(57)【要約】  本開示は、マイクロエンジニアリング生理学的システムの生理学的測定値を得るための方法およびデバイスを開示するものであり、臨床神経伝導および神経線維密度（ＮＦＤ）試験を模倣するインビトロ神経組織のマイクロスケール器官型モデルを含む。これらの方法およびデバイスの使用から得られる結果は、臨床転帰のより良好な予測であり、後期での成功の可能性が高い有望なリード化合物を選択するためのより費用対効果の高いアプローチを可能にする。本開示は、固有に密度が高く、高度に平行した神経線維管の成長を可能にする、マイクロエンジニアリングされたシステムにおける三次元マイクロ電極アレイの作製および利用を含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元マイクロ電極アレイであって、
少なくとも１つの二次元電極、少なくとも１つの三次元電極、またはそれらの組み合わせをさらに含むチップを含み、
マイクロエンジニアリング生理学的システム内の１つ以上の生体電気信号についてのリアルタイムで信頼性の高い検出を提供するように構成されている、
前記三次元マイクロ電極アレイ。
【請求項２】
前記１つ以上の生体電気信号が、単一活動電位、複合活動電位、高周波、低周波、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３】
前記マイクロエンジニアリング生理学的システムが、組織移植片、細胞の懸濁液、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４】
前記マイクロエンジニアリング生理学的システムが、マイクロパターン化プラットフォーム上で培養された神経細胞、またはマイクロパターン化プラットフォーム上に播種された組織移植片を含み、前記マイクロパターン化プラットフォームが、ニューラルアーキテクチャの形成を可能にし、かつ
前記マイクロ電極アレイが、前記ニューラルアーキテクチャの構成と相補的な構成を有する領域を含む、
請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項５】
前記ニューラルアーキテクチャが、軸索成長領域、神経節領域、樹状突起領域、シナプス領域、スフェロイド領域、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項６】
前記神経節領域またはスフェロイド領域に位置決めされた第１の複数の電極と、前記軸索成長領域の下に規定間隔で位置決めされた第２の複数の電極とを含む、請求項５に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項７】
前記第１の複数の電極、前記第２の複数の電極、またはその両方が、記録電極、刺激電極、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項８】
前記第１の複数の電極が、少なくとも１つの平面電極を含み、前記第２の複数の電極が、少なくとも１つの三次元電極を含み、またはその逆もまた同様である、請求項６に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項９】
前記規定間隔が、最大約５ｍｍの間隔を含む、請求項６に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１０】
前記マイクロ電極アレイが、最大約６４個の電極を含む、請求項６に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１１】
前記第１の複数の電極が、最大１０個の電極を含み、前記第２の複数の電極が、最大１０個の電極を含み、またはそれらの組み合わせである、請求項６に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１２】
前記ニューラルアーキテクチャの領域と相補的な領域内に、少なくとも１６個の三次元電極、少なくとも１６個の平面電極、またはそれらの組み合わせを収容するように構成されている、請求項４に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１３】
少なくとも１０μＶの１つ以上の生体電気信号を検出するように構成されている、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１４】
マイクロエンジニアリング生理学的システム内の１つ以上の生体電気信号を最大１年間検出するように構成されている、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１５】
マイクロエンジニアリング生理学的システム内の１つ以上の生体電気信号を最大約８週間検出するように構成されている、請求項１４に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１６】
生体適合性導電性インク、生体適合性導電性ペースト、生体適合性導電性複合材料、またはそれらの組み合わせを含む、請求項に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１７】
１つ以上のビアをさらに含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１８】
絶縁層をさらに含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項１９】
前記絶縁層が、生体適合性である材料を含む、請求項１８に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２０】
前記絶縁層が、パリレン、ポリ−ジ−メチル−シロキサン（ＰＤＭＳ）、ＳＵ−８、二酸化ケイ素、ポリイミド、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸グリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートグリコール、ポリエチレンナフタレート、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２１】
前記マイクロエンジニアリング生理学的システムを刺激するように構成された体積刺激装置をさらに含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２２】
前記電極が、約５０μｍ以下の直径を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２３】
前記電極が、約１０００μｍまでの直径を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２４】
前記電極が、約３０μｍ以下の直径を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２５】
前記電極が、約３０〜５０μｍの直径を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの三次元電極が、１μｍ〜１ｍｍ（両端の値を含む）の曲率半径（ＲＯＣ）をさらに含む先端を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの三次元電極が、約１５μｍの曲率半径（ＲＯＣ）をさらに含む先端を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２８】
生体適合性材料で構成されている、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項２９】
ニューロン細胞の生存率を維持するように構成されている、請求項２８に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３０】
前記マイクロエンジニアリング生理学的システムが、末梢神経解剖学的構造に類似した構造を有する少なくとも１つのニューロン細胞を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３１】
前記三次元マイクロ電極が、マイクロニードル型電極を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの三次元電極が、最大約１０００μｍの高さを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの三次元電極が、約３００μｍ〜約１０００μｍの高さを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの三次元電極が、最大約１５０μｍの高さを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの三次元電極が、約５０μｍ〜約１５０μｍの高さを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３６】
前記チップが、標準商用マルチチャネルシステムおよび標準商用記録増幅器とのインターフェースを有するように構成されている、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３７】
伝導速度、振幅、積分、化合物投与後の興奮度、閾値、感度、ＣＡＰ時間幅、ＣＡＰ波形形状、またはそれらの組み合わせについての推測のための複合活動電位を測定するように構成されている、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３８】
導電性トレース層を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項３９】
前記導電性トレース層が、チタン、窒化チタン、酸化イリジウム、白金、金、アルミニウム、ステンレス鋼、酸化インジウムスズ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３８に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４０】
前記導電性トレース層が、導電性ポリマーを含む、請求項３８に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４１】
導電性トレース層、ポリエチレンテレフタレート絶縁層、マイクロタワー、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのマイクロタワーが、マイクロ多孔質白金、ナノ多孔質白金、ナノ金、またはそれらの組み合わせでコーティングされている、請求項４１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４３】
チタン／金の金属トレースを含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４４】
チタン／アルミニウムのトレース層および二酸化ケイ素絶縁層を含む、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ。
【請求項４５】
マイクロ電極アレイと、
１つ以上のニューロン細胞を含む生体模倣システムと
を含む、マイクロエンジニアリング生理学的システム内の複合活動電位を再現可能に検出するためのシステムであって、
前記マイクロ電極アレイが、請求項１に記載のマイクロ電極アレイを含む、
前記システム。
【請求項４６】
前記マイクロエンジニアリング生理学的システムが、前記マイクロ電極アレイ上で成長しているか、または前記マイクロ電極アレイに移されている、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記１つ以上の神経細胞が、末梢神経系ニューロン、中枢神経系ニューロン、シュワン細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア細胞、グリア細胞、他の末梢もしくは中枢神経支持細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４８】
前記１つ以上のニューロン細胞が、感覚ニューロン、介在ニューロン、または運動ニューロンを含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４９】
前記末梢神経系ニューロンが、少なくとも１つの背根神経節ニューロンを含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項５０】
試料神経組織を、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ上で成長させるか、または前記マイクロ電極アレイに移すことであって、前記試料神経組織が、軸索成長領域および神経節領域を含む、前記成長させるかまたは移すことと、
前記試料神経組織の神経伝導速度を決定するために電気生理学的試験を行うことであって、前記電気生理学的試験が、前記軸索成長領域、前記神経節領域、またはそれらの組み合わせに沿った少なくとも１つの場所を電気的に刺激すること、および前記神経節領域内、前記軸索成長領域内、またはそれらの組み合わせ内の少なくとも１つの場所から記録することを含む、前記行うことと、
試料神経組織から得られた神経伝導速度を、健常な神経組織であることが分かっている神経組織の神経伝導速度と比較することと
を含む、神経病理の種類および重症度を予測する方法であって、
前記健常な神経組織と比較した、前記試料神経組織における低下した神経伝導が、神経病理を示す、
前記方法。
【請求項５１】
前記神経組織の組織学的分析をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
組織学的分析が、軸索直径、軸索密度、髄鞘形成、細胞形態、細胞型、神経構造、またはそれらの組み合わせについての評価を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記電気生理学的試験が、前記軸索成長領域、前記神経節領域、またはそれらの組み合わせに沿った複数の場所を刺激することと、前記神経節領域、前記軸索成長領域、またはそれらの組み合わせからの、結果として生じる電気応答を記録することとをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記電気生理学的試験が、神経変性を長期的に測定するために複数週間にわたって実行される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
神経組織を、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ上で成長させるか、または前記マイクロ電極アレイに移すことと、
前記神経組織に１つ以上の刺激を導入することと、
前記１つ以上の刺激に対する前記神経組織からの１つ以上の応答を測定することと
を含む、神経組織からの応答を評価する方法であって、
前記１つ以上の応答が、複合活動電位振幅、伝導速度、波形形状、組織形態パラメータ、またはそれらの組み合わせを含む、
前記方法。
【請求項５６】
前記１つ以上の刺激を導入することが、前記神経組織を、少なくとも１つの薬理活性化合物、電気刺激、化学刺激、光学刺激、物理刺激、またはそれらの組み合わせと接触させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
神経組織を、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ上で成長させるか、または前記マイクロ電極アレイに移すことと、
少なくとも１つの薬剤を前記神経組織に曝露することと、
複合活動電位振幅、伝導速度、波形形状、組織形態パラメータ、またはそれらの組み合わせにおける変化を測定または観察することと、
前記神経組織の測定または観察されたいずれかの変化を前記薬剤の毒性と相関させることであって、これにより、
前記測定または観察された変化が細胞生存率の低下を示す場合、前記薬剤が毒性であると特徴付けられ、
前記測定または観察された変化が細胞生存率の不変または増加を示す場合、前記薬剤が無毒であると特徴付けられる、前記相関させることと
を含む、薬剤の毒性を評価する方法。
【請求項５８】
少なくとも１つの軸索を成長させるのに十分な条件下で、神経組織を、請求項１に記載のマイクロ電極アレイ上で成長させるか、または前記マイクロ電極アレイに移すことと、
前記神経組織内の複合活動電位を誘発することと、
前記複合活動電位を測定することと、
前記複合活動電位に基づいて前記神経組織の髄鞘形成のレベルを定量化することと
を含む、１つ以上のニューロン細胞の１つ以上の軸索の髄鞘形成または脱髄を測定する方法。
【請求項５９】
複数の電極、複数のビア、またはそれらの組み合わせを収容するようにチップを加工することと、
シャドウマスクを使用して前記複数の電極をメタライゼーションすることと、
導電性インクをスクリーン印刷することと、
前記導電性インクをオーブン内で硬化させることと、
前記導電性インクおよびメタライゼーションされた電極上に絶縁体を堆積させることと、
前記複数の電極の記録部位を画定することと、
プリント基板を前記チップと組み合わせることと
を含む、三次元マイクロ電極アレイを作製する方法。
【請求項６０】
加工チップの全体にわたって絶縁体が堆積されている、請求項［００２９］に記載の方法。
【請求項６１】
上下信号伝達のために導電性ビアを作製することをさらに含む、請求項［００２９］に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物の全体の開示は、本明細書に記載および請求された発明の日付の時点で当業者に知られている最新技術をより完全に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
本特許開示には、著作権保護の対象となる資料が包含されている。本著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録に記載されている特許文書または特許開示のファクシミリ複製に異議はないが、それ以外の場合、全ての著作権を留保する。
【０００３】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月５日に出願された米国特許仮出願第６２／７２７，４９４号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金Ｒ４３ＥＳ０２９８８６−０１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００５】
発明の分野
本発明は、マイクロエンジニアリング生理学的システムで使用するためのマイクロ電極アレイおよびその使用方法を対象とする。
【背景技術】
【０００６】
発明の背景
平均的な新薬は、市場の承認を得るために約２６億ドルかつ最大１５年を必要とし、承認を維持するための承認後の研究開発にはさらに３億１，２００万ドルを必要とする。残念ながら、従来の前臨床モデルでの医薬品開発が、臨床治療の成功につながったという実績は少ない。特に神経学的用途では、許容できない毒性またはヒトにおける有効性の欠如のいずれかに起因して、第Ｉ相臨床試験に入る神経学的薬物の９２％が消費者に販売されることはないと推定されている。動物モデルおよびインビトロモデルの両方を含む現在の前臨床モデルは、前臨床試験の成功を臨床試験につなげるという点では、非常に限られた予測性しかないことが明らかである。動物モデルは、関連するインビボ情報を提供し得るが、それらは労力を要するものである（低スループット）。一方で、より高いスループットのインビトロシステムは、典型的には、二次元でランダムに成長する分離された細胞からなる基本的な神経培養物に限定され、関連するインビボ情報を提供することができない。したがって、関連するインビボ測定基準を提供し得るより高いスループットのシステムが強く望まれている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、三次元マイクロ電極アレイを対象とする。一実施形態では、マイクロ電極アレイは、少なくとも１つの二次元電極、少なくとも１つの三次元電極、またはそれらの組み合わせをさらに含むチップを含む。一実施形態では、マイクロ電極アレイは、少なくとも１つの二次元電極を含む。一実施形態では、マイクロ電極アレイは、少なくとも１つの三次元電極を含む。マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システム内の１つ以上の生体電気信号についてのリアルタイムで信頼性の高い検出を提供するように構成することができる。特定の実施形態では、１つ以上の生体電気信号は、単一活動電位、複合活動電位、高周波、低周波、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、生体電気信号は、複合活動電位を含む。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、組織移植片、細胞の懸濁液、またはそれらの組み合わせを含む。マイクロエンジニアリング生理学的システムは、スフェロイド塊に凝集した様々な神経細胞型のいずれかを含み得る。マイクロエンジニアリング生理学的システムは、マイクロパターン化されたプラットフォーム上で培養された神経細胞を含み得る。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、マイクロパターンプラットフォーム上に播種された組織移植片を含む。マイクロパターンプラットフォームは、ニューラルアーキテクチャの形成を可能にするように構成することができる。実施形態では、マイクロ電極アレイは、ニューラルアーキテクチャの構成と相補的な構成を有する領域を含む。
【０００８】
特定の実施形態では、ニューラルアーキテクチャは、軸索成長領域、神経節領域、樹状突起領域、シナプス領域、スフェロイド領域、またはそれらの組み合わせを含む。マイクロ電極アレイは、神経節領域またはスフェロイド領域に位置決めされた第１の複数の電極と、軸索成長領域、樹状突起領域、シナプス領域、またはそれらの組み合わせの下に規定間隔で位置決めされた第２の複数の電極と、を含み得る。マイクロ電極アレイは、当業者に既知の様々な電極のいずれかを含み得る。実施形態では、第１の複数の電極、第２の複数の電極、またはその両方は、記録電極、刺激電極、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、第１の複数の電極、第２の複数の電極、またはその両方は、少なくとも１つのマイクロニードル電極、少なくとも１つの平面電極、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、第１の複数の電極、第２の複数の電極、または両方は、少なくとも１つのマイクロニードル電極を含む。一実施形態では、第１の複数の電極、第２の複数の電極、またはその両方は、少なくとも１つの平面電極を含む。
