(57)【要約】カベオリン−１（Ｃａｖ−１）ペプチドを含む組成物が本明細書で提供される。さらに、肺感染症または急性もしくは慢性の肺傷害、特に肺線維症の治療のためにＣａｖ−１ペプチドを使用する方法が提供される。第１の実施形態では、ペプチドの乾燥粉末を含む医薬組成物が提供され、前記ペプチドは、配列番号２〜２０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、７〜２０のアミノ酸長である。特定の態様では、ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
2022500500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの乾燥粉末を含む医薬組成物であって、前記ペプチドは、配列番号２〜２０のうちのいずれか１つの配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、７〜２０のアミノ酸長である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号２のペプチドのＮ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号２のペプチドのＣ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号２のペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の両方を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、少なくとも１つの重水素化残基を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、少なくとも１つの非標準アミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、２つの非標準アミノ酸を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記非標準アミノ酸が、オルニチンである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、Ｎ末端修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、Ｃ末端修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｎ末端修飾が、アシル化である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ｃ末端修飾が、アミド化である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ペプチドが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＣＰＰが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２３）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２４）、およびＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２５）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ペプチドが、配列番号２〜２０のうちのいずれか１つの配列の少なくとも２つの反復を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも２つの反復が、同一のアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記少なくとも２つの反復が、異なるアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記乾燥粉末が、粉砕プロセスによって製造される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記乾燥粉末が、噴霧乾燥プロセスによって製造される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記乾燥粉末が、エアジェット粉砕によって製造される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記乾燥粉末が、ボール粉砕によって製造される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記乾燥粉末が、湿式粉砕によって製造される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記乾燥粉末が、１０（重量）％未満の水を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記乾燥粉末が、１（重量）％未満の水を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記医薬組成物が、本質的に賦形剤を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記医薬組成物が、賦形剤を含まない、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記医薬組成物が、肺送達用に製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記医薬組成物が、乾燥粉末吸入用に製剤化されている、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物が、吸入加圧式定量吸入用に製剤化されている、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記医薬組成物が、経口投与用、局所投与用、または注射用に製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１〜５１に記載の医薬組成物を含む、ネブライザーデバイス。
【請求項５６】
対象を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜５１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
前記対象が、炎症性障害を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、線維性状態を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、肺炎症、急性肺傷害、肺感染症、または肺を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が、肺炎症を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象が、急性肺傷害または感染症を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象が、肺感染症を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が、化学物質誘発性肺傷害を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象が、鋳型気管支炎を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が、喘息を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、吸入煙誘発性急性肺傷害（ＩＳＡＬＩ）を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象が、細気管支炎を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が、閉塞性細気管支炎を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
前記肺疾患が、肺の線維性状態である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７２】
前記肺疾患が、間質性肺疾患である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７３】
前記肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または肺瘢痕化である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与が、乾燥粉末吸入を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７５】
前記投与が、変異体ポリペプチドを含む溶液を霧化することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つの追加の抗線維化治療薬を投与することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの追加の抗線維症薬が、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、ＤＭＡＲＤ、免疫抑制剤、生物学的応答モジュレーター、または気管支拡張剤である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象が、ヒトである、請求項５６に記載の方法。
【請求項７９】
呼吸可能な粒子サイズを有する、粉砕された乾燥粉末として製剤化された、配列番号２〜２０のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項８０】
対象を治療する方法であって、有効量の請求項７９に記載の組成物を吸入により前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７２９，０１０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、本発明がなされた時点で有効であった共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果としてなされた。上記の共同研究契約の当事者は、テキサスシステム大学および肺処置学の理事会（Ｔｈｅ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）である。
【０００３】
本発明は、一般に、分子生物学、薬剤学、および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、呼吸器系への送達などによる対象への乾燥粉末治療用ポリペプチド組成物の送達のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
肺損傷中に、ｐ５３発現は増加し、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）を誘発する一方、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびその受容体（ｕＰＡＲ）の発現を阻害し、肺上皮細胞（ＬＥＣ）のアポトーシスをもたらす。損傷のメカニズムは、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、カベオリン−１（「Ｃａｖ−１」）、およびβ１−インテグリンの間の細胞表面シグナル伝達相互作用を含む（Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの相互作用を調節する組成物は、損傷した、罹患した、または傷害を受けた組織のアポトーシスを阻害するための方法で使用することができる。例えば、炎症または肺線維症などの線維性状態を処置するため。したがって、肺の損傷および疾患を予防または処置するために使用することができるポリペプチド、ならびに特に、かかるポリペプチドの治療用送達のための安定した製剤および簡単な方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示によれば、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドの乾燥粉末組成物が提供される。
【０００６】
第１の実施形態では、ペプチドの乾燥粉末を含む医薬組成物が提供され、前記ペプチドは、配列番号２〜２０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの態様では、ペプチドは、７〜２０のアミノ酸長である。特定の態様では、ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、ペプチドは、配列番号２のペプチドのＮ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号２のペプチドのＣ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、ペプチドは、配列番号２のペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加された少なくとも１つのアミノ酸を含む。特定の態様では、ペプチドは、Ｌ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の両方を含み得る。追加の態様では、ペプチドは、少なくとも１つの非標準アミノ酸を含み得る。いくつかの態様では、ペプチドは、２つの非標準アミノ酸を含む。特定の態様では、非標準アミノ酸は、オルニチンである。
【０００７】
さらなる態様では、ペプチドは、Ｎ末端修飾もしくはＣ末端修飾、またはＮ末端およびＣ末端修飾の両方を含み得る。特定の態様では、Ｎ末端修飾は、アシル化である。別の態様では、Ｃ末端修飾は、アミド化である。
【０００８】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号２０を含み得る。いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２〜２０のうちのいずれか１つの配列の少なくとも２つの反復を含む。特定の態様では、少なくとも２つのリピートは、同一のアミノ酸配列を有する。他の態様では、少なくとも２つの反復は、異なるアミノ酸配列を有する。さらに別の態様では、医薬組成物は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含む。特定の態様では、ＣＰＰは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号：２３）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２４）、およびＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２５）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
追加の態様では、乾燥粉末は、粉砕プロセスによって製造される。いくつかの態様では、乾燥粉末は、噴霧乾燥プロセスによって製造される。別の態様では、乾燥粉末は、エアジェット粉砕、ボール粉砕、または湿式粉砕によって製造される。いくつかの態様では、乾燥粉末は、１０（重量）％未満の水を含む。別の態様では、乾燥粉末は、１（重量）％未満の水を含む。特定の態様では、医薬組成物は、本質的に賦形剤を含まない。特定の態様では、医薬組成物は、賦形剤を含まない。特定の態様では、医薬組成物は、肺送達のために製剤化される。さらなる態様では、医薬組成物は、乾燥粉末吸入のために製剤化される。他の態様では、医薬組成物は、吸入加圧定量吸入用に製剤化される。いくつかの態様では、医薬組成物は、経口投与用、局所投与用、または注射用に製剤化される。
【００１０】
特定の態様では、実施形態の乾燥粉末製剤は、約１０％、９％、８％、７％、６％、または５％未満の水分含有量を含む。さらなる態様では、組成物は、約０．０１％〜約１０％、０．１％〜約１０％、１．０％〜約８％、または１％〜約５％の水分含有量を含む。さらなる態様では、実施形態の乾燥粉末製剤は、１０μｍ未満の平均粒子サイズを含む。特定の態様では、平均粒子サイズは、約０．０１ｐｍ〜約１０μｍ、約０．１μｍ〜約８μｍ、約０．５μｍ〜約７μｍ、または約１μｍ〜約５μｍである。いくつかの態様では、実施形態の乾燥粉末組成物の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％は、約１μｍ〜約５μｍの粒子サイズを含む。特定の態様では、実施形態のペプチドの乾燥粉末製剤（例えば、ＣＳＰ７）は、約１μｍ〜約５μｍのサイズを有する少なくとも７０％（例えば、７０％〜８０％）の粒子から構成される。好ましい態様では、乾燥粉末製剤中の粒子の少なくとも約７０％、７５％、８０％、または８５％（例えば、７５％〜９５％）は、５μｍ未満のサイズである。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、実施形態および上記の態様の医薬組成物を含むネブライザー装置を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態では、対象に、有効量の、実施形態および上記の態様の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象を処置する方法が提供される。特定の態様では、対象は、炎症性障害を有する。他の態様では、対象は、線維性状態を有する。いくつかの態様では、対象は、肺炎症、急性肺損傷、肺感染症、または肺を有する。別の態様では、対象は、肺炎症を有する。特定の態様では、対象は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患っている。さらなる態様では、対象は、急性肺損傷または感染症、肺感染症、化学物質誘発性肺損傷、鋳型気管支炎、喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）、細気管支炎、または閉塞性細気管支炎を有し得る。特定の態様では、肺疾患は、肺線維性状態、間質性肺疾患、または特発性肺線維症（ＩＰＦ）もしくは肺瘢痕化である。追加の態様では、投与は、乾燥粉末吸入を含む。他の態様では、投与は、変異体ポリペプチドを含む溶液を霧化することを含む。
【００１３】
さらなる態様では、方法は、少なくとも１つの追加の抗線維化治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの追加の抗線維化剤は、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、ＤＭＡＲＤ、免疫抑制剤、生体応答モジュレーター、または気管支拡張剤である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、呼吸可能な粒子サイズを有する粉砕された乾燥粉末を製剤化された配列番号２〜２０のペプチドを含む、医薬組成物を提供する。例えば、特定の態様では、粉砕された乾燥粉末は、約１０ミクロン未満の空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）を含む。ＭＭＡＤを決定するための方法は、例えば、Ｃａｒｖａｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に提供されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
さらに別の実施形態では、有効量の実施形態の組成物を吸入によって対象に投与することを含む、対象を処置する方法が提供される。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、本発明の精神と範囲の中にある種々の変更および改変がこの詳細な記載から当業者に明らかになるので、詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の好まれる実施形態を示しながら、説明目的のみで提供されることが理解されるべきである。
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に提示す具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら１つ以上の図面を参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＳＰ７バルク粉末の走査型電子顕微鏡画像。粉末試料を試料トレイ上にスパッタリングし、圧縮窒素を吹き付けて広げた。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ５５００  ＳＥＭ／ＳＴＥＭ走査型電子顕微鏡を使用して、試料を観察した。スケールバーは、画像右下に描かれている。
【図２】ＣＳＰ７バルク粉末の光学顕微鏡画像。粉末試料をスライドガラス上にスパッタし、Ｌｅｉｃａ光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ６５００）を使用して観察した。スケールバーは、各画像の左下隅に示されている。矢印は、ニートなＣＳＰ７粉末の凝集粒子を指している。
【図３】ＣＳＰ７バルク粉末粒子のＸ線粉末回折。結晶化度を決定するためにＸ線粉末回折を使用して、ＣＳＰ７バルク粉末粒子を評価した。粉末は、０．０２５  ２θ°のステップサイズおよび２°／分の速度を使用して、２〜４０  ２θ°で測定される。
【図４】ＣＳＰ７バルク粉末の偏光顕微鏡。結晶化度を偏光顕微鏡によって評価した。写真は代表的な画像である。白い矢印は、結晶領域を指す。
【図５】ＣＳＰ７バルク粉末の示差走査熱量測定。バルクＣＳＰ７粉末を、ＴＡ機器Ｑ２０示差走査熱量測定装置を使用して示差走査熱量測定によって分析した。写真は、周波数１℃／６０秒、および速度２℃／分を用いて、２５〜３００℃まで上昇させた、変調ＤＳＣからの曲線である。
【図６】ＣＳＰ７バルク粉末の熱重量分析。Ｍｅｔｔｌｅｒ熱重量分析装置であるモデルＴＧＡ／ＤＳＣを使用して、熱重量分析を行った。写真はＴＧＡ曲線である。加熱速度を１０℃／分に設定し、２５〜５００℃まで上昇させた。
【図７】ＣＳＰ７バルク粉末の動的蒸気吸着。バルクＣＳＰ７粉末を、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＶＳ機器で、２５℃で、１０％刻みで相対湿度０％〜９０％の十分な吸着／脱着サイクルで実行した。湿度０％での水分脱着および湿度９０％での質量変化が示されている。
【図８】噴霧乾燥されたＣＳＰ７の粒子サイズ分布。ＣＳＰ７をロイシン、トレハロース、クエン酸ナトリウム、またはロイシンのいずれか、およびトレハロースと混合し、噴霧乾燥した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００（レーザー光回折、フラウンホーファー近似、分散空気圧：３．０Ｂａｒ）によって、粒子サイズを評価した。写真は、各噴霧乾燥混合物の曲線である。
【図９】均質化されたＣＳＰ７懸濁液の目視観察。Ａ．最高出力のローターステーターで１分間処理されたエタノール；Ｂ．未処理のＣＳＰ７−エタノール懸濁液、赤い矢印は大きな粒子／凝集物を示す；Ｃ．最高出力のＣＳＰ７−ローターステーターで１分間処理されたエタノール懸濁液、懸濁液は濃い灰色に変わる；Ｄ．最低出力のＣＳＰ７−ローターステーターで１分間処理されたエタノール懸濁液、懸濁液は薄い灰色に変わる。
【図１０】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末の光学顕微鏡。エアジェット粉砕機の示された位置から収集された粉末試料を光学顕微鏡によって画像化した。写真は代表的な画像である。
【図１１】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末の走査型電子顕微鏡。粉砕されたＣＳＰ７粉末（バッチ１７１０２７）を、バルクＣＳＰ７粉末と同じ条件下で、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって画像化した。写真は、粉砕されたＣＳＰ７粉末の代表的なＳＥＭ画像である。
