(57)【要約】【要約書】  本発明は、哺乳動物における肝疾患を診断するための方法であって、前記哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定する工程と、前記哺乳動物の前記試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量が、健康な哺乳動物の試料中で決定されるＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量とは異なる場合、肝疾患を診断する工程と、を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における肝疾患を診断するための方法であって、
前記哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定する工程と、
前記哺乳動物の前記試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量が、健康な哺乳動物の試料中で決定されるＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量とは異なる場合、肝疾患を診断する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物の前記試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量が、健康な哺乳動物の試料中で決定されるＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量と比較して、有意に低いか、または高い場合、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％低いか、または高い場合に、肝疾患が診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物の前記試料中、好ましくはヒト試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量が、１２ｐｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは１１ｐｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは９ｐｍｏｌ／ｌ未満である場合に、肝疾患が診断される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物における肝疾患の進行または肝疾患の処置を監視するための方法であって、
前記哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記肝疾患は、脂肪肝（脂肪肝疾患、ＦＬＤ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群より選択され、好ましくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または単純脂肪症（ＳＳ）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物は、ノギンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量は、イムノアッセイ、リガンド−レセプターアッセイ、タンパク質マイクロアレイ、質量分析法、バイオセンサー、または液体クロマトグラフィー法によって、決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイは、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発色検出または照度検出を伴う酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的流体試料は、血液、血清、血漿、尿または唾液流体試料である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物は、ヒト被験体、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、またはイヌ被験体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物における肝疾患を診断するため、または哺乳動物における肝疾患の進行もしくは肝疾患の処置を監視するために、生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定するためのキットの使用。
【請求項１３】
前記キットは、任意に固体支持体上に固定された、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物に結合する抗体またはその断片、および、
ＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物に結合する蛍光標識された抗体またはその断片を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記固体支持体は、金属で、好ましくは銀で、少なくとも部分的に被覆されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記キットは、特定量のノギンタンパク質を含有する少なくとも１つのキャリブレーター、所定量のノギンタンパク質を有する少なくとも１つのコントロール、および／または読取値が高い試料を希釈するための少なくとも１つの緩衝液、酵素もしくは蛍光色素標識ノギン特異的検出抗体調製物、ならびにノギン特異的捕捉抗体でコーティングされたマイクロプレートをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
