(57)【要約】  本開示は、それを必要とする対象にＴＧＲ５作動薬、例えば、胆汁酸（ＢＡ）を投与することを含む、免疫を増強するための方法を提供する。本明細書は、さらに、それを必要とする対象にＴＧＲ５拮抗薬を投与することを含む、免疫を抑制するための方法を提供する。本開示は、さらに、ＴＧＲ５を候補薬剤と相互作用させることを含む、免疫調節薬を同定するための方法を提供する。
2022500506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫を増強する方法。
【請求項２】
免疫が、微生物感染に対する免疫であり、前記微生物感染は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス感染が、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスによって引き起こされ、前記ＤＮＡウイルスは、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルスを含み、前記ＲＮＡウイルスは、ｓｓＲＮＡウイルス又はｄｓＲＮＡウイルスを含み、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ、ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ジカウイルス（Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ）、ＥＶ７１、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＥＢウイルス、及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択され、前記単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物感染が、結核、カンジダ症、アスペルギルス症、藻類ウイルス（ａｌｇｉｎｏｓｉｓ）、ノカルディア及びクリプトコッカス症からなる群より選択される疾患を引き起こす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
免疫が、腫瘍に対する免疫であり、前記腫瘍は、固形腫瘍又は白血病を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＲ５−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬が、ＴＧＲ５作動薬、ＧＲＫ作動薬、β−アレスチン作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬であり、
ここで、前記ＧＲＫ作動薬が、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５及び／又はＧＲＫ６作動薬、特に、ＧＲＫ２、ＧＫＲ４及び／又はＧＲＫ６作動薬、さらに特に、ＧＲＫ６作動薬から選ばれ、且つ
前記β−アレスチン作動薬は、β−アレスチン−１及び／又はβ−アレスチン−２作動薬から選ばれる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬が、胆汁酸源、特に、胆汁酸、例えば、一次胆汁酸又は二次胆汁酸、非抱合型胆汁酸又は抱合型胆汁酸である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
胆汁酸が、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ケトリソコール酸、スルホリソコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫を阻害する方法。
【請求項１０】
免疫が、自己免疫疾患に関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬が、ＴＧＲ５拮抗薬、β−アレスチン−１／２拮抗薬及び／又はＳｒｃ拮抗薬から選ばれる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫を調節することで治療できる疾患を処置するための方法。
【請求項１３】
疾患が、微生物感染によって引き起こされる疾患又は腫瘍であり、前記微生物感染は、ウイルス感染、細菌感染及び真菌感染を含み、前記腫瘍は、固形腫瘍及び白血病を含み、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
疾患が、自己免疫疾患であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターが、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬は、ＴＧＲ５拮抗薬、β−アレスチン−１／２拮抗薬及び／又はＳｒｃ拮抗薬から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
単独のアジュバントとして又はワクチン組成物のアジュバントとして、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてワクチン接種する方法であって、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれる、方法。
【請求項１６】
ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を含む、ワクチン接種用アジュバント組成物。
【請求項１７】
アジュバントとして、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を含む、ワクチン組成物。
【請求項１８】
候補薬剤をＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路のレポーターに接触させること、及びＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性を測定することを含む、免疫調節薬を同定するための方法であって、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路活性の変化が、前記候補薬剤が免疫調節薬であることを示す、方法。
【請求項１９】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性の増強は、前記候補薬剤が免疫増強剤であることを示し、且つＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性の低下は、前記候補薬剤が免疫抑制剤であることを示す、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年９月２５日に提出された、発明の名称が「Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＴＧＲ５  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｔ」であるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０７３５８に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、それを必要とする対象にＴＧＲ５作動薬（agonist）、例えば、胆汁酸（ＢＡ）を投与することを含む、免疫を増強するための方法を提供する。本明細書は、さらに、それを必要とする対象にＴＧＲ５拮抗薬（antagonist）を投与することを含む、免疫を抑制するための方法を提供する。本開示は、さらに、ＴＧＲ５を候補薬剤と相互作用させることを含む、免疫調節薬を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
胆汁酸（ＢＡ）は、主に、哺乳動物及び他の脊椎動物の胆汁に含まれるステロイド酸である。一次胆汁酸は、肝臓で生合成されたものであり、二次胆汁酸は、結腸内の細菌の作用によって生成されたものである。抱合型胆汁酸は、タウリン又はグリシンと抱合したものであり、遊離型胆汁酸は、抱合されていないものに対応する。
【０００４】
小腸内の胆汁酸／塩の濃度は、ミセルを形成して脂質を溶解するのに十分な高さである。胆汁酸を含むミセルは、リパーゼが脂質を消化するのに助け、それを小腸刷子縁膜の近くに運び、脂肪の吸収をもたらす。
【０００５】
胆汁酸は、生体内からコレステロールを排除する、胆汁の流れを促進して特定の異化代謝物（ビリルビンを含む）を排除する、脂溶性ビタミンを乳化して吸収できるようにする、腸管の蠕動運動を助けて小腸及び胆道内の細菌叢の存在を減らすなどの他の機能を有する。
【０００６】
Ｙ．Ｃａｌｍｕｓと共同研究者は、ケノデオキシコール酸及びウルソデオキシコール酸がインターロイキン−１、インターロイキン−６及び腫瘍壊死因子−αの産生を阻害し、インビトロ（in vitro）で単球活性に多かれ少なかれ強い免疫抑制効果をもたらすことを発見し、これは、ＴＧＲ５の活性化によって媒介されるものである（Ｃａｌｍｕｓ  Ｙ、  Ｇｕｅｃｈｏｔ  Ｊ、  Ｐｏｄｅｖｉｎ  Ｐ、  Ｂｏｎｎｅｆｉｓ  ＭＴ、  Ｇｉｂｏｕｄｅａｕ  Ｊ、  Ｐｏｕｐｏｎ  Ｒ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１、  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９２；  １６：７１９−２３．［１５］）。
【０００７】
ＴＧＲ５の抗炎症作用は、炎症誘発性転写核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の阻害によって媒介されたものである（Ｐｏｌｓ  ＴＷＨ、  Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ、  Ｈａｒａｃｈ  Ｔ、  ｅｔ  ａｌ．  ＴＧＲ５  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０１１；  １４：７４７−５７；Ｗａｎｇ  Ｙ−Ｄ、  Ｃｈｅｎ  Ｗ−Ｄ、  Ｙｕ  Ｄ、  Ｆｏｒｍａｎ  ＢＭ、  Ｈｕａｎｇ  Ｗ．  Ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、  Ｇｐｂａｒ１  （ＴＧＲ５）、  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ＮＦ−κＢ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１１；  ５４：１４２１−３２）。ＴＧＲ５ノックアウトマウスに由来するマクロファージでは、ＮＦ−κＢの標的となる複数の炎症誘発性遺伝子（誘導性ＮＯＳ、インターフェロン誘導性タンパク質及びＩＬ−１α）のｍＲＮＡレベルは、野生型マウスに由来するマクロファージよりも高くなる。同様に、マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７では、ＴＧＲ５の活性化は、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する。ＴＧＲ５が活性化されるか、又は過剰発現する場合には、ＬＰＳ処理後にＮＦ−κＢの転写活が阻害されている。
しかしながら、本発明者は、胆汁酸が自然免疫応答を増強することを予期せず発見し、次いで、先行技術の知識とは異なるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣシグナル伝達（ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−ａｒｒｅｓｔｉｎ−ＳＲＣ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の新た免疫調節効果を発見するため、本発明を完了している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、胆汁酸が自然免疫応答を増強するという本発明者らの予想外の発見に基づいている。
【０００９】
ウイルス感染は、胆汁酸、例えば、ケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＤＣＡ）、リトコール酸（ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＡＣ）又はデオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＣＡ）の細胞内蓄積を引き起こす。
【００１０】
胆汁酸、例えば、ＣＤＣＡ、ＬＡＣ及びＤＣＡは、ＴＧＲ５の作動薬として作用し、下流のシグナル伝達成分ＧＲＫ、β−アレスチン及びＳＲＣを活性化する。
【００１１】
胆汁酸及び一般的にＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣの作動薬は、免疫応答を誘発するため、ウイルスを排除することができる。
【００１２】
第１の側面、本発明は、免疫増強剤の調製におけるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬の使用を提供する。
【００１３】
他の側面では、本開示は、それを必要とする対象において免疫を増強するための方法であって、前記対象にＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
