(57)【要約】本明細書中に開示の方法および組成物は、がん免疫療法、特に、免疫細胞療法のための抗原特異的Ｔリンパ球の調製および使用に関する。本明細書中に開示の方法および組成物は、抗原提示細胞の産生ならびにその細胞療法およびワクチンでの使用、特に、がん免疫療法のための抗原特異的Ｔリンパ球の調製および使用に関する。本明細書中に記載の開示は、いくつかの態様では、細胞治療薬、ワクチン、および免疫治療薬で用いるための抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびかかるＡＰＣによって訓練されたＭＴＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成に関連する改良された方法および組成物を提供する。
2022500034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法であって、
（ａ）複数の単球および／または未熟樹状細胞をペプチドのライブラリーと、前記単球および／または未熟樹状細胞がペプチドの前記ライブラリーの１つまたはそれより多くを内在化するのに適切な条件下の培地中で接触させる工程であって、ここで、ペプチドの前記ライブラリーが抗原のペプチド断片を含み、ここで、前記ペプチドが、前記単球および／または未熟樹状細胞によるタンパク質分解性プロセシングならびにクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  Ｉ）および／またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）から選択される少なくとも１つの細胞表面タンパク質複合体上へのその後の負荷に適切である、接触させる工程；および
（ｂ）前記単球および／または未熟樹状細胞を、１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で、前記単球の分化および／または前記未熟樹状細胞の成熟抗原提示樹状細胞への成熟を誘導し、それにより、ＡＰＣを調製するのに適切な条件下にて培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ライブラリーが、５またはそれを超えるか、８またはそれを超えるか、１０またはそれを超えるか、１５またはそれを超えるか、２０またはそれを超えるか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１０〜１５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、８〜１０、８〜１５、８〜２０、１０〜２０、１５〜２０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、または２００アミノ酸より長い長さを有する複数のペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドの前記ライブラリーが、１つを超える抗原の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ペプチドの前記ライブラリーが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つの抗原の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、前記単球および／または未熟樹状細胞を、ペプチドの２またはそれを超えるライブラリーと接触させることを含み、ここで、ペプチドの各ライブラリーが異なる抗原の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）が、前記単球および／または未熟樹状細胞を、ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６ライブラリーと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原がウイルス腫瘍関連抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原が、腫瘍関連抗原、ウイルス腫瘍関連抗原、またはその両方である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドの前記ライブラリーが、腫瘍関連抗原由来のペプチドのライブラリー、ウイルス腫瘍関連抗原由来のペプチドのライブラリー、またはその両方を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
（ｃ）前記ＡＰＣがＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩから選択される少なくとも１つの細胞表面タンパク質複合体上に前記ペプチドを負荷するのに適切な条件下の培地中で、前記ＡＰＣをペプチドのライブラリーと接触させる工程であって、ここで、ペプチドの前記ライブラリーが抗原のペプチド断片を含む、接触させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｃ）を１回または複数回繰り返す工程
をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）で使用したペプチドの前記ライブラリーが、５またはそれを超えるか、８またはそれを超えるか、１０またはそれを超えるか、１５またはそれを超えるか、２０またはそれを超えるか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２５、１０〜１５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、８〜１０、８〜１５、８〜２５、１０〜２５、１５〜２５、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、または２００アミノ酸より長い長さを有する複数のペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）で使用したペプチドの前記ライブラリーが、１つを超える抗原のペプチド断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）で使用したペプチドの前記ライブラリーが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つの抗原の断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）が、前記ＡＰＣをペプチドの２またはそれを超えるライブラリーと接触させることを含み、ここで、ペプチドの各ライブラリーが異なる抗原の断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）が、前記ＡＰＣを、ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６ライブラリーと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）のペプチドの前記単数または複数のライブラリーの少なくとも１つが、工程（ａ）のペプチドの前記単数または複数のライブラリーの少なくとも１つと同一である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）のペプチドの前記単数または複数のライブラリーの少なくとも１つが、工程（ａ）のペプチドの前記単数または複数のライブラリーの少なくとも１つと異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーが、腫瘍関連抗原、ウイルス腫瘍関連抗原、またはその両方のペプチド断片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーが、腫瘍関連抗原の断片を含むペプチドのライブラリー、ウイルス腫瘍関連抗原の断片を含むペプチドのライブラリー、またはその両方を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）が、培地中で前記単球および／または未熟樹状細胞を第１の濃度のペプチドのライブラリーと接触させることを含み、工程（ｃ）が、培地中で前記ＡＰＣを第２の濃度のペプチドのライブラリーと接触させることを含み、ここで、前記第１の濃度が、前記第２の濃度と同一であるか、より高いか、またはより低い、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、およびＭＡＲＴからなる群から選択される１またはそれを超える腫瘍関連抗原の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＰＣを複数のＴ細胞と、前記Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切な条件下で接触させ、それにより、前記ＡＰＣによって提示された抗原に特異的なプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が産生される、接触させる工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）および／または工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーの少なくとも１つの存在下で、前記ＡＰＣを前記複数のＴ細胞と接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞の集団を、前記Ｔ細胞の増殖を誘導するのに適切な条件下にて１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で培養する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞の前記集団を、工程（ａ）および／または工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーの少なくとも１つの存在下で培養する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞の前記集団を、前記Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切な前記ＡＰＣの存在下で培養する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＰＣを前記プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞と接触させる工程を１回または複数回繰り返す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を前記ＡＰＣと共培養する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、
（ａ）複数の単球および／または未熟樹状細胞をペプチドのライブラリーと、前記単球および／または未熟樹状細胞が前記ペプチドの１つまたはそれより多くを内在化するのに適切な条件下の培地中で接触させる工程であって、ここで、ペプチドの前記ライブラリーが抗原のペプチド断片を含み、ここで、前記ペプチドが、前記単球および／または未熟樹状細胞によるタンパク質分解性プロセシングならびにクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  Ｉ）および／またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）から選択される少なくとも１つの細胞表面タンパク質複合体上へのその後の負荷に適切である、接触させる工程；
（ｂ）前記単球および／または未熟樹状細胞を、１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で、前記単球の分化および／または前記未熟樹状細胞の成熟抗原提示樹状細胞への成熟を誘導し、それにより、ＡＰＣを調製するのに適切な条件下にて培養する工程；
（ｃ）複数のＴ細胞を前記ＡＰＣと、Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切な条件下で接触させ、それにより、前記ＡＰＣによって提示された抗原に特異的なプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が調製される、接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で調製されたＴ細胞の前記集団をＡＰＣと、前記プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を刺激するための条件下で接触させる工程；および
（ｅ）必要に応じて、工程（ｄ）を１回または複数回繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）が、前記複数のＴ細胞を前記ＡＰＣとペプチドのライブラリーの存在下で培養することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーが工程（ａ）のペプチドの前記ライブラリーと同一である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）のペプチドの前記ライブラリーが工程（ａ）のペプチドの前記ライブラリーと異なる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｄ）が、Ｔ細胞の前記集団を前記ＡＰＣとペプチドのライブラリーの存在下で培養することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｄ）のペプチドの前記ライブラリーが、工程（ａ）のペプチドの前記ライブラリーと同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｄ）のペプチドの前記ライブラリーが、工程（ａ）で使用したペプチドの前記ライブラリーと異なる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法に従って調製されたＡＰＣの集団を含む組成物であって、前記ＡＰＣが、プロセシングされたペプチドが負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含み、ここで、好ましくは、前記プロセシングされたペプチドが、前記ＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体上の提示前に、例えばｉＤＣによってｉｎ  ｖｉｖｏで短縮されている、組成物。
【請求項３８】
前記プロセシングされたペプチドが、ペプチドの前記ライブラリー中のペプチドより長さが短く、好ましくは、８アミノ酸長未満、１０アミノ酸長未満、１２アミノ酸長未満、１５アミノ酸長未満、５アミノ酸長と１５アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１０アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１２アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１４アミノ酸長との間、または８アミノ酸長と１５アミノ酸長との間である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ペプチドの前記ライブラリー（例えば、ＴＡＡ）由来のペプチドで負荷された複数のｍＤＣをさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法にしたがって調製したＡＰＣの集団を含む組成物であって、ＡＰＣの前記集団が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体、ならびにペプチドの前記ライブラリー由来のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含み、ここで、好ましくは、前記組成物が、ＴＡＡで負荷された複数のｍＤＣをさらに含む、組成物。
