(57)【要約】  本発明は、ホップ由来イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への酵素触媒生物変換によるビール苦味料の製造方法、ならびにそのような方法に使用し得る新規の酵素触媒に関する。
2022500063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソアルファ酸を、ケトレダクターゼ酵素で、または該ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物で処理することを含む、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の製造方法。
【請求項２】
水性系で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温和な温度およびｐＨ条件下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イソアルファ酸の混合物に前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰを添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
補因子リサイクリングのためのイソプロパノールの存在下で、前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物へ添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イソアルファ酸、すなわち基質の濃度が、生物変換の体積生産性を増加させるために最大化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
混合物における補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの濃度が、生物変換の経済性を改善するために最小化される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
補因子リサイクリングのための別の酵素の存在下で、前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物へ添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
全細胞生体触媒であって、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する固定化微生物である全細胞生体触媒をイソアルファ酸の混合物に添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を培養し、イソアルファ酸を培地に添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ケトレダクターゼが熱安定性であるケトレダクターゼ酵素をイソアルファ酸の抽出物に添加することを含み、熱が適用され、混合物がインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ケトレダクターゼが、ｃｉｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケトレダクターゼが、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物をそれらの各々のジヒドロイソアルファ酸に還元するために有効な量で、２種以上のケトレダクターゼ酵素の混合物を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の２種以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が、化学還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムによって生成されるものとは異なるジヒドロイソアルファ酸の独特の混合物を生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ケトレダクターゼ酵素が、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記ケトレダクターゼ酵素、または前記ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物が、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼと比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ケトレダクターゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼと９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、ケトレダクターゼ酵素。
【請求項２０】
前記レダクターゼ酵素、または前記レダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物が、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼと比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる、請求項１９に記載のケトレダクターゼ酵素。
【請求項２１】
前記ケトレダクターゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼと９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、請求項２０に記載のケトレダクターゼ酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
ファイル名ＫＡＬＳＥＣ＿７６＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿２６＿Ｓｅｐｔ＿２０１９．ｔｘｔとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）で３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §１．８２１に基づいて本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０１９年９月２６日に作成された。
【０００２】
本発明は、ホップ由来イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への酵素触媒生物変換によるビール苦味料の製造方法、ならびにそのような方法に使用し得る新規の酵素触媒に関する。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸は、飲料添加剤としての有用性を改善する優れた特性を有する。消費者は、不快な化学試薬の使用を必要とせず、天然に存在し得る酵素を利用する、このプロセスによって産生されるジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を好み得る。
【背景技術】
【０００３】
ビールに苦味付けをする伝統的な方法は、ケトル煮沸の間に添加されるホールフレッシュホップ、ホール乾燥ホップまたはホップペレットを使用する。超臨界二酸化炭素を用いてホップを抽出することによって製造されるホップ抽出物、または触媒の存在下でホップを加熱することによって製造される異性化ホップペレットは、醸造者によっても採用されてきた、より最近の苦味付けの革新である。ホップペレットはまた、醸造プロセスにおいて後に添加することもでき、ドライホッピングの場合には、ホップはろ過の前に完成ビールに添加される。これらの方法は、ホップ中に存在する苦味化合物の利用が乏しく、そのことはコストに不利に強い影響を及ぼす。このようにして製造されたビールまたは他の麦芽飲料は光に対して不安定であり、著しい日光臭またはスカンク臭をもたらす３−メチル−２−ブテン−１−チオール（３−ＭＢＴ）の光誘発性の形成を避けるために、暗褐色の瓶もしくは缶に入れられるか、または配置されなければならない。瓶をボール箱に入れるか、またはそれらを遮光性もしくは光フィルタリング性の紙、箔もしくはプラスチックの覆いで完全に包むことが、これらの飲料を日光フレーバーおよび日光臭から保護する別の高価な方法である。
【０００４】
伝統的に醸造されたビールにおける苦味は、主としてイソアルファ酸に由来する。これらの化合物は、ホップ植物のルプリン腺に天然に存在する化合物であるフムロンの異性化によって醸造プロセスの間に形成される。この結果は、ビール中の光化学反応に関するイソアルファ酸の天然の不安定性を考慮すると、飲料は、日光フレーバーおよび日光臭あるいはスカンクフレーバーおよびスカンク臭を形成しやすい。
【０００５】