ノギン特異的捕捉抗体でコーティングされた前記マイクロプレートは、構造表面を含み、金属コーティングで少なくとも部分的に被覆されている、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、バイオマーカーを測定することによる、肝組織における病理学的変化の検出に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
脂肪肝疾患（ＦＬＤ）のような肝疾患は、一般的な人々において非常に一般的な病理である。欧米人において、栄養不良が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の最も一般的な原因であり、例えば、推定発生率は１５〜２０％であり、その進行の危険因子を呈する患者数が増加していることは、注目に値する（Ｂｅｄｏｇｎｉら、４２（２００５）：４４−５２；Ａｍａｒａｐｕｒｋａｒら、Ａｎｎ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ６（２００７）：１６１−１６３）。栄養過多および肥満に関連するＮＡＦＬＤは多因子性疾患であり、メタボリックシンドローム患者に見られるような、高グリセリド血症、肥満症、インスリン抵抗性と関連している（ＨｉｇｕｃｈｉおよびＧｏｒｅｓ、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３（２００３）：４８３−４９０）。
【０００３】
例えば、ＦＬＤはこのように広く蔓延する疾患であるが、その非侵襲的診断は未だ満たされていない医学的ニーズのままである。未だに大多数の患者は依然として痛みを伴う生検を受けなければならず、現在まで、これは依然としてＮＡＦＬＤ診断および病期分類のゴールドスタンダードである。しかし、それは、侵襲的手段であり、専門の病理医が実施した場合でも、サンプリングエラー、高コスト、手段に関連した合併症、および観察者のばらつきによって、制限される。磁気共鳴画像プロトン密度脂肪率（ＭＲＩ−ＰＤＦＦ）および磁気共鳴エラストログラフィ（ＭＲＥ）は、脂肪症を定量化するための正確なツールとして登場したが、非常に高価であり、すべての患者が利用しやすいものではない。また、それらはまた、炎症の検出において重大な問題があり、これはＳＳのＮＡＳＨへの進行を推定するための非常に重要な因子であり、患者の層別化および治療法の決定の鍵となる。したがって、上述の問題を解決するために、血液のような体液中で測定される非侵襲性肝疾患バイオマーカー、特にＮＡＦＬＤバイオマーカーが渇望されている。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、非侵襲的または最小侵襲的な方法を使用して、肝疾患の診断および肝疾患の進行の監視を可能にする方法および手段を提供することである。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、哺乳動物における肝疾患を診断するための方法であって、前記哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定する工程と、前記哺乳動物の前記試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量が、同種の健康な哺乳動物の試料中で決定されるＮＯＧ遺伝子によってコードされる前記生成物の量とは異なる場合、肝疾患を診断する工程と、を含む方法に関する。
【０００６】
驚くべきことに、生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子、好ましくはノギン（ｎｏｇｇｉｎ）によってコードされる生成物のレベルは、前記試料が得られた哺乳動物が肝疾患を患っているか否かを示すことが明らかになった。本発明の方法の主な利点の１つは、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物が生物学的流体試料中で測定され得るので、生物学的試料を得るために肝生検または任意の他の侵襲的方法を実行することは、もはや必要ではないという事実である。
【０００７】
本発明はまた、脂肪肝疾患（ＦＬＤ）、特に非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）またはアルコール性脂肪肝疾患（ＡＦＬＤ）のような肝疾患を診断するための非侵襲的または最小侵襲的方法に関する。
【０００８】