【請求項４１】
請求項２３〜３６のいずれか１項に記載の方法に従って調製されたプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、前記プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含む、組成物。
【請求項４２】
請求項２３〜３６のいずれか１項に記載の方法に従って調製されたプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、前記プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体、ならびにペプチドの前記ライブラリー由来のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含む、組成物。
【請求項４３】
プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の前記集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、請求項４１または４２に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項４１または４２に記載の組成物および薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む治療組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の治療組成物をそれ必要とする患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項４６】
組成物であって、
少なくとも２つの異なる長さを有する第１の複数のペプチドを提示するＡＰＣの第１の集団であって、ここで、好ましくは、前記第１の複数のペプチドが、ＡＰＣの前記第１の集団における提示前に、例えばｉＤＣによってｉｎ  ｖｉｖｏで短縮されている、ＡＰＣの第１の集団；および
均一の長さを有する第２の複数のペプチドを提示するＡＰＣの第２の集団
を含む、組成物。
【請求項４７】
ＡＰＣの前記第１の集団およびＡＰＣの前記第２の集団が約１：１の比で存在する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４８】
単球由来ＡＰＣの拡大された集団を含む組成物であって、ここで、各ＡＰＣが同一抗原由来のペプチドで負荷された少なくとも１つのＭＨＣ複合体を含み、ここで、集団として、前記ＡＰＣが、前記抗原由来の複数のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ複合体を含み、前記複数のペプチドが異なる長さである、組成物。
【請求項４９】
前記複数のペプチドの各々が、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、７またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、５アミノ酸と１０アミノ酸との間、５アミノ酸と１５アミノ酸との間、５アミノ酸と２０アミノ酸との間、６アミノ酸と１０アミノ酸との間、または６アミノ酸と２０アミノ酸との間の長さを有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
集団として、前記ＡＰＣが、第２の抗原由来の複数のペプチドで負荷された第２の複数のＭＨＣ複合体をさら含み、前記第２の複数のペプチドが同一の長さを有する、請求項４８または４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記第１の抗原および前記第２の抗原が同一の抗原である、請求項５０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１０日出願の米国特許仮出願第６２／７２９，２２０号および２０１９年８月８日出願の同第６２／８８４，５２７号（これらの各々の全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権および利益を主張する。
【０００２】
分野
本明細書中に開示の方法および組成物は、抗原提示細胞の産生ならびにその細胞療法およびワクチンでの使用、特に、がん免疫療法のための抗原特異的Ｔリンパ球の調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
免疫細胞療法、例えば、養子細胞療法（ＡＣＴ）は、典型的には、被験体から免疫細胞を回収する工程、細胞を拡大する工程、および細胞を同一の被験体および異なる被験体に再導入する工程を含む。例えば、ドナー由来のｅｘ−ｖｉｖｏで拡大された抗原特異的多標的化Ｔ細胞（ＭＴＣ）のＡＣＴが、がん処置のための有望なアプローチとして出現している。他のＡＣＴアプローチには、培養腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、単離および拡大されたＴ細胞クローン、および従来のＴ細胞受容体を発現するか、ＣＡＲ−Ｔ療法の場合にはキメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作されたリンパ球（例えば、Ｔ細胞）が含まれる。遺伝子操作されたリンパ球は、特異的抗原（複数可）を発現するがん細胞を排除するように設計され、患者に送達される前にｅｘ  ｖｉｖｏで拡大される。ＡＣＴは、患者内の腫瘍細胞を減少させる腫瘍特異的リンパ球（例えば、Ｔ細胞）を提供することができる。
【０００４】
しかしながら、従来のＭＴＣ調製方法は、多くの制限や欠点（低活性化率または低反応性など）があるか、最適とはいえないプロセス上の制限（複数回の新鮮血の採血、手順の複雑さ、規格化の欠如、複数日の樹状細胞生成サイクルなど）に見舞われる。そのため、ＭＴＣ調製のための方法および組成物を改良する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本明細書中に記載の開示は、いくつかの態様では、細胞治療薬（cell  therapeutics）、ワクチン、および免疫治療薬で用いるための抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびかかるＡＰＣによって訓練されたＭＴＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成に関連する改良された方法および組成物を提供する。かかる方法および組成物は、例えば、がん、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、またはウイルス感染症の処置または防止で用いられ得る。本発明によれば、ＡＰＣは、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）への分化および（ｉＤＣ）の完全成熟樹状細胞（ｍＤＣ）への成熟に適切な条件下で単球を培養することによって生成される。単球および／またはｉＤＣは、１またはそれを超える抗原、抗原タンパク質、および／または抗原ペプチドのライブラリーと、単球および／またはｉＤＣによるかかる抗原、抗原タンパク質、および／またはペプチドの内在化に適切な条件下で接触され、ここで、抗原、抗原タンパク質、および／またはペプチドの少なくとも一部がタンパク質分解性プロセシングに供され、最終的にｍＤＣの細胞表面上に提示されてＡＰＣを産生する。ある特定の実施形態は、タンパク質分解性にプロセシングされた抗原、タンパク質、および／またはペプチドの提示を特徴とする新規のＡＰＣ集団を含む組成物、ならびにかかるＡＰＣを含む樹状細胞治療薬およびワクチンを提供する。かかるＡＰＣによってプライミングまたは訓練された新規のＴ細胞集団を含む組成物、およびかかるＴ細胞を含むＴ細胞治療薬も本明細書中に提供する。
【０００６】
一つの態様では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法が本明細書中に提供され、この方法は、
（ａ）複数の単球および／または未熟樹状細胞をペプチドのライブラリーと、単球および／または未熟樹状細胞がペプチドの１つまたはそれより多くを内在化するのに適切な条件下の培地中で接触させる工程であって、ここで、ペプチドのライブラリーが１つまたはそれより多くの全長抗原および／または抗原のペプチド断片を含み、ここで、ペプチドが、単球および／または未熟樹状細胞によるタンパク質分解性プロセシングならびにクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  Ｉ）および／またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）から選択される少なくとも１つの樹状細胞表面タンパク質複合体上へのその後の負荷に適切である、接触させる工程；および
（ｂ）単球および／または未熟樹状細胞を、１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で、単球の分化および／または未熟樹状細胞の成熟抗原提示樹状細胞への成熟を誘導し、それにより、ＡＰＣを調製するのに適切な条件下にて培養する工程
を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリー中の各ペプチドは、５またはそれを超えるか、８またはそれを超えるか、１０またはそれを超えるか、１５またはそれを超えるか、２０またはそれを超えるか、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１０〜１５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、８〜１０、８〜１５、８〜２０、１０〜２０、１５〜２０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、または２００より多くのアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、１またはそれを超える全長抗原をライブラリーに含めることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、１つを超える抗原のペプチド断片またはタンパク質断片を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つの抗原の断片を含む。
【０００８】
種々の実施形態では、本方法を使用して、１またはそれを超える抗原の全長タンパク質または１またはそれを超える抗原の小ペプチドより大きな断片を使用してＡＰＣを調製することができる。これに関して、本方法は、ライブラリーおよびペプチドの使用に制限されない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、単球および／または未熟樹状細胞を接触させる工程は、単球および／または未熟樹状細胞を、ペプチドの２またはそれを超えるライブラリーと接触させることを含み、ここで、ペプチドの各ライブラリーが異なる抗原の断片を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）は、単球および／または未熟樹状細胞を、ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６ライブラリーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、腫瘍関連抗原の断片を含むペプチドのライブラリー、ウイルス腫瘍関連抗原の断片を含むペプチドのライブラリー、またはその両方を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、抗原はウイルス腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、腫瘍関連抗原、ウイルス腫瘍関連抗原、またはその両方である抗原を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｃ）ＡＰＣがＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩから選択される少なくとも１つの細胞表面タンパク質複合体上にペプチドを負荷するのに適切な条件下の培地中で、ＡＰＣをペプチドのライブラリーと接触させる工程であって、ここで、ペプチドのライブラリーが抗原のペプチド断片を含む、接触させる工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｃ）を１回または複数回繰り返す工程
をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、５またはそれを超えるか、８またはそれを超えるか、１０またはそれを超えるか、１５またはそれを超えるか、２０またはそれを超えるか、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２５、１０〜１５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、８〜１０、８〜１５、８〜２５、１０〜２５、１５〜２５、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、または２００アミノ酸より長い長さを有する複数のペプチドを含む。ある特定の実施形態では、１またはそれを超える全長抗原をライブラリーに含めることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、１つを超える抗原のペプチド断片を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６つの抗原の断片を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＡＣＰをペプチドのライブラリーと接触する工程は、ＡＰＣをペプチドの２またはそれを超えるライブラリーと接触させることを含み、ここで、ペプチドの各ライブラリーは、異なる抗原またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、工程は、ＡＰＣを、ペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２〜５、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６ライブラリーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーは、腫瘍関連抗原またはその断片を含むペプチドのライブラリー、ウイルス腫瘍関連抗原またはその断片を含むペプチドのライブラリー、またはその両方を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上記工程（ｃ）のペプチドの単数または複数のライブラリーの少なくとも１つは、上記工程（ａ）のペプチドの単数または複数のライブラリーの少なくとも１つと同一である。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）のペプチドの単数または複数のライブラリーの少なくとも１つは、工程（ａ）のペプチドの単数または複数のライブラリーの少なくとも１つと異なる。いくつかの実施形態では、ペプチドのライブラリーの少なくとも１つは、腫瘍関連抗原のペプチド断片、ウイルス腫瘍関連抗原のペプチド断片、またはその両方を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記工程（ａ）は、培地中で単球および／または未熟樹状細胞を第１の濃度のペプチドのライブラリーと接触させることを含み、上記工程（ｃ）は、培地中でＡＰＣを第２の濃度のペプチドのライブラリーと接触させることを含み、ここで、第１の濃度は、第２の濃度と同一であるか、より高いか、またはより低い。