(57)【要約】  本開示は、殺有害生物剤を検出するための方法およびキットを提供する。細胞表面でアセチルコリンエステラーゼを発現させることにより、迅速な殺有害生物剤スクリーニング、殺有害生物剤または殺虫剤の同定および定量が実現され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺有害生物剤を検出する方法であって、
（ａ）試料を、アセチルコリンエステラーゼを発現する細胞と接触させること、
（ｂ）アセチルコリンエステラーゼ基質を、前記細胞と接触させること、および
（ｃ）前記アセチルコリンエステラーゼ基質に起因する反応生成物を検出すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
アセチルコリンエステラーゼ基質が、アセチルコリン、アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）、プロピオニルチオコリン、またはアセチル−３−メチルコリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応生成物に蛍光指示薬を添加することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光指示薬が、５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］（ＤＴＮＢ）、ジチオジニコチン酸（ＤＴＮＡ）、２，２’−ジチオジピリジン（２−ＰＤＳ）、ヒドロキシルアミン、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ／フェノール／アミノアンチピリン、ＡｕＣｌ4の存在下でのＡｕ−ＮＰシード、レゾルフィンブチレート、酢酸インドキシル、Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル）フェニル］マレイミド、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬）、量子ドット（ＱＤ）、チオールグリーン指示薬またはＡｂＲｅｄ指示薬を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アセチルコリンエステラーゼ基質がＤＴＮＢであるという条件で、反応生成物が２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、前記殺有害生物剤を定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アセチルコリンエステラーゼが、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、または
（ｉｉ）膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、
である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アセチルコリンエステラーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料が農産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
農産物をエッペンドルフチューブ内でペッスルを用いて粉砕するステップ、前記農産物をＱ−チップを用いてディッピングするステップ、または前記農産物を、水、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ、アセトン、もしくはエタノールを含む抽出溶液中に浸漬するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
殺有害生物剤が、アセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
殺有害生物剤が有機リン酸エステル（ＯＰ）またはカルバメート（ＣＢ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＯＰが、マラチオン、マラオキソン、パラオキソン、メチルパラチオン、ダイアジノン、メタミドホス、アセフェート、クロルピリホス、ジメトエート、フェニトロチオン、プロフェノホス、トリアゾホス、またはオメトエートを含み、ＣＢが、カルバリル、ピリミカルブ、またはカルボフラン、メトミル、チオジカルブ、オキサミル、メチオカルブ、またはアルジカルブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に独立に提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼの反応生成物に基づき、殺有害生物剤を同定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるアセチルコリンエステラーゼ変異体または異なる生物に由来するアセチルコリンエステラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
フィンガープリントライブラリーとして異なる殺有害生物剤の発色パターンを記録することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
フィンガープリントライブラリーを比較することにより、未知の殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
機械学習により、異なる発色パターンを有する殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
機械学習が、ロジスティック回帰分析、デシジョンツリー（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）、サポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）、ＲａｎｄｏｍまたはｅＸｔｒｅｍｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｂｏｏｓｔｉｎｇを含むソフトウェアにより実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に様々な活性で独立に提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
様々な活性を有するアセチルコリンエステラーゼを発現させるために異なる細胞濃度が使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アセチルコリンエステラーゼが、プラスミド一過性トランスフェクション、安定なトランスフェクションまたはバキュロウイルス導入により細胞中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
アセチルコリンエステラーゼが、細胞または前記バキュロウイルスの包埋体上に提示される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
バキュロウイルスが、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
殺有害生物剤を検出するためのキットであって、
細胞上で発現されるアセチルコリンエステラーゼ、および
アセチルコリンエステラーゼ基質
を含むキット。
【請求項２８】
蛍光指示薬をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
殺有害生物剤が有機リン酸エステル（ＯＰ）またはカルバメート（ＣＢ）を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
細胞が、懸濁物、チューブ、チップ、またはプレート中にある、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６２／７４７，２５８号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、危険性のある殺有害生物剤、殺虫剤等を検出する分野に一般的に関する。より具体的には、本開示は、殺有害生物剤、殺虫剤等を検出するための方法およびキット、ならびに殺有害生物剤、殺虫剤等を検出するためのプラスミド、バキュロウイルス、細胞、およびそれらを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
農作物の生産を脅し、および／または病気を運ぶ害虫を管理するために、殺有害生物剤または殺虫剤が農業で一般的に使用される［１］。殺虫剤を徹底利用すると、農産物中の残留物がヒトおよびその他の動物の健康に障害をもたらすおそれがあり、重大な生態毒性学上の問題を引き起こす。有機リン酸（ＯＰ）およびカルバメート（ＣＢ）殺虫剤は、その高い有効性および低い持続性に起因して最も一般的に使用される殺有害生物剤である［２］。昆虫内のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ；ＥＣ３．１．１．７）の活性部位をブロックするために、ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤が開発された。ＡＣｈＥは、シナプス間隙内の神経伝達物質アセチルコリンの加水分解を触媒することにより、神経刺激を終結させる膜会合型酵素である。ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤は、触媒三残基のセリンをリン酸化またはカルバモイル化し、したがってシナプス後膜における神経刺激の終結を阻止し、その結果アセチルコリンの蓄積および昆虫神経系の連続刺激を引き起こし、最終的に昆虫を死に至らしめる［３］。脊椎動物のＡＣｈＥは構造および機能において昆虫酵素と類似しているので、ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤はしたがってヒトにとっても有毒である［４］。ＡＣｈＥの活性部位をブロックする主要な殺有害生物剤の構造を下記に示す。
【０００４】
【化１】
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ＡＣｈＥはＯＰ化合物およびＣＢ化合物の標的であるので、殺虫剤残留物の検出は、したがってＡＣｈＥの加水分解能力に依存し得る。神経伝達物質アセチルコリンはＡＣｈＥによりチオコリンに触媒的に加水分解される。溶液中のスルフヒドリル基を推定するためのエルマン試薬ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］）を適用することにより、検出可能な黄色の生成物ＴＮＢ（２−ニトロ−５−チオ安息香酸）が生成し、ＯＤ412nmにおいて測定され得る［５］。ＯＰ系またはＣＢ系殺虫剤が存在すると、ＡＣｈＥによるアセチルコリンの加水分解プロセスはブロックされ、黄色生成物の形成が阻害される。
【０００５】
このような毒物に人々や家畜が偶発的に曝露されるのを厳密に規制および阻止するために、査察機関は、農産物が許容度を上回る残留殺有害生物剤を少しでも含有するか検査するのに十分なＡＣｈＥの供給を要求する。現在のところ、最も一般的なＡＣｈＥ源は、イエバエの頭部から抽出され、ハエの飼育、抽出、ショ糖濃度勾配遠沈、酵素精製、および活性アッセイを必要とする［６］。これは、費用がかかり、労力を要し、また時間のかかるプロセスである。それに加えて、冗長且つやっかいな精製手順に起因して、ＡＣｈＥ収率は低いおそれがある。さらに、精製されたＡＣｈＥは粉末にしなければならない、または保存、出荷、および適用するために、プレートのウェルにコーティングされなければならない。ＡＣｈＥの粉末は可溶化され、残留殺虫剤の検出前に反応プレートのウェル中に適用されなければならない。したがって、殺虫剤残留物を検出するためのより良い戦略が必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
バキュロウイルスは、農業用途および生物工学用途に対する汎用ツールである。バキュロウイルスは、野外において害虫管理するための微生物として長年役目を果たしてきた。バキュロウイルスは、工学操作されたタンパク質を製造するための主要ツールの１つとしても役目を果たしている［７］。この系は、様々な用途、例えばワクチン、実験用タンパク質、工業用タンパク質、検出キット用の試薬等に適するタンパク質を、高い収率および正しい翻訳後修飾を実現しつつ生成することができる［８］。オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は、鱗翅目の昆虫および細胞株にのみ感染するタイプバキュロウイルス種である。このウイルスは、１３４ｋｂの二本鎖閉環状ＤＮＡゲノムを有し、１５４個を超えるポリペプチドのコード能を備える［９］。
当技術分野における必要性を考慮して、本発明者らは、組換えバキュロウイルスを使用して、細胞、例えば昆虫細胞の表面にＡＣｈＥを提示させることにより、殺虫剤残留物、例えばＯＰおよびＣＢの検査においてきわめて高感受性である細胞ベースの新規検出システムを開発することとした。殺虫剤を機能的に検出するために、ＡＣｈＥは細胞表面に提示されるので、ＡＣｈＥの抽出および精製は不要で、検出システム全体に関する生産時間およびコストは抑制され得る。検出システムを最適化するために、組換えウイルス感染条件および凍結乾燥の効果を分析した。
【０００７】
本出願では、本発明者らは、殺有害生物剤、例えば有機リン酸エステル（ＯＰ）およびカルバメート（ＣＢ）（農業実践において頻繁に適用される２つの主要な殺虫剤）を検出するための方法およびキットを開発する。本出願は、殺虫剤を含む殺有害生物剤を検出するための便利且つ迅速な解決策を提供する。これに加え、本発明者らは、１回の迅速分析において殺有害生物剤の種およびその濃度の両方を決定することができる方法および殺有害生物剤迅速スクリーニングシステムをさらに開発する。有利には、本方法は将来的なデータインプットにより継続的に改善され得る。
【０００８】
１つの態様では、殺有害生物剤を検出するための方法であって、
（ａ）試料を、アセチルコリンエステラーゼを発現する細胞と接触させること、
（ｂ）アセチルコリンエステラーゼ基質を前記細胞と接触させること、および
（ｃ）前記アセチルコリンエステラーゼ基質に起因する反応生成物を検出すること
を含む方法が本明細書で提供される。
別の態様では、殺有害生物剤を検出するためのキットであって、細胞上で発現されるアセチルコリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ基質を含むキットが本明細書で提供される。
【０００９】
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ基質は、アセチルコリン、アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）、プロピオニルチオコリン、またはアセチル−３−メチルコリンを含み得る。
好ましくは、方法は、反応生成物に蛍光指示薬を添加するステップをさらに含み得る。
好ましくは、蛍光指示薬は、５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］（ＤＴＮＢ）、ジチオジニコチン酸（ＤＴＮＡ）、２，２’−ジチオジピリジン（２−ＰＤＳ）、ヒドロキシルアミン、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ／フェノール／アミノアンチピリン、ＡｕＣｌ4存在下でのＡｕ−ＮＰシード、酪酸レゾルフィン、酢酸インドキシル、Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル）フェニル］マレイミド、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬）、量子ドット（ＱＤ）、チオールグリーン指示薬またはＡｂＲｅｄ指示薬を含み得る。