一実施形態では、前記免疫は、微生物感染、例えば、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染に対する免疫である。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ウイルス感染は、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス、例えば、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡウイルス又はｄｓＲＮＡウイルス、さらに、例えば、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ、ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ジカウイルス（Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ）、ＥＶ７１、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＥＢウイルス、及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選ばれるものによって引き起こされる。
【００１６】
他の実施形態では、微生物感染は、例えば、結核、カンジダ症、アスペルギルス症、藻類ウイルス（ａｌｇｉｎｏｓｉｓ）、ノカルディア及びクリプトコッカス症からなる群より選ばれる疾患を引き起こす。
【００１７】
他の実施形態では、免疫は、腫瘍、例えば、固形腫瘍又は白血病に対する免疫である。
【００１８】
他の実施形態では、ＴＧＲ５−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、ＧＲＫ作動薬、β−アレスチン作動薬、及び／又はＳｒｃ作動薬であり、
ここで、ＧＲＫ作動薬は、例えば、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５及び／又はＧＲＫ６作動薬、特に、ＧＲＫ２、ＧＫＲ４及び／又はＧＲＫ６作動薬、さらに特に、ＧＲＫ６的作動薬であり、且つ
ここで、β−アレスチン作動薬は、例えば、β−アレスチン−１及び／又はβ−アレスチン−２作動薬である。
【００１９】
他の実施形態では、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、胆汁酸源、特に、胆汁酸、例えば、一次胆汁酸又は二次胆汁酸、非抱合型胆汁酸又は抱合型胆汁酸である。
【００２０】
他の実施形態では、胆汁酸は、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ケトリソコール酸（ｋｅｔｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、スルホリソコール酸（ｓｕｌｐｈｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。
【００２１】
第２の側面、本発明は、免疫抑制剤の調製におけるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬の使用を提供する。
【００２２】
他の側面では、本開示は、それを必要とする対象において免疫を抑制するための方法であって、前記対象にＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬を投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
一実施形態では、免疫は、自己免疫疾患に関連する。
【００２４】
他の実施形態では、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬は、ＴＧＲ５拮抗薬、β−アレスチン−１／２拮抗薬及び／又はＳｒｃ拮抗薬である。
【００２５】
第３の側面では、本発明は、免疫を調節することで治療できる疾患を治療するための薬物の調製におけるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターの使用を提供する。
【００２６】
他の側面では、本開示は、それを必要とする対象において免疫を調節することで治療できる疾患を治療する方法であって、前記対象にＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
一実施形態では、前記疾患は、ウイルス感染、細菌感染及び真菌感染を含む微生物感染、固形腫瘍及び白血病を含む腫瘍から選ばれ、且つ前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬、例えば、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬である。
【００２８】
他の実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患であり、且つ前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬、例えば、ＴＧＲ５拮抗薬、β−アレスチン−１／２拮抗薬及び／又はＳｒｃ拮抗薬である。
【００２９】
第４の側面では、本発明は、ワクチンアジュバントの調製におけるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬の使用を提供し、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれる。
【００３０】
他の側面、本開示は、それを必要とする対象にワクチンを接種する方法であって、前記対象に、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬、例えば、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬を単独で投与するか、又はワクチン組成物のアジュバントとして投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
それに対応して、本開示は、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬、例えば、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬を含むワクチン接種用アジュバント組成物を提供する。しかも、本開示は、さらに、アジュバントとしてＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬、例えば、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬を含むワクチン組成物を提供する。
【００３２】
第５の側面では、本開示は、候補薬剤をＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路のレポーターに接触させること、及びＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性を決定することを含む、免疫調節薬を同定するための方法において、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路活性の変化は、前記候補薬剤が免疫調節薬であることを示す、方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性化増強は、前記候補薬剤が免疫増強剤であることを示し、且つＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性化低下は、前記候補薬剤が免疫抑制剤であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１。ウイルス感染は、ＢＡの生合成及び吸収に関与する複数のタンパク質の発現をＮＦ−κＢ依存的に誘導する。  Ａは、ウイルス感染によるＢＡ代謝に関与する遺伝子発現の誘導を示すヒートマップであり、ＴＨＰ１細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行い、次いで、ヒートマップによりデータを分析する。  Ｂは、ウイルスによって誘導されるＢＡ代謝に関与する複数の遺伝子発現への異なる阻害剤の影響を示し、ＴＨＰ１細胞をＤＭＳＯ又は特定の阻害剤で処理した後、ＨＳＶ−１又はＳｅＶを４時間感染させ、次いで、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｃは、ＳｅＶによって誘導されるＢＡ代謝に関与するタンパク質発現へのＩＲＦ３又はｐ６５ノックアウトの影響を示し、対照、ＩＲＦ３又はｐ６５のｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＳｅＶを特定の時間感染させ、次いで特定の遺伝子のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｄは、ＨＳＶ−１によって誘導されるＢＡ代謝に関与するタンパク質発現へのＩＲＦ３又はｐ６５ノックアウトの影響を示し、ＳｅＶの代わりにＨＳＶ−１を使用した以外は、Ｃと同様に実験を行う。  Ｅは、ｐ６５と特定の遺伝子のプロモーターと結合するＣＨＩＰ解析を示し、ＴＨＰ１細胞にＳｅＶ又はＨＳＶ−１を特定の時間感染させた後、ＣＨＩＰアッセイを行い、次いで、ｐ６５に結合したＤＮＡ断片の存在量のｑＰＣＲ解析を特定のプライマーで行う。  Ｆは、ウイルス感染によって誘導されるＢＡ代謝に関与するタンパク質発現へのＶＩＳＡノックアウトの影響を示し、対照及びＶＩＳＡのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の遺伝子のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｇは、ウイルス感染によって誘導されるＢＡ代謝に関与するタンパク質発現へのＭＩＴＡノックアウトの影響を示し、対照及びＭＩＴＡのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞をＨＳＶ−１で特定の時間感染させた後、特定の遺伝子のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｈは、ウイルス感染によって誘導されるＩＫＫα／β、ｐ６５及びＩＲＦ３のリン酸化へのＶＩＳＡノックアウトの影響を示し、対照及びＶＩＳＡのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＳｅＶを特定の時間感染させ、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行うために細胞を溶解する。  Ｉは、ウイルス感染によって誘導されるＩＫＫα／β、ｐ６５及びＩＲＦ３のリン酸化へのＭＩＴＡノックアウトの影響を示し、対照及びＭＩＴＡのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞をＨＳＶ−１で特定の時間感染させ、細胞を溶解して特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｊは、ウイルス感染によって誘導されるＢＡ代謝に関与するタンパク質の発現を示し、ＴＨＰ１細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｋは、ウイルスによって誘導されるＢＡ代謝に関与する遺伝子発現へのＵＶ処理の影響を示し、ＴＨＰ−１細胞に野生型又はＵＶ処理されたＨＳＶ−１及びＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｌは、ウイルスによって誘導されるＩＲＦ３、ＩＫＫα／β及びｐ６５のリン酸化への���Ｖ処理の影響を示し、ＴＨＰ−１細胞に野生型又はＵＶ処理されたＨＳＶ−１及びＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。
【００３５】
【図２】図２。ウイルス感染は、生合成及び吸収の両方により細胞内の胆汁酸の蓄積を誘発する。  Ａは、完全培地及びブランク培地で培養されたＴＨＰ−１細胞の細胞内ＢＡの測定を示し、ＴＨＰ−１細胞を新しい完全培地（ＣＭ）又はブランク培地（ＢＭ）で培養した後、ＳｅＶ又はＨＳＶ−１を特定の時間感染させ、次いで、細胞を収集してＢＡを測定する。  Ｂは、完全培地及びブランク培地で培養された肝細胞の細胞内ＢＡの測定を示し、肝臓のＷＲＬ６８細胞を使用した以外は、（Ａ）と同様に実験を行う。  Ｃは、ＭＳによる完全培地（ＣＭ）又はブランク培地で培養された初代マウス肝細胞の細胞内ＢＡの分析を示し、初代マウス肝細胞を完全又はブランク培地（ＢＭ）で２４時間培養した後、ＳｅＶ又はＨＳＶ−１を特定の時間感染させ、次いで、細胞を収集してＭＳによる細胞内ＢＡの分析を行う。  Ｄは、ウイルスによって誘導される細胞内ＢＡの蓄積へのＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１又はＨＳＤ３Ｂ７のノックダウンの影響を示し、対照、ＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１又はＨＳＤ３Ｂ７のｓｈＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを６時間感染させた後、細胞を収集してＴＢＡを測定する。  Ｅは、完全培地及びブランク培地で培養されたＨＥＫ２９３細胞の細胞内ＢＡの測定を示し、ＨＥＫ２９３細胞を新しい完全培地（ＣＭ）又はブランク培地（ＢＭ）で培養した後、ＳｅＶを特定の時間感染させ、細胞を収集してＢＡを測定する。
【００３６】
