(57)【要約】  本開示は、核酸送達のための、第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はリピトイドなどの脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む脂質混合物に関する。より具体的には、本開示は、脂質化カチオン性ペプチド化合物、並びに構造脂質、リン脂質及び遮蔽脂質を含む他の脂質成分を含む脂質ナノ粒子製剤に関する。本開示はまた、脂質混合物を調製及び使用する方法に関する。【選択図】図５
2022502451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のポリアニオン性化合物と；
脂質成分との複合体を含む組成物であって、ここで、脂質成分が、以下：
（ｉ）任意選択で１つ又は複数の構造脂質；
（ｉｉ）１つ又は複数のリン脂質；
（ｉｉｉ）１つ又は複数の遮蔽脂質；及び
（ｉｖ）１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物
を含み、ここで、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物が、以下：
（ａ）式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩：
2022502451.tif 000089
［式中：
ｍは、０から１０までの整数であり；
ｎは、０から５までの整数であり；
ｓは、０から５までの整数であり；
ｔは、０から１０までの整数であり；
ここで、ｍ、ｎ、ｓ、及びｔのうちの少なくとも１つは非ゼロであり；
ｒは、１から２０までの整数であり；
各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｐは、独立して、１又は２の整数であり；
Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ又は脂質部分であり、
ここで、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、又は−Ｏ−アルキルアリールであり；
各Ｒ２は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｕは、独立して、２から２００までの整数であり；
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり；
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分又は脂質部分であり；
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり；
各Ｒ６は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｖは、独立して、２から２００までの整数であり；
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、又は脂質部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分であり；かつ
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又は天然若しくは非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である］；
（ｂ）式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイド：
2022502451.tif 000090
［式中：
ｘは、１から１００までの整数であり；
各Ｒ９は、独立して、脂質部分であり；かつ
各Ｒ１０は、独立して、カチオン性又は中性スペーサー部分である］；
及び
（ｃ）それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物が、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ｎ又はｓの少なくとも１つが非ゼロである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、Ｎ−脂質化アミノ酸残基のブロックを含み、ここで、ｎ及びｓの少なくとも１つは、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４であり、任意選択で、２、３、又は４である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
各Ｒ３が、独立して、Ｃ４−Ｃ２２−アルキル又はＣ４−Ｃ２２−アルケニルであり、ここで、Ｃ４−Ｃ２２−アルケニルが、任意選択でモノ又はポリ不飽和である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
各Ｒ３が、独立して、Ｃ８−Ｃ１２アルキルである、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
各Ｒ３が、独立して、２−エチルヘキサ−１−イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の少なくとも１つが、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
各Ｒ５が、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ−ヘテロシクリルアルキル、又はＮ−ヘテロアリールである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
各Ｒ５が、独立して、
2022502451.tif 000091
からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
各Ｒ５が、
2022502451.tif 000092
である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
各中性スペーサー部分Ｒ４が、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１−Ｃ４−アルキルであり、ここで、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルは、１つ又は複数の置換基−ＯＨ、ハロ、又はアルコキシで置換されていてもよい、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
各中性スペーサー部分Ｒ４が、独立して、
2022502451.tif 000093
からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
各中性スペーサー部分Ｒ４が、
2022502451.tif 000094
である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の少なくとも１つが、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つのアミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含み、ここで、そのカチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基のそれぞれが、中性スペーサー又は脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つのアミノ酸残基によって隔てられている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、少なくとも１つの三量体サブユニット−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性を含み、ここで、Ｒカチオンは、カチオン性部分Ｒ５を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分Ｒ４を含むアミノ酸残基である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
各カチオン性部分Ｒ５が、
2022502451.tif 000095
であり、各中性スペーサー部分Ｒ４が、
2022502451.tif 000096
である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ｍが０から３までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２０から２００までの整数、任意選択で３０から５０までの整数であり；かつ
ｍが４から１０までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２から１０までの整数である
請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ｔが０から３までの整数であるとき、各ｖは、独立して、３０から５０までの整数であり；
ｔが４から１０までの整数であるとき、各ｖは、独立して、２から１０までの整数である
請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ｍが１であり、ｕが４０から４５までの整数であるか；又は
ｔが１であり、ｖが４０から４５までの整数である
請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｒａ及びＲｂが、独立して、−Ｈ及び−ＣＨ３からなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｒａ及びＲｂが、−Ｈである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物が、式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドが、リピトイド１である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
脂質成分の総重量の０−４０％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
脂質成分の総重量の０−２５％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
１つ又は複数の構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
１つ又は複数の構造脂質がコレステロールである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
脂質成分の総重量の１０−６０％ｗ／ｗの１つ又は複数のリン脂質を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
脂質成分の総重量の２０−４０％ｗ／ｗの１つ又は複数のリン脂質を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
１つ又は複数のリン脂質が、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ  １６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
１つ又は複数のリン脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
脂質成分の総重量の１−５％ｗ／ｗの１つ又は複数の遮蔽脂質を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数のＰＥＧ脂質である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の組成物：
2022502451.tif 000097
［式中：
ｍは、０から１０までの整数であり；
ｎは、０から５までの整数であり；
ｓは、０から５までの整数であり；
ｔは、０から１０までの整数であり；
ここで、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロであり；
ｒは、１から２０までの整数であり；
各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｐは、独立して、１又は２の整数であり；
Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ又は脂質部分であり、
ここで、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、又は−Ｏ−アルキルアリールであり；
各Ｒ２は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｕは、独立して、２から２００までの整数であり；
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり；
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分又は脂質部分であり；
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり；
各Ｒ６は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｖは、独立して、２から２００までの整数であり；
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、又は脂質部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分であり；かつ
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又は天然若しくは非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である］。
【請求項３９】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含み、ここで、
ｍが０から３までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２０から２００までの整数、任意選択で３０から５０までの整数であり；かつ
ｍが４から１０までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２から１０までの整数である
請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含み、ここで、
ｔが０から３までの整数であるとき、各ｖは、独立して、３０から５０までの整数であり；
ｔが４から１０までの整数であるとき、各ｖは、独立して、２から１０までの整数である
請求項３８又は請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含み、ここで、
ｍが１であり、ｕが４０から４５までの整数であるか；又は
ｔが１であり、ｖが４０から４５までの整数である
請求項３８から４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
脂質成分が、脂質成分の総重量の
ａ．４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物；
ｂ．０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；
ｃ．２０−４０％ｗ／ｗの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）
及び
ｄ．１−５％ｗ／ｗの１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）
を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
コレステロールとＤＯＰＥとの質量比が、０．５：１から１：１の間である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
１つ又は複数のポリアニオン性化合物が、核酸を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
１つ又は複数のポリアニオン性化合物が核酸を含み、該核酸がポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
１つ又は複数のポリアニオン性化合物が核酸を含み、該核酸がタンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比が、２：１から２５：１の間である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比が、５：１から１０：１の間である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
１つ又は複数の小分子活性剤又は原体を含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
細胞を、請求項１から４９のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法。
【請求項５１】
接触がエンドサイトーシスによるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
ポリアニオン性化合物が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞が複合体と接触した後に該ポリペプチドを発現する、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ポリアニオン性化合物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞が複合体と接触した後に該タンパク質を発現する、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と組み合わせることを含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
【請求項５６】
１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む溶液を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物を含む溶液と接触させることを含む、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３８７１７号及び２０１９年８月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８８５０３６号の優先権及び利益を主張し、それらの各々の開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、一般に、脂質化カチオン性ペプチド化合物及び他の脂質成分とポリアニオン性化合物との複合体を含む多成分脂質組成物に関する。より具体的には、本開示は、脂質化カチオン性ペプチド化合物が、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物及び／又はリピトイドを含む、多成分脂質製剤に関する。本開示はまた、本明細書に記載の多成分脂質組成物を調製する方法、及び細胞への核酸の送達のために脂質組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子治療は、医学の分野に革命を起こすことが期待される依然として有望な技術である。しかしながら、現在の慣例では、再現性があり効率的な方法で核酸物質を患者の細胞に送達する能力は、遺伝子治療法の実行可能性、ひいては広範な採用に対する大きな障害となっている。この重要な要件は、例えば、ウイルスベクターの使用、又は単一の（独立した）化合物送達ビヒクル若しくは核酸物質との電荷複合体形成のための多成分リポソーム製剤を利用する非ウイルス法を介するものを含む、多くの異なる手法によって様々な成功を収めてきた。ウイルスベクターは通常、非ウイルス組成物よりも効率的かつ選択的な核酸物質の細胞への送達を示すが、大規模生産を容易にし、宿主の免疫原性を低下させるために、非ウイルス手法が好ましい。
【０００４】
その結果、改善された送達効率を有する非ウイルス送達ビヒクル及び製剤を開発するための努力がなされている。しかしながら、上記の非ウイルス手法の両方に対する前向きな見通しにもかかわらず、所望される適用のための非ウイルス組成物のより広い適応性、又は少なくとも、既存の送達ビヒクルの最適化におけるより優れた単純化を可能にするという観点で、依然として改善の余地がたくさんある。
【０００５】
実用的な治療応用のための、細胞への遺伝物質の挿入は、各状況において送達される核酸の種類に大きく依存するため、様々な種類の核酸物質の様々な異なる標的への送達をサポートする柔軟性を有し、かつ任意の所与の遺伝子カーゴ及び／又は細胞標的に対してより容易に最適化することができる、新しい送達ビヒクル及び／又は製剤が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、改善された効率で核酸を送達するための脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質組成物を提供する。
【０００７】
一態様では、本開示は、
１つ又は複数のポリアニオン性化合物と；
脂質成分との複合体を含む組成物を提供し、ここで脂質成分は、以下：
（ｉ）任意選択で１つ又は複数の構造脂質；
（ｉｉ）１つ又は複数のリン脂質；
（ｉｉｉ）１つ又は複数の遮蔽脂質；及び
（ｉｖ）１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物
を含み、ここで、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、以下：
（ａ）式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩：
2022502451.tif 000003
［式中：
ｍは、０から１０までの整数であり；
ｎは、０から５までの整数であり；
ｓは、０から５までの整数であり；
ｔは、０から１０までの整数であり；
ここで、ｍ、ｎ、ｓ、及びｔのうちの少なくとも１つは非ゼロであり；
ｒは、１から２０までの整数であり；
各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｐは、独立して、１又は２の整数であり；
Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ又は脂質部分であり、
ここで、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、又は−Ｏ−アルキルアリールであり；
各Ｒ２は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｕは、独立して、２から２００までの整数であり；
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり；
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分又は脂質部分であり；
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり；
各Ｒ６は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｖは、独立して、２から２００までの整数であり；
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、又は脂質部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分であり；かつ
