(57)【要約】  本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ−２）変異タンパク質に関する。本発明はまた、当該ＩＬ−２変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該ＩＬ−２変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、当該ＩＬ−２変異タンパク質を調製する方法、当該ＩＬ−２変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、
３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６２Ｎ−６３Ｘ−６４Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓ
から選択されるアミノ酸位置に、１つ以上のグリコシル化モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔを導入する少なくとも１つの変異を含み、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘは、野生型ＩＬ−２において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸、またはその保存的置換残基であり、
ここで、アミノ酸の位置は配列番号２６に従って番号付けされる、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項２】
３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓから選択される１つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２６に従って番号付けされ、
ここで、哺乳動物細胞において発現される場合、好ましくはＦｃ融合タンパク質の形態で発現される場合、野生型ＩＬ−２と比較して、改善された発現および／または純度を有する（好ましくは、変異タンパク質の純度は、発現および一段階アフィニティー精製後に測定する）、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項３】
野生型ＩＬ−２と比較して、
（ｉ）Ｋ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７、
（ｉｉ）Ｒ３８Ｎ−Ｍ３９−Ｌ４０Ｓ、
（ｉｉｉ）Ｑ７４Ｎ−Ｓ７５−Ｋ７６Ｔ
から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくは、変異グリコシル化モチーフＫ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７を含む、請求項２に記載の変異タンパク質。
【請求項４】
配列番号３１、３２、および３８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む、請求項２または３に記載の変異タンパク質。
【請求項５】
４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、および７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓから選択される１つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくはグリコシル化モチーフ４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓを含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２６に従って番号付けされ、
ここで、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒαへの結合が低減または排除されている、請求項１に記載の変異タンパク質。
【請求項６】
野生型ＩＬ−２と比較して、
（ｉ）Ｔ４１Ｎ−Ｆ４２−Ｋ４３Ｓ、
（ｉｉ）Ｋ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔ、
（ｉｉｉ）Ｙ４５Ｎ−Ｍ４６−Ｐ４７Ｓ、
（ｉｖ）Ｅ６８Ｎ−Ｖ６９−Ｌ７０Ｓ、および
（ｖ）Ｌ７２Ｎ−Ａ７３−Ｑ７４Ｔ
から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、
好ましくは、変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔを含む、請求項５に記載の変異タンパク質。
【請求項７】
（ｉ）３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓから選択される変異グリコシル化モチーフ、および／または
（ｉｉ）変異Ｋ３５Ｑ
をさらに含み、
ここで、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒα結合が低減または排除されており、Ｆｃ融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞で発現されるときに発現および純度が改善されている、請求項５または６に記載の変異タンパク質。
【請求項８】
配列番号３３、３４、３５、３７、３９、および４５〜４７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の変異タンパク質。
【請求項９】
野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、切断されたＢ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列）、好ましくは、前記切断されたＢ’Ｃ’ループ領域は、１０、９、８、７、６、または５未満のアミノ酸長、より好ましくは７アミノ酸長であり、ここで、アミノ酸残基は配列番号２６に従って番号付けされる、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項１０】
野生型ＩＬ−２と比較して、
（ｉ）例えば、ＩＬ１５のＢ’Ｃ’ループ配列などの、４ヘリックス短鎖サイトカインＩＬファミリーメンバー由来の短いＢ’Ｃ’ループ配列の置換であり、好ましくは、置換されたループ領域は、配列ＳＧＤＡＳＩＨを有する、ａａ７３〜ａａ８３配列の置換、または
（ｉｉ）例えば、Ｃ末端から１、２、３または４アミノ酸の切断であり、好ましくは、切断されたループ領域は、配列Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを有し、好ましくは、前記切断されたループ領域は、配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＳＫＮＦＨを有する、ａａ７３〜ａａ８３配列の切断
を含む、請求項９に記載の変異タンパク質。
【請求項１１】
野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ結合が増強され、および／または発現収率および／または純度が改善されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の変異タンパク質。
【請求項１２】
配列番号４０〜４４、好ましくは配列番号４０〜４２、より好ましくは配列番号４０または４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の変異タンパク質。
【請求項１３】
野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、組み合わせ変異：（ｉ）４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、および７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓから選択される変異グリコシル化モチーフ、ならびに（ｉｉ）アミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間にある、ＳＧＤＡＳＩＨおよびＡ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈから選択される短縮Ｂ’Ｃ’ループ領域配列を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号２６に従って番号付けされる、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項１４】
配列番号４８、４９または５０、好ましくは配列番号４８または４９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載の変異タンパク質。
【請求項１５】
野生型ＩＬ−２と比較して、以下の特性：
−ＩＬ−２Ｒα受容体への結合親和性の排除または低減、
−ＩＬ−２Ｒβ受容体への結合親和性の増強、
−高親和性ＩＬ−２Ｒ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）への結合親和性の低減、
−中程度の親和性ＩＬ−２Ｒ受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）への結合親和性の増加、
−ＣＤ２５＋細胞（特にＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＴｒｅｇ細胞）に対する活性化の低下、
−ＣＤ２５＋細胞（特にＣＤ８＋Ｔ細胞）のＩＬ−２介在性シグナル伝達に対する刺激作用の低下、
−ＩＬ−２がＣＤ２５＋細胞（特にＴｒｅｇ細胞）を優先的に活性化する偏向性の排除または低減、
−ＩＬ−２誘導性Ｔｒｅｇ細胞による免疫反応のダウンレギュレート作用の低下、
−ＣＤ２５−細胞に対する活性化作用の保持または増強、
−エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の増殖と活性化の刺激、ならびに
−抗腫瘍効果の向上
のうちの１つ以上を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の変異タンパク質。
【請求項１６】
ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞において発現されるとき、以下の特性：
−野生型ＩＬ−２タンパク質よりも優れた発現量、
−野生型ＩＬ−２タンパク質よりも優れた安定性、
−より高いタンパク質純度、例えばワンステップ親和性クロマトグラフィー精製後のより高い純度への容易な精製
のうちの１つ以上を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項１７】
野生型ＩＬ−２と比較して少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％の同一性を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項１８】
野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるｐ−ＳＴＡＴＡ５シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性が低減され、かつ、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強され、
好ましくは、組み合わせ変異：
（ｉ）アミノ酸位置４３〜４５の変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔとアミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間の置換配列ＳＧＤＡＳＩＨ、または
（ｉｉ）アミノ酸位置４３〜４５の変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔとアミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間の切断配列ＡＱＳＫＮＦＨ
を含み、
より好ましくは、配列番号４８または４９の配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、またはそれ以上の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項１９】
ＩＬ−２変異タンパク質の融合タンパク質であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質を含み、好ましくはＦｃ抗体断片と融合し、好ましくはＩＬ−２変異タンパク質はリンカーを介してＦｃと融合し、前記リンカーは好ましくはＧＳＧＳであり、より好ましくは２ｘ（Ｇ４Ｓ）であり、
好ましくは、配列番号３〜１３および１６〜２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む、融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質と抗原結合分子とを含み、好ましくは、抗原結合分子が免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である、免疫複合体。
【請求項２１】
前記抗原結合分子が、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ  Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ  Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｂ、ＥＤＢ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、およびメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）から選択される抗原、と特異的に結合する、請求項２０に記載の免疫複合体。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質、請求項１９に記載の融合体、または請求項２０または２１に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞、または酵母である、宿主細胞。
【請求項２５】
ＩＬ−２変異タンパク質またはその融合体もしくは免疫複合体を製造する方法であって、請求項２４に記載の宿主細胞を、ＩＬ−２変異タンパク質または融合体または免疫複合体の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質、請求項１９に記載の融合体、または請求項２０もしくは２１に記載の免疫複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
対象の疾患を治療する方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質、請求項１９に記載の融合体、請求項２０もしくは２１に記載の免疫複合体、または請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記疾患は癌である、方法。
【請求項２８】
対象の免疫系を刺激する方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質、請求項１９に記載の融合体、または請求項２０もしくは２１に記載の免疫複合体を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
ＩＬ−２変異タンパク質を取得するための方法であって、
−ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒａとの結合インターフェースにおける変異により１つ以上（例えば２つまたは３つ）のグリコシル化モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔを導入する工程であって、ここで、ＸはＰ（プロリン）を除く任意のアミノ酸であってもよく、および／または、ＩＬ−２のＢ’Ｃ’ループ領域において変異により当該ループ領域配列を切断する工程、
好ましくは、請求項１〜７のいずれか１項に記載のグリコシル化変異および／または請求項９もしくは１０に記載のＢ’Ｃ’ループ配列変異を導入する工程、より好ましくは請求項１３または１８に記載の組み合わせ変異を導入する工程、
−哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において、前記ＩＬ−２変異タンパク質を、例えばＦｃ融合体（例えばＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で発現する工程、ならびに
−（ｉ）発現量および／または安定性の改善、（ｉｉ）ＩＬ２Ｒα結合の低減、ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ２Ｒβ結合の増強、のうちの１つ以上の改善された特性を有する変異タンパク質を同定する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ−２）変異タンパク質およびその使用に関する。特に、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して改善された特性、例えば、改善された薬剤形成性、低下したＩＬ−２Ｒα受容体結合能、および／または増加したＩＬ−２Ｒβ受容体結合能を有するＩＬ−２変異タンパク質に関する。本発明はまた、当該ＩＬ−２変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該ＩＬ−２変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、当該ＩＬ−２変異タンパク質を調製する方法、当該ＩＬ−２変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、活性化Ｔ細胞、特にCD4+ Tヘルパー細胞によって主に産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトＩＬ−２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、Ｎ末端２０アミノ酸を除去した後、成熟した分泌性ＩＬ−２を産生する。他の種のＩＬ−２の配列も開示されており、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  Ｎｏ．  ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）を参照されたい。
【０００３】
インターロイキン２は、その機能に不可欠な４次構造を形成する４つの反平行両親媒性  αヘリックスを有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１１６９−７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，４１０−４１３（１９９２））。ほとんどの場合、ＩＬ−２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ−２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ；ＣＤ１３２）の３つの異なる受容体によって機能する。ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２ＲγはＩＬ−２のシグナル伝達に重要であるが、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達に必要ではないが、ＩＬ−２の受容体への高い親和力結合を与えることができる（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０７，１１９０６−１１（２０１０））。ＩＬ−２Ｒ  α、β、γを組み合わせて形成される三量体受容体（ＩＬ−２αβγ）はＩＬ−２高親和力受容体（ＫＤが約１０ｐＭ）であり、βとγからなる二量体受容体（ＩＬ−２βγ）は中間親和力受容体（ＫＤが約１ｎＭ）であり、αサブユニットのみから形成されるＩＬ−２受容体は、低親和力受容体である。
【０００４】
