(57)【要約】  本開示は、胆管上皮細胞輸送体に関する核酸の組成物を提供する。例えば、本開示は、ホスファチジルコリンを含むリン脂質の胆汁分泌を制御し得る核酸、例えば、標的細胞においてＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）によりコードされるものまたはその生物学的活性断片に関する。好ましい一実施形態では、本開示は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型（ＰＦＩＣ３）を処置または予防するために有用である、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）担体中で製剤化されたＡＢＣＢ４をコードする修飾ｍＲＮＡ及び誘導コンストラクトを含む組成物を提供する。
2022500443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）担体中で製剤化された、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する修飾ポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
前記ＡＢＣＢ４ポリヌクレオチドが少なくとも１つの化学修飾ヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記修飾ポリヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メトキシウリジン及びＮ６−メチルアデノシンからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが５−メトキシウリジンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ウリジン残基の少なくとも３０％が５−メトキシウリジンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記修飾ポリヌクレオチドが、ポリＡ領域、コザック配列、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、ｍｉＲＮＡ結合部位、またはそれらの任意の組合せを含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲ−１４２結合部位である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対する前記ＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（ＵＴＭ％またはＴＴＭ％）が約１００％〜約１５０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＯＲＦが、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＯＲＦが、
ａ）ＡＢＣＢ４−ＣＯ１３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２２、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ９と少なくとも９２％同一であるか、または
ｂ）ＡＢＣＢ４−ＣＯ１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２５、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ２６と少なくとも９１％同一であるか、または
ｃ）ＡＢＣＢ４−ＣＯ７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ８、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１８、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ１９と少なくとも９０％同一である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＬＮＰがイオン性アミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記イオン性アミノ脂質が化合物１である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＯＲＦを含み、
ａ）前記ＯＲＦが、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２２、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ９と少なくとも９２％同一であるか、
ｂ）前記ＯＲＦが、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２５、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ２６と少なくとも９１％同一であるか、または
ｃ）前記ＯＲＦが、ＡＢＣＢ４−ＣＯ７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ８、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１８、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ１９と少なくとも９０％同一である、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＡＢＣＢ４ポリペプチドが、（ａ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム１のポリペプチド配列、（ｂ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム２のポリペプチド配列、または（ｃ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム３のポリペプチド配列と少なくとも約９５％同一なアミノ酸配列を含み、その際、前記ＡＢＣＢ４ポリペプチドがホスファチジルコリン転座活性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＡＢＣＢ４ポリペプチドがホスファチジルコリン転座活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の異種ポリペプチドに融合したＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の異種ポリペプチドが前記ＡＢＣＢ４ポリペプチドの薬物動態特性を増大させる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
対象に投与した場合に、前記ポリヌクレオチドが、ＡＢＣＢ４、アイソフォーム１、ＡＢＣＢ４、アイソフォーム２、またはＡＢＣＢ４、アイソフォーム３を含む対応するポリヌクレオチドと比べて、（ａ）長い血漿中半減期、（ｂ）前記ＯＲＦによりコードされるＡＢＣＢ４ポリペプチドの発現の増加、（ｃ）発現断片をもたらす翻訳停止の低い頻度、（ｄ）高い構造安定性、または（ｅ）それらの任意の組合せを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するポリヌクレオチドを生成する方法であって、少なくとも１つの同義置換を行うことにより、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含む、前記方法。
【請求項２１】
ウリジン残基の少なくとも９０％を５−メトキシウリジンに置換することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型（ＰＦＩＣ３）の処置または予防を必要とする患者においてそれを行う方法であって、前記患者に、治療有効量の、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記修飾ｍＲＮＡ分子が少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メトキシウリジン及びＮ６−メチルアデノシンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが５−メトキシウリジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾ｍＲＮＡ分子がカチオン脂質ナノ粒子中で製剤化されている、請求項２４〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＦＩＣ２またはＢＲＩＣ２の処置を必要とする患者においてそれを行う方法であって、前記患者に、治療有効量の、ＢＳＥＰポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
ＢＳＥＰポリペプチドをコードする前記修飾ｍＲＮＡが、ＡＢＣＢ１１をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＰＦＩＣ１の処置を必要とする患者においてそれを行う方法であって、前記患者に、治療有効量の、ＡＴＰ８Ｂ１をコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型（ＰＦＩＣ３）を処置または予防する方法において使用するための、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項３１】
ＰＦＩＣ２またはＢＲＩＣ２を処置する方法において使用するための、ＢＳＥＰ４ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物。
【請求項３２】
ＰＦＩＣ１を処置する方法において使用するための、ＡＴＰ８Ｂ１をコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物。
【請求項３３】
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法において使用するための医薬品を製造するための、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、それぞれ内容全体が参照により本明細書に援用される２０１８年９月１３日出願の米国特許仮出願第６２／７３１，０５５号、及び２０１９年４月２９日出願の米国特許仮出願第６２／８４０，３６９号の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）は、胆管上皮細胞輸送体の異常に起因する一群の家族性胆汁うっ滞状態を指す。臨床症状は通常、初めに小児期に進行性胆汁うっ滞を伴って生じる。これは通常、成長障害、硬変、及び肝臓移植の必要性につながる。当初の処置は支持的であり、ウルソデオキシコール酸、コレスチラミン、リファンピン及びナロキソンの使用を含む、胆汁うっ滞及びそう痒症を処置するための薬剤を使用する。部分胆汁外瘻術（ＰＥＢＤ）は、胆汁を胆嚢から外部の回腸造瘻バッグに流出させる外科的アプローチであり、これは、ＰＦＩＣの症状を緩和するためにも使用され得る。最終的に、肝臓機能不全が重篤になった場合、ＰＦＩＣは多くの場合に、肝臓移植に至る。この疾患は典型的には進行性であり、肝臓移植がなければ小児期での劇症肝不全及び死亡につながる。
【０００３】
ＰＦＩＣには３つの型があり、それぞれ異なる遺伝子の変異に起因する。ＰＦＩＣ１型（ＰＦＩＣ−１）は、ＡＴＰアーゼリン脂質輸送体８Ｂ１、ＢＲＩＣ１、ＦＩＣ１、ＰＦＩＣ、及びＰＦＩＣ１としても公知のＡＴＰアーゼアミノリン脂質輸送体クラスＩ、８Ｂ型、メンバー１（ＡＴＰ８Ｂ１）をコードする遺伝子の変異に起因する。ＡＴＰ８Ｂ１は、膜を通過してのリン脂質転座を担っているＰ型ＡＴＰアーゼタンパク質である。ＰＦＩＣ２型（ＰＦＩＣ−２）は、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）タンパク質をコードするＡＢＣＢ１１における様々な変異に起因する。ＰＦＩＣ３型（ＰＦＩＣ−３）は、フロッパーゼをコードするＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）における様々な変異に起因する。現在、ＰＦＩＣに至る根源的な遺伝子異常のための有効な処置は存在しない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）担体中で製剤化された、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する修飾ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施形態では、上記ＡＢＣＢ４ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、上記修飾ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、上記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メトキシウリジン及びＮ６−メチルアデノシンからなる群から選択される。一実施形態では、上記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５−メトキシウリジンである。一実施形態では、ウリジン残基の少なくとも３０％は、５−メトキシウリジンである。一実施形態では、上記修飾ポリヌクレオチドは、ポリＡ領域、コザック配列、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、ｍｉＲＮＡ結合部位、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２結合部位である。一実施形態では、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（ＵＴＭ％または％ＴＴＭ）は、約１００％から約１５０％の間である。一実施形態では、上記ＯＲＦはさらに、少なくとも１つの低頻度コドンを含む。一実施形態では、上記ＯＲＦは、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２２、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ９と少なくとも９２％同一、またはＡＢＣＢ４−ＣＯ１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２５、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ２６と少なくとも９１％同一、またはＡＢＣＢ４−ＣＯ７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ８、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１８、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ１９と少なくとも９０％同一である。一実施形態では、上記ＬＮＰはイオン性アミノ脂質を含む。一実施形態では、上記イオン性アミノ脂質は化合物１である。
【０００５】
別の態様では、本明細書では、ＯＲＦを含み、そのＯＲＦがＡＢＣＢ４−ＣＯ１３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２２、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ９と少なくとも９２％同一であるか、そのＯＲＦがＡＢＣＢ４−ＣＯ１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１２、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１５、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１６、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２０、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２１、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２３、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ２５、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ２６と少なくとも９１％同一であるか、またはそのＯＲＦがＡＢＣＢ４−ＣＯ７、ＡＢＣＢ４−ＣＯ８、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１４、ＡＢＣＢ４−ＣＯ１８、もしくはＡＢＣＢ４−ＣＯ１９と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドを開示する。一実施形態では、上記ＡＢＣＢ４ポリペプチドは、（ａ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム１のポリペプチド配列、（ｂ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム２のポリペプチド配列、または（ｃ）野生型ＡＢＣＢ４、アイソフォーム３のポリペプチド配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含み、その際、上記ＡＢＣＢ４ポリペプチドは、ホスファチジルコリン転座活性を有する。一実施形態では、上記ＡＢＣＢ４ポリペプチドは、ホスファチジルコリン転座活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である。一実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種ポリペプチドに融合したＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする。一実施形態では、上記１つまたは複数の異種ポリペプチドは、ＡＢＣＢ４ポリペプチドの薬物動態特性を増大させる。一実施形態では、対象に投与された場合に、上記ポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、アイソフォーム１、ＡＢＣＢ４、アイソフォーム２、またはＡＢＣＢ４、アイソフォーム３を含む対応するポリヌクレオチドに比べて、長い血漿中半減期、ＯＲＦによりコードされるＡＢＣＢ４ポリペプチドの発現の増加、発現断片をもたらす翻訳停止の低い頻度、高い構造安定性、またはそれらの任意の組合せを有する。
【０００６】
別の態様では、本開示は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するポリヌクレオチドを生産する方法であって、少なくとも１つの同義置換を行うことにより、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含む上記方法を提供する。一実施形態では、ウリジン残基の少なくとも９０％を、５−メトキシウリジンに置換する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型（ＰＦＩＣ３）の処置または予防を必要とする患者においてそれを行う方法であって、上記患者に、治療有効量の、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を含む組成物を投与することを含む上記方法を提供する。一実施形態では、上記修飾ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、上記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メトキシウリジン及びＮ６−メチルアデノシンからなる群から選択される。一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５−メトキシウリジンである。一実施形態では、上記修飾ｍＲＮＡ分子を陽イオン脂質ナノ粒子中で製剤化する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、ＰＦＩＣ２またはＢＲＩＣ２の処置を必要とする患者においてそれを行う方法であって、上記患者に、治療有効量の、ＢＳＥＰポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む上記方法を提供する。一実施形態では、ＢＳＥＰポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡは、ＡＢＣＢ１１をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ＰＦＩＣ１の処置を必要とする患者においてそれを行う方法であって、上記患者に、治療有効量の、ＡＴＰ８Ｂ１をコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む上記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡＢＣＢ４修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）コンストラクトをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＢＣＢ４タンパク質の発現が確認される、２つのウェスタンブロットが示されている。これらのブロットで、トランスフェクトされた哺乳類細胞におけるヒトまたはマウスＡＢＣＢ４  ｍＲＮＡの異所性発現が確認される。抗ＡＢＣＢ４（Ｃ−２１９）は、ｈＡＢＣＢ４及びｍＡＢＣＢ４の両方を認識するが、抗ＡＢＣＢ４（Ｐ３ＩＩ−２６）は、ｈＡＢＣＢ４特異的である。
【図２】ｍｏｄＲＮＡでの処置から２４時間後のｍｄｒ２ノックアウトマウスにおける胆汁ホスファチジルコリンのレベルを示すグラフである。
【図３】キャピラリー電気泳動（ＣＥ）をベースとしたシンプルウェスタンイメージ、及びｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から生じた相対ＡＢＣＢ４発現を示すグラフである。レーン５〜１８のｍｏｄＲＮＡはコドン最適化された。ｍｏｄＲＮＡ（コドン最適化なし）の初期反復は、レーン２〜４に示されている。レーン１はｅＧＦＰである。レーン１９及び２０は、ｍｏｃｋトランスフェクトされている。
【図４】種々のｍｏｄＲＮＡのホスファチジルコリン輸送活性を示すグラフである。棒１〜３は、コドン最適化されていないｍｏｄＲＮＡを示している。棒４〜１２及びｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ６、ｍｏｄＲＮＡ７、ｍｏｄＲＮＡ８、ｍｏｄＲＮＡ９は、コドン最適化されたｍｏｄＲＮＡを示している。矢印は、さらなる分析のために選択されたｍｏｄＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ６、ｍｏｄＲＮＡ７、ｍｏｄＲＮＡ８、及びｍｏｄＲＮＡ９）を示している。
【図５】コドン最適化前（左側のグラフ、棒１）及びコドン最適化後（右側のグラフ、ｍｏｄＲＮＡ５〜ｍｏｄＲＮＡ９）のｍｄｒ２ノックアウトマウスにおける種々のｍｏｄＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏホスファチジルコリン輸送活性を示す２つのグラフである。
【図６】１ｍｇ／ｋｇでｍｏｄＲＮＡ７  ｍＲＮＡを注射されたｍｄｒ２ノックアウトマウスにおけるｈＡＢＣＢ４タンパク質の肝発現を示している。
【図７】免疫蛍光研究を示している。ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡは、肝細胞の小管領域でＡＢＣＢ４タンパク質の発現をもたらすことが見い出された。密着結合関連タンパク質の閉鎖帯−１（ＺＯ−１）を使用して、胆汁小管構造の輪郭を可視化した。
【図８】Ｍｄｒ２ノックアウトマウスにおける、ｅＧＦＰまたはＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの注射から２４時間後の総胆汁酸血清中濃度を示すグラフである。野生型マウスは処置されなかった。
【図９】化合物３脂質ナノ粒子中で製剤化されたｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの単回注射後の、Ｍｄｒ２ノックアウトマウスにおける胆汁ホスファチジルコリン産出の動態解析に関連する２つのグラフである。
【図１０】血清中の総胆汁酸の動態研究を示すグラフである。
【図１１】２種の異なるナノ担体中で製剤化されたｍｏｄＲＮＡを使用して、胆汁におけるホスファチジルコリン産出を示す２つのグラフを示している。
【図１２】化合物１脂質ナノ粒子中のｍｏｄＲＮＡの第２の製剤の有効性を示す一連のグラフである。
【図１３】１回目の注射後及び５回目の注射後のマウスにおける胆汁ホスファチジルコリンレベルを、野生型に対するパーセンテージとして示しているグラフである。
【図１４】血清中の総胆汁酸を示すグラフである。ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡを投与されたマウスでは、有意な減少があった。
【図１５Ａ】ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡ処置と関連する改善が示されている。図１５Ａは、研究を通じた対象の体重を示している。
【図１５Ｂ】ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡ処置と関連する改善が示されている。図１５Ｂは、肝臓酵素測定値を示している。
【図１５Ｃ】ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡ処置と関連する改善が示されている。図１５Ｃは、肝臓重量、門脈圧、及び胆汁中のホスファチジルコリンレベルを、野生型に対するパーセンテージとして示している。
【図１６】ｈＡＢＣＢ４  ｍＲＮＡで処置されたＭｄｒ２−／−マウスにおける線維化進行を示している。ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡで処置されたｍｄｒ２マウスにおける結合組織染色及び線維化進行のグラフが示されている。染色には、シリウスレッドを使用した。コラーゲン含有量も検査した。
【図１７】肝線維症及び炎症における様々なマーカーのリアルタイムＰＣＲを示す一連のグラフである。
【図１８Ａ】免疫組織化学的染色を使用しての肝線維症の評価が示されている。
【図１８Ｂ】免疫組織化学的染色を使用しての肝線維症の評価が示されている。
【図１８Ｃ】免疫組織化学的染色を使用しての肝線維症の評価が示されている。種々の処置の後の肝臓の組織学的変化を観察するために、ＨＥ染色も実施した（下のパネル）。
【図１９】ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの複数回の注射が、小管領域におけるｈＡＢＣＢ４タンパク質の発現を大きく改善することを示す一連の画像である。
【図２０】ＡＢＣＢ４のアイソフォーム１のドメイン構造の略図である。
【図２１】ＡＢＣＢ４のアイソフォーム２のドメイン構造の略図である。
【図２２】ＡＢＣＢ４のアイソフォーム３のドメイン構造の略図である。
【図２３】ヒトＢＳＥＰの半減期を示すプロットである。タンパク質レベルを、検出のために抗ＡＢＣＢｌ１を用いるキャピラリー電気泳動を使用して測定した。発現を、内因性ＢＳＥＰ発現をノックアウトすることにより改変したＨｅｐａＲＧ細胞において測定した。
【図２４】ＢＳＥＰ活性のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの図及び代表的な結果を示している。滴定ＴＣＡを、対照（ＧＦＰ）及び発現されたＢＳＥＰ（ｍＡＢＣＢ１１）の存在下で、中央のパネルで測定した。下のパネルは、トランスフェクションの後、少なくとも４日間の胆汁酸の減少を示している。
【図２５】ＨｅｐａＲＧ細胞（図２３）における、ＧＦＰ（対照）またはｈＡＢＣＢ１１  ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトされた細胞の免疫染色を示している。
【図２６】野生型マウスの肝臓へのｍｏｄＲＮＡの送達を示すプロットである。
【図２７】通常食及びコール酸誘導モデル食のマウスにおけるタンパク質発現を示す免疫染色画像を示している。タンパク質は膜と関連し、コール酸給餌マウスで、発現が増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書では、修飾核酸分子を含む核酸分子、及び例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞障害を処置するためにそれを使用する方法を提供する。ｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む核酸分子は、例えば、その分子の特性を改善する１つまたは複数の修飾を含む。そのような改善には、限定されないが、組織における安定性及び／またはクリアランスの増大、受容体取り込み及び／または動態の改善、組成物による細胞アクセスの改善、翻訳機構とのエンゲージメントの改善、ｍＲＮＡ半減期の改善、翻訳効率の上昇、免疫回避の改善、タンパク質産生能の改善、分泌効率の改善、循環へのアクセシビリティの改善、タンパク質半減期及び／または細胞の状態の調節の改善、機能の改善及び／または活性の改善が含まれる。
【００１２】
本開示は、胆管上皮細胞輸送体に関する核酸の組成物を提供する。例えば、本開示は、ホスファチジルコリンを含むリン脂質の胆汁分泌を制御することができる核酸、例えば、標的細胞においてＡＢＣＢ４によりコードされるものまたはその生物学的活性断片に関する。他の実施形態では、本開示は、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）のタンパク質発現を制御することができる核酸、例えば、標的細胞においてＡＢＣＢ１１によりコードされるもの、またはその生物学的活性断片に関する。またさらなる実施形態では、本開示は、アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン）の輸送に関連するＡＴＰ加水分解の触媒に関連する核酸、例えば、標的細胞においてＡＴＰ８Ｂ１によりコードされるものまたはその生物学的活性断片を提供する。
【００１３】
本明細書で提供する組成物は、胆管上皮細胞輸送体の異常と関連する疾患または障害、例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）を処置するために有用である。ＰＦＩＣは、胆管上皮細胞輸送体の異常に起因する一群の家族性胆汁うっ滞状態を指す。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４（１）：２５−３６（２０１４）、Ｍｏｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３１（１）：３−１０（２０１１）、及びＳｔａｐｅｌｂｒｏｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．５２：２５８−２７１（２０１０）。ＰＦＩＣは、輸送体が関与する遺伝子異常に基づき、３つの型（１、２及び３型）に分類されている。ＰＦＩＣ３は、ＡＢＣＢ４の変異に起因する。
【００１４】
ＰＦＩＣの徴候及び症状は典型的には、乳児期に始まり、胆汁酸の増加及び肝疾患に関連する。具体的には、罹患している個体は、重篤な掻痒、皮膚及び白目の黄変（黄疸）、予測速度で体重増加及び成長し得ないこと、肝臓に血液を供給する静脈での高血圧（門脈高血圧）、ならびに肝臓及び脾臓肥大（肝脾肥大）を経験する。しかしながら、ＰＦＩＣ３を有する人の多くは、肝疾患にのみ関連する徴候及び症状を有する。また、ＰＦＩＣ３の徴候及び症状は通常、後期乳児期または初期小児期まで現れない。ＰＦＩＣ３を有する人では、肝不全が、小児期または成人期に起こり得る。
【００１５】
本開示はまた、例えば、標的細胞においてＡＢＣＢ１１によりコードされる胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ）のタンパク質発現を制御することができる核酸、またはその生物学的活性断片の組成物を提供する。本明細書で提供する組成物は、例えば、良性再発性肝内胆汁うっ滞２（ＢＲＩＣ２）及び進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）、例えば、ＰＦＩＣ２などのＢＳＥＰ活性の異常と関連する疾患または障害を処置するために有用である。核酸には、例えば、ポリヌクレオチドが含まれ、これにはさらに、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ、Ｙｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．，４：１８３  ７，２０１２）、グリコール核酸（ＧＮＡ、概説については、Ｕｅｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．，８：８２７  ９，１９７１、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：４１７４  ５，２００５を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７  ５００，１９９１）、ロック核酸（ＬＮＡ、Ａｌｅｘｅｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４：３６０７  ３０，１９９８）、及び当技術分野で公知の他のポリヌクレオチドが含まれる。
【００１６】
加えて、本明細書で提供する組成物は、限定されないが、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ−１）、良性再発性肝内胆汁うっ滞１型（ＢＲＩＣ１）、及び妊娠性肝内胆汁うっ滞１型（ＩＣＰ１）を含む、ＡＴＰ８Ｂ１における変異と関連する健康問題を処置するために有用である。例えば、Ｄｅｎｇ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１８：６５０４−６５０９（２０１２）、Ｋｌｏｍｐ，Ｌ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４０：２７−３８（２００４）、及びＭｕｅｌｌｅｎｂａｃｈ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ５４：８２９−８３４（２００５）を参照されたい。胆汁うっ滞は、肝臓から小腸への異常な胆汁輸送から生じる。同著。ＰＦＩＣ−１は、成人期前に肝線維症、硬変、及び末期肝疾患に進行する早期発症型胆汁うっ滞により特徴付けられる障害である。同著。ＢＲＩＣ１は、肝不全に進行しない胆汁うっ滞の間欠的エピソードにより特徴付けられる障害である。同著。血清中胆汁酸の初期上昇、続く、胆汁うっ滞性黄疸が存在し、これは一般的に、数週から数か月の期間の後に自発的に解消する。ＩＣＰ１は、第２または第３の３半期中に現れ、妊娠の進行と共により重篤となる強度のそう痒症、及び胆汁うっ滞を伴う妊娠性肝臓障害である。同著。ＩＣＰ１は、胎児仮死、自発的未熟分娩及び子宮内死亡を引き起こす。ＩＣＰ１患者は、出産後に胆汁うっ滞の自発的及び進行性消失を示す。同著。
【００１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸ベースの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）を送達することに関連する困難の１つは、身体の免疫系が外来核酸に遭遇した場合に生じ得る先天免疫応答に由来する。外来ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）により活性化されるｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、特にＴＬＲ７／８を介しての認識により免疫系を活性化し得る。非免疫細胞では、外来ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）を介して起こり得る。外来ｍＲＮＡの免疫認識は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）産生、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）分布、及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）応答を含む望ましくないサイトカイン作用をもたらし得る。本発明は、免疫活性化を最小化し、かつタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳効率を最適化するために、治療用ｍＲＮＡ内に種々の修飾ヌクレオチドを組み込むことを特徴とする。本発明の特定の態様は、先天免疫応答を減少させるためのヌクレオチド修飾と、タンパク質発現を増強するための、特にＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での配列最適化との組合せを特徴とする。
【００１８】
本発明のｍＲＮＡ治療技術はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムを介しての、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードするｍＲＮＡの送達を特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡを標的細胞に安全かつ有効に送達するための理想的なプラットフォームである。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送及びエンドソーム放出またはエンドソームエスケープを伴う機構により核酸を送達する独自の能力を有する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合に改善された特性を有するイオン性アミノ脂質ベースのＬＮＰを特徴とする。理論に束縛されることなく、本発明のイオン性アミノ脂質ベースのＬＮＰは、改善された特性、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出またはエンドソームエスケープを有すると考えられる。例えば、第１の投与で全身経路（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）により投与されたＬＮＰは、後で、例えば、さらなる投与において注射されたＬＮＰのクリアランスを加速し得る。この現象は、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）として公知であり、治療状況における重要な問題である。このことが、対象（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）に罹患している対象）において標的組織中で必要なレベルのタンパク質を維持するためには、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与が多くの場合に必須であることの理由である。反復投与の問題は、いくつかのレベルで対処され得る。ｍＲＮＡ操作及び／またはＬＮＰによる効率的な送達が、第１の用量の投与後に曝露されるタンパク質のレベルの上昇及びまた持続期間の増強をもたらし得、次いでこのことが、第１の投与とその後の投与との間の時間を延長し得る。加速血液クリアランス（ＡＢＣ）現象は、少なくとも一部では本質的に一過性であり、全身投与されてから十分な時間が経過した後にＡＢＣの根底にある免疫応答が解消することが公知である。したがって、一態様では、本発明のｍＲＮＡ治療薬が全身に送達された後のタンパク質発現及び／または活性の持続時間を延長することで、ＡＢＣ現象に対抗する。さらに、ＬＮＰを、免疫感知及び／または認識を回避するために操作することができ、したがって、その後の、または反復投与でのＡＢＣをさらに回避することができる。本発明の例示的な態様は、ＡＢＣが低下するように操作されている新規のＬＮＰを特徴とする。
【００１９】
加えて、そのような核酸を調製する、及びそれを標的細胞に送達する方法及びプロセスも提供する。さらに、そのような核酸の設計、調製、製造及び製剤化のためのキット及びデバイスも本開示に含まれる。
【００２０】
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４（ＡＢＣＢ４）（多剤耐性タンパク質３、多剤耐性３、ＭＤＲ３、ＭＤＲ２／３、ＭＤＲ／ＴＡＰ、Ｐ−糖タンパク質３、またはＰＧＹ３としても公知）は、フロッパーゼをコードする遺伝子である。ＡＢＣＢ４は３種のアイソフォーム：１，２７９アミノ酸残基を含有するアイソフォームＡ（アイソフォーム２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００４３４．１及びＮＭ＿０００４４３．３）、１，２８６アミノ酸残基を含有するアイソフォームＢ（アイソフォーム１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６１３３７．１及びＮＭ＿０１８８４９．２）、及び１，２３２アミノ酸残基を含有するアイソフォームＣ（アイソフォーム３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６１３３８．１及びＮＭ＿０１８８５０．２）を有する。アイソフォームＡは、アイソフォームＢのアミノ酸残基１０９４〜１１００を欠いている。アイソフォームＣは、アイソフォームＢのアミノ酸残基９２９〜９７５及び１０９４〜１１００を欠いている。図２１〜２３は各アイソフォームの略図を示している。
【００２１】
ＡＢＣＢ４は、リン脂質、主にホスファチジルコリンの胆汁分泌を担っている。欠損したホスファチジルコリン転座は、胆汁液においてホスファチジルコリンの欠乏をもたらす。ホスファチジルコリンは通常、胆汁酸に随伴して、胆汁上皮細胞への損傷を予防する。したがって、ＰＦＩＣ３／ＡＢＣＢ４異常は、胆汁上皮細胞及び胆細管への損傷、胆汁うっ滞、高血清γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル、及びコレステロール胆石疾患をもたらし得る。
【００２２】
ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１１（ＡＢＣＢ１１）
ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ、メンバー１１（ＡＢＣＢ１１）は、胆汁酸塩排出ポンプ（ＢＳＥＰ、ｓＰｇｐ（Ｐ−糖タンパク質の姉妹）としても知られる）をコードする。推定タンパク質は、多剤耐性（ＭＤＲ）ファミリーの他のメンバーのものと同様の予測トポロジーを有し、それぞれ６つのスパンを伴う２つの推定上の膜貫通ドメイン、及び高度保存ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）を含有する２つのヌクレオチド結合フォールドを伴う。ノーザンブロット分析は、ＡＢＣＢ１１遺伝子が、肝臓において５．５ｋｂ  ｍＲＮＡ転写物を産生することを示している。ＡＢＣＢ１１遺伝子の１０の異なる対立遺伝子がＰＦＩＣ２患者において同定されている。４つの対立遺伝子は、タンパク質の未成熟終止を引き起こし、残りの対立遺伝子は、ミスセンス変化であった。ミスセンス対立遺伝子のうちの５つは、近親婚家族で見い出され、罹患した個体はすべて、変異について同型接合型であった。ヒトＡＢＣＢ１１によりコードされるＢＳＥＰでの例示的なタンパク質配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００３７３３．２として公開されている。
【００２３】
ＡＴＰアーゼ、アミノリン脂質輸送体、クラスＩ、８Ｂ型、メンバー１（ＡＴＰ８Ｂ１）
ＡＴＰアーゼ、アミノリン脂質輸送体、クラスＩ、８Ｂ型、メンバー１（ＡＴＰ８Ｂ１、ＥＣ３．６．３．１）は、Ｐ型カチオン輸送ＡＴＰアーゼファミリーのメンバーであり、アミノリン脂質輸送ＡＴＰアーゼのサブファミリーに属している。ＡＴＰ８Ｂ１は、Ｐ４−ＡＴＰアーゼフリッパーゼ複合体の触媒成分として役立つ。Ｐａｕｌｕｓｍａ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７：２６８−２７８（２００８）。Ｐ４−ＡＴＰアーゼフリッパーゼ複合体は、様々な膜の外側から内側小葉へのホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンなどのアミノリン脂質の輸送に連結したＡＴＰの加水分解を触媒し、したがって、リン脂質の非対称分布の維持を保証している。同著。
【００２４】
リン脂質転座は、ベシクル形成及び脂質シグナル伝達分子の取り込みに関与している。これは、内耳における蝸牛有毛細胞の保存にも必要とされる。例えば、Ｍｕｎｏｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８０：７９３−８００（２０１０）及びＶｅｒｈｕｌｔｓｔ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１：２０４９−２０６０（２０１０）を参照されたい。リン脂質転座はさらに、細管膜におけるリン脂質の非対称分布、小管への胆汁酸の輸送、腸管内容から腸管粘膜への胆汁酸の取り込み、ＡＢＣＢ４と共同して細管膜の完全性を確立することによる胆汁酸塩からの肝細胞の保護、分極上皮細胞における微小絨毛形成において、かつ炎症損傷中にカルジオリピン輸送体として役割を果たし得る。同著。
【００２５】
野生型ＡＴＰ８Ｂ１正準ｍＲＮＡ配列でのコード配列（ＣＤＳ）は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）に受託番号ＮＭ＿００５６０３．４（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＡＴＰアーゼリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）、ｍＲＮＡ）で記載されている。野生型ＡＴＰ８Ｂ１標準タンパク質配列は、ＲｅｆＳｅｑデータベースに受託番号ＮＰ＿００５５９４．１（リン脂質輸送ＡＴＰアーゼＩＣ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］）で記載されている。ＡＴＰ８Ｂ１タンパク質は、１２５１アミノ酸長である。ＲｅｆＳｅｑ配列において参照タンパク質配列をコードする特異的核酸配列は、それぞれのＲｅｆＳｅｑデータベースエントリに示されているとおりのコード配列（ＣＤＳ）であることに注意する。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４ポリペプチドは、野生型全長ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、または３タンパク質である。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ１１ポリペプチドは、野生型全長ヒトＡＢＣＢ１１タンパク質である。一部の実施形態では、本発明のＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、野生型全長ヒトＡＴＰ８Ｂ１タンパク質である。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４ポリペプチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、野生型ＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、もしくは３配列、野生型ＡＢＣＢ１１配列、または野生型ＡＴＰ８Ｂ１配列に対して置換、及び挿入及び／または付加、欠失及び／または共有結合修飾を含むバリアント、ペプチドまたはポリペプチドである。一部の実施形態では、配列タグまたはアミノ酸を、例えば、位置限定のために、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加することができる。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、断片を得ることができる。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１、２、３または３つよりも多い置換を含み得る、ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、もしくは３配列、ヒトＡＢＣＢ１１配列、またはヒトＡＴＰ８Ｂ１配列の置換バリアントをコードする。一部の実施形態では、上記置換バリアントは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、上記バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、上記バリアントは、欠失バリアントである。
【００２８】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及びＡＴＰ８Ｂ１タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、バリアント、及び相同タンパク質（オルソログ）も、本開示のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドの範囲内である。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの非限定的例は、配列番号１（ＡＢＣＢ４、アイソフォーム２）、配列番号３（ＡＢＣＢ４、アイソフォーム１）、配列番号５（ＡＢＣＢ４、アイソフォーム３）、配列番号７（ＡＢＣＢ１１）、及び配列番号９（ＡＴＰ８Ｂ１）に示されている。
【００２９】
本開示で提示するある特定の組成物及び方法は、野生型ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、または３のタンパク質またはポリヌクレオチド配列に関する。そのような開示は、ＡＢＣＢ４の他のアイソフォームに同等に適用可能である。
【００３０】
ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）の処置または予防において使用するためのｍＲＮＡを特徴とする。本発明における使用を特徴とするｍＲＮＡは対象に投与されると、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質をコードする。したがって、本発明は、ヒトＡＢＣＢ４（配列番号１）、ＡＢＣＢ１１（配列番号７）、またはＡＴＰ８Ｂ１（配列番号９）、そのアイソフォーム、その機能性断片、及びＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１を含む融合タンパク質をコードする結合ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに関する。一部の実施形態では、上記オープンリーディングフレームは、配列最適化されている。特定の実施形態では、本発明は、ヒトＡＢＣＢ４、ヒトＡＢＣＢ１１、もしくはヒトＡＴＰ８Ｂ１のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、１つまたは複数のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態では、本発明のコードされるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、全長ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型ＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、もしくは３、野生型ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１と同じか、または本質的に同じ長さを有する）、本明細書に記載のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の機能性断片（例えば、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１よりも短いが、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１活性をまだ可能にする短縮化（例えば、カルボキシ、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、そのバリアント（例えば、１つまたは複数のアミノ酸が置換されている全長または短縮化ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質、例えば、参照アイソフォームに対してポリペプチドのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１活性の全部または大部分を維持しているバリアント（当技術分野で公知の任意の天然または人工バリアントなど））、あるいは（ｉ）全長ＡＢＣＢ４（例えば、配列番号１）、ＡＢＣＢ１１（配列番号７）、またはＡＴＰ８Ｂ１（配列番号９）、その機能性断片またはバリアントと、（ｉｉ）異種タンパク質とを含む融合タンパク質から選択され得る。
【００３２】
ある特定の実施形態では、コードされるＡＢＣＢ４ポリペプチドは、哺乳類ＡＢＣＢ４ポリペプチド、例えば、ヒトＡＢＣＢ４ポリペプチド、その機能性断片またはバリアントである。ある特定の実施形態では、コードされるＡＢＣＢ１１ポリペプチドは、哺乳類ＡＢＣＢ１１ポリペプチド、例えば、ヒトＡＢＣＢ１１ポリペプチド、その機能性断片またはバリアントである。ある特定の実施形態では、コードされるＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、哺乳類ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、例えば、ヒトＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片またはバリアントである。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞に導入された場合に、その細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベル及び／または検出可能な胆汁輸送レベルを、本発明のポリヌクレオチの投与前の細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベル及び／または検出可能な胆汁輸送レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％上昇させる。ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及びＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベル及び／または胆汁輸送活性は、当技術分野で公知の方法に従って測定することができる。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入する。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入する。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＡＢＣＢ４、例えば、ヒトＡＢＣＢ４の野生型アイソフォーム２（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＡＢＣＢ１１（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＡＴＰ８Ｂ１、例えば、野生型ヒトＡＴＰ８Ｂ１（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、その際、上記コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１配列（例えば、野生型ヒトＡＢＣＢ４、野生型ヒトＡＢＣＢ１１、または野生型ヒト  ＡＴＰ８Ｂ１）に由来する。例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする配列最適化ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドでは、対応する野生型配列は、天然ヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１である。同様に、ヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の機能性断片をコードする配列最適化ｍＲＮＡでは、対応する野生型配列は、ヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１からの対応する断片である。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム２の全長配列を有する（すなわち、イニシエーターのメチオニンを含む）ＡＢＣＢ４アイソフォーム２をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム１の全長配列を有する（すなわち、イニシエーターのメチオニンを含む）ＡＢＣＢ４アイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＡＢＣＢ４アイソフォーム３の全長配列を有する（すなわち、イニシエーターのメチオニンを含む）ＡＢＣＢ４アイソフォーム３をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＡＢＣＢ１１の全長配列を有するＡＢＣＢ１１アイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＡＴＰ８Ｂ１の全長配列を有する（すなわち、イニシエーターのメチオニンを含む）ＡＴＰ８Ｂ１をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の全長または成熟配列を有するＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は配列最適化されている。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１アミノ酸配列において少なくとも１つの点変異を含み、かつ胆汁輸送活性を維持しているＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。一部の実施形態では、上記変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、対応する野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１（すなわち、変異（複数可）を伴わないことを除けば同じＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１アイソフォーム）から生じる胆汁輸送活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である胆汁輸送活性をもたらす。一部の実施形態では、変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は配列最適化されている。
【００３８】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、胆汁輸送活性を変更しない変異を含むＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。そのような変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、機能的中立と称され得る。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の機能的中立の点変異を含む変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、上記変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、対応する野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１よりも高い胆汁輸送活性を有する。一部の実施形態では、上記変異型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドは、対応する野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１（すなわち、変異（複数可）を伴わないことを除けば同じＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１アイソフォーム）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い胆汁輸送活性をもたらす。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、機能性ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、その際、１つまたは複数の断片は、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、胆汁輸送活性を維持している。一部の実施形態では、上記ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片は、対応する全長ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の胆汁輸送活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である胆汁輸送活性をもたらす。一部の実施形態では、機能性ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は配列最適化されている。
【００４１】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する全長ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１よりも高い胆汁輸送活性をもたらすＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。したがって、一部の実施形態では、上記ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片は、対応する全長ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の胆汁輸送活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い胆汁輸送活性をもたらす。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＡＢＣＢ４アイソフォーム１、２、または３よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＡＢＣＢ４断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＡＢＣＢ１１よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＡＢＣＢ１１断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＡＴＰ８Ｂ１よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＡＴＰ８Ｂ１断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４ポリペプチド（例えば、配列番号１に示された配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、６８〜９２、１１８、１２０、１２２、及び１２４からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００４４】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド（例えば、配列番号７に示されている配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号８、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００４５】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、配列番号９に示されている配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０、９３〜１１７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００４６】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするＯＲＦを含み、その際、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、６８〜９２、１１８、１２０、１２２、及び１２４からなる群から選択される配列と７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするＯＲＦを含み、その際、上記ポリヌクレオチドは、配列番号８、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２からなる群から選択される配列と７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするＯＲＦを含み、その際、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１０、９３〜１１７からなる群から選択される配列と７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、６８〜９２、１１８、１２０、１２２、及び１２４からなる群から選択される配列と７０％〜９０％同一、７５％〜８５％同一、７６％〜８４％同一、７７％〜８３％同一、７７％〜８２％同一、または７８％〜８１％同一である。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号８、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２からなる群から選択される配列と７０％〜９０％同一、７５％〜８５％同一、７６％〜８４％同一、７７％〜８３％同一、７７％〜８２％同一、または７８％〜８１％同一である。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１０、９３〜１１７からなる群から選択される配列と７０％〜９０％同一、７５％〜８５％同一、７６％〜８４％同一、７７％〜８３％同一、７７％〜８２％同一、または７８％〜８１％同一である。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、９００〜１，０００、９００〜１，１００、９００〜１，２００、９００〜１，３００、９００〜１，４００、９００〜１，５００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，２００、１，０００〜１，３００、１，０００〜１，４００、１，０００〜１，５００、１，１８７〜１，２００、１，１８７〜１，４００、１，１８７〜１，６００、１，１８７〜１，８００、１，１８７〜２，０００、１，１８７〜３，０００、１，１８７〜５，０００、１，１８７〜７，０００、１，１８７〜１０，０００、１，１８７〜２５，０００、１，１８７〜５０，０００、１，１８７〜７０，０００、または１，１８７〜１００，０００）を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも、約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１８７、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００，５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくはそれ以上、または最高１００，０００ヌクレオチド長（及びこの値を含む））である。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、さらに、ノンコーディングである少なくとも１つの核酸配列、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はさらに、５’−ＵＴＲ（例えば、配列番号１２、１７２、１８３、１８４、１８６〜１８９、１９１〜１９４、２２３〜２３９、２８７及び２８８の配列から選択される）及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号１３、１５４、１７０〜１７３、１７６〜１８５、１９０〜２０５、及び２０６〜２２２の配列から選択される）を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１２、１７２、１８３、１８４、１８６〜１８９、１９１〜１９４、２２３〜２３９、２８７及び２８８からなる群から選択される配列を含む。さらなる一実施形態では、上記ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログ）及びポリＡテイル領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）を含む。さらなる一実施形態では、上記ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１３、２０６〜２２２、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、配列番号１３の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ポリＡテイルを含む。一部の例では、上記ポリＡテイルは、５０〜１５０、７５〜１５０、８５〜１５０、９０〜１５０、９０〜１２０、９０〜１３０、または９０〜１５０ヌクレオチド長である。一部の例では、上記ポリＡテイルは、１００ヌクレオチド長である。
【００５１】
一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、一本鎖または二本鎖である。
【００５２】
一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはそれとして機能する。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードし、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｅｘ  ｖｉｖｏで翻訳されて、コードされたＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドを産生し得るヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント、例えば、配列番号１、３、５、７、９を参照されたい）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、上記ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオ塩基、例えば、Ｎ１−メチルシュードウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。ある特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチド中のすべてのウラシルが、Ｎ１−メチルシュードウラシルである。他の実施形態では、上記ポリヌクレオチド中のすべてのウラシルが、５−メトキシウラシルである。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組合せを含む送達剤と共に製剤化する。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）約３０〜約６０ｍｏｌ％（例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５または５５〜６０ｍｏｌ％）、リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質」）約５〜約２０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質」）５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０ｍｏｌ％）、コレステロール（または関連ステロールまたは「非陽イオン」脂質）約２０〜約５０ｍｏｌ％（例えば、コレステロール（または関連ステロールまたは「非陽イオン」脂質）約２０〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０ｍｏｌ％）及びＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）約０．０５〜約１０ｍｏｌ％（例えば、ＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）０．０５〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜７、または７〜１０ｍｏｌ％）の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３．０または５０：１０：３８．５：１．５のモル比を含み得る。ある特定の例では、例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３のモル比を含み得る。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’末端キャップ（例えば、Ｃａｐ１）、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号１２）、配列番号２、４、６、６８〜１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２からなる群から選択されるＯＲＦ配列、３’ＵＴＲ（例えば、配列番号１３）、及びポリＡテイル（例えば、約１００ヌクレオチド長）を含むｍＲＮＡであり、その際、上記ポリヌクレオチド中のすべてのウラシルがＮ１−メチルシュードウラシルである。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩまたは化合物ＶＩをイオン性脂質として、かつＰＥＧ−ＤＭＧまたは化合物ＩをＰＥＧ脂質として含む。
【００５６】
シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コードされたポリペプチドの治療的に関連する部位への輸送を促進する追加の特徴をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を援助するそのような特徴の１つは、シグナル配列、または標的配列である。これらのシグナル配列によりコードされるペプチドは、標的ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含む様々な名称で公知である。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、上記「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、任意選択で、それぞれコード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）で組み込まれた、それぞれ約３０〜２１０、例えば、約４５〜８０または１５〜６０ヌクレオチド（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、または７０アミノ酸）長であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、１つまたは複数の標的化経路を介しての、コードされたポリペプチドの所望の部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアへの輸送をもたらす。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後に、例えば、シグナルぺプチダーゼによりタンパク質から切断される。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、その際、上記ヌクレオチド配列はさらに、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列を含む。
【００５９】
融合タンパク質
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする１つよりも多い核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み得る。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１つよりも多いＯＲＦ、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能性断片、またはバリアントをコードする第１のＯＲＦと、第２の目的のポリペプチドを発現する第２のＯＲＦとを含み得る。一部の実施形態では、目的の２つ以上のポリペプチドは、遺伝子融合されていてよく、すなわち、２つ以上のポリペプチドは、同じＯＲＦによりコードされ得る。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的のポリペプチドの間にリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ（配列番号１１）ペプチドリンカーまたは当技術分野で公知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、それぞれ目的のポリペプチドを発現する２、３、４つ、またはそれ以上のＯＲＦを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも３つのＯＲＦ：ＡＢＣＢ４をコードする第１のＯＲＦ、ＡＢＣＢ１１をコードする第２のＯＲＦ、及びＡＴＰ８Ｂ１をコードする第３のＯＲＦを含み得る。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）及び第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含み得る。
【００６２】
リンカー及び切断可能なペプチド
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１つよりも多いＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ドメインまたは異種ドメインをコードし、本明細書では多量体コンストラクトと称される。上記多量体コンストラクトのある特定の実施形態では、上記ｍＲＮＡはさらに、各ドメイン間に位置するリンカーをコードする。上記リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。ある特定の実施形態では、上記リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、ＡＴＰ８Ｂ１Ａリンカー、及びその組合せからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される、このファミリーの自己切断ペプチドリンカーは当技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。ある特定の実施形態では、上記リンカーはＦ２Ａリンカーである。ある特定の実施形態では、上記リンカーはＧＧＧＳ（配列番号２４０）リンカーである。ある特定の実施形態では、上記リンカーは（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４１）リンカーであり、ここで、ｎ＝２、３、４、または５である。ある特定の実施形態では、上記多量体コンストラクトは、３つのドメインを介在リンカーと共に含有し、構造：ドメイン−リンカー−ドメイン−リンカー−ドメイン、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ドメイン−リンカー−ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ドメイン−リンカー−ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ドメインを有する。
【００６３】
一実施形態では、上記切断可能なリンカーは、Ｆ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４２）を有する）である。他の実施形態では、上記切断可能なリンカーは、Ｔ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２４３）を有する）、Ｐ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２４４）を有する）またはＡＴＰ８Ｂ１Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２４５）を有する）である。当業者は、当技術分野において承認されている他のリンカーも、本発明のコンストラクトにおいて使用するために適し得ることは分かるであろう（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる）。同様に当業者は、他のマルチシストロニックコンストラクトも本発明において使用するために適し得ることは分かるであろう。例示的な実施形態では、上記コンストラクト設計は、本発明のコンストラクトによりコードされるほぼ等モル量の細胞内抗体及び／またはそのドメインをもたらす。
【００６４】
一実施形態では、上記自己切断ペプチドは、限定されないが、２Ａペプチドであり得る。様々な２Ａペプチドが、当技術分野で公知で、利用可能であり、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、馬鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、及び豚テシオウイルス−１  ２Ａペプチドを含めて、使用することができる。２Ａペプチドは、リボソームスキッピングにより１つの転写物から２種のタンパク質を産生するために、複数のウイルスにより使用されており、正常なペプチド結合が２Ａペプチド配列では損なわれていて、２つの不連続のタンパク質が１回の翻訳イベントから産生されることとなっている。非限定的例として、２Ａペプチドは、配列番号２４４のタンパク質配列、その断片またはバリアントを有し得る。一実施形態では、上記２Ａペプチドは、最後のグリシンと最後のプロリンとの間で切断する。別の非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２４４の断片またはバリアントのタンパク質配列を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の１つの例は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＵＡＣＵＡＡＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＧＡＣＣＵ（配列番号２４６）である。一例示的実施形態では、２Ａペプチドは、次の配列：５’−ＵＣＣＧＧＡＣＵＣＡＧＡＵＣＣＧＧＧＧＡＵＣＵＣＡＡＡＡＵＵＧＵＣＧＣＵＣＣＵＧＵＣＡＡＡＣＡＡＡＣＵＣＵ  ＵＡＡＣＵＵＵＧＡＵＵＵＡＣＵＣＡＡＡＣＵＧＧＣＴＧＧＧＧＡＵＧＵＡＧＡＡＡＧＣＡＡＵＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＵＣ−３’（配列番号２４７）によりコードされる。上記２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている、及び／または当技術分野で公知である方法により修飾またはコドン最適化されていてよい。
【００６５】
一実施形態では、この配列を使用して、２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を分離することができる。非限定的実施例として、上記Ｆ２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂとの間にあってよい（Ａ−Ｆ２Ａｐｅｐ−Ｂ）。Ｆ２Ａペプチドの存在は、Ｆ２Ａペプチド配列の末端でのグリシンとプロリンとの間での１つの長いタンパク質の切断をもたらして（ＮＰＧＰが切断されてＮＰＧ及びＰが生じる）、分離したタンパク質Ａ（Ｆ２Ａペプチド結合から２１アミノ酸、ＮＰＧで終止）及び分離したタンパク質Ｂ（Ｆ２Ａペプチド結合から１アミノ酸、Ｐ）を生成する。同様に、他の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＡＴＰ８Ｂ１Ａ）では、長いタンパク質中の上記ペプチドの存在が、２Ａペプチド配列の末端でのグリシンとプロリンとの間での切断をもたらす（ＮＰＧＰは切断されて、ＮＰＧ及びＰをもたらす）。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂは、目的の同じか、または異なるペプチドまたはポリペプチドであってよい（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、例えば、全長ヒトＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１またはその短縮化バージョン）。