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、およびＭＡＲＴからなる群から選択される１またはそれを超える腫瘍関連抗原あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、以下の腫瘍関連抗原、またはその断片を含むことができる：ＰＲＡＭＥ、ＮＹ  ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ＳＳＸ−２、およびサバイビン。ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、例えば、ＨＰＶ＋の頭頸部がんおよび／または子宮頸がんのウイルス腫瘍抗原をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、新生抗原ペプチドなどの変異タンパク質に由来し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＰＣを複数のＴ細胞と、Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切な条件下で接触させ、それにより、ＡＰＣによって提示された抗原に特異的なプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が産生される、接触させる工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）および／または工程（ｃ）のペプチドのライブラリーの少なくとも１つの存在下で、ＡＰＣを複数のＴ細胞と接触させる。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を誘導するのに適切な条件下にて１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で培養する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団を、工程（ａ）および／または工程（ｃ）のペプチドのライブラリーの少なくとも１つの存在下で培養する。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切なＡＰＣの存在下で培養する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＣをプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞と接触させる工程を１回または複数回繰り返す。いくつかの実施形態では、プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞をＡＰＣと共培養する。
【００１８】
別の態様は、抗原特異的Ｔ細胞（ＡＰＣ）を調製する方法に関し、この方法は、
（ａ）複数の単球および／または未熟樹状細胞をペプチドのライブラリーと、単球および／または未熟樹状細胞がペプチドの１つまたはそれより多くを内在化するのに適切な条件下の培地中で接触させる工程であって、ここで、ペプチドのライブラリーが抗原のペプチド断片を含み、ここで、ペプチドが、単球および／または未熟樹状細胞によるタンパク質分解性プロセシングならびにクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  Ｉ）および／またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）から選択される少なくとも１つの細胞表面タンパク質複合体上への負荷に適切である、接触させる工程；
（ｂ）単球および／または未熟樹状細胞を、１またはそれを超えるサイトカインおよび／または成長因子の存在下で、単球の分化および／または未熟樹状細胞の成熟抗原提示樹状細胞への成熟を誘導し、それにより、ＡＰＣを調製するのに適切な条件下にて培養する工程；
（ｃ）複数のＴ細胞をＡＰＣと、Ｔ細胞の抗原プライミングおよび／または抗原特異的活性化に適切な条件下で接触させ、それにより、ＡＰＣによって提示された抗原に特異的なプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞の集団が調製される、接触させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で調製されたＴ細胞の集団をＡＰＣと、プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞を刺激するための条件下で接触させる工程；および
（ｅ）必要に応じて、工程（ｄ）を１回または複数回繰り返す工程
を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、接触させる工程（ｃ）は、ペプチドのライブラリーの存在下で、複数のＴ細胞をＡＰＣと培養することを含む。いくつかの実施形態では、接触する工程（ｃ）のペプチドのライブラリーは、接触する工程（ａ）のペプチドのライブラリーと同一である。いくつかの実施形態では、接触する工程（ｃ）のペプチドのライブラリーは、工程（ａ）のペプチドのライブラリーと異なる。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）は、ペプチドのライブラリーの存在下で、Ｔ細胞の集団をＡＰＣと培養することを含む。いくつかの実施形態では、接触する工程（ｄ）のペプチドのライブラリーは、接触する工程（ａ）のペプチドのライブラリーと同一である。いくつかの実施形態では、接触する工程（ｄ）のペプチドのライブラリーは、接触する工程（ａ）で使用したペプチドのライブラリーと異なる。
【００２０】
さらなる態様は、本明細書に開示される方法に従って調製されたＡＰＣの集団を含む組成物に関し、ＡＰＣは、プロセシングされたペプチドが負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含み、ここで、好ましくは、プロセシングされたペプチドは、ＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体上の提示前に、例えば単球および／またはｉＤＣによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで短縮されている。いくつかの実施形態では、プロセシングされたペプチドは、ペプチドのライブラリー中のペプチドより長さが短い。いくつかの実施形態では、プロセシングされたペプチドは、８アミノ酸長未満、１０アミノ酸長未満、１２アミノ酸長未満、１５アミノ酸長未満、５アミノ酸長と１５アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１０アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１２アミノ酸長との間、８アミノ酸長と１４アミノ酸長との間、または８アミノ酸長と１５アミノ酸長との間である。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、従来の負荷を使用して）ペプチドのライブラリー由来のペプチドで負荷された複数のｍＤＣをさらに含むことができる。
【００２１】
他の態様は、組成物であって、本明細書中に開示の方法に従って調製されたＡＰＣの第１の集団であって、ここで、ＡＰＣの第１の集団が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含む、ＡＰＣの第１の集団、ならびにペプチドのライブラリー由来のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含むＡＰＣの第２の集団を含む、組成物に関する。
【００２２】
さらなる態様は、組成物であって、
少なくとも２つの異なる長さを有する第１の複数のペプチドを提示するＡＰＣの第１の集団であって、ここで、好ましくは、第１の複数のペプチドが、ＡＰＣの第１の集団における提示前に、例えばｉＤＣによってｉｎ  ｖｉｖｏで短縮されている、ＡＰＣの第１の集団；および
均一の長さを有する第２の複数のペプチドを提示するＡＰＣの第２の集団
を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、ＡＰＣの第１の集団およびＡＰＣの第２の集団は約１：１の比で存在する。
【００２３】
また、本明細書には、単球由来ＡＰＣの拡大された集団を含む組成物であって、ここで、各ＡＰＣが同一抗原由来のペプチドで負荷された少なくとも１つのＭＨＣ複合体を含み、ここで、集団として、ＡＰＣが、抗原由来の複数のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ複合体を含み、複数のペプチドが異なる長さである、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、複数のペプチドの各々は、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、７またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、５アミノ酸と１０アミノ酸との間、５アミノ酸と１５アミノ酸との間、５アミノ酸と２０アミノ酸との間、６アミノ酸と１０アミノ酸との間、または６アミノ酸と２０アミノ酸との間の長さを有する。ある特定の実施形態では、集団として、ＡＰＣは、第２の抗原由来の複数のペプチドで負荷された第２の複数のＭＨＣ複合体をさら含み、第２の複数のペプチドは同一の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原とは同一の抗原である。
【００２４】
さらなる態様は、本明細書中に開示の方法に従って調製されたプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、ここで、プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含む、組成物に関する。
【００２５】
別の態様は、本明細書中に開示の方法に従って調製されたプライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、ここで、プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞が、プロセシングされたペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体、ならびにペプチドのライブラリー由来のペプチドで負荷された複数のＭＨＣ  Ｉおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ複合体を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、プライミングされたおよび／または活性化されたＴ細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。
【００２６】
本明細書中に開示の組成物のうちのいずれか１つ、および薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書中に提供する。
【００２７】
さらなる態様は、本明細書中に開示の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本特許または本出願ファイルには、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または本特許出願公開のコピーは、米国特許商標庁に必要な料金を支払って請求すれば得られる。
【００２９】
【図１】図１は、非常に強力な多標的Ｔ細胞（ＭＴＣ）を産生するためのプラットフォームテクノロジーの概要である。簡潔に述べれば、Ｔ細胞および単球を、患者アフェレーシスから単離した。単球を、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドを示す成熟樹状細胞（ｍＤＣ）に変換する。これらのｍＤＣは、ＴＡＡ反応性Ｔ細胞の集団を拡大する（例えば、プライミングする）ために使用される。次いで、Ｔ細胞を、患者への再注入前に免疫調節性サイトカインで負荷することによってディーププライミングする（商標）（Deep  PrimedTM）ことができる。
【００３０】
【図２】図２は、１５マーペプチドで直接負荷された従来の成熟ＤＣと、６〜１５マーペプチドを提示する予備負荷ＤＣを組み合わせることによってＤＣプールの組み合わせを作出する実施形態を示す。
【００３１】
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＡＲＴ１ツールペプチドおよびＭＡＲＴ１特異的一本鎖ＴＣＲ試薬を使用した抗原のプロセシングおよび提示の評価である。
【００３２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、樹状細胞によるＭＡＲＴ１  １０マーペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１提示の例を示す。成熟後３日目に細胞をＭＡＲＴ１  １０マー、１５マー、または２３マーとインキュベートすることによって成熟樹状細胞をＭＡＲＴ１ペプチドで負荷した（従来法）。あるいは、ＭＡＲＴ１ペプチドを、樹状細胞の分化および成熟過程の０日目（Ｄ０予備負荷）に単球に添加するか、１日目（Ｄ１予備負荷）に未熟樹状細胞に添加した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１  １０マーの表面提示を、フルオロフォア標識した多量体の一本鎖ＴＣＲ試薬によって検出する。
【００３３】
【図３Ｃ】図３Ｃは、樹状細胞によるＭＡＲＴ１  １０マーペプチド−ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の提示に及ぼす予備負荷量の影響を示す。樹状細胞を、樹状細胞の分化および成熟過程の０日目または１日目にＭＡＲＴ１  １５マーを表示の濃度で添加することによって負荷した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１  １０マーの表面提示を、フルオロフォア標識した多量体の一本鎖ＴＣＲ試薬によって検出する。２名の健康なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナー由来の代表的データ。
【００３４】
【図４Ａ】図４Ａは、樹状細胞予備負荷によるＭＴＣ訓練の略図である。単球または未熟樹状細胞を、分化および成熟中に１５マーペプチドで予備負荷して樹状細胞を成熟させ、その後にＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞を訓練するために使用した。
【００３５】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ペプチド−ＭＨＣ四量体によるＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞の検出を示す。
【００３６】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＭＡＲＴ１  １５マーで予備負荷した成熟樹状細胞が、１４日間の２回刺激するＴ細胞訓練の共培養中にＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞の富化を刺激することを示す。２名の健康なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナー由来の代表的データ。
【００３７】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＭＡＲＴ１  １５マーで予備負荷した樹状細胞が、非特異的バイスタンダーＴ細胞よりも優先的にＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞の拡大および富化を刺激することを示す。２名の健康なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナー由来の代表的データ。
