(57)【要約】  本発明は、ホップ由来イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への酵素触媒生物変換によるビール苦味料の製造方法に関する。
2022500064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソアルファ酸を、ケトレダクターゼ酵素で、または該ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物で処理することを含む、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の製造方法。
【請求項２】
水性系で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温和な温度およびｐＨ条件下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イソアルファ酸の混合物への前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰの添加、それに続くインキュベーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
補因子リサイクリングのためのイソプロパノールの存在下で、前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物へ添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イソアルファ酸、すなわち基質の濃度が、生物変換の体積生産性を増加させるために最大化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
混合物における補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの濃度が、生物変換の経済性を改善するために最小化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
補因子リサイクリングのための別の酵素の存在下で、前記ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物へ添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
全細胞生体触媒であって、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する固定化微生物である全細胞生体触媒をイソアルファ酸の混合物に添加し、引き続きインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
イソアルファ酸を、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する増殖微生物で処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ケトレダクターゼが熱安定性であるケトレダクターゼ酵素をイソアルファ酸の抽出物に添加することを含み、熱が適用され、混合物がインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ケトレダクターゼが、ｃｉｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケトレダクターゼが、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
２種以上のケトレダクターゼ酵素の混合物を添加して、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、それらの各々のジヒドロイソアルファ酸に還元することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の２種以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が、化学還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムによって生成されるものとは異なるジヒドロイソアルファ酸の独特の混合物を生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ケトレダクターゼ酵素が、ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｂ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｄ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０３、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０９、ＫＲＥＤ−１０１、ＫＲＥＤ−１１９、ＫＲＥＤ−１３０、ＫＲＥＤ−ＮＡＤＨ−１１０、ＫＲＥＤ−４３０、ＫＲＥＤ−４３１、ＫＲＥＤ−４３２、ＫＲＥＤ−４３３、ＫＲＥＤ−４３４、ＫＲＥＤ−４３５およびＫＲＥＤ−４３６からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記ケトレダクターゼ酵素、または前記ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物が、ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｂ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｄ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０３、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０９、ＫＲＥＤ−１０１、ＫＲＥＤ−１１９、ＫＲＥＤ−１３０、ＫＲＥＤ−ＮＡＤＨ−１１０、ＫＲＥＤ−４３０、ＫＲＥＤ−４３１、ＫＲＥＤ−４３２、ＫＲＥＤ−４３３、ＫＲＥＤ−４３４、ＫＲＥＤ−４３５およびＫＲＥＤ−４３６からなる群から選択されるケトレダクターゼ酵素と比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ケトレダクターゼが、ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｂ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｄ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０３、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０９、ＫＲＥＤ−１０１、ＫＲＥＤ−１１９、ＫＲＥＤ−１３０、ＫＲＥＤ−ＮＡＤＨ−１１０、ＫＲＥＤ−４３０、ＫＲＥＤ−４３１、ＫＲＥＤ−４３２、ＫＲＥＤ−４３３、ＫＲＥＤ−４３４、ＫＲＥＤ−４３５およびＫＲＥＤ−４３６からなる群から選択されるケトレダクターゼ酵素と９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ケトレダクターゼ酵素が、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６および配列番号１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記ケトレダクターゼ酵素、または前記ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物が、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６および配列番号１５８からなる群から選択されるケトレダクターゼ酵素と比較して、任意選択的に、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を有することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ケトレダクターゼが、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６および配列番号１５８からなる群から選択されるケトレダクターゼ酵素と９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
ファイル名ＫＡＬＳＥＣ＿７５＿ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）で３７  ＣＦＲ  §１．８２１に基づいて本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピー（２５９キロバイトのファイルサイズを有する）は、２０１９年９月２５日に作成された。
【０００２】
本発明は、ホップ由来イソアルファ酸類のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸類への酵素触媒生物変換によるビール苦味料の製造方法に関する。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸は、飲料添加剤としての有用性を改善する優れた特性を有する。消費者は、不快な化学試薬の使用を必要とせず、天然に存在し得る酵素を利用する、このプロセスによって産生されるジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を好み得る。
【背景技術】
【０００３】
