(57)【要約】  免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドと、イムノアクティベーターをコードする第二異種ポリヌクレオチドとを有する改変された腫瘍溶解性ウイルスが提供される。さらに、前記改変された腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物、および対象に前記改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは前記医薬組成物を投与することを含む癌を処置する方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドと、イムノアクティベーターをコードする第二異種ポリヌクレオチドとを有するウイルスゲノムを含む、改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
ワクシニア、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎、パルボウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、水疱性口炎ウイルス、セネカバレーウイルス、マラバウイルス、およびニューカッスル病ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
ワクシニアである、請求項２に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
弱毒化され、腫瘍細胞において複製することができる、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスゲノムが、前記ウイルスが腫瘍細胞内において選択的複製をできるようにする、少なくとも１つの欠失または破壊を含む、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記欠失または破壊が、前記ウイルスの複製に必須であり、かつ非腫瘍細胞より腫瘍細胞において優先的に発現される酵素の少なくとも一部をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある、請求項５に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記酵素がキナーゼである、請求項６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記酵素がチミジンキナーゼである、請求項７に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
ウエスタンリザーブ株から誘導される、請求項２に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記免疫チェックポイント阻害因子が、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合することができる第一抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記免疫チェックポイントタンパク質が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１／２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３／４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ１６０からなる群から選択される、請求項１０に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記第一抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１に特異的に結合する、請求項１０に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記第一抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号２、３、および４を含む第一重鎖を含む、請求項１０に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記第一重鎖が、配列番号５、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む、請求項１３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、配列番号７の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記第一重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、配列番号８の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記第一抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号９、１０、および１１を含む第一軽鎖をさらに含む、請求項１３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記第一軽鎖が、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む、請求項１８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、配列番号１４の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む、請求項１５に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
前記第一軽鎖が、配列番号１３のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、配列番号１５の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む、請求項１７に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２３】
前記イムノアクティベーターが、共刺激分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２４】
前記共刺激分子が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ２７／７０、ＴＮＦＲＳ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ニュートロフィリン、およびＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２５】
前記第二抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６に特異的に結合する、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２６】
前記第二抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１７、１８、および１９を含む第二重鎖を含む、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２７】
前記第二重鎖が、配列番号２０のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む、請求項２６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２８】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、配列番号２２の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２９】
前記第二重鎖が、配列番号２１のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項２６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３０】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、配列番号２３の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３１】
前記第二抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号２４、２５、および２６を含む第二軽鎖をさらに含む、請求項２６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３２】
前記第二軽鎖が、配列番号２７のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む、請求項３１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３３】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、配列番号２９の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む、請求項２８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３４】
前記第二軽鎖が、配列番号２８のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項２６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３５】
前記イムノアクティベーターが、ＮＫ細胞活性を刺激するＮＫアクティベーターである、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３６】
前記ＮＫアクティベーターが、ＮＫ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３５に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３７】
前記ＮＫ分子が、Ｓｉｇｌｅｃ、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲｓ、およびＮＫＧ２Ａ／Ｄからなる群から選択される、請求項３６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３８】
前記イムノアクティベーターが、マクロファージ細胞活性を刺激するマクロファージアクティベーターである、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３９】
前記マクロファージアクティベーターが、マクロファージ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４０】
前記マクロファージ分子が、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ１キナーゼ、ＰＳ、およびＣＤ４７からなる群から選択される、請求項３９に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４１】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、配列番号３０の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む、請求項３０に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４２】
前記免疫チェックポイント阻害因子が、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、かつ前記イムノアクティベーターが、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４３】
前記第一異種ポリヌクレオチドおよび前記第二異種ポリヌクレオチドが、前記欠失の位置に挿入される、請求項４に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４４】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、前記第二異種ポリヌクレオチドのすぐ上流またはすぐ下流に存する、請求項４３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４５】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、前記第一抗体の第一重鎖および第一軽鎖をコードする、請求項１０に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４６】
前記第一異種ポリヌクレオチドが、前記第一重鎖の発現を駆動することができる第一プロモーターと、前記第一軽鎖の発現を駆動することができる第二プロモーターとをさらに含み、前記第一プロモーターおよび前記第二プロモーターは、ヘッドトゥヘッド配向にある、請求項４５に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４７】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、前記第二抗体の第二重鎖および第二軽鎖をコードする、請求項２３に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４８】
前記第二異種ポリヌクレオチドが、前記第二重鎖の発現を駆動することができる第三プロモーターと、前記第二軽鎖の発現を駆動することができる第四プロモーターとをさらに含み、前記第三プロモーターおよび前記第四プロモーターは、ヘッドトゥヘッド配向にある、請求項４７に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４９】
前記第一異種ポリヌクレオチドおよび前記第二異種ポリヌクレオチドが、それらが前記改変された腫瘍溶解性ウイルスの複製サイクルにおける同じ段階または異なる段階で発現されるように構成された、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５０】
前記第一プロモーターおよび前記第二プロモーターが、同じである、または異なる、請求項４６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５１】
前記第一プロモーターおよび前記第二プロモーターが、両方とも後期プロモーターである、請求項４６に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５２】
前記後期プロモーターがｐＳＬである、請求項５１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５３】
前記第三プロモーターおよび前記第四プロモーターが、同じである、または異なる、請求項４８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５４】
前記第三および前記第四が、両方とも初期および後期プロモーターである、請求項４８に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５５】
前記初期および後期プロモーターがｐＳＥ／Ｌである、請求項５４に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５６】
センス鎖の５’から３’の方向において、インフレームで以下の要素：ＣＤ１３７に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド−第一初期および後期プロモーター  ―  第二初期および後期プロモーター  ―  ＣＤ１３７に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  第一後期プロモーター  ―  第二後期プロモーター  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５７】
前記第一異種ポリヌクレオチドから発現される免疫チェックポイント阻害因子および前記第二異種ポリヌクレオチドから発現されるイムノアクティベーターが、別々のタンパク質として発現される、請求項１に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５８】
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項５９】
対象に有効量の請求項１〜５７のいずれか一項に記載の改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項５８に記載の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍を処置する方法。
【請求項６０】
前記対象がヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記腫瘍が、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌種、ホジキンリンパ腫、頭頚部の扁平上皮癌、膀胱癌、結直腸癌、または肝細胞癌である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
投与経路が局所である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記投与経路が腫瘍内注入である、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、改変された腫瘍溶解性ウイルス、改変された腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、および腫瘍の処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中において、毎年１４００万人を超える人々が腫瘍と診断されている。医学研究における頻繁な進歩にもかかわらず、腫瘍は、全ての死亡のおよそ１６％を占める。
【０００３】
悪性腫瘍はしばしば、従来の治療法に対して抵抗性があり、重要な治療課題を提示する。例えば、微小転移巣は、原発腫瘍の発生における非常に初期の段階において成立し得る。したがって、診断の時点で、多くの腫瘍患者は、既に、微小転移を有している。腫瘍反応性Ｔ細胞は、これらの微小転移巣を探し出して破壊し、周囲の健全な組織を温存する。しかしながら、悪性腫瘍に対しての天然に存在するＴ細胞の反応はしばしば、原発腫瘍または転移腫瘍の寛解を生じさせるには不十分である。
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルスは、抗腫瘍剤としての可能性を示している。従来の遺伝子治療とは異なり、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス複製および同時に生じる細胞溶解によって腫瘍組織を通じて広がることができる。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルス自体は、原発腫瘍または転移腫瘍のどちらに対してもそれらを処置するには不十分である。
【０００５】
したがって、腫瘍溶解性ウイルスの効力の増強および転移腫瘍細胞の排除に対する必要性は、非常に急を要している。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本開示は、免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドと、イムノアクティベーター〔immuno activator〕をコードする第二異種ポリヌクレオチドとを有するウイルスゲノムを含む、改変された腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【０００７】
