(57)【要約】本開示は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。これは、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））およびドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む細胞に関する。ある特定の実施形態では、細胞は、抗原指向性であり、増強された細胞持続性および増強された抗標的処置の有効性を示す。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、細胞質死ドメイン中に少なくとも１つの改変を含む。
2022502054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体、および
（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド
を含む細胞。
【請求項２】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、ヒトＦａｓの細胞質死ドメイン中に少なくとも１つの改変を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記少なくとも１つの改変が、突然変異、欠失および挿入からなる群から選択される、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記突然変異が、点突然変異である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記少なくとも１つの改変が、ヒトＦａｓの細胞質死ドメイン中にある、請求項２から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞質死ドメイン中の前記少なくとも１つの改変が、前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよびＦＡＤＤポリペプチドの間の結合を防止する、請求項２から５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓのアミノ酸２３０〜３１４の欠失を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓの２６０位に点突然変異を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記点突然変異が、Ｄ２６０Ｖである、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、免疫応答性細胞の細胞持続性を増強する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、免疫応答性細胞のアポトーシスまたはアネルギーを低減する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記抗原認識受容体が、組換えで発現される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、ベクターから発現される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
免疫応答性細胞である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
リンパ球系列の細胞または骨髄球系列の細胞である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
Ｔ細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
意図されるレシピエントに対して自家または同種異系である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記抗原が、腫瘍抗原または病原体抗原である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ軽鎖、ＫＤＲ、突然変異体ＫＲＡＳ、突然変異体ＰＩＫ３ＣＡ、突然変異体ＩＤＨ、突然変異体ｐ５３、突然変異体ＮＲＡＳ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ−ＬＣ−１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１，ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、およびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ  Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７腫瘍性タンパク質、ならびにＥＲＢＢからなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記抗原が、病原体関連抗原である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記病原体関連抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
前記抗原認識受容体が、病原体関連抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞が、病原体特異的Ｔ細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記抗原認識受容体が、腫瘍抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞が、腫瘍特異的Ｔ細胞である、請求項３２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項３５】
前記抗原認識受容体が、ＣＡＲである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
自殺遺伝子をさらに含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）またはトランケートされたヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドである、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項４２】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
新生物形成または病原体感染症を処置および／または予防するためのものである、請求項４１または４２に記載の組成物。
【請求項４４】
標的抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強する方法であって、対象に、有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞または請求項４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
対象における腫瘍負荷を低減する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞または請求項４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
腫瘍細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低減する、および／または前記対象における腫瘍を根絶する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
新生物形成を処置および／または予防する方法であって、対象に、有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞または請求項４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
新生物形成を有する対象の生存を延長する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞または請求項４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
前記腫瘍または新生物が、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記新生物が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
血液がんの処置を必要とする対象における血液がんを処置する方法であって、前記対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、前記Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む、方法。
【請求項５２】
前記血液がんが、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
固形腫瘍の処置を必要とする対象における固形腫瘍を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、前記Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む、方法。
【請求項５４】
前記固形腫瘍が、脳、乳房、肺、胃腸管（食道、胃、小腸、大腸および直腸を含む）、膵臓、前立腺、軟部組織／骨、子宮、子宮頸部、卵巣、腎臓、皮膚、胸腺、精巣、頭頸部、または肝臓が起源の腫瘍である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
対象における病原体感染症を予防および／または処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１から４０のいずれか一項に記載の細胞または請求項４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５６】
前記病原体が、疾患を引き起こすことができる、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
抗原特異的細胞を生成するための方法であって、細胞に、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を導入することを含む、方法。
【請求項５８】
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、ベクターに含まれる、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
（ａ）抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む、核酸組成物。
【請求項６２】
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている、請求項６１に記載の核酸組成物。
【請求項６３】
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、ベクターに含まれる、請求項６１または６２に記載の核酸組成物。
【請求項６４】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項６３に記載の核酸組成物。
【請求項６５】
請求項６１から６４のいずれか一項に記載の核酸組成物を含むベクター。
【請求項６６】
請求項１から７９のいずれか一項に記載の細胞、請求項１から４０のいずれか一項に記載の組成物、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の核酸組成物、または請求項６５に記載のベクターを含む、キット。
【請求項６７】
新生物形成または病原体感染症を処置および／または予防するための書面による使用説明書をさらに含む、請求項６６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３８，３１７号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれ、その優先権を主張する。
助成金情報
【０００２】
本発明は、ＮＣＩの内部研究プログラム、ＮＩＨのがん研究センターによって付与された助成金番号ＺＩＡ  ＢＣ０１１５８６およびＺＩＡ  ＢＣ０１０７６３の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
序論
【０００３】
本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。これは、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む免疫応答性細胞に関する。免疫応答性細胞は、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））をさらに含み得る。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作された自家または同種異系Ｔ細胞による養子細胞免疫療法は、黒色腫およびさまざまなＢ細胞悪性腫瘍を含むがそれらに限定されないヒトのがんの範囲内において、治療有効性の証拠を示している。Ｔ細胞は、がんまたはウイルス感染細胞によって発現される抗原に対する特異性を伝える、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される人工Ｔ細胞受容体、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする遺伝子の導入により、腫瘍関連抗原を標的にするように改変され得る。免疫療法は、がんの処置を提供するための可能性を有する標的療法である。
【０００５】
遺伝子操作されたＴ細胞を使用する養子細胞移入（ＡＣＴ）は、小児の急性リンパ芽球性白血病（１）および成人の侵襲性Ｂ細胞リンパ腫（２）を含む難治性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者のための標準治療に入っている。血液リンパ系悪性腫瘍におけるＡＣＴの格別の有効性は、施設、遺伝子ベクターまたは細胞組成にかかわらず、臨床試験全体で一貫して観察されている（３〜８）。対照的に、まとめて成人のがん関連死の主な原因である（９）、固形悪性腫瘍を有する患者における養子免疫療法に対する応答は、比較的中程度であった（１０〜１３）。したがって、移入されたＴ細胞の効力を増強する新たな戦略についての必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の主題は、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む細胞（例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、細胞質死ドメイン中に少なくとも１つの改変を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、突然変異、欠失または挿入からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、ヒトＦａｓの細胞質死ドメイン中にある。ある特定の実施形態では、細胞質死ドメイン中の少なくとも１つの改変は、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよびＦＡＤＤポリペプチドの間の結合を防止する。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓの２３０〜３１４位のアミノ酸の欠失を含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓの２６０位の点突然変異を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＦａｓの点突然変異は、Ｄ２６０Ｖである。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、免疫応答性細胞の細胞持続性を増強する。ある特定の実施形態では、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、免疫応答性細胞のアポトーシスまたはアネルギーを低減する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、外因性または内因性（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感作および／もしくは選択後に末梢血から得られるＴ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球からの天然の抗原特異性）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、組換えで発現される。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ベクターから発現される。
【００１０】
ある特定の実施形態では、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、ベクターから発現される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、細胞は、免疫応答性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、リンパ球系列の細胞または骨髄球系列の細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、意図されるレシピエントに対して自家または同種異系である。
【００１２】
ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ軽鎖、ＫＤＲ、突然変異体ＫＲＡＳ、突然変異体ＰＩＫ３ＣＡ、突然変異体ＩＤＨ、突然変異体ｐ５３、突然変異体ＮＲＡＳ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ−ＬＣ−１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１，ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、およびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ  Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７腫瘍性タンパク質、ならびにＥＲＢＢからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、抗原は、病原体関連抗原である。ある特定の実施形態では、病原体関連抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である。
【００１４】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、病原体関連抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞は、病原体特異的Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、腫瘍抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、細胞は、自殺遺伝子をさらに含む。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）またはトランケートされたヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドである。
【００１６】
本開示の主題は、本明細書に開示される有効量の細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である。ある特定の実施形態では、組成物は、新生物形成および／もしくは病原体感染症を処置ならびに／または予防するためのものである。
【００１７】
本開示の主題は、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に開示される有効量の細胞またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００１８】
本開示の主題は、対象における腫瘍負荷を低減する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に開示される有効量の細胞またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、腫瘍細胞の数を低減する。ある特定の実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを低減する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍を根絶する。
【００１９】
本開示の主題は、新生物形成を処置および／もしくは予防する方法、または新生物形成を有する対象の生存を延長する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、有効量の細胞またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、腫瘍または新生物は、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、新生物は、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、抗原は、ＣＤ１９である。ある特定の実施形態では、新生物形成は、固形がんから選択される。選択された固形悪性腫瘍は、脳、乳房、肺、胃腸管（食道、胃、小腸、大腸および直腸を含む）、膵臓、前立腺、軟部組織／骨、子宮、子宮頸部、卵巣、腎臓、皮膚、胸腺、精巣、頭頸部、または肝臓が起源のがんを含み得る。
【００２１】
本開示の主題は、対象における血液がんを処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、ならびに骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される。
【００２２】
本開示の主題は、対象における固形腫瘍を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、脳、乳房、肺、胃腸管（食道、胃、小腸、大腸および直腸を含む）、膵臓、前立腺、軟部組織／骨、子宮、子宮頸部、卵巣、腎臓、皮膚、胸腺、精巣、頭頸部、または肝臓が起源の腫瘍からなる群から選択される。
【００２３】
本開示の主題は、対象における病原体感染症を予防および／または処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に開示される有効量の細胞またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、病原体は、疾患を引き起こすことができる、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物からなる群から選択される。
【００２４】
本開示の主題は、抗原特異的細胞を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞に、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を導入することを含む。ある特定の実施形態では、第１および第２の核酸配列の一方または両方は、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第１および第２の核酸配列の一方または両方は、ベクターに含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００２５】
本開示の主題は、（ａ）抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む、核酸組成物を提供する。ある特定の実施形態では、（ａ）および（ｂ）の一方または両方は、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第１および第２の核酸配列の一方または両方は、ベクターに含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００２６】
本開示の主題は、本明細書に開示される核酸組成物を含むベクターをさらに提供する。
【００２７】
本開示の主題は、本明細書に開示される細胞、本明細書に開示される核酸組成物、または本明細書に開示されるベクターを含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、新生物形成および／もしくは病原体感染症を処置ならびに／または予防するための書面による使用説明書をさらに含む。
【００２８】
以下の詳細な説明は、例として与えられるが、本開示の主題を記載される具体的な実施形態に限定することを意図することなく、添付の図面と合わせて理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、ヒト腫瘍微小環境が、死誘導リガンドＦＡＳＬＧを過剰発現することを表す図である。（Ａ）マッチした起源の正常組織に対する２６の異なる腫瘍タイプの微小環境内のＦＡＳＬＧ発現のがん横断的解析。ヒトがんおよびマッチした正常組織からのＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）データを、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）および遺伝子型−組織発現データセットから抽出し、ＵＣＳＣ  Ｘｅｎａを使用して解析し、期待値最大化（ＲＳＥＭ）値によって正規化されたＲＮＡ−ｓｅｑとして表示した。腫瘍および正常組織の間の発現の統計比較を、ボンフェローニ補正によるマンホイットニーのｔ検定を使用して行った；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。（Ｂ）２６のＴＣＧＡ組織構造全体にわたって平均されたＦＡＳＬＧ発現と正に相関する遺伝子のすべてのＫＥＧＧ経路に対する選択された事前ランク付け遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）。円の直径は、ＧＳＥＡ特性セット内で特定された遺伝子の数を反映する。すべての表示されたＧＳＥＡについての名目Ｐ値およびＦＤＲ  ｑ値は＜０．００１であった。（Ｃ）ＴＣＧＡデータベース中の２６のヒトがんタイプ全体にわたるＦＡＳＬＧ遺伝子発現に対する上位２００の相関する遺伝子のピアソンの相関。パネル（Ｂ）に列挙されたＧＳＥＡ特性セットに関連する選択された免疫関連遺伝子が特定される。（Ｄ、Ｅ）表現型で定義されたＣＤ８ａ＋Ｔ細胞サブセットにおける代表的なヒストグラム（Ｄ）およびＦａｓ  ＭＦＩの要約プロット（Ｅ）。示されたデータは、４７人の患者およびＨＤ由来の末梢血Ｔ細胞からである。パネル（Ｄ）および（Ｅ）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、以下の通り定義した：ＴＮ細胞、ＣＤ８ａ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋Ｆａｓ−；ＴＣＭ、ＣＤ８ａ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋；ＴＥＭ、ＣＤ８ａ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−；ＴＥＭＲＡ、ＣＤ８ａ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−。（Ｆ）養子免疫療法臨床試験への登録の時点での年齢がマッチした健康なドナー（ＨＤ；ｎ＝３９；左）、ならびに黒色腫（ＭＥＬ；ｎ＝２０；中央）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ；ｎ＝１７；右）を有する患者の循環中のすべてのＣＤ８ａ＋Ｔ細胞のうちのＴＮの画分。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない（二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【００３０】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、Ｆａｓ  ＤＮＲで操作されたマウスＴ細胞がＦａｓＬ媒介アポトーシスを防止することを表す図である。（Ａ）生理学的Ｆａｓシグナル伝達および２つのマウスＦａｓドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）の設計の概略図。レトロウイルスでコードされるＦａｓ  ＤＮＲは、（ｉ）死ドメインの２４６位のイソロイシン残基に対するアスパラギンの置換（ＤＤ；ＦａｓＩ２４６Ｎ）、または（ｉｉ）大部分の細胞内死ドメインのトランケーション（ＦａｓΔＤＤ）のいずれかによる、死ドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）の動員を防止するように設計された。野生型Ｆａｓ（ＦａｓＷＴ）および空ベクターを対照として使用した。受容体を、Ｔｈｙ１．１レポーターを含有するバイシストロン性ベクターにクローニングした。ＥＣ、細胞外ドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン；Ｔ２Ａ、ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ自己切断ペプチド。（Ｂ）ＦａｓＩ２４６Ｎ、ＦａｓΔＤＤ、ＦａｓＷＴ、または空ベクター対照で改変されたＷＴ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞のｌｚ−ＦａｓＬ媒介アポトーシスの刺激、レトロウイルス形質導入、拡大増殖および試験についての実験タイムライン。（Ｃ）代表的なＦＡＣＳプロット、および（Ｄ）静置時およびｌｚ−ＦａｓＬ（５０ｎｇ  ｍＬ−１）への曝露６時間後のアポトーシスのアネキシンＶ＋／ＰＩ＋形質導入Ｔ細胞の頻度を示す要約棒グラフ。結果は、形質導入Ｔｈｙ１．１＋細胞におけるゲーティング後を示す。示されたデータは、６つの独立して行われた実験を表し、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示する。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない（二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００３１】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｈは、腫瘍微小環境におけるＦａｓ  ＤＮＲ操作Ｔ細胞の増強された生存性を表す図である。（Ａ）ＦａｓΔＤＤＤＮＲ（Ｌｙ５．１＋Ｔｈｙ１．１＋）または空ベクター対照（Ｌｙ５．１−Ｔｈｙ１．１＋）で操作された類遺伝子的に区別可能なＷＴ  ｐｍｅｌ−１  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の発生および混注についての実験概要。形質導入Ｔ細胞を、約１：１の混合物での組換え前にマイクロビーズ化された抗Ｔｈｙ１．１で濃縮し、合計で８ｅ６個のＴ細胞を、１０日の樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有する、亜致死的に照射された（６Ｇｙ）Ｔｈｙ１．１−Ｌｙ５．１−マウスに、ｉ．ｖ．注入した。レシピエントマウスは、３日間、毎日ｉ．ｐ．注射によってＩＬ−２を受け、脾臓および腫瘍を、７日目に分析のために収集した。（Ｂ）レシピエントマウスの脾臓および腫瘍における、空ベクター改変Ｔ細胞に対するＦａｓΔＤＤＤＮＲ改変Ｔ細胞の相対的持続性。結果は、生ＣＤ８α＋Ｔｈｙ１．１＋リンパ球におけるゲーティング後を表示し、それぞれｎ＝５〜８頭のマウスを用いる２つの独立した実験を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１（対応のない両側スチューデントのｔ検定）。（Ｃ）代表的なＦＡＣＳプロット、および（Ｄ）サイトカインを含まない培地のみ、Ｂ１６黒色腫の存在下、またはｌｚ−ＦａｓＬ（５０ｎｇ  ｍＬ−１）とともに終夜培養後のＴ細胞生存率の要約棒グラフ。Ｔ細胞を、終夜培養の開始前に、ビーズ濃縮なしで、ＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照のいずれかで形質導入した。データは、Ｔｈｙ１．１＋およびＴｈｙ１．１−リンパ球におけるゲーティング後を示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭとして表示され、条件あたりｎ＝３反復での４つの独立した実験を表す。（Ｅ）レシピエントマウスの脾臓および腫瘍における、空ベクター改変Ｔ細胞に対するＦａｓΔＤＤＤＮＲ改変Ｔ細胞の相対的持続性。生ＣＤ８α＋Ｔｈｙ１．１＋リンパ球におけるゲーティング後の結果は、それぞれｎ＝５〜８頭のマウスを用いる２つの独立した実験を表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のある両側スチューデントのｔ検定。（Ｆ）空またはＦａｓΔＤＤ構築物で形質導入された生Ｌｙ５．１＋ＣＤ８α＋Ｖβ１３＋細胞の総数。（Ｇ）示された日において脾臓中で見出される空の構築物に対して正規化されたＦａｓΔＤＤの相対的な拡大増殖倍率。（Ｈ）それぞれの条件について、Ｋｉ−６７を発現する生Ｌｙ５．１＋ＣＤ８α＋Ｖβ１３＋細胞のパーセンテージ。２つの独立した実験からの代表的なプロット。データは、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示される。＊Ｐ＜０．０５、ウィルコクソンの順位和検定。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【００３２】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞の移入が、後天性自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）をもたらさなかったことを表す図である。（Ａ）代表的なＦＡＣＳプロット、および（Ｂ）６Ｇｙの亜致死的照射とそれに続く５ｅ５個のビーズ精製された、ＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照で改変されたＴｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞の養子移入を受けたＷＴマウスの脾臓におけるＣＤ３＋Ｂ２２０＋ＣＤ４−ＣＤ８α−ダブルネガティブＴ細胞の頻度の要約棒グラフ。レシピエントマウスは、３日間、毎日ｉ．ｐ．注射によってＩＬ−２も受けた。年齢がマッチした野生型マウスおよびＦａｓ欠損ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、それぞれ、陰性対照および陽性対照として扱われた。（Ｃ）代表的なＦＡＣＳプロット、および（Ｄ）＞６か月後のＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照で改変された移入ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞の持続性および表面表現型を実証する要約散布図。示されたすべてのデータは、コホートあたりそれぞれｎ＝５〜８頭のマウスを用いる５つの独立した実験を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｅ）Ｂ６マウスにおいてＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照で改変されたＷＴ  ｐｍｅｌ−１  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の長期間の持続性を分析するための実験設計。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【００３３】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｈは、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞の養子移入が、Ｔ細胞分化状態とは無関係に抗腫瘍有効性を増強することを表す図である。（Ａ）ＦａｓΔＤＤ、ＦａｓＩ２４６Ｎまたは空ベクター対照で改変されたＷＴ  ｐｍｅｌ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生のための実験設計。（Ｂ）腫瘍縮小、および（Ｃ）対照として未処置のままにされたか、または５×１０５個のビーズで精製された、ＦａｓΔＤＤ、ＦａｓＩ２４６Ｎもしくは空ベクター対照で改変されたＴｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ−１細胞を受けた、１０日の樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有するマウスの生存。すべての処置マウスは、細胞注入とそれに続く３日間のｉ．ｐ．のＩＬ−２の前に、亜致死的に照射（６Ｇｙ）を受けた。（Ｄ）注入の前に、Ｆａｓ  ＤＮＲまたは空ベクター対照で改変された、選別されたＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋Ｔｈｙ１．１＋ＴＣＭ様ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞の純度を実証する代表的なＦＡＣＳプロット。（Ｅ）腫瘍縮小、および（Ｆ）未処置、または５×１０５個の選別−精製されたＴＣＭ様Ｔｈｙ１．１＋改変細胞を受けた１０日の樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有するマウスの生存。（Ｇ）腫瘍縮小、および（Ｈ）未処置、または５×１０５個の選別−精製されたＴＣＭ様Ｔｈｙ１．１＋改変細胞を受けた１０日の樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有するマウスの生存。すべての腫瘍測定は、独立した研究者による盲検法で行った。