(57)【要約】  本開示は、一般に、タンパク質ポリマーを作製するための方法に関する。本方法は、オリゴヌクレオチド官能化タンパク質のオリゴマー／ポリマー材料への会合経路を制御するためにオリゴヌクレオチドを利用することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ポリマーを作製する方法であって、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが結合している第１のタンパク質を含む第１のタンパク質モノマーであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｖ）および第２のドメイン（Ｗ）を含む、第１のタンパク質モノマーと、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドが結合している第２のタンパク質を含む第２のタンパク質モノマーであって、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｖ’）および第２のドメイン（Ｗ’）を含む、第２のタンパク質モノマーとを接触させることを含み、
（ｉ）Ｖは、適切な条件下でハイブリダイズするためにＶ’に十分に相補的であり、（ｉｉ）Ｗは、適切な条件下でハイブリダイズするためにＷ’に十分に相補的であり、前記接触により、Ｖ’がＶにハイブリダイズされ、
それにより、前記タンパク質ポリマーを作製する、方法。
【請求項２】
前記接触により、ＷがＷ’にハイブリダイズすることが可能となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が同じである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、マルチマータンパク質のサブユニットである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して前記第１のタンパク質に結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｖが、約１０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｗが、約１０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して前記第２のタンパク質に結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｖ’が、約１０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｗ’が、約１０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質ポリマーが、ヒドロゲルまたは治療剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療剤が、抗体、細胞透過性ペプチド、ウイルスキャプシド、天然変性タンパク質、レクチン、または膜タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質ポリマーを作製する方法であって、
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが結合している第１のタンパク質を含む第１のタンパク質モノマーであって、前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｘ）、第２のドメイン（Ｙ’）、第３のドメイン（Ｚ）、および第４のドメイン（Ｙ）を含み、Ｙは、適切な条件下でハイブリダイズして、第１のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、第１のタンパク質モノマーと、
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドが結合している第２のタンパク質を含む第２のタンパク質モノマーであって、前記第２のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｙ）、第２のドメイン（Ｘ’）、第３のドメイン（Ｙ’）、および第４のドメイン（Ｚ’）を含み、Ｙは、適切な条件下でハイブリダイズして、第２のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、第２のタンパク質モノマーと、
（ｃ）第１のドメイン（Ｙ）および第２のドメイン（Ｘ’）を含む開始剤オリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、
前記接触により、（ｉ）前記開始剤オリゴヌクレオチドのＸ’が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＸにハイブリダイズし、前記開始剤オリゴヌクレオチドのＹが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＹと置き換わり、それにより、前記第１のヘアピン構造を開き、（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドのＺ’が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＺにハイブリダイズし、それにより、前記第２のヘアピン構造を開き、
それにより、前記タンパク質ポリマーを作製する、方法。
【請求項１７】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が同じである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、マルチマータンパク質のサブユニットである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して前記第１のタンパク質に結合している、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＸが、約２〜２０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＹ’が、約１２〜８０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＺが、約２〜２０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のオリゴヌクレオチドのＹが、約１２〜８０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して前記第２のタンパク質に結合している、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のオリゴヌクレオチドのＹが、約１２〜８０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のオリゴヌクレオチドのＸ’が、約２〜２０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のポリヌクレオチドのＹ’が、約１２〜８０ヌクレオチド長である、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のポリヌクレオチドのＺ’が、約２〜２０ヌクレオチド長である、請求項１６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質ポリマーが、ヒドロゲルまたは治療剤である、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療剤が、抗体、細胞透過性ペプチド、ウイルスキャプシド、天然変性タンパク質、レクチン、または膜タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第３のオリゴヌクレオチドが結合している第３のタンパク質を含む第３のタンパク質モノマーを付加することをさらに含み、前記第３のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｘ）、第２のドメイン（Ｙ’）、第３のドメイン（Ｚ）、および第４のドメイン（Ｙ）を含み、Ｙが、適切な条件下でハイブリダイズして、第３のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、請求項１６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第３のタンパク質が、前記第１のタンパク質と同じである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第３のタンパク質が、前記第２のタンパク質と同じである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
第４のオリゴヌクレオチドが結合している第４のタンパク質を含む第４のタンパク質モノマーを付加することをさらに含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｙ）、第２のドメイン（Ｘ’）、第３のドメイン（Ｙ’）、および第４のドメイン（Ｚ’）を含み、Ｙは、適切な条件下でハイブリダイズして、第４のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、請求項１６〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第４のタンパク質が、前記第１のタンパク質と同じである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第４のタンパク質が、前記第２のタンパク質と同じである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のタンパク質ポリマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のタンパク質ポリマーおよび生理学的に許容される担体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７３１，６０１号および２０１８年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７３１，７３５号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権の利益を主張し、それらの各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の利益に関する陳述
本発明は、海軍研究局（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって授与された認可番号Ｎ０００１４−１５−１−００４３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「２０１８−１５１Ｒ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは２０１９年９月１３日に作成され、サイズは１，５２１バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本開示は、一般に、タンパク質ポリマーを作製するための方法に関する。本方法は、オリゴヌクレオチド官能化タンパク質のオリゴマー／ポリマー材料への会合経路を制御するためにオリゴヌクレオチドを利用することを含む。
【背景技術】
【０００５】
多くの生物学的機能に不可欠な超分子タンパク質ポリマーも重要な合成標的であり、生物学、医薬、および触媒作用での非常に様々な潜在的用途を有する。タンパク質のビルディングブロックの非共有結合から形成されたポリマー材料は、リビングシステム、方向性運動（ｇｕｉｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）1、認識、構造、および代謝において重要な役割を果たしている超分子構造である。2したがって、超分子タンパク質ポリマーは、生物学、医薬、および触媒作用での非常に様々な潜在的用途を有する重要な合成標的である。しかしながら、自然の生物学的重合事象では、組み立ての編成および再編成経路は、インビトロで模倣するのが難しい多数の複雑な結合事象によって慎重に調整される。3~4したがって、タンパク質ポリマーを合成する方法が開発されてきたが、それらが形成する経路を意図的に制御する能力は、現在のところ見込まれていない。5~9
【０００６】
すなわち生体プロセスを介して小分子の重合を制御することは、正確に定義された組成および構造、したがって均一な特性および特定の機能性を備えた構造を有する複雑な高分子への合成アクセスを提供することによって、ポリマー科学に革命をもたらした。10~12超分子重合の分野において、最近の例は、溶液中のモノマーのコンフォメーションまたは凝集状態が、重合が段階成長プロセスを介して自発的に起こるかどうか、または重合に対する速度論的障壁を克服し、それにより鎖成長経路を引き起こすために、開始事象が最初に必要かどうかを決定することが示されている。13~16したがって、一般に、重合に対する速度論的障壁またはその欠如は、システムが自発的な段階成長経路に従うかどうか、または鎖成長の可能性が存在するかどうかを決める。小分子モノマー重合に対する経路制御に磨きをかけるように努力した多くの文献にもかかわらず、これらの概念をタンパク質などのより大きな長さのスケールでのビルディングブロックにまで拡げたものは調べられていない。実際、自発的な段階成長プロセスによるタンパク質およびナノ粒子の重合の例が報告されているが9、ナノスケールのビルディングブロックの重合プロセスを意図的に制御する能力は、この長さスケールで相互作用を細かく制御することの固有の困難性による大きな課題を与えている。
【発明の概要】
【０００７】
ＤＮＡは、タンパク質を含むナノスケールのビルディングブロックの、結晶構造およびポリマー構造の両方への組み立てを制御するための高度に調整可能な結合モチーフとして出現した。17~23これらのシステムでは、配列特異性および注意深く設計された粘着末端が、リガンド配置と共に、粒子の会合、およびしたがって組み立ての最終的な熱力学的構造を制御するための設計操作として使用される。しかしながら、原則として、ＤＮＡコンフォメーションを使用して、組み立てのエネルギー障壁をプログラムし、配列特異的な相互作用を利用して、重合に対する速度論的障壁を設計することによって重合経路を操作する超分子戦略を連想させる様式でかかる障壁にアクセスすることができるであろう。24
【０００８】
