(57)【要約】  本発明は、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための方法に関する。方法は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを提供する工程、および前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、タイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程を含む。第１のポリヌクレオチドはイントロンの５’部分を含み、第２のポリヌクレオチドはイントロンの３’部分を含む。目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本発明によりさらに想定され、これは真核生物宿主細胞において転写される場合に、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも５つのイントロンを含む転写物に転写される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための方法であって、
（ａ１）第１のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第１のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に、
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における第１の切断配列は、前記認識配列に作動可能に連結される、工程、
（ａ２）第２のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第２のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、前記第２の切断配列は、（ａ２）（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列と異なる、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列であって、前記第３の切断配列は、（ａ２）（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結される、認識配列
を含む、工程、および
（ａ３）第３のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第３のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記第４の切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、第４の切断配列は、（ａ３）（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、工程、ならびに
（ｂ）前記第１、第２および第３のポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１、第２および第３のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生させる工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ａａ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｂｂ）第１のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第１のイントロンは機能的であり、前記第１のイントロンは、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｃｃ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｄｄ）第２のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第２のイントロンは機能的であり、前記第２のイントロンは、第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、ならびに
（ｅｅ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合ポリヌクレオチドは、真核生物宿主細胞において転写される場合、転写物に転写され、前記転写物は、各イントロンが前記転写物からスプライシングされるように前記細胞でプロセシングされ、それによって目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが産生される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１のイントロンおよび／または第２のイントロンは、融合ポリヌクレオチドに対して異種性である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１のイントロンをコードするポリヌクレオチドおよび／または第２のイントロンをコードするポリヌクレオチドは、４０から２０００ｂｐの長さを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１および／または第２のイントロンをコードするポリヌクレオチドは、５０から２００ｂｐ、特に５０から１５０ｂｐの長さを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および／または第２のイントロンは、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
目的とするポリペプチドを産生するための方法であって、
（ｉ）請求項１から７のいずれか１項に記載の方法によって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程、および
（ｉｉ）真核生物宿主細胞において前記融合ポリヌクレオチドを発現させ、それによって前記目的とするポリペプチドを産生する工程、および場合により、
（ｉｉｉ）産生された目的とするポリペプチドを前記真核生物宿主細胞から単離する工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
第１、第２および第３のポリヌクレオチドを含む組成物であって、
前記第１のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列であって、第１の切断配列は、前記認識配列に作動可能に連結される、認識配列、
を含み、前記第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、第２の切断配列は、第２のポリヌクレオチドの前記認識配列（ｉ）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列と異なる、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列であって、第３の切断配列は、前記認識配列に作動可能に連結される、認識配列
を含み、
前記第３のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第４の切断配列は、前記第３のポリヌクレオチドの認識配列（ｉ）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、前記組成物。
【請求項１０】
前記組成物はタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼをさらに含み、特に前記タイプＩＩｓ制限酵素および前記リガーゼは、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にし、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを生成する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項９で定義される第１、第２および第３のポリヌクレオチド、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの切断を可能にするタイプＩＩｓ制限酵素、ならびに前記タイプＩＩｓ制限酵素での切断から生じる切断産物のライゲーションを可能にするリガーゼを含むキット。
【請求項１２】
前記タイプＩＩｓ制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｆａＮＩから選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法、請求項９または１０に記載の組成物、または請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
真核生物宿主細胞において転写される場合に、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも５つのイントロンを含む転写物に転写される、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
各々の前記イントロンは、好ましくは、５０から２００ｎｔの長さ、より好ましくは５０から１５０ｎｔの長さ、および最も好ましくは５０から１００ｎｔの長さを有する、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
各々の前記イントロンは、好ましくは、８０から２００ｎｔの長さ、９０から１５０ｎｔまたは９０から１２０ｎｔのような長さを有する、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
全てのイントロンは、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含む、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
（ａ１）請求項１で定義される第１のポリヌクレオチド、
（ａ２）請求項１で定義される第２のポリヌクレオチド、および
（ａ３）請求項１で定義される第３のポリヌクレオチドの、
前記エンドヌクレアーゼでの切断、および生じる切断産物のライゲーションにより、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための、リガーゼおよびタイプＩＩｓ制限酵素を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
複数のＤＮＡ断片を単一の連続するＤＮＡのストレッチへと組立てることを可能にする組換えＤＮＡ分子および分子クローニング方法は、分子生物学、バイオテクノロジーおよび医学研究にとって必須のツールである。最初の組換えＤＮＡ分子は、制限酵素およびＤＮＡリガーゼの発見の直後、１９６０年代末期に作製された。それ以来、様々な方法が開発され、組換えＤＮＡ分子の生成がスピードアップされ、促進されている。
【０００２】
タンパク質工学は、典型的には、根底にあるコードＤＮＡ配列を操作することによって行われる。異なるタンパク質ドメインをコードするＤＮＡモジュールの指向性組立（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、新規バイオ医薬フォーマットの開発および最適化の中心となる。
【０００３】
分子クローニングは、単一のＤＮＡ断片の複数のＤＮＡ成分のアセンブリへのクローニングから、ＤＮＡの単一の連続するストレッチへと進歩してきた。しかしながら、複雑な構築物の生成を可能にする、効率的な技術の必要性が依然として存在する（非特許文献１を参照されたい）。特に、一連の標準的および信頼性が高い工学的な機構が、遺伝的な成分をより大きなシステムへと組立てる間の多くの単調性や予期しない事象を排除するため望まれる（非特許文献２を参照されたい）。
【０００４】
ＤＮＡモジュール（例えば、タンパク質ドメインをコードする）は、典型的には、定義されたフランキング接頭（ｐｒｅｆｉｘ）および接尾（ｓｕｆｆｉｘ）ＤＮＡ配列を使用するカットアンドペースト機構によって組立てられる。古典的に、接頭および接尾配列は、パリンドロームタイプＩＩ制限部位をコードする。タイプＩＩ酵素は、ＤＮＡを同じ部位で認識および切断し、単一鎖オーバーハングを作り出し、これが同じ制限酵素によって切断される他のＤＮＡモジュールに融合される。しかしながら、目的とするＤＮＡモジュールは、ＤＮＡ操作技術の手段によって適切なタイプＩＩ制限部位を５’および３’末端に備えなければならず、結果的に変更／変異した一次ヌクレオチド配列を生じる。さらに、直鎖状で指向性ＤＮＡモジュールの組立は、いくつかのユニークなタイプＩＩ部位を必要とする。組立は通常いくつかのクローニング工程を必要とする、その理由は、異なるタイプＩＩ制限酵素が反応条件に関して適合性ではないことが多いからである。
【０００５】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングは、頻繁に使用される分子クローニング方法であり、タイプＩＩｓ制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、単一のピースへの複数のＤＮＡ断片の同時および指向性組立を可能にする。非特許文献３および非特許文献４。標準のタイプＩＩ制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩと異なり、タイプＩＩｓ制限酵素、例えば、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩおよびＢｂｓＩは、それらの認識配列の外側を切断し、したがって、非パリンドロームのオーバーハングが作り出すことができる。切断部位の適切なデザインでは、タイプＩＩｓ制限酵素によって切断される２つの断片は、オリジナルの制限部位を欠く産物へとライゲーションされる。
【０００６】
タイプＩＩｓベースの制限ライゲーションは、単一のクローニング工程において多くのＤＮＡ断片の組立を可能にする。組立に関して、ＤＮＡ断片は、１から６ｂｐ長（例えば、３〜４ｂｐ長）のストレッチの相補的な配列を、それらの５’（接頭）および３’（接尾）端に必要とし、これは定義した距離および配向でタイプＩＩｓ酵素認識部位によってフランキングされる。認識部位への結合に際して、タイプＩＩｓ酵素は、ＤＮＡ断片を接頭および接尾ヌクレオチド配列で切断し、それによって実際の認識部位を除去し、同時にライゲーション配列からなる遊離５’および３’末端を生成する。これらのライゲーション配列を次に使用して、ＤＮＡ断片を、マッチする／適合性のライゲーション配列とライゲーション反応中に一緒に融合する。結果的に、５’接頭および３’接尾配列が２つの別個のＤＮＡ断片の間で同一である場合、これらの断片はタイプＩＩｓベースの制限ライゲーション反応中にシームレスにライゲーションされる。
【０００７】
一般に、特定のバリアントライブラリーを生成するために使用されてきたＤＮＡ断片／モジュールは、新しいプロジェクトの状況で再使用（すなわち、再組立）することができない、その理由は、それらが適合性の接頭および接尾配列を提示しないことが多いからである。代わりに、モジュールは、異なるクローニング戦略にマッチさせるために再設計することが必要である（すなわち、その接頭および接尾配列はライゲーションを可能にするために適合されることが必要である）。これは非常に時間を消費し費用のかかる局面であり、というのも、特にＤＮＡ断片／モジュールの４ｂｐ接頭および接尾配列が頻繁に修飾されることが必要であるが、接頭および接尾−フランキングコア配列は不変のままであるからである。
【０００８】
したがって、当技術分野で記載されるクローニング戦略の主要な限定は、それらが指向性組立を可能にするためＤＮＡモジュール内のユニークかつ適合性の接頭および接尾配列を依然として必要とすることである。これらの接頭および接尾配列は、異なるタンパク質ドメインおよび／またはフォーマットの間で適合されず、これらの方法の普遍的な適用性を限定する。
【０００９】
現在まで、包括的なＤＮＡ断片モジュールであって、それらの５’および３’接頭および接尾配列非依存性のタイプＩＩｓベースの制限ライゲーション反応において再使用および再組立の可能性がある、ＤＮＡ断片モジュールを生成するための効率的な方法は存在しない。
【００１０】
プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、真核生物遺伝子発現における必須のプロセスである。より高等な脊椎動物では、認識されることが必要な標的イントロンの長さは、＜５０ｎｔから＞５００．０００ｎｔの範囲にわたる。ヒトでは、約９０ｎｔから約２０００ｎｔの長さを有するイントロンが、プレ−ｍＲＮＡ内に最も一般的に見出される。しかしながら、短いまたはさらに極端に短いイントロン配列も記載されている。例えば、短いイントロンは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）（＜４０ｎｔ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（約２０〜５９ｎｔ）およびヒト組織（＜６５ｎｔ）に見出されている（非特許文献５；非特許文献６）。
【００１１】
プレ−ｍＲＮＡ中のイントロンとエキソンの間の境界に位置するイントロンは、スプライセオソームイントロンとも呼ばれる。ＲＮＡスプライシングは、非コードＲＮＡイントロンを除去し、エキソンを残し、これが次にスプライシングされ、一緒に繋がれて最終的なｍＲＮＡ（「成熟ｍＲＮＡ」）を形成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｎｄｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００５年  Ｎｏｖ  ２４；４３８（７０６７）：４４９〜５３頁
【非特許文献２】Ｋｎｉｇｈｔ、Ｔ．  Ｆ．  （２００３年）．  Ｉｄｅｍｐｏｔｅｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｂｒｉｃｋｓ．  ＤＯＩ：  １７２１．１／２１１６８
【非特許文献３】Ｅｎｇｌｅｒ  ２００８年、Ａ  ｏｎｅ  ｐｏｔ、ｏｎｅ  ｓｔｅｐ、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．  ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ３．１１：  ｅ３６４７
【非特許文献４】Ｅｎｇｌｅｒら、２００９年、Ｇｏｌｄｅｎ  ｇａｔｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ：  ａ  ｏｎｅ−ｐｏｔ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：  ｅ５５５３
【非特許文献５】Ｈｏｎｇら、２００６年、Ｉｎｔｒｏｎ  ｓｉｚｅ、ａｂｕｎｄａｎｃｅ、ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、２３（１２）、２３９２〜２４０４頁
【非特許文献６】Ｓｈｉｍａｄａら、２０１５年、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｉｎｔｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０１５年、１６、１０３７６〜１０３８８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
目的とする複数の遺伝子の発現を可能にする組換えＤＮＡ分子の迅速および容易に生成することに関する強い必要性が依然として存在する。特に、包括的なＤＮＡ断片モジュールであって、それらの５’末端および３’末端（すなわち、接頭および接尾配列）非依存性のタイプＩＩｓベースの制限ライゲーション反応において再使用および組立の可能性がある、ＤＮＡ断片モジュールを生成するための手段および方法が強く望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の根底にある技術的な課題は、前述の必要性を満たすための手段および方法の提供と認められる。技術的な課題は、特許請求の範囲および本明細書の以下に特徴付けられる実施形態により解決される。
【００１５】