【図３】図３。ウイルスによって引き起こされる細胞内ＢＡの蓄積は、Ｉ型ＩＦＮ産生及び抗ウイルス自然免疫応答を促進する。  Ａは、ウイルス誘導性ＩＦＮＢ１及びＣＸＣＬ１０発現へのＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＨＳＤ３Ｂ７の単独ノックダウンの影響を示し、対照又はＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１又はＨＳＤ３Ｂ７のｓｈＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを８時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｂは、ＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１発現のＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＨＳＤ３Ｂ７の単独ノックダウンの影響を示し、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析の前にＩＦＮ−γで８時間処理した以外は、Ａと同様に実験を行う。  Ｃは、ウイルスによって誘導されるＩＲＦ３のリン酸化へのＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１及びＣＹＰ７Ｂ１の単独ノックダウンの影響を示し、対照又はＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１又はＣＹＰ７Ｂ１のｓｈＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを４時間感染させた後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｄは、ＢＡによるＩ型ＩＦＮ及び他の幾つかの抗ウイルス遺伝子の誘導を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞を特定の濃度の特定ＢＡで処理した後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｅは、ＢＡによるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化の誘導を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞を特定の濃度のＣＤＣＡ及びＬＣＡで処理した後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｆは、ウイルスによって誘導されるＩ型ＩＦＮ及び他の幾つかの抗ウイルス遺伝子の発現へのＢＡの影響を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞にＨＳＶ−１又はＳｅＶを半時間感染させた後、ＬＣＡ又はＣＤＣＡ（１００μＭ）で処理し、次に、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｇは、ウイルスによって誘導されるＩＲＦ３のリン酸化へＢＡの影響を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞をＨＳＶ−１又はＳｅＶで半時間感染した後、ＣＤＣＡ（１００μＭ）で処理し、次いで特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｈは、ウイルス複製へのＢＡの影響を示し、ＲＡＷ２６４．７細胞をＶＳＶ−ＧＦＰで１時間感染させた後、ＤＭＳＯ又は特定濃度のＣＤＣＡを含む培地に交換し、次いで、細胞をさらに２４時間培養し、次に、蛍光顕微鏡実験及びフローサイトメトリー解析を行う。  Ｉは、肝臓におけるＢＡ生合成経路の概略図を示す。  Ｊは、レポーターアッセイでは、ウイルスによって誘導される、並びにトランスフェクトされたＲＮＡとＤＮＡによって誘導されるＩＦＮ−β活性化へのＢＡ生合成経路に関与する多くの酵素の単独ノックダウンの影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞を特定のプラスミドで３６時間トランスフェクトした後、１０時間ウイルス感染するか、又はＲＮＡ又はＤＮＡを１８時間トランスフェクトし、次いで、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイを行う。  Ｋは、レポーターアッセイにおいて、ＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１活性化へＢＡ生合成経路に関与する多くの酵素の単独ノックダウンの影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞を特定のプラスミドで３６時間トランスフ��クトした後、ＩＦＮ−γで１０時間刺激し、次いで、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用される。  Ｌは、ＢＡによるＩ型ＩＦＮ及び他の幾つかの抗ウイルス遺伝子の誘導を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞をＬＣＡ（２００μＭ）又はＣＤＣＡ（２００μＭ）で特定の時間処理し、次いで、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｍは、ウイルス複製へのＢＡの影響を示し、ＲＡＷ２６４．７細胞をＶＳＶ−ＧＦＰで１時間感染した後、ＤＭＳＯ又は特定濃度のＣＤＣＡを含む培地に交換し、次いで、細胞をさらに２４時間培養し、次に、フローサイトメトリー解析を行う。
【００３７】
【図４】図４。ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ経路は、ウイルス感染に応答して活性化される。  Ａは、レポーターアッセイにおいて、ウイルスによって誘導されるＩＦＮ−β活性化及びＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１活性化へのＴＧＲ５又はＦＸＲのノックダウンの影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞を特定のプラスミド及びレポータープラスミドで３６時間トランスフェクトした後、ＳｅＶを感染させるか、又はＩＦＮ−γで１２時間処理し、次いで、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。左の図は、特定のプラスミドのノックダウン効率を示す。  Ｂは、ウイルスによって誘導されるＩｆｎｂ１及びＣｘｃｌ１０の発現へのＴｇｒ５欠損の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭを特定のウイルスで６時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｃは、ウイルスによって誘導されるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化へのＴｇｒ５欠損の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭにＨＳＶ−１又はＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｄは、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−細胞におけるウイルス誘導性Ｉｆｎｂ１発現へのＣＤＣＡ及びＩＮＴ−７７７の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭにＨＳＶ−１又はＳｅＶを半時間感染させた後、ＣＤＣＡ又はＩＮＴ−７７７でさらに６時間処理し、次いで、細胞を収集してＩｆｎｂ１発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｅは、ウイルスによって誘導されるＩＦＮＢ１及びＣＸＣＬ１０の発現へのＡＲＲＢ１／２欠損の影響を示し、対照又はＡＲＲＢ１／２のｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＴＨＰ１細胞にＳｅＶ又はＨＳＶ−１を８時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｆは、ウイルス誘導性ＩＦＮ−β活性化へのＧＲＫのノックダウンの影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞を特定のプラスミドでトランスフェクトした後、ＳｅＶを１２時間感染させた後、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。  Ｇは、ＩＮＴ−７７７及びＢＡ処理によるＳＲＣ  ｐＹ４１６の誘導を示し、ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＳＯ、ＩＮＴ−７７７又は特定のＢＡで１時間処理した後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｈは、Ｙ４１６の部位でウイルスによって誘導されるｐ−ＳＲＣへのＴＧＲ５欠損の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭにＨＳＶ−１又はＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｉは、ウイルス感染によって誘導される、β−アレスチン１／２とＧＲＫ６とＳＲＣとＴＧＲ５の複合化を示し、ＨＥＫ２９３細胞にＳｅＶを特定の時間感染させた後、細胞を溶解して免疫前血清又はＴＧＲ５抗体で共免疫沈降を行い、次いで、特定の抗体で免疫沈降物及び溶解物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｊは、ウイルスによって誘導されるＩＦＮＢ１及びＣＸＣＬ１０発現へのＳＲＣ欠損の影響を示し、対照又はＳＲＣのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＭＬＦをｑＳｅＶ又はＨＳＶ−１で８時間感染させた後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｋは、ウイルスによって誘導されるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン���化へのＳＲＣ欠損の影響を示し、対照又はＳＲＣのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＭＬＦにＳｅＶを特定の時間感染させた後、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｌは、トランスフェクトされたヌクレオチド及びｃＧＡＭＰによって誘導されるＩｆｎｂ１及びＣｘｃｌ１０発現へのＴｇｒ５欠損の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭに特定のヌクレオチド又はｃＧＡＭＰを４時間トランスフェクトした後、細胞を収集して特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｍは、Ｉ型ＩＦＮ及び他の幾つかの抗ウイルス遺伝子へのＩＮＴ−７７７の誘導を示し、Ｒａｗ２６４．７細胞を特定濃度のＩＮＴ−７７７で処理した後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｎは、ウイルス誘導性ＩＦＮ−β活性化へのＧタンパク質又はβ−アレスチン欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミド及びレポータープラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＳｅＶを１０時間感染させた後、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用した。左の図は、特定のプラスミドのノックダウン効率を示す。  Ｏは、ＧＲＫ−ｓｈＲＮＡのノックダウン効率を検討し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドを４８時間トランスフェクトした後、特定の遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を行う。  Ｐは、ＩＦＮ−γ誘導性ＩＲＦ１活性化へのＧタンパク質、β−アレスチン又はＧＲＫ欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミド及びレポータープラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＩＦＮ−γで１０時間処理し、次に、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。  Ｑは、ウイルスによって誘導されるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化へのβ−アレスチン又はＧＲＫ欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＳｅＶを特定の時間感染させ、次に、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｒは、ウイルス誘導性ＳＲＣ  ｐＹ４１６へのβ−アレスチン１／２欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＳｅＶを特定の時間感染させ、次に、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行う。  Ｓは、ウイルス誘導性ＩＦＮ−β活性化へのＳＲＣ欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミド及びレポータープラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＳｅＶを１０時間感染させ、次に、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。左の図は、特定のプラスミドのノックダウン効率を示す。  Ｔは、ＩＦＮ−γ誘導性ＩＲＦ１活性化へのＳＲＣ欠損の影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミド及びレポータープラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＩＦＮ−γで１０時間処理し、次に、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。