したがって、オリゴヌクレオチド官能化タンパク質のオリゴマー／ポリマー材料への会合経路を制御するためにオリゴヌクレオチドを利用する戦略が、本明細書に開示される。付加されたオリゴヌクレオチドの意図的に制御された配列およびコンフォメーションに応じて、タンパク質−オリゴヌクレオチド「モノマー」は、段階成長（ｓｔｅｐ−ｇｒｏｗｔｈ）経路または鎖成長（ｃｈａｉｎ−ｇｒｏｗｔｈ）経路のいずれかを通じて重合することができる。得られたポリマーの構造および分布は、使用する合経路によって大きく影響を受けることが見出された。重要なことに、鎖成長メカニズムの場合、「リビング」鎖末端もまた観察される。これは、タンパク質の会合に対する機構的制御の例を示し、任意のナノ粒子システムに適用できる方法論を確立する。さらに、この戦略を使用して、配列が規定された、マルチブロックのブラシ状および分枝状タンパク質ポリマー構造を含む、複雑な構造を有するタンパク質オリゴマーおよびポリマーの合成。
【０００９】
本開示の主題の例示的な用途には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
・多段階触媒作用
・組み立てライン（ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｌｉｎｅ）生合成
・組織工学
・タンパク質組成によって決定される特有のバルク物性を有する軟質材料
【００１０】
本開示の主題の利点には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
・任意のタンパク質をポリマー構造に組み込むことができる一般化可能な戦略
・調整可能な分子量分布および構造を有するタンパク質ポリマー材料
・オリゴヌクレオチド長は、特定のタンパク質間距離を定義するように調整することができる。
【００１１】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、タンパク質ポリマーを作製する方法であって、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが結合している第１のタンパク質を含む第１のタンパク質モノマーであって、第１のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｖ）および第２のドメイン（Ｗ）を含む、第１のタンパク質モノマーと、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドが結合している第２のタンパク質を含む第２のタンパク質モノマーであって、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｖ’）および第２のドメイン（Ｗ’）を含む、第２のタンパク質モノマーと、を接触させることを含み、（ｉ）Ｖは、適切な条件下でハイブリダイズするためにＶ’に対して十分に相補的であり、（ｉｉ）Ｗは、適切な条件下でハイブリダイズするためにＷ’に十分に相補的であり、接触により、ＶがＶ’にハイブリダイズし、それにより、タンパク質ポリマーが作製される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触により、ＷがＷ’にハイブリダイズすることが可能となる。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は同じである。さらなる実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は異なる。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、マルチマータンパク質のサブユニットである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第１のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して第１のタンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である。さらなる実施形態では、Ｖは、約１０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｗは、約１０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第２のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して第２のタンパク質に結合している。さらなる実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である。いくつかの実施形態では、Ｖ’は、約１０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｗ’は、約１０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、タンパク質ポリマーは、ヒドロゲルまたは治療剤である。さらなる実施形態では、治療剤は、抗体、細胞透過性ペプチド、ウイルスキャプシド、天然変性タンパク質、レクチン、または膜タンパク質である。
【００１２】
いくつかの態様では、本開示は、タンパク質ポリマーを作製する方法であって、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドが結合している第１のタンパク質を含む第１のタンパク質モノマーであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｘ）、第２のドメイン（Ｙ’）、第３のドメイン（Ｚ）、および第４のドメイン（Ｙ）を含み、Ｙが、適切な条件下でハイブリダイズして、第１のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、第１のタンパク質モノマーと、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドが結合している第２のタンパク質を含む第２のタンパク質モノマーであって、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のドメイン（Ｙ）、第２のドメイン（Ｘ’）、第３のドメイン（Ｙ’）、および第４のドメイン（Ｚ’）を含み、Ｙが、適切な条件下でハイブリダイズして、第２のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である、第２のタンパク質モノマーと、（ｃ）第１のドメイン（Ｙ）および第２のドメイン（Ｘ’）を含む開始剤オリゴヌクレオチドと、を接触させることを含み、接触により、（ｉ）第開始剤オリゴヌクレオチドのＸ’が、第１のオリゴヌクレオチドのＸにハイブリダイズし、開始剤オリゴヌクレオチドのＹが、第１のオリゴヌクレオチドのＹと置き換わり、それにより、第１のヘアピン構造を開き、（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドのＺ’が、第１のオリゴヌクレオチドのＺにハイブリダイズし、それにより、第２のヘアピン構造を開き、それにより、タンパク質ポリマーが作製される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は同じである。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は異なる。さらなる実施形態では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、マルチマータンパク質のサブユニットである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第１のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して第１のタンパク質に結合している。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である。さらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＸは、約２〜２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＹ’は、約１２〜８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＺは、約２〜２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドのＹは、約１２〜８０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第２のタンパク質の表面上のリジンまたはシステインを介して第２のタンパク質に結合している。さらに別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの組み合わせ、またはそれらの修飾体である。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドのＹは、約１２〜８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドのＸ’は、約２〜２０ヌクレオチド長。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドのＹ’は、約１２〜８０ヌクレオチド長。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドのＺ’は、長約２〜２０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、タンパク質ポリマーは、ヒドロゲルまたは治療剤である。様々な実施形態では、治療剤は、抗体、細胞透過性ペプチド、ウイルスキャプシド、天然変性タンパク質、レクチン、または膜タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、第３のオリゴヌクレオチドが結合している第３のタンパク質を含む第３のタンパク質モノマーを付加することをさらに含み、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｘ）、第２のドメイン（Ｙ’）、第３のドメイン（Ｚ）、および第４のドメイン（Ｙ）を含み、Ｙは、適切な条件下でハイブリダイズして、第３のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である。いくつかの実施形態では、第３のタンパク質は、第１のタンパク質と同じである。いくつかの実施形態では、第３のタンパク質は、第２のタンパク質と同じである。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、第４のオリゴヌクレオチドが結合している第４のタンパク質を含む第４のタンパク質モノマーを付加することをさらに含み、第４のオリゴヌクレオチドは、第１のドメイン（Ｙ）、第２のドメイン（Ｘ’）、第３のドメイン（Ｙ’）、および第４のドメイン（Ｚ’）を含み、Ｙは、適切な条件下でハイブリダイズして第４のヘアピン構造を生成するためにＹ’に十分に相補的である。いくつかの実施形態では、第４のタンパク質は、第１のタンパク質と同じである。さらなる実施形態では、第４のタンパク質は、第２のタンパク質と同じである。本開示の態様または実施形態のいずれかでは、第３のモノマーおよび／または第４のモノマーの付加は、タンパク質ポリマー鎖の伸長をもたらす。いくつかの実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、約０．２当量〜約１．６当量、または約０．２〜約１．４当量、または約０．２〜約１．２当量、または約０．２〜約１．０である。当量、または約０．２〜約０．８当量、または約０．２〜約０．６当量、または約０．２〜約０．４当量である。さらなる実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、少なくとも、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、または２．０当量である。さらに別の実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、約２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、０．４、または０．２当量未満または以下である。
【００１３】
いくつかの態様では、本開示は、本開示のタンパク質ポリマーを対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、本開示のタンパク質ポリマーおよび生理学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】段階成長および鎖成長ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーセットの描写を示す。（Ａ）一本鎖ＤＮＡ修飾を有し、したがって重合に対する速度論的障壁を有しない、段階成長モノマーＳＡおよびＳＢ。（Ｂ）鎖成長モノマーＨＡおよびＨＢは、ヘアピンＤＮＡ修飾を有し、したがって、開始剤鎖（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｓｔｒａｎｄ）がない場合には、重合に対する克服し難い速度論的障壁を有する。（Ｃ）ＤＮＡ配列設計（下のボックス）に基づいた段階成長（左）および鎖成長（右）モノマーシステムのための提案された会合経路。重合事象のための提案されたシステム自由エネルギー図を示す。
【図２】モノマー設計の概略図を示す。（Ａ）一本鎖モノマーＳＡおよびＳＢは、互い違いの相補的パターンを有するＤＮＡ鎖の２つのセットから構成され、段階成長経路を介して重合する必要がある。（Ｂ）ヘアピン−ＧＦＰモノマーは、開始鎖がない場合には組み立てることができないヘアピンＤＮＡ鎖ＨＡおよびＨＢの２つのセットから構成される。
【図３】ＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの特性を示す。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの特性評価。（Ｂ）遊離ＤＮＡ（下）およびタンパク質、ならびにタンパク質−ＤＮＡコンジュゲート（上）の追跡を示す分析サイズ排除特性評価。
【図４】ポリマーのＳＥＣ特性評価を示す。開始剤鎖Ｉの濃度を変化させた、（Ａ）ＳＡ＋ＳＢ、（Ｂ）ＨＡ＋ＨＢ。
【図５】ポリマーのクライオＴＥＭ特性を示す。画像により、段階成長モノマーの異なるＤＰの線状および環状生成物の両方の形成、ならびにＤＰが［Ｉ］に依存する線状生成物のみの形成が明らかである。
【図６】リシンまたはシステイン残基上のＤＮＡを有するβＧａｌと相補的なＡｕＮＰとの組み立てにより、コンジュゲーションの化学に応じて、ＡｕＮＰの単純立方晶または単純六方晶配列のいずれかが生じることを示す。上：ＴＥＭ顕微鏡写真（スケールバー＝左５００ｎｍ、および右１μｍ）、および下：得られたＡｕＮＰ−タンパク質組み立てのＳＡＸＳパターン。
