(57)【要約】亢進された遺伝子編集のための組成物およびその使用方法である。組成物は、細胞透過性抗体と、細胞のゲノムにおける変異を修正することができる配列を含有するドナーオリゴヌクレオチドとを含有する。好ましくは、組成物は、ヌクレアーゼもＰＮＡもナノ粒子も含有しない。組成物を使用して、細胞を有効量の組成物と接触させることによって、細胞のゲノムを改変する。細胞を細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチドと接触させると、ゲノム改変は、細胞透過性抗体が存在しない場合と比較してｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で高い頻度で起こる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムにおける変異を修正することができる配列を含むドナーオリゴヌクレオチドと、
１つまたは複数のＤＮＡ修復経路に携わり、ドナー単独と比較してドナーオリゴヌクレオチドによるゲノム編集を増加させる増強剤と
を含む組成物。
【請求項２】
前記増強剤が、細胞透過性抗体、その断片またはヒト化バリアントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞透過性抗体が、抗ＤＮＡ抗体であり、ＲＡＤ５１を阻害する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞透過性抗体が、３Ｅ１０モノクローナル抗体もしくはその細胞透過性断片、一価、二価、もしくは多価単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはダイアボディ、またはそのヒト化型もしくはバリアントを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１〜６、１２、もしくは１３のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７〜１１、もしくは１５のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号１５〜２３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４〜３０から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化型、
（ｉｖ）配列番号１もしくは２のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７もしくは８との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ、
（ｖ）（ｉｖ）のヒト化型、または
（ｖｉ）配列番号３〜６のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９〜１１との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞透過性抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する組換え抗体を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗ＤＮＡ抗体が、自己免疫疾患を有する被験体または自己免疫疾患の動物モデルに由来する、請求項２から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞のゲノムが、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、リソソーム蓄積症、免疫不全症候群、例えばＸ連鎖重症複合免疫不全症およびＡＤＡ欠損症、チロシン血症、ファンコニ貧血、赤血球障害である球状赤血球症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、レーバー遺伝性視神経症、ならびに慢性肉芽腫性障害を含む群から選択される疾患または障害の根底にある変異を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記変異が、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、ジストロフィン、ベータ−グロビン、ＣＦＴＲ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＤＮＡポリメラーゼイータをコードする遺伝子、ファンコニ貧血遺伝子Ａ〜Ｌ、ＳＰＴＡ１および他のスペクトリン遺伝子、ＡＮＫ１遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ＡＤＡ遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、ならびにＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、またはＮＣＦ４遺伝子を含む慢性肉芽腫性疾患に関連する遺伝子にある、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチド配列が、前記遺伝子の野生型配列の一部分に対応する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヌクレアーゼも、三重鎖形成ペプチド核酸オリゴマーも、ナノ粒子も含まない、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ポリマーナノ粒子をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞のゲノムを改変する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
細胞のゲノムを改変する方法であって、前記細胞を、ドナーオリゴヌクレオチド、および
１つまたは複数のＤＮＡ修復経路に携わり、ドナー単独と比較してドナーオリゴヌクレオチドによるゲノム編集を増加させる増強剤
と接触させることを含むか、またはそれからなる方法。
【請求項２１】
前記ドナーオリゴヌクレオチドおよび前記増強剤が異なる組成物の一部である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増強剤が、細胞透過性抗体、その断片またはヒト化バリアントである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞透過性抗体が、抗ＤＮＡ抗体であり、ＲＡＤ５１を阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞透過性抗体が、３Ｅ１０モノクローナル抗体もしくはその細胞透過性断片、一価、二価、もしくは多価単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはダイアボディ、またはそのヒト化型もしくはバリアントを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）配列番号１〜６、１２、もしくは１３のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７〜１１、もしくは１５のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号１５〜２３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４〜３０から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化型、
（ｉｖ）配列番号１もしくは２のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７もしくは８との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ、
（ｖ）（ｉｖ）のヒト化型、または
（ｖｉ）配列番号３〜６のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９〜１１との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞透過性抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２４３９のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する組換え抗体を含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＤＮＡ抗体が、自己免疫疾患を有する被験体または自己免疫疾患の動物モデルに由来する、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ドナーオリゴヌクレオチドおよび前記増強剤が、同じまたは異なる時間に前記細胞と接触する、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞のゲノムが、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、およびリソソーム蓄積症、免疫不全症候群、例えばＸ連鎖重症複合免疫不全症およびＡＤＡ欠損症、チロシン血症、ファンコニ貧血、赤血球障害である球状赤血球症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、レーバー遺伝性視神経症、ならびに慢性肉芽腫性障害からなる群より選択される疾患または障害の根底にある変異を有する、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記変異が、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、ジストロフィン、ベータ−グロビン、ＣＦＴＲ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＤＮＡポリメラーゼイータをコードする遺伝子、ファンコニ貧血遺伝子Ａ〜Ｌ、ＳＰＴＡ１および他のスペクトリン遺伝子、ＡＮＫ１遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ＡＤＡ遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、ならびにＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、またはＮＣＦ４遺伝子を含む慢性肉芽腫性疾患に関連する遺伝子にある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチド配列が、前記遺伝子の野生型配列の一部分に対応する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記増強剤が、担体またはコンジュゲートの援助を受けずに前記細胞の核に輸送される細胞透過性抗体である、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記接触させることがｅｘ  ｖｉｖｏで起こる、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
それを必要とする被験体に前記細胞を投与することをさらに含む、請求項３５から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するのに有効な量で前記被験体に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記接触させることが、それを必要とする被験体に投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、およびリソソーム蓄積症、免疫不全症候群、例えばＸ連鎖重症複合免疫不全症およびＡＤＡ欠損症、チロシン血症、ファンコニ貧血、赤血球障害である球状赤血球症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、レーバー遺伝性視神経症、ならびに慢性肉芽腫性障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子改変が、前記被験体における前記疾患または前記障害の１つまたは複数の症状を低減させるのに有効な量で起こる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ドナーオリゴヌクレオチドおよび前記増強剤が、一緒にまたは別々にナノ粒子に被包される、請求項２２から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ナノ粒子がポリヒドロキシ酸ポリマーを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ナノ粒子が、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
標的化部分、細胞透過性ペプチド、またはその組合せが、前記ナノ粒子に直接または間接的に会合、連結、コンジュゲート、または他の方法で結合している、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞をヌクレアーゼまたはＰＮＡと接触させることを含まない、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ドナーオリゴヌクレオチドと、以下：
（ｉ）配列番号１〜６、１２、もしくは１３のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７〜１１、もしくは１５のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号１５〜２３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４〜３０から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化型、
（ｉｖ）配列番号１もしくは２のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７もしくは８との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ、
（ｖ）（ｉｖ）のヒト化型、または
（ｖｉ）配列番号３〜６のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９〜１１との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を含む結合タンパク質とを含む、組成物。
【請求項４８】
細胞のゲノムを改変する方法であって、前記細胞を、請求項４７に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が具体的に参照により本明細書に組み込まれている、２０１８年８月３１日に出願された米国特許出願第６２／７２５，９２０号の利益および優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府助成研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１６８７３３およびＣＡ１９７５７４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する言及
配列表は、２０１９年８月２８日に作成された「ＹＵ＿７５０３＿ＰＣＴ」という名称の、６１，３４１バイトのサイズを有するテキストファイルとして提出され、これは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本発明は、一般的に遺伝子編集技術の分野、より詳しくはｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子編集方法における細胞透過性抗ＤＮＡ抗体などの増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドの組成物および使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
遺伝子編集は、鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアなどの遺伝性の遺伝子障害の処置のための魅力的な戦略を提供する。遺伝子は、標的化ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｈａｅｎｄｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １１：２８−３７  （２０１１））およびＣＲＩＳＰＲ（Ｙｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３２：５５１−５５３  （２０１４））、短い断片の相同組換え（ＳＦＨＲ）（Ｇｏｎｃｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １６：２１３−２２４  （２００６））、または三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）（Ｖａｓｑｕｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９０：５３０−５３３  （２０００））を含むいくつかの方法によって選択的に編集することができる。ドナーＤＮＡによって高い効率で遺伝子編集を行うためには、標的遺伝子におけるＤＮＡの切断が必要であると一般的に考えられている。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術などの標的化ヌクレアーゼが、その使用しやすさおよび容易な試薬設計のために、広く注目されている（Ｄｏｕｄｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４６：１２５８０９６  （２０１４））。しかし、ＺＦＮと同様、ＣＲＩＳＰＲアプローチは、活性なヌクレアーゼを細胞に導入し、これはゲノムにおいてオフターゲット切断をもたらし得るが（Ｃｒａｄｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ４１：９５８４−９５９２  （２０１３））、この問題はこれまで解消されていない。
加えて、遺伝子改変効率は、特に初代幹細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性の編集の状況では低くなり得る。例えば、嚢胞性線維症患者由来の幹細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子座を修正する試みでは、所望の改変を有したのは、処置したオルガノイドのおよそ０．３％（３〜６／１４００）に過ぎなかった（Ｓｃｈｗａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．，  １３：６５３−６５８  （２０１３））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｏｕｄｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）３４６：１２５８０９６
【非特許文献２】Ｃｒａｄｉｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１３）４１：９５８４〜９５９２
【非特許文献３】Ｓｃｈｗａｎｋら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．（２０１３）１３：６５３〜６５８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、改善された遺伝子編集のための組成物および方法が必要である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、オフターゲット改変が低減されているかまたは低い、オンターゲット改変を達成するための組成物および方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、遺伝子改変頻度の増加を達成するための組成物および方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、被験体における疾患または障害の１つまたは複数の症状を改善する遺伝子改変のための組成物および方法を提供することである。
【００１１】
細胞を細胞透過性抗ＤＮＡループスによって処置すると、ヌクレアーゼまたはＰＮＡの非存在下で、ドナーＤＮＡ単独による標的化遺伝子編集を亢進することが発見されている。実施例に記載するように、ｅＭａｂ  ３Ｅ１０は、ドナーＤＮＡ単独を含有するナノ粒子による遺伝子編集をブーストすることが発見されている。同様に、３Ｅ１０は、いかなる関連するヌクレアーゼもＰＮＡも伴わず、送達のためにナノ粒子に被包することなく、培養物中の細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおいて裸のドナーＤＮＡ単独による遺伝子編集を促進することも発見されている。
【００１２】
このように、標的化遺伝子編集を亢進するための組成物およびそれを使用する方法を開示する。一部の実施形態では、組成物は、細胞透過性抗体などの増強剤と、細胞のゲノムにおける変異を修正することができる配列を含有するドナーオリゴヌクレオチドとを含有する。好ましくは、組成物は、ヌクレアーゼ（例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＺＦＮ、Ｃａｓ９）も、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も、ナノ粒子も含有しない。典型的には、ドナーオリゴヌクレオチドは、細胞透過性抗体に共有結合により連結されない。オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである。
【００１３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、疾患または障害（例えば、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症（ｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ）、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、リソソーム蓄積症、免疫不全症候群、例えばＸ連鎖重症複合免疫不全症およびＡＤＡ欠損症、チロシン血症、ファンコニ貧血、赤血球障害である球状赤血球症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、レーバー遺伝性視神経症、または慢性肉芽腫性障害）の根底にある変異した遺伝子の野生型配列に対応する。例示的な遺伝子としては、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、ジストロフィン、ベータ−グロビン、ＣＦＴＲ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＤＮＡポリメラーゼイータをコードする遺伝子、ファンコニ貧血遺伝子Ａ〜Ｌ、ＳＰＴＡ１および他のスペクトリン遺伝子、ＡＮＫ１遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子、インターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ＡＤＡ遺伝子、ＦＡＨ遺伝子、ならびにＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、またはＮＣＦ４遺伝子等を含む慢性肉芽腫性疾患に関連する遺伝子が挙げられる。
【００１４】
増強剤は、典型的には、ドナーオリゴヌクレオチドによる遺伝子編集を増加させる。好ましい実施形態では、増強剤は、細胞透過性抗体である。一部の実施形態では、増強剤は抗ＲＡＤ５１因子である。細胞透過性抗体は、担体またはコンジュゲートの援助を受けずに細胞の細胞質および／または核に輸送される抗ＤＮＡ抗体であり得る。
【００１５】
一部の実施形態では、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、全身性エリテマトーデスを有する被験体またはその動物モデル（例えば、マウスまたはウサギ）から単離されるかまたはそれらに由来する。好ましい実施形態では、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗ＤＮＡ抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０と同じエピトープに結合するそのバリアント、断片、もしくはヒト化型である。特に好ましいバリアントは、重鎖にＤ３１Ｎ置換を組み込んだ３Ｅ１０バリアントである。細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を有し得る。
【００１６】
一部の実施形態では、抗体は、
（ｉ）配列番号１〜６、１２、もしくは１３のいずれか１つのＣＤＲと、配列番号７〜１１、もしくは１５のいずれか１つのＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉ）配列番号１５〜２３から選択される第１、第２、および第３の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４〜３０から選択される第１、第２、および第３の軽鎖ＣＤＲとの組合せ、
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のヒト化型、
（ｉｖ）配列番号１もしくは２のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７もしくは８との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ、
（ｖ）（ｉｖ）のヒト化型、または
（ｖｉ）配列番号３〜６のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号９〜１１との少なくとも８５％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む軽鎖との組合せ
を有する。
【００１７】
好ましくは、抗体は、ＲＡＤ５１に直接結合することができる。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有する。抗ＤＮＡ抗体は、抗ＤＮＡ抗体の単鎖可変断片またはその保存的バリアントであり得る。例えば、抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の一価、二価、もしくは多価単鎖可変断片（３Ｅ１０  Ｆｖ）、またはそのバリアント、例えば保存的バリアントであり得る。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、重鎖にＤ３１Ｎ置換を組み込んだ３Ｅ１０の一価、二価、または多価単鎖可変断片（３Ｅ１０  Ｆｖ）である。