【００６６】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は配列最適化されている。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、任意選択で、目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ（上記５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲは任意選択で少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む）、任意選択でリンカーをコードするヌクレオチド配列、ポリＡテイル、またはそれらの任意の組合せ）を含み、ここで、上記ＯＲＦ（複数可）は配列最適化されている。
【００６７】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、コドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して少なくとも１つの同義ヌクレオ塩基置換を含む配列である。
【００６８】
配列最適化ヌクレオチド配列は、参照配列とは配列において部分的に、または完全に異なってよい。例えば、ＵＣＵコドンにより一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、そのヌクレオ塩基の１００％が置換されて（コドンごとに、１位のＵをＡにより置換し、２位のＣをＧにより置換し、かつ３位のＵをＣ置換して）配列最適化されると、ＡＧＣコドンにより一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列を得ることができる。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の全体的なペアワイズアライメントから得られる配列同一性のパーセンテージは０％である。しかしながら、両方の配列に由来するタンパク質産物の同一性は１００％である。
【００６９】
一部の配列最適化（時には、コドン最適化と称される）方法は、当技術分野で公知であり（かつ、下でより詳細に論述する）、１つまたは複数の所望の結果を達成するために有用であり得る。これらの結果には、例えば、ある特定の組織標的及び／または宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にすること、Ｇ／Ｃ含有量をバイアスしてｍＲＮＡ安定性を上昇させることまたは二次構造を減少させること、遺伝子コンストラクションもしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化すること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加する、除去する、またはシャッフリングすること、制限部位を挿入する、または欠失させること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインを適正に折り畳めるように翻訳速度を調整すること、及び／またはポリヌクレオチド内にある問題のある二次構造を軽減または排除することが含まれ得る。配列最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは当技術分野において公知であり、非限定的例には、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）及び／または特許下の方法が含まれる。
【００７０】
表１に、各アミノ酸のコドン選択肢を示す。
【表１】
2022500443.tif 000003
【００７１】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片、またはバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）、その機能性断片、またはバリアントを含み、その際、上記配列最適化ヌクレオチド配列によりコードされたＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片、またはバリアントは、（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によりコードされるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片、またはバリアントと比較して）改善された特性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の発現効率に関する特性が改善されている。そのような特性には、限定されないが、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織内での翻訳効率の上昇、発現した切断タンパク質数の減少、発現タンパク質の折り畳みの改善または折り畳み異常の防止、発現した産物の毒性の低下、発現した産物に起因する細胞死の減少、タンパク質凝集の増加及び／または減少が含まれる。
【００７２】
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を、ヒト対象における発現のためにコドン最適化して、当技術分野における１つ以上の問題を回避する構造的及び／または化学的特徴、例えば、構造的及び機能的完全性を保持しながら、核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達を最適化するために有用な特徴を得、発現閾値を克服し、発現速度、半減期及び／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在を最適化し、かつ免疫応答及び／または分解経路などの有害な生体応答を回避する。
【００７３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組合せ）を含み、これは、参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を代替コドンで置換し、ウリジン含有量を増加または減少させて、ウリジン修飾配列を生成すること、参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を、同義コドンセット中のコドン頻度が高い代替コドンで置換すること、参照ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのコドン（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）を代替コドンで置換して、Ｇ／Ｃ含有量を増加させること、またはその組合せを含む方法により配列最適化される。
【００７４】
一部の実施形態では、上記配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの改善特性を有する。
【００７５】
一部の実施形態では、上記配列最適化方法は、多パラメータを用いたものであり、本明細書に開示の１、２、３、４もしくはそれより多くの方法、及び／または当技術分野で公知の他の最適化方法を含む。
【００７６】
本発明の一部の実施形態で有益とみなされ得る特徴は、ポリヌクレオチドの領域のそばに、またはポリヌクレオチドの領域内にコードされ得、そのような領域は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）に、下流（３’）に、またはその領域内にあり得る。これらの領域は、タンパク質コード領域もしくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後に、ポリヌクレオチド内に組み込むことができる。そのような特徴の例には、限定されないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡテイル、及び検出可能なタグが含まれ、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位を含み得る。
【００７７】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、同じもしくは異なる配列であり得る２つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る２つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位のいずれかの部分を配列最適化することができ（いずれも配列最適化しないことを含む）、配列最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的もしくは化学修飾を独立に含んでもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、最適化後に、上記ポリヌクレオチドを、限定されないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などのベクターに再構成して形質転換する。例えば、高コピープラスミド様または染色体構造が本明細書に記載の方法により生じる場合、上記最適化されたポリヌクレオチドを再構成して、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ニューロスポラ、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換することができる。
【００７９】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、その際、上記ＯＲＦは配列最適化されている。
【００８０】
ヒトＡＢＣＢ４をコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号６８〜９２、１１８、１２０、１２２、及び１２４に記載のとおりである。ヒトＡＢＣＢ１１をコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２に記載のとおりである。ヒトＡＴＰ８Ｂ１をコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号９３〜１１７に記載のとおりである。一部の実施形態では、上記配列最適化ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１配列、その断片、及びバリアントを使用して、本明細書に開示の方法を実施する。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端で：本明細書に示す５’キャップ、例えば、Ｃａｐ１、５’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号１２、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号６８〜１１７、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２に記載のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする配列最適化核酸配列、少なくとも１つの停止コドン（３’ＵＴＲの５’末端に存在しない場合）、３’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列など、例えば、配列番号１３、２０６〜２２２、ならびに上に示したポリＡテイルを含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチド中のすべてのウラシルが、Ｎ１−メチルシュードウラシルである。ある特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチド中のすべてのウラシルが、５−メトキシウラシルである。
【００８３】
本明細書に開示の配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の公知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は独自の組成物特性を有する。
【００８４】
一部の実施形態では、参照野生型ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド、その機能性断片、またはバリアントをコードする）中のウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージは、変化している（例えば低下している）。そのような配列は、ウラシル修飾配列、またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列中のウラシルもしくはチミン含有量のパーセンテージは、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除算してから、１００で乗算すると決定することができる。一部の実施形態では、上記配列最適化ヌクレオチド配列は、参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含有量よりも低いウラシルもしくはチミン含有量を有する。一部の実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含有量は、参照野生型配列中のウラシルもしくはチミン含有量よりも多く、参照野生型配列と比較して有益効果、例えば、発現の増強、及び／またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答の減少を依然として維持する。
【００８５】
コドン使用頻度を最適化するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、本明細書に示すいずれか１つまたは複数の配列のＯＲＦをコドン最適化することができる。一部の実施形態では、コドン最適化を使用して、標的及び宿主生体におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にすること、ＧＣ含有量をバイアスしてｍＲＮＡ安定性を上昇させることまたは二次構造を減少させること、遺伝子コンストラクトもしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化すること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加する、除去する、またはシャッフリングすること、制限部位を挿入する、または欠失させること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインを適正に折り畳めるように翻訳速度を調整すること、またはポリヌクレオチド内にある問題のある二次構造を軽減または排除することが含まれ得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは当技術分野において公知であり、非限定的例には、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）及び／または特許下の方法が含まれる。一部の実施形態では、上記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を、最適化アルゴリズムを使用して最適化する。
【００８６】
配列最適化核酸の特徴付け
本発明の一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露された場合の安定性）または発現特性が非配列最適化核酸に対して改善されているかどうかを決定するために試験することができる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「発現特性」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、それを必要とする対象への投与後の合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルシステムで試験された合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかでの核酸配列の特性を指す。発現特性には、限定されないが、投与後にＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡにより産生されるタンパク質の量、及び産生される可溶性または別段に機能性タンパク質の量が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示の配列最適化核酸を、本明細書に開示のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によりコードされるタンパク質を発現する細胞の生存率に従って評価することができる。
【００８８】
特定の一実施形態では、非最適化参照核酸配列に対してコドン置換を含む本明細書に開示の複数の配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を機能的に特徴付けて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて、またはｉｎ  ｖｉｖｏで標的組織もしくは細胞において目的の特性、例えば、発現特性を機能的に測定することができる。
【００８９】
核酸配列の固有特性の最適化
本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性のために配列最適化することができる。一部の実施形態では、上記ヌクレオチド配列を、特定の標的組織または細胞での発現のために配列最適化することができる。一部の実施形態では、上記核酸配列を配列最適化して、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるその分解を防止することにより、その血漿中半減期を延長する。
【００９０】
他の実施形態では、上記核酸配列を、溶液中での加水分解に対する耐性を増強させるように配列最適化して、例えば、最小限の分解で水性条件下で配列最適化核酸または配列最適化核酸を含む医薬組成物を保存することができる時間を延長する。
【００９１】
他の実施形態では、上記配列最適化核酸を乾燥貯蔵条件における加水分解に対する耐性を増強させるように最適化して、例えば、最小限の分解で凍結乾燥後に配列最適化核酸を保存することができる時間を延長することができる。
【００９２】
タンパク質の発現のために最適化された核酸配列
本発明の一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示の配列最適化配列によりコードされるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、１つまたは複数の発現系を用いて測定することができる。一部の実施形態では、発現を、細胞培養系、例えばＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞で測定することができる。一部の実施形態では、例えばウサギ網状赤血球溶解産物のような生存細胞の抽出物から調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用するか、あるいは精製された個々の成分の集合によって調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用して、発現を測定することができる。他の実施形態では、タンパク質の発現を、ｉｎ  ｖｉｖｏ系、例えば、マウス、ウサギ、サルなどにおいて測定する。
【００９３】
一部の実施形態では、溶液形態のタンパク質の発現が所望され得る。したがって、一部の実施形態では、参照配列を配列最適化すると、可溶性形態で発現したタンパク質の最適化レベルを有する、配列最適化核酸配列を得ることができる。タンパク質発現のレベルならびに他の特性、例えば、溶解性、凝集レベル、及びトランケーション生成物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または翻訳の欠損に起因する断片）は、例えば、電気泳動（例えば、天然またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を用いて、当技術分野で公知の方法に従って測定することができる。
【００９４】
標的組織または標的細胞の生存率の最適化
一部の実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織もしくは細胞において有害作用を有し、タンパク質収量を減少させる、または（例えば、封入体内にタンパク質断片が存在する、または発現タンパク質が沈殿することにより）発現産物の質を低下させ得るか、あるいは毒性を惹起し得る。
【００９５】
したがって、本発明の一部の実施形態では、本明細書に開示の核酸配列、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化を用いると、配列最適化核酸によりコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。
【００９６】
異種タンパク質の発現はまた、自己移植または異種移植のために核酸配列をトランスフェクトされた細胞に対して有害となり得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示の核酸配列の配列最適化を用いて、配列最適化核酸によりコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を上昇させることができる。細胞または組織の生存率、毒性及び他の生理学的反応における変化は、当技術分野で公知の方法に従って、測定することができる。
【００９７】
免疫及び／または炎症応答の減少
場合によっては、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化核酸またはその機能性断片の投与は、（ｉ）治療薬（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）そのような治療薬の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによりコードされるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド）、または（ｉｖ）その組合せに起因し得るであろう免疫応答を誘発し得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示の核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化を使用して、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする核酸の投与により、あるいはそのような核酸によりコードされるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の発現産物により誘発される免疫応答または炎症応答を減少させることができる。
【００９８】
一部の態様では、炎症応答は、当技術分野で公知の方法、例えばＥＬＩＳＡを用いて１つまたは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇を検出することにより測定することができる。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例には、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、別称：ＧＲＯα、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘発性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が含まれる。「炎症性サイトカイン」という用語はまた、当技術分野で公知の、炎症応答に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（Ｉｌ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）なども含む。
【００９９】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、化学修飾されたウラシル、例えば、シュードウラシル、Ｎ１−メチルシュードウラシル、５−メトキシウラシルなどを含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、その際、上記ｍＲＮＡは、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、化学修飾されたウラシル、例えば、シュードウラシル、Ｎ１−メチルシュードウラシル、または５−メトキシウラシルを含む。
【０１００】
本発明のある特定の態様では、修飾ウラシル塩基がリボース糖に結合している場合、ポリヌクレオチド中のように、得られた修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは修飾ウリジンと称される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％修飾されたウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも９５％修飾されたウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、１００％修飾されたウラシルである。
【０１０１】
ポリヌクレオチド中のウラシルが少なくとも９５％修飾されたウラシルである実施形態では、ｍＲＮＡが、免疫応答をほとんどまたは全く誘発せずに適切なタンパク質の発現レベルをもたらすように、全体のウラシル含有量を調節することができる。一部の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含有量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含有量の約１００％及び約１５０％、約１００％〜約１１０％、約１０５％〜約１１５％、約１１０％〜約１２０％、約１１５％〜約１２５％、約１２０％〜約１３０％、約１２５％〜約１３５％、約１３０％〜約１４０％、約１３５％〜約１４５％、約１４０％〜約１５０％（ＵＴＭ％）である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含有量はＵＴＭ％の約１２１％〜約１３６％、または１２３％〜１３４％である。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含有量は、ＵＴＭ％の約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、または約１５０％である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、修飾されたウラシル及び／または天然に生じるウラシルを指し得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総ヌクレオ塩基含有量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総ヌクレオ塩基含有量の約１０％〜約２０％である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含有量は、ＯＲＦ中の総ヌクレオ塩基含有量の約１０％〜約２５％である。一実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含有量は、オープンリーディングフレーム中の総ヌクレオ塩基含有量の約２０％未満である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、修飾されたウラシル及び／または天然に生じるウラシルを指し得る。
【０１０３】
さらなる実施形態では、修飾ウラシルを有し、かつウラシル含有量が調節されている、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量（絶対または相対）を増加させている。一部の実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）の全体的な増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含有量（絶対または相対）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。一部の実施形態では、ＯＲＦ中のＧ、ＣまたはＧ／Ｃ含有量は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論的最大Ｇ、ＣまたはＧ／Ｃ含有量（ＧＴＭＸ％、ＣＴＭＸ％、もしくはＧ／ＣＴＭＸ％）の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満もしくは約８０％未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧ及び／またはＣ含有量（絶対または相対）の増加を、Ｇ、ＣまたはＧ／Ｃ含有量の低い同義コドンをより高いＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含有量のコドンで置換することにより行うことができる。他の実施形態では、Ｇ及び／またはＣ含有量（絶対または相対）の増加を、Ｕで終わるコドンを、ＧもしくはＣで終わる同義コドンで置換することにより行う。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、かつ調節されたウラシル含有量を有して、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルペア（ＵＵ）及び／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）及び／またはウラシルクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を含有する。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクアドラプレットを含まない。一部の実施形態では、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクアドラプレットは、ある特定の閾値未満、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中における出現数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以下に減少される。特定の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットを含む。別の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットを含まない。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、かつ調節されたウラシル含有量を有して、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルリッチなクラスタを含有する。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチなクラスタよりも長さが短いウラシルリッチなクラスタを含む。
【０１０６】
さらなる実施形態では、より低頻度の代替コドンを用いる。修飾ウラシル含有ｍＲＮＡの、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する各代替コドンでそれぞれ置換される。ＯＲＦはまた、上記のとおり調節されたウラシル含有量を有する。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替コドンで置換される。
【０１０７】
一部の実施形態では、ウラシル含有量が調節されると、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、哺乳類細胞に投与された場合、対応する野生型ｍＲＮＡからのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の発現レベルよりも高いＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の発現レベルを示す。一部の実施形態では、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳類の細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１は、上記ｍＲＮＡが哺乳類細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合、対応する野生型ｍＲＮＡからのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の発現レベルよりも高いレベルで発現される。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡをマウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与する。一実施形態では、マウスはヌルマウスである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡをマウスに約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇの量で投与する。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡを静脈内または筋肉内投与する。他の実施形態では、上記ｍＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類細胞に投与された場合に、上記ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドが発現する。一部の実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。
【０１０８】
一部の実施形態では、ウラシル含有量が調節されると、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、安定性の上昇を示す。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、同じ条件下にて対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞内での安定性の増強を示す。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、及び／または二次構造の安定化の向上を含む安定性の上昇を示す。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡにより示される安定性の上昇は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、血清、細胞もしくは組織試料中）を決定し、及び／または経時的に（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで）ｍＲＮＡによるタンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）を決定することにより測定される。同じ条件下で、半減期及び／またはＡＵＣが対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣを上回る場合に、ｍＲＮＡは、安定性が上昇していると同定される。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、同じ条件下で、対応する野生型ｍＲＮＡにより誘発された免疫応答と比べて検出可能に低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘導する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするが同じ条件下で修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡにより誘導される免疫応答と比べて、あるいはＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードし、かつ修飾ウラシルを含むが同じ条件下でウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡにより誘導される免疫応答と比べて、検出可能に低い免疫応答（例えば、先天性もしくは後天性）を誘発する。先天免疫応答は、炎症誘発性サイトカインの発現の増加、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の終結もしくは減少により顕在化し得る。一部の実施形態では、先天免疫応答の低下は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−ζ）の発現もしくは活性レベル、またはｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現により、及び／または本発明のｍＲＮＡを細胞に１回または複数回投与した後の細胞死の減少により測定することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答する哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするが修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードし修飾ウラシルを含むがウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９％超低下する。一部の実施形態では、上記インターフェロンはＩＦＮ−βである。一部の実施形態では、哺乳類の細胞への本開示のｍＲＮＡの投与に起因する細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするが修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードし修飾ウラシルを含むがウラシル含有量が調節されていないｍＲＮＡで観察される細胞死の頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超低い。一部の実施形態では、上記哺乳類細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳類の細胞は、脾細胞である。一部の実施形態では、上記哺乳類細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態では、哺乳類の細胞は、ヒトの細胞である。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡが導入された哺乳類細胞の先天免疫応答を実質的に誘発しない。
【０１１１】
ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。上記修飾ポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾されていてよい。本発明のポリヌクレオチドが化学修飾及び／または構造修飾されている場合、上記ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称され得る。
【０１１２】
本開示は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えばペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「ヌクレオ塩基」とも称される）との組合せで含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。例えば、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるための化学的、酵素的、または組換えによる方法などの任意の有用な方法により、修飾ヌクレオチドを合成することができる。ポリヌクレオチドは、結合したヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、可変の骨格結合を有し得る。その結合は、標準のホスホジエステル結合であり得、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むであろう。
【０１１３】
本明細書に開示の修飾ポリヌクレオチドは、様々な別個の修飾を含み得る。一部の実施形態では、上記修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つもしくはそれより多くの（任意選択で異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。一部の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、細胞に導入されると、非修飾ポリヌクレオチドと比較して１つまたは複数の望ましい特性、例えば、細胞でのタンパク質発現の向上、免疫原性の低下、または分解の減少を示し得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造修飾されている。本明細書で使用する場合、「構造」修飾とは、２つ以上の結合されたヌクレオシドを、ヌクレオチド自体に対して有意な化学修飾を施さずに、ポリヌクレオチド中に挿入、欠失、複製、逆位または無作為化することである。化学結合は必然的に破壊され、再編成されて構造修飾をもたらすことから、構造修飾は化学的性質のものであり、したがって化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらすこととなる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾することができる。その同じポリヌクレオチドを「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造修飾することもできる。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されて、ポリヌクレオチドに対して構造修飾が生じる。
【０１１５】
本開示の治療用組成物は、一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１（例えば、配列番号１、３、５、７、または９）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの核酸（例えば、ＲＮＡ）を含み、その際、上記核酸は、標準（非修飾）であってもよいし、または当技術分野で公知のとおりに修飾されていてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に生じる修飾ヌクレオチド及びヌクレオシド、または天然に存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってよい。そのような修飾は、当技術分野で認識されているとおりのヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、またはヌクレオ塩基部分での修飾を含み得る。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示の天然に生じる修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、一般的に公知であるか、当技術分野で認識されているとおりのものである。そのような天然に生じる修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースにおいて見い出すことができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示の天然に存在しない修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、一般的に公知であるか、当技術分野で認識されているとおりのものである。そのような天然に存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的例は、特に、公開米国出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７において見い出すことができ、これらはすべて、参照により本明細書に援用される。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示の少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾されてなく、アデノシン、グアノシン、シトシン及びウリジンからなる標準リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写されたＲＮＡ中に存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準ヌクレオシド残基を含む。一部の実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ中に存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。
【０１１９】
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に生じるヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１２０】
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、様々な（１つよりも多い）異なる種類の標準及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、核酸の特定の領域は、１、２またはそれを上回る（任意選択で異なる）種類の標準及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、細胞または生体に導入されると、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾の核酸と比べて、それぞれ細胞または生体における分解の減少を示す。
【０１２２】
一部の実施形態では、修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、細胞または生体に導入されると、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾の核酸と比べて、それぞれ細胞または生体における免疫原性の減少（例えば、先天応答の減少）を示し得る。
【０１２３】
核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、一部の実施形態では、核酸の合成中または合成後に、所望の機能または特性を達成するために導入される非天然修飾ヌクレオチドを含む。上記修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンまたはピリミジン塩基、または糖の上に存在してよい。上記修飾は、化学合成を用いて、またはポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端に、または鎖中の他の任意の場所に導入することができる。核酸のいずれの領域も化学修飾することができる。
【０１２４】
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体との組合せで含有する化合物（本明細書では「ヌクレオ塩基」とも称される）を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるための任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的に、もしくは組換え的に合成することができる。核酸は、結合したヌクレオシドの１つの領域または複数の領域を含み得る。そのような領域は、可変的な骨格結合を有し得る。結合は、標準のホスホジエステル結合であってよく、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
【０１２５】
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準アデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、非標準もしくは修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、その際、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置が、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸においてなど、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的非標準塩基構造どうしの間の水素結合を可能にする。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組合せを、本開示の核酸に組み込むことができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）中の修飾ヌクレオ塩基は、Ｎ１−メチル−シュードウリジン（ｍｌΨ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅｌΨ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（Ψ）を含む。一部の実施形態では、核酸中の修飾ヌクレオ塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５−メトキシメチルウリジン、５−メチルチオウリジン、１−メトキシメチルシュードウリジン、５−メチルシチジン、及び／または５−メトキシシチジンを含む。一部の実施形態では、上記ポリリボヌクレオチドは、限定されないが、化学修飾を含む上述の修飾ヌクレオ塩基のいずれか少なくとも２つ（例えば、２、３、４つ以上）の組合せを含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つまたは複数またはすべてのウリジン位にＮ１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）置換を含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つまたは複数またはすべてのウリジン位にＮ１−メチル−シュードウリジン（ｍｌΨ）置換及び核酸の１つまたは複数またはすべてのシチジン位に５−メチルシチジン置換を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つまたは複数またはすべてのウリジン位にシュードウリジン（Ψ）置換を含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つまたは複数またはすべてのウリジン位にシュードウリジン（Ψ）置換及び核酸の１つまたは複数またはすべてのシチジン位に５−メチルシチジン置換を含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つまたは複数またはすべてのウリジン位にウリジンを含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について一様に修飾されている（例えば、完全に修飾され、配列全体で修飾されている）。例えば、核酸は、Ｎ１−メチル−シュードウリジンで一様に修飾されていてよく、ｍＲＮＡ配列中のすべてのウリジン残基がＮ１−メチル−シュードウリジンで置換されていることを意味する。同様に、核酸は、例えば、上記のものなどの修飾残基での置換により、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について一様に修飾されていてよい。
【０１３３】
本開示の核酸は、分子の長さ全体で部分的に、または完全に修飾されていてよい。例えば、１つまたは複数または全部の所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つまたは複数または全部）が、本開示の核酸において、またはその所定の配列領域において一様に修飾されていてよい（例えば、ポリＡテイルを含む、または除くｍＲＮＡにおいて）。一部の実施形態では、本開示の核酸中（またはその配列領域中）のすべてのヌクレオチドＸが修飾ヌクレオチドであり、その際、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであってよい。
【０１３４】
上記核酸は、（総ヌクレオチド含有量に対してか、またはヌクレオチドの１つまたは複数の種類、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つまたは複数に対して）約１％〜約１００％または任意の中間パーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでよい。任意の残りのパーセンテージは非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在が占めることは理解されるであろう。
【０１３５】
上記核酸は、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、または任意の中間パーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、上記核酸は、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを含有し得る。一部の実施形態では、上記核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置換されている。修飾ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物により置換されていてよいか、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物により置換されていてよい。一部の実施形態では、上記核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾シトシン（例えば、５−置換シトシン）で置換されている。修飾シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物により置換されていてよいか、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物により置換されていてよい。
【０１３６】
非翻訳領域（ＵＴＲ）
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、様々なシス作用性核酸構造により与えられる様々な機構により調節及び制御され得る。例えば、ヘアピンまたは他の高次（例えば、シュードノット）分子内ｍＲＮＡ二次構造を形成する天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントは、翻訳制御活性をポリヌクレオチドに与えることができ、その際、特に、ＲＮＡエレメントが５’キャップ構造に近い５’ＵＴＲに位置している場合には、ＲＮＡエレメントは、ポリヌクレオチド翻訳の開始に影響を及ぼす、またはそれを調節する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０（３）：５１５−５２６、Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：２８５０−２８５４）。
【０１３７】
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されない開始コドン（５’ＵＴＲ）の前、及び停止コドン（３’ＵＴＲ）後のポリヌクレオチドの核酸部分である。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））はさらに、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能性断片、３’ＵＴＲもしくはその機能性断片、またはその組合せ）を含む。
【０１３８】
シス作用性ＲＮＡエレメントはまた、翻訳伸長に影響を及ぼし得て、多数のフレームシフティングイベントに関係する（Ｎａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３（２）：１５７−１６８）。内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は、別の種類のシス作用性ＲＮＡエレメントを表しており、これは典型的には、５’ＵＴＲに位置するが、天然に生じるｍＲＮＡのコード領域内においても見い出されることが報告されている（Ｈｏｌｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６（１０）：４６９−４７３）。細胞ｍＲＮＡでは、ＩＲＥＳは多くの場合に、５’−キャップ構造と共存し、ｍＲＮＡに、ｃａｐ依存的翻訳が損なわれている条件下で翻訳される機能的能力を与える（Ｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（７）：ａ０１２２４５）。別の種類の天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントは、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含む。天然に生じるｕＯＲＦは、多数のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に単独で、または複数で生じ、下流の主なＯＲＦの翻訳に、通常はマイナスの影響を及ぼす（酵母におけるＧＣＮ４  ｍＲＮＡ及び哺乳類におけるＡＴＦ４  ｍＲＮＡの注目すべき例外を伴い、その際、ｕＯＲＦは、ｅＩＦ２リン酸化増大の条件下で下流の主なＯＲＦの翻訳を促進するように作用する（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：４０７−４５０））。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する成分、構造、エレメント、モチーフ、及び／または特異的配列により与えられる追加の例示的な翻訳制御活性には、限定されないが、ｍＲＮＡの安定化または不安定化（Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｐａｒｋｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６（３）：２９３−２９９）、翻訳活性化（Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２１（４）：４５２−４５７）、及び翻訳抑制（Ｂｌｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｅｅｈ  Ｄｅｖ  １１０（１−２）：９７−１１２）が含まれる。研究は、天然に生じるシス作用性ＲＮＡエレメントが、導入により異種ポリヌクレオチドを修飾するために使用された場合、それらのそれぞれの機能を付与し得ることを示している（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（１６）：１３６３５−１３６４０）。
【０１３９】
機能性ＲＮＡエレメントを含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、所望の翻訳制御活性を与える修飾を含む合成ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエレメント）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、開始コドン、ポリペプチドをコードする全長オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及び少なくとも１つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、その際、上記少なくとも１つの修飾は、所望の翻訳制御活性、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または増強する修飾を与える。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはその近位での４３Ｓ転写前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの滞留時間の増大である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはそこからのポリペプチド合成の開始の増大である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の増加である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実性の上昇である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる読み漏らしの阻害または減少である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、開始コドン以外のｍＲＮＡ内の任意のコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または減少である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレーム以外のｍＲＮＡ内の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または減少である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または減少である。一部の実施形態では、上記所望の翻訳制御活性は、上述の翻訳制御活性のうちの１つまたは複数の組合せである。
【０１４０】
したがって、本開示は、本明細書に記載のとおりの所望の翻訳制御活性を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを提供する。一部の態様では、上記ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または増強する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。一部の態様では、上記ｍＲＮＡは、読み漏らしの阻害または減少などの所望の翻訳制御活性を与える配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。一部の態様では、本開示は、読み漏らしを阻害及び／または減少させて、それにより、ｍＲＮＡの翻訳忠実性を促進する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含むｍＲＮＡを提供する。
【０１４１】
一部の実施形態では、上記ＲＮＡエレメントは、天然及び／または修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、上記ＲＮＡエレメントは、本明細書に記載のとおりの所望の翻訳制御活性を提供する結合ヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列からなる。一部の実施形態では、上記ＲＮＡエレメントは、安定なＲＮＡ二次構造を形成するか、それに折り畳まれる結合ヌクレオチド、またはその誘導体もしくアナログの配列を含み、その際、上記ＲＮＡ二次構造は、本明細書に記載のとおりの所望の翻訳制御活性を提供する。ＲＮＡエレメントは、エレメントの一次配列（例えば、ＧＣリッチなエレメント）に基づき、エレメントにより形成されるＲＮＡ二次構造（例えば、ステムループ）により、ＲＮＡ分子内でのエレメントの位置（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置）により、エレメントの生物学的機能及び／または活性（例えば、「翻訳エンハンサーエレメント」）、及びそれらの任意の組合せにより同定及び／または特徴付けられ得る。
【０１４２】
一部の態様では、本開示は、読み漏らしを阻害する、及び／またはｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進する１つまたは複数の構造修飾を有するｍＲＮＡを提供し、その際、上記構造修飾の少なくとも１つはＧＣリッチなＲＮＡエレメントである。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、コザックコンセンサス配列から１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
【０１４３】
上述の態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、上記配列組成は、シトシン７０〜８０％、シトシン６０〜７０％、シトシン５０％〜６０％、シトシン４０〜５０％、シトシン塩基３０〜４０％である。上述の態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、上記配列組成は、シトシン約８０％、シトシン約７０％、シトシン約６０％、シトシン約５０％、シトシン約４０％、またはシトシン約３０％である。
【０１４４】
上述の態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、上記配列組成は、シトシン７０〜８０％、シトシン６０〜７０％、シトシン５０％〜６０％、シトシン４０〜５０％、またはシトシン３０〜４０％である。上述の態様または関連の態様のいずれかでは、本開示は、任意の順序で結合した２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを提供し、その際、上記配列組成は、シトシン約８０％、シトシン約７０％、シトシン約６０％、シトシン約５０％、シトシン約４０％、またはシトシン約３０％である。
【０１４５】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置し、かつ上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、任意の順序で結合した３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、その誘導体またはアナログを含み、その際、上記配列組成は、シトシン＞５０％である。一部の実施形態では、上記配列組成は、シトシン＞５５％、シトシン＞６０％、シトシン＞６５％、シトシン＞７０％、シトシン＞７５％、シトシン＞８０％、シトシン＞８５％、またはシトシン＞９０％である。
【０１４６】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流の結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置し、かつ上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、約３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０または約２０、約１５、約１２、約１０、約６または約３のヌクレオチド、または誘導体もしくはアナログの配列を含み、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフを含み、上記繰り返しＧＣモチーフは、［ＣＣＧ］ｎであり、ここで、ｎ＝１〜１０、ｎ＝２〜８、ｎ＝３〜６、またはｎ＝４〜５である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４または５である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝１、２、または３である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝１である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝２である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝３である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝４である。一部の実施形態では、上記配列は、繰り返しＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここで、ｎ＝５である。
【０１４７】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流の結合ヌクレオチドの配列を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、表２に記載の配列のいずれか１つを含む。一実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、コザックコンセンサス配列から１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
【０１４８】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載のとおりの配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号２９１）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ１を含む。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ１を含む。他の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ１を含む。
【０１４９】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載のとおりの配列Ｖ２［ＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号２９２）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ２を含む。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ２を含む。他の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ２を含む。
【０１５０】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載のとおりの配列ＥＫ［ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２９０）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログである。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載のとおりの配列ＥＫを含む。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列ＥＫを含む。他の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に記載のとおりの配列ＥＫを含む。
【０１５１】
さらに他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流に表２に記載のとおりの配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号２９１）］を含むＧＣリッチＲＮＡエレメント、またはその誘導体もしくはアナログであり、上記５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１２）を含む。当業者はもちろん、本明細書に記載のＲＮＡ配列中のすべてのＵが、本開示のｍＲＮＡが例えばＩＶＴを介して転写される対応するテンプレートＤＮＡ配列、例えば、ＤＮＡテンプレートまたはコンストラクトではＴとなることは分かるであろう。
【０１５２】
一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、表２に示されている５’ＵＴＲ配列中のコザックコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表２に記載のとおりの配列Ｖ１を含む。一部の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に示されているとおりの配列Ｖ１を含み、その際、上記５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１２）を含む。
【０１５３】
他の実施形態では、上記ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列から１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に示されているとおりの配列Ｖ１を含み、その際、上記５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１２）を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、表２に示されている次の配列：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号２８７）を含む。
【表２】
2022500443.tif 000004
【０１５５】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、その際、少なくとも１つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する順序で結合したヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくはアナログを含む安定なＲＮＡ二次構造を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。一実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約２０、約１５、約１０または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約５、約４、約３、約２、約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から約１５〜３０、約１５〜２０、約１５〜２５、約１０〜１５、または約５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列から１２〜１５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、上記安定なＲＮＡ二次構造は、約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０〜−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０〜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−５〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのデルタＧを有する。
【０１５６】
別の実施形態では、上記修飾は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作動可能に結合されており、その際、上記修飾及び上記オープンリーディングフレームは異種である。
【０１５７】
別の実施形態では、上記ＧＣリッチＲＮＡエレメントの配列は専ら、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）ヌクレオ塩基から構成される。
【０１５８】
本明細書に記載のとおりの所望の翻訳制御活性をもたらすＲＮＡエレメントは、リボソームプロファイリングなどの公知の技術を使用して同定及び特徴付けられ得る。リボソームプロファイリングは、ｍＲＮＡに結合したＰＩＣ及び／またはリボソームの位置の決定を可能にする技術である（例えば、参照により本明細書に援用されるＩｎｇｏｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９２４）：２１８−２３を参照されたい）。上記技術は、ＰＩＣ及び／またはリボソームによる、ヌクレアーゼ消化からのｍＲＮＡの領域またはセグメントの保護に基づく。保護は、「フットプリント」と呼ばれるＲＮＡの３０ｂｐ断片の生成をもたらす。ＲＮＡフットプリントの配列及び頻度を、当技術分野で公知の方法（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）により解析することができる。フットプリントは、リボソームのＡ部位にほぼ集中している。ＰＩＣまたはリボソームがｍＲＮＡに沿った特定の位置または場所に存在するならば、これらの位置で生成したフットプリントは比較的共通するであろう。研究は、ＰＩＣ及び／またはリボソームが加工性の低下を示す位置に、より多くのフットプリントが生成し、かつｆＰＩＣ及び／またはリボソームが加工性の増大を示す位置に、より少ないフットプリントが生成することを示している（Ｇａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ｅＬｉｆｅ  ３：ｅ０３７３５）。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡエレメントのいずれか１つまたは複数を含むポリヌクレオチドに沿った別個の位置または場所でのＰＩＣまたはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングにより決定される。
【０１５９】
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコード領域に対して相同または異種であり得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはそれらの機能性断片を含み、それらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはそれらの機能性断片を含み、それらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
【０１６０】
一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲもしくはそれらの機能性断片、３’ＵＴＲもしくはそれらの機能性断片、またはそれらの任意の組合せは、配列最適化されている。
【０１６１】
一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲもしくはその機能性断片、３’ＵＴＲもしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、Ｎ１−メチルシュードウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。
【０１６２】
ＵＴＲは、調節的役割、例えば、安定化、局在化及び／または翻訳効率の増大または減少を提供する特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを、細胞、組織、または生物に投与することができ、ルーチン的な方法を用いて、１つまたは複数の調節的特徴を測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能性断片は、それぞれ全長５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つまたは複数の調節機能を含む。
【０１６３】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴を持っている。これらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、コザック配列などのシグネチャを保持している。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２４８）を有し、ここで、Ｒは、開始コドンから３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）（ＡＵＧ）であり、その後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが公知である。
【０１６４】
特定の標的器官内に豊富に発現する遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質の産生を増大させることができる。例えば、肝臓で発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポイエチンまたは第ＶＩＩＩ因子の導入で、肝細胞系または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）では、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを用いて、その組織での発現を向上させることができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発達中のある時期に発現するタンパク質ファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する）ファミリーに属し得る。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じか、または異なるファミリーのタンパク質の他の任意のＵＴＲと交換して、新規のポリヌクレオチドを作成することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは異種であり得る。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
【０１６７】
共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開ＷＯ／２０１４／１６４２５３、その全体が参照により本明細書に援用される）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドで利用することができる例示的なＵＴＲのリストを提供している。
【０１６８】
本出願の例示的なＵＴＲには、限定されないが、以下の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが含まれる：グロビン、例えばαまたはβグロビン（例えば、ゼノパス、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）、強力なコザック翻訳開始シグナル、ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ−２４５αポリペプチド）、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）、ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７−β）脱水素酵素）、ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ即初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）、熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）、翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）、グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））、アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、クエン酸サイクル酵素、トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子（オリゴピリミジン領域）の５’ＵＴＲ））、リボソーマルタンパク質Ｌａｒｇｅ  ３２（Ｌ３２）、リボソーマルタンパク質（例えば、ｒｐｓ９などのヒトまたはマウスリボソーマルタンパク質）、ＡＴＰ合成酵素（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰ合成酵素のβサブユニット）、成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））、伸長因子（例えば、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、β−Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、コラーゲンＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、コラーゲンＶＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、コラーゲンＶＩ型、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））、リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質（例えば、ＬＲＰ１）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲン−リシン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）、ならびにヌクレオビンジン（例えば、Ｎｕｃｂ１）。
【０１６９】
