(57)【要約】  本発明は、非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関し、スフィンゴミエリンの含有量が正常対照群に比べて１．３倍以上である場合、非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加したと判断できるので、これを重症度診断又は予後測定に効果的に用いることができる。【選択図】  図４
2022502685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体から分離された生物学的試料のスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ；ＳＭ）の含有量を測定する測定段階を含む非アルコール脂肪肝疾患（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【請求項２】
前記スフィンゴミエリンは、飽和スフィンゴミエリンである、請求項１に記載の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【請求項３】
前記測定段階において飽和スフィンゴミエリンの含有量が正常対照群試料に比べて１．３倍以上であれば、検体の非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加したと判断する危険度判断段階をさらに含む、請求項２に記載の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【請求項４】
前記検体は、体質量指数（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ；ＢＭＩ）が２５未満のものである、請求項１に記載の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【請求項５】
前記検体は、アジア人のものである、請求項１に記載の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【請求項６】
前記生物学的試料は、血清又は血漿である、請求項１に記載の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保健福祉部の支援下で課題番号１４６５０２５６９９としてなされたものであり、該課題の研究管理専門機関は保健産業振興院、研究事業名は“疾患克服技術開発”、研究課題名は“大規模韓国人非アルコール脂肪肝前向コホートで肝病理組織所見による糞便内マイクロバイオームと血清代謝体分析”、主管機関はソウル特別市ボラメ病院、研究期間は２０１８．０１．０１〜２０１８．１２．３１である。
【０００２】
本特許出願は、２０１８年１０月２６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１８−０１２９１９０号に対して優先権を主張し、この特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００３】
本発明は、非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関し、より詳細には、飽和スフィンゴミエリンの含有量を測定し、非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度増加の有無を確認する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）は、肝脂肪症と呼ばれる肝臓の中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ；ＴＧ）の異常蓄積に起因し、時には非アルコール脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と関連線維化に進行するこがある。肝臓ＴＧの過度な蓄積がＮＡＦＬＤを開始することが知られているが、脂肪性肝で蓄積される脂質クラスの特定類型、量及びＮＡＦＬＤの進行に対する脂質変化の影響は完全に特性化されていない。大部分の脂質には重要な生物学的活性があるため、脂質学的プロファイリング接近法は、ＮＡＦＬＤの病因に対する理解を助ける有用な情報を提供する。
【０００５】
肥満とインスリン抵抗性はＮＡＦＬＤ及び第２型糖尿病のような代謝症候群の主要危険因子である。しかし、ＮＡＦＬＤ患者の相当数は、ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ２の比較的低い体質量指数を示し、インスリン抵抗性が比較的低く維持される。ＮＡＦＬＤは肥満と密接な関連があるため、以前のメタボロミクス研究は、ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ２以上である肥満の白人男性成人に焦点を合わせている。
【０００６】