したがって、ある特定の態様では、本発明は、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための方法に関する。ある特定の実施形態では、前記方法は、第１および第２のポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素ならびにリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを生成することを含む。ある特定の実施形態では、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドの各々は、タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識および切断部位を含むイントロン配列を含み、これは切断に際して、互いにライゲーションされる相補的な端を生成し、その結果、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドが産生される。ある特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドはイントロンの５’部分を含み、第２のポリヌクレオチドはイントロンの３’部分を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、第１、第２および第３のポリヌクレオチドを含む組成物にさらに関する。目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本発明によりさらに想定され、これは真核生物宿主細胞において転写される場合に、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも５つのイントロンを含む転写物に転写される。
【００１７】
前述の方法の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結される。
【００１８】
前述の方法の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列（すなわち、第２のポリヌクレオチドの認識配列）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
を含む。
【００１９】
したがって、本発明は、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための方法であって、
（ａ１）第１のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第１のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に、
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における切断配列は、（ｉｖ）における認識配列（すなわち、第１のポリヌクレオチドの認識配列）に作動可能に連結される、工程、
（ａ２）第２のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第２のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列（すなわち、第２のポリヌクレオチドの認識配列）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
含む、工程、ならびに
（ｂ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程
を含む、方法に関する。
【００２０】
産生されたポリヌクレオチドは、第１のイントロンを含む、すなわち、第１のイントロンをコードする。前記第１のイントロンは、機能的であり、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む。
したがって、産生された融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ａａ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｂｂ）第１のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第１のイントロンは機能的であり、前記第１のイントロンは、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、および
（ｃｃ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
を含む。
【００２１】
本発明の方法は、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドの産生を可能にする。したがって、方法はクローニング方法である。そのような方法は、典型的にはインビトロで実施される。本発明の方法は、上で明示的に言及された工程に限定されず、したがって、これらの工程に加えて工程を含み得る。例えば、さらなる工程は、本発明の融合ポリヌクレオチドへの追加のポリヌクレオチド配列のライゲーションに関し得る。例えば、以下本明細書に記載されるように、本発明の方法は、上で示されるエレメント（ａａ）、（ｂｂ）および（ｃｃ）を含む融合ポリヌクレオチドの産生を可能にするだけでなく、追加のエレメント、例えば、目的とするポリペプチドの第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０等々の部分をコードする核酸配列を含む融合ポリヌクレオチドの産生も可能にする。さらに、追加のポリヌクレオチドがライゲーションのために使用される。そのようなポリヌクレオチドは、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をコードし得る。これらの配列は転写されるが、翻訳されないので、本明細書に記載されるイントロンベースのクローニングアプローチを適用することが可能である。
【００２２】
そのうえ、さらなる工程は、ベクター、例えば、発現ベクターへの融合ポリヌクレオチドのクローニング、適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞への融合ポリヌクレオチド、または前記融合ポリヌクレオチドを含むベクターの導入、および／または単離、すなわち、宿主細胞または培養培地／上清からのポリペプチドの精製に関し得る。精製プロセスは、目的とするタンパク質における適切なタグ、例えば、Ｈｉｓタグの存在によって支持される。
【００２３】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、または特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。特に明記されない限り、本明細書の用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡポリヌクレオチドの一本鎖、または特に二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドを指す。前記二本鎖ＤＮＡは、本発明の方法の工程（ｂ）の間、端に１つまたは２つの一本鎖オーバーハングを一時的に含む。これは、ポリヌクレオチドに存在する切断配列、すなわち、切断部位の数に依存し：１つの切断部位が存在する場合、ポリヌクレオチドは１つの一本鎖オーバーハングを１つの端に含み、２つの切断配列が存在する場合、ポリヌクレオチドは２つの一本鎖オーバーハングを含む（各端に１つ）。オーバーハングはタイプＩＩｓエンドヌクレアーゼでの切断から生じ、（本明細書の他で記載されているように）所定の順序での断片のライゲーションを可能にする。
【００２４】
ポリヌクレオチドの長さは、塩基対またはヌクレオチドの数によって指定される。特に明記されない限り、それぞれの核酸が、一本または二本鎖核酸かどうかに関わらず、両方の用語は交換可能に使用される。また、ポリヌクレオチドはそれらのそれぞれのヌクレオチド配列によって定義されるので、用語ヌクレオチド／ポリヌクレオチドおよびヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド配列は交換可能に使用される。
【００２５】
本発明によって産生されるポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドであり、したがって、様々なポリヌクレオチドの融合によって産生される。特に、前記融合ポリヌクレオチドは、本明細書の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド、および場合により、少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド（例えば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０等々のポリヌクレオチド）を、タイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド（および、存在する場合、少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチド、例えば、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０等々のポリヌクレオチド）の切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生することによって産生される。
【００２６】
本発明の方法の工程（ａ１）および（ａ２）に従って、第１および第２のポリヌクレオチドが提供される。どのようにしてポリヌクレオチドを提供するかは、当技術分野で周知されている。一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に由来する（すなわち、それによって産生される）。別の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、人工的な遺伝子合成に由来する（すなわち、それによって産生される）。同じことが、本明細書の他で参照される、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、および第１０等々のポリヌクレオチドに適用される。一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、ベクターに存在する、すなわち、ベクターにより具備される。代替の実施形態では、ポリヌクレオチドは、直鎖状ＤＮＡ断片として提供される。
【００２７】
本発明の方法の工程（ａ１）で参照される第１のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における第１の切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結される。
【００２８】
本発明の方法の工程（ａ１）で参照される第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、以下のエレメント：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列（すなわち、第２のポリヌクレオチドの認識配列）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
を含む。
【００２９】
工程（ａ１）の項（ｉ）に示される核酸配列は目的とするポリペプチドの第１の部分をコードし、工程（ａ２）の項（ｉｖ）に示される核酸配列は前記ポリペプチドの第２の部分をコードする。典型的に、核酸配列コードは、本発明に従って本明細書で参照される、目的とするポリペプチドの部分をコードし、少なくとも１０、少なくとも５０、または少なくとも２００ｂｐの長さを有する。前記核酸配列は、コード配列の部分を含む。したがって、ポリペプチドの部分は、少なくとも１アミノ酸、少なくとも約３アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、または少なくとも約５０アミノ酸の長さを有し得る。したがって、部分は、最小１アミノ酸から、任意の可能な長さ、例えば、１００アミノ酸、５００アミノ酸、１０００アミノ酸、またはそれ以上の長さを有し得る。本発明の方法の実施形態では、部分はタンパク質ドメインを含む。したがって、部分は、例えば、１００から１５０アミノ酸の長さを有し得る。
【００３０】
ポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含み得る。ポリペプチドの最後の部分（すなわち、Ｃ末端）をコードするポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含み得る。
【００３１】
目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列は、好ましくは、融合ポリヌクレオチドの第１のエキソンである。したがって、前記核酸配列は、生じる転写物の第１のエキソンをコードする。目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列は、好ましくは、融合ポリヌクレオチドの第２のエキソンである。目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列は、好ましくは、融合ポリヌクレオチドの第３のエキソンである、等々。
【００３２】
産生される融合ポリヌクレオチドにより具備されるエキソンは、機能的なイントロンにより分離される。例えば、第１のエキソンおよび第２のエキソンは、第１のイントロンにより分離される。融合ポリヌクレオチドに存在する場合、さらなるエキソンは、好ましくは、同様に機能的なイントロンにより分離される。したがって、第３のエキソンが存在する場合、第２のエキソンおよび第３のエキソンは第２のイントロンにより分離され、第４のエキソンが存在する場合、第３のエキソンおよび第４のエキソンは第３のイントロンにより分離される、等々。一実施形態では、融合ポリヌクレオチドにより具備されるイントロンは、同一である、すなわち、同一の配列を有する。別の実施形態では、融合ポリヌクレオチドにより具備されるイントロンは、異なる配列を有する。この実施形態では、例えば、異なる遺伝子および／または異なる生物のイントロンが使用される。イントロンは、人工的なイントロン、すなわち、天然に存在しないイントロンであってもよい。例えば、人工的なイントロンは、２つの異なるイントロンから５’および３’部分を組み合わせることによって、または天然に存在するイントロンを変異させることによって設計される。天然に存在するイントロンは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを付加、置換、または欠失させることによって変異される。図７は、追加のヌクレオチドを含有するイントロンが、前記イントロンを含む転写物から効率的にスプライシングされることを示す。
【００３３】
本発明によると、本発明の方法により産生される融合ポリヌクレオチドは、目的とするポリペプチドを産生させるために、真核生物宿主細胞において発現（すなわち、転写）される。融合ポリヌクレオチドの発現から生じるプロセシングされていない転写物、すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）は、融合ポリヌクレオチドによりコードされる全てのエキソンおよびイントロン配列を含む。前記転写物は真核生物細胞でてプロセシングされ、その結果、イントロン（またはイントロン）が、前記転写物からスプライシングされ、それによって目的とするポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、すなわち、目的とするポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡを産生する。イントロンはスプライシングによって前駆体ｍＲＮＡから除去されるので、ｍＲＮＡはエキソン配列のみを含む。
【００３４】
本発明の根底にある研究において、全ての試験したイントロンが、生成された転写物からスプライシングされるわけではないことが示されている。したがって、本発明の方法は、本発明の方法により産生される融合ポリヌクレオチドが、真核生物宿主細胞において発現される場合に、目的とするポリペプチドの産生を可能にするかどうかを評価するさらなる工程を含み得る。この評価は、産生されるポリペプチド（例えば、その活性）を評価することによって行われる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
用語「イントロン」は、当技術分野で周知されている。本明細書で使用される、その用語は、ヌクレオチド配列が、真核生物宿主細胞によって転写物からスプライシングされる能力がある（すなわち、切除される）、プロセシングされていない転写物内に存在するヌクレオチド配列を指す。前記プロセシングされていない転写物は、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）とも頻繁に呼ばれる。プロセシングされていない転写物からのイントロンのスプライシングは、プロセシングされた転写物、すなわち、成熟メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に起こる。原則的には、機能的である（特に、本明細書で参照される融合ポリヌクレオチドが発現される、宿主細胞において機能的である）、任意のイントロンが使用される。そのようなイントロンは、天然に存在するイントロン、または人工的なイントロン、すなわち、天然に存在しないが、機能的であるイントロンであってもよい。機能的なスプライス部位を含む人工的なイントロンは、例えば、Ｇａｔｅｒｍａｎｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９：１５２６（１９８９年）によって記載された。
【００３６】
上で示されるように、融合ポリヌクレオチドによって具備されるイントロンは機能的である。イントロンに関連する用語「機能的」は、当業者に十分理解される。機能的なイントロンは、典型的には、真核生物宿主細胞において発現される転写物（特にプレ−ｍＲＮＡ）からスプライシングされる能力があるイントロンである。イントロンが機能的あるかどうかは、周知の方法によって評価される。例えば、イントロンが、スプライシングされているかまたはされていないかを評価するために、発現されたタンパク質の活性を分析することが可能である。融合ポリヌクレオチドは、真核生物宿主細胞において転写される場合、転写物に転写され、転写物は、機能的なイントロンが前記転写物からスプライシングされるように前記細胞でプロセシングされ、それによって目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが産生される。融合ポリヌクレオチドが１つまたはそれ以上のさらなるイントロン（例えば、第２のイントロン）を含む場合、さらなるイントロンは同様に転写物からスプライシングされる（目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡを産生する）。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、用語「イントロン」は、スプライセオソームイントロン（時々、核プレ−ｍＲＮＡイントロンと呼ばれる）を指す。当技術分野で知られているように、スプライセオソームイントロンは、イントロンとエキソンの間の境界に位置する特定のイントロン配列を含む。これらの配列は、スプライセオソームＲＮＡ分子により認識される（例えば、Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  （２０１６年）：  ＷＩＲＥｓ  ＲＮＡ  ２０１６．ｄｏｉ：  １０．１００２／ｗｒｎａ．１３７７；Ｓｈｅｆｅｒら（２０１４年）：  Ｃｏｍｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  １１、１１３を参照されたい）。
【００３８】