完全に光安定性のビールまたは他の麦芽飲料は、いわゆる改良型（ａｄｖａｎｃｅｄ）または変性された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ホップ酸を使用して製造することができる。これらの苦味料を用いて製造されたビールは、スカンク臭の生成のおそれなしに、非着色のフリントガラス瓶に入れることができる。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸は、光安定性であるイソアルファ酸の還元生成物である。今日まで、これらの化合物は天然には見出されていない。伝統的に、光化学に関与するイソアルファ酸の部分が、水素化ホウ素ナトリウムを用いたカルボニル基の還元によって変えられてきた。
【０００６】
水素化ホウ素ナトリウムは、ケトン類の還元に利用できる無機化合物である。皮膚接触、眼接触、吸入または摂取の場合、１６０ｍｇ／ｋｇ（ラット）の経口ＬＤ５０で、極めて有害である。水素化ホウ素ナトリウムはまた、可燃性であり、腐食性であり、酸化剤、酸、アルカリおよび水分と極めて反応性である（非特許文献１）。
【０００７】
消費者はますます、合成又は半合成材料よりも天然材料に対して優先志向を示している。従って、ビールおよび他の飲料のための苦味料として天然材料を使用する組成物を提供することだけでなく、前記材料のより天然の生産のためのプロセスも提供するニーズが存在している。
【０００８】
生体触媒による産生は、高価値化合物の高度に選択性で、安全で、クリーンでそしてスケーラブルな産生を提供する新興技術である。生体触媒による産生は、天然に存在する酵素に依存しており、化学触媒に置き換わるものである。
【０００９】
酵素は、特定の化学反応を触媒することができる天然に存在するタンパク質である。変性されたホップ苦味化合物の製造において、現在化学触媒に取って代われる酵素が天然に存在する（非特許文献２）。
【００１０】
フムロンは、植物フムラス・ルプラス（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）と共生する真菌および細菌に暴露されてきた、天然の二次代謝産物である。土壌−および植物に生息する真菌および細菌は、解毒またはスカベンジング目的のために、フムロンを修飾できる酵素を有し得る。さらに、生物は、フムロン様分子を修飾するために酵素を進化させてきたかもしれないが、見さかいない活性のために、これらの酵素は、興味ある化合物、すなわちイソアルファ酸類に対して活性を有する（非特許文献３；非特許文献４）。
【００１１】
酸化／還元反応、すなわち、ある物質から別の物質へ水素および酸素原子または電子の移動を触媒する酵素は、オキシドレダクターゼとして広く分類される。より具体的には、ケトン基をヒドロキシル基に還元する酵素がケトレダクターゼまたはカルボニルレダクターゼとして知られており、還元当量の外因性供給源（例えば、補因子ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）の補充に依存する。本明細書で特徴付けられる酵素の既存の命名と一致して、当該酵素を「ケトレダクターゼ」と呼ぶ。
【００１２】
高価な補因子（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）のコストは、補因子リサイクリングのための追加的な酵素および基質（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース）を含ませることによって、あるいは、低コストかつ天然の供給材料、例えばエタノール、を酸化することもできるケトレダクターゼを利用することによって、低減し得る。
【００１３】
醸造における酵素の有用性、およびビールの最終的な特徴に対するそれらの好ましい影響に関しては、数多くの先行するものが存在する（非特許文献５）。ビールの天然発酵における酵母酵素の存在は、最終飲料のフレーバーおよびアロマに影響を及ぼす化合物を生成することが知られている（非特許文献６）。外因的に添加された酵素は、醸造プロセスに対して種々の改良、例えば粘度の低下、発酵性糖の増加、チルプルーフィング（ｃｈｉｌｌ−ｐｒｏｏｆｉｎｇ）および清澄化、をもたらす（非特許文献７；非特許文献８）。さらに、ホップ抽出物は、特に、ホップ由来アロマ化合物を変性するための酵素で前処理されてきた（非特許文献９）。
【００１４】
しかし、本発明以前には、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への還元を触媒できる酵素は天然では観察されておらず、従って文献には記載されていなかった。本明細書に開示される方法は、新規な酵素反応を表す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ；  ＭＳＤＳ  Ｎｏ．  Ｓ９１２５；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．：  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ０１，  ２０１５
【非特許文献２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｐ．  Ｋ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１５，  ５９，  １−４１．
【非特許文献３】Ｈｕｌｔ，  Ｋ．；  Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，  Ｐ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７，  ２５  （５），  ２３１−２３８
【非特許文献４】Ｎｏｂｅｌｉ，  Ｉ．；  Ｆａｖｉａ，  Ａ．  Ｄ．；  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００９，  ２７  （２），  １５７−１６７
【非特許文献５】Ｐｏｚｅｎ，  Ｍ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ．  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ，  １９３４，  ２６  （１１），  １１２７−１１３３
【非特許文献６】Ｐｒａｅｔ，  Ｔ．；  Ｏｐｓｔａｅｌｅ，  Ｆ．；  Ｊａｓｋｕｌａ−Ｇｏｉｒｉｓ，  Ｂ．；  Ａｅｒｔｓ，  Ｇ．；  Ｄｅ  Ｃｏｏｍａｎ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｏｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｏｍａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｐｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ，  ２０１２，  ３６，  １２５−１３２
【非特許文献７】Ｗａｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｌ．  （１９４７）  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ，  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２，４３３，４１１．
【非特許文献８】Ｇｈｉｏｎｎｏ，  Ｌ．；  Ｍａｒｃｏｎｉ，  Ｏ．；  Ｓｉｌｅｏｎｉ，  Ｖ．；  Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ，  Ｇ．；  Ｐｅｒｒｅｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｇｌｕｔｅｎ  ｌｅｖｅｌｓ，  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１７，  ５２  （６），  １３６７−１３７４
【非特許文献９】Ｇｒｏｓ，  Ｊ．；  Ｔｒａｎ，  Ｔ．  Ｔ．  Ｈ．；  Ｃｏｌｌｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｏｄｏｕｒａｎｔ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｉｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｏｐ．  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ２０１３，  １１９  （４），  ２２１−２２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の目的
本発明の目的は、ヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸、すなわちホップ植物に由来する天然苦味料の変性バージョンの酵素的製造方法を提供することである。本発明の方法は、化学試薬、水素化ホウ素ナトリウムを利用する現在の製造方法に取って代わるように設計されている。そのような方法に使用し得る新規の酵素触媒を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明は、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸（これはその後、飲料において、天然由来でかつ光安定性の苦味料として使用できる）への生物変換のための、工業用レベルまでスケールアップすることができる方法に関する。