【００３８】
【図５】図５は、腫瘍関連抗原およびウイルス腫瘍関連抗原が同族ＭＴＣの富化およびナチュラルＴ細胞による抗腫瘍免疫応答を補完的に駆動することができることを示す。
【００３９】
【図６】図６は、抗原負荷方法を比較するためのＤＣ生成およびＴ細胞プライミングの略図である。
【００４０】
【図７】図７は、従来法、予備負荷、または組み合わせ（従来法および予備負荷の１：１混合物）によってＴＡＡペプチドで負荷したＤＣを用いて生成したＭＴＣを、共培養Ｔ細胞活性化アッセイを用いてＴＡＡに対する反応性について査定することを示す。１４日目（２回ＤＣ刺激プロセス）または２１日目（３回ＤＣ刺激プロセス）に回収した３名の健康なドナー由来のＭＴＣ産物についての反応性を報告する。破線は、標準的な２１日間の従来法で負荷したプロセスの結果を示す。
【００４１】
【図８】図８は、図７において見られるように生成されたＭＴＣについてのＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８区画におけるＴＡＡ反応性を示す。
【００４２】
【図９】図９は、ＴＡＡ／ＭＡＲＴ１  １５マーペプチドプールまたはＭＡＲＴ１  １０マーで刺激した場合の、活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生によって測定した従来法の負荷ＤＣまたは従来法／予備負荷組み合わせＤＣを用いて訓練したＭＴＣの反応性を示す。
【００４３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、３５６の固有の１５マーペプチドを含む５つのＴＡＡライブラリーのプールを単球に添加し、単球が未熟ＤＣおよび成熟ＤＣに成熟される実施形態を示す。得られたペプチド負荷された成熟ＤＣを自家Ｔ細胞と共培養して、ＴＡＡ特異的ＭＴＣを富化させる。回収したＭＴＣ産物を、フルオロフォアをコンジュゲートしたペプチド負荷ＭＨＣ  Ｉ四量体での染色によって選択されたＰＲＡＭＥ由来９マーおよび１０マーペプチドに対する反応性について査定する。
【００４４】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ペプチド負荷ＭＨＣ四量体によるＰＲＡＭＥ由来９マーおよび１０マーペプチドへの結合についての組み合わせプロセスを使用してＴＡＡに対して訓練したＭＴＣの照合を示す（４つのＰＲＡＭＥ四量体のプールへのＭＴＣ結合を左側に示す）。四量体に結合するＣＤ８細胞集団を強調している。個別のペプチドに対するＣＤ８反応性を右側に示す。
【００４５】
【図１１】図１１は、自家ＤＣおよび部分的にＨＬＡと適合するがん細胞での刺激に対する応答におけるＴ細胞活性化およびＩＦＮ−γ分泌を示す。活性化データを、Ｔ細胞のみの培養物を超えるＣＤ２５発現を示すＴ細胞のパーセントとして示し、エラーバーは、ペプチド負荷ＤＣの２つの異なるプールに対する応答範囲を示す。破線は、非負荷ＤＣに対する応答を示す。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  ＵＬＯＱ＝１×１ｅ４ｐｇ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本開示は、いくつかの実施形態では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製する方法ならびに例えば細胞治療薬およびワクチンの調製におけるかかるＡＰＣの使用を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法に従って調製したＡＰＣおよび／またはＴ細胞、ならびにある特定の薬学的調製物、細胞治療薬、およびワクチンを含む組成物も提供する。１つの態様では、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）への分化および（ｉＤＣ）の完全成熟樹状細胞（ｍＤＣ）への成熟に適切な条件下で単球を培養することによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＰＣを調製する方法を本明細書中に提供する。単球および／またはｉＤＣを、１またはそれを超える抗原、抗原タンパク質、および／または抗原ペプチドのライブラリーと、単球および／またはｉＤＣによるかかる抗原、抗原タンパク質、および／またはペプチドの内在化に適切な条件下で接触させ、ここで、前述の抗原、タンパク質、および／またはペプチドの少なくとも一部がタンパク質分解性プロセシングに供され、最終的に、ｍＤＣの細胞表面上に提示されてＡＰＣを産生する。本明細書中で使用される場合、予備負荷ＡＰＣは、完全な成熟化前に抗原、抗原タンパク質、および／またはペプチドで負荷された単球および／またはｉＤＣの分化から産生されたＡＰＣを指す。同様に、用語「予備負荷する（preload）」および「予備負荷すること（preloading）」は、抗原、抗原タンパク質、および／またはペプチドでの単球および／またはｉＤＣの負荷に関して使用される。本開示のある特定の実施形態は、タンパク質分解的にプロセシングされた抗原、タンパク質、および／またはペプチドの提示を特徴とする新規のＡＰＣ集団を含む組成物、ならびにかかるＡＰＣを含む樹状細胞治療薬およびワクチンを提供する。かかるＡＰＣによってプライミングまたは訓練された新規のＴ細胞集団を含む組成物、およびかかるＴ細胞を含むＴ細胞治療薬も本明細書中に提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせを提供する。いくつかの態様では、かかる組み合わせは、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの混合物を含み得る。従来法で負荷されたＤＣは、均一の長さを有するか、負荷のためのＤＣ（例えば、ｍＤＣ）に提供された最初のペプチドのライブラリーと同一の長さ（複数可）を有する複数の抗原ペプチドを含むか、その表面上に（例えば、ＭＨＣを介して）提示することができる。予備負荷されたＤＣは、他方では、異なる長さ（例えば、２つの異なる長さ、３つの異なる長さ、またはそれを超える異なる長さ）を有する複数のペプチドを含むか、その表面上に（例えば、ＭＨＣを介して）提示することができ、ここで、複数のペプチドは、各々がタンパク質分解的にプロセシングされており、したがって、例えば、ＤＣ上の提示前に単球またはｉＤＣによってｉｎ  ｖｉｖｏで短縮されている。長さの範囲は、抗原タンパク質またはペプチドの全長に応じて非常に変動し得る−例えば、１５マーのペプチドライブラリーを使用して単球またはｉＤＣを予備負荷する場合、ＤＣの集団は、８アミノ酸から１５アミノ酸の範囲のペプチドを提示し得る。他の態様では、かかる組み合わせは、同一のプロセスにおける（予備負荷したＤＣで最初にプライミングしたＴ細胞を再度刺激するために従来法で負荷されたＤＣを使用する（逆もまた同じ）ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞プライミングなどにおける）従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの個別の使用を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）複数の単球を準備する工程；
（ｂ）前述の単球の第１のアリコートを、サイトカイン（例えば、ＩＬ−４およびＧＭＣＳＦ）を含む第１の培養培地中で培養し、それにより、前述の単球の第１のアリコートの少なくとも一部の未熟樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導する工程；
（ｃ）前述の単球および／または未熟ＤＣに、１またはそれを超える腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（「ＴＡＡペプチド」）に由来する複数のペプチド（例えば、１５マー）を、例えば、前述のＴＡＡペプチド、ＴＡＡタンパク質全体とのインキュベーションによるか、ペプチドコンジュゲートリポソームの送達を介して送達する工程；
（ｄ）前述の単球および／または未熟ＤＣの培養を継続して、その表面上に６〜１５マーペプチド抗原、好ましくは８〜１１マーペプチド抗原を提示する第１の複数の成熟ＤＣにする工程；
（ｅ）前述の単球および／または複数の未熟ＤＣの第２のアリコートを第２の培養培地中で培養し、それにより、成熟ＤＣへの分化を誘導する工程；
（ｆ）前述の成熟ＤＣ上に複数のＴＡＡペプチドを負荷し、それにより、その表面上にＴＡＡペプチド（例えば、１５マーペプチド）を提示する第２の複数の成熟ＤＣを得る工程；および
（ｇ）前述の第１の複数の成熟ＤＣおよび前述の第２の複数の成熟ＤＣを、約１０：１〜１：１０（例えば、約５：１〜１：５、または約１：１）の比で組み合わせ、それにより、下流での使用（例えば、Ｔ細胞訓練）に適切なＡＰＣを生成する工程。
【００４９】
いくつかの実施形態では、未熟ＤＣは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を少なくともリンパ球富化画分および単球富化画分に溶離することによって獲得した単球であり得、ここで、好ましくは、前述の末梢血単核球は細胞療法を必要とするがん患者に由来する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、全長ＴＡＡおよび／またはＴＡＡ断片を含むことができる。ペプチドは、種々のＴＡＡから得たか種々のＴＡＡに由来するペプチドのライブラリーであり得る。ペプチドは、８〜１５アミノ酸（８〜１５マー）の長さを有することができる。ＴＡＡは、例えば、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、およびＷＴ−１から選択することができる。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、処置を必要とするがん患者から得る。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、ＨＰＶ＋の頭頸部がんおよび／または子宮頸がんのウイルス腫瘍抗原を含むことができる。
【００５１】
得られたＡＰＣは、その細胞表面上に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉによって提示される８〜１０マー抗原を表示することができ、ここで、８〜１０マーは、単球および／またはｉＤＣによってペプチドからタンパク質分解的にプロセシングされる抗原および／またはペプチドから作出される。
【００５２】
種々の実施形態では、本明細書中に開示の方法に従って調製したＡＰＣを使用して、多標的化Ｔ細胞（ＭＴＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することができる。例えば、ＰＢＭＣのリンパ球富化画分をＡＰＣと共培養して、ＴＡＡペプチドに反応性を示すＭＴＣを拡大することによってこれを行うことができる。かかる共培養を、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、および必要に応じて、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−２、およびＩＬ−６のうちの１つまたは複数の存在下で進めることができる。
【００５３】
図１に示すように、拡大したＭＴＣを治療タンパク質単量体のクラスターで負荷して、さらなる治療上の利点を得ることができる。治療タンパク質単量体の例には、制限されないが、抗体（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ＦｃとＦａｂの混合物）、単鎖抗体、抗体断片、操作したタンパク質（Ｆｃ融合物、酵素、補因子、受容体、リガンド、転写因子、および他の制御因子など）、サイトカイン、ケモカイン、およびヒト血清アルブミンなどが含まれる。これらのタンパク質は、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよい。他のタンパク質が意図され、本開示に従って使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１７／００８０１０４号、米国特許第９，６０３，９４４号、米国特許出願公開第２０１４／００８１０１２号、２０１７年６月１３日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１７／３７２４９号、および２０１８年４月１３日出願の米国特許仮出願第６２／６５７，２１８号（これらの全ての全体が、本明細書中で参考として援用される）に開示のように、任意のタンパク質を、架橋によって可逆的に改変して、クラスターまたはナノゲル構造を形成することができる。負荷した細胞は、多くの治療に適用することができる。例えば、負荷したＭＴＣを、Ｔ細胞療法（養子細胞療法が含まれる）で使用することができる。
定義
【００５４】
ある特定の用語を、本明細書中の以下に定義する。さらなる定義は、本出願の至る所に提供される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１または１を超える（例えば、少なくとも１つ）を指す。単語「ａ」または「ａｎ」は、本明細書中で用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と併せて使用される場合、「１」を意味し得るが、「１またはそれを超える」、「少なくとも１つ」、「１または１を超える」の意味とも一致する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量の許容され得る誤差の程度を意味する。典型的には、誤差の程度の例は、所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００５７】
用語「自家の」は、その後に再導入される個体と同一の個体由来の任意の材料を指す。
【００５８】
用語「同種の」は、材料が導入される個体と同一の種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。
【００５９】
「獲得する」または「獲得すること」または「得る」または「得ること」は、これらの用語を本明細書中で使用する場合、物理的な実体または値を「直接獲得する」か「間接的に獲得する」ことによって、物理的な実体（例えば、試料、細胞もしくは細胞集団、ポリペプチド、核酸、または配列）、または値（例えば、数値）を所有することを指す。１つの実施形態では、獲得は、細胞または細胞集団（例えば、本明細書中に記載の免疫エフェクター細胞または集団）を得ることまたは採取することを指す。「直接獲得すること」は、物理的な実体または値を得るためのプロセスを実施すること（例えば、合成法または分析法または精製法を実施すること）を意味する。「間接的獲得すること」は、別の団体または供給元（例えば、物理的な実体または値を直接獲得した第三者の研究所）から物理的な実体または値を受け取ることを指す。
【００６０】
「免疫細胞」は、この用語を本明細書中で使用する場合、免疫応答（例えば、免疫応答の促進）に関与する細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、α／βＴ細胞およびγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、および肥満細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、「免疫細胞」は、免疫応答に関与する細胞の改変バージョン（例えば、改変ＮＫ細胞（ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２４０７）、ｈａＮＫ（高親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を発現するＮＫ−９２バリアント）、およびｔａＮＫ（所与の腫瘍抗原のＣＡＲを発現する遺伝子でトランスフェクトした標的化ＮＫ−９２細胞が含まれる））（例えば、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．前出に記載）を指す。