免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ−２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ）で発現し、三量体受容体は主に活性化リンパ球とＣＤ４＋  ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋抑制的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現する（Ｂｙｍａｎ，  Ｏ．およびＳｐｒｅｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２，  １８０−１９０（２０１２））。静止状態のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、細胞表面上にＣＤ２５を有さないので、ＩＬ−２に対して比較的非感受性である。一方、Ｔｒｅｇ細胞は体内で常に最高レベルのＣＤ２５を発現しているため、通常ＩＬ−２はＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する。
【０００５】
ＩＬ−２は、異なる細胞上のＩＬ−２受容体との結合を介して、免疫反応における多重作用を介在する。一方、ＩＬ−２は免疫系刺激剤として、Ｔ細胞の増殖と分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成を誘導し、Ｂ細胞の増殖と分化と免疫グロブリンの合成を促進し、そしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生産、増殖、活性化を刺激することから、免疫治療剤としてがんやレンチウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。他方、ＩＬ−２は、免疫抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（即ち、Ｔｒｅｇ細胞）の維持を促進することができ（Fontenot  etal．,Nature Immunol  6,1142-51（2005）；D’CruzおよびKlein,Nature Immunol 6,1152-59（2005）；MaloyおよびPowrie,Nature Immunol6,1171-72（2005））、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）を介在し、自己抗原および腫瘍抗原に対する免疫寛容の確立および維持に関与し（Lenardo  etal．，Nature 353：858（1991））、したがって、ＡＩＣＤによる腫瘍耐性および活性化されたＴｒｅｇ細胞による免疫抑制が患者において引き起こされる。さらに、高用量ＩＬ−２は、患者において血管漏出症候群（ＶＬＳ）を引き起こす可能性がある。ＩＬ−２は、肺内皮細胞上のＩＬ−２三量体受容体（ＩＬ−２αβγ）と直接結合することによって肺浮腫を誘導することが示されている（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０７，１１９０６−１１（２０１０））。
【０００６】
ＩＬ−２免疫療法に関連する上述の問題を克服するために、ＩＬ−２の様々な受容体に対する選択性または選好性を変化させることにより、ＩＬ−２療法の毒性を低下させ、および／またはその有効性を増大させることが提案されている。例えば、ＩＬ−２モノクローナル抗体とＩＬ−２との複合物を用いて、ＣＤ２５ではなくＣＤ１２２を発現する細胞をＩＬ−２に標的化することにより、ＣＤ１２２ｈｉｇｈ集団の優先的増幅を誘導し、インビボＩＬ−２治療効果を増強することが提案されている  （Ｂｏｙｍａｎ  ｅｔａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１，  １９２４−１９２７（２００６））。Ｏｌｉｖｅｒ  ＡＳＴ  ｅｔａｌ．（ＵＳ２０１８／０１４２０３７）は、ＩＬ−２Ｒα受容体に対する親和性を低下させるために、ＩＬ−２のアミノ酸残基位置４２、４５および７２に三重変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを導入することを提案している。Ａｒｏｎ  Ｍ．  Ｌｅｖｉｎ  ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ  ４８４，  ｐ５２９−５３３，  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０９７５）は、五重変異Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ８６Ｖ／Ｉ９２Ｆを含む「ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ」と呼ばれるＩＬ−２変異体ＩＬ−２Ｈ９を提案し、これはＩＬ−２Ｒβ結合を増強し、それによってＣＤ２５−細胞への刺激作用を高め、しかしＣＤ２５への高い結合性は保たれている。Ｒｏｄｒｉｇｏ  Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ８：１５３７３，  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、三重変異ヒトＩＬ−２変異タンパク質ＩＬ−２３Ｘを提案しており、当該タンパク質は、アミノ酸残基位置３８、４３および６１にそれぞれ残基変異Ｒ３８Ｄ−Ｋ４３Ｅ−Ｅ６１Ｒを有するので、当該変異タンパク質はＩＬ−２Ｒαと結合せず、しかし、当該変異タンパク質はＣＤ２５−細胞を活性化する効果が弱く、ＣＤ２５＋細胞に対する活性化の偏向性は依然として存在する。また、Ｒｏｄｒｉｇｏ  Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔａｌ．は、インターロイキン−２−Ｆｃ融合体を調製することにより、インターロイキンの薬理学的特性を改善することも提案しているが、この融合タンパク質は発現量が低く、凝集体を形成しやすい。
【０００７】
免疫調節および疾患におけるＩＬ−２の役割を考慮すると、改善された特性を有する新規ＩＬ−２分子、特に生産、精製に有利で、および改善された薬理学的特性を示すＩＬ−２分子を開発する必要性が本分野において依然として存在する。
【発明の内容】
【０００８】
本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して改善された薬剤形成特性および／または改善されたＩＬ−２受容体選択性／偏向性を有する新規ＩＬ−２変異タンパク質を提供することによって、上記の要件を満たす。
【０００９】
したがって、１つの態様において、本発明は、新規ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、以下の１つ以上の特性を有する。
【００１０】
（ｉ）改善された薬剤形成性、特に哺乳動物細胞において発現された場合の発現および／または精製の改善、
（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒαとの結合の低減または排除、
（ｉｉｉ）ＩＬ−２Ｒβとの結合の増強。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒαとの結合インターフェースに導入された変異グリコシル化モチーフを含むＩＬ−２変異タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＩＬ−２のＢ’Ｃ’ループ領域に、切断されたループ配列を有するための欠失および／または置換を含むＩＬ−２変異タンパク質を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、変異グリコシル化モチーフおよび短縮Ｂ’Ｃ’ループ配列の両方を有するＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、ＩＬ−２変異タンパク質を含む融合タンパク質および免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品、ＩＬ−２変異タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のＩＬ−変異タンパク質、融合タンパク質および免疫複合体を産生する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明のＩＬ−２変異タンパク質および融合体および免疫複合体を用いて疾患を治療するための方法、ならびに対象の免疫系を刺激するための方法および使用も提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象においてＣＤ２５−エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の強力な活性化および増幅をもたらす。さらに他の実施形態において、本発明の方法により、Ｔｒｅｇ細胞で介在されるＩＬ−２の免疫ダウンレギュレート作用を効果的に減少させることができる。
【００１４】
以下、本発明を、図面および実施形態を参照してさらに説明する。しかし、これらの図面および実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に思いつく変更は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒαの結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（Ａ）およびＩＬ−２グリコシル化修飾タンパク質の構造概略図（Ｂ）を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−２結晶構造（ＰＢＤ：２ＥＲＪ）（Ａ）およびヒトおよびマウスのＩＬ−２およびヒトＩＬ１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造ｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、ＩＬ−２Ｒα精製後の試料ＨＰＬＣ純度検出プロファイルを示す。
【図４】図４は、ＩＬ−２Ｒβ精製後の試料ＨＰＬＣ純度検出プロファイルを示す。
【図５】図５は、選択および構築されたいくつかのＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣがＣＤ８＋  ＣＤ２５−／  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞上でｐ−ＳＴＡＴ５を活性化するシグナル曲線を示す。
【図６】図６は、ヒトインターロイキン（ＩＬ−２）の成熟タンパク質配列（配列番号２６）およびそのアミノ酸残基番号を示し、例示的なＩＬ−２グリコシル化変異体およびＩＬ−２キメラおよび切断されたＢ’Ｃ’ループ変異体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別に定義しない限り、本出願に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
【００１７】
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【００１８】
用語「および／または」は選択可能オプションのうちのいずれか１項または選択可能オプションのいずれか２項または複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。
【００１９】
本出願に使用される場合、用語「包含する」または「含む」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本出願において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数またはステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ−２変異タンパク質に言及する場合、その変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ−２変異タンパク質を包含することも意図される。
【００２０】
本明細書において、野生型「インターロイキン−２」または「ＩＬ−２」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートである親ＩＬ−２タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ−２タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドの除去なし）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドの除去あり）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ−２タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む完全長の天然ヒトＩＬ−２配列を配列番号２９に示し、成熟タンパク質の配列を配列番号３０に示す。さらに、この表現には、天然に存在するＩＬ−２対立遺伝子変異体およびスプライシング変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ−２の変異体も含まれ、例えば、前記変異体は、天然ＩＬ−２と少なくとも９５％−９９％またはそれ以上の同一性を有してもよく、または１−１０個以下または１−５個以下のアミノ酸変異（特に保存的アミノ酸置換）を有してもよく、天然ＩＬ−２タンパク質と実質的に同じＩＬ−２Ｒα結合親和性および／またはＩＬ２Ｒβ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ−２は、天然ＩＬ−２タンパク質と比較して、ＩＬ−２受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異、例えば、変異Ｃ１２５Ｓを１２５位に導入した天然ヒトＩＬ−２タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、本発明の野生型ＩＬ−２に属する。Ｃ１２５Ｓ変異を含む野生型ヒトＩＬ−２タンパク質の例を配列番号２６に示す。いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ−２配列は、配列番号２６または２９または３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％またはさらに高いアミノ酸配列同一性を有する。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行って、所望の特性（例えば、ＩＬ−２Ｒα結合親和性の低下）を有する最終変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノおよび／またはカルボキシ基末端における欠失および挿入を含む。例えば、アラニン残基は、全長ヒトＩＬ−２位置１で欠失することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。他の実施形態において、好ましいアミノ酸変異はアミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、改変されたグリコシル化モチーフを有するＩＬ−２変異タンパク質を得るために、本明細書に記載の特定の変異アミノ酸位置に変異を導入する。いくつかの実施形態において、Ｂ’Ｃ’ループ配列が切断されたＩＬ−２変異タンパク質を得るために、本明細書に記載の特定の変異アミノ酸位置に変異を導入する。
【００２２】
本発明において、ＩＬ−２タンパク質のアミノ酸位置に言及する場合、配列番号２６の野生型ヒトＩＬ−２タンパク質（ＩＬ−２ＷＴとも呼ばれる）アミノ酸配列（図６に示す）を参照して決定される。アミノ酸配列アラインメントを実施することによって（例えば、ＢＬＡＳＴを使用して、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ  ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆  ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅから取得可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、デフォルトパラメータを使用して、アラインメントを実施する）、他のＩＬ−２タンパク質またはポリペプチド（全長配列または切断断片を含む）上の対応するアミノ酸位置を同定する。したがって、本発明において、ＩＬ−２タンパク質またはポリペプチド中のアミノ酸位置は、特記しない限り、配列番号２６によるアミノ酸位置である。例えば、「Ｆ４２」に言及する場合、配列番号２６の第４２位フェニルアラニン残基Ｆ、または他のＩＬ−２ポリペプチド配列上の対応する位置でアラインメントされたアミノ酸残基を指す。
【００２３】
本明細書において、ＩＬ−２変異タンパク質に言及するとき、変異は以下のように記載される。アミノ酸置換は、［元のアミノ酸残基／位置／置換されたアミノ酸残基］として表される。例えば、位置３５のアミノ酸はアスパラギン（Ｎ）に置換されており、３５Ｎと表すことができ、３５位の元のアミノ酸残基がリジンであればＫ３５Ｎと表すこともできる。置換残基がＸで表される場合、例えば３６Ｘは、位置３６におけるアミノ酸が任意の残基で置換され得ることを意味し、Ｘが特定の残基を有する場合、その位置は定義された特定のＸ残基で置換される。しかし、元の残基および位置のみを示す表現、例えば、本発明の変異グリコシル化モチーフＫ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７におけるＬ３６およびＴ３７は、前記位置３６および３７において変異が起こらないこと、すなわち、３６位および３７位が元の残基ＬおよびＴを保持することを意味する。
【００２４】
本明細書では、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号２６）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、本分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：  ３３８９−４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔａｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−１０，  １９９０参照）。ＢＬＡＳＴ分析のためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。本出願の目的のために、同一性パーセントは、通常、デフォルトパラメータとして設定されたＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて決定される。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在性変異誘発などの本分野で公知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを意味する。以下の６組はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換が可能なアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。例えば、野生型ＩＬ−２タンパク質は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに対して保存的アミノ酸置換を有していてもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有していてもよい。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ−２タンパク質は、本明細書に具体的に示されるＩＬ−２変異タンパク質配列（例えば、配列番号３１−５０のいずれか）に対して保存的アミノ酸置換を有していてもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有していてもよい。
【００２６】
