(57)【要約】  本発明は、循環上皮細胞の血中濃度ならびにその遺伝子発現に基づいて肝臓疾患および症状を診断、決定またはモニタリングする方法に関する。【選択図】図３−３
2022500029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の循環上皮細胞（ＣＥＣ）中の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）分類子遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む方法であって、前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２からなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＡＣＴＧ２、ＡＤＭ２、ＡＦＰ、ＡＧＲ２、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＡＬＰＫ３、ＡＭＩＧＯ３、ＡＮＫＲＤ６５、ＡＮＬＮ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＲＨＧＡＰ１１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ３９、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＡＩＡＰ２Ｌ２、ＢＥＸ２、Ｃ１５ｏｒｆ４８、Ｃ１ｏｒｆ１０６、Ｃ１ＱＴＮＦ３、Ｃ６ｏｒｆ２２３、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＢＸ２、ＣＣＤＣ１７０、ＣＣＤＣ２８Ｂ、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＤ１０９、ＣＤ３４、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ７、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＴ１、ＣＥＬＦ６、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＵ、ＣＥＮＰＷ、ＣＫＢ、ＣＮＮＭ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＲＩＰ３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＮＮＤ２、ＣＸｏｒｆ３６、ＣＹＰ１７Ａ１、ＤＬＫ１、ＤＭＫＮ、ＤＳＣＣ１、ＤＴＬ、ＤＵＯＸ２、ＥＣＴ２、ＥＥＦ１Ａ２、ＥＦＮＡ３、ＥＰＨＢ２、ＥＰＰＫ１、ＥＴＶ４、ＦＡＢＰ４、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＩ、ＦＢＸＬ１８、ＦＥＲＭＴ１、ＦＧＦ１９、ＦＬＮＣ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＯＸＤ２−ＡＳ１、ＦＯＸＭ１、ＦＸＹＤ２、ＧＡＢＲＥ、ＧＡＬ３ＳＴ１、ＧＣＮＴ３、ＧＩＮＳ１、ＧＪＣ１、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＺ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＧＰＣ３、ＧＰＲ６４、ＧＰＳＭ１、ＨＲＣＴ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＳＦ１、ＩＧＳＦ３、ＩＱＧＡＰ３、ＩＴＧＡ２、ＩＴＰＫＡ、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、ＫＮＴＣ１、ＫＲＴ２３、ＬＡＭＡ３、ＬＥＦ１、ＬＧＲ５、ＬＩＮＣ００１５２、ＬＩＮＧＯ１、ＬＰＬ、ＬＲＲＣ１、ＬＹＰＤ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＭＡＰＴ、ＭＣＭ２、ＭＤＧＡ１、ＭＤＫ、ＭＦＡＰ２、ＭＩＳＰ、ＭＫＩ６７、ＭＭＰ１１、ＭＮＳ１、ＭＰＺ、ＭＳＣ、ＭＳＨ５、ＭＴＭＲ１１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＹＨ４、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＮＡＶ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＢ、ＮＫＤ１、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＵＭ、ＮＰＭ２、ＮＱＯ１、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５ＤＣ２、ＮＴＳ、ＯＢＳＣＮ、ＯＬＦＭＬ２Ａ、ＯＬＦＭＬ２Ｂ、ＰＡＱＲ４、ＰＥＧ１０、ＰＩ３、ＰＬＣＥ１、ＰＬＣＨ２、ＰＬＫ１、ＰＬＸＤＣ１、ＰＯＤＸＬ２、ＰＯＬＥ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＨＬＨ、ＰＴＫ７、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＴＧ１、ＰＹＣＲ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＢＭ２４、ＲＨＢＧ、ＲＮＦ１５７、ＲＯＢＯ１、ＲＰ４−８００Ｇ７．２、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１、ＳＣＧＮ、５−Ｓｅｐ、ＳＥＲＰＩＮＡ１２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＦＮ、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＮＣＧ、ＳＯＡＴ２、ＳＰ５、ＳＰＡＲＣＬ１、ＳＰＩＮＫ１、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ３９、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＴＣＦ１９、ＴＤＧＦ１、ＴＨＹ１、ＴＫ１、ＴＭＣ５、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＯＮＳＬ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ４５、ＴＴＣ３９Ａ、ＵＢＤ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７６、およびＺＷＩＮＴからなる群から選択される１つ、２つ、３つ以上の追加的な遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）を有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法であって、
（ａ）前記対象のＣＥＣにおいて請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを測定するステップと；
（ｂ）前記対象のＣＥＣ中の前記ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルをＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較し、それによってＨＣＣの存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６】
ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルを使用してＨＣＣスコアが算出され、前記算出されたＨＣＣスコアが参照スコアと比較され、ＨＣＣの存在が、前記参照スコアより高いＨＣＣスコアの存在に基づいて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＣＣスコアが、ランダムフォレスト分析を使用して算出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルが、多変量ロジスティック回帰モデル化手法を使用してＨＣＣ分類子遺伝子の前記参照発現レベルと比較される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
循環上皮細胞（ＣＥＣ）中のＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルが：
（ａ）前記対象から血液を含む試料を得るステップと；
（ｂ）サイズに基づく排除によって前記試料から赤血球、血小板および血漿を除去するステップと；
（ｃ）磁気泳動によって前記試料から白血球（ＷＢＣ）を除去するステップと；
（ｄ）ＲＮＡ配列決定、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、タンパク質マイクロアレイ、または質量分析およびタンパク質プロファイリングを使用して前記ＣＥＣ中の一組の遺伝子の発現を測定するステップと
によって測定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出される前記ＨＣＣが、早期段階のＨＣＣである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出される前記ＨＣＣが、後期段階のＨＣＣである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）超音波画像診断、ダイナミックＣＴ、ＭＲＩ画像診断、針生検および／または生検により患者中のＨＣＣの存在を確認するまたは確認したステップと；
（ｂ）前記患者においてＨＣＣの存在が確認された場合に、ＨＣＣ組織の外科的切除、前記ＨＣＣ組織の高周波アブレーション、前記ＨＣＣ組織の塞栓形成；ＨＣＣ組織の塞栓形成、化学療法および／または凍結療法によってＨＣＣについて前記対象を処置するまたは処置したステップと
をさらに含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＣＣの発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法であって、
（ａ）初期の時点で請求項６または７に記載の方法を実行するステップと、ＨＣＣスコアが参照スコアより低い場合に、次いで、
（ｂ）１つまたは複数のその後の時点で請求項６または７に記載の方法を実行するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、ＨＣＣの存在が決定されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記初期およびその後の各時点が、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法であって、
（ａ）前記対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を検出するステップと；
（ｂ）前記対象の血液試料中のＣＥＣの前記濃度を参照値と比較するステップと；
（ｃ）前記対象が、前記参照値より低い前記血液試料中のＣＥＣの濃度を有する場合に、前記対象を、早期段階の線維症と診断するステップと；
（ｄ）前記対象が、前記参照値より高い前記血液試料中のＣＥＣの濃度を有する場合に、前記対象を、後期段階の線維症と診断するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記対象が、Ｂ型肝炎を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＥＣの前記濃度が、免疫蛍光法によって測定される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＥＣの前記濃度が、グリピカン３（ＧＰＣ３）および／またはサイトケラチン（ＣＫ）を検出することによって測定される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
進行した線維症の発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法であって、
（ａ）請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するステップと；前記対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より低い場合に、次いで、
（ｂ）１つまたは複数のその後の時点で、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）が、前記対象が後期段階の線維症と診断されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
初期およびその後の各時点が、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
線維症またはＨＣＣの前記進行を防止するために処置されているＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法であって、
