(57)【要約】  本発明では、膀胱炎及び膀胱癌を治療するための膀胱内尿路上皮細胞療法など、様々な用途で使用するために尿路上皮細胞を単離し、増殖するための、マウス、ブタ、ウシ及びヒト源など、哺乳動物膀胱由来の尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法論を開示している。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物源の尿路上皮細胞を培養するための方法であって、前記方法は、哺乳動物源から膀胱組織のサンプルを得ることと；（ａ）膀胱組織の前記サンプルの粘膜層から尿路上皮を解離することと；（ｂ）膀胱組織の前記サンプルから解離した尿路上皮細胞を単離することと；（ｃ）前記解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック培養系に植えることと；（ｄ）前記解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック環境及び培養培地で培養することと、を含み、前記解離した尿路上皮細胞は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞またはそれらの前駆細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物源が、ヒト、ブタ、ウシ、またはウマの供給源から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオミメティック培養系が、付着性細胞培養支持体のための基底膜様支持体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が、ＦＢＳ、細胞マトリックス、成長因子、及びシグナル伝達経路モジュレータからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地が、ｂＦＧＦ及び／または抗生物質−抗真菌剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、血清、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及び／またはＷＮＴ活性化因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地が、細胞外マトリックス分子及び多糖類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記尿路上皮幹細胞または前記尿路上皮前駆細胞の細胞集団を維持するために、前記解離した尿路上皮細胞を、有効量の成長因子、細胞外マトリックス分子、多糖類、及びシグナル伝達経路モジュレータと接触させることと、前記前駆細胞の細胞集団を増幅して、総細胞数を増加させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆細胞が、ＣＫ５／１４＋尿路上皮幹細胞、ＣＫ５／１４＋尿路上皮前駆細胞、尿路上皮前駆細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
膀胱炎を患っている対象を治療する薬物を製造するための医薬組成物の使用であって、前記対象に異種尿路上皮細胞を含む有効量の組成物を含む溶液を膀胱内投与することを含み、前記異種尿路上皮細胞が、尿路上皮幹細胞、尿路上皮始原細胞、尿路上皮前駆細胞、及び成熟尿路上皮細胞である、使用。
【請求項１１】
尿路上皮癌または膀胱癌に罹患している対象を治療する薬物を製造するための医薬組成物の使用であって、前記対象に異種尿路上皮細胞を含む有効量の組成物を含む溶液を膀胱内投与することを含み、前記異種尿路上皮細胞が、尿路上皮幹細胞、尿路上皮始原細胞、尿路上皮前駆細胞、及び成熟尿路上皮細胞である、使用。
【請求項１２】
前記異種尿路上皮細胞が、ヒト、ブタ、ウシ、ウマの供給源または他の哺乳動物源から選択される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
薬学的有効量の１つ以上の化学療法薬と組み合わせて、異種尿路上皮細胞を含む組成物の有効量を前記対象に膀胱内投与する薬学的に有効な量である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記１つ以上の化学療法薬が、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗薬、アロマターゼ阻害剤、Ｐ−糖タンパク質阻害剤及び白金複合体誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
腫瘍増殖が抑制され、腫瘍細胞死が増加する、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱関連疾患を治療するために哺乳動物の尿路上皮細胞を単離し、増殖させるための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、バイオミメティック培養系を使用して、増殖能の尿路上皮細胞を得て、マトリックス溶液中で単離された細胞を使用して尿路上皮機能不全を治療することに関する。より具体的には、本発明は、膀胱炎及び尿路上皮癌などの尿路上皮損傷を有する膀胱を治療して、免疫系及び尿路上皮機能を修復、復活及び回復させるための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、損傷した尿路上皮を修復し、膀胱炎及び尿路上皮癌を治療するために異種細胞源を使用して免疫系を復活させるための新規の技術及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱炎及び尿路上皮癌などの尿路上皮損傷は、深刻な罹患率を（膀胱癌（ＢＣａ）の主要な形態である進行性尿路上皮癌の死さえ）引き起こし得る。膀胱癌（ＢＣａ）は世界中で一般的な疾患であり、世界中において罹患率及び死亡率の主な原因であり（推定４２９，８００例）、年間で推定１６５，１００名が死亡している［１］。ＢＣａは２つの群に分けられる：７５％近くが低悪性度の乳頭状で、通常は表在性の非筋肉浸潤性ＢＣａ（ＮＭＩＢＣ）であり、予後良好であるのに対し、２５％近くが高悪性度の筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）である［２，３］。新たに診断された表在性膀胱腫瘍の約３０％が多発性であり、膀胱癌の多発性発生は、潜在的な発癌物質への環境曝露が膀胱癌のほとんどの症例を占める「広域発癌（ｆｉｅｌｄ  ｃａｎｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」効果によって説明できるが、ほとんどの場合、多発性尿路上皮癌はモノクローナルであり、管腔内播種及び単一の形質転換細胞の上皮内移動とそれに続く様々な遺伝的変化から生じる［４，５］。まず、表在性非筋肉浸潤性ＢＣａ（ＮＭＩＢＣ）の６０〜７０％が再発し、それらの１０〜２０％が筋肉浸潤性または転移性疾患への病期進行となる［６］。表在性膀胱腫瘍は、腫瘍の外科的経尿道的切除術（ＴＵＲ）及び嚢内（膀胱内）のＢＣＧ
2022501006.tif 000002
補助免疫療法またはすべての肉眼で見える膀胱腫瘍（ＴＵＲＢＴ）の経尿道的切除術後の化学療法によって治療されるが、再発率は依然として高い［７］。高リスクの表在性膀胱癌の再発を治療するためにマイコバクテリウム・ボビスの弱毒化形態の生菌を使用する嚢内ＢＣＧ免疫療法は、何十年にもわたって標準的な治療アプローチである［８］。ＢＣＧの嚢内注入の正確な抗腫瘍メカニズムは不明であるが、ＣＤ４  Ｔ細胞浸潤の誘導など、様々な局所的免疫応答が数ヶ月間持続し、腫瘍抑制効果と相関していると考えられ得る［９，１０］。生きた細菌が導入されるため、ＢＣＧにより重度の膀胱炎が引き起こされ得、ＢＣＧ敗血症による死亡さえ引き起こし得る［９］。さらに、根治的膀胱切除術及び全身化学療法を行う筋肉浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）の場合、これらの膀胱癌患者の少なくとも５０％は、依然として診断から２年以内に転移により死亡する［２］。さらに悪いことに、化学療法による治療は、転移性膀胱癌患者の５年生存率が１０％未満の患者の９５％において奏功しない［２］。その理由は、すべての治療法が癌細胞を終結させ、同時に正常細胞に損傷を与え、炎症を刺激するため、癌細胞がより悪い形態であっても成長して元の状態に戻る機会をもたらすためであり得る。米国では、膀胱癌の再発率が高いため、患者１名あたりの費用は９６，０００〜１８７，０００ドル（診断から死亡まで、すべての癌の中で最も高い）に達し［１１］、２０１０年の推定費用は３９．８億ドルであった［１２］。これらの負担は、膀胱癌に対する現在の治療法（手術、免疫療法、及び化学療法）が不適格であるためである。膀胱炎または膀胱の炎症は、膀胱及び／または尿管の粘膜表面の炎症を誘発する化学的、生物学的または物理的刺激によって引き起こされる［１３］。膀胱炎の患者は、切迫感、少量の頻尿、及び排尿による痛みを伴う灼熱感を経験し得る。さらに、患者は恥骨上痛、脇腹痛または背中痛も受け得る。膀胱炎のこれらの症状は、生活の質に深刻な悪影響を有する。膀胱炎には、出血性膀胱炎（ＨＣ）など、いくつかの主要な種類が存在する。この種類の膀胱炎は、高用量の化学療法を受ける癌患者（［１４］など）によく見られ、重症の場合は、致命的となり得る。化学療法誘発性膀胱炎では、ＨＣは、シクロホスファミドの肝代謝物であるアクロレインの尿中排泄によって引き起こされ、結果として、進行性粘膜損傷となる。さらに、放射線療法による前立腺癌または子宮頸癌などの骨盤新生物の治療中の電離放射線もまた、尿粘膜を損傷させることによって出血性膀胱炎となり得る。しかし、膀胱炎に対して現在利用可能な治療法は、効果的ではあるが、部分的な解決策であり、緩和をもたらすのみであり、したがって、最適な治療アプローチはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔｏｒｒｅ  ＬＡ，  Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，  Ｗａｒｄ  ＥＭ，  Ｊｅｍａｌ  Ａ：  Ｇｌｏｂａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ−−Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２０１６，  ２５（１）：１６−２７．