【０００９】
実施形態では、電極は、マイクロエンジニアリング生理学的システムを記録または刺激するのに適切な任意のサイズを含み得る。少なくとも１つの平面電極を含む実施形態では、少なくとも１つの平面電極は、最大約１００μｍの長さを含み得る。平面電極は、最大約５ｍｍの長さを含み得る。平面電極は、最大約５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、または１ｍｍの長さを含み得る。実施形態では、平面電極の長さは、約１ｍｍ未満である。平面電極は、５００μｍ未満の長さを含み得る。実施形態では、平面電極は、約１０μｍの短い長さを含む。平面電極は、最大約１００μｍの長さを含み得る。一実施形態では、少なくとも１つの平面電極は、２０μｍ〜約８０μｍ（両端の値を含む）の長さを含む。平面電極は、約５０μｍの長さを含み得る。一部の実施形態では、平面電極は、約５０μｍ、約４０μｍ、約３０μｍ、約２０μｍ、または約１０μｍの長さを含む。実施形態では、電極の少なくとも１つは、実質的に正方形の平面電極を含む。
【００１０】
電極のうちの少なくとも１つは、三次元電極を含み得る。一実施形態では、少なくとも１つの三次元電極は、最大約１０００μｍの直径を有するベースを含む。三次元電極は、最大約５００μｍの直径を有するベースを含み得る。実施形態では、三次元電極のベースは、約７５μｍ〜約３５０μｍ（両端の値を含む）の直径を含む。三次元電極のベースは、約１００μｍ〜約３００μｍの直径を含み得る。三次元電極は、約５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、または１００μｍの直径を有するベースを含み得る。特定の実施形態では、ベースは、約２５０μｍの直径を含む。ベースの直径は、１００μｍ未満であり得る。実施形態では、ベースの直径は、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍ、約３０μｍ、約２０μｍ、または約１０μｍである。実施形態では、三次元電極の高さは、１μｍ〜約１０００μｍであり得る。三次元電極は、最大約１０００μｍの高さを含み得る。三次元電極は、約３０μｍ〜約１０００μｍの高さを含み得る。三次元電極は、最大約８００μｍの高さを含み得る。実施形態では、三次元電極の高さは、約１００μｍ〜約５００μｍ（両端の値を含む）である。三次元電極の高さは、約２５０μｍ〜約４５０μｍ（両端の値を含む）であり得る。特定の実施形態では、三次元電極の高さは、約３５０μｍ〜４５０μｍ（両端の値を含む）であり得る。実施形態では、三次元電極は、最大約１５０μｍの高さを含む。特定の実施形態では、三次元電極は、約５０μｍ〜約１５０μｍの高さを含む。三次元電極は、約８００、７００μｍ、６００μｍ、５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、または１００μｍの高さを含み得る。特定の実施形態では、三次元電極の高さは約４５０μｍである。三次元電極の高さは、１００μｍ未満であり得る。実施形態では、三次元電極の高さは、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍ、約３０μｍ、約２０μｍ、または約１０μｍである。特定の実施形態では、少なくとも１つの三次元電極は、１μｍ〜１ｍｍ（両端の値を含む）である曲率半径（ＲＯＣ）を有する先端を含む。特定の実施形態では、ＲＯＣは約５０μｍ未満である。ＲＯＣは、約５μｍ〜約３０μｍであり得る。一実施形態では、ＲＯＣは、約１５μｍである。
【００１１】
実施形態では、マイクロ電極アレイは、最大約５ｍｍの直径を有する少なくとも１つの電極を含む。少なくとも１つの電極の直径は、最大約５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、または１ｍｍであり得る。実施形態では、少なくとも１つの電極の直径は、約１ｍｍ未満である。実施形態では、少なくとも１つの電極は、最大約５００μｍの直径を含む。少なくとも１つの電極は、５００μｍ未満の直径を含み得る。マイクロ電極アレイは、最大約４００μｍの直径を有する少なくとも１つの電極を含む。実施形態では、少なくとも１つの電極の直径は、約７５μｍ〜約３５０μｍ（両端の値を含む）である。少なくとも１つの電極の直径は、約１００μｍ〜約３００μｍである。マイクロ電極アレイは、約５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、または１００μｍの直径を有する少なくとも１つの電極を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの電極は、約２５０μｍの直径を含む。少なくとも１つの電極の直径は、５０μｍ以下であり得る。少なくとも１つの電極の直径は、約３０μｍ以下であり得る。特定の実施形態では、マイクロ電極アレイは、直径約３０〜５０μｍの少なくとも１つの電極を含む。
【００１２】
実施形態では、軸索成長領域の下の第２の複数の電極の規定間隔は、最大約５ｍｍの間隔を含む。実施形態では、規定間隔は少なくとも１０μｍである。特定の実施形態では、規定間隔は、約１０μｍ〜約５ｍｍの距離を含む。規定間隔は、約１００μｍ〜約１ｍｍであり得る。実施形態では、規定間隔は、約１ｍｍである。
【００１３】
マイクロ電極アレイは、最大約３００個の電極を含み得る。実施形態では、マイクロ電極アレイは、最大約２００個の電極を含む。マイクロ電極アレイは、最大約１００個の電極を含み得る。特定の実施形態では、マイクロ電極アレイは、約３００、約２５０、約２００、約１５０、約１００、または約５０個の電極を含む。特定の実施形態では、マイクロ電極アレイは、最大約７０個の電極を含む。実施形態では、第１の複数の電極および第２の複数の電極は、組み合わせると最大で６４個の電極を含む。一部の実施形態では、第１の複数の電極または第２の複数の電極は、最大約６４個の電極を含む。第１の複数の電極または第２の複数の電極は、約１０〜約６４個の電極を含み得る。第１の複数の電極または第２の複数の電極は、約２０〜約６０個の電極を含み得る。特定の実施形態では、第１の複数の電極または第２の複数の電極は、２０、３０、４０、５０、または６０個の電極を含む。実施形態では、第１の複数の電極または第２の複数の電極は、約２０個未満の電極を含む。特定の実施形態では、第１の複数の電極は、最大１０個の電極を含み、第２の複数の電極は、最大１０個の電極、またはそれらの組み合わせを含む。第１の複数の電極、第２の複数の電極、または第１の複数の電極および第２の複数の電極の両方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の電極を含み得る。一実施形態では、第１の複数の電極は、３つの電極を含み、第２の複数の電極は、７つの電極を含む。代替の実施形態では、第１の複数の電極は、６つの電極を含み、第２の複数の電極は、９つの電極を含み得る。実施形態では、マイクロ電極アレイは、ニューラルアーキテクチャの領域と相補的な領域内に、少なくとも１６個のマイクロニードルタイプの電極、少なくとも１６個の平面電極、またはそれらの組み合わせを収容するように構成されている。
【００１４】
マイクロ電極アレイは、少なくとも約１０μＶの生体電気信号を検出するように構成することができる。実施形態では、マイクロ電極アレイは、約１０μＶ〜約１００μＶ（両端の値を含む）の生体電気信号を検出するように構成されている。マイクロ電極アレイは、約１０μＶ、２０μＶ、３０μＶ、４０μＶ、５０μＶ、６０μＶ、７０μＶ、８０μＶ、９０μＶ、または１００μＶの生体電気信号を検出するように構成することができる。マイクロ電極アレイは、少なくとも約４０μＶの生体電気信号を検出するように構成することができる。
【００１５】
実施形態では、マイクロ電極アレイは、長期間、マイクロエンジニアリング生理学的システム内の生体電気信号を検出するように構成され得る。実施形態では、マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システム内で最大１年間、生体電気信号を検出するように構成されている。マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システムにおいて、最大約１２ヶ月、１１ヶ月、１０ヶ月、９ヶ月、８ヶ月、７ヶ月、６ヶ月、５ヶ月、４ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、または１ヶ月間、生体電気信号を検出するように構成することができる。特定の実施形態では、マイクロ電極アレイは、最大２０週間、生体電気信号を検出するように構成され得る。マイクロ電極アレイは、最大１０週間、生体電気信号を検出するように構成することができる。マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システムにおいて、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、生体電気信号を検出するように構成され得る。実施形態では、マイクロ電極アレイは、少なくとも８週間、生体電気信号を検出するように構成されている。マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システム内で約４週間〜約８週間、生体電気信号を検出するように構成することができる。
【００１６】
一実施形態では、マイクロ電極アレイは、生体適合性導電性インク、生体適合性導電性ペースト、生体適合性導電性複合材料、またはそれらの組み合わせを含む。マイクロ電極アレイは、１つ以上のビアを含み得る。
【００１７】
実施形態では、マイクロ電極アレイは、絶縁層を含む。絶縁層は、生体適合性である材料を含み得る。一実施形態では、絶縁層は、室温でコンフォーマルコーティングされ得る。特定の実施形態では、絶縁層は、パリレン、ポリ−ジ−メチル−シロキサン（ＰＤＭＳ）、ＳＵ−８、二酸化ケイ素、ポリイミド、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸グリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートグリコール、ポリエチレンナフタレート、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
マイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システムを刺激するように構成された体積刺激装置をさらに含み得る。
【００１９】
様々な例示的な実施形態では、マイクロ電極アレイは、生体適合性材料で構成されている。マイクロ電極アレイは、ニューロン細胞の生存率を維持するように構成することができる。
【００２０】
実施形態では、マイクロエンジニアリングされた生理学的システムは、中枢神経系内、末梢神経系内、またはそれらの組み合わせ内の細胞の構造的特徴を有する少なくとも１つの細胞を含む。特定の実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、脳内、脊髄内、またはそれらの組み合わせ内に配置された神経ネットワーク内の細胞の構造的特徴を有する少なくとも１つのニューロン細胞を含む。マイクロエンジニアリング生理学的システムは、末梢神経解剖学的構造に類似した構造を有する少なくとも１つのニューロン細胞を含み得る。特定の実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、１つ以上のシナプスを含む。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、少なくとも１つの神経内分泌シナプス、少なくとも１つの神経筋肉シナプス、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
特定の実施形態では、三次元電極は、マイクロニードル型電極を含む。
【００２２】
実施形態では、マイクロ電極アレイチップは、標準商用マルチチャネル記録増幅器を含む標準商用マルチチャネルシステムとのインターフェースを有するように構成されている。実施形態では、例示的な商用システムおよび記録増幅器には、ＭＣＳ、Ａｘｉｏｎ、Ｐｌｅｘｏｎ、Ｉｎｔａｎ、ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ、ならびに他の既知のシステムおよび増幅器が含まれる。マイクロ電極アレイは、伝導速度、振幅、積分、化合物投与後の興奮度、閾値、感度、ＣＡＰ時間幅、ＣＡＰ波形形状、またはそれらの組み合わせについての推測のための活動電位を測定するように構成され得る。
【００２３】
特定の実施形態では、マイクロ電極アレイは、導電性トレース層を含む。実施形態では、導電性トレース層は、導電性材料を含む。導電性材料は、チタン、窒化チタン、酸化イリジウム、白金、金、アルミニウム、ステンレス鋼、酸化インジウムスズ、またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、導電性材料は、導電性ポリマーを含む。例示的な導電性ポリマーとしては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）、ポリピロール、ポリアニリン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。実施形態では、チタン／アルミニウムのトレース層、ポリエチレンテレフタレート絶縁層、マイクロタワー、またはそれらの組み合わせである。実施形態では、マイクロタワーは、マイクロ多孔質白金、ナノ多孔質白金、ナノ金、またはそれらの組み合わせでコーティングされている。マイクロタワーは、絶縁される場合があり、または絶縁されない場合がある。実施形態では、マイクロ電極アレイは、チタン／金の金属トレースを含む。マイクロ電極アレイは、チタン／アルミニウムのトレース層を含み得る。
【００２４】
本発明の別の態様は、マイクロエンジニアリング生理学的システムにおける複合活動電位を再現可能に検出するためのシステムを対象とする。実施形態では、システムは、本明細書で言及される様々なマイクロ電極アレイのいずれかを含む。本システムは、１つ以上の神経細胞をさらに含む生体模倣システムを含み得る。特定の実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、マイクロ電極アレイ上で成長する。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、マイクロ電極アレイに移される。実施形態では、１つ以上の神経細胞は、末梢神経系ニューロン、中枢神経系ニューロン、シュワン細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア細胞、グリア細胞、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、１つ以上のニューロン細胞は、感覚ニューロン、介在ニューロン、または運動ニューロンを含む。末梢神経系ニューロンは、少なくとも１つの背根神経節ニューロンを含み得る。
【００２５】
本発明の一態様は、神経病理の種類および重症度を予測する方法を対象とする。実施形態では、本方法は、本明細書に開示される様々なマイクロ電極アレイシステムのいずれかの上で神経組織を成長させること、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイシステムに神経組織を追加すること、マイクロ電極アレイシステムを神経組織に追加すること、またはそれらの組み合わせを含む。神経組織は、軸索成長領域および神経節領域を含み得る。電気生理学的試験を実施して、神経組織の神経伝導速度を決定することができる。特定の実施形態では、電気生理学的試験は、軸索成長領域、神経節領域、またはそれらの組み合わせに沿った少なくとも１つの場所を刺激することと、軸索成長領域、神経節領域、またはそれらの組み合わせに沿った少なくとも１つの場所から記録することと、を含む。実施形態では、電気生理学的試験は、軸索成長領域に沿った少なくとも１つの場所を電気的に刺激することと、神経節領域内の少なくとも１つの場所から記録することと、を含む。代替の実施形態は、神経節領域を電気的に刺激し、軸索成長領域に沿った少なくとも１つの場所から記録することを含む。特定の実施形態では、低下した神経伝導は、神経病理を示す。本方法は、神経組織の組織学的分析をさらに含み得る。実施形態では、組織学的分析は、軸索直径、軸索密度、髄鞘形成、細胞形態、細胞型、神経構造、またはそれらの組み合わせについての評価を含む。特定の実施形態では、電気生理学的試験は、軸索成長領域、神経節領域、またはそれらの組み合わせに沿った複数の場所を刺激することと、神経節領域、軸索成長領域、またはそれらの組み合わせからの、結果として生じる電気応答を記録することと、を含み得る。実施形態では、組織学的分析から得られたデータは、電気生理学的試験から得られたデータと相関する。神経病理学の特定の推測は、組織学的データと電気生理学的データとの間の相関に基づいて引き出され得る。特定の実施形態は、試料神経組織から得られた神経伝導速度を、健常な神経組織であることが分かっている神経組織の神経伝導速度と比較することをさらに含み、健常な神経組織と比較した、試料神経組織における低下した神経伝導は、神経病理を示す。実施形態では、形態、表現型、遺伝子型、構造、電気生理学、またはそれらの組み合わせにおける相対的な変化は、試料神経組織と健常な神経組織との間、または試料神経組織と少なくとも１つの薬剤に供された神経組織との間で比較することができる。特定の実施形態では、電気生理学的試験は、神経変性を長期的に測定するために複数週間にわたって実行される。
【００２６】
本発明の別の態様は、神経組織からの応答を評価する方法を対象とする。実施形態では、本方法は、本明細書に開示される様々なマイクロ電極アレイのいずれかの上で神経組織を成長させること、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイシステムに神経組織を追加すること、マイクロ電極アレイシステムを神経組織に追加すること、またはそれらの組み合わせを含む。本方法は、１つ以上の刺激を神経組織に導入することと、１つ以上の刺激に対する神経組織からの１つ以上の応答を測定することと、をさらに含み得る。実施形態では、１つ以上の応答は、複合活動電位振幅、伝導速度、波形形状、組織形態パラメータ、またはそれらの組み合わせを含む。実施形態では、１つ以上の刺激を導入することは、神経組織を、少なくとも１つの薬理活性化合物、電気刺激、化学刺激、光学刺激、物理的刺激、またはそれらの組み合わせと接触させることを含む。実施形態では、光学刺激は、光遺伝学による操作された光学感度、または光受容ニューロンの刺激を通じた自然に発現された光学感度を含む。物理的刺激には、ニューロンの機械的刺激が含まれ得る。実施形態では、機械的刺激は、一過性受容体電位バニロイド（ＴＲＰＶ）チャネル基などの機械感受性チャネルの活性化によって実現され得るが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、薬剤の毒性を評価する方法に関する。実施形態では、本方法は、本明細書に開示される様々なマイクロ電極アレイのいずれかの上で神経組織を成長させること、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイシステムに神経組織を追加すること、マイクロ電極アレイシステムを神経組織に追加すること、またはそれらの組み合わせを含む。本方法は、少なくとも１つの薬剤を神経組織に曝露することと、複合活動電位振幅、伝導速度、波形形状、組織形態パラメータ、またはそれらの組み合わせにおける変化を測定または観察することと、神経組織の任意の測定または観察された変化を薬剤の毒性と相関させることであって、これにより、測定または観察された変化が細胞生存率の低下を示す場合、薬剤が毒性であると特徴付けられ、測定または観察された変化が細胞生存率の不変または増加を示す場合、薬剤が無毒であると特徴付けられる、相関させることと、をさらに含み得る。
【００２８】
本発明の一態様は、１つ以上のニューロン細胞の１つ以上の軸索の髄鞘形成または脱髄を測定する方法を対象とする。実施形態では、本方法は、少なくとも１つの軸索を成長させるのに十分な条件下で、本明細書に開示される様々なマイクロ電極アレイの実施形態のいずれかの上で神経組織を成長させること、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイシステムに神経組織を追加すること、マイクロ電極アレイシステムを神経組織に追加すること、またはそれらの組み合わせを含む。本方法は、かかる神経組織において複合活動電位を誘発することと、複合活動電位を測定することと、複合活動電位に基づいて、かかる神経組織の髄鞘形成のレベルを定量化することと、をさらに含み得る。
【００２９】
別の態様では、本発明は、三次元マイクロ電極アレイを作製する方法を対象とする。実施形態では、本方法は、複数の電極、複数のビア、またはそれらの組み合わせを収容するようにチップを加工することを含む。方法は、シャドウマスクを使用して複数の電極をメタライゼーションすることをさらに含み得る。実施形態では、本方法は、導電性インクのスクリーン印刷を含む。本方法は、オーブン中で導電性インクを硬化させることをさらに含み得る。特定の実施形態では、方法は、導電性インクおよびメタライゼーションされた電極に絶縁体を堆積させるステップを含む。絶縁体は、加工チップの全体にわたって堆積することもできる。方法は、複数の電極の記録部位を画定するステップを含み得る。実施形態では、プリント回路基板は、チップと組み合わされる。特定の実施形態では、方法は、上下信号伝達のために導電性ビアを作製することをさらに含む。
【００３０】
本発明の他の目的および利点は、後続の説明から容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】一実施形態における末梢神経チップ（ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）（登録商標）（ＡｘｏＳｉｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ、ニューオーリンズ、ルイジアナ州）を示す。Ａ）ＤＡＰＩ（青色）染色核およびβ３−チューブリン（緑色）神経突起を有する構築物の蛍光画像。Ｂ）記録および刺激電極の配置を示す明視野画像。Ｃ）深度カラーマップを備えた３Ｄ神経突起成長の共焦点画像スタック。Ｄ）構築物の遠位端付近にＭＢＰ染色された髄鞘線維を示す共焦点画像スタックの３Ｄ直交図。Ｅ）髄鞘形成軸索および裸軸索ならびにシュワン細胞を示すＴＥＭ断面；挿入図は螺旋状のコンパクトミエリン構造の拡大図。Ｆ）健常な髄鞘形成軸索（左上）ならびにＦｓｋ誘発性髄鞘形成不全（赤い矢印）の代表的な画像。Ｇ）Ｆｓｋ投与前および投与後のＣＡＰの例のトレース（１０個の連続記録のオーバーレイであり、平均トレースを赤で示す）。Ｈ）対照の有髄（Ｍ＋）、デキサメタゾンのみ（ＯＤｅｘ）、フォースコリン加工（Ｆｓｋ）、およびデキサメタゾン（ＤｅｘＭ）共投与によるフォースコリンの平均ＣＡＰ振幅および伝導速度；ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２】一実施形態における「神経チップ（登録商標）」３Ｄ  ＭＥＡデバイスを提供する。概略図（左）は、製造プロセス（左）を示す。操作された神経組織アーキテクチャに整合するように設計された３Ｄ電極（中央）の光学像およびＳＥＭ画像である。３Ｄ  ＭＥＡの全スペクトル平均インピーダンスにより、無電解白金メッキ後のインピーダンス低減（Ｎ＝３、右上）、マイクロ多孔質白金を使用した３Ｄ電極の１０倍の充電容量増加（Ｎ＝３、右下）が実証される。