（ａ）請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するステップと；前記対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より低い場合に、次いで、１つまたは複数のその後の時点で請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法を実行するステップと；
（ｂ）初期の時点で請求項６または７に記載の方法を実行し、ＨＣＣスコアの発現レベルが、参照スコアより低い場合に、次いで、１つまたは複数のその後の時点で請求項６または７に記載の方法を実行するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）が、前記対象が後期段階の線維症と診断されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行され、および／またはステップ（ｂ）が、ＨＣＣの存在が決定されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載のステップ（ａ）またはステップ（ｂ）を実行する第１の初期およびその後の各時点が、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔であり、第２の初期およびその後の各時点が、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液中の前記ＣＥＣが、マイクロ流体デバイスを使用して精製または富化される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体デバイスが、ｉＣｈｉｐデバイスである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号ＤＫ００７１９１、ＥＢ０１２４９３、ＣＡ１７２７３８およびＤＫ０７８７７２の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、循環上皮細胞（ＣＥＣ）を単離し、分析することによって対象において肝臓疾患を検出し、特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体生検とは、実質器官に由来し、血流に入った細胞物質を試料採取することを指す。循環上皮細胞（ＣＥＣ）は、限局性がんの環境（Stott SL, et al. Sci Transl Med 2010;2:25ra23; Lucci A, et al. Lancet Oncol 2012;13:688-95）および新生物発生前の膵臓病変でも（Rhim AD, et al. Gastroenterology 2014;146:647-51; Franses JW, et al. Oncologist 2017）液体生検によって検出され得、その存在は、発癌現象に限定されないことを示唆している。
【０００４】
ＣＥＣの単離は、血流中のその希少性、および細胞捕捉に使用される抗原の多様な発現のため技術的な難題である。例えば、ＥｐＣＡＭ依存的なＶｅｒｉｄｅｘプラットフォームは、２つの独立した研究において肝細胞癌腫（ＨＣＣ）ＣＥＣ検出率３５％および４１％しかなかった（Kelley RK, et al. BMC Cancer 2015;15:206; Sun YF, et al. Hepatology 2013;57:1458-68）。この制約を克服するために、細胞生存率および高品質のＲＮＡ内容物を保ちながらＣＥＣを単離するｉＣｈｉｐと呼ばれる抗原非依存的細胞選別デバイスが開発された。ＨＣＣにおけるＣＥＣを富化し、検出するアッセイを作製するためにｉＣｈｉｐデバイスは、確立されている肝臓特異的マーカーに基づくＲＮＡシグネチャーとこれまで組み合わされてきた（Kalinich M, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2017;114:1123-1128）。
【０００５】
ＨＣＣの非侵襲的診断のための他の手法は、高い検出率を達成するのに失敗してきた。例えば、最近の研究は、無細胞ＤＮＡと血液に基づくタンパク質バイオマーカーとを組み合わせることによるＨＣＣの検出が、おそらく一般的な反復突然変異およびＨＣＣに固有の特異的タンパク質マーカーの不足のためＨＣＣの予測について４４％の精度しかもたらさなかったことを示している（Cohen JD, et al. Science 2018を参照）。
【０００６】
非侵襲的方法を使用することによる特定の肝臓疾患の診断における別の難題は、ＣＥＣが異なる２つの疾患に存在し得るため、ＣＥＣの定量分析が２つの疾患同士を区別するのに必要な情報を提供し得ないことである。
【０００７】
現在まで、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）がある対象においてＨＣＣなどの肝臓疾患を正確に検出する、または異なる肝臓疾患同士もしくは異なる段階の肝臓疾患同士を区別するために利用可能な非侵襲的な血液に基づく方法は存在しない。
【０００８】
したがって、ＣＬＤ患者において高精度でＨＣＣなどの肝臓疾患の存在を検出し、肝臓疾患の段階を決定するための非侵襲的方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも一部において、肝ＣＥＣ（ｈＣＥＣ）が、発癌現象に限定されず、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）などの非がん疾患または症状を有する対象にも存在し得るという発見に基づく。さらに、本発明は、少なくとも一部において、ＣＬＤの対象においてｈＣＥＣを定量的または定性的に分析して、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）などのがんの存在を正確に検出しおよび／または肝臓線維症などの肝臓疾患もしくは症状の異なる段階（例えば、早期または後期段階）を正確に特徴付け得るという発見に基づく。
【００１０】
一態様において、本発明は、対象の循環上皮細胞（ＣＥＣ）中の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）分類子遺伝子の発現レベルを測定する方法に関し、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上からなる。
【００１２】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２からなる。
【００１３】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＭ２、ＡＦＰ、ＡＧＲ２、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＡＬＰＫ３、ＡＭＩＧＯ３、ＡＮＫＲＤ６５、ＡＮＬＮ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＲＨＧＡＰ１１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ３９、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＡＩＡＰ２Ｌ２、ＢＥＸ２、Ｃ１５ｏｒｆ４８、Ｃ１ｏｒｆ１０６、Ｃ１ＱＴＮＦ３、Ｃ６ｏｒｆ２２３、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＢＸ２、ＣＣＤＣ１７０、ＣＣＤＣ２８Ｂ、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＤ１０９、ＣＤ３４、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ７、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＴ１、ＣＥＬＦ６、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＵ、ＣＥＮＰＷ、ＣＫＢ、ＣＮＮＭ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＲＩＰ３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＮＮＤ２、ＣＸｏｒｆ３６、ＣＹＰ１７Ａ１、ＤＬＫ１、ＤＭＫＮ、ＤＳＣＣ１、ＤＴＬ、ＤＵＯＸ２、ＥＣＴ２、ＥＥＦ１Ａ２、ＥＦＮＡ３、ＥＰＨＢ２、ＥＰＰＫ１、ＥＴＶ４、ＦＡＢＰ４、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＩ、ＦＢＸＬ１８、ＦＥＲＭＴ１、ＦＧＦ１９、ＦＬＮＣ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＯＸＤ２−ＡＳ１、ＦＯＸＭ１、ＦＸＹＤ２、ＧＡＢＲＥ、ＧＡＬ３ＳＴ１、ＧＣＮＴ３、ＧＩＮＳ１、ＧＪＣ１、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＺ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＧＰＣ３、ＧＰＲ６４、ＧＰＳＭ１、ＨＲＣＴ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＳＦ１、ＩＧＳＦ３、ＩＱＧＡＰ３、ＩＴＧＡ２、ＩＴＰＫＡ、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、ＫＮＴＣ１、ＫＲＴ２３、ＬＡＭＡ３、ＬＥＦ１、ＬＧＲ５、ＬＩＮＣ００１５２、ＬＩＮＧＯ１、ＬＰＬ、ＬＲＲＣ１、ＬＹＰＤ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＭＡＰＴ、ＭＣＭ２、ＭＤＧＡ１、ＭＤＫ、ＭＦＡＰ２、ＭＩＳＰ、ＭＫＩ６７、ＭＭＰ１１、ＭＮＳ１、ＭＰＺ、ＭＳＣ、ＭＳＨ５、ＭＴＭＲ１１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＹＨ４、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＮＡＶ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＢ、ＮＫＤ１、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＵＭ、ＮＰＭ２、ＮＱＯ１、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５ＤＣ２、ＮＴＳ、ＯＢＳＣＮ、ＯＬＦＭＬ２Ａ、ＯＬＦＭＬ２Ｂ、ＰＡＱＲ４、ＰＥＧ１０、ＰＩ３、ＰＬＣＥ１、ＰＬＣＨ２、ＰＬＫ１、ＰＬＸＤＣ１、ＰＯＤＸＬ２、ＰＯＬＥ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＨＬＨ、ＰＴＫ７、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＴＧ１、ＰＹＣＲ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＢＭ２４、ＲＨＢＧ、ＲＮＦ１５７、ＲＯＢＯ１、ＲＰ４−８００Ｇ７．２、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１、ＳＣＧＮ、５−Ｓｅｐ、ＳＥＲＰＩＮＡ１２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＦＮ、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＮＣＧ、ＳＯＡＴ２、ＳＰ５、ＳＰＡＲＣＬ１、ＳＰＩＮＫ１、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ３９、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＴＣＦ１９、ＴＤＧＦ１、ＴＨＹ１、ＴＫ１、ＴＭＣ５、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＯＮＳＬ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ４５、ＴＴＣ３９Ａ、ＵＢＤ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７６、およびＺＷＩＮＴからなる群から選択される１つ、２つ、３つ以上の追加的な遺伝子も含む。
【００１４】
一態様において、本発明は、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）の対象においてＨＣＣの存在を検出する方法に関し、本方法は、（ａ）対象のＣＥＣにおいて本明細書に記載されるＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを測定するステップと；（ｂ）対象のＣＥＣ中のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルをＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較し、それによってＨＣＣの存在を決定するステップとを含む。