２つの独立した実験からの代表的な結果を、ｎ＝５〜８頭のマウス／コホートを使用する平均±ＳＥＭとして示す。統計比較は、ウィルコクソンの順位和検定（Ｂ、Ｅ、Ｇ）またはログランクのマンテルコックス検定（Ｃ、Ｆ、Ｈ）を使用して行った。＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【００３４】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、Ｆａｓ  ＤＮＲによる遺伝子操作がＦａｓＬ誘導アポトーシスからヒトＴ細胞を保護することを表す図である。（Ａ）生理学的Ｆａｓシグナル伝達および２つのヒトＦａｓドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）の設計の概略図。レトロウイルスでコードされるヒトＦａｓ  ＤＮＲは、（ｉ）死ドメインの２６０位のアスパラギン酸残基に対するバリンの置換（ＤＤ；ｈＦａｓＤ２６０Ｖ）、または（ｉｉ）大部分のヒト細胞内死ドメインのトランケーション（ｈＦａｓΔＤＤ；ΔＤＤ＝ヒトＦａｓのａａ２３０〜３１４の欠失）のいずれかによる、死ドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）の動員を防止するように設計された。空ベクターを陰性対照として使用した。受容体を、Ｔｈｙ１．１レポーターを含有するバイシストロン性ベクターにクローニングした。ＥＣ、細胞外ドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン；Ｔ２Ａ、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａに由来する２Ａ自己切断ペプチド。（Ｂ）ＦａｓＤ２４４Ｖ、ＦａｓΔＤＤ、または空ベクター対照で改変された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のｌｚ−ＦａｓＬ媒介アポトーシスの刺激、レトロウイルス形質導入、拡大増殖および試験についての実験タイムライン。（Ｃ）代表的なＦＡＣＳプロット、および（Ｄ）静置時およびｌｚ−ＦａｓＬの滴定濃度への曝露６時間後のアポトーシスのアネキシンＶ＋Ｔ細胞の頻度を示す要約グラフ。結果は、形質導入された（Ｔｈｙ１．１＋）Ｔ細胞または形質導入されていない（Ｔｈｙ１．１−）Ｔ細胞におけるゲーティング後を示す。データは、表示された条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示され、３つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意ではない（ウィルコクソンの順位和検定）。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【００３５】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞におけるレトロウイルスでコードされるマウスＦａｓ  ＤＮＲ構築物および対照の設計ならびに発現を表す図である。（Ａ）マウス野生型（ＷＴ）Ｆａｓ、または死ドメインを介してＦａｓに関連する細胞内アダプター分子に結合するそれらの能力が損なわれたＦａｓの突然変異型をコードするレトロウイルスコンストラクトの設計の概略図。ＷＴ  Ｆａｓ、２４６位におけるイソロイシンを置き換えたアスパラギンを有するＦａｓ（ＦａｓＩ２４６Ｎ）、または細胞内死ドメインのトランケーションを有するＦａｓ（ＦａｓΔＤＤ）を、ＭＳＧＶ１発現ベクターに、Ｔ２Ａ切断部位およびＴｈｙ１．１レポーター遺伝子の前にクローニングした。Ｔｈｙ１．１レポーター遺伝子のみを含有する空ベクター（空）を陰性対照として使用した。（Ｂ）代表的なＦＡＣＳプロット、ならびにＦａｓ−欠損ｌｐｒ／ｌｐｒまたはＷＴ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入４日後の（Ｃ）Ｔｈｙ１．１および（Ｄ）Ｆａｓ発現の要約棒グラフ。ゲーティングしたＴｈｙ１．１＋またはＦａｓ＋細胞のパーセンテージを黒色で示し、Ｔｈｙ１．１＋またはＦａｓ＋細胞のＭＦＩをフロープロットにおいて赤色で示す。（Ｃ）および（Ｄ）におけるデータは、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示され、１２の独立した実験を表す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【００３６】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、Ｆａｓ  ＤＮＲが、ＡＫＴ活性化およびＴ細胞分化を誘導するｌｚ−ＦａｓＬを防止することを表す図である。（Ａ、Ｂ）代表的なＦＡＣＳヒストグラム（上）、ならびにＦａｓＩ２４６Ｎ、ＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照で形質導入されたＣＤ８α＋Ｔ細胞におけるｌｚ−ＦａｓＬ曝露と（Ａ）ホスホＡＫＴＳ４７３および（Ｂ）ホスホＳ６Ｓ２３５／２３６との間の用量−応答関係の要約プロット（下）。示された濃度のｌｚ−ＦａｓＬの連続的な存在下での活性化、レトロウイルス形質導入および拡大増殖の６日後を示す結果。（Ｃ）Ｔ細胞分化の代表的なＦＡＣＳプロット（上）、およびＣＤ８α＋Ｔ細胞が外因性ＦａｓＬの非存在下でＦａｓＩ２４６Ｎ、ＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照で形質導入された１１日後の細胞内ＩＦＮγ／ＩＬ−２産生（下）。細胞内サイトカイン染色は、ブレフェルジンＡおよびモネンシン中、ＰＭＡ／イオノマイシンとの約５時間のインキュベーション後に測定した。（Ｄ）活性化、形質導入および培養における拡大増殖の１１日後のＣＤ８α＋Ｔ細胞のメモリーＴ細胞サブセットの組成。グラフは、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示され、３つ（Ａ、Ｂ）および５つ（Ｃ、Ｄ）の独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５（ウィルコクソンの順位和検定）。
【図８−２】同上。
【００３７】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｅは、白血病のマウスモデルにおけるＦａｓ  ＤＮＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ改変Ｔ細胞処置の効果を表す図である。（Ａ）マウス白血病モデルにおいて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、およびＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかで同時形質導入された同系Ｔ細胞による処置のための実験設計。すべての処置マウスは、細胞注入とそれに続く３日間のｉ．ｐ．のＩＬ−２の前に、亜致死的に照射（５Ｇｙ）を受けた。（Ｂ）同時形質導入の効率、および（Ｃ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、およびＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかで改変された選別されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞の純度を実証する代表的なＦＡＣＳプロット。（Ｄ）対照として未処置のままにされたか、または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、およびＦａｓΔＤＤもしくは空ベクター対照のいずれかで改変された選別−精製されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞の高ＣＡＲ  Ｔ細胞用量（５．５×１０５個）を受けた、１０日の樹立されたＥ２ａ：ＰＢＸ  ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ腫瘍を保有するマウスの生存。（Ｅ）未処置のままにされたか、または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、およびＦａｓΔＤＤもしくは空ベクター対照のいずれかで改変された選別−精製されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞の低ＣＡＲ  Ｔ細胞用量（１．８×１０５個）を受けた、１０日の樹立されたＥ２ａ：ＰＢＸ  ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ腫瘍を保有するマウスの生存。すべての腫瘍測定は、独立した研究者による盲検法で行った。
【図９−２】同上。
【００３８】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｇは、Ｆａｓ  ＤＮＲの発現が、抗ＣＤ１９  ＣＡＲモデルにおける抗アポトーシス機能およびｉｎ  ｖｉｖｏ持続性を増強することを示す図である。（Ａ）代表的なフロープロット、ならびに（Ｂ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよび空またはＦａｓ  ＤＮＲをコードするレトロウイルス構築物によるＢ６  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の二重形質導入の要約データ。分析は、６日目のＴｈｙ１．１ビーズ濃縮の１１日後に行った。（Ｃ）サイトカインを含まない培地のみ、ｌｚ−ＦａｓＬ（１００ｎｇ  ｍｌ−１）、２μｇ  ｍｌ−１の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８またはＥ２ａ−ＰＢＸのそれぞれとの終夜培養後の相対Ｔ細胞生存率（ＦａｓΔＤＤに対する）の要約棒グラフ。Ｔｈｙ１．１＋リンパ球におけるゲーティング後の示されたデータは、３つの独立して行われた実験を表し、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、二元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｄ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲがＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照と一緒に発現するように操作されたＷＴ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の発生および注入についての実験概要。形質導入Ｔ細胞を、注射の前にＴｈｙ１．１ビーズで濃縮し、Ｔ細胞を、４日の樹立されたＥ２ａ−ＰＢＸ白血病を保有する亜致死的に照射された（５Ｇｙ）マウスにｉ．ｖ．で注入した。脾臓およびＢＭを、１４日目に分析のために収集した。ｃｏ−Ｔｄ、同時形質導入。（Ｅ）レシピエントマウスの脾臓およびＢＭにおける生ＣＤ８α＋Ｔｈｙ１．１＋リンパ球の数の要約データ。（Ｆ）レシピエントマウスのＢＭにおけるＥ２ａ−ＰＢＸ白血病の頻度の要約データ。ＥおよびＦにおける結果は、それぞれｎ＝３〜５頭のマウスを用いる２つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、チューキーの多重比較で補正された一元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｇ）未処置、または３×１０５個（左）または２×１０５個（右）の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔｈｙ１．１＋改変細胞を受けた４日の樹立されたＥ２ａ−ＰＢＸ白血病を保有するマウスの生存。４つの独立した実験からの代表的な結果を、ｎ＝５頭のマウス／コホートを使用する平均±ＳＥＭとして示す。統計比較を、ログランクのマンテルコックス検定を使用して行った；＊Ｐ＜０．０５  ＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【００３９】
【図１１】図１１は、Ｆａｓ  ＤＮＲが、非形質導入細胞をＦａｓＬ媒介アポトーシスから保護することができることを表す図である。ｌｚ−ＦａｓＬ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）への曝露後２０時間後の非形質導入Ｔ細胞および形質導入Ｔ細胞の細胞生存率の相対頻度を示す要約棒グラフ。生ＣＤ８α＋リンパ球におけるゲーティング後を示す結果、およびそれぞれの形質導入条件について培地と比べて示す生存率。示されたデータは、３つの独立して行われた実験を表し、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示する。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない（チューキーの多重比較で補正された一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００４０】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＷＴ  Ｆａｓへの復帰を引き起こさないＴ細胞におけるＦａｓＩ２４６Ｎの発現を示す図である。（Ａ）ＦａｓＷＴまたはＦａｓＩ２４６Ｎで改変されたＷＴ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の刺激、レトロウイルス形質導入、および分析についての実験タイムライン。（Ｂ）ＦａｓＷＴまたはＦａｓＩ２４６Ｎが形質導入された細胞についての６日目および１２日目のＴｈｙ１．１発現の代表的なＦＡＣＳプロット。（Ｃ）ＦａｓＷＴまたはＦａｓＩ２４６Ｎで改変されたＷＴ  ＣＤ８α＋Ｔ細胞の刺激、形質導入、Ｔｈｙ１．１濃縮およびシークエンシングについての実験タイムライン。（Ｄ）ＷＴ  Ｆａｓが、アミノ酸位置２４６のイソロイシンをコードするＡＣＴ配列を維持しているが、ＦａｓＩ２４６Ｎ配列が、導入されたＦａｓ  ＤＮＲ構築物のアミノ酸位置２４６のアスパラギンをコードするＡ−Ａ−Ｃであることを示す代表的なシークエンシングデータ。
【図１２−２】同上。
【００４１】
【図１３】図１３は、Ｂ１６腫瘍細胞の表面上のＦａｓＬを上方調節するＩＦＮγを表す図である。Ｂ１６細胞を、媒体（ＰＢＳ）またはＩＦＮγ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）で２４時間処置し、次いで、フローサイトメトリーによってＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ；左パネル）またはＦａｓＬ（右パネル）の表面発現について分析した。
【００４２】
【図１４】図１４は、さまざまな刺激からアポトーシスを防止するＦａｓ  ＤＮＲで操作されたＴ細胞を示す図である。ｌｚ−ＦａｓＬ（１００ｎｇ  ｍＬ−１）への曝露後２０時間後の形質導入Ｔ細胞の細胞生存率の相対頻度を示す要約棒グラフ。結果は、Ｔｈｙ１．１＋細胞におけるゲーティング後を示し、生存率は、ＦａｓΔＤＤに対して示される。示されたデータは、１０の独立して行われた実験を表し、条件あたりｎ＝３での平均±ＳＥＭとして表示する。＊Ｐ＜０．０５  ＊＊Ｐ＜０．０１  ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない（チューキーの多重比較で補正された一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００４３】
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｈは、Ｆａｓ  ＤＮＲ発現がＡＬＰＳ感受性ＭＲＬ系統におけるリンパ増殖を誘導しないことを示す図である。（Ａ）６〜９か月のＣ５７ＢＬ／６  Ｂ６−ｌｐｒマウスにおけるリンパ増殖の開始（上）を３〜４か月のＭＲＬ−ｌｐｒ系統と比較する概略図。（Ｂ）ＷＴ  ＭＲＬ−ＭｐマウスにおいてＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照で改変されたＷＴ  抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＣＤ８α＋Ｔ細胞の長期間の持続性を分析するための実験設計。合計で３×１０６個の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞を、亜致死的に照射された（６Ｇｙ  ＸＲＴ）マウスにｉ．ｖ．で注入した。レシピエントマウスは、３日間、毎日ｉ．ｐ．注射によってＩＬ−２を受け、脾臓を、９３日後に分析のために収集した。（Ｃ）年齢がマッチした野生型マウスおよびＦａｓ欠損Ｂ６−ｌｐｒマウス（それぞれ、陰性および陽性対照）と比較した、レシピエントマウスにおける脾臓重量の数の要約。（Ｄ、Ｅ）代表的なＦＡＣＳプロット（Ｄ）、ならびに（Ｅ）レシピエントおよび対照マウスの脾臓中のＣＤ３＋Ｂ２２０＋ダブルネガティブリンパ球の頻度の要約棒グラフ。（Ｆ）ＥＬＩＳＡによって測定された抗核抗体（ＡＮＡ）Ｉｇ（上）および抗ｄｓＤＮＡ  Ｉｇ（下）のレベルの要約棒グラフ。（Ｇ、Ｈ）ＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照で改変された移入Ｔｈｙ１．１＋Ｔ細胞の持続性（Ｇ）および表面表現型（Ｈ）を実証する要約棒グラフ。コホートあたりｎ＝２７頭のマウス。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意ではない（チューキーの多重比較で補正された一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【００４４】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｆａｓ  ＤＮＲで改変された養子移入Ｔ細胞が、ＡＬＰＳ感受性ＭＲＬ宿主マウスの肺において炎症性浸潤を誘導しないことを表す図である。（Ａ）代表的なＨ＆Ｅ染色されたマクロファージ、および（Ｂ）処置マウスの肺における炎症性単核細胞浸潤の強度を実証する要約グラフ。矢印および星形は、それぞれ高密度の血管周囲および細気管支周囲の単核炎症性浸潤の領域を指す。スケールバー＝３００μｍ。すべての画像は、解釈する病理学者による盲検法でスコア化した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない（チューキーの多重比較で補正された一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００４５】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｅは、Ｆａｓドミナントネガティブ受容体（ΔＤＤ）、抗原特異的ＴＣＲ（ＮＹ−ＥＳＯ−１、１Ｇ４）および扱いやすい自殺スイッチ（トランケートされたＥＧＦＲ）による初代ヒトＴ細胞の同時遺伝子操作を示す図である。（Ａ）これらの実験において使用されたヒトレトロウイルス構築物の設計。（Ｂ）ＴＣＲおよびＦａｓＤＮＲで同時改変された初代ヒトＴ細胞の模式図。（Ｃ）ヒトＦａｓＤＮＲおよびｔＥＧＦＲ自殺スイッチの同時発現。（Ｄ）抗原特異的サイトカイン産生、および（Ｅ）ｌｚ−ＦａｓＬに対する応答。
【図１７−２】同上。
【００４６】
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｄは、Ｆａｓドミナントネガティブ受容体（ΔＤＤ）、抗原特異的ＣＡＲ（抗ＣＤ１９、２８ｚ）および扱いやすい自殺スイッチ（トランケートされたＥＧＦＲ）による初代ヒトＴ細胞の同時遺伝子操作を表す図である。（Ａ）これらの実験において使用されたヒトレトロウイルス構築物の設計。（Ｂ）ＣＡＲおよびＦａｓＤＮＲで同時改変された初代ヒトＴ細胞の模式図。（Ｃ）ｌｚ−ＦａｓＬ曝露後に、ｔＥＧＦＲ単独またはｈＦａｓＤＮＲとの組合せで改変されたヒトＴ細胞におけるアポトーシスの時間依存性誘導。（Ｄ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ単独またはｈＦａｓＤＮＲとの組合せで改変されたヒトＴ細胞における抗原特異的サイトカイン放出および脱顆粒。
【図１８−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本開示の主題は、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を含む、細胞を提供する。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）をさらに含む。本開示の主題は、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強するためのこのような細胞を使用する方法、ならびに／あるいは新生物、病原体感染症もしくは他の疾患／障害（例えば、抗原特異的免疫応答の増加が望ましい疾患／障害）を処置および／または予防する方法も提供する。本開示の主題は、少なくとも一部分において、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、細胞持続性を増強する、細胞死を誘導する活性化を防止する、ＦａｓＬ誘導細胞死を防止する、および／または免疫応答性細胞の抗腫瘍効果を改善するという発見に基づく。
１．定義
【００４８】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参照文献は、本開示の主題において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton  et  al.,  Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology  (2nd  ed.  1994)；The  Cambridge  Dictionary  of  Science  and  Technology  (Walker  ed.,  1988)；The  Glossary  of  Genetics,  5th  Ed.,  R.  Rieger  et  al.  (eds.),  Springer  Verlag  (1991)；およびHale  &  Marham,  The  Harper  Collins  Dictionary  of  Biology  (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、下記に帰する意味を有する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、部分的に、特定の値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に応じて、当業者によって決定されるその値について許容される誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における実施ごとに、３または３よりも大きい標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、１桁以内、例えば、値の５倍以内または２倍以内を意味し得る。
【００５０】
「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、またはその祖先もしくは後代を意味する。
【００５１】
「免疫応答性細胞を活性化する」とは、免疫応答の開始をもたらす細胞におけるシグナル伝達の誘導またはタンパク質発現における変化を意味する。例えば、ＣＤ３鎖クラスターがリガンド結合および免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＡＭ）に応答すると、シグナル伝達カスケードが生じる。ある特定の実施形態では、内因性ＴＣＲもしくは外因性ＣＡＲが抗原と結合すると、結合した受容体の近くの多くの分子（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）のクラスター形成を含む免疫シナプスの形成が起こる。膜に結合したシグナル伝達分子のこのクラスター形成は、ＣＤ３鎖内に含有されるＩＴＡＭモチーフがリン酸化されるのを可能にする。このリン酸化は、次に、Ｔ細胞の活性化経路を開始し、最終的に、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１などの転写因子を活性化する。これらの転写因子は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始するために、主要調節因子のＴ細胞タンパク質の増殖および発現のためにＩＬ−２産生を増加させるＴ細胞の全体的な遺伝子発現を誘導する。
【００５２】
「免疫応答性細胞を刺激する」とは、強く、持続した免疫応答をもたらすシグナルを意味する。さまざまな実施形態では、これは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化後に起こるか、またはＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ４０およびＩＣＯＳが挙げられるがこれらに限定されない受容体を通じて同時に媒介される。複数の刺激シグナルを受容することは、強く、長期間のＴ細胞媒介性免疫応答を高めるために重要であり得る。Ｔ細胞は、迅速に阻害され、抗原に対して非応答性になり得る。これらの共刺激シグナル伝達の効果は変動し得るが、それらは、一般に、完全かつ持続した根絶のために抗原に強く応答する、長く生きている、増殖性かつ抗アポトーシス性のＴ細胞を生じさせるために、増加した遺伝子発現をもたらす。
【００５３】
「抗原認識受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原へのその結合に応答して免疫細胞または免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を指す。抗原認識受容体の非限定的な例としては、天然もしくは内因性のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、およびキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷抗体分子だけでなく、免疫原結合能を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片はまた、当技術分野において周知であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で普通は用いられる。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性な断片のＦ（ａｂ’）２およびＦａｂも意味する。Ｆ（ａｂ’）２および無傷抗体のＦｅ断片を欠くＦａｂ断片は、循環からより迅速に消失し、無傷抗体の非特異的組織結合がより少なくなり得る（Wahl  et  al.,  J.  Nucl.  Med.  24:316-325  (1983)）。本明細書で使用される場合、抗体としては、完全な天然抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および慣例に従わない抗体が挙げられる。ある特定の実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略す）および重鎖定常（ＣＨ）領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略す）および軽鎖定常ＣＬ領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、さまざまな免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の構成成分（Ｃ１  ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  4th  U.  S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  National  Institutes  of  Health  (1987)を参照されたい。一般に、抗体は、可変領域中に３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲまたはＣＤＲ領域を含む。ＣＤＲは、抗体の抗原またはエピトープへの結合のための大多数の接触残基を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ体系（Kabat,  E.  A.,  et  al.  (1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242）を使用して記述される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成するために共有結合的に連結される免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。ＶＨおよびＶＬは、直接接合されるか、またはペプチドコードリンカー（例えば、１０個、１５個、２０個、２５個のアミノ酸）によって接合されるかのいずれかであり、ＶＨのＮ末端がＶＬのＣ末端と、またはＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端と接続される。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが、および溶解度のためにセリンもしくはスレオニンが豊富である。定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Huston,  et  al.（Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  85:5879-5883,  1988）によって記載されるように、ＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニスト性ｓｃＦｖが記載されている（例えば、Zhao  et  al.,  Hyrbidoma  (Larchmt)  2008  27(6):455-51；Peter  et  al.,  J  Cachexia  Sarcopenia  Muscle  2012  August  12；Shieh  et  al.,  J  Imunol2009  183(4):2277-85;  Giomarelli  et  al.,  Thromb  Haemost  2007  97(6):955-63；Fife  eta.,  J  Clin  Invst  2006  116(8):2252-61；Brocks  et  al.,  Immunotechnology  1997  3(3):173-84；Moosmayer  et  al.,  Ther  Immunol  1995  2(10:31-40)を参照されたい）。刺激活性を有するアゴニスト性ｓｃＦｖが記載されている（例えば、Peter  et  al.,  J  Bioi  Chern  2003  25278(38):36740-7；Xie  et  al.,  Nat  Biotech  1997  15(8):768-71；Ledbetter  et  al.,  Crit  Rev  Immunol1997  17(5-6):427-55；Ho  et  al.,  BioChim  Biophys  Acta  2003  1638(3):257-66を参照されたい）。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、結合強度の尺度を意味する。親和性は、抗体結合部位および抗原決定基の間で立体化学的フィットの接近、それらの間の接触の面積のサイズ、ならびに／または荷電基および疎水性基の分布に依存し得る。本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、「アビディティー」も含み、これは、可逆的複合体の形成後の抗原−抗体結合の強さを指す。抗原に対する抗体の親和性を計算するための方法は、当技術分野において公知であり、さまざまな抗原−結合実験、例えば、機能性アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を含むが、これに限定されない。
【００５８】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答性細胞および膜貫通ドメインを活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインと融合される細胞外抗原結合ドメインを含む分子を指す。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、抗体の可変重鎖および軽鎖領域の融合に由来し得る。あるいは、または加えて、ｓｃＦｖは、Ｆａｂに由来し得る（抗体に由来する代わりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから得られる）。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合され、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原に対して高結合親和性またはアビディティーを有するように選択される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、目的のポリペプチド（例えば、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド）またはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％相同または同一である必要はないが、実質的な同一性を示し得る。内因性配列に対して「実質的な同一性」または「実質的な相同性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、さまざまなストリンジェンシーの条件下、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその部分の間で二本鎖分子を形成するための対を意味する（例えば、Wahl,  G.  M.  and  S.  L.  Berger  (1987)  Methods  Enzymol.  152:399；Kimmel,  A.  R.  (1987)  Methods  Enzymol.  152:507を参照されたい）。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む本開示のＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン）の結合特徴に有意に影響を与えないか、またはこれを変更しない、アミノ酸の改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加および欠失を含み得る。改変は、部位指向的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの当技術分野において公知の標準技法によって、本開示のＣＡＲのヒトｓｃＦｖに導入され得る。アミノ酸は、電荷および極性などのそれらの物理化学的性質に従ってグループに分類することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同じグループ内のアミノ酸で置き換えられる置換である。例えば、アミノ酸は、電荷によって分類することができる：正に荷電したアミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、中性電荷のアミノ酸としては、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。加えて、アミノ酸は、極性によって分類することができる：極性アミノ酸としては、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられ、非極性アミノ酸としては、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが挙げられる。ある特定の実施形態では、保存的置換としては、以下のグループ：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域内または外の１個または複数のアミノ酸残基は、同じグループ由来の他のアミノ酸残基と置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能性アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上記（ｃ）〜（ｌ）に示される機能）について試験することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域外またはＣＤＲ領域の特定された配列内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下の残基が変更される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、２つの配列の間の同一性パーセントに等しい。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある、ギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【００６２】
２つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE.  Meyers  and  W.  Miller（Comput.  Appl.  Biosci.,  4:11-17  (1988)）のアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さウエイト１、２、３、４、５または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman  and  Wunsch（J.  Mol.  Biol.  48:444-453  (1970)）アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００６３】
