゼ部位である。
【００１７】
本明細書で言及するすべての公表物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の公表物、特許、または特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に援用される。
【００１８】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に明らかにされている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を明らかにする後続の発明を実施するための形態を参照することによって得られる。本発明は、添付の図面と併せて読むと、後続の発明を実施するための形態から最良に理解される。一般的な慣例により、図面の種々の特徴は縮尺通りではないことを強調する。それどころか、種々の特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には次の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍のバーコード付けをハイスループット配列決定と組み合わせて、腫瘍サイズの並行した定量を可能にする。（Ａ）肺腫瘍サイズの分布を評価するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインの概略図を示す。ランダムな１５ヌクレオチドＤＮＡバーコード（ＢＣ）を含有するウイルスであるＬｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅを用いて、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＬＴ）、およびＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰＴ）マウスにおいて腫瘍を発症させた。腫瘍サイズを、腫瘍を担持する肺からのＤＮＡのバルクのバーコード配列決定を介して計算した。
【図１−２】（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ発症性腫瘍に罹患しているＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴマウスからの肺葉の蛍光解剖顕微鏡画像を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅの力価が示されている。全体的な腫瘍成長の違いにもかかわらず、ほぼ等しい総腫瘍量を得るために、異なる遺伝的背景で異なる力価を使用した。上のパネルのスケールバー＝５ｍｍ、下のパネルのスケールバー＝１ｍｍである。（Ｃ）ＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴマウスの腫瘍サイズの分布（１群あたりのマウスの個体数が示されている）を示す。各点は腫瘍を表している。各点の面積は、各腫瘍の癌細胞の数に比例する。直径１ｍｍの球形腫瘍における癌細胞のおおよその数に相当する点が、参照のためにデータの右側に示されている。
【図２−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍サイズを定量化するための堅牢かつ再現性がある方法である。（Ａ）アンプリコンデータのディープ配列決定用に設計されたノイズ除去アルゴリズムであるＤＡＤＡ２は、偽の腫瘍として現れる可能性がある頻発性読み取りエラーを排除する。既知のバーコードを有する細胞株を各マウスの各肺試料に添加した（各々５×１０５個の細胞）。これらの既知のバーコードに由来する頻発性読み取りエラーは、約５，０００個の細胞に偽の腫瘍として表示される。ＤＡＤＡ２は、これらの頻発性読み取り（配列決定）エラーを識別して大幅に低減させる。（Ｂ），（Ｃ）個別のバルクの肺試料から調製した技術的反復採取物の配列決定ライブラリーは、個別の病変の大きさ（Ｂ）と大きさ特性（Ｃ）との高い一致を実証している（第５０〜９９．９百分位数の腫瘍を示す）。
【図２−２】（Ｄ）本発明者らの分析パイプラインは、読み取り深度と、ＤＮＡバーコードのＧＣ含有量と、バーコードライブラリーの多様性とにおける変動に対して堅牢である。腫瘍を、各技術パラメータ、すなわち、配列決定深度、腫瘍バーコードのＧＣ含有量、および固有バーコードの概算数の高、中、および低レベルに相当する３分の１ずつへと分割した（方法を参照されたい）。１．５ＩＱＲを上限とするウィスカー。（Ｅ）５匹のＫＬＴマウス間の大きさの分布の再現性を示す。腫瘍サイズがマウス間でわずかに異なっているにもかかわらず、マウスは全体的に類似の大きさ特性を有している。個々のマウスにおける示された百分位数での腫瘍サイズが線によって結ばれている。
【図２−３】（Ｆ）同じマウス内での腫瘍を比較すると、大きさ特性の再現性が向上しており、このことは、腫瘍サイズにおけるマウス間の有意な変動性を示唆している。各マウスにおける腫瘍を２つの群へと分け、これらの群の特性を比較した。個々のマウスにおける示された百分位数での腫瘍サイズが線によって結ばれている。（Ｇ）規定した百分位数での腫瘍サイズ間の最小二乗距離の合計に基づくＫＴ、ＫＰＴ、およびＫＬＴマウスの教師なし階層性クラスター形成（Ｗａｒｄの分散最小化アルゴリズムによってクラスター形成）を示す。遺伝子型ごとのマウスクラスターは、Ｔｕｂａ−ｓｅｑが各遺伝子型の大きさの範囲における再現性がある差異を識別することを示唆している。
【図３−１】腫瘍サイズの超並列定量により、複数の遺伝子型にまたがる確率分布のあてはめが可能になる。（Ａ），（Ｂ）ＫＬＴ（ｎ＝５）マウス（Ａ）およびＫＰＴ（ｎ＝３）マウス（Ｂ）における示された百分位数での腫瘍サイズ対ＫＴマウス（ｎ＝７）における示された百分位数での腫瘍サイズを示す。各百分位数は、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅによる腫瘍発症の１１週間後の、各遺伝子型のマウス全個体からの腫瘍全部を使用して計算した。（Ｃ）同じ百分位数でのＫＴ腫瘍と比較した、各遺伝子型について示された百分位数での腫瘍サイズを示す。誤差棒は、ブートストラップ法によって得られた９５％信頼区間である。相応のＫＴ百分位数とは有意に異なっている百分位数をカラーで示している。
【図３−２】（Ｄ）正規分布の成長速度で指数関数的な腫瘍成長が予想されるように、腫瘍サイズの分布は対数正規分布に最も密接にあてはまった。ＫＬＴマウスにおける腫瘍は、大きさの範囲全体のいたるところで対数正規分布によって最もよく説明される（中央）。ＫＴマウス（左）およびＫＰＴマウス（右）における腫瘍サイズの分布を、より小さな規模での対数正規分布を、より大きな規模でのべき乗則分布と組み合わせることによって、よりよく説明した。これらの違いは、個々の遺伝子（または遺伝子の組み合わせ）がどのように腫瘍成長の増大につながっているかを考える上で基本的に重要である。べき乗則の関連性は両対数軸で直線的に低下し、ＫＴマウスにおける腫瘍の上位約１％内およびＫＰＴマウスにおける腫瘍の上位約１０％内にある、まれではあるが非常に大きな腫瘍と一致している。注：ＫＰＴマウスにおける腫瘍のみが１１週間後に１００万個の細胞をいつでも超えており、このことは、本研究における最大の腫瘍を発生させることができるｐ５３と一致している。
【図４−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑおよび多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性遺伝子不活性化を用いた腫瘍抑制表現型の迅速な定量を表す。（Ａ）各ｓｇＲＮＡに連結された８ヌクレオチドの「ｓｇＩＤ」配列とランダムな１５ヌクレオチドのランダムなバーコード（ＢＣ）とを有する２成分バーコードを含有するＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅベクターの概略図を示す。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、不活性ｓｇＲＮＡを有す、４つのベクターと、公知のかつ候補の腫瘍抑制遺伝子を標的とする１１のベクターとを含有している。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤおよびランダムなバーコードを含有している。ＮＴ＝非ターゲティングである。（Ｃ）肺腫瘍成長に及ぼす、標的とされる各遺伝子の機能をインビボで評価するための、Ｔｕｂａ−ｓｅｑと連結された多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性腫瘍抑制因子不活性化の概略図を示す。腫瘍は、ＫＴマウスおよびＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいてＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスで発症した。
【図４−２】（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅによる腫瘍の発症の１２週間後のＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の明視野（上）および蛍光（下）解剖顕微鏡画像を示す。肺葉は、蛍光画像において白色の破線で輪郭が描かれている。ウイルス力価が示されている。スケールバー＝５ｍｍである。（Ｅ）組織学的方法は、ＫＴマウスが過形成および小さな腫瘍に罹患していることに対し、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスははるかに大きな腫瘍に罹患していることを確認している。ウイルス力価が示されている。上のスケールバー＝３ｍｍ、下のスケールバー＝５００μｍである。
【図５−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、前例のない解像度で公知および新規の腫瘍抑制因子を明らかにする。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅによる腫瘍の発症の１２週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける相対的な腫瘍サイズの分析により、６つの腫瘍成長抑制遺伝子が同定された。示された百分位数での腫瘍の相対的な大きさは、ｓｇ不活性腫瘍サイズの平均に対して正規化された８匹のマウスからの併合したデータを表している。９５％信頼区間が示されている。ｓｇ不活性よりも有意に大きな百分位数は、カラーで示している。（Ｂ）腫瘍サイズの対数正規分布を仮定した腫瘍サイズの平均の推定値は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を有意に高めるｓｇＲＮＡを識別した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正され、ブートストラップされたｐ値を示している。ｐ値＜０．０５および該ｐ値の相当する平均は、太字である。（Ｃ）腫瘍の発症の１２週間後のＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウス、ならびに腫瘍の発症の１５週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける各ｓｇＲＮＡを有する腫瘍についての第９５百分位数の腫瘍の相対的な大きさ（左）、対数正規（ＬＮ）平均（中央）、および対数正規（ＬＮ）ｐ値（右）を表す。
【図５−２】（Ｄ）ＫＴマウスに対するＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける全体的なｓｇＩＤの画像における倍数変化（ΔｓｇＩＤ表示）により、標的とされる腫瘍抑制因子の不活性化による腫瘍の成長の増大と一致して、表示において増加するいくつかのｓｇＲＮＡが同定された。ΔｓｇＩＤ表示は、ｓｇ不活性についてのΔｓｇＩＤ表示＝１となるように正規化された、ＫＴ；Ｃａｓ９マウス対ＫＴマウスにおける各ｓｇＩＤによる読み取りの倍率変化（％）である。平均および９５％信頼区間が示されている。（Ｅ），（Ｆ）ｓｇＲＮＡ表示のみを組み込むことと比較して、バーコード配列決定由来の個々の腫瘍サイズを組み込むことにより、腫瘍抑制効果を検出する能力が大幅に改善される。現行のすべてのアプローチは、Ｔｕｂａ−ｓｅｑよりもはるかに劣るｓｇＲＮＡ表示に依存している。第９５百分位数の腫瘍の相対的な大きさ、およびＴｕｂａ−ｓｅｑによって決定された対数正規統計的有意性により、ΔｓｇＩＤ表示における平均の倍数変化よりも多数の、腫瘍抑制因子としての遺伝子および該遺伝子の関係するｐ値を同定した（（Ｅ）および（Ｆ））。（Ｅ）における誤差棒は、９５％信頼区間である。（Ｆ）における点線は、０．０５有意性の限界値を示す。点の色は、図４（Ｂ）におけるｓｇＲＮＡの色に相当する。
【図６−１】独立した方法により、Ｓｅｔｄ２が肺腫瘍成長の強力な抑制因子として同定される。（Ａ）標的とされる遺伝子座にインデルを含有する読み取りの百分率を、３つの独立したネオマイシン遺伝子座においてインデルを含有する読み取りの平均の百分率に対して正規化した。この値は、３匹の個々のマウスについての各ｓｇＲＮＡについての第９５百分位数の腫瘍サイズに対してプロットされている。本発明者らは、オンターゲットｓｇＲＮＡ切断についての選択と一致した、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、およびＲｂ１における高頻度のインデルを示している。各点は、１匹のマウスからのｓｇＲＮＡを表す。ｓｇＮｅｏ点は黒色であり、他の点はすべて、図４（Ｂ）によって色付けされている。（Ｂ）腫瘍の発症の９週間後に分析した、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅ、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウス由来の肺葉の蛍光解剖顕微鏡画像ならびにヘマトキシリンおよびエオシン。肺葉は、蛍光解剖顕微鏡画像において白色の破線で輪郭が描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍ、下のスケールバー＝２ｍｍである。
【図６−２】（Ｃ）組織学的方法による腫瘍面積百分率の定量は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴマウスと比較して、同じウイルスに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍量の有意な増加を示す。各点はマウスを表し、棒は平均である。＊ｐ値＜０．０５。ＮＳ＝有意ではない。（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅで発症した腫瘍対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症した腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝４匹のマウス／群）からの示された百分位数での腫瘍サイズ。百分位数は、各群におけるすべてのマウスからのすべての腫瘍を使用して計算した
【図７】ヒト肺腺癌におけるゲノム変化の頻度ならびに腫瘍の発症およびバーコード付与の説明を表す。（Ａ）各腫瘍抑制遺伝子において不活性化の可能性がある変化（フレームシフトもしくは非同義的突然変異、またはゲノム喪失）を伴う腫瘍の百分率が、すべての腫瘍（Ａｌｌ）および腫瘍原性ＫＲＡＳ突然変異（ＫＲＡＳｍｕｔ）を伴って示されている。各データセットにおけるＫＲＡＳでの腫瘍原性突然変異を有する腫瘍の数および百分率が示されている。（Ｂ）バーコード付きレンチウイルス−Ｃｒｅベクターの吸入によって、遺伝的に操作されたマウスモデルにおいて肺腫瘍が発症する。重要なことに、レンチウイルスベクターは、導入された細胞のゲノム内へと安定して組み込まれる。固有バーコード付きの各細胞の相対的な増殖は、ハイスループット配列決定に基づく方法によって決定することができる。（Ｃ）１．７×１０４のＬｅｎｔｉ−Ｃｒｅウイルスに感染した（これを導入した）ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）マウス由来の肺組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。これらのマウスは、腫瘍細胞のわずかな増殖を展開し、かつ大きな腺腫を発症する。スケールバー＝５０μｍである。
【図８−１】インビボで腫瘍サイズを定量化するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプライを表す。（Ａ）組み込んだレンチウイルスベクターのＤＮＡバーコード領域のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定によって、病変の大きさを正確に測定することができる。まず、Ｐｈｒｅｄ品質スコアが低いかまたは予期せぬ配列を有する読み取りを廃棄した。次に、読み取りを、固有バーコードを用いて複数の群へと積み上げた。頻発性のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定エラーを、ＤＡＤＡ２という、完全な読み取り長のディープ配列決定アンプリコンを識別するために初めて設計されたＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定エラーのモデルを用いて、小さな病変から示した。増幅された大きな腫瘍のバーコード領域からの頻発性配列決定エラーと見なされる小さなバーコード積み上げを、このクラスター形成アルゴリズムによってこれらのより大きな積み上げと組み合わせた。読み取りの積み上げを、ベンチマーク対照を使用して絶対細胞数へと変換した。最後に、パイプラインの再現性を最大限にするために、配列決定情報および絶対細胞数の両方を使用して、病変を呼び出すための最小カットオフを確立した。（Ｂ），（Ｃ）固有の読み取り積み上げは、固有の病変に相応していないことがあるが、むしろ、非常に大きな腫瘍（例えば、はるかに大きな腫瘍）からのバーコードの頻発性配列決定エラーから発生する。ＤＡＤＡ２を使用して、小さな読み取り積み上げを、十分な大きさおよび配列類似性の、より大きな病変と併合した。アルゴリズムは、本発明者らのディープ配列決定領域の非変性領域（すなわち、バーコードに隣接するレンチウイルスベクターの領域）から配列決定エラー率を計算する（Ｂ）。あらゆる塩基転位および塩基転換（Ａ→Ｃを示す）の尤度をあらゆるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｐｈｒｅｄスコアについて計算して、各試行に特異的なエラーモデルを生成した（Ｃ）。明らかになったＰｈｒｅｄエラー率（赤色）は概して、観察値（黒色）よりも低い（正則化法にはＬＯＥＳＳ回帰が使用される）。次に、これらのエラーモデル（各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機でトレーニング済み）を使用して、より小さな読み取り積み上げを配列類似性が高いより大きな積み上げへと束ねるものとする（より小さな積み上げが頻発性読み取りエラーであることを示唆）か、それとも個別の病変として残すかを決定した。
【図８−２】（Ｄ）〜（Ｆ）本発明者らは３つの異なるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機で本発明者らの第１の実験の試料（図１のＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴ）を配列決定して、ＤＡＤＡ２を評価しおよびパラメータにした。正常な病変呼び出しプロトコルは、（Ｄ）呼び出された病変の数における高い類似性、（Ｅ）バーコードの大きさ間の良好な相関、および（Ｆ）３回の試行にわたる各ｓｇＩＤプールの類似した平均の大きさを示すと予想された。３回の試行は、配列決定深度において自然に異なっており（加工前の後の４０．１×１０６、２２．２×１０６、および３４．９×１０６の読み取り）、１塩基あたり該読み取りの予想されるエラー率において自然に異なっており（０．８５％、０．９５％、および０．２５％）、該方法の一致を評価するために有用な技術的混乱を提唱した。５００個の細胞で病変の大きさを小さくし、１０−１０（赤色の正方形）でＤＡＤＡ２クラスター形成確率（オメガ）を小さくすると、本発明者らの試験の量の変動性をなおも最小限にしながら、非常に小さな規模で病変の大きさの特性が提供されることを本発明者らは発見した。
【図９】ベンチマーク対照により、各肺試料内での各腫瘍における癌細胞数を計算することができる。（Ａ）公知のバーコードを有する３つのベンチマーク対照細胞株を使用したプロトコルの概略図を示す。各細胞株の５×１０５個の細胞を各肺試料に添加した。次に、肺および３つのベンチマーク対照すべてからＤＮＡを抽出し、バーコードをＰＣＲ増幅して、ディープ配列決定した。次に、本発明者らは、ベンチマークと関係する％読み取りを、各腫瘍から観察された％読み取り（固有バーコード）で除しかつ５×１０５を乗じて癌細胞数を取得することによって、該肺試料内での各腫瘍における癌細胞数を計算した。（Ｂ）腫瘍量が大きく異なっている２つの肺の例を示す。これらのベンチマーク細胞株は、全体的な腫瘍量に関係なく、個々の腫瘍内での癌細胞の数を決定するために使用することができる。また、周囲の「正常な肺」組織は、レンチウイルスの組込みがなく、したがって読み取りに寄与しないため、この計算に影響を与えないことにも注意されるべきである。ベンチマーク対照（例えば、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、または５０個の細胞）を滴定することによって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑの解像度がより小さなクローン増殖に拡大されることが容易になる。
【図１０−１】ＤＡＤＡ２に基づく腫瘍呼び出しパイプラインは堅牢で再現性がある。（Ａ）腫瘍サイズは微妙なＧＣバイアスを呈した。残存腫瘍サイズの変動性を、大きさの対数変換およびあらゆるマウスにおける各ｓｇＲＮＡの大きさの平均による各腫瘍の正規化によって最小限にした。中間のＧＣ含有量を有するバーコードは、最も効率的にＰＣＲ増幅されるようである。残存バイアスへの４次多項式のあてはめは、病変の大きさを最も有効に補正した。この補正を計算し、後続のすべての分析に適用し、これにより、各病変の大きさが平均５％調整され、各マウスの各ｓｇＩＤの病変の大きさの標準偏差が平均と比較してわずか２．９％低減し、このことは、測定可能なまま、ＧＣバイアスによって導入された変動性が最小限であることを示唆した。（Ｂ）ランダムなバーコードは、意図したヌクレオチド全体で高度なランダム性を呈した。（Ｃ）Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用してマウス１匹ごとに呼び出された病変の数を示す。２つの異なる細胞数カットオフ（１０００および５００）を超える腫瘍の数を、マウス１匹あたりの平均腫瘍数±標準偏差として示す。ＫＴ１０マウスを、高力価（６．８×１０５）（本文で使用）およびより低い力価（１．７×１０５；ＫＴLOW）に曝露した。いずれの細胞カットオフでもカプシドごとに観察された腫瘍の数に統計的有意差はなく、バーコードの多様性がなおも５０万個の腫瘍を超えて制限されておらず、小さな腫瘍が腫瘍の密集によって引き起こされていないことを示唆した。
【図１０−２】（Ｄ）規定された百分位数での腫瘍サイズ間の合計最小二乗距離に基づくＫＴ、ＫＴLOW、ＫＰＴ、およびＫＬＴマウスの教師なし階層性クラスター形成（連鎖はＷａｒｄの増分アルゴリズムによって決定）を示す。同じ遺伝子型であるがウイルス力価が異なるマウスは、まとめてクラスター形成しており、大きさ特性の違いが、ウイルス力価の違いではなく、主として腫瘍の遺伝学的特性（遺伝子型）によって決定されることを示唆している。（Ｅ），（Ｆ）病変の大きさは、読み取り深度の違いによって劇的に影響を受けることはない。個々のマウスの担癌肺からのバーコード領域を、非常に大きな深度で配列決定し、次に、通常の読み取り深度へ無作為に下方抽出した。（Ｅ）完全な（ｘ軸）データセットおよび下方抽出したデータセット（ｙ軸）の腫瘍サイズ分布は非常に類似しており、本発明者らの分析パラメータが読み取り深度によって偏向しておらず、該読み取り深度に対してかなり堅牢であることを示した。（Ｆ）百分位数の計算はまた、下方抽出の際にも再現可能である。
【図１０−３】（Ｇ）Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ発症腫瘍に罹患しているＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴマウス（図１由来）は、６つの固有Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅウイルス（各々、固有のｓｇＩＤを保有しており、バーコードの多様性は天然に異なっている）を示す。これにより、本発明者らは、各マウス内での６つの反復採取物を用いた時の、ＤＡＤＡ２と呼ばれる腫瘍サイズの変動性を定量化することができた。腫瘍サイズの分布は、各マウス由来のすべての腫瘍を使用するときおよび所与のｓｇＩＤを有する腫瘍の各部分セットを使用するときに再現性よく呼び出される。示された百分位数での腫瘍サイズを、ＫＴ（左）、ＫＬＴ（中央）、およびＫＰＴ（右）についてプロットしている。各点は、単一のｓｇＩＤ内での腫瘍を使用して計算された百分位数の値を表している。百分位数をグレースケールで表している。異なるｓｇＩＤを有する腫瘍サイズの６つの反復採取物の百分位数の値は、各ｓｇＩＤについてのマーカーが非常に重複していることを該値の強い相関が意味するので、識別することが困難である。
【図１１−１】Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスにおけるレンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターで発症した肺腫瘍における効率的なゲノム編集を表す。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅ（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍ／Ｃｒｅ）ウイルスベクターおよびＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を用いた肺癌モデルにおける体細胞ゲノム編集を試験するための実験の概略図を示す。すべてのマウスは、ホモ接合性欠失の頻度を決定するためのＲ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ対立遺伝子についてホモ接合性であった。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅにより発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス由来の肺葉の蛍光解剖顕微鏡画像を示す。Ｔｏｍａｔｏ陰性腫瘍は、破線で輪郭を描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍ、下のスケールバー＝１ｍｍである。（Ｃ）Ｔｏｍａｔｏタンパク質で覆われていないＴｏｍａｔｏ陽性（陽性）、Ｔｏｍａｔｏ混合（混合型）、およびＴｏｍａｔｏ陰性（陰性）の腫瘍についての免疫組織化学的特性。腫瘍は、破線で輪郭を描かれている。スケールバー＝２００μｍである。（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍ／Ｃｒｅにより発症する腫瘍に罹患している４匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるＴｏｍａｔｏ発現の定量は、腫瘍のおおよそ半分が、癌細胞の少なくとも一部における標的とされる遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ホモ接合性不活性化を有することを示している。Ｔｏｍａｔｏ陽性、混合型、および陰性の腫瘍の割合を、括弧内に示された各群における腫瘍の数で示す。
【図１１−２】（Ｅ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／ＣｒｅウイルスおよびＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を用いて肺における体細胞ゲノム編集を試験するための実験の概略図を示す。（Ｆ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスの肺葉の蛍光解剖顕微鏡画像は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍量の増加を示している。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。スケールバー＝２ｍｍである。（Ｇ）肺重量によって表される腫瘍量は、腫瘍抑制因子Ｌｋｂ１の欠失が成功したことと一致して、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴマウスと比較してＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて増加している。正常な肺重量を、赤色の点線によって示している。＊ｐ値＜０．０２である。各点は、マウスであり、棒は平均を表している。（Ｈ）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるＬｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅにより発症する腫瘍がＣａｓ９を発現し、Ｌｋｂ１タンパク質を欠失していることを示すウエスタンブロット。Ｈｓｐ９０は、負荷していることを示す。
【図１２−１】１１の公知のおよび候補の腫瘍抑制遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの選択および特徴づけ。（Ａ）ｓｇＲＮＡを、各遺伝子内のｓｇＲＮＡの位置、スプライスアクセプター／スプライスドナー（ＳＡ／ＳＤ）領域に対する該ｓｇＲＮＡの近接度、該ｓｇＲＮＡが注釈付き機能ドメインの上流であった（またはこれに隣接していた）か否か、ならびに該ｓｇＲＮＡの予測されるオンターゲット切断効率スコア（最大スコアは１．０であり、より大きなスコア＝より大きな活性）およびオフターゲット切断スコア（最大スコアは１００．０であり、より大きなスコア＝より大きな特異性）に基づいて選択した（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【図１２−２】（Ｂ）これらの腫瘍抑制遺伝子を、ＫｒａｓＧ１２Ｄ推進肺癌モデルの流れで不活性化した、公表した研究由来のデータの要約を示す。（Ｃ）各ベクターは固有のｓｇＩＤを有しているので、ランダムなバーコードを用いて多様化していた。ベクターの各々についてのｓｇＩＤおよび各ｓｇＲＮＡと関係するバーコードの概算数を示している。
【図１２−３】（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ内での各ｓｇＲＮＡの初回表示を評価するための実験の概略図を示す。（Ｅ）３つの反復採取物感染由来の試料の配列決定によって決定されるような、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ内での各ｓｇＲＮＡの割合。平均±ＳＤを示している。プール内の各ベクトルの割合は、各ベクトルの予想される表示（赤色の破線）からほんのわずかにそれていた。
【図１３】インビトロでのｓｇＲＮＡ切断効率を表す。（Ａ）各個々のｓｇＲＮＡを保有しているレンチウイルスにＣａｓ９細胞を感染させることによって、各ｓｇＲＮＡのインビトロでの切断効率を評価するための実験の概略図を示す。本発明者らは、標的とされる各遺伝子座について３つの個々のｓｇＲＮＡを試験し、最良のｓｇＲＮＡの切断効率を報告している。（Ｂ）標的とされる各腫瘍抑制因子についての最適なｓｇＲＮＡの切断効率。切断効率を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定およびＴＩＤＥ分析ソフトウェアによって評価した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１４）。（Ｃ）Ｃａｓ９細胞にＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを感染させることによって各ｓｇＲＮＡのインビトロでの切断効率を評価するための実験の概略図を示す。感染（導入）の４８時間後に細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的となった１４の領域をＰＣＲ増幅し、生成物を配列決定した。各領域でのインデルの％を計算し、プール内の表示およびＳｅｔｄ２インデル％のいずれに対しても正規化することによって、相対的な切断効率をプール内での各ｓｇＲＮＡについて決定した。（Ｄ）不活性Ｎｅｏターゲティング対照を含む各ｓｇＲＮＡの相対的な切断効率を示す。
【図１４−１】Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用した複数の時点での腫瘍抑制因子の識別および検証を表す。（Ａ）腫瘍発症から１２週間後のＫＴマウスにおける各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターの表示割合（各ｓｇＩＤ／すべてのｓｇＩＤ読み取りを用いて読み取り数の１００倍として計算）を示す。ＫＴマウスにはＣａｓ９介在性の遺伝子不活性化がないので、これらのマウスにおける各ｓｇＩＤの割合は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅプールを用いてウイルスベクターの割合を表している。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いて腫瘍を発症させてから１２週間後のＫＴマウス（Ｃａｓ９を欠失）における相対的な腫瘍サイズの解析によって、本質的に均一な腫瘍サイズの分布が識別された。示された百分位数での腫瘍の相対的な大きさは、ｓｇ不活性腫瘍の平均に対して正規化された１０匹のマウスからの併合したデータを表している。９５％信頼区間を示している。ｓｇ不活性とは有意に異なる百分位数をカラーで示している。
【図１４−２】（Ｃ）対数正規の腫瘍サイズ分布を想定した腫瘍サイズの平均の推定値は、ＫＴマウスにおいて予想されるわずかな変動性を示した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正し、ブートストラップしたｐ値を示している。ｐ値＜０．０５および該ｐ値の相応する平均を太字で示している。（Ｄ）腫瘍発症から１２週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターの表示割合（各ｓｇＩＤ／すべてのｓｇＩＤ読み取りを用いて読み取り数の１００倍として計算）を示す。
【図１４−３】（Ｅ）同じ百分位数でのｓｇ不活性含有腫瘍の平均に対する各ｓｇＲＮＡについて示された百分位数での腫瘍サイズを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いた腫瘍発症から１５週間後の３匹のＫＴ；Ｃａｓ９マウスから併合したデータ。点線は、不活性からの変化がないことを表している。誤差棒は、９５％信頼区間を表している。信頼区間が点線と重複していない百分位数をカラーで示している。（Ｆ）対数正規性を仮定した腫瘍サイズの平均の概算値によって、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける有意な成長の利点を有するｓｇＲＮＡが識別された。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正し、ブートストラップしたｐ値を示している。ｐ値＜０．０５および該ｐ値の相応する概算値平均を太字で示している。
【図１５−１】２つの独立した時点でＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｐ５３介在性腫瘍抑制の識別を表す。（Ａ），（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを用いた腫瘍発症から１２週間後（Ａ）および１５週間後（Ｂ）のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける相対的な腫瘍サイズの解析によって、両時点でのべき乗則統計を用いてｐ５３が腫瘍抑制因子として識別された。示された百分位数での腫瘍の相対的な大きさは、ｓｇ不活性腫瘍の平均に対してそれぞれ正規化された８匹および３匹のマウスからの併合したデータである。９５％信頼区間を示している。ｓｇ不活性から有意に大きな百分位数をカラーで示す。べき乗則のｐ値を示している。この実験設定において、まさに最大のｓｇｐ５３で発症した腫瘍のみが、大きさがｓｇ不活性腫瘍よりも大きいことに留意されたい。このことは、ｓｇｐ５３の比較的低い切断効率によって部分的に説明される可能性がある（図１３のｄ）。
【図１５−２】（Ｃ）〜（Ｆ）ｐ５３遺伝子座での各大きさのインデルの割合（１０個のヌクレオチド欠失（−１０）から３個のヌクレオチド挿入まで（＋３）を、所与の大きさのインデルを有する読み取り数をインデルを有する読み取りの総数で除することによって計算した）を示す。インフレームインデルを灰色で示している。本発明者らは、Ｃａｓ９発現細胞株においてインビトロで生じたｐ５３遺伝子座でのインデルのスペクトルが、感染（導入）から４８時間後にＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）と評価した。（Ｃ）フレーム外の突然変異についての選好性はない。次に、本発明者らは、疾患の進行から１５週間後のＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患している３匹の個々のＫＴ；Ｃａｓ９マウスを分析した（Ｄ）〜（Ｆ）。ｐ５３の腫瘍抑制機能と一致して、増殖する腫瘍におけるフレーム外の機能喪失変化についての選択と一致するフレーム内インデル（−９、−６、−３および＋３）がより少なかった。これらの種類の分析は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑにより所見と一致しているが、Ｔｕｂａ−ｓｅｑプラットフォームと比較して不正確である。
【図１６】腫瘍サイズ分布の解析は、Ｌｋｂ１およびＳｅｔｄ２の欠損が対数正規であることを実証している。（Ａ），（Ｂ）ｓｇＬｋｂ１（Ａ）またはｓｇＳｅｔｄ２（Ｂ）を用いた示された百分位数（％百分位数）での腫瘍サイズと、同じ百分位数でのｓｇ不活性により発症した腫瘍サイズとを示す。各百分位数は、腫瘍発症から１２週間後に分析されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患しているすべてのＫＴ；Ｃａｓ９マウスからの各ｓｇＲＮＡを有するすべての腫瘍を使用して計算した（Ｎ＝８匹のマウス）。ｓｇ不活性により発症した腫瘍と比較した大きさを破線で示している。（Ｃ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅにより発症した腫瘍についての確率密度プロットは、ＫＬＴマウスにおいてみられる対数正規分布した腫瘍サイズと非常に類似した対数正規分布した腫瘍サイズとを示している。このことは、Ｓｅｔｄ２欠損症が追加の有利な変化の発生における有意な増加または該変化に対する耐性を提供することなく、腫瘍の成長を推進することを示している。
【図１７−１】オンターゲットのｓｇＲＮＡ効果の確認を表す。（Ａ）各インデルの割合（１０ヌクレオチドの欠失（−１０）から４ヌクレオチドの挿入（＋４）まで）を、所与の大きさのインデルを有する読み取りの数を、各上位の腫瘍抑制遺伝子内でのインデルを有する読み取りの総数で除することによって計算した。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患している３匹のＫＴ；Ｃａｓ９マウスの平均の割合および標準偏差を、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、Ｒｂ１について、およびＮｅｏにおける標的とされる３つの部位（Ｎｅｏ１〜３）の平均について示す。インフレーム突然変異を灰色で示している。Ｎｅｏ１〜３についての平均および標準偏差を、３匹のマウス全部および３つのＮｅｏ標的部位全部を１つの群として平均することによって計算した。概して、増殖する腫瘍内のこれらの遺伝子におけるフレーム外の機能喪失変化についての選択と一致して、インフレームインデル（−９、−６、−３、および＋３）がより少なかった。
【図１７−２】（Ｂ）各インデルの割合（１０ヌクレオチドの欠失（−１０）から４ヌクレオチドの挿入（＋４）まで）を、所与の大きさのインデルを有する読み取りの数を、各上位の腫瘍抑制遺伝子内でのインデルを有する読み取りの総数で除することによって計算した。（Ｂ）本発明者らはまた、感染（導入）から４８時間後にＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）Ｃａｓ９発現細胞株においてインビトロで生成したインデルのスペクトルも評価した。本発明者らは、これらのゲノム位置のいずれにおいてもインフレーム突然変異についての選好性を検出せず、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるバイアスがフレーム外インデル（すなわち、ヌル対立遺伝子）による腫瘍の有利な増殖による可能性が最も高いことを示唆した。
【図１７−３】（Ｃ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅ誘発性腫瘍に罹患しているＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。腫瘍原性のＫｒａｓＧ１２Ｄの存在下でのＳｍａｄ４のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性不活性化は生存を短縮せず、Ｓｍａｄ４の不活性化からの腫瘍の成長が増大していたとしてもこれを制限することを示唆している。（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍の大部分は、同じウイルスに感染した（これを導入した）ＫＴマウスと比較して、Ｓｍａｄ４タンパク質の発現を喪失しており、Ｓｍａｄ４遺伝子座でのインデルの創出と一致していた。スケールバー＝５０μｍである。（Ｅ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるいくつかの腫瘍は、明確な乳頭状組織学的特性、均一に大きな核を有しており、Ｓｏｘ９陽性であり、Ａｐｃ欠損、Ｋｒａｓ推進型肺腫瘍の公表された表現型と一致していた（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４）。代表的なＳｏｘ９陰性およびＳｏｘ９陽性腫瘍を示している。スケールバー＝１００μｍ（上）および２５μｍ（下）である。
【図１８】２つの独立したｓｇＲＮＡの各々を使用した、Ｓｅｔｄ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性不活性化を有するマウスにおける腫瘍量の増加を示す追加の画像を表す。腫瘍浸潤から９週間後に分析したＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ（左）、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ（中）、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅ（右）が浸潤した腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウス由来の肺葉の追加の代表的な蛍光解剖顕微鏡画像を示す。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。スケールバー＝５ｍｍである。
【図１９−１】肺腺癌マウスモデルにおける腫瘍抑制遺伝子機能を評価するためのシステムの比較を表す。腫瘍抑制遺伝子の不活性化の方法（ｆｌｏｘ化した対立遺伝子のＣｒｅ／ＬｏｘＰ介在性欠失とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集）、個々の腫瘍の遺伝子バーコード付与を経た腫瘍の数および大きさを定量化する能力、ならびにプールされたフォーマットにおける複数の遺伝子を不活性化する能力を示している。各システムの特に関連する長所および短所、ならびに例となる参考文献を示している。強調表示された研究はすべて、肺癌におけるものであるが、例外はＭａｒｅｓｃｈらであり、膵癌を研究するためにプールされたｓｇＲＮＡトランスフェクションを使用した。肺腺癌モデルにおける腫瘍抑制遺伝子の機能を評価するためにｆｌｏｘ化した対立遺伝子を使用する現実は、過去１５年間に本発明者らが調べた腫瘍抑制遺伝子のうち６個だけが、ｆｌｏｘ化した対立遺伝子をＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄと併用して調査された、という事実によって最もよく例証されている。定量方法がないことはまた、公知のおよび未知の技術的および生物学的変数（例えば、腫瘍の発症の再現性、齢、性別、およびマウスの系統）により、中程度の腫瘍抑制効果のみを有する遺伝子の識別を著しく妨げる。ｆｌｏｘ化した対立遺伝子を有する遺伝子を欠失させることによって生成されるデータはまた、異なる実験室において使用される異なる実験設定（例えば、異なるウイルス力価、発症後の時間、定量方法、マウス系統）間の比較が困難であることによっても制限される。したがって、異なる腫瘍抑制遺伝子の相対的な効果を文献から集めることは困難である。最後に、腫瘍バーコード付与による個々の腫瘍細胞数の定量は、前例がない精度を提供するだけでなく、腫瘍抑制の機能の異なる機序を反映している可能性が高い腫瘍サイズ分布に対する遺伝子特異的効果を明らかにもする。
【図１９−２】肺腺癌マウスモデルにおける腫瘍抑制遺伝子機能を評価するためのシステムの比較を表す。腫瘍抑制遺伝子の不活性化の方法（ｆｌｏｘ化した対立遺伝子のＣｒｅ／ＬｏｘＰ介在性欠失とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集）、個々の腫瘍の遺伝子バーコード付与を経た腫瘍の数および大きさを定量化する能力、ならびにプールされたフォーマットにおける複数の遺伝子を不活性化する能力を示している。各システムの特に関連する長所および短所、ならびに例となる参考文献を示している。強調表示された研究はすべて、肺癌におけるものであるが、例外はＭａｒｅｓｃｈらであり、膵癌を研究するためにプールされたｓｇＲＮＡトランスフェクションを使用した。肺腺癌モデルにおける腫瘍抑制遺伝子の機能を評価するためにｆｌｏｘ化した対立遺伝子を使用する現実は、過去１５年間に本発明者らが調べた腫瘍抑制遺伝子のうち６個だけが、ｆｌｏｘ化した対立遺伝子をＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄと併用して調査された、という事実によって最もよく例証されている。定量方法がないことはまた、公知のおよび未知の技術的および生物学的変数（例えば、腫瘍の発症の再現性、齢、性別、およびマウスの系統）により、中程度の腫瘍抑制効果のみを有する遺伝子の識別を著しく妨げる。ｆｌｏｘ化した対立遺伝子を有する遺伝子を欠失させることによって生成されるデータはまた、異なる実験室において使用される異なる実験設定（例えば、異なるウイルス力価、発症後の時間、定量方法、マウス系統）間の比較が困難であることによっても制限される。したがって、異なる腫瘍抑制遺伝子の相対的な効果を文献から集めることは困難である。最後に、腫瘍バーコード付与による個々の腫瘍細胞数の定量は、前例がない精度を提供するだけでなく、腫瘍抑制の機能の異なる機序を反映している可能性が高い腫瘍サイズ分布に対する遺伝子特異的効果を明らかにもする。
【図２０】腫瘍サイズ分布の統計的特性およびマウス全体のｓｇＲＮＡ腫瘍サイズの共分散を表す。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＰｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症した腫瘍に罹患しているあらゆるマウスにおける各ｓｇＩＤ分布の平均および分散を示す。マウスの遺伝子型を、示しているようにカラーで標識している。概して、分散はすべての遺伝子型についての平均の２乗とともに大きくなり、病変の大きさの対数変換によって分散が安定し、不均一分散が回避されるものとすることを示唆した。いくつかの分布は、平均の２乗よりも大きくなった分散を呈する。（Ｂ）〜（Ｄ）遺伝的変化に応じたマウス間の変動性を１２週目に屠殺したＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて調べた。各マウスにおける各ｓｇＲＮＡのＬＮ  ＭＬＥ平均の共分散を調べた。遺伝子型は大きさがマウス全体で互いに正に相関していたことを意味している（例えば、より大きなｓｇＬｋｂ１腫瘍に罹患しているマウスはまた、より大きなｓｇＳｅｔｄ２腫瘍も保有していた。）１２のｓｇＲＮＡ全部のうちの相関マトリックスのＰＣＡ分解（統合したｓｇ不活性）は、単一の主成分（ＰＣ１）ベクターによって説明することができるマウス間の実質的なレベルの変動性を明らかにした。各点は、ＰＣ１へと投影された単一のマウスを表しており、これは、ｓｇＲＮＡの大きさの平均におけるマウス間の観察された変動性の７５％を説明している。（Ｂ）ＰＣ１は、肺全体の重量と相関しており、（Ｃ）病変の大きさを意味しており、より大きな腫瘍に罹患しているマウスは、強いドライバーによって推進される腫瘍の成長に対してより感受性があることを示している（ＰＣ１は、ｓｇＳｅｔｄ２およびｓｇＬｋｂ１の大きさと相関しており、データは非表示である）。（Ｄ）マウスは、最初の２つの主成分へと投影したとき、別個のクラスターを形成していないように見える。複製マウスはほぼ常に、同じケージ内で飼育された同胞とした。本発明者らは、主成分混合モデルを使用して、外部ノイズ源を最小限にした（方法を参照されたい）。
【図２１】腫瘍進行の数学的モデルを表す。
【図２２】同じマウスにおける各病変とその最も近い隣接部との間の大きさの違いと比較したレンチウイルス感染（導入）の頻度とを表す。
【図２３−１】ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体細胞ＨＤＲを腫瘍のバーコード付与および配列決定と統合して、インビボでの推定上の腫瘍原性点突然変異の迅速な導入および機能的調査を可能にするプラットフォームを表す。（Ａ）〜（Ｄ）規定した点突然変異のパネルのインビボでの腫瘍原性を定量的に測定するためのパイプラインの概略図を示す。ＡＡＶベクターのライブラリーを、各ＡＡＶが、１）隣接するウォッブル推定上の腫瘍原性点突然変異と隣接するウォブル塩基にコードされたランダムなＤＮＡバーコードを含む相同性指向修復（ＨＤＲ）のテンプレート塩基においてコードされるランダムなＤＮＡバーコードとを含有する相同性指向型修復（ＨＤＲ）のためのテンプレート、２）ＨＤＲについての内在性遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、および３）遺伝的に操作したマウスにおいて条件付きＣａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）および他のＣｒｅ依存性対立遺伝子を活性化するためのＣｒｅ−リコンビナーゼ（Ａ）。ＡＡＶライブラリーは関心対象の組織へ送達される（Ｂ）。導入後、細胞の部分セットは、目的遺伝子座がｓｇＲＮＡ標的部位でＣａｓ９によって開裂し、ＡＡＶ  ＨＤＲテンプレートを用いて修復されるＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲを受ける。このことは結果として、所望の点突然変および固有ＤＮＡバーコードを、標的とされる遺伝子座内への正確な導入をもたらす（Ｃ）。導入された突然変異が腫瘍形成を開始し、腫瘍の成長を推進するために十分である場合、点突然変異で操作された体細胞は、デノボ腫瘍へと成長することができる。（Ｄ）２つの独立したアプローチを使用して腫瘍を分析することができる。１）腫瘍を個々に配列決定して、標的遺伝子の両方の対立遺伝子を特徴付けることができるか、または２）バルクの腫瘍担持組織全体からのバーコード付き突然変異ＨＤＲ対立遺伝子をディープ配列決定して、各突然変異を有する腫瘍の数および大きさを定量化することができる。
【図２３−２】（Ｅ）内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へのＣａｓ９介在性ＨＤＲのＡＡＶベクタープール（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ）を示す。各ベクターは、コドン１２および１３での１２個の非同義Ｋｒａｓ突然変異（または野生型Ｋｒａｓ）の１つと、ＰＡＭおよびｓｇＲＮＡ相同性領域（ＰＡＭ＊）内でのサイレント突然変異と、個々の腫瘍のＤＮＡバーコード付与のための下流コドンのウォッブル位置内での８ヌクレオチドのランダムなバーコードとを有するＨＤＲテンプレートを含有している。（Ｆ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリーにおける各Ｋｒａｓコドン１２および１３対立遺伝子の表示を示す。ｇ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリーにおけるバーコード領域の多様性を示す。
【図２４−１】ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体細胞ＨＤＲは、転移状態へと進行することができる腫瘍原性Ｋｒａｓ推進型肺腫瘍を発症する。（Ａ）点突然変異およびＤＮＡバーコードを、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、およびＬｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスにおける肺上皮細胞の内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へとＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの気管内投与によって導入する実験の概略図を示す。（Ｂ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ処理したＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるＴｏｍａｔｏpositive肺腫瘍および組織学的特性の代表的な画像を示す。スケールバー＝５ｍｍである。