しかしながら、より健康な代謝プロファイルを有する痩せたＮＡＦＬＤ患者の場合、過体重又は肥満グループのＮＡＦＬＤ患者と比較して相変らず全体死亡率が増加した。したがって、ＮＡＦＬＤを持つ非肥満及び肥満患者の代謝的差異に対するより良い認識は、ＮＡＦＬＤの様々な表現型と進行度に基づく精密医学及びオーダーメイド治療法の開発に決定的に重要である。
【０００７】
ＢＭＩ＜３０ｋｇ／ｍ２未満である西欧の非肥満性ＮＡＦＬＤ患者の血中代謝体プロファイルを提示した研究があるが、世界専門家会議（ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ；ＷＨＯ）は、アジア人口に対するＷＨＯ  ＢＭＩ基準値を国際分類とは異ならせて採択しなければならないと勧告した。
【０００８】
非肥満（ＢＭＩ≦２５ｋｇ／ｍ２）と肥満（ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ２）において血清代謝産物の明確な差異が発見されたが、肥満及び非肥満ＮＡＦＬＤ被験者から組織学的に確認された非アルコール脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とＮＡＳＨ間の差異は、更なる確認が必要な状況である。
【０００９】
したがって、非肥満及び肥満の成人アジア系患者から得た血清を用いて、ＮＡＦＬＤの組織学的重症度による血中脂質分布の変化を総合的に調べる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、非肥満性非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）患者の血清中のスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ；ＳＭ）含有量を測定することによって組織学的重症度を診断することができるということを実証した。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、検体から分離された生物学的試料のスフィンゴミエリンの含有量を測定する測定段階を含む非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、スフィンゴミエリン測定値の非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供用途に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関し、本発明に係る方法は、患者の血清中のスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ；ＳＭ）含有量を測定し、非アルコール脂肪肝疾患（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の重症度に関連した危険度増加の有無が確認できることを示す。
【００１４】
本発明者らは、飽和スフィンゴミエリンの量が正常血清に比べて１．３倍以上であれば非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加したものであることを導出した。
【００１５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一様態は、検体から分離された生物学的試料のスフィンゴミエリンの含有量を測定する測定段階を含む非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法である。
【００１６】
本発明において、前記スフィンゴミエリンは、飽和スフィンゴミエリンでよい。
【００１７】
本発明において、前記方法は、測定されたスフィンゴミエリンの含有量が正常対照群試料に比べて１．３倍以上であれば、検体の非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加していると判断する危険度判断段階をさらに含んでよい。
【００１８】
本明細書において、検体の体質量指数が２５未満の場合は非肥満として、検体の体質量指数が２５以上の場合は肥満として区別した。
【００１９】
本発明において、前記検体は、体質量指数（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ；ＢＭＩ）が２５未満であるものでよい。本発明の一具現例において、体質量指数が２５未満である非肥満群の場合、特定飽和ＳＭが非アルコール脂肪肝の発生の他にＮＡＳＨへの進行にも大きな役割を担当しているが、体質量指数が２５以上の肥満群では、このような現象が確認されなかったためである。
【００２０】
本発明において、前記検体はアジア人のものでよい。西欧の非肥満性ＮＡＦＬＤ患者の血中代謝体プロファイルを提示した研究が公知されたことがあるが、ＷＨＯではアジア人口に対するＷＨＯ  ＢＭＩ基準値を国際分類とは異ならせて採択しなければならないと勧告したためである。
【００２１】
本発明において、“アジア人”とは、中国、モンゴル、台湾、シンガポール、韓国、日本、ベトナム、カンボジア、ラオス、ミャンマー、タイ、マレーシア、インドネシア、及びフィリピンの本土の人々に起源する人を意味する。
【００２２】
