【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年1月14日(2010.1.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
遺伝子の単離およびポリヌクレオチドの構築
本発明のポリヌクレオチドは、ウィルス、非-ウィルス、細胞または組織特異的プロモーター(例えば、ワクチン接種対象の被験者の種の細胞における配列の転写を制御する調節要素由来のプロモーター)に機能的に結合した少なくとも一つの抗原（例えば、ウイルス、細菌、菌類、寄生虫、毒素、アレルゲン、または癌細胞に由来する、および/またはそれらによって発現される抗原）をコードする。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８４】
HSV-2抗原による免疫化では、いくつかの場合において、HCMVプロモーターを使用するgDまたはgBタンパク質を発現する単一遺伝子のプラスミドを使用した。単一遺伝子のプラスミドは、PCRによってゲノム配列を増幅し、pTARGET発現ベクターにPCR断片を挿入することによって作製した。いくつかの例において、HSV-2のゲノム断片を、本発明者らがサブゲノムワクチン(SV)と呼ぶ免疫化に使用した。これらはHCMVプロモーターを使用しないで、断片に存在する遺伝子の本来のプロモーターを使用する。ゲノム断片は、Stratagene製のSuperCosバックボーンにクローニングした。サブゲノムワクチンは、ゲノムのヌクレオチド110,931〜147,530を含有する約36,000塩基のゲノムセグメントを有する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９３】
細胞培養
単細胞懸濁液をマウス脾臓から得た。脾臓はメッシュを介して圧搾して、単細胞懸濁液を作製し、次いで細胞を沈殿させ、ACK緩衝液(Bio Whittaker, Walkersville MD)で処理して、赤血球細胞を溶解させた。HEPES、1%グルタミン(Bio Whittaker)および5%熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS、Harlan, Indianapolis IN)を添加したRPMI 1640培地で2回洗浄した。細胞を計数し、5%熱不活性化FCS、50 mMメルカプトエタノール(Gibco-BRL, Long Island NY)、ゲンタマイシン(Gibco-BRL)、1 mM MEMピルビン酸ナトリウム(Gibco-BRL)およびMEM非必須アミノ酸(Sigma, St. Louis MO)を添加したHEPESおよび1%グルタミンを含有するRPMI 1640からなる「トータル」培地に適当な濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を種々のイムノアッセイに使用した。CD8特異的アッセイのためには、既知のCD8エピトープに対応するペプチドの存在下において細胞をインビトロで培養した。BALB/CマウスにおけるHBsAgについては、ペプチドの配列はIPQSLDSWWTSL(QCB Inc)であった。Balb/CマウスにおけるHSV CD8応答につては、ICP27に見られるHGPSLYRTFペプチドを使用した。ペプチドはDMSO(10 mg/ml)中で作製され、培養培地で10 ug/mlに希釈した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９４】
ELISPOT
IFN-g ELISPOTアッセイのためには、Millipore Multiscreen膜濾過プレートに、15μg/ml抗-IFN-g抗血清(Pharmingen)の滅菌0.1 M炭酸緩衝液pH9.6溶液50 ulで4℃において終夜コーティングした。プレートを滅菌PBSで6回洗浄し、次いで10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有する組織培養培地で室温において1〜2時間ブロックした。培地を除去し、脾細胞を、ウェルあたり合計1×106細胞をウェルに分注した。免疫化した動物の細胞が1×106細胞未満しか添加されないウェルについては、未処理の動物の細胞を使用して合計を1×106にした。細胞は、上記のペプチドの存在下において組織培養インキュベーターにおいて終夜インキュベーションした。プレートをPBSで2回および蒸留水で1回洗浄した。次いで、PBSで3回洗浄した。ビオチン化抗IFN-gモノクローナル抗体(Pharmingen)をプレートに添加し(1μg/mlのPBS溶液50ul)、室温において2時間インキュベーションした。プレートをPBSで6回洗浄し、次いで50ulのストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ結合体(PBSで1000倍希釈、Pharmingen)を添加し、室温において2時間インキュベーションした。プレートをPBSで6回洗浄し、発色基質(BioRad)を添加し、黒点が出現するまで反応を進行させた。水で3回洗浄することによって反応を停止した。プレートを乾燥し、顕微鏡下でスポットを計数した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０１】
IFN-g ELISAおよびELISPOTによって示される細胞応答は、イミキモドによる処理は応答を増強することを示した。免疫化の1日後にアルダラで処理した動物は最も強力な影響を示した(図4)。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０２】
これは図5に示すデータによって確認される。以下の実験の全てにおいて、アルダラクリームは免疫化後1日目に投与した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１１】
実施例7
イミキモドのアジュバント活性のさらに別の特徴