【００１８】
本発明の一態様は、ケトレダクターゼ酵素または前記ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を利用した、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への高収率生物変換のための方法である。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の製造のためのそのような方法であって、温和な温度およびｐＨ条件（当該方法を環境に優しい製造方法にする）を用いる水性系において実施される、前記方法に関する。
【００２０】
本発明の一実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２１】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰを、補因子リサイクリングのためのイソプロパノールの存在下で、イソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様において、イソアルファ酸、すなわち基質の濃度は、生物変換の体積生産性を増加させるために最大化される。
【００２３】
本発明のさらなる実施態様において、混合物中の補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの濃度は、生物変換の経済性を改善するために最小限にされる。
【００２４】
本発明の一実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰを、補因子リサイクリングのための別の酵素（例えばグルコースデヒドロゲナーゼ）の存在下で、イソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、全細胞生体触媒をイソアルファ酸の混合物に添加し、引き続き、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含み、ここで、前記の全細胞生体触媒は、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する固定化された微生物である。
【００２６】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する増殖微生物へのイソアルファ酸の供給を含む。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、熱安定性ケトレダクターゼ酵素をアルファ酸の抽出物に添加することを含み、熱が適用され、そして混合物は、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の所望の収量が達成されるまでインキュベートされる。
【００２８】
本発明はまた、上記で定義されるような本発明の方法において使用し得る新規の酵素触媒に関する。
【００２９】
本発明におけるレダクターゼは、任意選択的に、イソアルファ酸のＣ（４）の側鎖におけるカルボニル基を還元し、光感受性アシロイン基を第２級アルコールに変換し、光安定性のイソアルファ酸誘導体を生成するための活性を示す（図１）。
【００３０】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、有利には、６つの主要なイソアルファ酸：ｃｉｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロン、ｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロン、およびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロンのいずれか１種の特定のメンバーの還元を触媒することに対して、最小限の優先傾向を示すか、または優先傾向は示さない。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、ｃｉｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する。
【００３２】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する。
【００３３】
本発明の別の実施態様では、上記の基質特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物をそれらのそれぞれのジヒドロイソアルファ酸に還元するために、本発明の方法において使用される。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、基質特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物を反応混合物に添加して、化学還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムによって生成されるものとは異なるジヒドロイソアルファ酸の独特の混合物を生成することができる。
【００３５】
さらなる実施態様において、本発明は、レダクターゼ酵素がケトレダクターゼである、上記に定義されるような方法に関する。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、前記ケトレダクターゼ酵素、または該ケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物が、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、上記に定義されるような方法に関する。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明は、ケトレダクターゼ酵素、またはケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物が、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２２から選択されるケトレダクターゼ酵素と比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる、上記に定義されるような方法に関する。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、ケトレダクターゼ酵素、またはケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物に関する。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明は、ケトレダクターゼ酵素、またはレダクターゼをコードする遺伝子を発現するまたは微生物に関し、これらは、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のレダクターゼ酵素配列と比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２および配列番号２２から選択されるケトレダクターゼ酵素と９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、ケトレダクターゼ酵素、またはケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物に関する。
【００４１】
本発明の別の態様は、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【００４２】
本発明はさらに、少なくとも１つの制御配列をさらに含む、そのようなベクターを含む。
【００４３】
本発明はさらに、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むそのようなベクターを含む宿主細胞を含む。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼを産生するための方法であって、ケトレダクターゼが前記宿主細胞によって産生される条件下で前記宿主細胞を培養することを含む方法を含む。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２２のケトレダクターゼを産生するための方法であって、前記宿主細胞によって産生されたケトレダクターゼを回収するステップをさらに含む方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、イソアルファ酸の代表的なエピマーの酵素触媒還元を示す。
【図２】図２は、精製されたレダクターゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３】図３は、３０℃で２４時間、レダクターゼＲ２０とともに（上の２つのパネル）およびレダクターゼＲ２０なしで（下の２つのパネル）インキュベートしたイソアルファ酸についてのＵＰＬＣクロマトグラムを示す。生成物、すなわちジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に対応するピークを示す。