【図７】ＤＮＡ相互作用によるタンパク質ポリマーの組み立てを示す。（ａ）βＧａｌ−ＤＮＡ変異体の１Ｄ構造への組み立て、（ｂ）βＧａｌ組み立てのネガティブ染色ＴＥＭ特性評価（スケールバー２００ｎｍ）。（ｃ）ＤＮＡコンフォメーションは、タンパク質重合経路を決定することができる。下：段階成長システムでの線状および環状生成物、ならびに鎖成長システムのみでの線状生成物を示す、クライオＴＥＭ顕微鏡写真（スケールバー１００ｎｍ）。
【図８】ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性を示す。ゲルにより、所望の種の精製が成功したことが確認され、モノマーのバンドは、タンパク質表面への単一のオリゴヌクレオチドの付加によく対応する電気泳動移動度を示す。２００Ｖで３５分間、ゲル（４〜１５％ＴＧＸ、Ｂｉｏｒａｄ）を泳動させた。
【図９】ｍＧＦＰ、遊離ＤＮＡ、およびＤＮＡ−ＧＦＰモノマーのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。各プロットは、未修飾ｍＧＦＰ（緑色）、遊離ＤＮＡ、および各モノマーの精製されたｍＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートのスペクトルを示す。各プロットのすべてのスペクトルは、２μＭの濃度に正規化されており、ｍＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートでは約１ＤＮＡ：１ｍＧＦＰの比率になる。
【図１０】ネイティブのｍＧＦＰ、遊離ＤＮＡ、およびｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーのＳＥＣクロマトグラムを示す。データにより、精製されたモノマー試料からの遊離ＤＮＡおよびコンジュゲートしていないｍＧＦＰの不存在が確認される。ｍＧＦＰのクロマトグラムは、ＤＮＡコンジュゲートの陰イオン交換精製時に除去されるタンパク質の酸化されたダイマーに対応する高分子量ピークを示す。ｍＧＦＰ蛍光および２６０ｎｍ吸光度シグナルは、各プロットにおいて同じ相対比に正規化されており、遊離ｍＧＦＰと比較してｍＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートの２６０ｎｍ吸光度の増加を強調している。
【図１１】ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーであるＳAおよびＳBの段階成長重合を示す。（Ａ）線状および環状生成物への一本鎖モノマーの自発的重合を示すスキーム。（Ｂ）ＳAモノマーのクライオＥＭ顕微鏡写真。（Ｃ）ＳAおよびＳBモノマー、ならびに２４時間のインキュベーション後の重合生成物のＳＥＣプロファイル。（Ｄ）支配的な環状生成物を示す差し込み図を用いたＳAおよびＳBモノマーから成長したポリマーのクライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバー＝５０ｎｍ（環状差し込み図では１０ｎｍ）。（Ｅ）線状種（上）および環状種（下）の数分率重合度のヒストグラム。
【図１２】位相板を使用せずに２００ｋＶで取得された、０．６当量開始剤を用いたヘアピンシステムの顕微鏡画像を示し、取得された最良のデータの代表例である。
【図１３】位相板を使用せずに２００ｋＶで取得された、０．６当量開始剤を用いたヘアピンシステムの顕微鏡画像を示し、典型的な試料の代表例である。
【図１４−１】ＴＥＭで分析されたすべての試料についての代表的な顕微鏡写真および分析を示す。左：元の画像（スケールバー＝１００ｎｍ）、右：繊維を青色でトレースした分析画像。
【図１４−２】図１４−１の記載に同じ。
【図１５】ＨAおよびＨBのモノマーの鎖成長重合を示す。（Ａ）鎖成長モノマーの開始された重合を示すスキーム。（Ｂ）開始剤を用いずに２４時間インキュベートした後の別々および一緒でのＨAおよびＨBモノマーのＳＥＣプロファイル。（Ｃ）ＨAおよびＨBモノマーのクライオＥＭ顕微鏡写真ならびにクラス平均データを示す差し込み図。（Ｄ）０．４、０．６、０．８、および１．０当量（当量）の開始剤（上から下）を用いたモノマーの重合度の定量分析。長い破線は、数平均を示し、短い破線は、重量平均重合度を示す。（Ｅ）０．４、０．６、０．８、および１．０相当の開始剤を用いた鎖成長重合生成物のＳＥＣプロファイル。（Ｆ）異なる濃度の開始剤を用いて調製された試料のクライオＥＭ顕微鏡写真。（Ｇ）添加された開始剤の当量の関数としての重量平均重合度および数平均重合度（左軸）ならびに％初期モノマー消費量（右軸）。すべてのスケールバー＝５０ｎｍ。
【図１６】室温での２４時間のインキュベーション後および１週間のインキュベーション後のＨAおよびＨBモノマーのＳＥＣクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、個々のモノマーと、両方のモノマー種と共にインキュベートされた試料と、の間における認識可能な変化を示さず、モノマーが研究された条件下で準安定であることを示す。ピークのわずかな広がりは、測定時に観察されたカラム性能のわずかな低下に起因する。
【図１７】タンパク質−ヘアピンＤＮＡコンジュゲートの複数の配向を示す、データ処理から生成された１２のクラスを示す。
【図１８】ポリマー分布に対する開始剤の添加のタイミングの影響を示す。異なる時間間隔で５回にわたって添加された１当量の開始剤のＨAおよびＨBのＳＥＣ。記号一欄は、各添加間の時間間隔を示す。１当量の開始剤を一度に添加するか（０分）、または合計１当量が試料に添加されるまで５分もしくは１５分ごとに０．２当量を添加することにより、実験を行った。
【図１９】ＤＮＡのみのヘアピン重合のＳＥＣクロマトグラムを示す。上から下：１、０．８、０．６、０．４、および０当量の開始剤。
【図２０】鎖伸長重合実験の時間経過ＳＥＣ実験を示す。０．６当量の開始剤を含有するポリマー試料を前述の条件下で調製し、一晩平衡化した。注入の直前に、５０μＬのポリマー試料を、同じ濃度であるが開始剤を含有しない５０μＬのモノマーに添加した。ＳＥＣ注入を前述のように１２分間隔で行った。
【図２１】活性な鎖末端を有するポリマー鎖の伸長を示す。（Ａ）活性な鎖末端を有する試料への新鮮なモノマーの付加を示すスキーム。（Ｂ）得られた鎖伸長生成物のクライオＥＭ顕微鏡写真。（Ｃ）鎖伸長前（赤）および鎖伸長後（紫）の試料の平均重合度の増加を示すヒストグラム。長い破線は、数平均を示し、短い破線は、重量平均重合度を示す。スケールバー＝５０ｎｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
タンパク質モノマーコンジュゲートは、単一のオリゴヌクレオチド鎖で修飾されたタンパク質を含む。このオリゴヌクレオチド鎖の配列に基づいて、それは、一本鎖またはヘアピンコンフォメーションのいずれかで存在することができ、これらのモノマーは、いくつかの態様では、段階成長経路または鎖成長経路によって重合することができる。これにより、タンパク質ポリマーのトポロジー（環状対線状）および重合度を制御できる。
【００１７】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の指示対象が含まれる。
【００１９】
タンパク質
本明細書で使用される「タンパク質」は、一連のアミノ酸を含む任意の部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質ポリマーは、状態の治療または診断のために患者に投与され得る。この用語にはペプチドも含まれる。本明細書で使用される「タンパク質モノマー」は、オリゴヌクレオチドが結合しており、かつ、本明細書に記載の方法に従って重合を受けることができる、任意のタンパク質を指す。
【００２０】
本開示によって企図されるタンパク質（治療用タンパク質を含む）には、ペプチド、酵素、構造タンパク質、ホルモン、受容体、および他の細胞または循環タンパク質、ならびにそれらの断片および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質治療剤には、抗体、細胞透過性ペプチド（例えばおよび限定するものではないが、エンドポーター）、ウイルスキャプシド、天然変性タンパク質（例えばおよび限定するものではないが、カゼインおよび／またはフィブリノーゲン）、レクチン（例えばおよび限定するものではないが、これらに限定されない）、コンカナバリンＡ）、または膜タンパク質（例えばおよび限定するものではないが、受容体、グリコホリン、インスリン受容体、および／またはロドプシン）が含まれる。様々な実施形態では、治療剤には、化学療法剤も含まれる。
【００２１】
さまざまな態様では、タンパク質治療剤には、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、骨形成タンパク質−１、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−３、骨形成タンパク質−４、骨形成タンパク質−５、骨形成タンパク質−６、骨形成タンパク質−７、骨形成タンパク質−８、骨形成タンパク質−９、骨形成タンパク質−１０、骨形成タンパク質−１１、骨形成タンパク質−１２、骨形成タンパク質−１３、骨形成タンパク質−１４、骨形成タンパク質−１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、表皮成長因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、酸性の線維芽細胞成長因子、塩基性の線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株誘導性神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ（ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２を含む）、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在性形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体���型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮成長因子、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的または免疫学的に活性な断片を含むがこれらに限定されないサイトカインまたは造血因子が含まれる。生物学的薬剤の例には、サイトカインなどの免疫調節タンパク質、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、腫瘍抑制遺伝子、およびがんワクチンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物および方法と併用して使用することができるインターロイキンの例には、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）が含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン以外の他の免疫調節剤には、ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、レバミゾール、およびオクトレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
ホルモン剤の例には、合成エストロゲン（例えば、ジエチルスチベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロール、およびラロキシフェン）、抗アンドロゲン（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール、およびテトラゾール）、ケトコナゾール、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、およびミフェプリストンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
使用が企図される化学療法剤には、酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、生物学的応答修飾因子、例えば、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦ、ホルモン、ならびに副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えば、プレドニゾンおよび同等物、デキサメタゾン、ならびにアミノグルテチミドを含む、アンタゴニスト；プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／同等物を含む、アンドロゲン；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、およびリュープロリド；ならびに非ステロイド性抗アンドロゲン、例えば、フルタミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
タンパク質化学療法剤には、抗ＰＤ−１抗体が含まれる。
【００２５】
本開示によって企図される構造ポリペプチドには、アクチン、チューブリン、コラーゲン、エラスチン、ミオシン、キネシン、およびダイニンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
ヒドロゲル本開示の様々な態様では、タンパク質ポリマーはヒドロゲルである。ヒドロゲルの生成に有用なタンパク質モノマーには、本明細書に記載の構造タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン、アクチン）、糖タンパク質、酵素、ヘパリン結合タンパク質、フィブロネクチン（細胞接着）、インテグリン、ラミニン、プロテアーゼ、および／または成長因子が含まれるが、これに限定されない。
【００２７】
モジュラータンパク質構造
いくつかの態様では、本開示は、マルチブロックタンパク質ポリマーを作製する方法を提供する。かかる方法は、本明細書に開示されるタンパク質ポリマーの「リビング」特性を利用する。本開示の方法は、例えば反応に新鮮なタンパク質モノマーを添加することにより、成長し続けることができるタンパク質ポリマーを提供する。したがって、様々な実施形態では、タンパク質ポリマーは、任意の組み合わせで合成されてもよく、複数の異なるタンパク質由来の部分を組み合わせてタンパク質ポリマーにすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、様々なタンパク質由来の部分が、各部分によって提供される特性を示す単一のタンパク質ポリマー（すなわち、ヘテロマータンパク質ポリマー）に組み立てられることを企図する。あるいは、タンパク質ポリマーは、ホモポリマーとして合成されてもよく、タンパク質ポリマーを合成するために使用される各タンパク質モノマーのタンパク質部分は同じである。
