(57)【要約】  本発明は、核酸、特にｍＲＮＡの最適化された細胞内送達のための方法および組成物に関する。ｍＲＮＡに加えて、組成物、特にナノ粒子は、糖脂質抗原を含んでよい。チェックポイント阻害剤との組み合わせも提供される。本発明の方法および組成物は、抗原提示細胞を標的とし、免疫療法およびワクチン接種の目的に特に有用である。
2022501421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、カチオン性脂質およびコレステロールを含む脂質成分、ならびにα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）化合物を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
カチオン性脂質がイオン化可能カチオン性脂質である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
カチオン性脂質が以下からなる群から選択される、請求項１または２に記載のナノ粒子：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートまたは「ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ」もしくは「ＭＣ３」、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ」もしくは「ＫＣ２」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ν，Ν−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、および２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」。
【請求項４】
ｍＲＮＡが、目的の抗原またはポリペプチド、特に腫瘍特異的抗原をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡが、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）および／または５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）などの天然に存在する修飾ヌクレオチドの、ｍＲＮＡ転写物への取り込みを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子、ならびに薬学的に許容し得る賦形剤および／または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子または組成物と、チェックポイント阻害剤との組み合わせであって、ここでチェックポイント阻害剤が特に、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４それぞれに特異的に結合し、かつ抗体、小分子、ポリペプチド、または核酸から選択されるＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＰＤ−Ｌ２阻害剤またはＣＴＬＡ−４阻害剤である、前記組合せ。
【請求項８】
医薬として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子、組成物または組み合わせ。
【請求項９】
対象におけるがんもしくは腫瘍細胞または感染性病原体に対する細胞傷害性Ｔ細胞およびｉＮＫＴ細胞またはＮＫ細胞を、プライミングおよび／または増大するための方法において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子、組成物または組み合わせ。
【請求項１０】
治療用がんワクチン接種で使用するための、または感染性もしくは自己免疫関連疾患における予防または治療用ワクチンとしての、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子、組成物または組み合わせ。
【請求項１１】
ナノ粒子、組成物または組み合わせが、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内投与によって、または吸入によって投与される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子、組成物または組み合わせ。
【請求項１２】
第１の容器、第２の容器、および添付文書を含むキットであって、第１の容器が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む医薬組成物の少なくとも１用量を含み、第２の容器が、チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物の少なくとも１用量を含み、および添付文書が、がんを有する個体を医薬組成物（単数または複数）を使用して処置するための説明書を含む、前記キット。
【請求項１３】
以下を含む組成物を投与することを含む、細胞における抗原の発現を抗原特異的Ｔ細胞免疫応答と共に誘導するのに使用するための組成物：
（ａ）少なくともその一部が抗原をコードする、少なくとも１つのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ；
（ｂ）ＣＤ１ｄ分子に提示され、ｉＮＫＴ細胞を刺激する、糖脂質抗原；
（ｃ）前記ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡおよび前記糖脂質抗原を含む、脂質ナノ粒子；および
（ｄ）任意に、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ−４阻害剤、特に抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体；
ここで前記組成物の投与後、ｍＲＮＡによってコードされる抗原は標的細胞で発現されて、および／または細胞から分泌または排出されることができ、およびここで、糖脂質抗原は、標的細胞によってＣＤ１ｄ経路に提示されて、ｉＮＫＴ細胞のライゲーションにより免疫カスケードを誘発する。
【請求項１４】
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２ｐ７０の産生、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞および／またはｉＮＫＴ細胞および／またはＮＫ細胞のプライミングおよび／または増大を特徴とする、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
標的細胞が、抗原提示細胞、好ましくは脾臓および肺における抗原提示細胞である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸、特にｍＲＮＡの最適化された細胞内送達のための方法および組成物に関する。組成物、特にナノ粒子は、ｍＲＮＡに加えて糖脂質抗原を含んでよい。チェックポイント阻害剤との組み合わせも提供される。本発明の方法および組成物は、抗原提示細胞を標的とし、免疫療法およびワクチン接種の目的に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
メッセンジャーＲＮＡの使用は、その不安定性が認識されているために長い間制限されていたが、今日ではｍＲＮＡをin vivoで正常に送達することが可能である［１］。これは、この分野における最近の２つのブレークスルーにより強く支持されている：（ｉ）ｍＲＮＡの選択的細胞標的化および細胞質ゾル送達を改善するよう設計された、ｍＲＮＡ分子のナノ粒子内へのパッケージング［２、３］、および（ｉｉ）修飾ヌクレオチドの取り込みを含むｍＲＮＡ構築物の技術的進歩による、翻訳能力が向上したより安定なｍＲＮＡの生成［４〜７］。特にワクチン接種の分野では、ｍＲＮＡがコードする抗原が、多用途で有望なプラットフォームとして浮上している［８］。
【０００３】
がん免疫療法の分野において、Kranzらは、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を樹状細胞（ＤＣ）に標的化することにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答がコードされた腫瘍抗原に対して誘導されたという、ヒト初の証拠を提供した［２］。彼らおよびその他らは、樹状細胞によるｍＲＮＡ発現の成功に加えて、ｍＲＮＡワクチンの作用機序がＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の誘導に依存することを実証した［３、９、１０］。より具体的には、ｍＲＮＡ分子は細胞侵入時に、エンドソームＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７および細胞質ゾル受容体ＭＤＡ−５およびＲＩＧ−１を含む生得免疫活性化経路を誘発し、これはＩ型ＩＦＮシグナル伝達および抗ウイルス免疫の誘導をもたらす。従来技術においては、ｍＲＮＡワクチンは、ｍＲＮＡのこの固有の自己アジュバント効果に依存している。しかしこれらのワクチンには重要な制限があり、それは、誘発された免疫応答がｍＲＮＡの翻訳を早期に停止し、それによって抗原のバイオアベイラビリティが低下するため、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が両刃の剣として機能することが示されているためである［１１、１２］。さらにＩ型ＩＦＮは、Ｔ細胞プライミングとの相対的なタイミングに応じて、Ｔ細胞応答にプラスまたはマイナスのいずれかの影響を及ぼすことができ、Ｉ型ＩＦＮの前曝露により、Ｔ細胞の枯渇とアポトーシスを生じることが示唆された［１３、１４］。さらに、高レベルのＩＦＮαは、インフルエンザ様症状から自己免疫後遺症、さらには生命を脅かす事象に至るまでの副作用を引き起こす可能性がある［１５、１６］。
【０００４】
ＨＰＬＣによる二本鎖ＲＮＡ断片の除去を含む、ｍＲＮＡ構築物のいくつかの修飾または追加の精製ステップは、ｍＲＮＡ分子の免疫刺激的側面を下方調節し、Ｉ型ＩＦＮレベルの低下を引き起こす可能性がある。例えば、修飾ヌクレオチド（例えばプソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチルシチジン（５ｍｅＣ））を組み込むと、ｍＲＮＡの安定性と翻訳が向上し、ｍＲＮＡの発現レベルがより高くより持続可能になる。この増強されたｍＲＮＡ発現はワクチンの開発に有利であり、なぜならば、結果として生じる抗原提示の増加が、濾胞性Ｔ細胞の形成を含む長寿命抗体およびヘルパーＴ細胞応答の誘導に有益であることが示されているからである［１７］。しかし、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡはその自己アジュバント作用を大幅に失い、その結果Ｉ型ＩＦＮレベルが低下し、ＣＴＬ免疫を誘発する能力が制限される。
【０００５】
以前の研究では、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）の両方をカプセル化できる脂質ナノ粒子が示され、Ｉ型ＩＦＮを強力に誘導することなくＴ細胞数を取得する能力が回復された［１８］。しかし、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとＭＰＬＡのこの組み合わせ戦略は腫瘍増殖に有意な影響を与えず、複数の抗腫瘍メカニズム（ＮＫ細胞の活性化、制御性Ｔ細胞の減少など）におけるＩ型ＩＦＮの関与を強調する。
【０００６】
アジュバントの使用は、ナノ粒子を使用するペプチドおよびタンパク質ベースのがんワクチンでも示されている（例えば、WO2012/088414、WO2016/154544、WO2014/128225、US2011229556）。タンパク質ワクチンまたはタンパク質ナノ粒子ワクチンからの所見は、抗原の細胞内位置、抗原のプロセシングおよび提示がｍＲＮＡワクチンでは完全に異なるため、ある程度しか役に立たない。ｍＲＮＡを他のアジュバント（例：ポリ（Ｉ：Ｃ）およびリポ多糖）と組み合わせた以前の試みは適合性の問題を提起したが、それは、ＤＣ成熟が細胞取り込みメカニズム（例：マクロピノサイトーシス）を通常より早く無効にし、かつｍＲＮＡ翻訳に不利な環境を作り出し得るからである［２、１９］。ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡワクチンと組み合わせて免疫原性を調節し、強力で耐久性のあるＣＴＬ応答を達成するために、適切で安全な免疫刺激剤の特定が依然として重要である。
【０００７】
ワクチンにより誘発されるＩ型ＩＦＮ分泌に関連する問題に加えて、ｍＲＮＡワクチンは、永続的な抗腫瘍免疫を呼び起こすにはしばしば不十分である。本質的に腫瘍浸潤ＣＴＬは、Ｍ２マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞などのさまざまな抑制細胞によって媒介される免疫抵抗性に対処する必要がある［２０］。さらに、免疫攻撃およびインターフェロン産生の間、免疫チェックポイント経路は、適応免疫、例えば腫瘍細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびエフェクター細胞上のその受容体ＰＤ−１によるプログラム細胞死１（ＰＤ−１）リガンドの発現などの適応免疫に対して、抵抗するメカニズムとして活性化される［２１〜２３］。したがって理想的には、ｍＲＮＡワクチンは、ＣＴＬの活性化のみに焦点を当てるのではなく、これらの異なる抑制メカニズムに取り組むために、宿主の免疫系をより広く利用する必要がある。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、様々な種類の障害を処置、予防または改善するように構成された核酸と会合した（例えば、複合体形成、コンジュゲート、カプセル化、吸収、吸着、または混合した）ナノ粒子、前記ナノ粒子を使用する方法、およびそれを合成する方法に関する。さらに本発明は、核酸の最適化された細胞質ゾル送達のための方法、組成物、キット、組み合わせ、およびその使用を提供する。組成物、キットまたは組み合わせは、ナノ粒子、核酸、特にｍＲＮＡ、および少なくとも１つのアジュバント、特にｉＮＫＴアゴニストを含む。組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤または希釈剤を任意に含む。
【０００９】
一態様において、ナノ粒子は、核酸に会合するかまたは核酸を含む、脂質ベースのナノ粒子および／またはカチオン性ナノ粒子、特にカチオン性リポソームである。さらなる態様において、ナノ粒子の脂質成分は、脂質、より具体的にはカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰなど）またはイオン化可能脂質、およびヘルパー脂質（単数または複数）、例えば、リン脂質、コレステロールまたはその（機能的）誘導体または類似体、および／またはＰＥＧを含む。ナノ粒子はさらに、アジュバント、特に免疫刺激アジュバント、より具体的にはｉＮＫＴアゴニストと会合している。より具体的には、本発明のナノ粒子は、ｍＲＮＡ、脂質成分、およびα−ＧａｌＣｅｒまたはそれらの類似体を含む。ｍＲＮＡとしては、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）および／または５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）などの修飾ヌクレオシドの、ｍＲＮＡ転写産物への部分的または完全な取り込みが含まれる。
【００１０】
一態様において、α−ＧａｌＣｅｒ化合物は、ナノ粒子の脂質成分に組み込まれる。ナノ粒子中のα−ＧａｌＣｅｒ化合物の濃度は、総脂質量（＜１μｇ／ｋｇ体重）の約０．００１５ｍｏｌ％から約１ｍｏｌ％である。ナノ粒子中のコレステロールの濃度は、総脂質量の４０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％である。ナノ粒子中のＤＯＴＡＰの濃度は、総脂質量の２０ｍｏｌ％から６０ｍｏｌ％である。
本明細書で提供されるｍＲＮＡは、目的の抗原またはポリペプチド、特に腫瘍特異的抗原をコードする。任意に、前記ｍＲＮＡは、ヌクレオシドを終結させる鎖、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、および／または５’キャップ構造を含む。
一態様において、ナノ粒子中の脂質成分とｍＲＮＡとの重量／重量比は、約５：１から約５０：１である。
【００１１】
さらなる態様において、本発明のナノ粒子、組成物、キットまたは組み合わせは、医薬として、特にin vitro、ex vivoまたはin vivo適用によって樹状細胞のサイトゾルに薬剤を送達する方法において、より特にがん、感染症または自己免疫疾患の処置に使用するために使用される。
より具体的には、本発明は、抗原提示細胞、好ましくは脾臓および肺の抗原提示細胞に抗原を送達および／または発現するための方法を提供し、前記方法は、本明細書で提供されるナノ粒子または組成物を投与することを含む。特定の態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。
さらなる態様において、本発明は、対象において、免疫応答、好ましくはがんに対する免疫応答を誘導するための方法において使用するためのナノ粒子または組成物を提供し、方法は、本明細書に記載のナノ粒子または組成物を対象に投与することを含む。ナノ粒子または組成物は、対象の細胞傷害性Ｔ細胞および／またはｉＮＫＴ細胞を刺激、プライミングおよび／または増大することができる。
【００１２】
本発明はさらに、細胞における抗原の発現を誘導する方法、および抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導する方法を提供し、方法は、以下を含む組成物を投与することを含む：
（ａ）少なくともその一部が抗原をコードする、少なくとも１つのヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ；および
（ｂ）ＣＤ１ｄ分子に提示され、ｉＮＫＴ細胞を刺激する、糖脂質抗原：および
（ｃ）ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子；および
（ｄ）任意に、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、または本明細書で提供されるかまたは当業者に知られている他のチェックポイント阻害剤、
ここで、前記組成物の投与後、ｍＲＮＡによってコードされる抗原は標的細胞で発現され、および／または細胞から分泌または排出され、糖脂質抗原は同じ標的細胞によってＣＤ１ｄ経路に提示される。
ｉＮＫＴ細胞による糖脂質認識は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２ｐ７０の産生を特徴とする免疫カスケードを誘発し、これにより、対象において細胞傷害性Ｔ細胞および／またはｉＮＫＴ細胞および／またはＮＫ細胞のプライミングおよび／または増大がもたらされる。
【００１３】
一態様において、本発明のナノ粒子または組成物は、対象に２、３、またはそれ以上の（その後の）用量で、例えば、週に２回、少なくとも週に１回、または２週間ごとに投与される。投与は、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、気管内、鼻腔内、または吸入によるものであり得る。