【非特許文献２】Ｗｕ  ＸＲ：  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：  ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５，  ５（９）：７１３−７２５．
【非特許文献３】Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇ，  Ｔｈｅｏｄｏｒｅｓｃｕ  Ｄ：  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００３，  １７０（５）：１９８７−１９９３．
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ，  Ｗａｎｇ  Ｍ，  Ｅｂｌｅ  ＪＮ，  ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ＧＴ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｌｔｒａｎ  Ａ，  Ｚｈａｎｇ  Ｓ，  Ｃｏｃｃｏ  Ａ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｌ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５，  １１（１８）：６５１２−６５１９．
【非特許文献５】Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ  Ｄ，  Ｆｒｏｓｔ  Ｐ，  Ｖｏｎ  Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ  Ａ，  Ｏｙａｓｕ  Ｒ，  Ｐｒｅｉｓｉｎｇｅｒ  ＡＣ，  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ：  Ｃｌｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９２，  ３２６（１１）：７３７−７４０．
【非特許文献６】Ｌｕｔｚｅｙｅｒ  Ｗ，  Ｒｕｂｂｅｎ  Ｈ，  Ｄａｈｍ  Ｈ：  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ３１５  ｃａｓｅｓ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９８２，  １２７（２）：２５０−２５２．
【非特許文献７】Ｂｕｒｇｅｒ  Ｍ，  Ｏｏｓｔｅｒｌｉｎｃｋ  Ｗ，  Ｋｏｎｅｔｙ  Ｂ，  Ｃｈａｎｇ  Ｓ，  Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ  Ｓ，  Ｐｒｕｔｈｉ  Ｒ，  Ｓｏｌｏｗａｙ  Ｍ，  Ｓｏｌｓｏｎａ  Ｅ，  Ｓｖｅｄ  Ｐ，  Ｂａｂｊｕｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ：  ＩＣＵＤ−ＥＡＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２：  Ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｄｄｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ２０１３，  ６３（１）：３６−４４．
【非特許文献８】Ｍｏｒａｌｅｓ  Ａ，  Ｅｉｄｉｎｇｅｒ  Ｄ，  Ｂｒｕｃｅ  ＡＷ：  Ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９７６，  １１６（２）：１８０−１８３．
【非特許文献９】Ａｌｅｘａｎｄｒｏｆｆ  ＡＢ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＡＭ，  Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ＭＡ，  Ｊａｍｅｓ  Ｋ：  ＢＣＧ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ２０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．  Ｌａｎｃｅｔ  １９９９，  ３５３（９１６５）：１６８９−１６９４．
【非特許文献１０】Ｂｏｈｌｅ  Ａ，  Ｂｒａｎｄａｕ  Ｓ：  Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００３，  １７０（３）：９６４−９６９．
【非特許文献１１】Ｂｏｔｔｅｍａｎ  ＭＦ，  Ｐａｓｈｏｓ  ＣＬ，  Ｒｅｄａｅｌｌｉ  Ａ，  Ｌａｓｋｉｎ  Ｂ，  Ｈａｕｓｅｒ  Ｒ：  Ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈ  ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ２００３，  ２１（１８）：１３１５−１３３０．
【非特許文献１２】Ｍａｒｉｏｔｔｏ  ＡＢ，  Ｙａｂｒｏｆｆ  ＫＲ，  Ｓｈａｏ  Ｙ，  Ｆｅｕｅｒ  ＥＪ，  Ｂｒｏｗｎ  ＭＬ：  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：  ２０１０−２０２０．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２０１１，  １０３（２）：１１７−１２８．
【非特許文献１３】Ｇｒｏｖｅｒ  Ｓ，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ａ，  Ｌｅｅ  Ｒ，  Ｔｅｗａｒｉ  ＡＫ，  Ｔｅ  ＡＥ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ．  Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｕｒｏｌ  ２０１１，  ３（１）：１９−３３．
【非特許文献１４】Ｔａｌａｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃ，  Ｈｉｊａｚｉ  ＹＭ，  Ｗａｌｔｈｅｒ  ＭＭ，  Ｌｉｎｅｈａｎ  ＷＭ，  Ｈａｌｌａｈａｎ  ＣＷ，  Ｌｕｂｅｎｓｋｙ  Ｉ，  Ｋｅｒｒ  ＧＳ，  Ｈｏｆｆｍａｎ  ＧＳ，  Ｆａｕｃｉ  ＡＳ，  Ｓｎｅｌｌｅｒ  ＭＣ：  Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｗｅｇｅｎｅｒ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ．  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９９６，  １２４（５）：４７７−４８４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、哺乳動物源から尿路上皮細胞を培養するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本方法は、（ａ）哺乳動物源から膀胱組織のサンプルを入手することと；（ｂ）膀胱組織のサンプルの粘膜層から尿路上皮を解離させることと；（ｃ）膀胱組織のサンプルから解離した尿路上皮細胞を単離することと；（ｄ）解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック培養系に植えることと；（ｅ）解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック環境及び培養培地で培養することと、を含み、解離した尿路上皮細胞は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞、それらの前駆細胞及び成熟細胞を含む。
【０００６】
本発明はまた、膀胱炎、尿路上皮癌、または膀胱癌に罹患している対象を治療するための方法を提供し、本方法は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞、及び細胞マトリックス分子及び多糖類を含む有効量の組成物を対象に膀胱内投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】膀胱内細胞療法のためのバイオミメティック培養法を用いて尿路上皮細胞を単離し、増殖させるための例示的なプロトコルを示す概略グラフを示す図である。
【図１Ｂ】膀胱炎または尿路上皮癌を伴う膀胱に異種尿路上皮細胞を注入することによる膀胱内細胞療法に関する本発明の好ましい実施形態を示す概略図である。
【図２Ａ】継代１でのＰＵＣ細胞の代表的な画像を示す図である。スケールバーは、５０ｍを表す。ＰＵＣ：ブタの尿路上皮細胞。
【図２Ｂ】継代５でのＰＵＣ細胞の代表的な画像を示す図である。スケールバーは、５０ｍを表す。ＰＵＣ：ブタの尿路上皮細胞。
【図２Ｃ】継代３ＰＵＣ細胞で行ったＣＫ５及びＣＫ１４発現のウエスタンブロット分析を示す図である。スケールバーは、５０ｍを表す。ＰＵＣ：ブタの尿路上皮細胞。
【図２Ｄ】ＣＫ５及びＣＫ１４に対する抗体、ＤＡＰＩで染色された核、４００倍の倍率で実施した継代３のＰＵＣ細胞の免疫蛍光染色の図である。スケールバーは、５０ｍを表す。ＤＡＰＩ：４０６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＰＵＣ：ブタの尿路上皮細胞。
