(57)【要約】組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を哺乳動物宿主細胞培養物から産生及び／または精製するための方法が開示される。【選択図】図２１
2022501037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を哺乳動物宿主細胞培養物から精製する方法であって、
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して複数のｒＡＡＶ粒子を精製して、前記複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記ＨＩＣ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を介して精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、
（ｃ）複数のフルｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって（ｂ）の前記ＣＥＸ溶出液から精製して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、
（ｄ）（ｃ）からの前記ＡＥＸ溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過し濃縮して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び最終製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記方法が、
複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞とウイルス放出溶液とを、前記複数のｒＡＡＶ粒子を採取培地に放出するのに好適な条件下で接触させて、複数のｒＡＡＶ粒子、ウイルス放出溶液、及び採取培地を含む組成物を生成するステップと、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して前記複数のｒＡＡＶ粒子を前記組成物から精製して、前記複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップをさらに含み、前記接触させるステップの前に、前記複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記採取培地が、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、安定化グルタミン、安定化グルタミンジペプチド、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記採取培地が、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、
Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記採取培地が、４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記採取培地が、無血清培地を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記採取培地が、無血清培地からなる、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記採取培地が、無タンパク質培地を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記採取培地が、無タンパク質培地からなる、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記採取培地が、清澄化培地を含む、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記採取培地が、清澄化培地からなる、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記外来配列が、
（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列と、
（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列と、
（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列と、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ロドプシンキナーゼプロモーターが、ＧＲＫ１プロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする前記配列が、コドン最適化ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＧＨポリＡシグナルをコードする前記配列が、
１  ｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記外来配列が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記外来配列が、プロモーターをコードする配列をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記外来配列が、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターをコードする配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＫプロモーターがＧＲＫ１プロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記外来配列が、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターをコードする配列をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＢＡプロモーターをコードする前記配列が、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番１６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれらからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、ヒトＡＢＣＡ４配列である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列から誘導される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記５’ＩＴＲをコードする配列及び前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１〜３４または３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記外来配列が、コザック配列をコードする配列をさらに含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記コザック配列が、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列を含む前記プラスミドベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする前記配列及び前記ウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列が、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離または誘導される配列を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物宿主細胞が、ポリマー、リン酸カルシウム、脂質、及び細胞膜を横断することが可能なベクターのうちの１つ以上を含む組成物でトランスフェクトされている、請求項２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞膜を横断することが可能なベクターが、リポソーム、ミセル、またはナノ粒子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ナノ粒子が、炭素、ケイ素、または金を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ナノ粒子が、ポリマーを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルス放出溶液が、塩及び高ｐＨを含む、請求項２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩が、ＮａＣｌを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記高ｐＨが、７．１以上のｐＨを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記高ｐＨが、９．０以上のｐＨを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項５１】
複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件が、前記哺乳動物宿主細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１８時間インキュベートすることを含む、請求項２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件が、前記哺乳動物宿主細胞を１０％ＣＯ２以下のＣＯ２レベルでインキュベートすることを含む、請求項２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）のＨＩＣステップが、
（ｉ）ＨＩＣクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記ＨＩＣクロマトグラム上の画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む前記ＨＩＣ溶出液を生成するステップと、を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＩＣクロマトグラムを生成する前に、前記採取培地を高塩濃度緩衝液中に希釈することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記段階勾配は、各段階勾配で塩濃度が低下する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記（ｂ）のＣＥＸステップが、
（ｉ）ＣＥＸクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記ＣＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＣＥＸ溶出物を生成するステップと、をさらに含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＣＥＸクロマトグラフィーが、ＳＯ３−陽イオン交換マトリックスを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＥＸクロマトグラムを生成する前に、前記ＨＩＣ溶出液を低塩濃度緩衝液に調整することをさらに含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記調整が、希釈ステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記調整ステップが、ＴＦＦステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＴＦＦステップが、７０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＴＦＦステップが、５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＴＦＦステップが、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｋＤａのＨＦＦ、またはそれらの間の任意の数のｋＤａを使用して実行される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＨＩＣ溶出液のｐＨが、両端を含めてｐＨ３．０〜ｐＨ４．０に調整される、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＨＩＣ溶出液のｐＨが、両端を含めてｐＨ３．５〜ｐＨ３．７に調整される、請求項５７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＨＩＣ溶出液を濾過することをさらに含む、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＨＩＣ溶出液を濾過することが、０．８／０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記段階勾配が、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、線形勾配を使用して溶出される、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記線形勾配が、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＣＥＸ溶出液の前記ｐＨを中和することをさらに含む、請求項５７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記中和されたＣＥＸ溶出液の前記ｐＨが、ｐＨ９．０である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記（ｃ）のＡＥＸクロマトグラフィーステップが、
（ｉ）ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）フルｒＡＡＶ粒子を含む前記ＡＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む前記ＡＥＸ溶出液を生成するステップと、をさらに含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡＥＸクロマトグラフィーが、陰イオン交換（ＱＡ）マトリックスを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＡＥＸクロマトグラムを生成する前に、前記ＣＥＸ溶出液を低塩濃度緩衝液に調整することをさらに含む、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記調整が、希釈ステップを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記調整ステップが、ＴＦＦステップを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記調整ステップが、第１のＴＦＦステップ及び第２のＴＦＦステップを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１及び第２のＴＦＦステップ両方が、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記希釈されたＣＥＸ溶出液が、ｐＨ９．０である、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子が、線形勾配を使用して溶出される、請求項７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、請求項７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む前記溶出液の前記ｐＨを中和することをさらに含む、請求項７６〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記（ｄ）のＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が第２のＴＦＦをさらに含み、前記第１及び第２のＴＦＦステップ両方が、１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記最終製剤緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む、請求項１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記最終製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記最終製剤緩衝液が、ポロキサマー１８８を０．００１％でさらに含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
プルロニック（登録商標）Ｆ−６８を前記最終組成物に添加することをさらに含む、請求項１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び前記最終製剤緩衝液を含む前記最終組成物が、−８０℃で凍結される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
請求項１〜９４のいずれか一項に記載の方法により産生された複数のｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
【請求項９６】
前記組成物が、
（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び
（ｂ）３０％未満の空キャプシドを含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記組成物が、
（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び
（ｂ）２５％未満の空キャプシドを含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９８】
前記組成物が、約０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬを含む、請求項９６または９７に記載の組成物。
【請求項９９】
前記組成物が、約１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬを含む、請求項９６または９７に記載の組成物。
【請求項１００】
前記組成物が、約５×１０１２ｖｇ／ｍＬを含む、請求項９６または９７に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記複数のｒＡＡＶの一部分が、機能的ベクターゲノムを含み、各機能的ベクターゲノムが、形質導入後に細胞中で外来配列を発現することができる、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０２】
機能的ベクターゲノムを含む前記複数のｒＡＡＶの前記部分が、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して２倍の増加で前記外来配列を発現する、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
機能的ベクターゲノムを含む前記複数のｒＡＡＶの前記部分が、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれらの間の任意の他の倍増値の増加で前記外来配列を発現する、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でない、請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でないが、前記外来配列によってコードされるタンパク質と前記内在配列によってコードされるタンパク質とが同一である、請求項１０２または１０３に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記外来配列及び前記対応する内在配列が、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、請求項１０４または１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記外来配列が、前記内在配列と比較してコドン最適化されている、請求項９５〜１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記外来配列及び前記対応する内在配列が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記組成物を用いた細胞の形質導入後に、前記外来配列がタンパク質をコードする、請求項９５〜１０８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記外来配列によってコードされる前記タンパク質が、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でない、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記外来配列と前記対応する内在配列とが、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記組成物を用いた細胞の形質導入後に、前記外来配列がタンパク質をコードする、請求項９５〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１または約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、それぞれ、約１：１：１、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、請求項３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約３：１：１のモル比で提供され、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、請求項３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約１０：１：１のモル比で提供され、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、請求項３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
外来配列を含む前記プラスミドベクター（ｐＩＴＲ）と前記ヘルパープラスミドベクター（ｐＨＥＬＰ）とのモル比が、１：１〜２０：１９であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、請求項３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ｐＩＴＲとウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクター（ｐＲＥＰＣＡＰ）とのモル比が、１：１〜２０：１９であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、請求項３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下での採取培地における複数の哺乳動物宿主細胞の前記培養が、トランスフェクション剤の存在下での培養を含む、請求項１１５〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記トランスフェクション剤がリン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記トランスフェクション剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記トランスフェクション剤が、ＰＥＩ及びＤＮＡを、それぞれ、約５：１〜約１：１（ｍＬ：ｍｇ）、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１の比で含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記トランスフェクション剤が、ＰＥＩ及びＤＮＡを含み、前記ＤＮＡが、外来配列を含むプラスミドベクター、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクター、ならびにヘルパープラスミドを、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１または約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で含む、請求項１２２または１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
組換えＡＡＶベクターを産生させる方法であって、哺乳動物宿主細胞を、
（ｉ）外来配列を含むプラスミドベクターと、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターと、
（ｉｉｉ）ヘルパープラスミドベクターと、を用いてトランスフェクトすることを含み、
前記哺乳動物宿主細胞を、前記外来配列を含む前記プラスミドベクター、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクター、ならびに前記ヘルパープラスミドを、それぞれ、約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で含むトランスフェクション培地と接触させる、前記方法。
【請求項１２６】
前記トランスフェクション培地が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びＣａＰＯ４から選択されるトランスフェクション剤を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記トランスフェクション剤がＰＥＩであり、前記トランスフェクション培地が、ＰＥＩ及びＤＮＡを、約５：１〜約１：１、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の比で含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記外来配列が、
（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列と、
（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列と、
（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列と、を含む、請求項１２５〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ロドプシンキナーゼプロモーターが、ＧＲＫ１プロモーターである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする前記配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする前記配列が、コドン最適化ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１３１または１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む、請求項１２８〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ＢＧＨポリＡシグナルをコードする前記配列が、
１  ｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、請求項１２８〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列から誘導される、請求項１２８〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記５’ＩＴＲをコードする配列及び前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、請求項１２８〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２８〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２８〜１３７または１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記外来配列が、コザック配列をコードする配列をさらに含み、任意選択で、前記コザック配列が、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記外来配列が、
１  ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧ  ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧ  ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣ
６１  ＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣ  ＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣ  ＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣ  ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧ
１２１  ＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡ  ＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴ  ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣ  ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧ  ＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣ  ＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴ
１８１  ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＣ  ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴ  ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣ  ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ  ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴ
２４１  ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧ  ＧＣＡＧＡＡＴＧＡＴ  ＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴ
３０１  ＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴ  ＧＴＣＴＴＴＴＴＣＴ  ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴ  ＴＧＣＣＡＣＴＣＣＴ  ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ
３６１  ＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣ  ＴＧＴＧＴＣＡＧＣＣ  ＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣ  ＣＡＴＧＡＧＡＧＡＧ
４２１  ＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡ  ＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡ  ＧＴＧＴＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣ  ＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴ
４８１  ＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣ  ＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡ  ＡＡＣＧＡＣＧＴＧＣ  ＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴ  ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＣ
５４１  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＡ  ＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴ  ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＣ  ＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧ  ＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣ
６０１  ＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣ  ＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧ  ＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴ  ＧＣＴＡＴＣＴＣＴＡ  ＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧ  ＣＧＴＧＡＡＧＧＣＡ
６６１  ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴ  ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣ
７２１  ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣ
７８１  ＡＣＴＧＡＧＧＡＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＴ  ＴＣＡＣＧＴＧＡＴＣ  ＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡ  ＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧ
８４１  ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧ  ＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧ  ＣＣＴＧＴＴＣＡＴＧ
９０１  ＴＧＧＧＧＡＧＡＴＡ  ＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧ  ＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧ  ＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴ  ＧＴＧＣＧＴＣＣＣＴ
９６１  ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡ  ＣＣＡＴＣＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴ  ＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＡＣＴＡ  ＴＣＡＴＡＧＣＧＣＣ
１０２１  ＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡ  ＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡ  ＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣ  ＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣ  ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧ  ＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣ
１０８１  ＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣ  ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧ  ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡ
１１４１  ＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣ  ＡＧＧＴＣＧＣＣＴＧ  ＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧ  ＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＴＣＣＴＧＡＣＴＧＡ  ＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧ
１２０１  ＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧ  ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡ  ＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ  ＧＡＡＣＣＴＴＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＡＧＡＣＡ
１２６１  ＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡ  ＡＡＧＴＧＡＴＣＧＡ  ＧＡＡＣＡＴＴＣＧＣ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＴＡ  ＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴ  ＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡ
１３２１  ＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡ  ＣＣＧＣＡＣＴＧＡＴ  ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＴ  ＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴ  ＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧ  ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡ
１３８１  ＣＡＣＧＧＧＡＡＧＣ  ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣ  ＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＧＴ
１４４１  ＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣ  ＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴ  ＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧ  ＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧ  ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＡ  ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ
１５０１  ＴＴＣＧＣＴＧＣＡＣ  ＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧ  ＣＧＴＧＧＣＴＡＡＧ  ＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴ  ＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴ  ＴＡＡＣＧＡＴＡＣＡ
１５６１  ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧ  ＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴ  ＣＣＴＧＣＣＡＴＡＣ  ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡ  ＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡ  ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧ
１６２１  ＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡ  ＧＴＧＣＡＡＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣ  ＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡ
１６８１  ＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ  ＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣ  ＴＡＴＣＧＡＧＧＧＡ  ＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ  ＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ  ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴ
１７４１  ＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴ  ＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧ  ＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧ  ＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧ  ＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴ  ＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧ
１８０１  ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡ  ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡ
１８６１  ＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴ  ＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧ  ＧＧＣＧＡＧＡＣＴＡ  ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴ  ＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡ
１９２１  ＣＡＣＡＴＴＡＴＧＴ  ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧ  ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＴＣＴＧＡＡＡＣ  ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴ  ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ
１９８１  ＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣ  ＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧ  ＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ  ＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡ  ＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴ
２０４１  ＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴ  ＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴ  ＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧ  ＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡ  ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡ  ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣ
２１０１  ＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡ  ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣ  ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣ  ＡＣＡＡＣＴＡＴＴＧ  ＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ  ＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡ
２１６１  ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣ  ＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡ  ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡ  ＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧ  ＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡ
２２２１  ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧ  ＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧ  ＡＡＡＧＴＣＣＡＣＧ  ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡ
２２８１  ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴ  ＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴ  ＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧ  ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴ  ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ  ＧＧＣＡＡＡＡＴＣＴ
２３４１  ＧＴＣＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧ  ＡＣＣＡＧＡＧＧＧＡ  ＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡ
２４０１  ＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧ  ＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡ  ＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＡＡＧＧＡ  ＴＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
２４６１  ＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧ  ＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧ  ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
２５２１  ＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡ  ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡ  ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣ  ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡ  ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣ
２５８１  ＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡ  ＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
２６４１  ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡ
２７０１  ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧ  ＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡ
２７６１  ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣ
２８２１  ＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧ  ＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧ
２８８１  ＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡ
２９４１  ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡ  ＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧ
３００１  ＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧ  ＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡ
３０６１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＧ  ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３１２１  ＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ
３１８１  ＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣ
３２４１  ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧ  ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３３０１  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＡＧＧＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡ
３３６１  ＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡ  ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ
３４２１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣ
３４８１  ＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣ
３５４１  ＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧ  ＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡ  ＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ
３６０１  ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ  ＧＡＡＡＧＴＡＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡ  ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ  ＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧ
３６６１  ＧＡＡＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡ  ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡ  ＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴ  ＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴ
３７２１  ＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡ  ＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧ  ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ  ＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴ
３７８１  ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡ  ＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ  ＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡ  ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴ
３８４１  ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＡＣＴＡＴＣＴＧＧＡ  ＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡ  ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡ
３９０１  ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴ  ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧ  ＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴ  ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴ  ＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡ
３９６１  ＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡ  ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ  ＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴ  ＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧ  ＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴ
４０２１  ＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣ  ＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ  ＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧ
４０８１  ＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣ  ＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧ  ＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣ  ＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴ  ＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ
４１４１  ＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴ  ＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡ
４２０１  ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣ  ＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡ  ＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴ
４２６１  ＣＣＴＣＴＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＡＧＣＡＴＣＧ  ＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴ  ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣ  ＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧ  ＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣ
４３２１  ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ  ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ
４３８１  ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ  ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ  ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ  ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ  ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ
４４４１  ＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号７４）の配列を含む、請求項１２８〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記外来配列が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む、請求項１２５〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記外来配列が、プロモーター配列をさらに含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
前記外来配列が、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列、任意選択で、ＧＲＫ１プロモーター配列を含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ＧＲＫ１プロモーター配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記外来配列が、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター配列を含む、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ＣＢＡプロモーター配列が、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれらからなる、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記外来配列が、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター配列、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター配列、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーター配列を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＡＢＣＡ４をコードする前記配列が、ヒトＡＢＣＡ４配列またはその変異体である、請求項１４３〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、請求項１４３〜１５４のいずれかに記載の方法。
【請求項１５６】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列またはそれらの変異体から誘導される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記５’ＩＴＲが、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３６）を含むか、またはそれからなる、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５８】
前記外来配列が３’ＩＴＲを含む、請求項１４３〜１５７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５９】
前記５’ＩＴＲが、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧ（配列番号３７）を含むか、またはそれからなる、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列を含む前記プラスミドベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１２５〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする前記配列及び前記ウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列が、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離または誘導される配列を含む、請求項１２５〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７３４，５０５号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年９月２３日作成の該ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＮＩＧＨ−０１５／００１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが３０８キロバイトである。
【０００３】
本開示は、ヒト治療薬、生物学的製剤、ヒトＤＮＡ配列のウイルス送達、及びそれらを製造する方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＡＡＶベースの送達ベクター及びこれらのＡＡＶベースの送達ベクターを製造する改善された方法に対するニーズは、長い間満たされていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を哺乳動物宿主細胞培養物から精製する方法を提供し、本方法は、（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して複数のｒＡＡＶ粒子を精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、（ｂ）（ａ）のＨＩＣ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を介して精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、（ｃ）複数のフルｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって（ｂ）のＣＥＸ溶出液から単離して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）からのＡＥＸ溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過し濃縮して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び最終製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、トランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞とウイルス放出溶液とを、複数のｒＡＡＶ粒子を採取培地に放出するのに好適な条件下で接触させて、複数のｒＡＡＶ粒子、ウイルス放出溶液、及び採取培地を含む組成物を生成するステップと、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して複数のｒＡＡＶ粒子を組成物から精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップをさらに含み、接触させるステップの前に、複数の哺乳動物宿主細胞は、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質またはその誘導体を含む。
【０００６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、安定化グルタミン、安定化グルタミンジペプチド、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅのうちの１つ以上を含む。
【０００７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチンジヒドロコロリド（ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含む。
【０００８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチドを含む。
【０００９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、無血清培地を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、無血清培地からなる。
【００１０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、無タンパク質培地を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、無タンパク質培地からなる。
【００１１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、清澄化培地を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、清澄化培地からなる。
【００１２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列は、（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列、（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列、及び（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列を含む。
【００１３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ロドプシンキナーゼプロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列は、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる。
【００１４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、コドン最適化ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。
【００１５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリＡシグナルをコードする配列は、
１  ｔｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む。
【００１７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列は、プロモーターをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＫプロモーターはＧＲＫ１プロモーターである。
【００１８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列は、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる。
【００１９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列は、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーターをコードする配列は、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれらからなる。
【００２０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、ヒトＡＢＣＡ４配列である。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜４５００を含む５’ヌクレオチド配列、またはいずれかのその３’短縮型変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３０００〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列、またはいずれかのその５’短縮型変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１９６〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３６０３〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１ヌクレオチド３６５３〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３６７８〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３７０２〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１を含む５’ヌクレオチド配列を含み、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２に対応するヒトＡＢＣＡ４核酸配列である。配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２と同一である。ＡＢＣＡ４コード配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜６９２６にわたる。
【００２２】
配列番号２は、次の突然変異：ヌクレオチド１６４０のＧ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９のＧ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３のＴ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。これらの突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変更せず、ゆえに配列番号２によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質と同一である。
【００２３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクターは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００２４】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コザック配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、コザック配列は、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００２５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、
１  ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧ  ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧ  ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣ
６１  ＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣ  ＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣ  ＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣ  ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧ
１２１  ＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡ  ＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴ  ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣ  ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧ  ＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣ  ＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴ
１８１  ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＣ  ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴ  ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣ  ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ  ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴ
２４１  ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧ  ＧＣＡＧＡＡＴＧＡＴ  ＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴ
３０１  ＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴ  ＧＴＣＴＴＴＴＴＣＴ  ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴ  ＴＧＣＣＡＣＴＣＣＴ  ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ
３６１  ＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣ  ＴＧＴＧＴＣＡＧＣＣ  ＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣ  ＣＡＴＧＡＧＡＧＡＧ
４２１  ＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡ  ＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡ  ＧＴＧＴＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣ  ＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴ
４８１  ＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣ  ＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡ  ＡＡＣＧＡＣＧＴＧＣ  ＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴ  ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＣ
５４１  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＡ  ＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴ  ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＣ  ＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧ  ＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣ
６０１  ＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣ  ＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧ  ＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴ  ＧＣＴＡＴＣＴＣＴＡ  ＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧ  ＣＧＴＧＡＡＧＧＣＡ
６６１  ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴ  ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣ
７２１  ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣ
７８１  ＡＣＴＧＡＧＧＡＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＴ  ＴＣＡＣＧＴＧＡＴＣ  ＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡ  ＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧ
８４１  ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧ  ＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧ  ＣＣＴＧＴＴＣＡＴＧ
９０１  ＴＧＧＧＧＡＧＡＴＡ  ＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧ  ＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧ  ＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴ  ＧＴＧＣＧＴＣＣＣＴ
９６１  ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡ  ＣＣＡＴＣＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴ  ＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＡＣＴＡ  ＴＣＡＴＡＧＣＧＣＣ
１０２１  ＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡ  ＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡ  ＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣ  ＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣ  ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧ  ＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣ
１０８１  ＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣ  ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧ  ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡ
１１４１  ＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣ  ＡＧＧＴＣＧＣＣＴＧ  ＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧ  ＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＴＣＣＴＧＡＣＴＧＡ  ＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧ
１２０１  ＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧ  ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡ  ＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ  ＧＡＡＣＣＴＴＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＡＧＡＣＡ
１２６１  ＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡ  ＡＡＧＴＧＡＴＣＧＡ  ＧＡＡＣＡＴＴＣＧＣ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＴＡ  ＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴ  ＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡ
１３２１  ＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡ  ＣＣＧＣＡＣＴＧＡＴ  ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＴ  ＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴ  ＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧ  ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡ
１３８１  ＣＡＣＧＧＧＡＡＧＣ  ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣ  ＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＧＴ
１４４１  ＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣ  ＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴ  ＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧ  ＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧ  ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＡ  ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ
１５０１  ＴＴＣＧＣＴＧＣＡＣ  ＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧ  ＣＧＴＧＧＣＴＡＡＧ  ＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴ  ＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴ  ＴＡＡＣＧＡＴＡＣＡ
１５６１  ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧ  ＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴ  ＣＣＴＧＣＣＡＴＡＣ  ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡ  ＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡ  ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧ
１６２１  ＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡ  ＧＴＧＣＡＡＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣ  ＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡ
１６８１  ＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ  ＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣ  ＴＡＴＣＧＡＧＧＧＡ  ＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ  ＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ  ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴ
１７４１  ＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴ  ＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧ  ＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧ  ＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧ  ＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴ  ＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧ
１８０１  ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡ  ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡ
１８６１  ＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴ  ＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧ  ＧＧＣＧＡＧＡＣＴＡ  ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴ  ＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡ
１９２１  ＣＡＣＡＴＴＡＴＧＴ  ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧ  ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＴＣＴＧＡＡＡＣ  ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴ  ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ
１９８１  ＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣ  ＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧ  ＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ  ＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡ  ＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴ
２０４１  ＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴ  ＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴ  ＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧ  ＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡ  ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡ  ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣ
２１０１  ＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡ  ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣ  ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣ  ＡＣＡＡＣＴＡＴＴＧ  ＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ  ＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡ
２１６１  ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣ  ＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡ  ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡ  ＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧ  ＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡ
２２２１  ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧ  ＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧ  ＡＡＡＧＴＣＣＡＣＧ  ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡ
２２８１  ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴ  ＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴ  ＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧ  ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴ  ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ  ＧＧＣＡＡＡＡＴＣＴ
２３４１  ＧＴＣＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧ  ＡＣＣＡＧＡＧＧＧＡ  ＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡ
２４０１  ＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧ  ＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡ  ＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＡＡＧＧＡ  ＴＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
２４６１  ＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧ  ＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧ  ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
２５２１  ＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡ  ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡ  ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣ  ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡ  ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣ
２５８１  ＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡ  ＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
２６４１  ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡ
２７０１  ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧ  ＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡ
２７６１  ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣ
２８２１  ＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧ  ＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧ
２８８１  ＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡ
２９４１  ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡ  ＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧ
３００１  ＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧ  ＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡ
３０６１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＧ  ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３１２１  ＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ
３１８１  ＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣ
３２４１  ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧ  ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３３０１  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＡＧＧＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡ
３３６１  ＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡ  ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ
３４２１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣ
３４８１  ＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣ
３５４１  ＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧ  ＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡ  ＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ
３６０１  ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ  ＧＡＡＡＧＴＡＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡ  ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ  ＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧ
３６６１  ＧＡＡＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡ  ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡ  ＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴ  ＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴ
３７２１  ＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡ  ＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧ  ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ  ＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴ
３７８１  ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡ  ＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ  ＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡ  ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴ
３８４１  ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＡＣＴＡＴＣＴＧＧＡ  ＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡ  ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡ
３９０１  ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴ  ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧ  ＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴ  ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴ  ＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡ
３９６１  ＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡ  ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ  ＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴ  ＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧ  ＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴ
４０２１  ＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣ  ＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ  ＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧ
４０８１  ＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣ  ＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧ  ＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣ  ＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴ  ＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ
４１４１  ＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴ  ＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡ
４２０１  ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣ  ＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡ  ＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴ
４２６１  ＣＣＴＣＴＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＡＧＣＡＴＣＧ  ＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴ  ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣ  ＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧ  ＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣ
４３２１  ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ  ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ
４３８１  ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ  ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ  ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ  ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ  ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ
４４４１  ＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号７４）の配列を含むか、またはそれからなる。
【００２６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。
【００２７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする配列及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離されるかまたはそれらに由来する配列を含む。
【００２８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、採取培地は、ＤＭＥＭ、４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチド、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを含む。
【００２９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）組成物）、リン酸カルシウム、脂質、細胞膜を横断することが可能なベクター（例えば、リポソーム、ミセル、ナノ粒子（例えば、炭素、ケイ素、ポリマー、及び金）のうちの１つ以上を含む組成物でトランスフェクトされている。いくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む組成物（すなわち、ＰＥＩ組成物）でトランスフェクトされている。
【００３０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ウイルス放出溶液は塩及び高ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、高ｐＨは塩基性ｐＨである。いくつかの実施形態では、高ｐＨは７．０超である。いくつかの実施形態では、高ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１．０、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２．０、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．０、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４．０以上のｐＨを含む。
【００３１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件は、哺乳動物宿主細胞を、インビボの生理を再現する条件で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、インビボの生理を再現する条件は、最小限にヒトの体内温度である温度での５％ＣＯ２を含む。いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件は、哺乳動物宿主細胞を１０％ＣＯ２以下のＣＯ２レベルでインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ヒトの体内温度は、少なくとも３６℃である。
【００３２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、（ａ）のＨＩＣステップは、（ｉ）ＨＩＣクロマトグラムを生成するステップと、（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣクロマトグラム上の画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣステップは、ＨＩＣクロマトグラムを生成する前に、採取培地を高塩濃度緩衝液中に希釈することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、段階勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、段階勾配は、各段階勾配で塩濃度が低下する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）のＣＥＸステップは、（ｉ）ＣＥＸクロマトグラムを生成するステップと、（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーは、ＳＯ３−陽イオン交換マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーステップは、ＣＥＸクロマトグラムを生成する前に、ＨＩＣ溶出液を低塩濃度緩衝液に調整することをさらに含む。いくつかの実施形態では、調整は希釈ステップを含む。いくつかの実施形態では、調整ステップはＴＦＦステップを含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、少なくとも７０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、少なくとも５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｋＤａのＨＦＦ、またはそれらの間の任意の数のｋＤａを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液のｐＨは、両端を含めてｐＨ３．０〜ｐＨ４．０に調整される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液のｐＨは、両端を含めてｐＨ３．５〜ｐＨ３．７に調整される。いくつかの実施形態では、ＣＥＸステップは、ＨＩＣ溶出液を濾過することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液を濾過することは、０．８／０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを含む。いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、段階勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、段階勾配は、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子は、線形勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、線形勾配は、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸステップは、ＣＥＸ溶出液のｐＨを中和することをさらに含む。いくつかの実施形態では、中和されたＣＥＸ溶出液のｐＨは、ｐＨ９．０である。
【００３３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、（ｃ）のＡＥＸクロマトグラフィーステップは、（ｉ）ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、（ｉｉ）フルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーは、陰イオン交換（ＱＡ）マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーステップは、ＡＥＸクロマトグラムを生成する前に、ＣＥＸ溶出液を低塩濃度緩衝液中に希釈することをさらに含む。いくつかの実施形態では、調整は希釈ステップを含む。いくつかの実施形態では、調整ステップはＴＦＦステップを含む。いくつかの実施形態では、調整ステップは、第１のＴＦＦステップ及び第２のＴＦＦステップを含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される。いくつかの実施形態では、希釈されたＣＥＸ溶出液は、ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子は、線形勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子は、段階勾配を使用して溶出される。いくつかの実施形態では、ＣＥＸステップは、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む溶出液のｐＨを中和することをさらに含む。
【００３４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、（ｄ）のＴＦＦステップは、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のＴＦＦステップをさらに含み、第１及び第２のＴＦＦステップ両方が、１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。いくつかの実施形態では、最終製剤緩衝液は、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、最終製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、最終製剤緩衝液は、ポロキサマー１８８を０．００１％でさらに含む。
【００３５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ポロキサマー１８８を最終組成物に添加することをさらに含む。
【００３６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び最終製剤緩衝液を含む最終組成物は、−８０℃で凍結される。
【００３７】
本開示は、本開示の方法によって生成された複数のｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。
【００３８】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）５０％未満の空キャプシドを含む。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または１×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）３０％未満の空キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または１×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）２５％未満の空キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または１×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）９９％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、またはその間の任意のパーセンテージ未満の空キャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約５×１０１２ｖｇ／ｍＬを含む。
【００３９】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または１×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）少なくとも７０％のフルキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または１×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び（ｂ）少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージのフルキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、５×１０１２ｖｇ／ｍＬを含む。
【００４０】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶの一部分は機能的ベクターゲノムを含み、各機能的ベクターゲノムは、形質導入後に細胞中で外来配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、機能的ベクターゲノムを含む複数のｒＡＡＶの部分は、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して２倍の増加で外来配列を発現する。いくつかの実施形態では、機能的ベクターゲノムを含む複数のｒＡＡＶの部分は、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれらの間の任意の他の倍増値の増加で外来配列を発現する。
【００４１】
複数のｒＡＡＶの一部分が機能的ベクターゲノムを含み、各機能的ベクターゲノムが形質導入後に細胞中で外来配列を発現することができる実施形態を含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは同一ではない。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは同一ではないが、外来配列によってコードされるタンパク質と内在配列によってコードされるタンパク質とは同一である。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。いくつかの実施形態では、外来配列は、内在配列と比較してコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する。
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いた細胞の形質導入後、外来配列はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、外来配列によってコードされるタンパク質は、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは同一である。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは同一でない。いくつかの実施形態では、外来配列と対応する内在配列とは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いた細胞の形質導入後、外来配列はタンパク質をコードする。
【００４２】
本方法が、複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップをさらに含み、接触させるステップの前に、複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する実施形態を含む、本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１、約１：１：１〜約１０：１：１、約２：１：１〜約１０：１：１、または約３：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約０．５：１：１、約１：１：１、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約３：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１０：１：１のモル比で提供される。
【００４３】
