(57)【要約】  疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む、ポリマー。【選択図】  図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む、ポリマー。
【請求項２】
前記第１の複数のペンダント基又は前記第２の複数のペンダント基の少なくとも１つが、連結部を介して前記疎水性ポリマー骨格に結合している、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記連結部が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基を含む、請求項２に記載のポリマー。
【請求項４】
前記第１の複数のペンダント基が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基を含む第１の連結基を介して、前記疎水性ポリマー骨格に結合される、請求項２に記載のポリマー。
【請求項５】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基が、芳香族基を含む、請求項４に記載のポリマー。
【請求項６】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基が、ベンジル基を含む、請求項５に記載のポリマー。
【請求項７】
前記疎水性ポリマー骨格が、ビニルモノマーのラジカル重合を介して形成されている、請求項１に記載のポリマー。
【請求項８】
前記疎水性ポリマー骨格が、フリーラジカル重合を介して形成される、請求項７に記載のポリマー。
【請求項９】
前記疎水性ポリマー骨格が、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成される、請求項７に記載のポリマー。
【請求項１０】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、親水性基である、請求項１に記載のポリマー。
【請求項１１】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、水性環境との水素結合を形成するように適合されている、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、糖基を含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１３】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、ヌクレオシドを含む、請求項１２に記載のポリマー。
【請求項１４】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、ヌクレオシド類似体、糖アルコール、アスコルビン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、トリエタノールアミン、ペンタエリスリトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ドーパミン、カテキン又はコール酸を含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１５】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、グリセロール、ジ−グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、フシトール、リビトール、ソルビトール、マルチトール、イソマルト、マンニトール、糖類、オリゴ糖類、多糖類、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸又はグリコサミンを含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１６】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクツロース又はラクトースを含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１７】
前記ヌクレオシドが、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド又はヌクレオシド類似体治療薬である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項１８】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、アスコルビン酸又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１９】
前記ヌクレオシドが、ゲムシタビン、アザシチジン、シタラビン又はそれらの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２０】
前記ヌクレオシドが、治療薬である、請求項１３に記載のポリマー。
【請求項２１】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、治療薬又は診断薬を含み、前記第２の複数のペンダント基が、in vivoで不安定な連結部を介して疎水性ポリマー骨格に結合している、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項２２】
前記in vivoで不安定な連結部が、還元感受性結合、ｐＨ感受性結合、ＲＯＳ感受性結合又はプロテアーゼ感受性結合のうち少なくとも１つを含む、請求項２１に記載のポリマー。
【請求項２３】
前記in vivoで不安定な連結部が、エステル結合、オルトエステル結合、チオエーテルエステル結合、無水物結合、アミド結合、炭酸結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、ｃｉｃ−アコチニル結合、アセタール結合、マレイン酸カルボキシジメチル結合、イミン結合、オキシム結合、シリルエーテル結合、ケタール結合、チオケタール結合又はプロテアーゼ切断可能ペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項２１に記載のポリマー。
【請求項２４】
前記連結部が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基をさらに含む、請求項２１記載のポリマー。
【請求項２５】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基が、芳香族基を含む、請求項２４に記載のポリマー。
【請求項２６】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基が、ベンジル基を含む、請求項２５に記載のポリマー。
【請求項２７】
前記複数のポリマーが、１００ｎｍ未満の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項２８】
前記複数のポリマーが、５０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項２９】
前記複数のポリマーが、３０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項３０】
前記複数のポリマーが、２０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項３１】
前記複数のポリマーが、１０〜３０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項３２】
前記複数のポリマーが、１０〜２０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項３３】
疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む、複数のポリマー、及び、少なくとも第１の化合物を含む、製剤。
【請求項３４】
少なくとも第２の化合物をさらに含む、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
前記第１の化合物及び前記第２の化合物のうち少なくとも１つが、治療化合物又は診断化合物である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記第１の化合物及び前記第２の化合物のうち少なくとも１つが、小分子化合物である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記第１の化合物及び前記第２の化合物のうち少なくとも１つが、１．５ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３８】
前記第１の化合物が、疎水性化合物である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３９】
前記第１の化合物及び前記第２の化合物が、疎水性化合物である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項４０】
前記第１の化合物が、第１の診断化合物である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項４１】
前記第１の診断化合物が、イメージング技法で使用するためのコントラスト増強剤を含む、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
前記第１の化合物が、第１の治療化合物である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項４３】
前記第１の治療化合物が、化学療法化合物、抗ウイルス化合物、抗生物質化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗拒絶反応化合物、鎮痛化合物、抗酸化化合物、免疫調節化合物又は抗炎症化合物である、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記第１の治療化合物が、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２'−フルオロ−２'−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２'−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２'−Ｃ−メチル−アデノシン、２'−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン又は９−デアザアデノシンである、請求項４３に記載の製剤。
【請求項４５】
少なくとも第２の化合物をさらに含む、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４６】
前記第２の化合物が、第２の治療化合物であり、前記第２の治療化合物が、化学療法化合物、抗ウイルス化合物、抗生物質化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗拒絶反応化合物、鎮痛化合物、抗酸化化合物、免疫調節化合物又は抗炎症化合物である、請求項４５に記載の製剤。
【請求項４７】
前記第２の化合物が、小分子治療化合物である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
前記第２の化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項４７に記載の製剤。
【請求項４９】
前記第２の化合物が、疎水性化合物である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項５０】
前記第２の化合物が、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２'−フルオロ−２'−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２'−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２'−Ｃ−メチル−アデノシン、２'−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン及び９−デアザアデノシンからなる群より選択される、請求項４６に記載の製剤。
【請求項５１】
前記第１の化合物が、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２'−フルオロ−２'−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２'−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２'−Ｃ−メチル−アデノシン、２'−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン及び９−デアザアデノシンからなる群より独立して選択される、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５２】
前記第１の複数のペンダント基又は前記第２の複数のペンダント基のうち少なくとも１つのうち少なくとも１つが、連結部を介して前記疎水性ポリマー骨格に結合される、請求項３３に記載の製剤。
【請求項５３】
前記連結部が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基を含む、請求項５２に記載の製剤。
【請求項５４】
前記第１の複数のペンダント基が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基を含む第１の連結基を介して、疎水性ポリマー骨格に結合される、請求項３３に記載の製剤。
【請求項５５】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基が、芳香族基を含む、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５６】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基が、ベンジル基を含む、請求項５５に記載の製剤。
【請求項５７】
前記疎水性ポリマー骨格が、ビニルモノマーのラジカル重合を介して形成されている、請求項３３に記載の製剤。
【請求項５８】
前記疎水性ポリマー骨格が、フリーラジカル重合を介して形成される、請求項５７に記載の製剤。
【請求項５９】
前記疎水性ポリマー骨格が、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成される、請求項５７に記載の製剤。
【請求項６０】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、親水性基である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項６１】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、水性環境との水素結合を形成するように適合されている、請求項６０に記載の製剤。