【図１２】薄膜凍結後のＣＳＰ７の光学顕微鏡。粉末試料をスライドガラス上にスパッタし、Ｌｅｉｃａ光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ６５００）を使用して観察した。スケールバーは、各画像の左下隅に示されている。
【図１３】噴霧乾燥されたＣＳＰ７の走査型電子顕微鏡。噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物（Ａ＝１００％ＬＴＩ、Ｂ＝ロイシン、Ｃ＝トレハロース、ｄ＝クエン酸ナトリウム、ｅ＝ロイシンおよびトレハロース）の粒子形態を、ＳＥＭを使用して調べた。代表的な画像が描かれている。
【図１４】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末のＸ線粉末回折。粉砕された（バッチ１７１０２７）および未処理のバルクＣＳＰ７粉末のＸ線粉末回折プロファイルが示されている。回折曲線は、粉砕されたＣＳＰ７の結晶化度の低下を示している。
【図１５】噴霧乾燥されたＣＳＰ７の物理的状態。噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物をＸ線回折によって調べた。ＣＳＰ７の各噴霧乾燥混合物の結晶化度またはその欠如を示す曲線が示されている。
【図１６】噴霧乾燥されたＣＳＰ７のＨＰＬＣ分析。噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物の純度を、ＨＰＬＣを使用してその化学的効力をアッセイすることによって調べた。
【図１７】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７安定性のＨＰＬＣ分析。未処理のバルクＣＳＰ７粉末およびエアジェット粉砕されたＣＳＰ７（バッチ１７１０２７）の両方の安定性を、ＨＰＬＣを使用してそれらの化学的効力を分析することによって調べた。各試料を、蓋を開いた／閉じたバイアルを用いて３つの異なる条件（４℃、２５℃／６０ＲＨ、４０℃／７５ＲＨ）で保存した後、５、１５、および３２日間の保存で化学的効力を分析した。
【図１８】エアロゾル化されたＣＳＰ７粒子の堆積。次世代インパクター（ＮＧＩ）を使用してエアロゾル化した後、すべての収集表面を既知量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．３）ですすいだ。スロート、プレセパレーター、およびステージ１〜ＭＯＣに堆積した粉末を別々に抽出し、測定した。特定の位置に堆積した未処理またはエアジェット粉砕（バッチ１７１０１３）ＣＳＰ７粉末（収集容器から収集）の割合が示されている。
【図１９】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７の空気力学的粒子サイズ分布。次世代インパクター（ＮＧＩ）を使用してエアロゾル化した後、すべての収集表面を既知量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．３）ですすいだ。カプセル、装置、アダプター、スロート、プレセパレーター、およびステージ１〜ＭＯＣに堆積した粉末を別々に抽出し、測定した。未処理またはエアジェット粉砕（バッチ１７１０２７）ＣＳＰ７粉末（粉砕された粉末のすべての画分から収集される）のいずれかが測定された粉砕機内の位置。各位置に存在する粉砕粉末の割合が示されている。
【図２０】噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物のエアロゾル性能。ＮＧＩによるエアロゾル化後、すべての収集表面を既知量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．３）ですすいだ。カプセル、装置、アダプター、スロート、プレセパレーター、およびステージ１〜ＭＯＣに堆積した粉末を別々に抽出し、測定した。特定の位置に堆積した粉末の割合が示されている。
【図２１】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末の動的蒸気吸着。粉砕されたＣＳＰ７粉末（バッチ１７１０２７）を、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＶＳ機器で、２５℃で、１０％刻みで相対湿度０％〜９０％までの完全な吸着／脱着サイクルで実行した。湿度０％での水分脱着および湿度９０％での質量変化が示されている。
【図２２】エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末の熱分析。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、上記の熱量計を使用して粉砕されたＣＳＰ７（バッチ１７１０２７）について行った。周波数１℃／６０秒および速度２℃／分を用い、２５〜３００℃まで上昇させたＤＳＣの曲線が描かれている。
【図２３】噴霧乾燥された１００％ＣＳＰ７の熱特性。賦形剤を含まない噴霧乾燥ＣＳＰ７を、変調示差走査熱量測定によって分析した。写真はｍＤＳＣ曲線である。
【図２４】ロイシンを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７の熱特性。２５％ロイシンを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７混合物を、変調示差走査熱量測定によって分析した。写真はｍＤＳＣ曲線である。
【図２５】トレハロースを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７の熱特性。２５％トレハロースを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７混合物を、変調示差走査熱量測定によって分析した。写真はｍＤＳＣ曲線である。
【図２６】クエン酸ナトリウムを用いた噴霧乾燥ＣＳＰ７の熱特性。２５％クエン酸ナトリウムを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７混合物を、変調示差走査熱量測定によって分析した。写真はｍＤＳＣ曲線である。
【図２７】ロイシンおよびトレハロースを含む噴霧乾燥ＣＳＰ７の熱特性。１５％のロイシンおよび１０％のトレハロースを含む噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物を、変調示差走査熱量測定によって分析した。写真はｍＤＳＣ曲線である。
【図２８】すべての噴霧乾燥ＣＳＰ７混合物の熱特性。製造された噴霧乾燥ＣＳＰ７混合物の各々をｍＤＳＣによって分析した。これらの粉末についてのすべてのｍＤＳＣ曲線が描かれている。
【図２９】マウスの解剖肺組織の湿重量。安楽死させたマウスを解剖し、肺を摘出し、体重を測定した。マウスを、生理食塩水で処理するかまたはブレオマイシンで処理して肺線維症を誘発するか、あるいはブレオマイシンで処理し、ＣＳＰ７ペプチドで１２または６０分間処理した。
【図３０】マウス肺組織のコラーゲン含有量。未処理、ブレオマイシン処理、またはブレオマイシンおよびＣＳＰ７処理肺組織を均質化し、Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅコラーゲンアッセイを使用してコラーゲン含有量を分析した。グラフは、肺の総コラーゲン含有量を示している。
【図３１】マウス肺組織のアシュクロフトスコア。未処理の、ブレオマイシン処理した、またはブレオマイシンおよびＣＳＰ７処理した肺組織を均質化し、Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅコラーゲンアッセイを使用してコラーゲン含有量を分析した。アシュクロフトスコアを、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８に記載されるように決定した。グラフは、肺の総コラーゲン含有量を示している。
【図３２】マウス肺組織のコラーゲン含有量。未処理の、ブレオマイシン処理した、またはブレオマイシンおよびＣＳＰ７処理した肺組織を均質化し、Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅコラーゲンアッセイを使用してコラーゲン含有量を分析した。グラフは、肺の総コラーゲン含有量を示している。
【図３３】最大５回の凍結融解サイクル後のＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）の安定性。
【図３４】粉砕されたおよびニートのＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末の比表面積。
【図３５】粉砕されたおよびニートのＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末の熱重量分析。
【図３６】粉砕されたおよびニートのＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末のＳＥＭ画像。
【図３７】安定性研究における粉砕されたＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末の外観。
【図３８】安定性研究における粉砕されたＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）の結晶化度。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、特定の構成要素に関して「本質的に含まない」とは、特定の構成要素が、組成物に意図的に配合され、および／または汚染物質としてのみもしくは微量で存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０１％をはるかに下回る。最も好ましいのは、具体的な構成成分の量が標準的な分析方法を用いて分析できない組成物である。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１以上を意味してもよい。特許請求の範囲で使用される場合、「〜を含む」との用語と組み合わせて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」といった用語は、１つ、または１つより多くを意味していてもよい。
【００２１】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、本開示が代替のみおよび「および／または」を指す定義を支持するけれども、代替のみを指すまたは代替が相互に排他的であることを指すように明白に指示されない限り、「および／または」を意味するように使用される。本明細書で使用されるとき、「別の」は少なくとも第２以上を意味してもよい。
【００２２】
本出願の全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するのに採用される装置、方法に関する誤差の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すのに使用される。「約」とは、特に注記しない限り、＋／−１０％を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、典型的には、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の一本鎖から構成されるアミノ酸の配列を指す。一般に、ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸残基を含み、特に明記しない限り、長さは約５０アミノ酸未満である。いくつかの態様では、ペプチドは、対イオンと共に提供され得る。同様に、いくつかの場合、ペプチドは、分解を低減したブロッキング修飾などのＮおよび／またはＣ末端修飾を含み得る。
【００２４】
「生物学的に活性な」カベオリン−１（Ｃａｖ−１）ペプチドは、ｐ５３タンパク質レベルを増加させ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）を減少させ、ならびに／または線維性肺線維芽細胞などの細胞中でのプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の発現を増加させるペプチドを指す。いくつかの態様では、生物学的に活性なペプチドは、配列番号１の天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの生物学的または生化学的活性の少なくとも２０％を有する（例えば、インビトロまたはインビボアッセイによって測定した場合）。いくつかの態様では、生物学的活性ペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドと比較して、同じ生物学的または生化学的活性を有するか、またはそれを増加させる。
【００２５】
「同一性」または「相同性」という用語は、必要に応じて全配列の最大パーセント同一性を達成し、かつ、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、配列をアラインしてギャップを導入した後、それが比較される対応する配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合を意味すると解釈されるべきである。Ｎ末端またはＣ末端の伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させると解釈されるべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを使用して測定し得る。
【００２６】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を指すために使用される。サブユニットは、アミド結合によって結合され得る。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって結合され得る。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃ）」という用語は、本発明によるペプチドが、例えば、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、または他の共有結合などの少なくとも１つの非ペプチド結合を含むように修飾されることを意味する。ペプチド鎖が短い場合、３つ以上のアミノ酸のペプチドが一般にオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合（例えば、５０アミノ酸より長い場合）、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と称される。
【００２７】
「対象」および「個体」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本明細書に開示される医薬組成物による予防的処置を含む処置が提供される動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を指す。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、および非哺乳動物、例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとしての実験動物または動物代替物である。非ヒト哺乳動物には、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、およびウシなどの哺乳動物が含まれる。いくつかの態様では、非ヒト動物は、イヌまたはネコなどのコンパニオンアニマルである。
【００２８】
対象における疾患もしくは状態を「処置する」、または疾患もしくは状態を有する患者を「処置する」とは、個体を例えば薬物の投与などの薬物処置に供し、その結果、疾患または状態の少なくとも１つの症状が軽減または安定することを指す。典型的には、ペプチドが処置として治療的に投与される場合、該ペプチドは、肺損傷または肺線維症のうちの１つ以上の症状を呈する対象に投与される。
【００２９】
「単離された」とは、ポリペプチドが、体液、例えば、血液などの任意の天然の環境から分離され、ポリペプチドに天然で付随する成分から分離されていることを意味する。
【００３０】
単離されたおよび「実質的に純粋な」とは、ポリペプチドに天然で付随する成分から少なくともある程度分離および精製されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然で関連しているタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも約６０重量％、または少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、またはさらに少なくとも約９９重量％含まない場合、実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然の供給源からの抽出によって、通常はそのタンパク質を発現しない細胞における組換え核酸の発現によって、または化学合成によって得ることができる。
【００３１】
明細書で使用される「変異体」という用語は、１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、置換、または側鎖修飾によってポリペプチドとは異なるが、天然に存在する分子の１つ以上の特定の機能または生物学的活性を未だ保持するポリペプチドを指す。アミノ酸置換には、アミノ酸が異なる天然に存在するまたは非従来型のアミノ酸残基で置換される変更が含まれる。かかる置換は「保存的」として分類され得、その場合、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は、極性、側鎖官能基、またはサイズのいずれかに関して同様の特徴の別の天然に存在するアミノ酸で置き換えられる。かかる保守的な置換は、当該技術分野で周知である。本発明に包含される置換はまた、「非保存的」であり得、この場合、ペプチド中に存在するアミノ酸残基が、異なる特性を有するアミノ酸、例えば、異なる群由来の天然に存在するアミノ酸で置換される（例えば、荷電したまたは疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）か、あるいは、天然に存在するアミノ酸が非従来型アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、変異体という用語には、それぞれ、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して（例えば、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して）、一次、二次、または三次構造が変化し得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指すこともまた包含され得る。
【００３２】
「挿入」または「欠失」という用語は、典型的には、約１〜５個のアミノ酸の範囲にある。許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を使用して配列中のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を体系的に行いながら、ペプチドを合成的に製造することによって実験的に決定することができる。
【００３３】
ペプチドを指す場合の「置換」という用語は、異なる実体、例えば、別のアミノ酸またはアミノ酸部分でのアミノ酸の変化を指す。置換は、保存的または非保存的置換であり得る。
【００３４】
ペプチドなどの分子の「類似体」は、分子全体またはその断片のいずれかに機能的に類似した分子を指す。「類似体」という用語はまた、対立遺伝子種および誘導された変異体を含むことを意図している。類似体は、典型的には、しばしば保存的置換によって、１つまたはいくつかの位置で天然に存在するペプチドとは異なる。類似体は、典型的には、天然ペプチドと少なくとも８０または９０％の配列同一性を示す。いくつかの類似体には、非天然アミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含まれる。非天然アミノ酸の例は、例えば、二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。断片および類似体は、以下に記載されるように、トランスジェニック動物モデルにおける予防的または治療的有効性についてスクリーニングすることができる。
【００３５】
「共有結合」とは、共有化学結合によって直接的または間接的に（例えば、リンカーを介して）結合されることを意味する。本発明のすべての実施形態のいくつかの態様では、融合ペプチドは共有結合している。
【００３６】
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、２つ以上のタンパク質の組換えタンパク質を指す。融合タンパク質は、目的のタンパク質すべてを含む単一のポリペプチドに細胞中で翻訳され得る単一のオープンリーディングフレームを構成するように、例えば、あるタンパク質をコードする核酸配列が別のタンパク質をコードする核酸に結合されることによって生成され得る。タンパク質の配置の順序は変動し得る。融合タンパク質には、エピトープタグまたは半減期延長因子が含まれ得る。エピトープタグには、ビオチン、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｈｉｓ６、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、緑色蛍光タンパク質、Ｖ５エピトープタグ、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＡＵ１、ＡＵ５、およびアビジンが含まれる。半減期延長因子には、Ｆｃドメインおよび血清アルブミンが含まれる。
【００３７】
「気道」という用語は、本明細書では、上気道、呼吸気道、および肺を含む、呼吸道の任意の部分を指す。上気道には、鼻および鼻腔、口、ならびに喉が含まれる。呼吸気道には、喉頭、気管、気管支、細気管支が含まれる。肺には、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、および肺胞が含まれる。
【００３８】
「吸入煙誘発性急性肺損傷」およびＩＳＡＬＩ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、煙吸入によって生じる急性肺損傷（ＡＬＩ）の形態を指す。ＡＬＩは「軽度の急性呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ」とも称する。ＡＲＤＳは、対象における以下の状態の１つ以上を見つけることによって定義することができる：１）胸部Ｘ線での両側肺浸潤、２）臨床的に示されるように右心カテーテル検査で測定した場合での、肺毛細血管楔入圧＜１８ｍｍＨｇ（２．４ｋＰａ）、および３）ＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００ｍｍＨｇ（４０ｋＰａ）。いくつかの実施形態では、ＩＳＡＬＩの処置には、以下の状態のうちの１つ以上の処置が含まれる：酸素供給の減少、気道閉塞（重度の気道閉塞を含む）、線維性気道鋳型（ｆｉｂｒｉｎｏｕｓ  ａｉｒｗａｙ  ｃａｓｔ）または破片、および肺胞フィブリン沈着。
【００３９】
「エアジェット粉砕」という用語は、圧縮ガスのジェットを使用して粒子を互いに衝突させ、それにより、粒子を粉砕することによって粒子サイズを低下させるための装置または方法を指す。エアジェット粉砕は、ペプチド粒子のサイズを低下させるために使用することができる。同じ機能を行う他の機械的粉砕装置も、エアジェット粉砕機と交換可能に使用することができる。エアジェット粉砕は、温度、圧力、相対／赦免湿度、酸素含有量などの様々な環境パラメータの下で生じさせることができる。
【００４０】