【００１４】
特定の側面において、目的のポリペプチドは、哺乳動物細胞において発現または産生される。さらに別の側面において、本発明は、対象（例えば、哺乳動物）に、（ｉ）脂質成分、（ｉｉ）ｍＲＮＡ、および（ｉｉｉ）ｉＮＫＴ細胞アゴニストを含むナノ粒子組成物を投与することを含む、ｍＲＮＡを細胞（例えば、哺乳動物細胞）に送達する方法を提供し、ここで、投与は細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含み、それによってｍＲＮＡおよび糖脂質抗原が細胞に送達される。
特に興味深いのは、本明細書で提供されるナノ粒子または組成物と、ＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１阻害剤または他のチェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ２．．．）、例えば、抗体、小分子、ポリペプチドまたは核酸、特に抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体との、組み合わせおよび組み合わせた使用（本発明の方法における；第１のおよびさらなる医学的使用）である。この組み合わせは、がん、感染症、または自己免疫疾患の処置に特に有用である。
【００１５】
本発明はさらに、第１の容器、第２の容器、および添付文書を含むキットを包含し、ここで第１の容器は、本明細書で提供されるナノ粒子を含む医薬組成物の少なくとも１用量を含み、第２の容器は、本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を含む医薬組成物の少なくとも１用量を含み、および添付文書は、例えばがん、感染症、または自己免疫疾患を有する個体を、医薬組成物（単数または複数）を使用して処置するための説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図を具体的に参照して、ここに示されている詳細は、例としておよび本発明の種々の態様の例示的な議論の目的のためであることに留意されたい。図と共に挙げた説明は、当業者に対し本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかを明らかにする。
【００１７】
【図１】図１は、（ｉ）低用量のα−ＧａｌＣｅｒ（マウスあたり約０．０２０μｇのα−ＧａｌＣｅｒ）を含有するＯＶＡコード化ヌクレオシド修飾ナノ粒子、または（ｉｉ）ＭＰＬＡをアジュバント添加したｍＲＮＡナノ粒子（マウスあたり約２μｇのＭＰＬＡ）の全身投与後の、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ担がんマウスにおける治療効果を示す図である。マウスにＥ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫細胞（３×１０５細胞）を皮下接種した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ担がんマウスに、ｍＲＮＡナノ粒子を８日目（腫瘍が明確に見えるとき）に静脈内投与し、腫瘍接種後１２日目に２回目のワクチン接種した（ｎ＝６）。
【００１８】
【図２】図２は、ＤＯＴＡＰコレステロールのトランスフェクション効率を、ｍＲＮＡ送達用の他の脂質製剤と比較して示す図である。（Ａ）細胞を、ＤＯＴＡＰ−コレステロール−、ＤＯＴＡＰ−ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール−ＤＯＰＥ、またはリポフェクタミン（登録商標）RNAiMAXナノ粒子（未修飾ｍＲＮＡを使用）にパッケージ化されたｍＲＮＡとインキュベートした２４時間後の、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をトランスフェクトしたＢＭ−ＤＣのパーセンテージ。トランスフェクションは、無血清培地（OptiMem（登録商標））および血清含有培地（５％Hyclone（商標）、FetalClone ISerum）中で行った。ＤＣは、ＣＤ１１ｃ表面染色に基づいてゲートした。
【００１９】
【図３】図３は、ｍＲＮＡナノ粒子の物理化学的特性を示す図である。（Ａ）Ｎ／Ｐ比を増加させつつＨＥＰＥＳバッファーに分散させたｍＲＮＡナノ粒子（１μｇのｍＲＮＡ用量）の、サイズ（Ｚ平均）、多分散性指数（ＰｄＩ）およびゼータ電位。（Ｂ）２．５：１のＮ／Ｐ比でＨＥＰＥＳバッファーに分散させたか、またはヒト血清中３７℃で２時間、６時間、および２４時間インキュベートしたｍＲＮＡナノ粒子（Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ）の、サイズ分析（ｆＳＰＴによる）。
【００２０】
【図４】図４は、ｍＲＮＡガルソームがα−ＧａｌＣｅｒの樹状細胞への送達を促進することを示す図である。（Ａ）ｍＲＮＡガルソームに配合されたＦＩＴＣ標識α−ＧａｌＣｅｒの、裸のα−ＧａｌＣｅｒと比較して増強された細胞送達；ＢＭ−ＤＣとのインキュベーションの２４時間後に評価したもの。（Ｂ）ｍＲＮＡガルソームにおけるα−ＧａｌＣｅｒとのインキュベーションの２４時間後の、ＢＭ−ＤＣによるＣＤ１ｄ複合体中のα−ＧａｌＣｅｒの増強された表面提示。（パネルは、３つの独立した実験の代表的なデータ（ｎ＝３）を示す）。（Ｃ）異なる糖脂質抗原をパッケージ化したナノ粒子でトランスフェクトされた、脾細胞とＢＭ−ＤＣの共培養物（２４時間）の上清は、裸のα−ＧａｌＣｅｒとの共培養物または修飾ｍＲＮＡのみより高いレベルのＩＦＮ−γを示した。（Ｄ）用量反応実験：低下用量のα−ＧａｌＣｅｒを含むｍＲＮＡガルソームの静脈注射の１２時間後の、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの血清におけるＩＦＮ−γ産生。
【００２１】
【図５】図５は、ｍＲＮＡガルソームの全身投与が、肺および脾臓において効率的なｍＲＮＡトランスフェクションをもたらすことを示す図である。（Ａ）次の異なるカーゴ（cargo）を含むナノ粒子の静脈注射の６時間後のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡの全身発現レベル；未修飾ｍＲＮＡナノ粒子、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡナノ粒子、またはα−ＧａｌＣｅｒを配合したヌクレオシド修飾ｍＲＮＡナノ粒子（ｎ＝６〜７、２つの独立した実験からプール）。（Ｂ）単離された臓器（肺、脾臓、肝臓）の代表的な生物発光画像。
【００２２】
【図６】図６は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ｆＬｕｃをコードするｍＲＮＡを含むＤＯＴＡＰ−コレステロールナノ粒子を、次の異なる投与経路：静脈内、腹腔内、鼻腔内または気管内投与で投与した場合の図である。図に示すように、投与経路に応じて、異なるｍＲＮＡ用量および／またはｍＲＮＡ修飾を使用した。図は、ｍＲＮＡナノ粒子の投与から６時間後のマウスの代表的な生物発光画像を示す。
【図７】図７は、低用量のα−ＧａｌＣｅｒ（２０ｎｇ）を含むｍＲＮＡガルソームが、in vivoで樹状細胞の成熟を誘導することを示す図である。（Ａ）脾臓ＤＣ（ＣＤ１１ｃhigh集団）は、活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８６、およびＣＤ８０の発現の増加（ＭＦＩの倍数変化で示す）を、ｍＲＮＡガルソーム投与の２４時間後に示した（ｎ＝４）。（Ｂ）ＣＤ４０、ＣＤ８６、およびＣＤ８０発現の代表的なヒストグラム。
【００２３】
【図８】図８は、低用量のα−ＧａｌＣｅｒ（２０ｎｇ）を含むｍＲＮＡガルソームが、免疫刺激性サイトカインの放出を刺激することを示す図である。血清試料を注射後６時間で収集し、炎症性サイトカインの放出についてスクリーニングした：未修飾のｍＲＮＡナノ粒子はＩＦＮ−α産生を引き起こすが、ｍＲＮＡガルソームは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２７、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む異なるサイトカイン応答を誘導する。データは、少なくとも２つの独立した実験からプールされる。
【図９】図９は、ｍＲＮＡガルソームが、未修飾のｍＲＮＡとパッケージ化されたナノ粒子よりも優れた抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を媒介することを示す図である。（Ａ）α−ＧａｌＣｅｒは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導を強力に媒介する。マウスをＯＶＡ ｍＲＮＡナノ粒子で免疫化した。６日後、脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、Ｈ−２ｋｂ ＯＶＡテトラマー染色を使用して測定した。（Ｂ）ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー散布図。
【００２４】
【図１０】図１０は、ｍＲＮＡガルソームの全身投与により、ｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞の増大が生じることを示す図である。（Ａ）ｍＲＮＡガルソーム注射の３日後、脾臓および肝臓は、未処置のマウスと比較して増大したｉＮＫＴ細胞数を示した。（Ｂ）脾臓および肝臓におけるｉＮＫＴ細胞の代表的なフロープロット（ＴＣＲβ＋、ｍＣＤ１ｄ ＰＢＳ−５７＋細胞）。（Ｃ）ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＮＫ１．１＋細胞）の下流活性化。この図のデータ（ｎ＝６）は、２つの独立した実験からプールされている。
【図１１】図１１は、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫における、ＯＶＡ ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡナノ粒子による治療用ワクチン接種を示す図である。マウスに、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫細胞（３×１０５細胞）を皮下接種した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ担がんマウスには、腫瘍が明確に見える８日目にワクチン接種した。グラフは、未処置の対照群、およびＯＶＡ ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ＯＶＡ ｍＲＮＡナノ粒子で処置したマウス（ｎ＝７〜８）の、時間の関数としてのカプランマイヤー生存曲線とそれぞれの腫瘍増殖曲線（ＡおよびＢ）を示す。
【００２５】
【図１２】図１２は、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルにおける、ＯＶＡ ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡナノ粒子による治療用ワクチン接種を示す図である。マウスに、Ｂ１６−ＯＶＡリンパ腫細胞（３×１０５細胞）を皮下接種した。Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスは、８日目、１２日目、１６日目に３回ワクチン接種した。グラフは、未処置対照群、およびＯＶＡ ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ＯＶＡ ｍＲＮＡナノ粒子で処置したマウス（ｎ＝７〜８）の、時間の関数としてのカプランマイヤー生存曲線とそれぞれの腫瘍増殖曲線（ＡおよびＢ）を示す。
【図１３】図１３は、ｍＲＮＡガルソームによる治療用ワクチン接種が、エフェクター細胞の腫瘍浸潤をもたらすことを示す図である。２回のワクチン接種を受けたＢ１６−ＯＶＡ保有マウスを１４日目に犠牲にし、浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）およびＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）、ｉＮＫＴ細胞（Ｃ）およびＮＫ細胞（Ｄ）について評価した。
【００２６】
【図１４】図１４は、ｍＲＮＡガルソームによる治療用ワクチン接種が、Ｂ１６ ＯＶＡ黒色腫の抑制性骨髄細胞にプラスの影響を及ぼすが、しかしＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を活性化することを示す図である。腫瘍部位における（Ａ）ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋、ＧＲ１＋、ＭＨＣ−ＩＩ−）および（Ｂ）Ｍ１分極ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣ−ＩＩ＋）の存在（ｎ＝８、２つの独立した実験からプール）。（Ｃ）ｍＲＮＡガルソームは、腫瘍細胞（ＣＤ４５−）およびＡＰＣ（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｃ＋）でＰＤ−Ｌ１発現を誘導した（ｎ＝５）。（Ｄ）腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１の発現についての評価を、１４日目（ブーストの２日後）（ｎ＝６〜８、２回の実験からプール）または２１〜３３日後の時点で腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達した時に実施した（ｎ＝５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍部位においてＰＤ−１のより高い表面発現レベルを示した。脾臓において活性化されたｉＮＫＴ細胞は、ｍＲＮＡガルソームによる最初のチャレンジの３日後に測定された、ＰＤ−１発現の増加を示した（ｎ＝８、２つの実験からプール）。
【００２７】
【図１５】図１５は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるチェックポイント阻害が、ｍＲＮＡガルソームによる刺激後のｉＮＫＴアネルギーの誘導を防ぐことを示す図である。ｉＮＫＴアネルギーの評価のために、ナイーブマウスに対し、２回の連続したｍＲＮＡガルソームへの曝露を、初回投与と２回目投与の間に５日間おいて与えた。（Ａ）アイソタイプ抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかと組み合わせたｍＲＮＡガルソームの１回目および２回目の投与の６時間後に収集した血清中の、ＩＦＮ−γの産生を示すグラフ。バーは平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。（Ｂ）各ワクチン接種の３日後に測定した、脾細胞中のｉＮＫＴ細胞（ＴＣＲβ＋、ｍＣＤ１ｄ ＰＢＳ−５７＋細胞）のパーセンテージ。（Ｃ）脾臓ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋細胞）でのＰＤ−Ｌ１発現およびｉＮＫＴ細胞でのＰＤ−１発現、それぞれ最初の処置の６時間後および２回目の処置の３日後に測定（ｎ＝４）。
【００２８】
【図１６】図１６は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたｍＲＮＡガルソームが、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫保有マウスの治療結果を改善することを示す図である。マウスにＢ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞（５×１０５細胞）を皮下接種し、腫瘍が明確に見える８日目にワクチン接種した。このため、Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスに、１００μｇのラットＩｇＧ２ｂ抗体（アイソタイプ対照）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を単剤療法で、またはｍＲＮＡガルソームとの併用療法で腹腔内投与した。グラフ（Ａ）は、それぞれの処置の平均腫瘍増殖曲線および（Ｂ）カプランマイヤー生存曲線を示し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体とｍＲＮＡガルソーム（ｎ＝６〜８）の間の相乗効果を実証する。矢印は処置日を示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、ｍＲＮＡガルソームまたは関連する腫瘍抗原ＴＲＰ−２をコードする未修飾のｍＲＮＡナノ粒子との併用療法を示す図である。マウスにＢ１６Ｆ０黒色腫細胞（５×１０５細胞）を皮下接種し、腫瘍が明確に見える８日目にワクチン接種した。Ｂ１６Ｆ０保有マウスに、１００μｇのラットＩｇＧ２ｂ抗体（アイソタイプ対照）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を単剤療法で、またはガルソームもしくはＴＲＰ−２をコードするｍＲＮＡを含む未修飾ｍＲＮＡナノ粒子との併用療法で腹腔内投与した。グラフは、それぞれの処置の平均腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６）。矢印は処置日を示す。
【００３０】
【図１８】図１８は、αＧＣ類似体によるｍＲＮＡガルソームワクチン接種後の、ｉＮＫＴ細胞および抗原特異的ＣＴＬの増殖を示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓を、αＧＣまたは異なるαＧＣ類似体（すなわち、ＮＵ−αＧＣ、ＰｙｒＣ−αＧＣまたはＯＣＨ）を含むｍＲＮＡガルソームでワクチン接種した３日後に、ｉＮＫＴ細胞の存在について分析した。（Ｂ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｈ２Ｋｂテトラマー染色を使用して、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をワクチン接種したマウスの脾臓で同定した（７日目）。（Ｃ）ｉＮＫＴ細胞でのＰＤ−１発現。αＧＣと比較した統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定により実施した。（＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｎ＝３）。
【００３１】
