【手続補正書】
【提出日】平成22年10月4日(2010.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
特に、本発明は初めて、既知組成脂質濃縮物（CDLC）を添加した培地において細胞を培養することによりウイルスを増殖させるための方法を提供する。ある実施形態において、CDLC添加培地は血清を実質的に含まない。特定の、より具体的な実施形態において、培地は無血清である。一実施形態においては、既知組成の培地を使用して、変動を回避し、ウイルス産生を増大させる。別の実施形態において、CDLC添加培地は、最大濃度0.5％ v/vの血清を含有する。ある実施形態において、CDLCは、プルロニックF-68（Pluronic F-68）、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸及びリノレン酸のうちの１以上を含む。特定の実施形態において、CDLCは、100,000 mg/LのPluronic F-68、100,000 mg/Lのエチルアルコール、220 mg/Lのコレステロール、2,200 mg/LのTween 80、70 mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10 mg/Lのステアリン酸、10 mg/Lのミリスチン酸、10 mg/Lのオレイン酸、10 mg/Lのリノール酸、10 mg/Lのパルミチン酸、10 mg/Lのパルミトレイン酸、2 mg/Lのアラキドン酸、及び10 mg/Lのリノレン酸を含む（第５．１．１節も参照されたい）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
一実施形態において、CDLC添加培地は血清を実質的に含まない。別の実施形態において、CDLC添加培地は、最大濃度0.5％ v/vの血清を含有する。ある実施形態において、CDLC添加培地は、Pluronic F-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸及びリノレン酸のうちの１以上を含有する。他の実施形態において、CDLCは、100,000 mg/LのPluronic F-68、100,000 mg/Lのエチルアルコール、220 mg/Lのコレステロール、2,200 mg/LのTween 80、70 mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10 mg/Lのステアリン酸、10 mg/Lのミリスチン酸、10 mg/Lのオレイン酸、10 mg/Lのリノール酸、10 mg/Lのパルミチン酸、10 mg/Lのパルミトレイン酸、2 mg/Lのアラキドン酸、及び10 mg/Lのリノレン酸を含む。他の実施形態において、CDLCは、50,000〜250,000 mg/LのPluronic F-68、50,000〜250,000 mg/Lのエチルアルコール、100〜300 mg/Lのコレステロール、1,000〜4,000 mg/LのTween 80、50〜100 mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、5〜20 mg/Lのステアリン酸、5〜20 mg/Lのミリスチン酸、5〜20 mg/Lのオレイン酸、5〜20 mg/Lのリノール酸、5〜20 mg/Lのパルミチン酸、5〜20 mg/Lのパルミトレイン酸、1〜5 mg/Lのアラキドン酸、及び5〜20 mg/Lのリノレン酸を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
特定の実施形態において、増殖させるウイルスはMEDI-534である。MEDI-534は、最初にウシPIV3における融合（F）及び血球凝集素ノイラミニダーゼ（HN）糖タンパク質遺伝子をヒトPIV3及びNH遺伝子でそれぞれ置き換えることにより組換えウシPIV3ベクターを構築することで構築される（Haller et al., 2000, J Virol 74:11626-11635）。続いて、RSV F遺伝子をウシ−ヒトPIV3ベクター骨格に挿入して、RSV Fタンパク質を発現するキメラウイルスを作製する（Tang et al., 2003, J Virol 77:10819-10828）。このキメラウイルスはMEDI-534と名づけられ、動物研究において生弱毒化二価ワクチンとして機能する。すなわち、MEDI-534で免疫したハムスター及び非ヒト霊長類が、RSV及びhPIV3によるチャレンジからの防御を示し、そしてそれらの動物は、RSV中和抗体及びhPIV3血液凝集阻害抗体を生成した（Tang et al., 2003, 前掲；Tang et al., 2004, 前掲）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
５．８  キット