本方法が、複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップを含み、接触させるステップの前に、複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する実施形態を含む、本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター（ｐＩＴＲ）及びヘルパープラスミドベクター（ｐＨＥＬＰ）は、１：１〜２０：１９もしくは１：２０〜２０：１、または１：２０〜１：１（例えば、以下で表Ａに示される比のうちのいずれか）のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、ｐＩＴＲとウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクター（ｐＲＥＰＣＡＰ）とのモル比は、１：１〜２０：１９、または１：２０〜２０：１、または１：２０〜１：１（例えば、以下で表Ａに示される比のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約３：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１０：１：１のモル比で提供される。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＣａＰＯ４またはＰＥＩを使用して実施される。特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩを、それぞれ、約１：１〜約５：１、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比（ｍＬ：ｍｇ）で使用して実施される。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩを使用して実施され、ここでは、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１：１：１のモル比で提供される。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩを、それぞれ、約０．５：１〜５：１または約１：１〜約５：１、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比ｍＬ：ｍｇ）で使用して実施され、ここでは、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、約０．５：１：１〜約１０：１：１、約１：１：１〜約１０：１：１、約２：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約０．５：１：１、約１：１：１、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約３：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約１０：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約２：１：１、約約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、または約９：１：１のモル比で提供される。
【表Ａ−１】
2022501037.tif 000003
【表Ａ−２】
2022501037.tif 000004
【表Ａ−３】
2022501037.tif 000005
【００４４】
本方法が、複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップを含み、接触させるステップの前に、複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成し、プラスミドベクターとヘルパープラスミドベクターまたはＲｅｐＣａｐベクターとのモル比は、プラスミドベクターの値がヘルパープラスミドベクターまたはＲｅｐＣａｐベクターのいずれかよりも大きい、実施形態を含む、本開示の方法のいくつかの実施形態では、複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップは、トランスフェクション剤を含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション剤は、ポリエチレンイミンを含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション剤は、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）を含む。
【００４５】
ある特定の関連する実施形態では、本開示は、哺乳動物宿主細胞を、（ｉ）外来配列を含むプラスミドベクター、（ｉｉ）ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクター、ならびに（ｉｉｉ）ヘルパープラスミドベクターを用いてトランスフェクトすることを含む、組換えＡＡＶベクターを産生する方法を提供し、ここで、哺乳動物宿主細胞は、外来配列を含むプラスミドベクター、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクター、ならびにヘルパープラスミドを、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１、または約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で含む、トランスフェクション培地と接触する。いくつかの実施形態では、トランスフェクション培地は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びＣａＰＯ４から選択されるトランスフェクション剤を含む。ある特定の実施形態では、トランスフェクション剤はＰＥＩであり、トランフェクション培地は、ＰＥＩとＤＮＡとを、約５：１〜約１：１、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の比で含む。
【００４６】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列は、（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列、（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列、及び（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ロドプシンキナーゼプロモーターは、ＧＲＫ１プロモーター、例えば、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる、ＧＲＫ１プロモーターである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、本明細書に開示されるもののいずれかを含むがこれらに限定されない、コドン最適化されたヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である。
【００４８】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、本明細書に開示されるもののいずれかを含むがこれらに限定されない、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む。
【００４９】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクターは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む。他の実施形態では、ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２と比較して１つ以上の修飾、例えば、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、安定化したＩＴＲを産生するように、順方向及び逆方向の向きで、後に欠失を伴って、３’ＡＡＶ２  ＩＴＲに由来する。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００５０】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列は、コザック配列をコードする配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、コザック配列は、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）ヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列は、
１  ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧ  ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧ  ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣ
６１  ＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣ  ＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣ  ＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣ  ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧ
１２１  ＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡ  ＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴ  ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣ  ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧ  ＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣ  ＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴ
１８１  ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＣ  ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴ  ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣ  ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ  ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴ
２４１  ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧ  ＧＣＡＧＡＡＴＧＡＴ  ＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴ
３０１  ＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴ  ＧＴＣＴＴＴＴＴＣＴ  ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴ  ＴＧＣＣＡＣＴＣＣＴ  ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ
３６１  ＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣ  ＴＧＴＧＴＣＡＧＣＣ  ＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣ  ＣＡＴＧＡＧＡＧＡＧ
４２１  ＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡ  ＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡ  ＧＴＧＴＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣ  ＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴ
４８１  ＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣ  ＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡ  ＡＡＣＧＡＣＧＴＧＣ  ＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴ  ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＣ
５４１  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＡ  ＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴ  ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＣ  ＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧ  ＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣ
６０１  ＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣ  ＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧ  ＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴ  ＧＣＴＡＴＣＴＣＴＡ  ＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧ  ＣＧＴＧＡＡＧＧＣＡ
６６１  ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴ  ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣ
７２１  ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣ
７８１  ＡＣＴＧＡＧＧＡＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＴ  ＴＣＡＣＧＴＧＡＴＣ  ＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡ  ＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧ
８４１  ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧ  ＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧ  ＣＣＴＧＴＴＣＡＴＧ
９０１  ＴＧＧＧＧＡＧＡＴＡ  ＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧ  ＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧ  ＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴ  ＧＴＧＣＧＴＣＣＣＴ
９６１  ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡ  ＣＣＡＴＣＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴ  ＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＡＣＴＡ  ＴＣＡＴＡＧＣＧＣＣ
１０２１  ＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡ  ＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡ  ＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣ  ＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣ  ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧ  ＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣ
１０８１  ＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣ  ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧ  ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡ
１１４１  ＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣ  ＡＧＧＴＣＧＣＣＴＧ  ＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧ  ＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＴＣＣＴＧＡＣＴＧＡ  ＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧ
１２０１  ＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧ  ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡ  ＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ  ＧＡＡＣＣＴＴＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＡＧＡＣＡ
１２６１  ＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡ  ＡＡＧＴＧＡＴＣＧＡ  ＧＡＡＣＡＴＴＣＧＣ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＴＡ  ＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴ  ＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡ
１３２１  ＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡ  ＣＣＧＣＡＣＴＧＡＴ  ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＴ  ＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴ  ＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧ  ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡ
１３８１  ＣＡＣＧＧＧＡＡＧＣ  ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣ  ＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＧＴ
１４４１  ＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣ  ＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴ  ＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧ  ＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧ  ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＡ  ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ
１５０１  ＴＴＣＧＣＴＧＣＡＣ  ＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧ  ＣＧＴＧＧＣＴＡＡＧ  ＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴ  ＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴ  ＴＡＡＣＧＡＴＡＣＡ
１５６１  ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧ  ＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴ  ＣＣＴＧＣＣＡＴＡＣ  ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡ  ＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡ  ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧ
１６２１  ＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡ  ＧＴＧＣＡＡＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣ  ＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡ
１６８１  ＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ  ＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣ  ＴＡＴＣＧＡＧＧＧＡ  ＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ  ＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ  ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴ
１７４１  ＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴ  ＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧ  ＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧ  ＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧ  ＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴ  ＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧ
１８０１  ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡ  ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡ
１８６１  ＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴ  ＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧ  ＧＧＣＧＡＧＡＣＴＡ  ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴ  ＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡ
１９２１  ＣＡＣＡＴＴＡＴＧＴ  ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧ  ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＴＣＴＧＡＡＡＣ  ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴ  ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ
１９８１  ＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣ  ＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧ  ＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ  ＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡ  ＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴ
２０４１  ＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴ  ＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴ  ＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧ  ＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡ  ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡ  ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣ
２１０１  ＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡ  ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣ  ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣ  ＡＣＡＡＣＴＡＴＴＧ  ＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ  ＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡ
２１６１  ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣ  ＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡ  ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡ  ＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧ  ＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡ
２２２１  ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧ  ＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧ  ＡＡＡＧＴＣＣＡＣＧ  ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡ
２２８１  ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴ  ＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴ  ＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧ  ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴ  ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ  ＧＧＣＡＡＡＡＴＣＴ
２３４１  ＧＴＣＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧ  ＡＣＣＡＧＡＧＧＧＡ  ＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡ
２４０１  ＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧ  ＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡ  ＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＡＡＧＧＡ  ＴＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
２４６１  ＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧ  ＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧ  ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
２５２１  ＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡ  ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡ  ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣ  ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡ  ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣ
２５８１  ＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡ  ＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
２６４１  ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡ
２７０１  ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧ  ＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡ
２７６１  ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣ
２８２１  ＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧ  ＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧ
２８８１  ＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡ
２９４１  ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡ  ＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧ
３００１  ＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧ  ＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡ
３０６１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＧ  ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３１２１  ＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ
３１８１  ＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣ
３２４１  ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧ  ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３３０１  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＡＧＧＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡ
３３６１  ＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡ  ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ
３４２１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣ
３４８１  ＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣ
３５４１  ＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧ  ＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡ  ＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ
３６０１  ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ  ＧＡＡＡＧＴＡＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡ  ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ  ＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧ
３６６１  ＧＡＡＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡ  ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡ  ＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴ  ＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴ
３７２１  ＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡ  ＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧ  ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ  ＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴ
３７８１  ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡ  ＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ  ＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡ  ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴ
３８４１  ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＡＣＴＡＴＣＴＧＧＡ  ＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡ  ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡ
３９０１  ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴ  ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧ  ＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴ  ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴ  ＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡ
３９６１  ＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡ  ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ  ＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴ  ＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧ  ＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴ
４０２１  ＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣ  ＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ  ＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧ
４０８１  ＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣ  ＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧ  ＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣ  ＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴ  ＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ
４１４１  ＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴ  ＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡ
４２０１  ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣ  ＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡ  ＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴ
４２６１  ＣＣＴＣＴＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＡＧＣＡＴＣＧ  ＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴ  ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣ  ＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧ  ＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣ
４３２１  ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ  ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ
４３８１  ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ  ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ  ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ  ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ  ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ
４４４１  ＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号７４）の配列を含む。
【００５２】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、プロモーターをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外来配列は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターをコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＫプロモーターはＧＲＫ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列は、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ  
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ  
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号７５）を含むか、または
【００５３】
ある特定の実施形態では、外来配列は、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーターをコードする配列は、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号７６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号７７）、を含むか、またはそれからなる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、ヒトＡＢＣＡ４配列またはその変異体である。ある特定の実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示の方法は、本明細書に開示のデュアルベクターシステムに従って使用されてもよい上流及び／または下流のＡＢＣＡ４ベクターを産生するために使用される。特定の実施形態では、ＡＢＣＡ４ベクターには、図３０７〜３３５のうちのいずれかに開示されているもの、またはそこに開示されている配列を含むものが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。
【００５６】
本明細書に開示の組換えＡＡＶベクターを産生する方法の特定の実施形態では、ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする配列及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離されるかまたはそれらに由来する配列（その変異体を含む）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本特許のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面／写真を含む。カラー図面（複数可）／写真（複数可）を備えた本特許の複製は、要請、及び必要手数料の支払いに応じて、特許庁により提供されることになる。
図面のうちのいくつかはクロマトグラムである。概して、緑色の線は蛍光を示し、赤色の線は吸光度（２６０ｎｍ）を示し、青色の線は吸光度（２８０ｎｍ）を示し、黒色の線は導電度を示す。白黒で見ると、導電度線は典型的には低く始まり、時間の経過とともに増加し、吸光度（２６０ｎｍ）及び吸光度（２８０ｎｍ）の線は大いに互いを追う。
【図１】製造プロセスの例示的な細胞培養及び拡大プロセスを要約する図表である。接着細胞培養物を含有する血清中の細胞を、示されるステップをとおして継代し、拡大して、２０個のＨＹＰＥＲｓｔａｃｋ（３６層培養容器）に移入する。
【図２】プロセス内限界及び  ＱＣ試験を含むＡＡＶ８−ＲＰＧＲ上流製造プロセスの図式的概要である。
【図３】細胞解凍ステップの概略フロー図である。
【図４】細胞解凍プロセスのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図５】細胞解凍プロセスに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図６】一般的継代手順の概略フロー図である。
【図７】細胞継代レジームのための一般的な指針を示す表である。
【図８】細胞継代のための推奨試薬体積（ＨＢＳＳ、細胞解離溶液、及び成長培地）及び細胞播種密度を示す表である。
【図９】細胞解凍及び継代レジームに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図１０】製造プロセスのトランスフェクション及び採取ステップを要約する図表である。細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクションプロトコルを使用してトランスフェクトする。（１）ＤＮＡ及びＰＥＩｐｒｏ（登録商標）をトランスフェクション溶液中で別々に希釈する。（２）ＰＥＩ溶液を、ＤＮＡ溶液に滴加して、１０分間室温でインキュベートする。（３）ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液を、事前に調製したトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ＋４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチド＋１０％のＦＢＳ）に添加する。（４）成長培地（ＤＭＥＭ＋４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチド＋１０％のＦＢＳ）をＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出し、ＤＮＡ／ＰＥＩを含有するトランスフェクション培地を添加し、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、２４時間インキュベートする。（５）トランスフェクション培地をＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出し、採取培地（ＤＭＥＭ＋４  ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチド＋０％のＦＢＳ＋Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を添加し、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、７２時間インキュベートする。（６）ウイルス放出溶液をＨＹＰＥＲｓｔａｃｋに添加し、細胞を、５％のＣＯ２中で１８時間インキュベートして、ＡＡＶ粒子を放出させる。
【図１１】５×３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）ごとのリン酸カルシウム媒介トランスフェクション溶液を創出するための指導を示す表である。
【図１２】５×３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）ごとのＰＥＩｐｒｏ（登録商標）媒介トランスフェクション溶液を創出するための指導を示す表である。
【図１３】一過性トランスフェクション及び培地採取ステップの概略フロー図である。
【図１４】最初の培地交換に必要なクロロキン及び培地の体積を生成規模の関数として示す表である。
【図１５】トランスフェクション及び採取ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１６】リン酸カルシウム細胞トランスフェクションプロセスに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図１７】ＰＥＩ細胞トランスフェクションプロセスに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図１８】濾過清澄化ステップの概略フロー図である。
【図１９】清澄化濾過のためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図２０】清澄化濾過ステップに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図２１】製造プロセスの下流処理ステップ（ＤＳＰ）を要約する図表である。（１）ＡＡＶ粒子を含有する採取培地をＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから収集する。（２）希釈した採取培地を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製し、ＡＡＶ粒子を含むピークを選択し、溶出液を収集する。（３）希釈したＨＩＣ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によりさらに精製し、ｒＡＡＶ粒子を含むピークを選択肢、溶出液を収集する。（５）希釈したＣＥＸ溶出物を、勾配溶出を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によりフルｒＡＡＶ粒子について富化し、フルｒＡＡＶ粒子を含むピークを選択し、溶出液を収集する。（６）ＡＥＸ溶出液を濃縮し、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップを介して最終製剤緩衝液（ＦＦＢ）（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８なし）中に透析濾過する。（７）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ポロキサマー１８８とも称される）を添加し、原薬を−８０℃で凍結させる。
【図２２】ＱＣ試験及びプロセス内制御を含む、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ下流ならびに充填及び仕上げの製造プロセスの図式的概要である。
【図２３】Ａは、マクロ多孔性クロマトグラフィー技術の利点を示す表である。Ｂは、左から右に、膜、モノリス、及び従来のビーズを示す、クロマトグラフィー培地の一連の３枚の画像である。
【図２４Ａ】初期材料（フィンガープリント、総粒子、空／フル粒子）（採取）に対するＨＰＬＣ分析を示す一対のグラフである（左のグラフは分離法分析を示し、右のグラフはトータル分析を示す）。
【図２４Ｂ】初期材料（フィンガープリント、総粒子、空／フル粒子）（採取）に対するＨＰＬＣ分析を示す一対のグラフである（左のグラフは分離法分析を示し、右のグラフはトータル分析を示す）。
【図２５】ｒＡＡＶ−ＲＰＧＲ採取材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図２６】採取した培地及び清澄化後の採取した培地の試料からの全宿主ＤＮＡ及びタンパク質についての例示的な結果である。
【図２７】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ＡＡＶ捕捉プロセスを要約する表である。
【図２８】疎水性条件のための安定性試験手順を示す模式図である。
【図２９】図８９に概説するＨＩＣ手順からのクロマトグラムを示すグラフである。
【図３０】図８９に示す条件でのＯＤ６００測定による、採取時、濾過前（ＢＦ）、及び濾過後（ＡＦ）のＨＩＣの結果を示す表である。
【図３１】ロードの濾過を行わない場合のＨＩＣの実行条件を示す表である。
【図３２】図３１のＨＩＣ実行条件に対応する一対のクロマトグラフである。
【図３３】図３１及び図３２に示すＨＩＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す一対の写真である。
【図３４】リン酸カリウム（ＫＰ）沈殿を伴うＨＩＣを示す模式図である。タンパク質変性が低下し、タンパク質安定性が上昇する（天然）。
【図３５】図３４のＨＩＣ実験（Ｃ４  Ａカラム使用）に対応する一対のクロマトグラムである。
【図３６】図３４のＨＩＣ実験（ＯＨカラム使用）に対応する一対のクロマトグラムである。
【図３７】図９５〜９７に示すＨＩＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す一連の写真である。
【図３８】Ｃ４  Ａ及びＯＨカラムを使用する（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＰＫの結果を示す一連の表である。
【図３９】ＨＩＣ条件を示す模式図である。この図中のロード量は、図４０〜９６及び１０２のロード量である。
【図４０】図３９のＨＩＣ実験に対応する一対のクロマトグラムである。
【図４１】例えば、図３９及び４０に示すような、１ｍＬカラム上のＨＩＣのロード可能量を示す模式図である。
【図４２】初期材料ＨＰＬＣトータル分析のＦＬＤ応答を示す一対のクロマトグラムである。
【図４３】２つのＨＩＣ実験についての一対のｄｄＰＣＲ分析（各々につき表及びクロマトグラフ）である。ＨＩＣ−９はソルビトールなしで行った。ＨＩＣ−１０はソルビトールを使用して行った。
【図４４】２つのＨＩＣ実験についてのｄｄＰＣＲ分析を示す一対の表である。ＨＩＣ−１０はＯＨカラム上で行った。ＨＩＣ−１０はＣ４  Ａカラム上で行った。
【図４５】線形勾配溶出とＨＩＣ精製ステップのために最適化した段階溶出との比較を示す一対のグラフである。
【図４６】ＨＩＣ希釈緩衝液のモル濃度の比較によるＨＩＣ実験の頑健性を示す一連のクロマトグラムである。
【図４７】２ｍＬカラムでのＨＩＣ実験（ＨＩＣ−１６及びＨＩＣ−１７）の容量を示す一連のクロマトグラムである。
【図４８】ＨＩＣ−１８のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図４９】図４８に対応する一対のクロマトグラムである。
【図５０−１】ＨＩＣ−１８（ＯＨ  ８０−ｍＬ容量カラム上で実行）からのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図５０−２】ＨＩＣ−１８（ＯＨ  ８０−ｍＬ容量カラム上で実行）からのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図５１】ＨＩＣ−１９のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図５２】図５１に対応する一対のクロマトグラムである。
【図５３】ＨＩＣ−１９（段階溶出により実行）からのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図５４】それぞれ、ＨＩＣ−１８及びＨＩＣ−１９の伝導度測定値を提供する一対の表、ならびに図４９、５０、及び５１のＨＩＣ実験に対応するクロマトグラムである。
【図５５】ＨＩＣ−２０のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図５６】図５５に対応する一対のクロマトグラムである。
【図５７−１】ＨＩＣ−２０（ＯＨ  ８０−ｍＬ容量カラム上で実行）からのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図５７−２】ＨＩＣ−２０（ＯＨ  ８０−ｍＬ容量カラム上で実行）からのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図５８】図５７に対応するＨＩＣ−２０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図５９】カラムの種類、使用する緩衝液、及び２０個のＨＩＣ実験の各々の目的を要約する表である。
【図６０】それぞれ、クロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、例示的なＨＩＣ  ＡＡＶ捕捉ステップを示す。図６０Ａは、８０ｍＬカラムからのクロマトグラムを示す。ＨＩＣ捕捉ステップは、１ｍＬカラムから８０ｍＬカラムへと首尾よくスケールアップできた。図６０Ｂは、採取培地、フロースルー、ロード、及び溶出分画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。レーンは、左から右に、マーカー、投入採取培地、ロード、フロースルー（ＦＴ）、Ｗ、画分Ｅ１、Ｅ２、２倍希釈したＥ２（Ｅ２．２Ｘ）、２倍希釈したＥ３（Ｅ３．２Ｘ）、クリーンインプレイス（ＣＩＰ）、及び２倍希釈したクリーンインプレイス（ＣＥＰ．２Ｘ）を示す。ＡＡＶ粒子を含むＥ２画分は緑色で囲み、採取培地レーンは赤色で囲んである。    （図６０Ｂ）それぞれ、クロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、例示的なＨＩＣ  ＡＡＶ捕捉ステップを示す。図６０Ａは、８０ｍＬカラムからのクロマトグラムを示す。ＨＩＣ捕捉ステップは、１ｍＬカラムから８０ｍＬカラムへと首尾よくスケールアップできた。図６０Ｂは、採取培地、フロースルー、ロード、及び溶出分画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。レーンは、左から右に、マーカー、投入採取培地、ロード、フロースルー（ＦＴ）、Ｗ、画分Ｅ１、Ｅ２、２倍希釈したＥ２（Ｅ２．２Ｘ）、２倍希釈したＥ３（Ｅ３．２Ｘ）、クリーンインプレイス（ＣＩＰ）、及び２倍希釈したクリーンインプレイス（ＣＥＰ．２Ｘ）を示す。ＡＡＶ粒子を含むＥ２画分は緑色で囲み、採取培地レーンは赤色で囲んである。
【図６１】ＨＩＣステップのための勾配（図６１Ａ）及びアイソクラティック溶出（図６１Ｂ）プロトコルを示す一対のクロマトグラムである。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３画分を囲んである。    （図６１Ｂ）ＨＩＣステップのための勾配（図６１Ａ）及びアイソクラティック溶出（図６１Ｂ）プロトコルを示す一対のクロマトグラムである。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３画分を囲んである。
【図６２】２ステップ対３ステッププロセスの論拠を示す一対のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ａは、例示的なＨＩＣ溶出を示す。Ｂは、コンセプトランのＡＥＸのフルから空への分離の証拠を示す。キャプシドを含有する画分を赤色で囲み（図６２Ａ）、ＡＥＸステップ後の空及びフルキャプシドを含有する画分を赤色（左）及び緑色（右）（図６２Ｂ）で囲んである。ＨＩＣ及びＡＥＸ  ＱＡ精製生成物のＨＩＣステップ中の純度及びその後の純度は不十分であった。中間研磨ステップ（ＣＥＸ陽イオン交換、ＳＯ３−）が必要である。    （図６２Ｂ）２ステップ対３ステッププロセスの論拠を示す一対のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ａは、例示的なＨＩＣ溶出を示す。Ｂは、コンセプトランのＡＥＸのフルから空への分離の証拠を示す。キャプシドを含有する画分を赤色で囲み（図６２Ａ）、ＡＥＸステップ後の空及びフルキャプシドを含有する画分を赤色（左）及び緑色（右）（図６２Ｂ）で囲んである。ＨＩＣ及びＡＥＸ  ＱＡ精製生成物のＨＩＣステップ中の純度及びその後の純度は不十分であった。中間研磨ステップ（ＣＥＸ陽イオン交換、ＳＯ３−）が必要である。
【図６３】ＨＩＣ捕捉ステップの後である濾過ステップの最適化を示すグラフである。Ｘ軸上に、異なる種類のフィルタを示す：ＰＥＳ＝ポリエーテルスルホン、ＣＡ＝酢酸セルロース、ＧＦ＝ガラス繊維、ＰＶＤＦ＝フッ化ポリジビニル、ＰＴＦＥ＝ポリテトラフルオロエチレン、ＭＶ＝混合エステル、ＲＣ＝再生セルロース。ｙ軸上に、各フィルタ種についてのＡＡＶ粒子の平均回収（％）を示す。橙色のバーは、スケールアップが制限されるオプション（ＰＶＤＦ及びＰＴＦＥ）のフィルタを示す。
【図６４】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用するｒＡＡＶ粒子の捕捉を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１６Ａでは、ｍＡＵ単位の吸光度を、５０きざみで０〜３００まで、ｙ軸上に示す。ｒＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ２及びＥ３を、それぞれ深緑色及び薄緑色で囲む。洗浄、溶出、及びＣＩＰ画分を、Ｘ軸に示す。    （図６４Ｂ）図６４Ａからの溶出画分の純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ｒＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ２を示すレーンを囲んである。２×は２倍希釈を示す。
【図６５】例示的なＨＩＣステップのステップ回収率を示すクロマトグラム及び表である。    （図６５Ｂ）例示的なＨＩＣステップのステップ回収率を示すクロマトグラム及び表である。
【図６６】ＨＩＣを使用して精製したＡＡＶ粒子を示す透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）のクロマトグラム及び顕微鏡写真の３枚の画像である。図６６Ａは、例示的なＨＩＣステップにおける精製されたＡＡＶ粒子の溶出を示すクロマトグラムである。ＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５を、ｘ軸上の括弧で示す。図６６Ｂは、Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５画分中の溶出されたＡＡＶ粒子のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。スケールバーは２００ｎｍを示す。    （図６６Ｂ）ＨＩＣを使用して精製したＡＡＶ粒子を示す透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）のクロマトグラム及び顕微鏡写真の３枚の画像である。図６６Ａは、例示的なＨＩＣステップにおける精製されたＡＡＶ粒子の溶出を示すクロマトグラムである。ＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５を、ｘ軸上の括弧で示す。図６６Ｂは、Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５画分中の溶出されたＡＡＶ粒子のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。スケールバーは２００ｎｍを示す。
【図６７】２つの異なる倍率でのＥ３、Ｅ４、及びＥ５  ＨＩＣ画分の一連の６枚のＴＥＭ顕微鏡写真である。上の行のスケールバーは、左から右に、０．５μＭ、０．５μＭ、及び５００ｎＭを示す。下の行のスケールバーは２００ｎｍを示す。
【図６８】ＡＡＶ中間精製のための陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）プロセスを要約する表である。
【図６９】ｐＨ４．０（ＳＯ３−１）またはｐＨ３．５（ＳＯ３−２）のいずれかで行った開発中間精製ステップＳＯ３を示す一対のクロマトグラムである。
【図７０】ｐＨ３．５（ＳＯ３−２）で行った中間精製ＳＯ３ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図７１−１】ＳＯ３−２についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図７１−２】ＳＯ３−２についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図７２】ＳＯ３−３のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図７３】図７２に対応する一対のクロマトグラムである。
【図７４−１】ＳＯ３−３についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図７４−２】ＳＯ３−３についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一対の表及びクロマトグラムである。
【図７５】ＳＯ３−４のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図７６】図７５に対応する一対のクロマトグラムである。
【図７７】ＳＯ３−４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図７８】ｐＨ３．８（ＳＯ３−５）またはｐＨ３．６（ＳＯ３−７）のいずれかで行った開発中間精製ステップＳＯ３を示す一対のクロマトグラムである。
【図７９】図６９〜７８の条件を使用するＨＩＣ実験の好ましいまたは最適なｐＨが、ｐＨ３．６±０．１であることを示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図８０】ＳＯ３についてのカラム容量定量の分析である。
【図８１】ロード材料の濾過を行わない容量ランであるＳＯ３−９のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図８２】図１３５に対応する一対のクロマトグラムである。
【図８３】ロード材料の濾過を行わない容量ランであるＳＯ３−１０のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図８４】図１３５に対応する一対のクロマトグラムである。
【図８５】ＳＯ３−７、ＳＯ３−９、及びＳＯ３−１０を比較する一連のクロマトグラムである。
【図８６】ＳＯ３−９及びＳＯ３−１０のＨＰＬＣ分析を示す一対の表である。
【図８７】ＳＯ３−１１のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図８８】図１４１に対応するクロマトグラムである。
【図８９】ポロキサマー、ＳＯ３−７なし（左のグラフ及びクロマトグラム）またはポロキサマーＳＯ３−１１あり（右のグラフ及びクロマトグラム）のいずれかの一対のｄｄＰＣＲ分析である。
【図９０】ＳＯ３−１２のクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図９１】ＳＯ３−１２ロード試料及びＳＯ３−１２  ＦＴ試料を示す写真である。
【図９２】図９０に対応する一対のクロマトグラムである。
【図９３】ＨＩＣ−２０（左のグラフ及びクロマトグラム）またはＳＯ３−１２（右のグラフ及びクロマトグラム）のいずれかの一対のｄｄＰＣＲ分析である。
【図９４】ＳＯ３−１２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。
【図９５】カラムの種類、使用する緩衝液、及び１２個のＳＯ３実験の各々の目的を要約する表である。
【図９６】中間精製ＳＯ３−１２後の材料のフル：空の比を決定するＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９７】ＳＯ３−カラムマトリックスを使用するＣＥＸによる習慣研磨ステップを示す、それぞれ、クロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ａは、ｒＡＡＶ粒子を含有する画分を囲んだ、ｐＨ３．６のＳＯ３について拡大表示したクロマトグラムを示す。Ｂは、ｐＨ３．５（Ｅ２）、ｐＨ３．６（ＳＯ３  ７  Ｅ２）、ｐＨ３．８（ＳＯ３−５  Ｅ２）、及びｐＨ４．０（Ｅ２）の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。本試料中の全てのタンパク質バンドを露出させるために、全てのゲルをわずかに過剰に現像した。ｐＨがより低い試料では、ｐＨがより高い試料中よりも、存在する汚染物質がわずかに少ない。最適なｐＨは３．６±０．１である。
【図９８】ＣＥＸステップのｐＨ最適化を示す、一対のクロマトグラム（Ａ、Ｃ）及びクロマトグラムに対応する一対のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂ、Ｄ）である。Ａ、Ｂは、ｐＨ４．０であり、Ｃ、Ｄは、ｐＨ３．５である。
【図９９】ＳＯ３  ＣＥＸ溶出液の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を示す、一連の２枚の透過電子顕微鏡写真（Ａ〜Ｂ）及び表（Ｃ）である。試料中、ＡＡＶの２１．８％がフルでも空でもなかった。青色の矢印はフルキャプシドＡＡＶを示し、赤色の矢印は空キャプシドＡＡＶを示し、緑色の矢印は不明確な（フルでも空でもない）ＡＡＶを示す。
【図１００】それぞれ、ＡＡＶ中間（研磨）精製ステップにおけるＡＡＶ粒子ＣＥＸの溶出を示すクロマトグラム及びＳＤＳ  ｐａｇｅゲルである。Ａでは、ｙ軸は、ｍＡＵ単位の吸光度を示し、５００きざみで０〜２５００まで示される。洗浄、溶出、及びＣＩＰ画分を、ｘ軸に示す。ＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ２及びＥ３を、それぞれ深緑色及び薄緑色で囲む。Ｂでは、Ａからの溶出画分の純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ２を示すレーンを囲んである。２×及び１０×は、それぞれ、２倍及び１０倍希釈を示す。
【図１０１】ｒＡＡＶ  フル粒子の富化のための陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）プロセスを要約する表である。
【図１０２】ＭｇＣｌ２を含まない異なるｐＨの緩衝液を使用する中間精製（ＳＯ３−１２）後の材料のＱＡ溶出プロファイルを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０３】それぞれ、ｐＨ及びＭｇＣｌ２濃度の関数としてフル及び空のピークの分解能を示すクロマトグラム及びヒートプロットである。Ａは、様々な濃度のＭｇＣｌ２によるｐＨ９．５での重ね合わせたＡＥＸ  ＱＡマトリックスクロマトグラム（Ａ２６０シグナル）を示す。黒色の矢印は、０ｍＭのＭｇＣｌ２を示し、橙色の矢印は２ｍＭのＭｇＣｌ２を示し、青色の矢印は１ｍＭのＭｇＣｌ２を示す。Ｂは、フル粒子と空粒子とを分離する能力を例解するヒートプロットであり、一方の軸がｐＨ、他方の軸がＭｇＣｌ２である。分離は、最小（紫色）から最大（白色）まで、色で示される。最適な分離は、ｐＨ９．０及び０ｍＭのＭｇＣｌ２で見られる。
【図１０４】それぞれ、ＡＥＸを使用するフルＡＡＶ粒子の富化を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ａでは、ｙ軸は、ｍＡＵ単位の吸光度を示し、５０きざみで０〜１００まで示される。画分Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、及びＥ６が、Ｘ軸に示される。フルＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ３を囲んである。Ｂは、図１０４Ａからの溶出画分の純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。フルｒＡＡＶ粒子を含有する画分ＱＡ２  Ｅ３を囲んである。
【図１０５】フル粒子富化ステップを要約する、２つのクロマトグラム（Ａ、Ｄ）、３つの表（Ｂ、Ｃ、Ｆ）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｅ）である。Ａは例示的なＡＥＸ  ＱＡ−２クロマトグラムであり、一方でＤは、Ａのクロマトグラムの拡大である。Ｂは、分光光度法によるフル粒子純度予測を要約する表である。Ｅ３画分に見られる約１．３のＡ２６０：Ａ２８０比は、フル粒子の割合が高いことを示す。Ｃは、ＱＡ２  Ｅ２及びＥ３  ＡＥＸ画分のＨＰＬＣによるフル粒子含有量予測を要約する表である。Ｅは、ＱＡ２  ＡＥＸロード、溶出液、及びＣＩＰ画分を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。フルＡＡＶ粒子を含有する画分Ｅ３を囲んである。Ｆは、ＨＰＬＣによる各画分におけるフル粒子回収率を要約する表である。
【図１０６】それぞれ、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によるフルＡＡＶ粒子の富化を示すＴＥＭ顕微鏡写真及び２つの表である。Ａは、ｒＡＡＶ粒子を示すＱＡ２  Ｅ３画分のＴＥＭ顕微鏡写真である。スケールバーは２００ｎｍを示す。Ｂは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるＡＡＶ粒子の力価を示す。Ｅ３画分を緑色の囲みで示す。Ｃは、画分ＡＱ２Ｅ３（ＱＡ２  Ｅ３とも称される）について、計数されたウイルスの数、百分率によるフル及び部分粒子のパーセント、ならびに百分率による空／損傷粒子の予測数を示す。
【図１０７】製造プロセスの各ステップでの予期される収率を示す表である。
【図１０８Ａ】試料Ｓ０３−１４  Ｅ１、ＱＡ−３（Ａ）、ＱＡ−４（Ｂ）、ＱＡ−５（Ｃ）、及びＱＡ−６（Ｄ）についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一連のグラフである。
【図１０８Ｂ】試料Ｓ０３−１４  Ｅ１、ＱＡ−３（Ａ）、ＱＡ−４（Ｂ）、ＱＡ−５（Ｃ）、及びＱＡ−６（Ｄ）についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一連のグラフである。
【図１０８Ｃ】試料Ｓ０３−１４  Ｅ１、ＱＡ−３（Ａ）、ＱＡ−４（Ｂ）、ＱＡ−５（Ｃ）、及びＱＡ−６（Ｄ）についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一連のグラフである。
【図１０８Ｄ】試料Ｓ０３−１４  Ｅ１、ＱＡ−３（Ａ）、ＱＡ−４（Ｂ）、ＱＡ−５（Ｃ）、及びＱＡ−６（Ｄ）についてのｄｄＰＣＲ結果を示す一連のグラフである。
【図１０９】ＱＡ−３〜ＱＡ−８についてのＴＥＭ結果を提供するチャートである。全ての試料は透明で、不純物はなく、試料ＳＯ３−１４、ＱＡ−３  Ｅ３、ＱＡ−６  Ｅ３、及びＱＡ−８  Ｅ３では、粒子の凝集はほとんど認められなかった。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、全てのＱＡ試料で類似していた（７１〜７７％）ものの、ＳＯ３−１４試料では低かった（４６％）。粒子の一部は、フルにも空にも分類されなかった。ウイルスの第３のグループが導入された（未分類）。このグループのウイルスは、表面全体において電子透過性ではなかったが、表面に電子密度の高いスポットを示しただけであった。そのようなウイルスは、フルであるか、完全にフルではないか、正しく形成されていなか、または損傷している可能性がある。
【図１１０】ＱＡ−７（容量）及びＱＡ−８（一定条件）下での空粒子及びフル粒子の精製の比較を示すクロマトグラム及び対応する表である。
【図１１１】ＱＡ−８の精製を示す一対のクロマトグラムである。下のクロマトグラムは、上のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１１２Ａ】ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ結果を提供する一連の表である。ＱＡ−７以降の分取ランは、分析カラム（ＱＡ−２μｍポアの０．１ｍＬ）を使用して実行した。
【図１１２Ｂ】ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ結果を提供する一連の表である。ＱＡ−７以降の分取ランは、分析カラム（ＱＡ−２μｍポアの０．１ｍＬ）を使用して実行した。
【図１１２Ｃ】ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ結果を提供する一連の表である。ＱＡ−７以降の分取ランは、分析カラム（ＱＡ−２μｍポアの０．１ｍＬ）を使用して実行した。
【図１１３】ＱＡ−７及びＱＡ−８の各々について、精製の各ステップで見出されたタンパク質の存在を示す一対のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析である。
【図１１４】ＱＡ−８ランからのフル画分（Ｅ３）を示す一対のＴＥＭ顕微鏡写真及び対応する表である。
【図１１５】Ｓ０３  １５のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１１６】Ｓ０３１５の精製を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１１７Ａ】ＳＯ３  １５のＨＰＬＣ（Ａ）及びｄｄＰＣＲ（Ｂ）の結果を提供する一対の表である。
【図１１７Ｂ】ＳＯ３  １５のＨＰＬＣ（Ａ）及びｄｄＰＣＲ（Ｂ）の結果を提供する一対の表である。
【図１１８】ＱＡ−９のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１１９】ＱＡ−９を使用する精製を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１２０】ＱＡ−１０のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１２１】ＱＡ−１０を使用する精製を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１２２】ＱＡ−１１のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１２３】ＱＡ−１１を使用する精製を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１２４】ＱＡ−１２のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１２５】ＱＡ−１２を使用する精製を示すクロマトグラムである。
【図１２６】ＱＡ−９を使用する空／フルの比を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１２７】ＱＡ−９を使用する空／フルの比を示すクロマトグラムである。
【図１２８】ＱＡ−１０を使用する空／フルの比を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１２９】ＱＡ−１０を使用する空／フルの比を示すクロマトグラムである。
【図１３０】ＱＡ−１１を使用する空／フルの比を示す一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１３１】ＱＡ−１１を使用する空／フルの比を示すクロマトグラムである。
【図１３２Ａ】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１からのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣの結果を提供する一連の表である。
【図１３２Ｂ】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１からのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣの結果を提供する一連の表である。
【図１３２Ｃ】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１からのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣの結果を提供する一連の表である。
【図１３２Ｄ】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１からの空／フルの比、純度、及び回収率を提供する表である。
【図１３３】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１分取ランからの溶出特性を提供する表である。
【図１３４】ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１分取ランを使用するタンパク質精製を示す一連のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析である。
【図１３５】Ｓ０３−１５  Ｅ１、ＱＡ−９、ＱＡ−１０、及びＱＡ−１１からの精製されたウイルスを精製しＴＥＭ分析した後のウイルス計数、フルのパーセント、空のパーセント、及び未分類のパーセントを提供する表である。全ての試料に小さい凝集が含まれており、これは、損傷したまたは完全に形成されていないウイルスで大部分が構成されていた。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、ＱＡ−１０及びＱＡ−１１試料で類似していた（７４％）ものの、ＳＯ３−１４試料では低く（４５％）、試料ＱＡ−９  Ｅ３では高かった。粒子の一部は、フルにも空にも分類されなかった。ウイルスの第３のグループが導入された（未分類）。このグループのウイルスは、表面全体において電子透過性ではなかったが、表面に電子密度の高いスポットを示しただけであった。そのようなウイルスは、フルであるか、完全にフルではないか、正しく形成されていなか、または損傷している可能性がある。
【図１３６】ＱＡ−１３のためのクロマトグラフィー条件を提供する表である。
【図１３７】分画方法を明らかにするＱＡ−１３の一対のクロマトグラムである。下方のクロマトグラムは、上方のクロマトグラムをより高倍率にしたものである。
【図１３８】製剤緩衝液へのＴＦＦ交換のための条件を提供する表である。
【図１３９】ＭＡＬＳ検出器分析と組み合わせたＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆを示す一連のクロマトグラムである。
【図１４０】ＭＡＬＳ検出器分析と組み合わせたＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆを示す一連のクロマトグラムである。
【図１４１】ＱＡ−１３を使用するウイルス精製の各ステップについての空／フルの比、純度、及び回収率を要約する表である。
【図１４２】試料Ｓ０３−１４、ＱＡ−３、ＱＡ−４、ＱＡ−５、ＱＡ−６、及びＱＡ−８の各々の組成物を要約する表である（図１４２〜１５６に関連）。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による分析のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５つの試料及び１つの追加の試料を分析して、ウイルスの完全性を判断し、フル／空の粒子間の関係を評価した。
【図１４３】低倍率で観察したときにウイルスがグリッド全体に均一に広がっていることを示すＴＥＭ顕微鏡写真である（Ｓ０３−１４）。図１４３〜１７０について、試料を、逆染色法を使用するＴＥＭによる検査のために調製した。解凍した試料を緩徐に混合し、グロー放電したばかりのコッパーグリッド（４００メッシュ、ホルムバール−炭素コーティング）に５分間適用し、洗浄し、１滴の酢酸ウラニルの１％（ｗ／ｖ）水溶液１滴で染色した。各試料について、２つのグリッドを調製した。透過電子顕微鏡Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ  １００（ＦＥＩ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を８０ｋＶで操作して、グリッドを観察した。少なくとも１０個のグリッド正方形をくまなく検査し、多数の顕微鏡写真（カメラＯＲＩＵＳ  ＳＣ  ２００、Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．）を撮影して、フル粒子と空粒子との間の関係を評価した。顕微鏡写真は、グリッド上の異なる場所で同時に撮影した。
【図１４４】試料ＳＯ３−１４の一対の代表的な顕微鏡写真であり、小さい凝集が存在する（黒色の矢印）。不純物は検出されず、わずかな小さい凝集しか認められなかった。
【図１４５】フルにも空／損傷にも分類することができなかった粒子（白色の矢印）を示す顕微鏡写真である。
【図１４６】試料ＱＡ３−Ｅ３において、試料ＳＯ３−１４と比較してより多くの凝集が存在し、凝集がわずかに大きくなり得たことを示す一対の顕微鏡写真である。他の不純物は見つからなかった。
【図１４７】黒色の矢印で指し示した空／損傷粒子及び白色の矢印で指し示した未分類粒子を示す一対の顕微鏡写真である。未分類粒子は、フルウイルスを表し得るが、完全であるようには見受けられなかった。
【図１４８】ウイルス（ＱＡ−４  Ｅ３）がグリッド全体に均一に広がったことを示す顕微鏡写真である。不純物も凝集も見出されなかった。
【図１４９】フル、空、及び未分類の粒子を示すＱＡ−４  Ｅ３の一対の代表的な顕微鏡写真である。
【図１５０】フル、空、及び未分類の粒子を示すＱＡ−５  Ｅ３の一対の代表的な顕微鏡写真である。不純物も凝集も見出されなかった。空／損傷粒子を黒色の矢印で指し示し、未分類粒子を白色の矢印で指し示す。未分類粒子は、フルウイルスを表し得るが、完全であるようには見受けられなかった。
【図１５１】フル、空、及び未分類の粒子を低倍率で示すＱＡ−５  Ｅ３の代表的な顕微鏡写真である。
【図１５２】フル、空、及び未分類の粒子を示すＱＡ−６  Ｅ３の一対の代表的な顕微鏡写真である。不純物も凝集も見出されなかった。ウイルスは均一に広がり（左の顕微鏡写真）、少数の凝集が存在した（右の顕微鏡写真）。
【図１５３】フル／空の比の評価に選択した試料ＱＡ−６  Ｅ３の一対の代表的な顕微鏡写真であり、空／損傷粒子を黒色の矢印で、未分類粒子を白色の矢印で指し示す。
【図１５４】低倍率で観察したＱＡ−８  Ｅ３ウイルスの顕微鏡写真である。試料には不純物はなかったが、いくつかの小さい凝集が含まれていた。
【図１５５】試料ＱＡ−８  Ｅ３の一対の代表的な顕微鏡写真であり、小さい凝集（黒色の矢印）に損傷したウイルスが含まれている。
【図１５６】フル粒子と空／損傷粒子との比を提供する表である。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、同じ倍率で撮影された選択された顕微鏡写真中の粒子を計数することによって決定した。試料ＳＯ３−１４は、４６％のフルウイルスを含み、全ての他の試料は、より高くより類似した％のフルウイルス（７１〜７７％）を含んだ。全ての試料は透明で、不純物はなく、試料ＳＯ３−１４、ＱＡ−３  Ｅ３、ＱＡ−６  Ｅ３、及びＱＡ−８  Ｅ３では、粒子の凝集はほとんど認められなかった。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、全てのＱＡ試料で類似していた（７１〜７７％）ものの、ＳＯ３−１４試料では低かった（４６％）。
【図１５７】図１５７〜１６９について分析に使用した各試料の組成を提供する表である。
【図１５８】低倍率で観察された希釈されていない試料のＳ０３−１５  Ｅ１ウイルスを示す代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。ウイルスは全体に均一に広がった。試料を、逆染色法を使用するＴＥＭによる検査のために調製した。解凍した試料を緩徐に混合し、グロー放電したばかりのコッパーグリッド（４００メッシュ、ホルムバール−炭素コーティング）に５分間適用し、洗浄し、１滴の酢酸ウラニルの１％（ｗ／ｖ）水溶液１滴で染色した。各試料について、３つのグリッドを、１つは希釈せず、２つは希釈して調製した。試料は０．１ＭのＰＢで希釈した。透過電子顕微鏡Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ  １００（ＦＥＩ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を８０ｋＶで操作して、グリッドを観察した。少なくとも１０個のグリッド正方形をくまなく検査し、数枚の顕微鏡写真（カメラＯＲＩＵＳ  ＳＣ  ２００、Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．）を撮影して、フル粒子と空粒子との間の比を評価した。顕微鏡写真は、グリッド上の異なる場所で同時に撮影した。
【図１５９】試料ＳＯ３−１５の一対の代表的な顕微鏡写真であり、左は希釈されていない試料、右は希釈されている試料である。ウイルスはグリッド全体に均一に広がった。
【図１６０】試料ＳＯ３−１５の一対の代表的な顕微鏡写真であり、左は希釈されていない試料、右は希釈されている試料である。ウイルスはグリッド全体に均一に広がり、いくつかの小さい凝集が希釈されていない試料及び希釈されている試料に存在した（白色の矢印）。
【図１６１】低倍率で観察した、非希釈試料（左）及び希釈試料（右）のＱＡ−９  Ｅ３ウイルスの一対の代表的な顕微鏡写真である。ウイルスは均一に広がり、少数の凝集しか見ることができなかった。他の不純物は存在しなかった。
【図１６２】計数のために選択した非希釈試料（左）及び希釈試料（右）のＱＡ−９  Ｅ３ウイルスの一対の代表的な顕微鏡写真である。ウイルスは均一に広がり、少数の凝集しか見ることができなかった。他の不純物は存在しなかった。
【図１６３】ＱＡ−９  Ｅ３ウイルスの一対の代表的な顕微鏡写真である。ウイルスの大部分は特徴的な形状をしたフルであり（左）、小さい凝集は損傷粒子を含んだ（右）。
【図１６４】低倍率で観察した、非希釈試料（左）及び希釈試料（右）のＱＡ−１０  Ｅ３ウイルスの一対の代表的な顕微鏡写真である。試料ＱＡ−１０  Ｅ３を有する全てのグリッドが適切な品質を示した。いくつかの小さい凝集のほかに、完全に崩壊したウイルスを表し得る他の構造が見出された（図１６５、右の顕微鏡写真）。そのような構造は、試料の３つ全てのグリッドに存在したが、グリッドのごく一部にのみ結合していた。試料ＱＡ−１０  Ｅ３は、試料ＱＡ−９  Ｅ３と比較してより多くの損傷粒子を含んだ。
【図１６５】希釈試料ＱＡ−１０  Ｅ３のＱＡ−１０  Ｅ３ウイルスの一対の代表的な顕微鏡写真であり、ほぼ完全に損傷したウイルスを示し（左）、右の顕微鏡写真は、ほぼ確実に破壊されたウイルスの残りである。
【図１６６】ウイルスの計数のために選択した非希釈試料ＱＡ−１０  Ｅ３の代表的な顕微鏡写真である。２１枚の顕微鏡写真を粒子の計数及びフルウイルスと空／損傷ウイルスとの比の計算に使用した。
【図１６７】低倍率で観察した非希釈試料のＱＡ−１１  Ｅ３ウイルスの代表的な顕微鏡写真である。試料ＱＡ−１１  Ｅ３には小さい凝集が含まれた。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、同じ倍率で撮影された３３枚の顕微鏡写真中の粒子を計数することで決定した。
【図１６８】計数のために選択したＱＡ−１１  Ｅ３ウイルス非希釈試料（左）及び希釈試料（右）の一対の代表的な顕微鏡写真である。
【図１６９】各試料についてのフル粒子と空／損傷粒子との比を提供する表である。同じ倍率で撮影された選択された顕微鏡写真中の粒子を計数することによるフルウイルスと空／損傷ウイルスとの比。粒子を、フル、未分類、合わせた空及び損傷の３つのグループに分類した。試料ＳＯ３−１５  Ｅ１は４５％のフルウイルスを含み、試料ＱＡ−９  Ｅ３  ８０％、試料ＱＡ−１０  Ｅ３及びＱＡ−１１  Ｅ３は、フル／空の比の点で類似していた（７４％のフルウイルス）。全ての試料に小さい凝集が含まれており、これは、損傷したまたは完全に形成されていないウイルスで大部分が構成されていた。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は、ＱＡ−１０及びＱＡ−１１試料で類似していた（７４％）ものの、ＳＯ３−１４試料では低く（４５％）、試料ＱＡ−９  Ｅ３では高かった。粒子の一部は、フルにも空にも分類されなかったため、それらを「未分類」として第３のグループに入れた。このグループのウイルスは、表面全体において電子透過性ではなかったが、表面に電子密度の高いスポットを示しただけであった。そのようなウイルスは、フルであるか、完全にフルではないか、正しく形成されていなか、または損傷している可能性がある。
【図１７０Ａ】ＱＡ−１３及びＴＦＦ１ステップのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ結果を提供する一対の表である。
【図１７０Ｂ】ＱＡ−１３及びＴＦＦ１ステップのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ結果を提供する一対の表である。
【図１７１】ＴＦＦ１のＭＡＬＳ検出器分析と組み合わせたＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆを提供する一連のチャート及び要約表である。
【図１７２】精製されたＱＡ−１３ウイルスのＳＤＳ分析である。
【図１７３】ＱＡ及びＴＦＦ後のウイルス精製を比較する一対のＳＤＳ分析である。
【図１７４】プロセス内限界及びＱＣ試験を含むＡＡＶ８−ＲＰＧＲ上流製造プロセスの図式的概要である。
【図１７５】細胞解凍ステップの概略フロー図である。
【図１７６】培地の加温に推奨される最小加温時間を示す表である。
【図１７７−１】細胞解凍プロセスのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１７７−２】細胞解凍プロセスのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１７８】細胞解凍プロセスに使用する材料／消耗品を示す表である。    （図１７６）最初の培地交換に必要なクロロキン及び培地の体積を生成規模の関数として示す表である。    （図１７７）トランスフェクション及び採取ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。    （図１７８）例示的な継代手順の概略フロー図である。
【図１７９】細胞継代レジームのための一般的な指針を示す表である。
【図１８０】細胞継代のための推奨試薬体積（ＨＢＳＳ、細胞解離溶液、及び成長培地）及び細胞播種密度を示す表である。
【図１８１】解凍及び継代レジームに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図１８２】一過性トランスフェクション及び培地採取ステップの概略フロー図である。
【図１８３】最初の培地交換に必要なクロロキン及び培地の体積を生成規模の関数として示す表である。
【図１８４】トランスフェクション及び採取ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１８５】５×３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）ごとのリン酸カルシウム媒介トランスフェクション溶液を創出するための指導を示す表である。
【図１８６】濾過清澄化ステップの概略フロー図を示す表である。
【図１８７】清澄化濾過ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１８８】清澄化濾過ステップに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図１８９】大規模タンジェンシャルフロー濾過単位操作の概略フロー図である。
【図１９０】大規模タンジェンシャルフロー濾過ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１９１】大規模タンジェンシャルフロー濾過ステップに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図１９２】イオジキサノール濃縮単位操作の概略フロー図である。
【図１９３】初期イオジキサノール濃縮ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１９４】遠心分離濃縮ステップに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図１９５】イオジキサノール勾配精製ステップを完了するために必要なステップの概略フロー図である。
【図１９６】イオジキサノール勾配精製ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図１９７】イオジキサノール勾配精製ステップに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図１９８】陽イオン交換クロマトグラフィー単位操作の概略フロー図である。
【図１９９】陽イオン交換クロマトグラフィーステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図２００】陽イオン交換クロマトグラフィー操作条件を示す表である。
【図２０１】陽イオン交換クロマトグラフィーステップに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図２０２】小規模タンジェンシャルフロー濾過ステップを完了するために必要なステップの概略フロー図である。
【図２０３】小規模タンジェンシャルフロー濾過ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図２０４】小規模タンジェンシャルフロー濾過ステップに使用する主要な材料／消耗品を示す表である。
【図２０５】無菌濾過及び充填単位操作の概略フロー図である。
【図２０６】無菌濾過及び充填ステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図２０７】無菌濾過及び充填ステップに使用する材料／消耗品を示す表である。
【図２０８】プロセス内ホールドポイント及び保管条件を示す表である。
【図２０９】溶液調製用の好ましい化学物質の一覧を示す表である。
【図２１０】実験Ａのために清澄化ＤＭＥＭ培地で製剤化された試料を示す表である。
【図２１１Ａ】実験Ａの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２１１Ｂ】実験Ａの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２１１Ｃ】実験Ａの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２１２】実験ＡにおけるＨＩＣ精製専用の緩衝液を用いたＳＯＰ段階勾配を示す表である。
【図２１３】実験ＡにおけるＣＥＸ精製専用の緩衝液を用いたＳＯＰ段階勾配を示す表である。
【図２１４】実験Ａについて、６０カラム体積（ＣＶ）で０％から１００％の移動相Ｂ、続いて１０ＣＶ、１００％のＭＰＣに段階的に移るＳＯＰ線形勾配を示す表である。
【図２１５】実験Ａの分取ラン条件を示す表である。
【図２１６Ａ】実験ＡについてのＨＩＣ−２５ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中の圧力上昇は０．６バールであった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。ロード相でのＵＶスパイクは、試料をより小さい容器に移すためにロードを停止した後に発生した、カラムを通過する気泡に対応する。
【図２１６Ｂ】実験ＡについてのＨＩＣ−２５ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中の圧力上昇は０．６バールであった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。ロード相でのＵＶスパイクは、試料をより小さい容器に移すためにロードを停止した後に発生した、カラムを通過する気泡に対応する。
【図２１７Ａ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｂ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｃ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｄ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｅ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｆ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｇ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｈ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｉ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１７Ｊ】実験Ａ．ＨＩＣ−２５のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２１８】実験ＡについてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−２５ランの回収率の表である。
【図２１９】実験ＡのＨＩＣ−２５ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。Ｍ−はしご。画分Ｅ１、Ｗ３、及びＣＩＰは、それぞれ、５倍、５倍、及び２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【図２２０】実験Ａについて、結合条件に一致するように調製し、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムにロードしたＥ１  ＨＩＣ−ＯＨの分取ラン条件を示す表である。
【図２２１Ａ】実験ＡについてのＳＯ３−１６ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２２１Ｂ】実験ＡについてのＳＯ３−１６ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２２２Ａ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｂ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｃ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｄ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｅ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｆ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｇ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２２Ｈ】実験Ａ．ＳＯ３−１６のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２２３】実験Ａの分取ランＳＯ３−１６についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を示す表である。
【図２２４】実験ＡからのＳＯ３−１６ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ−はしご。画分Ｅ１は、５倍及び１０倍希釈され、画分Ｗ３及びＣＩＰは２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【図２２５】実験ＡのＳＯ３−１６からＡＥＸ−ＱＡ（ＱＡ−１４）カラムに全溶出（Ｅ１）をロードするための分取ラン条件を示す表である。
【図２２６Ａ】実験ＡについてのＱＡ−１４ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図２２６Ｂ】実験ＡについてのＱＡ−１４ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図２２７Ａ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｂ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｃ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｄ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｅ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｆ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｇ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｈ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２７Ｉ】実験ＡについてのＱＡ−１４に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。写真Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ｄは２倍大きい縮尺であり、Ｅは４倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２２８】実験Ａについて、ＱＡ−１４  Ｅ３試料に対するＴＦＦの導入による濃縮及び緩衝液交換条件を示す表である。
【図２２９Ａ】実験Ａからの分取ランＱＡ−１４  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収率についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率の表を示す。
【図２２９Ｂ】実験Ａからの分取ランＱＡ−１４  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収率についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率の表を示す。
【図２３０】実験ＡについてのＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく空及びフルＡＡＶキャプシド両方の純度の表を示す。
【図２３１】実験ＡについてのＴＥＭによって評価したフル及び空ＡＡＶの比の表を示す。
【図２３２】実験ＡについてのＴＥＭによって評価したＴＦＦ後のＱＡ−１４からの代表的な画分を示す。Ｅ３画分（上）、Ｅ２画分（下）。
【図２３３】実験ＡのＱＡ−１４ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ−はしご。画分Ｅ３は純で５倍希釈されたものであり、他のものは純である。主画分はＥ３である。ＡＡＶ８  フルＳは、ＴＦＦ後のＥ３画分である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【図２３４】実験Ｂのために清澄化ＤＭＥＭ培地で製剤化された試料を示す表である。
【図２３５Ａ】実験Ｂの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２３５Ｂ】実験Ｂの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２３５Ｃ】実験Ｂの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す表である。
【図２３６】実験ＢにおけるＨＩＣ精製専用の緩衝液を用いたＳＯＰ段階勾配を示す表である。
【図２３７】実験ＢにおけるＣＥＸ精製専用の緩衝液を用いたＳＯＰ段階勾配を示す表である。
【図２３８】実験Ｂについて、６０カラム体積（ＣＶ）で０％から１００％の移動相Ｂ、続いて１０ＣＶ、１００％のＭＰＣに段階的に移るＳＯＰ線形勾配を示す表である。
【図２３９】実験Ｂの分取ラン条件を示す表である。
【図２４０Ａ】実験ＢについてのＨＩＣ−２６ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中の圧力上昇は０．５バールであった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２４０Ｂ】実験ＢについてのＨＩＣ−２６ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中の圧力上昇は０．５バールであった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２４１Ａ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｂ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｃ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｄ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｅ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｆ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｇ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｈ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｉ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４１Ｊ】実験Ｂ．ＨＩＣ−２６のトータル法についてのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−採取、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、Ｇ−溶出（Ｅ１）、Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、Ｉ−ＣＩＰ、Ｊ−蛍光シグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４２】実験ＢについてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−２６ランの回収率の表である。
【図２４３】実験ＢのＨＩＣ−２６ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。Ｍ−はしご。画分Ｅ１、Ｗ３、及びＣＩＰは、それぞれ、５倍、５倍、及び２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【図２４４】実験Ｂについて、結合条件に一致するように調製し、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムにロードしたＥ１  ＨＩＣ−ＯＨの分取ラン条件を示す表である。
【図２４５Ａ】実験ＢのＳＯ３−１７ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２４５Ｂ】実験ＢのＳＯ３−１７ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図２４６Ａ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｂ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｃ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｄ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｅ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｆ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｇ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４６Ｈ】実験Ｂ．ＳＯ３−１７のトータル法からのＨＰＬＣ分析に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、Ｂ−ロードＢＦ、Ｃ−ロード、Ｄ−フロースルー＋洗浄１（Ｗ１）（ＦＴ）、Ｅ−洗浄２（Ｗ１）、Ｆ−溶出（Ｅ１）、Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、Ｈ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は１００倍希釈され、他の画分は２．５倍希釈または５倍希釈されている（Ｗ３及びＣＩＰ）。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図２４７】実験Ｂの分取ランＳＯ３−１７についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を示す表である。
【図２４８】実験ＢからのＳＯ３−１７ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ−はしご。画分Ｅ１は、５倍及び１０倍希釈され、画分Ｗ３及びＣＩＰは２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【図２４９】実験ＢのＳＯ３−１７からＡＥＸ−ＱＡ（ＱＡ−１５）カラムに全溶出（Ｅ１）をロードするための分取ラン条件を示す表である。
【図２５０Ａ】実験ＢについてのＱＡ−１５ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図２５０Ｂ】実験ＢについてのＱＡ−１５ランからの代表的なクロマトグラムである。ラン−ロード相全体（上）、拡大した溶出セクション（下）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図２５１Ａ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｂ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｃ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｄ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｅ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｆ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｇ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｈ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５１Ｉ】実験ＢについてのＱＡ−１５に対するＨＰＬＣ分析空−フル法に基づく代表的なクロマトグラムである。Ａ−ＳＯ３−１６  Ｅ１、Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、Ｃ−Ｅ１、Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、Ｆ−Ｅ４（主なフルピークの後尾部）、Ｇ−Ｅ５、Ｈ−Ｅ６、Ｉ−ＣＩＰ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。写真Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、及びＩは同じ縮尺であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、及びＦは２倍大きい縮尺である。画分は２０倍（写真Ａ）または１０倍（写真Ｈ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図２５２】実験Ｂについて、ＱＡ−１５  Ｅ３試料に対するＴＦＦの導入による濃縮及び緩衝液交換条件を示す表である。
【図２５３Ａ】実験Ｂからの分取ランＱＡ−１５  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収率についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率の表を示す。
【図２５３Ｂ】実験Ｂからの分取ランＱＡ−１５  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収率についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率の表を示す。
【図２５４】実験ＢについてのＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく空及びフルＡＡＶキャプシド両方の純度の表を示す。
【図２５５】実験ＢについてのＴＥＭによって評価したフル及び空ＡＡＶの比の表を示す。
【図２５６】実験ＢについてのＴＥＭによって評価したＴＦＦ後のＱＡ−１５からの代表的な画分を示す。ＱＡ−１５  Ｅ３画分（上）、Ｅ５画分（下）。
【図２５７】実験ＢのＱＡ−１５ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ−はしご。画分Ｅ３は純で５倍希釈されたものであり、他のものは純である。主画分はＥ３である。ＡＡＶ８  フルＳは、ＴＦＦ後のＥ３画分である。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌｕｓ  ４〜２０％ゲルを使用した。
【図２５８Ａ】実験Ｂからの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムフィンガープリント法を示す。各クロマトグラフ段階の重ね合わせを提示する。Ａ：ＨＩＣ−ＯＨステップの採取と主溶出液との重ね合わせ。ＨＩＣ溶出液は、採取と比較して６０倍希釈されている。Ｂ：採取と主ＳＯ３溶出液（Ｅ１）との重ね合わせ。ＳＯ３溶出液は、採取材料と比較して２００倍希釈されている。Ｃ：採取、ＱＡロード、及びＱＡ主溶出液（Ｅ３）の重ね合わせ。採取と比較して、ロードは１０倍、Ｅ３は６０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。Ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度である。
【図２５８Ｂ】実験Ｂからの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムフィンガープリント法を示す。各クロマトグラフ段階の重ね合わせを提示する。Ａ：ＨＩＣ−ＯＨステップの採取と主溶出液との重ね合わせ。ＨＩＣ溶出液は、採取と比較して６０倍希釈されている。Ｂ：採取と主ＳＯ３溶出液（Ｅ１）との重ね合わせ。ＳＯ３溶出液は、採取材料と比較して２００倍希釈されている。Ｃ：採取、ＱＡロード、及びＱＡ主溶出液（Ｅ３）の重ね合わせ。採取と比較して、ロードは１０倍、Ｅ３は６０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。Ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度である。
【図２５８Ｃ】実験Ｂからの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムフィンガープリント法を示す。各クロマトグラフ段階の重ね合わせを提示する。Ａ：ＨＩＣ−ＯＨステップの採取と主溶出液との重ね合わせ。ＨＩＣ溶出液は、採取と比較して６０倍希釈されている。Ｂ：採取と主ＳＯ３溶出液（Ｅ１）との重ね合わせ。ＳＯ３溶出液は、採取材料と比較して２００倍希釈されている。Ｃ：採取、ＱＡロード、及びＱＡ主溶出液（Ｅ３）の重ね合わせ。採取と比較して、ロードは１０倍、Ｅ３は６０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。Ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度である。
【図２５９】ＡＢＣＡ４のためのＨＩＣ（ＯＨ）クロマトグラフィー条件を示す表である。
【図２６０Ａ】ＡＢＣＡ４についての代表的なＨＩＣ（ＯＨ）クロマトグラム及びベクター回収分析である。（Ａ）クロマトグラムの拡大した溶出セクションを示す。溶出断片を括弧で示す。（Ｂ）ＨＰＬＣ総粒子分析によって測定したＨＩＣ画分中のベクター回収。全ステップ収率に必要とされるＨＩＣ溶出ステップ最適化。
【図２６０Ｂ】ＡＢＣＡ４についての代表的なＨＩＣ（ＯＨ）クロマトグラム及びベクター回収分析である。（Ａ）クロマトグラムの拡大した溶出セクションを示す。溶出断片を括弧で示す。（Ｂ）ＨＰＬＣ総粒子分析によって測定したＨＩＣ画分中のベクター回収。全ステップ収率に必要とされるＨＩＣ溶出ステップ最適化。
【図２６１】ＡＢＣＡ４のためのＣＥＸ（ＳＯ３）クロマトグラフィー条件を示す表である。ｐＨ９．０の１Ｍ  Ｔｒｉｓを加えて全ての画分を中和し、全画分体積の１０％を加えた。
【図２６２Ａ】ＡＢＣＡ４の代表的なＣＥＸ（ＳＯ３）クロマトグラム及びベクター分析の回収率である。（Ａ）は拡大した溶出を示す。（Ｂ）は、ＨＰＬＣ全粒子分析によって測定したＳＯ３画分中で回収されたベクターを示す。
【図２６２Ｂ】ＡＢＣＡ４の代表的なＣＥＸ（ＳＯ３）クロマトグラム及びベクター分析の回収率である。（Ａ）は拡大した溶出を示す。（Ｂ）は、ＨＰＬＣ全粒子分析によって測定したＳＯ３画分中で回収されたベクターを示す。
【図２６３】ＡＢＣＡ４のためＡＥＸ（ＱＡ）クロマトグラフィー条件を示す表である。ｐＨ６．５の１Ｍ  ＢＴＰを加えて全ての画分を中和し、全画分体積の５％を加えた。
【図２６４Ａ】ＡＢＣＡ４の代表的なＡＥＸ（ＱＡ）クロマトグラム及びベクター回収分析である。（Ａ）は、空粒子及びフル粒子を括弧で示した、拡大した溶出を示す。（Ｂ）は、全粒子ＨＰＬＣ分析によって測定したＱＡ画分中の空粒子（上方）及びフル粒子（下方）のベクター回収率を示す。
【図２６４Ｂ】ＡＢＣＡ４の代表的なＡＥＸ（ＱＡ）クロマトグラム及びベクター回収分析である。（Ａ）は、空粒子及びフル粒子を括弧で示した、拡大した溶出を示す。（Ｂ）は、全粒子ＨＰＬＣ分析によって測定したＱＡ画分中の空粒子（上方）及びフル粒子（下方）のベクター回収率を示す。
【図２６５】ＡＢＣＡ４のためのＨＰＬＣ分析に基づく（フル：空）粒子の純度を示す表である。純度（Ｅ／Ｆ）比の最適な説明は、ＦＬＤ及びＭＡＬＳ検出器によって得られる。およそ５５％〜９４％のフルＡＡＶ粒子からの富化は、ＱＡステップによって達成される。
【図２６６Ａ】ＡＢＣＡ４のＴＥＭに基づく粒子の代表的な純度（フル：空）である。（Ａ）は、試料詳細の表を示す。（Ｂ）は、イオジキサノールで精製した試料（ＡＡＶ８Ｙ７３３Ｆ）（２つの左パネル）及びＱＡクロマトグラフィーで精製した試料（ＡＡＶ８  ＱＡ−１  Ｅ３）（２つの右パネル）を示す。
【図２６６Ｂ】ＡＢＣＡ４のＴＥＭに基づく粒子の代表的な純度（フル：空）である。（Ａ）は、試料詳細の表を示す。（Ｂ）は、イオジキサノールで精製した試料（ＡＡＶ８Ｙ７３３Ｆ）（２つの左パネル）及びＱＡクロマトグラフィーで精製した試料（ＡＡＶ８  ＱＡ−１  Ｅ３）（２つの右パネル）を示す。
【図２６７】ＡＢＣＡ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による代表的な粒子精製である。
【図２６８】ＡＢＣＡ４のＨＩＣクロマトグラフィー単位操作を示す概略フロー図である。
【図２６９】ＡＢＣＡ４のＨＩＣ捕捉ステップのためのパラメータ及び動作範囲を示す表である。
【図２７０】ＡＢＣＡ４のためのＨＩＣクロマトグラフィー操作パラメータを示す表である。
【図２７１】ロード、洗浄、溶出、及びＣＩＰ段階を含む、ＡＢＣＡ４のためのＨＩＣステップの代表的なクロマトグラムである。凡例：フロースルー（Ｆ１）、ロード後洗浄（Ｗ１）、ロード後洗浄２（Ｗ２）、溶出（Ｅ１）、溶出後洗浄（Ｗ３）、クリーニングインプレイス（ＣＩＰ）。
【図２７２】ＡＢＣＡ４のためのＨＩＣステップの代表的な拡大クロマトグラムである。凡例：ロード後洗浄（Ｗ１）、ロード後洗浄２（Ｗ２）、溶出（Ｅ１）、溶出後洗浄（Ｗ３）、クリーニングインプレイス（ＣＩＰ）。
【図２７３】ＡＢＣＡ４のためのＨＩＣ緩衝液組成及び標的仕様を示す表である。
【図２７４】ＡＢＣＡ４のＨＩＣクロマトグラフィーステップに利用される主要な材料及び消耗品の詳細を示す表である。
【図２７５】ＡＢＣＡ４のＳＯ３クロマトグラフィー単位操作を示す概略フロー図である。
【図２７６】ＡＢＣＡ４のＳＯ３クロマトグラフィーステップのためのパラメータ及び動作範囲／定値を示す表である。
【図２７７】ＡＢＣＡ４のための個々のクロマトグラフィーステップ及び操作パラメータを示す表である。
【図２７８】ＡＢＣＡ４の代表的かつ典型的なフルＳＯ３クロマトグラムランである。
【図２７９】ＡＢＣＡ４のクロマトグラムの代表的な拡大溶出セクションである。赤色の長方形は主な溶出ピークを指し示す。凡例：ロード後洗浄２（Ｗ２）、溶出（Ｅ１）、溶出後洗浄（Ｗ３）、クリーニングインプレイス（ＣＩＰ）。
【図２８０】ＡＢＣＡ４に使用されるＳＯ３緩衝液組成を示す表である。
【図２８１】ＡＢＣＡ４の遠心分離濃縮ステップで使用される主要な材料／消耗品を示す表である。
【図２８２】ＡＢＣＡ４のＱＡクロマトグラフィー単位操作プロセスフローを示す概略フロー図である。