【００３８】
【図５】図５。ＳＲＣは、抗ウイルスシグナル伝達の複数の成分のグローバルなチロシンリン酸化を仲介する。  Ａは、ＳＲＣと過剰発現系の抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質との相互作用を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドを２４時間トランスフェクトした後、細胞を溶解してＩｇＧ又はＨＡ抗体を用いた共免疫沈降に使用し、次に、特定の抗体を使用して免疫沈降物及び溶解物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｂは、ＳＲＣとウイルス感染によって誘導される抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質との内因的な複合化を示し、ＭＬＦにＳｅＶ又はＨＳＶ−１を特定の時間感染させた後、細胞を溶解してＩｇＧ又はＳＲＣ抗体を用いた共免疫沈降に使用し、次に、特定の抗体で免疫沈降物及び溶解物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｃは、抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質のチロシンリン酸化へのＳＲＣの影響を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドを２４時間トランスフェクトした後、細胞を溶解してＨＡ抗体を用いた免疫沈降に使用し、次に、特定の抗体で免疫沈降物及び溶解物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｄは、ウイルスによって誘導される抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質のチロシンリン酸化へのＳＲＣ欠損の影響を示し、対照又はＳＲＣのｇＲＮＡで安定的に形質導入されたＭＬＦにＳｅＶ又はＨＳＶ−１を特定の時間感染させた後、細胞を溶解して示した抗体を用いた免疫沈降に使用し、次に、特定の抗体で免疫沈降物及び溶解物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｅ〜Ｈは、抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質のＳＲＣがチロシンを標的とするリン酸化部位の同定を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミドで２４時間トランスフェクトした後、細胞を溶解して示した抗体を用いた免疫沈降に使用し、特定の抗体で免疫沈降物にイムノブロッティング解析を行う。  Ｉは、抗ウイルスシグナル伝達における野生型タンパク質及びその変異体によるＩＳＲＥの活性化を示し、ＨＥＫ２９３細胞に特定のプラスミド及びレポータープラスミドで２４時間トランスフェクトした後、細胞を溶解してルシフェラーゼアッセイに使用する。  Ｊは、ＧＰＳ  ３．０プログラムによる抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質のＳＲＣ標的リン酸化部位の予測を示す。
【００３９】
【図６】図６。ＢＡ−ＴＧＲ５経路は、生体内のウイルス感染に対する宿主の防御に重要である。  Ａは、ウイルス誘発性血清サイトカイン発現へのＴｇｒ５欠損の影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウス（ｎ＝８）にＨＳＶ−１又はＥＭＣＶをマウス１匹あたり１ｘ１０７ｐｆｕ  腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で６時間感染させた後、ＥＬＩＳＡにより血清サイトカインを測定する。  Ｂは、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウス脳中のウイルス力価の測定を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウス（ｎ＝６）にＨＳＶ−１をマウス１匹あたり１ｘ１０７ｐｆｕで、又はＥＭＣＶをマウス１匹あたり１ｘ１０６ｐｆｕ  ｉ．ｐ．で感染させ、３日後に脳を採取してウイルス量の測定に使用する。  Ｃは、ウイルス感染後にＴｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウスの生存率を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウス（ｎ＝１２）にＨＳＶ−１をマウス１匹あたり１ｘ１０７ｐｆｕで、又はＥＭＣＶをマウス１匹あたり１ｘ１０６ｐｆｕ  ｉ．ｐ．で感染し、マウスの生存率を２週間観察して記録する。  Ｄは、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウスのウイルス感染によって誘発される血清サイトカイン産生へのＣＤＣＡの影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウスにＨＳＶ−１をマウス１匹あたり１ｘ１０７  ｐｆｕ、１時間感染させた後、ＣＤＣＡ（３０ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、６時間後、ＥＬＩＳＡにより血清サイトカインを測定する。  Ｅは、ウイルス感染によって誘導されるマウスの死亡へのＣＤＣＡの影響を示し、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−マウスにＨＳＶ−１をマウス１匹あたり１ｘ１０７  ｐｆｕ、１時間感染させた後、ＣＤＣＡ（３０ｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、次に、２週間の生存率を記録する。  Ｆは、ＢＡ代謝を介して抗ウイルス自然免疫を調節するための機構の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
「胆汁酸（ＢＡ）」という用語とは、主に哺乳動物及び他の脊椎動物の胆汁に含まれるステロイド酸である。異なる種は、肝臓で異なる分子形態の胆汁酸を合成することができる。
【００４１】
一次胆汁酸は、コール酸（ＣＡ）及びケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を含み、動物の肝臓によって合成されるものである。二次胆汁酸は、デオキシコール酸（ＤＣＡ）及びリトコール酸（ＬＣＡ）を含み、腸内の細菌によって生成されたものである。なお、一次胆汁酸及び二次胆汁酸は、それらの合成位置のみによって分類されることを理解すべきである。特定の一次胆汁酸は、動物の肝臓以外の場所で生成することができるが、特定の二次胆汁酸は、細菌以外の作用にて腸以外の場所で生成することができる。
【００４２】
胆汁酸は、遊離型胆汁酸及び抱合型胆汁酸に交換可能で分けることができる。遊離型胆汁酸は、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成後の元の形態のものであり、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ及びＬＣＡを含む。抱合型胆汁酸は、遊離型胆汁酸とタウリン又はグリシンとの抱合体であり、タウロコール酸及びグリココール酸（コール酸の誘導体）、タウロケノデオキシコール酸及びグリコケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸的誘導体）、さらにＤＣＡ及びＬＣＡのタウリン及びグリシン抱合体を含む。胆汁酸は、通常、その塩の形態、主にカリウム塩及びナトリウム塩として存在する。これらの塩としての胆汁酸は、通常に胆汁酸塩と称される。
【００４３】
ヒトでは、タウロコール酸やグリココール酸（コール酸の誘導体）、及びタウロケノデオキシコール酸やグリコケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸の誘導体）は、胆汁中の主な胆汁酸塩であり、且つ濃度がほぼ同じである。さらに、その７−α−デヒドロキシ誘導体、デオキシコール酸及びリトコール酸の抱合塩も発見され、それらの中で、コール酸、ケノデオキシコール酸及びデオキシコール酸の誘導体は、ヒト胆汁酸の９０％以上を占める。
【００４４】
「胆汁酸源」という用語とは、それが使用される場合に胆汁酸を提供することができる物質を指す。例えば、胆汁酸源は、胆汁酸自体、その塩、その抱合体、その誘導体、又はそれらの任意の混合物であることができる。胆汁酸の誘導体という用語とは、胆汁酸に変換できる物質を意味する。例えば、胆汁酸の誘導体は、胆汁酸の抱合体であってもよい。
【００４５】
「作動薬」という用語とは、受容体に結合し、この受容体を活性化して生物学的応答をもたらす薬剤であり、ここで、受容体は、通常、シグナル伝達経路のメンバーである。本明細書では、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の受容体メンバーに結合し、該経路を活性化して増強された免疫応答、特に、自然免疫応答をもたらす薬剤である。「拮抗薬」という用語とは、「作動薬」の反対の意味を持つ。拮抗薬は、受容体に結合して遮断する（作動薬のように受容体を活性化するのではなく）ことにより生物学的応答を遮断するか、又は抑制する（ｄａｍｐｅｎ）。拮抗薬とその受容体の結合は、受容体とその作動薬との相互作用を破壊し、受容体の機能を阻害する。
【００４６】
真実ではないかもしれないが、ある特定の実施形態において、ある化合物が本開示の作動薬又は拮抗薬として機能することが当技術分野で知られている場合には、その化合物は、この特定の状況下で、作動薬／拮抗薬の定義から除外することができる。例えば、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、当技術分野でＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬として機能することが知られていない薬剤であるとともに、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬は、当技術分野でＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬として機能することが知られていない薬剤である。
【００４７】
「経路」又は「シグナル伝達経路」という用語は、１つまたは複数の細胞機能、例えば、自然免疫応答を制御するために一緒に働く細胞中の一連の分子を意味する。経路中の第１の分子は、信号を受信した後、他の分子を活性化する。このプロセスは、最後の分子が活性化され、細胞機能が達成されるまで繰り返す。例えば、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路では、ＴＧＲ５、ＧＲＫ、β−アレスチン及びＳｒｃを含む必須メンバーがあり、且つ該経路が活性化されると自然免疫応答が増強される。特定の場合には、自然免疫経路（例えば、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ）をブロックすると、癌などの健康障害を引き起こす可能性があり、この経路を強化するための薬物を開発することができ、しかも、これらの薬物は、癌細胞の成長をブロックし、癌細胞を殺すのに役立つ。
【実施例】
【００４８】
実験手順
薬剤、抗体、ウイルス及び細胞
以下の薬剤は、指定されたメーカーから購入された。即ち、キナーゼ阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１、ＳＡＲ−２０３４７及びＭＲＴ６７３０７（ＭＣＥ）；ＩＮＴ−７７７（ＭＣＥ）；ＬＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ及びＣＡ（Ｓｉｇｍａ）；ＩＳＤ４５及びＨＳＶ１２０（Ｓａｎｇｏｎ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び２’，３’−ｃＧＡＭＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）；ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｔｅｃｈ）；ＢＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）；マウスＩＦＮ−β及びＩＦＮ−α（ＰＢＬ）のＥＬＩＳＡ用キット；マウス抗ＨＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗Ｆｌａｇ及び抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）モノクローナル抗体；ウサギ抗ＳＲＣ、ｐ−ＳＲＣ（Ｙ４１６）、β−アレスチン１、β−アレスチン２、ＧＲＫ６、ＭＩＴＡ、ｐ−ｐ６５、ｐ−ＩＫＫα／β、ＩＫＫα／β及びｐ−ＩＲＦ３（Ｓ３９６）（ＣＳＴ）、ＴＢＫ１及びｐ−ＴＢＫ１（Ｓ１７２）（Ａｂｃａｍ）、ＩＲＦ３及びｐ６５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ポリクローナル抗体。マウスＴＧＲ５、ＲＩＧ−１、ＩＲＦ３及びＶＩＳＡに対するマウス抗血清は、それぞれの組換えタンパク質を抗原として使用して作成された。ＳｅＶ、ＥＭＣＶ、ＨＳＶ−１及びＶＳＶ−ＧＦＰは、上記に説明された（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ、  ２０１６  ａｎｄ  ２０１７）。ＨＥＫ２９３細胞及びＨＦＦは、ＡＴＣＣから取得された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、最初に、Ｇａｒｙ  Ｊｏｈｎｓｏｎ博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｈｅａｌｔｈ）によって提供された。文献（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）に記載のように、初代Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−  ＢＭＤＭ、ＢＭＤＣ及びＭＬＦを作製した。