【図３】軸索成長領域に沿った異なる位置を刺激する３つの電極および神経節領域内に示される記録電極を備えた一実施形態の下での実験装置の概略図を示す。
【図４】一実施形態下での実験的な設計を示す。この実施形態では、ベースラインの生理学的記録は、培養物中の成長および髄鞘形成の後に行われる。実験には、各薬物の急性（４８時間）適用、続いて、生理学的記録（Ｒｅｃ）およびイメージング（ＣＦＭおよびＴＥＭ）による即時または遅延（７日間）評価が含まれる。対照群は、薬物を含まない溶媒投与から構成される。
【図５】一実施形態におけるカスタム固体基板ＭＥＡ設計のために使用されるマスクの概略図を示す。ボックス化された領域が右図でより詳細に示されている。応答を記録するための細胞スフェロイドの領域に配置された９個の５０×５０μｍの電極が示され、６個の１００×５００μｍの電極がチャネルの長さまで１ｍｍ間隔で示される（右側の拡大図では３個のみ視認される）。
【図６】３Ｄ  ＭＥＡの製造のための例示的なプロセスフローを示しており、（ａ）ベース構造の３Ｄ印刷、（ｂ）マイクロミルステンシルマスクを介したメタライゼーション、（ｃ）生体適合性ラミネート「グロス」絶縁層の適用、および（ｄ）作製したデバイス上の３Ｄ印刷培養ウェルの組み立てが示される。プロセスステップごとに、１０個の３Ｄ電極を包含する記録／刺激パッチのうちの１つの拡大図が与えられており、（ｅ）白金の無電解メッキ後のパッチのうちの１つの拡大図、（ｆ）メタライゼーションステップ後の「微細」ＳｉＯ２絶縁層の堆積を示すデバイスの分解図である。（ｇ）ＳｉＯ２の堆積後の単一の３Ｄマイクロタワー、（ｈ）ＳｉＯ２絶縁体のレーザ微細加工（これによりその下の金属が露出する）後の単一の３Ｄマイクロタワー、（ｉ）白金の無電解メッキ後のより小さいマイクロ電極を有する単一の３Ｄマイクロタワーである。
【図７】（ａ）１０個の３Ｄマイクロタワーを包含する記録／刺激パッチのうちの１つ、（ｂ）ＳＬＡ印刷の層別加工による３Ｄ印刷後の固有のストライプを示すパッチの環状領域内の３つのマイクロタワー、（ｃ）ストライプの削減をもたらすマイクロタワーのアセトン蒸気研磨後のマイクロタワー表面の平滑化、（ｄ）約１５μｍの曲率半径を示す単一の３Ｄマイクロタワーの先端の拡大図のＳＥＭ画像を提供する。
【図８】一実施形態における作製したデバイスの顕微鏡写真を示しており、（ａ）メタライゼーション済みのデバイス、（ｂ）３Ｄマイクロタワーの拡大図、（ｃ）点線状の円で示される生体適合性ラミネート「グロス」絶縁層の適用、および（ｄ）増幅器セットアップとの互換性のために４９ｍｍ×４９ｍｍ×１ｍｍのフォームファクターで組み立てられた３Ｄ  ＭＥＡデバイスを示す。
【図９】３ＤマイクロタワーＭＥＡの（ａ）インピーダンスおよび（ｂ）位相特性のフルスペクトルを提供する。線は、グラフの右側の電気生理学的に有意な１ｋＨｚの値を示している。（ｃ）マイクロ多孔質白金の無電解メッキ前（ｃ）および後（ｄ）の単一の３ＤマイクロタワーＭＥＡの光学顕微鏡写真である。顕微鏡写真から、マイクロタワーの先端にマイクロ多孔質白金が堆積していることが明らかである。
【図１０】図１０（ａ）および（ｂ）は、一実施形態の（ａ）無電解白金メッキ前および（ｂ）後の３ＤマイクロタワーＭＥＡの循環電圧測定の走査速度変化を示す。（ｃ）マイクロ多孔質白金メッキ前後の二重層キャパシタンス値を推定するために（ａ）および（ｂ）から抽出された電流対走査速度、（ｄ）マイクロ多孔質白金の無電解メッキ前後の３Ｄマイクロタワー上の３０μｍ×３０μｍの「微細」マイクロ電極のフルスペクトルインピーダンスおよび位相応答を示す。
【図１１】（ａ）ＳｉＯ２層の紫色の色相を示すＳｉＯ２堆積後の一実施形態における３Ｄマイクロタワーの先端の拡大図顕微鏡写真、（ｂ）ＳｉＯ２のレーザ微細加工後の白金の無電解メッキ後の「微細」マイクロ電極上の特徴的なマイクロ多孔質白金、（ｃ）「微細」レーザーアブレーションされたマイクロ多孔質白金メッキＳｉＯ２電極のＳＥＭ画像、（ｄ）形成されたマイクロ多孔質材料の島に白金を無電解メッキした後の「微細」マイクロ電極のＥＤＳ分析を提供する。
【図１２】（ａ）一実施形態におけるＭＥＡの３Ｄマイクロタワー上のＤＲＧ（青色でマーク）を、（ｂ）マトリゲル（登録商標）マトリックス鍵穴（青色でマーク）の拡大図とともに示す。ＰＥＧ層の輪郭は赤色でマークされている。（ｃ）神経チップ（登録商標）の環状領域におけるＭＥＡの３Ｄマイクロタワー上のＤＲＧの蛍光顕微鏡像である。（ｄ）マトリゲルを使用して、ＭＥＡ（１）上に配置されたＤＲＧを示すステッチされた複合画像である。ＤＲＧをカルセインＡＭ染色（緑色）およびヨウ化プロピジウム染色（赤色）で染色し、４倍で倒立顕微鏡を使用して撮影した。（２）は３Ｄマイクロタワーに巻かれた神経細胞であり、細胞の生体適合性を決定する。（ｅ）対照試料のための神経チップ（登録商標）の環状領域の拡大図である。
【図１３】一実施形態では、ＭＥＡ上で１０日間培養した後に神経細胞生存率を測定することによって得られる神経チップ（登録商標）の生体適合性からのデータを示す。（ａ）棒グラフにより、対照（組織培養プラスチック上の神経細胞生存率）と絶縁デバイスおよびプレーン樹脂上で成長した細胞とが比較される。エラーバーはＳＤを示し、＊＊＊はＡＮＯＶＡに対するｐ＜０．０００１の有意性を示す。（ｂ）（ｃ）フィンガープリント領域の分解プロットを用いた３Ｄ印刷クリア樹脂のＦＴＩＲ分析である。（ｄ）一実施形態による神経チップ（登録商標）設計に従って、１３１個の記録部位／刺激部位を有する、加工された３Ｄ  ＭＥＡの吸水特性、および（ｅ）３Ｄ印刷された高密度３Ｄ  ＭＥＡ（ベース直径約１００μｍ、高さ約１５０μｍ）のＳＥＭ画像である。
【図１４】（ａ）一実施形態の下のシャドウマスクの概略図、（ｂ）一実施形態の下のマイクロミルラミネートの概略図、および（ｃ）一実施形態の下のマイクロミルステンレスステンシルマスクを提供する。
【図１５】ベース直径（左）および高さ（右）の変動を示すＮ＝２０個の電極のボックスプロットを示す。
【図１６】（ａ）一実施形態の単一パッチの１０個のマイクロ多孔質白金電極の顕微鏡写真および（ｂ）マイクロ多孔質白金電極の拡大図を提供する。（ｃ）一実施形態による無電解メッキ前の３ＤマイクロタワーＭＥＡの顕微鏡写真および（ｄ）無電解メッキ前のＭＥＡの拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
略語および定義
本明細書において１つ以上の好ましい実施形態の詳細な説明を提供する。ただし、本発明が様々な形態で実施され得ることを理解されたい。したがって、本明細書に開示される特定の詳細事項は、限定的ではなく、特許請求の範囲の基礎として、かつ本発明を任意の適切な方法で使用するように当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。
【００３３】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲および／または明細書中の用語「含む」と併用される場合、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、「１つ」を指し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つ以上」も指し得る。
【００３４】
本明細書で「例えば」、「など」、「含む」などの語句のいずれかが使用される場合、別途明示的に記載されない限り、「かつ限定されない」という語句が続くと理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。
【００３５】
「実質的に」という用語は、意図される目的に悪影響を与えない記述からの逸脱を許容するものである。説明的な用語は、「実質的に」という用語が明示的に列挙されなくても、「実質的に」という用語によって修飾されると理解される。したがって、例えば、語句「レバーは垂直に延在する」は、正確な垂直配置が、レバーがその機能を実行するために必要でない限り、「レバーは実質的に垂直に延在する」ことを意味する。
【００３６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（ならびに同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などは、互換的に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語の各々は、「含む」という米国特許法の一般的な定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下の」を意味するオープンな用語であると解釈され、追加の特徴、制限、態様などを除外しないようにも解釈される。したがって、例えば、「ステップａ、ｂ、およびｃを伴うプロセス」は、プロセスが少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」が使用される場合は、かかる解釈が文脈において無意味でない限り、「１つ以上」が理解される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、「おおよそ」、「ほぼ」、「周囲」、または「その領域内」を指し得る。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、それは、記載される数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、記載される値を上方または下方（より高いまたはより低い）２０パーセントの分散で修正するために使用される。
【００３８】
本明細書で使用される「マイクロエンジニアリング生理学的システム」、「器官型調製物」、「３Ｄ細胞ネットワーク」、「３Ｄ器官モデル」、「生体機能チップ」などの用語は、任意の生体模倣インビトロシステムを指し得る。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、特定の生物学的システムの構造的特徴および機能的特徴を発現するように構成されている。マイクロエンジニアリングされたシステムの一例には、三次元細胞培養システムが含まれる。一実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、神経細胞のための三次元細胞培養システムを含み、これは、インビボ神経線維のものを模倣する構造的特徴および機能的特徴の両方を促進する。特定のマイクロエンジニアリング生理学的システムは、単離された細胞、組織移植片、組織移植片断片、またはそれらの組み合わせの成長を促進するように構成され得る。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、ニューロン細胞、神経細胞、神経組織移植片、またはそれらの組み合わせを含む。実施形態では、マイクロエンジニアリング生理学的システムは、米国特許出願第１５／５１０，９７７号に開示されている様々なシステムのいずれかを含み、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。マイクロエンジニアリング生理学的システムは、米国特許出願第１６／０７７，４１１号に開示される様々なシステムのいずれかを含むことができ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「組織移植片」は、生物または対象から得られる、単離されるか、または別様で分離される任意の組織を含み得る。例示的な組織移植片としては、単離された神経移植片が挙げられる。組織移植片は、任意の電気的に活性または電気的に応答性のある組織の移植片を含み得る。実施形態では、組織移植片は、末梢神経組織の移植片、および中心神経組織の移植片、またはそれらの組み合わせを含む。移植片は、脳由来組織移植片、脊髄由来組織移植片、腸由来組織移植片、末梢由来組織移植片、またはそれらの組み合わせであり得る。実施形態では、組織移植片は、背根神経節（ＤＲＧ）移植片、網膜移植片、皮質移植片、またはそれらの組み合わせを含む。組織移植片は、複数の１つ以上のニューロン細胞を含み得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ニューロン細胞」、「神経細胞」などの用語は、樹状突起、軸索、および体細胞の少なくとも１つもしくは組み合わせを含む細胞、または代替的に、神経系組織から単離された、もしくは神経系組織内で見出された任意の細胞もしくは細胞群を指し得る。実施形態では、ニューロン細胞は、軸索を含むか、または軸索を形成し得る任意の細胞である。ニューロン細胞は、単離された一次神経節組織を含み得る。一部の実施形態では、神経細胞は、シュワン細胞、グリア細胞、神経膠細胞、皮質ニューロン、神経細胞から単離されたもしくは神経細胞に由来するか、または神経細胞の表現型に実質的に類似した神経細胞表現型もしくは表現型を有する細胞に分化した胚性細胞、神経細胞表現型に分化した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、あるいは神経組織に由来するか、または神経表現型に分化した間葉系幹細胞である。特定の実施形態では、ニューロン細胞は、背根神経節（ＤＲＧ）組織、網膜組織、脊髄組織、腸組織、または脳組織由来のニューロンであり、各場合において、成人、青年、子供、または胎児の対象に由来する。一部の実施形態では、神経細胞は、対象の神経組織から単離された任意の１つ以上の細胞である。実施形態では、神経細胞は、対象の末梢神経系に由来する一次細胞、対象の中枢神経系に由来する一次細胞、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、神経細胞は、哺乳類細胞である。実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態では、神経細胞は、初代ヒト組織またはヒト幹細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト哺乳類細胞であるか、または非ヒト哺乳類から単離された細胞に由来する。細胞が由来する元の動物から単離されるか、または分離された場合、ニューロン細胞は、２つ以上の種から単離されたニューロンを含み得る。
【００４１】
実施形態では、ニューロン細胞は、交感神経ニューロン、脊髄運動ニューロン、中枢神経系ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、血清作動性ニューロン、介在ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、および三叉神経節ニューロンのうちの１つ以上のニューロンである。一部の実施形態では、神経細胞は、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、ミクログリア、上衣細胞、放射状グリア、衛星細胞、腸グリア細胞、および下垂体細胞のうちの１つ以上のグリア細胞である。一部の実施形態では、神経細胞は、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、リンパ球、単球、肥満細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、および好塩基球のうちの１つ以上の免疫細胞である。一部の実施形態では、神経細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、星状細胞由来誘導多能性幹細胞、線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞、腎上皮由来誘導多能性幹細胞、角質細胞由来誘導多能性幹細胞、末梢血由来誘導多能性幹細胞、肝細胞由来誘導多能性幹細胞、間葉細胞由来誘導多能性幹細胞、神経幹細胞由来誘導多能性幹細胞、脂肪細胞由来誘導多能性幹細胞、前脂肪細胞由来誘導多能性幹細胞、軟骨細胞由来誘導多能性幹細胞、および骨格筋由来誘導多能性幹細胞のうちの１つ以上の幹細胞である。一部の実施形態では、神経細胞は、角質細胞である。一部の実施形態では、神経細胞は、内皮細胞である。
【００４２】
「単離されたニューロン」、「単離されたニューロン細胞」、「単離された神経細胞」などは、それらが元々成長する生物または培養物から除去または分離された神経細胞を指し得る。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、懸濁液中のニューロンである。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、組織試料または非ニューロン細胞もしくは非神経細胞を有する懸濁液を含む細胞のより大きな混合物の成分である。一部の実施形態では、神経細胞は、組織移植片の場合のように、それらが由来する動物から除去されるときに単離されたものである。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、動物から切除されたＤＲＧ中のニューロンである。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ブタ細胞、または他の非ヒト哺乳動物から選択される１つの種、または種の組み合わせに由来する少なくとも１つ以上の細胞を含む。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、ヒト細胞である。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、ヒトニューロン細胞に類似または実質的に類似した分化表現型を有するように予め条件付けされた幹細胞である。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、ヒト細胞である。一部の実施形態では、単離されたニューロンは、非ヒトニューロン細胞に類似または実質的に類似した分化表現型を有するように予め条件付けされた幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、哺乳動物の臍帯から単離された幹細胞、または内皮幹細胞から選択される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ニューロン細胞培養培地」または単に「培養培地」という用語は、細胞の成長、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）、増殖、伝搬、または別様で操作をサポートするのに好適な任意の栄養物質を指し得る。一部の実施形態では、培地は、神経成長因子（ＮＧＦ）を補充した神経バサル培地を含む。一部の実施形態では、培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。実施形態では、培地は、Ｌ−グルタミンを含む。培養培地は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を含み得る。特定の実施形態では、培地は、約０．００１体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。実施形態では、培地は、約０．００１体積％〜約０．００８体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。一部の実施形態では、培地は、約０．００１体積％〜約０．００６体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。培地は、約０．００１体積％〜約０．００４体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含み得る。一部の実施形態では、培地は、約０．００２体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。実施形態では、培地は、約０．００３体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。特定の実施形態では、培地は、約０．００４体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。実施形態では、培地は、約０．００６体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。培地は、約０．００８体積％〜約０．０１体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含み得る。一部の実施形態では、培地は、約０．００２体積％〜約０．００６体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。一部の実施形態では、培地は、約０．００３体積％〜約０．００５体積％の範囲の濃度のアスコルビン酸を含む。シュワン細胞分化を組み込む実施形態では、培養培地は、吸収性酸、ＦＢＳ、ｃＡＭＰ、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳類、爬虫類、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、霊長類、ラット、マウス、ウサギなど）およびヒトを含むがこれらに限定されない、動物界の全てのメンバーを含む。
【００４５】