【図２４−２】（Ｃ）示されたＡＡＶベクター（ｓｇＫｒａｓありおよびなし）に感染した（これを導入した）マウスの示された遺伝子型における肺腫瘍の定量を示す。各点は、１匹のマウスを表している。ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの１：１０，０００希釈物を導入したＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＬＴ（ＫＬＴ）マウスおよびＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＰＴ（ＫＰＴ）マウスは、希釈していないウイルスに感染させた（これを導入した）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスおよびＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスのおおよそ半分の腫瘍を発症した。したがって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリー内のすべてのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子が腫瘍原性であると仮定すると、このことは、ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲが、導入した細胞のおおよそ０．０２％において生じることを示唆している。あるいは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリー内の突然変異対立遺伝子の２０％のみが腫瘍形成を推進すると仮定する場合、ＨＤＲの割合はおおよそ０．１％である。（Ｄ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにより発症する肺腫瘍に罹患しているＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの胸膜腔内のＴｏｍａｔｏpositive播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。（Ｅ）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにより発症する肺腫瘍からの転移の組織学的特性を示す。スケールバー＝５０μｍである。ｆ）個々の肺腫瘍における多様なＨＤＲにより生成される腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有する腫瘍の数を示している。いかなる肺腫瘍においても同定されなかった対立遺伝子は、示されていない。
【図２５−１】ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲによる体細胞性膵細胞および筋肉細胞への突然変異Ｋｒａｓ変異体の導入は、浸潤癌の形成を推進する。（Ａ）膵癌を誘発するためのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの逆行性膵管注射の概略図を示す。（Ｂ）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの逆行性膵管注射によって発症する膵腫瘍の組織学的特性を示す。スケールバー＝７５μｍである。（Ｃ）原発性ＰＤＡＣに罹患しているＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるリンパ節（上のパネル）および横隔膜（下のパネル）における転移の組織学的特性を示す。スケールバー＝５０μｍである。（Ｄ）膵腫瘍塊におけるＨＤＲにより生成される腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有する腫瘍の数を示している。いかなる膵腫瘍塊においても同定されなかった対立遺伝子は示されていない。
【図２５−２】（Ｅ）肉腫を誘発するためのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋へのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射の概略図を示す。（Ｆ），（Ｇ）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋へのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射によって発症するステレオタイプの肉腫（Ｆ）および浸潤性肉腫（Ｇ）の組織学的特性を示す。スケールバー＝７５μｍである。ｈ）肉腫におけるＨＤＲにより生成される腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有する腫瘍の数を示している。いかなる肉腫においても同定されなかった対立遺伝子は示されていない。これらのデータは、複数の組織にわたる細胞系列のクローン標識を文書化している。
【図２６−１】ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体細胞ＨＤＲを用いたＫｒａｓ突然変異体腫瘍原性および個々にバーコード付与された腫瘍のハイスループット配列決定の多重定量分析を表す。（Ａ）腫瘍バーコードのハイスループット配列決定によって、バルクの肺試料から個々の腫瘍サイズおよび数を定量的に測定するためのパイプラインを示す。（Ｂ）各突然変異Ｋｒａｓ対立遺伝子を保有する肺腫瘍の初回表示（ＡＡＶプラスミドライブラリーにおける突然変異体表示／ＡＡＶプラスミドライブラリーにおける野生型表示）に対して正規化されかつ野生型と比較した該肺腫瘍の数（突然変異腫瘍数／野生型腫瘍数）を示す。野生型よりも有意に多くの腫瘍に存在する変異体（ｐ＜０．０１）は、青色で示されており、より濃い青色はＧ１２Ｄとは有意差がないことを示しており（ｐ＞０．０５）、より薄い青色は、Ｇ１２Ｄよりも変異体を有する腫瘍が有意に少ないことを示している（ｐ＜０．０１）。（Ｃ）異なる遺伝子型にわたる各Ｋｒａｓ変異体を有する肺腫瘍の数の両側多項式カイ二乗検定からのｐ値を示す。有意なｐ値（ｐ＜０．０５）は太字で示されている。
【図２６−２】（Ｄ），（Ｅ）ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ｄ）またはＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（ｅ）全部にわたるｂにおける腫瘍原性として識別されるＫｒａｓ変異体についての肺腫瘍サイズ分布を示す。各点は、固有のＫｒａｓ変異体−バーコード対を有する１つの腫瘍を表している。各点の大きさは、それが表す腫瘍サイズに比例しており、このことは、正規化対照読み取り計数に対して腫瘍の読み取り計数を正規化することによって概算される。（Ｆ）膵腫瘍塊の腫瘍バーコード配列決定によって識別された、ＨＤＲにより生成された多様なＫｒａｓ対立遺伝子を示す。各対立遺伝子を有する固有のバーコードを付与された腫瘍の数を示している。いずれの膵腫瘍塊においても同定されなかった対立遺伝子は示されていない。（Ｇ）単一のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ処理したＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス由来の原発性膵腫瘍量および転移物のハイスループット配列決定によって、多様な範囲の変異Ｋｒａｓ対立遺伝子が明らかとなり、原発性腫瘍と該腫瘍が転移した子孫とのクローン関係を確立することができた。各点は、示されたＫｒａｓ変異体と示された試料内の固有バーコードとを有する１つの腫瘍を表している。色付きの線で結ばれている点は、同じバーコードを保有しており、これらがクローンとして関連していることを示唆する。各点の大きさは、各点が表す腫瘍サイズによって素描が拡大縮小される（点の直径＝相対的な大きさ１／４）。膵腫瘍サイズは対照に対して正規化されていないので、腫瘍サイズは同じ試料内でのみ比較することができる。したがって、各試料内の最大の腫瘍は、同じ標準的な大きさに設定される。
【図２７−１】Ｋｒａｓの多重突然変異のためのＡＡＶライブラリーの設計、生成、および検証を表す。（Ａ）Ｋｒａｓエクソン２を標的とする３つのｓｇＲＮＡの配列を示す。各ｓｇＲＮＡの切断効率を、各ｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを用いた導入から４８時間後にＣａｓ９を発現するＭＥＦからＤＮＡを配列決定することによって決定した。３つのｓｇＲＮＡはすべて、標的とされる遺伝子座でインデル形成を誘導した。したがって、Ｋｒａｓコドン１２および１３に最も近い配列を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＫｒａｓ＃３）を、その後の実験全部について使用して、ＨＤＲの尤度を高めた。（Ｂ）野生型（ＷＴ）Ｋｒａｓ配列に加えて、コドン１２および１３にある１２の非同義の単一ヌクレオチドＫｒａｓ変異体の各々、ＰＡＭおよびｓｇＲＮＡ相同領域（ＰＡＭ＊）内のサイレント突然変異、ならびに個々の腫瘍のバーコード付与のための下流のコドンのウォッブル位置内での８ヌクレオチドのランダムなバーコードを含有する二本鎖ＤＮＡ断片の合成されたライブラリーを示す。各Ｋｒａｓ対立遺伝子は、約２．４×１０４の固有バーコードと関係づけることができる。断片はまた、クローン化のための制限部位も含有していた。（Ｃ）ＡＡＶベクターライブラリーは、合成された領域を親ＡＡＶベクターへと大規模にライゲートして、ＷＴＫｒａｓとＫｒａｓコドン１２および１３における１２個の一塩基非同義突然変異全部とを有するバーコード付きプールを作製することによって生成された。
【図２７−２】（Ｄ）ＫｒａｓＨＤＲテンプレート内でのＫｒａｓエクソン２の位置を示す。相同性アームの長さを示している。（Ｅ）ＨＤＲバイアスについて試験するための実験の概略図を示す。Ｃａｓ９発現細胞株にＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入した後、ＨＤＲ事象を定量化するために配列決定した。（Ｆ）ＨＤＲを介してゲノム内へと導入されたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を特異的に増幅するためのＰＣＲ戦略の概略図を示す。順方向プライマー１（Ｆ１）は、３つのＰＡＭ＊突然変異を含有する配列に結合するのに対し、逆方向プライマー１（Ｒ１）は、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの相同性アームに存在する配列の外側で、内在性Ｋｒａｓ遺伝子座を結合する。Ｆ２は、Ｆ１によって付加されたＩｌｌｕｍｉｎａアダプターへ結合し、Ｒ２は、エクソン２近くの領域へ結合し、Ｒ３は、Ｒ２によって同じ反応において付加されたＩｌｌｕｍｉｎａアダプターへ結合する。（Ｇ）内在性Ｋｒａｓ遺伝子座内での各Ｋｒａｓ対立遺伝子の表示は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターライブラリーを導入した培養物中のＣａｓ９発現細胞内のＨＤＲを経て生じた。（Ｈ）各ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子についてのＨＤＲ事象の頻度は、ウイルスライブラリーを生成するために使用されるＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリーにおける各Ｋｒａｓ突然変異対立遺伝子の初回頻度に対してプロットした。初回プラスミドライブラリーとＨＤＲ後の突然変異Ｋｒａｓ対立遺伝子の表示との間の高い相関関係は、ＨＤＲバイアスがほとんどないかまったくないことを示唆している。
【図２８−１】成熟上皮細胞への導入に最適なＡＡＶ血清型の識別を表す。（Ａ）成熟肺上皮細胞への導入について１１のＡＡＶ血清型をスクリーニングするための実験の概略を示す。ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターを異なるＡＡＶカプシド血清型で包装し、野生型レシピエントマウスに気管内投与した。処置から５日後、肺を摘出し、ＧＦＰpositive上皮細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定した。（Ｂ）異なるＡＡＶ血清型を異なる濃度で生成することができる。本発明者らの目標は、ＤＮＡテンプレートを肺上皮細胞に送達することができるＡＡＶ血清型を識別することとし、該ＡＡＶ血清型は、達成可能なウイルス力価とビリオンあたりの導入効率との両方によって大いに必要とされる。したがって、感染（導入）前のＡＡＶ血清型の力価を正規化するのではなく、むしろ６０μｌの未希釈の精製済みウイルスの投与後の感染（導入）率を決定した。（Ｃ）異なるＡＡＶ血清型によって導入された肺上皮細胞の割合を評価するために、本発明者らは、感染（導入）マウスの肺を単一細胞懸濁液へと分離し、ＧＦＰについてならびに造血細胞（ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９、およびＦ４／８０）、内皮細胞（ＣＤ３１）、および上皮細胞（ＥｐＣＡＭ）のマーカーについてフローサイトメトリーを実行した。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲート処理した、生存可能な（ＤＡＰＩnegative）、肺上皮（ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９／Ｆ４−８０／ＣＤ３１陰性、ＥｐＣＡＭpositive）細胞を示している。各試料におけるＧＦＰpositive上皮細胞の割合をゲート上に示している。ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶＤＪは、これらの血清型の高い最大力価と一致して、他のすべての血清型（Ｐｌａｔｔｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４）でにおいて効率的なＨＤＲにし損ねたＡＡＶ６を含む）よりもかなり良好であった。本発明者らは、このデータおよび必要とされるＡＡＶ８の能力に基づいて、ＡＡＶ８を使用して、多くの他のマウス細胞型をインビボで効率するよう選択した。
【図２８−２】（Ｃ）異なるＡＡＶ血清型によって導入された肺上皮細胞の割合を評価するために、本発明者らは、感染（導入）マウスの肺を単一細胞懸濁液へと分離し、ＧＦＰについてならびに造血細胞（ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９、およびＦ４／８０）、内皮細胞（ＣＤ３１）、および上皮細胞（ＥｐＣＡＭ）のマーカーについてフローサイトメトリーを実行した。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲート処理した、生存可能な（ＤＡＰＩnegative）、肺上皮（ＣＤ４５／Ｔｅｒ１１９／Ｆ４−８０／ＣＤ３１陰性、ＥｐＣＡＭpositive）細胞を示している。各試料におけるＧＦＰpositive上皮細胞の割合をゲート上に示している。ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶＤＪは、これらの血清型の高い最大力価と一致して、他のすべての血清型（Ｐｌａｔｔｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４）でにおいて効率的なＨＤＲにし損ねたＡＡＶ６を含む）よりもかなり良好であった。本発明者らは、このデータおよび必要とされるＡＡＶ８の能力に基づいて、ＡＡＶ８を使用して、多くの他のマウス細胞型をインビボで効率するよう選択した。
【図２９−１】肺上皮細胞におけるＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性のインビボでのＨＤＲは、転移能を獲得するために進行する可能性がある原発性腫瘍を発症する。（Ａ）点突然変異を内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へと導入し、Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、およびＲ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスにおいて、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの気管内投与によって、肺上皮細胞をバーコード付与する実験の概略図を示す。（Ｂ）図２（Ａ）における蛍光画像に相当する明視野画像を示す。より高倍率の組織像は、ｐ５３欠乏性腫瘍における腺癌の組織学的特性およびより大きな核異型を記録している。上のスケールバー＝５ｍｍ、下のスケールバー＝５０μｍである。
【図２９−２】（Ｃ）ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘発性肺腫瘍の追加例を示す。スケールバー＝５ｍｍである。導入効率が高いので、ほとんどの肺細胞はＴｏｍａｔｏを発現するが、各腫瘍内の細胞の数および密度が大きいので、腫瘍ははるかに明るいことに留意されたい。（Ｄ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患している各遺伝子型のマウスにおける肺の総重量を示す。各点は、１匹のマウスを表している。（Ｅ）１：１０に希釈されたＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅに感染させた（これを導入した）各遺伝子型のマウスにおける蛍光解剖顕微鏡下で識別された表面肺腫瘍の数を示す。各点は、１匹のマウスを表している。（Ｆ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにより発症する肺腫瘍に罹患しているＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて形成されたリンパ微小転移の組織学的特性を示す。スケールバー＝５０μｍである。（Ｇ）胸膜腔内の播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ＞１０）およびリンパ節への転移を有した各遺伝子型のマウスの数を示す。数字は、ＤＴＣまたは転移を有するマウスの数／分析されたマウスの総数を表している。
【図３０】ヌクレアーゼ非含有ＡＡＶ介在性ＨＤＲは、多数の肺腫瘍を発症するために十分な高速では生じない。（Ａ）１２個の単一ヌクレオチドの非同義突然変異とバーコードとは有するが、Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡは有しない２．５ｋｂのＫｒａｓ  ＨＤＲテンプレートを含有する対照ＡＡＶベクターライブラリーの概略図を示す。（Ｂ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅプラスミドプール内の各Ｋｒａｓコドン１２および１３対立遺伝子の表示を示す。百分率は、３つの反復採取物の配列決定の平均である。（Ｃ）ＡＡＶベクターライブラリーの力価（ｖｇ＝ベクターゲノム）を示す。重要なことに、対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅウイルス調製物は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅよりも力価が高い。（Ｄ）未希釈の６０μＬまたは１：１０に希釈したＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅプールの投与後に腫瘍が発達したＬＴ、ＰＴ、およびＴマウスの数の定量を示す。
【図３１−１】個々の腫瘍の分析は、腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子を識別し、非ＨＤＲＫｒａｓ対立遺伝子におけるインデルを明らかにする。（Ａ）ＰＡＭ＊突然変異と、Ｇ１２Ｄ突然変異と、バーコードとを有するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の例となる配列決定トレースを示す。（Ｂ）Ｓａｎｇｅｒ非亜列決定によって個々の肺腫瘍において検出された４つの代表的な腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子の配列を示す。分析した各原発性腫瘍は、変異体ごとに約２．４×１０４個の可能なバーコードが与えられた場合に予想されるように、固有の変異体−バーコード対を有していた。この遺伝子座でのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレート配列および野生型Ｋｒａｓ配列における塩基の変化を参照のために示している。（Ｃ）ＨＤＲ事象は概して、２つの操作された制限部位の外で生じた。しかしながら、いくつかの腫瘍は、エクソン２と制限部位のうちの１つとの間の組換えと一致するＫｒａｓ対立遺伝子を有しており、Ｃａｓ９／ｓｇＫｒａｓ誘導性二本鎖ＤＮＡ切断に非常に近い組換えを示唆した。
【図３１−２】（Ｄ）完全なＨＤＲを受けなかった個々の腫瘍における腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子の図を示す。完全なＨＤＲ事象と不完全なＨＤＲ事象との両方が、各マウスの遺伝子型において認められる（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける１４／３０腫瘍における完全なＨＤＲおよびＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける３／７腫瘍）。不完全ＨＤＲ事象には、エクソン２の上流でのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの５’末端の相同的組換えと、Ｃａｓ９／ｓｇＫｒａｓ誘導性二本鎖ＤＮＡ切断のすぐ下流のエクソン２領域へのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの３’末端のライゲーションとを経て、Ｋｒａｓ遺伝子座へと組み込まれている可能性がある対立遺伝子が含まれた。この不完全なＨＤＲの結果として、Ｋｒａｓエクソン２の下流のイントロン配列において挿入または欠失が行われた。挿入および欠失は、長さが可変性であり（大きさは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定またはゲル電気泳動法によって概算）、野生型エクソン２の一部もしくは全部、またはまれな場合では、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターのセグメントを含んでいた。これらの部分的なＨＤＲ事象はいずれも、腫瘍形成のための腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子の発現のための必要条件と一致して、突然変異体のエクソン２からエクソン３までのスプライシングを変化させるとは予測されなかった。（Ｅ），（Ｆ）治療された大きな個々の腫瘍における発癌性Ｋｒａｓ対立遺伝子ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９  ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、ほとんどの場合、エクソン２でのＣａｓ９を介したインデル形成を介して他のＫｒａｓ対立遺伝子の不活性化を伴った。Ｓａｎｇｅｒ配列決定は、個々の腫瘍の４７／４８（９８％）においてＰＡＭ配列に隣接したインデルを識別した。例となるインデル（Ｅ）およびすべてのインデルの要約（Ｆ）を示している。ＮＤは、野生型対立遺伝子を検出できなかったことを示しており、このことは、プライマー結合部位のうちの１つを包含したヘテロ接合性の喪失、非常に大きなインデル、または大きな欠失のいずれかと一致している。
【図３２−１】膵細胞における内在性Ｋｒａｓ遺伝子座への腫瘍原性突然変異のＨＤＲ介在性導入は、膵管腺癌の形成につながる。（Ａ）膵癌を誘発するためのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの逆行性膵管注射の概略図を示す。（Ｂ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて発症した膵腫瘍の代表的な明視野画像および蛍光画像を示す。スケールバー＝５ｍｍである。（Ｃ）前癌性ＰａｎＩＮ病変（左上）、高分化型腫瘍領域（右上）、低分化型ＰＤＡＣ（左下）を含む、膵腫瘍の進行の異なる病期の組織像を示す。右下は、ＰＤＡＣ内の高コラーゲン間質環境（三重染色）の発達を示している。スケールバー＝７５μｍである。
【図３２−２】（Ｄ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにより発症するＰＤＡＣに罹患しているＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの胸膜腔内のＴｏｍａｔｏpositive播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。プロットは、ＦＳＣ／ＳＳＣゲート処理した生存可能な癌細胞（ＤＡＰＩ／ＣＤ４５／ＣＤ３１／Ｆ４−８０／Ｔｅｒ１１９negative）を示している。（Ｅ）ＨＤＲ誘発性ＰＤＡＣは、進行して転移能を獲得し、リンパ節内および横隔膜上に播種性転移をすることができる。明視野および蛍光解剖顕微鏡画像を示している。スケールバー＝３ｍｍである。（Ｆ）示されたＡＡＶベクターライブラリーを感染させ（導入し）てから３〜１３か月後のマウスの腹腔内でのＰＤＡＣ、ＤＴＣの発生、および示される遺伝子型における転移を示す。
【図３３】骨格筋における腫瘍原性ＫｒａｓのＨＤＲ介在性誘導は、肉腫を誘導することを表す。（Ａ）肉腫を誘発するためのＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋へのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射の概略図を示す。（Ｂ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを注射した後のマウス腓腹筋の代表的なホールマウント明視野（上のパネル）および蛍光解剖顕微鏡（下のパネル）の画像を示す。広範囲のＴｏｍａｔｏ陽性組織によって証明されるように、効率的な形導入にもかかわらず、右側腓腹筋には肉腫があるのに対し、左側腓腹筋には肉腫がない（データ非表示）。スケールバー＝５ｍｍである。ｃ）ステレオタイプの組織学的特性および周辺筋肉への浸潤も有する肉腫の存在を確認する組織学的ヘマトキシリンおよびエオシン切片の画像を示す。スケールバー＝７５μｍである。（Ｄ）ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射から３〜７か月後のＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける肉腫の発生率を示す。発生率は、注射されたマウスの総数のうち、肉腫を発症したマウスの数を表している。処置された７匹のマウスのうちの１匹はまだ分析されていなかったが、感染（導入）から６か月後に明らかな肉腫はなかった。（Ｅ）肉腫におけるＫｒａｓＨＤＲ遺伝子座の配列決定により、突然変異Ｋｒａｓの対立遺伝子およびバーコードが明らかとなる。
【図３４】各突然変異Ｋｒａｓ対立遺伝子を有する肺腫瘍サイズおよび数を定量化するための、バルクの肺組織のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定のための試料および調製を表す。（Ａ）バーコード付きＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定のためにＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを気管内投与したマウスからのバルクの肺組織試料を示す。試料名、マウスの遺伝子型、およびＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの希釈を示している。重量、腫瘍数、解剖した腫瘍の数、ならびに増幅されたＤＮＡの量、各試料についてＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定のためにプールしたＰＣＲ反応の数を示している。繰り返し試料は、技術的な反復採取物である。ＮＤ＝データなしである。（Ｂ）既知の細胞数のベンチマーク対照からの読み取りを使用して、各腫瘍における細胞数の概算を可能にし、別々のマウスからのデータを組み合わせることができる、バルク肺試料からの配列決定読み取りの正規化のための簡素化されたパイプラインを示す。
【図３５−１】バルク組織からの腫瘍の遺伝子型、大きさ、および数のバーコード配列決定に基づく並行分析の再現性を表す。（Ａ）〜（Ｄ）示されるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子と技術的な反復採取物（すなわち、バルクの組織溶解物からの独立したＤＮＡ抽出およびＰＣＲ反応）にわたるハイスループット配列決定によって検出される固有バーコードとを有する個々の腫瘍の回帰プロットを示す。（Ａ）および（Ｂ）における反復採取物を、異なる多重タグを有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅したが、同じ配列決定レーン上で試行した。（Ｃ）および（Ｄ）における反復採取物を、同じプライマーを使用してＰＣＲ増幅したが、異なる配列決定レーン上で試行した。バルク肺重量によって測定された推定値として平均を上回る腫瘍量（Ａ），（Ｃ）および平均を下回る腫瘍量（Ｂ），（Ｄ）を有するマウスを分析して、可変数の腫瘍試料にわたるこのパイプラインの技術的および計算上の再現性を確認した。
【図３５−２】バルク組織からの腫瘍の遺伝子型、大きさ、および数のバーコード配列決定に基づく並行分析の再現性を表す。（Ａ）〜（Ｄ）示されるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子と技術的な反復採取物（すなわち、バルクの組織溶解物からの独立したＤＮＡ抽出およびＰＣＲ反応）にわたるハイスループット配列決定によって検出される固有バーコードとを有する個々の腫瘍の回帰プロットを示す。ａ）およびｂ）における反復採取物を、異なる多重タグを有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅したが、同じ配列決定レーン上で試行した。（Ｃ）および（Ｄ）における反復採取物を、同じプライマーを使用してＰＣＲ増幅したが、異なる配列決定レーン上で試行した。バルク肺重量によって測定された推定値として平均を上回る腫瘍量（Ａ），（Ｃ）および平均を下回る腫瘍量（Ｂ），（Ｄ）を有するマウスを分析して、可変数の腫瘍試料にわたるこのパイプラインの技術的および計算上の再現性を確認した。
【図３６−１】バルクの肺組織からの腫瘍のハイスループットバーコード配列決定によって、さまざまな数および大きさの腫瘍が明らかになる。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝６）（Ａ）、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）（Ｂ）、またはＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝３）（Ｃ）全部にわたるすべてのＫｒａｓ変異体の腫瘍サイズ分布を示す。各点は、固有のＫｒａｓ変異体−バーコード対を有する腫瘍を表している。各点の大きさは、それが表す腫瘍サイズに比例しており、このことは、正規化対照読み取り計数に対して腫瘍の読み取り計数を正規化することによって概算される。ＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を保有する病変は、腫瘍原性ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を有する腫瘍におけるヒッチハイカーであると考えられている（方法を参照されたい）。
【図３６−２】バルクの肺組織からの腫瘍のハイスループットバーコード配列決定によって、さまざまな数および大きさの腫瘍が明らかになる。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝６）（Ａ）、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）（Ｂ）、またはＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝３）（Ｃ）全部にわたるすべてのＫｒａｓ変異体の腫瘍サイズ分布を示す。各点は、固有のＫｒａｓ変異体−バーコード対を有する腫瘍を表している。各点の大きさは、それが表す腫瘍サイズに比例しており、このことは、正規化対照読み取り計数に対して腫瘍の読み取り計数を正規化することによって概算される。ＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を保有する病変は、腫瘍原性ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を有する腫瘍におけるヒッチハイカーであると考えられている（方法を参照されたい）。
【図３６−３】（Ｄ），（Ｅ）各遺伝子型にわたる各Ｋｒａｓ変異体を保有する腫瘍（個々の腫瘍の解剖および分析によって識別された、各変異体を有する腫瘍を含む）の生（Ｄ）および正規化された（Ｅ）数の表を示す。（Ｅ）では、各Ｋｒａｓ変異体を保有する腫瘍の数は、ＡＡＶプラスミドライブラリー内の各変異体の初回表示に対して、および同じ遺伝子型内での野生型対立遺伝子を保有する病変の数に正規化されている。（Ｅ）におけるヒートマップの色彩強度尺度は、比較を容易にするために各遺伝子型に固有であることに注意されたい。
【図３７】膵腫瘍の塊と転移のハイスループット配列決定によって、腫瘍原性Ｋｒａｓ突然変異体が識別される。（Ａ）バーコード付きのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のために逆行性膵管注射によってＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを投与されたマウスからのバルクの膵臓組織および転移の試料を示す。試料名、マウスの遺伝子型、ウイルスの希釈、および組織を示している。原発性腫瘍塊および転移の異なる領域において存在するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を、これらの試料からＦＳＣ／ＳＳＣゲート処理した生癌細胞（ＤＡＰＩ／ＣＤ４５／ＣＤ３１／Ｆ４−８０／Ｔｅｒ１１９negative）を分離するＦＡＣＳの後にＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定することによって分析した。（Ｂ）ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの膵臓内でＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅにより発症する腫瘍塊におけるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を識別するための分析パイプラインを示す。（Ｃ）単一のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅで処理したＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおける大きな膵腫瘍塊の多重領域配列決定によって、さまざまな範囲の突然変異Ｋｒａｓ対立遺伝子を明らかにし、原発性腫瘍を該腫瘍の転移子孫と関連させた。各点は、示されたＫｒａｓ変異体と示された試料に固有のバーコードとを有する腫瘍を表している（１〜４と標識）。異なる原発性腫瘍試料（１〜３と標識）にわたって結ばれた点は、同じＫｒａｓ変異体−バーコード対を共有していたので、おそらく、複数の試料中に存在していた同じ原発性腫瘍の領域である。複数のサンプルに存在した同じ原発腫瘍の領域である。カラーの線は、同じＫｒａｓ変異体−バーコード対を保有している原発性腫瘍およびリンパ節転移を連結しており、クローンの関連性を示している。各点の大きさは、各点が表す腫瘍サイズによって素描が拡大縮小される（点の直径＝相対的な大きさ１／２）。膵腫瘍サイズは対照に対して正規化されていないので、腫瘍サイズは同じ試料内でのみ他の腫瘍と比較することができる。したがって、各試料内での最大の腫瘍は、同じ標準の大きさに素描が拡大縮小されている。ｇ＝胆嚢、ｓｔｏ＝胃、ｄｕｏ＝十二指腸、ｐａｎ＝膵臓、ｓｐ＝脾臓、ｌｎ＝腸間膜リンパ節である。
【図３８−１】Ｋｒａｓ突然変異体のインビボでの腫瘍原性と生化学的挙動との間の関連性を表す。（Ａ）〜（Ｃ）Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において報告された示された生化学的特性の関数としての、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したマウスにおける肺腫瘍の相対数（図４の（Ｂ）を参照されたい）を示す。相対的な肺腫瘍数は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプールにおける各Ｋｒａｓ変異体の初回表示に正規化されている。縦棒は、正規化された相対的な肺腫瘍数についての９５％信頼区間を表している。横棒は、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において説明されるような３回の反復採取物実験の平均の標準誤差を表している。Ｐ１２０ＧＡＰを使用して、ＧＡＰで刺激されたＧＴＰ加水分解速度を決定した（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。（Ｄ）Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において報告された示された生化学的特性の関数としての、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したマウスにおける膵腫瘍の数（図４の（Ｆ）を参照されたい）。縦棒は、膵腫瘍数についての９５％信頼区間を表している。横棒は、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において説明されるような３回の反復採取物実験の平均の標準誤差を表している。Ｐ１２０ＧＡＰを使用して、ＧＡＰで刺激されたＧＴＰ加水分解速度を決定した（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【図３８−２】（Ｅ），（Ｆ）Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において報告された示された生化学的特性の関数としての、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したマウスにおける膵腫瘍の数（図４の（Ｆ）を参照されたい）。縦棒は、膵腫瘍数についての９５％信頼区間を表している。横棒は、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において説明されるような３回の反復採取物実験の平均の標準誤差を表している。Ｐ１２０ＧＡＰを使用して、ＧＡＰで刺激されたＧＴＰ加水分解速度を決定した（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【図３９−１】組み合わされた遺伝的変化の調査を表し、ｐ５３欠損は、インビボでのＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍における腫瘍抑制の成長効果を変化させる。（Ａ）インビボでのコンビナトリアル腫瘍抑制因子の不活性化を研究するためのＴｕｂａ−ｓｅｑアプローチ。腫瘍は、３つの異なる遺伝子操作されたマウスの背景、すなわち、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）、ＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＰＴ；Ｃａｓ９）、およびＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）において、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ（４つの不活性ｓｇＲＮＡベクターと公知のおよび候補の腫瘍抑制遺伝子を標的とする１１のベクターとを含有）を用いて発症させた。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤおよびランダムなバーコードを含有しており、該ｓｇＲＮＡベクターを使用して、ディープ配列決定を介して個々の腫瘍サイズを定量した。
【図３９−２】（Ｂ）腫瘍発症から１５週間後のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける相対的な腫瘍サイズの分析を示す。示された百分位数での腫瘍の相対的な大きさは、ｓｇ不活性腫瘍サイズの平均に対して正規化された、１０匹のマウスからの併合したデータである。この研究全体の誤差棒は、ブートストラップサンプリングによって決定された９５％信頼区間を示している。ｓｇ不活性とは有意に異なる百分位数をカラーで示している。（Ｃ）腫瘍サイズの対数正規分布を仮定した腫瘍サイズの平均の概算値は、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を有意に高めるｓｇＲＮＡを識別した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正され、ブートストラップされたｐ値を示している。ｐ値＜０．０５であるｓｇＲＮＡを太字で示している。
【図３９−３】（Ｄ），（Ｅ）１２匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスからの併合されたデータを除き、（Ｂ），（Ｃ）と同じである。
【図３９−４】（Ｆ）ゲノムを標的とする不活性ｓｇＲＮＡＮｅｏ１〜３の中央値と比較した、標的とされる遺伝子座でのインデルの量を示し、（Ａ）によるカラー標識を表す。（Ｇ）ＴＣＧＡおよびＧＥＮＩＥデータセットからのヒト肺腺癌におけるＴＰ５３およびＲＢ１の機能的突然変異（Ｎ＝１７９２）を示す。ＲＢ１およびＴＰ５３の変化は同時に発生する。
【図４０−１】組み合わされた遺伝子変化の調査：Ｌｋｂ１欠損腫瘍における腫瘍抑制因子の不活性化の弱毒化効果は、荒いあてはめの展望をさらに強調している。（Ａ）同じ百分位数でのｓｇ不活性含有腫瘍の平均と比較した、各ｓｇＲＮＡについて示された百分位数での腫瘍サイズを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅによる腫瘍の発症から１５週間後の１３匹のＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）マウスからの併合したデータを示している。ｓｇ不活性と有意に異なる百分位数をカラーで示している。（Ｂ）腫瘍サイズの対数正規分布を仮定した腫瘍サイズの平均の概算値は、ＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を有意に高めるｓｇＲＮＡを識別した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正され、ブートストラップされたｐ値を示している。ｐ値＜０．０５であるｓｇＲＮＡを太字で示している。（Ｃ）ＴＣＧＡおよびＧＥＮＩＥデータセット（Ｎ＝１７９２）からのヒト肺腺癌におけるＬＫＢ１（ＳＴＫ１１）およびＳＥＴＤ２突然変異の相互排他性を示す。
【図４０−２】（Ｄ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝３）における腫瘍サイズを示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍よりもＬＮ平均が２．４倍高く、第９５百分位数の腫瘍サイズは４．６倍大きい。（Ｅ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＬＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝７）対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＬＴ；Ｃａｓ９マウス（Ｎ＝５）における腫瘍サイズを示す。相対的なＬＮの平均および相対的な第９５百分位数は２．２および２．８であり、いずれも図２のｄ）よりも有意に小さい（それぞれｐ＜０．０４、およびｐ＜０．０００１）。（Ｆ）遺伝的背景にわたる腫瘍抑制因子（ＬＮ平均によって決定）のあてはめ効果のピアソン相関を示す。ｓｇｐ５３およびｓｇＬｋｂ１の成長速度は、ＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスおよびＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて除外している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。（Ｇ）腫瘍原性Ｋｒａｓ推進型肺腫瘍の流れの中での、ｐ５３欠損またはＬｋｂ１欠損と同時の各腫瘍抑制遺伝子の差分効果を示す。ｓｇ不活性腫瘍から有意に逸脱している第９５百分位数を青色で示している。（Ｈ）候補となる腫瘍抑制因子をドライバーとして識別する可能性（（Ｇ）において定義）と研究された遺伝的背景の数を示す。すべての遺伝的状況を平均化した。
【図４１−１】本研究における推定腫瘍抑制因子の変化およびヒト肺腺癌におけるこれらのゲノム変化の頻度の分析のための、遺伝的に操作された肺癌のマウスモデルの現状を表す。（Ａ）本発明において研究された推定腫瘍抑制遺伝子が、ｐ５３またはＬｋｂ１の不活性化を用いてまたは用いずに、腫瘍原性Ｋｒａｓ推進型肺癌モデルの流れにおいて不活性化された公表された研究からのデータの要約を示す。
【図４１−２】（Ｂ）すべての腫瘍（すべて）およびＴＰ５３（ＴＰ５３ｍｕｔ）またはＬＫＢ１（ＬＫＢ１ｍｕｔ）における変化を不活性化する可能性がある腫瘍についての、各腫瘍抑制遺伝子における変化を不活性化する可能性がある腫瘍の割合を示す。各種類の変化を伴う腫瘍の割合を示している。２つの臨床癌ゲノミクス研究、すなわち、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ，２０１４）、およびｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ，２０１７）データベースについてのデータを示している。
【図４２−１】多重レンチウイルスベクター、腫瘍発症、およびインビボでの腫瘍サイズ分布を定量化するためのＴｕｂａ−ｓｅｑパイプラインの説明を表す。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、不活性ｓｇＲＮＡを有する４つのベクターと、腫瘍抑制遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを有する１１個のベクターとを含有している。各ｓｇＲＮＡベクターは、固有のｓｇＩＤおよびランダムなバーコードを含有している。ＮＴ＝非ターゲティングである。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／ＣｒｅにおけるベクターのｓｇＩＤ−バーコード領域の概略図を示す。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、所与のｓｇＩＤ−バーコード読み取りを特定のｓｇＲＮＡに連結させる１５個の異なる８ヌクレオチドの固有識別子（ｓｇＩＤ）を有するベクターを含有している。これらのベクターはまた、１５個のヌクレオチドのランダムなバーコード要素（例えば、固有分子識別子（ＵＭＩ））も含有している。この二重バーコードシステムによって、個々の腫瘍、および各腫瘍を発症させるベクター内のｓｇＲＮＡの識別が可能となる。
【図４２−２】（Ｃ）バーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅプールの肺上皮細胞への導入は、（１）Ｃｒｅにより調節される腫瘍原性ＫｒａｓＧ１２Ｄ（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋）対立遺伝子、（２）Ｃｒｅレポーター対立遺伝子（Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ）、（３）Ｃｒｅにより調節されるＣａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、および（４）ｐ５３またはＬｋｂ１のいずれかのホモ接合性ｆｌｏｘ化対立遺伝子、を有する遺伝的に操作されたマウスにおいて肺腫瘍を発症させる。レンチウイルスベクターは、導入された細胞のゲノム内へと安定して組み込まれる。腫瘍を、ＫＴ；Ｃａｓ９マウス、ＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス、およびＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて発症させて、３１の異なる遺伝子型の肺腫瘍を生じさせた。１５週間の腫瘍の成長後のマウスを分析した。バーコード付き「ベンチマーク」細胞株の添加後に全肺からゲノムＤＮＡを抽出し、ｓｇＩＤ−バーコード領域をＰＣＲ増幅し、ディープ配列決定し、分析して、Ｔｕｂａ−ｓｅｑパイプラインを用いて固有バーコードを付与した各腫瘍の相対的な増殖を決定した。
【図４３−１】ＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腺癌におけるインビボでの腫瘍抑制。（Ａ）Ｃａｓ９を欠失しており、それゆえｓｇ不活性と比較して増殖しないものとする、ＫＴマウスと比較したＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｓｇＩＤ表示の倍数変化（ΔｓｇＩＤ表示）。いくつかのｓｇＲＮＡ（ｓｇＩＤ）は、標的とされた腫瘍抑制遺伝子の不活性化に伴う腫瘍の成長の増大を反映して、表示が増加する。平均および９５％信頼区間を示している。（Ｂ），（Ｃ）バルクのｓｇＲＮＡ表示と比較した個々にバーコード付与した腫瘍（ΔｓｇＩＤ表示）を分析することによって、腫瘍抑制効果を検出する能力が改善される。（Ｂ）各ｓｇＲＮＡ有する第９５百分位数の腫瘍の相対的な大きさの分析によって、ΔｓｇＩＤ表示とやや類似の相対的な腫瘍サイズの概算値が識別され、これは、より広い信頼区間を呈する。（Ｃ）相対的な腫瘍サイズの対数正規平均（ＬＮ平均）測定値のＰ値とＰ値のΔｓｇＩＤ表示とを示す。個々の腫瘍サイズを測定した後、適切に正規化して外来のノイズ源を除去するので、第９５百分位数およびＬＮ平均の両方の量は、より大きな信頼度および正確度で機能的な腫瘍抑制因子を識別する。ｐ５３の喪失は例外とし、その理由は、その成長効果は対数正規分布では十分に説明されていないからである。すべてのＰ値は両側であり、２×１０６のブートストラップ順列検定および調査された腫瘍抑制因子の数についてのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を介して得られる。
【図４３−２】（Ｄ）〜（Ｆ）（Ａ）〜（Ｃ）と同じであるが、ＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスにおける成長効果を除く。倍率変化はＫＴマウスに関連しているのに対し、第９５百分位数およびＬＮの大きさの平均の概算値は、ＫＰＴ；Ｃａｓ９内部ｓｇ不活性対照に関連している。
【図４３−３】（Ｇ）〜（Ｉ）（Ａ）〜（Ｃ）と同じであるが、ＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおける成長効果を除いている。Ｔｕｂａ−ｓｅｑがなければ、腫瘍抑制因子はまったく識別されない。
【図４４】Ｔｕｂａ−ｓｅｑによって識別され、Ｃｒｅ／ｌｏｘ調節対立遺伝子を使用したマウスモデルで確認され、ならびにヒト肺腺癌におけるＲＢ１およびＴＰ５３突然変異の同時発生によって裏付けられた、肺腺癌におけるＲｂおよびｐ５３腫瘍抑制因子の協同性を表す。（Ａ）ｓｇＳｅｔｄ２腫瘍、ｓｇＬｋｂ１腫瘍およびｓｇＲｂ１腫瘍の相対的なＬＮの大きさの平均を示す。Ｒｂ１の不活性化は、ｐ５３能が高いＫＴ；Ｃａｓ９背景においてＳｅｔｄ２またはＬｋｂ１の不活性化が腫瘍サイズを増大させるよりも低い程度で、腫瘍サイズを増大させる。逆に、Ｒｂ１の不活性化は、ｐ５３欠損ＫＰＴ；Ｃａｓ９背景におけるＳｅｔｄ２またはＬｋｂ１の不活性化と同様の程度まで腫瘍サイズを増大させる。Ｐ値は、ｓｇＲｂ１と同様のＬＮ平均の帰無仮説を検定する。Ｐ＜０．０５を太字で示している。（Ｂ）Ａｄｅｎｏ−ＣＭＶ／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰマウスおよびＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスからの代表的な肺葉のヘマトキシリンおよびエオシン染色。腫瘍発症から１２週間後にマウスを分析した。スケールバー＝５００μｍである。（Ｃ）ＫＰマウスおよびＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスからの肺の代表的なエクスビボμＣＴ画像を示している。肺葉は、白色の破線で輪郭が描かれている。（Ｄ）Ｋ；Ｒｂ１ｗｔ／ｗｔマウス、Ｋ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス、ＫＰ；Ｒｂ１ｗｔ／ｗｔマウス、およびＫＰ；Ｒｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおける腫瘍面積の割合の定量を示す。組織学的定量化によって、Ｒｂ１欠失が、ｐ５３欠損腫瘍において腫瘍量をより劇的に増加させることが確認される。＊ｐ値＜０．０５、ｎ．ｓ．＝有意ではない。Ａｄ−Ｃｒｅの力価を示している。（Ｅ），（Ｆ）２つのヒト肺腺癌ゲノミクスデータセット、つまり（Ｅ）ＴＣＧＡ２０１４データセット、および（Ｆ）ＧＥＮＩＥコンソーシアム２０１７におけるＲＢ１およびＴＰ５３の突然変異の同時発生を示す。Ｐ値は、体細胞の変化についてＤＩＳＣＯＶＥＲ統計的独立性検定を使用して計算した。
【図４５】標的とされるゲノム遺伝子座のディープ配列決定によって、標的とされるすべての遺伝子座でのインデルの生成が確認され、最強の腫瘍抑制遺伝子においてインデルを有する癌細胞の選択的増殖が示されている。（Ａ）４匹のＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスの標的とされる領域からの全肺ＤＮＡのディープ配列決定によって決定されるような、ｓｇＲＮＡによって標的とされる各領域のインデル量を示す。インデル量は、ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、およびｓｇＮｅｏ３の量の中央値に対して正規化される。誤差棒は、観察された量の範囲を示しているのに対し、点は中央値を示している。インデルは、標的とされるすべての領域において観察された。標的部位が、ｐ５３ｆｌｏｘ化対立遺伝子のＣｒｅ介在性組換えによって欠失しているので、ｓｇｐ５３は示されていない。（Ｂ）（Ａ）において説明されているインデル量と、Ｔｕｂａ−ｓｅｑによって決定される第９５百分位数の腫瘍サイズ（図１の（Ｄ）において説明）とを示す。各点は、個々のマウスにおける単一のｓｇＲＮＡを表しており、各マウスは固有の形状によって表される。インデル量は、（予想どおり）Ｔｕｂａ−ｓｅｑ大きさ特性と相関していたが、インデル量は、個々の腫瘍サイズを測定しておらず、より大きな統計的ノイズを呈している。Ｔｕｂａ−ｓｅｑによって決定されるように、この分析全体において最大の単一の腫瘍は、遺伝的事象をさらにＴｕｂａ−ｓｅｑによって確証する忠実な分析であるインデル分析において外れ値として同様に現れたｓｇＣｄｋｎ２ａ腫瘍であった。