本発明において、前記生物学的試料は、血清又は血漿でよい。
【００２３】
本発明の一具現例において、体質量指数が２５未満である非肥満アジア人の患者から分離された血清から、飽和スフィンゴミエリンの含有量を測定し、正常対照群試料に比べて１．３倍以上増加した場合、非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加していると判断できる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関し、スフィンゴミエリンの含有量が正常対照群に比べて１．３倍以上である場合、非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度が増加していると判断できるので、これを重症度診断又は予後測定に効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】非肥満患者に対する、非アルコール脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）／非−非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏ−ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ｎｏ−ＮＡＦＬＤ）による脂質種の倍率変化を示すグラフである。
【図１Ｂ】非肥満患者に対する、非アルコール脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）／ＮＡＦＬによる脂質種の倍率変化を示すグラフである。
【図１Ｃ】肥満患者に対する、ＮＡＦＬ／ｎｏ−ＮＡＦＬＤによる脂質種の倍率変化を示すグラフである。
【図１Ｄ】肥満患者に対する、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬによる脂質種の倍率変化を示すグラフである。
【図２Ａ】アシル鎖（ａｃｙｌ  ｃｈａｉｎ）の長さ及び不飽和度によるジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＤＡＧ）含有量の変化を示すグラフである。
【図２Ｂ】アシル鎖（ａｃｙｌ  ｃｈａｉｎ）の長さ及び不飽和度によるトリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＴＡＧ）含有量の変化を示すグラフである。
【図３】非肥満グループと肥満グループに対してＮＡＦＬ／ｎｏ−ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ／ＮＡＦＬ間のスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ；ＳＭ）含有量の変化を示すグラフである。
【図４】ＳＭ含有量と代謝危険因子及び肝組織学的重症度との相関関係を示すスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の相関関係ヒートマップである。
【図５Ａ】非肥満グループで脂肪症における等級別飽和スフィンゴミエリンの含有量を示すグラフである。
【図５Ｂ】非肥満グループで小葉内炎症における等級別飽和スフィンゴミエリンの含有量を示すグラフである。
【図５Ｃ】非肥満グループで風船様変形における等級別飽和スフィンゴミエリンの含有量を示すグラフである。
【図５Ｄ】非肥満グループで線維化における等級別飽和スフィンゴミエリンの含有量を示すグラフである。
【図６Ａ】飽和スフィンゴミエリンの組成を用いた脂肪症の肝組織学的予測可能性を示すグラフである。
【図６Ｂ】飽和スフィンゴミエリンの組成を用いた小葉内炎症の肝組織学的予測可能性を示すグラフである。
【図６Ｃ】飽和スフィンゴミエリンの組成を用いた風船様変形の肝組織学的予測可能性を示すグラフである。
【図７】非肥満（青色曲線）及び肥満（赤色曲線）群においてＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０とアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＡＬＴ）及びガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＧＴ）の組合せによるＮＡＦＬＤの組織学的重症度診断能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、検体から分離された生物学的試料からスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ；ＳＭ）の含有量を測定する測定段階を含む非アルコール脂肪肝疾患（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関する。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：研究参加者の基本特性