DNAによる粒子媒介性免疫化(PMID)のアジュバントとしてのイミキモド(アルダラクリーム)の有効性を評価するためにさらに2つの実験を実施した。両方の実験は、試験ワクチンとしてHBV sAgおよびcAgを発現するプラスミドを使用した。DNAの投与量、アルダラの製剤(未処理対対照クリームで希釈)およびアルダラの投与回数は変えた。読み取りは、2つの抗原に対する抗体力価およびサイトカインELISPOTを含んだ。先の実施例の結果から予想されるように、イミキモドは、主にIFN-g ELISPOT応答を増強し、抗体力価およびIL-4 ELISPOTに対してはほとんど影響しなかった。これらの結果も、PMIDの1日または7日後のアルダラの送達は、一般に、PMID投与時に送達された対照クリームまたはアルダラと比較してより効果的であることを示した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１２】
PMIDのアジュバントとしてのイミキモドの有効性を試験するために、ND5.5装置を使用してHBV sAg-およびcAg-をコードするDNAを投与し、イミキモドをアルダラクリームとして投与した。第一の実験において、DNAの異なる用量およびアルダラの投与回数を試験した(表1)。第二の実験において、HBV-をコードするDNA(2μg)の単回投与を、PMIDワクチン接種後1日目のアルダラ、PMIDと同時の希釈アルダラおよびPMIDの1週間後のアルダラと共に試験した(表2)。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１３】
5〜10匹のBalb/cマウスからなる群は、0日目(初回免疫投与のみ)または0日目および28日目(初回免疫投与および追加免疫投与)に各々1回のショットで剃毛した腹部にワクチン接種した。PMIDは、1mg Auのペイロードおよび35barシリンダーを備えるND5.5装置を使用して投与した。アルダラは、上記の表に示す用量および回数で投与した。イミキモドは、薬局から得られるアルダラクリーム(5%イミキモド)として投与した。実験1では、少量の未計量の量のアルダラを、クリームをすり込んだ消毒綿を使用して示した経過時間に送達した。実験2では、20 mlのアルダラを計量し、マウスに塗布した。対照クリームは、アルダラ系クリームと同じ成分の多くを含有する市販のハンドクリームであった。アルダラを希釈した群では、対照クリームとアルダラの5:1混合物を、3方向ストップコックを使用して2つのシリンジ間で乳化した。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１７】
本発明者らは、追加免疫投与およびアルダラ処理後長期間の経過時点においてELISPOTを試験しなかったので、この影響が一過的であるかどうかはわからない。実験1と同様に、CD8+応答はCD4+応答と同様であり、例外は、追加免疫投与のみの24時間後に送達したアルダラは、初回免疫投与のみの後に送達した場合と比較して高くなかった。実験1(初回免疫投与のみの検討)と異なり、IL-4 ELISPOT応答の増加が追加免疫投与後に観察され、特に追加免疫投与の7日後に処理した群に観察された(データは示していない)。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１８】
これらの実験は、イミキモドは、PMIDワクチン接種後にg-IFN分泌細胞の頻度を増加することを示す。この影響の最適な経過時点は、PMIDのほぼ1日〜最長7日後であると思われる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３０】
ELISPOT
IFN-g ELISPOTアッセイのためには、Millipore Multiscreen膜濾過プレートに、15μg/ml抗-IFN-g抗血清(Pharmingen)の滅菌0.1 M炭酸緩衝液pH9.6溶液50 ulで4℃において終夜コーティングする。プレートを滅菌PBSで6回洗浄し、次いで10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有する組織培養培地で室温において1〜2時間ブロックする。培地を除去し、脾細胞は、ウェルあたり合計1×106細胞をウェルに分注する。免疫化した動物の細胞が1×106細胞未満しか添加されないウェルについては、未処理の動物の細胞を使用して合計を1×106にする。細胞は、上記のペプチドの存在下において組織培養インキュベーションにおいて終夜インキュベーションする。プレートをPBSで2回および蒸留水で1回洗浄する。次いで、PBSで3回洗浄する。ビオチン化抗IFN-gモノクローナル抗体(Pharmingen)をプレートに添加し(1μg/mlのPBS溶液50ul)、室温において2時間インキュベーションする。プレートをPBSで6回洗浄し、次いで50ulのストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ結合体(PBSで1000倍希釈、Pharmingen)を添加し、室温において2時間インキュベーションする。プレートをPBSで6回洗浄し、発色基質(BioRad)を添加し、黒点が出現するまで反応を進行させる。水で3回洗浄することによって反応を停止する。プレートを乾燥し、顕微鏡下でスポットを計数する。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３１】
（図１〜図１７）  一連のワクチン接種実験における本発明の化合物のアジュバント活性を示す。
（図１６）  イミキモドをpdpsc18.1のアジュバントとして使用する場合に、初回免疫投与の2週間後のIFN-γ sAgELISPOTを示す。図の1〜13のカラムの投与は以下のようである：
1.  2.0μg pdpsc 18
2.  0.2μg pdpsc 18
3.  0.02μg pdpsc 18
4.  2.0μg pdpsc 18 IMQ前
5.  0.2μg pdpsc 18 IMQ前
6.  0.02μg pdpsc 18 IMQ前
7.  2.0μg pdpsc 18 IMQ後
8.  0.2μg pdpsc 18 IMQ後
9.  0.02μg pdpsc 18 IMQ後
10.  2.0μg pdpsc 18 IMQ24時間pp
11.  0.2μg pdpsc 18 IMQ24時間pp
12.  0.02μg pdpsc 18 IMQ24時間pp
13.  2μg p7313plc
（図１７）  HBV sAgペプチドのIFN-γELISPOTを示す。