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又は天然若しくは非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である］；
（ｂ）式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイド：
2022502451.tif 000004
［式中：
ｘは、１から１００までの整数であり；
各Ｒ９は、独立して、脂質部分であり；かつ
各Ｒ１０は、独立して、カチオン性又は中性スペーサー部分である］；
及び
（ｃ）それらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される。
【０００８】
この態様のいくつかの実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。特定の実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。
【０００９】
前述の実施態様の１つ又は複数と組み合わせることができる特定の実施態様では、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩である。前述の実施態様の１つ又は複数と組み合わせることができる特定の実施態様では、ｎ又はｓの少なくとも１つは非ゼロである。前の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化アミノ酸残基のブロックを含み、ここで、ｎ及びｓの少なくとも１つは、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４であり、任意選択で、２、３、又は４である。他の前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができる前述の実施態様の他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、Ｃ４−Ｃ２２−アルキル又はＣ４−Ｃ２２−アルケニルであり、ここで、Ｃ４−Ｃ２２−アルケニルは、任意選択でモノ又はポリ不飽和である。他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、Ｃ８−Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、２−エチルヘキサ−１−イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される。
【００１０】
本態様のいくつかの実施態様では、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の少なくとも１つは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含む。前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる他の実施態様では、各Ｒ５は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ−ヘテロシクリルアルキル、又はＮ−ヘテロアリールである。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができる特定の実施態様では、各Ｒ５は、独立して、
2022502451.tif 000005
からなる群から選択される。さらに他の実施態様では、各Ｒ５は、
2022502451.tif 000006
である。
【００１１】
本態様のさらに他の実施態様では、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１−Ｃ４−アルキルであり、ここで、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルは、１つ又は複数の置換基−ＯＨ、ハロ、又はアルコキシで置換されていてもよい。前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができるいくつかの実施態様では、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、
2022502451.tif 000007
からなる群から選択される。特定の実施態様では、各中性スペーサー部分Ｒ４は、
2022502451.tif 000008
である。
【００１２】
前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができるさらに別の実施態様では、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の少なくとも１つは、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つのアミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含み、ここで、そのカチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基のそれぞれは、中性スペーサー又は脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つのアミノ酸残基によって隔てられている。前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様のいくつかの実施態様では、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の少なくとも１つは、少なくとも１つの三量体サブユニット−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性を含み、ここで、Ｒカチオンは、カチオン性部分Ｒ５を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分Ｒ４を含むアミノ酸残基である。前述の実施態様のいずれかの特定の実施態様では、各カチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000009
であり、各中性スペーサー部分Ｒ４は、
2022502451.tif 000010
である。
【００１３】
前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、この態様のいくつかの実施態様では、ｍが０から３までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２０から２００までの整数、任意選択で３０から５０までの整数であり；ｍが４から１０までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２から１０までの整数である。前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、この態様の他の実施態様では、ｔが０から３までの整数であるとき、各ｖは、独立して、３０から５０までの整数であり；ｔが４から１０までの整数であるとき、各ｖは、独立して、２から１０までの整数である。この態様のさらに別の実施態様では、ｍは１であり、ｕは４０から４５までの整数であり；又はｔは１であり、ｖは４０から４５までの整数である。
【００１４】
前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、この態様の他の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ及び−ＣＨ３からなる群から選択される。前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、この態様の特定の他の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、−Ｈである。
【００１５】
本態様の他の実施態様では、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドである。特定の実施態様では、式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドは、リピトイド１である。
【００１６】
前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、この態様のさらに他の実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の０−４０％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む。さらに他の実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の０−２５％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む。さらに別の実施態様では、１つ又は複数の構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施態様では、１つ又は複数の構造脂質はコレステロールである。
【００１７】
前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様のいくつかの実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の１０−６０％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む。他の実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の２０−４０％ｗ／ｗの１つ又は複数のリン脂質を含む。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施態様では、１つ又は複数のリン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ  １６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。特定の実施態様では、１つ又は複数のリン脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００１８】
前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができるさらに別の実施態様では、組成物は、脂質成分の総重量の１−５％ｗ／ｗの１つ又は複数の遮蔽脂質を含む。前述の実施態様のいくつかの実施態様では、１つ又は複数の遮蔽脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は複数のＰＥＧ脂質である。特定の実施態様では、１つ又は複数の遮蔽脂質は、１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）である。
【００１９】
この態様のさらに他の実施態様では、１つ又は複数の遮蔽脂質は、式（Ｉ）の１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含む：
2022502451.tif 000011
［式中：
ｍは、０から１０までの整数であり；
ｎは、０から５までの整数であり；
ｓは、０から５までの整数であり；
ｔは、０から１０までの整数であり；
ここで、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロであり；
ｒは、１から２０までの整数であり；
各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数であり；
各ｐは、独立して、１又は２の整数であり；
Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ又は脂質部分であり、
ここで、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、又は−Ｏ−アルキルアリールであり；
各Ｒ２は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｕは、独立して、２から２００までの整数であり；
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり；
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分又は脂質部分であり；
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり；
各Ｒ６は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、ここで、各ｖは、独立して、２から２００までの整数であり；
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、又は脂質部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分であり；かつ
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又は天然若しくは非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である］。
【００２０】
１つ又は複数の遮蔽脂質が、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む、本態様のさらに他の実施態様では、ｍが０から３までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２０から２００までの整数、任意選択で３０から５０までの整数であり；ｍが４から１０までの整数であるとき、各ｕは、独立して、２から１０までの整数である。１つ又は複数の遮蔽脂質が、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含むさらに他の実施態様であって、前の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる実施態様では、ｔが０から３までの整数であるとき、各ｖは、独立して、３０から５０までの整数であり；ｔが４から１０までの整数であるとき、各ｖは、独立して、２から１０までの整数である。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができる特定の実施態様では、ｍは１であり、ｕは４０から４５までの整数であり；又はｔは１であり、ｖは４０から４５までの整数である。
【００２１】
本態様のさらに他の実施態様では、脂質成分は、脂質成分の総重量の
４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物；
０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；
２０−４０％ｗ／ｗの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；及び
１−５％ｗ／ｗの１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）
を含む。
【００２２】
前述の実施態様の１つ又は複数と組み合わせることができる特定の実施態様では、コレステロールとＤＯＰＥとの質量比は０．５：１から１：１の間である。
【００２３】
前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様のさらに他の実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、核酸を含む。前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様のいくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、核酸を含み、ここで、核酸は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様の特定の実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、核酸を含み、ここで、核酸は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。前述の実施態様のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる、本態様のさらに別の実施態様では、脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比は、２：１から２５：１の間である。特定の実施態様では、脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比は、５：１から１０：１の間である。
【００２４】
前述の実施態様のいずれか１つと組み合わせることができるさらに別の実施態様では、組成物は、１つ又は複数の小分子活性剤又は原体をさらに含む。
【００２５】
本明細書で提供されるのは、その様々な実施態様のいずれか及び全てにおいて、細胞を前述の態様の組成物と接触させることを含む、ポリアニオン性化合物を細胞に送達することである。この態様の特定の実施態様では、接触はエンドサイトーシスによるものである。前述の態様と組み合わせることができる、この態様の他の実施態様では、細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる。前述の実施態様のいずれか又は両方と組み合わせることができる、ポリペプチドをコードする核酸を含むこの態様の特定の実施態様では、細胞は、組成物と接触した後にポリペプチドを発現する。前述の実施態様の１つ又は複数と組み合わせることができる、タンパク質をコードする核酸を含むさらに別の実施態様では、細胞は、組成物と接触した後にタンパク質を発現する。
【００２６】
本開示の追加の態様は、組成物及びその様々な実施態様のいずれか及び全てに関連する前述の態様の組成物を、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と組み合わせることによって調製する方法を提供する。この態様の一実施態様では、組成物は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む溶液を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物を含む溶液と接触させることによって形成される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、例示的な第二級アミンリン脂質化カチオン性ペプチド「リピトイド１」を示す。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ−２Ｆは、第三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイドを一般的に示す。図２Ａは、第三級アミノ脂質化ペプトイドの一般化された構造を示す。図２Ｂは、例示的な第三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイドを示す。図２Ｃは、例示的な脂質モノマーを示す。図２Ｄは、例示的なカチオン性モノマーを示す。図２Ｅは、例示的なスペーサーモノマー及びポリエチレングリコールモノマーを示す。図２Ｆは、例示的な第三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物８を示す。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ−３Ｅは、固相におけるアミノ酸残基の連続的な付加を介して、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製するための例示的なプロセスを示す。図３Ａは、樹脂結合第二級アミンのアシル化剤ブロモ酢酸への一般化されたアシル化反応を示す。図３Ｂは、得られたアシル化生成物を、求核置換を介して適切なアミンと反応させ、対応するＮ−置換アミノ酸残基を生成する反応を示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、所望の樹脂結合カチオン性ペプチド化合物を生成するためのアシル化反応及び求核置換反応の連続的な反復を示す。図３Ｅは、固体樹脂支持体からカチオン性ペプチド化合物を切断して遊離ペプチドを提供する切断を示す。
【図４】図４は、ペプトイド：ｍＲＮＡの質量比が２：１、３．５：１、５：１、７．５：１において、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）ｍＲＮＡと個別に複合体を形成した第三級アミノ脂質化ペプトイド化合物１−１８によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されたＨｅＬａ細胞について測定された平均生物発光（ＲＬＵ）の結果のグラフを示す。
【図５】図５は、リピトイド１又は本開示のアミノ脂質化ペプトイド化合物の選択物の１つを含む多成分脂質製剤によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されたＨｅＬａ細胞において観察された平均生物発光（ＲＬＵ）のグラフを示す。リピトイド１又は選択したアミノ脂質化ペプトイド化合物を、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）と３つの質量比（５０：１６：３２：２、６３：０：３５：２、４２：２３：３３：２）で組み合わせ、さらにペプトイド：ｍＲＮＡの質量比が７：１又は１０：１のいずれかでホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）ｍＲＮＡと混合し、試験製剤を得た。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ペプトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比が４１：２３：３３：３、及びペプトイド：ｍＲＮＡの質量比が１０：１において、コレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含むアミノ脂質化ペプトイドの多成分脂質製剤により処理されたＨｅＬａ細胞中のＦｌｕｃ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す。図６Ａ及び図６Ｂは、製剤１−３６（図６Ａ）及び３７−７２（図６Ｂ）により処理されたＨｅＬａ細胞において観察された平均生物発光を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、ペプトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比が４１：２３：３３：３、及びペプトイド：ｍＲＮＡの質量比が１０：１において、コレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含むアミノ脂質化ペプトイドの多成分脂質製剤の皮下投与により処置されたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＦｌｕｃ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を示す。図７Ａ及び図７Ｂは、製剤１−３６（図７Ａ）及び３７−７２（図７Ｂ）による投与の６時間後に観察された平均生物発光を示す。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ−８Ｂは、コレステロール、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含むリピトイド１の多成分脂質製剤を使用して、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡの送達についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ  アッセイで測定された生物発光を示す。図８Ａは、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡと複合体を形成した９６種類の多成分脂質製剤を使用した、ＨｅＬａ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション調査において観察された生物発光シグナル（ＲＬＵ）のプロットを示す。図８Ｂは、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡのみ、又は市販の脂質ナノ粒子キット、リピトイド１、リピトイド製剤Ａ、及びリピトイド製剤Ｂで製剤化されたＦｌｕｃ  ｍＲＮＡにより処理されたＨｅＬａ細胞において記録されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物発光強度（ＲＬＵ）の棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