【００６１】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語を本明細書中で使用する場合、免疫応答（例えば、免疫エフェクター応答の促進）に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、αＴ細胞、βＴ細胞、γＴ細胞、およびδＴ細胞）；Ｂ細胞；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；樹状細胞；および肥満細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、がん抗原に結合するＣＡＲ）を含む（例えば、発現する）免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、免疫細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を富化されている（例えば、目的のＴＡＡ（例えば、ＭＡＲＴ−１）を表示するＭＨＣに対する特異性を有するＴ細胞を選別することによって富化されている）Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、目的のＴＡＡペプチドを表示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）によってＴＡＡに対する特異性を保有するように「訓練」されているＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、またはサバイビンなどのうちの１つまたは複数から選択されるＴＡＡに対して訓練される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、目的の複数のＴＡＡペプチドを表示するＡＰＣ（例えば、樹状細胞）によって複数のＴＡＡに対する特異性を保有するように「訓練」されているＴ細胞の集団を含む。かかるＴ細胞は、本明細書中で多標的化Ｔ細胞（「ＭＴＣ」）とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。
【００６２】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、Ｔ細胞などのある特定のリンパ球によって認識されるように細胞表面で主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した抗原を表示することによって細胞性免疫応答を媒介する免疫細胞群である。古典的なＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、およびＢ細胞が含まれる。
【００６３】
「樹状細胞（ＤＣ）」の主な機能は、Ｔ細胞に抗原を提示することである。樹状細胞は、抗原ペプチドを表示するために以下の２つのタイプの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）を使用する：ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ。ＭＨＣ  ＩはＣＤ８＋Ｔ細胞を細胞傷害性の腫瘍細胞キラーに訓練し；ＭＨＣ  ＩＩはＣＤ４＋Ｔ細胞をサイトカイン産生ヘルパー細胞に訓練する。臨床データおよび前臨床データから、両方のＴ細胞型が腫瘍を死滅させるのに役立つことが示唆されている。存在するペプチドＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩは、必ずしも相互に同一でなく、患者間で同一でもない。
【００６４】
未熟樹状細胞（ｉＤＣ）は、細胞内活性の高さおよびＴ細胞活性化能の低さを特徴とする。未熟樹状細胞は、病原体を貪食し、そのタンパク質を小片に分解し、成熟したときにＭＨＣ分子を使用してその細胞表面上に断片を提示する。同時に、これらの細胞は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として作用する細胞表面受容体を上方制御し、細胞表面受容体がＴ細胞を活性化する能力を非常に増強する。これらの細胞が提示可能な抗原と遭遇した時点で、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）に活性化されるようになり、次いで、非抗原特異的共刺激シグナルと共に病原体に由来する抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、樹状細胞を、単球からｉｎ  ｖｉｖｏ（ｅｘ  ｖｉｔｒｏ）で生成することができる（時折、単球由来樹状細胞と呼ばれる）。簡潔に述べれば、細胞は、ＩＬ−４およびＧＭＣＳＦの影響下でＣＤ１４＋ＣＤ８３−単球からＣＤ１４−ＣＤ８３−未熟ＤＣへ移行することができ、次いで、活性化／成熟の際にＣＤ８３を上方制御してＣＤ１４−ＣＤ８３＋ｍＤＣになる。例えば、Ｐｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１０９：７１−８２（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。未熟ＤＣから成熟ＤＣへの移行が即時的でなく、いくらかの時間を必要とし、その間はＤＣが成熟プロセスにあることに注目すべきである。いくつかのＤＣは他のＤＣより早熟な場合があり、したがって、ＤＣ集団は、未熟、成熟中、半成熟、および成熟ＤＣの混合物の場合があり、一方、ＤＣ集団は、全体として成熟プロセスにある。
【００６６】
また、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。組織培養フラスコ中にＰＢＭＣをプレーティングすると、単球が接着する。これらの単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処置すると、未熟樹状細胞に分化する。その後に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ、および／またはＰＧＥ２で処置すると、ｉＤＣが成熟ＤＣにさらに分化する。
【００６７】
本明細書中で使用される「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、標的細胞を死滅させる能力を有するＴ細胞を指す。ＣＴＬ活性化は、以下の２つの工程が生じた場合に起こり得る：１）標的細胞上の抗原結合ＭＨＣ分子とＣＴＬ上のＴ細胞受容体との間に相互作用が生じる工程；２）Ｔ細胞および標的細胞上の共刺激分子の結合によって共刺激シグナルが生じる工程。次いで、ＣＴＬは、標的細胞上の特異的抗原を認識し、例えば、細胞溶解によってこれらの標的細胞の破壊を誘導する。
【００６８】
「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）は、本明細書中で、腫瘍に遊走したリンパ球を指すために使用される。実施形態では、ＴＩＬは、異なる成熟段階または分化段階の細胞であり得る（例えば、ＴＩＬには、いくつかあるリンパ球型の中で特に、ＣＴＬ、Ｔｒｅｇ、および／またはエフェクター記憶Ｔ細胞が含まれ得る）。
【００６９】
「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、宿主内で免疫応答を誘発する腫瘍細胞内で産生される抗原性物質である。腫瘍抗原は、診断試験を用いた腫瘍細胞の同定で有用な腫瘍マーカーであり、がん療法用の有力な候補である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、原発性または転移性の黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および腺癌（乳がん、前立腺がん、卵巣がん、および膵臓がんなど）が含まれるが、これらに限定されないがんに由来し得る。ＴＡＡは、患者特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、ｐ５３、Ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、α−アクチニン−４、チロシナーゼ、ＴＲＰｌ／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐｌＯＯ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ  １、ガングリオシド、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、サバイビン、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。例示的なＴＡＡには、黒色腫（ＰＲＡＭＥ）、滑膜肉腫Ｘ（ＳＳＸ）ブレークポイント２（ＳＳＸ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、およびウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ−１）の選択的に発現された抗原が含まれる。
【００７０】
用語「相同性」または「同一性」は、２つの高分子の間（例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子の間、または２つのポリペプチド分子の間）のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同一の単量体サブユニットで占められる場合；例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンで占められる場合、これらの分子はその位置において相同であるか同一である。２つの配列の間の相同性は、適合する位置または相同性のある位置の数の一次関数である；例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマー中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり；位置の９０％（例えば、１０のうち９）が適合するか相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【００７１】
ポリペプチドの文脈における用語「機能的バリアント」は、天然に存在する配列の１またはそれを超える活性の少なくとも１０％を有することができるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、天然に存在する配列とアミノ酸配列が実質的に同一であるか、実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、その結果、機能的バリアントは、天然に存在する配列の１またはそれを超える活性を有する。
【００７２】
本明細書中で使用される「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質（例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント）を指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）および抗体断片を包含する。例えば、全長抗体は、天然に存在するか、通常の免疫グロブリン遺伝子断片組み換えプロセスによって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）である。実施形態では、抗体分子は、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分（抗体断片など）を指す。抗体断片（例えば、機能的断片）は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））である。機能的抗体断片は、インタクトな（例えば、全長）抗体によって認識される抗原と同一の抗原に結合する。また、用語「抗体断片」または「機能的断片」には、可変領域からなる単離断片（重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片または軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組み換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）など）が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体断片には、抗原結合活性を持たない抗体の一部（Ｆｃ断片または単一のアミノ酸残基など）は含まれない。例示的な抗体分子には、全長抗体および抗体断片（例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ））が含まれる。実施形態では、抗体分子は、単一特異性であり、例えば、抗体分子は、単一のエピトープの結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、多重特異性であり、例えば、抗体分子は、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、二重特異性抗体分子である。本明細書中で使用される「二重特異性抗体分子」は、１つを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える）エピトープおよび／または抗原に対して特異性を有する抗体分子を指す。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「抗原」は、高分子（全てのタンパク質またはペプチドが含まれる）を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、免疫応答（ある特定の免疫細胞の活性化および／または抗体の生成に関与する）を誘発することができる分子である。ＡＰＣ調製のために、抗原は、１またはそれを超える抗原の全長タンパク質または１またはそれを超える抗原の小ペプチドより大きな断片であり得る。いくつかの実施形態では、抗原には、疾患の抗原（例えば、腫瘍抗原、細胞膜抗原、および細胞外基質区画）が含まれ得る。本明細書中で使用される場合、「腫瘍抗原」、または互換的に「がん抗原」には、がん（例えば、免疫応答を誘発することができるがん細胞または腫瘍微小環境）上に存在するか関連する任意の分子が含まれる。腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ウイルス抗原、抗体認識された抗原、その任意の断片、またはその任意の組み合わせであり得る。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「サイトカイン」または「サイトカイン分子」は、天然に存在する野生型サイトカインの全長、断片、またはバリアント（天然に存在するサイトカイン分子の活性の少なくとも１０％を有するその断片および機能的バリアントが含まれる）を指す。実施形態では、サイトカイン分子は、天然に存在する分子の活性（例えば、免疫調節活性）の少なくとも３０、５０、または８０％を有する。実施形態では、サイトカイン分子は、必要に応じて免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングされた受容体ドメイン（例えば、サイトカイン受容体ドメイン）をさらに含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングされている。他の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子（例えば、免疫グロブリンのＦａｂまたはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディの断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、シングルドメイン抗体、二重特異性または多重特異性の抗体）にカップリングされている。