【請求項６２】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、糖基を含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６３】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、ヌクレオシドを含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６４】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、ヌクレオシド類似体、糖アルコール、アスコルビン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、トリエタノールアミン、ペンタエリスリトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ドーパミン、カテキン又はコール酸を含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６５】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、グリセロール、ジ−グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、フシトール、リビトール、ソルビトール、マンニトール、糖類、オリゴ糖類、多糖類、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸又はグリコサミンを含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６６】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクツロース又はラクトースを含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６７】
前記ヌクレオシドが、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド又はヌクレオシド類似体治療薬である、請求項６３に記載の製剤。
【請求項６８】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、アスコルビン酸又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む、請求項６１に記載の製剤。
【請求項６９】
前記ヌクレオシドが、ゲムシタビン、アザシチジン、シタラビン又はそれらの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される、請求項６３に記載の製剤。
【請求項７０】
前記ヌクレオシドが、治療薬である、請求項６３に記載の製剤。
【請求項７１】
前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、治療薬又は診断薬であり、前記第２の複数のペンダント基が、in vivoで不安定な連結部を介して疎水性ポリマー骨格に結合している、請求項３３に記載の製剤。
【請求項７２】
前記in vivoで不安定な連結部が、還元感受性結合、ｐＨ感受性結合、ＲＯＳ感受性結合又はプロテアーゼ感受性結合のうち少なくとも１つを含む、請求項７１に記載の製剤。
【請求項７３】
前記in vivoで不安定な連結部が、エステル結合、オルトエステル結合、チオエーテルエステル結合、無水物結合、アミド結合、炭酸結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、ｃｉｃ−アコチニル結合、アセタール結合、マレイン酸カルボキシジメチル結合、イミン結合、オキシム結合、シリルエーテル結合、ケタール結合、チオケタール結合又はプロテアーゼ切断可能ペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項７２に記載の製剤。
【請求項７４】
前記連結部が、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基をさらに含む、請求項７２に記載の製剤。
【請求項７５】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基が、芳香族基を含む、請求項７４に記載の製剤。
【請求項７６】
前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基が、ベンジル基を含む、請求項７５に記載の製剤。
【請求項７７】
前記複数のポリマーが、１００ｎｍ未満の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７８】
前記複数のポリマーが、５０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７９】
前記複数のポリマーが、３０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８０】
前記複数のポリマーが、２０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８１】
前記複数のポリマーが、１０〜３０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８２】
前記複数のポリマーが、１０〜２０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する、請求項３３〜７６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８３】
前記ミセルが、少なくとも４〜３０重量％の前記第１の治療化合物のロード容量を有する、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８４】
前記ミセルが、少なくとも８〜３０重量％の前記第１の治療化合物のロード容量を有する、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８５】
前記ミセルが、少なくとも８〜２０重量％の前記第１の治療化合物のロード容量を有する、請求項７９に記載の製剤。
【請求項８６】
疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマーを含む、in vivoにて化合物を送達するための製剤。
【請求項８７】
前記複数のポリマーが、ミセルを形成する、請求項８６に記載の製剤。
【請求項８８】
第１の化合物を送達するための組成物を製剤化する方法であって、前記方法は、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマーを、複数の前記第１の化合物と混合することを含む、方法。
【請求項８９】
前記複数のポリマーが、ミセルを形成する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の化合物が、治療薬又は診断薬である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
第１の化合物を送達する方法であって、前記方法は、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマー、及び、複数の前記第１の化合物、を含む製剤を投与することを含む、方法。
【請求項９２】
前記複数のポリマーがミセルを形成し、前記第１の化合物が前記ミセル内にロードされる、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の化合物が、治療薬又は診断薬である、請求項９２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって与えられた認可番号ＣＡ１７４３０５及びＣＡ２２３７８８の下で、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４４，９２８号の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
以下の情報は、以下に開示される技術及びそのような技術が通常使用され得る環境についての読者の理解を補助するために提供される。本明細書において使用される用語は、本明細書にて別途明記されない限り、特定の狭い解釈に限定されることは意図されていない。本明細書において説明される参考文献は、それらの技術又は背景の理解を容易にし得る。本明細書において引用される全ての参考文献の開示は、参照により組み込まれる。
【０００４】
様々な小分子が、患者の抗癌治療又は抗ウイルス治療等の治療的処置のための有力な候補として開発されている。しかしながら、低い水溶性、乏しい生物学的利用能、高い毒性副作用等の多くの欠点によって、そのような治療薬又は化合物の臨床応用が制限される。これらの薬物をナノサイズのミセルに製剤化すると、溶解性が向上し、制御可能な薬物送達が得られる。このことは、治療効果を高め、全身毒性を低減するための有望な戦略である。ミセルの生体内分布プロファイル及び腫瘍浸透は、粒子サイズを最適化することによって調整され得ることが知られている。ナノ粒子のサイズを小さくすると、循環時間及び薬物の腫瘍への蓄積が増加し得る。しかしながら、ナノ粒子が小さくなるほど、通常は薬物のペイロード及びロード効率が低くなる。
【０００５】
さらに、治療薬以外の薬剤又は化合物を、ナノ粒子担体薬を介して送達することが望ましい場合もある。そのような薬剤は、例えば、上記の治療薬について述べたものと同じ欠点又は送達の問題のいくつかを有する場合がある。例えば、イメージング技法（例えば、Ｘ線技法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波イメージング、光ベースイメージング及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）等の診断及びイメージング技法（例えば、血管造影、静脈造影及び尿路造影を含む））において使用するための造影剤又は化合物等の診断薬又は化合物を、他の薬剤又は化合物（例えば、治療薬）とは独立して送達することが望ましい場合もあり、それらと組み合わせて送達することが望ましい場合もある。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、ポリマーは、疎水性ポリマー骨格（例えば、ラジカル重合によって形成される）と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む。
【０００７】
前記第１の複数のペンダント基及び／又は前記第２の複数のペンダント基の少なくとも１つは、例えば、独立して、連結部を介して前記疎水性ポリマー骨格に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、前記連結部は、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基を含む。いくつかの実施形態では、前記第１の複数のペンダント基は、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基を含む第１の連結基を介して、疎水性ポリマー骨格に結合される。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基は、例えば、芳香族基を含んでいてもよい。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基は、例えば、ベンジル基を含んでいてもよい。
【０００８】
いくつかの実施形態では、前記疎水性ポリマー骨格は、ビニルモノマーのラジカル重合を介して形成されている。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、フリーラジカル重合を介して形成されていてもよい。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成されていてもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、親水性基である。前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、例えば、水性環境との水素結合を形成するように適合されていてもよい。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、糖基を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、ヌクレオシドを含む。前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、例えば、ヌクレオシド類似体、糖アルコール、アスコルビン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、トリエタノールアミン、ペンタエリスリトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ドーパミン、カテキン又はコール酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、グリセロール、ジ−グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、フシトール、リビトール、ソルビトール、マルチトール、イソマルト、マンニトール、糖類、オリゴ糖類、多糖類、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸又はグリコサミンを含む>。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクツロース又はラクトースを含む。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、アスコルビン酸又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド又はヌクレオシド類似体治療薬である。前記ヌクレオシドは、例えば、ゲムシタビン、アザシチジン、シタラビン又はそれらの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択されてもよい。前記ヌクレオシドは、例えば、治療薬であってもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、治療薬又は診断薬を含み、前記第２の複数のペンダント基が、in vivoで不安定な連結部を介して疎水性ポリマー骨格に結合している。前記in vivoで不安定な連結部は、例えば、還元感受性結合、ｐＨ感受性結合、ＲＯＳ感受性結合又はプロテアーゼ感受性結合のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。前記in vivoで不安定な連結部は、例えば、エステル結合、オルトエステル結合、チオエーテルエステル結合、無水物結合、アミド結合、炭酸結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、ｃｉｃ−アコチニル結合、アセタール結合、マレイン酸カルボキシジメチル結合、イミン結合、オキシム結合、シリルエーテル結合、ケタール結合、チオケタール結合又はプロテアーゼ切断可能ペプチドのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。上述のように、前記連結部は、例えば、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基をさらに含んでいてもよい。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基は、例えば、芳香族基（例えば、ベンジル基）を含んでいてもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書における前記複数のポリマーは、１００ｎｍ未満の直径、５０ｎｍ以下の直径、３０ｎｍ以下の直径、２０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する。いくつかの実施形態では、前記複数のポリマーは、１０〜３０ｎｍの範囲又は１０〜２０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する。