「電気刺激」という用語は、細胞が交流（ＡＣ）または直流（ＤＣ）のいずれかの電流に曝露されているプロセスを指し得る。電流は、固体基板に導入されるか、または細胞培養培地または細胞培養システムの他の好適な構成要素を介して印加され得る。一部の実施形態では、電気刺激は、１つ以上の電極をデバイスまたはシステム内の異なる位置に位置決めして、細胞培養容器にわたって電圧電位を生成することによってデバイスまたはシステムに提供される。電極は、１つ以上のワイヤによって、１つ以上の増幅器、電圧計、電流計、および／または電気化学システム（電池または発電機など）と動作可能に接続している。かかるデバイスおよびワイヤにより、電流が生成され、組織培養システム全体で電位が生成される回路が形成される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「固体基板」という用語は、細胞毒素を含まないか、または実質的に含まない固体支持体である任意の物質を指し得る。一部の実施形態では、固体基板は、シリカ、プラスチック、および金属の１つまたは組み合わせを含む。実施形態では、固体基板は、細胞培養培地の存在下で、固体基板を通るタンパク質、栄養素、およびガスの拡散または非活性輸送を可能にするのに十分なサイズおよび形状の孔を含む。特定の実施形態では、孔径は、直径が約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ミクロン以下である。当業者は、細胞培養培地の内容物および特定の微小環境中の固体基板上で成長する細胞の曝露に基づいて、必要または適切な孔径を決定することができる。例えば、当業者は、システムまたはデバイス内の任意の培養細胞が、固体基板が様々な直径の孔を含む条件下で生存可能であるかどうかを観察することができる。一部の実施形態では、固体基板は、外面および内面の形状を画定する所定の形状を有するベースを含む。実施形態では、ベースは、シリカ、プラスチック、セラミック、もしくは金属のうちの１つまたは組み合わせを含み、ベースは、シリンダの形状であるか、またはシリンダに実質的に類似した形状であり、これにより、第１の細胞貫通不能ポリマーおよび第１の細胞貫通可能ポリマーは、ベースの内面を被覆し、円筒形または実質的に円筒形の内部チャンバを画定し、開口部は、シリンダの一端に位置決めされる。一部の実施形態では、ベースは、細胞培養培地の存在下で固体基板を通してタンパク質、栄養素、および酸素の拡散を可能にするのに十分なサイズおよび形状の１つ以上の孔を含む。実施形態では、固体基板は、直径が１ミクロン以下の孔径を有するプラスチック基板を含み、少なくとも１層のヒドロゲルマトリックスを含み、ヒドロゲルマトリックスは、少なくとも第１の細胞貫通不能ポリマーおよび少なくとも第１の細胞貫通可能ポリマーを含み、ベースは、第１の細胞貫通不能ポリマーおよび少なくとも第１の細胞貫通可能ポリマーが物理的に接着または化学結合する所定の形状を含み、固体基板は、固体基板の内面の形状によって少なくとも部分的に画定され、開口部によって固体基板の外側からアクセス可能であり、任意選択的に固体基板の一端に位置決めされる少なくとも１つの区画を含む。固体基板が少なくとも１つの内面によって画定された中空の内側部分を含む実施形態では、懸濁液または組織移植片中の細胞は、細胞が成長の前に固体基板の内側表面の少なくとも一部分に付着し得るように、開口部にまたはその近くに細胞を配置することによって播種することができる。固体基板の少なくとも１つの区画または中空内部は、内面固体基板の形状によって画定された特定の三次元形状の細胞の格納を可能にし、開口部から離れた細胞の方向性成長を促進する。ニューロン細胞の場合、少なくとも１つの区画の格納の程度および形状は、少なくとも１つの区画内に、開口部に、または開口部に近接して位置決めされた体細胞からの軸索成長に有利である。特定の実施形態では、固体基板は、内部区画が円筒形または部分的に円筒形となるように、管状または実質的に管状である。実施形態では、固体基板は、１つ以上の分岐管状内部区画を含む。実施形態では、固体の中空内部部分の分岐または多重分岐形状は、軸索が複数の分岐パターンで成長するように構成されるか、またはそれを可能にする。電極が軸索の遠位端付近に配置され、ニューロン細胞体に配置されるか、またはニューロン細胞体に近接して配置される場合、細胞内活動電位などの電気生理学的測定基準をデバイスまたはシステム内で測定することができる。
【００４７】
特定の実施形態では、１つ以上の電極は、１つ以上の開口部に配置されるか、または１つ以上の開口部に近接して配置され得、その結果、軸索長に沿った１つ以上の位置にわたって記録を行うことができる。これはまた、軸索の長さに沿った１つ以上の位置を調べるために使用され得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「記録」という用語は、１つ以上のニューロン細胞の応答を測定することを指し得る。かかる応答は、電気生理学的応答、例えば、パッチクランプ電気生理学的記録または電界電位記録であり得る。
【００４９】
マイクロエンジニアリング生理学的システム
電気生理学的および組織学的評価が神経障害を評価するためのゴールドスタンダード測定である神経系について、神経伝導速度および神経線維密度などの臨床的に関連する測定基準を提供し得る生体模倣インビトロシステムにより、臨床予測性を向上させることができる。好適な生体模倣インビトロ神経チップ（ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）（登録商標）（ＮＯａＣ）システムは、米国特許出願第１５／５１０，９７７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、実施形態は、動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせを使用することができ、軸索を、３Ｄ偏光構造で細胞外刺激することで、シグナルの一方向伝搬をもたらし、その結果、複合活動電位（ＣＡＰ）を評価することができる。
【００５０】
三次元（３Ｄ）マイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）
これらの革新的なシステムおよび器官型調製物は、インビトロ環境におけるインビボ情報を提供するが、電気生理学的試験には、マイクロマニピュレータを使用した刺激電極および記録電極の労力を要する手動配置が含まれており、マイクロマニピュレータは、他のより高いスループットの２Ｄ多電極アレイ（ＭＥＡ）システムと比較して、試験速度が低下する。
【００５１】
この課題を克服するために、マイクロエンジニアリング生理学的システムを３Ｄマイクロ電極と統合して、刺激、記録、またはその両方のプロセスを自動化することができる。かかる自動化により、システムのスループットを増加させることができ、治療用化合物を大規模にスクリーニングするのに適している。３Ｄ電極は、他の２Ｄ  ＭＥＡプラットフォームと比較して、より多くの多様な軸索線維を調べることができ、よりインビボ神経組織に類似した集団ベースの電気生理学的応答を実現する。
【００５２】
さらに、従来のＭＥＡの平面構成は、培養物が成熟して３Ｄ形態になったときに一定の高さで発生するシグナルを捕捉するのに不十分である。チップ上の神経学的モデルでは、より厚く、かつ成熟した組織に由来するシグナルの捕捉および分析が特に重要である。
【００５３】
本発明の実施形態は、迅速な電気生理学的試験を可能にするために、３Ｄヒドロゲル環境などの生体模倣システムに統合され得るマイクロ電極設計を提供する。
【００５４】
従来の２Ｄ  ＭＥＡ加工は、シリコンまたはガラス基板上のリソグラフィ、メタライゼーション、およびエッチング技術を伴い得る。特に、非平面表面上のリソグラフィ技術が困難であるため、モノリシック３Ｄ  ＭＥＡ加工技術は稀少な技術である。最近、様々な３Ｄ細胞培養システムの開発に多大な努力が投資されており、その結果、インビトロＭＥＡを三次元まで拡張する必要性が高まっている。３Ｄ  ＭＥＡは、中枢または末梢神経系用途を含む生物学的システムのための３Ｄマイクロエンジニアリングシステムの研究に向けたネットワークダイナミクスの単純で迅速なスクリーニングおよび測定を可能にし得る。
【００５５】
３Ｄ  ＭＥＡは、既存の基板上で製造することができる。実施形態では、かかる既存の基板には、マイクロ電極アレイの構築に一般的に使用されていることが当該技術分野で既知の任意の材料が含まれる。既存の基板の非限定的な例としては、シリコンおよびガラスが挙げられる。代替の実施形態では、非既存基板が、３Ｄ  ＭＥＡの製造で使用される。非既存基板には、ＭＥＡの製造に使用するのに適切であることが当該技術分野で既知の任意の基板であって、従来はそのように使用されていなかった基板が含まれる。例示的な非既存基板としては、パリレン、ＳＵ−８、各種金属、ポリイミド、各種樹脂、各種エポキシ、他の非既存基板、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シリコンベースの３Ｄ  ＭＥＡは、インビボ用途に使用される。加えて、金属、ガラス、およびポリマープローブは、３Ｄ  ＭＥＡと共に使用され得、これには、放電機械加工（ＥＤＭ）、ポリイミドまたはカプトン微細加工、パリレンベースの技術、マイクロ電極およびマイクロ流体機能を有するＳＵ−８ベースの活性３Ｄマイクロスキャフォールド技術、ならびに金属トランスファマイクロ成形（ＭＴＭ）などの技術から製造された３Ｄ  ＭＥＡが含まれる。前述のタイプの３Ｄ  ＭＥＡの多くを製造するには、クリーンルームでの広範にわたる加工が必要となる場合があり、または複雑な製造／組み立て方法を伴う場合がある。このため、それらは高価なものとなり、広範な設備を有するエンドユーザのみが利用できる。さらに、これらの技術は、コンセプトから最終デバイスに進歩させるために相当な時間の投資を必要とする場合がある［表Ｓ１］。
【００５６】
３Ｄ  ＭＥＡ製造の費用対効果の高い「オンデマンド」加工プロセスでは、堅牢でベンチトップベースの設計からデバイスへのストラテジを利用した迅速なプロトタイピング技術の導入が、次の論理的なステップである。ほとんどの生理学的デバイスが高度なクリーンルーム環境を必要としないため、ナノバイオセンサ、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（ＢｉｏＭＥＭＳ）、およびマイクロ総合分析システム（ＭｉｃｒｏＴＡＳ）用途のための微細製造技術は、リソグラフィ技術から非既存のベンチトップベースの製造プロセスに移行しつつある。メーカースペースは、アプリケーション開発者に脅威のない環境で様々なツールに簡単にアクセスできる一方で、様々な素材に非常に柔軟に対応するものであり、拡張性のある製造および組み立てにより迅速な設計変更を可能にする。発明者らは、最近、２Ｄマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）、マイクロニードル（ＭＮ）、マイクロ流体チャネル（ＭＦＣ）などの生理学的マイクロデバイスの実現に使用される「メーカースペース微細製造」の概念を導入している。発明者らの「メーカースペース微細製造」は、必要に応じて既存技術を利用し、３Ｄスピンキャスト絶縁およびエレクトロスピニングなどの新規のツールボックス技術を含むように拡張されている。実施形態では、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイは、少なくとも部分的に、３Ｄ印刷、レーザエッチングもしくは微細加工、導電性インクのレーザジェットもしくはインクジェット印刷、スクリーン印刷、従来のＣＮＣマイクロミリング、エレクトロメッキ、ラミネート、またはそれらの任意の組み合わせを使用して製造することができる。
【００５７】
実施形態では、「メーカースペース微細製造」は、３Ｄマイクロエンジニアリングシステムの電気生理学的評価のための３Ｄ  ＭＥＡを実現するために使用され得る。デバイスのプロセスフローは、マイクロタワーの物理構造を実現する３Ｄ印刷から開始し得る。実施形態では、３ＤマイクロタワーＭＥＡは、２５０μｍのベース直径および４００μｍの高さを有する。様々な実施形態では、３Ｄマイクロエンジニアリングシステムは、１つ以上のパッチを含み得、それぞれが３Ｄマイクロタワーの形態で１０個の記録部位を包含する。特定の実施形態は、２つのパッチを含む。１０個のマイクロタワーは、それらを、直線チャネル（神経管）に通じる環状領域（神経節）を含み得る３Ｄマイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）の幾何学形状と一致させるように配置することができる。マイクロタワーは、環状神経節および神経管の両方と重複して、記録電極／刺激電極として機能し得る。ステンシルマスク蒸着技術によって実現され得るメタライゼーション層により、メタライゼーションされたタワーおよび導電性トレースが画定され得る。生体適合性ラミネート層は、トレースを絶縁するために使用され得、それにより、背根神経節（ＤＲＧ）移植片を組み込むための３Ｄデュアルヒドロゲル構築物が画定または移植され得る３ＤマイクロタワーＭＥＡの実現が可能となる。追加の電子ビーム蒸着ＳｉＯ２層により、３Ｄ  ＭＥＡの「微細」絶縁が画定され得る。適用可能な実施形態では、３Ｄ印刷基板の上のメタライゼーションおよびＳｉＯ２蒸着は、非既存加工技術と半導体加工技術との間のコラボレーションを実証するものである。これは、「メーカースペース微細製造」の特徴的な品質である。プロセスの階層的性質はまた、絶縁層を画定するためのマイクロミリングおよびレーザ微細加工などの除去加工技術を可能にし得る。かかる積層により、あらゆるプロセスによって機能を追加し、複雑な設計を実現することが可能になる。光学イメージングおよびＳＥＭイメージングは、様々な構成プロセスを特徴付けるために実施されている。加工された電極のフルスペクトルのインピーダンス分析により、白金の無電解堆積によってその容量挙動をさらに向上させ得るマイクロ電極の性質が確認される。マイクロタワー電極および小さい３０μｍ×３０μｍの電極の両方を、ＭＥＡ材料の化学的および生理学的特性とともに、さらに実証することができる。
【００５８】
実施形態では、電極は、マイクロエンジニアリング生理学的システムを記録または刺激するのに適切な任意のサイズを含み得る。実施形態では、電極の少なくとも１つは、任意の想定される形状または形態の平面電極を含む。電極の形状は、楕円形、円形、または多角形であり得る。実施形態では、平面電極の形状は、三角形、正方形、長方形、菱形、平行四辺形、台形、五角形、六角形、七角形、八角形、九角形、十角形、円、楕円形、半円、または四分円を含む。平面電極の形状には、曲線が含まれ得る。
【００５９】
実施形態では、電極の少なくとも１つは、任意の想定される形状、形態、または幾何学形状の三次元電極を含む。実施形態では、三次元電極は、実質的に円筒形または多面体形状を含む。一部の実施形態では、三次元電極は、円筒形ピラー、テーパピラー、またはそれらの組み合わせを含む。三次元電極は、実質的にピラミッド形状であり得る。三次元電極は、実質的に円錐形を含み得る。
【００６０】
本開示は、マイクロエンジニアリング生理学的システムの生理学的測定値を得るための方法およびデバイスを開示するものであり、臨床神経伝導および神経線維密度（ＮＦＤ）試験を模倣するインビトロ神経組織のマイクロスケール器官型モデルを含む。これらの方法およびデバイスの使用から得られる結果は、臨床転帰のより良好な予測であり、後期での成功の可能性が高い有望なリード化合物を選択するためのより費用対効果の高いアプローチを可能にする。本開示は、固有に密度が高く、高度に平行した神経線維管の成長を可能にする、マイクロエンジニアリングされたシステムにおける三次元マイクロ電極アレイの製造および利用を含む。管の制限された性質のため、このインビトロモデルにより、ＣＡＰおよび細胞内パッチクランプ記録の両方を測定することができる。さらに、その後の共焦点および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、ＮＦＤを含む定量的構造分析が可能となる。これらを総合すると、インビトロモデル系は、臨床組織病理学および神経伝導試験と同様に、組織形態測定および集団電気生理学を評価する新規な能力を有する。
【００６１】
使用方法
様々な例示的な方法において、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システムに使用することができ、電気生理学的刺激および電気的に活性な細胞集団の記録に役立つ。
【００６２】
様々な実施形態において、かつ本明細書に開示されるマイクロ電極アレイの使用を通じて、本開示は、天然の解剖学的および生理学的特徴を模倣するマイクロエンジニアリング神経組織の生体測定特性を評価するための高スループットの電気生理学的刺激および記録方法を提供する。本開示のマイクロ電極アレイを使用する方法は、複合活動電位（ＣＡＰ）を臨床的に類似した測定基準として使用して、インビトロで神経生理学を評価するための新規なアプローチを提供するものであり、過去に利用可能な方法よりもヒト生理学的に感度が高く予測可能な結果が得られる。
【００６３】
本開示の一態様は、微小管、イオンチャネル、ミエリン、ミトコンドリア、および小神経線維を含むが、これらに限定されない様々な細胞標的の機能を測定するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のマイクロ電極アレイおよびインビトロモデルを使用して軸索の髄鞘形成を測定する方法を含む。ヒト求心末梢神経の構造と同様に、これらのインビトロ構築物中の背根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは、末梢に長く平行な筋循環軸索を投射する。天然組織において、様々な直径および髄鞘度の軸索は、異なる速度で感覚情報を中枢神経系に戻す。シュワン細胞は、軸索を髄鞘化し、より迅速な伝導のための絶縁を提供することによって感覚リレーをサポートする。同様に、このインビトロ構築物によって誘発される三次元成長は、最大１０ｍｍの距離にわたる密度の高い平行配向の様々な直径の軸索を含む。シュワン細胞の存在および被覆は、共焦点およびＴＥＭイメージングにおいて観察することができる。
【００６４】
ニューロンの形態は、表現型の成熟度の有用な指標であるが、健常なニューロンのより決定的な徴候は、それらの活動電位を伝導する能力である。アポトーシスだけでは、ニューロンの健常の完全な尺度とはならない。細胞死が現れる前に多くの病理学的変化が生じる可能性があるためである。活動電位生成の電気生理学的研究により、観察された構造が予測機能をサポートするかどうか、かつ臨床的に関連するエンドポイントを測定する能力がより予測的な結果を生成するかどうかを判定することができる。同様に、イメージングから収集された情報により、髄鞘形成の程度の定量的測定基準が決定され得る。一方で、ＣＡＰ測定は、ミエリンの全体的な健常性を実証し、様々な薬剤または目的の化合物の毒性および神経保護機序をさらに深く理解するのに役立ち得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つの薬剤」は、小化学化合物を指し得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの環境汚染物質または工業汚染物質／化合物を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、化学療法剤、鎮痛剤、心血管調節剤、コレステロール、神経保護剤、神経調節剤、免疫調節剤、抗炎症薬、および抗微生物薬物から選択される小化学化合物の１つまたは組み合わせを含む。
【００６６】
少なくとも１つの薬剤は、化学療法剤の１つまたは組み合わせを含み得る。例示的な化学療法剤としては、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カペシタビン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピリピシン、エポチロン、エロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニトロスーレ、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ロミデプシン、タフルオシド、テモゾロミド（オルダカルバジン）、テニポシド、チオグアニン（旧チオグアニン）、トポテカン、トレチノイン、バルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチンビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビスモデギブ、およびボリノスタットのうちのいずれか１つ以上が挙げられる。
【００６７】
実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、鎮痛剤の１つまたは組み合わせを含む。例示的な鎮痛剤としては、パラセトアモール、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤、オピオイド、フルピルチン、三環式抗うつ剤、カルバマキセピン、ガバペンチン、およびプレガバリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、心血管調節剤の１つまたは組み合わせを含む。心血管調節剤としては、ネピカスタット、コレステロール、ナイアシン、スキュテラリア、プレニルアミン、デヒドロエピアンドロステロン、モナテピル、エスケタミン、ニグルジピン、アセナピン、アトモキセチン、フルナリジン、ミルナシプラン、メキシレチン、アンフェタミン、チオペンタルナトリウム、フラボノイド、ブレチリウム、オキサゼパム、およびホノキオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、神経保護剤および／または神経調節剤の１つまたは組み合わせを含む。例示的な神経保護剤および／または神経調節剤としては、トリプタミン、ガラニン受容体２、フェニルアラニン、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、アデノシン、キプトルフィン、サブスタンスＰ、３−メトキシチラミン、カテコールアミン、ドーパミン、ＧＡＢＡ、カルシウム、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびセロトニンが挙げられる。
【００７０】
少なくとも１つの薬剤は、免疫調節剤の１つまたは組み合わせを含み得る。例示的な免疫調節剤としては、クレノリジマブ、エノチクマブ、リゲリズマブ、シンツズマブ、バテリズマブ、パルサツズマブ、イムガツズマブ、トレガリザウムブ、パテクリズマブ、ナムルマブ、ペラキズマブ、ファラリモマブ、パトリツマブ、アチヌマブ、ウブリツキシマブ、フツキシマブ、およびデュリゴツマブが挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、抗炎症剤の１つまたは組み合わせを含む。例示的な抗炎症剤としては、イブプロフェン、アスピリン、ケトプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、エトドラク、フェノプロフェン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ケトロラック、ピロキシカム、インドメタシン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ケトプロフェン、ファモチジン、メクロフェナメート、トルメチン、およびサラレートが挙げられる。
【００７２】
特定の実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、抗微生物薬の１つまたは組み合わせを含む。抗微生物薬としては、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、熱、放射線、およびオゾンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