【図４６−１】マウスモデルおよびヒト肺腺癌におけるＳｅｔｄ２とＬｋｂ１との間の冗長性の検証を表す。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅで発症する腫瘍またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴマウスおよびＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスからの肺葉の蛍光解剖顕微鏡画像（上）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片（下）を示す。９週間の腫瘍の成長後のマウスを分析した。肺葉は、蛍光解剖顕微鏡画像において白色の破線で輪郭が描かれている。上のスケールバー＝５ｍｍ、下のスケールバー＝４ｍｍである。（Ｂ）Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス、およびＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴマウスにおける腫瘍面積の割合の定量を示す。各点はマウスを表し、横棒は平均である。同じウイルスで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスとＫＰＴマウスとの間では腫瘍面積の増加があるが、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅで発症するＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスと、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスとの間には差がなく、おそらくマウス間の変動性が高いことによる。これらのレンチウイルスベクターにバーコードを付与しているので、本発明者らは、これらのマウスのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析を実行して、誘発した腫瘍サイズを定量した。ｓｇＳｅｔｄ２によって、ｓｇＮｅｏ２と比較してＫＰＴ；Ｃａｓ９において腫瘍サイズが増加した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意ではない。
【図４６−２】（Ｃ），（Ｄ）（Ａ），（Ｂ）と同じだが、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅまたはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスを除く。９週間の腫瘍の成長後のマウスを分析した。上のスケールバー＝５ｍｍ、下のスケールバー＝４ｍｍである。（Ｅ），（Ｆ）２つのヒト肺腺癌ゲノミクスデータセット、すなわち（Ｅ）ＴＣＧＡ２０１４データセット１４（Ｎ＝２２９名の患者）、および（Ｆ）ＧＥＮＩＥコンソーシアム（Ｎ＝１５６３名の患者）におけるＳＥＴＤ２およびＬＫＢ１（ＨＧＮＣ名ＳＴＫ１１）の同時発生を示す。両側のＰ値は、ＤＩＳＣＯＶＥＲ統計的独立性検定を使用して計算した。
【図４７−１】ヒトゲノムパターンに対するＴｕｂａ−ｓｅｑあてはめ測定値の対応を表す。（Ａ）本発明者らが調査した１９の対に関する相互作用の相対的なあてはめ測定値およびヒトでの同時発生率を示す。ＬＮ比の平均は、関心対象の背景内での相対的なＬＮの平均（ｓｇＴＳ／ｓｇ不活性）を３つの背景すべての平均の相対的なＬＮ平均で除した比率である。背景率は、３つの背景の重み付けされていない平均（生）、またはヒト肺腺癌における各背景の発生率によって重みづけされた平均（重みづけ）のいずれかであることができる。＊ＯＲ＝ヒトのデータ内での遺伝子対の同時発生率の「オッズ比」。ヒトの同時発生率の片側Ｐ値（＞０．５は相互排他性を示唆）は、ＤＩＳＣＯＶＥＲ検定を使用して決定した。Ｓｔｏｕｆｆｅｒの方法を使用して、組み合わせたＰ値を生成した（方法）。Ｐ＜０．０２５およびＰ＞０．９７５を太字で示している。あてはめ測定値および同時発生率は概して対応している（重みづけしたＬＮの比の平均についてはＳｐｅａｒｍａｎのｒ＝０．５０、Ｐ値＝０．０３、重みづけしていないものについてはｒ＝０．４）。
【図４７−２】（Ｂ）（Ａ）からのあてはめ測定値および同時発生率のグラフによる要約を示す。ヒト遺伝学の協調性は、オッズ比＞１と冗長性＜１との組み合わせによって規定した。Ｔｕｂａ−ｓｅｑデータについての協調性は、ＬＮの比の平均＞１および冗長性＜１を示している。（Ｃ）２１種類の腫瘍の全癌分析から示唆された統計的に有意な遺伝的相互作用の数を示す。腫瘍の種類の略語は、ＴＣＧＡから借用している。肺腺癌（ＬＵＡＤ）は黒色であり、中央値と同様の量の遺伝的相互作用を含有していると予測されており、本発明において研究されたあてはめ展望の凹凸が概して癌の進化を表す可能性があることを示唆している。
【図４８】大規模な遺伝的調査のパワー解析を表す。腫瘍サイズの対数正規分布を仮定することによって、より大規模な遺伝的調査におけるドライバー成長効果および非相加的ドライバーの相互作用を検出するＴｕｂａ−ｓｅｑの統計的パワーを予測することができる。将来の実験では、推定腫瘍抑制因子を標的とする、より大きなマウスコホートおよびより大きなｓｇＲＮＡプールを利用する可能性がある。すべての仮想実験では、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ力価、およびプールを不活性ｓｇＲＮＡ（正規化用）で除したものを、本発明者らの元の実験と一致させたままにした。（Ａ）弱いドライバーを検出する上での信頼性についてのＰ値の等高線（ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｓｇＣｄｋｎ２ａ分布によってパラメータ化）を示す。等高線よりも上のいかなる実験設定も、等高線のＰ値以上の信頼性で弱いドライバーを検出する。（Ｂ），（Ｃ）（Ａ）と同じだが、それぞれ中程度のおよび強いドライバーを除く（ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｓｇＲｂ１およびｓｇＬｋｂ１によってパラメータ化）。ｓｇＲＮＡのプールの大きさは、（プールにおける１００個の標的の代わりに）５００個の標的まで拡張され、その理由は、これらの効果の強度を有する遺伝子を調査するとき、より大きなふるいが可能であるからである。（Ｄ）〜（Ｆ）（Ａ）〜（Ｃ）と同じだが、ドライバーの相互作用を除く。ドライバー相互作用（ＬＮの比の平均）は、一方の帰無仮説と統計的に異なっていたドライバーの成長速度の比（背景＃１におけるｓｇＴＳ／ｓｇ不活性）／（背景＃２におけるｓｇＴＳ／ｓｇ不活性）として定義される。（Ｄ）Ｒｂｍ１０−ｐ５３によってパラメータ化される弱いドライバーの相互作用（７％の大きさの効果）、（Ｅ）Ｒｂ１−ｐ５３によってパラメータ化される中程度のドライバーの相互作用（１３％の大きさの効果）、（Ｆ）Ｓｅｔｄ２−Ｌｋｂ１によってパラメータ化される強いドライバーの相互作用（６８％の大きさの効果）を示す。
【図４９】肺癌療法のＫｒａｓ遺伝子型特異性を明らかにするためのアプローチを表す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援型ＨＤＲおよび治療処置を、配列決定に基づく腫瘍サイズの定量と関連させた、遺伝子型−薬物応答マトリックスの生成（５，上）、薬理ゲノミクス特性評価パイプラインのための時系列（１〜５，下）を示している。丸で囲んだ数字は、この実験の主要なステップに相当する。ＰＴＸ＝パクリタキセル、Ｃａｒｂｏ＝カルボプラチン、ＭＥＫｉ＝ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）である。
【図５０】レンチウイルスでコードされたｓｇＲＮＡの誘導性Ｆｌｐ介在性発現を使用した腫瘍抑制遺伝子のパネルの連続的な不活性化についての概略を表す。（Ａ）Ｕ６プロモーター内に埋め込まれたＴＡＴＡ  ＦＲＴ隣接終止カセットを有するｐＩｎｓａｎｅベクターを示す。ＴＡＴＡ  ＦＲＴ部位内でのＴＡＴＡボックスを太字で示している。Ｆｌｐ活性によって終止カセットが除去されたので、ｓｇＲＮＡ発現が可能になる。ユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）およびｓｇＩＤ／ＢＣ領域を示している。（Ｂ）Ｉｎｓａｎｅ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅは、１１個の腫瘍抑制因子および４個の不活性ｓｇＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡを含有している。（Ｃ）実験群。２つの陰性対照コホートおよび２つの陽性対照コホートを示している。タモキシフェン（Ｔａｍ）処置のタイミングを示している。
【図５１】インビボでの腫瘍抑制遺伝子のコンビナトリアル二重ｓｇＲＮＡターゲティングを表す。（Ａ）２つのｓｇＲＮＡの発現のための本発明者らのウイルスベクターの概略図を示す。アンカーｓｇＲＮＡ（ｓｇ不活性またはｐ５３もしくはＬｋｂ１を標的とする６個のｓｇＲＮＡのうちの１つ）と１１個の腫瘍抑制因子を標的とするｓｇＲＮＡのプールとを含むバーコード付きベクターの７個のプールを示す。（Ｂ）Ｔｕｂａ−ｓｅｑ分析と関連した腫瘍抑制因子対の多重分析の概略図を示す。
【図５２】癌遺伝子を識別するバーコードを遺伝子イントロンへと組み込むための戦略を表す。Ｋｒａｓのイントロン２の場合について、複数の異なる腫瘍原性活性化突然変異を識別するバーコード付与とともに、マウスにおいて該突然変異を発生させるコンストラクトを示している。Ｋｒａｓのイントロン２を標的とするｓｇＲＮＡ、ならびにＫｒａｓの活性化突然変異ホットスポットおよびＫｒａｓのイントロン２の両方にまたがるＨＤＲカセットがコンストラクトに含まれている。ＨＤＲカセットは、活性化突然変異（該ＨＤＲカセットのエクソン部分内）、ＰＡＭ突然変異（修復された転写産物の再切断を防ぐため）、およびバーコード配列（該ＨＤＲカセットのイントロン部分内）を担持している。バーコード配列には、導入された突然変異を固有に識別するセグメントと、場合により、腫瘍を生じさせた個々の核酸分子を識別する固有分子識別子配列とが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本方法および組成物を説明する前に、本発明は、説明された特定の方法または組成物に限定されず、このようなものとして、当然のことながら、変動することがあることは理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されることになるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００２１】
値の範囲が提供される場合、文脈上別段に明確に記載されていない限り、下限の単位の１０分の１までの、該範囲の上限と下限との間にある各介在値もまた、具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の記載された何らかの値または介在値と、該記載された範囲内のその他の記載された値または介在値との間のより小さな各範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してこの範囲の中に含まれることができるかまたは除外されることができ、およびいずれかの限界がより小さな範囲に含まれ、いずれの限界もより小さな範囲に含まれず、またはいずれの限界もより小さな範囲に含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の具体的に除外されるいかなる限界も条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が限界の片方または両方を含む場合、限界を含んだ範囲のいずれかまたは両方を除外することもまた、本発明に含まれる。
【００２２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと同様のまたは同等のいずれかの方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの可能性がある好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及されるすべての公表物は、該公表物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた公表物のいかなる開示よりも優先されることが理解される。
【００２３】
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書に説明および例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離することができるか、または該特徴と組み合わせることができる個別の要素および特徴を有する。何らかの列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能であるその他の順序で実施することができる。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞（例えば、このような細胞の集団）を含み、「タンパク質」への言及は、１つまたは複数のタンパク質および当業者に公知のその等価物、例えば、ポリペプチドに対する言及を含む、などである。
【００２５】
本明細書で論議される公表物は、本出願の出願日の前に該公表物の開示にのみ準備される。本明細書内のいかなるものも、本発明がこのような公表物に先立する権利を先行の発明によって与えられないという了解として解釈されるべきではない。さらに、提供されている公表日は、実際の公表日とは異なることがあり、別途確認する必要がある可能性がある。
【００２６】
方法および組成物
先に要約したように、同じ個体内の複数のクローン細胞集団について集団サイズを測定するための組成物および方法が提供されている。一例として、いくつかの場合では、対象の方法は、同じ個体内のクローンとして独立した複数の腫瘍細胞集団（例えば、異なる腫瘍）についての腫瘍サイズ（例えば、腫瘍内での腫瘍細胞の数）を測定する方法である。いくつかの場合では、対象の方法は、（ａ）個体の組織を遺伝性であり、互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触した組織内で遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を発生させることと、（ｂ）遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在する複数の細胞マーカーの少なくとも２つの量を検出および測定し、それにより一連の測定値を生成することと、（ｃ）一連の測定値を入力として使用して、遺伝性であると標識された細胞の該識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された細胞の数を計算することとを含む。
【００２７】
組織の接触
いくつかの実施形態では、対象の方法は、組織（例えば、個体の組織）（例えば、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器系および性器系、例えば、精巣、生殖組織など）を、遺伝性でありかつ互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させて、接触した組織内での遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を生じるステップを含む。いくつかの場合では、組織は、動物の体外で成長した、操作された組織（例えば、オルガノイド、培養中の細胞など）である。いくつかの場合では、組織は、生きている動物の一部であり、それゆえ、組織は個体の組織と見なすことができ、該接触させることは、細胞マーカーを個体に（例えば、注射を介して）投与することによって行うことができる。
【００２８】
何らかの便利な投与経路を使用することができる（例えば、気管内、鼻腔内、逆行性膵管、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、局所、皮下、経口、腫瘍内など）。いくつかの場合では、投与は注射を介する（例えば、ウイルスライブラリーなどのライブラリーの標的組織への直接の注射）。いくつかの場合では、マーカーの細胞への移動は、電気穿孔法（例えば、ヌクレオフェクション）、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質などを使用）、流体力学的送達、ソノポレーション、微粒子銃粒子送達、またはマグネトフェクションを介する。何らかの便利な送達ベクターを使用することができる（例えば、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、むき出しの核酸、プラスミド、オリゴヌクレオチド、エキソソーム、リポプレックス、ゲシクル、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、バイオリスティクス粒子、リボ核タンパク質複合体、デンドリマー、細胞浸透性ペプチドなど）。
【００２９】
組織は、何らかの所望の動物からの何らかの種類の組織であることが可能である。例えば、いくつかの実施形態では、接触した組織は、無脊椎動物の組織（例えば、脱皮動物、冠輪動物、海綿動物、刺胞動物、有櫛動物、節足動物、環形動物、軟体動物、扁形動物、環形動物、節足動物、昆虫、または虫の組織）である。いくつかの実施形態では、接触した組織は、脊椎動物の組織（例えば、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、または哺乳動物の組織）である。適切な組織にはまた、齧歯類（例えば、ラットの組織、マウスの組織）、有蹄動物、家畜、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類、およびヒトからの組織も含まれるが、これらに限定されない。標的組織には、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟部組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、ならびに生殖器系および性器系、例えば、精巣、生殖組織などを含むことができるが、これらに限定されない。
【００３０】
いくつかの場合では、細胞を腫瘍性に誘導する目的のために組織を接触させることがあり、例えば、複数の独立した腫瘍を発症させて形成する目的のために組織を接触させる。例えば、いくつかの場合では、導入された細胞マーカー（および／または細胞マーカーと関連した成分）が腫瘍性形質転換を引き起こし（腫瘍性細胞形成につながる）、複数の異なる腫瘍性発症事象の結果を互いに比較することができ、その理由は、各事象が、識別可能な遺伝性細胞マーカーで固有に標識されたからである。いくつかのこのような場合では、細胞マーカーは同じ遺伝的変化を開始し、それにより、誘発された腫瘍は同じ種類（または同一でさえある）の遺伝的混乱によって始まるが、個々の細胞マーカーはその他とは識別可能であるので、各開始事象の結果を追跡することができる。このような方法の目的は、例えば、集団サイズ（例えば、腫瘍サイズ、各腫瘍内の腫瘍細胞の数）の分布特性を所与の目的遺伝子型について生じるために、同じ組織（および／または同じ動物）における複数の独立した細胞系列を追跡することとすることができる。あるいは、いくつかの場合では、異なる遺伝的混乱を使用し（例えば、細胞メーカーは、２つ以上の異なる遺伝的混乱を引き起こすことができ、細胞メーカーに関連した成分は、２つ以上の異なる遺伝的混乱を引き起こすことができる）、（例えば、いくつかの場合では、同じ動物における）同じ組織内の異なる遺伝子型からの結果を比較することができる（例えば、同じ組織内に存在する異なる遺伝的基盤を有する異なる腫瘍、例えば、肺、筋肉、腎臓などにおける複数の異なる腫瘍）。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組織はすでに、細胞マーカーとの接触の前に、腫瘍細胞（例えば、腫瘍）を含有している。いくつかの場合では、腫瘍は細胞マーカーと接触している（例えば、細胞マーカーは、腫瘍内へと注入され、血流中へと注入されて腫瘍（複数可）に接触し、別の器官または組織に投与されて腫瘍（複数可）に接触させることができる、など）。例として、いくつかの場合では、細胞マーカーは、新生物または腫瘍内での異なる細胞などの独立した腫瘍細胞を標識する方法として使用された後、標識された各細胞を個別の系列として処置することができ、１回以上の細胞分裂後に存在する各マーカーを有する細胞（各マーカーが存在する細胞）の数を計数することによって、追跡された各系列について生成された細胞の数を追跡することができる。いくつかの場合では、この方法は、細胞マーカーが導入される細胞を遺伝子修飾することを含む。例えば、組織はすでに、対象の方法を実行する前に１つまたは複数の腫瘍に罹患している可能性があり、細胞マーカーを導入する目的は、腫瘍細胞に追加の遺伝子修飾（すなわち、腫瘍細胞内にすでに存在する変化に加えた変化）を導入する効果を試験することとする。このようなものとして、識別可能な各細胞マーカーは、異なる遺伝子変化に関係していることができる（例えば、各ガイドＲＮＡ、それゆえ各遺伝子修飾が、ＤＮＡバーコードなどの固有識別子と関係しているように、特定の遺伝子標的を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸をＤＮＡバーコードなどの固有識別子と対形成することによる）。このような場合では、標識した系列は、互いに遺伝的に異なる（例えば、特定の遺伝子座に突然変異を有する）細胞のセットである。
【００３２】
あるいは、いくつかの場合では、各腫瘍は遺伝的に同じであり、細胞マーカーは必ずしも互いに遺伝的に異なるとは限らない系列を追跡する。このことによって、本方法の実践者は、同じ動物内で複数の独立した細胞系列を追跡することができ、関心対象の所与の遺伝子型について集団サイズ（例えば、腫瘍サイズ、腫瘍内の腫瘍細胞の数）の分布特性を生じることができる。
【００３３】
細胞マーカー
複数の細胞マーカー（すなわち、導入された（異種、人工）細胞マーカーであって、マーカーが細胞内に既存のものではない場合のマーカーであって、例えば、導入されたマーカーは単に腫瘍内の既存のクローン体細胞突然変異ではない）は、２つ以上（例えば、３つ以上、５つ以上、１０個以上、または１５個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上、１，０００，０００個以上、１，０００，０００，０００個以上など）の細胞マーカーである。同様に、複数の標識された細胞系列は、２つ以上（例えば、３つ以上、５つ以上、１０個以上、または１５個以上、１００個以上、１，０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上など）の標識された細胞系列である。（互いに識別可能である）何らかの便利な遺伝性細胞マーカーを使用することができ、いくつかの遺伝性細胞マーカーは当業者に公知である。いくつかの場合では、（すなわち、遺伝性で互いに識別可能である導入された（異種、人工））細胞マーカーは、バーコード付き核酸である。いくつかの場合では、バーコード付き核酸を標的細胞のゲノム内へと組み込むことができるか、またはバーコード付き核酸をエピソームで維持することができる。バーコード付き核酸には、検出および定量／測定される各細胞系列について固有識別子を提供するヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの場合では、遺伝性であり、互いに識別可能である複数の細胞マーカーは、バーコード付き核酸のライブラリーであり、バーコードの正確な配列は、あるランダムな要素を有する。例えば、いくつかの場合では、バーコードを一連のＮ（例えば、各ヌクレオチドが定義されていないが、正規または非正規のヌクレオチドの考えられるすべてのうちの１つまたは該ヌクレオチドの規定された部分セットのうちの１つである核酸配列における位置）で説明することができる。対象のバーコード付き核酸は、何らかの便利な数のＮを含むことができる。
【００３４】
いくつかの場合では、対象のバーコード付き核酸（複数／ライブラリー）には、５以上（例えば、６以上、７以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上）の無作為化した位置、例えば、ヌクレオチドがあらかじめ決まっていない５以上（例えば、６以上、７以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上）の位置が含まれる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸のライブラリー（複数）についての式には、５以上の位置（例えば、６以上、７以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上の位置）が規定されていない少なくとも１０塩基対（ｂｐ）長（例えば、少なくとも１２ｂｐ、１５ｂｐ、１７ｂｐ、または２０ｂｐ長）のヌクレオチド鎖（すなわち、塩基同一性がライブラリーのメンバー間で異なっている位置）が含まれる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸のライブラリー（複数）についての式には、５〜４０の位置（例えば、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、８〜１５、８〜１０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１５、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２０、１２〜１８、または１２〜１５の位置）が規定されていないヌクレオチド鎖（すなわち、塩基同一性がライブラリーのメンバー間で異なっている位置）が含まれる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸のライブラリー（複数）についての式には、５〜１０００の位置（例えば、５〜８００、５〜６００、５〜５００、５〜２５０、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１０、８〜１０００、８〜８００、８〜６００、８〜５００、８〜２５０、８〜１５０、８〜１００、８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１８、８〜１５、８〜１０、１０〜１０００、１０〜８００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１５、１２〜１０００、１２〜８００、１２〜６００、１２〜５００、１２〜２５０、１２〜１５０、１２〜１００、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２５、１２〜２０、１２〜１８、または１２〜１５の位置）が定義されていないヌクレオチド鎖（すなわち、塩基同一性がライブラリーのメンバー間で異なっている位置）が含まれる。
【００３５】
バーコード付き核酸は、線状（例えば、ウイルス）または環状（例えば、プラスミド）のＤＮＡ分子であることができる。バーコード付き核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子であることができる。非限定的な例としては、プラスミド、合成された核酸断片、合成されたオリゴヌクレオチド、ミニサークル、およびウイルスＤＮＡが挙げられる。バーコード付き核酸は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ（ＤＮＡ分子）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、または核酸／タンパク質複合体であることができる。
【００３６】
いくつかの場合では、細胞マーカーは、遺伝性であり互いに識別可能である、互いに識別可能である、および併用するとき複数の他のバイオマーカーと識別可能である、複数のバイオマーカー（例えば、抗体、蛍光タンパク質、細胞表面タンパク質）を、単独で、または同じかもしくは異なる種類の他の複数のバイオマーカーと組み合わせて含むことができる。このような場合では、バイオマーカーは、個々の細胞および／または細胞系列の内外で、あらかじめ規定されたまたは無作為化した様式で存在することができ、当業者によって一般に公知である方法（例えば、ハイスループット／次世代ＤＮＡ配列決定、顕微鏡、フローサイトメトリー、質量分析計など）を使用して定量および／または測定することができる。
【００３７】
細胞マーカーは、何らかの便利な方法を使用して細胞に送達することができる。いくつかの場合では、細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）は、ウイルスベクターを介して組織に送達される。何らかの便利なウイルスベクターを使用することができ、例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
後の作業実施例からの一例（図４のＡを参照されたい）では、複数の細胞マーカーを、レンチウイルスベクターを介して標的組織に送達した。２成分バーコードを含む１つのバーコード付き核酸を各ウイルス粒子が含んだレンチウイルス粒子のライブラリーを使用し、ここで、第１の成分は、コードした各ガイドＲＮＡに固有であり、第２の成分は、各分子に固有であり、それにより、ひいては検出および定量／測定されるべき各細胞系列に固有であるようになっていた。バーコードの第２の成分の配列についての式は、ＮＮＮＮＮＴＴＮＮＮＮＮＡＡＮＮＮＮＮであった。したがって、１９塩基対の鎖では、該塩基対のうちの１５は定義されていなかった（例えば、無作為化）。ライブラリーの各バーコード付き核酸は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードし、（ｉｉ）第１のバーコード、すなわち、異なる各ガイドＲＮＡ配列をそれ自体の固有の８ヌクレオチドバーコードへ連結するようにガイドＲＮＡへ連結した固有識別子の８ヌクレオチドバーコードを含んでおり、（ｉｉｉ）第２のバーコード、すなわち、（細胞系列を追跡するための）１５の規定されていない位置を有する先のランダムな１９ヌクレオチドバーコード、および（ｉｖ）発現が標的組織内のＣａｓ９発現につながる遺伝子編集タンパク質（ＣＲＥ）をコードしていた。したがって、この場合では、複数のバーコード付き核酸の複数の異なるメンバーは、同じ第１のバーコードを含んでおり、各第１のバーコードは、「相応の」ガイドＲＮＡを有していた。しかしながら、第２のバーコードは、検出および定量／測定される各細胞系列が固有識別子を有するように、ライブラリーの各メンバーに固有とした。したがって、いくつかのメンバーは共通のガイドＲＮＡを共有していたので、第１のバーコード配列を共有しており、ライブラリーの各メンバーは、各組込み（すなわち、各系列）を追跡するために使用することができる第２の固有バーコードを有していた。
【００３９】
いくつかの場合では、遺伝性で識別可能である複数の細胞マーカーは、遺伝性であり互いに識別可能である、および細胞マーカーが関係づけられている別の複数の細胞マーカーの細胞マーカーとは識別可能である、１つ以上（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、５つ以上、７つ以上、９つ以上、１１個以上、１３個以上、１５個以上、または２０個以上）の複数の細胞マーカーと関係づけられている。例えば、１つのバーコード付き核酸は、４成分バーコードを含むことができ、ここで、第１の成分は、候補療法（例えば、候補抗癌化合物）に固有であり、第２の成分は、各個体（例えば、候補療法を受ける可能性があるまたは可能性がないマウス）に固有であり、第３の成分は、コードされたガイドＲＮＡに固有であり、第４の成分は、各分子に固有であるので、バーコード付き核酸が、検出および定量／測定されるべき各細胞系列に固有であるろう。したがって、この例では、各細胞系列の細胞数を定量／測定することができ、各細胞系列はまた、その４成分核酸バーコードによって、該細胞系列におけるガイドＲＮＡによって誘導される特定の遺伝的混乱、該細胞系列が遭遇する特定の候補療法、および細胞系列が存在する特定の個体（例えば、マウス）に直接連結することもできる。
【００４０】
いくつかの場合では、バーコードは、相同性指向型修復（ＨＤＲ）、または、例えば、規定した核酸配列をゲノム内の所望の位置へと組み込む何らかの他の機序のためのＤＮＡドナーテンプレートへと組み込まれる。例えば、ＨＤＲ修復テンプレートを使用して、同じコード変更（例えば、同じコード対立遺伝子）、または所望の変更の部分セットさえ、接触する細胞のゲノム内へと導入することができるが、各組込み事象は、ＨＤＲテンプレートのライブラリーが、特定の位置で無作為化されていたので、独立してタグ付けすることができる。後の作業実施例からの一例（例えば、図２３のＡを参照されたい）では、複数の細胞マーカー（各ＡＡＶ粒子が１つのＨＤＲテンプレートを含むＡＡＶ粒子のライブラリー）をＡＡＶ粒子によって標的組織に送達した。各ＡＡＶのＨＤＲテンプレートには、Ｋｒａｓコドン１２および１３または野生型Ｋｒａｓ配列における１２の起こり得る非同義の単一ヌクレオチド点突然変異のうちの１つと、ＨＤＲを受ける各細胞を固有にタグ付けするための、隣接するコドンのウォッブル位置におけるランダムな８ヌクレオチドバーコードとが含まれていた。バーコードは、（Ｎ）ＧＧ（Ｎ）ＡＡ（Ｒ）ＴＣ（Ｎ）ＧＣ（Ｎ）ＣＴ（Ｎ）ＡＣ（Ｎ）ＡＴ（Ｈ）（配列番号１）とし、したがって、８つの位置が規定されていない２２塩基対の鎖とした。
【００４１】
いくつかの場合では、細胞マーカーは、外部の混乱に応答して組織に接触することができる（例えば、候補抗癌療法）。このような場合では、外部混乱因子の投与は、調整可能な確率で、またはシグナル（例えば、細胞のあらかじめ規定した生理学的状態、特定の遺伝子の発現レベル、遺伝子の１つのセット、もしくは遺伝子の複数のセット、特定の１つまたは複数の経路の活性のレベル、または細胞もしくは細胞系列の内外の他のシグナル（例えば、組織の同一性、血液供給レベル、個体全体の免疫状態、細胞の物理的な位置など））のマッチングの組み合わせの結果として確率的に発生することがある。例えば、細胞マーカー（例えば、バーコード付きＤＮＡ）は、特定の種類の上皮細胞に特異的なエンハンサーの制御下にあるガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９との両方の発現の際に、組織が存在する個体に投与される化合物に応じて、組織に接触することができる。
【００４２】
いくつかの場合では、細胞マーカーは、個々の生物においてインビボで、または培養物もしくはオルガノイド培養物中の細胞集団においてインビトロで、健常なまたは罹患した細胞集団または組織に接触することができる。いくつかの場合では、細胞マーカーは、数または静的状態が増減する腫瘍性細胞系列に接触することができる。いくつかの場合では、細胞マーカーは、薬物の投与または他の生理学的もしくは環境上の混乱に応じて、確率的に調整可能な確率で、またはある特定の数の細胞分裂後に細胞マーカーが組織に接触するように誘導した計数機序を介して、実際にまたは確率的に、調整可能な平均および分散ならびに他のモーメントで、またはシグナルのマッチングの組み合わせの結果として組織に接触することができる。
【００４３】
標的細胞の遺伝子修飾（変化）
先に記載したように、いくつかの実施形態では、この方法は、細胞マーカーが導入される細胞を遺伝子修飾することを含む。いくつかのこのような場合では、導入された細胞マーカーは遺伝子修飾の薬剤である。例えば、いくつかの場合では、細胞マーカーは、遺伝子修飾（例えば、ゲノム修飾）を誘導するバーコード付き核酸であり、いくつかのこのような場合では、腫瘍細胞形成を誘導するバーコード付き核酸である。例えば、バーコード付き核酸からのＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）および／またはタンパク質（例えば、Ｃｒｅ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質など）の発現は、１つまたは複数のゲノム変化につながる可能性があり、いくつかの場合では、ゲノムの変化の結果、標的細胞から腫瘍細胞への変化がもたらされる（例えば、いくつかの場合では、結果として腫瘍形成をもたらす可能性がある）。
【００４４】
しかしながら、細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）がゲノム修飾を導入するか否かは、該細胞マーカーが腫瘍細胞形成を誘導することができるか否かとは無関係である可能性がある。例えば、いくつかの場合では、バーコード付き核酸は癌遺伝子（タンパク質として発現すると腫瘍細胞の形成につながる可能性がある遺伝子）をコードすることができる。いくつかのこのような場合では、バーコード付き核酸は、標的細胞におけるゲノム変化を誘導しないが、癌遺伝子の発現により腫瘍細胞の形成を誘導する。いくつかの場合では、癌遺伝子は野生型タンパク質をコードしており、該タンパク質が過剰発現すると細胞を腫瘍性にする可能性がある。いくつかの場合では、癌遺伝子は、タンパク質が発現したときに細胞を腫瘍性にする可能性がある変異タンパク質（例えば、変異型のＫＲＡＳ）をコードする。いくつかの場合では、細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）が標的細胞においてゲノム修飾を導入するが、修飾は、細胞マーカーの導入および関係するゲノム修飾の前、間、または後の期間に生じる可能性がある１つまたは複数の追加のゲノム修飾と組み合わせて、腫瘍形成（例えば、腫瘍／癌形成）を誘導するのみである。
【００４５】
もう一方で、いくつかの場合では、細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）は、標的細胞においてゲノム修飾を導入するが、該修飾は、腫瘍形成（例えば、腫瘍／癌形成）を誘導しない。例えば、いくつかの場合では、バーコード付き核酸は、不活性の方法で標的細胞のゲノム内へと組み込まれる。
【００４６】
いくつかの場合では、バーコード付き核酸はタンパク質（例えば、野生型または変異タンパク質）をコードし、該タンパク質は必ずしも癌に関連しているとは限らず、例えば、該タンパク質（複数可）は、関心対象の何らかの生物学的過程に関与することができ、該タンパク質の発現は、細胞増殖および／または腫瘍細胞の形成に影響を及ぼさないことがある（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子ではないことがある）。いくつかのこのような場合では、核酸は標的細胞のゲノム内へと組み込まれ、他の場合では、核酸はゲノム内へと組み込まれない（例えば、エピソームで維持されることができる）。いくつかの場合では、バーコード付き核酸は、野生型または変異タンパク質をコードし、例えば、成長／増殖の制御以外のある方法で腫瘍に対して有害であるタンパク質をコードするｃＤＮＡである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、対象の細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）は、標的細胞内でゲノム修飾を導入し、また、腫瘍細胞の形成（例えば、腫瘍／癌の形成）も誘導する。例えば、いくつかの場合では、バーコード付き核酸は、標的遺伝子座での編集を引き起こして腫瘍抑制因子を修飾し、癌遺伝子の発現を変化させ、遺伝子（例えば、Ｋｒａｓ）を編集して腫瘍誘導性対立遺伝子にすることができるなどである。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾を介して腫瘍形成を誘導する。いくつかの実施形態では、癌遺伝子を包含するゲノム修飾は、活性化している突然変異を有する癌遺伝子を担持する組み込まれた導入遺伝子からの終止コドンの切除であり、導入遺伝子の発現は、遺伝子のオープンリーディングフレームの開始時に［リコンビナーゼ部位］−［終止コドン］−［リコンビナーゼ部位］配列（例えば、ＬｏｘＰ−終止コドン−ＬｏｘＰ）の組込みを介して遮断され、それにより、リコンビナーゼ（例えば、ＬｏｘＰの場合はＣｒｅ）の発現が終止コドンの除去を引き起こし、癌遺伝子の転写を活性化する。リコンビナーゼ部位は、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ部位など、トランスジェニック動物の作出に適した何らかのリコンビナーゼ部位であることが可能である。いくつかの実施形態では、癌遺伝子を包含するゲノム修飾は、内在性癌遺伝子における活性化突然変異である（例えば、遺伝子のＣＲＩＳＰＲ切断に続く相同性指向型修復（ＨＤＲ）によって導入）。いくつかの実施形態では、活性化突然変異は、プロトスペーサー隣接部位（ＰＡＭ）突然変異、および導入された突然変異を識別するための活性化癌遺伝粗突然変異から上流または下流のコドン（少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコドン）のウォッブル塩基の突然変異が伴う。いくつかの実施形態では、活性化突然変異は、プロトスペーサー隣接部位（ＰＡＭ）突然変異、および癌遺伝子のスプライシングが中断されないように、癌遺伝子のイントロン内での少なくとも３、６、９、１２、１５、１８、または２０ヌクレオチドの突然変異が伴う。このようなバーコードをＫｒａｓのイントロンへと組み込んだ図を図５２に実証する。癌遺伝子を包含するゲノム修飾が内在性癌遺伝子の導入遺伝子または突然変異であるか否かにかかわらず、癌遺伝子は、細胞モデル、動物モデル、またはヒト腫瘍において腫瘍促進活性を有することが実証された、Ｈｒａｓ、Ｋｒａｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ、Ｒａｆ、またはｍｙｃを含むがこれらに限定されない何らかの哺乳動物遺伝子であることができる。いくつかの実施形態では、癌遺伝子は、以下の表１からの遺伝子のうちの１つである。
【００４８】
【表１】
2022502063.tif 000003
【００４９】
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾は、腫瘍抑制遺伝子または腫瘍抑制遺伝子活性に重要な断片の切除であり、遺伝子（またはその重要な断片）は、リコンビナーゼの発現が腫瘍抑制遺伝子または腫瘍抑制遺伝子活性に重要な断片の切除を引き起こすように、リコンビナーゼ部位がすでに隣接している。リコンビナーゼ部位は、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、ΦＣ３１インテグラーゼ、ＫＤ酵母リコンビナーゼ、Ｒ酵母リコンビナーゼ、Ｂ２酵母リコンビナーゼ、またはＢ３酵母リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ部位など、トランスジェニック動物の作出に適した何らかのリコンビナーゼ部位であることが可能である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾は、インデルの組込みである（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ指向型二本鎖切断を介する）。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾は、腫瘍抑制遺伝子の早期終結または腫瘍抑制遺伝子のオープンリーディングフレームからのナンセンス配列の発現を引き起こすフレームシフト突然変異を導入するインデルの組込み（例えば、ＣＲＩＳＰＲ指向型二本鎖切断を介する）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾は、腫瘍抑制遺伝子の転写を防止する（例えば、腫瘍抑制プロモーターの重要な要素の破壊を介する）インデルの組込み（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ指向型二本鎖切断を介する）である。いくつかの実施形態では、インデルの組込みである腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾はまた、インデルの部位に対して指向するｓｇＲＮＡの組込みも包含する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを識別するバーコード核酸配列が伴う（例えば、標的とされた腫瘍抑制遺伝子の特定の部位を識別するため、または標的とされた腫瘍抑制遺伝子を識別するため）。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを識別するバーコード核酸配列および細胞へ導入されたＤＮＡの個々の分子を識別する固有分子識別子配列（ＵＭＩ）（例えば、個々の腫瘍を識別するため）が伴う。腫瘍抑制遺伝子を包含するゲノム修飾がリコンビナーゼ介在性切除であろうと、腫瘍抑制遺伝子へのインデルの導入であろうと、腫瘍抑制遺伝子は、ｐ５３、Ｌｋｂ１、Ｓｅｔｄ２、Ｒｂ１、Ｐｔｅｎ、Ｎｆ１、Ｎｆ２、Ｔｓｃ１、Ｒｎｆ４３、Ｐｔｐｒｄ、Ｆｂｘｗ７、Ｆａｔ１、Ｌｒｐ１ｂ、Ｒａｓａ１、Ｌａｔｓ１、Ａｒｈｇａｐ３５、Ｎｃｏａ６、Ｎｃｏｒ１、Ｓｍａｄ４、Ｋｅａｐ、Ｕｂｒ５、Ｍｇａ、Ｃｌｃ、Ａｔｆ７ｉｐ、Ｇａｔａ３、Ｒｂｍ１０、Ｃｍｔｒ２、Ａｒｉｄ１ａ、Ａｒｉｄ１ｂ、Ａｒｉｄ２、Ｓｍａｒｃａ４、Ｄｎｍｔ３、Ｔｅｔ２、Ｋｄｍ６ａ、Ｋｍｔ２ｃ、Ｋｍｔ２ｄ、Ｄｏｔ１ｌ、Ｅｐ３００、Ａｔｒｘ、Ｂｒｃａ２、Ｂａｐ１、Ｅｒｃｃ４、Ｐｏｌｅ、Ａｔｍ、Ｗｍ、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｄｋｎ２ｃ、またはＳｔａｇ２を含むがこれらに限定されない、細胞モデル、動物モデル、またはヒト腫瘍における機能の部分的なまたは完全な喪失の下で腫瘍促進活性を有することが実証された何らかの哺乳動物遺伝子であることが可能である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、以下の表２からの遺伝子のうちの１つである。
【００５０】
【表２】
2022502063.tif 000004
【００５１】
先に記載したように、バーコード付き核酸からのＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）および／またはタンパク質（例えば、Ｃｒｅ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質など）の発現は、１つまたは複数のゲノム変化につながる可能性があり、いくつかの場合では、ゲノムの変化の結果、標的細胞から腫瘍細胞への変化がもたらされる（例えば、いくつかの場合では、結果として腫瘍形成をもたらす可能性がある）。いくつかの実施形態では、標的細胞のゲノム変化は、腫瘍性特徴の発症から（例えば、腫瘍の発症から）一時的に分離することができる。一例として、ベクター（複数可）は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡの一時的な制御および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ核酸誘導タンパク質活性（例えば、Ｃａｓ９活性）の一時的な制御を可能にするように操作することができた。
【００５２】
いくつかの場合では、遺伝的（例えば、ゲノム）修飾を導入するタンパク質が標的細胞内で発現する。タンパク質は、タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）として標的細胞内へ導入することができる。タンパク質はまた、細胞内の核酸によってすでにコードされている可能性があり（例えば、細胞内のゲノムＤＮＡによってコード）、この方法は、タンパク質の発現を誘導することを含む。いくつかの場合では、標的組織の標的細胞内の遺伝子修飾を導入するタンパク質は、ゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼである（そのいくつかは「プログラム可能」であり、そのいくつかはそうではない）。例としては、プログラム可能な遺伝子編集タンパク質（例えば、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）などのＤＮＡ誘導ポリペプチド、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ，ＣａｓＹ，Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質）（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ；１５（３）：１６９−１８２、およびＢｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７  Ｆｅｂ  ９；５４２（７６４０）：２３７−２４１を参照されたい）；トランスポゾン（例えば、クラスＩまたはクラスＩＩトランスポゾン−例えば、ピギーバック、スリーピングビューティー、Ｔｃ１／マリナー、Ｔｏｌ２、ＰＩＦ／ハービンジャー、ｈＡＴ、ミューテーター、マーリン、トランシブ、ヘリトロン、マーベリック、フロッグプリンス、ミノス、ハイマール１など）；メガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩＩ、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｔｌｉ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ  ＩＩ、ＰＩ−ＳｃｅＶなど）；メガＴＡＬ（例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｆｅｂ；４２（４）：２５９１−２６０１を参照されたい）；ファージ由来インテグラーゼ；Ｃｒｅタンパク質；Ｆｌｐタンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質）は、ヌクレアーゼ活性を除去する（ヌクレアーゼデッドタンパク質である）１つまたは複数の突然変異を有しており、タンパク質は転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ／ＣＲＩＳＰＲｉ）に融合している。いくつかの場合では、ゲノム編集ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質）は、ヌクレアーゼ活性を除去する（ヌクレアーゼデッドタンパク質である）またはヌクレアーゼ活性を部分的に除去する（ニッカーゼタンパク質である）１つまたは複数の突然変異を有しており、タンパク質の機能または活性を調節する１つまたは複数の追加の突然変異、およびタンパク質がデアミナーゼドメイン（例えば、ＡＤＡＲ、ＡＰＯＢＥＣ１など）に融合し、それ自体がタンパク質の機能もしくは活性を調節する１つまたは複数の追加の突然変異を有することができるか、またはデアミナーゼドメインおよび１つまたは複数の追加のタンパク質もしくはペプチド（例えば、バクテリオファージＧａｍタンパク質、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤など）へ融合し、これらはまた、タンパク質の機能または活性（例えば、ＲＮＡ塩基エディター、ＤＮＡ塩基エディター）を調節する１つまたは複数の追加の突然変異を有することもできる。
【００５３】
いくつかの場合では、ＣｒｅまたはＦｌｐなどの編集タンパク質を、ゲノムからの別のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質）の発現を誘導する目的で、標的組織へと導入することができ、例えば、動物は、Ｃａｓ９のｌｏｘ−終止−ｌｏｘ対立遺伝子を含有することができ、導入されたＣｒｅタンパク質（例えば、バーコード付き核酸によってコード）は「終止」の除去をもたらし、したがってＣａｓ９タンパク質の発現をもたらす。
【００５４】
いくつかの実施形態では、バーコード付き核酸は、腫瘍細胞形成を誘導することができ、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、癌遺伝子をコードする核酸（タンパク質の野生型および／または突然変異対立遺伝子を含む）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、およびゲノム編集タンパク質をコードする核酸、のうちの１つまたは複数を含む。
【００５５】
いくつかの場合では、バーコード付き核酸がＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートであるとき、該バーコード付き核酸は、標的細胞のゲノムへと突然変異を導入することができる。いくつかのこのような場合では、ゲノム編集ヌクレアーゼは、ドナーテンプレートを使用してバーコード付き配列を挿入するように標的とされるＤＮＡを開裂させる細胞内に存在する（対象の方法の一部として導入されるかもしくは誘導されるか、または標的とされる細胞内ですでに発現している）。いくつかの場合では、ＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートのライブラリー（複数）には、各分子についての固有配列識別子（バーコード）を有するメンバーが含まれるが、分子は同じ機能的混乱をもたらす（例えば、該分子はすべて、例えば、いくつかの場合では突然変異したアミノ酸配列を有する同じタンパク質の発現をもたらすことができるが、該分子は、コドンのウォッブル位置において異なることがあるので、結果として生じる複数の細胞系列が、突然変異した同じタンパク質を発現するにもかかわらず、互いに識別可能であるようにタンパク質をコードする）。いくつかの場合では、ＨＤＲ  ＤＮＡドナーテンプレートのライブラリー（複数）には、各分子についての固有配列識別子（バーコード）を有するメンバーが含まれ、該分子は、異なる機能的混乱をもたらす（例えば、異なる遺伝子座を標的にすることができ、同じ遺伝子座を標的にすることができるが、異なる対立遺伝子を導入することができるなど）。
【００５６】
いくつかの場合では、バーコード付き核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡであるか、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子である。このような分子のライブラリーには、異なる遺伝子座を標的とする分子および／または同じ遺伝子座を標的とする分子を含むことができる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸は、癌遺伝子をコードし、該癌遺伝子には、本開示の目的のために、過剰発現した時に腫瘍細胞の形成を引き起こすことができる野生型タンパク質、および腫瘍細胞の形成を引き起こすことができる変異タンパク質（例えば、ＫＲＡＳであって、後の作業実施例を参照されたい）を含む。このような分子のライブラリーは、同じ癌遺伝子を発現する分子または異なる癌遺伝子を発現する分子のライブラリーを含むことができる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および／またはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ分子（複数可）を含む（例えば、何らかの所望の遺伝子、例えば腫瘍抑制因子に対して標的とすることができる）。このような分子のライブラリーは、同じｓｈＲＮＡを発現する分子または異なるｓｈＲＮＡを発現する分子のライブラリーを含むことができる。いくつかの場合では、バーコード付き核酸には、１つまたは複数のゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡおよび／またはＤＮＡが含まれる（例、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸまたはＣａｓＹなどのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質；Ｃｒｅリコンビナーゼ；Ｆｌｐリコンビナーゼ；ＺＦＮ；ＴＡＬＥＮなどについては、上述を参照されたい）。このような分子のライブラリーは、同じゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼを発現する分子、または異なるゲノム編集タンパク質／エンドヌクレアーゼを発現する分子のライブラリーを含むことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、識別可能に標識された粒子（例えば、ビーズ、ナノ粒子など）である。例えば、いくつかの場合では、粒子は、識別可能な質量タグ（質量分析を介して分析することができる）、識別可能な蛍光タンパク質、識別可能な無線タグなどで標識することができる。