「親和力」または「結合親和力」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和力は、平衡解離定数（ＫＤ）によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎである）との比値である。結合親和力は本分野の既知の常用方法で測定される。親和力を測定するための１つの特定の方法は、本明細書におけるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術による測定である。
【００２７】
本明細書において、抗体結合分子は、抗原と特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。
【００２８】
本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を意味し、天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。１つの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０からカルボキシル基末端に延伸する。他の実施形態において、Ｆｃ−断片のＣ−末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他の実施形態において、Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異などの変異を含んでもよい。本出願では特記しない限り、Fｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥU番号付けシステムによるものであり、ＥU索引とも呼ばれる。例えば、Kａｂａｔ、Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Bｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２に記載される。
【００２９】
本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。
【００３０】
１．本発明のＩＬ−２変異タンパク質
本発明は、１つの態様において、改善された薬剤形成特性および／または改善されたＩＬ−２受容体選択性／選好性を有する新規ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００３１】
本発明のＩＬ−２変異タンパク質の有利な生物学的特性
ＩＬ−２タンパク質は、ＩＬ−２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を誘発し、機能する。野生型ＩＬ−２は、異なるＩＬ−２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ−２との親和性が低いＩＬ−２βおよびＩＬ−２γ受容体を、静止エフェクター細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現した。野生型ＩＬ−２との親和性が高いＩＬ−２Ｒαを、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現した。高い親和性のために、野生型ＩＬ−２は、細胞表面のＩＬ−２Ｒαと優先的に結合し、ＩＬ−２Ｒβγを動員し、ＩＬ−２Ｒβγを介して下流のｐ−ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されるものではないが、ＩＬ−２Ｒα受容体に対するＩＬ−２の親和性を低減または排除することは、ＩＬ−２がＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化する偏向を低減し、ＩＬ−２介在性Ｔｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減するであろう。理論に束縛されるものではないが、ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する親和性の維持または増強は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのエフェクター細胞に対するＩＬ−２の活性化およびそれによるＩＬ−２の免疫刺激作用を保持または増強する。
【００３２】
本発明者らは、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒα受容体との結合インターフェースに１つ以上の特定のＮグリコシル化モチーフを導入することにより、ＩＬ−２変異タンパク質の発現および／または純度を改善し、および／またはＩＬ−２変異タンパク質のＩＬ−２Ｒαへの結合を低減することができることを見出した。さらに、本発明者らは、ＩＬ−２自体のＢ’Ｃ’ループ配列を、ＩＬ−１５などの他のインターロイキンサイトカイン由来の短いＢ’Ｃ’ループ配列に置換することにより、またはＩＬ−２自体のＢ’Ｃ’ループ配列を切断することにより、ＩＬ−２の発現および／または純度を増加させ、同時にＩＬ−２Ｒβに対する親和力を増加させることができることをも見出した。
【００３３】
したがって、本発明は、改善された特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を提供する。本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、例えば、（ｉ）哺乳動物細胞で発現させたときに発現および／または純度が改善されること、（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒα受容体への結合の低減または排除、および／または（ｉｉｉ）ＩＬ−２Ｒβ受容体への結合の増強の群から選択される１つ以上の改善された特性を有することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、例えば、以下の群から選択される１つ以上の改善された特性を有する。
【００３５】
（１）ＩＬ−２Ｒα受容体への結合親和性の低減または排除、
（２）ＩＬ−２Ｒβ受容体への結合親和性の増強、
（３）高親和性ＩＬ−２Ｒ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）への結合親和性の低減、
（４）中程度の親和性ＩＬ−２Ｒ受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）への結合親和性の増加、
（５）ＣＤ２５＋細胞（特に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）におけるＩＬ−２シグナル伝達の活性化、特にＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化能の低下、
（６）ＩＬ−２介在性ＣＤ２５＋細胞（特に、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）の活性化および増殖の減少、
（７）Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激するＩＬ−２の偏向の低減または解消、
（８）ＩＬ−２誘導下でのＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
（９）特に、ＣＤ２５−細胞（特にＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞）に対する活性化作用の保持または増強、
（１０）ＩＬ−２介在性エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖の増加、
（１１）免疫刺激作用の向上、
（１２）抗腫瘍効果の向上。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、上記（１）の特性を有し、好ましくは、（３）および（５）−（８）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは（２）および（９）−（１２）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、上記（２）の特性を有し、好ましくは、（９）−（１２）から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは（１）、（３）および（５）−（８）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有する。
【００３７】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、高親和性受容体ＩＬ−２ＲαβγへのＩＬ−２の結合によって介在されるインビボ毒性の減少という特性の１つ以上をさらに有する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、改善された薬剤形成特性を有し、例えば、Ｈ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞で発現される場合、好ましくはＦｃ融合タンパク質で発現される場合、（ｉ）野生型ＩＬ−２タンパク質よりも優れた発現量、（ｉｉ）野生型ＩＬ−２タンパク質よりも優れた安定性、および（ｉｉｉ）より高いタンパク質純度への容易な精製からなる群から選択される１つ以上の特性を有する。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、発現の増加は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清（好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清）中の組換えＩＬ−２タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって決定することができる。例えば、試料中の組換えＩＬ−２タンパク質の量は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、哺乳動物細胞において少なくとも１．１倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、３倍、または４倍以上の発現量を増加させる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質−Ｆｃ融合体は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、野生型ＩＬ−２タンパク質融合体よりも良好な安定性を示し、例えば凝集体を形成する傾向が少ない。いくつかの実施形態において、タンパク質純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、一次タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ−２変異タンパク質産物の純度は、７０％以上、または８０％以上、または９０％以上に達することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号２６に示されるＩＬ−２ＷＴ）と比較して、ＩＬ−２Ｒα受容体に対する結合親和力が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍または１００倍以上低下した。好ましい実施形態において、本発明の変異はＩＬ−２受容体αと結合しない。結合親和力は、本発明のＩＬ−２変異タンパク質、例えばＦｃ断片と融合した本発明のＩＬ−２変異タンパク質と、受容体ＩＬ−２Ｒα受容体との平衡解離定数（ＫＤ）を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定することで決定され得る。いくつかの実施形態において、受容体ＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２Ｒβに対するＩＬ−２変異タンパク質（例えばＦｃ融合体の形態）の一価結合親和力は、ＢＬＩ技術によって測定される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号２６に示されるＩＬ−２ＷＴ）と比較して、ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する結合親和力が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に、少なくとも３０倍、５０倍、または１００倍、より好ましくは、少なくとも１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、または５００倍、または５５０倍以上増強される。結合親和力は、本発明のＩＬ−２変異タンパク質、例えばＦｃ断片と融合した本発明のＩＬ−２変異タンパク質と、受容体ＩＬ−２Ｒβ受容体との平衡解離定数（ＫＤ）を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定することで決定され得る。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質の受容体ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する一価結合親和力ＫＤ値は、ＢＬＩ測定（例えば、実施例に記載のＢＬＩ測定）においてＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質の形態で１０．０Ｅ−０７Ｍ未満であり、例えば８．０Ｅ−０７Ｍ〜１．０Ｅ−０７Ｍ、例えば４．０Ｅ−０７Ｍ、３．０Ｅ−０７Ｍ、２．０Ｅ−０７Ｍ、１．０Ｅ−０７Ｍ、より好ましくは１０．０Ｅ−０８Ｍ未満、例えば９．０Ｅ−１０Ｍ未満である。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２介在性ＣＤ２５＋細胞活性化および増殖の減少をもたらす。１つの実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。１つの実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＩＬ−２変異タンパク質がＣＤ２５＋細胞中でＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化することを検出することにより、ＩＬ−２変異タンパク質がＣＤ２５＋細胞を活性化する能力を同定する。例えば、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定することができる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２介在性ＣＤ２５−エフェクター細胞の維持されたかまたは増強された活性化および増殖をもたらす。１つの実施形態において、ＣＤ２５−細胞はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞またはＮＫ細胞である。１つの実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５−細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ−２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって、ＣＤ２５−細胞を活性化するＩＬ−２変異タンパク質の能力を同定する。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいて測定されるように、野生型ＩＬ−２タンパク質（例えば、配列番号２６のヒトＩＬ−２）と比較して、ＣＤ２５＋細胞を活性化する能力は、少なくとも１倍、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増加する。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＣＤ２５＋細胞の優先的活性化に対するＩＬ−２の偏向性を排除または低減する。１つの実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。１つの実施形態において、ＩＬ−２変異体がＣＤ２５−細胞を活性化する能力は、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、それぞれＣＤ２５−細胞およびＣＤ２５＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ−２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。例えば、ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ−２変異タンパク質の活性化偏向は、ＣＤ２５−およびＣＤ２５＋Ｔ細胞上のＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比を計算することによって決定される。好ましくは、変異タンパク質のＣＤ２５＋に対する偏向性は、野生型タンパク質と比較して少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、１５０倍、または２００倍減少する。
【００４６】
本発明の変異タンパク質
グリコシル化変異タンパク質
１つの態様において、本発明は、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒａ結合インターフェースに変異グリコシル化モチーフを含むＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００４７】
当該技術分野で知られているように、ポリペプチドは、典型的にはＮ−連結またはＯ連結を介してグリコシル化される。Ｎ−連結グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合していることを意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン（Ｎ  Ｘ  Ｓ）およびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｎ  Ｘ  Ｔ）は、Ｎ−連結グリコシル化モチーフであり、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｎ連結グリコシル化部位のタンパク質（例えばＩＬ−２）への添加は、１つ以上の上記トリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成され得る。例えば、Ｎ−連結グリコシル化部位は、単一アミノ酸のコドンを変更させることによって添加することができる。例えば、Ｎ−Ｘ−ｚ（ｚは任意のアミノ酸である）をコードするコドンは、Ｎ−Ｘ−Ｔ（またはＮ−Ｘ−Ｓ）をコードするように変更されてもよく、またはｙ−Ｘ−Ｔ／Ｓをコードするコドンは、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓをコードするように変更されてもよい。あるいは、２つのアミノ酸をコードするコドンを同時に変更してＮ−連結グリコシル化部位を導入してもよい（例えば、ｙ−Ｘ−ｚのコドンを変更してＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓをコードしてもよい）。
【００４８】
本明細書において、ＩＬ−２タンパク質中に導入された変異に起因して出現するグリコシル化モチーフは、変異グリコシル化モチーフとして記述することができる。例えば、変異グリコシル化モチーフＫ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７は、３５位のリジンがアスパラギンに置換され、３６位および３７位の残基が変化しないＮ−連結グリコシル化モチーフである。本発明の好ましい実施形態において、導入される変異グリコシル化モチーフは、Ｎ−連結グリコシル化モチーフ、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであり、ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、例えば、Ｘは、野生型ＩＬ−２において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であってもよく、またはその保存的置換残基であってもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、 