本発明の実施形態では、機能的なイントロンは、スプライスドナー部位、分岐点、ポリピリミジントラクト、およびスプライスアクセプター部位を含む。前記エレメントは、当技術分野において周知されている。スプライスドナー部位は、イントロンの５’末端のＧＵ（ＧＴ）配列からなる。スプライスアクセプター部位は、イントロンの３’末端に位置し、したがってイントロンを終結させる。前記アクセプター部位はＡＧ配列からなる。分岐点には、ラリアット形成に関与するアデニンヌクレオチドが含まれる。ポリピリミジントラクトは、ピリミジンヌクレオチドに富んでおり、典型的には１５〜２０ｎｔの長さを有する。典型的には、それはスプライシングされるイントロンの３’末端の前の約５〜４０ｎｔに位置する。トラクトは、スプライセオソームの組立を促進する。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「イントロン」は、イントロンならびに前記配列の転写物中の対応する配列をコードする核酸配列の両方を指す。
【００４０】
融合ポリヌクレオチドによって具備されるイントロンは、（機能的である限り）任意の長さを有し得る。本発明の方法の実施形態では、イントロン（すなわち、イントロンのライゲーションされた５’および３’部分を含む機能的なイントロン）をコードする核酸は、４０から２０００ｂｐの長さ、特に５０から１０００ｂｐの長さを有する。したがって、イントロンは、融合ポリヌクレオチドによってコードされる、すなわち、転写物によって具備されるイントロン（例えば、第１、第２および／または第３のイントロン）は、４０から２０００ｎｔの長さ、特に５０から１０００ｎｔの長さを有する。
【００４１】
一実施形態では、本発明に従って使用されるイントロン、すなわち、融合ポリヌクレオチドによってコードされる転写物により具備されるイントロンは、短いイントロンである。そのようなイントロンの使用は有利であり、その理由は、これにより本発明の方法によって産生される融合ポリヌクレオチドのサイズが減少し、取扱いが容易にされるからである。さらに、遺伝子合成による小さいイントロンの合成は、大きいイントロンと比較して、低コストに結びつく。本明細書で参照される短いイントロンは、典型的には、５００ｎｔ未満の長さを有する。一実施形態では、短いイントロンは、５０から２００ｎｔの長さを有する。別の実施形態では、短いイントロンは、５０から１５０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態では、短いイントロンは、５０から１００ｎｔの長さを有する。例えば、転写物中に存在する各々のイントロンは、５０から２００ｎｔの長さ、例えば、５０から１５０ｎｔの長さまたは５０から１００ｎｔの長さを有し得る。したがって、イントロン（すなわち、機能的なイントロン）をコードするポリヌクレオチドは、５０から２００ｂｐ、特に５０から１５０ｂｐ、または５０から１００ｂｐの長さを有することが想定される。
【００４２】
機能的な極端に短いイントロンは、当技術分野において記載されている。例えば、極端に短いイントロンは、非特許文献６によって記載されている。
【００４３】
８０ヌクレオチドより長いイントロンの組合せが、極端に短いイントロンを含有するものよりも高い発現レベルを一般に生じることが、本発明に従って実施された研究において示されている（例えば、実施例セクションのイントロンＩ８およびＩ９に関する結果を参照されたい）。好ましい実施形態では、産生されたポリヌクレオチドのイントロンは、したがって、少なくとも８０ヌクレオチド、特に少なくとも９０ヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態では、イントロンは、８０から２００ｎｔの長さを有する。別の実施形態では、イントロンは、８０から１５０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態では、イントロン、例えば、転写物中に存在する各々のイントロンは、８０から１２０ｎｔの長さを有する。さらに、イントロンは９０から１５０ｎｔまたは９０から１２０ｎｔの長さを有することが想定される。
【００４４】
好ましくは、産生されたポリヌクレオチドによってコードされるイントロンは、ｎヌクレオチドの長さを有し、ｎは３で割ることができない整数である。したがって、産生されたポリヌクレオチドによってコードされるイントロン（特に各々のイントロン）は、ｎヌクレオチドの長さを有していてもよく、ｎは、整数であり、３で割る場合に整数を生じない。例えば、イントロンは、９１、９２、９４、９５、９７、９８、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１５、１１６、１１８または１１９ｎｔの長さを有し得る。
【００４５】
本発明の方法の実施形態では、使用されるイントロンは、本発明の根底にある研究において使用されたイントロンから選択される。特に、イントロンは、実施例セクションの表１に示されるようなイントロンＩ２、Ｉ３、Ｉ４、Ｉ５、もしくはＩ７（例えば、Ｉ２、Ｉ４、Ｉ５もしくはＩ７）、特にＩ８もしくはＩ９、または表２に示されるようなその機能的なバリアントであってもよい。これらのイントロンの配列は、実施例セクションの表３に示される。
【００４６】
本発明の方法の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによって具備される少なくとも１つのイントロン（例えば、第１のイントロン）は、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含む。したがって、少なくとも１つのイントロンは、１つまたはそれ以上のインフレームの中止コドンを含み得る。さらに、融合ポリヌクレオチドが１を超えるイントロン（例えば、第１のおよび第２のイントロン）を含む場合、全てのイントロンは目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含むことが想定される。したがって、ポリヌクレオチドの各イントロンは、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの１つまたはそれ以上の内部終止コドンを含み得る。１つまたはそれ以上の内部中止コドンの存在は、不完全なスプライシングのケースで切断型ポリペプチドの産生を生じる。そのような切断型ポリペプチドは、目的とするポリペプチドから分離される可能性があり、その理由は、それらの長さが短いからである。
【００４７】
ＲＮＡ中の中止コドンは、例えば、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）である。対応するＤＮＡ配列は、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡである。
【００４８】
一部の実施形態では、イントロンは、本明細書に記載されるように、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各オープンリーディングフレーム中に少なくとも１つの終止コドンを含む。したがって、１つまたはそれ以上のイントロンは、全て３つのオープンリーディングフレーム中に少なくとも１つの終止コドンを含み得る。
【００４９】
本明細書の他で既に説明されているように、本発明の方法によって産生される融合ポリヌクレオチドによって具備される機能的なイントロンは、イントロン（例えば、第１のイントロン）の５’部分をコードする核酸配列およびイントロン（例えば、第１のイントロン）の３’部分をコードする核酸配列を含む。本発明の方法によって産生される融合ポリヌクレオチドによって具備される機能的なイントロンは、機能的なイントロンの５’末端および機能的なイントロンの３’末端を組み合わせることによって生成される。組合せは、第１、第２（および、存在する場合、第３、第４、第５、等々）のポリヌクレオチドのタイプＩＩｓ制限酵素での切断から生じる適合性の（すなわち、相補的な）オーバーハングを介して、本発明の方法の工程（ｂ）において達成される。切断およびライゲーションは、好ましくは、同時に実施される。したがって、ポリヌクレオチドは、いわゆるＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング、すなわち、タイプＩＩｓ制限酵素による、ポリヌクレオチドの切断を含む反応における所望の順序での断片の融合ならびにタイプＩＩｓ制限酵素（すなわち、活性タイプＩＩｓ制限酵素）およびリガーゼ両方の存在下での切断産物のライゲーションによって組み合わせられる。
【００５０】
本発明に従って、本明細書で参照されるイントロンの５’部分および３’部分が、機能的ではないこと、すなわち、機能的なイントロンではないことが想定される。好ましくは、イントロンの前記部分は、転写物からスプライシングされるために必要とされる全てのエレメントを含まない。本発明に従って、イントロンの５’部分をコードする核酸配列が、スプライスアクセプター部位を含まないことが想定される。前記部位は、イントロンの３’部分をコードする核酸配列によって具備される。さらに、イントロンの３’部分をコードする核酸配列が、スプライスドナー部位を含まないことが想定される。前記部位は、イントロンの５’部分をコードする核酸配列によって具備される。
【００５１】
必ずしもスプライシングに必要とされる全てのエレメントが存在するとは限らないので、前記部分は、転写物に単独で存在する、すなわち、対応する５’または３’部分なしの場合、転写物からスプライシングされる能力がない。イントロンの機能性は、イントロンの５’部分および３’部分を含む２つのポリヌクレオチドをライゲーションすることによって達成され、それぞれは本明細書の他で記載される。
【００５２】
イントロンの５’および３’部分をコードする配列は、適切とみなされる任意の長さを有し得る。部分の最小の長さは、本発明の方法に適用される制限酵素での切断によって生成されるオーバーハングの長さである。一実施形態では、イントロンの５’部分は少なくともスプライスドナー部位を含み、イントロンの３’部分は少なくともスプライスアクセプター部位を含む。典型的には、５’部分および３’部分の各々は、少なくとも１０ｎｔまたは少なくとも２０ｎｔの長さを有する。実施例セクションで試験された部分の長さは、１２ｎｔから９８ｎｔであった（表４を参照されたい）。
【００５３】
本発明の方法の実施形態では、イントロンにおける５’および３’部分は、単一イントロンに由来する。本発明の方法の別の実施形態では、イントロンの５’および３’部分は、２つの異なるイントロンに由来する。したがって、本明細書で参照されるポリヌクレオチドを組立てることにより、人工的なイントロンが生成される。
【００５４】
本発明の実施形態では、本明細書で参照される、少なくとも１つの機能的なイントロン（例えば、第１のイントロン）は、目的とするポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドに対して異種性である。本発明の実施形態では、本明細書で参照される、機能的なイントロン（例えば、第１のイントロン）、複数の機能的なイントロン、ならびに／またはイントロンの５’および／もしくは３’部分は、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドに対して異種性である。したがって、融合ポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドの配列を有していない可能性がある。本発明の実施形態では、本明細書で参照される、機能的なイントロン（例えば、第１のイントロン）、複数の機能的なイントロン、ならびに／またはイントロンの５’および／もしくは３’部分は、目的とするポリペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドに対して異種性である。融合ポリヌクレオチドに対して異種性であるポリヌクレオチド（例えば、イントロン、またはその部分）は、好ましくは、融合ポリヌクレオチドにおいて天然に存在するポリヌクレオチド（例えば、イントロンまたはその部分）ではないポリヌクレオチドである。一実施形態では、融合ポリヌクレオチドによって具備される全てのイントロン（例えば、第１、第２、第３等々のイントロン）は、融合ポリヌクレオチドに対して異種性である。
【００５５】
同じことが、本明細書で参照されるイントロンの５’部分および３’部分に適用される、すなわち、前記部分が、それらが含まれるポリヌクレオチドに対して異種性であることが想定される。特に、イントロンの５’部分または３’部分をコードする核酸配列は、目的とするポリペプチドの部分をコードする核酸配列に対して異種性である。例えば、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列は、目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列に対して異種性である、または第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列は、目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列に対して異種性である。
【００５６】
さらに、機能的なイントロン（複数の機能的なイントロン）が、融合ポリヌクレオチドのある位置（融合ポリヌクレオチドの位置）に位置し、これが天然で（すなわち、その生物学的ゲノムの環境にある場合）イントロンを含まないことが想定される。
【００５７】
目的とするポリペプチドの部分をコードする第１、第２、第３、第４、第５等々のポリヌクレオチドは、タイプＩＩｓ制限酵素に関する少なくとも１つの切断配列およびタイプＩＩｓ制限酵素に関する少なくとも１つの認識配列を含む。タイプＩＩｓ制限酵素は、融合ポリヌクレオチドの産生のため本発明の方法の工程（ｂ）においてリガーゼと組み合せて使用される。産生は、所定の順序で様々なポリヌクレオチドを組立てることによって達成される。
【００５８】
用語「タイプＩＩｓ制限酵素」は、当業者に十分理解される。本明細書で使用される、その用語は、ＤＮＡをその認識配列の外側で切断するエンドヌクレアーゼ（「制限酵素」とも頻繁に呼ばれる）を指す。タイプＩＩｓ酵素は、その認識配列から０から２０ｂｐの距離においてＤＮＡを切断することが知られている。本発明の方法に従って使用されるタイプＩＩｓ制限酵素は、好ましくは、非対称性の二本鎖ＤＮＡ配列を認識し、二本鎖ＤＮＡにおける認識配列の外側で二本鎖ＤＮＡを切断する。一本鎖オーバーハング（「粘着端」）は、エンドヌクレアーゼでの切断によって作り出される。本発明の方法に従って使用されるエンドヌクレアーゼによって作り出されるオーバーハングは、典型的には、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを有する。これは、当業者に知られているように、使用されるタイプＩＩｓ制限酵素の特異性に依存する。しかしながら、ある特定のタイプＩＩｓ制限酵素による、より長いオーバーハングの産生も可能である。一実施形態では、タイプＩＩｓ制限酵素は、切断に際して３ヌクレオチドのオーバーハングを作り出す。別の実施形態では、タイプＩＩｓ制限酵素は、４ヌクレオチドのオーバーハングを作り出す。４ｂｐのオーバーハングを作り出すエンドヌクレアーゼに関して、２５６（すなわち、４４）の潜在的なオーバーハング配列が可能である。したがって、最大２５６ポリヌクレオチドが正確な順序で組立てられる。
【００５９】
タイプＩＩｓ制限酵素は、その認識配列（本明細書で「認識部位」とも呼ばれる）の外側である（すなわち、それによって具備されない）、切断配列（本明細書で「切断部位」とも呼ばれる）においてＤＮＡを切断するので、本発明の前述の方法の工程（ａ）に提供される第１の、第２の、第３等々のポリヌクレオチドは、認識配列および切断配列の両方を含む。切断配列は認識配列に作動可能に連結される。これは、エンドヌクレアーゼが認識配列をポリヌクレオチド中に認識した後に、ポリヌクレオチドがエンドヌクレアーゼによって切断部位で切断されることを意味する。
【００６０】
切断が切断部位と認識部位の間の定義された距離でのみ起こることが当技術分野において知られている。例えば、ほとんどのタイプＩＩｓ制限酵素（しかし、全てではない）は、認識配列と切断配列の間のスペーサーの存在を必要とする。したがって、スペーサーは、（エンドヌクレアーゼがスペーサーを必要とする場合）認識配列と切断配列の間に存在しなければならない。スペーサーは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドからなる。スペーサーの長さは、適用される制限酵素に依存する。例えば、ＢｓａＩは、１つのヌクレオチド後の一本の鎖を切断する（５’から３’方向）。したがって、１つのヌクレオチドのスペーサーは、この酵素による切断部位での切断を可能にするために、認識配列と切断配列の間に存在しなければならない。他のエンドヌクレアーゼは、より長いスペーサーが必要となる場合がある。例えば、適用されるエンドヌクレアーゼがＦｏｋＩであるとしたら、９つのヌクレオチドの長さを有するスペーサーが必要とされるであろう。
【００６１】
さらに、一部のタイプＩＩｓ制限酵素はメチル化感受性であり得、したがって、メチル化シトシン残基を切断することができず、メチル化ＤＮＡを無傷で残すことが当技術分野において知られている。タイプＩＩｓ酵素の活性が、それらのそれぞれの認識配列の中または周囲のメチル化配列によってブロックされることを回避するために、切断されるポリヌクレオチドは１つまたは２つのヌクレオチドで伸長され、その結果、潜在的な既知のメチル化部位が回避される。認識部位がポリヌクレオチドの５’末端に位置する場合、追加のヌクレオチドはポリヌクレオチドの５’末端に付加される。認識部位がポリヌクレオチドの３’末端に位置する場合、追加のヌクレオチドはポリヌクレオチドの３’末端に付加される。したがって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、（認識部位の位置に依存して）５’末端または３’末端に１つまたは２つのヌクレオチドをさらに含み得る。
【００６２】
認識配列は、タイプＩＩｓエンドヌクレアーゼにより認識される配列である。切断配列は、好ましくは、前記エンドヌクレアーゼの存在下で切断される、すなわち、前記エンドヌクレアーゼによって切断される能力がある配列である。認識部位が、切断部位での切断および引き続くライゲーションを可能するために、正確な配向になければならないことが理解される。当業者によって理解されるように、認識部位の配向は、切断が、ポリヌクレオチドの５’または３’末端で起こるかどうかに依存する。５’末端で、切断は５’から３’方向に起こる。３’末端で、切断は３’から５’方向に起こる。
【００６３】
本発明に従って、融合ポリヌクレオチドを産生するための方法の工程（ａ）で参照されるポリヌクレオチドによって具備される切断配列および認識配列は、したがってエンドヌクレアーゼでの切断に際して、認識配列は、前記ポリヌクレオチド（例えば、第１、第２、第３等々のポリヌクレオチド）から除去されるように配置される。これは、認識配列を切断配列に関して正確な配向（すなわち、上流または下流）に配置することによって達成される。例えば、認識配列は、前記ポリヌクレオチドの端で正確な配向に配置される可能性がある。したがって、本明細書で参照されるポリヌクレオチドが５’末端で切断される場合、タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列は切断配列が続く前記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する。したがって、切断配列は、前記認識配列から下流に位置する。本明細書で参照されるポリヌクレオチドが３’末端で切断される場合、タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列は前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する。このケースでは、切断配列は、前記認識配列から上流に位置する。前記ポリヌクレオチドの端で認識配列を配置することが必要とされないことが理解される。むしろ、追加のヌクレオチドが存在してもよい。例えば、追加のヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの３’末端に付加される可能性がある。
【００６４】
イントロンの５’部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドでは、タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断配列には、前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列が続く。イントロンの３’部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドでは、タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列には、前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断配列が続く。