【００１５】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを使用してＨＣＣスコアが算出され、算出されたＨＣＣスコアが参照スコアと比較され、ＨＣＣの存在が、参照スコアより高いＨＣＣスコアの存在に基づいて決定される。
【００１６】
一部の実施形態において、ＨＣＣスコアは、ランダムフォレスト分析を使用して算出される。
【００１７】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルは、多変量ロジスティック回帰モデル化手法を使用してＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較される。
【００１８】
一部の実施形態において、循環上皮細胞（ＣＥＣ）中のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルは、（ａ）対象から血液を含む試料を得るステップと；（ｂ）サイズに基づく排除によって試料から赤血球、血小板および血漿を除去するステップと；（ｃ）磁気泳動によって試料から白血球（ＷＢＣ）を除去するステップと；（ｄ）ＲＮＡ配列決定、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、タンパク質マイクロアレイ、または質量分析およびタンパク質プロファイリングを使用してＣＥＣ中の一組の遺伝子の発現を測定するステップとによって測定される。
【００１９】
一部の実施形態において、検出されるＨＣＣは、早期段階のＨＣＣまたは後期段階のＨＣＣである。
【００２０】
一部の実施形態において、ＣＬＤを有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法は、（ａ）超音波画像診断、ダイナミックＣＴ、ＭＲＩ画像診断、針生検および／または生検により患者中のＨＣＣの存在を確認するまたは確認したステップと；（ｂ）患者においてＨＣＣの存在が確認された場合に、そのＨＣＣ組織の外科的切除、そのＨＣＣ組織の高周波アブレーション、そのＨＣＣ組織の塞栓形成；ＨＣＣ組織の塞栓形成、化学療法および／または凍結療法によってＨＣＣについて対象を処置するまたは処置したステップも含む。
【００２１】
一態様において、本発明は、ＨＣＣの発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法に関し、本方法は、（ａ）初期の時点で本明細書に記載のＣＬＤを有する対象においてＨＣＣの存在を検出するステップと、ＨＣＣスコアが参照スコアより低い場合に、次いで、（ｂ）１つまたは複数のその後の時点で検出ステップを実行するステップとを含む。一部の実施形態において、検出ステップは、ＨＣＣの存在が決定されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行される。一部の実施形態において、初期およびその後の各時点は、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である。
【００２２】
一態様において、本発明は、ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法に関し、本方法は、（ａ）対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を検出するステップと；（ｂ）対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を参照値と比較するステップと；（ｃ）参照値より低い血液試料中のＣＥＣの濃度を有する対象を、早期段階の線維症と診断するステップと；（ｄ）参照値より高い血液試料中のＣＥＣの濃度を有する対象を、後期段階の線維症と診断するステップとを含む。
【００２３】
一部の実施形態において、対象はＢ型肝炎を有する。一部の実施形態において、ＣＥＣの濃度は、免疫蛍光法によって測定される。一部の実施形態において、ＣＥＣの濃度は、グリピカン３（ＧＰＣ３）および／またはサイトケラチン（ＣＫ）を検出することによって測定される。
【００２４】
一態様において、本発明は、進行した線維症の発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法に関し、本方法は、（ａ）本明細書に記載されるＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法を実行するステップと；対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より低い場合に、次いで、（ｂ）１つまたは複数のその後の時点でＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法を実行するステップとを含む。
【００２５】
一部の実施形態において、ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法は、対象が後期段階の線維症と診断されるまで１つまたは複数のその後の時点で実行される。一部の実施形態において、初期およびその後の各時点は、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である。
【００２６】
一態様において、本発明は、線維症またはＨＣＣの進行を防止するために処置されているＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法に関し、方法は、（ａ）本明細書に記載されるＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法を実行するステップと；対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より低い場合に、次いで、１つまたは複数のその後の時点でＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法を実行するステップと；（ｂ）本明細書に記載のＣＬＤを有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法を実行し、ＨＣＣスコアの発現レベルが参照スコアより低い場合に、次いで、１つまたは複数のその後の時点で検出方法を実行するステップとを含む。
【００２７】
一部の実施形態において、ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法は、対象が後期段階の線維症と診断されるまで１つもしくは複数のその後の時点で実行され、および／またはＣＬＤを有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法は、ＨＣＣの存在が決定されるまで１つもしくは複数のその後の時点で実行される。一部の実施形態において、ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法またはＣＬＤを有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法を実行する第１の初期およびその後の各時点は、約３ヵ月、６ヵ月もしくは１年間隔であり、第２の初期およびその後の各時点は、約３ヵ月、６ヵ月もしくは１年間隔である。
【００２８】
一部の実施形態において、対象の血液中のＣＥＣは、マイクロ流体デバイスを使用して精製または富化される。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ｉＣｈｉｐデバイスである。
【００２９】
別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に使用するために本明細書に記述され；当業者に公知の他の、適切な方法および材料も使用され得る。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録および他の参照の全ては、その全体を参照により組み込む。加えて、米国特許出願公開第２０１６／０３１２２９８号明細書は、特にその全体を参照により本明細書に組み込み、一部の実施形態において、本明細書に記述される方法は、その出願に記載される方法と組み合わせて使用され得る。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先される。
【００３０】
本発明の他の特徴および優位性は、以下の詳細な説明および図、ならびに請求項から明らかになる。
【００３１】
特許または出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いがあれば事務局によって提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、造血細胞を除去するために使用したｉＣｈｉｐ抗原非依存的細胞選別デバイス（ｉＣｈｉｐデバイス）の略図である。試料を、ｉＣｈｉｐデバイスで処理してＣＥＣについて試料を富化し、そのＣＥＣは、免疫蛍光法またはＲＮＡ配列決定によって分析され得る。
【図２−１】図２Ａは、ＣＬＤの対象の末梢血からの免疫蛍光標識されたｈＣＥＣの蛍光顕微鏡検査画像を示す図である。ＨＣＣまたはＣＬＤの患者からの血液試料を、ｉＣｈｉｐデバイスを使用して処理してＣＥＣを単離し、ＤＡＰＩ、ＣＤ４５、グリピカン３（ＧＰＣ３）および広スペクトルサイトケラチン（ＣＫ−ＷＳ）染色した。白血球細胞（ＷＢＣ）を比較のために示す。
【図２−２】図２Ｂは、健康なドナー（ＨＤ）もしくはＣＬＤ、ＨＣＣの患者、またはＨＣＣについて処置され、悪性疾患の所見がない患者（ＨＣＣ  ＮＥＤ）からのｉＣｈｉｐデバイス処理した血液試料における免疫蛍光標識されたｈＣＥＣの検出を表すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。図２Ｃは、早期段階の肝臓線維症のＣＬＤ患者および進行した線維症の患者におけるｈＣＥＣの検出を表すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図３−１】図３Ａは、対照血液、ＨｅｐＧ２細胞１〜５０個でスパイクした対照血液中のｈＣＥＣのＲＮＡ−ｓｅｑ、およびＨｅｐＧ２単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑから得られたＨｅｐＧ２遺伝子発現シグネチャーのヒートマップである。
【図３−２】図３Ｂは、ＣＬＤ患者、ＨＣＣ患者からのｈＣＥＣおよびフロー選別したＷＢＣのＲＮＡ−ｓｅｑから得られた肝臓特異的遺伝子シグネチャーのヒートマップである（Ｂ、Ｂ細胞；Ｃ、細胞障害性Ｔ細胞；Ｈ、ヘルパーＴ細胞；Ｍ、単球；Ｎ、ＮＫ細胞；Ｇ、顆粒白血球）。ヒートマップ単位は、ｌｏｇ２（リード１００万個当たりのリード数＋１）として示される。
【図３−３】図３Ｃは、本明細書に記載されるランダムフォレストアルゴリズムの概略を示す図である。
【図３−４】図３Ｄは、ＣＬＤ、早期段階のＨＣＣおよび後期段階のＨＣＣにおけるＨＣＣスコア（ランダムフォレスト分類子の票割合）を示すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図４−１】図４Ａは、健康なドナー（ＨＤ）もしくはＣＬＤの患者（ＣＬＤ）、ＨＣＣの患者、または以前にＨＣＣを有したが、ＨＣＣについて処置された後に悪性疾患の所見を示さない患者（ＨＣＣ  ＮＥＤ）由来のｉＣｈｉｐデバイス処理血液試料中のグリピカン３陽性（ＧＰＣ３）ＣＥＣの検出を示すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図４−２】図４Ｂは、健康なドナー（ＨＤ）もしくはＣＬＤの患者（ＣＬＤ）、ＨＣＣの患者（ＨＣＣ）、または以前にＨＣＣを有したが、ＨＣＣについて処置された後に悪性疾患の所見を示さない患者（ＨＣＣ  ＮＥＤ）由来のｉＣｈｉｐデバイス処理血液試料中の広スペクトルサイトケラチンを発現するＣＥＣ（ＣＫ＋細胞）の検出を示すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図４−３】図４Ｃは、線維症段階（Ｆ１またはＦ２と定義される早期段階およびＦ３またはＦ４と定義される進行した線維症）によって層化されたＨＢＶ  ＣＬＤ患者（ＨＣＣなし）におけるｈＣＥＣ（ＣＫ＋またはＧＰＣ３＋である細胞）の検出を示すグラフである。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図４−４】図４Ｄは、肝臓疾患の病因によって層化されたＣＬＤ患者におけるＣＥＣ濃度を示すグラフである：非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）；原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）。ｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図５−１】図５Ａは、ＣＬＤ患者、処置を受けたが、採血時に依然として活性な疾患を有したＨＣＣ患者（ＨＣＣ  Ｏｎ  Ｔｘ）、および処置ナイーブである活性なＨＣＣの患者（ＨＣＣ  Ｎｏ  Ｔｘ）におけるＣＥＣのＨＣＣスコア（ランダムフォレスト分類子の票割合）を示すグラフである。示したｐ値は、マンホイットニー検定によって算出された。