【００１２】
別の態様では、本明細書の製剤は、例えば、ラジカル重合によって形成された（上述のような）複数のポリマーであって、それにより、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを有する、複数のポリマーを含む。前記製剤は、さらに、少なくとも第１の化合物をさらに含んでいてもよい。前記製剤は、さらに、前記第１の化合物とは異なる少なくとも第２の化合物をさらに含んでいてもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物は、例えば、独立して第１の疎水性化合物及び第２の疎水性化合物であってもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物の一方又は両方は、例えば、独立して小分子化合物であってもよい。そのような小分子化合物は、例えば、１．５ｋＤａ未満又は１．０ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。
【００１３】
前記第１の化合物及び／又は前記第２の化合物は、例えば、独立して治療化合物又は診断化合物であってもよい。前記第１の診断化合物は、例えば、イメージング技法で使用するためのコントラスト増強剤を含んでいてもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記第１の化合物は、第１の治療化合物であり、例えば、化学療法化合物、抗ウイルス化合物（例えば、ＨＩＶ及び／又は他のウイルス感染症の治療に使用するためのもの）、抗生物質化合物、抗真菌化合物、抗癌化合物、抗拒絶反応化合物、鎮痛化合物、抗酸化化合物、免疫調節化合物又は抗炎症化合物等が挙げられる。前記第１の治療化合物は、例えば、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２’−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２’−Ｃ−メチル−アデノシン、２’−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン又は９−デアザアデノシンであってもよい。抗ウイルス剤としては、例えば、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２’−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２’−Ｃ−メチル−アデノシン、２’−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン及び９−デアザアデノシンが使用されてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記第２の治療化合物は、独立して、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２'−フルオロ−２'−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２'−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２'−Ｃ−メチル−アデノシン、２’−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン及び９−デアザアデノシンである。
【００１６】
上述のように、前記第１の複数のペンダント基及び／又は前記第２の複数のペンダント基のうち少なくとも１つは、例えば、独立して、連結部を介して前記疎水性ポリマー骨格に結合される。いくつかの実施形態では、前記連結部は、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基を含む。いくつかの実施形態では、前記第１の複数のペンダント基は、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基を含む第１の連結基を介して、疎水性ポリマー骨格に結合される。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基は、例えば、芳香族基を含んでいてもよい。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基は、例えば、ベンジル基を含んでいてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記疎水性ポリマー骨格は、ビニルモノマーのラジカル重合を介して形成されている。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、フリーラジカル重合を介して形成されていてもよい。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成されていてもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基が、親水性基である。前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、例えば、水性環境との水素結合を形成するように適合されていてもよい。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、糖基を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、ヌクレオシドを含む。前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、例えば、ヌクレオシド類似体、糖アルコール、アスコルビン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、トリエタノールアミン、ペンタエリスリトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ドーパミン、カテキン又はコール酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、グリセロール、ジ−グリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、フシトール、リビトール、ソルビトール、マルチトール、イソマルト、マンニトール、糖類、オリゴ糖類、多糖類、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸又はグリコサミンを含む。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクツロース又はラクトースを含む。いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、アスコルビン酸又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド又はヌクレオシド類似体治療薬である。前記ヌクレオシドは、例えば、ゲムシタビン、アザシチジン、シタラビン又はそれらの生物学的に活性な誘導体からなる群から選択されてもよい。前記ヌクレオシドは、例えば、治療薬であってもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基は、治療薬又は診断薬であり、前記第２の複数のペンダント基が、in vivoで不安定な連結部を介して疎水性ポリマー骨格に結合している。前記in vivoで不安定な連結部は、例えば、還元感受性結合、ｐＨ感受性結合、ＲＯＳ感受性結合又はプロテアーゼ感受性結合のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。前記in vivoで不安定な連結部は、例えば、エステル結合、オルトエステル結合、チオエーテルエステル結合、無水物結合、アミド結合、炭酸結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、ｃｉｃ−アコチニル結合、アセタール結合、マレイン酸カルボキシジメチル結合、イミン結合、オキシム結合、シリルエーテル結合、ケタール結合、チオケタール結合又はプロテアーゼ切断可能ペプチドのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。上述のように、前記連結部は、例えば、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基をさらに含んでいてもよい。前記π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基は、例えば、芳香族基（例えば、ベンジル基）を含んでいてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書の前記複数のポリマーは、１００ｎｍ未満の直径、５０ｎｍ以下の直径、３０ｎｍ以下の直径、２０ｎｍ以下の直径を有するミセルを形成する。いくつかの実施形態では、前記複数のポリマーは、１０〜３０ｎｍの範囲又は１０〜２０ｎｍの範囲の直径を有するミセルを形成する。前記ミセルは、例えば、少なくとも４〜３０重量％、少なくとも８〜３０重量又は少なくとも８〜２０重量％の第１の治療化合物のロード容量を有していてもよい。
【００２１】
別の態様では、本明細書のin vivoにて化合物を送達するための製剤は、（上述のような）複数のポリマーであって、（例えば、ラジカル重合によって形成された）疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマーを含む。前記製剤は、さらに、少なくとも第１の化合物をさらに含んでいてもよい。前記製剤は、さらに、前記第１の化合物とは異なる少なくとも第２の化合物をさらに含んでいてもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物は、例えば、独立して第１の疎水性化合物及び第２の疎水性化合物であってもよい。前記第１の化合物及び／又は前記第２の化合物は、例えば、独立して治療化合物又は診断化合物であってもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物の一方又は両方は、例えば、小分子化合物であってもよい。そのような小分子化合物は、例えば、１．５ｋＤａ未満又は１．０ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。前記複数のポリマーは、例えば、ミセルを形成していてもよい。
【００２２】
別の態様では、第１の化合物を送達するための組成物を製剤化する方法は、（上述のような）複数のポリマーであって、（例えば、ラジカル重合によって形成された）疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマーを、複数の前記第１の化合物と混合することを含む。前記製剤は、さらに、前記第１の化合物とは異なる少なくとも複数の第２の化合物をさらに含んでいてもよい。上述のように、前記第１の化合物及び前記第２の化合物は、例えば、独立して第１の疎水性化合物及び第２の疎水基であってもよい。前記第１の化合物及び／又は前記第２の化合物は、例えば、独立して治療化合物又は診断化合物であってもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物の一方又は両方は、例えば、小分子化合物であってもよい。そのような小分子化合物は、例えば、１．５ｋＤａ未満又は１．０ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。前記複数のポリマーは、例えば、ミセルを形成していてもよい。
【００２３】
さらなる態様では、第１の化合物を送達する方法は、（上述のような）複数のポリマー及び複数の前記第１の化合物を含む製剤を投与することを含み、前記複数のポリマーは、（例えば、ラジカル重合によって形成された）疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、複数のヒドロキシル基を含む少なくとも１つの基を含む第１の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマーを含む第２の複数のペンダント基とを含む複数のポリマーを含む。前記製剤は、さらに、前記第１の化合物とは異なる少なくとも複数の第２の化合物をさらに含んでいてもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物は、例えば、疎水性化合物であってもよい。前記第１の化合物及び／又は前記第２の化合物は、例えば、独立して治療化合物又は診断化合物であってもよい。前記第１の化合物及び前記第２の化合物は、例えば、小分子化合物であってもよい。そのような小分子化合物は、例えば、１．５ｋＤａ未満又は１．０ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。いくつかの実施形態では、前記複数のポリマーはミセルを形成し、前記第１の化合物は及び／又は第２の化合物は、前記ミセル内にロードされてもよい。
【００２４】
本システム、方法及び組成物は、その特質及び付随する利点と共に、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて考慮することによって最もよく認識及び理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、両親媒性ポリマーの一般化された構造の代表的な実施形態を概略的に示す。
【００２６】
【図２】図２は、両親媒性ポリマーの一般化された構造の別の代表的な実施形態を概略的に示す。
【００２７】
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書の複数のポリマーで形成されたミセル担体構造に複数の治療薬、化合物又は薬物がロードされている、理想化された概略図を示す。
【００２８】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーによるミセル凝集の可能なメカニズムをＰＧＥＭポリマーによる小さなミセルの形成及びの改善された薬物ロードと比較して概略的に示す。
【００２９】
【図４】図４は、図１及び２の代表的なリンカー基Ｌ1を示す。
【００３０】
【図５】図５は、図１及び２の代表的なリンカー基Ｌ2を示す。
【００３１】
【図６】図６は、本明細書のＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーの合成スキームを示す。
【００３２】
【図７】図７は、薬物をロードしたミセルの特性を示す。ここで、パネルＡは、ＰＴＸをロードしたＰＧＥＭミセルの粒子サイズを示す。パネルＢは、ＮＬＧをロードしたＰＧＥＭミセルの粒子サイズを示す。パネルＣは、ＰＴＸ／ＮＬＧを共にロードしたＰＧＥＭミセルの粒子サイズを示す。パネルＤは、ＰＴＸをロードしたＰＧＥＭミセルのＴＥＭ画像を示す。パネルＥは、ＮＬＧをロードしたＰＧＥＭミセルのＴＥＭ画像を示す。パネルＦは、ネガティブ染色を使用したＰＴＸ／ＮＬＧを共にロードしたＰＧＥＭミセルのＴＥＭ画像を示す。スケールバーは、パネルＤからＦにおいて１００ｎｍであり、ＤＬＣ研究では、ＰＴＸ及びＮＬＧは、それぞれ３．８％及び７．４％である。