【００６５】
一実施形態では、本明細書で参照されるポリヌクレオチドによって（すなわち、第１、第２、第３等々のポリヌクレオチドによって）具備される切断配列は、（ライゲーションされる）イントロンの５’または３’部分の部分である。例えば、第１のポリヌクレオチドにおける第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列は、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列を含む。例えば、第２のポリヌクレオチドにおける第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列は、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列を含む。ライゲーション後、生じたイントロンは、イントロンの５’部分、切断部位およびイントロンの３’部分を含む（本明細書で機能的なイントロンとも呼ばれる）。認識配列は、もはや存在しない。
【００６６】
切断配列は、本明細書に示されるイントロンにおいて天然で存在する配列であってもよい。あるいは、切断配列は、イントロンにおいて天然で存在しなくてもよい。このケースでは、切断配列は（例えば、挿入によって）付加される、または切断配列は、点突然変異を天然に存在するイントロンの配列に導入することによって生成される。
【００６７】
多数のタイプＩＩｓ制限酵素は、市販されている。一実施形態では、タイプＩＩｓ制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｆａＮＩから選択される。好ましくは、タイプＩＩｓ制限酵素は、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｔｇＺＩおよびＳａｐＩからなる群から選択される。
【００６８】
第２のポリヌクレオチドは、第１の切断配列に対して相補的である第２の切断配列を含む。本発明に従って、「別の切断配列に対して相補的である切断配列」（例えば、第１の切断配列に対して相補的である第２の切断配列）という語句は、好ましくは、エンドヌクレアーゼでの切断によって作り出されるオーバーハングが、互いに相補的である、すなわち、適合性であることを意味する。
【００６９】
本発明の実施形態では、たった１つのタイプＩＩｓ制限酵素が使用される。前記エンドヌクレアーゼは、組立てられるポリヌクレオチド（第１、第２等々のポリヌクレオチド）によって具備される全ての認識配列を認識する。本発明の代替の実施形態では、異なる認識部位を有する異なるタイプＩＩｓ制限酵素が使用され、例えば、２、３またはそれ以上の異なるタイプＩＩｓ制限酵素が使用される。前記異なるエンドヌクレアーゼは、理想的には、切断されたポリヌクレオチドのライゲーションを可能にするために、同じ長さ（例えば、４ｎｔ）かつ相補的な配列を有するオーバーハングを作り出す。
【００７０】
さらに、組立てられるポリヌクレオチドが、使用されるタイプＩＩｓ制限酵素に関するさらなる認識配列を含まないことが想定される、すなわち、それらは本明細書で参照される認識配列に加えて認識配列を含まないが、これは望ましくない位置での切断を防止するためである。これは当業者によって考慮される。
【００７１】
本発明の前述の方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）に提供されるポリヌクレオチドは、タイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させられ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する。
【００７２】
本明細書で使用される用語「リガーゼ」は、ポリヌクレオチドを一緒に繋ぐために使用される酵素に関する。本発明の方法に従って適用されるリガーゼは、ＤＮＡリガーゼである。ＤＮＡリガーゼは、当技術分野において周知されており、バクテリオファージリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、細菌性古細菌リガーゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｃｈｅａｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｇａｓｅ）を含む。好ましい実施形態では、リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼである。このリガーゼは、ＡＴＰをコファクターとして必要とする。リガーゼを使用することによって、本発明の方法の工程（ａ）に提供されるポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼでの切断後、作り出された相補的なオーバーハングを介してライゲーションされる。それによって、ポリヌクレオチドは指向性様式で組立てられる。
【００７３】
工程（ｂ）における切断およびライゲーション、すなわち、ポリヌクレオチドの組立は、同時または本質的に同時に実施される。したがって、組立は、リガーゼおよびタイプＩＩｓ制限酵素の両方の存在下で実施される。両方の酵素は活性であるべきである。この種の組立は、「Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ」組立として知られている。
【００７４】
工程（ｂ）における組立のために使用される酵素は異なる至適温度を有するので、典型的に組立はサーモサイクラーで実施される。典型的なサーモサイクラープロトコールは、約３７℃（タイプＩＩｓ制限酵素に対して至適）および約１６℃（リガーゼに対して至適）の間を組み合わせる。いくつかのサイクルが作られる。最後の工程で、酵素は、熱によって（例えば、６５℃で）不活性化される。プログラム可能なサーモサイクラーは、いくつかの商業的な供給元から容易に利用可能である。
【００７５】
切断およびライゲーション後、組立の産物は、コンピテント細菌細胞、例えば、大腸菌細胞に形質転換される。
【００７６】
融合ポリヌクレオチドは、目的とするポリペプチドをコードする。原核細胞はスプライシング機構を有さないので、融合ポリヌクレオチドが真核生物細胞において発現されなければならないことが理解される。ポリヌクレオチドを発現させるために、それは１つまたはそれ以上の発現制御配列に作動可能に連結される。好ましくは、発現制御配列は、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である。
【００７７】
本明細書で使用される用語「発現制御配列」は、本ケースでは上記核酸配列である、目的とする核酸配列の転写を統制する（すなわち、開始するおよび制御する）能力がある核酸配列を指す。そのような配列は、通常、プロモーターまたはプロモーターおよびエンハンサー配列の組合せを含むまたはそれからなる。したがって、発現制御配列は好ましくはプロモーターである。ポリヌクレオチドの発現は、核酸分子の転写、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。追加の調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサーを含み得る。
【００７８】
好ましくは、プロモーターは、真核生物宿主細胞、より好ましくは哺乳動物細胞および／または昆虫細胞において活性である。一実施形態では、融合ポリヌクレオチドは、ＣＭＶ−５−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−、ＥＦ１ａ−、ＭＰＳＶ−、およびＳＲアルファ−プロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結される。昆虫細胞に関して、多角体プロモーター、ｐ１０プロモーター、またはｉｅ１プロモーターが使用される。
【００７９】
発現を可能にするために、融合ポリヌクレオチドは、ベクター中に存在してもよい。好ましくは、ベクターは、本発明の方法により産生される融合ポリヌクレオチドの発現のために適切な組換えＤＮＡ構築物である。そのうえ、その用語はまた、ターゲティング構築物のゲノムＤＮＡへのランダムまたは部位特異的な組み込みを可能にするターゲティング構築物に関する。そのような標的構築物は、好ましくは相同的なまたは異種性の組換えのいずれかに関して十分な長さのＤＮＡを含む。ベクターは、宿主における増幅（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）および／または選択のための選択可能なマーカーを含み得る。
【００８０】
融合ポリヌクレオチドが発現される宿主細胞は、任意の真核生物細胞、例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）細胞、植物細胞または昆虫細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物または昆虫細胞である。例えば、宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞２９３）、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｅ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）ＨＥＫ−２９３細胞であってもよい。あるいは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞であってもよい。
【００８１】
本発明の方法は、事前に定義された目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドの産生に適用される。
【００８２】
しかしながら、方法はまた、融合ポリヌクレオチドを生成するために使用される第１、第２およびさらなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド部分の順序の異なる、目的とするポリペプチドをコードする複数の異なる融合ポリヌクレオチドを産生するために適用される。そのようなケースでは、融合ポリヌクレオチドは、典型的には、本発明の方法に従って特定されるように、第１、第２、および少なくとももう１つのポリヌクレオチドを含む。しかしながら、前記適用に関して、さらなるポリヌクレオチドならびに／または第１および第２のポリヌクレオチドの間のケースでのタイプＩＩｓ制限酵素に関する切断配列は、全て互いに相補的であり、その結果、第１、第２およびさらなるポリヌクレオチドのライゲーションは、実質的にランダムな様式で起こることが想定される。
【００８３】
用語「ポリペプチド」は、当業者に十分理解される。ポリペプチドは、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結されるアミノ酸残基から構成される分子である。目的とするポリペプチドは任意の長さを有し得る。例えば、目的とするポリペプチドは、少なくとも５０、１００、３００、または５００アミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。構築物に依存して、ポリペプチドは、例えば、生成される目的とするポリペプチドが人工的な抗体である場合、さらに長くてもよい。例えば、目的とするポリペプチドは、少なくとも２０００アミノ酸を含み得る。
【００８４】
本発明の根底にある研究において、異なる融合ポリペプチドが分析された（ルシフェラーゼおよび抗体、図１から１６を参照されたい）。しかしながら、本発明は、これらのポリペプチドに限定されない。原則的には、目的とするポリペプチドは任意のポリペプチドであってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、目的とするポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドである。典型的には、前記ポリペプチドは、酵素、転写因子、ヌクレアーゼ、リガンドタンパク質、治療タンパク質、転写因子、増殖因子、増殖因子受容体である。また、目的とするポリペプチドは、抗体またはその誘導体、例えば、二重特異性または多重特異性タンパク質構築物／抗体であってもよい。ある特定の実施形態では、目的とするポリペプチドは、少なくとも２つの天然に存在するポリペプチドの部分または全てを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、目的とするポリペプチドは、少なくとも１つの天然に存在するポリペプチドおよび少なくとも１つの天然に存在しないポリペプチドの部分または全てを含む融合タンパク質である。例えば、目的とするポリペプチドは、治療ペプチドもしくはタンパク質および治療抗体、またはその抗原結合性断片の融合物であってもよい。
【００８５】
上で示されるように、前記目的とするポリペプチドはまた、抗体またはその抗原結合断片であってもよい。抗体はまた、二重特異性抗体または多重特異性抗体であってもよい。本明細書で使用される用語「二重特異性抗体」は、２つの異なるエピトープに特異的に結合する抗体を指す。多重特異性抗体は、２つまたはそれ以上の異なるエピトープに結合する抗体である。前記二重特異性および多重特異性抗体の異なるエピトープは、典型的には、重複していないエピトープである。さらに、抗体は、二価または多価抗体であってもよい。一実施形態では、抗体は、多重特異性、多価抗体である。一実施形態では、抗体は、二重特異性、二価抗体である。
【００８６】
一実施形態では、目的とするポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドである。
【００８７】
本発明の方法は、２つのポリヌクレオチドの組立のみならず、３つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの組立も可能にする。例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０のポリヌクレオチドは、所定の順序で組立てられて（すなわち、ライゲーションされて）、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する。２つを超えるポリヌクレオチドが組立てられて融合ポリヌクレオチドを産生する場合、融合ポリヌクレオチドの中心位置（本明細書で中心ポリヌクレオチドとも呼ばれる）に位置する、組立てられるポリヌクレオチドは、タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断および認識部位を、両方の端、すなわち５’末端および３’末端に含む。融合ポリヌクレオチドの端（本明細書で末端ポリヌクレオチドとも呼ばれる）にある、組立てられるポリヌクレオチドは、一端のみに、タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断および認識部位を含む可能性がある。しかしながら、前記末端ポリヌクレオチドが、両方の端に、タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断および認識部位を含むことも想定される。これは、例えば、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのベクター（例えば、発現ベクター）へのクローニングを可能にするであろう。本明細書の他で記載されているように、切断部位および認識部位は、互いに作動可能に連結される。
【００８８】
本発明の方法の実施形態では、方法は、上で示される第１のポリヌクレオチド、上で示される第２のポリヌクレオチド、および第３のポリヌクレオチドの３つのポリヌクレオチドの組立、すなわち、ライゲーションを含む。それぞれ工程（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）に提供されるポリヌクレオチドは、（５’から３’に）以下の順序でライゲーションされる：
第１のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）−第２のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第３のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）。
【００８９】
第２のポリヌクレオチドが中心ポリヌクレオチドになるので、本発明の方法の工程（ａ２）に示される第２のポリヌクレオチドのエレメント（ｉ）から（ｉｖ）に加えて、（再び５’から３’方向に）以下の配列：
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列と異なる、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第３の切断配列は、前記認識配列に作動可能に連結される。
【００９０】
方法は、工程（ａ３）をさらに含む。前記工程は、工程（ｂ）の前に実施される。本発明の方法の工程（ａ３）では、第３のポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記第４の切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第４の切断配列は、前記認識配列（すなわち、（ｉ）のもとでの第３のポリヌクレオチドの認識配列）に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
【００９１】
本発明の方法の実施形態では、方法は、上で示される第１のポリヌクレオチド、３つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第２のポリヌクレオチド、および上で示される第３のポリヌクレオチド、および第４のポリヌクレオチドの４つのポリヌクレオチドの組立、すなわち、ライゲーションを含む。それぞれ工程（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）および（ａ４）に提供されるポリヌクレオチドは、（５’から３’に）以下の順序でライゲーションされる：
第１のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）−第２のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第３のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第４のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）。
【００９２】
第３のポリヌクレオチドが中心ポリヌクレオチドになるので、上の工程（ａ３）に示される第３のポリヌクレオチドのエレメント（ｉ）から（ｉｖ）に加えて、（再び５’から３’方向に）以下の配列：
（ｖ）第３のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第５の切断配列であって、第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列および第２のポリヌクレオチドの第３の切断配列と異なる、切断配列、ならびに
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第５の切断配列は、前記認識配列（すなわち、（ｖｉｉ）における認識配列）に作動可能に連結される。
【００９３】
方法は、工程（ａ４）をさらに含む。前記工程は、工程（ｂ）の前に実施される。本発明の方法の工程（ａ４）では、第４のポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第６の切断配列であって、前記第６の切断配列は、第５の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第６の切断配列は、（ｉ）における前記認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第３のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第４の部分をコードする核酸配列
を含む、ポリヌクレオチドが提供される。
【００９４】