【図２８３】ＡＢＣＡ４のＱＡクロマトグラフィーステップに使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を示す表である。
【図２８４】ＡＢＣＡ４のクロマトグラフィーランに関連する特定のステップを示す表である。
【図２８５】ＡＢＣＡ４のための線形勾配溶出の代表的なフルＱＡクロマトグラムである。
【図２８６】勾配溶出について拡大した代表的なＱＡクロマトグラムである。Ｅ２−空粒子。Ｅ３−フル粒子。Ｅ４−フル粒子、空粒子、及び損傷粒子の混合物を含むピーク後尾部。
【図２８７】ＡＢＣＡ４のためのＱＡ緩衝液組成及び標的仕様を示す表である。
【図２８８】ＡＢＣＡ４のＱＡクロマトグラフィー単位操作で使用される主要な材料／消耗品を示す表である。
【図２８９】ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４ベクター精製のためのタンジェンシャルフロー濾過単位操作のフロー図の模式図である。
【図２９０】ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４ベクター精製のためのＴＦＦランに使用され得る例示的なパラメータ及び関連する動作範囲または定値を列挙する表である。
【図２９１】ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４ベクター精製のためのタンジェンシャルフロー濾過単位操作に使用され得る例示的な材料及び消耗品を提供する表である。
【図２９２】ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４生成物の製造中に使用され得るプロセス内ポイントでの例示的な保持時間を提供する表である。
【図２９３】組み合わさって完全なＡＢＣＡ４導入遺伝子を形成する上流及び下流導入遺伝子構造を示す概略図である。
【図２９４】フレーム内ＡＵＧコドンの前のフレーム外ＡＵＧコドンとの重複Ｃ配列を示す概略図である。
【図２９５】重複ゾーンＣ及びＢの予測二次構造を示す概略図である。
【図２９６】例示的な重複ベクターを示す概略図である。
【図２９７】ＡＢＣＡ４重複デュアルベクターシステムを用いた形質導入後の導入遺伝子の結果の一連の図である。（Ａ）上流及び下流導入遺伝子一本鎖ＤＮＡ形態。これらを相補的な導入遺伝子上の相同性の領域を介して一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によってアニーリングすることができ（Ｂ）、その後、完全に組換えられた大型導入遺伝子を生成することができる（Ｃ）。略語：ＣＤＳ＝コード配列；ＤＳＢ＝二本鎖切断；ＨＲ＝相同組換え；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＳＳＡ＝一本鎖アニーリング；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図２９８】重複上流及び下流デュアルベクターを示す概略図である。
【図２９９】重複上流及び下流デュアルベクターを示す一連の図である。
【図３００】ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４またはＡＡＶ２／８−ＡＢＣＡ４いずれかに含まれ得るデュアルベクター上流及び下流変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＸを示す図であるが示される。完全長または短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）は、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。
【図３０１】デュアルベクター重複変異体を示す概略図である。各導入遺伝子に含まれているＡＢＣＡ４コード配列（配列番号１１）のヌクレオチドを示す。
【図３０２】上流導入遺伝子変異体Ｂからのヌクレオチド配列のセグメントを示す図である。ＳｗａＩ部位からの配列は、全ての上流導入遺伝子変異体で一貫しており、潜在的クリプティックポリＡシグナルの特徴を強調表示する。
【図３０３】ＡＢＣＡ４デュアルベクターシステムの開発の一対の図である。Ａ．導入遺伝子及びベクターキャプシドの遺伝子要素及び構造ならびに用量など、ベクター設計の異なる態様を検討及び評価した。Ｂ．重複する長さが異なるデュアルベクター変異体を比較して、２つの導入遺伝子間の組換えに最適な領域を決定した。ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス；ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；Ｄｏ＝下流導入遺伝子変異体；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；Ｉｎ＝イントロン；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；Ｕｐ＝上流導入遺伝子変異体；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図３０４】概略図であって、（Ａ）上流導入遺伝子によって提供されるＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する順方向プライマー及び下流導入遺伝子のＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する逆方向プライマーを使用して、組換え導入遺伝子からの転写産物を増幅したことを示す。アンプリコンの配列を決定して、転写産物の重複領域にわたって正しいＡＢＣＡ４  ＣＤＳが含有されていることを確認した。（Ｂ）予測されたＧＲＫ１転写開始部位（ＴＳＳ）の下流と結合する順方向プライマー及び上流ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ内で結合する逆方向プライマーを使用して、デュアルベクターＣ注射眼及びデュアルベクター５’Ｃ注射眼からの転写産物形態を評価した。
【図３０５】ＡＢＣＡ４上流配列の発現を駆動するために使用できるプロモーター及び追加の配列の図である。ＲＫ＝ＧＲＫ１プロモーター、ＩｎｔＥｘ＝イントロン及びエクソン配列、ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス初期エンハンサー；ＣＢＡ＝ニワトリベータアクチンプロモーター；ＳＡ／ＳＤ＝スプライスアクセプター及びスプライスドナー。
【図３０６】ＡＢＣＡ４上流配列またはＧＦＰを発現するために使用したＡＡＶベクターの図である。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素、ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質、ＩｎｔＥｘ＝イントロン及びエクソン配列、ＣＢＡ＝ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスエンハンサー、ＲＫ＝ロドプシンキナーゼプロモーター（ＧＲＫ１プロモーター）、ＲＢＧ＝ウサギベータグロビン、ＳＡ／ＳＤ＝スプライスアクセプター及びスプライスドナー配列。
【図３０７−１】ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１７）。
【図３０７−２】ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１７）。
【図３０７−３】ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１７）。
【図３０８−１】ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１８）。
【図３０８−２】ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１８）。
【図３０８−３】ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１８）。
【図３０９−１】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３０９−２】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３０９−３】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３１０−１】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３１０−２】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３１０−３】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３１１−１】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３１１−２】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３１１−３】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３１１−４】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３１２−１】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図３１２−２】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図３１２−３】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図３１２−４】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図３１３−１】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図３１３−２】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図３１３−３】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図３１３−４】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図３１４】本開示の例示的なＡＢＣＡ４発現構築物を示す一連の概略図である。
【図３１５−１】ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ（配列番号２６）のＩＴＲからＩＴＲ部分の配列であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む。
【図３１５−２】ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ（配列番号２６）のＩＴＲからＩＴＲ部分の配列であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む。
【図３１５−３】ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ（配列番号２６）のＩＴＲからＩＴＲ部分の配列であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む。
【図３１６−１】ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分の配列（配列番号３０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む。
【図３１６−２】ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分の配列（配列番号３０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む。
【図３１６−３】ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分の配列（配列番号３０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む。
【図３１７】二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）によってコードされる導入遺伝子の一本鎖センス及びアンチセンスＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への変換、及びＡＡＶウイルス粒子におけるｓｓＤＮＡのキャプシド形成を示す一連の写真である。
【図３１８Ａ−Ｂ】核によるセンス及びアンチセンスｓｓＤＮＡを含有するＡＡＶウイルス粒子の取り込み（Ａ）、ウイルス粒子からのセンス及びアンチセンス鎖の放出（Ｂ）、ｄｓＤＮＡを再生するための相補鎖の合成（Ｃ）、導入遺伝子の転写（Ｄ）を示す一連の写真である。
【図３１８Ｃ−Ｄ】核によるセンス及びアンチセンスｓｓＤＮＡを含有するＡＡＶウイルス粒子の取り込み（Ａ）、ウイルス粒子からのセンス及びアンチセンス鎖の放出（Ｂ）、ｄｓＤＮＡを再生するための相補鎖の合成（Ｃ）、導入遺伝子の転写（Ｄ）を示す一連の写真である。
【図３１９Ａ−Ｃ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の写真である。大型導入遺伝子は、最初はｄｓＤＮＡとしてコードされている（Ａ〜Ｂ）。続いて、大型導入遺伝子の重複する５’及び３’断片のｓｓＤＮＡは、ＡＡＶウイルス粒子によってキャプシド形成される（Ｃ）。大型導入遺伝子の５’及び３’断片の相補鎖を含むウイルス粒子が生成され、これらのｓｓＤＮＡは、相補的な重複配列の領域を含む（赤色で示す）。この例では、５’断片のアンチセンスｓｓＤＮＡ及び３’のセンス鎖が示されている。ｓｓＤＮＡを含むＡＡＶ粒子が形質導入され（Ｄ）、ｓｓＤＮＡがウイルス粒子から核へと放出される（Ｅ）。５’及び３’断片は、核環境において相補的な重複配列でハイブリダイズし（Ｆ）、大型導入遺伝子全体のｄｓＤＮＡが第二鎖合成をとおして生成され（Ｇ）、このｄｓＤＮＡがその後転写され、導入遺伝子が発現する（Ｈ）。
【図３１９Ｄ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の写真である。大型導入遺伝子は、最初はｄｓＤＮＡとしてコードされている（Ａ〜Ｂ）。続いて、大型導入遺伝子の重複する５’及び３’断片のｓｓＤＮＡは、ＡＡＶウイルス粒子によってキャプシド形成される（Ｃ）。大型導入遺伝子の５’及び３’断片の相補鎖を含むウイルス粒子が生成され、これらのｓｓＤＮＡは、相補的な重複配列の領域を含む（赤色で示す）。この例では、５’断片のアンチセンスｓｓＤＮＡ及び３’のセンス鎖が示されている。ｓｓＤＮＡを含むＡＡＶ粒子が形質導入され（Ｄ）、ｓｓＤＮＡがウイルス粒子から核へと放出される（Ｅ）。５’及び３’断片は、核環境において相補的な重複配列でハイブリダイズし（Ｆ）、大型導入遺伝子全体のｄｓＤＮＡが第二鎖合成をとおして生成され（Ｇ）、このｄｓＤＮＡがその後転写され、導入遺伝子が発現する（Ｈ）。
【図３１９Ｅ−Ｈ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の写真である。大型導入遺伝子は、最初はｄｓＤＮＡとしてコードされている（Ａ〜Ｂ）。続いて、大型導入遺伝子の重複する５’及び３’断片のｓｓＤＮＡは、ＡＡＶウイルス粒子によってキャプシド形成される（Ｃ）。大型導入遺伝子の５’及び３’断片の相補鎖を含むウイルス粒子が生成され、これらのｓｓＤＮＡは、相補的な重複配列の領域を含む（赤色で示す）。この例では、５’断片のアンチセンスｓｓＤＮＡ及び３’のセンス鎖が示されている。ｓｓＤＮＡを含むＡＡＶ粒子が形質導入され（Ｄ）、ｓｓＤＮＡがウイルス粒子から核へと放出される（Ｅ）。５’及び３’断片は、核環境において相補的な重複配列でハイブリダイズし（Ｆ）、大型導入遺伝子全体のｄｓＤＮＡが第二鎖合成をとおして生成され（Ｇ）、このｄｓＤＮＡがその後転写され、導入遺伝子が発現する（Ｈ）。
【図３２０】本開示のＡＢＣＡ４重複デュアルベクターシステムの概要である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入遺伝子の要素を、「上流」及び「下流」の２つの独立した導入遺伝子に分割した。上流導入遺伝子は、プロモーター及びＡＢＣＡ４コード配列の上流断片を含み、下流導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４コード配列の下流断片に加えてＷＰＲＥ及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ｐＡシグナルを有した。示している最適化された重複デュアルベクターシステムでは、両方の導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４コード配列塩基３，４９４〜３，７０１から形成された２０７ｂｐ領域の重複を有した。同じ宿主細胞核内に入ると、２つの導入遺伝子は整列し、重複領域を介して組換えする。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；Ｉｎ＝イントロン；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図３２１】試験したデュアルベクターの組合わせの導入遺伝子の詳細を示す表である。最後の行に、最適化された重複デュアルベクターシステムの詳細を含めた。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ｂｐ＝塩基対；ＣＤＳ＝コードＤＮＡ配列；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図３２２】ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４、上流及び／または下流ベクターの製造プロセスの下流の充填及び仕上げステップの概要を示す模式図である。
【図３２３Ａ】代表的な最適化したＨＩＣクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．０２Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．０８Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２３Ｂ】代表的な最適化したＨＩＣクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．０２Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．０８Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２３Ｃ】代表的な最適化したＨＩＣクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．０２Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．０８Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２３Ｄ】代表的な最適化したＨＩＣクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．０２Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．０８Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２４Ａ】代表的な最適化されたＣＥＸクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．３３Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．３Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２４Ｂ】代表的な最適化されたＣＥＸクロマトグラムである。最適化したピークカッティングアノテーション（１．３３Ｍ緩衝液）と最適化していないピークカッティングアノテーション（１．３Ｍ緩衝液）との両方が示される。解説：Ｗ２＝ロード後洗浄２、Ｅ１＝溶出画分、Ｗ３＝溶出後緩衝液。
【図３２５】それぞれ、ＨＩＣ、ＣＥＸ、及びＱＡステップのクロマトグラムをとおした一連の代表的な最適化調整ランである。
【図３２６Ａ】最適化プロセスのためのステップ回収率を詳述する表である。
【図３２６Ｂ】最適化プロセスのためのステップ回収率を詳述する表である。
【図３２７Ａ】ＭＡＬＳによるＱＡ分離のフル：空ＡＡＶ結果を詳述する表である。
【図３２７Ｂ】ＭＡＬＳ及びＴＥＭによるＱＡ分離のフル：空ＡＡＶ結果を詳述する表である。
【図３２８Ａ】ＡＡＶ−ＲＰＧＲデュアルベクターの４回の確認トランスフェクション及び精製ランからのデータを提供する概念実証表及び一連の３つのグラフであるが、このトランスフェクション及び精製ランは、ＡＢＣＡ４を含む任意の導入遺伝子とともに使用することができる。最初のスコーピング研究の結果から続いて、４つのトランスフェクション条件（Ａ）を評価した。ベクター粒子の数（キャプシドＥＬＩＳＡ）及びゲノム挿入物を含む粒子の数（ゲノム力価）を各条件について定量化した（Ｂ）。
【図３２８Ｂ】ＡＡＶ−ＲＰＧＲデュアルベクターの４回の確認トランスフェクション及び精製ランからのデータを提供する概念実証表及び一連の３つのグラフであるが、このトランスフェクション及び精製ランは、ＡＢＣＡ４を含む任意の導入遺伝子とともに使用することができる。最初のスコーピング研究の結果から続いて、４つのトランスフェクション条件（Ａ）を評価した。ベクター粒子の数（キャプシドＥＬＩＳＡ）及びゲノム挿入物を含む粒子の数（ゲノム力価）を各条件について定量化した（Ｂ）。
【図３２８Ｃ】ＡＡＶ−ＲＰＧＲデュアルベクターの４回の確認トランスフェクション及び精製ランからのデータを提供する概念実証表及び一連の３つのグラフであるが、このトランスフェクション及び精製ランは、ＡＢＣＡ４を含む任意の導入遺伝子とともに使用することができる。最初のスコーピング研究の結果から続いて、４つのトランスフェクション条件（Ａ）を評価した。ベクター粒子の数（キャプシドＥＬＩＳＡ）及びゲノム挿入物を含む粒子の数（ゲノム力価）を各条件について定量化した（Ｂ）。
【図３２９】ＡＡＶ−ＲＰＧＲのフル：空の比を評価する直交法の定量化を示す概念実証グラフ（Ａ）及び表（Ｂ）であるが、このフル：空の比を評価する直交法は、ＡＢＣＡ４を含む任意の導入遺伝子とともに使用することができる。図３２８に提示したフル粒子分析は、実際の値を過小評価し得るが、傾向は有効である。したがって、４つの条件からの試料を、直交法によってさらに測定した。直交法からの結果は、フル粒子分析から見た傾向を反映する（図３２８）。異なるトランスフェクション剤（ＣａＰＯ４）を用いて生成された材料からの以前の結果と比較すると、トランスフェクション剤の選択もフル粒子対空粒子の比に影響を有し得ることが示唆される。
【図３３０】トランスフェクション試薬（ＰＥＩ対ＣａＰＯ４）がＡＡＶフル：空ベクター比に与える影響を示すグラフである。ＰＥＩ対ＣａＰＯ４比較トランスフェクション試験により物質を生成し、これを、ＨＰＬＣを使用してフルｌ空ベクター比について分析した。以前の分析と同様に、材料はフル粒子について濃縮するプロセスステップを経ていなかった。２つのトランスフェクション条件の間で一定に保たれた以前の可変条件は、総ＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ比、及びトランスフェクションプラスミドの比であった。２つのトランスフェクション試薬の各々について、左のバーはＦＬＤであり、右のバーはＭＡＬＳである。
【図３３１−１】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４１）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４２）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４３）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４４）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４５）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列はヌクレオチド１８１〜３５０９を含むかまたはそれからなり、ＷＰＲＥはヌクレオチド３５２２〜４１１０を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいはＢＧＨポリＡはヌクレオチド４１１５〜４３８３を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３１−２】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４１）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４２）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４３）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４４）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４５）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列はヌクレオチド１８１〜３５０９を含むかまたはそれからなり、ＷＰＲＥはヌクレオチド３５２２〜４１１０を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいはＢＧＨポリＡはヌクレオチド４１１５〜４３８３を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３１−３】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４１）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４２）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４３）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４４）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４５）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列はヌクレオチド１８１〜３５０９を含むかまたはそれからなり、ＷＰＲＥはヌクレオチド３５２２〜４１１０を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいはＢＧＨポリＡはヌクレオチド４１１５〜４３８３を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３１−４】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４１）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４２）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４３）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４４）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４５）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列はヌクレオチド１８１〜３５０９を含むかまたはそれからなり、ＷＰＲＥはヌクレオチド３５２２〜４１１０を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいはＢＧＨポリＡはヌクレオチド４１１５〜４３８３を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３１−５】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４１）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４２）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４３）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４４）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４５）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４６）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列はヌクレオチド１８１〜３５０９を含むかまたはそれからなり、ＷＰＲＥはヌクレオチド３５２２〜４１１０を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいはＢＧＨポリＡはヌクレオチド４１１５〜４３８３を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３２−１】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４７）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４８）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４９）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号５０）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５１）、５’ＡＢＣＡ４（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５２）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５３）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡプロモーターはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＩｎＥｘはヌクレオチド４６９〜６４３を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド６５０〜４３５０を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３２−２】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４７）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４８）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４９）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号５０）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５１）、５’ＡＢＣＡ４（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５２）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５３）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡプロモーターはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＩｎＥｘはヌクレオチド４６９〜６４３を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド６５０〜４３５０を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３２−３】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４７）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４８）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４９）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号５０）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５１）、５’ＡＢＣＡ４（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５２）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５３）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡプロモーターはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＩｎＥｘはヌクレオチド４６９〜６４３を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド６５０〜４３５０を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３２−４】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４７）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４８）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４９）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号５０）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５１）、５’ＡＢＣＡ４（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５２）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５３）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡプロモーターはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＩｎＥｘはヌクレオチド４６９〜６４３を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド６５０〜４３５０を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３２−５】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４７）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４８）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４９）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号５０）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５１）、５’ＡＢＣＡ４（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５２）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５３）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡプロモーターはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＩｎＥｘはヌクレオチド４６９〜６４３を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド６５０〜４３５０を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３３−１】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５４）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５５）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５６）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号５９）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＲＧＢはヌクレオチド４６９〜８８１を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド９１９〜４６１９を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４６５８〜４７７８を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３３−２】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５４）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５５）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５６）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号５９）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＲＧＢはヌクレオチド４６９〜８８１を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド９１９〜４６１９を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４６５８〜４７７８を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３３−３】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５４）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５５）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５６）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号５９）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＲＧＢはヌクレオチド４６９〜８８１を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド９１９〜４６１９を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４６５８〜４７７８を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３３−４】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５４）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５５）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５６）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号５９）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＲＧＢはヌクレオチド４６９〜８８１を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド９１９〜４６１９を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４６５８〜４７７８を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３３−５】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５４）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５５）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５６）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号５９）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド１８６〜４６８を含むかまたはそれからなり、ＲＧＢはヌクレオチド４６９〜８８１を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド９１９〜４６１９を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４６５８〜４７７８を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３４−１】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６０）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６１）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６２）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６３）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＭＶはヌクレオチド１８６〜５６８を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド５６９〜８４９を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド５５６〜４５５６を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４５９５〜４７１５を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３４−２】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６０）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６１）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６２）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６３）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＭＶはヌクレオチド１８６〜５６８を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド５６９〜８４９を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド５５６〜４５５６を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４５９５〜４７１５を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３４−３】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６０）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６１）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６２）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６３）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＭＶはヌクレオチド１８６〜５６８を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド５６９〜８４９を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド５５６〜４５５６を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４５９５〜４７１５を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３４−４】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６０）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６１）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６２）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６３）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＭＶはヌクレオチド１８６〜５６８を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド５６９〜８４９を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド５５６〜４５５６を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４５９５〜４７１５を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３４−５】例としてのプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６０）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６１）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６２）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６３）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６６７〜４７８８、配列番号６５）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはヌクレオチド１〜１３０を含むかまたはそれからなり、ＣＭＶはヌクレオチド１８６〜５６８を含むかまたはそれからなり、ＣＢＡはヌクレオチド５６９〜８４９を含むかまたはそれからなり、５’ＡＢＣＡ４はヌクレオチド５５６〜４５５６を含むかまたはそれからなり、かつ／あるいは３’ＩＴＲはヌクレオチド４５９５〜４７１５を含むかまたはそれからなる。ＩＲ＝ＩＴＲ。
【図３３５−１】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６８）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６９）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号７０）を含む。
【図３３５−２】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６８）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６９）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号７０）を含む。
【図３３５−３】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６８）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６９）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号７０）を含む。
【図３３５−４】例となるプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６８）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６９）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号７０）を含む。
【図３３６Ａ】ＡＢＣＡ４  ＨＩＣ（図３３６Ａ）、ＣＥＸ（図３３６Ｂ）、及びＡＥＸ（図３３６Ｃ）分取ラン、及び分析ラン（図３３６Ｄ）のための緩衝液の説明を提供する。
【図３３６Ｂ】ＡＢＣＡ４  ＨＩＣ（図３３６Ａ）、ＣＥＸ（図３３６Ｂ）、及びＡＥＸ（図３３６Ｃ）分取ラン、及び分析ラン（図３３６Ｄ）のための緩衝液の説明を提供する。
【図３３６Ｃ】ＡＢＣＡ４  ＨＩＣ（図３３６Ａ）、ＣＥＸ（図３３６Ｂ）、及びＡＥＸ（図３３６Ｃ）分取ラン、及び分析ラン（図３３６Ｄ）のための緩衝液の説明を提供する。
【図３３６Ｄ】ＡＢＣＡ４  ＨＩＣ（図３３６Ａ）、ＣＥＸ（図３３６Ｂ）、及びＡＥＸ（図３３６Ｃ）分取ラン、及び分析ラン（図３３６Ｄ）のための緩衝液の説明を提供する。
【図３３７】ＡＢＣＡ４分取ランのためのＨＩＣクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図３３８】ＡＢＣＡ４分取ランのためのＣＥＸ（ＳＯ３）クロマトグラフィー条件を示す表である。
【図３３９−１】ＡＢＣＡ４分取ランのためのＡＥＸクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図３３９−２】ＡＢＣＡ４分取ランのためのＡＥＸクロマトグラフィー条件を示す表である。
【図３４０】ＯＨカラムＨＰＬＣ分析方法を使用するＨＩＣでの捕捉ステップのための条件を示す表である。分取ランのために、清澄化した採取材料（１．２Ｌ−各々０．６Ｌを含む２本のボトルに分けたもの）を室温で解凍し、プールし、希釈緩衝液で１：１（１．２Ｌの採取物＋１．２Ｌの緩衝液）に希釈した。システムポンプを５ＣＶ／分で使用してカラムにロードする。技術移転ランは、ＨＩＣ条件について８ラン（ＨＩＣ−８）であった。
【図３４１Ａ】全ランロード相（図３４１Ａ）及び拡大溶出セクション（図３４１Ｂ）を伴うＨＩＣ−８ランからのクロマトグラムである。１０００での図３４１Ａについて、上の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出であり、その下の線は伝導度であり、その下の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出であり、一番下の線は圧力である。約２４００での図３４１Ｂは、最高ピークは２８０ｎｍでのＵＶ検出であり、次に高いピークは２６０ｎｍでのＵＶ検出であり、下の線は伝導度である。ロード中の圧力上昇は０．３バールであった。画分をマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図３４１Ｂ】全ランロード相（図３４１Ａ）及び拡大溶出セクション（図３４１Ｂ）を伴うＨＩＣ−８ランからのクロマトグラムである。１０００での図３４１Ａについて、上の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出であり、その下の線は伝導度であり、その下の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出であり、一番下の線は圧力である。約２４００での図３４１Ｂは、最高ピークは２８０ｎｍでのＵＶ検出であり、次に高いピークは２６０ｎｍでのＵＶ検出であり、下の線は伝導度である。ロード中の圧力上昇は０．３バールであった。画分をマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図３４２Ａ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｂ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｃ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｄ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｅ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｆ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｇ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｈ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｉ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４２Ｊ】ＨＰＬＣ分析−ＨＩＣ−８のトータル法に基づくクロマトグラムを示す。図３４２Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４２Ｂ−採取、図３４２Ｃ−ロード、図３４２Ｄ−フロースルー（ＦＴ）、図３４２Ｅ−洗浄１（Ｗ１）、図３４２Ｆ−洗浄２（Ｗ２）、図３４２Ｇ−溶出（Ｅ１）、図３４２Ｈ−洗浄３（Ｗ３）、図３４２Ｉ−ＣＩＰ、図３４２Ｊ−蛍光とＭＡＬＳシグナルとの重ね合わせ。図３４２Ａ〜Ｉの各グラフについて、ｘ軸は、保持時間（分）を示し、ｙ軸は、吸光度、伝導度、及び光散乱を示す。ｙ軸の中央付近から始まる線は蛍光であり（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）、ｙ軸の下部付近から始まる２本の線は、２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度であり、保持時間約１０分でピークに達している線は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）である。主溶出（Ｅ１）は、他の画分と比較して１０倍希釈されている。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４３】ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−８ランの回収率を示す表である。
【図３４４】ＨＩＣ−８ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ−はしご。画分Ｅ１、Ｗ３、及びＣＩＰは、それぞれ、５倍、５倍、及び２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を、Ｅ１  ５×  ｄｉｌｌ．レーンにおいて赤色の長方形で指し示す。全ての画分を脱塩し、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。
【図３４５】ＣＩＭ  ＳＯ３カラムを使用するＣＥＸ上の中間研磨のための条件を示す表である。分取ランのために、ＨＩＣ−ＯＨからの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように調製し、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムにロードした。このランはＣＥＸ条件の第７のランであった（ＳＯ３−７）。
【図３４６Ａ】ＳＯ３−７ランからのクロマトグラムを示す。全ラン−ロード相（図３４６Ａ）、拡大溶出セクション（図３４６Ｂ）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図３４６Ｂ】ＳＯ３−７ランからのクロマトグラムを示す。全ラン−ロード相（図３４６Ａ）、拡大溶出セクション（図３４６Ｂ）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度、深緑色の線は圧力である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出はＥ１である。
【図３４７Ａ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｂ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｃ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｄ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｅ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｆ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｇ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｈ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４７Ｉ−Ｊ】ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムである。図３４７Ａ−ブランク（緩衝液）ラン、図３４７Ｂ−ロードＢＦ、図３４７Ｃ−ロード、図３４７Ｄ−フロースルー＋洗浄１（ＦＴ＋Ｗ１）、図３４７Ｅ−洗浄２（Ｗ２）、図３４７Ｆ−溶出（Ｅ１）、図３４７Ｇ−洗浄３（Ｗ３）、図３４７Ｈ−ＣＩＰ、図３４７Ｉ−蛍光シグナルの重ね合わせ、図３４７Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線。主溶出（Ｅ１）は５倍希釈され、他の画分は希釈されていない。全てのクロマトグラムは同じ縮尺である。
【図３４８】調製ランＳＯ３−７についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を示す表である。出発ＨＩＣ−８Ｅ１材料と比較した中間研磨ステップＣＥＸ−ＳＯ３の回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）について、それぞれ９０％及び８６％であった。２つの方法間の不一致はわずかであった。ＨＰＬＣ分析の場合、質量収支は１００％ではなかった。２つ（ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）の結果の正規化によって、より正確な値が得られ、主画分におけるＡＡＶの回収率は平均９７％であった。
【図３４９】ＳＯ３−７ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ−はしご。画分Ｅ１は、５倍及び１０倍希釈され、画分Ｗ３及びＣＩＰは２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を長方形で指し示す。
【図３５０】ＣＩＭ  ＱＡカラムを使用したＡＥＸでの空及びフルＡＡＶキャプシド分離のための条件を示す表である。分取ランの間、ＳＯ３−７からの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように希釈し、ＡＥＸ−ＱＡカラムにロードした。このランは、ＡＥＸ条件の第３のランであった（ＱＡ−３）。
【図３５１Ａ】ＱＡ−３ランからのクロマトグラムを示す。全ラン−ロード相（図３５１Ａ）、拡大溶出セクション（図３５１Ｂ）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図３５１Ｂ】ＱＡ−３ランからのクロマトグラムを示す。全ラン−ロード相（図３５１Ａ）、拡大溶出セクション（図３５１Ｂ）。凡例：青色の線は２８０ｎｍでのＵＶ検出、赤色の線は２６０ｎｍでのＵＶ検出、茶色の線は伝導度である。ロード中に圧力上昇はなかった。画分を茶色のマーカーで示す。主な溶出（フルキャプシドＡＡＶ）はＥ３である。
【図３５２Ａ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｂ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｃ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｄ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｅ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｆ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｇ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｈ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｉ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５２Ｊ】ＨＰＬＣ分析−ＱＡ−３の空フル方法に基づくクロマトグラムを示す。図３５２Ａ−ＳＯ３−７  Ｅ１、図３５２Ｂ−ＦＴ＋Ｗ、図３５２Ｃ−Ｅ１、図３５２Ｄ−Ｅ２（空ＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｅ−Ｅ３（フルＡＡＶキャプシド）、図３５２Ｆ−Ｅ４（主要なフルピークの後尾部）、図３５２Ｇ−Ｅ５、図３５２Ｈ−Ｅ６、図３５２Ｉ−ＣＩＰ、図３５２Ｊ−ＭＡＬＳシグナルの重ね合わせ。凡例：凡例：蛍光（Ｅｘ  ２８０ｎｍ、ＥＭ  ３４８ｎｍ）：緑色の曲線、２６０ｎｍでの吸光度：赤色の曲線、２８０ｎｍでの吸光度：青色の曲線、伝導度（ｍＳ／ｃｍ）：黒色の曲線、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）は桃色の曲線である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧは同じ縮尺であり、Ａ及びＥはそれぞれ３倍及び８倍大きいス縮尺である。画分は２０倍（写真Ｉ）または１０倍（写真Ｅ及びＨ）希釈であり、他のものは５倍希釈である。Ａ２６０／Ａ２８０比を、対応する画分上に提示する。
【図３５３】ＱＡ−３  Ｅ３試料に対して透析を使用して緩衝液交換を達成するための条件を示す表である。試料の最終体積は３ｍＬであった。
【図３５４Ａ】分取ランＡ−３（図３５４Ａ）、ゲノムＤＳＰ収率（図３５４Ｂ）、及び正規化ＤＳＰ収率（図３５４Ｃ）についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率を示す表である。
【図３５４Ｂ−Ｃ】分取ランＡ−３（図３５４Ａ）、ゲノムＤＳＰ収率（図３５４Ｂ）、及び正規化ＤＳＰ収率（図３５４Ｃ）についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率を示す表である。
【図３５５】ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく純度（空及びフルＡＡＶキャプシドの比）を示す表である。
【図３５６】希釈及び非希釈ＱＡ−１５ならびにＴＦＦ後試料においてＴＥＭによって評価したフル及び空ＡＡＶキャプシドの比を示す表である。
【図３５７Ａ−Ｄ】ＴＥＭによって評価したＳＯ３−７  Ｅ１（上段）、ＱＡ−３  Ｅ３（中段）、及び透析後（下段）の顕微鏡写真を提供する。左：低倍率、右：計数に使用した倍率。
【図３５７Ｅ−Ｆ】ＴＥＭによって評価したＳＯ３−７  Ｅ１（上段）、ＱＡ−３  Ｅ３（中段）、及び透析後（下段）の顕微鏡写真を提供する。左：低倍率、右：計数に使用した倍率。
【図３５８】ＱＡ−３ランの銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ−はしご。画分Ｅ３は純で５倍希釈されたものであり、ＣＩＰ（２倍）以外の他のものは純である。主画分はＥ３である。ＡＡＶ８−ＰＤは、透析後のＥ３画分である。銀染色手順、Ｂｉｏｒａｄ  ＴＧＸ  ４〜２０％ゲルを使用した。
【図３５９Ａ】ＨＰＬＣクロマトグラム−フィンガープリント法を示す。各クロマトグラフ段階の重ね合わせを提示する。図３５９Ａ：Ａ２６０シグナルの重ね合わせ。図３５９Ｂ：ＭＡＬＳシグナルの重なり（これはより大型の粒子のみを描写するもので、タンパク質によって影響されないため、Ｅ／Ｆのより良好な分解能が得られる）。画分を類似の応答を有するように比例的に希釈した。
【図３５９Ｂ】ＨＰＬＣクロマトグラム−フィンガープリント法を示す。各クロマトグラフ段階の重ね合わせを提示する。図３５９Ａ：Ａ２６０シグナルの重ね合わせ。図３５９Ｂ：ＭＡＬＳシグナルの重なり（これはより大型の粒子のみを描写するもので、タンパク質によって影響されないため、Ｅ／Ｆのより良好な分解能が得られる）。画分を類似の応答を有するように比例的に希釈した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本開示は、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を哺乳動物宿主細胞培養物から精製する方法を提供し、本方法は、（ａ）複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、成長培地中で培養するステップであって、複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する、ステップと、（ｂ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞とウイルス放出溶液とを、複数のｒＡＡＶ粒子を採取培地に放出するのに好適な条件下で接触させて、複数のｒＡＡＶ粒子、ウイルス放出溶液、及び採取培地を含む組成物を生成するステップと、（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して複数のｒＡＡＶ粒子を（ｂ）の組成物から精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、（ｄ）（ｂ）のＨＩＣ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を介して精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、（ｅ）複数のフルｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって（ｄ）のＣＥＸ溶出液から単離して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、（ｆ）（ｅ）のＡＥＸ溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過し濃縮して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び最終製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む。
【００５９】
本開示は、（ａ）複数の哺乳動物宿主細胞を、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトして、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を産生するステップを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を産生する方法にさらに関係し、細胞は、ＰＥＩをトランスフェクション試薬として使用してトランスフェクトされ、細胞は、ＰＥＩ及びベクターと、プラスミドベクターの特定の比で接触する。
【００６０】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲ
本開示は、本開示の方法を使用して製造された組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、（ｂ）５０％未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入後に細胞中でＲＰＧＲＯＲＦ１５配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、（ｂ）３０％未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入後に細胞中でＲＰＧＲＯＲＦ１５配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、（ｂ）９９％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、またはその間の任意のパーセンテージ未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入後に細胞中でＲＰＧＲＯＲＦ１５配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いた細胞の形質導入後、ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列はＲＰＧＲＯＲＦ１５タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列によってコードされるタンパク質は、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるＲＰＧＲＯＲＦ１５の活性レベル以上の活性レベルを有する。いくつかの実施形態では、外来ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列と対応する内在ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列とは同一である。いくつかの実施形態では、外来ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列と対応する内在ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列とは同一でない。いくつかの実施形態では、外来ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列と対応する内在ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列とは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。
【００６１】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、（ｂ）少なくとも７０％のフルキャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入後に細胞中でＲＰＧＲＯＲＦ１５配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、（ｂ）少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージのフルキャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入後に細胞中でＲＰＧＲＯＲＦ１５配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１×１０１２ｖｇ／ｍＬを含む。
【００６２】
本開示の組成物は、哺乳動物への、好ましくはヒトへの全身または局所投与に好適な治療用ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物を含む。本開示の例示的なＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ＲＰＧＲＯＲＦ１５またはその一部分をコードする配列を含む。好ましくは、本開示のＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５またはその一部分をコードする配列を含む。本開示の例示的なＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、遺伝子またはその一部分の発現を可能にするか、またはそれを増強するための調節性要素をコードする１つ以上の配列（複数可）をさらに含んでもよい。例示的な調節性要素は、プロモーター、イントロン、エンハンサー要素、応答要素（転写後応答要素または転写後制御性要素を含む）、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、ならびに転写の効率的な終止を促進するための遺伝子断片（β−グロビン遺伝子断片及びウサギβ−グロビン遺伝子断片を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ヒト網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）タンパク質またはその一部分に対応するヒト遺伝子またはその一部分を含む。ヒトＲＰＧＲは、複数のスプライスされたアイソフォームを含む。アイソフォームＯＲＦ１５  ＰＧＲ（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）は、光受容体に局在する。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲタンパク質は、ＲＰＧＲＯＲＦ１５である。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、コドン最適化配列を含むヒト遺伝子またはその一部分を含む。いくつかの実施形態では、配列は、哺乳動物における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。
【００６４】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５生成物は、ＲＰＧＲＯＲＦ１５のｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型２（ｒＡＡＶ）からなる。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含み、この一本鎖ＤＮＡ挿入配列は、ＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、１９９ｂｐのＧＲＫ１プロモーター、３４５９ｂｐのヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５  ｃＤＮＡ、２７０ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及びＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ、ならびに要素に隣接する短いクローニング配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ＲＰＧＲＯＲ１５をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、または同一である、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、野生型ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、
１  ａｔｇａｇｇｇａｇｃ  ｃｇｇａａｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃｃｇａｔ  ｔｃｇｇｇｔｇｃｔｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｔｇｇｇａａａａｇｔ
６１  ａａａｔｔｔｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｔｃｃ  ｃｇｇｔａａａｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｔｇａｔｇｔｃｃｃ  ｔｇｔａｃａｔｃｔｔ
１２１  ｔｃａｔｇｔｇｇａｇ  ａｔｇａａｃａｔｔｃ  ｔｇｃｔｇｔｔｇｔｔ  ａｃｃｇｇａａａｔａ  ａｔａａａｃｔｔｔａ  ｃａｔｇｔｔｔｇｇｃ
１８１  ａｇｔａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇｔｃａｇｔｔ  ａｇｇａｔｔａｇｇａ  ｔｃａａａｇｔｃａｇ  ｃｃａｔｃａｇｃａａ  ｇｃｃａａｃａｔｇｔ
２４１  ｇｔｃａａａｇｃｔｃ  ｔａａａａｃｃｔｇａ  ａａａａｇｔｇａａａ  ｔｔａｇｃｔｇｃｃｔ  ｇｔｇｇａａｇｇａａ  ｃｃａｃａｃｃｃｔｇ
３０１  ｇｔｇｔｃａａｃａｇ  ａａｇｇａｇｇｃａａ  ｔｇｔａｔａｔｇｃａ  ａｃｔｇｇｔｇｇａａ  ａｔａａｔｇａａｇｇ  ａｃａｇｔｔｇｇｇｇ
３６１  ｃｔｔｇｇｔｇａｃａ  ｃｃｇａａｇａａａｇ  ａａａｃａｃｔｔｔｔ  ｃａｔｇｔａａｔｔａ  ｇｃｔｔｔｔｔｔａｃ  ａｔｃｃｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｔａａｇｃ  ａｇｃｔｇｔｃｔｇｃ  ｔｇｇａｔｃｔａａｔ  ａｃｔｔｃａｇｃｔｇ  ｃｃｃｔａａｃｔｇａ  ｇｇａｔｇｇａａｇａ
４８１  ｃｔｔｔｔｔａｔｇｔ  ｇｇｇｇｔｇａｃａａ  ｔｔｃｃｇａａｇｇｇ  ｃａａａｔｔｇｇｔｔ  ｔａａａａａａｔｇｔ  ａａｇｔａａｔｇｔｃ
５４１  ｔｇｔｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａａｇｔｇａｃ  ｃａｔｔｇｇｇａａａ  ｃｃｔｇｔｃｔｃｃｔ  ｇｇａｔｃｔｃｔｔｇ  ｔｇｇａｔａｔｔａｃ
６０１  ｃａｔｔｃａｇｃｔｔ  ｔｔｇｔａａｃａａｃ  ａｇａｔｇｇｔｇａｇ  ｃｔａｔａｔｇｔｇｔ  ｔｔｇｇａｇａａｃｃ  ｔｇａｇａａｔｇｇｇ
６６１  ａａｇｔｔａｇｇｔｃ  ｔｔｃｃｃａａｔｃａ  ｇｃｔｃｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃａｇａａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｔｇａａ
７２１  ａｔｔｃｃｇｇａｇａ  ａｇｇｔｇａｔｃｃａ  ａｇｔａｇｃｃｔｇｔ  ｇｇｔｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃｔｇｔｇｇｔ  ｔｃｔｃａｃｇｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｔｇｇ  ｇｃｔｇｇｇａｃａａ  ｔｔｔｇｇｔｃａｇｃ  ｔｇｇｇｔｃｔｔｇｇ  ｃａｃｔｔｔｔｃｔｔ
８４１  ｔｔｔｇａａａｃｔｔ  ｃａｇａａｃｃｃａａ  ａｇｔｃａｔｔｇａｇ  ａａｔａｔｔａｇｇｇ  ａｔｃａａａｃａａｔ  ａａｇｔｔａｔａｔｔ
９０１  ｔｃｔｔｇｔｇｇａｇ  ａａａａｔｃａｃａｃ  ａｇｃｔｔｔｇａｔａ  ａｃａｇａｔａｔｃｇ  ｇｃｃｔｔａｔｇｔａ  ｔａｃｔｔｔｔｇｇａ
９６１  ｇａｔｇｇｔｃｇｃｃ  ａｃｇｇａａａａｔｔ  ａｇｇａｃｔｔｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｔｔ  ｔｔａｃｃａａｔｃａ  ｃｔｔｃａｔｔｃｃｔ
１０２１  ａｃｔｔｔｇｔｇｃｔ  ｃｔａａｔｔｔｔｔｔ  ｇａｇｇｔｔｔａｔａ  ｇｔｔａａａｔｔｇｇ  ｔｔｇｃｔｔｇｔｇｇ  ｔｇｇａｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔａｇｔｔｔ  ｔｔｇｃｔｇｃｔｃｃ  ｔｃａｔｃｇｔｇｇｔ  ｇｔｇｇｃａａａａｇ  ａａａｔｔｇａａｔｔ  ｃｇａｔｇａａａｔａ
１１４１  ａａｔｇａｔａｃｔｔ  ｇｃｔｔａｔｃｔｇｔ  ｇｇｃｇａｃｔｔｔｔ  ｃｔｇｃｃｇｔａｔａ  ｇｃａｇｔｔｔａａｃ  ｃｔｃａｇｇａａａｔ
１２０１  ｇｔａｃｔｇｃａｇａ  ｇｇａｃｔｃｔａｔｃ  ａｇｃａｃｇｔａｔｇ  ｃｇｇｃｇａａｇａｇ  ａｇａｇｇｇａｇａｇ  ｇｔｃｔｃｃａｇａｔ
１２６１  ｔｃｔｔｔｔｔｃａａ  ｔｇａｇｇａｇａａｃ  ａｃｔａｃｃｔｃｃａ  ａｔａｇａａｇｇｇａ  ｃｔｃｔｔｇｇｃｃｔ  ｔｔｃｔｇｃｔｔｇｔ
１３２１  ｔｔｔｃｔｃｃｃｃａ  ａｔｔｃａｇｔｃｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ｔｃｔｇａｇａｇａａ  ａｃｃｔｃｃａａｇａ  ｇａｇｔｇｔｃｔｔａ
１３８１  ｔｃｔｇａａｃａｇｇ  ａｃｃｔｃａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃａｇａｔｔａｔｔ  ｔｇｃｔａｇａｔｇａ  ａａｔｇａｃｃａａａ
１４４１  ｇａａｇｃａｇａｇａ  ｔａｇａｔａａｔｔｃ  ｔｔｃａａｃｔｇｔａ  ｇａａａｇｃｃｔｔｇ  ｇａｇａａａｃｔａｃ  ｔｇａｔａｔｃｔｔａ
１５０１  ａａｃａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｃａｔｇａｇ  ｃｃｔｇａａｔｔｃｃ  ａａｔｇａａａａｇｔ  ｃａｔｔａａａａｔｔ  ａｔｃａｃｃａｇｔｔ
１５６１  ｃａｇａａａｃａａａ  ａｇａａａｃａａｃａ  ａａｃａａｔｔｇｇｇ  ｇａａｃｔｇａｃｇｃ  ａｇｇａｔａｃａｇｃ  ｔｃｔｔａｃｔｇａａ
１６２１  ａａｃｇａｔｇａｔａ  ｇｔｇａｔｇａａｔａ  ｔｇａａｇａａａｔｇ  ｔｃａｇａａａｔｇａ  ａａｇａａｇｇｇａａ  ａｇｃａｔｇｔａａａ
１６８１  ｃａａｃａｔｇｔｇｔ  ｃａｃａａｇｇｇａｔ  ｔｔｔｃａｔｇａｃｇ  ｃａｇｃｃａｇｃｔａ  ｃｇａｃｔａｔｃｇａ  ａｇｃａｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｔｇａｇｇａａｇ  ｔａｇａｇａｔｃｃｃ  ａｇａｇｇａｇａａｇ  ｇａａｇｇａｇｃａｇ  ａｇｇａｔｔｃａａａ  ａｇｇａａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔａｇａｇｇａｇｃ  ａａｇａｇｇｔａｇａ  ａｇｃａａａｔｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａｇｇｔｇｃａｔｇｇ  ａｇｇａａｇａａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａｇａｔｃｃｔａｔｃ  ａｇａｔｇａｃｃｔｔ  ａｃａｇａｃａａａｇ  ｃａｇａｇｇｔｇａｇ  ｔｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃａｇ  ｔｇｇｇａｇａａｇｃ  ａｇａｇｇａｔｇｇｇ  ｃｃｔｇａａｇｇｔａ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｔｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｔａｇｔｔ  ｃａｇｇａｇｃａｇａ  ａｃａｃｔｇｇｃａａ  ｇａｔｇａｇｇａｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇｇ  ｇｇａｇａａａｇａｃ
２０４１  ａａｇｇｇｔａｇａｇ  ｇａｇａａａｔｇｇａ  ｇａｇｇｃｃａｇｇａ  ｇａｇｇｇａｇａｇａ  ａｇｇａａｃｔａｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａａ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｔｇｇ  ｇｇａａｇａｇｃａｇ  ｇａｇｃａａａａｇｇ  ａｇａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｔｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａａａｇａａ  ａｃｃａａｇａｇａｔ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ａｇｃａｔｇｇａｇａ  ａｇｇａｇａａｇａａ
２２２１  ｇａｇｇａｇｇｇａｇ  ａｃａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａａｇａｇ  ａａｇｇａｇｇｇａｇ  ａａｇｇｇａａａｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａａ
２２８１  ｇｇｇｇａａｇａａｇ  ｔｇｇａｇｇｇａｇａ  ａｃｇｔｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇａｇｇａａａａａ  ｇｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｇｇｇｇａａｇｇ  ａｇｇａｇａａａｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａａ  ｇｇａｇａｃｃａａｇ  ｇａｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇａｇｇａｇｇａａ
２４０１  ａｃａｇａｇｇｇｇａ  ｇａｇｇｇｇａｇｇａ  ａａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇｇｇａａｇ  ｔａｇａｇｇｇａｇｇ  ｇｇａａｇｔａｇａｇ
２４６１  ｇａｇｇｇｇａａａｇ  ｇａｇａｇａｇｇｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａｇｇｇｔｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇａ  ｇｇａｇｇａａｇｇｇ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａｇｇａｇｇａａｇｇ  ｇｇａｇｇｇｇｇａａ  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ｇａｇａａｇｇｇａａ  ａｇｇｇｇａｇｇａａ
２５８１  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ａａｇｇａｇａａｇｇ  ｇｇａｇｇａａｇａａ  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ｇａｇａａｇｇｇｇａ  ｇｇｇｇｇａａｇａｇ
２６４１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇａｇａａｇｇｇｇ  ａｇｇｇａｇａａｇａ  ｇｇａｇｇａａｇｇａ
２７０１  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇａｇａａｇａｇｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｇ  ｇａｇｇｇａｇａａｇ  ａｇｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａａ
２７６１  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｇ  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａｇｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇｇａａ
２８２１  ｇｇｇｇａｇｇａｔｇ  ｇａｇａａｇｇｇｇａ  ｇｇｇｇｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｔｇｇｇａｇｇｇ  ｇｇａａｇａｇｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇａｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇａｇｇａａｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇｇａｇ
２９４１  ｇｇｇｇａａｇａｇｇ  ａｇｇａａｇｇａｇａ  ａｇｇｇｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａａｇａ  ａｇａａｇｇｇｇａｇ
３００１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ａｇａａｇｇｇｇａｇ  ｇｇａｇａａｇｇｇｇ  ａｇｇａａｇａａｇａ  ｇｇａａｇｇｇｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａａｇｇｇｇ  ａｇｇｔｇｇａａｇｇ  ｇｇａｇｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ｇａｇａｇｇａａｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
３１２１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｇａａａｇｇｇａ  ａａａｇｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇａｇａａｇ  ａａａａｃａｇｇａｇ  ｇａａｃａｇａｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａｇｇ  ａａｇａａｇａｇｇｇ  ｇａａｇｔａｔｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａｇａａ  ｔｇａａａｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇａｇａｇｇ  ａｇｔａｃａａａａａ  ａｇｔｇａｇｃａａａ  ａｔａａａａｇｇａｔ  ｃｔｇｔｇａａａｔａ  ｔｇｇｃａａａｃａｔ
３３０１  ａａａａｃａｔａｔｃ  ａａａａａａａｇｔｃ  ａｇｔｔａｃｔａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇａａ  ａｔｇｇｇａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇｔｃｃ
３３６１  ａａａａｔｇｃｃａｇ  ｔｃｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇａｃｔｔｔｔａ  ａａａａａｃｇｇｇｃ  ｃａｔｃａｇｇｔｔｃ  ｃａａａａａｇｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｔａａｔｇ  ｔａｔｔａｃｃａｃａ  ｔｔａｃｔｔｇｇａａ  ｔｔｇａａｇｔａａ（配列番号７９）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列は、コドン最適化ヌクレオチド配列を含む。ＲＰＧＲＯＲＦ１５は、３’末端及びすぐ上流にあるスプライス部位に、高度に反復性のプリンに富んだ領域を含み、これは、ＡＡＶ．ＲＰＧＲベクターのクローニングにおいて深刻な困難を創出し得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化を使用することで、内在スプライス部位を無効にし、ＲＰＧＲＯＲＦ１５転写物中のプリンに富んだ配列を、ＲＰＧＲＯＲＦ１５タンパク質のアミノ酸配列を改変することなく安定化することができる。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲタンパク質のグルタミル化などの翻訳後修飾は、コドン最適化後に保存される。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５ヌクレオチド配列は、哺乳動物における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５ヌクレオチド配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、コドン最適化された３４５９ｂｐのヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５  ｃＤＮＡは、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９９％の同一性、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、コドン最適化された３４５９ｂｐのヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５  ｃＤＮＡは、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８１）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。
【００７０】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ロドプシンキナーゼプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ロドプシンキナーゼプロモーターは、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）遺伝子のプロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列は、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号８２）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターは、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号８２）を含むか、またはそれからなる。
【００７１】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物はポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルから単離または誘導されたポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリＡシグナルは、
１  ｔｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリＡをコードする配列は、
１  ｔｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００７２】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一でない。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、短縮型野生型ＡＡＶ２配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型ＡＡＶ２配列と比較した際に、変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、野生型または変異体配列の短縮型または伸長を含む。
【００７３】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一でない。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、短縮型野生型ＡＡＶ２配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型ＡＡＶ２配列と比較した際に、変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、野生型または変異体配列の短縮型または伸長を含む。
【００７４】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス配列は、５’ＩＴＲをコードする配列または３’ＩＴＲをコードする配列の一方または両方と同じ血清型のＡＡＶから単離されるか、またはＡＡＶに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、または３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離されるか、またはＡＡＶ２に由来する。
【００７５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列を含むが、ＡＡＶから単離されるか、またはＡＡＶに由来するいかなる他の配列も含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、及び本開示のＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物をコードする配列を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞においてｒＡＡＶを作成するために使用されるプラスミドＤＮＡは、選択マーカーを含む。例示的な選択マーカーには、抗生物質抵抗性遺伝子が含まれるが、これに限定されない。抗生物質抵抗性遺伝子の例には、アンピシリン及びカナマイシンが含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーには、薬物または小分子抵抗性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーには、ｄａｐＤ、及びｄａｐＤ発現を制御または抑制するｌａｃＯ／Ｐ構築物を含むがこれに限定されない抑制可能オペレーターが含まれ、プラスミド選択は、オペレーターリプレッサータイトレーション（ＯＲＴ）が可能なプラスミドに形質転換された細胞を投与または接触させることにより実行される。例示的な選択マーカーには、ｃｃｄ選択遺伝子が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ｃｃｄ選択遺伝子は、毒性ｃｃｄＢ遺伝子を発現するように操作された宿主細胞株を救済するｃｃｄＡ選択遺伝子をコードする配列を含む。例示的な選択マーカーには、ｓａｃＢが含まれるがこれに限定されず、ＲＮＡは、宿主細胞に投与または接触されて、スクロース培地中でのｓａｃＢ遺伝子の発現を抑制する。例示的な選択マーカーには、Ｈｏｋ（宿主殺傷遺伝子）及びＳｏｋ（殺傷の抑制）から構成されるｐａｒＡＢ＋座位などの分離殺傷メカニズムが含まれるが、これに限定されない。
【００７７】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲ構築物構造
ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５−構築物生成物は、治療用構築物をコードするｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）からなる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５−構築物は、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型８アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８）から単離及び／または誘導されるキャプシドタンパク質をコードする配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５−構築物は、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型８アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８）から単離及び／または誘導されるキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５−構築物は、５’ＩＴＲをコードする短縮型配列、血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離及び／または誘導される３’ＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型８アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ８）から単離及び／または誘導されるキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−構築物は、野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ（野生型５’ＩＴＲ及び野生型３’ＩＴＲ）を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードするｃＤＮＡ、及び（ｄ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードするｃＤＮＡ、（ｃ）ポリアデニル化シグナル、及び（ｄ）ｂｐ  ３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）転写後制御性要素（ＰＲＥ）、（ｅ）ポリアデニル化配列（ポリＡ）、及び（ｆ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）プロモーター、任意選択で、１９９ｂｐのＧＲＫ１プロモーター、（ｃ）ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）２７０ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及び（ｅ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）プロモーター、任意選択で、１９９ｂｐのＧＲＫ１プロモーター、（ｃ）ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）２７０ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及び（ｅ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【００８４】
本開示のＡＡＶまたはＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、哺乳動物細胞における発現が可能なプロモーターをコードする配列を含んでもよい。好ましくは、本開示のＡＡＶまたはＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ヒト細胞における発現が可能なプロモーターをコードする配列を含んでもよい。本開示の例示的なプロモーターには、構成的に活性なプロモーター、細胞型特異的プロモーター、ウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、及びハイブリッドまたは組換えプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−構築物の治療用構築物は、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーターの制御下にある。
【００８５】
本開示のＡＡＶまたはＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物は、ポリアデノシン（ポリＡ）配列を含んでもよい。本開示の例示的なポリＡ配列には、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ−ポリＡ）配列が含まれるが、これに限定されない。ＢＧＨ−ポリＡ配列は、遺伝子発現を増強するために使用され、ＳＶ４０及びヒトコラーゲンポリＡなどの他のポリＡ配列よりも３倍高い発現レベルをもたらすことが示されている。この増加した発現は、上流のプロモーターまたは導入遺伝子の型から主に独立している。ＢＧＨ−ポリＡ配列を使用して発現レベルを増加させることで、注射されるＡＡＶまたはプラスミドベクターの全体的用量を低下することが可能となり、宿主免疫応答を生成する可能性がより低くなる。
【００８６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、原薬を含む。本明細書で使用される場合、原薬は、本開示のＰＧＲＯＲＦ１５構築物を含む本開示のｒＡＡＶを含む。
【００８７】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４
【００８８】
本開示は、本開示の方法を使用して製造された組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）それぞれ、０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜５×１０１３ｖｇ、または０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）上流または下流ベクター、（ｂ）５０％未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、上流の機能的ベクターゲノムと下流の機能的ベクターゲノムとの対は、形質導入後に細胞中でＡＢＣＡ４配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）それぞれ、０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）上流または下流ベクター、（ｂ）３０％未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、上流の機能的ベクターゲノムと下流の機能的ベクターゲノムとの対は、形質導入後に細胞中でＡＢＣＡ４配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）それぞれ、０．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ〜５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）上流または下流ベクター、（ｂ）９９％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、またはその間の任意のパーセンテージ未満の空キャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、上流の機能的ベクターゲノムと下流の機能的ベクターゲノムとの対は、形質導入後に細胞中でＡＢＣＡ４配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いた細胞の形質導入後、ＡＢＣＡ４配列はＡＢＣＡ４タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４配列によってコードされるタンパク質は、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるＡＢＣＡ４の活性レベル以上の活性レベルを有する。いくつかの実施形態では、外来ＡＢＣＡ４配列と対応する内在ＡＢＣＡ４配列とは同一である。いくつかの実施形態では、外来ＡＢＣＡ４配列と対応する内在ＡＢＣＡ４配列とは同一でない。いくつかの実施形態では、外来ＡＢＣＡ４配列と対応する内在ＡＢＣＡ４配列とは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する。
【００８９】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）それぞれ、両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの上流または下流のベクター、（ｂ）少なくとも７０％のフルキャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、上流の機能的ベクターゲノムと下流の機能的ベクターゲノムとの対は、形質導入後に細胞中でＡＢＣＡ４を発現することができる。いくつかの実施形態では組成物は、（ａ）それぞれ、両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜５×１０１３ｖｇ／ｍＬ、または０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの上流または下流ベクター、（ｂ）少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはその間の任意のパーセンテージのフルキャプシド、及び（ｃ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬを含み、上流の機能的ベクターゲノムと下流の機能的ベクターゲノムとの対は、形質導入後に細胞中でＡＢＣＡ４配列を発現することができる。
【００９０】
本開示の組成物は、哺乳動物への、好ましくはヒトへの全身または局所投与に好適な治療用ＡＢＣＡ４構築物を含む。本開示の例示的なＡＢＣＡ４構築物は、ＡＢＣＡ４またはその一部分をコードする配列を含む。好ましくは、本開示のＡＢＣＡ４構築物は、ヒトＡＢＣＡ４またはその一部分をコードする配列を含む。本開示の例示的なＡＢＣＡ４構築物は、遺伝子またはその一部分の発現を可能にするか、またはそれを増強するための調節性要素をコードする１つ以上の配列（複数可）をさらに含んでもよい。例示的な調節性要素は、プロモーター、イントロン、エンハンサー要素、応答要素（転写後応答要素または転写後制御性要素を含む）、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、ならびに転写の効率的な終止を促進するための遺伝子断片（β−グロビン遺伝子断片及びウサギβ−グロビン遺伝子断片を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、ヒトＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部分に対応するヒト遺伝子（またはその変異体）またはその一部分を含む。ヒトＡＢＣＡ４は、光受容体に局在する。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、野生型またはコドン最適化配列を含むヒト遺伝子またはその一部分を含む。いくつかの実施形態では、配列は、哺乳動物における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、上流ＡＢＣＡ４構築物は、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分を含み、下流ＡＢＣＡ４構築物は、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分及びヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分は、各々、他方と「重複する」配列を含み、これは、重複する配列が二本鎖を形成することを意味し、この二本鎖中、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分の重複する部分の配列はヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分の重複する部分の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分の重複する部分の配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはその間の任意の数のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分の重複する部分の配列は、２０個のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分の重複する部分の配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはその間の任意の数のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分の重複する部分の配列は、２０個のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００９２】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４生成物は、ＡＢＣＡ４のｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型８（ｒＡＡＶ８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４生成物は、精製された突然変異型ｒＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含み、ここで、突然変異型ｒＡＡＶ８は、アミノ酸位置７３３でフェニルアラニンがチロシンに置換されている（ＡＡＶ８  Ｙ７７３Ｆ突然変異体）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４上流生成物は、ＡＢＣＡ４の５’部分のｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型８（ｒＡＡＶ８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４下流生成物は、ＡＢＣＡ４の３’部分のｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型８（ｒＡＡＶ８）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４またはその一部分は、ヒトＡＢＣＡ４である。
【００９３】
本開示のＡＡＶ−ＡＢＣＡ４生成物のいくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含み、この一本鎖ＤＮＡ挿入配列は、ＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ、及びＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ、ならびに要素に隣接する短いクローニング配列を含む。
【００９４】
本開示のＡＡＶ−ＡＢＣＡ４上流生成物のいくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含み、この一本鎖ＤＮＡ挿入配列は、ＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ、及びＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ、ならびに要素に隣接する短いクローニング配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡは、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを、単独で、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー及びウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）スプライス受容体部位のうちの１つ以上と組み合わせて含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、及び本明細書において「ＣＡＧ」プロモーターとも称されるＲＢＧスプライス受容体部位を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、イントロンをコードする配列及び／またはエクソンをコードする配列をさらに含む一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含む。
【００９５】
本開示のＡＡＶ−ＡＢＣＡ４下流生成物のいくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含み、この一本鎖ＤＮＡ挿入配列は、ＡＡＶ２  ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ、及びＡＡＶ２  ３’ＩＴＲ、ならびに要素に隣接する短いクローニング配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡは、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、翻訳後調節要素（ＰＲＥ）をコードする配列をさらに含む一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）をコードする配列をさらに含む一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、ポリアデニル化シグナルをコードする配列をさらに含む一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする配列をさらに含む一本鎖ＤＮＡ挿入配列を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、ヒトＡＢＣＡ４またはその一部分をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、
１  ＭＧＦＶＲＱＩＱＬＬ  ＬＷＫＮＷＴＬＲＫＲ  ＱＫＩＲＦＶＶＥＬＶ  ＷＰＬＳＬＦＬＶＬＩ  ＷＬＲＮＡＮＰＬＹＳ  ＨＨＥＣＨＦＰＮＫＡ
６１  ＭＰＳＡＧＭＬＰＷＬ  ＱＧＩＦＣＮＶＮＮＰ  ＣＦＱＳＰＴＰＧＥＳ  ＰＧＩＶＳＮＹＮＮＳ  ＩＬＡＲＶＹＲＤＦＱ  ＥＬＬＭＮＡＰＥＳＱ
１２１  ＨＬＧＲＩＷＴＥＬＨ  ＩＬＳＱＦＭＤＴＬＲ  ＴＨＰＥＲＩＡＧＲＧ  ＩＲＩＲＤＩＬＫＤＥ  ＥＴＬＴＬＦＬＩＫＮ  ＩＧＬＳＤＳＶＶＹＬ
１８１  ＬＩＮＳＱＶＲＰＥＱ  ＦＡＨＧＶＰＤＬＡＬ  ＫＤＩＡＣＳＥＡＬＬ  ＥＲＦＩＩＦＳＱＲＲ  ＧＡＫＴＶＲＹＡＬＣ  ＳＬＳＱＧＴＬＱＷＩ
２４１  ＥＤＴＬＹＡＮＶＤＦ  ＦＫＬＦＲＶＬＰＴＬ  ＬＤＳＲＳＱＧＩＮＬ  ＲＳＷＧＧＩＬＳＤＭ  ＳＰＲＩＱＥＦＩＨＲ  ＰＳＭＱＤＬＬＷＶＴ
３０１  ＲＰＬＭＱＮＧＧＰＥ  ＴＦＴＫＬＭＧＩＬＳ  ＤＬＬＣＧＹＰＥＧＧ  ＧＳＲＶＬＳＦＮＷＹ  ＥＤＮＮＹＫＡＦＬＧ  ＩＤＳＴＲＫＤＰＩＹ
３６１  ＳＹＤＲＲＴＴＳＦＣ  ＮＡＬＩＱＳＬＥＳＮ  ＰＬＴＫＩＡＷＲＡＡ  ＫＰＬＬＭＧＫＩＬＹ  ＴＰＤＳＰＡＡＲＲＩ  ＬＫＮＡＮＳＴＦＥＥ
４２１  ＬＥＨＶＲＫＬＶＫＡ  ＷＥＥＶＧＰＱＩＷＹ  ＦＦＤＮＳＴＱＭＮＭ  ＩＲＤＴＬＧＮＰＴＶ  ＫＤＦＬＮＲＱＬＧＥ  ＥＧＩＴＡＥＡＩＬＮ
４８１  ＦＬＹＫＧＰＲＥＳＱ  ＡＤＤＭＡＮＦＤＷＲ  ＤＩＦＮＩＴＤＲＴＬ  ＲＬＶＮＱＹＬＥＣＬ  ＶＬＤＫＦＥＳＹＮＤ  ＥＴＱＬＴＱＲＡＬＳ
５４１  ＬＬＥＥＮＭＦＷＡＧ  ＶＶＦＰＤＭＹＰＷＴ  ＳＳＬＰＰＨＶＫＹＫ  ＩＲＭＤＩＤＶＶＥＫ  ＴＮＫＩＫＤＲＹＷＤ  ＳＧＰＲＡＤＰＶＥＤ
６０１  ＦＲＹＩＷＧＧＦＡＹ  ＬＱＤＭＶＥＱＧＩＴ  ＲＳＱＶＱＡＥＡＰＶ  ＧＩＹＬＱＱＭＰＹＰ  ＣＦＶＤＤＳＦＭＩＩ  ＬＮＲＣＦＰＩＦＭＶ
６６１  ＬＡＷＩＹＳＶＳＭＴ  ＶＫＳＩＶＬＥＫＥＬ  ＲＬＫＥＴＬＫＮＱＧ  ＶＳＮＡＶＩＷＣＴＷ  ＦＬＤＳＦＳＩＭＳＭ  ＳＩＦＬＬＴＩＦＩＭ
７２１  ＨＧＲＩＬＨＹＳＤＰ  ＦＩＬＦＬＦＬＬＡＦ  ＳＴＡＴＩＭＬＣＦＬ  ＬＳＴＦＦＳＫＡＳＬ  ＡＡＡＣＳＧＶＩＹＦ  ＴＬＹＬＰＨＩＬＣＦ
７８１  ＡＷＱＤＲＭＴＡＥＬ  ＫＫＡＶＳＬＬＳＰＶ  ＡＦＧＦＧＴＥＹＬＶ  ＲＦＥＥＱＧＬＧＬＱ  ＷＳＮＩＧＮＳＰＴＥ  ＧＤＥＦＳＦＬＬＳＭ
８４１  ＱＭＭＬＬＤＡＡＶＹ  ＧＬＬＡＷＹＬＤＱＶ  ＦＰＧＤＹＧＴＰＬＰ  ＷＹＦＬＬＱＥＳＹＷ  ＬＧＧＥＧＣＳＴＲＥ  ＥＲＡＬＥＫＴＥＰＬ
９０１  ＴＥＥＴＥＤＰＥＨＰ  ＥＧＩＨＤＳＦＦＥＲ  ＥＨＰＧＷＶＰＧＶＣ  ＶＫＮＬＶＫＩＦＥＰ  ＣＧＲＰＡＶＤＲＬＮ  ＩＴＦＹＥＮＱＩＴＡ
９６１  ＦＬＧＨＮＧＡＧＫＴ  ＴＴＬＳＩＬＴＧＬＬ  ＰＰＴＳＧＴＶＬＶＧ  ＧＲＤＩＥＴＳＬＤＡ  ＶＲＱＳＬＧＭＣＰＱ  ＨＮＩＬＦＨＨＬＴＶ
１０２１  ＡＥＨＭＬＦＹＡＱＬ  ＫＧＫＳＱＥＥＡＱＬ  ＥＭＥＡＭＬＥＤＴＧ  ＬＨＨＫＲＮＥＥＡＱ  ＤＬＳＧＧＭＱＲＫＬ  ＳＶＡＩＡＦＶＧＤＡ
１０８１  ＫＶＶＩＬＤＥＰＴＳ  ＧＶＤＰＹＳＲＲＳＩ  ＷＤＬＬＬＫＹＲＳＧ  ＲＴＩＩＭＳＴＨＨＭ  ＤＥＡＤＬＬＧＤＲＩ  ＡＩＩＡＱＧＲＬＹＣ
１１４１  ＳＧＴＰＬＦＬＫＮＣ  ＦＧＴＧＬＹＬＴＬＶ  ＲＫＭＫＮＩＱＳＱＲ  ＫＧＳＥＧＴＣＳＣＳ  ＳＫＧＦＳＴＴＣＰＡ  ＨＶＤＤＬＴＰＥＱＶ
１２０１  ＬＤＧＤＶＮＥＬＭＤ  ＶＶＬＨＨＶＰＥＡＫ  ＬＶＥＣＩＧＱＥＬＩ  ＦＬＬＰＮＫＮＦＫＨ  ＲＡＹＡＳＬＦＲＥＬ  ＥＥＴＬＡＤＬＧＬＳ
１２６１  ＳＦＧＩＳＤＴＰＬＥ  ＥＩＦＬＫＶＴＥＤＳ  ＤＳＧＰＬＦＡＧＧＡ  ＱＱＫＲＥＮＶＮＰＲ  ＨＰＣＬＧＰＲＥＫＡ  ＧＱＴＰＱＤＳＮＶＣ
１３２１  ＳＰＧＡＰＡＡＨＰＥ  ＧＱＰＰＰＥＰＥＣＰ  ＧＰＱＬＮＴＧＴＱＬ  ＶＬＱＨＶＱＡＬＬＶ  ＫＲＦＱＨＴＩＲＳＨ  ＫＤＦＬＡＱＩＶＬＰ
１３８１  ＡＴＦＶＦＬＡＬＭＬ  ＳＩＶＩＰＰＦＧＥＹ  ＰＡＬＴＬＨＰＷＩＹ  ＧＱＱＹＴＦＦＳＭＤ  ＥＰＧＳＥＱＦＴＶＬ  ＡＤＶＬＬＮＫＰＧＦ
１４４１  ＧＮＲＣＬＫＥＧＷＬ  ＰＥＹＰＣＧＮＳＴＰ  ＷＫＴＰＳＶＳＰＮＩ  ＴＱＬＦＱＫＱＫＷＴ  ＱＶＮＰＳＰＳＣＲＣ  ＳＴＲＥＫＬＴＭＬＰ
１５０１  ＥＣＰＥＧＡＧＧＬＰ  ＰＰＱＲＴＱＲＳＴＥ  ＩＬＱＤＬＴＤＲＮＩ  ＳＤＦＬＶＫＴＹＰＡ  ＬＩＲＳＳＬＫＳＫＦ  ＷＶＮＥＱＲＹＧＧＩ
１５６１  ＳＩＧＧＫＬＰＶＶＰ  ＩＴＧＥＡＬＶＧＦＬ  ＳＤＬＧＲＩＭＮＶＳ  ＧＧＰＩＴＲＥＡＳＫ  ＥＩＰＤＦＬＫＨＬＥ  ＴＥＤＮＩＫＶＷＦＮ
１６２１  ＮＫＧＷＨＡＬＶＳＦ  ＬＮＶＡＨＮＡＩＬＲ  ＡＳＬＰＫＤＲＳＰＥ  ＥＹＧＩＴＶＩＳＱＰ  ＬＮＬＴＫＥＱＬＳＥ  ＩＴＶＬＴＴＳＶＤＡ
１６８１  ＶＶＡＩＣＶＩＦＳＭ  ＳＦＶＰＡＳＦＶＬＹ  ＬＩＱＥＲＶＮＫＳＫ  ＨＬＱＦＩＳＧＶＳＰ  ＴＴＹＷＶＴＮＦＬＷ  ＤＩＭＮＹＳＶＳＡＧ
１７４１  ＬＶＶＧＩＦＩＧＦＱ  ＫＫＡＹＴＳＰＥＮＬ  ＰＡＬＶＡＬＬＬＬＹ  ＧＷＡＶＩＰＭＭＹＰ  ＡＳＦＬＦＤＶＰＳＴ  ＡＹＶＡＬＳＣＡＮＬ
１８０１  ＦＩＧＩＮＳＳＡＩＴ  ＦＩＬＥＬＦＥＮＮＲ  ＴＬＬＲＦＮＡＶＬＲ  ＫＬＬＩＶＦＰＨＦＣ  ＬＧＲＧＬＩＤＬＡＬ  ＳＱＡＶＴＤＶＹＡＲ
１８６１  ＦＧＥＥＨＳＡＮＰＦ  ＨＷＤＬＩＧＫＮＬＦ  ＡＭＶＶＥＧＶＶＹＦ  ＬＬＴＬＬＶＱＲＨＦ  ＦＬＳＱＷＩＡＥＰＴ  ＫＥＰＩＶＤＥＤＤＤ
１９２１  ＶＡＥＥＲＱＲＩＩＴ  ＧＧＮＫＴＤＩＬＲＬ  ＨＥＬＴＫＩＹＰＧＴ  ＳＳＰＡＶＤＲＬＣＶ  ＧＶＲＰＧＥＣＦＧＬ  ＬＧＶＮＧＡＧＫＴＴ
１９８１  ＴＦＫＭＬＴＧＤＴＴ  ＶＴＳＧＤＡＴＶＡＧ  ＫＳＩＬＴＮＩＳＥＶ  ＨＱＮＭＧＹＣＰＱＦ  ＤＡＩＤＥＬＬＴＧＲ  ＥＨＬＹＬＹＡＲＬＲ
２０４１  ＧＶＰＡＥＥＩＥＫＶ  ＡＮＷＳＩＫＳＬＧＬ  ＴＶＹＡＤＣＬＡＧＴ  ＹＳＧＧＮＫＲＫＬＳ  ＴＡＩＡＬＩＧＣＰＰ  ＬＶＬＬＤＥＰＴＴＧ
２１０１  ＭＤＰＱＡＲＲＭＬＷ  ＮＶＩＶＳＩＩＲＥＧ  ＲＡＶＶＬＴＳＨＳＭ  ＥＥＣＥＡＬＣＴＲＬ  ＡＩＭＶＫＧＡＦＲＣ  ＭＧＴＩＱＨＬＫＳＫ
２１６１  ＦＧＤＧＹＩＶＴＭＫ  ＩＫＳＰＫＤＤＬＬＰ  ＤＬＮＰＶＥＱＦＦＱ  ＧＮＦＰＧＳＶＱＲＥ  ＲＨＹＮＭＬＱＦＱＶ  ＳＳＳＳＬＡＲＩＦＱ
２２２１  ＬＬＬＳＨＫＤＳＬＬ  ＩＥＥＹＳＶＴＱＴＴ  ＬＤＱＶＦＶＮＦＡＫ  ＱＱＴＥＳＨＤＬＰＬ  ＨＰＲＡＡＧＡＳＲＱ  ＡＱＤ（配列番号４０）のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有するか、または同一である、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその一部分を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、野生型ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、