一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、βグロビン５’ＵＴＲ、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、シトクロムｂ−２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ、ヒドロキシステロイド（１７−β）脱水素酵素（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム、デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ、ヒートショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ、ｅＩＦ４Ｇ５’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１５’ＵＴＲ、それらの機能性断片、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１７０】
一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、βグロビン３’ＵＴＲ、ＣＹＢＡ３’ＵＴＲ、アルブミン３’ＵＴＲ、成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ、ＶＥＥＶ３’ＵＴＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ、α−グロビン３’ＵＴＲ、ＤＥＮ３’ＵＴＲ、ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）３’ＵＴＲ、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ、ミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰ合成酵素（β−ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲのβサブユニット、ＧＬＵＴ１  ３’ＵＴＲ、ＭＥＦ２Ａ  ３’ＵＴＲ、β−Ｆ１−ＡＴＰアーゼ３’ＵＴＲ、それらの機能性断片、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１７１】
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲを、本発明のポリヌクレオチドに組み込みことができる。一部の実施形態では、ＵＴＲを、野生型もしくは天然のＵＴＲに対して変化させて、例えばＯＲＦに対するＵＴＲの配向または位置の変更により、あるいは追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位により、バリアントＵＴＲを生成することができる。一部の実施形態では、５’もしくは３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、あるいは１つまたは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されているか、またはそのＵＴＲの末端から除去されるバリアントを利用することができる。
【０１７２】
加えて、１つまたは複数の合成ＵＴＲを、１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用することができる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｎｄａｌ及びＲｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２を参照されたい。
【０１７３】
ＵＴＲまたはその一部を、その選択元となった転写物においてと同じ向きに配置してもよいし、または配向もしくは位置を変更してもよい。したがって、５’及び／または３’ＵＴＲを、反転、短縮、延長すること、または１つまたは複数の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと併用することもできる。
【０１７４】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重もしくは四重５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列であるかまたは実質的に直列であるかのいずれかの、同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータグロビン３’ＵＴＲを使用することができる（その内容全体が参照により本明細書に援用されるＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたい）。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、以下に示す例示的な５’ＵＴＲ配列のいずれか１つを含む：
【表３】
2022500443.tif 000005
【０１７６】
一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、以下に示す例示的な３’ＵＴＲ配列のいずれか１つを含む：
【表４】
2022500443.tif 000006
2022500443.tif 000007
2022500443.tif 000008
2022500443.tif 000009
2022500443.tif 000010
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３、８８〜１０２、または１６５〜１６７のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号４、１０４〜１１２、または１５０、及びそれらの任意の組合せのいずれかを含む３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含み得る。例えば、上記ＯＲＦは、ポリＡテイルの鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲに由来する、第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい）。
【０１７９】
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内部の領域またはサブ領域として使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。イントロン配列の組み込みで、タンパク質の産生、さらにはポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりにまたはそれに加えて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＹａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０  ３９４（１）：１８９−１９３を参照されたい）。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを非合成３’ＵＴＲとの組合せで含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、上記ＵＴＲはまた、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、または翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（「ＴＥＥ」と総称）を含み得る。非限定的例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
【０１８１】
一態様では、ＴＥＥは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促進することができる、ＵＴＲ内の保存エレメントである。
【０１８２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子のシュード受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと称される。
【０１８３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、かつさらに、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みにより、天然に生じるｍｉＲＮＡの組織特異的な発現及び／または細胞型特異的な発現に基づき、本発明のポリヌクレオチドが制御され、次いで、それからコードされるポリペプチドが制御される。
【０１８４】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一部の実施形態では、上記組成物または製剤はさらに、送達剤を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列に対して有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０１８６】
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡは、安定性を低下させるか、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することにより、ポリヌクレオチドに結合して遺伝子発現を下方制御する、１９〜２５ヌクレオチド長の非コードのＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。
【０１８７】
マイクロＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡ（前駆体ｍｉＲＮＡ）と呼ばれることが多い短いヘアピン構造を形成するように自身に折り畳まれたＲＮＡ転写物の領域から酵素的に誘発される。プレｍｉＲＮＡは典型的に、その３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基と５’ホスファート基とを有する。この前駆体ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、続いて細胞質に輸送され、ＤＩＣＥＲ（ＲＮアーゼＩＩＩ酵素）によりさらに処理されて、約２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。次いで、成熟マイクロＲＮＡは、リボ核粒子中に組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。成熟ｍｉＲＮＡについて当技術分野において承認されている命名法は典型的に、成熟ｍｉＲＮＡが由来するプレｍｉＲＮＡのアームを指定しており、「５ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの５’アーム由来であることを意味し、「３ｐ」は、マイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡヘアピンの３’末端に由来することを意味する。本明細書において番号で言及されるｍｉＲは、同じプレｍｉＲＮＡの反対のアーム（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）に由来する２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれかを指し得る。本明細書において言及されるすべてのｍｉＲは、特に３ｐまたは５ｐの指定により特定されていない限り、３ｐ及び５ｐアーム／配列の両方を含むことを意図したものである。
【０１８８】
本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用するか、会合するか、またはｍｉＲＮＡに結合するために十分なｍｉＲＮＡの全部もしくは一部の領域に対する相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む、例えばＤＮＡ内もしくはＲＮＡ転写物内のポリヌクレオチド内の配列を指す。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、かつさらに、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
【０１８９】
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性調整、例えばポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性翻訳の抑制または分解を促すうえで相補性の度合いが十分であることを指す。本発明の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍｉＲＮＡガイド付きＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を媒介してｍＲＮＡの切断を促進するうえで、相補性の度合いが十分であることを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば１９〜２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみに対して、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列の全長より１、２、３または４ヌクレオチド少ない部分に対して、あるいは、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列より１、２、３または４ヌクレオチド短い部分に対して相補的であり得る。所望の調節が、ｍＲＮＡの分解である場合、相補性が十分であるかまたは完全である（例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡの長さの全部分または有意な部分にわたって相補性が十分であるかまたは完全である）ことが好ましい。
【０１９０】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２もしくは３個のヌクレオチド置換、末端付加、及び／または末端切断は除くが、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する。
【０１９１】
一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと長さが同じである。他の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端またはその両方で対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２短い。さらに他の実施形態では、上記マイクロＲＮＡ結合部位は、対応する５’末端、３’末端、またはその両方でマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然としてｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つまたは複数を組み込んだｍＲＮＡを分解することができるか、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位をＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡに結合することにより、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解するか、あるいはｍＲＮＡが翻訳されるのを防ぐ。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体によりｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドが切断される程度に、ｍｉＲＮＡに対する相補性が十分である。他の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体により、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドにおける不安定性が誘発される。別の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位の相補性が不完全なことに起因して、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体により、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写が抑制される。
【０１９３】
一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の不整合部を有する。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
【０１９４】
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することにより、該当するｍｉＲＮＡが利用可能な場合、そのポリヌクレオチドを分解または翻訳低下の標的とすることが可能となる。こうすることで、ポリヌクレオチドが送達される際に、オフターゲット効果を減少させることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達されることは意図されないが、最終的に前述の組織または細胞に帰結するものである場合、組織または細胞内に多く存在するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作することで、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、核酸分子送達の際のオフターゲット作用の危険を低下させ得る、及び／またはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現の組織特異的制御が可能となり得る。また他の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸送達の際の免疫応答を調節することができる。さらなる実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のｍＲＮＡ内に組み込むことにより、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の加速血クリアランス（ＡＢＣ）を調節することができる。
【０１９５】
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、天然に生じるポリヌクレオチド配列から除去することで、特定の組織におけるタンパク質の発現を増加させることができる。例えば、特定のｍｉＲＮＡ用の結合部位をポリヌクレオチドから除去することで、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞でのタンパク質の発現を改善することができる。
【０１９６】
複数の組織における発現の調節は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つまたは複数の別個のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去により達成することができる。発症及び／または疾患状態にある組織及び／または細胞でのｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそのプロファイリングに基づいて、ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかそれとも挿入するかの決定を成すことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位及びそれらの発現パターンの同定、ならびに生物学における役割が報告されてきた（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄＮａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３ならびに本明細書のすべての参照文献、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１９７】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節することによりタンパク質の発現を調節することが公知である組織の例には、限定されないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が含まれる。
【０１９８】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの免疫細胞（別称：造血細胞）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて差次的に発現することが公知である。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、さらには遺伝子治療及び組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化及びアポトーシスの局面の多くも調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は免疫細胞においてのみ、特に骨髄性樹状細胞で豊富に発現する。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ−１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに付加することにより遮断することができ、組織及び細胞内での遺伝子導入の安定性向上を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞内で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１、Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５−５９１、Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４−４１５２、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１９９】
抗原媒介性免疫応答は、生物に進入する際に抗原提示細胞により処理され、抗原提示細胞の表面上に提示される、外来抗原により誘発される免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識して、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導し得る。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を導入し、ｍｉＲ−１４２媒介性分解を通じて抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制することにより、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）内での抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。次いで、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を誘発することなく、標的組織または細胞で安定に発現する。
【０２００】
一実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡのための結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することで、ｍｉＲＮＡ介在性ＲＮＡの分解により抗原提示細胞でのポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介性免疫応答を抑制することができる。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞では、ポリヌクレオチドの発現が維持される。例えば、一部の実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去し、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作することができる。
【０２０１】
ＡＰＣ及びマクロファージにおける選択的な分解及び抑制をさらに駆動するために、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に、さらなる負の調節エレメントを単独で、またはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位と組み合わせて含んでもよい。非限定的例として、さらなる負の調節エレメントは、構成的減衰エレメント（ＣＤＥ）である。
【０２０２】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−ｌ−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−−２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれる。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析により免疫細胞において新規のｍｉＲＮＡを同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７、Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２０３】
肝臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが含まれる。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去すると、肝臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２０４】
肺で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが含まれる。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することにより、肺でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で操作することも、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、組み込むこともできる。
【０２０５】
心臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれる。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するかまたは除去することで、心臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２０６】
神経系で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが含まれる。神経系内で富化されるｍｉＲＮＡにはさらに、限定されないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含む、ニューロンで特異的に発現されるもの、かつ限定されないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７を含む、神経膠細胞で特異的に発現されるものが含まれる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することによって、神経系でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２０７】
膵臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が含まれる。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２０８】
腎臓で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が含まれる。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチド内に導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、腎臓でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２０９】
筋肉で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが含まれる。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することで、筋肉でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を単独で、または本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて、操作することもできる。
【０２１０】
ｍｉＲＮＡはまた、様々な種類の細胞、例えば、限定されないが、内皮細胞、上皮細胞及び脂肪細胞で差次的に発現する。
【０２１１】
内皮細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれる。ディープシーケンシング分析により、新規ｍｉＲＮＡの多くが内皮細胞において発見されている（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することにより、内皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０２１２】
上皮細胞で発現することが公知であるｍｉＲＮＡには、限定されないが、呼吸繊毛上皮細胞において特異的なｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、肺上皮細胞において特異的なｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、腎上皮細胞において特異的なｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ−７６２が含まれる。任意の上皮細胞に特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入するか、またはそのポリヌクレオチドから除去することにより、上皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０２１３】
加えて、巨大なｍｉＲＮＡ群が胚性幹細胞内に富化されていて、幹細胞の自己再生を制御すると共に、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞及び筋肉細胞などの様々な細胞系統の発達及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４、Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６、Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１、Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡには、限定されないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８１、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ，ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１，ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれる。予測された新規のｍｉＲＮＡの多くは、ヒト胚性幹細胞におけるディープシークエンシングにより発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１、Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５、これらはそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２１４】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系統の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞ならびにＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現する、及び／または内皮細胞及び血小板などのサイトカインを分泌し得ることが公知である細胞における発現及び存在量に基づいて選択される。したがって一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡセットは、これらの細胞の免疫原性の一部を担い得るｍｉＲを含み、そのため、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）内に対応するｍｉＲ部位の組み込みは、特異的細胞型におけるｍＲＮＡの不安定化、及び／またはこれらのｍＲＮＡからの翻訳の抑制につながり得る。非限定的な代表例には、造血細胞の多くで特異的であるｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−２２３、Ｂ細胞で発現するｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２２３、前駆造血細胞で発現するｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板及び内皮細胞で発現するｍｉＲ−１２６が含まれる。ｍｉＲの組織発現に関するさらなる考察については、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ−Ｍｏｎｔｏｙａ、Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅｌ０２２５９、Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １２９：１４０１−１４１４、Ｂｉｓｓｅｌｓ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＲＮＡ  １５：２３７５−２３８４を参照されたい。３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲ中のいずれか１つのｍｉＲ部位（例えば、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方において多く存在するｍｉＲ−１４２）を組み込むことで、目的の複数の細胞型においてそのような効果を媒介できる。
【０２１５】
一部の実施形態では、複数のｍｉＲを有する同じ細胞型を標的とすること、ならびに３ｐアーム及び５ｐアームの両方が多く存在する（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ１４２−５ｐの両方が造血幹細胞内に多く存在する）場合、それら両方の各々に対し結合部位を組み込むことが、有益とされ得る。したがって、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−２２３（多くの造血細胞で発現するもの）からなる群、あるいは（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２２３（Ｂ細胞で発現するもの）からなる群、あるいはｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６（前駆造血細胞で発現するもの）からなる群からの２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれより多く）のｍｉＲ結合部位を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、様々なｍｉＲを組み合わせることにより、目的の複数の細胞型を同時に標的とする（例えば、造血系統及び内皮細胞中の多くの細胞を標的とするためにはｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６）ことも有益であり得る。したがって、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれより多く）のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際、（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５もしくはｍｉＲ−２２３）を標的とし、かつｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とする、または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６もしくはｍｉＲ−２２３）を標的とし、かつｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とする、または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは前駆造血細胞（例えば、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａもしくはｍｉＲ−１６）を標的とし、かつｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とする、または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは造血系統の細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５もしくはｍｉＲ−２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つはＢ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６もしくはｍｉＲ−２２３）を標的とし、かつｍｉＲのうちの少なくとも１つは形質細胞様樹状細胞、血小板または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とする、あるいは上記４つのクラスのｍｉＲ結合部位の他の任意の可能な組合せ（すなわち、造血系統を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、前駆造血細胞を標的とするもの及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）を含む。
【０２１７】
一実施形態では、免疫応答を調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞）で発現する１つまたは複数のｍｉＲに結合する１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合配列を含み得る。従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を発現し、かつ炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞及び／または脾細胞及び／または内皮細胞）で発現する１つまたは複数のｍｉＲを、ｍＲＮＡに組み込むことにより、免疫細胞活性化（例えば、活性化Ｂ細胞の頻度により測定されるようなＢ細胞活性化）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦαの産生）が減少する、または阻害されることが、昨今になって発見されている。さらに昨今では、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を発現し、かつ炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞及び／または脾細胞及び／または内皮細胞）で発現する１つまたは複数のｍｉＲを、ｍＲＮＡ中に組み込むことにより、ｍＲＮＡによりコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を減少させる、または阻害することができることが発見されている。
【０２１８】
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物中に含まれて送達されるポリヌクレオチドに対する加速血液クリアランスを調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡに結合する１つまたは複数のｍｉＲ結合配列を含み得、そのｍｉＲ結合配列は、従来の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、かつ炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞（例えば、末梢リンパ器官の免疫細胞及び／または脾細胞及び／または内皮細胞）で発現するものである。昨今では、１つまたは複数のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡ内に組み込むことにより、ｍＲＮＡを送達する際に使用される脂質含有化合物または組成物に対する加速血液クリアランス（ＡＢＣ）が減少する、または阻害されることが発見されている。さらに昨今では、１つまたは複数のｍｉＲ結合部位をｍＲＮＡ中に組み込むことにより、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルが低下し（例えば、Ｂ細胞によるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急性産生が減少する、または阻害され）、及び／または脂質含有化合物またはｍＲＮＡを含む組成物を投与された後に形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化が減少する、または阻害されることが発見されている。
【０２１９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ配列は、免疫細胞で発現する任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得て、このｍｉＲ配列には、限定されないが、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号、及び米国特許出願公開ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されているものが含まれる。免疫細胞で発現するｍｉＲの非限定的例には、脾臓細胞、骨髄系細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／またはマクロファージで発現するｍｉＲが含まれる。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７は骨髄系細胞で発現し、ｍｉＲ−１５５は樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞で発現し、ｍｉＲ−１４６はＴＬＲを刺激した際にマクロファージで上方制御され、ｍｉＲ−１２６は形質細胞様樹状細胞で発現する。ある特定の実施形態では、上記ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞において豊富に、または優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１２６−５ｐ）、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、ならびにｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５−５ｐ）は、免疫細胞において豊富に発現する。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当技術分野で公知であり、したがって、当業者は、これらのマイクロＲＮＡがワトソン−クリック相補性に基づいて結合する結合配列または標的配列を容易に設計することができる。
【０２２０】
したがって、様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡに対して少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡ用の１〜４つ（１、２、３または４つ）のｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、及びそれらの組合せからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対応し得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現する同じｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２、３、４つ）のコピー、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
【０２２１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位のコピーを３つ使用すれば、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して有益な特性を示し得る。３つのｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的例は、配列番号１９９（３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）、及び配列番号１９０（３つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）に示す。
【０２２２】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位２つ以上（例えば、２、３、４つ）のコピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲ配列の非限定的例は、配列番号１７３（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）、配列番号１７９（２つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）及び配列番号１８２（２つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）で示される。
【０２２３】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つはｍｉＲ−１４２−３ｐ用である。様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０２２４】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つはｍｉＲ−１２６−３ｐ用である。様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐまたはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）用の結合部位を含む。
【０２２５】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つはｍｉＲ−１４２−５ｐ用である。様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０２２６】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現するマイクロＲＮＡ用の少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、その際、ｍｉＲ結合部位のうちの１つはｍｉＲ−１５５−５ｐ用である。様々な実施形態で、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）用の結合部位を含む。
【０２２７】
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生（例えばｍｉＲ−１３２）のような複雑な生物学的過程を調節することができる（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本発明のポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせてカスタマイズするために、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することができる。これに関連して、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
【０２２８】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のいずれか１つまたは複数の１つまたは複数のコピーを含む表３から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはさらに、表３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの同じか、または異なるｍｉＲＮＡ結合部位（それらの任意の組合せを含む）を含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合するか、またはｍｉＲ−１４２に対して相補的である。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１４２は、配列番号１４４を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号１４６を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位は、配列番号１４８を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１４６または配列番号１４８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合するか、またはｍｉＲ−１２６に対して相補的である。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１２６は、配列番号１４９を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐに結合する。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位は、配列番号１５１を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲ−１２６−５ｐ結合部位は、配列番号１５３を含む。一部の実施形態では、上記ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１５１または配列番号１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
【０２３１】
一実施形態では、上記３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、その際、第１のｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１４２に結合し、第２のｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１２６に結合する。特定の実施形態では、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号１７３または１９５の配列を含むか、この配列からなるか、または本質的にこの配列からなる。
【０２３２】
【表５】
2022500443.tif 000011
【０２３３】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で、本発明のポリヌクレオチド中に挿入される。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。上記ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能性ポリペプチドの翻訳を妨げない限り、及びｍｉＲＮＡの存在下では、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入と、ｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合とがポリヌクレオチドを劣化させ得る、またはポリヌクレオチドの翻訳を妨げ得る限り、ポリヌクレオチド内の挿入部位はポリヌクレオチド内のどこにあってもよい。
【０２３４】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
【０２３５】
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ内のコード領域の停止コドンの直後にある３’ＵＴＲ内に挿入される。一部の実施形態では、コンストラクト内に停止コドンのコピーが複数存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最後の停止コドンの直後に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、停止コドンのさらに下流に挿入され、その場合、停止コドンとｍｉＲ結合部位との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。一部の実施形態では、３’ＵＴＲ内のｍｉＲ用の可能な挿入部位の３つの非限定的例を、配列番号１８３、１８４、及び１８５に示すが、それらは、それぞれ３’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ−１４２−３ｐ部位が挿入された３’ＵＴＲ配列を示す。
【０２３６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ内の１つまたは複数の可能な挿入部位に位置し得る。例えば、５’ＵＴＲ内のｍｉＲ用の可能な挿入部位の３つの非限定的例を、配列番号１８７〜１８９に示すが、それらは、それぞれ５’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに、ｍｉＲ−１４２−３ｐ部位が挿入された５’ＵＴＲ配列を示す。
【０２３７】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは停止コドンを含み、かつ少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンの後の３’ＵＴＲ１〜１００ヌクレオチド以内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは停止コドンを含み、かつ免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は停止コドンの後の、３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチド以内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは停止コドンを含み、かつ免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は停止コドンの後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは停止コドンを含み、かつ免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンの直後の３’ＵＴＲ内、停止コドンの後の３’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチド以内、または停止コドンの後の３’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチド以内に位置する。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つより多いｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にスペーサ領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチド長）が存在し得る。別の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡテイルヌクレオチドとの間にスペーサ領域を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡテイルの開始部との間には、１０〜１００ヌクレオチド長、２０〜７０ヌクレオチド長、または３０〜５０ヌクレオチド長のスペーサ領域が存在し得る。
【０２３８】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１〜１００ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより１０〜５０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンより少なくとも２５ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは開始コドンを含み、免疫細胞で発現するｍｉＲ用の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドンの直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドンより１５〜２０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内、または開始コドンより７０〜８０ヌクレオチド前（上流）の５’ＵＴＲ内に位置する。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つより多いｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、その際、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にスペーサ領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチド長）が存在し得る。
【０２３９】
一実施形態では、上記３’ＵＴＲは、１つより多い停止コドンを含み、その際、停止コドンの下流には少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が位置する。例えば、３’ＵＴＲは、１つ、２つまたは３つの停止コドンを含み得る。使用することができる三連停止コドンの非限定的例には、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧが含まれる。３’ＵＴＲ内部では、例えば、１、２、３もしくは４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、停止コドン（複数可）に直接隣接して、または最後の停止コドンから任意の数のヌクレオチド下流に位置し得る。３’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、これらの結合部位は、コンストラクト内で互いに隣接して（すなわち、順番に）配置され得る。あるいは別法では、スペーサヌクレオチドが各結合部位の間に配置され得る。
【０２４０】
一実施形態では、上記３’ＵＴＲは、第３の停止コドンより下流に位置する単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する３つの停止コドンを含む。３つの停止コドン、及び最後の停止コドンより下流の異なる位置に位置する単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲ配列の非限定的例を、配列番号１７２、１８３〜１８５に示す。
【表６】
2022500443.tif 000012
2022500443.tif 000013
2022500443.tif 000014
2022500443.tif 000015
停止コドン＝太字
ｍｉＲ  １４２−３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲ  １２６−３ｐ結合部位＝太字に下線
ｍｉＲ  １５５−５ｐ結合部位＝網掛け
ｍｉＲ  １４２−５ｐ結合部位＝網掛け、太字に下線
【０２４１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞で発現したｍｉＲ用の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び結合ヌクレオシドの３’テイル領域を含む。様々な実施形態で、３’ＵＴＲは、免疫細胞で発現したｍｉＲ、好ましくは免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現したｍｉＲ用のｍｉＲＮＡ結合部位を１〜４つ（少なくとも２つ、１つ、２つ、３つもしくは４つ）含む。
【０２４２】
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１４５に示す配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１４６に示す配列を含む。
【０２４３】
一実施形態では、免疫細胞で発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１６９に示す配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１５１に示す配列を含む。
【０２４４】
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲの非限定的例示的配列には、ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号１４５）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列番号１４７）、ｍｉＲ−１４６−３ｐ（配列番号１５５）、ｍｉＲ−１４６−５ｐ（配列番号１５６）、ｍｉＲ−１５５−３ｐ（配列番号１５７）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ（配列番号１５８）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１５０）、ｍｉＲ−１２６−５ｐ（配列番号１５２）、ｍｉＲ−１６−３ｐ（配列番号１５９）、ｍｉＲ−１６−５ｐ（配列番号１６０）、ｍｉＲ−２１−３ｐ（配列番号１６１）、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号１６２）、ｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号１６３）、ｍｉＲ−２２３−５ｐ（配列番号１６４）、ｍｉＲ−２４−３ｐ（配列番号１６５）、ｍｉＲ−２４−５ｐ（配列番号１６６）、ｍｉＲ−２７−３ｐ（配列番号１６７）及びｍｉＲ−２７−５ｐ（配列番号１６８）が含まれ得る。免疫細胞で発現する他の適切なｍｉＲ配列（例えば、免疫細胞内に豊富にまたは優先的に発現）は、当技術分野において、例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅで公知であり利用可能である。前述のｍｉＲのいずれかと結合する部位は、ｍｉＲに対するワトソン−クリック相補性、典型的にはｍｉＲに対する１００％相補性に基づいて設計され、本明細書に記載のとおりの本開示のｍＲＮＡコンストラクトに挿入することができる。
【０２４５】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、その３’ＵＴＲ）は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、それにより、例えば、ＩｇＭの産生を減少させる、または阻害することにより、例えば、Ｂ細胞による、ＰＥＧに対する加速血液クリアランスを減少させる、または阻害する、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を減少させる、または阻害することができ、目的のコードされたタンパク質の組織発現を調節するための、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０２４６】
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、限定されないが、周囲の配列の種、配列の型（異種、相同、外因性、内在性もしくは人工）、周囲の配列内の調節エレメント及び／または周囲の配列内の構造エレメントなどのｍｉＲＮＡを囲繞する配列による影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによる影響を受け得る。非限定的例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、ｍｉＲＮＡ配列が目的のポリペプチドの発現に対して及ぼす調節効果を増大させ得る。
【０２４７】
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響し得る。制御エレメント及び／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）であり、これは、タンパク質翻訳を開始するに当たって、翻訳伸長因子の結合に必要とされる。５’ＵＴＲ内のこの二次構造エレメントに対するＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子の発現に必要である（全体が参照により本明細書に援用されるＭｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２−８５）。マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子調節を増強するために、本発明のポリヌクレオチドはさらに、この構造化５’ＵＴＲを含むことができる。
【０２４８】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作することができる。これに関連して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多くのｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作することができる。例えば１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡ結合部位は、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ部位であり得る。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれた種々のｍｉＲＮＡ結合部位の組合せには、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの、１を超えるコピーが組み込まれている組合せが含まれ得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織を標的とし得る。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に組織、細胞型または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、特異的細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞）内での発現の度合いを減少させることができる。
【０２４９】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中の３’ＵＴＲの５’末端付近に、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の付近に操作され得る。非限定的例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに操作され得る。別の非限定的例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近に、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分のところに操作され得る。さらに別の非限定的例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近に、及び３’ＵＴＲの３’末端付近に操作され得る。
【０２５０】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり得る。
【０２５１】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与用にポリヌクレオチドを製剤化することにより制御することができる。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、本明細書に記載の脂質のいずれかを含むイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中にポリヌクレオチドを配合することにより、組織または細胞を標的とし得る。
【０２５２】
本発明のポリヌクレオチドを、異なる組織、細胞型、または生物学的状態におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型もしくは生物学的状態において標的化を強化した発現用に操作することもできる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、本発明のポリヌクレオチドを、組織もしくは細胞での最適なタンパク質発現のために、または生物学的状態という観点から設計することができる。
【０２５３】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を低下させて、結果としてポリヌクレオチドの下方調節が減少するように、部分的に変異させることができる。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間の一致または不一致の度合いは、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するための可変抵抗器として作用することができる。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域内での変異はまた、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を及ぼす可能性がある。
【０２５４】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列を、ステムループのループに組み込むことができる。
【０２５５】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列をステムループのループ内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムループの５’ステム内または３’ステム内に組み込むことができる。
【０２５６】
一実施形態では、５’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化することができる。
【０２５７】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ内のｍｉＲＮＡ配列を使用することで、限定されないが、開始コドンなどの翻訳開始部位へのアクセス性を減少させることができる。例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたい。これは、開始コドンの周りのアンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）を用いて（−４〜＋３７、ＡＵＧコドンのＡは＋１）、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセス性を減少させた。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドン周辺の配列を変更すると、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響が及ぶことを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらにより記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列でなく、ｍｉＲＮＡ配列を翻訳開始部位近くに含めることで、翻訳開始部位へのアクセス性を減少させることができる。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後またはその中に存在し得る。非限定的例として、翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列、例えばシード配列または結合部位の内部に位置し得る。
【０２５８】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドには、抗原提示細胞による抗原提示を減少させるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。上記ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、ｍｉＲＮＡ配列（シードなし）、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的例として、抗原提示を減少させるために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞でのコードされたポリペプチドの発現を減少させるために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むことができる。非限定的例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位（シードなし）、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位（シード配列なし）を含むことができる。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中のｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含むことで、治療的送達により引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。非限定的例として、ｍｉＲＮＡ結合部位が、抗原提示細胞内の本発明のポリヌクレオチドの不安定度を高め得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的例には、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、及びｍｉｒ−１４６−３ｐが含まれる。
【０２６１】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）、及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０２６２】
３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はさらに、３’ＵＴＲを含む。
【０２６３】
３’ＵＴＲは、翻訳停止コドンのすぐ後に続くｍＲＮＡのセクションであり、多くの場合に、転写後に遺伝子発現に対し影響を与える調節領域を含む。３’ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡに対する結合部位を含む。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号１３、１５４、１７０〜１７３、１７６〜１８５、１９０〜２２２、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号１３、２０６〜２２２、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号１３の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２０６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２０７の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２０８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２０９の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１３の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１４の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１５の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１７の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１８の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２１９の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２２０の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２２１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、配列番号２２２の核酸配列を含む。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号１３、１５４、１７０〜１７３、１７６〜１８５、１９０〜２２２、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
【０２６６】
５’キャップを有する領域
本発明はまた、５’キャップと本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
【０２６７】
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を上昇させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）とポリＡ結合タンパク質との会合を介して細胞内でのｍＲＮＡ安定性及び翻訳適格性を担うＣＢＰと結合することにより、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成する。上記キャップはさらに、ｍＲＮＡのスプライシング中に５’近位イントロンを除去する一助となる。
【０２６８】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャッピングされて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスファート結合を生成していてよい。次いで、この５’−グアニレートキャップがメチル化されると、Ｎ７−メチル−グアニレート残基が生成され得る。ｍＲＮＡの５’末端及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖も任意選択で、２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニレートキャップ構造の加水分解及び切断を介した５’デキャッピングは、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とし得る。
【０２６９】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）には、キャップ部分が組み込まれている。
【０２７０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）が非加水分解性キャップ構造を含むと、デキャッピングが防止されて、ｍＲＮＡ半減期が延びる。キャップ構造の加水分解では５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断が必要とされるので、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドが使用され得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のワクシニアキャッピング酵素を、製造者指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドと併用することで、５’−ｐｐｐ−５’キャップ中にホスホロチオアート結合を生ずることができる。追加の修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α−メチル−ホスホナート及びセレノ−フォスファートヌクレオチドを使用することもできる。
【０２７１】
追加の修飾には、限定されないが、糖環の２’−ヒドロキシル基上での（上記）ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が含まれる。複数の異なる５’キャップ構造を用いることにより、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの、核酸分子の５’キャップを生成することができる。本明細書において、キャップアナログは、合成キャップアナログ、化学的キャップ、化学的キャップアナログ、または構造的もしくは機能性キャップアナログとも称され、キャップ機能を保持しているが、その化学構造において天然の（すなわち、内因性、野生型もしくは生理学的）５’キャップとは異なる。キャップアナログを、本発明のポリヌクレオチドに化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成し、及び／または本発明のポリヌクレオチドに結合することができる。
【０２７２】
例えば、抗逆方向キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−トリホスファート基により結合された２つのグアニンを含み得、その際、一方のグアニンには、Ｎ７メチル基と、３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリフォスファート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ）、等価的に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと称され得る）とが含有されている。他方の修飾されていないグアニンの３’−Ｏ原子は、キャップ付きポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに結合されるようになる。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアニンにより、キャップ付きポリヌクレオチドの末端部分が提供される。
【０２７３】
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に、２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスファート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０２７４】
一部の実施形態では、上記キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的例として、ジヌクレオチドキャップアナログは、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，５１９，１１０号において記載されているジヌクレオチドキャップアナログなど、ボラノホスファート基またはホスホロセレノアート基を用いて異なるホスファート位置で修飾され得る。
【０２７５】
別の実施形態では、上記キャップは、キャップアナログであり、当技術分野で公知の、及び／または本明細書に記載のキャップアナログのＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップアナログの非限定的例には、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが含まれる（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＫｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載されている種々のキャップアナログ及びキャップアナログの合成方法を参照されたい）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４−クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
【０２７６】
キャップアナログは、ポリヌクレオチドまたはその領域に対する同時的キャッピングを可能にするが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応では、転写産物のうちの最高２０％が、キャップされていないまま維持され得る。このことと、さらには、内因性細胞転写機構を介して産生された核酸の内因性５’キャップ構造とのキャップアナログの構造上の相違とが、翻訳適格性の低下及び細胞安定性の低下をももたらし得る。