表１及び表２に示すように、被験者はＢＭＩによって非肥満（＜２５）と肥満（≧２５）とに分類されている（ＤＭ（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ、糖尿）、ＭＳ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、代謝症候群）、ｈｓＣＲＰ（高感度Ｃ反応性タンパク質）、ＦＰＧ（ｆａｓｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ、空腹時血糖値）、ＴＣ（ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、総コレステロール）、ＨＤＬ−Ｃ（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、高密度脂質タンパクコレステロール））。
【表１】
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【表２】
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【００２９】
表１及び表２から確認できるように、非肥満グループと肥満グループの両方において、ＮＡＦＬＤの組織学的重症度にしたがって血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）及びガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＧＴ）の含有量を段階的に上昇させた。
【００３０】
総３６１人（平均５３±１４歳、男性４８．５％）のうち２９５人は、生検による診断がＮＡＦＬＤであり、６６人は代謝的に健康な対照群（Ｎｏ−ＮＡＦＬＤ群）であった。Ｎｏ−ＮＡＦＬＤ群は、脂肪肝の臨床的、生化学的、放射線学的又は組織学的証拠がなかった。非肥満患者のうち、８２人はＮＡＦＬＤで、４８人は対照群であった。肥満グループでは２１３人がＮＡＦＬＤで、１８人は対照群であった。
【００３１】
ＢＭＩと肝組織学所見（非ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨ）に基づき、研究対象者は非肥満／非ＮＡＦＬＤ；非肥満／ＮＡＦＬ；非肥満／ＮＡＳＨ；肥満／非ＮＡＦＬＤ；肥満／ＮＡＦＬ；及び肥満／ＮＡＳＨの６グループに区別した。ＮＡＦＬＤの組織学的重症度が増加するほど非肥満及び肥満グループにおいてＢＭＩ、ウェイストサイズ、ＶＡＴ面積（内臓脂肪量）、ａｄｉｐｏ−ＩＲ（脂肪組織インスリン抵抗性）、ＨＯＭＡ−ＩＲ（インスリン抵抗性）、ＨｂＡ１ｃ（糖化ヘモグロビン）、空腹時血糖値、ＴＧ（中性脂肪）、ＨＤＬ−コレステロール、糖尿病有病率及び代謝症候群の頻度が増加した（表１）。
【００３２】
実施例２：ＵＰＬＣ／Ｑ  ＴＯＦ−ＭＳに基づく血清脂質特性
生検によりＮＡＦＬＤと診断され且つＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２未満である被験者（‘ボラメＮＡＦＬＤコホート’（ＮＣＴ０２２０６８４１））を、非肥満ＮＡＦＬＤ被験者と定義した。対照群は、生体供与者肝移植の評価における肝生検から決定され、腹部画像検査に基づく肝腺腫又は限局性結節性過形成と疑われる固形肝腫塊の特性分析から、ＮＡＦＬＤがないことが確認された。
【００３３】
ＮＡＦＬＤは、組織学的検査によって確認された５％以上の大滴性脂肪変性の存在と定義された。ＮＡＳＨは、ＮＡＳＨ−ＣＲＮ（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｎｅｔｗｏｒｋ）の組織学的基準に基づいて診断された：脂肪症、小葉内炎症、風船様変形又は線維化からなる組織学的肝損傷の全般的なパターンを、ＮＡＦＬＤ活動点数体系によって等級を指定した。
【００３４】
内臓脂肪量の定量のために内臓脂肪組織面積（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｅａ；ＶＡＴ）を測定した。ＨＯＭＡ−Ｂを用いて全身インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）とベータ−細胞機能（ＨＯＭＡ−β）を評価し、脂肪組織インスリン抵抗性（ａｄｉｐｏ−ＩＲ）も計算した。代謝症候群は、国際コレステロール教育プログラム成人治療パネルＩＩＩ（ＮＣＥＰ−ＡＴＰ  ＩＩＩ）基準によって定義された。
【００３５】
３６１人の研究対象の血清をＵＰＬＣ／Ｑ  ＴＯＦ−ＭＳに基づくグローバル脂質プロファイリングによって分析し、２２４個の脂質代謝産物を種々の標準物質とＨＭＤＢ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ｗｗｗ．ｈｍｄｂ．ｃａ）、ＭＥＴＬＩＮ（ｍｅｔｌｉｎ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ）及びＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ（ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｍａｐｓ．ｏｒｇ）のようなオンラインデータベースを用いて確認した。