１  ＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ  ＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣ  ＡＧＡＧＧＣＧＣＴＣ  ＴＴＡＡＣＧＧＣＧＴ  ＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴ  ＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡ
６１  ＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧ  ＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡ  ＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣ  ＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴ  ＴＡＧＣＡＴＧＧＧＣ  ＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣ
１２１  ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴ  ＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧ  ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡ  ＣＣＣＴＧＣＧＧＡＡ  ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧ  ＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧ
１８１  ＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴ  ＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴ  ＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴ  ＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴ  ＧＡＴＣＴＧＧＴＴＡ  ＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡ
２４１  ＡＣＣＣＧＣＴＣＴＡ  ＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴ  ＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴ  ＴＣＣＣＣＡＡＣＡＡ  ＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣ  ＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡ
３０１  ＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧ  ＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧ  ＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡ  ＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡ  ＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴ  ＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡ
３６１  ＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡ  ＡＴＴＧＴＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡ  ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＧ  ＧＣＡＡＧＧＧＴＡＴ
４２１  ＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴ  ＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣ  ＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧ  ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧ  ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴ  ＧＧＣＣＧＴＡＴＴＴ
４８１  ＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴ  ＡＣＡＣＡＴＣＴＴＧ  ＴＣＣＣＡＡＴＴＣＡ  ＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴ  ＣＣＧＧＡＣＴＣＡＣ  ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡ
５４１  ＴＴＧＣＡＧＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＴＡＣＧＡ  ＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡ  ＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡ  ＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡ  ＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴ
６０１  ＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡ  ＡＡＡＣＡＴＣＧＧＣ  ＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡ  ＣＣＴＴＣＴＧＡＴＣ  ＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧ
６６１  ＴＣＣＧＴＣＣＡＧＡ  ＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴ  ＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣ  ＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣ  ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣ  ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡ
７２１  ＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴ  ＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣ  ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴ  ＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧ  ＡＣＧＣＧＧＧＧＣＡ  ＡＡＧＡＣＧＧＴＧＣ
７８１  ＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴ  ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣ  ＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡ  ＣＣＣＴＡＣＡＧＴＧ  ＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣ  ＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧ
８４１  ＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡ  ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧ  ＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧ  ＴＧＣＴＴＣＣＣＡＣ  ＡＣＴＣＣＴＡＧＡＣ  ＡＧＣＣＧＴＴＣＴＣ
９０１  ＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡ  ＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴ  ＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡ  ＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡ  ＴＡＴＧＴＣＡＣＣＡ  ＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧ
９６１  ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＡ  ＴＣＧＧＣＣＧＡＧＴ  ＡＴＧＣＡＧＧＡＣＴ  ＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴ  ＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣ  ＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡ
１０２１  ＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴ  ＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡ  ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴ  ＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣ  ＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴ
１０８１  ＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧ  ＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴ  ＣＧＧＧＴＧＣＴＣＴ  ＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧ  ＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣ  ＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡ
１１４１  ＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴ  ＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣ  ＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡ  ＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴ  ＣＴＡＴＴＣＴＴＡＴ  ＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡ
１２０１  ＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴ  ＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡ  ＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡ  ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＣ  ＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡ  ＡＣＣＡＡＡＡＴＣＧ
１２６１  ＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣ  ＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴ  ＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴ  ＧＴＡＣＡＣＴＣＣＴ  ＧＡＴＴＣＡＣＣＴＧ
１３２１  ＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧ  ＧＡＴＡＣＴＧＡＡＧ  ＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴ  ＣＡＡＣＴＴＴＴＧＡ  ＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡ  ＣＡＣＧＴＴＡＧＧＡ
１３８１  ＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡ  ＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡ  ＧＡＡＧＴＡＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧ  ＧＴＡＣＴＴＣＴＴＴ  ＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡ
１４４１  ＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡ  ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡ  ＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧ  ＧＧＡＡＣＣＣＡＡＣ  ＡＧＴＡＡＡＡＧＡＣ  ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡ
１５０１  ＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧ  ＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴ  ＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧ  ＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴ  ＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣ  ＴＡＣＡＡＧＧＧＣＣ
１５６１  ＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧ  ＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣ  ＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡ  ＡＣＴＴＣＧＡＣＴＧ  ＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡ  ＴＴＴＡＡＣＡＴＣＡ
１６２１  ＣＴＧＡＴＣＧＣＡＣ  ＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧ  ＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴ  ＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧ  ＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧ  ＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧ
１６８１  ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＡ  ＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴ  ＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣ  ＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴ  ＣＴＣＴＣＴＡＣＴＧ  ＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡ
１７４１  ＴＧＴＴＣＴＧＧＧＣ  ＣＧＧＡＧＴＧＧＴＡ  ＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡ  ＴＧＴＡＴＣＣＣＴＧ  ＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴ  ＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣ
１８０１  ＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＣＧＡ  ＡＴＧＧＡＣＡＴＡＧ  ＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡ  ＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴ  ＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧ
１８６１  ＡＣＡＧＧＴＡＴＴＧ  ＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴ  ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧ  ＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡ  ＡＧＡＴＴＴＣＣＧＧ  ＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧ
１９２１  ＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣ  ＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧ  ＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧ  ＡＡＣＡＧＧＧＧＡＴ  ＣＡＣＡＡＧＧＡＧＣ  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧ
１９８１  ＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣ  ＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣ  ＴＡＣＣＴＣＣＡＧＣ  ＡＧＡＴＧＣＣＣＴＡ  ＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣ  ＧＴＧＧＡＣＧＡＴＴ
２０４１  ＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴ  ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣ  ＣＧＣＴＧＴＴＴＣＣ  ＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴ  ＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡ  ＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴ
２１０１  ＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴ  ＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧ  ＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴ  ＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＴＴＧＣＧＡＣＴＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴ
２１６１  ＴＧＡＡＡＡＡＴＣＡ  ＧＧＧＴＧＴＣＴＣＣ  ＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡ  ＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣ  ＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴ
２２２１  ＣＣＡＴＣＡＴＧＴＣ  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣ  ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＧＡＴＡＴＴＣＡＴ  ＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡ  ＡＧＡＡＴＣＣＴＡＣ
２２８１  ＡＴＴＡＣＡＧＣＧＡ  ＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ  ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴ  ＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣ  ＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴ  ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡ
２３４１  ＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴ  ＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣ  ＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴ  ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧ  ＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡ  ＧＣＣＴＧＴＡＧＴＧ
２４０１  ＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡ  ＴＴＴＣＡＣＣＣＴＣ  ＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣ  ＡＣＡＴＣＣＴＧＴＧ  ＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧ  ＣＡＧＧＡＣＣＧＣＡ
２４６１  ＴＧＡＣＣＧＣＴＧＡ  ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧ  ＧＣＴＧＴＧＡＧＣＴ  ＴＡＣＴＧＴＣＴＣＣ  ＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴ  ＧＧＡＴＴＴＧＧＣＡ
２５２１  ＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴ  ＧＧＴＴＣＧＣＴＴＴ  ＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧ  ＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴ  ＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣ  ＡＡＣＡＴＣＧＧＧＡ
２５８１  ＡＣＡＧＴＣＣＣＡＣ  ＧＧＡＡＧＧＧＧＡＣ  ＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴ  ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣ  ＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧ  ＡＴＧＣＴＣＣＴＴＧ
２６４１  ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡ  ＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴ  ＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡ  ＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＴＡＴＧ
２７０１  ＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴ  ＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣ  ＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣ  ＡＡＧＡＧＴＣＧＴＡ  ＴＴＧＧＣＴＴＧＧＣ  ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴ
２７６１  ＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧ  ＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡ  ＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡ  ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣ  ＣＣＴＡＡＣＡＧＡＧ  ＧＡＡＡＣＧＧＡＧＧ
２８２１  ＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡ  ＡＴＡＣＡＣＧＡＣＴ  ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡ  ＡＣＧＴＧＡＧＣＡＴ  ＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧ
２８８１  ＴＴＣＣＴＧＧＧＧＴ  ＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧ  ＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡ  ＡＧＡＴＴＴＴＴＧＡ  ＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣ  ＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧ
２９４１  ＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴ  ＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＡ  ＡＣＣＡＧＡＴＣＡＣ  ＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧ  ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧ
３００１  ＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡ  ＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣ  ＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣ  ＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴ  ＧＴＴＧＣＣＡＣＣＡ  ＡＣＣＴＣＴＧＧＧＡ
３０６１  ＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴ  ＴＧＧＧＧＧＡＡＧＧ  ＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡ  ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡ  ＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧ  ＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧ
３１２１  ＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣ  ＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣ  ＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣ  ＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧ  ＣＡＣＡＴＧＣＴＧＴ
３１８１  ＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡ  ＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡ  ＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡ  ＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧ  ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴ
３２４１  ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣ  ＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣ  ＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡ  ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣ  ＴＣＡＧＧＡＣＣＴＡ  ＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡ
３３０１  ＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡ  ＧＣＴＧＴＣＧＧＴＴ  ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ  ＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡ  ＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧ  ＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧ
３３６１  ＡＣＧＡＡＣＣＣＡＣ  ＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧ  ＧＡＣＣＣＴＴＡＣＴ  ＣＧＡＧＡＣＧＣＴＣ  ＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡ
３４２１  ＡＧＴＡＴＣＧＣＴＣ  ＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣ  ＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴ  ＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡ  ＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧ  ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣ
３４８１  ＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧ  ＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣ  ＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧ  ＧＡＡＧＧＣＴＣＴＡ  ＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣ  ＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴ
３５４１  ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡ  ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣ  ＡＣＡＧＧＣＴＴＧＴ  ＡＣＴＴＡＡＣＣＴＴ  ＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧ  ＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡ
３６０１  ＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡ  ＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣ  ＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡ  ＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧ  ＣＴＣＧＴＣＴＡＡＧ  ＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡ
３６６１  ＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣ  ＡＧＣＣＣＡＣＧＴＣ  ＧＡＴＧＡＣＣＴＡＡ  ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡ  ＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴ  ＧＧＧＧＡＴＧＴＡＡ
３７２１  ＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴ  ＧＧＡＴＧＴＡＧＴＴ  ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧ  ＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣ  ＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧ  ＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ
３７８１  ＧＴＣＡＡＧＡＡＣＴ  ＴＡＴＣＴＴＣＣＴＴ  ＣＴＴＣＣＡＡＡＴＡ  ＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡ  ＧＣＡＣＡＧＡＧＣＡ  ＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣ
３８４１  ＴＴＴＴＣＡＧＡＧＡ  ＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧ  ＡＣＧＣＴＧＧＣＴＧ  ＡＣＣＴＴＧＧＴＣＴ  ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴ  ＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧ
３９０１  ＡＣＡＣＴＣＣＣＣＴ  ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴ  ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧ  ＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡ  ＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡ  ＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴ
３９６１  ＴＴＧＣＧＧＧＴＧＧ  ＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧ  ＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡ  ＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ  ＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣ  ＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣ
４０２１  ＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡ  ＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧ  ＡＣＴＣＣＡＡＴＧＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡ  ＧＧＧＧＣＧＣＣＧＧ
４０６１  ＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣ  ＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧ  ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧ  ＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧ  ＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡ
４１２１  ＣＧＧＧＧＡＣＡＣＡ  ＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣ  ＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣ  ＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴ  ＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡ  ＴＴＣＣＡＡＣＡＣＡ
４１８１  ＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧ  ＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣ  ＴＴＣＣＴＧＧＣＧＣ  ＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴ  ＣＣＣＧＧＣＴＡＣＣ  ＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴ
４２４１  ＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴ  ＧＣＴＴＴＣＴＡＴＴ  ＧＴＴＡＴＣＣＣＴＣ  ＣＴＴＴＴＧＧＣＧＡ  ＡＴＡＣＣＣＣＧＣＴ  ＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣ
４３０１  ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧ  ＣＡＧＴＡＣＡＣＣＴ  ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ  ＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡ  ＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣ
４３６１  ＡＧＴＴＣＡＣＧＧＴ  ＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣ  ＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡ  ＡＴＡＡＧＣＣＡＧＧ  ＣＴＴＴＧＧＣＡＡＣ  ＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡ
４４２１  ＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧ  ＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧ  ＴＡＣＣＣＣＴＧＴＧ  ＧＣＡＡＣＴＣＡＡＣ  ＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧ  ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧ
４４８１  ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＡ  ＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡ  ＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧ  ＧＡＣＡＣＡＧＧＴＣ  ＡＡＣＣＣＴＴＣＡＣ
４５４１  ＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧ  ＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣ  ＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴ  ＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧ
４６０１  ＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴ  ＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣ  ＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣ  ＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣ  ＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＡＡＧＡＣＣＴＧＡ
４６６１  ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡ  ＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣ  ＴＴＣＴＴＧＧＴＡＡ  ＡＡＡＣＧＴＡＴＣＣ  ＴＧＣＴＣＴＴＡＴＡ  ＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴ
４７２１  ＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡ  ＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣ  ＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡ  ＧＧＴＡＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴ  ＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣ
４７８１  ＴＣＣＣＡＧＴＣＧＴ  ＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧ  ＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣ  ＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴ  ＴＴＴＡＡＧＣＧＡＣ  ＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡ
４８４１  ＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴ  ＧＡＧＣＧＧＧＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＡＧＡＧＧＣＣＴＣ  ＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡ  ＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣ
４９０１  ＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴ  ＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡ  ＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡ  ＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴ  ＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡ  ＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧ
４９６１  ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ  ＣＴＴＴＣＴＣＡＡＴ  ＧＴＧＧＣＣＣＡＣＡ  ＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴ  ＡＣＧＧＧＣＣＡＧＣ  ＣＴＧＣＣＴＡＡＧＧ
５０２１  ＡＣＡＧＧＡＧＣＣＣ  ＣＧＡＧＧＡＧＴＡＴ  ＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧ  ＴＣＡＴＴＡＧＣＣＡ  ＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣ  ＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧ
５０８１  ＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣ  ＡＧＡＧＡＴＴＡＣＡ  ＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡ  ＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡ  ＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧ
５１４１  ＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣ  ＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣ  ＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡ  ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＴ  ＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣ  ＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧ
５２０１  ＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣ  ＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣ  ＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡ  ＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧ  ＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ  ＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡ
５２６１  ＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴ  ＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣ  ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴ  ＣＣＧＴＧＡＧＴＧＣ  ＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧ  ＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴ
５３２１  ＴＣＡＴＣＧＧＧＴＴ  ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡ  ＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴ  ＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡ  ＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣ  ＣＴＴＧＴＧＧＣＡＣ
５３８１  ＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴ  ＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ  ＧＣＧＧＴＣＡＴＴＣ  ＣＣＡＴＧＡＴＧＴＡ  ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣ  ＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧ
５４４１  ＡＴＧＴＣＣＣＣＡＧ  ＣＡＣＡＧＣＣＴＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴ  ＣＴＴＧＴＧＣＴＡＡ  ＴＣＴＧＴＴＣＡＴＣ  ＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡ
５５０１  ＧＣＡＧＴＧＣＴＡＴ  ＴＡＣＣＴＴＣＡＴＣ  ＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡ  ＣＣＧＧＡＣＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡ
５５６１  ＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴ  ＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴ  ＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴ  ＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣ  ＣＧＧＧＧＣＣＴＣＡ
５６２１  ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣ  ＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧ  ＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＣＧＧＴＴＴＧＧＴ  ＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴ
５６８１  ＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣ  ＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧ  ＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧ  ＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧ  ＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧ
５７４１  ＧＧＧＴＧＧＴＧＴＡ  ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧ  ＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧ  ＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡ  ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣ  ＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡ
５８０１  ＴＴＧＣＣＧＡＧＣＣ  ＣＡＣＴＡＡＧＧＡＧ  ＣＣＣＡＴＴＧＴＴＧ  ＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡ  ＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣ
５８６１  ＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴ  ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡ  ＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧ  ＡＣＡＴＣＴＴＡＡＧ  ＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡ  ＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡ
５９２１  ＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ  ＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣ  ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧ  ＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧ  ＴＧＴＣＧＧＡＧＴＴ  ＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧ
５９８１  ＡＧＴＧＣＴＴＴＧＧ  ＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡ  ＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧ  ＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣ  ＡＡＣＣＡＣＡＴＴＣ  ＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡ
６０４１  ＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣ  ＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣ  ＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴ  ＡＴＴＴＴＡＡＣＣＡ
６１０１  ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＡ  ＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡ  ＡＡＴＡＴＧＧＧＣＴ  ＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡ  ＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡ  ＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣ
６１６１  ＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧ  ＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴ  ＣＴＴＴＡＣＣＴＴＴ  ＡＴＧＣＣＣＧＧＣＴ  ＴＣＧＡＧＧＴＧＴＡ  ＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧ
６２２１  ＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡ  ＧＧＴＴＧＣＡＡＡＣ  ＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡ  ＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧ  ＣＣＴＧＡＣＴＧＴＣ  ＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴ
６２８１  ＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ  ＣＡＣＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＧＧＧＣＡＡＣＡ  ＡＧＣＧＧＡＡＡＣＴ  ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣ  ＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡ
６３４１  ＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣ  ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣ  ＡＧＧＧＡＴＧＧＡＣ  ＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣ
６４０１  ＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＧＴＣ  ＡＴＣＧＴＧＡＧＣＡ  ＴＣＡＴＣＡＧＡＧＡ  ＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡ
６４６１  ＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧ  ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡ  ＴＧＴＧＡＧＧＣＡＣ  ＴＧＴＧＴＡＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣ  ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧ
６５２１  ＧＣＧＣＣＴＴＴＣＧ  ＡＴＧＴＡＴＧＧＧＣ  ＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣ  ＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣ  ＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡ  ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＡ
６５８１  ＴＣＧＴＣＡＣＡＡＴ  ＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡ  ＴＣＣＣＣＧＡＡＧＧ  ＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴ  ＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧ  ＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧ
６６４１  ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ  ＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣ  ＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡ  ＧＴＧＴＧＣＡＧＡＧ  ＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣ  ＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣ
６７０１  ＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡ  ＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ  ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴ  ＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ  ＣＴＣＴＣＣＣＡＣＡ
６７６１  ＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴ  ＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧ  ＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧ  ＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣ  ＣＡＣＡＣＴＧＧＡＣ  ＣＡＧＧＴＧＴＴＴＧ
６８２１  ＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣ  ＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧ  ＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣ  ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＣ  ＴＣＴＧＣＡＣＣＣＴ  ＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧ
６８８１  ＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧ  ＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧ  ＧＡＣＴＧＡＴＣＴＴ  ＴＣＡＣＡＣＣＧＣＴ  ＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧ
６９４１  ＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣ  ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣ  ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴ  ＧＴＧＣＣＣＡＴＡＴ  ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＡ  ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＣ
７００１  ＣＡＧＣＧＴＡＡＡＴ  ＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧ  ＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡ  ＣＡＡＡＣＡＣＡＣＧ  ＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣ  ＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡ
７０６１  ＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣ  ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧ  ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣ  ＴＧＡＣＴＴＧＣＴＣ  ＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡ  ＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧ
７１２１  ＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡ  ＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴ  ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧ  ＡＣＣＣＣＡＧＡＡＣ  ＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣ  ＧＧＧＣＣＡＴＣＣＣ
７１８１  ＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴ  ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡ  ＴＡＴＴＧＣＴＣＴＣ  ＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡ  ＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴ  ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴ
７２４１  ＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧ  ＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴ  ＧＴＧＴＧＡＴＴＴＴ  ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡ  ＴＡＡＡＡＴＧＣＡＡ  ＡＴＧＣＡＣＴＣＡＴ
７３０１  ＣＡＣＡＡＡ（配列番号１）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、修飾されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４をコードする配列は、
１  ＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ  ＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣ  ＡＧＡＧＧＣＧＣＴＣ  ＴＴＡＡＣＧＧＣＧＴ  ＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴ  ＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡ  ６１  ＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧ  ＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡ  ＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣ  ＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴ  ＴＡＧＣＡＴＧＧＧＣ  ＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣ
１２１  ＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴ  ＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧ  ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡ  ＣＣＣＴＧＣＧＧＡＡ  ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧ  ＡＴＴＣＧＣＴＴＴＧ
１８１  ＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴ  ＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴ  ＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴ  ＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴ  ＧＡＴＣＴＧＧＴＴＡ  ＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡ
２４１  ＡＣＣＣＧＣＴＣＴＡ  ＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴ  ＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴ  ＴＣＣＣＣＡＡＣＡＡ  ＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣ  ＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡ
３０１  ＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧ  ＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧ  ＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡ  ＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡ  ＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴ  ＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡ
３６１  ＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡ  ＡＴＴＧＴＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡ  ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＧ  ＧＣＡＡＧＧＧＴＡＴ
４２１  ＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴ  ＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣ  ＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧ  ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧ  ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴ  ＧＧＣＣＧＴＡＴＴＴ
４８１  ＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴ  ＡＣＡＣＡＴＣＴＴＧ  ＴＣＣＣＡＡＴＴＣＡ  ＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴ  ＣＣＧＧＡＣＴＣＡＣ  ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡ
５４１  ＴＴＧＣＡＧＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＴＡＣＧＡ  ＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡ  ＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡ  ＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡ  ＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴ
６０１  ＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡ  ＡＡＡＣＡＴＣＧＧＣ  ＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡ  ＣＣＴＴＣＴＧＡＴＣ  ＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧ
６６１  ＴＣＣＧＴＣＣＡＧＡ  ＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴ  ＣＡＴＧＧＡＧＴＣＣ  ＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣ  ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣ  ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡ
７２１  ＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴ  ＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣ  ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴ  ＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧ  ＡＣＧＣＧＧＧＧＣＡ  ＡＡＧＡＣＧＧＴＧＣ
７８１  ＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴ  ＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣ  ＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡ  ＣＣＣＴＡＣＡＧＴＧ  ＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣ  ＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧ
８４１  ＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡ  ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧ  ＣＴＣＴＴＣＣＧＴＧ  ＴＧＣＴＴＣＣＣＡＣ  ＡＣＴＣＣＴＡＧＡＣ  ＡＧＣＣＧＴＴＣＴＣ
９０１  ＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡ  ＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴ  ＴＧＧＧＧＡＧＧＡＡ  ＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡ  ＴＡＴＧＴＣＡＣＣＡ  ＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧ
９６１  ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＡ  ＴＣＧＧＣＣＧＡＧＴ  ＡＴＧＣＡＧＧＡＣＴ  ＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴ  ＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣ  ＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡ
１０２１  ＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴ  ＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡ  ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴ  ＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣ  ＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴ
１０８１  ＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧ  ＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴ  ＣＧＧＧＴＧＣＴＣＴ  ＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧ  ＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣ  ＡＡＴＡＡＣＴＡＴＡ
１１４１  ＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴ  ＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣ  ＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡ  ＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴ  ＣＴＡＴＴＣＴＴＡＴ  ＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡ
１２０１  ＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴ  ＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡ  ＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡ  ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＣ  ＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡ  ＡＣＣＡＡＡＡＴＣＧ
１２６１  ＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣ  ＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴ  ＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴ  ＧＴＡＣＡＣＴＣＣＴ  ＧＡＴＴＣＡＣＣＴＧ
１３２１  ＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧ  ＧＡＴＡＣＴＧＡＡＧ  ＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴ  ＣＡＡＣＴＴＴＴＧＡ  ＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡ  ＣＡＣＧＴＴＡＧＧＡ
１３８１  ＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡ  ＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡ  ＧＡＡＧＴＡＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧ  ＧＴＡＣＴＴＣＴＴＴ  ＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡ
１４４１  ＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡ  ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡ  ＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧ  ＧＧＡＡＣＣＣＡＡＣ  ＡＧＴＡＡＡＡＧＡＣ  ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡ
１５０１  ＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧ  ＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴ  ＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧ  ＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴ  ＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣ  ＴＡＣＡＡＧＧＧＣＣ
１５６１  ＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧ  ＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣ  ＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡ  ＡＣＴＴＣＧＡＣＴＧ  ＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡ  ＴＴＴＡＡＣＡＴＣＡ
１６２１  ＣＴＧＡＴＣＧＣＡＣ  ＣＣＴＣＣＧＣＣＴＴ  ＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴ  ＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧ  ＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧ  ＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧ
１６８１  ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＡ  ＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴ  ＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣ  ＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴ  ＣＴＣＴＣＴＡＣＴＧ  ＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡ
１７４１  ＴＧＴＴＣＴＧＧＧＣ  ＣＧＧＡＧＴＧＧＴＡ  ＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡ  ＴＧＴＡＴＣＣＣＴＧ  ＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴ  ＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣ
１８０１  ＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＣＧＡ  ＡＴＧＧＡＣＡＴＡＧ  ＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡ  ＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴ  ＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧ
１８６１  ＡＣＡＧＧＴＡＴＴＧ  ＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴ  ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧ  ＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡ  ＡＧＡＴＴＴＣＣＧＧ  ＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧ
１９２１  ＧＣＧＧＧＴＴＴＧＣ  ＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧ  ＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧ  ＡＡＣＡＧＧＧＧＡＴ  ＣＡＣＡＡＧＧＡＧＣ  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧ
１９８１  ＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣ  ＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣ  ＴＡＣＣＴＣＣＡＧＣ  ＡＧＡＴＧＣＣＣＴＡ  ＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣ  ＧＴＧＧＡＣＧＡＴＴ
２０４１  ＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴ  ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣ  ＣＧＣＴＧＴＴＴＣＣ  ＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴ  ＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡ  ＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴ
２１０１  ＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴ  ＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧ  ＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴ  ＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＴＴＧＣＧＡＣＴＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴ
２１６１  ＴＧＡＡＡＡＡＴＣＡ  ＧＧＧＴＧＴＣＴＣＣ  ＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡ  ＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣ  ＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴ
２２２１  ＣＣＡＴＣＡＴＧＴＣ  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣ  ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＧＡＴＡＴＴＣＡＴ  ＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡ  ＡＧＡＡＴＣＣＴＡＣ
２２８１  ＡＴＴＡＣＡＧＣＧＡ  ＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ  ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴ  ＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣ  ＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴ  ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡ
２３４１  ＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴ  ＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣ  ＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴ  ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧ  ＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡ  ＧＣＣＴＧＴＡＧＴＧ
２４０１  ＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡ  ＴＴＴＣＡＣＣＣＴＣ  ＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣ  ＡＣＡＴＣＣＴＧＴＧ  ＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧ  ＣＡＧＧＡＣＣＧＣＡ
２４６１  ＴＧＡＣＣＧＣＴＧＡ  ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧ  ＧＣＴＧＴＧＡＧＣＴ  ＴＡＣＴＧＴＣＴＣＣ  ＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴ  ＧＧＡＴＴＴＧＧＣＡ
２５２１  ＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴ  ＧＧＴＴＣＧＣＴＴＴ  ＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧ  ＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴ  ＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣ  ＡＡＣＡＴＣＧＧＧＡ
２５８１  ＡＣＡＧＴＣＣＣＡＣ  ＧＧＡＡＧＧＧＧＡＣ  ＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴ  ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣ  ＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧ  ＡＴＧＣＴＣＣＴＴＧ
２６４１  ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＡ  ＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴ  ＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡ  ＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＴＡＴＧ
２７０１  ＧＡＡＣＣＣＣＡＣＴ  ＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣ  ＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣ  ＡＡＧＡＧＴＣＧＴＡ  ＴＴＧＧＣＴＴＧＧＣ  ＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴ
２７６１  ＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧ  ＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡ  ＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡ  ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＣ  ＣＣＴＡＡＣＡＧＡＧ  ＧＡＡＡＣＧＧＡＧＧ
２８２１  ＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡ  ＡＴＡＣＡＣＧＡＣＴ  ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡ  ＡＣＧＴＧＡＧＣＡＴ  ＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧ
２８８１  ＴＴＣＣＴＧＧＧＧＴ  ＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧ  ＡＡＴＣＴＧＧＴＡＡ  ＡＧＡＴＴＴＴＴＧＡ  ＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣ  ＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧ
２９４１  ＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴ  ＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣ  ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＡ  ＡＣＣＡＧＡＴＣＡＣ  ＣＧＣＡＴＴＣＣＴＧ  ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＧ
３００１  ＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡ  ＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣ  ＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣ  ＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴ  ＧＴＴＧＣＣＡＣＣＡ  ＡＣＣＴＣＴＧＧＧＡ
３０６１  ＣＴＧＴＧＣＴＣＧＴ  ＴＧＧＧＧＧＡＡＧＧ  ＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡ  ＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡ  ＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧ  ＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧ
３１２１  ＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣ  ＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣ  ＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣ  ＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧ  ＣＡＣＡＴＧＣＴＧＴ
３１８１  ＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡ  ＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡ  ＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡ  ＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧ  ＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴ
３２４１  ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣ  ＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣ  ＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡ  ＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣ  ＴＣＡＧＧＡＣＣＴＡ  ＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡ
３３０１  ＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡ  ＧＣＴＧＴＣＧＧＴＴ  ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ  ＴＴＧＴＧＧＧＡＧＡ  ＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧ  ＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧ
３３６１  ＡＣＧＡＡＣＣＣＡＣ  ＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧ  ＧＡＣＣＣＴＴＡＣＴ  ＣＧＡＧＡＣＧＣＴＣ  ＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡ
３４２１  ＡＧＴＡＴＣＧＣＴＣ  ＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣ  ＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴ  ＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡ  ＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧ  ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣ
３４８１  ＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧ  ＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣ  ＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧ  ＧＡＡＧＧＣＴＣＴＡ  ＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣ  ＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴ
３５４１  ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡ  ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣ  ＡＣＡＧＧＣＴＴＧＴ  ＡＣＴＴＡＡＣＣＴＴ  ＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧ  ＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡ
３６０１  ＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡ  ＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣ  ＡＧＴＧＡＧＧＧＧＡ  ＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧ  ＣＴＣＧＴＣＴＡＡＧ  ＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡ
３６６１  ＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣ  ＡＧＣＣＣＡＣＧＴＣ  ＧＡＴＧＡＣＣＴＡＡ  ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡ  ＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴ  ＧＧＧＧＡＴＧＴＡＡ
３７２１  ＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴ  ＧＧＡＴＧＴＡＧＴＴ  ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧ  ＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣ  ＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧ  ＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ
３７８１  ＧＴＣＡＡＧＡＡＣＴ  ＴＡＴＣＴＴＣＣＴＴ  ＣＴＴＣＣＡＡＡＴＡ  ＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡ  ＧＣＡＣＡＧＡＧＣＡ  ＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣ
３８４１  ＴＴＴＴＣＡＧＡＧＡ  ＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧ  ＡＣＧＣＴＧＧＣＴＧ  ＡＣＣＴＴＧＧＴＣＴ  ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴ  ＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧ
３９０１  ＡＣＡＣＴＣＣＣＣＴ  ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴ  ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧ  ＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡ  ＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡ  ＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴ
３９６１  ＴＴＧＣＧＧＧＴＧＧ  ＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧ  ＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡ  ＡＣＧＴＣＡＡＣＣＣ  ＣＣＧＡＣＡＣＣＣＣ  ＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣ
４０２１  ＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡ  ＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧ  ＡＣＴＣＣＡＡＴＧＴ  ＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡ  ＧＧＧＧＣＧＣＣＧＧ
４０８１  ＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣ  ＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧ  ＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧ  ＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧ  ＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡ
４１４１  ＣＧＧＧＧＡＣＡＣＡ  ＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣ  ＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣ  ＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴ  ＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡ  ＴＴＣＣＡＡＣＡＣＡ
４２０１  ＣＣＡＴＣＣＧＣＡＧ  ＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣ  ＴＴＣＣＴＧＧＣＧＣ  ＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴ  ＣＣＣＧＧＣＴＡＣＣ  ＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴ
４２６１  ＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴ  ＧＣＴＴＴＣＴＡＴＴ  ＧＴＴＡＴＣＣＣＴＣ  ＣＴＴＴＴＧＧＣＧＡ  ＡＴＡＣＣＣＣＧＣＴ  ＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣ
４３２１  ＡＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧ  ＣＡＧＴＡＣＡＣＣＴ  ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ  ＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡ  ＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣ
４３８１  ＡＧＴＴＣＡＣＧＧＴ  ＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣ  ＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡ  ＡＴＡＡＧＣＣＡＧＧ  ＣＴＴＴＧＧＣＡＡＣ  ＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡ
４４４１  ＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧ  ＧＣＴＴＣＣＧＧＡＧ  ＴＡＣＣＣＣＴＧＴＧ  ＧＣＡＡＣＴＣＡＡＣ  ＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧ  ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧ
４５０１  ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＡ  ＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧ  ＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡ  ＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧ  ＧＡＣＡＣＡＧＧＴＣ  ＡＡＣＣＣＴＴＣＡＣ
４５６１  ＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧ  ＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣ  ＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴ  ＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧ
４６２１  ＣＣＧＧＧＧＧＣＣＴ  ＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣ  ＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣ  ＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣ  ＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＡＡＧＡＣＣＴＧＡ
４６８１  ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡ  ＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣ  ＴＴＣＴＴＧＧＴＡＡ  ＡＡＡＣＧＴＡＴＣＣ  ＴＧＣＴＣＴＴＡＴＡ  ＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴ
４７４１  ＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡ  ＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣ  ＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡ  ＧＧＴＡＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴ  ＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣ
４８０１  ＴＣＣＣＡＧＴＣＧＴ  ＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧ  ＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣ  ＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴ  ＴＴＴＡＡＧＣＧＡＣ  ＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡ
４８６１  ＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴ  ＧＡＧＣＧＧＧＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＡＧＡＧＧＣＣＴＣ  ＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡ  ＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣ
４９２１  ＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴ  ＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡ  ＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡ  ＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴ  ＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡ  ＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧ
４９８１  ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ  ＣＴＴＴＣＴＣＡＡＴ  ＧＴＧＧＣＣＣＡＣＡ  ＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴ  ＡＣＧＧＧＣＣＡＧＣ  ＣＴＧＣＣＴＡＡＧＧ
５０４１  ＡＣＡＧＧＡＧＣＣＣ  ＣＧＡＧＧＡＧＴＡＴ  ＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧ  ＴＣＡＴＴＡＧＣＣＡ  ＡＣＣＣＣＴＧＡＡＣ  ＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧ
５１０１  ＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣ  ＡＧＡＧＡＴＴＡＣＡ  ＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡ  ＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡ  ＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧ
５１６１  ＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣ  ＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣ  ＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡ  ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＴ  ＴＴＡＴＴＴＧＡＴＣ  ＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧ
５２２１  ＴＧＡＡＣＡＡＡＴＣ  ＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣ  ＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡ  ＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧ  ＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ  ＴＡＣＴＧＧＧＴＡＡ
５２８１  ＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴ  ＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣ  ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴ  ＣＣＧＴＧＡＧＴＧＣ  ＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧ  ＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴ
５３４１  ＴＣＡＴＣＧＧＧＴＴ  ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡ  ＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴ  ＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡ  ＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣ  ＣＴＴＧＴＧＧＣＡＣ
５４０１  ＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴ  ＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ  ＧＣＧＧＴＣＡＴＴＣ  ＣＣＡＴＧＡＴＧＴＡ  ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣ  ＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧ
５４６１  ＡＴＧＴＣＣＣＣＡＧ  ＣＡＣＡＧＣＣＴＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴ  ＣＴＴＧＴＧＣＴＡＡ  ＴＣＴＧＴＴＣＡＴＣ  ＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡ
５５２１  ＧＣＡＧＴＧＣＴＡＴ  ＴＡＣＣＴＴＣＡＴＣ  ＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴ  ＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡ  ＣＣＧＧＡＣＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡ
５５８１  ＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴ  ＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴ  ＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴ  ＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣ  ＣＧＧＧＧＣＣＴＣＡ
５６４１  ＴＴＧＡＣＣＴＴＧＣ  ＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧ  ＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＣＧＧＴＴＴＧＧＴ  ＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴ
５７０１  ＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣ  ＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧ  ＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧ  ＧＧＡＡＧＡＡＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧ  ＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧ
５７６１  ＧＧＧＴＧＧＴＧＴＡ  ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧ  ＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧ  ＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡ  ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣ  ＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡ
５８２１  ＴＴＧＣＣＧＡＧＣＣ  ＣＡＣＴＡＡＧＧＡＧ  ＣＣＣＡＴＴＧＴＴＧ  ＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡ  ＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣ
５８８１  ＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴ  ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡ  ＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧ  ＡＣＡＴＣＴＴＡＡＧ  ＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡ  ＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡ
５９４１  ＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ  ＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣ  ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧ  ＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧ  ＴＧＴＣＧＧＡＧＴＴ  ＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧ
６００１  ＡＧＴＧＣＴＴＴＧＧ  ＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡ  ＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧ  ＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣ  ＡＡＣＣＡＣＡＴＴＣ  ＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡ
６０６１  ＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣ  ＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣ  ＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴ  ＡＴＴＴＴＡＡＣＣＡ
６１２１  ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＡ  ＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡ  ＡＡＴＡＴＧＧＧＣＴ  ＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡ  ＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡ  ＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣ
６１８１  ＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧ  ＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴ  ＣＴＴＴＡＣＣＴＴＴ  ＡＴＧＣＣＣＧＧＣＴ  ＴＣＧＡＧＧＴＧＴＡ  ＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧ
６２４１  ＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡ  ＧＧＴＴＧＣＡＡＡＣ  ＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡ  ＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧ  ＣＣＴＧＡＣＴＧＴＣ  ＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴ
６３０１  ＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ  ＣＡＣＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＧＧＧＣＡＡＣＡ  ＡＧＣＧＧＡＡＡＣＴ  ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣ  ＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡ
６３６１  ＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣ  ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣ  ＡＧＧＧＡＴＧＧＡＣ  ＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣ
６４２１  ＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＧＴＣ  ＡＴＣＧＴＧＡＧＣＡ  ＴＣＡＴＣＡＧＡＧＡ  ＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡ
６４８１  ＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧ  ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡ  ＴＧＴＧＡＧＧＣＡＣ  ＴＧＴＧＴＡＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣ  ＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧ
６５４１  ＧＣＧＣＣＴＴＴＣＧ  ＡＴＧＴＡＴＧＧＧＣ  ＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣ  ＡＴＣＴＣＡＡＧＴＣ  ＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡ  ＧＡＴＧＧＣＴＡＴＡ
６６０１  ＴＣＧＴＣＡＣＡＡＴ  ＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡ  ＴＣＣＣＣＧＡＡＧＧ  ＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴ  ＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧ  ＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧ
６６６１  ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ  ＣＣＡＧＧＧＧＡＡＣ  ＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡ  ＧＴＧＴＧＣＡＧＡＧ  ＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣ  ＴＡＣＡＡＣＡＴＧＣ
６７２１  ＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡ  ＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ  ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴ  ＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣ  ＣＴＣＴＣＣＣＡＣＡ
６７８１  ＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴ  ＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧ  ＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧ  ＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣ  ＣＡＣＡＣＴＧＧＡＣ  ＣＡＧＧＴＧＴＴＴＧ
６８４１  ＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣ  ＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧ  ＡＣＴＧＡＡＡＧＴＣ  ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＣ  ＴＣＴＧＣＡＣＣＣＴ  ＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧ
６９０１  ＧＡＧＣＣＡＧＴＣＧ  ＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧ  ＧＡＣＴＧＡＴＣＴＴ  ＴＣＡＣＡＣＣＧＣＴ  ＣＧＴＴＣＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧ
６９６１  ＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣ  ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣ  ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴ  ＧＴＧＣＣＣＡＴＡＴ  ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＡ  ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＣ
７０２１  ＣＡＧＣＧＴＡＡＡＴ  ＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧ  ＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡ  ＣＡＡＡＣＡＣＡＣＧ  ＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣ  ＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡ
７０８１  ＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣ  ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧ  ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣ  ＴＧＡＣＴＴＧＣＴＣ  ＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡ  ＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧ
７１４１  ＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡ  ＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴ  ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧ  ＡＣＣＣＣＡＧＡＡＣ  ＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣ  ＧＧＧＣＣＡＴＣＣＣ
７２０１  ＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴ  ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡ  ＴＡＴＴＧＣＴＣＴＣ  ＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡ  ＧＡＴＣＴＧＣＴＴＴ  ＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴ
７２６１  ＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧ  ＴＣＴＧＣＧＴＴＧＴ  ＧＴＧＴＧＡＴＴＴＴ  ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡ  ＴＡＡＡＡＴＧＣＡＡ  ＡＴＧＣＡＣＴＣＡＴ
７３２１  ＣＡＣＡＡＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９９】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ロドプシンキナーゼプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ロドプシンキナーゼプロモーターは、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）遺伝子のプロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列は、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号７５）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＲＫ１プロモーターは、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号７５）を含むか、またはそれからなる。
【０１００】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーターをコードする配列は、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）、または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）、または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれからなる。
【０１０１】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、プロモーター変異体、例えば、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＣＭＶエンハンサー及びＣＢＡプロモーターを含む、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーターをコードする配列は、
ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号８４）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＣＢＡプロモーター及びＲＧＢイントロンを含む、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーターをコードする配列は、
ＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧ  ＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣ  ＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣ  ＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣ  ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ  ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡ  ＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴ  ＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴ  ＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴ  ＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴ  ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ  ＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣ  ＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧ  ＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧ  ＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣ  ＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣ  ＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣ  ＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣ  ＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣ  ＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧ  ＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣ  ＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧ  ＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣ  ＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣ  ＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣ  ＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣ  ＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣ  ＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡ
ＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴ  ＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡ  ＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧ  ＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣ  ＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣ  ＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴ  ＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧ  ＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴ  ＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣ  ＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧ  ＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧ  ＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧ  ＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧ  ＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣ  ＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣ  ＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧ  ＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ  ＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴ  ＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧ  ＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧ  ＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴ  ＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣ  ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡ  ＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧ  ＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴ  ＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧ  ＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡ  ＡＧＡＡＴＴ（配列番号８５）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、ＣＢＡプロモーター、イントロン、及びエクソンを含む、ＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーター変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターをコードする配列は、
ＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧ  ＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣ  ＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣ  ＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣ  ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣ  ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡ  ＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴ  ＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴ  ＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴ  ＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴ  ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ  ＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣ  ＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧ  ＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧ  ＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣ  ＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣ  ＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣ  ＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣ  ＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣ  ＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧ  ＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣ  ＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧ  ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧ  ＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴ  ＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡ  ＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧ  ＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧ  ＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴ  ＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧ
ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣ  ＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣ  ＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧ  ＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ  ＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧ  ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡ  ＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴ  ＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧ  ＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴ（配列番号８６）（イントロンは斜体である）と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１０５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルから単離または誘導されたポリＡシグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリＡシグナルは、
１  ｔｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＧＨポリＡをコードする配列は、
１  ｔｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【０１０６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＢＣＡ４構築物は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一でない。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離または誘導される。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、短縮型野生型ＡＡＶ２配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型ＡＡＶ２配列と比較した際に、変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、野生型または変異体配列の短縮型または伸長を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、安定化したＩＴＲを産生するように、順方向及び逆方向の向きで、後に欠失を伴って、３’ＡＡＶ２  ＩＴＲから誘導される。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、次の配列：ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３６）を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲは、次の配列：
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧ（配列番号３７）を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離または誘導される野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ  （配列番号３５）の配列を含む。
【０１０７】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス配列は、５’ＩＴＲをコードする配列または３’ＩＴＲをコードする配列の一方または両方と同じ血清型のＡＡＶから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、ウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、または３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離または誘導される。
【０１０８】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列を含むが、ＡＡＶから単離または誘導されるいかなる他の配列も含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、及び本開示のＡＢＣＡ４構築物をコードする配列を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞においてｒＡＡＶを作成するために使用されるプラスミドＤＮＡは、選択マーカーを含む。例示的な選択マーカーには、抗生物質抵抗性遺伝子が含まれるが、これに限定されない。抗生物質抵抗性遺伝子の例には、アンピシリン及びカナマイシンが含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーには、薬物または小分子抵抗性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーには、ｄａｐＤ、及びｄａｐＤ発現を制御または抑制するｌａｃＯ／Ｐ構築物を含むがこれに限定されない抑制可能オペレーターが含まれ、プラスミド選択は、オペレーターリプレッサータイトレーション（ＯＲＴ）が可能なプラスミドに形質転換された細胞を投与または接触させることにより実行される。例示的な選択マーカーには、ｃｃｄ選択遺伝子が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ｃｃｄ選択遺伝子は、毒性ｃｃｄＢ遺伝子を発現するように操作された宿主細胞株を救済するｃｃｄＡ選択遺伝子をコードする配列を含む。例示的な選択マーカーには、ｓａｃＢが含まれるがこれに限定されず、ＲＮＡは、宿主細胞に投与または接触されて、スクロース培地中でのｓａｃＢ遺伝子の発現を抑制する。例示的な選択マーカーには、Ｈｏｋ（宿主殺傷遺伝子）及びＳｏｋ（殺傷の抑制）から構成されるｐａｒＡＢ＋座位などの分離殺傷メカニズムが含まれるが、これに限定されない。
【０１１０】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４デュアルベクター構築物
【０１１１】
ＡＡＶは非常に低い免疫原性を提示する小型ウイルスであり、いかなる公知のヒト疾患にも関連していない。付随する免疫反応がないということは、ＡＡＶを眼の中に注射しても網膜損傷を引き起こさないことを意味する。
【０１１２】
しかしながら、ＡＡＶキャプシドのサイズにより、その中にパッケージできるＤＮＡの量が制限を受ける。ＡＡＶゲノムは、サイズがおよそ４．７キロベース（ｋｂ）であり、ＡＡＶにおけるＤＮＡパッケージングに関する対応する上限サイズは、およそ５ｋｂであると考えられている。ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列は、サイズがおよそ６．８ｋｂであり（遺伝子発現のためにはさらなる遺伝要素が必要となる）。標準的なＡＡＶベクターに組み込むには大きすぎる。
【０１１３】
「デュアル」ベクター
【０１１４】
代替的な手法は、デュアルベクターシステムを調製することとなっており、デュアルベクターシステムでは、およそ５ｋｂ限界よりも大きな導入遺伝子が、規定された配列の２つの別々のベクター：導入遺伝子の５’部分を含有する「上流」ベクター、及び導入遺伝子の３’部分を含有する「下流」ベクターへと、概ね半分に分割されている。上流ベクター及び下流ベクターの両方による標的細胞の形質導入によって、完全長導入遺伝子が様々な細胞内機構を使用して２つの断片から再構成されることが可能になる。本明細書に開示の方法は、デュアルベクターシステムのいずれかまたは両方のベクターを生成するために使用されてもよい。本明細書に開示の組成物は、デュアルベクターシステムの一方または両方のベクトルを含んでもよい。
【０１１５】
本開示のデュアルベクターシステムは、「重複」手法を使用する。重複デュアルベクターシステムでは、上流コード配列部分の３’末端のコード配列の部分は、下流コード配列部分の５’の相同配列と重複する。上流及び下流ベクターによる標的細胞の形質導入の際、コード配列の上流部分と下流部分との間での相同組換えにより、完全長導入遺伝子の再作製が可能になり、これから対応するｍＲＮＡが転写され、完全長タンパク質が発現される。
【０１１６】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、完全長導入遺伝子（例えば、ＡＢＣＡ４）は、第二鎖合成、その後の相同組換えにより、重複デュアルベクターシステムから生成され得る。上流ＡＡＶ粒子及び下流粒子による細胞の形質導入の際に、対応するｓｓＤＮＡ上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターは、細胞またはその核へと放出され、導入遺伝子の５’（上流）部分及び導入遺伝子の３’（下流）部分を含むｄｓＤＮＡは、第二鎖合成によってｓｓＤＮＡのそれぞれから生成される。次いで、ｄｓＤＮＡは、コード配列の上流部分と下流部分との間の重複の領域にて相同組換えを受け、これにより完全長導入遺伝子の再作製が可能になり、これから対応するｍＲＮＡが転写され、完全長タンパク質が発現され得る。例えば、ＷＯ２０１４／１７０４８０は、ヒトＡＢＣＡ４タンパク質をコードするデュアルＡＡＶベクターシステムを記載している（その内容は、その全体が本明細書に組込まれる）。
【０１１７】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の５’部分を含む。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の３’部分を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部分及び３’末端部分は、少なくとも約２０個のヌクレオチドで重複する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターはそれぞれ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び／またはＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。いくつの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び／またはＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、５’ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び３’ＡＢＣＡ４コード配列の一部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、３’ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び５’ＡＢＣＡ４コード配列の一部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターは、第二鎖合成を受けて、第１のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクター及び第２のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクターを生成する。いくつかの実施形態では、第１のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクター及び第２のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクターは、相同組換えをとおして完全長ＡＢＣＡ４導入遺伝子を生成する。
【０１１８】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、完全長導入遺伝子はまた、一本鎖アニーリング及び第二鎖合成をとおして、重複デュアルベクターシステムから生成され得る。上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターによる細胞の形質導入の際、上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターの各々がｓｓＤＮＡを含み、上流ＡＡＶベクターが導入遺伝子の５’部分をコードする配列を含み、下流ＡＡＶベクターが導入遺伝子の３’部分をコードする配列を含む場合、相補的な上流ベクター及び下流ベクターは、細胞またはその核へと放出される。いくつかの実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードする配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードするセンス配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードするアンチセンス配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードする配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードするアンチセンス配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードするセンス配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、上流ベクター及び下流ベクターは、相補性の領域（重複）にてハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに続いて、完全長導入遺伝子が第二鎖合成によって生成される。
【０１１９】
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の５’部分を含み、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の３’部分を含み、５’部分及び３’部分は少なくとも２０個の連続ヌクレオチドで重複する。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターは各々、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列を含み、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターは、相補的な重複領域でアニーリングして、続く第二鎖合成によって完全長ｄｓＤＮＡ  ＡＢＣＡ４導入遺伝子を生成する。いくつかの実施形態では、完全長ｄｓＤＮＡ  ＡＢＣＡ４導入遺伝子は、インビトロまたはインビボ（細胞内または対象内）で生成される。
【０１２０】
本開示は、特許請求の範囲に記載する通りのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供することにより、上記の先行技術の問題に対処する。
【０１２１】
デュアルベクター手法は、ＡＡＶ遺伝子治療の能力を増大させるが、治療効果を達成するには不十分であり得る標的タンパク質のレベルを実質的に減少させることもあり得る。デュアルベクターシステムのいくつかの実施形態では、デュアルベクターの組換えの効率は、プラス鎖及びマイナス鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）間のＤＮＡ重複の長さに依存する。ＡＢＣＡ４コード配列のサイズにより、大型遺伝子における突然変異によって引き起こされる障害の処置に最適なデュアルベクター戦略に関するゾーンを同定するための、プラス鎖及びマイナス鎖間の重複の様々な長さの探索が可能となる。これらの戦略は、治療効果を提供するのに十分な標的タンパク質の産生をもたらすことができる。シュタルガルトマウスモデルでは、標的タンパク質であるＡＢＣＡ４が、網膜の光受容体細胞において豊富に必要であり、その欠如がビスレチノイド化合物の蓄積を誘発し、それが７９０ｎｍ自家蛍光の増加につながるため、治療効果を容易に評価できる。重複デュアルベクターシステムの治療可能性は、処置後のこのビスレチノイド蓄積及び後続の７９０ｎｍ自家蛍光レベルにおける減少を観察することにより、インビボで検証できる。
【０１２２】
有利なことに、本開示のＡＡＶベクターシステムは、形質導入された細胞において完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の驚くほど高いレベルの発現を提供し、ＡＢＣＡ４の不要な短縮断片の生成は限定的である。最適化された組換えを用いると、完全長ＡＢＣＡ４タンパク質は、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節にて、ビスレチノイドの形成を減少させ、網膜イメージングでの自家蛍光表現型を矯正するのに十分なレベルで発現される。これらの所見は、シュタルガルト病を処置するためのＡＡＶ遺伝子治療のデュアルベクター手法を支持する。
【０１２３】
第１の態様では、本発明は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み；第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第１の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第１の核酸配列及び第２の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１２４】
「ＡＡＶベクターシステム」という用語は、第１及び第２のＡＡＶベクターが相補的な様式で共に作用することが意図されるという事実を包含するように使用される。
【０１２５】
本発明のＡＡＶベクターシステムの第１及び第２のＡＡＶベクターは、一緒になってＡＢＣＡ４導入遺伝子全体をコードする。ゆえに、標的細胞におけるコードされたＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現には、第１（上流）及び第２（下流）のベクターの両方で標的細胞を形質導入することが必要である。
【０１２６】
本開示のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶ粒子（ビリオンとも称される）の形態である。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノムである核酸のコアを囲むタンパク質コート（キャプシド）を含む。本発明はまた、本明細書に記載のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターゲノムをコードする核酸配列を包含する。
【０１２７】
配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２に対応するヒトＡＢＣＡ４核酸配列である。配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２と同一である。ＡＢＣＡ４コード配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜６９２６にわたる。
【０１２８】
配列番号２は、次の突然変異：ヌクレオチド１６４０のＧ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９のＧ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３のＴ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。これらの突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変更せず、ゆえに配列番号２によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質と同一である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む第１の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、その５’末端を含むＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第１の核酸配列（ゆえに、第１のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む第２の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、その３’末端を含むＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第２の核酸配列（ゆえに、第１のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１３１】
５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する（後述されるように、配列が重複する領域を伴う）。ゆえに、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、本発明のＡＡＶベクターシステムに含有され、第１及び第２のＡＡＶベクターにわたって分割され、第１及び第２のＡＡＶベクターを用いた標的細胞の形質導入後に標的細胞において再構築されることができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、上記のような第１の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５で始まる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、上記のような第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。
【０１３４】
ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含するために、第１及び第２の核酸配列はそれぞれ、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの少なくとも一部をさらに含み、第１及び第２の核酸配列が整列した場合に配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの全体が包含されるようにする。ゆえに、整列すると、第１及び第２の核酸配列は一緒になって、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する。
【０１３５】
さらに、第１及び第２の核酸配列は、本発明の第１及び第２のＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞内の完全長導入遺伝子の一部としてＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体の再構築を可能にする配列重複の領域を含む。
【０１３６】
第１及び第２の核酸配列が互いに整列している場合、第１の核酸配列の３’末端の領域は、第２の核酸配列の５’末端の対応する領域と重複する。ゆえに、第１及び第２の核酸配列の両方が、配列重複の領域を形成するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部を含む。
【０１３７】
第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の重複の領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む場合に、特に有利な結果が得られる。
【０１３８】
重複の領域は、該２０個の連続ヌクレオチドの上流及び／または下流に伸びてもよい。ゆえに、重複の領域は、２０ヌクレオチド長を超えてもよい。
【０１３９】
重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応する位置の上流のヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、または加えて、重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０５に対応する位置の下流のヌクレオチドを含んでもよい。
【０１４０】
あるいは、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分内に含有されてもよい。
【０１４１】
ゆえに、一実施形態では、核酸配列重複の領域は、２０〜５５０ヌクレオチド長、好ましくは、５０〜２５０ヌクレオチド長、好ましくは、１７５〜２２５ヌクレオチド長、好ましくは、１９５〜２１５ヌクレオチド長である。
【０１４２】
一実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチド、好ましくは、２０８個全ての連続ヌクレオチドを含む。
【０１４３】
好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する。「開始する」という用語は、核酸配列重複の領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドから始まり５’から３’への方向に走ることを意味する。ゆえに、好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域の最も５’のヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応する。
【０１４４】
さらなる好ましい実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列ベクター間の核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する。
【０１４５】
本発明のさらなる利点は、上記のような核酸配列重複の領域を含むデュアルＡＡＶベクターの構築により、不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳レベルを有利に減少できることである。
【０１４６】
短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳の問題は、翻訳が下流ベクターのみに由来するｍＲＮＡ転写産物から開始される場合に、デュアルＡＡＶベクターシステムにて生じ得る。この関連で、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲなどのＡＡＶ  ＩＴＲは、プロモーター活性を有してもよい。これは、（後述されるような）ＷＰＲＥ及びｂＧＨポリアデニル化配列の下流ベクターにおける存在と共に、非組換え下流ベクターからの安定したｍＲＮＡ転写産物の生成をもたらしてもよい。野生型ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、その下流部分に複数のインフレームＡＵＧコドンを有し、これはアミノ酸配列を変更することなく他のコドンに置き換えることはできない。これにより、短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの存在につながる、安定した転写産物からの翻訳が生じる可能性が創出される。
【０１４７】
核酸配列重複の領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する本発明の好ましい実施形態では、重複ゾーンの開始配列は、翻訳機構が非組換え下流のみの転写産物の翻訳をアウトオブフレーム部位から開始することを促進するために、（潜在的コザックコンセンサス配列に関して）より弱いコンテクストのインフレームＡＵＧコドンよりも前に良好なコンテクストのアウトオブフレームＡＵＧ（開始）コドンを含む。本発明の特に好ましい実施形態では、インフレームＡＵＧの前に、様々なコンテクストで合計４つのアウトオブフレームＡＵＧコドンが存在する。これらは全て、１０アミノ酸以内で終始コドンに翻訳されることになり、ゆえに不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳を防止する。
【０１４８】
好ましくは、第１の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、そうして上記のような核酸配列重複の特に好ましい領域を包含する。
【０１４９】
ゆえに、好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０１５０】
さらに好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０１５１】
ゆえに、好ましい実施形態では、本発明は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、このＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み、第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０１５２】
さらに好ましい実施形態では、本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、このＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み、第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０１５３】
「からなる」という用語に従い、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分及びＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分が上記の通りの連続ヌクレオチドの特定の配列からなる実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は各々、追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１５４】
典型的には、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターの各々は、５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
【０１５５】
典型的には、ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作用して複製の機能的起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切除を可能にする。ＡＡＶ  ＩＴＲは、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後、ＡＡＶ感染細胞の核におけるコンカテマー形成を助けると考えられている。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の生存期間中にベクター構築物を保護するのに役立ってもよく、それにより、インビボでの導入遺伝子の長期発現が可能となる。
【０１５６】
ゆえに、一実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲ（すなわち、ＡＡＶゲノムにおいて見出されるＩＴＲ配列から誘導されるＩＴＲ配列）である。
【０１５７】
本発明のＡＡＶベクターシステムの第１及び第２のＡＡＶベクターは一緒になって、両方のベクターによる形質導入後に、標的細胞において完全機能性ＡＢＣＡ４導入遺伝子が再構成されるために必要な全ての構成要素を含む。当業者は、ウイルスベクター形質導入細胞において導入遺伝子の発現を保証するために一般に使用される追加の遺伝要素を把握するであろう。これらは、発現制御配列と称されてもよい。ゆえに、本発明のＡＡＶウイルスベクターシステムのＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＢＣＡ４導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター配列を含む）を含む。
【０１５８】
５’発現制御配列構成要素は、ウイルスベクターシステムの第１の（「上流」）ＡＡＶベクターに適当に位置し、一方で、３’発現制御配列は、ウイルスベクターシステムの第２の（「下流」）ＡＡＶベクターに適当に位置する。
【０１５９】
ゆえに、第１のＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、その性質上、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’に位置する必要があり、従って第１のＡＡＶベクターに位置する。
【０１６０】
任意の好適なプロモーターを使用してよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。プロモーター配列は、恒常活性型（すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドで作動するもの）であってもよく、またあるいは、特定の宿主細胞環境でのみ活性であり、ゆえに特定の細胞型で導入遺伝子の標的発現を可能とするもの（例えば、組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞に存在する因子の存在に応じて誘導可能な発現を示してもよい。いずれにせよ、ベクターが治療用に投与される場合、プロモーターは標的細胞バックグラウンドにおいて機能性であることが好ましい。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子が網膜細胞集団でのみ発現されることを可能にするために、網膜細胞特異的発現を示すことが好ましい。ゆえに、プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的、例えば、網膜神経感覚上皮及び網膜色素上皮の細胞にのみ限定されるものであってもよい。
【０１６２】
本発明での使用に好適な例としてのプロモーターは、任意選択でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー要素と組合わせた、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。本発明で使用するための別の例としてのプロモーターは、ハイブリッドＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター、例えばｒＡＶＥ発現カセットにおいて使用されるプロモーターである（ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ．ｃｏｍ）。本明細書に開示されるプロモーターのうちのいずれを使用してもよい。
【０１６３】
網膜特異的遺伝子発現を誘導し得るヒト配列に基づくプロモーターの例には、桿体及び錐体に関してはロドプシンキナーゼ、錐体のみに関してはＰＲ２．１、ならびに網膜色素上皮に関してはＲＰＥ６５が含まれる。
【０１６４】
ＡＡＶ−ＧＲＫ１−ＡＢＣＡ４デュアルベクター構築物
本発明者らは、ＧＲＫ１プロモーターを使用して、特に有利なレベルの遺伝子発現を達成できることを見出した。ゆえに、一実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーターである。
【０１６５】
本発明のＧＲＫ１プロモーター配列は、長さが１９９ヌクレオチドであり、ＧＲＫ１遺伝子のヌクレオチド−１１２から＋８７を含んでもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、配列番号５の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
１  ＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧ  ＴＴＧＴＴＴＧＴＣＣ  ＴＴＣＴＣＡＧＧＧＧ  ＡＡＡＡＧＴＧＡＧＧ  ＣＧＧＣＣＣＣＴＴＧ
６１  ＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧ  ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＡ  ＴＧＡＴＣＴＡＡＴＣ  ＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧ  ＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧ  ＧＡＴＴＧＴＣＴＴＴ
１２１  ＴＴＣＴＡＧＣＡＣＣ  ＴＴＣＴＴＧＣＣＡＣ  ＴＣＣＴＡＡＧＣＧＴ  ＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＧＧＧ  ＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧ
１８１  ＧＴＧＣＴＧＴＧＴＣ  ＡＧＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号５）
【０１６６】
第１のＡＡＶベクターは、プロモーターと上流ＡＢＣＡ４核酸配列との間に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）（すなわち、５’ＵＴＲ）を含んでもよい。
【０１６７】
任意の好適なＵＴＲ配列を使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０１６８】
ＵＴＲは、以下の要素：Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  βアクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片、及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビンエクソン３断片のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０１６９】
ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列を含んでもよい。任意の好適なコザックコンセンサス配列を使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０１７０】
好ましい実施形態では、ＵＴＲは、配列番号６で指定された核酸配列、または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１７１】
配列番号６のＵＴＲは、１８６ヌクレオチド長であり、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  βアクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片（予測されるスプライスドナー部位を伴う）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片（予測される分岐点及びスプライスアクセプター部位を含む）、及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビンエクソン３断片、その直後にコザックコンセンサス配列を含む。
【０１７２】
本発明者らは、驚くべきことに、上記のＵＴＲ、具体的には、配列番号６で指定されたＵＴＲ配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の存在により、ＡＢＣＡ４導入遺伝子からの翻訳収量が増加することを見出した。
１  ＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧ  ＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧ  ＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ  ＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴ  ＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧ
６１  ＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧ  ＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴ  ＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣ  ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡ
１２１  ＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧ  ＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴ  ＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧ  ＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡ  ＡＧＡＡＴＴＡＣＣＡ
１８１  ＣＣＡＴＧＧ（配列番号６）
【０１７３】
本発明のＡＡＶベクターシステムの第２の（「下流」）ＡＡＶベクターは、転写後応答要素（転写後制御要素としても知られる）またはＰＲＥを含んでもよい。任意の好適なＰＲＥを使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。好適なＰＲＥの存在は、ＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現を増強し得る。
【０１７４】
好ましい実施形態では、ＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である。特に好ましい実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号７で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を有する。
１  ＡＴＣＧＡＴＡＡＴＣ  ＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡ  ＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴ  ＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴ  ＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴ  ＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴ
６１  ＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴ  ＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧ  ＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴ  ＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣ  ＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡ  ＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴ
１２１  ＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧ  ＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴ  ＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧ  ＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴ  ＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣ  ＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧ
１８１  ＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣ  ＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧ  ＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣ  ＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡ  ＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣ  ＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣ
２４１  ＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴ  ＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣ  ＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ  ＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴ  ＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴ  ＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣ
３０１  ＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧ  ＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡ  ＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣ  ＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧ  ＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧ  ＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴ
３６１  ＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧ  ＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡ  ＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧ  ＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡ  ＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣ  ＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧ
４２１  ＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴ  ＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣ  ＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧ  ＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴ  ＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡ  ＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧ
４８１  ＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣ  ＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴ  ＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣ  ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣ  ＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧ  ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧ
５４１  ＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣ  ＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡ  ＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧ  ＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴ  ＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣ  ＣＣＣ（配列番号７）
【０１７５】
第２のＡＡＶベクターは、下流ＡＢＣＡ４核酸配列の３’に位置するポリアデニル化配列を含んでもよい。任意の好適なポリアデニル化配列を使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０１７６】
好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列である。特に好ましい実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化配列は、配列番号８で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を有する。
【０１７７】
本発明のＡＡＶベクターシステムの好ましい実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０１７８】
本発明のＡＡＶベクターシステムの別の好ましい実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０１７９】
本発明のＡＡＶベクターシステムは、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるために好適である。
【０１８０】
よって、一態様では、本発明は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞において発現されるように、標的細胞を、上記のような第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを用いて形質導入するステップを含む。
【０１８１】
ヒトＡＢＣＡ４タンパク質の発現には、標的細胞が第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターの両方で形質導入される必要があるが、順序は重要ではない。よって、標的細胞は、任意の順序で（第１のＡＡＶベクターの後に第２のＡＡＶベクター、または第２のＡＡＶベクターの後に第１のＡＡＶベクター）、または同時に第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターで形質導入されてもよい。
【０１８２】
標的細胞をＡＡＶベクターで形質導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、当業者であれば熟知しているだろう。
【０１８３】
標的細胞は、好ましくは、眼の細胞、好ましくは網膜細胞（例えば、神経光受容体細胞、桿体細胞、錐体細胞、または網膜色素上皮細胞）である。
【０１８４】
本発明は、上で定義したように、第１のＡＡＶベクターも提供する。上で定義したように、第２のＡＡＶベクターも提供される。
【０１８５】
別の態様では、本発明は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。したがって、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの該配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１８６】
第１のＡＡＶベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；プロモーター、好ましくはＧＲＫ１プロモーター；及び／またはＵＴＲを含んでもよく、該要素は、本発明のＡＡＶベクターシステムに関して上記したとおりである。
【０１８７】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含む。
【０１８８】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１８９】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１９０】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含む。
【０１９１】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１９２】
一実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。したがって、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの該配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１９４】
第２のベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；ＰＲＥ、好ましくはＷＰＲＥ；及び／またはポリアデニル化配列、好ましくはｂＧＨポリアデニル化配列を含んでもよく、該要素は、本発明のＡＡＶベクターシステムに関して上記したとおりである。
【０１９５】
一実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０１９６】
一実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１９７】
一実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２０１】
本発明はさらに、上記の核酸配列を含む核酸を提供する。
【０２０２】
本発明は、上記のとおりのＡＡＶベクターから誘導可能なＡＡＶベクターゲノムも提供する。
【０２０３】
本発明の例示的なＡＡＶベクターシステムは、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２０４】
本発明のさらなる例としてのＡＡＶベクターシステムは、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２０５】
特定の実施形態では、本明細書に開示の方法及び組成物は、以下のベクターのうちのいずれかに関連する：ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクター（配列番号１７）、ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクター（配列番号１８）、ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクター（配列番号１９）、ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクター（配列番号２０）、ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター（配列番号２１）、ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター（配列番号２２）、またはＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター（配列番号２３）。
【０２０６】
特定の実施形態では、本明細書に開示の方法及び組成物は、以下の配列のうちのいずれかを対象とする：（ｉ）５’ＩＴＲ（配列番号２７）をコードする配列、ＲＫプロモーター（配列番号２８）をコードする配列、ウサギベータ−グロブリン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む、ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲの部分（配列番号２６）、または（ｉｉ）５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む、ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲの部分の配列（配列番号３０）。
【０２０７】
本発明は、配列番号１の代わりに配列番号２が参照配列として使用される場合にも実施され得る。
【０２０８】
これに関して、配列番号２は、次の突然変異：ヌクレオチド１６４０のＧ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９のＧ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３のＴ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。これらの突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変更せず、ゆえに配列番号２によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質と同一である。
【０２０９】
よって、本発明の代替の実施形態では、配列番号１への上記の参照は、配列番号２への参照で代置されてもよい。加えて、本明細書に開示の構築物のうちのいずれも、代替的に、異なるプロモーター、例えば、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターなどを含んでもよい。同様に、構築物のうちのいずれも、配列番号６を含むかもしくはそれからなる５’ＩＴＲ、及び／または配列番号３７を含むかもしくはそれからなる３’ＩＴＲを含んでもよい。
【０２１０】
配列の対応
【０２１１】
本明細書で使用する場合、所与の核酸配列中のヌクレオチドに関して使用される場合の「に対応する」という用語は、特定の配列番号への参照によってヌクレオチドの位置を規定する。しかしながら、そのような参照がなされる場合、本発明は、参照される特定の配列番号に示される正確な配列に限定されず、その変異体配列を含むことが理解されるであろう。配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレオチドは、配列アライメントプログラムを使用することなどによる配列アライメントによって容易に決定することができ、その使用は当該技術分野で周知である。これに関して、当業者は、遺伝暗号の縮重の性質が、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更することなく、所与のポリペプチドをコードする核酸配列の変異が存在し得ることを意味することを容易に理解するであろう。ゆえに、他のＡＢＣＡ４コード配列におけるヌクレオチド位置の同定が企図される（すなわち、当業者が考えるだろう位置のヌクレオチドは、例えば、配列番号１で同定された位置に対応する）。
【０２１２】
例として、配列番号２は、上記のように、３つの特定の突然変異を除いて配列番号１と同一である（これらの３つの突然変異は、コードされるＡＢＣＡ４ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない）。それゆえ、この場合、当業者は、配列番号２の所与のヌクレオチド位置が、配列番号１の同じ番号が付けられたヌクレオチド位置に対応すると考えるであろう。
【０２１３】
典型的には、ＡＡＶゲノムの誘導体は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは２つまたはそれ以上のＩＴＲなど、１つ超のＩＴＲを含むことになる。ＩＴＲのうちの１つ以上は、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムから誘導されてもよく、あるいはキメラまたは突然変異型ＩＴＲであってもよい。好ましい突然変異型ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分解部位）の欠失を有するものである。この欠失により、ゲノムの継続的な複製が可能になり、コード配列及び相補配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的なＡＡＶゲノムが生成される。これにより、標的細胞におけるＤＮＡ複製を省くことが可能になり、導入遺伝子発現の加速を可能にする。
【０２１４】
本開示のＡＡＶベクターは、ある血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘導体が異なる血清型のキャプシドにパッケージされているトランスキャプシド化形態を含む。本発明のＡＡＶベクターは、２つ以上の異なる血清型由来の非修飾キャプシドタンパク質の混合物がウイルスキャプシドを構成するモザイク形態も含む。ＡＡＶベクターは、キャプシド表面に吸着されたリガンドを担持する化学的に修飾された形態も含み得る。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含んでもよい。
【０２１５】
ゆえに、例えば、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／２）、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／５）、ならびにＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ８キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／８）を含む。
【０２１６】
本発明のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み得る。一実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む。好ましくは、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆキャプシドタンパク質である。
【０２１７】
ＡＡＶ−ＣＢＡ−ＡＢＣＡ４デュアルベクター構築物
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み、第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第１の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第１の核酸配列及び第２の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み、配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０２１８】
一般にＡＡＶベクターは当該技術分野で周知であり、当業者は、この分野における当業者の共通の一般知識から、それらの調製に好適な一般的な技術を熟知している。当業者の知識は、目的の核酸配列をＡＡＶベクターのゲノムへと組み込むのに好適な技術を含む。
【０２１９】
「ＡＡＶベクターシステム」という用語は、第１及び第２のＡＡＶベクターが相補的な様式で共に作用することが意図されるという事実を包含するように使用される。
【０２２０】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第１及び第２のＡＡＶベクターは、一緒になってＡＢＣＡ４導入遺伝子全体をコードする。ゆえに、標的細胞におけるコードされたＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現には、第１（上流）及び第２（下流）のベクターの両方で標的細胞を形質導入することが必要である。
【０２２１】
本開示のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターは、ＡＡＶ粒子（ビリオンとも称される）の形態であることができる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノムである核酸のコアを囲むタンパク質コート（キャプシド）を含む。本開示はまた、本明細書に記載のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターゲノムをコードする核酸配列を包含する。
【０２２２】
配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２に対応するヒトＡＢＣＡ４核酸配列である。配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２と同一である。ＡＢＣＡ４コード配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜６９２６にわたる。
【０２２３】
第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む第１の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、その５’末端を含むＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第１の核酸配列（ゆえに、第１のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２２４】
第２のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む第２の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、その３’末端を含むＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第２の核酸配列（ゆえに、第１のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２２５】
５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する（後述されるように、配列が重複する領域を伴う）。ゆえに、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、本開示のＡＡＶベクターシステムに含有され、第１及び第２のＡＡＶベクターにわたって分割され、第１及び第２のＡＡＶベクターを用いた標的細胞の形質導入後に標的細胞において再構築されることができる。
【０２２６】
上記のような第１の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５で始まる。
【０２２７】
上記のような第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。
【０２２８】
ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含するために、第１及び第２の核酸配列はそれぞれ、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの少なくとも一部をさらに含み、第１及び第２の核酸配列が整列した場合に配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの全体が包含されるようにする。ゆえに、整列すると、第１及び第２の核酸配列は一緒になって、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する。
【０２２９】
さらに、第１及び第２の核酸配列は、本開示の第１及び第２のＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞内の完全長導入遺伝子の一部としてＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体の再構築を可能にする配列重複の領域を含む。
【０２３０】
第１及び第２の核酸配列が互いに整列している場合、第１の核酸配列の３’末端の領域は、第２の核酸配列の５’末端の対応する領域と重複する。ゆえに、第１及び第２の核酸配列の両方が、配列重複の領域を形成するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０２３２】
重複の領域は、該２０個の連続ヌクレオチドの上流及び／または下流に伸びてもよい。ゆえに、重複の領域は、２０ヌクレオチド長を超えてもよい。
【０２３３】
重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応する位置の上流のヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、または加えて、重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３８０５に対応する位置の下流のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２３４】
あるいは、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分内に含有されてもよい。
【０２３５】
ゆえに、一実施形態では、核酸配列重複の領域は、２０〜５５０ヌクレオチド長、好ましくは、５０〜２５０ヌクレオチド長、好ましくは、１７５〜２２５ヌクレオチド長、好ましくは、１９５〜２１５ヌクレオチド長である。
【０２３６】
一実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチド、好ましくは、２０８個全ての連続ヌクレオチドを含む。
【０２３７】
ある特定の好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する。「開始する」という用語は、核酸配列重複の領域が、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドから始まり５’から３’への方向に走ることを意味する。ゆえに、好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域の最も５’のヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８に対応する。
【０２３８】
ある特定の好ましい実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列ベクター間の核酸配列重複の領域は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する。
【０２３９】
上記のような核酸配列重複の領域を含むデュアルＡＡＶベクターの構築により、不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳レベルを減少できる。
【０２４０】
短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳の問題は、翻訳が下流ベクターのみに由来するｍＲＮＡ転写産物から開始される場合に、デュアルＡＡＶベクターシステムにて生じ得る。この関連で、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲなどのＡＡＶ  ＩＴＲは、プロモーター活性を有してもよい。これは、（後述されるような）ＷＰＲＥ及びｂＧＨポリアデニル化配列の下流ベクターにおける存在と共に、非組換え下流ベクターからの安定したｍＲＮＡ転写産物の生成をもたらしてもよい。野生型ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、その下流部分に複数のインフレームＡＵＧコドンを有し、これはアミノ酸配列を変更することなく他のコドンに置き換えることはできない。これにより、短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの存在につながる、安定した転写産物からの翻訳が生じる可能性が創出される。
【０２４１】
核酸配列重複の領域が、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する本開示のある特定の好ましい実施形態では、重複ゾーンの開始配列は、翻訳機構が非組換え下流のみの転写産物の翻訳をアウトオブフレーム部位から開始することを促進するために、（潜在的コザックコンセンサス配列に関して）より弱いコンテクストのインフレームＡＵＧコドンよりも前に良好なコンテクストのアウトオブフレームＡＵＧ（開始）コドンを含む。本開示のある特定の特に好ましい実施形態では、インフレームＡＵＧの前に、様々なコンテクストで合計４つのアウトオブフレームＡＵＧコドンが存在する。これらは全て、１０アミノ酸以内で終始コドンに翻訳され、ゆえに不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳を防止する。
【０２４２】
ある特定の好ましい実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、そうして上記のような核酸配列重複の領域を包含する。
【０２４３】
ゆえに、ある特定の好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０２４４】
ある特定の好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０２４５】
ゆえに、ある特定の好ましい実施形態では、本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、このＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み、第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０２４６】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、このＡＡＶベクターシステムは、第１の核酸配列を含む第１のＡＡＶベクター及び第２の核酸配列を含む第２のＡＡＶベクターを含み、第１の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第２の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０２４７】
「からなる」という用語に従い、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分及びＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分が上記の通りの連続ヌクレオチドの特定の配列からなる実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は各々、追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターの各々は、５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作用して複製の機能的起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切除を可能にする。ＡＡＶ  ＩＴＲは、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後、ＡＡＶ感染細胞の核におけるコンカテマー形成を助けると考えられている。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の生存期間中にベクター構築物を保護するのに役立ってもよく、それにより、インビボでの導入遺伝子の長期発現が可能となる。
【０２５０】
ゆえに、いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲ（すなわち、ＡＡＶゲノムにおいて見出されるＩＴＲ配列空誘導されるＩＴＲ配列）である。
【０２５１】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第１及び第２のＡＡＶベクターは一緒になって、両方のベクターによる形質導入後に、標的細胞において完全機能性ＡＢＣＡ４導入遺伝子が再構成されるために必要な全ての構成要素を含む。当業者は、ウイルスベクター形質導入細胞において導入遺伝子の発現を保証するために一般に使用される追加の遺伝要素を把握する。これらは、発現制御配列と称されてもよい。ゆえに、本開示のＡＡＶウイルスベクターシステムのＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＢＣＡ４導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター配列を含む）を含んでもよい。
【０２５２】
５’発現制御配列構成要素は、ウイルスベクターシステムの第１の（「上流」）ＡＡＶベクターに位置することができ、一方で、３’発現制御配列は、ウイルスベクターシステムの第２の（「下流」）ＡＡＶベクターに位置することができる。
【０２５３】
ゆえに、いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分に作動可能に連結されたプロモーターを含んでもよい。プロモーターは、その性質上、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’に位置する必要があり得、従って第１のＡＡＶベクターに位置する。
【０２５４】
任意の好適なプロモーターを使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。プロモーター配列は、恒常活性型（すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドで作動するもの）であってもよく、またあるいは、特定の宿主細胞環境でのみ活性であり、ゆえに特定の細胞型で導入遺伝子の標的発現を可能とするもの（例えば、組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞に存在する因子の存在に応じて誘導可能な発現を示してもよい。ベクターが治療用に投与される実施形態では、プロモーターは、標的細胞バックグラウンドにおいて機能性であるべきである。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子が網膜細胞集団でのみ発現されることを可能にするために、網膜細胞特異的発現を示す。ゆえに、プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的、例えば、網膜神経感覚上皮及び網膜色素上皮の細胞にのみ限定されるものであってもよい。
【０２５６】
ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を増加させるために、本開示の上流及び下流ベクターの両方に要素を含めてもよい。例えば、本開示の上流ベクターなどのベクターにイントロンを含めることにより、そのベクターからのＲＮＡまたは目的のタンパク質の発現を増加させることができる。イントロンは、ＲＮＡ成熟中にＲＮＡスプライシングによって除去される遺伝子内のヌクレオチド配列である。イントロンの長さは、数十の塩基対から複数のメガベースまで変動できる。しかしながら、スプライセオソーム型イントロン（すなわち、真核生物のスプライセオソームによってスプライスされるイントロン）は、イントロンの５’末端にスプライスドナー（ＳＤ）部位、イントロン３’末端近くに分岐部位、及び３’末端にスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含んでもよい。これらのイントロン要素は、適切なイントロンスプライシングを促進する。ＳＤ部位は、イントロンの５’末端にコンセンサスＧＵを含んでもよく、イントロンの３’末端にあるＳＡ部位は「ＡＧ」で終了してもよい。ＳＡ部位の上流で、イントロンは、分岐点アデニンヌクレオチドとＳＡとの間に、ピリミジンの多い領域を含むことが多い。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、イントロンの存在は、ＲＮＡ転写の速度、核外輸送、またはＲＮＡ転写の安定性に影響を与え得る。さらに、イントロンの存在は、ｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させ、目的のタンパク質（例えば、ＡＢＣＡ４）をより多くもたらし得る。図３０９及び３１０は、ＡＢＣＡ４デュアルベクター、ＩｎｔＥｘ、及びＲＢＧ  ＳＡ／ＳＤと共に使用するための２つの例示的なイントロン（及び付随するエクソン）を示している。しかしながら、本開示は、本開示の構築物における、遺伝子発現を増強し、真核細胞におけるスプライシングを促進する任意のイントロンの使用を包含する。
【０２５７】
本開示のベクターのいくつかの実施形態では、イントロン、ＩｎｔＥｘまたはＳＡ／ＳＤ（ＲＢＤ  ＳＡ／ＳＤを含む）は、ベクターからのタンパク質発現を増加させるように機能するいくつかの要素のうちの１つであってもよい。例えば、プロモーター及び任意選択でエンハンサーは、遺伝子発現の細胞または組織特異性だけでなく、ベクターから転写されるｍＲＮＡのレベルにも影響を与え得る。プロモーターは、ＲＮＡ転写を開始するＤＮＡの領域である。プロモーターの特定の配列要素に応じて、プロモーターは、強度及び組織特異性が変動してもよい。エンハンサーは、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を開始するプロモーターの能力に影響を与えることにより、プロモーターからの転写を制御するＤＮＡ配列である。それゆえ、ベクターにおけるプロモーターの選択、及び任意選択で、エンハンサーの組込み及び／またはエンハンサー自体の選択は、ベクターがコードする遺伝子の発現に大きな影響を与えることができる。任意選択でＣＭＶエンハンサーと組み合わされる、ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを、図３１０及び３１１に示す。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、エンハンサー要素の使用を除外する。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、ＣＭＶエンハンサー要素などのエンハンサー要素の使用を除外する。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、エンハンサー要素の使用を除外し、かつイントロン、ＩｎｔＥｘ、またはＳＤ／ＳＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、ＣＭＶエンハンサー要素などのエンハンサー要素の使用を除外し、かつイントロン、ＩｎｔＥｘ、またはＳＤ／ＳＡを含む。
【０２５８】
ｍＲＮＡ転写産物自体の非コード配列内の要素も、ベクター内でコードされる配列のタンパク質レベルに影響を与えることができる。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、ｍＲＮＡ非翻訳領域（ＵＴＲ）内の配列要素は、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることができ、ひいては、タンパク質翻訳のレベルに影響を与える。例示的な配列要素は、ｍＲＮＡの安定性を増加させる、転写後制御要素（ＰＲＥ）（例えば、ウッドチャック肝炎ＰＲＥ（ＷＰＲＥ））である。例示的なプロモーター、エンハンサー、ＰＲＥ、及び本開示のベクターにおけるこれらの要素の配置を、図３０７〜３１６に示す。
【０２５９】
本開示の第１のＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、プロモーターは、イントロン及びエクソン配列と作動可能に連結されてもよい。本開示の第１のＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、核酸配列は、プロモーター、イントロン及びエクソン配列を含んでもよい。イントロン及びエクソン配列は、プロモーター配列の下流にあってもよい。イントロン及びエクソン配列は、プロモーター配列と上流ＡＢＣＡ４核酸配列（ＵＳ−ＡＢＣＡ４）との間に配置されてもよい。イントロン及びエクソンの存在は、タンパク質発現のレベルを増加させ得る。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモーターとエクソンとの間に配置される。イントロンがプロモーターとエクソンとの間に配置されている実施形態を含むいくつかの実施形態では、エクソンは、ＵＳ−ＡＢＣＡ４配列の５’に配置される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、脊椎動物遺伝子から単離または誘導されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターまたはニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ．ＲＧＢプロモーター、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターである。
【０２６０】
エクソンは、コード配列、非コード配列、または両方の組合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、エクソンは、非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、エクソンは、哺乳動物遺伝子から単離または誘導される。実施形態では、哺乳動物は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ウサギベータグロビン遺伝子またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、エクソンは、ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡ  ＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴ  ＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧ  ＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴ  ＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡ  ＡＴＴ（配列番号１４）の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、エクソンは、ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡ  ＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴ  ＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧ  ＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴ  ＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡ  ＡＴＴ（配列番号１４）の核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【０２６２】
イントロンは、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、または分岐点を含んでもよい。イントロンは、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、及び分岐点を含んでもよい。例示的なスプライスアクセプター部位は、イントロンの５’末端にヌクレオチド「ＧＴ」（プレｍＲＮＡでは「ＧＵ」）を含む。例示的なスプライスアクセプター部位は、イントロンの３’末端に「ＡＧ」を含む。いくつかの実施形態では、分岐点は、イントロンの３’末端の上流に、両端を含めて２０〜４０ヌクレオチドのアデノシン（Ａ）を含む。イントロンは、人工または非天然に生じる配列を含んでもよい。あるいは、イントロンは、脊椎動物遺伝子から単離または誘導されてもよい。イントロンは、２つの配列の融合をコードする配列を含んでもよく、その各々は、脊椎動物遺伝子から単離または誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、イントロン核酸配列またはその一部が由来する脊椎動物遺伝子には、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）遺伝子が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ニワトリ遺伝子には、ニワトリベータアクチン遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、イントロン核酸配列またはその一部が由来する脊椎動物遺伝子には、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、ウサギ遺伝子には、ウサギベータグロビン遺伝子またはその一部が含まれる。いくつかの実施形態では、イントロンは、
１  ＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧ  ＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧ  ＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ  ＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴ  ＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧ
６１  ＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧ  ＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴ  ＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣ  ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡ
１２１  ＣＡＧ（配列番号１３）の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、イントロンは、
１  ＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧ  ＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧ  ＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ  ＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴ  ＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧ
６１  ＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧ  ＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧ  ＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴ  ＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣ  ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴ  ＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡ
１２１  ＣＡＧ（配列番号１３）の核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６４】
第１の（または上流）ＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドプロモーター（ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターを伴うサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサー配列は、
１  ＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴ  ＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣ  ＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣ  ＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣ  ＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣ  ＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡ
６１  ＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧ  ＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴ  ＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴ  ＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧ  ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡ  ＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴ
１２１  ＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡ  ＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴ  ＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴ  ＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴ  ＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧ  ＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣ
１８１  ＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡ  ＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡ  ＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴ  ＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡ  ＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴ  ＡＧＴＣＡ（配列番号１５）の核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意のパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、第１の（または上流）のＡＡＶベクターをコードする配列は、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ＣＭＶエンハンサー要素を伴わない）、イントロンをコードする配列及びエクソンをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーター配列は、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）の核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意のパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーター配列は、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）の核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意のパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、イントロンをコードする配列は、配列番号１３の核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、エクソンをコードする配列は、配列番号１４の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２６８】
第１のＡＡＶベクターは、プロモーターと上流ＡＢＣＡ４核酸配列との間に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）（すなわち、５’ＵＴＲ）を含んでもよい。
【０２６９】
任意の好適なＵＴＲ配列を使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０２７０】
ＵＴＲは、以下の要素：Ｇａｌｌｕｓ  β−アクチン（ＣＢＡ）イントロン１またはその一部、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビン（ＲＢＧ）イントロン２またはその一部、及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビンエクソン３またはその一部のうちの１つ以上を含むか、またはそれからなる。
【０２７１】
ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列を含んでもよい。任意の好適なコザックコンセンサス配列を使用してもよい。
【０２７２】
ある特定の好ましい実施形態では、ＵＴＲは、配列番号６で指定された核酸配列、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％）配列同一性を有するその変異体または一部を含む。
【０２７３】
配列番号６のＵＴＲは、１８６ヌクレオチド長であり、Ｇａｌｌｕｓ  βアクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片（予測されるスプライスドナー部位を伴う）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片（予測される分岐点及びスプライスアクセプター部位を含む）、及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  βグロビンエクソン３断片、その直後にコザックコンセンサス配列を含む。
【０２７４】
上記のＵＴＲ、具体的には、配列番号６で指定されたＵＴＲ配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の存在により、ＡＢＣＡ４導入遺伝子からの翻訳収量が増加し得る。
【０２７５】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第２の（「下流」）ＡＡＶベクターは、転写後応答要素（転写後制御要素としても知られる）またはＰＲＥを含んでもよい。任意の好適なＰＲＥを使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。ある特定の実施形態では、好適なＰＲＥの存在は、ＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現を増強し得る。
【０２７６】
ある特定の好ましい実施形態では、ＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である。ある特定の特に好ましい実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号７で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を有する。
【０２７７】