【図５−２】図５Ｂは、多変量ロジスティック回帰モデリングによって作製されたＨＣＣ分類子に対する受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。
【図５−３】図５Ｃは、ＨＣＣランダムフォレスト分類子に対するＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、少なくとも一部において、ｈＣＥＣが、発癌現象に限定されず、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）などの非がん疾患または症状を有する対象にも存在し得るという発見に基づく。さらに、本発明は、少なくとも一部において、ＣＬＤの対象においてｈＣＥＣを定量的または定性的に分析して、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）などのがんの存在を正確に検出しおよび／または肝臓線維症などの肝臓疾患もしくは肝臓症状の段階（例えば、早期または後期段階）を正確に特徴付け得るという発見に基づく。
【００３４】
本明細書において実証された通り、血流中を循環している、疾患のある肝臓由来の細胞（すなわち、ｈＣＥＣ）は、ＨＣＣおよびＣＬＤの診断に使用するために定量的（例えば、免疫蛍光法による）ならびに定性的（例えば、遺伝子発現プロファイルまたはＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベル）の両方で検出される。この液体生検の重要な適用には、ＨＣＣ、ＣＬＤなどの肝臓疾患もしくは症状の検出または診断、病因決定、肝臓線維症病期分類、およびＨＣＣ調査もしくはモニタリングがある。本発明は、ＣＬＤなどの肝臓症状がある患者の診断およびモニタリングに適用され得る。
【００３５】
本明細書では、疾患または症状に関して語句「正確に診断する」および「正確に検出する」とは、高い感度（すなわち、真の陽性率、または疾患もしくは症状が存在する場合に疾患もしくは症状を検出する）または高い特異度（すなわち、真の陰性率、または疾患もしくは症状が存在しない場合に疾患もしくは症状を検出しない）で疾患または症状の存在を予測することを指す。一部の実施形態において、語句「正確に診断する」および「正確に検出する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陽性率で疾患または症状の存在を検出できることも意味し得る。一部の実施形態において、語句「正確に診断する」および「正確に検出する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陰性率で疾患または症状の存在を検出できることを意味し得る。
【００３６】
本明細書では、２つの疾患または症状に関して語句「正確に区別する」とは、第２の疾患もしくは症状も存在するかしないかにかかわらず、高い感度（すなわち、第１の疾患または症状が存在する場合に第１の疾患または症状を検出する、すなわち、真の陽性率）または高い特異度（すなわち、第１の疾患または症状が存在しない場合に第１の疾患または症状を検出しない、すなわち、真の陰性率）で第１の疾患もしく第１の症状の存在を検出することを指し得る。一部の実施形態において、語句「正確に区別する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陽性率で疾患または症状の存在を検出できることを意味し得る。一部の実施形態において、語句「正確に区別する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陰性率で疾患または症状の存在を検出できることを意味し得る。
【００３７】
本明細書では、疾患もしくは症状の異なる段階に関して語句「正確に区別する」とは、症状もしくは疾患の特定の段階が予測され得るように、高い感度（すなわち、疾患または症状がその段階で存在する場合に疾患または症状の段階を検出する、すなわち、真の陽性率）または高い特異度（すなわち、疾患または症状がその段階で存在しない場合に疾患または症状の段階を検出しない、すなわち、真の陰性率）で特定の段階の疾患（例えば、肝臓における進行した線維症）の存在を検出することを指し得る。一部の実施形態において、語句「正確に区別する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陽性率で疾患または症状の段階の存在を検出できることを意味し得る。一部の実施形態において、語句「正確に診断する」は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％および少なくとも約９９．９％の真の陰性率で疾患または症状の存在を検出できることを意味し得る。
【００３８】
本明細書では、用語「循環上皮細胞（ＣＥＣ）」は、組織（例えば、病変組織、腫瘍組織または非腫瘍組織）から脱落し、血液中に存在する、すなわち循環している上皮起源の細胞を指し得る。血液の他の成分からＣＥＣを同定しおよび／または単離するために使用され得る細胞マーカー（例えばマーカー遺伝子）については、本明細書において後述する。一部の実施形態において、肝臓疾患（例えば、ＨＣＣおよび／またはＣＬＤ）がある対象由来のＣＥＣは、主に、例えば、肝細胞において発現される遺伝子（例えば、ＧＰＣ３およびＣＫ）でＣＥＣを免疫蛍光染色することによって決定される肝ＣＥＣ（ｈＣＥＣ）である。
【００３９】
本明細書では、用語「慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）」とは、肝臓実質の進行性破壊および再生に関係する肝臓の疾患過程を指す。一部の実施形態において、ＣＬＤは、線維化肝硬変に至る可能性がある。他の一部の実施形態において、ＣＬＤは、門脈圧亢進（例えば、腹水症、脾機能亢進、およびより下部食道静脈瘤および直腸静脈瘤）、肺肝症候群、肝腎症候群、脳症またはＨＣＣなどの合併症をもたらし得る。ＣＬＤは、６ヵ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間または５年間より長くの期間にわたって続く肝臓の疾患も指し得る。ＣＬＤは、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、黄熱病ウイルス、アルコール性肝臓疾患および／またはメトトレキサート、アミオダロン、ニトロフラントインもしくはアセトアミノフェン由来の薬物誘発性肝臓疾患によって引き起こされる可能性がある。他の実施形態において、ＣＬＤは、非アルコール性脂肪肝臓疾患、血色素症、ウィルソン病または原発性胆汁胆管炎もしくは原発性硬化性胆管炎などの自己免疫反応によって引き起こされる可能性がある。
【００４０】
本明細書では、用語「モニタリング」または「調査」とは、疾患または症状の存在について対象もしくは患者（例えば、症状を発症する危険性がある対象）を定期的に評価することを指す。一部の実施形態において、定期的なアセスメントは、約毎日、約１日おき、約１週間に１回、約１週間おきに１回、約１ヶ月毎、約２ヵ月毎、約３ヵ月毎、約４ヵ月毎、約５ヵ月毎、約６ヵ月毎、約７ヵ月毎、約８ヵ月毎、約９ヵ月毎、約１年毎、約１８ヵ月毎、約２年毎、約３年毎、約４年毎、約５年毎、約６年毎、約７年毎、約８年毎、約９年毎または約１０年毎に起こり得る。疾患または症状の存在に対する対象または患者のこの反復アセスメントは、（１）疾患または症状が、対象もしくは患者において検出される；（２）患者が、疾患または症状を発症する危険性がもはやなくなる；（３）モニタリングを受けている対象もしくはモニタリングを行っている者の裁量で；または（４）他の理由のため反復アセスメントの中断が余儀なくされるまで継続することができる。対象が疾患または症状の存在について評価される間隔は、モニタリングの過程で調整され得る。
【００４１】
本明細書では用語「集合学習方法」とは、訓練し、次いでそれを使用して予測を作り得るランダムフォレストなどの教師あり学習アルゴリズムを指す。
【００４２】
本明細書では、用語「肝細胞癌腫（ＨＣＣ）」とは、ＣＬＤの対象に一般的な原発性肝臓がんの一種を指す。ＨＣＣは、ＨＢＶ感染の陰性マーカーを持つ患者および肝細胞ゲノムに組み込まれたＨＢＶ  ＤＮＡを有する患者を含めて、様々な病因の硬化性肝臓疾患を根底に持つ患者に発症し得る。ＨＣＣの疫学、病因および発癌現象については、Ghouri YA, et al., J Carcinog 2017; 16:1に記載されており、それを参照により本明細書に組み込む。
【００４３】
本明細書では、語句「早期段階のＨＣＣ」は、ミラノ基準内にあるＨＣＣを指し得る。本明細書では、語句「後期段階のＨＣＣ」は、ミラノ基準外にあるＨＣＣを指し得る。ミラノ基準は、ＨＣＣの対象が以下の基準：ＨＣＣが、５ｃｍ未満の１つの病変またはそれぞれ３ｃｍ未満の最大３つの病変である；肝外徴候がない；著しい脈管浸潤の所見がない、を満たすことを必要とする。言い換えれば、「早期段階のＨＣＣ」は、全てのミラノ基準を満たし、「後期段階のＨＣＣ」は、全てのミラノ基準を満たさない。
【００４４】
本明細書では、用語「早期段階の肝臓線維症」および「後期段階の肝臓線維症」はそれぞれ、ＭＥＴＡＶＩＲ分類によって定義されるＦ１またはＦ２段階およびＦ３またはＦ４段階を指す。
【００４５】
本明細書に記述される方法を使用して、ランダムフォレスト分類子などの集合学習方法に基づく分類子を使用して患者のＣＥＣ中にある一組の遺伝子の発現を検出し、分析することによって非癌疾患症状、例えばＣＬＤの患者において、がん、例えばＨＣＣの存在を正確に診断または予測することができる。
【００４６】
一部の実施形態において、ＣＬＤの対象（例えば、Ｂ型肝炎の対象またはＢ型肝炎ウイルスに感染している対象）由来のｈＣＥＣを（例えば、定性的に）分析して、ＨＣＣの対象とそうでない対象とを正確に区別することができる。他の実施形態において、ＣＬＤの対象由来のｈＣＥＣを定量的測定して、早期段階の肝臓線維症の対象と後期段階の肝臓線維症の対象とを正確に区別することができる。
【００４７】
本明細書において実証されるように、がん、例えばＨＣＣの存在、および非がん疾患または症状、例えばＣＬＤの存在は、ＣＥＣの存在の増大と関連する。ＣＥＣの存在の増大は、処置されて疾患の臨床的所見がないがん（例えば、ＨＣＣ）の以前の存在（例えば、治療的処置を受け、疾患の臨床的所見が無いＨＣＣ患者における）とも関連する。
【００４８】
したがって、本方法は、様々な統計的およびコンピュータ予測方法（例えば、ランダムフォレスト分類子などの集合学習方法または多変量ロジスティック回帰などの統計的方法）を使用して一組の遺伝子（例えば、ＨＣＣ分類子遺伝子）を検出ならびに分析して、がん、例えば、ＨＣＣの存在を検出するステップを含み得る。
【００４９】
本方法は、一部の実施形態において、早期段階でがんの存在を検出することができ、そのがんは、この方法を使わなければ、超音波画像診断、ダイナミックＣＴ、ＭＲＩ画像診断、針生検または生検などの現在公知の方法を使用して検出することが困難な場合がある。
【００５０】
一部の実施形態において、微小流体（例えば、「ラボオンチップ」またはｉＣｈｉｐデバイス）を本方法に使用して、ＣＥＣを分離、精製、富化、または調製することができる。そのようなデバイスは、微小流体フローサイトメトリー、連続的なサイズに基づく分離、クロマトグラフィーまたは磁気泳動分離のために成功裏に使用されてきた。例えば、ｉＣｈｉｐデバイスおよびそのようなデバイスの他の様々な実施形態は、米国特許出願公開第２０１６／０３１２２９８号明細書（参照により本明細書に組み込む）に記載されており、これを使用して、細胞の混合物からｈＣＥＣを分離し、またはｈＣＥＣの富化された集団を調製することができる。特に、そのようなデバイスを使用して、全血などの複雑な混合物からｈＣＥＣを単離することができる。
【００５１】
一部の実施形態において、デバイスは、初期の試料混合物と比較して所望の細胞を少なくとも７５％、例えば、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％保持し、一方で１つまたは複数の望ましくない細胞型と比較して少なくとも１００、例えば、１０００、１０，０００、１００，０００もしくはさらに１，０００，０００の倍数に所望の細胞の集団を富化する。一例において、検出モジュールは、分離または富化デバイスと流体連結され得る。検出モジュールは、本明細書に開示される任意の検出の方法または当技術分野で公知の他の方法を使用して作動し得る。例えば、検出モジュールには、顕微鏡、細胞計数器、磁石、ｂｉｏｃａｖｉｔｙレーザ［例えば、Gourley et al., J. Phys. D: Appl. Phys., 36: R228-R239 (2003)を参照］、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マイクロアレイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＮＡハイブリダイゼーションを実行するためのデバイスまたはハイパースペクトル画像化システム［例えば、Vo-Dinh et al., IEEE Eng. Med. Biol. Mag., 23:40-49 (2004)を参照］がある。一部の実施形態において、コンピュータ端末が、検出モジュールに接続され得る。例えば、検出モジュールは、目的の細胞、タンパク質または核酸、例えば、ＨＣＣ分類子遺伝子の転写産物もしくはコードされているタンパク質に選択的に結合する標識を検出することができる。
