(57)【要約】本開示は、分析物分子の量を測定する方法を提供する。いくつかの態様では、この方法は、結合分子と分析物分子との相互作用が核酸分子を近接させるように、合成核酸分子にコンジュゲートした結合分子で試料を区画化することを含む。近接により、存在する分析物の量を決定するためにカウントできる分析物含有区画で、蛍光などの光シグナルをもたらす反応が誘発される。本開示は、アッセイを実行するための方法、システム、及び組成物を提供する。様々な態様では、本開示は、増幅反応を使用して、及び／または単一ステップまたは単一コンテナで、実行することができるデジタルアッセイ、特に特定の態様ではタンパク質アッセイに関する。
2022502031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分析物のデジタル検出のための方法であって、
均質アッセイを形成するために流体を複数の区画化された流体ボリュームに分割することであって、前記複数のボリュームのいくつかは区画化された非分析物含有ボリュームであり、前記複数のボリュームの他のものは区画化された分析物含有ボリュームである、前記分割することと、
前記複数の区画化されたボリュームからの光シグナルに基づいて、前記区画化された分析物含有ボリューム内の分析物の存在を検出することと、
を含み、
前記光シグナルが、分析物及び区画化された流体ボリュームの構成要素を含む前記区画化された分析物含有ボリュームにおける近接誘導相互作用によって誘発され、
前記光シグナルの存在を検出する間に、前記複数の区画化された流体ボリュームのそれぞれの流体が、本質的に、前記分割ステップによって生成された前記それぞれの区画化された流体ボリューム及びそれから生成された反応産物からなる、
前記方法。
【請求項２】
前記複数の区画化された流体ボリュームの各流体ボリュームが、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１の核酸分子に結合する、第１のプローブと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分が第２の核酸分子に結合する、第２のプローブと、を含み、
前記近接誘導相互作用が、前記分析物に結合すると、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間で起こり、
前記近接誘導相互作用が増幅反応を誘発し、
前記光シグナルが、前記分析物含有ボリュームにおける前記増幅反応によって誘発される蛍光シグナルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光が生成されるボリュームの数をカウントすることと、それによって前記試料の分析物カウントを生成することとをさらに含む、請求項１〜２、のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記検体カウントがポアソン統計に基づいて生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅反応が等温反応である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅反応がデジタル等温反応である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法がリガーゼなしで実行される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記光シグナルを使用して前記分析物の存在を検出する間、前記複数の区画化されたボリュームのそれぞれが、前記分割ステップによって生成されたそれぞれの区画化された流体ボリューム及びそれから生成された反応産物からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記流体を前記複数の区画化された流体ボリュームに分割した後、それぞれの流体ボリュームが、前記光シグナルを使用する前記分析物の前記検出まで、前記方法の残りの部分を通じて、単一のコンテナ内に収容されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が洗浄ステップなしで実行される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記光シグナルが吸光シグナルまたは発光シグナルである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記近接誘導相互作用と前記増幅反応の両方が等温反応である、請求項２〜６または８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記近接誘導相互作用と前記増幅反応の両方がデジタル等温反応である、請求項２〜６または８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記近接誘導相互作用が等温反応であり、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２〜４または６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記近接誘導相互作用がデジタル等温反応であり、前記増幅反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２〜４または６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記近接誘導相互作用が鎖置換相互作用である、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記近接誘導相互作用の前に、前記第２の核酸分子が、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合しており、
前記近接誘導相互作用が、ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液に変位させる前記第１及び第２の核酸間の相互作用を含み、
前記増幅反応が、ブロッカーオリゴヌクレオチドの変位後に前記第１の核酸分子を伸長するテンプレート重合を誘導することを含み、
各流体ボリュームは、伸長された第１の核酸を切断するように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼを含み、ニッキングされた部分の溶液への放出を可能にし、
前記蛍光が、前記分析物含有ボリューム内の前記ニッキングされた部分の前記放出に基づいて誘発される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅反応が、前記第１の核酸を繰り返し伸長し、前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、前記伸長された第１の核酸を繰り返し切断し、それにより、ニッキングされた核酸鎖の蓄積を引き起こし、
各流体ボリュームが、蓄積されたニッキングされた核酸鎖に結合するように構成された複数の蛍光部分を含み、
前記蛍光が、前記蓄積されたニッキングされた核酸鎖への蛍光部分の結合によって、及び前記複数のボリュームを前記結合した蛍光部分に近い共鳴光で照射することによって誘発され、それによって前記結合した蛍光部分からの蛍光を誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各流体ボリュームが、複数の補助基質を含み、前記補助基質は、それぞれ、補助核酸鎖を含み、
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それにより、溶液中で前記ニッキングされた部分と前記補助核酸鎖とを含む補助核酸複合体を形成し、
前記補助核酸複合体が、前記ニッキングされた部分を伸長し、前記ニッキングエンドヌクレアーゼまたはポリメラーゼによって前記伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成され、前記除去された伸長されたニッキングされた部分は、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記補助基質のうちの少なくとも一部がそれぞれ補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それによって、前記補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の補助基質が、前記拡張されたニッキングされた部分に結合し、それを非生産的に伸長して指数関数的増殖の閾値を作り出すことによってそれを不活性化するように設計された補助基質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅反応が、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、酵素を含まないハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅反応がローリングサークル増幅であり、
前記第２のプローブが前記第２の核酸分子に結合した環状核酸鎖を含むローリングサークル増幅基質を含み、
前記環状核酸鎖は、前記第１の核酸分子に結合する第１の結合部位と、前記第２の核酸分子に結合する第２の結合部位とを含み、前記環状核酸鎖は、前記第２の結合部位と前記第２の核酸分子との間よりも前記第１の結合部位と前記第１の核酸分子との間で同等以上の親和性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の結合部位が、前記第２の核酸分子の対応する核酸に相補的ではない１つ以上のミスマッチ核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質分析物のデジタル検出のための方法であって、
相同アッセイを形成するために流体を複数の区画化された流体ボリュームに分割することであって、前記複数のボリュームのいくつかは区画化された非分析物含有ボリュームであり、前記複数のボリュームの他のものは区画化された分析物含有ボリュームであり、それぞれの区画化された流体ボリュームが、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１の核酸分子に結合する、第１のプローブ、及び
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分、
を含み、前記第２の結合部分が第２の核酸分子に結合する、第２のプローブ、
をさらに含む、前記分割することと、
前記第１の核酸分子と前記第２の核酸分子間の近接誘導相互作用によって、前記区画化された分析物含有ボリューム中に増幅反応を引き起こすことと、
前記増幅反応に基づいて前記分析物含有ボリューム内の分析物の存在を検出することと、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記増幅反応が等温反応である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅反応がデジタル等温反応である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記分析物の存在を検出することが、
前記複数の区画化されたボリュームを光で照射することと、
前記区画化された分析物含有ボリュームからの蛍光を検出することと、
を含む、請求項２８〜３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記分割ステップが、各区画化された流体ボリュームを複数のコンテナのそれぞれのコンテナに配置することを含み、各区画化された流体ボリュームが、前記検出ステップが実行されるまでそれぞれのコンテナにとどまる、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記近接誘導性相互作用が、前記第２の核酸分子が伸長される増幅反応を誘発する、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の核酸分子が、前記第１の核酸をテンプレートとして使用して伸長される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の核酸分子が前記近接誘導相互作用の前にローリングサークル基質に結合し、前記近接誘導相互作用が、前記ローリングサークル基質をテンプレートとして使用する前記第２の核酸分子の伸長を誘発する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の核酸が、前記近接誘導相互作用の前に伸長性基質に結合し、前記近接誘導相互作用が、前記伸長性基質を溶液中に放出させる、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記伸長性基質の放出が指数関数的増幅反応を誘発する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記指数関数的増幅反応がＥＸＰｏｎｅｎｔｉａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記近接誘導相互作用がヘアピンアセンブリ反応を誘発する、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記近接誘導性相互作用が、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子の一部からなる触媒表面を生成する、請求項２８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記流体が、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合した補助基質を含み、前記触媒表面が、前記補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、それにより、前記補助基質を含む増幅反応を誘発する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記流体が、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合したローリングサークル基質を含み、前記触媒表面が、前記補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、それにより、前記ローリングサークル基質を含む増幅反応を誘発する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記流体が、複数の折り畳まれたヘアピン分子を含み、前記触媒表面が、前記複数の折り畳まれたヘアピン分子のうちの少なくとも１つの展開を触媒する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
鎖置換増幅を介して流体中の分析物の存在を検出するための方法であって、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１の核酸分子にコンジュゲートする、第１のプローブを、前記流体中の溶液に提供することと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分が第２の核酸分子にコンジュゲートする、第２のプローブを、前記流体中の溶液に提供することとであって、前記第２の核酸分子が、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する、前記提供することと、
前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間の近接誘導相互作用によって、前記非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液中に変位させることと、
テンプレート化された重合を誘導して、前記第１の核酸分子を伸長することを誘導することと、
前記第１の核酸分子の伸長に基づいて蛍光の生成を誘発することと、
蛍光に基づいて前記流体中の前記分析物を検出することと、
を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させることが、前記第１の核酸分子を前記第２の核酸分子に結合することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２の核酸をテンプレートとして使用して前記第１の核酸分子を伸長する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記伸長された第１の核酸を切断し、前記ニッキングされた部分の溶液への放出を可能にするように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼを流体中に提供することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記流体が複数の補助基質を含み、前記補助基質がそれぞれ、補助核酸鎖を含み、
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、溶液中で前記ニッキングされた部分と前記補助核酸鎖とを含む補助核酸複合体を形成し、
前記補助核酸複合体が、前記ニッキングされた部分を伸長し、前記ニッキングエンドヌクレアーゼを使用して前記伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成され、前記除去された伸長されたニッキングされた部分が、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記補助基質のうちの少なくとも一部がそれぞれ補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それによって、前記補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数の補助基質が、前記拡張されたニッキングされた部分に結合し、それを非生産的に伸長して指数関数的増殖の閾値を作り出すことによってそれを不活性化するように設計された補助基質を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記分析物がタンパク質である、請求項４６〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の核酸及び前記第２の核酸がＤＮＡである、請求項２〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
分析物の検出のための組成物であって、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１の核酸分子にコンジュゲートする、第１のプローブと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分が第２の核酸分子にコンジュゲートする、第２のプローブと、
を含む溶液を含み、
前記第２の核酸分子が非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合し、
前記第１の核酸鎖及び前記第２の核酸鎖が、核酸の対応するセクションを含み、その結果、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが前記分析物に結合することによって近接すると、前記非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドが、前記第１のプローブと前記第２のプローブと間の近接誘導相互作用によって溶液へと変位され、
前記近接誘導相互作用の参加物質が、直接的または間接的に固体担体に結合しない、前記組成物。
【請求項５７】
前記溶液が、前記近接誘導相互作用による前記非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドの変位の際に前記第１の核酸を伸長するためのポリメラーゼをさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記溶液が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分を切断し、前記ニッキングされた部分を溶液中に放出するように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記溶液が、照射されたときに核酸の蓄積に応答して蛍光を発するように構成された蛍光部分をさらに含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記溶液が、複数の補助基質をさらに含み、前記補助基質は、それぞれ、補助核酸鎖を含み、
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、溶液中で前記ニッキングされた部分と前記補助核酸鎖とを含む補助核酸複合体を形成し、
前記補助核酸複合体が、前記ニッキングされた部分を伸長し、前記ニッキングエンドヌクレアーゼによって前記伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成され、前記除去された伸長されたニッキングされた部分は、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含む、
請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記補助基質のうちの少なくとも一部がそれぞれ補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記補助核酸鎖が、前記伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それによって、前記補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させる、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記複数の補助基質が、前記拡張されたニッキングされた部分に結合し、それを非生産的に伸長して指数関数的増殖の閾値を作り出すことによってそれを不活性化するように設計された補助基質を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
分析物のデジタル検出のためのシステムであって、
それぞれが複数の区画に配置された複数の流体ボリュームであって、前記複数の流体ボリュームのいくつかは区画化された非分析物含有ボリュームであり、前記複数の流体ボリュームの他のものは区画化された分析物含有ボリュームである、前記複数の流体ボリュームと、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１の核酸分子にコンジュゲートする、前記流体ボリュームのそれぞれの第１のプローブと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分が第２の核酸分子にコンジュゲートする、前記流体ボリュームのそれぞれの第２のプローブと、
前記画内の前記流体ボリュームを照射し、前記第１のプローブと前記第２のプローブと間の近接誘導相互作用であって、前記相互作用が、前記第１のプローブと前記第２のプローブの前記区画内の溶液中の前記分析物標本への結合の際に起こる、前記近接誘導相互作用によって誘発される増幅反応に応答して蛍光を誘導するように構成された光源と、
を含む、前記システム。
【請求項６５】
前記増幅反応が等温反応である、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記増幅反応がデジタル等温反応である、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６７】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖増幅反応である、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６８】
前記増幅反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６９】
前記区画化された分析物含有ボリュームからの前記蛍光を検出し、蛍光の前記検出に基づいて分析物標本のカウントを生成するように構成された検出器をさらに含む、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７０】
前記増幅反応が、テンプレート化された重合を含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７１】
前記増幅反応がカスケード脱クエンチング反応を含む、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７２】
前記近接誘導相互作用が鎖置換相互作用である、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７３】
前記近接誘導相互作用が、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記システムが、流体を分割して前記複数の流体ボリュームを生成するように構成され、前記システムが、前記流体を分割したとき、蛍光の誘導を検出するまで前記複数の流体ボリュームのそれぞれを本質的に閉じた流体システムとして維持するようにさらに構成される、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７５】
分析物検出の方法であって、
分析物を含む流体を提供することと、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１のＤＮＡ分子にコンジュゲートする、第１のプローブを、前記流体中の溶液に提供することと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分がＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む第２のＤＮＡ分子にコンジュゲートする、第２のプローブを、前記流体中の溶液に提供することとであって、前記第２のＤＮＡ分子が、前記ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をブロックするブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する、前記提供することと、