３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６２Ｎ−６３Ｘ−６４Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓ、７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓから選択されるアミノ酸位置に１つ以上のグリコシル化モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔを導入する少なくとも１つの変異を含み、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｘは、野生型ＩＬ−２において対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸、またはその保存的置換残基であり、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２６に従って番号付けされる、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、導入されるＮ連結グリコシル化部位の数は、１つより多く、例えば２つのグリコシル化部位であってもよい。異なるグリコシル化部位は、ＩＬ−２に異なる特性を付与することができ、例えば、いくつかのグリコシル化部位は、改善された発現および／または精製特性を付与することができ、いくつかのグリコシル化部位は、ＩＬ−２受容体選択性を改善することができる。さらに他の実施形態において、本発明の変異タンパク質は、変異によって導入されたグリコシル化モチーフに加えて、野生型ＩＬ−２とは異なる少なくとも１−３０個のアミノ酸残基、例えば１−２０、１−１５、１−１０、または１−５個の異なるアミノ酸残基を含んでもよい。これらの異なる残基は、保存的置換であってもよく、ＩＬ−２に他の改善された特性を与える他の変異であってもよい。
【００５０】
薬剤形成特性を改善するグリコシル化変異
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、ＩＬ−２タンパク質の薬剤形成特性を改善し、特にＩＬ−２タンパク質の発現および／または精製を促進する。
【００５１】
１つの実施形態において、前記薬剤形成特性を改善する変異グリコシル化モチーフは、３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓからなる群から選択される。１つの好ましい実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、（ｉ）Ｋ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７、（ｉｉ）Ｒ３８Ｎ−Ｍ３９−Ｌ４０Ｓ、および（ｉｉｉ）Ｑ７４Ｎ−Ｓ７５−Ｋ７６Ｔからなる群から選択される。１つのより好ましい実施形態において、変異グリコシル化モチーフはＫ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７である。
【００５２】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して、３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフを含むＩＬ−２変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質は、改善された薬剤形成特性を有する。１つの実施形態において、前記変異は、哺乳動物細胞において発現されるとき、好ましくはＦｃ融合タンパク質の形態でＩＬ−２変異タンパク質を発現するとき、変異タンパク質の発現および／または精製を促進し得る。さらに別の実施形態において、前記変異は、ＩＬ−２の安定性を促進することができ、例えば、Ｆｃ融合タンパク質として発現された場合、野生型ＩＬ−２と比較して、生産中に凝集体形成の傾向が低下する。例えば、発現およびワンステップタンパク質Ａ親和性精製後、変異タンパク質は、野生型タンパク質よりも高い純度を有することができる。１つの好ましい実施形態において、野生型ＩＬ−２と比較して、前記変異タンパク質は、（ｉ）Ｋ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７、（ｉｉ）Ｒ３８Ｎ−Ｍ３９−Ｌ４０Ｓ、（ｉｉｉ）Ｑ７４Ｎ−Ｓ７５−Ｋ７６Ｔからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフを含み、より好ましくは前記変異タンパク質は、変異グリコシル化モチーフＫ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、変異Ｋ３５Ｎを介してＩＬ−２タンパク質を導入する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸残基Ｔ３７および変異Ｋ３５Ｎを有する、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、Ｒ３８Ｎ／Ｌ４０ＳまたはＱ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔから選択されるペアとなる変異によってＩＬ−２タンパク質を導入する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を有する成熟領域を有し、Ｒ３８Ｎ／Ｌ４０ＳまたはＱ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔから選択されるペアとなる変異を有する、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号３１、３２および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％または９９％の同一性を有する配列を含む。さらに好ましい実施形態において、前記変異タンパク質は、アミノ酸配列配列番号３１、３２および３８を含む。
【００５６】
ＩＬ−２Ｒα結合を低下させるグリコシル化変異
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、ＩＬ−２タンパク質の受容体選択性を改善し、特にＩＬ−２ＲαへのＩＬ−２の結合を低減させる。
【００５７】
１つの実施形態において、ＩＬ−２ＲαへのＩＬ−２の結合を低減させる変異グリコシル化モチーフは、４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓから選択され、好ましくはグリコシル化モチーフ４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓであり、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２６に従って番号付けされる。１つの好ましい実施形態において、ＩＬ−２ＲαへのＩＬ−２の結合を低減させる変異グリコシル化モチーフは、（ｉ）Ｔ４１Ｎ−Ｆ４２−Ｋ４３Ｓ、（ｉｉ）Ｋ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔ、（ｉｉｉ）Ｙ４５Ｎ−Ｍ４６−Ｐ４７Ｓ、（ｉｖ）Ｅ６８Ｎ−Ｖ６９−Ｌ７０Ｓ、（ｖ）Ｌ７２Ｎ−Ａ７３−Ｑ７４Ｔ、より好ましくはＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔからなる群から選択される。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して、変異グリコシル化モチーフを含むＩＬ−２変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質が、４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓからなる群から選択される１つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、好ましくは４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓであり、ここで、アミノ酸位置は配列番号２６に従って番号付けされ、前記変異タンパク質は野生型ＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒα結合が低減または排除される。
【００５９】
さらに別の実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して、変異グリコシル化モチーフを含むＩＬ−２変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質が、（ｉ）Ｔ４１Ｎ−Ｆ４２−Ｋ４３Ｓ、（ｉｉ）Ｋ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔ、（ｉｉｉ）Ｙ４５Ｎ−Ｍ４６−Ｐ４７Ｓ、（ｉｖ）Ｅ６８Ｎ−Ｖ６９−Ｌ７０Ｓ、（ｖ）Ｌ７２Ｎ−Ａ７３−Ｑ７４Ｔからなる群から選択される１つ以上の変異グリコシル化モチーフを含み、より好ましくは、前記変異タンパク質は、変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、変異グリコシル化モチーフは、Ｔ４１Ｎ／Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ／Ｐ４７Ｓ、Ｅ６８Ｎ／Ｌ７０Ｓ、およびＬ７２Ｎ／Ｑ７４Ｔからなる群から選択されるペアとなる変異によってＩＬ−２タンパク質に導入される。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、Ｔ４１Ｎ／Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ／Ｐ４７Ｓ、Ｅ６８Ｎ／Ｌ７０Ｓ、およびＬ７２Ｎ／Ｑ７４Ｔからなる群から選択されるペアとなる変異を有し、好ましくはペアとなる変異Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔを有する、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号３３、３４、３５、３７、および３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２ＲαへのＩＬ−２の結合を低減する上記の変異グリコシル化モチーフに加えて、（ｉ）３５Ｎ−３６Ｘ−３７Ｔ／Ｓ、３８Ｎ−３９Ｘ−４０Ｔ／Ｓ、および７４Ｎ−７５Ｘ−７６Ｔ／Ｓから選択される変異グリコシル化モチーフ、および／または（ｉｉ）変異Ｋ３５Ｑを含み得る。前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒα結合が低減または排除されており、（例えば、Ｆｃ融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞で発現された場合に）発現および／または精製特性が改善されている。いくつかの好ましい実施形態において、本発明はＩＬ−２変異タンパク質を提供し、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、Ｔ４１Ｎ／Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ／Ｐ４７Ｓ、Ｅ６８Ｎ／Ｌ７０Ｓ、およびＬ７２Ｎ／Ｑ７４Ｔからなる群から選択されるペアとなる変異を有し、Ｋ３５Ｎ、Ｒ３８Ｎ／Ｌ４０Ｓ、Ｑ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔ  またはＫ３５Ｑから選択される変異を有する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号４５−４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む。
【００６２】
Ｂ’Ｃ’ループキメラ変異タンパク質および切断変異タンパク質
１つの態様において、本発明は、ＩＬ−２のＢ’Ｃ’ループ領域に変異を導入して形成されたＢ’Ｃ’ループキメラＩＬ−２変異タンパク質および切断ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。ＩＬ−２タンパク質は、４つのαヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーである。本明細書において、「Ｂ’Ｃ’ループ領域」または「Ｂ’Ｃ’ループ配列」は、互換的に使用され、ＩＬ−２タンパク質のＢヘリックスとＣヘリックスとの間の連結配列を指す。１つの実施形態において、当該連結配列は、配列番号２６に従って、ＩＬ−２ポリペプチドの位置７２の残基および位置８４の残基を連結する配列である。配列番号２６、２９および３０の野生型タンパク質において、当該連結配列は、Ａ７３−Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、導入された変異は、野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、変異タンパク質が切断された  Ｂ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列長の短縮）を含み、好ましくは、前記切断されたループ領域は、１０、９、８、７、６または５未満のアミノ酸長、好ましくは７アミノ酸長であり、アミノ酸残基は配列番号２６に従って番号付けされる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループキメラ変異タンパク質である。前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ａａ７３〜ａａ８３配列の置換、例えば、他の４ヘリックス短鎖サイトカインファミリーのメンバーからの短Ｂ’Ｃ’ループ配列の置換を含む。ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−２１などの他の４ヘリックス短鎖サイトカインＩＬファミリーメンバー、または非ヒト種（例えば、マウス）由来のＩＬファミリーメンバーから、結晶構造のｓｕｐｅｒｐｏｓｅを介して、野生型ＩＬ−２を置換するのに適した短いＢ’Ｃ’ループを同定した。１つの好ましい実施形態において、置換のための配列は、インターロイキンＩＬ−１５（特にヒトＩＬ−１５）由来のＢ’Ｃ’ループ配列である。好ましくは、野生型ＩＬ−２中の残基７３−８３の配列は、配列ＳＧＤＡＳＩＨに置換される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループ切断変異タンパク質である。前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ａａ７３〜ａａ８３配列の切断、例えばＣ末端からの１、２、３または４アミノ酸の切断を含む。好ましくは、切断されたループ領域（すなわち、位置７２と位置８４との間の連結配列）は、配列Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを有し、好ましくは、切断されたループ領域は、配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＳＫＮＦＨを有する。
【００６６】
１つの実施形態において、Ｂ’Ｃ’ループの置換または切断により、Ｂ’Ｃ’ループの安定性を増加させて、ＩＬ−２の安定性および／またはＩＬ−２Ｒβとの親和力を増加させることができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して、増大した安定性および／または増大したＩＬ−２Ｒβ結合親和力を有するＩＬ−２変異タンパク質を提供し、前記変異タンパク質は、前述のＢ’Ｃ’ループキメラ変異またはＢ’Ｃ’ループ切断変異、特に、位置７２と位置８４との間に位置する代替ループ配列ＳＧＤＡＳＩＨまたは切断ループ配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＳＫＮＦＨを含む。
【００６７】
１つの実施形態において、キメラＢ’Ｃ’ループ変異または切断Ｂ’Ｃ’ループ変異は、ＩＬ−２Ｒβ結合の増加を与えるだけでなく、ＩＬ−２タンパク質の発現および／または精製、特に哺乳動物細胞発現系における発現および／または精製を促進し得る。したがって、１つの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ結合の増強および／または発現の改善および／または精製特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を提供する。前記ＩＬ−２変異タンパク質は、前述のＢ’Ｃ’ループキメラ変異またはＢ’Ｃ’ループ切断変異、特に、位置７２と位置８４との間に位置する代替ループ配列ＳＧＤＡＳＩＨまたは切断ループ配列ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＳＫＮＦＨを含む。
【００６８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置７２と８４との間に、ＳＧＤＡＳＩＨ、ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＧＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、およびＡＱＳＡＮＯＨからなる群から選択される連結配列を含む、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号４０〜４４、好ましくは配列番号４０〜４２、より好ましくは配列番号４０または４１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む。
【００６９】
組み合わせ変異タンパク質
１つの態様において、本発明は、組み合わせ変異を含むＩＬ−２変異タンパク質を提供する。１つの態様において、ＩＬ−２およびＩＬ−Ｒα結合インターフェースに導入されるグリコシル化変異は、互いに組み合わせてもよく、Ｂ’Ｃ’ループ変異と組み合わせてもよく、好ましくは、本明細書に記載のＢ’Ｃ’ループ変異と組み合わせてもよい。別の実施形態において、本発明のＢ’Ｃ’ループ変異は、ＩＬ−２およびＩＬ−Ｒα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異、好ましくは本明細書に記載のグリコシル化変異と組み合わせることもできる。１つの好ましい実施形態において、Ｂ’Ｃ’ループ変異をＩＬ−２およびＩＬ−Ｒα結合インターフェースに導入されたグリコシル化変異と組み合わせることにより、（ｉ）ＩＬ−２Ｒα  結合の低減（または排除）、（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒα結合の増強、および（ｉｉｉ）発現レベルの改善および精製、からなる群から選択される改善された特性を提供することができる。
【００７０】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ−２（好ましくはヒトＩＬ−２、より好ましくは配列番号２６の配列を含むＩＬ−２）と比較して、組み合わせ変異：（ｉ）４１Ｎ−４２Ｘ−４３Ｔ／Ｓ、４３Ｎ−４４Ｘ−４５Ｔ／Ｓ、４５Ｎ−４６Ｘ−４７Ｔ／Ｓ、６８Ｎ−６９Ｘ−７０Ｔ／Ｓ、７２Ｎ−７３Ｘ−７４Ｔ／Ｓからなる群から選択される変異グリコシル化モチーフ、ならびに（ｉｉ）アミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間にある、ＳＧＤＡＳＩＨおよびＡ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈから選択される短縮Ｂ’Ｃ’ループ領域配列を含み、ここで、アミノ酸位置は配列番号２６に従って番号付けされる、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。