ある特定の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニア、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎、パルボウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、水疱性口炎ウイルス、セネカバレーウイルス、マラバウイルス、およびニューカッスル病ウイルスからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ウエスタンリザーブ〔Western Reserve〕株から誘導される。
【０００８】
ある特定の実施形態において、前記改変された腫瘍溶解性ウイルスは、弱毒化され、腫瘍細胞において複製することができる。ある特定の実施形態において、前記ウイルスゲノムは、前記ウイルスが腫瘍細胞内において選択的複製をできるようにする、少なくとも１つの欠失または破壊を含む。ある特定の実施形態において、前記欠失または破壊は、ウイルスの複製に必須であり、かつ非腫瘍細胞より腫瘍細胞において優先的に発現される酵素の少なくとも一部をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。ある特定の実施形態において、前記酵素はキナーゼである。ある特定の実施形態において、前記酵素はチミジンキナーゼである。
【０００９】
ある特定の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害因子は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合することができる第一抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態において、前記免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１／２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３／４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ１６０からなる群から選択される。
【００１０】
ある特定の実施形態において、前記第一抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１に特異的に結合する。
【００１１】
ある特定の実施形態において、前記第一抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２、３、および４を含む第一重鎖を含む。ある特定の実施形態において、前記第一重鎖は、配列番号５または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、前記第一重鎖は、配列番号６のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、前記第一抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９、１０、および１１を含む第一軽鎖をさらに含む。ある特定の実施形態において、前記第一軽鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、前記第一軽鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、配列番号１４の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、配列番号１５の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む。
【００１５】
ある特定の実施形態において、前記イムノアクティベーターは、共刺激アクティベーターである。ある特定の実施形態において、前記イムノアクティベーターは、共刺激分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である。
【００１６】
ある特定の実施形態において、前記共刺激分子は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＴＮＦＲＳ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ニュートロフィリン〔Neutrophilin〕、およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
【００１７】
ある特定の実施形態において、前記第二抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６に特異的に結合する。
【００１８】
ある特定の実施形態において、前記第二抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１７、１８、および１９を含む第二重鎖を含む。ある特定の実施形態において、前記第二重鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、前記第二重鎖は、配列番号２１のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、配列番号２２の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、配列番号２３の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、前記第二抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２４、２５、および２６を含む第二軽鎖をさらに含む。ある特定の実施形態において、前記第二軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、配列番号２８の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む。
【００２１】
ある特定の実施形態において、前記第二軽鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、配列番号３０の核酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列をさらに含む。
【００２３】
ある特定の実施形態において、前記イムノアクティベーターは、ＮＫ細胞活性を刺激するＮＫアクティベーターである。ある特定の実施形態において、前記ＮＫアクティベーターは、ＮＫ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態において、前記ＮＫ分子は、Ｓｉｇｌｅｃ、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲｓ、およびＮＫＧ２Ａ／Ｄからなる群から選択される。
【００２４】
ある特定の実施形態において、前記イムノアクティベーターは、マクロファージ細胞活性を刺激するマクロファージアクティベーターである。ある特定の実施形態において、前記マクロファージアクティベーターは、マクロファージ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態において、前記マクロファージ分子は、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ１キナーゼ、ＰＳ、およびＣＤ４７からなる群から選択される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害因子は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、かつ前記イムノアクティベーターは、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。
【００２６】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドおよび前記第二異種ポリヌクレオチドは、前記欠失の位置に挿入される。
【００２７】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、前記第二異種ポリヌクレオチドのすぐ上流またはすぐ下流に存する。
【００２８】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、前記第一抗体の第一重鎖および第一軽鎖をコードする。ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドは、前記第一重鎖の発現を駆動することができる第一プロモーターと、前記第一軽鎖の発現を駆動することができる第二プロモーターとをさらに含み、当該第一および第二プロモーターは、ヘッドトゥヘッド〔head-to-head〕配向にある。
【００２９】
ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、前記第二抗体の第二重鎖および第二軽鎖をコードする。ある特定の実施形態において、前記第二異種ポリヌクレオチドは、当該第二重鎖の発現を駆動することができる第三プロモーターと、当該第二軽鎖の発現を駆動することができる第四プロモーターとをさらに含み、当該第三および第四プロモーターは、ヘッドトゥヘッド配向にある。
【００３０】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドおよび前記第二異種ポリヌクレオチドは、それらが前記改変された腫瘍溶解性ウイルスの複製サイクルにおける同じ段階または異なる段階で発現されるように構成される。
【００３１】
ある特定の実施形態において、前記第一プロモーターおよび前記第二プロモーターは、同じである、または異なる。ある特定の実施形態において、前記第一プロモーターおよび前記第二プロモーターは、両方とも後期プロモーターである。ある特定の実施形態において、前記後期プロモーターは、ｐＳＬである。
【００３２】
ある特定の実施形態において、前記第三プロモーターおよび前記第四プロモーターは、同じである、または異なる。ある特定の実施形態において、前記第三および前記第四は、両方とも初期プロモーターおよび後期プロモーターである。ある特定の実施形態において、前記初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ｐＳＥ／Ｌである。
【００３３】
ある特定の実施形態において、前記改変された腫瘍溶解性ウイルスは、センス鎖の５’から３’の方向において、インフレームで以下の要素：ＣＤ１３７に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド−第一初期および後期プロモーター  ―  第二初期および後期プロモーター  ―  ＣＤ１３７に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  第一後期プロモーター  ―  第二後期プロモーター  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態において、前記第一異種ポリヌクレオチドから発現される免疫チェックポイント阻害因子および前記第二異種ポリヌクレオチドから発現されるイムノアクティベーターは、別々のタンパク質として発現される。
【００３５】
別の態様において、本開示は、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【００３６】
別の態様において、本開示は、有効量の本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、腫瘍を処置する方法に関する。
【００３７】
ある特定の実施形態において、前記対象はヒトである。
【００３８】
ある特定の実施形態において、前記腫瘍は固形腫瘍である。ある特定の実施形態において、前記腫瘍は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌種、ホジキンリンパ腫、頭頚部の扁平上皮癌、膀胱癌、結直腸癌、または肝細胞癌である。
【００３９】
ある特定の実施形態において、投与の経路は、局所である。ある特定の実施形態において、投与の経路は、腫瘍内注入である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ＷＲ−ＧＳ−６００におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠失、抗ＰＤ−１および抗４−１ＢＢ抗体挿入の構造を示す。
【図２】図２は、ＷＲ−ＧＳ−６２０におけるＴＫ欠失、および抗ＰＤ−１抗体挿入の構造を示す。
【図３】図３は、ＷＲ−ＧＳ−６００に対する組換えステップの概略図である。
【図４】図４は、ＷＲ−ＧＳ−６２０に対する組換えステップの概略図である。
【図５】図５は、ＧＳ−６００ウイルスゲノムに対するプライマーの位置を示す。
【図６】図６は、ＧＳ−６１０ウイルスゲノムに対するプライマーの位置を示す。
【図７】図７は、ＧＳ−６２０ウイルスゲノムに対するプライマーの位置を示す。
【図８】図８は、ＷＲ−ＧＳ−６００のＷＲ野生型株とのアラインメントを示す。
【図９】図９は、ＷＲ−ＧＳ−６１０のＷＲ野生型株とのアラインメントを示す。
【図１０】図１０は、ＷＲ−ＧＳ−６２０のＷＲ野生型株とのアラインメントを示す。
【図１１】図１１は、ヒトＩｇＧ発現の免疫蛍光検出の結果を示す。図１１ａは、Ｕ２ＯＳ細胞の位相コントラスト画像を示す。図１１ｂは、バックグラウンド染色を示す。図１１ｃは、ＷＲ−ＧＳ−６００を感染させたＵ２ＯＳ細胞の画像を示す。図１１ｄは、ＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させたＵ２ＯＳ細胞の画像を示す。
【図１２】図１２は、細胞溶解物を使用した、組換えウイルス（ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０）によって発現されたヒト抗体のウエスタンブロットの結果を示しており、ここで、Ｐ６００、Ｐ６１０、およびＰ６２０は、それぞれ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を意味する。このウエスタンブロッティング実験は、それぞれヒト抗体の重鎖および軽鎖に対応する、約５０ｋＤａおよび２５ｋＤａの分子量の２つのバンドを検出する。
【図１３】図１３は、上清を使用した、組換えウイルス（ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０）によって発現されたヒト抗体のウエスタンブロットの結果を示しており、ここで、Ｐ６００、Ｐ６１０、およびＰ６２０は、それぞれ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を意味する。このウエスタンブロッティング実験は、それぞれヒト抗体の重鎖および軽鎖に対応する、約５０ｋＤａおよび２５ｋＤａの分子量の２つのバンドを検出する。
【図１４】図１４は、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０ウイルスＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅によって生じたバンドを示す。
【図１５】図１５は、抗ｈｕＰＤ−１の重鎖のアミノ酸配列およびそのコード配列を示す。
【図１６】図１６は、抗ｈｕＰＤ−１の軽鎖のアミノ酸配列およびそのコード配列を示す。
【図１７】図１７は、抗ｈｕ４−１ＢＢの重鎖のアミノ酸配列およびそのコード配列を示す。
【図１８】図１８は、抗ｈｕ４−１ＢＢの軽鎖のアミノ酸配列およびそのコード配列を示す。
【図１９】図１９は、ＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させた上清に対するＰＤ−１結合アッセイのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２０】図２０は、ＷＲ−ＧＳ−６００を感染させた上清およびＷＲ−ＧＳ−６１０を感染させた上清に対する４−１ＢＢ結合アッセイのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２１】図２１は、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させたＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＭＣ−３８、およびＣＴ−２６細胞の生存率を示す。
【図２２】図２２は、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させたＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＭＣ−３８、およびＣＴ−２６細胞の生存率を示す。
【図２３】図２３は、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させたＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＭＣ−３８、およびＣＴ−２６細胞の生存率を示す。
【図２４】図２４は、ウイルス価特定のためのプレートのセットアップを示す。
【図２５】図２５は、ＷＲ−ＧＳ−６１０ウイルス価特定の代表的なプレートスキャン結果を示す。
【図２６】図２６は、ＷＲウイルス価特定の代表的なプレートスキャン結果を示す。
【図２７】図２７は、ＷＲ−ＧＳ−６２０ウイルス価特定の代表的なプレートスキャン結果を示す。
【図２８】図２８は、ＷＲ−ＧＳ−６００ウイルス価特定の代表的なプレートスキャン結果を示す。
【図２９】図２９は、製剤緩衝液（ＦＢ）で処理したコントロール群の代表的なプレートスキャン結果を示す。
【図３０】図３０は、腫瘍内注入後の腫瘍におけるインビボでのウイルス分布を示す。
【図３１】図３１は、腫瘍内注入後の卵巣におけるインビボでのウイルス分布を示す。
【図３２】図３２は、腫瘍内注入後の脳、脾臓、肝臓、および肺におけるインビボでのウイルス分布を示す。積算光子放出（１．９２８Ｅ１０対１．５５４Ｅ１０）は、腫瘍細胞の数に比例すると考えられる。当該データに基づいて、ＧＳ−６００は、腫瘍成長を制御する。
【図３３】図３３は、ＦＢ、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の腫瘍内注入（ＩＴ）後の同系ＣＴ−２６マウス腫瘍モデルの腫瘍体積変化を示す。
【図３４】図３４は、様々なウイルスで処理した同系マウスの効果モデルを示す。
【図３５】図３５は、ヒトＰＢＭＣを静脈内注入したヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ皮下腫瘍モデルのフローサイトメトリー結果を示す。
【図３６】図３６は、ヒトＰＢＭＣを静脈内注入したヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ皮下腫瘍モデルのフローサイトメトリー結果を示す。
【図３７】図３７は、ＦＢ、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の腫瘍内注入（ＩＴ）後のヒト化ＨＴ−２９皮下腫瘍モデルの腫瘍体積変化を示す。
【図３８】図３８は、ＦＢ、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の腫瘍内注入（ＩＴ）後のヒト化ＨＴ−２９皮下腫瘍モデルの腫瘍体積変化を示す。
【図３９】図３９は、腫瘍を染色したヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ皮下腫瘍モデルを示しており、ここで、当該マウスは、ｈＰＢＭを注入されていない。