前記第１の結合部分及び前記第２の結合部分を共通の分析物に結合し、それにより、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブを近接させることと、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの近接誘導相互結合によって、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液中に変位させることと、
ＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記第２のＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を誘導することと、
前記転写されたＲＮＡに基づいて蛍光の生成を誘発することと、
前記蛍光に基づいて前記流体中の前記分析物の存在を検出することと、
を含む、前記方法。
【請求項７６】
核酸配列ベースの増幅を使用して前記転写されたＲＮＡを増幅することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記分析物がタンパク質である、請求項７５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記方法が均質アッセイで実行される、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記方法がデジタルアッセイとして実行される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
分析物の検出のための組成物であって、
前記分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、前記第１の結合部分が第１のＤＮＡ分子にコンジュゲートする、第１のプローブと、
前記分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、前記第２の結合部分がＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む第２のＤＮＡ分子にコンジュゲートする、第２のプローブであって、前記第２のＤＮＡ分子が、前記ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をブロックするブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する、前記第２のプローブと、
ＲＮＡポリメラーゼと、
蛍光部分と、
を含む溶液を含み、
前記第１の結合ＤＮＡ及び前記第２の結合ＤＮＡ分子が、前記第１の結合部分及び前記第２の結合部分が共通の分析物に結合する際に近接するときに近接ベースの相互作用を生成するように構成され、前記近接ベースの相互作用が、ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液へと変位させ、前記ＲＮＡポリメラーゼが、前記第２のＤＮＡ分子をテンプレートとして使用してＲＮＡを転写することを可能にする、
前記組成物。
【請求項８１】
前記流体が、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、ヌクレオチド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、及び核酸配列ベースの増幅を使用して転写されたＲＮＡを増幅するためのＤＮＡプライマーをさらに含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記蛍光部分が蛍光色素である、請求項８０〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記蛍光部分が蛍光ナノ粒子である、請求項８０〜８１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
閾値オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項５６〜５９及び８０〜８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記複数の区画化された流体ボリュームが複数の補助基質を含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数の補助基質が、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する前記補助基質が前記増幅産物オリゴヌクレオチドを不活性化する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドの不活性化が、前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することが指数関数的増殖の閾値を作り出す、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記複数の補助基質が、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することによって前記増幅産物オリゴヌクレオチドを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出す補助基質を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記複数の区画化された流体ボリュームが複数の補助基質を含む、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９２】
前記複数の補助基質が、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質を含む、請求項９１に記載のシステム。
【請求項９３】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する前記補助基質が前記増幅産物オリゴヌクレオチドを不活性化する、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドの不活性化が、前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することを含む、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９５】
前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することが、指数関数的増殖の閾値を作り出す、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
前記複数の補助基質が、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、前記増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することによって前記増幅産物オリゴヌクレオチドを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出す補助基質を含む、請求項９１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／７３６，９７２号の権益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年９月２４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、３９３５５−７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２，５８５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
バイナリのイエスまたはノーの応答のカウントに基づいて測定が行われるデジタルアッセイは、その堅牢性、感度、及び精度のために、生物学においてますます重要になっている。アナログ測定では、実行標準を使用した較正がしばしば必要になるが、デジタル測定では較正が不要であり、アナログ測定よりも高速で、実施が簡単で、正確で、堅牢である可能性がある。
【０００４】
アナログアッセイに固有の制限、及び既存のデジタルアッセイの技術的制限を考えると、デジタルタンパク質アッセイを実行するための改善された方法及び装置を提供する必要があることは明らかである。本明細書に記載の本発明は、この必要性及びそれ以上に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、アッセイを実行するための方法、システム、及び組成物を提供する。様々な態様では、本開示は、増幅反応を使用して、及び／または単一ステップまたは単一コンテナで、実行することができるデジタルアッセイ、特に特定の態様ではタンパク質アッセイに関する。いくつかの態様では、増幅反応は等温増幅反応である。ある特定の態様では、等温増幅は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、増幅反応は、ＰＣＲ増幅である。ある特定の態様では、ＰＣＲ増幅は、デジタルＰＣＲ増幅である。多くの態様では、本明細書に開示されるアッセイは、洗浄ステップなしで実行される。本開示はさらに、均質アッセイとして、すなわち、固体支持体に反応剤を付着させずに実行することができるアッセイに関する。多くの実施形態では、均質アッセイは、均一溶液を使用し、これは、近接で誘発された増幅反応への全ての入力が約５０ｎｍよりも小さい溶液であり得る。必要に応じて、均質な溶液は分析物、及び／または５０ｎｍより大きい光プローブを含むことができる。
【０００６】
様々な態様では、本開示は、分析物のデジタル検出のための方法を提供する。流体が、複数の区画化された流体ボリュームに分割されて均質なアッセイを形成し、その結果、いくつかのボリュームは分析物を含み、いくつかは含まない。光シグナルは、分析物及び区画化されたボリュームの構成要素を含む分析物を含有ボリュームにおける近接誘導相互作用によって誘発される。分析物の存在は、分析物含有ボリュームにおいて、それらのボリュームからの光シグナルに基づいて検出される。検出中、複数の区画化された流体ボリュームのそれぞれの流体は、本質的に、分割ステップによって生成されたそれぞれの区画化された流体ボリューム及びそれから生成された反応産物からなる。
【０００７】
すなわち、流体をそれぞれの区画化されたボリュームに分割した後、反応の参加物質は、それぞれのボリュームの流体に維持されるか、または反応産物を生成するために消費されるが、除去されず、追加の反応産物または参加物質が追加されない。一方、反応に実質的に関与していない物質を追加または除去することができる。例えば、一部の液体が蒸発したり、追加されたりし得る。
【０００８】
多くの態様では、分析物はタンパク質である。
【０００９】
多くの態様では、複数の区画化された流体ボリュームの各流体ボリュームは、第１のプローブ及び第２のプローブを含む。第１のプローブは、分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、第１の結合部分は、第１の核酸分子に結合する。第２のプローブは、分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、第２の結合部分は、第２の核酸分子に結合する。多くの態様では、近接誘導相互作用は、分析物に結合すると、第１のプローブと第２のプローブとの間で起こり、増幅反応を誘発する。光シグナルは、分析物含有ボリュームにおける増幅反応によって誘発される蛍光シグナルであり得る。
【００１０】
多くの態様では、第１及び第２の核酸はＤＮＡ鎖である。例えば、それぞれは、任意選択で他の核酸分子とコンジュゲートした単一のＤＮＡ鎖であり得る。
【００１１】
いくつかの態様では、この方法は、蛍光が生成されるボリュームの数をカウントし、それによって試料の分析物カウントを生成することを含むことができる。例えば、分析物のカウントは、ポアソン統計に基づいて生成できる。
【００１２】
いくつかの態様では、増幅反応は等温反応である。ある特定の態様では、等温増幅は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、増幅反応は、ＰＣＲ増幅である。ある特定の態様では、増幅反応は、デジタルＰＣＲ増幅である。いくつかの態様では、この方法は、リガーゼなしで実行される。
【００１３】
いくつかの態様では、光シグナルを使用して分析物の存在を検出する間、複数の区画化されたボリュームのそれぞれは、分割ステップによって生成されたそれぞれの区画化された流体ボリューム及びそれから生成された反応産物からなる。すなわち、検出ステップは、分割ステップで生成されたのと同じ区画化されたボリュームの流体に対して実行される。例えば、流体を分割すると、各流体のボリュームを閉鎖系として維持できる。いくつかの態様では、流体は、複数の閉鎖されたコンテナに分割され、各流体ボリュームは、光シグナルを使用して分析物が検出されるまで、方法の残りを通して単一のコンテナ内に含まれる。
【００１４】
多くの態様では、この方法は、洗浄ステップなしで実行される。いくつかの態様では、光シグナルは、吸光シグナルまたは発光シグナルである。
【００１５】
いくつかの態様では、近接誘導相互作用及び増幅反応のうちの少なくとも１つは等温反応である。ある特定の態様では、近接誘導相互作用は等温反応である。ある特定の態様では、増幅反応は等温反応である。ある特定の態様では、等温反応は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、増幅反応は、ＰＣＲ反応である。ある特定の態様では、増幅反応は、デジタルＰＣＲ反応である。多くの態様では、近接誘導相互作用と増幅反応との両方は等温反応である。
【００１６】
多くの態様では、近接誘導相互作用は鎖置換相互作用である。いくつかの態様では、近接誘導相互作用の前に、第２の核酸分子は、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する。近接誘導相互作用は、ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液へと変位させる第１及び第２の核酸間の相互作用を含み、増幅反応は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの変位後に第１の核酸分子を伸長するためのテンプレート重合を誘導することを含む。第２の核酸は、例えば、第１の核酸の伸長のためのテンプレートであり得る。各流体ボリュームは、伸長された第１の核酸を切断し、ニッキングされた部分の溶液への放出を可能にするように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼを含み得る。ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９のバージョンなどの酵素またはリボザイムまたはＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであり得る。光シグナルは、分析物含有ボリューム内のニッキングされた部分の放出に基づいて誘発することができる。
【００１７】
いくつかの態様では、増幅反応は、第１の核酸を繰り返し伸長し、ニッキングエンドヌクレアーゼは、伸長された第１の核酸を繰り返し切断し、それにより、ニッキングされた核酸鎖の蓄積を引き起こす。いくつかの態様では、各流体ボリュームは、蓄積されたニッキングされた核酸鎖に結合するように構成された複数の蛍光部分を含み、蛍光は、蓄積されたニッキングされた核酸鎖への蛍光部分の結合によって、及び複数のボリュームを結合した蛍光部分に近い共鳴光で照射することによって誘発され、それによって結合した蛍光部分からの蛍光を誘導する。
【００１８】
いくつかの態様では、蛍光部分は色素である。いくつかの態様では、蛍光部分はタンパク質である。いくつかの態様では、蛍光部分はポリマードットである。
【００１９】
いくつかの態様では、各流体ボリュームは、複数の補助基質を含む。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そして少なくともいくつかの補助基質は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そしていずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合していない。補助核酸鎖は、伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それにより、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、溶液中で補助核酸複合体を形成する。補助核酸複合体は、ニッキングされた部分と補助核酸鎖とを含み、ニッキングされた部分を伸長し、ニッキングエンドヌクレアーゼまたはポリメラーゼによる伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成される。除去された伸長されたニッキングされた部分は、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含む。このプロセスは、核酸産物の蓄積のための指数関数的増幅を生み出すことができる。
【００２０】
多くの態様では、増幅反応は、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、酵素を含まないハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの態様では、増幅反応はローリングサークル増幅であり、第２のプローブは、第２の核酸分子に結合したローリングサークル増幅基質を含む。ローリングサークル基質は、環状核酸鎖を含む。環状核酸鎖は、第１の核酸分子に結合するための第１の結合部位と、第２の核酸分子に結合するための第２の結合部位とを含む。これらの部位は、任意選択で部分的または全体的に重複でき、例えば、１つの部位は他方の部位のサブセットであり得る。環状核酸鎖は、第２の結合部位と第２の核酸分子との間よりも第１の結合部位と第１の核酸分子との間で同等以上の親和性を有し得、それにより、環状核酸鎖の第１の核酸分子への転移を促進する。場合によっては、第２の結合部位は、第２の核酸分子の対応する核酸に相補的ではない１つ以上のミスマッチ核酸を含む。
【００２２】
様々な態様では、本開示は、タンパク質分析物のデジタル検出のための方法を提供する。流体は、複数の区画化された流体ボリュームに分割されて相同なアッセイを形成し、その結果、いくつかのボリュームは分析物を含み、いくつかは含まない。各区画化された流体ボリュームは、第１の核酸分子に結合した第１の結合部分を含む第１のプローブと、第２の核酸分子に結合した第２の結合部分を含む第２のプローブとをさらに含む。各結合部分は、分析物に結合するように構成され、例えば、共通のタンパク質分子上の異なる遺伝子座に結合するよう構成される。近接誘導相互作用が、分析物に結合すると、第１及び第２の核酸分子間で起こり、増幅反応が、区画化された分析物含有ボリュームをもたらす。分析物含有ボリューム内の分析物の存在は、増幅反応に基づいて検出される。いくつかの態様では、増幅反応は等温増幅反応である。ある特定の態様では、等温増幅は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、増幅反応は、ＰＣＲ増幅である。ある特定の態様では、増幅反応は、デジタルＰＣＲ増幅である。
【００２３】
いくつかの態様では、検出は、複数の区画化されたボリュームを光で照射し、区画化された分析物含有ボリュームからの蛍光を検出することによって実行される。
【００２４】
いくつかの態様では、分割ステップは、区画化された各流体ボリュームを複数のコンテナのそれぞれのコンテナに入れることを含む。区画化された各流体ボリュームは、検出ステップが実行されるまで、それぞれのコンテナにとどまることができる。
【００２５】
多くの態様では、近接誘導相互作用は、第２の核酸分子が伸長される増幅反応を誘発する。いくつかの態様では、第２の核酸分子は、第１の核酸をテンプレートとして使用して伸長される。場合によっては、第１の核酸分子は、近接誘導相互作用の前にローリングサークル基質に結合し、近接誘導相互作用は、ローリングサークル基質をテンプレートとして使用して、第２の核酸分子の伸長を誘発する。
【００２６】
多くの態様では、第１の核酸は、近接誘導相互作用の前に伸長性基質に結合し、近接誘導相互作用は、伸長性基質を溶液中に放出させる。いくつかの態様では、伸長性基質の放出は、指数関数的増幅反応を誘発する。
【００２７】
いくつかの態様では、近接誘導相互作用は、ヘアピンアセンブリ反応を誘発する。いくつかの態様では、近接誘導相互作用は、第１及び第２の核酸分子の一部から構成される触媒表面を生成する。場合によっては、流体は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合した補助基質を含み、触媒表面は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、それにより、補助基質を含む増幅反応を誘発する。場合によっては、流体は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合したローリングサークル基質を含み、触媒表面は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、それにより、ローリングサークル基質を含む増幅反応を誘発する。場合によっては、流体は複数の折り畳まれたヘアピン分子を含み、触媒表面は、複数の折り畳まれたヘアピン分子のうちの少なくとも１つの展開を触媒する。
【００２８】
様々な態様では、鎖置換増幅を介して流体中の分析物の存在を検出するための方法が提供される。第１のプローブ及び第２のプローブが溶液中に提供される。第１のプローブは、分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含み、結合部分は、第１の核酸分子にコンジュゲートする。第２のプローブは、分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含み、結合部分は、第１の核酸分子にコンジュゲートする。第２の核酸分子は、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第１プローブと第２プローブの間の近接誘導相互作用によって溶液中へと変位され、これは、それぞれが単一の分析物に結合すると発生し得る。テンプレート化された重合は、第１の核酸分子を伸長するために誘導され、この伸長は、流体中の分析物を検出するために使用される光シグナルを誘発するために使用される。いくつかの態様では、光シグナルは蛍光である。
【００２９】
多くの態様では、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させることは、第１の核酸分子を第２の核酸分子に結合することを含む。さらに、第１の核酸分子を伸長することは、第２の核酸分子をテンプレートとして使用することを含み得る。いくつかの態様では、伸長された第１の核酸を切断し、ニッキングされた部分の溶液への放出を可能にするように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼが流体中に提供される。
【００３０】
いくつかの態様では、流体は、複数の補助基質を含む。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そして少なくともいくつかの補助基質は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そしていずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合していない。補助核酸鎖は、伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それにより、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、溶液中でニッキングされた部分と補助核酸鎖とを含む補助核酸複合体を形成する。補助核酸複合体は、ニッキングされた部分を伸長し、ニッキングエンドヌクレアーゼまたはポリメラーゼを使用して伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成され、前記除去された伸長されたニッキングされた部分は、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含む。例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼは、伸長されたニッキングされた部分を切断することができ、これは、追加の伸長を実行するポリメラーゼによって溶液中へと除去され得る。
【００３１】
多くの態様では、分析物はタンパク質である。様々な態様では、核酸分子はＤＮＡである。
【００３２】
様々な態様では、本開示は、分析物の検出に使用するための組成物を提供する。組成物は、第１の核酸分子に結合した第１の結合部分を含む第１のプローブと、第２の核酸分子に結合した第２の結合部分を含む第２のプローブとを含む溶液を含む。第１及び第２の結合部分のそれぞれは、分析物に結合するように構成される。第２の核酸分子はまた、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。第１及び第２の核酸鎖は、核酸の対応するセクションを含み、その結果、第１及び第２のプローブが分析物に結合することによって近接すると、非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第１及び第２のプローブ間の近接誘導相互作用によって溶液へと変位される。さらに、近接誘導相互作用の参加物質は、直接的または間接的に固体担体に結合しない。
【００３３】