加えて、またはあるいは、本開示の主題のアミノ酸配列を、「クエリ配列」としてさらに使用して、公開データベースに対する検索を行って、例えば、関係配列を特定することができる。このような検索は、Altschul,  et  al.  (1990)  J.  Mol.  Biol.  215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて行って、本明細書において特定された配列と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップ入りの整列を得るために、Altschul  et  al.,  (1997)  Nucleic  Acids  Res.  25(17):3389-3402に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【００６４】
さらにまた、配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することによって、測定することができる。このようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失および／または他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一または同様の配列をマッチさせる。
【００６５】
「実質的に同一」または「実質的に相同」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）もしくは核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも約５０％相同または同一を示す、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある特定の実施形態では、このような配列は、比較のために使用されるアミノ酸または核酸の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である。
【００６６】
同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、密接に関係する配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の間の確率スコアで、ＢＬＡＳＴプログラムを使用し得る。
【００６７】
「アナログ」とは、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する、構造的に関係するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。
【００６８】
「リガンド」という用語は、本明細書で使用される場合、受容体に結合する分子を指す。ある特定の実施形態では、リガンドは、別の細胞上の受容体に結合し、細胞間の認識および／または相互作用を可能にする。
【００６９】
「構成的発現」または「構成的に発現される」という用語は、本明細書で使用される場合、あらゆる生理的条件下での発現または発現されることを指す。
【００７０】
「疾患」とは、細胞、組織もしくは臓器の正常な機能を損傷または妨げる任意の状態、疾患または障害、例えば、新生物形成および細胞の病原体感染症を意味する。
【００７１】
「有効量」（または「治療有効量」）とは、処置の際に、有益な臨床結果または所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１つまたは複数の用量で対象に投与することができる。処置に関して、有効量は、疾患の進行を軽減するか、改善するか、安定化させるか、反転させるか、もしくは遅らせる、またはそうでなければ疾患の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、ケースバイケースに基づいて医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。いくつかの因子が、典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する場合に考慮される。これらの因子としては、対象の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度、ならびに投与される免疫応答性細胞の形態および有効濃度が挙げられる。
【００７２】
「寛容を強化する」とは、移植された臓器もしくは組織を標的にする自己反応性細胞または免疫応答性細胞の活性を防止することを意味する。
【００７３】
「内因性」とは、細胞もしくは組織において通常発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。
【００７４】
「外因性」とは、細胞中に内因的に存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。したがって、「外因性」という用語は、細胞中で発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチド、例えば、外来性の異種の過剰発現される核酸分子およびポリペプチドを包含する。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞に存在しない核酸を意味し、例えば、外因性核酸は、内因性対応物から、配列、位置／場所またはその両方によって変わり得る。明確にするために、外因性核酸は、その天然の内因性対応物に対して同じまたは異なる配列を有していてもよく、細胞それ自体またはその前駆細胞への遺伝子操作によって導入されてもよく、必要に応じて、非天然プロモーターまたは分泌配列などの代替の制御配列に連結されていてもよい。
【００７５】
「異種核酸分子またはポリペプチド」とは、細胞中もしくは細胞から得られる試料中に通常存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物体に由来していてもよく、または例えば、細胞もしくは試料中で通常発現されないｍＲＮＡ分子であってもよい。
【００７６】
「モジュレートする」とは、正または負に変更することを意味する。例示的なモジュレーションは、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％の変化を含む。
【００７７】
「増加させる」とは、少なくとも約５％正に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれよりも高くであり得る。
【００７８】
「低減する」とは、少なくとも約５％負に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、またはさらには約１００％であり得る。
【００７９】
「単離された細胞」とは、細胞に天然で付随する分子および／または細胞成分から分離された細胞を意味する。
【００８０】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、変動する程度まで、その天然の状態において見出される通常それに付随する成分を含まない材料を指す。「単離する」とは、元の供給源または周囲のものからの分離の程度を表す。「精製する」とは、単離よりも高い分離の程度を表す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物が、タンパク質の生物学的性質に著しく影響を及ぼさないか、または他の有害な帰結を引き起こさないように、他の材料を十分に含まない。すなわち、細胞材料、ウイルス材料、もしくは組換えＤＮＡ技法によって産生される場合には培養培地、または化学合成される場合には化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合、核酸またはペプチドは、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを表し得る。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に付すことができるタンパク質について、異なる改変は、別々に精製され得る異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【００８１】
「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞上に存在する特定の抗原決定基または抗原決定基のセットに特異的に結合することができるドメインを指す。
【００８２】
「リンカー」は、本明細書で使用される場合、２個もしくはそれよりも多くのポリペプチドまたは核酸を、それらが互いに接続されるように、共有結合的に付着する官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒にカップリングする（例えば、ＶＨおよびＶＬドメインをカップリングする）ために使用される１個または複数のアミノ酸を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号１］に示される配列を含む。
【００８３】
「新生物」とは、細胞または組織の病理学的増殖、およびその後の、他の組織または臓器への遊走または浸潤によって特徴付けられる疾患を意味する。新生物形成の成長は、典型的には、未制御かつ進行性であり、正常な細胞の増殖を誘発しないか、またはその休止を引き起こすであろう条件下で起こる。新生物形成は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および腟からなる群から選択される臓器、またはそれらの組織もしくは細胞型が挙げられるがそれらに限定されない、種々の細胞型、組織または臓器に影響を及ぼし得る。新生物形成は、肉腫、癌腫または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんを含む。
【００８４】
「受容体」とは、１つまたは複数のリガンドに選択的に結合する、細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその部分を意味する。
【００８５】
「認識する」とは、標的への選択的な結合を意味する。腫瘍を認識するＴ細胞は、腫瘍抗原に結合する受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現することができる。
【００８６】
「参照」または「対照」とは、比較の標準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルは、ＣＡＲ単独を発現する対応する細胞におけるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルと比較され得る。
【００８７】
「分泌される」とは、分泌経路を介して、小胞体、ゴルジ装置を通り、細胞原形質膜で一過的に融合し、タンパク質を細胞の外側に放出する小胞として、細胞から放出されるポリペプチドを意味する。
【００８８】
「シグナル配列」または「リーダー配列」とは、分泌経路へのそれらの進入を方向付ける、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、２５個または３０個のアミノ酸）を意味する。例示的なリーダー配列としては、ＩＬ−２シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号２］（ヒト）、ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳ［配列番号３］（マウス）；カッパリーダー配列：ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ［配列番号４］（ヒト）、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ［配列番号５］（マウス）；ＣＤ８リーダー配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ［配列番号６］（ヒト）；トランケートされたヒトＣＤ８シグナルペプチド：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ［配列番号７］（ヒト）；アルブミンシグナル配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＳＳＡＹＳ［配列番号８］（ヒト）；およびプロラクチンシグナル配列：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ［配列番号９］（ヒト）が挙げられるが、それらに限定されない。「可溶性」とは、水性環境において、自由に拡散可能なポリペプチド（例えば、膜結合していない）を意味する。
【００８９】
「特異的に結合する」とは、本開示のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生体試料中で、目的の生物学的分子（例えば、ポリペプチド）を認識および結合するが、他の分子を実質的に認識および結合しない、ポリペプチドまたはその断片を意味する。
【００９０】
「腫瘍抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、正常または非ＩＳ新生細胞と比較して、腫瘍細胞上で固有にまたは差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原としては、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣ−１６）を介して免疫応答を活性化もしくは誘導することができるか、または受容体−リガンド結合を介して免疫応答を抑制することができる、腫瘍によって発現される任意のポリペプチド（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７．１／２）が挙げられる。
【００９１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することが意図され、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更しようとする臨床介入を指し、予防のため、または臨床病理学の経過の間に行うことができる。処置の治療効果は、限定されないが、疾患の発生または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の改善または軽減、および寛解または改善された予後を含む。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、罹患したかもしくは診断された対象、または障害を有すると疑われる対象における障害に起因する悪化を予防することができるが、処置はまた、障害の危険性がある対象もしくは障害を有すると疑われる対象における障害または障害の症状の開始を予防し得る。
【００９３】
本明細書における「個体」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物、げっ歯類およびペットが挙げられるが、それらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。「免疫無防備状態の」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫不全である対象を指す。対象は、健康な免疫系を有する人において疾患を通常は引き起こさないが、不十分に機能するか、または抑制された免疫系を有する人に影響を及ぼし得る、生物体によって引き起こされる感染症である、日和見感染に対して非常に脆弱である。
【００９４】
本開示の主題の他の態様を、以下の開示において記載するが、これは、本開示の主題の範囲内である。
２．ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド  
【００９５】
Ｆａｓ細胞表面死受容体（Ｆａｓ）は、ＡＰＴ１、ＣＤ９５、ＦＡＳ１、ＡＰＯ−１、ＦＡＳＴＭ、ＡＬＰＳ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６としても公知である。ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：３５５（ヒト）、１４１０２（マウス）、２４６０９７（ラット）、２８２４８８（ウシ）、４８６４６９（イヌ）。Ｆａｓのタンパク質産物としては、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００３４．１、ＮＰ＿００１３０７５４８．１、ＮＰ＿６９０６１０．１およびＮＰ＿６９０６１１．１が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９６】
Ｆａｓは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、死ドメインを含有する。これは、プログラム細胞死の調節に関与し、さまざまな悪性腫瘍および免疫系の疾患の病態形成に関係づけられている。Ｆａｓとそのリガンドの相互作用は、死誘導シグナル伝達複合体と他の構成成分、例えば、Ｆａｓ関連タンパク質とプログラム細胞死を誘導し得る死ドメイン（ＦＡＤＤ）の形成を可能にする。
【００９７】
ある特定の実施形態では、Ｆａｓポリペプチドは、ヒトＦａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ヒトＦａｓポリペプチドは、下記に提供されるＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００００３４．１（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ヒトＦａｓポリペプチドは、配列番号１０に示される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である、アミノ酸配列を含むか、または有する。
【化１】
2022502054.tif 000003
【００９８】
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、下記に提供される配列番号１１に示される。
【００９９】
ATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAGATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGTGACTGACATCAACTCCAAGGGATTGGAATTGAGGAAGACTGTTACTACAGTTGAGACTCAGAACTTGGAAGGCCTGCATCATGATGGCCAATTCTGCCATAAGCCCTGTCCTCCAGGTGAAAGGAAAGCTAGGGACTGCACAGTCAATGGGGATGAACCAGACTGCGTGCCCTGCCAAGAAGGGAAGGAGTACACAGACAAAGCCCATTTTTCTTCCAAATGCAGAAGATGTAGATTGTGTGATGAAGGACATGGCTTAGAAGTGGAAATAAACTGCACCCGGACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTAAACCAAACTTTTTTTGTAACTCTACTGTATGTGAACACTGTGACCCTTGCACCAAATGTGAACATGGAATCATCAAGGAATGCACACTCACCAGCAACACCAAGTGCAAAGAGGAAGGATCCAGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTTCTTTTGCCAATTCCACTAATTGTTTGGGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGAGTAAATATATCACCACTATTGCTGGAGTCATGACACTAAGTCAAGTTAAAGGCTTTGTTCGAAAGAATGGTGTCAATGAAGCCAAAATAGATGAGATCAAGAATGACAATGTCCAAGACACAGCAGAACAGAAAGTTCAACTGCTTCGTAATTGGCATCAACTTCATGGAAAGAAAGAAGCGTATGACACATTGATTAAAGATCTCAAAAAAGCCAATCTTTGTACTCTTGCAGAGAAAATTCAGACTATCATCCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTC（配列番号１１）
【０１００】
ある特定の実施形態では、「ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド」という用語は、Ｆａｓ遺伝子のドミナントネガティブ突然変異の遺伝子産物であるＦａｓポリペプチドのドミナントネガティブ形態を指す。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブ突然変異（「アンチモルフ突然変異」とも呼ばれる）は、野生型対立遺伝子に対してアンタゴニスト的に作用する変更された遺伝子産物を有する。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、同じ細胞内の正常な野生型Ｆａｓポリペプチドに悪影響を及ぼす。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、野生型Ｆａｓポリペプチドと相互作用するが、下流の分子、例えば、ＦＡＤＤへのそのシグナル伝達を遮断する。
【０１０１】
ある特定の非限定的な実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、異種シグナルペプチド、例えば、ＩＬ−２シグナルペプチド、カッパリーダー配列、ＣＤ８リーダー配列、または本質的に同等の活性を有するペプチドを含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、細胞内ドメイン中に少なくとも１つの改変を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＦａｓのＦＡＤＤポリペプチドへの結合を防止する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、死ドメイン内にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、配列番号１０の約２００〜約３２０のアミノ酸内にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、配列番号１０の約２００〜約３１９のアミノ酸内にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、配列番号１０の約２０２〜約３１９のアミノ酸内にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの改変は、配列番号１０の約２２６〜約３１９のアミノ酸内にある。Ｆａｓタンパク質の死ドメインは、Tartaglia  LA  et  al.  Cell.  (1993);74(5):845-53；Itoh  and  Nagata.  J  Biol  Chem.  (1993);268(15):10932；Boldin  MP  et  al.  J  Biol  Chem.  (1995);270(14):7795-8；およびHuang  B  et  al.  Nature  (1996);384(6610):638-41に開示されており、これらのすべては、本明細書に参照によって組み込まれる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、改変は、突然変異、欠失および挿入からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、突然変異は、点突然変異である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、改変は、欠失である。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、死ドメインの部分的または完全な欠失を含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、ヒト野生型Ｆａｓポリペプチド（例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）のアミノ酸残基２３０〜３１４の欠失を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒト野生型Ｆａｓポリペプチドのアミノ酸残基２３０〜３１４の欠失を有するドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、「ｈＦａｓΔＤＤ」として表される。ｈＦａｓΔＤＤは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１２は下記に提供される。
【０１０５】
MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLLKDITSDSENSNFRNEIQSLV（配列番号１２）
【０１０６】
配列番号１２のアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、下記に提供される配列番号１３に示される。
【０１０７】
ATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAGATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGTGACTGACATCAACTCCAAGGGATTGGAATTGAGGAAGACTGTTACTACAGTTGAGACTCAGAACTTGGAAGGCCTGCATCATGATGGCCAATTCTGCCATAAGCCCTGTCCTCCAGGTGAAAGGAAAGCTAGGGACTGCACAGTCAATGGGGATGAACCAGACTGCGTGCCCTGCCAAGAAGGGAAGGAGTACACAGACAAAGCCCATTTTTCTTCCAAATGCAGAAGATGTAGATTGTGTGATGAAGGACATGGCTTAGAAGTGGAAATAAACTGCACCCGGACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTAAACCAAACTTTTTTTGTAACTCTACTGTATGTGAACACTGTGACCCTTGCACCAAATGTGAACATGGAATCATCAAGGAATGCACACTCACCAGCAACACCAAGTGCAAAGAGGAAGGTTCCAGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTTCTTTTGCCAATTCCACTAATTGTTTGGGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTC（配列番号１３）
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である、アミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である、アミノ酸配列を有するドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、ヒトＦａｓポリペプチド（例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）のアミノ酸残基２３０〜３１４の欠失を含むか、または有する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、改変は、点突然変異である。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、ヒトＦａｓポリペプチド（例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）の２６０位の点突然変異を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、点突然変異は、Ｄ２６０Ｖである。ある特定の実施形態では、ヒト野生型Ｆａｓポリペプチドの点突然変異Ｄ２６０Ｖを有するドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、「ｈＦａｓＤ２６０Ｖ」として表され、ｈＦａｓＤ２６０Ｖは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１４は下記に提供される。
【０１１０】
MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIVEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV（配列番号１４）
【０１１１】
配列番号１４のアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、下記に提供される配列番号１５に示される。
【０１１２】
ATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAGATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGTGACTGACATCAACTCCAAGGGATTGGAATTGAGGAAGACTGTTACTACAGTTGAGACTCAGAACTTGGAAGGCCTGCATCATGATGGCCAATTCTGCCATAAGCCCTGTCCTCCAGGTGAAAGGAAAGCTAGGGACTGCACAGTCAATGGGGATGAACCAGACTGCGTGCCCTGCCAAGAAGGGAAGGAGTACACAGACAAAGCCCATTTTTCTTCCAAATGCAGAAGATGTAGATTGTGTGATGAAGGACATGGCTTAGAAGTGGAAATAAACTGCACCCGGACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTAAACCAAACTTTTTTTGTAACTCTACTGTATGTGAACACTGTGACCCTTGCACCAAATGTGAACATGGAATCATCAAGGAATGCACACTCACCAGCAACACCAAGTGCAAAGAGGAAGGATCCAGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTTCTTTTGCCAATTCCACTAATTGTTTGGGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACCTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGAGTAAATATATCACCACTATTGCTGGAGTCATGACACTAAGTCAAGTTAAAGGCTTTGTTCGAAAGAATGGTGTCAATGAAGCCAAAATAGTTGAGATCAAGAATGACAATGTCCAAGACACAGCAGAACAGAAAGTTCAACTGCTTCGTAATTGGCATCAACTTCATGGAAAGAAAGAAGCGTATGACACATTGATTAAAGATCTCAAAAAAGCCAATCTTTGTACTCTTGCAGAGAAAATTCAGACTATCATCCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTC（配列番号１５）
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である、アミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である、アミノ酸配列を有するドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、ヒトＦａｓポリペプチド（例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）の点突然変異Ｄ２６０Ｖを含むか、または有する。
【０１１４】
ある特定の非限定的な実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、異種シグナルペプチド、例えば、ＩＬ−２シグナルペプチド、カッパリーダー配列、ＣＤ８リーダー配列、または本質的に同等の活性を有するペプチドを含む。
３．抗原認識受容体
【０１１５】
本開示は、抗原に結合する抗原認識受容体を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。抗原認識受容体は、腫瘍抗原または病原体抗原に結合することができる。
３．１．抗原
【０１１６】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、腫瘍抗原に結合する。任意の腫瘍抗原（抗原ペプチド）は、本明細書に記載の腫瘍に関係する実施形態において使用することができる。抗原の源としては、がんタンパク質が挙げられるが、それに限定されない。抗原は、ペプチドとして、または無傷タンパク質もしくはその部分として発現され得る。無傷タンパク質またはその一部は、天然であり得、または変異誘発され得る。腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
【０１１７】
ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ軽鎖、ＫＤＲ、突然変異体ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃを含むが、それらに限定されない）、突然変異体ＰＩＫ３ＣＡ（Ｅ５２Ｋ、Ｅ５４５Ｋ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｌを含むが、それらに限定されない）、突然変異体ＩＤＨ（Ｒ１３２Ｈを含むが、それに限定されない）、突然変異体ｐ５３（Ｒ１７５Ｈ、Ｙ２２０Ｃ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、Ｒ２７３ＨおよびＲ２８２Ｗを含むが、それらに限定されない）、突然変異体ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋを含むが、それに限定されない）、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ−ＬＣ−１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１，ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、およびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ  Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７腫瘍性タンパク質、ならびにＥＲＢＢ。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ１９ポリペプチドは、下記に提供される配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK［配列番号１６］
【０１２０】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ヒトＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメインに結合する。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、例えば、免疫無防備状態の対象における、例えば、病原体感染症の処置および／または予防における使用のために、病原体抗原に結合する。病原体の非限定的な例としては、疾患を引き起こすことができる、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物が挙げられる。
【０１２２】
ウイルスの非限定的な例としては、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される）およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株などのヒト免疫不全ウイルス）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイラウイルス（Naira  viruses））；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内部的に伝染；クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）、ヒトパピローマウイルス（すなわち、ＨＰＶ）、ＪＣウイルス、エプスタインバーウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルスが挙げられる。
【０１２３】
細菌の非限定的な例としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、病原体抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である。
３．２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
【０１２５】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲである。ＴＣＲは、インバリアントＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現された２つの可変鎖からなるジスルフィド連結したヘテロ二量体タンパク質である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見出され、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチドとして抗原を認識する原因となる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ガンマ鎖およびデルタ鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）を含む。
【０１２６】