【００４９】
構築体
Ｆｌａｇ及びＨＡタグ付きＳＲＣ、ＨＡタグ付きＲＩＧ−１、ＶＩＳＡ、ｃＧＡＳ、ＭＩＴＡ、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３又はそれらの変異体、ＩＲＦ３、ｐ６５、ＶＩＳＡ、ＭＩＴＡ、β−アレスチン１／２及びＳＲＣに用いられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｇＲＮＡプラスミド、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＯＡＴＰ、ＣＹＰ２７Ａ１、ＨＳＤ３Ｂ７、ＡＫＲ１Ｄ１、ＡＭＡＣＲ、ＡＣＯＸ１、ＡＣＯＸ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＥＨＨＡＤＨ、ＳＣＰ２、ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＳ、ＡＲＲＢ１、ＡＲＲＢ２、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６及びＳＲＣに用いられるｐＳｕｐｅｒ．Ｒｅｔｒｏ−ｓｈＲＮＡプラスミド（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）は、標準的な分子生物学的手法によって構築された。
【００５０】
Ｔｇｒ５ノックアウトマウス
Ｔｇｒ５ノックアウトマウスは、Ｄｉ  Ｗａｎｇ博士（Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、  Ｃｈｉｎａ）によって提供された。全ての動物実験は、いずれも武漢大学の動物管理使用委員会（Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って実行された。
【００５１】
トランスフェクション
標準的なリン酸カルシウム沈殿法によりＨＥＫ２９３及び２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。メーカーが推奨する手順に従って、ＢＭＤＭにｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００をトランスフェクトした。
【００５２】
質量分析法による細胞内ＢＡの測定
従来文献には、ＭＳによるＢＡ分析を記載している（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。簡単に説明すると、細胞サンプルを氷上で解凍し、次に、メタノール１ｍＬをサンプルに添加した。５分間ボルテックスした後、さらに細胞を超音波セルクラッシャーで５分間破砕し、次に、４℃、１３６８０ｇで５分間遠心し、次いで、上清を収集した。この手順を２回繰り返した。合わせた上清を窒素ガス下で乾燥させ、アセトニトリル１００μＬで再構成し、次いで、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（２０μＭｏｌ／ｍＬ）２０μＬ、トリエチルアミン（２０μｍｏｌ／ｍＬ）４０μＬ及びｄ４−２−ジメチルアミノエチルアミン（２０μｍｏｌ／ｍＬ）４０μＬを順に添加した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。反応溶液を４０℃、１時間ボルテックスした後、窒素ガス下で蒸発させた。２−ジメチルアミノエチルアミンで化学標識した後の標準液（ＣＡ、ＬＣＡ、ＣＤＣＡ、ＤＣＡ）を内部標準として使用した。２ｎｇ／ｍＬ  ＩＳをサンプルに添加した後、２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）１００μＬに溶解させ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＭＳ−８０５０質量分析計（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０ＡＤ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で構成されるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムにかけた。単離は、４０℃でＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１×１００  ｍｍ，  １．７μｍ，  Ｗａｔｅｒｓ）にかけて行った。移動相は、（Ａ）ＡＣＮと（Ｂ）水中のギ酸（０．１％、ｖ／ｖ）からなる。勾配：０〜２分間８０％  Ｂ、２〜４分間８０％〜７５％  Ｂ、４〜８分間７５％〜７２％、８〜１１分間７２％〜７０％、１１〜１２分間７０％〜４０％  Ｂ、１２〜１４分間４０％〜２０％  Ｂ、１４〜１５分間２０％〜１０％  Ｂ及び１５〜１６分間１０％〜８０％  Ｂという勾配を使用した。移動相の流量は、０．４ｍＬ／分間に設定された。［Ｍ＋Ｈ］＋の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）＋適切なプロダクトイオンを選択してＢＡを定量した。Ｚｈｕ、  Ｑ．  Ｆ．，  Ｈａｏ、  Ｙ．  Ｈ．，  Ｌｉｕ、  Ｍ．  Ｚ．，  Ｙｕｅ、  Ｊ．，Ｎｉ、  Ｊ．，  Ｙｕａｎ、  Ｂ．  Ｆ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｙ．  Ｑ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  １４１０  （２０１５）１５４−１６３。
【００５３】
ｑＰＣＲ
全ＲＮＡを単離してｑＰＣＲ解析に使用し、特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。示されたデータは、ＧＡＰＤＨに対して正規化された特定のｍＲＮＡの相対的な存在量である。ｑＰＣＲは、以下のプライマーを使用して実行された。
マウスＩｆｎｂ１：フォワード−ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡ  （配列番号１）；
リバース−ＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＧＴＧＡＧＧＴＴ  （配列番号２）。
マウスＩｓｇ５６：フォワード−ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号３）；
リバース−ＡＣＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＴ（配列番号４）。
マウスＣｘｃｌ１０：フォワード−ＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴ（配列番号５）；
リバース−ＧＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＣＴＴＴＧ（配列番号６）。
マウスＩｆｎｂ１：フォワード−ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡ（配列番号７）；
リバース−ＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＧＴＧＡＧＧＴＴ（配列番号８）。
マウスＩｓｇ５６：フォワード−ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号９）；
リバース−ＡＣＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＴ（配列番号１０）。
マウスＣｘｃｌ１０：フォワード−ＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＴ（配列番号１１）；
リバース−ＧＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＣＴＴＴＣ（配列番号１２）。
マウスＧａｐｄｈ：フォワード−ＡＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣＡ（配列番号１３）；
リバース−ＡＣＧＧＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＣＡＣＡＣＣ（配列番号１４）。
【００５４】
共免疫沈降及びイムノブロッティング解析
ＲＩＰＡバッファーに完全プロテアーゼ阻害剤及び２０ｍＭ  ＮＥＭを加えたもので細胞を溶解した後、溶解物を１分間超音波処理した。溶解物を４℃、１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離させた。上清及び対応する抗体を４℃で一晩インキュベートした後、２時間かけてタンパク質Ｇビーズを加えた。ビーズを冷ＰＢＳに０．５Ｍ  ＮａＣｌを加えたもので３回洗浄した後、ＰＢＳでさらに洗浄した。タンパク質を８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、次いで、特定の抗体でイムノブロッティング解析を行った。
【００５５】
プラークアッセイ
マウスの脳中のＨＳＶ−１の複製を測定するために、急速凍結した脳の重さを量り、ＭＥＭ培地で３回（１回あたり５秒間）ホモジナイズした。ホモジナイズした後、脳懸濁液を１６２０ｇで３０分間遠心させ、上清を２４ウェルプレートに播種するＶｅｒｏ細胞単層によるプラークアッセイに使用した。
【００５６】
細胞内のＨＳＶ−１の複製を測定するために、細胞にＨＳＶ−１（ＭＯＩ＝０．０１）を特定の時間感染させた後、上清を収集して２４ウェルプレートに播種するＶｅｒｏ細胞単層によるプラークアッセイに使用した。細胞を脳懸濁液の段階希釈液にて３７℃、１時間インキュベートして細胞を感染させた。１時間の感染後、２％のメチルセルロースを被覆し、プレートを約４８時間インキュベートした。被覆物を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、１％クリスタルバイオレットで３０分間染色した後、プラークをカウントした。
【００５７】
統計
マウス実験では、特定の盲検法は使用されず、各サンプル群のマウスはランダムに選択された。各実験群のサンプルサイズ（ｎ）は、対応する各図の凡例に記載された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアは、すべての統計分析に使用された。ヒストグラムとして表示される定量的データは、平均値±ｓ．ｄ．（エラーバーとして表される）として表された。スチューデントの対応のないｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）及びログランク（Ｌｏｇ−ｒａｎｋ）（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用してデータを解析した。アスタリスクの数は、Ｐ値に対する有意度を表した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５に設定された。
【００５８】
実験結果
１．  ウイルス感染は、即時初期ＮＦ−κＢ活性化によりＢＡトランスポーター及び合成酵素の発現を誘導する。
ＢＡ代謝と抗ウイルス自然免疫の関係を調査するために、本発明者らは、まず、ウイルス感染後のヒト単球ＴＨＰ１細胞中のＢＡ生合成および吸収に関与する遺伝子の発現を調べた。予想外には、ＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）及びＲＮＡウイルスであるセンダイウイルス（ＳｅＶ）の両方は、胆汁酸生合成に関与する複数の重要な律速酵素（ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１及びＣＹＰ２７Ａ１を含む）及び原形質膜に位置する胆汁酸トランスポーターＯＡＴＰの転写を特異的に誘導した（図１Ａ及び１Ｊ）。これらの実験では、ＨＳＶ−１及びＳｅＶは、さらに古典的な抗ウイルス遺伝子ＩＦＮＢ１の転写を誘導するが、ＨＳＤ３Ｂ７、ＳＬＣ２７Ａ５、ＡＫＲ１Ｄ１、ＡＫＲ１Ｃ４、ＡＭＡＣＲ、ＡＣＯＸ１／２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＥＨＨＡＤＨ及びＳＣＰ２を含む他の非速度制限酵素、又はＳＬＣ５１Ａ及びＳＬＣ５１Ｂを含む他のトランスポーターの転写を誘導していなく、主に、腸細胞から門脈血への胆汁酸の輸出に関与する腸の基底外側トランスポーターとして機能するヘテロダイマーを形成した（図１Ａ）。さらに、在ＴＨＰ１細胞には、複数の肝臓及び腸肝組織制限タンパク質（ＣＹＰ８Ｂ１、ＳＬＣ２７Ａ５、ＮＴＣＰ及びＡＳＴＢを含む）の発現がほとんど検出されない（図１Ａ）。