【００３３】
【図８Ａ】図８Ａは、ＰＴＸ／ＮＬＧを同時にロードしたＰＧＥＭミセルからの累積ＰＴＸ放出プロファイルを示す。ここで、０．５％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリエトキシル化ソルビタンとオレイン酸に由来する非イオン性界面活性剤及び乳化剤）を含むＰＢＳが放出媒体として使用され、報告された値は、３つのサンプルの平均±ＳＤである。
【００３４】
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＰＴＸ／ＮＬＧを同時にロードしたＰＧＥＭミセルからの累積ＮＬＧ放出プロファイルを示す。ここで、０．５％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ  ８０を含むＰＢＳが放出媒体として使用され、報告された値は、３つのサンプルの平均±ＳＤである。
【００３５】
【図９Ａ】図９Ａは、対照群として遊離型ＧＥＭを用いた、ＰＡＮＣ０２細胞株におけるＰＧＥＭプロドラッグミセルのＭＴＴ細胞毒性アッセイを示す。ここで、細胞は種々異なるミセルで９６時間処理され、報告された値は３つのサンプルの平均±ＳＤである。
【００３６】
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＰＡＮＣ０２細胞株における様々な製剤のＭＴＴ細胞毒性研究を示す。ここで、細胞は種々異なるミセルで９６時間処理され、報告された値は３つのサンプルの平均±ＳＤである。
【００３７】
【図１０】図１０は、ＰＡＮＣ０２細胞を遊離型ＮＬＧ９１９、ＰＴＸ／ＰＧＥＭ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ及びＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭと共にＩＦＮ−γで処理し、２日後に上清中のキヌレニン（Ｋｙｎ）を測定したＩＤＯ活性のin vitro阻害効果を示す。
【００３８】
【図１１】図１１は、in vivo治療効果を示す。ここで、パネルＡは、ＰＡＮＣ０２細胞が、生理食塩水、ＰＧＥＭ、ＰＴＸ／ＰＧＥＭ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭ及びタキソールと遊離型ＧＥＭとの混合物を含む様々な製剤の治療の１２日前に皮下注射されたことを示す。このとき、３日毎に５回の静脈内注射が行われている。パネルＢは、様々な製剤で治療されたマウスの相対的腫瘍体積の変化を示す。パネルＣは、様々な治療を受けたマウスの腫瘍重量と、様々な製剤の腫瘍阻害率（ＩＲ）とを示す。パネルＤは、各治療群の切除された腫瘍の写真を示す。
【００３９】
【図１２Ａ】図１２Ａは、様々な製剤で治療した後の腫瘍組織におけるＣＤ４+ＦｏｘＰ３+Ｔｒｅｇ免疫細胞のフローサイトメトリー分析を示す。対応して腫瘍浸潤免疫細胞の割合が定量化され、結果は平均±ＳＤ、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１（ｖｓ対照群）、#ｐ＜０．０５（ｖｓタキソール＋フリーＧＥＭ）として報告されている。
【００４０】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、様々な製剤で治療した後の腫瘍組織におけるＣＤ４+ＩＦＮγ+Ｔ免疫細胞のフローサイトメトリー分析を示す。対応して腫瘍浸潤免疫細胞の割合が定量化され、結果は平均±ＳＤ、*ｐ＜０．０５（ｖｓ対照群）として報告されている。
【００４１】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、様々な製剤で治療した後の腫瘍組織におけるＣＤ８+ＩＦＮγ+Ｔ免疫細胞のフローサイトメトリー分析を示す。対応して腫瘍浸潤免疫細胞の割合が定量化され、結果は平均±ＳＤ、*ｐ＜０．０５、（ｖｓ対照群）、#ｐ＜０．０５（ｖｓタキソール＋フリーＧＥＭ）として報告されている。
【００４２】
【図１３】図１３は、アザシチジン共役ポリマー（ＰＡｚａ）の合成スキームを示す。
【００４３】
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤＬＳ粒子サイズの研究、及び、ブランクＰＡｚａミセルのＴＥＭ画像を示す。
【００４４】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＤＬＳ粒子サイズの研究、及び、ＤＯＸをロードしたＰＧＡｚａミセルのＴＥＭ画像を示す。
【００４５】
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ｐ２ＤＧポリマーを合成するための合成スキームを示す。ここで、２ＤＧは２デオキシ−Ｄ−グルコースである。
【００４６】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ｐ２ＤＧのＤＬＳ粒子サイズの研究、ブランクＰ２ＤＧミセルのＴＥＭ画像、及び、その蛍光強度の研究を示す。
【００４７】
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＰＴＸ（パネルＡ）、ＤＯＸ（パネルＢ）、ＮＬＧ９１９（パネルＣ）及びスニチニブ（ＳＵＮ；パネルＤ）をロードしたＰ２ＤＧのＤＬＣ粒子サイズの研究を示す。
【００４８】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、スニチニブ（ＳＵＮ）、ＰＴＸ及びＰＴＸ／ＳＵＮをロードしたブランクＰ２ＤＧ、及び、Ｐ２ＤＧのＴＥＭ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本デバイス、システム、方法及び組成物は、その特質及び付随する利点と共に、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて考慮することによって最もよく認識及び理解されるであろう。
【００５０】
本明細書の図面中に全体的に記載及び図示されるような実施形態の構成要素は、記載される例示的な実施形態に加えて、広く様々な異なる構成で配置及び設計されてもよいことが容易に理解されるであろう。したがって、以下に示す例示的な実施形態についてのより詳細な説明は、図面中に示されるように、実施形態の範囲を特許請求の範囲に記載されるように限定することを意図したものではなく、例示的な実施形態の単なる代表である。
【００５１】
本明細書を通じての「一実施形態」又は「実施形態」（あるいは同様のもの）に対する参照は、その実施形態に関して記載される特定の特徴、構造又は特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて「一実施形態では」又は「実施形態で」あるいは同等の語句が様々な箇所に現れたとしても、それらが必ずしも全て同じ実施形態を示すとは限らない。
【００５２】
さらに、記載された特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法にて組み合わせることができる。以下の説明では、実施形態が完全に理解されるように、多くの特定の詳細が提供される。しかしながら、当業者であれば、１つ以上の特定の詳細を用いることなく、又は他の方法、構成要素、材料等を用いて、様々な実施形態が実施可能であることを認識するであろう。他の例では、公知の構造、材料又は動作については、理解の妨げにならないように示されていないか、詳細には記載されない。
【００５３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形“a""an"及び"the"は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数に対する言及を含む。したがって、例えば、「化合物（a compound）」に対する言及には、複数のそのような化合物及びその当業者に既知の均等物等が含まれ、「該ウイルス（the virus）」に対する言及は、１つ又は複数のそのような化合物及びその当業者に既知の均等物等である。本明細書における値の範囲についての詳述は、範囲内に含まれる個々の値を個別に参照する簡略な方法として用いられることを単に意図したものである。本明細書中にて他に示されない限り、個々の値及び中間の範囲は、本明細書中で個別に記載されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に示されない限り、又は、文中において明らかに逆のことが他に示されていない限り、任意の適切な順序で実施され得る。
【００５４】
本明細書にて使用される場合、用語「ポリマー」は、複数の小分子又はモノマーからなり、これらの小分子又はモノマーが繰り返し構造によって配置されてより大きな分子を形成している化学化合物のことを称する。したがって、ポリマーは、複数の繰り返し単位（又は、モノマー単位）を有する化合物であり、用語「オリゴマー」（少数の繰り返し単位のみを有するポリマー）を含む。用語「コポリマー」は、２つ以上の異なる繰り返し単位を含むポリマー（ターポリマー（３つの異なる繰り返し単位を含む）等を含む）のことを称する。ポリマーは天然に存在してもよく、合成により形成されてもよい。用語「ポリマー」の使用には、ホモポリマー及びコポリマーが包含される。用語「コポリマー」は、本明細書では、２つ以上の異なるモノマーを有する任意のポリマーを含むものとして使用される。コポリマーには、例えば、交互共重合体、周期的共重合体、統計的共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体等が含まれ得る。ポリマーの例としては、例えば、ポリアルキレンオキシドが挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「ペンダント」は、上記のようなポリマー等の長分子の骨格に結合した基又は部分のことを称する。ペンダント基は、（１）短鎖又は低分子量基、又は（２）長鎖又はポリマーなどの高分子量基のいずれかであり得る。ペンダント基は、側基とされることもある。長鎖ペンダント基又は高分子量ペンダント基は、「ペンダント鎖」又は「側鎖」と称されることもある。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本明細書のシステム、製剤、方法及び組成物は、小分子治療薬又は薬物（例えば、化学療法薬、治療薬又は薬物）と、核酸ベースの治療薬又は薬物とを同時送達するために提供される。
【００５７】
図１及び２は、本明細書の両親媒性ポリマーを概略的に示している。該両親媒性ポリマーは、例えば、ラジカル重合を介して形成されることによって、それによって疎水性ポリマー骨格を有していてもよい。疎水性ポリマー骨格は、例えば、フリーラジカル重合によって形成されてもよく、可逆的不活性化ラジカル重合又はＲＤＲＰ（過去には制御ラジカル重合又はＣＲＰと称されていた）によって形成されてもよい。
【００５８】
可逆的不活性化ラジカル重合（ＲＤＲＰ）技法には、例えば、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）及び可逆的付加開裂移動（ＲＡＦＴ）、並びに、この２０年間で進化したその他のもの（コバルト媒介移動を含む）が含まれる。ＲＤＲＰは、事前に規定された分子量、組成、構造及び狭い／制御された分子量分布を備えたラジカル重合性／共重合性モノマーを含む、ポリマー及びコポリマーを得るための経路を提供する。ＲＤＲＰプロセスは、事前に規定された分子量、狭い／制御された分子量分布、高度なα鎖とω鎖の末端官能基化を備えた、組成的に均一で明確規定されたポリマーを提供できるため、いくつかのレビュー論文やＡＣＳシンポジウムで報告されているように、それらは多くの研究の対象となっている。例えば、Qiu, J.; Charleux, B.; Matyjaszewski, K., Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 2083; Davis, K. A.、Matyjaszewski, K. Adv. Polym. Sci. 2002, 159, 1、Matyjaszewski, K., Ed. Controlled Radical Polymerization（制御されたラジカル重合）; ACS: Washington, D. C., 1998; ACS Symposium Series 685.、Matyjaszewski, K., Ed.; Controlled/Living Radical Polymerization. Progress in ATRP, NMP, and RAFT（制御された／リビングラジカル重合。ＡＴＲＰ、ＮＭＰ及びＲＡＦＴにおける進行）; ACS: Washington, D. C., 2000; ACS Symposium Series 768、及び、Matyjaszewski, K., Davis, T. P., Eds. Handbook of Radical Polymerization（ラジカル重合ハンドブック）; Wiley: Hoboken, 200を参照。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
疎水性ポリマー骨格は、様々なラジカル重合性モノマーのラジカル重合を介して形成されてもよい。そのようなモノマーは、例えば、上記のようなペンダント基を、重合の前に含んでいてもよい。あるいは、そのようなペンダント基は、重合の後に結合してもよい。本明細書にて使用するための代表的なモノマーには、スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリル、ビニルモノマー及びそれらの誘導体が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書の疎水性ポリマーの重合度は、例えば、５００未満、２００未満又は１００未満である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、疎水性ポリマー骨格に結合し、複数（すなわち、少なくとも２つ）のヒドロキシル基（ＯＨ）を含む第１の複数のペンダント基（Ｘ）（すなわち、ポリオール）と、疎水性ポリマー骨格に結合し、少なくとも１つの親水性ポリマー（Ｐ）を含む第２の複数のペンダント基とを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数のペンダント基及び第２の複数のペンダント基のうちの少なくとも１つは、連結部を介して疎水性ポリマー骨格に結合している。連結部は、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも１つの基を含んでいてもよい。第１の複数のペンダント基は、例えば、第１の連結基（Ｌ1）を介して疎水性ポリマー骨格に結合されていてもよい。第１の連結基（Ｌ1）は、例えば、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第１の基を含んでいてもよい。第１の連結基（Ｌ1）はなくてもよく、基Ｘは、疎水性ポリマー骨格に直接結合していてもよい。第２の複数のペンダント基はまた、第２の連結基（Ｌ2）を介して疎水性ポリマー骨格に結合されていてもよい。第２の連結基（Ｌ2）はなくてもよく、親水性ポリマーが疎水性ポリマー骨格に直接結合していてもよい。第２の連結基（Ｌ2）は、例えば、独立して、π−πスタッキングを介して相互作用する少なくとも第２の基を含んでいてもよい。第１の連結基（Ｌ1）及び／又は第２の連結基（Ｌ2）は、例えば、芳香族基を含んでいてもよい。一般に、芳香族基は、同じ原子のセットを備えた他の幾何学的配置又は接続配置と比較して高い安定性を示す共鳴結合を含む環状分子である。芳香族基には、例えば、ベンジル基及びナフチル基が含まれる。本明細書のいくつかの実施形態では、本明細書の芳香族基は、ベンジル基である。