ビールに苦味付けをする伝統的な方法は、ケトル煮沸の間に添加されるホールフレッシュホップ、ホール乾燥ホップまたはホップペレットを使用する。超臨界二酸化炭素を用いてホップを抽出することによって製造されるホップ抽出物、または触媒の存在下でホップを加熱することによって製造される異性化ホップペレットは、醸造者によっても採用されてきた、より最近の苦味付けの革新である。ホップペレットはまた、醸造プロセスにおいて後に添加することもでき、ドライホッピングの場合には、ホップはろ過の前に完成ビールに添加される。これらの方法は、ホップ中に存在する苦味化合物の利用が乏しく、そのことはコストに不利に強い影響を及ぼす。このようにして製造されたビールまたは他の麦芽飲料は光に対して不安定であり、著しい日光臭またはスカンク臭をもたらす３−メチル−２−ブテン−１−チオール（３−ＭＢＴ）の光誘発性の形成を避けるために、暗褐色の瓶もしくは缶に入れられるか、または配置されなければならない。瓶をボール箱に入れるか、またはそれらを遮光性もしくは光フィルタリング性の紙、箔もしくはプラスチックの覆いで完全に包むことが、これらの飲料を日光フレーバーおよび日光臭から保護する別の高価な方法である。
【０００４】
伝統的に醸造されたビールにおける苦味は、主としてイソアルファ酸に由来する。これらの化合物は、ホップ植物のルプリン腺に天然に存在する化合物であるフムロンの異性化によって醸造プロセスの間に形成される。この結果は、ビール中の光化学反応に関するイソアルファ酸の天然の不安定性を考慮すると、飲料は、日光フレーバーおよび日光臭あるいはスカンクフレーバーおよびスカンク臭を形成しやすい。
【０００５】
完全に光安定性のビールまたは他の麦芽飲料は、いわゆる改良型（ａｄｖａｎｃｅｄ）または変性された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ホップ酸を使用して製造することができる。これらの苦味料を用いて製造されたビールは、スカンク臭の生成のおそれなしに、非着色のフリントガラス瓶に入れることができる。ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸は、光安定性であるイソアルファ酸の還元生成物である。今日まで、これらの化合物は天然には見出されていない。伝統的に、光化学に関与するイソアルファ酸の部分が、水素化ホウ素ナトリウムを用いたカルボニル基の還元によって変えられてきた。
【０００６】
水素化ホウ素ナトリウムは、ケトン類の還元に利用できる無機化合物である。皮膚接触、眼接触、吸入または摂取の場合、１６０ｍｇ／ｋｇ（ラット）の経口ＬＤ５０で、極めて有害である。水素化ホウ素ナトリウムはまた、可燃性であり、腐食性であり、酸化剤、酸、アルカリおよび水分と極めて反応性である（非特許文献１）。
【０００７】
消費者はますます、合成又は半合成材料よりも天然材料に対して優先志向を示している。従って、ビールおよび他の飲料のための苦味料として天然材料を使用する組成物を提供することだけでなく、前記材料のより天然の生産のためのプロセスも提供するニーズが存在している。
【０００８】
生体触媒による産生は、高価値化合物の高度に選択性で、安全で、クリーンで、そしてスケーラブルな産生を提供する新興技術である。生体触媒による産生は、天然に存在する酵素に依存しており、化学触媒に置き換わるものである。
【０００９】
酵素は、特定の化学反応を触媒することができる天然に存在するタンパク質である。変性されたホップ苦味化合物の製造において、現在化学触媒に取って代われる酵素が天然に存在する（非特許文献２）。
【００１０】
フムロンは、植物フムラス・ルプラス（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）と共生する真菌および細菌に暴露されてきた、天然の二次代謝産物である。土壌−および植物に生息する真菌および細菌は、解毒またはスカベンジング目的のために、フムロンを修飾できる酵素を有し得る。さらに、生物は、フムロン様分子を修飾するために酵素を進化させてきたかもしれないが、見さかいない活性のために、これらの酵素は、興味ある化合物、すなわちイソアルファ酸類に対して活性を有する（非特許文献３；非特許文献４）。
【００１１】
酸化／還元反応、すなわち、ある物質から別の物質へ水素および酸素原子または電子の移動を触媒する酵素は、オキシドレダクターゼとして広く分類される。より具体的には、ケトン基をヒドロキシル基に還元する酵素がケトレダクターゼまたはカルボニルレダクターゼとして知られており、還元当量の外因性供給源（例えば、補因子ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）の補充に依存する。本明細書で特徴付けられる酵素の既存の命名と一致して、当該酵素を「ケトレダクターゼ」と呼ぶ。
【００１２】
高価な補因子（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）のコストは、補因子リサイクリングのための追加的な酵素および基質（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース）を含ませることによって、あるいは、低コストかつ天然の供給材料、例えばエタノール、を酸化することもできるケトレダクターゼを利用することによって、低減し得る。
【００１３】
醸造における酵素の有用性、およびビールの最終的な特徴に対するそれらの好ましい影響に関しては、数多くの先行するものが存在する（非特許文献５）。ビールの天然発酵における酵母酵素の存在は、最終飲料のフレーバーおよびアロマに影響を及ぼす化合物を生成することが知られている（非特許文献６）。外因的に添加された酵素は、醸造プロセスに対して種々の改良、例えば粘度の低下、発酵性糖の増加、チルプルーフィング（ｃｈｉｌｌ−ｐｒｏｏｆｉｎｇ）および清澄化、をもたらす（非特許文献７；非特許文献８）。さらに、ホップ抽出物は、特に、ホップ由来アロマ化合物を変性するための酵素で前処理されてきた（非特許文献９）。
【００１４】
しかし、本発明以前には、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への還元を触媒できる酵素は天然では観察されておらず、従って文献には記載されていなかった。本明細書に開示される方法は、新規な酵素反応を表す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ；  ＭＳＤＳ  Ｎｏ．  Ｓ９１２５；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．：  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ０１，  ２０１５
【非特許文献２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｐ．  Ｋ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１５，  ５９，  １−４１
【非特許文献３】Ｈｕｌｔ，  Ｋ．；  Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，  Ｐ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７，  ２５  （５），  ２３１−２３８
【非特許文献４】Ｎｏｂｅｌｉ，  Ｉ．；  Ｆａｖｉａ，  Ａ．  Ｄ．；  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００９，  ２７  （２），  １５７−１６７
【非特許文献５】Ｐｏｚｅｎ，  Ｍ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ．  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ，  １９３４，  ２６  （１１），  １１２７−１１３３
【非特許文献６】Ｐｒａｅｔ，  Ｔ．；  Ｏｐｓｔａｅｌｅ，  Ｆ．；  Ｊａｓｋｕｌａ−Ｇｏｉｒｉｓ，  Ｂ．；  Ａｅｒｔｓ，  Ｇ．；  Ｄｅ  Ｃｏｏｍａｎ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｏｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｏｍａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｐｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ，  ２０１２，  ３６，  １２５−１３２
【非特許文献７】Ｗａｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｌ．  （１９４７）  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ，  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２，４３３，４１１．
【非特許文献８】Ｇｈｉｏｎｎｏ，  Ｌ．；  Ｍａｒｃｏｎｉ，  Ｏ．；  Ｓｉｌｅｏｎｉ，  Ｖ．；  Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ，  Ｇ．；  Ｐｅｒｒｅｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｇｌｕｔｅｎ  ｌｅｖｅｌｓ，  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１７，  ５２  （６），  １３６７−１３７４
