【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月16日(2010.9.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項６】
配列番号４、６および８に記載の配列の１つから選択されたアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のアレルゲンPhl p 5aの変異型。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項９】
配列番号３、５および７に記載の配列の１つから選択されたＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項１０】
発現制御配列に機能的に結合している、請求項８または９に記載のＤＮＡ分子を含有する、組み換え発現ベクター。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項１４】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、請求項１〜７のいずれかに対応する少なくとも１つのアレルゲン変異型、および任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項１５】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲン変異型の使用。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項１８】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターならびに、任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む、医薬組成物。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項２０】
イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはかかるアレルギーの予防のための薬剤の製造のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項１７に記載の発現ベクターの使用。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低減したＩｇＥ反応性により、および同時にＴリンパ球による実質的に保持された反応性により特徴付けられる、イチゴツナギ亜科(Pooideae)のグループ５アレルゲンの変異型の調製および使用に関する。
これらの低刺激性アレルゲン変異型を、草花粉アレルギーを有する患者の特異的免疫療法（減感作）または草花粉アレルギーの予防免疫療法のために用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉からの主要アレルゲンPhl p 5aの変異型に関する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
本発明の背景
１型アレルギーは、世界的にも重要である。先進国の人口の２０％までもが、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病状を患っている。これらのアレルギーは、植物の花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの様々な発生源から放出された空気中に存在するアレルゲン（空気アレルゲン）が原因である。同様に、これらの１型アレルギー患者の４０％までもが、草花粉アレルゲンに対し、特異的ＩｇＥ反応性を示す（Freidhoff et al., 1986, J. Allelgy Clin. Immunol. 78, 1190-2002）。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の優勢な主要アレルゲンは、Phl p 1およびPhl p 5であり、Phl p 5は、それらの分子量について異なり、独立した遺伝子によりコードされる5aおよび5bの２種の形状で生じる。Phl p 5aのおよびPhl p 5bの両方の推定アミノ酸配列を、組み換えＤＮＡ技術を用いて決定してきた。Phl p 5aは、約３２ｋＤａのタンパク質であり、草花粉アレルギー患者の８５〜９０％のＩｇＥ抗体と反応する。Phl p 5aは、点突然変異を通じてお互いに異なり、おそらく異なるアレルギー形態に対応する一連の相同変異型中に存在する。例えば、Lolium perenne、Poa pratensisなどの近縁の草種の花粉は、とりわけ、Phl p 5aと相同であるアレルゲンを含有し、共にグループ５アレルゲンとして知られる。草種のこれらのグループ５アレルゲンの高い構造的相同性は相応して、草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体を有する分子の高い交差反応性をもたらす。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
効果的なアレルギーの治療上の処置への古典的アプローチは、特異的免疫療法または減感作方法である（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562）。この方法において、患者に天然のアレルゲン抽出物を漸増用量で皮下注射する。しかしながら、この方法では、アレルギー反応またはさらにアナフィラキシーショックの危険性を伴う。これらの危険性を最小限に抑えるために、アレルゴイドの形状の画期的な製剤が用いられる。これらは、化学的に修飾されたアレルゲン抽出物であり、非処理の抽出物と比較して、著しく低減されたＩｇＥ反応性を有するが、同一のＴ細胞反応性を有する（Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382）。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
さらにより実質的な治療の最適化が、組み換え方法により調製したアレルゲンを用いて可能であろう。任意で患者の個々の感作パターンに適合した、組み換え方法により調製した高純度アレルゲンの定義済み混合物(defined cocktail)は、様々なアレルゲンに加えて、比較的多数の免疫原性であるがアレルゲン性でない二次タンパク質を含有することから、天然のアレルゲン源からの抽出物を置き換えることができる。
組み換え発現生成物による信頼性のある減感作をもたらすであろう現実的な展望は、治療に必須であるＴ細胞エピトープを損なわずに、ＩｇＥエピトープを特異的に欠失させる、特異的に突然変異した組み換えアレルゲンにより提供される（Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414）。
アレルギー患者における乱されたＴヘルパー細胞バランスの治療的処置についてのさらなる可能性は、関連アレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡによる処置である（免疫療法的ＤＮＡワクチン接種）。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