【０２７７】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）をまた、製造後（ＩＶＴかそれとも化学合成かを問わず）に酵素を使用してキャッピングして、高真正性５’キャップ構造を生成することができる。本明細書で使用する場合、「高真正性」という語句は、内因性または野生型特徴を、構造的にもしくは機能的に、密接に反映するかあるいは模倣する特徴を指す。すなわち、「高真正性」特徴とは、先行技術の合成の特徴またはアナログなどと比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理学的な細胞機能及び／または構造に優れているか、あるいは１つまたは複数の点で対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的特徴よりも優れているものの代表例である。本発明の高真正性５’キャップ構造の非限定的例は特に、当技術分野で公知の合成５’キャップ構造と比較して（または野性型、天然型または生理学的な５’キャップ構造と比較して）、キャップ結合タンパク質の結合が強化され、半減期が延び、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が減少し、及び／または５’デキャッピングが減少しているものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、例えば当技術分野で公知の他の５’キャップアナログ構造に対して、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準５’−５’−トリホスファート結合を生成し得、その際、キャップグアニンはＮ７メチル化を含み、ｍＲＮＡＮの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含む。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で公知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、翻訳適格性の向上、細胞安定性の増強、及び細胞性炎症性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、限定されないが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれる。
【０２７８】
非限定的例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップするほど、効率が高くなり得る。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でキャップアナログがキメラポリヌクレオチドに結合される場合、対照的に約８０％である。
【０２７９】
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップアナログを含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含み得る。有用なグアニンアナログには、限定されないが、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが含まれる。
【０２８０】
ポリＡテイル
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はさらに、ポリＡテイルを含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリＡテイル上に末端基を組み込むことができる。他の実施形態では、ポリＡテイルはｄｅｓ−３’ヒドロキシルテイルを含む。
【０２８１】
安定性を上昇させるために、ＲＮＡプロセシング中に、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）をｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加することができる。転写直後に、転写物の３’末端が切断して、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次いで、ポリＡポリメラーゼにより、アデニンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加される。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスにより、例えば、およそ８０〜およそ２５０残基長（およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含む）のポリＡテイルが付加される。一実施形態では、上記ポリＡテイルは、１００ヌクレオチド長である。
【０２８２】
コンストラクトが核からエクスポートされた後に、ポリＡテイルを付加することもできる。
【０２８３】
本発明によれば、安定化のために、ポリＡテイル上に末端基を組み込むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ−３’ヒドロキシルテイルを含み得る。これらはまた、内容全体が参照により本明細書に援用されるＪｕｎｊｉｅ  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１−１５０７，Ａｕｇｕｓｔ  ２３，２００５により教示されているような構造的残基または２’−Ｏ−メチル修飾を含み得る。
【０２８４】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡテイル構造を有する転写物がコードされるように、設計することができる。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化はまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上でも検出されてきた。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製が完了したかまたは阻害された後に有毒なヒストンが蓄積される可能性を未然に防止するうえで、重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、３’ポリＡテイルが欠如している点で判別され、代わりに、その機能は、安定なステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）により担われ、後者はポリアデニル化されたｍＲＮＡのＰＡＢＰと同じ機能を遂行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＯＰ，オンライン公開２９  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）、この内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２８５】
独自のポリＡテイルの長さは、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点をもたらす。一般的に、存在する場合、ポリＡテイルの長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、上記ポリＡテイルは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド長またはそれより長い）。
【０２８６】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）を含む。
【０２８７】
一部の実施形態では、上記ポリＡテイルは、ポリヌクレオチド全体の長さ、またはポリヌクレオチドの特定領域の長さに関連して設計されている。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。
【０２８８】
これに関連して、上記ポリＡテイルは、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％長くてもよい。また、ポリＡテイルを、そのポリＡテイルの属するポリヌクレオチドの一部として設計してもよい。これに関連して、ポリＡテイルは、コンストラクトの全長の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％もしくはそれを超える長さであってもよいし、あるいはコンストラクト領域またはコンストラクトの全長からポリＡテイルを減じた長さであってもよい。さらに、ポリＡ結合タンパク質用に操作された結合部位、及びポリヌクレオチドの共役は、発現を増強し得る。
【０２８９】
加えて、ポリＡテイルの３’末端における修飾ヌクレオチドを使用して、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して３’末端経由で、複数の異なるポリヌクレオチドを一体的に結合することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を行うことができ、タンパク質の産生を、トランスフェクション後１２時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目及び７日目にＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。
【０２９０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計されている。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチな配列により形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇ−カルテットはポリＡテイルの末端内に組み込まれている。結果として得られたポリヌクレオチドを、安定性、タンパク質の産生、及び様々な時点における半減期を含む他のパラメータに関してアッセイする。ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチド単独のポリＡテイルを用いて確認されたｍＲＮＡの少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質の産生をもたらすことが発見されている。
【０２９１】
開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域、または開始コドン領域と同様に機能する領域を有し得る。
【０２９２】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧ以外のコドン上で開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドン、例えば、限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ上で開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８及びＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照、これらはそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２９３】
非限定的例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧ上で開始される。別の非限定的例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始される。さらに別の非限定的例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始される。
【０２９４】
翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチド、例えば、限定されないが、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を及ぼすことが公知である。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたい、これは、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることにより、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更することができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドン付近でマスキング剤を使用してコドンをマスキングまたは隠蔽することにより、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンの翻訳開始確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的例には、アンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が含まれる（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏによるマスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣに関する記述（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１）を参照されたい、これは、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２９６】
別の実施形態では、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることにより、翻訳が代替の開始コドン上で開始される可能性を高めることができる。一部の実施形態では、マスキング剤を使用して第１の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスキングして、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンより下流の開始コドンまたは代替開始コドン上で翻訳が開始される可能性を高めることができる。
【０２９７】
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の内部に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体は、マスキング剤と同様にポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造を制御する一助となり得る。非限定的例として、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全補完体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチドまたは第２１ヌクレオチドの後に位置し得る。
【０２９８】
別の実施形態では、その開始コドン以外のコドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去することができる。その除去された開始コドンの後に続くコドン上で、下流の開始コドン上で、または代替の開始コドン上で、ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができる。非限定的例では、下流の開始コドン上でまたは代替の開始コドン上で、翻訳を開始させるために、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧをポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去する。翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するか、あるいはその制御を試みるために、開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列はさらに、下流の開始コドン及び／または代替の開始コドンのために少なくとも１つのマスキング剤を含むことができる。
【０２９９】
停止コドン領域
本発明はまた、停止コドン領域、及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの停止コドンを含み得る。ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧからコドンを選択することができ、ＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから停止コドンを選択することができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は停止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は停止コドンＵＧＡ、及び１つの追加的な停止コドンを含む。さらなる一実施形態では、追加の停止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続的停止コドン、４つの停止コドン、またはそれより多くの停止コドンを含む。
【０３００】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端で：上で示した５’キャップ、５’ＵＴＲ（例えば、上で示した配列）、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（例えば、本明細書に開示のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする配列最適化核酸配列）、少なくとも１つの停止コドン、３’ＵＴＲ（例えば、上で示した配列）、及び上で示したポリＡテイルを含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、上記５’ＵＴＲは、上記ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、上記３’ＵＴＲは、上記ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０３０２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ヒトＡＢＣＢ４（配列番号１）、野生型ヒトＡＢＣＢ１１（配列番号７）、または野生型ヒトＡＴＰ８Ｂ１（配列番号９）のタンパク質配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３０３】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上で示した５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、（２）５’ＵＴＲ、（３）配列番号２、５〜８、１０〜１３、１５〜１８、または２０〜２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列ＯＲＦ、（３）停止コドン、（４）３’ＵＴＲ、及び（５）上で示したポリＡテイル、例えば、約１００残基のポリＡテイルを含む。
【０３０４】
例示的なＡＢＣＢ４ヌクレオチドコンストラクトを下に記載する：
配列番号１４は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１５のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１７は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１８のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２１のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２３は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２４のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２７のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２９は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号３０のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号３２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号３３のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号３５は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号３６のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号３８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号３９のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４１は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号４２のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４４は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号４５のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４７は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号４８のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号５１のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５３は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号５４のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号５７のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５９は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号６０のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号６３のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６５は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号６６のＡＢＣＢ４ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
【０３０５】
例示的なＡＢＣＢ１１ヌクレオチドコンストラクトを下に記載する：
配列番号１２６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２４９のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１２８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５０のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１３０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５１のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１３２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５２のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１３４は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５３のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１３６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５４のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１３８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５５のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１４０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５６のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号１４２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号２５７のＡＢＣＢ１１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
【０３０６】
例示的なＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドコンストラクトを下に記載する：
配列番号２５８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９３のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２５９は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９４のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９５のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６１は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９６のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９７のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６３は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９８のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６４は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号９９のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６５は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１００のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０１のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６７は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０２のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０３のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２６９は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０４のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０５のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７１は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０６のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０７のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７３は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０８のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７４は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１０９のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７５は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１０のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７６は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１１のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７７は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１２のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７８は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１３のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２７９は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１４のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２８０は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１５のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２８１は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１６のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２８２は、５’末端から３’末端で：配列番号１２の５’ＵＴＲ、配列番号１１７のＡＴＰ８Ｂ１ヌクレオチドＯＲＦ、及び配列番号１３の３’ＵＴＲからなる。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、上に列挙したコンストラクトにおいて、その中のすべてのウラシルが、Ｎ１−メチルシュードウラシルにより置換されている。
【０３０８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上で示した５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、（２）配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、２５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、及び２５８〜２８２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに（３）上で示したポリＡテイル、例えば、約１００残基のポリＡテイルを含む。ある特定の実施形態では、配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、２５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、及び２５８〜２８２を有するコンストラクトにおいて、その中のすべてのウラシルが、Ｎ１−メチルシュードウラシルにより置換されている。
【０３０９】
ポリヌクレオチドの作製方法
本開示はまた、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはその相補体を作製するための方法を提供する。
【０３１０】
一部の態様では、本明細書に開示され、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を使用して構築することができる。他の態様では、本明細書に開示され、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成により構築することができる。
【０３１１】
他の態様では、本明細書に開示され、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用して作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当技術分野で公知の他の任意の方法のうちの１つまたは複数の組合せにより作製される。
【０３１２】
天然に生じるヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に生じるヌクレオシドを全体的または部分的に置換することができ、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。次いで、得られたポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを、タンパク質を産生する能力及び／または治療成績を生じる能力について試験することができる。
【０３１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／酵素合成
本明細書に開示の本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）系を使用して転写することができる。この系は典型的に、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮアーゼ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、限定されないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む、本明細書に記載のものから選択することができる。上記ポリメラーゼは、限定されないが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異型ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示のポリヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼから選択することができる。全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたい。
【０３１４】
任意数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失させることにより修飾することができる。非限定的例として、上記ＲＮＡポリメラーゼを、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’−修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込む能力の増加を示すように修飾することができる（国際公開ＷＯ２００８０７８１８０及び米国特許第８，１０１，３８５号を参照されたい、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３１５】
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸及び／または核酸配列を最適化することにより、及び／または当技術分野で公知の他の方法を使用することにより得ることができる。非限定的例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４９９−５０３（２０１１）、その全体が参照により本明細書に援用される）により述べられている連続指向性進化システムを使用して進化させることができ、その際、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、少なくとも１つの変異、例えば、限定されないが、スレオニン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、ＡＴＰ８Ｂ１２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆと置換された９３位のリシンをコードすることができる。別の非限定的例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、それらの全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１２００２４号及び同第２００７０１１７１１２号に記載のとおりの少なくとも変異をコードすることができる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、限定されないが、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントを含むこともできる。
【０３１６】
一態様では、上記ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼにより認識されるように設計することができる。そうすることで、上記ポリヌクレオチドを、野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列変化の部位または領域を含有するように修飾することができる。
【０３１７】
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法により実施することができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在公知のＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造解析に基づいて異なるファミリーに分けることができる。Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）またはＡポリメラーゼファミリーは、最もよく研究されたこれらのファミリーの１つである。別の大きなファミリーは、すべての真核生物複製ＤＮＡポリメラーゼ及びファージＴ４及びＲＢ６９由来のポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ  α）またはＢポリメラーゼファミリーである。それらは、同様の触媒機序を用いるが、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質特異性、基質アナログ組み込み効率、プライマー伸長の程度及び速度、ＤＮＡ合成様式、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感受性において異なる。
【０３１８】
ＤＮＡポリメラーゼは、それらが必要とする最適な反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型及びプライマー濃度に基づいても選択される。場合により、複数のＤＮＡポリメラーゼの組合せが、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、ｐＨを上昇させ、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増加させ、クローニングされたインサート及びヒトゲノムＤＮＡの長い標的を効果的に増幅する３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する（全体が参照により本明細書に援用されるＣｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：５６９５−５６９９（１９９４））。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼは、生化学的及び生物物理学的研究のためのＲＮＡを調製するために広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属中の国際公開ＷＯ２０１４／０２８４２９に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０３１９】
一態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用することができるＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼである（全体が参照により本明細書に援用されるＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたい）。Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは近年、Ｚｈｕらにより海洋シアノファージＳｙｎ５から特徴付けられ、その際、彼らは、プロモーター配列も同定した（内容全体が参照により本明細書に援用されるＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３を参照されたい）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度及び塩分濃度にわたってＲＮＡ合成を触媒することを見出した。加えて、プロモーターでの開始ヌクレオチドに対する要件は、ＲＮＡ合成に有望なＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを作製するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼでは、あまり厳しくないことが判明した。
【０３２０】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを、本明細書に記載のポリヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的例として、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを、精密な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成において使用することができる。
【０３２１】
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターを、ポリヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３）により記載されているとおりの配列番号２８３）であってよい。
【０３２２】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載及び／または当技術分野で公知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用することができる（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３に記載のシュードＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込みを参照されたい）。
【０３２３】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３）により記載された修正及び改良された精製手順を使用して精製されているＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成することができる。
【０３２４】
遺伝子工学での様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究及び他の研究ニーズでは、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。そのような方法を、本発明のポリヌクレオチドの製造に適用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）を、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域の製造に利用することができる。リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリングも広く用いられている。
【０３２５】
化学合成
目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成するための標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを合成することができる。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲートすることができる。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは典型的には、相補的なアセンブリのために、５’または３’オーバーハングを含有する。
【０３２６】
本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当技術分野で公知の化学合成方法及び可能なヌクレオ塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、すべて全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１４０９３９２４、ＷＯ２０１３０５２５２３、ＷＯ２０１３０３９８５７、ＷＯ２０１２１３５８０５、ＷＯ２０１３１５１６７１、米国特許出願公開第２０１３０１１５２７２号、または米国特許第８９９９３８０号もしくは同第８７１０２００号を参照されたい。
【０３２７】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１コードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、限定されないが、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、及び品質管理を含むことができる。クリーンアップは、当技術分野で公知の方法、例えば、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により実施することができる。
【０３２８】
「精製された」という用語は、「精製されたポリヌクレオチド」などのポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの汚染物質から分離されるものを指す。本明細書で使用する場合、「汚染物質」は、他を不適当、不純、または粗悪にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、自然にみられるものとは異なる形態もしくは環境、または、それを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境で存在する。
【０３２９】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、望ましくない免疫応答、例えば、サイトカイン活性の低下を減少させる、または除去することができる不純物を除去する。
【０３３０】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に精製される。
【０３３１】
一部の実施形態では、（カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製された本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法で精製された本開示の同じポリヌクレオチドで得られた発現レベルと比較して、コードされたＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質の発現の増加を示す。
【０３３２】
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））精製ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の点変異の１つまたは複数を含むＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０３３３】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞でのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１質発現レベルを、それらの細胞に導入された場合に、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％上昇させる。
【０３３４】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の機能性ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベルを、それらの細胞に導入された場合に、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質の機能性発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％上昇させる。
【０３３５】
一部の実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞内の検出可能なＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１活性を、それらの細胞に導入された場合に、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入する前または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドを細胞に導入した後の細胞内の機能性ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の活性レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％上昇させる。
【０３３６】
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９６％の純度、少なくとも約９７％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度、または約１００％の純度である。品質保証及び／または品質管理チェックは、限定されないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣなどの方法を使用して実施することができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法で配列決定することができる。
【０３３７】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする発現ポリヌクレオチドの定量化
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに分解産物及び代謝産物を、当技術分野で公知の方法に従って定量化することができる。
【０３３８】
一部の実施形態では、エキソソーム内で、または１つまたは複数の体液から生じる場合に、本発明のポリヌクレオチドを定量化することができる。本明細書で使用する場合、「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹腔液、心嚢液、リンパ液、消化粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、膣液、粘膜分泌液、糞便水、膵液、副鼻腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液、及び臍帯血を含む。別法では、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収することができる。
【０３３９】
エキソソーム定量化法では、多くとも２ｍＬの試料を対象から得、エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せで単離される。この分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与されるコンストラクトの発現レベル、存在、不存在、切断、または変更であり得る。レベルを、１つまたは複数の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーのアッセイと関連させることが有利である。
【０３４０】
アッセイは、コンストラクト特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実施することができるが、エキソソームは、免疫組織化学的方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して単離することができる。エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せでも単離することができる。
【０３４１】
これらの方法は、研究者に、残存するかまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムで監視する能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが構造的または化学修飾のために内因性形態と異なるので可能である。
【０３４２】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、限定されないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化することができる。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが適切なサイズであることが可能かどうかを決定するために、分析することができ、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認することができる。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ系精製方法、例えば、限定されないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ならびにキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法で確認することができる。
【０３４３】
医薬組成物及び製剤
本発明は、上記ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
【０３４４】
一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有することができる。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチド、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有することができる。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列と有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列と有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列と有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列と有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、及びｍｉＲ−２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【０３４５】
医薬組成物または製剤は、１つまたは複数のさらなる活性物質、例えば、治療的及び／または予防的活性物質を任意選択で含むことができる。本発明の医薬組成物または製剤は、滅菌及び／または発熱性物質不含であることができる。医薬品の製剤及び／または製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は一般に、本明細書に記載のとおりに送達されるポリヌクレオチドを指す。
【０３４６】
本明細書に記載の製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で公知または以後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を、添加剤及び／または１つまたは複数の他の補助成分と合わせるステップ、次いで、必要及び／または望ましい場合、分割し、成形し、及び／または製品を所望の単回投与単位もしくは複数回投与単位にパッケージングするステップを含む。
【０３４７】
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、及び／または販売することができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量、及び／または、そのような投薬量の好都合な分数、例えば、そのような投薬量の２分の１または３分の１と等しい。
【０３４８】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される添加剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、サイズ、及び／または状態に応じて、さらに、組成物が投与されるべき経路に応じて、変動し得る。
【０３４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び製剤は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含有することができる。非限定的例として、上記組成物または製剤は、本発明の１、２、３、４、または５ポリヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または製剤は、複数タイプのポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、線状及び環状形態のポリヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態では、上記組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含むことができる。さらに別の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、及び環状ポリヌクレオチドを含むことができる。
【０３５０】
本明細書で提供する医薬組成物及び製剤の説明は主に、ヒトへの投与に適する医薬組成物及び製剤に関するが、そのような組成物が一般に、他の任意の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類への投与に適することは、当業者に理解されるであろう。
【０３５１】
本発明は、１つまたは複数の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数のポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（１）安定性を増加させるために、（２）細胞トランスフェクションを増加させるために、（３）（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）生体内分布を変更するために（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に標的化するために）、（５）ｉｎ  ｖｉｖｏで、コードされたタンパク質の翻訳を増加させるために、及び／または（６）ｉｎ  ｖｉｖｏで、コードされたタンパク質の放出プロフィールを変更するために、１つまたは複数の添加剤を使用して製剤化することができる。一部の実施形態では、上記医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、あるいはそれらの任意の組合せを含む送達剤をさらに含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。
【０３５２】
薬学的に許容される添加剤には、限定されないが、本明細書で使用する場合、所望の特定の剤形に適するような、任意及びすべての溶媒、分散媒、もしくは他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結保護剤、及び／または増量剤が含まれる。医薬組成物を製剤化するための様々な添加剤及び組成物を調製するための技術は、当技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３５３】
例示的な希釈剤には、限定されないが、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、及び／またはそれらの組合せが含まれる。
【０３５４】
例示的な造粒剤及び／または分散剤には、限定されないが、デンプン、プレゼラチン化デンプンもしくは微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、アガー、ポリ（ビニルピロリドン）、（プロビドン）、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組合せが含まれる。
【０３５５】
例示的な界面活性剤及び／または乳化剤には、限定されないが、天然の乳化剤（例えば、アカシア、アガー、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドル（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミタート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレアート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８など、及び／またはそれらの組合せが含まれる。
【０３５６】
例示的な結合剤には、限定されないが、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにそれらの組合せが含まれる。
【０３５７】
酸化は、ｍＲＮＡ、特に、液体ｍＲＮＡ製剤の潜在的な分解経路である。酸化を防止するために、酸化防止剤を配合物に添加することができる。例示的な酸化防止剤には、限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ｍ−クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、プロピルガラート、アスコルビン酸ナトリウムなど、及びそれらの組合せが含まれる。
【０３５８】
例示的なキレート剤には、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、及びこれらの組合せが含まれる。
【０３５９】
例示的な抗菌剤または抗真菌剤には、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、及びそれらの組合せが含まれる。
【０３６０】
例示的な防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）など、及びそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を向上させるためにｐＨ５〜ｐＨ８に維持される。ｐＨを制御する例示的な緩衝剤には、限定されないが、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（もしくはヒスチジン−ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、及び／またはそれらの組合せが含まれ得る。
【０３６１】
例示的な潤沢剤には、限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、及びそれらの組合せが含まれる。本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結中に、本明細書に記載のポリヌクレオチドを安定化させる凍結防止剤を含有することができる。例示的な凍結防止剤には、限定されないが、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、及びそれらの組合せが含まれる。
【０３６２】
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、「薬学的に洗練された」固形物を得るために、増量剤を凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に含有することができ、凍結乾燥ポリヌクレオチドを長期間（例えば、３６ヶ月）保存中に安定化させることができる。本発明の例示的な増量剤には、限定されないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組合せが含まれ得る。
【０３６３】
一部の実施形態では、上記医薬組成物または製剤はさらに、送達剤を含む。本開示の送達剤には、限定ではないが、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、マイクロベシクル、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組合せが含まれ得る。
【０３６４】
送達剤
脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療薬及び／または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを哺乳類細胞または器官に送達するための脂質ナノ粒子組成物において有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、または全くない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療薬または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数の増加を示す。
【０３６５】
ある特定の実施形態では、本出願は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び送達剤を含む医薬組成物を提供する。
【０３６６】
ある特定の実施形態では、本出願は、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに送達剤を含む医薬組成物を提供する。
【０３６７】
脂質ナノ粒子製剤
一部の実施形態では、本発明の核酸（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１  ｍＲＮＡ）を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化する。脂質ナノ粒子は典型的には、イオン性カチオン脂質、非カチオン脂質、ステロール及びＰＥＧ脂質成分を目的の核酸カーゴと共に含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般に知られているとおりの構成成分、組成、及び方法を使用して生成することができる。例えば、すべて全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい。
【０３６８】
本開示の核酸（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１  ｍＲＮＡ）を典型的には、脂質ナノ粒子中で製剤化する。一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性カチオン脂質、少なくとも１つの非カチオン脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
【０３６９】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質２０〜６０％のモル比を含む。例えば、上記脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質２０〜５０％、２０〜４０％、２０〜３０％、３０〜６０％、３０〜５０％、３０〜４０％、４０〜６０％、４０〜５０％、または５０〜６０％のモル比を含んでよい。一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のモル比を含む。
【０３７０】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質５〜２５％のモル比を含む。例えば、上記脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質５〜２０％、５〜１５％、５〜１０％、１０〜２５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２５％、１５〜２０％、または２０〜２５％のモル比を含んでよい。一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、非カチオン脂質５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のモル比を含む。
【０３７１】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、ステロール２５〜５５％のモル比を含む。例えば、上記脂質ナノ粒子は、ステロール２５〜５０％、２５〜４５％、２５〜４０％、２５〜３５％、２５〜３０％、３０〜５５％、３０〜５０％、３０〜４５％、３０〜４０％、３０〜３５％、３５〜５５％、３５〜５０％、３５〜４５％、３５〜４０％、４０〜５５％、４０〜５０％、４０〜４５％、４５〜５５％、４５〜５０％、または５０〜５５％のモル比を含んでよい。一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、ステロール２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％のモル比を含む。
【０３７２】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％のモル比を含む。例えば、上記脂質ナノ粒子は、０．５〜１０％、０．５〜５％、１〜１５％、１〜１０％、１〜５％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％、５〜１５％、５〜１０％、または１０〜１５％のモル比を含んでよい。一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ修飾脂質０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のモル比を含む。
【０３７３】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、イオン性カチオン脂質２０〜６０％、非カチオン脂質５〜２５％、ステロール２５〜５５％、及びＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％のモル比を含む。
【０３７４】
イオン性脂質
一部の態様では、本開示のイオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2022500443.tif 000016
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体の１種または複数であり得る
［式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜３０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒に、複素環または炭素環を形成しており、
Ｒ４は、水素、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは独立に、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立に、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１〜１３アルキルまたはＣ２〜１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ３〜６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３〜１５アルキル及びＣ３〜１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｘは独立に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、かつｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、ここで、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５である場合に、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１または２である場合に、Ｑは、５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではない］。
【０３７５】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物：
【化２】
2022500443.tif 000017
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれる。
［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、かつＲ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及びＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。］
【０３７６】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＢ）の化合物：
【化３】
2022500443.tif 000018
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれる。［式中、すべての変項は、本明細書で定義するとおりである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、かつＲ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及びＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。］
【０３７７】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物：
【化４】
2022500443.tif 000019
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれる［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、かつＱは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、かつＲ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、及びＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される］。
【０３７８】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）の化合物、
【化５】
2022500443.tif 000020
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である［式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである］。
【０３７９】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物、
【化６】
2022500443.tif 000021
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である［式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである］。
【０３８０】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物：
【化７】
2022500443.tif 000022
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である［式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである］。
【０３８１】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）の化合物：
【化８】
2022500443.tif 000023
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である［式中、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ”は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ２〜６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５〜１４アルキル及びＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される］。
【０３８２】
さらなる一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物：
【化９】
2022500443.tif 000024
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である。［式中、ｎは、２、３、または４であり、かつｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２からＲ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２からＲ３のそれぞれは独立に、Ｃ５〜１４アルキル及びＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択され得る。］
【０３８３】
さらなる一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）の化合物：
【化１０】
2022500443.tif 000025
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である。［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｍ及びＭ’は独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、かつＲ２及びＲ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル及びＣ２〜１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、Ｍ”は、Ｃ１〜６アルキル（例えば、Ｃ１〜４アルキル）またはＣ２〜６アルケニル（例えば、Ｃ２〜４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は独立に、Ｃ５〜１４アルキル及びＣ５〜１４アルケニルからなる群から選択される。］
【０３８４】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、米国特許出願第６２／２２０，０９１号、同第６２／２５２，３１６号、同第６２／２５３，４３３号、同第６２／２６６，４６０号、同第６２／３３３，５５７号、同第６２／３８２，７４０号、同第６２／３９３，９４０号、同第６２／４７１，９３７号、同第６２／４７１，９４９号、同第６２／４７５，１４０号、及び同第６２／４７５，１６６号、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２に記載の化合物のうちの１種または複数である。
【０３８５】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、米国特許出願第６２／４７５，１６６号に記載の化合物１〜２８０から選択される。
【０３８６】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化１１】
2022500443.tif 000026
（化合物ＩＩ）、またはその塩である。
【０３８７】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化１２】
2022500443.tif 000027
（化合物ＩＩＩ）、またはその塩である。
【０３８８】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化１３】
2022500443.tif 000028
（化合物ＩＶ）、またはその塩である。
【０３８９】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化１４】
2022500443.tif 000029
（化合物Ｖ）、またはその塩である。
【０３９０】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化され得る。したがって、脂質は、生理学的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を有し得る。そのような脂質は、カチオンまたはイオン性（アミノ）脂質と称され得る。脂質はまた、双性イオン性であり得る、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
【０３９１】
一部の態様では、本開示のイオン性脂質は、式（ＩＩＩ）の化合物、
【化１５】
2022500443.tif 000030
またはその塩もしくは異性体のうちの１種または複数であり得る
［式中、
Ｗは、
【化１６】
2022500443.tif 000031
であり、
環Ａは、
【化１７】
2022500443.tif 000032
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立に、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２であるか、存在せず、その際、ＺがＣＨ２である場合には点線（１）及び（２）はそれぞれ、単結合を表し、かつＺが存在しない場合には、点線（１）及び（２）は両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立に、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
Ｒｘ１及びＲｘ２はそれぞれ独立に、ＨまたはＣ１〜３アルキルであり、
各Ｍは独立に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｍ＊は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ独立に、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群から選択され、
各Ｒ６は独立に、Ｈ及びＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立に、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立に、Ｃ３〜６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立に、Ｃ１〜１２アルキル及びＣ２〜１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立に、Ｃ１〜３アルキル及びＣ３〜６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立に、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立に、Ｃ３〜１２アルキル、Ｃ３〜１２アルケニル及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択され、かつ
ｎは、１〜６の整数であり、
環Ａが、
【化１８】
2022500443.tif 000033
である場合、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではなく、及び／または
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である］。
【０３９２】
一部の実施形態では、上記化合物は、式（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ８）のいずれかの化合物である：
【化１９】
2022500443.tif 000034