【図３】ブタの尿路上皮細胞の成長に対する異なる培養条件の影響を示す図である。細胞は、ｂＦＧＦ（１０μｇ／ｍｌ）＋Ｙ２７６３２（１０μＭ）の組み合わせで治療されたマトリゲルコーティングされた９６ウェルプレートまたはｂＦＧＦ＋Ｙ２７６３２治療プレートを備えたマトリゲルコーティングプレートのいずれかで１日間、２日間、及び６日間培養した。異なる時点で、細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。データは平均±ＳＤとして表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、１０％ＦＢＳのみの群と比較。Ｙ２７６３２はＲＯＣＫ阻害剤である。
【図４Ａ】溶媒対照群及びＰＵＣ治療群のシクロホスファミド注射後１日目のマウス膀胱の代表的な画像を示す図である。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。スケールバーは、５０μｍを表す。ＣＰＰ：シクロホスファミド。
【図４Ｂ】対照群及びＰＵＣ治療群の膀胱重量／体重比を示す図である。。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル対照。
【図４Ｃ】ヘマトキシリン−エオシン染色膀胱切片の代表的な組織学的変化を示す図である。スケールバーは、５０μｍを表す。ＣＰＰ：シクロホスファミド。
【図４Ｄ】溶媒対照及びＰＵＣ治療マウスの膀胱切片の浮腫指数を示す図である。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル対照。
【図５Ａ】溶媒対照群及びＰＵＣ治療群からの膀胱切片上のＩＨＣ染色されたＫｉ−６７の代表的な画像を示す図である。スケールバーは、５０μｍを表す。
【図５Ｂ】ＣＰＰ注射及び治療後の尿路上皮細胞増殖の定量化を示す図である。Ｋｉ−６７陽性細胞は、ＣＰＰ注射の２４時間後の全細胞のパーセントとして示す。データは平均＋ＳＤとして表し、有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって計算した。＊＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル対照。
【図５Ｃ】膀胱切片の代表的なＴＵＮＥＬ染色画像を示す図である。スケールバーは、５０μｍを表す。スケールバーは、５０μｍを表す。点線は、尿路上皮と固有層との境界を示す。Ｌ：膀胱内腔；ＴＵＮＥＬ：末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニックエンド標識。
【図５Ｄ】ＧＡＧ層のアルシアンブルー染色を示す図である。矢印は、ＧＡＧ層を示す。スケールバーは、５０μｍを表す。ＧＡＧ：グリコサミノグリカン。
【図６Ａ】ＭＢＴ−２−ｌｕｃ同所性移植膀胱腫瘍モデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、腫瘍生物発光シグナルが総ｐｌｅｘ（ｔｏｔａｌ  ｐｌｅｘ）１０５に達したときに登録した担腫瘍マウスの、治療スキームを示した図である。
【図６Ｂ】ＭＢＴ−２−ｌｕｃ同所性移植膀胱腫瘍モデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、治療前後の担腫瘍マウスの代表的なＩＶＩＳ画像を示した図である。
【図６Ｃ】ＭＢＴ−２−ｌｕｃ同所性移植膀胱腫瘍モデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  １３によって計算した、３つの独立した研究での異なる治療群の担腫瘍マウスの無憎悪カプランマイヤー生存曲線を示す図である。Ｐ値は、併用療法対異種尿路上皮細胞免疫療法及び化学療法について示す。
【図６Ｄ】ＭＢＴ−２−ｌｕｃ同所性移植膀胱腫瘍モデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  １３によって計算した、３つの独立した研究での異なる治療群の担腫瘍マウスの全生存曲線を示す図である。Ｐ値は、併用療法対異種尿路上皮細胞免疫療法及び化学療法について示す。
【図７Ａ】異なる治療群のマウスの腫瘍を採取し、処理し、腫瘍細胞Ｋｉ−６７ＩＨＣ及びＴＵＮＥＬ分析評価のために切片化し、Ｋｉ−６７  ＩＨＣ染色をして細胞増殖４５について評価した図である。
【図７Ｂ】３回の独立した実験のマウスから数えた腫瘍切片上のＫｉ−６７陽性細胞を定量化した図である。値は、平均±平均の標準誤差（ｎ＝３）として表す。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。
【図７Ｃ】腫瘍切片をＴＵＮＥＬ（ＦＩＴＣ）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した図である。核染色にはＤＡＰＩを使用した。スケールバー、５０μｍ。
【図７Ｄ】３回の独立した実験のマウスから数えた腫瘍切片上のＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化した図である。値は、平均±平均の標準誤差（ｎ＝３）として表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【図８Ａ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示し、特に抗ＣＤ４  ＩＨＣ染色の代表的な画像を示した図である。
【図８Ｂ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示し、特にＣＤ８  ＩＨＣ染色の代表的な画像を示した図である。
【図８Ｃ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示す図で、特に、ＮＫＧ２Ｄ  ＩＨＣ染色の代表的な画像を示した図である。
【図８Ｄ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示す図で、特に、各群３匹のマウスからランダムに選択した４つのＨＰＦの陽性細胞を数えることによる、各治療群の腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球の定量化を示した図である。データは、平均値±ＳＤとして表した。エラーバーはＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図８Ｅ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示す図で、特に、各群３匹のマウスからランダムに選択した４つのＨＰＦの陽性細胞を数えることによる、各治療群の腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔリンパ球の定量化を示した図である。データは、平均値±ＳＤとして表した。エラーバーはＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図８Ｆ】異なる治療を受けたＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍浸潤リンパ球及びＮＫ細胞の変化を示す図で、特に、各群３匹のマウスからランダムに選択した４つのＨＰＦの陽性細胞を数えることによる、各治療群の腫瘍におけるＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞の定量化を示した図である。データは、平均値±ＳＤとして表した。エラーバーはＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【図９Ａ】ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、担腫瘍マウスに対して実験を行うときのスキームを示した図である。
【図９Ｂ】ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、異なる治療を受けたマウスの肉眼的腫瘍の代表的な写真を示す図である。
【図９Ｃ】ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、異なる治療群の腫瘍重量（平均±ＳＤ、３回の独立した実験の少なくとも９匹のマウス）を示す図である。ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図９Ｄ】ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、異なる治療群の腫瘍の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す図である。
【図９Ｅ】ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおける膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用療法の抗腫瘍効果を示す図で、特に、異なる治療を受けたマウスの膀胱Ｈ＆Ｅ染色切片における過形成及び新生物性変化の割合の病理学的分析のヒストグラムを示す図である。
【図１０Ａ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞増殖に対する免疫活性化を示す図で、特に、異種尿路上皮細胞との２日間の培養後のＣＦＤＡ−ＳＥ標識リンパ球のフローサイトメトリー分析プロファイルを示す図である。
【図１０Ｂ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞増殖に対する免疫活性化を示す図で、特に、治療開始後２日目に採取された異種尿路上皮細胞に応答する増殖リンパ球の割合（パーセンテージ）を示す図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。平均は±ＳＤで示し、４つの別々の実験を表す。
【図１０Ｃ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞増殖に対する免疫活性化を示す図で、特に、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞との２日間の培養後のＣＦＤＡ−ＳＥ標識リンパ球のフローサイトメトリー分析プロファイルを示す図である。