この型のＤＮＡワクチンによる免疫反応のアレルゲンに特異的な影響の初期の実験的証拠は、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により齧歯動物において提供されている(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544)。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
本発明が基礎とする目的は、低減したＩｇＥ活性と同時に実質的に保持されたＴ細胞反応性により区別され、したがって、特異的免疫療法および免疫療法的ＤＮＡワクチン接種に好適な、タンパク質およびＤＮＡレベルでのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの新規の変異型の提供にある。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
発明の詳細な説明
ｃＤＮＡ配列の突然変異誘発およびクローニング
本発明の特に好ましい低刺激性Phl p 5a変異型の出発点は、オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉の全ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、特異的プライマーを用いて単離された野生型Phl p 5aのイソ型のｃＤＮＡである(NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) GenBank番号AJ555152)(配列番号1)。配列番号２のように、アミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推定された。２８４のアミノ酸からなるPhl p 5aは、E. coli中で可溶性タンパク質として細胞質的に(cytosolically)発現され、続いて精製された。この組み換え野生型形状のPhl p 5a(rPhl p 5a wt)は、モノクローナル抗Phl p 5抗体と、および天然の精製したPhl p 5a(nPhl p 5a)と反応性を有する草花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113（配列番号３、ｃＤＮＡ配列（７９５ｂｐ）、および配列番号４、アミノ酸配列（２６４ａａ））の構築のために、第一に、rPhl p 5a wtのｃＤＮＡから始め、２つのフラグメントを調製した。rPhl p 5a wtのアミノ酸１〜９３をコードしたフラグメント「Ｆ１−９３」を、ＰＣＲによって、プライマー１および５を用いて調製し、フラグメント「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー４および６を用いて調製した（プライマー配列、表１参照）。フラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」を、プライマー１および４を使ってさらなるＰＣＲにおいて鋳型として用い、欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113をコードした完全ｃＤＮＡの増幅をもたらした。ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１−９３」および「Ｆ１１４−２８４」の連結の基礎は、両方のフラグメントに共通の配列領域であった。この配列領域は、５’領域でアミノ酸８８〜９３をコードした追加ＤＮＡ配列を含有した特別なセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによるフラグメント「Ｆ１１４−２８４」の増幅によって形成された（表１）。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ175〜198（配列番号５、ｃＤＮＡ配列（７８３ｂｐ）、および配列番号６、アミノ酸配列（２６０ａａ））をコードしたｃＤＮＡ配列は、制限およびそれに続く２つの別々に調製したｃＤＮＡフラグメントの連結反応により発生した。５’末端フラグメント「Ｆ１−１７４」をプライマー１および２を用いて、そして３’末端フラグメント「Ｆ１９９−２８４」をプライマー３および４を用いて、ＰＣＲによって調製した。ｃＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＳｐｅＩにより消化され、続いて連結反応した（表１参照）。連結反応生成物を、プライマー１および４を用いてＰＣＲにより増幅させた。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
欠失変異型Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198（配列番号７、ｃＤＮＡ配列（７２３ｂｐ）、および配列番号８、アミノ酸配列（２４０ａａ））のｃＤＮＡも同様に、２つのｃＤＮＡフラグメントから調製した。５’末端フラグメントを、プライマー１および５を使用して、rPhl p 5a wt-cDNAを鋳型として発生させ、３’末端フラグメントを、プライマー４および６を使用して、Phl p 5a DM-Δ175〜198-cDNAを鋳型として発生させた。rPhl p 5a wtタンパク質のアミノ酸８８〜９３に対応する共通の配列領域を使って、フラグメントを、プライマー１および４を使用して３番目のＰＣＲによって連結し、生成物を増幅させた。
修飾されたアレルゲンをコードするｃＤＮＡを、EheIおよびHindIII制限部位を経て発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)に連結反応させ、続いて完全に配列決定した。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
例えば、Poa pratensisおよびLolium perenneなどのイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンの免疫交差反応性は、非常に類似したアミノ酸配列に基づいている。対応する遺伝子が共通の先祖遺伝子にさかのぼることは明白であると捉えられ得る。イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンにおける相同配列領域は、Phl p 5a wtタンパク質配列の欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の配列（参照：GenBank AJ555152）、またそれらのフランキング配列領域の両方について存在する。問題となっている配列領域の高い相同性を、ＤＮＡレベルで、またアミノ酸配列レベルでの両方で実証することができる（図１および図２）。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