【００７１】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置７２と８４との間に、ＳＧＤＡＳＩＨ、ＡＱＳＫＮＦＨ、ＡＧＳＫＮＦＨ、ＡＱＳＡＮＦＨ、およびＡＱＳＡＮＯＨからなる群から選択される連結配列を含み、Ｔ４１Ｎ／Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ／Ｐ４７Ｓ、Ｅ６８Ｎ／Ｌ７０Ｓ、およびＬ７２Ｎ／Ｑ７４Ｔからなる群から選択されるペアとなる変異を有する、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、、配列番号２６、２９または３０のいずれかに記載の野生型ＩＬ−２タンパク質とアミノ酸配列において少なくとも８５％または９０％の同一性を有する成熟領域を有し、アミノ酸位置７２と８４との間に、ＳＧＤＡＳＩＨ、ＡＱＳＫＮＦＨ、またはＡＧＳＫＮＦＨからなる群から選択される連結配列を含み、Ｋ４３Ｎ／Ｙ４５Ｔというペアとなる変異を有する、ＩＬ−２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、変異タンパク質は、配列番号４８、４９または５０、好ましくは配列番号４８または４９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも  ９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記変異タンパク質は、配列番号４８、４９または５０からなる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、組み合わせ変異は、ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるｐ−ＳＴＡＴＡ５シグナル伝達を優先的に刺激するＩＬ−２の偏向を減少させ、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力を増強させる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、組み合わせ変異：
（ｉ）アミノ酸位置４３〜４５の変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔとアミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間の置換配列ＳＧＤＡＳＩＨ、または
（ｉｉ）アミノ酸位置４３〜４５の変異グリコシル化モチーフＫ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔとアミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間の切断配列ＡＱＳＫＮＦＨを含み、
前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５＋  Ｔ細胞におけるｐ−ＳＴＡＴＡ５シグナル伝達を優先的に刺激する偏向性が低減され、ＣＤ２５−  Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強される。好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号４８または４９の配列、またはそれと少なくとも９５％、９６％、またはそれ以上の同一性を有する配列を含む。より好ましくは、前記変異タンパク質は、配列番号４８または４９の配列からなる。
【００７３】
その他の変異
上記の領域および位置における変異に加えて、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、それが本発明のＩＬ−２変異タンパク質の上記の１つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に１つ以上の変異を有してもよい。例えば、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、位置１２５での置換、例えばＣ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖを使用して、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供することができる（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号参照）。当業者は、本発明のＩＬ−２変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異を決定する方法を知っている。
【００７４】
ＩＬ−２変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって、または両者の間の異なるアミノ酸の数によって表すことができる。１つの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％であるが、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。別の実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質と野生型タンパク質との間には、本発明の上記グリコシル化変異またはＢ’Ｃ’ループ変異またはそれらの組み合わせ変異に加えて、１５個以下、例えば１−１０個、または１−５個の変異を有してもよい。１つの実施形態において、残りの変異は保存的置換であってもよい。
【００７５】
２.融合タンパク質および免疫複合体
本発明はまた、本発明のＩＬ−２変異タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ−変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。１つの実施形態において、Ｆｃ断片は、エフェクター機能を低減または排除する変異、例えば、Ｆｃγ受容体に対する結合を低下させるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａを含む。好ましくは、Ｆｃを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。１つの好ましい実施形態において、Ｆｃを含む融合タンパク質は、Ｆｃ領域によって介在されるエフェクター機能、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣエフェクター機能の低減または排除を同時に有する。
【００７６】
１つの実施形態において、本発明はまた、Ｆｃ断片がＡＤＣＣなどのエフェクター機能を含むＩＬ−２変異タンパク質−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。文献に報告されているように（Ｒｏｄｒｉｇｏ  Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔａｌ．、上記引用）、野生型ＩＬ−２は、Ｆｃとの融合によって、Ｆｃ−介在性（特にＦｃγＲへの結合によって仲介される）免疫エフェクター機能によってＴｒｅｇ細胞を枯渇させることができ、腫瘍に対する治療が改善する。したがって、改善された発現および／または精製などの生産特性を有する本発明のＩＬ−２変異タンパク質を、免疫エフェクター機能を保持するＦｃ断片と融合させることも、本発明の考察に含まれる。１つの実施形態において、前記融合タンパク質は、変異Ｋ３５ＮまたはＫ３５Ｑ、またはペアとなる変異Ｒ３８Ｎ／Ｌ４０ＳまたはＱ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔを含む。他の実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸位置ａａ７２〜ａａ８４の間の代替配列ＳＧＤＡＳＩＨまたは切断配列Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈを含む。１つの実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸配列配列番号７、８、１４、２０−２２に対して９０％−９９％以上の同一性を有するものを含む。別の実施形態において、前記融合タンパク質は、アミノ酸配列配列番号１２に対して０−１０または０−５以下のアミノ酸変異を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、リンカーによってＦｃ領域と融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するＦｃ融合タンパク質の活性化を増強するために、リンカーを選択することができる。１つの実施形態において、リンカーはＧＳＧＳであり、より好ましくは２ｘ（Ｇ４Ｓ）である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３−１３および１６−２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３−１３および１６−２５の配列からなる。
【００７９】
本発明はまた、本発明のＩＬ−２変異タンパク質および抗原結合分子を含む免疫複合体を提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態において、前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ  Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ  Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｂ、ＥＤＢ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される抗原と特異的に結合する。したがって、本発明の免疫複合体は、対象への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的とすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、抗腫瘍効果の増強などを提供する。
【００８０】
本発明の融合タンパク質および免疫複合体において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、いくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。
【００８１】
３．ポリヌクレオチド、ベクターと宿主
本発明は、上記ＩＬ−２変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ−２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって生成することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含み、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに作動可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
【００８２】
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターで、例えば、真核発現ベクターである。ベクターの非限定的な例は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＹＤＯ＿０１７発現ベクターである。
【００８３】
本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異ＩＬ−２タンパク質または融合体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適した宿主細胞は、当該技術分野において周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入することができ、しかもベクターを含む多くの細胞を培養して大型の発酵槽に接種して、臨床用として十分な量のＩＬ−２変異体または融合体または免疫複合体が得られる。１つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化を必要としない場合、細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分においてポリペプチドを細菌細胞のペースト状物から分離して、さらに精製することができる。原核生物の他、糸状菌または酵母などのような真核微生物は、ポリペプチドコーディングベクターのための適切なクローンまたは発現の宿主であり、グリコシル化経路が既に「ヒト化」される真菌と酵母菌株を含み、これは、一部または完全のヒトグリコシル化モードを有するポリペプチドの生成を引き起こす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２２，１４０９−１４１４（２００４）およびＬｉ  ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２４，２１０−２１５（２００６）が参照される。有用の哺乳動物宿主細胞系の実例は、ＳＶ４０形質転換のサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎臓系（例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ３６，５９（１９７７）に説明した２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ２３，２４３−２５１（１９８０）に説明したＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ  ｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ３８３，４４−６８（１９８２）に説明）、ＭＲＣ ５細胞、およびＦＳ４細胞である。使用可能な他の哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７，４２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。
【００８４】
４．調製方法
さらに別の態様において、本発明は、本発明のＩＬ−２変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、ＩＬ−２変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記タンパク質または融合体または複合体を回収することとを含む。
【００８５】
５．測定手法
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本発明のＩＬ−２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生理活性の特性評価を行うことができる。
【００８６】
１つの態様において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質に対してＩＬ−２受容体への結合活性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような本分野において既知の方法、または本出願の実施例に開示されている例示的な方法を利用して、ヒトＩＬ−２Ｒαまたはβタンパク質との結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクトされた細胞、例えば酵母ディスプレイ細胞を、標識された（例えばビオチン標識された）ＩＬ−２Ｒαまたはβタンパク質と反応させるフローサイトメトリーを用いて測定することができる。あるいは、結合動力学（例えば、ＫＤ値）を含む変異タンパク質の受容体への結合は、組換え変異タンパク質−Ｆｃ融合体を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）測定手法において測定することができる。いくつかの実施形態において、例えば実施例に記載のＢＬＩ測定手法を使用する。
【００８７】
さらに別の態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および／または免疫賦活効果を測定することによって、ＩＬ−２変異タンパク質がＩＬ−２受容体と結合する能力を間接的に測定することができる。
【００８８】
したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ−２タンパク質を同定するための測定手法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、ＩＬ−２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ−２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達を誘導する能力、Ｔ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力の低下、腫瘍の退縮の誘導および／または生存の改善、ならびに血管透過性の低下などのインビボ毒性特性の低下を含む。本発明は、インビボおよび／またはインビトロにおいて、かかる生物学的活性を有する変異ＩＬ−２タンパク質も提供する。
【００８９】
ＩＬ−２の生物学的活性を決定するために、当技術分野で公知の様な方法を使用することができる。例えば、本発明のＩＬ−２変異タンパク質がＮＫ細胞のＩＦＮ−γ産生を刺激する能力を試験するための適切な測定手法は、培養されたＮＫ細胞を本発明の変異ＩＬ−２タンパク質または融合または免疫複合体とインキュベートし、その後、培地中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより測定することを含む。ＩＬ−２シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）シグナル伝達分子に関与する。
【００９０】
ＩＬ−２と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体ならびにＪＡＫ１およびＪＡＫ３（βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する）のリン酸化をもたらす。次に、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これは、標的遺伝子の転写を促進する、受容体解離、ＳＴＡＴ５二量体化、およびＳＴＡＴ５二量体から核へのＳＴＡＴ５のシフトをもたらす。したがって、変異体ＩＬ−２ポリペプチドがＩＬ−２受容体を介してシグナル伝達を誘導する能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、ＰＢＭＣを本発明の変異体ＩＬ−２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理し、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーによって決定することができる。
【００９１】
さらに、血液から単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞を本発明の変異体ＩＬ−２ポリペプチドまたは免疫複合体とインキュベートし、次いで処理された細胞の溶解物中のＡＴＰ含量を測定することにより、ＩＬ−２の増殖に対するＴ細胞またはＮＫ細胞応答を測定する。処理前に、Ｔ細胞を植物レクチン（ＰＨＡ−Ｍ）で予備刺激することができる。この測定手法は、生存細胞数の高感度定量を可能にし、多数の適切な代替測定手法（例えば、［３Ｈ］−チミジン取り込み測定手法、細胞滴定ＧｌｏＡＴＰ測定手法、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ測定手法、ＷＳＴ−１測定手法、ＭＴＴ測定手法）も当技術分野で知られている。
【００９２】