【図４】図４は、活性部位キャビティーに代表的な基質（ｔｒａｎｓ−イソフムロン、黒）および補因子（ＮＡＤＰＨ、ライトグレー）が結合したレダクターゼＲ１７（ダークグレー、サーフェスレンダリング）の構造モデルを示す。
【図５】図５は、（Ａ）ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の１種のジアステレオマーのみを産生するケトレダクターゼ、および（Ｂ）ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の両方のジアステレオマーを産生するケトレダクターゼについてのＵＰＬＣクロマトグラムを示す。生成物、すなわちジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に対応するピークを示す。
【図６】図６は、活性なケトレダクターゼホモログ：  Ｒ４、Ｒ１７、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２３のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）を用いて生成されたアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明では、ケトレダクターゼ酵素が、水素化ホウ素ナトリウムの機能に取って代わり、飲料添加剤であるジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸のためのより天然の製造方法を可能にする。前記酵素は、イソアルファ酸の異性体（ｃｏ−、ｎ−  ａｄ−、およびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−）のいずれかのまたは全ての、ケトン基をヒドロキシ基へ特異的に還元する任意のケトレダクターゼであってよい。前記酵素は、細菌、真菌または植物に由来し得るが、これらに限定されない。前記酵素は、補因子依存的（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）であっても、非依存的であってもよい。
【００４８】
本明細書において、「イソアルファ酸」、「ホップイソアルファ酸」および「ホップ由来イソアルファ酸」は、互換的に使用され得る。
【００４９】
本発明では、イソアルファ酸溶液を、１種または複数の精製された酵素、または前記酵素（複数可）と任意選択的に補因子リサイクリングのための追加的な酵素とを含む混合物を用いる酵素的処理に付す。酵素の量は、継続時間、温度および基質の量および濃度を含むインキュベーションパラメーターに依存する。
【００５０】
あるいは、イソアルファ酸溶液は、前記酵素（複数可）を発現する微生物を含有する混合物を使用する酵素的処理に付される。本発明はさらに、ケトレダクターゼの発現を適宜誘導するケトレダクターゼ産生微生物を培養することを含む、本発明に従ってイソアルファ酸を還元するための方法を提供する。上記のようなイソアルファ酸の還元のためには、単離された酵素の代わりに、無傷の細胞回収し、反応に直接添加することができる。さらに、回収された細胞は、還元反応への添加の前に固定化することができる。微生物は公知の方法によって培養し、発酵させることができる。前記微生物は、細菌または真菌であり得る。
【００５１】
ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、両方の異性体を還元する能力を示す単一のケトレダクターゼと共にインキュベートすることができる。あるいは、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、様々な特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼと共にインキュベートしてもよく、ここでは、得られる生成物はｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸の混合物である。
【００５２】
あるいは、ｃｉｓ−イソアルファ酸のみを含有する溶液を、ｃｉｓ−異性体に特異的なケトレダクターゼ（複数可）と共にインキュベートしてもよく、得られる生成物はｃｉｓ−ジヒドロイソアルファ酸の溶液である。ｃｉｓ−ジヒドロイソアルファ酸のみの溶液は、有利な苦味および／または熱安定性特性を示し得る。
【００５３】
あるいは、ｔｒａｎｓ−イソアルファ酸のみを含有する溶液を、ｔｒａｎｓ−異性体に特異的なケトレダクターゼ（複数可）と共にインキュベートしてもよく、得られる生成物はｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸の溶液である。ｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸のみの溶液は、有利な苦味特性を示し得る。
【００５４】
ｔｒａｎｓ−およびｃｉｓ−イソアルファ酸のカスタマイズされたブレンドを、様々な基質特異性を示す１種または複数のケトレダクターゼと共にインキュベートして、さもなければ達成不可能なジヒドロイソアルファ酸の独特のブレンドを生成してもよい。
【００５５】
イソアルファ酸混合物を、追加的な所望の変性を触媒するための酵素（例えば限定はされないが、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、ヒドラターゼおよびリアーゼ）に加えて、ケトレダクターゼ酵素（複数可）を使用する酵素反応に付してもよい。種々の活性の酵素を、ワンポット反応で組み合わせるか、または順次的に添加することができる。
【００５６】
酵素インキュベーションにおいて使用するための適切な溶媒には、水、ならびに水と酵素に適合性の別の溶媒、例えばエタノールまたはイソプロパノールとの混合物が含まれる。酵素活性は、水溶液の緩衝から利益を享受する。緩衝剤には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（別名トリス）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（別名ＨＥＰＥＳ）、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定はされない。
【００５７】
酵素（複数可）およびイソアルファ酸は、適切なｐＨ範囲、例えばｐＨ６〜１０、および温度範囲、例えば１０〜９０℃内でインキュベートされ、イソアルファ酸を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸収量に変換するのに十分な時間この温度で保持される。連続的な撹拌は、一定の温度および基質の酵素への暴露を確実にする。反応時間（典型的には２４〜４８時間）は、酵素および基質の量および濃度、存在する溶媒、および選択された温度に依存する。
【００５８】
酵素（複数可）は、溶液においてフリーであっても、ビーズまたは類似の混合可能な足場上に固定化されても、またはイソアルファ酸の溶液を通過させるフィルムまたは樹脂上に固定化されてもよい。酵素の純度レベルは、精製方法に応じて３０〜９０＋％まで変化し得る。
【００５９】
酵素（複数可）は、物理的ろ過または遠心分離によって最終生成物から除去してもよい。酵素（複数可）はまた、極端な温度またはｐＨによって不活性化され、最終生成物中に残存されてもよい。
【００６０】
本発明に包含されるレダクターゼ酵素には、ケトレダクターゼ酵素が含まれる。
【００６１】
２３種の成功裏に精製された酵素の詳細を表１に列挙し、簡略ラベル、配列番号およびアミノ酸配列を含む。
【００６２】
【表１】
2022500063.tif 000003
2022500063.tif 000004
2022500063.tif 000005
【００６３】
ほとんど全ての候補は、ワンステップ精製後に十分に純粋であった（＞８０％タンパク質含有量が興味のタンパク質である）（図２を参照）。
【００６４】
本発明に包含されるレダクターゼ酵素には、以下のアミノ酸配列を含むものが含まれる：配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２２。
【００６５】
本発明によって包含されるレダクターゼ酵素にはまた、以下のアミノ酸配列：配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２２、と比較して、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有するものが含まれる。
【００６６】
本発明に包含されるレダクターゼ酵素にはまた、以下のアミノ酸配列：配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２２、と少なくとも４０％（少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％を含む）同一であるアミノ酸配列を含むものが含まれる。
【００６７】