本発明の方法はまた、単純脂肪症（ＳＳ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）とを識別することを可能にする。単純脂肪症に罹患している哺乳動物、特にヒトから得られた試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量は、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している同種の哺乳動物からの試料のそれよりも有意に低いことが見出されている。単純脂肪症に罹患している哺乳動物から得られた試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量は、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している同種の哺乳動物からの試料と比較して、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％低い。単純脂肪症は、試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量が３〜７ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは４〜６ｐｍｏｌ／ｌである場合、哺乳動物、特にヒトにおいて診断され得る。非アルコール性脂肪性肝炎は、試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量が７，５〜１１ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは８〜１０ｐｍｏｌ／ｌである場合、診断され得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、哺乳動物における肝疾患の進行または肝疾患の処置を監視するための方法であって、前記哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定する工程を含む、方法に関する。
【００１０】
哺乳動物の生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物のレベルは、肝臓の健康状態によって影響されるので、前記ＮＯＧ遺伝子生成物の濃度は、肝疾患の進行またはその処置を監視するために直接使用され得る。
【００１１】
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａは、ＳＳ患者、ＮＡＳＨ患者およびコントロールにおける血清ノギン濃度（平均値±標準誤差）を示す。血清ノギン濃度は、ＳＳ患者およびＮＡＳＨ患者においてはコントロールよりもはるかに低く（傾向検定について、ｐ＝０．０４０）、ＳＳ患者とＮＡＳＨ患者との間には差はなかった。＊：ｐ＜０．０５、コントロール群との比較。
【００１２】
図１Ｂは、ビタミンＥ単独療法、またはスピロノラクトンとビタミンＥとの併用療法にランダムに割り当てられたＮＡＦＬＤ患者における血清ｌｏｇ（ノギン濃度）（平均値±標準誤差）を示す。ノギン濃度は、２ヶ月目に両方の群において同様に増加し、その後、試験終了まで安定であった。＊：ｐ＜０．０５、ベースラインのノギン濃度との比較。
【００１３】
〔実施形態の説明〕
本明細書中で使用される場合、「診断する」および「診断」は、哺乳動物が所与の疾患または状態を罹患している否かを当業者が推定および決定することができる方法に言及する。この診断は、バイオマーカーに基づいて行われ、その量（存在または非存在を含む）は、状態の存在、重症度または非存在を示す。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「肝疾患」は、肝臓の機能に影響を及ぼす肝臓の任意の病理学的状態に言及する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物」は、ＮＯＧ遺伝子のコード領域から転写または翻訳されるｍＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびそれらの断片に言及する。
【００１６】
「ＮＯＧ遺伝子」は、神経組織、筋肉および骨を含む多くの体内組織の発達に関与するノギン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３２５３）と呼ばれるタンパク質をコードする。ノギンは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）と呼ばれるタンパク質群のメンバーと相互作用することが知られている。ＢＭＰは、骨および他の組織の発達の制御を補助する。
【００１７】
ノギンは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストである分泌ホモ二量体糖タンパク質である。ヒトノギンｃＤＮＡは、２３２アミノ酸（ａａ）前駆体タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３２５３；配列番号１）をコードし；２７ａａシグナルペプチドが開裂することで、Ｎ端末酸性領域、中央塩基性ヘパリン結合セグメントおよびＣ端末システインノット構造を含む２０５ａａ成熟タンパク質を生成する。これまで、ノギンは、腫瘍細胞の骨への播種、強直性脊椎炎または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の分野で研究されてきたが、肝臓のいかなる病理も伴わなかった。驚くべきことに、本発明者らは、非常に一般的な形態の肝疾患との強い関連性を見出した。
【００１８】
配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３２５３）：
ＭＥＲＣＰＳＬＧＶＴＬＹＡＬＶＶＶＬＧＬＲＡＴＰＡＧＧＱＨＹＬＨＩＲＰＡＰＳＤＮＬＰＬＶＤＬＩＥＨＰＤＰＩＦＤＰＫＥＫＤＬＮＥＴＬＬＲＳＬＬＧＧＨＹＤＰＧＦＭＡＴＳＰＰＥＤＲＰＧＧＧＧＧＡＡＧＧＡＥＤＬＡＥＬＤＱＬＬＲＱＲＰＳＧＡＭＰＳＥＩＫＧＬＥＦＳＥＧＬＡＱＧＫＫＱＲＬＳＫＫＬＲＲＫＬＱＭＷＬＷＳＱＴＦＣＰＶＬＹＡＷＮＤＬＧＳＲＦＷＰＲＹＶＫＶＧＳＣＦＳＫＲＳＣＳＶＰＥＧＭＶＣＫＰＳＫＳＶＨＬＴＶＬＲＷＲＣＱＲＲＧＧＱＲＣＧＷＩＰＩＱＹＰＩＩＳＥＣＫＣＳＣ