【００５９】
ウイルス感染は、キナーゼＩＫＫα／β及びＴＢＫ１（それぞれＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３を活性化する）を活性化することにより、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）及び炎症性サイトカインの誘導をもたらす。Ｉ型インターフェロンは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して下流の抗ウイルス遺伝子をさらに誘導する。ウイルス感染が如何にＢＡトランスポーター及び生合成酵素（ＴＢＥ）を誘導するかを調査するために、本発明者らは、ウイルスによって引き起こされるＢＡ  ＴＢＥ遺伝子の転写へのＩＫＫα／β阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１、ＴＢＫ１阻害剤ＭＲＴ６７３０７及びＪＡＫ阻害剤ＳＡＲ−２０３４７の影響を調査した。本発明者らは、ＭＲＴ６７３０７又はＳＡＲ−２０３４７ではなく、ＢＭＳ−３４５５４１がＴＨＰ１細胞中のＨＳＶ−１−及びＳｅＶによって誘導されるＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＯＡＴＰ遺伝子の転写を終結することを発見した（図１Ｂ）。同一の実験では、全ての３つの阻害剤は、いずれもウイルスによって誘導されるＩＦＮＢ１遺伝子の転写を阻害した（図１Ｂ）。これらの結果は、ウイルスによって引き起こされるＮＦ−κＢの活性化がＢＡ  ＴＢＥ遺伝子の誘導に不可欠であることを示唆している。それに対応して、ＩＲＦ３ではなく、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９によって誘導されるＮＦ−κＢトランス活性化因子ｐ６５のノックアウトは、ＳｅＶ及びＨＳＶ−１によって誘導されるＢＡ  ＴＢＥ遺伝子及びよく知られているＮＦ−κＢ標的遺伝子ＩＫＢＡの転写を顕著に阻害した（図１Ｃ及びＤ）。ＣＨＩＰアッセイは、ウイルス感染が誘導ｐ６５とＢＡ  ＴＢＥ及びＩＫＢＡ遺伝子のプロモーターとの結合を誘導するが、クロマチンの遺伝子間領域との結合を誘導しない（図１Ｅ）。これらの結果は、ウイルス感染がＮＦ−κＢ依存プロセスにおける胆汁酸の生合成及び吸収に関与する複数の重要な遺伝子の転写を誘導することを示した。
【００６０】
本実験は、ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡによって引き起こされるＮＦ−κＢ活性化経路のそれぞれに不可欠なアダプターであるＶＩＳＡ／ＭＡＶＳ又はＭＩＴＡ／ＳＴＩＮＧの欠損は、それぞれＳｅＶ及びＨＳＶ−１によって誘導されるＩＦＮＢ１遺伝子の転写を損なうが、ウイルスによって誘導されるＢＡ  ＴＢＥ（ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＯＡＴ）及びＩＫＢＡ遺伝子の転写に顕著な影響を与えないことを示した（図１Ｆ及びＧ）。興味深いことに、生化学的分析より分かるように、ＶＩＳＡ／ＭＡＶＳ又はＭＩＴＡ／ＳＴＩＮＧの欠損がそれぞれＳｅＶ及びＨＳＶ−１によって誘導されるＩＲＦ３のリン酸化を損なうが、それらの欠損は、ウイルス感染の初期段階（２時間）ではなく後期段階（４〜１０時間）でＮＦ−κＢ活性化の特徴であるＩＫＫα／β及びｐ６５のリン酸化を損なうだけである（図１Ｈ及びＩ）。これらの結果は、ウイルス感染後の最初の波とＶＩＳＡ又はＭＩＴＡ非依存性ＮＦ−κＢ活性化がＢＡ  ＴＢＥ遺伝子の転写を促進することを示した。それに応じて、ウイルス複製を損なうが細胞への侵入を損なうウイルスのＵＶ処理は、ＨＳＶ−１又はＳｅＶによって誘導されるＩＦＮＢ１遺伝子の転写を損なうが、ウイルスによって誘導されるＢＡ  ＴＢＥ遺伝子の転写に影響を与えない（図１Ｋ）。さらに、ＵＶ処理されたウイルスは、ウイルス感染の初期段階（２時間）でＩＫＫα／β及びｐ６５の正常なリン酸化を誘導するが、後期段階（４〜１０時間）でそのリン酸化を誘導できない（図１Ｌ）。同一の実験では、野生型細胞において、ＩＲＦ３のリン酸化は、ＳｅＶ又はＨＳＶ−１感染の４時間後に誘導され、それぞれＶＩＳＡ又はＭＩＴＡ欠損細胞又はウイルスのＵＶ処理によって消失する（図１Ｈ及びＩ、図１Ｌ）。これらの結果は、ＩＲＦ３の活性化が最初のＶＩＳＡ及びＭＩＴＡ依存性ＮＦ−κＢ活性化の後に発生し、且つウイルス複製及びＶＩＳＡ又はＭＩＴＡ依存性シグナル伝達をそれぞれ必要とすることを示した。
【００６１】
２．  ウイルス感染は、細胞内ＢＡの蓄積を誘導する。
本発明者らは、ＨＳＶ−１及びＳｅＶ感染が、ＦＢＳ含有完全培地（ＣＭ）又はＦＢＳフリー基本培地（ＢＭ）で培養されるヒト単球ＴＨＰ１、肝細胞株ＷＲＬ６８及びＨＥＫ２９３細胞において細胞内ＢＡレベルの急激な向上を引き起こすことを予期せず発見した（図２Ａ及びＢ、図２Ｅ）。興味深いことに、ＣＭと比較しては、ＢＭで培養された細胞にウイルスを感染させた後にＢＡのレベルの向上は、約４０％低かった（図２Ａ及びＢ、図２Ｅ）。ＣＭにはＢＡを含むが、ＢＭにはＢＡを含まないため、これらの結果は、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成及び細胞外から細胞内への輸送の両方がウイルスによって誘導される細胞内ＢＡの蓄積に寄与することを示した。本結果は、ＢＡレベルがウイルス感染後の初期段階（３〜６時間）で急速に向上し、その後、後期段階（１２時間）で低減することをさらに示し、これは、抗ウイルス自然免疫応答の調節におけるＢＡの重要な役割と一致する（下記を参照する）。唯一の例外は、ＣＭで培養された肝細胞株ＷＲＬ６８にＳｅＶを感染させた後１２時間までに、ＢＡレベルが低下することなく一貫して上昇することである（図２Ｂ）。肝細胞は、ＲＮＡウイルスによって誘導される細胞外ＢＡの取り込みにより長く応答する可能性がある。
【００６２】
ＢＡには、複数の一次及び二次分子を含む。本発明者らは、質量分析法（ＭＳ）によりウイルス感染後にどのＢＡが蓄積されるかをさらに確認した。本発明者らは、ＨＳＶ−１又はＳｅＶを６時間感染させた後、ＢＭで培養される初代マウス肝細胞において、一次胆汁酸ＣＤＣＡ及びＣＡのみが顕著に向上するが、二次胆汁酸ＬＣＡ又はＤＣＡが向上しないことを発見し、これは、ウイルス感染後に一次ＢＡのみが生合成されることを示した。しかし、ＨＳＶ−１又はＳｅＶを６時間感染させた後、ＣＭで培養される初代マウス肝細胞で全ての検査された、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＬＣＡ及びＤＣＡを含むＢＡは、いずれも向上し（図２Ｃ）、これは、ウイルス感染は、一次胆汁酸ＣＤＣＡ及びＣＡ、並びに二次胆汁酸ＬＣＡ及びＤＣＡの両方の培地からの取り込みを誘導することを示した。
【００６３】
次いで、本発明者らは、ウイルスによって誘導されるＢＡの細胞内蓄積に対するＢＡトランスポーター及び生合成酵素の寄与を調査した。本発明者らは、ｓｈＲＮＡによって誘導されるＢＡ生合成酵素ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１又はＨＳＤ３Ｂ７（ＣＹＰ７Ａ１及びＣＹＰ７Ｂ１の一般的な下流酵素）又はＢＡトランスポーターＯＡＴＰのノックダウンは、ＣＭで培養されるＴＨＰ１細胞においてＨＳＶ−１及びＳｅＶによって誘導されるＢＡレベルの向上を顕著に阻害した（図２Ｄ）。ＢＭでＴＨＰ１を培養する場合には、ＨＳＶ−１又はＳｅＶによって誘導される細胞内ＢＡレベルの向上は、ＯＡＴＰのノックダウンではなく、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１又はＨＳＤ３Ｂ７のノックダウンによって有意に抑制されることを発見した（図２Ｄ）。以上より、これらの結果は、ウイルス感染によって誘導される細胞内ＢＡの蓄積がＣＹＰ７Ａ１及びＣＹＰ７Ｂ１を介したデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成及びＯＡＴＰを介した培地からの取り込みの両方によるものであることを示した。
【００６４】
３．  ＢＡは、自然免疫応答の効果的な效誘導剤である。
本発明者らは、抗ウイルス自然免疫応答を実例として使用し、自然免疫におけるＢＡの重要性をさらに研究した。本発明者らは、ＯＡＴＰ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１又はＨＳＤ３Ｂ７のノックダウンによりＨＳＶ−１又はＳｅＶによって誘導される下流の抗ウイルスＩＦＮＢ１及びＣＸＣＬ１０遺伝子の転写を有意に阻害することを予期せず発見した（図３Ａ）。対照として、これらのＢＡトランスポーター及び生合成酵素のノックダウンは、ＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１遺伝子の転写に影響を与えなかった（図３Ｂ）。それに対応して、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１又はＣＹＰ２７Ａ１ノックダウン細胞では、ウイルスによって誘導されるＩＲＦ３のリン酸化は、有意に阻害された（図３Ｃ）。レポーターアッセイから、全ての検査されたＢＡ生合成経路に関与する酵素のノックダウンは、いずれもＳｅＶ、トランスフェクトされた合成ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＢ−ＤＮＡによって誘導されるＩＦＮ−βプロモーターの活性化を有意に阻害するが（図３Ｉ和Ｊ）、ＩＦＮγによって誘導されるＩＲＦ１プロモーターの活性化に有意な影響を与えない（図３Ｋ）ことを示した。これらの結果は、ＢＡの生合成が自然免疫応答に重要な役割を果たすことを示した。
【００６５】
次いで、本発明者らは、ＢＡが自然免疫応答を直接調節するか否かを確認した。本発明者らは、ＬＣＡ及びＣＤＣＡがＩＦＮＢ１、ＣＸＣＬ１０及びＩＳＧ５６を含む下流の自然免疫遺伝子の転写を強く誘導した（図３Ｄ）。それに対応して、ＬＣＡ及びＣＤＣＡは、必須の自然免疫シグナル伝達成分の活性化の特徴であるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化も誘導することを発見した（図３Ｅ）。経時実験より、ＢＡは、ＩＦＮＢ１遺伝子の転写を早くとも２時間に誘導し、且つ、刺激後４時間にピークに達した（図３Ｌ）。さらに、外因性ＢＡは、ＨＳＶ−１又はＳｅＶによって誘導されるＩＦＮＢ１、ＣＸＣＬ１０及びＩＳＧ５６遺伝子の転写（図３Ｆ）及びＩＲＦ３のリン酸化を増強させることもできる（図３Ｇ）。さらに、蛍光顕微鏡実験及びフローサイトメトリー解析の両方から、ＣＤＣＡによる処理は、ＶＳＶ−ＧＦＰ複製を有意に阻害する（図３Ｈ及びＭ）ことを示した。これらの結果は、ＢＡが自然免疫応答の効果的な誘導剤ことを示した。
【００６６】
４．  ＢＡは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ軸を介して自然免疫応答を促進する。
次いで、本発明者らは、ＢＡによって誘導される自然免疫応答のメカニズムを研究した。本発明者らは、レポーターアッセイでは、ＦＸＲではなくＴＧＲ５のノックダウンがＳｅＶによって誘導されるＩＦＮ−βプロモーターの活性化を有意に阻害するが、ＴＧＲ５又はＦＸＲのノックダウンがいずれもＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１プロモーターの活性化に有意な影響を与えない（図４Ａ）ことを予期せず発見し、これは、ＦＸＲではなくＴＧＲ５が抗ウイルス自然免疫応答に重要な役割を果たすことを示した。それに対応して、ＴＧＲ５欠損マウスマクロファージは、ＨＳＶ−１、ＳｅＶ又は脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の感染、合成ウイルスＤＮＡ模倣体ＨＳＶ１２０（ＨＳＶ−１ゲノムを代表するｄｓＤＮＡ（１２０−ｍｅｒｓ））又はＩＳＤ４５（ＩＦＮ刺激ＤＮＡ  ４５）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はｃＧＡＭＰのトランスフェクトに応答して、低レベルのＩｆｎｂ１及びＣｘｃｌ１０  ｍＲＮＡを発現した（図４Ｂ及び４Ｌ）。さらに、ＨＳＶ−１及びＳｅＶによって誘導されるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化は、ＴＧＲ５欠損マクロファージにおいて阻害された（図４Ｃ）。さらに、選択的ＴＧＲ５作動薬ＣＤＣＡ及びＩＮＴ−７７７（図４Ｍ）は、Ｔｇｒ５＋／＋マクロファージにおいてＨＳＶ−１−及びＳｅＶによって誘導されるＩｆｎｂ１の転写を増強させているが、Ｔｇｒ５−／−マクロファージにおいて増強させていなかった（図４Ｄ）。これらの結果は、ＢＡ受容体ＴＧＲ５が自然免疫応答を媒介することを示した。
【００６７】