【００１０】
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ基質がＤＴＮＢであるという条件で、反応生成物は２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）であってもよい。
好ましくは、方法は、殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、殺有害生物剤を定量するステップをさらに含み得る。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、または
（ｉｉ）膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ
であり得る。
より好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む。
【００１１】
好ましくは、試料は農産物であり得る。
好ましくは、方法は、農産物をエッペンドルフチューブ内でペッスルを用いて粉砕するステップ、または農産物をＱ−チップを用いてディッピングするステップをさらに含み得る。あるいは、方法は、水、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ、アセトン、またはエタノールを含む抽出溶液中に農産物を浸漬するステップをさらに含み得る。
好ましくは、殺有害生物剤は、アセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物を含み得る。
より好ましくは、殺有害生物剤は有機リン酸エステル系（ＯＰ系）またはカルバメート系（ＣＢ系）を含み得る。
【００１２】
好ましくは、ＯＰは、マラチオン、マラオキソン、パラオキソン、メチルパラチオン、ナレッド、ジスルホトン、トリクロルホン、トリアゾホス、ダイアジノン、ジメトエート、ホキシム、イソキサチオン、ピリダフェンチオン、ピラクロホス、テルブホス、プロフェノホス、アジンホスメチル、イソフェンホス、ピリミホスメチル、モノクロトホス、テメホス、イサゾホス、フェンチオン、キナルホス、ヘプテノホス、ホスメット、チオメトン、クロルピリホス、プロチオホス、クロルフェンビンホス、シアノホス、エチオン、メチダチオン、メカルバム、オキシデメトンメチル、デメトン−Ｓ−メチル、ホサロン、メタミドホス、ホルモチオン、ホレート、ホスファミドン、フェニトロチオン、アセフェート、オメトエート、イソチオエート、バミドチオン、フェントエート、またはジクロトホスを含み、ＣＢは、カルボスルファン、フェノブカルブ、ピリミカルブ、カルバリル、カルボフラン、プロポクスル、ブトカルボキシム、ベンフラカルブ、ベンジオカルブ、メトルカルブ、メトミル、チオファノックス、チオジカルブ、イソプロカルブ、ＸＭＣ、キシリルカルブ、メチオカルブ、オキサミル、またはホルメタナートを含み得る。
【００１３】
一実施形態では、２種以上のアセチルコリンエステラーゼが、好ましくは異なるウェル中の細胞上に独立に提示されることにより、本方法またはキットにおいて適用され得る。
好ましくは、本方法は、２種以上のアセチルコリンエステラーゼの反応生成物に基づき、殺有害生物剤を同定するステップをさらに含み得る。
より好ましくは、２種以上のアセチルコリンエステラーゼは、異なるアセチルコリンエステラーゼ変異体または異なる生物に由来するアセチルコリンエステラーゼであり得る。あるいは、アセチルコリンエステラーゼは、異なるウェル中の細胞上に様々な発現レベルで独立して提示され得る。
好ましくは、本キットは蛍光指示薬をさらに含み得る。任意に、キットは、テリトレムＢ、塩酸ドネペジル、またはシクロペニンを含む陽性対照をさらに含み得る。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、細胞表面、バキュロウイルス、またはバキュロウイルスの包埋体上に提示され得る。
好ましくは、細胞は凍結乾燥され得る。好ましくは、細胞は懸濁物、チューブ、チップ、またはプレート内にあり得る。任意に、プレートはシングルまたはマルチウェルプレートであり得る。
【００１４】
１つの態様では、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、または
（ｉｉ）細胞表面の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ
をコードするヌクレオチド配列、
ｈｒ１−ｈｓｐ７０デュエルプロモーター、
ｐ１０プロモーター、および
ミツバチメリチンシグナルペプチド（ＨＭ）および／または六量体ヒスチジンタグ（６Ｈ）
を含むプラスミドが本明細書で提供される。
【００１５】
１つの態様では、前記プラスミドでトランスフェクトされた細胞により生み出されたバキュロウイルスが本明細書で提供される。
１つの態様では、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、または
（ｉｉ）細胞表面の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ
を発現する細胞であって、
前記アセチルコリンエステラーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む細胞が本明細書で提供される。
【００１６】
１つの態様では、前記プラスミドを用いて細胞をトランスフェクトすること、または前記バキュロウイルスで細胞を感染させることを含む、殺有害生物剤を検出するための細胞を調製する方法が本明細書で提供される。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、ミバエ、イエバエ、ヒト、マウス、ラット、ツマジロクサヨトウ、ミジンコ、ニワトリ、ガ、アブラムシ、ミツバチ、小エビ、またはサカナ由来であり得る。
好ましくは、ヌクレオチド配列は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオミジンコ（Ｄａｐｈｎｉａ  ｍａｇｎａ）、またはミカンコミバエ（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ  ｄｏｒｓａｌｉｓ）に由来し得る。
【００１７】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸をコードし得る。
好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸をコードする配列番号２、または配列番号３のアミノ酸をコードする配列番号４であり得る。
好ましくは、プラスミドはレポーター遺伝子をさらに含み得る。より好ましくは、レポーター遺伝子はＥＧＦＰ遺伝子およびｐａｇプロモーターを含み得る。
好ましくは、プラスミドは、配列番号５または配列番号６の配列を含み得る。
【００１８】
好ましくは、細胞はスポドプテラ・フルギペルダＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞であり得る。
好ましくは、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(ＡｃＭＮＰＶ）またはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）であり得る。
好ましくは、ＡｃＭＮＰＶは、スポドプテラ・フルギペルダＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞内で繁殖する。
好ましくは、細胞は鱗翅目の細胞である。
好ましくは、細胞は、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）昆虫細胞である。
好ましくは、ＡｃＭＮＰＶの感染多重度（ＭＯＩ）は、０．１〜１０、０．２〜５、または０．５〜２である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】バキュロウイルス発現ベクター系による組換え完全長ＡＣｈＥおよび融合ＡＣｈＥの構築を例証する図である。試験で使用される発現コンストラクトの略図。（ａ）ＡＣｈＥ−ＦＬは、完全長ＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）ｃＤＮＡを含有する。（ｂ）ＡＣｈＥ−６ＭＣは、トランケートされたＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）を含有し、これによりＡＣｈＥ酵素のＴＭおよびＣＴＤは欠失し、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質由来のものと置き換わっている（すなわち、６ＭＣ）。（ｃ）ＡＣｈＥを発現しない対照バキュロウイルス（Ｃｏｎｔ−ｂａｃ）を生成させるための空ベクター（ｐＡＢＥＧｈｈｐ１０）。Ａｃ−１２５０ｂｐおよびＡｃ−１４３３ｂｐ：組換えウイルスを生成する相同的組換え用のバキュロウイルスのゲノムに由来するラテラル配列。ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子。ｐａｇ：ｐａｇプロモーター。ｈｒ１−ｈｓｐ７０−ｐ１０：ｈｒ１−ｈｓｐ７０およびｐ１０プロモーターを含有するデュエルプロモーター。ＨＭ：ミツバチメリチンシグナルペプチド。６Ｈ：六量体ヒスチジンタグ。
【図２】細胞表面発現型ＡＣｈＥ組換えタンパク質に関するＡＣｈＥ活性の決定を示す図である。０．５のＭＯＩ、および３日間のインキュベーションにより、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびＣｏｎｔ−ｂａｃにＨｉ５細胞を個別に感染させた。感染細胞内で発現したＡＣｈＥの活性を測定し、黄色により評価した。（ａ）標準溶液曲線はＡＣｈＥ標準溶液（Ａｂｃａｍ社）により確立された。個々のＣｏｎｔ−ｂａｃ（ｂ）、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ｃ）、およびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ｄ）クローンを、基質アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）およびエルマン試薬ＤＴＮＢ溶液を使用して９６ウェルプレート中で可視化した。
【図３−１】細胞表面発現型ＡＣｈＥタンパク質に対する凍結乾燥の効果について、その評価を示す図である。０．５のＭＯＩを用いて３日間、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、またはＣｏｎｔ−ｂａｃ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ感染させたＨｉ５細胞を凍結乾燥に５時間付した。模擬：ウイルスに感染していない細胞。−ｌｙｏ：凍結乾燥されない細胞。＋ｌｙｏ：凍結乾燥した細胞。（ａ）蛍光および明視野顕微鏡により検査した細胞形態。
【図３−２】細胞表面発現型ＡＣｈＥタンパク質に対する凍結乾燥の効果について、その評価を示す図である。０．５のＭＯＩを用いて３日間、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、またはＣｏｎｔ−ｂａｃ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ感染させたＨｉ５細胞を凍結乾燥に５時間付した。模擬：ウイルスに感染していない細胞。−ｌｙｏ：凍結乾燥されない細胞。＋ｌｙｏ：凍結乾燥した細胞。（（ｂ）組換えバキュロウイルス感染細胞のＡＣｈＥ活性を凍結乾燥有り／無しで決定した。
【図４−１】ＡＣｈＥ膜タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの最適化を示す図である。（ａ）示すように、様々なＭＯＩを用いてｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、およびＣｏｎｔ−ｂａｃ（Ｃｏｎｔ）に個別に感染させた９６ウェルＨｉ５細胞試料についてＡＣｈＥ活性の決定を可視化する。感染条件のいずれも三重で実施した。
【図４−２】ＡＣｈＥ膜タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの最適化を示す図である。（ｂ）感染細胞に由来するＡＣｈＥ活性を定量化する。
【図５−１】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ＡＣｈＥ−ＦＬ−ｂａｃ（ＦＬ）、ＡＣｈＥ−６ＭＣ−ｂａｃ（６ＭＣ）、またはＷＴ−ｂａｃ（ＷＴ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は、（ａ）パラオキソンエチルである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−２】図５−１続き。
【図５−３】図５−２続き。
【図５−４】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ＡＣｈＥ−ＦＬ−ｂａｃ（ＦＬ）、ＡＣｈＥ−６ＭＣ−ｂａｃ（６ＭＣ）、またはＷＴ−ｂａｃ（ＷＴ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は、（ｂ）マラオキソンである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−５】図５−４続き。
【図５−６】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ＡＣｈＥ−ＦＬ−ｂａｃ（ＦＬ）、ＡＣｈＥ−６ＭＣ−ｂａｃ（６ＭＣ）、またはＷＴ−ｂａｃ（ＷＴ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は（ｃ）カルボフランである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−７】図５−６続き。
【図５−８】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ＡＣｈＥ−ＦＬ−ｂａｃ（ＦＬ）、ＡＣｈＥ−６ＭＣ−ｂａｃ（６ＭＣ）、またはＷＴ−ｂａｃ（ＷＴ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は（ｄ）カルバリルである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−９】図５−８続き。
【図６】バキュロウイルス発現ベクター系について、７つの種に由来する組換えＡＣｈＥのコンストラクトを示す図である。（ａ）キイロショウジョウバエ（Ｙ４０８Ｆ変異体）、（ｂ）ホモサピエンス（Ｈｓ）、（ｃ）ラット（Ｒｎ）、（ｄ）セイヨウミツバチ（Ａｍ）、（ｅ）スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）、（ｆ）オオミジンコ（Ｄａｍ）、および（ｇ）ミカンコミバエ（Ｂｄ）に由来する組換えＡＣｈＥに関する発現コンストラクトの略図。ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子。ｐａｇ：ｐａｇプロモーター。ｈｒ１−ｈｓｐ７０−ｐ１０：ｈｒ１−ｈｓｐ７０およびｐ１０プロモーターを含有するデュアルプロモーター。ＨＭ：ミツバチメリチンシグナルペプチド。６Ｈ：六量体ヒスチジンタグ。