【図１９】図１９は、古典的αＧＣまたはαＧＣ類似体のいずれかを含むｍＲＮＡガルソームを用いた、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルにおける治療用ワクチン接種を示す図である。マウスに、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（３×１０５細胞）を皮下接種した。Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスに８日目にワクチン接種し、１５日目にブーストワクチン接種した。（Ａ）グラフは、腫瘍増殖曲線（生存時点の中央値まで）、ならびに、（Ｂ）未処置の対照群（陰性対照）およびαＧＣまたはαＧＣ類似体（すなわち、ＮＵ−α−ＧＣ、ＰｙｒＣ−α−ＧＣまたはＯＣＨ）を含むＯＶＡ ｍＲＮＡガルソームで処置したマウス（ｎ＝５〜６）それぞれの生存日数の中央値を示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、「イオン化可能な」脂質処方（すなわち、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）で構成されたｍＲＮＡガルソームからの、発現および免疫原性を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡおよびｔＯＶＡＩ８０ ｍＲＮＡと共製剤化されたＭＣ３ ｍＲＮＡガルソームを投与し、翻訳活性および免疫効果を前述のＤＯＴＡＰ／コレステロールｍＲＮＡガルソームと比較した。（Ａ）ＭＣ３ ｍＲＮＡガルソーム投与６時間後のマウスにおける、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ発現の代表的な生物発光画像。（Ｂ）ＤＯＴＡＰ対ＭＣ３ ｍＲＮＡガルソームのワクチン接種の６日後に測定された、ｉＮＫＴ細胞およびＯＶＡ特異的ＣＴＬの脾臓におけるパーセンテージ。（Ｃ）血清試料を注射後６時間で収集し、炎症性サイトカインの放出についてスクリーニングした。
【００３３】
発明の詳細な説明
次に本発明についてさらに説明する。以下の節では本発明の異なる側面がより詳細に定義されている。そのように定義された各側面は、明確に逆の指示がない限り、他の1つ以上の側面と組み合わせることができる。明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。例として、「化合物」は１つの化合物または複数の化合物を意味する。本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む（comprise）」という単語および「含むこと（comprising）」および「含む（comprises）」などの他の形態の単語は、例えば、他の添加剤、成分、整数、またはステップを含むがこれらに限定されないことを意味し、これらを除外することを意図しない。本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、および「著しく」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈によってある程度変化する。それが使用される文脈を考えると当業者に明らかでない用語の使用がある場合、「約」および「およそ」は、特定の値または用語のプラスマイナス１０％を意味する。上記の用語および本明細書で使用される他の用語は、当技術分野の人々によく理解されている。本明細書で引用されるすべての参考文献および具体的に言及される教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本発明は、抗原提示細胞を標的とし、ｍＲＮＡ発現を誘導し、適切な免疫応答を誘発するｍＲＮＡ送達システムに関する。驚くべきことに、送達システムの脂質組成に少量のみのｉＮＫＴ細胞アゴニストを組み込むことにより、効果的な抗原特異的Ｔ細胞免疫応答が、バランスの取れたサイトカイン応答およびｉＮＫＴ／ＮＫ細胞活性化と共に生成されることが見出された。従来技術とは対照的に、このプラットフォームは、ｍＲＮＡ構築物を最適に設計して、抗原認識のための改善された発現レベルを得ることを可能にする。
【００３５】
ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを糖脂質α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）またはその機能的類似体と組み合わせると、（がん）免疫療法にユニークな特性が得られることが、本明細書において実証された。より具体的には、α−ＧａｌＣｅｒはよく知られた糖脂質抗原であり、ＭＨＣ−Ｉ様分子ＣＤ１ｄの抗原提示細胞によって提示されると、不変のナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ）の強力な活性化をもたらす。この異例なＴ細胞のサブセットは生得免疫および適応免疫に寄与するが、直接的および間接的な抗腫瘍効果も発揮し得る。危険経路を直接トリガーする古典的な免疫アジュバントとは異なり、α−ＧａｌＣｅｒは、α−ＧａｌＣｅｒを提示するＤＣとｉＮＫＴ細胞の間の双方向の相互作用を通じて、間接的なアジュバント効果を発揮する。そのため、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド間の相互作用を通じて、ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＡＰＣを活性化し、サイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γなど）の産生と共刺激受容体（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０など）の発現を誘発する。
【００３６】
本発明において、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡと、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物（非常に低濃度で組み込まれる）などのｉＮＫＴリガンドとの組み合わせが、Ｔ細胞免疫を促進するだけでなく、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞を活性化してより広く相乗的な抗腫瘍免疫を形成する、という利点も提供することが示された。
本発明において、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとｉＮＫＴリガンドとの組み合わせは、疾患を介した免疫抑制メカニズムを劇的に変化させる。本質的に、本発明は、免疫抑制表現型を有するＭＤＳＣおよびマクロファージの数および機能性を低減した。
【００３７】
本発明は、ワクチンプラットフォームと最先端の免疫療法（例えば、チェックポイント阻害剤）との組み合わせによってさらに強化することができる防御免疫応答を、誘導することができる。
一態様において、本発明は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、脂質組成物、およびｉＮＫＴ細胞アゴニスト、特に、例えばα−ＧａｌＣｅｒ、またはその機能的類似体もしくは誘導体などの糖脂質抗原を含む、ナノ粒子に関する。
【００３８】
一態様において、ｍＲＮＡは、ナノ粒子、特にカチオン性ナノ粒子に組み込まれる。本明細書で使用される用語「ナノ粒子」は広く解釈することができ、薬物、特に核酸、より具体的にはｍＲＮＡなどの別の物質の輸送モジュールとして使用される担体を指す。ナノ粒子は現在、例えば薬物送達における使用について研究されており、サイズが直径５〜１０００ｎｍ、特に約５〜約５００ｎｍ、より具体的には約５０〜約４００ｎｍの範囲である。特に、ナノ粒子のサイズは、哺乳動物細胞、特に例えば樹状細胞などの抗原提示細胞によって取り込まれることができるようなものである。用語「カチオン性ナノ粒子」は、コアまたは表面に埋め込まれたカチオン性薬剤を含むナノ粒子を指す。ナノ粒子が治療薬として核酸の複合体形成に使用される場合、正に帯電したナノ粒子は負に帯電したＤＮＡ／ＲＮＡ分子と静電的に相互作用すると考えられ、治療薬の複合体形成を促進するだけでなく、後者を酵素分解から保護することもできる。
【００３９】
一態様において、カチオン剤は、ポリカチオン剤、例えばキトサン、ペプチド（ポリ（Ｌ−リジン）など）、ペプチド誘導体（ポリ（Ｌ−リジン）−パルミチン酸など）、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドエチレンイミン）、およびポリ（アミドアミン）などであり得るが、これらに限定されない。特定のポリカチオン剤は、ポリマー、好ましくは多糖類、より好ましくはデキストランであり、反応性（メタ）アクリレート部分で官能化され、続いてカチオン性（メタ）アクリレートモノマーと、例えば２−アミノエチルメタクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、２−Ｎ−モルホリノエチルメタクリレート、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、または［２−（メタクリロイルオキシ）−エチル］トリメチルアンモニウムクロリドなどと、共重合される。
【００４０】
さらなる態様において、本発明のナノ粒子は脂質成分を含む担体であり、リポプレックス製剤または脂質ベースのナノ粒子とも呼ばれ、固体脂質ナノ粒子、リポソームおよびミセルが含まれる。核酸、特にｍＲＮＡの標的細胞への送達を容易にするための脂質ベースのナノ粒子の使用は、本発明によって特に企図される。前記ナノ粒子の二重層膜は、両親媒性分子によって、例えば空間的に分離された親水性および疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などによって、典型的には形成される。（脂質）ベースのナノ粒子の二重膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど）によって形成することもできる。適切な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。
【００４１】
本発明の文脈において、脂質ベースのナノ粒子は、典型的には、例えばｍＲＮＡなどの核酸を標的細胞へ輸送するのに役立つ。組み込まれた核酸は、完全にまたは部分的に粒子の内部空間に、粒子の二重層膜内に、または粒子膜の外面に会合して位置し得る。核酸とナノ粒子との会合は、本明細書では「カプセル化」とも呼ばれ、ここで核酸は完全に粒子に組み込まれている。粒子は、核酸を酵素または化学物質を含み得る環境から保護し、カプセル化された核酸が標的細胞に到達することを可能にする。
ナノ粒子は核酸の標的細胞への導入を促進することができるが、本明細書で提供されるポリカチオンのコポリマーとしての添加はトランスフェクション効率を促進し、場合によっては著しく増強することができる。
【００４２】
さらなる態様において、脂質成分はカチオン性脂質であるか、またはそれを含み、すなわち脂質ベースのナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質を任意に非カチオン性脂質およびＰＥＧ修飾脂質と組み合わせて使用する様々な比率の多成分脂質混合物を含むことによって、調製され得る。カチオン性脂質は一般に、負に帯電したＤＮＡ／ＲＮＡ分子の静電複合体形成を可能にするために含まれ、アミノ基のｐＫａに従って次のように大まかに分けることができる：（ｉ）「永久帯電脂質」、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＣ−コレステロール、または（ｉｉ）「ｐＨ依存性イオン化可能脂質」、例えばＤ−Ｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよび脂質様分子Ｃ１２−２００。用語「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」は、本明細書において交換可能に使用され、１、２、３、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪性アルキル鎖およびｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノもしくはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質およびその塩を含む。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、それらの多くは市販されている。本発明の組成物および方法で使用するのに特に適切なカチオン性脂質としては、以下が挙げられる：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」。イオン化可能脂質はｐＫａ＜７であり、中性から軽度のカチオン電荷を生理学的ｐＨ条件下で有する。頭部基に第一級、第二級、または第三級アミンを含む前記のイオン化可能カチオン性脂質が、脂質がｐＫａ未満のｐＨ値（例えばｐＨ４）で正に帯電している場合に核酸をカプセル化する目的で、および生理学的ｐＨ値でほぼ中性のＬＮＰのために、開発された。これは恒久的に帯電した脂質に対して一定の利点を提供し、その最も重要なものは、イオン化可能脂質が毒性の低下と血液循環の延長に関連するということである。
【００４３】
企図されるカチオン性または「イオン化可能」カチオン性脂質には、以下も含まれる：１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートまたは「ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ」もしくは「ＭＣ３」、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ」もしくは「ＫＣ２」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ν，Ν−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」。
【００４４】
ナノ粒子中のカチオン性脂質の濃度は、総脂質量の１５ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％、特に２０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％、より具体的には３５ｍｏｌ％〜４５ｍｏｌ％である。
本発明の特定の態様において、カチオン性脂質１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」は、担体に使用される。ＤＯＴＡＰは、単独で製剤化することも、またはリポソーム輸送ビヒクルまたは脂質ナノ粒子中で任意に中性脂質または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせることもでき、かかる脂質ベースのナノ粒子を使用して、核酸の標的細胞への送達を増強することができる。特定の態様において、本発明のナノ粒子の脂質成分は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含まない。
【００４５】
さらなる態様において、本明細書で提供されるナノ粒子はコレステロールを含む。より具体的には、ナノ粒子の脂質成分は、脂質、特にカチオン性脂質、より具体的にはＤＯＴＡＰと、コレステロールとの組み合わせを含む。前記粒子は本実施例において、血清中で特に安定であることが示されている。ナノ粒子の脂質成分は、４０ｍｏｌ％〜８０ｍｏｌ％のコレステロールを含む。特に、ナノ粒子中のコレステロールの濃度は、総脂質量の５５ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％の間である。
コレステロールベースのカチオン性脂質の使用もまた、本発明によって企図される。かかるコレステロールベースのカチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と組み合わせてのいずれかで、ナノ粒子の脂質成分の一部として使用することができる。適切なコレステロールベースのカチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ−コレステロール３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンまたはＩＣＥが挙げられる。コレステロールの代替として、他の構造脂質または類似体を使用することができ、例えばフェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペルステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸およびα−トコフェロールからなる群から選択される脂質などである。
【００４６】
本発明のナノ粒子は、サイズ、表面電荷、および任意の標的化部分、例えば抗体、ペプチド、葉酸塩、炭水化物（マンノース、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃなど）、ハロペリドール、アニサミド、強心配糖体などの付着に関して、カスタマイズすることができる。さらに、ナノ粒子の表面は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはナノ粒子のコロイド安定性を維持し非特異的な相互作用および免疫系による認識を低減することができる関連するポリマーもしくは部分で、修飾可能である。
一般に、本発明のナノ粒子は、遺伝物質と共に（治療）薬剤として使用するのに適している。薬剤は、ナノ粒子によってカプセル化され得るか、またはその１つ以上の表面に付着してコンジュゲートを形成することができる。薬剤をナノ粒子内にカプセル化するための適切な方法は当業者に知られており、静電錯化、共有結合、疎水性相互作用、受動的負荷、遠隔負荷、塩析、ナノ沈殿、エマルジョン拡散、溶媒蒸発、噴霧乾燥および乳化重合を含む。典型的にはかかる方法は、ナノ粒子を作製するために使用する材料および選択した薬剤に応じて適応され得、その適応は、当業者の権限の範囲内である。
【００４７】
特定の態様において、遺伝物質は核酸であり、（プラスミド）ＤＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、転写因子デコイオリゴヌクレオチド、低分子非コードＲＮＡ（例：ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）および長鎖非コードＲＮＡを含む。特に好ましいのは、ナノ粒子とｍＲＮＡの複合体、およびより特異的なｍＲＮＡナノ粒子である。ｍＲＮＡは、天然または非天然に存在するｍＲＮＡであってよい。ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含み得る。ｍＲＮＡの核酸塩基は、プリンまたはピリミジンまたはそれらの誘導体などの有機塩基である。核酸塩基は、標準塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、およびシトシン）、または非標準もしくは修飾塩基であって、アルキル、アリール、ハロー、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、および／またはチオ置換を含むがこれらに限定されない１つ以上の置換または修飾；１つ以上の縮合環または開放環；酸化；および／または還元を含むものであってよい。
【００４８】
ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、および／またはコーディングもしくは翻訳配列を含み得る。任意に、ｍＲＮＡは、ステムループ、ヌクレオシドを終結させる鎖、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、および／または５’キャップ構造のうちの１つ以上を含む。