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「健康な哺乳動物の試料」は、哺乳動物においてＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を測定することによって得られる参照試料に言及する。当該哺乳動物は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも１０つ、より好ましくは少なくとも２０であり、腫瘍、強直性脊椎炎、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、肝疾患、および任意の他の疾患を含む、ノギン濃度の不均衡の結果である任意の疾患、または結果としてノギン濃度の不均衡を生じる任意の疾患に罹患していない。「健康な哺乳動物」は、肝組織のいかなる記録された病理も示さない。健康な哺乳動物の試料は、肝疾患に関して試験される哺乳動物の生物学的流体試料と同じ供給源（例えば、血液、血清）のもの、および同じ起源（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ）のものである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記哺乳動物の試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量が、健康な哺乳動物の試料中で決定されるＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量と比較して、有意に低いか、または高い場合、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％低いか、または高い場合、最も好ましくは低い場合に、肝疾患が診断される。
【００２１】
哺乳動物の試料中で、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量が、健康な哺乳動物の試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量と異なる場合に、肝疾患が診断される。少なくとも２５％の差が肝疾患の存在を示すことが見出された。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記哺乳動物、特にヒトの試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量が、１２ｐｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは１１ｐｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは９ｐｍｏｌ／ｌ未満である場合に、肝疾患が診断される。本発明の方法は、任意の肝疾患を診断すること、または肝疾患の処置および／または進行を監視することを可能にする。しかしながら、本発明の特に好ましい実施形態において、肝疾患は、脂肪肝（脂肪肝疾患、ＦＬＤ）である。
【００２３】
脂肪肝（脂肪肝）は、肝臓の肥大（肝腫脹）に関連する肝細胞の細胞質における脂質の細胞内蓄積、および続く脂肪滴（ＬＤ１）の形成を特徴とする。肝臓の脂肪症がさらに炎症を伴う場合には、当該状態は脂肪性肝炎と称される。いずれの病理学的状態も、アルコールが一次的要因として除外され得る場合には、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）という用語の下に包含される。したがって、ＮＡＦＬＤは、その進行段階（すなわち脂肪性肝炎）と同様に脂肪症に言及し、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純脂肪症（ＳＳ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含み、肝硬変および肝細胞癌へと進行する可能性がある。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群より選択され、好ましくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または単純脂肪症（ＳＳ）から選択される。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物は、ノギン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３２５３）である。
【００２６】
タンパク質、ポリペプチド、およびこれらの分子をコードするｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、決定および／または定量され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量は、イムノアッセイ、リガンド−レセプターアッセイ、タンパク質マイクロアレイ、質量分析法、バイオセンサー、または液体クロマトグラフィー法によって、決定される。
【００２７】