多くの態様では、溶液は、近接誘導相互作用による非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドの変位の際に第１の核酸を伸長するためのポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様では、溶液は、伸長された第１の核酸のニッキングされた部分を切断し、前記ニッキングされた部分を溶液中に放出するように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼをさらに含む。溶液は、照射されたときに核酸の蓄積に応答して蛍光を発するように構成された蛍光部分をさらに含むことができる。いくつかの態様では、流体は、複数の補助基質をさらに含む。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そして少なくともいくつかの補助基質は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そしていずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合していない。補助核酸鎖は、伸長された第１の核酸のニッキングされた部分に結合するように構成され、それにより、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドを変位させ、溶液中でニッキングされた部分と補助核酸鎖とを含む補助核酸複合体を形成する。補助核酸複合体は、ニッキングされた部分を伸長し、ニッキングエンドヌクレアーゼまたはポリメラーゼによる伸長されたニッキングされた部分の一部の除去を繰り返し誘発するように構成される。除去された伸長されたニッキングされた部分は、最初に除去されたニッキングされた部分のコピーを含むことができる。
【００３４】
様々な態様では、本開示は、分析物のデジタル検出のためのシステムを提供する。このシステムは、それぞれ複数の区画に配置された複数の流体ボリュームを含む。複数の流体ボリュームのいくつかは、区画化された非分析物含有ボリュームであり、他は、区画化された分析物含有ボリュームである。各流体ボリュームは、分析物に結合するように構成された第１の結合部分を含む第１のプローブを含み、前記第１の結合部分は、第１の核酸分子にコンジュゲートする。各流体ボリュームは、分析物に結合するように構成された第２の結合部分を含む第２のプローブをさらに含み、前記第２の結合部分は、第２の核酸分子にコンジュゲートする。このシステムはさらに、区画内の流体ボリュームを照射し、第１のプローブと第２のプローブとの間の近接誘導相互作用によって誘発される増幅反応に応答して蛍光を誘導するように構成された光源を含む。いくつかの態様では、増幅反応は等温増幅反応である。ある特定の態様では、等温増幅は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、増幅反応は、ＰＣＲ増幅である。ある特定の態様では、増幅反応は、デジタルＰＣＲ増幅である。相互作用は、区画内の溶液中の分析物に第１及び第２のプローブが結合すると発生する。
【００３５】
多くの態様では、システムは、区画化された分析物含有ボリュームからの蛍光を検出し、蛍光の検出に基づいて分析物標本のカウントを生成するように構成された検出器をさらに含む。
【００３６】
多くの態様では、増幅反応は、テンプレート化重合、またはカスケード脱クエンチング反応を含む。いくつかの態様では、テンプレート化重合またはカスケード脱クエンチング反応を含む増幅反応は、等温増幅反応である。ある特定の態様では、テンプレート化重合またはカスケード脱クエンチング反応を含む増幅反応は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、テンプレート化重合またはカスケード脱クエンチング反応を含む増幅反応は、ＰＣＲ増幅である。ある特定の態様では、テンプレート化重合またはカスケード脱クエンチング反応を含む増幅反応は、デジタルＰＣＲ増幅である。
【００３７】
多くの態様では、近接誘導相互作用は鎖置換相互作用である。多くの態様では、近接誘導相互作用は、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、酵素を含まないハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される。
【００３８】
いくつかの態様では、システムは、流体を分割して複数の流体ボリュームを生成するように構成される。システムは、蛍光の誘導を検出するまで流体を分割する際に、本質的に閉じた流体システムとして複数の流体ボリュームのそれぞれを維持するようにさらに構成することができる。本質的に閉じた流体システムは、例えば、添加または蒸発による流体の獲得または喪失など、相互作用または反応に重要ではない物質の添加または除去を可能にすることができる。代替的に、本質的に閉じた流体システムを完全に閉じて、各ボリュームの元の流体構成要素と任意の反応産物を維持することができる。
【００３９】
いくつかの態様では、システムは、ヌクレオチド三リン酸などのある特定の反応産物が個々の区画に流入及びそこから流出することを可能にされることを除いて、本質的に閉じられた流体区画を含み得る。そのような実施形態では、分析物検出のためのデジタルアッセイとして使用される場合、分析物も反応産物（例えば、増幅反応によって生成された核酸鎖）も区画間を移動できないようにする必要がある。
【００４０】
様々な態様では、分析物検出のための方法が提供される。分析物、第１のプローブ、及び第２のプローブを含む流体が提供される。第１のプローブは、第１のＤＮＡ分子にコンジュゲートされた第１の結合部分を含む。第２のプローブは、第２のＤＮＡ分子にコンジュゲートされた第２の結合部分を含む。第１及び第２の結合部分のそれぞれは、分析物に結合するように構成される。第２のＤＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含み、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をブロックするブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する。第１及び第２の結合部分は、分析物の共通の分子に結合することができ、それにより、第１及び第２のプローブを近接させる。プローブのＤＮＡ分子間に近接誘導相互作用が生じ、ブロッカーオリゴヌクレオチドの溶液への変位を生じる。次いで、ＲＮＡポリメラーゼが第２のＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を誘導し、転写に基づいて液体中の分析物の存在が検出される。多くの態様では、ＲＮＡの転写は、検出に使用される蛍光などの光シグナルの生成を誘発する。いくつかの態様では、蛍光は、ＲＮＡの蓄積によって誘発される。
【００４１】
いくつかの態様では、転写されたＲＮＡは、核酸配列ベースの増幅を使用してさらに増幅される。いくつかの態様では、この方法は、均質アッセイを使用して実行される。例えば、この方法はデジタルアッセイであり得る。
【００４２】
様々な態様では、分析物の検出のための組成物が提供される。組成物は、第１のプローブ及び第２のプローブを含む均質な流体を含む。第１のプローブは、分析物に結合するように構成され、第１のＤＮＡ分子に結合する第１の結合部分を含む。第２のプローブは、分析物に結合するように構成され、第２のＤＮＡ分子に結合する第２の結合部分を含む。第２のＤＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含み、第２のＤＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼ結合部位をブロックするブロッカーオリゴヌクレオチドに結合する。流体はさらに、ＲＮＡポリメラーゼ及び蛍光部分を含む。第１及び第２の結合ＤＮＡ分子は、第１及び第２の結合部分が分析物の共通の分子に結合すると近接したときに近接ベースの相互作用を生成するように構成される。近接ベースの相互作用により、ブロッカーオリゴヌクレオチドを溶液へと変位させ、ＲＮＡポリメラーゼが第２のＤＮＡ分子をテンプレートとして使用してＲＮＡを転写できるようになる。
【００４３】
多くの態様では、組成物は、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、ヌクレオチド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、及び核酸配列ベースの増幅を使用して転写されたＲＮＡを増幅するためのＤＮＡプライマーからなる群から選択される１つ以上の部分をさらに含む。例えば、組成物は、上記に列挙された部分の全てを含むことができる。
【００４４】
いくつかの態様では、蛍光部分は、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、または蛍光タンパク質である。
【００４５】
様々な態様では、本明細書に開示される増幅反応は、分析物に近接して起こる付着反応である。他の態様では、本明細書に開示される増幅反応は、溶液中で起こり、必ずしも分析物に近接しているとは限らない分離反応である。ある特定の態様では、本明細書に開示される増幅反応は、一部の増幅が分析物に近接して起こり、一部が分析物の近接せずに溶液中で起こる、部分的な付着反応である。
【００４６】
様々な態様では、本明細書に開示される増幅反応は、重合反応である。例えば、増幅反応は、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合などの核酸重合を含み得る。様々な態様では、本明細書に開示される増幅反応は、脱クエンチング反応などの非重合反応である。例えば、反応は、自己結合した核酸鎖または結合した鎖の対の結合解除を含み得る。いくつかの実施形態では、脱クエンチングは、ＤＮＡヘアピン分子の結合解除及び集合を含み得る。
【００４７】
様々な態様では、検出は光学的検出であり得る。いくつかの実施形態では、光学的検出は蛍光を使用することができる。いくつかの実施形態では、光学的検出は発光を使用することができる。いくつかの実施形態では、光学的検出は、吸光検出を含むことができる。様々な態様では、分析物の検出は、非光学的検出方法を含み得る。
【００４８】
様々な態様では、本明細書に開示される方法及びシステムは、分析物検出のためのデジタルアッセイを使用することができる。他の態様では、非デジタル（例えば、アナログ）検出を使用することができる。
【００４９】
様々な態様では、本明細書に開示される増幅反応は、指数関数的増幅反応として進行する。他の態様では、増幅反応は線形反応として進行する。いくつかの態様では、反応は実質的に線形反応として進行することができる。すなわち、反応速度が線形反応と同様かまたはそれより速く増殖するが、指数反応よりは遅く、例えば、多項式の増殖速度による。実質的に線形反応には、特に明記しない限り線形反応が含まれる。
【００５０】
様々な態様では、本明細書に開示される増幅反応は等温反応である。ある特定の態様では、等温増幅は、デジタル等温増幅である。いくつかの態様では、本明細書に開示される増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応である。ある特定の態様では、増幅反応は、デジタルＰＣＲ増幅である。本明細書に開示される近接ベースの相互作用は、好ましくは等温反応でもある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される近接ベースの相互作用は、デジタルＰＣＲ反応を含む。ある特定の実施形態では、近接ベースの相互作用と増幅反応とはデジタル等温反応である。場合によっては、方法とシステムが等温条件下及び／または相互作用のステップを実行し、これは実質的に一定の温度である。加熱ステップは、等温反応の前に実行することができ、例えば、温度閾値値を超えることによって反応の開始を誘発する。場合によっては、増幅及び／または相互作用のステップを実行する方法及びシステムは、ＰＣＲ増幅を含む条件下で実行され、これはサーマルサイクリングによる。
【００５１】
様々な態様では、本明細書に開示される結合部分は、抗体またはその部分を含む。抗体は、抗原に結合する抗原結合部位を含むことができる。分析物は、抗体が結合する部位を含むことができ、それは、例えば、それぞれが特定のプローブに対応する特定の抗体に結合する複数の結合部位である。
【００５２】
様々な態様では、本明細書に開示される方法及びシステムは、洗浄ステップを必要とせずに分析物を検出する。様々な態様では、近接ベースの相互作用と増幅反応は、単一のコンテナで実行される。様々な態様では、本明細書に開示される方法及びシステムは、検出のための単一のステップのみを含み、前記ステップは、流体構成要素（例えば、プローブ）間の近接ベースの相互作用から始まり、光学的または他の方法による分析物の存在を検出するために使用される増幅反応を誘発するよう進行する。
【００５３】
様々な態様では、本明細書に開示される方法及びシステムは、閾値オリゴヌクレオチドを含む複数の区画化されたボリュームを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法及びシステムは、複数の補助基質を含む、複数の区画化されたボリュームを含む。ある特定の態様では、複数の補助基質は、閾値オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、複数の区画化された流体ボリュームは、複数の補助基質を含む。ある特定の態様では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質を含む。いくつかの態様では、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質はそれを不活性化する。ある特定の態様では、増幅産物オリゴヌクレオチドの不活性化は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合することを含む。いくつかの態様では、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合することは、指数関数的増殖の閾値を作り出す。ある特定の態様では、増幅産物オリゴヌクレオチドの不活性化は、増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することを含む。いくつかの態様では、増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することは、指数関数的増殖の閾値を作り出す。ある特定の態様では、複数の補助基質は、指数関数的増殖の閾値を作り出すために増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質を含む。ある特定の態様では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、増幅産物オリゴヌクレオチドを非生産的に伸長することによって増幅産物オリゴヌクレオチドを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出す補助基質を含む。
【００５４】
本要約は、以下の詳細な説明でさらに説明される簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供される。本要約は、特許請求される主題の主要な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題を決定する際の補助として使用されることも意図されていない。
【００５５】
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
本明細書に記述される新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特に記載される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】分析物検出の方法を示す。
【図１Ｂ】様々な実施形態による分析物の検出のための組成物を示す。
【図１Ｃ】流体中の分析物を検出するために近接ベースの相互作用を使用するための一般的なスキームを示す。分析物検出のための「付着」検出スキームを示す。
【図１Ｄ】流体中の分析物を検出するために近接ベースの相互作用を使用するための一般的なスキームを示す。「分離」分析物検出スキームを示す。
【図２】付着した鎖置換増幅を使用する分析物検出の方法を示す。
【図３】付着した鎖置換増幅と組み合わせて分離した指数関数的増幅を使用する分析物検出の方法を示す。
【図４】付着したヘアピンアセンブリ反応を使用する分析物検出の方法を示す。
【図５】ヘアピンアセンブリ反応を触媒するために三叉路を使用する分析物検出の方法を示す。
【図６】付着した鎖置換増幅を触媒するために三叉路を使用する分析物検出の方法を示す。
【図７】付着したローリングサークル増幅を使用する分析物検出の方法を示す。
【図８】分離したローリングサークル増幅を活性化するために三叉路を使用する分析物検出の方法を示す。
【図９】分離した鎖置換増幅を使用する分析物検出の方法を示す。
【図１０】分離したローリングサークル増幅を使用する分析物検出の方法を示す。
【図１１】ＲＮＡ重合を誘発するためにブロッキングオリゴヌクレオチドの鎖置換を使用する分析物検出のための方法を示す。
【図１２Ａ】近接が鎖置換を誘導して、ポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼのための活性基質を生成する、付着した鎖置換増幅反応の概略図を示す。
【図１２Ｂ】鎖置換増幅を伴う分析物の検出における経時的な蛍光を示す。
【図１２Ｃ】鎖置換増幅からの試料の相対的蛍光を示すエンドポイント蛍光デジタル写真を示す。
【図１２Ｄ】鎖置換増幅において標的タンパク質を含む場合と含まない場合の３重の実験で実行された、経時的な蛍光を示す。
【図１２Ｅ】標的タンパク質を含む場合と含まない場合の３重の試料の相対的蛍光を示すエンドポイント蛍光デジタル写真を示す。
【図１３Ａ】付着した鎖置換増幅（「ＥＸＰＡＲ反応」と表示）と組み合わせた分離した指数増幅を使用する検出の概略図を示し、近接は、鎖置換を誘導して、ポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼの活性基質を生成し、指数関数的増殖を生成するその後の反応を生成する。
【図１３Ｂ】ＥＸＰＡＲ増幅を伴う分析物の検出における経時的な蛍光を示す。
【図１３Ｃ】デジタル等温増幅アッセイから生成された蛍光液滴のエンドポイント画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本開示は、一般に、近接ベースの相互作用を含むアッセイを使用して、分析物、特にタンパク質分析物を検出するための組成物、システム、及び方法に関する。
【００５９】
試料中の増幅バイオマーカー検出に最も一般的に使用される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ここでは、ＤＮＡ重合酵素によって触媒される温度感受性反応でＤＮＡが増幅される。ＰＣＲでは、試料は通常、サーマルサイクリングデバイスによって約６０℃から約９５℃の範囲の２つまたは３つの温度の間で循環される。ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅することにより、基礎生物学から臨床診断や法医学まで、幅広い分野が大幅に進歩した。ＰＣＲはまた、「デジタル」読み出しのために液滴内のＤＮＡを検出するように改良された。これにより、個々の核酸分子の絶対的な定量化またはカウントが可能になる。しかしながら、核酸のデジタル検出に関していくらかの進歩がなされたが、タンパク質の検出のための技術の開発の必要性が残っている。
【００６０】
タンパク質を検出するための増幅方法、特に洗浄ステップを必要としない方法が必要である。特に、タンパク質を検出するための等温増幅法、特に洗浄ステップを必要としない方法が必要である。等温タンパク質検出には、ポイントオブケア診断や個別化された精密医療など、幅広い用途がある。タンパク質検出のための等温増幅は、ＰＣＲに比べて少なくとも２つの実質的な利点を提供する。増幅を達成するために温度を正確に変更する必要がなく（すなわち、この技法は等温条件下で実行できる）、タンパク質分析物に適用できる（ＰＣＲは主にＤＮＡの検出に有用である）。本明細書に開示されるタンパク質検出のための等温技術は、タンパク質の等温増幅ベースの検出を提供し、デジタルアッセイの一部として実行することができる。
【００６１】
本明細書に記載のデジタルアッセイは、試料（またはその誘導体）を複数の区画化されたボリュームに分割、分注、または他の方法で分離すること、複数の区画化されたボリュームを検出可能なシグナルまたはコードの存在または非存在について個別に評価すること（例えば、蛍光プローブによって生成された検出可能なシグナルまたはコードを検出すること）、評価された各区画化されたボリュームにバイナリ値を割り当てることを含むことができる。場合によっては、区画化されたボリューム内の、存在、非存在、波長、強度、及び／または検出可能なシグナルもしくはコード（またはその一部）の寿命に基づいて、区画化されたボリュームに値を割り当てることができる。評価された区画化されたボリュームに割り当てられた値を使用して、各区画化されたボリューム内の標的分子の特性を決定できる。例えば、区画化されたボリューム内の検出可能なシグナル（例えば、検出可能なコードまたはその側面）の検出することまたは検出を失敗することは、区画化されたボリューム内の標的分子の存在または非存在を示し得、そして試料中の標的分子の濃度を決定するために使用され得る。場合によっては、区画化されたボリューム内の検出可能なシグナルを検出することまたは検出できないことを使用して、試料中のタンパク質分子が何であるか、またはその量を決定することができる。
【００６２】
１つの参考文献は、酵素、ベータガラクトシダーゼのビーズ捕捉に基づく等温デジタルタンパク質ＥＬＩＳＡを報告している。しかしながら、この種の不均一な技法（すなわち、溶液中で進行することではなく捕捉に依存する技法）には、かなりの制限がある。タンパク質検出器は、偽陽性シグナルをもたらすであろうバックグラウンド分析物を除去するために洗浄する必要がある。この必要な洗浄ステップは重大な欠点である。さらに、ビーズ捕捉の必要性は、技法が均質な溶液中で実行されることを妨げ、技法をさらに制限する。本明細書に開示される検出技法は、必要な洗浄ステップなしで、混合して読み取る方法で実行することができ、それらは、ビーズなどの支持体を使用せずに溶液中で実行することができる。
【００６３】
均質溶液中のタンパク質分析物のデジタル分析のための従来の方法もまた、本明細書に開示される技法と比較して複数の欠点を有する。例えば、近接ライゲーションアッセイとＰＣＲを使用してある特定のタンパク質毒素を検出する手法が報告されている。しかしながら、この技法は、分析物の等温検出を妨げる、かなりの範囲にわたる制御された温度変化を含むステップの必要性によって妨げられる。さらに、この技法には遠心分離ステップが必要であり、これにはコンテナ間の移動が必要である。これにより、この技法をワンポットまたはシングルステップで実行することが妨げられる。対照的に、本明細書に開示される等温技法は、等温プロセスにおけるタンパク質分析物の検出を可能にし、遠心分離などの追加のステップなしで、単一のコンテナ内で実行することができる。
【００６４】
最後に、近接誘導ローリングサークル増幅及びヘアピンアセンブリ反応など、アナログアッセイで使用するためのある特定の技法が開発されている。しかしながら、これらの技法は、較正が必要であり、修正や定量化が困難なエラーの影響を受けやすくなり得るアナログ溶液反応への依存によって制限される。例えば、増幅効率の不確実性は、指数関数的増殖をもたらす反応を処理するときに非常に大きなエラーをもたらす可能性がある。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅（本明細書では「ＰＣＲ増幅」などとも呼ばれる）を、タンパク質の検出に使用することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＲ増幅は、洗浄ステップを必要としない。ＰＣＲ増幅は、携帯型機械を使用して達成することができ、本明細書に開示されるポリメラーゼ連鎖増幅反応（本明細書では「ＰＣＲ増幅反応」、「ＰＣＲ反応」などとも呼ばれる）の有利な用途を提供する。本明細書に開示されるタンパク質検出のためのＰＣＲ増幅は、タンパク質のＰＣＲ増幅ベースの検出を提供し、デジタルアッセイの一部として実行することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅技法は、デジタルＰＣＲ増幅を含む。
【００６６】
図１Ａは、分析物検出の方法１００を示す。この方法は、流体に溶解または分散している分析物を検出するために実行することができる。例えば、この方法は、流体中のタンパク質を検出するために使用することができる。好ましくは、この方法は均質アッセイで実行される。すなわち、この方法は、ビーズまたは他の形態の固体支持体への粒子の付着に依存することなく実行される。この特徴により、柔軟性と効率が向上する。例えば、不均質アッセイとは異なり、洗浄ステップを使用する必要がない。
【００６７】
ステップ１１２において、分析物を含む流体が提供される。好ましくは、分析物はタンパク質であり、流体は多くの分析物タンパク質分子を含む。近接ベースの相互作用で分析物及び互いに相互作用することができる追加の流体構成要素を提供することができる。例えば、構成要素は、それぞれが分析物に結合するように構成された第１のプローブ及び第２のプローブを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、第１の核酸分子に結合した第１の結合部分を含む。第１の結合部分は、分析物に対して親和性を有する抗体であり得る。第２のプローブは、同様に、第２の核酸に結合した第２の結合部分を含むことができる。第２の結合部分もまた、分析物に対して親和性を有する抗体であり得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の結合部分は、共通のタンパク質分子の異なるそれぞれの部分に結合するように構成された異なる抗体である。流体構成要素はまた、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼ分子などの追加の反応成分、及び核合成で使用するための適切な核酸塩基、ならびに溶媒（例えば、水）、緩衝液などの非反応性構成要素を含むことができる。第１及び第２の核酸は好ましくはＤＮＡ分子である。