【非特許文献９】Ｇｒｏｓ，  Ｊ．；  Ｔｒａｎ，  Ｔ．  Ｔ．  Ｈ．；  Ｃｏｌｌｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｏｄｏｕｒａｎｔ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｉｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｏｐ．  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ２０１３，  １１９  （４），  ２２１−２２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、ヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸、すなわちホップ植物に由来する天然苦味料の変性バージョンの酵素的製造方法を提供することである。本発明の方法は、化学試薬、水素化ホウ素ナトリウムを利用する現在の製造方法に取って代わるように設計されている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明は、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸（これはその後、飲料において、天然由来でかつ光安定性の苦味料として使用できる）への生物変換のための、工業用レベルまでスケールアップすることができる方法に関する。
【００１８】
本発明の一態様は、ケトレダクターゼ酵素または前記ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を利用した、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への高収率生物変換のための方法である。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の製造のためのそのような方法であって、温和な温度およびｐＨ条件（当該方法を環境に優しい製造方法にする）を用いる水性系において実施される、前記方法に関する。
【００２０】
本発明の一実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰをイソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２１】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰを、補因子リサイクリングのためのイソプロパノールの存在下で、イソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様において、イソアルファ酸、すなわち基質の濃度は、生物変換の体積生産性を増加させるために最大化される。
【００２３】
本発明のさらなる実施態様において、混合物中の補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの濃度は、生物変換の経済性を改善するために最小限にされる。
【００２４】
本発明の一実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、精製ケトレダクターゼ酵素およびＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰを、補因子リサイクリングのための別の酵素（例えばグルコースデヒドロゲナーゼ）の存在下で、イソアルファ酸の混合物に添加し、その後、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含む。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、全細胞生体触媒をイソアルファ酸の混合物に添加し、引き続き、所望の収量が得られるまでインキュベートすることを含み、ここで、前記の全細胞生体触媒は、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する固定化された微生物である。
【００２６】
本発明の別の実施態様において、イソアルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、ケトレダクターゼをコードする遺伝子を発現する増殖微生物へのイソアルファ酸の供給を含む。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、アルファ酸のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸への生物変換は、熱安定性ケトレダクターゼ酵素をアルファ酸の抽出物に添加することを含み、熱が適用され、混合物は、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の所望の収量が達成されるまでインキュベートされる。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、好ましくは、イソアルファ酸のＣ（４）の側鎖におけるカルボニル基を還元し、光感受性アシロイン基を第２級アルコールに変換し、光安定性のイソアルファ酸誘導体を生成する（図１）。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、有利には、６つの主要なイソアルファ酸：
ｃｉｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロン、ｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロン、およびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロン
のいずれか１種の特定のメンバーの還元を触媒することに対して、最小限の優先傾向を示すか、または優先傾向は示さない。
【００３０】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、ｃｉｓ−イソフムロン、ｃｉｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｃｉｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、本発明による方法で使用されるケトレダクターゼは、ｔｒａｎｓ−イソフムロン、ｔｒａｎｓ−イソ−ｃｏ−フムロンおよびｔｒａｎｓ−イソ−ａｄ−フムロンを特異的に還元する。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、上記の基質特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物をそれらのそれぞれのジヒドロイソアルファ酸に還元するために、本発明の方法において使用される。
【００３３】
本発明の別の実施態様では、基質特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物を反応混合物に添加して、化学還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムによって生成されるものとは異なるジヒドロイソアルファ酸の独特の混合物を生成することができる。
【００３４】
さらなる実施態様において、本発明は、商業的に入手可能なケトレダクターゼがＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｂ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｄ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０３、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０９、ＫＲＥＤ−１０１、ＫＲＥＤ−１１９、ＫＲＥＤ−１３０、ＫＲＥＤ−ＮＡＤＨ−１１０、ＫＲＥＤ−４３０、ＫＲＥＤ−４３１、ＫＲＥＤ−４３２、ＫＲＥＤ−４３３、ＫＲＥＤ−４３４、ＫＲＥＤ−４３５およびＫＲＥＤ−４３６から選択される、上記に定義される方法に関する。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６または配列番号１５８のアミノ酸配列を含むケトレダクターゼ酵素に関する。
【００３６】
さらなる実施態様において、本発明は、ケトレダクターゼ酵素またはケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物が、任意選択的に、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６または配列番号１５８のアミノ酸配列を含むケトレダクターゼ酵素と比較して、アミノ酸残基において１つまたは複数の相違を有することができる、上記に定義される方法に関する。
【００３７】
さらなる実施態様において、本発明は、ケトレダクターゼが、配列番号４、配列番号６、配列番号８０、配列番号１０４、配列番号１００、配列番号１３６、配列番号１１６、配列番号１３２、配列番号１６２、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１４４、配列番号１４６または配列番号１５８のアミノ酸配列を含むケトレダクターゼ酵素と９９、９５、９０、８５、８０、７５または７０パーセント相同である、上記に定義される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、イソアルファ酸の代表的なエピマーの酵素触媒還元を示す。
【図２】図２は、イソアルファ酸（酸性溶液）と共に３０℃で４８時間インキュベートしたＣｏｄｅｘｉｓ  ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５（配列番号４）に関するＵＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、イソアルファ酸（酸性溶液）と共に３０℃で４８時間インキュベートしたＣｏｄｅｘｉｓ  ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５（配列番号４）に関するＨＰＬＣクロマトグラムおよびピーク定量を示す。