本発明の方法の実施形態では、方法は、上で示される第１のポリヌクレオチド、３つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第２のポリヌクレオチド、４つのポリヌクレオチドの組立に関連する第３のポリヌクレオチド、上で示される第４のポリヌクレオチドおよび第５のポリヌクレオチドの５つのポリヌクレオチドの組立、すなわち、ライゲーションを含む。それぞれ工程（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）および（ａ５）に提供されるポリヌクレオチドは、（５’から３’に）以下の順序でライゲーションされる：
第１のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）−第２のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第３のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第４のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第５のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）。
【００９５】
第４のポリヌクレオチドが中心ポリヌクレオチドになるので、上の工程（ａ４）に示される第４のポリヌクレオチドのエレメント（ｉ）から（ｉｖ）に加えて、（再び５’から３’方向に）以下の配列：
（ｖ）第４のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第７の切断配列であって、第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列、第２のポリヌクレオチドの第３の切断配列、および第３のポリヌクレオチドの第５の切断配列と異なる、切断配列、ならびに
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第７の切断配列は、（ｖｉｉ）における前記認識配列に作動可能に連結される。
【００９６】
方法は、工程（ａ５）をさらに含む。前記工程は、工程（ｂ）の前に実施される。方法の工程（ａ５）では、第５のポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第８の切断配列であって、前記第８の切断配列は、第７の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第４のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第５の部分をコードする核酸配列
を含むポリヌクレオチドが提供される。
【００９７】
本発明の方法の実施形態では、方法は、上で示される第１のポリヌクレオチド、３つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第２のポリヌクレオチド、４つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第３のポリヌクレオチド、５つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第４のポリヌクレオチド、上で示される第５のポリヌクレオチド、および第６のポリヌクレオチドの６つのポリヌクレオチドの組立、すなわち、ライゲーションを含む。それぞれ工程（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）、（ａ５）および（ａ６）に提供されるポリヌクレオチドは、（５’から３’に）以下の順序でライゲーションされる：
【００９８】
第１のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）−第２のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第３のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第４のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第５のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第６のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）。
【００９９】
第５のポリヌクレオチドが中心ポリヌクレオチドになるので、上の工程（ａ５）に示される第５のポリヌクレオチドのエレメント（ｉ）から（ｉｖ）に加えて、（再び５’から３’方向に）以下の配列：
（ｖ）第５のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第９の切断配列であって、第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列、第２のポリヌクレオチドの第３の切断配列、第３のポリヌクレオチドの第５の切断配列、および第４のポリヌクレオチドの第７の切断配列と異なる、切断配列、ならびに
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第９の切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結される。
【０１００】
方法は、工程（ａ６）をさらに含む。前記工程は、工程（ｂ）の前に実施される。方法の工程（ａ６）では、第６のポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１０の切断配列であって、前記第１０の切断配列は、第９の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第１０の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第５のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第６の部分をコードする核酸配列
を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１０１】
本発明の方法の実施形態では、方法は、上で示される第１のポリヌクレオチド、３つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第２のポリヌクレオチド、３つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第３のポリヌクレオチド、５つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第４のポリヌクレオチド、６つのポリヌクレオチドの組立に関連して示される第５のポリヌクレオチド、上で示される第６のポリヌクレオチド、および第７のポリヌクレオチドの７つのポリヌクレオチドの組立、すなわち、ライゲーションを含む。それぞれ工程（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）、（ａ５）、（ａ６）および（ａ７）に提供されるポリヌクレオチドは、（５’から３’に）以下の順序でライゲーションされる：
第１のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）−第２のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第３のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第４のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第５のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第６のポリヌクレオチド（中心ポリヌクレオチド）−第７のポリヌクレオチド（末端ポリヌクレオチド）。
【０１０２】
第６のポリヌクレオチドが中心ポリヌクレオチドになるので、上の工程（ａ６）に示される第６のポリヌクレオチドのエレメント（ｉ）から（ｉｖ）に加えて、（再び５’から３’方向に）以下の配列：
（ｖ）第６のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１１の切断配列であって、第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列、第２のポリヌクレオチドの第３の切断配列、第３のポリヌクレオチドの第５の切断配列、第４のポリヌクレオチドの第７の切断配列、および第５のポリヌクレオチドの第９の切断配列と異なる、切断配列、ならびに
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第１１の切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結される。
【０１０３】
方法は、工程（ａ７）をさらに含む。前記工程は、工程（ｂ）の前に実施される。方法の工程（ａ７）では、第７のポリヌクレオチドであって、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１２の切断配列であって、前記切断配列は、第１１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第１２の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第６のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第７の部分をコードする核酸配列
を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１０４】
上で定義される３、４、５、６、７等々のポリヌクレオチドの組立（したがって、ライゲーション）は、本発明の方法の工程（ｂ）に起こる。
【０１０５】
この工程（ｂ）では、上で定義される３、４、５、６、または７等々のポリヌクレオチドは、タイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による前記ポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させられ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する。
【０１０６】
３つのポリヌクレオチドが提供され、ライゲーションされる場合、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ａａ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｂｂ）第１のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第１のイントロンは機能的であり、前記第１のイントロンは、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｃｃ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｄｄ）第２のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第２のイントロンは機能的であり、前記第２のイントロンは、第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、ならびに
（ｅｅ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む。
【０１０７】
４つのポリヌクレオチドが提供され、ライゲーションされる場合、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｆｆ）第３のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第３のイントロンは機能的であり、前記第３のイントロンは、第３のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第３のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、ならびに
（ｇｇ）目的とするポリペプチドの第４の部分をコードする核酸配列
をさらに含む。
【０１０８】
５つのポリヌクレオチドが提供される場合、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｈｈ）第４のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第４のイントロンは機能的であり、前記第４のイントロンは、第４のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第４のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｉｉ）目的とするポリペプチドの第５の部分をコードする核酸配列
をさらに含む。
【０１０９】
６つのポリヌクレオチドが提供される場合、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｊｊ）第５のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第５のイントロンは機能的であり、前記第４のイントロンは、第５のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第５のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｋｋ）目的とするポリペプチドの第６の部分をコードする核酸配列
をさらに含む。
【０１１０】
７つのポリヌクレオチドが提供される場合、融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｌｌ）第６のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第６のイントロンは機能的であり、前記第６のイントロンは、第６のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第６のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｍｍ）目的とするポリペプチドの第７の部分をコードする核酸配列
をさらに含む。
【０１１１】
上で示される産生された融合ポリヌクレオチドは、真核生物宿主細胞において転写される場合、転写物に転写され、転写物は、機能的であるイントロンが前記転写物からスプライシングされるように前記細胞でてプロセシングされ、それによって目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが産生される。
【０１１２】
第１の実施形態では、転写物によって転写される全てのイントロンは、同一または本質的に同一である。したがって、第１のイントロン、第２のイントロン、および第３のイントロン等々は、同一または本質的に同一である。驚くべきことに、本発明の根底にある研究において、同一のイントロンが、多くのケースにおいて目的とするタンパク質の発現を妨げることなく、構築物内の複数の位置で使用されることが示された（実施例を参照されたい）。同一または本質的に同一のイントロンを有するポリヌクレオチドは、イントロン内の切断部位をシフトすること、すなわち、長さが異なる、同じイントロンの５’および３’部分を使用することによって生成される。したがって、第１のイントロンに関する５’および３’部分は、第２のイントロンに関する５’および３’部分と長さが異なる。異なる部分のライゲーションは、２つの同一または本質的に同一のイントロンを生じる。
【０１１３】
第２の実施形態では、全てのイントロンが互いに異なる。したがって、異なるイントロンが使用される。このケースでは、ユニークな切断部位が、各イントロンの組立のために使用される。さらに、異なる切断部位を有する単一のイントロンを使用することによって異なるイントロンを有する構築物を生成することが可能である。そのような切断部位は、イントロンに導入されていてもよい。
【０１１４】
第３の実施形態では、転写物は、転写物における他のイントロンと同一であるイントロン、および残りのイントロンと異なるさらなる少なくとも１つのイントロンを含み得る。したがって、転写物は、一回を超えて存在するイントロンおよびこれらのイントロンと異なる１つまたはそれ以上の他のイントロンを含み得る。前記１つまたはそれ以上の他のイントロンは、互いに同一であるかまたは同一ではない。
【０１１５】
本発明は、７つを超えるポリヌクレオチドの組立をさらに可能にする。一般に、本発明の方法の工程（ａ）および（ｂ）は、以下の通りである：
（ａ）ｎポリヌクレオチドを提供する工程であって、ｎは少なくとも３の整数であり、
１の番号が付けられたポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）目的とするポリペプチドの１の番号が付けられた部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）１の番号が付けられたイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する１の番号が付けられた切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結され、
２から（ｎ−１）の番号が付けられたポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断配列であって、前記切断配列は、１から（ｎ−２）の番号が付けられた切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）１から（ｎ−２）の番号が付けられたイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの２から（ｎ−１）の番号が付けられた部分をコードする核酸配列、
（ｖ）２から（ｎ−１）の番号が付けられたイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する、２から（ｎ−１）の番号が付けられた、切断配列、これは異なる数を有する切断配列と異なる、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結され、
ｎの番号が付けられたポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する切断配列であって、前記切断配列は、ｎ−１の番号が付けられた切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）ｎ−１の番号が付けられたイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドのｎの番号が付けられた部分をコードする核酸配列
を含む、工程、ならびに
（ｂ）前記ｎポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素によるｎポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程。
【０１１６】
有利なこととして、本発明の根底にある研究において、２つの、非機能的な部分（機能的なイントロンの５’末端および機能的なイントロンの３’末端）に分けられる機能的なイントロンの３’または５’末端での適切なタイプＩＩｓ切断配列の使用が、タイプＩＩｓ制限−ライゲーションによる、そうでなければ不適合性のＤＮＡ断片の組立を可能にすることが示された。不適合性のＤＮＡ断片は、それらの５’および３’末端に、そのようなタイプＩＩｓ−分割イントロンアダプターモジュール（ｔｙｐｅ  ＩＩｓ−ｓｐｌｉｔ  ｉｎｔｒｏｎ  ａｄａｐｔｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）を提示する核酸配列を備える。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング（すなわち、タイプＩＩｓエンドヌクレアーゼでの切断およびライゲーションを含む反応中の所望の順序での断片の融合）は、同一／適合性のタイプＩＩｓ接頭および接尾配列を含有する分割イントロンアダプターのシームレスなライゲーションによる機能的なイントロンの再構成を生じる。
【０１１７】