【０３９３】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、米国特許出願第６２／２７１，１４６号、同第６２／３３８，４７４号、同第６２／４１３，３４５号、及び同第６２／５１９，８２６号、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００に記載の化合物のうちの１つまたは複数である。
【０３９４】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、米国特許出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１〜１５６から選択される。
【０３９５】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、米国特許出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１〜１６、４２〜６６、６８〜７６、及び７８〜１５６から選択される。
【０３９６】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化２０】
2022500443.tif 000035
（化合物ＶＩ）、またはその塩である。
【０３９７】
一部の実施形態では、上記イオン性脂質は、
【化２１】
2022500443.tif 000036
（化合物ＶＩＩ）、またはその塩である。
【０３９８】
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化され得る。したがって、脂質は、生理学的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を有し得る。そのような脂質は、カチオンまたはイオン性（アミノ）脂質と称され得る。脂質はまた、双性イオン性であり得る、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
【０３９９】
リン脂質
本明細書に開示の脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つまたは複数の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
【０４００】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
【０４０１】
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負荷電リン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にし、例えば、１つまたは複数の要素の標的組織への送達を可能にすることができる。
【０４０２】
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種も企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合で置換されたアルケニル基）で官能化または架橋することができる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に、銅触媒付加環化を受ける可能性がある。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進する際に、またはナノ粒子組成物を、有用な構成成分、例えば、標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）にコンジュゲートさせる際に有用である可能性がある。
【０４０３】
リン脂質には、限定されないが、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ  ｇｌｙｃｅｒｏｌｓ）及びホスファチジン酸が含まれる。リン脂質には、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質も含まれる。
【０４０４】
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びその混合物を含む。
【０４０５】
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物：
【化２２】
2022500443.tif 000037
またはその塩である
［式中、
各Ｒ１は独立に、任意選択で置換されたアルキルであるか、または任意選択で、２個のＲ１は、間の原子と一緒になって結合して、任意選択で置換された単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された単環式ヘテロシクリルを形成しているか、または任意選択で、３個のＲ１は、間の原子と一緒になって結合して、任意選択で置換された二環式カルボシクリルまたは任意選択で置換された二環式ヘテロシクリルを形成しており、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
【化２３】
2022500443.tif 000038
であり、
Ｌ２の各例は独立に、結合または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキレンであり、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意選択で置換されており、
Ｒ２の各例は独立に、任意選択で置換されたＣ１〜３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜３０アルケニル、または任意選択で置換されたＣ１〜３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は独立に、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換されており、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であり、
ただし、上記化合物は、式：
【化２４】
2022500443.tif 000039
の化合物ではないことを条件とし、
ここで、Ｒ２の各例は独立に、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである］。
【０４０６】
一部の実施形態では、上記リン脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載のリン脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
【０４０７】
リン脂質ヘッド修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾リン脂質ヘッド（例えば、修飾コリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヘッドを有するリン脂質は、修飾４級アミンを有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。例えば、式（ＩＶ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、以下の式のうちの１つの化合物：
【化２５】
2022500443.tif 000040
またはその塩である
［式中、
各ｔは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、かつ
各ｖは独立に、１、２、または３である］。
【０４０８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ａ）の化合物：
【化２６】
2022500443.tif 000041
またはその塩である。
【０４０９】
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ｂ）の化合物：
【化２７】
2022500443.tif 000042
またはその塩である。
【０４１０】
リン脂質テイル修飾
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾テイルを含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾テイルを有するＤＳＰＣまたはそのアナログである。本明細書に記載される場合、「修飾テイル」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つまたは複数のメチレンが環式もしくはヘテロ原子基により置き換えられている脂肪族鎖、またはそれらの任意の組合せを有するテイルであってよい。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ａ）の化合物、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも一例は、任意選択で置換されたＣ１〜３０アルキルであるＲ２の各例であり、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は独立に、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換される。
【０４１１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ｃ）の化合物：
【化２８】
2022500443.tif 000043
またはその塩である
［式中、
各ｘは独立に、０及び３０を含む０〜３０の整数であり、かつ
Ｇの各例は独立に、任意選択で置換されているカルボシクリレン、任意選択で置換されているヘテロシクリレン、任意選択で置換されているアリーレン、任意選択で置換されているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択される］。各可能性は、別個の本発明の実施形態を表す。
【０４１２】
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、式中、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。したがって、ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、式中、ｎが１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である式（ＩＶ）の化合物である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、次の式のうちの１つの化合物：
【化２９】
2022500443.tif 000044
またはその塩である。
【０４１３】
代替脂質
ある特定の実施形態では、本発明で有用または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）修飾ホスホコリン部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、リン脂質が有用である。
【０４１４】
ある特定の実施形態では、代替の脂質を、本開示のリン脂質の代わりに使用する。
【０４１５】
ある特定の実施形態では、本発明の代替の脂質は、オレイン酸である。
【０４１６】
ある特定の実施形態では、上記代替の脂質は、以下のうちの１つである：
【化３０】
2022500443.tif 000045
【０４１７】
構造脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含むことができる。本明細書で使用する場合、「構造脂質」という用語は、ステロール、さらに、ステロール部分を含有する脂質を指す。
【０４１８】
脂質ナノ粒子中での構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を弱めるのに役立ち得る。構造脂質は、限定されないが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファトコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択することができる。一部の実施形態では、上記構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、上記構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、上記構造脂質は、コレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、上記構造脂質は、アルファトコフェロールである。
【０４１９】
一部の実施形態では、上記構造脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載の構造脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
【０４２０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含むことができる。
【０４２１】
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧセラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが含まれる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０４２２】
一部の実施形態では、上記ＰＥＧ脂質には、限定されないが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステニルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が含まれる。
【０４２３】
一実施形態では、上記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０４２４】
一部の実施形態では、上記ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、上記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの非限定的例には、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが含まれる。
【０４２５】
ＰＥＧ脂質は、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８１５８６０１号及び国際公開ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２に記載のものなど、当技術分野で公知である。
【０４２６】
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質構成成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、全体が参照により本明細書に援用される「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」との標題の２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されているように合成されてもよい。
【０４２７】
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子、例えば、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。別法では、そのような種は、ＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾されている脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であってよい。
【０４２８】
一部の実施形態では、上記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは、以下の構造を有する：
【化３１】
2022500443.tif 000046
【０４２９】
一実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２０９９７５５に記載のＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれもが、ヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、上記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義するとおり、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシＰＥＧ化脂質」とも称される）は、１つまたは複数のヒドロキシル（−ＯＨ）基を脂質に有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、上記ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、１つまたは複数のヒドロキシル基をＰＥＧ鎖に含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０４３０】
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書では、式（Ｖ）の化合物：
【化３２】
2022500443.tif 000047
またはその塩を提供する
［式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含む１〜１００の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されたＣ１〜１０アルキレンであり、その際、任意選択で置換されたＣ１〜１０アルキレンのうちの少なくとも１つのメチレンは独立に、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換されており、
Ｄは、クリックケミストリーにより得られる部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
【化３３】
2022500443.tif 000048
であり、
Ｌ２の各例は独立に、結合または任意選択で置換されたＣ１〜６アルキレンであり、その際、任意選択で置換されたＣ１〜６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意選択で置換されており、
Ｒ２の各例は独立に、任意選択で置換されたＣ１〜３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１〜３０アルケニル、または任意選択で置換されたＣ１〜３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は独立に、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換されており、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、かつ
ｐは、１または２である］。
【０４３１】
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、−ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）である。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ−ＯＨ）の化合物
【化３４】
2022500443.tif 000049
またはその塩である。
【０４３２】
ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、ペグ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明で有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書では、式（ＶＩ）の化合物：
【化３５】
2022500443.tif 000050
またはその塩を提供する
［式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されているアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含む１〜１００の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されているＣ１０〜４０アルキル、任意選択で置換されているＣ１０〜４０アルケニル、または任意選択で置換されている１０〜４０アルキニルであり、かつ任意選択で、Ｒ５の１個または複数のメチレン基は、任意選択で置換されているカルボシクリレン、任意選択で置換されているヘテロシクリレン、任意選択で置換されているアリーレン、任意選択で置換されているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲN）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（Ｏ）、ＮＲNＣ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、−ＮＲNＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲN）、Ｃ（＝ＮＲN）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（＝ＮＲN）、ＮＲNＣ（＝ＮＲN）Ｎ（ＲN）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲN）、ＮＲNＣ（Ｓ）、ＮＲNＣ（Ｓ）Ｎ（ＲN）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、Ｎ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲN）、またはＮ（ＲN）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換されており、
ＲＮの各例は独立に、水素、任意選択で置換されているアルキル、または窒素保護基である］。
【０４３３】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−ＯＨ）の化合物：
【化３６】
2022500443.tif 000051
またはその塩である。一部の実施形態では、ｒは、４５である。
【０４３４】
さらに他の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、
【化３７】
2022500443.tif 000052
またはその塩である。
【０４３５】
一実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、
【化３８】
2022500443.tif 000053
（化合物Ｉ）
である。
【０４３６】
一部の態様では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
【０４３７】
一部の実施形態では、上記ＰＥＧ脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載のＰＥＧ脂質のうちの１つまたは複数であってよい。
【０４３８】
一部の実施形態では、本発明のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びその混合物を含む。一部の実施形態では、上記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（ＰＥＧ−ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ−ＤＳＧ及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧである。
【０４３９】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４０】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４１】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４２】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４３】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのイオン性カチオン脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４４】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
【化３９】
2022500443.tif 000054
のイオン性カチオン脂質及び式ＶＩを含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４５】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
【化４０】
2022500443.tif 000055
のイオン性カチオン脂質及びオレイン酸を含む代替脂質を含む。
【０４４６】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
【化４１】
2022500443.tif 000056
のイオン性カチオン脂質、オレイン酸を含む代替脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４７】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
【化４２】
2022500443.tif 000057
のイオン性カチオン脂質、ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４８】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、
【化４３】
2022500443.tif 000058
のイオン性カチオン脂質、ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
【０４４９】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２：１〜約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０４５０】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０４５１】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
【０４５２】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１〜約１００：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
【０４５３】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２０：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
【０４５４】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１のイオン性カチオン脂質構成成分とＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比を含む。
【０４５５】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均直径を有する。
【０４５６】
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約７０ｎｍ〜約１２０ｎｍの平均直径を有する。
【０４５７】
本明細書で使用する場合、「アルキル」、「アルキル基」、または「アルキレン」という用語は、任意選択で置換されている、１個または複数の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の炭素原子）を含む直鎖状または分岐状の飽和炭化水素を意味する。「Ｃ１〜１４アルキル」という表記は、１〜１４個の炭素原子を含む、任意選択で置換されている直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。別段に指定されていない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
【０４５８】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」、「アルケニル基」、または「アルケニレン」という用語は、任意選択で置換されている、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。「Ｃ２〜１４アルケニル」という表記は、任意選択で置換されている、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４またはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含むことができる。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つまたは複数の二重結合を含むことができる。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。別段に指定されていない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
【０４５９】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」、「アルキニル基」、または「アルキニレン」という用語は、任意選択で置換されている、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。「Ｃ２〜１４アルキニル」という表記は、任意選択で置換されている、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルキニル基は、１、２、３、４またはそれ以上の炭素−炭素三重結合を含むことができる。例えば、Ｃ１８アルキニルは、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を含むことができる。別段に指定されていない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、非置換及び置換アルキニル基の両方を指す。
【０４６０】
本明細書で使用する場合、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つまたは複数の環を含む、任意選択で置換されている単環または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０員環であってよい。「Ｃ３〜６炭素環」という表記は、３〜６個の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つまたは複数の炭素−炭素二重または三重結合を含んでよく、非芳香族または芳香族（例えば、シクロアルキルまたはアリール基）であってよい。炭素環の例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２−ジヒドロナフチル基が含まれる。「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、非芳香族炭素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでも、または含まなくてもよい。別段に指定されていない限り、本明細書に記載の炭素環は、非置換及び置換の両方の炭素環基、すなわち、任意選択で置換されている炭素環を指す。
【０４６１】
本明細書で使用する場合、「複素環」または「複素環基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１個のヘテロ原子を含む１つまたは複数の環を含む任意選択で置換されている単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子であってよい。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４員環であってよい。複素環は、１つまたは複数の二重または三重結合を含んでよく、非芳香族または芳香族（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリール基）であってよい。複素環の例には、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が含まれる。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、非芳香族複素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでも、または含まなくてもよい。別段に指定されていない限り、本明細書に記載の複素環は、非置換及び置換の両方の複素環基、すなわち、任意選択で置換されている複素環を指す。
【０４６２】
本明細書で使用する場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、または「ヘテロアルキニル」という用語はそれぞれ、１個または複数（例えば、１、２、３、または４個）のヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄、窒素、ホウ素、ケイ素、リン）をさらに含み、その１個または複数のヘテロ原子が、親炭素鎖内の隣接する炭素原子の間に挿入されており、及び／または１個または複数のヘテロ原子が、炭素原子と親分子との間、すなわち、結合点の間に挿入されている、本明細書で定義するとおりのアルキル、アルケニル、アルキニル基を指す。別段に指定されていない限り、本明細書に記載のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルは、非置換及び置換の両方のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル、すなわち、任意選択で置換されているヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルを指す。
【０４６３】
本明細書で使用する場合、「生分解性基」は、哺乳類実体の脂質のより速い代謝を促進することができる基である。生分解性基は、限定されないが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され得る。本明細書で使用する場合、「アリール基」は、１つまたは複数の芳香環を含む任意選択で置換されている炭素環式基である。アリール基の例には、フェニル及びナフチル基が含まれる。本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール基」は、１つまたは複数の芳香環を含む任意選択で置換されている複素環基である。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが含まれる。アリール基及びヘテロアリール基の両方は、任意選択で置換されていてよい。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意選択で置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な基から選択することができる。本明細書の式では、Ｍ及びＭ’は独立に、上記の生分解性基のリストから選択することができる。別段に指定されていない限り、本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール基は、非置換及び置換の両方の基、すなわち、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基を指す。
【０４６４】
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、別段に指定されていない限り、任意選択で置換されていてよい。任意選択の置換基は、限定されないが、ハロゲン原子（例えば、クロリド、ブロミド、フルオリド、またはヨージド基）、カルボン酸（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、ＯＨ）、エステル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ  ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｒ、別法では、Ｃ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、ブロミド、フルオリド、クロリド、及びヨージドから選択されるハロゲン化物である））、カルボナート（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、ＯＲ）、アセタール（例えば、Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””（式中、各ＯＲは、同じまたは異なる可能性があるアルコキシ基であり、Ｒ””は、アルキル基またはアルケニル基である）、ホスファート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、ＳＨ）、スルホキシド（例えば、Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルファート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、Ｓ（Ｏ）２）、アミド（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、またはＮ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、Ｎ３）、ニトロ（例えば、ＮＯ２）、シアノ（例えば、ＣＮ）、イソシアノ（例えば、ＮＣ）、アシロキシ（例えば、ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、ＮＲ２、ＮＲＨ、またはＮＨ２）、カルバモイル（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、またはＮ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択することができる。上述のいずれかでは、Ｒは、本明細書で定義するとおりのアルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義するとおりの１、２、３、４、５、または６個の置換基でさらに置換されていてよい。例えば、Ｃ１〜６アルキル基は、本明細書に記載のとおりの１、２、３、４、５、または６の置換基でさらに置換されていてよい。
【０４６５】
窒素を含有する本開示の化合物を、酸化剤（例えば、３−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）及び／または過酸化水素）で処理してＮ−オキシドに変換すると、本開示の他の化合物を得ることができる。したがって、示されている、及び請求する窒素含有化合物はすべて、原子価及び構造が許す場合、示されている化合物及びそのＮ−オキシド誘導体（Ｎ→ＯまたはＮ＋−Ｏ―と示され得る）の両方を含むと判断される。さらに、他の例では、本開示の化合物中の窒素を、Ｎ−ヒドロキシまたはＮ−アルコキシ化合物に変換することができる。例えば、Ｎ−ヒドロキシ化合物は、親アミンをｍＣＰＢＡなどの酸化剤により酸化させることにより調製することができる。示されている、及び請求する窒素含有化合物はすべて、原子価及び構造が許す場合、示されている化合物ならびにそのＮ−ヒドロキシ（すなわち、Ｎ−ＯＨ）及びＮ−アルコキシ（すなわち、Ｎ−ＯＲ、ここで、Ｒは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、３〜１４員炭素環または３〜１４員複素環）誘導体の両方をカバーすると判断される。
【０４６６】
他の脂質組成物構成成分
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、１つまたは複数の構成成分を含むことができる。例えば、上記脂質組成物は、１つまたは複数の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成成分を含むことができる。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載の分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及びアナログ）を含むことができる。
【０４６７】
ポリマーは、本明細書に開示の医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）に含まれてよく、及び／またはそれを封入もしくは部分的に封入するために使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であることができる。ポリマーは、限定されないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリーラートから選択することができる。
【０４６８】
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１〜約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
【０４６９】
一部の実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比率は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。一部の実施形態では、脂質組成物対治療薬をコードするポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。一部の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、複数のポリペプチドを含有することができる。例えば、本明細書に開示の医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有することができる。
【０４７０】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、もしくは７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比、またはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１，約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１、もしくは約１５：１〜約７０：１で含むことができる。
【０４７１】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、または２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含むことができる。
【０４７２】
ナノ粒子組成物
一部の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示は、（ｉ）本明細書に記載の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び（ｉｉ）ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。本開示は（ｉ）本明細書に記載の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに（ｉｉ）ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物では、本明細書に開示の脂質組成物は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（複数可）を封入することができる。
【０４７３】
ナノ粒子組成物は通常、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０４７４】
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つまたは複数の脂質二重層を含むベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画により隔てられた２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋することができる。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含むことができる。
【０４７５】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び構造脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン性脂質、約５〜２５％の構造脂質、約２５〜５５％のステロール、及び約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。
【０４７６】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。
【０４７７】
本明細書で一般に定義する場合、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に生じる脂質または合成脂質であってよい。脂質の部類の例には、限定されないが、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、及びポリケチド、ならびにプレノール脂質が含まれる。一部の場合では、一部の脂質の両親媒性特性により、それらが水性媒体中でリポソーム、ベシクル、または膜を形成するようになる。
【０４７８】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「イオン性脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン性脂質は、正に荷電または負に荷電してもよい。イオン性脂質は、正に荷電してもよく、この場合、それは、「カチオン脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含んでもよく、イオン性アミノ脂質と称され得る。本明細書で使用する場合、「荷電部分」は、形式電荷、例えば、一価（＋１または−１）、二価（＋２または−２）、三価（＋３または−３）などを有する化学的部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電）またはカチオン性（すなわち、正に荷電）であってよい。正荷電部分の例には、アミン基（例えば、１級アミン、２級アミン、及び／または３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が含まれる。ある特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例には、カルボキシラート基、スルホナート基、スルファート基、ホスホナート基、ホスファート基、ヒドロキシル基などが含まれる。一部の場合では、荷電部分の電荷は、環境条件に伴い変動してもよく、例えば、ｐＨの変化は、部分の電荷を変化させ、及び／または部分が荷電または非荷電になるようし得る。一般に、分子の電荷密度は、要望どおりに選択され得る。
【０４７９】
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分的負電荷」または「部分的正電荷」を指さないことを理解すべきである。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語には、当技術分野で通常の意味が与えられる。電子密度が結合の１つの原子に向かって引っ張られて、原子上に部分的な負電荷を生成するように、官能基が分極化する結合を含む場合、「部分負電荷」が生じ得る。当業者らは一般に、このように分極することができる結合を認識するであろう。
【０４８０】
一部の実施形態では、イオン性脂質は、当技術分野で「イオン性カチオン脂質」と呼ばれる場合があるイオン性アミノ脂質である。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して結合される正荷電親水性ヘッド及び疎水性テイルを有し得る。
【０４８１】
これらに加えて、イオン性脂質は、環式アミン基を含む脂質であってもよい。
【０４８２】
一実施形態では、イオン性脂質は、限定されないが、内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３０８６３５４及びＷＯ２０１３１１６１２６に記載のイオン性脂質から選択され得る。
【０４８３】
また別の実施形態では、イオン性脂質は、限定されないが、それぞれ、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得る。
【０４８４】
一実施形態では、脂質は、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２１７０８８９に記載のものなどの切断可能な脂質であってよい。一実施形態では、脂質は、当技術分野で公知の方法により、及び／または内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３０８６３５４に記載のとおりに合成され得る。
【０４８５】
ナノ粒子組成物は、様々な方法により特徴付けることができる。例えば、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査型電子顕微鏡）を、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べるために使用することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を、ゼータ電位を測定するために使用することができる。動的光散乱法は、粒径を決定するために利用することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの装置を、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位を測定するために使用することもできる。
【０４８６】
ナノ粒子のサイズは、限定されないが、炎症などの生物学的反応を打ち消すのを助けることができ、または、ポリヌクレオチドの生物学的効果を増加させることができる。本明細書で使用する場合、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０４８７】
一実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中で製剤化する。
【０４８８】
一実施形態では、上記ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、上記ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ以下）である。
【０４８９】
ナノ粒子組成物は、比較的均質であり得る。多分散指数を、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すために使用することができる。小さな（例えば、０．３未満の）多分散指数は一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０４９０】
ナノ粒子組成物のゼータ電位を、組成物の界面動電電位を示すために使用することができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表すことができる。より高い電荷種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用をする可能性があるので、正または負の比較的少ない電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０４９１】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ，及び約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであり得る。
【０４９２】
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供された初期量に対する、調製後のナノ粒子組成物により封入されるか、または別の方法でこれと会合するポリヌクレオチドの量を表す。本明細書で使用する場合、「封入」は、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指し得る。
【０４９３】
封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、１つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を分解させた前後で、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を比較することにより、測定することができる。
【０４９４】
蛍光を、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定するために使用することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物では、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
【０４９５】
本明細書に開示の医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び／または用途、またはナノ粒子組成物の他の特性、さらにはポリヌクレオチドの特性に依存し得る。
【０４９６】
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さまたは分子量として表される）、配列、及び他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量も変動し得る。
【０４９７】
本開示の脂質組成物及び脂質ナノ粒子組成物中に存在するポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考察に従って最適化することができる。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物では、Ｎ：Ｐ比は、有用なメトリックとして機能し得る。
【０４９８】
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比が発現及び忍容性の両方を制御するので、低いＮ：Ｐ比及び強い発現を有するナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に従って変動する。
【０４９９】
一般に、より低いＮ：Ｐ比が、好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、及びその量は、約２：１〜約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１〜６：１である。ある特定の一態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
【０５００】
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を生成する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示の医薬組成物のいずれかを使用すること、及び当技術分野で公知の脂質ナノ粒子の生成方法に従って脂質ナノ粒子を生成することを含む。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８−８０、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０−９５４、Ｎａｓｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５−１３、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１−３０２、及びそれらの中に引用されている参照文献を参照されたい。
【０５０１】
他の送達剤
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リオプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤がポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させ、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるので、タンパク質産生を目的とするポリヌクレオチドの有効性を向上させるために使用することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの安定性を上昇させるために使用することもできる。
【０５０２】
リポソームは、主に脂質二重層で構成することができ、かつ医薬製剤を投与するための送達ビヒクルとして使用することができる人工的に調製されたベシクルである。リポソームは、種々のサイズであり得る。マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性区画により隔てられた一連の同心二重層を含有し得る。スモールユニセルベシクル（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍ未満であり得、ラージユニラメラベシクル（ＬＵＶ）は、直径が５０〜５００ｎｍであり得る。リポソームの設計は、限定されないが、不健康な組織へのリポソームの付着を向上させるための、または限定されないが、エンドサイトーシスなどのイベントを活性化するためのオプソニンまたはリガンドを含むことができる。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるために、低いまたは高いｐＨ値を含有することができる。
【０５０３】
リポソームの形成は、封入された医薬製剤及びリポソーム成分、脂質ベシクルが分散されている媒体の性質、封入された物質の有効濃度及びその潜在的な毒性、ベシクルの適用及び／または送達中に関与する任意の追加のプロセス、意図されている用途のためのベシクルの最適なサイズ、多分散性及び貯蔵寿命、ならびにバッチ間の再現性及び安全かつ効率的なリポソーム製品の生成のスケールアップなどに依存し得る。
【０５０４】
非限定的例として、合成膜ベシクルなどのリポソームを、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号、同第２０１３０１７７６３７号、同第２０１３０１７７６３６号、同第２０１３０１７７６３５号、同第２０１３０１７７６３４号、同第２０１３０１７７６３３号、同第２０１３０１８３３７５号、同第２０１３０１８３３７３号、及び同第２０１３０１８３３７２号に記載の方法、装置、及びデバイスで調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポソームにより封入することができ、及び／または、それは、例えば、国際公開ＷＯ２０１２０３１０４６、ＷＯ２０１２０３１０４３、ＷＯ２０１２０３０９０１、ＷＯ２０１２００６３７８、及びＷＯ２０１３０８６５２６、ならびに、米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号、同第２０１３０１９５９６９号、及び同第２０１３０２０２６８４号に記載のとおりのリポソームにより封入することができる水性コアに含有され得る。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、カチオン性水中油型エマルションに製剤化することができ、その際、エマルション粒子は、分子をエマルション粒子にアンカーするポリヌクレオチドと相互作用することができる油性コア及びカチオン脂質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、親水性相を分散させる連続疎水性相を含む油中水型エマルション中で製剤化することができる。例示的なエマルションは、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２００６３８０及びＷＯ２０１０８７７９１に記載の方法により作製することができる。
【０５０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、脂質−ポリカチオン複合体中で製剤化することができる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号に記載のとおりの方法により達成することができる。非限定的例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定されないが、ポリリシン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニン、ならびに、国際公開ＷＯ２０１２０１３３２６または米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドを含むことができる。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３１２３５２３、ＷＯ２０１２１７０９３０、ＷＯ２０１１１２７２５５、及びＷＯ２００８１０３２７６、ならびに米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号に記載のとおりのものなどの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化することができる。
【０５０８】
脂質ナノ粒子製剤は典型的には、１つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、当技術分野で「イオン性カチオン脂質」と称される場合があるイオン性脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、及び粒子凝集を減少させることができる分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む他の構成成分をさらに含む。
【０５０９】
例示的なイオン性脂質には、限定されないが、本明細書に開示の化合物１〜３４２のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組合せが含まれる。他の例示的なイオン性脂質には、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ν，Ν−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニリコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１��−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘニコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３��（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、ならびにそれらの任意の組合せが含まれる。
【０５１０】
リン脂質には、限定されないが、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール及びホスファチジン酸が含まれる。リン脂質には、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質も含まれる。一部の実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ１６：０ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％の範囲である。
【０５１１】
構造脂質は、ステロール及びステロール部分を含有する脂質を含む。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファトコフェロール、及びそれらの混合物を含む。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％の範囲である。
【０５１２】
ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンを含む。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一部の実施形態では、脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％の範囲である。
【０５１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は追加的に、透過促進分子を含むことができる。非限定的な透過促進分子は、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号に記載されている。
【０５１４】
上記ＬＮＰ製剤は、ホスファートコンジュゲートをさらに含有することができる。ホスファートコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環時間を増加させ、及び／またはナノ粒子の標的送達を増加させることができる。ホスファートコンジュゲートは、例えば、国際公開ＷＯ２０１３０３３４３８または米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号に記載の方法により作製することができる。ＬＮＰ製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号、同第２０１３０１９６９４８号、及び同第２０１３００７２７０９号に記載のとおりのポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有することができる。参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。
【０５１５】
上記ＬＮＰ製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を増強するコンジュゲートを含むことができる。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食クリアランスを阻害することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチド（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  ３３９，９７１−９７５により記載される「自己」粒子）であり得る。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらにより示されたとおり、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介クリアランスを遅延させて、ナノ粒子の送達を増強させた。
【０５１６】
上記ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含むことができる。非限定的例として、炭水化物担体には、限定されないが、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルスクシナート、フィトグリコーゲンベータデキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータデキストリンが含まれ得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２１０９１２１）。
【０５１７】
上記ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を向上させるために、界面活性剤またはポリマーでコーティングすることができる。一部の実施形態では、上記ＬＮＰを、親水性のコーティング、例えば、限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／またはその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号に記載のとおりの中性表面電荷を有するコーティングでコーティングすることができる。
【０５１８】
上記ＬＮＰ製剤は、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開ＷＯ２０１３１１００２８に記載のとおり、脂質ナノ粒子が粘膜バリアに浸透することができるように、粒子の表面特性を変更するように操作することができる。
【０５１９】
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含むことができる。ポリマー材料には、限定されないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバマート、ポリ尿素、ポリカルボナート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアナート、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが含まれ得る。
【０５２０】
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰには、表面改質剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウム）、糖類または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属の木、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびにｒｈＤＮアーゼを含む種々のＤＮアーゼが含まれ得る。
【０５２１】
一部の実施形態では、粘液浸透性ＬＮＰは、粘膜浸透促進コーティングを含む低張性製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して低張性であり得る。低張性製剤の非限定的例は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３１１００２８において見出すことができる。
【０５２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、リポプレックス、例えば、限定されないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、英国）製のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製ＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または核酸のプロタミンベースの標的化及び非標的化送達として製剤化する（Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  ６８：９７８８−９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  ５０：７６−７８、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０  ２３：３３４−３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  ３２：４９８−５０７、Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  ３１：１８０−１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００７  ６、１０４：４０９５−４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  １９：１２５−１３２、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０５２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１０〜１０００ｎｍの平均直径を有する球状であり得る固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化される。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なＳＬＮは、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３１０５１０１に記載のとおりのものであり得る。
【０５２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、徐放及び／または標的送達のために製剤化することができる。本明細書で使用する場合、「徐放」は、治療成績を達成する、放出のある特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態では、上記ポリヌクレオチドを、徐放及び／または標的送達のための、本明細書に記載の、及び／または当技術分野で公知の送達剤に封入することができる。本明細書で使用する場合、「封入」という用語は、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。それが本発明の化合物の製剤化に関連する場合、封入は、実質的、完全、または部分的であり得る。「実質的に封入された」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０超、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９％超を、送達剤に閉じ込めるか、取り囲むか、または内包することができることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ未満を、送達剤に閉じ込めるか、取り囲むか、または内包することができることを意味する。
【０５２５】
有利なことに、封入は、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することにより決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９または９９％超が、送達剤に封入される。
【０５２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、本明細書では「治療的ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称される治療的ナノ粒子内に封入することができる。治療的ナノ粒子を、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１０００５７４０、ＷＯ２０１００３０７６３、ＷＯ２０１０００５７２１、ＷＯ２０１０００５７２３、及びＷＯ２０１２０５４９２３、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、同第２０１０００６８２８５号、同第２０１１０２７４７５９号、同第２０１０００６８２８６号、同第２０１２０２８８５４１号、同第２０１２０１４０７９０号、同第２０１３０１２３３５１号、及び同第２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号に記載の方法により製剤化することができる。
【０５２７】
一部の実施形態では、上記治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドを、持続放出のために製剤化することができる。本明細書で使用する場合、「持続放出」は、ある特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。期間には、限定されないが、時間、日、週、月、年が含まれ得る。非限定的例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子を、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１００７５０７２及び米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号、同第２０１１０２１７３７７号、同第２０１２０２０１８５９号、及び同第２０１３０１５０２９５に開示のとおりに製剤化することができる。
【０５２８】
一部の実施形態では、上記治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドを、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２００８１２１９４９、ＷＯ２０１０００５７２６、ＷＯ２０１０００５７２５、ＷＯ２０１１０８４５２１、及びＷＯ２０１１０８４５１８、ならびに米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号、同第２０１２０００４２９３号、及び同第２０１００１０４６５５号に記載のものなど、標的特異的であるように製剤化することができる。
【０５２９】
ＬＮＰを、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して調製することができる。例示的マイクロ流体ミキサーには、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ  ｂｅｉ  Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）により製造されるもの及び／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）を含むスリットインターデジタルマイクロミキサーが含まれ得る（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔ  ａｌ．，“Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔ  ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｃｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２８：３６３３−４０（２０１２）、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８−５１（２０１２）を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）。例示的なマイクロミキサーには、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍａｉｎｚ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のスリットインターデジタル微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ−Ｖ２）または標準スリットインターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）または衝突噴流（ＩＪＭＭ）が含まれる。一部の実施形態では、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作製する方法は、少なくとも２つの入力ストリームを混合することをさらに含み、その際、混合は、微細構造誘導カオス移流（ＭＩＣＡ）で生じる。この方法によれば、流体ストリームは、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れて、回転流を引き起こし、流体を互いに混ぜる。この方法は、流体混合のための面を含むこともでき、その際、面は、流体循環中に方向を変える。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国特許出願公開第２００４０２６２２２３号及び同第２０１２０２７６２０９号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示のものが含まれる。
【０５３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子中で製剤化することができる（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ．，“Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４４２：３６８−３７３（２００６）、及びＡｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：６４７−６５１（２００２）を参照されたい、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドを、マイクロミキサーチップ、例えば、限定されないが、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ、英国）製のものなどを使用して、脂質ナノ粒子中で製剤化することができる。マイクロミキサーチップを、分割及び再結合機構を用いる２つ以上の流体ストリームの迅速な混合のために使用することができる。
【０５３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、及び／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中で製剤化することができる。
【０５３２】
一部の実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有することができる。一実施形態では、上記脂質ナノ粒子は、１００ｎｍより大きい、１５０ｎｍより大きい、２００ｎｍより大きい、２５０ｎｍより大きい、３００ｎｍより大きい、３５０ｎｍより大きい、４００ｎｍより大きい、４５０ｎｍより大きい、５００ｎｍより大きい、５５０ｎｍより大きい、６００ｎｍより大きい、６５０ｎｍより大きい、７００ｎｍより大きい、７５０ｎｍより大きい、８００ｎｍより大きい、８５０ｎｍより大きい、９００ｎｍより大きい、９５０ｎｍより大きい、または１０００ｎｍより大きい直径を有することができる。
【０５３３】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、より小さなＬＮＰを使用して送達することができる。そのような粒子は、０．１μｍ未満から１００ｎｍまで、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含むことができる。
【０５３４】
本明細書に記載のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するために幾何学的に操作することができる。幾何学的に操作された粒子は、標的送達、例えば、限定されないが、経肺送達のために本明細書に記載のポリヌクレオチドを組み込む様々な形状、サイズ、及び／または表面電荷を有することができる（例えば、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３０８２１１１を参照されたい）。粒子を幾何学的に操作する他の物理的特徴には、限定されないが、細胞及び組織との相互作用を変更することができる開口、曲げられたアーム、非対称性、及び表面粗さ、電荷が含まれる。
【０５３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、限定されないが、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号に記載のものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、限定されないが、ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリシアノアクリラート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリラート、ポリアクリラート、ポリシアノアクリラート、またはそれらの組合せなどの２つ以上のポリマーを含むことができるポリマーマトリックスを含むことができる。
【０５３６】
リピドイド
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドと共に製剤化することができる。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を調製すると、局所及び／または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードされたタンパク質（複数可）の産生により判定されるとおり、ポリヌクレオチド（複数可）の有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、限定されないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含む種々の手段により投与することができる。
【０５３７】
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０  ２１：１４４８−１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２０１０  ２６７：９−２１、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  ２６：５６１−５６９、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  １０８：１２９９６−３００１を参照されたい、これらはすべて、その全体が本明細書に援用される）。