【図４】図４は、イソアルファ酸と共に３０℃で２４時間インキュベートしたＣｏｄｅｘｉｓ  ＫＲＥＤ−４３３に関するＵＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、高基質および低ＮＡＤＰ濃度における配列番号８０、１０４、１００、１３６、１１６、１３２、１６２、１５０、１５２、１４４、１４６および１５８の改善されたＫＲＥＤ活性を示す。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明では、ケトレダクターゼ酵素が、水素化ホウ素ナトリウムの機能に取って代わり、飲料添加剤であるジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸のためのより天然の製造方法を可能にする。前記酵素は、イソアルファ酸の異性体（ｃｏ−、ｎ−  ａｄ−、およびｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−）のいずれかのまたは全ての、ケトン基をヒドロキシ基へ特異的に還元する任意のケトレダクターゼであってよい。前記酵素は、細菌、真菌または植物に由来し得るが、これらに限定されない。前記酵素は、補因子依存的（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）であっても、非依存的であってもよい。
【００４０】
本明細書において、「イソアルファ酸」、「ホップイソアルファ酸」および「ホップ由来イソアルファ酸」は、互換的に使用され得る。
【００４１】
イソアルファ酸溶液を、精製された酵素、または酵素と任意選択的に補因子リサイクリングのための追加的な酵素とを含む混合物を用いる酵素的処理に付す。酵素の量は、継続時間、温度および基質の量および濃度を含むインキュベーションパラメーターに依存する。
【００４２】
あるいは、イソアルファ酸溶液は、前記酵素を発現する微生物を含有する混合物を使用する酵素的処理に付される。本発明はさらに、ケトレダクターゼの発現を適宜誘導するケトレダクターゼ産生微生物を培養することを含む、本発明に従ってイソアルファ酸を還元するための方法を提供する。上記のようなイソアルファ酸の還元のためには、単離された酵素の代わりに、無傷の細胞回収し、反応に直接添加することができる。さらに、回収された細胞は、還元反応への添加の前に固定化することができる。微生物は公知の方法によって培養し、発酵させることができる。前記微生物は、細菌または真菌であり得る。
【００４３】
ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、両方の異性体を還元する能力を示す単一のケトレダクターゼと共にインキュベートすることができる。あるいは、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−イソアルファ酸の混合物を、様々な特異性を示す２種またはそれ以上のケトレダクターゼと共にインキュベートしてもよく、ここでは、得られる生成物はｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸の混合物である。
【００４４】
あるいは、ｃｉｓ−イソアルファ酸のみを含有する溶液を、ｃｉｓ−異性体に特異的なケトレダクターゼと共にインキュベートしてもよく、得られる生成物はｃｉｓ−ジヒドロイソアルファ酸の溶液である。ｃｉｓ−ジヒドロイソアルファ酸のみの溶液は、有利な苦味および／または熱安定性特性を示し得る。
【００４５】
あるいは、ｔｒａｎｓ−イソアルファ酸のみを含有する溶液を、ｔｒａｎｓ−異性体に特異的なケトレダクターゼと共にインキュベートしてもよく、得られる生成物はｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸の溶液である。ｔｒａｎｓ−ジヒドロイソアルファ酸のみの溶液は、有利な苦味特性を示し得る。
【００４６】
ｔｒａｎｓ−およびｃｉｓ−イソアルファ酸のカスタマイズされたブレンドを、様々な基質特異性を示す１種または複数のケトレダクターゼと共にインキュベートして、さもなければ達成不可能なジヒドロイソアルファ酸の独特のブレンドを生成してもよい。
【００４７】
イソアルファ酸混合物を、追加的な所望の変性を触媒するための酵素（例えば限定はされないが、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、ヒドラターゼおよびリアーゼ）に加えて、ケトレダクターゼ酵素を使用する酵素反応に付してもよい。種々の活性の酵素を、ワンポット反応で組み合わせるか、または順次的に添加することができる。
【００４８】
酵素インキュベーションにおいて使用するための適切な溶媒には、水、ならびに水と酵素に適合性の別の溶媒、例えばエタノールまたはイソプロパノールとの混合物が含まれる。酵素活性は、水溶液の緩衝から利益を享受する。緩衝剤には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（別名トリス）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（別名ＨＥＰＥＳ）、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定はされない。
【００４９】
酵素およびイソアルファ酸は、適切なｐＨ範囲、例えばｐＨ６〜１０、および温度範囲、例えば１０〜９０℃内でインキュベートされ、イソアルファ酸を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸収量に変換するのに十分な時間この温度で保持される。連続的な撹拌は、一定の温度および基質の酵素への暴露を確実にする。反応時間（典型的には２４〜４８時間）は、酵素および基質の量および濃度、存在する溶媒、および選択された温度に依存する。
【００５０】
酵素は、溶液においてフリーであっても、ビーズまたは類似の混合可能な足場上に固定化されても、またはイソアルファ酸の溶液を通過させるフィルムまたは樹脂上に固定化されてもよい。酵素の純度レベルは、精製方法に応じて３０〜９０＋％まで変化し得る。
【００５１】
酵素は、物理的ろ過または遠心分離によって最終生成物から除去してもよい。酵素はまた、極端な温度またはｐＨによって不活性化され、最終生成物中に残存されてもよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合に、ケトレダクターゼには、市販のケトレダクターゼ、例えばＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｂ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ０２、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｃ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｄ１１、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０３、ＫＲＥＤ−Ｐ２−Ｇ０９、ＫＲＥＤ−１０１、ＫＲＥＤ−１１９、ＫＲＥＤ−１３０、ＫＲＥＤ−ＮＡＤＨ−１１０、ＫＲＥＤ−４３０、ＫＲＥＤ−４３１、ＫＲＥＤ−４３２、ＫＲＥＤ−４３３、ＫＲＥＤ−４３４、ＫＲＥＤ−４３５およびＫＲＥＤ−４３６（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）が含まれる。本発明はまた、アミノ酸残基における１つまたは複数の相違を含む上述のケトレダクターゼ、ならびに上述のケトレダクターゼと９９、９５、９０、８５、８０、７５および／または７０パーセントの相同性を有するケトレダクターゼも意図する。
【００５３】
本発明はまた、単一のイソアルファ酸またはイソアルファ酸の混合物に対して様々な活性を示す、公知の突然変異誘発法を通して意図的に産生されたケトレダクターゼも含む。一部のバリアントは、市販のケトレダクターゼと比較して、基質耐性、温度耐性、溶媒耐性、および／またはターンオーバーにおいて大幅に改善されている。
【００５４】
本明細書において使用される場合に、「配列相同性のパーセント」、「パーセント相同性」および「パーセント同一性」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、そして比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。前記パーセントは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列において生じるか、またはマッチした位置の数を得るために核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとともに整列された位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、そしてその結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセントを得ることによって、算出される。最適なアラインメントおよびパーセント配列相同性の決定はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して行われる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：  ４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
【実施例】
【００５５】
例
以下の例は、本発明をその範囲を限定することなく例証する。
【００５６】
例１
組換えＫＲＥＤ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