【００６１】
本明細書で使用するのに適したポリオールには、例えば、糖基、ヌクレオシド、糖アルコール、ステロール及び他の基が含まれる。いくつかの実施形態では、代表的なポリオールには、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、アスコルビン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、トリエタノールアミン、ペンタエリスリトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ドーパミン、カテキン、コール酸、グリセロール、ジグリセロール、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、フシトール、リビトール、ソルビトール、マルチトール、イソマルト、マンニトール、糖類、オリゴ糖類、多糖類、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸又はグリコサミンが含まれる。代表的な糖類には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクツロース又はラクトースが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書のポリオールヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド又はヌクレオシド類似体治療薬（例えば、ゲムシタビン、アザシチジン又はシタラビン）である。いくつかの実施形態では、ポリオールは、アスコルビン酸又は２−デオキシ−Ｄ−グルコースである。
【００６２】
親水性オリゴマー又は親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖及びポリペプチドからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。ポリアルキレンオキシドは、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。本明細書のポリエチレングリコール又は他の親水性ポリマーは、例えば、少なくとも５００Ｄａの分子量を有していてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書の他の親水性ポリマーのポリエチレングリコールは、１００Ｄａ〜５ＫＤａの範囲、又は、５００Ｄａ〜２ＫＤａの範囲の分子量を有する。
【００６３】
本明細書の第１の複数のペンダント基及び／又は第２の複数のペンダント基等のペンダント基は、例えば、不安定な部分又は結合を含む連結基を介して疎水性ポリマー骨格に結合されていてもよい。（in vivoで）不安定である基又は部分は、例えば、加水分解に不安定な基、還元感受性結合、ｐＨ感受性結合、ＲＯＳ感受性結合又は酵素／プロテアーゼ感受性結合のうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。不安定な連結基は、例えば、酸性ｐＨ条件下で不安定であってもよい。ｐＨ感受性又は酸に不安定な結合には、例えば、マレイン酸カルボキシジメチル、ヒドラジン、イミン、アセタール、オキシム、シリルエーテル、ｃｉｓ−アソニチル、ケタール、又は、別のｐＨ又は酸に不安定な結合（bond）又は結合（linkage）を含まれていてもよい。酸性条件に感受性のある不安定な結合の使用は、例えば酸性の腫瘍環境において、ペンダント基を切断するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、不安定な連結基は、ジスルフィド結合などの還元性に感受性がある。いくつかの実施形態では、加水分解に不安定な基には、エステル基、オルトエステル基、チオエーテルエステル基、無水物基、アミド基（例えば、ペプチド基）又は炭酸基が含まれる。ＲＯＳ感受性の不安定な結合又は結合には、例えば、チオケタール結合が含まれる。酵素又はプロテアーゼ感受性結合又は結合には、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９の存在に応答して不安定な配列ＣＧＬＤＤを含むプロテアーゼ切断可能ペプチドが含まれる。
【００６４】
図３Ａは、本明細書の複数のポリマーで形成されたミセル担体構造に複数の治療薬、化合物又は薬物（すなわち、第１の化合物、第２の化合物等。これらは例えば、独立して抗癌化合物、抗ウイルス化合物等であり、以下にて詳細に説明する）がロードされている、理想化された概略図を示す。本明細書で使用される場合、治療薬、化合物又は薬物は、身体に効果（例えば、薬効又は治療効果、中毒効果、性能増強効果又は別の効果）のある生物学的に活性な物質である。治療薬は、例えば、抗体、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗癌剤、免疫調節剤、化学療法剤、抗拒絶反応剤、鎮痛剤又は抗炎症剤であってもよい。本明細書における使用に適した小分子薬には、以下に限定されないが、ＪＰ４−０３９、パクリタキセル、ドセタキセル、ＦＫ５０６（タクロリムス）、シクロスポリンＡ、プロトポルフィリン、ＧＷ４０６４（３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（３’−カルボキシ−２−クロロスチルベン−４−イル）オキシメチル−５−イソプロピルイソキサゾール）、ローズベンガル、エピガロカテキンガレート、シンバスタチン、クルクミン、インドメタシン、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ １５１、Ｉ−ＢＥＴ ７６２、レシキモド、リルゾール、タモキシフェン、ＮＬＧ−９１９（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤）、スニチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、ａ ｃ Ｍｙｃ阻害剤（１００５８−Ｆ４（５−［（４−エチルフェニル）メチレン］−２−チオキソ−４−チアゾリジノン）等）、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、トロキサシタビン、カペシタビン、２'−フルオロ−２'−デオキシアデノシン、アシクロビル、テノフォビル、ラミブジン、エンテカビル、ＧＳ−４４１５２４、ＧＳ−５７３４、２’−Ｃ−メチルアデノシン、７−デアザ−２’−Ｃ−メチル−アデノシン、２’−Ｃ−メチルグアノシン、ＩＮＸ−０８１８９、２’−Ｃ−メチルシチジン、２’−Ｃ−メチルウリジン、２’−Ｃ−エチニルアデノシン、ＮＩＴＤ００８、ＮＩＴＤ４４９、ＮＩＴＤ２０３、４’−Ｃ−アジドシチジン、バラピラビル、ＲＯ−９１８７、ＢＣＸ４４３０、リバビリン、６−アザウリジン及び９−デアザアデノシンが含まれる。
【００６５】
メカニズムに限定されることなく、また図３Ａを参照すると、本明細書のポリマーの疎水性骨格を介して、内方に配向した疎水性ドメインがミセル形成中に作成されることが仮定され、この疎水性ドメインは、鎖内疎水性相互作用を介して配向することにより、折り畳み型立体配座をとっていてもよい。ペンダント芳香族基が存在する場合、該ペンダント芳香族基は、疎水性を向上させて、疎水性ドメインの形成と、疎水性ドメイン内にロードされた１つ又は複数の疎水性治療又は他の化合物とのπ−π相互作用とを促進し得る。さらに、外方に配向した親水性ドメインが親水性ポリマー側鎖によって形成されたことが仮定されている。
【００６６】
メカニズムに限定されることなく、また図３Ｂを参照すると、従来の両親媒性ポリマーによる比較的大きなミセルの形成は、マルチミセル凝集体によって説明され得る。初期段階で形成された小さなミセルは十分に安定しておらず、ミセル間相互作用を通じて迅速に凝集し、より大きなマルチミセル凝集体となる。本明細書の両親媒性ポリマーでは、界面に複数のヒドロキシル基を含むペンダント基が水性環境と水素結合を形成することによって、比較的小さなミセルを安定化させ得る。このメカニズムは、両親媒性ポリマーによって形成された小さなミセルが、高い薬物ロード容量及び優れた安定性を示す理由についても説明し得る。疎水性コア（例えば、複数のベンジル環又は他のアリール環と疎水性骨格とから形成される）は、π−πスタッキング及び疎水性相互作用を通じて、疎水性薬剤をカプセル化し得る。ミセルコアの内側に配向したいくつかのヒドロキシル基もまた、薬物と水素結合を形成することによって、薬物のロード容量及び安定性をさらに高め得ることが仮定される。
【００６７】
複数のヒドロキシル基を含む共有結合したペンダント基Ｘは、生物学的に活性な基（例えば、治療薬）であってもよい。基Ｘが生物学的に活性である場合、基Ｘは、生物学的活性を改善するために、上記のように不安定な結合を介して結合されることが望ましいことがある（すなわち、Ｌ1は不安定な結合を含んでいてもよい）。Ｘが不活性（inert）又は不活性（inactive）である場合には、基Ｘは、例えば、安定した結合（すなわち、in vivoで容易に切断可能でない又は不安定でない結合）を介して結合されていてもよい。本明細書のポリマーのペンダント基Ｘ（ポリマー全体で同じであってもよく、異なっていてもよい）は、親水性であってもよい。したがって、本明細書のポリマーから形成されたミセルは、（本明細書のポリマーによって形成されたミセルなどの構造にロードされる）疎水性と、（本明細書のポリマーに共有結合する）親水性の治療（又は他の）薬との両方を送達してもよい。このことは、本組成物より以前には非常に達成困難であった。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書のポリマーは、糖又はヌクレオシド／ヌクレオシド類似体であるポリオール基Ｘを含む。多くのヌクレオシド類似体（例えば、ゲムシタビン、アザシチジン、シタラビン）は、例えば癌の治療に使用される一般的な薬物である。しかし、それらの薬物は急速に排出され、また非特異的に分布するため、多くの場合、副作用が起こり、治療効果が低く、また耐性が生じる。ヌクレオシド類似体が本明細書の両親媒性ポリマーに共役すると、それらの治療化合物又は薬物の生物学的利用能が改善される。さらに、本明細書のこれらのヌクレオシド類似体が共役したポリマーは、様々な疎水性薬物の送達／同時送達のためのプラットフォームとして役立つことができる。いくつかの実施形態では、ポリオール基は、１０００以下の分子量を有する。
【００６９】
本明細書のポリマーから製剤化されたナノ粒子は、例えば、容易なフィルム水和法によって調製されてもよく、小さい直径／サイズ（例えば、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１０〜２０ｎｍの範囲又は１０〜３０ｎｍの範囲）、高い薬物ロード容量（例えば、パクリタキセルでは２８％）及び優れた安定性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、薬物ロード容量は、４〜３０重量％の範囲、８〜３０重量％の範囲又は８〜２０重量％の範囲である。in vivoデータは、本明細書の製剤が、遊離型薬物又は対応する遊離型薬物の組み合わせと比較して、治療効果を有意に改善したことを示している。さらに、本明細書の多くの製剤は、全体的な抗腫瘍活性に寄与する免疫刺激効果を示している。
【００７０】
上記のように、いくつかの実施形態では、Ｌ2は不安定な結合を含んでいてもよい。例えば、標的領域（例えば、腫瘍細胞）への送達後に、親水性ポリマーが骨格から切断されてミセルが分解されるようにしてもよい。それによって、ロード又はカプセル化された薬物の放出が促進される。Ｌ1及びＬ2の代表的な連結基は、例えば、図４及び５にそれぞれ示される。
【００７１】
いくつかの代表的な実施形態では、本明細書の担体及び製剤は、例えば、膵臓癌の治療に効果的である。最も治療の難しい癌の１つとして、膵臓癌は、２０３０年までに癌関連死の第２の主因になると予測されている。膵臓癌の第一選択治療のための標準的な化学療法薬は、ゲムシタビン（ＧＥＭとも称される）であり、これはＤＮＡ複製の阻害を通じて作用するシチジン類似体である。しかしながら、ゲムシタビンは、シチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）代謝によって速やかに排出されることや、血管透過性が低いことから、限られた臨床的利益しか達成されていなかった。治療成績を改善するため、前臨床及び臨床研究において、ＧＥＭを他の化学療法又は標的療法（ｎａｂ−パクリタキセル、シスプラチン、エルロチニブなど）と組み合わせることの評価が行われている。パクリタキセル（ＰＴＸ）が、腫瘍細胞に対する直接的な細胞毒性効果に加え、ＣＤＡ発現を低下させ、腫瘍におけるＧＥＭ蓄積を増加させて、ＧＥＭとの相乗的な腫瘍殺傷効果を生じさせる可能性があることを示す証拠が増えてきている。加えて、ＰＴＸ及び／又はＧＥＭによる治療は、死に瀕した腫瘍細胞から放出された抗原を提示するか、免疫抑制細胞を直接殺傷することによって抗腫瘍免疫応答を刺激することができ、このこともまた、全体的な抗腫瘍活性に寄与する。
【００７２】
しかしながら、免疫チェックポイント細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）等の、高度に免疫抑制性の膵臓腫の瘍微小環境（ＴＭＥ）（これは、腫瘍が通常の免疫監視を逃れることを助長する）における様々なネガティブフィードバック機構のために、全体的な成功は依然として不十分である。インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、膵臓癌で過剰発現しているもう１つのよく特徴付けられた免疫抑制酵素である。ＩＤＯの高い発現が膵臓癌患者のより悪い予後と相関していることを示す証拠がある。ＩＤＯは、トリプトファンのキヌレニンへの分解を通じて機能する。キヌレニンは、エフェクターＴ細胞に対して毒性があり、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の動員を誘導し、抗腫瘍免疫応答を抑制する。したがって、化学療法と組み合わせたＩＤＯ経路の阻害は、膵臓癌の治療のための魅力的な戦略を表している。ＮＬＧ９１９は、ＥＣ50の低い強力なＩＤＯ１阻害剤である。ＥＣ50は、指定された曝露時間後にベースライン応答と最大応答との中間の応答を誘発する濃度であり、薬物の効力の尺度として一般的に使用される。溶解性が低く、経口での生物学的利用能が制限されており、化学療法剤とは異なる物理的特性があるため、ＮＬＧ９１９と化学療法剤を腫瘍に同時送達することは困難である。
【００７３】
ＮＬＧ９１９プロドラッグ（ＰＥＧ２Ｋ−Ｆｍｏｃ−ＮＬＧのミセル系）は、併用療法用にＰＴＸをカプセル化するための二重機能性担体として開発された。例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２１４５６３号を参照のこと。ＰＴＸは、ＮＬＧ９１９と相乗作用して、腫瘍細胞を直接殺傷すると同時に乳房腫瘍モデルの抗腫瘍免疫応答を増強することにより腫瘍成長を阻害することがわかっている。この系は、非水溶性の疎水性薬物の同時送達に適している。しかしながら、ＰＴＸ等の疎水性薬物とＧＥＭ等の水溶性薬物とを同時送達することには、さらに困難が伴う。さらに、上記のように、従来の多くのミセル系は比較的大きな流体力学的サイズを有し、このサイズによって、血管新生が不十分で膵臓腫瘍等の間質が豊富な腫瘍への浸透が妨げられる可能性がある。
【００７４】