【００３６】
ＵＰＬＣ／ＱＴＯＦ−ＭＳ（超高パフォーマンス液体クロマトグラフィー／四重極飛行時間型質量分析；ｕｌｔｒａ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析のためのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）−ＭＳ（質量分析）−等級溶媒は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。アンモニウムアセテート及び脂質標準物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００３７】
全ての脂質等級の脂質学的プロファイルには、遊離脂肪酸（ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；ＦＦＡ）；グリセロ脂質（ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＤＡＧ）及びトリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＴＡＧ））；グリセロリン脂質（リゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＬＰＥ）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；ＰＩ）；及びスフィンゴ脂質（セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ；Ｃｅｒ）及びＳＭ）を含む。非肥満及び肥満患者に対するＮＡＦＬ対非ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ対ＮＡＦＬの脂質種の倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）を、図１に示す。
【００３８】
図１から確認できるように、ＤＡＧ、ＴＡＧ、ＳＭのようないくつかの脂質種は、非肥満及び肥満成人ＮＡＦＬＤ患者においてＮＡＦＬＤの組織学的重症度にしたがって特徴的な変化パターンを示している。
【００３９】
特に、非肥満群に比べて肥満群において血中グリセロ脂質の、正常肝（非ＮＡＦＬＤ）対比ＮＡＦＬの含有量（濃度）比が有意に高かったが、ＮＡＦＬ対比ＮＡＳＨの含有量比は大差がなかった。一方、一部の特定飽和ＳＭでは、非肥満群においてのみ、血中ＳＭの、正常肝（非ＮＡＦＬＤ）対比ＮＡＦＬの含有量比とＮＡＦＬ対比ＮＡＳＨの含有量比が有意に高く、肥満群では統計的な差異が見られなかった。
【００４０】
このことから、肥満群において、非アルコール脂肪肝の発生に血中グリセロ脂質の役割が重要であるが、ＮＡＳＨへの進行には大きな役割がないか、却ってトリアシルグリセロールの場合は予防的保護役割を担うことが確認できる。
【００４１】
これに対し、非肥満群では、特定飽和ＳＭが非アルコール脂肪肝の発生の他にＮＡＳＨへの進行にも大きな役割を担当するが、肥満群ではこのような現象が確認できなかった。
【００４２】
実施例３：ＮＡＦＬＤ重症度によるＤＡＧ及びＴＡＧ変化
５０ｕＬの各血清サンプルを、５００ｕＬのクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）に混合した。４℃で１３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、下層の脂質相３００ｕＬを収集し、溶媒を室温で軟らかい窒素流れの下で除去した。乾燥抽出物を、イソプロパノール／アセトニトリル／水混合物（２：１：１，ｖ／ｖ／ｖ）２５０ｕＬで再構成した。その後、４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層液を、四重極飛行時間型質量分析（ＱＴＯＦ−ＭＳ）と結合したＵＰＬＣ（ＡＣＱＵＩＴＹＴＭＵＰＬＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いる脂質分析のためにバイアルに移し、ＱＴＯＦ−ＭＳを用いて測定することができた。
【００４３】
カラムオーブンと自動サンプラー温度は、それぞれ、４０℃と４℃に保たれた。サンプルをＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１ｕｍ×１．７ｍｍ粒子、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて溶離及び分離した。ＬＣ移動相は、アセトニトリル／水混合物（４：６，ｖ／ｖ）中１０ｍＭアンモニウムアセテート（溶媒Ａ）及びアセトニトリル／イソプロパノール混合物（１：９，ｖ／ｖ）中１０ｍＭアンモニウムアセテート（溶媒Ｂ）で構成された。勾配溶出は、４０％  Ｂから始まって５分後に６５％  Ｂに増加した後、Ｂ成分が９９％１０分まで増加し続けた。
【００４４】