特に好ましいのは、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物に特異的に結合し得る抗体またはその断片を伴う方法である。したがって、イムノアッセイは、好ましくは蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発色検出または照度検出を伴う酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群より選択される。
【００２８】
特に好ましいイムノアッセイは、蛍光標識抗体を使用する。このようなイムノアッセイの感度を高めるために、これらのアッセイは、例えばＷＯ２０１７／０４６３２０に記載されているように、金属増強蛍光に基づいてもよい。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、生物学的流体試料は、血液、血清、血漿、尿または唾液流体試料である。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、哺乳動物は、ヒト被験体、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、またはイヌ被験体である。
【００３１】
本発明の別の態様は、哺乳動物における肝疾患を診断するため、または哺乳動物における肝疾患の進行もしくは肝疾患の処置を監視するために、生物学的流体試料中のＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物の量を決定するためのキットの使用に関する。
【００３２】
好ましいキットは、任意に固体支持体上に固定された、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物に結合する抗体またはその断片、および、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる生成物に結合する蛍光標識された抗体またはその断片を含み得る。
【００３３】
当該検出方法の感度を高めるために、固体支持体は、好ましくは、金属、好ましくは銀で、少なくとも部分的に被覆されている。特に好ましい固体支持体は、ＷＯ２０１７／０４６３２０に開示されている。
【００３４】
本発明のキットは、特定量のノギンタンパク質を含有する少なくとも１つのキャリブレーター、所定量のノギンタンパク質を有する少なくとも１つのコントロール、および／または読取値が高い試料を希釈するための少なくとも１つの緩衝液、酵素もしくは蛍光色素標識ノギン特異的検出抗体調製物、ならびにノギン特異的捕捉抗体でコーティングされたマイクロプレートをさらに含み得る。
【００３５】
ノギン特異的捕捉抗体でコーティングされたマイクロプレートは、構造表面を含み、ＷＯ２０１７／０４６３２０に記載されているように、金属コーティングで少なくとも部分的に被覆されている。
【００３６】
〔実施例〕
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
実施例：
【００３８】
材料および方法
【００３９】
患者および試験デザイン
【００４０】
ＮＡＦＬＤ（「非アルコール性脂肪肝疾患」）患者の選択基準は：１）年齢＞１８歳；２）肝生検前の少なくとも６ヶ月間に脂肪肝を示す超音波画像診断、および肝機能検査の異常；および、３）肝生検に対する患者の同意；であった。年齢、性別、およびボディマスインデックス（ＢＭＩ）が同等の人をコントロール群に募集し、専門的ニーズのために定期検査を受けた健常者で構成した。コントロール群の選択基準は：１）年齢＞１８歳；２）超音波画像診断の肝異常、または肝機能検査の異常の既往がない；３）現在、超音波画像診断で肝が正常であり、肝機能検査が正常である；であった。除外基準は、患者とコントロールとで同様であり、ＮＡＦＬＤに影響を及ぼす可能性のある医薬品またはサプリメントを含む、脂肪肝の二次的要因を除外することを目標とした（Ｐｏｌｙｚｏｓ  Ｓら、Ａｎｎ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１３；１２（５）：７４９−７５７）。
【００４１】
本試験は、実薬コントロール群を設定した１施設５２週間の非盲検ＲＣＴ（ランダムコントロール試験）であった。ＲＣＴは、スクリーニング期、ベースライン期、および治療期中の３回の追加期（第２期：第８週；第３期：第２６週；および、第４期：第５２週）から構成された。
【００４２】
適格なＮＡＦＬＤ患者を、５２週間、ビタミンＥを経口投与する群（４００ＩＵ／日で等量２回；第１群）、またはスピロノラクトン（２５ｍｇを１日１回）＋ビタミンＥ（４００ＩＵ／日で等量２回；第２群）にランダムに振り分けた。ランダムな振り分けは、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を用いて行われ、治療への割り当ては、Ｐｏｌｙｚｏｓ  ＳＡら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２０１７；１９（１２）：１８０５−１８０９）に記載されるように、行われた。
【００４３】
分析方法
【００４４】