【図７−１】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ａ）クロルピリホス、（ｂ）エチオンを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図７−２】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ｃ）カルバリル、（ｄ）カルボフランを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図７−３】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ｅ）メトミルを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図８−１】多重種ＡＣｈＥによりアッセイされた殺有害生物剤残留物の迅速同定を実現するための機械学習の使用を示す図である。（ａ）所定の濃度を有する各殺有害生物剤について、多重種ＡＣｈＥプラットフォームから得られた検出結果を収集し、２１パラメーターデータセットに編成した。（ｂ）これらのデータセットを使用して同定モデルを訓練および構築した。
【図８−２】多重種ＡＣｈＥによりアッセイされた殺有害生物剤残留物の迅速同定を実現するための機械学習の使用を示す図である。所定の濃度を有する各殺有害生物剤について、多重種ＡＣｈＥプラットフォームから得られた検出結果を収集し、２１パラメーターデータセットに編成した。（ｂ）これらのデータセットを使用して同定モデルを訓練および構築した。（ｃ）未知の殺有害生物剤決定因子に由来するデータセットをインプットすると、同定モデルは殺有害生物剤および濃度（ｄ）の両方を区別し得る。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の上記およびその他の態様が、本明細書に記載されるその他の実施形態を勘案しながら今ここにより詳載される。本発明は異なる形態で具体化され得るものと認識すべきであり、また本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が網羅的且つ完全であり、また本開示により本発明の範囲が当業者に十分に伝わるように提供される。
【００２１】
本明細書において本発明の説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、また本発明を限定するように意図するものではない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が別途明示しない限り多重形もやはり含まれるように意図されている。
本明細書で使用する場合、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「〜を含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜により特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」、またはその任意の他の変形形態は、非排他的な包含を網羅するように意図されており、明確に示されたあらゆる制限の対象となる。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、または方法は、必ずしもそのような要素にのみ限定されるわけではなく、明示的に列挙されないまたはそのような組成物、混合物、プロセス、または方法に固有のその他の要素を含み得る。
【００２２】
移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特定されないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。特許請求の範囲で使用される場合、列挙した材料（それと通常関連する夾雑物を除く）以外の材料の包含を特許請求の範囲から排除する。慣用句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」が、プリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲本文の条項中に現れた場合、当該条項に定める要素のみを制限し、その他の要素は、特許請求の範囲から全体として除外されない。
移行句「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物、方法（材料、ステップ、特性、コンポーネント、または要素を、文言上開示されたものに付加して含む）を定義するのに使用されるが、ただしこれらの追加の材料、ステップ、特性、コンポーネント、または要素が、請求項に係る発明の基本的且つ新規の特徴に対して顕著に影響を及ぼさないことを前提とする。  用語「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の間の中間的な位置を占める。
【００２３】
出願者らが、非制限的用語、例えば「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等を用いて発明またはその一部分を定義した場合、（別途記載がなければ）説明は、用語「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用した発明がやはり記載されるものと解釈されるべきであると容易に理解されるはずである。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、数値には、例えば数値を決定するために採用された測定デバイス、方法が有する固有の誤差変動、または試験対象において存在するばらつきが含まれることを表すのに使用される。一般的に、該用語は、状況に応じておよそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％またはそれ未満の変動を含むように意図されている。
【００２４】
特許請求の範囲における用語「ｏｒ」の使用は、代替するもののみを指すことが明示されない限り、または（代替するもののみと「および／または」とを指すという定義を本開示が支持するものの）代替するものは相互排他的である場合に該当しない限り、「および／または」を意味するために使用される。
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で引用されるすべての公開資料、特許出願、特許、およびその他の参考資料は、参考資料が提示されている文および／またはパラグラフに関連する教示に関して参考としてそのまま組み込まれている。
【００２５】
本明細書で使用する場合、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）とは、神経伝達物質アセチルコリンの加水分解を触媒することにより神経シグナルを終結させるα／βフォールドヒドロラーゼタンパク質スーパーファミリー内のセリンヒドロラーゼを意味する。１つの実施形態では、ＡＣｈＥは、キイロショウジョウバエ（配列番号１）、ホモサピエンス（配列番号７）、ラット（配列番号８）、セイヨウミツバチ（配列番号９）、スポドプテラ・フルギペルダ（配列番号１０）、オオミジンコ（配列番号１１）、またはミカンコミバエ（配列番号１２）に由来し、それから最適化される。関連する態様では、これらＡＣｈＥ等価物の誘導体、断片、およびバリアントも、本出願の方法、キット、およびプラスミドにおいてやはり想定される。
【００２６】
１つの実施形態では、変異体は、従来型オリゴヌクレオチドの目標を定めたｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発システム、例えばEckstein et al., Nucleic Acids Research (1985) 13:8749-8785により記載されるシステム等を使用する部位特異的変異誘発（または発展法、例えば、Devlin et al., Science (1990) 249:404-406、およびScott & Smith, Science (1990) 249:386-390を参照)により調製可能である。（米国特許第６，００１，６２５号も参照）。当技術分野において公知であるその他の従来式のＰＣＲ技術も使用され得る。
１つの実施形態では、置換用の残基の選択は、Ｂｉｏｓｙｍソフトウェアを備えるＥｖａｎｓおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＰＳ３９０プラットフォーム上で、Ｓｕｓｓｍａｎらにより公表されたＡＣｈＥの結晶構造を使用する分子モデルに基づく。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「試料」は、その文法的変形形態を含め、農産物から得られる材料を意味する。例えば、そのような試料として、農産物の一部分、例えば殺有害生物剤または殺虫剤により汚染されている可能性のある皮が挙げられるが、ただしこれに限定されない。
本出願の反応生成物の蛍光または色を分析することにより、様々なクラスの殺有害生物剤または殺虫剤、例えばアセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物、例えば有機リン酸エステル（ＯＰ）またはカルバメート（ＣＢ）等について、それらを区別する方法が記載される。
【００２８】
１つの実施形態では、ＡＣｈＥは、ＡＣｈＥ阻害を検出するためのチップ、チューブ、またはプレート上に固定化され、または凍結乾燥され得る。プレートは、シングルまたはマルチウェルプレートであり得る。
本出願はキットも提供する。そのようなキットは、細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ基質を含む。細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、懸濁液、チューブ、プレート、ガラスバイアル、またはジャー、プラスチックパック等中にあり得る。１つの実施形態では、細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、懸濁液、チューブ、チップ、またはプレート中にあり得る。細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、凍結乾燥され得るが、またマイクロタイタープレートまたはチップ内に収納され得る。例えば、固定化の方法として、Ｔａｙｌｏｒら（米国特許第５，１９２，５０７号）に記載されるような方法を挙げることができるが、ただしこれに限定されない。その他の実施形態では、本キットは、酵素を収納するプラスチック、ガラス製のコンテナ、または金属チューブを含み得るが、またチューブは、一方の端部にインレット手段および他方の端部にアウトレット手段を有し得る。
【００２９】
本キットは陰性対照試料をさらに含み得る。そのような陰性対照試料は、殺有害生物剤、殺虫剤等を含有しない、または極少量の殺有害生物剤、殺虫剤等を含有する。本キットは、殺有害生物剤、殺虫剤等、例えばテリトレムＢ、塩酸ドネペジル、またはシクロペニンの量（陽性結果とみなされる）に等しいまたはそれを上回る、ある量の殺有害生物剤、殺虫剤等を一般的に含む陽性対照試料も含み得る。本キットは、化学物質、例えばバッファーまたは賦形剤等、および試料取扱い手段、例えばピペット、反応バイアル、容器、チューブ、またはフィルター等も含み得る。
それに加えて、本キットは、別紙指示書または任意のコンテナ手段または任意のその他の包装を含み得る。これらの指示書は、検出方法を実施するための条件、例えば混合比、量、インキュベーション時間等、およびスペクトルチャートを含む、本方法の結果を評価するための基準を通常定める。
【００３０】
一実施形態では、アセチルコリンエステラーゼを発現する２種以上の細胞のセットが、殺有害生物剤の検出に適用され、前記２種以上の細胞のセットは、試料と接触すると異なる量の反応生成物を生成する。
一態様では、２種以上の細胞のセット内で異なる量のＡＣｈＥを発現させるために、２種以上の細胞のセットが異なるバキュロウイルスクローンを用いて構築される。例えば、１つの細胞のセットがバキュロウイルスＡクローンを用いて構築され、他の細胞のセットがバキュロウイルスＢクローンを用いて構築され、バキュロウイルスＡを用いて構築された細胞のセットはバキュロウイルスＢを用いて構築された細胞のセットよりも多くのＡＣｈＥを発現する。
別の態様では、２種以上の細胞のセット内で異なるＡＣｈＥを発現させるために、異なるＡＣｈＥを用いて２種以上の細胞のセットが構築される。例えば、異なるＡＣｈＥは、感受性または非感受性ＡＣｈＥであり得る、あるいは異なるＡＣｈＥは、異なる起源、例えば脊椎動物もしくは無脊椎動物、またはミバエ、イエバエ、ヒト、マウス、ラット、ツマジロクサヨトウ、ミジンコ、ニワトリ、ガ、アブラムシ、ミツバチ、小エビ、もしくはサカナに由来し得る。
【００３１】
好ましい実施形態では、１つの細胞のセットがバキュロウイルスＡクローンを用いて構築され、他の細胞のセットがバキュロウイルスＢクローンを用いて構築され、バキュロウイルスＡを用いて構築された細胞のセットは、バキュロウイルスＢを用いて構築された細胞のセットよりも多くのＡＣｈＥを発現する。１つの実施形態では、２つの細胞のセットが試料と接触するとき、３つのシナリオ、すなわち（１）バキュロウイルスＡを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性およびバキュロウイルスＢを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性の両方が試料により阻害されず、試料は殺有害生物剤により汚染されていないことを示すシナリオ、（２）バキュロウイルスＡを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性は阻害されないが、しかしバキュロウイルスＢを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性は阻害され、試料中の殺有害生物剤は許容レベルを下回ることを示すシナリオ、ならびに（３）バキュロウイルスＡを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性およびバキュロウイルスＢを用いて構築された細胞のセット内のアセチルコリンエステラーゼ活性の両方が試料により阻害され、試料は殺有害生物剤により汚染されており、また許容レベルを上回ることを示すシナリオが存在する。
【００３２】
１つの実施形態では、２種以上のＡＣｈＥが、殺有害生物剤を検出、定量、または同定するために、異なるウェル内の異なる細胞上に独立に提示され得る。例えば、異なる濃度の殺有害生物剤が活性または発現の異なるＡＣｈＥにより測定され得るように、様々なアセチルコリンエステラーゼを発現する細胞が、殺有害生物剤濃度を反映するより強いおよびより弱い反応色を呈するように適用され得る。
【００３３】
代表的な実施形態として、１、２、３、４、および５ユニットのＡＣｈＥを有する細胞が、殺有害生物剤または殺虫剤の検出用として適用され得る。エルマン法（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を適用した場合、黄色の検出は、ＯＰ系またはＣＢ系殺虫剤の不存在またはその濃度が検出限界未満であることに対応する。下記の表に示すように、殺有害生物剤または殺虫剤は２ユニットのＡＣｈＥにより検出されたが、しかし３ユニットのＡＣｈＥでは検出されなかった。すなわち、殺有害生物剤または殺虫剤の濃度は、ＡＣｈＥのユニットと特定の殺有害生物剤または殺虫剤の濃度とを対応させることにより作成された標準曲線を参照しながら半定量され得る。例えば、殺有害生物剤Ａの濃度は、１．４×１０-7Ｍよりも高いまたはそれに等しいが、しかし１．６×１０-7よりも低い。