【００５２】
一部の実施形態において、微小流体システムは、（ｉ）ＣＥＣ（例えば、ｈＣＥＣ）の分離または富化のためのデバイス；（ｉｉ）富化されたＣＥＣの溶解のためのデバイス；および（ｉｉｉ）遺伝子転写産物（例えば、ＨＣＣ分類子遺伝子の転写産物）またはコードされているタンパク質の検出のためのデバイスを含む。
【００５３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスを使用して調製されたＣＥＣの集団を使用して、公知の分子生物学的技術、例えば、上述のおよびSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (Jan. 15, 2001)）；およびShort Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Current Protocols; 52 edition (Nov. 5, 2002)）に記載の技術を使用して遺伝子転写産物またはタンパク質の発現が分析される。
【００５４】
一般的に、ＣＥＣ（例えば、ＣＴＣ）の富化された集団においてがん診断に有用な分類子遺伝子もしくはコードされているタンパク質の発現を検出および／または定量化するためのデバイスは、本明細書に記載されており、がん、例えば、上皮起源の腫瘍の早期検出、例えば、肝臓、膵臓、肺、乳、前立腺、腎臓、卵巣または大腸がんの早期検出に使用され得る。
【００５５】
本明細書に記載される語句「差異的発現分析」は、試料（例えば細胞、例えば、ＣＥＣ、例えば、ｈＣＥＣ）中の個々の遺伝子（例えば、個々のＨＣＣ分類子遺伝子）の発現レベルおよび／または複数の遺伝子（例えば、複数のＨＣＣ分類子遺伝子）の発現パターンに対してコンピュータもしくは統計的分析を実行することを指し得る。用語「差異的発現」とは、過剰発現（参照値より高いレベルで遺伝子を発現する）または過小発現（参照値より低いレベルで遺伝子を発現する）を意味し得る。一部の実施形態において、差異的発現分析は、参照値（例えば、病的でない対応する細胞もしくは組織に由来する試料中の１つもしくは複数の遺伝子の発現レベルまたはパターン）と試料中の発現レベルまたはパターンを比較することができる。他の実施形態において、発現レベルまたはパターンは、１つまたは複数の対照遺伝子の発現レベルに対して標準化することができ、または非相対的様式（例えば、容積当たりの転写産物コピー数または絶対的コピー数）で定量化されてもよい。遺伝子発現レベルは、ＲＮＡ配列決定、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＮＡハイブリダイゼーション、タンパク質マイクロアレイ、ならびに／または質量分析およびタンパク質プロファイリングなどの公知の方法のいずれかによって測定され得る。他の公知の生化学または分子生物学的技術を使用して、遺伝子の発現を検出することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡ配列決定およびｑＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現レベルを測定するのに好ましい方法である。
【００５６】
差異的発現分析は、公知の統計的またはコンピュータ方法（例えば、ランダムフォレスト分類子などの集合学習方法または多変量ロジスティック回帰などの統計的方法）のいずれか１つによって実行され得る。
【００５７】
一態様において、本発明は、対象の循環上皮細胞（ＣＥＣ）中の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）分類子遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む方法を提供する。対象のＣＥＣによるＨＣＣ分類子遺伝子の過剰発現は、対象におけるＨＣＣの存在の高度な予測として決定された（例えば、実施例１〜４を参照）。一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ、２つ、３つ以上（例えば、全部）を含む。一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１の全てを含むことができる。他の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＨＣＣにおいて過剰発現される１つまたは複数の他の遺伝子、例えば、ＡＣＴＧ２、ＡＤＭ２、ＡＦＰ、ＡＧＲ２、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＡＬＰＫ３、ＡＭＩＧＯ３、ＡＮＫＲＤ６５、ＡＮＬＮ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＲＨＧＡＰ１１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ３９、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＡＩＡＰ２Ｌ２、ＢＥＸ２、Ｃ１５ｏｒｆ４８、Ｃ１ｏｒｆ１０６、Ｃ１ＱＴＮＦ３、Ｃ６ｏｒｆ２２３、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＢＸ２、ＣＣＤＣ１７０、ＣＣＤＣ２８Ｂ、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＤ１０９、ＣＤ３４、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ７、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＴ１、ＣＥＬＦ６、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＵ、ＣＥＮＰＷ、ＣＫＢ、ＣＮＮＭ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＲＩＰ３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＮＮＤ２、ＣＸｏｒｆ３６、ＣＹＰ１７Ａ１、ＤＬＫ１、ＤＭＫＮ、ＤＳＣＣ１、ＤＴＬ、ＤＵＯＸ２、ＥＣＴ２、ＥＥＦ１Ａ２、ＥＦＮＡ３、ＥＰＨＢ２、ＥＰＰＫ１、ＥＴＶ４、ＦＡＢＰ４、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＩ、ＦＢＸＬ１８、ＦＥＲＭＴ１、ＦＧＦ１９、ＦＬＮＣ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＯＸＤ２−ＡＳ１、ＦＯＸＭ１、ＦＸＹＤ２、ＧＡＢＲＥ、ＧＡＬ３ＳＴ１、ＧＣＮＴ３、ＧＩＮＳ１、ＧＪＣ１、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＺ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＧＰＣ３、ＧＰＲ６４、ＧＰＳＭ１、ＨＲＣＴ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＳＦ１、ＩＧＳＦ３、ＩＱＧＡＰ３、ＩＴＧＡ２、ＩＴＰＫＡ、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、ＫＮＴＣ１、ＫＲＴ２３、ＬＡＭＡ３、ＬＥＦ１、ＬＧＲ５、ＬＩＮＣ００１５２、ＬＩＮＧＯ１、ＬＰＬ、ＬＲＲＣ１、ＬＹＰＤ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＭＡＰＴ、ＭＣＭ２、ＭＤＧＡ１、ＭＤＫ、ＭＦＡＰ２、ＭＩＳＰ、ＭＫＩ６７、ＭＭＰ１１、ＭＮＳ１、ＭＰＺ、ＭＳＣ、ＭＳＨ５、ＭＴＭＲ１１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＹＨ４、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＮＡＶ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＢ、ＮＫＤ１、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＵＭ、ＮＰＭ２、ＮＱＯ１、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５ＤＣ２、ＮＴＳ、ＯＢＳＣＮ、ＯＬＦＭＬ２Ａ、ＯＬＦＭＬ２Ｂ、ＰＡＱＲ４、ＰＥＧ１０、ＰＩ３、ＰＬＣＥ１、ＰＬＣＨ２、ＰＬＫ１、ＰＬＸＤＣ１、ＰＯＤＸＬ２、ＰＯＬＥ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＨＬＨ、ＰＴＫ７、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＴＧ１、ＰＹＣＲ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＢＭ２４、ＲＨＢＧ、ＲＮＦ１５７、ＲＯＢＯ１、ＲＰ４−８００Ｇ７．２、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１、ＳＣＧＮ、５−Ｓｅｐ、ＳＥＲＰＩＮＡ１２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＦＮ、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＮＣＧ、ＳＯＡＴ２、ＳＰ５、ＳＰＡＲＣＬ１、ＳＰＩＮＫ１、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ３９、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＴＣＦ１９、ＴＤＧＦ１、ＴＨＹ１、ＴＫ１、ＴＭＣ５、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＯＮＳＬ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ４５、ＴＴＣ３９Ａ、ＵＢＤ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７６、およびＺＷＩＮＴのうちの１つまたは複数を含むこともできる。
【００５８】
別の態様において、本発明は、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）を有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法を提供する。本方法は、（ａ）対象のＣＥＣにおいてＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを測定するステップと；（ｂ）対象のＣＥＣ中のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルをＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較し、それによってＨＣＣの存在を決定するステップとを含み得る。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＨＣＣの発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法を提供する。本方法は、（ａ）初期の時点で対象のＣＥＣにおいてＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを測定し、対象のＣＥＣ中のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルをＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較するステップと；ＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルが、参照レベルより低い場合に、次いで、（ｂ）その後の時点、任意選択で追加の時点、例えば、ＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルが、参照レベルより高くなるまで、ステップを再び実行するステップとを含み得る。このアセスメントは、参照スコアまたは他の参照測定基準値と比較して対象のＣＥＣにおいてＨＣＣスコア（例えば、ＲＦ分類子の票割合）またはＨＣＣ分類子遺伝子の差異的発現の程度を示す他の測定基準を第１に算出することによって形成され得る。
【００６０】
別の態様において、本発明は、ＣＬＤを有する対象において早期段階の肝臓線維症と後期段階の肝臓線維症の存在を区別する方法を提供する。本方法は、（ａ）対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を検出するステップと；（ｂ）対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を参照値と比較するステップと；（ｃ）対象のＣＥＣの血中濃度が参照値より低い場合に、対象を、早期段階の線維症と診断するステップと；（ｄ）対象のＣＥＣの血中濃度が参照値より高い場合に、対象を、後期段階の線維症と診断するステップとを含み得る。
【００６１】