第２のＡＡＶベクターは、下流ＡＢＣＡ４核酸配列の３’に位置するポリアデニル化配列を含んでもよい。任意の好適なポリアデニル化配列を使用してもよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０２７８】
ある特定の好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列である。特に好ましい実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化配列は、配列番号８で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を有する。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列をコードする配列は、
１  ＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧ  ＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴ  ＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴ  ＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴ  ＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧ  ＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣ
６１  ＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴ  ＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡ  ＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴ  ＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣ  ＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡ  ＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡ
１２１  ＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣ  ＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧ  ＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴ  ＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧ  ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣ
１８１  ＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧ  ＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡ  ＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣ  ＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧ  ＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴ  ＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧ
２４１  ＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧ  ＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣ  ＣＡＧ（配列番号２５）の核酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意のパーセンテージの同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０２７９】
本開示のＡＡＶベクターシステムのある特定の好ましい実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２８０】
本開示のＡＡＶベクターシステムのある特定の好ましい実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０２８１】
本開示のＡＡＶベクターシステムは、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるために好適であってもよい。
【０２８２】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞において発現されるように、標的細胞を、上記のような第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを用いて形質導入するステップを含む。
【０２８３】
ヒトＡＢＣＡ４タンパク質の発現には、標的細胞が第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターの両方で形質導入される必要がある。ある特定の実施形態では、標的細胞は、任意の順序で（第１のＡＡＶベクターの後に第２のＡＡＶベクター、または第２のＡＡＶベクターの後に第１のＡＡＶベクター）、または同時に第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターで形質導入されてもよい。
【０２８４】
標的細胞をＡＡＶベクターで形質導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、当業者であれば熟知しているだろう。
【０２８５】
標的細胞は、眼の細胞、好ましくは網膜細胞（例えば、神経光受容体細胞、桿体細胞、錐体細胞、または網膜色素上皮細胞）であってもよい。
【０２８６】
本開示は、上で定義したように、第１のＡＡＶベクターも提供する。上で定義したように、第２のＡＡＶベクターも提供される。
【０２８７】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。ある特定の実施形態では、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの該配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２８８】
第１のＡＡＶベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；プロモーター、例えば、ＧＲＫ１プロモーター；及び／またはＵＴＲを含んでもよく、該要素は、本開示のＡＡＶベクターシステムに関して上記したとおりである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ．ＲＧＢプロモーター、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターである。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２９５】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。いくつかの実施形態では、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの該配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２９６】
第２のベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；ＰＲＥ、好ましくはＷＰＲＥ；及び／またはポリアデニル化配列、好ましくはｂＧＨポリアデニル化配列を含んでもよく、該要素は、本開示のＡＡＶベクターシステムに関して上記したとおりである。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０３００】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、
【０３０２】
９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０３０４】
本開示はさらに、上記の核酸配列を含む核酸を提供する。本開示は、上記のとおりのＡＡＶベクターから誘導可能なＡＡＶベクターゲノムも提供する。
【０３０５】
上記のような第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含むキットも提供される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ粒子の形態でキットにおいて提供されてもよい。
【０３０６】
上記のように、第１の核酸配列を含む核酸及び第２の核酸配列を含む核酸を含むキットがさらに提供される。
【０３０７】
本開示は、上記のようなＡＡＶベクターシステム及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【０３０８】
本開示のＡＡＶベクターシステム、本開示のキット、及び本開示の医薬組成物は、遺伝子治療において使用されてもよい。例えば、本開示のＡＡＶベクターシステム、本開示のキット、及び本開示の医薬組成物は、疾患の予防または処置に使用されてもよい。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、疾患を予防または処置するための本開示の組成物及び方法の使用は、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現をもたらすために第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを標的細胞に投与することを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、予防または処置される疾患は、網膜細胞の分解を特徴とする。そのような疾患の例は、シュタルガルト病である。いくつかの実施形態では、本開示の第１及び第２のＡＡＶベクターは、患者の眼、例えば眼の網膜組織に投与されてもよく、その結果、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が発現して、疾患に存在する突然変異（複数可）を代償する。
【０３１１】
本開示のＡＡＶベクターは、医薬組成物または薬剤として製剤化されてもよい。
【０３１２】
本開示の例示的なＡＡＶベクターシステムは、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０３１３】
本開示のさらなる例示的なＡＡＶベクターシステムは、第１のＡＡＶベクター及び第２のＡＡＶベクターを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、または９９．９％）の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法及び使用は、配列番号１の代わりに配列番号２が参照配列として使用される場合にも実施され得る。
【０３１５】
これに関して、配列番号２は、次の突然変異：ヌクレオチド１６４０のＧ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９のＧ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３のＴ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。これらの突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変更せず、ゆえに配列番号２によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質と同一である。
【０３１６】
よって、本開示の代替の実施形態では、配列番号１への上記の参照は、配列番号２への参照で代置されてもよい。
【０３１７】
加えて、本明細書に開示の構築物のうちのいずれも、代替的に、異なるプロモーター、例えば、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーターなどを含んでもよい。同様に、構築物のうちのいずれも、配列番号６を含むかもしくはそれからなる５’ＩＴＲ、及び／または配列番号３７を含むかもしくはそれからなる３’ＩＴＲを含んでもよい。
【０３１８】
配列の対応
【０３１９】
本明細書で使用する場合、所与の核酸配列中のヌクレオチドに関して使用される場合の「に対応する」という用語は、特定の配列番号への参照によってヌクレオチドの位置を規定する。しかしながら、そのような参照がなされる場合、本開示は、参照される特定の配列番号に示される正確な配列に限定されず、その変異体配列を含むことが理解されるであろう。配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレオチドは、配列アライメントプログラムを使用することなどによる配列アライメントによって容易に決定することができ、その使用は当該技術分野で周知である。これに関して、当業者は、遺伝暗号の縮重の性質が、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更することなく、所与のポリペプチドをコードする核酸配列の変異が存在し得ることを意味することを容易に理解するであろう。ゆえに、他のＡＢＣＡ４コード配列におけるヌクレオチド位置の同定が企図される（すなわち、当業者が考えるだろう位置のヌクレオチドは、例えば、配列番号１で同定された位置に対応する）。
【０３２０】
例として、配列番号２は、上記のように、３つの特定の突然変異を除いて配列番号１と同一である（これらの３つの突然変異は、コードされるＡＢＣＡ４ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない）。それゆえ、この場合、当業者は、配列番号２の所与のヌクレオチド位置が、配列番号１の同じ番号が付けられたヌクレオチド位置に対応すると考えるであろう。
【０３２１】
ＡＡＶベクター
本開示のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本開示のＡＡＶベクターは、成熟ＡＡＶ粒子またはビリオン、すなわち、ＡＡＶタンパク質キャプシドによって囲まれた核酸の形態であってもよい。
【０３２２】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含んでもよい。
【０３２３】
ＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の産生のための機能をコードし得るポリヌクレオチド配列である。これらの機能には、例えば、ＡＡＶゲノムのＡＡＶ粒子へのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルで機能する機能が含まれる。天然に生じるＡＡＶは、複製欠損であり、複製及びパッケージングのサイクルを完了するために、トランスのヘルパー機能の提供に依存している。したがって、本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、複製欠損であってもよい。
【０３２４】
ＡＡＶゲノムは、ポジティブまたネガティブセンスのいずれかの一本鎖形態、あるいは二本鎖形態であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖形態の使用により、標的細胞におけるＤＮＡ複製ステップを省くことが可能になり、そのため導入遺伝子発現を加速し得る。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、一本鎖形態であってもよい。
【０３２６】
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの任意の天然に誘導される血清型、分離株、またはクレードに由来してもよい。ゆえに、ＡＡＶゲノムは、天然に生じるＡＡＶの完全なゲノムであってもよい。当業者に知られているように、天然に生じるＡＡＶは、様々な生物学的システムに従って分類され得る。
【０３２７】
ＡＡＶは、その血清型に関して参照される。血清型は、キャプシド表面抗原の発現のプロファイルのために、他の変異亜種と区別するために使用できる独自の反応性を有する、ＡＡＶの変異亜種に対応する。特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、任意の他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。
【０３２８】
ＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびに近年霊長類脳から同定されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３などの組換え血清型も含まれる。本開示では、これらのＡＡＶ血清型のうちのいずれを使用してもよい。よって、本開示の一実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｅｃ２またはＲｅｃ３  ＡＡＶから誘導されてもよい。
【０３２９】
ＡＡＶ血清型の概説は、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：２９９−３１０及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４：３１６−２７に見出され得る。ＡＡＶゲノムの配列、またはＩＴＲ配列、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムの要素の配列は、ＡＡＶ全ゲノム配列に関する以下のアクセッション番号から誘導してよい：アデノ随伴ウイルス１  ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２  ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３  ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ  ＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４  ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５  Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６  ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−８６５  ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；トリＡＡＶ株ＤＡ−１  ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ  ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。
【０３３０】
ＡＡＶはまた、クレードまたはクローンに関して参照されてもよい。これは、例えば、天然由来ＡＡＶの系統学的関係、または共通の祖先まで遡ることができるＡＡＶの系統群を指し、その全ての子孫を含む。加えて、ＡＡＶは、特定の分離株、すなわち天然に見出される特定のＡＡＶの遺伝的分離株に関して参照されてもよい。遺伝的分離株という用語は、他の天然に生じるＡＡＶとの限定的な遺伝的混合を受け、それによって遺伝子レベルで認識可能な別個の集団を定義するＡＡＶの集団を表す。
【０３３１】
当業者は、彼らの共通の一般的知識に基づいて、本開示で使用するためのＡＡＶの適切な血清型、クレード、クローンまたは分離株を選択することができる。例えば、ＡＡＶ５キャプシドは、遺伝性の色覚異常の矯正に成功したことからも明らかなように、霊長類の錐体光受容体を効率的に形質導入することが示されている（Ｍａｎｃｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８４−７）。
【０３３２】
ＡＡＶ血清型により、ＡＡＶウイルスの感染の組織特異性（または向性）を決定することができる。従って、一部の好ましい実施形態では、本開示の患者に投与されるＡＡＶで使用するためのＡＡＶ血清型は、眼内の標的細胞に対する天然指向性または高い感染効率を有するものである。一実施形態では、本開示で使用するためのＡＡＶ血清型は、神経感覚網膜、網膜色素上皮及び／または脈絡膜の細胞に感染するものである。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作用して機能的な複製起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切除を可能にする。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子などのパッケージング遺伝子も含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０またはその変異体のうちの１つ以上をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３などの１つ以上のキャプシドタンパク質またはその変異体をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のキャプシドを構成してもよい。キャプシド変異体を以下で考察する。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、パッケージング遺伝子の各々に作動可能に連結されることができる。そのようなプロモーターの具体的な例には、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０プロモーターが含まれる（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５５６７−５５７１）。例えば、ｐ５及びｐ１９プロモーターを使用して、ｒｅｐ遺伝子を発現させてもよく、ｐ４０プロモーターを使用して、ｃａｐ遺伝子を発現させてもよい。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、本開示のベクターで使用されるＡＡＶゲノムは、それゆえ、天然に生じるＡＡＶの完全なゲノムであってもよい。例えば、完全なＡＡＶゲノムを含むベクターを使用して、インビトロでＡＡＶベクターを調製してもよい。いくつかの実施形態では、そのようなベクターは、原則として、患者に投与されてもよい。一部の好ましい実施形態では、ＡＡＶゲノムは、患者への投与を目的として誘導化されることになる。そのような誘導体化は当該技術分野で公知であり、本開示は、ＡＡＶゲノムの任意の既知の誘導体、及び当該技術分野で公知の技術を適用することによって生成され得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノム及びＡＡＶキャプシドの誘導体化は、Ｃｏｕｒａ  ａｎｄ  Ｎａｒｄｉ（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：９９ならびに上記で参照されたＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．に概説されている。
【０３３６】
ＡＡＶゲノムの誘導体は、インビボでの本開示のベクターからの導入遺伝子の発現を可能にする、ＡＡＶゲノムの任意の短縮型または改変型を含む。いくつかの実施形態では、最小のウイルス配列を含みながら上記の機能を保持するようにＡＡＶゲノムを切り詰めることが可能である。これは、例えばベクターと野生型ウイルスとの組換えのリスクを減少し、標的細胞内のウイルス遺伝子タンパク質の存在による細胞性免疫応答の誘発を回避することにより、ＡＡＶゲノムの安全性に寄与してもよい。
【０３３７】
ＡＡＶゲノムの誘導体は、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶゲノムの誘導体は、２つ以上のＩＴＲなどの１つ超のＩＴＲを含んでもよい。ＩＴＲのうちの１つ以上は、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムから誘導されてもよく、あるいはキメラまたは突然変異型ＩＴＲであってもよい。例示的な突然変異型ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分解部位）の欠失を有するものである。この欠失により、ゲノムの継続的な複製が可能になり、コード配列及び相補配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的なＡＡＶゲノムが生成される。これにより、標的細胞におけるＤＮＡ複製を省くことが可能になり、導入遺伝子発現の加速ができるようになる。
【０３３８】
１つ以上のＩＴＲを含めることで、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後、宿主細胞の核における本開示のベクターのコンカテマー形成が補助され得る。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の生存期間中にベクター構築物を保護し、それにより、インビボでの導入遺伝子の長期発現が可能となる。
【０３３９】
いくつかの好ましい実施形態では、ＩＴＲ要素は、誘導体において天然ＡＡＶゲノムから保持される唯一の配列である。よって、誘導体は、天然ゲノムのｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子ならびに天然ゲノムの任意の他の配列を含まない場合がある。これはまた、宿主細胞ゲノムへのベクターの組込みの可能性を減少させ得る。加えて、ＡＡＶゲノムのサイズを小さくすると、導入遺伝子に加えて、ベクター内に他の配列要素（例えば制御要素）を組込む際の柔軟性の増加が可能になる。
【０３４０】
以下の部分：１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）及びキャプシド（ｃａｐ）遺伝子は、本開示の誘導体において除去されてもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、誘導体は、１つ以上のｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子あるいはＡＡＶゲノムの他のウイルス配列を追加で含んでもよい。天然に生じるＡＡＶは、ヒト第１９染色体上の特定の部位に高頻度で組み込まれ、無視できる頻度のランダム組込みを示し、これにより、組込み能力をベクター中に保持することが治療設定において許容され得る。
【０３４１】
誘導体がキャプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３を含む場合、誘導体は、１つまたは以上の天然に生じるＡＡＶのキメラ、シャッフル、またはキャプシド修飾誘導体であってもよい。本開示は、同じベクター（すなわち、偽型ベクター）内のＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローン、または分離株からのキャプシドタンパク質配列の提供を包含する。
【０３４２】
キメラ、シャッフルまたはキャプシド修飾誘導体を選択して、ウイルスベクターに１つ以上の機能性を提供してもよい。例えば、これらの誘導体は、ＡＡＶ２のものなどの天然に生じるＡＡＶゲノムを含むＡＡＶベクターと比較して、遺伝子送達効率の増加、免疫原性（体液性または細胞性）の低減、向性範囲の変更、及び／または特定の細胞型の標的化の改善を提示し得る。遺伝子送達の効率の増加は、細胞表面での受容体または共受容体の結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核への輸送の改善、ウイルス粒子のアンコーティングの改善ならびに一本鎖ゲノムの二本鎖型への変換の改善によってもたらされ得る。効率の増加はまた、向性範囲の変更または特定の細胞集団の標的化にも関連し得、そのためベクター用量はそれが必要とされない組織への投与によって希釈されない。
【０３４３】
キメラキャプシドタンパク質には、天然に生じるＡＡＶ血清型の２つ以上のキャプシドコード配列間の組換えによって生成されるものが含まれる。これは、例えば、ある血清型の非感染性キャプシド配列が異なる血清型のキャプシド配列と同時トランスフェクトされるマーカーレスキュー手法によって実施され得るものであり、所望の特性を有するキャプシド配列に関して選択するために定方向選択が使用される。異なる血清型のキャプシド配列を細胞内での相同組換えによって変更して新規のキメラキャプシドタンパク質を産生することができる。
【０３４４】
本開示のキメラキャプシドタンパク質はまた、特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、または特定のアミノ酸残基を、２つ以上のキャプシドタンパク質間、例えば、異なる血清型の２つ以上のキャプシドタンパク質間で転移させるためのキャプシドタンパク質配列の操作によって生成されるものを含む。
【０３４５】
シャッフルまたはキメラキャプシドタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲによって生成されてもよい。ハイブリッドＡＡＶキャプシド遺伝子は、関連するＡＡＶ遺伝子、例えば複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードするものの配列を無作為に断片化し、次いでその後、配列相同性の領域における交差も引き起こし得る、自己プライミングポリメラーゼ反応において断片を再構成することによって作製することができる。いくつかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフルすることによってこのようにして作製されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーを、スクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンＰＣＲを使用して、ＡＡＶキャプシド遺伝子を無作為に突然変異させて、変異体の多様なライブラリーを作製してもよく、次いで、これを所望の特性について選択してもよい。
【０３４６】
キャプシド遺伝子の配列を遺伝子修飾して、天然の野生型配列に関して特定の欠失、置換または挿入を導入してもよい。例えば、キャプシド遺伝子を、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内、あるいはキャプシドコード配列のＮ末端及び／またはＣ末端にて、無関係なタンパク質またはペプチドの配列の挿入によって修飾してもよい。
【０３４７】
無関係のタンパク質またはペプチドは、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、それにより標的細胞への結合の改善または特定の細胞集団へのベクターの標的化の特異性の改善をもたらすものであり得る。無関係のタンパク質はまた、産生プロセスの一部としてウイルス粒子の精製を助けるもの、すなわち、エピトープまたはアフィニティータグであってもよい。挿入の部位は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、輸送を妨害しないように選択されてもよい。当業者は、自身らの共通の一般知識に基づいて挿入に好適な部位を同定することができる。具体的な部位は、上記で参照したＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ.に開示されている。
【０３４８】
本開示は、天然ＡＡＶゲノムの配列とは異なる順序及び構成でのＡＡＶゲノムの配列の提供を、追加で包含する。本開示は、１つ以上のＡＡＶ配列または遺伝子を、別のウイルス由来の配列で、または複数のウイルス由来の配列で構成されるキメラ遺伝子で置き換えることも包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列から構成されてもよい。
【０３４９】
本開示のＡＡＶベクターは、ある血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘導体が異なる血清型のキャプシドにパッケージされているトランスキャプシド化形態を含む。本開示のＡＡＶベクターは、２つ以上の異なる血清型由来の非修飾キャプシドタンパク質の混合物がウイルスキャプシドを構成するモザイク形態も含む。ＡＡＶベクターは、キャプシド表面に吸着されたリガンドを担持する化学的に修飾された形態も含んでもよい。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含んでもよい。
【０３５０】
ゆえに、例えば、本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／２）、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／５）、ならびにＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ８キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／８）を含んでもよい。
【０３５１】
本開示のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み得る。一実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆ突然変異型キャプシドタンパク質は、配列番号１２の７３３位でチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号１２と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆ突然変異型キャプシドタンパク質は、配列番号１２の７３３位でチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【０３５２】
ＡＡＶ  ＲＰＧＲ製剤
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、製剤を含む。本明細書で使用される場合、製剤は、疾患または障害の治療または予防のために対象への投与のために製剤化された原薬を含む。
【０３５３】
本開示の例示的な製剤の構成要素、それらの機能及び仕様が、表１Ａに列挙される。
【表１Ａ】
2022501037.tif 000006
【０３５４】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲ剤形
本開示の組成物は、全身性または局所投与のために製剤化されてもよい。
【０３５５】
本開示の組成物は、注射または注入のための懸濁液として製剤化されてもよい。
【０３５６】
本開示の組成物は、これらに限定されないが、硝子体内注射もしくは注入、網膜下注射もしくは点滴、または脈絡膜上注射もしくは注入を含む、任意の経路による注射または注入のために製剤化されてもよい。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約０．５×１０＾１１または０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍｌの濃度で製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化されてもよい。
【０３５８】
本開示の組成物は、本開示の希釈剤を使用して、投与前に希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一である。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−構築物製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一でない。
【０３５９】
表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物製剤を含む本開示の組成物は、両端を含めて０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ粒子を含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物製剤を含む本開示の組成物は、２．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ  ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ粒子を含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ、２．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ粒子を含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。プロトコルのために必要とされる場合、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、本開示の希釈剤を使用する投与の前に、クリニックにおいて（すなわち、医療専門家によって）希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、この希釈剤は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の調製のために使用される同じ製剤緩衝液である。
【０３６０】
本開示の組成物は、フルＡＡＶ粒子を含んでも空ＡＡＶ粒子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、フルＡＡＶ粒子は、本開示のＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５構築物をコードする一本鎖ＤＮＡを含む。当業者は、例えば、透過電子顕微鏡分析、ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲを介して、ＡＡＶ粒子がフルであるか空であるかを決定することができる。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、６５％、少なくとも６７％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７６％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のフルＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも７０％のフルＡＡＶ粒子を含む。
【０３６１】
本開示の組成物は、本開示の希釈剤を使用して使用して、投与前に希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一である。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一でない。
【０３６２】
表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤を含む本開示の組成物は、両端を含めて０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬを含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤を含む本開示の組成物は、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、例えば、２．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬまたは５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬを含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、表１Ａに記載されるＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤を含む本開示の組成物は、０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ、２．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬを含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。プロトコルのために必要とされる場合、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、本開示の希釈剤を使用する投与の前に、クリニックにおいて（すなわち、医療専門家によって）希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、この希釈剤は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の調製のために使用される同じ製剤緩衝液である。
【０３６３】
ＡＡＶ  ＡＢＣＡ４製剤
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、製剤を含む。本明細書で使用される場合、製剤は、疾患または障害の治療または予防のために対象への投与のために製剤化された原薬を含む。
【０３６４】
本開示の事例的製剤の構成要素、それらの機能及び仕様が、表１Ｂに列挙される。
【表１Ｂ】
2022501037.tif 000007
【０３６５】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４剤形
本開示の組成物は、全身性または局所投与のために製剤化されてもよい。
【０３６６】
本開示の組成物は、注射または注入のための懸濁液として製剤化されてもよい。
【０３６７】
本開示の組成物は、これらに限定されないが、硝子体内注射もしくは注入、網膜下注射もしくは点滴、または脈絡膜上注射もしくは注入を含む、任意の経路による注射または注入のために製剤化されてもよい。
【０３６８】
本開示の組成物は、それぞれ、上流及び／または下流のベクターについて、両端を含めて０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化されてもよい。
【０３６９】
本開示の組成物は、本開示の希釈剤を使用して使用して、投与前に希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一である。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−構築物製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一でない。
【０３７０】
表１Ｂに記載されるＡＡＶ−ＡＢＣＡ４構築物製剤を含む本開示の組成物は、それぞれ、上流及び／または下流のベクターについて、両端を含めて０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ粒子を含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。プロトコルのために必要とされる場合、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、本開示の希釈剤を使用する投与の前に、クリニックにおいて（すなわち、医療専門家によって）希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、この希釈剤は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の調製のために使用される同じ製剤緩衝液である。
【０３７１】
本開示の組成物は、フルＡＡＶ粒子を含んでも空ＡＡＶ粒子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、フルＡＡＶ粒子は、本開示のＡＡＶ−ＡＢＣＡ４構築物をコードする一本鎖ＤＮＡを含む。当業者は、例えば、透過電子顕微鏡分析、ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲを介して、ＡＡＶ粒子がフルであるか空であるかを決定することができる。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、６５％、少なくとも６７％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７６％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のフルＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも７０％のフルＡＡＶ粒子を含む。
【０３７２】
本開示の組成物は、本開示の希釈剤を使用して使用して、投与前に希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一である。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一でない。
【０３７３】
表１Ｂに記載されるＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤を含む本開示の組成物は、それぞれ、上流及び／または下流のベクターについて、両端を含めて０．５×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬを含む注射用懸濁液として製剤化されてもよい。プロトコルのために必要とされる場合、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、本開示の希釈剤を使用する投与の前に、クリニックにおいて（すなわち、医療専門家によって）希釈されてもよい。いくつかの実施形態では、この希釈剤は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の調製のために使用される同じ製剤緩衝液である。
【０３７４】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲ医薬組成物
本開示の組成物は原薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５及び製剤緩衝液を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、０．００１％のポロキサマー１８８と共に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。
賦形剤
本開示の組成物は製剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、原薬及び製剤緩衝液を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中で希釈された原薬を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中の最終製剤ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５  ベクターゲノム（ｖｇ）濃度に希釈されたＡＡＶ８−ＲＰＧＲＯＲＦ１５原薬を含むか、またはそれからなる。
【０３７５】
眼球製剤
本開示の組成物は、眼球の注射または注入のための最適濃度のＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５原薬を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるように製剤化されてもよい。
【０３７６】
本開示の組成物は、本開示のＡＡＶの安定性を増加または増強する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本開示のＡＡＶの安定性を確実にするか、または増強する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。代替的には、または加えて、本開示の組成物は、ＡＡＶ粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＡＡＶ粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。
【０３７７】
本開示の組成物は、中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、７〜９の中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．５〜８．５のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．７〜８．３のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．９〜８．１のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。
【０３７８】
本開示の組成物及び細胞の接触に続いて、ＡＡＶ−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、視細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはインサイツである。細胞がインビボであるものを含む、いくつかの実施形態では、接触させることは、対象への組成物の投与に続いて起こる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子生成物の発現の治療上有効なレベルで、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子生成物はタンパク質である。
【０３７９】
網膜下バッチ製剤
本開示の組成物は、両端を含めて、バッチあたり１〜１０００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり５０〜５００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり１００〜２５０バイアルの規模で製造されてもよい。
【０３８０】
本開示の例示的なバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜１００ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含んでもよい。
【表２Ａ】
2022501037.tif 000008
【０３８１】
製剤の調製のための本開示の方法のいくつかの実施形態では、原薬は＋３５±２℃で解凍され、必要とされる場合、無菌製剤緩衝液中で標的濃度（例えば、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬ）まで希釈される。
【０３８２】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の標的最終ＤＲＰ力価は１×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬであり、最小及び最大許容力価は、それぞれ、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ及び３．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬである。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の標的最終ＤＲＰ力価は、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、最大で１０倍希釈した後の投与または希釈なしの投与のいずれかのために、無菌濾過され、０．５ｍｌのポリプロピレンチューブまたは０．５ｍＬのＣｒｙｓｔａｌＺｅｎｉｔｈ（登録商標）（環状オレフィンポリマー）に充填される。
【０３８３】
その後、バイアルは凍結され、−６０℃以下で保管される。ＱＰ発表及び現場への流通の前のラベル付け及び保管のために、製剤は、認定された臨床販売業者に移される。製剤は、ＱＰ発表及び流通まで、温度監視された冷凍庫中で−６０℃以下で保管される。
【０３８４】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、網膜下送達用のマイクロデリバリーデバイスに事前に充填されてもよい。網膜下送達に好適なマイクロデリバリーデバイスは、マイクロニードルを含んでもよく、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、マイクロデリバリーデバイスにおけるプレフィルド室温保管またはプレフィルド冷蔵保管用にさらに製剤化されてもよい。
【０３８５】
脈絡膜上バッチ製剤
本開示の組成物は、両端を含めて、バッチあたり１〜１０００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり５０〜５００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり１００〜２５０バイアルの規模で製造されてもよい。
【０３８６】
本開示の例示的なバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜５００ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含んでもよい。
【表３Ａ】
2022501037.tif 000009
【０３８７】
製剤の調製のための本開示の方法のいくつかの実施形態では、原薬は＋３５±２℃で解凍され、必要とされる場合、無菌製剤緩衝液中で標的濃度（例えば、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬ）まで希釈される。
【０３８８】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の標的最終ＤＲＰ力価は１×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬであり、最小及び最大許容力価は、それぞれ、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ及び３．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬである。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤の標的最終ＤＲＰ力価は、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、最大で１０倍希釈した後の投与または希釈なしの投与のいずれかのために、無菌濾過され、０．５ｍｌのポリプロピレンチューブまたは０．５ｍＬのＣｒｙｓｔａｌＺｅｎｉｔｈ（登録商標）（環状オレフィンポリマー）に充填される。
【０３８９】
その後、バイアルは凍結され、−６０℃以下で保管される。ＱＰ発表及び現場への流通の前のラベル付け及び保管のために、製剤は、認定された臨床販売業者に移される。製剤は、ＱＰ発表及び流通まで、温度監視された冷凍庫中で−６０℃以下で保管される。
【０３９０】
ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、脈絡膜上送達用のマイクロデリバリーデバイスに事前に充填されてもよい。脈絡膜上送達に好適なマイクロデリバリーデバイスは、マイクロカテーテルを含んでもよく、ＡＡＶ−ＲＰＧＲＯＲＦ１５製剤は、マイクロデリバリーデバイスにおけるプレフィルド室温保管またはプレフィルド冷蔵保管用にさらに製剤化されてもよい。
【０３９１】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４医薬配合物
本開示の組成物は原薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４及び製剤緩衝液を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、０．００１％のポロキサマー１８８と共に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。
【０３９２】
賦形剤
本開示の組成物は製剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤は、原薬及び製剤緩衝液を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中で希釈された原薬を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中の最終製剤ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４ベクターゲノム（ｖｇ）濃度に希釈されたＡＡＶ８−ＡＢＣＡ４原薬を含むか、またはそれからなる。
【０３９３】
眼球製剤
本開示の組成物は、眼球の注射または注入のための最適濃度のＡＡＶ−ＡＢＣＡ４原薬を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるように製剤化されてもよい。
【０３９４】
本開示の組成物は、本開示のＡＡＶの安定性を増加または増強する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本開示のＡＡＶの安定性を確実にするか、または増強する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。代替的には、または加えて、本開示の組成物は、ＡＡＶ粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＡＡＶ粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含んでもよい。
【０３９５】
本開示の組成物は、中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、７〜９の中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．５〜８．５のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．７〜８．３のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．９〜８．１のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。
【０３９６】
本開示の組成物及び細胞の接触に続いて、ＡＡＶ−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、視細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはインサイツである。細胞がインビボであるものを含む、いくつかの実施形態では、接触させることは、対象への組成物の投与に続いて起こる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子生成物の発現の治療上有効なレベルで、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子生成物はタンパク質である。
【０３９７】
網膜下バッチ製剤
本開示の組成物は、両端を含めて、バッチあたり１〜１０００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり５０〜５００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり１００〜２５０バイアルの規模で製造されてもよい。
【０３９８】
本開示の例示的なバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜１００ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含んでもよい。
【表２Ｂ】
2022501037.tif 000010
【０３９９】
製剤の調製のための本開示の方法のいくつかの実施形態では、原薬は＋３５±２℃で解凍され、必要とされる場合、無菌製剤緩衝液中で標的濃度（例えば、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬ）まで希釈される。
【０４００】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の標的最終ＤＲＰ力価は１×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬであり、最小及び最大許容力価は、それぞれ、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ及び３．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、最大で１０倍希釈した後の投与または希釈なしの投与のいずれかのために、無菌濾過され、０．５ｍｌのポリプロピレンチューブまたは０．５ｍＬのＣｒｙｓｔａｌＺｅｎｉｔｈ（登録商標）（環状オレフィンポリマー）に充填される。
【０４０１】
その後、バイアルは凍結され、−６０℃以下で保管される。ＱＰ発表及び現場への流通の前のラベル付け及び保管のために、製剤は、認定された臨床販売業者に移される。製剤は、ＱＰ発表及び流通まで、温度監視された冷凍庫中で−６０℃以下で保管される。
【０４０２】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、網膜下送達用のマイクロデリバリーデバイスに事前に充填されてもよい。網膜下送達に好適なマイクロデリバリーデバイスは、マイクロニードルを含んでもよく、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、マイクロデリバリーデバイスにおけるプレフィルド室温保管またはプレフィルド冷蔵保管用にさらに製剤化されてもよい。
【０４０３】
脈絡膜上バッチ製剤
本開示の組成物は、両端を含めて、バッチあたり１〜１０００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり５０〜５００バイアルの規模で製造されてもよい。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり１００〜２５０バイアルの規模で製造されてもよい。
【０４０４】
本開示の例示的なバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜５００ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含んでもよい。
【表３Ｂ】
2022501037.tif 000011
【０４０５】
製剤の調製のための本開示の方法のいくつかの実施形態では、原薬は＋３５±２℃で解凍され、必要とされる場合、無菌製剤緩衝液中で標的濃度（例えば、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ、または１．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬ）まで希釈される。
【０４０６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤の標的最終ＤＲＰ力価は１×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬであり、最小及び最大許容力価は、それぞれ、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ及び３．０×１０＾１３ＤＲＰ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、最大で１０倍希釈した後の投与または希釈なしの投与のいずれかのために、無菌濾過され、０．５ｍｌのポリプロピレンチューブまたは０．５ｍＬのＣｒｙｓｔａｌＺｅｎｉｔｈ（登録商標）（環状オレフィンポリマー）に充填される。
【０４０７】
その後、バイアルは凍結され、−６０℃以下で保管される。ＱＰ発表及び現場への流通の前のラベル付け及び保管のために、製剤は、認定された臨床販売業者に移される。製剤は、ＱＰ発表及び流通まで、温度監視された冷凍庫中で−６０℃以下で保管される。
【０４０８】
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、脈絡膜上送達用のマイクロデリバリーデバイスに事前に充填されてもよい。脈絡膜上送達に好適なマイクロデリバリーデバイスは、マイクロカテーテルを含んでもよく、ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４製剤は、マイクロデリバリーデバイスにおけるプレフィルド室温保管またはプレフィルド冷蔵保管用にさらに製剤化されてもよい。
【０４０９】
組成物の保管
組成物が製剤を含み、組成物が無菌バイアルで供給されるものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、ゼロ（℃）未満で保管されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、製剤の有効性または無菌包装への完全性を失うことなく解凍及び凍結され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、製剤の有効性または無菌包装への完全性を失うことなく、複数回の解凍及び凍結を受け得る。
【０４１０】
組成物が製剤を含み、組成物が無菌バイアルで供給されるものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、室温で保管されてもよい。
【０４１１】
有機材料
本開示の緩衝液及び培地の調製において使用される出発物質は、動物由来の材料を含まないことが証明されている。
【０４１２】
フィルタ及びクロマトグラフィーマトリックス
原薬及び製剤の濾過に使用されるフィルタの非限定的な例は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ０．４５μｍ及び０．２μｍフィルタである。フィルタは、購入時に非無菌であり、オートクレーブ処理によって契約製造業者の社内で無菌化される。いくつかの実施形態では、フィルタは、閾値圧力（例えば、３．２バール）でのバブルポイント試験によって完全性試験される。
【０４１３】
全てのクロマトグラフィー材料は、使用前に解析証明書上で発売される。カラムは、プレパックされた状態で購入され、使用前に消毒される。
【０４１４】
ＡＡＶ−構築物製剤の製造の方法
細胞構築
１０の継代を含む例示的な継代プロトコルが図１に示される。端的には、出発ＨＥＫ２９３細胞がＴ２５フラスコ及び成長培地（培地は表７に要約されている）中で５日間培養される。５日後、ＨＥＫ２９３細胞がＴ１７５培養フラスコに移され、さらに４日間培養され、４つのＴ１７５フラスコに分割される。細胞は、さらに３日間培養された後、２つのＣＦ−１細胞工場（例えば、Ｎｕｎｃ（商標）ブランドのＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ）に移される。細胞は、さらに４日間培養され、２つのＣＦ−１細胞工場に移され、さらに３日間培養され、２つのＣＦ−１細胞工場に移され、さらに４日間培養され、２つのＣＦ−２細胞工場に移される。細胞は、さらに２日間培養され、２つのＣＦ−１０細胞工場に分割され、さらに４日間培養され、６つのＣＦ−１０細胞工場に分割され、さらに３日間培養され、３６層の接着細胞培養容器である２０個のＨＹＰＥＲｓｔａｃｋに移される。細胞は、トランスフェクションの前にＨＹＰＥＲｓｔａｃｋでさらに３日間培養される。
【０４１５】
Ｔ２５フラスコからＴ１７５フラスコへ：培地は廃棄され、細胞は予熱したＰＢＳで洗浄される。細胞は、ＴｒｙｐＬＥ細胞解離試薬でほぐされる。Ｔフラスコまたは細胞スタックは、３７±１℃に設定されたインキュベーター中で５〜１０分間インキュベートされ、細胞は、容器を軽く叩くことによって完全に取り出される。成長培地は、ＴｒｙｐＬＥを阻害するために添加される。異なる支持物に対して使用される成長培地、ＰＢＳ、及びＴｒｙｐＬＥの量が、表６に示される。次いで、全ての細胞懸濁液が、プールされる。
【０４１６】
細胞数及び細胞生存率が決定され、細胞は、表４に従って播種され、インキュベートされ、継代される。
【表４】
2022501037.tif 000012
【０４１７】
本開示の細胞構築プロセスは、使用されるＨＹＰＥＲｓｔａｃｋの数に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。ＨＹＰＥＲｓｔａｃｋの使用により、細胞培養の優れたスケーラビリティ及び効率が得られる。
【０４１８】
トランスフェクション
以下の温度、持続時間、スピン速度、及び体積は、他の因子のなかでも、使用される細胞型に依存して最適な結果のために調整され得る。以下に記載される例示的な実施形態について、条件を、ＨＥＫ２９３細胞の使用のために最適化した。これらの方法は、大規模生産向けに最適化することができる。
【０４１９】
本開示のＡＡＶ構築物を製造する際に使用される例示的なトランスフェクションプロセスは、ステップを含むか、またはステップからなる。プラスミドＤＮＡ（例えば、ＲＰＧＲＯＲＦ１５またはＡＢＣＡ４配列を含むＡＡＶ構築物をコードするプラスミド、Ａｄ５ヘルパー機能をコードするプラスミド、ならびにＡＡＶ８  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド）と、トランスフェクション組成物（例えば、ポリマーまたはＰＥＩを含むもの）とは、別々にトランスフェクション溶液中に希釈されて、それぞれ、ＤＮＡトランスフェクション組成物と希釈されたトランスフェクション組成物とを産生する。希釈されたトランスフェクション組成物はＤＮＡトランスフェクション組成物に加えられ、室温でインキュベートされて、トランスフェクション可能なＤＮＡ組成物を産生する。得られたトランスフェクション可能なＤＮＡ組成物は、トランスフェクション培地に加えられる。清澄培地がＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出され、トランスフェクション可能なＤＮＡ組成物を含むトランスフェクション培地が空のＨＹＰＥＲｓｔａｃｋに加えられる。ＨＹＰＥＲｓｔａｃｋは、３７℃、５％のＣＯ２で、少なくとも１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、または４８時間インキュベートされる。
【０４２０】
本開示のＡＡＶ構築物を製造する際に使用される例示的なトランスフェクションプロセスの要約は、図１０に示される。プラスミドＤＮＡ（例えば、ＲＰＧＲＯＲＦ１５またはＡＢＣＡ４配列を含むＡＡＶ構築物をコードするプラスミド、ならびにＡＡＶ８  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド）と、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬であるＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）とは、別々にトランスフェクション溶液中に希釈される。ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）溶液は、ＤＮＡ溶液に滴加され、１０分間室温でインキュベートされる。得られたＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）溶液は、トランスフェクション培地に加えられる。清澄培地がＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出され、ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）溶液を含むトランスフェクション培地が空のＨＹＰＥＲｓｔａｃｋに加えられる。ＨＹＰＥＲｓｔａｃｋは、３７℃、５％のＣＯ２で、２４時間インキュベートされる。
【表５】
2022501037.tif 000013
【０４２１】
プラスミド及びＰＥＩは、トランスフェクション培地で調製される（表５）。
【０４２２】
ある特定の実施形態では、プラスミドＤＮＡの量は表６に提示される。
【表６】
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【０４２３】
特定の実施形態では、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）対ＤＮＡの比（ｍＬ：ｍｇ）は、それぞれ、約０．５：１〜約５：１、または約１：１〜約５：１、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１である。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩを使用して実施され、ここでは、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、１：１：１のモル比で提供される。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩを、それぞれ、約０．５：１〜５：１または約１：１〜約５：１、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比ｍＬ：ｍｇ）で使用して実施され、ここでは、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、約０．５：１：１〜約１０：１：１、約１：１：１〜約１０：１：１、約２：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約０．５：１：１、約１：１：１、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で提供される。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、ＰＥＩ（例えば、ＰＥＩ  ｐｒｏ（登録商標））を、それぞれ、約１：１〜約５：１、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ（ｍＬ：ｍｇ）比で使用して実施され、ここでは、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、１：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、３：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、１０：１：１のモル比で提供される。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、それぞれ、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、または約９：１：１のモル比で提供される。
【０４２４】
トランスフェクション後、トランスフェクション培地はＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出され、採取培地が加えられる。細胞は、採取培地中、３７℃、５％のＣＯ２で、７２時間インキュベートされる。ウイルス放出溶液は、体積比１：２０でＨＹＰＥＲｓｔａｃｋに加えられ、細胞は、３７℃、５％のＣＯ２で、１８時間インキュベートされる。
【０４２５】
細胞を培養し、細胞をトランスフェクトし、ＡＡＶウイルス粒子を放出するために使用される異なる種類の培地及び溶液の例示的な配合は、表７に開示される。
【表７】
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【０４２６】
採取
ウイルス放出溶液とのインキュベーション後、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から放出されたＡＡＶウイルス粒子を含む採取培地がＨＹＰＥＲｓｔａｃｋから取り出される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、採取培地から精製される。
【０４２７】
下流処理
例示的な下流処理ステップの要約は、図２１に示され、付属の実施例に記載される。端的には、複数のＡＡＶ粒子を含む採取培地を収集した後、複数のＡＡＶ粒子は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して精製されて、複数のＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成する。ＨＩＣ溶出液は、希釈され、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を介して複数のＡＡＶ粒子をさらに精製されて、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成する。ＣＥＸからの複数のｒＡＡＶ粒子は、フルＡＡＶ粒子を富化するために、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって精製される。最後に、複数の精製され富化されたｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液が、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過及び濃縮されて、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び製剤緩衝液を含む最終組成物を生成する。いくつかの実施形態では、ポロキサマー１８８が製剤緩衝液に添加され、原薬は−６０℃未満で凍結される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、単一のＴＦＦ手順を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＦステップは、２つ以上の連続したＴＦＦ手順を含む。
【０４２８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ｒＡＡＶウイルス粒子を、疎水性相互作用を介したクロマトグラフィーカラムのマトリックスへのウイルスキャプシドタンパク質の結合に基づいて捕捉する。いくつかの実施形態では、疎水性表面のクラスター化を促進するために高塩濃度が使用される。
【０４２９】
本開示の製造プロセスの例示的な疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップのプロセス要約は、図２７に示される。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、ＨＩＣステップは、（ｉ）複数の放出されたｒＡＡＶ粒子を含む採取培地を希釈するステップ、（ｉｉ）希釈した採取培地をＨＩＣカラムにロードするステップ、（ｉｉｉ）ＨＩＣクロマトグラムを生成するステップ、（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣクロマトグラム上のピークを選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムで使用されるクロマトグラフィーマトリックスは、疎水性相互作用（ＯＨ）マトリックスである。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムは８００ｍＬのモノリスである。いくつかの実施形態では、採取培地は、高塩濃度緩衝液中に希釈される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を溶出するための段階勾配。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を溶出するためのアイソクラティック溶出。例となる緩衝液条件は、例えば、図２１２及び３３６に提供される。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、追加の精製の前に、すなわち、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）の前に、希釈され濾過される。濾過中のｒＡＡＶ粒子の損失を最小限に抑えるために、好適なフィルタが選択される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、０．８／０．４５μＭのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを使用して濾過される。
【０４３２】
陽イオン交換クロマトグラフィー
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＨＩＣステップによって生成されたＨＩＣ溶出液中の複数のｒＡＡＶ粒子をさらに精製するために、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）が使用され得る。ＣＥＸは、分子をその正味の表面電荷に基づいて分離する、イオン交換クロマトグラフィーの一種である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸは、正に帯電した分子に親和性を有する負に帯電したイオン交換樹脂を使用する。ｐＨがＡＡＶ粒子の等電点（ｐＩ）を下回ると、ＡＡＶウイルス粒子は正電荷を有し、ＣＥＸにより精製することができる。
【０４３３】
本開示の製造プロセスの例示的な陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）ステップのプロセス要約は、図６８に示される。
【０４３４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＣＥＸステップは、（ｉ）ＨＩＣステップからの複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＨＩＣ溶出液を希釈し、任意選択で、ＨＩＣ溶出液を濾過するステップと、（ｉｉ）希釈されたＨＩＣ溶出液をＣＥＸカラムにロードするステップと、（ｉｉｉ）ＣＥＸクロマトグラムを生成するステップと、（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーは、クロマトグラフィーカラム内にＳＯ３−陽イオン交換マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、８０ｍＬのモノリスである。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、ＣＥＸステップの前に低塩濃度緩衝液中に希釈される。いくつかの実施形態では、希釈されたＨＩＣ溶出液は、ｐＨ３．０〜４．０に調整される。いくつかの実施形態では、希釈されたＨＩＣ溶出液は、ｐＨ３．６±０．１に調整される。いくつかの実施形態では、これにより、ｐＨがｒＡＡＶウイルス粒子のｐＩのｐＨよりも低くなり、正に帯電したｒＡＡＶウイルス粒子がもたらされる。いくつかの実施形態では、段階勾配を使用して、ｒＡＡＶ粒子を溶出する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＥＸ溶出液のｐＨを中和することをさらに含む。例となる緩衝液条件は、例えば、図２１３及び３３６に提供される。
【０４３５】
陰イオン交換クロマトグラフィー
本開示の方法のいくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶ粒子をフルｒＡＡＶ粒子について富化するために、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）が使用され得る。フルｒＡＡＶ粒子は、本開示のＡＡＶ−構築物を含む一本鎖ＤＮＡを含むＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態では、フルｒＡＡＶ粒子は、５’ＩＴＲをコードする配列、ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列、ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列、ＢＧＨポリＡシグナルをコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、フルｒＡＡＶ粒子は、５’ＩＴＲをコードする配列、ＡＢＣＡ４またはその一部分をコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列を含む。
【０４３６】
ＡＥＸは、分子を正味の表面電荷に基づいて分離する、イオン交換クロマトグラフィーの一種である。フル、空、ならびに損傷した及び／もしくは凝集したＡＡＶウイルス粒子は、異なる等電点（ｐＩ）を有する。いくつかの実施形態では、フル粒子及び空粒子は、粒子の異なる電荷に基づいて分離される。フル粒子は、ＤＮＡゲノムの存在に起因して、空粒子よりもわずかにより負に帯電する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子のｐＩよりも高いｐＨの溶液中に希釈される。いくつかの実施形態では、分離は、溶液からＭｇＣｌ２を除去することによってさらに増強される。
【０４３７】
本開示の製造プロセスの例示的な陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップのプロセス要約は、図１０１に示される。
【０４３８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＡＥＸ  クロマトグラフィーは、（ｉ）複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＣＥＸ溶出液を希釈するステップと、（ｉｉ）希釈されたＣＥＸ溶出液をＡＥＸカラムにロードするステップと、（ｉｉｉ）ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、（ｉｖ）フルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーは、クロマトグラフィーカラム内に陰イオン交換（ＱＡ）マトリックスを含む。いくつかの実施形態では、カラムは、８０ｍＬのマクロ多孔性マトリックス組成物である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ溶出液は、ＡＥＸステップの前に低塩濃度緩衝液中に希釈される。いくつかの実施形態では、線形勾配を使用して、フルｒＡＡＶ粒子を溶出する。いくつかの実施形態では、本方法は、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む溶出液のｐＨを中和することをさらに含む。例となる緩衝液条件は、例えば、図２１３及び３３６に提供される。
【０４３９】
ＴＦＦ濃縮及び透析濾過
本開示の方法のいくつかの実施形態では、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して、最終製剤緩衝液（ＦＦＢ）中に透析濾過され、濃縮される。タンジェンシャルフロー濾過は、特定のＴＦＦの実施形態における膜の多孔性に応じて、精密濾過または限外濾過プロセスとして分類され得る膜濾過技法である。ＴＦＦでは、供給流は、一部分が膜を透過するときに膜面に平行に通過し、同時に、保持液はリザーバーに戻って再循環される。このプロセスにより、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の原理を使用して、体積の低減及び追加の精製が達成される。
【０４４０】
このプロセスは、所望の最終製剤緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、任意選択で、０．００１％でのポロキサマー）中へＡＡＶ生成物を製剤化するために透析濾過を利用する。
【０４４１】
溶出生成物のタンジェンシャルフロー濾過は、１００ｋＤａの分子量カットオフを有する中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用して実施される。カートリッジ及びシステムは、透過液側でｐＨ８．０±０．２が得られるように、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭのｐＨ８緩衝液で平衡化される。
【０４４２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本方法は、２つのＴＦＦステップを含み、第１及び第２のＴＦＦ両方が、１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。
【０４４３】
生成物は、製剤緩衝液の最小６体積に対して連続モードでの透析濾過を行う前に、最小体積に濃縮される。保持得物が収集される。システムは、製剤緩衝液ですすがれる。このすすぎ液は、異なる容器に収集される。
【０４４４】
長期保管（６０日超）のために必要とされる場合、長期保管方法のいくつかの非限定的な例では、生成物は、０．２μｍフィルタを使用してサブミクロン濾過される。原薬が完全に濾過されたら、フィルタは、最終製剤緩衝液ですすがれる。
【０４４５】
ＱＣサンプリング後、精製されたバルク原薬は、−８０℃未満で保管される。任意選択で、凍結前にポロキサマー１８８が原薬に加えられ、−８０℃未満で保管される。
【０４４６】
原薬から製剤を作製する方法
本開示の組成物は、液体として供給されてもよい。組成物が製剤を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、製剤は、無菌ガラス製バイアルで供給される。いくつかの実施形態では、無菌ガラス製バイアルは、無菌透明ガラス製バイアルである。いくつかの実施形態では、無菌ガラス製バイアルは、栓を有する蓋付きである。いくつかの実施形態では、栓はプラスチックである。いくつかの実施形態では、無菌ガラス製バイアルは、蓋付きであり、オーバーシールでさらに封入される。
【０４４７】
本開示の原薬の制御
例示的な原薬は、表８に列挙される試験によって特徴付けられる。
【表８】
2022501037.tif 000016
【０４４８】
分析手順
【０４４９】
物理力価：
【０４５０】
いくつかの実施形態では、ゲノム力価は、ｑＰＣＲを使用して決定される。この方法により、ゲノムのコピー数の定量化が可能になる。ベクターストックの試料は、緩衝液中で希釈される。試料はＤＮａｓｅ処理され、ウイルスキャプシドはプロテイナーゼＫで溶解されてゲノムＤＮＡを放出する。次いで、希釈系列が作製される。各試料の複製物は、Ｔａｑｍａｎベースのプライマー／プローブセットを使用するｑＰＣＲに供される。標準曲線は、標準プラスミド希釈系列の線形範囲において各点の平均を取ることと、各点についての平均ＣＴ値に対して対数コピー数をプロットすることと、によって生成される。いくつかの実施形態では、標準曲線に使用されるプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル構造であり、他のものにおいては、線形構造である。線形化プラスミドは、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化により調製され、アガロースゲル電気泳動により可視化され、製造元の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され得る。標準曲線を生成するために使用されるプラスミド内で切断する他の制限酵素も適切であり得る。いくつかの実施形態では、標準としてのスーパーコイルプラスミドの使用により、線形化プラスミドの使用と比較して、ＡＡＶベクターの力価が増加した。ｒＡＡＶベクターの力価は、標準曲線から計算され得、ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）／ｍＬとして表される。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、ゲノム力価は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して決定される。ＡＡＶまたはそのゲノムＤＮＡの試料は、油／水エマルションを含む複数のナノリットル規模の液滴（例えば、２０，０００液滴）に分画されてもよい。ＰＣＲは、複数の各液滴中で生じる。この技法により、液滴を使用せずに実行される反応と比較して、必要な試料が少なく、試薬の体積が小さいという利点がもたらされる。ＰＣＲの後、各液滴が分析されるかまたは読み取られ、元の試料中のＰＣＲ陽性液滴の割合が決定される。次に、これらのデータは、ポアソン統計を使用して分析されて、元の試料中の標的ＤＮＡ鋳型濃度が決定される。液滴の生成中、鋳型分子はランダムに液滴に分配される。いくつかの液滴には鋳型が含まれず、いくつかの液滴には１つの鋳型分子が含まれ、他の液滴には１つ超の鋳型分子が含まれる。分割のランダムな性質により、増幅後の蛍光データはポアソン分布に良好に適合する。陽性液滴の数は、試料中の標的配列の濃度に対応する。複数の標的が同じ液滴中で増幅されることで、液滴ごとの標的コピーを定量化するのに、反応開始時に液滴ごとに１つの鋳型、または反応後に液滴ごとに１つの標的を一切必要としないｄｄＰＣＲシステムは、試料を正確に分析できる。ｄｄＰＣＲは、標準ＰＣＲと同じＰＣＲ試薬を使用することができる。
【０４５２】
感染単位（ＩＵ）力価：このアッセイは、ＡＡＶの感染性粒子の数を定量化する。定量化は、ＲＣ３２細胞（ＨｅＬａ発現ＡＡＶ８  Ｒｅｐ／Ｃａｐ）に、段階希釈のベクター試料と均一濃度の野生型アデノウイルスとを感染させて、ヘルパー機能を提供することによって実行される。感染の数日後、細胞は、ＤＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫ消化が省略され、かつｑＰＣＲ部分のみが実行されることを除いて、上記の物理力価アッセイに記載されたのと同じ方法で、ＰＣＲ阻害剤を低減するために溶解希釈され、ｑＰＣＲによってアッセイされる。個々のウェルは、ＡＡＶ増幅に対して陽性または陰性としてスコアリングされる。スコアリングされたウェルは、Ｋａｒｂｅｒ法を使用してＩＵ／ｍＬ単位のＴＣＩＤ５０を決定するために使用される。
【０４５３】
総粒子：アッセイはＥＬＩＳＡ技法（ＡＡＶ８タイトレーションＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ）を使用する。組み立てられたＡＡＶ８キャプシド上のコンフォメーションエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体は、マイクロタイターストリップ上にコーティングされ、検体からのＡＡＶ８粒子を捕捉するために使用される。捕捉されたＡＡＶ粒子は、２つのステップで検出される。第１に、ＡＡＶ８に対するビオチン共役モノクローナル抗体は、免疫複合体に結合する。第２のステップでは、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートは、ビオチン分子と反応する。基質溶液の添加により、特異的に結合したウイルス粒子の量に比例する呈色反応が生じる。吸光度は、４５０ｎｍで測光的に測定される。
【０４５４】
完全：空比率（透過電子顕微鏡法）：ＡＡＶ２粒子のフル：空の比は、陰性染色透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して決定され得る。試料は、固定されたグリッドに適用される。試料は、透過電子顕微鏡を使用して視覚化され、フル（すなわち、ＤＮＡを含む）及び空のＡＡＶ２キャプシド粒子の計数は、それらの形態に基づいて実行される。フル：空粒子の比は、粒子数から計算される。
【０４５５】
フル：空比（解析用超遠心）：ＡＡＶ８粒子の完全：空の比は、解析用超遠心分離（ＡＵＣ）を使用して決定され得る。ＡＵＣは、非破壊的な他の方法よりも有利であり、すなわち、試料は、追加的な試験のためにＡＵＣに続いて回収され得る。空及びフルのＡＡＶ８粒子を含む試料は、液体組成物に適用され、これをとおして、超遠心分離中にＡＡＶ８が移動する。１つ以上のＡＡＶ８粒子の沈降速度を測定することで、ＡＡＶ粒子のサイズ及び形状に関する流体力学的情報が得られる。沈降平衡の尺度により、ＡＡＶ８粒子の溶液モル質量、化学量論、会合定数、及び溶液非理想性に関する熱力学的情報が得られる。ＡＵＣ中に取得される例示的な測定値は、放射状濃度分布、または「スキャン」である。いくつかの実施形態では、スキャンは、数分（速度沈降について）から数時間（平衡沈降について）の範囲に及ぶ間隔で取得される。本開示の方法のスキャンは、光学測定（例えば、吸光度、干渉及び／または蛍光）を含んでもよい。超遠心分離速度は、両端を含めて、毎分１０，０００回転（ｒｐｍ）〜７５，０００ｒｐｍの範囲であってもよい。フルＡＡＶ８粒子及び空ＡＡＶ８粒子はＡＵＣによる明確な測定を明示するので、試料の完全／空比率はこの方法を使用して決定されてもよい。
【０４５６】
ベクター同一性（ＤＮＡ）：このアッセイにより、ウイルスＤＮＡ配列が確認される。このアッセイは、ウイルスキャプシドを消化することと、ウイルスＤＮＡを精製することと、によって実行される。ＤＮＡは、可能な場合には（いくつかの領域、例えば、ＩＴＲは、配列決定するのに問題がある）、順方向と逆方向との両方で最小２倍の範囲で配列決定される。ＤＮＡ配列決定コンティグは、同一性を確認するために、予想される配列と比較される。
【０４５７】
総タンパク質：このアッセイは、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキットを使用して、試験品に存在するタンパク質の総量を定量化する。製剤緩衝液のマトリックス作用を排除するために、試料はアセトンで沈殿され、沈殿したタンパク質は解析前に等量の水に再懸濁される。タンパク質濃度決定は、試験品または希釈された試験品をキットに提供されるＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ試薬と混合することにより実行される。同じことが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準の希釈液を使用して実行される。混合物は６０℃でインキュベートされ、吸光度は５６２ｎｍで測定される。標準曲線は、直線回帰適合を使用して標準吸光度及び既知の濃度から生成される。未知の試料は、直線回帰に従って定量化される。
【０４５８】
純度：このアッセイにより、ＡＡＶ純度が半定量的に決定される。ＡＡＶ８キャプシド粒子ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、試料はＳｐｅｅｄＶａｃによって濃縮され、４×１０＾１０または１×１０＾１１粒子のいずれかが負荷され、キャプシドタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離される。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染色ゲルのデンシトメトリー解析により、キャプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３）に対するおよその不純物レベルの計算が可能になる。
【０４５９】
増殖型ＡＡＶ：試験品は、野生型アデノウイルスの存在下または非存在下でＨＥＫ２９３細胞を形質導入するために使用される。細胞増幅の３回の連続ラウンドが行われ、全ゲノムＤＮＡは各増幅ステップで抽出される。
【０４６０】
ｒｃＡＡＶ８は、リアルタイム定量的ＰＣＲによって検出される。２つの配列は単離されたゲノムＤＮＡである。１つはＡＡＶ２  Ｒｅｐ遺伝子に特異的であり、１つはＨＥＫ２９３細胞（ヒトアルブミン）の内在遺伝子に特異的である。細胞あたりのＲｅｐ遺伝子の相対コピー数が決定される。陽性対照は、単独で、またはｒＡＡＶベクター調製物の存在下で試験された野生型ＡＡＶウイルス血清型８である。
【０４６１】
アッセイの検出限界は、各試験されたバッチについて検証される。検出限界は、試験試料の「Ｙ」ゲノムあたり、「Ｘ」ｒｃＡＡＶである。試験試料がＲｅｐ配列に対して陰性である場合、この試料の結果は、次のように報告されることになる：ＮＯ  ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、試験試料の「Ｙ」ゲノムコピーあたり「Ｘ」ｒｃＡＡＶ未満。試験試料がＲｅｐ配列に対して陽性である場合、この試料の結果は、次のように報告されることになる：ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、試験試料の「Ｙ」ゲノムコピーあたり「Ｘ」ｒｃＡＡＶ超。
【０４６２】
ＨＥＫ２９３宿主細胞タンパク質：ＨＥＫ２９３宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）アッセイは、免疫酵素アッセイである。精製されたウイルスの試料は、アフィニティ精製された捕捉抗体でコーティングされたマイクロタイターストリップ中で反応する。二次的ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役酵素は、同時に反応し、固相抗体−ＨＣＰ−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。マイクロタイターストリップは、未結合の反応物を除去するために洗浄される。ＨＥＫ２９３  ＨＣＰの量は、ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼの各ウェルへの添加によって検出される。加水分解された基質の量は、プレートリーダー上で読み取られ、存在するＨＥＫ２９３  ＨＣＰの濃度に正比例する。
【０４６３】
総ＤＮＡ：Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ試薬は、二本鎖ＤＮＡに結合し、高発光複合体（λ励起＝４８０ｎｍ−λ発光＝５２０ｎｍ）を形成する超高感度蛍光核酸染色剤である。この蛍光発光強度は、溶液中のｄｓＤＮＡ量に比例する。既知の濃度を有するＤＮＡ標準曲線を使用して、試験試料におけるＤＮＡ含有量は、測定された蛍光を変換することによって取得される。
【０４６４】
ＨＥＫ２９３宿主細胞ＤＮＡ：元のプロセスは３つの異なるアンプリコンのサイズ及び量を測定したが、改善されたプロセスは高分子量及び断片化されたＤＮＡを含む総ｈｃＤＮＡを測定する。改善されたプロセスからの資格認定データは、アッセイが特異的であり、１０ｎｇ／用量未満の用量あたりのｈｃＤＮＡを評価する要件を満たすのに十分な感度があることを実証する（ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，２０１３）。
【０４６５】
残存ＢＳＡ：残存ＢＳＡは、Ｂｅｔｈｙｌによって製造及び販売される市販のＥＬＩＳＡキットを使用して定量化される。ＥＬＩＳＡキットの科学的原理は、宿主細胞タンパク質ＥＬＩＳＡについて指定されたものと非常に類似している。
【０４６６】
残存Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ：このアッセイは、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼに特異的な精製されたポリクローナル抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって試験試料中の残存Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを検出する。正確な測定は、試料のシグナルを、同時にアッセイされたＢｅｎｚｏｎａｓｅエンドヌクレアーゼ標準と比較することによって達成される。
【０４６７】
バイオバーデンアッセイ：この手順は、試料に存在するバイオバーデンの量を定量的に（検出可能な場合）決定するために使用される。使用される方法は、試料の半分の２つの膜の各々に対する膜濾過を伴う。膜は、２０〜２５℃及び３０〜３５℃で好気性条件と嫌気性条件とで逐次的にインキュベートされる別々の寒天培地プレート上に置かれる。インキュベーションの終わりに、好気性菌、嫌気性菌、及び真菌の計数が、試料のＣＦＵ／ｍＬとして表される。
【０４６８】
エンドトキシンアッセイ：このアッセイは、細菌性エンドトキシンが試験品に存在するかどうかを決定するために使用される。定量的手順は、速度論的発色法によって実行される。既知の量のエンドトキシンは、細菌性エンドトキシンのレベルの正確な決定のために、試験品と並行して試験される。試験品による干渉の可能性は、試験品及びＬＡＬ試薬に特定のレベルのエンドトキシンをスパイクすることにより検査される。阻害／増強試験に続いて、試験品のエンドトキシン含有量が測定される。
【０４６９】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）：ｑＰＣＲは、ＨＰＬＣクロマトグラムの結果を確認するために使用され得る（リアルタイムＰＣＲまたは逆転写ＰＣＲとも称され、どちらもＲＴ−ＰＣＲと略記される）。ｑＰＣＲは、標準的なＰＣＲ反応でポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を使用し、事前に検証されたプライマーまたはプライマー／プローブアッセイを使用して、複合体試料から標的ＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ反応では、蛍光レポーターを使用して、ＰＣＲの全てのサイクルで増幅されたＤＮＡの生成を測定し、それによってＤＮＡ量の絶対的または相対的な測定値のいずれかを提供する。ＤＮＡが増幅の対数線形段階にある場合、ＰＣＲによって生成される蛍光の量はバックグラウンドを超えて増加する。蛍光が測定可能になる点は、閾値サイクル（ＣＴ）または交差点と呼ばれる。試験試料のＣＴを既知の試料または標準曲線（既知の試料の一連の希釈を使用）と比較することにより、試験試料中のＤＮＡの量を決定することができる。好ましい実施形態では、試料／試験ＤＮＡの量は、宿主細胞の不変または内在遺伝子（例えば、β−アクチンを含むがこれに限定されないハウスキーピング遺伝子）と比較される。
【０４７０】
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）：ｄｄＰＣＲは、ＨＰＬＣクロマトグラムの結果を確認するために使用され得る。ｄｄＰＣＲは、標準的なＰＣＲ反応でＴａｑポリメラーゼを使用し、事前に検証されたプライマーまたはプライマー／プローブアッセイを使用して、複合体試料から標的ＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ反応は、増幅前に数千の個別の反応容器に分割され、データは反応エンドポイントで取得される。ｄｄＰＣＲにより、標準曲線なしでＤＮＡの直接的で独立した定量化がもたらされ、正確で再現性のあるデータを得ることができる。エンドポイント測定により、反応効率に関係なく核酸の定量が可能になる。ｄｄＰＣＲは、様々に汚染された試料からの非常に低い標的定量に使用することができる。
【０４７１】
ＡＡＶ組成物の安定性
本開示の組成物は、−６０℃未満で保管される際に長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、両端を含めて−８０℃〜４０℃の温度（およそのヒトの体温）で保管される際に、長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、両端を含めて−８０℃〜５℃の温度で保管される際に、長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、−８０℃、−２０℃、または５℃で保管される際に、長期安定性を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、−６０℃未満で保管される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、−８０℃、−２０℃、または５℃で保管される。
【０４７２】
本開示の組成物は、−６０℃未満で保管される際に長期安定性を維持するために、最適な表面積対体積比を有する容器に提供され得る。本開示の組成物は、−８０℃、−２０℃、または５℃で保管される際に長期安定性を維持するために、最適な表面積対体積比を有する容器に提供され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、全ての保管要件が考慮されると、表面積対体積比が可能な限り大きな１つ以上の容器に保管される。
【０４７３】
本開示の組成物は、周囲相対湿度で保管される際に、長期安定性を維持する。
【実施例】
【０４７４】
実施例１
精製プロセスの開発
図２３は、モノリス対ビーズクロマトグラフィーの比較を示す。マクロ多孔性カラム（膜及びモノリス）は、ｒＡＡＶウイルスベクターなどの高分子の精製に最適なクロマトグラフィー媒体として登場した。従来のビーズに対するマクロ多孔性技術の利点には、拡散に依存しない標的結合により、結合速度が速くなり、実行時間が短縮されること、より大きなフローチャネルにより、高流量で実行する際に背圧が低下すること、結合部位へのアクセスが良好になり、より高い結合能力が得られること、及び優れた流動特性により、プロセス内体積が減少することが含まれるが、これらに限定されない。従来のビーズ技術はより大きな全体的結合能力を保有するが、有効な結合能力は、細孔排除及び拡散駆動結合に関連する制限に起因して減少する。このため、マクロ多孔性技術は、ｒＡＡＶウイルス粒子の精製にはより優れた方法である。加えて、プロセススケールモノリス技術により、モノリス支持体に固定化された広範な結合化学（膜よりも広範である）が提供される。
【０４７５】
全粒子高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムは、所要時間が短い（２４時間未満）ため、スクリーニング目的に好ましい方法である。この方法は、実験の回収率を決定するための主要なレポートアッセイである。ＨＰＬＣ結果の検証は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）測定値を用いて確認される。
【０４７６】
図６０は、１ｍＬカラムから８０ｍＬカラムへとスケールアップされた例示的なＨＩＣ捕捉ステップを示す。図６０Ａでは、洗浄、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びクリーンインプレイス（ＣＩＰ）画分がｘ軸に示され、吸光度（ｍＡＵ）がｙ軸に示される。画分Ｅ２中のＡＡＶ粒子溶出が図６０Ａ〜Ｂの緑色の囲みで示される。溶出条件に関する感度分析により、これが頑健な単位操作であることが示されている。図６０Ｂは、採取培地、フロースルー、洗浄、溶出画分、及びＣＩＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。画分Ｅ２は緑色の囲みで示される。ｄｄＰＣＲと全粒子ＨＰＬＣ法との間で良好な相関が観察された。この単位操作には、８０％超の回収率が期待された。
【０４７７】
ＨＩＣの捕捉後、ＨＩＣ溶出液にタンパク質性の毛髪様の物質が観察され、これにより、その後のクロマトグラフィーステップ中に持続可能でない圧力上昇が生じた。繊維を保持するために０．４５μｍの酢酸セルロース（ＣＡ）フィルタを使用したが、これにより、ベクターの５０％を喪失した。続いて、フィルタをｒＡＡＶ保持についてスクリーニングして、好適な代替物を探した（図６３）。ＨＩＣ溶出液の濾過のために、０．８／０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）コンビネーションフィルタを選択した。このフィルタを組み入れた後は、最小限の喪失しか観察されなかった。フィルタの選択は、フィルタの回収率と大規模でのフィルタの可用性との両方に基づいた。
【０４７８】
勾配溶出法とアイソクラティック溶出法との両方をＨＩＣステップのために試験した（図６１）。勾配溶出をアイソクラティック溶出に変換することに成功した。いくつかの実施形態では、アイソクラティック溶出は、より頑健な方法であるため、スケールアップに好ましい方法である。しかしながら、アイソクラティック溶出戦略では、溶出種を完全に分割できない場合がある。いくつかの実施形態では、勾配溶出が好ましい。
【０４７９】
ＨＩＣの開発により、中間ＣＥＸ  ＳＯ３-研磨ステップを含む３ステッププロセスの必要性が確認された（図６２）。ＨＩＣ（図６２Ａ）及びＡＥＸ  ＱＡ精製生成物（図６２Ｂ）のＨＩＣステップ中の純度及びその後の純度は不十分であった。中間研磨ステップ（ＣＥＸ陽イオン交換、ＳＯ３−）が必要である。
【０４８０】
図９７Ａは、ＣＥＸ及びＳＯ３カラムマトリックスを使用する例示的な中間研磨ステップのクロマトグラムを示す。ｄｄＰＣＲ法と全粒子ＨＰＬＣ法との間で良好な相関が観察された。この単位操作には、８０％超の回収率が期待された。図９７Ｂは、ｐＨを、ｐＨ３．５、ｐＨ３．６、ｐＨ４．０、及びｐＨ４．０に調整した、４つの異なるＣＥＸ中間研磨ランの画分を含むＡＡＶ粒子を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。試料中に存在する全てのタンパク質バンドを露出させるために、全てのゲルをわずかに過剰に現像した。ｐＨが低い試料には、ｐＨが高い試料よりもわずかに少ない汚染物質（橙色の囲み）が含まれた。最適なｐＨはｐＨ３．６±０．１であった。
【０４８１】
図９８は、２つの例示的なＣＥＸクロマトグラム及び対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、一方はｐＨ４．０（上方）、他方はｐＨ３．５（下方）である。ｐＨ４．０よりもｐＨ３．５の方で、より高い精製が見られた。ＣＥＸ中間研磨ステップを使用すると、純度が適切なレベルまで上昇した。ＤＮＡをフロースルー画分（ＦＴ）で分離させた一方、タンパク質不純物はカラムに保持した。より低いｐＨ（３．５）を使用すると、精製係数が改善した。これは、ＡＡＶ粒子に見られるような等電点の低いタンパク質のカラムへの親和性が増加するためである。
【０４８２】
ｒＡＡＶ粒子を含む例示的なＣＥＸ  ＳＯ３-溶出液のＴＥＭ分析により、粒子の２７．２％がフルであり、粒子の５１．１％が空であるかまたは損傷していることが明らかになった（図９９）。粒子の２１．８％は、フルにも空にも分類できなかった。これらの粒子の表面は均一に明るくなく、いくつかの暗い斑点が存在し、それらは中央に白色の斑点がある灰色の円を呈した。これらの粒子は完全に空ではないと推定した。この材料は、構成された３’ＩＴＲ領域を伴うゲノムプラスミドから生成された。３’ＩＴＲがキャプシド形成に影響を与えた可能性がある。フル粒子と空粒子とを分離するためのさらなる開発作業では、異なる３’ＩＴＲの新しい材料を使用することになる。
【０４８３】
フルピーク及び空ピークの最適な分解能は、ｐＨのＭｇＣｌ２濃度に依存する。ＭＧ２＋は、空粒子とフル粒子との分離を助ける空ＡＡＶ粒子との優先的相互作用を有することが示されている。図１０３Ａは、ＣＥＸ溶出液をＡＥＸ  ＱＡカラム上でｐＨ９．５で実行すること、及びＭｇＣｌ２の濃度を変化させることによって生成されたクロマトグラムの重ね合わせを示す。最も鋭い分離は、０ｍＭ  ｇＣｌ２で見られた（黒色の矢印及び線）。図１０３Ａは、ヒートプロットを示し、ＡＥＸステップでのフル対空の最適な分離が、ｐＨ９．０及び０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で生じることを説明する。高い割合のフル粒子がＡＥＸ  Ｅ３画分中で回収された（図１０５）。ＨＰＬＣによると、Ｅ３溶出液で回収された粒子の推定９６％がフルであり、フル粒子の７８〜８１％がＥ３溶出液で回収された。
【０４８４】
実施例２：ｒＡＡＶ粒子の精製
採取培地からの本開示のｒＡＡＶ粒子の精製を示す例示的なＨＩＣクロマトグラムが図６４Ａに示される。ｒＡＡＶ粒子を含む採取培地を高塩濃度緩衝液で希釈し、結合及び溶出クロマトグラフィーモードを使用して疎水性相互作用（ＯＨ）マトリックスを有する８００ｍＬのＨＩＣモノリス上で実行した。ｒＡＡＶ粒子を、段階的勾配を使用して溶出した。図６４のクロマトグラムは、ｒＡＡＶ粒子が、囲んだＥ２及びＥ３画分中で溶出されることを示す。図６４Ｂは、図６４ＡのＨＩＣステップから回収した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、左から右に、マーカー、採取培地、ロード、フロースルー（ＦＴ）、洗浄（Ｗ）、画分Ｅ１、Ｅ２、２倍希釈したＥ２（Ｅ２．２Ｘ）、Ｅ３、２倍希釈したＥ３（Ｅ３．２Ｘ）、クリーンインプレイスステップ（ＣＩＰ）、及び２倍希釈したＣＩＰ（ＣＩＰ．２Ｘ）を示す。Ｅ２及びＥ２．２Ｘは、ｒＡＡＶ粒子を含み、囲んである。
【０４８５】
図６５Ａは、Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５画分でｒＡＡＶ粒子が溶出した例示的なＨＩＣクロマトグラムを示す。全粒子の収率は、ＨＰＬＣ及びｄｄＰＣＲで見られるように、Ｅ３画分で最も高かった（図６５Ｂ）。図６６Ｂは、画分Ｅ３、Ｅ４、及びＥ５からのｒＡＡＶ粒子の透過電子顕微鏡写真を示す。主要なピーク（Ｅ３）では、ｒＡＡＶベクターは均一に配置されており、大部分はフルキャプシドである。凝集や損傷粒子は多くない。フルキャプシド、凝集、及び損傷粒子の割合の両方の観点からの製品の品質は、その後の各画分で低下した。
【０４８６】
図１００Ａは、ＣＥＸを使用してＨＩＣ溶出液から精製したｒＡＡＶ粒子の例示的なクロマトグラムを示す。大部分のｒＡＡＶ粒子は、囲んだ画分Ｅ２で溶出する。図１００ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。左から右に、ＨＩＣ−２０中性、ＬＯＡＤ−ＢＦ、ＬＯＡＤ、フロースルー＋洗浄（ＦＴ＋Ｗ）、画分Ｅ１、２倍希釈したＥ２（Ｅ２．２Ｘ）、１０倍希釈したＥ２（Ｅ２．１０Ｘ）、Ｅ３、ＣＩＰ、ＣＩＰ．２Ｘ、及びマーカーをロードする。ｒＡＡＶ粒子はＥ２．２Ｘ及びＥ２．１０Ｘに存在し、これらを囲んである。
【０４８７】
図１０４Ａは、ＣＥＸ溶出液のさらなる精製の例示的なＡＥＸクロマトグラムを示す。フルｒＡＡＶ粒子を、囲んであるＥ３画分で富化する。フル粒子の富化は、粒子の電荷に基づいてフル粒子と空粒子とを分離することによって達成される。フル粒子は、ＤＮＡゲノムの存在に起因して、空粒子よりも極めてわずかにより負に帯電する。分離は、血清型ＡＡＶ８粒子のための緩衝液からＭｇＣｌ２を除去することによってさらに増強することができる。図１０４Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる純度を示す。レーンは、左から右に、マーカー、ＳＱ３  １３  Ｅ２  １０×、ＱＡ２  ＬＯＡＤ、ＱＡ２  ＦＴ＋Ｗ、画分ＱＡ２  Ｅ１、ＱＡ２  Ｅ２、ＱＡ２  Ｅ３、ＱＡ２  Ｅ４、ＱＡ２  Ｅ５、ＱＡ２  Ｅ６、ＢＬＡＮＫ、及びＱＡ２  ＣＩＰを示す。図１０４Ａのクロマトグラムからの画分ＱＡ２  Ｅ３の透過電子顕微鏡写真は、Ｅ３画分中のＡＡＶ粒子の回収を示す（図１０６Ａ）。２０９０個のフル粒子及び空粒子を計数すると、７７％がフルであり、２３％が空または損傷であった（図１０６Ｃ）。力価を液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定すると、画分Ｅ３は、力価が３．１×１０＾１１ｃ／ｍＬ、体積が４．５３ｍＬ、ベクターゲノムが１．４×１０＾１２であった。カラムにロードした投入試料からの回収率は６０％であり、最初の出発材料からの回収率は２９％であった（図１０６Ｂ）。
【０４８８】
プロセスの推定プロセス回収率を図１０７に示す。３段階クロマトグラフィープロセスで期待される総収率は４０〜６５％である。これは、従来の超遠心分離ベースのプロセスよりも優れている。
【０４８９】
実施例３：ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ製造プロセスの説明−上流の一次採取単位操作−ＰＤ−ＵＳＰ−００１
Ｘ連鎖網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）は、網膜色素変性症（ＲＰ）の非常に重篤な型であり、急速な疾患の進行及び重篤な網膜機能障害を引き起こす。ＸＬＲＰの世界的な有病率は約１：３０，０００〜１：４０，０００である（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＸＬＲＰの患者は、典型的には、最初の１０年間に夜盲症の発症を経験し、その後、視野及び視力が低下し、次第に重篤な視力障害が生じる。ほとんどの患者は、４０年の終わりまでに法的に盲目である。
【０４９０】
現在までに、ＲＰ２、ＲＰ  ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子としても知られているＲＰ３、及びＸＬＲＰの稀な原因として特定されているＯＦＤ１という３つの遺伝子がＸＬＲＰにマッピングされている（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＸＬＲＰの症例のおよそ７５％はＲＰＧＲ変異体によるものであり、ＲＰＧＲ変異体によるＸＬＲＰの世界的な有病率は、約１：４０，０００〜１：５３，０００である（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＰＧＲは、光受容体のタンパク質分布に関与し、結合繊毛をわたる光情報伝達成分及び他の外節タンパク質の輸送において役割を果たす（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。光受容体の生存に不可欠なＲＰＧＲ遺伝子生成物は、桿体光受容体の外節に局在する（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。網膜のＲＰＧＲ機能が失われると、桿体視及び錐体視が徐々に失われる。
【０４９１】
Ｎｉｇｈｔｓｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、ＲＰＧＲの突然変異に起因するＸＬＲＰの治療のための見込みある遺伝子治療医薬品（ＧＴＭＰ）としてＡＡＶ８−ＲＰＧＲを開発している。ＸＬＲＰ患者の欠損したＲＰＧＲを新しく生存能力のあるＲＰＧＲに置き換えると、網膜変性が遅延または停止し、視覚機能が維持または改善されることが期待される。
【０４９２】
この文書では、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生成物の製造に使用される上流の一次採取プロセスについて説明する。この文書には、全ての上流の一次採取処理ステップが含まれる。
【０４９３】
製造プロセスの説明及びプロセス制御
【０４９４】
バッチ定義
【０４９５】
生成物のバッチは、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生物学的製剤を生成するプラスミドＤＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を含む２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器からなる単一の生成キャンペーンとして定義される。細胞培養培地は、２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６−ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器から採取されプールされた後、単回の精製プロセスにかけられる。
【０４９６】
上流プロセスの概要
【０４９７】
Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ及びスタックを使用して細胞を拡大し、ベクター生産用に２０個のＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットに播種するのに十分な細胞量を生成させる。細胞のトランスフェクションは、最適化されたリン酸カルシウム共沈法を使用する２生産プラスミドシステムを用いて行われる。
【０４９８】
トランスフェクション後、培地を交換し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼを培地に添加して、培地に存在する遊離したゲノム及びプラスミドＤＮＡを消化する。培地へのベクターの放出を促進するために、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットにＨＥＰＥＳ緩衝Ｎａ２ＨＰＯ４溶液をスパイクし、採取の前にインキュベートする。各３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）からの培地を、使い捨てバイオプロセス袋を使用して無菌状態で採取し、単一体積（約８２Ｌ）にプールする。
【０４９９】
次に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むプールした培地を、カプセル０．６５μｍ孔プレフィルタ、続いて０．２μｍ無菌グレードカプセルフィルタを使用して清澄化する。
【０５００】
製造フロー図
【０５０１】
ＡＡＶ８−ＲＰＧＲの製造プロセスの上流の一次回収ステップの概要は、現在のプロセス制御及び実行したＱＣ／分析試験の概要と併せて図２２に示されている。
【０５０２】
上流製造プロセスの説明
【０５０３】
バイアル解凍
【０５０４】