【００２８】
本開示の方法はまた、ポリマー鎖に沿って交互のタンパク質を有するＡ／Ｂ型構造を生成するものを含む。いくつかの実施形態では、鎖伸長は、これらのポリマーのリビング特性の機能として行われる。タンパク質モノマー（すでに重合されているものと同じかまたは異なるもの）が、事前に重合された鎖に追加され、これは、新しいモノマーを用いて鎖の伸長をもたらす。本開示の態様または実施形態のいずれかでは、両方のモノマー（例えば、本明細書に記載される、「第１のオリゴヌクレオチドが結合している第１のタンパク質を含む第１のタンパク質モノマー」、および「第２のオリゴヌクレオチドが結合している第２のタンパク質を含む第２のタンパク質モノマー」）は、重合を継続するために添加される。本開示の態様または実施形態のいずれかでは、追加の開始剤オリゴヌクレオチドが反応に添加される。
【００２９】
反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、約０．２当量〜約２当量である。いくつかの実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、約０．２当量〜約１．６当量、または約０．２〜約１．４当量、または約０．２〜約１．２当量、または約０．２〜約１．０当量、または約０．２〜約０．８当量、または約０．２〜約０．６当量、または約０．２〜約０．４当量である。さらなる実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、少なくとも、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、または２．０当量である。さらに別の実施形態では、反応に添加される開始剤オリゴヌクレオチドの量は、約２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、０．４、または０．２当量未満または以下である。本明細書で使用される場合、開始剤の当量は、単一のビルディングブロック（すなわち、タンパク質モノマー）に関する当量を指す。例えばおよび限定するものではないが、０．４当量の開始剤の場合、試料は、０．４μＭの開始、１μＭの第１タンパク質モノマー、および１μＭの第２タンパク質モノマーを含有する。
【００３０】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語またはその複数形は、本明細書で論じられ、さもなければ当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ある特定の例では、当技術分野では、天然に存在するヌクレオチド、および修飾ヌクレオチドを含む天然に存在しないヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語を使用する。したがって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびＵを意味する。天然に存在しない核酸塩基には、例えばおよび限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ  ４４２９−４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が含まれる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体および互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｓａｎｇｈｖｉによる第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に第６２２頁および第６２３頁を参照のこと）、ならびにＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７が含まれ、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。様々な態様では、オリゴヌクレオチドはまた、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として機能する特定の「普遍的な塩基」を含む核酸塩基のように機能することができる、複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」を含む。普遍的な塩基には、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましい普遍的な塩基には、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が含まれ、当技術分野で知られている普遍的な塩基が含まれる。
【００３１】
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９および国際特許公開第ＷＯ９７／１２８９６号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオチドには、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジンなどのＧクランプ（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキ−サジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環系ピリミジンが含まれる。修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが含まれる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミ��ン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含み、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており、特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号を参照のこと、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
【００３３】
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３‘−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２結合である逆極性を有するものが含まれる。最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’から３’結合を含む逆極性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、脱塩基性であり得る（ヌクレオチドが欠落しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆ヌクレオシド残基も企図される。塩、混合塩、および遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、および同第５，６２５，０５０号が含まれ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ2構成要素部分を有する他のものが含まれる例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、および同第５，６７７，４３９号を参照のこと、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
さらに他の実施形態では、１つ以上の糖および／またはヌクレオチド単位の１つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物。一態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、例えば、アミノエチルグリシン骨格などのアミド含有骨格で置き換えることができる。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００を参照のこと、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
さらに他の実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第５，４８９，６７７号および同第５，６０２，２４０号に記載される−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−を含む。米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
【００３７】
様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の２つの連続するモノマー間の結合は、−ＣＨ2−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲH−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲH、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）2−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｐ（Ｏ）2−、−ＰＯ（ＢＨ3）−、−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）2−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ3）−、および−ＰＯ（ＮＨＲH）−（式中、ＲＨは、水素およびＣ1-4−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ1-6−アルキルおよびフェニルから選択される）から選択される、２〜４つ、望ましくは３つの基／原子から構成される。かかる結合の例示的な例は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＯ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ5を含む）、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−、−ＣＨ2−ＮＲH−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＯ−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＳ−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｃ（＝ＮＲH）−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＲH−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＯ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ2−ＮＲH−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ5を含む）、−ＣＨ2−Ｏ−ＮＲH−、−ＣＯ−ＮＲH−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＮＲH−Ｏ−、−ＣＨ2−ＮＲH−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲH−ＣＨ2−、−Ｏ−ＮＲH、−Ｏ−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ5を含む）、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＳＯ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）2−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）2−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ、Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）2−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ3）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ2ＣＨ3）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ3）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲN）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−ＮＲHＨ−、−ＮＲH−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、ＮＲH）−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−ＣＨ2−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）2−Ｏ−であり、その中でも、−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−ＣＨ2−ＮＲH−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ、Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）2−Ｏ−、−ＮＲHＰ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ、ＮＲH）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ3）−Ｏ−、およびｚ−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲN）−Ｏ−であり、式中、ＲＨは、水素およびＣ1-4−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ1-6−アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ２５：ｐｐ  ４４２９−４４４３に提供えられている。