ｍＲＮＡは、数十、数百、または数千の塩基対を含む任意の数の塩基対を含み得る。任意の数（例えば、すべて、一部、またはなし）の核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドは標準種の類似体であり、置換され、修飾され、またはそうでなければ天然に存在しなくてもよい。特定の態様において、ｍＲＮＡは修飾されている。本発明のｍＲＮＡへの置換および修飾は、当業者に容易に知られる方法によって実施することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、非天然を意味する。すなわちｍＲＮＡは、天然に存在しない１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。前記態様において、ｍＲＮＡは、核酸に増加または増強された安定性を与える少なくとも１つの修飾を含み得て、これは例えば、in vivoでのヌクレアーゼ消化に対する改善された耐性を含む。本明細書で使用される場合、用語「修飾」および「修飾された」は、本明細書で提供される核酸に関連し、好ましくは安定性を増強し、ｍＲＮＡを野生型またはｍＲＮＡの天然に存在するバージョンよりも安定にする（例えば、ヌクレアーゼ消化に耐性にする）、少なくとも１つの変更を含む。本明細書で使用される場合、用語「安定である」および「安定性」とは、本発明の核酸に関連し、特にｍＲＮＡに関して、例えば通常かかるｍＲＮＡを分解することができるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解に対する、増加または増強した耐性を指す。安定性の増加には、例えば、内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞もしくは組織内の条件による加水分解または他の破壊に対する、感受性の低下が含まれ、それによって標的細胞、組織、対象および／または細胞質におけるかかるｍＲＮＡの滞留が、増加または増強される。本発明のｍＲＮＡに関連するそのような用語としての「修飾」および「修飾された」の用語によって企図されるのは、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善または増強する変化であって、これは例えば、タンパク質翻訳の開始において機能する配列の包含を含む（例：コザックコンセンサス配列）。
【００５０】
さらなる態様において、本発明のｍＲＮＡは、これをより安定にするために化学的または生物学的修飾を受けている。ｍＲＮＡへの例示的な修飾には、塩基の除去（例えば、欠失またはあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換による）または塩基の修飾、例えば塩基の化学修飾が含まれる。本明細書で使用される「化学修飾」という句は、天然に存在するｍＲＮＡに見られるものとは異なる化学を導入する修飾、例えば、修飾ヌクレオチドの導入などの共有結合修飾（例えばヌクレオチド類似体、または天然ではかかるｍＲＮＡ分子に見出されないペンダント基の包含）を含む。
【００５１】
また、適切な修飾には、コドンが同じアミノ酸をコードするが、野生型バージョンのｍＲＮＡに見られるコドンよりも安定であるような、コドンの１つ以上のヌクレオチドの変更が含まれる。例えば、ＲＮＡの安定性と、より多くのシチジン（Ｃ）および／またはウリジン（Ｕ）残基との逆の関係が実証されており、ＣおよびＵ残基を欠くＲＮＡは、ほとんどのＲＮａｓｅに対して安定であることが見出されている［３０］。いくつかの態様において、ｍＲＮＡ配列中のＣおよび／またはＵ残基の数は減少されている。別の態様において、Ｃおよび／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同一または関連するアミノ酸をコードする別のコドンで置換することによって減少されている。修飾という用語はまた、例えば、非ヌクレオチド結合または修飾ヌクレオチドの、本発明のｍＲＮＡ配列への組み込み（例えば、機能的に分泌されたタンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３’および５’末端の一方または両方への修飾）を含む。かかる修飾には、ｍＲＮＡ配列への塩基の付加（例えば、ポリＡテールまたはより長いポリＡテールの包含）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの変化、ｍＲＮＡと薬剤（例えば、タンパク質または相補的核酸分子）との複合体形成、およびｍＲＮＡ分子の構造を変化させる（例えば、二次構造を形成する）要素の包含が含まれる。
【００５２】
特定の態様において、本発明のナノ粒子は、修飾ｍＲＮＡ、より具体的にはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを含み、ここで天然に存在する修飾ヌクレオチドが、部分的（少なくとも１０％）および最大で完全置換（例：１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％など）により、ｍＲＮＡ転写物に組み込まれる。好ましいヌクレオチドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）および／または５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）である。ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを使用することにより、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８による細胞内ｍＲＮＡ認識を低下させることができ、ｍＲＮＡを「免疫抑制性」にし、Ｉ型ＩＦＮの放出を回避する。さらにヌクレオチド修飾は、ＲＮＡを酵素分解に対してより耐性にすることができる。しかしこれはＲＮＡの自己アジュバント効果の喪失を伴い、ＤＣの活性化とＴ細胞のプライミングに影響を及ぼす。本発明において、本発明者らは、少量のｉＮＫＴアゴニスト、より具体的にはα−ＧａｌＣｅｒまたは類似体の組み込みが、Ｉ型ＩＦＮの強力な誘導なしに、高い抗原発現および強力な免疫活性化の両方を確実にすることを実証した。
【００５３】
一態様において、本発明は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡおよび本明細書で提供されるｉＮＫＴアゴニストなどのアジュバントの両方を、その中に複合体化することができる、カチオン性および／または脂質ベースのナノ粒子に関する。本明細書で使用される場合、「複合体化された」という用語は、ナノ粒子との、またはナノ粒子内での、アジュバントのコンジュゲーション、カプセル化、付着またはカップリングを含む。「混合」という用語は、ナノ粒子に溶解、分散、または懸濁されているアジュバントを指す。ｉＮＫＴアゴニストは、当業者に周知の方法によって、または本明細書で提供される方法によって、ナノ粒子に会合するか、共有結合するか、または組み込まれ／カプセル化される。一例として、ｉＮＫＴアゴニストは、本明細書で提供される脂質ベースのナノ粒子の水性コアおよび／または脂質膜内に組み込むことができ、ｉＮＫＴアゴニストは、脂質または高分子ミセル製剤の一部であり得るか、またはｉＮＫＴアゴニストを、ポリマーコンジュゲート、ポリマーマトリックスナノ粒子、固体ポリマーナノ粒子などのポリマーナノ粒子に適用することができる。
【００５４】
ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ、配列、およびその他の特性に依存し得る。ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡの量はまた、ナノ粒子組成物のサイズ、組成、所望の標的、および他の特性に依存し得る。ｍＲＮＡと他の要素（例えば脂質）の相対量も変化し得る。一態様において、ナノ粒子組成物中の脂質成分とｍＲＮＡの重量／重量比は、約１：１から約１００：１であり得る。例えば脂質成分とｍＲＮＡの重量／重量比は、約５：１から約５０：１であり得る。ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡの量は、例えば蛍光分光法（例：蛍光相関分光法）を使用して測定することができる。いくつかの態様において、１つ以上のｍＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、１つ以上の脂質中の窒素原子の、ｍＲＮＡ中の多数のリン酸基に対するモル比を指す。１つ以上のｍＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、Ｎ：Ｐ比として約１：２から約６：１、例えば、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、および６：１、特に約１：１から３：１等を提供するように、選択され得る。
【００５５】
さらなる態様において、ｍＲＮＡは目的の任意のポリペプチドまたは抗原をコードし、これには、任意の天然または非天然に存在するかまたは他の方法で修飾された、ポリペプチドまたはペプチドエピトープが含まれる。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは任意のサイズであり得、任意の二次構造または活性を有し得る。いくつかの態様において、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞において発現される場合、（間接的な）治療効果を有し得る。さらなる態様において本発明の方法は、ナノ粒子に、核酸、特にＲＮＡ、より具体的にはｍＲＮＡをコードする抗原を負荷またはトランスフェクトすることを含む。本明細書で使用される場合、「抗原」は本発明に限定されない。一態様において、抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、がん精巣抗原、ムタノーム由来抗原、（発がん性）ウイルス抗原、細菌抗原、酵母抗原、寄生虫抗原および真菌抗原からなる群から選択される。本発明のナノ粒子製剤は、高いトランスフェクション効率が、潜在的な（全身の）悪影響を最小限に抑えつつ適切な投与量のｍＲＮＡが標的細胞に送達される可能性を改善することを実証する。
【００５６】
ｍＲＮＡを含むナノ粒子の調製は、当業者に知られている任意の方法によって、例えばエタノール希釈、脂質膜水和、またはマイクロ流体デバイスの使用などにより行うことができる。本発明のｍＲＮＡを負荷した脂質ベースのナノ粒子を調製する例示的な方法は、以下のステップを含む：（１）適切な量の脂質をクロロホルムに溶解する、（２）適切な量のｉＮＫＴアゴニストを加える、（３）クロロホルムを蒸発させ、得られた脂質をバッファーで再水和する、（４）得られた脂質粒子のサイズを、超音波処理または押し出しにより低減する、（５）ｍＲＮＡと混合する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ｉＮＫＴ細胞アゴニスト」は当技術分野でのその一般的な意味を有し、脂質に由来する任意の誘導体または類似体を指し、これは通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＣＤ１ｄの状況で提示され、ｉＮＫＴ細胞を活性化することができる、すなわち、特定の方法でｉＮＫＴ細胞によるサイトカイン産生を促進する。特定の一態様において、本発明によるｉＮＫＴ細胞アゴニストは糖脂質抗原であり、例えばα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ；（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール）であって共通名ＫＲＮ７０００を有する、アゲラスフィン誘導体である。本明細書で使用される場合、「α−ガラクトシルセラミド化合物」または「α−ＧａｌＣｅｒ化合物」という用語は、当技術分野でのその一般的な意味を有し、ａ−結合によって可変長のアシル鎖とスフィンゴシン鎖を持つセラミド脂質に結合されたガラクトース炭水化物を含有するスフィンゴ糖脂質に由来する、機能的誘導体または類似体を含む。機能的な類似体または誘導体は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する能力を保持している。さまざまな出版物が、α−ＧａｌＣｅｒ化合物とその合成について説明している。α−ガラクトシルセラミドの機能的誘導体または類似体は、例えばWO2014001204（参照により組み込まれ、開示された化合物ＮＵ−αＧＣ、ＰｙｒＣ−αＧＣおよびＯＣＨを具体的に参照する）、WO201379687、およびWO2013162016に提供されている。ｉＮＫＴ細胞アゴニストの例としては、以下が挙げられる：ＨＳ４４、ＢｂＧＬ−ＩＩ、スレイトールセラミド、ＡＢＸ１９６、ＰＢＳ−２５、ＰＢＳ−５７、α−Ｃ−ＧａｌＣｅｒ、ＯＣＨ、ナフチル尿素−α−ＧａｌＣｅｒまたはＮＵ−α−ＧａｌＣｅｒ、アルファ−ＧａｌＣｅｒ−６”−（４−ピリジル）カルバメートまたはＰｙｒＣ−α−ＧａｌＣｅｒ、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（６”−Ｏ−（４−ピリジニルカルバモイル）−α−Ｃ−Ｄ−ガラクト−ピラノシル）−３−ヘキサコシルアミノ−ノナデカン−４，５−ジオール、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（６”−Ｏ−（４−ピリジニルカルバモイル）−α−Ｃ−Ｄ−ガラクト−ピラノシル）−３−ヘキサコシルアミノ−１−ノナデセン−４，５−ジオール、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（６”−ナフツレイド−６”−デオキシ−α−Ｃ−Ｄ−ガラクト−ピラノシル）−３−ヘキサコシルアミノ−ノナデカン−４，５−ジオール、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（６”−ナフツレイド−６”−デオキシ−α−Ｃ−Ｄ−ガラクト−ピラノシル）−３−ヘキサコシルアミノ−１−ノナデカン−４，５−ジオール、α−１Ｃ−ＧａｌＣｅｒ、または７ＤＷ８−５。α−ＧａｌＣｅｒ化合物は、当業者に知られている方法によって化学的に合成することができる。本発明の特定の態様において、α−ＧａｌＣｅｒ化合物は、本明細書で提供されるナノ粒子の脂質成分に組み込まれる。
【００５８】
驚くべきことに、本発明の使用および方法におけるｉＮＫＴ細胞アゴニスト、特にナノ粒子は、溶液中の同じアゴニストよりも約３から５倍強力である。従来技術のｍＲＮＡワクチン、特に未修飾のｍＲＮＡで構成される脂質ナノ粒子と比較して、本発明では、４〜５倍多い数の抗原特異的Ｔ細胞を得ることができる。ナノ粒子中のｉＮＫＴ細胞アゴニスト、特にα−ＧａｌＣｅｒ化合物、より具体的にはα−ＧａｌＣｅｒの濃度は、総脂質量の０．００１５ｍｏｌ％〜１ｍｏｌ％、特に０．００１５ｍｏｌ％〜０．５ｍｏｌ％、さらに特に０．００１５ｍｏｌ％〜０．２５ｍｏｌ％、さらにより特に０．００１５ｍｏｌ％〜０．１５ｍｏｌ％である。
「ｉＮＫＴ細胞を活性化する」または「ｉＮＫＴ免疫応答を誘導する」という句は同様の意味を持ち、サイトカイン産生の観察された誘導、例えば、α−ＧａｌＣｅｒ化合物による、ｉＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γなどの誘導を指す。ｉＮＫＴ細胞によるサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）産生の分析は、本明細書で提供される方法によって、またはαＧａｌＣｅｒもしくはＰＢＳ−５７などの誘導体を負荷したＣＤ１ｄテトラマーを使用するフローサイトメトリーによって、行うことができる。
【００５９】
組成物／製剤
本発明はさらに、本明細書で提供されるナノ粒子すなわちｍＲＮＡおよびｉＮＫＴ細胞アゴニストなどの遺伝物質を含むもの、ならびに１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤、担体および／または希釈剤を含む、医薬組成物、製剤または送達システムを提供する。
例えば、（医薬）組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤または付属成分を含んでよく、これは例えば、１つ以上の溶媒、分散媒体、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、および防腐剤などであるがこれらに限定されない。賦形剤、例えばワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香料、および芳香剤なども含まれ得る。薬学的に許容し得る賦形剤は当技術分野で周知である（例えば、Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照）。
【００６０】
薬学的に許容し得る賦形剤としては、固体（例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂）、ゲルまたは液体であり得る。経口および非経口投与用の液体賦形剤の適切な例には、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を、部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分別されたココナッツオイルおよび落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、賦形剤はまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであり得る。無菌液体賦形剤は、非経口投与用の無菌液体形態の組成物において有用である。無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、皮下、結節内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および筋肉内注射によって利用することができる。一態様において、組成物は凍結乾燥される。
【００６１】
医学的効果、すなわち特に免疫応答を支持するために、医薬組成物は、本発明の一態様において、同時または連続投与が考えられる場合さらなる活性化合物も含み得る。本発明による医薬組成物の治療効果が生じるのは、例えば、補体系の活性化を通じて、より良い作用を所望の副作用として有する特定の抗腫瘍薬によるか、または用量の減少によって、これらの医薬の副作用の数が低減することによる。したがって、本明細書に開示される使用および方法はまた、本明細書に記載のナノ粒子または組成物の、病状の処置のための１つ以上の追加の（治療）薬剤との使用を含み得る。一例において、前記治療剤は、化学療法剤、生物療法剤、免疫原性剤、免疫刺激性サイトカイン、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞から、選択される。有効成分の組み合わせは、以下のものであり得る：（１）本ナノ粒子自体に組み込まれる、例えばさらなるｍＲＮＡとして；（２）共製剤化され、併用製剤で同時に投与または送達される；（３）別々の製剤として（例えば、交互に、その後に、または並行して）送達される；または（３）当技術分野で知られている他の任意の併用療法レジメンによる。交互療法（alternation therapy）で送達される場合、本明細書に記載の方法は、例えば、別個の溶液、乳濁液、懸濁液、錠剤、丸薬またはカプセルで、または別個の注射器での異なる注射によって、有効成分を連続して投与または送達することを含み得る。一般に交互療法の間、各有効成分の有効投与量は順番に、すなわち連続して投与されるが、同時療法では、２つ以上の有効成分の有効投与量が一緒に投与される。間欠的併用療法の様々なシーケンスも使用することができる。場合によっては、本明細書に開示の化合物は、第２の治療薬と共に投与および／または製剤化される。