【図１０Ｄ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞増殖に対する免疫活性化を示す図で、特に、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞に応答する増殖リンパ球の割合（パーセンテージ）を示す図である。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。平均は±ＳＤで示し、４つの別々の実験を表す。
【図１１Ａ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、異なる治療群のマウス由来のリンパ球によるＩＦＮγ産生に対する異種尿路上皮細胞の相対的刺激活性を示す図である。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【図１１Ｂ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、異なる治療群のマウス由来のリンパ球によるＩＦＮγ産生に対するＭＢＴ−２−ｌｕｃの相対的刺激活性を示す図である。＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図１１Ｃ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、異種尿路上皮細胞を標的とする様々な治療を受けたマウス由来のリンパ球を添加したウェルの代表的な蛍光画像を示す図である。
【図１１Ｄ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、異種尿路上皮細胞を標的とするエフェクターリンパ球の細胞毒性の定量化を示す図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図１１Ｅ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞を標的とする様々な治療を受けたマウス由来のリンパ球を添加したウェルの代表的な蛍光画像を示す図である。
【図１１Ｆ】異なる治療によるＭＢＴ−２−ｌｕ−腫瘍担持マウスにおける反応性Ｔ細胞サイトカインの産生及び細胞毒性に対する刺激活性を示す図で、特に、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞を標的とするエフェクターリンパ球の細胞毒性の定量化を示す図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、哺乳動物の膀胱組織から尿路上皮細胞を培養するための方法を提供する。膀胱内尿路上皮細胞療法のために正常な尿路上皮細胞を生成する方法が必要である。本発明は、他の望ましい特性を有することに加えて、この必要性に対処するための解決策に向けられている。尿路上皮細胞を単離し、増殖させる方法が必要である。本発明は、他の望ましい特性を有することに加えて、この必要性に対処するための解決策に向けられている。
【０００９】
一態様では、本発明は、ヒト、ブタ、ウシ及びウマの供給源など、異なる哺乳動物源からの尿路上皮細胞を培養するための方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：第１のステップ−膀胱組織を哺乳動物源から取り除く。第２のステップ−酵素及び物理的手順を使用して、膀胱組織の粘膜層から尿路上皮を切片化する。第３のステップ−解離した尿路上皮細胞を単離し、付着細胞培養支持体用の基底膜様支持体を構成するバイオミメティック環境において、ならびにＦＢＳ、細胞マトリックス、成長因子、及びシグナル伝達経路モジュレータを含む培養培地で細胞を培養する。バイオミメティック系では、解離した尿路上皮細胞を尿路上皮幹／前駆細胞と共に増殖する。
【００１０】
この方法は、幹／前駆細胞集団を維持し、前駆細胞集団を増幅して総細胞数を増加させるために、尿路上皮幹／前駆細胞、その前駆細胞または成熟細胞を含む細胞集団を有効量の成長因子、細胞外マトリックス及びシグナル伝達経路モジュレータと接触させることを含む。
【００１１】
本発明の態様によれば、細胞前駆体は、ＣＫ５／１４＋尿路上皮幹／前駆細胞、尿路上皮前駆細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明の態様によれば、期間は３日間〜１０日間を含む。本発明の態様によれば、細胞培養集団は、少なくとも５０％及び９０％の尿路上皮幹／前駆細胞を含む。単離された尿路上皮幹／前駆細胞またはその集団は、尿路上皮幹／前駆細胞マーカー遺伝子を発現する。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、単離された尿路上皮幹／前駆細胞及び細胞マトリックスを含む組成物が提供される。本発明の一実施形態によれば、それを必要とする対象を治療するための方法が開示される。この方法は、それを必要とする対象に、単離された尿路上皮幹／前駆細胞及び細胞マトリックスを含む組成物を膀胱内投与することを含む。本発明の態様によれば、対象は、筋肉浸潤性膀胱癌を有するか、またはそのリスクが増加している。
【００１３】
本発明は、対象の哺乳動物膀胱の尿路上皮細胞のバイオミメティック培養のための方法論に関する。例えば、本発明はまた、ブタ膀胱の尿路上皮幹／前駆細胞を迅速かつ効率的に単離し、増殖させるための新規プロトコルに関する。これらの増殖した尿路上皮幹／前駆細胞は、膀胱炎及び尿路上皮癌などの尿路上皮機能不全の治療に使用され得る。この分野でのこれまでの研究では、尿路上皮損傷を治療するために膀胱組織由来の尿路上皮幹／前駆細胞を培養する際にバイオミメティック培養を使用していなかった。以前の研究では、細胞を２Ｄ環境で培養するのみであり、マトリックス及びシグナル伝達の変調なく、尿路上皮細胞の本来の成長条件及び維持条件を再現するものではない。
【００１４】
一実施形態では、対象は動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、マウスまたはラットなどのげっ歯類である。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウマ、イヌ、及び／または家畜として使用されるかまたはペットとして飼育される任意の他の種の動物である。
【００１５】
増殖した尿路上皮細胞の表現型は、マーカーを評価することによって決定できる。マーカーの発現は、当技術分野で公知である様々な方法によって評価できる。マーカーの存在は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドレベルで決定できる。一実施形態では、この方法は、マーカー遺伝子ポリペプチド発現の存在を検出することを含むことができる。ポリペプチドの発現には、マーカー遺伝子のポリペプチド配列の有無が含まれる。これらは、配列決定及び／または特定のリガンド（抗体など）への結合など、当技術分野で公知である様々な技術によって検出することができる。例えば、ポリペプチド発現は、これらに限定されないが、免疫染色、ＦＡＣＳ分析、またはウエスタンブロットなどの方法によって評価され得る。これらの方法は当技術分野において周知である。
【００１６】
別の実施形態では、この方法は、例えば尿路上皮細胞におけるマーカー遺伝子（例えば、ｐ６３、Ｋｉ−６７、ＣＫ５、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ２０、またはそれらの組み合わせ）ＲＮＡ発現の存在を検出することを含み得る。ＲＮＡ発現には、ＲＮＡ配列の存在、ＲＮＡスプライシングまたはプロセシングの存在、または大量のＲＮＡの存在が含まれる。これらは、マーカー遺伝子ＲＮＡの全部もしくは一部による、またはＲＮＡの全部もしくは一部の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅など、当技術分野で公知である様々な技術によって検出することができる。
【００１７】
本発明の実施形態によれば、それを必要とする対象を治療するための方法が提供される。一実施形態では、本発明は、損傷した尿路上皮を修復するための膀胱の膀胱炎の治療に関する。
【００１８】
この方法は、それを必要とする対象に、細胞外マトリックスを組み合わせた培地において、増殖した尿路上皮細胞の単離された集団を投与することを伴う。いくつかの態様では、対象は膀胱炎を有する。本発明の方法によって生成した増殖尿路上皮細胞は、膀胱炎の治療のために対象に膀胱内投与できる。いくつかの態様では、対象は、尿路上皮癌を有する。いくつかの態様では、対象に投与することは、尿路上皮細胞を対象に膀胱内投与することを含む。対象は、ヒト対象または動物対象であり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、損傷した尿路上皮を修復し、抗腫瘍免疫を復活させるための膀胱癌の治療に関する。
【００２０】
いくつかの態様では、治療の方法は、マトリックスを含む培地に細胞を組み込むことをさらに含む。細胞は、患者に投与する前に、マトリックス含有培地でｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができる。
【００２１】
一実施形態では、培養培地はｂＦＧＦを含む。別の実施形態では、培養培地はｂＦＧＦを含まない。一実施形態では、培養培地は、抗生物質−抗真菌剤を含む。別の実施形態では、培養培地は、抗生物質−抗真菌剤を含まない。
【００２２】
一実施形態では、培養培地は、これに限定されないが、ＦＢＳなどの血清を含む。別の実施形態では、培養培地は、これに限定されないが、ＦＢＳなどの血清を含まない。一実施形態では、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。別の実施形態では、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ阻害剤を含む。別の実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ阻害剤を含まない。一実施形態では、培養培地は、ＷＮＴ活性化因子を含む。別の実施形態では、培養培地は、ＷＮＴ活性化因子を含まない。