別の態様において、本発明は、進行した線維症の発症についてＣＬＤを有する対象をモニタリングする方法を提供する。本方法は、（ａ）対象の血液試料中のＣＥＣの濃度を検出し、血液ＣＥＣ濃度を参照値と比較するステップと；対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より低い場合に、次いで、（ｂ）１つまたは複数のその後の時点、例えば、対象の血液試料中のＣＥＣの濃度が参照値より高くなるまで、同じ検出および比較ステップを実行するステップとを含み得る。
【００６２】
一部の実施形態において、好ましくはランダムフォレスト分析を使用してＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルを使用してＨＣＣスコアが算出され、本方法は、ＨＣＣスコアを参照スコアと比較し、ＨＣＣの存在が、参照スコアより高いＨＣＣスコアの存在に基づいて決定されるステップを含む。
【００６３】
一部の実施形態において、ＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルは、多変量ロジスティック回帰モデル化手法を使用してＨＣＣ分類子遺伝子の参照発現レベルと比較される。
【００６４】
一部の実施形態において、循環上皮細胞（ＣＥＣ）中のＨＣＣ分類子遺伝子の発現レベルは、（ａ）対象から血液を含む試料を得るステップと；（ｂ）サイズに基づく排除によって試料から赤血球、血小板および血漿を除去するステップと；（ｃ）磁気泳動によって試料から白血球（ＷＢＣ）を除去するステップと；（ｄ）ＲＮＡ配列決定、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、タンパク質マイクロアレイ、または質量分析およびタンパク質プロファイリングを使用してＣＥＣ中の一組の遺伝子の発現を測定するステップとによって測定される。
【００６５】
一部の実施形態において、検出されるＨＣＣは、早期段階のＨＣＣまたは後期段階のＨＣＣである。
【００６６】
一部の実施形態において、本方法は、（ａ）超音波画像診断、ダイナミックＣＴ、ＭＩＲ画像診断、針生検および／または生検により患者中のＨＣＣの存在を確認するまたは確認したステップと；（ｂ）患者においてＨＣＣの存在が確認された場合、そのＨＣＣ組織の外科的切除、そのＨＣＣ組織の高周波アブレーション、そのＨＣＣ組織の塞栓形成；ＨＣＣ組織の塞栓形成、化学療法および／または凍結療法によってＨＣＣについて対象を処置するまたは処置したステップも含む。
【００６７】
一部の実施形態において、血液ＣＥＣ濃度を測定および比較するためのまたはＨＣＣ分類子遺伝子を測定および比較するための初期ならびにその後の各時点は、約３ヵ月、６ヵ月または１年間隔である。一部の実施形態において、対象はＢ型肝炎を有するまたはＢ型肝炎を有さない。一部の実施形態において、ＣＥＣの濃度は、免疫蛍光法によって測定される。一部の実施形態において、ＣＥＣの濃度は、グリピカン３（ＧＰＣ３）および／またはサイトケラチン（ＣＫ）を検出することによって測定される。
【００６８】
肝臓疾患の診断および処置
ＣＬＤまたはＨＣＣなどの肝臓疾患が対象において検出されると、ＣＬＤまたはＨＣＣなどの疾患の存在は、他の方法を使用して確認されてもよい。
【００６９】
ＨＣＣの診断または検出
ＨＣＣは、全血球計算（ＣＢＣ）、電解質、肝臓機能検査（ＬＦＴ）、凝固検査［例えば、国際標準比（ＩＮＲ）および部分的トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）］およびアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）決定法を含めた従来の方法を使用して血液試料を分析することによってさらに確認または診断され得る。
【００７０】
様々な画像化技術を使用してＨＣＣを診断することができる。例えば、超音波検査法は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）の費用または放射線およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）に必要とされる潜在的に腎毒性がある造影剤への曝露なしにスクリーニングの比較的安価な方法を提供する。スクリーニング方法としての超音波検査法は、硬化性集団において感度６０％および特異度９７％を有することが報告されており、費用効率が高いことは実証されている。この低い感度のため、超音波検査の結果は、さらなる画像診断研究および潜在的には生検により確認されるべきである。
【００７１】
ＨＣＣは、ＣＴ画像診断を使用して、好ましくは三相造影スキャンの門脈静脈相に対する造影を迅速に洗浄することにより動脈相を早期強化して検出され得る。ＨＣＣは、ＭＲＩを使用しても検出され得る。
【００７２】
ＨＣＣは、特に、低レベルのアルファフェトプロテインで２ｃｍより大きいＨＣＣ、またはアブレーション処置もしくは移植が禁忌である対象の場合には生検によって検出され得る。
【００７３】
ＡＦＰが上昇し、画像診断特性が一致する患者においては、患者は、生検なしにＨＣＣを推定して処置され得る。患者は、断面画像診断で肝外疾患（主に肺転移）の査定を好ましくは受けることもでき；このことは、治癒的な局所領域療法を妨げることになる。
【００７４】
ＨＣＣの処置
ＨＣＣは、肝臓移植を含めた当技術分野で公知の多数の方法を使用して処置され得る、しかしながら、ドナー器官の供給が限られるため、多くの対象にとって選択肢としての移植の利用可能性は限定されている。ＨＣＣは、切除、高周波アブレーション（ＲＦＡ）を使用して処置され得る。ソラフェニブ（または、ソラフェニブが失敗した場合には、レゴラフェニブ、ニボルマブもしくはレンバチニブ）による全身性療法を使用して、移植まで患者を橋渡しし、またはＨＣＣの再発を遅延させることができる。切除または移植後に再発を経験する患者では、積極的な外科的処置が最良の予後に関連すると思われる。
【００７５】
ＨＣＣは、経カテーテル動脈の化学塞栓術によって処置され得、これは、腫瘍への栄養動脈に選択的にカニューレを挿入し、ドキソルビシン、シスプラチンまたはマイトマイシンＣを含めた化学療法を高い局所用量で送達する。全身毒性を防止するために、栄養動脈をゲル泡またはコイルで閉塞して、流出を防止する。
【００７６】
ＨＣＣは、化学療法によって処置され得る、しかしながら、ＨＣＣは全身性化学療法にはほとんど応答しない。例えば、最大の有効性を有すると思われるドキソルビシンに基づく投薬計画は、奏功率２０〜３０％であり、生存に対する影響は極めて小さい。
【００７７】
小児肝硬変分類Ｃおよび移植が禁忌の患者の場合、ＨＣＣは、疼痛管理、腹水症、浮腫および門脈系脳症管理に集中することによって管理され得る。
【００７８】
ＨＣＣは、外科的に処置され得る。現在、効果的な化学療法がないことおよび放射線療法に対するＨＣＣの非感受性を考慮すると、完全な腫瘍摘出が、長期の治癒に対する唯一の選択肢である。肝部分切除による腫瘍の切除は、根底にある肝硬変の程度により限定された数の患者（一般に＜１５〜３０％）において達成され得る。
【００７９】
肝硬変の診断および処置
慢性肝臓疾患には肝硬変があり得、肝硬変は、線維症、および構造的に異常な小結節への正常肝臓構造の変換によって特徴付けられる。肝硬変への肝臓損傷の進行は、数週間から数年間にかけて起こり得る。線維症に加えて、肝硬変の合併症には、門脈圧高進症、腹水症、肝腎症候群および肝性脳症があるが、これに限定されない。
【００８０】
肝硬変は、Ｃ型肝炎、アルコール性肝臓疾患、ＮＡＳＨ；およびＢ型肝炎において起こり得る。肝線維症は、肝臓における細胞外基質の産生と分解の通常は均衡のとれている工程における変化により起こり得る。肝硬変において、星状細胞は、様々な傍分泌因子によりコラーゲン形成細胞へと活性化され得る。そのような因子は、肝臓損傷後に肝細胞、クップファー細胞および類洞内皮によって放出され得る。例えば、サイトカイン形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦベータ１）のレベルの増大が、慢性Ｃ型肝炎の患者および肝硬変の患者に観察される。ＴＧＦベータ１は、活性化型星状細胞を刺激してＩ型コラーゲンを産生させる。
【００８１】
肝硬変の診断
肝硬変の重症度は、チャイルドターコットピュー（ＣＴＰ）システムを使用して一般に評価され、このシステムは、脳症、腹水症の存在および／または重症度、血液中のビリルビンのレベルおよびアルブミンレベルならびにプロトロンビン時間といった臨床的変数を考慮することによって肝硬変の重症度を評価するスコアリングシステムである。
【００８２】
肝硬変の重症度は、透析が必要だった回数、クレアチニンの血液中レベル、ビリルビンレベル、ナトリウムおよびプロトロンビン時間の臨床的変数を考慮することによって、終期肝臓疾患（ＭＥＬＤ）スコアリングシステムのモデルを使用しても評価され得る。
【００８３】
肝硬変の処置
重篤なＣＬＤ（例えば、非代償性肝硬変）の対象は、肝臓移植を使用して処置され得る。肝臓移植は、８５〜９０％の１年生存率および７０％を超える５年生存率を有する。肝臓移植後の生活の質は、大部分の場合、良いまたは優れている。しかしながら、ドナー器官の供給が限られるため、多くの対象にとって選択肢としての移植の利用可能性は限定されている。
【００８４】
いくつかの療法：自己免疫性肝炎を処置するためのプレドニゾンおよびアザチオプリン、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を処置するためのインターフェロンおよび他の抗ウイルス薬、血色素沈着症に対する静脈切開、原発性胆汁性肝硬変に対するウルソデオキシコール酸、ならびにウィルソン病に対するトリエンチンおよび亜鉛が、ＣＬＤの対象において肝硬変の発症を防止または遅延させるのに利用可能である。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）の進行形態であり、ＮＡＳＨは、アロステリックアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤（例えば、ＮＤＩ−０１０９７６／ＧＳ−０９７６）、オベチコール酸、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾン、バラグリタゾン）、エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５）、オベチコール酸（ＯＣＡ）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤（セロンセルチブ）、二重ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤セニクリビロック（ＣＶＣ、またＴＢＲ−６５２またはＴＡＫ−６５２）およびビタミンＥを使用する処置について評価されている。
【００８５】
慢性肝臓疾患が肝硬変に進行した場合、これらの療法はあまり効果的でない。一旦肝硬変が発症すると、処置は、肝硬変に起因する合併症の管理に向けられる。例えば、肝硬変関連の亜鉛欠乏症は、味覚障害を改善し、食欲を刺激するために、硫酸亜鉛２２０ｍｇで経口で１日２回処置され得る。さらに、亜鉛は、筋けいれんの処置に効果的であり、肝性脳症に対する補助的療法である。ＣＬＤ（例えば、胆汁うっ滞性肝臓疾患またはＣ型肝炎）の対象において痒みは、コレスチラミン、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン）ならびに乳酸アンモニウム１２％皮膚クリーム（Ｌａｃ−ヒドリン）、ウルソデオキシコール酸、ドキセピンおよびリファンピンで処置され得る。ナルトレキソンは効果的であるが、しばしば許容性が不十分である。ガバペンチンは、不確かな療法である。重篤な痒みの患者は、紫外線療法または血奨交換の機関を必要とし得る。ＣＬＤの男性対象における性機能低下は、局所的テストステロン製剤で処置され得る。ＣＬＤ（特に慢性胆汁うっ滞または原発性胆汁性肝硬変）の対象における骨粗鬆症は、カルシウムおよびビタミンＤ補助剤で処置され得る。加えて、ＣＬＤの患者は、Ａ型肝炎に対してワクチン接種され得る。
【実施例】
【００８６】
本発明は、請求項に記載される本発明の範囲を限定しない以下の例においてさらに記載される。
【００８７】
方法
以下の材料および方法を、以下に述べる実施例に使用した。
【００８８】
臨床的プロトコール
患者の医療データを患者の許可を得て患者の電子診療記録から収集し、任意の所与の採血で患者から血液最高２０ｍＬを２本の１０ｍＬ  ＥＤＴＡ管に得て、患者当たり血液およそ８〜１５ｍＬを処理した。
【００８９】
ｉＣｈｉｐデバイスを使用する全血由来ＣＥＣの微小流体精製
抗ヒトＣＤ４５抗体（クローン２Ｄ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＭ１４３０）および抗ヒトＣＤ６６ｂ抗体（Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、８０Ｈ３）に対するビオチン化一次抗体を、それぞれ１００ｆｇ／ＷＢＣおよび３７．５ｆｇ／ＷＢＣで全血（総容積５〜１０ｍＬ）にスパイクし、室温で２０分間振とうしながらインキュベートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  Ｔ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、６５６０２）磁気ビーズを次いで添加し、室温でさらに２０分間振とうしながらインキュベートした。総血液容積（５〜１０ｍＬ）を、前述のとおりｉＣｈｉｐデバイスに次いで流した。