ＴＧＲ５は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのメンバーであり、そのファミリーは、Ｇタンパク質及びβ−アレスチン１／２を含む異なる下流エフェクタータンパク質を活性化する。本発明者らは、レポーターアッセイでは、β−アレスチン１又はβ−アレスチン２の単独ノックダウンではなく同時ノックダウンが、ＳｅＶによって誘導されるＩＦＮ−β活性化の転写を有意に阻害することを発見した（図４Ｎ）。同一実験では、幾つかのＧα（ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＩ２及びＧＮＡＩ３によってコードされる抑制性Ｇタンパク質のαサブユニット）及びＧαｓ（ＧＮＡＳによってコードされる刺激性Ｇタンパク質のαサブユニット）を含む複数のＧタンパク質サブタイプをノックダウンすると、ＳｅＶによって誘導されるＩＦＮ−β活性化に有意な影響を与えなかった（図４Ｎ）。それに対応して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりＡＲＲＢ１（β−アレスチン１をコードする）及びＡＲＲＢ２（β−アレスチン２をコードする）遺伝子を同時にノックアウトすると、ＴＨＰ−１細胞でＨＳＶ−１又はＳｅＶによって誘導されるＩＦＮＢ１及びＣＸＣＬ１０遺伝子の転写を有意に阻害した（図４Ｅ）。これらの結果は、β−アレスチン１及びβ−アレスチン２が抗ウイルス自然免疫応答において冗長な役割を果たすことを示した。活性化のＧＰＣＲへのβ−アレスチンの動員にはＧＰＣＲ関連キナーゼ（ＧＲＫ）を必要とすることがよく知られている（Ｐｒｅｍｏｎｔ  ｅｔ．  ａｌ．，  ２００７）。本発明者らは、ノックダウンＧＲＫ２、ＧＲＫ４又はＧＲＫ６がＳｅＶによって誘導されるＩＦＮ−βプロモーターの活性化を有意に阻害するが、ＧＲＫ３又はＧＲＫ５をノックダウンすると最小限の効果のみを持った（図４Ｆ及び４Ｏ）。対照として、レポーターアッセイでは、β−アレスチン又はＧＲＫのノックダウンは、ＩＦＮ−γによって誘導されるＩＲＦ１プロモーターの活性化に有意な影響を与えなかった（図４Ｐ）。さらなる生化学的実験から、ＳｅＶによって誘導されるＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化は、β−アレスチン１／２、ＧＲＫ２及びＧＲＫ６欠損細胞において有意に阻害される（図４Ｑ）ことを発見した。これらの結果は、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン軸がＢＡによって誘導される自然免疫応答が媒介することを示した。
【００６８】
次いで、本発明者らは、細胞内ＢＡがウイルス感染に応答してＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン軸を介してＳＲＣを活性化するか否かを確認した。生化学的実験から、ＢＡ及びＩＮＴ−７７７処理及びウイルス感染によって誘導されるＹ４１６におけるＳＲＣのリン酸化は、ＳＲＣ活性化の特徴であり（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）（図４Ｇ、４Ｈ及び４Ｒ）、且つＴｇｒ５欠損又はβ−アレスチン１／２のノックダウンがＳｅＶによって誘導されるＳＲＣ及びＩＲＦ３のリン酸化を弱める（図４Ｈ）ことを示した。内因性共免疫沈降実験は、ＳｅＶ感染がウイルス感染後３時間にＴＧＲ５へのβ−アレスチン、ＧＲＫ６及びＳＲＣの動員を誘導する（図４Ｉ）ことを示した。さらなる実験から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるＳＲＣのノックアウトは、ＳｅＶによって誘導されるＩｆｎｂ１及びＣｘｃｌ１０遺伝子の転写、並びにＴＢＫ１及びＩＲＦ３のリン酸化を著しく阻害することを示した（図４Ｊ及びＫ）。これらの結果は、ＢＡによって引き起こされる、並びにＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチンによって媒介されるＳＲＣの活性化は、効果的な自然免疫応答に不可欠である。
【００６９】
５．  ＳＲＣは、自然免疫シグナル伝達経路における複数の重要な成分のチロシンのリン酸化及び活性化を媒介する。
本発明者らは、ＳＲＣが抗ウイルス自然免疫シグナル伝達経路における他の成分を調節するか否かをさらに研究した。一過性トランスフェクションおよび共免疫沈降実験から、ＳＲＣがＲＩＧ−Ｉ、ＶＩＳＡ及びＭＩＴＡと強く相互作用し、且つＴＢＫ１及びＩＲＦ３と弱く相互作用するが、ｃＧＡＳと相互作用しない（図５Ａ）ことを示した。内因性共免疫沈降実験から、ウイルス感染後、ＳＲＣがＲＩＧ−１、ＶＩＳＡ／ＭＡＶＳ、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３との複合化が増加するが、ＳＲＣがＭＩＴＡ／ＳＴＩＮＧと複合化し続けた（図５Ｂ）。さらに、ＳＲＣの過剰発現は、ｃＧＡＳではなくＲＩＧ−１、ＶＩＳＡ、ＭＩＴＡ、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３のチロシンのリン酸化を引き起こすが（図５Ｃ）、ＳＲＣの欠損は、ＳｅＶ又はＨＳＶ−１によって誘導される内因性ＲＩＧ−Ｉ、ＶＩＳＡ／ＭＡＶＳ、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３及びＭＩＴＡ／ＳＴＩＮＧ的チロシンのリン酸化を弱める（図５Ｄ）ことを示した。これらの結果は、ＳＲＣが自然免疫シグナル伝達経路における複数のタンパク質のウイルス誘導性チロシンリン酸化を媒介することを示した。
次いで、本発明者らは、生来の抗ウイルス自然免疫シグナル伝達経路における重要な成分であるＳＲＣによって媒介されるチロシンのリン酸化の機能的重要性を研究した。ＲＩＧ−１（シグナル伝達の下流の活性化に関与する）、ＶＩＳＡ、ＭＩＴＡ及びＩＲＦ３のＣＡＲＤドメインにある複数の潜在的なＳＲＣ標的チロシン残基は、ＧＰＳ３．０プログラムにより同定された（図５Ｊ）。生化学的分析から分かるように、Ｙ２４、Ｙ４０及びＹ８６がフェニルアラニン（Ｆ）に同時変異（ＲＩＧ−Ｉ−ＣＡＲＤ−Ｙ３Ｆ）すると、ＳＲＣによって媒介されるＲＩＧ−Ｉ−ＣＡＲＤのチロシンリン酸化を完全に消し（図５Ｅ）、これらの３つの残基がＳＲＣの標的になることを示した。ＶＩＳＡのＹ９、Ｙ９２、Ｙ９５、Ｙ１３０、Ｙ１４０及びＹ４６０がＦに同時変異（ＶＩＳＡ−６ＹＦ）するとＳＲＣによって媒介されるチロシンのリン酸化を弱め（図５Ｆ）、これらの残基がＳＲＣの標的になることを示した。ＭＩＴＡのＹ２４５がＦに変異（ＭＩＴＡ−Ｙ／Ｆ）するとＭＩＴＡのＳＲＣ媒介性チロシンリン酸化を消し（図５Ｇ）、ＳＲＣがＹ２４５部位でＭＩＴＡのリン酸化を触媒することを示した。ＩＲＦ３のＹ１０７からＦに変異（ＩＲＦ３−Ｙ／Ｆ）するとＳＲＣによって媒介されるＩＲＦ３チロシンのリン酸化を弱め（図５Ｈ）、ＳＲＣがＹ１０７部位でＩＲＦ３のリン酸化を触媒することを示した。レポーターアッセイから、レポーターアッセイでは、これらの変異体は、野生型対応物よりも、ＩＳＲＥを活性化する能力を失うことを示した（図５Ｉ）。これらの結果は、抗ウイルス自然免疫応答経路における重要な成分であるＳＲＣによって媒介されるチロシンのリン酸化がその免疫応答経路の活性化に重要であることを示した。
【００７０】
６．  ＢＡ−ＴＧＲ５経路は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのウイルス感染に対する宿主防御に重要である。
最後に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ウイルス自然免疫におけるＢＡ−ＴＧＲ５軸の重要性を確認した。ＥＬＩＳＡ実験から、野生型同腹仔と比較しは、Ｔｇｒ５−／−マウスでは、ＨＳＶ−１及びＥＭＣＶによって誘導される血清サイトカイン（ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αを含む）の産生は有意に阻害される（図６Ａ）ことを示した。それに対応して、ＨＳＶ−１又はＥＭＣＶを感染させてから３日間後、Ｔｇｒ５−／−マウスの脳では、高いウイルス量が検出された（図６Ｂ）。さらに、Ｔｇｒ５−／−マウスは、ＨＳＶ−１及びＥＭＣＶによって誘発された死亡に対して有意に感受性が高かった（図６Ｃ）。これらの結果は、ＴＧＲ５がｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス感染に対する効率的な宿主防御に必要であることを示した。さらに、ＣＤＣＡ処置は、ＴＧＲ５欠損マウスではなく野生型マウスにおいてＨＳＶ−１によって誘導されるＩＦＮ−βの産生を増加させ（図６Ｄ）、ＴＧＲ５欠損マウスではなくＨＳＶ−１を感染させた野生型の生存率を有意に向上させ（図６Ｅ）、これは、自然免疫応答におけるＢＡ−ＴＧＲ５経路の重要な役割をさらに確認した。
【００７１】
従って、本発明者らは、ＢＡ代謝と抗ウイルス自然免疫の微妙な調節関係を解明するための機構の概略（図６Ｆ）を提案した。簡単に言えば、ウイルス感染は、即時初期ＮＦ−κＢ活性化を引き起こし、ＢＡ生合成及び吸収に関与する複数の重要なタンパク質ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＯＡＴＰの急速な誘導をもたらし、吸収及び生合成の両方による細胞内ＢＡの蓄積をもたらす。そして、蓄積されたＢＡは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ経路を活性化し、次に、抗ウイルス免疫シグナル伝達における複数のタンパク質（ＲＩＧ−Ｉ、ＶＳＩＡ／ＭＡＶＳ、ＭＩＴＡ／ＳＴＩＮＧ、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３を含む）のＳＲＣによって媒介されるグローバルなチロシンのリン酸化を行い、それは、その経路の活性化及び抗ウイルス自然免疫応答の可能性に重要である。
【００７２】
討論
近年、細胞代謝と免疫の間の相互調節の本質的な原理を解読することは、代謝性疾患と免疫疾患の両方の治療にいくつかの新しい方向性をもたらす可能性があるため、大きな注目を集めている。本研究結果は、ウイルス感染によって引き起こされる即時初期ＮＦ−κＢ活性化を介した細胞内ＢＡの蓄積により、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ経路による抗ウイルス自然免疫応答がＢＡ代謝と抗ウイルス自然免疫の間に微妙な回路を確立することができ、代謝及び免疫疾患の治療のための新しいアプローチを探すのに有利であることを発見した。
【００７３】
ＢＡの生合成は、多くの肝外組織の古典的なＢＡ生合成経路に関与する律速酵素ＣＹＰ７Ａ１のレベルが非常に低いため、肝臓にのみ制限されると考えられた。胆汁酸生合成の代替（酸性）経路における律速酵素ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＹＰ７Ｂ１は、マクロファージ及び肝臓以外の他の組織でも発現するが、ＢＡが肝外でこの経路を介して生合成できるか否かを示す強力な証拠はない。本研究では、本発明者らは、ＢＡ生合成に関与する複数の律速酵素（ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１及びＣＹＰ２７Ａ１を含む）の誘導により、ウイルス感染後に多くのタイプの細胞でＢＡの生合成を活性化することを実証し、これは、ＢＡ代謝の基礎知識に関する新しい視点を提供する。さらに、数十年前にＢＡをホルモンとして同定されてから、鋭意検討の結果、核内胆汁酸受容体ＦＸＲによる肝臓及び腸のグルコースと脂質代謝に対する直接的な代謝機構、並びに別の原形質膜結合型胆汁酸受容ＴＧＲ５による代謝、内分泌及び神経学的プロセスの調節ことを含むホルモンの機能を開示した。例外なく、これらの報告された機能は、いずれも生合成され、肝臓から分泌されるか、腸から吸収される外部細胞性ＢＡによって実行された。本研究では、初めて、生合成及び吸収の両方によるウイルス感染誘導性細胞内ＢＡ蓄積が細胞内ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ経路を活性化して抗ウイルス自然免疫応答を促進することを発見し、多くの細胞におけるＢＡ代謝の普遍的で固有な細胞機能を明らかにした。
【００７４】
本研究では、本発明者らは、一連の生化学的・遺伝的実験および分析により、ウイルス感染によって引き起こされるＴＢＥ遺伝子（ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１及びＯＡＴＰ）の発現が即時初期ＮＦ−κＢ活性化に依存することを強く実証する。ウイルス感染期間では、複数のメカニズム、例えば、ウイルス細胞膜融合、抗ウイルス自然免疫応答、ウイルス複製、及びいくつかのウイルス特異的タンパク質の発現がＮＦ−κＢ活性化に関与する可能性がある。以上の結果より、本発明者らは、これらのＴＢＥ遺伝子のウイルス感染誘導性発現がおそらく自然免疫応答及びウイルス複製前のウイルス−細胞膜融合誘発性シグナル伝達カスケードに依存することを提案した。これは、これらのＴＢＥ遺伝子の誘導が抗ウイルス自然免疫応答の活性化に重要であるというさらなる発見に貢献し、それと一致する。
【００７５】
本発明者らは、ウイルス誘発性シグナル伝達におけるＢＡの生合成及び吸収の機能を研究することにより、細胞内ＢＡの蓄積が最適な抗ウイルス自然免疫応答に必要であることを実証した。更なる研究により、ＦＸＲではなくＴＧＲ５がＢＡによって媒介される抗ウイルス自然免疫応答の増強に関与する主要な受容体であることを示した。ＧＰＣＲとして、ＴＧＲ５は、主に原形質膜で発現し、通常、細胞外ＢＡによって引き起こされるシグナル伝達を誘導し、多くの細胞内生物学的プロセスを調節し、これは、外因性ＢＡ処理によるＩ型ＩＦＮの誘導を部分的に説明する可能性がある。しかしながら、本研究では、本発明者らは、ＴＧＲ５が細胞内の胆汁酸の蓄積によって活性化されることができることを実証し、これは、ＴＧＲ５が原形質膜に加えて細胞内器官に分布している可能性があることを意味し、ＴＧＲ５がエンドソームおよび核酸膜にも分布している従来の報道（ＰＭＩＤ：  ２３５７８７８５、  ＰＭＩＤ：  １９５８２８１２）と一致した。ＴＧＲ５の正確な細胞内位置、及びウイルス感染期間でＴＧＲ５が原形質膜及び細胞内器官から移動するか否かについては、さらなる研究が必要である。
【００７６】