ＨＥＫ２９３  ＭＣＢからのバイアルを、−１５０℃の保管場所から取り出した後、３７±１℃の温度に設定した水槽で解凍する。目視確認を行って、細胞が解凍されていることを確認する。ＷＣＢは、あらゆる今後の生産ランに使用されることが見込まれる。
【０５０５】
解凍した細胞を、３７±１℃に予熱した４ｍＬの清澄培地（ＤＭＥＭ＋１０％血清）を含むＴ−２５フラスコに加える。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した加湿ＣＯ２インキュベーターに入れ、一晩放置する。図２７は、細胞解凍ステップのフロー図を示す。図２８には、細胞解凍手順中に順守すべきパラメータ及び動作条件が含まれる。図２９には、細胞解凍プロセスに必要な主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。
【０５０６】
細胞の拡大
【０５０７】
細胞を、一連の継代をとおして最初のＴ−２５フラスコから３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットに拡大させる。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した加湿インキュベーター中で成長させる。細胞集密度が８０％に達したら、細胞を継代する。これは、典型的には３〜５日ごとである。
【０５０８】
一般的な継代プロトコルは、以下からなる。
培地を現在の細胞フラスコ／スタックから取り出す。
−予熱したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を使用して細胞を洗浄する。
−予熱した細胞の１倍解離溶液を加え、溶液を旋回させて細胞表面が覆われていることを確実にする。余分な細胞解離溶液を除去する。
−細胞フラスコ／スタックをさらに３〜５分間インキュベートする。慎重に手でタッピングすることで細胞を取り外す。
−細胞を除去するのに役立つ増殖培地をさらに加える。
−細胞を中間保管容器に移す。
−細胞懸濁液を新しい予熱した成長培地と組み合わせる
−新しい細胞フラスコ／スタックに播種する。
−細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
図３０は、一般的な継代手順の高レベルの要約を提供し、図３１は、細胞継代の一般的な基準を詳述する。図３２には、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットまでの可能な各細胞培養容器についての継代に関連する推奨体積及び播種密度が含まれる。図３３には、推奨最小加温時間が含まれる。図３４には、細胞解凍及び慣習的継代ステップに必要な主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。細胞をおよそ３０代二次培養することが推奨される。細胞の有用な継代限界が迫ったら、古い細胞を廃棄する前に新しいバイアルを解凍すべきである。
【０５０９】
一過性トランスフェクション、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）添加、培地解放、及び採取
【０５１０】
播種後３日間の増殖後、ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）培地を血清及びクロロキンを含む新鮮なＤＭＥＭ培地で置き換える。これは、トランスフェクションの２〜８時間前に行われる。次に、最適化したリン酸カルシウム共沈法を使用して、細胞を２つの生産プラスミドでトランスフェクトする。
【０５１１】
５×３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）をトランスフェクトするのに十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション沈殿物を生物学的安全キャビネット中で調製する。まず、ＤＮＡ／カルシウム混合物を、ベクタープラスミド、ｐＤＰ８．ａｐｅヘルパープラスミド、及びＣａＣｌ２を含むように調製する。よく混合した後、プラスミド／ＣａＣｌ２溶液を、使い捨てプロセス袋中で同時に穏やかにかき混ぜながら等量の２倍ＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＨＰＯ４に加えて、最適な沈殿物を得る。溶液を室温で少なくとも５分間静置した後、マニホールドに連結した５つの５  ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）に加える。この手順を４回繰り返して、必要な２０個のＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットのトランスフェクションを完了する。
【０５１２】
トランスフェクション後、細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションのおよそ２２時間後、無血清ＤＭＥＭを使用して培地を交換する。このとき、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼを９０Ｕ／ｍＬの濃度で培地に添加して、培地に存在する遊離したゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを消化する。このステップは、最終ベクター生成物中の残存宿主細胞ＤＮＡの量を最小にするために行うものである。次に、細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でさらに６９〜７５時間インキュベートする。ベクターの放出を促進するために、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）にＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＨＰＯ４溶液をスパイクし、採取の前に３９℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でおよそ１８時間インキュベートする。各３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）からの培地を、使い捨てバイオプロセス袋を使用して無菌状態で採取し、単一体積（約８２Ｌ）にプールする。図１８２は、一過性トランスフェクション及び培地採取ステップのフロー図を示す。図１８３には、細胞培養ユニットあたりのクロロキンの体積が含まれ、図１８４は、トランスフェクション及び採取ステップの操作範囲を詳述する。図１８５には、トランスフェクションプロセスに使用する主要な消耗品及び材料の詳細が含まれる。
【０５１３】
濾過による清澄化
【０５１４】
次に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むプールした培地を、カプセルプレフィルタ、続いて無菌グレードカプセルフィルタをとおして清澄化する。第２の予備プレフィルタを濾過セットアップの一部として設置し、これは、第１のプレフィルタの使用中に入口圧力が１０ｐｓｉに達した場合に使用される。プレフィルタは、孔径０．６５μｍであり、ガラス繊維で構成される。バイオバーデン低減フィルタは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）で構成された０．２μｍの無菌グレードフィルタである。最大限の回収率を達成するために、製品濾過後、フィルタを無菌状態で吹き落とし、緩衝液で追う。図１８６は、濾過清澄化ステップのフロー図を示す。図１８７には、濾過清澄化単位操作のための操作パラメータが含まれる。図１８８は、清澄化濾過ステップに使用する主要な材料／消耗品を示す。
【０５１５】
溶液調製用の好ましい化学物質
【０５１６】
可能な限り、公定または複数公定の化学物質を使用すべきである。図２０８は、プロセスで使用した好ましい化学物質及び関連するグレードの一覧を提供する。
【０５１７】
実施例４：ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ製造プロセスの説明−上流の一次採取単位操作−ＰＤ−ＵＳＰ−００２
Ｘ連鎖網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）は、網膜色素変性症（ＲＰ）の非常に重篤な型であり、急速な疾患の進行及び重篤な網膜機能障害を引き起こす。ＸＬＲＰの世界的な有病率は約１：３０，０００〜１：４０，０００である（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＸＬＲＰの患者は、典型的には、最初の１０年間に夜盲症の発症を経験し、その後、視野及び視力が低下し、次第に重篤な視力障害が生じる。ほとんどの患者は、４０年の終わりまでに法的に盲目である。
【０５１８】
現在までに、ＲＰ２、ＲＰ  ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子としても知られているＲＰ３、及びＸＬＲＰの稀な原因として特定されているＯＦＤ１という３つの遺伝子がＸＬＲＰにマッピングされている（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＸＬＲＰの症例のおよそ７５％はＲＰＧＲ変異体によるものであり、ＲＰＧＲ変異体によるＸＬＲＰの世界的な有病率は、約１：４０，０００〜１：５３，０００である（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＰＧＲは、光受容体のタンパク質分布に関与し、結合繊毛をわたる光情報伝達成分及び他の外節タンパク質の輸送において役割を果たす（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。光受容体の生存に不可欠なＲＰＧＲ遺伝子生成物は、桿体光受容体の外節に局在する（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。網膜のＲＰＧＲ機能が失われると、桿体視及び錐体視が徐々に失われる。
【０５１９】
Ｎｉｇｈｔｓｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、ＲＰＧＲの突然変異に起因するＸＬＲＰの治療のための見込みある遺伝子治療医薬品（ＧＴＭＰ）としてＡＡＶ８−ＲＰＧＲを開発している。ＸＬＲＰ患者の欠損したＲＰＧＲを新しく生存能力のあるＲＰＧＲに置き換えると、網膜変性が遅延または停止し、視覚機能が維持または改善されることが期待される。
【０５２０】
この文書では、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生成物の製造に使用される上流の一次採取プロセスについて説明する。この文書には、全ての上流の一次採取処理ステップが含まれる。
【０５２１】
製造プロセスの説明及びプロセス制御
【０５２２】
バッチ定義
【０５２３】
生成物のバッチは、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生物学的製剤を生成するプラスミドＤＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を含む２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器からなる単一の生成キャンペーンとして定義される。細胞培養培地は、２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６−ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器から採取されプールされた後、単回の精製プロセスにかけられる。
【０５２４】
上流プロセスの概要
【０５２５】
Ｃｏｒｎｉｎｇフラスコ及びスタックを使用して細胞を拡大し、ベクター生産用に２０個のＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットに播種するのに十分な細胞量を生成させる。細胞のトランスフェクションは、最適化されたリン酸カルシウムまたはＰＥＩｐｒｏ（登録商標）媒介法のいずれかを使用する３生産プラスミドシステムを用いて行われる。
【０５２６】
トランスフェクション後、培地を交換し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼを培地に添加して、培地に存在する遊離したゲノム及びプラスミドＤＮＡを消化する。培地へのベクターの放出を促進するために、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットにＨＥＰＥＳ緩衝Ｎａ２ＨＰＯ４溶液をスパイクし、採取の前にインキュベートする。各３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）からの培地を、使い捨てバイオプロセス袋を使用して無菌状態で採取し、単一体積（約８２Ｌ）にプールする。
【０５２７】
次に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むプールした培地を、カプセル０．６５μｍ孔プレフィルタ、続いて０．２μｍ無菌グレードカプセルフィルタを使用して清澄化する。
【０５２８】
製造フロー図
【０５２９】
ＡＡＶ８−ＲＰＧＲの製造プロセスの上流の一次回収ステップの概要は、現在のプロセス制御及び実行したＱＣ／分析試験の概要と併せて図４４に示されている。
【０５３０】
上流製造プロセスの説明
【０５３１】
バイアル解凍
【０５３２】
ＨＥＫ２９３  ＭＣＢからのバイアルを、−１５０℃の保管場所から取り出した後、３７±１℃の温度に設定した水槽で解凍する。目視確認を行って、細胞が解凍されていることを確認する。ＷＣＢは、あらゆる今後の生産ランに使用されることが見込まれる。
【０５３３】
解凍した細胞を、３７±１℃に予熱した４ｍＬの清澄培地（ＤＭＥＭ＋１０％血清）を含むＴ−２５フラスコに加える。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した加湿ＣＯ２インキュベーターに入れ、一晩放置する。図４５は、細胞解凍ステップのフロー図を示す。図４６には、細胞解凍手順中に順守すべきパラメータ及び動作条件が含まれる。図４７には、細胞解凍プロセスに必要な主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。
【０５３４】
細胞の拡大
【０５３５】
細胞を、一連の継代をとおして最初のＴ−２５フラスコから３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットに拡大させる。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した加湿インキュベーター中で成長させる。細胞集密度が８０％に達したら、細胞を継代する。これは、典型的には３〜５日ごとである。
【０５３６】
一般的な継代プロトコルは、以下からなる。
−培地を現在の細胞フラスコ／スタックから取り出す。
−予熱したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を使用して細胞を洗浄する。
−予熱した細胞の１倍解離溶液を加え、溶液を旋回させて細胞表面が覆われていることを確実にする。余分な細胞解離溶液を除去する。
−細胞フラスコ／スタックをさらに３〜５分間インキュベートする。慎重に手でタッピングすることで細胞を取り外す。
−細胞を除去するのに役立つ増殖培地をさらに加える。
−細胞を中間保管容器に移す。
−細胞懸濁液を新しい予熱した成長培地と組み合わせる
−新しい細胞フラスコ／スタックに播種する。
−細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０５３７】
図１７８は、一般的な継代手順の高レベルの要約を提供し、図１７９は、細胞継代の一般的な基準を詳述する。図１８０には、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットまでの可能な各細胞培養容器についての継代に関連する推奨体積及び播種密度が含まれる。図１７６には、推奨最小加温時間が含まれる。図１８１には、細胞解凍及び慣習的継代ステップに必要な主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。細胞をおよそ３０代二次培養することが推奨される。細胞の有用な継代限界が迫ったら、古い細胞を廃棄する前に新しいバイアルを解凍すべきである。
【０５３８】
一過性トランスフェクション、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）添加、培地解放、及び採取
【０５３９】
播種後３日間の増殖後、ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）培地を血清及びクロロキン（クロロキンはリン酸カルシウムトランスフェクション法にのみ必要）を含む新鮮なＤＭＥＭ培地で置き換える。これは、トランスフェクションの２〜８時間前に行われる。次に、最適化したリン酸カルシウムまたはＰＥＩｐｒｏ（登録商標）媒介方法のいずれかを使用して、細胞を３つの生産プラスミドでトランスフェクトする。
【０５４０】
５×３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）をトランスフェクトするのに十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション沈殿物を生物学的安全キャビネット中で調製する。リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはＰＥＩｐｒｏ（登録商標）を使用するトランスフェクションのいずれかを行う選択肢がある。プロセスの説明のこのセクションでは、両方の方法について説明する。手順の多くは２つの方法で共通するが、違いがある場合には、どちらのトランスフェクション方法について考察されているかについて明確な指示を付与する。
【０５４１】
リン酸カルシウム特異的トランスフェクション
【０５４２】
まず、ＤＮＡ／カルシウム混合物を、導入遺伝子プラスミド、ＡＶヘルパープラスミド、キャプシドプラスミド、及びＣａＣｌ２を含むように調製する。よく混合した後、プラスミド／ＣａＣｌ２溶液を、使い捨てプロセス袋中で同時に穏やかにかき混ぜながら等量の２倍ＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＨＰＯ４に加えて、最適な沈殿物を得る。溶液を室温で少なくとも５分間静置した後、マニホールドに連結した５つのＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）に加える。この手順を４回繰り返して、２０個のＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットのトランスフェクションを完了する。
【０５４３】
ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）特異的トランスフェクション
【０５４４】
導入遺伝子プラスミド、ＡＶヘルパープラスミド、及びキャプシドプラスミドＤＮＡを無血清培地で希釈し、穏やかに撹拌する。希釈したＰＥＩｐｒｏ（登録商標）を一度にＤＮＡ溶液に加える。次に、得られた溶液を穏やかにかき混ぜ、室温に平衡化するまで放置する。次に、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）／ＤＮＡ複合体溶液を、マニホールドに連結した５つのＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）に加える。この手順を４回繰り返して、２０個のＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）ユニットのトランスフェクションを完了する。
【０５４５】
トランスフェクション後、細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でインキュベートする。トランスフェクションのおよそ２２時間後、無血清ＤＭＥＭを使用して培地を交換する。このとき、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼを９０Ｕ／ｍＬの濃度で培地に添加して、培地に存在する遊離したゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを消化する。このステップは、最終ベクター生成物中の残存宿主細胞ＤＮＡの量を最小にするために行うものである。次に、細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でさらに６９〜７５時間インキュベートする。ベクターの放出を促進するために、３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）にＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＨＰＯ４溶液をスパイクし、採取の前に３９℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中でおよそ１８時間インキュベートする。各３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）からの培地を、使い捨てバイオプロセス袋を使用して無菌状態で採取し、単一体積（約８２Ｌ）にプールする。図１０は、一過性トランスフェクション及び培地採取ステップのフロー図を示す。図１８３には、細胞培養ユニットあたりのクロロキンの体積が含まれ、図１８４は、トランスフェクション及び採取ステップの操作範囲を詳述する。トランスフェクションを作成するための具体的な指針は、リン酸カルシウムトランスフェクション法及びＰＥＩｐｒｏ（登録商標）トランスフェクション法について、それぞれ、図１１及び図１２に含まれる。ＰＥＩ：ＤＮＡ比の比は、図１２において２：１の比として付与されるが、他の比、例えば、１：１〜４：１の範囲の比を使用することが許容される。図１６には、リン酸カルシウムトランスフェクションプロセスに使用する主要な消耗品及び材料の詳細が含まれる。図１７には、ＰＥＩトランスフェクションプロセスに使用する主要な消耗品及び材料の詳細が含まれる。
【０５４６】
濾過による清澄化
【０５４７】
次に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むプールした培地を、カプセルプレフィルタ、続いて無菌グレードカプセルフィルタをとおして清澄化する。第２の予備プレフィルタを濾過セットアップの一部として設置し、これは、第１のプレフィルタの使用中に入口圧力が１０ｐｓｉに達した場合に使用される。プレフィルタは、孔径０．６５μｍであり、ガラス繊維で構成される。バイオバーデン低減フィルタは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）で構成された０．２μｍの無菌グレードフィルタである。最大限の回収率を達成するために、製品濾過後、フィルタを無菌状態で吹き落とし、緩衝液で追う。図１８６は、濾過清澄化ステップのフロー図を示す。図１８７には、濾過清澄化単位操作のための操作パラメータが含まれる。図１８８は、清澄化濾過ステップに使用する主要な材料／消耗品を示す。
【０５４８】
溶液調製用の好ましい化学物質
【０５４９】
可能な限り、公定または複数公定の化学物質を使用すべきである。図２０８は、プロセスで使用した好ましい化学物質及び関連するグレードの一覧を提供する。
【０５５０】
実施例５：ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ製造プロセスの説明−下流の充填及び仕上げ単位操作
Ｘ連鎖網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）は、網膜色素変性症（ＲＰ）の非常に重篤な型であり、急速な疾患の進行及び重篤な網膜機能障害を引き起こす。ＸＬＲＰの世界的な有病率は約１：３０，０００〜１：４０，０００である（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＸＬＲＰの患者は、典型的には、最初の１０年間に夜盲症の発症を経験し、その後、視野及び視力が低下し、次第に重篤な視力障害が生じる。ほとんどの患者は、４０年の終わりまでに法的に盲目である。
【０５５１】
現在までに、ＲＰ２、ＲＰ  ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子としても知られているＲＰ３、及びＸＬＲＰの稀な原因として特定されているＯＦＤ１という３つの遺伝子がＸＬＲＰにマッピングされている（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＸＬＲＰの症例のおよそ７５％はＲＰＧＲ変異体によるものであり、ＲＰＧＲ変異体によるＸＬＲＰの世界的な有病率は、約１：４０，０００〜１：５３，０００である（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＲＰＧＲは、光受容体のタンパク質分布に関与し、結合繊毛をわたる光情報伝達成分及び他の外節タンパク質の輸送において役割を果たす（Ｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。光受容体の生存に不可欠なＲＰＧＲ遺伝子生成物は、桿体光受容体の外節に局在する（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。網膜のＲＰＧＲ機能が失われると、桿体視及び錐体視が徐々に失われる。
【０５５２】
Ｎｉｇｈｔｓｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、ＲＰＧＲの突然変異に起因するＸＬＲＰの治療のための見込みある遺伝子治療医薬品（ＧＴＭＰ）としてＡＡＶ８−ＲＰＧＲを開発している。ＸＬＲＰ患者の欠損したＲＰＧＲを新しく生存能力のあるＲＰＧＲに置き換えると、網膜変性が遅延または停止し、視覚機能が改善されることが期待される。
【０５５３】
この文書では、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生成物の製造に使用される上流の一次採取プロセスについて説明する。この文書には、全ての下流の一次充填及び仕上げ処理ステップが含まれる。
【０５５４】
製造プロセスの説明及びプロセス制御
【０５５５】
バッチ定義
【０５５６】
生成物のバッチは、ＡＡＶ８  ＲＰＧＲ生物学的製剤を生成するプラスミドＤＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を含む２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６スタックＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器からなる単一の生成キャンペーンとして定義される。細胞培養培地は、２０個のＣｏｒｎｉｎｇ  ３６−ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋ（登録商標）容器から採取されプールされた後、単回の精製プロセスにかけられる。
【０５５７】
下流プロセスの概要
【０５５８】
プロセス流の清澄化後、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップを使用して、製品の１００倍体積濃度係数を実行し、続いてＴＭＮ５００Ｔ緩衝液への透析濾過ステップを行う。このステップでは、１００ｋＤＡの修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）膜を用いる。
【０５５９】
ＴＦＦ濃縮培地を、不連続イオジキサノール勾配を使用してさらに精製する。このステップは、ＤＮＡを含むｒＡＡＶ粒子の調製を強化する働きをする一方で、これらの粒子の示差的浮遊密度に基づいて、ＤＮＡを含まないｒＡＡＶ粒子（空粒子）の大部分を除去する。スループットを最大化するために、プロセスを２つの勾配ステップで完了する。
【０５６０】
イオジキサノール画分をセファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラムでさらに精製する。これは、正に帯電したＡＡＶベクターを捕捉しながら、他の残留不純物及びイオジキサノールをプロセス流から除去する、陽イオン交換ステップである。
【０５６１】
最終ベクター濃度及び透析濾過を、１００ｋＤａのＴＦＦ  ｍＰＥＳ膜を使用して達成する。生成物を最終製剤緩衝液（ｐＨ  ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ）に透析濾過する。最終製剤化の前に、ｑＰＣＲ法を使用してプロセス内試料をベクター回収率について分析し、ベクター力価及びＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）の収率を決定する。このデータを使用して、最終目標力価を達成するために必要な最終量を推定する。賦形剤ポロキサマー１８８を、０．００１％（ｖ／ｖ）の最終濃度でプロセス流に手で加える。最終製剤化の後、生成物を０．２２μｍフィルタをとおして最後に無菌濾過して、精製バルク原薬（ＰＢＤＳ）を得る。ＰＢＤＳを充填すると、プロセスが完了となり、最終製剤（ＦＤＰ）が得られる。放出試験をＰＢＤＳとＦＤＰとの両方に行う。
【０５６２】
製造フロー図
【０５６３】
ＡＡＶ８−ＲＰＧＲの製造プロセスの下流の充填及び仕上げステップの概要は、現在のプロセス制御及び製造全体で実行したＱＣ／分析試験の概要と併せて図６３に示されている。
【０５６４】
下流製造プロセスの説明
【０５６５】
大規模タンジェンシャルフロー濾過
【０５６６】
ＳＳＳ（塩及び界面活性剤溶液）を、１部ＳＳＳ緩衝液を９部の清澄化培地に対して使用して清澄化採取物に加える。ＳＳＳ緩衝液の添加は、清澄化培地でのタンパク質の溶解度を維持するために行う。１００ｋＤＡ  ｍＰＥＳ中空繊維膜を利用して、生成物の１００倍体積濃縮を実行する。濃縮後、４回の透析濾過を続け、これにより生成物をＴＭＮ５００Ｔ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）に緩衝液交換する。透析濾過ステップの後に最終濃縮を行い、目標体積濃度係数に到達させる。図１８９は、ＴＦＦステップのステップ概要を提供する。図１９０は、大規模ＴＦＦランに使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を列挙する。図１９１には、大規模タンジェンシャルフロー濾過単位操作に使用される主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。
【０５６７】
追加コメント−最終濃縮ステップ中にフローループに空気が入ると生成物の泡立ちが引き起こされるので、空気が入らないように注意すること。
【０５６８】
最初のイオジキサノール濃縮
【０５６９】
後続のイオジキサノール勾配ステップで処理されることになる体積を低減するために、最初の超遠心分離濃縮ステップを行う。イオジキサノール勾配分離の体積スループットが制限されるため、体積の低減が必要である。
【０５７０】
前のＴＦＦステップからの生成物を、３２ｍＬの体積に等分し、遠心分離チューブに入れる。１倍ＴＭＮＫ緩衝液を使用して、最後の遠心分離チューブが３２ｍＬ未満である可能性が高い場合にそれに補充することができる。３ｍＬの５７％イオジキサノール溶液の単層を、各生成物含有チューブの下に置く。遠心分離チューブを遠心分離機にロードし、４℃の温度を用いて６５，０００ｒｐｍで３０分間回転させる。必要に応じて遠心分離を繰り返し、生成物流全体を処理する。５７％イオジキサノールバンド全体を、１ｍＬの５７％界面と一緒に採取する。次に、採取した生成物を１倍ＴＭＮＫ緩衝液で希釈する。図１９２は、イオジキサノール濃縮ステップの例としての要約を提供する。図１９３は、遠心分離濃縮ステップに用いられるパラメータ及び定値を詳述する。遠心分離濃縮ステップで使用される主要な材料及び消耗品は、図１９４に示される。
【０５７１】
追加のコメント
−「Ｌｇ  ＴＦＦ濃縮」プール試料を超遠心分離チューブの底に移すときは、気泡や発泡が生じないようにすること。
−相の不要な混合を避けるために、５７％下敷はゆっくりと加えること。
−採取時には、遠心分離チューブの上部を穿刺して、生成物を収集するときに真空が形成されないようにすること。
【０５７２】
イオジキサノール勾配精製
【０５７３】
遠心分離濃縮培地を、不連続イオジキサノール勾配を使用してさらに精製する。このステップは、ＤＮＡを含むｒＡＡＶ粒子の調製を強化する働きをする一方で、超遠心分離に続くイオジキサノール勾配培地におけるこれらの粒子の示差的浮遊密度に基づいて、ＤＮＡを含まないｒＡＡＶ粒子（空粒子）の大部分を除去する。不連続勾配は、２５、４０、及び５７％のイオジキサノール相で形成される。遠心分離後、４０／５７％界面の直下からＤＮＡ富化ベクターを採取する。空粒子の大部分は２５／４０％界面に含まれる。採取しプールしたベクターは、ＡＡＶベクターの凝集を防ぐために１倍ＴＭＮＫ緩衝液中で希釈する。図１９５は、イオジキサノール勾配精製ステップを完了するために必要なステップのグラフによる概要を提供する。図１９６は、イオジキサノール勾配に使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を列挙し、一方で図１９７には、関連する主要な材料及び消耗品が含まれる。
【０５７４】
追加のコメント
−イオジキサノールバンドを加えることを移すときは、気泡や発泡が生じないようにすること。
−相の不要な混合を避けるために、イオジキサノールはゆっくりと加えること。
−採取時には、遠心分離チューブの上部を穿刺して、生成物を収集するときに真空が形成されないようにすること。
【０５７５】
陽イオン交換クロマトグラフィー
【０５７６】
イオジキサノール採取画分は、イオジキサノールを含む残留汚染物質を除去するのに役立つ陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム上で精製する。
【０５７７】
イオジキサノールプールは、最初に希釈緩衝液を使用して７倍に希釈する（６：１比−希釈緩衝液対イオジキサノールプール）。次に、ＷＦＩを使用して２倍に希釈する（１：１比−ＷＦＩ対希釈イオジキサノールプール）。伝導度を減少させ、試料のｐＨを低下させることにより、ベクターを陽イオン交換カラムに結合させるには、イオジキサノールプールの希釈が必要である。
【０５７８】
１４倍に完全に希釈されたイオジキサノールプールは、ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ樹脂を利用する陽イオン交換ステップの負荷となる。ベクターの結合を低伝導度及び低ｐＨのクエン酸ベースの緩衝液中で行い、高塩濃度緩衝液を使用して溶出を達成する。次に、溶出ピークを含むベクターをＡＭＰＤ緩衝液で希釈し（１：９比−ＡＭＰＤ緩衝液対ＣＥＸ溶出液）、その後、後続処理の前に２〜８℃で保管する。ＣＥＸ単位操作の概要が図１９８に例解され、一方、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの完全な動作パラメータが図１９９及び図２００に含まれる。ＣＥＸステップの首尾よい実施に必要な主要な材料及び消耗品が、それらの関連する詳細と共に図２０１に列挙される。
【０５７９】
小規模タンジェンシャルフロー濾過及び賦形剤の添加
【０５８０】
最終ベクター製剤化を、１００ｋＤａのＴＦＦ  ｍＰＥＳ膜を使用して達成する。最終製剤化の前に、ｑＰＣＲ法を使用してプロセス内試料をベクター回収率について分析し、ベクター力価及びＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）の収率を決定する。このデータを使用して、最終目標力価を達成するために必要な最終量を推定する。生成物を最終製剤緩衝液（ｐＨ  ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ）に透析濾過する。賦形剤ポロキサマー１８８を、０．００１％（ｖ／ｖ）の最終濃度で手で加える。図２０２は、小規模タンジェンシャルフロー濾過ステップを完了するために必要なステップのグラフによる概要を提供する。図２０３は、小規模ＴＦＦランに使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を列挙する。図２０４には、小規模タンジェンシャルフロー濾過単位操作に使用される主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。
【０５８１】
無菌濾過及びとバイアル作成
【０５８２】
最終製剤化の後、最終力価を決定し、続いて生成物を０．２２μｍフィルタをとおして最後に無菌濾過して、精製バルク原薬（ＰＢＤＳ）を得る。ＰＢＤＳを無菌チューブに充填し、その時点で生成物が最終製剤（ＦＤＰ）になる。ＦＤＰは、検査の後、−６０°Ｃ未満で保管する。図２０４は、無菌濾過及び充填単位操作のフロー図を示す。図２０５は、無菌濾過及び充填操作に使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を列挙する。図２０６には、無菌濾過及び充填ステップに使用される主要な材料及び消耗品の詳細が含まれる。
【０５８３】
プロセス内保持条件
【０５８４】
図２０７には、ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ生成物の製造中に使用したプロセス内ポイントでの保持時間の詳細が含まれる。プロセス内保持時間は、より多くの情報が利用可能につれ、最新のデータを反映するように精緻化されることになる。
【０５８５】
溶液調製用の好ましい化学物質
【０５８６】
可能な限り、公定または複数公定の化学物質を使用すべきである。図２０８は、プロセスで使用した好ましい化学物質及び関連するグレードの一覧を提供する。
【０５８７】
実施例６：ＡＡＶ８−ＲＰＧＲ産生のための下流プロセス
本プロジェクトの目的は、ｒＡＡＶ８  ＲＰＧＲ後期臨床及び商業プログラムのための産業用クロマトグラフィー下流プロセス（ＤＳＰ）を開発することであった。本プロジェクトには、マクロ多孔性ＯＨ、ＳＯ３、及びＱＡカラムを使用する空−フル（Ｅ／Ｆ）ＡＡＶ８キャプシドの捕捉、中間研磨、及び分離、ならびにクライアント側のプロトコルに続くタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）という、開発された全てのステップが含まれた。開発は、リン酸カルシウムをトランスフェクション剤として使用した清澄化された採取材料に基づいた。
【０５８８】
材及び方法
【０５８９】
試料
【０５９０】
試料を、清澄化したＤＭＥＭ培地中で配合した。２つの異なる実験ランである実験Ａ及び実験Ｂを、異なる日に実施した。図２１０には、実験Ａの試料詳細が含まれる。図２３４には、実験Ｂの試料詳細が含まれる。
【０５９１】
ＦＰＬＣシステム（分取ラン）
ＦＰＬＣ２：
−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００、ＵＶフローセル２ｍｍ
−０．７５ｍｍ内径キャピラリー（８及び８０ｍＬカラムで使用）
−試料ロード：システムポンプを介してロード
−検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ、ＵＶ  ２６０ｎｍ、導電率伝導度、ｐＨ
【０５９２】
ＨＰＬＣシステム（分析ラン）
ＨＰＬＣ１：
−ＰＡＴｆｉｘ（商標）、１０ｍＬポンプヘッド、０．２５ｍｍ内径キャピラリー
−試料ロード：５００μＬの試料ループ
−検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ、ＵＶ  ２６０ｎｍ、蛍光２８０／３４８（ＦＬＵ、ＦＬＤ）、伝導度、ＭＡＬＳ
−流量：１〜２ｍＬ／分
【０５９３】
モノリス固定相
分析ラン（３カラム）：
−マクロ多孔性Ａｄｅｎｏ−０．１
−マクロ多孔性ＳＯ３−０．１
−マクロ多孔性ＡＡＶ空／フル−０．１
分取ラン（３カラム）：
−マクロ多孔性ＯＨ−８０
−マクロ多孔性ＳＯ３−８
−マクロ多孔性ＱＡ−８
【０５９４】
緩衝液
【０５９５】
緩衝液を新鮮な精製水で調製し、０．２２μｍフィルタをとおして濾過した。図２１１は、実験Ａの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す。図２３５は、実験Ｂの分取ラン及び分析ランに使用される緩衝液を示す。
【０５９６】
クロマトグラフィー法
【０５９７】
分取ラン：
−ＨＩＣステップ−ＨＩＣ精製ステップを、下流処理ＳＯＰで指定するように実行した。図２１２は、実験Ａ専用の緩衝液によるＳＯＰ段階勾配を示す。図２３６は、実験Ｂ専用の緩衝液によるＳＯＰ段階勾配を示す。
−ＣＥＸステップ−ＣＥＸ精製ステップを、下流処理ＳＯＰで指定するように実行した。図２１３は、実験Ａ専用の緩衝液によるＳＯＰ段階勾配を示す。図２３７は、実験Ｂ専用の緩衝液によるＳＯＰ段階勾配を示す。
−ＡＥＸステップ−ＡＥＸ精製ステップを、下流処理ＳＯＰで実行した。図２１４は、実験Ａについて、６０カラム体積（ＣＶ）で０％から１００％の移動相Ｂ、続いて１０ＣＶ、１００％のＭＰＣに段階的に移るＳＯＰ線形勾配を示す。図２３８は、実験Ｂについて、６０カラム体積（ＣＶ）で０％から１００％の移動相Ｂ、続いて１０ＣＶ、１００％のＭＰＣに段階的に移るＳＯＰ線形勾配を示す。
【０５９８】
分析ラン：
−部分分離−５０ＣＶで０〜３５％の移動相Ｂ、続いて５ＣＶで３５〜１００％の線形勾配。部分分離法を、分析ＨＰＬＣ  ＳＯＰで指定するように実行した。
−トータル−５０ＣＶでの０から１００％の移動相Ｂの線形勾配トータル法を分析ＨＰＬＣ  ＳＯＰで指定されるように実行した。
−空／フル−５０カラム体積（ＣＶ）で０から４０％の移動相、続いて１０ＣＶで４０から１００％の線形勾配。
【０５９９】
総タンパク質アッセイ
【０６００】
２つのアッセイに続いて、試料を総タンパク質濃度について試験した。緩衝液の組成に応じて、ＢＣＡ  Ｐｉｅｒｃｅ法またはＢｒａｄｆｏｒｄ法のいずれかを使用した。製造元のプロトコルに従った。
【０６０１】
総ＤＮＡアッセイ
【０６０２】
試料中の総ＤＮＡを定量化するために、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを使用した。製造元のプロトコルに従った。
【０６０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０６０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、製造元の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従って還元条件下で４〜２０％の勾配ゲルを使用してＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により実行した。ゲルを、不連続Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝システムを使用して、２００Ｖで３５分間泳動させた。タンパク質バンドを、Ｐｌｕｓ  ｏｎｅ  Ｓｉｌｖｅｒ染色試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって視覚化した。１０〜２００ｋＤａの分子量標準を使用した（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。各回、適切に希釈された２０ｕｌの試料をウェルにロードした。
【０６０５】
ＴＥＭ
【０６０６】
試料を、逆染色法を使用するＴＥＭによる検査のために調製した。解凍した試料を緩徐に混合し、グロー放電したばかりのコッパーグリッド（４００メッシュ、ホルムバール−炭素コーティング）に５分間適用し、洗浄し、１滴の酢酸ウラニルの１％（ｗ／ｖ）水溶液１滴で染色した。
【０６０７】
透過電子顕微鏡Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ  １００（ＦＥＩ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を８０ｋＶで操作して、グリッドを観察した。少なくとも１０個のグリッド正方形をくまなく検査し、数枚の顕微鏡写真（カメラＯＲＩＵＳ  ＳＣ  ２００、Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．）を撮影して、フル粒子と空粒子との間の比を評価した。顕微鏡写真は、グリッド上の異なる場所で同時に撮影した。
【０６０８】
ｄｄＰＣＲ
【０６０９】
試料（及び対照）をＤＮＡｚｅ処理し、２連で３点希釈した（各試料につき６回の反応）。反応混合物：ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）。反応体積：２０ｕＬ、ＤＮＡ体積５ｕＬ、液滴体積０．０００７３９。使用した機器：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００（商標）ＡｕｔｏＤＧ（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ  ＨＤ。クライアントの推奨に基づいて使用されるプライマー及びプローブ。
【０６１０】
マクロ多孔性ＯＨカラムＨＰＬＣ分析法を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）上の捕捉ステップ
【０６１１】
分取ラン
【０６１２】
清澄化した採取材料（８Ｌを１Ｌボトルに分けたもの）を一晩室温で解凍した。翌日、これをプールし、蠕動ポンプを４００ｍＬ／分の速度で使用して希釈緩衝液により１：１（８Ｌの採取物＋８Ｌの緩衝液）に希釈した。システムポンプを１ＣＶ／分で使用してカラムにロードする。技術移転ランは、実験ＡのＨＩＣ条件（ＨＩＣ−２５）の２５回目のランであった。図２１５は、実験Ａの分取ラン条件を詳述する。図２１６は、実験ＡのランＨＩＣ−２５からの例示的なクロマトグラムを示す。技術移転ランは、実験ＢのＨＩＣ条件（ＨＩＣ−２６）の２６回目のランであった。図２３９は、実験Ｂの分取ラン条件を詳述する。図２４０は、実験ＢのランＨＩＣ−２６からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０６１３】
ＨＰＬＣトータル分析
【０６１４】
クロマトグラフィー回収率を決定するために、全粒子法をＨＰＬＣで使用した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５を使用して、画分を脱塩した。主溶出液を、注入前にさらに１０倍希釈した。図２１７は、実験ＡのＨＰＬＣ分析に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２１７から、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｗ２、Ｅ１、及びＷ３中で溶出することを確認することができる。写真Ｊ（重ね合わせ）を観察すると、画分Ｗ２とＷ３との両方に、主なＥ１溶出と比較して、他のタンパク質不純物が存在することがわかる。また、画分Ｅ１は他の２つと比較して１０倍希釈されているため、溶出液を取り巻く画分中のベクターの損失はごくわずかであることも考慮する必要がある。ピークの面積をロード及び採取面積のピークと比較して、回収率を決定した。
【０６１５】
図２４１は、実験ＢのＨＰＬＣ分析に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２４１から、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｗ２、Ｅ１、及びＷ３中で溶出することを確認することができる。写真Ｊ（重ね合わせ）を観察すると、画分Ｗ２とＷ３との両方に、主なＥ１溶出と比較して、他のタンパク質不純物が存在することがわかる。また、画分Ｅ１は他の２つと比較して１０倍希釈されているため、溶出液を取り巻く画分中のベクターの損失はごくわずかであることも考慮する必要がある。ピークの面積をロード及び採取面積のピークと比較して、回収率を決定した。
【０６１６】
分取ランの回収
【０６１７】
清澄化された出発採取材料と比較した捕捉ステップＨＩＣ−ＯＨの回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析について、それぞれ、１０２％及び６８％である。２つの方法間の不一致は、主に、試料中の高塩濃度が原因で生じ、さらに、両方の場合で物質収支が１００％ではないため、２つを正規化するとより正確な結果が得られ、主画分中、ＡＡＶの回収率は平均８０〜９０％である。図２１８は、実験ＡからのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−２５ランの回収率を詳述する。図２４２は、実験ＢからのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−２６ランの回収率を詳述する。図２１９は、実験ＡのＨＩＣ−２５ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。Ｍ−はしご。画分Ｅ１、Ｗ３、及びＣＩＰは、それぞれ、５倍、５倍、及び２倍希釈されている。主画分はＥ１である。ＶＰ１−ＶＰ３タンパク質を赤色の長方形で指し示す。
【０６１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０６１９】
全ての画分をまず脱塩し、その後、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。図２１８は、ＡＡＶの濃度を示し、実験Ａの清澄化された採取材料からの捕捉が成功している。ＨＩＣステップ後の主な溶出には、次のクロマトグラフィーステップＣＥＸ−ＳＯ３で除去されるタンパク質不純物が多くある。ＨＩＣ−２５ランからのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。図２４２は、ＡＡＶの濃度を示し、実験Ｂの清澄化された採取材料からの捕捉が成功している。ＨＩＣステップ後の主な溶出には、次のクロマトグラフィーステップＣＥＸ−ＳＯ３で除去されるタンパク質不純物が多くある。ＨＩＣ−２６ランからのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。
【０６２０】
マクロ多孔性ＳＯ３  カラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）上の中間研磨
【０６２１】
分取ラン
【０６２２】
ＨＩＣ−ＯＨからの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように調製し、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムにロードした。技術移転ランは、実験ＡのＣＥＸ条件の１６回目のラン（ＳＯ３−１６）であった。図２２０は、実験Ａの分取ラン条件を詳述する。図２２１は、実験ＡのランＳＯ３−１６からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０６２３】
技術移転ランは、実験ＢのＣＥＸ条件の１７回目のラン（ＳＯ３−１７）であった。図２４４は、実験Ｂの分取ラン条件を詳述する。図２４５は、実験ＢのランＳＯ３−１７からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０６２４】
【０６２５】
ＨＰＬＣトータル分析
【０６２６】
クロマトグラフィー回収率を決定するために、全粒子法をＨＰＬＣで使用した。画分を、注入前に１００倍（Ｅ１）または２．５倍（他の画分）に希釈した。図２２２は、実験ＡのＳＯ３−１６についてのＨＰＬＣ分析−トータル法に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２２２は、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｅ１及びＷ３中で溶出することを確認することができる。画分Ｅ１は比較して１００倍に希釈され、Ｗ３は５倍に希釈されているため、Ｗ３画分中のベクターの損失はごくわずかである。ピークの面積をロード及び初期ＨＩＣ−２５  Ｅ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。図２２３は、実験Ａの分取ランＳＯ３−１６についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を詳述する。出発ＨＩＣ−２８  Ｅ１材料と比較した中間研磨ステップＣＥＸ−ＳＯ３の回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）について、それぞれ９９％及び８７％である。２つの方法間の不一致はわずかである。ＨＰＬＣ分析の場合、質量収支は１００％ではない。
【０６２７】
図２４６は、実験ＢのＳＯ３−１７についてのＨＰＬＣ分析−トータル法に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２４６は、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｅ１及びＷ３中で溶出することを確認することができる。画分Ｅ１は比較して１００倍に希釈され、Ｗ３は５倍に希釈されているため、Ｗ３画分中のベクターの損失はごくわずかである。ピークの面積をロード及び初期ＨＩＣ−２６  Ｅ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。図２４７は、実験Ｂの分取ランＳＯ３−１７についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を詳述する。出発ＨＩＣ−２８  Ｅ１材料と比較した中間研磨ステップＣＥＸ−ＳＯ３の回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）について、それぞれ９９％及び８７％である。２つの方法間の不一致はわずかである。ＨＰＬＣ分析の場合、質量収支は１００％ではない。
【０６２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０６２９】
全ての画分を、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。図２２４は、実験ＡのＳＯ３−１６ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図２２４はＡＡＶのさらなる濃度を描出し、これは、ＨＩＣからＣＥＸステップまで１０倍低いカラムサイズを使用したためである。ＨＩＣステップ後の主な溶出には、ＡＡＶウイルスバンド以外に他のタンパク質不純物が存在する。洗浄３では、ＡＡＶバンドのごく一部が可視である。宿主細胞タンパク質の大部分を、ＣＩＰを用いたストリップにより除去する。
【０６３０】
図２４８は、実験ＢのＳＯ３−１７ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図２４８はＡＡＶのさらなる濃度を描出し、これは、ＨＩＣからＣＥＸステップまで１０倍低いカラムサイズを使用したためである。ＨＩＣステップ後の主な溶出には、ＡＡＶウイルスバンド以外に他のタンパク質不純物が存在する。洗浄３では、ＡＡＶバンドのごく一部が可視である。宿主細胞タンパク質の大部分を、ＣＩＰを用いたストリップにより除去する。
【０６３１】
マクロ多孔性ＱＡカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）上での空及びフルＡＡＶキャプシド分離
【０６３２】
分取ラン
【０６３３】
実験Ａのため、ＳＯ３−１６からの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように希釈し、ＡＥＸ−ＱＡカラムにロードした。技術移転ランは、ＡＥＸ条件の１４回目のラン（ＱＡ−１４）であった。図２２５は、実験Ａの分取ラン条件を詳述する。図２２６は、実験ＡのランＱＡ−１４からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０６３４】
実験Ｂのため、ＳＯ３−１７からの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように希釈し、ＡＥＸ−ＱＡカラムにロードした。技術移転ランは、ＡＥＸ条件の１５回目のラン（ＱＡ−１５）であった。図２４９は、実験Ｂの分取ラン条件を詳述する。図２５０は、実験ＢのランＱＡ−１５からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０６３５】
ＨＰＬＣ空−フル分析
【０６３６】
クロマトグラフィー回収率及び純度（Ｅ／Ｆキャプシドの比）を決定するために、空−フル法をＨＰＬＣで使用した。画分を注入前に希釈した。図２２７は、実験ＡからのＱＡ−１４についてのＨＰＬＣ分析−空−フル法に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２２７から、ＦＴ＋Ｗ画分にピークが見られないため、全てのＡＡＶがカラムに結合することを確認することができる。電荷のわずかな差異により、空キャプシドが最初に溶出し始め（Ｅ２）、続いてＥ３に見出されるフルキャプシドが溶出する。このＡ２６０／Ａ２８０比の差異により、ＡＡＶが空またはフルキャプシド中で純粋であることが確認される。Ａ２６０／Ａ２８０比の０．６の値は、主にタンパク質組成の空キャプシドに対応し、ここでは、ＤＮＡ挿入を有するフルキャプシドは、純度に応じて１．３以上の値を付与する。次の溶出ピークからの空キャプシド汚染に起因して純度が低くなるため、画分Ｅ４を個別に収集する。Ｅ５画分は、主に、空キャプシド、凝集キャプシド、及び損傷キャプシド（２つのピーク）を有し、Ｅ６画分にはＡＡＶ溶出はない。ピークの面積をロード及び初期ＳＯ３−１６  Ｅ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。
【０６３７】
図２５１は、実験ＢからのＱＡ−１５についてのＨＰＬＣ分析−空−フル法に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図２５１から、ＦＴ＋Ｗ画分にピークが見られないため、全てのＡＡＶがカラムに結合することを確認することができる。電荷のわずかな差異により、空キャプシドが最初に溶出し始め（Ｅ２）、続いてＥ３に見出されるフルキャプシドが溶出する。このＡ２６０／Ａ２８０比の差異により、ＡＡＶが空またはフルキャプシド中で純粋であることが確認される。Ａ２６０／Ａ２８０比の０．６の値は、主にタンパク質組成の空キャプシドに対応し、ここでは、ＤＮＡ挿入を有するフルキャプシドは、純度に応じて１．３以上の値を付与する。次の溶出ピークからの空キャプシド汚染に起因して純度が低くなるため、画分Ｅ４を個別に収集する。Ｅ５画分は、主に、空キャプシド、凝集キャプシド、及び損傷キャプシド（２つのピーク）を有し、Ｅ６画分にはＡＡＶ溶出はない。ピークの面積をロード及び初期ＳＯ３−１７  Ｅ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。
【０６３８】
タンジェントフロー濾過
【０６３９】
実験Ａについて、濃縮及び緩衝液交換をＱＡ−１４  Ｅ３  試料に対するＴＦＦの導入により達成した。試料の最終体積は２５ｍＬ（１０ｍＬの試料＋１５ｍＬのシステムホールドアップ体積）であった。図２２８は、実験Ａのタンジェントフロー濾過条件を詳述する。
【０６４０】
実験Ｂについて、濃縮及び緩衝液交換をＱＡ−１５  Ｅ３  試料に対するＴＦＦの導入により達成した。試料の最終体積は３５ｍＬ（１０ｍＬの試料＋２５ｍＬのシステムホールドアップ体積）であった。図２５２は、実験Ｂのタンジェントフロー濾過条件を詳述する。
【０６４１】
分取ランの回収
【０６４２】
出発ＳＯ３−１６  Ｅ１材料と比較したフルキャプシド富化ステップ（空とフルとの分離）ステップＡＥＸ−ＱＡの回収率は、実験Ａについて、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析で、それぞれ７３％及び６７％である。２つの方法間の不一致はわずかである。ＨＰＬＣ分析及びｄｄＰＣＲの場合、質量収支は１００％ではない。ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析では、蛍光がＤＮＡ（挿入）クエンチングＦＬＤシグナルに起因してフルＡＡＶキャプシド回収のより低い応答を付与するので、Ａ２６０及びＡ２８０領域のみを考慮する。ＴＦＦ後におよそ６０〜７０％の回収率が得られ、これは、ＱＡ溶出液を清澄化した採取材料と比較した場合、下流全体の収率が４３％または７３％であることを意味する。図２２９は、実験Ａについての分取ランＱＡ−１４  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収量のｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率を詳述する。
【０６４３】
出発ＳＯ３−１７  Ｅ１材料と比較したフルキャプシド富化ステップ（空とフルとの分離）ステップＡＥＸ−ＱＡの回収率は、実験Ｂについて、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析で、それぞれ６２％及び６４％である。２つの方法間の不一致はわずかである。ＨＰＬＣ分析及びｄｄＰＣＲの場合、質量収支は１００％ではない。ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析では、蛍光がＤＮＡ（挿入）クエンチングＦＬＤシグナルに起因してフルＡＡＶキャプシド回収のより低い応答を付与するので、Ａ２６０及びＡ２８０領域のみを考慮する。ＴＦＦ後におよそ７０〜８０％の回収率が得られ、これは、ＱＡ溶出液を清澄化した採取材料と比較した場合、下流全体の収率が５５％または８２％であることを意味する。図２５３は、実験Ｂ  についての分取ランＱＡ−１５  ＴＦＦ及び総ＤＳＰ収量のｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく回収率を詳述する。
【０６４４】
純度（空キャプシドとフルＡＡＶキャプシドとの比）
【０６４５】
図２３０は、実験ＡについてのＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく空及びフルＡＡＶキャプシド両方の純度を詳述する。図２３０は、ＦＬＤを考慮する場合、主Ｅ３画分の純度（フルキャプシドのパーセンテージ）が８７％であることを示す。両方の吸光係数の消衰係数が不明であるため、それらのシグナルに頼ることはできず、このため、ＦＬＤが最も信頼できる値となる。比が５５％でしかない主ピーク溶出（画分Ｅ４）の底部で、比が劇的に変化する。３．５ＣＶ（およそ８０％のピーク）の収集にとどまる理由は、Ｅ３でより高い純度を達成し、ベクター（Ｅ４）の損失をわずか（７％）のみにするためである。
【０６４６】
図２５４は、実験ＢについてのＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析に基づく空及びフルＡＡＶキャプシド両方の純度を詳述する。図２５４は、ＭＡＬＳ及びＦＬＤの両方を考慮する場合、主Ｅ３画分の純度（フルキャプシドのパーセンテージ）が９０％であることを示す。両方の吸光係数の消衰係数が不明であるため、それらのシグナルに頼ることはできず、これにより、ＭＡＬＳが、粒子の直径を測定するものであることを理由に、最も信頼できる検出器となる。次は、精度に関するＦＬＤ検出器である。比が６０〜７０％でしかない主ピーク溶出（画分Ｅ４）の底部で、比が劇的に変化する。３．５ＣＶ（およそ８０％のピーク）の収集にとどまる理由は、Ｅ３でより高い純度を達成し、ベクター（Ｅ４）の損失をわずか（６％）のみにするためである。
【０６４７】
実験Ａでは、Ｅ２（空キャプシド）及びＥ３（フルキャプシド）の純度をＴＥＭにより追加で試験したが、フルキャプシドについては、異なる段階、つまりＴＦＦ後のＱＡ−１４  Ｅ３試料を評価した。試料ＴＦＦ  ＡＡＶ８−ＲＰＧＲフルは、損傷粒子の小さい凝集のみを含む試料ＱＡ−１４  Ｅ２とは対照的に様々な種類の不純物が含まれた。フルウイルスと空／損傷ウイルスとの比は両方の試料で類似しており、試料ＴＦＦ  ＡＡＶ８−ＲＰＧＲフル６２％、試料ＱＡ−１４  Ｅ２で６５％であった。比較的高いパーセンテージは、未分類粒子を表した。このグループのウイルスは、表面全体において電子透過性ではなかったが、表面に電子密度の高いスポットを示しただけであった。そのようなウイルスは、完全にフルではないか、正しく形成されていなか、または損傷している可能性がある。図２３１は、実験ＡについてのＴＥＭによって評価したフル及び空ＡＡＶの比を詳述する。図２３２は、ＴＥＭによって評価したＴＦＦ後のＱＡ−１４  Ｅ３画分、実験ＡのＱＡ−１４  Ｅ２画分を示す。
【０６４８】
フィラメント状の不純物は、ＴＦＦ後の試料でのみ見出され、これは、適当に消毒されていないＴＦＦから誘導されることを後で確認した。空のピークに見出されるフルキャプシドの大部分は画分収集アプローチによって説明され、ここでは、フル粒子がすでに溶出しているために空画分Ｅ２を汚染している吸光度交差点まで、Ｅ２画分が延長される。
【０６４９】
実験Ｂでは、ＱＡ−１５  Ｅ３（フルキャプシド）及びＴＦＦ後の試料（ＴＴ  ＢＢ  ＲＰＧＲ−フル）の純度をＴＥＭによって追加で試験した。試料ＴＴ  ＢＢ  ＡＡＶ８−ＲＰＧＲフル及びＱＡ−１５  Ｅ３には、損傷粒子の小さい凝集のみが含まれた。両方の試料で、一部の凝集には、通常ディスクと呼ばれ、恐らくタンパク質を表す構造も含まれた。両方の試料で、フル粒子が優勢であったが、グリッド検査の時点で、試料ＱＡ−１５  Ｅ３の非希釈試料と希釈試料との差異に気が付いた。希釈試料及び非希釈試料について、別々に粒子を計数し計算した。非希釈試料からの計算のみを考慮に入れることを提案する。試料ＴＴ  ＢＢ  ＡＡＶ８−ＲＰＧＲフルには、７６％のフル粒子が含まれ、試料ＱＡ−１５  Ｅ３には、８４％のフル粒子が含まれた。図２５５は、実験ＢについてのＴＥＭによって評価したフル及び空ＡＡＶの比を詳述する。図２５６は、ＴＥＭによって評価したＴＦＦ後のＱＡ−１５  Ｅ３画分、実験ＢのＱＡ−１４  Ｅ２画分を示す。
【０６５０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０６５１】
全ての画分を、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。図２３３は、実験ＡからのＱＡ−１４ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図２３３は、Ｅ２からＥ６までの全ての画分にＡＡＶが含まれていることを描出する。Ｅ３及びＥ４画分に存在する２００ｋＤａマークを超えるタンパク質バンドは、フルキャプシドにのみ見出されるＤＮＡ挿入に対応し、これら２つの画分のみにフルキャプシドが含まれることを示し、このことは、ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析結果を補完する。他のタンパク質不純物は、ＶＰ１−ＶＰ３以外のＥ３画分に見出される。これらの不純物はＴＦＦ（ＡＡＶ８フル）によって部分的に除去されるが、ＴＥＭでも確認されているように、他のタンパク質は依然として存在する。ＴＦＦシステムの不十分な消毒に起因して、追加のタンパク質バンドが存在する。
【０６５２】
図２５７は、実験ＢからのＱＡ−１５ランのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図２５７は、Ｅ２からＥ６までの全ての画分にＡＡＶが含まれていることを描出する。Ｅ３及びＥ４画分に存在する２００ｋＤａマークを超えるタンパク質バンドは、フルキャプシドにのみ見出されるＤＮＡ挿入に対応し、これら２つの画分のみにフルキャプシドが含まれることを示し、このことは、ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析結果を補完する。他のタンパク質不純物は、ＶＰ１−ＶＰ３以外のＥ３画分に見出される。これらの不純物はＴＦＦ（ＡＡＶ８フル）によって部分的に除去される。
【０６５３】
ＨＰＬＣ分析−部分分離法
【０６５４】
図２５８は、実験Ｂについての部分分離法を使用する例示的なクロマトグラムを示す。図２５８から、不純物の大部分がＨＩＣステップによって除去されることを確認することができる（写真Ａ）。試料は、空キャプシドとフルキャプシドとの分離を達成するのに十分に純粋でないため、追加の研磨をＣＥＸ−ＳＯ３上で行った。この段階からの溶出液は、主に純粋であり、極めて濃縮されているが、依然として空キャプシドとフルキャプシドとの両方からなる。最後のＡＥＸ−ＱＡステップは、２つのキャプシドを分離し、その結果、フルキャプシドを隔離し富化する。採取材料をＱＡ主画分と比較することにより、ＡＡＶピークを出発材料から同定することができる。
【０６５５】
結論
【０６５６】
清澄化した採取物を出発材料として使用して、シームレスな下流精製ランを実行した。ＡＡＶの捕捉及び濃縮をＨＩＣ−ＯＨステップによって達成し、このステップでは、タンパク質がフロースルーで見出され、ＡＡＶがカラムに結合した。タンパク質不純物を、Ｗ２画分またはＷ３画分のいずれかにおいて除去した。
【０６５７】
タンパク質不純物の大半は、ＨＩＣステップの後に依然として主溶出画分（Ｅ１）に存在した。タンパク質不純物の大部分を、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムを使用する中間研磨ステップによって除去した。このステップでは、１０倍小さいカラムスケールを導入して、ＡＡＶの追加の濃縮を達成した。この段階でのフルキャプシドのパーセンテージは、実験Ａについておよそ５５％、実験Ｂについておよそ３４％であったため、ＡＥＸ−ＱＡを使用するフル粒子富化を実行した。
【０６５８】
フルキャプシドを空キャプシドから分離した後、製剤緩衝液中への緩衝液交換を、ＴＦＦを使用して実行した。清澄化採取からＴＦＦの完了までの全下流プロセス収率は、実験Ａの清澄化採取からＱＡフル粒子富化ステップの完了まで４３％及び７３％であった。清澄化採取からＴＦＦの完了まで全下流プロセス収率は、実験Ｂの清澄化採取からＱＡフル粒子富化ステップまで５５％及び８２％であった。
【０６５９】
実施例７：ＡＢＣＡ４精製プロセス互換性研究
本開示は、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ（ＡＢＣＡ４）後期臨床及び商業プログラムのための産業用クロマトグラフィー下流プロセス（ＤＳＰ）を提供する。本プロジェクトには、マクロ多孔性ＯＨ、ＳＯ３、及びＱＡカラムを使用する空−フル（Ｅ／Ｆ）ＡＡＶ８キャプシドの捕捉、中間研磨、及び分離、ならびにタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）という、開発された全てのステップが含まれた。
【０６６０】
代理ベクターを使用したＡＢＡＣＡ４ベクターの互換性研究を行った。代理ベクターは、ＡＢＣＡ４ベクターと同じキャプシド（ＡＡＶ８／Ｙ７３３Ｆ）を有する。キャプシドは、ＨＩＣ及び及びＳＯ３ステップにわたるベクターの挙動のための決定因子である。図２５９は、ＨＩＣ（ＯＨ）クロマトグラフィー条件を詳述する。図２６０は、ＨＰＬＣ全粒子分析によって測定した例示的なＨＩＣ（ＯＨ）クロマトグラム及びベクター回収分析を示す。
【０６６１】
図２６１は、ＣＥＸ（ＳＯ３）クロマトグラフィー条件を詳述する。図２６２は、ＣＥＸ（ＳＯ３）の例示的なクロマトグラム及びベクター回収分析を示す。
【０６６２】
パッケージ化されたゲノムは、ベストロフィン−１遺伝子（これは、ＡＢＣＡ４遺伝子より小さく、デュアルベクターを必要としないので、ベクター自体に対する概念実証研究を可能にする）を含む構築物であった。パッケージ化されたゲノムは、ＱＡステップでの挙動に影響を与える。このステップは線形勾配を用いるため、ＡＢＣＡ４導入遺伝子を使用する場合、ＱＡステップのための操作条件に変化がないことが見込まれる。図２６３は、ＡＥＸ（ＱＡ）クロマトグラフィー条件を詳述する。図２６４は、ＱＡ画分中の空粒子及びフル粒子の例示的なクロマトグラム及びベクター回収分析を示す。
【０６６３】
純度（Ｅ／Ｆ）比の最適な説明は、ＦＬＤ及びＭＡＬＳ検出器によって得られる。およそ５５％〜９４％のフルＡＡＶ粒子からの富化は、ＱＡステップによって達成される。図２６５は、ＨＰＬＣ分析に基づく（フル：空）粒子の純度を詳述する。図２６６は、ＴＥＭに基づく純度（フル：空）を示す。図２６７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による純度を示す。
【０６６４】
実施例８：ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４産生のための下流プロセス
ＡＡＶ−ＡＢＣＡ４ベクターの下流プロセスでは、ＡＡＶベクター精製の効率的で頑健な解決法の基礎を形成する、異なる化学の３つのモノリスクロマトグラフィーカラムの使用が中心となる。モノリスは、リガンド−標的間相互作用を拡散に依存しない様式で行うことを可能にするその大型のフローチャネルに起因して、ウイルスベクターなどの高分子の精製に特に好適である。
【０６６５】
精製トレインにおける第１の単位操作は、ブラインド及び溶出モードで動作する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）捕捉ステップである。ベクターのカラムへの結合を促進するために、高モル濃度のストック溶液で供給流を希釈して、塩析剤の濃度を増加させる必要がある。生成物の溶出は、低モル濃度塩緩衝液への段階的な変更を使用して達成する。
【０６６６】
ＨＩＣステップの後、ベクターが負に帯電した強陽イオン交換（ＣＥＸ  ＳＯ３）カラムに結合できるようにするには、供給流をさらに調整する必要がある。調整用緩衝液は、ＡＡＶベクターをプロトン化し、対イオン濃度を低下させることにより、ベクターが負に帯電したリガンドに結合できるようにする。供給物調製後に濾過ステップを実行して、あらゆる微粒子を除去し、ＳＯ３クロマトグラフィーカラムの有効性を保つ。ＳＯ３ステップを結合及び溶出モードでも操作し、塩濃度を段階的に増加させながら溶出を行う。
【０６６７】
フルＡＡＶ粒子に対する富化は、フル粒子と空粒子との間に存在するわずかな電荷の変動を利用することによって達成する。強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ  ＱＡ）カラムを利用した線形塩勾配溶出により、フルの種と空の種との間の十分な分解が可能になる。他の全ての単位操作と同様に、ベクターをクロマトグラフィー支持体に結合させるためには、供給物の調整が必要である。
【０６６８】
最終ベクター濃度及び透析濾過を、１００ｋＤａのＴＦＦ  ｍＰＥＳ膜を使用して達成する。生成物を最終製剤緩衝液（ｐＨ  ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８）に透析濾過する。最終製剤化の前に、ｑＰＣＲ法を使用してプロセス内試料をベクター回収率について分析し、ベクター力価及びＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）の収率を決定する。このデータを使用して、最終目標力価を達成するために必要な最終量を推定する。賦形剤ポロキサマー１８８を、０．００１％（ｖ／ｖ）の最終濃度でプロセス流に手で加える。最終製剤化の後、生成物を０．２２μｍフィルタをとおして最後に無菌濾過して、精製バルク原薬（ＰＢＤＳ）を得る。ＰＢＤＳを充填すると、プロセスが完了となり、最終製剤（ＦＤＰ）が得られる。放出試験をＰＢＤＳとＦＤＰとの両方に行う。
【０６６９】
下流製造プロセスの説明
【０６７０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー捕捉ステップ
【０６７１】
清澄化した採取材料の捕捉ステップを、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを使用して実行する。ベクターが疎水性支持体に確実に結合するようにするには、モル濃度を増加させる必要があり、２．６Ｍのリン酸カリウム、２％のソルビトール、ｐＨ７のスパイク緩衝液を添加することにより達成する。得られた溶液を十分に撹拌しながら、清澄化した採取物に希釈緩衝液を添加することにより、１：１体積添加を実行する。
【０６７２】
ＯＨモノリスカラム（２μｍ孔）を、この単位ステップのクロマトグラフィー単位として使用する。カラムの完全性が損なわれていないことを確実にするために、使用前にカラム上でパルス試験を実行する。
【０６７３】
カラムの消毒及び平衡化の後、生成物をモノリスにロードする。低モル濃度塩緩衝液（０．７３Ｍのリン酸カリウム、１％のソルビトール、ｐＨ７）への定組成変化を使用して、生成物の溶出を達成する前に、モル濃度の高い順に２回洗浄を行う。
【０６７４】
溶出液は、順方向処理の前に２〜８℃で一晩保管することができる（保存期間の制限は未確定）。
【０６７５】
図２６８は、ＨＩＣクロマトグラフィー単位操作に関連するプロセスフローを示す。図２６９は、ＨＩＣ捕捉ステップに使用されるパラメータ及び関連する動作範囲または定値を示す。図２７０は、クロマトグラフィー手順に特化して必要なステップを示す。
【０６７６】
図２７１は、典型的なフルクロマトグラフＨＩＣプロファイルを例解する代表的なクロマトグラムを示す。図２７２は、洗浄、溶出、及びＣＩＰ段階を拡大することでより明確にした代表的なクロマトグラムを示す。
【０６７７】
図２７３は、図２７０に列挙する段階に対応する緩衝液の詳細を示す。図２７４は、ＨＩＣクロマトグラフィーステップに利用される主要な材料及び消耗品の詳細を示す。
【０６７８】
陽イオン交換クロマトグラフィー
【０６７９】
陽イオン交換ベースの中間研磨クロマトグラフィーステップは、プロセス不純物をさらに減少させる。ＨＩＣステップからの溶出液は、ベクターが負に帯電したリガンドに結合できるように調整する必要がある。調整の最初の部分は、等電点（ｐＩ）未満である必要があるプロセス流のｐＨを低下させ、それによりベクターに全体的に正の表面電荷を付与することを伴う。また希釈ステップにより、ロードの伝導度が低下し、このことにより、溶液中の対イオンからの競合的結合が減少する。プロセス流を調整した後、濾過ステップ（０．８／０．４５μｍの組合せフィルタ）を実行して、あらゆる粒子を除去し、ＳＯ３クロマトグラフィーカラムの有効性を保つ。中和緩衝液を添加物に添加して、ｐＨを生理学的レベル付近に回復させる。溶出液は、順方向処理の前に２〜８℃で一晩保管することができる（保存期間の制限は未確定）。図２７５は、ＳＯ３クロマトグラフィー単位操作の実行に必要なステップを要約する。
【０６８０】
ＳＯ３モノリスカラム（２μｍ孔）を、この単位ステップのクロマトグラフィー単位として使用する。カラムの完全性が損なわれていないことを確実にするために、使用前にカラム上でパルス試験を実行する。図２７５は、ＳＯ３クロマトグラフィー単位操作のフロー図を示す。図２７６及び２７７は、ＳＯ３クロマトグラフィーステップに用いられるパラメータ及び動作範囲／定値の詳細である。
【０６８１】
図２７８は、代表的な典型的フルクロマトグラムを示す。図２７９は、ロード後の活動、すなわち、カラム洗浄、溶出、及びＣＩＰステップについての焦点を示す。図２８０は、このステップに使用される緩衝液の詳細を示す。図２８１は、遠心分離濃縮ステップに使用される例示的な材料及び消耗品の詳細を示す。
【０６８２】
ＱＡクロマトグラフィーステップ
【０６８３】
フルＡＡＶ粒子に対する富化は、フル粒子と空粒子との間に存在するわずかな電荷の変動を利用することによって達成する。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを利用した線形勾配溶出により、フルの種と空の種との間の十分な分解が可能になり、これによりピークカッティング法を用いることができるようになる。段階溶出は、存在する電荷の変動が最小限であるため、頑健な分離操作の基礎をなさない。溶出プロファイルを効果的に形成し監視するには、ＵＶ吸光度シグナルを監視する能力とともに、勾配を正確かつ再現性よく形成できるバイオプロセスシステムが必要とされる。中和緩衝液を添加物に添加して、ｐＨを生理学的レベル付近に回復させる。溶出液は、順方向処理の前に２〜８℃で一晩保管することができる（保存期間の制限は未確定）。
【０６８４】
ＱＡモノリスカラム（２μｍ孔）を、この単位ステップのクロマトグラフィー単位として使用する。カラムの完全性が損なわれていないことを確実にするために、使用前にカラム上でパルス試験を実行する。図２８２は、ＱＡクロマトグラフィー単位操作のフロー図を示す。図２８３は、ＱＡクロマトグラフィーステップに使用されるパラメータ及び関連する動作範囲及び定値を示す。図２８４は、クロマトグラフィーランに関連する特定のステップを示す。図２８５及び図２８６は、代表的なクロマトグラム（それぞれフル及び勾配溶出）を示す。
【０６８５】
溶出収集基準は、Ａ２６０及びＡ２８０波長を使用して開発した。収集の開始は、Ｅ３画分に対応するＡ２６０トレースとＡ２８０トレースとの交差点で始動する。注：基準を意味のあるものにするには、Ａ２６０波長とＡ２８０波長とを同じスケールで表す必要がある。ピーク収集の終了は、収集の開始後に３．５ＣＶで行う。同じ目標を達成するが、異なる方法を使用する収集基準は許容される。これは、１つの波長しか監視できない場合である。図２８７は、ＱＡ緩衝液条件及び標的仕様を示す。図２８８は、ＱＡクロマトグラフィー単位操作に使用する主要な材料／消耗品を示す。
【０６８６】
タンジェンシャルフロー濾過及び賦形剤の添加
【０６８７】
最終ベクター製剤化を、１００ｋＤａのＴＦＦ  ｍＰＥＳ膜を使用して達成する。最終製剤化の前に、ｑＰＣＲ法を使用してプロセス内試料をベクター回収率について分析し、ベクター力価及びＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）の収率を決定する。このデータを使用して、最終目標力価を達成するために必要な最終量を推定する。生成物を最終製剤緩衝液（ｐＨ  ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８）に透析濾過する。図２８９は、タンジェンシャルフロー濾過ステップを完了するために必要なステップのグラフによる概要を示す。図２９０は、タンジェンシャルフロー濾過ステップのためのパラメータ及び動作範囲を示す。図２９１は、タンジェンシャルフロー濾過単位操作に使用される主要な材料及び消耗品の詳細を示す。
【０６８８】
プロセス内保持条件
【０６８９】
図２９２は、ＡＡＶ生成物のプロセス開発中に使用したプロセス内ポイントでの保持時間の詳細を示す。
【０６９０】
実施例９：ＡＢＣＡ４精製プロセスの最適化
【０６９１】
代理ベクター
【０６９２】
プロキシベクターを互換性研究に使用した。代理ベクターは、ＡＢＣＡ４ベクターと同じキャプシド（ＡＡＶ８／Ｙ７７３Ｆ）を有する。キャプシドは、ＨＩＣ及びＳＯ３ステップにわたるベクターの挙動のための決定因子である。パッケージ化されたゲノムは、ＱＡステップでの挙動に影響を与える。例示的なパッケージ化されたゲノムは、野生型ベストロフィン−１をそのサイズの小ささに起因して使用したが、このステップは線形勾配を用いるため、例えば、ＡＢＣＡ４導入遺伝子またはサイズが類似した他の導入遺伝子を使用する場合、ＱＡステップのための操作条件に変化がないことが見込まれる。
【０６９３】
ＨＩＣ捕捉ステップの最適化
【０６９４】
ＡＢＣＡ４ベクターのためのクロマトグラフィープロセスの最適化を行った。ＨＩＣプロセスのための洗浄緩衝液及びＣＥＸプロセスのための溶出緩衝液に変更を加えた。図３２３は、勾配溶出ランを使用して最適化したＨＩＣステップパラメータを詳述し、例示的なＨＩＣ  クロマトグラムを示す。最適化したピークカッティングアノテーションは１．０２Ｍの緩衝液であった。最適化していないピークカッティングアノテーションは１．０８Ｍの緩衝液であった。ロード後洗浄２緩衝液（Ｗ２）を、１．０８Ｍのリン酸カリウム、１％のソルビトール、ｐＨ７．０から、１．０２Ｍのリン酸カリウム、１％のソルビトール、ｐＨ７．０に調整した。ロード後Ｗ２緩衝液のモル濃度の減少により、プロセスに関係する不純物の溶出画分への持ち越しが減少する。全ての他の動作パラメータは一定のままであった。特定の実施形態では、ＲＰＧＲベクターに使用するＨＩＣ洗浄緩衝液は、１．０８ＭのＫ２ＨＰＯ４＋ＫＨ２ＰＯ４＋１％のソルビトール、ｐＨ７．０であり、ＡＢＣＡ４ベクターに使用するＨＩＣ洗浄緩衝液は、１．０２ＭのＫ２ＨＰＯ４＋ＫＨ２ＰＯ４＋１％のソルビトール、ｐＨ７．０である。
【０６９５】
ＣＥＸステップの最適化
【０６９６】
ＣＥＸステップを、勾配溶出ランを使用して最適化した。図３２４は、最適化した溶出緩衝液（Ｅ１）を使用するＣＥＸランの例示的なクロマトグラムを示す。最適化したピークカッティングアノテーションは１．３３Ｍの緩衝液であり、最適化していないピークカッティングアノテーションは１．３Ｍの緩衝液であった。Ｅ１緩衝液を、５０ｍＭの酢酸塩、１．３ＭのＮａＣＬ、０．１％のポロキサマー１８８、ｐＨ３．６から、５０ｍＭの酢酸塩、１．３３ＭのＮａＣｌ、０．１％のポロキサマー１８８、ｐＨ３．６に交換した。Ｅ１のモル濃度の増加により、ＣＥＸステップのステップ回収率が改善する。特定の実施形態では、ＲＰＧＲに使用するＣＥＸ溶出緩衝液は、０．０５Ｍの酢酸塩＋１．３ＭのＮａＣｌ＋０．１％のポロキサマー１８８、ｐＨ３．６±０．０５であり、ＡＢＣＡ４ベクターに使用するＣＥＸ溶出緩衝液は、０．０５Ｍの酢酸塩＋１．３３ＭのＮａＣｌ＋０．１％のポロキサマー１８８、ｐＨ３．６±０．０５である。
【０６９７】
図３２５は、最適化したＨＩＣ及びＣＥＸクロマトグラフィーステップの両方を使用することによる例示的な最適化された調整ランを示す。例示的なＱＡクロマトグラムは、野生型ＢＥＳＴ−１の模範的なパックされたゲノムをそのサイズが小さいことに起因して使用し、実行する。図３２６は、各溶出のステップ回収率を詳述する。図３２７Ａは、ＭＡＬＳによるＱＡ分離ステップにわたるフル：空ベクターの結果を詳述する。図３２７Ｂは、ＭＡＬＳ及びＴＥＭによるＱＡ分離ステップにわたるフル：空ベクターの結果を詳述する。
【０６９８】
実施例１０：ＡＡＶ生成物の品質に対するトランスフェクション条件の影響
このプロジェクトの目的は、高品質のＡＡＶ生成物を生成するトランスフェクション条件を同定することであった。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬であるＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を、様々な比のプラスミドＤＮＡ（すなわち、ＲＰＧＲＯＲＦ１５配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ構築物をコードするプラスミド、ＡＡＶ８  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子（ＲｅｐＣａｐ）をコードするプラスミド、ならびにｐヘルパープラスミド）とトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）混合物を細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２９６時間インキュベートしてから採取し、得られたＡＡＶウイルス粒子を評価した。４つのトランスフェクション条件を評価し、ベクター粒子の数（キャプシドＥＬＩＳＡ）及びゲノム挿入物を含む粒子の数（ゲノム力価）を各条件について定量化した。図３２８Ａは、評価したＰＥＩ：ＤＮＡ（ｍＬ：ｍｇ）比及びプラスミドモル比を含む、試験したトランスフェクション条件を示す。図３２８Ｂは、計算したキャプシドＥＬＩＳＡ及びゲノム力価の結果の比から推定したフル粒子のパーセンテージを定量化するグラフを示し、これにより条件間の相違が強調される。図３２８Ｃ及び３２８Ｄは、それぞれ図３２３Ａに示される、トランスフェクション条件１、２、３、及び４から得られるゲノム力価（ＧＣ／ｍＬ）及びキャプシドＥＬＩＳＡ（粒子／ｍＬ）の定量値のグラフを示す。
【０６９９】
直交するフル対空の定量化
【０７００】
図３２８（Ａ〜Ｄ）の全粒子分析は、実際の値を過小評価するが、傾向は有効であると考えられる。したがって、４つの条件（図３２８Ｂ）からの試料を、直交法によって測定した。図３２９Ａは、直交法を使用して測定したフル粒子対空粒子の定量化の代表的なグラフを示す。図３２９Ｂは、実験条件及び結果の表を示す。結果は、図３２８（Ａ〜Ｄ）における傾向を反映した。異なるトランスフェクション剤（ＣａＰＯ４）を用いて生成された材料を使用した以前の結果と比較すると、トランスフェクション剤の選択もフル粒子対空粒子の比に影響を有し得ることと、ＰＥＩを使用することでフル粒子のパーセンテージがより高くなることとが示唆され、これは、Ｒｅｐ−ＣａｐもしくはｐＨｅｌｐプラスミドと比較してＩＴＲの相対量が高い３つのプラスミドのモル比を使用して、及び／または４：１以下、例えば、２：１のＰＥＩ：ＤＮＡ（ｍＬ：ｍｇ）比を使用して、向上させることができる。
【０７０１】
トランスフェクション剤（ＰＥＩ対ＣａＰＯ４）がｏｎ  ＡＡＶフル対空比に与える影響
【０７０２】
どちらの試薬によってより優れた生成物が得られたのかを決定するために、ＰＥＩ対ＣａＰＯ４比較トランスフェクション研究を実施した。ＰＥＩトランスフェクションまたはＣａＰＯ４から生成された材料を使用して、ＨＰＬＣによってフル対空のベクター比を定量化した。材料はフル粒子について濃縮するプロセスステップを経ていなかった。総ＤＮＡ、ＰＥＩ／ＤＮＡ比、及びトランスフェクションプラスミドの比を含む以前の可変条件を、２つのトランスフェクション条件の間で一定に保った。図３３０は、ＦＬＤ（各試薬について左のバー）またはＭＡＬＳ（各試薬について右のバー）によって測定したＣａＰＯ４対ＰＥＩトランスフェクションの関数としてのフルベクター粒子（％）分析の比較を示す代表的なグラフを示す。この対照比較試験は、ＣａＰＯ４の代わりにＰＥＩをトランスフェクション剤として使用することで、フルベクター粒子のより高い比が得られることをさらに示す。
【０７０３】
実施例１１：ＡＡＶ８−ＡＢＣＡ４産生のための下流プロセス
本プロジェクトの目的は、ｒＡＡＶ／Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４後期臨床及び商業プログラムのための産業用クロマトグラフィー下流プロセス（ＤＳＰ）を開発することであった。本プロジェクトには、マクロ多孔性ＯＨ、ＳＯ３、及びＱＡカラムを使用する空−フル（Ｅ／Ｆ）ＡＡＶ８キャプシドの捕捉、中間研磨、及び分離、ならびに透析によって達成される緩衝液交換という、開発された全てのステップが含まれた。開発は、リン酸カルシウムをトランスフェクション剤として使用した粗採取材料に基づいた。
【０７０４】
材料及び方法
【０７０５】
試料
【０７０６】
試料を、Ｂｅｒｚｏｎａｓｅ（商標）処理し、ＤＭＥＭ培地中で配合した。試料は、ＡＢＣＡ４ベクターと同じキャプシド（ＡＡＶ８／Ｙ７３３Ｆ）を有するＡＢＣＡ４代理ベクターであった。出荷体積は４Ｌであり、力価は２．２４Ｅ＋１０ｖｐ／ｍＬであり、総ベクターは８．９６＋１３ベクターゲノム（ｖｇ）であった。
【０７０７】
ＦＰＬＣシステム（分取ラン）
ＦＰＬＣ１：
−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００、ＵＶフローセル２ｍｍ
−０．７５ｍｍ内径キャピラリー（８ｍＬ及び８０ｍＬカラムで使用）
−試料ロード：システムポンプを介してロード
−検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ、ＵＶ  ２６０ｎｍ、導電率伝導度、ｐＨ
【０７０８】
ＨＰＬＣシステム（分析ラン）
ＨＰＬＣ１：
−ＰＡＴｆｉｘ（商標）、１０ｍＬポンプヘッド、０．２５ｍｍ内径キャピラリー
−試料ロード：５００μＬの試料ループ
−検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ、ＵＶ  ２６０ｎｍ、蛍光２８０／３４８（ＦＬＵ、ＦＬＤ）、伝導度、ＭＡＬＳ
−流量：１〜２ｍＬ／分
【０７０９】
モノリス固定相
分析ラン（２カラム）：
−マクロ多孔性Ａｄｅｎｏ−０．１
−マクロ多孔性ＳＯ３−０．１
分取ラン（３カラム）：
−マクロ多孔性ＯＨ−８０
−マクロ多孔性ＳＯ３−１
−マクロ多孔性ＱＡ−１
【０７１０】
緩衝液
【０７１１】
緩衝液を新鮮な精製水で調製し、０．２２μｍフィルタをとおして濾過した。図３３６は、分取ラン及び分析ランに使用する緩衝液を示す。
【０７１２】
クロマトグラフィー法
【０７１３】
分取ラン：
−ＨＩＣステップ−ＨＩＣ精製ステップを、段階勾配を使用し、図３３７に示す専用緩衝液を用いて実行した。
−ＣＥＸステップ−ＣＥＸ精製ステップを、段階勾配を使用し、図３３８に示す専用緩衝液を用いて実行した。
−ＡＥＸステップ−ＡＥＸ精製ステップを、図３３９に示すように、６０カラム体積（ＣＶ）で０から１００％の移動相Ｂ、続いて１０ＣＶ、１００％のＭＰＣに段階的に移る線形勾配を使用して実行した。
【０７１４】
分析ラン：
−フィンガープリント−５０ＣＶで０から３５％の移動相Ｂ、続いて５ＣＶで３５から１００％の線形勾配、ＣＩＭａｃ（商標）Ａｄｅｎｏ−０．１カラムを使用した。
−トータル−５０ＣＶでの０から１００％の移動相Ｂの線形勾配、ＣＩＭａｃ（商標）ＳＯ３−０．１カラムを使用した。
−空／フル−５０カラム体積（ＣＶ）で０から４０％の移動相、続いて１０ＣＶで４０から１００％の線形勾配、ＣＩＭａｃ（商標）Ａｄｅｎｏ−０．１を使用した。
【０７１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０７１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、製造元の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従って還元条件下で４〜２０％の勾配ゲルを使用してＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により実行した。ゲルを、不連続Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝システムを使用して、２００Ｖで３５分間泳動させた。タンパク質バンドを、Ｐｌｕｓ  ｏｎｅ  Ｓｉｌｖｅｒ染色試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって視覚化した。１０〜２００ｋＤａの分子量標準を使用した（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ、Ｔｈｅｒｍｏｓ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。各回、適切に希釈された２０ｕｌの試料をウェルにロードした。
【０７１７】
ＴＥＭ
【０７１８】
試料を、逆染色法を使用するＴＥＭによる検査のために調製した。解凍した試料を緩徐に混合し、グロー放電したばかりのコッパーグリッド（４００メッシュ、ホルムバール−炭素コーティング）に５分間適用し、洗浄し、１滴の酢酸ウラニルの１％（ｗ／ｖ）水溶液１滴で染色した。
【０７１９】
透過電子顕微鏡Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ  １００（ＦＥＩ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を８０ｋＶで操作して、グリッドを観察した。少なくとも１０個のグリッド正方形をくまなく検査し、数枚の顕微鏡写真（カメラＯＲＩＵＳ  ＳＣ  ２００、Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．）を撮影して、フル粒子と空粒子との間の比を評価した。顕微鏡写真は、グリッド上の異なる場所で同時に撮影した。
【０７２０】
ｄｄＰＣＲ
【０７２１】
試料（及び対照）をＤＮＡｚｅ処理し、２連で３点希釈した（各試料につき６回の反応）。反応混合物：ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）。反応体積：２０ｕＬ、ＤＮＡ体積５ｕＬ、液滴体積０．０００７３９。使用した機器：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００（商標）ＡｕｔｏＤＧ（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ  ＨＤ。使用したプライマー及びプローブは、検出された標的に基づいて決定した。
【０７２２】
結果及び考察
【０７２３】
マクロ多孔性ＯＨカラムＨＰＬＣ分析法を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）上の捕捉ステップ
【０７２４】
分取ラン
【０７２５】
清澄化した採取材料（各々０．６Ｌを含む２本のボトルに分けた１．２Ｌ）を室温で解凍し、プールし、希釈緩衝液で１：１（１．２Ｌの採取物＋１．２Ｌの緩衝液）に希釈した。システムポンプを５ＣＶ／分で使用してカラムにロードする。ランは、ＨＩＣ条件について第８のラン（ＨＩＣ−８）であった。図３４０は、分取ラン条件を詳述する。図３４１Ａ及びＢは、ランＨＩＣ−８からのクロマトグラムを示す。
【０７２６】
ＨＰＬＣトータル分析
【０７２７】
クロマトグラフィー回収率を決定するために、全粒子法をＨＰＬＣで使用した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５を使用して、画分を脱塩した。主溶出液を、注入前にさらに１０倍希釈した。図３４２Ａ〜Ｊは、ＨＰＬＣ分析に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図３４２Ｊから、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｗ２、Ｅ１、及びＷ３中で溶出することが確認される。図３４２Ｊ（重ね合わせ）を観察すると、画分Ｗ２とＷ３との両方に、主なＥ１溶出と比較して、他のタンパク質不純物が存在することが観察された。画分Ｅ１は他の２つと比較して１０倍希釈されているため、溶出液を取り巻く画分中のベクターの損失はごくわずかであったことも考慮する必要がある。ピークの面積をロード及び採取面積のピークと比較して、回収率を決定した。
【０７２８】
分取ランの回収
【０７２９】
清澄化された出発採取材料と比較した捕捉ステップＨＩＣ−ＯＨの回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）について、それぞれ、７６％及び７１％であった。他の検出器（Ａ２６０、Ａ２８０、ＦＬＤ）における他の方法間の不一致は、主に、試料中の高塩濃度が原因で生じ、さらに、両方の場合で物質収支が１００％ではないため、２つ（ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ））を正規化するとより正確な結果が得られ、主画分中、ＡＡＶの回収率は平均７２％＋２％である。図３４３は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づくＨＩＣ−８ランの回収率を詳述する。図３４４は、実験ＢのＨＩＣ−８ランについての代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図３４４は、ＡＡＶの濃度を描出し、清澄化された採取材料からの捕捉が成功していた。ＨＩＣステップ後の主な溶出は、高度に濃縮されていたが、次のクロマトグラフィーステップＣＥＸ−ＳＯ３で除去されたタンパク質不純物を多く有した。
【０７３０】
ＳＯ３カラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）上の中間研磨
【０７３１】
ＨＩＣ−ＯＨからの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように調製し、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムにロードした（ＳＯ３−７）。図３４５は、ランのパラメータについての詳細を提供する。図３４６Ａ及びＢは、ランＳ０３−７からのクロマトグラムを提供する。図３４７Ａ〜Ｊは、ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づくクロマトグラムを提供する。図３４７Ａ〜Ｊから、全てのＡＡＶがカラムに結合し、画分Ｅ１及びＷ３中で溶出することを確認することができる。画分Ｅ１はＷ３と比較して５倍希釈されていたため、Ｗ３中のベクターの損失はごくわずかであったことも考慮する必要がある。ピークの面積をロード及び初期ＨＩＣ−８  Ｒ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。図３４８は、分取ランＳＯ３−７についてのｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析に基づく回収率を提供する。出発ＨＩＣ−８Ｅ１材料と比較した中間研磨ステップＣＥＸ−ＳＯ３の回収率は、ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ）について、それぞれ９０％及び８６％であった。２つの方法間の不一致はわずかであった。ＨＰＬＣ分析の場合、質量収支は１００％ではなかった。２つ（ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣトータル分析（ＭＡＬＳ））の結果の正規化によって、より正確な値がもたらされ、主画分におけるＡＡＶの回収率は平均９７％であった。
【０７３２】
ＨＰＬＣトータル分析
【０７３３】
クロマトグラフィー回収率を決定するために、全粒子法をＨＰＬＣで使用した。画分Ｅ１を注射前に５倍希釈した。
【０７３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０７３５】
全ての画分を、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。図３４９は、ＡＡＶのさらなる濃度を描出し、これは、ＨＩＣからＣＥＸステップまで８倍低いカラムサイズを使用したためである。ＨＩＣステップ後の主な溶出には、ＨＩＣからＣＥＸのステップ以外に他のタンパク質不純物が存在する。洗浄３では、ＡＡＶバンドのごく一部が可視である。宿主細胞タンパク質の大部分を、ＣＩＰを用いたストリップにより除去する。
【０７３６】
ＣＩＭ  ＱＡカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）上での空及びフルＡＡＶキャプシド分離
【０７３７】
分取ラン
【０７３８】
ＳＯ３−７からの全溶出（Ｅ１）を結合条件に一致するように希釈し、ＡＥＸ−ＱＡカラムにロードした。このランは、ＡＥＸ条件の第３のランであった（ＱＡ−３）。図３５０は、分取ラン条件を詳述する。図３５１Ａ及びＢは、ランＳＯ３−７からの例示的なクロマトグラムを示す。
【０７３９】
ＨＰＬＣトータル分析
【０７４０】
クロマトグラフィー回収率及び純度（Ｅ．Ｆキャプシドの比）を決定するために、空−フル法をＨＰＬＣで使用した。画分を注入前に希釈した。図３５２Ａ〜Ｈは、ＨＰＬＣ分析−ＳＯ３−７のトータル法に基づく例示的なクロマトグラムを示す。図３５２Ａ〜Ｈから、ＦＴ＋Ｗ画分にピークが見られなかったため、全てのＡＡＶがカラムに結合することを確認することができる。電荷のわずかな差異により、空キャプシドが最初に溶出し始め（Ｅ２）、続いてＥ３に見出されるフルキャプシドが溶出する。このＡ２６０／Ａ２８０比の差異により、ＡＡＶが空またはフルキャプシド中で純粋であることが確認される。Ａ２６０／Ａ２８０比の０．６の値は、主にタンパク質組成の空キャプシドに対応し、ここでは、ＤＮＡ挿入を有するフルキャプシドは、純度に応じて１．３以上の値を付与する。次の溶出ピークからの空キャプシド汚染に起因して純度が低くなったため、画分Ｅ４を個別に収集した。Ｅ５画分は、主に、空キャプシド、凝集キャプシド、及び損傷キャプシド（２つのピーク）であり、Ｅ６画分にはＡＡＶ溶出はない。ピークの面積をロード及び初期ＳＯ３−７  Ｅ１材料のピークと比較して、回収率を決定した。
【０７４１】
透析
【０７４２】
緩衝液交換を、ＱＡ−３  Ｅ３試料に透析を導入することによって達成した。透析方法の詳細は図３５３に提供する。試料の最終体積は３ｍＬであった。
【０７４３】
分取ランの回収
【０７４４】
分取ランについての回収率は、図３５４Ａ〜Ｃに要約する。出発ＳＯ３−７  Ｅ１材料と比較したフルキャプシド富化ステップ（空とフルとの分離）ステップＡＥＸ−ＱＡの回収率は、ｄｄＰＣＲについて７２％、ＭＡＬＳ検出に基づくＨＰＬＣトータル分析について６１％であった（図３５４Ａ）。両方の場合（ｄｄＰＣＲ及びＨＰＬＣ分析）において、質量収支は１００％に達していなかった。主画分のパーセンテージを対応する検出器／アッセイの物質収支パーセンテージに正規化すると、８３％＋３％の値が得られた。透析後におよそ６１％の回収率が得られた（試料損失（０．６６ｍＬ）は考慮していない）。
【０７４５】
初期容量及び最終容量、ならびにそれらのゲノム値のみに基づいて、２８％（透析後）または４５％（ＱＡ主画分）のＤＳＰ収率が得られたが、各精製ステップ後の主画分のサンプリングでは、最終体積が少ない小規模での全体的な回収に大きな影響があった。ＤＳＰ収率のより正確な値を、各精製ステップ後の損失を考慮することによって達成した。正規化した値（図３５４Ｃ）を考慮することで、総ＤＳＰ収率は、クロマトグラフィーステップ後におよそ５８％、透析後に４２％に達した。
【０７４６】
純度
【０７４７】
図３５５は、ＭＡＬＳ及びＦＬＤの両方を考慮する場合、主Ｅ３画分の純度（フルキャプシドのパーセンテージ）がおよそ１００％であったことを示す。両方の吸光度の消衰係数が不明であるため、ＭＡＬＳが、粒子の直径を測定するものであることを理由に、より信頼できる検出器となる。次は精度に関するＦＬＤであった。比が８０〜８３％でしかなかった平均ピーク溶出（画分Ｅ４）の底部で、比が変化する。３．５％ＣＶ（およそ８０％のピーク）の収集にとどまる理由は、Ｅ３でより高い純度を達成し、ベクター（Ｅ４）の損失をわずか（１１％−図３５４Ａ〜Ｃ）のみにするためであった。
【０７４８】
純度を、ＳＯ３中間ステップ後の比、ＱＡ−３  Ｅ３（フルキャプシド）、及び透析後の最終試料（フルＡＡＶ）について、ＴＥＭによって追加で試験した。全てのグリッドは観察に適した品質を示し、ＳＯ３−７  Ｅ１、フルＡＡＶ、及びＱＡ−３  Ｅ３の３つの試料は全て、透明であり、不純物も粒子の凝集もなかった。試料ＳＯ３−７Ｅ１には、フル粒子は５０％しか含まれていなかったが、他の２つの試料のフル粒子のパーセンテージはより高かった（試料フルＡＡＶで７９％、試料ＱＡ−３  Ｅ３で８８％；図３５６）。図３５７は、ＴＥＭによって評価した、ＳＯ３−７  Ｅ１（上、Ａ及びＢ）、ＱＡ−３  Ｅ３（中央、Ｃ及びＤ）、及び透析後（下、Ｅ及びＦ）を示す。左（Ａ、Ｃ、及びＥ）：低倍率、右（Ｂ、Ｄ、及びＦ）：計数に使用した倍率。
【０７４９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０７５０】
全ての画分を、純でまたは還元条件下で希釈してゲルにロードした。図３５８は、Ｅ２からＥ５までの全ての画分にＡＡＶが含まれていることを描出する。Ｅ３及びＥ４画分に存在する２００ｋＤａマークを超えるタンパク質バンドは、フルキャプシドにのみ見出されるＤＮＡ挿入に対応し、これら２つの画分にフルキャプシドが含まれることを示し、このことは、ＨＰＬＣ  Ｅ／Ｆ分析結果を補完する。他のタンパク質不純物は、ＶＰ１−ＶＰ３以外のＥ３画分に見出される。これらの不純物は透析（ＡＡＶ８−ＰＤ）によって除去されなかったが、ＭＷＣＯ  １００ｋＤａのＴＦＥを使用したより大規模なものでは、追加のバンドが首尾よく除去されることが期待された。
【０７５１】
ＨＰＬＣ分析−フィンガープリント法
【０７５２】
図３５９Ａ及びＢは、不純物の大部分がＨＩＣステップによって除去されたことを示す（図３５９Ａ）。試料をＣＥＸ−ＳＯ３での研磨によってさらに精製した。この段階からの溶出液は、主に純粋であり、極めて濃縮されていたが、依然として空キャプシドとフルキャプシドとの両方で構成された。最後のＡＥＸ−ＱＡステップは、２つのキャプシドを分離し、その結果、フルキャプシドを隔離し富化した。採取材料をＱＡ主画分と比較することにより、ＡＡＶピークを出発材料から同定した。
【０７５３】
結論
【０７５４】
清澄化した採取物を出発材料として使用して、下流の精製ランを実行した。
【０７５５】
ＡＡＶの捕捉及び濃縮をＨＩＣ−ＯＨステップによって達成し、このステップでは、タンパク質がフロースルーで見出され、ＡＡＶがカラムに結合した。タンパク質不純物を、Ｗ２画分またはＷ３画分のいずれかにおいて除去した。ＨＩＣステップ後に主溶出画分（Ｅ１）に残留しているタンパク質不純物の大部分を、ＣＥＸ−ＳＯ３カラムを使用する中間研磨ステップによって除去した。このステップでは、８倍小さいカラムスケールを導入して、ＡＡＶの追加の濃縮を達成した。この段階でのフルキャプシドのパーセンテージは、およそ５０〜６５％であったため、ＡＥＸ−ＱＡを使用するフル粒子富化を実行した。フルキャプシドを空キャプシドから分離した後、製剤緩衝液中への緩衝液交換を、透析を使用して実行した。清澄化した採取物から透析の完了までの下流プロセス全体の収率は４２％（クロマトグラフィーステップ後−５８％）であり、およそ９０％のフルＡＡＶキャプシドという純度に達した。本プロセスは、製造規模で機能することに成功した。
【０７５６】
参照による組込み
あらゆる相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書に引用された全ての文献は、明示的に除外されない限り、または特に限定されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いずれの文献の引用も、それが、本明細書に開示、もしくは特許請求された任意の発明に関する先行技術であること、または、それ単独で、もしくは任意の他の文献との任意の組み合わせで、任意のそのような発明を教示、示唆、もしくは開示することを認めるものではない。さらに、本文書中の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文献における同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する限りにおいて、本文書中でその用語に割り当てられた意味または定義が適用されるものとする。
【０７５７】
他の実施形態
本開示の特定の実施形態を図示し、説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を哺乳動物宿主細胞培養物から精製する方法であって、
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して複数のｒＡＡＶ粒子を精製して、前記複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記ＨＩＣ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を介して精製して、複数のｒＡＡＶ粒子を含むＣＥＸ溶出液を生成するステップと、
（ｃ）複数のフルｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって（ｂ）の前記ＣＥＸ溶出液から精製して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸ溶出液を生成するステップと、
（ｄ）（ｃ）からの前記ＡＥＸ溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過し濃縮して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び最終製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記方法が、
複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞とウイルス放出溶液とを、前記複数のｒＡＡＶ粒子を採取培地に放出するのに好適な条件下で接触させて、複数のｒＡＡＶ粒子、ウイルス放出溶液、及び採取培地を含む組成物を生成するステップと、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して前記複数のｒＡＡＶ粒子を前記組成物から精製して、前記複数のｒＡＡＶ粒子を含むＨＩＣ溶出液を生成するステップと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記方法が、
複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、採取培地中で培養するステップをさらに含み、前記接触させるステップの前に、前記複数の哺乳動物宿主細胞が、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされて、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記採取培地が、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、安定化グルタミン、安定化グルタミンジペプチド、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅのうちの１つ以上を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記採取培地が、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、
Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩脱水物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記採取培地が、４ｍＭの安定化グルタミンまたは安定化グルタミンジペプチドを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記採取培地が、無血清培地を含む、項目３〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記採取培地が、無血清培地からなる、項目３〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記採取培地が、無タンパク質培地を含む、項目３〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記採取培地が、無タンパク質培地からなる、項目３〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記採取培地が、清澄化培地を含む、項目３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記採取培地が、清澄化培地からなる、項目３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記外来配列が、
（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列と、
（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列と、
（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列と、を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ロドプシンキナーゼプロモーターが、ＧＲＫ１プロモーターである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする前記配列が、コドン最適化ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む、項目１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＢＧＨポリＡシグナルをコードする前記配列が、
１  ｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記外来配列が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記外来配列が、プロモーターをコードする配列をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記外来配列が、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターをコードする配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＲＫプロモーターがＧＲＫ１プロモーターである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記外来配列が、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターをコードする配列をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記ＣＢＡプロモーターをコードする前記配列が、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番１６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれらからなる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、ヒトＡＢＣＡ４配列である、項目２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列から誘導される、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記５’ＩＴＲをコードする配列及び前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１〜３４または３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記外来配列が、コザック配列をコードする配列をさらに含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記コザック配列が、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列を含む前記プラスミドベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする前記配列及び前記ウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列が、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離または誘導される配列を含む、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記哺乳動物宿主細胞が、ポリマー、リン酸カルシウム、脂質、及び細胞膜を横断することが可能なベクターのうちの１つ以上を含む組成物でトランスフェクトされている、項目２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞膜を横断することが可能なベクターが、リポソーム、ミセル、またはナノ粒子を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ナノ粒子が、炭素、ケイ素、または金を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記ナノ粒子が、ポリマーを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ウイルス放出溶液が、塩及び高ｐＨを含む、項目２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記塩が、ＮａＣｌを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記高ｐＨが、７．１以上のｐＨを含む、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記高ｐＨが、９．０以上のｐＨを含む、項目４１または４２に記載の方法。
（項目５１）
複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件が、前記哺乳動物宿主細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１８時間インキュベートすることを含む、項目２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件が、前記哺乳動物宿主細胞を１０％ＣＯ２以下のＣＯ２レベルでインキュベートすることを含む、項目２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
（ａ）のＨＩＣステップが、
（ｉ）ＨＩＣクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記ＨＩＣクロマトグラム上の画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む前記ＨＩＣ溶出液を生成するステップと、を含む、項目１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記ＨＩＣクロマトグラムを生成する前に、前記採取培地を高塩濃度緩衝液中に希釈することをさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
前記段階勾配は、各段階勾配で塩濃度が低下する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記（ｂ）のＣＥＸステップが、
（ｉ）ＣＥＸクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）ｒＡＡＶ粒子を含む前記ＣＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むＣＥＸ溶出物を生成するステップと、をさらに含む、項目１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ＣＥＸクロマトグラフィーが、ＳＯ３−陽イオン交換マトリックスを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記ＣＥＸクロマトグラムを生成する前に、前記ＨＩＣ溶出液を低塩濃度緩衝液に調整することをさらに含む、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記調整が、希釈ステップを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記調整ステップが、ＴＦＦステップを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記ＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ＴＦＦステップが、７０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記ＴＦＦステップが、５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
前記ＴＦＦステップが、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ｋＤａのＨＦＦ、またはそれらの間の任意の数のｋＤａを使用して実行される、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
前記ＨＩＣ溶出液のｐＨが、両端を含めてｐＨ３．０〜ｐＨ４．０に調整される、項目５７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記ＨＩＣ溶出液のｐＨが、両端を含めてｐＨ３．５〜ｐＨ３．７に調整される、項目５７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ＨＩＣ溶出液を濾過することをさらに含む、項目５７〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記ＨＩＣ溶出液を濾過することが、０．８／０．４５μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、項目５７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記段階勾配が、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記複数のｒＡＡＶ粒子が、線形勾配を使用して溶出される、項目５７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記線形勾配が、ｐＨ勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ＣＥＸ溶出液の前記ｐＨを中和することをさらに含む、項目５７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記中和されたＣＥＸ溶出液の前記ｐＨが、ｐＨ９．０である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記（ｃ）のＡＥＸクロマトグラフィーステップが、
（ｉ）ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、