【００７６】
「サイトカインアゴニスト」には、本明細書中で使用される場合、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を惹起するサイトカイン受容体のアゴニスト（例えば、サイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体））が含まれ得る。
【００７７】
「試料」または「組織試料」は、被験体または患者の組織または体液から得た生物試料を指す。組織試料の供給源は、固形組織（新鮮な、凍結した、および／または保存した臓器、組織試料、生検、または吸引物など）；血液または任意の血液成分（例えば、血清、血漿）；骨髄または任意の骨髄成分；体液（尿、脳脊髄液、全血、血漿、および血清など）であり得る。試料には、非細胞画分（例えば、尿、血漿、血清、または他の非細胞性体液）が含まれ得る。他の実施形態では、試料が個体から得られる体液は、血液（例えば、全血）を含む。
【００７８】
用語「被験体」には、免疫応答を惹起することができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）が含まれる。１つの実施形態では、被験体は、患者（例えば、免疫細胞療法を必要とする患者）である。別の実施形態では、被験体は、ドナー（例えば、同種移植を意図する免疫細胞の同種ドナー）である。
【００７９】
用語「実質的に精製された細胞」は、他の細胞型を本質的に含まず、そして／または出発集団中の他の細胞型と比較して富化されている細胞を指す。また、実質的に精製された細胞は、その天然に存在する状態において通常は関連している他の細胞型から分離されている細胞を指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、単純に、その天然の状態で自然に関連している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの態様では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。他の態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されていない。
【００８０】
本開示の種々の態様を、単独、組み合わせ、または前述の実施形態で具体的に考察されていない種々の配置で使用してよく、したがって、前述の態様は、本発明の出願において、先の説明に記載されているか、図面に示す構成要素の詳細な記載および配置に制限されない。例えば、１つの実施形態に記載の態様を、任意の様式で、他の実施形態に記載の態様と組み合わせてよい。
【００８１】
クレーム要素を修飾するためのクレーム中の「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序を示す用語を使用すること自体は、いかなる一方のクレーム要素を他方のクレーム要素と比較した優先順位、先行、または順序や、方法実施の一時的な順序も意味しないが、クレーム要素を区別するために、ある特定の名称を有する一方のクレーム要素を、同一の名称（順序を示す用語の使用を別にして）を有する他方のクレーム要素と区別するためのラベルとして単に使用される。
【００８２】
また、本明細書中で使用される表現および専門用語は、説明を目的とし、制限と見なされないものとする。本明細書中での「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、または「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ」、およびその異形の使用は、以後に列挙した項目およびその等価物ならびにさらなる項目を含むことを意味する。「〜から本質的になる」は、以後に列挙した項目を含むことを意味し、開示の基本的性質および新規の性質に実質的に影響を及ぼさない列挙されていない項目も含む。
【００８３】
ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのＡＰＣの調製
抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を、本明細書中に開示の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。第１に、ｍｏＤＣを、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。組織培養フラスコ中にＰＢＭＣをプレーティングすると、単球が接着する。これらの単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処置するとｉＤＣに分化する。その後に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ、およびＰＧＥ２で処置すると、ｉＤＣがｍＤＣにさらに分化する。
【００８４】
単球、ｉＤＣ、および成熟ＤＣになる前の細胞を、その表面上に提示されるべき予め選択された抗原と接触させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の予備負荷プロセスを用いてこれをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。本明細書中で使用される場合、予備負荷は、単球および／または未熟ＤＣがペプチドを内在化し、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ上へのその後の負荷のためにより短い断片にタンパク質分解的にプロセシングするように誘導されるプロセスを指す。プロセシングされたペプチドは、分化および／または成熟プロセス中に単球および／または未熟ＤＣによって保存され、その後に得られた成熟ＤＣによってＭＨＣ上に負荷され得る。理論に拘束されることを望まないが、予備負荷プロセスを用いて負荷されたペプチドのほとんどが（標準的な最初の１５マーペプチドと比較して）８マー〜１１マーの長さであると考えられる。対照的に、従来のプロセスは、事前に成熟したＤＣ上のＴＡＡペプチドの負荷を指し、ペプチドを細胞内プロセシングを用いずにその元の長さでＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ上に直接負荷するために、ＤＣをペプチドで短期間（典型的には、１〜３時間）パルスする細胞外の方法である。腫瘍ＭＨＣ  Ｉに提示されるペプチドのほとんどが１５マーより短い（典型的には、８〜１０マー）ので、予備負荷を用いて負荷されたペプチドと従来のプロセスとの間のこのサイズの相違が重要である。そのため、１５マーを用いた従来の（すなわち、細胞外負荷）方法によって訓練されたＣＤ８＋ＣＴＬは、短い（８〜１０マー）ペプチドおよび長い（１５マー）ペプチドの負荷の間の内因性の生物物理学的な相違に起因して、腫瘍ペプチド：ＭＨＣに結合しないと予想できる。予備負荷は、ペプチドの細胞内プロセシングを用いてＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子に特異的なペプチドを提示し、したがって、それにより、生理学的に関連するＣＴＬレパートリーのより強力な刺激をもたらすことができ、該レパートリーは腫瘍ペプチド：ＭＨＣにより良好にかつより効率的に結合することができる。さらに、予備負荷を用いて、ペプチドは、ＭＨＣ対立遺伝子と無関係に生物学的に最も好ましいペプチドが負荷されるように、タンパク質分解（患者の間で異なってよい）を介して細胞によって特化され得る。種々の実施形態では、組み合わせ組成物（例えば、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの混合物）およびその作製および使用方法を本明細書中に開示する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＰＣ調製方法は、以下の工程を含むことができる（図２）：
（ａ）複数の単球を準備する工程；
（ｂ）前述の単球の第１のアリコートを、サイトカイン（例えば、ＩＬ−４およびＧＭＣＳＦ）を含む第１の培養培地中で培養し、それにより、前述の単球の第１のアリコートの少なくとも一部の未熟樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導する工程；
（ｃ）前述の単球および／または未熟ＤＣに、１またはそれを超える腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する複数のペプチド（例えば、１５マー）を、例えば、前述のＴＡＡペプチド、ＴＡＡタンパク質全体とのインキュベーションによるか、ペプチドコンジュゲートリポソームの送達を介して送達する工程；
（ｄ）前述の単球および／または未熟ＤＣの培養を継続して、その表面上に６〜１５マーペプチド抗原、好ましくは８〜１１マーペプチド抗原を提示する第１の複数の成熟ＤＣにする工程；
（ｅ）前述の単球および／または複数の未熟ＤＣの第２のアリコートを第２の培養培地中で培養し、それにより、成熟ＤＣへの分化を誘導する工程；
（ｆ）前述の成熟ＤＣ上に複数のＴＡＡペプチドを負荷し、それにより、その表面上にＴＡＡペプチド（例えば、１５マーペプチド）を提示する第２の複数の成熟ＤＣを得る工程；および
（ｇ）前述の第１の複数の成熟ＤＣおよび前述の第２の複数の成熟ＤＣを、約１０：１〜１：１０（例えば、約５：１〜１：５、または約１：１）の比で組み合わせ、それにより、下流での使用（例えば、Ｔ細胞訓練）に適切なＡＰＣを生成する工程。
【００８６】
いくつかの実施形態では、単球を、ＰＢＭＣを少なくともリンパ球富化画分および単球富化画分に溶離することによって獲得することができ、ここで、好ましくは、前述のＰＢＭＣは細胞療法を必要とするがん患者に由来する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、全長ＴＡＡおよび／またはＴＡＡ断片を含むことができる。ペプチドは、種々のＴＡＡから得たか種々のＴＡＡに由来するペプチドのライブラリーであり得る。ペプチドは、８〜１５アミノ酸（８〜１５マー）の長さを有することができる。ＴＡＡは、例えば、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、およびＷＴ−１から選択することができる。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、処置を必要とするがん患者から得る。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、ＨＰＶ＋の頭頸部がんおよび／または子宮頸がんのウイルス腫瘍抗原を含むことができる。
【００８８】
得られたＡＰＣは、その細胞表面上に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉによって提示される８〜１０マー抗原を表示することができ、ここで、８〜１０マーは、単球および／またはｉＤＣによってペプチドからタンパク質分解的にプロセシングされる抗原および／またはペプチドから作出される。
【００８９】
ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのＭＴＣ調製
種々の実施形態では、本明細書中に開示の方法に従って調製したＡＰＣを使用して、多標的化Ｔ細胞（ＭＴＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することができる。例えば、ＴＡＡペプチドに反応性を示すＭＴＣを拡大するためにＰＢＭＣのリンパ球富化画分をＡＰＣと共培養すること（例えば、約４０：１から約１：１までの間の比）によってこの拡大を行うことができる。かかる共培養を、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１のうちの１つまたは複数の存在下で進行させることができる。いくつかの実施形態では、共培養は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ならびに、必要に応じて、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、およびＩＬ−６のうちの１つまたは複数の存在下にあり得る。有利には、本明細書中に開示の方法および組成物を使用して、ＰＢＭＣからＭＴＣまでのプロセス全体の時間を１０〜２０日間まで短縮することができるのに対して、従来の方法には、典型的には、少なくとも２０日間必要である（例えば、Ｐｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１０９：７１−８２（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。得られたＭＴＣを、本明細書中でさらに開示のように、種々のＴ細胞療法で使用することができ
【００９０】
サイトカイン分子
拡大したＭＴＣを治療タンパク質単量体のクラスターで負荷（ディーププライミング（商標））して、さらなる治療上の利点を得ることができる。治療タンパク質単量体の例には、制限されないが、抗体（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ＦｃとＦａｂの混合物）、単鎖抗体、抗体断片、操作したタンパク質（Ｆｃ融合物、酵素、補因子、受容体、リガンド、転写因子、および他の制御因子など）、サイトカイン、ケモカイン、およびヒト血清アルブミンなどが含まれる。これらのタンパク質は、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよい。他のタンパク質が意図され、本開示に従って使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１７／００８０１０４号、米国特許第９，６０３，９４４号、米国特許出願公開第２０１４／００８１０１２号、２０１７年６月１３日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１７／３７２４９号、および２０１８年４月１３日出願の米国特許仮出願第６２／６５７，２１８号（これらの全ての全体が、本明細書中で参考として援用される）に開示のように、任意のタンパク質を、架橋によって可逆的に改変して、クラスターまたはナノゲル構造を形成することができる。負荷した細胞は、多くの治療に適用することができる。例えば、負荷したＭＴＣを、Ｔ細胞療法（養子細胞療法が含まれる）で使用することができる。
【００９１】
治療タンパク質単量体は、１またはそれを超えるサイトカイン分子を含み得る。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの全長、断片、またはバリアント（例えば、１またはそれを超える変異を含むサイトカイン）である。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、腫瘍壊死α（tumor  necrosis  alpha）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、またはその断片もしくはバリアント、または前述のサイトカインのいずれかの組み合わせから選択されるサイトカインを含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、もしくはインターフェロンγ、またはその断片もしくはバリアント、または前述のサイトカインのいずれかの組み合わせから選択される。サイトカイン分子は、単量体または二量体であり得る。
【００９２】