【００５８】
検出／測定／計算
対象の方法はまた、例えば、遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定するステップも含むことができる。
【００５９】
いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと、組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）に経過した時間は、遺伝性であると標識された細胞が少なくとも１回の分裂（例えば、少なくとも２回、４回、６回、８回、１０回、または１５回の細胞分裂）を受けるために十分な時間である。いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）に経過した時間は、２時間以上（例えば、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３６時間以上）である。いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）に経過した時間は、１日以上（例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、７日以上、１０日以上、または１５日以上、２０日以上、または２４日以上）である。いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）に経過した時間は、１週間以上（例えば、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、７週間以上、または１０週間以上）である。いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）の経過時間は、２時間〜６０週間（例えば、２時間〜４０週間、２時間〜３０週間、２時間〜２０週間、２時間〜１５週間、１０時間〜６０週間、１０時間〜４０週間、１０時間〜３０週間、１０時間〜２０週間、１０時間〜１５週間、１８時間〜６０週間、１８時間〜４０週間、１８時間〜３０週間、１８時間〜２０週間、１８時間〜１５週間、１日〜６０週間、１日〜４０週間、１日〜３０週間、１日〜２０週間、１日〜１５週間、３日〜６０週間、３日〜４０週間、３日〜３０週間、３日〜２０週間、３日〜１５週間、１週間〜６０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間〜２０週間、または１週間〜１５週間）の範囲である。いくつかの場合では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間（組織を複数の細胞メーカーと接触させることと組織内に存在する細胞マーカーを検出／測定することとの間）の経過時間は、２時間〜３００週間（例えば、２時間〜２５０週間、２時間〜２００週間、２時間〜１５０週間、２時間〜１００週間、２時間〜６０週間、２時間〜４０週間、２時間〜３０週間、２時間〜２０週間、２時間〜１５週間、１０時間〜３００週間、１０時間〜２５０週間、１０時間〜２００週間、１０時間〜１５０週間、１０時間〜１００週間、１０時間〜６０週間、１０時間〜４０週間、１０時間〜３０週間、１０時間〜２０週間、１０時間〜１５週間、１８時間〜３００週間、１８時間〜２５０週間、１８時間〜２００週間、１８時間〜１５０週間、１８時間〜１００週間、１８時間〜６０週間、１８時間〜４０週間、１８時間〜３０週間、１８時間〜２０週間、１８時間〜１５週間、１日〜３００週間、１日〜２５０週間、１日〜２００週間、１日〜１５０週間、１日〜１００週間、１日〜６０週間、１日〜４０週間、１日〜３０週間、１日〜２０週間、１日〜１５週間、３日〜３００週間、３日〜２５０週間、３日〜２００週間、３日〜１５０週間、３日〜１００週間、３日〜６０週間、３日〜４０週間、３日〜３０週間、３日〜２０週間、３日〜１５週間、１週間〜３００週間、１週間〜２５０週間、１週間〜２００週間、１週間〜１５０週間、１週間〜１００週間、１週間〜６０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間〜２０週間、１週間〜１５週間）の範囲である
【００６０】
識別可能な各細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）について検出されたシグナルの量（レベル）を使用して、接触した組織（遺伝性細胞マーカーが導入された組織）内に存在する細胞の数を決定することができる。何らかの便利な方法を使用して、細胞マーカーを検出／測定することができ、当業者は、使用される細胞マーカーの種類が測定にどの方法を使用すべきかを設定することを理解する。例えば、質量タグを使用する場合、質量分析が測定のために選択される方法であってよい。バーコード付き核酸を細胞マーカーとして使用する場合、配列決定（例えば、ハイスループット／次世代配列決定）が測定のために選択される方法であってよい。いくつかの場合では、ハイスループット配列決定を使用し、検出された各バーコードの配列読み取り数を使用して、その特定のバーコードを含有した細胞の数を決定することができる。いくつかの場合では、重要な量は、各系列における細胞数ではなく、むしろ、ある特定の細胞数を超過するクローン系列の数である。
【００６１】
いくつかの場合では、配列決定（例えば、ハイスループット／次世代配列決定）をＰＣＲ産物に関して実行し、ここで、ＰＣＲ産物は、細胞内での細胞マーカーからバーコード領域を増幅したＰＣＲ産物に由来する（いくつかの場合では、組み込まれた核酸にバーコードを付与したゲノム領域に由来する）（例えば、図１のＡを参照されたい）。
【００６２】
いくつかの場合では、腫瘍内の腫瘍細胞の数の定量、ならびに追加の表現型分類および分析は、プールされた試料、単一、複数、もしくは組み合わせて配置されたバイオマーカー（例えば、蛍光タンパク質、細胞表面タンパク質、および抗体）を介して、または組織、器官、細胞培養、もしくは細胞増殖の他の可能な手段からの個々の腫瘍の解剖を介して選別された試料から行われる。
【００６３】
いくつかの場合では、「ベンチマーク」を使用して細胞数を計算する上で役立てることができる。例えば、いくつかの場合では、対照を試料へと「スパイク」することができる。例えば、スパイクされた（スパイクイン）対照を使用して、細胞ごとの配列読み取りの数（例えば、配列読み取りごとの細胞数）を決定することができる。例えば、いくつかの場合では、スパイクされた（スパイクイン）対照を使用して、測定されたＤＮＡの量をＤＮＡが由来する細胞の数と相関させることもできる。例えば、既知の数の細胞を使用してＤＮＡを調製することができ、接触した組織（本開示の方法によって遺伝性細胞マーカーと接触した組織）の細胞から抽出したＤＮＡと並行してＤＮＡを加工することができる。このようなスパイクされた（スパイクイン）対照（「ベンチマーク」）には、それ自体の固有のバーコードを含めることができる。スパイクされた対照からの結果は、配列決定反応において検出された配列読み取りの数によって表される細胞の数を導出／計算するために使用することができる（すなわち、スパイクされた（スパイクイン）対照は、測定値の量、例えば配列読み取りの数を細胞数、例えば、絶対細胞数へと変換するための係数を提供するために使用することができる）。このようなプロセスは「正規化」と呼ぶことができ、例えば、配列決定結果は、検出された各固有バーコードについて読み取り数を提供し、次にこの値を１つまたは複数の「ベンチマーク」と比較して、検出された固有バーコードを含んだ細胞の絶対数を計算することができる（例えば、図１のＡを参照されたい）。
【００６４】
いくつかの場合では、複数のクローン細胞集団が対象組織を遺伝性細胞マーカーと接触させることによって検出可能であり、いくつかの場合では識別可能な核細胞集団が同様の遺伝子型を有しているので、対象の方法を使用して集団サイズの分布（例えば、腫瘍サイズの分布）を特定の表現型について提供することができる。例えば、初回の接触がすべての接触した細胞において同様のゲノム変化を引き起こす（例えば、すべての細胞が同じ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡを受け取る場合、すべての細胞が同じ癌遺伝子対立遺伝子をコードする核酸を受け取る場合など）が、各細胞集団（例えば、腫瘍）が独立している場合、結果として生じる細胞集団サイズは、その特定の遺伝子型についてのクローン細胞集団サイズの分布を提供することができる。例えば、対象の方法を実行する目的は、特定の方法において腫瘍の挙動を変化させる（例えば、腫瘍自体の数を変えずに大きさの分布を変える）遺伝的変化について検索することであってよい。例えば、以下の作業実施例（例えば、作業実施例１を参照されたい）には、ｐ５３欠損を有する腫瘍に罹患している動物が、最大の腫瘍に対してべき乗則分布していた腫瘍サイズ分布を生じたという実証が含まれている（非常に大きな腫瘍が追加の、獲得されるのが稀少なドライバー突然変異によって生じるＭａｒｋｏｖ過程と一致）。逆に、Ｌｋｂ１の不活性化を有する腫瘍に罹患している動物は、病変の大部分の大きさが増加しており、通常の指数関数的な成長過程を示唆した（例えば、図１０、図１３、図１６、および図２０を参照されたい）。
【００６５】
大きさ分布の測定結果は、いくつかの異なる方法において使用することができる。例えば、本明細書に説明する方法を実行することによって、所与の遺伝子型についての細胞集団サイズ（例えば、腫瘍サイズ）のベースラインの大きさの分布を決定することができ、かつ該大きさの分布を、同様に処理された動物がまた試験化合物（例えば、候補抗癌療法）を用いて処置されたときに測定される大きさの分布と比較することができる。大きさの分布の変化は、試験化合物が有効であったか否かの尺度として使用することができる。実施例として、本発明者らは、ｐ５３欠損を有する腫瘍に罹患しているマウスの腫瘍サイズの分布についてのベースライン測定値を決定し、ｐ５３欠損が他の腫瘍と比較してはるかに大きいいくつかの腫瘍につながる傾向があることを発見した。したがって、ｐ５３欠損腫瘍サイズの分布は標準分布ではないが、代わりに外れ値の腫瘍が含まれていた。本明細書に説明する方法を使用して、腫瘍サイズの分布を変化させるが腫瘍の動物を必ずしも治癒させない潜在的な治療法（例えば、小分子、高分子、放射線、化学療法、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、生物製剤、化合物など）をスクリーニングすることが可能である。例えば、療法（例えば、化合物）は、すべてのｐ５３欠損腫瘍を根絶するわけではないが、代わりに外れ値の大きな腫瘍の形成を阻害することがわかる。試験した化合物は必ずしも全体的な腫瘍数（腫瘍量）も腫瘍サイズの平均さえも低減させるとは限らないこと（およびこのような化合物は、腫瘍の成長を阻害することに対して何ら効果を有さない化合物として、他の方法を使用して棄却されるであること）から、このような変化は標準的な方法を用いて検出されないことがあるが、このような療法（例えば、化合物）は、ｐ５３欠損腫瘍患者を処置するための臨床設定において非常に有用である可能性があり、その理由は最も進行した腫瘍（例えば、最大のより危険な腫瘍）に対して有効である（外れ値の腫瘍の危険性を低減させる）からである。
【００６６】
したがって、いくつかの場合では、対象の方法は、候補療法（例えば、小分子、高分子、放射線、化学療法、絶食、抗体、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、生物製剤、化合物など）を集団サイズ（例えば、腫瘍の成長／増殖）に対する該候補療法の効果についてスクリーニングするために使用することができる。例えば、対象の方法は、試験療法、例えば、化合物（例えば、薬物）の存在下で実施することができ（例えば、この方法は、例えば、個体への投与を介して、組織を試験化合物と接触させるステップを含むことができる）、該薬物の効果は、例えば、薬物が添加されなかった（例えば、対照ビヒクル）並行実験との比較を介して測定することができる。系列で標識された細胞集団が遺伝的に同じ（または類似）である場合では、このような方法は、該化合物が細胞集団サイズの分布に対する効果を有するか否かを試験することができる。差次的に標識された細胞が異なる遺伝子型を有する（例えば、異なる遺伝子が変異している、および／または異なる細胞系列において発現している）場合では、療法（例えば、化合物）は、複数の異なる遺伝子型に対して例えば、組織が生きている動物においてインビボで存在する場合では、同じ動物において同時に試験することができる。いくつかの場合では、このような実験および／または療法（例えば、化合物）のスクリーニングは、培養物中で成長した組織（例えば、２次元培養組織、３次元培養組織、オルガノイド培養物）に関して実施することができる。いくつかの場合では、このような方法は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）、ブタ、モルモット、非ヒト霊長類などの非ヒト動物において実施することができる。
【００６７】
いかなる混乱因子（例えば、小分子、高分子（例えば、抗体またはおとり受容体）、放射線療法、化学療法、炎症誘発剤、ホルモン、ナノ粒子、免疫細胞療法、酵素、ウイルス、環境介入（例えば、断続的断食、一過性の運動、食事制限）など）は、標識した複数の細胞集団についての集団サイズに対する該混乱因子の効果について評価することができる。遺伝的混乱は、該遺伝的混乱の影響を評価するために、すべてのクローン系列において誘導することもできる。すべての系列が同じ初発遺伝子型である場合では、個々のクローン系列の応答（例えば腫瘍）を決定することができる。クローン系列が、規定された異なる変化を有するように誘導された場合では、異なる変化を伴うクローン系列に対する誘導性の遺伝的混乱の影響を決定することができる。誘導性遺伝子変化を生じる系には、Ｆｌｐ／ＦＲＴ系またはＣｒｅ／ｌｏｘＰ系の（ＦｌｐまたはＣｒｅにより調節される対立遺伝子で発症しなかった細胞系列における）、またはテトラサイクリンの調節可能な系（例えば、ＴＲＥ−ｃＤＮＡ（複数可）および／またはＴＲＥ−ｓｈＲＮＡ（複数可）および／またはＴＲＥ−ｓｇＲＮＡ（複数可）を用いたｔＴＡまたはｒｔＴＡ）の使用が含まれるが、これらに限定されない。調節可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集および腫瘍細胞の二次的な導入は、一時的な様式でゲノム変化を生じる可能性がある。
【００６８】
いくつかの場合では、標識された複数の細胞集団を有する個体による外部混乱（例えば、候補抗癌療法）の効果とそれに対する（例えば、薬理学的、化学的、代謝上、薬物動態学的、免疫原性、毒物学的、行動学的など）の応答は、細胞マーカーの測定前、測定中、および／または測定後に評価される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、対象の方法は、遺伝性であると標識された細胞（例えば、遺伝性であると標識された腫瘍）を作製した後、標識された１つまたは複数の細胞集団（例えば、１つまたは複数の腫瘍の全部または一部）をレシピエント（例えば、二次レシピエント）または複数のレシピエントへと移植して、例えば、該レシピエント（複数可）に腫瘍を播種することを含む。いくつかの場合では、このようなステップは、「レプリカめっき法」に類似していると見なすことができ、この場合、試験化合物に対して多数の動物をスクリーニングすることができ、ここで、各動物は、同じ開始腫瘍からの細胞から播種される。したがって、いくつかの場合では、この方法は、試験化合物を移植のレシピエント（複数可）に投与して（例えば、この方法は、二次レシピエントにおいて存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出することおよび測定することを含むことができる）、例えば、移植した細胞の成長を評価するステップ（およびこのことが試験化合物の存在下および／または非存在下で行うことができるいくつかの場合）を含む。したがって、対象の方法は、初回に作製された遺伝性であると標識された細胞（例えば、遺伝性であると標識された腫瘍）を１個体以上のレシピエントへと移植し、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された細胞の数を、遺伝性であると標識された細胞の識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて計算することができる。先の場合のうちのいくつか（例えば、連続移植）では、試験化合物を連続移植レシピエントに投与することができ、結果を対照（例えば、移植を受けたが試験化合物を受けていない動物、試験化合物を受けたが移植を受けていない動物）と比較することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝性であると標識された細胞は、再標識される（例えば、再バーコード付与される）。言い換えれば、いくつかの場合では、すでに遺伝性であると標識された細胞の集団（例えば、腫瘍）は、遺伝性であり、互いに識別可能であり、かつ第１の複数の細胞マーカーの細胞マーカーと識別可能である、第２の複数の細胞マーカーと接触する。このように、ユーザーは、例えば、標識された細胞集団（例えば、腫瘍）内で存在する変動性を調査することができる。いくつかの実施形態では、遺伝性マーカー自体は経時的に変化して、クローン系列（例えば、進化するヌクレオチドバーコード）を有する細胞の系統発生を記録する。
【００７１】
遺伝性系列マーカーは、標識された細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの分析を経て細胞系列が決定されることを促進する発現した遺伝子（内在性または操作されたもののいずれか）内でコードすることもできる。いくつかの場合では、細胞マーカーは、異なる種類の細胞マーカーへと変換される（例えば、バーコード付きのＲＮＡまたはタンパク質として標識された細胞によって発現するバーコード付きＤＮＡ）。このような場合では、当業者は、細胞マーカーを測定するために使用される方法が、測定時に、測定されることが所望である細胞マーカーの種類によって決定されることを理解する。例えば、バーコード付きＤＮＡが細胞マーカーとして使用され、バーコード付きＤＮＡがバーコード付きＲＮＡとして発現する場合、ＲＮＡ配列決定（例えば、全トランスクリプトーム配列決定、単一細胞ＲＮＡ配列決定など）は、ＲＮＡバーコードか、測定されることが所望である細胞マーカーの種類か否かを測定するために使用される方法であってよく、またはＤＮＡ配列決定（例えば、全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定、標的とされるＤＮＡの配列決定など）は、ＤＮＡバーコードが、測定されることが所望である細胞マーカーの種類であるか否かかを測定するために使用される方法であってよい。このような場合では、測定する細胞マーカーの選択は、調査する細胞の所望の表現型によって推進され、細胞マーカーに直接連結することができる（例えば、バーコード付きＲＮＡ細胞マーカーは、単一細胞ＲＮＡ配列決定を使用して測定することができるので、ＲＮＡ発現パターンを細胞マーカーに直接連結することができる）。いくつかの場合では、細胞系列マーカーは、単一細胞分析法（例えば、単一細胞ＲＮＡ配列決定、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、ＭＥＲＦＩＳＨ、単一細胞プロテオミクス）を使用して測定できるので、各系列由来の個々の細胞を他の各系列由来の個々の細胞に関連付けることができる。このような場合では、各系列内での細胞の表現型が調査される。このような場合では、これらの分析を使用して、外部の混乱（例えば、薬物処置）に対する異なる系列の細胞の表現型応答を評価することもできる。
【００７２】
遺伝性細胞マーカー（例えば、バーコード付き核酸）を検出および測定するとき、いくつかの場合では、測定結果が組織全体に由来する。このようなものとして、組織試料は、組織から採取された部分であることが可能であるか、または組織全体（例えば、全部の肺、腎臓、脾臓、血液、膵臓など）であることが可能である。このようなものとして、細胞マーカー（例えば、核酸）は、残りの組織を表すように組織試料から抽出することができるか、または組織全体から抽出することができる。
【００７３】
いくつかの場合では、生物学的試料は血液試料である。いくつかの場合では、生物学的試料は、血液試料であるが、接触した組織は血液ではない。例えば、いくつかの場合では、遺伝性であると標識された細胞は、化合物（例えば、タンパク質または核酸などの固有の分泌マーカー）を血中へと分泌することができ、血中に存在する化合物の量を使用して、特定の化合物を分泌する細胞の数を計算することができる。例えば、遺伝性であると標識された細胞は、いくつかの場合では、蛍光タンパク質を血中に分泌することができ、蛍光タンパク質を検出および測定することができ、該蛍光タンパク質を使用して、その特定の化合物を分泌する細胞についての細胞集団サイズを計算することができる。いくつかの場合では、これらの分泌した遺伝性マーカーは、混乱を受けていない個体において、または外部混乱因子（例えば、薬物）の投与後に検出される。
【００７４】
いくつかの場合では、生物学的試料は、体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、腹腔からの流体、胸膜腔からの流体、脳脊髄液など）である。いくつかの場合では、生物学的試料は、体液であるが、接触した組織は体液ではない。例えば、いくつかの場合では、遺伝性であると標識された細胞が、分析物（例えば、タンパク質、核酸、または代謝産物などの固有マーカー）を尿中へと放出することができ、尿中に存在する化合物の量を使用して、その特定の化合物を単独でまたは外部混乱因子（例えば、候補抗癌療法）に対する応答で放出した細胞の数または細胞系列の数を計算することができる。
【００７５】
いくつかの場合では、生物学的試料中の細胞マーカーを測定することは、細胞マーカーと直接的にまたは間接的に関係づけることができ、かつ同じ生物学的試料中にまたは別個の生物学的試料中に存在することができる細胞、細胞成分（例えば、無細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物など）、またはその他の分析物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、ホルモン、溶存酸素、溶存二酸化炭素、ビタミンＤ、グルコース、インスリン、温度、ｐＨ、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、コレステロール、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビンなど）の分析と並行して実施される。
【００７６】
いくつかの場合では、先に記載したように、検出することおよび測定することは、個体から収集された生物学的試料（例えば、血液試料）に関して実施される。いくつかの場合では、検出および測定することは、接触した組織の組織サンプルに関して実施され、これは、いくつかの場合では、接触した組織の一部であることがあるか、または組織全体であることがある。
【００７７】
検出および測定するとき、バイオマーカー（導入された遺伝性細胞マーカー以外）を考慮に入れることができる。例えば、対象の方法は、遺伝性であると標識された細胞のバイオマーカーを検出および／または測定するステップと、遺伝性であると標識された細胞をバイオマーカー測定の結果に基づいて分類するステップとを含むことができる。このようなバイオマーカーは、細胞特徴の数、例えば、増殖状態（例えば、Ｋｉ−６７タンパク質の検出、ＢｒｄＵの取り込みなど）、細胞型（例えば、さまざま細胞型のバイオマーカーを使用）、発生中の細胞系列、幹細胞性（例えば、細胞が幹細胞であるか否か、および／またはどの型の幹細胞であるか）、細胞死（例えば、アネキシンＶ染色、切断されたカスパーゼ３、ＴＵＮＥＬなど）、および細胞シグナル伝達状態（例えば、シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を、例えば、リン特異的抗体を用いて検出）のうちのいずれかを示すことができる。
【００７８】
いくつかの場合では、ある特定の療法または混乱の遺伝子型特異性を理解することを使用して、該療法または混乱の作用機序を（他の療法または混乱との類似性によって）通知することができる。遺伝子型の特異性を明らかにすることによって、本明細書に開示する方法を使用して、規定した遺伝子型の併用療法の予測を行い、試験することができる。療法のパネルは、該パネルの遺伝子型の特異性を確立するために試験することができる
【００７９】
キットおよびシステム
例えば、先の方法のいずれかを行うためのキットおよびシステムも提供される。対象のキットおよび／またはシステムの内容は大きく異なることがある。キットおよび／またはシステムは、例えば、（ｉ）互いに識別可能である遺伝性細胞マーカーのライブラリー（例えば、バーコード付き核酸）、（ｉｉ）対象の方法を実施するための指示、（ｉｉｉ）対象の方法の検出するステップおよび測定するステップから生じた値から細胞数を計算するためのソフトウェア、（ｉｖ）構成されたコンピューターシステム、のうちの１つまたは複数を含む／備えることができる。
【００８０】
先の構成要素に加えて、対象のキットはさらに、対象の方法を実施するための説明書を含むことができる。これらの説明書は、対象のキット内にさまざまな形態で存在することができ、そのうちの１つまたは複数はキット内に存在することができる。これらの説明書が存在することができる一形態は、キットの包装、添付文書中などの、適切な培地または基質に関する印字された情報、例えば情報が印字された１つまたは複数の紙片として存在することができる。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えばディスケット、ＣＤ、フラッシュドライブなどである。存在することができるさらに別の手段は、取り出されたサイトにある情報にアクセスするためにインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。何らかの便利な手段がキット内に存在することができる。
【００８１】
用途
本開示の対象のさまざまな用途の例としては、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
より複雑な遺伝子型の効果の定量：本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の複数対を発現して、各腫瘍内の２つの標的遺伝子の欠失を促進するレンチウイルスベクターを、すでに作製および検証している。腫瘍抑制因子の対に関する組み合わせを標的とするｓｇＲＮＡを用いたレンチウイルス−Ｃｒｅベクターの生成は、腫瘍抑制因子間の協調的および拮抗的な相互作用を高度に並行した様式で明らかにする。
【００８３】
併用療法のスクリーニングを可能にする多重化されたインビボゲノム編集がある。多くのシステムの適応能力により、併用療法は多くの疾患を処置する有効な方法として浮上している。膨大な数の潜在的な治療の組み合わせは、あらゆる組み合わせを患者または前臨床動物モデルにおいてでさえ試験することができなかったという困難な状況をすぐに生み出す。しかしながら、この分析不可能な薬剤の組み合わせのマトリックスには、患者に作用する組み合わせを含有している可能性がある。薬物処置を、追加の薬物標的についてコードする遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在性欠失と組み合わせると、治療組み合わせの多重モデリングが可能となる可能性がある。１００個を超える対に関する薬物処置の効果の調査は、本開示に説明する組成物および方法を使用して並行して実施することができる。例えば、ヒト肺癌のマウスモデルにおける３つの肺癌遺伝子型の流れでこれらの順列を調査すると、インビボでの対に関する薬物ターゲティングの効果を調べるためのセミハイスループットシステムを作製する。
【００８４】
他の種類の癌への拡張：本明細書に説明する方法は、（例えば、腫瘍、例えば、肺腺癌の流れにおいて）細胞の成長／増殖の薬理ゲノム感受性を明らかにするために使用することができ、この方法は、識別可能な系列の集団サイズが関心対象である何らかの便利な癌の種類および／または何らかの便利な状況に適用することができる。例えば、本開示で概略されるアプローチは、例えば、ウイルスベクターを用いて遺伝的に操作されたモデル（例えば、肉腫、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、造血など）において誘発することができるいかなる癌にも適応させることができる。
【００８５】
ヒト肺腺癌内での腫瘍遺伝子型の広範な多様性および潜在的な療法の数の増加に伴い、本開示に説明する多重定量プラットフォームは、トランスレーショナル癌生物学の主力になる可能性がある。本明細書で説明するアプローチによって、トランスレーショナル研究は、正しい療法を正しい患者に有効に適合させることができ、診療所での患者ケアに対して直接的な影響を及ぼす。また、処置に応答する可能性が最も高い腫瘍に罹患している患者の亜集団を用いた臨床試験の実施にも役立つことができ、したがって、薬剤開発の成功率を改善し、ほとんど的を絞れていない臨床試験において失敗に終わった薬剤を救済することもできる。
【００８６】
本開示の非限定的な態様の例
先に説明した本対象の実施形態を含む態様は、単独で、または１つまたは複数の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であることがある。上述の説明を制限することなく、１〜５７に番号付けされた本開示のある特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかとなるように、個々に番号付けされた態様の各々は、上述のまたは後続の個々に番号付けされた態様のうちのいずれかとともに使用することができるか、またはこれと組み合わせることができる。このことは、このような態様のすべての組み合わせに対する支援を提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
【００８７】
１．同じ組織内の複数のクローン細胞集団の集団サイズを測定する方法であって、
（ａ）生物学的組織を、遺伝性で互いに識別可能である複数の細胞マーカーと接触させることであって、それにより接触した組織内で遺伝性であると標識された細胞の複数の識別可能な系列を作製する、接触させることと、
（ｂ）遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定し、それにより、一連の測定値を生成することと、
（ｃ）一連の測定値を入力として使用して、遺伝性であると標識された細胞の識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された細胞の数を計算することと
を含む、方法。
２．接触した組織内での遺伝性であると標識された細胞が、腫瘍細胞である、１に記載の方法。
３．組織が、ステップ（ａ）の前に腫瘍細胞および／または腫瘍を含む、１または２に記載の方法。
４．ステップ（ｂ）の検出することおよび測定することが、組織から収集された生物学的試料に対して実行される、１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．ステップ（ｂ）の検出することおよび測定することが、接触した組織の組織試料に対して実行される、１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【００８８】
６．複数の細胞マーカーの各細胞マーカーが、遺伝性であると標識された細胞の系統の公知の細胞遺伝子型に対応している、１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．接触させることが、遺伝性であると標識された細胞を作製するために、組織の細胞を遺伝的に変化させることを含む、１〜６のいずれか一項に記載の方法。
８．同じ組織の複数の腫瘍の腫瘍サイズを測定する方法である、１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．組織を接触させるステップが、腫瘍細胞を誘導することを含む、１〜８のいずれか一項に記載の方法。
１０．細胞マーカーが、腫瘍細胞形成および／または腫瘍形成を誘導する薬剤である、１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【００８９】
１１．検出することおよび測定することが、接触させることの結果として、接触された組織内に腫瘍が形成されるために十分な時間が経過した後に実行される、１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．複数の細胞マーカーが、バーコード付き核酸を含む、１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．検出することおよび測定することが、検出された各バーコードのハイスループット配列決定、および配列読み取りの数の定量化を含む、１２に記載の方法。
１４．複数の細胞マーカーが、腫瘍細胞形成を誘導するバーコード付き核酸を含む、１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．バーコード付き核酸が、腫瘍細胞形成を誘導し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つまたは複数の癌遺伝子をコードする核酸、１つまたは複数の野生型タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数の突然変異タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、１つまたは複数の短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、および１つまたは複数のゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つまたは複数を含む、１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【００９０】
１６．ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、およびメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、１５に記載の方法。
１７．バーコード付き核酸が、線状または環状ＤＮＡ分子である、１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．バーコード付き核酸が、プラスミド、合成された核酸断片、およびミニサークルから選択される、１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１９．バーコード付き核酸が、ＲＮＡ分子である、１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
２０．バーコード付き核酸が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【００９１】
２１．組織が、無脊椎動物の組織である、１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２２．組織が、脊椎動物の組織である、１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２３．組織が、哺乳動物または魚の組織である、１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２４．組織が、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類の組織、またはヒト組織である、１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２５．組織が、生きている動物の一部である、１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【００９２】
２６．組織が、動物の体外で成長した操作された組織である、１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
２７．組織が、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟部組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、および性器系から選択される、１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．遺伝性であると標識された細胞の少なくとも一部が、少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、方法がさらに、（ｉ）遺伝性であると標識された細胞のバイオマーカーを検出することおよび／または測定することと、（ｉｉ）バイオマーカーの検出することおよび／または測定することの結果に基づいて、遺伝性であると標識された細胞を分類することとを含む、１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．細胞増殖状態、細胞型、発生細胞系列、細胞死、および細胞シグナル伝達状態のうちの１つまたは複数のバイオマーカーである、２８に記載の方法。
３０．細胞マーカーが、ウイルスベクターを介して組織に送達される、１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【００９３】
３１．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターから選択される、３０に記載の方法。
３２．同じ組織のクローンとして独立した複数の腫瘍の腫瘍サイズを測定する方法であって、
（ａ）組織を複数のバーコード付き核酸細胞マーカーと接触させることであって、それにより、接触した組織内で遺伝性であると標識された腫瘍細胞の複数の識別可能な系列を作製する、接触させることと、
（ｂ）遺伝性であると標識された腫瘍細胞の少なくとも一部が少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、接触した組織内に存在するバーコード付き核酸細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を検出および測定し、それにより一連の測定値を生成するためにハイスループット核酸配列決定を実行することと、
（ｃ）一連の測定値を入力として使用して、遺伝性であると標識された腫瘍細胞の該識別可能な系列のうちの少なくとも２つについて、接触した組織内に存在する遺伝性であると標識された腫瘍細胞の数を計算することと
を含む、方法。
３３．組織が、ステップ（ａ）の前に腫瘍細胞および／または腫瘍を含む、３２に記載の方法。
３４．ステップ（ｂ）のハイスループット核酸配列決定が、組織から収集された生物学的試料に対して実行される、３２または３３に記載の方法。
３５．ステップ（ｂ）のハイスループット核酸配列決定が、接触した組織の組織試料に対して実行される、３２または３３に記載の方法。
【００９４】
３６．複数のバーコード付き核酸細胞マーカーの各バーコード付き核酸細胞マーカーが、遺伝性であると標識された腫瘍細胞の系列の公知の細胞遺伝子型に対応している、３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．接触させることが、遺伝性であると標識された腫瘍細胞を作製するために、組織の細胞を遺伝的に変化させることを含む、３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．バーコード付き核酸が、腫瘍細胞形成を誘導する、３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．バーコード付き核酸が、腫瘍細胞形成を誘導し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）ＤＮＡドナーテンプレート、１つまたは複数の癌遺伝子をコードする核酸、１つまたは複数の野生型タンパク質をコードする核酸、１つまたは複数の突然変異タンパク質をコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、およびゲノム編集タンパク質をコードする核酸のうちの１つまたは複数を含む、３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
４０．ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＲＮＡ誘導タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、転写活性化因子またはリプレッサーポリペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ファージ由来インテグラーゼ、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、およびメガヌクレアーゼタンパク質から選択される、３９に記載の方法。
【００９５】
４１．バーコード付き核酸が、線状または環状ＤＮＡ分子である、３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．バーコード付き核酸が、プラスミド、合成された核酸断片、およびミニサークルから選択される、３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
４３．バーコード付き核酸が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは核酸／タンパク質複合体である、３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．組織が、無脊椎動物の組織である、３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．組織が、脊椎動物の組織である、３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【００９６】
４６．組織が、哺乳動物または魚の組織である、３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４７．組織が、ラット組織、マウス組織、ブタ組織、非ヒト霊長類の組織、またはヒト組織である、１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
４８．組織が、生きている動物の一部である、３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
４９．組織が、動物の体外で成長した操作された組織である、３２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
５０．組織が、筋肉、肺、気管支、膵臓、乳房、肝臓、胆管、胆嚢、腎臓、脾臓、血液、腸、脳、骨、膀胱、前立腺、卵巣、眼、鼻、舌、口、咽頭、喉頭、甲状腺、脂肪、食道、胃、小腸、結腸、直腸、副腎、軟部組織、平滑筋、脈管系、軟骨、リンパ、前立腺、心臓、皮膚、網膜、生殖器系、および性器系から選択される、３２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【００９７】
５１．遺伝性であると標識された腫瘍細胞の少なくとも一部が、少なくとも１回の分裂を経るために十分な時間が経過した後、方法がさらに、（ｉ）遺伝性であると標識された腫瘍細胞のバイオマーカーを検出することおよび／または測定することと、（ｉｉ）バイオマーカーの記検出することおよび／または測定することの結果に基づいて、遺伝性であると標識された腫瘍細胞を分類することとを含む、３２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
５２．細胞増殖状態、細胞型、発生細胞系列、細胞死、および細胞シグナル伝達状態のうちの１つまたは複数のバイオマーカーである、５１に記載の方法。
５３．細胞マーカーが、ウイルスベクターを介して組織に送達される、３２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
５４．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ボカウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターから選択される、５３に記載の方法。
５５．組織を試験化合物（例えば、試験薬物）と接触させることと、試験化合物が細胞集団サイズおよび／または細胞集団サイズの分布に対して効果を有していたか否かを決定することとを含む、１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【００９８】
５６．遺伝性であると標識された細胞を作製した後、方法が、遺伝性であると標識された細胞のうちの１つまたは複数を１つまたは複数のレシピエント（例えば、二次レシピエントにおいて腫瘍を播種するための、例えば、二次レシピエント）へと移植すること（例えば、１つまたは複数の腫瘍を移植すること）を含む、１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
５７．試験化合物が、１つまたは複数のレシピエントに投与され、方法が、レシピエント（複数可）内に存在する複数の細胞マーカーのうちの少なくとも２つの量を（試験化合物の存在に応じて、移植した細胞の成長を評価するために）検出および測定することを含む、５６に記載の方法。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように製造および使用するのかに関する完全な開示および説明を提供するように提案されており、本発明者らが自分らの発明として見なすものの範囲を制限するよう意図されておらず、該実施例は、以下の実験が、すべてであるかまたは実施された唯一の実験であることを表すよう意図しているのでもない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験上の誤差および偏差は考慮されるものとする。別段の指示がない限り、部分は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。
【０１００】
実施例１：Ｔｕｂａ−ｓｅｑ：インビボでの腫瘍抑制のあてはめ展望を明らかにするための定量的かつ多重化したアプローチ
癌の成長および進行は、多段階の確率論的進化過程である。癌ゲノム配列決定は、ヒト腫瘍において発生するゲノム変化を識別するために役立ってきたが、これらの変化が天然組織内での腫瘍の成長に及ぼす影響は、ほとんど解明されていないままである。遺伝的に操作されたヒト癌のマウスモデルは、インビボでの腫瘍成長の研究を可能にしているが、結果として生じる腫瘍サイズを正確かつ規模縮小拡大可能な様式で定量化する方法がないので、個々の腫瘍抑制遺伝子の規模および作用様式を理解することができる点は限られてきた。ここでは、本発明者らは、腫瘍バーコード付与を超深度バーコード配列決定（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）を統合して、ヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍抑制機能を調べる方法を紹介する。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、肺腫瘍の３つの典型的な遺伝子型における腫瘍サイズの異なる分布を明らかにする。Ｔｕｂａ−ｓｅｑを多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集と組み合わせることによって、本発明者らはさらに、ヒト肺腺癌において最も頻繁に不活性化される腫瘍抑制経路のうちの１１の効果を定量した。このアプローチは、メチルトランスフェラーゼＳｅｔｄ２とスプライシング因子Ｒｂｍ１０を肺腺癌成長の新規抑制因子として識別する。前例がない解像度、並列化、および精度により、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍抑制遺伝子機能のあてはめ展望を幅広く定量化することができる。
【０１０１】
結果
超ディープバーコード配列決定を用いた腫瘍バーコード付与（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）によって、腫瘍サイズの正確な並列定量が可能となる。腫瘍原性ＫＲＡＳは、ヒト肺腺癌の鍵となる推進因子であり、早期肺腫瘍は、肺上皮細胞におけるＣｒｅの発現が腫瘍原性ＫｒａｓＧ１２Ｄの発現につながるＬｏｘＰ−ＳｔｏｐーＬｏｘＰ  ＫｒａｓＧ１２Ｄノックインマウス（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋）を用いてモデル化することができる。ＬＫＢ１およびＰ５３は、腫瘍原性ＫＲＡＳ推進型ヒト肺腺癌において頻繁に変異する腫瘍抑制因子であり、Ｌｋｂ１欠損症およびｐ５３欠損症は、腫瘍原性ＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍のマウスモデルにおいて腫瘍量を増加させる（図７のＡ）。肺癌のウイルス−Ｃｒｅ誘導マウスモデルは、多数の腫瘍の同時発症を可能にし、個々の腫瘍はレンチウイルス介在性ＤＮＡバーコード付与によって安定してタグ付けすることができる。それゆえ、本発明者らは、バルクの腫瘍を担持する肺からのレンチウイルスバーコード領域のハイスループット配列決定が、固有のバーコードを付与した各腫瘍内での癌細胞の数を定量化することができるか否かを判断しようとした（図７のＢ）。
【０１０２】
腫瘍原性のＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍の成長、および腫瘍の成長に対するＬｋｂ１およびｐ５３の喪失の影響を調べるために、本発明者らは、１０６個よりも多数の固有ＤＮＡバーコードを含有しているレンチウイルス−Ｃｒｅベクター（Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ）のライブラリーを用いて、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）マウス、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＬＴ）マウス、およびＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰＴ）マウスにおいて腫瘍を発症させた（図１のＡおよび図７のＢ）。腫瘍の発症から１１週間後、ＫＴマウスは広範囲の過形成およびいくつかの小さな腫瘍塊を発達させた（図１のＢおよび図７のＣ）。興味深いことに、ＫＬＴマウスは比較的均一な大きさの大きな腫瘍を有していたが、ＫＰＴマウスは非常に多様な範囲の腫瘍サイズを有していた（図１のＢ）。
【０１０３】
超ディープ配列決定を用いてあらゆる病変における癌細胞数を定量化するために、本発明者らは、組み込まれたレンチウイルスバーコード領域を、各マウスから単離されたバルクの肺ＤＮＡの約１／１０からＰＣＲ増幅し、これを１匹のマウスあたり１０７を超える読み取りの平均深度まで配列決定した（図１のＡ、方法）。本発明者らは、マウス内での腫瘍サイズの１０００倍を超える変動を観察した（図１のＣ）。小さな病変からのバーコード読み取りは、固有の腫瘍を表すか、またはより大きな腫瘍からの同様のバーコードの再発性の配列決定エラーから生じる可能性がある。これらの偽の腫瘍の発生を最小限にするために、本発明者らは、配列決定エラーの統計モデルを生成するアルゴリズム（ＤＡＤＡ２）を使用して同じ腫瘍バーコードから派生すると予測される読み取りを集約した（図２および図８）。ＤＡＤＡ２の集約率および最小の腫瘍サイズはまた、腫瘍呼び出しパイプラインの再現性を最大限にするようにも選択された（図８のＤ〜Ｆ）。これらのアプローチは、腫瘍の定量に対する再発性の配列決定エラーの効果を大いに制限するが、完全には制限しない可能性がある（図２のＡ）。
【０１０４】
各腫瘍における癌細胞の絶対数の定量によって、同じ遺伝子型の個々のマウスからのデータの集約、および遺伝子型間の腫瘍サイズの比較が可能になる。読み取り計数を癌細胞数へ変換することができるようにするために、本発明者らは、組織の均質化およびＤＮＡ抽出の前に、公知のバーコードを有する細胞を規定数で各肺試料へ添加した（図１のＡおよび図９）。したがって、腫瘍の読み取り計数を「ベンチマーク」の読み取り計数に対して正規化することによって、各マウスにおける各腫瘍内の癌細胞の絶対数を計算することができた（図１のＡおよび図９）。
【０１０５】
Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、技術的な反復性採取物間で再現性が高く、配列決定エラー、個々のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定機の固有エラー率の変動、バーコードＧＣ含有量、バーコードの多様性、マウス内での腫瘍数、および読み取り深度を含めて、腫瘍サイズの分布にバイアスをかける可能性がある多くの技術的な変数の影響を受けない（図２のＢ〜Ｄ、図１０）。小さな大きさでは中程度の測定誤差が存在するが、これは全体的な大きさの分布にバイアスをかけない。腫瘍サイズの分布はまた、同じ遺伝子型のマウス間で再現性が高かった（Ｒ２＞０．９８、図２のＥ，Ｆ、図１０のＧ）。実際、大きさ分布の教師なし階層性クラスター形成は、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅの異なる力価で腫瘍を誘発したときでさえ、マウスの遺伝子型によってマウスを明確に分けた（図２のＧおよび図１０のＤ）。しかしながら、本発明者らの方法は、同じ遺伝子型のマウス間の腫瘍サイズの範囲において変動を検出した。この変動は、同じマウス内での腫瘍の２つの部分間で観察されるランダムノイズよりもはるかに大きく、Ｔｕｂａ−ｓｅｑがマウス間の腫瘍量の固有の変動よりも有意に正確であることを示唆している（図２のＥ，Ｇ）。したがって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、ＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴマウスにおける何千もの肺病変内での癌細胞の数を迅速かつ正確に定量した（図１のＣ、図１０のＣ）。
【０１０６】
腫瘍サイズの分析は、腫瘍抑制の２つの様式を明らかにする。腫瘍の成長に対するｐ５３欠損症またはＬｋｂ１欠損症のいずれかの効果を評価するために、本発明者らは、分布内での異なる百分位数で腫瘍内の癌細胞の数を計算した。興味深いことに、ＫＬＴマウスにおける腫瘍は一貫してＫＴ腫瘍よりも大きかったが、ｐ５３を欠失させても、大多数の腫瘍における癌細胞の数は変化しなかった（図３のＡ〜Ｃ）。代わりに、ｐ５３欠損腫瘍のごく一部が例外的な大きさまで成長し、マウスのいずれにおいても最大の腫瘍サイズであった（図１のＣ）。
【０１０７】