【００１８】
同様に、薬学的に許容される賦形剤中に増強剤、例えば細胞透過性抗体と、ドナーオリゴヌクレオチドとを含有する医薬組成物も提供する。組成物を使用して、細胞を有効量の組成物と接触させることによって細胞のゲノムを改変することができる。
【００１９】
同様に、細胞を、有効量の（ｉ）増強剤、例えば細胞透過性抗体、および（ｉｉ）細胞のゲノムにおける変異を修正することができる配列を含有するドナーオリゴヌクレオチドと接触させることによって、細胞のゲノムを改変する方法も提供する。ゲノム改変は、細胞を（ｉ）および（ｉｉ）の両方と接触させる場合では、（ｉ）の非存在下で（ｉｉ）と接触させる場合より高い頻度で起こり得る。好ましくは、方法は、細胞をヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、Ｃａｓ９）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）と接触させることを伴わない。
【００２０】
ドナーオリゴヌクレオチドは、別々にナノ粒子に被包することができる。ナノ粒子は、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））から形成され得る。ナノ粒子は、ダブルエマルジョンから調製され得る。一部の実施形態では、標的化部分、細胞透過性ペプチド、またはその組合せは、ナノ粒子に直接または間接的に会合、連結、コンジュゲート、または他の方法で結合する。
【００２１】
一部の実施形態では、細胞（例えば、造血幹細胞）を、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、それを必要とする被験体に細胞をさらに投与することができる。細胞は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するのに有効な量で被験体に投与され得る。他の実施形態では、細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチドを被験体に投与した後に、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。
【００２２】
被験体は、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、リソソーム蓄積症、免疫不全症候群、例えばＸ連鎖重症複合免疫不全症およびＡＤＡ欠損症、チロシン血症、ファンコニ貧血、赤血球障害である球状赤血球症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病、レーバー遺伝性視神経症、または慢性肉芽腫性障害などの疾患または障害を有し得る。そのような実施形態では、遺伝子改変は、被験体における疾患または障害の１つまたは複数の症状を低減させるのに有効な量で起こり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、１）ドナーＤＮＡ単独を含有するＮＰ、２）ドナーＤＮＡおよびＰＮＡを含有するＮＰ、ならびに３）ドナーＤＮＡ単独および３Ｅ１０を含有するＮＰによって処置したＭＥＦにおけるβ−グロビン／ＧＦＰ融合遺伝子内のＩＶＳ２−６５４（Ｃ−＞Ｔ）変異の遺伝子修正を示す棒グラフである。パーセント遺伝子編集を、フローサイトメトリーによって評価したＧＦＰ＋  ＭＥＦの割合によって決定した。
【００２４】
【図２】図２は、Ｔｏｗｎｅｓマウスからの骨髄細胞をｅＭａｂ（３Ｅ１０）およびドナーＤＮＡによってｅｘ  ｖｉｖｏで処置後のベータグロビン遺伝子の遺伝子編集のパーセンテージを示す棒グラフである。遺伝子編集頻度は、ゲノムＤＮＡの液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析によって決定した。
【００２５】
【図３】図３は、ＴｏｗｎｅｓマウスからのＭＥＦをｅＭａｂ（３Ｅ１０）およびドナーＤＮＡによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置後のベータグロビン遺伝子における遺伝子編集のパーセンテージを示す棒グラフである。遺伝子編集頻度を、ゲノムＤＮＡの液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析によって決定した。３Ｅ１０／ドナーＤＮＡによって処置したＭＥＦにおける編集は、ドナーＤＮＡ単独によって処置したＭＥＦより有意に高かった。
【００２６】
【図４】図４は、Ｔｏｗｎｅｓマウスを腹腔内注射によって送達される３Ｅ１０およびドナーＤＮＡによってｉｎ  ｖｉｖｏで処置後のベータグロビン遺伝子における遺伝子編集のパーセンテージを示す棒グラフである。遺伝子編集を、注射の２ヶ月後の骨髄細胞において評価した。ブランクＰＬＧＡナノ粒子と比較すると、３Ｅ１０／ドナーＤＮＡによって処置したマウスは、有意に高レベルの遺伝子編集を実証した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖが抗原結合に関して所望の構造を形成することを可能にするリンカーによって結合した単一のポリペプチド鎖において軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単鎖可変断片を意味する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨおよびＶＬが互いに会合してＦｖを形成する）。ＶＬおよびＶＨ領域は、親抗体に由来してもよく、または化学合成もしくは組換えにより合成されてもよい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「可変領域」は、免疫グロブリンのそのようなドメインを、抗体が広く共有するドメイン（例えば抗体Ｆｃドメイン）と識別すると意図される。可変ドメインは、その残基が抗原結合に関与する「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、典型的には、軽鎖可変ドメインにおけるおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおけるおよそ残基２７〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．  （１９９１））ならびに／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７）を含む。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義した超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、標的抗原に結合する天然または合成の抗体を指す。この用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらの免疫グロブリン分子の結合タンパク質、断片、およびポリマー、ならびに標的抗原に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化バージョンもまた含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「細胞透過性抗体」は、生きている哺乳動物細胞の細胞質および／または核に輸送される免疫グロブリンタンパク質、その断片、バリアント、またはそれに基づく融合タンパク質を指す。「細胞透過性抗ＤＮＡ抗体」は、ＤＮＡ（例えば、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡ）に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、担体またはコンジュゲートの援助を受けずに細胞の細胞質へと輸送される。他の実施形態では、抗体は、細胞透過性部分、例えば細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、細胞透過性抗体は、担体またはコンジュゲートの存在下または非存在下で核に輸送される。
【００３２】
インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、免疫グロブリン分子の断片、結合タンパク質、およびポリマー、免疫グロブリンの１つより多くの種、クラス、またはサブクラスからの配列を含有するキメラ抗体、例えばヒトまたはヒト化抗体、ならびにＤＮＡに特異的に結合する免疫グロブリンの少なくともイディオタイプを含有する組換えタンパク質もまた含まれる。抗体は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、または類似の方法によってその所望の活性に関して試験することができ、その後、そのｉｎ  ｖｉｖｏ治療活性を、公知の臨床的試験方法に従って試験する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、参照のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、差は限定的であり、そのため参照ポリペプチドとバリアントの配列は全体として極めて類似であり、多くの領域において同一である。バリアントおよび参照ポリペプチドは、１つまたは複数の改変（例えば、置換、付加、および／または欠失）によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされる残基であってもなくてもよい。ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントのように天然に存在してもよく、または天然に存在することが公知でないバリアントであってもよい。
【００３４】
本開示のポリペプチドの構造に改変および変化を行うことができ、それでもなおポリペプチドと類似の特徴を有する分子を得ることができる（例えば、保存的アミノ酸置換）。例えば、認識可能に活性を失うことなく、ある特定のアミノ酸を配列における他のアミノ酸の代わりに使用することができる。ポリペプチドの生物学的機能的活性を定義するのはそのポリペプチドの相互作用能および性質であることから、ある特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列に行うことができ、それでもなお、同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００３５】
そのような変化を行う場合、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することができる。ポリペプチドに対する相互作用生物機能の付与におけるアミノ酸ハイドロパシーインデックスの重要性は、一般的に当技術分野において理解されている。ある特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用することができ、それでもなお類似の生物活性を有するポリペプチドをもたらすことができることは公知である。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特徴に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられている。それらのインデックスは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００３６】
アミノ酸の相対的ハイドロパシー特徴は、得られたポリペプチドの二次構造を決定し、次にこれがポリペプチドと他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原、および補因子との相互作用を定義すると考えられている。アミノ酸を、類似のハイドロパシーインデックスを有する別のアミノ酸に置換することができ、それでもなお機能的に等価なポリペプチドを得ることができることは当技術分野で公知である。そのような変化では、そのハイドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、±０．５以内の置換がさらにより特に好ましい。
【００３７】
同様のアミノ酸の置換はまた、特にそれによって作製された生物学的機能的に等価なポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実施形態において使用することが意図される場合には、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）（＋０．２）、グリシン（０）、プロリン（−０．５±１）、トレオニン（−０．４）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似の親水性を有する別のアミノ酸の代わりに使用することができ、それでもなお生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドを得ることができると理解される。そのような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【００３８】
上記で概略を述べたように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れる例示的な置換は当業者に周知であり、これには（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）が挙げられる。本開示の実施形態はこのように、上記のポリペプチドの機能的または生物学的等価物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、目的のポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するバリアントを含み得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列させて、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後、参照核酸配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定する目的でのアライメントは、当業者の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適正なパラメーターは、公知の方法によって決定することができる。
【００４０】
本明細書における目的に関して、所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの、所定の核酸配列Ｄとの（ｔｏ）、Ｄとの（ｗｉｔｈ）、またはＤに対する％配列同一性（これは、あるいは所定の配列Ｄとの、Ｄとの、またはＤに対するある特定の％配列同一性を有するかまたは含む所定の配列Ｃと表現することができる）は、以下のように計算される：
割合Ｗ／Ｚ×１００
式中、Ｗは、配列アライメントプログラムのＣおよびＤのアライメントにおいてそのプログラムによって同一のマッチとしてスコア化されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤとの％配列同一性は、ＤのＣとの％配列同一性と等しくないと認識されるであろう。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、他の抗原に有意に結合しない、抗体のその同族抗原（例えば、ＤＮＡ）に対する結合を指す。そのような条件下で抗体が標的に特異的に結合するためには、抗体を標的に対するその特異性に関して選択する必要がある。多様なイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを慣用的に使用して、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載に関しては、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。好ましくは、抗体は、その第２の分子と約１０５ｍｏｌ−１より高い（例えば、１０６ｍｏｌ−１、１０７ｍｏｌ−１、１０８ｍｏｌ−１、１０９ｍｏｌ−１、１０１０ｍｏｌ−１、１０１１ｍｏｌ−１、および１０１２ｍｏｌ−１、またはそれより高い）親和性定数（Ｋａ）で抗原に「特異的に結合する」。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」は、実質的に均一な抗体集団から得た抗体を指し、すなわち集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さいサブセットに存在し得る起こり得る天然に存在する変異を除き、同一である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子編集増強因子」または「遺伝子編集増強剤」、または「増強因子」または「増強剤」は、化合物の非存在下でのドナーオリゴヌクレオチドの使用と比較して、ドナーオリゴヌクレオチドによる遺伝子、ゲノム、または他の核酸の編集（例えば、挿入、欠失、置換等を含む変異）の有効性を増加させる化合物を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、投与の標的である任意の個体を意味する。被験体は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。したがって、被験体はヒトであり得る。この用語は、特定の年齢または性別を指し示すものではない。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、使用される組成物の量が、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を改善するために十分な量であることを意味する。そのような改善は、単に低減または変更を必要とするに過ぎず、必ずしも排除を必要としない。正確な投薬量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康等）、処置される疾患または障害、ならびに投与される薬剤の投与経路および薬物動態などの多様な要因に応じて変化するであろう。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生物学的でもそれ以外で望ましくないものでもない材料を指し、すなわち材料は、いかなる望ましくない生物作用も引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬組成物の他のいかなる構成成分とも有害に相互作用することなく被験体に投与され得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「担体」または「賦形剤」は、それと共に１つまたは複数の活性成分を組み合わせる、製剤中の有機または無機成分、天然または合成の不活性成分を指す。担体または賦形剤は本来、当業者に周知であるように、活性成分のいかなる分解も最小限にするように、および被験体におけるいかなる有害な副作用も最小限にするように選択される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、疾患、病的状態、または障害を治癒する、改善する、安定化する、または防止する意図での患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的な処置、すなわち具体的に疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする処置を含み、同様に原因の処置、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去を目的とする処置も含む。加えてこの用語は、緩和処置、すなわち疾患、病的状態、または障害の治癒ではなくて症状の軽減のために設計された処置；防止的処置、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の発症を最小限にするか、または部分的もしくは完全に阻害することを目的とする処置；ならびに支持的処置、すなわち関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする別の特異的治療を補助するために用いられる処置を含む。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「標的化部分」は、選択された細胞または組織タイプ上の受容体部位に粒子または分子を方向付けることができ、結合分子として役立ち得るか、または別の分子とのカップリングもしくは結合のために役立ち得る物質である。本明細書で使用される場合、「方向付ける」は、選択した細胞または組織タイプに分子を優先的に結合させることを指す。これを使用して、以下に論じるように、細胞材料、分子、または薬物を方向付けることができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」または「低減する」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターの減少を意味する。これは、これらに限定されないが、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去を含み得る。これはまた、例えば天然または対照レベルと比較して活性、応答、状態、または疾患の１０％低減も含み得る。したがって、低減は、天然または対照レベルと比較して１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間で形成されたペプチド結合を通しての２つまたはそれより多くのポリペプチドの結合によって形成されたポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成要素ポリペプチドの化学的カップリングによって形成することができ、または単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現させることができる。単鎖融合タンパク質は、単一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、分子生物学の通常の技術を使用して２つの遺伝子をインフレームで単一の核酸配列に結合して調製することができ、次に融合タンパク質が産生される条件下で適正な宿主細胞において核酸を発現させることができる。
【００５２】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書においてそれ以外であると示されている場合を除き、単にその範囲内に入る各々の別々の値を個々に言及する省略方法として役立つと意図され、各々の別々の値は、あたかもそれが本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００５３】
用語「約」の使用は、記載の値より上または下のいずれかのおよそ±１０％の範囲の値を記載すると意図される。他の実施形態では、値は、記載の値より上または下のいずれかのおよそ±５％の範囲の値の範囲であり得る。他の実施形態では、値は、記載の値より上または下のいずれかのおよそ±２％の範囲の値の範囲であり得る。他の実施形態では、値は、記載の値より上または下のいずれかのおよそ±１％の範囲の値の範囲であり得る。上記の範囲は、文脈から明白になると意図され、さらなる限定を意味するものではない。
【００５４】
本明細書において記載する全ての方法は、文脈がそれ以外であることを示している場合を除き、または文脈と明らかに矛盾している場合を除き、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書において提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「などの」）の使用は、単に実施形態をよりよく明らかにすることを意図しているに過ぎず、それ以外であることを特許請求している場合を除き、本実施形態の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、特許請求されていない任意のエレメントが本発明の実践にとって必須であることを示すと解釈してはならない。
【００５５】
ＩＩ．組成物
標的化遺伝子編集を亢進するための組成物およびその使用方法を開示する。開示される方法は典型的には、細胞を、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドの両方と接触させることを含む。例示的な増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドを提供する。増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、同じまたは異なる組成物の一部であり得る。
【００５６】
一部の実施形態では、増強剤は、１つまたは複数の内因性の高忠実度ＤＮＡ修復経路に携わることができるか、またはエラープローン（すなわち低忠実度）ＤＮＡ修復経路を阻害／モジュレートすることができる。増強剤としては、例えばＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ修復因子のモジュレーター、相同組換え因子のモジュレーター、細胞接着モジュレーター、細胞周期モジュレーター、細胞増殖モジュレーター、および幹細胞動員因子が挙げられる。増強因子は、１つまたは複数の内因性の高忠実度ＤＮＡ修復経路をモジュレートする（例えば、変更する、阻害する、促進する、競合する）ことができるか、またはエラープローン（すなわち、低忠実度）ＤＮＡ修復経路を阻害／モジュレートすることができる。好ましい実施形態では、増強因子は、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復、または相同組換え因子の阻害剤であり得る。より好ましい実施形態では、増強因子はＲＡＤ５１の阻害剤であり得る。
【００５７】
例えば、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ修復因子の阻害剤を増強剤として使用してもよい。相同組換え因子の阻害剤を増強剤として使用してもよい。
【００５８】
細胞は、主に、ＤＮＡ切断領域でヌクレオチドを導入するかまたは欠失させることができる主要な経路であるがエラーを生じやすい経路である内因性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復を通してＤＮＡ切断を修復する。したがって、ＮＨＥＪは、標的遺伝子の永続的なサイレンシングに適している。あるいは、細胞は、鋳型ＤＮＡ鎖の存在下で相同組換えを伴うより正確な機構である相同組換え修復（ＨＤＲ）によって二本鎖切断を修復することもできる。典型的には、標的化ゲノム編集は、変異した配列を鋳型／ドナーＤＮＡによって提供される修正する配列に交換することによってゲノム中の変異配列の修正を対象とする。そのため、標的化ゲノム編集の効率を亢進するために鋳型／ドナーＤＮＡの相同組換えにとって都合がよい機構を同定および利用するために当技術分野で継続的な努力が行われている。ＤＮＡ修復に関係する因子の発現および／または活性をモジュレートすることは、ゲノム操作の精度を亢進するために有望なアプローチである。
