【手続補正書】
【提出日】平成21年12月4日(2009.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2009518448.tif 000001
【化２】
2009518448.tif 000002
から成る群から選択されるペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１記載のコンジュゲートを含む超音波造影剤組成物。
【請求項３】
造影剤がガス充填微小嚢を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
ガス充填微小嚢がリン脂質を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ガス充填微小嚢が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸及びステアリン酸から成る群から選択される、２つ以上の成分をさらに含む、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣとＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
該コンジュゲートが配列番号：４を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣとＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
該コンジュゲートが配列番号：４を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥ及びＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項９】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥ及びＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１１】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１２】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１３】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１４】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１５】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１６】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１７】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１８】
糖、多糖類及びポリオール類から成る群から選択される成分をさらに含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１９】
前記成分が、マンニトール、デキストラン及びポリエチレングリコールから成る群から選択される、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記ガスがフッ素化ガスを含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
該ガスが、任意に、空気、窒素、酸素又は二酸化炭素との混合物として、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０又はＳＦ６を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項２２】
【化３】
2009518448.tif 000003
を含むペプチド・モノマー。
【請求項２３】
【化４】
2009518448.tif 000004
から成る群から選択される１つ以上のモノマーを含む超音波造影剤組成物。
【請求項２４】
該造影剤が、ガス充填微小嚢を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記ガスがフッ素化ガスを含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
リン脂質をさらに含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸及びステアリン酸から成る群から選択される、２つ以上の成分をさらに含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
該ガスが、任意に、空気、窒素、酸素又は二酸化炭素との混合物として、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０又はＳＦ６を含む、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
請求項２２記載のペプチド・モノマーの１つ以上を含むペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項３０】
該リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、修飾ホスファチジルエタノールアミン及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００から成る群から選択される、請求項２９記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項３１】
リン脂質を含むガス充填微小嚢の製造方法であって、
ａ．（ｉ）水を包含する水性媒質、（ｉｉ）水と実質的に混和しない有機溶媒、（ｉｉｉ）リン脂質、（ｉｖ）請求項１記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート、及び（ｖ）分散保護剤を含む水性−有機エマルジョンを製造する工程；
ｂ．前記エマルジョンを凍結乾燥して、前記リン脂質を含む凍結乾燥マトリックスを得る工程；
ｃ．前記凍結乾燥マトリックスを生体適合性ガスと接触させる工程；
ｄ．前記凍結乾燥マトリックスを生理的に許容される水性キャリヤー液体中に溶解して、前記ガス充填微小嚢の懸濁液を得ることによって、前記凍結乾燥マトリックスを再構成する工程
を含む方法。
【請求項３２】
工程ａが、
ａ１．ＰＥＧ化リン脂質と請求項１記載のコンジュゲートを含む水性懸濁液を製造する工程；
ａ２．水性媒質、有機溶媒、リン脂質及び分散保護剤を含む水性−有機エマルジョンを製造する工程；及び
ａ３．工程ａ１の前記水性懸濁液に工程ａ２の該エマルジョンを混合する工程
を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
【化５】
2009518448.tif 000005
から成る群から選択されるペプチドをリン脂質と結合させることを含む、ペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法。
【請求項３４】
該リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
コンジュゲート化が該ペプチドのモノＮＨＳエステルを該リン脂質塩の遊離アミノ基と反応させることを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
低レベルのＴＦＡを有するペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法であって、
ペプチド・ダイマーＴＦＡ塩をアニオン交換によって酢酸塩に転化させる工程；及び
該ペプチド・ダイマーをリン脂質に結合させる工程を含む方法。
【請求項３７】
該ペプチドが、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ）−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド］−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２である、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