本明細書において使用される場合に、「配列相同性のパーセント」、「パーセント相同性」および「パーセント同一性」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、そして比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。前記パーセントは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列において生じるか、またはマッチした位置の数を得るために核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとともに整列された位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、そしてその結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセントを得ることによって、算出される。最適なアラインメントおよびパーセント配列相同性の決定はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して行われる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：  ４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
【００６８】
見境のない（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）酵素は、低い共有アミノ酸同一性を有するにもかかわらず、同一の化学反応を触媒し得る。ケトレダクターゼＲ４（配列番号３）が、その見境のない性質のためにスクリーニングのために最初に選択された［Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ２０１４，  １８４４］。同一の酵素ドメイン（ＩＰＲ００１５０９：ＮＡＤ依存性エピメラーゼ／デヒドラターゼ）を含み、Ｒ４（配列番号３）とアミノ酸同一性を共有する５つのさらなるケトレダクターゼ（Ｒ１７（配列番号１６）、Ｒ２０（配列番号１９）、Ｒ２１（配列番号２０）、Ｒ２２（配列番号２１）およびＲ２３（配列番号２２））を、合成遺伝子として取得し、精製し、特徴付けを行った。配列同一性カットオフを確立するために、レダクターゼを意図的に、次第により低い配列同一性で選択した。
【００６９】
Ｒ４（配列番号３）に対して比較的低いパーセント同一性（酵素の全長にわたって３４〜３９％）を共有するにもかかわらず、酵素Ｒ１７（配列番号１６）、Ｒ２０（配列番号１９）、Ｒ２１（配列番号２０）およびＲ２３（配列番号２２）は、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への変換を触媒する。Ｒ４（配列番号３）と３３％の同一性を共有するＲ２２（配列番号２１）は、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への変換を触媒しないが、他の点では、精製されると活性酵素である（イソプロパノールの酵素触媒酸化活性を測定することによって確認）。
【００７０】
ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を得るために機能性レダクターゼを非機能性レダクターゼから分離する特徴は、マルチプル配列アライメントによって示される（図６）。ケトレダクターゼＲ４（配列番号３）、およびここでイソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換できるものとして特徴付けられる全てのＲ４（配列番号３）ホモログは、低相同性（３８〜４６％）の３６〜３９個のアミノ酸によって隔てられた良好な相同性（＞５３％の同一性）の１３個のアミノ酸と高相同性（＞５５％）の９個のアミノ酸とから構成される、残基１００〜２００の間に存在するドメインを有する。このドメインは、非機能性Ｒ２２ポリペプチドにおいて欠失している（配列番号２１）。従って、当該ドメインは、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を得るためのケトレダクターゼ活性のホールマークであると考えられる。
【００７１】
本明細書において開示される特定の実施態様は、からなるまたは／および本質的になるという文言を用いて請求項においてさらに限定される。請求項において使用される場合、出願当初のままであるかまたは補正ごとに追加されたかにかかわらず、移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項で特定されていない要素、ステップまたは成分を排除する。移行句「から本質的になる」は、請求項の範囲を、特定された材料またはステップならびに基礎となる新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように特許請求される発明の実施態様は、本明細書において本質的にまたは明示的に記載され、実施可能にされる。
【００７２】
本明細書において使用される場合、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物または方法は列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味することが意図される。
【００７３】
語句「有効量」は、イソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するのに十分なレダクターゼの量を表す。所定の投与のための有効量の決定は、十分に医薬分野の通常の技術の範囲内である。
【００７４】
ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を製造するための方法において、イソアルファ酸溶液は、イソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するのに有効な量で、１種もしくは複数の精製されたレダクターゼ酵素、またはレダクターゼ酵素（単数または複数）および任意選択的に補因子リサイクルのための追加的な酵素を含有する混合物を使用する酵素処理に供される。酵素の量は、継続時間、温度および基質の量および濃度を含むインキュベーションパラメーターに依存する。
【００７５】
あるいは、イソアルファ酸溶液は、前記酵素を発現する微生物を含有する混合物を使用する酵素的処理に付される。
【００７６】
ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、両方の異性体を還元する能力を示す単一のレダクターゼ／ケトレダクターゼと共にインキュベートすることができる。あるいは、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、様々な特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼと共にインキュベートしてもよく、ここでは、得られる生成物はｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸の混合物である。
【００７７】
ｔｒａｎｓ−およびｃｉｓ−イソアルファ酸のカスタマイズされたブレンドを、様々な基質特異性を示す１種または複数のレダクターゼ／ケトレダクターゼと共にインキュベートして、さもなければ達成不可能なジヒドロイソアルファ酸の独特のブレンドを生成してもよい。
【００７８】
イソアルファ酸混合物を、追加的な所望の変性を触媒するための酵素（例えば限定はされないが、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、ヒドラターゼおよびリアーゼ）に加えて、レダクターゼ酵素を使用する酵素反応に付してもよい。種々の活性の酵素を、ワンポット反応で組み合わせるか、または順次的に添加することができる。
【００７９】
酵素インキュベーションにおいて使用するための適切な溶媒には、水、ならびに水と酵素に適合性の別の溶媒、例えばエタノールまたはイソプロパノールとの混合物が含まれる。酵素活性は、水溶液の緩衝から利益を享受する。緩衝剤には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（別名トリス）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（別名ＨＥＰＥＳ）、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定はされない。
【００８０】
酵素およびイソアルファ酸は、適切なｐＨ範囲、例えばｐＨ６〜１０、および温度範囲、例えば１０〜９０℃内でインキュベートされ、イソアルファ酸を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸収量に変換するのに十分な時間この温度で保持される。連続的な撹拌は、一定の温度および基質の酵素への暴露を確実にする。反応時間（典型的には２４〜４８時間）は、酵素および基質の量および濃度、存在する溶媒、および選択された温度に依存する。
【００８１】