組成物を９９％  Ｂで２分間維持した。１７分後に初期状態に戻し、平衡状態になるまで３分間維持した。流速は、３５０ｕＬ／ｍｉｎに設定した。５ｕＬの脂質抽出物をＵＰＬＣ／ＱＴＯＦ−ＭＳシステムに注入した。
【００４５】
全サンプルを同一量で集めて品質管理（ＱＣ）サンプルを生成した。ソルベントブランク及びＱＣサンプル注入は、分析再現性を評価するために、１２個のサンプル間で行われた。ハイブリッドＱＴＯＦ装備とＤｕｏＳｐｒａｙイオンソースが装着されたＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，Ｃａｎａｄａ）を用いて陽イオン及び陰イオンモードを各サンプルに適用した。質量範囲は、ｍ／ｚ  ５０〜１５００に設定された。
【００４６】
作動のために次のパラメータが用いられた：イオンスプレー電圧５５００Ｖ、ソース温度５００℃、噴霧器圧力５０ｐｓｉ、乾燥ガス圧力６０ｐｓｉ、カーテンガス３０ｐｓｉ、デクラスタリング電位９０Ｖ、そしてイオンに対するＭＳ／ＭＳスペクトルを得るために情報依存的獲得（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ；ＩＤＡ）が用いられた。
【００４７】
ＭＳ／ＭＳスペクトルを得るために、衝突エネルギー及び衝突エネルギースプレッドはそれぞれ、４０Ｖ及び１５Ｖに調整された。質量正確度は、ＤｕｏＳｐｒａｙイオンソースとインターフェースされた自動キャリブレーション伝達システム（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）で維持された。脂質代謝産物は、オンラインデータベース（ＤＢ、ＨＭＤＢ、ＭＥＴＬＩＮ、ＬＩＰＩＤ  ＭＡＰＳ）及び標準化合物のデータと一致する使用可能な情報（正確な質量、断片イオン及び／又は保持時間）によって確認された。
【００４８】
ＤＡＧ及びＴＡＧ種を含むグリセロ脂質の明確な増加が非肥満及び肥満グループの両方から観察され、ＮＡＦＬからＮＡＳＨに段階的に増加した。アシル鎖長、不飽和度、倍変化及びｐ−値を有するＤＡＧ及びＴＡＧ含有量の差異をバブルプロットを用いて視角化した。
【００４９】
バブルプロットは、組織学的サブグループを比較して、鎖長、不飽和度、倍変化、及びＤＡＧ及びＴＡＧのｐ−値間の関係を示した。ｙ軸は不飽和度を表し、ｘ軸に関連したバブルの位置は、鎖の長さに該当する。バブルの色は倍率変化を表し、バブルの大きさは、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正を用いてマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ−検定から得たｐ−値を表している。
【００５０】
図２Ａから確認できるように、ＤＡＧ含有量の変化は、様々な組織学的サブグループ間の特異なパターンを示した。相対的に短い鎖及び低い不飽和度を有するＤＡＧの含有量は、肥満に関係なくＮＡＦＬ対ＮＡＦＬＤにおいて統計的に増加した。対照的に、長い鎖及び高度な不飽和度を有するＤＡＧの含有量は、肥満グループのＮＡＳＨ対ＮＡＦＬにおいて有意に減少した。
【００５１】
図２Ｂから確認できるように、ＴＡＧ含有量の変化は、ＤＡＧ含有量の変化に似た傾向を示した。統計的有意性及び倍率変化は弱化したが、鎖長及び不飽和度が若干変化した。
【００５２】
ＤＡＧ及びＴＡＧ種を含むグリセロ脂質は、アシル鎖の長さ及び不飽和度によって影響を受ける特有の変化されたパターンを示した。また、組織学的重症度に基づくグリセロ脂質の変化パターンは、非肥満グループと肥満グループにおいて差異があった。結果的に、非肥満ＮＡＦＬＤ患者に比べて、組織学的重症度によって分類された循環ＤＡＧ及びＴＡＧの倍率変化が、肥満ＮＡＦＬＤにおいてより大きかった。
【００５３】
特に、非肥満群に比べて肥満群において血中グリセロ脂質の正常肝（非ＮＡＦＬＤ）対比ＮＡＦＬの含有量（濃度）比が有意に高かったが、ＮＡＦＬ対比ＮＡＳＨの含有量比は大差がなかった。
【００５４】
このことから、肥満群において非アルコール脂肪肝の発生に血中グリセロ脂質の役割が重要であるが、ＮＡＳＨへの進行には大きく働かないか、却って生物学的不活性化物質であるトリアシルグリセロールは、予防的保護の役割を担う無害な脂質であることが確認できた。
【００５５】
実施例４：ＮＡＦＬＤの重症度による代謝症候群の変化と肝組織と肝組織学との連関性
ＮＡＦＬＤの組織学的重症度による代謝症候群の強度の差異は、非肥満グループと肥満グループの両方で見られた。棒グラフで有意な差異点は星印（＊   Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ 補正を適用したマン・ホイットニーのＵ検定、＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、及び＊＊＊  ｐ＜０．００１）で表示した。
【００５６】
図３から確認できるように、興味深いことに、ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０を含む飽和ＳＭの含有量は、非肥満グループのＮＡＦＬ／ｎｏ−ＮＡＦＬＤグループにおいて１．３倍以上と著しく増加した。対照的に、肥満に関係なく、４２炭素以上の長い鎖長を含有するＳＭの含有量は、ＮＡＦＬ／ｎｏ−ＮＡＦＬＤグループにおいて減少した。