ｐ５３欠損症およびＬｋｂ１欠損症によってもたらされる腫瘍の成長の違いをよりよく理解するために、ＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴマウスにおける腫瘍サイズの分布に最もよくあてはまる数学的な分布を規定した。Ｌｋｂ１欠損腫瘍は、分布の全範囲にわたって対数正規分布していた（図３のＤ）。対数正規分布は、正規分布率を有する単純な指数関数的腫瘍成長から予想される。非常に大きな腫瘍がこの測定基準を大幅に移行可能にすることなく腫瘍サイズの平均を概算するために、本発明者らは、腫瘍サイズの対数正規分布（ＬＮ平均）を考慮した癌細胞の平均数の最尤概算量も計算した。この測定により、ＫＬＴ腫瘍は平均してＫＴ腫瘍の７倍多い癌細胞を有しており、増殖を抑制する上でのＬｋｂ１の役割と一致していた（図３のＡ，Ｃ）。ＫＰＴマウスでは腫瘍量が多く、腫瘍が目に見えて大きいにもかかわらず、ｐ５３欠損症は、病変の大きさの平均に関する本発明者らの概算値を上昇させなかった。代わりに、ｐ５３欠損腫瘍は、大きな大きさでべき乗則分布しており、総腫瘍量の増加は稀少な、例外的に大きな腫瘍によって推進された（図３のＤ）。これは、ｐ５３欠損腫瘍が、その後の迅速な成長を推進する、稀少だが深刻な追加の腫瘍形成事象を獲得することを示唆している。
【０１０８】
腫瘍抑制遺伝子の多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性不活性化のためのバーコード付きレンチウイルスベクターのライブラリーの生成
ヒトの肺腺癌には多様なゲノム変化があるが、腫瘍の成長に対する影響を説明する定量的なデータは不足している（図７のＡおよび図１２のＢ）。。多くの公知のおよび候補の腫瘍抑制遺伝子の腫瘍抑制機能を並行して同時に定量化するために、本発明者らは、Ｔｕｂａ−ｓｅｑおよび従来のＣｒｅに基づくマウスモデルを、多重ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性インビボゲノム編集と組み合わせた（図４のＡ〜Ｃ）。１匹のマウスにおいて異なる腫瘍遺伝子型を評価することはまた、マウス間の変動性の効果を排除することによって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑの解像度を最大限にすることもできる。本発明者らは最初に、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターまたはＬｋｂ１のいずれかを標的とするレンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターを用いて腫瘍を発症させることによって、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスの肺腫瘍における効率的なＣａｓ９介在性遺伝子不活性化を確認した（図１１）。ｔｄＴｏｍａｔｏのホモ接合性不活性化は、腫瘍の約４０％において達成され、Ｃａｓ９介在性Ｌｋｂ１不活性化は、腫瘍量を増加させた（図１１）。これらのデータは、本発明者らが、これらの方法を使用して、Ｋｒａｓ推進型肺癌モデルにおける腫瘍を遺伝的に変化させることができることを実証している。
【０１０９】
本発明者らは、クロマチンのリモデリング（Ｓｅｔｄ２およびＡｒｉｄ１ａ）、スプライシング（Ｒｂｍ１０）、ＤＮＡ損傷応答（Ａｔｍおよびｐ５３）、細胞周期制御（Ｒｂ１およびＣｄｋｎ２ａ）、栄養素および酸化ストレス感知（Ｌｋｂ１およびＫｅａｐ１）、環境ストレス応答（ｐ５３）、ならびにＴＧＦ−βおよびＷｎｔシグナル伝達（それぞれＳｍａｄ４およびＡｐｃ）に広範に関与する遺伝子を含む、多様な経路を表す１１の公知の推定上の肺腺癌腫瘍抑制遺伝子を選択した（図４のＢおよび図７のＡ）。本発明者らは、公知の機能ドメインの上流、およびヒト腫瘍内に存在するほとんどの突然変異の上流で、早期に転写産物中でインデルを生成した効率的なｓｇＲＮＡを識別した（図１２のＡ）。Ｔｕｂａ−ｓｅｑを使用して各腫瘍内の癌細胞数を正確に定量化することができるように、本発明者らは、各腫瘍抑制因子を標的とするＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクター、および２成分バーコードを有する４つのＬｅｎｔｉ−ｓｇ不活性／Ｃｒｅ陰性対照ベクターを多様化した。このバーコードは、各ｓｇＲＮＡに特異的な固有の８ヌクレオチド「ｓｇＩＤ」、および各腫瘍を固有にタグ付けするためのランダムな１５ヌクレオチドバーコード（ＢＣ）からなった（ｓｇＩＤ−ＢＣ、図４のＡ，Ｂおよび図１２のＣ〜Ｅ）。インビトロでの切断効率を、各ｓｇＲＮＡについて個別におよびプール内で決定した（図１３）。
【０１１０】
インビボでの腫瘍抑制機能の並行定量
肺腫瘍の成長に対する各遺伝子の不活性化の効果を多重化様式で定量化するために、本発明者らは、１１のバーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターおよび４つのバーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇ不活性／Ｃｒｅベクターからなるプール（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ）を用いて、ＫＴマウスおよびＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて腫瘍を発症させた（図４のＢ，Ｃ）。ＫＴマウスと比較して低用量のウイルスを投与されたにもかかわらず、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスは、腫瘍発症から１２週間後にＫＴマウスと比較して肉眼で見える腫瘍の数および大きさが増大した（図４のＤ，Ｅ）。各ｓｇＲＮＡを使用して各腫瘍の癌細胞の数を決定するために、バルク腫瘍担持肺ＤＮＡからｓｇＩＤ−ＢＣ領域を増幅し、産物をディープ配列決定し、本発明者らのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析パイプラインを適用した。本発明者らは、各マウス内での不活性ｓｇＲＮＡの分布と比較して、各腫瘍抑制因子の成長効果の全体的な分布を計算した。各ｓｇＲＮＡについて、分布内での異なる百分位数での腫瘍内の癌細胞の数を、不活性分布内の相応の百分位数の大きさで除した（図５のＡ）。この相対的なおよびマウス内での比較により、Ｔｕｂａ−ｓｅｑの精度が最大となった（方法）。本発明者らはまた、腫瘍抑制因子を標的とする１１個のｓｇＲＮＡの各々を含有する腫瘍の相対的な対数正規（ＬＮ）の大きさの平均も決定して、概して癌の成長を抑制する腫瘍抑制因子を識別した（図５のＢ）。これらの分析により、ＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍成長におけるＬｋｂ１、Ｒｂ１、Ｃｄｋｎ２ａ、およびＡｐｃの公知の腫瘍抑制機能を確認した（図５のＡ，Ｂおよび図１２のＢ）。ＫＴマウス（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を欠失）におけるＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで発症する腫瘍は、各ｓｇＲＮＡを有する腫瘍サイズの分布においてわずかな違いしかなかった（図１４のＡ〜Ｃ）。
【０１１１】
この方法の再現性を評価するために、本発明者らは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅによる腫瘍の発症から１５週間後に、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスの追加のコホートを分析した。本発明者らは、腫瘍発症から１２週間後に識別したすべての腫瘍抑制因子の腫瘍抑制効果を確認した（図５のＣおよび図１４のＥ〜Ｆ）。多重レンチウイルス−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅ送達および腫瘍バーコード配列決定を用いて腫瘍抑制因子を検出する本発明者らの能力は、第９５百分位数の腫瘍における癌細胞のＬＮの大きさの平均および相対的な数の両方によって評価されるように、再現性があった（図５のＣおよび図１４のＥ，Ｆ）。第９５百分位数の腫瘍での成長効果は非常によく相関しており（Ｒ２＝０．９５３）、１５週間の時点で３匹のマウスしか使用しなかったにもかかわらず、ＬＮ平均と関係するｐ値は、２つの時点間で類似していた（図５のＣ）。
【０１１２】
ｐ５３介在性腫瘍抑制の識別および腫瘍抑制因子プール内での腫瘍サイズの分布の再現
ＫＰＴマウスにおける腫瘍サイズの分布と一致して、ＬＮ平均も第９５百分位数までの腫瘍の分析も、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅにより発症する腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｐ５３を標的とする効果を明らかにした。予想どおり、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇｐ５３／Ｃｒｅで発症した腫瘍は、より大きな大きさでべき乗則分布を呈し、ｓｇｐ５３は、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅ誘発性腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて最大の腫瘍内で多量であった（図１５のＡ，Ｂ）。このことは、腫瘍のごく一部が大きな大きさにまで成長することができるｐ５３の不活性化と一致している。ｐ５３を標的とする効果は、追加の変化の蓄積が進行すること、および腫瘍の進行を制限する上でのｐ５３の公知の効果と一致して、１５週間後の時点でより大きかった（図１５のＡ、図１５のＢ）。
【０１１３】
重要なことに、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳＰｏｏｌ／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスでは、Ｌｋｂ１欠損腫瘍は、ＫＬＴマウスからのデータと一致して、腫瘍サイズの対数正規分布を呈した（図１６のＡ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集を経て発症したｐ５３欠損性およびＬｋｂ１欠損性腫瘍はいずれも、従来のｆｌｏｘ化対立遺伝子を用いて発症した腫瘍と同様の大きさの分布を有していた。このことは、プールされた設定においてでさえ、個々の腫瘍サイズの定量が、腫瘍抑制因子の不活性化の際の腫瘍サイズの明確で特徴的な分布を明らかにすることができることを示唆している。
【０１１４】
インビボでの肺腫瘍成長の抑制因子としてのＳｅｔｄ２およびＲｂｍ１０の識別
興味深いことに、インビボでの肺腫瘍成長に対する公知の効果を有するいくつかの腫瘍抑制因子を適切に明らかにすることに加えて、Ｔｕｂａ−ｓｅｑはまた、メチルトランスフェラーゼＳｅｔｄ２および肺腫瘍成長の主な抑制因子としてのスプライシング因子Ｒｂｍ１０も識別した。Ｓｅｔｄ２は、唯一のヒストンＨ３Ｋ３６ｍｅ３メチルトランスフェラーゼであり、微小管のメチル化を経てゲノムの安定性にも影響を与える可能性がある。肺腺癌を含むいくつかの主要な癌の種類において頻繁に突然変異しているにもかかわらず、インビボでの腫瘍抑制因子としてのその役割についてはごくわずかしか公知ではない。Ｓｅｔｄ２の不活性化は、腫瘍サイズを劇的に増加させ、多くのｓｇＳｅｔｄ２含有腫瘍は、対照腫瘍の５倍超も多くの癌細胞を有していた（図５のＡ，Ｂおよび図１６のＢ）。興味深いことに、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで発症する腫瘍は、腫瘍サイズの対数正規分布を呈した（図１６のＣ）。実際、Ｌｋｂ１の不活性化のみが同様のあてはめの利点を生じ、肺腺癌患者における横行する腫瘍成長を推進する上でのＳＥＴＤ２突然変異の潜在的な重要性を強調していた（図１６）。
【０１１５】
スプライシング因子はまた、多くの種類の癌における潜在的な腫瘍抑制因子として浮上してきた。スプライセオソームの構成要素はヒト肺腺癌の１０〜１５％で突然変異しているが、腫瘍抑制への該構成要素の機能的寄与についてはごくわずかしか公知ではない。Ｒｂｍ１０の不活性化により、肺腫瘍の上位５０％の癌細胞の数が有意に増加し、ＬＮの大きさの平均が増加した（図５のＡ，Ｂ）。これらのデータは、Ｓｅｔｄ２介在性のリジンのメチル化の欠如および異常なプレｍＲＮＡスプライシングが各々、肺腺癌において深刻な腫瘍形成促進効果を有していることを示唆している。
【０１１６】
Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、インビボでの腫瘍抑制を定量化する正確で高感度の方法である。同じマウス内で異なる遺伝的変化を保有する多くの腫瘍における癌細胞の数を定量化することによって、生物学的および技術的変動の複数の原因の特定および排除が可能となった（方法）。マウスごとに多くの病変を発症させ、あらゆる病変にバーコード付与し、複数のｓｇＲＮＡを各マウスへとプールし、不活性ｓｇＲＮＡをプールで含めることによって、本発明者らは、腫瘍成長の変動の多くの原因について特定および修正することができた。これらの重要な特徴がなければ、発症した腫瘍の数の変動（ＣＶ＝２７％）、同じ遺伝子型のマウス間での腫瘍サイズの平均（ＣＶ＝３８％）、および個々のマウス内での異なる腫瘍抑制遺伝子を不活性化する効果がある大きさの平均間での微妙な相関（ＣＶ＝１１％）における変動性によって、本発明者らの分析は混同された。
【０１１７】
すべての腫瘍内でのｓｇＲＮＡの表示などのバルク測定を使用するよりもむしろ、各腫瘍サイズを計算することによって、本発明者らは、異なる腫瘍抑制因子を不活性化する成長効果をより正確かつ高感度に確認した。興味深いことに、本発明者らの識別した腫瘍抑制因子（Ａｐｃ、Ｒｂ１、Ｒｂｍ１０、およびＣｄｋｎ２ａ）の３分の２を、本発明者らが各バーコード付き腫瘍内の癌細胞の数を考慮したときにのみ識別したが、ｓｇＩＤ表示の倍数変化を考慮したときのみ、識別しなかった（図５のＤ）。実際、効果がある大きさ、統計的有意性、および効果が小さい腫瘍抑制因子を検出する能力はすべて、ｓｇＩＤ表示の変化を単純に分析することと比較して、Ｔｕｂａ−ｓｅｑパイプラインを使用して改善された（図５のＥ，Ｆ）。したがって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、機能的な腫瘍抑制遺伝子の成長抑制効果を正確に捉えるために必要とされるレベルの解像度を提供する。
【０１１８】
オンターゲットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集の確認
腫瘍抑制因子の不活性化についての選択を調査し、オンターゲットｓｇＲＮＡ介在性ゲノム編集を確認するための直交アプローチとして、本発明者らは、３匹のＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウス由来のバルクの肺ＤＮＡからの各ｓｇＲＮＡ標的領域をＰＣＲ増幅し、ディープ配列決定した。Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１、およびＲｂ１対立遺伝子の比較的高い割合は、オンターゲットｓｇＲＮＡ活性およびこれらの遺伝子の不活性化による腫瘍の増殖と一致して、標的部位で不活性化しているインデルを有していた（図６のＡおよび図１５のＣ〜Ｆおよび１７のＡ，Ｂ）。
【０１１９】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウス由来のバルクの肺ＤＮＡからのこれらの遺伝子の標的とされる領域の増幅および配列決定はまた、標的とされる遺伝子すべてがインデルを含有していたことも確認した（図６のＡ）。本発明者らのプールに含まれるすべての遺伝子は、ヒト肺腺癌において繰り返し突然変異し、腫瘍原性ＫＲＡＳを有する腫瘍において頻繁に突然変異する（図７のＡ）が、Ａｒｉｄ１ａ、Ｓｍａｄ４、Ｋｅａｐ１、およびＡｔｍは、腫瘍抑制因子としていかなる量によっても識別されなかった（図５および図６のＡ、ならびに図１４Ｄ〜Ｆ）。Ａｔｍの腫瘍抑制機能の欠如は、Ａｔｍｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を用いた結果と一致しており、本発明者らは、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅに感染した（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいてインビボで腫瘍原性ＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍成長に及ぼすＳｍａｄ４の腫瘍抑制機能の欠如を確認した（図１７のＣ，Ｄ）。これらの遺伝子について、遺伝子発現もしくは環境状態の変化、追加の時間、または同時発生する癌遺伝子および／もしくは腫瘍抑制因子の変化が、肺癌細胞における成長の利点を与えるためにこれらの経路の不活性化に必要とされることがある。
【０１２０】
Ｓｅｔｄ２の腫瘍抑制効果をさらに検証するために、およびＳｅｔｄ２欠損腫瘍の組織学的特性を評価するために、本発明者らは、不活性ｓｇＲＮＡ、またはＳｅｔｄ２を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡのうちのいずれかを含有するレンチウイルスベクター（ｓｇＮｅｏ２）を用いて、ＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて腫瘍を誘発させた。Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅベクターのいずれかを用いて発症させた腫瘍に罹患しているＫＴ；Ｃａｓ９マウスは、大きな腺腫および腺癌を発達させ、同じウイルスが浸潤している腫瘍に罹患しているＫＴマウスよりも全体的な腫瘍量がより多かった（図６のＢ，Ｃ）。これらのマウスの組織学的分析により、マウス間の大きな変動が明らかになったが、Ｔｕｂａ−ｓｅｑによる個々の腫瘍サイズの分析によって、対照腫瘍と比較してＳｅｔｄ２欠損腫瘍における癌細胞の数のほぼ４倍増加を確認した（図６のＣ，Ｄおよび図１８）。重要なことに、従来の方法によるＳｅｔｄ２腫瘍抑制の検証には、スループットを増大させ、コストを削減するためにｓｇＲＮＡを多重化する利点を強調する、１１の推定腫瘍抑制因子の本発明者らの初回スクリーニングよりもはるかに多くのマウスが必要であった。
【０１２１】
考察
多くの推定腫瘍抑制因子が癌ゲノム配列決定から同定されてきたが、それらの機能を迅速な、体系的な、かつ定量的な様式で（例えば、インビボで）試験するための限られた戦略が存在する（図１９）。ＤＮＡバーコード付与、ハイスループット配列決定、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集を組み合わせることによって、Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、これらの分析の処理量を上げるだけでなく、例外的に正確か詳細な腫瘍成長をインビボでの定量を可能にもする。
【０１２２】
興味深いことに、同じマウス内で同じゲノム変化を伴って同時に発症した腫瘍は、わずか１２週間の成長の後、大きく異なる大きさまで成長した。したがって、追加の自発的変化、初回の形質転換細胞の状態の違い、または局所的な微小環境は、腫瘍がどれだけ急速に成長するか、および腫瘍が継続的に増殖する能力を有しているか否かに影響を与える可能性がある。Ｔｕｂａ−ｓｅｑはまた、遺伝子機能の特性を明らかにする腫瘍サイズの遺伝子型特異的分布を固有に明らかにすることもできた。ｐ５３欠損症は、追加の稀少に獲得されたドライバー突然変異によって非常に大きな腫瘍が生じたＭａｒｋｏｖプロセスと一致して、最大の腫瘍についてべき乗則分布している腫瘍サイズ分布を生じた。逆に、Ｌｋｂ１の不活性化は、病変の大部分の大きさが増加しており、通常の指数関数的な成長過程を示唆した。したがって、腫瘍抑制因子は、Ｔｕｂａ−ｓｅｑを介して識別された、分子機能の前兆となる可能性があるさまざまな様式の腫瘍抑制を有することができる。興味深いことに、Ｓｅｔｄ２は，チューブリンをメチル化することが最近示唆されており、Ｓｅｔｄ２欠損症は、微小管の変化による小核および染色体の遅れを含む、さまざまな形態のゲノム不安定性につながる可能性がある。ゲノム不安定性は、稀少で有利な変化、および非常に確率的でべき乗則分布である腫瘍成長を引き起こすと予想される。しかしながら、本発明者らの研究におけるＳｅｔｄ２欠損肺腫瘍サイズの分布は、厳密に対数正規分布であり、それゆえ、本発明者らは、Ｓｅｔｄ２の主な影響が、概して成長を調節不全にする遺伝子発現プログラムの誘導であると推測している（図６のＤおよび図１６のＢ，Ｃ）。
【０１２３】
何千もの個々の腫瘍を評価した本発明者らの分析の規模は、機能的な腫瘍抑制遺伝子を特定する能力を劇的に改善した。バルク測定を介して腫瘍成長を概算することによって、本発明者らが腫瘍成長に有利であると明らかにした腫瘍抑制因子の３分の１しか特定されなかった（図５のＤ〜ｆ）。従来のｆｌｏｘ化した対立遺伝子とは異なり、肺におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集は、すべての腫瘍のおおよそ半分においてホモ接合性ヌル対立遺伝子を生じた（図１１のＤ）。したがって、標的遺伝子の均一なホモ接合性欠失の欠如は、バルク測定からの腫瘍抑制シグナルを低減させるが、各腫瘍をバーコード付与および分析することにより、Ｔｕｂａ−ｓｅｑはこの技術的制限を有効に克服する。
【０１２４】
多数の腫瘍抑制因子を分析することによって、本発明者らのデータは、早期の腫瘍細胞が、多くの腫瘍抑制因子の変化が適応性であり、成長の利点をもたらした進化上の初期状態にあることを示唆している。対照的に、癌細胞株におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９スクリーニングでは、追加の腫瘍抑制因子の変化がほとんど利点をもたらさず、有害でさえある可能性があることがわかっている。この発見は、はるかに成熟した進化状態にある癌細胞株と一致しており、起源が進行期の疾患に由来し、および培養における最適な増殖能について選択することにより、最適な成長あてはめに近づいている。さらに、腫瘍抑制とインビボ環境の多くの態様との間の密接な関連は、インビボでの腫瘍における（または例えばオルガノイド培養もしくは３次元培養組織などの組織の流れにおける）腫瘍抑制因子喪失の効果を分析する重要性を強調している。
【０１２５】
興味深いことに、ヒトの癌における腫瘍抑制因子の変化の頻度は、それらの腫瘍抑制因子機能の大きさに直接相応していなかった。例えば、ＳＥＴＤ２およびＲＢＭ１０は、同様の割合のヒト肺腺癌で突然変異しているが、Ｓｅｔｄ２欠損症は、Ｒｂｍ１０欠損症よりもはるかに大きな成長利益を与えた（図５のＡ，Ｂ）。
【０１２６】
このことは、個々の患者にとって非常に重要である可能性がある低頻度の推定腫瘍抑制因子の機能的重要性を決定するために、インビボでの遺伝子機能の迅速かつ定量的な分析を可能にする方法についての必要性の高まりを浮き彫りにしている。
【０１２７】
腫瘍抑制因子の変化の臨床的重要性についての理解は非常に限られており、このことは依然としてかなりの必要性を満たしていないが、腫瘍成長が強いドライバーは、弱いドライバーよりも魅力的な臨床標的を表す可能性がある。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、腫瘍抑制遺伝子の喪失のより複雑な組み合わせの調査、ならびに腫瘍の成長および進行の他の態様の分析を可能にする。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、他の種類の癌の研究にも適応可能であり、腫瘍の成長を阻害するよりもむしろ、通常は促進する遺伝子の調査を可能にするものとする。最後に、この方法により、遺伝子型特異的治療応答の調査が可能になり、最終的にはより正確で個別化された患者の処置につながる可能性がある。
【０１２８】
本研究における病変の統計上の特性
腫瘍サイズの分布は、マウス−ｓｇＲＮＡ対内でみるとき、２位のべき乗則に向けた傾斜と概して対数正規分布していた（図２０）。本発明者らの研究における各腫瘍に、該腫瘍を担持するマウスｍによって規定した対数変換した大きさｔｍｒｂ、その第１のバーコードによって識別される同族ｓｇＲＮＡｒ、および固有バーコード配列（ＤＡＤＡ２クラスターのコンセンサス）ｂが割り当てられた。本発明者らのアプローチは、さまざまなエラーの原因を調査して対処するように設計された。本発明者らは、（ｉ）同じ挿管手順を介して同じレンチウイルス力価に感染した（これを導入した）複製マウス（多くの場合同腹仔）内での誘発腫瘍の数が非常にさまざまであり、（ｉｉ）腫瘍サイズの平均は、複製マウス内でさまざまであり、（ｉｉｉ）ある特定のマウスは特定の腫瘍抑制因子を標的とするｓｇＲＮＡで腫瘍の成長をより受けやすく、（ｉｖ）同じマウス内で同じｓｇＲＮＡを有する腫瘍サイズが劇的に変化したことを発見した。
【０１２９】
【表３】
2022502063.tif 000005
【０１３０】
全体として、腫瘍抑制因子の不活性化が腫瘍量に及ぼす効果は、これらの他の原因と比較して小さい。従来のウイルスＣｒｅに基づく遺伝的に操作されたマウスモデルは、マウス１匹あたり数百から数千の腫瘍を発症することによって、変動の主な原因に対処する。本発明者らは、この設定でも、同じ遺伝子構造を有する同じマウス内で引き起こされた腫瘍サイズにおける確率論を観察する。これらの実験における個々の腫瘍内の癌細胞の数は、一度も正確に測定されていないが、代わりに、総腫瘍面積が最も頻繁に測定されており、このことは、腫瘍サイズの平均および誘発された腫瘍の数の組み合わせである。したがって、このアプローチには欠陥があり、その理由は、（ｉ）採取した大きさの平均が、大きさの平均の最良の概算値ではなく、（ｉｉ）誘発された腫瘍の数が一度も直接測定されておらず（変動係数（ＣＶ）２７％で変化する量）、（ｉｉｉ）マウスの背景における変動が無視されており、かつ（ｉｖ）腫瘍面積を評価するために使用される方法がまた変動性も導入するからである。これらの理由により、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋背景（Ｓｅｔｄ２）におけるさらに最も強力な腫瘍抑制因子でさえその効果の程度は、複製マウス間の分散よりも小さい（図６のＣ）。
【０１３１】
個々のマウス内でのウイルスＣｒｅベクターによって誘発される病変の数の変動性も、腫瘍抑制因子の効果の概算値に影響を及ぼす。各腫瘍を固有にバーコード付与した後、方法において詳述する本発明者らの計算アプローチを使用して腫瘍を正確に呼び出すことによって、本発明者らは、この変動性の原因を最小限にする。パイプライン内の呼び出された病変の数の分散は、配列決定試行の繰り返しにわたってＣＶが１０．７％であることを呈したのに対し、複製マウス間の呼び出された病変における分散はＣＶが２７％であることを呈した。それゆえ、固有のＤＮＡバーコードに基づく本発明者らの腫瘍数の概算値は、複製マウス間で腫瘍数が一定であると仮定するよりも有意に正確である（感染（導入）に伴う技術的な変動性により、レンチウイルスベクターによって感染する（導入される）上皮細胞の数が異なる可能性がある）。以下では、本発明者らは、先の表において列挙されている変動性の残りの原因を調査、緩和、および論議する。
【０１３２】
ｓｇＲＮＡにとらわれないマウス間の変動性
本発明者らの多重化したアプローチは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的腫瘍抑制遺伝子、（ｉｉ）個々のマウス、および（ｉｉｉ）それらの相互作用に起因する成長効果を調査する。これが可能なことは、本発明者らが各マウス内で多くのｓｇＲＮＡを含め、同じマウスで同じｓｇＲＮＡを使用して多くの病変を測定したからである。本発明者らは、各ｓｇＲＮＡの平均の、対数変換した、バイアス補正した期待される大きさにおいて、表面上は複製であるマウス間で統計的有意差を観察した（ηｍｒ＝Ｅｍｒ［ｔｍｒｂ］）。これらの違いを簡潔に要約した後、各腫瘍抑制因子の強度をより良好にするために、ｔｍｒｂから減じた。
【０１３３】
マウスは、ｓｇＲＮＡにとらわれない成長混乱ηｍ＝Ｅｒ［ηｍｒ］（すなわち、腫瘍易感受性かつ腫瘍耐性マウスのスペクトルがあった）およびマウスηｍｒ内でのｓｇＲＮＡ依存性共分散の両方を呈した（例えば、異常に大きなＳｅｔｄ２欠損腫瘍も保有していた異常に大きなＬｋｂ１欠損腫瘍を保有していたマウス）。マウス間での変動性の約４０％が、ηｍを正確に正規化することによって除去されたのに対し、ｓｇＲＮＡに頼らない因子に起因しないηｍｒにおける変動性は、たったの１０．７％であると概算された。本発明者らは、このηｍｒ変動性の５分の１を除去することのみが可能であった（後で詳述）。それゆえ、腫瘍感受性の変動性のほとんどは、ｓｇＲＮＡにとらわれないように見えるが、腫瘍成長の平均の利点を１０％未満の精度で概算するとき、遺伝子−マウスの微妙な共分散は依然として重要である。
【０１３４】
複製マウス、すなわち腫瘍発症後の同じ時点で分析された同じ遺伝子操作された要素を有するマウスは、しばしば同腹仔およびケージメイトであったが、混合した１２９／ＢＬ６背景から派生している。これらのマウスは実際の患者よりもはるかに均質な遺伝子型および環境を有している可能性があるが、個々のマウス間の関連する違いは依然として現れた。これらの傾向は前例がない解像度により本データにおいて識別することができるが、変動性は小さく、異なるマウスコンストラクトを比較する実験（例えば、目的遺伝子のｆｌｏｘ化した対立遺伝子を有するおよび有さないマウスにおける腫瘍の成長を比較する従来のアプローチ、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅ対Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているマウスからの本発明者ら自体の結果（図６を参照されたい））に及ぼすさらにより大きな効果を有するはずであることに留意することが重要である。
【０１３５】
各マウスは、いくつかの不活性ｓｇＲＮＡを含有しているので（その手段がマウス内で互いにそこまで異なっていなかった）、本発明者らは、集約した不活性ｓｇＲＮＡ手段に対する大きさを正規化することによって、ｓｇＲＮＡにとらわれないマウスの効果を単純に減じることができた：μｍｒ＝Ｅｍｒ［ｔｍｒｂ］−Ｅｍ，inerts［ｔｍｒｂ］。本発明者らのノンパラメトリックアプローチでは、不活性ｓｇＲＮＡの中央値で単純に除し、これは、ＬＮ  ＭＬＥ平均とほぼ同じになる傾向がある。
【０１３６】
ｓｇＲＮＡ特異的なマウス間の変動性
１匹のマウスにおける活性がある複数のｓｇＲＮＡの使用可能度によって、本発明者らは、ｓｇＲＮＡ特異的なマウスの効果を調べることができた。全体として、μｍｒマトリックスは、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて活性があるｓｇＲＮＡ間で高い正の相関があった。本発明者らは、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、これらの相関関係を解析した。第１の主成分（ＰＣ１）は、複製ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにわたってμｍｒにおける分散の７５％を説明した。本発明者らは、この共分散についていくつかの仮説を試験した。
１．平均してより大きな腫瘍を担持しているマウスはまた、対数スケールでより大きな腫瘍の分散も保有している可能性があった。もしそうであれば、ｓｇＬｋｂ１とｓｇ不活性腫瘍サイズとの比は、ｓｇＳｅｔｄ２とｓｇ不活性腫瘍サイズの比と共変動する。
２．マウスの性別は、これらの多様な成長パターンを推進する。
３．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ切断効率は、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／＋であるマウスと、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／ＬＳＬ−Ｃａｓ９であるマウスとの間で異なる。
４．マウス内での未知の遺伝的または環境的要因は、ドライバーの部分セットの強度を混乱させる。
【０１３７】
ＰＣ１を腫瘍サイズの平均と比較し、本発明者らのＫＴ；Ｃａｓ９  １２週間コホートにおけるＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／＋マウスをＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９／ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスと比較することによって、これらの第１の２つの仮説を調査した。ＰＣ１は、腫瘍サイズの平均（本発明者らのパイプラインを介して計算）および肺重量の両方と十分に相関していた（図２０のＢ〜Ｄ）。肺重量（グラム単位）は、肺試料収集時に決定され、腫瘍数および腫瘍サイズの平均によって影響を受ける可能性がある。腫瘍サイズの平均のように、肺重量とＰＣ１との相関関係により、これらの観察された傾向がパイプラインの人工産物ではないことが確認される。マウスの性別はまたＰＣ１とも共変し（点双列相関ｒ＝０．７５、データ非表示）、オスのマウスが、より大きな腫瘍と、強いドライバーと不活性との間のより大きな大きさの不一致の両方を呈するので、本発明者らの１の仮説と一致している。
【０１３８】
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子状態（ヘテロ接合性またはホモ接合性）は、１２週間のＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて、ＰＣ１と統計的に有意な相関がなかった（ｒ＝０．３４、データ非表示）。それゆえ、本発明者らは、遺伝子不活性の有効性に実質的に貢献するＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子について、ヘテロ接合またはホモ接合であるとは考えていない。
【０１３９】
最後に、潜在的な遺伝的または環境的要因の仮説は、本発明では試験するにはあまりにも制限がない。しかしながら、本発明者らの方法論では、これらの要因の研究を前進させることができる。
【０１４０】
したがって、本発明者らは、腫瘍の許容性およびマウスの性別が複製マウス間のこれらのｓｇＲＮＡ特異的な違いについての主な原因であり、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼヘテロ接合性が、腫瘍の成長にそれほど影響を与えないようであり、本発明者らの分析パイプラインの結果は他のマウスの測定値と一致すると結論付ける。
【０１４１】
確率的主成分モデルの混合物を使用して、μｍｒからηｍｒを排除した。このモデルは、複製のコホート内の他のマウスと同じ分布から生じるマウスの対数尤度を規定する。本質的に、このモデルは異常なｓｇＲＮＡ特性を有するマウスを識別する。しかしながら、マウスを「外れ値」または「許容され得る」マウスとして分類するよりもむしろ、本発明者らは、単に外れ値の可能性に基づいて各マウスに重みつけした。統計的には、「外れ値」は、そのコホートとは異なる分布から引き出されたように見える点として定義される。実際、Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓ距離、すなわち、多次元データにおける外れ値を識別するための一般的な測定基準を使用して同様の外れ値マウスが識別されたことがわかった。しかしながら、Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓ距離測定基準には、アプリケーションでアドホックになる外れ値を分類するためのあるしきい値が必要である。確率的主成分モデルに関する本発明者らの混合物を用いてマウスに重みつけすると、Ｅｒ［μｍｒ］の変動性がＫＴ；Ｃａｓ９マウスについて２．１％低減した。
【０１４２】
【数１】
2022502063.tif 000006
【０１４３】
これはわずかな改善に過ぎないが、本発明者らは、この値が、識別された変動性のあらゆる原因を説明すべきであると考えたので、ｓｇＲＮＡによって与えられる成長利点の平均の最終レポートにこの修正を含めた。複製マウスのコホートにおける最終的に報告された各ｓｇＲＮＡの成長効果の平均は、すなわち、本発明者らのＰ（ｍ；μｍｒ）における各マウスｍの尤度によって重みつけされたすべてのマウスにわたるμｍｒの算術平均とした。
【０１４４】
本発明者らのパラメトリックアプローチおよびノンパラメトリックアプローチ、ならびに統計的検定
腫瘍成長の大きさのスペクトルを包括的に測定し、次に、このスペクトルの背後にあるすべての外因性要因を特定することは難問である。成長の利点は、あらゆる公知の定量された懸念を説明する腫瘍サイズの高度処理された尺度で要約でき、または成長の利点はより少ない仮定をする様式でより明確に要約することができた。本発明者らは、両方の極値を選択した。いずれの場合においても、定性的な結論に大きな違いはないが、合意が奨励されており、異なるアプローチが、異なる感性を有する読者に訴求する可能性があるので、いずれのアプローチも提示する。
【０１４５】
最尤推定に基づく本発明者らのアプローチは、先の節において詳述されている。要約すると、大きさの分布の対数正規形状、ならびに（ｉ）誘発された腫瘍の数、（ｉｉ）全体的な腫瘍許容度、および（ｉｉｉ）ｓｇＲＮＡ特異的な変動性、におけるマウス間の変動性の理解を説明することを試みる。それは本発明者らの大きさの測定の多次元性を活用し、本発明者らが発見したあらゆる公知の外因性要因について修正する。以下では、本発明者らは、対数正規性を仮定することの制限について論議し、べき乗則尾部を呈する腫瘍抑制因子の分布にパラメトリックアプローチを拡張する。
【０１４６】
本発明者らのノンパラメトリックな要約は、大きさの分布におけるさまざまな位置での腫瘍成長の増加を解析するためのｔ（ｎｏｎｐａｒａｍｅｒｉｃ）ｍｒｂ（先に定義）の百分位数を表している。腫瘍分布の形状を想定しておらず、マウス間の変動性をモデル化していない。しかし、活性物質の大きさの中央値および各マウスに存在する腫瘍の数を補正することにより、マウス間の変動性の大部分が排除される。このため、第１の実験の後、百分位数は常に、相応の不活性百分位数と比較して報告された。ｓｇＲＮＡの異なる百分位数層間の自己相関が予想され、観察されており、異なる百分位数層は統計的に独立した値ではなく、本発明者らは、該層の独立性を前提とする統計的検定は展開していない。
【０１４７】
ノンパラメトリックアプローチでは概して、活性があるｓｇＲＮＡの分布の第９０〜９９百分位数が不活性から最大で逸脱していることが認められる。分布が少なくとも対数正規に歪んでいるという本発明者らの発見は、この現象と一致している。さらに、活性があるｓｇＲＮＡは、不活性分布を模倣するフレーム内の挿入および欠失を導入することができるので、不活性の大きさを模倣するために、フレーム内の突然変異がある場合とない場合の活性があるｓｇＲＮＡの分布における最小の腫瘍を予想した。最後に、単一のヌル対立遺伝子のハプロ不全は概して、公知ではないが、ハプロ不全が部分的にドミナントまたは非存在である場合、大きさの分布は、より高い（第９０〜９９）百分位数で最も逸脱した。
【０１４８】
それゆえ、第９５百分位数が、ヌル突然変異率、接合性、統計的解像度（より高い百分位数で低下）、および一般的な大きさの分布に関する本発明者らの理解に関する本発明者らの懸念についておおよそ平衡状態にしていたので、本発明者らはこれをドライバーの成長利点の粗要約として使用した。本発明者らのデータは、腫瘍抑制因子の喪失が、個々の腫瘍すべてにわたる成長利点に必ずしもつながらないことを示唆している（例えば、図１および２におけるｐ５３欠損症対Ｌｋｂ１欠損症）。実際、第９５百分位数の測定値は、ｐ５３喪失およびファットテイル分布の予想される結果と一致している理由により、本発明者らの実験においてｐ５３を検出し損ねた。それにもかかわらず、単純化が有用であることがあり、大きさの第９５百分位数は、成長の違いをうまく要約している。
【０１４９】
すべての信頼区間およびｐ値を、ｔｍｒｂのブートストラップ処理を介して得た。ブートストラップサンプリング後、本発明者らの分析パイプラインにおける後続のすべてのステップを、あらゆるブートストラップについて再計算した（不活性物質、ＰＣＡなどに対する正規化）。ブートストラップ試料は、各実験についての元のｔｍｒｂと同じ大きさであり（例えば、腫瘍発症から１２週間後に分析したＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける腫瘍）、交換してサンプリングされた。報告されたあらゆる９５％信頼区間について、２００，０００個の試料を抽出し、報告されたあらゆるｐ値について、２，０００，０００個の試料を抽出した。比率の信頼区間は、活性があるｓｇＲＮＡ分布および不活性ｓｇＲＮＡ分布の両方における不確実性を反映している。それゆえ、ｓｇＲＮＡ比の信頼区間が１を包含しないとき、ｓｇＲＮＡのこの要約統計量が不活性ｓｇＲＮＡと一致するという帰無仮説は、ｐ＜０．０５で棄却することができる（複数の仮説について修正がないと仮定）。
【０１５０】
すべてのｐ値は、ｓｇＲＮＡ要約統計量が不活性ｓｇＲＮＡ要約統計量とは異なっているという両側仮説を報告しており、１１個の活性があるｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つが、成長の利点または不利な点を被る可能性という本発明者らの複数の仮説に対してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正した。活性があるｓｇＲＮＡを常に、ｓｇＲＮＡ分布（４つの異なる不活性ｓｇＲＮＡ）と比較したが、不活性ｓｇＲＮＡをその他の３つの不活性物質の分布のみと比較した。ｐ値は、０．０００１を超えると報告せず、その理由は、これが２，０００，０００個の試料に限定されるときにブートストラップ法の解像限界であるからである。
【０１５１】
大きさの分布の包括的なパラメトリック説明
病変の大きさは、おおよそ対数正規分布しており、いくつかの遺伝子型では過剰量の非常に大きな病変が存在していた。本発明者らは、広くさまざまな２〜３のパラメータ確率分布を、各遺伝子型および時間について病変の大きさの観察された分布にあてはめた。すなわち、（Ｌｏｇ）−正規、（Ｌｏｇ）−ガンマ、（Ｌｏｇ）−ロジスティック、指数関数、Ｂｅｔａ、一般化極値（Ｇｕｍｂｅｌを含む）、およびべき乗則（Ｐａｒｅｔｏを含む）である。すべての病変の大きさの分布は、対数正規分布、対数ガンマ分布、または対数ロジスティック分布のいずれかに最もよくあてはまったが、単一の分布が他のすべての分布を上回ることはなかった。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定はしばしば、最もよくあてはまる単一の分布を棄却し、すなわち、最も不適切ではないあてはめのみを多くの場合において認めることができた。この欠点は、本発明者らが初めて測定することができた膨大な量の腫瘍サイズと、腫瘍進行の複雑性とを強調している。それゆえ、本発明者らは、複数の家族のパラメトリックあてはめを調査した。
【０１５２】
いくつかの分布について、対数正規スケーリングおよびべき乗則スケーリングの組み合わせが、本データを最もよく説明していた。対数ガンマおよび対数ロジスティックのあてはめは、対数正規のあてはめよりも優れていることがあるが、これらの代替的な分布は、より迅速に成長する比較的高いモーメントを単に有しているに過ぎず、このことは、べき乗則の挙動を示唆している。その上、対数ガンマおよび対数ロジスティックの分布のパラメータの最尤概算値は、収束を保証することなく数値的に解く必要がある。
【０１５３】
べき乗則の分布を公平に識別するように注意が払われた。潜在的なべき乗則のあてはめを、最尤法を使用してパラメータにし、周辺尤度を使用して判断した。
１．正の実数の支援全体についての各ｓｇＲＮＡ分布についての最尤対数正規あてはめて、下記を識別した。ここで、ＬＮは対数正規分布の確率密度を示す。
【０１５４】
【数２】
2022502063.tif 000007
【０１５５】
２．ドメイン［ｘ（ｍｉｎ）ｒ，∞）を上回る腫瘍についての最尤べき乗則あてはめを識別した。
【０１５６】
【数３】
2022502063.tif 000008
【０１５７】
ここで、ＰＬは指数αｒのべき乗則またはＰａｒｅｔｏ分布の確率密度を示し、ステップ１からの対数正規あてはめを使用する。ｘ（ｍｉｎ）＝０のとき、べき乗則は定義されていないので、最小値が自由に変動する限られた支援にわたってべき乗則を検定する点が通例であることに留意されたい。
【０１５８】
３．多重あてはめモデルを、周辺尤度、すなわちベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を用いてモデルの自由度について補正した観察データの尤度を用いて判断した。
【０１５９】
このアプローチは、Ａｌｓｔｏｔ  ｅｔ  ａｌによって推奨されており、その添付のソフトウェアパッケージをこの分析に使用した。最尤あてはめの詳細を図３に提供する。報告されたｐ値は、ｐ＝１／（１＋Ｅｘｐ［周辺尤度］）となるように、対数正規分布とべき乗則との結合の周辺尤度の変換である。これらの値は、データがその支援全体を通じて対数正規分布しているという帰無仮説を検定する。
【０１６０】
本発明者らは、大きさが、指数関数的に切り捨てられたべき乗則によって分布しているという仮説も検定する。この比較は、通常のべき乗則に対する一般的な対立仮説であるので、スケールがない挙動は有限の間隔にわたってのみ存在することを意味する。指数関数的に切り捨てられたべき乗則の挙動についての良い証拠は見られていない（データ非表示）。この理由から、本発明者らは、データが、後で論議する遺伝子型における腫瘍進行のスケールがないモデルを支援していると考えている。
【０１６１】
本発明者らは、ｐ５３欠損腫瘍が大規模にべき乗則分布であるという強力で繰り返しがある証拠を観察している。べき乗則のダイナミクスは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋／ｐ５３Δ遺伝子型のすべての具体化で観察された（ＫＰＴ腫瘍、および両方のＫＴ；Ｃａｓ９  ｓｇ  ｐ５３腫瘍の時点）。これらのべき法則分布適合のすべての周辺尤度が、良好または優れていた。。この合意は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋／ｐ５３Δ遺伝子型が腫瘍サイズに分布するべき乗則であるという仮説を強く支持する。
【０１６２】
全体的には、べき乗則適合のＭＬ指数は、およそ２であった（αは約２）。べき乗則のダイナミクスは、癌の発生率を説明するために仮説を立てられてきたが、この仮説を試験するための測定は従来、時間および費用がかかり過ぎるという理由で、腫瘍サイズの分布は十分に研究されてこなかったので、本発明者らは、次節において大きさのべき乗則分布を生じる単純な展開性モデルを探索した。病変の大きさに関する本発明者らの詳細な調査は、ドライバーの成長利点を正確に特定することだけでなく、その根底にある作用様式の態様を明らかにする上でも有用であることが証明された。
【０１６３】
獲得されることが稀少である追加のドライバー突然変異は、腫瘍サイズのべき乗則分布を予測する。ｐ５３欠損腫瘍は、右端のすそにおいて大きさのべき乗則分布を呈する（図３のＤ）。べき乗則分布は概して、単一ステップのマルコフ過程からは発生せず、代わりに、複合不規則過程、例えばランダムウォークまたは降着過程から発生する。最も単純で、最も可能性が高いと思われるこの観察されたべき乗則分布についての説明は、指数関数的な過程の組み合わせ、すなわち指数関数的に増殖するｐ５３欠損腫瘍における第２のドライバー事象の稀少な獲得である。
【０１６４】
腫瘍サイズＮ（ｔ）が最初に時間ｔにわたって速度ｒ１で指数関数的に成長し、下記のようになるとする。
【０１６５】
【数４】
2022502063.tif 000009
【０１６６】
Ｎ（ｔ＝０）＝１、すなわち、ｔ＝０と定義される感染（導入）時に１つの腫瘍形成細胞があるとする。さらに、本発明者らは、時間ｔ＊において、新たなドライバーを有する新たなクローンが腫瘍の集団内に出現し、はるかに大きな速度ｒ２で成長し、それによりこのクローンが、屠殺時ｔＦに腫瘍集団を支配する、すなわち、ｒ２（ｔＦ−ｔ＊）＞＞ｒ１ｔＦと仮定する。０≦ｔ＊＜ｔＦであることに留意されたい。最後に、この形質転換クローンが、腫瘍サイズに比例する確率で時間内に不規則に出現する、すなわちｐ（ｔ＊）〜μＮ（ｔ）とする。このシナリオでは、分析時の腫瘍サイズＮ（ｔ＝ｔＦ）＝ｎは、下記である。
【０１６７】
【数５】
2022502063.tif 000010
【０１６８】
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｓという表題の、Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｐｏｗｅｒ  ｌａｗｓ，Ｐａｒｅｔｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｚｉｐｆ’ｓ  ｌａｗ．Ｃｏｎｔｅｍｐ．Ｐｈｙｓ．４６，３２３−３５１（２００５）（第４．１節）において総説されている導出に基づいて、本発明者らは、以下を発見している。
【０１６９】
【数６】
2022502063.tif 000011
【０１７０】
腫瘍サイズは、下記の指数でべき乗則分布している。
【０１７１】
【数７】
2022502063.tif 000012
【０１７２】
この結果は、観測された指数が２未満でなければならないか、または追加のドライバーを獲得しなければならないことを含意している。１１週で屠殺したＫＰＴマウスについての指数の最尤概算値は、２よりもわずかに大きいのに対し、１５週で屠殺したＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおけるｓｇｐ５３腫瘍についての指数は、２よりもわずか小さい（が、これらの値はいずれも、該値の９５％信頼区間において２を包含する）。
【０１７３】
【表４】
2022502063.tif 000013
【０１７４】
先のすべての仮定は、腫瘍進行の他の基本的な数学的モデルにおいて行った。したがって、本発明者らは、マルコフ過程が観測されたべき乗則の最良の説明であると考えている。
【０１７５】
最後に、本発明者らは、時間ｔ＊での変換事象が指定されていないことを留意している。それは、遺伝的変化、後成的変化、細胞シグナル伝達状態の切り替えなどである可能性がある。本発明者らはさらに、べき乗則分布を生成する可能性がある他の過程があることに留意している。
【０１７６】
多重レンチウイルス感染を伴う腫瘍の証拠
大きさの測定は、多重レンチウイルスベクターによって感染した（伝達された）と推定される病変を識別するために十分正確である。本発明者らの第１の実験（ＫＴ、ＫＬＴ、ＫＰＴマウス）では、より大きなウイルス力価（６，０００〜２２，０００カプシド）を使用したので、複数の感染がより一般的であると本発明者らは予想した。２つの異なるウイルスベクターが同じ創始細胞に感染した（導入された）場合、両方のレンチウイルスバーコードによって２つの病変として注釈が付けられた単一の腫瘍へと拡大する。それゆえ、本発明者らは、個々のマウス内で同じ大きさの２つのバーコード付き腫瘍を観察した場合、これらは単一の病変を発症する２つのレンチウイルスベクターから生じたと予想することができた。したがって、本発明者らは、同じマウスにおける各病変とその最近傍との間の大きさの違いを調査した。
【０１７７】
病変のごく一部では予想よりも大きさが近いことを観察し、このことは、複数のレンチウイルスベクターによる感染（導入）によって発症した場合、細胞からいくつかの病変が生じた可能性があることを示唆した。本発明者らの（帰無）予想分布は、異なる（ランダムに選択された）マウスにおいて観察された病変の大きさとそれらの最近傍との間の大きさの違いを表している。本発明者らのデータは、腫瘍の約１％において複数の感染が発生することを示唆しているが、（ｉ）複数の感染が稀少であるように見え、（ｉｉ）複数の感染が、（複数の感染が本発明者らのベースラインであるｓｇ不活性コンストラクトに成長の利点を与えることから）本発明者らのドライバーの成長利点の概算値を減衰させるので、本発明者らは、この稀少な発生が、本研究の他の結論に実質的に影響するとは考えていない。それにもかかわらず、この予備的な発見は、古い技術を使用して新たな生物学的特性を明らかにする本発明者らのアプローチ能力を再度示している。
【０１７８】
方法
マウスおよび腫瘍の発症
ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ（Ｋ）マウス、Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ（Ｌ）マウス、ｐ５３ｆｌｏｘ（Ｐ）マウス、Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（Ｔ）マウス、およびＨ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｃａｓ９）マウスが説明されてきた。肺腫瘍は、示された力価でレンチウイルス−Ｃｒｅベクターを使用してすでに説明したように、マウスの気管内感染（導入）によって発症した。示されているように、腫瘍量は、蛍光顕微鏡法、肺重量、および組織学的特性によって評価された。すべての実験は、スタンフォード大学の動物実験委員会のガイドラインに従って実施された。
【０１７９】
バーコード付きのＬｅｎｔｉ−ｍＢＣ／ＣｒｅおよびＬｅｎｔｉ−ｓｇＰｏｏｌ／Ｃｒｅベクタープールの作製
ハイスループット配列決定を使用して、個々の腫瘍内の癌細胞数を並行して定量化することができるようにするために、本発明者らは、レンチウイルスベクターを初回の感染した（導入された）肺上皮細胞へと安定して組み込むことによって、各腫瘍に固有である短いバーコード配列を有するレンチウイルス−Ｃｒｅベクターを多様化した。本発明者らは、バーコード付きレンチウイルスベクターの２つの異なるプールを使用して、さまざまなマウスの背景において腫瘍を作製した。第１は、Ｌｅｎｔｉ−ＰＧＫ−Ｃｒｅ（６個のバーコード付きＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターをプールすることによって作製した、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉｌｌｉｏｎＢＣ／Ｃｒｅ；Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ）の約１０６個の固有のバーコード付き変異体のプールとし、本発明者らはこれを使用して、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＴ）マウス、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＰＴ）マウス、およびＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（ＫＬＴ）マウスにおいて誘発させた腫瘍内の癌細胞の数を分析した（図１）。第２は、１５個のバーコード付きＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターのプールとし、本発明者らはこれを使用して、ＫＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウスおよびＫＴマウスを感染させることによって、３つの異なる遺伝的背景における候補腫瘍抑制遺伝子の腫瘍抑制効果を評価した。本発明者らのＬｅｎｔｉ−ｓｇ不活性／Ｃｒｅベクターには、Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ対立遺伝子内でＮｅｏＲ遺伝子を標的とする３つのｓｇＲＮＡが含まれており、該ｓｇＲＮＡは、活発に切断するが、機能的には不活性の陰性対照ｓｇＲＮＡである。
【０１８０】
ｓｇＲＮＡの設計、作製、およびスクリーニング