【図４０】図４０は、腫瘍を染色したヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ皮下腫瘍モデルを示しており、ここで、当該マウスは、ｈＰＢＭを注入されている。ケージ２のマウスは、ＷＲ−ＧＳ−６００を感染させた。ケージ３のマウスは、ＷＲを感染させた。ケージ４のマウスは、ＦＢを感染させた。ケージ５のマウスは、ＷＲ−ＧＳ−６１０を感染させた。ケージ６において、第一マウスはＷＲ−ＧＳ−６００を感染させ、第二マウスはＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させ、第三マウスはＷＲ−ＧＳ−６１０を感染させ、第四マウスはＷＲを感染させ、第五マウスはＦＢを感染させた。ケージ７のマウスは、ＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させた。
【図４１】図４１は、腫瘍を染色したヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ腹膜内腫瘍モデルを示す。
【図４２】図４２は、様々なウイルスによる１週間の処理後の化学発光強度変化の百分率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
一態様において、本開示は、免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドと、イムノアクティベーターをコードする第二異種ポリヌクレオチドとを挿入したウイルスゲノムを含む、改変された腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【００４２】
腫瘍溶解性ウイルス
用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書において使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、正常細胞に影響を与えずに、または最小の影響で、腫瘍細胞内において選択的に複製することができ、かつ腫瘍細胞の成長を鈍化することができるか腫瘍細胞の死を誘導することができる、ウイルスを意味する。ある特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス粒子（またはビリオン）内にパッケージされたウイルスゲノムを含み、かつ感染性である（すなわち、宿主細胞または対象に感染してその中に入ることができる）。ある特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであってもよく、かつ任意の好適な形態、例えば、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター、またはウイルス粒子など、であってもよい。
【００４３】
用語「選択的に複製する」は、本明細書において使用される場合、腫瘍溶解性ウイルスの複製速度が、非腫瘍細胞（例えば、健康な細胞）においてよりも腫瘍細胞において著しく高いことを意味する。ある特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、非腫瘍細胞（例えば、健康な細胞）においてよりも腫瘍細胞において少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍高い溶解の速度を示す。
【００４４】
ある特定の実施形態において、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、肝臓腫瘍細胞（例えば、Ｈｅｐａｌ−６細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、７４０２細胞、および７７２１細胞）、乳房腫瘍細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞）、舌腫瘍細胞（例えば、ＴＣａ８１１３細胞）、腺様嚢胞腫瘍細胞（例えば、ＡＣＣ−Ｍ細胞）、前立腺腫瘍細胞（例えば、ＬＮＣａＰ細胞）、ヒト胚腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、肺腫瘍細胞（例えば、Ａ５４９細胞）、または子宮頚部腫瘍細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）において選択的に複製することができる。
【００４５】
本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）、アデノウイルス（例えば、デルタ−２４、デルタ−２４−ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ−５、ＩＣＯＶＩＲ−７、Ｏｎｙｘ−０１５、ＣｏｌｏＡｄｌ、Ｈ１０１、およびＡＤ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦ）、レオウイルス（例えば、ＲＥＯＬＹＳＩＮ）、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＭＣＳＦ）、ニューカッスル病ウイルス（例えば、７３−Ｔ  ＰＶ７０１およびＨＤＶ−ＨＵＪ株、ならびに以下の文献に記載されるもの：Ｐｈｕａｎｇｓａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １７２（１）：  ２７−３６；  Ｌｏｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ７（２）：  １５７−６７；およびＦｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １３（１）：  ２２１−８）、レトロウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、粘液腫ウイルス、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス；以下の文献に記載されるもの：Ｓｔｏｊｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６（７）：  ８２１−５およびＳｔｏｊｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４（４）：  ２６３−７５）、ピコルナウイルス（例えば、セネカバレーウイルス；ＳＷ−００１およびＮＴＸ−０１０）、コクスサッキーウイルス、またはパルボウイルスから誘導することができる。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスから誘導される。用語「ポックスウイルス」は、本明細書において使用される場合、ポックスウイルス亜科に属すウイルスを意味する。ある特定の実施形態において、ポックスウイルスは、コードポックスウイルス〔Chordopoxviridae〕亜科に属すウイルスである。ある特定の実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス〔Orthopoxvirus〕亜科に属すウイルスである。様々なポックスウイルスのゲノム、例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、粘液腫ウイルスのゲノムの配列は、当技術分野および専門データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（それぞれ、受託番号ＮＣ＿００６９９８、ＮＣ＿００３６６３、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００４１０５、ＮＣ＿００１１３２）などにおいて入手可能である。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスから誘導される。ワクシニアウイルスは、ウイルスが宿主細胞機構から独立して複製するのを可能にする多数のウイルスの酵素および因子をコードする約１９０ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムによって特徴付けられる、ポックスウイルス科のメンバーである。ある特定の実施形態において、本開示のワクシニアウイルスは、エルストリー〔Elstree〕株、コペンハーゲン〔Copenhagen〕株、ウエスタンリザーブ株、またはワイエス〔Wyeth〕株から誘導される。ある特定の実施形態において、本開示のワクシニアウイルスは、ウエスタンリザーブ株である。ウエスタンリザーブ株は、十分に特性決定されており、その完全配列は、ＡＹ２４３３１２のアクセス番号によりＮＣＢＩサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）において入手可能である。
【００４８】
用語「改変された腫瘍溶解性ウイルス」は、本明細書において使用される場合、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって改変された腫瘍溶解性ウイルスを意味する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される改変された腫瘍溶解性ウイルスは、核酸配列の欠失および／または付加によって遺伝子操作される。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される改変された腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の欠失を含む。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される改変された腫瘍溶解性ウイルスは、抗ヒトＰＤ−１および／または抗ヒト４−１ＢＢ抗体をコードする核酸配列の付加を含む。
【００４９】
ある特定の実施形態において、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスは、弱毒化される。ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞（例えば、健康な細胞）において、その野生型の相対物と比較して減少された（例えば、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％未満の）病原性または検出不可能な病原性を有する。
【００５０】
本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスは、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において選択的に複製し腫瘍細胞を死に至らしめるその性向によって腫瘍溶解性であるよう、当技術分野において既知の任意の腫瘍溶解性ウイルスから誘導することができる。腫瘍溶解性ウイルスは、天然において腫瘍溶解性であり得る、または遺伝子組み換え技術によって、例えば、腫瘍選択性および／または腫瘍細胞での優先的複製を増加させるために１つまたは複数の遺伝子を改変するなどによって、腫瘍溶解性にされ得る。改変のためのそのような遺伝子の例としては、ＤＮＡ複製、核酸代謝、宿主指向性、表面接着、病原性、宿主細胞溶解、およびウイルス拡散に関与するものが挙げられる（例えば、Ｋｉｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：  ７８１；  Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：  ７８−１０６を参照されたい）。
【００５１】
ある特定の実施形態において、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスのウイルスゲノムは、ウイルスが腫瘍細胞内において選択的に複製できるようにする、少なくとも１つの欠失または破壊を含む。例えば、欠失または破壊は、ウイルス複製にとって不可欠な酵素の発現または機能を減少させ得、それによりウイルスは、そのような酵素の不在下において複製する能力が減退する。いくつかの実施形態において、ウイルス複製は、細胞におけるそのような酵素の存在および／またはレベルに依存し、酵素のレベルが高いほど、ウイルスの複製能力または複製速度は高い。
【００５２】
ある特定の実施形態において、欠失または破壊は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にある。用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」または「コード配列」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列へと翻訳することができるＤＮＡ配列を意味する。ＯＲＦは、通常、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、アミノ酸コードコドンが続き、停止コドン（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）で終わる。
【００５３】
ある特定の実施形態において、ＯＲＦは、ウイルスの複製に不可欠であって非腫瘍細胞より腫瘍細胞において優先的に発現される酵素の少なくとも一部をコードする。用語「発現する」は、本明細書において使用される場合、タンパク質またはペプチド配列がそのコードＤＮＡまたはＲＮＡ配列から産生されるプロセスを意味する。ある特定の実施形態において、酵素は、キナーゼである。
【００５４】
ある特定の実施形態において、ＯＲＦにおける欠失は、ＯＲＦの全長の１００％、９９％超、９８％超、９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％超、５０％超、４５％超、４０％超、３５％超、３０％超、２５％超、２０％超、１５％超、または１０％超を構成する。ある特定の実施形態において、ＯＲＦにおける欠失は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、５００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、２０００、２２００、２４００、２５００、またはそれ以上のヌクレオチド（場合により、連続するヌクレオチド）を構成する。
【００５５】
ある特定の実施形態において、チミジンキナーゼ（ＴＫ）のＯＲＦは、欠失させられるまたは破壊される。ＴＫは、デオキシリボヌクレオチドの合成に関与する。正常細胞は一般的に低い濃度のヌクレオチドを有するため、ＴＫはこれらの正常細胞でのウイルス複製において必要であるが、その一方で高いヌクレオチド濃度を含む腫瘍細胞において、ＴＫは必ずしも必要でない。ポックスウイルスでは、チミジンキナーゼコード遺伝子は、遺伝子座Ｊ２Ｒに位置する。ある特定の実施形態において、ＴＫは、完全に欠失させられる。
【００５６】
ある特定の実施形態において、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）のＯＲＦは、欠失させられるまたは破壊される。ＲＲは、ＤＮＡ生合成における重要なステップであるリボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒する。ウイルス酵素は、Ｒ１およびＲ２と命名された、２つの異種サブユニットで構成され、それぞれ、Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子座によってコードされる。Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子に対する配列および様々なポックスウイルスのゲノムにおけるそれらの位置は、公開データベースにおいて、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋの受託番号ＤＱ４３７５９４、ＤＱ４３７５９３、ＤＱ３７７８０４、ＡＨ０１５６３５、ＡＹ３１３８４７、ＡＹ３１３８４８、ＮＣ＿００３３９１、ＮＣ＿００３３８９、ＮＣ＿００３３１０、Ｍ−３５０２７、ＡＹ２４３３１２、ＤＱ０１１１５７、ＤＱ０１１１５６、ＤＱ０１１１５５、ＤＱ０１１１５４、ＤＱ０１１１５３、Ｙ１６７８０、Ｘ７１９８２、ＡＦ４３８１６５、Ｕ６０３１５、ＡＦ４１０１５３、ＡＦ３８０１３８、Ｕ８６９１６、Ｌ２２５７９、ＮＣ＿００６９９８、ＤＱ１２１３９４、およびＮＣ＿００８２９１によって、入手可能である。本発明との関連において、Ｉ４Ｌ遺伝子（Ｒ１大サブユニットをコードする）またはＦ４Ｌ遺伝子（Ｒ２小サブユニットをコードする）のいずれかまたは両方が、欠失させられ得るまたは破壊され得る。
【００５７】
ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスのウイルスゲノムはさらに、ウイルスの腫瘍特異性をさらに増加させる追加の欠失または破壊を含む。ある特定の実施形態において、追加の欠失または破壊は、腫瘍細胞において優先的または特異的に発現される腫瘍特異的タンパク質の少なくとも一部をコードするＯＲＦにある。腫瘍特異的タンパク質の代表例は、ＶＧＦである。ＶＧＦは、ウイルスによる細胞感染後の早期に発現される分泌タンパク質であり、その機能は、正常細胞でのウイルス拡散にとって重要であると考えられる。別の例は、ヘマグルチニンをコードするＡ５６Ｒ遺伝子である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：  １００３８−４６）。さらなる一例は、ＤＮＡ複製の正確さを維持すること、およびチミジル酸シンターゼによるＴＭＰの産生のための前駆体を提供することの両方に関与するウイルスｄＵＴＰａｓｅをコードするＦ２Ｌ遺伝子である（Ｂｒｏｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｖｉｒｏｌ．  １９５：  ８６３−５）。ワクシニアウイルスＦ２Ｌ遺伝子の配列は、受託番号Ｍ２５３９２によりＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。
【００５８】
免疫チェックポイント阻害因子
本明細書において提供される改変された腫瘍溶解性ウイルスは、免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドを有するウイルスゲノムを含む。
【００５９】
用語「異種」は、本明細書において使用される場合、配列が野生型ウイルスに対して内因性でないことを意味する。
【００６０】
用語「コードする」または「コードすること」は、本明細書において使用される場合、ｍＲＮＡへ転写されることができることおよび／またはペプチドもしくはタンパク質に翻訳されることができることを意味する。
【００６１】
用語「免疫チェックポイントタンパク質」は、本明細書において使用される場合、非制御の免疫反応を防ぐために、したがって、自己免疫寛容および／または組織保護の維持のために重要な免疫学的経路に、直接的または間接的に関与するタンパク質を意味する。本明細書において使用される１つまたは複数の免疫チェックポイントモジュレーターは、抗原特異的細胞のクローン選択、Ｔ細胞活性化、増殖、抗原および炎症の部位への輸送、直接的なエフェクター機能の実行、ならびにサイトカインおよび膜リガンドによるシグナル伝達を含む、Ｔ細胞媒介免疫の任意のステップにおいて、独立して機能し得る。
【００６２】
用語「免疫チェックポイント阻害因子」は、本明細書において使用される場合、免疫チェックポイントタンパク質の機能をネガティブな方向に調節することができる分子を意味する。免疫チェックポイント阻害因子は、これらに限定されるわけではないが、アプタマー、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ペプチド、抗体、球状核酸、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む、当技術分野において既知の分子モダリティのいずれかであり得る。
【００６３】
ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害因子は、阻害性免疫チェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ−４のリガンド（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２）、ＴＩＭ３のリガンド（例えば、ガレクチン−９）、Ａ２ａ受容体のリガンド（例えば、アデノシン、レガデノソン）、ＬＡＧ３のリガンド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）、ＢＴＬＡのリガンド（例えば、ＨＶＥＭ、Ｂ７−Ｈ４）、ＫＩＲのリガンド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子）、ＰＤ−１のリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）、ＩＤＯのリガンド（例えば、ＮＫＴＲ−２１８、インドキシモド、ＮＬＧ９１９）などの、天然のまたは遺伝子操作されたアンタゴニストである。
【００６４】
ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害因子は、抗ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ、ピディリズマブ、ペンブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ−９３６５５８、アテゾリズマブ、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＴＳＲ−０４２、またはＡＮＢ０１１）、抗ＰＤ−Ｌ１（例えば、ＫＹ−１００３、ＭＣＬＡ−１４５、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＳＴＩ−Ａ１０１０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ダピロリズマブ〔Dapirolizumab〕ＣＤＰ−７６５７、ＭＥＤＩ−４９２０、またはＰＣＴ／ＵＳ２００１／０２０９６４において引用されるもの）、抗ＰＤ−Ｌ２、抗（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方）（例えば、ＡＵＲ−０１２、およびＡＭＰ−２２４）、抗ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、またはＫＡＨＲ−１０２）、抗ＩＤＯ（例えば、Ｄ−ｌ−メチル−トリプトファン（Ｌｕｎａｔｅ）、抗ＫＩＲ（例えば、リリルマブ〔Lirilumab〕、ＩＰＨ２１０１、またはＩＰＨ４１０２）、抗ＬＡＧ３（例えば、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ３２１、またはＣ９Ｂ７Ｗ）、抗ＴＩＭ３（例えば、Ｆ３８−２Ｅ２またはＥＮＵＭ００５）、抗ＶＩＳＴＡ（例えば、ＶＡ．Ｆ６）、抗ＢＴＬＡ（例えば、ＡＦ３３５４）、抗ＣＤ７３（例えば、ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２またはＭＥＤＩ−９４４７）、抗Ｂ７−Ｈ３（例えば、ＭＧＡ２７１、ＤＳ−５５７３ａ、または８Ｈ９）、抗Ａ２ａＲ、抗Ｂ７−１、抗Ｂ７−Ｈ３（例えば、ＭＧＡ２７１）、抗Ｂ７−Ｈ４、抗（Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４の両方）、抗ＣＤ５２（例えば、アレムツズマブ）、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−３５、抗ＭＩＣＡ（例えば、ＩＰＨ４３）、および抗ＣＤ３９からなる群から選択される抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）である。
【００６５】
ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害因子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１／２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３／４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ１６０からなる群から選択される、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合性断片である。ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害因子は、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−Ｌ２抗体、あるいはＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の阻害因子である。ある特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害因子は、抗Ｂ７−Ｈ３または抗Ｂ７−Ｈ４抗体、あるいはＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４の両方の阻害因子である。
【００６６】
ＰＤ−１阻害因子
ある特定の実施形態において、本開示の第一異種ポリヌクレオチドは、ＰＤ−１阻害因子をコードする。
【００６７】
用語「ＰＤ−１」は、本明細書において使用される場合、プログラム細胞死タンパク質を意味し、それは、免疫グロブリンのスーパーファミリーに属し、免疫系をネガティブに調整する共阻害性受容体として機能する。ＰＤ−１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーであり、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を含む２つの既知のリガンドを有する。ヒトＰＤ−１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号：ＮＰ＿００５００９．２において開示されており、ヒトＰＤ−１をコードする代表的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号：ＮＭ＿００５０１８．２において示される。
【００６８】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化をネガティブに調節し、この阻害機能は、その細胞質ドメインの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に関係している（Ｐａｒｒｙ  ｅｔ．  ａｌ，  ２００５，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５：９５４３−５３）。ＰＤ−１のこの阻害機能の妨害は、自己免疫につながり得る。ＰＤ−１による持続的ネガティブシグナルは、多くの病的状態、例えば、腫瘍免疫回避および慢性ウイルス感染などにおけるＴ細胞機能不全に関与していた。
【００６９】
ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１の活性を阻害する任意の薬剤、例えば、ＰＤ−１の活性を少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上に低下させるものなどであり得る。
【００７０】
活性（例えば、ＰＤ−１の）は、例えば、機能性タンパク質とそのリガンドとの間の結合（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の結合）の阻害、その生物活性化の阻害（例えば、ＰＤ−１の活性化）、および／またはレベル（例えば、ＰＤ−１のレベル）の低下などの結果として、低下され得る。
【００７１】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１に特異的に結合することができる抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）である。
【００７２】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、２つの分子の間、例えば、抗体と抗原との間などにおける非ランダム結合反応を意味する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体または抗原結合性断片は、≦１０−６Ｍ（例えば、≦５×１０−７Ｍ、≦２×１０−７Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦５×１０−８Ｍ、≦２×１０−８Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦５×１０−９Ｍ、≦２×１０−９Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）でもって、ヒトおよび／またはサルＰＤ−１に特異的に結合する。ＫＤは、本明細書において使用される場合、会合速度に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を意味し、それは、例えば、ビアコアなどの機器を使用した表面プラズモン共鳴法を使用して特定され得る。
【００７３】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１に対する完全長モノクローナル抗体である。
【００７４】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、配列番号１に特異的に結合する。
【００７５】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−１抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２、３、および４を含む第一重鎖を含む。
【００７６】
用語「同一性」は、アミノ酸配列（または核酸配列）に関して本明細書において使用される場合、最大数を達成するために、配列を位置合わせし、必要であれば同一のアミノ酸（または核酸）のギャップを導入した後での、参照配列におけるアミノ酸（または核酸）残基と同一の、候補の配列におけるアミノ酸（または核酸）残基の百分率を意味する。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と見なされない。アミノ酸（または核酸）配列の同一性のパーセントを特定する目的のための位置合わせは、例えば、公的に入手可能なツール、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにおいて入手可能であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）；  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７）も参照されたい。）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトにおいて入手可能であり、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２６６：３８３−４０２  （１９９６）；  Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  （Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ），  ２３（２１）：  ２９４７−８  （２００７）も参照されたい。）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトのパラメーターを使用してもよく、または、例えば好適なアルゴリズムを選択することによってアラインメントに対して適切にパラメーターをカスタマイズしてもよい。
【００７７】
ある特定の実施形態において、重鎖は、配列番号５または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は、配列番号６のアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００７８】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態において、ＰＤ−１抗体またはその抗原結合性断片はさらに、配列番号９、１０、および１１を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態において、軽鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、軽鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、配列番号１４の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、配列番号１５の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００８１】
イムノアクティベーター
本明細書において提供される改変された腫瘍溶解性ウイルスは、イムノアクティベーターをコードする第二異種ポリヌクレオチドを有するウイルスゲノムを含む。
【００８２】
用語「イムノアクティベーター」は、本明細書において使用される場合、免疫系を増強することができる任意の薬剤を意味する。
【００８３】
用語「免疫系を増強する」は、本明細書において使用される場合、Ｔ細胞活性、Ｂ細胞活性、マクロファージ活性、および／またはＮＫ細胞活性の発生を刺激する、薬剤の能力を意味する。
【００８４】
ある特定の実施形態において、イムノアクティベーターは、共刺激アクティベーター、ＮＫアクティベーター、またはマクロファージアクティベーターである。
【００８５】
共刺激分子アクティベーター
ある特定の実施形態において、イムノアクティベーターは、共刺激分子アクティベーターである。
【００８６】
用語「共刺激分子」は、本明細書において使用される場合、抗原への結合の際のＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要な第二シグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子を意味する。そのような共刺激分子の例としては、ＣＤ１３７（すなわち、４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＴＮＦＲＳ２５、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、ニュートロフィリン、およびＩＣＯＳ（すなわち、ＣＤ２７８）が挙げられる。
【００８７】
ある特定の実施形態において、共刺激アクティベーターは、細胞免疫系を増強することができるペプチド、ポリペプチド（例えば、抗体）であり得る。ある特定の実施形態において、共刺激アクティベーターは、共刺激分子に結合し、それによって共刺激分子の活性を刺激する抗体、またはそのような抗体の抗原結合性断片、例えば、ＣＤ１３７抗体（例えば、ＢＭＳ−６６３５１３またはＰＦ−０５０８２５６６）、ＣＤ２８抗体（例えば、ＴＧＮ−１４１２）、ＣＤ４０抗体（例えば、ＣＰ−８７０，８９３、ＣＤＸ１１４０、ＢＩ−６５５０６４、ＢＭＳ−９８６０９０、ＡＰＸ００５、またはＡＰＸ００５Ｍ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）抗体（例えば、ＭＥＤＩ６３８３、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、または米国特許第７，９５９，９２５号に記載されるもの）、抗ＧＩＴＲ（例えば、ＴＲＸ−５１８、ＩＮＢＲＸ−１１０、またはＮＯＶ−１２０３０１）、ＣＤ７０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ１２２抗体、ＴＮＦＲＳ２５抗体、ニュートロフィリン抗体、およびＣＤ２７抗体（例えば、ＣＤＸ−１１２７、ＢＩＯＮ−１４０２、またはｈＣＤ２７．１５）などである。
【００８８】
ＣＤ１３７アクティベーター
ある特定の実施形態において、本開示の第二異種ポリヌクレオチドは、ＣＤ１３７アクティベーターをコードする。
【００８９】
４−１ＢＢとも呼ばれるＣＤ１３７は、細胞増殖、分化、およびプログラム細胞死の調整に関与するタンパク質を含む腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）遺伝子ファミリーのメンバーである（Ａ．  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２：  ４２０−４３０，  （２００２））。ＣＤ１３７は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞を含む、活性化されたＴ細胞において支配的に発現される（Ｂ．  Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １０：  １１９−１２６，  （２０００）；  Ｊ．  Ｈｕｒｔａｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：  ３３６０−３３６５，  （１９９５）；およびＬ．  Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９０：  １６７−１７２，  （１９９８）を参照されたい）。
【００９０】
ＣＤ１３７アクティベーターは、ＰＤ−１の活性を増強する任意の薬剤、例えば、ＣＤ１３７の活性を少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上に増強するものなどであり得る。
【００９１】
ある特定の実施形態において、ＣＤ１３７アクティベーターは、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体である。ある特定の実施形態において、ＣＤ１３７アクティベーターは、完全長抗体である。
【００９２】
ある特定の実施形態において、ＣＤ１３７アクティベーターまたはその抗原結合性断片は、配列番号１６に特異的に結合する。
【００９３】
ある特定の実施形態において、ＣＤ１３７アクティベーターまたはその抗原結合性断片は、配列番号１７、１８、および１９を含む重鎖を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態において、重鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、重鎖は、配列番号２１のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００９５】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２２の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２３の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００９６】
ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片はさらに、配列番号２４、２５、および２６を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態において、軽鎖は、配列番号２７のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を有する可変領域を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらに、配列番号２８の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００９７】
ある特定の実施形態において、軽鎖は、配列番号２９のアミノ酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、配列番号３０の核酸配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するその相同配列を含む。
【００９９】
ＮＫアクティベーター
ある特定の実施形態において、イムノアクティベーターは、ＮＫ細胞活性を刺激するＮＫアクティベーターである。ある特定の実施形態において、ＮＫアクティベーターは、ＮＫ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である。