【００５７】
肥満グループにおいてＳＭ  ｄ３４：０、ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０のような飽和ＳＭの含有量は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬにおいて有意に増加したが、ＮＡＦＬ／ｎｏ−ＮＡＦＬＤでは有意でなかった。
【００５８】
ＮＡＦＬＤの重症度及び肥満に関連した飽和ＳＭ含有量の差異は、代謝危険因子及び肝組織学との相関関係からも確認された。スピアマンの相関関係ヒートマップは、非肥満及び肥満グループの代謝症候群危険因子又は肝組織学とＳＭの相関関係を示した。統計的有意性は、星印（＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、及び＊＊＊  ｐ＜０．００１）で表示される。内臓脂肪（ＶＡＴ）；糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）；脂肪組織のインスリン耐性（脂肪組織−ＩＲ）；インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）；ホメオスタシスモデルアセスメント−ベータ指数（ＨＯＭＡ−β）；小葉内炎症（ＬＩ）。
【００５９】
図４から確認できるように、ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０、及びＳＭ  ｄ４０：０の含有量は、非肥満グループにおいてＶＡＴ領域、ａｄｉｐｏ−ＩＲ及びＨＯＭＡ−ＩＲと有意な正の相関関係を示し、肥満グループにおいてａｄｉｐｏ−ＩＲ及びＨＯＭＡ−ＩＲと正の相関関係を示した。さらに、飽和ＳＭ含有量は、非肥満グループにおいて脂肪症、風船様変形及び小葉内炎症の重症度と強い相関関係を示した。しかし、肥満グループでは脂肪症だけが飽和脂肪濃度と正の相関関係を示した。
【００６０】
次に、ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０を含む飽和ＳＭ種の含有量が脂肪症、及び小葉内炎症の存在及び重症度により変更されたか否かを確認した。ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０の強度は、脂肪症（Ａ；０−３）、小葉内炎症（Ｂ；０−３）及び風船様変形（Ｃ；０−２）、非肥満被験者では線維化（Ｄ；０−４）がなかった。データは、平均±標準偏差で表現した。有意な差は、星印（ヨンキー・テラプストラ検定（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ  ｔｅｓｔ）、＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１及び＊＊＊  ｐ＜０．００１）で表示した。
【００６１】
図５から確認できるように、ヒートマップに見られたのと同様に、飽和ＳＭ含有量は、等級による脂肪症、小葉内炎症、風船様変形及び線維化の重症度によって、特に非肥満患者において著しく増加した。これに対し、肥満患者の飽和ＳＭ含有量は、脂肪症等級測定の場合を除けば、ＮＡＦＬＤの組織学的重症度の測定と関連して段階的に増加しなかった。線維症段階はまた、肥満に関係なく、飽和ＳＭ含有量と段階的な連関性がなかった。
【００６２】
飽和ＳＭ含有量は、肥満のＮＡＦＬ及びＮＡＳＨよりは非肥満患者におけるＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの診断性能を向上させるのに有用であり、非肥満成人ＮＡＦＬＤ患者に特に不要な肝生検を予防することができる。
【００６３】
実施例５：循環飽和ＳＭ含有量を用いた非肥満ＮＡＦＬＤ予測
前記飽和ＳＭ含有量（ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０）の組合せの診断性能を評価してＮＡＦＬＤの組織学的重症度を予測するために、９５％  ＣＩを有するＡＵＲＯＣを、非肥満グループと肥満グループとに分けて表３及び図６に示した。
【表３】
2022502685.tif 000005
【００６４】
図６Ａから確認できるように、非肥満グループにおいて脂肪症１、２及び３（Ｓ１−３）に対するＡＵＲＯＣは、０．７２０、０．７６８及び０．８０４であった。肥満グループにおいてＳ１、Ｓ２及びＳ３のＡＵＲＯＣは、０．７２２、０．６５６及び０．７３３であった。
【００６５】
図６Ｂから確認できるように、小葉内炎症の場合、非肥満グループにおいて小葉内炎症に対するＡＵＲＯＣは、０．６１３（点数１）及び０．８２１（点数２）であり、ＡＵＲＯＣは肥満グループにおいて０．５４１及び０．６１４であった。
【００６６】
図６Ｃから確認できるように、風船様変形の場合、非肥満グループにおいて風船様変形に対するＡＵＲＯＣは、０．７０９（点数１）及び０．７８４（点数２）であった。肥満グループにおいて点数１と２のＡＵＲＯＣはそれぞれ、０．５６７及び０．５５１であった。
