【手続補正書】
【提出日】平成22年6月17日(2010.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
抗ウイルス活性
１）抗ＨＢＶ検査
ａ）感染ＨｅｐＡＤ３８細胞での検査
テトラサイクリン反応細胞系ＨｅｐＡＤ３８を使用した（Ladner et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41:1715-1720, 1997）。これらは、野生型ウイルスのプレゲノムＲＮＡのｃＤＮＡコピーで安定にトランスフェクトされた肝癌細胞である。培地からテトラサイクリンを除去すると、ウイルスの複製開始をもたらす。これは、通常使用されるＨｅｐ  Ｇ２．２．１５細胞系とは対照的に、バックグラウンドのウイルス性ＤＮＡの合成が無い、または非常に限定的であるという利点を提供する。細胞を３７℃で、加湿した５％ＣＯ２／大気中において播種培地、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｇ４１８  ４００μｇ／ｍｌ、およびテトラサイクリン０．３μｇ／ｍｌを補充したＤＭＥＭ／ハムＦ１２（５０／５０）で培養した。アッセイを開始した際、細胞は、４８穴プレートに１ウェル当たり５×１０５個の密度で播種した。２〜３日後、培養物を、予め温めたＰＢＳで洗浄することによってウイルス生成について誘導し、抗ウイルス化合物を含むまたは含まないアッセイ培地（テトラサイクリンおよびＧ４１８を含まない播種培地）２００μｌを与えた。培地は３日後に交換した。抗ウイルス効果を、誘導後６日目に細胞内ウイルス性ＤＮＡのレベルをリアル・タイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）法で測定することによって定量した。全細胞性ＤＮＡは、市販のキットを用いて細胞から抽出した。Ｑ−ＰＣＲは、２５μｌの反応容量中で、順方向プライマー（５’−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ−３’（配列番号１）、最終濃度６００ｎＭ）、逆方向プライマー（５’−ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＧＴＹ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＴＲＹ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＴ−３’（配列番号２）、最終濃度６００ｎＭ）、およびＴａｑｍａｎプローブ（６−ＦＡＭ−ＣＣＧ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３）、最終濃度１５０ｎＭ）で、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して実施した。反応は、ＳＤＳ  ７０００を使用して分析した。ＨＢＶゲノムの全長挿入断片を含有するプラスミドを、標準曲線を作成するために使用した。処理した培養物中に生成されたウイルス性ＤＮＡの量は、偽処理試料の百分率として表した。最初のアッセイで選択的抗ウイルス活性を示した化合物を、活性を確認するために再検査した。種々の化合物の細胞分裂阻害効果を、親肝癌細胞系ＨｅｐＧ２を使用して評価した。指数関数的に増殖しているＨｅｐＧ２細胞での化合物の効果を、ＭＴＳ法を用いて評価した。簡潔には、細胞を１ウェル当たり３０００個の密度で播種し（９６穴プレート）、化合物の存在下または非存在下で３日間増殖させ、その後９６穴プレートリーダーで光学密度を測定し、細胞密度を決定した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
反応に使用したＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３１塩基の鋳型（３１Ａ−ＲＴ、５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  Ｔ−３’（配列番号５））とハイブリダイズした２１塩基の５’−標識プライマー（５’−ＡＴＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＴＣＣ−３’（配列番号４））に相当する。天然ヌクレオチドについて、反応は、ＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の１００ｎＭプライマー／マトリックス複合体に結合した５０ｎＭ（活性部位で）ＨＩＶ−１  ＲＴを含む溶液を、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む様々な濃度のＮＴＰと混合することによって実施した。非環式ヌクレオチドを含む反応は、プライマー／鋳型複合体（１００ｎＭ）に関して過剰量の酵素（２００ｎＭ）で実施した。これらの条件は、低いレベルでの取込みの測定を干渉する酵素の代謝回転率（Ｋｓｓ）の影響を排除するために選択した。反応生成物は、電気泳動ゲル（ＴＢＥ緩衝液中、１４％アクリルアミド、８Ｍ尿素）で分析し、可視化後にＦＵＪＩＩＭＡＧＥＲ（登録商標）で定量した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
反応に使用したＤＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、３１塩基の鋳型（５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  Ｔ−３’（配列番号５））と５μＭでハイブリダイズした２１塩基のプライマー（５’−ＡＴＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＴＣＣ−３’（配列番号４））に相当する。反応は、ＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μＭ  ＭｇＣｌ２）中の２０μＭ  ＨＩＶ−１  ＲＴを含む溶液を、１０ｍＭ  ＰＭＥＡｐｐもしくはＰＭＰＡｐｐまたはＳ−ＰＭＥＡｐｐ  １２もしくはＳ−ＰＭＰＡｐｐ  １３と混合することによって実施した。反応物を３７℃で５０分間インキュベートした。各反応は、７０℃で５分間加熱することによって停止させた。ＲＴ伸長反応由来の２２塩基長生成物を、次いで逆相ＨＰＬＣによって精製した。使用した装置は、前ろ過無しで分析カラムへのタンパク質に富む混合物の注入を可能にするイン・ラインろ過系（プレカラム＋スイッチ）を有する。精製後、２２塩基長の回収画分をそれぞれ合わせ、凍結乾燥し、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって特徴付けた。それらの濃度は、ＯＤ２６０の測定によって決定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
【表１０】
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ｂ）実験結果
反応に使用したＤＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、３１塩基のマトリクス（５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  Ｔ−３’（配列番号５））とハイブリダイズした５’に３２Ｐで標識した２２塩基のプライマー（５’−ＡＴＡ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＴＣＣ−３’（配列番号４）、ＰＭＥＡ−２２塩基長もしくはＰＭＰＡ−２２塩基長またはＳ−ＰＭＥＡ−２２塩基長もしくはＳ−ＰＭＰＡ−２２塩基長）に相当する。反応は、ＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の５０ｎＭプライマー／マトリックス複合体に結合した、野生型ＨＩＶ−１または変異体ＨＩＶ−１（Ｄ６７Ｎ、Ｋ７０Ｒ、Ｔ２１５Ｆ、Ｋ２１９Ｑ）の１００ｎＭ  ＲＴを含む溶液を、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む濃度３．２ｍＭのＡＴＰと混合することによって実施した。反応物を、３７℃で２時間インキュベートし、試料を分析のために１時間および２時間で採取した。反応生成物は、電気泳動ゲル（ＴＢＥ緩衝液中、１４％アクリルアミド、８Ｍ尿素）で分析し、可視化後にＦＵＪＩＩＭＡＧＥＲ（登録商標）で定量した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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