【手続補正書】
【提出日】平成22年7月15日(2010.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の酵素活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、当該経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産することを特徴とするピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項２】
前記微生物が、ケイヒ酸を生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産することを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項３】
前記ピノシルビンが、シンナモイル−ＣｏＡからスチルベンシンターゼにより生産され、該スチルベンシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項２に記載の請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項４】
前記スチルベンシンターゼが、ラッカセイ属に属する植物、ダイオウ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、或いは、マツ属、トウヒ属、ユリ属、ユーカリノキ属、ツタ属、シッサス属、カロコルタス属、タデ属、グネツム属、パンノキ属、ナンキョクブナ属、ナツメヤシ属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ属、又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれか１種類に属する植物に由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．９５）、又は、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｓｔｒｏｂｅｓ、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｔａｅｄａを含むマツ属に属する植物、トウヒ属に属する植物、又はユーカリノキ属のいずれか１種類に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１４６）であることを特徴とする請求項３に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項５】
前記ケイヒ酸が、Ｌ−フェニルアラニンから、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されるＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）により、前記経路で生産されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項６】
前記ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、サクラ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アナナス属、アスパラガス属、ブロムヘディア属、ホウライチク属、フダンソウ属、カバノキ属、キュウリ属、ツバキ属、トウガラシ属、カッシア属、カタランサス属、マメ属、スイカ属、コーヒーノキ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、ニンジン属、デンドロビウム属、ナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ガルス属、イチョウ属、ダイズ属、オオムギ属、ヒマワリ属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、リソスペルマム属、ハス属、トマト属、ウマゴヤシ属、リンゴ属、マニホット属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、オリーブ属、オリザ属、ピスム属、ペルセア属、ペトロセリヌム属、ファレノプシス属、マダケ属、センタイ属、ピケア属、ピルス属、ケルクス属、ラファヌス属、ジオウ属、キイチゴ属、モロコシ属、スフェノスチリス属、ハコベ属、スタイロ属、コムギ属、シャジクソウ属、コムギ属、スノキ属、ササゲ属、又はジニア属のいずれか１種類に属する植物、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．５）によりＬ−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする請求項５に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項７】
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比は、１：１未満となるように、前記ＰＡＬが、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする請求項５又は６に記載の請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項８】
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ）／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ）の比は、少なくとも２：１であることを特徴とする請求項７に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項９】
前記シンナモイル−ＣｏＡが、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質で、且つ、ＡＤＰが生産物である酵素により触媒される反応で、前記経路により形成され、該反応を触媒する酵素が、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項１０】
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項１１】
前記微生物が、サッカロミセス属、クリベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、デバロミセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ザイゴサッカロミセス属、又はシゾサッカロミセス属に属する酵母菌であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項１２】
ピノシルビンの生産条件下で、代謝経路を作り出すピノシルビンを有する微生物細胞を培養する工程を含むピノシルビンを生産する方法であって、
前記経路が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を含み、
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比は、１：１未満であり、且つ、
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ）／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ）の比は、少なくとも２：１であることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。
【請求項１３】
基質とする４−シンナモイル−ＣｏＡとの転写回転率よりも、基質とするシンナモイル−ＣｏＡとより高い転写回転率を有するスチルベンゼンシンターゼの作用によって、シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する操作的な代謝経路を有する微生物。
【請求項１４】
スチルベンシンターゼの作用により、シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する操作的な代謝経路を有する微生物であって、
前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比は、１：１未満となるように、前記ケイヒ酸が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産する前記ＰＡＬにより、Ｌ−フェニルアラニンから形成されることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。
【請求項１５】
微生物細胞、及び少なくとも乾燥重量基準で１．５ｍｇ／ｇのピノシルビンを含む微生物組成物であって、微生物がピノシルビンに属する酵母菌である、及び／又は、該ピノシルビンの少なくとも一部が微生物の細胞の中に含まれることを特徴とする微生物組成物。