【手続補正書】
【提出日】平成22年4月23日(2010.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、および
ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
【請求項２】
ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、および
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
【請求項３】
２−ブタノールを生産するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、および
ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭
素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項４】
２−ブタノンを生産するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、および
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により生産される、２−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
【請求項６】
請求項４に記載の方法により生産される、２−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
以上、本発明を要約すると下記のとおりです。
１．ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、および
ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへ
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
２．ｉ）ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、および
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
３．ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
４．α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
５．アセトインから２，３−ブタンジオールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタンジオール脱水素酵素である、上記１または２に記載の宿主細胞。
６．２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
７．２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記１に記載の宿主細胞。
８．細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、上記１または２に記載の宿主細胞。
９．細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記８に記載の宿主細胞。
１０．アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記３に記載の宿主細胞。
１１．アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記４に記載の宿主細胞。
１２．ブタンジオール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号６、配列番号８５、配列番号８７、および配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記５に記載の宿主細胞。１３．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、配列番号８、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、および１６４の大型サブユニット、配列番号１０、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、および１６５の中型サブユニット、ならびに配列番号１２、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、および１６６の小型サブユニットを用いて作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを用いてクエリーが実行される場合に、０．０１以下のＥ値パラメータを各々与える全長の大型、中型および小型サブユニットを含み、各クエリーがｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを用いて実行され、ここで、Ｚパラメータが１０億に設定される、上記６に記載の宿主細胞。
１４．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、
ａ）ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素の大型、中型および小型サブユニットに対応するアミノ酸配列のアラインメントからプロファイル隠れマルコフモデルを生成させ、ここで、
ｉ）大型サブユニットが配列番号８、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、および１６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）中型サブユニットが配列番号１０、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、および１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
ｉｉｉ）小型サブユニットが配列番号１２、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ）ｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを用いて、（ａ）のプロファイル隠れマルコフモデルを用いてジオールおよびグリセロールデヒドラターゼの配列を有するタンパク質配列における少なくとも１つの公的データベースにクエリーを実行し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第１のデータセットを同定し、ここで、Ｚパラメータが１０億に設定されかつＥ値パラメータが０．０１に設定され、そして
ｃ）（ｂ）の第１のデータセットから任意の部分配列を取り出し、ジオールおよびグリ
セロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第２のデータセットを生成させ、ここでジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素が同定される、
ステップを含むプロセスによって同定される、上記６に記載の宿主細胞。
１５．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号８、９３、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、１３０、２４３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８および２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む大型サブユニットを含む、上記６に記載の宿主細胞。
１６．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１０、９５、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２４４、２５０、２５２、２６０、２６１、２６２、２６３、３６４、２６５、２６６、および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む中型サブユニットを含む、上記６に記載の宿主細胞。
１７．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２、９７、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４５、２４８、２４９、２５１、２５３、２６８、２７０、２７１、２７２、２７３、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む小型サブユニットを含む、上記６に記載の宿主細胞。
１８．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４６、および２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合された大型、中型および小型サブユニットを含む、上記６に記載の宿主細胞。
１９．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、融合された大型、中型および小型サブユニットを含み、かつ、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、
ａ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２、
ｂ）配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９７、
ｃ）配列番号９９、配列番号１０１、および配列番号１０３、
ｄ）配列番号１０５、配列番号１０７、および配列番号１０９、
ｅ）配列番号１３５、配列番号１３６、および配列番号１３７、
ｆ）配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０、
ｇ）配列番号１４６、配列番号１４８、および配列番号１５０、
ｈ）配列番号１４１、配列番号１４２、および配列番号１４３、および
ｉ）配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６、
からなる群から選択される大型、中型および小型サブユニットをコードするアミノ酸配列の３つ全てを含むアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、上記６に記載の宿主細胞。
２０．ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記８に記載の宿主細胞。
２１．２−ブタノールを生産するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、および
ｖ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
２２．２−ブタノンを生産するための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから２，３−ブタンジオールへ、および