少なくとも１つの薬剤は、生理学的薬剤または「生理学的製剤」を含み得る。生理学的製剤は、生体から産生されるか、または生体内に見出される成分を含有する任意の薬剤または治療薬を指し得る。実施形態では、「少なくとも１つの薬剤」は、免疫コンジュゲート、低分子薬物コンジュゲート、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸療法、ウイルスベクター、低分子干渉ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、免疫複合体は、少なくとも１つのエフェクター分子または少なくとも１つの化学化合物にコンジュゲートされた抗体を指し得る。実施形態では、かかるコンジュゲーションは、診断剤または治療剤として使用するための抗体分子の有効性を増加させるように機能し得る。抗体と化学化合物とのカップリングは、抗体またはそれにコンジュゲートされた化学化合物のそれぞれの活性に影響を与えることなく、２つの分子を一緒に結合する任意の機序または化学反応によって実現され得る。好適な結合機序としては、共有結合、親和性結合、インターカレーション、座標結合、複合体化、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞毒性活性を有する分子を含む。抗体に結合し得るエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７５】
ベクターは、標的部分（例えば、細胞表面受容体へのリガンド）、および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）を有する国際公開第ＷＯ９３／６４７０１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの化学コンジュゲート、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）、および核酸結合部分（例えば、プロタミン）、プラスミド、ファージなどを含有する融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０号（国際公開第ＷＯ９５／２２６１８号；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような融合タンパク質を含み得る。ベクターは、染色体、非染色体、または合成であり得る。
【００７６】
ベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートが挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。ベクターには、オルトポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクターが含まれ得る。
【００７７】
ポックスウイルスベクターにより、遺伝子が細胞質に導入され得る。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現のみをもたらし得る。アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターにより、核酸を神経細胞に導入することができる。アデノウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（約４ヶ月）よりも短期の発現（約２ヶ月）をもたらし得、これは、ＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および治療される状態に依存する。導入は、標準的な技法、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によって行うことができる。遺伝子移入のモードの例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰ０４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。ベクターを用いて、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とすることができる。
【００７８】
本開示の別の態様は、三次元培養プラットフォームにおける生体模倣神経組織の細胞内および細胞外記録の両方を測定する方法を含む。過去、電気生理学的実験は、分離表面メッキ培養または器官型スライス調製のいずれかで行われており、各方法に固有の制限があった。分離細胞培養における調査は、典型的には、本明細書に開示されるマイクロエンジニアリング生理学的システムのような器官型調製物に見られるように、組織化された多細胞神経学的アーキテクチャの欠如に起因して、単一細胞の記録に限定される。器官型調製物は、無傷の神経回路を有しており、細胞内および細胞外の両方の研究を可能にする。しかしながら、急性脳スライスは、個々の因子を制御する手段のない複雑な同時変数の配列を提示するため、スループットの可能性が本質的に制限される。
【００７９】
本開示は、集団レベルの電気生理学的行動の検査を可能にする生体模倣三次元神経培養物を提供する。本明細書に開示されるシステムおよび方法は、三次元幾何学形状における制限された神経突起の成長から生じる細胞外フィールド記録における全細胞パッチクランプ技術および同期集団レベルの事象をサポートするものである。
【００８０】
本明細書に開示される方法およびデバイスを使用して、フィールド記録を使用して、全ての動員線維におけるシグナル伝導によって引き起こされる電位の組み合わせた細胞外変化を測定することができる。電気刺激によって引き出される集団応答は、ＣＡＰである。電気的に誘発された母集団スパイクは、本質的に等級付けされ、遅い線維および速い線維における活動電位の組み合わせ効果を含む。スパイクは、迅速な発症と短い持続時間を有する単一の凝集イベントであり、ＣＡＰまたは応答の特徴は、シナプス入力がない場合に迅速なシグナル伝導を伴う単一の活動電位で構成されている。本開示によって開示される三次元神経構築物はまた、神経突起部またはチャネルに沿ってより遠い距離から刺激されるＣＡＰをサポートし、求心性末梢神経のように遠い刺激からのシグナルを迅速に運ぶ神経培養物の能力を実証するものである。本開示の三次元神経培養物は、伝導特性の測定に有用な近位および遠位刺激技術をサポートする。様々な実施形態では、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイは、マイクロエンジニアリング生理学的システムの刺激、ＣＡＰの記録、またはその両方のために使用される。
【００８１】
本明細書に開示されるシステムおよび方法は、神経線維管で典型的であるように、多数の線維型の動員を誘発する１つ以上の成長因子と共に使用され得る。特に、神経成長因子（ＮＧＦ）は、本明細書に提示されるデータに示されるように、痛みシグナル伝達にしばしば関連する小径線維を優先的に動員する。脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経栄養因子３（ＮＴ−３）は、より大きな直径の自己受容性線維の成長を優先的にサポートすることが示されている。生体活性分子および薬理学的薬剤のような成長影響因子は、電気生理学的調査と共に組み込まれ、機械的研究のための系統的な条件の操作を可能にし得る。追加の好適な因子としては、フォースコリン、ＴＧＦＢ−１、ＧＤＮＦ、グルタマックス、Ｎ２、Ｂ２７、ＦＢＳ、ロック阻害剤、アスコルビン酸、ＢＳＡ、およびｃＡＭＰが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
様々な例示的な方法において、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイは、様々な神経障害の根底にある機序を研究するために、マイクロエンジニアリング生理学的システムと共に使用され得る。例として、神経培養物に対する既知の髄鞘形成不全剤、神経障害を誘発する培養条件、および毒性神経障害を誘発する化合物の効果を調査することによって、ミエリン障害性疾患および末梢神経障害を研究する方法が本明細書に開示される。本開示により、伝導速度が、毒性および治療条件下でミエリンおよび神経線維の完全性の機能的尺度として使用され、薬物の安全性および有効性に関する研究を容易にし得る。本明細書に開示される技術を使用して産生された神経培養物中に遺伝子変異および薬物を組み込むことにより、制御された方法で疾患現象の再現を可能にし得、神経変性および可能な治療療法のより良好な理解につながる。
【００８３】
マイクロ電極アレイは、毒性、疾患、または任意の細胞集団内の任意の薬剤の病態生理学的機序を研究するため、または細胞の任意の態様もしくは成分に対する毒性、疾患、または任意の薬剤の効果を研究するために使用され得る。例として、本明細書に開示される様々な実施形態を適用して、細胞、細胞膜、または細胞膜の成分の任意の内容物を研究することができる。実施形態は、細胞器官、細胞下器官、細胞質、細胞膜内の構造、またはそれらの組み合わせに適用することができる。特定の実施形態を適用して、微小管、染色体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、リボソーム、ゴルジ装置、リソソーム、細網、液胞、前述のいずれかの断片、または細胞の他の内容物もしくは断片的内容物を調査することができる。細胞膜内の構造は、任意の膜タンパク質、膜チャネル、膜受容体、またはそれらの組み合わせを含み得る。実施形態は、環境との細胞相互作用の研究に適用することができる。
【００８４】
本発明の別の態様は、化学薬剤および生体薬剤の薬理学的および／または毒性特性のスクリーニングのための神経機能の高スループットのアッセイに対する培地を含む。実施形態では、薬剤は、細胞、例えば、本明細書に開示される任意の種類の細胞、または抗体、例えば、臨床疾患を治療するために使用される抗体である。実施形態では、毒性、効果、または神経調節が、提案される哺乳類治療である新規の薬剤とヒト疾患からの既存の治療との間で比較され得るように、薬剤は、ヒト疾患を治療するために使用される任意の薬物または薬剤である。一部の実施形態では、ヒト疾患の治療のための新規の薬剤は、神経変性疾患の治療であり、神経変性疾患の既存の治療と比較される。非限定的な例として、多発性硬化症の場合、新規の薬剤（修飾細胞、抗体、または小化学化合物）の効果を比較し、コパキソン、レビフ、他のインターフェロン療法、タイサブリ、フマル酸ジメチル、フィンゴリモド、テリフルオノマイド、ミトキサントロン、プレドニゾン、チザニジン、バクロフェン、またはそれらの組み合わせなどの既存の多発性硬化症の治療の同じ効果と対比することができる。
【００８５】
一態様では、本発明は、ミエリンを損なう疾患および末梢神経障害の根底にある機序を複製、操作、改変、および評価する方法を提供する。
【００８６】
別の態様では、本開示は、化学薬剤および生体薬剤の薬理活性および／または毒性活性のスクリーニングのためのヒト神経細胞における神経調節の高スループットのアッセイに対する培地を含む。
【００８７】
様々な態様において、現在開示されているマイクロ電極アレイは、ヒト神経細胞集団の記録を可能にするために、光学的および電気化学的刺激と組み合わせて、２Ｄおよび３Ｄマイクロエンジニアリングされたニューラルバンドルなどのユニークなマイクロエンジニアリング生理学的システムと組み合わせて用いられる。
【００８８】
末梢神経回路、中枢神経回路、またはそれらの組み合わせを特異的に模倣する生体模倣、マイクロエンジニアリング生理学的システムにおける誘発されたシナプス後電位を定量化する方法も本明細書に提供される。実施形態では、マイクロ電極アレイは、複合活動電位およびシナプス後電位の伝導などの集団レベルの生理学を研究するために使用される。特定の実施形態では、本明細書に開示される様々なマイクロ電極アレイのいずれかは、別々のマイクロエンジニアリング生理学的システム間の相互作用を研究するために使用され得る。例として、マイクロ電極アレイは、少なくとも２つの独立したオルガノイドシステム間、少なくとも２つの独立した生体機能チップシステム間、少なくとも１つのオルガノイドシステムと少なくとも１つの生体機能チップシステムとの間、またはそれらの組み合わせの相互作用を検出することができる。
【００８９】
別の態様では、照明および蛍光イメージングの光学的方法、ハードウェアおよびソフトウェア制御は、神経回路内で誘発された電位に対する多単位生理学的応答の非侵襲的刺激および記録を可能にするために、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイと関連して使用される。
【００９０】
追加の方法としては、選択的５−ＨＴ再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および第２世代抗精神病薬を試験する際にマイクロ電極アレイを使用して、それらが発達成熟を変化させるかどうかを調べる研究が挙げられる。
【００９１】
別の様々な例示的な実施形態では、本明細書に開示されるマイクロ電極アレイは、毒性および治療条件下での神経組織状態の機能的尺度として伝導速度を推定するために使用される。髄鞘形成の程度、ミエリンの健常状態、軸索輸送、ｍＲＮＡ転写、神経細胞損傷、またはそれらの組み合わせに関する情報は、電気生理学的分析から決定することができる。神経密度、髄鞘形成率、および神経線維型などの形態測定分析と組み合わせて、目的の化合物について作用機序を決定することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されているデバイス、方法、およびシステムは、制御された様式で疾患現象を再現するための遺伝子変異および薬物を組み込むことができ、神経障害および可能な治療療法のより良い理解をもたらす。
【実施例】
【００９２】
本発明のより完全な理解を容易にするために、以下に実施例を提供する。以下の実施例は、本発明を作製し、実施する例示的なモードを示している。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例で開示される特定の実施形態に限定されず、これらの実施例は、同様の結果を得るために代替の方法を利用できるので、例示のみを目的とする。
【００９３】
実施例１
背景：人間の環境に侵入する可能性のある工業汚染物質およびその他の毒素は、人間に神経毒性を引き起こすことがよく知られている。末梢神経障害は、化学毒性に対する神経系の最も一般的な応答の１つである［１］。これは、末梢神経軸索が、血液脳関門の外側にある細胞体から長い距離を延在するためであり得る。様々な毒素は、細胞体の細胞毒性、脱髄、または遠位軸索変性を生じ得る。人間では、手足の感覚喪失の症状が、通常、顕著な運動衰弱の前に起こる［１］。これらの病理現象を要約する実験モデルは、化学物質の毒性のスクリーニング、毒性機序の特定、および治療的対策の評価に最も有用である。
【００９４】
２００８年のＴｏｘ２１プログラムの開始以来、比較的短い期間で何千もの化合物をスクリーニングするために、様々なインビトロ定量的高スループットスクリーニング（ｑＨＴＳ）アッセイが開発された［２，３］。動物試験は、化学曝露後により具体的な解剖学的パラメータおよび生理学的パラメータを提供するが、このような実験を行うためのコストと時間は、何千もの化合物のスクリーニングに使用することができない［４，５］。一方、ｑＨＴＳアッセイは、本質的に迅速で安価であるが、典型的には、一度に１つまたは２つの生理学的出力のみを提供し［３］、インビボ測定基準に密接に関連するパラメータを提供するものではない。この不整合は、神経系に特に当てはまり、神経伝導速度および組織学的分析などの臨床的に関連する指標がゴールドスタンダードと見なされている［６］［７］。定量的ＨＴＳアッセイ［８］および２Ｄ多電極アレイ（ＭＥＡ）の開発［９］は、このギャップをわずかに埋めるものであるが、それでもインビボ系と同等の測定基準を提供することができない。
【００９５】
生体模倣システム（ＭＰＳ）または「オルガノイドチップ（ｏｒｇａｎｏｉｄ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」モデル（ＯＣＭ）は、それらが生物の生理学または病理学を予測する情報を提供することを条件として、毒素スクリーニングに有用な中スループットおよび高含有量データを提供し得る高度な細胞モデルとして非常に有望である。ＮＩＨ組織チッププログラム（ｎｃａｔｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｉｓｓｕｅｃｈｉｐ）は、薬物安全性および有効性試験のためのＭＰＳの開発ペースを向上させている。しかしながら、未試験の化学毒素の大部分について臨床データが欠如しているため、このプログラムの主な焦点は検証が困難なヒト組織チップのみの開発にある。したがって、動物細胞を利用する３Ｄ器官型細胞モデルを開発することが、動物データとの直接比較によるこれらのシステムの検証のために重要である。これは、ヒト組織チップが臨床薬物の安全性および有効性を予測すると仮定する前に実施されるべきである。
【００９６】
複数の受託研究組織が、様々な器官システムのためのかかるアッセイを提供して、商業的成功を収めている。しかしながら、末梢神経チップ（登録商標）アッセイの開発は遅れている。一般的に使用される末梢神経培養調製は、典型的には、臨床毒性を予測するものではない。これは、成人末梢ニューロンは完全に成長し、アポトーシスに抵抗することが知られているのに対し、測定可能なエンドポイントとしてアポトーシスまたは神経突起伸長を利用するためである。神経伝導試験および組織生検の組織形態測定は、神経障害の最も臨床的に関連する尺度である。しかしながら、かかる測定基準を提供する培養モデルは現在存在しない。神経毒性を評価するために、３Ｄ神経構築物［１０］、脳オルガノイド［１１］、またはニューロスフェア［１２］などの様々な脳ＭＰＳシステムが長年にわたって準備されてきたが、それらのいずれも神経系、特に末梢神経系の生体模倣学的複雑性を再現していなかった。ＭＰＳは、単純なモデルで最も関連性の高い解剖学的および生理学的毒性病理を要約しようとするモデルであり、システムアーキテクチャにより強い焦点を当てる必要がある［１３，１４］。
【００９７】
エクスビボ動物毒性スクリーニングとインビボ動物毒性スクリーニングとの間のギャップを埋めることが期待される、複合活動電位を検出し得る３Ｄアッセイ
発明者らは、末梢神経解剖学的構造に類似した３Ｄ配置で軸索成長を制限するために、マイクロパターンヒドロゲル構築物中で背根神経節を培養することによって、感覚神経チップ（ｓｅｎｓｏｒｙ−ｎｅｒｖｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）（登録商標）モデルを開発した。さらに、複合活動電位（ＣＡＰ）から生じる電気的に誘発される集団電界電位により、これらのモデル系において再現可能に記録することができる。これらの初期の結果は、動物（および臨床）試験のものと類似した形態学的および生理学的測定に適したマイクロエンジニアリング神経組織を使用する可能性を示している。単一のインビトロ調製から、ＣＡＰ振幅および伝導速度を測定し、その後、組織を切断して、軸索直径、軸索密度、および髄鞘形成等の組織形態パラメータを測定することができる。この３Ｄ器官型システムは、臨床神経病理学を模倣する方法で神経毒性パラメータを検出することができると想定される。この汎用性の高いシステムは、「オーミクス」研究を実行するためにさらに使用することができるため、最終的には、作用機序の理解ならびに生理学的プロセスの理解の向上をもたらす大きなスペクトルの毒性パラメータを決定するために使用される。
【００９８】
発明者らは、従来の細胞培養材料に直接１つ以上のヒドロゲルを迅速にマイクロパターン化するための、単純でありながらユニークなデジタル投影リソグラフィの方法を開発した［１５］。発明者らの単純かつ迅速なアプローチでは、制限型としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および許容マトリックスとして架橋メタクリル化ゼラチン（Ｍｅ−Ｇｅｌ）の２つのゲルを使用する。これらの二重ゲルは、特定の３Ｄ幾何学形状内の胚性背根神経節（ＤＲＧ）移植片からの神経突起成長を制限し、高密度で、かつ線維束性収縮を伴う軸索成長をもたらす（図１ＣおよびＤ）。ミエリン誘導培地で培養した場合、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対してミエリン染色が陽性であり（図１Ｄ）、その特徴的なスパイラル構造がＴＥＭ画像から明らかであることが示される（図１Ｅ）。高度に平行な生体模倣３Ｄ神経線維管を有するこの独自の培養モデルは、末梢神経アーキテクチャに対応し、神経形態測定を使用して評価され得、既存の細胞アッセイでは利用できない臨床的類似評価を可能にする。発明者らの神経チップ（登録商標）モデルに最もユニークなのは、複合活動電位（ＣＡＰ）を記録する能力である。トレースは、高周波（１００Ｈｚ）の刺激でも一貫性を保ち、テトロドトキシンによって可逆的に廃止され得る特徴的な一様な短時間集団応答を示しており、その応答は神経伝達遮断薬に感受性がなく、シナプス電位ではなくＣＡＰを示す［１６］。
【００９９】
このモデル系で化合物の神経学的効果がどのように評価され得るかの一例として、インビトロでの髄鞘形成不全を引き起こすことが示されている４０μＭのフォースコリン（Ｆｓｋ）を４８時間投与した［１７］。発明者らのモデル系において、組織学的に髄鞘形成不全の強力な証拠が示され（図１Ｆ）、髄鞘形成軸索率の７０％の低下を示し、かつミエリン鞘の薄化を示すＧ比が５０％増加した（データ図示せず）。電気生理学試験では、ＣＡＰ振幅および伝導速度の両方の約５０％の減少を示した（図１Ｇ）。共投与デキサメタゾン（ＤｅｘＭ）は、これらの効果を部分的に回復させた（図１Ｈ）。これらの形態学的および生理学的測定は、末梢神経病理学の動物モデルで利用可能な最も強力な測定基準に類似している［１８］。
【０１００】
胚性ＤＲＧ培養物は、数十年にわたって末梢神経生理学のモデルとして効果的に使用されてきた［１９］。従来のＤＲＧ培養物は、モデル系として有用であるものの、既存の細胞死アッセイで評価した場合、臨床毒性の予測が不十分であることが知られている。ＤＲＧから単一細胞の記録を取得する可能性があるが、組織アーキテクチャが欠如しているため、ＣＡＰの記録に関する報告はない。従来のモデル系とは異なり、本開示のシステムは、臨床組織病理学および神経伝導試験と同様に、組織形態測定および集団電気生理学を評価する能力を含む。
【０１０１】