【００６８】
ステップ１１４において、流体は区画化されたボリュームに分割され、デジタルアッセイを生成する。区画化されたボリュームは、例えば、液滴またはそれぞれが単一の液滴を含むウェルであり得る。流体を分割する他の方法も使用できる。例えば、区画化されたボリュームは、より大きな流体ボリューム内に膜または他の流体障壁を導入することによってｉｎ  ｓｉｔｕで生成することができ、それにより、流体構成要素をそれぞれの区画化されたボリュームに分割する。好ましくは、区画化されたボリュームは、ビーズなどの支持構造の存在に依存することなく反応を受ける均質な流体を含む。一部の区画化されたボリュームが分析物を含まず、一部の区画化されたボリュームがいくつかの分析物を含むように、流体を適切に希釈することができる。流体が均質であり、分析物が流体に完全に拡散している場合、分割ステップは、分析物分子をそれぞれの区画化されたボリュームにランダムに割り当てる傾向がある。各区画化されたボリュームが他のボリュームと類似している場合、分割ステップは典型的には、ポアソン分布に従って区画化されたボリュームに分析物を投入する。デジタルアッセイは通常、分析物を含むボリュームと分析物を含まないボリュームを区別することに依存しているため、区画化されたボリュームのかなりの分画に分析物が含まれないと予想されるアッセイでは、最良のシグナル対雑音比を達成できる。デジタルアッセイの形成には分割ステップ１１４の使用が好ましいが、いくつかの実施形態では、分割ステップを省略できる。例えば、いくつかの実施形態では、方法１００を実行して、単一の流体ボリュームでアナログ（すなわち、非デジタル）測定を生成することができる。
【００６９】
様々な流体構成要素は、分析物を流体に加えるステップの前に流体に導入することができ、または同時にまたは後で、例えば、分割ステップ１１４の間に導入することができる。場合によっては、異なる構成要素を異なる時間に追加できる。例えば、流体を区画に分割するまで１つ以上の試薬を差し控えて、区画化されたボリューム内でのみ反応が進行するようにし、相互汚染から保護することができる。
【００７０】
ステップ１１６において、近接ベースの相互作用が流体構成要素間で発生することが可能となる。相互作用は、例えば、溶液中の分析物及び他の流体構成要素の存在から自発的に起こり得るか、または相互作用が誘発され得る。例えば、相互作用及び／またはその後の増幅反応（例えば、脱クエンチングまたは酵素増幅）は、流体の温度を臨界温度より高くすることによって誘発され得る。好ましくは、増幅反応は等温反応である。必要に応じて、近接ベースの相互作用も等温反応である。より好ましくは、全ての等温増幅はデジタル等温増幅である。等温反応は、温度をある特定のレベルにすることで誘発できるが、反応を完了するために温度を変更する必要はない。本明細書で使用されるとき、等温反応は、一定の温度で完了するまで進行する反応である。「等温」という用語は、反応を特徴付けるが、反応が起こる条件ではなく、したがって、等温反応は、反応が行われるときにシステムの温度が変化しても、温度が一定に保たれていれば反応が依然として起こる限り、等温反応のままである。対照的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、完了まで実行するために様々な温度で多数のサイクルを必要とするため、等温ではない。他方、本明細書で論じられる増幅反応及び他の相互作用は、ある特定の範囲内の温度を必要とし得、温度の関数としてわずかに異なる速度で進行し得るが、完了まで実行する反応の過程で温度を変化させる必要がないため、典型的には等温である。いくつかの実施形態では、増幅反応はＰＣＲ反応であり、いくつかの実施形態では、増幅反応はデジタルＰＣＲ反応である。ある特定の実施形態では、増幅はＰＣＲ反応（例えば、デジタルＰＣＲ反応）であり、近接ベースの相互作用は、等温反応（例えば、デジタル等温反応）である。本明細書で使用されるとき、ＰＣＲ反応は、異なる温度依存性反応を可能にするために熱サイクリングを使用して完了するまで進行するものである。いくつかの実施形態では、増幅反応は、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、酵素を含まないハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増幅反応は、酵素を含まないヘアピン集合反応、酵素を含まない触媒ヘアピン反応、酵素を含まないハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増幅反応は、ヘアピン集合反応、触媒ヘアピン反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、増幅反応は、ヘアピン集合反応、触媒ヘアピン反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応、及び近接誘導ローリングサークル増幅、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００７１】
ある特定の実施形態では、増幅反応は、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、核酸配列ベースの増幅）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ループ媒介増幅）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｌ、鎖置換増幅）、ＥＸＰＡＲ（ＥＸＰｏｎｅｎｔｉａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、指数関数的増幅反応）、及びローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）などのデジタル等温増幅を使用し、デジタル化されたボリュームのアレイの使用は、デジタルＰＣＲと同様に、デジタルＮＡＳＢＡ、デジタルＬＡＭＰ、デジタルＳＤＡ、デジタルＥＸＰＡＲ、及びデジタルローリングサークル増幅を実行するために使用される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、近接ベースの相互作用は、第１及び第２の結合部分（例えば、抗原）に結合した第１及び第２の核酸分子間の相互作用を含み、それぞれタンパク質分析物に結合する第１及び第２のプローブを形成する。２つのプローブが共通の分析物に結合すると、２つのプローブが近接し、核酸鎖が相互作用できるようになる。いくつかの実施形態では、近接ベースの相互作用は、第１及び第２の核酸分子間の対形成相互作用を含む。例えば、核酸分子は、ＲＮＡの転写、ポリメラーゼによる２つの核酸分子のうちの１つの伸長、または２つの核酸分子の部分の部分的な対形成による触媒の形成を可能にするために対形成することができる。近接ベースの相互作用を進めることができる様々な方法について、残りの図に関してより詳細に説明する。場合によっては、近接ベースの相互作用により、流体中の溶液中に核酸鎖の蓄積などの反応産物が生成されてもよい。場合によっては、これらの副産物は、他の流体構成要素と相互作用して、例えば、指数関数的増幅反応において、さらなる反応産物を生成することができる。
【００７３】
ステップ１１８において、分析物は、近接ベースの相互作用に基づいて検出される。光シグナルを生成する蛍光、吸光、発光、または同様の方法による光学的検出が好ましい検出方法である。いくつかの実施形態では、蛍光部分（例えば、色素、ナノ粒子、タンパク質、またはポリマードット（ＰＤｏｔ）などの蛍光プローブ）が流体中に提供され、蛍光部分は、近接ベースの相互作用の蓄積された産物と相互作用する。蓄積された産物と相互作用する蛍光部分は、適切な波長の光による照射に応答して蛍光を発することができる。例えば、ＳｙＢｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（または一本鎖ＤＮＡの場合はＳｙＢｒ  ＧｒｅｅｎＩＩもしくはＳｙＢｒＧｏｌｄ）を使用して、標準的な蛍光検出を使用して溶液中に蓄積されたＤＮＡ分子を検出できる。代替的または追加的に、他の検出メカニズムを使用して分析物を検出することができる。いくつかの実施形態では、近接ベースの相互作用によって生成または変更された核酸鎖の検出は、吸収検出、比色検出、または様々な形態の化学的、電気的、または磁気的検出を使用して実行することができる。例えば、いくつかの実施形態では、挿入色素を使用して、ポリメラーゼによって生成された二本鎖ＤＮＡなどの核酸分子の蓄積を検出することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡまたは他の核酸産物の蓄積は、骨格相互作用またはライトアップアプタマーとその標的との間の相互作用によって一本鎖産物と相互作用する色素によって検出される。いくつかの実施形態では、他の核酸産物のＤＮＡの蓄積は、分子ビーコンによって検出される。いくつかの実施形態では、核酸産物の蓄積は、産物の核酸（例えば、ＤＮＡ）におけるＧ−四重鎖構造の形成によって検出され、これは、次いで、さらなる蛍光または着色産物を触媒することができる。いくつかの実施形態では、核酸産物の蓄積は、産物または産物の重合に関連する化学発光または生物発光によって検出される。いくつかの実施形態では、産物は、静電容量、導電率、または電子移動速度の変化など、溶液の電気化学的変化によって検出される。
【００７４】
アナログアッセイの実施形態では、検出は、流体中の分析物の数または濃度に相関するシグナル強度を決定することを含むことができる。デジタル実施形態では、検出は、複数の区画化されたボリュームについて、分析物を含むものと含まないものとを判定することを含むことができる。例えば、蛍光ベースの実施形態では、蛍光は、１つのタイプのボリューム（例えば、分析物を含むボリューム）から検出することができ、他方のタイプ（例えば、分析物を含まないボリューム）からは検出できない。あるいは、分析物含有ボリュームでの反応が蛍光を可能にするのではなく消光するのに役立つ場合は、読み出しを逆にすることができる。どのボリュームに分析物が含まれているかの決定に基づいて、分析物の総数などの分析物の特性を測定することができる。この測定は、ゼロ分析物と非ゼロ分析物を含むボリュームの数をポアソン分布と比較することで実行できる。例えば、ポアソン統計を使用して、コンテナごとの分析物の平均量を生成できる。分析物の総数または量は、ボリューム数にこの平均を掛けることによって生成できる。
【００７５】
方法１００は、デジタルアッセイを実行するように構成されたシステムによって実行することができる。システムは、流体を、それぞれ複数の区画に配置された複数の流体ボリュームに分割することができる。例えば、いくつかの実施形態では、システムは、ウェル、液滴、または他の区画化されたボリュームのアレイを含むことができ、そのそれぞれに、分析物含有流体の一部を堆積させることができる。区画化されたボリューム内の流体は、増幅反応及びその後の検出をサポートするために、第１及び第２のプローブのそれぞれの１つ以上、ならびにポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、塩基対などの適切な追加の構成要素を含むことができる。好ましくは、システムは、蛍光を誘導及び測定することによって、または吸光の変化を測定することによってなど、ウェル内の分析物の存在を光学的に検出する。代替的または追加的に、システムは、どのウェルが分析物を含むかを決定するために、化学的または電気的検出などの方法を使用することができる。システムは、ウェル内の分析物の検出に基づいて、分析物のカウントまたは分析物の濃度などの分析物の測定値をさらに生成することができる。
【００７６】
例えば、システムは、分析物含有流体を複数の区画化された流体ボリュームに自動的に分割し、反応条件（例えば、温度）を制御して分析物含有ボリュームにおける近接ベースの相互作用を促進するコンピュータ制御デジタルアッセイシステムを含むことができる。次いで、システムは、（例えば、蛍光または他の検出を使用して）どのボリュームに分析物が含まれ、どのボリュームに含まれないかを検出でき、この測定に基づいて、システムは流体に存在する分析物分子の数のカウントを生成できる。例えば、ポアソン統計を使用すると、分析対象物を含まないボリュームの割合ｘと分析対象物含有ボリュームの割合（１−ｘ）の測定値を分析物の合計割合−ｌｎ（ｘ）（式中、ｌｎは自然対数である）に対応させることができるか、または分析物の総数−ｌｎ（ｘ）＊Ｎ（式中、Ｎはボリュームの数である）に対応させることができる。システムは、分析物カウントを生成するために必要な計算を含む、デジタルアッセイシステムによって実行される各ステップを制御するための命令を実行するプロセッサを含むことができる。ボリュームの数（例えば、ウェルの数）は、全体的な測定において望ましいレベルの精度を提供するように選択することができる。例えば、流体は、１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、１０，０００以上、または１００，０００以上のボリュームに分割することができ、より多くのボリュームは、徐々に高い精度を提供する。不均一な分割が可能であり、統計的に考慮することができるが、流体は均等に分割されることが好ましい。
【００７７】
図１Ｂは、様々な実施形態による分析物の検出のための組成物１２０を示す。組成物１２０は、様々な流体構成要素を有する流体を含むことができる。例えば、組成物は水溶液であり得る。好ましくは、組成物は均質な流体である。すなわち、流体内の反応に関与する様々な流体構成要素は、検出プロセスの前または最中に洗浄ステップを必要とする可能性のあるビーズなどの巨視的な構造に付着していない。流体の構成要素は、使用される特定の検出方法に応じて、様々な生体分子及び構造を含むことができる。例えば、図２〜１１で論じられる検出方法は、様々な近接ベースの分析物検出方法を採用しており、流体構成要素は、図示された方法のうちのいずれか１つ以上を実行するために適切に選択することができる。
【００７８】
例示的な組成物１２０は、例示を容易にするために残りの図面に同様の形式で示されている様々な構成要素を含む。例えば、組成物１２０は、タンパク質分子、またはタンパク質複合体、代謝産物、炭水化物、脂質構造、薬物、ウイルス、核酸構造、または細菌や他の細胞などのさらに大きな構造などの他の生体分子が結合することができる様々な生物学的構造のいずれかであり得る分析物１２２を含む。組成物は、分析物１２２上の所与の位置（例えば、エピトープ）に結合するための結合部位を含む結合部分１２４をさらに含む。例えば、結合部分１２４は、抗体またはその部分であり得、分析物１２２は、結合部分１２４が分析物１２２を標的として結合するように、抗体に一致する抗原を構成することができる。さらに、分析物１２２は、異なる抗体が結合できる複数の部位を含むことができ、共通の分析物の適切な部位（例えば、異なるエピトープ）に同時に結合することによって、抗体はそれ自体（及びそれらが付着する他の分子）を近接ベースの相互作用を誘発するために近接にもたらすことができる。組成物は、核酸分子１２６、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの鎖をさらに含む。核酸分子１２６は、その５’末端に点及びその３’末端に矢印で示され、ポリメラーゼを使用して分子の重合が可能である方向を示している。結合部分と核酸分子を一緒に結合して、分析物に結合したときに別のプローブとの近接ベースの相互作用を誘発するために使用できるプローブ１２８を形成することができる。２つの核酸分子が近接ベースの相互作用に関与する場合、それらは、二本鎖ＤＮＡ複合体１３０などの二本鎖核酸複合体を形成することができる。二本鎖ＤＮＡ複合体１３０では、２つのＤＮＡ分子の一部のみが、（例えば、塩基対形成を介して）一緒に結合するように示されている。ＤＮＡ分子の残りの部分は、例えば分析物の異なる部位に付着したそれぞれの結合部分に付着するため、分離することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子に結合して重合、転写、または結合を阻害することができる「ブロッカー」１３２が含まれる。ブロッカーは、その３’末端に修飾を含めることによって形成され得る、非伸張性オリゴヌクレオチドであり得る。例えば、ブロッカー１３２は、逆位の３’末端、または別の同様の修飾を有し得、その結果、ポリメラーゼによるテンプレート化された伸長は、その末端で阻害される。ブロッカー１３２は、逆位の３’末端、またはエンドヌクレアーゼによるニッキングまたはポリメラーゼによるテンプレート化された伸長がその末端で阻害されるように、単独でまたは組み合わせて別の同様の修飾を有することができる。伸長を妨げ得る他の修飾には、ジデオキシ塩基、リン酸修飾、伸長ミスマッチ、または増幅に必要な１つ以上の酵素を阻害する他の修飾が含まれる。ブロッカーは、ブロッカーが核酸分子に結合して不活性化された複合体をもたらすように、別の核酸分子に対する複数の相補的塩基を含むことができる。組成物に任意選択で含まれ得るさらなる流体構成要素は、以下の図２〜１１に示されている。
【００７９】
図１Ｃ及び１Ｄは、流体中の分析物を検出するために近接ベースの相互作用を使用するための２つの一般的なスキームを示している。
【００８０】
図１Ｃは、分析物検出のための「付着した」検出スキーム１４０を示している。付着した検出スキーム１４０において、第１のプローブ１４２及び第２のプローブ１４４はそれぞれ、共通の分析物１４１に結合する。これにより、２つのプローブが近接し、互いに近接ベースの相互作用を受けることができる。２つのプローブは、相互作用して核酸複合体１４６を形成する核酸分子を含む。次いで、この複合体はさらなる反応に関与する。例えば、複合体を形成する核酸分子のうちの１つは、ポリメラーゼによって伸長され得、最終的に、分析物が流体中に存在するという検出可能なシグナルを生成するさらなる反応をもたらす。
【００８１】
図１Ｄは、代替の「分離した」分析物検出スキーム１５０を示している。検出スキーム１４０と同様に、検出スキーム１５０では、第１のプローブ１５２及び第２のプローブ１５４はそれぞれ、共通の分析物１５１に結合し、次いで近接ベースの相互作用を受けて複合体１５６を形成する。しかしながら、付着したスキーム１４０の複合体１４６は、さらなる増幅反応に関与するが、複合体１５６の形成は、代わりに、分析物から離れた反応を誘発する。例えば、複合体１５６の形成は、第１及び第２のプローブのうちの１つから活性核酸鎖１５８を取り除くことができ、次いで、他の流体構成要素と活性複合体を形成し、分析物から離れて溶液中で増幅反応をもたらすことができる。多くの実施形態では、分離反応は、指数関数的増幅反応の一部として使用される。
【００８２】
上記の厳密な「付着した」及び「分離した」スキームに加えて、一部のスキームは「部分的に付着」した反応を採用し、そこでは付着した複合体を含む増幅が発生するが、反応の他の部分は溶液中の分析物から離れて発生する。例えば、本明細書に記載の付着した反応の多くは、溶液中の他の基質と相互作用して指数関数的増幅反応を誘発することができる遊離核酸鎖を生成するために使用することができる。
【００８３】
図２〜１１は、分析物の測定値を生成するために、本明細書に開示された方法に従って、様々な近接ベースの相互作用をどのように使用できるかをより詳細に示している。図２〜１１に示されているプロセスのそれぞれは、等温条件下で（例えば、等温アセンブリ及び増幅反応を使用して）実行でき、単一の流体溶液（例えば、アナログアッセイとして）または複数の区画化された溶液ボリューム（例えば、デジタルアッセイとして）のいずれかで実行できる。代替的に、図２〜１１に示されているプロセスのそれぞれは、ＰＣＲ増幅を含む条件下で（例えば、サーマルサイクリングアセンブリ及びデジタルＰＣＲなどのＰＣＲ増幅反応を使用して）実行でき、単一の流体溶液（例えば、アナログアッセイとして）または複数の区画化された流体ボリューム（例えば、デジタルアッセイとして）のいずれかで実行できる。
【００８４】
図２は、付着した鎖置換増幅を使用する分析物検出の方法２００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物２０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法２００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（増幅反応）を伴うという点で、「付着した」方法として特徴付けることができる。
【００８５】
流体は、第１のプローブ２１０及び第２のプローブ２２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子２１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分２１２を含む。第１の結合部分２１２は、例えば、分析物２０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子２１４は、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチド２１６に結合している。第１の核酸分子２１４及び非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド２１６は、例えば、塩基対形成相互作用によって一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド２１６は、その３’末端（例えば、逆位の３’末端）への修飾を含み得、その結果、ＤＮＡポリメラーゼによるテンプレート化された伸長は、その末端（ならびに天然でＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない５’末端）で阻害される。第１の核酸分子２１４が３’末端で第１の結合部分２１２に結合している場合、重合は、第１の核酸分子２１４と非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド２１６の両方について阻害され得る。
【００８６】
第２のプローブ２２０は、第２の結合部分２２２と、第２の核酸分子２２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分２２２は、例えば、分析物２０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子２２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、そして５’末端で結合部分２２２に結合し得る。したがって、第２の核酸分子２２４は、適切なテンプレートが提供される場合、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長され得る。
【００８７】
第１のステップ２０２において、第１のプローブ２１０、第２のプローブ２２０、及び分析物２０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子２０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【００８８】
この相互作用は、第２のステップ２０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子２１４と第２の核酸分子２２４が相互作用して、複合体２３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体２３０を形成することができるように、複数の相補的塩基対を含むことができる。相互作用は、非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド２１６を変位させることができ、それはその後、廃棄物として溶液中に放出され得る。残りの複合体２３０は、２つの核酸分子の長さの不一致を含み得る。すなわち、第１の核酸分子２１４は、それが相補的である第２の核酸分子２２４の対応する部分を超えて伸長することができ、その結果、第１の核酸分子２１４は、第２の核酸分子２２４を伸長することを可能にする塩基対重合のためのテンプレートを提供する。
【００８９】
第１及び第２の核酸分子２１４及び２２４の間の核酸複合体の形成は、核酸増幅の反復可能なサイクルを設定することができる。そのようなサイクルの開始点は、ステップ２０６に示されている。第１及び第２の核酸分子２１４及び２２４は、それぞれ、結合部分２１２及び２２２に結合したままであり、これらは、次に、分析物２０１に結合したままとなる。結合部分２１２及び２２２の端部は、ステップ２０６に点線で示されているが、増幅プロセスステップの例示の残りでは図面から省略されている。
【００９０】
増幅プロセスは、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼが複合体２３０に結合することにより、ステップ２０６からステップ２０７に進む。ポリメラーゼは、第１の核酸分子２１２をテンプレートとして使用して、第２の核酸分子２２４を伸長する。伸長は、例えば、第１の核酸分子２１２の５’末端に到達するまで継続することができる。
【００９１】
ステップ２０７における第２の核酸分子２２４の伸長の後に、ステップ２０８において、ニッキングエンドヌクレアーゼの第２の核酸分子の伸長部分への結合が続くことができる。例えば、第２の核酸分子の伸長部分は、点２５２で第２の核酸分子を切断するように構成されたエンドヌクレアーゼの結合部位を形成する複数の塩基対を含むことができる。いくつかの実施形態では、点２５２は、第２の核酸分子２２４の元の３’末端またはその近辺にある。エンドヌクレアーゼの作用により、ニッキングされた核酸分子２５４が生成される。
【００９２】
ステップ２０９において、ニッキングされた核酸分子２５４が溶液中に放出され、ポリメラーゼの作用によって別のテンプレート化された伸長を受けることができる核酸複合体を生成する。この伸長により、プロセスがステップ２０７に戻り、サイクルを繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、ニッキングされた核酸分子２５４の放出は、ポリメラーゼによる伸長によって媒介される。この核酸増幅サイクルの反復作用は、溶液中のニッキングされた核酸分子２５４の蓄積をもたらし得、これは、検出に使用することができる。例えば、蛍光イメージングを使用して、ニッキングされた核酸分子の存在下で（例えば、それへの結合時に）適切な波長の光で照射すると蛍光を発する蛍光部分を流体中に提供することによって、ニッキングされた核酸分子の蓄積を検出することができる。