【００６２】
特定の態様において、第２の治療薬または薬剤は、化学療法剤または免疫療法剤のうちの１つ以上であり得る。本明細書に開示される併用療法で使用するための特定の免疫療法剤は、いわゆる「チェックポイント阻害剤」を含む。過去数年の間に、腫瘍溶解性ウイルスに基づく治療概念に加えて、免疫腫瘍学の分野はがんとの闘いにおいて貴重なアプローチになっている。治療的抗腫瘍免疫を活性化するための最新の有望なアプローチの１つは、免疫チェックポイントの遮断である。免疫チェックポイントとは、免疫系に物理的に組み込まれた多数の阻害経路を指し、これらは、側副組織の損傷を最小限に抑えるために、自己寛容を維持し、かつ末梢組織の生理学的免疫応答の持続時間と振幅を調整するのに重要である。腫瘍が、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして、特定の免疫チェックポイント経路を採用していることは今や明らかである。免疫チェックポイントの多くはリガンドと受容体の相互作用によって開始されるため、抗体によって容易にブロックされたり、組換え型のリガンドまたは受容体によって調節されたりする可能性がある。重要な免疫チェックポイント受容体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られている）であり、Ｔ細胞活性化の振幅を下方調節する。承認された抗ＣＴＬＡ４抗体は「イピリムマブ」という名前で知られており、Bristol Myers Squibb（BMS）から「Yervoy（登録商標）」のブランド名で販売されている。
【００６３】
もう１つの重要な免疫チェックポイント受容体はプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）であり、組織内のＴ細胞エフェクター機能を制限する。ヒト化モノクローナル抗体ペンブロリズマブ（Merck SharpDohme；MSDから販売されているMK-3575またはKeytruda（登録商標）としても知られている）は、標的ＰＤ−１に対するものである。別の抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブ；Bristol Myers Squibb；BMSが販売するオプジーボ（登録商標）である。したがって特定の態様において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤またはアンタゴニストであり、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する。さらなる態様において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４二重特異性分子である。かかる二重特異性分子は、消耗した耐性腫瘍浸潤リンパ球および他の細胞型の表面に存在するＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４分子に特異的に結合することができる。
【００６４】
特定の態様において、チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤、またはプログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）または（ＰＤ−Ｌ２）阻害剤である。用語「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、かかる細胞表面分子がそれらのそれぞれのリガンドに応答する能力を損なう、任意の化合物または生体分子を指し、例えば、がん細胞で発現したＰＤ−Ｌ１の、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫＴ細胞）で発現したＰＤ−１への結合をブロックする、および／またはがん細胞で発現したＰＤ−Ｌ２の、免疫細胞発現ＰＤ−１への結合をブロックする、化合物または分子である。ＰＤ−１およびそのリガンドの別名または同義語には、以下が挙げられる：ＰＤ−１については、ＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９、およびＳＬＥＢ２；ＰＤ−Ｌ１については、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４、およびＢ７−Ｈ；ＰＤ−Ｌ２については、ＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３。一態様において、ＰＤ−１阻害剤は、ヒトＰＤ−Ｌ１のヒトＰＤ−１への結合をブロックし、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２両方のヒトＰＤ−１への結合をブロックする。ヒトＰＤ−１アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子座番号：NP005009に見出すことができる。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２アミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ遺伝子座番号：NP054862およびNP079515に見出すことができる。
一態様において、前記阻害剤は、抗体およびその抗原結合断片を含む。代替として、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１（２）の結合部分またはアンタゴニストを使用することができ、これには、それぞれＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１（２）に特異的に結合する分子を含むさまざまな種類の分子が含まれる。かかるリガンドには、小分子、ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）または核酸（アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）などが含まれる。
【００６５】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、ヒト抗体、ならびに抗原結合抗体断片および抗原結合機能を有する分子を指す。より具体的には、「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖をジスルフィド結合によって連結された無傷の免疫グロブリンを含む。「抗体」という用語はまた、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１（２）結合抗体断片を含み、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、ミニボディ、ラクダ重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨまたはNanobody（登録商標））、新しい抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、および操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）である。また、抗体のような特性を持つペプチドや足場を使用することもでき、例えば、一本鎖逆平行コイル状タンパク質（アルファボディ）などである。活性断片は、多くの当技術分野で知られている技術によって抗体から誘導することができる。例えば精製されたモノクローナル抗体は、ペプシンなどの酵素で切断され、ＨＰＬＣゲル濾過にかけられる。次にＦａｂ断片を含む適切な画分を収集し、膜濾過などによって濃縮することができる。抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＰＤ−１抗体ならびにそれらを作製する方法は、当技術分野で知られている。
【００６６】
抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１（２）に特異的に結合することができる。かかる抗体は市販されているか、または当業者に一般に知られている方法によって生成することができる。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（Rocheが販売するTecentriq（登録商標））またはアベルマブ（Merckが販売するBavencio（登録商標））である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、その受容体ＰＤ−Ｌ１への結合および活性化をブロックし、それにより新生物に対するＴ細胞性免疫応答を増強し、慢性感染症におけるＴ細胞の不活性化を逆転させる可能性がある。ＰＤ−Ｌ１は、造血組織および実質組織で広く発現している。
【００６７】
医薬組成物は、活性化合物として有効量のナノ粒子および／またはその分散液を、薬学的に許容し得る助剤と共に含むことが重要である。用語「有効量」または「有効用量」は本明細書では互換的に使用され、疾患または病理学的変化に対して予防的または治療的に関連する作用を有する医薬活性化合物の量を示す。「予防作用」は、個々の類似物（individual representatives）の侵入後の病気の発生や病原体の感染さえも防ぎ、その後の蔓延を大幅に減らしたり、完全に非活性化したりする。「治療的に関連する作用」は、１つ以上の疾患症状から解放されるか、または疾患もしくは病理学的変化に関連するかまたは因果関係がある１つ以上の生理学的または生化学的パラメータの、正常な状態への部分的または完全な逆転をもたらす。本発明によるナノ粒子の投与のためのそれぞれの用量または用量範囲は、免疫応答の誘導の所望の予防的または治療的効果を達成するのに十分に大きい。さらにこの組成物は、一次または初期療法に加えて治癒的状況でその有効性を最大化するために与えられる「アジュバント療法」として、または疾患の制御および病気の再発の遅延を最大化するための、初期療法に続く「維持」または「統合」療法として使用することができる。
【００６８】
一般的には、投与量は、患者の年齢、体質、性別によって異なり、病気の重症度も考慮される。さらに、投与の特定の用量、頻度、および期間は多数の要因に依存し、例えば、ナノ粒子の標的化および結合能力、処置される個体の栄養習慣、投与の種類、排出速度および他の医薬との組み合わせなどである。個々の用量は、原発性疾患に関しても、任意の合併症の発生に関しても調整することができる。正確な用量は、当業者によって、既知の手段および方法を使用して確立することができる。本発明のこの教示は、それが適切であると思われる限り、ナノ粒子および／またはその分散液を含む医薬組成物に対して限定することなく有効であり、適用可能である。
【００６９】
用途
本発明は、本明細書で提供されるナノ粒子、組成物、または組み合わせの、初めてのおよびさらなる医学的使用を提供する。
本発明のナノ粒子、組成物および方法は、多くの障害を処置するための核酸、特にｍＲＮＡの送達を提供する。特に、本ナノ粒子および／またはナノ粒子分散液は、がん、感染症、腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、および慢性または急性の炎症過程の群から選択される疾患の、予防的または治療的処置に適している。
【００７０】
本明細書で使用される用語「感染症」は、病原性ウイルス、病原性細菌、真菌、原生動物、または多細胞寄生虫を含む病原性微生物因子の存在に起因する、あらゆる種類の臨床的に明らかな疾患を指す。
本発明はまた、免疫予防または免疫療法で使用するための、本発明によるナノ粒子および組成物に関する。本発明はさらに、免疫予防または免疫療法のためのワクチンの調製のための、本発明による有効量のナノ粒子の使用に関する。
一側面において、本発明は、本明細書で提供される腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡの送達によって、および本明細書に記載のナノ粒子を使用することによってがんに対する適応免疫応答を誘発する、（治療用）ワクチンの開発に関する。
【００７１】
開示された組成物および方法は、がんの処置、例えば、完全ながん寛解を含むがん増殖の阻害、がん転移の阻害、およびがん抵抗性の促進に特に有用である。本発明の文脈において「がん」という用語は、悪性腫瘍によって引き起こされるあらゆる種類の疾患を指す。「がん増殖」という用語は、一般に、がん内でのより発達した形態への変化を示唆する、いくつかの指標のいずれかを指す。したがって、がん増殖の阻害を測定するための指標には、がん細胞の生存の減少、腫瘍の体積または形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像化法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延過敏性皮膚検査のパフォーマンスの改善、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性の増加、および腫瘍特異的抗原レベルの低下が含まれるが、これらに限定されない。「がん耐性」という用語は、がん増殖、特にすでに有しているがんの増殖に抵抗する、対象の改善された能力を指す。言い換えれば、「がん耐性」という用語は、対象におけるがん増殖の傾向の低下を指す。
【００７２】
一側面において、がんは、固形腫瘍、例えば癌腫および肉腫を含む。癌腫には上皮細胞に由来する悪性新生物が含まれ、これは例えば、周囲の組織に侵入するなど浸潤し、転移を引き起こす。腺癌は、腺組織、または認識可能な腺構造を形成する組織に由来する癌腫である。がんの別の広いカテゴリーには、肉腫および線維肉腫が含まれ、これらは、その細胞が胚性結合組織などの線維性または均質な物質に埋め込まれている腫瘍である。
【００７３】
本発明はさらに、がんを有する対象における腫瘍増殖、がん細胞浸潤または転移を、本発明のナノ粒子または組成物を、がんを有する対象に投与することにより、減少または阻害する方法を提供し、ここでナノ粒子は、対象における腫瘍増殖、がん細胞浸潤または転移を減少させるのに十分な量で投与される。特定の態様において、がん細胞は、乳がん細胞、結腸がん細胞、腎臓がん細胞、肺がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、直腸がん細胞、胃がん細胞、甲状腺がん細胞、および子宮がん細胞からなる群から選択される。
さらなる態様において、本発明の方法は、対象のリンパ節における転移性がんの処置を含み、ここでナノ粒子または組成物は、転移性がんを有する対象のリンパ節に投与される。
【００７４】
さらなる側面において、ナノ粒子または組成物は、抗原提示細胞、好ましくは脾臓および肺における抗原提示細胞に抗原を送達および／または発現するための方法、および／または、対象における免疫応答、好ましくはがんに対する免疫応答を誘導するための方法において使用することができ、前記方法は、本発明によるナノ粒子または組成物を対象に投与することを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」は、抗原をＴ細胞に提示するように誘導され得る任意の細胞を意味すると解釈され、抗原提示細胞に分化および活性化され得る前駆細胞も含まれる。抗原提示細胞には、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、または他の活性化または修飾細胞タイプ、例えばＭＨＣ分子をその細胞表面に発現する上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが含まれ、好ましくは樹状細胞、特にリンパ節の樹状細胞が含まれる。抗原提示細胞の前駆体には、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞、および内皮細胞が含まれる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明の組成物および方法が投与されるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、本明細書ではヒト対象に関して交換可能に使用される。
【００７５】
投与
投与経路の１つは静脈内投与である。さらに、ナノ粒子またはナノ粒子を含む組成物は、任意の標準的な投与経路、例えば経口、直腸、膣、経粘膜、気管内または吸入を含む肺、または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射、および髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経口送達を使用して、患者に送達され得る。
特定の態様において、投与は、静脈内（ボーラスまたは注入）もしくは腹腔内注射によるか、または吸入もしくは気管内もしくは鼻腔内投与による。
【００７６】
代替的に、本発明の組成物は全身的よりむしろ局所的に、例えば、標的組織または腫瘍に直接、例えば徐放性製剤で医薬組成物を注射することにより、投与することができる。局所送達は、標的となる組織に応じて、さまざまな方法で影響を受ける可能性がある。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは、吸入することができる（鼻、気管、または気管支送達のため）；本発明の組成物は、例えば損傷、疾患の発現、または痛みの部位に注射することができる；組成物は、経口、気管、または食道適用のためにトローチで提供することができる；胃または腸に投与するために液体、錠剤またはカプセルの形態で供給することができ、直腸または膣に適用するために坐剤の形態で供給することができる；または、クリーム、点滴薬、もしくは注射を使用して目に送達することもできる。本発明の組成物を、治療用分子またはリガンドと複合体形成して含む製剤は、例えば、組成物を移植部位から周囲の細胞に拡散可能なポリマーまたは他の構造もしくは物質と会合させて、外科的に投与することさえできる。代替的に、ポリマーや支持体を使用せず外科的に適用することもできる。
【００７７】
投与は単回投与の形態をとることができ、または本明細書に開示の組成物は、分割用量または連続放出製剤または投与方法（例えば、ポンプ）のいずれかで、ある期間にわたって投与することができる。投与される組成物の量および選択される投与経路は、病状の効果的な処置を可能にするように選択されるべきである。一態様において、本発明のナノ粒子または組成物は、対象に１日１回、１日２回、毎日または隔日で投与される。好ましい態様において、本発明の組成物は対象に、週に２回、週に１回、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、またはより具体的には４週間ごと、月に１回、６週間ごと、８週間ごと、隔月、３か月ごと、４か月ごと、６か月ごと、８か月ごと、９か月ごとに、または毎年、投与される。