ＴＣＲのそれぞれの鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域で構成される。定常領域は、細胞膜に対して近位にあり、膜貫通領域および短い細胞質尾部に続く。可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。両方の鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、３つの二量体シグナル伝達モジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／εおよびＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηと受容体複合体を形成することができる。ＴＣＲ複合体がその抗原およびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、ＴＣＲ複合体を発現するＴ細胞が活性化される。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、内因性ＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ウイルス抗原を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ウイルス特異的Ｔ細胞において発現される。ある特定の実施形態では、ウイルス特異的Ｔ細胞は、ウイルス感染、例えば、ＢＫウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルスまたはアデノウイルスに対する個体の免疫に由来する。ある特定の実施形態では、ウイルス特異的Ｔ細胞は、Leen  et  al.,  Blood,  Vol.  121,  No.  26,  2013；Barker  et  al.,  Blood,  Vol.  116,  No.  23,  2010；Tzannou  et  al.,  Journal  of  Clinical  Oncology,  Vol.  35,  No.  31,  2017；またはBollard  et  al.,  Blood,  Vol.  32,  No.  8,  2014に開示されるＴ細胞であり、これらのそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、腫瘍抗原を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、腫瘍特異的Ｔ細胞において発現される。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞を腫瘍、例えば、黒色腫または上皮がんの外植片とともに培養することによって発生する腫瘍浸潤性Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞は、Stevanovic  et  al,  Science,  356,  200-205,  2017；Dudley  et  al.  Journal  of  Immunotherapy,  26(4):  332-342,  2003；またはGoff  et  al,  Journal  of  Clinical  Oncology,  Vol.  34,  No.  20,  2016に開示されるＴ細胞であり、これらのそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、組換えＴＣＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、天然に存在しないＴＣＲである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、任意の天然に存在するＴＣＲと、少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、任意の天然に存在するＴＣＲと、少なくとも約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個またはそれよりも多くのアミノ酸残基が異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲから、少なくとも１個のアミノ酸残基が改変されている。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲから、少なくとも約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個またはそれよりも多くのアミノ酸残基が改変されている。
３．３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【０１３０】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞または免疫応答性細胞に目的の特異性をグラフトまたは付与する、操作された受容体である。ＣＡＲを使用して、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性をグラフトすることができ、それらのコード配列の移入は、レトロウイルスベクターによって促進される。
【０１３１】
３つの世代のＣＡＲがある。「第一世代」ＣＡＲは、典型的には、細胞質／細胞内シグナル伝達ドメインに融合された膜貫通ドメインに融合された、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）で構成される。「第一世代」ＣＡＲは、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗原認識を提供することができ、ＨＬＡ媒介性抗原提示とは無関係に、単一の融合分子におけるそれらのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを通してＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。「第二世代」ＣＡＲは、さまざまな共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質尾部に付加して、Ｔ細胞に追加のシグナルを提供する。「第二世代」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものを含む。「第三世代」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第一世代ＣＡＲである。
【０１３２】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはそのアナログに具体化される）は、約２×１０−７Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、Ｋｄは、約２×１０−７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０−７Ｍもしくはそれ未満、約９×１０−８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０−８Ｍもしくはそれ未満、約９×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約５×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約４×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約３×１０−９もしくはそれ未満、約２×１０−９Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０−９Ｍもしくはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約３×１０−９Ｍまたはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１×１０−９Ｍ〜約３×１０−７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０−９Ｍ〜約３×１０−７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０−９Ｍ〜約２．７×１０−７Ｍである。
【０１３３】
細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはそのアナログにおける）の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般に、目的の複合体について特異的に標識された試薬（例えば、抗体またはｓｃＦｖ）を用いることによって、特に目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ｓｃＦｖを、放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるWeintraub,  B.,  Principles  of  Radioimmunoassays,  Seventh  Training  Course  on  Radioligand  Assay  Techniques,  The  Endocrine  Society,  March,  1986を参照されたい）。放射性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって、検出することができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、蛍光マーカーで標識される。蛍光マーカーの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＡｚｕｒｉｔｅおよびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、ＣｅｒｕｌｅａｎおよびＣｙＰｅｔ）および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＶｅｎｕｓおよびＹＰｅｔ）が挙げられる。
【０１３４】
本開示の主題に従って、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原または病原体抗原であり得る抗原に特異的に結合する。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、その全体が参照によって組み込まれるKochenderder,  JN  et  al.  Blood.  2010  Nov  11;116(19):3875-86に記載されているものである。
３．３．１．ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン
【０１３６】
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｆａｂであり、これは必要に応じて架橋されている。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。ある特定の実施形態では、先述の分子のいずれかは、異種配列との融合タンパク質に含まれて、細胞外抗原結合ドメインを形成してもよい。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、抗原−Ｆｃ融合タンパク質によるｓｃＦｖファージライブラリーをスクリーニングすることによって、特定される。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、抗原は、病原体抗原である。
３．３．２．ＣＡＲの膜貫通ドメイン
【０１３７】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部に及ぶ疎水性アルファヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体は、クラスター形成し、シグナルは、細胞に伝達される。本開示の主題に従って、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質に基づかない）、またはそれらの組合せを含むことができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１３９３４５．１を有する配列（配列番号１７）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である（本明細書において、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る）、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、もしくは少なくとも３０アミノ酸長、もしくは少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも５０アミノ酸長、および最大で２３５アミノ酸長である、配列番号１７の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１〜２３５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１３７〜２０９、１５０〜２００、もしくは２００〜２３５のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８（例えば、ヒトＣＤ８）の膜貫通ドメイン、またはその一部を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号１７のアミノ酸１３７〜２０９のアミノ酸配列を含むか、または有するＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。配列番号１７は下記に提供される。
【０１３９】
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV［配列番号１７］
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＡ９２５３３．１を有する配列（配列番号１８）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である（本明細書において、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る）、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、もしくは少なくとも約６０アミノ酸長、もしくは少なくとも約７０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１００アミノ酸長、もしくは少なくとも約２００アミノ酸長、および最大で２４７アミノ酸長である、配列番号１８の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸１〜２４７、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、１５１〜２１９、もしくは２００〜２４７のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８（例えば、マウスＣＤ８）の膜貫通ドメイン、またはその一部を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号１８のアミノ酸１５１〜２１９のアミノ酸配列を含むか、または有するＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。配列番号１８は下記に提供される。
【化２】
2022502054.tif 000004
【０１４１】
本開示の主題に従って、「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０を有する配列（配列番号１９）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を有することができ、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、もしくは少なくとも３０アミノ酸長、もしくは少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも５０アミノ酸長、および最大で２２０アミノ酸長である、配列番号１９の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１〜２２０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００、１５３〜１７９、もしくは２００〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１１４〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８（例えば、ヒトＣＤ２８）の膜貫通ドメイン、またはその一部を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１９のアミノ酸１５３〜１７９を含むか、または有するＣＤ２８ポリペプチドを含む。配列番号１９は下記に提供される。
【化３】
2022502054.tif 000005
【０１４３】
配列番号１９のアミノ酸１５３〜１７９をコードする例示的な核酸配列は、下記に提供される配列番号２０に示される。
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG［配列番号２０］
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３１６６８．３を有する配列（配列番号２１）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を有することができ、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、もしくは少なくとも３０アミノ酸長、もしくは少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも５０アミノ酸長、および最大で２１８アミノ酸長である、配列番号２１の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１〜２１８、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００、１５１〜１７７、もしくは２００〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１１４〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８（例えば、マウスＣＤ２８）の膜貫通ドメイン、またはその一部を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２１のアミノ酸１５１〜１７７を含むか、または有するＣＤ２８ポリペプチドを含む。配列番号２１は下記に提供される。
【化４】
2022502054.tif 000006
【０１４５】
本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１４６】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域を含むこともできる。スペーサー領域は、抗原結合ドメインを異なる方向に向けて、抗原認識を容易にすることを可能にするのに十分柔軟であり得る。スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、およびＣＤ３の部分、ＣＤ２８ポリペプチドの一部（例えば、配列番号１９または配列番号２１の一部）、ＣＤ８ポリペプチドの一部（例えば、配列番号１７の一部または配列番号１８の一部）、先述のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％相同または同一であるそれらの変形形態、あるいは合成スペーサー配列であり得る。
３．３．３．ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン
【０１４７】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞（例えば、リンパ球系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化または刺激することができるＣＤ３ζポリペプチドを含む。野生型（「天然」）ＣＤ３ζは、３個の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、抗原が結合された後に、細胞（例えば、リンパ球系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）に活性化シグナルを伝達する。天然ＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要伝達物質である。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０を有する配列（配列番号２２）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、もしくは少なくとも３０アミノ酸長、もしくは少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも５０アミノ酸長、および最大で１６４アミノ酸長である、配列番号２２の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸１〜１６４、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、５２〜１６４、もしくは１５０〜１６４のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸５２〜１６４を有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。配列番号２２は下記に提供される。
【化５】
2022502054.tif 000007
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１０６８６４．２を有する配列（配列番号２３）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、もしくは少なくとも約９０アミノ酸長、もしくは少なくとも約１００アミノ酸長、および最大で１８８アミノ酸長である、配列番号２３の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１〜１６４、１〜５０、５０〜１００、５２〜１４２、１００〜１５０、もしくは１５０〜１８８のアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号２３は下記に提供される。
【化６】
2022502054.tif 000008
【０１５０】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むか、または有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。配列番号２４は下記に提供される。
RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR［配列番号２４］
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。
【０１５２】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。
【０１５３】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、共刺激領域は、最適なリンパ球活性化を提供することができる少なくとも１つの共刺激分子を含む。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」は、抗原に対するリンパ球の高効率の応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ−１０ポリペプチドまたはそれらの組合せを含むことができる。共刺激分子は、細胞表面において発現されるタンパク質である共刺激リガンドに結合することができ、これは、その受容体への結合の際に、共刺激応答、すなわち、抗原がそのＣＡＲ分子に結合するときに提供される刺激をもたらす細胞内応答を生じる。共刺激リガンドとしては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬが挙げられるが、それらに限定されない。一例として、４−１ＢＢリガンド（すなわち、４−１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを提供するために、４−１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても公知）に結合し得る。４−１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ−１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，４４６，１９０号に開示されている。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその一部）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその一部）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸長、もしくは少なくとも３０アミノ酸長、もしくは少なくとも４０アミノ酸長、もしくは少なくとも５０アミノ酸長、および最大で２２０アミノ酸長である、配列番号１９の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１〜２２０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００、１８１〜２２０、もしくは２００〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１８１〜２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、マウスＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその一部）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、および最大で２１８アミノ酸長である、配列番号２１の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１〜２１８、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２１８、１１５〜２１８、１５０〜２００、１７８〜２１８、もしくは２００〜２１８のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１１５〜２１８のアミノ酸配列を含むか、または有する。
【０１５６】
本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のマウス細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のヒト細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激分子：ＣＤ２８および４−１ＢＢまたはＣＤ２８およびＯＸ４０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢの細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用し、刺激活性を有することができる。ある特定の実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１５５２を有する配列（配列番号２５）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、および最大で２５５アミノ酸長である、配列番号２５の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸１〜２５５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２１４〜２５５、もしくは２００〜２５５のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２１４〜２５５のアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号２５は下記に提供される。
【化７】
2022502054.tif 000009
【０１６０】
本開示の主題に従って、「４−１ＢＢ核酸分子」は、４−１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウス４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部を含む。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０の細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＯＸ４０の細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＯＸ４０ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００３３１８を有する配列（配列番号２６）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＯＸ４０ポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、および最大で２７７アミノ酸長である、配列番号２６の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、４−１ＢＢポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸１〜２７７、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、もしくは２００〜２７７のアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号２６は下記に提供される。
【化８】
2022502054.tif 000010
【０１６３】
本開示の主題に従って、「ＯＸ４０核酸分子」は、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＩＣＯＳの細胞内ドメインまたはその一部を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６２２４を有する配列（配列番号２７）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同または同一である、アミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは有し、および／あるいは必要に応じて最大で１つ、または最大で２つ、または最大で３つの保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＩＣＯＳポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長、もしくは少なくとも約３０アミノ酸長、もしくは少なくとも約４０アミノ酸長、もしくは少なくとも約５０アミノ酸長、および最大で１９９アミノ酸長である、配列番号２７の連続した部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、または加えて、非限定的なさまざまな実施形態では、ＩＣＯＳポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸１〜２７７、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、もしくは１５０〜１９９のアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号２７は下記に提供される。
【化９】
2022502054.tif 000011
【０１６５】
本開示の主題に従って、「ＩＣＯＳ核酸分子」は、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
３．３．４．例示的なＣＡＲ
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ１９ポリペプチド）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその一部）、ＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ヒトＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその一部）を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ＣＤ１９２８ζ」として表される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９２８ζ）は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。配列番号２８は下記に提供される。
【０１６７】
ALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR［配列番号２８］
【０１６８】
配列番号２８のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号２９に示される。配列番号２９は下記に提供される。
【０１６９】
gctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagaggtgaagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcctggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtcaagccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcggcctaacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaaagaccattagttcggtagtagatttctactttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctgacattgagctcacccagtctccaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaaccactgatttactcggcaacctaccggaacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaacgtgcagtctaaagacttggcagactatttctgtcaacaatataacaggtatccgtacacgtccggaggggggaccaagctggagatcaaacgggcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagagccccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc［配列番号２９］
４．細胞
【０１７０】
本開示の主題は、本明細書に開示されるドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、抗原に結合する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をさらに含む。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド（例えば、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド）は、細胞の抗腫瘍効果を促進することができる。細胞は、細胞が抗原認識受容体および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを同時発現するように、抗原認識受容体および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドで形質導入することができる。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、細胞は、免疫応答性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、リンパ球系列の細胞である。リンパ球系列の細胞は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来性病原因子の検出、宿主に対して外来の細胞の検出などを提供することができる。リンパ球系列の細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、およびリンパ系細胞が分化し得る幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）である。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、胸腺において成熟し、細胞媒介性免疫の主に原因となるリンパ球であり得る。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与する。本開示の主題のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞を含む）、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても公知）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞およびγδＴ細胞を含むがそれらに限定されない任意の種類のＴ細胞であり得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することができるＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞は、遺伝子改変されて、抗原認識受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲの導入により特異的抗原を標的にし得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、ウイルス特異的Ｔ細胞は、ウイルス抗原を認識する内因性ＴＣＲを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識する内因性ＴＣＲを含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介性免疫の一部であり、自然免疫応答の間に作用するリンパ球であり得る。ＮＫ細胞は、標的細胞におけるそれらの細胞傷害効果を行うために、事前の活性化を必要としない。