【００５９】
用語「ＤＮＡ修復」は、それによって細胞がＤＮＡ分子に対する損傷を同定し、修正するプロセスの集合体を指す。一本鎖欠損は、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、またはミスマッチ修復（ＭＭＲ）によって修復される。二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、または相同組換えによって修復される。ＤＮＡが損傷を受けると、細胞周期チェックポイントが活性化され、これが細胞周期を停止させて、分裂を継続する前に細胞に損傷を修復する時間を与える。チェックポイントメディエータータンパク質としては、ＢＲＣＡ１、ＭＤＣ１、５３ＢＰ１、ｐ５３、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、およびｐ２１が挙げられる。したがって、ＢＥＲ、ＮＥＲ、ＭＭＲ、ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、相同組換えまたはＤＮＡ合成等を含む上記のプロセスのいずれかに関係する因子は、ＤＮＡ損傷および／またはＤＮＡ修復因子として記載され得る。
【００６０】
ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ合成、または相同組換え因子の非制限的な例としては、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡｌ、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２，ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＵ、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ  ＣＰＩＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、およびＲＡＤ９が挙げられる。好ましい実施形態では、ＤＮＡ損傷因子またはＤＮＡ修復因子はＲＡＤ５１である。
【００６１】
ＲＡＤ５１リコンビナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡのオルトログであり、哺乳動物細胞の相同組換えにおける重要なタンパク質である。ＲＡＤ５１は、ＤＮＡ病変の最も有害なタイプである二本鎖切断の修復を促進する。二本鎖切断は、様々な化学剤および電離放射線によって誘導され得るが、鎖間架橋の修復の際にも形成される。一度二本鎖切断が形成されると、それらは最初にエキソヌクレアーゼによって処理され、広範な３’一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）テールを生成する（Ｃｅｊｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．，  ４６７（７３１１）：１１２−１６  （２０１０）；Ｍｉｍｉｔｏｕ  ＆  Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ．，  ８（９）：９８３−９５  （２００９））。ｓｓＤＮＡのこれらの痕跡は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ＲＰＡによって急速に覆われるようになるが、ＲＰＡは最終的にＲＡＤ５１によってｓｓＤＮＡから除去される。ＲＡＤ５１は、ＡＴＰ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、そのためｓｓＤＮＡテールに結合し、多量体を形成してらせん状のヌクレオプロテインフィラメントを形成し、これは相同なｄｓＤＮＡ配列の検索を促進する（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，  Ｎａｔｕｒｅ．，  ４５３（７１９４）：４６３−６  （２００８））。ＲＡＤ５１が、細胞中のｓｓＤＮＡ上でＲＰＡを除去することができるためには、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５１パラログ複合体、および他のタンパク質を含むいくつかのメディエータータンパク質が必要である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．，  ４７７：１３１−５３  （２００１））。相同なｄｓＤＮＡ配列が見出されると、ＲＡＤ５１は、フィラメント内に存在するｓｓＤＮＡと相同なｄｓＤＮＡとの間でＤＮＡ鎖交換を促進し、すなわち、ｓｓＤＮＡが相同なＤＮＡ二重鎖に侵入すると、二重鎖から同一のｓｓＤＮＡの除去および結合分子の形成をもたらす。ＤＳＢ修復の重要な中間体である結合分子は、二本鎖切断修復にとって必要なＤＮＡ修復合成のための鋳型およびプライマーの両方を提供する（Ｐａｑｕｅｓ  ＆  Ｈａｂｅｒ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ６３（２）：３４９−４０４  （１９９９））。
【００６２】
ＤＮＡ鎖交換を促進することによって、ＲＡＤ５１は相同組換えにおいて重要な役割を果たす。このタンパク質は、バクテリオファージから哺乳動物まで進化的に保存されている。全ての生物において、ＲＡＤ５１オルトログはＤＮＡ修復および相同組換えにおいて重要な役割を果たす（Ｋｒｏｕｇｈ  ＆  Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３８：２３３−７１  （２００４）；Ｈｅｌｌｅｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ，  ６（７）：９２３−３５  （２００７）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９３（１０）：４８２７−３２  （１９９６））。
【００６３】
好ましい実施形態では、増強剤は、ＲＡＤ５１、ＸＲＣＣ４、またはその組合せの発現および／または活性に拮抗するまたはそれらを低減させるものである。例えば、一部の実施形態では、増強剤は、ＲＡＤ５１および／またはＸＲＣＣ４阻害剤である。増強剤の非制限的な例としては、リボザイム、三重鎖形成分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子、および抗体が挙げられる。
【００６４】
前述の因子のいずれかを設計および産生する方法は、当技術分野で周知であり、使用することができる。例えば、予め設計された抗ＲＡＤ５１  ｓｉＲＮＡがＤｈａｒｍａｃｏｎから市販されており（実施例に記載されるように）、増強剤として使用してもよい。同様に、抗ＸＲＣＣ４  ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡは当技術分野で公知であり、容易に入手可能である。さらに、ＸＲＣＣ４およびＲＡＤ５１の低分子阻害剤が当技術分野で公知であり（例えば、Ｊｅｋｉｍｏｖｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ４：８６  （２０１４））、本開示の方法に従って増強剤として使用することができる。
【００６５】
Ａ．細胞透過性抗体
一部の実施形態では、増強剤は細胞透過性抗体である。細胞透過性分子は、一般的に本明細書において「細胞透過性抗体」と呼ばれるが、抗原結合性断片、バリアント、ならびに融合タンパク質、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｔｒ−ｓｃＦｖ、および他の単鎖可変断片を含む断片および結合タンパク質、ならびに本明細書に開示の他の細胞透過性分子が、この語句に包含され、同様に本明細書に開示される組成物および方法において使用するために明白に提供される。
【００６６】
組成物および方法において使用するための細胞透過性抗体は、抗ＤＮＡ抗体であり得る。細胞透過性抗体は、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡに結合し得る。細胞透過性抗体は、抗ＲＮＡ抗体（例えば、ＲＮＡに特異的に結合する抗体）であり得る。
【００６７】
二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）に対する自己抗体はしばしば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者の血清中で同定され、疾患の病因にしばしば関係している。したがって、一部の実施形態では、細胞透過性抗体（例えば、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体）は、ＳＬＥを有する患者またはＳＬＥの動物モデルに由来し得るか、またはそれらから単離することができる。
【００６８】
好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、細胞への進入、ならびに細胞質および／または核への輸送を促進するために、細胞透過性部分、例えば細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされる。細胞透過性ペプチドの例としては、これらに限定されないが、ポリアルギニン（例えば、Ｒ９）、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−Ｔｒｅｎ−コレステロール）が挙げられる。他の実施形態では、抗体はＴｒａｎｓＭａｂｓ（商標）技術（ＩｎＮｅｘｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して改変される。
【００６９】
好ましい実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、担体またはコンジュゲートの援助を受けずに細胞の細胞質および／または核へと輸送される。例えば、細胞傷害作用を伴わずにｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物細胞の核に輸送されるモノクローナル抗体３Ｅ１０およびその活性断片が、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｉｓｂａｒｔに対する米国特許第４，８１２，３９７号および第７，１８９，３９６号において開示されている。簡単に説明すると、抗体は、抗ＤＮＡ抗体の血清中レベルが上昇した宿主（例えば、ＭＲＬ／１ｐｒマウス）からの脾細胞を公知の技術に従って骨髄腫細胞と融合させること、または脾細胞を適正な形質転換ベクターによって形質転換し、細胞を不死化させることによって調製され得る。細胞を選択培地中で培養し、ＤＮＡに結合する抗体を選択するためにスクリーニングしてもよい。
【００７０】
一部の実施形態では、細胞透過性抗体は、Ｒａｄ５１に結合してもよく、および／またはＲａｄ５１を阻害してもよい。例えば、Ｔｕｒｃｈｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ４５（２０）：  １１７８２−１１７９９  （２０１７）に記載される細胞透過性抗体を参照されたい。
【００７１】
組成物および方法において使用することができる抗体としては、任意のクラスの免疫グロブリン全体（すなわち、インタクトな抗体）、その断片、および抗体の少なくとも抗原結合性可変ドメインを含有する合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体間で配列が異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、変動性は通常、抗体の可変ドメインの中に均一に分布していない。これは典型的には、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々が４つのＦＲ領域を含み、ほとんどがベータ−シート立体配置をとり、３つのＣＤＲによって接続され、ベータ−シート構造を接続し、一部の例ではその一部を形成するループを形成する。各々の鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって一緒に非常に近位に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。したがって、抗体は、典型的にはＤＮＡ結合を維持するためおよび／またはＤＮＡ修復を妨害するために必要な少なくともＣＤＲを含有する。
【００７２】
１．  ３Ｅ１０配列
一部の実施形態では、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗ＤＮＡ抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０と同じもしくは異なるエピトープに結合するそのバリアント、誘導体、断片、もしくはヒト化型である。したがって、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ２４３９ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体３Ｅ１０と同じまたは異なるエピトープ特異性を有し得る。抗ＤＮＡ抗体は、モノクローナル抗体３Ｅ１０のパラトープを有し得る。抗ＤＮＡ抗体は、抗ＤＮＡ抗体の単鎖可変断片、またはその保存的バリアントであり得る。例えば、抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の単鎖可変断片（３Ｅ１０  Ｆｖ）またはそのバリアントであり得る。
【００７３】
モノクローナル抗体３Ｅ１０のアミノ酸配列は当技術分野で公知である。例えば、３Ｅ１０重鎖および軽鎖の配列を以下に提供し、ここで一重下線はＫａｂａｔシステムに従って同定されたＣＤＲ領域を示し、配列番号１２〜１４においてイタリック体は可変領域を示し、二重下線はシグナルペプチドを示す。ＩＭＧＴシステムに従うＣＤＲも同様に提供する。
【００７４】
ａ．３Ｅ１０重鎖
一部の実施形態では、３Ｅ１０の重鎖可変領域は：
【化１】
2022500009.tif 000002
（配列番号１；Ｚａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７２：５１３−５２０  （１９９４）；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１６９８１．１−マウスＩｇ再配列Ｌ−鎖遺伝子；部分的ｃｄｓ；およびＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６５６７９．１−免疫グロブリン重鎖、部分的［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］）である。
【００７５】
一部の実施形態では、３Ｅ１０重鎖は、
【化２】
2022500009.tif 000003
として発現される。
【００７６】
野生型配列に変異を組み込む３Ｅ１０抗体のバリアントも同様に、例えばＺａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７（５）：２０８２−８  （１９９６）に記載されるように当技術分野で公知である。例えば、３Ｅ１０の重鎖可変領域のアミノ酸３１位は、抗体およびその断片が核の中に侵入してＤＮＡに結合する能力に影響を及ぼすことが決定されている（配列番号１、２、および１３における太字）。ＣＤＲ１におけるＤ３１Ｎ変異（配列番号２および１３における太字）は、核の中に侵入して元の抗体よりかなり高い効率でＤＮＡに結合する（Ｚａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７２：５１３−５２０  （１９９４）、Ｗｅｉｓｂａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．，  １１，  ５３９−５４６  （１９９８）；Ｗｅｉｓｂａｒｔ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２５，  １８６７−１８７３  （２００４））。
【００７７】
一部の実施形態では、３Ｅ１０の重鎖可変領域の好ましいバリアントのアミノ酸配列は：
【化３】
2022500009.tif 000004
である。
【００７８】
一部の実施形態では、３Ｅ１０重鎖は、
【化４】
2022500009.tif 000005
【化５】
2022500009.tif 000006
として発現される。
【００７９】
一部の実施形態では、配列番号１または２のＣ末端セリンは、存在しないか、または例えば３Ｅ１０重鎖可変領域においてアラニンに置換されている。
【００８０】
Ｋａｂａｔによって同定された相補性決定領域（ＣＤＲ）は、上記の下線で示され、ＣＤＲ  Ｈ１．１（元の配列）：ＤＹＧＭＨ（配列番号１５）、ＣＤＲ  Ｈ１．２（Ｄ３１Ｎ変異を有する）：ＮＹＧＭＨ（配列番号１６）、ＣＤＲ  Ｈ２．１：ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号１７）、ＣＤＲ  Ｈ３．１：ＲＧＬＬＬＤＹ（配列番号１８）を含む。
【００８１】
Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ  Ｈ２．１のバリアントはＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１９）である。
【００８２】
加えてまたはあるいは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＩＭＧＴシステムに従って定義することができる。ＩＭＧＴシステムによって同定された相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＣＤＲ  Ｈ１．３（元の配列）：ＧＦＴＦＳＤＹＧ（配列番号２０）、ＣＤＲ  Ｈ１．４（Ｄ３１Ｎ変異を有する）：ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号２１）、ＣＤＲ  Ｈ２．２：ＩＳＳＧＳＳＴＩ（配列番号２２）、ＣＤＲ  Ｈ３．２：ＡＲＲＧＬＬＬＤＹ（配列番号２３）を含む。
【００８３】
ｂ．３Ｅ１０軽鎖
一部の実施形態では、３Ｅ１０の軽鎖可変領域は：
【化６】
2022500009.tif 000007
である。
【００８４】
３Ｅ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列はまた：
【化７】
2022500009.tif 000008
でもあり得る。
【００８５】
一部の実施形態では、３Ｅ１０軽鎖は、
【化８】
2022500009.tif 000009
として発現される。
【００８６】
他の３Ｅ１０軽鎖配列は、当技術分野で公知である。例えば、Ｚａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５；１５４（４）：１９８７−９４  （１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１６９８１．１−マウスＩｇ再配列Ｌ鎖遺伝子、部分的ｃｄｓ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６５６８１．１−免疫グロブリン軽鎖、部分的［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］）を参照されたい。
【００８７】
Ｋａｂａｔによって同定された相補性決定領域（ＣＤＲ）を、下線で示し、ＣＤＲ  Ｌ１．１：
【化９】
2022500009.tif 000010
を含む。
【００８８】
Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ  Ｌ１．１のバリアントはＲＡＳＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹＬＡ（配列番号２７）である。
【００８９】
Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ  Ｌ２．１のバリアントはＹＡＳＹＬＱＳ（配列番号２８）である。
【００９０】
加えてまたはあるいは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＩＭＧＴシステムに従って定義することができる。ＩＭＧＴシステムによって同定された相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＣＤＲ  Ｌ１．２  ＫＳＶＳＴＳＳＹＳＹ（配列番号２９）、ＣＤＲ  Ｌ２．２：ＹＡＳ（配列番号３０）、ＣＤＲ  Ｌ３．２：ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２６）を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、配列番号７または８の配列のＣ末端は、３Ｅ１０軽鎖可変領域においてアルギニンをさらに含む。
【００９２】
２．ヒト化３Ｅ１０
一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、典型的に「インポート」可変ドメインからとって「インポート」残基と呼ばれる。抗体のヒト化技術は、一般的には、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するために、組換えＤＮＡ技術の使用を伴う。
【００９３】
例示的な３Ｅ１０ヒト化配列は、ＷＯ２０１５／１０６２９０号およびＷＯ２０１６／０３３３２４号において論じられ、以下に提供される。
【００９４】
ａ．ヒト化３Ｅ１０重鎖可変領域
一部の実施形態では、ヒト化３Ｅ１０重鎖可変ドメインは
【化１０】
2022500009.tif 000011
を含む。
【００９５】
ｂ．ヒト化３Ｅ１０軽鎖可変領域
一部の実施形態では、ヒト化３Ｅ１０軽鎖可変ドメインは
【化１１】
2022500009.tif 000012
【化１２】
2022500009.tif 000013
を含む。
【００９６】
３．断片、バリアント、および融合タンパク質
抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０またはそのヒト化型の可変重鎖および／または軽鎖（例えば、配列番号１〜１１のいずれか、または配列番号１２〜１４のいずれかの重鎖および／もしくは軽鎖）のアミノ酸配列と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体断片または融合タンパク質で構成され得る。
【００９７】
抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０またはそのバリアントもしくはヒト化型のＣＤＲ（例えば、配列番号１〜１１、または配列番号１２〜１４、または配列番号１５〜３０のいずれかのＣＤＲ）のアミノ酸配列と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体断片または融合タンパク質で構成され得る。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性の決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質比較によって決定することができる。一部の実施形態では、抗体は、上記の好ましい可変ドメインのＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含む。
【００９８】
好ましくは、抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各々の１つと、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各々の１つとの組合せを含む。
【００９９】
３Ｅ１０の軽鎖可変配列の予測される相補性決定領域（ＣＤＲ）は上記に提供される。同様にＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６５６８１．１−免疫グロブリン軽鎖、部分的［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］およびＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３４０５１．１−マウスＩｇ再配列カッパ鎖ｍＲＮＡ  Ｖ領域も参照されたい。３Ｅ１０の重鎖可変配列の予測される相補性決定領域（ＣＤＲ）は上記に提供される。同様に、例えばＺａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７２：５１３−５２０  （１９９４）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６５６７９．１．Ｚａｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４  （４），  １９８７−１９９４  （１９９５）、およびＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１６９８２．１−マウスＩｇ再配列Ｈ鎖遺伝子、部分的ｃｄｓも参照されたい。
【０１００】
このように、一部の実施形態では、細胞透過性抗体は、配列番号１もしくは２のＣＤＲ、もしくは重鎖および軽鎖可変領域全体、または配列番号１２もしくは１３の重鎖領域、あるいはそのヒト化型と、配列番号７もしくは８、または配列番号１４の軽鎖領域、あるいはそのヒト化型との組合せを含有する。一部の実施形態では、細胞透過性抗体は、配列番号３、４、５、または６のＣＤＲ、または重鎖および軽鎖可変領域全体と、配列番号９、１０、または１１との組合せを含有する。
【０１０１】
同様に、生物活性を有する抗体の断片も含まれる。他の配列に結合しているか否かによらず、断片は、断片の活性が非改変抗体または抗体断片と比較して有意に変更されていないかまたは損なわれない限り、特定の領域または特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された改変を含む。
【０１０２】
本開示の抗原性タンパク質に対して特異的な単鎖抗体の産生にも技術を適合させることができる。単鎖抗体の産生方法は当業者に周知である。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して重鎖および軽鎖の可変ドメインを一緒に融合させ、それによって抗原結合性部位を単一の分子上で再構成することによって作製することができる。１つの可変ドメインのＣ末端が、１５〜２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他の可変ドメインのＮ末端に繋がれている単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）が、抗原結合性または結合の特異性を有意に妨害することなく作製されている。リンカーは、重鎖および軽鎖をその適したコンフォメーションの配向で一緒に結合させることを可能にするように選択される。
【０１０３】