本発明の方法は、適用される場合、組立てられるポリヌクレオチドの配列の部分である適合性の配列の前提条件なしでポリヌクレオチドの包括的な組立を可能にする。したがって、一次ポリヌクレオチド配列の変更は必要とされない。本発明のおかげで、各々が目的とするポリペプチドの部分をコードする、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）融合が、ここで可能であり、その理由は、切断配列が、（コード配列によるというより）イントロン配列によって提供されるからである。付随して、そうでなければ不適合性のＤＮＡ断片が、直鎖状（けれどもイントロン−分散型）の様式に組立てられる。再構成されたイントロン「スペーサー」は、スプライシングによる転写後に、真核生物発現宿主へのトランスフェクションに際して除去されて、意図され、組立てられる核酸構築物を生じる。したがって、本発明の方法、すなわち、タイプＩＩｓベースのクローニングと分割イントロンアプローチの組合せは、それらの配列境界に非依存性のコードＤＮＡ断片を組立てるのに普遍的な方法を提供する。特に、本発明は、異なるタンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドの容易な組立を可能にする。適用される場合、本発明はタンパク質の容易な産生を可能にする。そのようなタンパク質は、例えば、スクリーニング方法に供試されるおよび改善された治療特性を有するタンパク質の同定を可能にし得る。適用される場合、本発明の方法は生物創薬における価値のあるツールとなる。本明細書に記載されるモジュラークローニングは、多重特異性タンパク質工学を可能にする。例えば、抗体は、多重特異性であり、したがって複数の標的を有するものに生成される可能性がある。そのような抗体は、単一の標的のみを有する単一特異性抗体と比較して、より広いスペクトルの活性を有する可能性がある。
【０１１８】
特に明記されない限り、本明細書に上で与えられる定義および説明は、以下に準用される。
【０１１９】
そのうえ、本発明は、
（ｉ）本発明の方法による融合ポリヌクレオチドを産生する工程、および
（ｉｉ）真核生物宿主細胞において前記融合ポリヌクレオチドを発現させ、それによって前記目的とするポリペプチドを産生する工程
を含む、目的とするポリペプチドを産生することに関する。
【０１２０】
一実施形態では、方法は、産生された目的とするポリペプチドを前記真核生物宿主細胞から単離する工程（ｉｉｉ）をさらに含む。用語「産生された目的とするポリペプチドを前記真核生物宿主細胞から単離すること」は、産生されたポリペプチドの培養培地の上清からの単離も包含する。
【０１２１】
工程（ｉ）では、融合ポリヌクレオチドは、本発明の方法によって、すなわち、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド産生する方法によって産生される。したがって、前記方法の工程が実施される。
【０１２２】
工程（ｉｉ）では、融合ポリヌクレオチドは、真核生物宿主細胞において発現され、それによって前記目的とするポリペプチドが産生される。どのようにしてポリヌクレオチドを発現させるかは、当技術分野で周知されており、また上で記載されている。前記ポリヌクレオチドを発現させるために、プロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。前記プロモーターは、宿主細胞において活性である。好ましい宿主細胞は上で記載される。
【０１２３】
本発明はまた、上で定義される第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む組成物に関する。前記組成物は、上で定義される第３のポリヌクレオチドをさらに含み得る。第１、第２および第３のポリヌクレオチドに加えて、前記組成物は、上で定義される第４、または第４および第５、または第４、第５、および第６、または第４、第５、第６、および第７のポリヌクレオチドを含み得る。さらに、組成物は、イントロンの部分を含まないが、適切な切断および認識部位を含む、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含み得る。したがって、前記ポリヌクレオチドは、切断部位に作動可能に連結されるタイプＩＩｓ制限酵素に関する認識部位を含み、これは前記タイプＩＩｓ制限酵素での切断に際して、組成物中に存在するさらなるポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドのライゲーションを可能にする。前記さらなるポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの切断部位に適合性の切断部位を有する。用語「作動可能に連結される」は、本明細書の他で定義される。定義は適宜適用される。
【０１２４】
前記ポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドである。しかしながら、切断およびライゲーションによる組立に際して、単一のポリヌクレオチド（すなわち、本明細書で参照される融合ポリヌクレオチド）が生成される。
【０１２５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、第１、第２および第３のポリヌクレオチドを含み、
前記第１のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における第１の切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結され、
前記第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列と異なる、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｖｉ）における第３の切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結され、
前記第３のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記第４の切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第４の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む。
【０１２６】
上で参照されるポリヌクレオチドに加えて、組成物は、リガーゼ、特にＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、およびタイプＩＩｓ制限酵素をさらに含み得る。前記タイプＩＩｓ制限酵素は、その（すなわち、全ての）切断配列でポリヌクレオチドを切断する能力がある。したがって、前記タイプＩＩｓ制限酵素は認識配列を認識する。
【０１２７】
本発明の組成物の好ましい実施形態では、組成物により具備されるタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼは、組成物により具備されるポリヌクレオチド（例えば、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチド）の切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にし、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを生成する。
【０１２８】
本発明はまた、上で定義される第１および第２のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの切断を可能にする（すなわち、切断する能力がある）タイプＩＩｓ制限酵素、および前記タイプＩＩｓ制限酵素での切断から生じる切断産物に関するライゲーションを可能にするリガーゼを含むキットに関する。
【０１２９】
前記キットは、上で定義される第３のポリヌクレオチドをさらに含み得る。第１、第２および第３のポリヌクレオチドに加えて、前記キットは、上で定義される第４、または第４および第５、または第４、第５、および第６、または第４、第５、第６、および第７のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１３０】
本発明は目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにさらに関し、これは真核生物宿主細胞において転写される場合に、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも３つのイントロンを含む転写物に転写される。
【０１３１】
用語「少なくとも３つのイントロン」は、３、または３を超える、特に少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１５のイントロンを意味する。好ましくは、転写物により具備される全てのイントロンは、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である。用語「異種性」は上で記載されている。
【０１３２】
用語「イントロン」は上で定義されている。定義は適宜適用される。
【０１３３】
一実施形態では、転写物によって転写される全てのイントロンは、同一または本質的に同一である。別の実施形態では、少なくとも１つのイントロンは、全ての他のイントロンと異なる。さらに別の実施形態では、全てのイントロンが互いに異なる。
【０１３４】
転写物によって具備されるイントロンの長さは、本発明の方法に関連して本明細書に上で特定される長さであってもよい。本発明のポリヌクレオチドの（または方法の）実施形態では、転写物によって具備される各々の前記イントロンは、５０から２００ｎｔ、特に５０から１５０ｎｔの長さを有する。例えば、各々の前記イントロンは、５０から１００ｎｔの長さを有する。さらに、各々の前記イントロンは、８０から１１０ｎｔの長さを有し得る。
【０１３５】
本明細書に他で記載される、産生されたポリヌクレオチドのイントロンはまた、少なくとも８０ヌクレオチド、特に少なくとも９０ヌクレオチドの長さを有し得る。好ましい実施形態では、イントロンは、８０から２００ｎｔの長さを有する。別の実施形態では、イントロンは、８０から１５０ｎｔの長さ、例えば、８０から１２０ｎｔの長さを有する。さらに、イントロンが、９０から１５０ｎｔの長さ、例えば、９０から１２０ｎｔの長さを有することが想定される。
【０１３６】
さらに、本発明により、転写物によって具備される各イントロンが、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含むことが想定される。
【０１３７】
最終的に、本発明は、
（ａ１）上で定義される第１のポリヌクレオチド、および
（ａ２）上で定義される第２のポリヌクレオチド、および場合により、
（ａ３）上で定義される第３のポリヌクレオチドの、
前記エンドヌクレアーゼでの切断、ならびに生じる切断産物のライゲーションにより、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための、リガーゼおよびタイプＩＩｓ制限酵素を含む組成物の使用に関する。
【０１３８】
前述の使用に従って、少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドが切断され、前記さらなるポリヌクレオチドは：
（ａ４）上で定義される第４のポリヌクレオチド、
（ａ５）上で定義される第５のポリヌクレオチド、
（ａ６）上で定義される第６のポリヌクレオチド、および
（ａ７）上で定義される第７のポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態は、以下本明細書に要約される。本明細書に上で与えられる説明および定義は、以下の好ましい実施形態に準用される：
【０１４０】
１．目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための方法であって、
（ａ１）第１のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第１のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
を含み、（ｉｉｉ）における第１の切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結される、工程
（ａ２）第２のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第２のポリヌクレオチドが、５’から３’方向に
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
を含む、工程、ならびに
（ｂ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程
含む、方法。
【０１４１】
２．前記融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ａａ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｂｂ）第１のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第１のイントロンは機能的であり、前記第１のイントロンは、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、ならびに
（ｃｃ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列
を含む、実施形態１に記載の方法。
【０１４２】
３．前記融合ポリヌクレオチドは、真核生物宿主細胞において転写される場合、転写物に転写され、転写物は、イントロンが前記転写物からスプライシングされるように前記細胞でプロセシングされ、それによって目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが産生される、実施形態１または２に記載の方法。
【０１４３】
４．第１のイントロンは、融合ポリヌクレオチドに対して異種性である、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
５．第１のイントロンをコードするポリヌクレオチドは４０から２０００ｂｐの長さを有する、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
６．イントロンをコードするポリヌクレオチドは５０から２００ｂｐ、特に５０から１５０ｂｐの長さを有する、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４６】
７．前記第１のイントロンは、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含む、実施形態１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
８．前記第２のポリヌクレオチドは、
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列であって、第１のポリヌクレオチドの第３の切断配列と異なる、切断配列、および
（ｖｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列
をさらに含み、（ｖｉ）における第３の切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結される、実施形態１から７のいずれか１つに記載の方法。
【０１４８】
９．（ａ３）第３のポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記第３のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記第４の切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第４の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含み、工程（ｂ）において、前記第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドをタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼと、前記タイプＩＩｓ制限酵素による第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にする条件下で接触させ、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生し、
前記融合ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、
（ａａ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｂｂ）第１のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第１のイントロンは機能的であり、前記第１のイントロンは、第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、
（ｃｃ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｄｄ）第２のイントロンをコードする核酸配列であって、前記第２のイントロンは機能的であり、前記第２のイントロンは、第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列および第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列を含む、核酸配列、および
（ｅｅ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、工程
をさらに含む、実施形態８に記載の方法。
【０１４９】
１０．（ｉ）実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法によって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生する工程、および
（ｉｉ）真核生物宿主細胞において前記融合ポリヌクレオチドを発現させ、それによって前記目的とするポリペプチドを産生する工程を含む、目的とするポリペプチドを産生するための方法。
【０１５０】
１１．産生された目的とするポリペプチドを前記真核生物宿主細胞から単離する工程（ｉｉｉ）をさらに含む、実施形態１０に記載の方法。
【０１５１】
１２．第１、第２および第３のポリヌクレオチドを含む組成物であって、
前記第１のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）目的とするポリペプチドの第１の部分をコードする核酸配列、
（ｉｉ）第１のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第１の切断配列、および
（ｉｖ）前記タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列であって、（ｉｉｉ）における第１の切断配列は、（ｉｖ）における認識配列に作動可能に連結される、認識配列
を含み、
前記第２のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第２の切断配列であって、前記第２の切断配列は、第１の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第２の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第１のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第２の部分をコードする核酸配列、
（ｖ）第２のイントロンの５’部分をコードする核酸配列、
（ｖｉ）第１のポリヌクレオチドの第１の切断配列と異なる、タイプＩＩｓ制限酵素に関する第３の切断配列、および
（ｖｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列であって、（ｖｉ）における第３の切断配列は、（ｖｉｉ）における認識配列に作動可能に連結される、認識配列
を含み、
前記第３のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に：
（ｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する認識配列、