【００２３】
一実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスを含む。別の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスを含まない。一実施形態では、培養培地は、マトリゲルを含む。別の実施形態では、培養培地は、マトリゲルを含まない。
【００２４】
一実施形態では、増殖尿路上皮細胞は、細胞培養培地でインキュベートする。一実施形態では、細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。別の実施形態では、細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）である。一実施形態では、細胞培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充される。
【００２５】
一実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、単一の細胞懸濁液に解離される。別の実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、細胞クラスターに解離される。
【００２６】
一実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、機械的に解離される。一実施形態では、組織サンプルは、鋏で細分化することによって機械的に解離される。
【００２７】
一実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、酵素的に解離される。一実施形態では、組織サンプルは、コラゲナーゼを補充した細胞培養培地と組織をインキュベートすることによって酵素的に解離される。コラゲナーゼは、組織内に見られるコラーゲンを分解することができる。
【００２８】
一実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、ヒアルロニダーゼを補充した細胞培養培地と組織をインキュベートすることによって酵素的に解離される。ヒアルロニダーゼは、組織内に見られるヒアルロン酸を分解することができる。
【００２９】
一実施形態では、組織サンプル、例えば、尿路上皮サンプルは、ディスパーゼＩＩが補充された細胞培養培地と組織をインキュベートすることによって酵素的に解離される。ディスパーゼＩＩは、組織内に見られるコラーゲンを分解できる。
【００３０】
一実施形態では、細胞培養培地には、コラゲナーゼヒアルロニダーゼ及びディスパーゼＩＩが補充される。
【００３１】
一実施形態では、解離した組織細胞懸濁液、例えば、解離した尿路上皮細胞懸濁液を、４０μｍのセルストレーナを通して濾過させる。一実施形態では、解離した組織細胞懸濁液を、７０μｍのセルストレーナを通して濾過させる。別の実施形態では、解離した組織細胞懸濁液は、１００μｍのセルストレーナを通して濾過させる。
【００３２】
細胞は、以前の培養物から新鮮な培地を含む培養物に移すことによって継代され得る。一実施形態では、誘導された上皮細胞は、細胞培養において、少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも２０継代、少なくとも２５継代、または少なくとも３０継代の間、安定して維持される。
【００３３】
一実施形態では、細胞、例えば、尿路上皮細胞は、各ウェルにディスパーゼを添加することによって継代用に調製される。一実施形態では、細胞、例えば、尿路上皮細胞は、各ウェルにトリプシンを添加することによって継代される。
【００３４】
培地には、次のカテゴリのいずれかからの１つ以上の成分を選択的に補充することもできる：（１）塩、例えば、マグネシウム、カルシウム、及びリン酸塩；（２）ホルモン、及び血清、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、及び線維芽細胞成長因子などの他の成長因子；（３）タンパク質及び組織の加水分解物、例えば、精製ゼラチン、植物材料、または動物副産物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物；（４）ヌクレオシド及びアデノシン、チミジン、ヒポキサンチンなどの塩基；（５）ＨＥＰＥＳなどの緩衝液；（６）ゲンタマイシンまたはアンピシリンなどの抗生物質；（７）プルロニックポリオールなどの細胞保護剤、ならびに（８）ガラクトース。
【００３５】
本発明で使用できる尿路上皮細胞は、培養される特定の細胞またはオルガノイドに好適な培地で調製される。一実施形態では、培養培地は、哺乳動物源の血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が補充された前述のもの（例えば、ＤＭＥＭ、またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地）のうちの１つであり得る。
【００３６】
一態様では、本発明は、尿路上皮細胞を提供し、尿路上皮細胞は、（ａ）対象から膀胱組織のサンプルを得ることと；（ｂ）尿路上皮を解離することと；（ｃ）膀胱組織のサンプルから、解離した尿路上皮細胞を単離することと；（ｄ）（ｃ）の単離された解離膀胱上皮細胞をバイオミメティック培養系にプレーティングすることと；（ｅ）解離した尿路上皮細胞を、ＦＢＳ、シグナル伝達経路モジュレータ、細胞外マトリックス分子及び多糖類を含む培養培地で培養することと、を含む方法によって得られ、解離した尿路上皮細胞が形成される。
【００３７】
細胞外マトリックス分子は、プロテオグリカン、非プロテオグリカン多糖類、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンからなる群から選択される。
【００３８】
本明細書に記載の治療用途のいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトなどの哺乳動物など、そのような膀胱内細胞療法を必要とするあらゆる対象に適用することができる。
【００３９】
本発明は、哺乳動物源から尿路上皮細胞を培養するための方法を提供し、本方法は、（ａ）哺乳動物源から膀胱組織のサンプルを得ることと；（ｂ）膀胱組織のサンプルの粘膜層から尿路上皮を解離することと；（ｃ）膀胱組織のサンプルから解離した尿路上皮細胞を単離することと；（ｄ）解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック培養系に植えることと；（ｅ）解離した尿路上皮細胞をバイオミメティック環境及び培養培地で培養することと、を含み、解離した尿路上皮細胞は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞、それらの前駆細胞及び成熟細胞を含む。
【００４０】
一実施形態では、哺乳動物源は、ヒト、ブタ、ウシ、またはウマの供給源から選択される。一実施形態では、解離は、酵素及び物理的手順によって処理される。一実施形態では、バイオミメティック培養系は、付着性細胞培養支持体のための基底膜様支持体を含む。一実施形態では、培養培地は、ＦＢＳ、細胞マトリックス、成長因子、及びシグナル伝達経路モジュレータからなる群から選択される。一実施形態では、培養培地は、ｂＦＧＦ、及び／または抗生物質−抗真菌剤を含む。一実施形態では、培養培地は、血清、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及び／またはＷＮＴ活性化因子を含む。一実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックス分子及び多糖類を含む。一実施形態では、細胞外マトリックス分子は、プロテオグリカン、非プロテオグリカン多糖、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンからなる群から選択される。一実施形態では、培養培地は、マトリゲルを含む。一実施形態では、この方法は、尿路上皮幹細胞または尿路上皮前駆細胞の細胞集団を維持するために、解離した尿路上皮細胞を、有効量の成長因子、細胞外マトリックス分子、多糖類、及びシグナル伝達経路モジュレータと接触させることと、前駆細胞の細胞集団を増幅して、総細胞数を増加させることと、をさらに含む。一実施形態では、前駆細胞は、ＣＫ５／１４＋尿路上皮幹細胞、ＣＫ５／１４＋尿路上皮前駆細胞、尿路上皮前駆細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４１】
本発明はまた、膀胱炎、尿路上皮癌、または膀胱癌に罹患している対象を治療するための方法を提供し、本方法は、尿路上皮幹細胞、尿路上皮前駆細胞、及び細胞マトリックス分子及び多糖類を含む有効量の組成物を対象に膀胱内投与することを含む。一実施形態では、この方法は、尿路上皮幹細胞及び尿路上皮前駆細胞を細胞外マトリックス分子及び多糖類と共に組み込むことをさらに含む。一実施形態では、細胞外マトリックス分子は、プロテオグリカン、非プロテオグリカン多糖、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンからなる群から選択される。一実施形態では、組成物は、５〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養培地を含む。
【００４２】
一実施形態では、膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法及びＧＣ化学療法の併用治療は、同所性ＭＢＴ−２−ｌｕｃ移植膀胱腫瘍マウスモデルにおいて相乗的抗腫瘍効果を有していた。一実施形態では、膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ならびにゲムシタビン及びシスプラチン化学療法の併用治療は、ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおいて相乗的に腫瘍の進行を遅延させる。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な態様及び特徴を単に代表するものである。