本発明はまた、本発明のアッセイレジメンを実施するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明のキットは無血清培地及び脂質濃縮物を含む。特定の実施形態において、キット中の無血清培地はOptiPROTM SFM又はVP-SFM又はSFM4MegaVirTMであり、脂質濃縮物はCDLCである。別の実施形態において、キットは、１又はそれ以上の容器中に、無血清培地、脂質濃縮物、及びエンベロープウイルスを感染させうる細胞のバイアルを含んでもよい。特定の実施形態において、キットは、Vero細胞のバイアルを１以上含む。別の実施形態において、キットは、無血清培地、脂質濃縮物、エンベロープウイルスを感染させうる細胞の１以上のバイアル、及びエンベロープウイルスの１以上のバイアルを含む。特定の実施形態において、キットは、MEDI-534又はMEDI-559の１以上のバイアルを含有する。別の実施形態において、本発明のキットは、本発明の方法を実施するためのマニュアルを含む。特定の実施形態において、そのマニュアルは、以下のようなウイルスの増殖を説明する：すなわち、そこでウイルスが十分に増殖することが知られている細胞を最適増殖条件下（例えば血清存在下及び37℃）で増殖させ、細胞をCDLC富化培地（例えば血清を含まない又は血清を実質的に含まない培地）に入れ、細胞にウイルスを感染させ、感染細胞を感染前培養よりも低い温度（例えば33℃又は30℃）で培養する。
５．９  発明の実施形態
1. Vero細胞においてウイルスを増殖させる方法であって、
（a）既知組成脂質濃縮物（chemically-defined lipid concentrate, CDLC）及びマイクロキャリアを含む細胞培養培地にVero細胞を播種することを含む、第１の温度にてバイオリアクター中でVero細胞を培養する工程、
（b）工程（a）で培養したVero細胞に、第１の温度に比べて低い第２の温度にて約0.001〜約0.10の感染多重度で感染させる工程、並びに
（c）工程（b）の細胞培養物から、少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じるウイルスを回収する工程、
を含む方法。
2. 前記バイオリアクターが単回使用バイオリアクター（SUB）システムである、実施形態1の方法。
3. SUBが攪拌型タンクリアクターシステムである、実施形態2の方法。
4. 細胞培養培地が無血清培地である、実施形態1の方法。
5. CDLCが1％v/vの濃度まで加えられる、実施形態1の方法。
6. 細胞培養培地が、OptiPROTM SFM、VP-SFM、SFM4MegaVirTM、Ex-Cell VeroTM、又はWMEからなる群より選択される無血清培地である、実施形態4の方法。
7. 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸のうちの１以上を含む、実施形態1の方法。
8. 既知組成脂質濃縮物が、プルロニックF-68、エチルアルコール、コレステロール、Tween 80、酢酸DL-α-トコフェロール、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、及びリノレン酸を含む、実施形態1の方法。
9. 既知組成脂質濃縮物が、100,000mg/LのプルロニックF-68、100,000mg/Lのエチルアルコール、220mg/Lのコレステロール、2,200mg/LのTween 80、70mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10mg/Lのステアリン酸、10mg/Lのミリスチン酸、10mg/Lのオレイン酸、10mg/Lのリノール酸、10mg/Lのパルミチン酸、10mg/Lのパルミトレイン酸、2mg/Lのアラキドン酸、及び10mg/Lのリノレン酸を含む、実施形態1の方法。
10. 工程（a）が、約50〜約150rpmの攪拌速度での培養物の攪拌を利用する、実施形態1の方法。
11. 前記攪拌が断続的である、実施形態10の方法。
12. 工程（a）の前記培養条件が、約35％〜約100％の溶存酸素（DO）量を利用する、実施形態11の方法。
13. 第１の温度が約36℃〜約38℃である、実施形態1の方法。
14. 第２の温度が約30℃〜約33℃である、実施形態1の方法。
15. マイクロキャリア濃度が約1〜約4g/Lである、実施形態1の方法。
16. 工程（a）の前記細胞培養物のpHが約6.6〜約7.6である、実施形態1の方法。
17. 工程（a）の後で且つ工程（b）の前に細胞培養培地の約50％〜約90％を交換する、実施形態1の方法。
18. 細胞培養培地を、同じ組成を有する細胞培養培地と交換する、実施形態16の方法。
19. 細胞培養培地を、異なる組成を有する細胞培養培地と交換する、実施形態16の方法。
20. 感染多重度が約0.01である、実施形態1の方法。
21. 工程（c）においてVero細胞を2〜12日間培養する、実施形態1の方法。
22. ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、実施形態1の方法。
23. マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、実施形態22の方法。
24. ウイルスがパラミクソウイルスである、実施形態23の方法。
25. パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、実施形態24の方法。
26. パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、実施形態25の方法。
27. ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態26の方法。
28. 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態25の方法。
29. 前記回収されたウイルスが少なくとも8.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態1の方法。
30. 前記回収されたウイルスが少なくとも9.0 log10TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態1の方法。
31. 前記Vero細胞を約0.5×105〜2×105細胞/mlの密度で播種する、実施形態1の方法。
32. 工程（a）において前記Vero細胞を少なくとも約8×105細胞/mlの細胞密度にまで培養する、実施形態1の方法。
33. 工程（a）の前記細胞培養物の体積が少なくとも1.5Lである、実施形態1の方法。
34. 工程（a）の前記細胞培養物の体積が少なくとも30Lである、実施形態2の方法。
35. 血清を実質的に含まない細胞培養培地中にウイルスを含むVero細胞培養物上清であって、前記上清が少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、Vero細胞培養物上清。
36. 前記上清が濃度約0.5〜約2.5g/Lのグルコースを含む、実施形態35の上清。
37. 前記上清が濃度約1.0〜約2.0g/Lの乳酸塩を含む、実施形態35の上清。
38. 前記上清が濃度約2.0〜約4.0g/Lのグルタミンを含む、実施形態35の上清。
39. 前記上清が濃度約1.25〜約2.5mMのアンモニウムイオンを含む、実施形態35の上清。
40. 前記上清が少なくとも8.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じる、実施形態35の上清。
41. ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、実施形態35の上清。
42. マイナス鎖RNAウイルスが非分節型ウイルスである、実施形態41の上清。
43. ウイルスがパラミクソウイルスである、実施形態42の上清。
44. パラミクソウイルスが組換えパラインフルエンザウイルス又は組換え呼吸器多核体ウイルス又は組換えメタニューモウイルスである、実施形態43の上清。
45. パラインフルエンザウイルスがウシパラインフルエンザウイルスである、実施形態44の上清。
46. ウシパラインフルエンザウイルスがさらに1以上のヒトパラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態45の上清。
47. 組換えパラインフルエンザウイルスがさらに呼吸器多核体ウイルスのヌクレオチド配列を含む、実施形態44の上清。
48. 工程（a）においてトリプシンを加えない、実施形態10の方法。
49. 工程（a）における前記培養物を、新しいマイクロキャリアを含む新しい培養培地を用いて1:1又は1:5で分割（split）する、実施形態48の方法。
50. 前記分割が工程（b）の前又は感染前に培養中少なくとも１回又は少なくとも２回行われる、実施形態49の方法。
51. 前記方法が、30Lのウイルス採集バッチあたり少なくとも2,000,000、少なくとも9,000,000、少なくとも12,000,000、少なくとも120,000,000のワクチン用量を産生する、実施形態1又は50の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
Vero細胞においてウイルスを増殖させる方法であって、
（a）既知組成脂質濃縮物（chemically-defined lipid concentrate, CDLC）及びマイクロキャリアを含む細胞培養培地にVero細胞を播種することを含む、第１の温度にてバイオリアクター中でVero細胞を培養する工程、
（b）工程（a）で培養したVero細胞に、第１の温度に比べて低い第２の温度にて約0.001〜約0.10の感染多重度で感染させる工程、並びに
（c）工程（b）の細胞培養物から、少なくとも7.0 log10 TCID50/mlのウイルス力価を生じるウイルスを回収する工程、
を含む方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
既知組成脂質濃縮物が、100,000mg/LのプルロニックF-68、100,000mg/Lのエチルアルコール、220mg/Lのコレステロール、2,200mg/LのTween 80、70mg/Lの酢酸DL-α-トコフェロール、10mg/Lのステアリン酸、10mg/Lのミリスチン酸、10mg/Lのオレイン酸、10mg/Lのリノール酸、10mg/Lのパルミチン酸、10mg/Lのパルミトレイン酸、2mg/Lのアラキドン酸、及び10mg/Lのリノレン酸を含む、請求項１４記載の方法。