【００３４】
2022501015.tif 000004
【００３５】
あるいは、異なるＡＣｈＥ変異体または異なる生物に由来するＡＣｈＥが、上記方法またはキットに適用され得る。換言すれば、様々な感受性を有するＡＣｈＥが異なるウェル上に表示され得る。したがって、殺有害生物剤は、上記議論の通り、ＡＣｈＥパネルのシリーズにより検出、定量、または同定され得る。
さらなる苦労を労せずとも、当業者は、上記説明に基づき、本発明をその全体について利用することができると考えられる。下記の具体例は、したがって単に例証的であり、またどのようなことがあっても本開示の残りの部分を制限するものではないと解釈される。本明細書で引用されたすべての公開資料は参照により組み込まれている。
【実施例】
【００３６】
材料および方法
化学物質および試薬
アセチルコリンエステラーゼアッセイキット（標準ＡＣｈＥ）をＡｂｃａｍ社から購入した。殺有害生物剤残留物の迅速バイオアッセイ試薬キット（Ｒａｐｉｄ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）（市販ＡＣｈＥ）をＳｉｃｈｅｎ社から購入した。
阻害アッセイ用の有機リン酸エステル化合物（パラオキソンエチル、マラオキソン、クロルピリホス、およびエチオン）、およびカルバメート化合物（カルバリル、カルボフラン、およびメトミル）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。４化合物すべてを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ａｍｅｒｅｓｃｏ社）中、１ｍＭのストック溶液として使用する前に調製した。アッセイ内の異なる濃度の各化合物溶液を、最終ＤＭＳＯ濃度を２％未満に維持しつつ、ＤＭＳＯ中での連続希釈によりさらに調整した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）をＣｏｒｎｉｎｇ社から購入した。使用される化学物質は、いずれも分析グレードのものであった。
【００３７】
細胞株およびウイルス
組換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）生成用のスポドプテラ・フルギペルダＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＴＣ１００昆虫培地（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）中、２６℃で増殖させた。最大組換えタンパク質発現用のイラクサギンウワバＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞を、ＥＳＦ９２１（商標）昆虫細胞培養培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）中、２６℃で増殖させた。ＡＣｈＥ−ＦＬ、ＡＣｈＥ−６ＭＣ、またはＡＣｈＥ  ｃＤＮＡを有さない対照ウイルス（ＷＴ−ｂａｃ）を含む組換えバキュロウイルスを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−昆虫トランスフェクション試薬（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｉｒｕｓ社）を使用して、ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）で改変されたＡｃＭＮＰＶゲノム（Ｍｉｒｕｓ社）を、トランスファーベクタープラスミドと共にＳｆ２１細胞中に同時トランスフェクトすることにより生成させた。組換え体を繁殖させ、連続希釈により単離した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の両方により、ウイルスクローン力価を測定した。
【００３８】
プラスミドの構築
ＡＣｈＥ配列は、変異Ｙ４０８Ｆ［１１］を有するキイロショウジョウバエ［１０］に由来し、その配列はＢｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．社により合成された。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０は、アミノ末端にミツバチメリチンシグナルペプチドおよびカルボキシル末端にＧＰ６４膜貫通ドメインおよびＣＴＤドメインを有するトランスファーベクターである（６ＭＣ）。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０は、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質の発現を推進するｐａｇプロモーターを担持し、ｐ１０プロモーターの下流に外来配列の挿入を可能にする。ＡＣｈＥ  Ｙ４０８Ｆ配列を、ＫＯＤホットスタートマスターミックス（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（Ｍｅｒｃｋ社）および２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。６ＭＣを有さないＦＬコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーはＨＡＣｈＥｉｆｐ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴ−３’、配列番号１３）、およびＡＣｈＥ２ｒｐ（５’−ＣＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＡＡＣＡＣＧＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＴＣ−３’、配列番号１４）であった。Ｃ末端ＧＰＩ係留トランケート化ＡＣｈＥ  ６ＭＣコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーは、ＨＡＣｈＥｉｆｐ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴ−３’、配列番号１３）、およびＡＣｈＥｄｅＧＰＩｒｐ（５’−ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＣ−３’、配列番号１５）であった。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０を、ＫＯＤホットスタートマスターミックス（Ｍｅｒｃｋ社）および２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。ＦＬコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、ｐＡＢｈｈｐ１０ＨＭ６Ｈ２ｆｐ（５’−ＡＣＴＡＡＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＡＴ−３’、配列番号１６）、およびＨＡＣｈＥｖｒｐ（５’−ＣＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号１７）であった。６ＭＣコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、ｐＡＢｈｈｐ１０ＨＭ６Ｈｆｐ（５’−ＡＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＣＴＴＴＧＴ−３’、配列番号１８）、およびＨＡＣｈＥｖｒｐ（５’−ＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号１７）であった。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．社）を使用することにより、挿入断片をベクター断片と融合させた。変換およびコロニー採集の後、プラスミドを増幅、抽出し、配列分析により検証した。得られた完全長ＡＣｈＥ、ＡＣｈＥ−６ＭＣを含有するプラスミド、およびＡＣｈＥ挿入を有さない対照ウイルスを、ＦＬ、６ＭＣ、およびＣｏｎｔとしてそれぞれ省略した。得られたプラスミドをｐＡＣｈＥ−ＦＬ（配列番号５）、ｐＡＣｈＥ−６ＭＣ（配列番号６）、およびｐＣｏｎｔ−Ｂａｃと命名し、また得られた組換えバキュロウイルスをｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびｖＣｏｎｔ−Ｂａｃと命名した。一実施形態では、ＡＣｈＥ−ＦＬは配列番号１のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ＡＣｈＥ−ＦＬは、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる。別の実施形態では、ＡＣｈＥ−６ＭＣは配列番号３のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、ＡＣｈＥ−６ＭＣは配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３９】
これに加えて、ヒト（ＨｓＡＣｈＥ）、ラット（ＲｎＡＣｈＥ）、セイヨウミツバチ（ＡｍＡＣｈＥ）、スポドプテラ・フルギペルダ（ＳｆＡＣｈＥ）、オオミジンコ（ＤａｍＡＣｈＥ）、およびミカンコミバエ（ＢｄＡＣｈＥ）に由来するＡＣｈＥ配列を、Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．社により合成した。組換えバキュロウイルス用のトランスファーベクターを生成するために、上記記載の全ＡＣｈＥ配列をベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０中にクローン化した。得られた組換えバキュロウイルスを、ｖＨｓＡＣｈＥ、ｖＲｎＡＣｈＥ、ｖＡｍＡＣｈＥ、ｖＳｆＡＣｈＥ、ｖＤａｍＡＣｈＥ、およびｖＢｄＡＣｈＥとそれぞれ呼ぶことにし、得られた組換えプラスミドを、ｐＨｓＡＣｈＥ、ｐＲｎＡＣｈＥ、ｐＡｍＡＣｈＥ、ｐＳｆＡＣｈＥ、ｐＤａｍＡＣｈＥ、およびｐＢｄＡＣｈＥとそれぞれ呼ぶことにした。ＡＣｈＥ、ＤｍＡＣｈＥを発現させるために、ｐＡＣｈＥ−ＦＬをここでは使用した。一実施形態では、ＨｓＡＣｈＥは、配列番号７のアミノ酸を含む。ＲｎＡＣｈＥは、配列番号８のアミノ酸を含む。ＡｍＡＣｈＥは、配列番号９のアミノ酸を含む。ＳｆＡＣｈＥは、配列番号１０のアミノ酸を含む。ＤａｍＡＣｈＥは、配列番号１１のアミノ酸を含む。ＢｄＡＣｈＥは、配列番号１２のアミノ酸を含む。
【００４０】
ＡＣｈＥの発現およびＡＣｈＥ提示細胞の収集
一次ウイルスストック（Ｖ0）を、ｆｌａｓｈＢＡＣ（商標）ＵＬＴＲＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ社）およびＤＮＡ−Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）混合物を用いたＳｆ２１細胞のトランスフェクションから取得し、単一ウイルス（Ｖ1）の力価をストックウイルス溶液の連続希釈により改善し、またプラーク精製により単離した。繁殖させた単一ウイルス（Ｖ2）を、Ｓｆ２１細胞のＶ1ウイルス感染を用いて増幅させた。９６ウェルマイクロプレート中のＨｉ５細胞（細胞４×１０5個／ｍＬ）をＶ2ウイルスに感染させ、２６℃で３〜４日間増殖させた。Ｈｉ５細胞を、０．１〜１０、好ましくは１〜５、０．２〜５、または０．５〜２の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。例えば、ＭＯＩは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。バイオマーカーとして蛍光、例えばＥＧＦＰレポーターの発現を使用することにより、ＡＣｈＥを発現する組換えバキュロウイルスをスクリーニングした。ＡＣｈＥの発現をＡＣｈＥ活性により決定した。感染から３日後に、細胞スクレーパーにより感染細胞を培養プレートまたはフラスコから削り取り、ＤＰＢＳに懸濁した。細胞カウンターにより細胞数をカウントし、いくつかの異なる濃度に稀釈した。好ましい実施形態では、ＡＣｈＥ提示細胞の種類に関する９６ウェルプレートアッセイにおいて使用される最終濃度は、細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個／ウェルであり得る。さらに、ＡＣｈＥ提示細胞を収集する場合、培地を９６ウェルマイクロプレートから慎重に除去した。マイクロプレート中の感染細胞は、残留する湿気を取り除くために、５時間凍結乾燥プロセスに置かれた。乾燥したマイクロプレートを密閉し、４℃に保った。
【００４１】
ＡＣｈＥ活性および阻害アッセイ
ＡＣｈＥ活性をエルマン法により決定した。各９６ウェルに対して、３ｍＭのＡＴＣｈを５０μｌおよび３ｍＭのエルマン試薬ＤＴＮＢ溶液を５０μｌ添加した。室温で１０分インキュベートした後、４１２ｎｍにおける平均吸収を決定した。各殺有害生物剤によるＡＣｈＥ活性の阻害を決定するために、殺有害生物剤、例えばクロルピリホス、エチオン、カルバリル、カルボフラン、およびメトミル等のストック溶液を、１％のＤＭＳＯを含むＤＰＢＳ中で１０-3Ｍ〜１０-9Ｍの範囲の濃度に稀釈した。次に稀釈した溶液を、７つの組換えウイルス（ｖＤｍＡＣｈＥ、ｖＨｓＡＣｈＥ、ｖＲｎＡＣｈＥ、ｖＡｍＡＣｈＥ、ｖＳｆＡＣｈＥ、ＤａｍＡＣｈＥ、およびｖＢｄＡＣｈＥ）に感染させたＨｉ５細胞を含む９６ウェルマイクロプレート中に個別に添加した。１０分間インキュベートした後、基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を反応混合物に添加した。室温で１０分インキュベートした後、残留活性を、マイクロプレートリーダーを用いて４１２ｎｍにおいて決定した。
【００４２】
アセチルコリンエステラーゼストック溶液を、アッセイバッファー中、１：５０の比で５０ユニット／ｍＬに稀釈し、１０００ｍＵ／ｍＬのアセチルコリンエステラーゼ標準溶液を生成した。次に、各標準の平均吸収を決定するために、１０００ｍＵ／ｍＬのアセチルコリンエステラーゼ標準溶液を、３００、１００、３０、１０、３、１、および０ｍＵ／ｍＬにさらに稀釈した。各標準の読み取りをアセチルコリンエステラーゼの量の関数としてプロットして標準曲線を確立し、各テスト試料中の対応するＡＣｈＥの量を、求めた直線式より計算した。ＡＣｈＥ活性阻害（％）を計算するのに、ｖＣｏｎｔ−Ｂａｃ感染細胞（表面でＡＣｈＥを発現しない）は、陰性対照として機能した一方、Ａｂｃａｍ社の精製タンパク質、Ｓｉｃｈｅｎ社の市販タンパク質、殺有害生物剤インキュベーション無しのｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ感染細胞は陽性対照として機能した。陽性対照の活性は１００％とみなした。ＡＣｈＥの残存活性を下記の式により評価する：
ＡＣｈＥ活性阻害（％）＝〔（ΔＡ0−ΔＡS）／ΔＡ0〕×１００
式中、ΔＡ0は、陽性対照の吸収の変化を表し、ΔＡSは、殺有害生物剤を適用してインキュベートした溶液の吸収の変化を表わす。阻害活性曲線により確立された直線式に基づき、ＡＣｈＥのＩＣ50の数値（活性を５０％阻害するのに必要とされる濃度）を計算した［１２］。
【００４３】
多重種ＡＣｈＥから決定されたＡＣｈＥ活性を使用する機械学習