ＫＲＥＤをコードする遺伝子を、ｌａｃ１リプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）にクローニングした。前記発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。得られたプラスミドで、当該分野で公知の標準的な方法を使用して、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を形質転換した。形質転換体を、当該分野で公知のように、細胞をクロラムフェニコール選択に付すことによって単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号および国際公開第２０１０／１４４１０３号を参照のこと）。
【００５７】
例２
ＨＴＰ  ＫＲＥＤ含有Ｗｅｔ細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニー由来の組換えＫＲＥＤコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェル・シャロ−ウェル・マイクロタイタープレートのウェル中の１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１９０μｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスに播種した。プレートをＯ２透過性シールでシールし、培養物を２０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で一晩増殖させた。次いで、各細胞培養物２０μｌを、３８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）および３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有する９６ウェル・ディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールでシールし、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度でインキュベートした。次いで、細胞培養物を、イソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで添加することによって誘導し、最初に使用したのと同じ条件下で一晩インキュベートした。引き続き、細胞を、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を用いてペレット化した。上清を捨て、ペレットを溶解前に−８０℃で凍結した。
【００５８】
例３
ＨＴＰ  ＫＲＥＤ含有細胞ライセートの調製
最初に、実施例２に記載されるように調製された細胞ペレットを、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８  トリエタノールアミン＊Ｈ２ＳＯ４もしくは２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８  リン酸カルシウム、１ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／ＬポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）を含有する１５０μＬの溶解バッファーを添加することによって溶解した。引き続き、細胞ペレットをベンチトップ型シェーカー上で室温で２時間振とうした。プレートを４０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離して、細胞デブリを除去した。引き続き、上清を生体触媒反応に使用して、それらの活性レベルを決定した。
【００５９】
例４
振とうフラスコ（ＳＦ）培養からの凍結乾燥ライセートの調製
振とうフラスコ法を、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＫＲＥＤポリペプチド振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）を調製するために使用することができ、これは、二次スクリーニングアッセイおよび／または本明細書中に記載される生体触媒プロセスにおける使用に有用である。酵素の振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）調製物は、ハイスループット（ＨＴＰ）アッセイにおいて使用される細胞ライセートと比較して、操作された酵素のより精製された調製物（例えば、最大３０％の全タンパク質）を提供し、そしてまた、より濃厚な酵素溶液の使用を可能にする。これを開始するために、上記のように増殖させた選択したＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。それぞれの培養物からの単一コロニーを、１％グルコールおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を３０℃において２５０ｒｐｍで１８時間増殖させ、３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含む２５０ｍｌのＴＢに約１：５０で継代培養し、最終ＯＤ６００を０．０５とした。培養物を３０℃において２５０ｒｐｍで約３時間、０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。引き続き、培養物を３０℃において２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。培養物を遠心分離した（４℃において４０００ｒｐｍで２０分間）。上清を捨て、ペレットを、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む５０ｍＭ  ｐＨ８リン酸カリウム３５ｍＬに再懸濁した。再懸濁した細胞を遠心分離した（４℃において４０００ｒｐｍで２０分間）。上清を捨て、ペレットを２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む５０ｍＭ  ｐＨ８リン酸カリウム６ｍＬに再懸濁し、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの細胞破砕機（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ）を用いて細胞を溶解した。ライセートをペレット化し（４℃において１０，０００ｒｐｍで６０分間）、上清を凍結し、凍結乾燥して振とうフラスコ（ＳＦ）酵素を調製した。
【００６０】
例５
市販のＫＲＥＤ酵素パネルのスクリーニング
ＫＲＥＤスクリーニングアッセイ
市販のケトレダクターゼのセットを、市販の「ＫＲＥＤ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ」（Ｃｏｄｅｘｉｓ  Ｉｎｃ．，  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用して、イソアルファ酸を還元するそれらの能力について試験した。このスクリーニングにおける酵素の一部について、酵素アッセイを、１．５ｍＬ体積チューブにおいて、１．７ｍＭのＭｇＳＯ４を含む１２８ｍＭ  ｐＨ７  リン酸ナトリウムにおいて１０ｇ／Ｌの酵素粉末、２．９もしくは６．９ｇ／Ｌのイソアルファ酸基質および０．８ｇ／ＬのＮＡＤＰを含む１０００μＬの全体積／チューブで行った。チューブを閉じ、３０℃において１８０ｒｐｍで２４〜４８時間振とうしながらインキュベートした。得られた反応混合物を、１０，０００ＭＷＣＯ遠心ろ過デバイスを用いてろ過して酵素を除去した。イソアルファ酸およびジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸をＵＰＬＣによって定量化した。例えば、図４に示されるＣｏｄｅｘｉｓ  ＫＲＥＤ−４３３のクロマトグラムを参照のこと。
【００６１】
このスクリーニングにおける酵素の他の一部については、酵素アッセイを、１．５ｍＬ体積チューブにおいて、１．７ｍＭのＭｇＳＯ４を含む２６３ｍＭ  ｐＨ７  リン酸ナトリウムにおいて１０ｇ／Ｌの酵素粉末、１．５ｇ／Ｌのイソアルファ酸基質、０．８ｇ／ＬのＮＡＤＰ、０．７ｇ／ＬのＮＡＤ、１４．４ｇ／ＬのＤ−グルコースおよび４．３Ｕ／ｍＬのグルコースデヒドロゲナーゼを含む１０００μＬの全体積／チューブで行った。チューブを閉じ、３０℃において１８０ｒｐｍで２４〜４８時間振とうしながらインキュベートした。得られた反応混合物を、１０，０００ＭＷＣＯ遠心ろ過デバイスを用いてろ過して酵素を除去した。イソアルファ酸およびジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸をＵＰＬＣによって定量化した。
【００６２】
ケトレダクターゼ特徴付けアッセイ
検出可能な量のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を産生したケトレダクターゼを、種々の反応条件下でさらに特徴付けした。この目的のために、酵素アッセイを、２．０ｍＬ体積チューブにおいて、１．７ｍＭのＭｇＳＯ４を含む１００〜２６３ｍＭ  ｐＨ７〜９  リン酸ナトリウム（または代わりにトリスＨＣｌ）において１０〜２０ｇ／Ｌの酵素粉末、１．５〜６．０ｇ／Ｌのイソアルファ酸基質、０．８ｇ／ＬのＮＡＤＰ（任意選択的に、０．７ｇ／ＬのＮＡＤ、１４．４ｇ／ＬのＤ−グルコース、４．３Ｕ／ｍＬのグルコースデヒドロゲナーゼまたは３０ｖｏｌ％のイソプロパノール）を含む１０００μＬの全体積／チューブで行った。チューブを閉じ、３０〜４０℃において１８０ｒｐｍで２４〜４８時間振とうしながらインキュベートした。得られた反応混合物を濾過して酵素を除去した。ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＨＰＬＣによりイソアルファ酸およびジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を検出した。