【００９３】
増幅プロセス２００は、（共通の分析物への結合を介して第１及び第２のプローブの近接性をもたらし、それにより近接ベースの相互作用を開始することにより）完了するまで実行する分析物２０１の存在に依存するため、溶液中のニッキングされた核酸分子２５４の生成は、分析物が存在することを示す。したがって、溶液中のニッキングされた核酸分子の蓄積または非蓄積に基づく蛍光（または他の特性）の存在または非存在は、どの流体ボリュームが分析物を含むか含まないかを検出することができる。したがって、デジタルアッセイの一部として方法２００を使用することにより、流体中の核酸分子の数、及び対応して分析物濃度などの他の特性の測定値を生成することができる。代替的に、プロセス２００を使用して、分析物のアナログ測定を実行することができる。溶液中のニッキングされた核酸分子２５４の生成速度は、溶液中に存在する分析物粒子の数とともに増加する。したがって、生成されたニッキングされた核酸の量の測定（例えば、蛍光強度の測定、所与の強度に到達する時間の測定などによる）を使用して、流体中の分析物の量のアナログ測定値を生成することができる。測定には、例えば、分析物の測定量を決定するために、測定されたシグナルを較正されたスケールと比較することが含まれ得る。
【００９４】
図３は、付着した鎖置換増幅を使用する分析物検出の方法３００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物３０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法３００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（増幅反応）を伴うが、付着した反応が溶液中で起こるさらなる反応ステップを誘発するという点で、「部分的に付着した」方法として特徴付けることができる。
【００９５】
流体は、第１のプローブ３１０及び第２のプローブ３２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子３１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分３１２を含む。第１の結合部分３１２は、例えば、分析物３０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子３１４は、連続する核酸配列を３＊、２＊、１＊の順番に含むことができ、ここで配列ｘ＊は、配列ｘに相補的な配列を示す。第１の核酸分子３１４は、非伸張性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６に結合している。第１の核酸分子３１４及び非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６は、塩基対形成相互作用によって、例えば、ブロッカー上の塩基対配列３を第１の核酸分子上の塩基対配列３＊に結合することによって、一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６は、その３’末端（例えば、逆位の３’）への修飾を含み得、その結果、ＤＮＡポリメラーゼによるテンプレート化された伸長は、その末端（ならびに天然でＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない５’末端）で阻害される。第１の核酸分子３１４が３’末端で第１の結合部分３１２に結合している場合、重合は、第１の核酸分子３１４と非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６の両方について阻害され得る。
【００９６】
第２のプローブ３２０は、第２の結合部分３２２と、第２の核酸分子３２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分３２２は、例えば、分析物３０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子３２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、そして５’末端で結合部分３２２に結合し得る。したがって、第２の核酸分子３２４は、適切なテンプレートが提供される場合、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長され得る。さらに、第２の核酸分子３２４は、第１の核酸分子の塩基対配列３＊に相補的な塩基対配列３を含むことができる。
【００９７】
第１のステップ３０２において、第１のプローブ３１０、第２のプローブ３２０、及び分析物３０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子３０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【００９８】
この相互作用は、第２のステップ３０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子３１４と第２の核酸分子３２４が相互作用して、複合体３３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、それぞれの相補的配列３＊及び３を形成する複数の相補的塩基対を含むことができ、その結果、近接したときにそれらが相互作用して二本鎖核酸複合体３３０を形成しながら、非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６をその結合から第１の核酸分子の同じ３＊配列に変位させることができる。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６はその後、廃棄物として溶液中に放出され得る。残りの複合体３３０は、２つの核酸分子の長さの不一致を含み得る。すなわち、第１の核酸分子３１４は、それが相補的である第２の核酸分子３２４の塩基対配列３に結合する塩基対配列３＊を有し、第１の核酸分子は、２＊配列とそれに続く１＊配列の形態のその鎖の連続をさらに含む。したがって、第１の核酸分子３１４は、塩基対重合が第２の核酸分子３２４を領域２及び１に伸長することを可能にするテンプレートを提供する。任意選択で、３の長さ及び配列は、１ドメインと実質的または完全に同一であり得る。任意選択で、第２の核酸分子上のドメイン３は、最初に、第１の核酸分子上の３配列よりも少ないまたは多い塩基対を含むことができる。例えば、第２の核酸分子は、最初に領域３を含み、その後に領域２の一部、または領域１の全てではないが一部を含むことができる。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３１６はまた、長さが変動し得、領域３よりも多くまたは少なく含むことができる。この変動性により、非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドと比較して、第１及び第２の核酸分子間の近接ベースの相互作用の強度を変動させることができ、これは反応速度を増加または（例えば、溶液中の第１と第２のプローブの偶然の衝突によって生成される反応速度を下げるために）減少させるために使用できる。さらに、第１の核酸と第２の核酸鎖の両方は、同定された領域と結合部分との間に複数の核酸を含むことができる。これらの追加の核酸は対形成相互作用を受ける必要がないため、自由に変動させることができ、相補的または非相補的な塩基対配列を含み得る。
【００９９】
流体は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３３６に任意選択で結合した補助基質３３４を含む補助複合体３３２をさらに含む。いくつかの態様では、補助基質は、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３３６に結合している。いくつかの態様では、補助基質はそれぞれ、補助核酸鎖を含み、そしていずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３３６に結合していない。補助基質３３４は、５’末端から読み取って連続する核酸配列１＊、２＊、１＊、２＊を含むことができ、その結果、補助基質３３４が少なくとも部分的に第１の核酸３１４に類似する。いくつかの実施形態では、２つは同一である。そのような場合、第１の核酸分子の追加の２＊部分は、分析物に結合する２つのプローブ間のギャップを架橋するので、近接ベースの相互作用中に第２の核酸分子との塩基対形成に関与することを回避できる。補助基質の一方または両方の鎖を（例えば、逆位の３’で）修飾して、補助基質のポリメラーゼ伸長を回避することができる。
【０１００】
複合体３３０、及び補助基質３３４は、繰り返される増幅のサイクルに関与することができ、その産物は、より多くの補助基質を誘発して増幅反応サイクルに参加させ、溶液中の核酸鎖の生産を指数関数的に増殖させることができる。このプロセスは、ステップ３０４に示される複合体３３０の構成から開始することができる。第２の核酸分子３２４は、第１の核酸をテンプレートとして使用するポリメラーゼによって伸長されて、ステップ３０６に示される構成に到達する。複合体は、補助基質３３４を含む同様のプロセスが発生するため、部分的に点線で示されているが、これについては、後で説明する。第２の核酸の伸長は、例えば図２に関して論じられた部位と同様に、ニッキングエンドヌクレアーゼのための結合部位を生成する。ニッキングエンドヌクレアーゼは、伸長した複合体に結合し、点３５４で第２の核酸の伸長部分をニッキングし、その点の後の核酸鎖が溶液中に放出されることを可能にする。第２の核酸の伸長は第１をテンプレートとして使用したので、ニッキングされた伸長部分３３８は、５’から３’まで読み取ってそれぞれ核酸配列２及び１を有し、これらは、最初の３＊配列が第２の核酸分子の３配列と対形成した後の第１の核酸分子の２＊及び１＊に相補的であるためである。（第２の核酸分子が第１の核酸分子の１＊配列と相互作用する可能性はあるが、この配置は、第１及び第２の核酸分子のそれぞれの５’及び３’末端の整列をもたらし、さらなる重合を妨げる。最終的に、ランダムな熱分離及び移動により、第１及び第２の核酸分子の適切な部分が適切な構成で接触し、このプロセスは、分子が近接している場合、比較的迅速に進行する。）ニッキングされた部分３３８が溶液に移動した後、複合体３３０は、ステップ３０６でサイクルを繰り返して、再び伸長することができる。
【０１０１】
さらに、溶液中に放出されたニッキングされた部分３３８は、最終的に、補助複合体３３２と衝突する可能性がある。ニッキングされた部分３３８は、その５’末端から読み取って配列２及び１を有し、その３’末端から読み取る補助基質３３４の２及び１と相補的である。したがって、ニッキングされた部分３３８は、一端で（及び中央で、第１及び第２の核酸分子について上で論じたのと同じ理由であるが、そのような対形成は一時的な行き止まりであり、熱−再平衡化を必要とする）補助基質３３４と対形成することができる。ニッキングされた部分３３８が補助基質３３４と結合するとき、それは補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド３３６を溶液へと変位させる。これは、ステップ３０９で活性複合体を形成する。ステップ３０５において、ニッキングされた部分３３８及び補助基質３３４を含む活性複合体は、補助基質３３４をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼによって伸長される。これは、ステップ２０６に示されるように、伸長された第２の核酸鎖と同様の伸長されたニッキングされた部分を生成する。２つの複合体は、点線の領域が異なる。伸長されたニッキングされた基質は、５’から３’まで読み取って補助基質の相補配列と対形成する配列２、１、２、１を有し、一方、第２の核酸は、第１の核酸と対形成しない部分を有し、その後に３、２、１配列が続く。ステップ３０７において、ニッキングエンドヌクレアーゼは、活性複合体に結合し、伸長されたニッキング部分をニッキングして、ニッキング部分の同一のコピーを生成し、これは、ステップ３０８において、またはその後のポリメラーゼによる活性中に溶液中に放出される。次いで、活性複合体は、ステップ３０６でサイクリングを継続することができ、一方、新しく放出されたニッキングされた部分は、さらに別の補助複合体をもたらし、別の活性複合体を形成し、それが次にサイクルに入る。このプロセスは指数関数的に増殖し、サイクルにますます多くの複合体を追加し、指数関数的に多くのニッキングされた部分を生成できる。
【０１０２】
繰り返されるサイクルは、溶液中にますます多くの核酸分子３３８の蓄積をもたらすので、この蓄積は、検出のために使用することができる。例えば、蓄積に基づいて光シグナルを生成することができる。多くの実施形態では、蛍光イメージングを、核酸分子の存在下で（例えば、それに結合するとき）、適切な波長の光による照射時に蛍光を発する蛍光プローブ（例えば、色素またはタンパク質）を流体中で提供することによって、核酸分子（例えば、ニッキングされた二本鎖または一本さの核酸分子）の蓄積を検出するのに使用できる。増幅プロセス３００は、（共通の分析物への結合を介して第１及び第２のプローブの近接性をもたらし、それにより近接ベースの相互作用を開始し、補助複合体の活性化をさらに誘発することにより）完了するまで実行する分析物３０１の存在に依存するため、溶液中の核酸分子３３８の生成は、分析物が存在することを示す。したがって、溶液中の核酸分子の蓄積または非蓄積に基づく蛍光（または他の特性）の存在または非存在は、どの流体ボリュームが分析物を含むか含まないかを検出することができる。したがって、デジタルアッセイの一部として方法３００を使用することにより、流体中の核酸分子の数、及び対応して分析物濃度などの他の特性の測定値を生成することができる。代替的に、プロセス３００を使用して、分析物のアナログ測定を実行することができる。溶液中の核酸分子３３８の生成速度は、溶液中に存在する分析物粒子の数とともに増加する。したがって、生成された核酸の量の測定（例えば、蛍光強度の測定、所与の強度に到達する時間の測定などによる）を使用して、流体中の分析物の量のアナログ測定値を生成することができる。測定には、例えば、分析物の測定量を決定するために、測定されたシグナルを較正されたスケールと比較することが含まれ得る。
【０１０３】
図４付着したヘアピンアセンブリ反応を使用する分析物検出の方法４００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物４０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法２００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（アセンブリ反応）を伴うという点で、「付着した」方法として特徴付けることができる。
【０１０４】
流体は、第１のプローブ４１０及び第２のプローブ４２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子４１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分４１２を含む。第１の結合部分４１２は、例えば、分析物４０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子４１４は、ヘアピン構成に結合するように構成された塩基対の配列を含むことができる。例えば、第１の部分４１１は、第２の部分４１３に相補的な複数の塩基対を含み得、第１の部分と第２の部分がヘアピン形状で一緒に結合するように、２つの間に非相補的領域を有する。第１の核酸分子はそれ自体に結合しているため、溶液中の相補的なヘアピン分子４３２との対形成が阻害される。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子の３’末端は、結合部分に結合し、それにより、重合を阻害する。しかしながら、方法４００は重合を必要とせず、したがってポリメラーゼの非存在下で行うことができるので、図４に示される５’及び３’末端は、任選択で変動し得る。しかしながら、図面との整合性のために、第１の核酸分子の第１の部分は３’部分４１１と呼ばれ、第２の部分は５’部分４１３と呼ばれる。
【０１０５】
第２のプローブ４２０は、第２の結合部分４２２と、第２の核酸分子４２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分４２２は、例えば、分析物４０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子４２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、そして５’末端で結合部分４２２に結合し得る。第２の核酸分子４２４は、第２の核酸分子の少なくとも一部、例えば、第１の核酸分子の自己結合部分に対応する３’部分４１１について、第１の核酸分子の塩基対配列に相補的な塩基対配列を含むことができる。しかしながら、第２の核酸分子はまた、３’末端に向かって第１の核酸分子に相補的でない部分を含み得、その結果、２つの分子は、一緒に対形成した場合、各鎖の中央部分でのみ互いに結合し、それぞれの一端がそれぞれの結合部分に結合し、それぞれの一端が熱的に自由に移動する。
【０１０６】
第１のステップ４０２において、第１のプローブ４１０、第２のプローブ４２０、及び分析物４０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子４０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１０７】
この相互作用は、第２のステップ４０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子４１４の３’位置４１１と第２の核酸分子４２４が相互作用して、複合体４３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、それぞれの相補的配列を形成する複数の相補的塩基対を含むことができ、その結果、近接したときにそれらが相互作用して、２つの分子の一部において二本鎖核酸複合体を形成し、その一方で、その閉じたヘアピン構成から第１の核酸を展開する。次いで、第１の核酸分子４１４の５’部分４１３は、溶液中で自由に移動する（任意選択で、第２の核酸分子４２４の末端にある残りの配列と同様である）。第１の核酸分子の５’部分４１３は３’部分４１１に相補的であったので、それは第２の核酸分子４１２のものと一致する塩基対を有する（一致は完全である必要はないが、２つの配列はそれぞれが３’部分４１１に十分に結合するように実質的に同一であるべきである）。
【０１０８】
流体は、ヘアピン分子４３２を含む複数の遊離ヘアピン分子をさらに含む。ヘアピン分子４３２は、各末端に、第１の核酸分子４１４の対応する末端と同様に互いに相補的な塩基対の配列を含むが、逆の順序で、ヘアピン分子４３２の３’末端が、ヘアピンターン近くの第１の核酸分子の一部と相補的である。遊離ヘアピン４３２は、第１の核酸分子の５’末端４１１に逆相補的である３’末端を含むので、２つは結合して、遊離ヘアピン４３２を展開し、２分子ヘアピン複合体４４０を形成することができる。
【０１０９】
ステップ４０８において、２分子ヘアピン複合体４４０の５’末端に逆相補的な末端を含む第２の遊離ヘアピン分子４３４が、溶液から引き出され、塩基対形成相互作用によって展開され、複合体に結合し、３分子ヘアピン複合体４５０を形成する。次いで、この新しい複合体の末端は、第２の分子、第１の遊離ヘアピン４３２に対して逆相補的であり、複合体の別の展開及びさらなる伸長を可能にする。このプロセスは、分析物への元の結合が壊れた場合でも、暴走するヘアピンアセンブリ反応として無期限に継続する可能性がある。次いで、蛍光または他の画像化を使用して、図２及び３について上述したのと同様の方法で、分析物含有ボリューム中のアセンブリ反応を検出することができる同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。例えば、蛍光部分は、展開されたヘアピンの存在下で溶液の蛍光に含まれ得るが、折り畳まれたヘアピンの存在下では含まれ得ない。ヘアピンが折り畳まれたままである間、蛍光はこうして消光されるが、ヘアピンアセンブリ反応は、多くのヘアピンが展開されるので、蛍光のカスケード脱クエンチングを引き起こす。
【０１１０】
図５ヘアピンアセンブリ反応を触媒するために三叉路を使用する分析物検出の方法５００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物５０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法５００は、流体構成要素が分析物に付着している間に近接ベースの相互作用が起こるが、相互作用は、ジャンクションから分離して溶液中で起こる反応のための触媒を生成するために使用されるという意味で、「分離した」方法として特徴付けることができる。さらに、方法５００には酵素は必要ない。したがって、例えば、核酸重合の必要はない。
【０１１１】
流体は、第１のプローブ５１０及び第２のプローブ５２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子５１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分５１２を含む。第１の結合部分５１２は、例えば、分析物５０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２のプローブは、第２の核酸分子５２４に結合した第２の結合部分５２２を含む。第２の結合部分５２２は、例えば、分析物５０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。
【０１１２】
第１のステップ５０２において、第１のプローブ５１０、第２のプローブ５２０、及び分析物５０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子５０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１１３】
この相互作用は、第２のステップ５０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子５１４と第２の核酸分子５２４が相互作用して、複合体５３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体５３０を形成することができるように、それぞれの分子の一部について複数の相補的塩基対を含むことができる。次いで、第１及び第２の核酸の残りの非相補的部分は、他の核酸分子が相互作用することができる触媒表面５３２を形成することができる。
【０１１４】
そのような触媒相互作用の例として、ステップ５０６において、複合体５３０の触媒表面５３２は、溶液中に提供される第１のヘアピン分子５３４及び第２のヘアピン分子５３６の展開を触媒することができる。触媒は、触媒表面５３２を形成する第１及び第２の核酸分子の部分と、ヘアピン分子の一方または両方の部分との間の塩基対形成を介して起こり得る。これらの展開されたヘアピン分子は、ステップ５０８で二本鎖核酸複合体を形成するように、相補的な塩基対配列を有することができる。さらに、触媒表面５３２がヘアピン分子の追加の対の展開を触媒し、溶液からのヘアピン分子の枯渇及び核酸の二本鎖の蓄積をもたらすので、ステップ５０６及び５０８を繰り返すことができる。次いで、蛍光または他の画像化を使用して、図２及び３について上述したのと同様の方法で、分析物含有ボリュームにおけるこれらの二本鎖の蓄積を検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。したがって、ヘアピンの展開は、図４に関して上で論じたものと同様の蛍光のカスケード脱クエンチングによって検出することができる。
【０１１５】
図６は、付着した鎖置換増幅を触媒するために三叉路を使用する分析物検出の方法６００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物６０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法６００は、流体構成要素が分析物に付着している間に近接ベースの相互作用が起こり、相互作用が分析物に付着している間に増幅反応で重合するという意味で、少なくとも部分的に付着した方法として特徴付けることができる。以下で論じるように、増幅反応は、任意選択で、分析物から分離して進行する指数関数的増幅反応を含むことができる。
【０１１６】
流体は、第１のプローブ６１０及び第２のプローブ６２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子６１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分６１２を含む。第１の結合部分６１２は、例えば、分析物６０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２のプローブは、第２の核酸分子６２４に結合した第２の結合部分６２２を含む。第２の結合部分６２２は、例えば、分析物６０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。
【０１１７】
第１のステップ６０２において、第１のプローブ６１０、第２のプローブ６２０、及び分析物６０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子６０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。また、溶液中には、補助伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド６３６に結合した補助基質６３４がある。補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド６３６は、補助基質６３４に結合し、重合を阻害する。補助基質６３４は、第１の核酸分子の末端またはその近傍の配列に相補的な第１の部分を含み、補助基質は、第２の核酸分子の末端の配列に相補的な第２の部分を含む。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド６３６は、補助基質６３４の第１及び第２の部分の少なくとも一部に相補的であり、それらに結合することができる。したがって、第１または第２の核酸分子は、ブロッカーと競合して補助基質の一部と結合する配列を含むことができるが、ブロッカーは、第１または第２の核酸分子のいずれかよりも強く（例えば、より相補的な核酸に）結合することができる。したがって、全ての分子が溶液中にあり、分析物に結合することなく、ブロッカーが外れる可能性はほとんどない。