多重種ＡＣｈＥ検出プラットフォームに適用された殺有害生物剤および濃度を区別するために、Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｂｏｏｓｔｉｎｇ（ＸＧＢｏｏｓｔ）モデルを開発した。ＸＧＢｏｏｓｔモデルを訓練およびテストするために、所定の濃度を有する殺有害生物剤毎に多重種ＡＣｈＥ検出から得られた光学濃度データを、７つのＡＣｈＥに由来する読み取りおよび３つの細胞濃度を含む２１パラメーターデータセットに編成した。実験を３回繰り返して得られた合計１２０個のデータセットを、訓練セット（１０６）とテストセット（１４）に分割した。サイキット・ラーン（ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ）を使用するＰｙｔｈｏｎ内でモデルを構築するために、１０６個の訓練セットを使用した。テストデータセットを使用してアウトカムモデルを確認し、同定の正確性を評価した。
【００４４】
結果
昆虫細胞表面発現用として高感受性ＡＣｈＥ変異体および異なる種に由来する７つのＡＣｈＥを合成した
キイロショウジョウバエ由来のＡＣｈＥを、本出願における酵素として選択し、この酵素をコードするオリゴヌクレオチド（バキュロウイルス−昆虫系に対してコドン最適化されている）を合成した。酵素感受性を高めるためにＹ４０８Ｆ変異を合成遺伝子に導入したが、それは酵素感受性の最大１２倍の増加を示した［１１］。この組換え酵素を発現させるために２つのコンストラクトを生成した（図１）。コンストラクトｐＡＣｈＥ−ＦＬは、完全長ＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）、タンパク質分泌用のＮ末端ミツバチメリチンシグナルペプチド（ＨＭ）、および六量体ヒスチジンタグ（６Ｈ）を含み、これらはいずれも、ｈｒ１−ｈｓｐ７０（すなわち、ｈｒ１エンハンサー配列と融合したｈｓｐ７０プロモーター）およびｐ１０プロモーターを含有するデュエルプロモーターの下に置かれる（図１、パート（ａ））。酵素の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）が欠失している他のコンストラクトｐＡＣｈＥ−６ＭＣも生成される。ＡＣｈＥ−６ＭＣ（図１、パート（ｂ））は、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質由来のＴＭおよびＣＴＤと融合しており、また同一の発現ベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０下に置かれる（図１、パート（ｃ））。ＧＰ６４のＴＭおよびＣＴＤを置換すれば、バキュロウイルスのエンベロープおよび昆虫細胞の表面への組換えタンパク質の係留が改善することが報告されている12-14。
【００４５】
キイロショウジョウバエＹ４０８変異体以外に、６つの異なる種に由来するＡＣｈＥ（図６）を本出願における多重酵素として選択した。本明細書では、明確に区別するために、多重酵素の実施形態において、キイロショウジョウバエＹ４０８変異体をＤｍＡＣｈＥと呼ぶことにした（図６、パート（ａ））。他の６つのＡＣｈＥを、ＨｓＡＣｈＥ、ＲｎＡＣｈＥ、ＡｍＡＣｈＥ、ＳｆＡＣｈＥ、ＤａｍＡＣｈＥ、およびＢｄＡＣｈＥを含む、その種の名称の略号により命名した。これら６つの酵素をコードするオリゴヌクレオチドを、バキュロウイルス−昆虫系に対してコドンを最適化して合成し、ＡＣｈＥ−ＦＬに対する戦略と同一の戦略を使用して、ベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０中にクローン化した。
【００４６】
昆虫細胞表面発現型ＡＣｈＥは酵素活性を示した
２つの組換えバキュロウイルスｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣをそれぞれ生成して、ＡＣｈＥ−ＦＬおよびＡＣｈＥ−６ＭＣを発現させた。空ベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０も、陰性対照として組換えウイルスを生成するのに使用され、Ｃｏｎｔ−ｂａｃと命名された（図１、パート（ｃ））。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞は一般的に使用される昆虫細胞においてより高レベルの組換えタンパク質を発現することができたので、Ｈｉ５昆虫細胞を酵素発現用として使用した。さらに、細胞を無血清培地内で順応させ、したがって、最終酵素反応は血清干渉がない状態で実施され得る。９６ウェルプレート内で、０．５のＭＯＩを用いてＨｉ５細胞を感染させるために、２０個の単一ウイルスのそれぞれをｖＡＣｈＥ−ＦＬ−ｂａｃおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ−ｂａｃ用として選択し、４つをＣｏｎｔ−ｂａｃ用として選択し、感染後３日目（ｄｐｉ）にそのＡＣｈＥ活性をアッセイした。酵素活性の標準曲線を確立するために、ＡＣｈＥ標準溶液を０〜１０００ｍＵ／ｍＬの範囲に稀釈した（図２、パート（ａ））。Ｃｏｎｔ−ｂａｃ感染細胞は基質アセチルコリンおよび発色剤ＤＴＮＢ溶液（図２、パート（ｂ））と反応した後、ほとんど透明な色を呈したように、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（図２、パート（ｃ））およびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（図２、パート（ｄ））単一ウイルスに感染した細胞は、いずれも目視可能な黄色を呈し、平均６０〜８０ｍＵ／ｍＬの酵素活性にそれぞれ変換された。各コンストラクトにおいて最高活性を示す１つの単一ウイルスを次の実験用として選択した。
【００４７】
細胞表面発現型ＡＣｈＥは凍結乾燥プロセスに耐える
細胞表面に提示されたＡＣｈＥは高い酵素活性を示したが、細胞含有培地は輸送に不便である。この問題を解決するために、培地を除去し、なおもウェルに付着している細胞を凍結乾燥プロセスに付した。本発明者らの細胞表面発現型ＡＣｈＥが凍結真空乾燥プロセスに耐えることができるか知るために、Ｈｉ５細胞を、０．５のＭＯＩを用いて、ＡＣｈＥ−ＦＬ、ＡＣｈＥ−６ＭＣ、またはＣｏｎｔ−Ｂａｃをそれぞれ発現するウイルスに３日間感染させ、次に９６ウェルプレート上の細胞試料を凍結乾燥に付した。凍結乾燥の前後両方において、顕微鏡検査により細胞形態を観察した。３つのウイルスコンストラクト、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびＣｏｎｔ−Ｂａｃのすべては、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を駆動するｐａｇプロモーターを含有するので、これら３ウイルスに感染した細胞は、模擬的感染細胞が蛍光を示さないのに対して緑色蛍光を示す（図３、パート（ａ））。凍結乾燥の後、該細胞試料のいずれも収縮した細胞形態を示したが、しかしこれら３つの感染細胞はなおも強い緑色蛍光を維持した（図３、パート（ａ））。これら細胞試料のＡＣｈＥ活性を分析し、凍結真空乾燥プロセスは、ＡＣｈＥ−ＦＬおよびＡＣｈＥ−６ＭＣについて酵素活性を失活させることもなく、またＣｏｎｔ−Ｂａｃのバックグラウンドの読み取りを増加させることもなかったことが判明した（図３、パート（ｂ））。
【００４８】
高ＡＣｈＥ活性は、低ＭＯＩを用いたウイルス感染によりなおも達成され得る。
凍結乾燥条件を決定した後、本発明者らのＡＣｈＥ発現細胞試料についてウイルス感染条件の最適化を目指した。Ｈｉ５細胞を、組換えウイルスｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびＣｏｎｔ−Ｂａｃに、０．１、０．５、１、２、および１０のＭＯＩを用いて、三重で個別に感染させた。３ｄｐｉにおいて、すべての感染細胞試料を凍結乾燥に付し、次にＡＣｈＥの活性を決定した（図４、パート（ａ））。ｖＡＣｈＥ−ＦＬに感染した細胞試料のいずれも、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣに感染した試料よりもわずかに高いＡＣｈＥ活性を示したが、両ウイルスに関する感染細胞は、ＭＯＩが高いほどＡＣｈＥ活性は減少するという傾向を示し、これはｖＡＣｈＥ−６ＭＣに感染した細胞に特に当てはまる（図４、パート（ｂ））。Ｃｏｎｔ−ｂａｃ感染細胞の場合、決定されたすべてのＭＯＩは活性において有意差を示さなかった（図４、パート（ｂ））。これらの結果に基づき、ＭＯＩ＝０．１を、ＡＣｈＥを提示させるための標準的感染条件として使用した。
【００４９】
ＡＣｈＥ−ＦＬおよびＡＣｈＥ−６ＭＣの細胞表面提示は、ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤を検出するための好都合なプラットフォームとなり得る
本出願の一実施形態に基づく細胞ベースのＡＣｈＥがＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤を判別するその能力を評価するために、２つのＯＰ系（例えば、パラオキソンエチルおよびマラオキソン）および２つのＣＢ系（例えば、カルボフランおよびカルバリル）殺虫剤化合物を本発明者らの系においてテストし、検出能力を標準として用いた精製ＡＣｈＥ（Ａｂｃａｍ社）と比較した（図５）。組換えバキュロウイルスｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣによりＡＣｈＥを細胞表面提示させた場合、それらはＡＣｈＥを細胞上に適切に提示でき、正確且つ容易にＯＰ系およびＣＢ系殺有害生物剤を検出するのに好都合であることが明らかとなった。比較する際には、Ｓｉｃｈｅｎ  Ｉｎｃ．社より販売されている台湾において最も一般的なＡＣｈＥ殺虫剤診断キットを使用した試験結果も含まれ、すべてのテスト試料のＩＣ５０についても計算した（表１）。Ｓｉｃｈｅｎ社の場合、ＡＣｈＥをハエから得ており、また測定にはキュベット（１ｍＬ）も使用しなければないので、したがって多量のＡＣｈＥが使用されるはずである。さらに、Ｓｉｃｈｅｎ社は、分光光度計を使用して発色反応を測定するように提案している。しかしながら、本出願においては、ハエを飼育する必要がなく、またＡＣｈＥを精製する必要もない。検出には、１００μＬの溶液しか必要とせず、且つ取扱いが容易な９６ウェルプレートが適用され、残留殺有害生物剤を検出する場合、肉眼により読み取り可能である。
【００５０】
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【００５１】
結論として、農産物中の殺虫剤残留物を好都合に検査するために、細胞ベースの検出システムが開発された。これは、わずらわしいハエの飼育、アセチルコリンエステラーゼの精製、キュベットアッセイ、および分光光度計での決定を不要とする、殺虫剤残留物をより良好に検出するための従来法に取って代る新規技術である。したがって、本明細書における開示は、ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤の検出について、これまで実現することが困難であった好都合且つ迅速な解決策を提供する。ＡＣｈＥ−ＦＬおよびＡＣｈＥ−６ＭＣは、異なる残留殺有害生物剤の検出において大雑把に１対数単位の差異を示したが、これら２つを組み合わせることで、過量投与から移行した残留殺有害生物剤の範囲から許容される範囲までカバーされるはずであり、またより良好な読み取りおよび検出のための前例のない簡易システムが実現する。
【００５２】
多重種ＡＣｈＥプラットフォームは様々なＯＰ系およびＣＢ系殺有害生物剤に対して顕著な感受性を示した
６つのＡＣｈＥ（ｖＨｓＡＣｈＥ、ｖＲｎＡＣｈＥ、ｖＡｍＡＣｈＥ、ｖＳｆＡＣｈＥ、ＤａｍＡＣｈＥ、およびｖＢｄＡＣｈＥ）に関する組換えバキュロウイルスを生み出した後、Ｈｉ５細胞をｖＤｍＡＣｈＥおよびこれらのウイルスにそれぞれ感染させた。感染から３日後、感染細胞を細胞スクレーパーにより培養プレートまたはフラスコから削り取り、ＤＰＢＳに懸濁した。ＡＣｈＥ酵素濃度を調整するために、各９６ウェルに添加される細胞数を変化させた。最初の細胞数を細胞カウンターによりカウントし、希釈または濃縮により３つの異なる細胞濃度を調整した。図７では、細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個／ウェルの細胞濃度を使用した結果を示した。殺有害生物剤を添加した後、ＡＣｈＥ活性が阻害されれば、黄色の発色（４１２ｎｍにおける吸収により決定可能である）の減少を引き起こす。異なる初期濃度を有する７つのＡＣｈＥは、クロルピリホスおよびエチオンを含むＯＰ、ならびにカルバリル、カルボフラン、およびメトミル殺有害生物剤を含むＣＢに対して様々な感受性を示した（図７）。
【００５３】
機械学習アプローチは多重種ＡＣｈＥによりアッセイされた殺有害生物剤残留物の迅速な識別を可能にする
多重種ＡＣｈＥはテストされた殺有害生物剤に対して異なる感受性を示したので、所定の濃度を有する殺有害生物剤に関するアウトカム光学濃度データは、７つのＡＣｈＥおよび３つの細胞濃度から得られる２１の読み取りを含む同定パネルとなり得る（図８、パート（ａ））。殺有害生物剤同定モデルを開発するために、実験を３回繰り返して得られた合計１２０個のデータセットを使用した。ＸＧＢｏｏｓｔにより構築されたモデルを訓練するために、１０６個の訓練セットをアルゴリズムにインプットし、同定の正確性を評価するために１４個のテストセットを使用した（図８、パート（ｂ））。モデルは、より多くの決定要素をインプットすること、および正確性を改善することにより継続して訓練され得る。
【００５４】
結論として、残留殺有害生物剤および濃度の両方を区別することができる、新規の多重種ＡＣｈＥ式殺有害生物剤決定法用の方法およびキットが開発された。機械学習を組み合わせることで、特定の殺有害生物剤を濃度と共に迅速に同定することが可能になり、また該システムはより多くの訓練データを付加することによりさらに最適化され得る。
【００５５】
考察
ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤は、農学品種に適用される一般的な化学殺有害生物剤であり、作物汚染を頻繁に引き起こし、またヒトの健康を脅す。本出願において、バキュロウイルスを使用して、ＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤に対して高感受性のＡＣｈＥ変異体を細胞表面に提示させることにより、これら殺虫剤を好都合に検出するための、測定を支援する分光光度計の必要の有無にかかわらない新規決定プラットフォームが、開発された。いくつかの条件、例えばウイルス感染のためのＭＯＩおよび凍結乾燥等も、システムを最適化するために検討された。注目すべきことには、ＧＰ６４のＴＭおよびＣＴＤに置き換えることで、殺虫剤残留物に対する表面提示型ＡＣｈＥの感受性が改善することが判明した。
【００５６】