【００９０】
ＣＥＣの免疫蛍光染色
ｉＣｈｉｐデバイス処理した血液試料のアリコート中の細胞を、２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いでＳｈａｎｄｏｎ  ＥＺ  Ｍｅｇａｆｕｎｎｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａ７８７１０００１）を使用するサイトスピンによって２０００ｒｐｍで５分間スライドガラスに塗布した。スライドを、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の５％ロバ血清＋０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにより室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。広スペクトルサイトケラチン（ＷＳ  ＣＫ、Ａｂｃａｍ  ａｂ９３７７）、グリピカン３（Ａｂｃａｍ  ａｂ８１２６３）およびＣＤ４５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ５５５４８０）に対する一次抗体（それぞれＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中に１：５０希釈）を次いで添加し、室温で１時間インキュベートした。一次抗体のそれぞれに対して作られた二次抗体（それぞれＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中に１：２００希釈）を蛍光標識のために次いで使用して、遮光して室温で１時間インキュベートした：それらは１）サイトケラチン−ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ−６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１１−６０５−１５２）；２）グリピカン３−ロバ抗ヒツジＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１３−１６５−００３）；３）ＣＤ４５−ロバ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１５−５４５−１５０）であった。細胞核を、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対比染色した。スライドを、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して封入した。染色した細胞を、画像取得に適当なフィルターキューブおよび自動化画像分析のためのＢｉｏＶｉｅｗプラットフォームを使用して蛍光顕微鏡（ＴｉＥまたはＥｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ、Ｎｉｋｏｎ）によって撮像した。検出した全ての候補ＣＥＣを再検討し、完全な形態、ＤＡＰＩ核対比染色剤によるＣＥＣマーカー（ＷＳ  ＣＫ  Ａｌｅｘａ−６４７および／またはＧＰＣ３  Ｃｙ３）の局在および白血球マーカー（ＣＤ４５  Ａｌｅｘａ−４８８）の不在に基づいてスコアリングした。
【００９１】
ＨｅｐＧ２細胞スパイク
ＨｅｐＧ２細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション推奨の培養条件に沿って培養した。ｉＣｈｉｐデバイスによる処理の前に、個々の細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｒａｎｓｆｅｒＭａｎ  ＮＫ２顕微操作装置を使用して微量ピペット採取し、健康なドナー由来の血液４ｍＬに導入した。
【００９２】
ＣＥＣのＲＮＡ配列決定
ｉＣｈｉｐデバイス処理した血液試料のアリコートをペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、−８０℃で急速冷凍した。ＲＮＡを抽出し（ＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮＡ−ｓｅｑのために以下の通りに処理した。増幅したｃＤＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがってＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ｖ３またはｖ４）ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、各試料のＲＮＡから生成した。簡潔には、ＥＲＣＣ  ＲＮＡ  Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：５０，０００希釈１μＬを各試料に添加した。ＲＮＡ分子の第１鎖合成を、ポリｄＴに基づく３’−ＳＭＡＲＴ  ＣＤＳプライマーＩＩ  Ａ、続いて逆転写酵素による伸長および鋳型切り替えを使用して実行した。第２鎖合成および増幅ＰＣＲを１８サイクル行い、増幅したｃＤＮＡを１×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄ  ｃｌｅａｎｕｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製した。製造業者のプロトコールにしたがってＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、試料をバーコード化し、断片化した。増幅したｃＤＮＡ  １ｎｇを使用して、酵素的にタグメンテーションし、続いて１２サイクル増幅し、個々のライブラリを固有にデュアルインデックスバーコード化した。ＰＣＲ産物を、１．８×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄ  ｃｌｅａｎｕｐで精製した。溶出されたｃＤＮＡライブラリは、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴプロトコールにおいてビーズに基づくライブラリ標準化ステップを受けなかった。ライブラリの確認および定量化を、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量的ＰＣＲによって実行した。個々のライブラリを等濃度でプールし、プール濃度をＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔを使用して決定した。ライブラリのプールを、２×１００塩基対キットおよび二重フローセルを使用してＨｉＳｅｑ  ２５００のＲａｐｉｄ  Ｒｕｎ  Ｍｏｄｅで、３つの複製でその後配列決定した。３つの配列決定したペアエンドリードを組み合わせ、初期設定でＳＴＡＲ  ｖ２．４．０ｈアライナーを使用してｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕのｈｇ３８ゲノムに対して整列させた。マップされなかったまたは複数の場所にマップされたリードを廃棄した。重複リードを、ｐｉｃａｒｄツール１．８．４中のＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓツールを使用して指定し、除去した。一意的に整列されたリードを、一般公開されているＨｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３８．７９．ｇｔｆ注釈表に対して交差ストリクトモードでｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔを使用して計数した。データを、Ｒ統計プログラミング言語へ次いで取り込んで分析した。全てのＲＮＡ−ｓｅｑ生データを、ＮＣＢＩ  ＧＥＯ：アクセッションＧＳＥ１１７６２３に提出した。
【００９３】
白血球のフロー選別
ＨＣＣ患者のサブセットについて、ｉＣｈｉｐデバイス処理した血液試料を、２つの等しいアリコートに分けた：一方のアリコートを、上記の通りペレット化し、急速冷凍した；第２のアリコートをフロー選別して、混入している白血球（単球、顆粒白血球、ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞およびＢ細胞）のサブタイプを単離した。細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６５５）で固定した。以下の抗体を使用した：ＣＤ４５（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ０７８２Ｕ）、ＣＤ５６（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＩＭ２０７３Ｕ）、ＣＤ１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３６０７１２）、ＣＤ１４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３０１８０８）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３１７３３０）、ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３０２２１６）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３００５５６）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３０１０１６）、ＣＤ６６ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３０５１１２）。上記の通り、フロー選別した細胞をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中で急速冷凍し、ＲＮＡ−ｓｅｑに供した。
【００９４】
[実施例１]
ランダムフォレスト分類子を使用するＣＬＤ患者の分類の概要
ＲＮＡ−ｓｅｑ生データは、６４個のＣＬＤおよび５２個のＨＣＣ試料に対して５９，０７４個の転写産物のリードカウントからなった。そのうち、総リード数２５０ｋより多い試料だけを残し、４４個のＣＬＤおよび３９個のＨＣＣ試料が残った。データセット中の特徴のリストを、ＨＣＣ状態を予測するのに関連する可能性が一層高い特徴へと絞るために、ＲＮＡ−ｓｅｑ発現データを、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）肝臓がんプロジェクト（ＬＩＨＣ）から入手した。そのデータは、正常肝臓およびＨＣＣ組織両方の発現カウントを含有する。Ｒの多重仮説検定用のベンジャミニホッホバーグ補正を含むＤＥＳｅｑ２パッケージ（バージョン１．１６．１）を使用してこのデータセットに対して差異的発現分析を実行して、正常肝臓組織に対してＨＣＣにおいて過剰発現している転写産物を同定した。フロー選別によって得たバルク白血球（ＷＢＣ）サブセットに対するＲＮＡ−ｓｅｑデータと組み合わせたこの分析を使用して、調整後ｐ値＜０．０５、ｌｏｇ２変化倍率＞２、合計ＷＢＣサブセットにおいてＷＢＣ＜５０ｒｐｍ、および健康な肝臓組織における平均発現＞０．５ｒｐｍの転写産物のリストを構築した。このリストを使用して、生データセット中の５９，０７４個の特徴を、ＨＣＣを予測する可能性が一層高い２４８個の転写産物のセットに絞った。