以下の記述は、例示的な方法、パラメータなどを説明する。しかしながら、そのような記述は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施態様の説明として提供されることを認識すべきである。
【００２９】
本開示は、核酸の送達のために、構造脂質、リン脂質、及び遮蔽脂質などのさらなる脂質成分と組み合わせた脂質化カチオン性ペプチド化合物の複合体を含む多成分脂質組成物を提供する。多成分脂質組成物及びその中の複合体は、リピトイドとしても知られるカチオン性ペプチド−リン脂質コンジュゲート、又はカチオン性ペプチド化合物として脂質部分及び／又は（オリゴ及び／又はポリ）エチレングリコール部分でＮ−置換されているＮ−置換カチオン性ペプチド化合物（本明細書では第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と呼ばれる）を含み得る。
【００３０】
本明細書に記載されるように、リピトイド並びに／又は第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質組成物は、他の市販の脂質ナノ粒子製剤（すなわち、キットから）又は独立した薬剤（例えば、リピトイド１のみ）について観察される効率を超える、細胞への核酸物質の非常に効率的な送達を示す。興味深いことに、本開示の脂質組成物は、構造脂質を含まずに、依然として核酸の送達の成功を達成したことがさらに観察された。
【００３１】
本明細書で使用される「アルケニル」は、オレフィン性不飽和の少なくとも１つの部位を有し（すなわち、式Ｃ＝Ｃの少なくとも１つの部分を有し）、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ２−Ｃ１０は、２から１０個の炭素原子を意味する）を有する、不飽和の直鎖状又は分枝状の一価炭化水素鎖又はそれらの組み合わせを指す。アルケニル基は、「シス」又は「トランス」配置、或いは「Ｅ」又は「Ｚ」配置であり得る。特定のアルケニル基は、２から２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ２０アルケニル」）、２から８個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ８アルケニル」）、２から６個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」）、又は２から４個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ４アルケニル」）である。アルケニルの例には、限定されるものではないが、エテニル（又はビニル）、プロプ−１−エニル、プロプ−２−エニル（又はアリル）、２−メチルプロプ−１−エニル、ブト−１−エニル、ブト−２−エニル、ブト−３−エニル、ブタ−１，３−ジエニル、２−メチルブタ−１，３−ジエニル、それらの同族体及び異性体、その他同種類のものなどの基が含まれる。
【００３２】
用語「アルキル」は、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１から１０個の炭素を意味する）を有する、飽和した直鎖状又は分枝状の一価炭化水素構造及びそれらの組み合わせを指し、それらを含む。特定のアルキル基は、１から２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ１−Ｃ２０アルキル」）である。より具体的なアルキル基は、１から８個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ８アルキル」）、３から８個の炭素原子（「Ｃ３−Ｃ８アルキル」）、１から６個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ６アルキル」）、１から５個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ５アルキル」）、又は１から４個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ４アルキル」）を有するものである。アルキルの例には、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体及び異性体、その他同種類のものなどの基が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される「アルキレン」は、アルキルと同じ残基を指すが、二価性を有する。特定のアルキレン基は、１から６個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ６アルキレン」）、１から５個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ５アルキレン」）、１から４個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ４アルキレン」）、又は１から３個の炭素原子（「Ｃ１−Ｃ３アルキレン」）を有するものである。アルキレンの例には、限定されるものではないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、その他同種類のものなどの基が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される「アルキニル」は、アセチレン性不飽和の少なくとも１つの部位を有し（すなわち、式Ｃ≡Ｃの少なくとも１つの部分を有し）、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ２−Ｃ１０は、２から１０個の炭素原子を意味する）を有する、不飽和の直鎖状又は分枝状の一価炭化水素鎖又はそれらの組み合わせを指す。特定のアルキニル基は、２から２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ２０アルキニル」）、２から８個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ８アルキニル」）、２から６個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」）、又は２から４個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２−Ｃ４アルキニル」）である。アルキニルの例には、限定されるものではないが、エチニル（又はアセチレニル）、プロプ−１−イニル、プロプ−２−イニル（又はプロパルギル）、ブト−１−イニル、ブト−２−イニル、ブト−３−イニル、それらの同族体及び異性体、その他同種類のものなどの基が含まれる。
【００３５】
用語「アリール」は、多価不飽和芳香族炭化水素基を指し、それらを含む。アリールは、追加の縮合アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及び／又はヘテロシクリル環を含む、追加の縮合環（例えば、１から３個の環）を含み得る。１つの変形例では、アリール基は、６から１４個の環状炭素原子を含む。アリール基の例には、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、その他同種類のものが含まれる。
【００３６】
「カルボニル」は、基Ｃ＝Ｏを指す。
【００３７】
本明細書で使用される「複合体」は、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、金属−配位子配位、他の化学的力、及び前述の１つ又は複数の組み合わせによって媒介され得る、２つ以上の分子間の任意の化学的会合を含む。複合体は、例えば、ポリプレックス、コアセルベート複合体、ナノ複合体、ナノ粒子、及びマイクロ粒子を含む高次構造を形成し得る。
【００３８】
用語「シクロアルキル」は、完全に飽和、モノ又はポリ不飽和である得るが、指定された炭素原子の数（例えば、Ｃ１−Ｃ１０は１から１０個の炭素を意味する）を有する非芳香族である、環状一価炭化水素構造を指し、これを含む。シクロアルキルは、シクロヘキシルなどの１つの環、又はアダマンタン（ａｄａｍａｎｔｌｙ）などの複数の環で構成され得るが、アリール基は除外される。２つ以上の環を含むシクロアルキルは、縮合、スピロ若しくは架橋、又はそれらの組み合わせであり得る。好ましいシクロアルキルは、３から１３個の環状炭素原子を有する環状炭化水素である。より好ましいシクロアルキルは、３から８個の環状炭素原子を有する環状炭化水素である（「Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル」）。シクロアルキルの例には、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル、ノルボルニル、その他同種類のものが含まれる。
【００３９】
「ハロ」又は「ハロゲン」は、原子番号９から８５を有する第１７族系列の元素を指す。好ましいハロ基には、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードが含まれる。残基が複数のハロゲンで置換されている場合、それは結合したハロゲン部分の数に対応する接頭辞を使用することによって参照することができ、例えば、ジハロアリール、ジハロアルキル、トリハロアリールなどは、２つ（「ジ」）又は３つ（「トリ」）のハロ基（これらは同じハロであり得るが、必ずしも同じではない）で置換されたアリール及びアルキルを指し；したがって、４−クロロ−３−フルオロフェニルはジハロアリールの範囲内にある。各水素がハロ基で置き換えられたアルキル基は、「ペルハロアルキル」と称される。好ましいペルハロアルキル基は、トリフルオロアルキルである。同様に、「ペルハロアルコキシ」は、ハロゲンが、アルコキシ基のアルキル部分を構成する炭化水素中の各Ｈに取って代わるアルコキシ基を指す。ペルハロアルコキシ基の例は、トリフルオロメトキシ（−ＯＣＦ３）である。
【００４０】
用語「ヘテロアリール」は、１から１０個の環状炭素原子と、限定されるものではないが、窒素、酸素、硫黄などのヘテロ原子を含む少なくとも１つの環状ヘテロ原子とを有する不飽和芳香族環状基であって、窒素及び硫黄原子は任意選択で酸化され、窒素原子は任意選択で四級化されるものを指し、それらを含む。ヘテロアリール基は、環状炭素又は環状ヘテロ原子で分子の残りの部分に結合することができる。ヘテロアリールは、追加の縮合アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、及び／又はヘテロシクリル環を含む、追加の縮合環（例えば、１から３個の環）を含み得る。ヘテロアリール基の例には、限定されるものではないが、ピリジル、ピリミジル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、その他同種類のものが含まれる。
【００４１】
用語「複素環」又は「ヘテロシクリル」は、１から１０個の環状炭素原子と、窒素、硫黄又は酸素などの１から４個の環状ヘテロ原子とを有する飽和又は不飽和非芳香族基であって、窒素及び硫黄原子は任意選択で酸化され、窒素原子は任意選択で四級化されるものを指す。ヘテロシクリル基は、単環又は複数の縮合環を有し得るが、ヘテロアリール基は除外される。２つ以上の環を含む複素環は、縮合、スピロ若しくは架橋であるか、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。縮合環系において、１つ又は複数の縮合環は、アリール又はヘテロアリールであり得る。ヘテロシクリル基の例には、限定されるものではないが、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル、４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル、その他同種類のものが含まれる。
【００４２】
「オキソ」は、部分＝Ｏを指す。
【００４３】
「チオカルボニル」は、基Ｃ＝Ｓを指す。
【００４４】
特に指定のない限り、「置換されていてもよい」とは、ある基が非置換であるか、又はその基に関して列挙された置換基のうちの１つ又は複数（例えば、１、２、３、４又は５つ）によって置換されてよく、ここで、該置換基は同じであっても異なっていてもよいことを意味する。一実施態様では、置換されていてもよい基は、１つの置換基を有する。別の実施態様では、置換されていてもよい基は、２つの置換基を有する。別の実施態様では、置換されていてもよい基は、３つの置換基を有する。別の実施態様では、置換されていてもよい基は、４つの置換基を有する。いくつかの実施態様では、置換されていてもよい基は、１つから２つ、２つから５つ、３つから５つ、２つから３つ、２つから４つ、３つから４つ、１つから３つ、１つから４つ又は１つから５つの置換基を有する。
【００４５】
用語「置換された」とは、部分の１つ又は複数の水素原子を一価又は二価の基（ｒａｄｉｃａｌ）で置換することを指す。「置換されていてもよい」とは、その部分が置換されていても、非置換であってもよいことを示す。適切な置換基には、例えば、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ（例えば、−ＮＨ２又はジアルキルアミノ）、イミノ、シアノ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、ハロアルキル（−ＣＣｌ３又は−ＣＦ３など）、チオ、スルホニル、チオアミド、アミジノ、イミジノ、オキソ、オキサミジノ、メトキサミジノ、イミジノ、グアニジノ、スルホンアミド、カルボキシル、ホルミル、アルキル、アルコキシ、アルコキシ−アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ（−ＯＣＯＲ）、アミノカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、カルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアラルキル−カルボニル、アルキルチオ、アミノアルキル、シアノアルキル、カルバモイル（−ＮＨＣＯＯＲ−又は−ＯＣＯＮＨＲ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨＲ−）、アリール、その他同種類のものが挙げられ、ここで、Ｒは任意の適切な基、例えば、アルキル又はアルキレンである。いくつかの実施態様では、置換されていてもよい部分は、記載されているように、選択された基のみで任意に置換されている。いくつかの実施態様では、上記の基（例えば、アルキル基）は、例えば、アルキル（例えば、メチル又はエチル）、ハロアルキル（例えば、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨＣｌ２又は−ＣＦ３）、シクロアルキル（例えば、−Ｃ３Ｈ５、−Ｃ４Ｈ７、−Ｃ５Ｈ９）、アミノ（例えば、−ＮＨ２又はジアルキルアミノ）、アルコキシ（例えば、メトキシ）、ヘテロシクロアルキル（例えば、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、アゼチジンとして）、ヒドロキシル、及び／又はヘテロアリール（例えば、オキサゾリル）で置換されていてもよい。いくつかの実施態様では、置換基はそれ自体置換されていてもよい。いくつかの実施態様では、置換基はそれ自体置換されない。置換基上に置換される基は、例えば、カルボキシル、ハロ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アミノカルボニル、−ＳＲ、チオアミド、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２Ｒ又はシクロアルキルであってよく、ここで、Ｒは、任意の適切な基、例えば、水素又はアルキルである。
【００４６】
一態様では、本開示は、複合体を含む組成物を提供し、ここで、複合体は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び３つ以上の脂質成分を含む。前述のいくつかの実施態様では、複合体は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、及び２つ以上の他の脂質成分を含む。
【００４７】
１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物と共に、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む組成物及び複合体が、２つ以上の脂質成分（本明細書に記載のリン脂質、構造脂質、及び／又は遮蔽脂質など）をさらに含むいくつかの実施態様では、組成物は脂質製剤として記述され得る。組成物が２つ以上の脂質成分を含む特定の実施態様では、脂質組成物は、多成分脂質製剤として記述され得る。複合体が脂質化カチオン性ペプチド化合物、ポリアニオン性化合物、リン脂質、構造脂質、並びに遮蔽脂質を含む特定の実施態様では、組成物は脂質ナノ粒子を含む。組成物が脂質ナノ粒子複合体を含むさらに他の実施態様では、組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物として特徴づけられ得る。
【００４８】
いくつかの実施態様では、本開示の組成物は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。いくつかの実施態様では、本開示の組成物は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実施態様では、組成物は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分との複合体を含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。
【００４９】
脂質化カチオン性ペプチド化合物
本開示の組成物は、複合体を含み、ここで、複合体は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分を含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。
【００５０】
それらの正電荷のおかげで、複合体及び組成物中の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、ポリアニオンカーゴ上の負電荷を相殺する複合体を形成し、したがって、カーゴの標的細胞への取り込みを促進することができる。本明細書に記載の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、正味のゼロ電荷又は正味の正電荷を有する。複合体又は組成物が、１つ又は複数のカチオン性化合物を含むいくつかの実施態様では、１つ又は複数のカチオン性化合物は、独立して、正味のゼロ電荷又は正味の正電荷を有する。特定の実施態様では、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、独立して、少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。１つ又は複数のカチオン性化合物に存在する正味荷電は、環境条件に応じて変化する可能性があることを認識されたい。例えば、いくつかの実施態様では、１つ又は複数のカチオン性化合物は、独立して、生理学的に適切なｐＨ範囲で安定した正味の正電荷を有する。例えば、生理学的ｐＨは、少なくとも約５．５、典型的には少なくとも約６．０である。より典型的には、生理学的ｐＨは少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは約８．５未満であり、典型的には約８．０未満である。より典型的には、生理学的ｐＨは約７．５未満である。
【００５１】
本明細書で提供される組成物において利用される脂質化カチオン性ペプチド化合物は、リピトイドとしても知られるカチオン性ペプトイド−リン脂質コンジュゲート構築物、又は本明細書では第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と呼ばれる、ペプチド骨格全体に脂質部分及び／若しくは（オリゴ及び／又はポリ）エチレングリコール部分を有するＮ−置換カチオン性ペプチド化合物を含み得る。いくつかの実施態様では、本開示の組成物は、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む複合体を含む。他の実施態様では、組成物は、１つ又は複数のリピトイドを含む複合体を含む。さらに他の実施態様では、組成物は、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリピトイド、又はそれらの任意の組み合わせを含む複合体を含む。
【００５２】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物
いくつかの実施態様では、本開示の複合体及び組成物は、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む複合体を含む。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−置換アミノ酸残基を含むペプチド鎖である。本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、オリゴペプチド骨格を含み、ここで、オリゴペプチド骨格は、Ｎ−置換中性（「スペーサー」）及び／又は脂質アミノ酸残基と任意選択で交互配置されたＮ−置換カチオン性アミノ酸残基の繰り返しサブユニットを含む。オリゴペプチド骨格は、そのＮ末端及び／又はＣ末端で、脂質部分でＮ−置換されている（「Ｎ−脂質化」）アミノ酸残基並びに／又はオリゴエチレングリコール及び／若しくはポリエチレングリコールでＮ−置換されている（「Ｎ−ＰＥＧ化」）アミノ酸残基によってさらにキャップされる。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩である：
2022502451.tif 000012
【００５４】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ペプチド化合物に存在するアミノ酸残基の総数によって特徴づけることができ、ここで、各アミノ酸残基は一般構造体−（ＮＲ−ＣＲａＲｂ−Ｃ（Ｏ））−によって表される。いくつかの実施態様では、アミノ酸残基の総数は、２から４０アミノ酸残基の間、２から３０アミノ酸残基の間、３から２５アミノ酸残基の間、５から２０アミノ酸残基の間、又は７から１５アミノ酸残基の間である。特定の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、５から２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施態様では、アミノ酸残基の総数は、ｍ、ｎ、ｓ、ｔ、及び［ｒ×（ｏ＋ｐ＋ｑ）］の合計である。