本発明者らは、Ｃｒｅならびに１１の公知のおよび推定の肺腺癌腫瘍抑制因子、すなわち、ｓｇＬｋｂ１、ｓｇＰ５３、ｓｇＡｐｃ、ｓｇＡｔｍ、ｓｇＡｒｉｄ１ａ、ｓｇＣｄｋｎ２ａ、ｓｇＫｅａｐ１、ｓｇＲｂ１、ｓｇＲｂｍ１０、ｓｇＳｅｔｄ２、およびｓｇＳｍａｄ４、の各々を標的とするｓｇＲＮＡを保有するレンチウイルスベクターを作製した。また、不活性ガイド、すなわち、ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、ｓｇＮｅｏ３、ｓｇＮＴ１、およびｓｇＮＴ３を保有するベクターも作製した。関心対象の各腫瘍抑制遺伝子を標的とするすべての可能な２０ｂｐのｓｇＲＮＡ（ＮＧＧ  ＰＡＭを使用）を同定し、利用可能なｓｇＲＮＡ設計／採点アルゴリズムを使用して、予測されるオンターゲット切断効率について採点した。各腫瘍抑制遺伝子について、ヌル対立遺伝子を生成する可能性が最も高いと予測される３つの固有ｓｇＲＮＡを選択し、予測される切断効率が最も高いｓｇＲＮＡと、すべての公知のスプライスアイソフォーム（ＥＮＳＥＭＢＬ）で保存され、スプライスアクセプター／スプライスドナー部位に最も近く、遺伝子コード領域において最も早期に位置し、注釈付き機能ドメイン（ＩｎｔｅｒＰｒｏ；ＵｎｉＰｒｏｔ）の上流で生じ、かつ公知のヒト肺腺癌突然変異部位の上流で生じたエクソンを標的とするｓｇＲＮＡとに優先性が与えられた。各ｓｇＲＮＡを含有するＬｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターは、すでに説明したとおり作製した。簡単に説明すると、Ｑ５部位特異的変異誘発（ＮＥＢ  Ｅ０５５４Ｓ）を使用して、Ｕ６プロモーターとＰＧＫ−Ｃｒｅとを含有する親レンチウイルスベクターへとｓｇＲＮＡを挿入した。各ｓｇＲＮＡの切断効率を、ＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞に各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅウイルスを感染させることによって決定した。感染（導入）から４８時間後、ＹＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリーによる定量を使用して、感染（導入）率を決定した。次に、すべての細胞からＤＮＡを抽出し、標的とされた腫瘍抑制遺伝子座をＰＣＲによって増幅した。
【０１８１】
ＰＣＲアンプリコンをサンガー法で配列決定し、ＴＩＤＥ分析を使用して分析し、インデル形成率を定量した。最後に、ＴＩＤＥによって決定したインデル率を、フローサイトメトリーによって決定したＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞の感染（導入）率で除して、ｓｇＲＮＡ切断効率を決定した。関心対象の各腫瘍抑制遺伝子を標的とする最も効率的なｓｇＲＮＡをその後の実験に使用した。ＴｏｍａｔｏとＬｋｂ１とを標的とするｓｇＲＮＡはすでに説明しており、本発明者らは、ｐ５３を標的とするｓｇＲＮＡをすでに検証した（未公表データ）。本研究で使用した上位のガイドについての標的インデル領域を増幅するために使用したプライマー配列は以下のとおりである。
【０１８２】
【表５】
2022502063.tif 000014
【０１８３】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅのバーコード多様化
関心対象の各腫瘍抑制因子を標的とする最良のｓｇＲＮＡを特定した後、本発明者らは、相応のＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターを、各個々のｓｇＲＮＡに特異的な公知の８ヌクレオチドのＩＤ（ｓｇＩＤ；太字）および１５ヌクレオチドのランダムバーコード（ＢＣ；下線付き）とを用いて多様化した（図１０のＡを参照されたい）。
【０１８４】
【表６】
2022502063.tif 000015
【０１８５】
これらのプライマーを使用して、ＰＧＫプロモーターの３’’末端とＣｒｅの５’部分とを含むＬｅｎｔｉ−ＰＧＫ−Ｃｒｅベクターの領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（プレミックス）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｒ０４０Ａ）を使用して行い、ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（２８１０６）を使用して精製した。ＰＣＲインサートをＢｓｐＥＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＸｍａＩ（ＢｓｐＥＩ和合末端を生成）およびＢａｍＨＩで切断したＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｃｒｅベクターとライゲートした。
【０１８６】
固有にバーコードを付与した多数のベクターを生成するために、本発明者らは、各々ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩで消化した３００ｎｇのＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｃｒｅベクターを、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）および標準的なプロトコル（８０μｌの総反応量）を使用して、各々ＢｓｐＥＩ、ＢａｍＨＩで消化した１８０ｎｇのＰＣＲ産物とライゲートした。ライゲーション物を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ精製して、残分の塩を除去した。固有にバーコードを付与したＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターの可能な限り最大のプールを取得するために、１μｌの精製されたライゲーション物を、２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，１８２９００１５）内へと転換した。細胞を、ＢＤ  ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（商標）電子穿孔機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１６５−２１００）内の０．１ｃｍ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，１６５−２０８９）内で１．９ｋＶで電気穿孔した。次に、５００μｌの培地を添加し、３７℃、２００ｒｐｍで３０分間振盪することによって、細胞を救助した。各ライゲーション物につき、細菌を７枚のＬＢ−Ａｍｐプレート（１枚のプレートに１μｌ、１枚のプレートに１０μｌ、および５枚のプレートに１００μｌ）上に播種した。翌日、１μｌまたは１０μｌのプレート上でコロニーを計数して、１００μｌのプレート上でコロニーの数を概算し、これを各ＩＤと関係づけられた固有バーコードの数の初回概算として使用した。
【０１８７】
１０ｍｌの液状ＬＢ−Ａｍｐを各細菌プレートに添加して、コロニーをプールした。コロニーをプレートから液状物へと掻把収集し、各転換からのすべてのプレートをフラスコへと合わせた。フラスコを２００ｒｐｍ３７℃で３０分間振盪して混合した。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＨｉＳｐｅｅｄ  ＭｉｄｉＰｒｅｐキット（１２６４３）を使用して、ＭｉｄｉＰｒｅｐ処理した。ＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ  二本鎖ＤＮＡ  ＨＳキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５１）を使用して決定した。
【０１８８】
品質管理手段として、各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／ＣｒｅプラスミドプールからのｓｇＩＤ−ＢＣ領域を、製造元の取扱説明書に従ってＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）を使用してＰＣＲ増幅した。これらのＰＣＲ産物をサンガー法で配列決定して（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ施設）、予想されるｓｇＩＤおよびランダムなＢＣの存在を確認した。ＢｓｐＥＩおよびＸｍａＩは、和合性があるオーバーハングを有しているが、異なる認識部位を有しているので、ｓｇＩＤ／ＢＣのライゲーションの成功から生成されたＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅベクターは、ＸｍａＩ部位を欠失している。したがって、サンガー法による配列決定によって決定されたバーコードなしの親Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅプラスミドの検出可能な量を有するプールについて（＞５％）、本発明者らは、標準的な方法を用いてＸｍａＩ（ＮＥＢ、１００μｌ反応液）でプールを消化することによって、バーコードなしの親ベクターを破壊した。これらの再消化したプラスミドプールを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用いて再精製し、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐによって再決定した。
【０１８９】
Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／ＣｒｅおよびＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅの作製
Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を欠失しているマウスにおいて本発明者らの初回実験において使用するためのおおよそ１０６個の関係づけられたバーコードを使用してライブラリーを取得するために、本発明者らは、６個のｓｇＩＤ−ＢＣバーコード付与ベクターをプールして、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉｌｌｉｏｎバーコード／Ｃｒｅ（Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ）を作製した。本発明者らは次に、バーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ｓｇＩＤ−ＢＣ／Ｃｒｅベクター（ｓｇＬｋｂ１、ｓｇｐ５３、ｓｇＡｐｃ、ｓｇＡｔｍ、ｓｇＡｒｉｄ１ａ、ｓｇＣｄｋｎ２ａ、ｓｇＫｅａｐ１、ｓｇＮｅｏ１、ｓｇＮｅｏ２、ｓｇＮｅｏ３、ｓｇＮＴ１、ｓｇＲｂ１、ｓｇＲｂｍ１０、ｓｇＳｅｔｄ２、およびｓｇＳｍａｄ４）をプールして、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅを作製した。すべてのプラスミドを、レンチウイルス産生に先立って、Ｑｕｂｉｔ濃度によって決定したように等しい比率でプールした。
【０１９０】
レンチウイルスの産生、精製、および力価測定
レンチウイルスベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づく２９３Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターならびにｄｅｌｔａ８．２およびＶＳＶ−Ｇパッケージングプラスミドのトランスフェクションを使用して産生した。Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃３／Ｃｒｅ、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅ、およびＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅを腫瘍発症のために生成した。酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ５８８７）を、トランスフェクションから８時間後に０．２ｍＭの終濃度で添加して、ウイルス粒子の生成を上昇させた。トランスフェクションから３６、４８、および６０時間後にウイルス含有培地を収集し、超遠心分離（２５，０００ｒｐｍで１．５〜２時間）によって濃縮し、ＰＢＳ中で一晩再懸濁し、−８０℃で凍結した。濃縮したレンチウイルス粒子を、ＬＳＬ−ＹＦＰ細胞（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏ博士からの贈呈品）に感染させ、フローサイトメトリーによってＹＦＰ陽性細胞の割合を決定し、感染力価を既知の力価のレンチウイルス調製物と比較することによって力価測定した。
【０１９１】
「ベンチマーク」細胞株の作製
ｓｇＩＤ「ＴＴＣＴＧＣＣＴ」を使用した３つの固有バーコード付きＬｅｎｔｉ−Ｃｒｅベクターを使用して、既知の細胞数で各バルク肺試料へとスパイクすることができるベンチマーク細胞株を作製して、各腫瘍内の癌細胞数の計算を可能にした。個々の細菌コロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（２７１０６）を用いて単離した。クローンをサンガー法で配列決定し、レンチウイルスを先に説明したとおり生成し、ＬＳＬ−ＹＦＰ細胞を非常に低い感染（導入）多重度で感染させ（導入し）て、おおよそ３％の細胞が４８時間後にＹＦＰ陽性となるようにした。感染させた（導入した）細胞を、ＢＤ  Ａｒｉａ  ＩＩ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して増殖させおよび選別した。ＹＦＰ陽性の選別された細胞を再播種しおよび増殖させて、多数の細胞を得た。増殖後、細胞をＢＤ  ＬＳＲＩＩ（商標）分析装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＹＦＰ陽性細胞率について再分析した。この百分率を使用して、５×１０５の組み込まれたバーコード付きレンチウイルスベクターを含有するために必要とされる細胞総数を、３つの細胞株の各々について計算し、この計算に基づいて細胞を分注して凍結させた。
【０１９２】
【表７】
2022502063.tif 000016
【０１９３】
マウスの肺からのゲノムＤＮＡの単離
バーコード配列決定を使用して各腫瘍内の癌細胞の数を定量した実験については、Ｆｉｓｈｅｒ  ＴｉｓｓｕｅＭｅｉｓｅｒを使用して各マウスの全肺を均質化した。３つの個々にバーコード付与したベンチマーク細胞株の各々からの５×１０５個の細胞を均質化時に添加した。組織を、２００μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ２５４４）含有の２０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）中で均質化した。均質化した組織を５５℃で一晩インキュベートした。すべての腫瘍の正確な表示を維持するために、ＤＮＡを全肺溶解液の約１／１０から、標準的なプロトコルを用いてフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿した。０．３グラム未満の重量の肺については、ＤＮＡを全肺溶解液の約１／５から、０．２グラム未満の重量の肺については、ＤＮＡを全肺溶解液の約３／１０から抽出して、ＤＮＡ収量を高めた。
【０１９４】
配列決定用のｓｇＩＤ−ＢＣライブラリーの調製
ライブラリーを、マウス１匹あたり３２μｇのゲノムＤＮＡからｓｇＩＤ−ＢＣ領域を増幅することによって調製した。集積したＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−ＢＣ／ＣｒｅベクターのｓｇＩＤ−ＢＣ領域を、ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）アダプターと５’多重化タグとを含有する２４プライマー対のうちの１つを用いてＰＣＲ増幅した（ＴｒｕＳｅｑ  ｉ７インデックス領域は太字で示されている）。
【０１９５】
【表８】
2022502063.tif 000017
【０１９６】
本発明者らは、ｓｇＩＤ−ＢＣ領域の単一ステップＰＣＲ増幅を使用し、これは、各腫瘍内の癌細胞の数を決定するための再現性が高い定量的な方法であることがわかった。以下のＰＣＲプログラムで、標準緩衝液（ＮＥＢ、Ｍ０４８２Ｌ）ＯｎｅＴａｑ２×Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘＯｎｅＴａｑ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ、Ｍ０４８２Ｌ）を使用して、マウス１匹あたり８回の１００μｌＰＣＲ反応（１回の反応あたり４μｇのＤＮＡ）を行った。
１．９４Ｃ１０分
２．９４Ｃ３０秒
３．５５Ｃ３０秒
４．６８Ｃ３０秒
５．２へ進む（３４×）
６．６８Ｃ７分
７．４Ｃ無限
【０１９７】
プールされたＰＣＲ産物をゲル電気泳動法によって単離し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを用いてゲル抽出した。個々のマウスから精製されたＰＣＲ産物の濃度を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって決定し、等しい比率でプールした。試料をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑで配列決定して、１００ｂｐの単一末端の読み取りを生成した（ＥＬＩＭ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）。
【０１９８】
超ディープ配列決定を介した個別のｓｇＲＮＡおよび腫瘍の識別
固有のｓｇＩＤ−ＢＣは腫瘍を識別する。これらのｓｇＩＤ−ＢＣを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑでの次世代配列決定を介して検出した。細胞数に関する各腫瘍サイズを、各固有ｓｇＩＤ−ＢＣ対の量にほぼ相当すると予想した。腫瘍サイズは、読み取り配列決定エラー率よりも大きな因子によって変化するので、真の腫瘍を頻発性の読み取りエラーと識別するためには、ディープ配列決定データを注意深く分析する必要があった。
【０１９９】
腫瘍と該腫瘍の個々のｓｇＲＮＡを、３つのステップにおいて識別し、すなわち、（ｉ）異常で低品質の読み取りを超ディープ配列決定試行から廃棄し、（ｉｉ）固有バーコード積み上げを、本発明者らが同じ腫瘍から発生すると予測された群へとバンドルし、（ｉｉｉ）細胞数を、最も再現性が高いことが証明された様式でこれらのバンドルから概算した。
【０２００】
読み取りの前処理
読み取りには、本発明者らの順方向プライマーの下流４９ヌクレオチドで始まり、本発明者らの１００ｂｐの単一末端読み取りの末端の上流２２ヌクレオチドで終わる２成分ＤＮＡバーコード（８ヌクレオチドのｓｇＩＤと、１５のランダムなヌクレオチドを含有する２１ヌクレオチドのバーコード配列）が含有されていた。本発明者らは、異常な読み取り、すなわち、隣接するレンチウイルス配列を欠失している読み取り、予期しないバーコードが含有されている読み取り、およびエラー率が高い読み取りを廃棄した。このことは、３つのステップにおいて達成された（図８のＡ）。
１．本発明者らは、ｓｇＩＤ−ＢＣのすぐ上流および下流にある１２個のレンチウイルスヌクレオチドを調べた。これらの１２ヌクレオチドは、隣接する６マーの検索記号列の対を使用して識別され、それにより、各６マーが１つの誤対合に耐えることができた。本発明者らは、これらの１２ヌクレオチドが読み取り内での３７位から始まると予想したが、本発明者らは、この位置付けを必要とせず、またはこの情報を活用しなかった入れ子式の６マーのアプローチ（ｓｇＩＤ−ＢＣに隣接するレンチウイルス配列を識別する２つの機会による）を使用して、読み取りの廃棄を最小限にした。このことは、この第１のステップにおいて特に重要であったが、その理由は、本発明者らの読み取りのバーコード付与されていない領域を使用して配列決定エラー率を概算し、それゆえ読み取りエラーに対してバイアスをかけないものとするからであった。読み取りの約７〜８％については、この第２の６マーの一致はこの読み取りを利用し、すなわち、ｓｇＩＤ−ＢＣに直接隣接する６マーは、予想どおりではなかった（１つの誤対合に関する本発明者らの許容範囲にもかかわらず）が、これらの内側の６マー配列のすぐ外側の６マーは、認識可能であり、本発明者らは、読み取りを利用してバーコードを識別することができた。
２．本発明者らは次に、ｓｇＩＤ−ＢＣの長さがいずれかの方向に２ヌクレオチドを超えてずれている読み取りを廃棄した。本発明者らの第１のバーコードには１５個のｓｇＩＤのうちの１つが含有されていると予想されたので、本発明者らは、これらの１５個の配列のうちの１つに一致しない読み取りを廃棄した。対合では、１つの誤対合および１つのインデルが許容された。
３．本発明者らは次に、１８ｂｐがｓｇＩＤ−ＢＣのいずれかの末端に隣接するように各読み取りの末端を整えた。本発明者らは次に、整えられた読み取りを品質スコアによってフィルタリングし、２つ以下の配列決定エラーが含有されると予測された読み取りを保持した。本発明者らはまた、第２の（ランダムな）バーコードに呼び出されていない塩基を有する読み取りを廃棄し、その他で呼び出されていない塩基を修正した。
【０２０１】
これらの３つのステージでは、ステージ１で読み取りの１４％を、ステージ２で約７％を、ステージ３で＜２％を廃棄した。
【０２０２】
本発明者らは次に、各ステージで内容不足であったそれらの読み取りを調べた。ＢＬＡＳＴ検索を実行することによって、本発明者らは、ステージ１で廃棄された読み取りが、本発明者らの調製物（Ｐｈｉ  Ｘバクテリオファージゲノムおよびマウスゲノム）またはレーンで対形成している他の試料（一般的なプラスミドＤＮＡ）に由来する人工産物に相当する、情報がない配列をしばしば含有していると判断した。ステージ２では、本発明者らは、異常なバーコード長さを有する読み取りには、大きなインデルがしばしば含有されているか、またはｓｇＩＤ−ＢＣの片方または両方が完全に欠落していることを発見した。最後に、読み取りの内部領域が、相応の末端よりも高い品質スコアを呈したという事実により、ステージ３で廃棄された読み取りはごくわずかであった。この傾向の結果として、２つを超える配列決定エラーが含有されると予測される読み取りを廃棄する前に、読み取りの末端を整えることが常識である。
【０２０３】
ＤＡＤＡ２を介した固有読み取り積み上げのクラスター形成
ｓｇＩＤ−ＢＣ読み取りを、同一の配列のセットに集約し、計数した。大きな腫瘍は頻発性の配列決定エラーを生じると予想されるので、固有のＤＮＡバーコード対の計数は、固有の腫瘍に直接相応していない（図８のＢ）。本発明者らはそれゆえ、小さな腫瘍を、大きな腫瘍から生じる頻発性の配列決定エラーと識別する方法を開発することにかなり尽力した（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機が０．１〜１％のエラー率を有する場合、１，０００万個の細胞の腫瘍が、１〜１０万個の細胞の腫瘍を模倣する配列決定エラーの積み上げを生成することを考慮されたい）。ＤＡＤＡ２は、これまで、超ディープ配列決定を包含するバーコード付与実験においてこの問題に対処するためにすでに使用されてきた。しかしながら、ＤＡＤＡ２は、全長のＩｌｌｕｍｉｎａアンプリコンの超ディープ配列決定用に設計されていたので、本発明者らは、ＤＡＤＡ２を本発明者らの目的のために調整および較正しなければならなかった。
【０２０４】
ＤＡＤＡ２では、より大きな積み上げの頻発性配列決定エラーに起因するバーコード積み上げの尤度は、以下による。
１．より大きな積み上げ量、
２．より小さな積み上げとより大きな積み上げとの間の具体的なヌクレオチドの違い、および
３．変異体の位置でのより小さい積み上げの平均品質スコア。
【０２０５】
第１因子および第２因子は、最初はヒューリスティックに（計算速度を最大限にするために）、次に（必要とされるときに）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを介してより正確に考慮される。ＤＡＤＡ２は、配列決定エラーによって小さな積み上げが生成される確率がΩ未満であるとき、クラスターを２つに分割する。それゆえ、この値は、より大きなクラスターを分割するためのしきい値を表している。このしきい値が大きいとき、読み取り積み上げは分割されることが許容され（呼び出される腫瘍が多く、おそらく大きな腫瘍を分割する）、Ωが小さいとき、読み取り積み上げは制限して分割される（呼び出される腫瘍が少なく、おそらく異なる小さな腫瘍を集約している）。
【０２０６】
配列決定エラーの尤度を、本発明者らの超ディープ配列決定データから推測した。Ｐｈｒｅｄ品質スコアは、配列決定エラー率の理論的な概算値を提供するが、これらの概算値は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機ごとに異なっている傾向があり、本発明者らのプロトコル（例えば、本発明者らが高忠実度のポリメラーゼを使用するにもかかわらず、ＰＣＲ増幅を介して導入される偶発的なエラーを含む）の仕様を考慮していない。通常、ＤＡＤＡ２は、固有のＤＮＡクラスターと同時に配列決定エラー率を概算するが、本発明者らのレンチウイルスコンストラクトは、本発明者らのｓｇＩＤ−ＢＣ領域の外側に非縮重領域を有しており、これを使用して、配列決定エラー率を直接概算することができた。その上、エラー率およびバーコードクラスターを一緒に概算することは、計算量が比較的多く、本発明者らのデータセット全体をクラスター形成し、関連するクラスター形成パラメータを探索するために２０，０００ＣＰＵ時間超を必要とした。
【０２０７】
配列決定エラーモデルは、以下によって各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機にトレーニングされた。
１．本発明者らのｓｇＩＤ−ＢＣのすぐ上流の１８ヌクレオチドを、バーコードのすぐ下流の１８ヌクレオチドと連結することにとって、トレーニング擬似読み取りを生成すること、次に、
２．ＤＡＤＡ２の単一の試行を使用して、これらの擬似読み取りをクラスター形成すること、
３．ＤＡＤＡ２の単一の試行を使用して、ｓｇＩＤ−ＢＣをクラスター形成するために、このトレーニング試行から概算されたエラー率を使用すること。
【０２０８】
本発明者らは、レンチウイルスｓｇＩＤ−ＢＣ隣接配列のうちのたった１つのクラスターを予想したとおり、トレーニング試行において配列決定エラーを概算するために、Ω＝１０−１００の非常に低い値を使用した。この値を変更しても、トレーニングの試行にそれほど影響がなかったが、本発明者らは、それにもかかわらず、この値でさえ、本発明者らのレンチウイルス配列から非常に小さな派生クラスターを時折観察した。これらの派生クラスターはおそらく稀少なＤＮＡ人工産物であり、本発明者らが処理した読み取りの２％を超えることは一度もない。非常に厳格なＤＡＤＡ２試行を使用して、配列決定エラーを概算することは、優れたアプローチ（Ｇｏｌｄｉｌｏｃｋｓの原理による）であると本発明者らは感じており、より許容度が高いしきい値は、配列決定エラーを過大評価し、配列決定エラー率を過小評価する可能性があるのに対し、エラー率を期待値からの各読み取りの逸脱から直接概算するアプローチ（Ω＝０であるＤＡＤＡ２試行と類似して）、本データにおけるＤＮＡ人工産物の存在を無視するし、それゆえ、配列決定エラー率を過大評価している。
【０２０９】
本発明者らは、本研究において使用する各Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機で配列決定エラー率をトレーニングした（合計７回）。トレーニングにより、あらゆる置換型（Ａ→Ｃ、Ａ→Ｔなど）の確率を概算することが可能になった。Ｐｈｒｅｄ品質スコアの関数としてのエラー率を、利用可能なデータのＬＯＥＳＳ回帰を使用して決定した（図８のＣ）。概して、エラー率は、塩基転換のためのＰｈｒｅｄ品質スコアによって予測されたものよりもおおよそ２〜３倍高かった（および、移行についての期待値とおおよそ一致）。このエラー率の上昇は通常であり、機械の誤校正および／またはＰＣＲ中に導入された突然変異を反映している可能性がある。
【０２１０】
本発明者らは次に、ＤＡＤＡ２を使用して、本発明者らの前処理フィルターを通過した二重バーコードをクラスター形成した。バーコードには、バーコード内でのいかなるインデルも識別することができるように、非縮重レンチウイルス隣接領域の７ヌクレオチドが与えられた（十分な隣接配列なしでは、ＤＮＡアラインメントアルゴリズムは、インデルを複数の点突然変異と時折呼び違える）。クラスター形成中に、本発明者らはまた、（ｉ）クラスターが少なくとも２塩基ほど互いにずれていること（すなわち、ＭＩＮ＿ＨＡＭＭＩＮＧ＿ＤＩＳＴＡＮＣＥ＝２）、（ｉｉ）積み上げの大きさがエラー処理の下で予想を少なくとも２の量（ＭＩＮ＿ＦＯＬＤ＝２）ほど超過したときに新たなクラスターのみが形成されること、および（ｉｉｉ）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが、最多４つの正味の挿入または欠失を有するアラインメントのみを考慮していること（ＢＡＮＤ＿ＳＩＺＥ＝４，ＶＥＣＴＯＲＩＺＥＤ＿ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝ＦＡＬＳＥ）、も必要とした。これらの選択はいずれも結果に大きな影響を与えなかったが、計算成績が向上し、バーコードが妥当な大きさの腫瘍へと集約されていることを追加で検証した。
【０２１１】
パイプラインの精査および較正
本発明者らは、本発明者らの第１のＰＣＲ増幅した多重ＤＮＡライブラリー（ＫＴ、ＫＬＴ、およびＫＰＴ腫瘍由来）を３つ組で配列決定して、腫瘍呼び出しアプローチを精査および設計した。
【０２１２】
再現性を３つの方法、すなわち、（ｉ）すべてのバーコードおよびすべてのマウスについての概算細胞量間の相関、（ｉｉ）本発明者らの第１の実験での各マウスにおける各ｓｇＩＤについて呼び出される病変数の変動性、および（ｉｉｉ）各ｓｇＩＤについての平均の大きさの変動性（これは、Ｃａｓ９を発現していないマウスにおいて定常であるものとする）において調査した。本発明者らの３つ組の試行の読み取り深度は自然に変化したので（前処理後に４０．１×１０６、２２．２×１０６、および３４．９×１０６読み取り）、これらの３回の試行を、異なる配列決定エラー率を有する異なるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機で行い、本発明者らの初回レンチウイルスプールが、バーコードの多様性のレベルが異なる６つの異なるｓｇＩＤを含有していたので、本発明者らが精査する過程における技術的な変動性は、のちの実験の技術的な変動性に十分に近似していた。本発明者らの腫瘍サイズの分析のパイプラインにおいて、本発明者らは、以下のことを発見した。
１．本発明者らの３つの「ベンチマーク」ＤＮＡバーコードの平均量は、反復採取物の試行間で中央値の量よりも再現性があった。したがって、ベンチマーク読み取り量のこの平均値（５００，０００個の細胞に相当）を使用して、読み取り量を各腫瘍内の癌細胞の絶対細胞数へと変換した（図９）。
２．クラスターのコンセンサスバーコードからの２つ以上のエラーがある読み取りを無視すると、再現性が向上した。通常、バーコードクラスター内の読み取りの約８０〜９０％は、コンセンサスバーコードと完全に一致していたが、読み取りの約５％はこの読み取りからの単一のエラーであり、読み取りの約５〜１５％は、２以上のエラーでそれていた。エラーが２以上のこれらの読み取りは、反復採取物の試行間の相関が乏しく、本発明者らが絶対細胞数／腫瘍サイズを再現性よく概算することができる点を妨げていた。これらの読み取りには、おそらく、読み取り自体の病変と見なすために十分な証拠も、より大きなクラスターに計数されるために十分な証拠もない。それゆえ、これらの読み取りを除外した。
３．ＤＡＤＡ２のクラスター分割傾向は、Ω＝１０−１０でしきい値が設定され、反復採取物の試行間での再現性を最大限にするために、病変は図１〜３については５００個以上、図４〜６については１０００個以上の細胞を含有している必要があった（図８のＤ〜Ｆ）。特異度が高いしきい値パラメータ（Ωが小さく、最小細胞数が多い）は、病変の大きさをより再現性よく呼び出したのに対し、感度が高いしきい値パラメータ（Ωが大きく、最小細胞数が少ない）は、病変量をより再現性よく呼び出した。再現性の１つの側面のみを優先し過ぎることは無意味である。測定誤差が異なる側面を考慮して、２つのしきい値を使用して、これらの競合する優先順位のバランスをよりよくした。
【０２１３】
このパイプラインを使用して、本発明者らは、本発明者らのスクリーニングにおいてバーコードの多様性をいくつかの方法で調査した。第１に、本発明者らは、このバーコード内のヌクレオチドがＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ間で均等に分布していることを確認した（図１０のＢ）。第２に、本発明者らは、繰り返される記号列の過剰についての証拠を認めていなかった（例えば、配列ＡＡＡＡＡ）。第３に、本発明者らは、本発明者らのレンチウイルスプール内の各ｓｇＩＤと対形成したランダムなバーコードの数を計算した。本発明者らのバーコードライゲーションアプローチを経て本発明者らが生成した各ベクターの固有バーコード付き変異体が多数あるので、（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅのバーコードの多様化を参照されたい）レンチウイルスプール内に存在するほとんどのバーコードは、本実験のいずれにおいてもいかなる病変においても検出されなかった（多様性が総病変数よりもはるかに高いので）。それにもかかわらず、本発明者らはなおも、観察されたバーコードからバーコードの多様性の量を推測した。この推測をするために、本発明者らは、ｉ匹のマウスにおいてバーコードを観察する確率がポアソン分布している、すなわちＰ（ｋ＝ｉ；λ）＝λｋｅ−λ／ｋ！であり、式中、λｒ＝Ｌｒ／Ｄｒであり、本発明者らのデータセット全体（既知の量）における各ｓｇＩＤｒについて呼び出された病変の数Ｌｒを、各ｓｇＩＤについての固有バーコードの総数Ｄｒによって除した比率である。λｒ／（１−ｅ−λｒ）＝μｎｏｎ−ｚｅｒｏであり、式中、μｎｏｎ−ｚｅｒｏ＝Σｉ＝１∞Ｐ（ｋ＝ｉ；λｒ）が単に、１回以上発生した各バーコードの発生の平均数であることを留意することによって、本発明者らは、Ｄｒを計算することができた。本発明者らのデータセット全体にわたって、同じバーコードが同じマウスにおいて２つの異なる腫瘍を発症する平均確率は、０．９１％であった。
【０２１４】
良好なバーコードの多様性はまた、Ｌｅｎｔｉ−ｍＢＣ／Ｃｒｅ実験における６つのｓｇＩＤによっても実証される。バーコードの多様性が低く、マウス内でバーコードが頻繁に重複する場合、同じバーコードを有する２つの異なる腫瘍が一緒にバンドルされるので、多様性が低いｓｇＩＤの平均の大きさは増加する。しかしながら、各ｓｇＩＤの平均の大きさは、複製マウス内で１％未満で変動しており、したがって、この可能性に反駁している。本発明者らはまた、配列決定エラーにもかかわらず、ディープ配列決定試行を２つの方法で処理することによって、すなわち、生の読み取り配列に基づいてクラスター形成する前に各読み取りの同族ｓｇＩＤを識別することによって、またはクラスターのコンセンサス配列に基づいてクラスター形成した後に同族のｓｇＩＤを識別することによって、本発明者らがｓｇＩＤを正確に呼び出すことができることも評価した。いずれかのアプローチを使用して、読み取りの９９．８％が同じ同族のｓｇＩＤと対形成し、したがって、ｓｇＩＤが正確に識別される保証を提供した。本発明者らは、本発明者らの最終的な分析については、後者のアプローチを採用すると選択した。
【０２１５】
本発明者らの腫瘍を呼び出すパイプラインを徹底的に開発および精査することによって、さらに１０年分の大きさの解像度を救出した。本発明者らの３つのＤＮＡベンチマーク（ＤＮＡ調製の最初で肺試料へ添加）（図９）は、この解像度をそれとなく見させる。ＤＮＡベンチマークの配列決定エラーは、ＤＮＡベンチマークの固有ｓｇＩＤおよび既知の二次バーコードによって容易にされる。これらの配列決定エラーは通常廃棄されるが、普通の読み取り積み上げとして該配列決定エラーを取り扱うことができ、潜在的な配列決定エラーの特性を観察することができる。本発明者らの較正した分析パイプラインがいと、配列決定エラーは約１０３個の細胞の病変として現れ、本発明者らのパイプラインでは、これらの配列決定エラーは約１０２個の細胞の病変として現れ、本発明者らの最小細胞しきい値を下回っている（図２のＡ）。
【０２１６】
さらに重要なことに、本発明者らのパイプラインは、技術的な混乱に対して堅牢である。第１の実験からの２つの特定のマウスにおける２つの追加の技術的混乱により、本発明者らは、再現性をより集中的に特性を明らかにした。最初に、ＫＬＴ１１週マウス（ＪＢ１３４９）を大きな深度で配列決定し、次に通常の読み取り深度に対して１０倍、無作為にダウンサンプリングした（このダウンサンプリングは、本研究全体で実際に検出された読み取り深度のいかなる変動性よりも劇的であった）。この最初の混乱では、病変の大きさは非常に高い相関関係があった（図２のＢ）。追加として、ＫＴ１１週マウス（ＩＷ１３０１）は、異なる多重化タグを使用した２つのＰＣＲ反応において増幅した（図２のＣ）。ＰＣＲおよび多重化は、全体的に再現性は良好だが、読み取り深度よりも再現性を妨げるようである。これらのマウスはまた、２つの有望な再現性の傾向、すなわち（ｉ）より大きな病変／腫瘍が複製間で最も一致しており、（ｉｉ）腫瘍病変の大きさの全体的な形状（ヒストグラム）は、個々の腫瘍よりも複製間で良好に相関していた（例えば、ＩＷ１３０１における各病変についてはｒ＝０．８９であるのに対し、図８のｂの６０のヒストグラムビン内での腫瘍の量についてはｒ＝０．９９３）ことを示している。この第２の見解は、技術的な混乱が偏りのないノイズを導入することを意味している。また、すべての相関は対数での大きさを比較しているが、より大きな腫瘍はより良好に相関しているので、この変換によりピアソン相関係数が大幅に低減する。
【０２１７】
腫瘍サイズの呼び出しに対するＧＣ増幅バイアスの影響を最小限にすること
本発明者らは、本発明者らの研究における各腫瘍を、該腫瘍を担持するマウスｍに相応する大きさＴｍｒｂ、その第１のバーコードによって識別される同族ｓｇＲＮＡｒ、および固有バーコード配列（ＤＡＤＡ２クラスターのコンセンサス）ｂによって規定した。本データのおおよそ対数正規構造（図３のｄおよびデータ非表示）を考慮すると、本発明者らは、Ｔｍｒｂ＝Ｌｎ（Ｔｍｒｂ／Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］）となるように大きさを対数変換および正規化した。ここで、Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］＝ΣｂＴｍｒｂ／Ｎｍｒは、所与のマウスｍおよびｓｇＲＮＡｒについて予想される病変の大きさであり、本発明者らは、この注釈を期待値について使用する。集約されたインデックスが添え字から削除されるこの注釈は、全体で使用される。ＧＣバイアスは微妙であった。Ｅｍｒ［Ｔｍｒｂ］の変動係数（ＣＶ）は５．０％であった。この周辺分布は依然として、Ｅｂ［Ｔｍｒｂ］の第４次最小二乗式多項式あてはめｆ４（ｂ）によって最良に説明されたバーコード配列の組み合わせのＧＣ含有量に関して微妙な依存性を呈した（調整したｒ２＝０．９９４）。ｓｇＩＤはすべて、十分にバランスが取れたＧＣ含有量で設計されていたが、第２のバーコードはランダムな配列を含む。バーコードを生成する多項式処理により、中間レベルのＧＣ含有量が最も一般的となったが、ＧＣ含有量の何らかの偏差が観察された。ｆ４（ｂ）の最大値は、中間のＧＣ含有量で生じ、ＰＣＲが中間の融解温度のテンプレートＤＮＡに向かって増幅を偏らせることを示唆している。本発明者らは、対数変換された値からこのＧＣバイアスの影響を減じた。ｔｍｒｂ＝Ｌｎ［Ｔｍｒｂ］−ｆ４（ｂ）である。この修正により、腫瘍サイズが平均で５％変化する。
【０２１８】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを用いたインビトロでの切断効率の計算
Ｃａｓ９発現細胞株にＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを感染させ（これを導入し）、４８時間後に収集した。ｇＤＮＡを抽出し、標的遺伝子座を、先のプライマーを使用して増幅した。
【０２１９】
標的部位でのインデルの分析
インビボでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性インデル形成を確認するために、関心対象の各遺伝子の標的領域を、バルク肺試料から抽出したゲノムＤＮＡから、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）と、対形成した末端の配列決定に適した短いアンプリコンを生じるプライマー対とを使用してＰＣＲ増幅した。
【０２２０】
【表９】
2022502063.tif 000018
【０２２１】
ＰＣＲ産物を、ゲル抽出かまたはＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅキットを使用して直接精製するかのいずれかを行った。ＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して、製造元の取扱説明書に従って決定した。１４の精製されたＰＣＲ産物をすべて、各マウスについて同じ比率で組み合わせた。ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定アダプターをマウス１匹あたり単一の多重化タグを有するプールしたＰＣＲ産物へと、標準プロトコルを備えたＳＰＲＩｗｏｒｋｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａ８８２６７）を用いてライゲートした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑで配列決定を行って、単一末端の１５０ｂｐの読み取りを生成した（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）。
【０２２２】
カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、インデル配列決定データを分析した。１４の標的領域の各々について、標的領域のいずれかの側で８マーを選択して、４６塩基対の領域を生成した。読み取りには両方のアンカーを含有する必要があり、配列決定エラーは許容されなかった。次に、２つのアンカー間の各断片の長さを決定し、予想した長さと比較した。インデルを、挿入または欠失した塩基対の数により分類した。
【０２２３】
各個々のマウスにおける各個々の遺伝子座についてのインデルの割合を、以下のとおり計算した。
【０２２４】
【数８】
2022502063.tif 000019
【０２２５】
次に、３つのＮｅｏ遺伝子座におけるインデルの平均％を計算し、他のあらゆる標的遺伝子座でのインデルの％をこの値に対して正規化して、図６のＡにプロットされているＮｅｏに対するインデルの％を生成した。
【０２２６】
Ｌｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを用いたインビトロでの切断効率の計算
Ｃａｓ９発現細胞株にＬｅｎｔｉ−ＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅウイルスを感染させ（これを導入し）、４８時間後に収集した。ｇＤＮＡを抽出し、標的遺伝子座を、先のプライマーを使用して増幅した（標的部位でのインデルの分析を参照されたい）。まず、すべてのプライマーをプールし、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ７１２３）を使用して、１５回のＰＣＲを行った。次に、これらの産物を、先に説明したとおり、個々のプライマー対を用いたその後の増幅に使用した。配列決定ライブラリーを、先に説明したとおり調製した。
【０２２７】
組織学、免疫組織化学、および腫瘍分析
試料を４％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。免疫組織化学的分析を、Ｔｏｍａｔｏ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６００−４０１−３７９）、Ｓｍａｄ４（ＡｂＣａｍ，ＡＢ４０７５９）、およびＳｏｘ９（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ５５３５）に対する抗体を備えたＡＢＣ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて４μｍ切片上で行った。切片をＤＡＢで発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を、標準的な方法を使用して行った。
【０２２８】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴｏｍａｔｏ／Ｃｒｅを感染させた（これを導入した）肺由来の切片をＴｏｍａｔｏについて染色し、腫瘍を陽性（＞９５％のＴｏｍａｔｏ陽性癌細胞）、陰性（Ｔｏｍａｔｏ陽性癌細胞なし）、または混合型（すべての他の腫瘍）として採点した。腫瘍を、４匹の独立したマウス由来の肺葉全部を経た単一の切片から分類および計数した。
【０２２９】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２およびＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏで誘発した腫瘍の腫瘍面積の定量およびバーコード配列決定
ｔＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／Ｃｒｅウイルス、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃２／Ｃｒｅウイルス、またはＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅウイルスに感染させた（これを導入した）マウス由来の腫瘍担持肺葉をパラフィン内に包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。腫瘍面積の割合を、ＩｍａｇｅＪを使用して決定した。
【０２３０】
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２＃１／ＣｒｅおよびＬｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／Ｃｒｅに感染させた（これを導入した）ＫＴ；Ｃａｓ９マウスにおける個々の腫瘍内の癌細胞の数の分布を、先に説明したとおり、これらの個々のレンチウイルスバーコードのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定およびその後の分析によって評価した。
【０２３１】
Ｌｋｂ１およびＣａｓ９のウエスタンブロット法
Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＬｋｂ１／Ｃｒｅで発症する腫瘍に罹患しているＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスに由来する顕微解剖したＴｏｍａｔｏ陽性肺腫瘍を、Ｃａｓ９およびＬｋｂ１タンパク質発現について分析した。試料をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、ＬＤＳローディング色素で煮沸した。変性させた試料を４％〜１２％のビス−トリスゲル（ＮｕＰａｇｅ）上で泳動し、ＰＶＤＦ膜上へと転写した。膜に、Ｈｓｐ９０（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，６１０４１９）、Ｌｋｂ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１３０３１Ｐ）、Ｃａｓ９（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢＰ２−３６４４０）に対する一次抗体、ならびに二次ＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２００５）および抗ウサギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−２００４）を使用して免疫ブロット法を行った。
【０２３２】
Ｓｍａｄ４のＣａｓ９介在性不活性化を用いたマウスの生存分析
Ｓｍａｄ４に起因する機能的腫瘍抑制がないことを確認するために、ＫＴマウスおよびＫＴ；Ｃａｓ９マウスに１０５Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＳｍａｄ４／Ｃｒｅを気管内感染させた（これを導入した）。生存を評価するために、可視的な困難の徴候を示したとき、マウスを屠殺した。
【０２３３】
実施例２：インビボでの腫瘍原性変異体の多重定量分析
ヒトの癌の大規模なゲノム分析によって、腫瘍の発達を開始し、癌の成長を持続すると考えられている体細胞の点突然変異が分類されてきた。しかしながら、特定の変化の機能的有意性を決定することは、癌の遺伝的決定因子の理解における主要な障害のままである。本明細書では、本発明者らは、多重化したＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性相同性指向型修復（ＨＤＲ）を、ＤＮＡバーコード付与およびハイスループット配列決定を組み合わせて、マウスにおける新規の癌内の複数のゲノム変化を同時に調べるプラットフォームを紹介する。このアプローチを使用して、本発明者らは、成体体細胞におけるＫｒａｓのホットスポットコドン１２および１３へと非同義突然変異のバーコード付きライブラリを導入し、肺、膵臓、および筋肉において腫瘍を発症させた。バルク肺および膵臓からのバーコード付きＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のハイスループット配列決定は、Ｋｒａｓ変異体の腫瘍原性において驚くべき多様性を明らかにした。インビボで正確なゲノム変化の機能を同時に調べるための迅速で費用効果の高い定量的アプローチは、発癌に対する新たな生物学的なおよび臨床的に実行可能な洞察を明らかにする。
【０２３４】
結果
定量的かつ比較的ハイスループットの様式で、インビボでの多様な点突然変異の腫瘍原性機能を解析するために、本発明者らはいくつかの癌の種類の自発性マウスモデルにおいてＤＮＡバーコード付与およびハイスループット配列決定を組み込む、体性ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲについてのプラットフォームを開発した（図２３のＡ〜Ｄ）。本発明者らは、ＡＡＶベクターのライブラリを設計、生成、および検証して、可能なすべてのＫｒａｓコドン１２および１３の一塩基非同義点突然変異を体性マウス細胞へとに多重化した様式で導入した（図２３のＥ〜Ｇ、および図２７）。各ＡＡＶは、Ｋｒａｓの第２のエクソンを標的とするｓｇＲＮＡ、約２ｋｂのＫｒａｓＨＤＲテンプレート、およびＣｒｅ−リコンビナーゼを含有していた（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ、図２３のＥおよび図２７のＡ〜Ｃ）。
【０２３５】
ＫｒａｓＨＤＲテンプレートは、野生型（ＷＴ）ＫｒａｓまたはＫｒａｓのコドン１２および１３における１２の一塩基非同義突然変異のうちの１つのいずれかと、Ｋｒａｓの第２のエクソンに隣接しているゲノム配列とを含有していた。各ＫｒａｓＨＤＲテンプレートはまた、ｓｇＫｒａｓ標的配列内でのサイレント突然変異と、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のＣａｓ９介在性開裂を防止ための関係するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ＊）も含有していた。バルク組織からのＤＮＡのハイスループット配列決定による個々の腫瘍の並列定量を可能にするために、本発明者らは、１２および１３の下流のコドンのゆらぎ位置へと操作されたランダムな８ヌクレオチドバーコードを用いて、各ＫｒａｓＨＤＲテンプレートを多様化した（図２３のＥおよび図２７のＢ，Ｃ）。
【０２３６】
ＡＡＶベクターはまた、Ｃｒｅ−リコンビナーゼもコードしていた。Ｃｒｅ発現により、Ｃｒｅ調節性Ｃａｓ９対立遺伝子（Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）、蛍光Ｃｒｅレポーター対立遺伝子（Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ）、および周知の腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のｆｌｏｘ化対立遺伝子（ｐ５３ｆｌｏｘ）またはＬｋｂ１のｆｌｏｘ化対立遺伝子（Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ）を含有しているマウスにおいて腫瘍の発症が可能になった。本発明者らは、高力価産生、インビボでのマウス肺上皮細胞の効率亭な導入（図２８）、および広範囲の成体マウス組織の導入を可能にするＡＡＶ８カプシドを用いたＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリーをパッケージ化した。
【０２３７】
本発明者らは最初に、ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲが、内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へと点突然変異を操作する偏りがない方法であるか否かを決定するために、培養中のＣａｓ９発現細胞にＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入した（図２７のＥ）。ＫｒａｓＨＤＲ特異的ＰＣＲ増幅およびそれに続く導入された細胞のハイスループット配列決定により、すべての点突然変異型Ｋｒａｓ対立遺伝子の生成が確認された（図２７のＦ，Ｇ）。さらに、インビトロでのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子頻度は、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドライブラリーにおける表示と相関していた。この結果は、本発明者らのＡＡＶベクターを使用したＨＤＲが、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートにおけるいかなる一塩基Ｋｒａｓコドン１２または１３点突然変異によっても識別可能に偏っていないことを確認している。それゆえ、特定のＫｒａｓ突然変異対立遺伝子を保有する腫瘍のいかなる差次的な拡大も、各Ｋｒａｓ対立遺伝子を有するドナーＤＮＡテンプレートを使用したＨＤＲの効率の違いよりもむしろ、Ｋｒａｓ突然変異体間の生化学的な違いに起因する可能性がある（図２７のＨ）。
【０２３８】
体細胞におけるＨＤＲが、腫瘍を発症することができるか否かを決定するために、およびＫｒａｓ変異体が腫瘍形成を推進する能力に違いがあるか否かを調べるために、本発明者らは、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子を有するマウスの肺へ、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリーを気管内送達した（図２４および図２９）。具体的には、本発明者らは、腫瘍抑制遺伝子の同時不活性化が、Ｋｒａｓ変異体の腫瘍原性を調節するか否かへの洞察を提供するように、３つの異なる遺伝子型のマウス、すなわち、１）Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、２）ウイルスで発症した腫瘍がｐ５３を欠失するｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウス、および３）ウイルスで発症した腫瘍がＬｋｂ１を欠失するＬｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスを導入した（図２４のＡおよび図２９のＡ）。