レダクターゼ酵素は、溶液においてフリーであっても、ビーズまたは類似の混合可能な足場上に固定化されても、またはイソアルファ酸の溶液を通過させるフィルムまたは樹脂上に固定化されてもよい。酵素の純度レベルは、精製方法に応じて３０〜９０＋％まで変化し得る。
【００８２】
レダクターゼは、物理的ろ過または遠心分離によって最終生成物から除去してもよい。酵素はまた、極端な温度またはｐＨによって不活性化され、最終生成物中に残存されてもよい。
【００８３】
本発明は、イソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するためにレダクターゼを利用する新規な方法である。コドン最適化レダクターゼ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において、細胞培養物１Ｌあたり１００ｍｇを超える精製酵素という収量を達成した。全ての酵素を補因子としてのＮＡＤＰＨを用いて特徴付けを行った。この研究において特徴付けられたレダクターゼは、以前に記載されていない酵素活性を有する。これらの酵素は、水素化ホウ素ナトリウムを利用する現在のプロセスに取って代わるための新規な生物学的変換において利用し得る新規な生体触媒のための基礎を形成する。
【実施例】
【００８４】
例
以下の例は、本発明をその範囲を限定することなく例証する。
【００８５】
例１−レダクターゼ調製およびスクリーニング
方法
候補の同定
レダクターゼ候補を、所望の反応と類似の性質の特徴付けされた酵素反応に関する文献の広範な検索、それに続く３つの公共タンパク質配列データベースのバイオインフォマティックマイニングの後に選択した：ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）、Ｐｆａｍ  （／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）、およびＩｎｔｅｒＰｒｏ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／Ｅ．  ｃｏｌｉ）。バイオインフォマティクスは、特徴付けされた酵素とレダクターゼ候補との間のＢＬＡＳＴＰ配列アライメント（／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に依拠した。
【００８６】
酵素発現および精製
プラスミドＤＮＡをいくつかの様式で得た：１）ＤＮＡＳＵ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ｗｗｗ．ｄｎａｓｕ．ｏｒｇ）からの発現ベクターにおいて、２）ＤＮＡＳＵ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのクローニングベクターにおいて、引き続き、自家発現ベクターへのクローニング、３）Ａｔｕｍ（ｗｗｗ．ａｔｕｍ．ｂｉｏ）からの発現ベクターにおいて合成遺伝子として、または４）Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｒａｌｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）からの発現ベクターにおいて合成遺伝子として。合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した。
【００８７】
適切な抗生物質を含む５ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈに、興味の発現ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の寒天プレートから植菌し、３０℃で一晩振とうしながらインキュベートした。翌日、一晩培養物を、抗生物質を含むフレッシュな０．５ＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ中に１：１００に逆希釈（ｂａｃｋ−ｄｉｌｕｔｅｄ）し、光学密度が０．５に達するまで２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２〜３時間インキュベートした。培養物を０．２ｍＭの最終濃度のイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、１８０ｒｐｍで振とうしながら２５℃で１６時間インキュベートした。細胞を、４８００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを１２ｍＬのＢｉｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）に再懸濁し、細胞を１５分間超音波処理（５秒間オン、５秒間オフ）によって溶解した。細胞ライセートを、１０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって清澄化した。タグ化タンパク質を、コバルトアフィニティー、マルトースアフィニティーまたはグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによって、清澄化細胞ライセートから精製した。タンパク質溶液を、遠心ろ過によってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．０）に交換した。適切なアミノ酸配列を用いることによって計算した吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの吸光度によってタンパク質濃度を測定した。グリセロールを２０％の最終濃度まで添加し、酵素溶液を−２０または−８０℃で凍結した。
【００８８】
イソアルファ酸還元アッセイ
精製された酵素候補を、それらのイソアルファ酸を還元する能力に関して試験した。特定の反応が、イソアルファ酸（ｃｏ−、ｎ−  ａｄ−、およびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−）のいずれかまたはすべての異性体および同族体の、特定のケトン基を、ヒドロキシ基に還元することを伴う。２ｍＬの微小遠心管において、１００ｕＬの酵素溶液（最終濃度０．１５〜１．８ｍｇ／ｍＬの酵素）を、グルコースデヒドロゲナーゼ（２６３ｍＭリン酸ナトリウム、１．７ｍＭ硫酸マグネシウム、１．１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１．１ｍＭ  ＮＡＤ＋、８０ｍＭ  Ｄ−グルコース、４．３Ｕ／ｍＬグルコースデヒドロゲナーゼ、ｐＨ  ７．０）による補因子リサイクリングを伴う９００ｕＬの緩衝水溶液に添加した。５ｕＬのアルカリ性イソアルファ酸溶液（ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）、２９％イソアルファ酸）を、０．２９％イソアルファ酸という最終濃度で添加する。反応を、３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートした。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去した。ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりイソアルファ酸およびジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を検出した。ネガティブコントロールサンプルは、上記の反応成分を全て含むが、酵素溶液はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒで置き換えた。
【００８９】
結果
候補選択
公共の機能アノテーションおよびアミノ酸配列類似性に基づき、６０個のユニークな酵素配列を、レダクターゼ候補であるとして同定した。
【００９０】
酵素発現および精製
３０個の候補を、ＤＮＡの利用可能性、および６０個の候補の最初の群において示されるアミノ酸配列の多様性の十分なサンプリングに基づいて、発現および精製のために選択した。大部分の候補は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において良好な発現および溶解性レベルを示し、１リットルの培養物あたり５〜１００ｍｇの精製タンパク質の収量で変動した。いくつかの候補については、宿主生物における乏しい溶解性のために断念した。
【００９１】
レダクターゼ特徴付け
ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−  ｃｏ／ａｄ／ｎ−ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に対応するピークが、酵素を欠くコントロールサンプルよりも強い強度でＵＰＬＣによって検出された場合、酵素はイソアルファ酸を還元すると決定された。１０個の特有な酵素が、イソアルファ酸レダクターゼとして決定された（図３参照）。これらの酵素の詳細を表２に要約する。溶解度および酵素収率のために、アッセイにおける自家酵素の最終濃度は、０．１５〜１．８ｍｇ／ｍＬで変動させた。より低い酵素濃度は、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸収率に寄与する。
【００９２】