【００５５】
他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、正味のゼロ電荷又は正味の正電荷を有する。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である特定の実施態様では、第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物は、少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又は第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である他の実施態様では、カチオン性ペプチド化合物は、正味のゼロ電荷を有するか（すなわち、電荷中性である）又は正味の正電荷を有する。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又は第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であるいくつかの実施態様では、カチオン性ペプチド化合物は＋１の正味の正電荷を有する。特定の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、（ｒ×ｐ）＋の正味の正電荷を有する。
【００５６】
特定の実施態様では、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のアミノ酸残基は、天然又は非天然に存在するアミノ酸のＮ−置換変異体であり、ここで、炭素側鎖はＲａ及びＲｂによって表される。アミノ酸残基は、Ｄ−又はＬ−配置のいずれかで存在し得る。さらに、アミノ酸残基のＮ位の置換がアミド結合の自由回転を制限する可能性があることを認識すべきである。そのため、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、様々な回転異性体コンフォメーション（回転異性体）で存在し得る。
【００５７】
いくつかの実施態様では、各Ｒａ及び各Ｒｂは、独立して、天然又は非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である。本明細書で使用される場合、用語「天然に存在するアミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、又はＴｒｐを指す。用語「非天然に存在するアミノ酸」は、通常、自然界には見られないアミノ酸を指し、例えば、天然に存在するアミノ酸のＤ−異性体、２−アミノアジピン酸、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンを含む。特定の実施態様では、各Ｒａ及びＲｂは、独立して−Ｈ、−ＣＨ３、又は
2022502451.tif 000013
である。
【００５８】
他の実施態様では、各Ｒａ及び各Ｒｂは、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ４−アルキルである。特定の実施態様では、各Ｒａ及び各Ｒｂは、独立して、−Ｈ又はＣＨ３である。他の実施態様では、Ｒａ及びＲｂは−Ｈである。Ｒａ及びＲｂが−Ｈである実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、Ｎ−脂質化及び／又はＰＥＧ化ポリグリシン化合物又はＮ−脂質化及び／又はＰＥＧ化ペプトイド化合物と呼ばれ得る。特定の実施態様では、各Ｒａ及び各Ｒｂは、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又は天然若しくは非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分である。
【００５９】
オリゴペプチド骨格、又は繰り返しサブユニット、及び構造モチーフ
本明細書に記載されるように、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、核酸などのポリアニオン性化合物との複合体形成、及びそのようなポリアニオン性化合物の細胞への送達に有用であり得る。本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｎ−置換中性スペーサーアミノ酸残基及び／又はＮ−脂質化アミノ酸残基と任意選択で交互配置されたＮ−置換カチオン性アミノ酸残基の繰り返しサブユニットのオリゴペプチド骨格を含む。
2022502451.tif 000014
【００６０】
オリゴペプチド骨格の繰り返しサブユニット中のカチオン性アミノ酸残基は、本開示の化合物に正電荷を付与し、これにより、核酸のようなポリアニオン種との好ましい静電相互作用及び電荷中和が可能になる。カチオン性残基の間に中性又は脂質化アミノ酸残基を交互配置することにより、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物全体の正電荷の空間分布をより良く制御することができ、これにより、カチオン性ペプチド化合物と、特定の長さ、電荷分布、コンフォメーションを有するポリアニオン種との複合体形成の改善が可能になる。
【００６１】
オリゴペプチド骨格において、ｒは、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物におけるカチオン性及び中性及び／又は脂質化アミノ酸残基の繰り返しサブユニットの数を表す。いくつかの実施態様では、ｒは１から２５までの整数である。特定の実施態様では、ｒは１から２０までの整数である。他の実施態様では、ｒは１から１５までの整数である。いくつかの実施態様では、ｒは１から５までの整数である。特定の実施態様では、ｒは２から４までの整数である。
【００６２】
各サブユニットｒは、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物全体内の他のサブユニットと厳密に同一であってもなくてもよいことを認識すべきである。例えば、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物内で、各サブユニットｒは、他のサブユニットに存在するカチオン性及び中性及び／又は脂質化アミノ酸残基に関して独立して選択されるカチオン性アミノ酸残基、並びに任意選択で中性及び／又は脂質化アミノ酸残基も含み得る。
【００６３】
カチオン性部分
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各繰り返しサブユニットは、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基を含む。カチオン性アミノ酸残基は、本明細書に記載のペプチド化合物が、核酸又はポリアニオン性化合物上の負電荷との相互作用によって、核酸又は他のポリアニオン性化合物と静電複合体を形成することを可能にする正電荷を提供する。核酸の複合体形成は、核酸の負電荷を部分的又は完全に遮蔽し、細胞の脂質膜を通過して細胞内への輸送を促進する。
【００６４】
各サブユニットｒ内で、ｐはそのサブユニットに存在するカチオン性アミノ酸残基の数を表す。いくつかの実施態様では、各ｐは、独立して、１又は２の整数である。特定の実施態様では、ｐは１である。
【００６５】
各カチオン性アミノ酸残基は、Ｎ位にカチオン性部分Ｒ５を含む。各カチオン性部分Ｒ５は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の繰り返しサブユニット内だけでなく、オリゴペプチド骨格全体にわたって選択され得ることを認識すべきである。
【００６６】
本明細書に記載のカチオン性部分は、生理学的に適切なｐＨ範囲で安定した正味の正電荷を有する置換基であり得る。例えば、生理学的ｐＨは、少なくとも約５．５、典型的には少なくとも約６．０である。より典型的には、生理学的ｐＨは少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは約８．５未満であり、典型的には約８．０未満である。より典型的には、生理学的ｐＨは約７．５未満である。カチオン性部分は、例えば、生理学的ｐＨで正電荷を生成するのに十分である部分に存在する官能基の閾値ｐＫａ値によって特徴づけることができる。特定の実施態様では、カチオン性部分は、少なくとも７．５のｐＫａ値を有する。他の実施態様では、カチオン性部分は、生理学的ｐＨとより酸性のｐＨとの間、例えば、ｐＨ４．５ー５．５の間のｐＫａを有する。追加の実施態様では、複数の独立したｐＫａ値を有する置換基が使用される。
【００６７】
本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、オリゴペプチド骨格に沿って互いに近接して複数のカチオン性部分を含み得ることを認識すべきである。複数のカチオン性部分がオリゴペプチド骨格に沿って存在する場合、特定のカチオン性部分のプロトン化又は脱プロトン化状態が、近接する他のカチオン性部分のｐＫａ値に影響を及ぼす可能性がある。この機構により、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物の特定のカチオン性部分のｐＫａは、単独で測定されたそのｐＫａ値に対して変化している可能性がある。例えば、オリゴペプチド骨格中の１つのアミンのプロトン化によりｐＫａが〜８になると、近傍のカチオン性部分のｐＫａ値を正常値〜７．５からｐＫａ〜５−６に低下させる可能性がある。
【００６８】
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、複数のカチオン性部分を互いに様々に近接させて収容する能力は、これらのカチオン性ペプチド化合物、及びそれらの任意の複合体が、生理学的ｐＨの変動に対して高感度で応答することを可能にする。生理学的ｐＨの変化に対するこれらの化合物及びそれらの複合体の感受性は、エンドソーム輸送（エンドソームコンパートメントのｐＨは〜４．５から５．５）後のサイトゾルへの核酸の送達及び放出を促進するために重要であり得る。
【００６９】
カチオン性又は正に帯電した部分は、例えば、以下の官能基：アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、及びアミジノを含むものなど、窒素ベースの置換基を含み得る。これらの官能基は、芳香族、飽和環状、又は脂肪族のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、各Ｒ５は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ−ヘテロシクリルアルキル、又はＮ−ヘテロアリールである。他の実施態様では、各Ｒ５は、独立して、
2022502451.tif 000015
である。
【００７０】
特定の実施態様では、各Ｒ５は、独立して、
2022502451.tif 000016
からなる群から選択される。さらに他の実施態様では、各Ｒ５は、
2022502451.tif 000017
である。
【００７１】
カチオン性残基がペプチド化合物全体の末端残基であるさらに別の実施態様では、合成又は脱保護条件と適合しないか（酸に不安定なリンカーなど）、或いは適切な保護基戦略が利用できない（例えばポリアミン）追加のカチオン性部分Ｒ５を利用することができる。例えば、いくつかの実施態様では、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、ポリアミンである。末端残基のＲ５がポリアミンであるいくつかの実施態様では、ポリアミンは、
2022502451.tif 000018
である。特定の実施態様では、ポリアミンは、
2022502451.tif 000019
からなる群から選択される。
【００７２】
他の実施態様では、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシエーテル、アルコキシアルキル、又はヒドロキシルヘテロアルキルである。特定の実施態様では、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000020
である。
【００７３】
さらに特定の実施態様では、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000021
である。
【００７４】
ペプチド鎖の非置換窒素原子は、すなわち、Ｒ５が水素である場合、生理学的条件下でイオン化可能なカチオン性部分としても機能し得ることをさらに認識すべきである。いくつかの実施態様では、カチオン性部分Ｒ５は水素原子である。
【００７５】
中性スペーサー部分
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内で、カチオン性アミノ酸残基は、Ｎ位に中性スペーサー部分を有する中性スペーサーアミノ酸残基と任意選択で交互配置され得る。中性アミノ酸残基は、カチオン性ペプチド化合物と複合体を形成するポリヌクレオチドを含むポリアニオン性化合物との静電相互作用を改善するために、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するのに有用であり得る。
【００７６】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各繰り返しサブユニットにおいて、中性アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸残基のＮ末端又はＣ末端のいずれかに１つ又は複数のＲ４基として存在し得る。サブユニットｒが中性スペーサー部分Ｒ４を含むいくつかの実施態様では、存在する各中性スペーサー部分に対応するｏ及び／又はｑは、サブユニットｒ内のカチオン性アミノ酸残基のＮ末端及びＣ末端に結合した中性スペーサー残基のそれぞれの数を表す。いくつかの実施態様では、各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数である。他の実施態様では、各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数である。
【００７７】
各中性スペーサーアミノ酸残基は、Ｎ位に中性スペーサー部分Ｒ４を含む。本明細書に記載のカチオン性部分と同様に、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の繰り返しサブユニット内、並びにオリゴペプチド骨格の繰り返しサブユニットｒの中から選択されることを認識すべきである。
【００７８】
中性スペーサー部分は、生理学的に適切なｐＨ範囲において中性であるか、又は正味電荷がゼロである任意の置換基を含み得ることも認識すべきである。いくつかの実施態様では、各中性部分Ｒ４は、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１−Ｃ４−アルキルであり、ここで、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルは、１つ又は複数の置換基−ＯＨ、ハロ、又はアルコキシで置換されていてもよい。さらにいくつかの実施態様では、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、
2022502451.tif 000022
からなる群から選択される。特定の実施態様では、各中性スペーサー部分Ｒ４は、
2022502451.tif 000023
である。
【００７９】
脂質部分
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内での中性アミノ酸残基とカチオン性アミノ酸残基との任意の交互配置に加えて、Ｎ位に脂質部分を有するＮ−脂質化アミノ酸残基はまた、任意選択で、カチオン性（及び任意選択の中性スペーサー）アミノ酸残基と交互配置されてもよい。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ−脂質化アミノ酸残基を含むいくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はＮ−脂質化されている。中性アミノ酸残基と同様に、オリゴペプチド骨格内のＮ−脂質化アミノ酸残基は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するのに有用であり得るだけでなく、ポリアニオン性物質のカプセル化と細胞内送達を改善するために、それらの親油性を増大させるためにも有用である。ペプトイド骨格に沿った脂質の間隔も、細胞への取り込みとエンドソームへの放出に影響を与えることが知られている脂質の流動性／結晶化度に影響を与え得る。
【００８０】
中性スペーサー残基と同様に、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各繰り返しサブユニットにおいて、Ｎ−脂質化アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸残基のＮ末端若しくはＣ末端のいずれか又は両端に１つ又は複数のＲ４基として存在し得る。サブユニットｒが脂質部分Ｒ４を含むいくつかの実施態様では、存在する各脂質部分に対応するｏ及び／又はｑは、サブユニットｒ内のカチオン性アミノ酸残基のＮ末端及びＣ末端に結合した脂質化残基のそれぞれの数を表す場合もある。いくつかの実施態様では、各ｏは、独立して、０、１、又は２の整数である。他の実施態様では、各ｑは、独立して、０、１、又は２の整数である。
【００８１】
各Ｎ−脂質化アミノ酸残基は、Ｎ位に脂質部分Ｒ４を含む。本明細書に記載のカチオン性及び中性部分と同様に、各脂質部分Ｒ４は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の繰り返しサブユニット内、並びにオリゴペプチド骨格の繰り返しサブユニットｒの中から選択されることを認識すべきである。
【００８２】
適切な脂質部分は、例えば、置換されていてもよい分岐若しくは直鎖脂肪族部分、又は脂肪酸、ステロール、及びイソプレノイドを含む天然脂質化合物に由来する置換されていてもよい部分を含み得る。
【００８３】
いくつかの実施態様では、脂質部分は、約６から約５０個の炭素原子又は約１０から約５０個の炭素原子を有する分岐又は直鎖脂肪族部分を含み得、任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み、任意選択で１つ又は複数の二重結合又は三重結合（すなわち、飽和又はモノ若しくはポリ不飽和）を含む。特定の実施態様では、脂質部分は、置換されていてもよい脂肪族、直鎖又は分岐部分を含み得、各疎水性末端は、独立して、約８から約３０個の炭素原子又は約６から約３０個の炭素原子を有する。特定の実施態様では、脂質部分は、例えば、脂肪酸及び脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４−アルキル又はＣ８−Ｃ２４−アルケニルであり、ここで、Ｃ８−Ｃ２４−アルケニルは、任意選択でモノ又はポリ不飽和である。いくつかの実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ６−Ｃ１８アルキル又はＣ６−Ｃ１８アルケニルである。特定の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ８−Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、ｎ−デシルなどのＣ１０−アルキルである。他の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、独立して、２−エチルヘキサ−１−イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される。
【００８４】
前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、独立して、
2022502451.tif 000024
である。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、独立して、式
2022502451.tif 000025
の脂質であり、ここで、Ｒ８は、約６から約５０個の炭素原子又は約１０から約５０個の炭素原子を有し、任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み、任意選択で１つ又は複数の二重結合又は三重結合を含む分岐又は直鎖脂肪族部分である。特定の実施態様では、各脂質部分Ｒ４は、独立して、
2022502451.tif 000026
である。
【００８５】
本発明の実施において使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質、グリセリド（ジグリセリド又はトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、飽和及び不飽和ステロール、イソプレノイド、並びにその他の同様の天然脂質から誘導することができる。
【００８６】
他の適切な脂質部分は、例えばナフタレニル若しくはエチルベンジルを含む、置換されていてもよいアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、若しくはアリールアルキル部分などの親油性炭素環式若しくは芳香族基、又は、例えば、ステロールエステル及びワックスエステルを含むエステル官能基を含む脂質を含み得る。さらに他の実施態様では、脂質部分Ｒ４は、
2022502451.tif 000027
である。
【００８７】
構造モチーフ
いくつかの実施態様では、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、互いにカチオン性、中性スペーサー、及び脂質化アミノ酸残基の特定の配列又は配置を含み得、これは、線状共重合体の様々な分類（ランダム、ブロック、交互、周期的、ステレオブロックなど）と同様に記述することができる。
【００８８】
例えば、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性化合物が一般的な部分Ｒカチオン、Ｒ中性、及びＲ脂質を含むいくつかの実施態様では、アミノ酸残基は、ランダム配列、交互配列又はブロック配列に配置され得る。Ｒカチオン及びＲ中性の表示は、それぞれカチオン性部分Ｒ５及び中性部分Ｒ４を含むアミノ酸残基と同等であることを理解されたい。一般的な部分Ｒ脂質は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＮ−脂質化残基の位置に応じて、脂質部分Ｒ４及び脂質部分Ｒ３を有するアミノ酸残基の両方を含むと理解され得る。
【００８９】
カチオン性及び中性スペーサーアミノ酸残基の交互配列の一例は、Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒカチオン−Ｒ中性、又はＲ中性−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒカチオンによって表すことができる。カチオン性及び脂質化アミノ酸残基の交互配列の別の例は、Ｒカチオン−Ｒ脂質−Ｒカチオン−Ｒ脂質又はＲ中性−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒカチオンによって表すことができる。ブロック配列のいくつかの例は、Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性−Ｒ中性、Ｒ中性−Ｒ中性−Ｒ中性−Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒカチオン、Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒ脂質−Ｒ脂質−Ｒ脂質、又はＲ脂質−Ｒ脂質−Ｒ脂質−Ｒカチオン−Ｒカチオン−Ｒカチオンによって表すことができる。さらにいくつかの実施態様では、カチオン性部分、中性スペーサー部分、及び脂質化部分は、オリゴペプチド化合物全体内の異なる繰り返しサブユニットセグメントについてブロック配列及び交互配列中に配置され得る。例えば、いくつかの実施態様では、カチオン性ペプチド化合物内に、Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性などのより大きなオリゴマーユニットの繰り返しモチーフが存在し得る。他の実施態様では、カチオン性ペプチド化合物は、交互のカチオン性及び中性残基のブロックと組み合わされたＮ−脂質化残基のブロックを含み得る。