【００４４】
材料及び方法
ＰＵＣの単離及び培養
尿路上皮細胞を単離するためのブタ膀胱は、地元の食肉処理場から入手した。膀胱組織を１〜２ｃｍ２の組織片に解剖し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に溶解したディスパーゼＩＩで治療して、尿路上皮を剥取した。剥取した尿路上皮を細分化し、ＨＢＳＳ（１００Ｕ／ｍｌ）中のＶＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含む細胞分離溶液でインキュベートして、細胞の解凝集を行った。ブタ上皮細胞を単離し、抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、アンホテリシンＢ５ｍｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、成長因子、またはシグナル伝達経路の阻害剤を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ１２培地を含むマトリゲルコーティングディッシュで培養した。継代２〜１０の細胞を実験に使用した。
【００４５】
シクロホスファミド誘発性膀胱炎におけるＰＵＣ細胞療法
雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪ９週齢のマウスは、Ｌａｓｃｏ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。化学的損傷誘発性膀胱炎を誘発するために、マウスに、３００ｍｇ／ｋｇのＣＰＰ（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を含む１００ｍｌのＰＢＳ溶液を腹腔内注射した。ＣＰＰ誘発性膀胱炎マウスは、ランダムに２つの群（溶媒治療対照及びＣＰＰ注射の４時間後のＰＵＣ治療群）に分けた。溶媒治療群には、マウスに溶媒の膀胱内注入を行い、ＰＵＣ治療群には、１０６個の細胞（継代１〜継代５）を膀胱に膀胱内注入した。簡潔に述べると、カテーテルチューブを尿道を介して膀胱に導入し、シリンジを使用して溶媒またはＰＵＣ細胞を膀胱に注入し、５０分間放置して、ＰＵＣ細胞を付着させた。治療２０時間後にすべてのマウスを安楽死させ、膀胱を迅速に除去して、体重を量り、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定させた。組織を縦方向に切断し、通常はパラフィンに包埋し、切片化し、組織病理学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。尿路上皮の完全性を評価するために、尿路上皮グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層のアルシアンブルー染色も行った。浮腫スコアは、膀胱炎の重症度を反映するように各膀胱の切片を調べることによって決定した。スコアは次のとおり決定した：０＝浮腫の明らかな兆候はない；１＝固有層の拡大が正常サイズの２倍未満である軽度の浮腫；２＝正常と比較して、固有層サイズの２倍である中等度の浮腫；３＝正常と比較して、固有層サイズが３倍である中等度の浮腫；４＝固有層の重度の浮腫、及び排尿筋の固有層の拡大が正常サイズの３倍以上である。動物プロトコルは、Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ＩＡＣＵＣ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００４６】
同系マウス移植ＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍モデル
雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪ  ９週齢マウスを使用して、壁内同所性モデルを確立した。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するＭＢＴ−２マウス尿路上皮癌細胞（ＭＢＴ−２−ｌｕｃ）をマウス膀胱壁に筋肉内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００によって画像化した腫瘍を週に１回捕捉した。生物発光イメージングで、腫瘍が総フラックス約１ｘ１０５ｐ／ｓに達したときに、マウスを対照群及び実験群に分ける。担腫瘍マウスは、４つの治療群に分けた：（ｉ）溶媒対照、（ｉｉ）異種尿路上皮細胞：異種尿路上皮細胞（１ｘ１０６細胞）の膀胱内注入、週に１回、３日目から４週間、（ｉｉｉ）ゲムシタビン及びシスプラチン（ＧＣ）の化学療法：ゲムシタビン（６ｍｇ／マウス、１日目及びシスプラチン（０．１２ｍｇ／マウス、２日目）の腹腔内注射（ＩＰ）を週に１回、４週間及び（ｉｖ）併用治療。すべてのマウス実験は、Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  （ＩＡＣＵＣ）  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄによって承認された。正常な異種尿路上皮細胞の膀胱内注入では、サブコンフルエントな細胞がトリプシン処理され、トリパンブルー排除法によって、９０％を超える細胞生存率が確認される。雌のＣ３Ｈマウスは、イソフルランで麻酔する。腹部に軽度の圧力を加えることによって、膀胱から尿を排出させる。２４ゲージのカテーテルは、尿道内を通して膀胱の内腔に導入させる。次に、１ｘ１０６異種尿路上皮細胞を含む１００μｌの懸濁液を膀胱に注入する。異種尿路上皮細胞の排出を防ぐために、注射シリンジを取り付けた状態でカテーテルを少なくとも４０分間所定の位置に保持する。マウスが麻酔から回復する前に、カテーテルを抜去する。マウスの応答は、ベースラインからのＢＬＩ総フラックス強度の変化について分析する。次に、マウスの無憎悪生存率（腫瘍体積が２０％増加）及び全生存率（死亡時またはヒトのエンドポイント：１３匹の動物が重篤な罹患の兆候を呈する）をすべて、カプランマイヤー法によって分析する。
【００４７】
Ｎ−ブチル−Ｎ−（４−ヒドロキシブチル）−ニトロソアミン（ＢＢＮ）誘発腫瘍モデル
ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍を形成するために、濃度０．０５％のＢＢＮ（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を飲料水に溶解させ、膀胱腫瘍形成の兆候として、血尿スコアが２＋（Ａｒｋｒａｙ  Ａｕｔｉｏｎ  Ｓｔｉｃｋｓ尿試験紙）を超えるまで、暗色ボトルに入ったＢＢＮ含有水を８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０〜２０週間自由に与えた。ＢＢＮ誘発腫瘍担持マウスは、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍担持マウスにおける実験スキームに従って治療した。治療後、膀胱を採取し、秤量し、組織学的検査を行った。結果は、６つの独立した実験からプールした。病理学的評価は、膀胱のＨ＆Ｅ染色パラフィン切片で実施し、以下のとおり定義した；過形成、浸潤のない上皮肥厚；上皮内癌（ＣＩＳ）、上皮層に限定された癌細胞；浸潤、粘膜下層または筋層への癌細胞の浸潤。すべてのマウス実験は、Ｃｈｉｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄによって承認された。
【００４８】
混合リンパ球増殖アッセイ
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）増殖アッセイの場合、異なる治療を行ったＭＢＴ−２−ｌｕｃ担腫瘍マウスの脾臓のリンパ球を、５μＭＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ１１５７，ＵＳＡ）を含むＰＢＳと共に暗所で１５分間インキュベートし、次いで洗浄した。アッセイは、１ｘ１０５の標的異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞を脾臓由来の５ｘ１０５のＣＦＤＡ−ＳＥ標識リンパ球（Ｅ／Ｔ比５：１）と２日間共培養することによって実施した。リンパ球中のＣＦＤＡ−ＳＥ蛍光の強度を測定し、リンパ球は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【００４９】
細胞毒性アッセイ
標的異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞をＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、２４時間プレーティングし、エフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比＝１０で異なる治療を行った１４のマウスの脾臓から単離させたエフェクターリンパ球と共培養した。４時間のインキュベーション後、エフェクター細胞を除去し、残っている付着性のＣＦＤＡ−ＳＥ標識標的細胞の蛍光強度を蛍光光度計で測定した。エフェクター細胞を共培養しないＣＦＤＡ−ＳＥ標識標的細胞の強度をベースラインとして設定した。異なる治療のマウスからのエフェクターリンパ球の相対的な細胞毒性活性は、３つのサンプルから以下の式（１）を用いて算出し、パーセンテージとして表した。
【００５０】
【数１】
2022501006.tif 000003
【００５１】
免疫組織化学