「ボール粉砕」という用語は、目的の粒子および粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）媒体をシリンダーの内部に添加し、シリンダーを回転させることによって粒子サイズを低下させるための装置または方法を指す。目的の粒子は、粉砕媒体が回転するときにシリンダーの外側に沿って上下するときに分解される。ボール粉砕は、ペプチド粒子のサイズを低下させるために使用することができる。同じ機能を行う他の機械的粉砕装置も、エアジェット粉砕と交換可能に使用することができる。
【００４１】
「湿式粉砕」または「媒体粉砕」という用語は、液体および粉砕媒体を含む媒体を含む、攪拌機を備えた装置に目的の粒子を加えることによって粒子サイズを低下させるための装置または方法を指す。目的の粒子を添加し、攪拌機が回転すると、攪拌機が分散するエネルギーにより、粉砕媒体と目的の粒子とが接触し、目的の粒子が分解される。同じ機能を行う他の機械的粉砕装置も、エアジェット粉砕と交換可能に使用することができる。
【００４２】
「高圧均質化」という用語は、圧力および機械力の両方を組み合わせて目的の粒子を分解する装置に目的の粒子を加えることによって粒子サイズを低下させる方法を指す。高圧均質化で使用される機械力には、特に、衝撃、せん断、およびキャビテーションが含まれ得る。同じ機能を行う他の機械的粉砕装置も、エアジェット粉砕と交換可能に使用することができる。
【００４３】
「極低温粉砕」という用語は、最初に、目的の粒子をドライアイス、液体窒素、または他の極低温液体で冷却し、続いて、目的の粒子を粉砕してサイズを低下させることによって粒子サイズを低下させるための装置または方法を指す。同じ機能を行う他の機械的粉砕装置も、エアジェット粉砕と交換可能に使用することができる。
【００４４】
「有効量」または「治療上有効な」という句は、所望の治療結果を生じさせるのに十分な薬物または薬剤の投与量を意味する。所望の治療結果は、投与のレシピエントにおける主観的または客観的な改善、感染症の軽減、炎症の軽減、肺成長の増加、肺修復の増加、組織浮腫の軽減、ＤＮＡ修復の増加、アポトーシスの減少、腫瘍サイズの低下、癌細胞の増殖速度の低下、転移の減少、または上記の任意の組み合わせであり得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、対象への活性医薬成分（ＡＰＩ）の投与または送達を容易にするために使用されるか、または対象の作用部位への送達のために医薬的に使用される薬物製剤への、ＡＰＩの処理を容易にするために使用される比較的不活性な物質である薬学的に許容される担体を指す。賦形剤または薬学的に許容される担体には、活性成分を除く、剤形のすべての不活性成分が含まれる。賦形剤の非限定的な例には、担体剤、増量剤、安定化剤、界面活性剤、表面修飾剤、溶解性増強剤、緩衝剤、封入剤、抗酸化剤、防腐剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤、および吸収促進剤が含まれる。「賦形剤を含まない」とは、任意の賦形剤を含まない製剤中の目的の医薬組成物を指す。
【００４６】
「医薬的または薬理学的に許容される」との句は、必要に応じて、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害な反応、アレルギー反応、または他の不利な反応を生じない分子部分および組成物を指す。ＣＳＰ７などのＣａｖ−１ペプチドまたは追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤は、ＦＤＡまたは他の認められた規制当局によって要求されるバイオバーデン、無菌性、発熱性、一般的な安全性、および／または純度基準を満たす必要があることが理解される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、当業者に既知であるような、任意および全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、Ｒｉｎｇｅｒデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性気体）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、香味調整剤（例えば、甘味剤、香味剤）、そのような材料およびそれらの組み合わせが含まれる。医薬組成物中のｐＨおよび種々の構成要素の実際の濃度は、周知であるパラメータにしたがって調節される。いくつかの態様では、担体は、治療剤をカプセル化し得るが、それ自体は、対象に消費または投与されない（例えば、乾燥粉末吸入器で使用するなどのために、乾燥粉末組成物を封入するシェルカプセル）。
【００４８】
ＩＩ．カベオリン−１ペプチド
本開示の実施形態は、カベオリン−１（Ｃａｖ−１）ペプチドの乾燥粉末製剤を提供する。カベオリン−１（Ｃａｖ−１）足場ドメインまたはペプチドは、ＳｒｃキナーゼとのＣａｖ−１相互作用を妨げ、ｕＰＡおよび抗β１−インテグリン抗体の組み合わせ効果を模倣する。天然ヒトＣａｖ−１は、１７８アミノ酸の長さ、および２２ｋＤａの分子量を有する。Ｃａｖ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を以下に示す：
【化１】
2022500500.tif 000003
【００４９】
いくつかの態様では、ペプチドは、配列番号２、ＦＴＴＦＴＶＴと少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む足場ドメインペプチドである。ペプチドは、配列番号１の配列と比較して、１、２、３、４個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み得、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９残基のポリペプチドを誘導する。特定の態様では、ペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの切断型、例えば、表１に示される例示的なペプチドである。
【表１】
2022500500.tif 000004
【００５０】
本開示で提供されるペプチドは、結合または生物学的活性のｉインビトロまたはインビボアッセイにおいて天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの活性を有する生物学的に活性な誘導体である。特定の態様では、ペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの活性の少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、約９５％、９７％、９９％、およびそれらから導くことが可能な任意の範囲、例えば、約７０％〜約８０％、より好ましくは約８１％〜約９０％。またはさらにより好ましくは、約９１％〜約９９％の活性で、インビトロまたはインビボでブレオマイシンによって誘発される肺上皮細胞（ＬＥＣ）のアポトーシスを阻害または防止する。ペプチドは、天然ＣＡＶ−１ポリペプチドよりも１００％以上の活性を有し得る。生物学的活性、例えば、抗線維化活性、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、およびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡの発現に影響を与える能力、または肺線維芽細胞の増殖を阻害する能力を試験するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。
【００５１】
本開示のペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドまたはその改変型である。ペプチドは、当該技術分野で周知の方法を使用して単離または生成された、合成、組換え、または化学的に修飾されたペプチドであり得る。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部のアミノ酸に改変を加えることができる。Ｎ末端修飾は、例えば、アシル化、アセチル化、またはＣ末端アミド化であり得るが、これらに限定されない。ペプチドは、以下に記載されるように、保存的または非保存的アミノ酸変化を含み得る。ポリヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらし得る。ペプチドはまた、例えば、限定するものではないが、挿入アミノ酸、または通常はヒトのタンパク質には存在しない非標準アミノ酸、例えば、オルニチンを含む、ペプチドの基礎であるアミノ酸配列において通常は存在しないアミノ酸（および他の分子）の挿入および置換を含む、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含み得る。保存的置換という用語は、ペプチドを説明する場合、ペプチドの活性を実質的に変化させないペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。例えば、保存的置換とは、同様の化学的特性を有する異なるアミノ酸残基をアミノ酸残基で置換することを指す。保存的アミノ酸置換には、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置換、アスパラギン酸のグルタメートでの置換、またはスレオニンのセリンでの置換が含まれる。
【００５２】
保存的アミノ酸置換は、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで置換し、アスパラギン酸をグルタメートで置換し、またはスレオニンをセリンで置換するなど、あるアミノ酸を同様の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することから生じる。したがって、特定のアミノ酸配列の保存的置換とは、重要なアミノ酸の置換でさえペプチドの活性を低下させないように、ポリペプチド活性に重要ではないアミノ酸の置換、または同様の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負に帯電した、極性または非極性など）を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。機能的に同様であるアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。例えば、以下６つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）も参照のこと、これは参照によりその全体が組み込まれる。）いくつかの実施形態では、変化によってペプチドの活性が低下しない場合、単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変更、付加、または削除する個々の置換、欠失、または付加も、保存的置換とみなすこともすることができる。挿入または欠失は、典型的には、約１〜５個のアミノ酸の範囲である。保存的アミノ酸の選択は、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり、かつ溶媒に曝露される場合、または内側にあり、かつ溶媒に曝露されない場合、ペプチド中で置換されるアミノ酸の位置に基づいて選択し得る。
【００５３】
代替の実施形態では、既存のアミノ酸の位置、すなわち、溶媒への曝露に基づいて（すなわち、溶媒に曝露されていない内部に局在するアミノ酸と比較して、アミノ酸が溶媒に曝露されるか、またはペプチドもしくはポリペプチドの外面に存在する場合）、既存のアミノ酸を置換するアミノ酸を選択することができる。かかる保存的アミノ酸置換の選択は、例えば、Ｄｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７，７２１−７３９  およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９（１９８６）；２０５−２１８、ならびにＳ．Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９（１９８３）１７１に開示されている。したがって、タンパク質またはペプチドの外側のアミノ酸（すなわち溶媒に曝露されているアミノ酸）に好適な保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、以下の置換を使用することができるが、これらに限定されない：ＹのＦでの置換、ＴのＳまたはＫでの置換、ＰのＡでの置換、ＥのＤまたはＱでの置換、ＮのＤまたはＧでの置換、ＲのＫでの置換、ＧのＮまたはＡでの置換、ＴのＳまたはＫでの置換、ＤのＮまたはＥでの置換、ＩのＬまたはＶでの置換、ＦのＹでの置換、ＳのＴまたはＡでの置換、ＲのＫでの置換、ＧのＮまたはＡでの置換、ＫのＲでの置換、ＡのＳでの置換、ＫまたはＰでの置換。
【００５４】
代替の実施形態では、タンパク質またはペプチドの内部のアミノ酸に好適に包含される保存的アミノ酸置換を選択することもでき、例えば、タンパク質またはペプチドの内部にあるアミノ酸（すなわちアミノ酸が溶媒に曝露されていない）に好適な保存的置換を使用することができ、例えば、以下の保存的置換を使用することができるが、これらに限定されない：ＹがＦで置換され、ＴがＡまたはＳで置換され、ＩがＬまたはＶで置換され、ＷがＹで置換され、ＭがＬで置換され、ＮがＤで置換され、ＧがＡで置換され、ＴがＡまたはＳで置換され、ＤがＮで置換され、ＩがＬまたはＶで置換され、ＦがＹまたはＬで置換され、ＳがＡまたはＴで置換され、ＡがＳ、Ｇ、Ｔ、またはＶで置換される。いくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換も、変異体の用語内に包含される。
【００５５】
いくつかの態様では、ポリペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの誘導体である。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、例えば、限定するものではないが、アセチル化、ユビキチン化、標識化、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、脂質化、グリコシル化、アミド化、または他の分子の付加によるなどの技術によって化学的に修飾されたペプチドを指す。分子は、通常は該分子の一部ではない追加の化学部分を含む場合、別の分子の「誘導体」でもある。かかる部分は、ｐＨを変更し、または分子の安定性、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、該部分は、分子の毒性を低下させ、分子の望ましくない任意の副作用などを排除または軽減することができる。かかる効果を媒介することが可能な部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
「誘導体」または「変異体」と組み合わせて使用される場合の「機能的」という用語は、機能的誘導体または機能的変異体である実体または分子の生物学的活性と実質的に同様の生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を有する本発明のポリペプチドを指す。機能的誘導体という用語は、分子の断片、類似体、または化学的誘導体を含むことを意図している。
【００５７】
いくつかの態様では、アミノ酸置換は、置換が同様の親水性を有するアミノ酸のためのものである１つ以上の位置でポリペプチド中でなされ得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｅｘ）の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な親水性特性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで該二次構造が、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定していることが受け入れられている。したがって、かかる保存的置換は、ポリペプチド中で行うことができ、それらの活性にわずかな影響しか及ぼさない可能性が高い。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。これらの値は指針として使用することができ、したがって、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。したがって、異なるが相同である、同様の親水性値を有するアミノ酸をアミノ酸で置換することによって、本明細書に記載のポリペプチドのいずれも修飾され得る。±／−１．０または±／−０．５ポイント以内の親水性を有するアミノ酸は相同とみなされる。
【００５８】
Ｃａｖ−１ペプチドは、かかる修飾が単離されたペプチドの抗炎症特性または血糖制御を改善する能力に影響を及ぼさない程度で、同時翻訳および翻訳後（Ｃ末端ペプチド切断）修飾、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解切断（例えば、フューリンまたはメタロプロテアーゼによる切断）などを含み得る。
【００５９】
いくつかの態様では、Ｃａｖ−１ペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含む。ペプチドは、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の組み合わせを含むことができ、または天然に存在しないアミノ酸のみを含み得る。天然に存在しないアミノ酸は、合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸を含むことができ、またはペプチド（またはプロテアーゼ認識配列を除く、組成物の他の成分）への１つ以上のＤ−アミノ酸が特定の状況において望ましい。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドは、Ｌ−アミノ酸含有形態と比較して、インビトロまたはインビボで増加した安定性を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込んだペプチドの構築は、より高いインビボまたは細胞内安定性が所望されるかまたは必要とされる場合、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドは、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、それにより、結合された薬物およびコンジュゲートのより良い経口経上皮送達および経皮送達、膜永久複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）のバイオアベイラビリティの改善（さらなる詳細については以下を参照）、ならびにかかる特性が望ましい場合の血管内および間質の寿命の延長を提供する。Ｄ−異性体ペプチドの使用はまた、結合された薬物および他のカーゴ（ｃａｒｇｏ）分子の経皮および経口経上皮送達を促進することができる。さらに、Ｄ−ペプチドは、Ｔヘルパー細胞への主要組織適合遺伝子複合体クラスＩｌ制限提示について効率的に処理することができず、したがって、生物全体における体液性免疫応答を誘発する可能性が低くなる。したがって、ペプチドコンジュゲートは、例えば、細胞透過性ペプチド配列のＤ異性体形態、切断部位のＬ異性体形態、および治療用ペプチドのＤ異性体形態を使用して構築することができる。
【００６０】
２０個の「標準的な」Ｌ−アミノ酸に加えて、当該技術分野で明確に定義されるＤ−アミノ酸または非標準の修飾または異常アミノ酸も、本開示での使用のために企図される。リン酸化アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）、グリコシル化アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ）、β−アミノ酸、ＧＡＢＡ、ω−アミノ酸は、本開示での使用のためにさらに企図される。これらには、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、および他のω−アミノ酸、例えば、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（メレ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ−メチル化アミノ酸、およびペプトイド（Ｎ置換グリシン）が含まれる。
【００６１】
カルボン酸末端修飾には、カルボン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、脂肪酸（ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸）、コハク酸、安息香酸、カルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）によるアシル化、アセチル化、およびビオチン化が含まれる。アミノ末端修飾には、（ｉ）カルボン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、脂肪酸（ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸など）、コハク酸、安息香酸、カルボベンゾキシ（Ｃｂｚ）によるアシル化、（ｉｉ）ビオチン化、（ｉｉｉ）アミド化、（ｉｖ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ、ＦＡＭなど）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−酢酸、７−ヒドロキシクマリン−３−酢酸、７−メトキシクマリン−３−酢酸、および他のクマリンなどの色素の付加；ローダミン（５−カルボキシローダミン１１０または６Ｇ、５（６）−ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ）；Ｎ−［４−（４−ジメチルアミノ）フェニルアゾ］安息香酸（Ｄａｂｃｙｌ）、２，４−ジニトロベンゼン（Ｄｎｐ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（Ｄａｎｓｙｌ）、および他の色素、ならびに（ｖ）ポリエチレングリコールが含まれる。
【００６２】
ポリペプチドは、そのＮ末端およびＣ末端においてそれぞれアシル（「Ａｃ」と略す）基およびアミド（略称「Ａｍ」と略す）基でキャッピングされ得、例えば、Ｎ末端においてアセチル（ＣＨ３ＣＯ−）でキャップされ、Ｃ末端においてアミド（−ＮＨ２）でキャップされ得る。好ましくは末端アミノ基への結合での、広範囲のＮ末端キャッピング機能が企図され、例えば、ホルミル；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル；
１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル、例えば、ヘキサ−３−エノイル；
１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル、例えば、ヘキサ−５−イノイル；
アロイル、例えば、ベンゾイルまたは１−ナフトイル；
ヘテロアロイル、例えば、３−ピロイルまたは４−キノロイル；
アルキルスルホニル、例えば、メタンスルホニル；
アリールスルホニル、例えば、ベンゼンスルホニルまたはスルファニリル；
ヘテロアリールスルホニル、例えば、ピリジン−４−スルホニル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルカノイル、例えば、４−アミノブチリル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケノイル、例えば、６−ヒドロキシ−ヘキサ−３−エノイル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキノイル、例えば、３−ヒドロキシ−ヘキサ−５−イノイル；
置換アロイル、例えば、４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ナフト−２−オイル；