【０１７５】
本開示の主題のヒトリンパ球の種類としては、限定されないが、末梢ドナーリンパ球、例えば、Sadelain,  M.,  et  al.  2003  Nat  Rev  Cancer  3:35-45（ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Morgan,  R.A.,  et  al.  2006  Science  314:126-129（αおよびβヘテロ二量体を含む、全長腫瘍抗原を認識するＴ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Panelli,  M.C.,  et  al.  2000  J  Immunol  164:495-504；Panelli,  M.C.,  et  al.  2000  J  Immunol  164:4382-4392（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物を開示する）、およびDupont,  J.,  et  al.  2005  Cancer  Res  65:5417-5427；Papanicolaou,  G.A.,  et  al.  2003  Blood  102:2498-2505（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖された抗原特異的末梢血白血球の選択性を開示する）に開示されるものが挙げられる。免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種異系）であり得、または操作された前駆細胞もしくは幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、細胞は、骨髄球系列の細胞である。骨髄球系列の細胞の非限定的な例としては、単球、マクロファージ、好塩基球、好中球、好酸球、肥満細胞、赤血球、巨核球、血小板、および骨髄球系細胞が分化し得る幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞）である。
【０１７７】
本開示の細胞は、腫瘍微小環境をモジュレートすることができる。腫瘍は、免疫認識および排除からそれ自身を保護するための悪性細胞による一連の機構を含む、宿主免疫応答に敵対する微小環境を有する。この「敵対的な腫瘍微小環境」は、浸潤調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄球由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＴＧＦ−βを含む免疫抑制サイトカイン、および活性化Ｔ細胞（ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）によって発現される免疫抑制受容体を標的にするリガンドの発現を含む、種々の免疫抑制因子を含む。免疫抑制のこれらの機構は、寛容の維持および不適当な免疫応答の抑制において役割を果たすが、しかしながら、腫瘍微小環境内では、これらの機構は有効な抗腫瘍免疫応答を防止する。まとめると、これらの免疫抑制因子は、標的化腫瘍細胞との遭遇の際に、養子移入されるＣＡＲ改変Ｔ細胞の著しいアネルギーまたはアポトーシスのいずれかを誘導することができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、細胞持続性を増加させた。ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、アポトーシスおよび／またはアネルギーを減少させた。
５．組成物およびベクター
【０１７９】
本開示の主題は、本明細書に開示される（例えば、セクション２に開示される）ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド、および本明細書に開示される（例えば、セクション３に開示される）抗原認識受容体を含む組成物を提供する。このような組成物を含む細胞（例えば、免疫応答性細胞）も提供される。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第２のプロモーターに作動可能に連結される。
【０１８１】
さらにまた、本開示の主題は、本明細書に開示される（例えば、セクション２に開示される）ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および本明細書に開示される（例えば、セクション３に開示される）抗原認識受容体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。このような核酸組成物を含む細胞も提供される。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、核酸組成物は、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドに作動可能に連結された第１のプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態では、核酸組成物は、抗原認識受容体に作動可能に連結された第２のプロモーターをさらに含む。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、内因性または外因性である。ある特定の実施形態では、外因性プロモーターは、伸長因子（ＥＦ）−１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、誘導プロモーターである。ある特定の実施形態では、誘導プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、ＩＬ−２プロモーター、ＩＬ−１２プロモーター、ｐ４０プロモーターおよびＢｃｌ−ｘＬプロモーターからなる群から選択される。
【０１８４】
組成物および核酸組成物は、当技術分野で公知の方法によって、または本明細書に記載のようにして、対象に投与することができ、または／および細胞に送達することができる。細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、実質的に同種の細胞組成物を組換えＤＮＡ構築物で形質導入することによって、達成することができる。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのいずれか）を、ＤＮＡ構築物の細胞への導入のために用いられる。例えば、抗原認識受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、およびドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、発現は、その内因性プロモーターから、レトロウイルス長い末端反復から、または目的の標的細胞の種類に特異的なプロモーターから駆動され得る。非ウイルスベクターも同様に使用され得る。
【０１８５】
ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよび抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を含む細胞の最初の遺伝子改変のために、レトロウイルスベクターが、一般に、形質導入のために用いられるが、しかしながら、任意の他の適切なウイルスベクターまたは非ウイルス送達システムを使用することができる。抗原認識受容体およびドミナントネガティブＦａｓポリペプチドは、単一のマルチシストロン性発現カセット、単一ベクターの複数の発現カセット、または複数のベクターにおいて構築することができる。多シストロン性発現カセットを作出するエレメントの例としては、さまざまなウイルスおよび非ウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ−１  ＩＲＥＳ、ＦＧＦ−２  ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ、ＩＧＦ−ＩＩ  ＩＲＥＳ、ＮＦ−κＢ  ＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１  ＩＲＥＳ、ｐ５３  ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳおよび脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）、および切断可能リンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド）が挙げられるが、それらに限定されない。レトロウイルスベクターおよび適当なパッケージングラインの組合せも適切であり、ここで、カプシドタンパク質は、ヒト細胞を感染させるために機能的である。ＰＡ１２（Miller,  et  al.  (1985)  Mol.  Cell.  Biol.  5:431-437）；ＰＡ３１７（Miller,  et  al.  (1986)  Mol.  Cell.  Biol.  6:2895-2902）；およびＣＲＩＰ（Danos,  et  al.  (1988)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:6460-6464）を含むがそれらに限定されない、さまざまな両種指向性ウイルス産生細胞系が公知である。非両種指向性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープでシュードタイプ化された粒子、および当技術分野において公知の任意の他のものも適切である。
【０１８６】
形質導入の可能な方法としては、例えば、Bregni,  et  al.  (1992)  Blood  80:1418-1422の方法による産生細胞との細胞の直接共培養、または例えば、Xu,  et  al.  (1994)  Exp.  Hemat.  22:223-230；およびHughes,  et  al.  (1992)  J.  Clin.  Invest.  89:1817の方法による、ウイルス上清のみと、もしくは適当な成長因子およびポリカチオンを用いるか、または用いない濃縮ベクターストックとの培養も挙げられる。
【０１８７】
他の形質導入ウイルスベクターを使用して、細胞を改変することができる。ある特定の実施形態では、選択されるベクターは、高効率の感染、ならびに安定した組込みおよび発現を示す（例えば、Cayouette  et  al.,  Human  Gene  Therapy  8:423-430,  1997；Kido  et  al.,  Current  Eye  Research  15:833-844,  1996；Bloomer  et  al.,  Journal  of  Virology  71:6641-6649,  1997；Naldini  et  al.,  Science  272:263-267,  1996；およびMiyoshi  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  94:10319,  1997を参照されたい）。使用することができる他のウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えばエプスタインバーウイルスが挙げられる（例えば、Miller,  Human  Gene  Therapy  15-14,  1990；Friedman,  Science  244:1275-1281,  1989；Eglitis  et  al.,  BioTechniques  6:608-614,  1988；Tolstoshev  et  al.,  Current  Opinion  in  Biotechnology  1:55-61,  1990；Sharp,  The  Lancet  337:1277-1278,  1991；Cornetta  et  al.,  Nucleic  Acid  Research  and  Molecular  Biology  36:311-322,  1987；Anderson,  Science  226:401-409,  1984；Moen,  Blood  Cells  17:407-416,  1991；Miller  et  al.,  Biotechnology  7:980-990,  1989；LeGal  La  Salle  et  al.,  Science  259:988-990,  1993；およびJohnson,  Chest  107:77S-83S,  1995のベクターも参照されたい）。レトロウイルスベクターは特によく開発され、臨床場面において使用されている（Rosenberg  et  al.,  N.  Engl.  J.  Med  323:370,  1990；Anderson  et  al.、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０１８８】
非ウイルスアプローチも、細胞の遺伝子改変のために用いることができる。例えば、核酸分子は、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって（Feigner  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  84:7413,  1987；Ono  et  al.,  Neuroscience  Letters  17:259,  1990；Brigham  et  al.,  Am.  J.  Med.  Sci.  298:278,  1989；Staubinger  et  al.,  Methods  in  Enzymology  101:512,  1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲーション（Wu  et  al.,  Journal  of  Biological  Chemistry  263:14621,  1988；Wu  et  al.,  Journal  of  Biological  Chemistry  264:16985,  1989）、または手術条件下のマイクロインジェクション（Wolff  et  al.,  Science  247:1465,  1990）によって、免疫応答性細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔およびプロトプラスト融合を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションが挙げられる。リポソームはまた、ＤＮＡの細胞への送達のために潜在的に有益であり得る。正常な遺伝子の対象の罹患組織への移植はまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養可能な細胞型（例えば、自己もしくは異種初代細胞またはその後代）に正常な核酸を導入することによって達成することができ、その後、細胞（または、その子孫）は、標的化組織に注射されるか、または全身的に注射される。組換え受容体はまた、トランスポザーゼまたは標的化ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して誘導または得ることができる。一時的発現は、ＲＮＡ電気穿孔によって得てもよい。
【０１８９】
任意の標的化ゲノム編集方法を使用して、本明細書に開示されるドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよび／または抗原認識受容体を、細胞または対象に送達することもできる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムが、本明細書に開示されるドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよび／または抗原認識受容体を送達するために使用される。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、本明細書に開示されるドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよび／または抗原認識受容体を送達するために使用される。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムが、本明細書に開示されるドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよび／または抗原認識受容体を送達するために使用される。
【０１９０】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞で発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集のために利用される場合、このシステムは、Ｃａｓ９（そのガイドとしてｃｒＲＮＡを利用してＤＮＡを改変することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９と活性複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般に、ヘアピンループの形態）に結合する領域と一緒にそれを宿主ＤＮＡの正しい部分に導くためにＣａｓ９によって使用されるＲＮＡを含有する）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９と活性複合体を形成する）、およびＤＮＡ修復鋳型（特異的ＤＮＡ配列の挿入を可能にする細胞修復プロセスを導くＤＮＡ）の必要に応じた部分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、多くの場合、標的細胞をトランスフェクトするプラスミドを用いる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が細胞の中の標的ＤＮＡを特定し、それに直接結合するために使用する配列であるので、それぞれの適用のために設計する必要がある。ＣＡＲ発現カセットを持つ修復鋳型も、その切断のいずれかの側の配列と重複し、挿入配列をコードしなければならないので、それぞれの適用のために設計する必要がある。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、一緒にパッケージされて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。このｓｇＲＮＡは、細胞にトランスフェクトさせるために、Ｃａｓ９遺伝子と一緒に接合させ、プラスミドにすることができる。
【０１９１】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、人工制限酵素であり、これは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生じる。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノム内の所望の配列を標的にすることを可能にする特異的ＤＮＡ配列を標的にするように操作することができる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、複数の個々のジンクフィンガー反復配列を含有し、複数の塩基対をそれぞれ認識することができる。新たなジンクフィンガードメインを生じさせる最も一般的な方法は、公知の特異性のより小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮにおける最も一般的な切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の非特異的切断ドメインである。内因性相同組換え（ＨＲ）機構およびＣＡＲ発現カセットを持つ相同ＤＮＡ鋳型を使用して、ＺＦＮを使用して、ＣＡＲ発現カセットをゲノムに挿入することができる。標的化配列がＺＦＮによって切断される場合、ＨＲ機構は、損傷を受けた染色体および相同ＤＮＡ鋳型の間の相同性を検索し、次いで、染色体の２つの切断端の間の鋳型の配列をコピーし、それによって相同ＤＮＡ鋳型がゲノムに組み込まれる。
【０１９２】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特異的配列を切断するように操作することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮとほとんど同じ原理で作動する。それらは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生じる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特異的ヌクレオチドのための強力な認識を有する２つの可変位置を有する３３〜３４アミノ酸の反復モチーフで構成される。これらのＴＡＬＥのアレイをアセンブルすることによって、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、所望のＤＮＡ配列に結合し、それによってゲノムＤＮＡ配列中の特異的位置で切断するようにヌクレアーゼを導くように操作することができる。
【０１９３】
ポリヌクレオチド治療方法は、任意の適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）から指示することができ、任意の適当な哺乳動物の調節エレメントまたはイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節することができる。例えば、所望により、特異的細胞型において遺伝子発現を優先的に指示することが公知のエンハンサーを使用して、核酸の発現を指示することができる。使用されるエンハンサーとしては、限定されないが、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが挙げられ得る。あるいは、ゲノムクローンが治療用構築物として使用される場合、調節は、同族の調節配列によって、または、所望により、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む異種起源に由来する調節配列によって、媒介することができる。
【０１９４】
ゲノム編集剤／システムを送達するための方法は、必要性に応じて変えることができる。ある特定の実施形態では、選択されたゲノム編集方法の構成成分は、１つまたは複数のプラスミド中のＤＮＡ構築物として送達される。ある特定の実施形態では、構成成分は、ウイルスベクターを介して送達される。一般的な送達方法としては、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インペールフェクション、静水圧、持続注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイピング、複製可能なベクターのシスおよびトランス作用性エレメント、単純ヘルペスウイルス、および化学的媒体（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子および細胞透過性ペプチド）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９５】
得られる細胞は、未改変細胞のためのものと類似の条件下で成長させることができ、それによって、改変細胞を種々の目的のために拡大増殖させ、使用することができる。
６．ポリペプチドおよびアナログ
【０１９６】
免疫応答性細胞において発現される場合に、それらの抗新生物活性を増強する方法で改変される、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８、ＣＤ３ζおよびＦａｓポリペプチドまたはそれらの断片も本開示の主題に含まれる。本開示の主題は、配列中に変更を生成させることによって、アミノ酸配列もしくは核酸配列を最適化するための方法を提供する。このような変更としては、ある特定の突然変異、欠失、挿入、または翻訳後修飾が挙げられ得る。本開示の主題は、本明細書に開示される任意の天然に存在するポリペプチド（ＣＤ１９、ＣＤ８、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζおよびＦａｓを含むが、それらに限定されない）のアナログをさらに含む。アナログは、本明細書に開示される天然に存在するポリペプチドから、アミノ酸配列の相違によって、翻訳後修飾によって、またはその両方によって、異なり得る。アナログは、本開示の主題の天然に存在するアミノ酸配列のすべてもしくは一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくはそれよりも高い相同または同一を示し得る。配列比較の長さは、少なくとも５個、１０個、１５個もしくは２０個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも２５個、５０個もしくは７５個のアミノ酸残基、または１００個より多くのアミノ酸残基である。再び、同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを、密接に関係する配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の間の確率スコアで使用してもよい。改変としては、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化もしくはグリコシル化が挙げられ；このような改変は、ポリペプチド合成もしくはプロセシングの間に、または単離された改変酵素での処理後に、起こり得る。アナログはまた、天然に存在するポリペプチドから、一次配列における変更によって異なり得る。これらとしては、天然および誘発性（例えば、照射もしくはエタンメチルスルフェートへの曝露によるか、またはSambrook,  Fritsch  and  Maniatis,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (2d  ed.),  CSH  Press,  1989、またはAusubel  et  al.、上記の部位特異的突然変異誘発による、ランダム突然変異誘発から生じる）の両方の遺伝的変異体が挙げられる。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸、または天然に存在しない、または合成のアミノ酸、例えば、βまたはγアミノ酸を含有する、環化ペプチド、分子およびアナログも挙げられる。
【０１９７】
全長ポリペプチドに加えて、本開示の主題は、本明細書に開示されるポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片も提供する。本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも５個、１０個、１３個または１５個のアミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸、少なくとも３０個の連続したアミノ酸、または少なくとも５０個の連続したアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも６０〜８０個、１００個、２００個、３００個またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を含む。断片は、当業者に公知の方法によって生じさせることができ、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、生物活性のために必要ではない発生期ポリペプチドからのアミノ酸の除去、または選択的ｍＲＮＡスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）に由来していてもよい。
【０１９８】
非タンパク質アナログは、本明細書に開示されるタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド）の機能活性を摸倣するように設計された化学構造を有する。このようなアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超えてもよい。アナログ設計の方法は、当技術分野において周知であり、アナログの合成は、得られるアナログが、免疫応答性細胞において発現される場合に元のポリペプチドの抗新生物活性を増加させるように、化学構造を修飾することによって、このような方法に従って行うことができる。これらの化学修飾としては、代替のＲ基に置換すること、および参照ポリペプチドの特定の炭素原子の飽和度を変化させることが挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態では、タンパク質アナログは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に比較的耐性であり、投与の際により長期の治療効果を生じる。機能活性を測定するためのアッセイとしては、下記の実施例に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
７．投与
【０１９９】
本開示の細胞またはそれを含む組成物は、抗原への免疫応答を誘導および／もしくは増強するため、ならびに／あるいは新生物形成および／もしくは病原体感染症を処置および／または予防するために、対象に、全身的または直接的に提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の細胞またはそれを含む組成物は、目的の臓器（例えば、新生物形成の影響を受けた臓器）に直接的に注射される。あるいは、本開示の細胞またはそれを含む組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の臓器に間接的に提供される。拡大増殖剤および分化剤を、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生成を増加させるために、細胞または組成物の投与の前、その間またはその後に提供することができる。
【０２００】
本開示の細胞は、任意の生理学的に許容される媒体中で、通常は血管内に投与することができるが、細胞はまた、細胞が再生および分化のための適当な部位を見出し得る骨または他の便利な部位（例えば、胸腺）に導入されてもよい。通常、少なくとも約１×１０５個の細胞が投与され、最終的に約１×１０１０個またはそれより多くに達する。本開示の細胞は、精製された細胞の集団を含むことができる。当業者は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などのさまざまな周知の方法を使用して、集団中の本開示の免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。本開示の細胞を含む集団における純度の適切な範囲は、約５０％〜約５５％、約５％〜約６０％、および約６５％〜約７０％である。ある特定の実施形態では、純度は、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、または約８０％〜約８５％である。ある特定の実施形態では、純度は、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、および約９５％〜約１００％である。投薬量は、当業者によって容易に調整され得る（例えば、純度の減少は、投薬量の増加を必要とし得る）。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。
【０２０１】
本開示の組成物は、本開示の細胞またはそれらの前駆細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。投与は、自己または異種であり得る。例えば、細胞または前駆細胞は、１人の対象から得ることができ、同じ対象、または異なる適合する対象に投与することができる。末梢血由来細胞またはそれらの後代（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏに由来する）は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与を含む局所注射を介して投与することができる。本開示の治療組成物を投与する場合、それは、単位投薬量の注射形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化することができる。
８．製剤
【０２０２】
本開示の細胞を含む組成物は、無菌の液体調製物、例えば、等張性の水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性の組成物として好都合に提供することができ、これは選択されたｐＨに緩衝されていてもよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性の組成物および固体組成物よりも調製するのが容易である。加えて、液体組成物は、特に注射によって、投与するために幾らかより便利である。他方で、粘性の組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液体組成物または粘性の組成物は、担体を含むことができ、これは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。
【０２０３】
無菌の注射可能な溶液は、所望により、さまざまな量の他の成分とともに必要な量の適当な溶媒中の遺伝子改変された免疫応答性細胞を組み込むことによって、調製することができる。このような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば、滅菌水、生理的食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合であってもよい。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤または増粘添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などのような補助物質を含有することができる。標準テキスト、例えば、参照により本明細書に組み込まれる"REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE",  17th  edition,  1985を参考にして、過度の実験なく適切な調製物を調製し得る。
【０２０４】
抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート化剤および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強するさまざまな添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。注射可能な医薬形態の長期にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意の媒体、希釈剤または添加剤は、遺伝子改変免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞と適合しなければならないだろう。
【０２０５】
組成物は、等張性であり得、すなわち、それらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有することができる。組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機の溶質などの他の薬学的に許容される薬剤を使用して、達成され得る。塩化ナトリウムは、特に、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のためのものであり得る。
【０２０６】
組成物の粘度は、所望により、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されるレベルで維持することができる。例えば、メチルセルロースは、容易かつ経済的に入手可能であり、作業するのが容易である。他の適切な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に依存し得る。重要な点は、選択される粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態、例えば、持続放出型形態または液体充填形態に製剤化されるか否か）に依存する。
【０２０７】
投与される細胞の量は、処置される対象によって変わる。一実施形態では、約１０４〜約１０１０個の間、約１０５〜約１０９個の間、または約１０６〜約１０８個の間の本開示の細胞が、ヒト対象に投与される。より有効な細胞は、さらに少ない数で投与されてもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも約１×１０８個、約２×１０８個、約３×１０８個、約４×１０８個または約５×１０８個の本開示の細胞が、ヒト対象に投与される。有効な用量と考えられるものの正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重および状態を含む、それぞれの対象に対する個々の因子に基づき得る。投薬量は、本開示および当技術分野における知識から、当業者によって容易に確認され得る。
【０２０８】
当業者は、組成物中の、および方法において投与される、細胞ならびに必要に応じた添加剤、媒体および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（活性細胞および／または薬剤に加えて）は、リン酸緩衝食塩水中に０．００１〜５０（重量）％溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムのオーダーで、例えば、約０．０００１〜約５重量％、約０．０００１〜約１重量％、約０．０００１〜約０．０５重量％、または約０．００１〜約２０重量％、約０．０１〜約１０重量％、または約０．０５〜約５重量％で存在する。動物またはヒトに投与される任意の組成物のために、以下を決定することができる：適切な動物モデル、例えば、マウスなどのげっ歯動物における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することなどによる毒性：適切な応答を誘発する、組成物の投薬量、その中の構成成分の濃度、および組成物を投与するタイミング。このような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書において引用される文書からの過度の実験を必要としない。また、連続的な投与のための時間は、過度の実験なく確認することができる。