【０１１８】
しかしながら、第１及び第２のプローブが分析物に結合すると、この関係は、第１及び第２の核酸分子間の近接ベースの相互作用のために変化する可能性がある。この相互作用は、第２のステップ６０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子６１４と第２の核酸分子６２４が相互作用して、複合体６３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体６３０を形成することができるように、それぞれの分子の一部について複数の相補的塩基対を含むことができる。次いで、第１及び第２の核酸の残りの非相補的部分は、他の核酸分子が相互作用することができる触媒表面６３２を形成することができる。触媒表面６３２を形成する第１及び第２の核酸分子の部分は、補助基質の第１及び第２の部分に相補的な部分を含むことができる。どちらの部分も、ブロッカー６３６の補助基質６３４への結合を確実に克服するのに個別に十分ではないかもしれないが、２つの核酸分子は一緒になって、ブロッカーを確実に変位させるのに十分強く補助基質に結合する触媒表面を形成し得る。この変位は、ステップ６０６で発生し、ブロッカー６３６を溶液中に放出する。
【０１１９】
これは、第２の核酸分子の３’末端がテンプレートとして補助基質を使用して伸長され得る活性複合体６４０を形成する。伸長部分は、図２に示されるものと同様のプロセスを使用して、ニッキングエンドヌクレアーゼによってニッキングすることができ、ニッキングされた部分を溶液に放出する。いくつかの実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、ｓｇＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、このプロセスは単に繰り返され、ニッキングされた部分がほぼ線形の速度で溶液に蓄積する。代替的に、補助基質は、指数関数的増幅反応に参加するように構成することができる。例えば、補助基質は、図３に示されるものと同様の塩基対のパターン、例えば、５’から３’まで読み取って、領域１＊、２＊、１＊、２＊を有することができる。次いで、第１及び第２の核酸の部分は、それぞれ、触媒表面６３２を形成する相補的配列１及び２を提供することができる。溶液へのニッキングされた伸長部分は、この表面のコピーであり得、５’から３’まで、配列１、２を有する。ニッキングされた部分は、自由に移動する触媒表面として機能し、溶液中の追加の補助基質からブロッカーを変位させ、次いで伸長してニッキングし、同じ１、２配列でさらにニッキングされた部分を生成することができる。次いで、このプロセスは、図３に示されるプロセスに類似することができ、溶液中のニッキングされた部分の指数関数的に増殖する蓄積をもたらす。
【０１２０】
いずれの増幅方法が選択されたとしても、次いで、蛍光または他の画像化を使用して、図２及び３について上述したのと同様の方法で、分析物含有ボリュームにおける増幅反応を検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。
【０１２１】
本開示のいくつかの実施形態では、流体ボリュームは、複数の補助基質を含む。ある特定の実施形態では、補助基質の少なくともいくつかは、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、いずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合していない。いくつかの実施形態では、流体ボリュームは、伸長された核酸を切断するように構成されたニッキングエンドヌクレアーゼを含み、補助核酸鎖は、伸長された核酸のニッキングされた部分に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、複数の補助基質は、核酸の拡張されたニッキングされた部分に結合し、それを不活性化するように設計された補助基質を含む。ある特定の実施形態では、核酸の伸長されたニッキングされた部分に結合するように設計された補助基質は、それを非生産的に伸長することによってそれを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出す。核酸の拡張されたニッキングされた部分に結合してそれを不活性化するように設計された補助基質（本明細書では「閾値オリゴヌクレオチド」及び「漏出閾値オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を、本明細書に開示される流体ボリュームのいずれかに加えることができる。漏出閾値オリゴヌクレオチドは、産物と反応し、それを不活性化して、標的タンパク質の非存在下での自発的な指数関数的開始を抑制することができる。
【０１２２】
本開示のいくつかの実施形態では、流体ボリュームは複数の補助基質を含む。ある特定の実施形態では、補助基質のうちの少なくとも一部が補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、いずれの補助基質も、補助非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチドに結合していない。いくつかの実施形態では、流体ボリュームは、増幅産物オリゴヌクレオチドを生成する増幅反応を含む（例えば、デジタル等温増幅またはデジタルＥＸＰＡＲまたはデジタルＰＣＲから）。いくつかの実施形態では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチド（または産物オリゴヌクレオチド）に結合し、それを不活性化するように設計された補助基質を含む。ある特定の実施形態では、補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを不活性化することによって、増殖の閾値を作り出すように設計されている。ある特定の実施形態では、補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを不活性化することによって、指数関数的増殖の閾値を作り出すように設計されている。ある特定の実施形態では、補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを非生産的に伸長することによってそれを不活性化し、増殖の閾値を作り出すように設計されている。ある特定の実施形態では、補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを非生産的に伸長することによってそれを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出すように設計されている。増幅産物オリゴヌクレオチドに結合するように設計された補助基質（本明細書では「閾値オリゴヌクレオチド」及び「漏出閾値オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を、本明細書に開示される流体ボリュームのいずれかに加えることができる。漏出閾値オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下での自発的開始を抑制するために、産物オリゴヌクレオチドと反応し、それを不活性化することができる。漏出閾値オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下での自発的開始及び指数関数的増殖を抑制するために、産物オリゴヌクレオチドと反応し、それを不活性化することができる。
【０１２３】
いくつかの態様では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合してそれを不活性化する補助基質を含む。いくつかの態様では、複数の補助基質は、産物オリゴヌクレオチドに結合してそれを不活性化する補助基質を含む。ある特定の実施形態では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合することによって増殖の閾値を作り出す補助基質を含む。ある特定の実施形態では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合することによって、指数関数的増殖の閾値を作り出す補助基質を含む。ある特定の実施形態では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを非生産的に伸長することによってそれを不活性化し、増殖の閾値を作り出す補助基質を含む。ある特定の実施形態では、複数の補助基質は、増幅産物オリゴヌクレオチドに結合し、それを非生産的に伸長することによってそれを不活性化し、指数関数的増殖の閾値を作り出す補助基質を含む。増幅産物オリゴヌクレオチドに結合する補助基質（本明細書では「閾値オリゴヌクレオチド」及び「漏出閾値オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を、本明細書に開示される流体ボリュームのいずれかに加えることができる。
【０１２４】
図７は、付着したローリングサークル増幅を使用する分析物検出の方法７００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物７０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法７００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（増幅反応）を伴うという点で、「付着した」方法として特徴付けることができる。
【０１２５】
流体は、第１のプローブ７１０及び第２のプローブ７２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子７１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分７１２を含む。第１の結合部分７１２は、例えば、分析物７０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子７１４は、ローリングサークル基質７３８（例えば、環状核酸分子）に結合している。第１の核酸分子７１４及びローリングサークル基質７３８は、例えば、塩基対形成相互作用によって一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。ローリングサークル基質７３８は、一緒に鎖状になってループを形成する複数の核酸を含むことができる。ループは末端を欠くため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が阻害される。ローリングサークル基質７３８は、第１の核酸分子上の第１の結合配列７１６に相補的な第１の結合部位７３４を含む。第１の核酸分子７１４が３’末端で第１の結合部分７１２に結合している場合、または第１の核酸分子が伸長を防ぐように修飾されている場合（例えば、逆位ヌクレオチドによって）、第１の核酸分子７１４の重合を同様に阻害することができる。
【０１２６】
第２のプローブ７２０は、第２の結合部分７２２と、第２の核酸分子７２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分７２２は、例えば、分析物７０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子７２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、そして５’末端で結合部分７２２に結合し得る。したがって、第２の核酸分子７２４は、適切なテンプレートが提供される場合、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長され得る。
【０１２７】
第１のステップ７０２において、第１のプローブ７１０、第２のプローブ７２０、及び分析物７０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子７０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１２８】
この相互作用は、第２のステップ７０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子７１４がローリングサークル基質７３８を第２の核酸分子７２４に移す。第２の核酸分子は、ローリングサークル基質７３８の第２の結合部分７３６に相補的な塩基対配列を有し、これは、結合部分７３４と全体的または部分的に重複し得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子７２４は、第１の核酸分子７１４が第１の結合部位７３４に対して有するよりも、第２の結合部位７３６に対してより高い親和性を有することができる。代替の実施形態では、第２の核酸は、第１の核酸と同等またはさらに弱い親和性を有し、最終的にローリングサークル基質を移すために熱平衡に依存する。親和性は、例えば、異なる長さの相補的塩基対配列を有することによって、または一方または両方の核酸分子にいくつかのミスマッチの塩基対を含めることによって変えることができる。ローリングサークル基質に結合すると、第２の核酸分子７２４は、ローリングサークル基質をテンプレートとして使用して、その３’末端から伸長することができる。
【０１２９】
重合はステップ７０６で継続し、最終的に第２の核酸分子７２４を伸長して、ローリングサークル基質７３８に相補的なループを形成する。反応は、第２の核酸分子の３’末端を伸長し続けることができ、必要に応じて第２の核酸分子を巻き戻し、さらなる伸長のために重合部位７２８を除去する。プロセスが暴走増幅反応を続けると、第２の核酸分子はどんどん大きくなる。この大きな鎖の生成は、蛍光または他のイメージングを使用して検出できる。反応は、分析物含有ボリュームでのみ完了する傾向があるので、したがって、そのようなボリュームは図２及び３について上述したのと同様の方法で検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。
【０１３０】
図８は、分離したローリングサークル増幅を活性化するために三叉路を使用する分析物検出の方法８００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物８０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法８００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（増幅反応）を伴うという点で、「付着した」方法として特徴付けることができる。
【０１３１】
流体は、第１のプローブ８１０及び第２のプローブ８２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子８１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分８１２を含む。第１の結合部分８１２は、例えば、分析物８０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２のプローブは、第２の核酸分子８２４に結合した第２の結合部分８２２を含む。第２の結合部分８２２は、例えば、分析物８０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。
【０１３２】
第１のステップ８０２において、第１のプローブ８１０、第２のプローブ８２０、及び分析物８０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子８０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。また、溶液中には、非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド８１６に結合したローリングサークル基質８３８がある。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド８１６は、ローリングサークル基質８３８に結合し、重合を阻害する。ローリングサークル基質８３８は、第１の核酸分子の末端またはその近傍の配列に相補的な第１の部分を含み、ローリングサークル基質８３８は、第２の核酸分子の末端の配列に相補的な第２の部分を含む。非伸長性ブロッカーオリゴヌクレオチド８１６は、ローリングサークル基質８３８の第１及び第２の部分の少なくとも一部に相補的であり、それらに結合することができる。したがって、第１及び第２の核酸分子いずれも、ブロッカーと競合してローリングサークル基質８３８の一部と結合する配列を含むことができるが、ブロッカーは、第１または第２の核酸分子のいずれかよりも強く（例えば、より相補的な核酸に）結合することができる。したがって、全ての分子が溶液中にあり、分析物に結合することなく、ブロッカーが外れる可能性はほとんどない。
【０１３３】
しかしながら、第１及び第２のプローブが分析物に結合すると、この関係は、第１及び第２の核酸分子間の近接ベースの相互作用のために変化する可能性がある。この相互作用は、第２のステップ８０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子８１４と第２の核酸分子８２４が相互作用して、複合体８３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体８３０を形成することができるように、それぞれの分子の一部について複数の相補的塩基対を含むことができる。次いで、第１及び第２の核酸の残りの非相補的部分は、他の核酸分子が相互作用することができる触媒表面８３２を形成することができる。触媒表面８３２を形成する第１及び第２の核酸分子の部分は、ローリングサークル基質８３８の第１及び第２の部分に相補的な部分を含むことができる。どちらの部分も、ブロッカー８１６のローリングサークル基質８３８への結合を確実に克服するのに個別に十分ではないかもしれないが、２つの核酸分子は一緒になって、ブロッカーを確実に変位させるのに十分強くローリングサークル基質８３８に結合する触媒表面を形成し得る。
【０１３４】
この変位は、ステップ８０６で発生し、ブロッカー８１６を溶液中に放出する。これは、第２の核酸分子の３’末端がテンプレートとしてローリングサークル基質８３８を使用して伸長され得る活性複合体８３０を形成する。重合が続くと、それは最終的に第２の核酸分子８２４を伸長して、ローリングサークル基質８３８に相補的なループを形成する（例えば、図７、ステップ７０６を参照されたい）。反応は、第２の核酸分子の３’末端を伸長し続けることができ、必要に応じて第２の核酸分子を巻き戻し、さらなる伸長のために重合部位を除去する。重合プロセスが開始されると、第１の核酸分子がローリングサークル基質に結合したままである必要はなくなる。実際、重合が１回周回すると、ローリングサークル基質をテンプレートとして使用し続けるために、第１の核酸分子を分離する必要がある。複合体８３０は、必要に応じて分解することができるが、プロセスが十分に遠くまで移動すると、分析物の近くの第１及び第２の分子の構成は無関係である。実際、プロセスが継続している間、２つのプローブは分析物から自由に分離できる。プロセスが暴走増幅反応を続けると、第２の核酸分子はどんどん大きくなる。この大きな鎖の生成は、蛍光または他の検出方法（例えば、他の光学的または非光学的検出方法）を使用して検出することができる。反応は、分析物含有ボリュームでのみ完了する傾向があるので、したがって、そのようなボリュームは、図２及び３について上記で説明したのと同様の方法で検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。
【０１３５】
図９  は、分離した鎖置換増幅を使用する分析物検出の方法９００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物９０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法９００は、分析物に付着した流体構成要素を含む近接ベースの相互作用が生じるが、この相互作用は、分析物から分離した構成要素を含む増幅反応の開始を誘発するのに役立つだけであるという点で、「分離した」方法として特徴付けることができる。
【０１３６】
流体は、第１のプローブ９１０及び第２のプローブ９２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子９１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分９１２を含む。第１の結合部分９１２は、例えば、分析物９０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子９１４は、伸張性基質９１６に結合している。第１の核酸分子９１４及び伸張性基質９１６は、例えば、塩基対形成相互作用によって一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。伸張性基質９１６は、その３’末端が第１の核酸分子９１４の５’末端に付着して結合することができ、したがって、ＤＮＡポリメラーゼがその末端で機能するためのテンプレートを提供しない。第１の核酸分子９１４が３’末端で第１の結合部分９１２に結合している場合、重合は、第１の核酸分子９１４と伸張性基質９１６の両方について阻害され得る。
【０１３７】
第２のプローブ９２０は、第２の結合部分９２２と、第２の核酸分子９２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分９２２は、例えば、分析物９０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子９２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、結合部分９２２に結合し得る。第２の核酸分子９２４は、両端での伸長を阻害することができる。結合部分に結合した末端は、結合によって自然に伸長が阻害され、３’または５’末端のいずれかであり得る。もう一方の端は、溶液中で自由に移動しながら、第２の核酸分子の５’末端であるか、または３’末端であるが、重合を防ぐための修飾（例えば、逆位３’末端）を含むことによって、伸長するのを防ぐことができる。
【０１３８】
流体は、伸長性基質９１６に相補的な塩基対配列及び相補的な塩基対配列と隣接して位置する複数の追加の塩基を含む補助基質９２６をさらに含むことができ、その結果、伸長性基質９１６が補助基質９２６の対応する配列と対形成する場合、伸張性基質９１６は、補助基質９２６をテンプレートとして使用してポリメラーゼによって伸長できる。いくつかの実施形態では、補助基質９２６、伸長性基質９１６、第１の核酸分子９１４、及び第２の核酸分子９２４の相対的親和性は、第１の核酸分子９１４からの伸長性基質９１６の除去を第２の核酸分子９２４と近接するまで阻害するように選択される。例えば、伸長性基質９１６基質は、補助基質９２６よりも第１の核酸分子９１４に対してより大きな（または同様の）親和性を有することができるが、第１の核酸分子９１４は、伸長性基質基質９１６よりも第２の核酸分子９２４に対してより大きな（または同様の）親和性を有することができる。親和性は、例えば、各分子の一致する塩基対のそれぞれの長さを変動することによって、ならびに（任意選択で）結合親和性を低下させるために１つ以上のミスマッチ塩基対を含めることによって変動することができる。
【０１３９】
第１のステップ９０２において、第１のプローブ９１０、第２のプローブ９２０、及び分析物９０１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子９０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１４０】
この相互作用は、第２のステップ９０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子９１４と第２の核酸分子９２４が相互作用して、複合体９３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体９３０を形成することができるように、複数の相補的塩基対を含むことができる。相互作用は、伸張性基質９１６を変位させることができ、それは次いで溶液に放出され得る。拡張性基質９１６は溶液中に放出され、溶液中の補助基質９２６とコンジュゲートすることができる。ステップ９０６において、伸長性基質９１６は、相補的な塩基対形成によって補助基質９２６に結合し、続いて、テンプレートとして補助基質９２６を使用して、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、伸長部分をニッキングエンドヌクレアーゼによってニッキングすることができ、その結果、プロセスを繰り返して、図２に記載のプロセスと同様に、ニッキングされた核酸部分の蓄積をもたらすことができる。さらに、複数の補助基質９２６が溶液中に存在する場合、及び補助基質９２６の塩基対配列が、伸長性基質９１６に相補的な反復配列を含む場合（例えば、図３について記載した１＊、２＊、１＊、２＊配列、ここで伸張性基質９１６は、１、２配列を有し、またはもっと単純に１＊、１＊配列であり、伸長性基質９１６が１配列を有する）、増幅反応は、図３について記載されたプロセスと同様に、指数関数的増幅反応において追加の補助基質を含むように拡張することができる。
【０１４１】
いずれの増幅方法が選択されたとしても、次いで、蛍光または他の画像化を使用して、図２及び３について上述したのと同様の方法で、分析物含有ボリュームにおける増幅反応を検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。
【０１４２】