（ｉｉ）タイプＩＩｓ制限酵素に関する第４の切断配列であって、前記切断配列は、第３の切断配列に対して相補的であり、（ｉｉ）における第４の切断配列は、（ｉ）における認識配列に作動可能に連結される、切断配列、
（ｉｉｉ）第２のイントロンの３’部分をコードする核酸配列、および
（ｉｖ）目的とするポリペプチドの第３の部分をコードする核酸配列
を含む、組成物。
【０１５２】
１３．前記組成物はタイプＩＩｓ制限酵素およびリガーゼをさらに含む、実施形態１２に記載の組成物。
【０１５３】
１４．前記タイプＩＩｓ制限酵素および前記リガーゼは、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの切断および生じる切断産物のライゲーションを可能にし、それによって目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを生成する、実施形態１３に記載の組成物。
【０１５４】
１５．実施形態１２で定義される第１、第２および第３のポリヌクレオチド、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドの切断を可能にするタイプＩＩｓ制限酵素、ならびに前記タイプＩＩｓ制限酵素での切断から生じる切断産物に関するライゲーションを可能にするリガーゼを含むキット。
【０１５５】
１６．前記タイプＩＩｓ制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、およびＳｆａＮＩから選択される、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法、実施形態１１から１４のいずれか１つに記載の組成物、実施形態１５に記載のキット。
【０１５６】
１７．真核生物宿主細胞において転写される場合に、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも５つのイントロンを含む転写物に転写される、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１５７】
１８．前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドに対して異種性である少なくとも７つのイントロンを含む転写物に転写される、実施形態１７に記載のポリヌクレオチド。
【０１５８】
１９．各々の前記イントロンは、５０から２００ｎｔ、特に５０から１５０ｎｔの長さを有する、実施形態１７または１８に記載のポリヌクレオチド。
【０１５９】
２０．各々の前記イントロンは、８０から２００ｎｔの長さ、例えば、９０から１５０ｎｔまたは９０から１２０ｎｔの長さを有する、実施形態１７から１９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【０１６０】
２１．各々の前記イントロンは５０から１００ｎｔの長さを有する、実施形態１９に記載のポリヌクレオチド。
【０１６１】
２２．全てのイントロンは、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列のオープンリーディングフレームとインフレームの内部終止コドンを含む、実施形態１７から２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【０１６２】
２３．（ａ１）実施形態１で定義される第１のポリヌクレオチド、および
（ａ２）実施形態１または３で定義される第２のポリヌクレオチド、および場合により、
（ａ３）実施形態３で定義される第３のポリヌクレオチドの、
前記エンドヌクレアーゼでの切断、ならびに生じる切断産物のライゲーションにより、目的とするポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを産生するための、リガーゼおよびタイプＩＩｓ制限酵素を含む組成物の使用。
【０１６３】
本明細書に引用された全ての参考文献は、それらの開示内容の全体および本明細書において特に言及された開示内容について、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１６４】
図面は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】発現構築物のために使用されるバイシストロニックベクター（ｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴ、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］に基づく）の図である。
【図２】１つまたは２つのイントロンでのルシフェラーゼ実験：イントロンはウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に位置することを示す図である。ボックスは「エキソン」を描写し、黒色水平バーは人工的に挿入されたイントロンを表す。
【図３】ｈＲｌｕｃ発現−イントロン＃２および＃３における標準スプライス部位の変異は、ウミシイタケルシフェラーゼの発現を破壊し、そのＣ末端配列の部分の欠失と同様であることを示す図である。ｘ軸は、ｈＲｌｕｃ遺伝子におけるイントロン有り無しの構築物を表す。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。示される構築物は、イントロン位置＃１で（非）機能的なイントロンを有するもの（図２を参照されたい）およびｈＲｌｕｃのＣ末端欠失構築物を含む。エラーバー：標準偏差。
【図４】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃１で単一イントロンを有する構築物は、イントロンなし制御構築物の発現レベルを保持することを示す図である。イントロン＃１のみは、タンパク質の機能的な発現を導かない。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。
【図５】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃１および＃２で２つの同一のイントロンを有する構築物は、イントロンなし制御構築物の発現レベルの少なくとも８０％を保持することを示す図である。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。
【図６】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃１および＃２で２つの異なるイントロンを有する構築物は、イントロンなし制御構築物の発現レベルの少なくとも７０％を保持することを示す図である（いずれの組合せが使用されても）。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。
【図７】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃１でイントロンＩ３の様々な修飾を有する構築物は、イントロンなし制御構築物の６０〜９０％の間を示すことを示す図である（その長さによりも挿入された配列のタイプにより依存する）。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。図中の配列：ｃａａｇｔｇｇｇｃｔｇａｇは配列番号４１であり、ｃａｇｃｔｇｇｇｃｔｇｃｔｔは配列番号４２である。
【図８】３から７イントロンでのルシフェラーゼ実験を示す図である：ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子中のイントロン位置。ボックスは「エキソン」を描写し、黒色水平バーはイントロンを表す。３を超えるイントロンを有する構築物は、全て、イントロンを位置＃３、＃４、および＃５に含有する。
【図９】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃３〜＃７（図８を参照されたい）で３から７つの同一のイントロンを有する構築物は、イントロンなしの制御構築物と比較して、低下したレベルの発現を示すことを示す図である。構築物当たりの使用されるイントロンの数は、全ての構築物中で同じ効果を有するように見えない。２を超えるコピーが同じ構築物中で使用される場合、イントロン＃２が機能するように見えない。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。
【図１０】ｈＲｌｕｃ発現−ｈＲｌｕｃのイントロン位置＃３〜＃７で３から７つの異なるイントロンを有する構築物は、イントロンなしの制御構築物と比較される場合、低下したレベルの発現を示すことを示す図である。ここでは、より多くイントロンが発現レベルを増加させる傾向があるように見える。発現は、使用されるイントロンの組合せおよびそれらが使用される順序に依存するように見える。参照構築物：斜線のバー。エラーバー：標準偏差。ｘおよびｙ軸の利用に関して図３を参照されたい。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、可変ドメインと定常ドメインとの間（１つのイントロン、図１１Ａを参照されたい））、またはリーダー配列と可変ドメインおよび可変ドメインと定常ドメインとの間の両方（２つのイントロン、図１１Ｂを参照されたい））に１つまたは２つのイントロンを有する抗体構築物（軽鎖および重鎖）を示す図である。
【図１２】抗体発現−イントロンの有り無しの配列から産生される抗体の発現レベルは同等であることを示す図である。ｘ軸は、抗体の軽鎖および重鎖遺伝子におけるイントロン有り無しの構築物を表す。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。示される構築物は、わずかに異なる発現ベクター（ＥＶ１およびＥＶ２）または発現ベクターＥＶ２（Ｉ８／Ｉ８、Ｉ９／Ｉ９）のいずれかにおける鎖当たりイントロンを含有しないまたは１つのイントロンを含有する抗体を含む（イントロン位置について図１１Ａおよび１１Ｂを参照されたい）。エラーバー：１２の独立した実験からの標準偏差。
【図１３】抗体発現−重鎖（黒色バー）または軽鎖（チェックのバー）のいずれかにおける１つのイントロンを含有する構築物の比較は、イントロン＃３または修飾型のイントロン＃３（ｍＩ３）を含有する構築物に関してより低い発現を示すことが多いことを示す図である。軽鎖は、より強く影響されるように見える。対照的に、イントロン＃８または＃９は、対照と同じレベルで発現されるかまたはさらに上昇した発現レベルを示すかのいずれかである。参照構築物：斜線のバー。構築物名は軽鎖／重鎖の順序でイントロン参照を含有する：「−−−」は、イントロンなしの軽鎖または重鎖を表し、他の全てはオリジナルのイントロン（Ｉ３、Ｉ８、Ｉ９）またはハイブリッドイントロン（Ｉ３＿Ｉ８、Ｉ８＿Ｉ３）を含有する。ｘ軸は、抗体の軽鎖または重鎖遺伝子におけるイントロン有り無しの構築物を表す。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。エラーバー：３つの独立した実験（モックおよびイントロンなしの対照に対する１２実験）からの標準偏差。
【図１４】抗体発現−リーダー配列の３’末端での異なる末端コドンの利用を示す図である：ＡＧＣ（黒色バー）またはＴＣＧ（チェックのバー）の利用は、重鎖配列中に２つのイントロンを含有する様々な構築物の発現レベルに影響しない。したがって、イントロンスタートに対して−１位に最小頻度で使用されるヌクレオチド「Ｃ」は、エキソン中で最大頻度で使用される最後のヌクレオチドを表す「Ｇ」と比較する場合、発現を減少させない。野生型イントロン＃３もその修飾バージョン（ｍＩ３）も含有しないイントロン組合せの利用は、対照構築物と比較される場合、より安定な発現レベルを示す。参照構築物：斜線のバー。構築物名は、軽鎖（「−−−」＝イントロンなし）／重鎖の順序でイントロン参照を含有する。ｘ軸は、抗体の軽鎖または重鎖遺伝子におけるイントロン有り無しの構築物を表す。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。エラーバー：３つの独立した実験（モックおよびイントロンなしの対照に対する１２実験）からの標準偏差。
【図１５】抗体発現−リーダー配列の３’末端での異なる末端コドンの利用を示す図である：ＡＧＣ（黒色バー）またはＴＣＧ（チェックのバー）の利用は、軽鎖配列中に２つのイントロンを含有する様々な構築物の発現レベルに影響しない。したがって、イントロンスタートに対して−１位に最小頻度で使用されるヌクレオチド「Ｃ」は、エキソン中で最大頻度で使用される最後のヌクレオチドを表す「Ｇ」と比較する場合、発現を減少させない。野生型イントロン＃３もその修飾バージョン（ｍＩ３）も含有しないイントロン組合せの利用は、対照構築物と比較される場合、より安定な発現レベルを示す。参照構築物：斜線のバー。構築物名は、軽鎖／重鎖（「−−−」＝イントロンなし）の順序でイントロン参照を含有する。ｘ軸は、抗体の軽鎖または重鎖遺伝子におけるイントロン有り無しの構築物を表す。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。エラーバー：３つの独立した実験（モックおよびイントロンなしの対照に対する１２実験）からの標準偏差。
【図１６】抗体発現−軽鎖および重鎖の両方で様々なイントロン組合せは、他のイントロンが同じ鎖に存在しない場合、発現レベルにイントロン＃３のマイナスの影響をほぼ常に示すことを示す図である。発現レベルは、イントロン＃３が同じ鎖にイントロン＃８または＃９と組み合わせられる場合、再び増加し得る。黒色バー：各鎖中に１つのイントロン、ストライプのバー：軽鎖中に１つのイントロン、重鎖中に２つのイントロン、灰色バー：軽鎖中に２つのイントロン、重鎖中に１つのイントロン、チェックのバー：各鎖中に２つのイントロン。参照構築物：斜線のバー。構築物名は、軽鎖／重鎖の順序でイントロン参照を含有する。ｘ軸は、抗体の軽鎖または重鎖遺伝子における様々なイントロンまたはイントロン組合せを有する構築物を表す（「ｍＩ３」＝イントロン＃３の修飾バージョン）。ｙ軸は、イントロンなしの参照構築物（斜線のバー）と比較して、各構築物の発現レベルを示す。エラーバー：３つの独立した実験（モックおよびイントロンなしの対照に対する１２実験）からの標準偏差。
【実施例】
【０１６６】
本発明は、以下の実施例により単に例示される。前記実施例は、本発明の範囲を限定する様式で一切解釈されない。
【０１６７】
実施例１
材料および方法
プラスミド
（ａ）ルシフェラーゼを含有する構築物のクローニング
プラスミドｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯに基づき、修飾を施して、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨｐＡ部位との間にａｔｔＲ１／２部位を挿入することによってＧａｔｅｗａｙクローニングを可能にする）を調整して、以下のように、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ（それぞれｈＲｌｕｃおよびｌｕｃ２、図１を参照されたい）の付随する発現を可能にする：（ｉ）真核生物伸長因子１α（ＥＦ１α）のプロモーターを、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴのＰｍｌＩ部位にブラントライゲーションによって導入して、５’ＰｍｅＩ部位を破壊したが、３’部位は維持して、それによってｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴを作り出した。（ｉｉ）ホタルルシフェラーゼヌクレオチド配列（アミノ酸配列はｐＧＬ４．１０［Ｐｒｏｍｅｇａ］から取られた、ヒト細胞株における発現のためにコドン最適化での遺伝子合成はＧｅｎｅＡｒｔ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇにより行われた）。その５’末端での５’コンセンサスコザック配列（ＣＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣ、配列番号４３）およびその３’末端での二重終止コドン（ＴＡＡＴＧＡ）を、ｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴのＰｍｌＩ部位に挿入し、ｌｕｃ２−ｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴを得た。（ｉｉｉ）イントロン配列を有する全ウミシイタケルシフェラーゼヌクレオチド配列（ウミシイタケルシフェラーゼのアミノ酸配列はｐＧＬ４．７５［Ｐｒｏｍｅｇａ］）から取られた）は、５’Ｋｏｚａｋコンセンサス配列および３’二重終止コドン（それぞれＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号４４）およびＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧ（配列番号４５））を含む、フランキングａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列とともにＧｅｎｅＡｒｔ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇによって（上のようにコドン最適化して）合成され、ｌｕｃ２−ｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴ（正確なイントロン位置に関して図２および８を参照されたい）へのＧａｔｅｗａｙクローニングを可能にした。（ｉｖ）同様に、イントロンなしのウミシイタケルシフェラーゼを、ｐｃＤＮＡ５ｄｕａｌ−ＦＲＴ−ＴＯ＿ＤＥＳＴ（ホタルルシフェラーゼ遺伝子なし）にクローニングし、これを全てのウミシイタケルシフェラーゼアッセイにおいて主な陽性対照として使用した。
【０１６８】
（ｂ）抗体構築物のクローニング（標準的な制限およびＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅベースのクローニング）。
真核生物細胞における一過性発現のための従来のＣＭＶベースのベクターを使用して、抗体発現構築物（軽鎖および重鎖構築物）を、制限クローニング（挿入物はＫｏｚａｋコンセンサス配列を含有）またはＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングのいずれかを使用して生成した。後者に関して、ＢｓａＩ制限部位をベクター骨格から除去し、スタッファー配列を導入し、発現ベクターへの抗体配列の統合のために使用されるＢｓａＩ部位（５’：ｃｇｃｃａｇＧＡＧＡＣＣ（配列番号４６）、３’：ＧＧＴＣＴＣｔａｔａａｔ（配列番号４７）；ＢｓａＩ認識配列を太字）をフランキングした。抗体構築物（全ての抗ｈｕＩＬ４）を、異なるイントロンを含有するモジュールの様々な組合せを使用して組立て、次にＷｅｂｅｒら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ２０１１  Ｆｅｂ  １８；６（２）：ｅ１６７６５）およびＥｎｇｌｅｒら（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｎｏｖ  ２１；３（１１）：８３９〜４３頁）によって記載されるように発現ベクターにクローニングした。抗体構築物のコード配列のヌクレオチド配列は、以下を除きイントロンなしおよびイントロン含有抗体の両方において同一であった、（ｉ）（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅベースのクローニングを使用して作り出された構築物に関して）破壊するためにＢｓａＩ部位を必要とする、重鎖の定常領域中の１つのヌクレオチド、および（ｉｉ）リーダー配列の最後のコドン。
【０１６９】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅモジュール
イントロンを含有する抗体軽鎖および重鎖を作り出すＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅモジュールを設計して、３つの部分を含有させた：イントロンの３’部分をモジュールの５’末端に配置し、続いてドメインのコード配列、すなわち、抗体鎖の可変または定常部分を配置した。次に、コード配列には、次のイントロンの５’部分が続く。両端で、ＢｓａＩ部位を、これらの部位が、ＢｓａＩでの消化に際して、各イントロン位置に特異的な４ヌクレオチドオーバーハングを残し、したがって最終的な構築物の特異的なライゲーションおよび組立を可能にするような方式で配置した。