９．処置の方法
【０２０９】
本開示の主題は、それを必要とする対象における免疫応答を誘導および／または増加させるための方法を提供する。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象における新生物形成を処置および／または予防するために使用することができる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、新生物形成を患っている対象の生存を延長するために使用することができる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象における新生物形成を処置および／または予防するために使用することもできる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象における腫瘍負荷を低減するために使用することもできる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象、例えば、免疫無防備状態のヒト対象における病原体感染症または他の感染性疾患を処置および／または予防するために使用することもできる。このような方法は、既存の状態の軽減または再発の予防である所望の効果を達成するために有効な量の本開示の細胞またはそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。処置のためには、投与される量は、所望の効果をもたらすのに有効な量である。有効量は、１回または一連の投与で提供することができる。有効量は、ボーラスまたは連続灌流によって提供することができる。
【０２１０】
抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法のために、典型的には、約１０６〜１０１1個（例えば、約１０９個）の範囲内の細胞用量が注入される。宿主への本開示の細胞の投与およびその後の分化の際に、特異的抗原に対して特異的に向けられるＴ細胞が誘導される。改変細胞は、静脈内、皮下、節内、腫瘍内、髄腔内、胸膜内、腹腔内、髄内、および胸腺に直接を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって投与することができる。
【０２１１】
本開示の主題は、対象における新生物を処置および／または予防するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、有効量の本開示の細胞またはそれを含む組成物を、新生物形成を有する対象に投与することを含む。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、新生物形成または腫瘍は、マッチした臓器の正常組織と比べて、増加したＦＡＳＬＧ  ＲＮＡ発現を有するがんである。参照によって本明細書に組み込まれるYamamoto  et  al.,  J  Clin  Invest.  (2019);129(4):1551-1565を参照されたい。
【０２１３】
新生物形成の非限定的な例としては、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽頭がん、黒色腫、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫、およびさまざまな癌腫（前立腺がんおよび小細胞肺がんを含む）が挙げられる。適切な癌腫としては、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞および大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌およびその肝臓転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞腫、胆管細胞癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭癌、皮脂腺癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、および重鎖病、管および小葉の腺癌などの乳房腫瘍、子宮頸部の扁平上皮および腺癌、子宮および卵巣の上皮癌、前立腺腺癌、膀胱の移行性扁平上皮癌、ＢおよびＴ細胞リンパ腫（結節性および散在性）プラズマ細胞腫、急性および慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫、ならびに平滑筋肉腫を含むがそれらに限定されない、腫瘍学の分野で公知の任意のものがさらに挙げられる。ある特定の実施形態では、新生物形成は、血液がん（例えば白血病、リンパ腫および骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫および咽頭がんからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、従来の治療的介入を受け入れない、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）または卵巣がんを処置および／または予防するために使用することができる。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、新生物は、固形がんまたは固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、固形腫瘍または固形がんは、神経膠芽腫、前立腺腺癌、腎乳頭細胞癌、肉腫、卵巣がん、膵臓腺癌、直腸腺癌、結腸腺癌、食道癌、子宮体類内膜癌、乳がん、皮膚黒色腫、肺腺癌、胃腺癌、子宮頸がん、腎明細胞癌、精巣胚細胞腫瘍および侵襲性Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【０２１５】
対象は、進行した形態の疾患を有し得、その場合において、処置の目的は、疾患進行の緩和もしくは反転、および／または副作用の改善を含み得る。対象は、既に処置された状態の病歴を有し得、その場合において、治療の目的は、典型的には、再発の危険性の減少または遅延を含む。
【０２１６】
治療のために適切なヒト対象は、典型的には、臨床基準によって区別することができる２つの処置群を含む。「進行疾患」または「高腫瘍負荷」を有する対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を保有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍質量に基づいて検出することができる腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラムまたはＸ線によって；それら自身における陽性の生化学的または病理組織学的マーカーはこの集団を特定するには不十分である）。医薬組成物は、対象の状態を軽減する目的で、抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの対象に投与される。理想的には、腫瘍質量の低減は、結果として起こるが、任意の臨床改善が利益を構成する。臨床改善としては、腫瘍の進行の危険性もしくは速度の減少、または腫瘍の病理学的帰結における低減が挙げられる。
【０２１７】
適切な対象の第２の群は、「アジュバント群」として当技術分野において公知である。これらは、新生物の病歴を有しているが、別の様式の治療に対して応答性である個体である。以前の治療は、外科的切除、放射線療法および伝統的化学療法が挙げられ得るが、それらに限定されない。結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有さない。しかしながら、それらは、元の腫瘍部位の近く、または転移によってのいずれかで、疾患の進行の危険性があると疑われる。この群は、高い危険性および低い危険性の個体にさらに細分化することができる。細分化は、初期の処置の前後で観察される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は、臨床分野において公知であり、それぞれ異なる新生物形成について適切に規定される。高い危険性のサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に侵入しているか、またはリンパ節の関与を示すものである。
【０２１８】
別の群は、新生物形成への遺伝的素因を有するが、新生物形成の証拠付けられた臨床徴候はまだ有していない。例えば、乳がんに関連する遺伝的突然変異についての試験が陽性であるが、まだ妊娠可能年齢である女性は、予防手術を行うのに適切になるまで、新生物形成の発生を予防するための予防的な処置において、本明細書に記載される免疫応答性細胞の１つまたは複数を受けることを望む場合がある。
【０２１９】
腫瘍抗原に結合する抗原認識受容体、ならびに抗原認識受容体およびドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む細胞の抗腫瘍効果を増強するドミナントネガティブＦａｓポリペプチド（例えば、外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド）の表面発現の結果として、養子移入されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、腫瘍部位で増大された選択的な細胞溶解活性を与えられる。さらにまた、腫瘍へのそれらの局在化またはウイルス感染およびそれらの増殖の後、Ｔ細胞は、生理学的な抗腫瘍または抗ウイルス応答に関与する広範囲の免疫細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞およびマクロファージ）のために、腫瘍またはウイルス感染部位を高伝導性環境に変化させる。
【０２２０】
加えて、本開示の主題は、対象において、例えば、免疫無防備状態の対象において、病原体感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症または原虫感染症）を処置および／または予防するための方法を提供する。本方法は、有効量の本開示の細胞またはそれを含む組成物を、病原体感染症を有する対象に投与することを含み得る。処置に対して感受性である例示的なウイルス感染としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルスの感染症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２１】
さらなる改変を、免疫学的合併症（「悪性Ｔ細胞形質転換」として公知）、例えば、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の危険性を回避もしくは最小化するために、または健康な組織が腫瘍細胞と同じ標的抗原を発現し、ＧｖＨＤと同様の結果をもたらす場合に、本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。この課題に対する可能性がある解決手段は、本開示の細胞に自殺遺伝子を操作することである。適切な自殺遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）およびトランケートされたヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）を投与することによって、Ｔ細胞除去を可能にし得る。ＥＧＦＲｔは、抗原認識受容体の上流に共有結合的に接合され得る。自殺遺伝子は、本開示のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター内に含まれ得る。この方法において、悪性腫瘍のＴ細胞形質転換（例えば、ＧＶＨＤ）の間に自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ（例えば、プロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ−９を活性化することができるＡＰ１９０３）の投与は、自殺遺伝子−活性化受容体−発現（例えば、ＣＡＲ−発現）Ｔ細胞においてアポトーシスを引き起こす。本開示の抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲ）への自殺遺伝子の組込みは、大多数の受容体発現（例えば、ＣＡＲ−発現）Ｔ細胞を非常に短時間で排除する能力により安全性のさらなるレベルを与える。自殺遺伝子が組み込まれた本開示の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ｔ細胞注入後の所与の時点で先制して排除され得るか、または毒性の最も初期の徴候で根絶され得る。
１０．キット
【０２２２】
本開示の主題は、免疫応答を誘導および／もしくは増強するため、ならびに／または対象における新生物または病原体感染症を処置および／もしくは予防するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の本開示の細胞またはそれを含む医薬組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは、無菌の容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の適切な容器の形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔、または医薬を保持するために適切な他の材料で作製することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、目的の抗原の方に向けられた抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする単離された核酸分子、および必要に応じて同じまたは異なるベクターに含まれていてもよい、発現可能な形態のドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【０２２３】
所望により、細胞および／または核酸分子は、新生物または病原体または免疫障害を有するかそれを発生する危険性がある対象に、細胞または核酸分子を投与するための使用説明書と一緒に提供される。使用説明書は、一般に、新生物形成または病原体感染症の処置および／または予防のための組成物の使用についての情報を含む。ある特定の実施形態では、使用説明書は、以下の少なくとも１つを含む：治療剤の説明；新生物形成、病原体感染症もしくは免疫障害、またはそれらの症状の処置あるいは予防のための投薬スケジュールおよび投与；注意；警告；適応症；禁忌；過剰摂取情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに／または参考文献。使用説明書は、容器（存在する場合）の上に直接、または容器に適用されるラベルとして、または容器の中もしくは容器と一緒に供給される別々のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷されてもよい。
【実施例】
【０２２４】
本開示の実施は、他に指示されない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用い、これらは十分に当業者の範囲内である。このような技法は、文献、例えば、"Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual",  second  edition  (Sambrook,  1989)；"Oligonucleotide  Synthesis"  (Gait,  1984)；"Animal  Cell  Culture"  (Freshney,  1987)；"Methods  in  Enzymology"  "Handbook  of  Experimental  Immunology"  (Weir,  1996)；"Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells"  (Miller  and  Calos,  1987)；"Current  Protocols  in  Molecular  Biology"  (Ausubel,  1987)；"PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction",  (Mullis,  1994)；"Current  Protocols  in  Immunology"  (Coligan,  1991)に十分に説明されている。これらの技法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、このように、本開示の主題の作製および実施において考慮され得る。特定の実施形態のために特に有用な技法は、続くセクションにおいて議論する。
【０２２５】
以下の実施例は、本開示の細胞および組成物を作製および使用する方法の完全な開示ならびに記載を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明者らの発明と見なす範囲を限定することを意図しない。
（実施例１）
腫瘍微小環境内の死シグナル伝達を克服するように操作されたＴ細胞は、養子がん免疫療法を増強する
序論
【０２２６】
複数の変数が、がんの退縮を媒介する移入されたＴ細胞の成功または失敗に影響を及ぼし得る（１５）。これらとしては、Ｔ細胞分化の状態（１６）、および腫瘍を保有する宿主内に存在する局所の免疫抑制因子（１７）が挙げられ得る。これらの複雑さにもかかわらず、血液がん（２〜５、７）および固形がん（１０、１８、１９）の両方で観察される応答の単一の最も一貫した相関の１つは、注入後の移入Ｔ細胞の拡大増殖および／または持続性であった。
【０２２７】
Ｔ細胞の増殖および生存を負に調節する因子の破壊が、養子免疫療法を増強する可能性があるすぐに使用可能な経路を表し得るという仮説を立てた。いくつかの臨床試験は、細胞の外的アプローチが、免疫チェックポイント阻害剤の共投与を含む養子移入Ｔ細胞の持続性を改善することができるか否かを試験した（２０、２１）。しかしながら、これらの薬剤は、固形腫瘍の微小環境に常に効率的に入らない場合があり（２２）、有効性に寄与しない全身毒性をもたらす非特異的免疫活性化を引き起こし得る（２３）。したがって、細胞固有の戦略を、腫瘍特異的Ｔ細胞内で独占的に機能を増強するために探求し、それによって、全身毒性の危険性を含み、かつ臨床適用のためにヒトＴ細胞を確実に遺伝子操作する能力の利点を完全に活用する。
【０２２８】
腫瘍を保有する宿主内で拡大増殖および持続するＴ細胞の能力を制限することができる候補リガンドを特定するがん横断的解析を使用して、標準的なアポトーシス誘導リガンドＦＡＳＬＧが、ヒト腫瘍微小環境の大部分で優先的に発現することを発見した。さらに、養子免疫療法のために恒常的に使用されるほとんどの治療用Ｔ細胞が、ＦａｓＬについての同族受容体であるＦａｓを発現するとして見出された。これらの知見に基づいて、初代マウスおよびヒトＴ細胞の両方において機能して、ＦａｓＬ誘導アポトーシスを防止する、一連のＦａｓドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）を開発した。養子移入されたＦａｓ  ＤＮＲ操作Ｔ細胞は、未制御のリンパ増殖をもたらすことなく、増強されたＴ細胞持続性および抗腫瘍免疫を示した。まとめると、これらの結果は、ＡＣＴ後に広範囲のヒト悪性腫瘍において養子移入Ｔ細胞の耐久性および生存性を増強する、可能性がある普遍的戦略を提供する。
方法および材料
【０２２９】
ヒト検体：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、年齢および性別がマッチした健康なドナー、または養子免疫療法の臨床プロトコールに登録された黒色腫患者およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者から得た。ＰＢＭＣ試料を提供するすべての匿名のＮＩＨ血液バンクドナーおよびがん患者は、ＮＩＨ臨床センターおよびＮＣＩ治験審査委員会によって承認された臨床試験に登録された。それぞれの患者は、インフォームドコンセントフォームに署名し、参加の前に患者情報フォームを受け取った。
【０２３０】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）がん横断的バイオインフォマティクス解析：ＴＣＧＡデータセットからの２６のヒトがんからのＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）データ、およびＧＴＥｘデータセットからのマッチした正常組織を収集し、期待値最大化（ＲＳＥＭ）値によって、正規化されたＲＮＡ−ｓｅｑの形態でＵＣＳＣ  Ｘｅｎａによって解析した。正規化されたＲＳＥＭカウントとしてＦＡＳＬＧ遺伝子発現を、それぞれ解析した。統計値を、マンホイットニーＵ検定によって補正した。ＦＡＳＬＧ発現に正に相関する遺伝子を特定するために、事前ランク付け遺伝子セット富化を、ｍＳｉｇＤＢデータベースにおけるすべてのＫＥＧＧ経路に対して実行した。ピアソンの相関を、２６のＴＣＧＡ組織学全体にわたって平均されたＦＡＳＬＧ発現に正に相関する上位１０００遺伝子において行った。
【０２３１】
マウス：成体６〜１２週齢の雄または雌Ｃ５７ＢＬ／６  ＮＣＲ（Ｂ６；Ｌｙ５．２＋）は、ＮＣＩ  ＦｒｅｄｅｒｉｃｋのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（Ｌｙ５．１＋）、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１Ｌｍ／Ｍｏｍ／Ｊ（Ｒａｇ）、Ｂ６．ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（ｌｐｒ）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｈｙ１ａ／Ｃｙ  Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ（ｐｍｅｌ−１（６７））、ＭＲＬ／ＭｐＪ（ＭＲＬ−Ｍｐ）およびＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（ＭＲＬ−ｌｐｒ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。示される場合、ｐｍｅｌ−１マウスは、Ｌｙ５．１、Ｒａｇ、またはＲａｇ×ｌｐｒバックグラウンドに交雑させた。すべてのマウスは、特定の病原体がない条件下で維持された。動物実験は、ＮＩＣのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認され、ＮＩＨガイドラインに従って行った。
【０２３２】
レトロウイルスベクター、ならびにマウスおよびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入：マウスおよびヒトＦａｓ  ｃＤＮＡ配列を合成し、ＭＳＧＶレトロウイルスプラスミドに、Ｔ２Ａスキップ配列および選択マーカーＴｈｙ１．１に先立って、別々にクローニング（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）した。マウスＴ細胞の形質導入を、以前に記載されているようにして（６８）、行った。簡潔には、白金−Ｅ同種志向性パッケージング細胞（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、ＢｉｏＣｏａｔ  １０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、トランスフェクションの前に終夜蒔いた。翌日、ＭＳＧＶ−Ｔｈｙ１．１（空）、ＭＳＧＶ−ＷＴ−ｍＦａｓ−Ｔｈｙ１．１（ｍＷＴ）、ＭＳＧＶ−Ｉ２４６Ｎ−ｍＦａｓ−Ｔｈｙ１．１（ＦａｓＩ２４６Ｎ）もしくはＭＳＧＶ−ΔＤＤ−ｍＦａｓ−Ｔｈｙ１．１（ＦａｓΔＤＤ）、またはＭＳＧＶ−１Ｄ３−２８Ｚ（抗ＣＤ１９  ＣＡＲ）（７１）をコードする２４ｕｇのレトロウイルスプラスミドＤＮＡを、抗生物質を含まない１０％培地中で７時間、白金−Ｅ細胞に適用されたＯｐｔｉＭＥＭ中、６ｕｇのｐＣＬ−ＥｃｏプラスミドＤＮＡを６０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と一緒に、別々に混合した。
【０２３３】
ヒトＦａｓ突然変異体遺伝子をコードするプラスミドを、Maher  et  al.,  Nat  Biotechnol  (2002);20:70-75に記載のＳＦＧレトロウイルスベクターに基づくマウス白血病ウイルスにサブクローニングした。
【０２３４】
培地を７時間後に交換し、ウイルス上清を４８時間後に細胞から収集し、遠心分離して残屑を除去した。レトロウイルス上清を、２０ｕｇ／ｍＬのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）で終夜コーティングされた、非組織培養処理２４ウェルプレートにおいて、２０００ｘｇで３２℃で２時間回転させた。２４時間活性化されたＣＤ８α＋Ｔ細胞を、１００ｕＬ以外はすべてのウイルス上清を除去したプレートに添加し、１５００ｒｐｍで３２℃で５分間回転させ、次いで、終夜インキュベートした。形質導入を、上記の方法で、翌日、２回繰り返した。ヒトＴ細胞の形質導入のために、２９３Ｔ細胞（６９）およびＲＤ１１４を、白金−Ｅ細胞の代わりに使用し、トランスフェクションおよびウイルス収集を、上記のマウスウイルス産生の間に進めた。
【０２３５】
Ｔ細胞培養およびＦａｓ死アッセイ：健康なドナーまたは患者からのヒトＰＢＭＣを、白血球除去または静脈穿刺のいずれかによって得て、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｏｎｚａ）勾配上で遠心分離して、赤血球を除去し、リンパ球を単離した。細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中で定着性細胞生存色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、次いで、２％のＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）で補充されたＰＢＳで２回洗浄した。手付かずのヒトＣＤ８α＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ８単離キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。マウスおよびヒトＴ細胞、ならびにＥ２ａ−ＰＢＸ白血病細胞（７２）を、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ、１００Ｕ／ｍＬおよび１００ｕｇ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）、ゲンタマイシン（１０ｕｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｎＭ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２ｍＭ）、０．０１１ｍＭの２−メルカプトエタノールおよびアンフォテリシンＢ（２５０ｎｇ／ｍＬ）を有するＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。Ｂ１６−ｍｈｇｐ１００腫瘍細胞、白金−Ｅ細胞および２９３Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳおよび上述の添加剤で補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。
【０２３６】
手付かずのマウスＣＤ８α＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ８＋陰性選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して脾細胞から単離し、組織培養処理２４ウェルプレート中、プレート結合抗ＣＤ３（２ｕｇ／ｍＬ、クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、可溶性抗ＣＤ２８（１ｕｇ／ｍＬ、クローン３７−５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、全脾細胞培養物中、１ｕｇ／ｍＬのヒトｇｐ１００（２５−３３）ペプチドおよびＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）で刺激した。ヒトＰＢＭＣまたはＣＤ８α＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３（１ｕｇ／ｍＬ、クローンＯＫＴ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、可溶性抗−ＣＤ２８（１ｕｇ／ｍＬ、クローンＣＤ２８．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２日間刺激し、次いで、残りの培養の間にＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）を与えた。細胞を、培養の１日目および２日目のウイルス上清による形質導入の前に、２４時間刺激した。３日目に、細胞をレトロネクチンでコーティングされたプレートから除去し、組織培養処理２４ウェルプレートまたはフラスコに戻した。言及される場合、細胞は、媒体または示された濃度のｌｚ−ＦａｓＬ、オリゴマー化されたＦａｓＬの組換え型（４３、５２）のいずれかとともに成長させた。刺激の５〜６日後、Ｔ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、示された濃度のｌｚ−ＦａｓＬを有する２４ウェルプレートにおいて１〜２×１０５個細胞／ウェルで蒔き、３７℃で、５％のＣＯ２で、６または２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、２回洗浄し、アネキシンＶおよびＰＩ陽性、または生／死定着性色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれか、ならびにＣＤ８α（クローン５３−６．７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＴｈｙ１．１（クローンＨＩＳ５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。
【０２３７】
フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色およびホスホフロー：細胞を、ＰＢＳ中で定着性細胞生存色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、次いで、２％のＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）で補充されたＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、以下の蛍光色素コンジュゲート化抗体で染色した：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＣＲ７（３Ｄ１２）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、ＣＤ９５（ＤＸ２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；およびＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ−５６）、ＣＤ８α（ＳＫ１）、ＣＤ４（ＯＫＴ４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。
【０２３８】
マウスＴ細胞、ＢＭおよび脾細胞を、定着性生／死色素、続いて以下の抗体で染色した：ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ８α（５３−６．７）、Ｖβ１３（ＭＲ１２−３）、Ｌｙ５．１（Ａ２０）、Ｌｙ５．２（１０４）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ９５（Ｊｏ２）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ１９（６Ｄ５）、ＣＤ９３（ＡＡ４．１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；Ｔｈｙ１．１（ＨＩＳ５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ検出（６７）のために、ビオチン−プロテインＬ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を利用した。
【０２３９】
ホスホフローのために、細胞を、固定し、ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ試薬を使用して、製造者のプロトコールに従って、透過処理した。透過処理後、細胞を、Ｃｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇからのｐＡｋｔ（Ｓ４７３）（Ｄ９Ｅ）およびｐＳ６（Ｓ２３５／２３６）（Ｄ５７．２．２Ｅ）で染色した。細胞内サイトカイン染色のために、細胞を、ＰＢＳ中、定着性生／死色素で染色し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中、表面抗体について染色し、次いで、固定し、透過処理し（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＩＬ−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について染色した。ＦａｓＬ染色のために、腫瘍細胞を、媒体（ＰＢＳ）またはマウスＩＦＮ−γ（１００ｎｇ  ｍｌ−１、Ｂｉｏ−Ｌｅｇｅｎｄ）とともに２４時間インキュベートし、次いで、ＦａｓＬ（Ｋａｙ−１０）およびＨ−２Ｄｂ（ＫＨ９５）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。すべてのフローサイトメトリーデータを、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ．９．９ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０２４０】
サンガーシークエンシング解析：Ｔｈｙ１．１濃縮空ベクターまたはＦａｓＩ２４６Ｎ形質導入細胞からのゲノムＤＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＲ／ＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出した。プライマー（ＩＤＴ）を、フォワードプライマーがＦａｓＩ２４６Ｎ点突然変異の上流のＦａｓに位置し、リバースプライマーがＴｈｙ１．１レポーターに位置するように、設計した。ＰＣＲ増幅（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）後、サンガーシークエンシングを行った。
【０２４１】
養子細胞移入、Ｔ細胞列挙および腫瘍処置：ｉｎ  ｖｉｖｏ持続性の分析のために、６〜１２週齢の雄または雌Ｂ６マウスは、６Ｇｙの全身照射を受けた。１日後、それらに、Ｔｈｙ１．１を含有するレポーター構築物で形質導入された５×１０５個の類遺伝子的にマークされたｐｍｅｌ−１Ｔ細胞を尾静脈注射によって注射した。マウスを示された日に屠殺し、脾細胞を、ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞の恒常性拡大増殖について分析した。
【０２４２】
腫瘍処置実験のために、６〜１２週齢の雄または雌Ｂ６マウスに、キメラヒト／マウスｇｐ１００抗原ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（ａ．ａ．２５〜３３）を過剰発現する５×１０５個の以前に記載されたＢ１６黒色腫系統（５７）、または１×１０６個のＣＤ１９＋Ｅ２ａ−ＰＢＸ白血病細胞を注射した。示された日に、腫瘍を保有するマウスは、６Ｇｙの全身照射を受けた。マウスは、対照として未処置のままにされたか、またはＴｈｙ１．１を含有するレポーター構築物で改変された類遺伝子的にマークされたｐｍｅｌ−１または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の示された用量を尾静脈注射によって受けた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の持続性および白血病負荷を分析するために、マウスを１４日後に屠殺し、脾細胞およびＢＭにおける細胞分析を行った。
【０２４３】
ＭＲＬ−Ｍｐマウスでの実験のために、８週齢の雌マウスは、６Ｇｙの全身照射を受けた。１日後、マウスに、Ｔｈｙ１．１を含有するレポーター構築物も形質導入された３×１０６個の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入ＣＤ８α＋Ｔ細胞を注射した。年齢がマッチしたＭＲＬ−ｌｐｒ雌マウスを、ＡＬＰＳ陽性対照として、未操作のままにした。すべての形質導入Ｔ細胞を、注入の直前に抗Ｔｈｙ１．１磁性マイクロビーズを使用して（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、＞９２％の純度にビーズ濃縮した。すべての処置マウスは、１２μｇのＩＬ−２のｉ．ｐの１日１回、３日間の注射を受けた。すべての腫瘍測定は、独立した研究者による盲検法で行った。
【０２４４】
Ｔ細胞および腫瘍細胞の共培養アッセイ：およそ６日間の培養後、ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、９６ウェル丸底プレートにウェルあたり５×１０４個の細胞でＩＬ−２を含まないＴ細胞培地に蒔いた。Ｔ細胞を、単独、プレート結合抗ＣＤ３／ＣＤ２８（それぞれ２μｇ  ｍｌ−１）とともに、Ｅ：Ｔが１：３でウェルあたり１．５×１０５個のＢ１６−ｍｈｇｐ１００細胞とともに、または１００ｎｇ／ｍＬのｌｚ−ＦａｓＬとともにのいずれかで、インキュベートした。細胞を、６または２４時間一緒に培養後、洗浄し、細胞生存率のために染色した。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡアッセイ：血清抗核および抗ｄｓＤＮＡ抗体の分析を、１：５希釈された血清において行い、ＥＬＩＳＡを、製造者の使用説明書（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に従って行った。