【００３８】
オリゴヌクレオチドのさらに他の修飾体は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖部分を含んでもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10アルケニルおよびアルキニルであり得る。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2、およびＯ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3］2が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、およびＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬物力学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基。一態様では、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる、２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。他の修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、以下の本明細書の実施例に記載される２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ2）2ＯＮ（ＣＨ3）2基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、Ｏ（ＣＨ2）2-Ｎ（ＣＨ3）2が含まれる。
【００４０】
さらに他の修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、２’−アリル（２’−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってもよい。一態様では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、および同第５，７００，９２０号を参照のこと、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
いくつかの場合では、糖の修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様では、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ2−）nであり、式中、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【００４２】
オリゴヌクレオチドはまた、塩基修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「天然」塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾ヌクレオチドには、他の合成および天然塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジンなどのＧクランプ（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキ−サジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環系ピリミジンが含まれる。修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９��に開示されているものが含まれる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含み、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており、特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号を参照のこと、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
「修飾塩基」または他の同様の用語は、天然の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／もしくはチミン）と対形成することができ、ならびに／または天然に存在しない塩基と対形成することができる組成物を指す。特定の態様では、修飾塩基は、１５、１２、１０、８、６、４、または２℃、またはそれ以下のＴm差を提供する。例示的な修飾塩基は、ＥＰ１０７２６７９およびＷＯ９７／１２８９６に記載される。
【００４４】
「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびに天然に存在しない核酸塩基、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ6−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ4，Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ3−Ｃ6）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびに米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ  ４４２９−４４４３に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基を意味する。したがって、「核酸塩基」という用語には、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、それらの複素環類似体および互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｓａｎｇｈｖｉによる第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に第６２２および６２３頁を参照のこと）、ならびにＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７が含まれ、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」という用語は、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないがヌクレオシド塩基として機能する特定の「普遍的な塩基」を含む核酸塩基のように機能することができる、複素環式化合物などの化合物を含むことをさらに意図する。普遍的な塩基には、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましい普遍的な塩基には、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が含まれ、当技術分野で知られている普遍的な塩基が含まれる。
【００４５】
所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）ａｎｄ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照のこと。固相合成法は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号；Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）；Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）；Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５  （２００２）を参照のこと。
【００４６】
オリゴヌクレオチドまたはその修飾体が結合している本開示のタンパク質は、一般に、約５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む。より具体的には、本明細書に開示されるタンパク質に結合したオリゴヌクレオチドは、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約１０ヌクレオチド長、およびオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの長さのすべてのオリゴヌクレオチド中間体である。したがって、様々な実施形態では、本開示によって企図されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチド長、または少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチド長である。
【００４７】
ドメイン。本開示の態様または実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のドメインを含む。本明細書で使用される場合、「ドメイン」は、２つのヌクレオチド配列（すなわち、２つのドメイン）がハイブリダイズすることを可能にするために、同じオリゴヌクレオチドまたは別個のオリゴヌクレオチドのいずれかにおける別のヌクレオチド配列（すなわち、別のドメイン）に十分に相補的であるヌクレオチド配列である。本開示の態様または実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のドメインを含む。ドメインの長さは、様々な実施形態では、約２〜約２０ヌクレオチド長、または約１０〜約１００ヌクレオチド長、または約１２〜約８０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、ドメインの長さは、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約１０ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの長さのすべてのオリゴヌクレオチド中間体である。さらなる実施形態では、ドメインの長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９，もしくは１００ヌクレオチド長、または少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、ドメインの長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００未満のオリゴヌクレオチド長、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００未満のオリゴヌクレオチド長である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、タンパク質に結合したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその修飾体である。いくつかの実施形態では、タンパク質に結合したオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその修飾体である。いくつかの実施形態では、タンパク質に結合したオリゴヌクレオチドは、タンパク質に結合したオリゴヌクレオチドおよび第２のタンパク質に結合した第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが起こり、それにより、２つのオリゴヌクレオチドが会合するように、第２のタンパク質に結合した第２のオリゴヌクレオチドのドメインに十分に相補的な配列（すなわち、ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズし、それにより、ヘアピン構造を形成するのに互いに十分に相補的であり、ドメインを含む。
【００４９】
いくつかの態様では、複数のオリゴヌクレオチドがタンパク質に結合している。様々な態様では、複数のオリゴヌクレオチドがそれぞれ同じ配列を有し、他の態様では、１つ以上のポリヌクレオチドが異なる配列を有する。
【００５０】
タンパク質へのオリゴヌクレオチドの結合。本方法での使用が企図されるオリゴヌクレオチドには、任意の手段（例えば、共有結合または非共有結合）を通したタンパク質またはナノ粒子に結合したものが含まれる。オリゴヌクレオチドがタンパク質またはナノ粒子に結合する手段に関係なく、様々な態様での結合は、５’結合、３’結合、ある種の内部結合、またはこれらの結合の任意の組み合わせを通して行われる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質またはナノ粒子に共有結合している。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質またはナノ粒子に非共有結合している。
【００５１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、酵素を使用してインビボでタンパク質に結合している。Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１８  ｅ１６０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの相補性。「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリックＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、または当技術分野で既知の他の配列特異的結合の規則に従った、水素結合による核酸の２本の鎖間の相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、当技術分野で既知の異なるストリンジェンシー条件下で行うことができる。適切なストリンジェンシー条件下では、２つの相補鎖間のハイブリダイゼーションは、反応物において約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約反応において、９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上に達する。
【００５３】