多くの腫瘍血管は、正常な血管と比べて大きな孔径により漏出し易く、このためにナノサイズ範囲（４〜２００ｎｍ）の粒子が腫瘍組織に選択的に蓄積されることが十分に確証されている。しかしながら、腫瘍血管系のカットオフ孔径は、腫瘍の種類によって大きく異なる。膵臓癌は、血管新生が他の種類の癌と比べて遥かに小さい孔径（〜５０〜６０ｎｍ）で不十分であることが知られている。さらに、膵臓癌は、大きなサイズのナノ粒子の浸透をさらに制限する高密度の間質を有している。従来の研究では、５０ｎｍより小さなナノ粒子のみが、透過性の乏しい膵臓腫瘍に浸透できることがわかっている。また、小さなサイズ（〜１０ｎｍ）のナノ粒子は、他の腫瘍モデルの大きなナノ粒子と比較して優れた腫瘍浸透を示したことが報告されている。しかしながら、小さなサイズのナノ粒子は、多くの場合、大きなナノ粒子と比較して薬物のロード容量及び効率が低いことから、薬物のロードに制限がある。深い腫瘍浸透が可能でありながら膵臓癌の免疫化学療法のための様々な薬剤（ＧＥＭ／ＰＴＸ、ＮＬＧ等）の同時送達に非常に効果的である小型ナノキャリアの開発は、依然として課題とされている。
【００７５】
繰り返しになるが、膵臓癌の生物学的複雑性、及び、免疫抑制性の高いＴＭＥといった理由により、免疫療法剤と化学療法剤との新しい組み合わせ、及び、膵臓癌免疫化学療法の関連製剤の開発が切実に必要とされている。遊離型薬剤の組み合わせと比較して、単一のナノ担体内で組み合わせられた薬剤を設計することによって、薬物動態及び生体内分布プロファイルを改善し、副作用を低減し、複数の薬剤を最適な投与量で腫瘍部位へと同時に送達させられるため、相乗的な治療効果が改善される。
【００７６】
本明細書の代表的な実施形態では、酸化還元応答性ゲムシタビン（ＧＥＭ）結合ポリマーＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭ（ＰＧＥＭ）から組み立てられた「超小型」ナノ担体は、例えば、ＩＤＯ阻害剤ＮＬＧ９１９と化学療法薬のＰＴＸ及びＧＥＭとを、例えば、免疫化学療法のための膵臓腫瘍内に同時送達することが説明される。ＧＥＭ共役ポリマー（ＰＧＥＭ）ナノ担体は、多種多様な疎水性薬物を、高いロード容量及び優れた安定性をもって同時にロード可能であった。ＰＧＥＭナノ担体は、腫瘍コアに効率的に浸透でき、腫瘍の成長を阻害可能であった。ＰＴＸをＰＧＥＭ担体に組み込むと、ＣＤＡ発現を下方制御して、同時送達されたＧＥＭと相乗的に腫瘍増殖を阻害することが示された。ＮＬＧを担体に組み込むと、ＩＦＮ−γ+ＣＤ４+及びＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞が増加すると共にＴｒｅｇ細胞が減少した、より免疫活性の高い腫瘍微小環境が誘導され、それによって治療効果が向上した。ナノ担体を通じたＧＥＭ／ＰＴＸ／ＮＬＧの同時送達は、９０．４％もの高い腫瘍阻害率で治療効果をさらに向上させた。このことは、膵臓癌免疫化学療法の効果的な併用療法としての大きな可能性を示している。
【００７７】
繰り返しになるが、注射可能な担体の粒子サイズは、細胞の取り込み、生体内分布及び腫瘍浸透に重要な役割を果たすため、考慮すべき非常に重要な物理化学的パラメータである。また、上記のように、直径範囲が４〜２００ｎｍのナノ粒子は、循環時間が長く、増強された透過性及び保持（ＥＰＲ）効果の結果として、腫瘍内に効率的に蓄積可能であることが報告されている。４ｎｍ未満のナノ粒子は、腎臓から急速に排泄されるが、２００ｎｍを超えるナノ粒子は、細網内皮系（ＲＥＳ）に取り込まれる傾向がある。さらに、蓄積された証拠は、小さなサイズ（１０〜３０ｎｍ）のナノ医療が、特に膵臓癌に対して、優れた腫瘍浸透及び増強された抗腫瘍活性を示すことを示している。本明細書の代表的なＰＧＥＭ担体は、ＲＥＳの取り込み及び腎排泄を避けるために望ましい粒子サイズ（約１３ｎｍ）を示し、これはまた、膵臓腫瘍組織（＜５０ｎｍ）における蓄積及び浸透に有益である。
【００７８】
さらに、本明細書の代表的なＰＧＥＭ担体は、薬物ロードにおける超小型ポリマー担体の限界を克服する。一般に、高分子ミセルのサイズを小さくすることは、親水性／疎水性ブロックの比を増加させることによって達成可能であると考えられている。しかしながら、このような高い比率では、「小さな」コアを持つ厚いシェルが生成されるため、カプセル化能力が低くなり、薬物をロードしたミセルの安定性が低下する。驚くべきことに、本明細書の代表的なＰＧＥＭ担体は、クルクミン、ＮＬＧ９１９、ドキソルビシン、ダサチニブ及びｃ−Ｍｙｃ阻害剤１００５８−Ｆ４等の多種多様な疎水性薬剤を、優れた安定性及び高いロード容量でロード可能であった。ＰＴＸをロードした場合、２４．２重量％の容量が達成された。さらに、本明細書のＰＧＥＭ担体は、親水性ＧＥＭ及び疎水性ＰＴＸ／ＮＬＧ等の種々異なる特性を有する複数の薬物の高い同時ロードを可能にする。親水性ＧＥＭ分子のＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーへの共役は、粒子サイズを大幅に減少させたが（約１６０ｎｍから約１３ｎｍ）、ロード容量及び製剤安定性が改善された。
【００７９】
繰り返しになるが、ＣＤＡは膵臓腫瘍内において過剰発現しており、これは、ＧＥＭ耐性において重要な役割を果たしている。投与されたＧＥＭの約８０％は、細胞外及び細胞内のＣＤＡによって不活性型の２’，２’−ジフルオロデオキシウリジン（ｄＦｄＵ）へと代謝され、これは、ＧＥＭの治療効果を大きく制限する。ＰＴＸは、おそらくＰＴＸ誘導ＲＯＳによって媒介されて、ＲＮＡレベルの代わりにＣＤＡタンパク質レベルを低下させることが可能であり、このＣＤＡ発現の低下によって、腫瘍における活性ＧＥＭ形態の蓄積がより高くなったことが示された。これらの研究と一致して、本発明者らのデータは、ＰＴＸがＰＡＮＣ０２細胞を殺傷する際にＧＥＭと相乗作用すること、及び、ＰＴＸがＰＧＥＭ担体内に取り込まれると、ＣＤＡ発現が有意な下方制御されることを示した。このことは、in vitro及びin vivoでのＰＧＥＭと比較して向上したＰＴＸ／ＰＧＥＭの抗腫瘍効果に貢献した。
【００８０】
一方、膵臓ＴＭＥでは、ＴＧＦ−β、ガレクチン−１及びＩＤＯ等の様々な免疫抑制メカニズム及び分子が同定されており、これによって、膵臓癌の免疫化学療法の新たな窓が開かれている。その中で、ＩＤＯは魅力的な免疫療法の標的であって、膵臓癌では過剰発現しているが、健康な膵臓組織では発現していない。高度なＰＤＡＣのためのｎａｂ−ＰＴＸ及びＧＥＭを含む化学療法剤と併用したＩＤＯ阻害剤インドキシモドは、第Ｉｂ相試験に移行している。ＮＬＧ９１９は、明確なメカニズム及び低いＥＣ50を備えた、もう１つの強力なＩＤＯ阻害剤である。ＰＧＥＭ担体内において製剤化されたＮＬＧ９１９は、ＩＤＯ活性を阻害する生物学的効果を維持し、ＰＴＸ及びＮＬＧの同時送達は、ＮＬＧのＩＤＯ阻害効果に影響を与えなかった。免疫学的分析は、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ処理が、ＰＧＥＭと比較してＣＤ４+／ＣＤ８+Ｔ細胞及びＩＦＮ−γ陽性ＣＤ４+／ＣＤ８+Ｔ細胞の増加を伴う、より免疫活性の高いＴＭＥを生成することを示した。ＮＬＧを組み込んでもＰＧＥＭの細胞毒性は改善されなかったため、ＰＧＥＭに対するＮＬＧ／ＰＧＥＭの治療効果の改善は、主に抗腫瘍免疫応答の強化に起因している。ＰＧＥＭ自体も、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞が少なくＩＦＮ−γの産生が多いことによって、抗腫瘍免疫応答を高める可能性があり、このことは、ＰＧＥＭが免疫刺激性担体であることを示している。ＧＥＭは、投与量に応じて、Ｔｒｅｇ細胞を抑制することが報告されている。ＰＴＸ／ＰＧＥＭは、タキソール＋ＧＥＭの組み合わせと比較して、免疫系の活性化においてより優れた効果を示し、このことは、例えば、本明細書の担体を介して、ＰＴＸ及びＧＥＭの腫瘍への送達がより効果的になされた結果であり得る。ＮＬＧ／ＰＧＥＭと比較して、ＰＧＥＭを介してＰＴＸ及びＮＬＧを同時送達した場合には、免疫腫瘍の微小環境に大きな変化は生じなかったが、最高の治療効力が得られた。このことは、ＰＴＸ／ＮＬＧの組み合わせが望ましいことを示唆している。
【００８１】
図３Ａは、本明細書の代表的なＰＧＥＭ担体の作用について提案されたメカニズムを概略的に示す。ＰＴＸ及びＮＬＧを同時にロードしたＰＧＥＭミセルは、粒子サイズが小さいため、腫瘍組織に効率的に浸透する。ＰＧＥＭは、腫瘍殺傷効果、及び、免疫刺激効果自体を示した。ＰＴＸ及びＮＬＧは、細胞内ＧＳＨに応答して、ＰＧＥＭ担体から容易に放出された。放出されたＰＴＸは、ＣＤＡの発現を低下させ、腫瘍を殺傷する際にＧＥＭとの相乗作用を発揮し得た。放出されたＮＬＧ９１９は、さらにＩＤＯ１機能を逆転させ、腫瘍に対するＴ細胞応答を増加させる。
【００８２】
代表的な研究では、以下でさらに説明するように、本明細書のＰＧＥＭ担体によって提供されるＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭレジメンが、ＰＡＮＣ０２細胞株モデルにおける膵臓癌の治療に非常に有効であることが示されている。ＰＡＮＣ０２は、ほとんど全ての公知の臨床化学療法剤に対して高い耐性を持つユニークな腫瘍モデルであり、ヒト膵臓癌の近似した模擬体（close mimic）として使用され得る。
【００８３】
図６に示すように、塩化ビニルベンジルと４，４’−ジチオジ酪酸との反応によって、ジスルフィド結合を備えたビニルベンジルモノマー（ＶＤモノマー）を合成した。次に、ＶＤモノマーとＯＥＧ９５０モノマーのＲＡＦＴ共重合によって、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーを合成した。このＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー骨格に（例えば、化学技術において知られるＥＤＣ／ＨＯＢｔカップリング反応を使用して）ＧＥＭを結合させることにより、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーを得た。
【００８４】
ＶＤモノマー、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤ及びＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーの構造を、1ＨＮＭＲによって特性評価した。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーの場合、ＯＥＧ９５０モノマーの平均重合度（ＤＰ）は、重合終了時のＯＥＧ９５０モノマーの転換率に基づいて、９と計算された。ＶＤモノマーのＤＰは、ＩcとＩdとの強度を比較することによって、２３と決定された。ＧＥＭをＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーに共役させた後に、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいてＧＥＭに対応するプロトンピークが観察され、ポリマー分子あたりのＧＥＭユニットの数が、ＩcとＩdとの強度を比較することによって、８と決定された。ＧＥＭのロード容量は、アルカリ加水分解法によるＨＰＬＣ−ＵＶ分析によっても決定された。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマー担体へのゲムシタビンロードは、８．９％ｗ／ｗと決定された。
【００８５】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤ及びＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーの分子量及び分布もまた、ＧＰＣによって決定された。ＧＰＣによって決定された数平均分子量Ｍnはそれぞれ、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤでは１１６００、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭでは９２００であった。いずれのポリマーも、１．１２の低い多分散性を示した。なお、ＧＰＣによって決定されたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭのＭnは、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー骨格へのＧＥＭ結合後に減少したことに留意されたい。ＧＰＣがモル質量ではなく流体力学的サイズによってポリマーを分離することは、よく知られている。したがって、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭの測定されたポリスチレン相対分子量の減少は、ＧＥＭ結合後のＴＨＦ中のポリマー鎖の圧密化（compaction）を示していた。ＧＰＣ及びＮＭＲの結果は、定義された制御可能な構造を備えたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭ（ＰＧＥＭ）コポリマーの合成が成功したことを示している。
【００８６】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤ及びＰＧＥＭポリマーはいずれも、水溶液中で単純膜水和法によってナノ粒子を形成することができた。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤミセルは、１６１ｎｍの直径を示した。ＧＥＭ結合後、ＰＧＥＭポリマーは、直径が１３．１ｎｍに減少した小さなナノ粒子を形成した。このことは、ＧＥＭ構造が小さなサイズのナノ粒子の形成に重要な役割を果たしたことを示している。
【００８７】
ＰＧＥＭナノ粒子のＴＥＭ画像は、平均直径が１２．５±２．０ｎｍの球状の形態を示し、この値はＤＬＳ測定と一致している。ＰＧＥＭの臨界ミセル濃度は、プローブとしてナイルレッドを使用する蛍光分光法によって評価された。ＰＧＥＭミセルの臨界ミセル濃度値（ＣＭＣ；この値を超えるとミセルが形成される濃度）は、０．００７２ｍｇ／ｍＬであり、血液循環内で希釈された後に、良好なコロイド安定性が得られた。
【００８８】
ＰＴＸをロードしたミセルは、種々異なる担体／薬物の質量比の膜水和法によって調製した。表１に示すように、担体／ＰＴＸの質量比を小さくするとＰＴＸのロード容量が増加し、２４．２％という驚くほど高いロード容量が達成された。全ての製剤は非常に小さい粒子サイズを示し、これは、例えば、膵臓の腫瘍組織に浸透することに適している。サイズの変化を測定することによって、室温での製剤安定性もまた評価した。約５％のＰＴＸロード容量で、製剤は２０日以上安定であることができて、沈殿物が観測されることもなかった。さらに、ミセル溶液は、凍結乾燥を繰り返した後も安定していた。
【表１】
2022502531.tif 000003
【００８９】
ＰＴＸに加えて、ＰＧＥＭ担体は、クルクミン、ＮＬＧ９１９、ドキソルビシン、ダサチニブ、ｃ−Ｍｙｃ阻害剤１００５８−Ｆ４（以下の表２を参照）等の他の様々な薬剤（それらのいくつかは、製剤化が困難な化合物である）をロードすることができた。これらのミセル製剤は全て、超小型で、薬物ロード容量が高く、優れた安定性を示した。さらに、ＰＧＥＭ担体は、ＰＴＸやＮＬＧ９１９等の２つの異なる薬剤を同時にカプセル化し得た。ＰＴＸをロードしたミセル、ＮＬＧをロードしたミセル又はＰＴＸ／ＮＬＧを同時にロードしたミセルのサイズ分布及び形態は、ＤＬＳ及びＴＥＭによって特性評価した（図７を参照）。これらの製剤の全てが、約１５ｎｍの均一な粒子サイズの球状の形態を示した。
【表２】
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【００９０】
ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルのＰＴＸ及びＮＬＧ放出プロファイルは、透析法で評価された。図８Ａに示すように、タキソールはＰＴＸのより速い放出を示し、ＰＴＸのほぼ７５％が７２時間以内に放出された。比較すると、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルはＰＴＸのより好ましい放出動態を示し、ＰＴＸの３５％のみが７２時間以内にゆっくりと放出された。１０ｍＭ ＧＳＨの存在下では、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルからのＰＴＸ放出が促進され、ＰＴＸの４７％が７２時間で放出された。１０ｍＭ ＧＳＨがある場合とない場合とにおける、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルのＮＬＧ放出プロファイルを図８Ｂに示す。ＮＬＧの約７２％が７２時間でＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルから放出されたのに対し、１０ｍＭ ＧＳＨがある場合には、ＮＬＧの８４％が放出された。これらの結果は、腫瘍細胞における高度な酸化還元環境が、細胞内ＧＳＨによるジスルフィド結合の切断の結果として、担体からのＰＴＸ及びＮＬＧの放出を促進し得ることを示している。
【００９１】
遊離型ＧＥＭとＰＴＸとの併用効果を、２つの膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ０２及びＨ７にて研究した。単一の薬物と比較して、ＰＴＸとＧＥＭとの組み合わせは、腫瘍細胞の殺傷効果を大幅に改善した。ＰＡＮＣ０２細胞とＨ７細胞との併用係数（ＣＩ）は、それぞれ０．５及び０．６と計算された。このことは、両方の細胞においてＰＴＸとＧＥＭとの相乗効果（ＣＩ＜１）を示唆している。
【００９２】
ＰＧＥＭプロドラッグミセルの細胞毒性は、ＰＡＮＣ０２細胞において調査した。図９Ａより、遊離型ＧＥＭ及びＰＧＥＭの両方が、濃度依存的な細胞殺傷効果を示したことが見られる。ＰＧＥＭプロドラッグミセルのＩＣ50は、ＰＡＮＣ０２細胞の遊離型ＧＥＭのＩＣ50よりも高かった。このことは、短期間の処理時間内における細胞内のＰＧＥＭポリマーからＧＥＭの切断が不完全だった結果である可能性がある。最大阻害濃度の半分、すなわちＩＣ50は、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する物質の有効性の尺度である。様々なナノ製剤の細胞毒性もまた、ＰＡＮＣ０２細胞で評価した（図９Ｂ参照）。ＮＬＧをロードしたミセルは、ＰＧＥＭ担体と比較して同様の細胞毒性を示した。ＰＴＸをロードしたミセル及びＰＴＸ／ＮＬＧを同時ロードしたミセルは、遊離型のＰＴＸ、ＰＧＥＭ及びＮＬＧをロードしたミセルと比較して優れた細胞毒性を示した。Ｈ７細胞の様々な製剤についても同様の傾向が見られ、ＮＬＧを組み込んでもＰＧＥＭの細胞殺傷効果は変化しなかったが、製剤にＰＴＸを組み込むと細胞殺傷効果が向上したことが示された。
【００９３】
上記のように、ＣＤＡは膵臓癌において過剰発現し、シチジン類似体薬物（例えば、ゲムシタビン（ＧＥＭ）等）の代謝を媒介して、これらの薬物による治療に対する耐性を生じさせる。したがって、ＣＤＡの発現を低減すれば、膵臓癌の新しい治療域が開かれる。様々な製剤で処理されたＰＡＮＣ０２細胞におけるＣＤＡ発現は、ウエスタンブロットにより調査した。対照群と比較して、ＣＤＡ発現は遊離型ＧＥＭ及びＰＧＥＭによっては変化しなかったが、ＰＴＸ／ＰＧＥＭ製剤又はＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭ製剤による治療後には、ＣＤＡ発現が有意に下方制御された。さらに、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ製剤はまた、ＣＤＡタンパク質レベルをもある程度減少させた。
【００９４】
製剤ＮＬＧ／ＰＧＥＭ及びＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭのＩＤＯ阻害活性は、ＰＡＮＣ０２細胞において、比色アッセイによってキヌレニン（Ｋｙｎ）のレベルの低下を検出することにより調査した。図１０は、様々なＮＬＧ濃度の遊離型ＮＬＧ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ及びＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭにより処理した後の、ＰＡＮＣ０２細胞のＫｙｎ阻害率を示す。全ての組成物は、ＮＬＧ濃度に依存してＩＤＯ機能を阻害した。ＮＬＧ／ＰＧＥＭ及びＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭ製剤は、遊離型ＮＬＧ９１９と比較して同様のＩＤＯ阻害効果を示した。
【００９５】
ＰＧＥＭミセルのin vivo生体内分布は、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤナノ粒子を対照群（〜１６０ｎｍ）として使用したＰＡＮＣ０２モデルでの近赤外蛍光光学イメージングにより調査した。組織をイメージングするために、透過性の高い疎水性蛍光色素ＤｉＲをミセル内にロードした。ＤｉＲシグナルは、時間の経過と共に腫瘍領域で増加し、両方のミセルの治療から２４時間後に最も強くなった。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤと比較して、ＰＧＥＭミセルは、肝臓、脾臓、腎臓による取り込みが少ないことを示した。
【００９６】
小さなサイズのナノ粒子は、腫瘍への浸透が深いことが報告されている。したがって、本明細書の超小型ＰＧＥＭ担体の腫瘍浸透能力は、蛍光イメージングにより、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー骨格（約１６０ｎｍ）によって自己組織化されたより大きなナノ粒子と比較して決定した。ローダミン及びフルオレセインを、それぞれ、ＰＧＥＭ担体及びＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤ担体に蛍光プローブとしてロードした。個体差を最小限にするために、２種類の色素をロードしたナノ粒子を同じ量で混合し、同一のマウスにて静脈内に同時注射した。フルオレセイン／ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤナノ粒子からの緑色蛍光シグナルは、腫瘍コアで弱くなっていったが、ローダミン／ＰＧＥＭナノ粒子からの強い赤色蛍光シグナルは、依然として明確に観察された。これにより、ＰＧＥＭ担体のより深い浸透能力が示された。異なる強度の蛍光が結果に干渉する可能性を排除するために、蛍光プローブを交換し、ＰＧＥＭ担体を使用してフルオレセインをロードして、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤを使用することによりローダミンをロードした。同様に、フルオレセインをロードしたＰＧＥＭは、ローダミンをロードしたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤよりも、高い腫瘍取り込み及び深い腫瘍拡散を示した。
【００９７】
膵臓癌における免疫療法と化学療法との併用効果をさらに研究するために、ＰＡＮＣ０２腫瘍を伴う免疫担当マウスモデルを使用した。ＰＡＮＣ０２細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。１２日後、担腫瘍マウスに、生理食塩水、ＰＧＥＭ担体、ＰＴＸ／ＰＧＥＭ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ、ＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセル、及び、遊離型ＧＥＭと組み合わせたタキソールを、静脈内（ＩＶ）注射した（図１１、パネルＡ参照）。
【００９８】
ＰＧＥＭプロドラッグミセルは、タキソールと遊離型ＧＥＭとを組み合わせた群と同様の抗腫瘍活性を示した（図１１、パネルＢ参照）。ＰＴＸ／ＰＧＥＭミセルは、ＰＧＥＭ担体よりもはるかに高い抗腫瘍活性を示し、これは、in vitro ＭＴＴ細胞毒性の結果と一致していた（図９Ａ及び９Ｂ参照）。ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルは、ＰＴＸ／ＰＧＥＭミセルと比較してさらに高い抗腫瘍活性を示し、これは、ＩＤＯ阻害剤ＮＬＧ９１９をＰＧＥＭ担体に導入すると、抗腫瘍免疫応答が改善される可能性があることを示している。このことは、膵臓癌治療にとって非常に重要である。全ての製剤の中で、ＰＴＸ／ＮＬＧをロードしたミセルが最も高い抗腫瘍活性を示した。マウスの体重も監視したが、様々な製剤で治療されたマウスは体重に有意な変化を示さなかった。マウスを屠殺した後に、腫瘍重量を測定した（図１１、パネルＣ参照）。ＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルにより処理されたマウスは、最低の腫瘍重量と最高の腫瘍阻害率（９０．４％）とを示し、これによって、他の製剤よりも治療効果が向上していることがさらに確認された。
【００９９】
図１１、パネルＤは、様々な治療の後に摘出された腫瘍の写真を示す。ＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルにより治療されたマウスは、最小サイズの腫瘍を示していた。様々な治療の後の腫瘍切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色画像（図示しない）では、生理食塩水治療では腫瘍細胞内に大きな核が観察され、他の治療では腫瘍組織内に縮んだ核が観察された。それらの中で、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭで治療されたマウスは、最も広い腫瘍細胞の壊死範囲を示していた。
【０１００】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを含む生化学的パラメータを、肝機能及び腎機能の指標として評価した。ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭ製剤で治療した後のマウスは、これらのパラメータについて正常レベルを示し、このことは、ＰＴＸ＋ＮＬＧ／ＰＧＥＭミセルで治療した後における肝機能及び腎機能への明らかな損傷がなかったことを示唆している。
【０１０１】
様々な治療の後のＰＡＮＣ０２腫瘍微小環境の変化を、腫瘍内の免疫細胞集団のフローサイトメトリー分析によって調査した。対照群と比較して、様々な治療後の腫瘍における総ＣＤ４+Ｔ細胞の数の有意な変化は観察されなかった。ＰＧＥＭ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ又はＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭによる治療の後、腫瘍内のＣＤ８+Ｔ細胞の相対数は有意に増加した。これらの群の中で、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ治療群における腫瘍は、ＣＤ８+Ｔ細胞の相対数が最も多かった。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫抑制性微小環境に寄与するＴ細胞のサブタイプである。全ての治療は、タキソールと遊離型ＧＥＭとの組み合わせを除き、腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の数を大幅に減少させることができた（図１２Ａ参照）。ＩＦＮ−γは、Ｔ細胞によって産生される強力な分子であり、固形腫瘍の除去に重要な役割を果たす［３７］。腫瘍におけるＩＦＮ−γ+ＣＤ４+Ｔ細胞（図１２Ｂ参照）及びＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞（図１２Ｃ参照）の相対数は、ＰＧＥＭ、ＰＴＸ／ＰＧＥＭ、ＮＬＧ／ＰＧＥＭ又はＰＴＸ／ＮＬＧ／ＰＧＥＭによる治療の後に、有意に増加することがわかった。ＰＴＸ／ＰＧＥＭ群は、タキソールと遊離型ＧＥＭとの併用群と比較して、ＩＦＮ−γ+ＣＤ４+及びＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の相対数が多く、Ｔｒｅｇ細胞の数が少ないことを示した。加えて、ＰＧＥＭと比較して、製剤にＮＬＧを組み込むと、ＩＦＮ−γ+ＣＤ４+及びＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の数がさらに増加した。全体として、本発明者らの製剤は、より免疫活性の高い腫瘍微小環境を誘発し、抗腫瘍免疫応答の増強を起こすことができた。
【０１０２】
本書の担体プラットフォームは、ＧＥＭ固有の又は限定されたシステムではない。本明細書の担体は、例えば、ＧＥＭの多くの構造類似体や、他の親水性化合物／薬物により形成されてもよい。したがって、本明細書の担体システム戦略は、様々な併用療法のための複数の別個の親水性薬剤及び疎水性薬剤の同時送達に拡張され得る。
【０１０３】
本明細書の他の実施形態は、図１３〜１６Ｂに記載され、特性評価されている。図１３は、アザシチジン共役ポリマー（ＰＡｚａ）の合成スキームを示す。ＰＡｚａポリマーは、例えば化学技術において知られるＥＤＣ／ＨＯＢｔカップリング反応を使用して、アザシチジンをＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー骨格に共役させることによって得られた。図１４Ａは、ブランクＰＡｚａミセルのＤＬＳ粒子サイズの研究及びＴＥＭ画像を示す。ブランクＰＡｚａミセルは、約１３ｎｍの粒子サイズ及び球状の形態を示している。図１４Ｂは、ＤＬＳ粒子サイズの研究及びＤＯＸをロードしたＰＡｚａミセルのＴＥＭ画像を示す。ＤＯＸをロードしたＰＡｚａミセルもまた、やや大きい１６ｎｍのサイズの球状の形態を示している。
【０１０４】
図１５Ａは、２ＤＧ共役ポリマー（Ｐ２ＤＧ）を合成するための合成スキームを示す。ここで、２ＤＧは２デオキシ−Ｄ−グルコースである。Ｐ２ＤＧポリマーは、例えば化学技術において知られるＥＤＣ／ＨＯＢｔカップリング反応を使用して、２ＤＧをＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー骨格に共役させることによって得られた。図１５Ｂは、ＤＬＳ粒子サイズの研究、ブランクＰ２ＤＧミセルのＴＥＭ画像、及び、その蛍光強度の研究を示す。ＤＬＳ粒子は、約１１．４８ｎｍの粒子サイズ及び球状の形態を示していた。加えてＤＬＳ粒子は、低い臨界ミセル濃度（ＣＭＣ、２２．６ｍｇ／Ｌ）による良好な安定性を示していた。図１６Ａは、ＰＴＸ（パネルＡ）、ＤＯＸ（パネルＢ）、ＮＬＧ９１９（パネルＣ）及びスニチニブ（パネルＤ）をロードしたＰ２ＤＧのＤＬＣ粒子サイズの研究を示す。これらのナノ粒子の全てが、小さなサイズであった。図１６Ｂは、スニチニブ（ＳＵＮ）、ＰＴＸ及びＰＴＸ／ＳＵＮの組み合わせをロードしたブランクＰ２ＤＧ、及び、Ｐ２ＤＧのＴＥＭ画像を示す。これらのナノ粒子の全てが、球状の形態を示していた。これらの結果は、Ｐ２ＤＧポリマーが抗癌剤及び／又は抗ウイルス剤等の様々な生物活性剤をロード可能であったことを示している。
【０１０５】
実験例
【０１０６】
材料