ＢＡ−ＴＧＲ５−ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達経路は、さまざまな生物学的プロセスの調節に関与することが確認されているが、本研究では、細胞内ＢＡの蓄積によりＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−ＳＲＣ経路を活性化して抗ウイルス自然免疫応答を増強させることを示し、その経路のタンパク質のいずれの欠損でもウイルス誘導性Ｉ型ＩＦＮの産生を弱めるためでる。さらに、ウイルス感染後、β−アレスチン、ＧＲＫ６及びＳＲＣとＴＧＲ５との内因性複合化を検出した。本実験では、本発明者らは、ＴＧＲ５欠損がＹ４１６におけるＳＲＣのＨＳＶ−１によって誘導されるリン酸化を完全に阻害するが、ＳｅＶによって誘導されるリン酸化を部分的に弱めることを注意し、これは、ＨＳＶ−１によって誘導されるＳＲＣの活性化がＢＡ−ＴＧＲ５経路に完全に依存するが、ＳｅＶによって誘導されるＳＲＣの活性化がＢＡ−ＴＧＲ５経路に部分的に依存することを意味した。抗ウイルスシグナル伝達における複数のタンパク質のＳＲＣ標的リン酸化部位の変異によりＩＦＮ−βへの活性化を顕著に弱めるという結果により、本発明者らは、ＳＲＣによる抗ウイルス経路のパンチロシンリン酸化がその経路の活性化に重要であることを示唆し、ＳＲＣ媒介性パンチロシンリン酸化により抗ウイルスシグナル伝達中の複数のタンパク質を調節する詳細なメカニズムについては、さらに研究が必要であるが、これは、ＳＲＣ欠損がウイルスによって媒介されるＩＦＮＢ１及び他の抗ウイルス遺伝子の誘導を顕著に弱める結果と一致した。
【００７７】
本研究では、本発明者らは、ウイルス感染の前後に、Ｔｇｒ５＋／＋及びＴｇｒ５−／−細胞の両方でＹ４１６におけるＳＲＣのリン酸化を容易に検出することに気づき、これは、ＴＧＲ５欠損細胞中の余分の抗ウイルスシグナルの活性化及びＩ型ＩＦＮの産生を説明する可能性がある。ＳＲＣは多くの異なるタイプの細胞受容体（免疫応答受容体、インテグリンおよびその他の接着受容体、受容体タンパク質チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役型受容体及びサイトカイン受容体を含む）によって活性化されるため（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、  ２０００）、インビトロでの実験でのＦＢＳ培養細胞における制御不能で非特異的なＳＲＣ活性化のある避けられない要因に加えて、ウイルス感染の前後のＳＲＣの活性化に他のメカニズムが存在する可能性もある。そのインビボ実験より、ＴＧＲ５欠損マウスはウイルス誘発死に対してはるかに感受性が高かったため、ＢＡ−ＴＧＲ５経路が自然免疫（感染に対する宿主防御を含む）に重要な役割を果たすことを示した。さらに、ＢＡ処置によりＴＧＲ５欠損マウスではなく野生型の血清サイトカインの産生及び生存率を有意に向上させることは、抗ウイルス自然免疫応答におけるＢＡ−ＴＧＲ５経路の重要な役割をさらに確認しただけでなく、ＢＡが適用可能で強力な抗ウイルス薬であることも示された。
【００７８】
参照文献
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２０．Ｃ．Ｇｕｏ、  Ｓ．  ｘｉｅ、  Ｚ．  Ｃｈｉ、  Ｊ．Ｚｈａｎｇ、  Ｙ．  Ｌｉｕ、  Ｌ．  Ｚｈａｎｇ、  Ｍ．Ｚｈｅｎｇ、  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ、Ｄ．  Ｘｉａ、  Ｙ．  Ｋｅ、  Ｌ．  Ｌｕ、  Ｄ．  Ｗａｎｇ、  Ｂｉｌｅ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＬＲＰ３  Ｉｍｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４５、  ８０２−８１６  （２０１６）；  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＱｃｔ  １８  （１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１６．０９．００８）．
２１．Ｒ．  Ｔ．  Ｐｒｅｍｏｎｔ、  Ｒ．  Ｒ．Ｇａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ、  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆＧ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｉｎｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ６９、  ５１７−５３４  （２００７）１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐｈｙｓｉｏｌ．６９．０２２４０５．１５４７３１）．
２２．Ｊ．  Ａ．  Ｃｏｏｐｅｒ、  Ｂ．  Ｈｏｗｅｌｌ、  Ｔｈｅ  ｗｈｅｎ  ａｎｄ  ｈｏｗ  ｏｆ  Ｓｒｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  ７３、  １０５１−１０５４（１９９３）；  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｎ  １８
２３．            Ｊ．  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、  Ｎｅｗ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｒｃ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ１００、  ２９３−２９６  （２０００）；  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＦｅｂ  ４（
【図１−１】
2022500506.tif 000003
【図１−２】
2022500506.tif 000004
【図２−１】
2022500506.tif 000005
【図２−２】
2022500506.tif 000006
【図３−１】
2022500506.tif 000007
【図３−２】
2022500506.tif 000008
【図４−１】
2022500506.tif 000009
【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
2022500506000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において免疫を増強するために使用される、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項２】
免疫が、微生物感染に対する免疫であり、前記微生物感染は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染を含む、請求項１に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項３】
ウイルス感染が、ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスによって引き起こされ、前記ＤＮＡウイルスは、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルスを含み、前記ＲＮＡウイルスは、ｓｓＲＮＡウイルス又はｄｓＲＮＡウイルスを含み、前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ、ＫＳＨＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ジカウイルス（Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ）、ＥＶ７１、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＥＢウイルス、及びヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）からなる群より選択され、前記単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を含む、請求項２に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項４】
微生物感染が、結核、カンジダ症、アスペルギルス症、藻類ウイルス（ａｌｇｉｎｏｓｉｓ）、ノカルディア及びクリプトコッカス症からなる群より選択される疾患を引き起こす、請求項２に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項５】
免疫が、腫瘍に対する免疫であり、前記腫瘍は、固形腫瘍又は白血病を含む、請求項１に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項６】
ＴＧＲ５作動薬、ＧＲＫ作動薬、β−アレスチン作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬であり、
ここで、前記ＧＲＫ作動薬は、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５及び／又はＧＲＫ６作動薬、特に、ＧＲＫ２、ＧＫＲ４及び／又はＧＲＫ６作動薬、さらに特に、ＧＲＫ６作動薬から選ばれ、且つ
前記β−アレスチン作動薬は、β−アレスチン−１及び／又はβ−アレスチン−２作動薬から選ばれる、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項７】
胆汁酸源、特に、胆汁酸、例えば、一次胆汁酸又は二次胆汁酸、非抱合型胆汁酸又は抱合型胆汁酸である、請求項６に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項８】
胆汁酸が、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ケトリソコール酸、スルホリソコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる、請求項７に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬。
【請求項９】
それを必要とする対象において免疫を調節することで治療できる疾患を処置するために使用される、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターであって、前記疾患が、微生物感染によって引き起こされる疾患又は腫瘍であり、前記微生物感染は、ウイルス感染、細菌感染及び真菌感染を含み、前記腫瘍は、固形腫瘍及び白血病を含み、
前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれる、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーター。
【請求項１０】
疾患が、自己免疫疾患であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーターは、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬であり、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ拮抗薬は、ＴＧＲ５拮抗薬、β−アレスチン−１／２拮抗薬及び／又はＳｒｃ拮抗薬から選ばれる、請求項９に記載のＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃモジュレーター。
【請求項１１】
単独のアジュバントとして又はワクチン組成物のアジュバントとして、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてワクチン接種する方法であって、前記ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬は、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれる、方法。
【請求項１２】
ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を含む、ワクチン接種用アジュバント組成物。
【請求項１３】
アジュバントとして、ＴＧＲ５作動薬、β−アレスチン−１／２作動薬及び／又はＳｒｃ作動薬から選ばれるＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ作動薬を含む、ワクチン組成物。
【請求項１４】
候補薬剤をＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路のレポーターに接触させること、及びＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性を決定することを含む、免疫調節薬を同定するための方法であって、ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路活性の変化が、前記候補薬剤が免疫調節薬であることを示す、方法。
【請求項１５】
ＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性化増強は、前記候補薬剤が免疫増強剤であることを示し、且つＴＧＲ５−ＧＲＫ−β−アレスチン−Ｓｒｃ経路の活性化低下は、前記候補薬剤が免疫抑制剤であることを示す、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2022500506.tif 000014
2022500506.tif 000015
2022500506.tif 000016