【０２３９】
ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは最初に、ＡＡＶ投与からおおよそ５か月後に頻呼吸および体重減少を含む腫瘍発生の徴候を示した。このことは、Ｃｒｅ調節性ＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子およびＬｋｂ１喪失を有するマウスにおける肺腫瘍の急速な成長と一致している。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、多くの原発性肺腫瘍に起因する非常に高い腫瘍量を有していた（図２４のＢ，Ｃ、および図２９のＢ〜Ｄ）。これらのマウスの肺の組織学的分析により、大きな腺腫および腺癌の存在が確認された（図２４のＢおよび図２９のＢ）。ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスはまた、多数の大きな原発性肺腫瘍を発達させた。ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスと比較して、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて発症した腫瘍は、ｐ５３欠損に特徴的な特色である、より顕著な核異型を有していた。最後に、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは、より後の時点でさえ、より小さく、あまり進行していない病変を発達させた（図２４のＢ，Ｃおよび図２９のＢ〜Ｄ）。ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの１０倍低い用量を導入したマウスは、比例してより少ない腫瘍を発達させた（図２９のＥ）。
【０２４０】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入した数匹のＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスおよびＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスはまた、浸潤性原発性肺腫瘍、胸膜腔内播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）、およびリンパ節転移も発達させた（図２４のＤ、Ｅ、および図２９のＦ，Ｇ）。したがって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘発性腫瘍は、悪性および転移性肺癌へと進行する可能性がある。
【０２４１】
本発明者らは、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＰＴマウスおよびＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；ＬＴマウスに１：１０，０００希釈のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを感染させ、それにより腫瘍原性ＫｒａｓＧ１２Ｄがウイルスを導入された細胞すべてにおいて発現することによって、肺におけるＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲの効率を概算した。これらのマウスは、腫瘍原性のＫｒａｓ対立遺伝子がＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲによって生成されるマウスのおおよそ半分の腫瘍を発達させた。この結果は、０．０２％〜０．１％のＨＤＲ頻度と一致しており、個々のマウスにおいて複数の肺腫瘍を並行して堅固に発症させることができる（図２４のＣ）。重要なことに、ｓｇＫｒａｓ（ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ）を有さない類似のベクターライブラリーをＴマウス、ＰＴマウス、およびＬＴマウスへ送達すると、効率的な腫瘍の発症にはつながらず、ｐ５３欠損もＬｋｂ１欠損も高レベルのＡＡＶベクター導入と組み合わされて、肺腫瘍形成を十分には推進しないことを示唆した（図２４のＣ、および図３０）。
【０２４２】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを用いて発症する腫瘍が、突然変異体ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を保有していることを確認するために、本発明者らは、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスおよびＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス由来の大きな個々の肺腫瘍から、ＦＡＣＳ単離したＴｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅ癌細胞におけるＫｒａｓ遺伝子座を分析した。ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、各腫瘍における固有のバーコードを有する腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子の存在が確認された（図２４のＦおよび図３１のＡ，Ｂ）。興味深いことに、初回のＡＡＶライブラリーにおいて、いかなる検出可能なＨＤＲもないことおよび突然変異体対立遺伝子の表示が相対的に均一であることにもかかわらず、１３個のＫｒａｓ突然変異体のうちの５個のみを約５０の大きな肺腫瘍において識別した（図２４のＦ）。この結果は、肺腫瘍形成におけるＫｒａｓ変異体の差次的な選択と一致している。
【０２４３】
個々の腫瘍を分析することにより、本発明者らは、腫瘍細胞内に存在するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子および第２のＫｒａｓ対立遺伝子の両方を注意深く評価することができた（図３１）。腫瘍原性のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のおおよそ半分が、完璧なＨＤＲ事象に起因し、該事象において、Ｋｒａｓ点突然変異および固有バーコードを内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へと継ぎ目なく組換えた。残分のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子は、継ぎ目なく５’末端から突然変異体エクソン２を経ていたが、イントロン２における小さな重複、挿入、または欠失を含有していた（図３１のＤ）。重要なことに、これらの変化のいずれも、変異体エクソン２からエクソン３へのスプライシングを妨害するとは予想されなかった。加えて、ほとんどすべての腫瘍が第２のＫｒａｓ対立遺伝子においてＣａｓ９誘導性インデルを保有していたが、これは、腫瘍原性ＫＲＡＳ推進型ヒト腫瘍における野生型ＫＲＡＳ対立遺伝子の頻繁な喪失と一致している（図３１のＥ，Ｆ）。従来の研究では、マウスにおける野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の不活性化後の強化されたＫｒａｓＧ１２ＤおよびＫｒａｓＱ６１Ｌで推進される肺腫瘍の成長を文書にされてきたが、本発明者らの結果は、多くの腫瘍原性Ｋｒａｓ変異体が、肺腫瘍の成長中に野生型Ｋｒａｓによって抑制される可能性があることを示唆している。
【０２４４】
ヒトの肺癌を推進することに加えて、腫瘍原性ＫＲＡＳは、ヒトの膵管腺癌（ＰＤＡＣ）にほぼ汎存している。ＫｒａｓＧ１２ＤまたはＫｒａｓＧ１２Ｖの発現およびｐ５３の不活性化は、マウスモデルにおいてＰＤＡＣの発達につながる。ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲがまた、膵臓上皮細胞における癌を発症する腫瘍原性点突然変異を誘導することができるか否かを決定するために、本発明者らは、逆行性膵管注射によって、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅをＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスに導入した（図２５のＡおよび図３２のＡ）。これらのマウスは、前癌性膵臓上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮｓ）およびＰＤＡＣを発達させた（図２５のＢおよび図３２のＢ，Ｃ，Ｆ）。数匹のマウスはまた、ヒト疾患の攻撃的な性質と一致して、浸潤性および転移性のＰＤＡＣも発達させた（図２５のＣおよび図３２のＤ〜Ｆ）。いくつかの大規模な膵腫瘍塊からＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を配列決定すると、固有バーコードを有する腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子が明らかとなった（図２４のＤ）。興味深いことに、ちょうど４つの試料を分析したが、ヒト膵癌における最も頻繁なＫＲＡＳ突然変異であるＫｒａｓＧ１２ＤおよびＫｒａｓＧ１２Ｖのみを観察した。腫瘍原性ＫｒａｓがＰＤＡＣを発症する必要条件と一致して、本発明者らの陰性対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅベクターの逆行性膵管注射によるＰＴマウスにおける膵細胞の導入は、いかなる膵腫瘍も誘発しなかった（図３２Ｆ）。
【０２４５】
ヒト軟部肉腫はまた、ＲＡＳ経路においておよびＴＰ５３において突然変異をしばしば保有している。肉腫は、ＫｒａｓＧ１２Ｄの発現およびｐ５３の不活性化を経て遺伝子操作されたマウスにおいて誘発されてきた。ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲが点突然変異をＫｒａｓへと導入して肉腫の形成を推進するために使用することができるか否かを決定するために、本発明者らは、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスの腓腹筋へとＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの筋肉内注射を行った（図２５のＥおよび図３３のＡ）。これらのマウスは、固有バーコード付きＫｒａｓＧ１２Ｄ対立遺伝子、ＫｒａｓＧ１２Ａ対立遺伝子、およびＫｒａｓＧ１３Ｒ対立遺伝子を保有する、急速に成長する浸潤性肉腫を発達させた（図２５のＦ〜Ｈおよび図３３）。発症から悪性進行を経た腫瘍形成をモデル化するためのこのプラットフォームの応用の成功は、広範囲の種類の癌における腫瘍原性ドライバーの突然変異の多重機能分析についてその幅広い適用性を強調している。
【０２４６】
自発性癌モデルにおける遺伝子機能を評価する現行の方法は、腫瘍の数および大きさの手動による定量に大きく依存しているが、本発明者らは、バルク組織から直接、腫瘍細胞数を腫瘍遺伝子型と関連させるための、単純でありながらハイスループットの多重化したアプローチを確立した（図２３のＤおよび図４のＡ）。ＨＤＲによって体細胞へと導入された固有ＤＮＡバーコードは、細胞が分裂するにつれて数が増えるので、所与の腫瘍内の癌細胞の相対数は、バーコード領域のディープ配列決定によって決定することができる。さらに、各腫瘍における細胞の絶対数は、ディープ配列決定の前に各試料に正規化対照を添加することによって概算することができる。遺伝子型を決定し、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからの全肺における各腫瘍内の癌細胞の絶対数を概算するために、本発明者らはまず、既知のバーコードを有する５×１０５個の細胞を各試料へ添加した（図２６のＡおよび図３４）。本発明者らは次に、バルク肺試料からＤＮＡを抽出し、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子をＰＣＲ増幅し、各対立遺伝子の変異体−バーコード領域をディープ配列決定した（図２３のＤおよび図４のＡ、ならびに図３４）。
【０２４７】
ハイスループット配列決定に続いて、本発明者らは、頻発性配列決定エラーと、個々の腫瘍が同一のバーコードを持っている可能性とを修正した。本発明者らは次に、腫瘍バーコード配列決定読み取り計数を、正規化対照ＤＮＡからの読み取り数に対して正規化することにより、各腫瘍内の癌細胞の絶対数を概算した。この分析パイプラインは、技術的な複製物にわたって腫瘍サイズと高い程度で一致して、例外的に再現性があった（図３５）。バルク組織から並行して個々の腫瘍の定量分析を可能にすることによって、このＨＤＲに基づくバーコード付与およびディープ配列決定アプローチは、インビボでの腫瘍の展開の前例がない画像を提供する。
【０２４８】
ＫｒａｓＨＤＲ変異体−バーコード領域のハイスループット配列決定により、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて、多くのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ誘発性肺腫瘍が明らかになった（図３６のａ〜ｃ）。ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターライブラリーにおける各ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の初回表示に対する腫瘍数の正規化によって、本発明者らは、各Ｋｒａｓ変異体のインビボでの腫瘍原性を直接比較することができた（図２６のＢおよび図３６のＤ，Ｅ）。５００個を超える腫瘍にわたって、ＫｒａｓＧ１２Ｄが最も一般的な変異体であり、非喫煙者におけるヒト肺腺癌内で最も頻繁なＫＲＡＳ突然変異であるＫＲＡＳＧ１２Ｄと一致していた。ＫｒａｓＧ１２Ａ、ＫｒａｓＧ１２Ｃ、およびＫｒａｓＧ１２Ｖ（ＫＲＡＳＧ１２Ｄ後のヒト肺腺癌における最も頻繁なＫＲＡＳ変異体）、ならびにＫｒａｓＧ１３Ｓは、肺腫瘍形成の中程度のドライバーとして識別されたが、ＫｒａｓＧ１２Ｄよりも有意に少数の腫瘍において存在していた（図２６のＢ）。興味深いことに、ＫｒａｓＧ１２ＲおよびＫｒａｓＧ１３Ｒはまた、ヒト肺癌においてめったに突然変異しないにもかかわらず、強力な腫瘍原性変異体として識別された（図２６のＢ）。
【０２４９】
本発明者らは、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて腫瘍を発症させて、腫瘍抑制因子の同時変化によって、異なるＫｒａｓ変異体が腫瘍の成長を発症させおよび推進する能力が調節されるか否かを直接評価した。興味深いことに、Ｋｒａｓ腫瘍原性の全体的な範囲は、Ｌｋｂ１の不活性化によって有意に変化したが、本発明者らは、ｐ５３またはＬｋｂ１の同時不活性化を有する腫瘍における個々のＫｒａｓ変異体の相対的な腫瘍形成能において劇的な違いを観察しなかった（図２６のＣ〜Ｅおよび図３６）。このデータは、インビボでこれらの腫瘍原性Ｋｒａｓ変異体によって誘導されるシグナル伝達の強度がｐ５３経路に関与するには不十分であるモデルと一致しており、したがって、ｐ５３は、腫瘍の進行を抑制するように機能するが、ある特定のＫｒａｓ遺伝子型を有する腫瘍の初期拡大を制限するものではない。加えて、Ｌｋｂ１欠損症は腫瘍の成長を増大させるが、Ｌｋｂ１欠損症によって誘導されるシグナル伝達は、Ｋｒａｓの特定の変異型によって誘導される下流シグナルと優先的に相乗作用しない。
【０２５０】
本発明者らの腫瘍バーコード付与および配列決定プラットフォームにより、本発明者らは、バルク肺から並行して多くの個々の肺腫瘍を識別することができるので、本発明者らは、このアプローチを使用して、ヒトＰＤＡＣの自発性マウスにおいて発症した多発性腫瘍塊における個々の膵腫瘍クローンを識別および分析するという課題を克服することもできると予想した。それゆえ、本発明者らは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅを導入したＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスからのバルクの膵腫瘍試料も分析した（図２６のＦおよび図３７のＡ，Ｂ）。膵腫瘍塊のバーコード付与により、マウス１匹につき複数の原発性腫瘍クローンが各々、Ｋｒａｓコドン１２または１３における点突然変異と固有ＤＮＡバーコードとを有するＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を保有していることが明らかとなった。膵腫瘍は、腫瘍原性のＫｒａｓ対立遺伝子の選好性を実証し、ＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＫｒａｓＧ１２Ｖ、およびＫｒａｓＧ１２Ｒが最も一般的な変異体であった（図２６のＦ）。特に、これら３つのＫｒａｓ変異体は、ヒトＰＤＡＣにおいて最も一般的な腫瘍原性ＫＲＡＳ変異体でもある。
【０２５１】
特定のＫｒａｓ変異体のインビボでの腫瘍原性を決定することに加えて、本発明者らのバーコード配列決定アプローチにより、本発明者らは、ＰＤＡＣ量の多重領域配列決定から隣接する腫瘍クローンを識別し、原発性腫瘍とその転移性子孫との間のクローンとしての関連性を明らかとすることができた（図２６のｇおよび図３７のｃ）。
【０２５２】
ヒトの癌における突然変異の有病率は、突然変異が発生する頻度と、突然変異が腫瘍形成を推進する程度との両方の関数である。／ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲを使用して、点突然変異を内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へとに偏りがない様式で導入することにより、本発明者らは、Ｋｒａｓ変異体が肺腫瘍形成を推進する能力が量的に異なっていることを決定した（図４のＢおよび図３６）。さらに、本発明者らのＨＤＲに基づくアプローチを使用してマウスにおいて発症させた膵腫瘍により、ヒトＰＤＡＣと同じ優性Ｋｒａｓ変異体についての選択が実証され、ヒトＰＤＡＣにおいて観察されたＫＲＡＳ突然変異の範囲が、ＫＲＡＳ突然変異体の変異率の違いによるよりもむしろ、ＫＲＡＳ突然変異体間での生化学的な違いによって推進される可能性があることを示唆した（図２６のＦおよび図３７）。
【０２５３】
各Ｋｒａｓ変異体の生化学的特性が該Ｋｒａｓ変異体のインビボでの腫瘍原性にどのように影響するのかを理解し始めるために、本発明者らは、Ｋｒａｓ変異体のすでに文書化された生化学的挙動と、本発明者らの研究における肺腫瘍または膵腫瘍の形成を推進する該Ｋｒａｓ変異体の能力との間の関連性を調べた（図３８）。特に、ＫＲＡＳ突然変異は、ＫＲＡＳ機能に重要であると考えられる生化学的特色（例えば、ＧＴＰアーゼ活性およびＲＡＦキナーゼ親和性）における劇的な違いにつながったが、単一の生化学的特性は、インビボでのＫｒａｓ変異体の腫瘍原性を予測しなかった。この結果は、Ｋｒａｓ変異体のインビボでの腫瘍原性が、代替の生化学的特性によって最もよく説明されることができるか、またはおそらく、複数の生化学的出力の統合を経て説明される可能性がさらに高いことを示唆している。
【０２５４】
本発明は、本発明者らのＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲアプローチを定量的な規模拡大縮小可能な、モジュール式アプローチとして、並行した突然変異のパネルのインビボでの腫瘍原性の費用効果がある体系的な研究のために強調している。インビボでのＫｒａｓ機能の遺伝的解剖を可能にする多重化アプローチは、ＲＡＳタンパク質の変異型の進行中の生化学的研究および細胞培養研究への重要な補完である。この方法により、多くの一般的な癌の種類にわたる一般的な癌遺伝子における多様な突然変異と、稀少な推定上の腫瘍原性突然変異との機能に関する前例がない理解が可能となる。最後に、本発明者らは、このプラットフォームが、正確に規定された癌の遺伝子亜型に対する標的療法の発見と前臨床での検証との両方を劇的に加速させると想定している。
【０２５５】
方法
Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡの設計、作製、およびスクリーニング
Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡを取得して、体性マウス細胞における相同性指向型修復（ＨＤＲ）を強化するために、本発明者らは、Ｋｒａｓエクソン２を標的とする可能なすべての２０ｂｐのｓｇＲＮＡ（コンセンサスＣａｓ９  ＰＡＭを使用：ＮＧＧ）ならびに隣接するイントロン配列を識別し、これらを、利用可能なｓｇＲＮＡ設計／採点アルゴリズムを使用して予想されるオンターゲット切断効率について採点した。本発明者らは次に、Ｋｒａｓを標的とする３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＫｒａｓ＃１：ＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＴＡ、ｓｇＫｒａｓ＃２：ＧＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＧ、ｓｇＫｒａｓ＃３：ＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ）の切断効率を経験的に決定した（図２７のＡ）。簡単に説明すると、Ｋｒａｓを標的とする各ｓｇＲＮＡについて、Ｌｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターを、すでに説明したとおり作製した。Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発（ＮＥＢ）を使用して、Ｕ６プロモーラーを含有する親レンチウイルスベクターへとｓｇＲＮＡを挿入して、ｓｇＲＮＡの転写およびＣｒｅ−リコンビナーゼを推進するＰＧＫプロモーターを推進した。各ｓｇＫｒａｓの切断効率を、各Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅウイルスとともに培養中のＬＳＬ−ＹＦＰ；Ｃａｓ９細胞の導入を介して決定した。本発明者らは、感染（導入）から４８時間後のＹＦＰｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞をＦＡＣＳによって単離し、ＤＮＡを抽出し、標的Ｋｒａｓ遺伝子座をＰＣＲ増幅し（順方向プライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ、逆方向プライマー：ＡＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＣＴＣＧＧＡＧ）、アンプリコンをサンガー法で配列決定した（配列決定プライマー：ＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣ）。配列決定トレースをＴＩＤＥによって分析して、インデル誘導率を決定した。予想した遺伝子座で３つのｓｇＲＮＡはすべてインデルを誘導したので、Ｋｒａｓコドン１２および１３に最も近い配列を標的とするｓｇＫｒａｓ（ｓｇＫｒａｓ＃３）をその後の実験すべてに使用して、このことが所望の遺伝子座のＨＤＲを最もよく促進すると予想されたとおりであった（図２７のＡ）。
【０２５６】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリーの設計、構築、および検証
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ骨格の生成
ｐＬＬ３．３；Ｕ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−ＣｒｅからのＵ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−ＣｒｅカセットをＱ５（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）でＰＣＲ増幅し、ＴＯＰＯクローン化し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、配列決定によって検証した。ＡＡＶ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターを生成するために、３８８−ＭＣＳ  ＡＡＶプラスミド骨格のＩＴＲ間の配列を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩを用いて除去した。Ｕ６−ｓｇＫｒａｓ／ＰＧＫ−ＣｒｅカセットをＴＯＰＯベクターからＸｈｏＩ／ＸｂａＩで消化し、１．９ｋｂの断片を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩで消化した３８８−ＭＣＳ骨格へとライゲートし、ＳｐｅＩ部位を破壊した。ＭｌｕＩ消化後、ＢＧＨポリＡ配列をＣｒｅの３’に挿入した。マウスＫｒａｓのエクソン２を取り囲む約２ｋｂの領域をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（順方向プライマー：ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣ、逆方向プライマー：ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧ）。その後、アンプリコンをＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。ＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位をＴＯＰＯでクローン化した２ｋｂのＫｒａｓ配列へと、Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発（ＮＥＢ）（ＡｖｒＩＩ順方向プライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ、ＡｖｒＩＩ逆方向プライマー：ＣＣＴａｇＧＴＧＴＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＴＡＴＴＣＣ、ＢｓｉＷＩ順方向プライマー：ＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣ、ＢｓｉＷＩ逆方向プライマー：ＣＧｔＡＣＧＣＡＧＡＣＴＧＴＡＧＡＧＣＡＧＣ、制限部位に下線を付しており、誤対合塩基を下付き文字にしている）を用いて導入した。ＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩ部位を保有するＫｒａｓ断片をＴＯＰＯから、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで放出し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化したＡＡＶ−ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅへとライゲートして、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ骨格を生成した。
【０２５７】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ骨格の生成
Ｋｒａｓを標的とするｓｇＲＮＡなしでＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格を生成するために、ＰＧＫ−ＣｒｅをＴＯＰＯクローンからＮｏｔＩ／ＸｂａＩで切り出し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩで消化した３８８−ＭＣＳ  ＡＡＶプラスミド骨格へとライゲートした。ＢＧＨポリＡ配列およびマウスＫｒａｓ断片を先に説明したとおり添加して、対照ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ骨格を生成した。
【０２５８】
多様なＫｒａｓ変異体／バーコード領域の設計および合成
ＡＡＶ骨格のＫｒａｓＨＤＲ配列へと活性化型単一点突然変異およびＤＮＡバーコードのライブラリーを導入するために、本発明者らは、４つの２９５ｂｐのＫｒａｓ断片を、縮重「Ｎ」塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）と、Ｋｒａｓコドン１２および１３の最初の２つの塩基対の各々で合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（図２７のｂ）。設計上、４つの断片プールの各々は、コドン１２およびコドン１３での３つの非同義の一塩基突然変異、ならびに対照として機能する野生型Ｋｒａｓ配列からなった。したがって、４つのプールの各々が野生型断片を含有していたので、野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子の全体的な表示は、突然変異型Ｋｒａｓ対立遺伝子の各々よりもおおよそ４倍高いと予想された。合成された断片はまた、ｓｇＫｒａｓ標的配列および関係するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ＊）内でのサイレント突然変異、ならびに個々の腫瘍バーコード付与のために下流のＫｒａｓコドンのウォッブル位置へと縮重塩基を導入することによって作製された８ヌクレオチドのランダムなバーコードも含有されていた（図２７のＢ）。最後に、各フラグメントは、ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格へとクローン化するための隣接するＡｖｒＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位を含んでいた（図２７のＢ）。
【０２５９】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲベクターへのＫｒａｓ突然変異体／バーコードの断片のライゲーション
合成した４つの断片プールを等しい比率で組み合わせて、ＰＣＲ増幅した（順方向プライマー：ＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧ、逆方向プライマー：ＧＴＡＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴＧＧＴＣＧＣＣ）。アンプリコンをＡｖｒＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、エタノール沈殿によって精製し、いずれのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ骨格にもライゲートした（図２７のＣ）。ライゲートした各プラスミドライブラリーをＳｔｂｔ３電気適格（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ＮＥＢ）へと形質転換し、２０枚のＬＢ−Ａｍｐプレート上へ播種し、これは、１つのライブラリーあたり約３×１０５個の細菌コロニーを生じた。コロニーをＬＢ−Ａｍｐ液状培地へと掻把収集し、３７℃で６時間増殖させてプラスミド収量を増加させ、ＡＡＶ産生に十分なプラスミドＤＮＡを取得した。次に、Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２６０】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリーの検証
各Ｋｒａｓ変異体の表示および各ＡＡＶプラスミドライブラリー内でのバーコードヌクレオチドの分布を決定するために、精製済みＡＡＶプラスミドライブラリーを、多重化タグ（下線を付したＮ）を含有するＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（下付き）で尾部処理したプライマーを用いてＰＣＲ増幅した（順方向プライマー：ａａｔｇａｔａｃｇｇｃｇａｃｃａｃｃｇａｇａｔｃｔａｃａｃｔｃｔｔｔｃｃｃｔａｃａｃｇａｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃｔＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、逆方向プライマー：ｃａａｇｃａｇａａｇａｃｇｇｃａｔａｃｇａｇａｔＮＮＮＮＮＮｇｔｇａｃｔｇｇａｇｔｔｃａｇａｃｇｔｇｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｃＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧ）後、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標））でディープ配列決定した。
【０２６１】
ＡＡＶカプシド血清型肺上皮細胞導入分析
組換えＡＡＶ−ＧＦＰベクターを、ｐＡｄ５ヘルパー、ｓｓＡＡＶ−ＲＳＶ−ＧＦＰ転移ベクター、および関心対象の９のカプシド、すなわち、ＡＡＶ１、２、３ｂ、４、５、６、８、９＿ｈｕ１４およびＤＪの各々についてのシュードタイピングするプラスミドを有するＣａ３（ＰＯ４）２三重トランスフェクションプロトコルを用いて作製した。ウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）内で産生し、次いで二重塩化セシウム密度勾配精製および透析をすでに説明したとおりに行った。ｒＡＡＶベクター調製物をＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによってＧＦＰについて力価測定した（順方向プライマー：ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴ、逆方向プライマー：ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣ、プローブ：６−ＦＡＭ／ＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧ／ＢＨＱ−１）。成人の肺上皮細胞の導入に最適なＡＡＶ血清型を特定するために、各マウスは、気管内投与を介して最大力価で６０μｌのシュードタイピングしたＡＡＶ−ＧＦＰを投与された。ＡＡＶ投与から５日後にマウスを分析した。肺を単一細胞懸濁液へと分離し、すでに説明したとおり、ＧＦＰｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞のＦＡＣＳ分析のために調製した。ＧＦＰｐｏｓｉｔｉｖｅ率を、１０，０００を超えるライブゲート処理した細胞を分析することによって決定した（図２８を参照されたい）。
【０２６２】
ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲプラスミドライブラリーの作製および力価測定
ＡＡＶライブラリーを、ｐＡｄ５ヘルパー、ｐＡＡＶ２／８パッケージングプラスミド、および先に説明したバーコード付きＫｒａｓライブラリー転移ベクタープールを備えたＣａ３（ＰＯ４）２三重トランスフェクションプロトコルを用いて作製した。トランスフェクションを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において行った後、二重塩化セシウム密度勾配精製および透析を、すでに説明したとおり行った。ＡＡＶライブラリーをＣｒｅについてのＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによって力価測定した（順方向プライマー：ＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧ、逆方向プライマー：ＣＣＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴ、プローブ：６−ＦＡＭ／ＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣ／ＢＨＱ−１）。
【０２６３】
インビトロでのＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲ
コドン１２および１３での突然変異を取り巻くヌクレオチドの変化（ｓｇＲＮＡ認識部位およびＰＡＭモチーフを突然変異させるためのコドン１２／１３の５’での３つのヌクレオチドの変化、ならびにバーコード配列における最多１０の変化）により、Ｋｒａｓコドン１２および１３は、ＨＤＲの速度に差次的に影響を及ぼす可能性は低くなる。本発明者らは、それにもかかわらず、ＨＤＲ効率が、個々のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の配列の違いによって影響される可能性があるか否かを試験した。インビトロでのＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性ＨＤＲを誘導するために、本発明者らは、ＬＳＬ−ＹＦＰ／Ｃａｓ９細胞に精製済みＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリーを導入した（図２７のＥ）。細胞を、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の阻害剤である１０μＭのＳＣＲ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含有する細胞培養培地中で維持して、相同性指向型修復を促進した。導入から９６時間後、フェノール／クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿により、ＬＳＬ−ＹＦＰ／Ｃａｓ９細胞からＤＮＡを単離した。Ｋｒａｓ遺伝子座をこのＤＮＡから、本発明者らが内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へと組み込んだＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の特異的増幅のために開発したＰＣＲ戦略を用いて増幅した。本発明者らは次に、インビトロでのＨＤＲ後にＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の表示を決定するためにこれらのアンプリコンをディープ配列決定した（ＰＣＲおよび配列決定に関する詳細について後続の「Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリー調製およびバルクの組織からの腫瘍バーコードの配列決定」を参照されたい）。
【０２６４】
マウスおよび腫瘍の発症
Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ（Ｌ）マウス、ｐ５３ｆｌｏｘ（Ｐ）マウス、Ｒ２６ＬＳＬ−Ｔｏｍａｔｏ（Ｔ）マウス、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ（Ｋ）マウスがすでに説明されてきた。肺腫瘍を発症させるための気管内吸入によるＡＡＶ投与、膵腫瘍を発症させるための逆行性膵管注射、および肉腫を発症させるための筋肉内腓腹筋注射を説明したとおり行った。肺腫瘍を、６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウス、およびＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて、６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ（２．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＰＴマウス、ＬＴマウス、およびＴマウスにおいて、または１×ＰＢＳ中で１：１０，０００希釈した６０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＫＰＴマウスおよびＫＬＴマウスにおいて発症させた。膵腫瘍を、１００〜１５０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおいて、または１００〜１５０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／Ｃｒｅ（２．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＰＴマウスにおいて発症させた。１×ＰＢＳ中のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅの１：１０希釈物も、示されたマウスの肺または膵臓へ投与した。肉腫を、３０μｌのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅ（５．２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）でＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９において発症させた。マウスが腫瘍発達の症状を示したときに、安楽死させた。スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会は、すべてのマウス手順を承認した。
【０２６５】
個々の腫瘍の分析
個々の肺腫瘍の分析
腫瘍発達の症状を示す肺腫瘍担持マウスであり、ウイルス投与から４〜１０か月後に分析した。肺腫瘍量は、示されているように、肺重量によって、および蛍光解剖顕微鏡下で肉眼で見えるＴｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅ腫瘍の定量によって評価した（ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスは１匹だけ、ＡＡＶの不適切な気管内投与を示す、片肺葉の小さな領域に制限された最小のＴｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅシグナルを有しており、該マウスを本研究から除外した）。目に見えて多病巣性ではなかった最大の個々の肺腫瘍を、バルクの肺から蛍光解剖顕微鏡下で、配列決定のために解剖した。いくつかの肺腫瘍については、スタンフォード共有ＦＡＣＳ施設内でのＦＡＣＳ機（Ａｒｉａ  ｓｏｒｔｅｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、Ｔｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅ腫瘍細胞を精製した。組織学的分析のために、個々のマウスからいくつかの肺葉も収集した。
【０２６６】
個々の膵腫瘍塊の分析
膵腫瘍担持マウスは、腫瘍発達の症状を示し、ウイルス投与から３〜４か月後に分析した。膵腫瘍は主に。多病巣性であるように見えたので、Ｔｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅ腫瘍塊を含有する膵臓の個々の領域を解剖し、配列決定のためにＦＡＣＳ精製した（１：１０希釈のＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅライブラリーで処理したマウスはまた膵腫瘍塊も発達させ、それゆえ、これらの分析に含めた）。いくつかの膵臓の領域を、組織学的分析のために維持した。
【０２６７】
個々の肉腫の分析
明らかな腫瘍の発達を有する肉腫担持マウスであり、ウイルス投与から３〜７か月後に分析した。各肉腫の領域を配列決定のために維持し、隣接する領域を組織学的分析のために保存した。
【０２６８】
個々の腫瘍におけるＫｒａｓ対立遺伝子の特徴づけ
配列決定用のＤＮＡをＦＡＣＳ精製した腫瘍細胞および未分類の腫瘍試料から、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。腫瘍内のＫｒａｓ点突然変異およびバーコードを識別するために、本発明者らは、アニーリング温度、伸長時間、およびプライマー配列を含むいくつかの変数にわたって最適化された２つのプロトコル、すなわち、（プロトコル１−順方向プライマー：ＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、逆方向プライマー：ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴ、配列決定プライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ、アニーリング温度：６６℃、プロトコル２−順方向プライマー：ＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ、逆方向プライマー：ＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧ、配列決定プライマー：ＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣ、アニーリング温度：６４℃）を使用してＰＣＲ増幅し、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を配列決定した。これらのプロトコルを使用して、個々の腫瘍からの組み込まれたＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を、各々が、コドン１２およびコドン１３の上流のＰＡＭ領域において操作された突然変異を重複する順方向プライマーと、相同性アームの外側の逆方向プライマーとを組み込んだ場合、特異的に増幅した。長い伸長時間（２〜３分）を使用して、Ｋｒａｓ遺伝子座のイントロン２に挿入または重複を含有するものさえ、すべてのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の増幅を可能にした（図３１のＤ）。
【０２６９】
ＨＤＲを介して内在性Ｋｒａｓ遺伝子座に所望の点突然変異を導入するほかに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＫｒａｓエクソン２を標的とすることも、ＨＤＲの代わりにＮＨＥＪによるＤＮＡの修復後の切断部位にインデルを結果として生じると予想された。これらの修飾を特徴づけるために、本発明者らは、一般的なＰＣＲプロトコルを使用していずれのＫｒａｓ対立遺伝子も増幅した（順方向プライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ、逆方向プライマー：ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣ、配列決定プライマー：ＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＧＧＴＧＴＧＴＣ、アニーリング温度：７２℃）。ＤＮＡ切断部位での挿入および欠失の範囲を、このアプローチによって識別した（図３１のＥ，Ｆ）。いくつかの個々の腫瘍試料については、いずれのＫｒａｓ対立遺伝子の配列も、先のＰＣＲおよび配列決定戦略の後ではすぐに明らかではなかった。これらの試料からのＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローン化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および形質転換し、各試料からのいくつかのコロニーをプラスミド調製および配列決定して、各腫瘍内のいずれのＫｒａｓ対立遺伝子も特徴付けた。このアプローチは、生物学的複製物と技術的複製物との両方で再現性および信頼性があり、ＨＤＲによって誘導されるさまざまな腫瘍原性Ｋｒａｓ対立遺伝子を同定した。インデルを含有するＫｒａｓ対立遺伝子を、約５０個の腫瘍において同定した（図３１のＡ，Ｂ）。
【０２７０】
これらの分析はまた、個々の肺腫瘍からのＫｒａｓ対立遺伝子のいくつかにおける他のいくつかの予期しない特色も明らかにした。分析された個々の肺腫瘍の小さな部分セットにおいて、コドン２４での３つの異なるミスセンス突然変異（Ｉ２４Ｌ、Ｉ２４Ｎ、Ｉ２４Ｍ）が観察された。これらの変化の機能は、あったとしても、不明である。
【０２７１】
さらに、本発明者らは当初、内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へのＫｒａｓＨＤＲテンプレートの再結合がＫｒａｓＨＤＲテンプレートへと操作されたＡｖｒＩＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位の外側で生じると予想した（図３１Ｃ）。しかしながら、エクソン２の上流の２塩基対を９７塩基対に変化させることによって操作されたＡｖｒＩＩ部位は、本発明者らがＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の領域を直接分析した２５個の腫瘍のうちの５つにおいて欠失していた。エクソン２の下流の１塩基対を２０塩基対に変化させることによって設計されたＢｓｉＷＩ部位は、５８個の腫瘍のうち１１個に存在しなかった。これらの発見は、ＫｒａｓＨＤＲテンプレートの組換えが、より大きくより遠位の相同性アーム内で最も頻繁に発生した一方で、該組換えがまた、５’および３’ミスマッチによって隣接された相同性の非常に短い領域内で検出可能な頻度でも生じたことを示す（ＰＡＭ＊突然変異、Ｋｒａｓコドン１２または１３の突然変異、およびバーコード内での８の潜在的な誤対合を含む）。
【０２７２】
本発明者らが最初に、いくつかの腫瘍においてＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子における重複の存在を特定した後、本発明者らは、ＨＤＲで組み込まれたＫｒａｓ遺伝子座のいずれかの側で生じるＫｒａｓエクソン２の重複を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーを設計した（右手重複−順方向プライマー：ＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＧ、逆方向プライマー：ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡ、配列決定プライマー：ＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＧ、左手重複−順方向プライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ、逆方向プライマー：ＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＧＡＴＧ、配列決定プライマー：ＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧ）。これらの重複特異的ＰＣＲプロトコルの各々は、反対方向の隣接するプライマー対を使用し、重複が存在する場合にのみ増幅が発生することを確保した。野生型エクソン２の後半またはエクソン２全体（ただしスプライスアクセプターの重要な領域を欠失）の重複を含む、さまざまな長さの重複を識別した（図３１のＤ）。イントロン２の領域の欠失および重複も観察された。さらに、本発明者らは、Ｕ６プロモーターおよびウイルスＩＴＲを含むＡＡＶベクターの一部がイントロン２へと組み込まれていることを観察した。これらの変化の大きさおよび位置を考えると、腫瘍形成を推進する腫瘍原性Ｋｒａｓの必要条件と一致して、Ｋｒａｓ突然変異体のエクソン２のスプライシングをエクソン３に変更することは誰にも期待されない。
【０２７３】
既知のＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子とバーコードとを有する細胞株からのハイスループット配列決定のための正規化対照の生成
配列決定正規化対照として使用する細胞株を確立するために、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスから単一の大きな腫瘍を摘出し、単一細胞懸濁液中へと消化し、播種して細胞株を生成した。これらの細胞を増殖させ、次にＤＮＡを抽出した後、Ｋｒａｓエクソン２をＰＣＲ増幅した（順方向プライマー：ＴＣＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧ、逆方向プライマー：ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣ）。ＰＣＲ産物を（先に説明した特異的および一般的配列決定プライマーを使用して）配列決定し、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子およびバーコードの存在を確認した。固有バーコード（ＣＧＧＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＣＴＴＡＣＧＡＴＣ）を有する単一のＫｒａｓＧ１２Ｖ対立遺伝子を同定した。この細胞株からのゲノムＤＮＡを、すべてのバルク肺試料のハイスループット配列決定についての正規化対照として使用した（図３４）。
【０２７４】
バルクの組織加工およびＤＮＡ抽出
バルクの肺組織加工およびＤＮＡ抽出
感染した（導入された）マウスからバルク肺試料を摘出し、加工前に−８０℃で保存した。配列決定用のＤＮＡを抽出するために、試料を解凍し、５０ｍＬコニカルチューブに移した。２０ｍＬの溶解緩衝液（Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ）および２００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各試料へ添加した。次に、３μｇ（約５×１０５のゲノム）の正規化対照ＤＮＡを各試料へ添加した（図２５のＡおよび図３５のＢ）。次に、組織配合機を使用して試料を注意深く均質化し、組織配合機を、清潔な１０％漂白剤、７０％エタノール、および１×ＰＢＳを経て進行させることによって、各試料間で該組織配合機を清潔にした。均質化した試料を５５℃で一晩溶解した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿によって組織溶解物から分離した（図３７のＡ，Ｂ）。
【０２７５】
バルク膵組織加工およびＤＮＡ抽出
膵腫瘍塊を解剖し、消化し、生存可能な（ＤＡＰＩｎｅｇａｔｉｖｅ）、系列（ＣＤ４５、ＣＤ３１、Ｔｅｒ１１９、Ｆ４／８０）ｎｅｇａｔｉｖｅ、Ｔｏｍａｔｏｐｏｓｉｔｉｖｅの細胞をＦＡＣＳによって単離した。正規化対照を膵癌試料に添加しなかった。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＦＡＣＳで単離した腫瘍細胞からＤＮＡを単離した後、エタノール沈殿によってさらに精製した。
【０２７６】
バルクの組織からのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリー調製および腫瘍バーコードの配列決定