Phl p 5a欠失変異型の低減したＩｇＥ結合の決定
アレルゲン性分子のＩｇＥ反応性の決定についての単純な試験方法は、ストリップテストによるアレルギー患者からの血清からの特異的ＩｇＥの、膜結合性試験タンパク質への結合の調査である。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
図８ａ〜ｃは、２つの個々の血清および草花粉アレルギー患者の血清プールにより生じた試験物質の特異的阻害曲線を典型的に示す。nPhl p 5a/bは、すべての試験における最大の阻害効果を示した（１０μｇ／ｍｌの濃度で約８０〜９５％の阻害効果）。rPhl p 5aの阻害効果は、最大阻害の７０〜８０％へと著しく低下した。この効果は、イソ型Phl p 5aに加えてイソ型Phl p 5bも含有する、nPhl p 5a/bの組成によるものである。Phl p 5bに対する特異的ＩｇＥ抗体を、rPhl p 5a wtにより阻害することはできない。
ヒスチジン融合成分は、ＩｇＥ結合への効果を示さなかった。これは、rPhl p 5a wt (His)およびrPhl p 5a wtの同一の阻害曲線を通じてすべての試験において明らかである。これは、ヒスチジン融合タンパク質を用いる試験の妥当性を実証している。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
一般的に、２グループの患者血清を、定性的ＩｇＥ結合に関して区別した。
第一のグループは、個々の血清Ｐ１５により表される（図８ａ）。アレルギー患者からのこれらの血清は、Phl p 5への結合が欠失Δ94〜113およびΔ175〜198の両方により低減したＩｇＥ抗体を含んだ。欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113 (His)は、本発明においてほんの約５０％の最大阻害効果を示し、および欠失突然変異体Phl p 5a DM-175〜198 (His)は、たった２０〜３０％の阻害効果を示した。
二重欠失突然変異体Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198 (His)は、用いた最高濃度でＩｇＥ抗体の結合を０〜１０％しか阻害することができなかった。非融合タンパク質Phl p 5a DM-Δ94〜113、175〜198の使用は、この結果を確認した（０〜１０％の最大ＩｇＥ阻害）。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
好塩基球の活性化試験のために、草花粉アレルギー患者からのヘパリン添加全血を、様々な濃度の試験物質と共にインキュベートする。アレルゲン性物質は、好塩基性顆粒球の高親和性ＩｇＥ受容体に結合した特異的ＩｇＥ抗体と結合することができる。
アレルゲン分子により開始されるＩｇＥ／受容体複合体の架橋は、エフェクター細胞の脱顆粒、したがってin vivoでアレルギー反応の開始をもたらす、シグナル変換をもたらす。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
Ｔ細胞反応性
Ｔヘルパーリンパ球は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）における酵素分解により形成されたアレルゲンのペプチドフラグメント（およそ１２〜２５のアミノ酸）と反応し、ＡＰＣｓの表面で個々のＭＨＣクラスＩＩ分子における好適なペプチドの封入(inclusion)後、Ｔ細胞に現れる。Ｔヘルパーリンパ球のこのアレルゲン特異的活性化は、続く反応（増殖、アネルギー、アポトーシス）におよび機能的分化（ＴＨ１およびＴＨ２）に必須の条件である。減感作におけるアレルゲンまたはアレルゲン変異型を用いた処置によるアレルゲン特異的Ｔ−リンパ球の影響は、治療上の有効性のためのカギであるとされている。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
グループ５アレルゲンにおいて欠如するまたは除去されるPhl p 5aのアミノ酸配列領域94〜113および175〜198に対応するアミノ酸配列領域について、本発明の目的に特に好ましいと証明されたように、本発明は特に、かかるアレルゲン変異型に関する。最初に述べたまたは二番目に述べた領域は、個々に欠如していてもよいが、両方の前記領域はまた同時に欠如していてもよく、後者の態様が、非常に特に好ましい。
イチゴツナギ亜科からのグループ５アレルゲン内の高い配列の相同性のおかげで、これらの領域を、他のグループ５アレルゲンからの配列を有するPhl p 5a配列の配列アライメントにおいて疑いなく同定することができる。上記アレルゲン変異型は、好ましくはPhl p 5a由来であるか、または配列番号４、６または８に記載の配列に対応する。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
本発明のアレルゲン変異型を、遺伝子工学方法を用いて、クローン化ＤＮＡ配列から出発して調製することができる。しかしながら、原理上は、天然のアレルゲン抽出物の化学修飾もまた、可能である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382)。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
本発明はさらに、特に配列番号３、５または７に記載の配列に対応した、上記のアレルゲン変異型をコードするＤＮＡ分子に、このＤＮＡ分子を含有する組み換え発現ベクターに、ならびに前記ＤＮＡ分子または前記発現ベクターにより形質転換した宿主生物に関する。好適な宿主生物は、バクテリアまたは酵母などの原核生物または真核生物、単細胞生物または多細胞生物であってもよい。本発明にしたがって好ましい宿主生物は、E. coliである。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
本発明はさらに、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための、これらのアレルゲン変異型の少なくとも１つまたは対応するＤＮＡ分子または対応する発現ベクターおよび任意でさらなる活性成分および／または補助剤を含む医薬組成物に関する。
これらが、第二の型（少なくとも１つのＤＮＡ分子または１つの発現ベクターを含む）の医薬組成物である場合、これらの組成物は、好ましくはさらに、水酸化アルミニウム、免疫刺激性ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはこれら２種の組み合わせを、補助剤として含む。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
最後に、本発明は、イチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイチゴツナギ亜科のグループ５アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの防止のための薬剤の調製のための、本発明の少なくとも１つのアレルゲン変異型または本発明のＤＮＡ分子または本発明の発現ベクターの使用に関する。