抗ＤＮＡ抗体を、その治療能を改善するように改変することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体を、標的細胞の細胞質および／または核における第２の治療標的に対して特異的な別の抗体にコンジュゲートする。例えば、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０  Ｆｖおよび第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体の単鎖可変断片を含有する融合タンパク質であり得る。他の実施形態では、細胞透過性抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０からの第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに第２の治療標的に特異的に結合するモノクローナル抗体からの第２の重鎖および第２の軽鎖を有する二特異性抗体である。
【０１０４】
二価の単鎖可変断片（ジ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作することができる。これは、２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を産生し、タンデムｓｃＦｖを生じることによって行うことができる。ｓｃＦｖはまた、２つの可変領域を一緒にフォールドするには短すぎるリンカーペプチド（約５アミノ酸）によって、ｓｃＦｖを二量体化させることによって設計することができる。このタイプは、ダイアボディとして公知である。ダイアボディは、対応するｓｃＦｖの４０分の１までの解離定数を有することが示されており、このことは、それらがその標的に対してかなり高い親和性を有することを意味している。さらにより短いリンカー（１または２アミノ酸）は、三量体（トリアボディまたはトリボディ）の形成をもたらす。テトラボディもまた産生されている。それらは、その標的に対してダイアボディよりさらに高い親和性を示す。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、３Ｅ１０の２つまたはそれより多くの連結した単鎖可変断片（例えば、３Ｅ１０ジ−ｓｃＦｖ、３Ｅ１０トリ−ｓｃＦｖ）、またはその保存的バリアントを含有し得る。一部の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体は、ダイアボディまたはトリアボディ（例えば、３Ｅ１０ダイアボディ、３Ｅ１０トリアボディ）である。３Ｅ１０の１つのおよび２つまたはそれより多くの連結された単鎖可変断片の配列は、ＷＯ２０１７／２１８８２５号およびＷＯ２０１６／０３３３２１号に提供される。
【０１０５】
抗体の機能は、抗体またはその断片を治療剤とカップリングさせることによって亢進され得る。抗体または断片と治療剤とのそのようなカップリングは、抗体または抗体断片および治療剤を含む免疫コンジュゲートを作製することによって、または融合タンパク質を作製することによって、または抗体もしくは断片を核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に連結させることによって達成することができる。
【０１０６】
組換え融合タンパク質は、融合遺伝子の遺伝的操作を通して作製されたタンパク質である。これは典型的には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から停止コドンを除去すること、次に第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列をライゲーションまたはオーバーラップ伸長ＰＣＲを通してインフレームで付加することを伴う。次に、ＤＮＡ配列を、細胞によって単一のタンパク質として発現させる。タンパク質は、両方の元のタンパク質の完全な配列、またはそのいずれかの一部分のみを含むように操作することができる。２つの実体がタンパク質である場合、しばしばリンカー（または「スペーサー」）ペプチドもまた付加され、これによってタンパク質は独立して折り畳まれ、予想されるように挙動する可能性がより高くなる。
【０１０７】
一部の実施形態では、細胞透過性抗体は、その半減期を変更するように改変される。一部の実施形態では、抗体が、循環中または処置部位により長期間存在するように、抗体の半減期を増加させることが望ましい。例えば、抗体の力価を、循環中または処置される位置でより長期間維持することが望ましい場合がある。他の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体の半減期は、可能性がある副作用を低減させるように減少させる。抗体断片、例えば３Ｅ１０Ｆｖは、全長の抗体より短い半減期を有し得る。半減期を変更する他の方法は公知であり、記載の方法において使用することができる。例えば、抗体は、例えばＸｔｅｎｄ（商標）抗体半減期延長化技術（Ｘｅｎｃｏｒ、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）を使用して半減期を延長させるＦｃバリアントによって操作することができる。
【０１０８】
ａ．リンカー
本明細書で使用される用語「リンカー」は、限定されないが、ペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、可変領域によるエピトープの結合を妨害しない限り、任意のサイズであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のグリシンおよび／またはセリンアミノ酸残基を含む。一価の単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）は、１つの可変ドメインのＣ末端が、１５〜２５アミノ酸ペプチドまたはリンカーを介して他の可変ドメインのＮ末端に典型的に繋がれている。リンカーは、重鎖および軽鎖がその適したコンフォメーションの配向で一緒に結合することができるように選択される。ダイアボディ、トリアボディ等におけるリンカーは、典型的に上記で論じたように一価のｓｃＦｖより短いリンカーを含む。ジ、トリ、および他の多価ｓｃＦｖは、典型的に３つまたはそれより多くのリンカーを含む。リンカーは、長さおよび／またはアミノ酸組成に関して同じであっても異なっていてもよい。したがって、リンカーの数、リンカーの組成、およびリンカーの長さは、当技術分野で公知であるようにｓｃＦｖの所望の価数に基づいて決定することができる。リンカーは、ジ、トリ、および他の多価ｓｃＦｖの形成を可能にするかまたは促進することができる。
【０１０９】
例えば、リンカーは、４〜８アミノ酸を含み得る。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＱＳＳＲＳＳ（配列番号３１）を含む。別の実施形態では、リンカーは、１５〜２０アミノ酸、例えば１８アミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＱＳＳＲＳＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号３２）を含む。他のフレキシブルリンカーとしては、これらに限定されないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３４）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２（配列番号３５）および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号３６）、ならびに（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号３７）が挙げられる。
【０１１０】
ｂ．例示的な抗ＤＮＡ  ｓｃＦｖ配列
モノ、ジ、およびトリｓｃＦｖを含む例示的なマウス３Ｅ１０  ｓｃＦｖ配列は、ＷＯ２０１６／０３３３２１号およびＷＯ２０１７／２１８８２５号に開示され、以下に提供する。本開示の組成物および方法において使用するための細胞透過性抗体は、例示的なｓｃＦｖ、ならびにその断片およびバリアントを含む。
【０１１１】
ｓｃＦｖ  ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は：
【化１３】
2022500009.tif 000014
である。
【０１１２】
配列番号３８に関連するｓｃＦｖタンパク質ドメインのアノテーション
・ＡＧＩＨ配列は溶解度を増加させる（配列番号３８のアミノ酸１〜４）
・Ｖｋ可変領域（配列番号３８のアミノ酸５〜１１５）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号３８のアミノ酸１１６〜１２１）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３８のアミノ酸１２２〜１３６）
・ＶＨ可変領域（配列番号３８のアミノ酸１３７〜２５２）
・Ｍｙｃタグ（配列番号３８のアミノ酸２５３〜２６８）
・Ｈｉｓ６タグ（配列番号３８のアミノ酸２６９〜２７４）
【０１１３】
３Ｅ１０ジ−ｓｃＦｖ（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列
ジ−ｓｃＦｖ  ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）は、３Ｅ１０の２×重鎖および軽鎖可変領域を含むジ−単鎖可変断片であり、重鎖の３１位のアスパラギン酸がアスパラギンに変異している。ジ−ｓｃＦｖ  ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は：
【化１４】
2022500009.tif 000015
である。
【０１１４】
配列番号３９に関連するジ−ｓｃＦｖタンパク質ドメインのアノテーション
・ＡＧＩＨ配列は溶解度を増加させる（配列番号３９のアミノ酸１〜４）
・Ｖｋ可変領域（配列番号３９のアミノ酸５〜１１５）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号３９のアミノ酸１１６〜１２１）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３９のアミノ酸１２２〜１３６）
・ＶＨ可変領域（配列番号３９のアミノ酸１３７〜２５２）
・ヒトＩｇＧ  ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖ断片間のリンカー（配列番号３９のアミノ酸２５３〜２６５）
・Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号３９のアミノ酸２６６〜２７１）
・Ｖｋ可変領域（配列番号３９のアミノ酸２７２〜３８２）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号３９のアミノ酸３８３〜３８８）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号３９のアミノ酸３８９〜４０３）
・ＶＨ可変領域（配列番号３９のアミノ酸４０４〜５１９）
・Ｍｙｃタグ（配列番号３９のアミノ酸５２０〜５３５）
・Ｈｉｓ６タグ（配列番号３９のアミノ酸５３６〜５４１）
【０１１５】
トリ−ｓｃＦｖのアミノ酸配列
トリ−ｓｃＦｖ  ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）は、３１０Ｅの３×重鎖および軽鎖可変領域を含むトリ−単鎖可変断片であり、重鎖の３１位のアスパラギン酸がアスパラギンに変異している。トリ−ｓｃＦｖ  ３Ｅ１０（Ｄ３１Ｎ）のアミノ酸配列は：
【化１５】
2022500009.tif 000016
である。
【０１１６】
配列番号４０に関連するトリ−ｓｃＦｖタンパク質ドメインのアノテーション
・ＡＧＩＨ配列は溶解度を増加させる（配列番号４０のアミノ酸１〜４）
・Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸５〜１１５）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号４０のアミノ酸１１６〜１２１）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸１２２〜１３６）
・ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸１３７〜２５２）
・ヒトＩｇＧ  ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖ断片間のリンカー（配列番号４０のアミノ酸２５３〜２６５）
・Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号４０のアミノ酸２６６〜２７１）
・Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸２７２〜３８２）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号４０のアミノ酸３８３〜３８８）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸３８９〜４０３）
・ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸４０４〜５１９）
・ヒトＩｇＧ  ＣＨ１の最初の１３アミノ酸からなるＦｖ断片間のリンカー（配列番号４０のアミノ酸５２０〜５３２）
・Ｓｗｉｖｅｌ配列（配列番号４０のアミノ酸５３３〜５３８）
・Ｖｋ可変領域（配列番号４０のアミノ酸５３９〜６４９）
・軽鎖ＣＨ１の最初（の６アミノ酸）（配列番号４０のアミノ酸６５０〜６５５）
・（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７）リンカー（配列番号４０のアミノ酸６５６〜６７０）
・ＶＨ可変領域（配列番号４０のアミノ酸６７１〜７８６）
・Ｍｙｃタグ（配列番号４０のアミノ酸７８７〜８０２）
・Ｈｉｓ６タグ（配列番号４０のアミノ酸８０３〜８０８）
【０１１７】
ＷＯ２０１６／０３３３２１号およびＮｏｂｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７５（１１）：２２８５−２２９１（２０１５）は、ジ−ｓｃＦｖおよびトリ−ｓｃＦｖが、その一価の対応物と比較していくつかの改善された追加の活性を有することを示している。例示的な融合タンパク質の各々の異なるドメインに対応する部分配列もまた、上記に提供される。当業者は、例示的な融合タンパク質、またはそのドメインを利用して、上記でより詳細に論じられた融合タンパク質を構築することができることを認識するであろう。例えば、一部の実施形態では、ジ−ｓｃＦｖは、ＶＨ可変ドメインに連結された（例えば、配列番号３９のアミノ酸１３７〜２５２、またはその機能的バリアントもしくは断片）、Ｖｋ可変領域を含む第２のｓｃＦｖに連結された（例えば、配列番号３９のアミノ酸２７２〜３８２、またはその機能的バリアントもしくは断片）、ＶＨ可変ドメインに連結された（例えば、配列番号３９のアミノ酸４０４〜５１９、またはその機能的バリアントもしくは断片）、Ｖｋ可変領域を含む第１のｓｃＦｖ（例えば、配列番号３９のアミノ酸５〜１１５、またはその機能的バリアントもしくは断片）を含む。一部の実施形態では、トリ−ｓｃＦｖは、Ｖｋ可変領域を含む第３のｓｃＦｖドメインに連結された（例えば、配列番号４０のアミノ酸５３９〜６４９、またはその機能的バリアントもしくは断片）、ＶＨ可変ドメインに連結された（例えば、配列番号４０のアミノ酸６７１〜７８６、またはその機能的バリアントもしくは断片）ジ−ｓｃＦｖを含む。
【０１１８】
Ｖｋ可変領域は、例えば、リンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３７））によって、単独または軽鎖ＣＨ１の（６アミノ酸）（配列番号３９のアミノ酸１１６〜１２１）と組み合わせて、ＶＨ可変ドメインに連結することができる。他の適切なリンカーは上記に論じられており、当技術分野で公知である。ｓｃＦｖは、単独で、またはｓｗｉｖｅｌ配列（例えば、配列番号３９のアミノ酸２６６〜２７１）と組み合わせて、リンカー（例えば、配列番号３９のヒトＩｇＧ  ＣＨ１の最初の１３アミノ酸（２５３〜２６５））によって連結することができる。他の適切なリンカーは上記で論じられ、当技術分野で公知である。
【０１１９】
したがって、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸５〜５１９を含み得る。トリ−ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸５〜７８６を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、追加のドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、溶解度を亢進する配列（例えば、配列番号３９のアミノ酸１〜４）を含む。したがって、一部の実施形態では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸１〜５１９を含み得る。トリ−ｓｃＦｖは、配列番号４０のアミノ酸１〜７８６を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質の精製、単離、捕捉、同定、分離等を亢進する１つまたは複数のドメインを含む。例示的なドメインとしては、例えばＭｙｃタグ（例えば、配列番号３９のアミノ酸５２０〜５３５）および／またはＨｉｓタグ（例えば、配列番号３９のアミノ酸５３６〜５４１）を含む。したがって、一部の実施形態では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み得る。トリ−ｓｃＦｖは配列番号４０のアミノ酸配列を含み得る。他の置換可能なドメインおよび追加のドメインは上記で詳細に論じられている。
【０１２０】
例示的な３Ｅ１０ヒト化Ｆｖ配列は、ＷＯ２０１６／０３３３２４号において論じられている：
【化１６】
2022500009.tif 000017
【０１２１】
Ｂ．ドナーオリゴヌクレオチド
ドナーオリゴヌクレオチドは、組成物および方法において使用するために提供される。一部の実施形態では、組成物は、ドナーオリゴヌクレオチドを含むかまたはドナーオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される。ドナーオリゴヌクレオチドは、増強剤に共有結合により連結していてもしていなくてもよい。例えば、ドナーオリゴヌクレオチドは、細胞透過性抗体と非共有結合性の複合体を形成し得る。
【０１２２】
ドナーオリゴヌクレオチド戦略としては、これらに限定されないが、小断片相同置換（例えば、ポリヌクレオチド小ＤＮＡ断片（ＳＤＦ））および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド媒介遺伝子改変（例えば、ｓｓＯＤＮ／ＳＳＯ）が挙げられる。
【０１２３】
一般的に、遺伝子治療の場合、ドナーオリゴヌクレオチドは、宿主ゲノムにおける変異を修正することができる配列を含むが、一部の実施形態では、ドナーは、例えばＨＩＶ感染症を促進する癌遺伝子または受容体の発現を低減させることができる変異を導入する。所望の修正または変異を導入するように設計された配列を含有することに加えて、ドナーオリゴヌクレオチドはまた、同義（サイレント）変異（例えば、７〜１０個）も含有し得る。追加のサイレント変異は、処置した細胞から単離されたゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用して、修正された標的配列の検出を促進することができる。
【０１２４】
ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）型（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）で存在することができる。このように、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその組合せ）は、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡである。
【０１２５】
ドナーオリゴヌクレオチドは、任意の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、ドナーオリゴヌクレオチドのサイズは１〜８００ヌクレオチドの間であり得る。一実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、２５〜２００ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、１００〜１５０ヌクレオチドの間である。さらなる実施形態では、ドナーヌクレオチドは、約４０〜８０ヌクレオチド長である。ドナーオリゴヌクレオチドは、約６０ヌクレオチド長であり得る。長さ２５〜２００のｓｓＤＮＡは活性である。ほとんどの研究は、長さ６０〜７０のｓｓＤＮＡによって行われている。７０〜１５０のようなより長いオリゴヌクレオチドも作用する。好ましい長さは６０である。
【０１２６】
ドナー配列は、組換えのために標的化される領域の配列と比較して、１つまたは複数の核酸配列の変更、例えば１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含有し得る。ドナー配列の組換えの成功は、標的領域の配列の変化をもたらす。ドナーオリゴヌクレオチドはまた、本明細書においてドナー断片、ドナー核酸、ドナーＤＮＡ、またはドナーＤＮＡ断片とも呼ばれる。ドナー断片内の相同な位置の数が多ければ、ドナー断片が標的配列、標的領域、または標的部位に組み換えられる確率が増加することは、当技術分野で理解されている。
【０１２７】
ドナーオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ配列と比較して、少なくとも１つの変異した、挿入された、または欠失されたヌクレオチドを含有し得る。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内であり得る。標的配列はまた、プロモーターもしくはエンハンサー配列またはＲＮＡスプライシングを調節する配列を含む、標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内であり得る。
【０１２８】
ドナーオリゴヌクレオチドは、標的配列と比較して多様な変異を含有し得る。代表的なタイプの変異としては、これらに限定されないが、点変異、欠失、および挿入が挙げられる。欠失および挿入は、フレームシフト変異または欠失をもたらし得る。点変異は、ミスセンスまたはナンセンス変異を引き起こし得る。これらの変異は、標的遺伝子の発現を妨害、低減、停止、増加、改善、または他の方法で変更し得る。
【０１２９】
ドナーオリゴヌクレオチドは、遺伝子（またはその一部分）、例えば疾患または障害（例えば、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、リソソーム蓄積症）に関係する変異遺伝子の野生型配列に対応し得る。例示的な遺伝子としては、凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第ＩＸ因子、ジストロフィン、ベータ−グロビン、ＣＦＴＲ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、およびＤＮＡポリメラーゼイータをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３０】
組成物は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの）異なるドナーオリゴヌクレオチド配列を含み得る。１つより多くのドナーオリゴヌクレオチドの使用は、例えば２つの対立遺伝子が異なる改変を含有するヘテロ接合標的遺伝子を作製するために有用であり得る。
【０１３１】
ドナーオリゴヌクレオチドは、好ましくは複素環式塩基として主要な天然に存在するヌクレオチド（ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニン）、糖部分としてデオキシリボース、およびリン酸エステル結合で構成されるＤＮＡオリゴヌクレオチドである。ドナーオリゴヌクレオチドは、組換え部位での置換配列の所望の構造に応じて、またはヌクレアーゼによる分解に対する何らかの抵抗性を提供するために、核酸塩基、糖部分、または骨格／連結に対する改変を含み得る。例えば、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの各末端（５’および３’末端の両方）での末端の３つのヌクレオシド間結合を、通常のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合に交換し、それによってエキソヌクレアーゼに対する抵抗性の増加を提供することができる。ドナーオリゴヌクレオチドに対する改変は、ドナーオリゴヌクレオチドの組換え標的配列での組換えの成功を妨害してはならない。
【０１３２】
１．ドナーオリゴヌクレオチドの設計
挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドを、編集される細胞に提供する。「ドナー配列」、「ドナーポリヌクレオチド」、または「ドナーオリゴヌクレオチド」は、標的部位で挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、典型的には標的部位でゲノム配列と十分な相同性、例えば、ドナーポリヌクレオチドとドナーポリヌクレオチドが相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え修復を支持するために、標的部位でヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含有する。
【０１３３】
ドナー配列は、それが交換するゲノム配列と同一であってもなくてもよい。ドナー配列は、標的配列（例えば、遺伝子）の野生型配列（またはその一部分）に対応し得る。ドナー配列は、相同組換え修復を支持するために十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つまたは複数の一塩基変化、挿入、欠失、転位、または再配列を含有し得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接する配列との間の相同組換え修復によって標的領域の非相同配列の挿入がもたらされるように、２つの相同性領域が隣接する非相同配列を含む。
【０１３４】
ドナーオリゴヌクレオチドは、それが相同性を有する染色体における部位と単純に組換えすると考えられる。外因性のヌクレアーゼを使用しないことから、内因性のＤＮＡ修復および／または複製因子は、その標的部位へのドナーＤＮＡの相同指向性の組換えを支持することに関係すると考えられている。３Ｅ１０は、ＤＮＡ修復および組換え経路のバランスを、ＲＡＤ５１媒介性である経路からＲＡＤ５２媒介性である経路へとシフトさせることによって、組換えを促進すると考えられる。
【０１３５】