実施形態では、サイトカイン分子は、受容体ドメイン（例えば、サイトカイン受容体ドメイン）をさらに含む。１つの実施形態では、サイトカイン分子は、本明細書中に記載のＩＬ−１５受容体またはその断片（例えば、ＩＬ−１５受容体αの細胞外ＩＬ−１５結合ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子（例えば、本明細書中に記載のＩＬ−１５またはＩＬ−１５スーパーアゴニスト）である。本明細書中で使用される場合、サイトカイン分子のスーパーアゴニスト形態は、天然に存在するサイトカインと比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％高い活性を示す。例示的なスーパーアゴニストはＩＬ−１５  ＳＡである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５  ＳＡは、ＩＬ−１５とＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５結合断片（例えば、ＩＬ−１５受容体αまたはそのＩＬ−１５結合断片）の複合体を含む。
【００９３】
他の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、例えば、免疫グロブリンのＦａｂまたはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディの断片または誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、例えば、Ｆｃ領域、シングルドメイン抗体、二重特異性または多重特異性の抗体）をさらに含む。１つの実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃまたはＦａｂをさらに含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２分子（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃ）である。他の実施形態では、サイトカインアゴニストを、本明細書中に開示の方法および組成物中で使用することができる。実施形態では、サイトカインアゴニストは、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を惹起するサイトカイン受容体のアゴニスト（例えば、サイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体））である。実施形態では、サイトカインアゴニストは、サイトカイン受容体のアゴニスト（例えば、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体））である。
【００９５】
例示的なサイトカインは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１７／３７２４９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
【００９６】
治療での使用および治療方法
予備負荷したＤＣ、ｍＤＣ、組み合わせたＤＣ、ＡＰＣ、ＭＴＣ、および上記のいずれかを含む医薬組成物は、多数の治療的有用性を有する（例えば、がん、自己免疫障害、および感染症の処置が含まれる）。組成物を、ワクチンへの適用において使用することもできる。組成物は、細胞療法（養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練されたＴ細胞療法、富化抗原特異的Ｔ細胞療法、またはＮＫ細胞療法など）のｅｘ  ｖｉｖｏ調製に有用であり得る。種々の樹状細胞組成物を、ワクチン接種またはがん治療のためのＤＣ療法として移入することもできる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、とりわけ、がんを有する被験体を処置するためにがんを有する被験体における免疫応答を誘導する方法を提供する。例示的な方法は、治療有効量の本明細書中に記載の任意の組成物を被験体に投与することを含む。
【００９８】
本明細書中に記載の方法は、本明細書中に開示の任意の組成物を使用することによって被験体におけるがんを処置することを含む。被験体におけるがんの症状を軽減または改善する方法、ならびにがんの成長を阻害し、そして／または１またはそれを超えるがん細胞を死滅させる方法も提供する。実施形態では、本明細書中に記載の方法は、本明細書中に記載の医薬組成物を投与した被験体における腫瘍のサイズを減少させ、そして／またはがん細胞数を減少させる。
【００９９】
実施形態では、がんは血液学的がんである。実施形態では、血液学的がんは、白血病またはリンパ腫である。本明細書中で使用される場合、「血液学的がん」は、造血組織またはリンパ系組織の腫瘍（例えば、血液、骨髄、またはリンパ節に影響を及ぼす腫瘍）を指す。例示的な血液悪性疾患には、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ワンデンシュトレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
実施形態では、がんは固形がんである。例示的な固形がんには、卵巣がん、直腸がん、胃がん、睾丸がん、肛門部のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、子宮頸部扁平上皮がんの癌（carcinoma  of  the  cervix  squamous  cell  cancer）、ファロピウス管の癌、子宮内膜の癌、膣の癌、軟部組織の肉腫、尿道のがん、外陰部の癌、陰茎のがん、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌、脊髄軸の腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前述のがんの転移性病変、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
実施形態では、細胞組成物（またはこれを含む医薬組成物）を、処置または予防すべき疾患に適切な様式で投与する。投与の量および頻度は、患者の健康状態、患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定される。適切な投与量を、臨床試験によって決定してよい。例えば、「有効量」または「治療量」を示す場合、医薬組成物の正確な量を、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、被験体の年齢、体重、および健康状態の個別の相違を考慮して医師が決定することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重）（前述の範囲内の全ての整数値が含まれる）の投与量で投与することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、これらの投与量で複数回投与することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、免疫療法に記載の注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８を参照のこと）。
【０１０２】
実施形態では、医薬組成物を、被験体に非経口投与する。実施形態では、細胞を、被験体に、静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内、または腹腔内に投与する。実施形態では、細胞を、腫瘍またはリンパ節内に直接投与する（例えば、注射する）。実施形態では、細胞を、注入（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８に記載）または静注として投与する。実施形態では、細胞を、注射用デポー製剤として投与する。
【０１０３】
実施形態では、被験体は哺乳動物である。実施形態では、被験体は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスである。実施形態では、被験体はヒトである。実施形態では、被験体は、小児被験体（１８歳未満、例えば、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳未満、またはそれ未満）である。実施形態では、被験体は成人（例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または８０〜９０歳）である。
【０１０４】
併用療法
本明細書中に開示の細胞組成物を、第２の治療剤または手順（１またはそれを超える本明細書中に開示の免疫調節性サイトカインを用いた表面負荷または共投与など）と組み合わせて使用することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、細胞組成物を、放射線療法と組み合わせて投与する。
【０１０６】
実施形態では、細胞組成物および第２の治療剤または手順を、被験体ががんの診断を受けた後に、例えば、被験体からがんが排除される前に投与する／実施する。実施形態では、細胞組成物および第２の治療剤または手順を、同時または併せて投与する／実施する。例えば、一つの処置の送達は、第２の処置の送達を開始したときに、依然として継続されている（例えば、前記処置の投与が重複している）。他の実施形態では、細胞組成物および第２の治療剤または手順を、逐次的に投与する／実施する。例えば、一方の処置の送達を、他方の処置の送達を開始する前に停止する。
【０１０７】
実施形態では、併用療法は、いずれかの薬剤のみを使用する単剤療法よりも有効に処置することができる。実施形態では、第１の処置と第２の処置との組み合わせは、第１の処置または第２の処置のみより有効である（例えば、症状および／またはがん細胞がより減少する）。実施形態では、単剤療法として投与したときに類似の効果を達成するために通常必要とする第１または第２の処置の用量と比較して、併用療法ではより低い用量の第１または第２の処置を使用する。実施形態では、併用療法は、部分的な相加効果、全体的な相加効果、または相加効果を超える効果がある。
【０１０８】
１つの実施形態では、細胞組成物を、療法、例えば、がん療法（例えば、抗がん剤、免疫療法、光力学療法（ＰＤＴ）、手術、および／または照射のうちの１つまたは複数）と組み合わせて投与する。用語「化学療法剤（chemotherapeutic）」、「化学療法剤（chemotherapeutic  agent）」、および「抗がん剤」を、本明細書中で互換的に使用する。細胞組成物の投与および療法（例えば、がん療法）は、逐次的（重複するか、重複しない）または同時であり得る。細胞組成物の投与は、一連の療法（例えば、がん療法）の間で連続的または断続的であり得る。本明細書中に記載のある特定の療法を使用して、がんおよび非がん性疾患を処置することができる。例えば、本明細書中に記載の方法および組成物を使用して、がん性状態および非がん性状態（例えば、結核）におけるＰＤＴの有効性を強化することができる（例えば、Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６１：２５０−２８１に概説）。
【０１０９】
他の実施形態では、細胞組成物を、低分子量または小分子量の化学療法剤と組み合わせて投与する。例示的な低分子量または小分子量の化学療法剤には、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、フルオロウラシル、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（パクリタキセルタンパク質結合）、アクチノマイシン−Ｄ（ダクチノマイシン、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルシウムロイコボリン（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウェハー（カルムスチンインプラントを含むプロリフェプロスパン２０、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウェハー）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（ロイケラン）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デクスラゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシ��（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、エトポシドホスファート、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（リューロクリスチン、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（塩酸メクロレタミン、ムスチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペグアスパラガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスホアミド、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビノレルビン（酒石酸ビノレルビン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、およびボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
別の実施形態では、細胞組成物を、生物製剤と併せて投与する。例示的な生物製剤には、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）；ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン）；ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）；ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）；およびＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）が含まれる。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：組み合わせプロセスの概要
【０１１２】
予備負荷方法の従来の負荷方法との組み合わせからなる例示的な「組み合わせ」法を、図２に示す。簡潔に述べれば、従来法では、ｉＤＣへの分化を誘導するために、単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で最初に処置する。その後に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ□）、ＩＬ−６、ＩＬ−１□、およびＰＧＥ２で処置して、ｉＤＣをｍＤＣに分化させる。次いで、１５マーＴＡＡペプチドを、直接負荷のためにｍＤＣに添加して、１５マー提示ＤＣを含む集団を産生させる。従来の方法によって産生された成熟ＤＣを、必要に応じて、その後の使用のために凍結させることができる。（例えば、細胞療法において）使用準備済みである場合、ＤＣの予め凍結させたアリコートを解凍するか、下記の予備負荷方法由来のＤＣと組み合わせて新鮮なまま使用することができる。
【０１１３】
予備負荷方法では、１５マーＴＡＡペプチドを、単球および／またはｉＤＣ（ｍＤＣとは対照的に）に最初に添加する。成熟ＤＣへの分化後に、６〜１５マー、好ましくは８〜１１マーを提示するＤＣが得られる。これらの６〜１５マーを提示するｍＤＣを必要に応じて凍結し、従来の方法から得た１５マー提示ｍＤＣと直接組み合わせて（例えば、１：１の比）ＤＣの組み合わせを作出することができるか、単独で使用することができる。予備負荷されたＤＣ、従来のＤＣ、またはＤＣの組み合わせを、その後の使用のために凍結することができる。（例えば、細胞療法において）使用準備済みである場合、新鮮なＤＣまたは凍結アリコートを、Ｔ細胞との共培養のために解凍することができる。
【０１１４】
実施例２：ＭＡＲＴ１  １５マーを使用した予備負荷プロセスの概念証明