【００７８】
本発明の組み合わせまたは組成物は、疾患の処置、改善、リスクの低減、または予防のための単剤療法に使用することができる。代替的に、組み合わせまたは組成物は、疾患の処置、改善、リスクの低減、または予防のために使用され得る既知の治療法の補助として、またはそれらと組み合わせて、使用され得る。
本明細書に記載のすべての特徴（付随する特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法またはプロセスのすべてのステップは、上記側面のいずれかと任意の組み合わせで組み合わせることができ、ただし、かかる特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である場合を除く。本発明を、以下の図、表、および実施例によってさらに説明するが、これらは、特許請求の範囲で定義される保護の範囲を制限することを意図するものではない。
【００７９】
例
材料および方法
細胞培養およびマウス
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）をEnvigo（Gannat、France）から購入し、ＳＰＦ施設に収容した。すべての動物実験はベルギーの法律の規制に従って実施し、地元の倫理委員会によって承認された。初代マウス骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）培養物は、Verbeke et al. (2017)に記載のように生成した。
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−ＯＶＡ（K. Rock、University of Massachusetts Medical Centerの好意による提供）およびＴ細胞リンパ腫Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（American Type Culture Collection, Rockville, MD, USAから入手）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍｍのＬ−グルタミンおよび０．４ｍｇ ｍｌの選択剤Ｇ４１８（Thermo-Scientific, Aalst, Belgium）を添加したRPMI 1640培地（Sigma-Aldrich, Diegem, Belgium）中、加湿５％ＣＯ２雰囲気３７℃で培養した。
【００８０】
ｍＲＮＡ構築物
未修飾およびホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）をコードするヌクレオシド修飾（５ｍｅＣ、Y）ｍＲＮＡ、およびｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡは、TriLink（San Diego, CA）から購入した。免疫化研究では、不変鎖（Ｉｉ８０）の最初の８０アミノ酸に融合した切断型の卵白アルブミン（ｔＯＶＡ）を、ｐＧＥＭ−Ｉｉ８０ｔＯＶＡプラスミドからのin vitroのｍＲＮＡ転写によって生成した［２４］。プラスミドは、QIAquickＰＣＲ精製キット（Qiagen, Venlo, The Netherlands）を使用して精製し、ＳｐｅＩ制限酵素（Promega, Leiden, The Netherlands）を使用して線形化した。線形化されたプラスミドは、Anti-Reverse Cap Analog（ＡＲＣＡ）およびポリ（Ａ）テーリング試薬（Ambion, Life Technologies, Ghent, Belgium）を含むT7 MegaScriptキットを使用したin vitro転写反応のテンプレートとして使用した。修飾ｍＲＮＡの転写のために、シチジンおよびウリジンヌクレオチドを、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジン（TriLink）に１００％置き換えた。得られたｍＲＮＡをＤＮａｓｅＩ消化により精製し、ＬｉＣｌで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。ｍＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。ｍＲＮＡは、１μｇ／μｌの濃度で−８０℃で少量ずつ保存した。マウスチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）をコードするｍＲＮＡは、Karine Breckpot教授およびKris Thielemans教授の好意により提供された。ＴＲＰ−２は、Ｂ１６黒色腫細胞によって発現される腫瘍関連抗原として知られている［３４］。
【００８１】
ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の調製
ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）およびコレステロールは、Avanti Polar Lipids（Alabaster, USA）から購入した。アルファ−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、ナフチル尿素−α−ＧａｌＣｅｒ（ＮＵ−α−ＧａｌＣｅｒ）、アルファ−ＧａｌＣｅｒ−６”−（４−ピリジル）カルバメート（Ｐｙｒ−α−ＧａｌＣｅｒ）、（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−テトラコサノイル−２−アミノ−１，３，４−ノナントリオール）（ＯＣＨ）およびＦＩＴＣ標識α−ＧａｌＣｅｒは、S. Van Calenbergh（Ghent University, Ghent, Belgium）から提供された。ＤＯＴＡＰ−コレステロール（２：３モル比）のカチオン性リポソームは、クロロホルムに溶解した適切な量の脂質を丸底フラスコに移すことによって調製した。α−ＧａｌＣｅｒを配合したリポソームの場合、全脂質量の０．５、０．１５、０．０１５または０．００１５ｍｏｌ％を、α−ＧａｌＣｅｒまたは提供された類似体に置き換えた。クロロホルムを窒素下で蒸発させた後、脂質膜をＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、Sigma-Aldrich）で再水和して、１２．５μｍｏｌ／ｍｌの最終脂質濃度を得た。得られたカチオン性リポソームを、分散液が透明になるまでバスソニケーター（Branson Ultrasonics, Dansbury, USA）で超音波処理した。次にこれをｍＲＮＡと混合して、カチオン性脂質対ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比３でｍＲＮＡナノ粒子を取得した。in vivoで使用するｍＲＮＡナノ粒子は、５％グルコースを含む等張ＨＥＰＥＳバッファー（Sigma-Aldrich）中で調製した。
【００８２】
「イオン化可能な」アミノ脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡで構成されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、前述のようにR. van der Meelの研究室で調製された［３１］。簡単に説明すると、適切な脂質（Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびα−ＧａｌＣｅｒ）をエタノールに溶解して、最終濃度を１０ｍＭの総脂質にした。ｍＲＮＡカーゴを２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４のバッファーに溶解した。次に２つの溶液を、Ｔ−ジャンクションミキサー［３２］を使用して、カチオン性（アミノ）脂質対ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比３で混合した（水溶液（ｍＲＮＡ）と有機溶液（脂質）の流量比３：１）。得られた混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して一晩透析し、最後に０．２２μｍフィルターに通した。ｍＲＮＡ ＬＮＰの総ｍＲＮＡ量を、Quant-iT（商標）RiboGreen（商標）ＲＮＡアッセイキット（Thermo-Scientific）を使用して測定し、マウス研究のｍＲＮＡ ＬＮＰ用量を算出した。１つのＬＮＰ製剤では、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡとｔＯＶＡＩ８０ ｍＲＮＡの両方（５０：５０）が組み合わされた。
【００８３】
ｍＲＮＡリポプレックスの物理化学的特性
異なるＮ／Ｐ比でＨＥＰＥＳバッファー中に調製されたｍＲＮＡナノ粒子を、Malvern Zetasizer nano-ZS（Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK）を使用して、サイズおよびゼータ電位の品質管理に供した。ｍＲＮＡのリポソームへの複合体形成および血清含有培地におけるこの相互作用の安定性を調べるために、ｍＲＮＡナノ粒子を希釈し、５０％ＦＣＩ血清または５０％ヒト血清中でインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション後、Ambionローディングバッファー（Ambion）を添加し、混合物をＴＢＥバッファー中の１％アガロースゲルに負荷し、それにGelRed（Biotium, Hayward, CA)）を添加してｍＲＮＡを可視化した。ゲルを１００Ｖで３０分間泳動し、ＵＶ光下で画像化した。ｍＲＮＡのみ（パッケージ化されていない、すなわち「裸の」と呼ばれる）、血清のみ、または血清と裸のｍＲＮＡとを含む試料を、対照として実行した。ＲＮＡのサイズ決定を提供するために、０．２５から１０ｋｂの範囲のバンドを有する分子量マーカーも含まれていた（Promega, Leiden, The Netherlands）。
【００８４】
血清中のｍＲＮＡナノ粒子のコロイド安定性を予測するために、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡを含有するナノ粒子を、９０％ヒト血清中３７℃で２４時間までインキュベートした。続いてそれらのサイズ分布を、蛍光単一粒子追跡（ｆＳＰＴ）顕微鏡法によって評価した。ｆＳＰＴを使用すると、体液中の蛍光標識ナノ粒子の拡散をモニタリングできる［２５］。個々に動く粒子の高速共焦点動画を記録することにより、単一粒子の運動軌跡を視覚化し、それらのサイズ分布を計算することができる。ｍＲＮＡナノ粒子のｆＳＰＴ測定は次のように実行した。まず、２０μｌのＣｙ５標識ｍＲＮＡナノ粒子をヒト血清（１：２５）で希釈し、３７℃で２時間、６時間、または２４時間インキュベートした後、５μｌを４５μｌのヒト血清に添加した。次に、試料を黒色コーティングされた９６ウェルプレートに移し、Plan Apo ６０ｘの１．０ＮＡ油浸対物レンズ（Nikon）および高速・高感度のＥＭＣＣＤカメラ（Ixon Ultra 897；Andor Technology, CT, USA）を備えた掃引フィールド共焦点顕微鏡（LiveScan Swept Field Confocal Microscope System；Nikon, Brussels, Belgium）に配置した。顕微鏡はウェルプレートの底から２０μｍ上に焦点を合わせ、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡナノ粒子をソリッドステート１２５ｍＷ ６４０ｎｍ（Agilent Technologies, CA, USA）レーザーで励起した。試料ごとに、試料内のさまざまなランダムな場所で、それぞれ約１００フレームの２０本のムービーを記録した。
【００８５】
ｍＲＮＡトランスフェクション、α−ＧａｌＣｅｒ送達およびα−ＧａｌＣｅｒ提示のＢＭ−ＤＣによるin vitro評価
in vitro実験を、細胞培養６日目にＢＭ−ＤＣで行った。トランスフェクションの前日、細胞を２４ウェルプレートにウェルあたり５×１０５細胞で播種し、５％ＦＣＩ血清を含む細胞培養培地で増殖させた。ｍＲＮＡリポプレックスのトランスフェクション効率は、ｅＧＦＰレポーターｍＲＮＡを使用して評価した。OptiMem（登録商標）でトランスフェクションを行うために、細胞培養培地を除去し、OptiMem（登録商標）に分散されたｅＧＦＰ ｍＲＮＡリポプレックスを細胞に添加し（５×１０５細胞あたり１μｇのｍＲＮＡ）、２時間のインキュベーション後、細胞を、５％ＦＣＩ血清を含む培養培地で再度培養した。α−ＧａｌＣｅｒを送達するために、０．５ｍｏｌ％のα−ＧａｌＣｅｒを含むｍＲＮＡナノ粒子を完全細胞培養培地中の細胞に直接添加した（５×１０５細胞あたり１μｇのｍＲＮＡ）。α−ＧａｌＣｅｒの細胞取り込みは、共有結合したＦＩＴＣ色素（S. Van Calenberghからの提供）で標識されたα−ＧａｌＣｅｒを使用して評価した。細胞表面ＣＤ１ｄ複合体におけるα−ＧａｌＣｅｒの提示を評価するために、ＢＭ−ＤＣ細胞を、α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄ複合体に特異的なモノクローナル抗体（クローンL363、eBioscience）で表面染色した。フロー分析を、ｍＲＮＡナノ粒子（ｆＬｕｃ ｍＲＮＡ）を添加して２４時間後に行った。細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、固定可能な生存性色素eFluor（登録商標）450（eBioscience）で製造元の指示に従って染色し、Ｆｃブロック（ＣＤ１６／３２）とインキュベートして非特異的ＦｃＲ結合をブロックし（BD Biosciences, Erembodegem, Belgium）、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ（clone N418）およびα−ＧａｌＣｅｒ：ＣＤ１ｄ複合体−ＰＥで４℃で３０分間表面染色した。マウスＩｇＧ２ａカッパＰＥ抗体は、α−ＧａｌＣｅｒ：ＣＤ１ｄの提示のためのアイソタイプ対照として使用した。追加の洗浄ステップの後、CytoFLEX（Beckman Coulter, Krefeld、Germany）を使用したフローサイトメトリーによって細胞を分析し、FlowJoソフトウェア（FlowJo, OR, USA）を使用して分析を実行した。細胞の共焦点顕微鏡画像は、Plan Apo ６０ｘの１．０ＮＡ油浸対物レンズ（Nikon）を備えた電動Nikon TE2000-E倒立顕微鏡（Nikon Benelux, Brussels, Belgium）に取り付けられたNikon C1si共焦点レーザー走査モジュールを使用して記録した。
【００８６】
ｍＲＮＡナノ粒子および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与
マウスは、酸素中に３％イソフルランを含む換気された麻酔チャンバー内で麻酔した。注射の前に、滅菌０．９％ＮａＣｌ溶液を含むポリエチレンチューブ（Intramedic PE10, BD）のカテーテルを尾静脈に挿入した。正しく配置した後、滅菌５％グルコースＨＥＰＥＳバッファーに希釈した指定のカーゴを含むナノ粒子をゆっくりと注入した（マウスあたり、１０μｇのｍＲＮＡを含有する２００μｌ）。ナノ粒子にカプセル化したα−ＧａｌＣｅｒの最適化用量は、サイトカイン産生とｉＮＫＴ活性化に基づいて決定され、マウスあたり２０ｎｇ（０，０１５ｍｏｌ％）であった。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（10F.9G2, Bio X cell, West Lebanon, USA）またはラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体（LTF-2, Bio X cell）を１００μｇの用量で腹腔内投与し、これはｍＲＮＡナノ粒子の投与直後に注射した。
【００８７】
生物発光イメージング
ｆＬｕｃ ｍＲＮＡを含有するナノ粒子投与（静脈内、腹腔内、鼻腔内または脊髄内）の６時間後、マウスに麻酔し、腹部と胸部を脱毛クリームで脱毛した。続いてVivoGlo（商標）ルシフェリン（Promega）をマウス１匹あたり１００μｌ（３３ｍｇ／ｍｌ）の容量で腹腔内投与した。５〜１０分後、生物発光画像をIVIS lumina IIシステム（PerkinElmer, Waltham, MA）で取得した。
【００８８】
治療用ワクチン接種実験
ｍＲＮＡナノ粒子（異なるカーゴを含むか、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたもの）の治療可能性を、担がんマウスに治療ワクチン接種を行うことによって評価した。このため、Ｃ５７ＢＬ／６に、×１０５のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ、Ｂ１６−ＯＶＡまたはＢ１６Ｆ０腫瘍細胞（ＰＢＳに懸濁）の脇腹への皮下注射を行った。腫瘍接種の８日後、病変が触知可能になったとき、マウスを腫瘍体積に基づいて異なる治療群にランダム化し、ｍＲＮＡナノ粒子を静脈内経路でワクチン接種した。いくつかの実験では、動物に２回目と３回目の治療ワクチン接種を行った。腫瘍の増殖は、デジタルノギスを使用して1日おきまたは２日ごとに測定した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３（Ｂ１６−ＯＶＡ、Ｂ１６Ｆ０）または１５００ｍｍ３（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）を超えたとき、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。
【００８９】
単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析
免疫後の異なる時点でマウスを犠牲にし、脾臓、肺、肝臓、または腫瘍を採取し、［１８］に記載されているように単一細胞懸濁液へと処理した。単一細胞懸濁液は、固定可能な生存性色素eFluor（登録商標）450（Thermo Scientific）またはZombie Yellow（商標）（Biolegend, San Diego, CA）のいずれかで製造元の指示に従って染色して死細胞を分析から除外し、Ｆｃブロック（ＣＤ１６／３２）でインキュベートして非特異的ＦｃＲ結合をブロックし（BD Biosciences, Erembodegem, Belgium）、示された抗体で４℃で３０分間、表面染色した（すべてThermo-Scientific）。追加の洗浄ステップの後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。スペクトルオーバーラップの補正は、個々の蛍光色素結合抗体で染色したUltraComp eBeads（商標）補正ビーズ（Thermo-Scientific）を使用して計算した。
【００９０】