さらに、腫瘍成長および生存に対する変異ＩＬ−２の効果は、当技術分野で公知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、ヒト癌細胞株の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体ＩＬ−２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理することができる。死亡率、生命期観察（行動、体重、体温などの有害作用の可視症状）、ならびに臨床病理学および解剖病理学（血液化学測定および／または組織病理学分析など）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ−２ポリペプチド、融合および免疫複合体のインビボでの毒性を測定することができる。例えば、ＩＬ−２処理によって誘発された血管透過性は、血管透過性前処理動物モデルにおいて、血管滲出レポータ分子を用いて検査することができる。好ましくは、血管滲出レポータ分子は、前処理のためのＩＬ−２野生型形態の透過性を明らかにするのに十分な大きさである。
【００９３】
さらに、本発明のＩＬ−２グリコシル化変異タンパク質について、グリコシル化の存在、非存在、または程度は、当業者に知られている任意の方法によって決定することができ、分子量（ＭＷ）オフセットの半定性的測定、例えばウェスタンブロットまたはクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの観察を含むことができ、定量的測定は、質量分析計技術の使用およびアスパラギン連結グリコシル化の付加に対応するＭＷオフセットの観察、またはペプチド−Ｎ−グリシングリチルリナーゼＦ  （ＰＮＧａｓｅ−Ｆ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの酵素によるアスパラギン連結グリコシル化の除去に伴う質量オフセットの観察を含むことができる。
【００９４】
６．スクリーニング方法
さらに別の態様において、本発明は、改善された特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を得るための方法を提供する。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明は、
−ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒａとの結合インターフェースにおいて、１つ以上（例えば、２つまたは３つ）のグリコシル化モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘは任意のアミノ酸であってもよいが、Ｐ（プロリン）を除く）  を人為的に操作し、好ましくはＩＬ−２のａａ３５−４０、ａａ４１−４７、ａａ６２−６４、ａａ６８−７４、ａａ７４−７６から選択される領域にグリコシル化モチーフを導入することと、
−改変されたＩＬ−２変異タンパク質を、例えば、Ｆｃ融合体（例えば、ＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において発現させることと、を含む、ＩＬ−２変異タンパク質を得るための方法を提供する。グリコシル化モチーフを導入する部位の設計のために、Ｎ−グリコシル化予測ツールを使用して、例えば、標準的なＮ−ｘ−Ｔ／Ｓグリコシル化部位（Ｎがアスパラギンであり、ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である）を形成するように変異可能な残基を同定することによって、潜在的Ｎ−連結グリコシル化を促進するように変異可能な部位を選択することができる。さらに、構造ベースの方法を用いて、ＩＬ−２におけるＩＬ−２Ｒαからの距離が３．６Åであり、側鎖が溶液に曝されているアミノ酸を、アスパラギンへの変異の候補アミノ酸として同定することができる。いくつかの好ましい実施形態において、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、Ｋ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７、Ｒ３８Ｎ−Ｍ３９−Ｌ４０Ｓ、Ｔ４１Ｎ−Ｆ４２−Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ−Ｍ４６−Ｐ４７Ｓ、Ｅ６２Ｎ−Ｌ６３−Ｋ６４Ｔ、Ｅ６８Ｎ−Ｖ６９−Ｌ７０Ｓ、Ｌ７２Ｎ−Ａ７３−Ｑ７４Ｔ、Ｑ７４Ｎ−Ｓ７５−Ｋ７６Ｔからなる群から選択される。
【００９６】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、ＩＬ−２変異タンパク質を得るための方法を提供する。
−ＩＬ−２のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループ領域（ａａ７３−８３）に欠失および／または置換を導入して短縮ループ領域を形成し、好ましくはＩＬ１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループ配列のような他の４ヘリックス短鎖サイトカインファミリーメンバーに置換してＢ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラを形成し、またはＩＬ−２のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐを切断してＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ切断体を形成し、好ましくは短縮ループ領域は１０、９、８未満であり、好ましくは７アミノ酸長に等しく、好ましくはループ領域のＣ末端から１、２、３または４アミノ酸を切断し、好ましくは短縮ループ領域は配列Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）Ｎ（Ｆ／Ｉ）Ｈ、またはＳＧＤＡＳＩＨを有すること、
−改変されたＩＬ−２変異タンパク質を、例えば、Ｆｃ融合体（例えば、ＦｃＬＡＬＡ融合体）の形態で、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）において発現させることと、を含む、ＩＬ−２変異タンパク質を得るための方法を提供する。
【００９７】
１つの実施形態において、本方法は、タンパク質発現および精製後に、薬物性（例えば、発現量および／または製品安定性および／または均質性、例えば、ワンステップＦｃアフィニティークロマトグラフィー純度）が改善されたＩＬ−２変異タンパク質を同定することをさらに含む。１つの好ましい実施形態において、ＩＬ−２の領域ａａ３５−４０またはａａ７４−７６にグリコシル化モチーフ変異を導入して、変異タンパク質の薬剤形成性を改善する。好ましくは、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、Ｋ３５Ｎ−Ｌ３６−Ｔ３７、Ｒ３８Ｎ−Ｍ３９−Ｌ４０Ｓ、およびＱ７４Ｎ−Ｓ７５−Ｋ７６Ｔからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、変異タンパク質の薬剤形成性は、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐループをＩＬ１５のような短縮ループのループ配列に置換することによって、またはＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループを切断することによって改善される。好ましくは、切断されたループ配列は、Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）ＮＦＨ、またはＳＧＤＡＳＩＨから選択される。さらに好ましい実施形態において、前記方法は、変異タンパク質の薬剤形成性を改善するために、グリコシル化変異に加えて他の部位変異、例えばＫ３５Ｑを導入することを含む。当業者には明らかなように、これらの変異を他の改良された特性を付与する変異と組み合わせて、複数の改良された特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を得ることができる。
【００９８】
１つの実施形態において、前記方法は、野生型ＩＬ−２と比較してＩＬ−２Ｒａ結合能が低減された（好ましくは排除された）ＩＬ−２変異タンパク質を同定することをさらに含む。１つの実施形態において、ＩＬ−２Ｒａに対するＩＬ−２変異タンパク質の結合能は、例えばバイオレイヤー干渉法技術によって、親和力ＫＤ値を測定することによって決定される。さらに別の実施形態において、結合能は、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞に対するＩＬ−２変異タンパク質の活性化の有効性を決定することによって決定される。１つの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、例えば細胞内のｐ−ＳＴＡＴ５シグナルの活性化を測定することによって決定されるように、野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５  ＋  Ｔ細胞活性化の低下した有効性を示す。好ましくは、変異は、ＩＬ−２の領域、ａａ４１−４７またはａａ６８−７０またはａａ７２−７４に導入されて、潜在的なＮ連結グリコシル化部位を形成し、次いで、変異がＩＬ−２ＲαへのＩＬ−２の結合の低減または排除をもたらすかどうかを検出する。好ましくは、導入されたグリコシル化モチーフ変異は、Ｔ４１Ｎ−Ｆ４２−Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｎ−Ｆ４４−Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｎ−Ｍ４６−Ｐ４７Ｓ、Ｅ６８Ｎ−Ｖ６９−Ｌ７０Ｓ、Ｌ７２Ｎ−Ａ７３−Ｑ７４Ｔからなる群から選択される。当業者には明らかなように、これらのグリコシル化変異を他の修飾特性を付与する変異と組み合わせて、複数の修飾特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を得ることができる。
【００９９】
１つの実施形態において、前記方法は、野生型ＩＬ−２に対してＩＬ−２Ｒβ結合が増強されたＩＬ−２変異タンパク質を同定することをさらに含む。１つの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質のＩＬ−２Ｒβへの結合能は、例えばバイオレイヤー干渉法によって、親和力ＫＤ値を測定することによって決定される。さらに別の実施形態において、結合能は、ＣＤ２５−  Ｔ細胞に対するＩＬ−２変異タンパク質の活性化の有効性を決定することによって決定される。１つの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質は、例えば細胞内のｐ−ＳＴＡＴ５シグナルの活性化を測定することによって決定されるように、野生型ＩＬ−２と比較してＣＤ２５−  Ｔ細胞活性化の増強された有効性を示す。１つの好ましい実施形態において、ＩＬ−２Ｒβへの結合を増強するために、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐループをＩＬ１５のような短縮ループのループ配列に置換するか、または切断されたＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループに置換する。好ましくは、切断されたループ配列は、Ａ（Ｑ／Ｇ）Ｓ（Ｋ／Ａ）ＮＦＨ、またはＳＧＤＡＳＩＨから選択される。当業者には明らかなように、これらのグリコシル化変異を他の修飾特性を付与する変異と組み合わせて、複数の修飾特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を得ることができる。
【０１００】
さらに別の実施形態において、前記方法は、上記の薬物形成を改善する変異、ＩＬ２Ｒａ結合を減少させる変異、および／またはＩＬ２Ｒβ結合を増強する変異、および／または複数の修飾された特性を有するＩＬ−２変異タンパク質を得るために他の修飾された特性を付与する変異の組み合わせを導入することを含む。１つの好ましい実施形態において、グリコシル化変異、例えば領域ａａ４１−４７およびａａ６８−７４、ならびにＢ’Ｃ’ｌｏｏｐループ領域の長さを短縮する切断および／または置換変異を組み合わせて導入する。１つの好ましい実施形態において、前記方法は、野生型ＩＬ−２に対して低減したＩＬ−２Ｒａ結合および増強したＩＬ−２Ｒβ結合を示すＩＬ−２変異タンパク質を同定することと、場合により改善された薬物形成（例えば、改善された発現および／または純度、および／または製品安定性および／または均質性）も有するＩＬ−２変異タンパク質を同定することとを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型ＩＬ−２タンパク質は、好ましくは、配列番号２６に対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％または９５％の同一性を有し、より好ましくは、ヒト由来ＩＬ−２タンパク質である。
【０１０２】
７．医薬組成物と薬物製剤
本発明はまた、ＩＬ−２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または薬物製剤を含む）、およびＩＬ−２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。
【０１０３】
本発明に適する薬学的に許容可能な担体は、石油、動物もしくは植物に由来するまたは合成された、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油など、水、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射溶液に用いることができる。適切な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその用途に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，５ｔｈ  ｅｄｉｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ、Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏが参照される。必要があれば、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに少量に含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用できる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。
【０１０４】
所望の純度を有する本発明のＩＬ−２変異タンパク質、融合体または免疫複合体を任意の１つまたは複数の医薬品添加物（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′  ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することによって、本発明を含む薬物製剤を調製し、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形式で調製する。例示的な凍結乾燥抗体製剤に関する説明は、米国特許第６，２６７，９５８号が参照される。水性抗体製剤に関しては、米国特許第６，１７１，５８６号、世界特許ＷＯ２００６／０４４９０８が参照され、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝剤を含む。また、持続性放出製剤を調製できる。持続性放出製剤の適切な例は、タンパク質を含有する疎水性固体ポリマーによる半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどのように一定の形態を有する。
【０１０５】
本発明の医薬組成物または製剤は、１種以上の他の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いにマイナスの影響を与えない活性的に相補な活性成分を含む。例えば、好ましくは、化学療法剤、ＰＤ−１軸結合拮抗剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体）などの他の抗がん活性成分をさらに提供する。前記活性成分は、目的用途において有効な量で適切に組み合わせた形で存在する。
【０１０６】
したがって、１つの実施形態において、組成物は、第２の治療剤をさらに含む。例えば、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。例えば、第２の治療剤は、例えば、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体、抗−ＣＤ４０抗体、抗−ＯＸ４０  （ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとも呼ばれる）抗体、抗−ＬＡＧ−３抗体、抗−ＣＤ７３抗体、抗−ＣＤ１３７抗体、抗−ＣＤ２７抗体、抗−ＣＳＦ−１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯまたはＴＧＦβの小分子アンタゴニストを含むが、これらに限定されない１つ以上から選択することができる。好ましくは、第２の治療剤は、ＰＤ−１拮抗剤であり、特に抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ−３、抗ＣＤ４７である。免疫治療薬物に加えて、第２の治療剤は、他の放射線療法または化学療法薬物であってもよい。
【０１０７】
８．組み合わせ製品
１つの態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および１種以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して対象の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体または抗−ＬＡＧ−３抗体または抗−ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＴＩＭ−３抗体である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、がん、例えば、胃がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管がん、または悪性黒色腫などの皮膚がん、または腎細胞癌、膀胱癌、非小細胞肺癌などである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防または治療に用いられる。
【０１１０】
９．治療方法と使用
本出願では、用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
【０１１１】
本明細書では、用語「治療」は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床介入を指す。所望の治療效果は、疾病の出現または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾病の如何なる直接的または間接的病理学結果を減少すること、転移を防止すること、病状進展速度を低減すること、疾病の状態を改善または緩和させること、および、予後を緩和または改善させることを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
１つの態様において、本発明は、対象の免疫系を刺激する方法であって、本発明のＩＬ−２変異タンパク質または融合体または免疫複合体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、ＣＤ２５−  ＣＤ１２２＋エフェクター細胞（細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞）に対して高い活性および選択性を有し、ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞に対する刺激を低減する。したがって、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、対象の免疫系を刺激するために低用量で使用することができる。