置換ヘテロアロイル、例えば、２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−オイル；
置換アルキルスルホニル、例えば、２−アミノエタンスルホニル；
置換アリールスルホニル、例えば、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル；
置換ヘテロアリールスルホニル、例えば、１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニル；
カルバモイルまたはチオカルバモイル；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）（式中、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリール、または置換ヘテロアリールである）；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）および置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）（式中、Ｒ’は、アルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換アルカノイル、置換アルケノイル、置換アルキノイル、置換アロイル、または置換ヘテロアロイルである）であり、すべて上記で定義されている通りである。
【００６３】
Ｃ末端キャッピング機能は、末端カルボキシルとのアミド結合またはエステル結合のいずれかであり得る。アミド結合を提供するキャッピング機能は、ＮＲ１Ｒ２として規定され、Ｒ１およびＲ２は、以下の群から独立して引用され得る：
【００６４】
１〜１０個の炭素原子を好ましくは有するアルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル；
１〜１０個の炭素原子を好ましくは有するアルケニル、例えば、プロプ−２−エニル；
１〜１０個の炭素原子を好ましくは有するアルキニル、例えば、プロプ−２−イニル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキル、例えば、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケニル、例えば、ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニル；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキニル、例えば、ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニル；
最大１０個の炭素原子を有するアロイルアルキル、例えば、フェナシルまたは２−ベンゾイルエチル；
アリール、例えば、フェニルまたは１−ナフチル；
ヘテロアリール、例えば、４−キノリル；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル、例えば、アセチルまたはブチリル；
アロイル、例えば、ベンゾイル；
ヘテロアロイル、例えば、３−キノロイル；
ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフミル、またはＳＯ２−Ｒ’’’’もしくはＳＯ−Ｒ’’’’であり、Ｒ’’’は、置換または非置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはアルキニルである。
【００６５】
エステル結合を提供するキャッピング機能は、ＯＲとして示され、ここで、Ｒは、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、置換アルコキシ、置換アリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、置換アラルキルオキシ、または置換ヘテロアラルキルオキシであり得る。
【００６６】
Ｎ末端またはＣ末端キャッピング機能のいずれかまたはその両方は、キャップされた分子が、活性薬物を放出するために身体内で自発的または酵素的変換を受け、かつ、親薬物分子よりも送達特性が改善されている、プロドラッグ（親薬物分子の薬理学的に不活性な誘導体）として機能するような構造のものであり得る（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  Ｈ，Ｅｄ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）。
【００６７】
キャッピング基の賢明な選択により、ペプチドに対する他の活性の付加が可能となる。例えば、Ｎ末端またはＣ末端キャップに結合したスルフヒドリル基の存在により、誘導体化ペプチドを他の分子にコンジュゲートすることができる。
【００６８】
さらに別の態様では、ペプチドまたはその断片もしくは誘導体は、「レトロインベルソペプチド」であり得る。「レトロインベルソペプチド」は、少なくとも１つの位置でのペプチド結合の方向の反転、すなわち、アミノ酸の側鎖に関してアミノ末端およびカルボキシ末端の反転を有するペプチドを指す。したがって、レトロインベルソ類似体は、天然ペプチド配列のように側鎖のトポロジーをほぼ維持しながら、末端を逆にし、ペプチド結合の方向を逆にしている。レトロインベルソペプチドは、Ｌ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、または最大でもすべてのアミノ酸がＤ−異性体である、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の混合物を含むことができる。部分的なレトロインベルソペプチド類似体は、配列の一部のみが逆であり、エナンチオマーアミノ酸残基で置き換えられているポリペプチドである。かかる類似体の逆反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ）部分はアミノ末端とカルボキシル末端とが逆になっているため、逆反転部分に隣接するアミノ酸残基は、側鎖が類似するａ−置換ジェミナル−ジアミノメタンおよびマロン酸にそれぞれ置き換えられる。細胞透過性ペプチドのレトロインベルソ形態は、天然形態と同じように膜を通過して移動する際に効率的に機能することが見出されている。レトロインベルソペプチド類似体の合成は、Ｂｏｎｅｌｌｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２４（６）：５５３−６（１９８４）；Ｖｅｒｄｉｎｉ，Ａ  ａｎｄ  Ｖｉｓｃｏｍｉ，Ｇ．Ｃ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ：６９７−７０１（１９８５）、および米国特許第６，２６１，５６９号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。部分的なレトロインベルソペプチド類似体の固相合成のためのプロセスが記載されており（ＥＰ９７９９４−Ｂ）、これも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、別の配列手段に対する特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」または「相同性」を有し、これらは、アラインしたときに、２つの配列の比較において塩基（またはアミノ酸）の割合が同じであることを意味する。このアラインメント、および相同性または配列同一性の割合は、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラム、例えば、分子生物学における現在のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータがアラインメントに使用される。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
【００７０】
Ｂ．多量体ポリペプチド
本開示の実施形態はまた、Ｃａｖ−１ペプチドの繰り返し単位から構築されたより長いポリペプチドを含む。ポリペプチド多量体は、ポリペプチドの異なる組み合わせを含み得る。かかる多量体ポリペプチドは、本明細書で論じられる化学合成または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。化学合成によって生成される場合、オリゴマーは、コアポリペプチド配列の２〜５回の繰り返しを有することが好ましく、多量体中のアミノ酸の総数は、約１６０残基を超えてはならず、好ましくは１００残基（またはリンカーまたはスペーサーを含む場合、その同等物）を超えてはならない。
【００７１】
Ｃ．ペプチド模倣物
Ｃａｖ−１ペプチドは、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの生物学的効果を模倣するペプチド模倣化合物であり得る。ペプチド模倣剤は、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの結合活性および生物学的活性を有するように天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの結合要素の立体空間特性を再現する、非天然ペプチドまたは非ペプチド剤であり得る。天然Ｃａｖ−１ポリペプチドまたはポリペプチド多量体と同様に、ペプチド模倣物は、結合面（天然Ｃａｖ−１が結合する任意のリガンドと相互作用する）および非結合面を有する。
【００７２】
いくつかの態様では、本開示はまた、部分的なペプチド特性を保持する化合物を含む。例えば、本発明のペプチド内の任意のタンパク質分解に不安定な結合は、分子の残部がそのペプチド特性を保持しながら、非ペプチド要素、例えば等価体（Ｎ−メチル化；Ｄ−アミノ酸）または減少したペプチド結合によって選択的に置き換えることができる。
【００７３】
アゴニスト、基質、または阻害剤のいずれかであるペプチド模倣化合物が、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなどの多くの生物活性ペプチド／ポリペプチドについて説明されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製する方法は、当該技術分野で既知である（Ｈｒｕｂｙ，ＶＪ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７）。二次構造を模倣する特定の模倣物は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ（Ｅｄｓ．），ＮＹ，１９９３に記載されている。これらの方法は、少なくとも、天然Ｃａｖ−１ポリペプチドの結合能力および特異性を有し、好ましくは生物学的活性も有する、ペプチド模倣物を作製するために使用される。当該技術分野で利用可能なペプチド化学および一般的な有機化学の知識は、本開示を考慮に入れて、かかる化合物を設計および合成するのに十分である。
【００７４】
例えば、かかるペプチド模倣物は、遊離であるか、またはリガンド（例えば、可溶性ｕＰＡＲまたはその断片）と複合体中で結合した、本発明のポリペプチドの三次元構造の検査によって同定され得る。あるいは、リガンドに結合した本発明のポリペプチドの構造は、核磁気共鳴分光法の技術によって得ることができる。ペプチドとそのリガンドまたは受容体との相互作用の立体化学についてのより沢山の知識は、かかるペプチド模倣剤の合理的な設計を可能にするであろう。リガンドの非存在下での本発明のペプチドまたはポリペプチドの構造はまた、模倣分子の設計のための足場を提供し得る。
【００７５】
Ｄ．ＰＥＧ化
Ｃａｖ−１ペプチドは、ポリエチレングリコールなどの異種ポリペプチドセグメントまたはポリマーとコンジュゲートし得る。ポリペプチドは、酵素の流体力学的半径を増加させ、したがって、血清持続性を増加させるために、ＰＥＧに連結され得る。ポリペプチドは、外部受容体に特異的かつ安定的に結合する能力を有するリガンドなどの任意の標的化剤にコンジュゲートすることができる（米国特許公開２００９０３０４６６６）。
【００７６】
特定の態様では、実施形態の方法および組成物は、開示されたポリペプチドのペグ化に関連している。ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の、別の分子（通常、薬剤または治療用タンパク質）への共有結合プロセスである。ＰＥＧ化は、標的巨大分子によるＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションによりルーチン的に達成される。ＰＥＧを薬剤または治療用タンパク質に共有結合することにより、宿主免疫系（免疫原性および抗原性が低下）から作用物質を「マスク」することができるか、または作用物質流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）を増加させることができ、これにより、腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延ばす。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬剤およびタンパク質に水溶性を付与することもすることができる。
【００７７】
ＰＥＧ化の第１工程は、ＰＥＧポリマーの一端または両端を好適に官能基化することである。各末端が同じ反応性部位で活性化されたＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られる一方、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と称する。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体は、ＰＥＧに所望の分子を付加して調製される。
【００７８】
ＰＥＧ誘導体での好適な官能基の選択は、ＰＥＧに結合する分子において利用可能な反応性基の種類に基づく。タンパク質に関して、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、およびチロシンが含まれる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸もまた使用可能である。
【００７９】
第１世代のＰＥＧ誘導体の形成に使用する技術は通常、ＰＥＧポリマーをヒドロキシル基、通常は無水物、酸塩化物、クロロホルメート、および炭酸塩と反応する基と反応させることである。第２世代のＰＥＧ化化学では、より効率的な官能基、例えば、アルデヒド、エステル、アミドなどがコンジュゲーションに利用可能である。
【００８０】
ＰＥＧ化の用途はより一層発達し洗練されているため、コンジュゲーションのためのヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が増加している。親水性で柔軟、かつ生体適合性のスペーサーが必要とされる場合において、これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは２つの構成要素を結合するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに対する好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、およびＮＨＳエステルである。
【００８１】
最も一般的な修飾剤、即ちリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子をベースにする。これらの活性は、アルコール末端へのタンパク質修飾基の付加に依存する。いくつかの場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として使用する。ジオールはその後、ヘテロまたはホモ二量体ＰＥＧ結合分子を作製するために、両端が修飾される。
【００８２】
タンパク質は通常、求核性部位、例えば非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基にてＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾剤の例としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、およびＰＥＧビニルスルホンが含まれる。これら４つ全ては、穏やかな条件下にて非常にシステイニル特異的であり、中性からわずかにアルカリ性のｐＨであるが、それぞれ、いくつかの欠点を有する。マレイミドを用いて形成されるチオエーテルは、アルカリ性条件下で幾分不安定となり得、これにより、このリンカーを用いる製剤化オプションには若干の制限が存在し得る。ヨードＰＥＧを用いて形成したカルバモチオエート結合はより安定しているが、遊離ヨウ素がいくつかの条件下でチロシン残基を修飾する可能性がある。ＰＥＧチオールはタンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ性条件下にて不安定となり得る。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミドおよびヨードＰＥＧと比較して遅いが、形成されるチオエーテル結合は極めて安定している。この、より遅い反応速度によってもまた、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応の制御を一層容易にすることができる。
【００８３】
天然システイニル残基における部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が通常、ジスルフィド結合の形態をとっているか、または生物活性のために必要とされるため、滅多に行われない。他方では、部位特異的突然変異誘発を使用して、チオール特異的リンカーのためにシステイニルＰＥＧ化部位を組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬が到達可能であり、かつＰＥＧ化後も依然として生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【００８４】
アミン特異的修飾試薬としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、およびいくつかの他の試薬が含まれる。これらは全て、穏やかな条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルはおそらく、より反応性の高い薬剤の１つであるが、その高反応性により、大規模ではＰＥＧ化反応の制御が困難となり得る。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基と共にイミンを形成し、これが次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより二級アミンに還元される。ホウ化水素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は非常に毒性があり、特に揮発性となる低ｐＨにおいては、注意深く取り扱われなければならない。
【００８５】
大部分のタンパク質に存在する複数のリジン残基により、部位特異的ＰＥＧ化は困難であり得る。幸運なことに、これらの試薬は、非プロトン化アミノ基と反応するため、低いｐＨにて反応を実施することにより、ＰＥＧ化を低ｐＫアミノ基に向けることが可能である。一般的に、αアミノ基のｐＫは、リジン残基のεアミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高選択性を頻繁に得ることができる。しかし、このことは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性のために必要とされない場合にのみ実行可能である。依然として、ＰＥＧ化による薬物動態上の利点は頻繁に、インビトロ生物活性の著しい損失よりも優り、ＰＥＧ化化学反応に関係なく、はるかに大きいインビボ生物活性を有する製造物をもたらす。
【００８６】
ＰＥＧ化手順を開発する際には、考えるべきいくつかのパラメータが存在する。幸運なことに、鍵となるパラメータは通常、４個または５個以下である。ＰＥＧ化条件の最適化のための「実験の設計」アプローチは、非常に有用であることができる。チオール特異的なペグ化反応については、考慮するパラメータには、タンパク質濃度、ＰＥＧ対タンパク質の比（モル基準で）、温度、ｐＨ、反応時間、いくつかの場合では酸素の排除が含まれる。（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与することができ、これにより、ＰＥＧ化製造物の収率が低下する。）ｐＨが、特にＮ末端アミノ基を標的化する場合にはさらに一層重要となり得ることを除いて、アミン特異的改変についても同じ因子（酸素は除外）が考慮されなければならない。
【００８７】
アミン特異的およびチオール特異的修飾の両方に関して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。これは温度、タンパク質濃度、およびｐＨを制限し得る。加えて、ＰＥＧリンカーの反応性は、ＰＥＧ化反応を開始する前に知られていなければならない。例えば、ＰＥＧ化剤が７０％しか活性でない場合、使用するＰＥＧの量は、活性ＰＥＧ分子のみが、タンパク質−ＰＥＧ反応化学量論で確実に数えられなければならない。
【００８８】
Ｅ．融合タンパク質
本発明の特定の実施形態は、融Ｃａｖ−１ペプチドに関する。これらの分子は、Ｎ末端またはＣ末端で異種ドメインに結合された実施形態のポリペプチドを有し得る。例えば、融合には他の種からのリーダー配列もまた用いて、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を可能にすることができる。融合タンパク質は、半減期延長因子（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を含むことができる。別の有用な融合としては、タンパク質親和性タグ（例えば血清アルブミン親和性タグ若しくは６個のヒスチジン残基）、または、好ましくは切断可能であり、融合タンパク質の精製を促進する免疫活性ドメイン（例えば抗体エピトープ）の付加が含まれる。非限定的な親和性タグとしては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。
【００８９】
特定の実施形態では、実施形態のペプチドは、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドなどの、インビボ半減期を増加させるペプチドに結合され得る。
【００９０】
融合タンパク質を製造する方法は、当業者には周知である。かかるタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の結合、そしてそれに続く、インタクトな融合タンパク質の発現により、作製することができる。
【００９１】
親タンパク質の機能活性を回復させる融合タンパク質の作製は、一列に接続したポリペプチドの間でスプライシングされたペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントに遺伝子を接続することにより促進され得る。リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さである。
【００９２】
２．リンカー
特定の実施形態では、実施形態のポリペプチドは、二官能性架橋試薬を使用して化学的にコンジュゲートされ得るか、またはタンパク質レベルでペプチドリンカーと融合され得る。
【００９３】
二官能性架橋試薬は、親和性マトリクスの調製、多様な構造の修飾と安定化、リガンドおよび受容体結合部位の特定、および構造的研究を含む種々の目的で広範に使用されている。Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーなどの好適なペプチドリンカーを使用して、実施形態のポリペプチドを結合し得る。
【００９４】