脾臓におけるＣＤ１１ｃ−（ＡＰＣまたはＦＩＴＣ）陽性のＤＣの活性化状態を、共刺激分子ＣＤ４０−ＦＩＴＣ（ＨＭ４０−３）、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（ＣＬ１）、ＣＤ８０−ＰＥ／Ｃｙ７（１６−１０Ａ１）、および阻害分子PD-L1-Super Bright 436（ＭＩＨ５）の上方制御を測定することにより、分析した。Ｔ細胞は、ＣＤ３ｅ−ＰＥ（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ−（ＡＰＣまたはＡＦ４８８）（５３−６．７）、およびＰＤ−１−（ｅｆｌ４５０またはＦＩＴＣ）（ＲＭＰ１−３０）などのモノクローナル抗体で染色した。ＯＶＡ選択的Ｔ細胞を染色するために、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のTetramer Core Facilityから入手したＢＶ４５０結合Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー（ＯＶＡ−テトラマー）を使用した。ｉＮＫＴ細胞は、ＮＩＨのTetramer Core Facilityから入手したＴＣＲβ−ＡＰＣ（Ｈ５７−５９７）、ＰＤ１−ｅｆｌ４５０、およびｍＣＤ１ｄ ＰＢＳ−５７ＰＥテトラマーで染色した。ＮＫ細胞は、ＣＤ３ｅ−ＰＥ（ネガティブゲーティング）およびＮＫ１．１−ＡＰＣ（ＰＫ１３６）染色を使用して検出した。さらに、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ／Dazzle（商標）594（Biolegend）、ＭＨＣ−ＩＩ−ｅｆｌ４５０（Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｆ４／８０−（ＦＩＴＣまたはＡＦ７００）（６Ｆ１２）、Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ−ＦＩＴＣ（ＲＢ６−８Ｃ５）およびＣＤ２０６−ＡＰＣ（Ｃ０６８Ｃ２）などの抗体で染色した。ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）および腫瘍細胞（ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５陰性細胞）は、ＰＤ−Ｌ１の発現について評価した。
【００９１】
サイトカイン測定およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性
血清をｍＲＮＡナノ粒子の静脈内投与の６時間後に採取し、試料を−８０℃で保存した。Mouse Platinium IFN alpha ＥＬＩＳＡキット、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキット（Ready-SET-Go!（登録商標））はThermo-Scientificから購入した。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦを含む１３の他のサイトカインのパネルは、マルチプレックスアッセイ（LEGENDplex（商標）Mouse Inflammation Panel, Biolegend）を使用して定量化し、ＡＬＴ酵素活性は、比色分析キット（MaxDiscovery（商標）、Bioo Scientific Corporation, Austin, USA）を使用して測定した。すべてのアッセイは、製造元の指示に従って実行した。
【００９２】
統計分析
すべてのデータは平均±標準偏差で表される。提示されたin vitro実験のデータは、３つの異なる日に行われた少なくとも３回の独立した実験の代表である。in vivo実験には、単一のグラフにマージされた少なくとも２つの実験のデータが含まれており、これは図のキャプションに明示的に記載されている。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定（GraphPad Prism6, La Jolla, CA, USA）を使用して行った。アスタリスクは統計的有意性を示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。生存はカプランマイヤープロットで視覚化した。生存率の違いは、ログランク（マンテル−コックス）検定により分析した。
【００９３】
結果
１．ｍＲＮＡガルソームは古典的アジュバントと組み合わせたｍＲＮＡナノ粒子より優れた治療効果を有する。
我々は以前の研究［１８］において、ＴＬＲアゴニスト（ＭＰＬＡ）とヌクレオシド修飾ｍＲＮＡリポプレックスを同時送達することが可能であり、生得免疫活性化の促進に使用できることを示した。しかし、例えばがんなどにおける治療用途について、図１は、比較的高用量のＭＰＬＡ（マウスあたり２μｇ）を含むｍＲＮＡナノ粒子で得られた免疫応答が免疫寛容を破れず、確立されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍において腫瘍増殖を阻害できなかったことを示している。際立って対照的に、本明細書では「ｍＲＮＡガルソーム」と呼ばれる、ｉＮＫＴアゴニストα−ＧａｌＣｅｒを含むｍＲＮＡナノ粒子の投与が、腫瘍退縮を達成するのに効果的であることが見出された。興味深いことに、α−ＧａｌＣｅｒを使用したこれらの結果は、ＭＰＬＡを使用したｍＲＮＡナノ粒子（マウスあたり２μｇのＭＰＬＡ）に使用されたものよりも１００倍低い用量のアジュバント（マウスあたり０．０２０μｇのα−ＧａｌＣｅｒ）で得られた。
【００９４】
２．血清中のｍＲＮＡナノ粒子の物理化学的特性と安定性
異なる脂質組成のｍＲＮＡナノ粒子を初めに評価した。ｍＲＮＡナノ粒子は以下から構成されていた：カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロリド）またはＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、およびヘルパー脂質、すなわちＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）またはコレステロールのいずれか。リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ ｍＲＮＡナノ粒子は、（Broos etal., 2016）に記載されているように調製した。
興味深いことに、ＤＯＴＡＰ−コレステロールｍＲＮＡナノ粒子は、広く報告されているＤＯＴＡＰ−ＤＯＰＥ ｍＲＮＡナノ粒子、または市販のトランスフェクションリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸよりも、マウス骨髄由来（ＢＭ）−ＤＣのトランスフェクションに優れていることが見出された。図２は、血清への曝露後、ＤＯＴＡＰ−ＤＯＰＥ ｍＲＮＡナノ粒子が（ほぼ）（ＢＭ）−ＤＣのトランスフェクションに失敗したが、ＤＯＴＡＰ−コレステロールｍＲＮＡナノ粒子は成功し、in vivoでの使用により適していることを示す。
【００９５】
ＤＯＴＡＰ−コレステロールｍＲＮＡナノ粒子の血清中（in vitro）の挙動に焦点を当てた。完全なｍＲＮＡ複合体形成と酵素分解に対するｍＲＮＡの保護を保証するために、さまざまなＮ／Ｐ比（すなわち「電荷比」）を持つｍＲＮＡナノ粒子を調査した。ＤＯＴＡＰ−コレステロール／ｍＲＮＡナノ粒子のゲル電気泳動実験（結果は示されていない）から、ｍＲＮＡの完全な複合体形成は２．５：１のＮ／Ｐ比から開始したと結論づけることができる。したがって、Ｎ／Ｐ２．５：１のｍＲＮＡナノ粒子を、さらなる実験のために選択した。この電荷比において、ナノ粒子の平均サイズは１６０ｎｍ、ゼータ電位は＋５０ｍＶであった（図３Ａ）。
【００９６】
in vivoでのｍＲＮＡナノ粒子の安定性を予測し、複合体の非経口注射時のｍＲＮＡの早期放出を回避するために、ｍＲＮＡナノ粒子を、ヒト血清中３７℃で２時間インキュベートした。蛍光ゆらぎ分光法（ＦＦＳ）を実施して、血清中のＤＯＴＡＰ−コレステロール製剤に対するｍＲＮＡ複合体形成の定量的情報を可能にした。簡単に言えば、この技術は、少量の蛍光分子の蛍光強度の変動をモニタリングする。これらの蛍光変動は、励起容積の内外への蛍光分子の拡散によるものである。この技術により、蛍光強度に基づいて、遊離蛍光ｍＲＮＡ（Ｃｙ５標識）をリポソームに関連する蛍光ｍＲＮＡから区別することができる。この実験は、血清中での２時間のインキュベーション後にＤＯＴＡＰ−コレステロールリポプレックスについて、８６±９％のＣｙ５修飾ｍＲＮＡの複合体形成効率を示した。
続いて、血清中のｍＲＮＡリポプレックス凝集の程度を、蛍光単一粒子追跡（ｆＳＰＴ）を使用して測定した。図３Ｂは、ｍＲＮＡナノ粒子が初期サイズを保持し、血清含有培地で凝集しないことを明確に示している。興味深いことに、これは、ナノ粒子の凝集を防ぐために通常使用されるペグ化脂質を含めることが、このリポソーム製剤では冗長であることを示す。
【００９７】
３．ｍＲＮＡガルソーム：ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの送達剤としてのＤＯＴＡＰ−コレステロールリポソーム
ナノ粒子カーゴであるｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの両方が、その細胞内送達に関して異なる要件を持っていることに注意することが重要である。ｍＲＮＡはエンドソームから急速に漏れ出し、適切な抗原産生を可能にするはずである。対照的に、α−ＧａｌＣｅｒはＤＣの後期エンドソームおよびリソソームに蓄積する必要があり、そこでＣＤ１ｄ分子に負荷され、ｉＮＫＴ細胞に提示される。そのため、最初に、担体系としてＤＯＴＡＰ−コレステロールリポソームを使用して、ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの両方の送達効率を推定し、ｍＲＮＡ翻訳とα−ＧａｌＣｅｒ提示プロセスの間の適合性を評価した。
【００９８】
α−ＧａｌＣｅｒの送達を評価するために、骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）を、遊離α−ＧａｌＣｅｒまたはｍＲＮＡガルソーム（等用量のα−ＧａｌＣｅｒを含む）のいずれかを用いてインキュベートした。ＦＩＴＣ標識α−ＧａｌＣｅｒを使用した場合、α−ＧａｌＣｅｒの細胞内送達がｍＲＮＡガルソームを介した送達によって２倍になることは明らかであった（図４Ａ）。これは、ＣＤ１ｄでのα−ＧａｌＣｅｒの提示の強化にも変換された；可溶性α−ＧａｌＣｅｒフォーマットと比較して、ＣＤ１ｄ複合体を介したα−ＧａｌＣｅｒの提示が約３倍増加することが観察された（図４Ｂ）。ＢＭ−ＤＣを脾細胞と一緒に培養した場合、ｍＲＮＡガルソームで処理した細胞との共培養で４〜５倍高いＩＦＮ−γの産生を実証することができた。興味深いことに、同様の効果が、ナノ粒子内に異なるα−ＧａｌＣｅｒ類似体がパッケージされた場合にも観察された（図４Ｃ）。
【００９９】
in vivoで免疫応答を開始するｍＲＮＡガルソームの効力を決定するために、１０μｇのｍＲＮＡの固定用量およびα−ＧａｌＣｅｒの減少用量を含むｍＲＮＡガルソームをマウスに静脈内注射して、用量反応研究を行った（図４Ｄ）。注射の１２時間後、ｉＮＫＴ細胞の活性化は、血清中のＩＦＮ−γの産生によって間接的に測定した。マウスに日常的に全身投与されるα−ＧａｌＣｅｒの量に相当する用量である１．４μｇのα−ＧａｌＣｅｒを含むｍＲＮＡガルソームを注射すると、血清中で最大２５．０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γレベルが検出された［２６］。これは、ｍＲＮＡガルソームが免疫を誘導するのに非常に強力であることを示すが、これはすべての動物において脾腫と一致していた。ただしＩＦＮ−γのレベルは、α−ＧａｌＣｅｒの用量調整によって簡単に改善できた。重要なことに、マウスあたり２０ｎｇのα−ＧａｌＣｅｒ（またはナノ粒子内の脂質の総量の０．０１５ｍｏｌ％）までの大幅に低い用量を使用した場合でも、高レベルのＩＦＮ−γ（〜４０００ｐｇ／ｍｌ）が得られ、しかし急性毒性の兆候はなかった。したがって、さらなる実験のために、２０ｎｇのα−ＧａｌＣｅｒをパッケージ化したｍＲＮＡガルソームを使用した。
【０１００】
ｍＲＮＡを他のアジュバントと組み合わせた以前の試みでは、ＤＣ成熟は細胞取り込みメカニズム（例えばマクロピノサイトーシス）を早期に無効にしたり、抗ＲＮＡ防御メカニズム（Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達など）を誘発してｍＲＮＡの分解を早める可能性があったりするため、互換性の問題が発生した［１９、２７］。これらの理由から、α−ＧａｌＣｅｒの包含のｍＲＮＡ翻訳に対する影響を調査した。さまざまなカーゴをカプセル化したナノ粒子を、マウスに静脈内注射した：ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡのみ、α−ＧａｌＣｅｒと組み合わせたヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、またはホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）をコードする非修飾ｍＲＮＡ（免疫原性）など。生物発光は６時間後に評価した。図５Ａ〜Ｂは、α−ＧａｌＣｅｒの取り込みが、肺および脾臓でのｍＲＮＡの翻訳を妨害しなかったことを示している。予想通り、未修飾のｆＬｕｃ ｍＲＮＡナノ粒子は有意に低い発現レベルを示し、これは、細胞内の安定性が低いこと、および、分解してｍＲＮＡの翻訳を回避するようにプログラムされたＩ型ＩＦＮ媒介性抗ウイルス経路に起因する［２７］。本発明のナノ粒子は、腹腔内、鼻腔内、または気管内投与などの他の投与経路を介したｍＲＮＡの送達にも使用できることに留意されたい（図６）。総合すると、これらの結果は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの同時パッケージングが、ｍＲＮＡ発現レベルに影響を与えることなく、α−ＧａｌＣｅｒの送達と提示を改善することを示している。
【０１０１】
４．ｍＲＮＡガルソームは強力なアジュバント効果を媒介し、樹状細胞をin vivoで活性化する
α−ＧａｌＣｅｒによる免疫活性化は間接的現象である：ＣＤ１ｄにα−ＧａｌＣｅｒを提示するＤＣはｉＮＫＴ細胞を刺激し、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用によってＤＣの表現型の成熟を引き起こす。これがｍＲＮＡガルソームにも当てはまるかどうかを評価するために、特に低用量（２０ｎｇ）のα−ＧａｌＣｅｒを使用して、粒子注入の２４時間後の脾臓ＤＣの成熟状態を調査した（図７Ａ〜Ｂ）。未処置のマウスと比較して、脾臓ＤＣ上の活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の強力かつ有意な上方制御が観察できた。重要なことに、ＤＣ成熟は、ｍＲＮＡガルソームをｉＮＫＴ細胞の非存在下でＢＭ−ＤＣ培養物に添加した場合には観察されず、これは、この成熟効果がｉＮＫＴ細胞とのライゲーションによって媒介されたことを示している。
【０１０２】
免疫応答の幅を調査するために、炎症性サイトカインの広範なスクリーニングをワクチン接種の６時間後に動物の血液で実施した（図８）。予想通り、未修飾のｍＲＮＡナノ粒子がＩＦＮ−αの強力な放出を誘導した場合、これはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡナノ粒子（α−ＧａｌＣｅｒの有無にかかわらず）には当てはまらなかった。対照的に、ｍＲＮＡガルソームはＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の顕著な産生を誘導した。さらに、ｍＲＮＡガルソームを投与された群では、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２７などのＴ細胞刺激サイトカインの存在、およびＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１７ａのレベルの上昇も検出することができた。重要なことには、この広範囲のサイトカインは目に見える毒性症状を誘発せず、肺、脾臓、および肝臓のＨ＆Ｅ染色臓器切片で病理学的変化は確認されず、ＡＬＴ活性の正常レベルが測定された。
【０１０３】
５．免疫の多能性誘導物質としてのｍＲＮＡガルソーム
強力なＤＣ成熟と組み合わされたｍＲＮＡ発現レベルの増加、およびＩＬ−１２ｐ７０などのＣＴＬ誘導サイトカインの産生は、ｍＲＮＡガルソームがＩ型ＩＦＮ依存性ｍＲＮＡワクチンと競合するという可能性を期待させる。Ｔ細胞媒介性免疫に加えて、α−ＧａｌＣｅｒとの組み合わせは、ｉＮＫＴ細胞とＮＫ細胞の両方を活性化して、より広く潜在的に相乗的な抗腫瘍免疫を形成するという利点も提供する。
【０１０４】
これら複数のエフェクター応答を評価するために、動物を、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）をモデル抗原としてコードするｍＲＮＡで免疫化した。免疫化の６日後、ＯＶＡ特異的ＣＴＬの細胞数を単離された脾臓で測定した（図９）。興味深いことに、ｍＲＮＡガルソームは、「ゴールデンスタンダード」の未修飾ＯＶＡ ｍＲＮＡナノ粒子で処置されたマウスと比較して４〜５倍高いレベルのＯＶＡ特異的ＣＴＬを生成することが観察された。
ｉＮＫＴ細胞の増殖および下流のＮＫ細胞応答を評価するために、脾臓と肝臓をワクチン接種の３日後に単離した。サイトカイン応答に対応して（図８）、ｉＮＫＴ細胞の増殖が脾臓で０．８から２．３％に、肝臓で４．４から１４％に増加することが観察された（図１０Ａ〜Ｂ）。それに応じて、ｍＲＮＡガルソームはまた、脾臓および肝臓において、そのレベルがそれぞれ２．２から３．８％および４．７から１２％に増加するにつれて、ＮＫ細胞の増殖を媒介した。（図１０Ｃ）。
【０１０５】
６．Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫およびＢ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルにおけるｍＲＮＡガルソームの治療効果
ｍＲＮＡガルソームの治療ワクチン接種研究における可能性を評価するために、マウスにＯＶＡ発現Ｅ．Ｇ７リンパ腫細胞またはＢ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞を皮下接種し、腫瘍が８日目に触知可能になったときに、ＯＶＡをコードするｍＲＮＡをワクチン接種した。
ｉＮＫＴ細胞の活性化またはＩ型ＩＦＮ応答に基づき免疫を誘発するナノ粒子の治療可能性をそれぞれ区別するために、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ保有マウスを、ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子のいずれかの単回投与で処置した。第一に、両方の治療法は、未処置のマウスと比較して、腫瘍の進行を著しく遅延させた（図１１Ａ〜Ｂ）。全体として、未修飾のｍＲＮＡナノ粒子で処置されたマウスは４／６の動物で完全な腫瘍退縮を示し、ｍＲＮＡガルソームでの処置は３／７の動物で完全な腫瘍退縮をもたらした。
【０１０６】