【０１７０】
イントロン
イントロンのセットが、本発明の根底にある研究において使用された：すなわち、オリジナルのイントロン、修飾されたイントロンおよび部分的なイントロンである：
イントロンの概要は、表１から４に見出される。
修飾されたまたは部分的なイントロンには、以下が含まれた：
（ａ）陰性対照として使用されるイントロンの５’または３’末端のいずれかで標準スプライス部位の欠失があるイントロン（イントロン＃１０〜＃１３）
（ｂ）４ヌクレオチド挿入を有するイントロン（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング反応のための挿入された重複配列に関する例として；イントロン＃１４〜＃１６および＃１９〜＃２０）
（ｃ）挿入のいずれかの側で２つの潜在的な重複配列を含有するより大きいヌクレオチド挿入物を有するイントロン（これは、エキソンのスキッピングのために使用することができた；イントロン＃１７〜＃１８）
（ｄ）異なるイントロンの２つの半分の領域からなるハイブリッドイントロン（イントロン＃２１〜２４）
（ｅ）Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング反応に使用する、そのオリジナルのイントロンの５’部分または３’部分のいずれかからなる部分的なイントロン（部分的なイントロン＃１〜＃１６）
【０１７１】
【表１】
2022501036.tif 000002
【表２】
2022501036.tif 000003
【０１７２】
【表３】
2022501036.tif 000004
【表４】
2022501036.tif 000005
【０１７３】
【表５】
2022501036.tif 000006
【表６】
2022501036.tif 000007
【表７】
2022501036.tif 000008
【表８】
2022501036.tif 000009
【０１７４】
【表９】
2022501036.tif 000010
【表１０】
2022501036.tif 000011
【０１７５】
細胞培養およびトランスフェクション
懸濁適合（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ａｄａｐｔｅｄ）ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号５１−００２）を、６ｍＭグルタミンを含有するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｆ１７発現培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１３８３５０２）中で培養した。トランスフェクションの前の日、１リットルの細胞を、ベントキャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ４３１２５２）を有する３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ三角フラスコ中に１．２ｅ６細胞／ｍｌの密度で播種し、３７℃、１１０ｒｐｍで撹拌し、８％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０１７６】
トランスフェクションの日、細胞をＦ１７発現培地で１．９ｅ６細胞／ｍｌに調整した。各トランスフェクションに関して、５０ｎｇ  ｐＸＬ４６１７＿ＥＢＮＡ（ＥＢＮＡ１発現プラスミド）を、目的とする発現構築物の１μｇ  ＤＮＡおよび２．８μｇ  ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２３９６６−２）と混合し、Ｆ１７発現培地で２３０μｌの体積に調整した。１５分のインキュベーション後、８７０μｌ細胞（１．６５ｅ６）を、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体に付加した。全てのトランスフェクション実験を、１１００μｌの最終的な作業体積中で９６ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号１０４４７１８１）において行った。プレートを、ＤＵＥＴＺ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｉｄ（Ｋｕｅｈｎｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でカバーし、３７℃、８％ＣＯ２で、１，０００ｒｐｍ、３ｍｍ軌道（Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏ）で振盪して、２日インキュベートした。全てのトランスフェクションを、少なくとも二連で実施し、２〜５回繰り返した。
【０１７７】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ルシフェラーゼ構築物）を使用する発現分析
（ａ）実験手順
トランスフェクトされた細胞のルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの２日後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２９４０）で測定した。５０μｌ細胞懸濁液を、９６ウェルアイソプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒカタログ番号６００５０４０））に移し、１０分、室温で平衡させた。５０μｌ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を付加し、１０分インキュベートして、細胞を溶解した。ホタルルシフェラーゼ発光を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰ；設定：３０読み取り、高ＰＭＴ）で測定した。５０μｌ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、付加し、ホタル反応からの発光をクエンチした。１０分インキュベーション後、ウミシイタケルシフェラーゼ発光を、ホタルルシフェラーゼに関して記載されたのと同じ条件下で測定した。
【０１７８】
（ｂ）データ分析
１つのトランスフェクションからの複数のデータポイント（二連または三連）を使用して、平均値を算出した。これらを、次に、ウミシイタケルシフェラーゼ［ｈＲＬｕｃ、イントロンなし］をホタルルシフェラーゼ［ｌｕｃ２］）と一緒に含有するバイシストロニック構築物の平均シグナルに対して正規化して、相対発現レベルを得た。試験した構築物当たり２から９実験の相対発現レベルの平均値を、次に（標準偏差と一緒に）計算した。
【０１７９】
ホタルルシフェラーゼの測定からのシグナルを対照として使用して、成功したトランスフェクションを示した（データ示さず）。
【０１８０】
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅ（抗体構築物）を使用する発現分析
（ａ）定量
トランスフェクション７日後、発現された抗体構築物を含有する細胞上清を、遠心分離（３２２０ｒｃｆ、２分）によって収集した。これらの上清を、プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、＃１８−５０１３）を使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅシステム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、＃３０−５０４６）を使用するバイオレイヤー干渉測定（ＢＬＩ）によって定量化した。バイオセンサーの再生を伴った定量化を、以下のように実施した：細胞上清を１：１０にＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０−０９４）中に希釈し、アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒマイクロプレート９６ウェル、ＰＰ、黒色、＃６５５２０９）に移した。定量時間を１２０秒に設定し、バイオセンサーの再生／中和を１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．５およびＤ−ＰＢＳで５秒に設定し、３サイクルを使用し、最初の測定の前および全ての続く測定の間に行った。アッセイを、３０℃および振盪を１０００ｒｐｍで実施した。センサーオフセットを、３ｍｍに設定した。実験を６００秒の遅延後に開始し、プレートを１０分平衡化した（３０℃および振盪）。
【０１８１】
（ｂ）データ分析
データ分析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ９．０を事前に検証されたヒトＩｇＧ標準曲線（結合速度対濃度）と一緒に使用して行った。いくつかのトランスフェクション（各々二連で行われた）からの複数のデータポイントを使用して、３つの独立した実験からの平均値および標準偏差を算出した。
【０１８２】
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅを使用する結合アッセイ
（ａ）ヒトＩＬ４への抗体結合
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅシステムを使用して、ヒトＩＬ４からの発現された抗ＩＬ４抗体の解離速度（ｋｄ）も試験した。この目的のため、Ｈｉｓ６タグを有する２．５μｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ４（ノボプロテイン、＃ＣＤ８８）を、１２０秒の間に抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）でプレコートされたバイオセンサー（ＨＩＳ１Ｋ、Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、＃１８−５１２２）に捕捉した。モックトランスフェクション（「ベースラインウェル」、Ｄ−ＰＢＳ中で１：１０希釈、負荷時間３０秒）からの上清を使用するベースライン記録後、バイオセンサーを、サンプル上清（同様にＤ−ＰＢＳ中で１：１０希釈）を含有するサンプルウェルに浸漬した。１２０秒のインキュベーション後、バイオセンサーを、ベースラインウェルの上清に戻して、結合した抗ＩＬ４抗体が６００秒の間に固定化されたＩＬ４から解離することを可能にした。バイオセンサーを、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ１．７およびＤ−ＰＢＳを各５秒、３サイクルを使用し、最初の測定の前および全ての続く測定の間に再生／中和した。各アッセイを、３０℃および１０００ｒｐｍで振盪し、センサーオフセットを３ｍｍに設定し、６００秒の遅延後に開始し、プレートを１０分平衡化した（３０℃および振盪）。全てのサンプルを、二重参照様式（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅマニュアルに記載される）で測定した、２つの参照は：（ｉ）結合リガンドなしのモックトランスフェクションの上清（Ｄ−ＰＢＳ中に１：１０）、および（ｉｉ）結合ＩＬ４リガンドでのモックトランスフェクションの上清（Ｄ−ＰＢＳ中に１：１０）である。
【０１８３】
（ｂ）抗体結合実験のデータ分析
全てのサンプルデータポイントは、（ｉ）二重参照（上記参照されたい）、それによって非特異的な結合およびリガンド解離を補正する、および（ｉｉ）二測定工程（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅマニュアルに記載される）の間のミスアラインメントを回避するための、工程間補正（ｉｎｔｅｒｓｔｅｐ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を使用して計算した。生じた結合曲線を、局所完全１：１モデルによりフィットさせ、解離定数ｋｄｉｓを計算した。いくつかのトランスフェクション（各々二連で行われた）からの複数のデータポイントを使用して、３つの独立した実験からの平均値および標準偏差を算出した。
【０１８４】
実施例２
結果／結論
ルシフェラーゼ実験の結果は図３から１０に示され、抗体実験の結果は図１２から１６に示される。
細胞内に発現された一鎖ルシフェラーゼ構築物および分泌された二鎖抗体構築物の両方を使用して、以下が示された：
（ａ）様々なタンパク質のコード配列に様々な短いおよび極端に短いイントロンを導入することにより、（真核生物の）ＨＥＫ２９３ＦＳ細胞に発現された場合に、イントロンなしの対照タンパク質と類似する発現レベルを有する、機能的なタンパク質（サイトゾル性または分泌性）が導かれた。
（ｂ）標準スプライス部位を変異させることにより、予想された通り、モックトランスフェクションのレベルに対して、目的とするタンパク質の発現レベルの低下が導かれ、したがって、機能的なイントロン（したがって、そのプレ−ｍＲＮＡからの除去）が目的とするタンパク質の適切な発現に対して最優先されることが示される。
（ｃ）２つの同一であるまたは同一ではないイントロンの導入により、１つのみイントロンを含有する配列に匹敵する発現レベルが導かれた。
（ｄ）イントロンへの「外来」配列の挿入により、一部のタンパク質の発現レベルが対照レベルと比較される場合にわずかに低下したとしても、良好な発現が導かれた。
（ｅ）３から７の（同一であるまたは同一ではない）イントロンの挿入は、一部のイントロンに関して発現を示さなかった。他の全ては低下したレベルの発現を示した。
（ｆ）イントロンは、スプライシングされない構築物が、予想されるタンパク質（スプライシング後）の特性をなおも保持する（しかし、必ずしも必要としない）可能性がある、伸長したタンパク質を生じないことを確実にするため少なくとも１つの内部インフレーム終止コドンを含有してもよい、例えば、イントロンの長さが３の倍数であるケース。
（ｇ）様々な組合せのイントロンを含有した、モジュラー、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅベースのクローニングによって生成された抗体構築物が、予想されるように、産生され、培養培地に分泌されたが、構築物に使用されるイントロン組合せに依存して様々な発現レベルであった。より長いイントロン、例えば、イントロンＩ８およびＩ９の組合せは、極端に短いイントロンを含有するものよりも高い発現レベルを一般に生じた。抗体構築物の機能的な試験は、予想される範囲で、それらの標的に結合を示したが、一部（しかし、全てのケースではない）でイントロンＩ３またはその修飾型ｍＩ３はわずかに低下した結合を提示した。
【０１８５】
イントロンを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングアプローチに一緒に使用して、機能的なｍＲＮＡを産生する細胞スプライシング装置を使用することによって、正しくフォールディングされた目的とするタンパク質が作り出されることが示された。本発明のクローニング方法は有利である、その理由は、それがＤＮＡモジュール特異的な接頭および接尾配列の必要性を排除し、それゆえ、そうでなければ不適合性のＤＮＡモジュールの組合せを可能にし、完全に包括的で普遍的なタンパク質工学の方法論をもたらすからである。対照的に、当技術分野において記載されているクローニング技術では、目的とするＤＮＡモジュールは、それらがユニークかつ適合性の接頭−接尾ペアを含有する場合、直線的に融合されるだけであり、結果的に不適合性の接頭−接尾ペアを有する一次モジュール配列が、指向性組立を可能にするためには、一次ＤＮＡ配列操作によって（例えば、適合性の配列を導入することによって）修飾されなければならない。適合性の接頭および接尾配列は、タイプＩＩｓ制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）によって生成される相補的な４塩基対オーバーハング（接頭−接尾ペア）で作られる。結果的に、タンパク質モジュールは、共有される末端４ｂｐ標的部位（典型的には、共通アミノ酸コドン＋１追加ヌクレオチド）で、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングによって繋がれる。
【０１８６】
しかしながら、本発明の方法は、ＤＮＡモジュール（例えば、タンパク質ドメインをコードする）が、非パリンドロームタイプＩＩｓ制限部位をコードする、定義されたフランキング接頭および接尾配列を使用するカットアンドペースト機構によって組立てられることを可能にする。ここでは、ＤＮＡモジュール組立のための接頭および接尾配列は、ＤＮＡモジュールの末端部分から置き換えられ（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）、代わりに目的とするＤＮＡモジュールに融合される分割イントロン配列（例えば、２つの非機能的な部分に分けられる機能的なイントロン）の３’または５’末端に位置する。したがって、接頭および接尾配列は、イントロン配列によって提供される。一次ＤＮＡ配列の部分である、適合性の末端接頭および接尾配列の前提条件なしでのＤＮＡモジュールの包括的な組立。一次ＤＮＡ配列の変更は必要とされない。したがって、一次ＤＮＡ配列の部分である、適合性の末端接頭および接尾配列の前提条件なしでのＤＮＡモジュールの包括的な組立が、可能である。一次ＤＮＡ配列の変更は必要とされない。接頭および接尾配列はもはや一次ＤＮＡモジュールの一部ではないので、複数ドメイン組立に関する可動性／変動性が、ｉ）イントロン配列内のタイプＩＩｓ標的部位の位置をシフトすること、またはｉｉ）代替のイントロン配列を使用すること、またはｉｉｉ）その組合せによって達成される。
【０１８７】
本発明の方法は有利である、その理由は、重複位置、すなわち、切断後に生成されるオーバーハング内で、少なくとも１つの同一の３ヌクレオチドのストレッチを共有する配列（例えば、タンパク質ドメインをコードする）のライゲーションを可能にするからである。これにより、ＤＮＡ配列の柔軟性およびコード配列非依存性ライゲーションが可能になる。したがって、本発明は、ライゲーションおよびそれゆえコード配列の非依存性のライゲーションに使用される／それを可能にするフランキング核酸配列を有するコード配列のコンカテネーションを可能にする。
【０１８８】
方法によって組立てられる構築物は、人工的なイントロンを含むことができる。イントロンが、スプライシングによって真核生物発現宿主において除去され、意図される目的とするポリペプチドを生じるが、ここで試験されたイントロンを自由裁量で組み合わせることができないことが明白となったことが示されている。しかしながら、このことは予想外ではなかった。当技術分野において知られているように、スプライシングは、エキソンおよびイントロンの両方内の活性化および阻害性ヌクレオチド配列によって調節される（例えば、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒｉｏ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０１５年．  ８４：２９１〜３２３頁、またはＹｅｏ  ＧＷ、Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  ＥＬ、Ｌｉａｎｇ  ＴＹ  （２００７年）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ３（５）：  ｅ８５．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００３００８５を参照されたい）。スプライシング効率における様々な短いヌクレオチド配列の影響を示す、多くの実験データが存在するにもかかわらず、全ての調節配列が知られているわけではない。それらの影響は、前々から知られている所与の配列関係にない。さらに、スプライシングの調節は、より長いイントロンに対するよりも極端に短いイントロンに対して異なって機能し得る。上で記載されている実験では、極端に短いイントロンのスプライシングが、ここで使用されるより長いイントロンよりも、潜在的な調節エレメントに対してより感受性があるかのように見える。
【０１８９】
驚くべきことに、多くのケースでは、同一のイントロンが、目的とするタンパク質の発現を妨げることなく、構築物内の複数の位置で使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2022501036.tif 000029
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