理論に束縛されることなく、ラットにおいて神経毒性を引き起こすことで知られている化学毒素は、これが臨床測定基準に類似した形態学的および生理学的尺度を使用して定量化されているように、マイクロエンジニアリング神経組織において毒性を誘発する。この目的にアプローチするために、モデル系の電気生理学的特性を試験するための３Ｄマイクロ電極を設計することによって、まずシステムのスループットを向上させる。次に、ベースライン変動性を決定し、３Ｄマイクロ電極を使用して構造と機能関係を特徴付ける。次いで、化学毒素の急性適用によって誘発される変化を定量化し、神経毒性の前臨床アッセイとして複合活動電位（ＣＡＰ）波形を使用する技術的メリットを実証する。
【０１０２】
３Ｄマイクロエンジニアリングされたラット末梢神経組織における進行性神経変性の定量化のためのカスタム３Ｄマイクロ電極アレイの開発
サブタスク１．１−末梢神経チップ（登録商標）用に構成された３Ｄマイクロ電極を開発し、試験する。
三次元マイクロ電極アレイ（３Ｄ  ＭＥＡ）は、様々な細胞培養物、バイオ材料、および他の生理学的薬剤をエクスビボで調べるための次世代のツールを表す。これらのツールは、動物試験を減らすための必要な複雑性を与え、標的化された神経チップ（登録商標）を含む様々な用途のための細胞ベースのバイオセンサの有効性を改善する。典型的には、３Ｄ  ＭＥＡは、平面内で加工され、平面外［２０、２１］で組み立てられるか、またはガラスもしくはシリコンウェハから一元的に画定される［２２〜２４］。アセンブリは、典型的には、チップオンボード技術を使用して実施される。しかしながら、これらのアレイの費用対効果の高い製造を実施し、かつシステムレベルで組み立てを行うには、大きな課題があり、新たなイノベーションの可能性がある。３Ｄ用途では、金属「バルブ」［２５］およびカーボンナノチューブ［２６］またはナノピラー［２７］が組織の３Ｄ体積で潜在的に記録されることが実証されているが、高ＳＮＲ記録の繰り返し可能な実証が依然として課題となっている。発明者らは、少なくとも２つのイノベーション、すなわち（１）マイクロ技術を利用して加工されたマイクロ電極の制御可能な３Ｄ位置を有する３Ｄ  ＭＥＡのオールポリマー、パッケージ、およびデバイス共加工である「メーカースペース」、ならびに（２）体積刺激で使用し得る、ＭＥＡ上で任意に定義された３Ｄ電極のための３Ｄナノテクスチャ体積材料を開発する。
【０１０３】
方法：図２は、３Ｄ  ＭＥＡのために開発された微細製造プロセスフローの概略図を示す。チップは、チッププラットフォーム上の５ｍｍ×５００／８００μｍの面積で１６個のマイクロニードルタイプの電極（３００〜１０００μｍの様々な高さの３Ｄ）と１６個の平面電極を収容することができる。チップの全体的なサイズは、４９ｍｍ２×１ｍｍとなり、市販のマルチチャネルシステムズの記録増幅器とのインターフェースに対応している。かかるデバイスの構造的特徴を一工程で開発するために、３Ｄ印刷を利用する。発明者らは、最近、バイオメディカルデバイスの開発に３Ｄ印刷技術を利用することで大きな進歩を遂げている［２８］。この技術は、設計から最終デバイスへの迅速な移行、マイクロ流体ポートなどの複雑な構造を定義する能力、および異なる寸法を有する様々なアレイの開発など、全てを単一のプロセスステップで行う利点を表している。デバイスおよびパッケージの共同設計および共同製造、ならびに最後に、様々な生体適合性樹脂材料の選択は、印刷プロセスにおいて利用され得る。シャドウ／ステンシルマスクは、ＣＮＣマイクロミリング（Ｔ−Ｔｅｃｈ  ＱＣ  Ｊ−５）および／またはレーザ微細加工を使用して、適切な金属またはポリマー（例えば、ステンレス鋼またはカプトン）から製造される。ＣＮＣマイクロフライスは、ナノフライス盤で約７μｍまでのパターンを画定するために使用され得る。あるいは、これらのステンシルマスクは、マルチモーダル（それぞれ波長１０６４ｎｍ、３５５ｎｍ、および５３２ｎｍを有する）であるレーザ微細加工ツール（ＥｚＬａｚｅ３）で製造され得、約１μｍまでのポリマー、金属、および樹脂などの様々な材料上でシャドウマスクのためのパターンを画定するために使用され得る。その後、チタン／金の層でメタライゼーションして、電極、高密度金属トラック、パッケージボンドパッド上の金属を画定する。シャドウマスクと３Ｄ印刷樹脂の熱特性と機械特性を一致させることは、アライメント機能の重要な必要性と同様に、シャドウマスクのメタライゼーションにとって非常に重要である。相互接続性のために３Ｄ印刷によって画定されるビア内の導電性インクのスクリーン印刷（ＡＳＹＳ  ＸＭマニュアルプリンタ）に続く、例えば、３Ｄ印刷樹脂上での上側および下側のメタライゼーションなどの多層加工を、３Ｄおよび２Ｄ電極の密度を増加させるためにさらに利用することができる。
【０１０４】
インクは、オーブンで硬化され、最終的な特性が実現される。かかる目的のために、複数の生体適合性インクが利用可能であり、これらは、抵抗性、表面多孔性、および製造の容易さのために意図される用途に合わせて調整される。ＳＥＭおよびＡＦＭなどのツールを使用して、プロセス開発中にこれらの特性を確認する。プロセス開発へのかかるフィードバックは、金属トレースおよび導電性ビアの所望の特性を実現するために重要である。画定された導電性インクおよび金属電極上に最終絶縁体を堆積し、電極を作製するために、平面および第３の寸法で記録部位を画定する必要がある。パリレンは生体適合性があり、室温でコンフォーマルコーティングが可能で、レーザ微細加工が可能であるため、理想的な絶縁層である［２９］。パリレンは、アレイ上に堆積され（ＳＣＳラボコーター）、ＵＶモードでレーザ微細加工を使用して任意の３Ｄ位置に記録部位が画定される。
【０１０５】
発明者らはすでに、神経チップ（登録商標）組織アーキテクチャおよび既製のＭＥＡ記録装置の両方に適合する構成の試験デバイスを製造している（図２）。試験およびフィードバックのために試料が提供された。マイクロ電極ノイズは、電極が２Ｄおよび３Ｄ神経培養物から微小な電流または電圧信号を拾うか、または送達する能力を決定する特性である。加えて、体積刺激装置として定義される３Ｄナノ材料は、全ての三次元で神経チップ（登録商標）内の組織の刺激を実行し、興味深い応答を生み出し得る。発明者らは、電極部位にナノ多孔質白金または電気メッキ／ナノテクスチャ金などの低インピーダンスおよび生体適合性ナノ材料の開発に豊富な経験を有している［２９，３０］。最適化された金電気メッキおよびナノテクスチャ（ＥｚＬａｚｅ３）レシピは、電極の２Ｄ表面調節と、オーバーメッキ技術を使用した３Ｄ体積刺激装置の画定の両方のために開発される。これらの方法は、ＳＥＭ、ＡＦＭを使用して直接評価され、マルチチャネルシステムズ増幅器を使用してノイズの測定と間接的に評価される。かかる技術は、直径が３０〜５０μｍ以下の低ノイズ電極を実現するように適合され得る。
【０１０６】
３Ｄ  ＭＥＡは、電子的、電気化学的、および電気生理学的性能について評価される。３Ｄマイクロ電極の電子的特性評価と２Ｄマイクロ電極を比較するために、デバイスのフルスペクトルインピーダンス性能は、主要なアプリケーション関連電極特性を確立し、さらに、マイクロ／ナノ加工へのフィードバックを提供する。生理食塩水および基準白金線電極を用いて、ＭＥＡのインピーダンス特性を試験する。ＢＯＤＥインピーダンスアナライザーを使用して１Ｈｚから１０ＭＨｚまでのフルスペクトルインピーダンス測定を実行し、この手法を使用して２Ｄ電極と３Ｄ電極を比較し、製造プロセスの歩留まりを推定する。さらに、発明者らの電極ナノ材料からのインピーダンスデータは、文献と比較され得、電極形状は、神経チップ（登録商標）用途に合わせて調整される。２つのタイプの電極の電気化学的特性のために、個々のマイクロ電極材料の電荷担持容量を定量化する循環ボルタモグラム（ＣＶ）は、ｅＤＡＱポテンショスタットを使用して測定され、文献からの市販の薄膜金電極からのボルタモグラムと比較される。これらの測定基準は、長期にわたる使用のための電極の信頼性を可能にし、電極ナノ材料の刺激能力および寿命測定を保証する。
【０１０７】
サブタスク１．２：二重ヒドロゲル構築物および胚性ラットＤＲＧ組織を使用した３Ｄ  ＭＥＡの生理学的性能を特徴付ける。
理論に束縛されることなく、３Ｄ電極設計は、神経チップ（登録商標）の独自の組織アーキテクチャに対処するものであり、ＮＣＶ試験のための比較的大きな組織体積のサンプリングを可能にする。これは、症状が完全に現れる前でも、ヒトにおいて臨床神経病理の種類および重症度を予測することが示されている［３１］。３Ｄ  ＭＥＡの上で組織を成長させることにより、電気生理学的試験を自動化することで、チップ上の神経のスループットを増加させ、同じ構築物から数週間にわたって神経変性を長期的に測定することができる。これは現在、従来の電界電極では実用的ではないものである。
【０１０８】
方法：生理学的な特徴付けのために、３Ｄ  ＭＥＡデバイスは、ヒドロゲル組織構築物および電気生理学的評価と共に組み込まれる。先駆的な投影リソグラフィ法により、多数の表面にハイドロゲル基板をパターン化することが可能となった［１５，１６］。髄鞘形成および非髄鞘形成神経組織構築物は、発明者らが発表した研究の改良物を使用して製造される［１５，１６］。二重ヒドロゲル構築物は、ラミニンで補充されたメタクリル化ゼラチン（Ｍｅ−Ｇｅｌ）で充填されたＰＥＧゲルマイクロモールドから製造される。神経突起成長構築物は、幅約４００μｍ、長さ最大１０ｍｍになるように製造される（図１ＡおよびＢ）。背根神経節（ＤＲＧ）は、胚の１５日目（Ｅ１５）ラット胚から解剖された脊髄の胸部レベルから採取され、二重ヒドロゲル構築物の球状領域内に組み込まれる。髄鞘形成された組織構築物を、ＩＴＳサプリメントおよび０．２％ＢＳＡと共に基礎イーグル培地で１０日間培養し、シュワン細胞の遊走および神経突起成長を促進し、続いて、１５％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸をさらに補充した同じ培地で最大４週間培養して髄鞘形成を誘発する［３２］。非髄鞘形成構築物は、同じ培地レジメンで培養することによって形成されるが、アスコルビン酸を欠く。コンパクトミエリンの実質的な形成には、アスコルビン酸を含むミエリン誘導培地中での少なくとも２週間の培養が必要とされる。
【０１０９】
ＭＥＡを市販の記録装置に挿入し、軸索成長領域に沿った７つの異なる場所で組織を刺激し、神経節領域に対応する３つの記録場所から同時に記録する（図３）。振幅が５０μＶ以上に達した場合、複合活動電位（ＣＡＰ）は測定可能と見なされる。様々な成熟段階での組織形態を評価するために、髄鞘形成および非髄鞘形成組織構築物のそれぞれの約１２個を、髄鞘形成誘導培地で１、２、３、および４週間（またはインビトロ、ＤＩＶで合計１７、２４、３１、および３８日）４％パラホルムアルデヒドに固定し、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、神経突起（βＩＩＩ−チューブリン）、シュワン細胞（Ｓ−１００）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびアポトーシス（アネキシン−ＶおよびＴＵＮＥＬ）について染色する。試料は、ＤＲＧ内の領域、神経節の近位、線維管の中間点付近、および神経節の遠位の線維管で共焦点顕微鏡で撮像され、正確な距離は平均最大神経突起に比例する。
【０１１０】
（表１）形態学的および生理学的測定基準
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【０１１１】
想定される代替案。神経チップ（登録商標）プラットフォームにおける３Ｄ  ＭＥＡの開発は、決して簡単な問題ではない。最近の３Ｄ印刷技術の驚異的な進歩にもかかわらず、発明者らの３Ｄプリンタの解像度は約１００μｍで、単層硬化は２５μｍである。３Ｄおよび２Ｄマイクロ電極の密度を高めるために、または神経チップ（登録商標）デバイスの５ｍｍ×５００／８００μｍエリアの一次製造プロセスで問題が発生した場合に、金属トランスファマイクロ成形とレーザ微細加工技術［２９、３０］の十分に特徴付けられた組み合わせを利用して、３２個の電極を備えたＭＥＡチップを加工し、密度を６４個の電極に増加させる。これらのデバイスは、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリカーボネート（ＰＣ）などのポリマー上で開発される。ＭＴＭ技術は、下請ＰＩ［３０，３３，３４］によって過去に十分に特徴付けられ、研究されてきた。別途、イノベーティブサーキッツなどの商業ベンダーからＰＣＢを設計および製造する。ＰＣＢおよびＭＥＡチップは、アクリルスペーサとフォースコンタクトを伴う自己整列スキームを利用して組み合わされる。パリレンは、レーザ微細加工を利用して、画定されたＭＥＡアセンブリおよび記録部位全体にさらに堆積することができる。
【０１１２】
期待される結果の解釈。理論に束縛されることなく、３Ｄ  ＭＥＡは、発明者らの神経チップ（登録商標）システムのスループットを増加させる。ＣＡＰ波形およびＮＣＶの長期にわたる反復モニタリングにより、これらの構築物のベースライン生理学的パラメータが実証される。理論に束縛されることを望むものではないが、神経突起が電極を通過して伸長するにつれて遠位振幅が現れ、増加し、ミエリン形態として伝導速度が増加する。
【０１１３】
３Ｄ末梢神経チップ（登録商標）におけるＮＣＶおよび組織形態測定による末梢神経毒性の定量化の実現可能性を実証する。
神経系の複雑な生理機能および独自の形態の変化を研究することは、神経毒性物質のスクリーニングに伴う重大な課題である［３５］。発達毒性および成人毒性を引き起こす神経毒性化合物の数は増加しており［３６，３７］、既存のインビボスクリーニングならびにインビトロモデルは、依然として化学曝露をスクリーニングするのに不十分である。ＡｘｏＳｉｍの３Ｄ器官型ラットモデルは、過去のベンチマークを可能にしながら、インビボおよびインビトロモデルの予測性、複雑性、スループットを橋渡しすることができる。実験対象を管理しやすくするために、実験は、過去にラットにおけるＮＣＶ変化を実証した４つの既知の化学毒素アクリルアミド［３８］、メチル水銀［３９］、ｎ−ヘキサン（代謝産物２，５ヘキサンジオンの形態）［４０］、およびロテノン［４１］に限定される（表２）。マイクロパターン培養物の準３Ｄ的性質は、従来の細胞および分子アッセイに適している。
【０１１４】
（表２）初期パイロット研究のための薬物投与量
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【０１１５】
サブタスク２．１：環境および産業用神経毒性に関連する化合物の小さなライブラリを伴うパイロット研究における投薬量および培養時間を決定する。
効果的な投薬を確実にするために、まず、パイロット研究を実施する。発明者らは、インビトロ（４８時間）でニューロン細胞死を誘発することが証明された急性（４８時間）投与量から始め、これらの濃度で発明者らのモデルにおいて形態学的および生理学的変化が測定可能であることを検証する（図４）。
【０１１６】
方法：ＤＲＧ移植片（ｎ＝２０）は、髄鞘形成誘導レジメンに従って、マイクロパターンゲル（サブタスク１．２と同様）で培養される。完全に髄鞘化された構築物を産生するために、サブタスク１．２で決定された時点で、検体は、神経突起増殖（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ）および髄鞘化（ＦｌｕｏｒｏＭｙｅｌｉｎ  Ｒｅｄ）についてチェックされる。この時点で十分な神経突起増殖および／または髄鞘化を有しない検体は除外される。健常な構築物の電気生理学的記録が行われ、翌日、表２に要約されるように、４つの化学物質の神経毒性濃度が４８時間適用される。対照は溶媒のみを受容する。電気生理学試験は、４８時間投与期間の終了時、および投与期間の残りの半分７日後に、半分（ｎ＝１０）の移植片に対して行われる。全ての試料を最終記録後に固定し、染色し、表１に要約するように評価する。３Ｄシステムで得られたＮＣＶデータは、表２に参照されるように、文献で入手可能なＮＣＶデータと比較される。さらに、クロマチン凝縮、くすみ、および軸索セグメンテーションなどの体細胞および軸索損傷について定性的観察が行われる。
【０１１７】
サブタスク２．２：パイロット研究で決定した終点で、化合物投与後のＣＡＰ伝導速度、振幅、積分、興奮度を測定し、形態測定の変化と相関させる。
理論に束縛されることなく、各化学物質の急性投与により、ベースラインに対するＣＡＰの変化を測定することによって検出可能な毒性が誘発される。機序に応じて、ＣＡＰ振幅および／またはＮＣＶの変化が期待される。その後の組織病理学的分析により、生理学との相関のための形態学的変動性の重要な定量的指標が提供される。組織病理学的分析は、より労力を要するものであるが、神経変性の機械的詳細を提供する［７］。したがって、両方の指標間の相関を理解することにより、神経障害の発現および進行を理解するために必要な時間および労力を削減することができる。理論に束縛されることなく、生理学的変化は、インビボおよび臨床病理学的に並行して記録される。
【０１１８】
方法：電気生理学的および組織学的方法は、サブタスク１．２および２．１と同一である。共焦点撮像後、試料を２％の四酸化オスミウム中に後固定し、脱水し、エポキシ樹脂中に埋め込む。各画定領域（すなわち、神経節、近位、中間点、遠位）で約１０個の超薄断面を切断し、ＴＥＭイメージングのためにクエン酸リードおよび酢酸ウラニルで染色する。分析を、図３および表１に要約されるように評価する。統計的相互相関を行い、どの形態学的尺度がどの生理学的尺度と最も相関しているかを決定する［４６］。加えて、これらの実験は、エイム（Ａｉｍ）２の適切な試料サイズを決定するために統計力分析に使用される変動性の尺度を提供し、除外基準を定義するために使用される。例えば、神経突起の成長が平均から２以上／２未満の標準偏差を有する試料が除外される。
【０１１９】
想定される代替案。４つの毒素の神経毒性は、インビトロで観察されているが、生理学的効果は、３Ｄ調製によって予想以上に影響する可能性がある。予想される形態学的および生理学的病態がパイロット研究に現れない可能性があり、また細胞死が機能的尺度を圧倒する可能性がある。その場合、投与量を増減し、かつ／または長期的な適用に切り替えてもよい（７日）。神経障害は明らかになる可能性があるが、定量的なばらつきがあるため、１０％の検出可能な差は現実的ではない。その場合、２０〜３０％の検出可能な差を検出するように、より大規模な研究を設計する。
【０１２０】
期待される結果の解釈。理論に束縛されることなく、各化学物質の急性投与は、ベースラインに対するＣＡＰの変化を測定することによって検出され得る毒性を誘発する。これらの変化のほとんどは、発明者らの形態測定分析によって定量化された形態学的損傷と相関すると予想される。
【０１２１】
マイルストーン。１）化学曝露の前後数週間、５０μＶ以上のリアルタイムで信頼性の高い検出ＣＡＰが可能な３Ｄマイクロ電極の開発。２）ＡｘｏＳｉｍの神経チップ（登録商標）プラットフォームが、４つの化学毒素によって引き起こされる電気生理学的および組織学的神経毒性を評価する実現可能性の実証。これらの研究は、過去のインビボデータと比較するためのさらなる検証研究の基礎となるものである。
【０１２２】
本実施例で引用した参考文献
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【０１２３】
実施例２
固体基板上で製造されたＭＥＡ設計
上記の活動と並行して、発明者らは、より一般的な固体基板上で製造されるカスタムＭＥＡ設計にも取り組んでいる。目的は、透過性基板が細胞の生存率だけでなく、細胞の電気生理学的応答にどの程度影響し得るかを特異的に決定することである。図５に示すように、これらのデバイスの設計を確定した。これらのデバイスは、より一般的な微細製造技術を利用しているため、加工が容易である。これらのデバイスを透過性基板ＭＥＡと並行して使用することで、過去に観察された電気生理学的転帰からの逸脱が平面マイクロ電極の使用に起因するか、または透過性基板に起因するかどうかを解析する。
【０１２４】
実施例３
末梢神経チップ（登録商標）用の３Ｄ印刷された３Ｄマイクロ電極アレイの製造および特性評価
要約：発明者らは、インビトロで３Ｄ細胞ネットワークから電気生理学的活性を刺激し記録し得る三次元（３Ｄ）マイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）を実現するための非既存の製造技術を提示する。この技術は、費用対効果の高いメーカースペース微細製造技術を使用して、３Ｄ印刷されたベース構造で３Ｄ  ＭＥＡを製造し、ステンシルマスク蒸着技術によって実行されるマイクロタワーおよび導電性トレースのメタライゼーションを行うものである。生体適合性ラミネート層により、３ＤマイクロタワーＭＥＡを実現するためのトレースが絶縁される。このプロセスを延長して、追加の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）絶縁層および無電解メッキのレーザ微細加工を使用して、３Ｄマイクロタワーの上に４００μｍの高さでより小さなマイクロ多孔質白金電極（３０μｍ×３０μｍ）を実現した。背根神経節（ＤＲＧ）細胞の電気活動を記録および刺激するための３Ｄマイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）インビトロモデルが、３Ｄ  ＭＥＡとさらに統合されている。３Ｄ  ＭＥＡは、電気、電気化学、化学、および生理学的性能測定基準について評価された。白金無電解メッキ時の１ｋＨｚの電気生理学的に適切な周波数の場合、マイクロタワー電極では１．８ｋΩから６７０Ω、３０μｍ２電極では５５ｋΩから３９ｋΩのインピーダンスの減少が観察される。さらに、キャパシタンスは、無電解メッキ後、０．３ｍＦから３．０ｍＦに増加しており、これは、性能の１０倍の増加を表す。システムの構成要素に対する生体適合性アッセイにより、構成要素に応じて、広い範囲（約３〜７０％の生細胞）が得られた。樹脂のＦＴＩＲ分析により、細胞毒性化合物の発見が得られている。ＴＰＯ（ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド）およびニトロベンゼンは、この変動の一部を説明するものである。さらにインビトロ応力試験では、２．５ｍｍを超えるチップ厚により、最大３０ＤＩＶの反りのない性能が得られたという結論に至った。最後に、本研究では、マイクロＬＥＤ  ＤＬＰ印刷による高密度３Ｄマイクロ電極への経路を検討した。製造された３Ｄ  ＭＥＡは、クリーンルームの最小限の使用で迅速に作製され、統合された「神経チップ（登録商標）」モデルで完全に機能する。当該神経チップは、インビトロでの化合物の高スループット薬学的スクリーニングおよび毒性試験のための３Ｄ器官モデルの電気的イントロゲーションをサポートする。
【０１２５】
はじめに