（ｉｉ）フルｒＡＡＶ粒子を含む前記ＡＥＸクロマトグラムからの画分を選択して、精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む前記ＡＥＸ溶出液を生成するステップと、をさらに含む、項目１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記ＡＥＸクロマトグラフィーが、陰イオン交換（ＱＡ）マトリックスを含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記ＡＥＸクロマトグラムを生成する前に、前記ＣＥＸ溶出液を低塩濃度緩衝液に調整することをさらに含む、項目７６または７７に記載の方法。
（項目７９）
前記調整が、希釈ステップを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記調整ステップが、ＴＦＦステップを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記調整ステップが、第１のＴＦＦステップ及び第２のＴＦＦステップを含む、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記ＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記第１及び第２のＴＦＦステップ両方が、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記希釈されたＣＥＸ溶出液が、ｐＨ９．０である、項目７８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子が、線形勾配を使用して溶出される、項目７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子が、段階勾配を使用して溶出される、項目７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子を含む前記溶出液の前記ｐＨを中和することをさらに含む、項目７６〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記（ｄ）のＴＦＦステップが、１００ｋＤａの中空繊維フィルタ（ＨＦＦ）を使用して実行される、項目１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記方法が第２のＴＦＦをさらに含み、前記第１及び第２のＴＦＦステップ両方が、１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記最終製剤緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む、項目１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記最終製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記最終製剤緩衝液が、ポロキサマー１８８を０．００１％でさらに含む、項目９０または９１に記載の方法。
（項目９３）
プルロニック（登録商標）Ｆ−６８を前記最終組成物に添加することをさらに含む、項目１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記精製され富化された複数のフルｒＡＡＶ粒子及び前記最終製剤緩衝液を含む前記最終組成物が、−８０℃で凍結される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
項目１〜９４のいずれか一項に記載の方法により産生された複数のｒＡＡＶ粒子を含む、組成物。
（項目９６）
前記組成物が、
（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び
（ｂ）３０％未満の空キャプシドを含む、項目９５に記載の組成物。
（項目９７）
前記組成物が、
（ａ）両端を含めて０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬ、及び
（ｂ）２５％未満の空キャプシドを含む、項目９５に記載の組成物。
（項目９８）
前記組成物が、約０．５×１０１１ｖｇ／ｍＬを含む、項目９６または９７に記載の組成物。
（項目９９）
前記組成物が、約１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬを含む、項目９６または９７に記載の組成物。
（項目１００）
前記組成物が、約５×１０１２ｖｇ／ｍＬを含む、項目９６または９７に記載の組成物。
（項目１０１）
前記複数のｒＡＡＶの一部分が、機能的ベクターゲノムを含み、各機能的ベクターゲノムが、形質導入後に細胞中で外来配列を発現することができる、項目９６〜１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０２）
機能的ベクターゲノムを含む前記複数のｒＡＡＶの前記部分が、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して２倍の増加で前記外来配列を発現する、項目１０１に記載の組成物。
（項目１０３）
機能的ベクターゲノムを含む前記複数のｒＡＡＶの前記部分が、形質導入されていない細胞中の対応する内在配列の発現のレベルと比較して、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはそれらの間の任意の他の倍増値の増加で前記外来配列を発現する、項目１０１に記載の組成物。
（項目１０４）
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でない、項目１０１〜１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０５）
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でないが、前記外来配列によってコードされるタンパク質と前記内在配列によってコードされるタンパク質とが同一である、項目１０２または１０３に記載の組成物。
（項目１０６）
前記外来配列及び前記対応する内在配列が、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、項目１０４または１０５に記載の組成物。
（項目１０７）
前記外来配列が、前記内在配列と比較してコドン最適化されている、項目９５〜１０６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０８）
前記外来配列及び前記対応する内在配列が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、項目１０７に記載の組成物。
（項目１０９）
前記組成物を用いた細胞の形質導入後に、前記外来配列がタンパク質をコードする、項目９５〜１０８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１０）
前記外来配列によってコードされる前記タンパク質が、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する、項目１０９に記載の組成物。
（項目１１１）
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一である、項目１１０に記載の組成物。
（項目１１２）
前記外来配列と前記対応する内在配列とが同一でない、項目１１０に記載の組成物。
（項目１１３）
前記外来配列と前記対応する内在配列とが、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれらの間の任意のパーセンテージの同一性を有する、項目１１２に記載の組成物。
（項目１１４）
前記組成物を用いた細胞の形質導入後に、前記外来配列がタンパク質をコードする、項目９５〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１５）
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１または約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、それぞれ、約１：１：１、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、項目３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約３：１：１のモル比で提供され、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、項目３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、それぞれ、約１０：１：１のモル比で提供され、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、項目３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
外来配列を含む前記プラスミドベクター（ｐＩＴＲ）と前記ヘルパープラスミドベクター（ｐＨＥＬＰ）とのモル比が、１：１〜２０：１９であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、項目３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記ｐＩＴＲとウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクター（ｐＲＥＰＣＡＰ）とのモル比が、１：１〜２０：１９であり、任意選択で、前記細胞が、ＰＥＩを使用してトランスフェクトされている、項目３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下での採取培地における複数の哺乳動物宿主細胞の前記培養が、トランスフェクション剤の存在下での培養を含む、項目１１５〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記トランスフェクション剤がリン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）である、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記トランスフェクション剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２３）
前記トランスフェクション剤が、ＰＥＩ及びＤＮＡを、それぞれ、約５：１〜約１：１（ｍＬ：ｍｇ）、任意選択で、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、または約２：１の比で含む、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記トランスフェクション剤が、ＰＥＩ及びＤＮＡを含み、前記ＤＮＡが、外来配列を含むプラスミドベクター、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクター、ならびにヘルパープラスミドを、それぞれ、約０．５：１：１〜約１０：１：１または約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で含む、項目１２２または１２３に記載の方法。
（項目１２５）
組換えＡＡＶベクターを産生させる方法であって、哺乳動物宿主細胞を、
（ｉ）外来配列を含むプラスミドベクターと、
（ｉｉ）ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターと、
（ｉｉｉ）ヘルパープラスミドベクターと、を用いてトランスフェクトすることを含み、
前記哺乳動物宿主細胞を、前記外来配列を含む前記プラスミドベクター、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクター、ならびに前記ヘルパープラスミドを、それぞれ、約１：１：１〜約１０：１：１、任意選択で、約２：１：１、約３：１：１、約４：１：１、約５：１：１、約６：１：１、約７：１：１、約８：１：１、約９：１：１、または約１０：１：１のモル比で含むトランスフェクション培地と接触させる、前記方法。
（項目１２６）
前記トランスフェクション培地が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びＣａＰＯ４から選択されるトランスフェクション剤を含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記トランスフェクション剤がＰＥＩであり、前記トランスフェクション培地が、ＰＥＩ及びＤＮＡを、約５：１〜約１：１、約２：１〜約４：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の比で含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記外来配列が、
（ａ）ロドプシンキナーゼプロモーターをコードする配列と、
（ｂ）網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子ＯＲＦ１５アイソフォーム（ＲＰＧＲＯＲＦ１５）をコードする配列と、
（ｃ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列と、を含む、項目１２５〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記ロドプシンキナーゼプロモーターが、ＧＲＫ１プロモーターである、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記ＧＲＫ１プロモーターをコードする前記配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする前記配列が、コドン最適化ヒトＲＰＧＲＯＲＦ１５配列である、項目１２８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ＭＲＥＰＥＥＬＭＰＤ  ＳＧＡＶＦＴＦＧＫＳ  ＫＦＡＥＮＮＰＧＫＦ  ＷＦＫＮＤＶＰＶＨＬ  ＳＣＧＤＥＨＳＡＶＶ  ＴＧＮＮＫＬＹＭＦＧ
６１  ＳＮＮＷＧＱＬＧＬＧ  ＳＫＳＡＩＳＫＰＴＣ  ＶＫＡＬＫＰＥＫＶＫ  ＬＡＡＣＧＲＮＨＴＬ  ＶＳＴＥＧＧＮＶＹＡ  ＴＧＧＮＮＥＧＱＬＧ
１２１  ＬＧＤＴＥＥＲＮＴＦ  ＨＶＩＳＦＦＴＳＥＨ  ＫＩＫＱＬＳＡＧＳＮ  ＴＳＡＡＬＴＥＤＧＲ  ＬＦＭＷＧＤＮＳＥＧ  ＱＩＧＬＫＮＶＳＮＶ
１８１  ＣＶＰＱＱＶＴＩＧＫ  ＰＶＳＷＩＳＣＧＹＹ  ＨＳＡＦＶＴＴＤＧＥ  ＬＹＶＦＧＥＰＥＮＧ  ＫＬＧＬＰＮＱＬＬＧ  ＮＨＲＴＰＱＬＶＳＥ
２４１  ＩＰＥＫＶＩＱＶＡＣ  ＧＧＥＨＴＶＶＬＴＥ  ＮＡＶＹＴＦＧＬＧＱ  ＦＧＱＬＧＬＧＴＦＬ  ＦＥＴＳＥＰＫＶＩＥ  ＮＩＲＤＱＴＩＳＹＩ
３０１  ＳＣＧＥＮＨＴＡＬＩ  ＴＤＩＧＬＭＹＴＦＧ  ＤＧＲＨＧＫＬＧＬＧ  ＬＥＮＦＴＮＨＦＩＰ  ＴＬＣＳＮＦＬＲＦＩ  ＶＫＬＶＡＣＧＧＣＨ
３６１  ＭＶＶＦＡＡＰＨＲＧ  ＶＡＫＥＩＥＦＤＥＩ  ＮＤＴＣＬＳＶＡＴＦ  ＬＰＹＳＳＬＴＳＧＮ  ＶＬＱＲＴＬＳＡＲＭ  ＲＲＲＥＲＥＲＳＰＤ
４２１  ＳＦＳＭＲＲＴＬＰＰ  ＩＥＧＴＬＧＬＳＡＣ  ＦＬＰＮＳＶＦＰＲＣ  ＳＥＲＮＬＱＥＳＶＬ  ＳＥＱＤＬＭＱＰＥＥ  ＰＤＹＬＬＤＥＭＴＫ
４８１  ＥＡＥＩＤＮＳＳＴＶ  ＥＳＬＧＥＴＴＤＩＬ  ＮＭＴＨＩＭＳＬＮＳ  ＮＥＫＳＬＫＬＳＰＶ  ＱＫＱＫＫＱＱＴＩＧ  ＥＬＴＱＤＴＡＬＴＥ
５４１  ＮＤＤＳＤＥＹＥＥＭ  ＳＥＭＫＥＧＫＡＣＫ  ＱＨＶＳＱＧＩＦＭＴ  ＱＰＡＴＴＩＥＡＦＳ  ＤＥＥＶＥＩＰＥＥＫ  ＥＧＡＥＤＳＫＧＮＧ
６０１  ＩＥＥＱＥＶＥＡＮＥ  ＥＮＶＫＶＨＧＧＲＫ  ＥＫＴＥＩＬＳＤＤＬ  ＴＤＫＡＥＶＳＥＧＫ  ＡＫＳＶＧＥＡＥＤＧ  ＰＥＧＲＧＤＧＴＣＥ
６６１  ＥＧＳＳＧＡＥＨＷＱ  ＤＥＥＲＥＫＧＥＫＤ  ＫＧＲＧＥＭＥＲＰＧ  ＥＧＥＫＥＬＡＥＫＥ  ＥＷＫＫＲＤＧＥＥＱ  ＥＱＫＥＲＥＱＧＨＱ
７２１  ＫＥＲＮＱＥＭＥＥＧ  ＧＥＥＥＨＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＤＲＥＥＥＥＥ  ＫＥＧＥＧＫＥＥＧＥ  ＧＥＥＶＥＧＥＲＥＫ  ＥＥＧＥＲＫＫＥＥＲ
７８１  ＡＧＫＥＥＫＧＥＥＥ  ＧＤＱＧＥＧＥＥＥＥ  ＴＥＧＲＧＥＥＫＥＥ  ＧＧＥＶＥＧＧＥＶＥ  ＥＧＫＧＥＲＥＥＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
８４１  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＥＥＥＧＥＧＫＧＥＥ  ＥＧＥＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＥＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＧＥＧＥＥＥ  ＧＥＧＥＧＥＥＥＥＧ
９０１  ＥＧＥＧＥＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＫ  ＧＥＥＥＧＥＥＧＥＧ  ＥＧＥＥＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＤＧＥＧＥＧＥＥ  ＥＥＧＥＷＥＧＥＥＥ
９６１  ＥＧＥＧＥＧＥＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＧＥＧＥ  ＧＥＥＥＥＧＥＧＥＧ  ＥＥＥＥＧＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＧＥＥＥＧＥ  ＧＥＧＥＥＥＥＥＧＥ
１０２１  ＶＥＧＥＶＥＧＥＥＧ  ＥＧＥＧＥＥＥＥＧＥ  ＥＥＧＥＥＲＥＫＥＧ  ＥＧＥＥＮＲＲＮＲＥ  ＥＥＥＥＥＥＧＫＹＱ  ＥＴＧＥＥＥＮＥＲＱ
１０８１  ＤＧＥＥＹＫＫＶＳＫ  ＩＫＧＳＶＫＹＧＫＨ  ＫＴＹＱＫＫＳＶＴＮ  ＴＱＧＮＧＫＥＱＲＳ  ＫＭＰＶＱＳＫＲＬＬ  ＫＮＧＰＳＧＳＫＫＦ
１１４１  ＷＮＮＶＬＰＨＹＬＥ  ＬＫ（配列番号７８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記ＲＰＧＲＯＲＦ１５をコードする配列が、
１  ａｔｇａｇａｇａｇｃ  ｃａｇａｇｇａｇｃｔ  ｇａｔｇｃｃａｇａｃ  ａｇｔｇｇａｇｃａｇ  ｔｇｔｔｔａｃａｔｔ  ｃｇｇａａａａｔｃｔ
６１  ａａｇｔｔｃｇｃｔｇ  ａａａａｔａａｃｃｃ  ａｇｇａａａｇｔｔｃ  ｔｇｇｔｔｔａａａａ  ａｃｇａｃｇｔｇｃｃ  ｃｇｔｃｃａｃｃｔｇ
１２１  ｔｃｔｔｇｔｇｇｃｇ  ａｔｇａｇｃａｔａｇ  ｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃ  ａｃｔｇｇｇａａｃａ  ａｔａａｇｃｔｇｔａ  ｃａｔｇｔｔｃｇｇｇ
１８１  ｔｃｃａａｃａａｃｔ  ｇｇｇｇａｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇｃｔｇｇｇａ  ｔｃｃａａａｔｃｔｇ  ｃｔａｔｃｔｃｔａａ  ｇｃｃａａｃｃｔｇｃ
２４１  ｇｔｇａａｇｇｃａｃ  ｔｇａａａｃｃｃｇａ  ｇａａｇｇｔｃａａａ  ｃｔｇｇｃｃｇｃｔｔ  ｇｔｇｇｃａｇａａａ  ｃｃａｃａｃｔｃｔｇ
３０１  ｇｔｇａｇｃａｃｃｇ  ａｇｇｇｃｇｇｇａａ  ｔｇｔｃｔａｔｇｃｃ  ａｃｃｇｇａｇｇｃａ  ａｃａａｔｇａｇｇｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ
３６１  ｃｔｇｇｇｇｇａｃａ  ｃｔｇａｇｇａａａｇ  ｇａａｔａｃｃｔｔｔ  ｃａｃｇｔｇａｔｃｔ  ｃｃｔｔｃｔｔｔａｃ  ａｔｃｔｇａｇｃａｔ
４２１  ａａｇａｔｃａａｇｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｃｔｃｃａａｃ  ａｃａｔｃｔｇｃａｇ  ｃｃｃｔｇａｃｔｇａ  ｇｇａｃｇｇｇｃｇｃ
４８１  ｃｔｇｔｔｃａｔｇｔ  ｇｇｇｇａｇａｔａａ  ｔｔｃａｇａｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｔｇｇｇｃ  ｔｇａａａａａｃｇｔ  ｇａｇｃａａｔｇｔｇ
５４１  ｔｇｃｇｔｃｃｃｔｃ  ａｇｃａｇｇｔｇａｃ  ｃａｔｃｇｇａａａｇ  ｃｃａｇｔｃａｇｔｔ  ｇｇａｔｔｔｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔａｃｔａｔ
６０１  ｃａｔａｇｃｇｃｃｔ  ｔｃｇｔｇａｃｃａｃ  ａｇａｔｇｇｃｇａｇ  ｃｔｇｔａｃｇｔｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａｇｃｃ  ｃｇａａａａｃｇｇａ
６６１  ａａａｃｔｇｇｇｃｃ  ｔｇｃｃｔａａｃｃａ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃ  ａａｔｃａｃｃｇｇａ  ｃａｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇｇｔｇｔｃｃｇａｇ
７２１  ａｔｃｃｃｔｇａａａ  ａａｇｔｇａｔｃｃａ  ｇｇｔｃｇｃｃｔｇｃ  ｇｇｇｇｇａｇａｇｃ  ａｔａｃａｇｔｇｇｔ  ｃｃｔｇａｃｔｇａｇ
７８１  ａａｔｇｃｔｇｔｇｔ  ａｔａｃｃｔｔｃｇｇ  ａｃｔｇｇｇｃｃａｇ  ｔｔｔｇｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇ  ａａｃｃｔｔｃｃｔｇ
８４１  ｔｔｔｇａｇａｃａｔ  ｃｃｇａａｃｃａａａ  ａｇｔｇａｔｃｇａｇ  ａａｃａｔｔｃｇｃｇ  ａｃｃａｇａｃｔａｔ  ｃａｇｃｔａｃａｔｔ
９０１  ｔｃｃｔｇｃｇｇａｇ  ａｇａａｔｃａｃａｃ  ｃｇｃａｃｔｇａｔｃ  ａｃａｇａｃａｔｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔａ  ｔａｃｃｔｔｔｇｇｃ
９６１  ｇａｔｇｇａｃｇａｃ  ａｃｇｇｇａａｇｃｔ  ｇｇｇａｃｔｇｇｇａ  ｃｔｇｇａｇａａｃｔ  ｔｃａｃｔａａｔｃａ  ｔｔｔｔａｔｃｃｃｃ
１０２１  ａｃｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｃｔａａｃｔｔｃｃｔ  ｇｃｇｇｔｔｃａｔｃ  ｇｔｇａａａｃｔｇｇ  ｔｃｇｃｔｔｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｃａｃ
１０８１  ａｔｇｇｔｇｇｔｃｔ  ｔｃｇｃｔｇｃａｃｃ  ｔｃａｔａｇｇｇｇｃ  ｇｔｇｇｃｔａａｇｇ  ａｇａｔｃｇａａｔｔ  ｔｇａｃｇａｇａｔｔ
１１４１  ａａｃｇａｔａｃａｔ  ｇｃｃｔｇａｇｃｇｔ  ｇｇｃａａｃｔｔｔｃ  ｃｔｇｃｃａｔａｃａ  ｇｃｔｃｃｃｔｇａｃ  ｔｔｃｔｇｇｃａａｔ
１２０１  ｇｔｇｃｔｇｃａｇａ  ｇａａｃｃｃｔｇａｇ  ｔｇｃａａｇｇａｔｇ  ｃｇｇａｇａａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇａａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇａｃ
１２６１  ａｇｔｔｔｃｔｃａａ  ｔｇｃｇａｃｇａａｃ  ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ａｔｃｇａｇｇｇａａ  ｃａｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ
１３２１  ｔｔｃｃｔｇｃｃｔａ  ａｃｔｃａｇｔｇｔｔ  ｔｃｃａｃｇａｔｇｔ  ａｇｃｇａｇｃｇｇａ  ａｔｃｔｇｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇ
１３８１  ａｇｔｇａｇｃａｇｇ  ａｔｃｔｇａｔｇｃａ  ｇｃｃａｇａｇｇａａ  ｃｃｃｇａｃｔａｃｃ  ｔｇｃｔｇｇａｔｇａ  ｇａｔｇａｃｃａａｇ
１４４１  ｇａｇｇｃｃｇａａａ  ｔｃｇａｃａａｃｔｃ  ｔａｇｔａｃａｇｔｇ  ｇａｇｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｃｇａｇａｃｔａｃ  ｃｇａｔａｔｃｃｔｇ
１５０１  ａａｔａｔｇａｃａｃ  ａｃａｔｔａｔｇｔｃ  ａｃｔｇａａｃａｇｃ  ａａｔｇａｇａａｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃｔ  ｇｔｃａｃｃａｇｔｇ
１５６１  ｃａｇａａｇｃａｇａ  ａｇａａａｃａｇｃａ  ｇａｃｔａｔｔｇｇｃ  ｇａｇｃｔｇａｃｔｃ  ａｇｇａｃａｃｃｇｃ  ｃｃｔｇａｃａｇａｇ
１６２１  ａａｃｇａｃｇａｔａ  ｇｃｇａｔｇａｇｔａ  ｔｇａｇｇａａａｔｇ  ｔｃｃｇａｇａｔｇａ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ａｇｃｔｔｇｔａａｇ
１６８１  ｃａｇｃａｔｇｔｃａ  ｇｔｃａｇｇｇｇａｔ  ｃｔｔｃａｔｇａｃａ  ｃａｇｃｃａｇｃｃａ  ｃａａｃｔａｔｔｇａ  ｇｇｃｔｔｔｔｔｃａ
１７４１  ｇａｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａｇａｔｃｃｃ  ｃｇａｇｇａａａａａ  ｇａｇｇｇｃｇｃａｇ  ａａｇａｔｔｃｃａａ  ｇｇｇｇａａｔｇｇａ
１８０１  ａｔｔｇａｇｇａａｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａｇｃｃａａｃｇａｇ  ｇａａａａｔｇｔｇａ  ａａｇｔｃｃａｃｇｇ  ａｇｇｃａｇｇａａｇ
１８６１  ｇａｇａａａａｃａｇ  ａａａｔｃｃｔｇｔｃ  ｔｇａｃｇａｔｃｔｇ  ａｃｔｇａｃａａｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃｇａａｇｇｃａａｇ
１９２１  ｇｃａａａａｔｃｔｇ  ｔｃｇｇａｇａｇｇｃ  ａｇａａｇａｃｇｇａ  ｃｃａｇａｇｇｇａｃ  ｇａｇｇｇｇａｔｇｇ  ａａｃｃｔｇｃｇａｇ
１９８１  ｇａａｇｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｇｇｇｃｔｇａ  ｇｃａｔｔｇｇｃａｇ  ｇａｃｇａｇｇａａｃ  ｇａｇａｇａａｇｇｇ  ｃｇａａａａｇｇａｔ
２０４１  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｇｇｇａｇａｔｇｇａ  ａｃｇａｃｃｔｇｇａ  ｇａｇｇｇｃｇａａａ  ａａｇａｇｃｔｇｇｃ  ａｇａｇａａｇｇａｇ
２１０１  ｇａａｔｇｇａａｇａ  ａａａｇｇｇａｃｇｇ  ｃｇａｇｇａａｃａｇ  ｇａｇｃａｇａａａｇ  ａａａｇｇｇａｇｃａ  ｇｇｇｃｃａｃｃａｇ
２１６１  ａａｇｇａｇｃｇｃａ  ａｃｃａｇｇａｇａｔ  ｇｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ａｇｃａｔｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ
２２２１  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｔａｇａｇａａｇａ  ｇｇａａｇａｇｇａａ  ａａａｇａａｇｇｃｇ  ａａｇｇｇａａｇｇａ  ｇｇａａｇｇａｇａｇ
２２８１  ｇｇｃｇａｇｇａａｇ  ｔｇｇａａｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇａａａａｇ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａａｃｇｇａａｇａａ  ａｇａｇｇａａａｇａ
２３４１  ｇｃｃｇｇｃａａａｇ  ａｇｇａａａａｇｇｇ  ｃｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｃｇａｔｃａｇｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ｇｇａｇｇａａｇａｇ
２４０１  ａｃｃｇａｇｇｇｃｃ  ｇｃｇｇｇｇａａｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇａｇｇ  ｔｇｇａｇｇｇｃｇｇ  ａｇａｇｇｔｃｇａａ
２４６１  ｇａｇｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇａ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇａａｇａｇｇｇｃｇ  ａｇｇｇｃｇａｇｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ
２５２１  ｇａｇｇｇｇｇａａｇ  ａａｇａｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ  ｇａｇｇａａｇａｇｇ  ｇｇｇａｇｇｇａａａ  ｇｇｇｃｇａａｇａｇ
２５８１  ｇａａｇｇａｇａｇｇ  ａａｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇａｇｇａａｇａｇ  ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇｇｃｇａｇｇａｇ
２６４１  ｇａａｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａｇｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｇｇ  ａａｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇａａｇｇｇ
２７０１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇａｇｇａ  ｇｇｇａｇａａｇｇａ  ｇａｇｇｇｇｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ａｇａａｇｇｇａａｇ
２７６１  ｇｇｃｇａｇｇａｇｇ  ａａｇｇｃｇａａｇａ  ｇｇｇａｇａｇｇｇｇ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａｇａｇｇａａｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃｇａａ
２８２１  ｇｇａｇａｇｇａｃｇ  ｇｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇｇｇａｇａａｇａｇ  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ａａｔｇｇｇａａｇｇ  ｃｇａａｇａａｇａｇ
２８８１  ｇａａｇｇｃｇａａｇ  ｇｃｇａａｇｇｃｇａ  ａｇａａｇａｇｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｇａｇｇ  ｇｃｇａｇｇａｇｇｇ  ｃｇａａｇｇｃｇａａ
２９４１  ｇｇｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇｇｃｇａ  ａｇｇａｇａａｇｇｃ  ｇａｇｇａａｇａａｇ  ａｇｇｇａｇａｇｇａ  ｇｇａａｇｇｃｇａｇ
３００１  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ａｇｇｇｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｇｇａｇａａ  ｇｇｃｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇａａｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａａ
３０６１  ｇｔｇｇａｇｇｇｃｇ  ａａｇｔｃｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｇｇａａｇ  ｇｇｇａｇｇａａｇａ  ａｇａｇｇｇｃｇａａ
３１２１  ｇａａｇａａｇｇｃｇ  ａｇｇａａａｇａｇａ  ａａａａｇａｇｇｇａ  ｇａａｇｇｃｇａｇｇ  ａａａａｃｃｇｇａｇ  ａａａｔａｇｇｇａａ
３１８１  ｇａｇｇａｇｇａａｇ  ａｇｇａａｇａｇｇｇ  ａａａｇｔａｃｃａｇ  ｇａｇａｃａｇｇｃｇ  ａａｇａｇｇａａａａ  ｃｇａｇｃｇｇｃａｇ
３２４１  ｇａｔｇｇｃｇａｇｇ  ａａｔａｔａａｇａａ  ａｇｔｇａｇｃａａｇ  ａｔｃａａａｇｇａｔ  ｃｃｇｔｃａａｇｔａ  ｃｇｇｃａａｇｃａｃ
３３０１  ａａａａｃｃｔａｔｃ  ａｇａａｇａａａａｇ  ｃｇｔｇａｃｃａａｃ  ａｃａｃａｇｇｇｇａ  ａｔｇｇａａａａｇａ  ｇｃａｇａｇｇａｇｔ
３３６１  ａａｇａｔｇｃｃｔｇ  ｔｇｃａｇｔｃａａａ  ａｃｇｇｃｔｇｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｇｃｃ  ｃａｔｃｔｇｇａａｇ  ｔａａａａａａｔｔｃ
３４２１  ｔｇｇａａｃａａｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃａ  ｃｔａｔｃｔｇｇａａ  ｃｔｇａａａｔａａ（配列番号８０）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、項目１３１または１３２に記載の方法。
（項目１３３）
前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列を含む、項目１２８〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記ＢＧＨポリＡシグナルをコードする前記配列が、
１  ｃｇｃｔｇａｔｃａ  ｇｃｃｔｃｇａｃｔｇ  ｔｇｃｃｔｔｃｔａｇ  ｔｔｇｃｃａｇｃｃａ  ｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃ
６１  ｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｇａｃｃｃｔｇｇ  ａａｇｇｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃａｃｔｇｔｃ  ｃｔｔｔｃｃｔａａｔ  ａａａａｔｇａｇｇａ
１２１  ａａｔｔｇｃａｔｃｇ  ｃａｔｔｇｔｃｔｇａ  ｇｔａｇｇｔｇｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｃａｇｇａ
１８１  ｃａｇｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇｇａｔｔｇｇｇ  ａａｇａｃａａｔａｇ  ｃａｇｇｃａｔｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｇｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｔｃｔａｔ
２４１  ｇｇｃｔｔｃｔｇａｇ  ｇｃｇｇａａａｇａａ  ｃｃａｇｃｔｇｇｇｇ（配列番号８３）のヌクレオチド配列を含む、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、項目１２８〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列から誘導される、項目１２８〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記５’ＩＴＲをコードする配列及び前記３’ＩＴＲをコードする配列が、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの配列及び３’ＩＴＲの配列と同一である配列を含む、項目１２８〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１２８〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、項目１２８〜１３６または１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記外来配列が、コザック配列をコードする配列をさらに含み、任意選択で、前記コザック配列が、ＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号７３）のヌクレオチド配列を含む、項目１２８〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記外来配列が、
１  ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣ  ＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧ  ＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧ  ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣ
６１  ＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣ  ＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣ  ＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣ  ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡ  ＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧ
１２１  ＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡ  ＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴ  ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣ  ＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧ  ＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣ  ＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴ
１８１  ＡＡＧＧＴＡＧＣＣＣ  ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴ  ＣＡＡＴＴＧＧＧＧＣ  ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣ  ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ  ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴ
２４１  ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＴＧＡＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧ  ＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧ  ＧＣＡＧＡＡＴＧＡＴ  ＣＴＡＡＴＣＧＧＡＴ
３０１  ＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣ  ＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴ  ＧＴＣＴＴＴＴＴＣＴ  ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴ  ＴＧＣＣＡＣＴＣＣＴ  ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ
３６１  ＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧ  ＧＣＴＧＧＧＡＴＴＴ  ＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣ  ＴＧＴＧＴＣＡＧＣＣ  ＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣ  ＣＡＴＧＡＧＡＧＡＧ
４２１  ＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡ  ＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡ  ＧＴＧＴＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣ  ＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴ
４８１  ＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣ  ＣＡＧＧＡＡＡＧＴＴ  ＣＴＧＧＴＴＴＡＡＡ  ＡＡＣＧＡＣＧＴＧＣ  ＣＣＧＴＣＣＡＣＣＴ  ＧＴＣＴＴＧＴＧＧＣ
５４１  ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＡ  ＧＴＧＣＣＧＴＧＧＴ  ＣＡＣＴＧＧＧＡＡＣ  ＡＡＴＡＡＧＣＴＧＴ  ＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧ  ＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣ
６０１  ＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣ  ＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧ  ＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴ  ＧＣＴＡＴＣＴＣＴＡ  ＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧ  ＣＧＴＧＡＡＧＧＣＡ
６６１  ＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴ  ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴ  ＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣ
７２１  ＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡ  ＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣ  ＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧ  ＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＧＧＧＡＣ
７８１  ＡＣＴＧＡＧＧＡＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＣＴＴ  ＴＣＡＣＧＴＧＡＴＣ  ＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡ  ＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡ  ＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧ
８４１  ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡ  ＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧ  ＡＧＧＡＣＧＧＧＣＧ  ＣＣＴＧＴＴＣＡＴＧ
９０１  ＴＧＧＧＧＡＧＡＴＡ  ＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧ  ＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧ  ＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴ  ＧＴＧＣＧＴＣＣＣＴ
９６１  ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡ  ＣＣＡＴＣＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴ  ＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴ  ＧＴＧＧＣＴＡＣＴＡ  ＴＣＡＴＡＧＣＧＣＣ
１０２１  ＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡ  ＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡ  ＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣ  ＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣ  ＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧ  ＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣ
１０８１  ＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣ  ＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧ  ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ  ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡ
１１４１  ＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣ  ＡＧＧＴＣＧＣＣＴＧ  ＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧ  ＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＴＣＣＴＧＡＣＴＧＡ  ＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧ
１２０１  ＴＡＴＡＣＣＴＴＣＧ  ＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡ  ＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧ  ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ  ＧＡＡＣＣＴＴＣＣＴ  ＧＴＴＴＧＡＧＡＣＡ
１２６１  ＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡ  ＡＡＧＴＧＡＴＣＧＡ  ＧＡＡＣＡＴＴＣＧＣ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＴＡ  ＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴ  ＴＴＣＣＴＧＣＧＧＡ
１３２１  ＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡ  ＣＣＧＣＡＣＴＧＡＴ  ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＴ  ＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴ  ＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧ  ＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡ
１３８１  ＣＡＣＧＧＧＡＡＧＣ  ＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧ  ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣ  ＴＴＣＡＣＴＡＡＴＣ  ＡＴＴＴＴＡＴＣＣＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＴＧＴ
１４４１  ＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣ  ＴＧＣＧＧＴＴＣＡＴ  ＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧ  ＧＴＣＧＣＴＴＧＣＧ  ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＡ  ＣＡＴＧＧＴＧＧＴＣ
１５０１  ＴＴＣＧＣＴＧＣＡＣ  ＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧ  ＣＧＴＧＧＣＴＡＡＧ  ＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴ  ＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴ  ＴＡＡＣＧＡＴＡＣＡ
１５６１  ＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧ  ＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴ  ＣＣＴＧＣＣＡＴＡＣ  ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡ  ＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡ  ＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧ
１６２１  ＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡ  ＧＴＧＣＡＡＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣ  ＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡ  ＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡ
１６８１  ＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ  ＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣ  ＴＡＴＣＧＡＧＧＧＡ  ＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣ  ＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ  ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴ
１７４１  ＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴ  ＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧ  ＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧ  ＡＡＴＣＴＧＣＡＧＧ  ＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴ  ＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧ
１８０１  ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣ  ＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＣ  ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ  ＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡ  ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡ
１８６１  ＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴ  ＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴ  ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧ  ＧＧＣＧＡＧＡＣＴＡ  ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴ  ＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡ
１９２１  ＣＡＣＡＴＴＡＴＧＴ  ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧ  ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＴＣＴＧＡＡＡＣ  ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴ  ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ
１９８１  ＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣ  ＡＧＡＣＴＡＴＴＧＧ  ＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴ  ＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ  ＣＣＣＴＧＡＣＡＧＡ  ＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴ
２０４１  ＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴ  ＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴ  ＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧ  ＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡ  ＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡ  ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣ
２１０１  ＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡ  ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣ  ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣ  ＡＣＡＡＣＴＡＴＴＧ  ＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ  ＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡ
２１６１  ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣ  ＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡ  ＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡ  ＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧ  ＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡ
２２２１  ＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧ  ＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧ  ＡＡＡＧＴＣＣＡＣＧ  ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡ  ＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡ
２２８１  ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＴ  ＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴ  ＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧ  ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴ  ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ  ＧＧＣＡＡＡＡＴＣＴ
２３４１  ＧＴＣＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧ  ＡＣＣＡＧＡＧＧＧＡ  ＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧ  ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡ
２４０１  ＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧ  ＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡ  ＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡ  ＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＡＡＧＧＡ  ＴＡＡＡＧＧＣＣＧＣ
２４６１  ＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧ  ＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡ  ＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧ  ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
２５２１  ＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡ  ＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡ  ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣ  ＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡ  ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣ
２５８１  ＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡ  ＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡ  ＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ
２６４１  ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡ
２７０１  ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ  ＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧ  ＡＧＣＣＧＧＣＡＡＡ
２７６１  ＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧ  ＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＧＡＴＣＡＧ  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣ
２８２１  ＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧ  ＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧ  ＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧ  ＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧ
２８８１  ＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧ  ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡ
２９４１  ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡ  ＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧ
３００１  ＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧ  ＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡ  ＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡ
３０６１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＧ  ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３１２１  ＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ
３１８１  ＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣ
３２４１  ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧ  ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧ  ＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡ  ＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡ
３３０１  ＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧ  ＣＧＡＡＧＧＧＧＡＧ  ＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ  ＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡ
３３６１  ＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧ  ＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡ  ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡ  ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡ
３４２１  ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧ  ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡ  ＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣ
３４８１  ＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧ  ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡ  ＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＣＧＡ  ＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣ
３５４１  ＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧ  ＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧ  ＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡ  ＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡ  ＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ
３６０１  ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ  ＧＡＡＡＧＴＡＣＣＡ  ＧＧＡＧＡＣＡＧＧＣ  ＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡ  ＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ  ＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧ
３６６１  ＧＡＡＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡ  ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡ  ＴＣＣＧＴＣＡＡＧＴ  ＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴ
３７２１  ＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡ  ＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡ  ＣＡＣＡＣＡＧＧＧＧ  ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ  ＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴ
３７８１  ＧＴＧＣＡＧＴＣＡＡ  ＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴ  ＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣ  ＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡ  ＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴ  ＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴ
３８４１  ＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＡＣＴＡＴＣＴＧＧＡ  ＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡ  ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧ  ＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡ
３９０１  ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴ  ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧ  ＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ  ＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴ  ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴ  ＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡ
３９６１  ＣＣＧＧＴＣＡＴＣＡ  ＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣ  ＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴ  ＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧ  ＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴ
４０２１  ＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡ  ＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴ  ＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴ  ＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣ  ＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ  ＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧ
４０８１  ＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣ  ＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧ  ＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣ  ＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴ  ＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ
４１４１  ＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴ  ＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴ  ＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡ
４２０１  ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡ  ＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴ  ＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴ  ＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣ  ＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡ  ＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴ
４２６１  ＣＣＴＣＴＣＴＴＡＡ  ＧＧＴＡＧＣＡＴＣＧ  ＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴ  ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣ  ＡＧＧＧＴＡＡＴＧＧ  ＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣ
４３２１  ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ  ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧ  ＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧ
４３８１  ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣ  ＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣ  ＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧ  ＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡ  ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣ
４４４１  ＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号７４）の配列を含む、項目１２８〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
前記外来配列が、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質またはその一部をコードする配列を含む、項目１２５〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする５’配列を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記外来配列が、ＡＢＣＡ４タンパク質またはその一部をコードする３’配列を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４５）
前記外来配列が、プロモーター配列をさらに含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４６）
前記外来配列が、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列、任意選択で、ＧＲＫ１プロモーター配列を含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記ＧＲＫ１プロモーター配列が、
１  ｇｇｇｃｃｃｃａｇａ  ａｇｃｃｔｇｇｔｇｇ  ｔｔｇｔｔｔｇｔｃｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ａａａａｇｔｇａｇｇ  ｃｇｇｃｃｃｃｔｔｇ
６１  ｇａｇｇａａｇｇｇｇ  ｃｃｇｇｇｃａｇａａ  ｔｇａｔｃｔａａｔｃ  ｇｇａｔｔｃｃａａｇ  ｃａｇｃｔｃａｇｇｇ  ｇａｔｔｇｔｃｔｔｔ
１２１  ｔｔｃｔａｇｃａｃｃ  ｔｔｃｔｔｇｃｃａｃ  ｔｃｃｔａａｇｃｇｔ  ｃｃｔｃｃｇｔｇａｃ  ｃｃｃｇｇｃｔｇｇｇ  ａｔｔｔａｇｃｃｔｇ
１８１  ｇｔｇｃｔｇｔｇｔｃ  ａｇｃｃｃｃｇｇｇ（配列番号５）を含むか、またはそれらからなる、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記外来配列が、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター配列を含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４９）
前記ＣＢＡプロモーター配列が、
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣ  ＧＣＧＣＴＧＣＣＴＴ
３０１  ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣ  ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣ  ＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
３６１  ＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣ  ＡＧ（配列番号１６）
または
１  ＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴ  ＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴ  ＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴ  ＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣ  ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡ
６１  ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
１２１  ＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣ  ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣ  ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧ  ＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧ  ＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴ
１８１  ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ  ＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣ  ＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣ  ＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣ  ＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
２４１  ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧ  ＣＧＧＣＧＧＧＣＧ（配列番号２４）を含むか、またはそれらからなる、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記外来配列が、ＣＭＶ．ＣＢＡプロモーター配列、ＣＢＡ．ＲＢＧプロモーター配列、またはＣＢＡ．ＩｎＥｘプロモーター配列を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１５１）
前記ＡＢＣＡ４をコードする前記配列が、ヒトＡＢＣＡ４配列またはその変異体である、項目１４２〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド１〜３７０１または１〜４３２６を含む５’ヌクレオチド配列を含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＡＢＣＡ４をコードする配列が、配列番号２または配列番号１のヌクレオチド３１５４〜６８２２、３１９６〜６８２２、３４９４〜６８２２、３６０３〜６８２２、３６５３〜６８２２、３６７８〜６８２２、３７０２〜６８２２、または３４９４〜６８２２を含む３’ヌクレオチド配列を含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５４）
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、項目１４２〜１５３のいずれかに記載の方法。
（項目１５５）
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列及び前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列またはそれらの変異体から誘導される、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記５’ＩＴＲが、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３６）を含むか、またはそれからなる、項目１５４に記載の方法。
（項目１５７）
前記外来配列が３’ＩＴＲを含む、項目１４２〜１５６のいずれかに記載の方法。
（項目１５８）
前記５’ＩＴＲが、
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧ（配列番号３７）を含むか、またはそれからなる、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列を含む前記プラスミドベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む、項目１２５〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６０）
前記ウイルスＲｅｐタンパク質をコードする前記配列及び前記ウイルスＣａｐタンパク質をコードする前記配列が、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ウイルスＲｅｐタンパク質配列及びウイルスＣａｐタンパク質配列から単離または誘導される配列を含む、項目１２５〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
2022501037.tif 000017
【図２】
2022501037.tif 000018
【図３】
2022501037.tif 000019
【図４】
2022501037.tif 000020
【図５】
2022501037.tif 000021
【図６】
2022501037.tif 000022
【図７】
2022501037.tif 000023
【図８】
2022501037.tif 000024
【図９】
2022501037.tif 000025
【図１０】
2022501037.tif 000026
【図１１】
2022501037.tif 000027
【図１２】
2022501037.tif 000028
【図１３】
2022501037.tif 000029
【図１４】
2022501037.tif 000030
【図１５】
2022501037.tif 000031
【図１６】
2022501037.tif 000032
【図１７】
2022501037.tif 000033
【図１８】
2022501037.tif 000034
【図１９】
2022501037.tif 000035
【図２０】
2022501037.tif 000036
【図２１】
2022501037.tif 000037
【図２２】
2022501037.tif 000038
【図２３】
2022501037.tif 000039
【図２４Ａ】
2022501037.tif 000040
【図２４Ｂ】
2022501037.tif 000041
【図２５】
2022501037.tif 000042
【図２６】
2022501037.tif 000043
【図２７】
2022501037.tif 000044
【図２８】
2022501037.tif 000045
【図２９】
2022501037.tif 000046
【図３０】
2022501037.tif 000047
【図３１】
2022501037.tif 000048
【図３２】
2022501037.tif 000049
【図３３】
2022501037.tif 000050
【図３４】
2022501037.tif 000051
【図３５】
2022501037.tif 000052
【図３６】
2022501037.tif 000053
【図３７】
2022501037.tif 000054
【図３８】
2022501037.tif 000055
【図３９】
2022501037.tif 000056
【図４０】
2022501037.tif 000057
【図４１】
2022501037.tif 000058
【図４２】
2022501037.tif 000059
【図４３】
2022501037.tif 000060
【図４４】
2022501037.tif 000061
【図４５】
2022501037.tif 000062
【図４６】
2022501037.tif 000063
【図４７】
2022501037.tif 000064
【図４８】
2022501037.tif 000065
【図４９】
2022501037.tif 000066
【図５０−１】
2022501037.tif 000067
【図５０−２】
2022501037.tif 000068
【図５１】
2022501037.tif 000069
【図５２】
2022501037.tif 000070
【図５３】
2022501037.tif 000071
【図５４】
2022501037.tif 000072
【図５５】
2022501037.tif 000073
【図５６】
2022501037.tif 000074
【図５７−１】
2022501037.tif 000075
【図５７−２】
2022501037.tif 000076
【図５８】
2022501037.tif 000077
【図５９】
2022501037.tif 000078
【図６０】
2022501037.tif 000079
【図６１】
2022501037.tif 000080
【図６２】
2022501037.tif 000081
【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４−１】
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【図７４−２】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８Ａ】
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【図１０８Ｂ】
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【図１０８Ｃ】
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【図１０８Ｄ】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２Ａ】
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【図１１２Ｂ】
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【図１１２Ｃ】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７Ａ】
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【図１１７Ｂ】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２Ａ】
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【図１３２Ｃ】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０Ａ】
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【図１７０Ｂ】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３】
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【図１７４】
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【図１７５】
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【図１７６】
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【図１７７−１】
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【図１７７−２】
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【図１７８】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８１】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【図１８６】
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【図１８７】
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【図１８８】
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【図１８９】
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【図１９０】
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【図１９１】
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【図１９３】
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【図１９４】
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【図１９５】
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【図１９６】
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【図１９７】
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【図１９８】
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【図１９９】
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【図２００】
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【図２０１】
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【図２０２】
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【図２０３】
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【図２０４】
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【図２０５】
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【図２０６】
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【図２０７】
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【図２０８】
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【図２０９】
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【図２１０】
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【図２１１Ａ】
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【図２１１Ｂ】
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【図２１１Ｃ】
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【図２１２】
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【図２１３】
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【図２１４】
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【図２１５】
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【図２１６Ａ】
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【図２１６Ｂ】
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【図２１７Ａ】
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【図２１７Ｂ】
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【図２１７Ｃ】
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【図２１７Ｅ】
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【図２１７Ｆ】
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【図２１７Ｇ】
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【図２１７Ｈ】
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【図２１７Ｉ】
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【図２１９】
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【図２２０】
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【図２２１Ａ】
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【図２２２Ａ】
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【図２２２Ｂ】
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【図２２２Ｃ】
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【図２２２Ｄ】
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【図２２２Ｅ】
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【図２２２Ｆ】
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【図２２３】
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【図２２４】
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【図２２５】
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【図２２６Ａ】
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【図２２６Ｂ】
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【図２２７Ａ】
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【図２２７Ｃ】
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【図２２８】
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【図２３０】
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【図２３１】
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【図２３２】
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【図２３３】
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【図２３４】
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【図２３５Ａ】
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【図２３５Ｃ】
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【図２３６】
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【図２３７】
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【図２３８】
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【図２３９】
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【図２４０Ａ】
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【図２４０Ｂ】
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【図２４１Ａ】
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【図２４１Ｂ】
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【図２４１Ｃ】
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【図２４１Ｄ】
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【図２４１Ｅ】
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【図２４１Ｆ】
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【図２４１Ｇ】
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【図２４１Ｈ】
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【図２４１Ｉ】
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【図２４１Ｊ】
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【図２４２】
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【図２４３】
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【図２４４】
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【図２４５Ａ】
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【図２４５Ｂ】
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【図２４６Ａ】
2022501037.tif 000321
【図２４６Ｂ】
2022501037.tif 000322
【図２４６Ｃ】
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【図２４６Ｄ】
2022501037.tif 000324
【図２４６Ｅ】
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【図２４６Ｆ】
2022501037.tif 000326
【図２４６Ｇ】
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【図２４６Ｈ】
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【図２４７】
2022501037.tif 000329
【図２４８】
2022501037.tif 000330
【図２４９】
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【図２５０Ａ】
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【図２５０Ｂ】
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【図２５１Ａ】
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【図２５１Ｂ】
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【図２５１Ｃ】
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【図２５１Ｄ】
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【図２５１Ｅ】
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【図２５１Ｆ】
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【図２５１Ｇ】
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【図２５１Ｈ】
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【図２５１Ｉ】
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【図２５２】
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【図２５３Ａ】
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【図２５３Ｂ】
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【図２５４】
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【図２５５】
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【図２５６】
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【図２５７】
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【図２５８Ａ】
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【図２５８Ｂ】
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【図２５８Ｃ】
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【図２５９】
2022501037.tif 000353
【図２６０Ａ】
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【図２６０Ｂ】
2022501037.tif 000355
【図２６１】
2022501037.tif 000356
【図２６２Ａ】
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【図２６２Ｂ】
2022501037.tif 000358
【図２６３】
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【図２６４Ａ】
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【図２６４Ｂ】
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【図２６５】
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【図２６６Ａ】
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【図２６６Ｂ】
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【図２６７】
2022501037.tif 000365
【図２６８】
2022501037.tif 000366
【図２６９】
2022501037.tif 000367
【図２７０】
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【図２７１】
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【図２７２】
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【図２７３】
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【図２７４】
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【図２７５】
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【図２７６】
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【図２７７】
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【図２７８】
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【図２７９】
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【図２８０】
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【図２８１】
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【図２８２】
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【図２８３】
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【図２８４】
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【図２８５】
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【図２８６】
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【図２８７】
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【図２８８】
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【図２８９】
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【図２９０】
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【図２９１】
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【図２９２】
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【図２９３】
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【図２９４】
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【図２９５】
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【図２９６】
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【図２９７】
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【図２９８】
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【図２９９】
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【図３００】
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【図３０１】
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【図３０２】
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【図３０３】
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【図３０４】
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【図３０５】
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【図３０６】
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【図３０７−１】
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【図３０７−２】
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【図３０７−３】
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【図３０８−１】
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【図３０８−２】
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【図３０８−３】
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【図３０９−１】
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【図３０９−２】
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【図３０９−３】
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【図３１０−１】
2022501037.tif 000414
【図３１０−２】
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【図３１０−３】
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【図３１１−１】
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【図３１１−２】
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【図３１１−３】
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【図３１１−４】
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【図３１２−１】
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【図３１２−２】
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【図３１２−３】
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【図３１２−４】
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【図３１３−１】
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【図３１３−２】
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【図３１３−３】
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【図３１３−４】
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【図３１４】
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【図３１５−１】
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【図３１５−２】
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【図３１５−３】
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【図３１６−１】
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【図３１６−２】
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【図３１６−３】
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【図３１７】
2022501037.tif 000436
【図３１８Ａ−Ｂ】
2022501037.tif 000437
【図３１８Ｃ−Ｄ】
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【図３１９Ａ−Ｃ】
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【図３１９Ｄ】
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【図３１９Ｅ−Ｈ】
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【図３２０】
2022501037.tif 000442
【図３２１】
2022501037.tif 000443
【図３２２】
2022501037.tif 000444
【図３２３Ａ】
2022501037.tif 000445
【図３２３Ｂ】
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【図３２３Ｃ】
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【図３２３Ｄ】
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【図３２４Ａ】
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【図３２４Ｂ】
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【図３２５】
2022501037.tif 000451
【図３２６Ａ】
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【図３２６Ｂ】
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【図３２７Ａ】
2022501037.tif 000454
【図３２７Ｂ】
2022501037.tif 000455
【図３２８Ａ】
2022501037.tif 000456
【図３２８Ｂ】
2022501037.tif 000457
【図３２８Ｃ】
2022501037.tif 000458
【図３２９】
2022501037.tif 000459
【図３３０】
2022501037.tif 000460
【図３３１−１】
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【図３３１−２】
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【図３３１−３】
2022501037.tif 000463
【図３３１−４】
2022501037.tif 000464
【図３３１−５】
2022501037.tif 000465
【図３３２−１】
2022501037.tif 000466
【図３３２−２】
2022501037.tif 000467
【図３３２−３】
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【図３３２−４】
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【図３３２−５】
2022501037.tif 000470
【図３３３−１】
2022501037.tif 000471
【図３３３−２】
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【図３３３−３】
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【図３３３−４】
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【図３３３−５】
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【図３３４−１】
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【図３３４−２】
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【図３３４−３】
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【図３３４−４】
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【図３３４−５】
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【図３３５−１】
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【図３３５−２】
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【図３３５−３】
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【図３３５−４】
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【図３３６Ａ】
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【図３３６Ｂ】
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【図３３６Ｃ】
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【図３３６Ｄ】
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【図３３７】
2022501037.tif 000489
【図３３８】
2022501037.tif 000490
【図３３９−１】
2022501037.tif 000491
【図３３９−２】
2022501037.tif 000492
【図３４０】
2022501037.tif 000493
【図３４１Ａ】
2022501037.tif 000494
【図３４１Ｂ】
2022501037.tif 000495
【図３４２Ａ】
2022501037.tif 000496
【図３４２Ｂ】
2022501037.tif 000497
【図３４２Ｃ】
2022501037.tif 000498
【図３４２Ｄ】
2022501037.tif 000499
【図３４２Ｅ】
2022501037.tif 000500
【図３４２Ｆ】
2022501037.tif 000501
【図３４２Ｇ】
2022501037.tif 000502
【図３４２Ｈ】
2022501037.tif 000503
【図３４２Ｉ】
2022501037.tif 000504
【図３４２Ｊ】
2022501037.tif 000505
【図３４３】
2022501037.tif 000506
【図３４４】
2022501037.tif 000507
【図３４５】
2022501037.tif 000508
【図３４６Ａ】
2022501037.tif 000509
【図３４６Ｂ】
2022501037.tif 000510
【図３４７Ａ】
2022501037.tif 000511
【図３４７Ｂ】
2022501037.tif 000512
【図３４７Ｃ】
2022501037.tif 000513
【図３４７Ｄ】
2022501037.tif 000514
【図３４７Ｅ】
2022501037.tif 000515
【図３４７Ｆ】
2022501037.tif 000516
【図３４７Ｇ】
2022501037.tif 000517
【図３４７Ｈ】
2022501037.tif 000518
【図３４７Ｉ−Ｊ】
2022501037.tif 000519
【図３４８】
2022501037.tif 000520
【図３４９】
2022501037.tif 000521
【図３５０】
2022501037.tif 000522
【図３５１Ａ】
2022501037.tif 000523
【図３５１Ｂ】
2022501037.tif 000524
【図３５２Ａ】
2022501037.tif 000525
【図３５２Ｂ】
2022501037.tif 000526
【図３５２Ｃ】
2022501037.tif 000527
【図３５２Ｄ】
2022501037.tif 000528
【図３５２Ｅ】
2022501037.tif 000529
【図３５２Ｆ】
2022501037.tif 000530
【図３５２Ｇ】
2022501037.tif 000531
【図３５２Ｈ】
2022501037.tif 000532
【図３５２Ｉ】
2022501037.tif 000533
【図３５２Ｊ】
2022501037.tif 000534
【図３５３】
2022501037.tif 000535
【図３５４Ａ】
2022501037.tif 000536
【図３５４Ｂ−Ｃ】
2022501037.tif 000537
【図３５５】
2022501037.tif 000538
【図３５６】
2022501037.tif 000539
【図３５７Ａ−Ｄ】
2022501037.tif 000540
【図３５７Ｅ−Ｆ】
2022501037.tif 000541
【図３５８】
2022501037.tif 000542
【図３５９Ａ】
2022501037.tif 000543
【図３５９Ｂ】
2022501037.tif 000544
【配列表】
2022501037000001.app
【国際調査報告】
2022501037.tif 000545
2022501037.tif 000546