【０２４６】
病理組織学：肺組織を、緩衝化された１０％のホルマリン中で固定し、Ｈ＆Ｅで染色した。組織切片を、解釈する病理学者による盲検法でスコア化した。スコア付けは以下の通りであった：０、特異的な知見なし；１、軽度の浸潤；２、最小限の浸潤；３、中程度の浸潤；４、重度の浸潤。
【０２４７】
統計分析：垂直の腫瘍直径の積を、それぞれのデータポイントについて平均±ＳＥＭとしてプロットし、腫瘍処置グラフを、ウィルコクソンの順位和検定を使用することによって比較し、動物の生存分析を、ログランクマンテルコックス検定を使用して評価した。すべての他の実験のために、データを、示されるように、ボンフェローニ調整による多重比較について補正された対応のない両側スチューデントのｔ検定、または一元配置もしくは二元配置ＡＮＯＶＡを使用する反復測定のいずれかを使用して、比較した。すべてのケースにおいて、０．０５未満のＰ値を有意と見なした。統計値を、Ｐｒｉｓｍ  ７  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して計算した。
結果
ヒト腫瘍微小環境は、死誘導リガンドＦＡＳＬＧを過剰発現する
【０２４８】
血液がんおよび固形がんの両方についてのヒトＡＣＴ臨床試験全体にわたって、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞の拡大増殖および持続性は、臨床応答と正に相関した（３〜５、１０、１９）。これらの観察は、Ｔ細胞増殖および生存を損なう経路の破壊が、養子移入後の予後を改善するための可能性があるすぐに使用可能な標的を表す可能性があるという仮説をもたらした。Ｔ細胞増殖および生存を負にモジュレートするリガンドが、ヒト腫瘍微小環境内で富化されるか否かを決定するために、ＲＮＡシークエンシングデータを、マッチした起源の正常組織と比べて、ＴＣＧＡデータベースからの腫瘍含有試料を使用して比較した。切除された腫瘍に隣接する組織が、形質転換組織および非形質転換組織の間の中間状態を反映する炎症を起こしたトランスクリプトームプロファイルを有するという最近の証拠を考慮して（２４）、遺伝子型−組織発現（ＧＴＥｘ）データベース（２５）からの発現データを、正常な対照として使用した。合計で、適切にマッチした起源の組織が利用可能である２６の異なるがんタイプから得られた９，３３０試料を分析した（表１）。それぞれのデータセットからの生データを抽出し、期待値最大化（ＲＳＥＭ）法によるＲＮＡ−Ｓｅｑを使用する同一の方法で正規化した（２６）。
【０２４９】
【表１−１】
2022502054.tif 000012
【表１−２】
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【０２５０】
細胞のアポトーシスの標準的な誘導因子ＦａｓＬ（ＣＤ１７８）をコードする遺伝子であるＦＡＳＬＧの発現が、正常な組織と比べて、大部分の評価されるがんタイプにおいて過剰発現されたことを発見した（図１Ａ）。これは、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、腎臓明細胞癌（ＫＩＲＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、および胃食道癌（ＳＴＡＤ／ＥＳＣＡ）などの免疫療法応答性がん、ならびに乳がん（ＢＲＣＡ）、結腸直腸腺癌（ＲＥＡＤ／ＣＯＡＤ）、多形神経膠芽腫（ＧＭＢ）、卵巣がん（ＯＶ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、および前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）などの現在の免疫療法に比較的抵抗性のがんの両方を含む。合計で、評価されたヒト腫瘍タイプの７３％（１９／２６）は、正常組織対照と比べて、腫瘍体積内のＦＡＳＬＧの有意な差次的発現を示した（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１；マンホイットニーＵ検定、ボンフェローニ補正）。対照的に、がんタイプの１９％（５／２６）のみが有意な差次的発現を示さず、少数のみ（８％；２／２６）が、腫瘍試料対正常組織において、低減されたＦＡＳＬＧ発現の証拠を示した。
【０２５１】
ヒト腫瘍微小環境内のＦＡＳＬＧ発現の性質に対するより多くの洞察を得るために、２６の評価されたがんタイプのすべてにわたってＦＡＳＬＧと正に相関する遺伝子を使用する遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）（２７）を行った（図１Ｂ）。ＮＫ細胞の細胞傷害性、抗原のプロセシングおよび提示、ＴＣＲシグナル伝達、原発性免疫不全およびアポトーシスを含む多くの腫瘍関連経路についての発現プロファイルは、それぞれ有意に富化された（正規化されたＰ値＜０．００１、ＦＤＲ  ｑ値＜０．００１）。これらの知見と一致して、ＦＡＳＬＧと正に相関する上位２００の遺伝子の調査は、ＩＦＮＧ、ＰＲＦ１、４１ＢＢおよびＩＣＯＳなどのリンパ球活性化、ならびにＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３およびＩＬ１０ＲＡなどの免疫カウンター調節の両方に関連する優位なマーカーを明らかにした（図１Ｃおよび表２）。総合すれば、これらのデータは、Ｔ細胞生存を損なう可能性がある死誘導リガンドが、大部分のヒトがん微小環境において有意に過剰発現され、免疫の活性化および調節の発現特性に非常に相関することを示した。
【０２５２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０２５３】
次に、ＦａｓＬに対する同族受容体であるＦａｓ（ＣＤ９５）が、臨床養子免疫療法のために使用されるＴ細胞の表面上で発現されるか否かを決定した。Ｆａｓは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞を共発現するＣＤ４５ＲＡ（ＴＥＭＲＡ）を含む健康なドナー（ＨＤ）からのすべての非ナイーブヒトＴ細胞サブセットにおいて発現することが以前に見出されていた（２８、２９）。ＣＤ８α＋Ｔ細胞サブセットの頻度、ならびにＡＣＴに対する治療用Ｔ細胞を発生させるために使用されるアフェレーシス産物からの黒色腫および侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する患者におけるそれぞれのサブセットのＦａｓ発現を分析した。これらの患者において、ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴＥＭＲＡサブセットにおけるＦａｓの高発現があることが見出された（図１Ｄおよび１Ｅ）。加えて、年齢がマッチしたＨＤの群に対するこれらの患者におけるナイーブＣＤ８α＋Ｔ細胞（ＴＮ）の頻度を比較した。ＨＤが、黒色腫およびリンパ腫患者と比較してＦａｓ−ＴＮ細胞の有意に高いパーセンテージを有することが見出され（図１Ｆ）、分析されたがん患者における以前の免疫刺激およびリンパ球除去療法の影響を反映する可能性が高いことが見出された（５、３０、３１）。したがって、ＡＣＴのために使用されるヒトＴ細胞のかなりの割合が公知の死受容体を発現し、これらの細胞は、その同族リガンドの発現が富化された腫瘍微小環境に移入された。
Ｆａｓドミナントネガティブ受容体で操作されたＴ細胞はＦａｓＬ媒介アポトーシスを防止する
【０２５４】
この知見は、養子免疫療法のために使用される患者由来のＴ細胞が、その後、ＦＡＳＬＧ富化腫瘍微小環境に移入されたＦａｓ発現サブセットに対して傾斜したことを示した。これらのデータに基づいて、養子移入Ｔ細胞内のＦａｓシグナル伝達の破壊が、これらのアポトーシスを防止し、ｉｎ  ｖｉｖｏの持続性を改善する可能性があるか否かを、次に調べた。Ｔ細胞アポトーシスを引き起こすのに加えて、ＦａｓＬは、Ｔ細胞媒介性腫瘍死滅のための必須のエフェクター分子でもある（３２）。さらに、抗ＦａｓＬ抗体またはＦａｓ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかの全身投与は、リンパ増殖性症候群の発生およびダブルネガティブ（ＤＮ）ＣＤ３＋Ｂ２２０＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲα／β＋リンパ球の異常な集団の蓄積を含む毒性を誘導し得る（３３、３４）。これらの理由のために、細胞固有の遺伝子操作戦略を、抗腫瘍効力を維持し、かつ全身毒性の危険性を最小化するために、腫瘍反応性Ｔ細胞内でのみＦａｓシグナル伝達を無効にするために探求した。
【０２５５】
生理学的に、ＦａｓＬは、細胞膜でＦａｓ受容体の三量体またはより大きなオリゴマーへのオリゴマー化を最初に誘導することによって、アポトーシスのシグナル伝達を開始する（図２Ａ）（３５）。Ｆａｓオリゴマーは、それぞれの分子に存在する同型の死ドメイン（ＤＤ）を通して死ドメイン（ＦＡＤＤ）を介して関連する細胞内アダプター分子Ｆａｓを動員する（３６、３７）。ＦＡＤＤの凝集は、それぞれの分子における相同の死エフェクタードメインを通してシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼプロカスパーゼ８（３８）を動員し、アポトーシスのシグナル伝達カスケードを開始し得る死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成する（３９）。この作用機構に基づいて、ＦＡＤＤ結合を防止するように遺伝子的に変更された突然変異Ｆａｓバリアントの過剰発現が、養子免疫療法のために使用されるＦａｓ適格野生型（ＷＴ）Ｔ細胞において発現される場合、ドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）として機能するだろうという仮説を立てた。現在、ウイルス系構築物は、臨床適用のためにヒトＴ細胞を安定的に改変するために最も一般的に使用される方法である（４０）。したがって、いずれかのアスパラギン残基がＤＤの２４６位のイソロイシンに対して置換されたマウスＦａｓ配列（ＦａｓＩ２４６Ｎ）、ＦＡＤＤに結合することができないマウスＦａｓの天然に存在する突然変異体（４１、４２）、または細胞内ＤＤの大部分がＦＡＤＤ結合を防止するためにトランケートされたＦａｓ突然変異体（ｄｅｌ  ａａ２２２〜３０６；ＦａｓΔＤＤ）をコードする一連のレトロウイルス構築物を作出した（図２Ａおよび７Ａ）。対照として、空ベクター構築物、およびＦａｓの完全ＷＴ配列（ＦａｓＷＴ）をコードする構築物の両方を発生させた。形質導入された細胞を特定するために、すべてのベクターは、Ｔ２Ａ「自己切断」配列を使用してＦａｓから分離されたＴｈｙ１．１レポーターを含有していた。
【０２５６】
Ｔ細胞を、Ｆａｓ適格ＷＴマウスから単離し、ＩＬ−２の存在下で活性化し、空、ＦａｓＷＴ、ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤ構築物で形質導入した（図２Ｂ）。活性化および形質導入の６日後の表現型分析は、Ｔｈｙ１．１発現によって測定されるすべての構築物についての高い形質導入の効率性を明らかにした（図７Ｂおよび７Ｃ）。とりわけ、異所性Ｆａｓ発現は、ＷＴ（６．８倍高いＦａｓ  ＭＦＩ）または突然変異体Ｆａｓバリアント（ＦａｓＩ２４６ＮおよびＦａｓΔＤＤについて、それぞれ、４３倍および９８倍高いＦａｓ  ＭＦＩ）のいずれかを含有する構築物について、Ｆａｓ発現の内因性レベルよりも測定できる程度に高かった（図７Ｂおよび７Ｄ）。培養６日後、形質導入Ｔ細胞を、膜結合ＦａｓＬの機能（４３）を模倣するためにロイシンジッパードメイン（ｌｚ−ＦａｓＬ）を通してオリゴマー化された組換えＦａｓＬ分子で刺激するか、または対照として未処置のままにした。ｌｚ−ＦａｓＬの非存在下では、それぞれの構築物で形質導入されたＴ細胞は、同様の生存能のままであった（図２Ｃ）。しかしながら、ｌｚ−ＦａｓＬへの曝露後、空ベクター対照またはＦａｓＷＴのいずれかで形質導入されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞のかなりの割合が、アポトーシス性アネキシンＶ＋ＰＩ＋集団に転換した（図２Ｃおよび２Ｄ；Ｐ＜０．００１）。興味深いことに、ＦａｓＷＴの過剰発現は、空ベクター形質導入Ｔ細胞と比べて、より高いレベルのアポトーシスを一貫してもたらし、生理学的レベルを上回るＦａｓの発現が、Ｔ細胞をＦａｓＬ媒介細胞死に感作させることを示す。対照的に、ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤベクターのいずれかで形質導入されたＴ細胞は、ｌｚ−ＦａｓＬ誘導アポトーシスからほぼ完全に保護された。ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤで形質導入されたＴ細胞のプールのなかで、アポトーシスからの保護は、Ｔｈｙ１．１＋集団に限られ、Ｆａｓ  ＤＮＲの細胞固有の機能を示す（図１１）。これは、ＦａｓＩ２４６ＮおよびＦａｓΔＤＤも、局所的なＦａｓＬの「シンク」としておそらく機能することによって、隣接するＴ細胞をアポトーシスから保護し得ることを示した。ＦａｓＩ２４６Ｎで改変されたＴ細胞では、ＷＴ配列への復帰の機能的証拠も遺伝的証拠も見出されなかった。連続的なｉｎ  ｖｉｔｒｏの再刺激後のＦａｓＷＴと比較してＦａｓＩ２４６Ｎで改変されたＴ細胞についての選択的富化が測定され、ＤＮＲが経時的に機能的に無傷のままであったことを示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。さらに、連続的に再刺激されたＦａｓＩ２４６Ｎ形質導入Ｔ細胞のサンガーシークエンシングは、Ｉ２４６Ｎ点突然変異のＷＴ  Ｆａｓ配列への復帰の証拠は示さなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。したがって、Ｆａｓバリアントの過剰発現は、ＷＴ  Ｔ細胞におけるＦａｓＬ媒介アポトーシスを防止するドミナントネガティブな方法で、ＦＡＤＤ機能に結合するそれらの能力を無効にした。
【０２５７】
最後に、Ｆａｓ  ＤＮＲが、養子移入Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇する可能性がある他のアポトーシス誘導刺激からの保護を提供したか否かを究明しようとした。これらとしては、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）、サイトカイン離脱、および腫瘍細胞との近接が挙げられる。これらのアッセイのために、がん抗原ｇｐ１００に対して特異的なｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞、およびヒトｇｐ１００を発現するように操作されたＢ１６黒色腫（Ｂ１６細胞）を利用した。Ｂ１６細胞は静置時にＦａｓＬを発現しなかったが、ＦａｓＬ発現は、ＩＦＮ−γとのインキュベーション後に測定できる程度に上方調節された（図１３）。ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤで形質導入されたｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞は、ｌｚ−ＦａｓＬまたは腫瘍共培養のいずれかによって引き起こされるアポトーシスから等しく保護された（図１４）。対照的に、ＦａｓΔＤＤでのＴ細胞の形質導入は、ＦａｓＩ２４６Ｎで改変された細胞と比べて、抗ＣＤ３／ＣＤ２８再刺激または急性的なサイトカイン離脱によるＡＩＣＤ誘導後に有意に高い細胞生存率をもたらした。これらの知見は、ある特定の条件下で低減された有効性を有するＦＡＤＤに結合するＦａｓＩ２４６Ｎバリアントの能力に起因する可能性であった（７３）。したがって、本開示は、これ以降、その優れた機能的属性を与えるすべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、ＦａｓΔＤＤ  ＤＮＲだけに集中した。これは、養子移入Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ機能におけるＦａｓシグナル伝達を除去する影響をより明確に決定することを可能にした。
Ｆａｓ  ＤＮＲで操作されたＴ細胞の養子移入は優れた持続性をもたらす
【０２５８】
Ｔ細胞中のＦａｓ  ＤＮＲの発現が、腫瘍を保有する宿主への養子移入後に、優れたｉｎ  ｖｉｖｏの持続性をもたらすか否かを次に決定した。
【０２５９】
類遺伝子的にマークされた遺伝子改変ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、亜致死的に照射されたＴｈｙ１．１−Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに養子移入して、恒常性増殖を誘導し、移入細胞の経時的な拡大増殖および持続性を測定した。ＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照で形質導入されたＴ細胞を、Ｔｈｙ１．１レポーター遺伝子の発現によって特定した。Ｔ細胞増殖を測定するために、Ｔ細胞を、細胞増殖マーカーＫｉ−６７について共染色した。
【０２６０】
移入の１日後、ＦａｓΔＤＤおよび空ベクター改変ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、類似のレベルで移植し、ほぼ均一にＫｉ−６７を発現した（図３Ｆ〜３Ｈ）。移入の３日以内に開始して、改変細胞の両方の集団のマルチ対数拡大増殖を測定した。しかしながら、拡大増殖のピークで、対照改変細胞と比べて、ＦａｓΔＤＤ改変Ｔ細胞の数のおよそ５０倍高い増加が観察された。これは、次に、３０日目に、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞の１０倍よりも高いレベルの持続性をもたらした（図３Ｆおよび３Ｇ）。経時的に、両方の操作されたＴ細胞集団におけるＫｉ−６７発現の同等の低減（図３Ｈ）が観察され、これは、宿主の内因性Ｔ細胞区画の再構成と相関した。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が、２つの操作されたＴ細胞集団の間で同等であったことを示唆した。しかしながら、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞は、おそらくアポトーシスの低減により、優れた全体的な拡大増殖および中期的な持続性を実証した。
【０２６１】
次に、Ｆａｓ  ＤＮＲによる遺伝子改変がＴＭＥ内で優れたＴ細胞持続性をもたらしたか否かを究明しようとした。改変Ｔ細胞が任意の所与の腫瘍内の同じ微小環境因子に曝露されたことを確実にするために、混注実験を行った。
【０２６２】
がん抗原ｇｐ１００に対して特異的な類遺伝子的に区別可能なｐｍｅｌ−１  ＣＤ８Ｄ＋Ｔ細胞を、Ｌｙ５．１−／Ｔｈｙ１．１−またはＬｙ５．１＋／Ｔｈｙ１．１−バックグラウンドのいずれかから得た。細胞を、それぞれ、ＦａｓΔＤＤ  ＤＮＲまたはＴｈｙ１．１を発現する空ベクター対照で形質導入した。Ｔｈｙ１．１を発現する形質導入Ｔ細胞を、その後、抗Ｔｈｙ１．１マイクロビーズを使用して精製し、およそ１：１の比で組み換え、次いで、１０日間の樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有する亜致死的に照射されたＬｙ５．１−／Ｔｈｙ１．１−マウスに混注した（図３Ａ）。固形腫瘍のための多くのＡＣＴ臨床試験において現在行われているように、処置マウスは、移入後にＩＬ−２の限定的な治療単位を受けた（１３、１８、４４〜４６）。注入の７日後、レシピエントマウスの脾臓および腫瘍の両方を収集し、養子移入された遺伝子改変Ｔｈｙ１．１＋ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞の存在について分析した。レシピエントマウスの脾臓および腫瘍の両方において、Ｌｙ５．１−Ｔｈｙ１．１＋空ベクター改変Ｔ細胞と比べて、Ｌｙ５．１−Ｔｈｙ１．１＋ＦａｓΔＤＤ改変Ｔ細胞の有意な富化を一貫して見出した（図３Ｂおよび３Ｅ；Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。ＦａｓΔＤＤ  ＤＮＲで操作されたＴ細胞が、腫瘍細胞中で富化された微小環境中でのＴ細胞の生存を増強し得るか否かを試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイを行った。ＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかを発現するｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を、単独でＩＬ−２の非存在下、終夜蒔いたか、またはＢ１６黒色腫腫瘍と共培養した。細胞死についての陽性対照として、Ｔ細胞をｌｚ−ＦａｓＬの存在下で培養した。この実験では、Ｔ細胞は、追加の内部対照を可能にするＴｈｙ１．１のために、ビーズ濃縮しなかった。２４時間後、Ｔ細胞生存率をＦＡＣＳ解析によって評価した。かなりの細胞死が、Ｂ１６との共培養またはｌｚ−ＦａｓＬの添加のいずれかによって、空ベクター形質導入ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞において誘導されたが、これは、ＦａｓΔＤＤ形質導入対応物において観察されなかった（図３Ｃ）。また、両方の群の非形質導入細胞は、Ｂ１６共培養またはｌｚ−ＦａｓＬに応答して、同等の細胞生存率を示した（図３Ｄ）。一緒に、これらの結果は、Ｆａｓ  ＤＮＲによる遺伝子操作が、養子細胞移入および腫瘍が豊富な微小環境への曝露後の腫瘍反応性Ｔ細胞の生着および生存性を増強したことを示した。
Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞のＡＣＴはＡＬＰＳ表現型をもたらさない
【０２６３】
Ｆａｓなどの正常なアポトーシスシグナル伝達の構成要素に生殖細胞系列の欠陥を有するマウスおよびヒトは、正常なリンパ球の恒常性および発達に深刻な変化を発生し得る。まとめて自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）と称されるこれらの異常は、異常なＣＤ３＋Ｂ２２０＋ＣＤ４−ＣＤ８−リンパ球集団の蓄積および生存の低下をもたらす自己抗体の発生を含む（４７、４８）。成熟Ｔ細胞における正常なＦａｓシグナル伝達の無効化に関係する可能性がある安全性の懸念を考慮して、６か月よりも前にＦａｓΔＤＤＤＮＲ改変Ｔ細胞を受けた動物の詳細な長期間の免疫モニタリングを行った（図４Ｅ）。この時点は、Ｆａｓ中に生殖細胞系列の欠陥を有するマウスが、典型的には、バックグラウンド系統に応じて生後３．５〜５か月以内に明白な臨床症状を発生するように、選択した（４９、５０）。非操作ＷＴおよびＦａｓ欠損ｌｐｒ／ｌｐｒマウスをＡＬＰＳ表現型についてのそれぞれの陰性および陽性対照として使用して、ＦａｓΔＤＤＤＮＲまたは空ベクター対照で改変されたＶβ３  １３＋ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞のＡＣＴを以前に受けたマウスの脾臓中のＣＤ３＋Ｂ２２０＋リンパ球の頻度を評価した。予期されたように、ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの脾臓は、ＷＴ対照と比べて、異常なＣＤ３＋Ｂ２２０＋リンパ球の有意な蓄積を示した（図４Ａおよび４Ｂ；Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１）。対照的に、空ベクター対照またはＦａｓ  ＤＮＲで改変されたＴ細胞を受けたマウスはどちらも、この集団における有意な増加を示さなかった。我々の改変Ｔ細胞集団の形質転換を除外するために、我々は、移入されたＶβ３  １３＋Ｔｈｙ１．１＋操作Ｔ細胞の長期間の持続性および表現型を評価した。２００日を超えて、ＦａｓΔＤＤＤＮＲで操作されたＴ細胞は空ベクター対照で改変された細胞よりも高い数で持続した（図４Ｃおよび４Ｄ；Ｐ＜０．０５）。長期間持続するＦａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞は、従来のＣＤ３＋Ｂ２２０−表現型を維持した。これらのデータは、Ｆａｓ  ＤＮＲを発現する養子移入ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞が、Ｂ６宿主において異常なリンパ増殖を受けなかったことを示した。
【０２６４】
Ｆａｓ欠損ｌｐｒバックグラウンドと交雑されたトランスジェニックＴＣＲの発現がＡＬＰＳの発生を制限することができることが以前に示された（７４）。加えて、Ｂ６系統は、他の系統と比較して、より遅い速度でリンパ増殖の症状が現れる（４９、５０、７５）。したがって、ＦａｓΔＤＤＤＮＲ改変の安全性を評価する追加の実験を、Ｆａｓ  ＤＮＲまたは空対照のいずれかで遺伝子操作されたオープンＴ細胞レパートリーをＡＬＰＳ感受性ＭＲＬ−Ｍｐ系統に養子移入することによって行った。ＭＲＬバックグラウンドのＦａｓ欠損マウス（ＭＲＬ−ｌｐｒマウス）は、Ｂ６−ｌｐｒマウスよりも重症で、かつ数か月早く、自己抗体、腎炎および脾腫を発生した（図１５Ａ）（４９、５０、７５）。このモデルにおける養子移入Ｔ細胞の活性化および拡大増殖を誘導するために、ＭＲＬ−Ｍｐマウスからのオープン−レパートリーＴ細胞を、以前に記載の第二世代の抗ＣＤ１９  ２８ζ  ＣＡＲ（７１）およびＦａｓΔＤＤまたは対照ベクターで同時形質導入した。これらの実験における抗ＣＤ１９  ＣＡＲの使用は、宿主のＣＤ１９＋Ｂ細胞の認識によるＴ細胞の強いｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を促進した。注目すべきは、最近発表されたデータは、ＣＡＲで改変されたＴ細胞が、依然として、それらのＴＣＲにより刺激を受けることができることを示す（７２、７６）。
【０２６５】
細胞を受けていない（ＰＢＳ）か、またはＦａｓΔＤＤもしくは空ベクターで形質導入された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受けたＭＲＬ−Ｍｐマウスの脾臓を、分析し、年齢がマッチしたＦａｓ欠損ＭＲＬ−ｌｐｒマウスの脾臓と比較した（図１５Ｃ）。年齢がマッチしたＭＲＬ−ｌｐｒマウスからの脾臓は、すべての他の処置群からの脾臓と比較する場合に、より有意に重かった。重要なことには、ＰＢＳ処置マウス、およびＦａｓΔＤＤまたは対照のいずれかで改変された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入細胞を受けたマウスの間で、脾臓サイズの相違は観察されなかった。脾細胞のフローサイトメトリー分析は、合計ですべてのリンパ球の３０％を超えて占めるＭＬＲ−ｌｐｒマウスの脾臓における普通ではないＤＮ  ＣＤ３＋Ｂ２２０＋リンパ球の強い拡大増殖を実証した（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。対照的に、空ベクターおよびＦａｓΔＤＤＴ細胞処置マウスにおけるＣＤ３＋Ｂ２２０＋リンパ球の頻度は、ＰＢＳ対照マウスにおいて観察されたレベルと同様であった。
【０２６６】
自己免疫の発生を評価するために、すべての処置動物の血清分析を、陽性対照としてＭＲＬ−ｌｐｒマウスからの試料を使用して行った。ＦａｓΔＤＤまたは空ベクターで改変された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受けたマウスは、ＰＢＳ対照と同等の低い抗核および抗ｄｓＤＮＡ抗体価を有していた（図１５Ｆ）。対照的に、ＭＲＬ−ｌｐｒ陽性対照マウスからの血清は、両方の種類の自己抗体の高い力価を実証した。未制御のリンパ増殖および自己抗体の形成の非存在下で、Ｆａｓ  ＤＮＲで同時形質導入された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、対照改変抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して、レシピエントＭＲＬ−Ｍｐマウスの脾臓中で有意に高いレベルで持続した（図１５Ｇ）。さらに、持続性のＦａｓ  ＤＮＲ改変ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、対照改変ＣＡＲ＋細胞と比較して、異常なＣＤ３＋Ｂ２２０＋細胞のより高い割合を獲得しなかった（図１５Ｈ）。これらの結果は、Ｂ６宿主に移入されたＦａｓΔＤＤ改変ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を使用して、知見に直接反映した（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０２６７】
最後に、ＡＬＰＳ感受性のＭＲＬ−ＭｐレシピエントマウスがＦａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞の養子移入後に肺病変を発生したか否かを評価するために、Ｈ＆Ｅ染色肺検体の盲検での病理学的評価を行った。以前の報告（７７）と一致して、Ｆａｓ欠損ＭＲＬ−ｌｐｒマウスは、血管周囲および細気管支周囲の領域で高密度の単核細胞の炎症性肺浸潤を発生した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。対照的に、ＦａｓΔＤＤまたは対照改変Ｔ細胞で処置されたマウスは、ＰＢＳ処置対照注射と比べて、炎症性浸潤の増加の証拠を表さなかった。さらに、肺線維症の証拠は観察されなかった。
【０２６８】
総合すると、Ｂ６およびＭＲＬ−Ｍｐ系統の両方におけるこれらのデータは、ＦａｓΔＤＤＤＮＲ  Ｔ細胞の相対生存の増大にもかかわらず、未制御のリンパ蓄積の証拠、Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ３＋Ｂ２２０＋集団の形成、または自己免疫の臨床的証拠が検出されなかったことを実証した。これらのデータに基づいて、Ｆａｓシグナル伝達が損なわれた成熟Ｔ細胞の注入は、後天的なリンパ増殖性表現型をもたらさない。
Ｆａｓシグナル伝達のＴ細胞固有の破壊は、ＡＣＴ後の抗腫瘍有効性を増強する
【０２６９】
Ｆａｓ  ＤＮＲで操作された養子移入Ｔ細胞が、長期毒性なく増強された持続性をもたらすことを確立し、これらの細胞の抗腫瘍有効性を次に評価した。ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞は、刺激、およびＦａｓＩ２４６Ｎ、ＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかで形質導入されたレトロウイルスを受けた。これに続いて、再刺激およびさらなる拡大増殖を行って、がん患者の循環中に存在するより分化したＴ細胞集団を模倣した（５、３１）（図１Ｄおよび５Ａ）。１１日後、それぞれの条件からの形質導入Ｔ細胞を、抗Ｔｈｙ１．１マイクロビーズを使用して、＞９８％の純度に単離し、次いで、樹立されたＢ１６黒色腫腫瘍を保有する亜致死的に照射されたマウスに別々に注射した。処置マウスは、ｉ．ｐ．注射によってＩＬ−２も受けた。未処置対照と比べて、養子移入ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を受けたすべてのマウスは、腫瘍成長における有意な遅延を経験した（図５Ｂ）。しかしながら、ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤＤＮＲのいずれかで操作されたＴ細胞を受けたこれらのマウスは、対照改変ｐｍｅｌ−１細胞と比べて、増強された腫瘍制御（図５Ｂ；Ｐ＜０．００１）、および有意に改善された動物の生存を示した（図５Ｃ；Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１）。
【０２７０】
Ｆａｓ刺激が、非アポトーシス性Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達を誘導することができ、Ｔ細胞分化の増大をもたらすことが最近発見された（５１、５２）。以前の結果と一致して、ｌｚ−ＦａｓＬへの曝露が、空ベクター対照で形質導入されたＴ細胞において、リン酸化（ｐ）ＡｋｔＳ４７３およびｐＳ６Ｓ２３５，Ｓ２３６の用量依存性の増加を引き起こしたことが見出された（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０２７１】
対照改変細胞の拡大増殖は、ＩＬ−２を産生する能力が低下したＴＥＭ様細胞の蓄積をもたらした（図８Ｃおよび８Ｄ）。対照的に、ＦａｓＩ２４６ＮまたはＦａｓΔＤＤのいずれかで形質導入されたＴ細胞は、ＡｋｔおよびＳ６リン酸化を示さず、Ａｋｔ媒介Ｔ細胞分化の増大から保護した。これらの細胞は、優性のＴＣＭ様表現型およびＩＬ−２を産生する能力を維持した。いくつかの異なる動物モデル（２９、５３、５４）および臨床試験（１０、５５）では、ＴＣＭ様細胞の移入は、ＴＥＭ用細胞の移入と比較して、優れた腫瘍縮小と関連した。これらの知見は、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変細胞で観察された優れた腫瘍縮小が、Ｆａｓ媒介Ｔ細胞死からの保護よりもむしろ細胞分化における相違に起因する可能性があるという可能性を高めた。この可能性を試験するために、Ｔ細胞の分化状態を、＞９６％純度の形質導入されたＴＣＭ様表現型の細胞（Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌ＋）をＦＡＣＳ選別によって単離することによって、細胞注入の時点で正規化した（図５Ｄ）。セントラルメモリー様選別Ｔ細胞を、その後、図５Ａに記載のように、亜致死的に照射されたＢ１６腫瘍保有マウスに移入した。ＴＣＭ様分化状態について正規化される場合でさえ、Ｆａｓ  ＤＮＲで改変されたＴ細胞の養子移入が、対照改変Ｔ細胞と比較して、優れた腫瘍縮小および動物の生存をもたらしたことが見出された（図５Ｅ〜５Ｈ；Ｐ＜０．０５）。
【０２７２】
総合すれば、養子移入された、Ｆａｓ  ＤＮＲで操作された腫瘍反応性Ｔ細胞におけるＦａｓ媒介細胞死の防止は、優れた腫瘍縮小および動物の生存をもたらす。
Ｆａｓ  ＤＮＲによる遺伝子操作はヒトＴ細胞をＦａｓ媒介アポトーシスから保護する
【０２７３】
Ｆａｓ  ＤＮＲによるヒトＴ細胞の操作の臨床成否を決定するために、ＦＡＤＤ結合を防止するように突然変異したヒトＦａｓ配列をコードするレトロウイルス構築物を設計した。これは、２４４位のアスパラギン酸残基をバリンに置換する点突然変異を含有するヒトＦａｓバリアント（ｈＦａｓＤ２４４Ｖ）（５６、５７）、および細胞内死ドメインの大部分がトランケートされたヒトＦａｓ（ｄｅｌ  ａａ  ２３０〜３１４；ｈＦａｓΔＤＤ）（図６Ａ）（５６、５７）を含んでいた。
【０２７４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＤ  ＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびＩＬ−２で刺激し、続いて、ｈＦａｓＤ２４４Ｖ、ｈＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照での形質導入を行った（図６Ｂ）。追加刺激の非存在下、非形質導入Ｔｈｙ１．１−および形質導入Ｔｈｙ１．１＋Ｔ細胞は両方とも、アネキシンＶおよびＰＩ染色によって測定されるように、類似の生存能のままであった（図６Ｃ）。しかしながら、これらの細胞を、ｌｚ−ＦａｓＬの増加する用量の存在下で培養した場合に、空ベクターで形質導入されたＴ細胞は、アネキシンＶ＋アポトーシスおよび壊死細胞の頻度の有意で用量依存性の増加を示した（図６Ｃおよび６Ｄ）。対照的に、ｈＦａｓＤ２４４ＶまたはｈＦａｓΔＤＤのいずれかで改変されたＴ細胞は、ｌｚ−ＦａｓＬ媒介アポトーシスから有意に保護された。この保護は、非形質導入Ｔｈｙ１．１−細胞が、ｈＦａｓＤ２４４ＶまたはｈＦａｓΔＤＤで形質導入されたＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞と比べて、有意に高い頻度のアネキシンＶ＋細胞を示したので、主にＴ細胞固有であった。したがって、Ｆａｓ  ＤＮＲによる遺伝子操作は、初代ヒトＴ細胞をＦａｓＬ誘導細胞死から保護し、ヒト腫瘍微小環境内で養子移入Ｔ細胞を保護する新たな方法を提供する。
考察
【０２７５】
ここで報告するがん横断的解析の結果は、標準的な死誘導リガンドＦＡＳＬＧが、大部分のヒトがん微小環境内で過剰発現することを強く示唆した。養子免疫療法のために使用されるかなりの割合のヒトＴ細胞は、ＦａｓＬについての同族受容体のＦａｓを共発現した。これらの知見に基づいて、一連のＦａｓ  ＤＮＲによる遺伝子操作を使用するＦａｓＬ誘導アポトーシスからＦａｓ適格マウスおよびヒトＴ細胞を「遮蔽する」細胞固有の戦略を試験した。機能的に養子移入されたＦａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞は、腫瘍を保有する動物の末梢および腫瘍の両方における優れた持続性を示し、優れた腫瘍縮小および全生存期間をもたらした。重要なことには、Ｆａｓ  ＤＮＲで改変されたＴ細胞が、移入後６か月程度まで、対照改変Ｔ細胞と比べて増強された生存を示したが、未制御のリンパ増殖または自己免疫の証拠は検出されなかった。したがって、これらの知見は、進行固形がんを含む広範囲のヒト悪性腫瘍に対する養子移入Ｔ細胞の機能を増強する新規で可能性がある普遍的な遺伝子操作戦略を提供する。
【０２７６】
その標準的なアポトーシス誘導機能に加えて、Ｆａｓが、ＡＫＴ依存性の方法で、マウスおよびヒトＴ細胞分化を促進することもできることが以前に報告された（５１、５２）。これらの知見と一致して、Ｆａｓ  ＤＮＲで形質導入されたＴ細胞は、ｐＡＫＴＳ４７３およびｐＳ６Ｓ２３５，Ｓ２３６のｌｚ−ＦａｓＬ媒介誘導から保護された。そのため、ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達におけるこの遮断は、Ｔ細胞分化を最小化し、リンパ球ホーミングマーカーのＣＤ６２Ｌの発現およびＩＬ−２を産生する能力を保持したＴＣＭ様細胞の蓄積を促進した。複数の前臨床モデルにおいて（２９、５３、５４）、およびヒト臨床試験のレトロスペクティブ分析において（１０、５５）、ＴＣＭ様細胞の注入は、ＴＥＭ様細胞と比較して、優れた抗腫瘍結果に関連した。これらの知見は、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変細胞を使用する優れた処置の結果が、アポトーシスの予防よりむしろ、低分化Ｔ細胞の注入から生じた可能性があるという可能性を高めた。この可能性に対処するために、表現型がマッチしたＦＡＣＳ選別されたＦａｓ  ＤＮＲまたは空ベクター対照で改変されたＴＣＭ様細胞の抗腫瘍有効性を比較した。表面の表現型について正規化した場合であっても、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変ＴＣＭは、対照改変ＴＣＭと比較して、優れた処置有効性を示した。機構的に、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞を使用する増強されたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性の主要な原因は、細胞死の破壊に起因したが、低分化細胞の注入に起因しなかった。これらの知見は、免疫チェックポイント阻害剤の有効性を制限する腫瘍浸潤リンパ球のＦａｓＬ誘導アポトーシスを実証するZhu  et  al.、Horton  et  al.およびLakins  et  al.からの最近の報告（１７、５８、５９）とも一致する。