製薬業界では、新薬を市場に投入するために必要なコストが膨大であることは周知の事実である。平均的な新薬は、市場の承認を得るために約２６億ドルかつ最大１５年を必要とし、承認を維持するための承認後の研究開発にはさらに３億１，２００万ドルを必要とする［１］。残念ながら、従来の前臨床モデルでの医薬品開発が、臨床治療の成功につながったという実績は少ない。特に神経学的用途では、第Ｉ相臨床試験に入る神経学的薬物の９２％は、許容できない毒性またはヒトにおける有効性の欠如のいずれかのために、消費者に販売されることはないと推定されている［２］。動物モデルとインビトロモデルの両方を含む現在の前臨床モデルは、明らかに、前臨床の成功を臨床試験に変換することに関して、予測が非常に限られている。動物モデルは、関連するインビボ情報を提供し得るが、それらは労力を要するものであり（低スループット）、一方で、より高いスループットのインビトロシステムは、典型的には、二次元でランダムに成長する分離された細胞からなる基本的な神経培養物に限定され、関連するインビボ情報を提供することができない。したがって、関連するインビボ測定基準を提供し得るより高いスループットシステムが非常に望ましく、高度な生体模倣システム（ＭＰＳ）または「生体機能チップ」の開発につながる、［３，４］。
【０１２６】
電気生理学的および組織学的評価が神経障害を評価するためのゴールドスタンダード測定値である神経系について［５］、神経伝導速度および神経線維密度などの臨床的に関連する測定基準を提供し得る生体模倣インビトロシステムにより、臨床予測性を向上させることが期待される。過去、発明者らは、動物［６、もしくはＨｕｖａｌ（４６）］またはヒト細胞［７］のいずれかを使用して、新規の生体模倣インビトロ神経チップ（登録商標）（ＮＯａＣ）システムを開発しており、軸索を３Ｄ偏光構造で細胞外刺激することで、信号が一方向伝搬し、複合活動電位（ＣＡＰ）を評価することができる。これらの革新的なシステムは、インビトロ環境におけるインビボ情報を提供するが、電気生理学的試験には、マイクロマニピュレータを使用した刺激電極および記録電極の、労力を要する手動配置が含まれており、マイクロマニピュレータは、他のより高いスループットの２Ｄ多電極アレイ（ＭＥＡ）システムと比較して、試験速度が低下する。
【０１２７】
この課題を克服するために、発明者らは、ＮＯａＣシステムを３Ｄマイクロ電極と統合して刺激と記録のプロセスを自動化し、システムのスループットを向上させて、治療用化合物を大規模にスクリーニングできるようにすることを計画している。３Ｄ電極は、神経伝導速度の評価のために過去に開発された他の２Ｄ  ＭＥＡプラットフォーム［８，９］と比較して、より多くの多様な軸索線維を調査し、よりインビボ神経組織に類似した集団ベースの電気生理学的応答を実現することが期待されている。さらに、従来のＭＥＡの平面構成は、培養物が成熟して３Ｄ形態になったときに一定の高さで発生する信号を捕捉するのに不十分である［１０、１１］。チップ上の神経学的モデルでは、より厚く、かつ成熟した組織からの信号の捕捉と分析が特に重要である［１２］。本稿の目的は、より迅速な電気生理学的試験のために、ユニークな３Ｄハイドロゲル環境に統合されたマイクロ電極設計を定義することである。
【０１２８】
従来の２Ｄ  ＭＥＡ加工は、典型的には、シリコンまたはガラス基板上のリソグラフィ、メタライゼーション、およびエッチング技術を伴う［１３，１４］。非平面表面上のリソグラフィ技術は特に困難であるため、モノリシック３Ｄ  ＭＥＡ加工技術は稀少な技術である。最近、様々な３Ｄ細胞培養システムの開発に多大な努力が投資されており、その結果、インビトロＭＥＡを三次元まで拡張する必要性が高まっている［１５−２１］。３Ｄ  ＭＥＡは、中枢または末梢神経系用途のための３Ｄマイクロエンジニアリングシステムの研究のために、ネットワークダイナミクスの単純で迅速なスクリーニングおよび測定を可能にする。
【０１２９】
３Ｄ  ＭＥＡは、シリコンおよびガラスなどの既存基板、ならびにパリレン、ＳＵ−８、各種金属、ポリイミドなどの非既存基板上で製造されている［２２］。ミシガンプローブ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  ｐｒｏｂｅ）［２３〜２５］、ユタアレイ（Ｕｔａｈ  Ａｒｒａｙ）［２６〜２９］、ヨーロッパニューロプローブ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅｓ）［１３，３０〜３５］などが、インビボ用途のための３Ｄ  ＭＥＡ開発の最前線にあるシリコンベースの３Ｄ  ＭＥＡである。さらに、金属［３６］、ガラス［３７］、および３Ｄ  ＭＥＡとしてのポリマープローブも、放電機械加工（ＥＤＭ）［３８］、ポリイミドまたはカプトン［３９，４０］微細加工、パリレン［４１，４２］、マイクロ電極およびマイクロ流体機能を有するＳＵ−８［１０］ベースのアクティブ３Ｄマイクロスキャフォールド技術、ならびに金属トランスファマイクロ成形（ＭＴＭ）［１１］などの技術から製造された３Ｄ  ＭＥＡを含めて調査されている。しかしながら、前述の大部分のタイプの３Ｄ  ＭＥＡの製造には、クリーンルームでの広範な加工が必要であり、かつ／または複雑な製造／組み立て方法を伴うものであり、それらは高価で、コンセプトから最終デバイスに費やされた時間は言うまでもなく、広範な施設を有するエンドユーザのみが利用可能である［表Ｓ１］。
【０１３０】
３Ｄ  ＭＥＡ製造の費用対効果の高い「オンデマンド」加工プロセスでは、堅牢でベンチトップベースの設計からデバイスへのストラテジを利用した迅速なプロトタイピング技術の導入が、次の論理的なステップである。実際、ほとんどの生理学的デバイスが高度なクリーンルーム環境を必要としないため、ナノバイオセンサ、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（ＢｉｏＭＥＭＳ）、およびマイクロ総合分析システム（ＭｉｃｒｏＴＡＳ）用途のための微細製造技術は、リソグラフィ技術から非既存のベンチトップベースの製造プロセスに移行しつつある［４３］。メーカースペースは、アプリケーション開発者に脅威のない環境で様々なツールに簡単にアクセスできる一方で、様々な素材に非常に柔軟に対応するものであり、拡張性のある製造および組み立てにより迅速な設計変更を可能にする。発明者らは、最近、２Ｄマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）、マイクロニードル（ＭＮ）、マイクロ流体チャネル（ＭＦＣ）などの生理学的マイクロデバイスの実現に使用される「メーカースペース微細製造」［４４］の概念を導入している。発明者らの「メーカースペース微細製造」は、必要に応じて既存の技術を利用し、３Ｄスピンキャスト絶縁およびエレクトロスピニングなどの新規のツールボックス技術を含むように拡張されている［４５］。
【０１３１】
本稿では、３Ｄマイクロエンジニアリングシステムの電気生理学的評価のための３Ｄ  ＭＥＡを実現するための「メーカースペース微細製造」の最初の応用を報告する。デバイスのプロセスフローは、マイクロタワーの物理構造を実現する３Ｄ印刷から開始する。３ＤマイクロタワーＭＥＡは、ベース直径２５０μｍおよび高さ４００μｍを有する。３Ｄマイクロタワーの形態で１０個の記録部位をそれぞれ含有する２つのパッチが設計された。１０個のマイクロタワーは、それらを、直線チャネル（神経管）に通じる環状領域（神経節）を含む３Ｄマイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）［４６］の幾何学形状と一致するように配置した。マイクロタワーは、環状神経節および神経管の両方と重複して、記録／刺激電極として機能する。ステンシルマスク蒸着技術によって実現されるメタライゼーション層により、メタライゼーションされたタワーおよび導電性トレースが画定される。生体適合性ラミネート層は、トレースを絶縁するために使用され、それにより、背根神経節（ＤＲＧ）移植片を組み込むための３Ｄデュアルヒドロゲル構築物が画定された３ＤマイクロタワーＭＥＡの実現が可能となる。追加の電子ビーム蒸着ＳｉＯ２層により、３Ｄ  ＭＥＡの「微細」絶縁が画定される。３Ｄ印刷基板の上のメタライゼーションおよびＳｉＯ２蒸着は、「メーカースペース微細製造」の基盤である非既存および半導体加工技術のコラボレーションを実証している。プロセスの階層的性質はまた、絶縁層を画定するためのマイクロミリングおよびレーザ微細加工などの除去加工技術を可能にする。かかる積層により、あらゆるプロセスによって機能を追加し、複雑な設計を実現することが可能になる。光学イメージングおよびＳＥＭイメージングは、様々な構成プロセスを特徴付けるために実施されている。加工された電極のフルスペクトルのインピーダンス分析により、白金の無電解堆積によってその容量挙動をさらに向上させ得るマイクロ電極の性質が確認される。マイクロタワー電極およびより小さい３０μｍ２の両方は、ＭＥＡ材料の化学的および生理学的特徴付けとともに、さらに実証される。
【０１３２】
材料および方法
デバイスの製造、特徴付け、およびアッセイ方法論は、このセクションで詳細に記載される。
【０１３３】
３Ｄ印刷
３Ｄ  ＭＥＡはＳｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（２０１６ｘ６４ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で設計された。ＭＥＡチップのサイズは４９ｍｍ×４９ｍｍ×２．５ｍｍで、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ロイトリンゲン、アスペンハウシュトラーセ、独国）記録増幅器との接続を確保する。３Ｄタワーの形態で１０個の記録部位をそれぞれ包含する２つのパッチが設計された。マイクロタワーは、ベース直径２５０μｍおよび高さ４００μｍを有した。ピッチが６００μｍの７つのマイクロタワーを直線に沿って配置し、３つのマイクロタワーを、直線的に配置された電極から７５０μｍの距離で、同じ直線に沿って中心対称に配置した。図６（ａ）は、１０個の記録部位／刺激部位を包含するマイクロタワーパッチの１つの分解図を伴う３Ｄ印刷された幾何学形状の概略図を示す。設計されたＣＡＤファイルは、フォトポリマークリア樹脂（ＦＬＧＰＣＬ  ０４、Ｆｏｒｍｌａｂｓ、サマービル、マサチューセッツ州、米国）を使用して、レーザ波長４０５ｎｍの３Ｄ  ＳＬＡプリンタ（Ｆｏｒｍ  Ｌａｂｓ  Ｆｏｒｍ２、サマービル、マサチューセッツ州、米国）に直接印刷した。このデバイスは、水平方向で４５°の角度で印刷されており、当該角度は、かかる３Ｄジオメトリに最適であることが判明している。［４４］３Ｄ印刷が完了すると、デバイスをビルドプラットフォームから除去し、穏やかな撹拌で１０分間、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）浴中で洗浄した。洗浄サイクルを、新鮮なＩＰＡ浴中で２回繰り返した。その後、デバイスを窒素中で乾燥させ、続いて支持構造を除去した。アセトン蒸気研磨のために、作製したデバイスを、１リットルのガラスビーカー内に置かれたアルミホイルの上に置いた。キムワイプ（Ｋｉｍｔｅｃｈ、ロズウェル、ジョージア州、米国）をアセトンに浸し、ビーカーの内縁部から吊るした。ビーカーをＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）、（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で密封し、３Ｄ印刷デバイスをアセトン蒸気中で４分間研磨した。
【０１３４】
メタライゼーション
Ｔｉ／Ａｕの電子ビーム蒸着を、３Ｄマイクロタワーのメタライゼーションのためのマイクロミルステンレスステンシルマスクを通じて行い、パッケージランディングパッド（２．２ｍｍ×２．２ｍｍ）によって終端する導電トレース（２００μｍ幅）の画定を行った。ステンレス鋼マスクの製造のために、９０度Ｔ−８ミルツール（直径１５０μｍ〜２５０μｍ、Ｔ−Ｔｅｃｈ、ピーチツリーコーナーズ、ジョージア州、米国）を、Ｔ−Ｔｅｃｈ  Ｊ５クイック回路プロトタイピングシステム中で２ｍｍ／秒の送り速度で５５，０００ｒｐｍで回転させ、ステンレス鋼板（８０μｍ厚、Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｒａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カントリーサイド、イリノイ州、米国）をマイクロミリングした。３Ｄ印刷デバイスおよびマイクロミルマスクを立体鏡下で整列させ、チタンおよび金（Ｔｉ，４Ｎ５純度ペレットおよびＡｕ，５Ｎ純度ペレット（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ、ジェファーソンヒルズ、ペンシルベニア州、米国））を含むメタライゼーション層を電子ビーム（Ｅビーム）蒸着（Ｔｈｅｒｍｉｏｎｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．、ヘイワード、カリフォルニア州、米国）によって堆積させた。Ｔｉ層およびＡｕ層を、３．１×１０−６Ｔｏｒｒの真空中で、それぞれ、１．０ｎｍ／ｓの堆積速度および１．０ｎｍ／ｓの１００ｎｍで１０ｎｍの厚さまで堆積させた。図６（ｂ）は、記録／刺激パッチのうちの１つの分解図を伴うメタライゼーションパターンの概略図を示す。シャドウマスクの概略図を補足情報に示す［図１４（ａ）］。
【０１３５】
ラミネート
生体適合性ラミネート層（Ｍｅｄｃｏ（登録商標）ＲＴＳ３８５１−１７接着剤〜５０μｍ厚、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）〜２０μｍ厚；Ｍｅｄｃｏコーティング製品、クリーブランド、オハイオ州、米国）は、その後、トレースを絶縁するために３Ｄ印刷チップに接合され、それによって、３Ｄ印刷構造全体のサイズを有する電極を用いた３ＤマイクロタワーＭＥＡの実現を可能にする。生体適合性ラミネートは、そのアライメントおよび取り付けの前にマイクロミリングされ、それぞれが１０個の記録部位を包含する３Ｄタワーアレイの２つのパッチのサイズに対応する開口部を有する。生体適合性ラミネート層の開口部は、直線チャネル（長さ４．２ｍｍ、幅５００μｍ）につながる環状領域（直径約８００μｍ）を含む神経チップ（登録商標）寸法に対応する。バイオラミネート層の直径は３２ｍｍであり、これは、後でデバイスに貼付される培養ウェルの直径よりもわずかに大きかった。Ｔ−８ミルツールを使用して、４５，０００ｒｐｍで５ｍｍ／秒の送り速度で回転させて、マイクロミリングを行った。図６（ｃ）は、記録／刺激パッチの１つの分解図を有するラミネーションプロセスの概略図を示す。マイクロミルラミネートの概略図とその幾何学形状が、補足情報に示されている［図１４（ｂ）］。
【０１３６】
パッケージ
外径３０ｍｍ、厚さ２．１ｍｍの培養ウェルを３Ｄ印刷し、ＰＤＭＳでコーティングして生体適合性を向上させ、生体適合性エポキシ（Ｅｐｏ−ｔｅｋ（登録商標）３５３ＮＤ）を使用して結合して最終デバイスが実現される。培養ウェルの高さは３ｍｍである。図６（ｄ）に示されるように、エポキシの部分ＡおよびＢを１０：１（重量）の比率で混合し、３Ｄマイクロタワーデバイス上に固定した。パッケージ化デバイスを４０℃で４時間硬化させた。デバイスを、無電解白金メッキ、ならびに電気、電気化学、および生理学的特徴付けの前に、ＩＰＡおよびＤＩ水の滴下で漏れについて試験した。
【０１３７】
無電解白金メッキ
金コーティングされた３ＤマイクロタワーＭＥＡ上のマイクロ多孔質白金（一般に白金黒として知られる）の無電解堆積のために、３．７５ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ由来の約８％クロロプラチン酸）、０．００５重量％酢酸リード（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．２ｍＬ、１．２３Ｍ  ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）４．０６５ｍＬ、およびＤＩ水２．０８５ｍＬを使用して、０．０１重量％の白金溶液を調製した。この溶液の約５ｍＬをＭＥＡ培養ウェルに移し、マイクロタワー電極上で白金被覆を得るために受動無電解メッキを６時間行った。次いで、完了したデバイスをＤＩ水で洗浄し、窒素で乾燥させた。図６（ｅ）は、マイクロ多孔質白金の無電解メッキ後の異なるサイズの個々の電極の概略図を示す。
【０１３８】
マイクロ電極の絶縁およびレーザ微細加工
より小さな電極を実現するために、セクション２．２で説明したＴｉ／Ａｕメタライゼーション後、ＳｉＯ２の絶縁層が３Ｄマイクロ電極タワーの上部に画定される。ＳｉＯ２ペレット（４Ｎ５純度（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｌｅｓｋｅｒ、ジェファーソンヒルズ、ペンシルベニア州、米国））の手動回転電子ビーム蒸着を行った。補足情報に示されるように、マイクロミリングされたステンレス鋼製のステンシルマスクを通して堆積を行った［図１４（ｃ）］。堆積速度は、標的ＳｉＯ２厚さ４００ｎｍで１０ｎｍ／ｓであった。続いて、デバイスのラミネート（セクション２．３）およびパッケージ（セクション２．４）が行われた。ここで、生体適合性ラミネート層がＳｉＯ２絶縁３Ｄ  ＭＥＡに必要ではない場合があることに留意されたい。しかしながら、ラミネート層の切り出し［図１４（ｂ）］は、神経チップ（登録商標）設計［４６］と同様であるため、マイクロエンジニアリングされた３Ｄ神経培養物を含有する役割を果たし得る。図６（ｆ）は、ＳｉＯ２の蒸着層を伴う、作製したデバイスの分解図を示す。図６（ｇ）は、ＳｉＯ２絶縁体を有する単一のマイクロタワーの拡大図を示す。均一なＳｉＯ２絶縁層は、その後、図６（ｈ）の概略図に示されるように、市販のＭＥＡに類似するサイズのマイクロ電極を画定するために選択的にレーザ微細加工され得る。これらの３Ｄマイクロ電極のサイズは３０μｍ２であり、ＱｕｉｃｋＬａｚｅ５０  ＳＴ２（Ｅｏｌｉｔｅ  Ｌａｓｅｒ、ポートランド、オレゴン州、米国）を利用したレーザ微細加工（エネルギーレベルが１．２ｍＪの５３２ｎｍの４ｎｓレーザパルス）を用いて実現した。レーザ微細加工された電極の白金無電解メッキは、その後、セクション２．５に概説されるように実施することができ、図６（ｉ）に概略的に示される。
【０１３９】
イメージング、化学測定、電気測定、応力測定
ＢＸ５１Ｍ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センターバレー、ペンシルベニア州、米国）およびＪＳＭ６４８０（ＪＥＯＬ、ピーボディ、マサチューセッツ州、米国）をそれぞれ使用して、微細製造開発の全ての段階で光学画像および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を取得した。
【０１４０】
３Ｄ印刷樹脂（ＦＬＧＰＣＬ０４、Ｆｏｒｍｌａｂｓ、サマービル、マサチューセッツ州、米国）に対してフーリエ変換赤外線分光法を実施して、化学組成物に、材料に存在する様々な官能基と共にアクセスした。これは、長期のインビトロ培養への適合性に影響を与えるものである。ＦＴＩＲ測定は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ１００ＦＴ−ＩＲ分光計（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して実施し、１〜５ｍｇの試料を各ＦＴＩＲ試験に使用した。
【０１４１】
培養類似条件下でのデバイスの応力試験のために、試験デバイス（Ｎ＝５）を０．５ｍｍ、１ｍｍ〜３ｍｍの厚さ間隔で製造した。デバイスを、０．０２５倍のダルベッコのリン酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を含有するペトリ皿に浸して、水和および細胞培養培地の両方を模倣し、培養条件をシミュレートした。デバイスを、細胞培養インキュベーター（ＮＵＡＩＲＥ、ＮＵ−５１００シリーズ２、ミネソタ州、米国）に、３７℃、９０％ＲＨ、および１２％ＣＯ２で３０日間インビトロ（ＤＩＶ）で入れた。デバイスのベースからの歪みを平面上で測定することを可能にしたフィーラーゲージ（０．０２〜１ｍｍ厚さギャップ測定基準フィラーフィーラーゲージ、中国京華社）を利用して、３０日間にわたって１日２回の歪みデータを得た。培養ウェルの上に小さなカウンター重量（例えば、ガラススライド）を配置して、それを所定の位置に保持し、フィーラーゲージをベースの下に挿入して、直近の曲率の厚さを識別した。この値は、デバイスの４つの側面全てに記録され、続いて、毎日の測定中にデバイス間のデータの平均が記録された。蒸発を考慮して、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を毎日の開始時に添加した。
【０１４２】
Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液を電解質として用いたＢｏｄｅ１００インピーダンスアナライザー（Ｏｍｉｃｒｏｎ  Ｌａｂｓ、ヒューストン、テキサス州、米国）を用いて、マイクロタワーおよびマイクロ電極３Ｄ  ＭＥＡの両方でＭＥＡのインピーダンス測定を行った。インピーダンススキャンは、白金線（ｅＤＡＱ、Ｄｅｎｉｓｔｏｎｅ  Ｅａｓｔ、オーストラリア）を対極として１０Ｈｚ〜１ＭＨｚで実施した。循環電圧測定（ＣＶ）は、ポテンショスタット４６６システム（ｅＤＡＱ由来）および基準電極として作用する銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）ワイヤおよび対電極として使用される白金線を用いた３電極セットアップを使用して実施した。ＰＢＳを電解質として使用した。電極ＣＶスキャンのキャパシタンスを推定するために、２０ｍＶ／ｓ、４０ｍＶ／ｓ、６０ｍＶ／ｓ、１６０ｍＶ／ｓ、および２５０ｍＶ／ｓの走査速度で−１Ｖから１Ｖまで実行した。
【０１４３】
神経チップ（登録商標）の製造および３Ｄ  ＭＥＡとの統合
デュアルヒドロゲルスキャフォールドを、フォトリソグラフィを使用して半透過性膜（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート０．４μｍポア／ＰＥＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で製造した。開口鍵穴中心を有する細胞不透過性の外側ヒドロゲルモールドは、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧ１０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）の溶液を使用して作製し、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と光架橋させた。外側のヒドロゲルは、図１４（ｂ）に示されるように、３Ｄ電極が中央の鍵穴領域内に露出するように製造される。１０％ｗ／ｖのＰＥＧおよび１．１ｍＭのＬＡＰ溶液を１：１溶液として混合し、次いで０．２２μｍのフィルタで滅菌濾過した。０．６ｍｌの溶液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物に添加し、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ、ＰＲＯ４５００、Ｗｉｎｔｅｃｈ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ）のレンズの下に配置した。マスクおよび重合パラメータをＤＭＤソフトウェア内で作成した。溶液を、波長３８５ｎｍの紫外線を使用して３０秒間照射した。加工後、過剰なＰＥＧＤＭＡ／ＬＡＰを、インサートの上部および下部に２％抗生物質−抗真菌性ＰＢＳ溶液を使用して１０分間、３回洗浄した。洗浄緩衝液をインサートおよび内部鍵穴状チャネルから除去した。