【０１００】
ある特定の実施形態において、ＮＫアクティベーターは、Ｓｉｇｌｅｃ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＫＩＲｓ抗体、およびＮＫＧ２Ａ／Ｄ抗体（例えば、モナリズマブ〔monalizumab〕からなる群から選択される。
【０１０１】
マクロファージアクティベーター
ある特定の実施形態において、イムノアクティベーターは、マクロファージ細胞活性を刺激するマクロファージアクティベーターである。ある特定の実施形態において、マクロファージアクティベーターは、マクロファージ分子に結合する第二抗体またはその抗原結合性断片である。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、マクロファージアクティベーターは、ＣＳＦ１Ｒ抗体（例えば、ＦＰＡ００８）、ＣＳＦ１キナーゼ抗体、ＰＳ抗体、およびＣＤ４７抗体（例えば、ＣＣ−９０００２、ＴＴＩ−６２１、またはＶＬＳＴ−００７）からなる群から選択される。
【０１０３】
抗体
用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、または二重特異性（二価）抗体を包含する。天然のインタクトな抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域と、第一、第二、および第三定常領域とからなるが、その一方で、各軽鎖は、可変領域と定常領域とからなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、哺乳動物の軽鎖は、λまたはκとして分類される。抗体は、「Ｙ」形状を有し、Ｙの幹は、ジスルフィド結合によって一緒に結合された２つの重鎖の第二および第三定常領域からなる。Ｙの各腕部は、単一の軽鎖の可変領域および定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域および第一定常領域を含み、その場合、重鎖の第一定常領域は、ヒンジ領域を介して第二定常領域に連結されている。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合特異性を担っている。両方の鎖の可変領域は、概して、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変なループを含む（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ）。本明細書において開示される抗体および抗原結合性断片に対するＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義または特定され得る（詳細については、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，  Ｂ．，  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２７３（４），  ９２７  （１９９７）；  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｄｅｃ  ５；１８６（３）：６５１−６３  （１９８５）；  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６，９０１  （１９８７）；  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  Ｄｅｃ  ２１−２８；  ３４２（６２５２）：８７７−８３  （１９８９）；  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）を参照されたい）。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接する伸縮部の間に介在し、フレームワーク領域は、ＣＤＲより高度に保存され、可変領域の構造を支えるための足場を形成する。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合特異性には無関係だが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいたクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それらは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμ重鎖の存在によって特徴付けられる。主要な抗体クラスのいくつかは、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）などに分割される。
【０１０４】
用語「抗原結合性断片」は、本明細書において使用される場合、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成された抗体断片を意味するが、インタクトな抗体構造は含まない。抗原結合性断片の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体、ラクダ化単一ドメイン抗体、およびナノボディが挙げられる。抗原結合性断片は、親抗体が結合する同じ抗原に結合することができる。
【０１０５】
用語「Ｆａｂ」は、本明細書において使用される場合、ジスルフィド結合によって単一の重鎖の可変領域および第一定常領域に結合した単一の軽鎖（可変領域および定常領域の両方）からなる抗体の一部を意味する。
【０１０６】
用語「Ｆａｂ’」は、本明細書において使用される場合、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を意味する。
【０１０７】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、本明細書において使用される場合、Ｆａｂ’の二量体を意味する。
【０１０８】
用語「Ｆｖ」は、本明細書において使用される場合、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域とからなるＦｖ断片を意味する。
【０１０９】
用語「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、本明細書において使用される場合、直接的にまたはペプチドリンカー配列を介してお互いに結合した軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる、遺伝子操作された抗体を意味する（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８５：５８７９（１９８８）を参照されたい）。
【０１１０】
用語「ｓｃＦｖ二量体」は、本明細書において使用される場合、２つのｓｃＦｖによって形成された重合体を意味する。
【０１１１】
用語「ラクダ化単一ドメイン抗体」は、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」（重鎖のみ抗体〔heavy-chain-only antibody〕）としても知られ、２つの重鎖可変領域を含むが軽鎖は含まない抗体を意味する（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｄｅｃ  １０；  ２３１（１−２）：２５−３８  （１９９９）；  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊｕｎ；  ７４（４）：２７７−３０２  （２００１）；  ＷＯ９４／０４６７８；  ＷＯ９４／２５５９１；および米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい）。重鎖抗体は、元々は、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ）から誘導された。ラクダ化抗体は、軽鎖を欠くが、正統な抗原結合性レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３６３（６４２８）：４４６−８  （１９９３）；  Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｍｅｌｉｄａｅ；  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，”  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ５４（１）：３９−４７  （２００２）；およびＮｇｕｙｅｎ  ＶＫ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  １０９（１）：９３−１０１  （２００３）を参照されたく、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１１２】
用語「ナノボディ」は、本明細書において使用される場合、重鎖抗体由来の重鎖可変領域と２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３とからなる抗体を意味する。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、またはウサギ抗体である。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体である。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体はさらに、標識されてもよい。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合性断片は、完全ヒト抗体であり、それは、場合により、トランスジェニックラット、例えば内因性ラット免疫グロビン遺伝子の発現が不活性化されたトランスジェニックラットによって産生され、かつＪ遺伝子座欠失およびＣ−κ変異を有する組換えヒト免疫グロビン遺伝子座を有し、遺伝子操作された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）によっても発現され得る。
【０１１４】
用語「完全ヒト」は、抗体または抗原結合性断片に関して本明細書において使用される場合、抗体または抗原結合性断片のアミノ酸配列が、ヒトまたはヒト免疫細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するか、非ヒト源、例えばヒト抗体レパートリーを利用するトランスジェニック非ヒト動物などに由来するか、他のヒト抗体コード配列であることを意味する。
【０１１５】
用語「ヒト化」は、抗体または抗原結合性断片に関して本明細書において使用される場合、非ヒト動物に由来するＣＤＲと、ヒトに由来するＦＲ領域と、適切であればヒトに由来する定常領域とを含む抗体または抗原結合性断片を意味する。ヒト化抗体または抗原結合性断片は、免疫原性が減少しているため、ある特定の実施形態において人の治療法として有用である。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターなどである。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体または抗原結合性断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的に全てヒト配列で構成される。
【０１１６】
用語「キメラ」は、抗体または抗原結合性断片に関して本明細書において使用される場合、ある種に由来する重鎖および／または軽鎖の一部と、異なる種に由来する重鎖および／または軽鎖の残りの部分とを有する抗体または抗原結合性断片を意味する。ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域と、非ヒト種、例えばマウスまたはラビットなどに由来する可変領域とを含み得る。
【０１１７】
用語「保存的置換」は、アミノ酸配列に関して本明細書において使用される場合、アミノ酸残基を、同様の生理化学的性質の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換することを意味する。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）の間において、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間において、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間において、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）の間において、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）の間において、行うことができる。当技術分野において既知のように、保存的置換は、通常、タンパク質の立体配座構造において著しい変化を引き起こさず、したがって、タンパク質の生物活性を維持することができる。
【０１１８】
ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態において、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスは、ＰＤ−１に特異的に結合する阻害抗体またはその抗原結合性断片をコードする第一異種ポリヌクレオチドと、ＣＤ１３７に特異的に結合する活性化抗体またはその抗原結合性断片をコードする第二異種ポリヌクレオチドとを含む。
【０１１９】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において使用される場合、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または混合リボ核酸−デオキシリボ核酸、例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを意味する。ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、直鎖状または環状であり得る。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、ウイルスがＤＮＡウイルスの場合には両方ともＤＮＡであり、あるいは第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、両方ともＲＮＡである。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、両方とも二本鎖ＤＮＡである。
【０１２０】
第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の従来的方法の使用、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成および互換性制御末端を有するウイルスゲノムとのライゲーションなどによって、改変された腫瘍溶解性ウイルスに導入され得る。詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９））を参照されたく、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、ＯＲＦにおける欠失の位置に導入される。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドは、第二異種ポリヌクレオチドのすぐ上流またはすぐ下流にある。用語「すぐ上流またはすぐ下流」は、本明細書において使用される場合、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドが、それらが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下のヌクレオチドによってお互いに離間されて、ウイルスゲノム上において非常に接近して位置されていることを意味する。例えば、上流のポリヌクレオチドの３’末端が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下のヌクレオチドによって下流のポリヌクレオチドの５’末端から離間されている場合、上流のポリヌクレオチドの３’末端は、下流のポリヌクレオチドの５’末端にすぐ隣接している。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドと第二異種ポリヌクレオチドとの間にＯＲＦは存在しない。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドと第二異種ポリヌクレオチドとの間に制限部位が存在する。
【０１２２】
ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドは、第一抗体の第一重鎖および第一軽鎖をコードする。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドはさらに、第一重鎖の発現を駆動することができる第一プロモーターと、第一軽鎖の発現を駆動することができる第二プロモーターとを含み、第一プロモーターおよび第二プロモーターは、ヘッドトゥヘッド配向にある。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドは、第一抗体の第一重鎖の可変領域、リンカー、および第一抗体の第一軽鎖の可変領域をコードする。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドは、第一抗体の第一重鎖をコードするが、第一抗体の第一軽鎖はコードしない。
【０１２４】
用語「ヘッドトゥヘッド配向」は、本明細書において使用される場合、２つのプロモーターがウイルスゲノム上においてお互いにすぐ近くに隣接しており、それらは反対の方向にタンパク質発現を駆動することを意味する。具体例を図２に示す。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、第二異種ポリヌクレオチドは、第二抗体の第二重鎖および第二軽鎖をコードする。ある特定の実施形態において、第二異種ポリヌクレオチドはさらに、第二重鎖の発現を駆動することができる第三プロモーターと、第二軽鎖の発現を駆動することができる第四プロモーターとを含み、第三プロモーターおよび第四プロモーターは、ヘッドトゥヘッド配向にある。
【０１２６】
用語「プロモーター」は、本明細書において使用される場合、コード配列の転写を制御することができるポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合、転写開始に対して十分である特定の配列を含む。さらに、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合、および転写開始の活性を調節する配列を含み得る。プロモーターは、自身と同じ核酸分子上に位置する遺伝子または自身とは異なる核酸分子上に位置する遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。プロモーター配列の機能は、調整の性質に応じて、恒常的である、または刺激により誘発的であり得る。「恒常的」なプロモーターは、本明細書において使用される場合、宿主細胞における遺伝子発現を連続的に活性化するように機能するプロモーターを意味する。「誘発的」プロモーターは、本明細書において使用される場合、ある特定の刺激の存在下において宿主細胞における遺伝子発現を活性化するプロモーターを意味する。
【０１２７】