低レベルのＴＦＡを有するペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法であって、サイズ排除カラムにおいてペプチド・リン脂質コンジュゲート及びＴＦＡイオンを溶出することを含む方法。
【請求項４０】
前記溶出が炭酸水素アンモニウムの存在下で行われる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該ペプチド・リン脂質コンジュゲートがＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２を含む請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該ペプチド・ダイマーがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ）−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド］−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該ペプチド・リン脂質コンジュゲートが、
【化６】
2009518448.tif 000006
から成る群から選択されるモノマーを含む、請求項３９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
理想的には、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）若しくは（３１）の製造を促進するためには、該線状ペプチドモノマー（２）又は（３２）を大量に製造すべきである。次に、精製線状ペプチドモノマー（２）又は（３２）の、例えば、塩形でのＰＥＧ化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４））のようなリン脂質への、リンカー、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を介してのコンジュゲート化を用いて、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）又は（３１）を生成することができる。
モノマーペプチド−リン脂質コンジュゲートの製造方法
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）及び（３１）の製造では、本発明による方法は、少なくとも下記利点：ペプチド合成の収率上昇；ラセミ化の程度の低下；合成中の以前に観察されたピペリジンアミド形成の回避；ペプチドモノマー（２）と（３２）の効果的な精製；ペプチドモノマー（２）と（３２）の大規模でのコンジュゲート化方法の開発；及び出発ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）からのモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）と（３１）の容易な分離を可能にすると考えられる精製プロトコールの開発；を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【化１０】
2009518448.tif 000007
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
（これらは、それらの全体で本明細書に援用される）
に記載された方法を用いて製造することができる。好ましくは、国際特許出願WO 04/069284に開示されているように、水のエマルジョン又は水非混和性有機溶媒のエマルジョン中に分散した、分散保護剤(lyoprotecting agent)（例えば、炭水化物、糖アルコール、ポリグリコール及びこれらの混合物、以下に詳述）と、任意に他の両親媒性物質（例えば、ステアリン酸）との混合物としてリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ及び／又はＤＳＰＡ）を含有するマイクロエマルジョンを製造することができる。好ましい有機溶媒は、１．０ｇ／Ｌ以下、好ましくは、約０．０１ｇ／Ｌより低い水中溶解度を有するものであり、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、１−ペンテン、２−ペンテン、１−オクテン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、１−メチル−シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、１，２−ジメチルベンゼン、１，３−ジメチルベンゼン、ジブチルエーテルとジイソプロピルケトン、クロロホルム、四塩化炭素、２−クロロ−１−（ジフルオロメトキシ）−１，１，２−トリフルオロエタン（エンフルラン）、２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロエタン（イソフルラン）、テトラクロロ−１，１−ジフルオロエタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロベンゼン、ペルフルオロデカリン、メチルペルフルオロブチルエーテル、メチルペルフルオロイソブチルエーテル、エチルペルフルオロブチルエーテル、エチルペルフルオロイソブチルエーテル、及びこれらの混合物を包含する。本発明のペプチド−リン脂質コンジュゲートは、マイクロエマルジョン中で、微小嚢のエンベロープを形成するリン脂質と一緒に混合することができる。好ましくは、最初に、ペプチド−リン脂質コンジュゲートとＰＥ−ＰＥＧ（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の水性懸濁液を調製し、これを次に、該リン脂質と分散保護剤を含む水性―有機エマルジョンと一緒に混合する。好ましくは、前記混合を例えば約４０℃〜８０℃に加熱しながら行う。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
ペプチドモノマー（１２）のＨＰＬＣ精製に用いた方法に従って、２０％ＣＨ３ＣＮ−水混合物（１００ｍｌ）中に溶解した粗環状ジスルフィドペプチドモノマー（１３），Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２（０．５ｇ）を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）と予め平衡させてある逆相Ｃ１８分取カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ粒子, 300Å孔, 50 x 250mm,流速100ml/分)上に装填した。該カラムへのサンプル溶液の供給中に、分取ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れは停止した。該サンプル溶液を該カラムに供給した後に、勾配ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れを再度開始させ、該カラムを１０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）によって５分間溶出させた。次に、溶離剤の組成を３０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．５％／分の速度で線形勾配の溶離を開始して、５０分間維持した。生成物溶離のインジケーターとして２２０ｎｍにおけるＵＶを用いて、画分（１５ｍｌ）を手動で回収した。該画分をWatersXTerra分析用逆相Ｃ−１８カラム（4.6mm i.d. x 50mm, ５μ粒子，１２０Å孔）上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥させて、対応する環状ジスルフィドペプチドモノマー（１３）を得た。典型的には、粗ペプチドモノマー（１３）０．５ｇの精製によって、所望の生成物（＞９５％純度）０．１２ｇ（２４％収率）が得られた。