ゲノム編集組成物が、標的ＤＮＡ配列と相同性を有する少なくともセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列を含む場合、方法を使用して、標的ＤＮＡ配列に核酸材料を部位特異的に付加、すなわち挿入または交換する（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の発現を可能にする核酸を「ノックイン」するために）、タグ（例えば、６×Ｈｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）を付加する、遺伝子に調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在シグナル等）を付加する、または核酸配列を改変する（例えば、変異を導入する）ことができる。
【０１３６】
２．オリゴヌクレオチド組成物
ドナーオリゴヌクレオチドまたは他の核酸のいずれかは、核酸塩基または結合に対する１つまたは複数の改変または置換を含み得る。改変は、遺伝子編集の活性、持続、または機能を防止してはならず、好ましくは亢進すべきである。例えば、オリゴヌクレオチドに対する改変は、二重鎖の侵入および／または鎖の置き換えを防止してはならず、好ましくは亢進すべきである。改変された塩基および塩基アナログ、改変された糖および糖アナログ、ならびに／または当技術分野で公知の様々な適切な結合もまた、本明細書における分子における使用に適切である。
【０１３７】
ａ．複素環式塩基
主要な天然に存在するヌクレオチドとしては、複素環式塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニンが挙げられる。遺伝子編集分子は、そのヌクレオチド構成要素に対する化学的改変を含み得る。例えば、シトシンが隣接する標的配列は、問題であり得る。ヌクレオチドの化学改変は、生理的条件下で結合親和性および／または安定性を増加させるために有用であり得る。
【０１３８】
複素環式塩基または複素環式塩基アナログの化学改変は、ヌクレオチドの結合親和性または複合体（例えば、二重鎖または三重鎖）におけるその安定性を増加させるために有効であり得る。化学改変複素環式塩基としては、これらに限定されないが、イノシン、５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５−（１−プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５−メチルシトシン、８−オキソ−アデニン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５および２−アミノ−５−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン（２−アミノピリジン）、および様々なピロロ−およびピラゾロピリミジン誘導体が挙げられる。
【０１３９】
ｂ．骨格
オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットは、ある特定の改変を含有し得る。例えば、オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格を、反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位によってその全体を交換してもよく、および／またはホスホジエステル結合をペプチド結合もしくはホスホロチオエート結合に部分的にまたは完全に交換してもよい。複素環式塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結してもよく、これによって高い親和性および配列特異性でワトソン−クリックの塩基対形成を介してＤＮＡと二重鎖を形成することができる。
【０１４０】
他の骨格改変は、ペプチドおよびアミノ酸の変動および改変を含む。ドナーオリゴヌクレオチドの骨格構成要素は、ペプチド結合であり得るか、またはあるいは、それらは非ペプチド結合であり得る。例としては、アセチルキャップ、アミノスペーサー、例えば８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（本明細書においてＯ−リンカーと呼ばれる）が挙げられ、アミノ酸、例えばリシンは、正電荷がオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）等において望ましい場合には特に有用である。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドの骨格改変は、ＤＮＡ標的部位に対して高い特異性で分子が結合するのを防止してはならず、情報の伝達を媒介するのを防止してはならない。
【０１４２】
ｃ．改変核酸
オリゴヌクレオチドは、互いに連結されたヌクレオチドの鎖で構成される。標準的なヌクレオチドは典型的には、複素環式塩基（核酸塩基）、複素環式塩基に結合した糖部分、および糖部分のヒドロキシル官能基をエステル化するホスフェート部分を含む。主な天然に存在するヌクレオチドは、複素環式塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニン、ならびにホスホジエステル結合によって連結されたリボースまたはデオキシリボース糖を含む。本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」または「化学改変ヌクレオチド」は、複素環式塩基、糖部分、またはホスフェート部分構成要素のうちの１つまたは複数の化学改変を有するヌクレオチドを定義する。改変ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低減させることができる。オリゴヌクレオチドは、標的部位でのヌクレオチド二重鎖による静電気的反発が、対応する核酸塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低減されるように、低い負電荷を有していてもよく、電荷を有していなくてもよく、または正電荷を有していてもよい。
【０１４３】
低減された電荷を有する改変ヌクレオチドの例としては、改変ヌクレオチド間結合、例えば非キラルおよび非荷電サブユニット間結合を有するホスフェートアナログ（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，  Ｅ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，  ５２：４２０２，（１９８７））、および非キラルサブユニット間結合を有する非荷電モルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）を含む。一部のヌクレオチド間結合アナログとしては、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド結合複素環が挙げられる。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、改変ＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ８（１）：１−７（２００１）を参照されたい）。ＬＮＡは、ＤＮＡとハイブリッドを形成するが、これはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドより安定である。したがって、ＬＮＡを使用することができる。ＬＮＡの結合効率は、一部の実施形態では、正電荷をそれに付加することによって増加させることができる。市販の核酸合成機および標準的なホスホルアミダイト化学を使用してＬＮＡを作製する。
【０１４４】
分子はまた、改変された複素環式塩基、糖部分、または糖部分アナログを有するヌクレオチドも含み得る。改変ヌクレオチドは、上記の改変複素環式塩基または塩基アナログを含み得る。糖部分の改変としては、これらに限定されないが、２’−Ｏ−アミノエトキシ、２’−Ｏ−アミノエチル（２’−ＯＡＥ）、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−メチル、２−グアニドエチル（２’−ＯＧＥ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−（メトキシエチル）（２’−ＯＭＥ）、および２’−Ｏ−（Ｎ−（メチル）アセトアミド）（２’−ＯＭＡ）が挙げられる。
【０１４５】
一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれより多くの必要に応じたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。一部の実施形態では、ドナーは、ドナーオリゴヌクレオチドにおける最初の２、３、４、もしくは５ヌクレオチド、および／または最後の２、３、４、もしくは５ヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【０１４６】
Ｃ．医薬組成物
細胞透過性抗ＤＮＡ抗体およびドナーオリゴヌクレオチド組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
【０１４７】
組成物は、好ましくは、適切な薬学的担体と組み合わせて治療的使用のために用いられる。そのような組成物は、有効量の組成物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるヌクレオチドは、細胞および組織に取り込まれ、分布することは当業者によって理解される（Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ５５８（１−３）：６９−７３  （２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を吸入すると、内因性のサーファクタント（肺細胞によって産生される脂質）に結合し、追加の担体脂質の必要なく肺細胞に取り込まれることを示した（Ｎｙｃｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８５：７２１−７２５  （１９９７））。小さい核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織培養細胞に容易に取り込まれる（Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，  ８：４１５−４２６  （１９９８））。
【０１４９】
増強剤、例えば細胞透過性抗体、およびドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物は、適切な薬学的担体中で局部、局所、または全身投与するための製剤に存在し得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ  （Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９７５）は、典型的な担体および調製方法を開示している。化合物はまた、細胞に標的化するために、生物分解性または非生物分解性のポリマーまたはタンパク質またはリポソームで形成される適切な生体適合性の粒子に被包することができる。そのようなシステムは当業者に周知であり、適正な核酸と共に使用するために最適化することができる。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に被包される。
【０１５０】
様々な核酸送達方法が、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）に記載されている。そのような核酸送達システムは、所望の核酸を、例として、しかし限定ではないが「裸の」核酸としての「裸の」形態で、または送達にとって適切なビヒクル中で製剤化された、例えばカチオン性分子もしくはリポソーム形成脂質との複合体中で、またはベクターの構成成分もしくは医薬組成物の構成成分として含む。核酸送達システムは、例えばそれを細胞と接触させることによって細胞に直接提供することができ、または例えば、いずれかの生物プロセスの作用を通して間接的に提供することができる。そのような核酸送達システムは、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然もしくは合成の細胞膜断片とのカップリング、電気穿孔などの物理的手段、核酸送達システムとポリマー担体、例えば制御放出性フィルムもしくはナノ粒子もしくはマイクロ粒子と組み合わせること、ベクターを使用すること、核酸送達システムを組織もしくは細胞周囲の流体に注入すること、細胞膜を通しての核酸送達システムの単純な拡散、または細胞膜を超えての任意の能動的もしくは受動的輸送機構によって細胞に提供することができる。加えて、核酸送達システムは、ウイルスベクターの抗体関連標的化および抗体媒介性固定などの技術を使用して、細胞に提供することができる。
【０１５１】
注射のための製剤は、必要に応じて追加の保存剤と共に単位剤形、例えばアンプルまたは多用量容器で提示され得る。組成物は、ある特定の実施形態では被験体の血液と等張であり得る滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁物、およびエマルジョンのような形態をとることができる。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ゴマ油、ココナツ油、落花生油、ピーナッツ油、鉱油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または合成モノもしくはジグリセリドを含む固定油である。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含む。静脈内ビヒクルとしては、補液および栄養補充剤、ならびに電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づく補充剤）が挙げられる。材料は溶液、エマルジョン、または懸濁物中であり得る（例えば、粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）。典型的には、製剤を等張にするために、適正な量の薬学的に許容される塩が製剤において使用される。トレハロースは典型的に、１〜５％の量で医薬組成物に添加され得る。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。
【０１５２】
医薬組成物は、担体、濃化剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、および表面活性剤を含み得る。担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａに見出され得る。当業者は過剰な実験を行うことなく組成物を調製および製剤化するための様々なパラメーターを容易に決定することができる。
【０１５３】
組成物（細胞透過性抗体およびドナーリゴヌクレオチド）は、単独でまたは他の適切な構成成分と共に、吸入により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらを「噴霧化」することができる）に作製することができる。エアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素および空気の中に入れることができる。吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１５４】
一部の実施形態では、組成物（細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチド）は、製剤成分、例えば塩、担体、緩衝化剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、保存剤、溶解剤、または安定化剤と共に薬学的に許容される担体を含む。ドナーオリゴヌクレオチドは、細胞取り込みを改善するために、親油性基、例えばコレステロールならびにＣ３２官能基を有するラウリン酸およびリトコール酸誘導体にコンジュゲートすることができる。例えば、コレステロールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｌｏｒｅｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １４（１９）：４９７５−４９７７  （２００４））およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３２（７０１４）：１７３−１７８  （２００４））でｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を亢進することが実証されている。加えて、ステロイドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが血流中で異なるリポタンパク質、例えばＬＤＬと結合すると、完全性を保護し、生体分布を促進することが示されている（Ｒｕｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ５９（１１）：１４０７−１４１６  （２０００））。細胞取り込みを増加するために上記の化合物に結合またはコンジュゲートすることができる他の基としては、アクリジン誘導体；架橋剤、例えばソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビンおよびアジドプロフラビン；人工エンドヌクレアーゼ；金属錯体、例えばＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）；アルキル化部分；ヌクレアーゼ、例えばアルカリホスファターゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性担体；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射性マーカー；非放射性マーカー；炭水化物；ならびにポリリリシンまたは他のポリアミンが挙げられる。Ｌｅｖｙらに対する米国特許第６，９１９，２０８号もまた、亢進された送達方法を記載している。これらの医薬組成物は、それ自体が公知である様式、例えば従来の混合、溶解、造粒、粉砕、乳化、被包、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
【０１５５】
さらなる担体としては、徐放性調製物、例えば抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成形された粒子、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子の形状である。埋め込みは、埋め込み可能な薬物送達システム、例えばマイクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、ポリマーシステム、例えばマトリックス侵食および／または拡散システム、ならびに非ポリマーシステムを挿入することを含む。吸入は、インヘラーにおいて組成物（細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチド）を単独で、または吸収することができる担体に結合させてエアロゾルによって投与することを含む。全身投与の場合、組成物をリポソームに被包することが好ましい場合がある。
【０１５６】
組成物は、血管または尿カテーテルなどの侵襲性デバイスを使用して、および薬物送達能を有し、拡張するデバイスまたはステントグラフトとして構成されるステントなどの介入性デバイスを使用して、薬剤および／またはヌクレオチド送達システムの組織特異的取り込みを可能にする様式で送達され得る。
【０１５７】
製剤（細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチドを含有する）は、拡散によって、またはポリマーマトリックスの分解によって生体崩壊性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）のインプラントを使用して送達され得る。ある特定の実施形態では、製剤の投与は、ある一定期間、例えば数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたって組成物に対する逐次的な曝露をもたらすように設計され得る。これは、例えば製剤の反復投与によって、または反復投与することなく長期間にわたって組成物が送達される徐放性もしくは制御放出送達システムによって達成され得る。
【０１５８】
適切な他の送達システムとしては、時限放出、遅延放出、徐放性、または制御放出送達システムが挙げられる。そのようなシステムは、多くの症例において反復投与を回避できるので、被験体および医師の利便性を増加させる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらには、例えばポリマーベースのシステム、例えばポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、および／またはこれらの組合せが挙げられる。核酸を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。他の例としては、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ、ジ、およびトリグリセリドを含む脂質ベースの非ポリマーシステム、ハイドロゲル放出システム、リポソームベースのシステム、リン脂質ベースのシステム、ｓｉｌａｓｔｉｃシステム、ペプチドベースのシステム、ワックスコーティング、通常の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠、または部分的に融合したインプラントが挙げられる。製剤は、例えばマイクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックスまたはポリマーシステムとしてであり得る。一部の実施形態では、システムは、例えば、細胞透過性抗体および／またはドナーオリゴヌクレオチドを含有する製剤の拡散または侵食／分解速度の制御を通して、組成物の徐放または制御放出が起こることを可能にし得る。
【０１５９】
活性剤（細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチド）およびその組成物は、肺または粘膜投与のために製剤化することができる。投与は、肺、鼻、口腔（舌下、または口腔内）、膣、または直腸粘膜への組成物の送達を含み得る。本明細書で使用される場合、用語エアロゾルは、噴射剤を使用して産生されるか否かによらず、溶液または懸濁物であり得る粒子の微細なミストの任意の調製物を指す。エアロゾルは、標準的な技術、例えば超音波処理または高圧処置を使用して産生することができる。
【０１６０】
上気道を介して投与する場合、製剤は、滴剤またはスプレーとして鼻腔内投与するための溶液、例えば緩衝化されたもしくは緩衝化されていない水もしくは等張食塩水、または懸濁物として製剤化することができる。好ましくは、そのような溶液または懸濁物は、鼻分泌物に対して等張であり、例えば約ｐＨ４．０〜約ｐＨ７．４、またはｐＨ６．０〜ｐＨ７．０の範囲のほぼ同じｐＨである。緩衝液は生理的に適合性でなければならず、単なる例としてリン酸緩衝液が挙げられる。
【０１６１】
増強剤、例えば細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子送達ビヒクルを使用して標的細胞に送達することができる。一部の実施形態では、組成物の一部をナノ粒子にパッケージングし、一部をパッケージングしない。例えば、一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に組み込まれるが、細胞透過性抗体は組み込まれない。ナノ粒子は、一般的に５００ｎｍ〜０．５ｎｍ未満の間の範囲の粒子、好ましくは５０〜５００ｎｍの間である直径を有する粒子、より好ましくは５０〜３００ｎｍの間である直径を有する粒子を指す。ポリマー粒子の細胞内部移行は、そのサイズに高度に依存することから、ナノ微粒子ポリマー粒子は、マイクロ微粒子ポリマー粒子より非常に高い効率で細胞に内部移行する。例えば、Ｄｅｓａｉらは、直径１００ｎｍであるナノ粒子は、直径１μＭを有するマイクロ粒子と比較して約２．５倍多く培養Ｃａｃｏ−２細胞によって取り込まれることを実証した（Ｄｅｓａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，  １４：１５６８−７３（１９９７））。ナノ粒子はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織の中により深く拡散する能力がより高い。
【０１６２】
好ましい生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（ヒドロキシ酸）などの加水分解により分解する合成ポリマー、例えば乳酸およびグリコール酸のポリマーおよびコポリマー、他の分解性ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびポリ（アミン−ｃｏ−エステル）ポリマー、例えば、Ｚｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １１：８２−９０  （２０１２）およびＷＯ２０１３／０８２５２９号、米国特許出願公開第２０１４／０３４２００３号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６１３７５号に記載されるものが挙げられる。
【０１６３】
核酸のナノ粒子への被包効率を増加させるために、核酸をポリカチオンと複合体形成させることができる。用語「ポリカチオン」は、正電荷、好ましくは選択されたｐＨで、好ましくは生理的ｐＨで少なくとも２の正電荷を有する化合物を指す。ポリカチオン部分は、選択されたｐＨ値で約２〜約１５の間の正電荷を有し、好ましくは約２〜約１２の間の正電荷を有し、より好ましくは約２〜約８の間の正電荷を有する。
【０１６４】
多くのポリカチオンが当技術分野で公知である。ポリカチオンの適切な構成要素は、塩基性アミノ酸およびその誘導体、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびヒスチジン、カチオン性デンドリマー、ならびにアミノ多糖類を含む。適切なポリカチオンは、構造が線形、例えば線形のテトラリシン、分岐またはデンドリマーであり得る。
【０１６５】
例示的なポリカチオンとしては、これらに限定されないが、アクリルアミドおよび２−アクリルアミド−２−メチルプロパントリメチルアミンに基づく合成ポリカチオン、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン）、または類似の４級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマーおよびデキストランコンジュゲート、硫酸ポリミキシンＢ、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば強いポリカチオンであるポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、およびポリペプチド、例えばプロタミン、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン、およびポリオルニチンが挙げられる。適切な天然に存在するポリアミンとしては、これらに限定されないが、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレシンが挙げられる。一部の実施形態では、粒子自体がポリカチオン（例えば、ＰＬＧＡとポリ（ベータアミノエステル）のブレンド）である。