超並列および定量的な様式で各Ｋｒａｓ変異体を保有する腫瘍の数および大きさを明らかにするために、本発明者らは、バーコード付きＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の多重化したＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定を可能にする２回ＰＣＲ戦略を開発した（図２７のＦ）。第１の回のＰＣＲについては、本発明者らは、３つのＰＡＭおよびｓｇＲＮＡ標的部位突然変異（ＰＡＭ＊；第１の回の順方向プライマー配列において太字）を含有するＫｒａｓＨＤＲ配列に相補的な順方向プライマー（第１の回の順方向プライマー：ＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ）（配列番号２）、およびＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅベクターにおけるＨＤＲテンプレート内には存在しない内在性Ｋｒａｓ遺伝子座の下流領域に相補的な逆方向プライマー（第１の回の逆方向プライマー：ＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧ）（配列番号３）を使用した。このプライマー対を選択して、多量の野生型Ｋｒａｓ対立遺伝子またはバルクの腫瘍担持組織から精製したＤＮＡにおいて存在する潜在的なエピソームＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅベクターを増幅することなく、ゲノムＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を特異的に増幅した。加えて、Ｐ５アダプター（斜字体）、８ｂｐのカスタムｉ５インデックス（Ｎ’ｓ）、およびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定プライマー配列（読み取り１）（下線部）を第１の回の順方向プライマーの５’末端で含んで、多重化したＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のための第１の回の順方向プライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣ）（配列番号４）を可能にした。
【０２７７】
重要なことに、個々の腫瘍におけるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の特徴づけにより、ＨＤＲの何らかの変動性が明らかとなり、結果的にＫｒａｓイントロン２における多様なインデルを生じ（図３２のＤ）、４サイクル（肺試料）または６サイクル（膵臓試料）のみを第１の回のＰＣＲにおいて行って、可変長の産物の増幅中のバイアスについての可能性を最小限にした。さらに、高効率ポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ，ＮＥＢ、６４℃のアニーリング温度）および長い伸長時間（３：００分）を使用して、すべてのＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の堅牢な増幅を確保した。ゲノム肺ＤＮＡにおけるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子を、４〜４０個の別々の１００μＬのＰＣＲ反応物を用いて増幅し、次いで増幅後にプールし、ＰＣＲくじ引きの効果を低減させた（図３４のａ）。これらの１００μＬのＰＣＲ反応物の各々は、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の大きな初回プールから増幅するための４μｇのＤＮＡテンプレートを含有していた。第１の回の増幅後、すべての複製ＰＣＲ反応物をプールし、各試料１００μＬを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて浄化した。
【０２７８】
精製された第１の回のＰＣＲアンプリコンを、第２の回のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリーＰＣＲ１００μＬのためのテンプレートＤＮＡとして使用した（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（ＮＥＢ）、７２℃のアニーリング温度、肺試料については３５サイクル、膵臓試料については４０サイクル）。第２の回のＰＣＲは、第１の回のＰＣＲアンプリコンにおいて存在するＫｒａｓエクソン２配列の完全に中で１１２ｂｐ領域を増幅した。第２の回の逆方向プライマーは、Ｐ７アダプター（斜字体）、逆補完８ｂｐカスタムｉ７インデックス（「Ｎｓ」）、および逆補完Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー配列（読み取り２）（下線部）を５’末端に含有しており、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの二重インデックス付きの、対形成した末端の配列決定が可能となった（第２の回の逆方向プライマー＃１：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡ）（配列番号５）。第２の回のＰＣＲ順方向プライマーを、第１の回のＰＣＲの間、順方向プライマーによって、増幅済みＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子に付加されたＰ５  Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターと相補的であった（第２の回の順方向プライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ）（配列番号６）。このプライマーは、第１の回のＰＣＲ反応から持ち越された可能性があるいかなる汚染ゲノムＤＮＡも増幅することなく、第１の回のＰＣＲアンプリコンを増幅するために使用した。さらに、Ｐ７アダプター配列をコードする第２の逆方向プライマーを、２つの他のプライマーと同じ濃度で第２の回のＰＣＲ反応に添加した（第２の回の逆方向プライマー＃２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ）（配列番号７）。このプライマーは、第２の回の逆方向プライマー＃１によって、ＫｒａｓＨＤＲアンプリコンへ付加された逆補完Ｐ７アダプター配列を結合する。第２の回のＰＣＲを３５〜４０サイクルにわたって行ったので、Ｐ７アダプター（第２の回の逆方向プライマー＃２）を添加して、冗長な第２の回の逆方向プライマー＃１によって生じる非特異的増幅の量を制限した。
【０２７９】
第２の回の増幅後、１００μＬのＰＣＲ反応物を２．５％アガロースゲル上で泳動し、予想される大きさのバンドを切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡをゲル断片から抽出した。精製されたＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリーの品質と濃度とを、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて決定した。次に、固有の二重インデックスを備えた個々のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリーをまとめてプールし、それにより、腫瘍量がより大きなイルミナ（登録商標）ライブラリーを一緒にプールし、腫瘍量が多いマウスから元来得られるライブラリーを、腫瘍量が少ないマウスから得られるものよりも、最終プールにおいて高い比率で表示された（図３４のＡ）。合計３５個の個々の試料を２つのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリープールへと合わせた。各プールの品質および濃度をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で確認した。次に、各最終Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリープールを、多重化した１５０ｂｐの対形成した末端のＲａｐｉｄ  Ｒｕｎ配列決定プログラム（Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑレーンでディープ配列決定した。
【０２８０】
バーコード付き腫瘍サイズおよび数を概算するためのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定データの解析
本発明者らは、本発明者らの多重分離したＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定データから腫瘍を呼び出すためのパイプラインを開発した。パイプラインは、固有バーコード配列を集計し、アンプリコンのディープ配列決定データのノイズを除去するように設計されたアルゴリズム（ＤＡＤＡ２）を使用して、頻発性配列決定エラーを排除する。本発明者らは、このアルゴリズムを調整して、偽の腫瘍呼び出しの発生を最小限にし、技術的なバイアス（読み取り深度の変動性、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定機のエラー率の変動性、およびバーコードの多様性における変動性を含む）を最小限にした。このパイプラインは、ＡＡＶ／Ｃａｓ９介在性体性ＨＤＲで推進される腫瘍形成後の腫瘍遺伝子型およびバーコードの分析についての変更を含んでおり、後で説明する。
【０２８１】
対形成した末端の読み取りの併合、フィルタリング、および調整
本発明者らのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定ライブラリーは、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の小さな１１２ｂｐ断片を含有していたが、本発明者らは、これらの断片の１５０ｂｐの対形成した末端の配列決定を行って、重複する順方向および逆方向の読み取りを併合して、Ｋｒａｓコドン１２および１３とＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のバーコード領域とにおけるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定エラーの尤度を低減させた。重複する対形成した末端の読み取りを、ＰＡＮＤＡｓｅｑを用いて併合、品質フィルタリング、および調整した（断片長：６０ｂｐ、順方向調整プライマー：ＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴ、逆方向調整プライマー：ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＧＡ）。
【０２８２】
固有の腫瘍の呼び出し
配列決定エラーを低減させるために順方向および逆方向の読み取りを併合させた後でさえ、おそらく頻発性のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定エラーから（または可能性はそれより低いが、頻発性のＰＣＲエラーから）、１０，０００塩基あたりの−１エラーの平均を検出した。このエラー率を考えると、本発明者らは、一塩基の誤対合を含有する大規模な、固有バーコード付きの腫瘍からの読み取りが、大きな実際の腫瘍サイズの約−１／１００００の小さな偽腫瘍として呼び出されると予想した。この現象は、特定のマウスにおける最大の腫瘍と比較して３〜４桁小さく、１塩基のずれを含有している偽の「腫瘍」の小さなクラスターを観察したので、目で識別することができた。加えて、各ＫｒａｓＨＤＲ変異体−バーコード対はまた、腫瘍原性コドン１２または１３における突然変異体塩基において頻発性配列決定エラーも生じた。
【０２８３】
腫瘍を正確に呼び出すために、本発明者らは、次のステップで腫瘍バーコード配列決定データを解析するための計算および統計用パイプラインを開発した。
【０２８４】
ＤＡＤＡ２を使用した読み取りの非バーコード領域からのエラーモデルのトレーニング、および腫瘍への固有の読み取り積み上げのクラスター形成
本発明者らは、ＫＲＡＳコドン１２の上流の７ヌクレオチドと最終バーコード塩基の下流の７ヌクレオチドとから、配列決定／ＰＣＲエラーの残存率を概算した。本発明者らは次に、本発明者らの配列決定エラーモデルを使用して、（バーコード付き塩基の７ヌクレオチド以内まで切り詰められた）固有読み取り積み上げを固有の腫瘍へとＤＡＤＡ２を介してクラスター形成する。０．０１（すなわち、オメガ＿ａ＝０．０１）のクラスターの固有起源における最小の信頼度を使用した。しきい値を大きくすると、マウス試料において呼び出される固有の腫瘍の数が増加した。対形成した末端の配列決定により、固有の読み取り積み上げが真に別個の腫瘍であるという確信が高まったので、このより大きな値を選択した。例えば、本発明者らは、このしきい値によって意図しない読み取り配列がすべて排除され（例えば、バーコードの外側に不適切なヌクレオチドがある読み取り）、このしきい値によって、生物学的複製物間でより一致している各マウス内での病変の総数が呼び出されることがわかった。読み取りエラーを適切に処理しないと、呼び出された腫瘍の数が配列決定読み取り深度と正に相関する可能性があるので、これらは重要な考慮事項であった。最後に、本発明者らは、１０，０００倍大きな病変からわずか１ヌクレオチドずれたＤＮＡ配列を有するいかなる腫瘍も除去した。このことは、腫瘍の呼び出しの１．５６％にのみ影響した。
【０２８５】
読み取り積み上げを正規化対照に対して正規化して、おおよその腫瘍サイズを取得すること
読み取り積み上げを生成し、先に説明した補正を実行した後、本発明者らは、呼び出された各腫瘍からの読み取り数を、バルクの腫瘍担持組織の溶解物からのＤＮＡ抽出の前に各試料へとスパイクされた正規化対照からの読み取り数に対して正規化した。これにより、各腫瘍内の細胞数の合理的な概算値を生成することができ、同じ遺伝子型および処置のマウスからのデータを併合させることができた。しかしながら、各腫瘍内での細胞の絶対数を正確に定量化する能力に影響を与えるいくつかの因子がある。
【０２８６】
第１の考慮事項は、個々の腫瘍におけるＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のいくつかが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定のためのＰＣＲプライマーの内側でＫｒａｓイントロン２における挿入または欠失を保有していたことである。異なる大きさのアンプリコンの存在はＰＣＲバイアスを生成することはできるが、本発明者らは、長い伸長時間（約３分）を使用し、迅速で（２０〜３０秒／ｋｂ）、高忠実度のポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）；ＮＥＢ）を使用する、ＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーＰＣＲの第１の回において４〜６サイクルのみを実行することによって、該存在によるＰＣＲバイアスの生成を低減させようとした。第２の回の増幅における最終的なＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリーＰＣＲが短く、試料全部にわたって均一であるので、ＰＣＲ増幅はこのステップにおいて偏りがないものとする。
【０２８７】
さらに、Ｋｒａｓ変異体およびバーコードが内在性Ｋｒａｓ遺伝子座へとノックインされていることを考えると、いくつかの腫瘍ではこの領域がゲノム増幅されている可能性がある（これは、肺癌のマウスモデルにおいて発症したＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍において文書化されている）。Ｋｒａｓ増幅は通常、Ｋｒａｓコピー数が非常に多くなることはないが、読み取り計数から細胞数への変換では各細胞にバーコード付きＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のコピーが１つ含有されていると想定しているので、増幅すると、ＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子が増幅された腫瘍の細胞数がわずかに過大評価される。
【０２８８】
最後に、正規化対照自体は、Ｋｒａｓイントロン２において重複が既知である腫瘍の細胞から生成され、これにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製の第１の回で、重複のない腫瘍よりも大きなＰＣＲ産物が生成される。したがって、正規化対照においてＫｒａｓ対立遺伝子から離れたいかなるＰＣＲバイアスも、重複することなく腫瘍サイズを体系的に過小評価する結果となる。
【０２８９】
バーコードの重複率を概算し、腫瘍サイズの分布を補正すること
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｈｉ−Ｓｅｑ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎの２つのレーンにおいて３５個の試料からの腫瘍バーコードを、本発明者らの分析パイプラインと組み合わせて配列決定することで、５桁を超える読み取り計数の固有バーコード検出が可能となった。したがって、このアプローチの前例がない解決策により、バルクの組織内での大きな病変および小さな過形成の検出が可能となる。しかしながら、バルクの組織内での多数の病変を検出する能力により、バーコードの衝突の確率が高まる。すなわち、同じマウスにおいて同じＤＮＡバーコードを有する２つ以上の病変が発生する。バーコードの衝突は、２つの小さな「衝突している」腫瘍が単一のより大きな腫瘍として識別されるため、観察された腫瘍サイズを誇張する可能性がある。それゆえ、本発明者らは、バーコード衝突の統計モデルを開発して、この問題が控えめであり、呼び出された腫瘍の概算された大きさに明白に偏りが出ないことを確保した。
【０２９０】
バーコードの衝突の本発明者らのモデルは、本発明者らの研究では、各Ｋｒａｓ変異体について２４，５７６個の可能なバーコードｉの各々を観察する尤度ｐｉを占めている。本発明者らのプール内のバーコード頻度間の再現可能な変動性の大部分は、各ウォッブル塩基でのヌクレオチド頻度の統計的に独立した変動性に由来する（すなわち、バーコード断片の合成中にヌクレオチド濃度に微妙な変動性があったので、各バーコードがプール内に等しくある可能性は低くなる）（図２３のＧ）。したがって、本発明者らは、バーコードにおけるあらゆる塩基ｂにおける各ヌクレオチドｎの独立した頻度ｆｂ，ｎを概算し、この表を使用して、以下のように各バーコードの配列Ｂｉ、ｂ、ｎに基づいてバーコードの可能性を予測する（ここで、バーコードｉがヌクレオチドｎを位置ｂに所有している場合、Ｂは１であり、それ以外は０である）。
【０２９１】
【数９】
2022502063.tif 000020
【０２９２】
ここでは、行列表記を使用して点乗積を示している。このモデルは、２１個の自由パラメータのみであらゆるバーコードの頻度を予測している。バーコードのいくつかの残分過剰表示が肺試料において持続したので、本発明者らは、ヌクレオチド頻度を補正した後、すべての肺分析から、最も頻繁に観察された１０％のバーコードを単純に廃棄した。これらの最も頻繁に観察されるバーコードは、ウイルス産生に先立って、本発明者らのＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／ＣｒｅプラスミドプールのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定（ＭｉＳｅｑ）による本発明者らのマウスの実験とは独立して同定された。この処理の後、本発明者らは次に、Σｉｐｉを１に再正規化した。
【０２９３】
本発明者らは次に、各マウス内での各バーコードの出現が、多項サンプリングプロセスであると想定した。各マウス内で観察された各バーコードについての衝突の平均数Ｃｉは、次のようになる。
【０２９４】
【数１０】
2022502063.tif 000021
【０２９５】
ここで、μｉは、各マウス内でのバーコードの平均数を示すのに対し、Ｎは腫瘍の総数を示す（両方とも不明）。Ｎは、式Ｎ（ｏｂｓ）＝Ｎ−ΣｉＣｉ（ｐｉ，Ｎ）およびＢｒｅｎｔの方法を使用して、各マウスＮ（ｏｂｓ）における観察された腫瘍数から決定される。
【０２９６】
このモデルでは、バーコードの衝突は概して、本発明者らのマウス試料では稀少であることがわかった（平均４．０４％）。しかしながら、衝突の尤度は、マウスによっておよびＫｒａｓ変異体によって異なる可能性がある。例えば、ＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子の平均予測衝突数は５．８％であり、１匹のマウスで１２％と高かった。ＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子は、ＷＴＫｒａｓベクターが、初回ＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプールにおける各突然変異体Ｋｒａｓベクターよりも約４倍高く意図的に表示されたので、最高衝突数を減ることが予想された）（図２３のＦ）。したがって、本発明者らは、腫瘍サイズの分布にバーコードの衝突が与えるバイアスを最小限にするために、各病変のサイズを１＋Ｃｉによって除した。衝突が稀少な事象であるので、特定のマウス内での特定の衝突数は、Ｃｉとは実質的に異なる可能性がある。この制限があるので、本発明者らは、この補正により、バーコードの衝突に起因する腫瘍サイズの分布の体系的な偏りが最小限にされると考えているが、発生した具体的な衝突を有効に特定することはできない。
【０２９７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定の品質および再現性の決定
Ｋｒａｓ変異体が、腫瘍形成を推進するために定量的に異なる能力を有するか否かを決定するために、本発明者らは、１００，０００個を超える細胞を含有することが概算された腫瘍に的を絞ることを選択した（すなわち、約５×１０５個の細胞から得られた各試料に添加された正規化対照ＤＮＡの「大きさ」の１／５）。複製試料からのこの細胞数カットオフを超える腫瘍の回帰分析（独立した試料調製物、配列決定、および処理）は、高い相関を実証した（すべてのＲ２は、０．９９を上回っており、図３６を参照されたい）。さらに、このカットオフを下回る腫瘍の概算細胞数は、バーコードの衝突ならびにＰＣＲ増幅および配列決定における変動性によって偏りが出る可能性が高く、これらのことはすべて、各Ｋｒａｓ変異体を保有する腫瘍サイズおよび数を正確に呼び出す能力を低下させた。
【０２９８】
バルク腫瘍担持肺からの配列決定データの解析
本発明者らは、すべてのマウス遺伝子型における１００，０００個を上回る腫瘍を、Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９対立遺伝子（ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、ＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９、およびＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９）で計数すること、ならびに各変異体をＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅプラスミドプールにおけるその初回表示によって除することによって、各Ｋｒａｓ変異体を保有する腫瘍の相対的な数を定量した（この分析について、プラスミドプール内の各変異体の初回表示を、バーコードの量の第９８百分位数を上回るバーコードを除去した後、各Ｋｒａｓ変異体と関係づけられた総読み取り数から計算し、この制約は、結果をあまり変化させず、非常に豊富な変異体−バーコード対が具体的な変異体の全体的な表示に明白に影響しないことを確保するよう単純に適用された）。
【０２９９】
次に、ＷＴＫｒａｓ変異体が１の表示を有するように、相対的な腫瘍数を拡大縮小した。１００，０００個を上回る細胞の腫瘍から生じるように思われた比較的少数のＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子があった。これらは、ＨＤＲ事象が非腫瘍原性Ｋｒａｓ  ＷＴ遺伝子型を作製するが、それにもかかわらず、他の理由から、腫瘍へと進化した腫瘍、またはＷＴＫｒａｓ変異体が腫瘍原性変異体によって付随されるが増殖が推進される同じ肺細胞における同時のＨＤＲによって腫瘍原性Ｋｒａｓ変異体と「ヒッチハイクする」ことを表すことができた。
【０３００】
バルク組織から解剖された（かつ先に説明したとおり分析された）個々の腫瘍からの少数の残存細胞は、通常、本発明者らのバルク腫瘍配列決定データにおいて検出可能であった。腫瘍サイズのすべての解析において、これらの解剖された腫瘍は、それらの真の大きさを推測することができなかったので、除外された。しかしながら、処理された各マウス遺伝子型において１００，０００個を上回る細胞の腫瘍の数を分析するとき、解剖可能な腫瘍は常にいかなるマウス内でも観察された最大の腫瘍のうちであり、それゆえ確かに１００，０００個の細胞のしきい値を超えているので、個別に解剖された腫瘍からのデータを含めた。
【０３０１】
腫瘍数における統計的有意差を、フィッシャーの直接検定を使用して決定した。各変異体について２つの検定を行い、Ｇ１２Ｄの頻度またはＷＴＫｒａｓＨＤＲ対立遺伝子のいずれかと比較した。すべてのｐ値は、調べられた変異体の数に対してボンフェローニ補正されており、両側検定されている。両側検定した「多細胞」ピアソンのカイ二乗検定を使用して、ＰＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスおよびＬＴ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスにおけるすべてのＫｒａｓ変異体にわたる腫瘍数の分布を、Ｔ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスと比較した。
【０３０２】
実施例３：肺腺癌におけるインビボでの腫瘍抑制のあてはめ展望
単独または組み合わせて、癌に見られるほとんどのゲノム変化の機能的影響は、ほとんど知られていないままである。本明細書で説明する実験、腫瘍バーコード付与、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集、および超深度バーコード配列決定の統合が、ヒト肺腺癌の自発性マウスモデルにおける腫瘍抑制因子の変化の対ごとの組み合わせを調査するために実証されている。３１個の一般的な肺腺癌遺伝子型の腫瘍抑制効果をマッピングし、状況依存性および差次的効果の強度に関する粗削りな展望が明らかになる。
【０３０３】
結果
癌の成長は、主に複数の協調的なゲノム変化の結果である。癌ゲノム配列決定は、ヒトの癌内での多数の変化を分類してきたが、腫瘍の成長に対するこれらの変化の組み合わせ効果はほとんど知られていない。ほとんどの推定ドライバーは、腫瘍の１０％未満で変化しており、これらの変化が不活性、弱く有益、またはある特定のゲノム状況でのみ有益である可能性があることを示唆している。可能な組み合わせの数は候補遺伝子の数に応じて変化するので、共起率だけを経た遺伝的相互作用を推測することは事実上不可能である。遺伝子操作されたマウスモデルは、自発的な設定内で成長する腫瘍における遺伝子機能への洞察を提供することができるが、実際の考慮により、腫瘍抑制遺伝子の不活性化の組み合わせの広範な研究が妨げられている（図４１）。このゆえに、インビボでの腫瘍の成長を推進する遺伝的相互作用に関する理解は、制限されたままである。
【０３０４】
これらの実際の課題に対処するために、ディープ配列決定と関連した腫瘍バーコード付与（Ｔｕｂａ−ｓｅｑ）を並行使用して、多くの異なる腫瘍抑制遺伝子の変化の影響を定量的に測定する方法が開発された（本明細書に説明）。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、遺伝的に操作された肺腺癌のマウスモデルを、腫瘍抑制因子の不活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性）、腫瘍のバーコード付与、およびディープ配列決定と組み合わせている。Ｔｕｂａ−ｓｅｑは、あらゆる腫瘍サイズを測定し、個々のマウスにおける腫瘍遺伝子型の多重化と互換性があるので、成長効果を前例にない精度、感度、およびスループットで測定することができる。ここでは、このアプローチを使用して、３１の一般的な腫瘍抑制遺伝子型を有する腫瘍原性のＫｒａｓＧ１２Ｄ推進型肺腫瘍の成長を定量化する（図３９）。予期しない遺伝的相互作用を特定し、ほとんどの腫瘍抑制因子の効果が状況依存的であることがわかり、ヒト肺腺癌における遺伝的変化のいくつかのパターンを説明した。
【０３０５】
腫瘍抑制因子ＴＰ５３は、ヒト肺腺癌の半数超で不活性化されている。他の１０個の推定腫瘍抑制因子の成長抑制効果に対するｐ５３の欠失の効果を決定するために、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ；Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ；Ｈ１１ＬＳＬ−Ｃａｓ９（ＫＴ；Ｃａｓ９）マウス、およびＫＴ；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＰＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいて、多くの共通の腫瘍抑制遺伝子を標的とするバーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅベクターと４つのバーコード付きＬｅｎｔｉ−ｓｇ不活性／Ｃｒｅベクターとのプール（Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅ）を使用して腫瘍を発症させた（図３９，４１および４２）。バーコードには、各腫瘍およびそのｓｇＲＮＡを固有に識別する２つの成分が含有されていた（ｓｇＩＤ−ＢＣ、図４２）。各遺伝子型の各腫瘍での腫瘍細胞の数を、肺が広範囲の過形成、腺腫、およびいくつかの早期腺癌を含んでいたとき、腫瘍発症から１５週間後に決定した。ｓｇＩＤ−ＢＣ領域を、バルク腫瘍担持肺ゲノムＤＮＡから増幅し、産物をディープ配列決定し、Ｔｕｂａ−ｓｅｑ分析パイプライン（本明細書に説明）を適用した。
【０３０６】
ＫＴ；Ｃａｓ９マウスおよびＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスのＴｕｂａ−ｓｅｑ分析により、本発明者らの調査において該遺伝子の多くについての腫瘍抑制効果の範囲の変化が明らかとなった（図３９および４３）。２つのすでに吟味された手段、すなわち、対数正規（ＬＮ）平均および第９５百分位数の腫瘍サイズによって腫瘍サイズを要約した（図３９）。ｐ５３欠損腫瘍では、Ｒｂ１、Ｓｅｔｄ２、Ｌｋｂ１／Ｓｔｋ１１、Ｃｄｋｎ２ａ、またはＡｐｃの不活性化は、成長利点をなおも提供したのに対し、Ｓｍａｄ４、Ａｒｉｄ１ａ、およびＡｔｍは、ｐ５３の非存在下でのみ、腫瘍抑制因子として出現した（図３９および４３）。この背景における追加の腫瘍抑制因子の出現は、ｐ５３欠損がその後の腫瘍の進化を増強することを示唆している。より多くの突然変異を適応させることにより、ｐ５３喪失は、腫瘍の進化の予測可能性を低下させ、処置抵抗性および転移性疾患の出現を含む将来の腫瘍の進化を促進する可能性がある。
【０３０７】
ｐ５３の同時欠失は、より多くの変化を適応させるだけでなく、腫瘍抑制因子喪失の影響の程度を有意に変化させた。ＫＴ；Ｃａｓ９マウスでは、Ｒｂ１欠損は、Ｌｋｂ１欠損症またはＳｅｔｄ２欠損症よりも腫瘍サイズの増加は小さかった（図３９および図４４のＡ、Ｐ＜０．０００１、別段の指定がない限り、ブートストラップ検定）。対照的に、ｐ５３欠損背景では、Ｒｂ１欠損症は、Ｌｋｂ１欠損症またはＳｅｔｄ２欠損症の場合と比べて、成長利点をもたらし（Ｐ＞０．０５）、ｐ５３腫瘍抑制経路とＲｂ１腫瘍抑制経路との間の強い相補的な相互作用と一致している（図３９）。バルクのＫＰＴ；Ｃａｓ９肺ＤＮＡにおける各標的遺伝子座でのＣａｓ９により生成されるインデルの定量により、インデルを有するＬｋｂ１、Ｓｅｔｄ２、およびＲｂ１対立遺伝子の割合がかなり高いことが確認された（図３９および４５）。最後に、肺癌成長に及ぼすｐ５３およびＲｂ１の同時不活性化の影響を、従来のＣｒｅ／ＬｏｘＰに基づくマウスモデルを使用して確認した（図４４）。
【０３０８】
ｐ５３能が高い腫瘍とｐ５３欠損腫瘍とにおけるＲｂ１不活性化の量的に異なる成長の利点は、ドライバーのあてはめ強度の変化がヒト肺腺癌におけるその変化の頻度を変えるか否かを調べる機会を提示した。実際、ＲＢ１の変化（ＳＮＶおよびＣＮＶ）およびＴＰ５３の変化の同時発生は、ヒト肺腺癌において濃縮されていた（Ｐ＝０．０３、図３９および図４４）。特に、これら２つの変更の共起が約５倍に濃縮されているにもかかわらず、この相互作用は、多重仮説検定を補正した後のすべての潜在的な対ごとのドライバーの相互作用のナイーブ調査では統計的に有意ではないし、したがって、同時発生パターンを超えた遺伝的相互作用を機能的に研究する必要があることを示している（１０個の対ごとの相互作用についてのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正後のＰ＝０．３２）
【０３０９】
次に、ＫＴ；Ｌｋｂ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；Ｃａｓ９（ＫＬＴ；Ｃａｓ９）マウスにおいてＬｅｎｔｉ−ｓｇＴＳ−Ｐｏｏｌ／Ｃｒｅで腫瘍を発症させることによって、Ｌｋｂ１および他の推定上の腫瘍抑制因子の組み合わせ喪失の影響を調べた（図４０および４３）。Ｌｋｂ１は、自発的モデルにおいて肺腫瘍の成長を劇的に増大させ、ヒト肺腺癌では頻繁に不活性化されるので、Ｌｋｂ１を調べた（図４１）。興味深いことに、適応性がある腫瘍抑制因子の喪失数および成長利点の中央値の両方が、すでに急速に成長しているＬｋｂ１欠損腫瘍において弱化していた（マウスの背景間の統計的検定力の変化とは無関係、Ｐ＜０．０５、方法）。このことは、１回の変化で腫瘍のあてはめ展望全体が変わることができることをもう一度実証している。収穫逓減エピスタシスと称されるあてはめ利点の一般的な減衰は、進化において一般的であり、腫瘍が最終的にあてはめの平衡状態に達する可能性があることを示唆している。
【０３１０】
ＡｐｃおよびＲｂ１の不活性化は、Ｌｋｂ１欠損腫瘍に有意な成長の利点を提供する唯一の変化であった（図４０）。腫瘍サイズを増大させるＲｂ１欠損症の能力は、偶然のＬｋｂ１欠損であっても、細胞周期調節におけるＲｂ１の不可欠な役割、およびＬｋｂ１喪失とは根本的に異なる作用機序を強調している。Ａｐｃ喪失は、肺癌の成長の重要な推進力でもあり、Ａｐｃは、研究された３つの背景すべてにおいて腫瘍抑制性であった。
【０３１１】
驚くべきことに、Ｌｋｂ１欠損腫瘍の成長に対するＳｅｔｄ２欠損症の影響は中程度であり、統計的に有意ではなかった（図４０）。Ｌｋｂ１およびＳｅｔｄ２の両方の不活性化が、ＫＴ；Ｃａｓ９マウスおよびＫＰＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて成長を強力に促進しており、これらの遺伝子が同じ経路で機能しているという証拠がないので、この冗長性は印象的であった。したがって、ＫＰＴマウス、ＫＰＴ；Ｃａｓ９マウス、およびＫＬＴ；Ｃａｓ９マウスにおいて、Ｌｅｎｔｉ−ｓｇＮｅｏ２／ＣｒｅおよびＬｅｎｔｉ−ｓｇＳｅｔｄ２／Ｃｒｅで腫瘍を発症させることによって、Ｓｅｔｄ２の不活性化の状況依存性を試験および確認した。Ｓｅｔｄ２の不活性化は、Ｌｋｂ１能が高い肺腫瘍の成長を増強したが、Ｌｋｂ１欠損腫瘍には、もしあったとしても、成長の利点をほとんど与えなかった（組織学的分析について、（ＫＰＴ；Ｃａｓ９／ＫＬＴ；Ｃａｓ９におけるｓｇＳｅｔｄ２）／（ＫＰＴ；Ｃａｓ９／ＫＬＴ；Ｃａｓ９におけるｓｇＮｅｏ２）のＰ＜０．０５、Ｔｕｂａ−ｓｅｑ分析についてＰ＜０．０００１、図４０および４６）。この観察結果はまた、ヒト肺腺癌におけるＬＫＢ１／ＳＴＫ１１およびＳＥＴＤ２の変化の相互排他性によっても十分に裏付けられている（Ｐ＜０．００１、図４０および４６）。
【０３１２】
これらの研究におけるほとんどの遺伝子は、状況依存的成長効果を呈しており、ｐ５３またはＬｋｂ１の存在下または非存在下でのみ腫瘍の成長を推進した（図４０）。３つの状況すべて（Ｒｂ１およびＡｐｃ）で利点をもたらす腫瘍抑制因子の変化でさえ、状況に依存した腫瘍抑制の程度をなおも呈した。このような広範囲にわたる状況依存性は、ドライバーの包括的な調査では見落とされており、ドライバーの相互作用は無視されるか、またはわずかな相関関係のみを考慮して正当化するためには十分に稀少であるかおよび／または弱いと推定される。それにもかかわらず、これらのデータの統計的解像度が限られてはいるが、本発明者らのあてはめ測定値は、ヒト肺癌における突然変異の同時発生パターンと全体的に一致している（Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｒ＝０．５０、Ｐ＜０．０５、図４７）。さらに、肺癌は、状況依存性の程度が独特であるようには見えず（図４７）、本発明での発見は、他の種類の癌における状況依存性の直接的な測定が必要であることを示唆している。
【０３１３】
腫瘍の進化のこの荒い態様には、いくつかの意味がある。まず、遺伝子機能を理解するには、複数の遺伝的状況で推定ドライバーを調査することが重要であり、調査のほとんどの遺伝子（１１個のうちの８個）は、一部の状況でのみ適応性があったためである（図４０）。第二に、より広範なあてはめプロファイリングが望ましい。本明細書でのべき分析は、１００匹のマウスのコホートでＴｕｂａ−ｓｅｑを使用して、約５００の中程度の強度の相互作用を調査することができたことを示唆している（図４８）。より大きなゲノムスクリーニングは、より推定されるドライバー、他の腫瘍原性事象との相互作用、同じ遺伝子を標的とする複数のｓｇＲＮＡ、または腫瘍抑制因子の三つ組の変化を調査することができた。最後に、この広範な状況依存性は、特定の遺伝的状況においてでのみ有益であるので、ほとんどのドライバーの変更が固定に対して覆ることはめったにないことを示唆している。
【０３１４】
インビボでの組み合わせの腫瘍抑制因子喪失の適合性効果に関する本明細書に説明する研究は、従来の方法論およびヒト肺腺癌ゲノミクスデータによって検証された予期しない遺伝的相互作用を特定した。本明細書に説明するバーコード付与および多重ゲノム編集アプローチは、治療応答、細胞シグナル伝達、および／または転移進行に対するそれらの影響を含む、これらの遺伝的相互作用の機能的結果を調べるために容易に利用することができた。
【０３１５】
実施例４：ＨＤＲ／ｓｇＲＮＡ／Ｃｒｅマウスでの薬物スクリーニングによる癌遺伝子の遺伝子型と薬物との相互作用の検出
特定の癌遺伝子（例えば、Ｈｒａｓ、Ｋｒａｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ、Ｒａｆ、ｍｙｃ、または表１の遺伝子のいずれか）に複数の異なる活性化コドン突然変異を有する腫瘍を含むマウスを、実施例２および図２３のＡ〜Ｄで説明したＡＡＶ−ＫｒａｓＨＤＲ／ｓｇＫｒａｓ／Ｃｒｅマウスと同様の方法で作出し、これらのマウスを使用して、スクリーニングプロセスで癌遺伝子の遺伝子型と薬物との相互作用を特定し、これをＫｒａｓの場合について図４９に示す。これは、プロモーター−ＬＳＬ−Ｃａｓ９（例えば、Ｈ１１  ＬＳＬ−Ｃａｓ９）マウスに、実施例２および図２３のＡに説明されたものと同様に設計されたＣｒｅアデノウイルスのプールを感染させることによって達成される。ａ）活性化している突然変異が導入されるべきである箇所に近位の関心対象の特定の癌遺伝子の関連領域を標的とするｓｇＲＮＡ、およびｂ）相同性アーム、活性化コドン突然変異（各コンストラクト間で異なる）、バーコード配列（例えば、活性化突然変異の下流の３、４、５、６、７，８，９，または１０のコドンにおけるＷＴ配列からのウォッブル塩基における変動性によって導入）、およびＨＤＲ修復ゲノム領域の再開裂を防止するためのｓｇＲＮＡ標的部位における任意のＰＡＭ突然変異を含有するＨＤＲテンプレートである。癌遺伝子はＫｒａｓがある場合には、ＨＤＲテンプレートは、例えば、ＫｒａｓにおけるＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、およびＧ１３Ｄのエクソン２突然変異についてのコドン突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスプールの生成後、プール内の各コドン突然変異（例えば、Ｋｒａｓの場合、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、および／またはＧ１３Ｄ）の組成は、ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスへ投与されたときに、個々のコトン突然変異を保有する各ウイルスの量が、同数の腫瘍を生じるように変更される（例えば、Ｋｒａｓの場合、図２３Ｂのものと同様の情報を使用することによる）。次に、Ｃｒｅアデノウイルスの多活性化変異プール（さまざまな変異の腫瘍形成効率を説明するために調整されているか、調整されていないか）がマウスに全身投与されるかまたは組織特異的に投与される（例えば、肺腫瘍を誘発するために気管内に）。
【０３１６】
ＡＡＶ−Ｃｒｅウイルスに感染させた後、マウスを一定期間（例えば、１２週間）休ませておき、腫瘍を成長させておいた後、特定の化学治療薬（例えば、広範なスペクトルのアルキル化剤、またはシスプラチンおよびパクリタキセルなどのチューブリン標的薬、またはＭＥＫ阻害剤、Ｅｒｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、および／もしくはＰＩ３Ｋ阻害剤などの標的剤）を用いて一定の週（例えば、４週間）処置する。次に、感染した臓器（ウイルスの気管内投与の場合は肺など）を採取し、バルク組織からゲノムＤＮＡを単離し、実施例２のように癌遺伝子とバーコードの増幅とディープ配列決定を実行して、数、組織内の各腫瘍のサイズ、および遺伝子型を決定する。同様の分析が、対応するＡＡＶ−Ｃｒｅ感染ＬＳＬ−Ｃａｓ９マウスで実行され、化学治療薬の代わりにビヒクルでマウスを処置するだけである。実施例２で実施されたのと同様のバイオインフォマティクス分析を使用して、処置動物と未処置動物との間、および同じ動物内での異なる活性化癌遺伝子変異（例えば、Ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖおよび／またはＧ１３Ｄ）に由来する腫瘍間の腫瘍数／大きさの違いを決定する。特に、化学療法で治療された同じ動物内の異なる遺伝子型腫瘍間の腫瘍サイズの比較は、データが腫瘍開始率または生物間の変動によってバイアスされないため、薬物に対する遺伝子型特異的感受性の検出をより正確に可能にする。
【０３１７】
実施例５：条件付きｓｇＲＮＡ発現のためのレンチウイルスベクターの設計
腫瘍発症事象とその後のゲノム変化の順次制御とを可能にするために、ＣｒｅとＦｌｐ調節Ｕ６−ｓｇＲＮＡ要素を含むレンチウイルスベクターが設計されている。このベクターは、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ対立遺伝子を持つマウスでＣｒｅ／Ｌｏｘを介した腫瘍の発症を可能にすると同時に、誘導性Ｆｌｐ活性を介したｓｇＲＮＡ発現の誘導を可能にすることを目的としている。このベクターの重要な設計上の特徴は、ｓｇＲＮＡリーディングフレームの上流のＵ６プロモーター内に２つのハイブリッドＴＡＴＡ−ＦＲＴ部位（例えば、配列番号８  ５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）が隣接するストップカセットの組み込みである。これにより、ストップカセットをＵ６プロモーター内に組み込むことができ、Ｆｌｐを介した組換え後にのみ、ＴＡＴＡボックスが転写を指示するように適切に配置される。このデザインを誘導性で安定したｓｇＲＮＡ発現と呼ぶ、ｐＩｎｓａｎｅ。ゲノムの組込み後、位置効果と周囲の染色質環境とによりウイルスベクターが沈黙する可能性があるので、本発明者らはまた、ｓｇＲＮＡおよびＵ６プロモーターの近位の遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）も組み込んでいる。このＵＣＯＥは、ヒトＣＢＸ３遺伝子のメチル化のないＣｐＧ島に由来し、異種近位プロモーターの転写活性を維持することが示されている。このＵＣＯＥには、例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｋｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｆｅｂ  １８；４３（３）：１５７７−１５９２（例えば、図Ｓ３由来のＣＢＸまたはＣＢＸ３＊）からのＵＣＯＥのいずれかを含むことができる。例示的なＵＣＯＥは、以下の配列番号９である。
【０３１８】
【表１０】
2022502063.tif 000022
【０３１９】
使用できるＵＣＯＥの他の例には、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｓｅｐ；１８（９）：１６４０−９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．１３２の例が含まれる。
【０３２０】
ｐＩｎｓａｎｅベクターからのｓｇＲＮＡの有効な誘導には、調節可能なＦｌｐ活性が必要である。これは、リガンド誘導性システムの制御下でＦｌｐを組み込むことによって達成することができる（例えば、リガンドの非存在下でその活性をブロックするドメインへのＦｌｐのタンパク質融合、またはリガンド誘導性プロモーターの制御下でのＦｌｐ遺伝子の組込み）。このようなシステムの一例は、エストロゲン受容体に融合したコドン最適化ＦｌｐＯ（Ｒ２６  ＦｌｐＯＥＲ（Ｔ２））を含むＲｏｓａ２６ノックイン対立遺伝子であり、これをモデルに組み込んでＫｒａｓ  ＬＳＬＧ１２Ｄ  ／＋を生成できる。Ｈ１１  ＬＳＬ−Ｃａｓ９；Ｒ２６  ＦｌｐＯＥＲ（Ｔ２）／  ＬＳＬ−トマトマウス（ＫＴＣ；ＦｌｐＯＥＲ）。このＲ２６ＦｌｐＯＥＲ（Ｔ２）対立遺伝子は、タモキシフェン（Ｔａｍ）によって誘発されるＦｌｐＯＥＲの核移行と活性を可能にする。この対立遺伝子は、類似のインビボ肺腫瘍モデルにおいてＦｌｐ活性を誘導するために使用されており、タム投与後のインビボでの肺腫瘍において活性を有する。リガンド誘導性システムの他の例は、以下を含む。
【０３２１】
ＣｒｅおよびＦｌｐＯＥＲリコンビナーゼ、および誘導剤としてタモキシフェンを使用するこのシステムの例を図５０にす。図５０Ａは、Ｆｌｐ組換えの前後の例示的な構築物の構造を示し、一方、図５０Ｂは、異なる腫瘍抑制遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ構築物の例示的なプールを示している。図５０Ｃは、タモキシフェンの処理の有無にかかわらず、さまざまなトランスジェニックバックグラウンドのマウスに導入された場合のこのコンストラクトの予想される動作を示している。
【０３２２】
実施例６：二重ｓｇＲＮＡマウスにおける腫瘍プロファイリングによる対ごとの腫瘍抑制因子−腫瘍抑制因子相互作用を検出するための戦略
マウスは実施例１〜３のように構築され、２つのｓｇＲＮＡの組み合わせを一意に識別するバーコード配列（ｓｇＩＤ）と、場合により固有の分子識別子配列とともに、異なるｓｇＲＮＡ配列をコードする２つのＵ６−ｓｇＲＮＡ要素を持つウイルスベクターにのみ感染させる。（ＵＭＩ）は、個々の腫瘍（ＢＣ）を生じさせた核酸分子を特定する（図５１Ａ）。ウイルスベクターは、スクリーニングされることが望まれる数の腫瘍抑制因子のペアワイズの組み合わせ（例えば、上記の表２からの２つの腫瘍抑制因子の組み合わせ）で構築される。いくつかの実施形態において、ウイルス構築物は、活性化突然変異を有する癌遺伝子をコードするＣｒｅ活性化可能な導入遺伝子をすでに有するマウス（例えば、すべてＬＳＬ−Ｋｒａｓ活性化対立遺伝子を有する図５１ＢのＫＴ、ＫＰＴ、ＫＬＴマウス）に導入される。腫瘍抑制因子の対ごとの組み合わせの効果を、特定の癌遺伝子のバックグラウンドで評価することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス構築物は、癌遺伝子突然変異をまだ有していないマウスに導入され、これにより、腫瘍抑制因子の対ごとのみ合わせの効果を、所与の癌遺伝子バックグラウンドで評価することができる。ウイルス構築物は、全身的に、または組織特異的な方法で（例えば、肺のために気管内に）投与され、腫瘍が分析に適切なサイズに達した後（例えば、１５週間）、所望の組織または組織の組み合わせが単離される。バルクＤＮＡは組織から調製され、統合されたウイルスコンストラクトのバーコード領域が増幅され、実施例１〜３のようにディープ配列決定によって分析される。実施例２で実施されたのと同様のバイオインフォマティクス分析を使用して、活性化された癌遺伝子バックグラウンドがある場合とない場合との腫瘍抑制ガイドＲＮＡの異なるペアワイズ組み合わせ間の腫瘍数／サイズの違いを決定する。
【０３２３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換を思いつく。本明細書に説明されている本発明の実施形態のさまざまな代替形態が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図されている。
【０３２４】
（連邦政府が後援する研究に関する陳述）
本発明は、米国国立衛生研究所／米国国立癌研究所による契約番号Ｒ０１ＣＡ２０７１３３の下で米国政府の支援を受けてなされた。
【０３２５】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月２日出願の米国仮特許出願第６２／７４０，３１１号の利益を主張する。
【図１−１】
2022502063.tif 000023
【図１−２】
2022502063.tif 000024
【図２−１】
2022502063.tif 000025
【図２−２】
2022502063.tif 000026
【図２−３】
2022502063.tif 000027
【図３−１】
2022502063.tif 000028
【図３−２】
2022502063.tif 000029
【図４−１】
2022502063.tif 000030
【図４−２】
2022502063.tif 000031
【図５−１】
2022502063.tif 000032
【図５−２】
2022502063.tif 000033
【図６−１】
2022502063.tif 000034
【図６−２】
2022502063.tif 000035
【図７】
2022502063.tif 000036
【図８−１】
2022502063.tif 000037
【図８−２】
2022502063.tif 000038
【図９】
2022502063.tif 000039
【図１０−１】
2022502063.tif 000040
【図１０−２】
2022502063.tif 000041
【図１０−３】
2022502063.tif 000042
【図１１−１】
2022502063.tif 000043
【図１１−２】
2022502063.tif 000044
【図１２−１】
2022502063.tif 000045
【図１２−２】
2022502063.tif 000046
【図１２−３】
2022502063.tif 000047
【図１３】
2022502063.tif 000048
【図１４−１】
2022502063.tif 000049
【図１４−２】
2022502063.tif 000050
【図１４−３】
2022502063.tif 000051
【図１５−１】
2022502063.tif 000052
【図１５−２】
2022502063.tif 000053
【図１６】
2022502063.tif 000054
【図１７−１】
2022502063.tif 000055
【図１７−２】
2022502063.tif 000056
【図１７−３】
2022502063.tif 000057
【図１８】
2022502063.tif 000058
【図１９−１】
2022502063.tif 000059
【図１９−２】
2022502063.tif 000060
【図２０】
2022502063.tif 000061
【図２１】
2022502063.tif 000062
【図２２】
2022502063.tif 000063
【図２３−１】
2022502063.tif 000064
【図２３−２】
2022502063.tif 000065
【図２４−１】
2022502063.tif 000066
【図２４−２】
2022502063.tif 000067
【図２５−１】
2022502063.tif 000068
【図２５−２】
2022502063.tif 000069
【図２６−１】
2022502063.tif 000070
【図２６−２】
2022502063.tif 000071
【図２７−１】
2022502063.tif 000072
【図２７−２】
2022502063.tif 000073
【図２８−１】
2022502063.tif 000074
【図２８−２】
2022502063.tif 000075
【図２９−１】
2022502063.tif 000076
【図２９−２】
2022502063.tif 000077
【図３０】
2022502063.tif 000078
【図３１−１】
2022502063.tif 000079
【図３１−２】
2022502063.tif 000080
【図３２−１】
2022502063.tif 000081
【図３２−２】
2022502063.tif 000082
【図３３】
2022502063.tif 000083
【図３４】
2022502063.tif 000084
【図３５−１】
2022502063.tif 000085
【図３５−２】
2022502063.tif 000086
【図３６−１】
2022502063.tif 000087
【図３６−２】
2022502063.tif 000088
【図３６−３】
2022502063.tif 000089
【図３７】
2022502063.tif 000090
【図３８−１】
2022502063.tif 000091
【図３８−２】
2022502063.tif 000092
【図３９−１】
2022502063.tif 000093
【図３９−２】
2022502063.tif 000094
【図３９−３】
2022502063.tif 000095
【図３９−４】
2022502063.tif 000096
【図４０−１】
2022502063.tif 000097
【図４０−２】
2022502063.tif 000098
【図４１−１】
2022502063.tif 000099
【図４１−２】
2022502063.tif 000100
【図４２−１】
2022502063.tif 000101
【図４２−２】
2022502063.tif 000102
【図４３−１】
2022502063.tif 000103
【図４３−２】
2022502063.tif 000104
【図４３−３】
2022502063.tif 000105
【図４４】
2022502063.tif 000106
【図４５】
2022502063.tif 000107
【図４６−１】
2022502063.tif 000108
【図４６−２】
2022502063.tif 000109
【図４７−１】
2022502063.tif 000110
【図４７−２】
2022502063.tif 000111
【図４８】
2022502063.tif 000112
【図４９】
2022502063.tif 000113
【図５０】
2022502063.tif 000114
【図５１】
2022502063.tif 000115
【図５２】
2022502063.tif 000116
【配列表】
2022502063000001.app
【国際調査報告】
2022502063.tif 000117
2022502063.tif 000118
2022502063.tif 000119
2022502063.tif 000120