【００９０】
本明細書に記載されるように、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の骨格は、「カチオン性ドメイン」又は「カチオン性ブロック」を含む。カチオン性ドメインは、複数のカチオン性部分Ｒ５、例えば、少なくとも２つのカチオン性残基を有するオリゴペプチド鎖内の連続するアミノ酸残基のセグメントとして広く理解され得る。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、カチオン性ドメインを含み、ここで、カチオン性ドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのカチオン性アミノ酸残基を含む。
【００９１】
カチオン性ドメインは、例えば、連続する直鎖状配列に複数のＲ５カチオン性部分を有するアミノ酸残基のブロックを含み得る（例えば、Ｒ５Ｒ５Ｒ５又はＲカチオンＲカチオンＲカチオン）。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、「カチオン性ドメイン」を含み、ここで、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの連続するアミノ酸残基を含む。
【００９２】
他の実施態様では、「カチオン性ドメイン」は、隣接するアミノ酸残基のブロックを含み得、ここで、複数のカチオン性残基は、２つのカチオン性残基の間に間隔を置いて配置された追加の非カチオン性（すなわち、中性又は脂質化）残基を特徴とし、その結果、ブロック内のカチオン性残基のいずれも、別のカチオン性残基に直接結合しない。例えば、いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、「カチオン性ドメイン」を含み、ここで、カチオン性ドメインは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含み、かつ、カチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基のそれぞれは、中性スペーサー又は脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つ又は少なくとも２つのアミノ酸残基によって隔てられている。いくつかの実施態様では、非カチオン性残基は、カチオン性ドメイン内の２つのカチオン性残基の間に、均一な長さの規則的な間隔で交互配置される。カチオン性ドメインが、カチオン性残基の間に交互配置された非カチオン性残基を含むいくつかの実施態様では、カチオン性ドメインは、繰り返し（二量体、三量体、四量体など）サブユニットを含むドメインとして記述され得る。これらのサブユニットには、限定されるものではないが、−ＲカチオンＲ中性−、−ＲカチオンＲ中性Ｒ中性−、−ＲカチオンＲ脂質−、−ＲカチオンＲ脂質Ｒ脂質−、−ＲカチオンＲ中性Ｒ脂質−、又は−ＲカチオンＲ脂質Ｒ中性−が含まれる。他の実施態様では、非カチオン性残基は、カチオン性ドメイン内の２つのカチオン性残基の間に散在しており、カチオン性残基の各対の間に様々な数の非カチオン性残基がある。カチオン性ドメインがカチオン性残基の間に散在する非カチオン性残基を含む特定の実施態様では、カチオン性残基の各対は、少なくとも１つの非カチオン性残基によって独立して隔てられている。
【００９３】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がカチオン性ドメインを含むいくつかの実施態様では、各Ｒ５は、
2022502451.tif 000028
である。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドがカチオン性ドメインを含む他の実施態様では、各カチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000029
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000030
である。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドが、１つ又は複数の二量体又は三量体サブユニットを含むカチオン性ドメインを含む特定の実施態様では、各カチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000031
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000032
である。さらに他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、１つ又は複数の三量体サブユニット−ＲカチオンＲ中性Ｒ中性−を含むカチオン性ドメインを含み、各カチオン性部分Ｒ５は、
2022502451.tif 000033
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000034
である。
【００９４】
本明細書に記載されるように、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、１つ若しくは複数の異なるカチオン性部分（Ｒカチオン１、Ｒカチオン２、Ｒカチオン３など）、１つ若しくは複数の異なる中性スペーサー部分（Ｒ中性１、Ｒ中性２、Ｒ中性３など）、及び／又は１つ若しくは複数の異なる脂質部分（Ｒ脂質１、Ｒ脂質２、Ｒ脂質３、など）を含み得る。一般的なカチオン性及び中性スペーサーアミノ酸残基の配列又は配置の上記の例は、本開示のペプチド化合物に限定することを意図するものではないことを認識すべきである。上記で一般的に説明されているように、ランダム、交互、又はブロック配列中に存在し得るカチオン性、中性スペーサー、及び脂質部分は、より大きなブロック又は交互の構造モチーフ内の個々のカチオン性部分、中性部分、及び脂質部分の特定の配列中にも存在し得る。例えば、残基のいくつかの例示的な配置は、限定されるものではないが、以下を含み得る：Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１、Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒ脂質１、Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１−Ｒ脂質２Ｒカチオン２Ｒ中性２Ｒ脂質２Ｒカチオン２Ｒ中性２、Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質３Ｒ脂質４Ｒ中性１Ｒ中性２Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性２Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質３Ｒ脂質４、又はＲ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質１Ｒ脂質２。
【００９５】
側鎖の機能化及びペプチドコンジュゲート化合物
上記のように、オリゴペプチド骨格は、主に、Ｎ位にカチオン性、中性スペーサー、又は脂質部分（Ｒ４及びＲ５）を有する天然又は非天然に存在するアミノ酸に見られる側鎖部分（Ｒａ及びＲｂ）を有するアミノ酸残基を含む。
【００９６】
一態様では、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＲａ、Ｒｂ、Ｒ４、及びＲ５基は、治療剤及び／又は小分子若しくは抗体などの標的要素に共有結合するために使用することができる反応性リンカー基をさらに含み得る。これらの追加の官能基はまた、合成又は脱保護条件と適合しないか（酸に不安定なリンカーなど）、或いは適切な保護基戦略が利用できない（例えば、ポリアミン）カチオン性基を含み得る。反応性基は、例えば、当技術分野で知られている化学的方法により、既存の側鎖Ｒａ及び／若しくはＲｂ、又はＮ位のＲ５のカチオン性部分、Ｒ４の中性スペーサー若しくは脂質部分に付加することができる。あるいは、所望の反応性部分を有するＲａ、Ｒｂ、Ｒ４、又はＲ５基が対応する遊離アミンとして商業的に入手可能である場合、対応する遊離アミンは、ペプチド鎖の一般的な合成中に（例えば、サブモノマー合成中に）組み込むことができる。
【００９７】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、反応性基又はリンカー基を含む１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。適切な反応性基には、限定されるものではないが、エステル、アミド、イソシアネート、チオール、又は「クリック」ケミストリー適合性部分（例えば、アジド、アルキニル）が含まれ得る。
【００９８】
別の態様では、本開示はさらに、カチオン性化合物として、ペプチド化合物が治療剤及び／又は標的化要素に共有結合又はコンジュゲートしている、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を提供する。特定の実施態様では、治療剤及び／又は標的化要素は、小分子、ペプチド配列、抗体若しくは抗体断片、アプタマー、単糖若しくはオリゴ糖（例えば、ガラクトース）、又はグリカンである。
【００９９】
特定の生理学的条件下で感受性であるか又は不安定なリンカー基又は結合は、特定の器官又は細胞への標的化送達と、それに続く細胞内（へ）の治療剤及び／又はポリアニオン性物質の選択的放出を可能にするために有用であり得る。さらに、不安定な結合はまた、ポリアニオン性物質の送達後に、細胞（又は器官、又は全身）からの第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性化合物の消失及びクリアランスを促進し得る。特定の実施態様では、リンカー基は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と治療剤又は標的化要素との間の共有結合が、加水分解的に不安定、化学的に不安定、ｐＨに不安定、光に不安定、熱に不安定、又は酵素的に切断可能であるように選択される。
【０１００】
末端（キャッピング）残基と保護末端基
本明細書に記載されるように、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、そのＮ末端及び／又はＣ末端で、脂質部分でＮ−置換されている（「Ｎ−脂質化」）アミノ酸残基並びに／又はオリゴエチレングリコール及び／若しくはポリエチレングリコールでＮ−置換されている（「Ｎ−ＰＥＧ化」）アミノ酸残基によって、さらにキャップされるオリゴペプチド骨格を含む。カチオン性ペプチド化合物のＮ−脂質化は、化合物並びに化合物とポリアニオン種との間に形成された任意の複合体に好ましい親油性を与える。Ｎ−ＰＥＧ化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの粒子形成及び凝集に対してより良い制御を提供する。Ｎ末端及びＣ末端の末端アミノ及びカルボン酸部分は、保護末端基でさらにキャップされ得る。
【０１０１】
本明細書に記載されるように、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化及び／又はＮ−ＰＥＧ化されたアミノ酸残基を含み得る。本明細書で提供されるカチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化又はＮ−ＰＥＧ化された少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である。他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。さらに他の実施態様では、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化及びＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基の両方を含む。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。
【０１０２】
脂質部分
上記のように、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸残基を含み得、ここで、アミノ酸残基は脂質部分でＮ−置換されている、すなわち「Ｎ−脂質化」されている。本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のＮ末端及び／又はＣ末端でのＮ−脂質化アミノ酸残基の組み込みは、化合物の親油性を増加させる。カチオン性ペプチド化合物の親油性の増加は、細胞膜の脂質二重層などの疎水性環境に対する親和性を増強し、したがって、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、並びにそれらのポリアニオン性化合物との任意の複合体が細胞内に輸送される傾向を高める。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化される。いくつかの実施態様では、本開示の第三級アミン脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端にＮ−脂質化アミノ酸残基を含む。他の実施態様では、本開示の第三級アミン脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｃ末端にＮ−脂質化アミノ酸残基を含む。特定の実施態様では、本開示の第三級アミン脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端及びＣ末端にＮ−脂質化アミノ酸残基を含む。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のＮ末端におけるＮ−脂質化アミノ酸残基の数は、ｎによって表される。他の実施態様では、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のＮ末端におけるＮ−脂質化アミノ酸残基の数は、ｓによって表される。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、ｎは０から８までの整数である。特定の実施態様では、ｎは０から５までの整数である。他の実施態様では、ｎは０、１、２、３、４、５、６、又は７の整数である。さらに他の実施態様では、ｎは１、２、３、又は４の整数である。いくつかの実施態様では、ｓは０から８までの整数である。特定の実施態様では、ｓは０から５までの整数である。他の実施態様では、ｓは０、１、２、３、４、５、６、又は７の整数である。さらに他の実施態様では、ｓは１、２、３、又は４の整数である。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ−脂質化されているいくつかの実施態様では、ｎ又はｓの少なくとも１つは非ゼロである。いくつかの実施態様では、ｎは非ゼロである。他の実施態様では、ｓは非ゼロである。特定の実施態様では、ｎ及びｓの両方が非ゼロである。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、ｎとｓの合計は、１から８、２から７、又は４から６の整数である。他の実施態様では、ｎとｓの合計は、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも又は４である。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化残基のブロック、すなわち「Ｎ−脂質ブロック」を含み、ここで、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、互いに隣接する少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのＮ−脂質化残基（例えば、Ｒ脂質Ｒ脂質Ｒ脂質）を含む。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化残基のブロックを含み、ここで、ｎは、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４である。他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ｓが少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４であるＮ−脂質化残基のブロックを含む。
【０１０８】
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドのＮ−脂質化アミノ酸残基は、脂質部分Ｒ３でＮ−置換されている。本開示の脂質部分は、中性である（すなわち、電荷を持たない、又は正味荷電がゼロである）疎水性又は親油性部分を含み得る。本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性化合物の脂質部分は、天然又は合成のいずれかに由来し得る。各Ｒ３は、独立して、同じであっても異なっていてもよい脂質部分である。いくつかの実施態様では、各Ｒ３は同じである。他の実施態様では、各Ｒ３は異なる。
【０１０９】
Ｎ−脂質化アミノ酸残基の特定の配列又は配置は、核酸との複合体形成及び核酸の送達を改善するために特に有用であり得ることを認識すべきである。例えば、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性化合物が、２つの異なる脂質部分Ｒ３ａ及びＲ３ｂのうちの１つを有する混合Ｎ−脂質化アミノ酸残基のセットを含むいくつかの実施態様では、Ｎ−脂質化アミノ酸残基は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかに交互又はブロック配列中に配置され得る。Ｎ−脂質化アミノ酸残基の交互配列の１つの例は、Ｒ３ａ−Ｒ３ｂ−Ｒ３ａ−Ｒ３ｂ又はＲ３ｂ−Ｒ３ａ−Ｒ３ｂ−Ｒ３ａによって表すことができる。ブロック配列の例は、Ｒ３ａ−Ｒ３ａ−Ｒ３ｂ−Ｒ３ｂ又はＲ３ｂ−Ｒ３ｂ−Ｒ３ａ−Ｒ３ａによって表すことができる。他の実施態様では、Ｎ−脂質化アミノ酸残基の配列は、ランダムに順序付けられてもよい。２つのＮ−脂質化アミノ酸残基の配列又は配置の上記の例は、限定することを意図するものではないことを認識すべきである。さらに、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｒ３の２つ以上の異なる脂質部分を含み得、これは、一般に上記のように、ランダム、交互又はブロック配列中に存在し得る。
【０１１０】
適切な脂質部分は、例えば、置換されていてもよい分岐若しくは直鎖脂肪族部分、又は脂肪酸、ステロール、及びイソプレノイドを含む天然脂質化合物に由来する置換されていてもよい部分を含み得る。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、脂質部分は、約６から約５０個の炭素原子又は約１０から約５０個の炭素原子を有する分岐又は直鎖脂肪族部分を含み得、任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み、任意選択で１つ又は複数の二重結合又は三重結合（すなわち、飽和又はモノ若しくはポリ不飽和）を含む。特定の実施態様では、脂質部分は、置換されていてもよい脂肪族、直鎖又は分岐部分を含み得、各疎水性末端は、独立して、約８から約３０個の炭素原子又は約６から約３０個の炭素原子を有する。特定の実施態様では、脂質部分は、例えば、脂肪酸及び脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施態様では、各Ｒ３は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４−アルキル又はＣ８−Ｃ２４−アルケニルであり、ここで、Ｃ８−Ｃ２４−アルケニルは、任意選択でモノ又はポリ不飽和である。いくつかの実施態様では、各Ｒ３は、Ｃ６−Ｃ１８アルキル又はＣ６−Ｃ１８アルケニルである。特定の実施態様では、各Ｒ３は、Ｃ８−Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施態様では、各Ｒ３は、ｎ−デシルなどのＣ１０−アルキルである。いくつかの実施態様では、各Ｒ３は、独立して、３−エチルヘキサ−１−イル、カプリリル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される。他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される。
【０１１２】
前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、
2022502451.tif 000035
である。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、式
2022502451.tif 000036
の脂質であり、ここで、Ｒ８は、約６から約５０個の炭素原子又は約１０から約５０個の炭素原子を有し、任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み、任意選択で１つ又は複数の二重結合又は三重結合を含む分岐又は直鎖脂肪族部分である。特定の実施態様では、各Ｒ３は、独立して、
2022502451.tif 000037
である。
【０１１３】
本発明の実施において使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質、グリセリド（ジグリセリド又はトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、飽和及び不飽和ステロール、イソプレノイド、並びにその他の同様の天然脂質から誘導することができる。
【０１１４】
他の適切な脂質部分は、例えばナフタレニル若しくはエチルベンジルを含む、置換されていてもよいアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、若しくはアリールアルキル部分などの親油性炭素環式若しくは芳香族基、又は、例えば、ステロールエステル及びワックスエステルを含むエステル官能基を含む脂質を含み得る。さらに他の実施態様では、脂質部分Ｒ４は、
2022502451.tif 000038
である。
【０１１５】
エチレングリコール部分
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に、エチレングリコールのオリゴマー又はポリマーでＮ−置換された、すなわち、オリゴエチレングリコール及び／又はポリエチレングリコールでＮ−置換されたキャッピングアミノ酸残基を含み得る。本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物へのオリゴ及び／又はポリエチレングリコール部分の組み込みは、核酸と形成された複合体の粒子安定性を促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの粒子凝集を防止し得る。
【０１１６】