【０１４４】
細胞培養フード下で最初にＵＶで２０分間滅菌することによって、細胞培養のためにＭＥＡを調製した。試料を３回洗浄し、それぞれ８分間、カルシウムおよびマグネシウムを含まず、１％抗生物質−抗真菌剤（１００倍、Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で洗浄した。次いで、試料を細胞培養フード下で乾燥させた。３Ｄマイクロ電極を含有する鍵穴ボイドを、１０μｌの８％マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ヒドロゲルに封入し、次いで１５分間インキュベーターに入れて固化した。
【０１４５】
実験に使用された一次神経組織は、一部、チューレーン大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）による動物の取り扱いおよび組織採取の手順に従って抽出された。末梢感覚ニューロンおよびグリアルシュワン細胞からなるＤＲＧを、Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット、１５日目の子犬の胚（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）から単離した。次いで、ＤＲＧをＭＥＡ上のマトリゲルに直接配置した。細胞を、Ｂａｓａｌ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、１５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、インスリン転移セレニウム（ＩＴＳ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、抗生物質−抗真菌剤、４ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、および５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）からなる２０ｍｌの培地中で培養した。５％ＣＯ２インキュベーターで培養物を３７℃に維持した。
【０１４６】
神経チップ（登録商標）の測定
ＤＲＧは、１０日間のインキュベーション後の生体適合性および生存率について分析された。ＭＥＡをＰＢＳで３回洗浄し、次に３７℃で３μＭのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（死細胞染色）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および４ｍＭのカルセインＡＭ（生細胞染色）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳでさらに３回洗浄し、蛍光顕微鏡を使用して撮像した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）Ｆｉｊｉソフトウェアパッケージを使用して、染色細胞の総数を数えることによって、画像を分析した。簡潔に述べると、各画像について、背景蛍光をソフトウェア閾値化を通じて除去し、染色細胞の最大強度を点選択性を使用してカウントした。各試料について発見された細胞数を平均した（試料当たりｎ＝４ＤＲＧ）。分散の一方向分析（ＡＮＯＶＡ）を、生細胞数のみについて計算した（ｐ＞０．０５）。特に指定されない限り、データは平均（±）標準偏差として提示される。
【０１４７】
結果および議論
このセクションでは、３Ｄ  ＭＥＡの微細製造プロセス開発の結果について詳しく説明する。３ＤマイクロタワーＭＥＡならびに３０μｍ２３Ｄ  ＭＥＡの電気的および電気化学的結果について論じた。さらに、デバイスを神経チップ（登録商標）モデルとカップリングする際の統合、生体適合性、インビトロ応力試験、および化学分析について説明する［４６］。
【０１４８】
デバイス微細製造
図７（ａ）は、記録／刺激ＭＥＡの１つのパッチにおける３Ｄ印刷された３ＤマイクロタワーのＳＥＭ画像を示す。マイクロタワーの寸法は、２５０μｍのベース幅と４００μｍの高さの設計寸法と密接に一致することが観察される。ベース直径および高さの変動を示すＮ＝２０個の電極のボックスプロットを図１５に示す。かかるマイクロタワーＭＥＡの配置により、記録部位および刺激部位は、３Ｄマイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）［４６］の幾何学形状と十分に一致することが可能になる。３つのマイクロタワーは、神経チップ（登録商標）の神経節の球状バルブと接触するように設計され、個々の記録部位／刺激部位として機能する一方で、７つのマイクロタワーは神経軸索管と重複し、記録／刺激電極として機能するように配置される。図７（ｂ）は、環状領域内の３Ｄマイクロタワーの拡大図を示しており、マイクロタワー形状がＳＬＡベースの３Ｄ印刷に固有のストライプを有することが観察される。かかるストライプは、３Ｄ印刷層の各々が後続の層に共有結合でステッチされるときに生じる。図７（ｃ）に見られるように、アセトン蒸気研磨を用いて、３Ｄマイクロタワーの外面を等方的にエッチングして、縞を減少させることができる。ただし、ストライプは、電極の表面積を増加させるための有用な方法であり得る。等方性エッチングプロセスにより、図７（ｄ）に示すように、約１５μｍの曲率半径（ＲＯＣ）を有するマイクロタワーチップが得られる。
【０１４９】
図８（ａ）は、メタライゼーションされた３Ｄマイクロタワーおよび導電トレースを得るためのＴｉ／Ａｕの堆積後のデバイスの顕微鏡写真を示す。図８（ｂ）は、単一の記録／刺激パッチに対応する１０個のメタライゼーションマイクロタワーの拡大図を示す。図８（ｃ）は、トレースを絶縁するためのデバイスの選択的ラミネートを示している。これにより、図８（ｄ）に示すように、３Ｄ印刷培養物を取り付けた後に３ＤマイクロタワーＭＥＡが実現される。この時点で、デバイスは無電解白金メッキ、電気、化学、電気化学測定、および３Ｄマイクロエンジニアリング神経チップ（登録商標）との統合の準備がなされる。
【０１５０】
３Ｄ  ＭＥＡの電気的および電気化学的特性評価
マイクロ多孔質白金の無電解メッキは、化学腐食に非常に強く、生体適合性があり、記録のための電気インピーダンスを低減するコーティングが得られる［１８］。さらに、この層の低閾値電位は、電気刺激における応用にとって興味深いものとなる［４７］。図９（ａ）および９（ｂ）は、マイクロ多孔質白金の無電解メッキの前後の３ＤマイクロタワーＭＥＡのフルスペクトルインピーダンスおよび位相応答を示す（各電極タイプのＮ＝１０の平均）。インピーダンスの大きさは、電極の表面積の増加をもたらす３Ｄ  ＭＥＡの表面積の増加に起因し得る多孔質白金の無電解堆積時に減少することが観察される。電気生理学的に適切な１ｋＨｚの周波数では、１．８ｋΩから６７０Ωへのインピーダンスの減少が観察される。位相スペクトルは−６０°からほぼ０°にシフトすることが観察される。これは、他のＭＥＡで観察されているように、電解質の溶液抵抗が電極−電解質界面インピーダンスを支配し始めるにつれて、電極−電解質界面インピーダンスの全体的な特性が低周波数で二重層キャパシタンス（ＣＤＬ）によって支配され、より高い周波数でより抵抗性になることを意味する［４８］。１ｋＨｚでは、無電解メッキの前後にそれぞれ−１３．９°および−１２．８°の位相が３ＤマイクロタワーＭＥＡで観察される。興味深いことに、１０Ｈｚ以下の周波数での位相応答からの３ＤタワーＭＥＡの容量挙動は、大きなＣＤＬ値を意味している。しかしながら、非常に低い周波数（＜１０Ｈｚ）では、二重層キャパシタンスに関するインピーダンスは省略できるほど大きく、オープン回路に置き換えることができ、無電解メッキ前の３ＤマイクロタワーＭＥＡの位相応答からより抵抗挙動の傾向が見られる［４８］。
【０１５１】
図９（ｃ）および９（ｄ）から明らかなように、金の表面が黒くなっていることから、光学的にマイクロ多孔質白金が観察されている。補足情報には、単一パッチの１０個のマイクロ多孔質白金電極の顕微鏡写真が提供されている［図１６（ａ）、（ｂ）］。視覚的に容易に参照するために、無電解メッキ前の３ＤマイクロタワーＭＥＡの顕微鏡写真も提供される［図１６（ｃ）および（ｄ）］。３ＤタワーＭＥＡの循環電圧測定中の走査速度の変動は、無電解白金メッキ後の二重層キャパシタンスの変化を推定するために実行されている。図１０（ａ）および１０（ｂ）は、無電解メッキの前後の３ＤタワーＭＥＡの走査速度の変動を示す。電流対走査速度プロットの線形フィットは、走査速度の変動データを用いて実行され、キャパシタンス値は、グラフの傾きから抽出された［４４，４９］。図１０（ｃ）に示すグラフの傾きから明らかなように、キャパシタンスは無電解めっき後、０．３ｍＦから３．０ｍＦに増加しており、これはキャパシタンスの１桁（１０倍）の増加である。ＭＥＡの表面テクスチャの制御におけるマイクロ多孔質白金の能力を実証するものであり、小さな神経学的シグナルを捕捉する能力の向上を実証するものである。より小さい電極（３０μｍ２のサイズ）では、電極サイズの減少はインピーダンスの著しい増加をもたらすため、信号対ノイズ比（ＳＮＲ）を減少させる［１８］。結果として、ＳＮＲを改善するために、これらの電極にマイクロ多孔質白金を堆積させた。図１０（ｄ）は、白金の無電解メッキの前後の３０μｍ２マイクロ電極のフルスペクトルインピーダンスおよび位相応答を示す。電気生理学的に適切な１ｋＨｚの周波数では、５５ｋΩ〜３９ｋΩへのインピーダンスの有意な減少（Ｎ＝２）が観察される。この値は、商用されている類似のサイズのナノ多孔質白金２Ｄ電極に関して非常に広い範囲である［５０］。より小さい電極の位相シグネチャも同じ図に示され、電極のサイズが小さいほど、ＣＤＬの値が低くなることが観察され、これは、最大１００Ｈｚの周波数に対するＭＥＡの抵抗挙動として現れる。周波数が大きくなるにつれて、ＣＤＬの影響が顕著になり、電極−電解質界面インピーダンスがより容量性になる［４９］。
【０１５２】
図１１（ａ）は、ＳｉＯ２堆積後の３Ｄマイクロタワーの先端の拡大図マイクロ写真を示す。ＳｉＯ２の透明性による光の干渉により、マイクロ電極に明確な青紫色が付与される。図１１（ｂ）は、レーザ微細加工された記録部位に無電解メッキを施した後のマイクロタワー上部のマイクロ多孔質白金の特徴的な黒色を示す。図１１（ｃ）は、無電解メッキ時の白金のマイクロアイランドによる著しい粗化を伴うマイクロ多孔質白金電極の先端のＳＥＭ画像を示す。この現象の影響は、表面積が大きくなり、インピーダンス値が低くなることである。白金の存在を検証するために、ＭＥＡの電子分散分光法（ＥＤＳ）分析を行った。図１１（ｄ）は、白金に起因するピークにより、３Ｄマイクロタワーの先端に形成されたマイクロ多孔質島上に、無電解堆積後、白金の存在をほぼ９０重量％確認するものである［５１］。
【０１５３】
３Ｄ  ＭＥＡの生理学的および化学的特性評価
生体適合性試験の目的は、３Ｄ  ＭＥＡ試料内の細胞生存率を評価するための単純かつ迅速な方法を考案することであった。カルセインＡＭは、インキュベーションを介して細胞に導入される広く使用される染色である。細胞内に入ると、カルセインＡＭは、内因性エステラーゼによって加水分解され、細胞質に保持される緑色の蛍光分子になる。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、赤色蛍光核酸対染色として知られており、これは、生細胞の無傷膜に対して不透過性である。図１２（ａ）は、３ＤマイクロタワーＭＥＡ上のＤＲＧを示す。１０個の記録部位／刺激部位を包含する１つの記録パッチが青色でマークされている。１０個の記録部位／刺激部位を包含するパッチのうちの１つの拡大図を図１２（ｂ）に示す。マトリゲル（登録商標）マトリックスで充填された鍵穴は青色でマークされ、ＰＥＧ構造は赤色でマークされている。神経チップ（登録商標）の円形部分のＭＥＡ表面の上部に増殖したＤＲＧの生細胞（緑色）および死細胞（赤色）の複合画像を図１２（ｃ）に示す。図１２（ｄ）は、１０個の記録部位／刺激部位を包含するパッチのためにＭＥＡ上に配置されたＤＲＧを示すステッチされた複合画像を示す。神経細胞が３Ｄマイクロタワーの周囲に巻かれていることが明らかに観察されており、これは、構築物の固定を示唆している。図１２（ｅ）は、対照試料についての神経チップ（登録商標）の環状領域の拡大図を示す。
【０１５４】
試料および対照の生体適合性の定量化は、生細胞の割合として示される［図１３（ａ）］。対照試料は、３Ｄ  ＭＥＡの基板を３Ｄ印刷するために使用されるフォトポリマークリア樹脂（約３％）とは対照的に、最も高い割合の生細胞（約９６％）を示すことが観察される。３Ｄ  ＭＥＡ材料セットの他の試験ベッドは、この２つの極端な値の間（約５５〜７０％）にあり、３Ｄ印刷樹脂材料からの潜在的な細胞毒性浸出液の可能性を示唆している。この潜在的な細胞毒性を調査するために、３Ｄ印刷物のＦＴＩＲ分析を行った。図８（ｂ）は、未硬化および硬化樹脂のＦＴＩＲ結果を示す。ＦＴＩＲのフィンガープリント領域（２０００ｃｍ−１〜６５０ｃｍ−１）の分解図を図８（ｃ）にさらに示す。分析により、未硬化ベースモノマー／オリゴマーが、１７００ｃｍ−１のＣ＝Ｏ伸長、１２５０ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ（メタクリレート）非対称伸長、および１０５０ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ（メタクリレート）非対称伸長によって検証されたメタクリル酸エステルであることが明らかである。この結論は、１１６８ｃｍ−１におけるエステル基（Ｏ＝Ｃ−Ｏ−Ｒ）の振動によって裏付けられる。１６３８ｃｍ−１および８１６ｃｍ−１のＣ＝Ｃアクリレート部分に対応するシグナルは、硬化後に有意に減少し、重合上のネットワーク形成による二重結合の消費を示すことに留意することが重要である。同じ理由で、エステル基の振動を表すシグナルが１１６８ｃｍ−１から１１３７ｃｍ−１にシフトし、７７２ｃｍ−１でＨ−Ｃ＝Ｒに対応するシグナルが弱まってシフトし、メチレンによるＣ−Ｈベンディングによる１４５３ｃｍ−１でのシグナルが減少した。これらのシグナルは、モノマー／オリゴマー／ポリマー中で３３６４ｃｍ−１で現れるＣ＝Ｏ伸長からのオーバートーンとともに、ポリマーがメタクリル酸エステルであり、グローバル調和システム（ＧＨＳ）分類による危険な化合物ではないことを確認するものである［５２］。したがって、材料の細胞毒性は、ベースポリマーによるものではなく、光開始剤および／または熱重合阻害剤などの他の化合物の存在によるものである。光開始剤は光重合の触媒として作用するが、熱重合阻害剤は、時間の経過とともに熱重合または重合を防止して、樹脂の保存期間を増加させるために使用される［５３］。市販の樹脂中に存在する典型的な光開始剤は、ホスフィンオキシド化合物、ヒドロキシル−アセトフェノン、ベンゾフェノン化合物、カンフォルキノン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、トリアリールスルホニウム塩などが挙げられる［５４］、［５５］。しかしながら、ＦＴＩＲ分析からは、１３２０ｃｍ−１でのＰ＝Ｏ伸長は、光開始剤が実際にホスフィンオキシドに基づくことが確認される。さらに、フェニル−Ｐ結合から生じる１４０６ｃｍ−１および９４５ｃｍ−１で生じるシグナルは、光開始剤がＴＰＯ（ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド）またはＢＡＰＯ（ホスフィンオキシド、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）のいずれかであることを裏付ける。ＢＡＰＯは、典型的には硬化後に観察される著しい黄色変色をもたらす［５６］。同じ効果は、ＴＰＯでは観察されず、樹脂が光��合時に本質的に「透明」であるため、光開始剤は、ＴＰＯであると結論付けることができる。
【０１５５】
フィンガープリント領域からさらに２つの他の重要なシグナルが出現しており、これは、芳香族環に結合したＮＯ基から生じる１５３０ｃｍ−１（非対称伸長）および１３６５ｃｍ−１（対称伸長）での吸収ピークである。これは、経時的な熱重合を防止するために一般的に使用される化合物であるニトロベンゼン［５７］の存在を示唆する。ＴＰＯおよびニトロベンゼンの両方は、ＧＨＳ［５８］、［５９］によって分類される有害化合物であり、これが、ほとんどの場合、基板について観察されたＤＲＧ細胞適合性が著しく低下した理由である（約３％）。ただし、３０μｍ２の電極を実現するためのメタライゼーション（生体適合性Ｔｉ／Ａｕ）、粗断熱（ＰＥＴベースのバイオラミネート層）および生体適合性ＳｉＯ２断熱などの機能性をデバイスに追加すると、生細胞の割合は約７０％まで増加することが観察される［図１３（ａ）］。より小さい電極を実現するためのＳｉＯ２の蒸着は、フォトポリマーに曝露された電極間領域を必然的にカバーする（金のメタライゼーションは３Ｄマイクロタワーのみをカバーする）。これにより、デバイスが約３０μｍ２の小さな記録部位を実現できるようにすることに加えて、デバイスの生体適合性が向上する。
【０１５６】
化学分析により明らかとなるように、ベースポリマーは、メタクリル酸エステルであり、細胞培養実験中に水／培地吸着を起こしやすく、歪みにつながる可能性がある。考察したように、水の吸着特性を評価するために、異なる厚さの試験樹脂試料をピーク生理学的条件に置き、細胞培養条件を最良に模倣した。実験のための水和定数が常に可能な限り１００％に近いことを確実にし、合理的な時間スケールで結果を得るために、デバイスを完全に水没させた。図１３（ｄ）に見られるように、樹脂系デバイスの歪みは、厚さ範囲（１〜３ｍｍ）にわたって一定ではなかったが、３Ｄ  ＭＥＡの厚さの増加とともに減少傾向を示した。ピークは、デバイスの完全な飽和を示しており、一方、データのわずかな減少は、変動する平衡状態を示す。これらの低減は、蒸発量が最も多く、より多くの水をデバイスから拡散させたときに生じた。厚いデバイス（２ｍｍ以上のデバイス）は、著しく低い歪みを示し、２．５ｍｍおよび３ｍｍのデバイスは実験期間（３０ＤＩＶ）にわたって全く歪みを示さなかった。デバイスの歪みは、樹脂のポリマー構造上の圧縮応力をもたらすデバイスの水和、および永久的な歪みに起因し得る。
【０１５７】
このように、３Ｄ印刷されたポリマー化学物質は、３Ｄプリンタの解像度に依存する最適な設計−デバイス変換を実現するだけでなく、長期のインビトロ培養のための生体適合性にも非常に重要な役割を果たすことが見出された。３Ｄ印刷技術の向上に伴い、オープンプラットフォーム３Ｄプリンタで印刷できる多種多様な生体適合性ポリマーを使用することで、３Ｄマイクロ電極の充填密度が著しく高い設計を実現することができる。かかる概念実証用デバイスは、２７μｍ／２７μｍのＸ／Ｙ分解能および１μｍのＺ分解能を提供するＡｓｉｇａ  ＭＡＸ  Ｘ２７ＵＶ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、オーストラリア）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＤＬＰ）３Ｄプリンタを使用して３Ｄ印刷された。図８（ｅ）は、神経チップ（登録商標）［４６］プラットフォームと互換性のある１３１個の記録部位／刺激部位を有する高密度３Ｄ  ＭＥＡのＳＥＭ画像を示す。電極のベース直径は約１００μｍであり、高さは約１５０μｍである。生体適合性ビルド材料（Ｐｒｏ３ｄｕｒｅ  ＧＲ−１  ＣＬＥＡＲ、Ｐｒｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ニューヨーク州、米国）をポリマー材料として使用して、３Ｄプリンタのオープンプラットフォームを使用して印刷した。
【０１５８】
結論
本研究では、３Ｄ印刷ベースの微細製造技術を用いて、新規の３ＤマイクロタワーＭＥＡと、高さ４００μｍで３０μｍ２のサイズを有する小さなカスタマイズ可能な電極を迅速に作製し、マイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）モデルに統合することを実証した。これらのＭＥＡは、技術的に堅牢であり、インビトロ用途において完全に機能している。製造方法は、マイクロ／ナノ加工の新規のコンセプトである「メーカースペース微細製造」技術の適用を伴うものであり、これは、従来の半導体技術と非既存ベンチトップ微細加工アプローチとの間の緊密な相乗効果を実証するものである。３Ｄ  ＭＥＡの電気的および電気化学的特性は、高度かつ精緻でコストを要する技術を使用して実現された３Ｄ  ＭＥＡと同等の性能を示している。生体適合性試験は、デバイスの構成要素を使用したＭＥＡ上で良好な細胞生存率を示し、ベース樹脂およびその可能性のある細胞毒性成分の詳細な化学的理解をもたらす。樹脂材料の応力試験により、ＭＥＡを用いた長期アッセイのための設計フレームワークを確立した。３Ｄ印刷と、３Ｄ  ＭＥＡと、３Ｄマイクロエンジニアリングされた神経チップ（登録商標）モデルとの間のかかる統合により、迅速な薬学的、化学的、および環境スクリーニングに向けた、「ディッシュ内疾患（ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｄｉｓｈ）」および「生体機能チップ」のように、細胞／組織の成長、増殖、および長期培養をインビトロで適用に対応したシステムが提供される。
【０１５９】
本実施例で引用した参考文献
2022500021.tif 000008
2022500021.tif 000009
2022500021.tif 000010
2022500021.tif 000011
【０１６０】
実施例４
【０１６１】
（表Ｓ１）インビトロ３Ｄ  ＭＥＡの比較表
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【０１６２】
本実施例で引用した参考文献
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【０１６３】
等価物
当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質および手順に多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の特許請求の範囲によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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