ＭＡＲＴ１は、いくつかのメラノーマ腫瘍によって発現される腫瘍関連抗原である。ＭＡＲＴ１タンパク質は、２６〜３５位にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子に拘束される免疫原性ペプチドを含む。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する親和性を増強するために２７位にロイシン置換を含むコードされた１０マーペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１）は、ヒトＴ細胞におけるプライミング応答を評価するための原型的な抗原である。この概念証明（ＰＯＣ）実験（図３）において、従来の負荷（成熟ＤＣのペプチドへの１時間の曝露）方法または予備負荷（単球の分化および成熟中の成熟樹状細胞へのペプチドの連続曝露）方法のいずれかを使用して、樹状細胞に重複ＭＡＲＴ１ペプチド（１０マー、１５マー、または２３マー）を負荷する。全てのペプチドは、以下の１０マーを含む：ＭＡＲＴ２６−３５（２７Ｌ）。樹状細胞に、可溶性一本鎖ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１／ＭＡＲＴ１２６−３５（２７Ｌ）特異的ＴＣＲを負荷してペプチド：ＭＨＣ  Ｉ提示を試験する（図３Ａ）。
【０１１５】
図３Ｂに示すように、従来の負荷方法を使用する場合、ＴＣＲは１０マーの提示のみを認識する。対照的に、ＤＣ生成の０日目（単球として予備負荷）または１日目（未熟ＤＣとして予備負荷）にペプチドを予備負荷した場合、ＴＣＲは１０マー、１５マー、または２３マーのプロセシングした１０マーエピトープバージョンを認識する。したがって、このＰＯＣ実験において、ＤＣを予備負荷するとより長いペプチドが生物学的に適切なＭＨＣ  Ｉエピトープにプロセシングおよび提示されることが確認される。
【０１１６】
図３Ｃに示すように、ＭＡＲＴ特異的ＴＣＲによって検出した場合に、ＤＣ生成の０日目および１日目の両方においてＭＡＲＴ１  １５マーペプチドを予備負荷すると、１５マーペプチドの用量範囲にわたって１０マーペプチド：ＭＨＣ  Ｉ複合体が用量反応性に提示される。
【０１１７】
図４Ａは、ＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞のプライミングで用いる１５マーで予備負荷された樹状細胞の機能性を確証するために使用されたストラテジーを示す。
【０１１８】
ＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞を、ペプチド：ＭＨＣ四量体試薬でそのＴＣＲを標識することによって同定することができる（図４Ｂ）。
【０１１９】
図４Ａに示すスキームを使用して、自家Ｔ細胞を、１４日間のＴ細胞を訓練する共培養の０日目および７日目にＴ細胞：ＤＣ比１０：１にてＭＡＲＴ１  １５マーを予備負荷したＤＣで刺激した。図３Ｃに示すように、これらの１５マーで予備負荷されたＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット（１０００個のナイーブＴ細胞中約１個）の標的ペプチド：ＭＨＣエピトープであるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に関してＭＡＲＴ１  １０マーを提示する。図４Ｃでは、２名の健康なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナーについてのＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞の富化を示す。図４Ｄは、ＭＡＲＴ１  １５マー予備負荷ＤＣが、非特異的バイスタンダーＴ細胞よりも優先的にＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞の拡大を駆動することを示す。非負荷ＤＣで刺激しても、ＭＡＲＴ１特異的細胞は拡大も富化もされない（データ示さず）。
【０１２０】
実施例３：ＭＴＣ訓練のための従来法で負荷された樹状細胞、予備負荷された樹状細胞、および従来法／予備負荷の組み合わせで負荷された樹状細胞
ｉｎ  ｖｉｖｏで、抗原ペプチドは、固有のＤＣ依存性様式（すなわち、タンパク質分解の優先度およびＭＨＣハプロタイプは人によって異なる）でプロセシングされ、提示される。予備負荷方法は、単球および／またはｉＤＣが好ましいペプチドを内在化し、タンパク質分解的にプロセシングし、その後にＭＨＣ上に負荷することによって、このカスタマイズ化を利用する（図３中でＭＡＲＴ１について例示）。しかしながら、この方法を、ペプチドの多様なライブラリーを含むように拡大することができる（図５）。この技術は、Ｔ細胞に提示されるライブラリーを拡大し、さらに、患者のＤＣ上に提示され得るペプチドが１５マーライブラリーからの提示を利用できることを確実にする。さらに、より短い８〜１５マーペプチドは、ＭＨＣ  Ｉ上により良好に負荷され得、ＭＴＣにより良く結合する可能性がある。
【０１２１】
従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣがＴＡＡ反応性多標的化Ｔ細胞（ＭＴＣ）を訓練する能力を評価するためのスキームを、図６に示す。ＴＡＡ反応性の腫瘍標的化Ｔ細胞の多様なプールの刺激および拡大が免疫細胞療法に好ましいので、高いペプチド−ＭＨＣ多様性を示すと予想される従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせ（図２に示す）を、従来法で負荷されたＤＣとさらに比較した。負荷のために使用されるペプチドは、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、およびＳＳＸ−２由来の既製の１５マーペプチドプールを含む。健康な３ドナーについて、Ｔ細胞富化自家ＰＢＭＣを、以下のＴＡＡ負荷ＤＣを使用して、０日目および７日目（「１４日間」）または０、７、および１４日目（「２１日間」）に刺激した：（ａ）Ｔ細胞：ＤＣ比１０：１にて従来法で負荷されたＤＣ；（ｂ）Ｔ細胞：ＤＣ比１０：１で予備負荷されたＤＣ；（ｃ）Ｔ細胞：総ＤＣ比１０：１にて従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの１：１組み合わせ；（ｄ）Ｔ細胞：総ＤＣ比５：１にて従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの１：１組み合わせ。１４日目または２１日目の採取の際に、ＭＴＣを、ＴＡＡ負荷ＤＣおよび非負荷ＤＣと一晩共培養してＴＡＡ特異的反応性を査定し、抗原負荷共培養物と非負荷共培養物との間の活性化Ｔ細胞のパーセントの相違として比較する。ドナー間の変動は予想通り高かったが、全てのＤＣ条件でＴＡＡ反応性Ｔ細胞が富化される（図７）。一般に、２１日間の培養物は、第３の刺激に起因して、１４日間の培養物と対比して反応性が増加する。３／３ドナーについて、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせ（１０：１）を使用して訓練した培養物における１４日目までの反応性は、従来法で負荷されたＤＣを使用して訓練された培養物において２１日目までに達成された反応性に等しいかより高かった。
【０１２２】
１名のドナーについて、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８  Ｔ細胞区画におけるＴＡＡ反応性を比較し、ＴＡＡ負荷ストラテジーが異なるとＴ細胞反応性の特徴が異なり得ることが明らかとなった（図８）。簡潔に述べれば、従来法で負荷されたＤＣでＴ細胞を訓練するとＴＡＡ反応性がＣＤ８区画において排他的に得られたのに対して、予備負荷されたＤＣまたは従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせでＴ細胞を訓練するとＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方においてＴＡＡ反応性が得られた。これらの結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞訓練のために使用したＤＣによる抗原提示の多様性が増加すると得られるＴ細胞産物の多様性が増加し得ることを示す。
【０１２３】
図６に示すスキームを修正して、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣが異なるＴＡＡ反応性ＭＴＣを訓練する能力を直接評価した。簡潔に述べれば、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ−１、およびサバイビン由来の既製の１５マーペプチドプールの混合物に、等モルのＭＡＲＴ１  １５マーを補充した。ＭＡＲＴ１  １０マー保有ＡＰＣで刺激したときにＭＡＲＴ１  １０マー特異的Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２：０１個体から再現可能に拡大することができるので、このストラテジーは、反応性の多様性についての代替読み取りとしてＭＡＲＴ１  １０マー特異的細胞を使用することを試みた。
【０１２４】
従来法で負荷されたＤＣのみまたは従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせのいずれかを使用したＴＡＡ反応性Ｔ細胞の拡大後、Ｔ細胞を、ＴＡＡ／ＭＡＲＴ１  １５マーペプチドまたはＭＡＲＴ１  １０マーで刺激し、Ｔ細胞活性化応答を、ＩＦＮ−γ産生のフローサイトメトリー分析を使用して査定した（図９）。従来法で負荷されたＤＣのみを使用して訓練されたＴ細胞は、１５マーペプチドに対する反応性を示したが、ＭＡＲＴ１  １０マーに対する特異性はなかった。対照的に、従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせを使用して訓練されたＴ細胞は、ＴＡＡおよびＭＡＲＴ１  １５マーならびに生物学的に関連することが確証されたＭＡＲＴ１  １０マーに対する反応性を含む混合反応特性を示した。ペプチド−ＭＨＣ四量体染色によってＭＡＲＴ１  １０マー特異性を確認した（データ示さず）。従来法で負荷されたＤＣおよび予備負荷されたＤＣの組み合わせによって訓練されたＴ細胞産物において認められた反応性の多様性は、ＴＡＡ提示ＤＣの多様性が、拡大のためにＤＣが刺激することができるＴＡＡ反応性Ｔ細胞の好ましい多様性を支持することができることを示す。
【０１２５】
実施例４：予備負荷すると市販の１５マーライブラリーから８〜１１マーに反応性を示すＭＴＣを単離することが可能である
採取した産物中のより小さなペプチドに反応性を示すＭＴＣを同定するために、ＳＳＸ２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビン、およびＷＴ１のライブラリーを含む５つの多様な１５マーペプチドライブラリーのプールを使用して組み合わせ法を行った。プールされたライブラリーは、１２５のＰＲＡＭＥ由来ペプチドを含む総数３５６のペプチドからなっていた。簡潔に述べれば、予備負荷方法において（図１０Ａ）、これらのペプチドをＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で富化単球に添加した。単球をｉＤＣに変換するための１日間の培養後、細胞をＴＮＦ□、ＩＬ−６、ＩＬ−１□、およびＰＧＥ２とさらに２日間インキュベートして、６〜１５マーペプチドを発現する成熟ＤＣにｉＤＣを変換させた。対照的に、従来の方法は、最初に単球をｉＤＣに変換し、次いで、１５マーペプチドライブラリープールでの負荷前にｍＤＣに変換した。予備負荷ＤＣおよび従来のＤＣを１：１で混合し、これを使用して、０日目および７日目にＴ細胞：総ＤＣ比１０：１で刺激した１４日間継続する共培養においてＴ細胞プールを活性化し、拡大した。
【０１２６】
産物中のより小さなプロセシングされたペプチドに反応性を示すＭＴＣを同定するために、採取したＭＴＣを市販のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（選択されたＰＲＡＭＥ由来９マーおよび１０マーペプチドで負荷されたフルオロフォアコンジュゲート四量体）とインキュベートした。９マーおよび１０マー負荷四量体に反応性を示すＴＣＲを保有するＭＴＣを、四量体染色に基づいたフローサイトメトリーによって同定する（図１０Ｂ）。ＭＡＲＴ１２６−３５（２７Ｌ）四量体を、四量体への非特異的結合の陰性対照として使用する。本研究では、免疫学的に有意な９マーおよび１０マーに反応性を示すクローンを既製の多様性の高いペプチドプールから単離することができることを示す。
【０１２７】
実施例５：予備負荷ＤＣおよび従来／予備負荷組み合わせＤＣが抗原発現がん細胞を認識するＴ細胞を刺激して拡大する
ＴＡＡ  １５マー予備負荷ＤＣがＴＡＡ発現がん細胞を認識するＴＡＡ反応性Ｔ細胞を刺激して拡大する能力を査定するために、１５マーペプチドの長さのＰＲＡＭＥのライブラリーを使用して予備負荷方法を行った。反応性についての陰性対照を提供するために、非負荷ＤＣを使用して、同一の出発Ｔ細胞プールを並行プロセス（例えば、さらなるプロセスを並行して行ったが、ＰＲＡＭＥ  ＴＡＡペプチドをＤＣに添加しなかった）において刺激した。ＴＡＡ負荷ＤＣまたは非負荷ＤＣとの共培養を介してＰＲＡＭＥ反応性について評価した場合、７．７％のＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞が特異的に活性化され、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡによって測定したところ、ＵＬＯＱ（１×１０４ｐｇ／ｍＬ）を超えてＩＦＮ−γ分泌が増加した（図１１、左側のパネル）。対照的に、ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞は、無関係のＴＡＡ  ＷＴ１で予備負荷されたｍＤＣに対する活性化応答は示さず、非負荷ＤＣで訓練されたＴ細胞は抗原特異的活性化やＩＦＮ−γ分泌を示さなかった。部分的にＨＬＡ適合するＰＲＡＭＥ＋がん細胞株を用いて２４時間培養した場合、ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞は、３／６のがん細胞株（Ａ３７５、ＬＮ１８、およびＵ２−ＯＳ）に対する応答においてベースラインを超える活性化を示した。ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞はがん細胞共培養においてＩＦＮ−γ分泌が変動したが、Ｔ細胞活性化はＩＦＮ−γ分泌の増加に関連していた（図１１、右のパネル）。非標的化Ｔ細胞のみは、Ａ３７５細胞に対する応答においてベースラインを超える活性化を示し（潜在的に、同種間相互作用に起因する）、ＰＲＡＭＥ標的化Ｔ細胞よりＩＦＮ−γの分泌量は一貫して低かった。
【０１２８】
均等物
本開示は、とりわけ、抗原特異的Ｔリンパ球を調製するための新規の方法およびシステムを提供する。本開示の特定の実施形態を考察しているが、上記実施形態は、例示であり、本発明を制限しない。本明細書を精査すれば、本開示の多数の変形形態が当業者に明らかとなる。本開示の全ての範囲は、特許請求の範囲の均等物の全範囲を伴う特許請求の範囲およびかかる変形形態を伴う明細書を参照することによって決定されるものとする。
【０１２９】
参照による援用
国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１７／２１８５３３号、ＷＯ／２０１９／０５０９７７号、ＷＯ／２０１９／０５０９７８号、ＷＯ２０１９／０１０２２４号、ＷＯ／２０１９／０１０２１９号、およびＷＯ／２０１９／０１０２２２号を参照する。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許、公開特許出願、および配列データベースのエントリーは、各々の刊行物または特許または配列データのエントリーが参考として援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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