用語「ＰＥＧ化」は、本明細書では、オリゴエチレングリコール、又はポリエチレングリコール、又はそれらの組み合わせでＮ−置換され得る末端アミノ酸残基を含むカチオン性ペプチド化合物を記述するために使用されることを認識すべきである。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−ＰＥＧ化されている。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｎ末端にＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む：
2022502451.tif 000039
【０１１８】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ末端にＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む特定の実施態様では、ｍは、Ｎ末端のＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基の数を表し、各Ｒ２は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＲ２ａのエチレングリコール部分であり、ここで、Ｒ２ａは−Ｈ又はＣ１−Ｃ４−アルキルである。いくつかの実施態様では、Ｒ２ａは、−Ｈ、−ＣＨ３、又はＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施態様では、Ｒ２ａは−Ｈである。他の実施態様では、Ｒ２ａは−ＣＨ３である。さらに他の実施態様では、Ｒ２ａは−ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１１９】
いくつかの実施態様では、ｍは０から１０までの整数、０から３までの整数、又は４から１０までの整数である。いくつかの実施態様では、各ｕは、独立して、２から２００のまでの整数、２から１００までの整数、２から５０までの整数、５０から２００までの整数、５０から１００までの整数、１００から２００までの整数、又は１５０から２００までの整数である。
【０１２０】
特定の実施態様では、ｍは０から３までの整数であり、各ｕは２０から２００まで、又は任意選択で３０から５０までの整数である。特定の実施態様では、ｍは０から３までの整数であり、ｕは４０から４５までの整数である。さらに他の実施態様では、ｍは１であり、ｕは４０から４５までの整数である。他の実施態様では、ｍは４から１０までの整数であり、各ｕは２から１０までの整数である。特定の実施態様では、ｍは４から１０までの整数であり、ｕは２から５までの整数である。さらに他の実施態様では、ｍは７から１０までの整数であり、ｕは３である。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｃ末端にＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む：
2022502451.tif 000040
【０１２２】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＣ末端にＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む特定の実施態様では、ｔは、Ｎ末端のＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基の数を表し、各Ｒ６は、独立して、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＲ６ａのエチレングリコール部分であり、ここで、Ｒ６ａは−Ｈ又はＣ１−Ｃ４−アルキルである。いくつかの実施態様では、Ｒ６ａは、−Ｈ、−ＣＨ３、又はＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施態様では、Ｒ６ａは、−Ｈである。他の実施態様では、Ｒ６ａは、−ＣＨ３である。さらに他の実施態様では、Ｒ６ａは、−ＣＨ２ＣＨ３である。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、ｔは０から１０までの整数、０から３までの整数、又は４から１０までの整数である。いくつかの実施態様では、各ｕは、独立して、２から２００のまでの整数、２から１００までの整数、２から５０までの整数、５０から２００までの整数、５０から１００までの整数、１００から２００までの整数、又は１５０から２００までの整数である。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、ｔは０から３までの整数であり、各ｖは３０から５０までの整数である。特定の実施態様では、ｔは０から３までの整数であり、ｖは４０から４５までの整数である。さらに他の実施態様では、ｔは１であり、ｖは４０から４５までの整数である。他の実施態様では、ｔは４から１０までの整数であり、各ｖは２から１０までの整数である。特定の実施態様では、ｔは４から１０までの整数であり、ｖは２から５までの整数である。さらに他の実施態様では、ｔは７から１０までの整数であり、ｖは３である。
【０１２５】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ−ＰＥＧ化されているいくつかの実施態様では、ｍ又はｔの少なくとも１つは非ゼロである。いくつかの実施態様では、ｍは非ゼロである。他の実施態様では、ｔは非ゼロである。特定の実施態様では、ｍ及びｔの両方が非ゼロである。
【０１２６】
Ｎ−脂質化及び／又はＮ−ＰＥＧ化
本明細書に記載されるように、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化及び／又はＮ−ＰＥＧ化されたアミノ酸残基を含み得る。本明細書で提供されるカチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化又はＮ−ＰＥＧ化された少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のいくつかの実施態様では、ｍ、ｎ、ｓ、又はｔのうちの少なくとも１つは非ゼロである。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ｎ及びｓの少なくとも１つが非ゼロである第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である。特定の実施態様では、ｎ及びｓの両方が非ゼロである。さらに特定の実施態様では、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉａ）の第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物であり：
2022502451.tif 000041
式中、ｎ及びｓの少なくとも１つは非ゼロであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、及びｒは、式（Ｉ）について定義された通りである。式（Ｉａ）の化合物の特定の実施態様では、ｎ及びｓの両方が非ゼロである。
【０１２８】
他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ｍ及びｔの少なくとも１つが非ゼロである第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。特定の実施態様では、ｍ及びｔの両方が非ゼロである。特定の実施態様では、ｍ及びｔの両方が非ゼロである。他の実施態様では、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉｂ）の第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり：
2022502451.tif 000042
式中、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、及びｒは、式（Ｉ）について定義された通りである。式（Ｉｂ）の化合物の特定の実施態様では、ｍ及びｔの両方が非ゼロである。
【０１２９】
さらに他の実施態様では、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ−脂質化及びＮ−ＰＥＧ化アミノ酸残基の両方を含む。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である特定の実施態様では、ｍ及びｔの少なくとも１つが非ゼロであり、ｎ及びｓの少なくとも１つが非ゼロである。
【０１３０】
さらに別の実施態様では、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉｃ）の第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり：
2022502451.tif 000043
式中、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロであり、ｎ及びｓの少なくとも１つは非ゼロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、及びｒは式（Ｉ）で定義された通りである。
【０１３１】
他の実施態様では、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、Ｎ末端又はＣ末端に、Ｎ−ＰＥＧ化残基と同様の遮蔽効果を提供する他の中性遮蔽ポリマー又は部分を有するＮ−置換アミノ酸残基を含み得る。これらには、ヒドロキシルアルキル、ヒアルロン酸、多糖類、ポリリン酸及びポリホスホエステル、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオール、親水性ポリペプチド、又は他の合成親水性ポリマーなどの例が含まれ得る。
【０１３２】
Ｎ末端及びＣ末端基
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、そのＮ末端及びＣ末端がそれぞれ遊離アミン形態及び遊離酸の形態で提供されてもよく、又は保護された形態で提供されてもよい。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端及び／又はＣ末端残基にさらに保護基又は末端キャッピング基を含む。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端残基に保護基又は末端キャッピング基Ｒ１を含む。いくつかの実施態様では、Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ、−ＣＨ２−ＣＯＲ１ａ、カチオン性部分、脂質部分、又はオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール部分であり、ここで、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルキルアリール、又は脂質部分である。特定の実施態様では、Ｒ１は、−Ｈ、アルキル、アルキルアリール、−ＣＯＲ１ａ、又は脂質部分であり、Ｒ１ａは、−Ｈ、−ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、−Ｏ−アルキル、又は−Ｏ−アルキルアリールである。Ｒ１が脂質部分である特定の実施態様では、脂質部分はリン脂質ではない。Ｒ１がアルキル又は−ＣＯＲ１ａであり、Ｒ１ａがアルキルであるさらに他の実施態様では、アルキルは、−ＯＨ又はハロによって置換されていてもよい。
【０１３４】
他の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｃ末端残基に保護基又は末端キャッピング基Ｒ７を含む。いくつかの実施態様では、Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、カチオン性部分、脂質部分、又はオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分である。いくつかの実施態様では、Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アシル、−ＯＨ、−ＯＲ７ａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７ａ、又は脂質部分であり、ここで、Ｒ７ａは、アルキル、アシル、又は脂質部分である。Ｒ７が脂質部分である特定の実施態様では、脂質部分はリン脂質ではない。
【０１３５】
さらに別の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＮ末端及びＣ末端は、Ｒ１及びＲ７が反応性リンカー基などの追加の官能基を有するように選択されるか、又はさらに修飾され得る。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドのＲ１及び／又はＲ７は、独立して、１つ又は複数の反応性リンカー基を含む。適切な反応性基には、限定されるものではないが、エステル、アミド、イソシアネート、チオール、又は「クリック」ケミストリー適合性部分（例えば、アジド、アルキニル）が含まれ得る。
【０１３７】
また、反応性リンカー基は、標的化要素又は治療剤などの他の有用な化合物をペプチド化合物に共有結合させるために使用することができる。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、治療剤及び／又は標的化要素に共有結合又はコンジュゲートしている。特定の実施態様では、治療剤及び／又は標的化要素は、小分子、抗体又は抗体断片である。
【０１３８】
さらに、Ｒ１及びＲ７のための追加の官能基はまた、合成又は脱保護条件と適合しないか（酸に不安定なリンカーなど）、或いは適切な保護基戦略が利用できない（例えば、ポリアミン）カチオン性基を含み得る。さらに別の実施態様では、Ｒ１はポリアミンである。Ｒ１がポリアミンであるいくつかの実施態様では、ポリアミンは、
2022502451.tif 000044
である。特定の実施態様では、ポリアミンは、
2022502451.tif 000045
からなる群から選択される。
【０１３９】
上記のように、特定の生理学的条件下で感受性であるか又は不安定なリンカー基又は結合は、特定の細胞への標的化ポリアニオン物質の送達を促進し、消失などの特定の薬物動態特性を改善し得る。特定の実施態様では、リンカー基は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と治療剤又は標的化要素との間の共有結合が、加水分解的に不安定、化学的に不安定、ｐＨに不安定、光に不安定、熱に不安定、又は酵素的に切断可能であるように選択される。
【０１４０】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の組み合わせ
本開示の複合体及び組成物は、１つ又は複数のカチオン性化合物を含み得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体は、１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含み得る。単一の複合体における本開示の複数のカチオン性ペプチド化合物の混合物及び組み合わせの使用は、特定の薬物動態学的及び薬力学的特性に適合した製剤の調製を可能にし得る。関連する薬物動態学的及び薬力学的特性には、限定されるものではないが、生体内分布、免疫原性、製剤安定性、カプセル化のパーセンテージ、トランスフェクション効率、血漿半減期などが含まれ得る。これらの特性の異なる組み合わせが、異なる適用のために必要になることもある。
【０１４１】
例えば、特定の実施態様では、複合体又は組成物は、カチオンに富む１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、高度に脂質化され、かつ／又は少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物との組み合わせを含み得る。理論的には、そのような組み合わせは、（脂質化ペプチド化合物のおかげで）より大きな親油性遮蔽とともに（カチオンに富むペプチド化合物を介して）より大きな電荷安定化を提供することによって、ポリアニオン性化合物の改善された送達をもたらす可能性がある。さらに、個々の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のそれぞれの個々の量は、所望の特性を達成するために調整され得ることを認識すべきである。
【０１４２】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の合成
別の態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製する方法である。
【０１４３】
本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、脂質部分をオリゴペプチドコアにコンジュゲートさせるための追加のリンカー種を必要とせずに合成することができる。本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物について、脂質及びエチレングリコール部分は、ペプチドそれ自体内の窒素原子、つまり、アミノ酸残基のアミド窒素又はＮ位に共有結合で直接結合している。したがって、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、ペプチド鎖中にＮ−置換残基を生成するための当技術分野で知られている方法によって、完全に合成することができる。
【０１４４】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、残基がＮ位にカチオン性、中性、脂質、又はオリゴ／ポリエチレングリコール部分を有するかどうかにかかわらず、付加される各アミノ酸残基の一連のアシル化（アミド化）及び求核置換（アミノ化）反応によって調製することができる。本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物は、ペプチド鎖への個々の残基の逐次付加によって合成される。残基の逐次付加は、アミノ酸の所望の配列及び長さが達成されるまで繰り返し実行され得る。
【０１４５】
本発明の化合物は、固相法及び液相法の両方によって合成することができる。固相合成によって、本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含むＮ−置換ペプチドを調製するための例示的な方法が以下に論じられ、図３Ａ−３Ｅに示される。
【０１４６】
図３Ａに示されるように、末端第二級アミンを有する固体樹脂支持体が、合成の開始時に提供される。アシル化剤を、適切なペプチドカップリング試薬と溶媒とともに末端第二級アミンに加え、末端第二級アミンとアシル化剤との間にアミド結合を形成する。アシル化剤は、好ましくはアセチル化剤である。アシル化剤は、α炭素でのアミド化とそれに続くアミノ化を促進するために、少なくとも２つの適切な脱離基を含む。特定の実施態様では、アシル化剤はハロ酢酸である。他の実施態様では、アシル化剤はブロモ酢酸である。
【０１４７】
図３Ｂでは、図３Ａにおいて生成されたアシル化生成物は、所望の置換された第一級又は第二級アミンと反応して、対応するＮ−置換末端アミノ酸残基を提供する。選択された第一級又は第二級アミンは、ブロモ酢酸中の臭素などの脱離基をα炭素上に置換し、対応するアミノ化生成物を生成する。いくつかの実施態様では、第一級又は第二級アミンは、ＮＨＲｐＲ２、ＮＨＲｐＲ３、ＮＨＲｐＲ４、ＮＨＲｐＲ５、及びＮＨＲｐＲ６からなる群から選択されるアミンであり、ここで、Ｒｐは−Ｈ又は保護基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物について定義された通りである。
【０１４８】
アミド化及びアミノ化反応は、所望のペプチド配列が達成されるまで（図３Ｄ）、連続して繰り返される（図３Ｃ）。本明細書に記載の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製する方法は、さらに、連続するアミド化／アミノ化反応の過程でペプチド鎖の反応性部分との望ましくない反応を防ぐための保護及び脱保護工程を含み得ることを認識すべきである。例えば、保護基Ｒｐは、合成中に本明細書に記載のペプチド化合物に沿った任意の場所で、α炭素での側鎖及び／又はＮ−置換基に付加され得る。適切な保護基Ｒｐは、当技術分野で知られている任意の保護基、特にＢｏｃ／Ｂｚｌ又はＦｍｏｃ／ｔＢｕなどの直交性保護スキームにおけるペプチド合成用に適した保護基を含み得る。
【０１４９】
Ｎ末端及びＣ末端での末端基の取り込み（Ｒ１及びＲ７）、並びにオリゴペプチド骨格に沿ったアミノ酸残基（Ｒａ、Ｒｂ、Ｒ４、Ｒ５）の末端基及び／又は側鎖の官能化は、当技術分野で知られている方法によって行うことができる。当業者は、適切な方法の選択、及び固相合成全体に対する追加の官能化工程のタイミングは、付加される末端基及び／又はリンカー基、並びにペプチド化合物上に存在する他の部分及び／又は保護基との前記方法の適合性に依存するであろうことを認識するであろう。
【０１５０】
所望のペプチド化合物は、上記の合成において利用される任意の保護スキームに応じて、塩酸、臭化水素酸、又はトリフルオロ酢酸を含む酸性条件などの適切な反応条件下で固体樹脂支持体から切断される（図３Ｅ）。固体樹脂支持体からの第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の切断は、溶液中に対応する遊離カチオン性ペプチド化合物を生成する。
【０１５１】
カチオン性ペプチド化合物を溶液から単離及び精製するために、例えば、固体樹脂支持体からのペプチド含有溶液の濾過及び単離された濾液の凍結乾燥を含むさらなる工程を実施して、固体生成物を提供することができる。
【０１５２】
樹脂の切断を引き起こすために用いられる酸性条件のため、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、対応する酸性塩の形態で存在し得ることを認識すべきである。例えば、いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、その塩形態である。特定の実施態様では、塩の形態は、酸付加塩である。いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、塩酸塩（塩酸付加塩）、臭化水素酸塩（臭化水素酸付加塩、又はトリフルオロ酢酸塩（トリフルオロ酢酸付加塩）である。特定の実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のトリフルオロ酢酸付加塩又はトリフルオロ酢酸塩である。
【０１５３】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の酸付加塩形態は、１つ又は複数の薬学的に許容される塩形態を得るために、当技術分野の方法（例えば、イオン交換）を介してさらに修飾され得る。「薬学的に許容される」という句は、物質又は組成物が、製剤を構成する他の成分、及び／又は製剤が投与されている対象と、化学的及び／又は毒物学的に適合性でなければならないことを示す。用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、限定されるものではないが、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸など、並びに、有機酸の脂肪族クラス、脂環式クラス、芳香族クラス、アリール脂肪族クラス、複素環式クラス、カルボン酸クラス、及びスルホン酸クラスから選択される有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、安息香酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸「メシレート」、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、及びサリチル酸などにより形成される薬学的に許容される塩を含み得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、薬学的に許容される塩である。特定の実施態様では、塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、又はサリチル酸塩である。