ある特定の実施形態において、本開示のプロモーターは、真核細胞プロモーター、例えば、ＣＭＶ由来のプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター））、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト遺伝子由来のプロモーター、例えば、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、ヒト筋クレアチンプロモーター、ヒトメタロチオネインβ−アクチンプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ヒトチミジンキナーゼプロモーター（ＴＫ）、ヒト延長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１Ａ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅ２Ｆ−１プロモーター（Ｅ２Ｆ１転写因子１のプロモーター）、α−フェトタンパクのプロモーター、コレシストキニンのプロモーター、癌胎児抗原のプロモーター、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ腫瘍原のプロモーター、シクロオキシゲナーゼのプロモーター、ＣＸＣ−ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のプロモーター、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）のプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ型のプロモーター、Ｌ−プラスチンのプロモーター、ムチン様糖タンパク質（ＭＵＣ１）のプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のプロモーター、サバイビンのプロモーター、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ１）のプロモーター、およびチロシナーゼのプロモーターなど、である。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、本開示のプロモーターは、腫瘍特異的プロモーターであり得る。用語「腫瘍特異的プロモーター」は、本明細書において使用される場合、腫瘍細胞において優先的にまたは排他的に遺伝子発現を活性化するように機能し、非腫瘍細胞または非腫瘍細胞において活性を有さない、または活性が低下する、プロモーターを意味する。腫瘍特異的プロモーターの具体例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、α−フェトタンパクのプロモーター、コレシストキニンのプロモーター、癌胎児抗原のプロモーター、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ腫瘍原のプロモーター、シクロオキシゲナーゼのプロモーター、ＣＸＣＲ４のプロモーター、ＨＥ４のプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ型のプロモーター、Ｌ−プラスチンのプロモーター、ＭＵＣ１のプロモーター、ＰＳＡのプロモーター、サバイビンのプロモーター、ＴＲＰ１のプロモーター、およびチロシナーゼのプロモーターが挙げられる。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドは、それらが改変された腫瘍溶解性ウイルスの複製サイクルにおける同じ段階または異なる段階で発現されるように構成される。例えば、２つのポリヌクレオチドは、ウイルス複製の初期段階において誘導された初期プロモーターによって両方とも駆動され得る、あるいは、ウイルス複製の後期段階において誘導された後期プロモーターによって両方とも駆動され得る、あるいは、一方は初期プロモーターによって駆動され、他方は後期プロモーターによって駆動される。
【０１３０】
ある特定の実施形態において、第一プロモーターおよび第二プロモーターは、同じである、または異なる。ある特定の実施形態において、第一プロモーターおよび第二プロモーターは、両方とも後期プロモーターである。ある特定の実施形態において、後期プロモーターは、ｐＳＬである。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、第三プロモーターおよび第四プロモーターは、同じである、または異なる。ある特定の実施形態において、第三および第四は、両方とも初期および後期プロモーターである。ある特定の実施形態において、初期および後期プロモーターは、ｐＳＥ／Ｌである。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、センス鎖の５’から３’の方向において、インフレームで以下の要素：ＣＤ１３７に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  第一初期および後期プロモーター  ―  第二初期および後期プロモーター  ―  ＣＤ１３７に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド  ―  第一後期プロモーター  ―  第二後期プロモーター  ―  ＰＤ−１に結合する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、を含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドから発現される免疫チェックポイント阻害因子および第二異種ポリヌクレオチドから発現されるイムノアクティベーターは、別々のタンパク質として発現される。換言すると、それらは、融合タンパク質としては発現されず、お互いには接続されていない（共有結合的にも、リンカーによっても）。ある特定の実施形態において、第一異種ポリヌクレオチドから発現される免疫チェックポイント阻害因子は、いかなる他のタンパク質とも融合されず、ならびに第二異種ポリヌクレオチドから発現されるイムノアクティベーターは、いかなる他のタンパク質とも融合されない。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドを除いて、免疫チェックポイント阻害因子またはイムノアクティベーターをコードするいかなる他の異種ポリヌクレオチドをも含まない。ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスは、第一異種ポリヌクレオチドおよび第二異種ポリヌクレオチドを除いて、異種ポリヌクレオチドをコードするいかなる他のタンパク質をも含まない。
【０１３５】
医薬組成物
別の態様において、本開示は、本開示において説明される改変された腫瘍溶解性ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１３６】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書において使用される場合、十分に医学的な判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは併発症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に対して好適である、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を意味する。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される化合物、材料、組成物、および／または投薬形態は、規制機関（例えば、米食品医薬品局、中国食品医薬品局、または欧州医薬品庁など）によって承認されているもの、または動物、より詳細にはヒト、における使用に対して、一般的に認定されている薬局方（例えば、米国薬局方、中国薬局方、または欧州薬局方など）にリストされているものを意味する。
【０１３７】
本発明の医薬組成物における使用のための薬学的に許容される担体は、これらに限定されるわけではないが、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、水性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、等張ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、またはグルコースおよび乳酸塩によるリンガー液など）、非水性ビヒクル（例えば、野菜起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、胡麻油、または落花生油など）、抗微生物剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖など）、緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液など）、酸化防止剤（例えば、重硫酸ナトリウムなど）、麻酔薬（例えば、塩酸プロカインなど）、懸濁化剤／分配剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなど）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）など）、乳化剤（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）など）、希釈剤、助剤、賦形剤、または非毒性補助剤、当技術分野において既知の他の成分、またはそれらの様々な組み合わせを含み得る。好適な成分は、例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、防腐剤、潤滑剤、風味剤、増粘剤、着色剤、または乳化剤を含み得る。
【０１３８】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、経口製剤である。経口製剤としては、これらに限定されるわけではないが、カプセル剤、カシェ剤、丸薬、錠剤、トローチ剤（味覚基剤としては、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガント）、粉末剤、粒剤、または水性もしくは非水性の溶液剤もしくは懸濁剤、または油中水エマルションもしくは水中油エマルション、またはエリキシル剤またはシロップ剤、または菓子錠剤（不活性基剤としては、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、あるいはショ糖またはアカシアなど）、および／またはうがい薬およびその類似物が挙げられる。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、無菌の水溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液などが挙げられる、注射製剤であり得る。全ての場合において、注射製剤は、無菌でなければならず、かつ注射を容易にするために液体でなければならない。製造および貯蔵の条件下において安定でなければならず、かつ微生物（例えば、細菌および菌類など）の感染に対して抵抗性でなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物および／または植物油などを含む、溶媒または分散媒であり得る。注射製剤は、適切な流動性を維持しなければならず、それは、様々な方法、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、界面活性剤の使用など、において維持され得る。抗微生物汚染は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）の添加によって達成することができる。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、単位用量の非経口製剤は、アンプル、バイアル瓶、または針を伴った注射器にパッケージされる。当技術分野において既知であり実施されているように、非経口投与のための全ての調製物は、無菌でなければならず、発熱性であってはならない。
【０１４１】
処置方法
別の態様において、本開示は、有効量の本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、腫瘍を処置する方法を提供する。
【０１４２】
用語「対象」は、本明細書において使用される場合、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。「対象」は、家畜動物（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、またはウマ）、または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）、または霊長類（例えば、ゴリラまたはサル）、または飼育動物（例えば、イヌまたはネコ）でもあり得る。「対象」は、雄または雌であり得、さらに異なる年齢でもあり得る。ある特定の実施形態において、対象は、ヒトである。ヒト「対象」は、コーカサス人、アフリカ人、アジア人、シュメール人、または他の人種、あるいは異なる人種のハイブリッドであり得る。ヒト「対象」は、年配者、成人、ティーンエイジャー、小児、または幼児であり得る。
【０１４３】
用語「腫瘍」は、本明細書において使用される場合、腫瘍性または悪性の細胞成長、増殖、または転移によって媒介される任意の医学的状態を意味し、ならびに、固形腫瘍および非固形腫瘍、例えば、白血病など、の両方を包含する。本開示において、「腫瘍」は、用語「癌」、「悪性腫瘍」、「過増殖」、および「新生物」と相互互換的に使用される。用語「腫瘍細胞」は、明記されない限り、用語「癌細胞」、「悪性細胞」、「過増殖細胞」、および「新生細胞」と相互互換可能である。ある特定の実施形態において、腫瘍は、頭頚部腫瘍、乳房腫瘍、直腸結腸腫瘍、肝臓腫瘍、膵臓腺癌、胆嚢および胆管腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、腎細胞癌種、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、骨腫瘍、中皮腫、脳腫瘍、軟部組織肉腫、子宮腫瘍、甲状腺腫瘍、上咽頭癌、および黒色腫からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。ある特定の実施形態において、腫瘍は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌種、ホジキンリンパ腫、頭頚部の扁平上皮癌、膀胱癌、結直腸癌、または肝細胞癌である。ある特定の実施形態において、腫瘍は、以前の治療（例えば、腫瘍溶解性ウイルス、免疫チェックポイント阻害因子、および／またはイムノアクティベーターの別々の投与）に対して難治性であった。
【０１４４】
状態を「処置すること」または状態の「処置」なる用語は、本明細書において使用される場合、状態を予防または軽減すること、状態の発症または進行速度を鈍化すること、状態が進行するリスクを減らすこと、状態に関連する症状の進行を予防することまたは遅延させること、状態に関連する症状を減じることまたは終わらせること、状態の完全なまたは部分的な改善を生じさせること、状態を治療すること、あるいはそれらのいくつかの組み合わせ、を包含する。腫瘍に関連する場合、「処置すること」または「処置」は、新生細胞または悪性細胞の成長、増殖、または転移を阻害することまたは鈍化させること、新生細胞または悪性細胞の成長、増殖、または転移の進行を予防することまたは遅延させること、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを意味し得る。腫瘍に関連する場合、「処置すること」または「処置」は、腫瘍の全てまたは一部を根絶させること、腫瘍の成長および転移を阻害することまたは鈍化させること、腫瘍の進行を予防することまたは遅延させること、あるいはそれらのいくつかの組み合わせを包含する。
【０１４５】
改変された腫瘍溶解性ウイルスおよび医薬組成物は、当技術分野において既知の任意の好適な経路、例えば、これらに限定されるわけではないが、非経口、経口、経腸、頬側、経鼻、局所、経直腸、経膣、経粘膜、上皮、経皮、真皮、点眼、経肺、および皮下投与経路を介して投与され得る。ある特定の実施形態において、投与の経路は、局所である。ある特定の実施形態において、投与の経路は、腫瘍内注入である。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスおよび医薬組成物は、治療有効投与量において投与される。用語「治療有効投与量」は、本明細書において使用される場合、対象の疾患または症状を改善または排除することができる薬物の量、または疾患または症状の発生を予防的に阻害または予防することができる薬物の量を意味する。治療有効量は、対象における１つまたは複数の疾患または症状をある特定の程度にまで改善する薬物の量；疾患または症状の原因に関連する１つまたは複数の生理学的または生化学的パラメーターを部分的にまたは完全に正常な状態に回復することができる薬物の量；および／または疾患または症状が生じる可能性を減じることができる薬物の量であり得る。
【０１４７】
改変された腫瘍溶解性ウイルスおよび医薬組成物の治療有効投与量は、当技術分野において既知の様々な要因、例えば、体重、年齢、既存の医療状態、現在受けている治療、対象の健康状態、ならびに薬物相互作用の強度、アレルギー性、高アレルギー性および副作用、ならびに投与の経路、ならびに疾患の進行の程度、などに依存する。当業者（例えば、医師または獣医）は、これらのおよび他の状態または要件に従って投与量を減少または増加させ得る。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスおよび医薬組成物は、約１０４ＰＦＵから約１０１４ＰＦＵ（例えば、約１０４ＰＦＵ、約２×１０４ＰＦＵ、約５×１０４ＰＦＵ、約１０５ＰＦＵ、約２×１０５ＰＦＵ、約５×１０５ＰＦＵ、約１０６ＰＦＵ、約２×１０６ＰＦＵ、約５×１０６ＰＦＵ、約１０７ＰＦＵ、約２×１０７ＰＦＵ、約５×１０７ＰＦＵ、約１０８ＰＦＵ、約２×１０８ＰＦＵ、約５×１０８ＰＦＵ、約１０９ＰＦＵ、約２×１０９ＰＦＵ、約５×１０９ＰＦＵ、約１０１０ＰＦＵ、約２×１０１０ＰＦＵ、約５×１０１０ＰＦＵ、約１０１１ＰＦＵ、約２×１０１１ＰＦＵ、約５×１０１１ＰＦＵ、約１０１２ＰＦＵ、約２×１０１２ＰＦＵ、約５×１０１２ＰＦＵ、約１０１３ＰＦＵ、約２×１０１３ＰＦＵ、約５×１０１３ＰＦＵ、または約１０１４ＰＦＵ）の治療有効投与量において投与され得る。ある特定のこれらの実施形態において、改変された腫瘍溶解性ウイルスおよび医薬組成物は、約１０１１ＰＦＵ以下の投与量において投与される。ある特定のこれらの実施形態において、投与量は、５×１０１０ＰＦＵ以下、２×１０１０ＰＦＵ以下、５×１０９ＰＦＵ以下、４×１０９ＰＦＵ以下、３×１０９ＰＦＵ以下、２×１０９ＰＦＵ以下、または１０９ＰＦＵ以下である。特定の投与量は分割することができ、ある間隔で分割された複数回、例えば、１日１回、１日２回以上、１か月に２回以上、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、または２か月以上に１回など、において投与することができる。ある特定の実施形態において、投与される投与量は、処置の過程において変わり得る。例えば、ある特定の実施形態において、最初に投与される投与量は、その後に投与される投与量よりも多くすることができる。ある特定の実施形態において、投与される投与量は、投与対象の反応に応じて、処置の過程において調節される。
【０１４９】
用語「ＰＦＵ」は、本明細書において使用される場合、プラーク形成単位を意味し、それは、プラークを形成することができる粒子の数の指標である。
【０１５０】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節してもよい。例えば、１回用量を投与してもよく、または複数に分割された用量を、時間経過において投与してもよい。
【０１５１】
組み合わせ