２つの同一の官能基を持つホモ二官能性試薬は、同一のおよび異なる高分子または高分子のサブユニットの間で架橋を誘導すること、およびポリペプチドリガンドをその特異的な結合部位に連結することにおいて効率が高いことが判明した。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含有する。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用して、選択的におよび順次の双方で架橋を制御することができる。二官能性架橋試薬は、官能基、例えば、アミノ、スルフヒドリル、グアニジン、インドール、カルボキシルに特異的な基の特異性に従って分けることができる。これらのうちで、遊離のアミノ酸に向けられた試薬は、その市販性、合成の容易さ、およびそれを適用することができる反応条件の穏やかさのために特に評判が良くなっている。
【００９５】
ヘテロ二官能性架橋試薬の大半は、１級アミン反応性基とチオール反応性基を含有する。別の例では、ヘテロ二官能性架橋試薬および架橋試薬を使用する方法が記載されている（米国特許第５，８８９，１５５号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基を求電子性マレイミド残基と組み合わせて、一例では、アルデヒドの遊離チオールへの結合を可能にする。架橋試薬を修飾して種々の官能基を架橋することができる。
【００９６】
さらに、当業者に既知の任意の他の結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）／結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）剤および／またはメカニズム、例えば、抗体抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホルアミド結合、無水結合、ジスルフィド結合、イオン相互作用および疎水性相互作用、二重特異性抗体および抗体断片、またはそれらの組み合わせなどを、実施形態のポリペプチドを合わせるのに使用し得る。
【００９７】
血中で理に適った安定性を有する架橋剤を採用することが好まれる。標的化剤と治療剤／予防剤をコンジュゲートするのに上手く採用することができる多数の種類のジスルフィド結合を含有するリンカーが既知である。立体的に妨害されるジスルフィド結合を含有するリンカーは生体内でさらに大きな安定性を与えることが判明し得る。従って、これらのリンカーは連結剤の一群である。
【００９８】
妨害される架橋剤に加えて、妨害されない架橋剤も本明細書に従って採用することができる。保護されたジスルフィドを含有するまたは製造するとはみなされない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオラン（ＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋおよびＴｈｏｒｐｅ，１９８７）が含まれる。かかる架橋剤の使用は当該技術でよく理解されている。別の実施形態には柔軟性リンカーの使用が関与する。
【００９９】
いったん化学的にコンジュゲートされると、ペプチドが一般に精製されてコンジュゲートされていない作用剤および他の混入物からコンジュゲートを分離する。臨床的に有用にするのに十分な程度の純度のコンジュゲートを提供して使用するために多数の精製法が利用可能である。
【０１００】
例えば、ゲル濾過、ゲル透過または高速液体クロマトグラフィのようなサイズの分離に基づく精製法が一般に最もよく使用される。例えば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離のような他のクロマトグラフィ法も使用してもよい。例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＬＳ）のような弱い界面活性剤を用いた、封入体から融合タンパク質を精製する従来の方法が有用であってもよい。
【０１０１】
３．細胞透過性および膜移行ペプチド
さらに、特定の態様では、Ｃａｖ−１ペプチドは、細胞結合ドメインまたは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」および「膜移行ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、ポリペプチドが細胞膜（例えば、真核細胞の場合は原形質膜）を通過することを可能にするポリペプチド配列のセグメントを指す。ＣＰＰセグメントの例には、ＨＩＶ  Ｔａｔに由来するセグメント（例えば、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２３））、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ホメオボックス遺伝子産物、プロテグリンＩ、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２４））、またはメリチン（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２５）が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、ＣＰＰは、Ｔ１（ＴＫＩＥＳＬＫＥＨＧ（配列番号２６））、Ｔ２（ＴＱＩＥＮＬＫＥＫＧ（配列番号２７））、２６（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡ（配列番号２８））、またはＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＥＧＷＹＧＣＧ（配列番号２９））ＣＰＰ配列を含む。
【０１０２】
ＩＩＩ．使用方法
本発明の一態様は、本明細書に記載のペプチド、およびその突然変異体、変異体、類似体、または誘導体の使用に関する。具体的には、これらの方法は、本明細書に記載のペプチドのうちのいずれか１つまたはその薬学的に許容される修飾を乾燥粉末として対象に投与すること、肺の疾患、損傷、または感染症（例えば、肺の線維性状態）を処置または予防することの処置に使用するための組成物に関し、該組成物は、薬学的に許容される担体中に実施形態のポリペプチドを含む。
【０１０３】
Ａ．医薬組成物
本明細書で提供されるＣａｖ−１ペプチドは、細胞アポトーシスを阻害するため、ならびに肺組織の損傷の処置および予防のために、全身的または局所的に投与することができる。それらは、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、および／または腹腔内に投与することができる。例えば、乾燥粉末製剤は、点滴注入（例えば、皮下点滴注入）によって対象に投与することができ、または注射前に液体で再構成し得る。特定の態様では、ペプチドは、乾燥粉末吸入器を使用して乾燥粉末製剤を投与するなど、気道に局所的に送達される。それらは、単独で、または抗線維化合物と組み合わせて投与することができる。
【０１０４】
Ｃａｖ−１ペプチド乾燥粉末は、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、肺線維症の処置のための治療剤）と組み合わせて、同時にまたは連続して投与し得る。追加の治療剤は、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、ＤＭＡＲＤ、免疫抑制剤、生体応答モジュレーター、気管支拡張剤、または抗線維化剤、例えば、ピルフェネドン、抗線維化メカニズムは完全には理解されていないがＴＧＦ−ベータの遮断を伴い得る薬剤、ニンテダニブ、広範なチロシンキナーゼ遮断剤、または任意の他の抗線維化剤であり得る。好適なＮＳＡＩＤＳは、非選択的ＣＯＸ阻害剤であるアセチルサリチル酸、メサラジン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ゾメピラク、ナブメトン、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、アルクロフェナク、ブロムフェナク、イブフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、フェンティアザック、クリダナック、エトドラク、オキシナク、メフェナミン酸、メクロフェナミック酸、フルフェナミン酸、ニフルミン酸、トルフェナミン酸、ジフルニサル、フルフェニサル、ピロキシカム、テノキシカム、ロルノキシカム、およびニメスリド、ならびにおよびそれらの薬学的に許容される塩、選択的ＣＯＸ２阻害剤であるメロキシカム、セレコキシブ、およびロフェコキシブ、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択される。好適なステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ブデノシド、フルオコルトロン、およびトリアムシノロンである。好適なＤＭＡＲＤは、スルファサラジン、オルサラジン、クロロキン、金誘導体（Ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、Ｄ−ペニシラミン、ならびにメトトレキサートおよびシクロホスファミドなどの細胞増殖抑制剤である。好適な免疫抑制剤は、シクロスポリンＡおよびその誘導体、ミコフェノラートモフェチル、ＦＫ５０６、ＯＫＴ−３、ＡＴＧ、１５−デソキシスペルグアリン、ミゾリビン、ミソプロストール、ラパマイシン、レフルノミド、ならびにアザチオプリンである。好適な生体応答調節剤は、インターフェロンβ、抗ＴＮＦ−α（エタネルセプト）、ＩＬ−１０、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ２５である。好適な気管支拡張剤は、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、臭化チオトロピウム、塩酸エピネフリン、サルブタモール、硫酸テルブタモール、フェノテロール臭化水素酸塩、サルメテロール、およびホルモテロールである。かかる組み合わせで、各有効成分は、その通常の投与量範囲またはその通常の投与量範囲未満の用量のいずれかに従って（例えば、経口または吸入によって）投与することができる。ＮＳＡＩＤ、ステロイド、ＤＭＡＲＤ、免疫抑制剤、および生体応答調節剤を組み合わせた投与量は、通常推奨される最低用量の１／５０〜通常推奨される投与量の１／１まで、好ましくは１／２０〜１／２、より好ましくは１／１０から１／５である。併用薬剤の通常推奨される��量は、例えば、ＲｏｔｅＬｉｓｔｅ（登録商標）２００２，Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅに開示されている用量であると理解されるべきである。
【０１０５】
臨床用途を企図する場合、目的の用途に好適な形態でタンパク質、抗体、および薬剤を含む医薬組成物を調製することが必要であり得る。一般に、医薬組成物は、有効量の実施形態のポリペプチドのうちの１つ以上、または医薬的に許容される担体中に溶解もしくは分散された追加の薬剤を含み得る。語句「薬学上または薬理学上許容される」とは、動物、例えばヒトに適切に投与された場合に、副反応、アレルギー反応、または他の副作用を生み出さない、分子要素および組成物を意味する。本明細書に開示された方法によって単離した少なくとも１つの実施形態のポリペプチド、または追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０（参照により本明細書に組み込まれる）に例示されているように、本開示に照らして当業者に既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤は、ＦＤＡ生物学的基準局または他の適切な規制当局によって要求されるバイオバーデン、無菌性、発熱性、一般的な安全性、および／または純度基準を満たす必要があることが理解される。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態は、固体、液体、またはエアゾール形態のどれで投与されるのか、そして、注射などの投与経路に対して滅菌する必要があるのか否かに応じて、異なる種類の担体を含み得る。組成物は、静脈内、髄腔内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、噴霧製剤の吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浴液させる局所灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物中（例えば、リポソーム）中で、または当業者に既知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０を参照のおと）他の方法もしくは任意の組み合わせによって投与することができる。注射量および針サイズの選択は、注射部位、注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）および注射可能性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）に基づいて当業者によって選択されてもよく、注射される溶液または懸濁液の粘度、ならびに薬物濃度、ｐＨ、および浸透圧を考慮することを含む。いくつかの場合、投与時に（例えば、皮下注射によって）所望の溶解速度を提供するように、活性剤の粒子サイズを選択することができる。
【０１０７】
本明細書に提示されるペプチドは、遊離塩基、中性、双性イオン、または塩の形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基と形成したもの、または、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、若しくは、有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸）と形成したものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成した塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、若しくはプロカインなどの有機塩基に由来することができる。製剤化の際、溶液は、投与製剤と適合性のある方法で、治療有効量で投与される。製剤は、様々な投薬形態で容易に投与される、例えば、非経口的投与用に、例えば、注射可能な溶液、若しくは肺送達用のエアゾールに製剤化される、または、消化管投与用に、例えば薬物放出カプセルなどに製剤化される。
【０１０８】
本発明の特定の態様にさらに従うと、投与に好適な組成物は、不活性希釈剤と共に、または不活性希釈剤無しで、薬学的に許容される担体中に提供されてよい。担体は、いくつかの態様では、エアロゾル、ガス、液体、半固体、すなわち、ペースト、または固体担体を含むことができる。任意の従来の培地、作用物質、希釈剤、または担体がレシピエント、または中に含有される組成物の治療効果に対して有害である場合を除いて、本方法の実践に使用するために、投与可能な組成物を使用することは適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油類、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラーなど、またはこれらの組み合わせが含まれる。組成物は、１種以上の構成成分の酸化を遅延させるための、様々な酸化防止剤もまた含むことができる。さらに、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な抗菌および抗カビ剤などの防腐剤により、微生物の作用の防止をもたらすことができる。
【０１０９】
本発明の特定の態様によれば、組成物は、任意の好都合かつ実用的な様式で、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、および吸着などによって担体と合わせられる。かかる手順は、当業者には日常的なものである。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態では、組成物を、半固体または固体担体と、完全に組み合わせる、または混合する。任意の従来の方法、例えば粉砕により、混合を実施することができる。安定化剤も、治療活性の喪失、すなわち、胃での変性から組成物を保護するために混合プロセスで添加することができる。組成物中に使用するための安定剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸、例えば、グリシンおよびリジン、炭水化物または凍結防止剤、例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが含まれる。
【０１１１】
いくつかの態様では、医薬製剤は、１つ以上の界面活性剤を含む。開示された方法に従って使用される界面活性剤としては、イオン性および非イオン性界面活性剤が含まれる。代表的な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０界面活性剤（ニュージャージー州ブリッジウォーターのＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）界面活性剤（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、または、セチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルニドプロピル−、または（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、または二ナトリウムメチルオレイル−タウレート；ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）界面活性剤（ニュージャージー州パターソンのＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）；ポリエチルグリコール；ポリプロピレングリコール；エチレンとプロピレングリコールとのブロック共重合体、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤（ニュージャージー州マウントオリーブのＢＡＳＦ）など；オリゴ（エチレンオキシド）アルキルエーテル；アルキル（チオ）グルコシド、アルキルマルトシド；およびリン脂質が含まれる。例えば、界面活性剤は、約０．０１％〜約５％（製剤の他の固体成分の総重量に対する界面活性剤の重量；「ｗ／ｗ」）、約０．０３％〜約５％、約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｗ）、または約０．１％〜約０．５％（ｗ／ｗ）の量で製剤中に存在することができる。しかしながら、さらなる態様では、実施形態の医薬製剤は、本質的に非イオン性界面活性剤を含まないか、または本質的にすべての界面活性剤を含まない。
【０１１２】
本発明の治療方法に関して、本明細書に開示される１つ以上のペプチドまたはその突然変異体、変異体、類似体、または誘導体の投与は、特定の投与様式、投与量、または投与の頻度に限定されることを意図するものではなく、本発明は、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、病変内、皮下、または炎症関連障害を処置するのに十分な用量を提供するのに十分な任意の他の経路を含む、すべての投与様式を企図する。治療剤は、単回投与または複数回投与で患者に投与することができる。複数の用量が投与される場合、用量は、例えば、１時間、３時間、６時間、８時間、１日、２日、１週間、２週間、または１ヶ月によって互いに分離され得る。例えば、治療剤は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０週またはそれ以上、投与され得る。特定の対象について、特定の投与レジメンは、個々の必要性および組成物の投与を投与または監督する人の専門的判断に従って、経時的に調整される必要があることを理解されたい。例えば、より低い用量が十分な治療活性を提供しない場合、治療剤の投与量を増やすことができる。
【０１１３】
受持医が最終的に適切な量および投与レジメンを決定しながら、本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドまたはその突然変異体、変異体、類似体、または誘導体の治療有効量は、０．０００１、０．０１、０．０１  ０．１、１、５、１０、２５、５０、１００、５００、または１，０００ｍｇ／ｋｇもしくはｇ／ｋｇの用量で提供され得る。有効量は、インビトロもしくは動物モデル試験のバイオアッセイまたはシステムから得られた用量反応曲線から外挿され得る。
【０１１４】
特定の患者または対象の投与量は、従来の考慮事項を使用して（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルによって）、当業者によって決定することができる。医師は、例えば、最初は比較的低用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで用量を増加させてもよい。患者に投与される用量は、用途に応じて、患者での有益な治療応答に対して経時的に影響を与えるのに十分であるか、または、例えば、用途に依存して、症状もしくは他の適切な活性を低減するのに十分である。用量は、特定の製剤の効力、ならびに本明細書に開示される１つ以上のポリペプチドまたはその突然変異体、変異体、類似体、もしくは誘導体の活性、安定性、または血清半減期、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。
【０１１５】
いくつかの態様では、対象は、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、それに起因する肺線維症に罹患しているかまたはそれに感受性であるヒトを処置するために１日１回与えられる単回投与を与えられ、例えば、点滴注入を介して（吸入により）、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。かかる用量は、約３日〜１週間以上のいずれにもわたって毎日投与することができる。
【０１１６】
当該技術分野でよく理解されているように、用量を少なく調整する必要があり得るが、長期投与も可能である。しかしながら、個々の処置レジームにおける変数の数が多く、これらの好ましい値からのかなりの逸脱が予想されるので、前述の範囲は示唆的である。
【０１１７】
連続投与の場合、例えば、以下に記載される実験のいくつかで使用された浸透圧ポンプなどのポンプシステムにより、約１〜２週間の時間経過の総投与量は、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは２０〜３００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５０〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。かかる連続投与レジメンの後、活性化合物の総濃度は、好ましくは約０．５〜約５０μＭ、好ましくは約１〜約１０μＭの範囲である。
【０１１８】
インビトロでアポトーシスを阻害または防止するための活性化合物の有効濃度は、約０．５ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２ｎＭ〜約２０ｎＭの範囲である。有効用量および最適用量範囲は、本明細書に記載の方法を使用してインビトロで決定することができる。
【０１１９】
Ｂ．乾燥粉末粒子サイズの低下および乾燥粉末吸入装置。
製剤の粒子サイズは、粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）、粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、薄膜凍結、噴霧乾燥、または破砕を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって低下させることができる。粉砕は、エアジェット粉砕、ボール粉砕、湿式粉砕、媒体粉砕、高圧均質化、または低温粉砕など当該技術分野で既知である任意の方法によって行うことができる。
【０１２０】