【０５３８】
限定されないが、ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ、９８Ｎ１２−５としても公知、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照されたい）、Ｃ１２−２００（誘導体及びバリアントを含む）、ならびにＭＤ１を含む種々のリピドイドを有する製剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性について試験することができる。リピドイド「９８Ｎ１２−５」は、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  １７：８７２−８７９により開示されている。リピドイド「Ｃ１２−２００」は、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  １０７：１８６４−１８６９及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０  ６６９−６７０により開示されている。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５３９】
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイド中で製剤化することができる。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により調製することができる。
【０５４０】
上記リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、３または４以上の構成成分を含む粒子を含むことができる。リピドイド及びリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開ＷＯ２０１５０５１２１４（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０５４１】
ヒアルロニダーゼ
一部の実施形態では、注射（例えば、筋肉内または皮下注射）用の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の構成成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより、組織透過性を増加させる（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０）。別法では、ヒアルロニダーゼを、筋肉内または皮下投与されたポリヌクレオチドに曝露された細胞の数を増加させるために使用することができる。
【０５４２】
ナノ粒子模倣物
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣物内に封入され、及び／またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生体または粒子、例えば、限定されないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、及び細胞を模倣することができる。非限定的例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入することができる（例えば、それぞれ、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２００６３７６ならびに米国特許出願公開第２０１３０１７１２４１号及び同第２０１３０１９５９６８号を参照されたい）。
【０５４３】
自己組織化ナノ粒子または自己組織化巨大分子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を、送達のための自己組織化ナノ粒子または両親媒性巨大分子（ＡＭ）中に含む。ＡＭは、アルキル化糖骨格がポリ（エチレングリコール）に共有結合した生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中において、ＡＭは、自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、ＡＭ及びＡＭを形成する方法は、米国特許出願公開第２０１３０２１７７５３号に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０５４４】
カチオン及びアニオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびにカチオンまたはアニオン、例えばＺｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、及びこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に援用される米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号に記載されているとおり、金属カチオンと複合体を形成したポリマー及びポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、カチオンナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオンナノ粒子またはカチオンナノ粒子を含む１つもしくは複数のデポ剤中でのポリヌクレオチドの送達は、長時間作用性デポ剤として作用すること及び／またはヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを向上させることができる。
【０５４５】
アミノ酸脂質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と共に製剤化された本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び１つまたは複数の親油性テイルを含む親油性化合物である。アミノ酸脂質、及びアミノ酸脂質を製造する方法の非限定的例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合し、それを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの放出は、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、及び同第５，５０５，９３１号に記載されているとおりの酸不安定なリンカーにより提供することができる。
【０５４６】
高分子電解質間複合体
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、高分子電解質間複合体中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが１つまたは複数のアニオン性分子と複合化されるときに形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間複合体ならびに高分子電解質間複合体を作製する方法の非限定的例は、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，５２４，３６８号に記載されている。
【０５４７】
結晶性ポリマー系
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶性ポリマー系中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０５４８】
ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコアシェルナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）ならびに天然及び／または合成ポリマーを含む。ポリマーには、限定されないが、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝鎖ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、多元ブロックコポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオンマルチブロックコポリマー、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはそれらの組合せが含まれる。
【０５４９】
例示的なポリマーには、ＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製の製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、ならびにｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）が含まれる。
【０５５０】
ポリマー製剤は、（例えば、筋肉内または皮下注射後の）ポリヌクレオチドの持続放出または遅延放出を可能にする。ポリヌクレオチドの変更された放出プロファイルは、例えば、長期間にわたって、コードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるために使用することもできる。持続放出製剤には、限定されないが、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、フィブリノゲンポリマーなどの外科用シーラント（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）が含まれ得る。
【０５５１】
非限定的例として、修飾ｍＲＮＡを、調整可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）を有するＰＬＧＡミクロスフェアを調製すること、ならびに封入プロセス中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡミクロスフェアに封入することにより、ＰＬＧＡミクロスフェア中で製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント用途で広範に使用される非生分解性生体適合性ポリマーである（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートである徐放性製品Ｏｃｕｓｅｒｔ、または持続放出プロゲステロン子宮内デバイスであるＰｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ、経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ、及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ、カテーテル）。ポロキサマーＦ−４０７  ＮＦは、５℃未満の温度での低粘度を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンの親水性非イオン性界面活性三元ブロックコポリマーであり、１５℃を超える温度で、固体ゲルを形成する。
【０５５２】
非限定的例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載のとおりのＰＬＬでグラフトされたＰＥＧのポリマー化合物と共に製剤化することができる。別の非限定的例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号ならびに米国特許第８，２３６，３３０号及び同第８，２４６，９６８号を参照されたい）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照されたい）などのブロックコポリマーと共に製剤化することができる。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、限定されないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−コ−エステル）またはそれらの組合せなどの少なくとも１つのアミン含有ポリマーと共に製剤化することができる。例示的なポリアミンポリマー及び送達剤としてのそれらの使用は、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されている。
【０５５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、及び同第８，４４４，９９２号、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号、同第２００４０１４２４７４号、同第２０１００００４３１５号、同第２０１２００９１４５号、及び同第２０１３０１９５９２０号、ならびに国際公開ＷＯ２００６０６３２４９及びＷＯ２０１３０８６３２２（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のとおりの生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはそれらの組合せ中で製剤化することができる。
【０５５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０１８４４５３号に記載のとおりの少なくとも１つのシクロデキストリンポリマー中で、またはこれらと共に製剤化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開ＷＯ２０１３１０６０７２、ＷＯ２０１３１０６０７３、及びＷＯ２０１３１０６０８６に記載のとおりの少なくとも１つの架橋カチオン結合ポリマー中で、またはこれらと共に製剤化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許出願公開第２０１３０２３１２８７号に記載されるような少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマー中で、またはこれらと共に製剤化することができる。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５５６】
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、及び／または限定ではないが、リン酸カルシウムなどの他の生分解性薬の組合せを使用して、ナノ粒子として製剤化することができる。構成成分を、コアシェル、ハイブリッド、及び／または層ごとの構造で組み合わせて、送達のためのナノ粒子の微調整を可能にすることができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．２００６  ５：７９１−７９６、Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８  ２９：１５２６−１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１１  ６３：７４８−７６１、Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  ３２：７７２１−７７３１、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７、その全体が参照により本明細書に援用される）。非限定的例として、ナノ粒子は、限定されないが、親水性−疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、及び／または親水性ポリマー（全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１２０２２５１２９）などの複数のポリマーを含むことができる。
【０５５７】
コアシェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコア及び種々のシェルを合成するハイスループットアプローチにさらに焦点を当てている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  １０８：１２９９６−１３００１、その全体が参照により本明細書に援用される）。ポリマーナノ粒子の複合化、送達、及び内在化を、ナノ粒子のコア構成成分及びシェル構成成分の両方における化学組成を変更することにより、正確に制御することができる。例えば、コアシェルナノ粒子を、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達することができる。
【０５５８】
一部の実施形態では、中間ＰＬＧＡ層を含む中空脂質コア及びＰＥＧを含有する外側の中性脂質層を、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドの送達に使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチドのコア及びコア中のポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含むことができる。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーのいずれかであってよく、当技術分野で公知である。ポリマーシェルを、コア中のポリヌクレオチドを保護するために使用することができる。
【０５５９】
本明細書に記載のポリヌクレオチドと共に使用されるコアシェルナノ粒子は、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開ＷＯ２０１３１２４８６７に記載されている。
【０５６０】
ペプチド及びタンパク質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチド（複数可）による細胞のトランスフェクションを増加させ、及び／または（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることにより）ポリヌクレオチド（複数可）の生体内分布を変更し、及び／またはコードされたタンパク質（複数可）の翻訳を増加させるペプチド及び／またはタンパク質（例えば、国際公開ＷＯ２０１２１１０６３６及びＷＯ２０１３１２３２９８）と共に製剤化されている、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドは、米国特許出願公開第２０１３０１２９７２６号、同第２０１３０１３７６４４号、及び同第２０１３０１６４２１９号に記載のものであり得る。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５６１】
コンジュゲート
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基に共有結合されている、または融合タンパク質を共に産生する２つのコード領域を含む（例えば、標的化基及び治療的タンパク質もしくはペプチドを持つ）、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。上記コンジュゲートは、ナノ粒子を組織もしくは生体内のニューロンに選択的に向けるか、または血液脳関門の横断に役立つペプチドであり得る。
【０５６２】
上記コンジュゲートは、天然に生じる物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質を含む。リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸が含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファらせんペプチドが含まれる。
【０５６３】
一部の実施形態では、上記コンジュゲートは、本明細書に開示のポリヌクレオチドのための担体として機能することができる。上記コンジュゲートは、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）でグラフトされ得るポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを含むことができる。例示的なコンジュゲート及びそれらの調製物は、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，５８６，５２４号及び米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号に記載されている。
【０５６４】
上記コンジュゲートは、腎臓細胞などのある特定の細胞型に結合する標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、抗体を含むこともできる。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、またはアプタマーであり得る。
【０５６５】
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、内皮細胞もしくは骨細胞などのある特定の細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基は、ホルモン及びホルモン受容体を含むこともできる。それらは、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、多価性フルクトース、またはアプタマーを含むこともできる。リガンドは、例えば、リポ多糖体、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベーターであり得る。
【０５６６】
標的化基は、ある特定の受容体を標的とし得る任意のリガンドであり得る。例には、限定されないが、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが含まれる。ある特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、非修飾であるか、または本明細書に開示の修飾の任意の組合せを有することができる。非限定的例として、標的化基は、例えば、米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のとおりの、血液中枢神経系関門を越える標的化送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートであり得る。
【０５６７】
一部の実施形態では、上記コンジュゲートは、より大きい治療有効性を提供するために長時間作用型連続放出系を含む相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートであり得る。相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３０１９５７９９号に記載のものであり得る。一部の実施形態では、上記コンジュゲートは、国際特許公開ＷＯ２０１２０４０５２４に記載のとおりのアプタマーコンジュゲートであり得る。一部の実施形態では、上記コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載のとおりのアミン含有ポリマーコンジュゲートであり得る。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドを、ＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にコンジュゲートすることができる。
【０５６８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、シグナル配列または標的化配列を含むこともできる細胞浸透性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートする。上記コンジュゲートを、安定性の増加及び／または細胞トランスフェクションの増加、及び／または生体内分布の変更（例えば、ある特定の組織または細胞型を標的とする）を有するように設計することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、送達を増強するために、薬剤にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、上記薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開番号ＷＯ２０１１０６２９６５に記載のとおりの標的化ブロックを有する標的化モノマーまたはポリマーであり得る。一部の実施形態では、上記薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５．３９３号及び同第７，３７４，７７８号に記載のとおり、ポリヌクレオチドと共有結合した輸送薬剤であり得る。一部の実施形態では、上記薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号及び同第８，００３，１２９号に記載のとおりの膜バリア輸送促進剤であり得る。参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０５６９】
加速血液クリアランス
本開示は、生物学的に活性な薬剤などの反復投与される活性薬剤に対するＡＢＣの作用を低下させるための化合物、組成物、及びその使用方法を提供する。容易に分かるように、投与された活性薬剤に対するＡＢＣの作用を全体的に低下させる、または排除することは、その半減期を、したがって有効性を効果的に増加させる。
【０５７０】
一部の実施形態では、ＡＢＣを低下させるという用語は、ＭＣ３  ＬＮＰなどの正の参照対照ＡＢＣ誘導ＬＮＰと比較してのＡＢＣの任意の低下を指す。ＡＢＣを誘導するＬＮＰは、所与の時間枠内の２回目またはその後の投与時に、活性薬の循環レベルの低下を引き起こす。したがって、ＡＢＣの低下は、標準ＬＮＰと比較して、薬剤の２回目またはその後の投与時に、循環薬のクリアランスがより少ないことを指す。上記低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％であってよい。一部の実施形態では、上記低下は、１０〜１００％、１０〜５０％、２０〜１００％、２０〜５０％、３０〜１００％、３０〜５０％、４０％〜１００％、４０〜８０％、５０〜９０％、または５０〜１００％である。別法では、ＡＢＣの低下は、２回目もしくはその後の投与後に循環薬剤が少なくとも検出可能なレベルであること、または、標準ＬＮＰの投与後の循環薬剤と比較して、循環薬剤が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍増加することとして特徴付けられ得る。一部の実施形態では、上記低下は、２〜１００倍、２〜５０倍、３〜１００倍、３〜５０倍、３〜２０倍、４〜１００倍、４〜５０倍、４〜４０倍、４〜３０倍、４〜２５倍、４〜２０倍、４〜１５倍、４〜１０倍、４〜５倍、５〜１００倍、５〜５０倍、５〜４０倍、５〜３０倍、５〜２５倍、５〜２０倍、５〜１５倍、５〜１０倍、６〜１００倍、６〜５０倍、６〜４０倍、６〜３０倍、６〜２５倍、６〜２０倍、６〜１５倍、６〜１０倍、８〜１００倍、８〜５０倍、８〜４０倍、８〜３０倍、８〜２５倍、８〜２０倍、８〜１５倍、８〜１０倍、１０〜１００倍、１０〜５０倍、１０〜４０倍、１０〜３０倍、１０〜２５倍、１０〜２０倍、１０〜１５倍、２０〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、２０〜３０倍、または２０〜２５倍である。
【０５７１】
本開示は、クリアランスの影響をあまり受けず、したがってｉｎ  ｖｉｖｏでより長い半減期を有する脂質含有化合物及び組成物を提供する。これは特に、組成物が長期投与を含む繰り返しのために意図されている場合、及びさらにより詳細には、そのような反復投与が数日または数週間以内に発生する場合である。重大なことに、これらの組成物は、感受性が低いか、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）の観察される現象を完全に回避する。ＡＢＣは、ある特定の外因的に投与された薬剤が、２回目及びその後の投与時に血液から急速にクリアランスされる現象である。この現象は、部分的には、限定されないが、脂質化剤、リポソーム、または他の脂質ベースの送達ビヒクル、及び脂質封入剤を含む様々な脂質含有組成物で観察されている。従来、ＡＢＣの基礎は、あまり理解されておらず、一部の場合には、体液性免疫応答に起因するとされ、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特に、臨床設定において、その影響を制限するための方策は依然として不明である。
【０５７２】
本開示は、ＡＢＣの影響を受けたとしても、あまり影響を受けない化合物及び組成物を提供する。一部の重要な態様では、そのような化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物または組成物は、２回目及びその後のｉｎ  ｖｉｖｏ投与時にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性により、これらの化合物及び組成物は、数日または１〜２週間を含む短期間内の反復使用を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでの反復使用に特に適している。この安定性及び／または半減期の増強は、部分的には、これらの組成物がＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞及び／または従来のＢ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板を活性化し得ないことに起因する。
【０５７３】
したがって、本開示は、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）の根底にある機序の解明を提供する。本開示及び本明細書に提示の本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも脂質及び脂質ナノ粒子に関する限り、少なくとも部分的に、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ、及び／または血小板を含む先天免疫応答に媒介されることが見出されている。Ｂ１ａ細胞は通常、循環ＩｇＭの形態で天然抗体の分泌を担っている。このＩｇＭは、ポリ反応性であり、それが様々な抗原に結合することができるが、各抗原に対する親和性は比較的低いことを意味する。
【０５７４】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与された脂質ナノ粒子などのいくつかの脂質化剤または脂質含有製剤が、ＡＢＣを誘発し、ＡＢＣの影響を受けることが見出されている。本発明によれば、ＬＮＰの初回用量の投与時に、先天免疫応答の生成に関与する１つまたは複数の細胞（本明細書ではセンサーと称される）は、そのような薬剤に結合し、活性化され、次いで、ＡＢＣ及び毒性を促進する免疫因子（本明細書ではエフェクターと称される）のカスケードを開始することが現在見出されている。例えば、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、（単独で、またはｐＤＣなどの他のセンサー及び／またはＩＬ６などのエフェクターの存在下で）活性化されるようになり、ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを分泌し得る。対象の既存の天然ＩｇＭは、ＬＮＰも認識して結合し、それにより、補体結合を誘発し得る。初回用量の投与後に、天然ＩｇＭの産生は、ＬＮＰの投与から１〜２時間以内に開始される。典型的には、約２〜３週間までに、天然ＩｇＭは、ＩｇＭの自然半減期に起因して、系からクリアランスされる。天然ＩｇＧは、ＬＮＰの投与から約９６時間後から産生される。薬剤は、ナイーブな環境で投与された場合、Ｂ１ａ細胞またはＢ１ｂ細胞または天然ＩｇＧの活性化後に産生された天然ＩｇＭにより比較的妨げられない生物学的効果を発揮することができる。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは、非特異的であり、したがって、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ  ＩｇＧとは異なる。
【０５７５】
出願人は機序に拘束されていないが、ＬＮＰが、次の機序により、ＡＢＣ及び／または毒性を誘発することが提案される。ＬＮＰが対象に投与された際、ＬＮＰは、血液を介して脾臓に急速に輸送されると考えられる。ＬＮＰは、血液及び／または脾臓中で免疫細胞に遭遇し得る。血液及び／または脾臓内のＬＮＰの存在に応答して、迅速な先天免疫応答が誘発される。本明細書では、ＬＮＰの投与の数時間以内に、いくつかの免疫センサーが、ＬＮＰの存在に反応していることを、本出願人は示している。これらのセンサーには、限定されないが、免疫応答の生成に関与する免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、ｐＤＣ、及び血小板が含まれる。センサーは、脾臓、例えば、脾臓の周辺領域及び／または血液に存在し得る。ＬＮＰは、１つまたは複数のセンサーと物理的に相互作用し得て、それらは他のセンサーとも相互作用し得る。そのような場合では、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーは、脾臓内に位置しており、容易に互いに相互作用することができる。別法では、センサーのうちの１つまたは複数は、血液中のＬＮＰと相互作用して、活性化されるようになり得る。次いで、活性化されたセンサーは、他のセンサーと直接的に、または（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ６）のようなメッセンジャーの刺激または産生を介して）間接的に相互作用し得る。
【０５７６】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、以下のセンサー：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板のそれぞれと直接的に相互作用して、これを活性化し得る。次いで、これらの細胞は、相互に直接的または間接的に相互作用して、最終的に、ＬＮＰの反復投与に伴うＡＢＣ及び／または毒性をもたらすエフェクターの産生を開始し得る。例えば、出願人は、ＬＮＰ投与がｐＤＣ活性化、血小板凝集及び活性化、ならびにＢ細胞活性化をもたらすことを示している。ＬＮＰに応答して、血小板もまた、凝集し、活性化され、Ｂ細胞と凝集する。ｐＤＣ細胞は活性化される。ＬＮＰは、比較的迅速に血小板及びＢ細胞の表面と相互作用することが見出されている。ＬＮＰに応答して、これらのセンサーの任意の１つまたは組合せの活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答を減衰させるのに有用である。免疫応答のこの減衰は、ＡＢＣ及び／または毒性の回避をもたらす。
【０５７７】
センサーは、一旦活性化されると、エフェクターを産生する。本明細書で使用されるエフェクターは、Ｂ細胞などの免疫細胞により産生される免疫分子である。エフェクターには、限定されないが、天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧなどの免疫グロブリンならびにＩＬ６などのサイトカインが含まれる。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後の２〜６時間以内に、天然ＩｇＭの産生を刺激する。天然ＩｇＧは、９６時間以内に検出することができる。ＩＬ６レベルは、数時間以内に増加する。天然ＩｇＭ及びＩｇＧは、体内を数日から数週間循環する。この時間中、循環エフェクターは、新たに投与されたＬＮＰと相互作用して、そのＬＮＰを身体によるクリアランスのために誘発することができる。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識して、これに結合し得る。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージにより、認識され得、マクロファージによる装飾ＬＮＰの取り込みを誘発する。次いで、マクロファージは、脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣについて観察されるタイミングと相関する過渡応答である。
【０５７８】
投与される用量が、２回目またはその後の投与される用量である場合で、かつそのような２回目またはその後の用量が、以前誘導された天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧが系からクリアランスされる前に（例えば、２〜３のウィンドウ期間の前に）投与される場合、そのような２回目またはその後の用量は、副補体経路の活性化を誘発し、それ自体急速にクリアランスされる循環天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧもしくはＦｃにより標的とされる。エフェクターが体内からクリアランスされるか、または数が減少した後に、ＬＮＰが投与される場合、ＡＢＣは観察されない。
【０５７９】
したがって、ＬＮＰと１つまたは複数のセンサーとの間の相互作用を阻害すること、（直接的または間接的な）ＬＮＰによる１つまたは複数のセンサーの活性化を阻害すること、１つまたは複数のエフェクターの産生を阻害すること、及び／または１つまたは複数のエフェクターの活性を阻害することは、本発明の態様によると有用である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰのセンサーとの相互作用を制限またはブロックするように設計される。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防止するために、変更されたＰＣ及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的または追加的に、ＬＮＰにより誘導される免疫応答を阻害する薬剤は、これらの効果のうちのいずれか１つまたは複数を達成するために使用されてもよい。
【０５８０】
さらに、従来のＢ細胞もＡＢＣに関与していると決定されている。具体的には、薬剤の初回投与時に、本明細書では、ＣＤ１９（＋）と称される従来のＢ細胞は、薬剤に結合し、これに対して反応する。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞とは異なるが、従来のＢ細胞は、（ＬＮＰの投与から約９６時間後から）ＩｇＭ応答を最初に起こすことができ、続いて、（ＬＮＰ投与後から約１４日後から）記憶応答に付随するＩｇＭ応答を起こすことができる。したがって、従来のＢ細胞は、投与された薬剤と反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にはＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭ及びＩｇＧは典型的には、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ  ＩｇＧである。
【０５８１】
一部の場合では、ＡＢＣ応答の大部分が、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ａ媒介免疫応答を介して媒介されると想定される。一部の例では、従来のＢ細胞及びＢ１ａ細胞の両方がそのような作用を媒介しながら、ＡＢＣ応答が、ＩｇＭ及びＩｇＧの両方により媒介されることがさらに想定される。さらに他の場合では、ＡＢＣ応答は、天然ＩｇＭ分子により媒介され、これらのいくつかは、活性化されたＢ１ａ細胞により産生され得る天然ＩｇＭに結合することができる。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つまたは複数の構成成分に結合し、例えば、ＬＮＰのリン脂質構成成分に結合（例えば、リン脂質のＰＣ部分に結合）し、及び／またはＬＮＰのＰＥＧ脂質構成成分に結合（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧに結合、特に、ＰＥＧ−ＤＭＧのＰＥＧ部分に結合）し得る。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンがリガンドであるＣＤ３６を発現するので、ＣＤ３６受容体が、Ｂ１ａ細胞の活性化、したがって天然ＩｇＭの産生を媒介し得ると想定される。さらに他の場合では、ＡＢＣ応答は主に、従来のＢ細胞により媒介される。
【０５８２】
本発明によれば、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（例えば、薬剤、送達ビヒクル、及び製剤）を使用することにより、ＡＢＣ現象を少なくとも部分的に低下させ、または排除することができることが見出されている。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ不活性化合物及び組成物と称され得る。さらに、本発明によれば、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用により、ＡＢＣ現象を、少なくとも部分的に低下させ、または排除することができることが見出されている。一部の実施形態では、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、ＣＤ１９不活化合物及び組成物と称され得る。したがって、本明細書で提供される一部の実施形態では、上記化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、それらは、従来のＢ細胞を活性化しない。一部の実施形態では、Ｂ１ａ細胞及び従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称され得る。
【０５８３】
これらの根底にある機序は、従来理解されておらず、この現象における、Ｂ１ａ及びＢ１ｂの細胞の役割及びそれらの従来のＢ細胞との相互作用も認識されていなかった。
【０５８４】
したがって、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物及び組成物を提供する。これらは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板及び／またはｐＤＣ、ならびに任意選択で、従来のＢ細胞も活性化し得ないことで、さらに特徴付けられ得る。これらの化合物（例えば、予防薬、治療薬、及び診断薬などの生物学的に活性な薬剤を含む薬剤、リポソーム、脂質ナノ粒子、及び他の脂質ベースの封入構造体を含む送達ビヒクルなど）ならびに組成物（例えば、製剤など）は、特に、反復投与、特に、短期間（例えば、１〜２週間以内）内で生じる反復投与を必要とする用途に望ましい。これは、例えば、薬剤が規則的で密接した間隔で対象に提供される核酸ベースの治療薬である場合である。本明細書で提供される知見は、同様に投与される、及び／またはＡＢＣを受けやすいこれら及び他の薬剤に適用され得る。
【０５８５】
ＡＢＣの影響を受けやすいことが公知であるために、脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物が特に興味深い。そのような脂質含有化合物粒子及び組成物は、生物学的に活性な薬剤としてまたはそのような薬剤の送達ビヒクルとして広範囲に使用されている。したがって、そのような薬剤の有効性を向上させる能力は、薬剤自体またはその送達ビヒクルに対するＡＢＣの作用を低下させるかどうかに関わらず、多種多様な活性薬剤にとって有益である。
【０５８６】
１つまたは複数の生物学的に活性な薬剤の反復用量投与と関連する急性期応答（ＡＲＰ）を刺激または増強しない組成物もまた本明細書で提供される。
【０５８７】
上記組成物は、一部の場合では、限定されないが、天然ＩｇＭを含むＩｇＭに結合しないことがある。
【０５８８】
上記組成物は、一部の場合では、限定されないが、Ｃ反応性タンパク質などの急性期タンパク質に結合しないことがある。
【０５８９】
上記組成物は、一部の場合では、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用する場合、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答は、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞により媒介される免疫応答である。そのような応答は、ＡＢＣ応答、急性期応答、天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧの誘導などを含み得る。
【０５９０】
上記組成物は、一部の場合では、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答を誘発しないことがある。本明細書で使用する場合、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答は、従来のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（−）Ｂ細胞により媒介される免疫応答である。そのような応答には、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、メモリーＢ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、タンパク質がＬＮＰ内に封入され得る抗タンパク質応答を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答などが含まれ得る。
【０５９１】
Ｂ１ａ細胞は、先天免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と称される循環ＩｇＭの供給源である。天然ＩｇＭ抗体は、いくつかの抗原に対して弱い親和性を有することで特徴付けられ、したがって、それらは、「ポリ特異的」または「ポリ反応性」と称され、複数の抗原に結合する能力を示す。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生することができない。加えて、それらは、メモリー細胞に発展せず、したがって、適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、それらは、活性化時に、ＩｇＭを分泌することができる。分泌されたＩｇＭは典型的には、約２〜３週間以内にクリアランスされ、この時点で、免疫系は、以前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原が、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示された場合、抗原は、急速にはクリアランスされない。しかしながら、重大なことに、抗原がその期間内（例えば、１週間以内を含む２週間以内、または数日以内）に提示される場合、抗原は急速にクリアランスされる。連続投与間のこの遅延により、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
【０５９２】
ヒトでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（−）、及びＣＤ５（＋）である。マウスでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。Ｂ１ａ細胞を他の従来のＢ細胞と区別するのは、典型的には、ＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ５を高レベルで発現し得、これに基づき、ＣＤ５を低いまたは検出不可能なレベルで発現するＢ−１ｂ細胞などの他のＢ−１細胞と区別し得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞は、脂肪酸トランスロカーゼとしても公知のＣＤ３６を発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む多くのリガンドに結合することができる。
【０５９３】
Ｂ１ｂ細胞は、先天免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を介してＴ細胞非依存の免疫を誘導することができる。ＣＤ２７は典型的に、抗原活性化に応答して、Ｂ１ｂ細胞上で上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は典型的に、脾臓及び腹膜腔などの特異的な身体の場所に存在し、血液中では非常に少ない。Ｂ１ｂ分泌型天然ＩｇＭは典型的に、約２〜３週間以内にクリアランスされ、その時点で、免疫系は、以前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原が、この期間後（例えば、最初の曝露の約３週間後）に提示された場合、抗原は、急速にはクリアランスされない。しかし、重大なことに、抗原がその期間内（例えば、１週間以内を含む２週間以内、または数日以内）に提示される場合、抗原は急速にクリアランスされる。連続投与間のこの遅延により、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適さなくなる。
【０５９４】
一部の実施形態では、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のどの構成成分がＢ細胞活性化を促進するのかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。少なくともＰＥＧ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）が、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞の他の細胞との相互作用及び／または活性化に寄与することが、本明細書では発見されている。ＰＥＧは、活性化をもたらし得るＢ１細胞及び血小板の間の凝集の促進において役割を果たし得る。ＰＣ（ＬＮＰ中のヘルパー脂質）は、おそらくＢ細胞表面上のＣＤ３６受容体との相互作用により、Ｂ１細胞の活性化にも関与する。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物、ＰＥＧレス、及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸またはそのアナログ）が設計及び試験されている。置換しなければ反復投与時にＡＢＣを促進するであろうＬＮＰ内のこれらの１つまたは複数の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生及び／またはＢ細胞活性化を低下させることによりＡＢＣを予防するのに有用であることを、出願人は確立している。したがって、本発明は、Ｂ細胞トリガーの包含を排除する設計の結果としてＡＢＣを低下させているＬＮＰを包含する。
【０５９５】
Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための別の方策は、ＬＮＰにより誘導される免疫応答を阻害する薬剤を使用することを含む。これらのタイプの薬剤は、以下でより詳細に検討される。一部の実施形態では、これらの薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞とＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣの間の相互作用を遮断する。例えば、薬剤は、抗体または相互作用を物理的に遮断する他の結合剤であってよい。この一例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が、一旦活性化されるか、または活性化される前に、シグナル伝達することを防止または無効化する化合物であってもよい。例えば、ＬＮＰまたは他の免疫細胞とのＢ細胞の相互作用からもたらされるＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケード中の１つまたは複数の構成成分を遮断することが可能である。他の実施形態では、薬剤は、活性化後に、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞により産生される１つまたは複数のエフェクターに作用し得る。これらのエフェクターは、例えば、天然ＩｇＭ及びサイトカインを含む。
【０５９６】
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化が遮断されるとき、ＬＮＰに応答するＢ細胞活性化を減少させることが実証されている。したがって、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するために、ｐＤＣ活性化を防止することが望ましいことがある。上で論述した方策と同様に、ｐＤＣ細胞活性化は、ｐＤＣとＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板の間の相互作用を阻害する薬剤により遮断され得る。別法では、ｐＤＣに作用して活性化される能力を抑制するか、またはエフェクターに作用する薬剤を、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
【０５９７】
血小板は、ＡＢＣ及び毒性においても重要な役割を果たし得る。ＬＮＰの初回用量が対象に投与された後に非常に迅速に、血小板は、ＬＮＰと会合し、凝集し、活性化される。一部の実施形態では、血小板凝集及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板凝集及び／または活性化を抑制するための１つの方策は、脂質ナノ粒子のどの構成成分が血小板凝集及び／または活性化を促進するかを決定し、それらの構成成分を中和することを含む。本明細書では、少なくともＰＥＧは、血小板凝集、活性化、及び／または他の細胞との相互作用に寄与することが発見されている。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧレスは、設計及び試験されている。別の方法は、置換しなければ反復投与時にＡＢＣを促進するであろうＬＮＰ内のこれらの１つまたは複数の構成成分の置換が、天然ＩｇＭの産生及び／または血小板凝集を減少させることによりＡＢＣを予防するのに有用であることを、出願人は確立している。したがって、本発明は、血小板トリガーの包含を排除する設計の結果としてＡＢＣを低下させているＬＮＰを包含する。別法では、活性化されると、血小板に作用して活性を抑制するか、またはエフェクターに作用する薬剤は、ＬＮＰと共に使用してＡＢＣを回避することができる。
【０５９８】
ＡＢＣ活動及び関連活動の測定
ＬＮＰを含む本明細書で提示される種々の化合物及び組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、多数のアッセイ、例えば、限定されないが、以下に記載のもののうちのいずれか、さらには、実施例の方法のサブセクションを含む実施例セクションに開示のアッセイのいずれかにより、特徴付ける、及び／または同定することができる。
【０５９９】
一部の実施形態では、上記方法は、ＡＢＣを促進する免疫応答を生ずることなくＬＮＰを投与することを含む。ＡＢＣを促進する免疫応答は、１つまたは複数のセンサー、例えば、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板、及び１つまたは複数のエフェクター、例えば、天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧ、またはＩＬ６などのサイトカインの活性化を含む。したがって、ＡＢＣを促進する免疫応答を生じることのないＬＮＰの投与は少なくとも、１つまたは複数のセンサーの有意な活性化及び１つまたは複数のエフェクターの有意な産生のないＬＮＰの投与を最低限含む。この文脈で使用される有意な、とは、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの２回目の投与の場合に予想される血液クリアランスのレベルに対して、２回目の用量の全部またはいくつかの血液クリアランスが加速されるという生理学的結果をもたらす量を指す。例えば、２回目の投与後に観察されるＡＢＣが、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの場合に予想されているものよりも低くなるように、免疫応答を減衰させるべきである。
【０６００】
Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供されるある特定の組成物は、Ｂ細胞、例えば、Ｂ１ａまたはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）及び／または従来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、様々な方法で決定することができ、これらのいくつかを以下に示す。Ｂ細胞集団は、分別Ｂ細胞集団または脾細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の未分画集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、一定の期間、選択すべきＬＮＰとインキュベートされ、次いで、さらなる分析のために採取され得る。別法では、上清は、採取及び分析され得る。
【０６０１】
活性化マーカー細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６などの後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの発現の増加として実証され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団として、またはＰＢＭＣ集団として提供され、ある特定の期間、選択すべきＬＮＰと共にインキュベートされ、次いで、ＣＤ１９などの標準的なＢ細胞マーカー及びＣＤ８６などの活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析される。適切な陰性対照は、培地を用いて同じ集団をインキュベートすること、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを含む。陰性対照と比較して、試験集団におけるＣＤ８６発現の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
【０６０２】
炎症誘発性サイトカイン放出
Ｂ細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイによっても評価され得る。例えば、活性化は、目的のＬＮＰと共に曝露されたときの、ＩＬ−６及び／またはＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生及び／または分泌を介して評価され得る。
【０６０３】
そのようなアッセイは、当技術分野で周知のルーチン的なサイトカイン分泌アッセイを使用して実施され得る。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
【０６０４】
Ｂ細胞によるＬＮＰ結合／会合及び／または取り込み
Ｂ細胞へのＬＮＰ会合または結合を使用して、目的のＬＮＰを評価し、さらに、そのようなＬＮＰを特徴付けることができる。会合／結合及び／または取り込み／内在化を、検出可能に標識された、例えば、蛍光標識されたＬＮＰを使用し、種々の期間のインキュベーション後のＢ細胞内またはＢ細胞上でのそのようなＬＮＰの場所を追跡して評価することができる。本明細書で提供する組成物が、認識または検出、及び任意選択で、循環ＩｇＭ及び／または急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））などの急性期応答メディエーターなどのＡＢＣの下流のメディエーターによる結合を回避し得ることを、本発明はさらに企図する。
【０６０５】
ＡＢＣを低下させるための使用方法
ＡＢＣを促進することなく対象に治療薬などの薬剤を封入し得るＬＮＰを送達するための方法も本明細書で提供する。
【０６０６】
一部の実施形態では、上記方法は、ＡＢＣを促進せず、例えば、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導せず、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない、本明細書に記載のＬＮＰのいずれかを投与することを含む。本明細書で使用する場合、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰは、実質的なＡＢＣをもたらす免疫応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの免疫応答を誘導するＬＮＰを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの天然ＩｇＭ分子を誘導するＬＮＰを指す。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを産生するＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実施的に低いレベルのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞応答を誘導するＬＮＰを指す。
【０６０７】
一部の実施形態では、産生を活性化しない及び誘導しないという用語は、参照値または状態に対する相対的な低下である。一部の実施形態では、参照値または条件は、ＭＣ３  ＬＮＰなどの標準的なＬＮＰによるＩｇＭなどの分子の産生の活性化または誘導の量である。一部の実施形態では、相対的な低下は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低下である。他の実施形態では、Ｂ細胞などの細胞を活性化しない及びＩｇＭなどのタンパク質の産生を誘導しないという用語は、検出不可能な量の活性細胞または特定のタンパク質を指し得る。
【０６０８】
血小板の効果及び毒性
本発明は、部分的に、ＬＮＰ投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明をさらに前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性または慢性かどうかに関わらず、播種性血管内凝固（ＤＩＣ、消耗性凝固障害とも称される）及び／または血管血栓症を含み得る。一部の場合では、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性期応答（ＡＰＲ）または補体活性化関連偽アレルギー（ｐｓｅｕｄｏａｌｌｅｒｇｙ）（ＣＡＲＰＡ）である。
【０６０９】
本明細書で使用する場合、凝固障害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの凝固（血液凝固）の増加を指す。本開示で報告された知見は、そのような凝固の増加と一致し、根本的な機序についての洞察を重要なこととして提供する。凝固は、多数の異なる因子及び細胞型を含むプロセスであり、従来、ＬＮＰ及び血小板の間の関係及び相互作用は、この点に関しては理解されていない。本開示は、そのような相互作用の証拠を提供し、血小板会合の減少、血小板凝集の減少、及び／または血小板凝集の減少を含む、血小板効果の低下を有するように改変された化合物及び組成物を提供する。そのような血小板効果を、好ましくは、下方調節する能力を含む調節する能力は、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低下させることができる。これは、順次、そのようなＬＮＰに関連する毒性を低下させ、それにより、より高い用量のＬＮＰ、重要なことに、それらのカーゴが、それを必要とする患者に投与されることが可能となる。
【０６１０】
ＣＡＲＰＡは、ナノ医薬品及び生物製剤により誘発され得る、過敏反応（ＨＳＲ）に現れる急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは典型的には、ＩｇＥを含まないが、病原体を除去する身体の能力を増強する先天免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。以下の経路、古典補体経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）のうちの１つまたは複数は、ＣＡＲＰＡに含まれ得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３−１７３（２０１４）。
【０６１１】
古典経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１複合体の活性化により誘発される。Ｃ１複合体の活性化は、Ｃ１ｑが抗原と複合化されたＩｇＭまたはＩｇＧに結合する場合、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合する場合に生じる。そのような結合は、順次Ｃ１ｓを切断するＣ１ｒの活性化をもたらすＣ１ｑ分子の立体配座変化をもたらす。ここで、Ｃ１ｒ２ｓ２構成成分は、Ｃ４、次にＣ２を分解して、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを生じる。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂは結合して、Ｃ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂を促進する古典経路Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成する。次いで、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素に結合して、Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。代替経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として、連続的に活性化される。因子Ｐ（プロパージン）は、副経路の正の制御因子である。プロペルジンのオリゴマー化は、Ｃ３転換酵素を安定化させ、次いで、これは、より多くのＣ３を切断することができる。Ｃ３分子は、表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性を増強して、補体活性化の増幅をもたらすことができる。
【０６１２】
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染の予防及び潜在的な病原体のクリアランスのための複雑な全身先天免疫応答である。多数のタンパク質は、ＡＰＲに関与しており、Ｃ反応性タンパク質は、十分に特徴付けられたタンパク質である。
【０６１３】
本発明によれば、ある特定のＬＮＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のほぼ直後に、血小板と物理的に会合することができるが、他のＬＮＰは、血小板と全く会合しないか、またはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが見出されている。重大なことに、血小板と会合するＬＮＰは、その後形成される血小板凝集体も明らかに安定化させる。血小板のある特定のＬＮＰとの物理的接触は、そのような血小板が、凝集したままか、または投与後の長期間にわたり凝集体を継続的に形成する能力と相関する。そのような凝集体は、活性化血小板、さらに、マクロファージ及びＢ細胞などの先天免疫細胞も含む。
【０６１４】
使用方法
本明細書に記載のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞関連疾患（例えば、ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３）、障害、または状態を処置及び／または予防するための調製、製造、及び治療用途に使用される。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物、及び製剤は、ＰＦＩＣ（例えば、ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３）を処置及び／または予防するために使用される。補充療法は、ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、及びＰＦＩＣ３の有望な処置である。したがって、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ＰＦＩＣのための遺伝子補充療法において使用するために適している、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチド、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを対象に提供することにより、小管輸送体障害を処置する。
【０６１５】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤を、それを必要とする対象においてＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１のレベルを上昇させるための方法において使用する。例えば、本発明の一態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（複数可）を含む組成物または製剤（例えば、ＡＢＣＢ４ポリペプチド、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（複数可）をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡ（複数可））を対象に投与することを含む上記方法を提供する。別の例では、本発明の一態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＢＣＢ４をコードするポリヌクレオチド、ＡＢＣＢ１１をコードするポリヌクレオチド、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を含む組成物または製剤を対象に投与することを含む上記方法を提供する。別の例では、本発明の一態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＢＣＢ４をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤、ＡＢＣＢ１１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤を、対象に同時投与することを含む上記方法を提供する。本発明の別の態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＢＣＢ４をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤（例えば、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む上記方法を提供する。本発明の別の態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＢＣＢ１１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤（例えば、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む上記方法を提供する。本発明の別の態様は、対象においてＰＦＩＣの症状を緩和する方法であって、ＡＴＰ８Ｂ１をコードするポリヌクレオチドを含む組成物または製剤（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を対象に投与することを含む上記方法を提供する。
【０６１６】
上記のとおり、補充療法は、ＰＦＩＣのための有望な処置である。したがって、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ＰＦＩＣのための遺伝子補充療法で使用するために適している、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、ＡＢＣＢ４ポリペプチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを対象に提供することにより、対象におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１の欠損を処置する。一部の実施形態では、上記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、配列最適化されている。一部の実施形態では、上記少なくとも１つのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＢＣＢ４ポリペプチド、ＡＢＣＢ１１ポリペプチド、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、その際、少なくとも１つの核酸が、例えば、そのＧ／Ｃ、ウリジン、またはチミジン含有量を修飾することにより配列最適化されている、及び／または少なくとも１つのポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、上記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲＮＡ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０６１７】
一部の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物または製剤、本発明の医薬組成物または製剤の対象への投与は、組成物または製剤の投与前に観察されたレベルよりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低いレベルまでの胆汁ホスファチジルコリンの低下をもたらす。
【０６１８】
一部の実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、対象の細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１の発現をもたらす。一部の実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、対象におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現の増加をもたらす。例えば、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用し、その際、その方法は、対象の少なくとも一部の細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現の増加をもたらす。
【０６１９】
一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物または製剤の対象への投与は、正常な対象、例えば、ＰＦＩＣに罹患していないヒトで予測される発現及び／または活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％以上のレベルまでの、対象の細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１発現の増加をもたらす。別の実施形態では、反復投与は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現の持続をもたらす。
【０６２０】
一部の実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、胆汁輸送を可能にするために十分な期間持続する、対象の細胞の少なくともいくつかにおけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質の発現をもたらす。
【０６２１】
一部の実施形態では、コードされたポリペプチド（複数可）の発現が増加する。一部の実施形態では、上記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、細胞に導入された場合に、これらの細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現レベルを、上記少なくとも１つのポリペプチドが細胞に導入される前の細胞におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現に対して、例えば、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる。
【０６２２】
一部の実施形態では、上記方法または使用は、配列番号６８〜１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、及び１４２の群から選択されるポリヌクレオチドと配列類似性を有する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含み、その際、上記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド（複数可）をコードする。
【０６２３】
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳類対象への移植に関する。細胞の哺乳類対象への投与は、当業者らに公知であり、限定されないが、局所移植（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達、または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、及び薬学的に許容される担体中での細胞の製剤化が含まれる。
【０６２４】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、医薬組成物、及び製剤は、本明細書に開示のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオ塩基、例えば、Ｎ１−メチルシュードウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本発明のＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の１種のヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾ヌクレオ塩基である。一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウルシルの少なくとも９５％は、１−Ｎ−メチルシュードウリジンまたは５−メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、あるいはそれらの任意の組合せを含む送達剤と共に製剤化する。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば約４７．５：１０．５：３９．０：３．０または約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）約３０〜約６０ｍｏｌ％（例えば、化合物ＩＩまたはＶＩ（または関連の適切なアミノ脂質）３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５または５５〜６０ｍｏｌ％）、リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質）約５〜約２０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質（または関連の適切なリン脂質または「ヘルパー脂質）５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０ｍｏｌ％）、コレステロール（または関連ステロールまたは「非カチオン」脂質）約２０〜約５０ｍｏｌ％（例えば、コレステロール（または関連ステロールまたは「非カチオン」脂質）約２０〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０ｍｏｌ％）及びＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）約０．０５〜約１０ｍｏｌ％（例えば、ＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）０．０５〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜７、または７〜１０ｍｏｌ％）の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３．０または５０：１０：３８．５：１．５のモル比を含み得る。ある特定の例では、例示的な送達剤は、例えば、４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３のモル比を含み得る。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０または約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０６２５】
本発明の薬物または処置の治療有効性は、対象（例えば、前臨床試験対象（げっ歯類、霊長類など）または臨床対象（ヒト））から取られた試料（複数可）中のコードされたタンパク質（例えば、酵素）の発現のレベルを測定することにより特徴付ける、または決定することができることを、当業者は理解するであろう。同様に、本発明の薬剤または処置の治療有効性は、対象（例えば、前臨床試験対象（げっ歯類、霊長類など）または臨床対象（ヒト））から取られた試料（複数可）中のコードされたタンパク質（例えば、酵素）の活性のレベルを測定することにより特徴付ける、または決定することができる。さらに、本発明の薬物または処置の治療有効性は、対象から取られた試料（複数可）中の適切なバイオマーカーのレベルを測定することにより特徴付ける、または決定することができる。タンパク質及び／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回投与で投与後に、決定することができるか、または単回用量で投与後のいくつかの時点で、決定及び／または監視することができるか、または処置、例えば、複数回投与の処置の経過を通して、決定及び／または監視することができる。
【０６２６】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベル
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物（例えば、げっ歯類、霊長類など）またはヒト対象におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１の発現レベル（複数可）の測定、決定及び／または監視を特徴とする。動物には、正常、健康または野生型動物、さらには、ＰＦＩＣ及びその処置の理解において使用するための動物モデルが含まれる。例示的な動物モデルには、げっ歯類モデル、例えば、ＰＦＩＣマウスとも称されるＰＦＩＣ欠損マウスが含まれる。
【０６２７】
ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベルは、例えば、血液試料または針生検からの生体試料中のタンパク質レベルを決定するための当技術分野において承認されている任意の方法により測定または決定することができる。「レベル」または「タンパク質のレベル」という用語は、本明細書で使用する場合、好ましくは、試料または対象内でのそのタンパク質の重量、質量または濃度を意味する。ある特定の実施形態では、試料を精製、沈殿、分離、例えば遠心分離及び／またはＨＰＬＣのいずれかにかけ、続いて、例えば、質量及び／または分光分析を使用して、タンパク質のレベルを決定することができることは当業者に理解されるであろう。例示的な実施形態では、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を、タンパク質発現レベルを決定するために使用することができる。他の例示的な実施形態では、タンパク質精製、分離及びＬＣ−ＭＳを、本発明によるタンパク質のレベルを決定するための手段として使用することができる。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療薬（例えば、単回静脈内投与）は、ｍＲＮＡ治療薬の単回投与後少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間にわたって、対象の肝臓組織におけるＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１タンパク質発現レベルの上昇（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の上昇及び／または正常レベルに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の上昇）をもたらす。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療薬（例えば、単回静脈内投与）は、ｍＲＮＡ治療薬の単回投与後少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間にわたって、対象の血漿中でのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現レベルの上昇及び／または対象の尿中でのＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１発現レベルの上昇（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５または１，２００μＭ未満）をもたらす。
【０６２８】
使用のための組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、上で開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤を対象とする。
【０６２９】