異なる治療群のマウスから除去したＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍は、ホルマリンで固定し、パラフィン包理し、パラフィン切片は、自動Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＩＩＩ−ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを使用して、標準的な製造業者の手順により、抗ＣＤ４（ＧＴＸ８５５２５、ＧｅｎｅＴｅｘ）、ＣＤ８（ＧＴＸ５３１２６、ＧｅｎｅＴｅｘ、及び抗ＮＫＧ２Ｄ（ｂｓ−０９３８Ｒ、Ｂｉｏｓｓ））で染色した。ＤＡＢを適用してインキュベートし、抗体染色のシグナルを視覚化した。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。染色陽性細胞の計数は、腫瘍切片の４つのランダムな高倍率視野ｘ４００倍率で行い、視野あたりの平均細胞数として表わした。
【００５２】
ＴＵＮＥＬアッセイ
ＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍切片を使用してＤＮＡ断片化を検出した。アポトーシス細胞におけるＤＮＡ断片化は、製造業者のプロトコルに従って、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）によって検出した。（ＴＵＮＥＬ  ＢｒｉｇｈｔＧｒｅｅｎアポトーシス検出キット、Ｖａｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）。すべての画像は、ＣＣＤカメラが取り付けられている顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ）を使用して得た。
【００５３】
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γの定量化
標的異種細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞の２日間の共培養によって刺激された、異なる治療群のＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍担持マウスから単離されたエフェクターリンパ球の培養培地中のＩＦＮ−γレベルを、製造業者のプロトコルに従って酵素結合免疫吸着測定キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて評価した。共培養したエフェクター細胞は、ベースライン対照として機能させた。共培養された標的細胞によって刺激されたエフェクター細胞の相対的なＩＦＮ−γ活性化は、以下の式（２）のように算出した：
【００５４】
【数２】
2022501006.tif 000004
【００５５】
統計分析
統計分析は、ＰＡＳＷ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１８を使用して実施した。グラフは平均値±平均の標準誤差を表す。Ｐ値は、２つの群を比較するためのスチューデントのｔ検定を使用して算出した。生存分析は、ログランク検定によって決定した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【００５６】
結果
膀胱内細胞療法のためのバイオミメティック培養法を用いて尿路上皮細胞を単離し、増殖させるための例示的なプロトコルを例解した概略グラフを図１Ａに示し、異種尿路上皮細胞を膀胱炎または尿路上皮癌を有する膀胱に注入することによる膀胱内細胞療法に関する本発明の好ましい実施形態の概略図を図１Ｂに示す。
【００５７】
増殖させたＰＵＣは、尿路上皮前駆細胞／幹細胞マーカー：サイトケラチン５（ＣＫ５）及びサイトケラチン１４（ＣＫ１４）を発現する
治療仮説を検証するために、尿路上皮細胞をブタ膀胱尿路上皮から単離し、増殖させた。継代１及び５でのＰＵＣの画像を図２Ａ及び２Ｂに示した。尿路上皮幹／前駆細胞マーカー：サイトケラチンタンパク質であり、尿路上皮幹／前駆細胞内で共発現するＣＫ５及びＣＫ１４を使用して、増殖したＰＵＣの特徴を明らかにした。ＰＵＣのウエスタンブロッティングアッセイ（図２Ｃ）及び免疫蛍光染色（図２Ｄ）により、ＣＫ５及びＣＫ１４の両方がＰＵＣ細胞で発現していることが明らかになった。次に、培地及び環境の異なる成分で培養することにより、ＵＰＣの増殖能をさらに調べる。これらの結果は、ＰＵＣをマトリゲルコーティングプレート上で培養したときに、増殖倍率が増加することを示した。さらに、マトリゲルコーティングプレート上で培養し、ＦＢＳ、ｂＦＧＦ、及びＹ２７６３２で治療された細胞は、最も高い増殖能を示した（図３）。
【００５８】
ＰＵＣ膀胱内注入により、ＣＰＰ誘発性膀胱炎を軽減する
出血性膀胱炎に対するＰＵＣの膀胱内注入の治療効果を実証するために、ＣＰＰ誘発性膀胱炎マウスモデルは、尿路上皮損傷及び出血性膀胱炎の動物モデルとして広く使用されている。ＣＰＰを注射した雌マウスを２つの群に分け、対照群は溶媒対照を受け、治療群はＣＰＰ注射の４時間後に１０６のＰＵＣを受け、実験のため、ＣＰＰ注射２４時間後にすべてのマウスを屠殺した。溶媒治療対照と比較して、これらの結果は、ＰＵＣ膀胱内治療により、膀胱出血、鬱血及び体重の減少を伴う、ＣＰＰ注射によって引き起こされた損傷が救済されたことを示した（図４Ａ及び４Ｂ）。さらに、膀胱ＨＥ染色切片の組織学的分析では、ＰＵＣ治療群において、固有層の浮腫がより少なく、剥離がより少ないことが観察されたことも示された（図４Ｃ及び４Ｄ）。これらの結果は、ＰＵＣの膀胱内投与により、有害な化学物質による攻撃から尿路上皮を保護して、尿路上皮の損傷を減少させることができることを示唆している。
【００５９】
ＰＵＣの膀胱内注入により、ＣＰＰ誘発性尿路上皮損傷を抑制する
尿路上皮におけるＫｉ−６７陽性細胞の割合は、ＣＰＰ注射の２４時間後、溶媒治療群と比較してＰＵＣ治療群で有意に低かった（図５Ａ及び５Ｂ）。このことは、ＰＵＣによって基底尿路上皮細胞における損傷誘発性増殖が減少したことを示唆している。ＣＰＰによって得た細胞損傷に対するＰＵＣの膀胱内注入の効果を評価するために、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、ＣＰＰによって引き起こされたアポトーシス細胞を検出した。これらの結果は、ＣＰＰ誘発アポトーシス細胞が尿路上皮の尿路上皮細胞及び固有層内の間質細胞の両方で観察されたが、ＰＵＣ膀胱内治療により、溶媒対照と比較してアポトーシス細胞を著しく減少させたことを示した（図５Ｃ）。アルシアンブルー染色は、ＣＰＰ治療によって影響を受けた尿路上皮の完全性を調べるために実施した。これらの結果は、ＧＡＧの表層がＰＵＣ治療群では保持されていたが、溶媒対照群では存在しないことを示した（図５Ｄ）。これらの結果は、ＰＵＣ膀胱内治療が、ＣＰＰ誘発性細胞の増殖及び細胞アポトーシスを減少させ、かつ尿路上皮の完全性を維持したことを示した。
【００６０】
膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法及びＧＣ化学療法の併用治療は、同所性ＭＢＴ−２−ｌｕｃ移植膀胱腫瘍マウスモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を有していた
同所性ＭＢＴ−２−ｌｕｃ移植尿路上皮膀胱腫瘍マウスモデルを使用して、治療法として、及び標準的な細胞毒性化学療法と組み合わせて、異種尿路上皮細胞に対する抗腫瘍効果の有効性を評価した。実験スキームを図６Ａに示した。これらの結果では、溶媒治療群と比較して、すべての異種尿路上皮細胞、ＧＣ、または組み合わせ治療群において、腫瘍成長が有意に減少したことを示した（図６Ｂ）。さらに、無増悪生存期間（図６Ｃ）及び全生存期間（図６Ｄ）が延長された。異種尿路上皮細胞またはその組み合わせで治療された場合は、無増悪生存期間でそれぞれ約３０％及び４０％の持続的応答を示し、全生存期間でそれぞれ４５％及び６０％を示した。異種尿路上皮細胞免疫療法またはゲムシタビン及びシスプラチンの化学療法単独では抗腫瘍活性を有するが、異種細胞免疫療法及びＧＣ化学療法の両方で治療されたマウスは、無増悪生存及び全生存において有意な延長を呈し、併用治療では、最も高い生存を有する。無増悪生存及び全生存の両方における異種細胞治療では、すべて曲線の裾が上昇しており、このことは、化学療法よりも異種細胞免疫療法により、より効果が持続することを示唆している。
【００６１】
膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法、及び併用治療は、腫瘍細胞の増殖を減少させ、かつ腫瘍細胞のアポトーシスを増加させる
さらに、異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法、及び併用治療の抗腫瘍効果を実証するために、腫瘍を固定し、Ｋｉ−６７  ＩＨＣ染色及びＴＵＮＥＬアッセイのために切片化して、それぞれ細胞増殖及び細胞死を決定した。これらの結果は、すべての治療群において、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞が未治療の対照よりも少ないことを示した。さらに、増殖性腫瘍細胞は、併用治療群で最も低かった（図７Ａ及び７Ｂ）。それとは対照に、ＴＵＮＥＬアッセイの結果は、すべての治療群、特に併用治療群において、腫瘍組織のアポトーシス細胞の増加を呈した。単一の異種尿路上皮細胞免疫療法または化学療法との併用治療に関係なく、腫瘍細胞死を誘発する効果は化学療法よりも良好であった（図７Ｃ及び７Ｄ）。
【００６２】
膀胱内異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用治療では、腫瘍における免疫細胞浸潤が増加した
腫瘍内免疫細胞組成物に対する異なる治療の影響を評価するために、腫瘍へのＴ細胞及びＮＫ細胞の浸潤を分析した。腫瘍Ｔ細胞浸潤（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞）は、異種尿路上皮細胞免疫療法、ＧＣ治療、及び併用療法（図８Ａ及び８Ｂ）において増加しており、このことは、効果的な免疫療法であることを反映している。定量化の結果は、溶媒治療群腫瘍と比較して、単一及び組み合わせ治療群からの異種尿路上皮細胞治療腫瘍が、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞（図８Ｄ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図８Ｅ）及びＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞（図８Ｆ）の腫瘍への浸潤の有意な増加を有することが見出されたことを示した。しかし、ＮＫ細胞浸潤の増加は、ＧＣ治療単独群の腫瘍では観察されなかった（図８Ｃ及び８Ｆ）。