【０１５５】
リピトイド
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物の１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、リピトイドとしても知られる１つ又は複数のカチオン性ペプトイド−リン脂質コンジュゲート構築物を含む。リピトイドは、ペプトイド骨格に沿ったグリシン残基のＮ位にカチオン性及び／又は中性側鎖の組み合わせを有するＮ−置換ポリグリシン化合物（「ペプトイド」としても知られる）がさらにペプトイド鎖の単一末端リン脂質基に結合しているものである。リピトイドとその合成は、一般的に、Simon R.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9367-9371 (1992); Lobo, B. A.; Vetro, J. A.; Suich, D. M.; Zuckermann, R. N.; Middaugh, C. R. Structure/Function Analysis of Peptoid/Lipitoid:DNA Complexes. Journal of Pharmaceutical Sciences 2003, 92 (9), 1905-1918；及びUtku, Y.; Dehan, E.; Ouerfelli, O.; Piano, F.; Zuckermann, R. N.; Pagano, M.; Kirshenbaum, K. A Peptidomimetic SiRNA Transfection Reagent for Highly Effective Gene Silencing. Molecular BioSystems 2006, 2 (6-7), 312に記載されている。例示的なリピトイドは、図１に示されるような九量体「リピトイド１」である。リピトイド化合物の一般的な構造を以下の式（ＩＩ）に示す。ここで、ｘは１から１００までの整数であり、各Ｒ９は、独立して、脂質部分であり、各Ｒ１０は、独立して、カチオン性又は中性部分である。
2022502451.tif 000046
【０１５６】
式（ＩＩ）では、ｘは１から１００までの整数である。特定の数の残基は、本明細書に記載の複合体及び組成物における使用に特に適している可能性がある。例えば、いくつかの実施態様では、ｘは、１から５０、２から２５、又は３から１５の整数である。
【０１５７】
上記の式（ＩＩ）に示されているように、Ｒ９は脂質部分を表し、その脂質部分は、限定されるものではないが、約６から約５０個の炭素原子又は約１０から約５０個の炭素原子を有する分岐又は直鎖脂肪族部分を含み得、任意選択で１つ又は複数のヘテロ原子を含み、任意選択で１つ又は複数の二重結合又は三重結合（すなわち、飽和又はモノ若しくはポリ不飽和）を含む。特定の実施態様では、脂質部分Ｒ９は、置換されていてもよい脂肪族、直鎖又は分岐部分を含み得、各疎水性末端は、独立して、約８から約３０個の炭素原子又は約６から約３０個の炭素原子を有する。特定の実施態様では、脂質部分は、例えば、脂肪酸及び脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施態様では、各脂質部分Ｒ９は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４−アルキル又はＣ８−Ｃ２４−アルケニルであり、ここで、Ｃ８−Ｃ２４−アルケニルは、任意選択でモノ又はポリ不飽和である。他の実施態様では、各脂質部分Ｒ９は、独立して、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、及びラウリルからなる群から選択される。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに他の実施態様では、各脂質部分Ｒ９は、独立して、
2022502451.tif 000047
である。
【０１５８】
アミノグリシン残基のＮ位の基Ｒ１０は、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物について上に記載されたものと同様のカチオン性及び中性部分を含む。
【０１５９】
カチオン性又は正に帯電した部分は、例えば、以下の官能基：アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、及びアミジノを含むものなど、窒素ベースの置換基を含み得る。これらの官能基は、芳香族、飽和環状、又は脂肪族のいずれかであり得る。リピトイドのいくつかの実施態様では、各カチオン性部分は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、又はＮ−ヘテロシクリルアルキルである。他の実施態様では、各カチオン性部分は、独立して、
2022502451.tif 000048
である。特定の実施態様では、各カチオン性部分は、独立して、
2022502451.tif 000049
からなる群から選択される。さらに他の実施態様では、各カチオン性部分は、
2022502451.tif 000050
である。
【０１６０】
中性部分には、限定されるものではないが、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１−Ｃ４−アルキルが含まれ、ここで、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、又はヒドロキシアルキルは、１つ又は複数の置換基−ＯＨ、ハロ、又はアルコキシで置換されていてもよい。リピトイドのいくつかの実施態様では、各中性部分は、
2022502451.tif 000051
からなる群から独立して選択される。特定の実施態様では、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000052
である。さらに他の実施態様では、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000053
である。
【０１６１】
さらに他の実施態様では、各カチオン性部分は、
2022502451.tif 000054
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000055
である。さらに別の実施態様では、１つ又は複数のリピトイドは、リピトイド１を含む。
【０１６２】
上記の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と同様に、本明細書に記載のリピトイドは、ランダム配列に配置されたアミノ酸残基、又は交互配列又はブロック配列の繰り返しモチーフを含み得る。いくつかの実施態様では、式（ＩＩ）のリピトイドは、ｘ残基の鎖内に繰り返し（二量体、三量体、四量体など）サブユニットを含み得る。これらのサブユニットには、限定されるものではないが、−ＲカチオンＲ中性−又は−ＲカチオンＲ中性Ｒ中性−が含まれ、ここで、Ｒカチオンは、カチオン性部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基である。他の実施態様では、式（ＩＩ）のリピトイドは、少なくとも１つの三量体サブユニット−Ｒカチオン−Ｒ中性−Ｒ中性を含み、Ｒカチオンは、カチオン部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基である。
【０１６３】
式（ＩＩ）のリピトイドがカチオン性ドメインを含むいくつかの実施態様では、各カチオン性部分Ｒ１０は、
2022502451.tif 000056
である。前述の実施態様の他の実施態様では、各カチオン性部分Ｒ１０は、
2022502451.tif 000057
であり、各中性スペーサー部分Ｒ１０は、
2022502451.tif 000058
である。特定の実施態様では、式（ＩＩ）のリピトイドは、１つ又は複数の二量体又は三量体サブユニットを含み、ここで、各カチオン性部分は、
2022502451.tif 000059
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000060
である。さらに他の実施態様では、式（ＩＩ）のリピトイドは、１つ又は複数の三量体サブユニット−ＲカチオンＲ中性Ｒ中性−を含むカチオン性ドメインを含み、ここで、Ｒカチオンは、カチオン性部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基であり、各カチオン性部分は、
2022502451.tif 000061
であり、各中性スペーサー部分は、
2022502451.tif 000062
である。
【０１６４】
第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と同様に、本明細書に記載の複合体及び組成物は、１つ又は複数のリピトイドを含み得る。特定の実施態様では、１つ又は複数のカチオン性化合物は、１つ又は複数のリピトイドを含む。さらに他の実施態様では、１つ又は複数のカチオン性化合物は、リピトイド１を含む。
【０１６５】
他の脂質成分
カーゴとしての１つ又は複数のポリアニオン性化合物の電荷中和のための主要な脂質成分として使用される脂質化カチオン性ペプチド化合物に加えて、多成分脂質組成物及びその中の複合体は、構造脂質、リン脂質及び遮蔽脂質を含む他の脂質成分を含み得る。本明細書に記載の追加の脂質成分は、カチオン性ペプチド化合物とポリアニオン性物質の複合体に物理的構造と安定性を提供し、溶液中でのそれらの投与を容易にし、細胞内への複合体の取り込みを促進する。
【０１６６】
構造脂質
多成分組成物内のポリアニオン性化合物の複合体に物理的安定性を付与し、複合体の親油性を増強して標的細胞との結合及びエンドサイトーシスを促進するために、本明細書に記載のように構造脂質を使用することができる。いくつかの実施態様では、本開示の組成物は、任意選択で、脂質成分として１つ又は複数の構造脂質を含む複合体を含む。いくつかの変形例では、組成物は、１つ又は複数の構造脂質を含む複合体を含む。
【０１６７】
本開示の組成物及び複合体に適した構造脂質には、ステロールが含まれ得るが、これに限定されない。いくつかの実施態様では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施態様では、構造脂質はコレステロールである。
【０１６８】
しかしながら、本開示のいくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物及び複合体は、構造脂質を含まないが、それでも非常に良好な送達効率を示すことに留意されたい。特定の他の実施態様では、本明細書で提供される組成物及び複合体は、構造脂質を含まない。
【０１６９】
（双性イオン性）リン脂質又は双性イオン性脂質
上記の構造脂質と同様に、リン脂質もまた、本開示の複合体及び組成物に組み込まれ得る。リン脂質は、その両親媒性特性と細胞膜を破壊する能力により、溶液中の複合体をさらに安定化させるだけでなく、細胞のエンドサイトーシスを促進する。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物は、脂質成分として１つ又は複数のリン脂質を含む複合体を含む。特定の実施態様では、１つ又は複数のリン脂質は、１つ又は複数の双性イオン性リン脂質を含む。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のリン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ  １６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施態様では、リン脂質はＤＯＰＥである。
【０１７１】
エンドサイトーシスのための細胞膜の破壊を促進する、リン脂質によって提供される両親媒性特性は、リン脂質ではない双性イオン性脂質によって代替的に提供され得ることを認識すべきである。いくつかの実施態様では、組成物は、リン脂質ではない１つ又は複数の双性イオン性脂質を含む複合体を含む。さらに別の実施態様では、組成物は、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の双性イオン性脂質、又はそれらの任意の組み合わせを含む複合体を含む。
【０１７２】
遮蔽脂質
本明細書に記載されるように、本開示の複合体及び組成物は、１つ又は複数の遮蔽脂質をさらに含み得る。ＰＥＧ化脂質などの遮蔽脂質は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物に対する対電荷として、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物に電荷中和の追加層を提供し、細胞の食作用プロセスによるクリアランスを防ぐことができる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物は、脂質成分として１つ又は複数の遮蔽脂質を含む複合体を含む。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、遮蔽脂質は、ＰＥＧ脂質である。他の実施態様では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）、及びＰＥＧ修飾ＤＯＰＥ（ＤＯＰＥ−ＰＥＧ）からなる群から選択されるＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールである。特定の実施態様では、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール−ポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）、ジステアロイルグリセロール−ポリエチレングリコール（ＤＳＧ−ＰＥＧ）、ジパルミトイルグリセロール−ポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ）、及びジオレオイルグリセロール−ポリエチレングリコール（ＤＯＧ−ＰＥＧ）からなる群から選択される。特定の実施態様では、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ−ＰＥＧである。
【０１７４】
前述のＰＥＧ脂質中のＰＥＧ鎖の特定の分子量が、本開示の複合体への組み込みに特に有利であり得ることをさらに認識すべきである。例えば、いくつかの実施態様では、ＰＥＧ鎖は、３５０から６０００ｇ／ｍｏｌの間、１０００から５０００ｇ／ｍｏｌの間、又は２０００から５０００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有する。特定の実施態様では、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、３０００ｇ／ｍｏｌ、５０００ｇ／ｍｏｌ、又は１００００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。他の特定の実施態様では、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、又は５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。例えば、特定の実施態様では、ＰＥＧ化脂質は、ジミリストイルグリセロール−ポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）である。
【０１７５】
さらに別の実施態様では、１つ又は複数のＰＥＧ脂質は、少なくとも１つのオリゴ又はポリエチレングリコール部分を含む式（Ｉ）の第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。ペプチド鎖の骨格に沿って脂質部分とＰＥＧ部分の両方を収容するそれらの柔軟性のおかげで、それらの特定の置換基の性質に応じて、本開示の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、脂質化カチオン性ペプチド化合物としてだけでなく、カチオン性化合物−ポリアニオン性化合物複合体を安定化するための適切な遮蔽脂質としても役立つことができる。式（Ｉ）の第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、リピトイド又は脂質様化合物などの他のクラスのカチオン性化合物、並びに式（Ｉ）の他の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と組み合わせることができることを認識すべきである。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、ＰＥＧ脂質は、本明細書に記載の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ここで、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロである（すなわち、Ｎ−ＰＥＧ化）。さらに別の実施態様では、ＰＥＧ脂質は、ｍ及びｔが、独立して、０から１０までの整数であり、ｍ及びｔの少なくとも１つが非ゼロである、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。いくつかの実施態様では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｉｂ）の第三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。さらに他の実施態様では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｉｃ）の第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性化合物である。
【０１７７】
上記のＰＥＧ脂質と同様に、前述の第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物におけるＰＥＧ鎖の特定の分子量は、本開示の複合体への組み込みに特に有利であり得る。例えば、いくつかの実施態様では、ＰＥＧ鎖は、３５０から６０００ｇ／ｍｏｌの間、１０００から５０００ｇ／ｍｏｌの間、又は２０００から５０００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有する。特定の実施態様では、第三級アミノ脂質化及びＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＰＥＧ鎖は、約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、３０００ｇ／ｍｏｌ、又は５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。他の特定の実施態様では、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１０００ｇ／ｍｏｌ、２０００ｇ／ｍｏｌ、又は５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【０１７８】
しかしながら、式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、少数のより長いポリエチレングリコール部分の代わりにいくつかの短いオリゴエチレングリコール部分を含み、複合体に同様の粒子安定化を提供し得ることを認識すべきである。ＰＥＧ化化合物が式（Ｉ）のＮ−ＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であるいくつかの実施態様では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＲ２ａ［ここで、各Ｒ２ａは、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ４−アルキルである］の少なくとも１つのエチレングリコール部分Ｒ２を含む。他の実施態様では、式−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＲ６ａ［ここで、各Ｒ６ａは、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ４−アルキルである］の少なくとも１つのエチレングリコール部分Ｒ６である。ｍが非ゼロである前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施態様では、ｍは０から１０までの整数であり、各ｕは、独立して、２から２００までの整数である。ｔが非ゼロである前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるさらに別の実施態様では、ｔは０から１０までの整数であり、各ｖは、独立して、２から２００までの整数である。
【０１７９】
いくつかの実施態様では、ＰＥＧ脂質は、本明細書に記載の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ここで、ｍ及びｔの少なくとも１つは非ゼロであり、ｎ及びｓの少なくとも１つは非ゼロである（すなわち、Ｎ−脂質化）。式（Ｉ）のＮ−ＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物もＮ−脂質化されている特定の実施態様では、ｎ及びｓの少なくとも１つは非ゼロである。いくつかの実施態様では、ｎとｓの合計は、少なくとも１、２、３、又は４である。いくつかの実施態様では、ｓは４である。さらに別の実施態様では、ｎは４である。
【０１８０】
ポリアニオン性化合物
本明細書に記載されるように、本開示の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質組成物は、核酸などの１つ又は複数のポリアニオン性化合物との複合体形成に有用であり得る。一態様では、本開示は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物及び２つ以上の他の脂質成分と複合体を形成した、本明細書に記載の１つ又は複数のポリアニオン性化合物を含む複合体を含む組成物を提供する。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、核酸を含む。本明細書で使用される核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はそれらのハイブリッドなどの天然に存在する核酸の他、ホスホロチオエートなどの非天然骨格及び修飾骨格結合、非天然及び修飾塩基、並びに非天然及び修飾末端を有する非天然に存在するバリエーションが含まれる。例示的な核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡが含まれる。
【０１８２】
核酸は、組換え的に生成された分子又は化学的に合成された分子であり得る。核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、及び四本鎖、並びに一本鎖及び二本鎖領域を含むより複雑な三次元形態であり得る。
【０１８３】
核酸の種類に応じて、核酸の長さ（必要に応じてヌクレオチド単位又は塩基対（ｂｐ）で定義される）は異なる場合がある。核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施態様では、ｍＲＮＡは、１００から１００００ヌクレオチド単位、又は１０００から３０００ヌクレオチド単位を有し得る。核酸がＤＮＡである他の実施態様では、ＤＮＡは、５０００ｂｐから２００００ｂｐ、又は約１００００ｂｐを有し得る。