様々な態様では、本方法は、互いに１００％相補的である、すなわち完全に一致する、オリゴヌクレオチドまたはそのドメインの使用を含み、他の態様では、オリゴヌクレオチドまたはそのドメインは、関連する長さにわたって、互いに少なくとも（以上を意味する）約９５％相補的、関連する長さにわたって互いに少なくとも約９０％、約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である。関連する長さは、本明細書に開示される別のオリゴヌクレオチドまたはそのドメインにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそのドメインの長さを意味する。例えば、かつ、限定されないが、本開示のいくつかの態様では、第１のオリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチド長であり、ドメインＹおよびドメインＹ’を含んでもよく、ドメインＹは、適切な条件下でハイブリダイズするためにドメインＹ’に十分に相補的である。したがって、ドメインＹおよびＹ’がそれぞれ２０ヌクレオチド長であり、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが相補的である場合、２つのドメインは互いに９０％相補的である。
【００５４】
使用方法／組成物
いくつかの態様では、本開示は、本開示のタンパク質ポリマーを対象に投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。
【００５５】
いくつかの態様では、本開示のタンパク質ポリマーは、かかる材料のプラズモン増強触媒特性のために１つ以上のナノ粒子（例えば、本明細書に例示される）と併せて使用される。
【００５６】
本開示に従って作製された任意のタンパク質ポリマーもまた、組成物中で提供される。これに関して、タンパク質ポリマーは、本明細書でさらに記載される生理学的に許容される（すなわち、薬理学的に許容される）担体または緩衝液と共に製剤化される。任意選択で、タンパク質ポリマーは、生理学的に許容される塩の形態であり、これは、本開示に含まれる。「生理学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される任意の塩を意味する。適切な塩のいくつかの例には、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、およびシュウ酸塩が含まれる。「担体」という用語は、ビヒクル中のタンパク質ポリマーが哺乳動物対象に投与される、ビヒクルを指す。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、およびそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｍａｒｔｉｎ，１９７５を参照のこと）。
【００５７】
例示的な「希釈剤」には、滅菌液体、例えば、滅菌水、生理食塩水、および緩衝液（例えば、リン酸塩、トリス、ホウ酸塩、コハク酸塩、またはヒスチジン）が含まれる。例示的な「賦形剤」は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、炭水化物（例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、またはセルロース）、およびアルコール（例えば、グリセロール、ソルビトール、またはキシリトール）を含むがこれらに限定されない不活性物質である。
【００５８】
補助剤には、乳剤、微粒子、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）、ＬＰＳ、ＣｐＧ、またはＭＰＬが含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００５９】
本開示は、タンパク質の重合経路を制御するためにオリゴヌクレオチドを利用する方法を提供する。一本鎖またはヘアピンＤＮＡ修飾のいずれかを有するｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマー対の２つのセットを設計し、オリゴヌクレオチド配列を使用してこれら２つのシステムの重合を制御する方法を調べる（図１）。極低温電子顕微鏡（クライオＥＭ）技術を使用した生成物分布の特性評価は、ＤＮＡ結合事象の注意深い設計によって、高い選択性かつ意図的な形式で段階成長経路または鎖成長経路のいずれかを通した２つのモノマーセットの会合をプログラムすることができる方法を明らかにする。まとめると、本研究は、タンパク質の組み立て経路または原則として任意のナノスケールのビルディングブロックを、オリゴヌクレオチド相互作用を使用して細かく制御できる一般的な戦略を確立した。重要なことに、この手法により、制御可能な分子量分布およびリビング末端基を有するタンパク質ポリマーの合成が可能になった。これにより、正確な組成および複雑な構造を有するタンパク質ポリマーの合成が可能になり、かかる合成生体材料の範囲および機能が大幅に広がる。
【００６０】
実施例１
タンパク質−ＤＮＡモノマーの合成および特性評価。ＧＦＰを細菌発現システムで発現し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーを使用して精製した。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した試薬を用いた標準的な固相プロトコルを使用して、ＤＮＡを合成した。以下の配列を使用した：
【表１】
2022500442.tif 000003
【００６１】
ピリジルジスルフィド化学を使用して、１０倍過剰のピリジルジスルフィド末端ＤＮＡ（アミノ−ＤＮＡとスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートクロスリンカーとの反応によって調製される）を添加することにより、ＤＮＡをＧＦＰの表面チオールにコンジュゲートさせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーの特性評価から明らかなように（図２）、反応物を連続したＮｉ−ＮＴＡアフィニティーおよび陰イオン交換によって精製し、単一のＤＮＡ修飾を有するタンパク質モノマーが生成された。コンジュゲートのＵＶ−ｖｉｓスペクトルはまた、コンジュゲーションおよび精製の成功をサポートし、ＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートの２６０  ｎｍでの吸光度は、遊離ＤＮＡと比較して大きく上昇する。
【００６２】
タンパク質−ＤＮＡポリマーの組み立て。タンパク質ポリマーは、１ｘＰＢＳ＋０．５  Ｍ  ＮａＣｌ中、室温で、等モル比のＡおよびＢモノマー種を組み合わせ、続いて、一晩インキュベートすることによって組み立てた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析サイズ排除特性評価により、ＧＦＰ−ＤＮＡモノマーを分析した（図３）。
【００６３】
ＳＥＣおよびクライオＴＥＭによるタンパク質−ＤＮＡポリマーの特性評価。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ  ３００Åカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣを使用した分析ＳＥＣにより、ポリマーを特性評価した。結果は、生成物の分布が開始剤の濃度に依存することを示した（図４）。
【００６４】
クライオＴＥＭの特性評価は、ホーリーカーボンＴＥＭグリッドでＭａｒｋ  ＩＶ  ｖｉｔｒｏｂｏｔを使用して試料を検証することによって行った。Ｖｏｌｔａ位相板およびＫ２サミットカメラ（Ｇａｔａｎ）を備えたＪＥＯＬ３２００ＦＳで画像を収集した。構造の画像により、１Ｄポリマー材料への明確な組み立てが示され、分子量分布を推定することが可能となった。これにより、ヘアピンシステムの開始剤濃度に重合度が依存することが確認され、一本鎖ＤＮＡシステムの環状および線状生成物の分布が示された（図５）。
【００６５】
実施例２
タンパク質は、生物システムの中心的なビルディングブロックであり、明確に規定された構造および洗練された化学機能により、超分子材料の強力なシントンである。自然界における明確に規定された１、２、および３次元機能構造へのそれらの組み立ては、タンパク質の設計構造への組み立てを画策する努力を刺激している［Ｐｉｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．，Ｎａｔｕｒａｌ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１６，４５  （１），２４−３９；Ｍａｎｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７（２９），５３０６−５３２０］。しかしながら、タンパク質の組み立ては、その表面の化学的不均一性のために、合成的に制御することは困難であり、この目標に向けた大きな課題を表している［Ｐａｐａｐｏｓｔｏｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．２００９，５（７），７２３−７３２］。この課題に対処するために、本実施例では、タンパク質の組み立てを媒介し、タンパク質の表面上のＤＮＡ修飾が組み立ての結果を制御するように設計され得る方法についての基本的な理解するために、堅牢かつプログラム可能なＤＮＡ相互作用の使用を調べた［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，３４７（６２２４）］。
【００６６】
ＤＮＡをタンパク質の表面に結合するために、表面アミン（リジン）またはチオール（システイン）を、ＮＨＳ−エステル−アジド架橋剤およびシクロオクチン末端ＤＮＡとの反応、またはピリジルジスルフィド末端ＤＮＡとの反応のいずれかを通して、オリゴヌクレオチドと選択的に反応させることができる（図６）。最初に対処した重要な課題は、表面ＤＮＡ修飾を有するタンパク質（タンパク質−ＤＮＡコンジュゲート）を特徴付ける堅牢な分析戦略の開発であった。吸収分光法、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、溶液中のタンパク質：ＤＮＡ比、およびＤＮＡがタンパク質に共有結合しているのかまたは非特異的に吸着しているのかが決定される。円偏光二色性により、タンパク質のコンフォメーションが修飾によって破壊されないことが保証され、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、コンジュゲートの流体力学的サイズを評価することができる。
【００６７】
タンパク質表面の化学的不均一性のために、アミン基およびチオール基はしばしば、劇的に異なる空間分布で提示される。したがって、ＤＮＡコンジュゲーションの化学は、ＤＮＡ修飾の数および位置の両方を変化させ、コンジュゲーションの化学的性質、したがって、タンパク質表面でのＤＮＡの空間分布は、組み立ての結果に影響を与え得るのか？という疑問を引き起こす。この質問に答えるために、タンパク質の隅に局在する８個のシステイン残基と比較して３６個の均一に分布したリジン残基を有する酵素ベータ−ガラクトシダーゼ（βＧａｌ）を使用して、各残基をＤＮＡで別々に官能化することによって、タンパク質−ＤＮＡコンジュゲートを調製した。次いで、ＡｕＮＰベースの結晶組み立ては簡単に特性評価することができるために、これら２つのコンジュゲートを、相補的なオリゴヌクレオチド配列で官能化された金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と共組み立てし、その組み立て特性を調べた。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）およびＴＥＭ特性評価により、ＤＮＡコンジュゲーションの化学は、タンパク質周辺のＡｕＮＰの好ましい配置を変化させたが、リジンで官能化されたβＧａｌは、単純立方体ナノ粒子配列をもたらし、システインで官能化されたβＧａｌは、単純六方晶ＡｕＮＰ配置を好むことが明らかとなった（図６）［ＭｃＭｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９（５），１７５４−１７５７］。
【００６８】
ＤＮＡの配置がタンパク質の組み立てを変化させることができるというこの基本的な観察により、ＤＮＡ修飾部位の配置を合理的に制御することによって、一次元（１Ｄ）材料などの他のクラスのタンパク質構造にアクセス可能かどうかを調べることにつながった。これを行うために、βＧａｌのタンパク質配列を部位特異的突然変異誘発技術を使用して変更し、近くに位置するチオール基の対がタンパク質の上表面および下表面に専ら配置されるようにした。このタンパク質の官能化により、正確に４つのＤＮＡ修飾を有するコンジュゲートがもたらされ、相補的なビルディングブロックの温度依存関連研究により、タンパク質が向かい合った形式で相互作用したという強力な証拠が提供された（図７ａ）。ネガティブ染色およびクライオＴＥＭの両方を用いたこれらの組み立ての特性評価により、ＤＮＡ相互作用によって媒介される１Ｄタンパク質構造の形成が実証された（図７ｂ）［ＭｃＭｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（２２），６７７６−６７７９］。
【００６９】
１Ｄタンパク質組み立ては、多くの生体触媒用途にとって重要な材料であるが、分子スケールのモノマーとは対照的に、その分子量および構造の制御を大幅に阻害する形成メカニズムを制御することはできない。しかしながら、ＤＮＡを使用すると、重合に対するエネルギー障壁をその配列、したがって、コンフォメーションを通して精巧に制御でき、段階成長および鎖成長の両方の組み立て経路を設計することができる可能性を提供する。これを行うために、段階または鎖成長メカニズムのいずれかによって重合するように設計された一本鎖またはヘアピンＤＮＡのいずれかで官能化された、タンパク質ビルディングブロックの２つのセットを合成し、特性評価を行った。ＳＥＣおよびクライオＴＥＭの両方を使用したこれらのシステムの特性評価により、重合経路の違いについての強力な証拠、すなわち、段階成長システムについての環状および線状生成物分布、および鎖成長システムについての開始剤濃度に依存した重合度を有する専ら線状である生成物の観察が提供された（図７ｃ）。この研究は、タンパク質重合の経路（または任意のナノスケールビルディングブロック）を合理的に制御できる最初の例、およびタンパク質ポリマーの分子量に対する合成制御の最初の例を表している。さらに、この研究により、ブロックまたはブラシ状タンパク質ポリマーなどの現在アクセスできないタンパク質構造の合成が可能になる。
【００７０】
全体として、この実施例により、タンパク質を明確に規定された構造に組み立てる根本的に新しい戦略が実証され、コンジュゲーション化学、タンパク質配列、およびＤＮＡのコンフォメーションが、最終的な熱力学的組み立ておよびこれらのシステムにおける組み立て経路の両方を決定することにおける重要な設計パラメーターであることが示された。まとめると、本研究により、化学的に複雑なタンパク質間相互作用に換えて高度に調節されたＤＮＡ相互作用にする際のタンパク質組み立て分野の主要な課題が克服され、これにより、触媒作用および組織工学の用途で現在アクセスできないタンパク質構造の合成が可能になった。