身体計測（体重、身長、胴囲）データを記録し、空腹時朝（午前８〜９時）血清試料を、すべての期で採取した。肝機能（すなわち、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ））、およびグルコース代謝（すなわち、グルコース、インスリン）についての臨床試験は、既に記載されたようにして、自動分析器を使用する標準的な方法を用いて行われた（Ｐｏｌｙｚｏｓ  ＳＡら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２０１７；１９（１２）：１８０５−１８０９；および、Ｐｏｌｙｚｏｓ  Ｓら、Ａｎｎ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１３；１２（５）：７４９−７５７；を参照のこと）。
【００４５】
ノギンの血清濃度は、プラズモンマイクロタイタープレート（ＦｌｕｏＢｏｌｔＴＭ−Ｎｏｇｇｉｎ；Ｆｉａｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ａｕｓｔｒｉａ）に基づく高感度蛍光イムノアッセイを使用して測定され、Ｈａｗａ  Ｇら（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１８  Ｍａｙ  １５；５４９：３９−４４）に記載されるように、蛍光色素のシグナルを数百倍増加させた。このアッセイは、ＢＭＰに結合していない遊離した生物活性ヒトノギンを検出する。簡潔には、アッセイ手順は、以下を含む：５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で、４℃で一晩、捕捉抗体の吸着コーティングを行い、次いで０．１％  トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて洗浄する。非特異的結合のブロッキングは、合成ポリマーおよびメルカプト化合物を含有するＦＩＡＮＯＳＴＩＣＳ独自の溶液を用いて達成された。もう１回の洗浄工程の後、標準品／試料（血清）の２０μｌの複製を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０で標識された抗ヒトノギン抗体２５μｌと共に室温、暗所で一晩、インキュベートした。測定は、標準的な蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、行われた。ノギンが１００ｐｍｏｌ／ｌを超える試料は、アッセイ緩衝液を用いて希釈し、再実行してシグナルの直線性をチェックした。アッセイ間変動係数（ＣＶ）は２〜７％であり、アッセイ内ＣＶは４〜１０％であった。
【００４６】
肝生検は、ＮＡＦＬＤ患者全体において、コンピュータトモグラフィーガイドの下で実施され、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の基準、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ＤＥら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５；４１（６）：１３１３−１３２１）にしたがって、判断された。
【００４７】
ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、アセスメント−ＩＲのホメオスタシスモデル（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコア、およびＡＳＴ／血小板比インデックス（ＡＰＲＩ）は、既に記載されたようにして、算出された（Ｐｏｌｙｚｏｓ  ＳＡら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２０１７；１９（１２）：１８０５−１８０９；を参照のこと）。ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコアおよびＡＰＲＩは、脂肪肝の４つの非侵襲的指標および肝線維症の５つの非侵襲的指標の中から、それぞれ以前は選択されていたが、これは、それらが、ベースラインのそれぞれの組織学的結果に、特にこのＲＣＴに、最もよく適合していたためである。
【００４８】
統計解析
【００４９】
連続データは、平均値±標準誤差（ＳＥΜ）として、示される。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定が使用され、連続変数の分布の正規性がチェックされた。ケースコントロールセクションにおいて、カテゴリー変数間の比較にはカイ二乗検定またはＦｉｓｃｈｅｒの正確確率検定が使用された。Ｓｐｅａｒｍａｎ係数（ｒｓ）が二変量相関のために使用された。独立標本ｔ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定が、連続変数の２つの群の間の比較のために、使用された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定が、連続変数の２つの群以上の比較のために、使用された。一元配置共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）が、潜在的交絡因子を調整するために、使用された。多重線形回帰分析が、ノギンの独立した関連性を調べるために、使用された。
【００５０】
ＲＣＴセクションにおいて、二元配置分散分析を使用して、被験者内、被験者間、および変数＊時間内相互作用、潜在的交絡因子に対する順化または未順化（二元配置共分散分析）の差の傾向を同定した。球面性の仮定は、Ｍａｕｃｈｌｙの球面性検定を用いて試験された。必要であれば、多重一対比較のためにボンフェローニ補正が使用された。ＲＣＴのデータは、包括解析を使用して、解析された。
【００５１】