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、１種または複数種の他の薬物と組み合わせて使用してもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１種の他の薬物を含む。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、他の薬物は、抗腫瘍剤である。腫瘍に対して活性であることが知られている任意の薬剤は、抗腫瘍剤として使用してもよい。ある特定の実施形態において、抗腫瘍剤は、化学薬剤、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、抗腫瘍剤は、化学薬剤である。抗腫瘍化学薬剤の具体例としては、これらに限定されるわけではないが、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、タモキシフェン、パクリタキセル、ビンクリスチン、およびラパマイシンが挙げられる。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、抗腫瘍剤は、ポリヌクレオチドである。抗腫瘍ポリヌクレオチドの具体例としては、これらに限定されるわけではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド、クラステリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、ならびにＲＮＡ干渉ができるＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる）、例えば、抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡなど、抗ｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、ならびに抗クローディン−３  ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡが挙げられる。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、抗腫瘍剤は、ペプチドまたはタンパク質である。抗腫瘍ペプチドまたはタンパク質の具体例としては、これらに限定されるわけではないが、抗体、例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ダクリズマブ、ニモツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、およびエドレコロマブなど、タンパク質治療薬、例えば、エンドスタチン、アンギオスタチンＫ１−３、ロイプロリド、性ホルモン結合性グロブリン、およびビクニンなど、が挙げられる。
【０１５６】
医学的使用
別の態様において、本開示は、腫瘍を処置するための医薬の製造における、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは本開示の医薬組成物の使用を提供する。
【０１５７】
別の態様において、本開示は、腫瘍の処置における使用のための、本開示の改変された腫瘍溶解性ウイルスまたは本開示の医薬組成物を提供する。
【実施例】
【０１５８】
下記の実施例は、本開示の理解を支援するために詳細に説明され、いかなる点においても、その後に続く特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【０１５９】
［実施例１］ウイルス構築
出発材料のワクシニアウイルスのＷＲ株をＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ：  ＶＲ−１３５４）から得た。関与する同義遺伝子により、段階的な遺伝子組換え操作アプローチにおいてＷＲ−ＧＳ−６００を構築した。要するに、第一ステップでは、改変されたｐＳＥＭ−１ベクター（Ｒｉｎｔｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）によってＷＲ  ＤＮＡを組み換えることにより、ＴＫ遺伝子座にマーカー／選択遺伝子を挿入した。これは、さらなる遺伝子操作のために、野生型の親との容易な区別を可能にする。その後、ＴＫを完全に欠失させて抗体配列を挿入するために、Ｊ１ＲおよびＪ３Ｒの隣接した配列を有し、抗ヒトＰＤ−１（抗ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列および抗ヒトＰＤ−１をコードする核酸配列を、それぞれ、図１５および１６に示す）および抗ヒト４−１ＢＢ（抗ヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列および抗ヒト４−１ＢＢをコードする核酸配列を、それぞれ、図１７および１８に示す）をコードする組換えプラスミドを、ＷＲを感染させたＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。図１は、ＷＲ−ＧＳ−６００におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠失、抗ＰＤ−１抗体および抗４−１ＢＢ抗体挿入の構造を示しており、図３は、ＷＲ−ＧＳ−６００を生成する組換えステップの概略図を示している。
【０１６０】
組換え反応を、特徴付けられたマスターワーキングセルバンクからのＵ２ＯＳ細胞を使用して行った。Ｕ２ＯＳ細胞を使用して３ラウンドのプラーク精製を行い、ＨｅＬａ細胞を使用して１ラウンド行った。その後、選択された最終プラークがクローナルであることを確実にするために、０．６５μｍフィルターを使用した濾過ステップを組み入れた。詳細な情報を下記の表１に記載する。
【０１６１】
【表１】
2022502074.tif 000003
【０１６２】
さらなるプラーク精製の後、免疫蛍光およびフローサイトメトリーによって抗体発現をモニターした。Ｕ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞を、別々に、模擬感染させるか（すなわち、ウイルスを伴わないコントロール溶液によって感染させる）、抗体発現を有するコントロールウイルスに感染させるか、ＷＲ−ＧＳ−６００の精製クローンに感染させた。
【０１６３】
最後に、検証されたＤＮＡ配列と高レベルの抗体発現を有する唯一のクローンを、２つのローラーボトル（１７００ｃｍ２）において増殖させた。細胞をペレット化し、次いで、ｐＨ９．０において１ｍＭＴｒｉｓに再懸濁させた。１ラウンドの凍結融解（−８０／３７度）の後、混合物を再びペレット化した。上清を１２の極低温管に１ｍｌずつ分取した（プレＭａｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂａｎｋ）。ペレット化した細胞を、ｐＨ９．０において３ｍｌの１ｍＭＴｒｉｓに再懸濁させ、凍結／融解のさらなるラウンドを行った。ペレット化した後に上清を収集し、次いで、ベンゾナーゼ処理を終夜行い、スクロース精製を行った。プレＭＶＢおよび精製したベンゾナーゼの力価を、Ｕ２ＯＳ細胞を使用して特定した。力価は、合計５ｍＬのストックに対して１．０〜２．１×１０９ＰＦＵ／ｍＬの範囲であることが見いだされ、それは、親ＷＲウイルスと同様である。
【０１６４】
抗ヒトＰＤ−１をコードする遺伝子および抗ヒト４−１ＢＢをコードする遺伝子のどちらもＷＲ−ＧＳ−６００に挿入されていることを除いて、ＷＲ−ＧＳ−６００と同じプロトコルによって、ＷＲ−ＧＳ−６１０（抗ヒト４−１ＢＢをコードする遺伝子を挿入）およびＷＲ−ＧＳ−６２０（抗ヒトＰＤ−１をコードする遺伝子を挿入）を製造した。図２は、ＷＲ−ＧＳ−６２０におけるＴＫ欠失および抗−４−１ＢＢ抗体挿入の構造を示しており、図４は、ＷＲ−ＧＳ−６２０に対する組換えステップの概略図を示している。
【０１６５】
［実施例２］ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０のキャラクタリゼーション
これらの新規のウイルスの遺伝子操作のプロセスの際、それらのゲノムの完全性およびタンパク質発現を、詳細にモニターした。
【０１６６】
ＰＣＲ、配列決定、および制限消化
ウイルス調製物をベンゾナーゼエンドヌクレアーゼによって処理し、スクロースによってペレット化し、その後にプロテイナーゼＫおよび界面活性剤処理を行い、次いでＤＮＡを抽出し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出を使用して回収し、エタノール沈殿を行うことで、精製されたスクロースクッションからウイルスのゲノムＤＮＡを単離した。
【０１６７】
ウイルスゲノムが、設計された抗体配列を含む予想された配列を有することを確実なものとするために、組換え領域内のものおよび遺伝子操作セクションの外側のものを含む、一連のプライマーを設計した。ウイルス（ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０）の同一性を、ｑＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって確認した。ＰＣＲに使用したプライマーを表２に示す。ウイルスゲノムにおけるプライマーの位置を図５から７に示すが、ここで、ＰＣＲのバンドの予想されるサイズを図５から７に表す。ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を図１４に示す。
【０１６８】
ＴＫ欠失も、サンガー配列決定法によって検証した。図８、９、１０は、抗体コード遺伝子の挿入後における、ＷＲからの遺伝子変化を示している。ＷＲ−ＧＳ−６００において抗ｈｕ４−１ＢＢおよび抗ｈｕＰＤ−１を発現するために設計されたＤＮＡ配列に対する、ＷＲ−ＧＳ−６００ウイルスゲノムのサンガー配列決定のアラインメントを実施した。アラインメントは、ＷＲ−ＧＳ−６００のウイルスゲノムが設計されたＤＮＡ配列と同一であることを示した。
【０１６９】
【表２】
2022502074.tif 000004
【０１７０】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩは、ＷＲのＴＫ領域の周りを切断し、５００４ｂｐのバンドを生じさせた。ＴＫが欠失して、抗ｈｕＰＤ−１および／または抗ｈｕ４−１ＢＢ抗体がＷＲ−ＧＳ−６００に挿入される場合、２つの余分なＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が導入され、それらは、それぞれ１６３８ｂｐ、２５４８ｂｐ、および４６６６ｂｐに３つのバンドを生じる。ＷＲ−ＧＳ−６２０では、野生型ＷＲの５００４ｂｐのバンドは、１９２２ｂｐおよび４６６６ｂｐの２つのバンドに置き換えられた。制限酵素消化パターンにおけるこれらの違いは、これらのウイルスの迅速な同定のために用いることができる。結果を表３に示す。
【０１７１】
【表３（１）】
2022502074.tif 000005
【０１７２】
免疫蛍光
ヒト抗体のトランスジェニック発現を、ヒトＩｇＧに対する免疫蛍光によって検証した（図１１を参照されたい）。ウイルス感染Ｕ２ＯＳ細胞を染色するために、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，、Ｃａｔ  ＃６２−８４１１）を使用した。
【０１７３】
フローサイトメトリー分析
別々に、模擬感染させた、コントロールＷＲウイルス（ＷＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を感染させた、ＷＲ−ＧＳ−６００を感染させた、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させた、ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー分析を行うことにより、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させた場合におけるヒト抗体の特異的発現を確認した。ウエスタンブロットにおいて感染させた上清から検出されたヒトＩｇＧは、ヒト抗体の発現のさらなる証拠を提供した。
【０１７４】
ウエスタンブロット法
感染させた上清からヒトＩｇＧを検出するウエスタンブロットは、抗体発現のさらなる証拠を提供した。図１２および１３は、ウエスタンブロットを使用することにより、細胞溶解物および上清を使用した場合の組換えウイルス（ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０）による抗ＰＤ−１抗体および抗−４１−ＢＢ抗体の発現を示している。
【０１７５】
ＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡを使用する発現された抗ＰＤ−１抗体の機能的キャラクタリゼーション
組換えヒトＰＤ−１Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を、０．２ｍｇ／ｍｌまで、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）に再懸濁させ、０．０３μｇ／ｍｌの最終濃度までＤＰＢＳで希釈する。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートを、ウェルあたり０．１ｍＬにおいて組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままで、４℃で終夜インキュベートする。コーティング溶液を除去し、プレートを洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ中における０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、各回において１ウェルあたり２００μＬ）で洗浄する。ブロッキング緩衝液（５％の脱脂粉乳、ＤＰＢＳ中における０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、各回において１ウェルあたり２００μＬ）を全てのウェルに加え、混合しながら４℃で１時間インキュベートする。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。ＷＲ−ＧＳ−６２０上清およびＷＲ−ＧＳ−６００上清をＤＰＢＳで段階希釈し、希釈した上清（ウェルあたり１００μＬ）をプレートに加える。プレートを室温で１．５時間インキュベートする。抗体を含有する上清溶液を除去し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ＰＡ）を、ＤＰＢＳで希釈し、ウェルあたり１００μＬをプレートに加える。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄する。ウェルあたり１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ  ゲイザースバーグ、ＭＤ）を加え、室温で２０分間インキュベートする。同量の２ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベル、ＣＡ）において４５０ｎｍの吸光度を読み取る。
【０１７６】
分析のため、ＭＯＩ０．０５で４８時間感染させたＵ２ＯＳからの上清を使用し、その結果を図１９に示す。これらの結果は、ＧＳ−６２０において発現した抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ−１に特異的に結合することができ、その結合が濃度依存性であることを示唆している。
【０１７７】
４−１ＢＢ結合ＥＬＩＳＡを使用する発現された抗−４−１ＢＢ抗体の機能的キャラクタリゼーション
ヒト４−１ＢＢＩｇＧ１Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を、０．２ｍｇ／ｍｌまで、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）によって再懸濁させ、０．０３μｇ／ｍｌの最終濃度までＤＰＢＳで希釈する。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートを、ウェルあたり０．１ｍＬにおいて組換え４−１ＢＢキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままで、４℃で終夜インキュベートする。４−１ＢＢ溶液を除去し、プレートを洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ中における０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄する。ブロッキング緩衝液（５％の脱脂粉乳、ＤＰＢＳ中における０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を全てのウェルに加え、混合しながら４℃で１時間インキュベートする。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。ＷＲ−ＧＳ−６１０およびＷＲ−ＧＳ−６００上清の段階希釈をＤＰＢＳにおいて調製し、希釈した上清をプレートに加える。プレートを室温で１．５時間インキュベートする。抗体を含有する上清溶液を除去し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ＰＡ）を、ＤＰＢＳで希釈し、プレートに加える。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄する。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ  ゲイザースバーグ、ＭＤ）を加え、室温で２０分間インキュベートする。同量の２ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベル、ＣＡ）において４５０ｎｍの吸光度を読み取る。
【０１７８】
分析のため、ＭＯＩ０．０５で４８時間感染させたＵ２ＯＳからの上清を使用し、結果を図２０に示す。これらの結果は、ＧＳ−６００およびＧＳ−６１０において発現した抗４−１ＢＢ抗体が、４−１ＢＢに特異的に結合することができ、その結合が濃度依存性であることを示唆している。
【０１７９】
上記の試験は、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０が十分に構成されており、機能的な対応する抗体（ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６２０に対する抗ＰＤ１抗体、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０に対する抗−４−１ＢＢ抗体）が発現することができることを示している。
【０１８０】
［実施例３］ＷＲ−ＧＳ−６１０およびＷＲ−ＧＳ−６２０組換えウイルスのインビボ研究
以下の研究は、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０組換えウイルスがマウスに安全かどうか、および組換えウイルスがマウスにおいて腫瘍を標的化し腫瘍に入り込むことができるか否かを特定するために実施される。送達経路は、静脈投与（ＩＶ）または腹腔内投与（ＩＰ）である。全ての動物実験は、地元の動物実験委員会のガイドラインに従って実施した。
【０１８１】
ＣＴ２６、ＭＣ３８、ＨＴ−２９、およびＨＣＴ−１１６細胞株でのＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の細胞傷害性の測定（細胞致死データ）
インビトロ細胞傷害性試験のために、結直腸癌細胞株ＣＴ２６−ＬａｃＺ（マウス）、ＭＣ３８−Ｌｕｃ（マウス）、ＨＴ−２９−Ｌｕｃ（ヒト）およびＨＣＴ−１１６−Ｌｕｃ（ヒト）を使用した。ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０を、それぞれ３つの異なるＭＯＩ、すなわち、０．０１ＭＯＩ（３Ｅ２ＰＦＵ）、０．１ＭＯＩ（３Ｅ３ＰＦＵ）および１．０ＭＯＩ（３Ｅ４ＰＦＵ）となるように調製した。測定は、３つの異なる時点、すなわち、２４時間、４８時間、および７２時間の時点において実施した。
【０１８２】
細胞調製：最初に、各細胞株を２つの１５ｃｍの組織培養皿に蒔き、７５〜９０％の間のサブコンフルエントとなるまでインキュベートした。細胞を洗浄し、当業者に既知の従来法を用いてカウントした。９６ウェル平底プレートの各ウェルに、約３Ｅ４の細胞を蒔いた。各細胞タイプは、９つの異なる実験条件のための９枚のプレートを必要とする。
【０１８３】