粒子サイズ低下後のペプチド安定性は、サイズ排除クロマトグラフィ、電気泳動技術、ＨＰＬＣ、質量分析、ＵＶ分光法および円偏光二色性分光法などの分光技術、および活性（インビトロまたはインビボで測定される）を含む、当該技術分野で既知である技術を使用して評価することができる。タンパク質の安定性のインビトロアッセイを行うために、エアロゾル組成物を収集し、次いで、蒸留するか、またはフィルターに吸着させることができる。インビボアッセイを行うために、または組成物の対象への肺投与のために、乾燥粉末分散のための装置を対象による吸入用に適合させる。例えば、タンパク質の安定性は、タンパク質凝集レベルを決定することによって評価することができる。好ましくは、本発明の乾燥粉末組成物は、タンパク質凝集物を実質的に含まない。可溶性凝集物の存在は、動的光散乱（ＤＬＳ）（ＤｙｎａＰｒｏ−８０ｌＴＣ、バージニア州シャーロッツビルのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、および／または紫外分光光度法によって定性的に決定することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、粉砕されたＣＳＰ７による患者の処置は、調節された薬物放出を含み得る。いくつかの実施形態では、粉砕されたＣＳ７は、徐放または遅延放出のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、粉砕されたＣＳＰ７は、即時放出のために製剤化され得る。さらなる実施形態では、粉砕されたＣＳＰ７は、徐放および即時放出（すなわち、二重放出プロファイル）の両方のために製剤化され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される吸入可能なＣＳＰ７組成物の投与のための方法を提供する。投与は、吸入器を使用した粉砕されたＣＳＰ７の吸入であり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ  ＲＳＯｌ単回投与ＤＰＩなどの受動乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）である。乾燥粉末吸入器では、乾燥粉末はリザーバーに保存され、噴射剤を使用せずに吸入によって肺に送られる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、吸入器は、ＤｏｓｅＯｎｅ（商標）、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ、Ｒｏｔｏｈａｌｅｒ（登録商標）、Ａｅｒｏｌｉｚｅｒ（登録商標）、またはＨａｎｄｉｈａｌｅｒなどの単回投与ＤＰＩである。いくつかの実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ  ＲＳ０２、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（商標）、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）、またはＥｌｌｉｐｔａ（商標）などの複数回投与ＤＰＩである。いくつかの実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ  ＲＳ０４複数種単回投与（ｐｌｕｒｉｍｏｎｏｄｏｓｅ）ＤＰＩなどの複数の薬剤の単回投与の同時送達のための複数種単回投与ＤＰＩである。典型的には、乾燥粉末吸入器は、内部リザーバーに保存された薬剤を有し、薬剤は、噴射剤を使用してまたは使用せずに吸入によって送達される。他の種類の乾燥粉末吸入器は、カプセル（例えば、セルロースまたはゼラチンベース）またはフォイルポーチに保存された事前に分割された用量の薬剤を有し、それらの各々は、装置によって穿刺されて、患者に用量を放出する。乾燥粉末吸入器は、効果的な送達のために、３０Ｌ／分超、例えば約３０〜１２０Ｌ／分の吸気流量を必要とし得る。いくつかの実施形態では、粉砕されたＣＳＰ７の効率的なエアロゾル化は、吸気力とは無関係である。いくつかの実施形態では、乾燥粉末吸入器は、０．０１ｋＰａ０．５分／Ｌ〜０．０５ｋＰａ０．５分／Ｌ、例えば、０．０２ｋＰａ０．５分／Ｌ〜０．０４ｋＰａ０．５分／Ｌの流動抵抗性を有する。乾燥粉末吸入器（例えば、高抵抗性、低抵抗性、受動型、能動型）は、患者集団およびその吸気能力に基づいて選択される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、吸入器は、定量吸入器であり得る。定量吸入器は、噴射剤の使用によって支援されるエアロゾル化された薬の短いバーストで、定義された量の薬を肺に送達する。定量吸入器は、キャニスター、計量バルブ、およびアクチュエーターの３つの主要部分を含み、放出された粒子を減速し、患者によるエアロゾル化雲（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ｃｌｏｕｄ）の吸入を容易にするために、スペーサー装置を利用し得る。噴射剤および任意の必要な賦形剤を含む医薬製剤は、キャニスターに保存される。計量バルブにより、規定の量の製剤を分注することができる。定量吸入器のアクチュエーターまたはマウスピースには、篏合する吐出ノズルが含まれ、典型的には、汚染を防ぐためのダストキャップが含まれている。定量吸入器の使用に必要である必要な吸気流量は、９０Ｌ／分未満、例えば、約１５〜９０Ｌ／分、好ましくは約３０Ｌ／分であり得る。いくつかの実施形態では、粉砕されたＣＳＰ７の効率的なエアロゾル化は、吸気力とは無関係である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、吸入器はネブライザーである。ネブライザーは、肺に吸入されるエアロゾル化されたミストの形態で薬剤を送達するために使用される。製剤は、圧縮ガスまたは超音波によってエアロゾル化される。ジェットネブライザーは、コンプレッサーに接続されている。コンプレッサーは、液体医薬製剤を通って圧縮ガスを高速で放出し、医薬製剤をエアロゾル化する。その後、エアロゾル化された薬剤が患者に吸入される。超音波ネブライザーは、高周波超音波を発生させ、医薬製剤の液体リザーバーと接触する内部要素の振動を引き起こし、これにより、医薬製剤がエアロゾル化する。次いで、エアロゾル化された薬剤が患者によって吸入される。ネブライザーは、約３〜１２Ｌ／分、例えば約６Ｌ／分の流量を利用し得る。いくつかの例では、粉砕された活性物質（例えば、ＣＳＰ７）は、薬学的に許容される液体担体ビヒクルに懸濁され、霧化（例えば、エアジェット霧化）によって投与することができる。さらなる態様では、実施形態の組成物は、電子タバコ装置などによる気化方法（例えば、急速気化）によって投与することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、組成物は、通常のスケジュールで投与され得る。本明細書で使用される場合、通常のスケジュールは、所定の指定された期間を指す。通常のスケジュールは、スケジュールが所定である限り、同一または異なる長さの期間を包含することができる。例えば、通常のスケジュールは、１日２回、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、毎月、またはその間の日もしくは週の任意の設定数の投与を含み得る。あるいは、所定の通常のスケジュールは、最初の週に１日２回、続いて数ヶ月間毎日投与することなどを含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド（例えば、ＣＳＰ７）は、１日１回投与される。好ましい実施形態では、ペプチドは、１日１回未満で、例えば、１日おき、３日おき、または週に１回投与される。いくつかの実施形態では、実施形態のペプチド（例えば、ＣＳＰ７）の完全な用量は、１〜１００ｍｇ、例えば、２０〜１００、５０〜１００、１０〜２０、２０〜４０、５０〜７０、または８０〜９０ｍｇである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、実施形態のペプチド（例えば、ＣＳＰ７）は、カプセル、ブリスター、またはカートリッジなどの単位剤形（例えば、事前に分割された用量）で提供され得、単位用量は、用量あたり、少なくとも１ｍｇのペプチド、例えば、少なくとも５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇの実施形態のペプチド（例えば、ＣＳＰ７）のペプチドを含む。いくつかの態様では、単位用量は、１〜１０ｍｇ（例えば、約５ｍｇ）のペプチドである。特定の態様では、単位剤形は、任意の賦形剤の投与または添加を含まず、吸入用の粉末を保持するために単に使用される（すなわち、カプセル、ブリスター、またはカートリッジは投与されない）。いくつかの態様では、２つ以上の単位剤形が対象に投与される。例えば、乾燥粉末吸入器の場合、実施形態のペプチドが単位用量カプセルで提供され得、２つ以上の単位用量カプセル（例えば、３〜４）が吸入によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＳＰ７などのペプチドは、少なくとも１０ｍｇ、好ましくは少なくとも１５ｍｇ、さらにより好ましくは２０ｍｇなどの高放出用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、実施形態の粉砕されたペプチド（例えば、ＣＳＰ７）の投与は、５ｍｇ超などの肺深部への微粒子用量をもたらす。好ましくは、肺深部への微粒子用量は、少なくとも１０ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも１５ｍｇである。いくつかの態様では、粒子用量は、実施形態（例えば、ＣＳＰ７）のペプチドの用量を含む１、２、３、４または５つ以上のカプセルから製造される。いくつかの態様では、微粒子用量は、放出される用量の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０、６５、７０、７５、または８０％である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、吸入圧力低下の変化は、放出される用量の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、３ｋＰａの吸入圧力の変化、例えば４ｋＰａから１ｋＰａへの変化は、２５％未満、例えば、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、またはそれ以下の放出される用量の減少をもたらす。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、吸入圧力の変化は、微粒子用量の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、３ｋＰａの吸入圧力の変化、例えば４ｋＰａから１ｋＰａへの変化は、１５％未満、例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、またはそれ以下の微粒子用量の減少をもたらす。
【０１３０】
ＩＶ．処置のための肺の状態
本発明のペプチドは、様々な肺の状態を処置するために使用することができる。処置のための肺の状態は、急性または慢性であり得る。急性の肺状態は、急性肺損傷、感染症、または化学物質誘発性であり得る。慢性の肺疾患は、損傷、感染症、または疾患の結果であり得る。
【０１３１】
Ａ．肺損傷
いくつかの態様では、対象は、急性肺損傷（ＡＬＩ）もしくは感染症、または化学物質誘発性肺損傷を有する。特定の態様では、対象は、鋳型気管支炎、喘息、慢性閉塞性気道／肺（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、吸入煙誘発性急性肺損傷（ＩＳＡＬＩ）、気管支拡張症、吸入毒素誘発性気道疾患（例えば、塩素または他の誘発性気道疾患）、マスタードガスへの曝露、粒子状物質（例えば、シリカダスト）への曝露、閉塞性細気管支炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、コラーゲン血管肺疾患（例えば、ループス、強皮症、または混合結合組織疾患から）、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症またはサルコイドーシス）、薬物誘発性肺疾患、および加速性肺線維症（例、ＡＲＤＳを含む急性肺損傷後に発生する）を有する。慢性閉塞性肺疾患、喘息、感染症、ならびに線維症をもたらす急性および慢性肺損傷を含む肺疾患は、世界で３番目に多い死因を構成している（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。急性肺損傷（ＡＬＩ）は、米軍人の間で深刻な医学的問題である。戦闘中のＡＬＩは、非常に幅広い病因から生じ得る。
【０１３２】
吸入損傷からのＡＬＩは、吸入される抗凝固剤、ステロイド、ベータアゴニスト、高頻度換気、および体外式膜型人工肺で処置されており、結果は変動し、一般に最適ではない。呼吸マスクによる障壁以外に有効な予防策はない。ＡＲＤＳの管理は大幅に進歩したが、大部分が対症的なままであり、内因性治癒メカニズムが効果を発揮するのを注意深く待つこととなる。院内死亡率は４０％を超えたままである（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＡＬＩの生存者は、生活の質が低下する慢性呼吸器疾患にしばしば罹患する。回復を早め、および／または慢性呼吸不全および肺線維症などの後期合併症を防ぐことができる任意のモダリティが非常に望ましい。ＡＬＩの早期診断、さらに重要なことに、予防および処置を改善することが切実に必要とされている。直接吸入肺損傷からのＡＬＩまたは全身性疾患に起因するＡＲＤＳの病態生理学は、非常に複雑で不均一であり、全身性および局所性の心肺因子、例えば、膜透過性の増加、炎症性サイトカインの流入、酸化的細胞損傷、コンパートメントへの体液移動、イオンチャネルの障害、および他の多くのものを包含する（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。明らかに、ＡＬＩなどの肺障害を処置および予防するには、新しい処置法が必要である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、対象における急性肺損傷、肺感染症、または肺疾患を処置または予防する方法であって、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号２）のアミノ酸配列またはその変異体を含む有効量のペプチドを対象に投与することを含み、ペプチドはカベオリン−１（Ｃａｖ−１）の生物学的活性を維持している、方法が提供される。いくつかの態様では、ペプチドの医薬製剤を投与する方法は、乾燥粉末吸入を含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１３４】
Ｂ．肺疾患
肺疾患には、肺線維症、肺炎症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、細気管支炎、閉塞性細気管支炎、喘息、および肺感染症、ならびに線維症をもたらす急性および慢性肺損傷（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が含まれる。これらの疾患は、世界で３番目に多い死因となっている。
【０１３５】
嚢胞性線維症は、主に消化器系および呼吸器系に影響を与える外分泌腺および外分泌汗腺の遺伝性疾患である。この疾患は、通常、慢性呼吸器感染症、膵臓機能不全、異常に粘液性の粘液分泌物、および早死を特徴とする。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、進行性の気流閉塞を特徴とする。ＣＦを有する患者のサブセットは、吸入コリン作動薬に対する気道過敏性（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，２００２およびＭｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８）および気管支拡張剤に応答した気流制限の可逆性（ｖａｎ  Ｈａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  およびｖａｎ  Ｈａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）も発症する。気道過敏性および気道閉塞の存在は、ＣＦと、気道平滑筋機能不全が疾患プロセスに寄与すると考えられている喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの気道狭窄の他の疾患と、の間の疾患の共通の病因の可能性を示唆している。
【０１３６】
肺感染症は、細菌感染症であり得る。感染性細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｅｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｉｎ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｆａｌｌａｘ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｈｉｍｏｉｄｅｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｏｐｈｉｌｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａであり得る。細菌感染症は、肺炎をもたらし得る。
【０１３７】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、２つの主要な気流閉塞障害である慢性気管支炎および肺気腫を分類するために使用される用語である。約１６００万人の米国人がＣＯＰＤを患っており、その８０〜９０％は生涯の多くを通して喫煙者であった。ＣＯＰＤは、米国の主要な死因であり、２００３年では１２２，２８３人の死亡数である。ＣＯＰＤの米国の費用は、２００３年の直接医療費では約２０９億ドルであった。慢性気管支炎は、気管支気道の炎症である。気管支気道は気管と肺とを接げている。炎症を起こした場合、気管支が粘液を分泌し、慢性の咳を引き起こす。
【０１３８】
肺気腫では、肺のエラスチン骨格への損傷の結果として、肺胞嚢が過剰に膨張している。気腫性肺における炎症細胞はエラスターゼ酵素を放出し、これが肺マトリックス内のエラスチン線維を分解するかまたは損傷させる。肺気腫には、喫煙、環境汚染物質への曝露、アルファ１アンチトリプシン欠乏症、および老化を含む多くの原因がある。
【０１３９】
細気管支炎は、ウイルス性下気道感染症によって最も一般的に引き起こされ、急性炎症、浮腫、小気道の内壁を形成している上皮細胞の壊死、および粘液産生の増加を主に特徴とする（Ｒａｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。兆候および症状は、典型的には、鼻炎および咳から始まり、頻呼吸、喘鳴、ラ音、副筋の使用、および／または鼻翼呼吸（ｎａｓａｌ  ｆｌａｒｉｎｇ）に進行し得る。
【０１４０】
閉塞性細気管支炎は、肺における小気道の異常なリモデリングの結果としての進行性の気流の減少である（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。閉塞性細気管支炎症候群は、肺移植の主な合併症であり、他の既知の原因によって引き起こされない努力呼気肺活量および努力呼気肺活力の持続的低下をもたらす、同種移植片機能不全の遅延を説明するためにしばしば使用される（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１４１】
「喘息」という用語は、急性喘息、慢性喘息、間欠性喘息、軽度持続性喘息、中等度持続性喘息、重度持続性喘息、慢性持続性喘息、軽度から中等度の喘息、軽度から中等度の持続性喘息、軽度から中等度の慢性持続性喘息、アレルギー性（外因性）喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、夜間性喘息、気管支喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、季節性喘息、無症候性喘息、胃食道性喘息、特発性喘息、および咳喘息を指し得る。喘息の間、気道は持続的に炎症を起こし、時折けいれんを起こし得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、対象における肺感染症または肺疾患を処置または予防する方法であって、対象に、ＦＴＴＦＴＶＴのアミノ酸配列（アミノ酸配列２、本明細書ではＣＳＰ７と称される）を含む、有効量の乾燥粉末ペプチドを対象に投与することを含み、乾燥粉末ペプチドは、カベオリン−１（Ｃａｖ−１）の生物学的活性を維持する、方法が提供される。いくつかの態様では、実施形態の医薬製剤を投与する方法は、ペプチドの乾燥粉末吸入を含む。特定の態様では、対象はヒトである。
【実施例】
【０１４３】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。後に続く実施例で開示した技術は、発明者により発見された技術が、本発明の実施に際して十分機能することを示し、それ故、その実施のための好ましい方式を構成すると考えることができるということが、当業者により理解されなければならない。しかし、当業者は、本開示の観点で、開示される具体的な実施形態では、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じまたは同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得ることを理解するべきである。
【０１４４】
実施例１−方法および材料
乾燥粉末ペプチドの調製。ＣＳＰ７ペプチド（配列番号２）、ロット番号：ＡＨＦ６６／／４７０１０３は、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（サンディエゴ，米国）によって合成された。
【０１４５】
ＣＳＰ７混合物の製造および噴霧乾燥。ＣＳＰ７のみ（ＣＳＰ７）、またはＣＳＰ７／ロイシン、ＣＳＰ７／トレハロース、もしくはＣＳＰ７／クエン酸ナトリウムの７５％／２５％混合物、またはＣＳＰ７／ロイシン／トレハロースの７５％／１５％／１０％混合物のいずれかを含む、ＣＳＰ７製剤をｐＨ１０の水（ＮＨ４ＯＨで調整）中で調製し、２’’サイクロンを備えたＢＬＤ−３５を使用して噴霧乾燥した。
【０１４６】
薄膜凍結（ＴＦＦ）による乾燥粉末ＣＳＰ７粒子サイズの低下。０．３ｍｇ／ｍｌのＣＳＰ７バルク粉末および０．９ｍｇ／ｍｌのマンニトール（質量比１：３）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解し、ｐＨを８．０５に調整した。次いで、溶液を０．４５μｍの膜で濾過し、液体窒素が充填されたローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）チャンバーに滴下した。計測された凍結温度は−５５〜−６５℃であって。次いで、凍結した薄片をＶｉｒＴｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ（ＶｉｒＴｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州）で凍結乾燥した。凍結乾燥条件は以下の通りである：平衡化：−５５℃で保持する、１００ｍＴｏｒｒで３０分間；一次乾燥：−３０℃までの温度を上昇する、１００ｍＴｏｒｒで２５０分；−３０℃で保持する、１００ｍＴｏｒｒで６６０分間；二次乾燥：３０℃まで上昇させる、１００ｍＴｏｒｒで７２０分間；および３０℃で保持する、１００ｍＴｏｒｒで２４０分間。ＴＦＦで処理された試料をバッチ１７１０１４と称する。
【０１４７】