【００６３】
結果
ＫＲＥＤスクリーニング結果 
Ｃｏｄｅｘｉｓの「ＫＲＥＤ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ」からの一部の市販酵素は、イソアルファ酸を還元することができる（表１）。元々のキットは２４種のケトレダクターゼ（ＫＲＥＤと呼ぶ）から構成されており、これらは、製造業者によって広範な基質範囲および増強された活性に関して選択されているか（すなわち、天然）、または操作されている。追加的なキットは、ＫＲＥＤ−１３０のバックボーンをベースとして７種の操作されたバリアントから構成されていた。
【００６４】
【表１】
2022500064.tif 000003
【００６５】
ケトレダクターゼ特徴付け
ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ−  ｃｏ／ａｄ／ｎ−ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に対応するピークが、酵素を欠くコントロールサンプルよりも強い強度でＵＰＬＣによって検出された場合、酵素はイソアルファ酸を還元すると決定された。
【００６６】
ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）が、ＵＰＬＣピーク高さの定性的比較により、２４時間の期間で最もジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を産生した（図２参照）。ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５（配列番号４）は、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）由来の天然に存在する野生型ケトレダクターゼであるアミノ酸配列（配列番号２）をコードするヌクレオチド（配列番号１）によってコードされる酵素に由来する。このケトレダクターゼによって産生されたジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸は、ＨＰＬＣによって定量化されるのに十分に高い濃度で存在した。３０℃において２４時間で、ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５は１８％ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸という収率を達成した。反応を４８時間の反応時間で二重に行い、４２％のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸という収率を達成した（図３参照）。反応温度を３０℃から３７℃に４８時間上昇させた場合、収率は３３％であった。
【００６７】
ＫＲＥＤ−Ｐ１−Ｂ０５活性を、補因子リサイクリングのための３０ｖｏｌ％イソプロパノールに加えて、バッファー（１．７ｍＭ硫酸マグネシウム、０．８ｇ／Ｌ  ｍＭ  ＮＡＤＰを含む１２８ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７）を使用して最初に試験した。複数の反応条件（温度、期間、バッファー組成、基質濃度など）が、イソアルファ酸の還元のために適切であると決定された。
【００６８】
基質特異性
生物学的変換目的のための理想的なケトレダクターゼは、側鎖組成に基づいて変化するイソフムロン同族体（ｎ−、ａｄ−、およびｃｏ−イソフムロンを参照）に関して基質特異性を示さない。さらに、ケトレダクターゼは、酵素的還元部位に近接したＣ４第三級アルコール基で空間的に変化するイソフムロンのｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体に関して特異性を示さない。基質特異性は、アミノ酸配列、および従って酵素の基質結合ポケットのジオメトリーによって影響される。より大きな結合ポケットは、より制限された結合ポケットと比較して、より大きな基質、ならびにより多様な基質を収容できる。
【００６９】
イソアルファ酸分子上に２つの追加的なケトン基が存在するにもかかわらず、全ての特徴付けられたケトレダクターゼについて、Ｃ４側鎖での所望の還元だけが観察された。
【００７０】
例６
改善されたＫＲＥＤ活性のための、配列番号４に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
配列番号４の酵素を、エン酸基質の還元に関するバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、親酵素として選択した。よく確立された技術（例えば、飽和突然変異誘発、および以前に同定された有益な突然変異の組換え）を用いて、操作された遺伝子のライブラリーを作製した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例２に記載されるようにＨＴＰにおいて産生し、可溶性ライセートは例３に記載されるように生成した。
【００７１】
優れたＫＲＥＤ活性を示す配列番号４をコードする配列番号３の操作されたポリヌクレオチドを用いて、表２のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソアルファ酸からのジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドは、上記のような指向性進化法を、ＨＴＰアッセイおよび以下で表２に記載される分析方法と一緒に使用して、配列番号４の「バックボーン」アミノ酸配列から生成した。
【００７２】
【表２】
2022500064.tif 000004
【００７３】
指向性進化は、配列番号３に記載のポリヌクレオチドで始めた。操作されたポリペプチドを、その後、出発「バックボーン」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和突然変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して作製し、ＨＴＰアッセイおよびイソアルファ酸基質を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸生成物に変換するポリペプチド能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。
【００７４】
酵素アッセイは９６ウェルフォーマットで、２００μＬの全体積／ウェルで実施し、これは、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８  トリエタノールアミン＊Ｈ２ＳＯ４において、５０％  ｖ／ｖ  ＨＴＰ酵素ライセート、８ｇ／Ｌイソアルファ酸基質、および４０ｖｏｌ％イソプロパノール（ＩＰＡ）中の０．１ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰを含んでいた。プレートをシールし、４０℃において６００ｒｐｍで２０〜２４時間振とうしながらインキュベートした。
【００７５】
２０〜２４時間後、０．１％酢酸を含む１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートをシールし、４℃において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クエンチしたサンプルを、ＨＰＬＣ分析の前に、５０：５０のアセトニトリル：水混合物において４〜５倍にさらに希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを以下の表３に記載する。
【００７６】
【表３】
2022500064.tif 000005
【００７７】
例７
改善されたＫＲＥＤ活性のための、配列番号６に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
よく確立された技術（例えば、飽和突然変異誘発、および以前に同定された有益な突然変異の組換え）を用いて、操作された遺伝子のライブラリーを作製した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例２に記載されるようにＨＴＰにおいて産生し、可溶性ライセートは例３に記載されるように生成した。
【００７８】
優れたＫＲＥＤ活性を示す配列番号６のポリペプチドをコードする配列番号５の操作されたポリヌクレオチドを用いて、表４のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソアルファ酸からのジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドは、上記のような指向性進化法を、ＨＴＰアッセイおよび表３に記載される分析方法と一緒に使用して、配列番号６の「バックボーン」アミノ酸配列から生成した。
【００７９】
【表４】
2022500064.tif 000006
【００８０】
指向性進化は、配列番号５に記載のポリヌクレオチドで始めた。操作されたポリペプチドを、その後、出発「バックボーン」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和突然変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して作製し、ＨＴＰアッセイおよびイソアルファ酸基質を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸生成物に変換するポリペプチド能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。
【００８１】