【００７１】
実施例３
本明細書に記載されるように、本開示の態様のいずれかでは、タンパク質の会合経路を制御するためにオリゴヌクレオチドを利用する方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、重合に対するエネルギー障壁をプログラムするための配列特異的オリゴヌクレオチド相互作用の使用を含み、これにより、段階成長または鎖成長経路のいずれかにアクセスすることが可能なる。単一のＤＮＡ修飾を有する変異緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）−ＤＮＡモノマーの２つのセットを合成し、特性評価した。付加されたＤＮＡの意図的に制御された配列およびコンフォメーションに応じて、これらのモノマーは、段階成長または鎖成長経路のいずれかを通して重合することができる。Ｖｏｌｔａ位相板技術を使用した低温電子顕微鏡法により、オリゴマーおよびポリマー生成物、さらに、小さなｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの分布を視覚化することができる。段階成長ＤＮＡ設計では環状および線状ポリマー分布が観察されたが、鎖成長システムの場合では、線状鎖が専ら観察され、鎖長が開始剤鎖の濃度に依存することが認められた。重要なことに、鎖成長システムは、リビング特性を有しており、それにより、新鮮なモノマーを付加することで鎖を伸長することができる。本研究は、タンパク質組み立てに対する機械的制御の重要かつ初期の例を表し、それにより、構造に対する優れた制御を有する、オリゴマーおよびポリマータンパク質ベース材料を合成するための堅牢な方法論を確立する。
【００７２】
オリゴヌクレオチドの設計、合成、および精製。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した試薬および標準プロトコルを使用して、オリゴヌクレオチドを固体支持体上で合成した。生成物を、室温で１６時間、３０％ＮＨ3を使用して固体支持体から切断し、４５分にわたって酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中の０〜７５％アセトニトリルの勾配で逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。ＨＰＬＣ精製後、最終ジメトキシトリチル基を２０％酢酸中で２時間除去し、続いて酢酸エチルで抽出した。３−ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして使用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を使用して、オリゴヌクレオチドの質量を確認した。
【００７３】
鎖成長システムでは、以前に報告されたヘアピン配列を使用した［Ｄｉｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４，１０１（４３），１５２７５−１５２７８］。段階成長システムの場合、ＩＤＴオリゴアナライザー（ｏｌｉｇｏａｎｌａｙｚｅｒ）ツールを使用して配列を設計し、配列によって２５℃超の予測融解温度を示す二次構造要素が生じなくなるまで、単一ドメインの配列を繰り返した。
【００７４】
【表２】
2022500442.tif 000004
【００７５】
ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの合成および特性評価
ｍＧＦＰの発現および精製。前述した変異ＥＧＦＰ（ｍＧＦＰ）の遺伝子を含有する変異プラスミドを、熱ショックによりＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に形質転換し、細胞を１００μｇ／  ｍＬアンピシリンを有するＬＢ寒天プレート上で一晩増殖させた。単一のコロニーを選び、７ｍＬの培養物を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢブロス［Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（２９），９２６９−９２７４］中で３７℃で一晩増殖させた。これらの培養物を、１％グリセロールおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む、１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に添加し、細胞を３７℃で光学密度０．６まで増殖させ、次いで、０．０２  ｗｔ％アラビノースで１７℃で一晩誘導した。細胞を沈降させ（６０００ｇ、３０分間）、１００ｍＬの１ｘＰＢＳに再懸濁し、次いで高圧ホモジナイザーを使用して溶解した。細胞溶解物を３００００ｇで３０分間遠心分離することにより清澄化し、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ（商標）ＭｉｎｉＰｒｏｆｉｎｉｔｙ（商標）ＩＭＡＣカートリッジ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に充填した。カラムを１００ｍＬの再懸濁緩衝液で洗浄し、次いで２５０ｍＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。Ｍａｃｒｐ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＤＥＡＥ樹脂に充填し、２０ｍＬの１ｘＰＢＳで洗浄することにより、溶出した画分をさらに精製した。ｍＧＦＰを１ｘＰＢＳ＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌの溶液で溶出した。
【００７６】
ＤＮＡコンジュゲーション。ＤＮＡコンジュゲーションは、前述の方法［Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（２９），９２６９−９２７４］を使用して精製直後に行った。簡単に説明すると、アミン末端ＤＮＡ（３００ｎｍｏｌｅｓ）を、５０％ＤＭＦ、１ｘＰＢＳ＋１ｍＭＥＤＴＡ中の５０当量のＳＰＤＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ）クロスリンカーと室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＮＡＰ１０およびＮＡＰ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を連続して使用した２ラウンドのサイズ排除により、過剰なＳＰＤＰをＤＮＡから除去した。１０当量の得られたピリジルジスルフィド末端ＤＮＡを１．５ｍＬの２０μＭタンパク質溶液に添加し、反応を室温で１６時間進行させた。ヘアピンＤＮＡ−ｍＧＦＰコンジュゲーション反応では、ＳＰＤＰコンジュゲーション後であるがｍＧＦＰに添加する前に、ヘアピンＤＮＡを急冷した。これは、ＤＮＡ溶液を９５℃で４分間加熱し、次いで４℃で３分間加熱することから構成された。次いで、ＤＮＡ溶液を室温で５分間平衡化した後、タンパク質溶液に添加した。
【００７７】
ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの精製および特性評価。未反応のＤＮＡおよびタンパク質の両方の除去を確保するために、２段階のプロトコルを使用して、ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーを精製した。まず、試料をＮｉ−ＮＴＡカラムに充填し、３０ｍＬの１ｘＰＢＳで洗浄して、過剰なＤＮＡの除去を確保した。次いで、タンパク質試料を１ｘＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾールの溶液で溶出した。次いで、この溶出液をＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＤＥＡＥ樹脂に充填し、２０ｍＬの１ｘＰＢＳおよび１ｘＰＢＳ＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。続いて、ｍＧＦＰ−ＤＮＡコンジュゲートを１ｘＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌの溶液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、ＤＮＡコンジュゲーションおよび精製の成功を確保した。
【００７８】
サイズ排除特性評価。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ  ３００Åカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣを使用して、サイズ排除クロマトグラムを収集した。この研究で報告されるすべてのクロマトグラムは、２６０ｎｍでモニタリングされ、４８８ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光を用いた蛍光検出器を使用した。１ｍＬ／分の流量において５μＬの注入体積で、試料を測定した。モノマーの特性評価のために、試料を２〜５μＭの濃度で注入した。ポリマーの特性評価のために、試料を組み立ての濃度で注入した。
【００７９】
ポリマー組み立て
ポリマー組み立て条件。研究されたすべてのｍＧＦＰ−ＤＮＡポリマーは、１ｘＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の１μＭの各ビルディングブロック（２μＭの総タンパク質濃度）で室温で組み立てられた。提示するすべての特性評価データのために、試料を室温で分析前に最低１２時間インキュベートした。鎖成長システムでは、開始剤鎖を添加する前に、両方のモノマーを合わせて溶液中で混合した。このシステムでは、報告する開始剤の当量は、単一のビルディングブロックに対する当量を指す（例えば、０．４当量の開始剤では、試料は、０．４μＭ開始剤、１μＭ  ＨA、および１μＭ  ＨBを含有する）。
【００８０】
重合速度論的測定。速度論的測定は、ＳＥＣ注入の直前（約１５秒）に、開始剤を試料に添加し、この最初の注入後のモノマーピークの積分面積パーセントを初期重合速度の推定値として計算することによって行った。ここで報告されているエラーバーは、３回の測定からの標準偏差を報告する。
【００８１】
クライオＴＥＭ画像化
試料の凍および画像化。試料溶液を４００メッシュの１．２／１．３  Ｃ−Ｆｌａｔグリッド（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ）に堆積させ、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（商標）ＭａｒｋＩＶを使用して液体エタンに急速凍結した。Ｖｏｌｔａ位相板およびＯｍｅｇａエネルギーフィルターを備えた３００ｋＶで作動するＪＥＯＬ３２００ＦＳ顕微鏡を使用して、グリッドを画像化した。取得した画像において９０°の位相シフトが得られるように、顕微鏡を整列し、調整した。動画は、１．１オングストロームのピクセルサイズのカウントモードを使用して、０．１〜１．０μｍのデフォーカス範囲において、Ｋ２サミットカメラ（Ｇａｔａｎ）で取得した。使用された線量率は、約１０ｅ−／ｐｉｘ／秒（試料の平面上で８．３ｅ−／Å2／秒に相当する）であり、６秒間の総露光であった。
【００８２】
データ取得およびクラス平均データ処理。記録された１２本の動画に対して、ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２［Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１７，１４，３３１］を使用してモーション補正を行った。ＣＴＦＦＩＮＤ４［Ｒｏｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５，１９２（２），２１６−２２１］を使用したＣＴＦ推定後、さらに処理するために最高品質である８枚の顕微鏡写真を選択した。９６オングストロームのボックスサイズで約１５００個の粒子を選択し、抽出し、２次元分類をすべてＲＥＬＩＯＮ−２ソフトウェアパッケージ［Ｋｉｍａｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅＬｉｆｅ  ２０１６，５，ｅ１８７２２］内で行った。
【００８３】
ポリマーの長さ分布の分析。ＦｉｂｅｒＡｐｐ  ［Ｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１５，４８（５），１２６９−１２８０］を使用して、ポリマーの長さを分析した。画像のノイズレベルが比較的大きいため、ポリマーを視覚的に識別する必要があった。明確な開始点および終了点を識別することができる繊維状物のみをカウントし、分析された各画像において識別可能なすべての繊維をカウントした。ＦｉｂｅｒＡｐｐで分析する前に、画像を分類し（ｂｉｎｎｅｄ）、反転して、繊維を視覚化しやすくした。すべての試料について、２〜３枚の画像を分析して、２００超のポリマー計数を得た。次いで、ＦｉｂｅｒＡｐｐによって生成された計算された長さを、二本鎖ＤＮＡの塩基対間の距離（ｒｉｓｅ−ｐｅｒ−ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）に基づく以下の変換を使用して重合度（ＤＰ）に変換し、四捨五入して最も近い整数とした。
【数１】
2022500442.tif 000005
【００８４】
モノマーの設計および合成。ＤＮＡ媒介タンパク質重合の経路を指示するために、全体的な相補性は同じであるが重合のために存在するエネルギー障壁が異なる、ＤＮＡ配列の２つの異なるセットを設計した。段階成長プロセスに関与すると予想されるタンパク質モノマーのＤＮＡ設計（図１Ａ）は、最小の二次構造を有し、したがってモノマー会合のための最小のエネルギー障壁を有する、２つの４８塩基対（ｂｐ）鎖から構成される。段階成長モノマーの重合は、４８ｂｐのＤＮＡ配列の各々の二等分間の互い違いの相補的重複によって駆動される。したがって、一次元の交互するＡ鎖およびＢ鎖の不確定の会合が可能である。鎖成長重合経路（図１Ｂ）を実現させるために、モノマーが開始剤配列の結合まで速度論的に捕捉されたままであるＤＮＡ配列を利用した。この目的のために、開始剤配列の添加時に２つのヘアピンのセットが重合するように誘導することができるＤＮＡ反応スキームである、ハイブリダイゼーション連鎖反応を使用した。24ここでは、ヘアピンＡのループがヘアピンＢの足場（ｔｏｅｈｏｌｄ）に相補的であるように、１８ｂｐのステムおよび直交する６ｂｐの足場を有する２つの４８ｂｐヘアピンを使用した。開示剤鎖がヘアピンＡを開き、それにより、ヘアピンＢの足場に相補的なそのループ配列が露出し、これにより、ヘアピン開口のカスケードが誘導される場合にのみ、重合は起こる。全体として、使用されるＤＮＡ配列の各セットは、同じ長さおよび二重化パターンを有し、Ａ型配列およびＢ型配列の６５％が段階成長ＤＮＡと鎖成長ＤＮＡとの間で同じである（表１）。しかしながら、それらは、重合を開始するために必要な設計されたコンフォメーションおよび条件において異なる。