【００６７】
全般的に、非肥満グループの組織学的重症度に基づくＲＯＣ曲線は、肥満グループに比べて有意に高いＡＵＲＯＣを示した。
【００６８】
図７から確認できるように、ＮＡＦＬＤのない患者においてＮＡＳＨ又はＮＡＦＬを持つ対象を効果的に区別するために、ＡＵＲＯＣは、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＧＧＴ含有量（モデル１）又は飽和ＳＭ（ＳＭ  ｄ３６：０、ＳＭ  ｄ３８：０及びＳＭ  ｄ４０：０）をＡＳＴ、ＡＬＴ及びＧＧＴ含有量（モデル２）の組合せで調整した。ＡＵＲＯＣのペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較のためのＰ−値は、ＤｅＬｏｎｇテストを用いて提供した。
【表４】
2022502685.tif 000006
【００６９】
表４から確認できるように、非肥満グループにおいてＮＡＦＬＤとＮＡＦＬを比較したモデル１及びモデル２のＡＵＲＯＣは、０．７２０及び０．８３３（ＡＵＲＯＣｓ比較時にｐ＝０．０１１）であった。血清飽和ＳＭが血清ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＧＧＴの組合せに追加されるとき、非肥満グループにおいてＮＡＦＬ及びＮＡＳＨを区別する診断性能は有意に向上した。
【００７０】
ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨを比較したモデル１とモデル２のＡＵＲＯＣにおいて０．８２３及び０．９１４（ＡＵＲＯＣｓ比較時にｐ＝０．０３３）であった。肥満グループにおいてＮＡＦＬＤ及びＮＡＦＬを比較したモデル１及びモデル２のＡＵＲＯＣは、０．７８５及び０．７８１であった（ＡＵＲＯＣｓ比較時にｐ＝０．８６６）。ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨを比較したモデル１及びモデル２のＡＵＲＯＣは、０．９２８及び０．９６０（ＡＵＲＯＣｓ比較のためのｐ＝０．０５９）であった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、非アルコール脂肪肝疾患の組織学的重症度診断又は予後測定に関する情報提供方法に関し、より詳細には、飽和スフィンゴミエリンの含有量を測定して非アルコール脂肪肝疾患の重症度に関連した危険度増加の有無を確認する方法に関する。
【図１Ａ】
2022502685.tif 000007
【図１Ｂ】
2022502685.tif 000008
【図１Ｃ】
2022502685.tif 000009
【図１Ｄ】
2022502685.tif 000010
【図２Ａ】
2022502685.tif 000011
【図２Ｂ】
2022502685.tif 000012
【図３】
2022502685.tif 000013
【図４】
2022502685.tif 000014
【図５Ａ】
2022502685.tif 000015
【図５Ｂ】
2022502685.tif 000016
【図５Ｃ】
2022502685.tif 000017
【図５Ｄ】
2022502685.tif 000018
【図６Ａ】
2022502685.tif 000019
【図６Ｂ】
2022502685.tif 000020
【図６Ｃ】
2022502685.tif 000021
【図７】
2022502685.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月31日(2021.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
図６Ａから確認できるように、非肥満グループにおいて脂肪症１、２及び３（Ｓ１−３）に対するＡＵＲＯＣは、０．６４４、０．７８９及び０．８６８であった。肥満グループにおいてＳ１、Ｓ２及びＳ３のＡＵＲＯＣは、０．６７９、０．６７０及び０．８０９であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
図６Ｂから確認できるように、小葉内炎症の場合、非肥満グループにおいて小葉内炎症に対するＡＵＲＯＣは、０．６１３（点数１）及び０．８１２（点数２）であり、ＡＵＲＯＣは肥満グループにおいて０．５６１及び０．６６６であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
図６Ｃから確認できるように、風船様変形の場合、非肥満グループにおいて風船様変形に対するＡＵＲＯＣは、０．７２６（点数１）及び０．７９３（点数２）であった。肥満グループにおいて点数１と２のＡＵＲＯＣはそれぞれ、０．６１３及び０．６４３であった。
【国際調査報告】
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2022502685.tif 000024
2022502685.tif 000025
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