イソアルファ酸還元に必要なＮＡＤＰをリサイクルするために、酵素を最初に、グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤの存在下でレダクターゼ活性について試験した。レダクターゼ活性の決定後、酵素に関して、イソプロパノール、すなわち補因子リサイクリングのためのより経済的な代替物を酸化するそれらの能力について特徴付けを行った。イソプロパノールを効率的に酸化する能力を表２に示す。
【００９３】
【表２】
2022500063.tif 000006
【００９４】
基質特異性
生物学的変換目的のための理想的なケトレダクターゼは、側鎖組成に基づいて変化するイソフムロン同族体（ｎ−、ａｄ−、およびｃｏ−イソフムロンを参照）に関して基質特異性を示さない。さらに、ケトレダクターゼは、酵素的還元部位に近接したＣ４第三級アルコール基で空間的に変化するイソフムロンのｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体に関して特異性を示さない。基質特異性は、アミノ酸配列、および従って酵素の基質結合ポケットのジオメトリーによって影響される。より大きな結合ポケットは、より制限された結合ポケットと比較して、より大きな基質、ならびにより多様な基質を収容できる。（図４参照）。
【００９５】
２種の還元立体特異性が、特徴付けられたレダクターゼの間で観察された（図５を参照）。
【００９６】
イソアルファ酸分子上には２つの追加的なケトン基が存在するにもかかわらず、全ての特徴付けられたケトレダクターゼについて、Ｃ４側鎖での所望の還元だけが観察された。
【００９７】
例２−イソプロパノール酸化による補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
１．５ｍＬの微小遠心管において、１０ｍｇのレダクターゼを、７００ｕＬの緩衝水溶液（例えば、リン酸ナトリウムｐＨ  ７．５）中に再懸濁する。２９０ｕＬのイソプロパノールを添加する。１０ｕＬのアルカリ性イソアルファ酸溶液（２９％イソアルファ酸）を、０．２９％イソアルファ酸の最終濃度で添加する。反応を、３０℃において１８０ｒｐｍで４８時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去する。イソアルファ酸およびジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸をＨＰＬＣによって定量化する。
【００９８】
例３−イソプロパノール酸化による補因子リサイクリングを用いた酸性化ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソアルファ酸を例２に記載の様式で処理し、ここで、イソアルファ酸の供給源はｐＨ＜７を有する非常に濃厚な材料（６８．９％イソアルファ酸）である。
【００９９】
例４−グルコースデヒドロゲナーゼによる補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールを４．３Ｕ／ｍＬグルコースデヒドロゲナーゼ、０．７ｇ／Ｌ  ｍＭ  ＮＡＤおよび１４．４ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例２に記載の様式で処理する。
【０１００】
例５−補因子リサイクリングを伴わないホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールを基質としての等モル量のＮＡＤＰＨで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例２に記載の様式で処理する。
【０１０１】
例６−熱安定性レダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
天然の熱安定性レダクターゼは、好熱性細菌および古細菌生物（ａｒｃｈａｅａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、例えばテルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）から得られる。１．５ｍＬの微小遠心管において、１００ｕＬの酵素溶液（１．５〜１５．０ｍｇ／ｍＬ酵素）を、９００ｕＬの緩衝水溶液（２６３ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１．７ｍＭ硫酸マグネシウム、４．３Ｕ／ｍＬグルコースデヒドロゲナーゼ、１．１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、１．１ｍＭ  ＮＡＤ＋、８０ｍＭ  Ｄ−グルコース）に添加する。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、６０〜８０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去する。
【０１０２】
例７−エタノール酸化による補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールをエタノールで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例２に記載の様式で処理する。
【０１０３】
例８−ＳｉＯ２による固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをＳｉＯ２に吸着させ、グルタルアルデヒドを用いて架橋して、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例２に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０４】
例９−ＤＥＡＥ−セルロースによる固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ＤＥＡＥ−セルロース上に吸着させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例２に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０５】
例１０−ＰＥＩ処理アルミナによる固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ポリエチルイミン（ＰＥＩ）処理アルミナ上に吸着させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例２に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０６】
例１１−共固定化酵素を用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼおよび補因子リサイクリング酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼを、上記の方法のいずれかを利用して、単一の組成物中に連続的にまたは一緒に固定化して、共固定化された材料を得る。共固定化された材料を、緩衝水溶液（５０〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１〜１．０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０〜４０％イソプロパノール、ｐＨ７〜９）中０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に添加する。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０７】
例１２−架橋された／球状化された細胞を用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼを発現する細胞（細菌、真菌、植物）をポリアミン／グルタルアルデヒドで架橋し、押し出し、球状化して、固定化レダクターゼ材料を得る。固定化されたレダクターゼを、緩衝水溶液（５０〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１〜１．０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０〜４０％イソプロパノール、ｐＨ７〜９）中０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に添加する。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０８】
例１３−架橋された／封入された（Ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）細胞を用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼを発現する細胞（細菌、真菌、植物）をグルタルアルデヒドで架橋し、ゼラチンまたはポリマービーズ内に封入して、固定化レダクターゼ材料を得る。固定化されたレダクターゼを、緩衝水溶液（５０〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１〜１．０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０〜４０％イソプロパノール、ｐＨ７〜９）中０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に添加する。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０９】