【００８５】
変異緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）をモデルシステムとして選択し、ＤＮＡ配列を使用してタンパク質モノマーの重合経路をプログラムする方法を検討した。そのモノマーオリゴマー形成状態および溶媒にアクセス可能なシステイン残基（Ｃ１４８）により、設計されたオリゴヌクレオチドの単一の修飾を有するタンパク質−ＤＮＡコンジュゲートを調製することが可能となる。研究されたすべてのシステムで、以前に公開された手順を使用することよって、ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーを調製した（説明については上記を参照）。23簡単に説明すると、過剰のピリジルジスルフィド官能化オリゴヌクレオチドをｍＧＦＰと共に一晩インキュベートし、続いて、陰イオン交換による精製によって未反応タンパク質を除去し、ニッケル親和性によって過剰なＤＮＡを除去した。一本鎖タンパク質−ＤＮＡコンジュゲート、ＳAおよびＳB、ならびにヘアピンタンパク質−ＤＮＡコンジュゲート、ＨAおよびＨBの両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、単一の４８ｂｐＤＮＡ修飾の取り込みと一致する、電気泳動移動度が低減した単一のタンパク質バンドが明らかにされた（図８）。重要なことに、ＨAおよびＨBの両方は、使用したヘアピン配列から得られたよりコンパクトなＤＮＡ高次構造と一致する、ＳAおよびＳBよりもわずかに高い移動度を示した。さらに、コンジュゲートのＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより、各タンパク質へのＤＮＡの一本鎖のコンジュゲーションと一致する、ｍＧＦＰ発色団の吸光度（４８８ｎｍ）とＤＮＡの吸光度（２６０ｎｍ）との比率が明らかにされた（図９）。最後に、すべてのモノマーの分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、予想される質量の増加を確認した別個のピークが示され、遊離ＤＮＡまたは凝集タンパク質の不存在が示された（図１０）。まとめると、これらのデータにより、目的のタンパク質−ＤＮＡコンジュゲートの合成および精製が明確に確認された。重要なことに、各組の合成されたモノマーは、それらの総質量がほぼ同じであり、結合されたＤＮＡ鎖は、ＡモノマーとＢモノマーとの間で、ＤＮＡ修飾のコンフォメーションのみが異なる、同じの互い違いの相補性を有する。したがって、本研究から得られた１つの結論は、配列のこの小さな違い、およびそれによるタンパク質が付加されたＤＮＡのコンフォメーションが、自発的な段階成長プロセスの間の基礎となるモノマー重合経路を、鎖成長プロセスの開始へと変えることである。
【００８６】
段階成長重合。最初に、ｍＧＦＰの凝集状態を特徴付ける有効な方法として分析ＳＥＣを使用して、一本鎖ｍＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの重合を研究した。等モル量のＳAおよびＳBモノマーの組合せおよび室温での一晩インキュベーションにより、ほぼ完全なモノマー消費を示すサイズ排除プロファイル、およびより高次の凝集体（図１１Ｃ）の存在が得られた。溶液中の種の大部分は使用するカラムの排除限界を超えていたが、低分子量種も存在していた。数日後であっても試料に残った低分子量種は、環状生成物の存在を示唆した。
【００８７】
生成物の分布の特性評価をより良く行うために、試料をクライオＥＭによって分析して、可能な環状生成物を含む生成物分布の直接的特性評価および定量化を行うことができた。二本鎖ＤＮＡ骨格を通して接続されたクライオＥＭによって日常的に視覚化されるタンパク質よりもはるかに小さいタンパク質であるｍＧＦＰモノマーから構成される種の決定的な識別を可能にするのに十分なコントラストの画像を取得することは簡単ではない。実際に、直接電子検出器カメラを用いて大きなデフォーカスを使用した場合であっても、合成された構造をほとんど識別することができなかった（図１２、１３）。これらの画像におけるコントラストを改善するために、散乱電子ビームを位相シフトする連続した炭素薄膜であるＶｏｌｔａ位相板を使用し、インフォーカス位相コントラストを高め、それにより、画像の信号対雑音比を大幅に向上させる。25~27位相板により、二本鎖ＤＮＡ骨格を明確に視覚化でき、特定の画像では、ｍＧＦＰに対応する電子密度の小さなスポットを視覚化することもできた（図１１Ｂ、１１Ｄ）。顕微鏡写真により、繊維分析ソフトウェアを使用して定量化された線状および環状生成物の混合物が明確に明らかにされた（図１４）。28この分析により、末端相補性オーバーハングの鎖間ハイブリダイゼーションを通して形成された環状生成物が、生成物分布全体の２８数パーセント（ｎｕｍｂｅｒ  ｐｅｒｃｅｎｔ）を占めていることが明らかになった。サイクル円周の定量化により、形成された支配的な環状生成物（１５数パーセント）がＳAおよびＳBの二量化を通したものであると決定することができた。
【００８８】
環状オリゴマーは、成長中のポリマー鎖の両端が反応性であり、したがって環化の可能性がある段階成長メカニズムを経る、共有結合重合および超分子重合の両方の一般的に観察される副生成物である。確かに、環状生成物の存在は、同様の互い違いのＤＮＡ設計を有するＤＮＡのみの重合システムで確認されているが、直接観察されてはいない。29直径１５ｎｍの４８ｂｐ環状ダイマーが支配的な環状生成物の観察された分布は、広く報告されているＤＮＡの持続長が約５０ｎｍであることを考えると、最初は驚くべきことに思われる。30~32しかしながら、その持続長を大きく下回る二本鎖ＤＮＡの屈曲が報告されている。６３ｂｐｓ長の短いＤＮＡは、環化の際にハイブリダイズする１０ｂｐの一本鎖オーバーハング領域を含む二本鎖の場合では自発的に環状構造を形成することが示され（このシステムでは２４ｂｐｓと比較）、33~35、鋳型指向性連結アプローチは、４２ｂｐｓの小さいニックのないサイクルが生ずることが報告されている。36さらに、鋭く屈曲したＤＮＡは、ＤＮＡニック部位を形成する38ニックの存在によって説明することができる。37興味深いことに、環状ダイマーは、円形コンフォメーションおよびより扁平なコンフォメーションの両方で観察することができ、ここでは、鋭いＤＮＡの屈曲がニック部位で起こっているようである（図１１Ｄ）。
【００８９】
使用したクライオＥＭ技術により、一本鎖ＤＮＡ修飾を有するｍＧＦＰモノマーに起因する生成物の徹底的な特性評価が可能となり、設計された段階成長形成プロセスと一致する分布を示す。このＥＭ研究により、位相板技術と組み合わせたクライオＥＭが、鋭く屈曲したＤＮＡのコンフォメーションを容易に観察し、かつ、小さなＤＮＡミニサークルのトポロジーに対する洞察を与える強力なプラットフォームであることも示唆された。39
【００９０】
鎖成長重合。ＤＮＡが、タンパク質の自発的重合を媒介して、段階成長プロセスと一致する生成物分布をもたらすことができることを示したので、この研究の包括的仮説：タンパク質−モノマー重合の基礎となる経路を付加ＤＮＡ配列の二次構造によって制御することができ、次いで、これが重合に対するエネルギー障壁を制御すること、を次に試験した。まず、ＨAおよびＨBモノマーを、段階成長システムで研究された条件と同じの条件下で混合し、ヘアピンＤＮＡ設計が所望のようにモノマーの自発的重合を阻害するかどうかを試験した。実際、室温で１週間インキュベートした後であっても、個々のモノマーと区別がつかないＳＥＣプロファイルが観察された（図１５Ｂ、図１６）。さらに、任意の重合種が存在しないことがククライオＥＭ画像から明らかであった（図１５Ｃ）。ｍＧＦＰ−ヘアピンモノマーの構造は検査時にすぐには明らかではないが、約２５０個の粒子の２次元クラス平均は、ｍＧＦＰおよびヘアピン付加物の両方に対応する電子密度を明確に示している（図１５Ｃ、挿入図、図１７）。重要なことに、タンパク質の会合を制御するためにハイブリダイゼーション連鎖反応を適用する以前に報告された試みは、熱的に不安定なタンパク質にコンジュゲートされたヘアピンのアニーリングの困難性のために失敗した。40しかしながら、ここでは、上記のタンパク質コンジュゲーション反応前にヘアピンＤＮＡを急冷することによって、この問題を回避した。
【００９１】
ＳＥＣによって証明されるように、開始剤鎖の添加により、ＧＦＰ−ＤＮＡモノマーの重合が誘導される（図１５Ｅ）。モノマーに関して開始剤鎖の当量を変化させることにより、ＳＥＣによって観察された凝集体の分子量分布が劇的に変化する（図１５Ｅ）。定性的に、これらのクロマトグラムは、開始剤の当量が増加するにつれて分子量分布が減少し、より高い開始剤濃度でカラムの排除限界未満の種がより顕著になり、これは鎖成長重合プロセスと一致していることを示す。これらの試料のクライオＥＭ分析により、この変化を定量化することができた。１から０．４当量の開始剤で、それぞれ、３．７および４．９から６．９および１０．２単位への重合度の数平均および重量平均の両方の安定した増加が観察された（図１５Ｄ−Ｇ）。重要なことに、これらの画像により、段階成長システムで観察された大集団の環状生成物とは非常に対照的に、試験されたすべての開始剤濃度に対して線状生成物のみが存在することも明らかになった。鎖成長プロセスにより成長するポリマーは、一本鎖「活性末端」を１つのみ含み、他方の末端は開始剤で完全に二重化されたままであるため、環化事象に速度論的にアクセスできない。したがって、環状種および線状種の両方の混合物から完全に線状への、生成物分布のこの変化は、ポリマー形成経路の変化を反映している。モノマー消費の初期速度もＳＥＣにより推定し、該モノマー消費は開始剤濃度の増加と共に増加し、これは分子スケールでの鎖成長経路のもう１つの重要な特性である（図１５Ｇ）。さらに、システムの生成物分布は、分子重合技術と同様に、開始剤添加のタイミングを変えることによってもシフトし得る。41１当量の開始剤を２５分または７５分にわたって５つのアリコートで添加したとき、大きな割合の高分子量生成物を有するＳＥＣプロファイルが観察され、５ｍＬ未満の保持体積で溶出する化学種の割合が、２７％からそれぞれ３１％および４３％のｍＧＦＰ蛍光シグナルの全積分面積に増加した（図１８）。これは、ハイブリダイゼーション連鎖反応によるタンパク質重合の指示により、得られるタンパク質ポリマーの分子量および多分散性の両方を制御することができることを示唆している。
【００９２】
最終的に、このシステムは、理想的な鎖成長重合とはいくつかの重要な違いを示した。理想的な鎖成長反応では、開始速度は成長に比べて速く、Ｍn＝［Ｍ］0／［Ｉ］である。しかしながら、このシステムでは、Ｍnは、［Ｍ］0／［Ｉ］から予測されるよりもはるかに大きく、モノマーが枯渇する前に開始反応が完了しないことを示唆している。開始速度が成長速度よりもはるかに速い原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）42などの典型的な鎖成長プロセスとは対照的に、このシステムでの開始速度は、ＤＮＡの観点からのこれら２つの反応の同じの化学的性質に起因して、成長速度と同様である可能性がある。さらに、０．６当量未満の開始剤濃度を用いると、変換が約９０％から７４％に低下することが観察され、これは数週間後も継続した。これらの結果を同じ条件下で重合された遊離ＤＮＡシステムと比較して、０．４当量の開始剤ではモノマーのほぼ完全な消費（９０％）が観察されたが、これは、低開始剤濃度で観察された不完全な変換が、熱力学の結果ではなく、質量移動または鎖末端のアクセスのしやすさの問題であり得ること示唆し、これは将来の調査の対象である（図１９）。  
【００９３】
鎖伸長。特定のクラスの共有結合および超分子鎖成長重合は、鎖停止事象がないリビング特性を示す。これらのシステムでは、活性な鎖末端が無期限に続くため、ポリマー試料に新しいモノマーを添加することにより、モノマーが消費され、続いて、ポリマー試料の分子量分布が増加する。本明細書で使用されるハイブリダイゼーション連鎖反応は、リビング重合特性を有することが提案されており24、ＤＮＡ配列に基づいて、鎖停止または組み合わせ事象は可能ではないはずである。したがって、鎖成長システムのリビング特定を試験するために、ＨAおよびＨBの重合溶液を、開始剤を含有しない等しい体積の準安定モノマー溶液に、０．６当量の開始剤と共に添加した。ポリマーの添加後の溶液中のモノマー画分をモニタリングすることにより、経時的なモノマーの消費がＳＥＣにより観察され（図３、２０）、これは、重合が継続していることを示し、鎖の伸長を示唆している。新鮮なモノマーの添加後の分子量分布の変化を特徴付けるために、この試料についてクライオＥＭ分析を行ったところ、数平均重合度および重量平均重合度が、それぞれ、５．４から７．３、６．７から１３．６に大幅に増加したことが明らかになった。これは、ＳＥＣにより観察されたモノマー消費が新鮮なモノマーと反応する過剰な開始剤鎖の結果のみである可能性を排除し、本明細書で報告されたタンパク質のＤＮＡ媒介鎖成長重合がリビング特性を有することを明確に示した。
【００９４】
結論自然界の非常に複雑で機能的なポリマー構造へのタンパク質の組み立てプロセスにおいて観察された複雑性は、合成空間では比類のないものである。設計されたタンパク質重合経路の制御の最初の実証を提供することによって、この方向への最初のステップが本明細書で報告されている。本研究により、触媒作用、センシングおよび組織工学用途、ならびに医薬品開発の重要な材料標的を表し得る、配列が規定された、マルチブロックのブラシ状および分枝状のタンパク質ポリマー構造を含む、現在アクセスできないタンパク質構造の実現が可能になる。本願明細書で報告された研究は、タンパク質ポリマーの生成物分布に対する前例のない制御を構成し、それらの物理的および化学的特性を体系的に調査および制御するための扉を開くものである。まとめると、本研究は、ＤＮＡを使用して、ナノスケールのビルディングブロックのエネルギーランドスケープを正確に調整し、それにより、その組み立て経路を正確に調整する方法の強力な実証として存在し、まったく新しいクラスのタンパク質ベースの材料を合成するための扉を開くものである。
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【図１】
2022500442.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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