２４８個の転写産物の組は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＭ２、ＡＦＰ、ＡＧＲ２、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＡＬＰＫ３、ＡＭＩＧＯ３、ＡＮＫＲＤ６５、ＡＮＬＮ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲＨＧＡＰ１１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ３９、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＳＰＭ、ＡＵＲＫＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＡＩＡＰ２Ｌ２、ＢＥＸ２、Ｃ１５ｏｒｆ４８、Ｃ１ｏｒｆ１０６、Ｃ１ＱＴＮＦ３、Ｃ６ｏｒｆ２２３、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＢＸ２、ＣＣＤＣ１７０、ＣＣＤＣ２８Ｂ、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＤ１０９、ＣＤ３４、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＴ１、ＣＥＬＦ６、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮＰＵ、ＣＥＮＰＷ、ＣＫＢ、ＣＮＮＭ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＲＩＰ３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＮＮＤ２、ＣＸｏｒｆ３６、ＣＹＰ１７Ａ１、ＤＬＫ１、ＤＭＫＮ、ＤＳＣＣ１、ＤＴＬ、ＤＵＯＸ２、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＴ２、ＥＥＦ１Ａ２、ＥＦＮＡ３、ＥＰＨＢ２、ＥＰＰＫ１、ＥＴＶ４、ＥＺＨ２、Ｆ２ＲＬ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＦＡＭ３Ｂ、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＩ、ＦＢＸＬ１８、ＦＢＸＯ３２、ＦＥＲＭＴ１、ＦＧＦ１９、ＦＬＮＣ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＭＯ１、ＦＯＸＤ２−ＡＳ１、ＦＯＸＭ１、ＦＸＹＤ２、ＧＡＢＲＥ、ＧＡＬ３ＳＴ１、ＧＣＮＴ３、ＧＩＮＳ１、ＧＪＣ１、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＺ、ＧＯＬＧＡ２Ｐ７、ＧＰＣ３、ＧＰＲ６４、ＧＰＳＭ１、ＨＲＣＴ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＳＦ１、ＩＧＳＦ３、ＩＱＧＡＰ３、ＩＴＧＡ２、ＩＴＰＫＡ、ＫＩＡＡ０１０１、ＫＩＦ１１、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、ＫＮＴＣ１、ＫＲＴ２３、ＬＡＭＡ３、ＬＥＦ１、ＬＧＲ５、ＬＩＮＣ００１５２、ＬＩＮＧＯ１、ＬＰＬ、ＬＲＲＣ１、ＬＹＰＤ１、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＭＡＰＴ、ＭＣＭ２、ＭＤＧＡ１、ＭＤＫ、ＭＦＡＰ２、ＭＩＳＰ、ＭＫＩ６７、ＭＭＰ１１、ＭＮＳ１、ＭＰＺ、ＭＳＣ、ＭＳＨ５、ＭＴＭＲ１１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＨ４、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＮＡＶ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＢ、ＮＫＤ１、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＵＭ、ＮＰＭ２、ＮＱＯ１、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５ＤＣ２、ＮＴＳ、ＮＵＳＡＰ１、ＯＢＳＣＮ、ＯＬＦＭＬ２Ａ、ＯＬＦＭＬ２Ｂ、ＯＳＢＰ２、ＰＡＱＲ４、ＰＤＺＫ１ＩＰ１、ＰＥＧ１０、ＰＩ３、ＰＬＣＥ１、ＰＬＣＨ２、ＰＬＫ１、ＰＬＶＡＰ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＬＸＮＢ３、ＰＯＤＸＬ２、ＰＯＬＥ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＨＬＨ、ＰＴＫ７、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＴＴＧ１、ＰＹＣＲ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＢＭ２４、ＲＥＣＱＬ４、ＲＨＢＧ、ＲＮＦ１５７、ＲＯＢＯ１、ＲＰ４−８００Ｇ７．２、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１、ＳＣＧＮ、５−Ｓｅｐ、ＳＥＲＰＩＮＡ１２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＦＮ、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＬＣ６Ａ９、ＳＮＣＧ、ＳＯＡＴ２、ＳＰ５、ＳＰＡＲＣＬ１、ＳＰＩＮＫ１、ＳＰＰ１、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ３９、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＴＣＦ１９、ＴＤＧＦ１、ＴＥＳＣ、ＴＨＹ１、ＴＫ１、ＴＭＣ５、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＯＮＳＬ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ４５、ＴＴＣ３９Ａ、ＵＢＤ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＳＨ１Ｃ、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７６、ＺＷＩＮＴであった。
【００９５】
全ての分析に使用した最終的なデータセットは、上で同定した２４８個の転写産物に対するｌｏｇ２（１＋ＲＰＭ）および８３個の試料からなった。分類アルゴリズムの成績を審査するために１０倍交差検定の１０回繰り返しを実施した。検定について以下に段階的に記載する：
１．特徴選択．対立仮説ＨＡ：μＣＬＤ＜μＨＣＣを用いる片側ｔ検定を、Ｒ統計パッケージ（バージョン３．４．２）を使用するＴＣＧＡ差異的発現分析によって同定した２４８個の転写産物それぞれに対する訓練セットで行った。ｐ値０．０５未満のものだけを保持した。
２．ランダムフォレスト分類子．特徴選択ステップから残した転写産物全てを使用して、ランダムフォレストを訓練し、その訓練は、ＲのｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージ（バージョン４．６−１２）を使用して構築された。パラメータｍｔｒｙを、その初期設定値ｓｑｒｔ（ｐ）のままにした。ここでｐは、データセット中の特徴の数であり、ｎｔｒｅｅ＝５００木を構築した。サンプリングを疾患の状態によって層化した。コンパレータ分類子として、特徴選択ステップからのｐ値によって最も有意な１０個の遺伝子を使用して多変量ロジスティック回帰モデルを作製した。
３．予測．試験セット中の各試料についてがんの分類に対して投票したランダムフォレストにおいて木の割合をランダムフォレスト出力から得、それを使用してｐＲＯＣパッケージ（バージョン１．１０．０）でＲＯＣ曲線を構築した。
【００９６】
[実施例２]
免疫蛍光法によるＣＥＣの検出
ＣＥＣを免疫蛍光法（ＩＦ）によって最初に検出した。血液試料を、健康な供血者１０名、通常の臨床的調査を受けたが、ＨＣＣの所見がなかったＣＬＤ患者３９名、ＨＣＣの患者５４名、および治療処置を受け、疾患の臨床的所見がなかった（ＮＥＤ）ＨＣＣ患者１０名から得た（表１〜表４を参照）。ｉＣｈｉｐデバイスは、赤血球、血小板および血漿のサイズに基づく除外を実行し、続いて標識された白血球（ＷＢＣ）を磁気泳動した（Ozkumur E, et al. Sci Transl Med 2013;5:179ra47に記載されているとおり）（図１を参照）。次いで、ＣＥＣを、ＨＣＣにおいて発現されるが、ＣＬＤ肝臓組織においても発現される腫瘍胎児性タンパク質であるグリピカン３（Wang HL, et al. Arch Pathol Lab Med 2008;132:1723-8に記載されている）または上皮マーカーであるサイトケラチンに対するＩＦ染色によって列挙した（図２Ａを参照）。全血１０ｍＬ当たり細胞５個の閾値を使用すると、ＣＥＣは、ＣＬＤ患者（７９％）、ＨＣＣ患者（８１％）、およびＮＥＤ患者（９０％）の類似の割合で同定されたが、健康なドナーでは２０％しか同定されなかった（図２Ｂおよび図４Ａ〜図４Ｂを参照；ｐ＜０．０１、各群対健康ドナー）。ｉＣｈｉｐデバイスを使用する精製と免疫蛍光定量との組み合わせは、ＨＣＣおよびＣＬＤ患者において類似の濃度を持つＣＥＣ検出に対する高い感度を実証した。ＣＬＤ患者のうち、進行した線維症（ＭＥＴＡＶＩＲ  Ｆ３またはＦ４）の患者は、進行した線維症のない患者（０．７個細胞／ｍＬ、ｐ＜０．０１、図２Ｃを参照）と比較してより高濃度のＣＥＣ（中央値５．１個細胞／ｍＬ）を有した。ＣＬＤ研究集団は、調査を受けるのにＨＣＣの危険性が十分高い患者だけからなったので、進行した線維症のないサブグループ内の各患者のＣＬＤの病因は、Ｂ型肝炎感染であった。分析をＢ型肝炎誘導性ＣＬＤの患者のみに限定した場合でも傾向が存続したので、線維症段階に関連するＣＥＣ濃度の差異は、ＣＬＤの病因のためではないと思われた（進行した線維症ありの中央値５．０個細胞／ｍＬ、進行した線維症なしの中央値０．７個細胞／ｍＬ、ｐ＝０．０６、図４Ｃを参照）。それ以外の場合、ＣＬＤ病因によってＣＥＣ濃度に差異はなかった（図４Ｄを参照）。
【００９７】
[実施例３]
ＲＮＡ配列決定によるＣＥＣの検出
ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を実行してＣＥＣを検出した。この手法の感度を決定するために、０、１、３、５、１０または５０個のＨｅｐＧ２  ＨＣＣ細胞を、健康なドナー血液４ｍＬにスパイクし、ＲＮＡ−ｓｅｑのためにｉＣｈｉｐデバイスで処理した。ＨｅｐＧ２特異的遺伝子発現は、全血において単一細胞から検出可能であった（図３Ａを参照）。ＣＥＣを、６４名のＣＬＤおよび５２名のＨＣＣ患者由来の臨床的血液試料において同定した。第１に、１７個の肝臓特異的遺伝子シグネチャーを、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）発現データに基づいて作製した。肝臓特異的遺伝子が、両方の患者群の試料中に同定されたが、ｉＣｈｉｐデバイス処理血液からフロー選別されたＷＢＣサブタイプには存在しなかった（図３Ｂを参照）。したがって、肝臓特異的シグネチャーは、混入したＷＢＣにおけるこれら遺伝子の異常な発現ではなく希少なＣＥＣを同定した。
【００９８】
[実施例４]
ＨＣＣを検出するための分類子の生成
ＣＥＣが、根本的な疾患状態に応じて表現型的に異なり得ることを示すために、遺伝子発現プロファイリングを実行して、ＣＬＤ対ＨＣＣの環境においてＣＥＣ間で、定量的ではなく定性的な差異を同定した（図３Ｃを参照）。Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースを使用して、肝臓組織と比較してＨＣＣにおいて過剰発現した遺伝子２４８個を同定し、ＷＢＣにおいて発現した遺伝子を除外した。ランダムフォレスト（ＲＦ）機械学習手法を使用してこれらの遺伝子に基づいて分類子を生成し、それによりＣＬＤをＨＣＣ  ＣＥＣと区別した。より具体的には、ランダムフォレストにおける各決定木は、ＣＬＤまたはＨＣＣとして試料を分類する「票」を投じた。最終的な分類子は２５個の遺伝子を使用し、それを表５に挙げる。特に、分類子において最も有益な３つの遺伝子（ＴＥＳＣ、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＰＰ１）は、がん転移に関係し、もう１つ（Ｅ２Ｆ１）は、確立された細胞増殖マーカーである（Kang J, et al. Tumour Biol 2016;37:13843-13853；Loo JM, et al. Cell 2015;160:393-406；およびSangaletti S, et al. Cancer Res 2014;74:4706-19を参照）。
【００９９】
交差検定した分類子は、特異度（すなわち、真の陰性率）９５％、感度（すなわち、真の陽性率）８５％、ならびに早期および後期段階のＨＣＣ両方の同定（ミラノ基準による）で、ＣＬＤとＨＣＣ試料の間に優れた分離をもたらした（図３Ｄおよび図５Ａ〜図５Ｃを参照）。この例において達成された精度（感度および特異度）のレベルは、ＨＣＣの予測について４４％の精度しか達成されなかった（一般的な反復突然変異およびＨＣＣに固有の特異的タンパク質マーカーの不足のためであり得る）無細胞ＤＮＡと血液に基づくタンパク質バイオマーカーを組み合わせた最近の研究（Cohen JD, et al. Science 2018）と比較してより高い。
【０１００】
【表１−１】
2022500029.tif 000003
【０１０１】
【表１−２】
2022500029.tif 000004
【０１０２】
【表２−１】
2022500029.tif 000005
【０１０３】
【表２−２】
2022500029.tif 000006
【０１０４】
【表２−３】
2022500029.tif 000007
【０１０５】
【表３】
2022500029.tif 000008
【０１０６】
【表４】
2022500029.tif 000009
【０１０７】
【表５−１】
2022500029.tif 000010
【０１０８】
【表５−２】
2022500029.tif 000011
【０１０９】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図し、限定することを意図しないことは理解されるべきである。他の態様、優位性および修飾は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2022500029.tif 000012
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【国際調査報告】
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