図１０は、分離したローリングサークル増幅を使用する分析物検出の方法１０００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物１００１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法１０００は、分析物に付着した流体構成要素を含む近接ベースの相互作用が生じるが、この相互作用は、分析物から分離した構成要素を含む増幅反応の開始を誘発するのに役立つだけであるという点で、「分離した」方法として特徴付けることができる。
【０１４３】
流体は、第１のプローブ１０１０及び第２のプローブ１０２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子１０１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分１０１２を含む。第１の結合部分１０１２は、例えば、分析物１００１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子１０１４は、伸張性基質１０１６に結合している。第１の核酸分子１０１４及び伸長性基質１０１６は、例えば、塩基対形成相互作用によって一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。伸張性基質１０１６は、その３’末端が第１の核酸分子１０１４の５’末端に付着して結合することができ、したがって、ＤＮＡポリメラーゼがその末端で機能するためのテンプレートを提供しない。第１の核酸分子１０１４が３’末端で第１の結合部分１０１２に結合している場合、重合は、第１の核酸分子１０１４と伸長性基質１０１６の両方について阻害され得る。
【０１４４】
第２のプローブ１０２０は、第２の結合部分１０２２と、第２の核酸分子１０２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分１０２２は、例えば、分析物１００１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子１０２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、結合部分１０２２に結合し得る。第２の核酸分子１０２４は、両端での伸長を阻害することができる。結合部分に結合した末端は、結合によって自然に伸長が阻害され、３’または５’末端のいずれかであり得る。もう一方の端は、溶液中で自由に移動しながら、第２の核酸分子の５’末端であるか、または３’末端であるが、重合を防ぐための修飾（例えば、逆位３’末端）を含むことによって、伸長するのを防ぐことができる。
【０１４５】
流体は、伸長性基質１０１６に相補的な塩基対配列及び相補的な塩基対配列と隣接して位置する複数の追加の塩基を含むローリングサークル基質１０３８をさらに含むことができ、その結果、伸長性基質１０１６がローリングサークル基質１０３８の対応する配列と対形成する場合、伸張性基質１０１６は、ローリングサークル基質１０３８をテンプレートとして使用してポリメラーゼによって伸長できる。いくつかの実施形態では、ローリングサークル基質１０３８、伸長性基質１０１６、第１の核酸分子１０１４、及び第２の核酸分子９２４の相対的親和性は、第１の核酸分子１０１４からの伸長性基質１０１６の除去を第２の核酸分子１０２４と近接するまで阻害するように選択される。例えば、伸長性基質１０１６基質は、ローリングサークル基質１０３８よりも第１の核酸分子１０１４に対してより大きな（または同様の）親和性を有することができるが、第１の核酸分子１０１４は、伸長性基質基質１０１６よりも第２の核酸分子１０２４に対してより大きな（または同様の）親和性を有することができる。親和性は、例えば、各分子の一致する塩基対のそれぞれの長さを変動することによって、ならびに（任意選択で）結合親和性を低下させるために１つ以上のミスマッチ塩基対を含めることによって変動することができる。
【０１４６】
第１のステップ１００２において、第１のプローブ１０１０、第２のプローブ１０２０、及び分析物１００１は、それぞれ、流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子１００１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１４７】
この相互作用は、第２のステップ１００４で起こり、そこでは、第１の核酸分子１０１４と第２の核酸分子１０２４が相互作用して、複合体１０３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体１０３０を形成することができるように、複数の相補的塩基対１０３２を含むことができる。相互作用は、伸長性基質１０１６を変位させることができ、それはその後、溶液中に放出され得る。伸張性基質１０１６は溶液中に放出され、溶液中のローリングサークル基質１０３８とコンジュゲートすることができる。第１の核酸分子から放出された後、伸長性基質１０１６は、溶液中でローリングサークル基質１０３８とコンジュゲートすることができる。伸長性基質１０１６は、相補的な塩基対形成によってローリングサークル基質１０３８に結合し、続いて、テンプレートとしてローリングサークル基質１０３８を使用して、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。
【０１４８】
重合はステップ１００６で継続し、最終的に伸張性基質１０１６を伸長して、ローリングサークル基質１０３８に相補的なループを形成する。反応は、第２の核酸分子の３’末端を伸長し続けることができ、必要に応じて伸張性基質１０１６を巻き戻し、さらなる伸長のために重合部位１０２８を除去する。プロセスが暴走増幅反応を続けると、伸張性基質１０１６はどんどん大きくなる。この大きな鎖の生成は、蛍光または他のイメージングを使用して検出できる。反応は、分析物含有ボリュームでのみ完了する傾向があるので、したがって、そのようなボリュームは、図２及び３について上記で説明したのと同様の方法で検出することができ、同様の分析技法を使用して、例えば、分析物の数または濃度などの特性を決定することができる。
【０１４９】
図１１は、ＲＮＡ重合を誘発するためにブロッキングオリゴヌクレオチドの鎖置換を使用する分析物検出のための方法１１００を示す。この方法は、流体中で実行することができる。例えば、複数の区画化された流体含有ボリュームのそれぞれにおいて実行することができる。流体中に分析物１１０１が提供される。例えば、分析物はタンパク質分子であってよい。方法１１００は、分析物に付着した複合体で起こる反応（ＲＮＡ重合）を伴うという点で、「付着した」方法として特徴付けることができる。
【０１５０】
流体は、第１のプローブ１１１０及び第２のプローブ１１２０をさらに含むことができる。第１のプローブは、第１の核酸分子１１１４を含む第１の相互作用部分に結合した第１の結合部分１１１２を含む。第１の結合部分１１１２は、例えば、分析物１１０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第１の核酸分子１１１４は、ブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６に結合している。第１の核酸分子１１１４及びブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６は、例えば、塩基対形成相互作用によって一緒に結合したＤＮＡ分子であり得る。ブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６は、その３’末端（例えば、逆位の３’末端）への修飾を含み得、その結果、ＤＮＡポリメラーゼによるテンプレート化された伸長は、その末端（ならびに天然でＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない５’末端）で阻害される。第１の核酸分子１１１４が３’末端で第１の結合部分１１１２に結合している場合、重合は、第１の核酸分子１１１４とブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６の両方について阻害され得る。ブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６及び第１の核酸分子１１１４は、集合的に、不活性なＲＮＡポリメラーゼ基質を構成することができる。例えば、分子の対は、修飾された塩基またはミスマッチと二本鎖ＤＮＡ複合体を形成して、ポリメラーゼ認識部位を破壊することができる。したがって、流体はＲＮＡポリメラーゼをさらに含むことができるが、ポリメラーゼ認識部位の不活性化のためにＲＮＡの産生が阻害される。
【０１５１】
第２のプローブ１１２０は、第２の結合部分１１２２と、第２の核酸分子１１２４を含む第２の相互作用部分とを含むことができる。第２の結合部分１１１２は、例えば、分析物１１０１に結合するための結合部位を有する抗体またはその部分であり得る。第２の核酸分子１１２４は、例えば、ＤＮＡ分子であり得、そして５’末端で結合部分１１２２に結合し得る。
【０１５２】
第１のステップ２０２において、第１のプローブ１１１０、第２のプローブ１１２０、及び分析物１１０１は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼを伴って流体中に一緒に提供される。第１及び第２のプローブはそれぞれ、共通の分析物分子１１０１に結合し、この結合は、２つのプローブを近接させ、プローブの相互作用部分が相互作用することを可能にする。
【０１５３】
この相互作用は、第２のステップ１１０４で起こり、そこでは、第１の核酸分子１１１４と第２の核酸分子１１２４が相互作用して、複合体１１３０を形成する。第１及び第２の核酸分子は、例えば、それらが近接したときに相互作用して二本鎖核酸複合体１１３０を形成することができるように、複数の相補的塩基対を含むことができる。相互作用は、ブロッカーオリゴヌクレオチド１１１６を変位させることができ、それはその後、廃棄物として溶液中に放出され得る。ブロッカー１１１６及び第１の核酸分子１１１４を含む複合体は、不活性なＲＮＡポリメラーゼ基質を含むが、第１及び第２の核酸分子を含む新しい複合体１１３０は、活性なＲＮＡポリメラーゼ基質を含む。
【０１５４】
ステップ１１０６において、ＲＮＡポリメラーゼは、流体中の溶液中の複合体１１３０と相互作用し、複数のＲＮＡ分子１１３６を転写する。ＲＮＡ分子の蓄積は、蛍光イメージングなどの技術を使用して検出でき、これは、ＲＮＡ鎖の存在下（例えば、それに結合するとき）で適切な波長の光を照射すると蛍光を発する蛍光部分を流体に提供することにより、ＲＮＡ鎖の蓄積を検出するために使用できる。
【０１５５】
増幅プロセス１１００は、（共通の分析物への結合を介して第１及び第２のプローブの近接性をもたらし、それにより近接ベースの相互作用を開始することにより）完了するまで実行する分析物１１０１の存在に依存するため、溶液中のＲＮＡ鎖１１３６の生成は、分析物が存在することを示す。したがって、溶液中のＲＮＡの蓄積または非蓄積に基づく蛍光（または他の特性）の存在または非存在は、どの流体ボリュームが分析物を含むか含まないかを検出することができる。したがって、デジタルアッセイの一部として方法１１００を使用することにより、流体中の核酸分子の数、及び対応して分析物濃度などの他の特性の測定値を生成することができる。代替的に、プロセス１１００を使用して、分析物のアナログ測定を実行することができる。溶液中のＲＮＡの生成速度は、溶液中に存在する分析物粒子の数とともに増加する。したがって、生成されたＲＮＡの量の測定（例えば、蛍光強度の測定、所与の強度に到達する時間の測定などによる）を使用して、流体中の分析物の量のアナログ測定値を生成することができる。測定には、例えば、分析物の測定量を決定するために、測定されたシグナルを較正されたスケールと比較することが含まれ得る。
【０１５６】
任意選択で、二本鎖ＤＮＡ複合体１１３０からの重合によって生成されたＲＮＡを使用して、指数関数的増幅プロセスを誘発し、それにより、分析物の存在を示すシグナル強度を増強することができる（本明細書で開示された他の指数関数的増幅反応に適用可能な増強のタイプと同様）。例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの指数関数的増幅反応を使用することができる。図３で論じられるものなどの指数関数的反応のデジタルまたはアナログ測定のための検出メカニズムを使用して、流体中の分析物の量の測定値を生成することができる。
【０１５７】
いくつかの態様では、本明細書に記載のシステムは、１つ以上のプロセッサと、実行可能命令が格納されたメモリデバイスとを含むコンピュータを含む。いくつかの態様では、コンピュータは、本明細書に記載される方法を実行するために使用される。様々な態様では、コンピュータを使用して、上に例示及び記載されたシステムまたは方法のいずれかを実施することができる。いくつかの態様では、コンピュータは、バスサブシステムを介していくつかの周辺サブシステムと通信するプロセッサを含む。これらの周辺サブシステムは、メモリサブシステム及びファイルストレージサブシステムを含むストレージサブシステム、ユーザーインターフェース入力デバイス、ユーザーインターフェース出力デバイス、ならびにネットワークインターフェースサブシステムを含むことができる。
【０１５８】
いくつかの態様では、バスサブシステムは、コンピュータの様々なコンポーネント及びサブシステムが意図されたように互いに通信することを可能にするためのメカニズムを提供する。バスサブシステムには、単一のバスまたは複数のバスを含めることができる。
【０１５９】
いくつかの態様では、ネットワークインターフェースサブシステムは、他のコンピュータ及びネットワークへのインターフェースを提供する。ネットワークインターフェースサブシステムは、コンピュータから他のシステムとの間でデータを送受信するためのインターフェースとして機能できる。例えば、ネットワークインターフェースサブシステムを使用すると、コンピュータをインターネットに接続して、インターネットを使用した通信を促進することができる。
【０１６０】
いくつかの態様では、コンピュータは、キーボードマウス、トラックボール、タッチパッド、またはグラフィックタブレットなどのポインティングデバイス、スキャナ、バーコードスキャナ、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システム、マイクロホンなどのオーディオ入力デバイス、及びその他のタイプの入力デバイスなどのユーザーインターフェース入力デバイスを含む。一般に、「入力デバイス」という用語の使用は、コンピュータに情報を入力するための全ての可能なタイプのデバイス及びメカニズムを含むことを意図している。
【０１６１】
いくつかの態様では、コンピュータは、ディスプレイサブシステム、プリンタ、ファックス機、またはオーディオ出力デバイスなどの非視覚的ディスプレイなどのユーザーインターフェース出力デバイスを含む。ディスプレイサブシステムは、陰極線管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのフラットパネルデバイス、または投影デバイスを含み得る。一般に、「出力デバイス」という用語の使用は、コンピュータから情報を出力するための全ての可能なタイプのデバイス及びメカニズムを含むことを意図している。
【０１６２】
いくつかの態様では、コンピュータは、基本的なプログラミング及びデータ構成を格納するためのコンピュータ可読記憶媒体を提供する記憶サブシステムを含む。いくつかの態様では、ストレージサブシステムは、プロセッサによって実行されると、本明細書で記載される方法及びシステムの機能を提供するソフトウェア（プログラム、コードモジュール、命令）を格納する。これらのソフトウェアモジュールまたは命令は、１つ以上のプロセッサで実行できる。ストレージサブシステムはまた、本開示に従って使用されるデータを格納するためのレポジトリを提供することができる。ストレージサブシステムには、メモリサブシステム及び／またはストレージサブシステムが含まれ得る。
【０１６３】
いくつかの態様では、コンピュータは、プログラム実行中に命令及びデータを記憶するためのメインランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）及び固定命令が記憶される読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）を含むいくつかのメモリを含むことができるメモリサブシステムを含む。ファイルストレージサブシステムは、プログラム及びデータファイル用の非一時的な永続（不揮発性）ストレージを提供し、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブと関連するリムーバブルメディア、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学ドライブ、リムーバブルメディアカートリッジ、及びその他の同様のストレージメディアを含めることができる。
【０１６４】
コンピュータは、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、メインフレーム、キオスク、サーバー、または他の任意のデータ処理システムを含む様々なタイプのものであり得る。コンピュータ及びネットワークの絶えず変化する性質のために、本明細書に含まれるコンピュータの説明は、コンピュータの態様を説明するための特定の例としてのみ意図されている。本明細書に記載のシステムよりも多いまたは少ないコンポーネントを有する他の多くの構成が可能である。
【０１６５】
本開示の装置、デバイス、システム、及びそれらの構成要素のいずれかの特定の寸法は、本明細書の開示を考慮して当業者に明らかであるように、意図される用途に応じて容易に変えることができる。さらに、本明細書に記載される実施例及び態様は例示のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆でき、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれることは理解されよう。本明細書に記載の態様の多数の異なる組み合わせが可能であり、そのような組み合わせは、本開示の一部とみなされる。
【０１６６】
本明細書で使用されるとき、Ａ及び／またはＢは、ＡまたはＢのうちの１つ以上、ならびにＡ及びＢなどのそれらの組み合わせを包含する。
【０１６７】
本明細書の任意の態様または態様に関連して論じられる全ての特徴は、本明細書の他の態様及び態様での使用に容易に適合させることができる。異なる態様における同様の特徴のための異なる用語または参照番号の使用は、必ずしも明示的に記載されたもの以外の違いを意味するわけではない。したがって、本開示は、本明細書に開示される態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ説明されることを意図している。
【０１６８】
特に指定のない限り、現在説明されている方法及びプロセスは、任意の順序で実行することができる。例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を記載する方法は、最初にステップ（ａ）、次にステップ（ｂ）、次にステップ（ｃ）で実行できる。または、この方法は、例えば、最初にステップ（ｂ）、次にステップ（ｃ）、次にステップ（ａ）のように、異なる順序で実行することができる。さらに、これらのステップは、特に指定されていない限り、同時にまたは個別に実行できる。
【０１６９】
本明細書に示される詳細は、例として、本開示の好ましい態様の例示的な考察のみを目的としており、本発明の様々な態様の原理及び概念的態様の最も有用で容易に理解できる説明であると考えられるものを提供する目的で提示されている。この点について、本発明の基本的理解に必要である以上に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされておらず、図面及び／または実施例とともに行われる説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具現化され得るかを当業者に対して明らかにするものである。
【０１７０】
本開示の好ましい態様が本明細書に示され、説明されたが、特定の態様の変形を行うことができ、それでも添付の特許請求の範囲の範囲内にあるので、本開示は、記載された開示の特定の態様に限定されないことを理解されたい。使用される用語は、本開示の特定の態様を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解されたい。むしろ、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって確立される。
【０１７１】
一定の範囲の値が提供されるとき、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間、及び、その述べられた範囲内の他の述べられた値または中間の値における、各々の中間の値は、その下限の単位の１０分の１まで本明細書で提供される本開示に包含されると理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、より小さな範囲に含まれ得、独立して本発明に包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方のいずれかを除外する範囲は、本明細書で提供される本開示に含まれる。
【０１７２】
本明細書の態様または態様に関連して論じられる全ての特徴は、本明細書の他の態様及び態様での使用に容易に適合させることができる。異なる態様における同様の特徴のための異なる用語または参照番号の使用は、必ずしも明示的に記載されたもの以外の違いを意味するわけではない。したがって、本開示は、本明細書に開示される態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ説明されることを意図している。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例は、本開示のいくつかの態様をさらに説明するために含まれており、本発明の範囲を限定するために使用されるべきではない。
【０１７４】
実施例１
鎖置換増幅（ＳＤＡ）による分析対象物の検出
この実施例は、上述され、図２に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。第１のプローブのＤＮＡは、標準的な市販のＤＮＡ合成方法を使用して、２つの部分を合成することによって生成される。ＤＮＡの第１の鎖であるＤＮＡ  Ａは、結合部分に付着したアンカーとして機能し、６０ヌクレオチドの長さの３’アミン末端オリゴヌクレオチドである。この配列は、５’末端から２５ヌクレオチドの位置にＮｂ．ＢｓｒＤＩニッキングエンドヌクレアーゼの制限部位を含むように合成される。ブロッカーとして機能する別の鎖は、アンカーのヌクレオチド３０〜６０に相補性を有する３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。２つのＤＮＡ分子の融解温度は６５℃よりも大幅に高くなっている。ブロッカーは、ポリメラーゼによる伸長を防ぐために、その３’末端が逆ｄＴで修飾されている。
【０１７５】
アンカーとブロッカーは、適切な緩衝液（例えば、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭの塩化ナトリウム）中で約１μＭで等モル濃度で配置し、８０℃まで、０．１℃／秒でゆっくりと冷却することによって、ハイブリダイズされる。次いで、２液型複合体をゲル電気泳動で精製して、残余の結合していない一本鎖ＤＮＡを全て除去する。
【０１７６】
第２のプローブのＤＮＡは、３０ヌクレオチドの長さとブロッカーと同じ配列を持つ５’アミン末端オリゴヌクレオチドを合成することによって生成される。これは、ブロッカーと同じアンカーの位置にハイブリダイズするように合成される。第２のプローブのＤＮＡ鎖であるＤＮＡ  Ｂには、溶液中にブロッカーを変位させるための大きなエネルギー上の利点はなく、鎖置換反応は遅い。そのため、ＤＮＡ  Ｂは溶液中のＤＮＡ  Ａに結合する傾向がない。
【０１７７】
目的の標的（例えば、インターロイキン−２またはＩＬ−２）に対する１つの抗体ＡＢ  ＡをＤＮＡ  Ａに化学的に連結して、第１のプローブを形成する。二次抗体であるＡＢ  ＢはＤＮＡ  Ｂに化学的に連結され、二次プローブを形成する。これらの２つの抗体は両方ともＩＬ−２に結合するが、エピトープは異なる。ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは、ＦＰＬＣまたは同様の方法で精製して、遊離ＤＮＡを除去する。
【０１７８】
ＩＬ−２を含む試料は、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩニッキングエンドヌクレアーゼを含む緩衝液中の両方のＤＮＡ−抗体コンジュゲート、及び酵素活性の適切な条件（例えば、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、２５℃でｐＨ８．８、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰのそれぞれ０．５ｍＭ、ならびに１／１００，０００希釈されたＳＹＢＲグリーンＩ）で処理される。２時間の適切なインキュベーション後、温度を６５℃に上げて反応を開始する。
【０１７９】
ＩＬ−２抗体は溶液中のＩＬ−２に結合し、ＤＮＡ  ＡとＤＮＡ  Ｂを近接させる。ＤＮＡ  Ｂは、ＤＮＡ  Ａに付着したブロッカーを変位させる。これにより、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼの活性基質が作り出される。重合が完了すると、新しく生成された二本鎖ＤＮＡ産物には、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位が含まれる。Ｎｂ．ＢｓｒＤＩは一本鎖切断を作り出し、これをポリメラーゼが認識して一本鎖産物を変位させることができる。エンドヌクレアーゼとポリメラーゼのサイクリングにより、一本鎖ＤＮＡが蓄積する。この蓄積は、標準的な蛍光検出を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉからの蛍光の増加によって検出される。
【０１８０】
実施例２