一部の実施形態では、上記組成物または製剤は、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、野生型配列、その機能性断片、またはバリアント）（その際、上記ポリヌクレオチド（複数可）は、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオ塩基、例えば、Ｎ１−メチルシュードウラシルまたは５−メトキシウラシルを含み（例えば、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％がＮ１−メチルシュードウラシルまたは５−メトキシウラシルである）、かつ上記ポリヌクレオチド（複数可）はさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ結合部位）を含む）、ならびに例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組合せを含む送達剤を含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、化合物ＶＩ、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組合せを含む脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。一部の実施形態では、上記送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約４７．５：１０．５：３９．０：３．０のモル比で含む。
【０６３０】
一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量に対するＯＲＦのウラシルまたはチミン含有量（ＵＴＭ％またはＴＴＭ％）は、約１００％〜約１５０％である。
【０６３１】
一部の実施形態では、上記のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１関連疾患、障害、または状態、例えば、ＰＦＩＣを処置及び／または予防するために使用される。
【０６３２】
投与の形態
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、治療上有効な結果をもたらす任意の経路により投与することができる。これらには、限定されないが、経腸（腸内に）、胃腸内、硬膜外（硬膜内に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、大脳内（大脳内に）、脳室内（脳室内に）、経皮（皮膚への適用）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下に）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内に）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓内に）、骨内注入（骨髄内に）、髄腔内（脊髄管内）、腹腔内、（腹膜への注入もしくは注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、空洞内注射（病理学的空洞内に）、腔内（陰茎の付け根に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送法（鼻で吸う）、舌下、唇の下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳、耳介（耳の中もしくは耳から）、頬側（頬に向かって）、結膜、皮膚、歯科用（歯（複数可））、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内に）、仙骨内（馬尾内に）、大槽内（脳延髄大槽内に）、角膜内（角膜内に）、歯科内膜、冠動脈内（冠動脈内に）、海綿体内（陰茎の陰核海綿体の拡張可能な空間内の）、椎間板内（椎間板内に）、管内（腺管内に）、十二指腸内（十二指腸内に）、硬膜内（硬膜内もしくは硬膜下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内に）、歯肉内（歯肉内に）、回腸内（小腸の遠位部分内に）、病巣内（局所的な病変内にもしくは局所的な病変に直接導入）、管腔内（管の管腔内に）、リンパ腺内（リンパ内に）、髄内（骨の髄腔内に）、髄膜内（髄膜内に）、眼内（眼内に）、卵巣内（卵巣内に）、心膜内（心膜内に）、胸膜腔内（胸膜内に）、前立腺内（前立腺内に）、肺内（肺もしくはその気管支内に）、副鼻腔内（鼻洞もしくは眼窩洞内に）、脊髄内（脊柱内に）、滑液嚢内（関節の滑液腔内に）、腱内（腱内に）、精巣内（精巣内に）髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に）、胸腔内（胸郭内に）、尿細管内（器官の尿細管内に）、鼓室内（中耳内に）、血管内（血管（複数可）内に）、脳室内（脳室内に）、イオントフォレーゼ（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流により）、潅注（開いた創傷もしくは体腔を浸し、もしくは洗浄する）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通して、胃に）、閉塞性包帯技術（領域を閉塞する包帯剤で覆われる局所経路投与）、眼内（外眼部へ）、口咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯根膜、経直腸、呼吸器（局所的もしくは全身的効果のために経口的もしくは鼻的に吸入することにより気道内に）、眼球後（脳橋の後ろ、もしくは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所用、経胎盤（胎盤を通して、もしくは胎盤を越えて）、経気管（気管の壁を通して）、経鼓室（鼓室を越えて、もしくは通して）、尿管（尿管への）、尿道（尿道への）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレシス、または脊髄が含まれる。特定の実施形態では、組成物を、それらが、血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を越えることができるように投与することができる。一部の実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。
【０６３３】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を、ｎａｋｅｄ細胞に送達することができる。本明細書で使用する場合、「ｎａｋｅｄ」は、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。ｎａｋｅｄポリヌクレオチドは、当技術分野で公知及び本明細書に記載の投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
【０６３４】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、もしくはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、本明細書に記載の方法を使用して製剤化することができる。上記製剤は、修飾及び／または非修飾であり得るポリヌクレオチドを含有することができる。上記製剤は、限定されないが、細胞浸透剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体内分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、及び徐放性送達デポ剤をさらに含むことができる。製剤化されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知及び本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達することができる。
【０６３５】
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含むことができる。使用された不活性成分のいずれかが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されているか、または、いずれもが承認されていない可能性がある。非経口投与のための医薬組成物に使用される不活性成分の限定的なリストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び水酸化ナトリウムが含まれる。
【０６３６】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液を、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルションであり得る。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌不揮発性油は従来、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用することができる。滅菌製剤は、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤、及び緩衝剤を含むこともできる。
【０６３７】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通した濾過により、及び／または、使用前に滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌することができる。
【０６３８】
注射製剤は、組織、器官、及び／または対象の領域への直接注射用であり得る。非限定的例として、組織、器官、及び／または対象に、虚血領域への心筋内注射により、製剤を直接注射することができる（例えば、Ｚａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１３を参照されたい、これは、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０６３９】
活性成分の効果を延長するために、それは多くの場合に、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性の低い結晶質または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成することができる。次いで、薬物の吸収速度は、溶解速度に依存し、同様に、これは、結晶サイズ及び結晶形に依存する可能性がある。別法では、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁させることにより達成される。注射用デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の薬物のマイクロ封入マトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの比及び用いられるある特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポ注射製剤は、薬物を、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルションに封入することにより調製される。
【０６４０】
キット及びデバイス
キット
本発明は、本発明の特許請求されるヌクレオチドを、都合よく及び／または効果的に使用するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、ユーザが対象（複数可）の複数の処置を実施し、及び／または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／または数の構成成分を含む。
【０６４１】
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
【０６４２】
上記キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含むタンパク質産生のためのものであり得る。上記キットは、製剤組成物を形成するためのパッケージ及び使用説明書及び／または送達剤をさらに含むことができる。送達剤は、本明細書に開示の生理食塩水、緩衝溶液、リピドイド、または任意の送達剤を含むことができる。
【０６４３】
一部の実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ホスファート、及び／またはＥＤＴＡを含むことができる。別の実施形態では、緩衝溶液は、限定されないが、生理食塩水、２ｍＭのカルシウムを含む生理食塩水、５％のスクロース、２ｍＭのカルシウムを含む５％のスクロース、５％のマンニトール、２ｍＭのカルシウムを含む５％のマンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭのカルシウムを含む塩化ナトリウム、及びマンノースを含むことができる（例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号を参照されたい）。さらなる実施形態では、緩衝溶液を、沈殿させるか、または凍結乾燥させることができる。各構成成分の量は、均一な再現可能な高濃度の生理食塩水または単純な緩衝液製剤を可能にするように変動させることができる。構成成分は、一定の期間を通して、及び／または様々な条件下で、緩衝溶液中の修飾ＲＮＡの安定性を増大させるように変動させることもできる。一態様では、本発明は、標的細胞に導入された場合に、翻訳可能領域によりコードされる所望量のタンパク質を産生するのに有効な量で提供される翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、細胞の先天免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される阻害性核酸を含む第２のポリヌクレオチド、ならびにパッケージ及び使用説明書を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
【０６４４】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、ならびにパッケージ及び説明書を含む、タンパク質産生のためのキットを提供し、その際、上記ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解が減少しているものである。
【０６４５】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、及び第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適する哺乳類細胞を含む、タンパク質産生のためのキットを提供し、その際、上記ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解が減少しているものである。
【０６４６】
デバイス
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、ヒト患者などのそれを必要とする対象に直ちに送達するために利用可能な製剤中でポリヌクレオチドを合成する試薬を、安定的な剤形で含有する。
【０６４７】
投与のためのデバイスは、本明細書に教示の単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのようなデバイスは、例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に教示される。
【０６４８】
本発明の実施形態として、本明細書に開示の方法及び組成物と組み合わせて使用するために、細胞、器官、及び組織への複数投与のために当技術分野で公知の方法及びデバイスが企図される。これらは、例えば、複数のニードルを有する方法及び装置、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイス、さらには、熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスを含む。
【０６４９】
本発明に従って、これらの複数投与デバイスを、本明細書で企図される単回用量、複数用量、または分割用量を送達するために利用することができる。そのようなデバイスは、例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に教示されている。
【０６５０】
一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、同時に、または６０分の期間以内に、３つの異なる任意選択で隣接する部位に、少なくとも３本の針を介して、皮下投与または筋肉投与される（例えば、同時に、または６０分の期間以内に、４、５、６、７、８、９、または１０部位に投与される）。
【０６５１】
カテーテル及び／またはルーメンを利用する方法及びデバイス
カテーテル及びルーメンを使用する方法及びデバイスは、本発明のポリヌクレオチドを、単回投与、複数回投与、または分割投与スケジュールで投与するために用いることができる。そのような方法及びデバイスは、内容全体が参照により本明細書に援用される国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に記載されている。
【０６５２】
電流を利用する方法及びデバイス
電流を利用する方法及びデバイスは、本明細書に教示の単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのような方法及びデバイスは、内容全体が参照により本明細書に援用される国際出願公開ＷＯ２０１３１５１６６６に記載されている。
【０６５３】
定義
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が初めに定義される。本出願で使用する場合、本明細書に別途明示のない限り、以下の用語はそれぞれ、下記の意味を有するものとする。追加の定義は、本出願の全体にわたって記載される。
【０６５４】
本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。本発明は、複数またはすべてのグループメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらに用いられるか、または別の方法でそれらに関連する実施形態を含む。
【０６５５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。ある特定の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「１つ」を意味する。他の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「２つ以上」または「複数」を含む。
【０６５６】
さらに、本明細書で使用される「及び／または」は、他のものの有無に関わらず、２つのある特定の特徴または構成成分のそれぞれのある特定の開示とみるべきである。したがって、「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、本明細書では、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含するものとする。
【０６５７】
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
【０６５８】
態様が「含む」という文言を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」及び／または「から本質的になる」という用語で別途記載された類似の態様もまた提供される。
【０６５９】
単位、接頭語、及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に認められた形態で表示される。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。値の範囲が列挙される場合、その範囲の列挙された上限値及び下限値の間の各介在整数値及びその各分率もまた、そのような値の間の各部分範囲に加えて、具体的に開示されることを理解すべきである。任意の範囲の上限及び下限は独立に、その範囲に含まれるか、または範囲から除外される可能性があり、各範囲もまた、境界のいずれかが含まれるか、いずれもが含まれないか、または両方が含まれる場合が、本発明に包含される。値が明らかに列挙される場合、列挙された値とほぼ同じ数量または量である値もまた、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。組合せが開示される場合、その組合せの要素の各サブコンビネーションもまた、具体的に開示され、本発明の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素群が個々に開示される場合、それらの組合せもまた開示される。発明の任意の要素が、複数の代替物を有するものとして開示される場合、各代替物が単独でまたは他の代替物との任意の組合せで除外される本発明の例もまた、本明細書に開示され、本発明の複数の要素は、そのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素の組合せはすべて、本明細書に開示される。
【０６６０】
ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードにより称される。別途指示のない限り、核酸は、５’から３’の方向で、左から右に書かれる。ヌクレオ塩基は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される、一般に知られている一文字記号により称される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
【０６６１】
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字の記号のいずれかで称される。別途指示のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に書かれる。
【０６６２】
約：
本明細書及び特許請求の範囲を通じて数値と関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られており、認められている精度の間隔を示す。そのような精度の間隔は、±１０％である。
【０６６３】
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、別途指示のない限り、または、文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈に別途明示のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲とみなすことができる。
【０６６４】
組み合わせて投与される：
本明細書中で使用する場合、「組み合わせて投与される」または「組合せ投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、同時に、または各薬剤の患者への効果の重複が可能な間隔の範囲内で、対象に投与されることを意味する。一部の実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、コンビナトリアル（例えば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に接近して配置される。
【０６６５】
アミノ酸置換：
「アミノ酸置換」という用語は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチド配列）内で、例えば、化学的ペプチド合成または当技術分野で公知の組換え法により置換することができる。したがって、「位置Ｘでの置換」への言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸の、代替アミノ酸残基での置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って記載することができ、Ａは、ｎ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って記載することができ、Ａは、Ｘ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードであり、Ｙ及びＺは、代替置換アミノ酸残基である。
【０６６６】
本開示の文脈では、置換（それらが、アミノ酸置換と呼ばれる場合であっても）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンと置換することにより行われる。
【０６６７】
動物：
本明細書で使用する場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発生期のヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発生期の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、限定されないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫が含まれる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
【０６６８】
ほぼ：
本明細書で使用する場合、目的の１つまたは複数の値に付される「ほぼ」という用語は、記載された参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「ほぼ」という用語は、別途記載のない限り、または別途文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載された参照値のいずれかの（より大きいまたはより小さい）方向に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、以下の範囲に入る値を指す。
【０６６９】
関連する：
疾患に対して本明細書で使用する場合、「関連する」という用語は、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行に関連することを意味する。関連は、原因として疾患との関連がある可能性があるが、関連がある必要はない。例えば、症状、後遺症、またはＰＦＩＣの患者の生活の質の減少を引き起こす任意の作用は、ＰＦＩＣと関連すると考えられており、本発明の一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することにより、処置、改善、または予防することができる。
【０６７０】
２つ以上の部分に対して使用される場合、「会合する」「コンジュゲートされる」、「連結される」、「結合される」、及び「拘束される」という用語は、２つ以上の部分に対して使用される場合、構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で、部分が物理的に会合したままであるように、十分に安定である構造を形成するように、部分が、直接、または結合剤としての働きをする１つまたは複数のさらなる部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合し、または結合されることを意味する。「会合」は、厳密に直接共有化学結合によるものである必要はない。それは、「会合する」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定な結合性に基づくイオン結合または水素結合またはハイブリダイゼーションも示唆することができる。
【０６７１】
二機能性：
本明細書で使用する場合、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能の能力があるか、または維持する任意の物質、分子、または部分を指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与える可能性がある。機能を生じる構造は、同じまたは異なる可能性がある。例えば、本発明の二機能性修飾ＲＮＡは、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ペプチドをコードすることができる（第１機能）が、コード化ＲＮＡを含むヌクレオシドは、それ自体として、ＲＮＡの半減期を延長することが可能である（第２機能）。この例では、二機能性修飾ＲＮＡを、タンパク質欠乏症に罹患する対象に送達すると、疾患または状態を改善または処置することができるペプチドまたはタンパク質分子を産生するだけでなく、長い期間にわたって対象に存在する集団修飾ＲＮＡも維持するであろう。他の態様では、二機能性修飾ｍＲＮＡは、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ペプチドをコードするＲＮＡ（第１の機能）及び第１のタンパク質に融合されるか、または第１のタンパク質と同時発現される第２のタンパク質を含むキメラ分子であり得る。
【０６７２】
生体適合性：
本明細書で使用する場合、「生体適合性」という用語は、免疫系による傷害、毒性、または拒絶のリスクをほとんどか、全く有さない生細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
【０６７３】
生分解性：
本明細書で使用する場合、「生分解性」という用語は、生物の作用による無害な産物への分解が可能であることを意味する。
【０６７４】
生物学的に活性な：
本明細書で使用する場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系及び／または生体内で活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生体に投与された場合に、その生体に生物学的影響を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのいくつかでも生物学的活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると考えることができる。
【０６７５】
キメラ：
本明細書中で使用する場合、「キメラ」は、２つ以上の不調和または異種の部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドを含む第１の部分及び第２の治療用タンパク質を含む（例えば、第１の部分と遺伝子融合した）第２の部分（例えば、別個の酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の血漿中半減期を延長することが可能な部分、例えば、抗体のＦｃ領域）を含むことができる。
【０６７６】
配列最適化：
「配列最適化」という用語は、参照核酸配列内のヌクレオ塩基が代替ヌクレオ塩基で置換されて、特性の向上、例えば、タンパク質発現が向上または免疫原性が減少した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
【０６７７】
一般に、配列最適化の目標は、参照ヌクレオチド配列によりコードされた同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を生成することである。したがって、参照ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドに対して、コドン最適化ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドに（コドン最適化の結果としての）アミノ酸置換は存在しない。
【０６７８】
コドン置換：
配列最適化の文脈での「コドン置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「コドン置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」という用語は、参照核酸配列中に存在するコドンを、別のコドンで置換することを指す。コドンは、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当技術分野で公知の組換え方法により、参照核酸配列中で置換することができる。したがって、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）中のある特定の場所での、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の領域もしくは部分配列内での「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」または「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」への言及は、そのような場所または領域でのコドンの代替コドンによる置換を指す。
【０６７９】
本明細書で使用する場合、「コード領域」及び「領域コード化」という用語ならびにその文法的変形形態は、発現時に、ポリペプチドまたはタンパク質を生じるポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
【０６８０】
化合物：
本明細書で使用する場合、「化合物」という用語は、示された構造のすべての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用する場合、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、シス及びトランス異性体）、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、エナンチオマー的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態を含む、本明細書に記載の化合物のありとあらゆる立体異性体、ならびにエナンチオマー及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を包含する。化合物のエナンチオマー及び立体的混合物、ならびにそれらを、構成成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は、周知である。「同位体」は、細胞核内の異なる数の中性子の結果として生じる、原子番号が同じであるが質量数が異なる原子を指す。例えば、水素の同位体は、三重水素及び重水素を含む。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、ルーチン的な方法により溶媒和物及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製することができる。
【０６８１】
接触：
本明細書で使用する場合、「接触」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳類細胞及びナノ粒子が物理的接続を共有させられることを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方で、細胞を、外部実体と接触させる方法は、生物学的技術分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物及び哺乳類内に位置する哺乳類細胞を接触させることは、種々の投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）により実施することができ、種々の量のナノ粒子組成物を含むことができる。さらに、２つ以上の哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させることができる。
【０６８２】
保存的アミノ酸置換：
「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列内のアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において規定されている。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置換される場合、そのアミノ酸置換は、保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。
【０６８３】
非保存的アミノ酸置換：
非保存的アミノ酸置換は、（ｉ）正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓ）を有する残基が、負電荷残基（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）と置換され、もしくはこれにより置換され、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくはＶａｌ）と置換され、もしくはこれにより置換され、（ｉｉｉ）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基と置換され、もしくはこれにより置換され、または（ｉｖ）嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、もしくはＴｒｐ）を有する残基が、より小さい側鎖を有するもの（例えば、ＡｌａもしくはＳｅｒ）、もしくは側鎖を有さないもの（例えば、Ｇｌｙ）と置換され、もしくはこれにより置換されるものを含む。
【０６８４】
他のアミノ酸置換は、当業者らが容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システイン、及びＤ−システインのいずれか１つから行うことができる。リシンの場合、置換は、Ｄ−リシン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、またはＤ−オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想することができる機能上重要な領域での置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンと（もしくはそれで）置換されるか、（ｉｉ）システイン残基が、他の任意の残基と（もしくはそれで）置換されるか、（ｉｉｉ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンが、負電荷側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸と（もしくはそれで）置換されるか、または、（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有しないもの、例えば、グリシンで（もしくはそれで）置換されるものである。上述の非保存的置換の１つがタンパク質の機能的特性を変更し得る可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも関連しており：いくつかの非保存的置換は、それに応じて、生物学的特性にほとんどまたは全く影響し得ない。
【０６８５】
保存：
本明細書で使用する場合、「保存された」という用語はそれぞれ、比較される２つ以上の配列の同じ位置で改変されていないものである、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連している配列の間で保存されているものである。
【０６８６】
一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。一部の実施形態では、２つ以上の配列は、互いに、約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用することができ、またはそのある部分、領域、または機能に適用することができる。
【０６８７】
徐放：
本明細書で使用する場合、「徐放」という用語は、治療成績を達成する放出のある特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
【０６８８】
環状または環化：
本明細書で使用する場合、「環状」という用語は、連続ループの存在を指す。環状分子は、サブユニットの破壊されていない鎖を形成するために、環状である必要はなく、単に結合される。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一単位もしくは多量体であるか、または複合体もしくは高次構造の１つまたは複数の構成成分を含むことができる。
【０６８９】
細胞傷害性：
本明細書で使用する場合、「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを、死滅させること、または有害な、有毒な、もしくは致命的な影響を引き起こすことを指す。
【０６９０】
送達：
本明細書で使用する場合、「送達」という用語は、実体を行き先に提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により）投与することを含み得る。ナノ粒子組成物の哺乳類または哺乳類細胞への投与は、１つまたは複数の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含むことができる。
【０６９１】
送達剤：
本明細書で使用する場合、「送達剤」は、ポリヌクレオチドの標的細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏ送達を、少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
【０６９２】
不安定化：
本明細書で使用する場合、「不安定な（ｄｅｓｔａｂｌｅ）」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発、野生型、または天然形態よりも安定性の低い領域または分子を意味する。
【０６９３】
ジアステレオマー：
本明細書で使用する場合、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像でなく、かつ互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
【０６９４】
消化：
本明細書で使用する場合、「消化」という用語は、より小さな断片または構成成分に分裂することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
【０６９５】
遠位：
本明細書で使用する場合、「遠位」という用語は、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
【０６９６】
ドメイン：
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに言及する場合、「ドメイン」という用語は、１つまたは複数の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０６９７】
投与レジメン：
本明細書で使用する場合、「投与レジメン」または「投与レジメン」は、投与スケジュールまたは医師が決定した処置、予防、または対症ケアのレジメンである。
【０６９８】
有効量：
本明細書で使用する場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、タンパク質異常（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１異常）を処置する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、薬剤の投与なしに観察された症状の重症度と比較して、例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１異常に関連する症状を改善、減少、排除または予防するのに十分なＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、及び／またはＡＴＰ８Ｂ１を発現するｍＲＮＡの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療的有効量」、または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
【０６９９】
エナンチオマー：
本明細書で使用する場合、「エナンチオマー」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、１つのエナンチオマーが少なくとも９０％、他のエナンチオマーが多くとも１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％の（当技術分野で標準的な方法により決定されるとおりの）光学純度またはエナンチオマー過剰を有する本発明の化合物のそれぞれ個々の光学活性形態を意味する。
【０７００】
封入：
本明細書で使用する場合、「封入」という用語は、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。
【０７０１】
封入効率：
本明細書で使用する場合、「封入効率」は、ナノ粒子組成物の調製に使用されるポリヌクレオチドの初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供された合計１００ｍｇのポリヌクレオチドのうち９７ｍｇのポリヌクレオチドが、ナノ粒子組成物に封入される場合、封入効率は９７％として与えられ得る。本明細書で使用する場合、「封入」は、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指し得る。
【０７０２】
コードされたタンパク質切断シグナル：
本明細書で使用する場合、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０７０３】
操作された：
本明細書で使用する場合、本発明の実施形態は、構造的または化学的に関わらず、出発点、野生型、または天然分子から変化する特徴または性質を有するように設計される場合、「操作される」。
【０７０４】
増強された送達：
本明細書で使用する場合、「増強された送達」という用語は、ポリヌクレオチドの対照ナノ粒子による目的の標的組織（例えばＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）への送達のレベルと比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳類の肝臓）への送達を意味する。ナノ粒子のある特定の組織への送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を上記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を該組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を上記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチド量を、上記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。ナノ粒子の標的組織への送達の増強は、処置される対象において決定される必要はなく、それは、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができることを理解されるであろう。
【０７０５】
エキソソーム：
本明細書で使用する場合、「エキソソーム」は、哺乳類細胞により分泌されるベシクル、またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
【０７０６】
発現：
本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベント：（１）（例えば、転写による）ｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡ配列からの生成、（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）ｍＲＮＡ転写のプロセシング、（３）ｍＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１つまたは複数を指す。
【０７０７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ：
本明細書で使用する場合、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）の外側で発生するイベントを指す。ｅｘ  ｖｉｖｏイベントは、天然（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）環境から最小限に変更された環境で行うことができる。
【０７０８】
特徴：
本明細書で使用する場合、「特徴」は、特徴、特性、または特有の要素を指す。ポリペプチドに言及する場合、「特徴」は、分子の異なるアミノ酸配列に基づく構成成分として定義される。本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの特徴は、表面症状発現、局所立体配座形状、フォールディング、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０７０９】
製剤：
本明細書で使用する場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、ならびに担体、添加剤、及び送達剤のうちの１つまたは複数を含む。
【０７１０】
断片：
本明細書で使用する場合、「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、断片は、Ｎ末端及び／またはＣ末端及び／または内部の部分配列が欠失している全長タンパク質（例えば、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１）の部分配列である。本発明のいくつかの好ましい態様では、本発明のタンパク質の断片は、機能性断片である。
【０７１１】
機能性：
本明細書で使用する場合、「機能性」生物学的分子は、特徴となる特性及び／または活性を示す形態の生物学的分子である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの機能性断片は、機能性ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１断片を発現することが可能なポリヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の機能性断片は、野生型ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１の断片（すなわち、その天然に生じるアイソフォームのいずれかの断片）、またはその変異体もしくはバリアントを指し、その断片は、対応する全長タンパク質の生物学的活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
【０７１２】
ヘルパー脂質：
本明細書で使用する場合、「ヘルパー脂質」という用語は、（脂質層、例えば、脂質二重層に挿入するための）脂質部分及び（脂質層の表面での生理学的溶液との相互作用のための）極性部分を含む化合物または分子を指す。典型的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、例えば、アミノ脂質を「補完」して二重層の融合性を増加させること、及び／または例えば、細胞に送達された核酸の、エンドソーム脱出を促進することである。ヘルパー脂質は、ＬＮＰの表面の重要な構造構成成分であるとも考えられる。
【０７１３】
相同性：
本明細書で使用する場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な相関性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である２つの分子は、共通の進化的先祖を有するであろう。本発明の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
【０７１４】
一部の実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一であり（正確に同じモノマー）または類似している（保存的置換）場合、互いに「相同である」と考えられる。「相同である」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較を指す。
【０７１５】
同一性：
本明細書で使用する場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の、及び／またはポリペプチド分子間の、全体的なモノマーの保存を指す。２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較のために２つの配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために、ギャップを第１及び第２の核酸配列のうちの一方または両方に導入することができ、同一でない配列は、比較のために無視してよい）ことにより実施することができる。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有される場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数であり、その際、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップ数及び各ギャップ長さを考慮に入れる。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等と考えることができる。
【０７１６】
適切なソフトウェアプログラムは、種々の供給源から、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントのために、入手可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの適切なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴ  ｓｕｉｔｅの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の適切なプログラムは、生命情報科学プログラムのＥＭＢＯＳＳ  ｓｕｉｔｅの一部、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも入手可能である。
【０７１７】
配列アラインメントは、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。
【０７１８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインする単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列と異なる領域はそれぞれ、それら自体のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性値は、少数第２位で四捨五入されることに注意する。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に、整数であることにも注意する。
【０７１９】
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）対第２のアミノ酸配列（または核酸配列）のパーセンテージ同一性「ＩＤ％は」は、ＩＤ％＝１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、（視覚検査または特定の配列アラインメントプログラムによりアラインされた）第１及び第２の配列のアラインメントにおいて完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基（またはヌクレオ塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列対第２の配列のパーセント同一性は、第２の配列対第１の配列のパーセント同一性よりも高くなるであろう。
【０７２０】
パーセント配列同一性の計算のための配列アラインメントの生成は、一次配列データだけにより進められるバイナリー配列−配列比較に限定されないことを当業者は理解するであろう。配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能性データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの異種供給源からのデータと統合することにより生成することができることも理解されるであろう。多重配列アラインメントを生成するために、異種データを統合する適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能な、あるいは、例えば、ＥＢＩから入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅである。また、パーセント配列同一性を計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで管理することができることも理解されるであろう。
【０７２１】
免疫応答：
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、ならびに上記細胞または肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用であって、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、または、自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の、選択的な損傷、破壊、または人体からの排除をもたらす作用を指す。一部の場合では、脂質構成成分及び封入された治療薬を含むナノ粒子の投与は、（ｉ）封入された治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）そのような封入された治療薬（例えば、ｍＲＮＡによりコードされたポリペプチド）の発現産物、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質構成成分、または（ｉｖ）それらの組合せにより引き起こすことができる免疫応答を誘発し得る。
【０７２２】
炎症性応答：
「炎症性応答」は、特異的及び非特異的な防御系を含む免疫応答を指す。特定の防御系反応は、抗原に対する特異的な免疫系反応である。特異的防御系反応の例には、抗体応答が含まれる。非特異的防御系反応は、免疫記憶が一般に不可能な白血球、例えば、マクロファージ、好酸球、及び好中球により媒介される炎症応答である。一部の態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインの分泌を含み、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす。
【０７２３】
炎症性サイトカイン：
「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例には、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＧＲＯαとしても公知のＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が含まれる。炎症性サイトカインという用語には、当技術分野で公知の炎症性応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）なども含まれる。
【０７２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：
本明細書で使用する場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、または微生物）内の代わりに、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで生じるイベントを指す。
【０７２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：
本明細書で使用する場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生体（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）内で発生するイベントを指す。
【０７２６】
挿入及び欠失バリアント：
ポリペプチドに言及する場合の「挿入バリアント」は、天然配列または出発配列中のある特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接する」は、アミノ酸のアルファ−カルボキシまたはアルファ−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。ポリペプチドに言及する場合の「欠失バリアント」は、天然または出発アミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で１つまたは複数のアミノ酸が欠失しているであろう。
【０７２７】
インタクト：
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの文脈では、「インタクト」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させないまたは置換しないことを意味する。逆に、核酸との関連で、「インタクト」という用語は、野生型核酸に対応するヌクレオ塩基を保持すること、例えば、野生型ヌクレオ塩基を変異させない、または置換しないことを意味する。
【０７２８】
イオン性アミノ脂質：
「イオン性アミノ脂質」という用語は、１、２、３またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノヘッド基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノヘッド基）を有する脂質を含む。イオン性アミノ脂質は典型的には、アミノヘッド基のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電し）、ｐＫａを上回るｐＨで、実質的に荷電していない。そのようなイオン性アミノ脂質には、限定されないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）及び（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）が含まれる。
【０７２９】
単離された：
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、（天然または実験的設定に関わらず）関連した構成成分の少なくともいくつかから分離されている物質または実体を指す。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離されている物質に関して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、最初に関連した他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離することができる。一部の実施形態では、単離された物質は、約８０％を超える、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超える純度である。本明細書で使用する場合、他の構成成分を実質的に含まない場合、物質は、「純粋」である。
【０７３０】
実質的に単離された：
「実質的に単離された」は、化合物が形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の化合物が豊富な組成物を含むことができる。実質的な分離は、本開示の化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含むことができる。
【０７３１】
「単離された」ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または本明細書に開示の任意の組成物は、天然にはみられない形態のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、もはや天然に生じる形態ではない程度に精製されているものを含む。一部の態様では、単離されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
【０７３２】
異性体：
本明細書で使用する場合、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つまたは複数のキラル中心及び／または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）などの立体異性体あるいはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（−））またはシス／トランス異性体）として存在することが認められる。本発明によれば、本明細書に記載の化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体的に純粋な（例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な）形態とエナンチオマー及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本発明の化合物のエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物は典型的に、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体として化合物を結晶化すること、またはキラル溶媒中で化合物を結晶化することで、それらの構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分離させることができる。エナンチオマー及び立体異性体は、周知の不斉合成法により、立体異性または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。
【０７３３】
リンカー：
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、原子の群、例えば、１０〜１，０００の原子を指し、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子または基からなり得る。リンカーは、第１の末端で、ヌクレオ塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、第２の末端で、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療薬に、結合させることができる。リンカーは、核酸配列への取り込みを阻害しない程度に十分であり得る。リンカーは、任意の有用な目的、例えば、（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子またはＩＶＴポリヌクレオチドの結合により）ポリヌクレオチド多量体またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するために、かつ本明細書に記載とおり、ペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例には、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが含まれ、これらはそれぞれ、本明細書に記載のとおり、任意選択で置換されていてよい。リンカーの例には、限定されないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー、ならびにその誘導体が含まれる。他の例には、限定されないが、還元剤または光分解を使用して切断することができる、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）などのリンカー内の切断可能部分が含まれる。選択的に切断可能な結合の非限定的例には、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤の使用及び／または光分解により切断することができるアミド結合、ならびに、例えば、酸性または塩基性の加水分解により切断することができるエステル結合が含まれる。
【０７３４】
投与方法：
本明細書で使用する場合、「投与方法」には、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を対象に送達する他の方法が含まれ得る。投与方法は、身体の特異的領域または系に標的送達するために（例えば、特異的に送達するために）、選択することができる。
【０７３５】
修飾されている：
本明細書で使用する場合、「修飾されている」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む、多くの方式で修飾することができる。一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入により修飾されており、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するような場合である。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾されている」とはみなされない。
【０７３６】
粘液：
本明細書で使用する場合、「粘液」は、粘性であり、かつムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
【０７３７】
ナノ粒子組成物：
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子組成物」は、１つまたは複数の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は典型的には、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０７３８】
天然に生じる：
本明細書で使用する場合、「天然に生じる」は、人工的な援助なしに、天然に存在することを意味する
【０７３９】
非ヒト脊椎動物：
本明細書で使用する場合、「非ヒト脊椎動物」には、野生種及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例には、限定されないが、哺乳類、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤール、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクが含まれる。
【０７４０】
核酸配列：
「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用され、連続した核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、例えば、ｍＲＮＡであり得る。
【０７４１】
最も広い意味での「核酸」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは多くの場合に、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドには、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのハイブリッドもしくは組合せが含まれる。
【０７４２】
「ヌクレオチド配列コード化」という語句は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳類の細胞において発現を指向することが可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に結合された開始シグナル及び終結シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
【０７４３】
標的外：
本明細書で使用する場合、「標的外」は、任意の１つまたは複数の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない作用を指す。
【０７４４】
オープンリーディングフレーム：
本明細書で使用する場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに停止コドンを含有しない配列を指す。
【０７４５】
作動可能に結合された：
本明細書で使用する場合、「作動可能に結合された」という語句は、２つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能性結合を指す。
【０７４６】
任意選択で置換された：
本明細書では、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（式中、Ｘは任意選択で置換されている）」（例えば、「アルキル（式中、上記アルキルは、任意選択で置換されている）」と同等であるものとする。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味するものではない。
【０７４７】
部：
本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドの「一部」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
【０７４８】
患者：
本明細書で使用する場合、「患者」は、処置を望むか、もしくは処置を必要とする可能性があるか、処置を必ず必要とするか、処置を受けているか、処置を受けることになっている対象、または、特定の疾患もしくは状態のための、訓練を受けた専門家によるケアの下にある対象を指す。一部の実施形態では、急性疾患を発症するリスクを予防し、または減少させる処置が必要とされ、必ず必要とされ、または施され、すなわち、それは、予防的処置である。
【０７４９】
薬学的に許容される：
「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内であり、合理的な利益／リスク比に見合う、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、ヒト及び動物の組織との接触での使用に適する化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために、本明細書では用いられる。
【０７５０】
薬学的に許容される添加剤：
「薬学的に許容される添加剤」という語句は、本明細書で使用する場合、かつ本明細書に記載の化合物以外の、患者において実質的に無毒及び非炎症性である特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることが可能なビヒクル）を指す。添加剤には、例えば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング、風味剤、香料、流動促進剤（フローエンハンサー）、滑沢剤、保存剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が含まれ得る。例示的な添加剤には、限定されないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、プレゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミタート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれる。
【０７５１】
薬学的に許容される塩：
本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）修飾されている開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、限定されないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸塩、ペクチナート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及び限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が使用される。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ��ｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９（１９７７）に見出され、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０７５２】
薬学的に許容される溶媒和物：
本明細書で使用される「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与された投薬量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿により調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。
【０７５３】
薬物動態学：
本明細書で使用する場合、「薬物動態学」は、生体に投与される物質の運命の決定に関する場合、分子または化合物の任意の１つまたは複数の特性を指す。薬物動態学は、吸収、分布、代謝、及び排泄の程度及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは、（Ａ）吸収が血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分布が身体の体液及び組織を通した物質の分散または拡散であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）が親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、かつ（Ｅ）排泄（または除去）が物質の身体からの除去を指す場合、ＡＤＭＥと一般に称される。まれに、いくつかの薬物が、体内組織に不可逆的に蓄積する。
【０７５４】
物理化学的：
本明細書で使用する場合、「物理化学的」は、物理的及び／または化学的特性を意味し、またはそれに関連する。
【０７５５】
ポリヌクレオチド：
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。これはまた、例えば、アルキル化、及び／またはキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、「ポリヌクレオチド」という用語は、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、スプライシングまたは未スプライシングに関わらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む（Ｄ−リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドのである他の任意のタイプのポリヌクレオチド、ならびにノルムクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、ただし、ポリマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡにみられるような塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置のヌクレオ塩基を含有する。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然ヌクレオ塩基を含む。一部の態様では、ある特定のクラスのすべてのヌクレオ塩基は、非天然ヌクレオ塩基で置換されている（例えば、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のすべてのウリジンは、非天然ヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウリジンで置換することができる）。一部の態様では、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、合成ＤＮＡの場合には、天然のヌクレオ塩基、すなわち、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）のみを、または合成ＲＮＡの場合には、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ（ウリジン）のみを含む。
【０７５６】
本明細書に開示のコドンマップのＴ塩基が、ＤＮＡ中に存在するが、Ｔ塩基が、対応するＲＮＡ中ではＵ塩基で置換されることになることを、当業者は理解するであろう。例えば、ＤＮＡ形態の本明細書に開示のコドン−ヌクレオチド配列、例えば、ベクター、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、その対応する転写されたｍＲＮＡ中のＵ塩基として転写されたＴ塩基を有するであろう。この点では、（Ｔを含む）コドン最適化ＤＮＡ配列及び（Ｕを含む）それらの対応するｍＲＮＡ配列の両方が、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列と考えられる。等価コドンマップを、１つまたは複数の塩基を非天然塩基で置換することにより生成することができることも、当業者は理解するであろう。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応することになり、それにより、これは、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置換されたＲＮＡマップ）に対応するであろう。
【０７５７】
標準Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３−Ｈ及びＣ４−オキシの間の水素結合ならびにアデノシンのそれぞれＮ１及びＣ６−ＮＨ２の間の水素結合、ならびに、シチジンのＣ２−オキシ、Ｎ３、及びＣ４−ＮＨ２の間の水素結合ならびにグアノシンのそれぞれＣ２−ＮＨ２、Ｎ’−Ｈ、及びＣ６−オキシの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。したがって、例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン）は、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン）を形成するために修飾することができる。そのような修飾は、もはや標準塩基対をシトシンと共に効果的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかし、イソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシピリミジン−）を形成するための、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノピリミジン）の修飾は、修飾ヌクレオチドをもたらし、これは、グアノシンと共に塩基対を効果的に形成しないが、イソグアノシンと共に塩基対を形成するであろう（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，６８１，７０２号）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０４８９−１０４９６及びその中で引用された参照文献により記載された方法により調製することができ、２’−デオキシ−５−メチルイソシチジンは、Ｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−４４６７及びその中で引用された参照文献の方法により調製することができ、イソグアニンヌクレオチドは、上掲のＳｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、及びＭａｎｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１により記載された方法を使用して、またはＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法により調製することができる。他の非天然塩基対は、２，６−ジアミノピリミジン及びその相補体（１−メチルピラゾロ−［４，３］ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成のために、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：３３−３７に記載の方法により合成することができる。独自の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３及び上掲のＳｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に記載のものなど、公知である。
【０７５８】
ポリペプチド：
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。この用語は、天然に、または介入：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾、例えば、標識構成成分との複合化により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。さらに、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、Ｄ−アミノ酸、及びクレアチンを含む）を含有するポリペプチド、ならびに当技術分野で公知の他の修飾が、この定義内に含まれる。
【０７５９】
本明細書で使用される用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に生じるポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに上述の他の等価物、バリアント、及びアナログを含む。ポリペプチドは、モノマーであり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらは、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含むこともできる。最も一般に、ジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見出される。ポリペプチドという用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用することもできる。一部の実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
【０７６０】
ポリペプチドバリアント：