天然基質のアセチルコリンに加えて、ＡＣｈＥは、チオコリンのエステル、例えばアセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）、プロピオニルチオコリン、およびアセチル−３−メチルコリン等を含む、多くのその他のエステルを加水分解するのにも使用可能である15。ＡＣｈＥは、アセチルコリン、コリン、エゼリン、キニジン、テトラメチルアンモニウムイオン、ｐ−カルボキシフェニルトリメチルアンモニウムヨウ化物、トリメチル（ｐ−アミノフェニル）塩化アンモニウム塩酸塩、ネオスチグミン、エチオナミド、ジメトエート、ホスファチジルセリン、プロスチグミン、アンモニウム塩、および様々な有機リン酸エステル系、有機塩素系、およびカルバメート系殺有害生物剤により阻害される。いくつかの分光測定ベースのアッセイ法が、ＵＶ−Ｖｉｓアッセイ、蛍光アッセイ、および質量分析スペクトル分析アッセイを含め、幅広く使用されている16。該試験で使用される最も汎用な方法は、エルマン法である。ＡＣｈＥは、ＡＴＣｈを触媒的に加水分解してチオコリンを生成し、チオコリンはＤＴＮＢと反応して４１２ｎｍにおいて測定可能である黄色のＴＮＢを生成する。代替法は、ＤＴＮＢに代わりジチオジニコチン酸（ＤＴＮＡ）または２，２’−ジチオジピリジン（２−ＰＤＳ）を使用する。反応の生成物は３４４ｎｍにおいて測定可能である17。エルマン法以外に、ＡＣｈＥの活性および阻害のその他アッセイ法もまた、以下に説明するような本発明者らの表面提示式検出システムに適用され得る。基質アセチルコリンの検出に基づく比色分析法は、ヒドロキシルアミンとの反応で、測光法によりモニタリング可能なＦｅ3+を担持するアセチルヒドロキサム酸をもたらす18。コリンは、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ／フェノール／アミノアンチピリン系（５００ｎｍに最大吸収を有するピンク色の生成物を生成する）を使用することによってもやはり検出され得る19。ＡｕＣｌ4の存在下でＡｕ  ＮＰシードの触媒的凝集拡大を刺激するためにチオコリンを使用するナノテクノロジーベースのセンシング法は、５７０ｎｍに最大吸収を有する青色を誘発する20。２つの蛍光誘発性基質、酪酸レゾルフィンおよび酢酸インドキシルは非蛍光化合物であるが、これらはコリンエステラーゼにより、５８０ｎｍおよび４７０ｎｍに最大吸収をそれぞれ有するきわめて蛍光性の物質に加水分解され得る21。蛍光誘発性の化合物Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル）フェニル］マレイミドもまた、チオコリンと反応して４７３ｎｍで蛍光発光する濃い青色の蛍光生成物を生成することができる22。ＡＣｈＥはアセチルコリンをコリン変換し、その後コリンはＣｈＯにより酸化されてベタインおよびＨ2Ｏ2となる。西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下、後者は、蛍光誘発性プローブであるＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）と反応して、５７１ｎｍおよび５８５ｎｍで蛍光発光するきわめて蛍光性の生成物レゾルフィンを生成する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．社）。半導体ナノ粒子である量子ドット（ＱＤ）は、ＱＤ発光を消光させるＨ2Ｏ2とも反応することができるという固有の蛍光特性を有する。そのサイズ制御さ���た蛍光特性および高い蛍光量子収率により、量子ドットは、５７０ｎｍで蛍光発光するバイオセンシングにとって優れた光学標識となっている23。蛍光チオールグリーン指示薬またはＡｂＲｅｄ指示薬を含む２つのアセチルコリンエステラーゼアッセイキットが、蛍光発光Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２０ｎｍおよび５４０／５９０ｎｍをそれぞれ用いたＡＣｈＥ活性検出用として設計されている（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．社）。
【００５７】
本出願に基づく表面提示型ＡＣｈＥの殺虫剤残留物を検知する能力を決定した。ＡＣｈＥ−ＦＬに対するパラオキソンエチル、マラオキソン、カルボフラン、およびカルバリルのＩＣ50は、それぞれ４．９×１０-7、５．６×１０-7、４．８×１０-5、６．８×１０-6Ｍであり、またＡＣｈＥ−６ＭＣに対するそれは、それぞれ５．５×１０-8、６．２×１０-8、４．５×１０-6、６．５×１０-7Ｍであった。Ａｂｃａｍ社ＡＣｈＥと同一の活性ユニットを有するＳｉｃｈｅｎ社の市販キットとを比較すると、上記殺虫剤に対して、それぞれ５．１×１０-7、８．２×１０-7、５．４×１０-7、６．５×１０-6Ｍ、およびそれぞれ２．３×１０-6、９．５×１０-7、２．８×１０-6、５．９×１０-6ＭのＩＣ50を示した。これらの結果は、野菜およびくだもの中の殺虫剤残留物に対する、簡便、迅速、且つ実用的で、しかもコストが手頃なテスト法としての本分析プラットフォームを保証する。
【００５８】
結果は、ＧＰ６４のＴＭおよびＣＴＤがなくても、昆虫細胞表面に外来膜タンパク質はなおも提示可能であるという戦略も明らかにした。しかしながら、外来タンパク質のＴＭおよびＣＴＤをＧＰ６４のそれと置換すれば、提示されたタンパク質が安定化する可能性があり、したがって該タンパク質は、物理的または化学的処理、例えば洗浄または薬物添加ステップ等に耐えることができる。とはいえ、いずれにしても、やっかいで費用のかかるプロセスである膜タンパク質精製に費やされる甚大な努力が省かれる。標的タンパク質の甚大な喪失を頻繁に引き起こす。このプラットフォームは、これまでのシステム対していくつかの長所を有する。第１番目に、ここで適用されるＡＣｈＥは、ハエ脳から得られたＡＣｈＥよりもはるかに敏感な変異体である。第２番目に、ＡＣｈＥを提示した昆虫細胞は９６ウェルマイクロプレートの底部に付着しており、したがってバイオセンサーに一般的に必要とされる固定化プロセスは不要であり、やっかいな精製プロセスも不要である。第３番目に、昆虫細胞上に提示されるＡＣｈＥは、出荷に好都合なようにフリーズドライされ得る。第４番目に、機器、例えば分光光度計等が不要である。第５番目に、コストは、すべての公知システムの中でもおそらくは最も低い。結論として、本発明者らは、ＯＰ系およびＣＢ系殺有害生物剤残留物の将来的迅速決定にとって有望である高感受性昆虫細胞表面提示式ＡＣｈＥプラットフォームを開発し、表面提示型膜タンパク質の性能を改善するための実用的戦略を提案した。
【００５９】
当業者にとって、様々な改変および変更が開示された実施形態に対してなし得ることは明白である。本明細書および実施例は例示限定とみなされ、本開示の真の範囲は下記の特許請求の範囲およびその等価物により示されることが意図されている。
参考資料
以下に列挙するおよび本明細書で引用された参考資料は、本明細書が明示的に別途規定しない限り、本明細書により参考として本明細書に組み込まれている。
【００６０】
1.    Shani, A. Integrated pest management using pheromones. Chemtech 28, 30-35 (1998).
2.    Donaldson, D., Kiely, T. & Grube, A. Pesticides Industry Sales and Usage: 1998 and 1999 Market Estimates.  (ed. Agency, U.S.E.P.) (Washington, DC, 2002).
3.    Fournier, D. & Mutero, A. Modification of acetylcholinesterase as a mechanism of resistance to insecticides. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology 108, 19-31 (1994).
4.    Jiang, H., Liu, S., Zhao, P. & Pope, C. Recombinant expression and biochemical characterization of the catalytic domain of acetylcholinesterase-1 from the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. Insect Biochemistry and Molecular Biology 39, 646-653 (2009).
5.    Ellman, G.L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics 82, 70-77 (1959).
6.    Steele, R.W. & Smallman, B.N. Acetylcholinesterase from the house-fly head. Molecular properties of soluble forms. Biochimica et biophysica acta 445, 131-146 (1976).
7.    Kost, T.A. & Condreay, J.P. Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors. Trends in Biotechnology 20, 173-180 (2002).
8.    Possee, R.D., Thomas, C.J. & King, L.A. The use of baculovirus vectors for the production of membrane proteins in insect cells. Biochemical Society Transactions 27, 928 (1999).
9.    Ayres, M.D., Howard, S.C., Kuzio, J., Lopez-Ferber, M. & Possee, R.D. The complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Virology 202, 586-605 (1994).
10.    Hall, L.M. & Spierer, P. The Ace locus of Drosophila melanogaster: structural gene for acetylcholinesterase with an unusual 5' leader. The EMBO journal 5, 2949-2954 (1986).
11.    Villatte, F., Marcel, V., Estrada-Mondaca, S. & Fournier, D. Engineering sensitive acetylcholinesterase for detection of organophosphate and carbamate insecticides. Biosensors and Bioelectronics 13, 157-164 (1998).
12.    Chang, Y.J., Liu, C.Y., Chiang, B.L., Chao, Y.C. & Chen, C.C. Induction of IL-8 release in lung cells via activator protein-1 by recombinant baculovirus displaying severe acute respiratory syndrome-coronavirus spike proteins: identification of two functional regions. J Immunol 173, 7602-7614 (2004).
13.    Grabherr, R., Ernst, W., Doblhoff-Dier, O., Sara, M. & Katinger, H. Expression of foreign proteins on the surface of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Biotechniques 22, 730-735 (1997).
14.    Yang, D.G., et al. Avian influenza virus hemagglutinin display on baculovirus envelope: cytoplasmic domain affects virus properties and vaccine potential. Mol Ther 15, 989-996 (2007).
15.    Brestkin, A.P., Viniar, T.N. & Rozengart, E.V. [Interaction between various cholinesterases and reversible inhibitors of polymethylene-bis-(trimethylammonium) diiodide series]. Ukrainskii biokhimicheskii zhurnal 55, 77-79 (1983).
16.    Miao, Y., He, N. & Zhu, J.J. History and new developments of assays for cholinesterase activity and inhibition. Chemical reviews 110, 5216-5234 (2010).
17.    Uete, T., Miyamato, Y., Onishi, M. & Shimano, N. Spectrophotometric micromethod for measuring cholinesterase activity in serum or plasma. Clinical chemistry 18, 454-458 (1972).
18.    McOsker, D.E. & Daniel, L.J. A colorimetric micro method for the determination of cholinesterase. Archives of Biochemistry and Biophysics 79, 1-7 (1959).
19.    Abernethy, M.H., George, P.M., Herron, J.L. & Evans, R.T. Plasma cholinesterase phenotyping with use of visible-region spectrophotometry. Clinical chemistry 32, 194-197 (1986).
20.    Pavlov, V., Xiao, Y. & Willner, I. Inhibition of the acetycholine esterase-stimulated growth of Au nanoparticles: nanotechnology-based sensing of nerve gases. Nano letters 5, 649-653 (2005).
21.    Guilbault, G.G. & Kramer, D.N. RESORUFIN BUTYRATE AND INDOXYL ACETATE AS FLUOROGENIC SUBSTRATES FOR CHOLINESTERASE. Analytical chemistry 37, 120-123 (1965).
22.    Parvari, R., Pecht, I. & Soreq, H. A microfluorometric assay for cholinesterases, suitable for multiple kinetic determinations of picomoles of released thiocholine. Analytical biochemistry 133, 450-456 (1983).
23.    Gill, R., Bahshi, L., Freeman, R. & Willner, I. Optical detection of glucose and acetylcholine esterase inhibitors by H2O2-sensitive CdSe/ZnS quantum dots. Angewandte Chemie (International ed. in English) 47, 1676-1679 (2008).