【０１６６】
機能的分子を、送達のために利用される担体に直接または間接的に会合、連結、コンジュゲート、または他の方法で結合させることができる。標的化部分を、ドナーオリゴヌクレオチド、もしくはナノ粒子、またはその他の送達ビヒクルに直接または間接的に会合、連結、コンジュゲート、または他の方法で結合させることができる。標的化部分は、標的化細胞の表面上の受容体または他の分子に結合するタンパク質、ペプチド、核酸分子、糖類、または多糖類であり得る。移植片に対する結合の特異性およびアビディティの程度は、標的化分子の選択を通してモジュレートすることができる。
【０１６７】
部分の例としては、例えば特定の細胞への分子の送達を提供する標的化部分、例えば造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、または他の任意の好ましい細胞タイプ、ならびに好ましい細胞タイプ上に発現される受容体およびリガンドに対する抗体が挙げられる。好ましくは、部分は造血幹細胞を標的とする。細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）を標的化する分子の例としては、グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）およびコラーゲンが挙げられる。一実施形態では、ポリマー粒子の外部表面は、粒子が選択された細胞または組織と相互作用する能力を亢進するように改変され得る。標的化分子にコンジュゲートされたアダプターエレメントを粒子に挿入する上記の方法が好ましい。しかし、別の実施形態では、カルボキシ末端を有するポリマー性のマイクロまたはナノ粒子の外部表面は、遊離のアミン末端を有する標的化分子に連結され得る。
【０１６８】
ポリマー性のマイクロおよびナノ粒子に結合する他の有用なリガンドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。ＰＡＭＰは、細胞もしくは組織の表面上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を標的とし、または細胞もしくは組織の内部にシグナルを送り、それによっておそらく取り込みを増加させる。粒子表面にコンジュゲートされたまたは同時被包されたＰＡＭＰとしては、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ（細菌）、二本鎖ＲＮＡ（ウイルス）、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｒｉｄｅ）（細菌）、ペプチドグリカン（細菌）、リポアラビノマンナン（ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎｉｎ）（細菌）、ザイモサン（酵母）、マイコプラズマリポタンパク質、例えばＭＡＬＰ−２（細菌）、フラジェリン（細菌）、ポリ（イノシン−シチジン）酸（細菌）、リポテイコ酸（細菌）、またはイミダゾキノリン（合成）が挙げられ得る。
【０１６９】
別の実施形態では、粒子の外部表面をマンノースアミンを使用して処置し、それによって粒子の外部表面をマンノシル化してもよい。この処置によって、粒子は抗原提示細胞表面上のマンノース受容体で標的細胞または組織に結合することができる。あるいは、Ｆｃ部分（Ｆｃ受容体を標的化する）を含有する免疫グロブリン分子、熱ショックタンパク質部分（ＨＳＰ部分）、ホスファチジルセリン（スキャベンジャー受容体）、およびリポ多糖類（ＬＰＳ）との表面コンジュゲーションは、細胞または組織上の追加の受容体標的である。
【０１７０】
マイクロおよびナノ粒子に共有結合することができるレクチンは、ムチンおよび粘膜細胞層に対してそれらを標的特異的にする。
【０１７１】
標的化部分の選択は、ナノ粒子組成物の投与方法、および標的化される細胞または組織に依存する。標的化分子は、一般的に細胞もしくは組織に対する粒子の結合親和性を増加させることができるか、またはナノ粒子を臓器中の特定の組織もしくは組織中の特定の細胞タイプに標的化することができる。純粋型または部分精製型のムチンの天然の構成成分のいずれかが粒子に共有結合すると、ビーズと腸管界面の表面張力を減少させ、ムチン層におけるビーズの溶解度を増加させる。余分なペンダントカルボン酸側基を含有するポリアミノ酸、例えばポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸の結合は、生体接着性を増加させる。１５，０００〜５０，０００ｋＤａの分子量範囲のポリアミノ酸を使用すると、粒子の表面に結合した１２０〜４２５アミノ酸残基の鎖を生じる。ポリアミノ鎖は、ムチン鎖における鎖のもつれによって、およびカルボン酸電荷の増加によって生体接着を増加させる。
【０１７２】
ＩＩＩ．方法
細胞のゲノムを改変する方法は、細胞を、有効量の（ｉ）細胞透過性抗体、および（ｉｉ）細胞ゲノムにおける変異を修正することができる配列を含有するドナーオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。ゲノム改変は、細胞を（ｉ）および（ｉｉ）の両方と接触させた場合では、（ｉ）の非存在下で（ｉｉ）と接触させた場合より高い頻度で起こり得る。好ましくは、方法は、細胞を、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、Ｃａｓ９）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）と接触させることを伴わない。方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子編集を実施することができる。
【０１７３】
増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、同じまたは異なる混合物中で一緒に細胞と接触させることができるか、または増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドを細胞と別々に接触させることができる。例えば、細胞を最初に増強剤と接触させた後、ドナーオリゴヌクレオチドと接触させることができる。あるいは、細胞を最初にドナーオリゴヌクレオチドと接触させた後、増強剤と接触させることができる。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドおよび増強剤を、溶液中で混合し、同時に細胞と接触させる。好ましい実施形態では、ドナーＤＮＡを溶液中で増強剤と混合し、その組合せを培養物中の細胞に添加するか、または処置される動物に注射する。
【０１７４】
増強剤および／またはドナーオリゴヌクレオチドの有効量または治療有効量は、疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状を処置する、阻害する、もしくは軽減するために、または他の方法で所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を提供するために、例えば疾患もしくは障害の根底にある病理生理学的機構の１つもしくは複数を低減する、阻害する、もしくは逆転させるために十分な投薬量であり得る。
【０１７５】
有効量はまた、増強剤の非存在下でのドナー断片の投与と比較して、ドナー断片の組換え率を増加させるために有効な量でもあり得る。増強剤および／またはドナーオリゴヌクレオチドの製剤は、投与様式に適合するように作製される。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、増強剤および／またはドナーオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物の広く多様な適切な製剤が存在する。正確な投薬量は、多様な要因、例えば被験体依存的変数（例えば、年齢、免疫系の健康、臨床症状等）に従って変化する。
【０１７６】
増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、１日１回、２回、または３回、週に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、月に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、または８回標的細胞に投与することができるか、または標的細胞と他の方法で接触させることができる。例えば、一部の実施形態では、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、２日毎もしくは３日毎、または平均でほぼ１週間に約２〜約４回投与される。
【０１７７】
増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、同時に投与してもしなくてもよい。一部の実施形態では、増強剤を細胞と接触させた後に、ドナーオリゴヌクレオチドと接触させる。増強剤を、被験体に投与して例えば１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１８、もしくは２４時間後、または１、２、３、４、５、６、もしくは７日後、またはその任意の組合せ後に、ドナーオリゴヌクレオチドを被験体に投与することができる。
【０１７８】
好ましい実施形態では、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドは、標的細胞の少なくとも０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５％の頻度で、少なくとも１つの標的対立遺伝子において遺伝子改変が起こるのを誘導するために有効な量で投与される。一部の実施形態では、特にｅｘ  ｖｉｖｏ適用では、遺伝子改変は、約０．１〜２５％、または０．５〜２５％、または１〜２５％、２〜２５％、または３〜２５％、または４〜２５％または５〜２５％または６〜２５％、または７〜２５％、または８〜２５％、または９〜２５％、または１０〜２５％、１１〜２５％、または１２〜２５％、または１３％〜２５％または１４％〜２５％または１５〜２５％、または２〜２０％、または３〜２０％、または４〜２０％または５〜２０％または６〜２０％、または７〜２０％、または８〜２０％、または９〜２０％、または１０〜２０％、１１〜２０％、または１２〜２０％、または１３％〜２０％または１４％〜２０％または１５〜２０％、２〜１５％、または３〜１５％、または４〜１５％または５〜１５％または６〜１５％、または７〜１５％、または８〜１５％、または９〜１５％、または１０〜１５％、１１〜１５％、または１２〜１５％、または１３％〜１５％または１４％〜１５％の頻度で少なくとも１つの標的対立遺伝子に起こる。
【０１７９】
一部の実施形態では、特にｉｎ  ｖｉｖｏ適用では、遺伝子改変は、約０．１％〜約１５％、または約０．２％〜約１５％、または約０．３％〜約１５％、または約０．４％〜約１５％、または約０．５％〜約１５％、または約０．６％〜約１５％、または約０．７％〜約１５％、または約０．８％〜約１５％、または約０．９％〜約１５％、または約１．０％〜約１５％、または約１．１％〜約１５％、または約１．１％〜約１５％、１．２％〜約１５％、または約１．３％〜約１５％、または約１．４％〜約１５％、または約１．５％〜約１５％、または約１．６％〜約１５％、または約１．７％〜約１５％、または約１．８％〜約１５％、または約１．９％〜約１５％、または約２．０％〜約１５％、または約２．５％〜約１５％、または約３．０％〜約１５％、または約３．５％〜約１５％、または約４．０％〜約１５％、または約４．５％〜約１５％、または約５．０％〜約１５％、または約１％〜約１５％、約１．５％〜約１５％、約２．０％〜約１５％、または約２．５％〜約１５％、または約３．０％〜約１５％、または約３．５％〜約１５％、または約４．０％〜約１５％、または約４．５％〜約１５％の頻度で少なくとも１つの標的対立遺伝子に起こる。
【０１８０】
一部の実施形態では、遺伝子改変は、低いオフターゲット効果で起こる。一部の実施形態では、オフターゲット改変は、実施例に記載される解析のような、しかしこれらに限定されない慣用的な解析を使用して検出不能である。一部の実施形態では、オフターゲットインシデントは、０〜１％、または０〜０．１％、または０〜０．０１％、または０〜０．００１％、または０〜０．０００１％、または０〜０．００００１％、または０〜０．０００００１％の頻度で起こる。一部の実施形態では、オフターゲット改変は、標的部位より約１０２分の１、１０３分の１、１０４分の１、または１０５分の１の頻度で起こる。
【０１８１】
Ａ．Ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療
一部の実施形態では、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は、被験体における遺伝子障害を処置するために使用される。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療に関して、細胞を、被験体から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで組成物（増強剤およびドナーオリゴヌクレオチド）と接触させ、変更された配列を遺伝子の中にまたはそれに隣接して含有する細胞を産生する。好ましい実施形態では、細胞は、処置される被験体から、または同系宿主から単離される。標的細胞を被験体から採取した後、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドと接触させる。細胞は、造血前駆細胞または幹細胞であり得る。好ましい実施形態では、標的細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）、例えばＣＤ３４＋細胞は、赤血球を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。したがって、ＣＤ３４＋細胞を、例えばサラセミア、鎌状赤血球症、またはリソソーム蓄積症を有する患者から単離することができ、変異体遺伝子を、組成物および方法を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで変更または修復し、細胞を処置または療法として患者に再度導入することができる。
【０１８２】
幹細胞は、当業者によって単離および濃縮することができる。ＣＤ３４＋および他の細胞のそのような単離および濃縮方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９６５，２０４号、第４，７１４，６８０号、第５，０６１，６２０号、第５，６４３，７４１号、第５，６７７，１３６号、第５，７１６，８２７号、第５，７５０，３９７号および第５，７５９，７９３号に開示されている。造血前駆細胞および幹細胞に関して濃縮された組成物の文脈において本明細書で使用される場合、「濃縮された」は、細胞の天然供給源で見出されるものより高い割合の望ましいエレメント（例えば、造血前駆細胞および幹細胞）を示す。細胞の組成物は、細胞の天然供給源に対して少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは１０、１００、２００、または１０００倍濃縮され得る。
【０１８３】
ヒトでは、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯血から、骨髄から、または造血増殖因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）を、骨髄腔から末梢循環中へと造血幹細胞の移動を引き起こすために十分な量でドナーに皮下または静脈内注射することによってサイトカイン動員を行った後の血液から回収することができる。最初に、骨髄細胞を骨髄の任意の適切な供給源、例えば脛骨、大腿骨、椎骨、または他の骨小腔から得てもよい。骨髄を単離するために、適正な溶液を使用して骨を洗い流し、この溶液は、低濃度の一般的に約５〜２５ｍＭの許容される緩衝液と共にウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を好都合に補充した平衡塩類溶液である。好都合な緩衝液は、Ｈｅｐｅｓ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等を含む。
【０１８４】
細胞は、正の選択および負の選択技術によって選択することができる。細胞は、当業者に公知の方法を使用して、造血前駆細胞または幹細胞表面抗原、例えばＣＤ３４に結合する市販の抗体を使用して選択することができる。例えば、抗体を、磁気ビーズにコンジュゲートして、免疫原性の手順を利用して所望の細胞タイプを回収してもよい。他の技術は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用を伴う。ＣＤ３４抗原は、非白血病個体の造血系内の前駆細胞において見出され、モノクローナル抗体Ｍｙ−１０（すなわち、ＣＤ３４抗原を発現する）によって認識される細胞集団上に発現され、骨髄移植のための幹細胞を単離するために使用することができる。Ｍｙ−１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）にＨＢ−８４８３として寄託され、抗ＨＰＣＡ１として市販されている。加えて、ヒト骨髄からの分化した、および「専門の」細胞の負の選択を利用して、実質的に任意の所望の細胞マーカーに対して選択することができる。例えば、前駆細胞または幹細胞、最も好ましくはＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３−、ＣＤ７−、ＣＤ８−、ＣＤ１０−、ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、ＣＤ３３−、クラスＩＩ  ＨＬＡ＋およびＴｈｙ−１＋のいずれかであるとして特徴付けることができる。
【０１８５】
前駆細胞または幹細胞が単離された後、それらを、任意の適切な培地中で成長させることによって増大させてもよい。例えば、前駆細胞または幹細胞を、間質細胞からの馴化培地中、例えば因子の分泌に関連して骨髄もしくは肝臓から得ることができる培地中、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地中で成長させることができる。間質細胞は、望ましくない細胞を除去するために適正なモノクローナル抗体を用いて造血細胞から取り除くことができる。
【０１８６】
単離された細胞を、修復または変更を必要とする遺伝子、例えばヒトベータ−グロビンまたはα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子の中でまたは遺伝子に隣接して所望の変更を引き起こすために有効な量で、増強剤、例えば細胞透過性抗体または抗ＲＡＤ５１因子とドナーオリゴヌクレオチドとの組合せとｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる。これらの細胞を、本明細書において改変細胞と呼ぶ。細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチドの溶液は、単純に培養物中の細胞に添加され得る。あるいは、トランスフェクション技術を使用してもよい。細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトさせる方法は当技術分野で周知である（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．，  ５５（２）：  ２６７−２８０  （２００３））。遺伝子修正頻度をさらに増加させるためには、Ｓ期の細胞を同期させることが望ましい場合がある。例えばダブルチミジンブロックによって培養細胞を同期させる方法は、当技術分野で公知である（Ｚｉｅｌｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ８：１０７−１２１  （１９７４））。
【０１８７】
改変細胞は、培養において維持または増大させた後に被験体に投与することができる。培養条件は一般的に、細胞タイプに応じて当技術分野で公知である。特にＣＤ３４＋を維持するための条件は十分に研究されており、いくつかの適切な方法が利用可能である。ｅｘ  ｖｉｖｏで多能性造血細胞を増大させる一般的なアプローチは、インターロイキン−３などの早期作用型サイトカインの存在下で精製前駆細胞または幹細胞を培養することである。同様に、造血前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで維持するために、栄養培地中にトロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ；すなわちｆｌｔ３遺伝子産物のリガンド）の組合せを含めることも、始原（すなわち、比較的未分化の）ヒト造血前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増大させるために有用であり、それらの細胞はＳＣＩＤ−ｈｕマウスに生着することが可能であることも示されている（Ｌｕｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｌｏｏｄ  ９１：１２０６−１２１５）。他の公知の方法では、細胞は、マウスプロラクチン様タンパク質Ｅ（ｍＰＬＰ−Ｅ）またはマウスプロラクチン様タンパク質Ｆ（ｍＰＩＰ−Ｆ；集合的にｍＰＬＰ−Ｅ／ＩＦと呼ぶ）を含む栄養培地中、ｅｘ  ｖｉｖｏで維持することができる（例えば、数分間、数時間、または３、６、９、１３日、もしくはそれより多くの日数）（米国特許第６，２６１，８４１号）。他の適切な細胞培養および増大方法も同様に使用することができると認識される。細胞はまた、米国特許第５，９４５，３３７号に記載されるように無血清培地中で成長させることもできる。
【０１８８】
別の実施形態では、インターロイキンおよび増殖因子の特定の組合せを使用して、改変造血幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでＣＤ４＋細胞培養物へと分化させた後、当技術分野で周知の方法を使用して被験体に投与する。細胞を、単離された造血幹細胞の元の集団と比較して、ｅｘ  ｖｉｖｏで大量に、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２０倍増大させてもよい。
【０１８９】
別の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療のための細胞は、脱分化した体細胞であり得る。体細胞を、多能性幹細胞様細胞になるように再プログラムすることができ、これを造血前駆細胞になるように誘導することができる。次に、造血前駆細胞を、ＣＤ３４＋細胞に関して上記のように、増強剤、例えば細胞透過性抗体とドナーオリゴヌクレオチドとによって処置し、１つまたは複数の改変遺伝子を有する組換え細胞を産生することができる。再プログラムすることができる代表的な体細胞としては、これらに限定されないが、線維芽細胞、脂肪細胞、および筋細胞が挙げられる。誘導した幹細胞様細胞由来の造血前駆細胞は、マウスにおいて発生に成功している（Ｈａｎｎａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８：１９２０−１９２３  （２００７））。
【０１９０】
誘導した幹細胞様細胞から造血前駆細胞を産生するために、体細胞を宿主から採取する。好ましい実施形態では、体細胞は自己の線維芽細胞である。細胞を培養し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ転写因子をコードするベクターを形質導入する。形質導入された細胞を培養し、胚性幹細胞（ＥＳ）の形態、ならびにＡＰ、ＳＳＥＡ１、およびＮａｎｏｇを含むがこれらに限定されないＥＳ細胞マーカーに関してスクリーニングする。形質導入されたＥＳ細胞を培養し、誘導幹細胞様細胞を産生するように誘導する。次に、細胞をＣＤ４１およびｃ−ｋｉｔマーカー（初期造血前駆細胞マーカー）ならびに骨髄系および赤血球系分化のマーカーに関してスクリーニングする。
【０１９１】
次に、改変造血幹細胞または改変誘導造血前駆細胞を被験体に導入する。細胞の送達は、様々な方法を使用して行ってもよく、最も好ましくは注入による静脈内投与ならびに骨膜、骨髄、および／または皮下部位への直接デポー注射を含む。
【０１９２】
改変細胞を投与された被験体を、細胞の生着を亢進するために骨髄前処置のために処置してもよい。レシピエントを、生着を亢進するために放射線または化学療法処置を使用して処置した後、細胞を投与してもよい。投与の際、細胞は一般的に生着するまで一定期間を要する。造血幹細胞または前駆細胞の有意な生着の達成には、典型的に数週間から数ヶ月を要する。
【０１９３】
改変造血幹細胞の高いパーセンテージの生着は、有意な予防または治療効果を達成するために必要であるとは考えられていない。生着した細胞は生着後経時的に増大し、改変細胞のパーセンテージを増加させると考えられている。例えば、一部の実施形態では、改変細胞は、修正されたα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子を有する。したがって、ハーラー症候群を有する被験体では、改変細胞は状態を改善または治癒することができる。予防効果または治療効果を提供するために必要であるのは、改変造血幹細胞のごく少数または小さいパーセンテージの生着であると考えられる。
【０１９４】
好ましい実施形態では、被験体に投与される細胞は自己、例えば被験体に由来するか、または同系である。
【０１９５】
一部の実施形態では、組成物および方法を使用して、胚ゲノムをｉｎ  ｖｉｔｒｏで編集することができる。方法は典型的には、胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、胚のゲノムにおいて少なくとも１つの変更を誘導するために有効量の増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。最も好ましくは、胚は単細胞接合体であるが、受精の前および間での雄性および雌性配偶子、ならびに２、４、８、または１６細胞を有し、接合体のみならず桑実胚および未分化胚芽細胞を含む胚の処置も同様に提供される。典型的には、胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精の間または受精後の培養０〜６日目に組成物と接触させる。
【０１９６】
接触させることは、胚を浸漬する液体培地に組成物を添加することであり得る。例えば、組成物をピペットで直接胚培養培地に入れることができ、それによってそれらは胚に取り込まれる。
【０１９７】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療