ｉｖ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
２３．発酵可能な炭素基質が単糖、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される、上記２１または２２に記載の方法。
２４．ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記２１または２２に記載の方法。
２５．α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記２１または２２に記載の方法。
２６．アセトインから２，３−ブタンジオールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタンジオール脱水素酵素である、上記２１または２２に記載の方法。
２７．２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼである、上記２１または２２に記載の方法。
２８．２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記２１に記載の方法。
２９．細胞が細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、上記２１または２２に記載の方法。
３０．細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディ
オコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記２９に記載の方法。
３１．アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２４に記載の方法。
３２．アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２５に記載の方法。
３３．ブタンジオール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号６、配列番号８５、配列番号８７、および配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２６に記載の方法。
３４．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、配列番号８、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、および１６４の大型サブユニット、配列番号１０、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、および１６５の中型サブユニット、ならびに配列番号１２、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、および１６６の小型サブユニットを用いて作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを用いてクエリーが実行される場合に、０．０１以下のＥ値パラメータを各々与える全長の大型、中型および小型サブユニットを含み、各クエリーがｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを用いて実行され、ここで、Ｚパラメータが１０億に設定される、上記２７に記載の方法。
３５．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、
ａ）ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素の大型、中型および小型サブユニットに対応するアミノ酸配列のアラインメントからプロファイル隠れマルコフモデルを生成させ、ここで、
ｉ）大型サブユニットが配列番号８、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、および１６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）中型サブユニットが配列番号１０、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、および１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
ｉｉｉ）小型サブユニットが配列番号１２、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ）ｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを用いて、（ａ）のプロファイル隠れマルコフモデルを用いてジオールおよびグリセロールデヒドラターゼの配列を有するタンパク質配列における少なくとも１つの公的データベースにクエリーを実行し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第１のデータセットを同定し、ここでＺパラメータが１０億に設定されかつＥ値パラメータが０．０１に設定され、そして
ｃ）（ｂ）の第１のデータセットから任意の部分配列を取り出し、ジオールおよびグリセロールデヒドラターゼのアミノ酸配列の第２のデータセットを生成させ、ここでジオールデヒドラターゼおよびグリセロールデヒドラターゼ酵素が同定される、
ステップを含むプロセスによって同定される、上記２７に記載の方法。
３６．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号８、９３、９９、１０５、１３５、１３８、１４１、１４６、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８、１９１、１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、１３０、２４３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８および２５９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む大型サブユニットを含む、上記２７に記載の方法。
３７．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１０、９５、１０１、１０７、１３６、１３９、１４２、１４８、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９、１９２、１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２４４、２５０、２５２、２６０、２６１、２６２、２６３、３６４、２６５、２６６、および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む中型サブユニットを含む、上記２７に記載の方法。
３８．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２、９７、１０３、１０９、１３７、１４０、１４３、１５０、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４５、２４８、２４９、２５１、２５３、２６８、２７０、２７１、２７２、２７３、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む小型サブユニットを含む、上記２７に記載の方法。
３９．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４６、および２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合された大型、中型および小型サブユニットを含む、上記２７に記載の方法。
４０．ジオールデヒドラターゼまたはグリセロールデヒドラターゼが、融合された大型、中型および小型サブユニットを含み、かつ、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、
ａ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２、
ｂ）配列番号９３、配列番号９５、および配列番号９７、
ｃ）配列番号９９、配列番号１０１、および配列番号１０３、
ｄ）配列番号１０５、配列番号１０７、および配列番号１０９、
ｅ）配列番号１３５、配列番号１３６、および配列番号１３７、
ｆ）配列番号１３８、配列番号１３９、および配列番号１４０、
ｇ）配列番号１４６、配列番号１４８、および配列番号１５０、
ｈ）配列番号１４１、配列番号１４２、および配列番号１４３、および
ｉ）配列番号１６４、配列番号１６５、および配列番号１６６、
からなる群から選択される大型、中型および小型サブユニットをコードするアミノ酸配列の３つ全部てを含むアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、上記２７に記載の方法。
４１．ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２８に記載の方法。
４２．上記２１に記載の方法により生産される、２−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
４３．上記２２に記載の方法により生産される、２−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
実施例１
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸シンターゼ酵素をコードするｂｕｄＢ遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。ＰＣＲを用い、ｂｕｄＢ遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅した。
アセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ配列を、プライマー対のＢ１（配列番号１５）およびＢ２（配列番号１６）を用いるＰＣＲにより、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ２５９５５）のゲノムＤＮＡから増幅した。他のＰＣＲ増幅試薬（例えばＫｏｄ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）；カタログ番号７１８０５−３））は製造業者のキットで供給されたものであり、それらを製造業者のプロトコルに準じて使用した。クレブシエラ・ニューモニエのゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用いて調製した。増幅をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ）のＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で行った。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列は各々、配列番号３および配列番号４として示される。