ウイルス希釈調製：ウイルスを氷上において解凍し、その後、完全な解凍を確実にするために、３７℃の水浴において解凍した。解凍されたウイルスを、２回、その都度２０秒間、最大スピードでボルテックスした。ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０ウイルスを、３つの異なる濃度、すなわち、ＭＯＩ１．０、ＭＯＩ０．１、およびＭＯＩ０．０１となるように調製した。５０μＬのウイルスを、対応するウェルに加え、その後、混合するために９６ウェル平底プレートを４象限において穏やかに揺動した。プレートを、５％のＣＯ２を補充した３７℃においてインキュベートした。ＭＯＩ１．０は、３Ｅ４ＰＦＵ／５０μＬ、または６００ＰＦＵ／μＬ、または６Ｅ５ＰＦＵ／ｍＬに対応する。ＭＯＩ０．１は、３Ｅ３ＰＦＵ／５０μＬ、または６０ＰＦＵ／μＬ、または６Ｅ４ＰＦＵ／ｍＬに対応する。ＭＯＩ０．０１は、３Ｅ２ＰＦＵ／５０μＬ、または６ＰＦＵ／μＬ、または６Ｅ３ＰＦＵ／ｍＬに対応する。
【０１８４】
当業者に既知の従来法を使用して、上記において言及した４つの細胞株におけるウイルスの細胞傷害性を検出するために、アラマーブルー〔Alamar Blue〕を使用した各条件に対して６回の反復試験によって細胞生存率を計算した。図２１〜２３は、３つの異なる濃度および３つの異なる時点において、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の処理による上述した４つの細胞タイプの細胞生存率に、有意な差が無いことを示している。このことは、ワクシニアウイルス（ＷＲ）ゲノム中への、チェックポイント阻害因子抗体のためのポリヌクレオチド配列の組み込みが、ウイルスの細胞傷害性を変更しないことを示唆している。図２１〜２３はさらに、ウイルスの処理に関して、ＨＴ−２９およびＨＣＴ−１１６細胞株の細胞生存率が、ＣＴ−２６およびＭＣ−３８よりも著しく減少したことを示しており、これは、ヒト癌細胞が、ウイルス感染およびウイルス殺傷性に対してより敏感であることを示している。
【０１８５】
ウイルスベクターの生体内分布の測定
組織のホモジナイズ：
５つの異なる群における２５Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を一度に１匹犠牲にした。消毒スプレーの後、マウスを開腹し、そこから、腫瘍、肺、脾臓、肝臓、脳、または卵巣のいずれかの５０〜１００ｍｇを切除した。残りの組織は、ＯＣＴによって瞬間凍結させた。切除した組織を秤量し、２．０ｍＬのエッペンチューブに入れた。組織試料を−８０℃で終夜凍結させた。翌日、当業者に既知の方法において、組織試料をホモジナイズした。簡潔には、２つのオートクレーブ処理した５ｍｍのＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒビーズを各チューブに分注した。合計で４８本のチューブをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒに入れた。２８Ｈｚにおいて１分間、ホモジナイズを実施した。この後、アダプターの差し込みを１８０°反転させ、一様なホモジナイズを達成するためにさらに１分間、均質化を行った。この後、５００μＬのＤＭＥＭを各試料に加えた。チューブを、３５００ｇにおいて２分間遠心分離処理した。上清を１．５ｍＬのエッペンチューブに移し、力価測定まで−８０℃において貯蔵した。
【０１８６】
力価測定のための２４ウェルフォーマット：
ウイルス価測定のために、Ｕ２ＯＳ細胞を使用し、ならびに１０Ｅ２  ＰＦＵ／ｍＬ  ＪＸ５９４ストック（ａ）および３１．０  ＰＦＵ／ｍＬ  ＪＸ５９４ストック（ｂ）を調製して、ポジティブコントロールとして使用した。
【０１８７】
５種の組織、すなわち、脳（Ｂ）、肝臓（Ｖ）、肺（Ｌ）、卵巣（Ｏ）、および脾臓（Ｓ）に対して、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の各ウイルスの３つの濃度を調製した：（１）感染のための純粋な１５０μＬ；（２）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（１）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る；および（３）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（２）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る。
【０１８８】
コントロール（Ｃ）に対して、Ｕ２ＯＳ細胞を、（１）１５０μＬの１０Ｅ２  ＰＦＵ／ｍＬ  ＪＸ５９４ストック（ａ）；（２）１５０μＬの３１．０  ＰＦＵ／ｍＬ  ＪＸ５９４ストック（ｂ）；または（３）１５０μＬのＤＭＥＭ、で処理した。
【０１８９】
腫瘍（Ｔ）に対して、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の各ウイルスに対して６つの濃度を調製した：（１）感染のための純粋な１５０μＬ；（２）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（１）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る；（３）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（２）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る；（４）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（３）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る；（５）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（４）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る；および（６）２１２μＬのＤＭＥＭ中に（５）からの９８μＬを入れ、ミックスし、感染のための１５０μＬを取る。
【０１９０】
２４ウェルプレートを、図２４に示されるようにセットアップした。上記組織のホモジナイズのセクションにおいて説明した方法を使用して、１匹のマウスから調製した腫瘍、肺、脾臓、肝臓、脳、および卵巣の細胞を各プレートに蒔いた。
【０１９１】
上記において言及したように、２５匹のマウスを５つの群に分け、各群は、５匹のマウスを有し、すなわち、５つのプレートを有した。群１における腫瘍、肺、脾臓、肝臓、脳、および卵巣の細胞にＷＲ−ＧＳ−６１０を感染させ、群２ではＷＲを感染させ、群３ではＷＲ−ＧＳ−６２０を感染させ、群４ではＷＲ−ＧＳ−６００を感染させ、群５における全ての細胞（ポジティブコントロールのウェル細胞を除く）を、ネガティブコントロールとして、製剤緩衝液（ＦＢ）によって処理した。当該製剤緩衝液は、ｐＨ値７において、３０ｍＭのＴｒｉｓ、１０％のショ糖、および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。図２５は、ＷＲ−ＧＳ−６１０ウイルスプラークが、腫瘍細胞のウェルのみに存在すことを示している。図２６は、ＷＲウイルスプラークが、腫瘍細胞のウェルと卵巣細胞のウェルの両方に存在することを示している。図２７は、ＷＲ−ＧＳ−６２０ウイルスプラークが、腫瘍細胞のウェルと卵巣細胞のウェルの両方に存在することを示している。図２８は、ＷＲ−ＧＳ−６００ウイルスプラークが、腫瘍細胞のウェルのみに存在することを示している。図２９は、群５において腫瘍細胞のウェルにウイルスプラークが存在しないことを示している。これらのデータは、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０は、ＷＲ−ＧＳ−６２０およびＷＲと比較して、より特異的に腫瘍を標的化することができることを示唆している。
【０１９２】
注入された皮下腫瘍および他の組織におけるインビボウイルス分布
目標：ウイルスベクターの安全性および生体内分布
研究プロトコル
ｉ．３５Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を注文する。マウスは、５つの処置群、すなわち、ＰＢＳコントロール（ＦＢ）、ならびにＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０の群、に分けられる。
ｉｉ．腫瘍群の腫瘍が５ｍｍのサイズに達したとき、処置を開始する。
ｉｉｉ．尾静脈注入によるウイルスの３回の注入（１日目、４日目、７日目に計画）
ｉｖ．マウスの体重と健康状態をモニターする。
ｖ．９日目に、マウスを犠牲にし、脳、肺、肝臓、卵巣、脾臓から組織を採取する。Ｕ２ＯＳ細胞におけるプラークアッセイによって、異なる組織におけるワクシニア力価を特定する。
【０１９３】
下記の表３〜５は、処置群、処置スケジュール、および麻酔、エンドポイントおよび安楽死をまとめたものである。
【０１９４】
【表３（２）】
2022502074.tif 000006
【０１９５】
【表４】
2022502074.tif 000007
【０１９６】
【表５】
2022502074.tif 000008
【０１９７】
データは、群あたり５匹のマウスの平均を取ることによって提示した。図３０〜３２は、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０は、むしろ腫瘍に存在し、卵巣、脳、脾臓、肝臓、および肺では、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０ウイルスはほんのわずかしか認められなかったことを示している。対照的に、腫瘍内注入の後、大量のＷＲ−ＧＳ−６２０ウイルスが、腫瘍、卵巣、脳、脾臓、肝臓、および肺において観察された。これらのデータは、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０が、ＷＲ−ＧＳ−６２０よりも非常に高い腫瘍標的化特異性を有することを裏付けている。その上、図３０〜３２の棒グラフにおける第二バーおよび第三バーは、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０に対する組織１グラムあたりのＰＦＵの数値が、卵巣（ＷＲ−ＧＳ−６１０は、ＷＲ−ＧＳ−６００よりわずかに高い）、脳、脾臓、肝臓、および肺において同様であり、ＷＲ−ＧＳ−６００に対する腫瘍組織１グラムあたりのＰＦＵの数値が、ＷＲ−ＧＳ−６１０より約３倍高いことを示している。このことは、他の細胞にＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０を同様に感染させた場合、ＷＲ−ＧＳ−６００の方がＷＲ−ＧＳ−６１０よりも強く腫瘍に感染できることを示唆している。
【０１９８】
以前の研究は、ワクシニアウエスタンリザーブ株が、正常なマウスの臓器、特に卵巣に感染することができることを示しており（Ｚｈａｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２０１１，  ２４，  ３８７）、これは、図３１に示された結果に一致する。
【０１９９】
まとめると、これらのデータは、腫瘍溶解性ウイルス、例えばＷＲなどへの免疫チェックポイント阻害因子をコードする第一異種ポリヌクレオチドおよびイムノアクティベーターをコードする第二異種ポリヌクレオチドの組み込みは、結果として、腫瘍標的化および感染の相乗効果を生じ、そうでなければ、そのような相乗効果は、野生型腫瘍溶解性ウイルス、または第一異種ポリヌクレオチドのみまたは第二異種ポリヌクレオチドのみを有する改変された腫瘍溶解性ウイルスによっては達成できないことを示唆している。
【０２００】
異なるウイルス感染の後のＣＴ−２６マウス腫瘍モデルにおける腫瘍サイズの変化の測定
２５Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）に、ＣＴ２６腫瘍を移植した（ＣＴ−２６  ＬａｃＺ  ５Ｅ６細胞、ＳＧ、右脇腹）。マウスをさらに、５つの処理群：製剤緩衝液（剤）（ＦＢ）、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０、に分けた。腫瘍群の腫瘍が５ｍｍのサイズに達したとき、処理を開始する。１Ｅ７ＰＦＵの異なるウイルスを、１日目、４日目、および７日目に腫瘍内に注入し、マウスの体重および健康状態をモニターした。腫瘍成長の後、ノギスによって腫瘍サイズを測定した。
【０２０１】
腫瘍サイズ変化を記録し、結果を図３３にまとめるが、ここで、ｘ日目の腫瘍の体積変化％は、１日目の腫瘍の体積とｘ日目の腫瘍の体積とを比較することによって計算される。図３３は、ウイルス注入後の１日目、４日目、および７日目に、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０で処理した場合の腫瘍体積サイズの増加は、製剤緩衝液（ＦＢ）で処理した場合より著しく小さいことを示しており、それは、上記において言及したウイルスのインビボでの腫瘍阻害効果を示唆している。
【０２０２】
同系マウスモデルにおける有効性の測定
Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける皮下ＣＴ−２６ＬａｃＺ腫瘍モデルを調製した。１Ｅ７の異なるウイルスを、１日目、３日目、および７日目に尾静脈注入によって注入し、マウスの体重および健康状態をモニターした。エンドポイントを、腫瘍＞１，７００ｍｍ３に設定し、３１日目に研究を終了した。マウス生存の結果を図３４に示す。
【０２０３】
異なるウイルス感染後のヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ皮下腫瘍モデルの腫瘍サイズ変化の測定
当該実験を、以下のように簡単に説明する。
【０２０４】
１日目：３０  Ｒａｇ２  −／−ＩＬ２Ｒｇヌルマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）  を注文し、ＨＴ−２９腫瘍を移植する（ＨＴ−２９  Ｌｕｃ  ５Ｅ６細胞、ＳＱ、右脇腹）。
【０２０５】
７日目：腫瘍成長をＩＶＩＳチェックする。
【０２０６】
８日目：静脈内注入により５．８Ｅ６ヒトＰＢＭＣ  ＩＰを投与する。
【０２０７】
１４日目：群のＩＶＩＳ割り当て。
【０２０８】
１５日目：１Ｅ７  ＩＴ処理。
【０２０９】
１８日目：ＩＶＩＳおよび１Ｅ７  ＩＴ処理。
【０２１０】
２４日目：ＩＶＩＳ。
【０２１１】
ヒト末梢血単核細胞移植の確認
処理したマウスを顎下放血させ、１００μＬの血液を採取し、ナトリウムヘパリンに加えた。赤血球を溶解させ、ｈＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４に対して染色する蛍光結果をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにおいて読み取り、それを図３５および３６にまとめており、それは、ヒト末梢血単核細胞が首尾よく免疫不全マウスに移植されていることを裏付けている。
【０２１２】
ウイルス感染後の腫瘍体積変化を図３７および３８にまとめる。図３７は、コントロール群と比較して、ＷＲ−ＧＳ−６００で処理したマウスは、ＷＲ−ＧＳ−６１０、ＷＲ−ＧＳ−６２０、またはＷＲで処理したマウスと比較して、腫瘍体積において最少の増加を示すことを示している。より興味深いことに、ＷＲ−ＧＳ−６００を感染させた後のマウスは、ＨＴ−２９−Ｌｕｃ注入後３２日目において、腫瘍サイズはあまり増加しておらず、ＷＲ−ＧＳ−６００処理の８日目からは減少さえしている。図３８は、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０より高いＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６２０の毒性に起因して、ＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６２０は、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０より早いエンドポイントを有することを示している。図３８はさらに、製剤緩衝液と比較した場合、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０が腫瘍成長を制御することができることを示している。まとめると、これらのデータは、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０が、ＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６２０より低い毒性を有し、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０は、ともに腫瘍成長を制御できることを示唆している。
【０２１３】
図３９および４０は、インビボイメージングＩＶＩＳ測定（Ｔｈｅ  ＩＶＩＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）により、ヒト腫瘍ＨＴ−２９が、ヒトＰＢＭＣの有無におけるＮＣＧマウスにおいて成長することを示している。
【０２１４】
図４１および４２は、ウイルスが腹腔内に注入されるヒト化ＨＴ−２９−Ｌｕｃ腹膜内マウスモデルの場合、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６２０感染は、腫瘍の化学発光強度を著しく減少させることができることを示しており、それは、ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６２０の腫瘍阻害効率を示唆している。製剤緩衝液と比較して、ＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６１０は、腫瘍の化学発光強度のより少ない増加を示しており、これは、ＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６１０の腫瘍成長制御有効性を示唆している。
【０２１５】
前述のインビトロおよびインビボの結果は、ＷＲ、ＷＲ−ＧＳ−６００、ＷＲ−ＧＳ−６１０、およびＷＲ−ＧＳ−６２０が、癌細胞を死に到らしめること、および腫瘍成長を制御することができることを示している。しかしながら、ＷＲおよびＷＲ−ＧＳ−６２０は、より高い毒性を示し、これは、薬物試験の早い終了につながっている。ＷＲ−ＧＳ−６００およびＷＲ−ＧＳ−６１０は、腫瘍成長制御においてより効果的であり、この場合、ＷＲ−ＧＳ−６００は、ＷＲ−ＧＳ−６１０より高い腫瘍標的化特異性を有する。より重要なことに、ヒト化ＨＴ−２９腹膜内腫瘍マウスモデルにおいて、ＷＲ−ＧＳ−６００の腹腔内注入は、腫瘍サイズを減少させるが、その一方で、ＷＲ−ＧＳ−６１０の腹腔内注入は、腫瘍サイズの増加を止めなかったが、腫瘍サイズ増加の百分率は、ＷＲで処理した場合より著しく小さい。これらのデータは、免疫チェックポイント阻害因子をコードする異種ポリヌクレオチドとイムノアクティベーターをコードする異種ポリヌクレオチドの両方の組み込みは、毒性を減少させ、腫瘍標的化特異性を増加させ、腫瘍制御有効性を向上できることを示唆している。
【０２１６】
実質的に任意の複数形および／または単数形用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または適用に対して適切なように、複数形から単数形へ、および／または単数形から複数形へ翻訳することができる。
【０２１７】
さらに、本開示の特徴および態様が、マーカッシュ群の用語において説明される場合、その結果、当業者は、本開示が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも説明されることを理解するであろう。
【０２１８】
本明細書において様々な態様および実施形態が開示されると同時に、他の態様および実施形態も、当業者に明らかとなるであろう。本明細書において開示される様々な態様および実施形態は、説明目的のためであり、限定であることを意図するものではなく、真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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