例１４−生細胞を用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼを発現する微生物（細菌、真菌）を発酵により高密度に増殖させ、回収し、洗浄し、ペレット化して細胞ペーストを形成する。細胞ペーストを、０．１４５〜１６％イソアルファ酸を含有するフレッシュな増殖培地に再懸濁する。細胞培養物を、混合しながら２５〜３７℃で２４〜７２時間インキュベートする。細胞培養物を、１０，０００ｇで遠心分離して、使用済み増殖培地から細胞を除去する。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を、エタノールを用いて使用済み増殖培地から抽出する。
【０１１０】
例１５−細胞ライセートを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼを発現する微生物（細菌、真菌）を発酵により高密度に増殖させ、回収し、洗浄し、溶解して、粗製細胞ライセートを得る。イソアルファ酸を、０．１４５〜１６％イソアルファ酸の最終濃度まで粗製細胞ライセートに添加する。細胞培養物を、混合しながら２５〜４０℃で２４時間インキュベートする。反応混合物を、１０，０００ｇで遠心分離するかまたはろ過して、ライセートから細胞性物質を除去する。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を、エタノールを用いて清澄化ライセートから抽出する。
【０１１１】
例１６−好冷性レダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
レダクターゼが好冷性（低温耐性）微生物からのホモログである酵素処理。レダクターゼを、緩衝水溶液（５０〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１〜１．０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０〜４０％イソプロパノール、ｐＨ７〜９）中０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度に添加する。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、０〜２０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去する。
【０１１２】
例１７−ＮＡＤＨ補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ＮＡＤＰＨ補因子をＮＡＤＨで置き換えた酵素処理。イソアルファ酸を、例２に記載の様式で処理するが、ＮＡＤＰをＮＡＤで置き換える。
【０１１３】
例１８−エタノール酸化を介した補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノール出発物質をエタノールで置き換える酵素処理であって、緩衝水溶液（５０〜２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１〜１．０ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０〜４０％エタノール、ｐＨ  ７〜９）にレダクターゼを０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加する酵素処理。ＩＳＯＬＯＮＥ（登録商標）異性化ホップ抽出溶液（２９％イソアルファ酸）を最終濃度０．１４５〜１６％イソアルファ酸となるように添加する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去する。
【０１１４】
例１９−ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く抽出
酵素処理、それに続く、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の最終濃度を増加させるための抽出。イソアルファ酸を、例２に記載の様式で処理する。得られた反応混合物をろ過して酵素を除去し、食品グレードの溶媒で抽出して、所望の濃度のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を得る。
【０１１５】
例２０−ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く熱不活化
イソアルファ酸を、例２に記載の様式で処理する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を８０〜１００℃で１０〜３０分間加熱し、酵素を不活化する。
【０１１６】
例２１−ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く化学的不活化
イソアルファ酸を、例２に記載の様式で処理する。反応を、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。食品グレードのエタノールを＞５０％の最終濃度まで添加して酵素を不活化する。
【０１１７】
例２２−固定化ケトレダクターゼリサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ＤＥＡＥ−セルロース上に吸収させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。引き続き、イソアルファ酸を、例２に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、反応溶液から固定化ケトレダクターゼを分離する。固定化ケトレダクターゼを回収し、水または水性バッファーで洗浄し、新しい反応混合物中で再使用する。
【０１１８】
結論
２３種のケトレダクターゼが、イソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するものとして特徴付けられた。この研究において特徴付けられたケトレダクターゼは、以前に記載されていない酵素活性を有する。この研究で特徴付けられたケトレダクターゼは全てケトン基をアルコールに還元し、従ってケトレダクターゼである。これらの結果は、ケトレダクターゼ生体触媒が、新規な生物学的変換プロセスにおいてイソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するために使用し得ることを実証している。本発明は、水素化ホウ素ナトリウムを利用する現行の化学プロセスに取って代わるものである。
【０１１９】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様による範囲に限定されるものではない。実際、本明細書に記載される実施態様に加えて、種々の改変が前述の説明から当業者に明らかになるだろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０１２０】
本明細書において引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献および他の資料は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
参照文献
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９．Ｇｒｏｓ，  Ｊ．；  Ｔｒａｎ，  Ｔ．  Ｔ．  Ｈ．；  Ｃｏｌｌｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｏｄｏｕｒａｎｔ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｉｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｏｐ．  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ２０１３，  １１９  （４），  ２２１−２２７．
【図１】
2022500063.tif 000007
【図２】
2022500063.tif 000008
【図３】
2022500063.tif 000009
【図４】
2022500063.tif 000010
【図５】
2022500063.tif 000011
【図６】
2022500063.tif 000012
【配列表】
2022500063000001.app
【国際調査報告】
2022500063.tif 000013
2022500063.tif 000014
2022500063.tif 000015
2022500063.tif 000016
2022500063.tif 000017
2022500063.tif 000018