酵素アッセイは９６ウェルフォーマットで、２００μＬの全体積／ウェルで実施し、これは、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８トリエタノールアミン＊Ｈ２ＳＯ４において、５０％  ｖ／ｖ  ＨＴＰ酵素ライセート、４０ｇ／Ｌイソアルファ酸基質、および４０ｖｏｌ％イソプロパノール（ＩＰＡ）中の０．１ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰを含んでいた。プレートをシールし、４０℃において６００ｒｐｍで２０〜２４時間振とうしながらインキュベートした。
【００８２】
２０〜２４時間後、０．１％酢酸を含む１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートをシールし、４℃において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クエンチしたサンプルを、ＨＰＬＣ分析の前に、５０：５０のアセトニトリル：水混合物において１０〜２０倍にさらに希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表３に記載する。
【００８３】
例８
改善されたＫＲＥＤ活性のための、配列番号８０に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
よく確立された技術（例えば、飽和突然変異誘発、および以前に同定された有益な突然変異の組換え）を用いて、操作された遺伝子のライブラリーを作製した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例２に記載されるようにＨＴＰにおいて産生し、可溶性ライセートは例３に記載されるように生成した。
【００８４】
優れたＫＲＥＤ活性を示す配列番号８０のポリペプチドをコードする配列番号７９の操作されたポリヌクレオチドを用いて、表５のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソアルファ酸からのジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドは、上記のような指向性進化法を、ＨＴＰアッセイおよび以下で表３に記載される分析方法と一緒に使用して、配列番号８０の「バックボーン」アミノ酸配列から生成した。
【００８５】
【表５】
2022500064.tif 000007
【００８６】
指向性進化は、配列番号７９に記載のポリヌクレオチドで始めた。操作されたポリペプチドを、その後、出発「バックボーン」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和突然変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して作製し、ＨＴＰアッセイおよびイソアルファ酸基質を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸生成物に変換するポリペプチド能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。
【００８７】
酵素アッセイは９６ウェルフォーマットで、２００μＬの全体積／ウェルで実施し、これは、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８リン酸カリウムにおいて、２５％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素ライセート、６０もしくは８０ｇ／Ｌのイソアルファ酸基質、および４０ｖｏｌ％イソプロパノール（ＩＰＡ）中の０．０２ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰを含んでいた。プレートをシールし、４５℃において６００ｒｐｍで２０〜２４時間振とうしながらインキュベートした。
【００８８】
２０〜２４時間後、０．１％酢酸を含む１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートをシールし、４℃において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クエンチしたサンプルを、ＨＰＬＣ分析の前に、５０：５０のアセトニトリル：水混合物において２０〜４０倍にさらに希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表３に記載する。
【００８９】
例９
高基質濃度での、改善されたＫＲＥＤ活性のための、配列番号８０に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
よく確立された技術（例えば、飽和突然変異誘発、および以前に同定された有益な突然変異の組換え）を用いて、操作された遺伝子のライブラリーを作製した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例２に記載されるようにＨＴＰにおいて産生し、可溶性ライセートは例３に記載されるように生成した。
【００９０】
優れたＫＲＥＤ活性を示す配列番号８０のポリペプチドをコードする配列番号７９の操作されたポリヌクレオチドを用いて、表６のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソアルファ酸からのジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドは、上記のような指向性進化法を使用して、配列番号８０の「バックボーン」アミノ酸配列から生成し、そして表３に記載される。
【００９１】
【表６】
2022500064.tif 000008
【００９２】
指向性進化は、配列番号７９に記載のポリヌクレオチドで始めた。操作されたポリペプチドを、その後、出発「バックボーン」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和突然変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して作製し、ＨＴＰアッセイおよびイソアルファ酸基質を所望のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸生成物に変換するポリペプチド能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングした。
【００９３】
酵素アッセイは９６ウェルフォーマットで、２００μＬの全体積／ウェルで実施し、これは、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１００ｍＭ  ｐＨ８リン酸カリウムにおいて、１０〜２０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素ライセート、８０もしくは１６０ｇ／Ｌのイソアルファ酸基質、および４０ｖｏｌ％イソプロパノール（ＩＰＡ）中の０．０２ｇ／Ｌ  ＮＡＤＰを含んでいた。プレートをシールし、４５℃において６００ｒｐｍで２０〜２４時間振とうしながらインキュベートした。
【００９４】
２０〜２４時間後、０．１％酢酸を含む１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートをシールし、４℃において４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クエンチしたサンプルを、ＨＰＬＣ分析の前に、５０：５０のアセトニトリル：水混合物において２０〜４０倍にさらに希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表３に記載する。
【００９５】
例１０
高基質濃度および低ＮＡＤＰ濃度での、改善されたＫＲＥＤ活性のための、配列番号８０、１０４、１００、１３６、１１６、１３２、１６２、１５０、１５２、１４４および１４６に由来する操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング
２００ｇ／Ｌの酵素ストック溶液を、１００ｍｇの酵素粉末を、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰを含む５００μＬの１００ｍＭ  ｐＨ８リン酸カリウムバッファーに溶解することによって調製した。９６ディープウェルプレートのウェルに、４０μＬの酵素／ＮＡＤＰストック溶液、８０μＬのイソプロパノール、および８０μＬの４０重量％イソアルファ酸水溶液を添加した。最終反応組成は、４０％  ＩＰＡにおいて酵素４０ｇ／Ｌ、イソアルファ酸１６０ｇ／ＬおよびＮＡＤＰ０．０２ｇ／Ｌであった。プレートをシールし、４０℃で２４時間インキュベートし、次いでクエンチして、ＨＰＬＣ−ＵＶによって分析した。データを表７および図５に示す。
【００９６】
【表７】
2022500064.tif 000009
【００９７】
例１１
イソプロパノール酸化による補因子リサイクリングを用いた酸性化ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソアルファ酸を例１０に記載の様式で処理し、ここで、イソアルファ酸の供給源はｐＨ＜７を有する非常に濃厚な材料（６８．９％イソアルファ酸）である。
【００９８】
例１２
グルコースデヒドロゲナーゼによる補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールを４．３Ｕ／ｍＬグルコースデヒドロゲナーゼ、０．７ｇ／Ｌ  ｍＭ  ＮＡＤおよび１４．４ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例１０に記載の様式で処理する。
【００９９】
例１３
補因子リサイクリングを伴わないホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールを基質としての等モル量のＮＡＤＰＨで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例１０に記載の様式で処理する。
【０１００】
例１４