より攻撃的なＢ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルでは、動物にｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡナノ粒子のいずれかを３回、腫瘍接種後８日目、１２日目、１６日目に投与した。腫瘍増殖の遅延が観察されたが、ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡナノ粒子で処置したマウスの生存期間はわずかにのみ延長され、未処置の動物の２２．５日と比較して、生存期間の中央値は２８日と２９日であった（図１２Ａ〜Ｂ）。さらに、複数回の投与は抗腫瘍反応を効率的に促進または延長できないことに気づいた。これはＥ．Ｇ７−ＯＶＡモデルでも発生し、２回目の（ブースト）ワクチン接種では腫瘍増殖のより良い制御がもたらされなかった。
【０１０７】
７．ｍＲＮＡガルソームはＣＴＬ、ｉＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞の腫瘍浸潤を促進するが、免疫学的監視はＰＤ−Ｌ１の発現によって妨げられる
腫瘍増殖の完全な制御が達成されなかったため、どの免疫抑制メカニズムが働いて、ｍＲＮＡガルソームまたは未修飾ｍＲＮＡナノ粒子により誘発された抗腫瘍免疫を打ち消すのかを調査することを目的とした。したがって、実験を行って、Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスを２回目のナノ粒子投与の２日後（１４日目）に犠牲にし、腫瘍免疫微小環境の詳細な分析を行った。腫瘍および脾臓を、治療結果に影響を与える可能性のあるエフェクター応答および／または抑制メカニズムについてスクリーニングした。最も重要な所見を図１３〜１４に示す。
【０１０８】
まず、ｍＲＮＡガルソームで処置した動物は、腫瘍浸潤ＣＴＬのレベルが最大５倍高かったのに対し、腫瘍部位におけるＣＴＬの存在は、未処置群と比較して未修飾ｍＲＮＡナノ粒子のワクチン接種後に２倍になった（図１３Ａ）。同様に、ｍＲＮＡガルソームのワクチン接種は、未修飾ｍＲＮＡ処置動物と比較して、６〜７倍高いＯＶＡ特異的ＣＴＬの数（ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｈ２Ｋｂテトラマー染色により決定されるとおり、腫瘍における生細胞の１０％）をもたらしたが、未処置の動物の腫瘍では、ＯＶＡ特異的ＣＴＬはほとんど検出されなかった（＜０．０４％）（図１３Ｂ）。さらに、ｍＲＮＡガルソームで処置したマウスの腫瘍では、他の群と比較して、ｉＮＫＴ細胞数の４倍の増加が検出された（図１３Ｃ）。両方の処置で、腫瘍浸潤ＮＫ細胞のレベルの上昇が観察され、ｍＲＮＡガルソームでは±１３％ＮＫ細胞、未修飾ｍＲＮＡナノ粒子では±１１％ＮＫ細胞が、わずか±５％ＮＫ細胞の未処置マウスと比較して、観察された（図１３Ｄ）。
【０１０９】
抑制免疫細胞の腫瘍部位を分析することによって、未修飾ｍＲＮＡの送達により、未処置の対照と比較してＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋、ＧＲ１＋、ＭＨＣ−ＩＩ−細胞）が２倍増加することが見出された。興味深いことに、ＭＤＳＣレベルのこの上昇は、ｍＲＮＡガルソームで処置した動物では観察されなかった（図１４Ａ）。さらに、ｍＲＮＡガルソーム群のほぼすべてのＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋細胞）が、ＭＨＣ−ＩＩレベルの上昇を特徴とする炎症誘発性のＭ１様表現型を示すことが認められた（図１４Ｂ）。
【０１１０】
ｍＲＮＡガルソームのワクチン接種は「炎症性（hot）」Ｔ細胞浸潤腫瘍をもたらしたが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を介した免疫抑制がワクチン誘発性免疫応答の対抗に関与するかどうかを調査した［２３］。実際、ｍＲＮＡガルソームで処置したマウスの腫瘍は、未処置動物の腫瘍と比較して、ＰＤ−Ｌ１発現の約４倍の増加を示した。同様の効果が腫瘍内のＡＰＣで観察され、対照と比較してＰＤ−Ｌ１発現の約２倍の上方制御を受けた（図１４Ｃ）。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＯＶＡ特異的ＣＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのさまざまな腫瘍浸潤Ｔ細胞サブセットは、ＰＤ−１発現の上方制御を示し、これは時間の経過と共に増加した（図１４Ｄ）。これらの影響は、ｍＲＮＡナノ粒子の種類に関係なく発生したことに注意されたい；ＰＤ−１の上方制御は、ｍＲＮＡガルソームと未修飾ｍＲＮＡナノ粒子の両方で同様の量で測定された。重要なことに、活性化されたｉＮＫＴ細胞でのＰＤ−１発現の有意な上昇も、ｍＲＮＡガルソームによる最初のチャレンジ後に観察された（図１４Ｄ）。これは、ｍＲＮＡガルソームの複数回の注射で観察された限られたブースト効果と一致しており（図１１〜１２）、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１経路を介した抑制性シグナルが、後続する（過剰）刺激後のα−ＧａｌＣｅｒ刺激に対する応答性の喪失に役割を果たすことを示唆する、以前の報告と適合する。
まとめると、これらの所見は、阻害性ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント軸がＣＴＬの抑制に関与していること、および２回目の（ブースト）ワクチン接種に対するｉＮＫＴ細胞の限定された応答性、したがって限定された抗腫瘍免疫を説明できる可能性があることを実証する。
【０１１１】
８．抗ＰＤ−Ｌ１チェックポイント遮断抗体はｍＲＮＡガルソームの抗腫瘍効果と相乗する
以前のデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の増加がＴ細胞応答を麻痺させｉＮＫＴ細胞アネルギーを誘導することにより、抗腫瘍免疫を制限することを示唆している。これは、ｍＲＮＡガルソームワクチン接種と抗ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害の治療的組み合わせを調査する根拠を提供する。
【０１１２】
最初にｉＮＫＴアネルギーの問題をより詳細に調査するために、ナイーブマウスにｍＲＮＡガルソームを５日間隔で２回、ワクチン接種した。各投与のそれぞれ６時間後と３日後に、サイトカイン放出とｉＮＫＴ活性化を評価した。図１５Ａに示すように、２回目の曝露後に測定されたＩＦＮ−γレベルは、最初の投与後に測定されたレベルの半分にすぎなかった。さらに、より高いレベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０が測定されたため、連続投与後にＴｈ２極性化サイトカイン産生へのシフトを観察することができた。最後に、ｍＲＮＡガルソームによるブーストワクチン接種はｉＮＫＴ細胞数をさらに増加させないことに気づき、ｉＮＫＴ細胞の低応答状態の誘導を確認した。対照的に、マウスにワクチン接種と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の注射を同時に行った場合、ＩＦＮ−γの産生は、最初のチャレンジと比較して、２回目のワクチン接種で最大４倍に上昇した。同じ方針に沿って、抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせにより、ｉＮＫＴ細胞の増大がさらに促進され、２回目の投与で脾臓ｉＮＫＴ細胞数が２倍になった（２．２５±０．７対４．７３±１．２％、図１５Ｂ）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の役割をさらに調査するために、脾臓ＤＣのＰＤ−Ｌ１発現と活性化ｉＮＫＴ細胞のＰＤ−１発現を測定した。他の報告と同様に、アイソタイプ対照で処置した動物でＰＤ−Ｌ１の発現を急速に上方制御するＤＣの大部分が観察され、これは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の同時送達によって完全に排除できる（図１５Ｃ）［２８、２９］。さらに、ｍＲＮＡガルソームのみの単回ワクチン接種を受けたマウスのｉＮＫＴ細胞と比較して、ＰＤ−１レベルが半分に減少したため、ｍＲＮＡガルソーム／チェックポイントの組み合わせ戦略によるｉＮＫＴ細胞の反復活性化が実現可能であった（図１５Ｃ）。
【０１１３】
上記の併用療法の効果が治療成績の改善にもつながるかどうかを評価するために、Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはアイソタイプ対照抗体の腹腔内投与と組み合わせてｍＲＮＡガルソームをワクチン接種した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはアイソタイプ抗体の単剤療法を、追加の対照として使用した。図１６の結果は、最後のワクチン接種時（２２日目）までに、ｍＲＮＡガルソームとチェックポイント遮断抗体の組み合わせで処置したマウスの平均腫瘍体積が、５９±４６ｍｍ３に制限されたままであることを示している。対照的に他のすべての群では、腫瘍はすでに１０倍まで増殖している。これは、生存期間の中央値の大幅な増加にもつながった。抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはｍＲＮＡガルソームの単剤療法を受けたマウスは、それぞれ２１日目と２２．５日目に生存期間中央値に達し、これは、アイソタイプ対照抗体のみを注射した対照群の動物（生存期間中央値１９日）よりも有意に長くはない。併用療法は生存期間中央値を３０日まで有意に延長し、両方の処置戦略間の相乗効果を示している。
【０１１４】
次に、同様の抗腫瘍反応が得られるかどうかを、Ｂ１６Ｆ０黒色腫モデルにおいて自然発現したチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）腫瘍抗原を標的として調査した。より具体的には、Ｂ１６Ｆ０保有マウスは、抗ＰＤ−Ｌ１チェックポイント療法と組み合わせて、ｍＲＮＡガルソームまたはＴＲＰ−２をコードするｍＲＮＡを含む未修飾ｍＲＮＡナノ粒子のいずれかのワクチン接種を受けた（図１７）。チェックポイント療法と組み合わせた両方のｍＲＮＡプラットフォームを直接比較して評価したところ、ｍＲＮＡガルソーム製剤のほうが未修飾ｍＲＮＡナノ粒子より優れた抗腫瘍効果を観察でき、生存期間の中央値はそれぞれ２４日対１８日であった。この場合も、Ｂ１６Ｆ０保有マウスはＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害の単剤療法に反応せず、アイソタイプ対照抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与された動物は両方とも、１５日目に生存期間中央値に達した。
【０１１５】
全体として、ｍＲＮＡガルソームの治療効果は、ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤と合理的に組み合わせることで高め得ることが明確に示された。このチェックポイントの遮断は、（１）ｉＮＫＴアネルギーの誘導を防ぎ複数のワクチン接種ラウンドを可能にする、および（２）腫瘍部位での適応耐性メカニズムを回避し、Ｂ１６−ＯＶＡ−またはＢ１６Ｆ０黒色腫モデルで抗腫瘍効果を延長する。さらにｍＲＮＡガルソームは、腫瘍の微小環境をより炎症誘発性の表現型にシフトできるため、最先端の未修飾ｍＲＮＡナノ粒子より優れた抗腫瘍応答を得ることができ、ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害との組み合わせにより長期生存を示した；これは例えば、ＴＲＰ−２を標的とするＢ１６Ｆ０黒色腫モデルで実証されている。
【０１１６】
９．α−ＧａｌＣｅｒの機能的誘導体を配合したｍＲＮＡガルソーム
さらに、ＣＤ１ｄ複合体内の糖脂質の安定性を増減するために特異的に合成されたα−ＧａｌＣｅｒ類似体を配合したｍＲＮＡガルソームの治療効果を検証した。３つの機能的誘導体が選択された：（１）ＮＵ−α−ＧａｌＣｅｒ（α−ＧａｌＣｅｒ−６”−（１−ナフチル）尿素）、（２）ＰｙｒＣ−α−ＧａｌＣｅｒ（ａ−ＧａｌＣｅｒ−６”−（ピリジン−４−イル）カルバメート）、および（３）（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−テトラコサノイル−２−アミノ−１，３，４−ノナントリオール）（ＯＣＨ）。ＮＵ類似体およびＰｙｒＣ類似体は、ガラクトース部分がそれぞれナフチル尿素およびピリジンカルバメート基で修飾されており、それぞれ、ＣＤ１ｄ（樹状細胞）またはＴＣＲ受容体（ｉＮＫＴ細胞）との相互作用が増加している。対照的に、ＯＣＨはアシル鎖が短いセラミド修飾類似体であるため、ＣＤ１ｄ受容体に対する親和性が弱いことが知られている。
【０１１７】
ｍＲＮＡガルソームは、α−ＧａｌＣｅｒまたは構造類似体の１つのいずれかを含めて調製した（総脂質量の０．０１５ｍｏｌ％）。まず、これらのｍＲＮＡガルソームの、ｉＮＫＴおよび抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発する活性を、腫瘍のないマウスで比較した。ワクチン接種の３日後、αＧＣを含むｍＲＮＡガルソーム（〜３％）と比較して、ＰｙｒＣ−αＧＣ（〜１２％）およびＮＵ−αＧＣ（〜６％）でワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓において、ｉＮＫＴ細胞の割合の増加を検出でき、一方、ＯＣＨではより低い増殖が観察された（〜１．８％）（図１８Ａ）。明確なｉＮＫＴ細胞活性にもかかわらず、すべてのｍＲＮＡガルソームはＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増殖を誘導することができた（＞３％；７日後に測定）（図１８Ｂ）。糖脂質アジュバントを含まない同じ粒子は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をほとんどもたらさないことに注意する必要がある。続いて、さまざまなα−ＧａｌＣｅｒ類似体の取り込みがｉＮＫＴ細胞でのＰＤ−１発現にどの程度影響するかを評価した。以前の研究では、ｉＮＫＴアネルギーには「活性化閾値」があることが示されている［２８、３０］。図１８Ｃに示すように、ＯＣＨ ｍＲＮＡガルソームで処置した後、ｉＮＫＴ細胞により、ＰＤ−１の発現が有意に低下することが観察された。
【０１１８】
次に、α−ＧａｌＣｅｒまたはこれらの類似体をパッケージ化したｍＲＮＡガルソームの治療可能性を、本明細書に記載のＢ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルで比較した。Ｂ１６−ＯＶＡ保有マウスは、８日目に最初のワクチン接種を受け、１５日目にブーストワクチン接種を受けた。図１９は、α−ＧａｌＣｅｒ類似体を含むｍＲＮＡガルソームでワクチン接種されたマウスが、古典的α−ＧａｌＣｅｒを配合した粒子よりも優れた抗腫瘍効果をもたらしたことを示している。ＰｙｒＣ類似体およびＯＣＨ類似体の両方が腫瘍増殖に最も顕著な影響を及ぼし、これは、ＮＵ−α−ＧａｌＣｅｒの２６日およびα−ＧａｌＣｅｒの２５日、および未処置動物の２１日と比較して、それぞれ３２日および２８日の生存期間中央値の改善によって実証された。ＰｙｒＣ類似体の場合、これは、この類似体のｉＮＫＴ細胞を刺激する能力の強化によって説明できる可能性がある（図１８）。対照的に、ＯＣＨの優れた抗腫瘍効果は、ｉＮＫＴ細胞刺激の低下によって説明される可能性があり、その結果、１回のワクチン接種後にｉＮＫＴ細胞でのＰＤ−１発現レベルの低下が生じる（図１８Ｃ）。最初のｉＮＫＴ細胞アネルギーを制限することにより、２回目のワクチン接種は、特に継続的なＣＴＬ応答を確立するために、ＯＣＨ類似体に対し他のα−ＧａｌＣｅｒバリアントに比べて優れた効果をもたらす可能性がある。これらの結果に基づいて、これらのα−ＧＣ類似体の使用は、ｍＲＮＡガルソーム製剤の有効性と（潜在的な安全性）を調節できる、非常に魅力的なパラメータであることが見出された。
【０１１９】
１０．イオン化可能脂質ＭＣ３で構成される代替脂質ナノ粒子系を使用した、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの同時送達。
イオン化可能カチオン性脂質、およびリン脂質、コレステロール、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質などの他の「ヘルパー」脂質で構成される脂質ナノ粒子は、ＲＮＡ治療のための臨床的に最も進んだ技術であると考えられている。優れた例として、かかるイオン化可能ＬＮＰ技術を利用した、遺伝性トランスサイレチン媒介性アミロイドーシスの処置のための短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ治療薬Onpattro（patisiran）は、その種類の最初のものとしてＦＤＡとＥＭＡによる承認を最近受けた。さらに、イオン化可能カチオン性脂質で構成されるこれらのＬＮＰは、ｍＲＮＡワクチンの送達のための「ゴールドスタンダード」脂質製剤にもなっている。かかる脂質製剤、特にイオン化可能脂質ＭＣ３を使用して、ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒをｉＮＫＴアゴニストとして同時送達できるかどうかを評価した。
【０１２０】
同一の動物でα−ＧａｌＣｅｒを添加されたＭＣ３ ＬＮＰのトランスフェクション効率と免疫原性の両方を評価するために、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡとｔＯＶＡＩ８０ ｍＲＮＡを単一のナノ粒子に配合した。第一に、ＭＣ３ ＬＮＰの全身送達は、ＤＯＴＡＰとコレステロールで構成されるｍＲＮＡガルソームと比較してはるかに高い全身ルシフェラーゼ発現レベルを達成する可能性がある（図２０Ａ）。以前の報告と同様に、顕著に高い選択的ｍＲＮＡ発現が肝臓で検出された［３３］。
重要なことに、脾臓におけるｉＮＫＴ細胞の割合の増加は、ＤＯＴＡＰ ｍＲＮＡガルソームによる免疫化と類似の細胞数で観察される（図２０Ｂ）。さらに、ＭＣ３ ｍＲＮＡガルソームは、脾臓で測定されたＯＶＡ特異的ＣＴＬ（１．６５±０．６２％）を誘導することもできたが、ただしＤＯＴＡＰ ｍＲＮＡガルソーム（４．４２±０．８５％）よりも程度は低い。さらに、免疫後早期に、ｉＮＫＴ細胞刺激に関連するＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン応答を、ＭＣ３ ｍＲＮＡガルソームで処置した動物で検出することができた。サイトカイン分極のわずかなパターンシフトのみが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６の同様またはより高いサイトカインレベルで観察されたが、ＩＬ−４およびＩＬ−２のレベルはより低かった（図２０Ｃ）。これらの違いは、全身投与後の両方の粒子の他の臓器における分布プロファイルに関連し、これらのナノ粒子が標的とする臓器に存在する他のＮＫＴ細胞サブセットを刺激している可能性がある。
結論として、これらの結果は、代替のカチオン性脂質を使用するＬＮＰが、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡとα−ＧａｌＣｅｒの同時送達の担体として使用可能であり、ｉＮＫＴ細胞の刺激と抗原特異的Ｔ細胞応答の増強を誘導することを示している。
【０１２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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