【図１】
2022501015.tif 000006
【図２（ａ）】
2022501015.tif 000007
【図２（ｂ）】
2022501015.tif 000008
【図２（ｃ）】
2022501015.tif 000009
【図２（ｄ）】
2022501015.tif 000010
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
2022501015.tif 000013
【図４−２】
2022501015.tif 000014
【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月30日(2021.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺有害生物剤を検出するin vitroの方法であって、
（ａ）試料を、アセチルコリンエステラーゼを発現する細胞と接触させること、
（ｂ）アセチルコリンエステラーゼ基質を、前記細胞と接触させること、および
（ｃ）前記アセチルコリンエステラーゼ基質に起因する反応生成物を検出すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
アセチルコリンエステラーゼ基質が、アセチルコリン、アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）、プロピオニルチオコリン、またはアセチル−３−メチルコリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）の前に、反応生成物を形成させるために蛍光指示薬を添加することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光指示薬が、５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］（ＤＴＮＢ）、ジチオジニコチン酸（ＤＴＮＡ）、２，２’−ジチオジピリジン（２−ＰＤＳ）、ヒドロキシルアミン、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ／フェノール／アミノアンチピリン、ＡｕＣｌ4の存在下でのＡｕ−ＮＰシード、レゾルフィンブチレート、酢酸インドキシル、Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル）フェニル］マレイミド、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬）、量子ドット（ＱＤ）、チオールグリーン指示薬またはＡｂＲｅｄ指示薬を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
蛍光指示薬がＤＴＮＢであるという条件で、反応生成物が２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、前記殺有害生物剤を定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アセチルコリンエステラーゼが、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
（ｉｉｉ）ＧＰＩ係留部位が欠失しており、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質由来の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼ、
である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アセチルコリンエステラーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
殺有害生物剤が、アセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
殺有害生物剤が有機リン酸エステル（ＯＰ）またはカルバメート（ＣＢ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に独立に提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼの反応生成物に基づき、殺有害生物剤を同定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるアセチルコリンエステラーゼ変異体または異なる生物に由来するアセチルコリンエステラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
フィンガープリントライブラリーとして異なる殺有害生物剤の発色パターンを記録することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
フィンガープリントライブラリーを比較することにより、未知の殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
機械学習により、異なる発色パターンを有する殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
機械学習が、ロジスティック回帰分析、デシジョンツリー（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ）、サポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）、ＲａｎｄｏｍまたはｅＸｔｒｅｍｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｂｏｏｓｔｉｎｇを含むソフトウェアにより実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に様々な活性で独立に提示される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
様々な活性を有するアセチルコリンエステラーゼを発現させるために異なる細胞濃度が使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
殺有害生物剤を検出するためのキットであって、
細胞上で発現されるアセチルコリンエステラーゼ、および
アセチルコリンエステラーゼ基質
を含むキット。
【請求項２１】
蛍光指示薬をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
殺有害生物剤が有機リン酸エステル（ＯＰ）またはカルバメート（ＣＢ）を含む、請求項２０に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼ基質がＤＴＮＢであるという条件で、反応生成物は２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）であってもよい。
好ましくは、方法は、殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、殺有害生物剤を定量するステップをさらに含み得る。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
（ｉｉｉ）ＧＰＩ係留部位が欠失しており、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）に置き換わっている、アセチルコリンエステラーゼ
であり得る。
より好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
１つの態様では、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
（ｉｉｉ）ＧＰＩ係留部位が欠失しており、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼ、
をコードするヌクレオチド配列、
ｈｒ１−ｈｓｐ７０およびｐ１０デュエルプロモーター、および
ミツバチメリチンシグナルペプチド（ＨＭ）および／または六量体ヒスチジンタグ（６Ｈ）
を含むプラスミドが本明細書で提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
１つの態様では、前記プラスミドでトランスフェクトされた細胞により生み出されたバキュロウイルスが本明細書で提供される。
１つの態様では、
（ｉ）完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
（ｉｉｉ）ＧＰＩ係留部位が欠失しており、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼ
を細胞表面に発現する細胞であって、
前記アセチルコリンエステラーゼが、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸を含む細胞が本明細書で提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
【図１】バキュロウイルス発現ベクター系による組換え完全長ＡＣｈＥおよび融合ＡＣｈＥの構築を例証する図である。試験で使用される発現コンストラクトの略図。（ａ）ＡＣｈＥ−ＦＬは、完全長ＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）ｃＤＮＡを含有する。（ｂ）ＡＣｈＥ−６ＭＣは、トランケートされたＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）を含有し、これによりＡＣｈＥ酵素のグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)係留部位が欠失し、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質由来の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞質ドメイン（ＣＴＤ）に置き換わっている（すなわち、６ＭＣ）。（ｃ）ＡＣｈＥを発現しない対照バキュロウイルス（Ｃｏｎｔ−ｂａｃ）を生成させるための空ベクター（ｐＡＢＥＧｈｈｐ１０）。Ａｃ−１２５０ｂｐおよびＡｃ−１４３３ｂｐ：組換えウイルスを生成する相同的組換え用のバキュロウイルスのゲノムに由来するラテラル配列。ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子。ｐａｇ：ｐａｇプロモーター。ｈｒ１−ｈｓｐ７０−ｐ１０：ｈｒ１−ｈｓｐ７０およびｐ１０プロモーターを含有するデュエルプロモーター。ＨＭ：ミツバチメリチンシグナルペプチド。６Ｈ：六量体ヒスチジンタグ。
【図２】細胞表面発現型ＡＣｈＥ組換えタンパク質に関するＡＣｈＥ活性の決定を示す図である。０．５のＭＯＩ、および３日間のインキュベーションにより、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびＣｏｎｔ−ｂａｃにＨｉ５細胞を個別に感染させた。感染細胞内で発現したＡＣｈＥの活性を測定し、黄色により評価した。（ａ）標準溶液曲線はＡＣｈＥ標準溶液（Ａｂｃａｍ社）により確立された。個々のＣｏｎｔ−ｂａｃ（ｂ）、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ｃ）、およびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ｄ）クローンを、基質アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）およびエルマン試薬ＤＴＮＢ溶液を使用して９６ウェルプレート中で可視化した。
【図３−１】細胞表面発現型ＡＣｈＥタンパク質に対する凍結乾燥の効果について、その評価を示す図である。０．５のＭＯＩを用いて３日間、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、またはＣｏｎｔ−ｂａｃ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ感染させたＨｉ５細胞を凍結乾燥に５時間付した。模擬：ウイルスに感染していない細胞。−ｌｙｏ：凍結乾燥されない細胞。＋ｌｙｏ：凍結乾燥した細胞。（ａ）蛍光および明視野顕微鏡により検査した細胞形態。
【図３−２】細胞表面発現型ＡＣｈＥタンパク質に対する凍結乾燥の効果について、その評価を示す図である。０．５のＭＯＩを用いて３日間、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、またはＣｏｎｔ−ｂａｃ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ感染させたＨｉ５細胞を凍結乾燥に５時間付した。模擬：ウイルスに感染していない細胞。−ｌｙｏ：凍結乾燥されない細胞。＋ｌｙｏ：凍結乾燥した細胞。（（ｂ）組換えバキュロウイルス感染細胞のＡＣｈＥ活性を凍結乾燥有り／無しで決定した。
【図４−１】ＡＣｈＥ膜タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの最適化を示す図である。（ａ）示すように、様々なＭＯＩを用いてｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＡＣｈＥ−ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（ＡＣｈＥ−６ＭＣ）、およびｖＣｏｎｔ（Ｃｏｎｔ）に個別に感染させた９６ウェルＨｉ５細胞試料についてＡＣｈＥ活性の決定を可視化する。感染条件のいずれも三重で実施した。
【図４−２】ＡＣｈＥ膜タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの最適化を示す図である。（ｂ）感染細胞に由来するＡＣｈＥ活性を定量化する。
【図５−１】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（６ＭＣ）、またはｖＣｏｎｔ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は、（ａ）パラオキソンエチルである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−２】図５−１続き。
【図５−３】図５−２続き。
【図５−４】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（６ＭＣ）、またはｖＣｏｎｔ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は、（ｂ）マラオキソンである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−５】図５−４続き。
【図５−６】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（６ＭＣ）、またはｖＣｏｎｔ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は（ｃ）カルボフランである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−７】図５−６続き。
【図５−８】細胞表面提示型ＡＣｈＥによるＯＰ系およびＣＢ系殺虫剤残留物の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（ＦＬ）、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（６ＭＣ）、またはｖＣｏｎｔ（Ｃｏｎｔ）にそれぞれ３日間感染させた。培地を除去した後、細胞を９６ウェルプレート内で５時間の凍結乾燥に付した。２つのＯＰ系および２つのＣＢ系殺虫剤化合物を連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞試料および１００ｍＵ／ｍＬのＡＣｈＥ（ＳＴ、Ａｂｃａｍ社）に、ならびにさらに比較するためのキュベット中の市販ＡＣｈＥ（Ｓｉｃｈｅｎ社）に添加した。異なる殺虫剤に対するこれらＡＣｈＥの感受性を決定するために、これらの試料すべてについてＡＣｈＥ活性を分析した。ＤＰＢＳ中で異なる濃度のＤＭＳＯを添加してバックグラウンド効果を確認した。テストされた殺有害生物剤は（ｄ）カルバリルである。ピンク色のブロックで覆われた領域は、様々な農産物から検出可能な残留殺有害生物剤の最大許容限界を示した。
【図５−９】図５−８続き。
【図６】バキュロウイルス発現ベクター系について、７つの種に由来する組換えＡＣｈＥのコンストラクトを示す図である。（ａ）キイロショウジョウバエ（Ｙ４０８Ｆ変異体）、（ｂ）ホモサピエンス（Ｈｓ）、（ｃ）ラット（Ｒｎ）、（ｄ）セイヨウミツバチ（Ａｍ）、（ｅ）スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）、（ｆ）オオミジンコ（Ｄａｍ）、および（ｇ）ミカンコミバエ（Ｂｄ）に由来する組換えＡＣｈＥに関する発現コンストラクトの略図。ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰレポーター遺伝子。ｐａｇ：ｐａｇプロモーター。ｈｒ１−ｈｓｐ７０−ｐ１０：ｈｒ１−ｈｓｐ７０およびｐ１０プロモーターを含有するデュアルプロモーター。ＨＭ：ミツバチメリチンシグナルペプチド。６Ｈ：六量体ヒスチジンタグ。