極低温粉砕による乾燥粉末ＣＳＰ７の粒子サイズの低下。１グラムのＣＳＰ７バルク粉末を小さなクリオミル（ｃｒｙｏｍｉｌｌ）チューブに添加し、６８７０Ｆｒｅｅｚｅ／Ｍｉｌｌ（ＳＰＥＸ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ（商標），米国ニュージャージー州）に充填する。粉砕は、５サイクル、１０分の予冷で行われ、各サイクルは、１０ＣＰＳで５分の実施時間を有し、続いて２分冷却する。粉砕された試料を回収、計量し、収率は、充填重量に対する回収重量に基づき、７３．５％と計算された。
【０１４８】
ボール粉砕（ＢＭ）によるＣＳＰ７粉末の粒子サイズの低下。ＣＳＰ７バルク粉末を、その貧溶媒であるエタノール（無水）に懸濁して、１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。ジルコニウムボールの溶媒量の約半分（２ｍｍ）を懸濁液に添加した。次いで、懸濁液を８０００Ｍ  Ｍｉｘｅｒ／Ｍｉｌｌ（ＳＰＥＸ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ，米国ニュージャージー州）に充填し、粉砕した。試料を粉砕プロセスから収集し、それぞれ５分、１０分、および３０分で試験した。
【０１４９】
ローターステーター（Ｒｏｔｏｒ−ｓｔａｔｏｒ）を使用したＣＳＰ７粉末の粒子サイズの低下。ＣＳＰ７バルク粉末をエタノールに分散させて、１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。ローターステーターの先端（５ｍｍ×７５ｍｍ平底）を懸濁液に沈め、均質化を行って粒子サイズを低下させた。
【０１５０】
高速液体クロマトグラフィ分析試料を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．３）に溶解し、５μｍの粒子サイズおよび１００ÅのポアサイズのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃｌ８（２）液体クロマトグラフィカラムで分析した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｇｕａｒｄカートリッジキットをガードカラムとして使用した。移動相Ａは、Ｈ２Ｏ＋０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、移動相Ｂは、８０％アセトニトリル＋２０％  Ｈ２Ｏ＋０．０９％（ｖ／ｖ）ＴＦＡであった。試料を２０μＬの量で注入した。試料をそれぞれ２５分間実行し、カラムを１ｍｌ／分の流速で、２５℃で保持した。試料を２２０ｎｍの波長で検出した。緩衝液勾配は、表２に特定された条件に設定した。
【表２】
2022500500.tif 000005
【０１５１】
粉砕されたＣＳＰ７バルク粉末の空気力学的粒子サイズ分布の決定。約３．５ｍｇの粉砕されたＣＳＰ７粉末を、サイズ３のＨＰＭＣカプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）中に手動で充填した。次いで、ＣＳＰ７カプセルをＲＳ０１単回投与乾燥粉末吸入器（高耐性）を使用してエアロゾル化し、空気力学的粒子サイズ分布をＮｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ（ＮＧＩ，ＭＳＰ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ，ＭＮ）で測定した。エアロゾルを吸入器用に６０Ｌ／分の空気流量で４秒間にわたって生成し、装置全体で４Ｌの吸入体積および４ｋＰａの圧力低下を達成した。各実行の前に、ＮＧＩ収集表面をメタノール中の５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０でコーティングした。実行ごとに１カプセルを撮影し、各試料を３回繰り返しで実行した（３カプセル）。エアロゾル化後、すべての収集表面を特定の量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０．３）ですすぎ、薬物を収集した。カプセル、装置、アダプター、スロート、プレセパレーター、およびステージ１〜ＭＯＣに堆積した粉末をそれぞれ抽出した。
【０１５２】
各試験について、送達された用量は、ＮＧＩに入ったＣＳＰ７の質量として定義される。幾何標準偏差（ＧＳＤ）、空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）、および微粒子率％（ＦＰＦ％）は、Ｃｏｐｌｅｙ  Ｉｎｈａｌｅｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＩＴＤＡＳ，Ｃｏｐｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，英国ノッティンガム）を使用し、ＮＧＩのステージ１〜ＭＯＣに蓄積された用量に基づいて計算された。ＦＰＦは、送達用量を用いて５．０μｍ未満の粒子の質量分率として定義される。
【０１５３】
肺組織の調製および溶解。６〜８週齢の雌マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，保管：０００６６４  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから注文し、ＩＡＣＵＣガイドラインに従ってケアされ、飼育される。翌週、マウスの体重を測定し、８０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび６ｍｇ／ｋｇのキシラジン（約１１５ｕｌ／マウス）のＩＰ注射で麻酔をかけ、ブレオマイシンの気管内点滴注入を１回享受させる。簡単に説明すると、２６Ｇプラスチックカテーテルを気管に挿入し、マウスは、ピペットを介して、０．８Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｂｉｏｔａｎｇ、カタログ番号ＲＢ００３）の２ｘ２０ｕｌの点滴注入（気道からの除去を可能にするために３０秒間隔とする）を受ける。対象は、同じ体積の生理食塩水のみを受ける。体重を追跡し（損傷した動物では約１０％の体重低下が起こる）、動物に、１週間毎日、乾燥粉末吸入プロトコル（ＣＨ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を享受させた。乾燥粉末投与は、０．７ｍｃｇ／動物の肺送達用量であると推定された以前の霧化製剤の最小有効用量（Ｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、これは参照により本明細書に組み込まれる）に基づいた。要約すると、１２分／日の曝露時間は、「１Ｘ」用量と一致し、「５Ｘ」用量は、３．５ｍｃｇ／動物に等しい６０分／日の処置を指定するものであった。動物を７日間連続して曝露し（１４〜２０日目、ブレオマイシン損傷線維化期間中）、最終致死用量のヘパリン化ケタミン／キシアリジンカクテル（２５％ヘパリン）の２４時間後に犠牲死させた。肺全体のサブセットを組織学のために採取した。簡単に説明すると、１０ｍｌの生理食塩水による経心腔的灌流により、肺から血液を除去する。次いで、解剖ステージの２０ｃｍ上で、肺を生理食塩水で１分間膨らませ、続いて４％ＰＦＡで１分間膨らませた。気管をひもで縛り、肺を切除し、固定し、包埋し、４ミクロンに切片化して最大表面積の可視化を達成し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＡｐｅｒｉｏＡＴ２高容量デジタル全スライドスキャナーで、画像をキャプチャし、修正されたアシュクロフトスコアリングプロトコル（Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、参照により本明細書に組み込まれる）に従って線維性損傷について、肺をスコアリングした。分子分析では、肺全体を、ＲＩＰＡ緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ならびに１％ＤＴＴ（ＲＮＡｓｅｓを阻害するため）中で均質化し、４℃で並行して均質化し（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｅｒｔｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、下流のアッセイのために処理した。肺ホモジネートのコラーゲン含有量は、Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ（Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅ）を使用し、製造元から提供されたコラーゲン標準を使用して、製造元の説明書に従ってアッセイした。比色分析は、マイクロプレートリーダー（ＦｉｌｔｅｒＭａｘ  Ｆ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、５８０ｎｍ）で読み取った。さらに、ＲＮＡをホモジネートから抽出し（Ｚｙｍｏｇｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｃＤＮＡに逆転写した（Ｑｉａｇｅｎ、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ逆転写２０５４１３）。これらの研究の結果は、図２９〜３２に示されている。
【０１５４】
２８個の試料のための均質化緩衝液を、２２４μＬのカクテル阻害剤、２２４μＬのＮａＯＶ４、２２４μＬのＰＭＳＦ、および０．２２ｇのＤＴＴを２２．４ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液に添加することによって調製した。試料あたり８００μＬの均質化緩衝液を添加した。ＣＫ２８ビーズを備えるＰｒｅｃｅｌｌｙｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎを使用して、試料を均質化した。使用した均質化プロトコルは、硬組織用であり、各試料に対して４℃で２回行った。次いで、均質化した試料を等分化し、４００μＬをＢＣＡ濃度決定およびタンパク質アッセイ用に保存し、２００μＬをＲＮＡ分離用に保存し、２００μＬをコラーゲンアッセイ用に保存した。
【０１５５】
コラーゲンアッセイ。コラーゲン標準は、１２５μＬのＱｕｉｃｋｚｙｍｅコラーゲン標準を１２５μＬの１２Ｍ  ＨＣＬに添加し、２００μＬの各試料を２００μＬの１２ＭＨＣｌに添加することにより使用のために調製した。試料および標準液を９５℃で２０時間インキュベートし、２０分後に短時間ボルテックスした。インキュベーション後、試料を１３，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。標準は、製造元の説明書（Ｑｕｉｃｋｚｙｍｅ）に従って作成された。次いで、１００μＬの各試料を５０μＬの水に希釈した。次いで、１０μＬの各希釈試料を１００μＬの４Ｍ  ＨＣｌでさらに希釈した。標準の複製と各試料をピペットでプレートに入れた。７５μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、プレートにカバーをかけた後、２０分間振とうした。１ウェルあたり７５μＬの検出試薬混合物を添加し、プレートを混合した後、６０℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記のように読み取った。
【０１５６】
ＲＮＡ単離。ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを使用し、製造業者の指示書に従って、ＲＮＡ単離を行った。簡単に説明すると、２５μＬのＲＬＴ緩衝液および７５μＬの７０％エタノールをＲＩＰ  Ａ緩衝液中の５０μＬの試料に添加し、合計１５０μＬの出発物質を得た。次いで、５０μＬの各試料の出発物質をＲＮａｓｅフリー水５０μＬに添加した。次いで、３５０μＬの緩衝液ＲＬＴを添加し、試料を十分に混合した。次いで、２５０μＬの９５〜１００％エタノールをそれぞれに添加し、試料を再度混合した。次いで、７００μＬの各試料をそれぞれのスパインカラムに添加し、８０００ｘｇで遠心分離し、通過画分を廃棄した。５００μＬのＲＰＥを各カラムに添加し、カラムを再度遠心分離した。５００μＬのＲＰＥを再度添加し、今回は試料を８０００ｘｇで２分間遠心分離した。試料を新しいマイクロ遠心チューブに移し、８０００ｘｇで１分間遠心分離することにより、ＲＮＡを４０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶出した。試料をナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって定量化し、上記のように分析した。
【０１５７】
実施例２−ＣＳＰ７バルク粉末の特性評価
走査型電子顕微鏡法。ＣＳＰ７のバルク粉末試料を試料トレイにスパッタリングし、圧縮窒素を吹き付けて広げた。走査型電子顕微鏡法により、試料を画像化した（図１）。ＳＥＭは、大きな粒子（＞５μｍ）の存在を示している。さらに、ほとんどの粒子は大きい（＞５μｍ）ようであり、したがって呼吸可能な範囲外であるようであった。
【０１５８】
ＣＳＰ７粒子サイズ評価。粒子サイズを、固体または湿式分散アタッチメントが装備されたＳｐｒａｙ  ｔｅｃレーザー回折およびＳｙｍｐａｔｅｃレーザー回折装置ＨＥＬＯＳ−Ｒシステムを使用して調べ、バルク粉末が呼吸可能な範囲内にあるかどうかが決定した。乾式分散法を使用して、ＣＳＰ７バルク粉末粒子のサイズは、呼吸可能な粒子サイズよりも大きいと決定された。表３は、分布内でＤｖ１０、Ｄｖ５０（中央値）、およびＤｖ９０であると評価された粒子の粒子サイズを示している。表３に示されるように、分析されたすべてのＣＳＰ７粒子の５０％超が、呼吸可能な範囲よりも大きい５．３μｍ以上の粒子サイズを有していた。
【表３】
2022500500.tif 000006
【０１５９】
次いで、湿式分散法によるＳｙｍｐａｔｅｃレーザー回折により、粒子サイズを決定した。ＣＳＰ７を分散媒体としてエタノール＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０に溶解し、１０分間超音波処理した。湿式分散を使用したＣＳＰ７粒子のサイズ測定結果を表４に示す。表４に示すように、湿式分散粒子の平均粒子サイズ（Ｄｖ５０）は、２９．０±０．８であり、呼吸可能範囲を大きく超えていた。
【表４】
2022500500.tif 000007
【０１６０】
平均粒子サイズを、再び乾式分散法を使用し、Ｓｐｒａｙｔｅｃレーザー回折装置を使用してさらに評価した。ＣＳＰ７バルク粉末は４０ＰＳＩで分散され、平均粒子サイズ（８．６±１．５μｍ）は呼吸可能な範囲を上回っていた（表５）。
【表５】
2022500500.tif 000008
【０１６１】
５μｍより小さいことが見出された乾燥粉末粒子の割合は、わずか３４．５±４．１％であることが見出された。それぞれのレーザー回折法により、バルク粉末の大部分が呼吸可能な範囲外の粒子サイズを有することが見出されたことを考慮すると、処置に使用される乾燥粉末は、粒子サイズを低下させるために何らかの方法で処理する必要がある。
【０１６２】
バルクＣＳＰ７粉末の形態。バルク粉末ＣＳＰ７試料をスライドガラス上にスパッタリングし、光学顕微鏡で観察した（図２）。光学顕微鏡によりＳＥＭが確認され、大きな粒子（＞５μｍ）の存在が示された。光学顕微鏡法はまた、図２の矢印に見られる粒子凝集物の存在を示している。
【０１６３】
ＣＳＰ７バルク粉末粒子の結晶化度の決定。ＣＳＰ７バルク粉末粒子をＸ線粉末回折を使用して評価した（図３）。ニートのＣＳＰ７は、Ｘ線粉末回折により、いくらかの結晶性を示すことが見出された（図３）。Ｘ線回折の結果を確認するために、偏光顕微鏡法によって結晶化度を評価した（図４）。図４に見られるように、バルクＣＳＰ７粉末中に結晶性ＣＳＰ７が存在し、特定の典型的な結晶形態が画像中の白い矢印で示されている。
【０１６４】
ＣＳＰ７バルク粉末の熱分析。示差走査熱量測定を使用して、ニートのＣＳＰ７の融点を決定した（図５）。ＤＳＣによって決定されるように、ＣＳＰ７の融点は２１１．０３℃であると決定された（図５）。熱重量分析（ＴＧＡ）を使用して分析を続けた（図６）。ＴＧＡは、ニートのＣＳＰ７の重量が２１６℃超で劇的に減少し始めることを示している。
【０１６５】
ＣＳＰ７バルク粉末の水分含有量。バルク粉末ＣＳＰ７の水分含有量をＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｔｉｔｒａｔｏｒを使用してＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ（ＫＦ−Ｖ）滴定によって評価し、３つ組で実施した。表６は、各試験の水分含有量と３つの試験の平均水分含有量を示している。
【表６】
2022500500.tif 000009
【０１６６】
次いで、ＣＳＰ７バルク粉末の水分吸着を、動的蒸気吸着ＤＶＳを使用して分析した（図７）。ＣＳＰ７試料を十分な吸着／脱着サイクルで実行し、試料は、相対湿度ゼロにおいて６．３２％の水分脱着を有することが見出された。相対湿度が９０％のときの質量変化は１０．５４％であることが見出された（図７）
【０１６７】
実施例３−粒子サイズ低下後のＣＳＰ７粉末の特性評価
ＣＳＰ７粉末の粒子サイズ低下。粉末を肺に効果的に吸入して沈着させるために、粒子サイズは、一般に、約５μｍ未満の空気動力学的中央粒子径を有する必要がある。ニートの材料の粒子サイズを小さくするために、エアジェット粉砕（ＡＪＭ）、ボール粉砕（ＢＭ）、極低温粉砕（ＣＭ）、薄膜凍結（ＴＦＦ）、および噴霧乾燥など、様々な技術を実施した。最初に、ＣＳＰ７バルク粉末の粒子サイズを小さくするためにＡＪＭを実施し、粉砕されたＣＳＰ７を粉砕機内のいくつかの位置から収集した。示された位置から収集された粉砕粉末の最初のバッチ（バッチ１７１０１３）の収率および粒子サイズ分布を表５および６に示す。粒子サイズ分布を、Ｓｙｍｐａｔｅｃレーザー回折乾式分散（表８）またはＳｙｍｐａｔｅｃレーザー回折湿式分散（表９）によって上記のようにして決定した。
【表８】
2022500500.tif 000010
【表９−１】
2022500500.tif 000011
【０１６８】
上記と同じ条件を使用して、ＣＳＰ７の第２のバッチ（バッチ１７１０２７）を１０グラムのニートのバルク粉末から粉砕した。再度、粉末サイズの分布および収率を同じ位置から評価し、表１０に列挙する。
【表１０】
2022500500.tif 000012
【０１６９】
ＣＳＰ７乾燥粉末の第３のバッチを薄膜凍結（ＴＦＦ）（バッチ１７１０１４）に供し、Ｓｙｍｐａｔｅｃレーザー回折乾式分散（表１１）および湿式分散（表１２）の両方を使用して、上記のように分析した。
【表１１−１】
2022500500.tif 000013
【表１２】
2022500500.tif 000014
【０１７０】
ＣＳＰ７乾燥粉末の別のバッチを、粒子サイズを低下させるために極低温粉砕（ＣＭ）に供した。ＣＭ  ＣＳＰ７の粒子サイズを、乾式分散（表１３）および湿式分散（表１４）を使用したレーザー回折によって上記のようにして評価した。
【表１３】
2022500500.tif 000015
【表１４】
2022500500.tif 000016
【０１７１】
ＣＳＰ７バルク粉末の別のバッチを、粒子サイズを低下させるためにボール粉砕（ＢＭ）に供した。粉砕プロセス中のいくつかの時点から得られたＢＭＣＳＰ７粉末の粒子サイズ分布を表１５に示す。
【表１５】
2022500500.tif 000017
【０１７２】
ＣＳＰ７（指定の開発頭字語により、ＣＳＰ７とも称する）およびロイシン、トレハロース、クエン酸ナトリウム、またはロイシンおよびトレハロースの混合物を用いてさらなるバッチを作成し、粒子サイズを低下させるために噴霧乾燥に供した。噴霧乾燥粒子のサイズを乾式分散レーザー回折によって調べた（図８、表１６）。再度、バルクＣＳＰ７と比較して、噴霧乾燥により、ＣＳＰ７粒子のサイズが大幅に低下した。
【表１６】
2022500500.tif 000018
【０１７３】
ＣＳＰ７粒子サイズは、固体分散および湿式分散によって測定された場合に両方とも、粒子サイズを低下させるための各方法（エアジェット粉砕、薄膜凍結、極低温粉砕、ボール粉砕、および噴霧乾燥）の後に劇的に低下した（表１および２表５、６、１０、１３、１４、１６、１７、１８、および１９と比較する）。エアジェット粉砕後、ＣＳＰ７粒子の大部分は呼吸可能な範囲内にあるが、薄膜凍結、極低温粉砕、およびボール粉砕はそれほど効果的ではなく、固体分散または液体分散を使用してレーザー回折で測定した場合、呼吸可能な範囲内にある粉砕された粉末の割合はより少なかった。
【０１７４】
粒子サイズはまた、ローターステーターハンドヘルド（ｒｏｔｏｒ−ｓｔａｔｏｒ  ｈａｎｄｈｅｌｄ）ホモジナイザーを使用して低下させた（図９）。ＣＳＰ７は、均質化の持続時間および力に応じて、均質化後、エタノールの色を明るい灰色または濃い灰色のいずれかに変え（図９）、観察された色の変化ゆえに、この方法はさらに追求されなかったが、均質化が粒子サイズを低下させたことは明らかである。
【０１７５】
粉砕されたＣＳＰ７粉末の形態。光学顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法を使用して、粉砕された各試料の形態を調べた。エアジェット粉砕からの粉末試料を上記のように調べ、光学顕微鏡により、粒子サイズが１μｍ＞粒子サイズ＞５μｍのサイズに低下し、均一であることが示された（図１０）。さらに、粉砕されたＣＳＰ７粒子は、凝集物を含まなかった（図１０）。ＳＥＭは、エアジェット粉砕された粒子の均質化および低下した粒子サイズが１〜５μｍの間であることを示した（図１１）。ＴＦＦ後に得られた粉末試料も調べ、粒子サイズはより大きかったが、試料には凝集物がないことが見出された（図１２）。さらなる分析は、走査型電子顕微鏡による噴霧乾燥製剤の粒子形態の評価を含んだ。製剤の代表的なＳＥＭ画像を図１３に示す。
【０１７６】
ＡＪＭＣＳＰ７の結晶化度。粉砕されたＣＳＰ７粉末（バッチ１７１０２７）をＸ線回折によって評価し、結晶化度は、回折図（図１４）に示されている。噴霧乾燥されたＣＳＰ７の結晶化度もＸ線回折によって調べ、曲線は図１５に描かれている。ＣＳＰ７単独またはトレハロースもしくはクエン酸ナトリウムと結合したＣＳＰ７の製剤は、アモルファスであるが、ロイシンまたはロイシンおよびトレハロースと結合したＣＳＰ７は、図１５の鋭いピークによって示されるように、結晶性ロイシン特性を含むようである。
【０１７７】
粉砕または噴霧乾燥されたＣＳＰ７粉末のＨＰＬＣ評価。ＣＳＰ７バルク粉末の粉砕が化学的効力に影響を与えるかどうかを判断するために、粉砕されたＣＳＰ７粉末の試料を粉砕機の様々な部分から収集し、表２に列挙した条件下で行ったＨＰＬＣを使用して評価した。次式を使用して、効力を評価した。
【数１】
2022500500.tif 000019
【０１７８】
表２６から明らかなように、粉砕は、収集された試料の効力に対して悪影響を及ぼさなかった。同様に、バッチ１７１０２７を試験したとき、化学的効力は１００．１４％であると決定された。
【表２６−１】
2022500500.tif 000020
【０１７９】
純度を調べるために、噴霧乾燥されたＣＳＰ７混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって調べた（表１７、図１６）。エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末と同様に、噴霧乾燥されたＣＳＰ７は約１００％の純度を保持する。
【表１７】
2022500500.tif 000021
【０１８０】
ＣＳＰ７の安定性。未処理のバルクＣＳＰ７粉末およびエアジェット粉砕されたＣＳＰ７（バッチ１７１０２７）の両方の安定性を、ＨＰＬＣを使用してそれらの化学的効力を分析することによって調べた。各試料は、３つの異なる条件で保存された後、保存の５日、１５日、および３２日の化学的効力をアッセイした（図１７）。噴霧乾燥されたＣＳＰ７の２４時間にわたる安定性もまた、その短期間の安定性を理解するためにＨＰＬＣ（仕様で前述した方法）によって調べた。各製剤は安定していることが見出され、２時間または２４時間後に不純物が増加していなかった（表３１）。
【表３１−１】
2022500500.tif 000022
【０１８１】