【０１１３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、対象における身体の免疫応答を増強する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のＩＬ−２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を、抗腫瘍免疫応答を刺激するように、腫瘍を携帯する対象に投与する。別の一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、抗感染免疫応答を刺激するように、感染を携帯する対象に投与する。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、Ｔｒｅｇによる免疫抑制をさらに低減するために、Ｔｒｅｇ枯渇抗体（例えば、ＦｃγＲ介在性Ｔｒｅｇ枯渇）と組み合わせて使用することができる。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、例えば、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせて、癌免疫治療効果を増強するために投与することができる。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、腫瘍および癌および感染症などの対象の疾患を治療する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のＩＬ−２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を前記対象に投与することを含む。
【０１１５】
がんは、早期、中期または末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞は、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫および頭頸部腫瘍から選択され得る。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫および頭頸部がんから選択され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍はメラノーマ、腎細胞癌、結腸直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌である。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患、例えば慢性感染の治療方法に関し、前記方法は、本明細書に係る任意のＩＬ−２変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む。１つの実施形態において、前記感染はウイルス感染である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質またはその融合体または複合体の他、本発明の方法は、前記対象に１種以上の療法（例えば、治療法および／または他の治療剤）を組み合わせて適用することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療法は、手術治療および／または放射線治療を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１種の他の免疫刺激性抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗−ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ４３抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することをさらに含み、これらの抗体は、例えば、完全ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ＩＢＩ３０８（シンディリマブ、ＷＯ２０１７／０２５０１６Ａ１）、ＭＤＸ−１１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５（ＭＫ−３４７５、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＣＴ−０１１（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はＭＤＸ−１１０６である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。さらに、いくつかの実施形態において、ＩＬ−２変異タンパク質またはその断片は、単独でまたはＰＤ−１拮抗剤との組み合わせとして、１種以上の他の療法、例えば、治療方式および／または他の治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、治療法は、外科的手術（例えば、腫瘍切除）、放射線治療（例えば、照射領域が設定された三次元原体放射線療法などの外部粒子ビーム療法）、局所照射（例えば、所定の標的もしくは器官に対する照射）または集中的照射などを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の変異タンパク質およびＣＴＬＡ−４拮抗性抗体を対象に投与することを含む、疾患（例えば、腫瘍）を治療する方法を提供する。抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、ＹＥＲＶＯＹ(R)（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／１４４２４に記載されている）、ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（旧称ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ，ＣＰ−６７５，２０６）、およびＷＯ  ９８／４２７５２、ＷＯ  ００／３７５０４、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔａｌ．（１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−１００７１、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔａｌ．（２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  ２５０５  （抗体ＣＰ−６７５２０６）、およびＭｏｋｙｒ  ｅｔａｌ．（１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：５３０１−５３０４に記載されている抗−ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される抗体であり得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の抗−変異タンパク質および抗−ＬＡＧ−３拮抗剤抗体を対象に投与することを含む、疾患（例えば、腫瘍）を治療する方法を提供する。抗−ＬＡＧ３抗体は、例えば、米国特許出願番号ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２、または１７Ｅ５、またはこれらの抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体、ＢＭＳ−９８６０１６、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載されているＩＭＰ７３１から選択され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、化学療法または化学療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、放射線療法または放射線療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、標的療法または標的治療剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ−２変異タンパク質は、免疫療法または免疫治療剤、例えばモノクローナル抗体と併用して投与されてもよい。
【０１２２】
本発明の変異（およびそれを含む医薬組成物またはその融合体または免疫複合体、任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療の場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。なお、投与期間の長さによって、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路にすることができる。本発明において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス療法などの様々な頻度の投与が含まれる。
【０１２３】
本発明の変異タンパク質は、疾患の予防または治療に用いられる場合、その適切な投与量（単独で投与される場合または１種以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、または一連の治療において患者に適切に投与される。
【０１２４】
さらに別の態様において、本発明は、上述の方法（例えば治療のため）の医薬の調製における、本発明のＩＬ−２変異タンパク質、組成物、免疫複合体、融合体の使用を提供する。
【０１２５】
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【０１２６】
実施例１．インターロイキン−２変異体の設計
・ インターロイキン−２グリコシル化タンパク質の設計
ＰＤＢデータベース中のインターロイキン−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２、ＩＬ−２と略称する）とその  α受容体ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒαと略称する）の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（図１Ａ）により、アミノ酸の部位特異的変異により、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒａとの結合インターフェースにＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸であってもよいが、Ｐ（プロリン）を除く）を人為的に改変することにより、ＩＬ−２はＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞の発現過程において、細胞の翻訳後修飾により、ＩＬ−２の表面に多糖鎖が形成され、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒとの結合が阻害される（図１Ｂの構造図に示されるように）。
【０１２７】
ＩＬ−２グリコシル化部位設計：ＩＬ−２中のＩＬ−２Ｒａから３．６Åの距離にあり、かつ、側鎖が溶液に曝されているアミノ酸を探し出し、それをアスパラギンに変異させ、その後３番目のアミノ酸をセリンまたはトレオニンに変異させ、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸であってもよいが、Ｐを除く）を形成した（表１参照）。
【表１】
2022501009.tif 000002
【０１２８】
・ ＩＬ−２  Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラとトランケートの設計
Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐ：ＩＬ−２のＢ  ｈｅｌｉｘとＣ  ｈｅｌｉｘとの連結配列（図２Ａ）、Ａ７３−Ｒ８３の合計１１アミノ酸を含む。
【０１２９】
ＩＬ−２モノマー（ＰＤＢ：１Ｍ４７）と複合体の結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）を比較すると、ＩＬ−２モノマーの結晶構造でＢ’Ｃ’ｌｏｏｐが欠損しているのは、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐが溶液中で非常に活発であるためであり、比較的安定したコンフォメーションを形成することができないからである。
【０１３０】
Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐを遺伝子操作することにより、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐの安定性が増加し、ＩＬ−２の安定性およびＩＬ−２Ｒbとの親和力が増加する。したがって、ヒトＩＬ１５結晶構造（ＰＤＢ：２Ｚ３Ｑ）を比較し、Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐが短く安定であることを見出した（図２．Ｂ）。そこで１つのＩＬ−２キメラ分子（Ｌ０１７）と４つのトランケート分子（Ｌ０５７〜Ｌ０６０）を設計した（表２参照）。
【表２】
2022501009.tif 000003
【０１３１】
実施例２：ＩＬ−２変異体−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＬ−２受容体の発現精製
発現プラスミドの構築
野生型ＩＬ−２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１−１５３，Ｃ１２５Ｓ，ＩＬ−２ＷＴと略称する）およびＩＬ−２変異体ＩＬ−２３Ｘ（Ｒ３８Ｄ，Ｋ４３Ｅ，Ｅ６１Ｒ），ＩＬ−２ｇｌｙｃａｎｓおよびＢ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラおよびトランケートを、ＧＳＧＳ連結配列を介してヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＦｃＬＡＬＡ、配列番号２８と略称される）と連結し、ｐＴＴ５のベクター上に構築し、以下のタンパク質を発現させた。
【表３】
2022501009.tif 000004
【０１３２】
ＩＬ−２ＷＴ、ＩＬ−２３Ｘ およびＬ０１１（ＩＬ−２ｇｌｙｃａｎ５）は、２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結され、ｐＣＤＮＡ３．１のベクター上に構築され、以下のタンパク質を発現させた。
【表４】
2022501009.tif 000005
【０１３３】
Ｌ０１１（ＩＬ−２ｇｌｙｃａｎ５）の上でもう１つのグリコシル化部位を増やしたりＫ３５Ｑ変異部位を増やしたり（Ｋ３５Ｑ変異は前述の変異タンパク質Ｙ００７とタンパク質３Ｄ構造に基づいて設計されている）、ＧＳＧＳ連結配列を通じてＦｃＬＡＬＡと連結し、ｐＴＴ５のベクター上に構築され、以下のタンパク質を発現させた。
【表５】
2022501009.tif 000006
【０１３４】
Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ（Ｌ０１７）およびトランケート（Ｌ０５７／０５８）をグリコシル化ＩＬ−２（Ｌ０１１）と組み合わせ、２つのＧＧＧＧＳを介してＦｃＬＡＬＡに連結し、ｐＣＤＮＡ３．１のベクター上に構築し、以下のタンパク質を発現させた。
【表６】
2022501009.tif 000007
【０１３５】
上記タンパク質分子の具体的な配列情報を配列表に示す。
【０１３６】
上記の分子を構築するために使用される野生型ＩＬ−２ＷＴの配列は、ジスルフィド架橋ＩＬ−２二量体形成を回避するために１２５位にＣ１２５Ｓ変異を有する配列番号２６に示されている。ＩＬ−２３Ｘは、以前の文献（Ｒｏｄｒｉｇｏ  Ｖａｚｑｕｅｚ  −  Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ８：１５３７３，  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）に報告されたＩＬ−２変異体であり、ＩＬ−２ＷＴと同様にＣ１２５Ｓ変異も含み、変異Ｒ３８Ｄ、Ｋ４３Ｅ、Ｅ６１Ｒを含み、その配列を配列番号２７に示す。文献によると、ＩＬ−２３ＸはＩＬ−２Ｒαと結合せず、ＩＬ−２Ｒβとの結合力は野生型ＩＬ−２と同等に維持される。
【０１３７】
ＩＬ−２融合タンパク質の発現精製
所定のトランスフェクション体積のＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代培養し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０６個の細胞／ｍｌに調整しておく。トランスフェクション当日、細胞密度は約３×１０６個の細胞／ｍｌである。最終体積の１／１０（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５−０７０）をトランスフェクション緩衝液として使用し、上記で構築した発現プラスミドを加え均一に混合し、０．２２μｍのフィルターで濾過して使用に備える。前の工程のプラスミドに適量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を加え（プラスミドとＰＥＩの比率は１：３）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートすることによって、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得る。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％  ＣＯ２の条件下で２４ｈ培養した後、ＶＰＡＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｐ４５４３−１００Ｇ）を追加し、最終濃度を２  ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄ（１ｇ／Ｌ  Ｐｈｙｔｏｎｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ＋  １ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈｙｔｏｎｅ）にし、６ｄ培養を継続した。
【０１３８】
細胞培養液を１３０００ｒｐｍで  ２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収し、前カラム  Ｈｉｔｒａｐ  Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１−００３４−９５）を用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである：精製前に５倍カラム体積の平衡液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ  ３．５）で充填剤を洗浄し、溶出液を収集した。溶出液１ｍｌあたり８０μＬ  Ｔｒｉｓ（２Ｍ  Ｔｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、製品番号：ＵＦＣ９０１０９６）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、製品番号：７００１１−０４４）に交換し、濃度を測定した。精製後のタンパク質１００μｇの濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ゲル濾過カラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）を用いてタンパク質の純度を測定した。
【０１３９】
グリコシル化変異体Ｙ００７、Ｙ００８およびＹ０１４は、表面のアミノ酸の１つまたは２つを変異させることにより、Ｙ００１に比べてタンパク質の発現量および純度が有意に向上した。Ｙ０４８、Ｙ０４９およびＹ０５０は、Ｙ０１１を基準として、グリコシル化部位を１箇所増やしたり、Ｋ３５Ｑ変異部位を１箇所増やしたりして、発現量を７．７７ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌ以上（Ｙ０４８およびＹ０４９）または４０ｍｇ／Ｌ（Ｙ０５０）に向上させ、純度を３１．３５％から８０％以上に向上させることで、分子の薬剤化能を著しく向上させた。
【０１４０】
Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ（Ｙ０１７）とトランケート（Ｙ０５７／０５８／０５９）はＹ００１に比べて発現量とワンステップ親和性クロマトグラフィー純度が大きく向上した。
【０１４１】
Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐ最適化後の配列をグリコシル化変異Ｌ０１１と組み合わせると、Ｙ０５６、Ｙ０８１およびＹ０８２は、Ｌ０１１を有する変異タンパク質Ｙ０１１と比較して発現量および純度の両方において改善された（表３）。
【表７】
2022501009.tif 000008
【０１４２】
IＬ−２受容体の発現と精製
ヒトＩＬ−２受容体a(Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９，ａａ22−２１７）およびb（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４，ａａ２７−２４０）は、配列のＣ末端にａｖｉタグ（ポリペプチド：ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、ＢｉｒＡ酵素によるビオチン化を触媒することができる）および６つのヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を連結し、ｐＴＴ５ベクター上にそれぞれ構築した。プラスミドトランスフェクション２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）方法はＩＬ−２Ｆｃ融合タンパク質の発現方法と同じである。
【０１４３】
精製前に、回収された培地に対し４５００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離して、細胞を捨てる。次に上清に対し０．２２μｌフィルターで濾過する。精製に使用したニッケルカラム（５ｍｌ  Ｈｉｓｔｒａｐ  ｅｘｃｅｌ，  ＧＥ，  １７−３７１２−０６）を０．１ＭのＮａＯＨに２ｈ浸漬した後、５−１０倍のカラム体積の超純水で洗浄し、アルカリ液を除去した。精製前に５倍カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４，  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ）で精製カラムを平衡化し、細胞上清を平衡化カラムに通し、１０倍カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．４，  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をカラムに通して非特異的結合ヘテロタンパク質を除去し、次いで標的タンパク質を3-5倍カラム体積溶出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．４，  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。回収したタンパク質限外濾過濃縮物をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１−０４４）に交換した後、  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，  １０／３００ＧＬ，  １０２４５６０５）をさらに単離して精製し、単量体の溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，７００１１−０４４）であった。ゲルフィルタカラムＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）を用いて精製後のタンパク質試料１００μｇのタンパク質純度を測定した（図３および４）。
【０１４４】
実施例３．ＩＬ−２変異体Ｆｃ融合タンパク質（略称：ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣ）とその受容体との親和力測定
ヒトＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２Ｒβと結合する本発明のＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣの平衡解離定数（ＫＤ）を、バイオレイヤー干渉法（ＢｉｏｌａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）  技術を用いて測定した。従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ２７０−８）でＢＬＩ法親和力測定を行う。
【０１４５】
実験開始より半時間前に、試料の数量分に応じて、適切な数量のＡＨＣ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８−５０６０）（陽性対照検出用）センサを用意し、ＳＤ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ  １×、ＢＳＡ  ０．１％、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％）に浸漬する。
【０１４６】
ＳＤ緩衝液、ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣ、ＩＬ−２受容体αまたはβ各１００μｌをそれぞれ９６ウェルのブラックポリスチレン半量マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５０７６）に加える。試料の位置に対応するようにプレートを配置し、センサの位置を決定する。次のように機器パラメータを設定する。ステップＢａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ〜１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを実行し、試料の結合と解離の速度で各ステップの実行時間を決定し、回転数は４００ｒｐｍで、温度は３０℃である。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを用いてＫＤ値を分析する。
【表８】
2022501009.tif 000009
【０１４７】
以上の親和力データから以下のことが分かる。１）Ｙ００９、Ｙ０１０、Ｙ０１１、Ｙ０１３およびＹ０１５はＩＬ−２Ｒαの結合を遮断できること（表４ａ）、２）Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐキメラ分子および切断分子は、分子の発現量を増加させるだけでなく、分子とＩＬ−２Ｒ(R)の親和力も増加したこと（表４ｂ）、３）ＩＬ−２グリコシル化とＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ改造の組み合わせＹ０５６とＹ０８１は、Ｙ０４５（ＩＬ−２ＷＴ−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）、Ｙ０４０（ＩＬ−２．３Ｘ−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）およびＹ０３８（ＩＬ−２．ｇｌｙｃａｎ５−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）と比較して、ＩＬ２Ｒαとの結合を阻害すると同時に、ＩＬ２Ｒ(R)結合との親和力を増強させたこと。
【０１４８】
実施例４：ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣインビトロ機能試験
ＩＬ−２Ｒαに対するＩＬ−２ＷＴの親和力はＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγより高く、細胞表面のＩＬ−２Ｒαと優先的に結合し、ＩＬ−２Ｒβγを募集し、ＩＬ−２Ｒβγにより下流ｐ−ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激する。Ｔｒｅｇ細胞表面にＩＬ−２Ｒαがあり、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞表面にＩＬ−２Ｒαがないため、正常時にＩＬ−２ＷＴはＴｒｅｇ細胞増殖を優先的に刺激し、免疫反応をダウンレギュレートさせる。ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔはＩＬ−２Ｒαと結合せず、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にＴ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激し、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。
【０１４９】
本実施例は各ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣの初代ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞ｐ−ＳＴＡＴ５シグナルに対する活性化を検出することにより、各変異体のＣＤ２５＋細胞の活性化偏向性の除去を検証し、ＣＤ２５−細胞の活性化作用が強い変異体をスクリーニングした。具体的な工程は以下のとおりである。
【０１５０】
1.  ＰＢＭＣ細胞の蘇生
a)  液体窒素からＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ製品番号：ＰＢ００５Ｆ、１００Ｍ入り）を取り出し、３７℃の水浴鍋に迅速に入れ、ＰＢＭＣ細胞を蘇生した。
b)  細胞を予熱した５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ製品番号：１００−５１２）と１‰  ＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ製品番号：０７９００）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ製品番号：０４−４１８Ｑ）培地１０ｍＬに添加し、４００Ｇ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離し（後続遠心分離はすべてこの条件）洗浄した。
c)  ２０ｍＬの培地を加えて細胞を再懸濁し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
【０１５１】
2.  ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞の精製：
a)  工程１で懸濁した細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
b)  Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  製品番号：２０１０４）１ｍＬとヒトＡＢ血清１００μＬおよびヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製品番号：１１３４８Ｄ）１００μＬに抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
c)  均一に混合した後、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに振とうした。
d)  インキュベートした後、１０ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、遠心分離して２回洗浄した。
e)  同時に、１ｍＬの磁性微小球（ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞精製キット）を用意し、７ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えて磁気スタンドに入れて１ｍｉｎ上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
f)  各１ｍＬ  Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で３０ｍｉｎ回転インキュベートした。
g)  インキュベートした後、  ６ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
h)  収集液を再び磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
i)  遠心分離して上清を捨て、予熱したＴ培地で再懸濁し、密度を１×１０６／ｍＬに調整した。
j)  １／３の細胞を用意してＣＤ２５の発現を刺激し、残りの細胞は３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
【０１５２】
3.  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ２５を発現するように刺激した：
a)  １／３工程２で精製したＣＤ８＋  Ｔ細胞を用意し、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の磁性微小球（ＧＩＢＣＯ製品番号：１１１３１Ｄ）を加え、細胞と微小球の割合は３：１であった。
b)  ３７  ℃の二酸化炭素インキュベーターに３ｍｉｎ静置した。
c)  培地１０ｍＬを加えて２回洗浄した。
d)  培地を加えて細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、 ３７℃の炭酸ガスインキュベーターで２ｄ静置培養した。
【０１５３】
4.  細胞純度と発現レベルの測定：
a)  抗ヒトＣＤ８−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号：１２−００８６−４２）、抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号：１２−０２５９−４２）、同型対照抗体（ＢＤ製品番号：５５６６５３）を用いて細胞のＣＤ８とＣＤ２５を検出した。
b)  工程２において細胞はＣＤ８＋  ＣＤ２５−Ｔ細胞であり、工程３において細胞はＣＤ８＋  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞であった。
【０１５４】
5.  各ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣによるＣＤ８＋  ＣＤ２５−Ｔ細胞に対するｐ−ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：
a)  ＣＤ８＋  ＣＤ２５−Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製品番号：ＣＬＳ３７９９−５０ＥＡ）を敷いた。
b)  １００μＬの各ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣ、市販ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ製品番号：２０２−ＩＬ−５００）、ＩＬ−２ＷＴ−ＦＣ、ＩＬ−２３Ｘ−ＦＣを添加し、最高濃度２６６．７ｎＭから始めて合計１２段階の４倍の濃度勾配で希釈し、３７℃のインキュベーター中で２０ｍｉｎインキュベートした。
c)  ４．２％  ホルムアルデヒド溶液５５．５μＬを加え、室温で１０ｍｉｎ固定した。
d)  上清を遠心分離し、２００μＬの氷メタノール（Fisher製品番号：Ａ４５２−４）を加えて細胞を再懸濁し、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。
e)  上清を遠心分離し、２００μＬ染色緩衝液（ＢＤ製品番号：５５４６５７）で３回洗浄した。
f)  抗ｐ−ＳＴＡＴ５−ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７（ＢＤ製品番号：５６２０７６、１：２００希釈）を含む破膜・固定緩衝液（ＢＤ製品番号：５１−２０９１ＫＺ）２００μＬを加え、室温で遮光して３ｈインキュベートした。
g)  染色緩衝液を用いて３回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
h)  ＩＬ−２分子の濃度を横軸、ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７中間蛍光値を縦軸として、ｐ−ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値を作成した結果を図５および表５に示す。
【０１５５】
6.  各ＩＬ−２ｍｕｔａｎｔ−ＦＣによるＣＤ８＋  ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対するｐ−ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：
a)  ＣＤ８＋  ＣＤ２５＋Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレートを敷いた。
b)  工程５におけるｂ−ｈと同様にして、ｐ−ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値を作成し、結果を図５および表５に示す。
【表９】
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【０１５６】
実験の結果（同じｄｏｎｏｒで比較）：
1）  Ｙ００１（ＩＬ−２ＷＴ−ＧＳＧＳ−ＦｃＬＡＬＡ）  とＹ０４５（ＩＬ−２ＷＴ−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）、Ｙ００２（ＩＬ−２．３Ｘ−ＧＳＧＳ−ＦｃＬＡＬＡ）とＹ０４０（ＩＬ−２．３Ｘ−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）、Ｙ０１１（ＩＬ−２．ｇｌｙｃａｎ５−ＧＳＧＳ−ＦｃＬＡＬＡ）  とＹ０３８（ＩＬ−２．ｇｌｙｃａｎ５−２＊（Ｇ４Ｓ）−ＦｃＬＡＬＡ）の曲線位置を比較し、長い連結配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）は短い連結配列（ＧＳＧＳ）よりＣＤ２５−ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に優れていることがわかった（図５Ａ）。
2）  ヒトＩＬ−１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐをキメラした後、Ｙ０１７（ＩＬ−２ｈｙｂ１５ＢＣＬ−ＧＳＧＳ−ＦｃＬＡＬＡ）によるＣＤ２５−ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ｙ０１７のＥＣ５０値は０．９９０２）はＹ００１  （ＥＣ５０値は１０．６９）より１０．７９倍向上した（図５Ａ）  。一方、ＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ｙ０１７のＥＣ５０値は０．００１８）はＹ００１（ＥＣ５０値は０．００２０）に相当する（図５Ｂ）。
3）  ＩＬ−２のインターフェースにＮグリカンが１個増加した後（Ｙ０３８）、ＣＤ２５−ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ｙ０３８のＥＣ５０値は３６９．０）は野生型のＩＬ−２（Ｙ０４５、ＥＣ５０値は３１．７３）より１１．６３倍低下したが、文献報告のＩＬ−２３Ｘ（Ｙ０４０）より優れた。これにヒトＩＬ−１５のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐをキメラしたところ（Ｙ０５６、ＥＣ５０値は８．５７１）、ＣＤ２５−ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する活性化はＹ０４５より３．７倍向上し、Ｙ０３８より４３．０５倍向上した（図５Ｃ）。
4）  同じｄｏｎｏｒで、刺激前後のＣＤ８＋Ｔ細胞を比較すると、Ｙ０５６およびＹ０８１がＣＤ２５−ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増強し、ＣＤ２５＋細胞の活性化の偏向性を減少させたことが示された（図５Ｄ、Ｅおよび表５）。
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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