塩化ビニルベンジル、４，４’−ジチオジ酪酸、オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート（ＯＥＧ９５０モノマー、平均Ｍn＝９５０）、４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸、２，２−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、全てSigma-Aldrich社（米国ミズーリ州）から購入した。ＡＩＢＮは、無水エタノール中での再結晶により精製した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）は、GL Biochem社（中国上海市）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Acros Organics社から購入した。パクリタキセルは、AK Scientific社（米国カリフォルニア州）から購入した。ドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ・ＨＣｌ）及びゲムシタビン（ＧＥＭ）は、LC Laboratories社（米国マサチューセッツ州）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液は、Invitrogen社（米国ニューヨーク州）から購入した。
【０１０７】
特性評価
モノマー及びポリマーの構造は、Varian 400 FT-NMR分光計（４００．０ＭＨｚ）における1Ｈ ＮＭＲスペクトルによって特性評価した。ポリマーの分子量（Ｍn及びＭw）及び多分散度指数（Ｍw／Ｍn）は、Waters 2414屈折率検出器によるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定した。較正曲線のために、一連の市販のポリスチレン標準を使用した。ミセルの平均粒子サイズ、サイズ分布及び形態は、動的光散乱（ＤＬＳ、Malvern社製Zeta Sizer）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって測定した。
【０１０８】
ＶＤモノマーの合成
塩化ビニルベンジル（３０５．２ｍｇ、２ｍＭ）、４，４’−ジチオジ酪酸（２．３８ｇ、１０ｍＭ）及びＫ2ＣＯ3（０．６９ｇ、５ｍＭ）を１０ｍＬ ＤＭＦに溶解し、５０℃で撹拌しつつ反応させた。１６時間後、混合物を室温まで冷却し、続いて８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2を添加した。混合物を４５００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上清を水で３回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させた。溶出液として酢酸エチル／石油エーテル（ｖ／ｖ、１／２〜１／１）を用いたカラムクロマトグラフィー精製により、ＶＤモノマーを得た。
【０１０９】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーの合成
４−シアノ−４−（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸（６ｍｇ、０．０２１５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（２ｍｇ、０．０１２４ｍｍｏｌ）、ＶＤモノマー（３００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、ＯＥＧ９５０モノマー（４００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及び乾燥したテトラヒドロフラン２ｍＬを、シュレンク管内に添加した。３回の凍結脱気（free-pump-thawing）サイクルにより脱酸素した後、混合物をＮ2保護下にて８０℃で１８時間撹拌した。次に、反応を液体窒素によりクエンチし、エーテル中で３回沈殿させることにより、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマーを得た。転換率(OEG950モノマー)＝４５．９％；転換率(VDモノマー)＝５０．０％。
【０１１０】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーの合成
合成されたままの状態である（as-synthesized）ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤポリマー（１２０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ−ＣＯＯＨ）、ＧＥＭ（１７９ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２７０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４５０ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を、３００μＬのＤＩＰＥＡを添加した３０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。３７℃で７２時間撹拌した後、混合物をＤＭＳＯ及び水に対して２〜３日間透析した。凍結乾燥させた後に、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーを得た。
【０１１１】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーのＧＥＭロード量の決定
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーのＧＥＭロード量は、１Ｎ ＮａＯＨを用いたアルカリ加水分解法により定量化した［３２，３３］。ポリマー中のＧＥＭの量は、移動相としてメタノール／水（０４：９６ｖ／ｖ）を使用して、ＵＶ検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。
【０１１２】
薬物をロードしたミセルの調製及び特性評価
ブランク及び薬物をロードしたミセルは、フィルム水和法によって調製した。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭポリマーと、抗癌剤（例えば、ＰＴＸ、ＮＬＧ９１９、ＤＯＸ、ダサチニブ、１００５８−Ｆ４）とを、種々異なる担体／薬剤比のジクロロメタン／メタノール中で混合した。有機溶媒を完全に除去した後に、薄膜が形成された。その後、薄膜をＰＢＳ溶液により水和して、ＰＴＸをロードしたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセルを得た。同様の方法で、ＰＴＸとＮＬＧとを同時にロードしたミセルを調製した。
【０１１３】
薬物ロード容量（ＤＬＣ）及び薬物ロード効率（ＤＬＥ）は、ＨＰＬＣによって決定され、次の式に従って計算された。
【０１１４】
ＤＬＣ（％）［ロードされた薬物の重量／（ポリマーの重量＋使用された薬物）］×１００
【０１１５】
ＤＬＥ（％）＝（ロードされた薬物の重量／入力された薬剤の重量）×１００
【０１１６】
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセルの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセルのＣＭＣ値は、蛍光プローブとしてナイルレッドを使用して測定した［５９］。ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセル（１ｍｇ／ｍＬ）は、フィルム水和法によって調製し、種々異なる濃度に希釈した後、ナイルレッドを含む各バイアルに添加した。一晩インキュベーションした後、溶液の蛍光強度を蛍光分光計によって測定した。
【０１１７】
In vitroＰＴＸ及びＮＬＧ放出
ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセルからのＰＴＸ及びＮＬＧの放出は、透析法により３７℃で調査した。ＰＴＸ／ＮＬＧを同時にロードしたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセルを、３５００ＤａのＭＷＣＯを備えた透析バッグに移して、０．５％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ８０を含む５０ｍＬ ＰＢＳ中にて、穏やかに振とうしつつインキュベートした。特定の時間間隔で、透析バッグ内のＰＴＸ及びＮＬＧ濃度を、ＨＰＬＣによって測定した。
【０１１８】
ＭＴＴアッセイ
ＰＴＸ及びＧＥＭの併用効果、及び、ブランクミセル及び薬物をロードしたミセルの細胞毒性は、マウス膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ０２及びＨ７細胞を使用したＭＴＴアッセイによって調査した。細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳを含む１００μＬのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２４時間インキュベートした。様々な濃度の遊離型ＰＴＸ、ＧＥＭ又はミセル溶液により、細胞を９６時間処理した。次に、２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、細胞をさらに４時間インキュベートした。培地を除去した後、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、それによってＭＴＴホルマザン結晶を溶解した。光学密度をマイクロプレートリーダーを使用して測定し、未処理の細胞を対照群として、細胞生存率を計算した。
【０１１９】
in vitroＩＤＯ阻害。
ＩＤＯアッセイは、薬物をロードしたミセルのＩＤＯ阻害活性を評価するために使用した［１５］。これについて簡単に説明すると、ＰＡＮＣ０２細胞を、９６ウェルプレート内に播種した（５×１０3細胞／ウェル）。一晩培養した後、組換えヒトＩＦＮ−γを各ウェルに５０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。次に、様々な濃度のミセル又は遊離型ＮＬＧ９１９により、細胞を４８時間処理した。上清（１５０μＬ）を新たな９６ウェルプレートに移し、続いて７５μＬの３０％トリクロロ酢酸を添加した。５０℃で３０分間インキュベートした後、Ｎ−ホルミルキヌレニンを加水分解することによって、キヌレニンとした。上清を新たな９６ウェルプレートに移し、４９０ｎｍでの比色分析のために、等量のエールリッヒ試薬（氷酢酸中の２％ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド、ｗ／ｖ）により１０分間処理した。
【０１２０】
in vivo生体内分布
ＤｉＲをロードしたＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤミセル及びＤｉＲ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬのＰＧＥＭミセルを、ＰＡＮＣ０２担癌マウスに注射した。指示された時点において、IVIS 200システム（Perkin Elmer社製、米国）により、７３０ｎｍでの励起及び８３５ｎｍでの発光を伴った６０秒の曝露時間で、マウスをイメージングした。イメージングのために、マウスを屠殺した。腫瘍及び様々な臓器を、ex vivoイメージングのために切除した。
【０１２１】
in vivo腫瘍浸透
蛍光プローブであるローダミン及びフルオレセインは、それぞれＰＧＥＭ担体及びＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤ担体にロードした［６０］。これらのナノ粒子（各４ｍｇ）を２００μＬのＰＢＳで混合して、マウスに尾静脈から同時注射した。注射の１５時間後に腫瘍を切除し、凍結切片を７μｍの厚さで作成した。これらの切片を、細胞核を標識するためにＤＡＰＩで染色した。蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡（OLYMPUS America、ニューヨーク州メルビル）にて調査した。
【０１２２】
in vivo治療研究
同系のＰＡＮＣ０２膵臓腫瘍モデルは、２×１０5のＰＡＮＣ０２細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に接種することによって確証した。腫瘍体積が約５０ｍｍ3に達した際に、マウスを６つの群（ｎ＝５）に分け、ＰＢＳ、ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセル、ＰＴＸ／ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセル、ＮＬＧ／ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセル、ＴＸ／ＮＬＧ／ＰＯＥＧ−ｃｏ−ＰＶＤＧＥＭミセル、及びタキソールと遊離型ＧＥＭとの併用により、それぞれ３日ごとに合計５回の治療を行った。ＧＥＭ、ＰＴＸ及びＮＬＧの投与量を、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇに保った。腫瘍体積とマウスの体重を、３日毎に測定した。腫瘍体積（Ｖ）は、次の式で計算した：Ｖ＝（腫瘍の長さ）×（腫瘍の幅）2／２。実験完了後、腫瘍組織を切除して、１０％ホルムアルデヒドにより固定した後、パラフィン内に包埋した。５μｍにスライスした組織をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Zeiss Axiostar plus Microscope（米国ペンシルベニア州）にて観察した。
【０１２３】
フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤リンパ球の定量化
ＰＡＮＣ０２腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスは、３日毎に３回の静脈内投与により、様々な治療を受けた。最後の治療の２４時間後に、腫瘍及び脾臓を切除した。単細胞懸濁液をろ過して、赤血球を溶解した。その後、FlowJoソフトウェア（Tree Star社製）を使用したフローサイトメトリー分析のために、細胞を様々な抗体で染色した。
【０１２４】
統計分析
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。各群の間の差は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較され、ｐ＜０．０５であれば統計的に有意であるとみなされる。
【０１２５】
前述の説明及び添付の図面は、現時点におけるいくつかの代表的な実施形態を提示している。当然ながら、様々な修正、追加及び代替設計は、前述の教示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかになるであろう。ここで、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、以下の特許請求の範囲によって示唆されている。特許請求の範囲と均等である意味及び範囲内に属する全ての変更及び変形は、それらの範囲内に包含されることになる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際調査報告】
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