【００６３】
異種尿路上皮細胞膀胱内免疫療法及びゲムシタビンとシスプラチンとの化学療法の併用治療は、ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍マウスモデルにおいて相乗的に腫瘍の進行を遅延させる
腫瘍進行の遅延における化学療法剤と組み合わせた膀胱内異種細胞療法の抗腫瘍効果を試験するために、過形成、上皮内癌（ＣＩＳ）から浸潤癌までのヒト膀胱腫瘍形成をシミュレートするＢＢＮ誘発腫瘍マウスモデルを使用した。ＢＢＮ誘発膀胱腫瘍担持マウスを４つの治療群に分けた：（ｉ）溶媒対照、（ｉｉ）異種尿路上皮細胞：異種尿路上皮細胞の膀胱内注入（１ｘ１０６細胞）、週に１回、３日目から４週間、（ｉｉｉ）ゲムシタビン及びシスプラチン（ＧＣ）化学療法：ゲムシタビン（６ｍｇ／マウス、１日目）及びシスプラチン（０．１２ｍｇ／マウス、２日目）の腹腔内注射（ＩＰ）を週に１回、４週間、及び（ｉｖ）併用治療。治療群及び対照群におけるＢＢＮ誘発膀胱腫瘍の進行は、採取した膀胱の肉眼的及び組織病理学的検査によって評価した。実験スキームを図９Ａに示した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞膀胱内免疫療法、ＧＣ治療単独または化学療法の組み合わせにより、腫瘍重量が有意に減少したことを示した。さらに、併用治療により、腫瘍重量の最大の減少を得た（図９Ｂ及び９Ｃ）。この肉眼による差異と一致して、組織病理学的分析ではまた、異種細胞、ＧＣ治療群、及び併用療法において浸潤性癌に進行したマウスの割合が有意に低いことを示した（図９Ｄ及び９Ｅ）。
【００６４】
異種尿路上皮細胞膀胱内免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用治療では、免疫応答が活性化した
異種細胞免疫療法の仮説では、異種拒絶による免疫応答を誘発し、副次的に抗腫瘍免疫応答を増加させ得る。異種細胞により治療されたマウスから単離されたＴ細胞が、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）ベースの増殖アッセイを使用した混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって、異種尿路上皮細胞または膀胱腫瘍細胞と共培養されたときに増強された増殖応答を呈することができるかどうかを調べるために、最初に、リンパ球を、異なる治療法によるＭＢＴ−２−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの脾臓から単離し、次にＣＦＤＡ−ＳＥで標識した。標識されたＣＦＤＡ−ＳＥリンパ球は、付着した異種尿路上皮細胞または腫瘍細胞（エフェクター／標的細胞比５：１）と２日間共培養した。その後、リンパ球を採取し、フローサイトメトリー分析によって分析して、ＣＦＤＡ−ＳＥ蛍光の強度を測定した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞との共培養によって刺激されたエフェクターリンパ球が、異種尿路上皮細胞により治療されたマウスのリンパ球の増殖割合（ＣＦＤＡ−ＳＥ低）が、溶媒対照で治療されたマウスよりも高いことを示し、このことは、異種尿路上皮細胞により治療されたマウスが、異種細胞に対する免疫応答を発現したことを示唆している（図１０Ａ及び１０Ｂ）。さらに、異種尿路上皮細胞で治療されたマウスのエフェクターリンパ球も、ＭＢＴ−２−ｌｕｃ膀胱腫瘍細胞で刺激された場合、より高い増殖率を示した（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。リンパ球増殖の増加は、併用治療マウスでも見られ、このことは、異種尿路上皮細胞治療が、移植された異種尿路上皮細胞及び腫瘍細胞の両方に対して、担腫瘍マウスにおいて免疫応答を誘発することを示唆している。
【００６５】
異種尿路上皮細胞膀胱内免疫療法、ＧＣ化学療法及び併用治療では、エフェクター免疫細胞機能が向上した
免疫細胞における抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすエフェクターサイトカイン（ＩＦＮγ）の産生を評価した。異なる治療法を受けた担腫瘍マウスの脾臓から単離されたリンパ球を、異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞のいずれかと共培養し、次に、共培養馴化培地において、ＩＦＮ−γ活性化を決定した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞または腫瘍ＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞と共培養しても、ＩＦＮγ活性化は、異種尿路上皮細胞免疫療法単独及び化学療法との併用治療の両方において、単離されたリンパ球においてより高かったことを示した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。これらの治療によるエフェクターサイトカイン産生の増加は、エフェクター細胞の増殖の変化と相関しており、異種尿路上皮細胞の移植がエフェクター細胞機能を調節することを示唆している。それにもかかわらず、マウスでの抗腫瘍応答のための異種尿路上皮細胞誘発性細胞活性化に関与するエフェクター細胞亜集団を決定する必要がある。より多くのＴ細胞がエフェクター特性を呈したことは、異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再刺激時に、対照治療マウスよりも、Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮ−γの産生がより活性化されたことによって確認された。異種尿路上皮細胞免疫療法がＴ細胞の細胞毒性活性機能に影響を与え得るかを実証するために、免疫エフェクター細胞媒介の標的細胞の細胞毒性アッセイを実施した。異なる治療の脾臓から単離したエフェクターリンパ球は、異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞であるＣＦＤＡ−ＳＥ標識標的細胞と共培養し、残りのＣＦＤＡ−ＳＥ標識細胞の蛍光強度を測定することによって、Ｔ細胞の細胞毒性活性機能を検出した。これらの結果は、異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞のいずれかに対する最も高い細胞毒性活性が、併用治療を受けたマウスの群で認められたことを示した。異種尿路上皮細胞治療では、細胞毒性細胞の有意な活性化を有し、また、ＧＣ治療では、異種尿路上皮細胞またはＭＢＴ−２−ｌｕｃ細胞の両方を標的とするために、細胞毒性を増加させた（図１１Ｃ〜Ｆ）。
【図１Ａ】
2022501006.tif 000005
【図１Ｂ】
2022501006.tif 000006
【図２Ａ】
2022501006.tif 000007
【図２Ｂ】
2022501006.tif 000008
【図２Ｃ】
2022501006.tif 000009
【図２Ｄ】
2022501006.tif 000010
【図３】
2022501006.tif 000011
【図４Ａ】
2022501006.tif 000012
【図４Ｂ】
2022501006.tif 000013
【図４Ｃ】
2022501006.tif 000014
【図４Ｄ】
2022501006.tif 000015
【図５Ａ】
2022501006.tif 000016
【図５Ｂ】
2022501006.tif 000017
【図５Ｃ】
2022501006.tif 000018
【図５Ｄ】
2022501006.tif 000019
【図６Ａ】
2022501006.tif 000020
【図６Ｂ】
2022501006.tif 000021
【図６Ｃ】
2022501006.tif 000022
【図６Ｄ】
2022501006.tif 000023
【図７Ａ】
2022501006.tif 000024
【図７Ｂ】
2022501006.tif 000025
【図７Ｃ】
2022501006.tif 000026
【図７Ｄ】
2022501006.tif 000027
【図８Ａ】
2022501006.tif 000028
【図８Ｂ】
2022501006.tif 000029
【図８Ｃ】
2022501006.tif 000030
【図８Ｄ】
2022501006.tif 000031
【図８Ｅ】
2022501006.tif 000032
【図８Ｆ】
2022501006.tif 000033
【図９Ａ】
2022501006.tif 000034
【図９Ｂ】
2022501006.tif 000035
【図９Ｃ】
2022501006.tif 000036
【図９Ｄ】
2022501006.tif 000037
【図９Ｅ】
2022501006.tif 000038
【図１０Ａ】
2022501006.tif 000039
【図１０Ｂ】
2022501006.tif 000040
【図１０Ｃ】
2022501006.tif 000041
【図１０Ｄ】
2022501006.tif 000042
【図１１Ａ】
2022501006.tif 000043
【図１１Ｂ】
2022501006.tif 000044
【図１１Ｃ】
2022501006.tif 000045
【図１１Ｄ】
2022501006.tif 000046
【図１１Ｅ】
2022501006.tif 000047
【図１１Ｆ】
2022501006.tif 000048
【国際調査報告】
2022501006.tif 000049
2022501006.tif 000050
2022501006.tif 000051