【図７−１】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ａ）クロルピリホス、（ｂ）エチオンを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図７−２】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ｃ）カルバリル、（ｄ）カルボフランを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図７−３】多重種ＡＣｈＥによる殺有害生物剤の検出を示す図である。Ｈｉ５細胞を、ｖＤｍＡＣｈＥ（Ｄｍ）、ｖＨｓＡＣｈＥ（Ｈｓ）、ｖＲｎＡＣｈＥ（Ｒｎ）、ｖＡｍＡＣｈＥ（Ａｍ）、ｖＳｆＡＣｈＥ（Ｓｆ）、ＤａｍＡＣｈＥ（Ｄａｍ）、およびｖＢｄＡＣｈＥ（Ｂｄ）にそれぞれ感染させた。感染後３日目に採取した後、細胞をＰＢＳ中で３つの異なる濃度に稀釈した：１ウェル当たり細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個。５つの殺有害生物剤、すなわち（ｅ）メトミルを１０-3〜１０-9Ｍに連続稀釈し、９６ウェルプレート中の感染細胞に個別に添加した。基質ＡＴＣｈおよびＤＴＮＢ溶液を添加することにより、残存するＡＣｈＥ活性を測定し、４１２ｎｍにおいて光学濃度を決定した。
【図８−１】多重種ＡＣｈＥによりアッセイされた殺有害生物剤残留物の迅速同定を実現するための機械学習の使用を示す図である。（ａ）所定の濃度を有する各殺有害生物剤について、多重種ＡＣｈＥプラットフォームから得られた検出結果を収集し、２１パラメーターデータセットに編成した。（ｂ）これらのデータセットを使用して同定モデルを訓練および構築した。
【図８−２】多重種ＡＣｈＥによりアッセイされた殺有害生物剤残留物の迅速同定を実現するための機械学習の使用を示す図である。所定の濃度を有する各殺有害生物剤について、多重種ＡＣｈＥプラットフォームから得られた検出結果を収集し、２１パラメーターデータセットに編成した。（ｂ）これらのデータセットを使用して同定モデルを訓練および構築した。（ｃ）未知の殺有害生物剤決定因子に由来するデータセットをインプットすると、同定モデルは殺有害生物剤および濃度（ｄ）の両方を区別し得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
細胞株およびウイルス
組換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）生成用のスポドプテラ・フルギペルダＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＴＣ１００昆虫培地（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）中、２６℃で増殖させた。最大組換えタンパク質発現用のイラクサギンウワバＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞を、ＥＳＦ９２１（商標）昆虫細胞培養培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）中、２６℃で増殖させた。ｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、またはＡＣｈＥ  ｃＤＮＡを有さない対照ウイルス（ｖＣｏｎｔ）を含む組換えバキュロウイルスを、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−昆虫トランスフェクション試薬（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｉｒｕｓ社）を使用して、ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）で改変されたＡｃＭＮＰＶゲノム（Ｍｉｒｕｓ社）を、トランスファーベクタープラスミドと共にＳｆ２１細胞中に同時トランスフェクトすることにより生成させた。組換え体を繁殖させ、連続希釈により単離した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の両方により、ウイルスクローン力価を測定した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
プラスミドの構築
ＡＣｈＥ配列は、変異Ｙ４０８Ｆ［１１］を有するキイロショウジョウバエ［１０］に由来し、その配列はＢｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．社により合成された。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０は、アミノ末端にミツバチメリチンシグナルペプチドおよびカルボキシル末端にＧＰ６４膜貫通ドメインおよびＣＴＤドメインを有するトランスファーベクターである（６ＭＣ）。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０は、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質の発現を推進するｐａｇプロモーターを担持し、ｐ１０プロモーターの下流に外来配列の挿入を可能にする。ＡＣｈＥ  Ｙ４０８Ｆ配列を、ＫＯＤホットスタートマスターミックス（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（Ｍｅｒｃｋ社）および２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。６ＭＣを有さないＦＬコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーはＨＡＣｈＥｉｆｐ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴ−３’、配列番号１３）、およびＡＣｈＥ２ｒｐ（５’−ＣＧＧＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＡＡＣＡＣＧＣＧＣＴＴＡＧＴＴＣＴＣ−３’、配列番号１４）であった。Ｃ末端ＧＰＩ係留トランケート化ＡＣｈＥ  ６ＭＣコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーは、ＨＡＣｈＥｉｆｐ（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＴ−３’、配列番号１３）、およびＡＣｈＥｄｅＧＰＩｒｐ（５’−ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＣ−３’、配列番号１５）であった。プラスミドｐＡＢＥＧｈｈｐ１０を、ＫＯＤホットスタートマスターミックス（Ｍｅｒｃｋ社）および２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。ＦＬコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、ｐＡＢｈｈｐ１０ＨＭ６Ｈ２ｆｐ（５’−ＡＣＴＡＡＧＣＧＣＧＴＧＴＴＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＡＴ−３’、配列番号１６）、およびＨＡＣｈＥｖｒｐ（５’−ＣＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号１７）であった。６ＭＣコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、ｐＡＢｈｈｐ１０ＨＭ６Ｈｆｐ（５’−ＡＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＣＴＴＴＧＴ−３’、配列番号１８）、およびＨＡＣｈＥｖｒｐ（５’−ＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号１７）であった。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．社）を使用することにより、挿入断片をベクター断片と融合させた。変換およびコロニー採集の後、プラスミドを増幅、抽出し、配列分析により検証した。得られた完全長ＡＣｈＥ、ＡＣｈＥ−６ＭＣを含有するプラスミド、およびＡＣｈＥ挿入を有さない対照ウイルスを、ＦＬ、６ＭＣ、およびＣｏｎｔとしてそれぞれ省略した。得られたプラスミドをｐＡＣｈＥ−ＦＬ（配列番号５）、ｐＡＣｈＥ−６ＭＣ（配列番号６）、およびｐＣｏｎｔ−Ｂａｃと命名し、また得られた組換えバキュロウイルスをｖＡＣｈＥ−ＦＬ、ｖＡＣｈＥ−６ＭＣ、およびＣｏｎｔ−Ｂａｃと命名した。一実施形態では、ＡＣｈＥ−ＦＬは配列番号１のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ＡＣｈＥ−ＦＬは、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる。別の実施形態では、ＡＣｈＥ−６ＭＣは配列番号３のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、ＡＣｈＥ−６ＭＣは配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
これに加えて、ヒト（ＨｓＡＣｈＥ）、ラット（ＲｎＡＣｈＥ）、セイヨウミツバチ（ＡｍＡＣｈＥ）、スポドプテラ・フルギペルダ（ＳｆＡＣｈＥ）、オオミジンコ（ＤａｍＡＣｈＥ）、およびミカンコミバエ（ＢｄＡＣｈＥ）に由来するＡＣｈＥ配列を、Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．社により合成した。組換えバキュロウイルス用のトランスファーベクターを生成するために、上記記載の全ＡＣｈＥ配列をベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０中にクローン化した。得られた組換えバキュロウイルスを、ｖＨｓＡＣｈＥ、ｖＲｎＡＣｈＥ、ｖＡｍＡＣｈＥ、ｖＳｆＡＣｈＥ、ｖＤａｍＡＣｈＥ、およびｖＢｄＡＣｈＥとそれぞれ呼ぶことにし、得られた組換えプラスミドを、ｐＨｓＡＣｈＥ、ｐＲｎＡＣｈＥ、ｐＡｍＡＣｈＥ、ｐＳｆＡＣｈＥ、ｐＤａｍＡＣｈＥ、およびｐＢｄＡＣｈＥとそれぞれ呼ぶことにした。一実施態様では、ｐＡＣｈＥ−ＦＬから生成したバキュロウイルスをｖＤｍＡＣｈＥと命名した。一実施形態では、ＨｓＡＣｈＥは、配列番号７のアミノ酸を含む。ＲｎＡＣｈＥは、配列番号８のアミノ酸を含む。ＡｍＡＣｈＥは、配列番号９のアミノ酸を含む。ＳｆＡＣｈＥは、配列番号１０のアミノ酸を含む。ＤａｍＡＣｈＥは、配列番号１１のアミノ酸を含む。ＢｄＡＣｈＥは、配列番号１２のアミノ酸を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
アセチルコリンエステラーゼストック溶液を、アッセイバッファー中、１：５０の比で５０ユニット／ｍＬに稀釈し、１０００ｍＵ／ｍＬのアセチルコリンエステラーゼ標準溶液を生成した。次に、各標準の平均吸収を決定するために、１０００ｍＵ／ｍＬのアセチルコリンエステラーゼ標準溶液を、３００、１００、３０、１０、３、１、および０ｍＵ／ｍＬにさらに稀釈した。各標準の読み取りをアセチルコリンエステラーゼの量の関数としてプロットして標準曲線を確立し、各テスト試料中の対応するＡＣｈＥの量を、求めた直線式より計算した。ＡＣｈＥ活性阻害（％）を計算するのに、Ｃｏｎｔ−Ｂａｃ感染細胞（表面でＡＣｈＥを発現しない）は、陰性対照として機能した一方、Ａｂｃａｍ社の精製タンパク質、Ｓｉｃｈｅｎ社の市販タンパク質、殺有害生物剤インキュベーション無しのｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ感染細胞は陽性対照として機能した。陽性対照の活性は１００％とみなした。ＡＣｈＥの残存活性を下記の式により評価する：
ＡＣｈＥ活性阻害（％）＝〔（ΔＡ0−ΔＡS）／ΔＡ0〕×１００
式中、ΔＡ0は、陽性対照の吸収の変化を表し、ΔＡSは、殺有害生物剤を適用してインキュベートした溶液の吸収の変化を表わす。阻害活性曲線により確立された直線式に基づき、ＡＣｈＥのＩＣ50の数値（活性を５０％阻害するのに必要とされる濃度）を計算した［１２］。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
結果
昆虫細胞表面発現用として高感受性ＡＣｈＥ変異体および異なる種に由来する７つのＡＣｈＥを合成した
キイロショウジョウバエ由来のＡＣｈＥを、本出願における酵素として選択し、この酵素をコードするオリゴヌクレオチド（バキュロウイルス−昆虫系に対してコドン最適化されている）を合成した。酵素感受性を高めるためにＹ４０８Ｆ変異を合成遺伝子に導入したが、それは酵素感受性の最大１２倍の増加を示した［１１］。この組換え酵素を発現させるために２つのコンストラクトを生成した（図１）。コンストラクトｐＡＣｈＥ−ＦＬは、完全長ＡＣｈＥ（Ｙ４０８Ｆ）、タンパク質分泌用のＮ末端ミツバチメリチンシグナルペプチド（ＨＭ）、および六量体ヒスチジンタグ（６Ｈ）を含み、これらはいずれも、ｈｒ１−ｈｓｐ７０（すなわち、ｈｒ１エンハンサー配列と融合したｈｓｐ７０プロモーター）およびｐ１０プロモーターを含有するデュエルプロモーターの下に置かれる（図１、パート（ａ））。Ｃ−末端ＧＰＩ係留部位が欠失し、バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質由来のＴＭおよびＣＴＤと融合し、同一の発現ベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０（図１、パート（ｃ））の下に置かれている他のコンストラクト、ｐＡＣｈＥ−６ＭＣ（図１パート（ｂ））も生成される。ＧＰ６４のＴＭおよびＣＴＤで置換すれば、バキュロウイルスのエンベロープおよび昆虫細胞の表面への組換えタンパク質の係留が改善することが報告されている12-14。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
昆虫細胞表面発現型ＡＣｈＥは酵素活性を示した
２つの組換えバキュロウイルスｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣをそれぞれ生成して、ＡＣｈＥ−ＦＬおよびＡＣｈＥ−６ＭＣを発現させた。空ベクターｐＡＢＥＧｈｈｐ１０も、陰性対照として組換えウイルスを生成するのに使用され、Ｃｏｎｔ−ｂａｃと命名された（図１、パート（ｃ））。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞は一般的に使用される昆虫細胞においてより高レベルの組換えタンパク質を発現することができたので、Ｈｉ５昆虫細胞を酵素発現用として使用した。さらに、細胞を無血清培地内で順応させ、したがって、最終酵素反応は血清干渉がない状態で実施され得る。９６ウェルプレート内で、０．５のＭＯＩを用いてＨｉ５細胞を感染させるために、２０個の単一ウイルスのそれぞれをｖＡＣｈＥ−ＦＬおよびｖＡＣｈＥ−６ＭＣから選択し、４つの単一ウイルスをＣｏｎｔ−ｂａｃ用として選択し、感染後３日目（ｄｐｉ）にそのＡＣｈＥ活性をアッセイした。酵素活性の標準曲線を確立するために、ＡＣｈＥ標準溶液を０〜１０００ｍＵ／ｍＬの範囲に稀釈した（図２、パート（ａ））。Ｃｏｎｔ−ｂａｃ感染細胞は基質アセチルコリンおよび発色剤ＤＴＮＢ溶液（図２、パート（ｂ））と反応した後、ほとんど透明な色を呈したように、ｖＡＣｈＥ−ＦＬ（図２、パート（ｃ））およびｖＡＣｈＥ−６ＭＣ（図２、パート（ｄ））単一ウイルスに感染した細胞は、いずれも目視可能な黄色を呈し、平均６０〜８０ｍＵ／ｍＬの酵素活性にそれぞれ変換された。各コンストラクトにおいて最高活性を示す１つの単一ウイルスを次の実験用として選択した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
多重種ＡＣｈＥプラットフォームは様々なＯＰ系およびＣＢ系殺有害生物剤に対して顕著な感受性を示した
６つのＡＣｈＥ（ｖＨｓＡＣｈＥ、ｖＲｎＡＣｈＥ、ｖＡｍＡＣｈＥ、ｖＳｆＡＣｈＥ、ｖＤａｍＡＣｈＥ、およびｖＢｄＡＣｈＥ）に関する組換えバキュロウイルスを生み出した後、Ｈｉ５細胞をｖＤｍＡＣｈＥおよびこれらのウイルスにそれぞれ感染させた。感染から３日後、感染細胞を細胞スクレーパーにより培養プレートまたはフラスコから削り取り、ＤＰＢＳに懸濁した。ＡＣｈＥ酵素濃度を調整するために、各９６ウェルに添加される細胞数を変化させた。最初の細胞数を細胞カウンターによりカウントし、希釈または濃縮により３つの異なる細胞濃度を調整した。図７では、細胞５×１０3個、１．５×１０4個、および４．５×１０4個／ウェルの細胞濃度を使用した結果を示した。殺有害生物剤を添加した後、ＡＣｈＥ活性が阻害されれば、黄色の発色（４１２ｎｍにおける吸収により決定可能である）の減少を引き起こす。異なる初期濃度を有する７つのＡＣｈＥは、クロルピリホスおよびエチオンを含むＯＰ、ならびにカルバリル、カルボフラン、およびメトミル殺有害生物剤を含むＣＢに対して様々な感受性を示した（図７）。
【国際調査報告】
2022501015.tif 000030
2022501015.tif 000031