粉砕されたＣＳＰ７の空気力学的粒子サイズ分布。粉砕されたＣＳＰ７の空気力学的粒子サイズ分布を決定するために、ＮＧＩ収集機の様々な位置に堆積した粉末の量を別々に抽出した。送達された用量をエアロゾル化後にＮＧＩ収集機に入ったＣＳＰ７の質量として測定し、個々の表面に堆積したＣＳＰ７の量を抽出し、別々に測定した。カプセル内に残された、または装置、アダプター、スロート、プレセパレーター、およびステージ１〜ＭＯＣ内に堆積された、未処理またはエアジェット粉砕（バッチ１７１０１３）のいずれかのＣＳＰ７の量が、送達されたＣＳＰ７の総量の割合として図１８に示されている。粉砕および未処理（例えば、未粉砕または未処理）の両方のＣＳＰ７の微粒子の割合（ＦＰＦ％）、質量平均空気力学的直径（ＭＭＡＤ）、および幾何標準偏差（ＧＳＤ）を表９に示す。
【表９−２】
2022500500.tif 000023
【０１８２】
第２の粉砕されたＣＳＰ７バッチ（１７１０２７）の空気力学的粒子サイズ分布は、サイズ３のＨＰＭＣカプセルあたり約４．２５ｍｇの粉末を使用することを除いて、上記のように決定された。ＧＳＤ、ＦＰＦ％、およびＭＭＡＤが表１１に示され、各位置に堆積されたＣＳＰ７の割合が、ここでも送達されたＣＳＰ７の総量の割合として、図１９に示されている。
【表１１−２】
2022500500.tif 000024
【０１８３】
噴霧乾燥製剤のエアロゾル化も同様に調べた（図２０）。各製剤は、６０％超の微粉末画分を示し、各製剤は、２．５μｍ〜３μｍのＭＭＡＤを有していた（表２５）。水分含有量を含む噴霧乾燥製剤の分析結果の要約を表２５に示す。
【表２５−１】
2022500500.tif 000025
【０１８４】
粉砕されたＣＳＰ７の水分含有量の決定。バルクＣＳＰ７を分析するために使用されたのと同じ条件下で、エアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末（バッチ１７１０２７）を動的蒸気吸着を使用して分析した（図２１）。ニートのバルク粉末と同様に、粉砕されたＣＳＰ７は、０％の相対湿度で４．６１％の水分脱着を有していた（図２１）。ＫＦ−Ｖ分析により、４．９％の水分含有量が見出されたが（表７）、相対湿度が９０％の場合、質量変化は１３．５９％に増加した（図２１）。
【表７】
2022500500.tif 000026
【０１８５】
低下した粒子サイズのＣＳＰ７粉末の熱重量分析。バルクＣＳＰ７と同じ方法で、粉砕されたＣＳＰ７（バッチ１７１０２７）について熱重量分析を行い、粉砕されたＣＳＰ７は未処理のＣＳＰ７と非常に類似した特性を有することが見出された（図２２）。噴霧乾燥製剤の熱特性も評価し、表２４および図２３〜２７（図２８に要約）に示されている。特に、混合製剤の中間点Ｔｇは、噴霧乾燥されたＣＳＰ７単独よりも有意に低かった（表２４における００１Ｃ−Ｆと００１Ｂとを比較）。
【表２４】
2022500500.tif 000027
【０１８６】
本明細書に提示された結果は、ＣＳＰ７粉末の粒子サイズを低下させるために様々な方法が効果的であり、得られた粉末が非常に類似した特性を示すことを示している。
【０１８７】
実施例４−ＣＳＰ７乾燥粉末の吸入によるブレオマイシン誘発性肺線維症の処置
マウスにおける線維症の誘発およびＣＳＰ７処置。ブレオマイシンによる処置により、肺線維症をマウスで誘発した。マウスに０．８Ｕ／ｋｇのブレオマイシンを鼻腔内投与し、１４日間待って、処置前に疾患を発症させた。次いで、マウスを未処理のままにするか、ＣＳＰ７の乾燥粉末吸入で１２分間処理するか、またはＣＳＰ７の乾燥粉末吸入で６０分間処理した。処置の最終日にマウスを安楽死させ、肺を取り出し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。さらなる分析の前に、瞬間冷凍された肺の重さを測った（図２９）。
【０１８８】
肺組織を均質化し、コラーゲン含有量をＱｕｉｃｋｚｙｍｅコラーゲンアッセイを使用して分析した（図３０）。ブレオマイシンによる線維症の誘発は、生理食塩水処置と比較して、肺におけるコラーゲンの有意な増加をもたらした（Ｐ＝０．００６２）（図３０）。マウスの肺線維症の尺度であるアシュクロフトスコアは、ブレオマイシンによる肺線維症の誘発後、ＣＳＰ７で処置されたマウスでは低かった（図３１）。
【０１８９】
ＲＮＡを均質化された肺組織からも調製し、上記のように使用した。
【０１９０】
実施例５−筋肉内／皮下注射用の製剤懸濁液
【表２５−２】
2022500500.tif 000028
【０１９１】
調製について：
１．１．２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を調製する（ｐＨ約１０．３である必要がある）
２．２．１．５％（ｗ／ｗ）ＣＭＣを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解し、０．２％（ｗ／ｗ）ポロキサマー１８８を添加する。約６００ｒｐｍで一晩攪拌する。
３．３．０．７％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌをＣＭＣ溶液に添加する。
４．４．約２８．５μＬ／ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加することにより、溶液のｐＨを７に調整する。
５．５．特定の量のエアジェット粉砕されたＣＳＰ７粉末（小さな粒子サイズの画分を得るために収集バッグから収集されれる）を清浄なバイアル中で計量および添加する。
６．６．清浄なロッドを使用して最初に粉末を粉砕し、目視可能な凝集粒子がないことを確認する。
７．７．ロッドを用いた粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）／粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）により、調製した溶液をバイアルに徐々に添加する。
８．８．粉末が完全に湿り、目視可能な凝集粒子が見出される場合、適量添加して標的体積にする。
結果
【表２６−２】
2022500500.tif 000029
【０１９２】
実施例６−筋肉内／皮下注射用の製剤溶液
調製について：
１．１．２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を調製する（ｐＨ約１０．３である必要がある）
２．２．１．５％（ｗ／ｗ）ＣＭＣを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解し、０．２％（ｗ／ｗ）ポロキサマー１８８を添加する。約６００ｒｐｍで一晩攪拌する。
３．３．０．７％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌをＣＭＣ溶液に添加する。
４．４．１．２〜１．４ｍｇ／ｍｌ  ＣＳＰ７（未処理の粉末）を溶液に添加し、ボルテックスして溶解する。ｐＨは約９である必要があり、次いで、−５０μＬ１Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨを８．２〜８．５に調整する。
【表２７】
2022500500.tif 000030
結果
【表２８】
2022500500.tif 000031
【０１９３】
実施例７−ポリペプチド変異体の事前製剤化（ｐｒｅ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）研究
変異体粉末を５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶媒に添加し、次いで３分間ボルテックスすることにより、変異体の溶解度研究を行った。５分で溶液の外観を観察する。さらに粉末を添加し（毎回約５ｍｇ／ｍｌ）、ボルテックスを繰り返し、沈殿またはゲル化が発生するまで観察する。
結果：
【表２９】
2022500500.tif 000032
【表３０】
2022500500.tif 000033
【表３１−２】
2022500500.tif 000034
【表３２】
2022500500.tif 000035
【表３３】
2022500500.tif 000036
【０１９４】
実施例８−ＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）形態の事前製剤化前研究
ニートの（すなわち、粉砕されていない）ＣＳＰ７アンモニウム対イオン形態（表３５）の溶解は、過剰量のペプチド粉末を３ｍＬの異なるｐＨ緩衝液に添加し（表３６）、オービタルシェーカー上で、１００ｒｐｍで２４分間混合することによって行った。
【０１９５】
凍結融解安定性研究のために（図３３）のために、リン酸緩衝系（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の０．１ｍｇ／ｍＬ  ＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）ペプチドを、それぞれ、急速および低速凍結のために１５ｍＬ／バイアルに等分化した。高速および低速凍結のために、試料を液体窒素に少なくとも５分間浸漬するか、または−２０℃の冷凍庫に少なくとも１．５時間入れて、バイアル中の等分量を完全に凍結した後、室温に解凍するようにした。各試料は５回の凍結融解サイクルを受けた。回収率％は、元の（未処理の）濃度と比較した各試料濃度の割合を表す。
【０１９６】
溶解度および凍結融解試料を０．４５μｍの膜を通して濾過した後に、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）を行うことによってアッセイした。簡単に説明すると、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）逆相Ｃ１８カラム２．５μｍ、１５０ｍｍｘ４．６０ｍｍを備えたＤｉｏｎｅｘ３０００ＨＰＬＣシステムを使用して試料を分析した。試験のためにＨＰＬＣカラムを６０℃に加熱し、ペプチドを２１５ｎｍの波長と１ｍＬ／分の流速で検出した。２つの移動相は、Ａ（水中０．１％酢酸）およびＢ（アセトニトリル中０．１％酢酸）とした。注入体積は２０μＬであり、標準曲線を０．０１〜１ｍｇ／ｍｌからプロットした。
【表３４】
2022500500.tif 000037
【表３５】
2022500500.tif 000038
【表３６】
2022500500.tif 000039
【０１９７】
実施例９：ロット番号ＵＴＡ１８１０２８としての粉砕されたＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末の特性評価および安定性研究
モデル００Ｊｅｔ−Ｏ−Ｍｉｚｅｒ（商標）（Ａｌｊｅｔ  ｍｉｌｌとしても既知，Ｆｌｕｉｄ  Ｅｎｅｒｇｙ，ペンシルベニア州テルフォード）を使用して、ＣＳＰ７ペプチドを粉砕した。供給速度、押し出し圧力、および粉砕圧力は、それぞれ１ｇ／分、６０ｐｓｉ、７０ｐｓｉである（表３７）。バッチサイズは２０ｇであり、粉砕された粉末は、粉砕チャンバー後のチューブ（ｂｆＣ）、サイクロン（Ｃ）、収集容器アダプター（Ｄ）、収集バッグアダプター（Ｅ）、収集バッグ（Ｈ）、および収集容器（Ｇ）を含む、ジェット粉砕の様々な区域から収集される。Ｔｕｒｂｕｌａミキサー（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，米国ニュージャージー州）を使用して、収集した粉末を１０分間混合した。
【表３７】
2022500500.tif 000040
【０１９８】
粉砕されたおよびＣＳＰ７アンモニウム対イオンニート粉末の比表面積。粉砕および未処理のＣＳＰ７粉末の比表面積は、Ｍｏｎｏｓｏｒｂ急速表面積分析装置モデルＭＳ−２１（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，フロリダ州ボイントンビーチ）とシングルポイントＢＥＴ法を使用して分析される（図３４）。試料を２５℃で２０ｐｓｉの窒素ガスを使用して２０〜２４時間ガス放出し、表面上の水および他の不純物分子を除去する。窒素／ヘリウムの混合物（５０：５０ｖ／ｖ）を吸着物として使用し、設備を試験前に窒素で校正する。
【０１９９】
粉砕されたおよびＣＳＰ７アンモニウム対イオンニート粉末の熱重量分析。開始温度を２５℃ではなく３５℃としたことを除いて、段落［００２１］に記載された方法を使用する。結果を図３５に示す。
【０２００】
粉砕されたおよびニートのＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）粉末の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。ＣＳＰ７の形態（図３６）を、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｕｐｒａ  ４０ＶＰ  ＳＥＭ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ、ドイツ・イエナ）で分析する。試料は、炭素導電性テープによってアルミニウムＳＥＭスタブに取り付けられ、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎスパッタコーター２０８ＨＲ（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，英国ワトフォード）を使用して１２ｎｍの白金／パラジウム（Ｐｔ／Ｐｄ）でコーティングされる。画像は、ニートの（すなわち、未処理の）ＣＳＰ７試料および粉砕後のＣＳＰ７試料に対して撮影される。
【０２０１】
ロット番号ＵＴＡ１８１０２８からの粉砕されたＣＳＰ７（アンモニウム対イオン）の安定性研究。粉砕されたＣＳＰ７粉末の安定性を、最大６ヶ月間の様々な保存条件下で調査した。粉砕されたＣＳＰ７ペプチドは、バルク粉砕粉末およびカプセル化粉砕粉末の２つの形態でパッケージ化されている。バルク粉砕粉末として保存する場合、０．２１〜０．２４ｇのペプチドを２０ｍＬのシンチレーションバイアル（Ｋｉｍｂｌｅ（登録商標）、ＤＷＫ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国ニュージャージー州ミルビル）に充填し、各ポーチ中に１ｇのシリカゲル乾燥剤（Ｔｙｖｅｋ（登録商標）およびＳｏｒｂｃｏ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ＬＬＣ，米国ニュージャージー州ベレン）の２つのバッグを含む、熱密封されたフォイルポーチ（Ｉｍｐａｋ  Ｃｏｒｐ，米国カリフォルニア州ロサンゼルス）内に保存する。粉砕されたペプチド粉末をまた、サイズ３のＨＰＭＣカプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ，米国ニュージャージー州モリスタウン）に約１１±５％ｍｇの重量でカプセル化し、次いで、２２〜２６個のカプセルがＨＤＰＥボトル（Ｄｒｕｇ  Ｐｌａｓｔｉｃ，米国ペンシルベニア州ボイヤータウン）、続いてＨＤＰＥボトルをフォイルポーチ（乾燥剤なし）内に密封する。パッケージを、以下の保存条件：−２０℃、２５℃／６０％ＲＨ、および４０℃／７５％ＲＨで安定チャンバーに保する。試料を試験のために１、３、および６ヶ月で取り出す（表３８）。空気力学的粒子サイズ分布以外の試験では、カプセル化粉末をカプセルから取り出し、バイアルを回転させることによってガラスバイアル中で混合した。
【表３８】
2022500500.tif 000041
【０２０２】
粉砕された粉末の外観。粉砕された粉末の外観は、通常のカメラで写真を撮ることによって記録された（図３０）。
【０２０３】
粉砕されたペプチドの化学的安定性。実施例８に記載のＨＰＬＣ法を使用して、粉末をアッセイした。結果を以下の表３９に示す。パーセンテージは、物質収支と比較したアッセイ量を表す。アッセイを水分含有量について調整した。
【表３９】
2022500500.tif 000042
【０２０４】
ＣＳＰ粉末の水分含有量。Ｃｏｕｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  Ｃ２０  Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，米国オハイオ州）を使用して、ペプチド粉末中の水分含有量を測定する（表４０）。機器の信頼性をカールフィッシャーの水分含有量標準（Ｈｙｄｒａｎａｌ（商標）水標準品，Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，米国ノースカロライナ州シャーロット）で試験する。既知量の粉末を無水メタノール（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）に懸濁し、懸濁液を陽極液（Ｈｙｄｒａｎａｌ（商標）−Ｃｏｕｌｏｍａｔ  ＡＧ，Ｈ  Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ、米国ノースカロライナ州シャーロット）に注入して、陰極液（Ｈｙｄｒａｎａｌ（商標）−Ｃｏｕｌｏｍａｔ  ＣＧ、Ｈ  Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，米国ノースカロライナ州シャーロット）の存在下で滴定を生じさせる。ブランクの無水メタノール溶液を差し引いた試料中の水分含有量の差として、結果を記録する。
【表４０】
2022500500.tif 000043
【０２０５】
幾何学的粒子サイズ分布。ＲＯＤＯＳ分散を備えたＳｙｍｐａｔｅｃＨＥＬＯＳレーザー回折機器（Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ，ドイツ）を使用して、粉砕の前後にＣＳＰ７粉末のＧＰＳＤを分析した。測定は、３バールでの粉末分散後に１０ミリ秒ごとに行われる。粒子サイズ分布を決定するために、５〜２５％の光学密度の測定値を平均した。体積による粒子サイズは、それぞれ１０、５０、および９０のパーセンタイル（例えば、Ｄｖ１０、Ｄｖ５０、およびＤｖ９０）、ならびに１〜５μｍのサイズ範囲に入る粒子の割合で報告される。結果を４１に示す。
【表４１】
2022500500.tif 000044
【０２０６】
空気力学的粒子サイズ分布分析試験されたカプセル中の粉末重量が１１±５％ｍｇであり、プレセパレーターを安定性研究でのＮＧＩの組み立てで取り除いたことを除いて、段落［００２１５］に記載されるＮＧＩを実施することにより、空気力学的粒子サイズ分布を評価した。結果を表４２に示す。
【表４２】
2022500500.tif 000045
【０２０７】
ＣＳＰ７粉末の結晶化度。粉末の結晶化度は、段落［００１８］に記載された方法によって評価され、その結果は図３８に示されている。
【０２０８】
本明細書に開示され、特許請求される全ての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程または工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の作用物質を、同じ結果または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される作用物質に交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる同様の代替物および改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
参考文献
【０２０９】
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的に例示的な手順または他の詳細を与える程度まで、本明細書に参照により組み込まれる。
Ｃａｒｖａｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  −  Ｗｈａｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｉｓ  ｔｈｅｒｅ？”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．４０６：１−１０，２０１１．
Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｒ．−Ｈ．；Ｇｉｔｔｅｒ，Ｗ．；Ｅｌ  Ｍｏｋｈｔａｒｉ，Ｎ．Ｅ．；Ｍａｔｈｉａｋ，Ｍ．；Ｂｏｔｈ，Ｍ．；Ｂｏｌｔｅ，ＥＬ；Ｆｒｅｉｔａｇ−Ｗｏｌｆ，Ｓ．；Ｂｅｗｉｇ，Ｂ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４４，５０７−１１，５１４−７，２００８．
Ｓｕｒａｓａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｈａｌｅｄ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｆｏｒ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，４４（２）：１８４−１９８，２０１７．
Ｔｅｐｐｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｋｕｅｈｌ，Ｐ．Ｊ．；Ｃｒａｃｋｎｅｌｌ，Ｓ．；Ｎｉｋｕｌａ，Ｋ．Ｊ．；Ｐｅｉ，Ｌ．；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｄ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｕｍｍａｒｙ：“ｂｒｅａｔｈｅ  Ｉｎ，Ｂｒｅａｔｈｅ  Ｏｕｔ，Ｉｔｓ  Ｅａｓｙ：Ｗｈａｔ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｎｈａｌｅｄ  Ｄｒｕｇｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３５，３７６−３９２，２０１６．
【図１】
2022500500.tif 000046
【図２】
2022500500.tif 000047
【図３】
2022500500.tif 000048
【図４】
2022500500.tif 000049
【図５】
2022500500.tif 000050
【図６】
2022500500.tif 000051
【図７】
2022500500.tif 000052
【図８】
2022500500.tif 000053
【図９】
2022500500.tif 000054
【図１０】
2022500500.tif 000055
【図１１】
2022500500.tif 000056
【図１２】
2022500500.tif 000057
【図１３】
2022500500.tif 000058
【図１４】
2022500500.tif 000059
【図１５】
2022500500.tif 000060
【図１６】
2022500500.tif 000061
【図１７】
2022500500.tif 000062
【図１８】
2022500500.tif 000063
【図１９】
2022500500.tif 000064
【図２０】
2022500500.tif 000065
【図２１】
2022500500.tif 000066
【図２２】
2022500500.tif 000067
【図２３】
2022500500.tif 000068
【図２４】
2022500500.tif 000069
【図２５】
2022500500.tif 000070
【図２６】
2022500500.tif 000071
【図２７】
2022500500.tif 000072
【図２８】
2022500500.tif 000073
【図２９】
2022500500.tif 000074
【図３０】
2022500500.tif 000075
【図３１】
2022500500.tif 000076
【図３２】
2022500500.tif 000077
【図３３】
2022500500.tif 000078
【図３４】
2022500500.tif 000079
【図３５】
2022500500.tif 000080
【図３６】
2022500500.tif 000081
【図３７】
2022500500.tif 000082
【図３８】
2022500500.tif 000083
【配列表】
2022500500000001.app
【国際調査報告】
2022500500.tif 000084
2022500500.tif 000085
2022500500.tif 000086