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドバリアント」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有することができる。通常、バリアントは、天然配列または参照配列と、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有するであろう。一部の実施形態では、それらは、天然配列または参照配列と、少なくとも約８０％同一または少なくとも約９０％同一であろう。
【０７６１】
単位薬物当たり（ＰＵＤ）のポリペプチド：
本明細書で使用する場合、ＰＵＤすなわち単位薬物当たりの産物は、体液または組織中で測定されるような産物（例えば、ポリペプチド）の総１日用量、通常は、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇなどの細別された部分として定義され、通常は、濃度、例えば、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどで定義され、体液中での測定値で分けられる。
【０７６２】
予防すること：
本明細書で使用する場合、「予防すること」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状、特徴、もしくは臨床症状発現の発症を部分的にもしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状、特徴、もしくは症状発現の発症を部分的もしくは完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害、及び／または状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること、及び／または感染、疾患、障害、及び／または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させることを指す。
【０７６３】
増殖する：
本明細書で使用する場合、「増殖する」という用語は、成長、拡大、もしくは増加すること、または急速に成長、拡大、もしくは増加させることを意味する。「増殖性」は、増殖能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に反するか、または不適当な特性を有することを意味する。
【０７６４】
予防的：
本明細書で使用する場合、「予防的」は、疾患の拡大を予防するために使用される治療薬または一連の作用を指す。
【０７６５】
予防：
本明細書で使用する場合、「予防」は、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐための措置を指す。「免疫予防」は、疾患の拡大を予防するための能動免疫または受動免疫を生じる措置を指す。
【０７６６】
タンパク質切断部位：
本明細書中で使用する場合、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段により、アミノ酸鎖の制御された切断が達成され得る部位を指す。
【０７６７】
タンパク質切断シグナル：
本明細書で使用する場合、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグを立てるまたはマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
【０７６８】
目的のタンパク質：
本明細書中で使用する場合、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書で提供されるもの、ならびに、その断片、変異体、バリアント、及び改変体を含む。
【０７６９】
近位：
本明細書で使用する場合、「近位」という用語は、中心または目的の点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
【０７７０】
シュードウリジン：
本明細書で使用する場合、シュードウリジン（Ψ）は、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジンアナログ」は、シュードウリジンの任意の改変体、バリアント、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジンアナログには、限定されないが、１−カルボキシメチルシュードウリジン、１−プロピニルシュードウリジン、１−タウリノメチルシュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）（Ｎ１−メチルシュードウリジンとしても公知）、１−メチル−４−チオシュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチルシュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオウリジン、４−メトキシシュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、及び２’−Ｏ−メチルシュードウリジン（Ψｍ）が含まれる。
【０７７１】
精製された：
本明細書で使用する場合、「精製する」、「精製した」、「精製」は、望ましくない構成成分、材料汚染、混合物、または不完全性から実質的に純粋またはクリアにすることを意味する。
【０７７２】
参照核酸配列：
「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」という用語は、配列最適化することができる出発核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）を指す。一部の実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、その断片またはバリアントである。一部の実施形態では、参照核酸配列は、以前に配列最適化された核酸配列である。
【０７７３】
塩：
一部の態様では、送達のための医薬組成物は、本明細書に開示され、それらの脂質成分のいくつかの塩を含む。「塩」という用語は、任意のアニオン性及びカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定的例には、無機及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びそれらの混合物が含まれる。
【０７７４】
試料：
本明細書中で使用する場合、「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞、または構成成分部分（例えば、限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、及び精液を含む体液）のサブセットを指す。試料にはさらに、限定されないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸、及び泌尿生殖路、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または器官を含む、完全な生体もしくはその組織、細胞もしくは構成成分部分のサブセット、またはその画分もしくは一部から調製されるホモジネート、溶解物、もしくは抽出物も含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞構成成分を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指す。
【０７７５】
シグナル配列：
本明細書で使用する場合、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」という語句は、互換的に使用され、ある特定の細胞小器官、細胞区画、または細胞外排出へのタンパク質の輸送または局在化を導くことができる配列を指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチド及びシグナル配列をコードする核酸配列の両方を包含する。したがって、核酸の文脈でのシグナル配列への言及は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
【０７７６】
シグナル伝達経路：
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たしている様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用する場合、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナル及びそのようなシグナルの、細胞の原形質膜を越える伝達を受け取ることが可能な分子及び分子の複合体を含む。
【０７７７】
類似性：
本明細書で使用する場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の、及び／またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互のパーセント類似性の計算は、パーセント類似性の計算が当技術分野で理解されるような保存的置換を考慮に入れていることを除いて、パーセント同一性の計算と同じ方法で実施することができる。
【０７７８】
単回単位用量：
本明細書で使用する場合、「単回単位用量」は、１回の用量で／一度に／単一経路で／単一の接触点、すなわち、単回投与イベントで、投与される任意の治療薬の用量である。
【０７７９】
分割用量：
本明細書で使用する場合、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量の２回以上の用量への分割である。
【０７８０】
特異的送達：
本明細書で使用する場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、標的外の組織（例えば、哺乳類の脾臓）と比較して、より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳類の肝臓）への送達を意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を上記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を上記組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を上記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチド量を、上記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。例えば、腎血管の標的化では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、組織１ｇ当たり、１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達される場合に、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳類の腎臓に特異的に提供される。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、処置される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代用物で決定することができると理解されるであろう。
【０７８１】
安定性：
本明細書で使用する場合、「安定性」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を耐え抜く十分な強さを有し、一部の場合では、有効な治療薬への製剤化が可能な化合物を指す。
【０７８２】
安定化した：
本明細書中で使用する場合、「安定化する」、「安定化した」、「安定化した領域」という用語は、安定にさせるか、または安定になることを意味する。
【０７８３】
立体異性体：
本明細書中で使用する場合、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が有することができるすべての可能な異なる異性体形態及び立体配座形態、特に、基本分子構造のすべての可能な立体化学的及び立体配座的異性体形態、すべてのジアステレオマー、エナンチオマー、及び／または立体配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性体形態で存在することができ、後者はすべて本発明の範囲内に含まれる。
【０７８４】
対象：
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、限定されないが、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー、イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミ、ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ、ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ、クマ、食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、及びヒツジ、有蹄動物、例えば、シカ及びキリン、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどが含まれる。ある特定の実施形態では、哺乳類は、ヒト対象である。他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。ある特定の実施形態では、対象は、処置を必要とするヒト患者である。
【０７８５】
実質的に：
本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体またはほぼ全体の程度（ｅｘｔｅｎｔ）または程度（ｄｅｇｒｅｅ）を示す定性的条件を指す。生物学的及び化学的特徴が、あるとしても、完結し、及び／または完全まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはほとんどないことを、生物学の当業者は、理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的特徴に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用される。
【０７８６】
実質的に同等：
用量間の時間差に関連して本明細書で使用する場合、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
【０７８７】
実質的に同時：
本明細書で使用する場合、かつ複数の用量に関連する場合、この用語は、２秒以内を意味する。
【０７８８】
に罹患している：
疾患、障害、及び／または状態「罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の症状と診断されており、またはこれを示す。
【０７８９】
に罹患しやすい：
疾患、障害、及び／または状態「に罹患しやすい」個体は、症状、障害、及び／または状態の症状と診断されておらず、及び／またはこれらを示すことができないが、疾患もしくはその症状を発症する性質を有する。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態（例えば、ＰＦＩＣ）に罹患しやすい個体は、以下の：（１）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的変異、（２）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝的多型、（３）疾患、障害、及び／または状態に関連するタンパク質及び／または核酸の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する習慣及び／または生活様式、（５）疾患、障害、及び／または状態の家族歴、ならびに、（６）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する微生物への曝露及び／または感染のうちの１つまたは複数により特徴付けることができる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症するであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、及び／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症しないであろう。
【０７９０】
持続放出：
本明細書で使用する場合、「持続放出」という用語は、ある特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
【０７９１】
合成：
「合成」という用語は、人の手により生成、調製、及び／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
【０７９２】
標的細胞：
本明細書で使用する場合、「標的細胞」は、目的の１つまたは複数の任意の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または生体の組織もしくは器官で見出すことができる。生体は、動物、例えば、哺乳類、ヒト、対象、または患者であり得る。
【０７９３】
標的組織：
本明細書で使用する場合、「標的組織」は、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらすであろう、目的の１つまたは複数の任意の組織型を指す。目的の標的組織の例には、特定の組織、器官、及びそれらの系または群が含まれる。特定用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管（例えば、冠動脈内または大腿内）内の血管内皮であり得る。「標的外の組織」は、コードされたタンパク質の発現が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つまたは複数の組織型を指す。
【０７９４】
標的外問題における治療薬の存在は、（ｉ）拡散による、もしくは血流を通した、ポリヌクレオチドの投与部位から末梢組織もしくは遠位の標的外の組織への漏れ（例えば、ある特定の組織内でポリペプチドを発現するように意図されたポリヌクレオチドが標的外の組織に到達し、ポリペプチドが、その標的外の組織内で発現することとなる）、または（ｉｉ）拡散による、もしくは血流を通した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後のそのようなポリペプチドの末梢組織もしくは離れた遠位の標的外の組織への漏れ（例えば、ポリヌクレオチドがポリペプチドを標的組織内で発現し、そのポリペプチドが末梢神経へ拡散することとなる）の結果であり得る。
【０７９５】
標的化配列：
本明細書で使用する場合、「標的配列」という語句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を導くことができる配列を指す。
【０７９６】
末端：
本明細書で使用する場合、「末端」（複数可）という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最終部位のみに限定されないが、末端領域に追加的なアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチドをベースとする分子は、（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で末端処理した）Ｎ末端及び（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で末端処理した）Ｃ末端の両方を有することで特徴付けられ得る。本発明のタンパク質は、一部の場合では、ジスルフィド結合または非共有結合力により１つにされた複数のポリペプチド鎖（多量体、オリゴマー）で構成されている。これらのタイプのタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有するであろう。別法では、ポリペプチドの末端を、それらが、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドをベースとする部分で、開始または終了するように修飾することができる。
【０７９７】
治療薬：
「治療薬」という用語は、対象に投与される場合、治療的、診断的、及び／または予防的効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。例えば、一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療薬であり得る。別の例では、一部の実施形態では、ＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療薬であり得る。さらに別の例では、一部の実施形態では、ＡＢＣＢ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＡＢＣＢ１１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、及びＡＴＰ８Ｂ１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、合わさっていると考えて、一つの治療薬であり得る。
【０７９８】
治療有効量：
本明細書で使用する場合、「治療的有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象に投与される場合、感染、疾患、障害、及び／または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び／またはこれらの発症を遅延させるのに十分である送達されるべき薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【０７９９】
治療上有効な結果：
本明細書で使用する場合、「治療上有効な結果」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び／または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び／またはこれらの発症を遅延させるのに十分である結果を意味する。
【０８００】
総１日用量：
本明細書で使用する場合、「総１日用量」は、２４時間の期間に与えられるか、または処方される量である。総１日用量を、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
【０８０１】
転写因子：
本明細書で使用する場合、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、単独で転写の制御を行うが、他のものは、他のタンパク質と協調して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で転写を活性化することも抑制することもできる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の制御領域において特異的標的配列または特異的コンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、または他の分子との複合体中で、調節することができる。
【０８０２】
転写：
本明細書で使用する場合、「転写」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ鋳型または配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列または鋳型）を産生する方法を指す。
【０８０３】
トランスフェクション：
本明細書中で使用する場合、「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチド（例えば、外因性核酸）の細胞への導入を指し、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが発現されるか（例えば、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドが細胞機能を調節する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、及び／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。トランスフェクションの方法には、限定されないが、化学的方法、物理的処理、及びカチオン脂質または混合物が含まれる。
【０８０４】
処置すること、処置、治療：
本明細書で使用する場合、「処置すること」または「処置」または「治療」という用語は、疾患、例えば、ＰＦＩＣの１つまたは複数の症状または特徴を、部分的または完全に緩和すること、改善すること、好転させること、軽減すること、これらの発症を遅延させること、これらの進行を阻害すること、これらの重症度を低下させること、及び／またはこれらの発生率を低下させることを指す。例えば、ＰＦＩＣを「処置すること」は、疾患と関連する症状の減少、患者の寿命延長（生存率の増加）、疾患の重症度の低下、疾患の発症の予防または遅延などを指し得る。処置は、疾患、障害、及び／または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させるために、疾患、障害、及び／または状態の徴候を示していない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示している対象に投与することができる。
【０８０５】
非修飾：
本明細書で使用する場合、「非修飾」は、何らかの方法で変更される前の任意の物質、化合物、または分子を指す。非修飾は、必ずしも常にではないが、野生型または天然形態の生体分子を指し得る。分子は、一連の修飾を受けることができ、それにより、それぞれの修飾分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として役立ち得る。
【０８０６】
ウラシル：
ウラシルは、ＲＮＡの核酸の４つのヌクレオ塩基のうちの１つであり、これは、文字Ｕで表される。ウラシルは、Ｎ１−グリコシド結合を介して、リボース環、またはより具体的には、リボフラノースと結合して、ヌクレオシドウリジンをもたらし得る。ヌクレオシドウリジンはまた一般に、そのヌクレオ塩基の１文字コード、すなわち、Ｕに省略される。したがって、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがＵである場合、そのようなＵは、「ウラシル」または「ウリジン」として互換的に呼ばれる。
【０８０７】
ウリジン含有量：
「ウリジン含有量」または「ウラシル含有量」という用語は、互換的であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含有量またはウラシル含有量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）または相対値（核酸配列中のヌクレオ塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルパーセンテージ）として表すことができる。
【０８０８】
ウリジン修飾配列：
「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含有量及び／またはウリジンパターンに対して、異なる全体的または局所的ウリジン含有量（より高いまたはより低いウリジン含有量）を有する、または異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布またはクラスタリング）を有する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の記載内容では、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等であり互換性があると考えられる。
【０８０９】
「高ウリジンコドン」は、２つまたは３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「無ウリジンコドン」は、いずれのウリジンもないコドンである。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンとの置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンとの置換、及びそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置換することができる。一部の実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置換することができる。一部の実施形態では、無ウリジンコドンは、別の無ウリジンコドンで置換することができる。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化またはウリジン希薄化することができる。
【０８１０】
ウリジン富化：
本明細書で使用する場合、「ウリジン富化」という用語及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中の（絶対値で、またはパーセンテージ値として表される）ウリジン含有量の増加を指す。ウリジン富化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジンヌクレオ塩基を含有する同義コドンで置換することにより実施することができる。ウリジン富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）であり得る。
【０８１１】
ウリジン希薄化：
本明細書で使用する場合、「ウリジン希薄化」という用語及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中の（絶対値で、またはパーセンテージ値として表される）ウリジン含有量の減少を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジンヌクレオ塩基を含有する同義コドンで置換することにより実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する）であり得る。
【０８１２】
バリアント：
本開示で使用されるバリアントという用語は、天然バリアント（例えば、多型、アイソフォームなど）と、天然または出発配列（例えば、野生型配列）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、異なるアミノ酸が同じ場所のその位置に挿入されている人工バリアントとの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」として記載することができる。置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一であってもよいし、または２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている複数であってもよい。アミノ酸を挿入する、または欠失させる場合、得られるバリアントは、それぞれ「挿入バリアント」または「欠失バリアント」であろう。
【０８１３】
開始コドン：
本明細書で使用する場合、「開始コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）」という用語と互換的に使用される「開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）」という用語は、リボソームにより翻訳されるオープンリーディングフレームの第１のコドンを指し、結合したアデニン−ウラシル−グアニンヌクレオ塩基の三重項から構成される。開始コドンは、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）の第１の１文字コードにより示され、多くの場合に簡単に「ＡＵＧ」と記される。天然ｍＲＮＡは、開始コドンとして、本明細書では「代替開始コドン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）」と称されるＡＵＧ以外のコドンを使用することもあるが、本明細書に記載のポリヌクレオチドの開始コドンは、ＡＵＧコドンを用いる。翻訳開始のプロセス中に、開始コドンを含む配列は、リボソームにより結合したイニシエーターｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ）のアンチコドンとの相補的塩基対合を介して認識される。オープンリーディングフレームは、１つよりも多いＡＵＧ開始コドンを含むことがあり、それらは本明細書では「交代用開始コドン（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）」と称される。
【０８１４】
開始コドンは、翻訳開始において重大な役割を果たす。開始コドンは、リボソームにより翻訳されるオープンリーディングフレームの第１のコドンである。典型的には、開始コドンは、ヌクレオチド三重項ＡＵＧを含むが、しかしながら、一部の例では、翻訳開始は、別個のヌクレオチドから構成される他のコドンで生じ得る。真核生物における翻訳開始は、多数のタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、及びメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）間のＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、４０Ｓリボソームサブユニット、翻訳機構の他の構成成分（例えば、真核開始因子、ｅＩＦ）が関与するマルチステップ生化学プロセスである。ｍＲＮＡ翻訳開始の現行のモデルは、前開始複合体（別法では「４３Ｓ前開始複合体」、略して「ＰＩＣ」）が、５’から３’の方向でヌクレオチドをスキャニングすることにより、特異的な翻訳促進ヌクレオチドコンテキスト（コザック配列）内に存在する第１のＡＵＧコドンに遭遇するまで、ｍＲＮＡ（典型的には、５’キャップ）上の動員部位から、開始コドンへと移動することを仮定している（Ｋｏｚａｋ（１９８９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８：２２９−２４１）。ＰＩＣによるスキャニングは、イニシエーターＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔトランスファーＲＮＡのアンチコドンを含むヌクレオチドと、ｍＲＮＡの開始コドンを含むヌクレオチドとの間の相補的塩基対合で終了する。ＡＵＧコドンとＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔアンチコドンとの間の生産的塩基対合は、大きな６０ＳリボソームサブユニットとＰＩＣとが一緒になって、翻訳伸長に適した活性なリボソームを形成すると最高潮に達する一連の構造的及び生化学的イベントを誘発する。
【０８１５】
コザック配列：
「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも称される）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を増強する翻訳開始エンハンサーエレメントを指し、真核生物では、５’ＵＴＲに位置する。コザックコンセンサス配列は元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する開始コドン（ＡＵＧ）周囲の単一変異の作用の解析に従って、配列ＧＣＣＲＣＣとして定義された（ここで、Ｒ＝プリン）（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：２８３−２９２）。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体または変更形態を含む（翻訳エンハンサー組成及びその使用方法の例については、全体が参照により本明細書に援用されるＡｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，８０７，７０７号、全体が参照により本明細書に援用されるＣｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙに付与された米国特許第５，７２３，３３２号、全体が参照により本明細書に援用されるＷｉｌｓｏｎに付与された米国特許第５，８９１，６６５号を参照されたい）。
【０８１６】
修飾された：
本明細書で使用する場合、「修飾された」または「修飾」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造が変化した状態またはその変化を指す。ポリヌクレオチドを、化学的、構造的、及び／または機能的を含む様々な方式で修飾することができる。例えば、ポリヌクレオチドを、１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みにより構造的に修飾することができ、その際、ＲＮＡエレメントは、１つまたは複数の機能（例えば、翻訳制御活性）を与える配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を含んでよい（例えば、１つまたは複数の化学的、構造的、または機能的修飾を、それらの任意の組合せを含めて、含んでよい）。
【０８１７】
ヌクレオ塩基：
本明細書で使用する場合、「ヌクレオ塩基」（別法では、「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）という用語は、改良された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を核酸またはその部分もしくはセグメントに付与する、天然に生じるプリン及びピリミジンの任意の誘導体またはアナログを含む、核酸において見い出されるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが、天然核酸において主に見い出されるヌクレオ塩基である。当技術分野で公知である、及び／または本明細書に記載の他の天然、非天然、及び／または合成ヌクレオ塩基を核酸に組み込むことができる。
【０８１８】
ヌクレオシド／ヌクレオチド：
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオ塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはその誘導体もしくはアナログ（「ヌクレオ塩基」とも称される）に共有結合した糖分子（例えば、ＲＮＡ中のリボースまたはＤＮＡ中のデオキシリボース）、またはその誘導体もしくはアナログを含有するが、インターヌクレオシド結合基（例えば、リン酸基）が存在しない化合物を指す。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、改良された化学的及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性）を核酸またはその部分もしくはセグメントに付与するインターヌクレオシド結合基（例えば、リン酸基）、または任意のその誘導体、アナログ、もしくは変更形態に共有結合したヌクレオシドを指す。
【０８１９】
核酸：
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味で用いられ、ヌクレオチドのポリマー、またはその誘導体もしくはアナログを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは多くの場合に、「ポリヌクレオチド」と称される。したがって、本明細書で使用する場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は同等であり、互換的に使用される。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドには、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘発薬、ＲＮＡｉ薬、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘発するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオ異性体）、２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含むＬＮＡ）またはそのハイブリッドが含まれる。
【０８２０】
核酸構造：
本明細書で使用する場合、「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と互換的に用いられる）という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び／または配列の配置または組織化を指す。この用語はまた、核酸の二次元または三次元状態を指す。したがって、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び／または配列の配置または編成を指し、及び／またはＲＮＡ分子の二次元または三次元状態を指す。核酸構造をさらに、組織的複雑性の上昇に基づき「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と本明細書では称される４つの組織カテゴリーに区別することができる。
【０８２１】
オープンリーディングフレーム：
本明細書で使用する場合、「ＯＲＦ」と略される「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、開始コドンから始まって停止コドンで終了する非重複インフレームコドンの連続ストレッチを含み、リボソームにより翻訳される。
【０８２２】
前開始複合体（ＰＩＣ）：
本明細書で使用する場合、「前開始複合体」（別法では「４３Ｓ前開始複合体」、略して「ＰＩＣ」）という用語は、４０Ｓリボソームサブユニット、真核開始ファクター（ｅＩＦｌ、ｅＩＦｌＡ、ｅＩＦ３、ｅＩＦ５）、及びｅＩＦ２−ＧＴＰ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ三元複合体を含むリボ核タンパク質複合体を指し、これは、内因的にｍＲＮＡ分子の５’キャップに結合することができ、結合の後に、５’ＵＴＲのリボソームスキャニングを行うことができる。
【０８２３】
ＲＮＡエレメント：
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡエレメント」という用語は、生物学的機能を提供する、及び／または生物学的活性（例えば、翻訳制御活性）を有するＲＮＡ分子の部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載されているものなどの１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みによるポリヌクレオチドの修飾は、１つまたは複数の望ましい機能的特性を、修飾ポリヌクレオチドに与える。本明細書に記載のとおりのＲＮＡエレメントは、天然に生じる、天然に生じない、合成されている、操作されている、またはそれらの組合せであってよい。例えば、制御活性を与える天然に生じるＲＮＡエレメントには、ウイルス、原核及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトームを通じて見い出されるエレメントが含まれる。ＲＮＡエレメント、特に、真核ｍＲＮＡ及び翻訳ウイルスＲＮＡは、細胞における多くの機能の媒介に関与していることが示されている。例示的な天然ＲＮＡエレメントには、限定されないが、翻訳開始エレメント（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ  ７（２）：１９４−２０６を参照されたい）、翻訳エンハンサーエレメント（例えば、ＡＰＰ  ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１０）：６４２１−６４３１を参照されたい）、ｍＲＮＡ安定性エレメント（例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、Ｇａｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８（２）：１１３−１２６を参照されたい）、翻訳抑制エレメント（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｅｅｈ  Ｄｅｖ  １１０（１−２）：９７−１１２を参照されたい）、タンパク質結合ＲＮＡエレメント（例えば、鉄応答エレメント、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２５（１８）：３３０１−３３１０を参照されたい）、細胞質ポリアデニル化エレメント（Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２１（４）：４５２−４５７）、及び触媒ＲＮＡエレメント（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８９（９−１０）：６３４−６４１を参照されたい）が含まれる。
【０８２４】
滞留時間：
本明細書で使用する場合、「滞留時間」という用語は、ｍＲＮＡ分子に沿った別個の位置または場所での前開始複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの占有時間を指す。
【０８２５】
翻訳制御活性：
本明細書で使用する場合、「翻訳制御活性」（「翻訳制御機能」と互換的に用いられる）という用語は、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性を含む翻訳装置の活性を調節する（例えば、制御する、影響を及ぼす、調節する、変化させる）生物学的機能、機構、またはプロセスを指す。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または増強する。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、読み漏らしを減少させる、及び／または阻害する。
【０８２６】
均等物及び範囲
当業者らは、ルーチン的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を認識することとなり、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記明細書に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０８２７】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または別途文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味することができる。グループメンバーのうちの１つ、複数、またはすべてが、反対の指示がない限り、または文脈から別途明白でない限り、所与の産物またはプロセスに存在するか、これらに用いられ、または別の方法でこれらに関連する場合、「または」をグループの１つまたは複数のメンバー間に含む特許請求の範囲または明細書は、条件を満たすと考えられる。本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの複数またはすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、これらに用いられるか、または別の方法でこれらに関連する実施形態を含む。
【０８２８】
「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップを含むことを許容するが、必要としないことにも注意する。「含む」という用語を本明細書で使用する場合、「からなる」という用語もまた、このように包含及び開示される。
【０８２９】
範囲が与えられる場合は、端点が含まれる。さらに、別途指示のない限り、または文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈に別途明示のない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までの、本発明の異なる実施形態の記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲とみなすことができることを理解すべきである。
【０８３０】
加えて、先行技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つまたは複数から明白に除外することができることを理解すべきである。そのような実施形態は、当業者に公知とみなされるので、除外が本明細書では明記されてないとしても、除外することができる。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、それによりコードされた任意の核酸またはタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、任意の理由で、任意の１つまたは複数の請求項から除外することができる。
【０８３１】
引用された出典、例えば、本明細書で引用された参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術はすべて、引用に明記されていなくても、参照により本出願に援用される。引用された出典及び本出願の記載と矛盾する場合、本出願中の記載が優先されることとする。
【０８３２】
セクション及び表の見出しは、限定されることを意図したものではない。
【０８３３】
例示的配列
本明細書に記載のｍＲＮＡ配列のいずれも、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることは理解されるはずである。ＵＴＲ配列は、次の配列から選択されてよいか、または他の公知のＵＴＲ配列が使用されてよい。本明細書に記載のｍＲＮＡコンストラクトのいずれもさらに、ポリＡテイル及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ）を含み得ることも理解されるはずである。さらに、本明細書に記載のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列の多くは、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されているシグナルペプチド及び／またはペプチドタグは、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグで置換されていてもよいか、またはシグナルペプチド及び／またはペプチドタグは省かれていてもよいことは理解されるはずである。
【０８３４】
【表７】
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【実施例】
【０８３５】
実施例１：ポリヌクレオチドの作製
本開示によれば、ポリヌクレオチド及び／またはその部分もしくは領域の作製は、内容全体が参照により本明細書に援用される「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」と標題された国際公開ＷＯ２０１４／１５２０２７に教示の方法を利用して達成することができる。
【０８３６】
精製方法は、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１４／１５２０３０及び国際公開ＷＯ２０１４／１５２０３１に教示の方法を含むことができる。
【０８３７】
ポリヌクレオチドの検出及び特徴付けの方法は、全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１４／１４４０３９に教示されているとおりに行うことができる。
【０８３８】
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素シーケンシング、電荷分布解析、ＲＮＡ不純物の検出、または上述の２つ以上の任意の組合せを用いて達成することができる。「特徴付け」は、例えば、ＲＮＡ転写物配列を決定すること、ＲＮＡ転写物の純度を決定すること、またはＲＮＡ転写物の荷電異質性を決定することを含む。そのような方法は、例えば、それぞれ内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１４／１４４７１１及び国際公開ＷＯ２０１４／１４４７６７に教示されている。
【０８３９】
実施例２：キメラポリヌクレオチド合成
本開示によれば、三リン酸化学を用いてキメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を接合するか、またはライゲートすることができる。１００ヌクレオチド以下の最初の領域または部分は、例えば、５’一リン酸及び末端の３’ｄｅｓＯＨまたはブロックされたＯＨを用いて化学的に合成される。この領域が８０ヌクレオチドよりも長い場合、これはライゲーション用の２本鎖として合成され得る。
【０８４０】
最初の領域または部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を使用して非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、５’一リン酸の変換と、その後の３’末端のキャッピングとが続くこともある。
【０８４１】
一リン酸保護基は、当技術分野で公知の任意の一リン酸保護基から選択することができる。
【０８４２】
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを用いて合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾キャップを有するプライマーを利用し得るＲＮＡポリメラーゼを含み得る。別法では、最大１３０ヌクレオチドのキャップを化学的に合成し、ＩＶＴ領域または部分に結合してもよい。一部の実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐである。
【０８４３】
ライゲーション方法については、ＤＮＡ  Ｔ４リガーゼでのライゲーション、続く、ＤＮアーゼでの処理で、鎖状体形成は容易に回避されるはずである。
【０８４４】
キメラポリヌクレオチド全体をリン酸−糖骨格で製造する必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分はリン酸−糖骨格を含み得る。
【０８４５】
次いで、ライゲーションを、任意の公知のクリックケミストリー、オルソクリックケミストリー、ソルリンク、または当業者に公知の他のバイオコンジュゲートケミストリーを使用して行う。
【０８４６】
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作製することができる。そのようなセグメントには以下が含まれる：
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップされ保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域及び正常な３’ＯＨを含んでよい、５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含むか、または３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テイル）のための５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）。
【０８４７】
合成（化学的またはＩＶＴ）後に、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピンで処理し、次いで、ピロホスファターゼで処理して、５’一リン酸を生成することができる。
【０８４８】
次いで、セグメント２（ＳＥＧ．２）を、ＲＮＡリガーゼを用いてＳＥＧ．３にライゲートすることができる。次いで、ライゲートしたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸を切断する。次いで、処理したＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３コンストラクトを精製することができ、ＳＥＧ．１を５’末端にライゲートする。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを行ってもよい。
【０８４９】
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲートされた、または接続されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表され得る。
【０８５０】
各ステップの収率は、９０〜９５％程度であり得る。
【０８５１】
実施例３：ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２×ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行うことができる。このシステムは、２×ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ１００ｎｇ、及び２５．０μｌに希釈したｄＨ２Ｏを含む。反応条件は９５℃で５分間であり得る。反応を、９８℃で２０秒間、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで終了まで４℃からなる２５サイクルで行うことができる。
【０８５２】
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造元の指示（最大５μｇ）に従って使用して、反応液をクリーンアップすることができる。より大きな反応は、より大きな対応能力を有する製品を使用するクリーンアップを必要とし得る。クリーンアップ後に、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を用いてｃＤＮＡを定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ｃＤＮＡが予想されるサイズであることを確認することができる。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡを配列決定分析にかける。
【０８５３】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、ＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。そのようなポリヌクレオチドは、化学修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドは、均一に修飾されたポリヌクレオチドであり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の特注混合物を利用する。ＮＴＰは、化学修飾ＮＴＰ、または天然及び化学修飾ＮＴＰの混合物、または天然ＮＴＰを含んでよい。
【０８５４】
典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、以下：
１）鋳型ｃＤＮＡ    １．０μｇ
２）１０×転写緩衝液（４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）    ２．０μｌ
３）特注ＮＴＰ（各２５ｍＭ）    ０．２μｌ
４）ＲＮアーゼ阻害剤    ２０Ｕ
５）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ    ３０００Ｕ
６）ｄＨ２Ｏ    最高２０．０μｌ、及び
７）３７℃で３時間〜５時間のインキュベーション
を含む。
【０８５５】
粗ＩＶＴ混合物を翌日のクリーンアップのために、４℃で一晩保存することができる。次いで、１ＵのＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼを、元の鋳型を消化するために使用することができる。３７℃で１５分間にわたってインキュベートした後に、ｍＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して精製することができる。このキットは、最高５００μｇのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後に、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析することができる。
【０８５６】
実施例５：酵素的キャッピング
ＲＮＡポリヌクレオチドのキャッピングを次のとおりに行い、その際、混合物は、ＩＶＴ  ＲＮＡ  ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏ最高７２μｌを含む。混合物を６５℃で５分間にわたってインキュベートして、ＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷に移す。
【０８５７】
次いで、プロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（１００Ｕ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ（最高２８μｌ）の混合と、６０μｇのＲＮＡでは３７℃で３０分にわたる、または１８０μｇのＲＮＡでは最高２時間にわたるインキュベーションとを含む。
【０８５８】
次いで、ＲＮＡポリヌクレオチドを、製造者の指示に従って、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して精製することができる。クリーンアップ後に、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して定量化し、アガロースゲル電気泳動により分析することができる。ＲＮＡポリヌクレオチド産物を、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するために、逆転写ＰＣＲを実行することにより、配列決定することもできる。
【０８５９】
実施例６：ポリＡテイル付加反応
ｃＤＮＡ中にポリＴがなければ、ポリＡテイル付加反応は、最終産物を洗浄する前に実施しなければならない。これは、キャップ化ＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ）、１０×テイル付加緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、最高１２３．５μＬのｄＨ２Ｏを混合することと、３７℃で３０分間にわたってインキュベートすることにより行う。ポリＡテイルが転写物に既に存在する場合、テイル付加反応をスキップし、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（最大５００μｇ）を用いるクリーンアップに直接進むことができる。ポリＡポリメラーゼは、酵母で発現する組換え酵素である。
【０８６０】
ポリＡテイル付加反応の進行性または完全性は、正確なサイズのポリＡテイルを常にもたらし得るわけではないことを理解すべきである。したがって、ほぼ４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５のポリＡテイルは、本開示の範囲内である。
【０８６１】
実施例７：天然５’キャップ及び５’キャップアナログ
ポリヌクレオチドの５’キャッピングを、製造者プロトコルに従って、５’−グアノシンキャップ構造を生成するために、以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応中に付随して完了させることができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、「Ｃａｐ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させることができる。Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成することができる。Ｃａｐ２構造を、Ｃａｐ１構造から生成し、続いて、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して、５’末端から３番目のヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することができる。Ｃａｐ３構造を、Ｃａｐ２構造から生成し、続いて、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して、５’末端から４番目のヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することができる。酵素は好ましくは、組換え供給源に由来する。
【０８６２】
一部の実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐである。
【０８６３】
哺乳類細胞にトランスフェクトする場合、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間を超える、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間を超える安定性を有する。
【０８６４】
実施例８：キャッピングアッセイ
タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示のキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４、及び／または３６時間目に、培養培地に分泌されたタンパク質の量を、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力を有するＣａｐ構造を有する合成ポリヌクレオチドに対応する。
【０８６５】
純度分析合成
本明細書に教示のキャップのいずれかを含有する、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動による単一のまとまったバンドを有するＲＮＡポリヌクレオチドは、複数のバンドまたはストリーキングバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドは、より高純度の産物にも対応する。より高い効率でのキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供する。
【０８６６】
サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有する、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後６、１２、２４、及び／または３６時間目に、培地に分泌されたＴＮＦ−α及びＩＦＮ−βなどの炎症誘発性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。より高レベルの炎症誘発性サイトカインの培地への分泌をもたらすＲＮＡポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに対応する。
【０８６７】
キャッピング反応効率
本明細書で教示するキャップのいずれかを含有する、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ処理後にＬＣ−ＭＳにより、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップ化ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチド及びＬＣ−ＭＳにより検出可能なキャップ化５’−５トリホスファートキャップ構造体の混合物を生じる。ＬＣ−ＭＳスペクトルでのキャップ化産物の量は、反応由来の総ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に対応する。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによると、より多量のキャップ化産物を有する。
【０８６８】
実施例９：修飾ＲＮＡまたはＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のＲＮＡポリヌクレオチド（２０μｌ体積中の２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、ウェル中の非変性１．２％のアガロースＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上に装填し、製造業者のプロトコルに従って、１２〜１５分間にわたって実行することができる。
【０８６９】
実施例１０：ナノドロップ修飾ＲＮＡ定量化及びＵＶスペクトルデータ
化学合成またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量化するためのＮａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ吸光度読み取りでは、ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドを使用する。
【０８７０】
実施例１１：リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤化
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを、細胞に添加する前に、ポリヌクレオチドをリピドイドと規定の比で混合することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために製剤化することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ製剤は、身体全体の循環を促進するために特別な成分の添加を必要とし得る。これらのリピドイドがｉｎ  ｖｉｖｏ研究に適する粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスは、出発点として使用することができる。粒子の形成後に、ポリヌクレオチドは、添加し、複合体を一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを使用して決定することができる。
【０８７１】
実施例１２：ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＢＣＢ４タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＢＣＢ４修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）コンストラクトをトランスフェクトした。４種のコンストラクトを調製した：ｍｏｄＲＮＡｌ（ｈＡＢＣＢ４、アイソフォーム１）、ｍｏｄＲＮＡ２（ｈＡＢＣＢ４、Ｃ末端フラグを含むアイソフォーム１）、ｍｏｄＲＮＡ３（ｈＡＢＣＢ４、Ｃ末端フラグを含むアイソフォーム２）、及びｍｏｄＲＮＡ４（ｍＡＢＣＢ４、Ｃ末端フラグを含む）。ウェスタンブロットを行って、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＢＣＢ４タンパク質の発現を確認し、結果を図１に示す。左側のゲルでは、ｈＡＢＣＢ４及びｍＡＢＣＢ４の両方を認識する抗ＡＢＣＢ４（Ｃ−２１９）を使用した。ｍｏｄＲＮＡ３（ヒトアイソフォーム２）及びｍｏｄＲＮＡ４（マウス）ＡＢＣＢ４コンストラクトの両方を見ることができた。対照的に、右側のゲルでは、ｈＡＢＣＢ４特異的である抗ＡＢＣＢ４抗体（Ｐ３ＩＩ−２６）を使用した。予測されたとおり、ｍｏｄＲＮＡ３（ヒトアイソフォーム２）のみが陽性であった。ｐＣ−ＤＮＡ３．ｌ−ｈＡＢＣＢ４コンストラクト及びＧＦＰを、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。
【０８７２】
図３に示されているとおり、ＨＥＫ２９３細胞に、コドン最適化ＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡコンストラクトもトランスフェクトした。コドン最適化ＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡコンストラクト（レーン５〜１８）は、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした場合に、初期ｍｏｄＲＮＡ（レーン２、コドン最適化なし）と比較してタンパク質発現において有意な改善を示した。
【０８７３】
実施例１３：ｍｄｒ２ノックアウトマウスモデルにおけるＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの評価
マウスｍｄｒ２  Ｐ−糖タンパク質遺伝子の均質な破壊が、胆汁からのリン脂質の完全な欠損をもたらし、最終的に、肝疾患をもたらすことが以前に示された（Ｃｅｌｌ，１９９３，７５：４５１−４６２）。胆汁の構成成分の研究において、野生型マウスと比較して、ｍｄｒ２ノックアウトマウスでは、スフィンゴミエリンのみが増加していることが見い出された。
【０８７４】
ｍｄｒ２ノックアウトマウスを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの作用を検査した。０時点目に、マウスに、ビヒクル（陰性対照）、ｅＧＦＰ（陽性対照）、ｍｏｄＲＮＡ３（ｈＡＢＣＢ４、１．０または２．０ｍｇ／ｋｇ）、またはｍｏｄＲＮＡ４（ｍＡＢＣＢ４、１．０または２．０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を与えた。２４または４８時間後に、胆汁を採取し、胆汁リン脂質含有量（すなわち、ホスホチジルコリン）について分析した。肝臓切片も採取し、タンパク質発現及び／または組織学を検査するために使用した。
【０８７５】
図２に示されているとおり、ｍｏｄＲＮＡコンストラクトで処置されたｍｄｒ２ノックアウトマウスは、有意に上昇したレベルの胆汁ホスファチジルコリンを有したが（ＰＢＳまたはｅＧＦＰ対照で処置されたｍｄｒ２ノックアウトマウスと比較した場合、２〜４倍の上昇）、しかしながら、そのレベルは、正常な生理学的レベルよりもまだ著しく低かった（ＷＴレベルの０．５％と同等にすぎない）。
【０８７６】
細胞ベースのモデルにおいてコドン最適化ｍｏｄＲＮＡの機能の改善を確認するために、本発明者らは、図３に示されているとおりにＨＥＫ２９３細胞に、コドン最適化ｍｏｄＲＮＡのセットをトランスフェクトし、細胞培養培地においてＡＢＣＢ４媒介リン脂質産出を測定した。機能性ＡＢＣＢ４は、リン脂質が細胞から出ることを可能にするので、細胞培養物へのリン脂質（ホスファチジルコリン）の分泌を、細胞培養培地からの脂質抽出を用いて測定した。コドン最適化ＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡコンストラクトは、ＨＥＫ２９３細胞においてホスファチジルコリン輸送活性の顕著な上昇を付与することが見い出された（図４、棒４〜１２及びｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ６、ｍｏｄＲＮＡ７、ｍｏｄＲＮＡ８、及びｍｏｄＲＮＡ９）。これらの結果に基づき、５種のｍｏｄＲＮＡをさらなる分析のために選択した（図４で矢印により示されている）。５種の選択されたコドン最適化ｍｏｄＲＮＡコンストラクトを、ｍｄｒ２ノックアウトマウスモデルを使用して分析した。
【０８７７】
０時点目に、マウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）、ｅＧＦＰ（対照ｍｏｄＲＮＡ）、ｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ６、ｍｏｄＲＮＡ７、ｍｏｄＲＮＡ８、及びｍｏｄＲＮＡ９の静脈内注射を０．５ｍｇ／ｋｇの投薬レベルで与えた。１２時間後に、胆汁を採取し、リン脂質含有量について分析した。１０体積のメタノールを胆汁試料に添加し、得られた混合物を５０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心して、追跡可能なタンパク質をすべて除去した。溶液１０μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳに装填して、ホスファチジルコリン種（３４：２）（ＰＣ）を分析した。
【０８７８】
図５に示されているとおり、コドン最適化ＡＢＣＢ４コンストラクトは、対照（ＰＢＳまたはｅＧＦＰ）と比較して、胆汁性ホスファチジルコリン産出において劇的な増加（ほぼ２０倍）をもたらし、得られた胆汁ＰＣ産出は、コドン最適化されていないＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡコンストラクトで処置されたマウスにおいて観察されたＷＴレベルに対して０．５％のみと比較して、野生型マウスの胆汁ＰＣ産出に対して５〜１０％に達した。
【０８７９】
Ａｂｃｂ４／ｍｄｒ２ノックアウトマウスにおけるｈＡＢＣＢ４の肝発現を検査した。Ａｂｃｂ４／ｍｄｒ２ノックアウトマウスに、ｍｏｄＲＮＡ  ｈＡＢＣＢ４（ｍｏｄＲＮＡ７）またはｅＧＦＰを投与した。野生型マウスを対照として使用した。図６のウェスタンブロットにおいて示されているとおり、ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの投与は、Ａｂｃｂ４ノックアウトマウスにおいてｈＡＢＣＢ４タンパク質の肝発現をもたらしたが、ｅＧＦＰ及び野生型の２種の対照は、なんの発現も示さなかった。
【０８８０】
得られたＡＢＣＢ４タンパク質の、肝細胞における場所を、免疫蛍光を使用して検査した。図７において示されているとおり、ＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞の小管領域でのＡＢＣＢ４タンパク質の発現をもたらした。
【０８８１】
コドン最適化ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡコンストラクトは、ｍｄｒ２ノックアウトマウスにおいて血清中総胆汁酸レベルを改善することも見い出された（図８）。
【０８８２】
ｍｏｄＲＮＡの種々の製剤を試験した。図９は、化合物３脂質ナノ粒子中で製剤化されたｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの単回注射後の、ｍｄｒ２ノックアウトマウスにおける胆汁ホスファチジルコリン産出の動態解析を示している。１フェーズ減衰解析は、ｈＡＢＣＢ４の機能半減期は、ほぼ２０時間であることを示唆した。同じマウスにおける血清中総胆汁酸レベルの動態解析は、注射から１２時間後に、有意な低下を示す（図１０）。上記コンストラクト（ｍｏｄＲＮＡ５）を２種の異なる脂質ナノ粒子（化合物１及び化合物３）中で製剤化した場合、上記ｍｏｄＲＮＡは、化合物１製剤において胆汁中のホスファチジルコリン産出の軽微だが、有意な改善を示す（図１１）。
【０８８３】
３種のｍｏｄＲＮＡ：ｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ７、及びｍｏｄＲＮＡ９を合成し、化合物１中で製剤化した。研究のために、マウス（１群当たりｎ＝３〜４）に、新たに製剤化されたｍｏｄＲＮＡ５、ｍｏｄＲＮＡ７、もしくはｍｏｄＲＮＡ９、またはｍｏｄＲＮＡ７の古い製剤（化合物３）の静脈内注射を投与した。注射から１２時間後に、胆汁を対象から採取し、リン脂質含有量を、ＬＣ／ＭＳを使用して測定した。
【０８８４】
図１２に示されているとおり、化合物１中で製剤化されたＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡは、胆汁ホスファチジルコリンの生理学的レベルの２０〜３０％の回復をもたらした（３４：２）。ＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡ処置はまた、すべての範囲のリン脂質分子種の回復をもたらした（データは図示せず）。
【０８８５】
新たなコンストラクトの有効性をＭｄｒ２ノックアウトマウスでも試験した（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のＭｄｒ２−／−マウスは、同じ変異を持つＦＶＢマウスと比較して、肝線維症、門脈高血圧、及び初期硬変の発生の加速を実証することが示されている（Ｉｋｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１５，１８５（２）：３２５−３４）。この研究では、マウスの処置を、化合物１脂質ナノ粒子中で製剤化されたｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡで、４週齢で開始した。処置プロトコルは２週間続いた。マウスに、０、３、７、１０、及び１３日目に静脈内注射した（１ｍｇ／ｋｇ）。次いで、マウスを１４日目に屠殺した。血清及び肝臓の両方を採取した。図１３に示されているとおり、Ｍｄｒ２ノックアウトマウスでは、ホスファチジルコリンのより高いレベルの回復があった。加えて、ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡでのｍｄｒ２ノックアウトマウスの処置は、血清中総胆汁酸レベルの有意な低下をもたらした（図１４）。また、図１５Ａ〜１５Ｃに示されているとおり、上記処置は、体重（図１５Ａ）、肝臓酵素（図１５Ｂ）、及び、門脈血圧（図１５Ｃ）の有意な改善をもたらした。
【０８８６】
線維症の進行も分析した。肝臓試料をシリウスレッド染色（組織の結合について）にかけ、コラーゲン含有量を分析した。結果は図１６に示されている。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）も試料で行った。肝線維症及び炎症の様々なマーカーを検査した。結果は図１７に示されている。肝線維症をさらに、免疫組織化学的染色を使用して分析した。具体的には、硬化性胆管炎の指標であるＣＫ−１９（サイトケラチン１９）、及びＫｉ−６７（細胞増殖のマーカー）、及びαｖβ６（線維症の別の重要なマーカーである上皮特異的インテグリン）を使用した。アルファ−平滑筋アクチン（アルファ−ＳＭＡ）も、線維症のマーカーとして使用した。結果は、図１８Ａ〜１８Ｂに示されている。本発明者らは、炎症マーカーＦ４／８０（好酸球用）及びＣＤ１１ｂ（白血球用）も検査して、炎症及び免疫細胞浸潤に対するｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの作用を示した。結果は、Ｈ＆Ｅ染色と一緒に、図１８Ｃに示されている。本発明者らのデータは、ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの反復投与が、線維症の進行及び肝炎症の両方を有意に改善したことを示唆している（図１８Ａ〜１８Ｃ）。図１９は、ｈＡＢＣＢ４  ｍｏｄＲＮＡの複数回の注射が、小管領域におけるｈＡＢＣＢ４  タンパク質の発現を改善したことを示している。
【０８８７】
実施例１４：胆汁酸塩輸送タンパク質（ＢＳＥＰ）活性の特徴付け
ＢＳＥＰ活性を検査するために、研究を行った。初めに、ヒトＢＳＥＰの半減期を、内因性ＢＳＥＰ発現をノックアウトすることにより改変されたＨｅｐａＲＧ細胞において決定した。キャピラリー電気泳動を使用して、検出のために抗ＡＢＣＢ１１を用いて、タンパク質レベルを測定した。結果は図２３に示されている。
【０８８８】
別の研究では、ＨｅｐＲＧ細胞をチャンバースライド上に７日間にわたってプレーティングした。７日目に、細胞に、ＧＦＰ及びｈＡＢＣＢ１１  ｍＲＮＡを７日目にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、４％ＰＦＡを用いて８日目（トランスフェクション後２４時間目）に固定し、免疫細胞化学を、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｘで、ＶＥＣＴＡＦＬＵＯＲ（商標）Ｅｘｃｅｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）５９４抗ウサギＩｇＧキットを用いて行った。結果の代表的な画像が図２５に示されている。実験により、ＢＳＥＰがトランスフェクトされた細胞に存在することが確認された。
【０８８９】
ＢＳＥＰ活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。滴定ＴＣＡを、対照（ＧＦＰ）及び発現ＢＳＥＰ（ｍＡＢＣＢ１１及びｈＡＢＣＢ１１）の存在下で測定した。図２４の下のパネルに示されているとおり、ｈＡＢＣＢ１１及びｍＡＢＣＢ１１の両方が、対照（ＧＦＰ）と比較して、トランスフェクション後少なくとも４日は胆汁酸を減少させた。
【０８９０】
ＢＳＥＰ活性も、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。野生型マウスに、ｈＡＢＣＢｌ１  ｍｏｄＲＮＡを投与した。投与から２４または４８時間目に、対象の肝臓を取り出し、ｈＡＢＣＢ１１についてアッセイした。図２６に示されているとおり、２４時間ＢＳＥＰ群が、他の実験群と比べて最大の応答を有した。
【０８９１】
図２７は、免疫染色画像を示しており、これは、マウスにおける通常食での、及びモデル誘導コール酸（ＣＡ）食でのタンパク質発現を示している。タンパク質は膜と会合し、発現は、コール酸給餌マウスで増加することが見い出されたことに注意されたい。
【０８９２】
特定の実施形態の上述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするので、他の者は、当業者の技能範囲内の知識を適用することにより、本発明の一般的な概念を逸脱することなく、過度な実験をすることなく、種々の用途にむけてそのような特定の実施形態を容易に修正し、及び／またはこれらに適合させることができる。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示の教示及び指導に基づいて、開示された実施形態の意味の範囲及びその均等物の範囲内にあるものとする。本明細書の語法または用語は、本明細書の用語または語法が教示及び指導に照らして当業者により解釈されるように、説明のためのものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の広がり及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではないが、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。
【０８９３】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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