一部の実施形態では、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を、被験体における遺伝子障害の処置のために使用する。組成物（細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチド）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療のために被験体に直接投与することができる。
【０１９８】
一般的に、抗体、オリゴヌクレオチド、および関連分子を含む化合物を投与する方法は、当技術分野で周知である。特に、現在使用中の製剤と共に核酸治療薬のために既に使用されている投与経路は、上記のドナーオリゴヌクレオチドの好ましい投与経路および製剤を提供する。好ましくは、組成物（増強剤およびドナーオリゴヌクレオチド）は、遺伝子治療を必要とする動物などの、遺伝子操作を受けている生物に注射または注入される。
【０１９９】
組成物（例えば、増強剤、例えば細胞透過性抗体およびドナーオリゴヌクレオチド）は、静脈内、腹腔内、羊水内、筋肉内、皮下、または局部（舌下、直腸、鼻腔内、肺、直腸粘膜および膣）、および経口（舌下、口腔内）を含むがこれらに限定されない複数の経路によって投与することができる。
【０２００】
一部の実施形態では、化合物は、肺送達、例えば鼻腔内投与または経口吸入のために製剤化される。
【０２０１】
製剤の投与は、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドがその標的に達することができる任意の許容される方法によって達成され得る。投与は、処置される状態に応じて、局所的（すなわち、特定の領域、生理的システム、組織、臓器、または細胞タイプに）であってもよく、または全身であってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のための組成物および方法はまた、ＷＯ２０１７／１４３０４２号においても論じられている。
【０２０２】
方法はまた、有効量の増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドを、胚もしくは胎児、またはその妊娠中の母親にｉｎ  ｖｉｖｏで投与することを含み得る。一部の方法では、組成物を卵黄静脈もしくは臍帯静脈などの静脈もしくは動脈の中に、または胚もしくは胎児の羊膜に注射および／または注入することによって、組成物を子宮内に送達する。例えば、Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１８  Ｊｕｎ  ２６；９（１）：２４８１．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓ４１４６７−０１８−０４８９４−２、およびＷＯ２０１８／１８７４９３号を参照されたい。
【０２０３】
Ｃ．処置される疾患
遺伝子治療は、ヒト遺伝子疾患、例えば嚢胞性線維症、血友病、グロビン異常症、例えば、鎌状赤血球貧血およびベータ−サラセミア、色素性乾皮症、ならびにリソソーム蓄積症の状況において研究する場合には明らかであるが、この戦略はまた、ＨＩＶなどの非遺伝子疾患を処置するために、ｅｘ  ｖｉｖｏベースの細胞改変の状況において、および同様にｉｎ  ｖｉｖｏ細胞改変のためにも有用である。増強剤、例えば細胞透過性抗体とドナーオリゴヌクレオチドとを使用する方法は、単一の遺伝子における変異によって引き起こされる遺伝子欠損、障害、および疾患を処置するために、例えば点変異によって引き起こされる遺伝子欠損、障害および疾患を修正するために特に有用である。標的遺伝子が遺伝子障害の原因である変異を含有する場合、標的遺伝子のＤＮＡ配列を正常へと回復し得る方法を、変異原性修復のために使用することができる。標的配列は、遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内であり得る。標的配列はまた、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内であり得る。
【０２０４】
本明細書における方法において、増強剤およびドナーオリゴヌクレオチドと接触した細胞を、被験体に投与してもよい。被験体は、血友病、筋ジストロフィー、グロビン異常症、嚢胞性線維症、色素性乾皮症、またはリソソーム蓄積症などの疾患または障害を有し得る。そのような実施形態では、遺伝子改変は、被験体における疾患または障害の１つまたは複数の症状を低減させるのに有効な量で起こり得る。グロビン異常症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、およびリソソーム蓄積症における変異を修正するために設計されたドナーオリゴヌクレオチドの例示的な配列は、当技術分野で公知であり、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、公開された国際出願ＷＯ２０１７／１４３０４２号、ＷＯ２０１７／１４３０６１号、ＷＯ２０１８／１８７４９３号、および公開された米国出願第２０１７／０２８３８３０号に開示されている。
【０２０５】
ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得、標的遺伝子座でゲノム配列の１つまたは両方の鎖を標的とすることができる。例示的なドナーオリゴヌクレオチドを以下に提供する。ドナーは典型的に、標的ゲノム遺伝子座の１つの鎖を標的化する一本鎖ＤＮＡ配列として提示される。しかし、たとえ以下に明白に提供されていない場合であっても、各ドナーの逆相補鎖および二本鎖ＤＮＡ配列もまた、提供された配列に基づいて開示される。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、本開示の配列の機能的断片、またはその逆相補鎖、もしくはその二本鎖ＤＮＡである。
【０２０６】
１．グロビン異常症
世界全体で、グロビン異常症は、有意な病的状態および死亡の原因である。１，２００を超える異なる公知の遺伝的変異がヒトアルファ様（ＨＢＺ、ＨＢＡ２、ＨＢＡ１、およびＨＢＱ１）およびベータ様（ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＤ、およびＨＢＢ）グロビン遺伝子のＤＮＡ配列に影響を及ぼす。より蔓延していて十分に研究されている２つのグロビン異常症は、鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアである。鎌状赤血球貧血患者におけるβ−グロビン鎖の６位のグルタミン酸のバリンへの置換は、ヘモグロビン多量体化の素因となり、鎌状細胞の硬化性および血管閉塞をもたらし、その結果組織および臓器の損傷をもたらす。β−サラセミア患者では、多様な変異機構がβ−グロビンの合成の低減をもたらし、不対の不溶性α鎖の凝集体の蓄積をもたらし、これが無効な赤血球生成、赤血球破壊の加速、および重度の貧血を引き起こす。
【０２０７】
併せて、グロビン異常症は、ヒトにおける最も一般的な単一遺伝子障害を表す。本明細書におけるドナーオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび生きている細胞の両方で、動物においてｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でヒトβ−グロビンとの結合に関して有効である。実験結果はまた、ＩＶＳ２−６５４サラセミア変異（内因性のマウスベータグロビンの代わりに）を有するヒトベータグロビン遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでサラセミア関連変異の修正も実証している。
【０２０８】
β−サラセミアは、ＲＢＣ内でα−ヘモグロビンの沈殿をもたらす不安定な異常ヘモグロビン症であり、重度の溶血性貧血を引き起こす。患者は黄疸および脾腫を示し、血液中のヘモグロビン濃度の実質的な減少により、繰り返し輸血を必要とし、典型的には経時的に重度の鉄過剰負荷をもたらす。心筋鉄沈着症による心不全が、２０代の終わりまでのβ−サラセミアによる死亡の主な原因である。したがって、これらの患者における繰り返し輸血の低減は、患者の転帰を改善するために根本的に重要である。
【０２０９】
例示的なβ−グロビン遺伝子変異
塩基６０００１から塩基６６０６０までの第１１染色体のヒト天然ヘモグロビン遺伝子クラスタのＧｅｎＢａｎｋ配列の一部分（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０１３１７．１−第１１染色体上のヒトベータグロビン領域−ＬＯＣＵＳ  ＨＵＭＨＢＢ，７３３０８ｂｐ  ｄｓ−ＤＮＡ）を以下に示す。６２１８７〜６２１８９位での遺伝子コード配列の開始を、波状の下線で示す。ＧｅｎＢａｎｋ配列のこの部分は、天然のβグロビン遺伝子配列を含有する。鎌状赤血球ヘモグロビンでは、６２２０６位のアデニン塩基がチミンに変異している。他の一般的な点変異はイントロン２（ＩＶＳ２）で起こり、これを以下の配列においてイタリック体で強調する。変異は、ＩＶＳ２−１、ＩＶＳ２−５６６、ＩＶＳ２−６５４、ＩＶＳ２−７０５、およびＩＶＳ２−７４５を含み、これらもまた太字および太字の下線で示し、番号付けはイントロン２の開始に対するものである。
【０２１０】
遺伝子編集分子は、本明細書に提供するガイダンスに基づいて、および当技術分野で公知の他の方法に基づいて設計することができる。例示的なドナーオリゴヌクレオチド配列が、例えばＷＯ１９９６／０４０２７１号、ＷＯ／２０１０／１２３９８３号、および米国特許第８，６５８，６０８号に提供されており、本明細書における改変の１つまたは複数を含むように変更することができる。標的領域は、ゲノムＤＮＡのコード鎖またはその相補的な非コード配列（例えば、ワトソンまたはクリック鎖）に基づいて参照することができる。ドナーオリゴヌクレオチドによって標的化される例示的な部位は、ベータグロビン遺伝子における任意の疾患関連変異（以下に示す）を包含する任意の領域であり得る。
【化１７】
2022500009.tif 000018
【化１８】
2022500009.tif 000019
【化１９】
2022500009.tif 000020
【化２０】
2022500009.tif 000021
【０２１１】
例示的なβ−グロビンドナー
一部の実施形態では、増強剤、例えば細胞透過性抗体は、配列
５’ＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴ  ３’（配列番号４３）を含み、修正するＩＶＳ２−６５４ヌクレオチドを下線で示すＩＶＳ２−６５４変異の修正のためのドナーオリゴヌクレオチド、またはＩＶＳ２−６５４変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片と組み合わせて使用される。
【０２１２】
他の例示的なドナー配列としては、これらに限定されないが、
ドナーＧＦＰ−ＩＶＳ２−１（センス）
５’ＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＣＣ
ＴＴＧＡＴＧＴＴＴ  ３’（配列番号４４）、
ドナーＧＦＰ−ＩＶＳ２−１（アンチセンス）
【０２１３】
５’ＡＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＡＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣ  ３’（配列番号４５）、および変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片が挙げられる。
【０２１４】
一部の実施形態では、鎌状赤血球症の変異は、配列
【化２１】
2022500009.tif 000022
、もしくは変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片であって、枠で囲んだ３つのヌクレオチドが、変異体バリン（ヒト鎌状赤血球症に関連する）を野生型グルタミン酸に復帰させる修正されたコドン６を表し、太字のフォント（下線のない）のヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに対する変化を表すがコードされるアミノ酸に対する変化を表さない、配列もしくはその機能的断片、または
【化２２】
2022500009.tif 000023
、もしくは変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片であって、太字および下線の残基が修正である、配列もしくはその機能的断片、または
【化２３】
2022500009.tif 000024
、もしくは変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片であって、太字および下線の残基が修正であり、「（ｓ）」が、必要に応じたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す、配列もしくはその機能的断片
を有するドナーを使用して修正することができる。
【０２１５】
２．嚢胞性線維症
組成物および方法を使用して、嚢胞性線維症を処置することができる。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、Ｃｌ−輸送を媒介するイオンチャネルである嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）の欠損によって引き起こされる致死性の常染色体劣性疾患である。ＣＦＴＲ機能の欠如は、慢性閉塞性肺疾患および呼吸器不全による早期死亡、腸閉塞症候群、外分泌および内分泌膵機能不全、ならびに不妊をもたらす（Ｄａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｖ．，  ２２（８）：２５７−６４  （２００１））。ＣＦにおける最も一般的な変異は、３塩基対欠失（Ｆ５０８ｄｅｌ）であり、これはフェニルアラニン残基の喪失をもたらし、ＣＦＴＲタンパク質の細胞内分解および細胞表面発現の欠如を引き起こす（Ｄａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，  １７３（５）：４７５−８２  （２００６））。この一般的な変異に加えて、早期の停止コドンによる変異のクラスであるナンセンス変異を含む他の多くの変異が存在し、疾患をもたらす。実際に、ナンセンス変異は、疾患を引き起こす変異のおよそ１０％を占める。ナンセンス変異の中で、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘは、最も一般的であり、頻度はそれぞれ２．６％および１．６％である。
【０２１６】
ＣＦは、最も厳密に特徴付けられた遺伝子疾患の１つであるが、ＣＦを有する患者の現行の処置は、遺伝子欠損の根本的な修正ではなくて症状の管理が中心である。遺伝子治療は、肺および他の臓器系へのｉｎ  ｖｉｖｏ送達が難しいために、ＣＦではなおも漠然とした標的である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  （２０１４）  ｄｏｉ：  １０．１１３６／ａｒｃｈｄｉｓｃｈｉｌｄ−２０１２−３０２１５８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４４６４９７８）。近年、血液リンパ系が関係する疾患の処置のための遺伝子治療に多くの進歩が認められ、自家移植のための細胞の採取およびｅｘ  ｖｉｖｏでの操作が可能である；一部の例は、ＨＩＶ−１抵抗性細胞を産生するためにＣＣＲ５を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼの使用（Ｈｏｌｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２８（８）：  ８３９−４７  （２０１０））、副腎脳白質ジストロフィーの処置のためのレンチウイルスベクターによるＡＢＣＤ１遺伝子の修正（Ｃａｒｔｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２６（５９５４）：８１８−２３  （２００９））、およびレトロウイルス遺伝子移入を使用するＡＤＡ欠損症によるＳＣＩＤの修正（Ａｉｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３６０（５）：４４７−５８  （２００９））を含む。
【０２１７】
残念なことに、採取および自家移植片は、肺および他の内部臓器を巻き込むことにより、ＣＦにおける選択肢ではない。１つのアプローチとして、ＵＫの嚢胞性線維症遺伝子治療コンソーシアムは、ＣＦＴＲをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドを肺に送達するためにリポソームを試験した（Ａｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｏｒａｘ，  ６８（１１）：１０７５−７  （２０１３），  Ａｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  （２０１５）．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／Ｓ２２１３−２６００（１５）００２４５−３．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６１４９８４１）、他の臨床試験は、ポリエチレングリコール置換リシン３０量体ペプチドによって圧縮されたＣＦＴＲ遺伝子またはＣＦＴＲ発現プラスミドを送達するためにウイルスベクターを使用しているが、成功は限定的であった（Ｋｏｎｓｔａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １５（１２）：１２５５−６９  （２００４））。標的化挿入を伴わない遺伝子付加のためのプラスミドＤＮＡの送達は、内因性遺伝子の修正をもたらさず、正常なＣＦＴＲ遺伝子調節を受けず、ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡのウイルス媒介性の組み込みは、重要なゲノム部位への非特異的組み込みのリスクを導入し得る。
【０２１８】
増強剤、例えば細胞透過性抗体、およびドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、嚢胞性線維症をもたらす変異を修正することができる。好ましい実施形態では、組成物は、鼻腔内または肺送達によって投与される。一部の実施形態では、複数の組織、例えば腸における変異を修正する必要性により、ＩＶ注射または注入などの全身投与を利用してＣＦを処置する。組成物は、嚢胞性線維症の１つまたは複数の症状を低減するために有効な量で遺伝子修正を誘導または亢進するために有効な量で投与することができる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子修正は、環状ＡＭＰ刺激に対する応答障害を改善するため、フォルスコリンに対する応答の過分極を改善するため、鼻での大きいルーメン負電位の低減を改善するため、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の炎症細胞の低減を改善するため、肺組織学を改善するため、またはその組合せのために有効な量で起こる。一部の実施形態では、標的細胞は、皮膚の汗腺を構成する、肺、肝臓、膵臓、または消化器もしくは生殖系の通路を裏打ちする細胞、特に上皮細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、気管支上皮細胞である。本明細書に記載の遺伝子編集方法を使用する永続的なゲノム変化は、プラスミドに基づくアプローチほど一過性ではなく、変化は娘細胞に受け継がれるが、一部の改変細胞は、呼吸上皮の通常の代謝回転により時間と共に失われ得る。一部の実施形態では、標的細胞は肺上皮前駆細胞である。肺上皮前駆細胞の改変は、表現型のより長期間の修正を誘導することができる。
【０２１９】
ヒト嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）の配列は、当技術分野で公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＨ００６０３４．１を参照されたく、ＣＦＴＲの標的化修正の組成物および方法は、ＭｃＮｅｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ６：６９５２，  （ＤＯＩ  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９５２），  １１  ｐａｇｅｓに記載されている。
【０２２０】
例示的なＣＦＴＲドナー
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子の修正のために使用することができるドナーは、配列
５’ＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＧ３’（配列番号４９）、または嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子におけるＦ５０８ｄｅｌ変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片を含む。この位置でＣＦＴＲ遺伝子の他の鎖にマッチする相補的配列またはその機能的断片もまた適切である。
【０２２１】
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子修正のために使用することができるドナーは、配列
【化２４】
2022500009.tif 000025
またはＣＦＴＲにおける変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片であって、太字および下線のヌクレオチドが挿入された変異であり、「（ｓ）」が必要に応じたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す、配列またはその機能的断片を含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子修正のために使用することができるドナーは、配列
【化２５】
2022500009.tif 000026
、またはＣＦＴＲにおける変異を修正するために適切かつ十分なその機能的断片であって、太字および下線のヌクレオチドが挿入された変異であり、「（ｓ）」が必要に応じたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を示す、配列またはその機能的断片を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、ＣＦＴＲ遺伝子における変異を修正するために設計された配列を含有することに加えて、ドナーオリゴヌクレオチドはまた、追加の同義（サイレント）変異も含有し得る。追加のサイレント変異は、処置した細胞から単離したゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用して、修正された標的配列の検出を促進することができる。
【０２２４】
３．リソソーム蓄積症
本開示の組成物および方法は、リソソーム蓄積症を処置するためにも使用することができる。リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の欠損に起因する５０を超える臨床的に認識されたまれな遺伝性代謝障害群である（Ｗａｌｋｌｅｙ，  Ｊ．  Ｉｎｈｅｒｉｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓ．，  ３２（２）：１８１−９  （２００９））。リソソーム蓄積症は、より大きいエンドソーム／リソソーム系の一部である細胞のリソソームオルガネラの機能障害によって引き起こされる。ユビキチン−プロテオソームおよびオートファゴソーム系と併せて、リソソームは、基質の分解およびリサイクル、恒常性の制御、および細胞内でのシグナル伝達にとって必須である。リソソームの機能障害は通常、分解またはリサイクルされる運命にある脂質、糖タンパク質（糖含有タンパク質）、またはムコ多糖類（反復二糖単位からなる長鎖非分岐多糖類；グリコサミノグリカンまたはＧＡＧとしても公知）の代謝にとって必要な単一の酵素の欠乏の結果である。酵素の欠乏は、望ましくない脂質、糖タンパク質、およびＧＡＧの分解またはリサイクルを低減させるか、または防止し、細胞内でのこれらの材料の増進または「蓄積」をもたらす。ほとんどのリソソーム病は、広範な組織および臓器の罹患を示し、脳、内臓、骨、および結合組織がしばしば罹患する。３分の２を超えるリソソーム病が脳に罹患する。ニューロンはリソソームの機能障害に対して特に影響を受けやすいように思われ、特定の軸索および樹状突起の異常からニューロンの死に至る範囲の欠損を示す。
【０２２５】
個別ではＬＳＤは、１：１００，０００未満の頻度で起こるが、群としての頻度は、出生数１，５００〜７，０００例あたり１という高率である（Ｓｔａｒｅｔｚ−Ｃｈａｃｈａｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，  １２３（４）：１１９１−２０７  （２００９））。ＬＳＤは、典型的に先天性の遺伝的エラーの結果である。これらの障害のほとんどは常染色体劣性遺伝であるが、ファブリー病およびハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）のようにＸ連鎖劣性遺伝されるものもある。罹患した個体は一般的に、出生時は正常であるように見えるが、疾患は進行性である。臨床疾患の発症は、数年または数十年後まで起こらない場合があるが、典型的に致死性である。リソソーム蓄積症は、多くは小児に罹患し、しばしば幼少期および予測不能な年齢で、多くは生後数ヶ月または数年以内に死亡する。他の多くの小児は、その特定の障害の様々な症状に数年苦しんだ後にこの疾患が原因で死亡する。臨床疾患は、精神遅滞および／または認知症、盲目または難聴を含む感覚消失、運動系機能障害、発作、睡眠および行動障害等として出現し得る。リソソーム蓄積症を有する一部の人は、肝臓肥大（肝腫）および脾臓肥大（脾腫）、肺および心臓の問題、ならびに骨の成長異常を有する。
【０２２６】
多くのＬＳＤの処置は、酵素補充療法（ＥＲＴ）および／または基質低減療法（ＳＲＴ）、ならびに症状の処置または管理である。米国におけるＥＲＴの平均年間費用は＄９０，０００〜＄５６５，０００の範囲である。ＥＲＴは、多様なＬＳＤに関して有意な全身での臨床有効性を有するが、組換えタンパク質が血液脳関門を通過することができないことから、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患症状に関してはほとんどまたは全く効果が認められない。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、選択されたＬＳＤにとって非常に有効な処置を表す。これは現在、関連する神経続発症の進行を防止する唯一の手段である。しかし、ＨＳＣＴは、費用が高く、ＨＬＡ適合ドナーを必要とし、有意な病的状態および死亡に関連する。最近の遺伝子治療研究は、ＬＳＤがこのタイプの処置の良好な標的であることを示唆している。
【０２２７】