ＳＤＡと指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）による分析物の検出
この実施例は、上述され、図３に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。合成ＤＮＡは、図３に示されるスキームに従って生成される。ドメイン１−２−１を有する効率的なＥＸＰＡＲテンプレートが使用され、この具体例では、ドメイン１はＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣ（配列番号１）であり、ドメイン２はＧＧＡＣＧＡＣＴＣである。ドメイン１とそれに続くミスマッチ塩基を有する閾値オリゴヌクレオチドもまた、活性基質なしで偽反応を阻害するために含まれ得る。図３に示されるようなドメインを有する合成ＤＮＡは、実施例１に記載のプロセスを使用して、２つのそれぞれの抗体のそれぞれに連結されて、抗体−ＤＮＡコンジュゲートを形成する。各抗体は、標的分析物の異なるエピトープに結合するための結合部位を含む。
【０１８１】
全体的なプロトコルには、抗体−ＤＮＡコンジュゲートを含む反応緩衝液への試料の希釈が含まれる。これらのコンジュゲートが標的分析物に結合するとき、これは、図３に示されるように、ＥＸＰＡＲのイニシエーターを放出することができる。ＥＸＰＡＲ酵素、基質ＤＮＡ、挿入色素を添加し、試料を液滴に分割する。反応ボリュームは、ポリメラーゼ活性に適した温度に加熱される。有効化温度（Ｂｓｔポリメラーゼの場合は５５℃）で、反応は放出されたプライマーを指数関数的に増幅する。消化やライゲーションは必要なく、また、酵素条件の変更（緩衝液交換など）も必要ない。
【０１８２】
より具体的には、抗体は、上述の実施例１に記載のプロトコルに従ってＤＮＡにコンジュゲートされる。抗原とＤＮＡ修飾抗体は、対照の組み合わせの全ての順列とともに、ナノモル濃度で混合される。これらの試料にはそれぞれ、３０μＬボリュームの、６ユニットのＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素、０．９ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２４ｍＭの各ｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１×Ｅｖａｇｒｅｅｎ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、３０ｍＭのＫＣｌ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、及び５０ｎＭのＥＸＰＡＲ基質ＤＮＡ（例えば、配列ＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣ（配列番号２）を有するオリゴヌクレオチド）の反応混合物を添加する。これはＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液の調整バージョンである。Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２５℃にてｐＨ８．８）は、適切な代替手段であり得、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩによって提供される。ＥＸＰＡＲプライマーＤＮＡ（例えば、配列ＧＴＡＧＣＧＴＧＡＧ（配列番号３）を有するオリゴヌクレオチド）の５０ｎｍから０．５ｐＭまでの段階希釈物を調製する。次いで、反応を５５℃に上げ、１２０分間毎分モニターする必要がある。
【０１８３】
実施例３
酵素を含まない触媒ヘアピン反応による分析物の検出
この実施例は、上述され、図５に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。第１のプローブのＤＮＡは、標準的な市販のＤＮＡ合成方法を使用して、オリゴヌクレオチドを合成することによって生成される。ＤＮＡの第１の鎖であるＤＮＡ  Ａは、結合部分に付着したアンカーとして機能し、６０ヌクレオチドの長さの３’アミン末端オリゴヌクレオチドである。この配列は、ＤＮＡ  Ｂの結合領域を含むように設計されている。
【０１８４】
第２のプローブのＤＮＡは、３０ヌクレオチドの長さとＤＮＡ  Ａに部分的に相補的な配列を持つ５’アミン末端オリゴヌクレオチドを合成することによって生成される。第２のプローブであるＤＮＡ  Ｂの結合エネルギーは非常に弱く、融点は室温付近またはそれ以下である。そのため、ＤＮＡ  Ｂは溶液中のＤＮＡ  Ａに結合する傾向がない。
【０１８５】
目的の標的（例えば、インターロイキン−２またはＩＬ−２）に対する１つの抗体ＡＢ  ＡをＤＮＡ  Ａに化学的に連結して、第１のプローブを形成する。二次抗体であるＡＢ  ＢはＤＮＡ  Ｂに化学的に連結され、二次プローブを形成する。これらの２つの抗体は両方ともＩＬ−２に結合するが、エピトープは異なる。ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは、ＦＰＬＣまたは同様の方法で精製して、遊離ＤＮＡを除去する。
【０１８６】
ヘアピンＤＮＡ１とヘアピンＤＮＡ２は、折りたたまれた構造を形成するように設計されている。ヘアピンＤＮＡ２は、分子ビーコンとして機能するフルオロフォアとクエンチャーを含むように合成される。ヘアピンオリゴヌクレオチドは、反応緩衝液（例えば、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カリウム、２５℃でｐＨ  ８）で個別に調製する。ヘアピンＤＮＡは、８０℃で３分間加熱してから、氷上で急冷することによりアニーリングする。次いで、ヘアピンＤＮＡ  １及びヘアピンＤＮＡ  ２を希釈し、反応緩衝液中の第１及び第２のプローブのそれぞれ１ｎＭとともに、それぞれ２００ｎＭの濃度に混合する。次いで、ＩＬ−２を含む試料をこの混合物に加える。
【０１８７】
ＩＬ−２抗体は溶液中のＩＬ−２に結合し、ＤＮＡ  ＡとＤＮＡ  Ｂを近接させる。ＤＮＡ  ＢはＤＮＡ  Ａに結合し、活性触媒複合体を作り出す。触媒複合体はヘアピンＤＮＡ  １にハイブリダイズし、二本鎖ステムを破壊することができる。これにより、ヘアピンＤＮＡ  ２にハイブリダイズできる一本鎖領域が利用可能になる。次いで、ヘアピンＤＮＡ  ２は、ヘアピンＤＮＡ  １に結合して、触媒複合体を変位させる。これにより、二本鎖産物が蓄積する。この蓄積は、ヘアピンＤＮＡ  ２のフルオロフォアとクエンチャーが分離されるにつれて増加する蛍光によって検出される。
【０１８８】
実施例４
分離したローリングサークル増幅反応による分析物の検出
この実施例は、上述され、図１０に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。第１のプローブのＤＮＡは、標準的な市販のＤＮＡ合成方法を使用して、２つの部分を合成することによって生成される。ＤＮＡの第１の鎖であるＤＮＡ  Ａは、結合部分に付着したアンカーとして機能し、６０ヌクレオチドの長さの３’アミン末端オリゴヌクレオチドである。この配列は、バクテリオファージＭ１３（Ｍ１３  ＤＮＡ）からの環状テンプレートウイルスゲノムの一部（１６塩基）を含むように合成される。プライマーである別の鎖は、アンカーのヌクレオチド３０〜６０に相補性を有する３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。２つのＤＮＡ分子の融解温度は６５℃よりも大幅に高くなっている。プライマーは、ポリメラーゼによる伸長を受けにくい位置でＤＮＡ  Ａに結合する。
【０１８９】
アンカーとプライマーは、適切な緩衝液（例えば、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭの塩化ナトリウム）中で約１μＭで等モル濃度で配置し、８０℃まで、０．１℃／秒でゆっくりと冷却することによって、ハイブリダイズされる。次いで、２液型複合体をゲル電気泳動で精製して、残留する結合していない一本鎖ＤＮＡを全て除去する。
【０１９０】
第２のプローブのＤＮＡであるＤＮＡ  Ｂは、３０ヌクレオチドの長さとプライマーと同じ配列を持つ５’アミン末端オリゴヌクレオチドを合成することによって生成される。３’末端もまた、ポリメラーゼによる伸長を防ぐために逆塩基で修飾されている。これは、プライマーと同じアンカーの位置にハイブリダイズするように合成される。第２のプローブのＤＮＡ鎖であるＤＮＡ  Ｂには、溶液中にブロッカーを変位させるための大きなエネルギー上の利点はなく、鎖置換反応は遅い。そのため、ＤＮＡ  Ｂは溶液中のＤＮＡ  Ａに結合する傾向がない。
【０１９１】
目的の標的（例えば、インターロイキン−２またはＩＬ−２）に対する１つの抗体ＡＢ  ＡをＤＮＡ  Ａに化学的に連結して、第１のプローブを形成する。二次抗体であるＡＢ  ＢはＤＮＡ  Ｂに化学的に連結され、二次プローブを形成する。これらの２つの抗体は両方ともＩＬ−２に結合するが、エピトープは異なる。ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは、ＦＰＬＣまたは同様の方法で精製して、遊離ＤＮＡを除去する。
【０１９２】
ＩＬ−２を含む試料は、１ｎＭのＭ１３  ＤＮＡ、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ、及び酵素活性に適した条件（例えば、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、２５℃でｐＨ８．８、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰのそれぞれ０．５ｍＭ）と、Ｍ１３  ＤＮＡの逆相補体に結合するように設計された５０ｎＭの分子ビーコンを含む緩衝液中の両方のＤＮＡ−抗体コンジュゲートで処理される。２時間の適切なインキュベーション後、温度を６５℃に上げて反応を開始する。
【０１９３】
ＩＬ−２抗体は溶液中のＩＬ−２に結合し、ＤＮＡ  ＡとＤＮＡ  Ｂを近接させる。ＤＮＡ  Ｂは、ＤＮＡ  Ａに付着したプライマーを変位させる。次いでこのぷりまーはＭ１３  ＤＮＡに結合し、Ｂｓｔ  ＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼの活性基質を生成する。重合が進むにつれて、新しく生成されたローリングサークルＤＮＡ産物は、標準的な蛍光検出を使用して増加した蛍光によって検出される溶液中の分子ビーコンに結合できる。
【０１９４】
実施例５
鎖置換増幅（ＳＤＡ）による分析物の検出
この実施例は、上述され、図２に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。第１のプローブのＤＮＡは、標準的な市販のＤＮＡ合成方法を使用して、２つの部分を合成することによって生成される。ＤＮＡの第１の鎖であるＤＮＡ  Ａは、結合部分に結合したアンカーとして機能し、６０ヌクレオチドの長さとＣＴＴＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡの配列（配列番号４）を持つ３’ビオチン末端オリゴヌクレオチドであった。
【０１９５】
この配列は、５’末端から２２ヌクレオチドの位置にＮｂ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼの制限部位のテンプレートを含むように合成された。ブロッカーとして機能する別の鎖は、アンカー（配列ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＡＧＡＧＴＣＧＴＣＣ＊ＧｉｎｖｄＴ（配列番号５））のヌクレオチド２１〜６０に相補性を有する４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであった。ブロッカーは、エンドヌクレアーゼによる切断またはポリメラーゼによる伸長を防ぐために、３’末端から１塩基の位置にあるホスホロチオエート（＊で示される）及び３’末端にある逆ｄＴ（ｉｎｖｄＴで示される）で修飾された。
【０１９６】
アンカー（ＵＶ−Ｖｉｓで測定して１μＭ）とブロッカー（ＵＶ−Ｖｉｓで測定して１．１μＭ）を適切な緩衝液（この場合、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で構成される１×ＮＥＢ等温増幅緩衝液、２５℃でｐＨ８．８）で調製した。混合物は、８０℃に加熱し、０．１℃／秒でゆっくりと冷却することによってアニールされた。全てのテンプレート鎖が確実に覆われるように、ブロッカー鎖を１０％モル過剰で添加した。二液型複合体は、ゲル電気泳動によって任意選択で分離して、残留する未結合の一本鎖ＤＮＡを除去することができる。
【０１９７】
第２のプローブのＤＮＡは、長さが３９ヌクレオチドで、ブロッカーと同じ配列から修飾を除いた（配列ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＡＧＡＧＴＣＧＴＣＣＧ（配列番号６））５’ビオチン末端オリゴヌクレオチドを合成することによって生成された。これは、ブロッカーと同じアンカーの位置にハイブリダイズするように合成された。第２のプローブのＤＮＡ鎖であるＤＮＡ  Ｂには、溶液中にブロッカーを変位させるための大きなエネルギー上の利点はなく、鎖置換反応は遅い。そのため、ＤＮＡ  Ｂは溶液中のＤＮＡ  Ａに結合する傾向がない。
【０１９８】
両方のＤＮＡ複合体をプローブ（ビオチン）に結合させた。試料は、そのプローブ（アビジン）に結合する標的タンパク質の存在についてアッセイすることができる。１μＭのアビジン含む試料は、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩニッキングエンドヌクレアーゼを含む反応緩衝液に、両方のＤＮＡ−プローブ複合体とともに、酵素活性の適切な条件（例えば、上述のような適切な緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰのそれぞれ０．５ｍＭ、ならびに１／５０，０００希釈されたＳＹＢＲグリーンＩＩ）で添加される。反応を開始するために温度を５５℃に上げた。反応の構成要素を除外（すなわち、テンプレート、プライマー、ブロッカー、またはアビジンを省略）した対照反応物も調製した。
【０１９９】
ビオチン部分は溶液中のアビジンに結合し、ＤＮＡ  ＡとＤＮＡ  Ｂを近接させる。ＤＮＡ  Ｂは、ＤＮＡ  Ａに付着したブロッカーを変位させた。これにより、Ｂｓｔ  ＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼの活性基質が作り出された。重合が完了したとき、新しく生成された二本鎖ＤＮＡ産物には、Ｎｂ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位が含まれた。Ｎｂ．ＢｓｔＮＢＩは一本鎖切断を作り出し、これをＢｓｔポリメラーゼが認識して一本鎖産物を変位させた。エンドヌクレアーゼとポリメラーゼのサイクリングにより、一本鎖ＤＮＡが蓄積する。この蓄積は、標準的な蛍光検出を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩからの蛍光の増加によって検出された。結果を図１２Ａ〜Ｅに示す。
【０２００】
図１２Ａは、近接が鎖置換を誘導して、ポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼのための活性基質を生成する反応の概略図を示す。図１２Ｂは、経時的な蛍光が、タンパク質へのＤＮＡの結合によって駆動される近接の効果を示すことを示している。試料は次のもので調製された：１．水のみ、２．テンプレートのみ、３．テンプレートとプライマーを含む陽性対照（ブロックなし）、４．テンプレートブロックを示す陰性対照、５．テンプレートブロックを示す陰性対照＋プライマー、６．テンプレートブロック、プライマー、及び標的タンパク質を含む実験試料。テンプレートブロック、プライマー、及び標的タンパク質を含む試料６は、時間の経過とともに蛍光の有意な増加を示した。図１２Ｃは、試料１〜６の相対蛍光を描写するエンドポイント蛍光デジタル写真を示す。点線は、ヌル対照バイアルの位置を示す。図１２Ｄは、標的タンパク質を含む場合と含まない場合の３重の実験で実行された経時的な蛍光を示す。標的タンパク質を含む３重の試料は、標的タンパク質を含まない３重の試料と比較した場合、経時的に増加した蛍光を示した。図１２Ｅは、標的タンパク質を含む場合と含まない場合の３重の試料の相対蛍光を示すエンドポイント蛍光デジタル写真を示す。蛍光デジタル写真によると、標的タンパク質を含む３つの試料は、標的タンパク質を含まない試料と比較して蛍光の増加を示した。
【０２０１】
実施例６
溶液及び液滴中のＥＸＰＡＲによる分析物の検出
この実施例は、上述され、図３に示されるプロセスに対応するプロセスにおける分析物の検出を記載する。第１のプローブのＤＮＡは、標準的な市販のＤＮＡ合成方法を使用して、２つの部分を合成することによって生成される。ＤＮＡの第１の鎖であるＤＮＡ  Ａは、結合部分に結合したアンカーとして機能し、６０ヌクレオチドの長さとＣＴＴＴＡＡＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡの配列（配列番号４）を持つ３’ビオチン末端オリゴヌクレオチドであった。
【０２０２】
この配列は、５’末端から２２ヌクレオチドの位置にＮｂ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼの制限部位のテンプレートを含むように合成された。ブロッカーとして機能する別の鎖は、アンカー（配列ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴ  ＩｎｖｄＴ（配列番号７））のヌクレオチド３４〜６０に相補性を有する３２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであった。ブロッカーは、ポリメラーゼによる伸長を防ぐために、ミスマッチのポリＴと３’末端の反転ｄＴ（ｉｎｖｄＴで示される）で伸長された。
【０２０３】
アンカー（ＵＶ−Ｖｉｓで測定して１μＭ）とブロッカー（ＵＶ−Ｖｉｓで測定して１．１μＭ）を適切な緩衝液（この場合、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で構成される１×ＮＥＢ等温増幅緩衝液、２５℃でｐＨ８．８）で調製した。混合物は、８０℃に加熱し、０．１℃／秒でゆっくりと冷却することによってアニールされた。全てのテンプレート鎖が確実に覆われるように、ブロッカー鎖を１０％モル過剰で添加した。二液型複合体は、ゲル電気泳動によって任意選択で分離して、残留する未結合の一本鎖ＤＮＡを除去することができる。
【０２０４】
第２のプローブのＤＮＡは、長さが２８ヌクレオチドで、ブロッカーと同じ配列からミスマッチポリＴ及び逆位ｄＴ修飾を除いた（配列ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴ（配列番号８））５’ビオチン末端オリゴヌクレオチドを合成することによって生成された。これは、ブロッカーと同じアンカーの位置にハイブリダイズするように合成された。第２のプローブのＤＮＡ鎖であるＤＮＡ  Ｂには、溶液中にブロッカーを変位させるための大きなエネルギー上の利点はなく、鎖置換反応は遅かった。そのため、ＤＮＡ  Ｂは溶液中のＤＮＡ  Ａに結合する傾向がない。
【０２０５】
両方のＤＮＡ複合体をプローブ（ビオチン）に結合させた。試料は、そのプローブ（アビジン）に結合する標的タンパク質の存在についてアッセイすることができる。１μＭのアビジンを含む試料は、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｂ．ＢｓｒＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼを含む反応緩衝液に、両方のＤＮＡ−プローブ複合体とともに、酵素活性の適切な条件（例えば、上述のような適切な緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰのそれぞれ０．５ｍＭ、ならびに５００ｎＭのヘアピンレポーター）で添加される。ヘアピンレポーターは、５’末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８フルオロフォア、３’末端にＢＨＱ−１（登録商標）クエンチャーで修飾されたオリゴヌクレオチド（配列ＡＴＴＧＴＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴ（配列番号９））であった。ヘアピンレポーターは、産物にハイブリダイズし、直線状立体配座を呈し、蛍光を増加させるように設計されている。反応緩衝液には、５０ｎＭの補助テンプレートオリゴヌクレオチド（配列ＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣ（配列番号２））も含まれていた。補助テンプレートは、産物を指数関数的に再現するように設計されている。漏出閾値オリゴヌクレオチド（配列ＴＴＴＴＴＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣ（配列番号１０））も１０ｎＭで含まれていた。これは産物と反応し、それを不活性化して、標的タンパク質の非存在下での自発的な指数関数的開始を抑制する。反応を開始するために温度を４５℃に上げた。反応の構成要素を除外（すなわち、プライマー、ブロッカー、またはアビジンを省略）した対照反応物も調製する。
【０２０６】
ビオチン部分は溶液中のアビジンに結合し、ＤＮＡ  ＡとＤＮＡ  Ｂを近接させた。ＤＮＡ  Ｂは、ＤＮＡ  Ａに付着したブロッカーを変位させた。これにより、Ｂｓｔ  ＬａｒｇｅＦｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼの活性基質が作り出された。重合が完了したとき、新しく生成された二本鎖ＤＮＡ産物には、Ｎｂ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位が含まれた。Ｎｂ．ＢｓｔＮＢＩは一本鎖切断を作り出し、これをＢｓｔポリメラーゼが認識して一本鎖産物を変位させた。エンドヌクレアーゼとポリメラーゼのサイクリングにより、一本鎖ＤＮＡが蓄積した。一本鎖産物は、補助テンプレートのプライマーとして機能できる。補助テンプレートは、テンプレートと同じように機能して、同じ配列を持つ一本鎖産物ＤＮＡを触媒的に生成した。これにより、産物が指数関数的に蓄積された。産物は、産物とヘアピンレポーター間の結合による蛍光の増加によって検出された。
【０２０７】
反応も液滴に囲まれていた。上述のように反応混合物を調製したら、試料と反応緩衝液を油相（ＢｉｏＲａｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）内で、３０秒間急速にボルテックスすることにより乳化する。これにより、全ての試薬構成要素を含む油中水滴が生成された。一部の実験では、一部の液滴には標的分子が含まれていたが、一部の液滴には標的分子（分析物分子とも呼ばれる）が含まれていなかった。反応を開始するために温度を４５℃に上げた。Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼの活性基質は、単離された液滴内で蛍光産物を生成した。不活性な液滴は、指数関数的増殖に対する活性なイニシエーターがないことを示し、低レベルの蛍光産物のみを示した。全ての液滴が反応産物を含む限定的な場合では、全ての液滴は蛍光性である。結果を図１３Ａ〜Ｃに示す。
【０２０８】
図１３Ａは、反応の概略図を示しており、近接は、鎖置換を誘導して、ポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼのための活性基質を生成し、その後、指数関数的増殖を生成する。図１３Ｂは、経時的に検出された蛍光を示し、ＤＮＡ／プローブの標的分子（または標的タンパク質）への結合によって駆動される近接の効果を示している。試料は次のもので調製された：１．水のみ、２．テンプレートとプライマーを含む陽性対照（ブロックなし）、３．テンプレートブロックを示す陰性対照、４．テンプレートブロックを示す陰性対照＋プライマー、５．テンプレートブロック、プライマー、及び標的タンパク質を含む実験試料。テンプレートとプライマーを含む陽性対照、及び実験試料は、経時的に最高レベルの蛍光を示した。図１３Ｃは、試料を囲む生成された蛍光液滴の画像を示す。上の３つの画像はエンドポイントの明視野画像を示し、下の３つの画像はエンドポイントの蛍光画像を示す。画像は、非活性テンプレート（左）、活性テンプレート（中央）、及び反応産物を含む全ての液滴を含む限定的な場合（右）を示す。
【図１Ａ】
2022502031.tif 000003
【図１Ｂ】
2022502031.tif 000004
【図１Ｃ】
2022502031.tif 000005
【図１Ｄ】
2022502031.tif 000006
【図２】
2022502031.tif 000007
【図３】
2022502031.tif 000008
【図４】
2022502031.tif 000009
【図５】
2022502031.tif 000010
【図６】
2022502031.tif 000011
【図７】
2022502031.tif 000012
【図８】
2022502031.tif 000013
【図９】
2022502031.tif 000014
【図１０】
2022502031.tif 000015
【図１１】
2022502031.tif 000016
【図１２Ａ】
2022502031.tif 000017
【図１２Ｂ】
2022502031.tif 000018
【図１２Ｃ】
2022502031.tif 000019
【図１２Ｄ】
2022502031.tif 000020
【図１２Ｅ】
2022502031.tif 000021
【図１３Ａ】
2022502031.tif 000022
【図１３Ｂ】
2022502031.tif 000023
【図１３Ｃ】
2022502031.tif 000024
【配列表】
2022502031000001.app
【国際調査報告】
2022502031.tif 000025
2022502031.tif 000026
2022502031.tif 000027
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2022502031.tif 000030