エタノール酸化による補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
イソプロパノールをエタノールで置き換えることを除いて、イソアルファ酸を例１０に記載の様式で処理する。
【０１０１】
例１５
ＳｉＯ２による固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをＳｉＯ２に吸着させ、グルタルアルデヒドを用いて架橋して、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０２】
例１６
ＤＥＡＥ−セルロースによる固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ＤＥＡＥ−セルロース上に吸着させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０３】
例１７
ＰＥＩ処理アルミナによる固定化ケトレダクターゼを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ポリエチルイミン（ＰＥＩ）処理アルミナ上に吸着させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、固定化酵素を除去する。
【０１０４】
例１８
ＮＡＤＨ補因子リサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ＮＡＤＰＨ補因子をＮＡＤＨで置き換えた酵素処理。イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で処理するが、ＮＡＤＰをＮＡＤで置き換える。
【０１０５】
例１９
ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く抽出
酵素処理、それに続いて、ジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸の最終濃度を増加させるために抽出を行う。イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で処理する。得られた反応混合物をろ過して酵素を除去し、食品グレードの溶媒で抽出して、所望の濃度のジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸を得る。
【０１０６】
例２０
ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く熱不活化
イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で処理する。反応を、３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。得られた反応混合物を８０〜１００℃で１０〜３０分間加熱し、酵素を不活化する。
【０１０７】
例２１
ホップ由来イソアルファ酸の酵素処理、それに続く化学的不活化
イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で処理する。反応を、３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間旋回振とうしながらインキュベートする。食品グレードのエタノールを＞５０％の最終濃度まで添加して酵素を不活化する。
【０１０８】
例２２
固定化ケトレダクターゼリサイクリングを用いたホップ由来イソアルファ酸の酵素処理
ケトレダクターゼをグルタルアルデヒドで架橋し、ＤＥＡＥ−セルロース上に吸着させて、固定化ケトレダクターゼ材料を得る。引き続き、イソアルファ酸を、例１０に記載の様式で固定化ケトレダクターゼで処理する。得られた反応混合物を１０，０００ｇで遠心分離し、反応溶液から固定化ケトレダクターゼを分離する。固定化ケトレダクターゼを回収し、水または水性バッファーで洗浄し、新しい反応混合物中で再使用する。
【０１０９】
結論
１６２種のケトレダクターゼが、イソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するものとして特徴付けられた。この研究において特徴付けられたケトレダクターゼは、以前に記載されていない酵素活性を有する。この研究で特徴付けられたケトレダクターゼは全てケトン基をアルコールに還元し、従ってケトレダクターゼである。これらの結果は、ケトレダクターゼ生体触媒が、新規な生物学的変換プロセスにおいてイソアルファ酸をジヒドロ−（ｒｈｏ）−イソアルファ酸に変換するために使用し得ることを実証している。本発明は、水素化ホウ素ナトリウムを利用する既存のプロセスに取って代わることが意図される。
【０１１０】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様による範囲に限定されるものではない。実際、本明細書に記載される実施態様に加えて、種々の改変が前述の説明から当業者に明らかになるだろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０１１１】
本明細書において引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献および他の資料は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
参照文献
１．Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ；  ＭＳＤＳ  Ｎｏ．  Ｓ９１２５；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．：  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ０１，  ２０１５．  （ａｃｃｅｓｓｅｄ  ０６／０８／１７）．
２．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｐ．  Ｋ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１５，  ５９，  １−４１．
３．Ｈｕｌｔ，  Ｋ．；  Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，  Ｐ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７，  ２５  （５），  ２３１−２３８．
４．Ｎｏｂｅｌｉ，  Ｉ．；  Ｆａｖｉａ，  Ａ．  Ｄ．；  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００９，  ２７  （２），  １５７−１６７．
５．Ｐｏｚｅｎ，  Ｍ．，  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ．  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ，  １９３４，  ２６  （１１），  １１２７−１１３３．
６．Ｐｒａｅｔ，  Ｔ．；  Ｏｐｓｔａｅｌｅ，  Ｆ．；  Ｊａｓｋｕｌａ−Ｇｏｉｒｉｓ，  Ｂ．；  Ａｅｒｔｓ，  Ｇ．；  Ｄｅ  Ｃｏｏｍａｎ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｏｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｏｍａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｕｐｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ，  ２０１２，  ３６，  １２５−１３２．
７．Ｗａｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｌ．  （１９４７）  Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｅｅｒ，  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２，４３３，４１１．
８．Ｇｈｉｏｎｎｏ，  Ｌ．；  Ｍａｒｃｏｎｉ，  Ｏ．；  Ｓｉｌｅｏｎｉ，  Ｖ．；  Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ，  Ｇ．；  Ｐｅｒｒｅｔｔｉ，  Ｇ．，  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｇｌｕｔｅｎ  ｌｅｖｅｌｓ，  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１７，  ５２  （６），  １３６７−１３７４．
９．Ｇｒｏｓ，  Ｊ．；  Ｔｒａｎ，  Ｔ．  Ｔ．  Ｈ．；  Ｃｏｌｌｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｏｄｏｕｒａｎｔ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｉｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｏｐ．  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ２０１３，  １１９  （４），  ２２１−２２７．
【図１】
2022500064.tif 000010
【図２】
2022500064.tif 000011
【図３】
2022500064.tif 000012
【図４】
2022500064.tif 000013
【図５】
2022500064.tif 000014
【配列表】
2022500064000001.app
【国際調査報告】
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