ＷＯ２０１１／１３３８０２号は、組成物および方法において利用することができるドナーオリゴヌクレオチドの例を提供する。
【０２２８】
例えば、組成物および方法は、ゴーシェ病（ＧＤ）を処置するために用いることができる。ゴーシェ病は、ゴーシェ症候群としても公知であり、最も一般的なリソソーム蓄積症である。ゴーシェ病は、リソソームにおける酵素グルコセレブロシダーゼ（酸性β−グルコシダーゼとしても公知）の欠乏により、脂質が細胞およびある特定の臓器に蓄積する遺伝性遺伝子疾患である。グルコセレブロシダーゼ酵素は、ｂ−グリコシドをｂ−グルコースおよびセラミドサブユニットへと切断することによって、脂肪物質であるグルコセレブロシド（グルコシルセラミドとしても公知）の分解に寄与する（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ，  Ｂｅａｕｄｅｔ  ＡＬ，  Ｖａｌｌｅ  Ｄ，  Ｓｌｙ  ＷＳ．  Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  ８ｔｈ  ｅｄ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：    ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｕｂ，  ２００１：  ３６３５−３６６８）。この酵素に欠陥があると、特に単核細胞系列の細胞、ならびに脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳、および骨髄を含む臓器および組織に物質が蓄積する。
【０２２９】
２つの主要な型：非ニューロパチー性（タイプ１、成人において最も一般的に観察されるタイプ）およびニューロパチー性（タイプ２および３）が存在する。グルコシダーゼ媒介性ＧＤの原因である唯一の公知のヒト遺伝子であるＧＢＡ（ＧＢＡグルコシダーゼ、ベータ、酸性）は、第１染色体の位置１ｑ２１に位置する。２００個を超える変異が、この単一の遺伝子の公知のゲノム配列内で定義されている（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９７８３．１）。最も一般的に観察される変異は、Ｎ３７０Ｓ、Ｌ４４４Ｐ、ＲｅｃＮｃｉＩ、８４ＧＧ、Ｒ４６３Ｃ、およびｒｅｃＴＬである。８４ＧＧは、酵素を合成する能力がないヌル変異である。しかし、Ｎ３７０Ｓ変異は、タイプ１疾患およびより軽症型疾患にほぼ常に関連する。非常にまれにスフィンゴ脂質活性化タンパク質の欠乏（ゴーシェ因子、ＳＡＰ−２、サポシンＣ）がＧＤをもたらすことがある。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＧＢＡにおける変異を修正するために設計および使用される。
【０２３０】
別の実施形態では、組成物および方法は、まれなＸ連鎖劣性障害であり、酵素アルファガラクトシダーゼＡ（ａ−ＧＡＬ  Ａ、ＧＬＡによってコードされる）の欠乏に起因するファブリー病（ファブリー病、アンダーソン−ファブリー病、びまん性体部被角血管腫（ａｎｇｉｏｋｅｒａｔｏｍａ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ  ｄｉｆｆｕｓｕｍ）、およびアルファ−ガラクトシダーゼＡ欠乏症としても公知）を処置するために使用される。ＧＬＡをコードするヒト遺伝子は、公知のゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７１１９．１）を有し、第Ｘ染色体のＸｐ２２に位置する。ＧＬＡにおける変異は、血管、他の組織、および臓器内に糖脂質であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３と省略する、ＧＬ−３、またはセラミドトリヘキソシド）の蓄積をもたらし、その適切な機能の障害をもたらす（Ｋａｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊ．，  １１  （４）：  ８  （２００５））。この状態はヘミ接合性の男性（すなわち、全ての男性）、ならびにホモ接合性で、おそらくヘテロ接合性（キャリア）の女性に罹患する。男性は典型的に、重度の症状を示すが、女性は無症候性から重度の症状を有するまで多様であり得る。この変動性は、女性の胚発生の際のＸ不活化パターンによると考えられる。一部の実施形態では、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＧＬＡにおける変異を修正するために設計および使用される。
【０２３１】
組成物および方法は、ハーラー症候群（ＨＳ）を処置するために使用することができる。ハーラー症候群は、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ欠乏、およびハーラー病としても公知であり、リソソームにおけるムコ多糖類の分解に関与する酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼの欠乏によりムコ多糖類の増進をもたらす遺伝子障害である（Ｄｉｂ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｏｒｉｅｓ，  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｓ．，  ６（３）：６６７−７４  （２００７））。ＭＰＳ  Ｉは、症状の重症度に基づいて３つのサブタイプに分類される。３つのタイプ全てが、酵素α−Ｌ−イズロニダーゼの非存在または不十分なレベルに起因する。ＭＰＳ  Ｉ  Ｈまたはハーラー症候群は、ＭＰＳ  Ｉサブタイプのうちで最も重篤である。他の２つのタイプは、ＭＰＳ  Ｉ  Ｓまたはシャイエ症候群、およびＭＰＳ  Ｉ  Ｈ−Ｓ、またはハーラー−シャイエ症候群である。α−Ｌ−イズロニダーゼがなければ、結合組織の主な構成成分であるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸が体内で増進する。過剰量のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が血液循環の中を通過して体全体に蓄積し、一部は尿に分泌される。症状は小児期に出現し、０歳もの早期での発達の遅延を含み得る。患者は通常、年齢２歳から４歳の間でその発達のプラトーに達し、その後進行性の精神減退および身体スキルの喪失が起こる（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  ６：  ２８８−３０２  （１９９５））。言語は聴覚喪失および舌の肥大により限定的であり得、最終的に部位の障害は、角膜の混濁および網膜変性に起因し得る。手根管症候群（または体の他所での類似の神経圧迫）および関節の動きの制限もまた一般的である。
【０２３２】
例示的なドナー
一部の実施形態では、配列
５’ＡＧＧＡＣＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ３’（配列番号５２）、またはＷ４０２Ｘ変異（これは重度のハーラー症候群に関連するムコ多糖症Ｉ型の一般的な変異である）を修正するために適切かつ十分なその機能的断片を有するドナーオリゴヌクレオチドは、細胞におけるＷ４０２Ｘ変異を修正するために、増強剤、例えば細胞透過性抗体と共に投与される。
【０２３３】
配列
５’ＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣ  ３’（配列番号５３）、またはハーラー症候群に関連するアルファ−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子におけるＱ７０Ｘ変異を修正するために適切であるその機能的断片を有し得る例示的なドナーオリゴヌクレオチドは、細胞におけるＱ７０Ｘ変異を修正するために、増強剤、例えば細胞透過性抗体と共に投与される。
【０２３４】
一部の実施形態では、Ｑ７０Ｘでの点変異またはＷ４０２Ｘ変異を修正するために設計された配列を含有することに加えて、ドナーオリゴヌクレオチドはまた、７〜１０個の追加の同義（サイレント）変異も含有し得る。追加のサイレント変異は、処置された細胞から単離したゲノムＤＮＡの対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用して、修正された標的配列の検出を促進することができる。
【０２３５】
Ｄ．組合せ治療
本明細書における遺伝子編集のための異なる構成成分の各々は、単独で、または任意の組合せで、およびさらに１つまたは複数の追加の活性剤と組み合わせて投与することができる。全ての例において、薬剤の組合せは、同じ混合物の一部であり得るか、または別々の組成物として投与することができる。一部の実施形態では、別々の組成物は、同じ投与経路を通して投与される。他の実施形態では、別々の組成物は、異なる投与経路を通して投与される。
【０２３６】
好ましい追加の活性剤の例としては、所望の疾患または状態を処置するために当技術分野で公知の他の従来の治療を含む。例えば、鎌状赤血球症の処置では、追加の治療はヒドロキシウレアであり得る。
【０２３７】
嚢胞性線維症の処置では、追加の治療は、粘液溶解剤、抗生物質、栄養剤等を含み得る。特定の薬物が嚢胞性線維症基金の薬物パイプラインで概略が述べられており、これらには、これらに限定されないが、ＣＦＴＲモジュレーター、例えばＫＡＬＹＤＥＣＯ（登録商標）（イバカフトル）、ＯＲＫＡＭＢＩ（商標）（ルマカフトル＋イバカフトル）、アタルレン（ＰＴＣ１２４）、ＶＸ−６６１＋イバカフトル、リオシグアト、ＱＢＷ２５１、Ｎ９１１１５、およびＱＲ−０１０；気道表面液を改善する作用物質、例えば高張食塩水、ブロンキトール、およびＰ−１０３７；粘液変質剤、例えばＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）（ドルナーゼアルファ）；抗炎症剤、例えばイブプロフェン、アルファ１アンチトリプシン、ＣＴＸ−４４３０、およびＪＢＴ−１０１；抗感染薬、例えば吸入トブラマイシン、アジスロマイシン、ＣＡＹＳＴＯＮ（登録商標）（吸入用アズトレオナム液）、ＴＯＢＩ吸入パウダー、レボフロキサシン、ＡＲＩＫＡＣＥ（登録商標）（噴霧化したリポソームアミカシン）、ＡＥＲＯＶＡＮＣ（登録商標）（バンコマイシン塩酸塩吸入用パウダー）、およびガリウム；ならびに栄養補助剤、例えばａｑｕＡＤＥＫ、膵リパーゼ酵素産物、リプロタマーゼ（ｌｉｐｒｏｔａｍａｓｅ）、およびブルルリパーゼ（ｂｕｒｌｕｌｉｐａｓｅ）が挙げられる。
【０２３８】
ＨＩＶの処置では、追加の治療は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト（ＣＣＲ５）（進入阻害剤とも呼ばれる）、インテグラーゼストランドトランスファー阻害剤（ＩＮＳＴＩ）、またはその組合せが挙げられるがこれらに限定されない抗レトロウイルス剤であり得る。
【０２３９】
リソソーム蓄積症の処置では、追加の治療は、例えば酵素置換療法、骨髄移植、またはその組合せを含み得る。
【０２４０】
Ｅ．遺伝子改変の決定
シークエンシングおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲは、遺伝子改変が起こっているか否かを決定するための好ましい方法である。ＰＣＲプライマーは、元の対立遺伝子と、組換え後の新規の予想される配列とを識別するように設計される。組換え事象が起こっているか否かを決定する他の方法は当技術分野で公知であり、作製された改変のタイプに基づいて選択され得る。方法としては、これらに限定されないが、例えばシークエンシング、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、または制限エンドヌクレアーゼ選択的ＰＣＲ（ＲＥＭＳ−ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡの解析；例えばノザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、リアルタイムまたは定量的逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＴによる、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの解析；ならびに例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、またはＦＡＣＳによる標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの解析が挙げられる。一部の例では、改変細胞を親対照と比較する。他の方法は、標的遺伝子によって転写されたＲＮＡまたは標的遺伝子によってコードされたポリペプチドの機能の変化を試験することを含み得る。例えば、標的遺伝子が酵素をコードする場合、酵素機能を試験するために設計されたアッセイを使用してもよい。
【０２４１】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参照してさらに理解される。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１：３Ｅ１０は、ドナーＤＮＡのみを含有するＮＰによる遺伝子編集を亢進する）
【０２４３】
材料および方法
ドナーＤＮＡおよびナノ粒子の合成
一本鎖ドナーＤＮＡオリゴマーを標準的なＤＮＡ合成によって調製し、５’および３’末端を、各末端で３つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含めることによって保護した。ドナーＤＮＡの配列は、β−グロビンイントロン２における６２４〜６８４位にマッチし、以下：
【化２６】
2022500009.tif 000027
の通りであり、修正するＩＶＳ２−６５４ヌクレオチドを下線で示す。
【０２４４】
ドナーＤＮＡを含有するまたはドナーＤＮＡおよびＰＮＡを含有するナノ粒子を、既に記載されたダブルエマルジョン溶媒蒸発プロトコールによって合成した（Ｂａｈａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ７：１３３０４  （２０１６））。簡単に説明すると、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）をジクロロメタン中で４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。被包の前に、ＰＮＡおよびドナーＤＮＡを２：１のモル比で混合し、ボルテックス下でＰＬＧＡ溶液に滴下して添加した。ドナーＤＮＡ単独を含有するＮＰの場合、ＤＮＡを、２ｎｍｏｌｅ／ｍｇポリマーのモル比で滴下して添加した。得られた混合物に、３８％の振幅を使用して１０秒間の超音波処理を３回行った。次に、油中水エマルジョンを、ポリビニルアルコール（５ｗ／ｖ％）を含有する界面活性剤溶液に滴下して添加した。第２のエマルジョン後、超音波処理ステップを記載のように繰り返した。得られたナノ粒子溶液を０．３％ＰＶＡ溶液２５ｍｌに添加し、室温で３時間撹拌した。撹拌および粒子の「硬化」後、ナノ粒子を遠心分離（１６，１００ｇ、１５分間、４℃）を介して３回洗浄後、凍結保護剤（トレハロース、ｍｇ：ｍｇ）中で瞬間凍結して凍結乾燥した。乾燥ナノ粒子を後に使用するまで−２０℃で保存した。
【０２４５】
細胞の単離、培養、および処置
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、サラセミア関連ＩＶＳ２−６５４（Ｃ→Ｔ）変異がＧＦＰコード配列内に挿入されたヒトβ−グロビンイントロン２からなるβ−グロビン／ＧＦＰ融合トランスジーンを有するトランスジェニックマウスモデルから単離した（Ｓａｚａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０：１２２８−１２３３  （２００２）；Ｂａｈａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ７：１３３０４  （２０１６））。これは、β−グロビン／ＧＦＰ  ｍＲＮＡの不正確なスプライシングおよびＧＦＰ発現の欠如をもたらす。
【０２４６】
細胞培養物に単純に添加することによって、ＭＥＦを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中、細胞５，０００個／ウェルの播種密度で、ドナーＤＮＡ単独を含有する、またはドナーＤＮＡと組み合わせてＰＮＡを含有するナノ粒子２ｍｇによって処置した。
【０２４７】
一部の試料では、ドナーＤＮＡ含有ナノ粒子による処置の前に、ＭＥＦを、最終濃度７．５μＭの３Ｅ１０  ＷＴ（野生型３Ｅ１０重鎖および軽鎖配列を含有する）によって処置した。３Ｅ１０  ＷＴを、公開された配列に基づいて２９３細胞における組換え発現構築物からの発現によって、全長の組換え抗体として調製し、標準的な技術によって精製した。細胞を、７２時間後にフローサイトメトリーを介した蛍光によって遺伝子編集に関して解析した。
【０２４８】
結果
図１に示すように、ドナーＤＮＡ  ＮＰ単独による処置は、バックグラウンド（無処置対照）をわずかに超える何らかの検出可能な編集をもたらした。３Ｅ１０を添加すると、この編集が有意に増加した（図１）。ドナーＤＮＡ  ＮＰ＋３Ｅ１０による処置は、ドナーＤＮＡ／ＰＮＡを含有するＮＰによって処置した細胞と比較して、高いパーセンテージ編集を達成した（遺伝子編集に関して既に確立されたアプローチ（Ｂａｈａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ７：１３３０４  （２０１６）））。
【０２４９】
（実施例２：３Ｅ１０は、ｅｘ  ｖｉｖｏで骨髄細胞における裸のドナーＤＮＡによるベータグロビン遺伝子の編集を亢進する。）
【０２５０】
材料および方法
ドナーＤＮＡ
一本鎖ドナーＤＮＡオリゴマーを標準的なＤＮＡ合成によって調製し、５’および３’末端を、各末端で３つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含めることによって保護した。ドナーＤＮＡ配列は、鎌状赤血球変異の位置であるコドン６を中心とする野生型ヒトベータグロビン配列にマッチする６０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡである。ドナーＤＮＡの配列は以下の通りである
５’ＴＴＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＧ３’（配列番号４８）
【０２５１】
鎌状赤血球症のマウスモデル
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）では、コドン６での変異（ＧＡＧ−＞ＧＴＧ）は、グルタミン酸のバリンへの変化をもたらす。このＳＣＤ変異部位を修正（編集）するために、Ｔｏｗｎｅｓマウスモデルにおいて研究を実施した。
【０２５２】
Ｔｏｗｎｅｓマウスモデルは、Ｒｙａｎ  ＴＭ，  Ｃｉａｖａｔｔａ  ＤＪ，  Ｔｏｗｎｅｓ  ＴＭ．，  ”Ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９７  Ｏｃｔ  ３１；２７８（５３３９）：８７３−６．  ＰＭＩＤ：  ９３４６４８７によって開発された。
【０２５３】
Ｔｏｗｎｅｓマウスは、ヒト鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）を排他的に発現する。それらは、ヒトα−、γ−、およびβｓ−グロビンを発現するトランスジェニックマウスを生成した後、これをマウスα−およびβ−グロビン遺伝子の欠失を有するノックアウトマウスと交配させることによって産生した。このように、得られた子孫は、マウスα−およびβ−グロビンをもはや発現しない。その代わりに、マウスはヒトα−およびβｓ−グロビンを排他的に発現する。したがって、マウスはヒト鎌状ヘモグロビンを発現し、ＳＣＤを有する個体の主要な血液学的および組織病理学的特色の多くを保有する。
【０２５４】
細胞の単離、培養、および処置
ドナーＤＮＡにより誘導される遺伝子編集に及ぼす３Ｅ１０の効果をさらに評価するために、上記のようにヒトヘモグロビンアルファ（ｈα）およびヒト鎌状ヘモグロビンベータ（βＳ）によって設計した鎌状赤血球症のトランスジェニックマウスモデルを使用した（Ｔｏｗｎｅｓモデル、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。骨髄細胞をこれらのマウスから採取し、１２ウェルプレートにおいて２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ中、細胞２００，０００個／ウェルの密度で培養した。
【０２５５】
処置の前、３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ（３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ重鎖および野生型軽鎖配列を含有する）を、酢酸ナトリウム緩衝液中で、裸のドナーＤＮＡと共に室温で５分間同時インキュベートした（非共有結合抗体−ＤＮＡ複合体を形成させる）。次に、骨髄細胞を、最終濃度７．５μＭの３Ｅ１０および０．５μｇ／μｌのドナーＤＮＡの抗体−ＤＮＡ混合物によって処置した。
【０２５６】
７２時間後、細胞を３回洗浄した後、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した（ＳＶ  Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。新たに単離したｇＤＮＡを、遺伝子編集頻度の定量的決定のために液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析した。
【０２５７】
結果
３Ｅ１０がＤＮＡに結合して細胞に浸透する能力によって、ナノ粒子送達の必要をなくすことができるか否かを決定するために実験を設計した（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．，  ５：１２０２２  （２０１５））。したがって、ドナーＤＮＡをナノ粒子に被包する（実施例１に記載したように）のではなく、裸のドナーＤＮＡと組み合わせた３Ｅ１０が鎌状赤血球症トランスジェニックモデルからの骨髄細胞において遺伝子編集を媒介する能力を評価した。
【０２５８】
図２に示すように、細胞を、３Ｅ１０とドナーＤＮＡのプレインキュベートした混合物によって処置すると、８％の範囲の実質的な遺伝子編集頻度が観察された。遺伝子編集がアーチファクトではないことを保証するために、ドナー単独および無処置細胞からのゲノムＤＮＡにスパイクしたドナーからなるｄｄＰＣＲ対照を試料として含めた。バックグラウンドシグナルは対照において検出されず、アーチファクトは除外された（図２）。
【０２５９】
（実施例３：３Ｅ１０は、ＭＥＦにおける裸のドナーＤＮＡによるベータグロビン遺伝子の編集を亢進する）
【０２６０】
材料および方法
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、Ｔｏｗｎｅｓマウス胚（実施例２で使用したものと同じ鎌状赤血球トランスジェニックマウスモデル）から単離した。次に、ＭＥＦを２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中、細胞２００，０００個／ウェルの播種密度で１２ウェルプレートに播種した。
【０２６１】
処置の前、３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ（３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ重鎖および野生型軽鎖配列を含有する）およびドナーＤＮＡを、５分間インキュベートした。次に、ＭＥＦを、最終濃度７．５μＭの３Ｅ１０および０．５μｇ／μｌのドナーＤＮＡによって処置した。
【０２６２】
７２時間後、細胞を３回洗浄した後、ｇＤＮＡを単離した（ＳＶ  Ｗｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。新たに単離したゲノムＤＮＡを、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって編集頻度に関して分析した。
【０２６３】
結果
処置した骨髄細胞（上の実施例２に記載）における３Ｅ１０およびドナーＤＮＡによる知見を別の細胞タイプに拡大するために、ＭＥＦにおいて裸のドナーＤＮＡと組み合わせた３Ｅ１０による遺伝子編集の効率を評価した。ドナーＤＮＡ単独によって処置したＭＥＦにおいて観察された遺伝子編集が非常に低レベルであったことと比較すると、３Ｅ１０とドナーＤＮＡの組合せは、１３％の範囲の高レベルの遺伝子編集を達成した（図３）。
【０２６４】
（実施例４：３Ｅ１０およびドナーＤＮＡ単独は、Ｔｏｗｎｅｓマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ編集を達成する）
【０２６５】
材料および方法
３Ｅ１０が、生きている動物においてｉｎ  ｖｉｖｏでドナーＤＮＡにより誘導される遺伝子編集を促進するか否かを試験するために、Ｔｏｗｎｅｓモデル（実施例２および３で使用したものと同じ鎌状赤血球トランスジェニックマウスモデル）を使用した。マウスの処置の前に、３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ（３Ｅ１０  Ｄ３１Ｎ重鎖および野生型軽鎖配列を含有する）１ｍｇを、ドナーＤＮＡ３３０μｇと共に酢酸ナトリウム緩衝液中、室温で５分間混合した。次に、実験条件あたり２匹のマウスに、全体で４用量の３Ｅ１０／ドナーＤＮＡを２日の間隔を空けて腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。各用量は、３Ｅ１０  １ｍｇおよびドナーＤＮＡ３３０μｇからなった。２ヶ月後、骨髄細胞を採取し、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を介して鎌状赤血球変異でのベータグロビン遺伝子における遺伝子編集に関して分析した。
【０２６６】
結果
ブランクＰＬＧＡナノ粒子によって処置した対照マウスと比較すると、３Ｅ１０およびドナーＤＮＡによって処置したマウスは、１．５％の頻度で有意に高レベルの遺伝子編集を実証した（図４）。
【０２６７】
それ以外であると定義している場合を除き、本明細書で使用した全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書において引用した刊行物およびそれらが引用した材料は、具体的に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
当業者は、単なる慣用的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。
【図１】
2022500009.tif 000028
【図２】
2022500009.tif 000029
【図３】
2022500009.tif 000030
【図４】
2022500009.tif 000031
【配列表】
2022500009000001.app
【国際調査報告】
2022500009.tif 000032
2022500009.tif 000033
2022500009.tif 000034