【０２７７】
分析は、ＦＡＳＬＧ発現が多くのヒト腫瘍の微小環境内で富化されることを示したが、それらは、どの特異的な細胞型がリガンドを発現しているかを規定しない。免疫組織化学的タンパク質染色を使用して、以前の研究は、ＦａｓＬが、我々のがん横断的解析において特定された多くの固形がんの表面上で直接発現し得ることを特定した。これには、乳房、結腸、脳、腎臓および子宮頸部のがんを含む（６０、６１）。加えて、最近の研究は、ＦａｓＬが、ヒト卵巣がんおよび脳がんの周辺の心血管系の管腔表面に沿って発現し、Ｔ細胞浸潤を制限する腫瘍内皮死バリアを作出することを特定した（６０、６２）。最後に、ＦａｓＬが、自然免疫系および適応免疫系の両方の細胞によって腫瘍微小環境内で発現され得ることが可能である。この可能性は、他者によって以前に示されており（１７）、ＦＡＳＬＧおよび多くの免疫関連遺伝子の間の高度の相関を実証する我々自身の分析によって、さらに示唆される。最後に、機能性データは、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変が、腫瘍または感染症を保有する宿主への養子細胞移入後にＴ細胞が経験する可能性がある他のアポトーシス誘導刺激からの保護も提供することを実証する。これらとしては、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）、サイトカイン離脱、および抗原発現腫瘍細胞との近接が挙げられる。まとめると、これらのデータは、ＦａｓＬ源が、腫瘍組織学に依存する可能性があることを示唆する。したがって、移入Ｔ細胞のＦａｓＬ媒介腫瘍死滅能を損なわない細胞固有のＦａｓ  ＤＮＲアプローチは、さまざまながんのタイプに幅広く適用できる可能性がある。
【０２７８】
Ｆａｓ  ＤＮＲは、ここに、Ｔ細胞が、ＴＧＦβ受容体（６３）およびＰＤ１（６４）を含む腫瘍微小環境内に存在する免疫抑制因子によるシグナル伝達を本質的に破壊するように改変される可能性がある他の候補ＤＮＲの候補のリストに加わる。低分子ヘアピン型ＲＮＡアプローチを使用するＦａｓの破壊は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＴ細胞において報告されているが（６５）、しかしながら、Ｆａｓノックダウンの相対的に低い有効性に起因して、このアプローチは、長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を必要とした。さらにまた、これらの細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍能力は試験されなかった。Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞を使用して増強された細胞持続性が観察されるにもかかわらず、ダブルネガティブＴ細胞の形成または未制御のリンパ増殖の証拠は、観察されなかった。
【０２７９】
Ｆａｓシグナル伝達における生殖細胞系列の機能消失は、Ｆａｓ  ＤＮＲアプローチについての潜在的な安全性の考慮事項である、マウスおよびヒトの両方における自己免疫性リンパ増殖性疾患を生じ得る。ＦａｓΔＤＤ改変Ｔ細胞の増大した生存にもかかわらず、２つの異なるマウス系統を使用して、未制御のリンパ蓄積、異常なＣＤ３＋Ｂ２２０＋リンパ球集団の形成、または自己免疫の証拠は見出されなかった。これには、ＡＬＰＳ易発性ＭＲＬ−Ｍｐ系統へのポリクローナルＴ細胞集団の養子移入を行うことを含む。これらのデータに基づいて、Ｆａｓシグナル伝達が損なわれた成熟Ｔ細胞の注入は、後天的なリンパ増殖性症候群をもたらす可能性は低い。
【０２８０】
Ｆａｓは、外因性アポトーシスシグナル伝達カスケードを開始するための重要なメディエーターであるが、固有のアポトーシス経路は、細胞中で無傷のままである。したがって、恒常性サイトカインについての競合、抗原の非存在に起因する無視、およびＴ細胞の枯渇はすべて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｓ  ＤＮＲ細胞の恒常性の調節に寄与し得る。マウスにおけるこれらの安心を与える安全性データにもかかわらず、臨床適用のためのこのアプローチの改良は、Ｆａｓ  ＤＮＲの上流のトランケートされたＥＧＦＲなどの自殺機構の導入を含み得る（６６）。
【０２８１】
結論として、ＦａｓＬ／Ｆａｓ経路は、固形がんの処置のための養子免疫療法を受ける多くの患者において活性化する態勢にある。新規のドミナントネガティブ受容体が開発され、これは、初代マウスおよびヒトＴ細胞におけるこの経路のアポトーシス誘導機能を本質的に無効にし、増強された細胞の持続性および増大した抗腫瘍効果をもたらす。これらのデータは、固形がんおよび血液がんの両方に対する養子免疫療法の効力を増強する、可能性のある普遍的な戦略の土台を作る。
（実施例２）
白血病のマウスモデルにおけるＦａｓ  ＤＮＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ改変Ｔ細胞処置の効果
【０２８２】
Ｆａｓ  ＤＮＲおよびＣＡＲの両方で操作された養子移入Ｔ細胞の治療有効性を次に評価した。血液系悪性腫瘍がＣＡＲで標的にされた独立した腫瘍モデルを使用した。マウスの第二世代２８ζ抗ＣＤ１９  ＣＡＲを使用する処置モデルにおいて生理学的に関連するＥ２ａ−ＰＢＸ転座によって駆動される最近開発された同系Ｂ細胞ＡＬＬ（Ｂ−ＡＬＬ）系統を使用した（７２、７８）。２つの理由のために、より一般的に使用されている異種抗ＣＤ１９  ＣＡＲ処置モデルよりも同系モデルを選択した。第１に、移入Ｔ細胞が、腫瘍細胞および養子移入Ｔ細胞によるＦａｓＬ発現に加えて、宿主由来のＦａｓＬに完全に応答性であることを確実にするためである。第２に、移入Ｔ細胞におけるＡＩＣＤ誘導に対する異種反応性の潜在的な交絡の影響を回避するためである。
【０２８３】
Ｔ細胞は、刺激、ならびに抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかで形質導入されたレトロウイルスを受けた。形質導入Ｔ細胞の同時形質導入効率および純度を、図９Ｂ〜９Ｃおよび１０Ａ〜１０Ｂに示す。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を特定するためにプロテインＬを使用して（７９）、同時形質導入効率は、ＦａｓΔＤＤおよび空ベクター対照、続いてＴｈｙ１．１ビーズ濃縮を使用する場合、同様に高効率であった。次に、同時形質導入された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、外因性ＦａｓＬ、サイトカイン離脱、ＡＩＣＤおよび抗原発現Ｂ−ＡＬＬ腫瘍細胞への曝露を含むさまざまなアポトーシス誘導刺激にどのように応答するかを決定した（図１０Ｃ）。ＴＣＲ発現ｐｍｅｌ−１  Ｔ細胞を使用する結果と同様に、ＦａｓΔＤＤの発現は、空ベクター対照形質導入ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比べて、これらの死誘導刺激のそれぞれからＣＡＲ改変Ｔ細胞を保護した。
【０２８４】
マウス白血病モデルにおいて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＦａｓΔＤＤまたは空ベクター対照のいずれかで同時形質導入された同系Ｔ細胞による処置のための実験設計を図９Ａおよび１０Ｄに示す。
【０２８５】
処置マウスは、毎日ＩＬ−２注射を３日間受けて、養子移入Ｔ細胞の拡大増殖をサポートした。細胞注入の１４日後、Ｅ２ａ−ＰＢＸ  Ｂ−ＡＬＬについての２つの疾患部位である脾臓およびＢＭを、養子移入細胞の持続性について分析した。空ベクター形質導入Ｔ細胞を受けたマウス（図１０Ｅ）との比較において、両方の疾患部位において高レベルのＴｈｙ１．１＋ＦａｓΔＤＤ細胞が観察された。Ｅ２ａ−ＰＢＸ白血病は、ＣＤ１９、Ｂ２２０およびＣＤ９３を含む古典的なｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬマーカーを発現する（８０）。図１０Ｆに示されるように、未処置（ＰＢＳ）および空ベクター処置マウスにおけるＢＭは、Ｔ細胞処置の１４日後に、おおよそ７０％の白血病細胞を含んでいた。しかしながら、ＦａｓΔＤＤ改変細胞を受けたマウスは、ＢＭに１％未満の白血病細胞を含んでいた。これらのデータは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を発現するＦａｓ  ＤＮＲ細胞が、空ベクター形質導入Ｔ細胞と比べて、優れた白血病排除を媒介することができたことを示した。
【０２８６】
１１日後、それぞれの条件からの形質導入Ｔ細胞を、抗Ｔｈｙ１．１マイクロビーズを使用して、＞９８％の純度に単離し、次いで、樹立されたＥ２ａ：ＰＢＸ  ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ腫瘍を保有する亜致死的に照射されたマウスに別々に注射した。処置マウスは、ｉ．ｐ．注射によってＩＬ−２も受けた。未処置対照と比べて、高用量のＣＡＲ  Ｔ細胞（５．５×１０５個）を受けたすべてのマウスは、腫瘍成長における有意な遅延を経験した（図９Ｄ）。しかしながら、低用量のＣＡＲ  Ｔ細胞（１．８×１０５個）で処置されると、ＦａｓΔＤＤＤＮＲで操作されたＴ細胞を受けたマウスのみが、対照と比べて、有意に改善された動物の生存を示した（図９Ｅ）。
【０２８７】
別の実験設定では、２つの異なる用量の、ＦａｓΔＤＤまたは空対照で同時改変された第二世代２８ζ抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の養子移入後の白血病保有マウスの生存を分析した。処置ウィンドウを提供するために、このモデルにおいて治療量以下であることが以前に示されたＣＡＲ改変Ｔ細胞の用量を移入した（７２）。より高い細胞用量（３×１０５個ＣＡＲ＋細胞）で、対照またはＦａｓΔＤＤ改変ＣＡＲ＋Ｔ細胞のいずれかの養子移入は、処置を受けていないマウスと比較して、有意に改善された動物の生存をもたらした（図１０Ｇ、左）。しかしながら、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受けたすべてのマウスが生存したが、対照改変ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受けたマウスは、５５日よりも長く生存しなかった。ＣＡＲ＋細胞の用量（２×１０５個）をさらに低下させると、Ｆａｓ  ＤＮＲ改変Ｔ細胞は、処置マウスの１００％で長期生存を提供し続けたが、対照改変Ｔ細胞は全体的に有効性を失った（図１０Ｇ、右）。以前の報告は、４−１ＢＢ含有第二世代ＣＡＲが、ＣＤ２８ドメインを含有するＣＡＲと比較して、より高いレベルの抗アポトーシスタンパク質を発現することを実証した（８０）。固形がんのＢ１６黒色腫、および血液のＥ２ａ−ＰＢＸ白血病モデルにおけるこれらのデータは、養子移入Ｔ細胞におけるＦａｓ  ＤＮＲ発現が、抗原標的化構造がＴＣＲまたは２８ζＣＡＲであるかにかかわらず、優れたｉｎ  ｖｉｖｏの細胞持続性および抗腫瘍有効性をもたらしたことを示す。
（実施例３）
ＦａｓＤＮＲは、ＦａｓＬ誘導アポトーシスから細胞を保護し、Ｔ細胞腫瘍標的化機能に影響を及ぼさない
方法
【０２８８】
細胞培養。白金−ＧＰレトロウイルスパッケージング細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１０％のウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）および２５単位／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたＲＰＭＩ中で培養した。初代Ｔ細胞を、１０％の熱失活ヒト血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）および５０単位／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を補給されたＲＰＭＩ中で培養した。
【０２８９】
ヒトＴ細胞の単離および拡大増殖。バフィーコートを、ニューヨーク血液センターで健康なドナーから取得した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して密度勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を使用して単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）抗体がコーティングされたプレート、および１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化した。ウイルス形質導入のために、Ｔ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で、形質導入の前に２日間処理した。
【０２９０】
プラスミド設計およびウイルス形質導入。ウイルスパッケージングのためのすべてのプラスミドを、ＳＦＧγレトロウイルスベクターに基づいて設計した。ネコ内因性レトロウイルスエンベロープＲＤ１１４を、白金−ＧＰ細胞におけるＳＦＧγベクターによる同時トランスフェクションのために使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、白金−ＧＰ細胞の同時トランスフェクションのために使用した。初代Ｔ細胞を、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）がコーティングされたプレート上、ウイルス上清で形質導入した。簡潔には、プレートを、２０ｕｇ／ｍｌのレトロネクチンで、４℃で終夜コーティングし、次いで、２％のＦＢＳを有するＰＢＳによって室温で３０分間ブロッキングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ウイルス上清をロードした。遠心分離を、２０００ｇ、３２℃で２時間行った。上清を吸引し、細胞をそれぞれのウェルにロードした。プレートを、１２００ｒｐｍ、３２℃で５分間、再度遠心分離し、３７℃で２日間インキュベートした。
【０２９１】
フローサイトメトリーおよび細胞内染色。フローサイトメトリーのために使用したコンジュゲート化抗体は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（商標）抗ヒトＥＧＦＲ（ＡＹ１３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ５抗ヒトＣＤ９５  Ｆａｓ（ＤＸ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／シアニン７抗ヒトＣＤ９５  Ｆａｓ（ＤＸ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＴＮＦ−α（Ｍａｂ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含む。ＮＹ−ＥＳＯ標的化ＴＣＲのために、ＰＥ抗ＴＣＲ  Ｖβ１３．１（ＩＭＭＵ  ２２２、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した。ＣＡＲ染色のために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
【０２９２】
ＦａｓＬアポトーシスアッセイ。ロイシンジッパーモチーフ（ＦａｓＬ−ＬＺ）によりオリゴマー化した可溶性ＦａｓＬの形態を、すべてのアポトーシスアッセイのために、１００ｎｇ／ｍｌで使用した。細胞を、設計された時点で、３７℃でＦａｓＬ−ＬＺで処理した。細胞を洗浄し、表面抗体について染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）カスパーゼ−３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で、３７℃で２５分間染色し、２回洗浄した。次いで、細胞を、アネキシンＶ結合緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中、ＡＰＣアネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、室温で２５分間染色した。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーのためにアネキシンＶ結合緩衝液に再懸濁させた。
【０２９３】
統計分析。すべての統計分析を、Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用して行った。試料サイズを事前に決定するために統計的方法は使用しなかった。すべての分析は、三反復の試料で行った。２つの群の間の統計比較は、マッチした試料について対応のあるスチューデントのｔ検定によって計算した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に重要であると見なす。
結果
【０２９４】
Ｆａｓ  ＤＮＲおよび抗原認識受容体（ＴＣＲおよびＣＡＲの両方）で操作されたＴ細胞の機能性も評価した。複数の構築物を、図１７Ａに示すように、設計した。得られる操作されたヒト初代Ｔ細胞は、ＦａｓＬ誘導アポトーシスからＴ細胞を保護するＦａｓＤＮＲ、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を標的にするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性を誘導するモノクローナル抗体によって標的にされ得るＥＧＦＲｔを発現した（図１７Ｂ）。細胞は、ＦａｓＤＮＲおよびｔＥＧＦＲを発現した。抗原刺激後、対照およびＦａｓＤＮＲ細胞は両方とも、増加したＴＮＦα染色を示した（図１７Ｄ）。さらにまた、異なる時点でのＦａｓＬロイシンジッパー（ＦａｓＬ−ｌｚ）への曝露後、ＦａｓＤＮＲを発現するＴ細胞は、アポトーシスマーカーに対する染色の低減を示した。
【０２９５】
同様に、Ｔ細胞の機能性を、初代ヒトＴ細胞の、ＦａｓＤＮＲ、追跡可能なトランケートされたＥＧＦＲおよび抗原特異的ＣＡＲ抗ＣＤ１９（ＣＤ１９２８ζ）の同時操作後に評価した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ＦａｓＬロイシンジッパー（ｌｚ−ＦａｓＬ）への曝露後、ＦａｓＤＮＲを発現するＴ細胞は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの発現とは無関係に、アポトーシスによって保護された（図１８Ｃ）。さらにまた、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞との共インキュベーション後、抗ＣＤ１９  ＣＡＲだけを発現するＴ細胞（１９２８ζ）、またはＦａｓＤＮＲとの組合せ（ｔＥＧＦＲ−ｈＦＡＳＤＮＲ＋ＣＤ１９２８ζ）は、同等の抗原特異的サイトカインの放出および脱顆粒を示した（図１８Ｄ）。したがって、ＦａｓＤＮＲは、Ｔ細胞の機能を変更することなく、ＦａｓＬによって誘導されるアポトーシスを低減する。
参照文献
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
2022502054.tif 000018
【化１３】
2022502054.tif 000019
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
2022502054.tif 000022
本開示の主題の実施形態
【０２９６】
先述の記載から、さまざまな使用法および条件に対してそれを選ぶために、本開示の主題に変形および改変を行ってもよいことが明らかであろう。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【０２９７】
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの記述は、任意の単一の要素または列挙された要素の組合せ（または、下位組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の記述は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分との組合せで、その実施形態を含む。
【０２９８】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、それぞれ独立した特許および刊行物が参照によって組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同程度で、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
2022502054.tif 000062
【図１６】
2022502054.tif 000063
【図１７−１】
2022502054.tif 000064
【図１７−２】
2022502054.tif 000065
【図１８−１】
2022502054.tif 000066
【図１８−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月28日(2021.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明は、ＮＣＩの内部研究プログラム、ＮＩＨのがん研究センターによって付与された助成金番号ＺＩＡ  ＢＣ０１１５８６およびＺＩＡ  ＢＣ０１０７６３の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年１０月１６日に作成され、０７２７３４．０９３４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４２，８３１バイトのサイズである。
序論
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本開示の主題は、本明細書に開示される細胞、本明細書に開示される核酸組成物、または本明細書に開示されるベクターを含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、新生物形成および／もしくは病原体感染症を処置ならびに／または予防するための書面による使用説明書をさらに含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体、および
（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチド
を含む細胞。
（項目２）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、ヒトＦａｓの細胞質死ドメイン中に少なくとも１つの改変を含む、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記少なくとも１つの改変が、突然変異、欠失および挿入からなる群から選択される、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記突然変異が、点突然変異である、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記少なくとも１つの改変が、ヒトＦａｓの細胞質死ドメイン中にある、項目２から４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６）
前記細胞質死ドメイン中の前記少なくとも１つの改変が、前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドおよびＦＡＤＤポリペプチドの間の結合を防止する、項目２から５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓのアミノ酸２３０〜３１４の欠失を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目８）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７に記載の細胞。
（項目９）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するヒトＦａｓの２６０位に点突然変異を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１１）
前記点突然変異が、Ｄ２６０Ｖである、項目１０に記載の細胞。
（項目１２）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０または１１に記載の細胞。
（項目１３）
前記ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、免疫応答性細胞の細胞持続性を増強する、項目１から１３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１５）
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、免疫応答性細胞のアポトーシスまたはアネルギーを低減する、項目１から１４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１６）
前記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、項目１から１５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１７）
前記抗原認識受容体が、組換えで発現される、項目１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１８）
前記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、項目１から１７のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１９）
前記外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドが、ベクターから発現される、項目１から１８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２０）
免疫応答性細胞である、項目１から１９のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２１）
リンパ球系列の細胞または骨髄球系列の細胞である、項目１から２０のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２２）
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージからなる群から選択される、項目１から２１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２３）
Ｔ細胞である、項目１から２２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２４）
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、項目２３に記載の細胞。
（項目２５）
意図されるレシピエントに対して自家または同種異系である、項目１から２４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２６）
前記抗原が、腫瘍抗原または病原体抗原である、項目１から２５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２７）
前記抗原が、腫瘍抗原である、項目１から２６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２８）
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ軽鎖、ＫＤＲ、突然変異体ＫＲＡＳ、突然変異体ＰＩＫ３ＣＡ、突然変異体ＩＤＨ、突然変異体ｐ５３、突然変異体ＮＲＡＳ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ−ＬＣ−１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１，ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、およびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ  Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ  Ｅ７腫瘍性タンパク質、ならびにＥＲＢＢからなる群から選択される、項目２７に記載の細胞。
（項目２９）
前記抗原が、ＣＤ１９である、項目２８に記載の細胞。
（項目３０）
前記抗原が、病原体関連抗原である、項目１から２９のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３１）
前記病原体関連抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
前記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目１から３１のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３３）
前記抗原認識受容体が、病原体関連抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞が、病原体特異的Ｔ細胞である、項目３２に記載の細胞。
（項目３４）
前記抗原認識受容体が、腫瘍抗原を認識する内因性ＴＣＲであり、前記細胞が、腫瘍特異的Ｔ細胞である、項目３２に記載の免疫応答性細胞。
（項目３５）
前記抗原認識受容体が、ＣＡＲである、項目１から３２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３６）
前記ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目３５に記載の細胞。
（項目３７）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、項目３６に記載の細胞。
（項目３８）
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、項目３７に記載の細胞。
（項目３９）
自殺遺伝子をさらに含む、項目１から３８のいずれか一項に記載の細胞。
（項目４０）
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）またはトランケートされたヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドである、項目３９に記載の細胞。
（項目４１）
有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
（項目４２）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物である、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
新生物形成または病原体感染症を処置および／または予防するためのものである、項目４１または４２に記載の組成物。
（項目４４）
標的抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強する方法であって、対象に、有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞または項目４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目４５）
対象における腫瘍負荷を低減する方法であって、前記対象に、有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞または項目４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目４６）
腫瘍細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低減する、および／または前記対象における腫瘍を根絶する、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
新生物形成を処置および／または予防する方法であって、対象に、有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞または項目４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目４８）
新生物形成を有する対象の生存を延長する方法であって、前記対象に、有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞または項目４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記腫瘍または新生物が、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、項目４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記新生物が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、前記抗原が、ＣＤ１９である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
血液がんの処置を必要とする対象における血液がんを処置する方法であって、前記対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、前記Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む、方法。
（項目５２）
前記血液がんが、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
固形腫瘍の処置を必要とする対象における固形腫瘍を処置する方法であって、前記対象に、有効量のＴ細胞を投与することを含み、前記Ｔ細胞が、抗原に結合する抗原認識受容体、および外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドを含む、方法。
（項目５４）
前記固形腫瘍が、脳、乳房、肺、胃腸管（食道、胃、小腸、大腸および直腸を含む）、膵臓、前立腺、軟部組織／骨、子宮、子宮頸部、卵巣、腎臓、皮膚、胸腺、精巣、頭頸部、または肝臓が起源の腫瘍である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
対象における病原体感染症を予防および／または処置する方法であって、前記対象に、有効量の項目１から４０のいずれか一項に記載の細胞または項目４２もしくは４３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目５６）
前記病原体が、疾患を引き起こすことができる、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
抗原特異的細胞を生成するための方法であって、細胞に、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を導入することを含む、方法。
（項目５８）
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、ベクターに含まれる、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
（ａ）抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列、および（ｂ）外因性ドミナントネガティブＦａｓポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む、核酸組成物。
（項目６２）
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている、項目６１に記載の核酸組成物。
（項目６３）
前記第１および第２の核酸配列の一方または両方が、ベクターに含まれる、項目６１または６２に記載の核酸組成物。
（項目６４）
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、項目６３に記載の核酸組成物。
（項目６５）
項目６１から６４のいずれか一項に記載の核酸組成物を含むベクター。
（項目６６）
項目１から７９のいずれか一項に記載の細胞、項目１から４０のいずれか一項に記載の組成物、項目６１から６４のいずれか一項に記載の核酸組成物、または項目６５に記載のベクターを含む、キット。
（項目６７）
新生物形成または病原体感染症を処置および／または予防するための書面による使用説明書をさらに含む、項目６６に記載のキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
腫瘍処置実験のために、６〜１２週齢の雄または雌Ｂ６マウスに、キメラヒト／マウスｇｐ１００抗原ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号３０）（ａ．ａ．２５〜３３）を過剰発現する５×１０５個の以前に記載されたＢ１６黒色腫系統（５７）、または１×１０６個のＣＤ１９＋Ｅ２ａ−ＰＢＸ白血病細胞を注射した。示された日に、腫瘍を保有するマウスは、６Ｇｙの全身照射を受けた。マウスは、対照として未処置のままにされたか、またはＴｈｙ１．１を含有するレポーター構築物で改変された類遺伝子的にマークされたｐｍｅｌ−１または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の示された用量を尾静脈注射によって受けた。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の持続性および白血病負荷を分析するために、マウスを１４日後に屠殺し、脾細胞およびＢＭにおける細胞分析を行った。
【国際調査報告】
2022502054.tif 000068
2022502054.tif 000069