正規分布でない変数は、正規分布の仮定を必要とする試験に入る前に、対数変換された。有意性は、ｐ＜０．０５（両側）に設定した。統計分析は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（ＩＢＭ社、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）についてＳＰＳＳ２１．０を用いて、行われた。
【００５２】
結果
【００５３】
ケースコントロールセクション
【００５４】
組織学的に確認されたＮＡＦＬＤ患者３１例（ＳＳ患者１５例、境界型または確定ＮＡＳＨ患者１６例）、およびコントロール２４例がこのセクションに含まれた。明確に選択したように、性別、年齢、ＢＭＩおよび胴囲においては、群間差はなかった。ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、グルコース、インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲは、群間に統計学的な差があり、ＮＡＳＨ群の方が高い傾向にあった。
【００５５】
ノギン濃度は、ＮＡＦＬＤ群全体（ｎ＝３１；７．４±１．５ｐｍｏｌ／ｌ）では、コントロール群（ｎ＝２４；１３．７±２．７ｐｍｏｌ／ｌ；ｐ＝００１６）よりも、低かった。同様に、ノギン濃度は、ＳＳ（５．８±１．５ｐｍｏｌ／ｌ）およびＮＡＳＨ（８．７±２．４ｐｍｏｌ／ｌ）患者においては、コントロール（１３．７±２．７ｐｍｏｌ／ｌ；傾向検定について、ｐ＝０．０４０）よりも、低かった（図１Ａを参照のこと）。年齢（モデル１）；年齢および性別（モデル２）；年齢、性別およびｌｏｇ（ＡＬＴ）（モデル３）；年齢、性別、ｌｏｇ（ＡＬＴ）および胴囲（モデル４）；年齢、性別、ｌｏｇ（ＡＬＴ）、胴囲およびｌｏｇ（ＨＯＭＡ−ＩＲ）（モデル５）；について順次補正した後、群間にはｌｏｇ（ノギン）の有意な差が残った。
【表１】
2022500623.tif 000002
【００５６】
患者（ｎ＝３１）内で、ノギン濃度は、脂肪症、門脈および小葉の炎症、肥大化、および線維症が異なる等級である群間では、差がなかった。
【００５７】
ＲＣＴセクション
【００５８】
ＮＡＦＬＤ患者３１例（ＳＳ患者１５例、およびＮＡＳＨ患者１６例）を、第１群（ｎ＝１７；女性１１例）または第２群（ｎ＝１４；女性１２例）にランダムに割り当てた。ベースラインでは、２つの群はすべてのパラメータで同様であり、治療中の有害事象に差はなかった。
【００５９】
ｌｏｇ（ノギン）値は、治療後には両群で同様に上昇した（第１群；ベースライン：０．６６±０．１３；２ヶ月目：０．９８±０．０９；６ヶ月目：１．０３±０．０７；１２ヶ月目：１．０２±０．０７ｐｍｏｌ／ｌ、および第２群；ベースライン０．５８±０．１３；２ヶ月目：０．８２±０．１０；６ヶ月目：０．８２±０．１１；１２ヶ月目：０．８３±０．１１ｐｍｏｌ／ｌ；図１Ｂ）。より具体的には、ｌｏｇ（ノギン）は、群間では差がなかった（ｐ＝０．２０）が、時間が経つにつれて、群内で増加した（ｐ＜０．００１）。群＊時間の相互作用に有意な差はなかった（ｐ＝０．６２）。多重比較の補正後、ｌｏｇ（ノギン）は、２ヶ月目に有意に増加し（ベースラインと比較して、ｐ＝０．００８）、さらに増加することなく６ヶ月目（ベースラインと比較してｐ＝０．００５）および１２ヶ月目（ベースラインと比較してｐ＝０．００１）には、安定していた（図１Ｂを参照のこと）。
【００６０】
議論
【００６１】
ＮＡＦＬＤ（ＳＳおよびＮＡＳＨ）において、より低いノギン濃度が初めて示された。ビタミンＥ単独療法、またはスピロノラクトンとビタミンＥとの併用による２ヶ月間の治療後に、ノギン濃度は同様に増加したが、これは、おそらくビタミンＥの作用のためである。
【００６２】
ＮＡＦＬＤの病因は多因子性であるため、単独療法よりも併用療法の方が、複数の病原因子を同時に標的とすることで、より効果的である可能性がある。しかし、ビタミンＥにスピロノラクトンを加えても、ノギンはさらには増加しなかった。ノギンはビタミンＥにより増加するが、その変化は脂肪肝の指標および指標の変化とは関連せず、それらに影響しないことを示唆した。
【００６３】
結論として、コントロールより低いノギン濃度がＮＡＦＬＤ患者において観察され、ノギン濃度は、ＮＡＦＬＤ患者における低用量のスピロノラクトン＋ビタミンＥの併用、またはビタミンＥ単独療法の後に、同様に増加した。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＳＳ患者、ＮＡＳＨ患者およびコントロールにおける血清ノギン濃度（平均値±標準誤差）を示す。血清ノギン濃度は、ＳＳ患者およびＮＡＳＨ患者においてはコントロールよりもはるかに低く（傾向検定について、ｐ＝０．０４０）、ＳＳ患者とＮＡＳＨ患者との間には差はなかった。＊：ｐ＜０．０５、コントロール群との比較。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ビタミンＥ単独療法、またはスピロノラクトンとビタミンＥとの併用療法にランダムに割り当てられたＮＡＦＬＤ患者における血清ｌｏｇ（ノギン濃度）（平均値±標準誤差）を示す。ノギン濃度は、２ヶ月目に両方の群において同様に増加し、その後、試験終了まで安定であった。＊：ｐ＜０．０５、ベースラインのノギン濃度との比較。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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