【０１８４】
核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施態様では、ｍＲＮＡは、タンパク質又はペプチドをコードするｍＲＮＡである。核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施態様では、ｍＲＮＡは、オリゴペプチド又はポリペプチドを含むペプチドをコードするｍＲＮＡである。特定の実施態様では、ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。さらに別の実施態様では、ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。他の実施態様では、ｍＲＮＡは、ペプチドをコードするｍＲＮＡである。上記のように、ｍＲＮＡは天然に存在してもよく（例えば、単離された腫瘍ＲＮＡ）、又は合成であってもよい（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成される）。ｍＲＮＡの合成又は非天然に存在するバリエーションの場合、ｍＲＮＡは、ホスホロチオエートなどの修飾骨格結合を有する非天然骨格、非天然及び修飾塩基、並びに／又は非天然及び修飾末端を含み得る。核酸がｍＲＮＡである特定の実施態様では、ｍＲＮＡは、自己増幅配列又は配列内リボソーム進入部位などの特別な配列を含み得る。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、２つの以上の特定の核酸の組み合わせ送達は、治療適用に特に有用であり得る。例えば、いくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、ＣＲＩＳＰＲ配列としてのｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの組み合わせを含む。さらに別の実施態様では、核酸はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体などのタンパク質と複合体を形成することができる。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、核酸ではないアニオン性又はポリアニオン性化合物を含み得る。適切なアニオン性化合物には、限定されるものではないが、タンパク質、ポリリン酸、又はヘパリンが含まれ得る。いくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、１つ又は複数のタンパク質を含む。一実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。他の実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、ポリリン酸を含む。さらに他の実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン性化合物は、ヘパリン又は他のグリコサミノグリカン誘導体を含む。
【０１８７】
本明細書に記載の他の脂質成分を有する脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む多成分脂質製剤はまた、細胞への送達のために他の非アニオン性薬剤又はカーゴ（疎水性化合物を含む）と複合体を形成するために利用され得る。これらの他のカーゴは、限定されるものではないが、例えば、１つ又は複数の小分子活性剤若しくは原体（独立した治療薬として、又は核酸などの別の薬剤と組み合わせて）及び／又は免疫学的アジュバントを含み得る。これらの他のカーゴ分子は、複合体形成のために本明細書に記載のポリアニオン性化合物のいずれかと組み合わされてもされなくてもよいことをさらに認識すべきである。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体は、エンドソームエスケープモジュレーター、ＴＬＲアゴニスト、及び化学療法剤を含む。他の実施態様では、本開示の複合体は、アジュバント又は免疫共刺激剤を含む。例えば、いくつかの実施態様では、複合体は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される免疫学的アジュバントを含む。
【０１８８】
複合体及び組成物の特性
上記のように、本開示の組成物は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物、及び脂質成分を含む複合体を含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、並びに任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む。本明細書に記載の複合体及び組成物の物理的特性は、所与のポリアニオン性化合物の脂質成分の特定の選択、並びに複合体及び組成物内の各成分の量によって影響され得る。いくつかの実施態様では、複合体及びその組成物内の脂質成分は、存在する総脂質成分の質量に対する脂質成分（単独又は組み合わせ）の質量百分率、及び／又は個々の脂質成分の互いに対する質量比によって特徴づけることができる。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、本開示の組成物は、存在する脂質成分の質量百分率によって特徴づけられる。本明細書に記載されるように、脂質成分の総質量又は重量は、存在する任意の脂質化カチオン性ペプチド化合物、任意の構造脂質、任意のリン脂質、並びに任意の遮蔽脂質の個々の質量の合計である。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む複合体を含む。前述のいくつかの変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。特定の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。前述の他の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含む。特定の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩を含む。さらに他の前述の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドを含む。特定の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの式（ＩＩ）のリピトイドを含む。
【０１９１】
本明細書に記載されるように、複合体を含む組成物は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質を含み得る。前述の実施態様のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の０−２５％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質を含む。特定の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の０−２５％ｗ／ｗのコレステロールを含む。
【０１９２】
本明細書に記載の組成物及び複合体はまた、１つ又は複数のリン脂質を含む。さらに他の実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の１０−６０％ｗ／ｗの１つ又は複数のリン脂質を含む。特定の変形例では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の２０−４０％ｗ／ｗの１つ又は複数のリン脂質を含む。いくつかの実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の１０−６０％ｗ／ｗの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。特定の実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の２０−４０％ｗ／ｗの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【０１９３】
さらなる実施態様では、組成物及びその中の複合体は、１つ又は複数の遮蔽脂質を含む。いくつかの実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の１−５％の１つ又は複数の遮蔽脂質を含む。特定の実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の１−５％の１つ又は複数のＰＥＧ脂質を含む。さらに他の実施態様では、組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の１−５％の１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）を含む。
【０１９４】
さらに他の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物；０−２５％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質；１０−６０％ｗ／ｗのリン脂質；及び１−５％の１つ又は複数の遮蔽脂質を含む。さらに別の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物；０−２５％ｗ／ｗの１つ又は複数の構造脂質；２０−４０％ｗ／ｗのリン脂質；及び１−５％の１つ又は複数の遮蔽脂質を含む。
【０１９５】
他の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩；０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；１０−６０％ｗ／ｗのＤＯＰＥ；及び１−５％のＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む。さらに別の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はその塩；０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；２０−４０％ｗ／ｗのＤＯＰＥ；及び１−５％のＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む。
【０１９６】
さらに他の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−８０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（ＩＩ）のリピトイド；０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；１０−６０％ｗ／ｗのＤＯＰＥ；及び１−５％のＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む。さらに別の実施態様では、本開示の組成物及びその中の複合体は、脂質成分の総重量の４０−７０％ｗ／ｗの１つ又は複数の式（ＩＩ）のリピトイド；０−２５％ｗ／ｗのコレステロール；２０−４０％ｗ／ｗのＤＯＰＥ；及び１−５％のＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む。
【０１９７】
複合体が、脂質化カチオン性ペプチド化合物、核酸、リン脂質、ＰＥＧ脂質、並びに任意選択で構造脂質も含むいくつかの実施態様では、複合体は、個々の成分の互いに対する質量比、又は１つ若しくは複数の成分の１つ若しくは複数の他の成分に対する質量比によって特徴づけることができる。例えば、いくつかの実施態様では、本開示の組成物及び複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物の、リン脂質、構造脂質（存在する場合）、遮蔽脂質に対する第１の質量比と、脂質化カチオン性ペプチド化合物の核酸に対する第２の質量比によって記述され得る。あるいは、他の実施態様では、本明細書で提供される組成物及び複合体は、総脂質成分の核酸に対する質量比によって記述され得、ここで、総脂質成分には、存在する任意の脂質化カチオン性ペプチド化合物、構造脂質、リン脂質、並びに遮蔽脂質が含まれる。
【０１９８】
別の態様では、本開示の複合体及び組成物は、個々の成分の互いに対する質量比によって特徴づけることができる。例えば、本明細書に記載されるように、本開示の複合体は、１つ又は複数のリン脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む。組成物が１つ又は複数の構造脂質及び１つ又は複数のリン脂質を含む複合体を含むいくつかの実施態様では、組成物は、１つ又は複数の構造脂質の１つ又は複数のリン脂質に対する質量比によって特徴づけることができる。いくつかの実施態様では、１つ又は複数の構造脂質が存在する場合、１つ又は複数のリン脂質に対する質量比は、０．５：１から２：１の間である。組成物がコレステロール及びＤＯＰＥを含む特定の実施態様では、コレステロールとＤＯＰＥとの質量比は、０．５：１から２：１の間である。
【０１９９】
本開示の複合体及び組成物中に存在するポリアニオン性化合物に関して、複合体内、したがって組成物内でも、ポリアニオン性化合物の量をいくつかの方法で特徴づけることができる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物及び複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物上のカチオン性基の数の、核酸上のアニオン性リン酸基の数に対する比によって特徴づけることができる。いくつかの実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、カチオン：アニオン電荷比が０．５：１から２０：１の間、０．５：１から１０：１の間、０．５：１から５：１の間、１：１から２０：１の間、１：１から１０：１の間、１：１から５：１の間、２：１から２０：１の間、２：１から１０：１の間、又は２：１から５：１の間で含む。特定の実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、２：１から５：１の間のカチオン：アニオン電荷比で含む。さらに他の実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、３：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。
【０２００】
あるいは、本明細書に記載の複合体及びその複合体を含む組成物は、複合体中のポリアニオン性化合物及び／又は他のカーゴに対する脂質化カチオン性ペプチド化合物の相対質量比によって特徴づけることができる。複合体の成分の質量比は、複合体の調製において使用される各成分のストック溶液の既知の濃度と体積に基づいて容易に計算することができる。さらに、非アニオン性カーゴが複合体中に存在する場合、質量比は、非アニオン性物質を考慮しないカチオン：アニオン電荷比よりも、カーゴ全体に対する脂質化カチオン性ペプチド化合物の相対量のより正確な表示を提供し得る。
【０２０１】
いくつかの実施態様では、複合体は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物とを、質量比が０．５：１から２０：１の間、０．５：１から１０：１の間、０．５：１から５：１の間、１：１から２０：１の間、１：１から１０：１の間、１：１から５：１の間、２：１から２０：１の間、２：１から１０：１の間、又は２：１から５：１の間で含む。特定の実施態様では、複合体は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物とを、２：１から５：１の間の質量比で含む。さらに他の実施態様では、複合体は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物とを、３：１の質量比で含む。
【０２０２】
複合体が核酸を含む特定の実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、質量比が０．５：１から２０：１の間、０．５：１から１０：１の間、０．５：１から５：１の間、１：１から２０：１の間、１：１から１０：１の間、１：１から５：１の間、２：１から２０：１の間、２：１から１０：１の間、又は２：１から５：１の間で含む。特定の実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、２：１から５：１の間の質量比で含む。さらに他の実施態様では、複合体は、脂質化カチオン性ペプチド化合物と核酸とを、３：１の質量比で含む。
【０２０３】
さらに他の実施態様では、複合体及びその組成物中に存在するポリアニオン性化合物の量は、脂質成分（脂質化カチオン性ペプチド化合物、リン脂質、遮蔽脂質、及び存在する場合は構造脂質）と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比によって特徴づけることができる。いくつかの実施態様では、脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比は、０．５：１から２０：１の間、０．５：１から１０：１の間、０．５：１から５：１の間、１：１から２０：１の間、１：１から１０：１の間、１：１から５：１の間、２：１から２５：１の間、２：１から２０：１の間、２：１から１０：１の間、又は２：１から５：１の間である。特定の実施態様では、脂質成分と、１つ又は複数のポリアニオン性化合物との質量比は、５：１から１０：１の間、又は６：１から７：１の間である。
【０２０４】
本開示の複合体は、少なくとも１つのポリアニオン性化合物若しくは他の適切なカーゴ化合物と複合体を形成した、少なくとも１つの脂質化カチオン性ペプチド化合物含むであろう。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体は、１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含み得る。他の実施態様では、本明細書で提供される複合体は、式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドを含む。単一の複合体における本開示の複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物の混合物及び組み合わせの使用は、特定の薬物動態学的及び薬力学的特性に適合した製剤の調製を可能にし得る。関連する薬物動態学的及び薬力学的特性には、限定されるものではないが、生体内分布、免疫原性、製剤安定性、カプセル化のパーセンテージ、トランスフェクション効率、血漿半減期などが含まれ得る。これらの特性の異なる組み合わせが、異なる適用のために必要になることもある。
【０２０５】
例えば、特定の実施態様では、複合体は、カチオンに富む１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、高度に脂質化された１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物との組み合わせを含み得る。理論的には、そのような組み合わせは、（脂質化ペプチド化合物のおかげで）より大きな親油性遮蔽とともに（カチオンに富むペプチド化合物を介して）より大きな電荷安定化を提供することによって、ポリアニオン性化合物の改善された送達をもたらす可能性がある。さらに、個々の脂質化カチオン性ペプチド化合物のそれぞれの個々の量は、所望の特性を達成するために調整され得ることを認識すべきである。
【０２０６】
追加の成分
ポリアニオンカーゴの高度なカプセル化及び／又はその標的化された放出制御を容易にするために、追加の成分を複合体に加えることもできる。そのような追加の成分は、例えば、ポリマー及び界面活性成分を含み得る。
【０２０７】
本開示で提供されるように、複合体は、核酸カーゴ及び他の化合物の細胞への送達に有用な追加の成分を含み得る。そのような成分には、限定されるものではないが、例えば、脂質ナノ粒子に匹敵する超複合体又は他の送達システム（例えば、ハイブリッド脂質−ポリマーナノ粒子）を一緒に形成するものが含まれ得る。
【０２０８】
本明細書に記載の複合体へのポリマーの組み込みは、ポリマーナノ粒子ベシクル、又は追加の脂質成分の存在下で、ハイブリッド脂質−ポリマーナノ粒子を形成することによって、脂質化カチオン性ペプチド化合物及びポリアニオン性化合物を含む複合体を安定化させ得る。いくつかの実施態様では、本開示の複合体は、ポリマーを含む。適切なポリマーには、中性ポリマー（ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）又はポリグリコール酸（ＰＧＡ）など）、アニオン性ポリマー（ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、及びヘパリンを含む）、及び／又はカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、プロタミン）が含まれる。
【０２０９】
他の実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物は、標的化リガンド、安定化剤、及び／又は界面活性剤などの表面活性成分を含む。
【０２１０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の複合体を含む組成物を含む製剤を提供する。本明細書に記載の製剤は、本明細書の複合体を調製するために使用されるストック溶液の混合物、並びに投与に使用される精製された薬学的製剤を包含する。本開示の複合体を含む製剤は、必然的に、本明細書に記載の複合体に存在する成分も含むことを理解されたい。
【０２１１】
いくつかの実施態様では、製剤は、溶液、懸濁液、コロイド懸濁液、スプレー、又はエアロゾルである。他の実施態様では、製剤は脂質複合体製剤である。いくつかの実施態様では、製剤は、経腸製剤、非経口製剤、又は局所製剤である。いくつかの実施態様では、製剤は、静脈内製剤、皮下製剤、筋肉内製剤、皮内製剤、眼内製剤、又は髄腔内製剤などの注射可能な製剤である。他の実施態様では、製剤は経口製剤である。さらに他の実施態様では、製剤は、例えば、経鼻製剤、肛門内製剤、頬側製剤、又は膣内製剤などを含む粘膜製剤である。
【０２１２】
本開示の複合体及び組成物について上に記載したように、本明細書で提供される組成物は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物と共に含む。脂質化カチオン性ペプチド、他の脂質成分、並びに１つ又は複数のポリアニオン性化合物及び／又は非アニオン性化合物に加えて、それらの薬物動態学的及び薬力学的特性を調整するために、さらに別の成分が製剤に含まれ得ることを認識すべきである。
【０２１３】
本開示の複合体及び製剤を調製する際に使用される成分、並びに前記複合体又は製剤を作製するための工程パラメータは、複合体及び／又は製剤が即時使用（「ジャストインタイム」）を意図しているか、又は将来の使用のために貯蔵に配置され得るのかに応じて適合され得ることをさらに認識すべきである。特に、貯蔵に関する考慮事項には、複合体及び／又は製剤が保持される温度（例えば、室温、４℃、−２０℃、−７８℃）及び貯蔵期間が含まれ得る。
【０２１４】
適切な添加物には、限定されるものではないが、投与を容易にするか、又は貯蔵安定性を改善するもの（例えば、凍結防止剤）が含まれ得る。例えば、上記の成分に加えて、本明細書に記載の製剤は、担体、溶媒、分散剤、希釈剤、充填剤、安定剤、防腐剤などの薬学的に許容される添加物を含み得る。
【０２１５】
複合体及びその組成物を調製する方法
脂質化カチオン性ペプチド化合物、他の脂質成分、及びポリアニオン性化合物の複合体並びにそれらの組成物は、それらの物理的、化学的、及び生物学的特性を調節するための様々な物理的及び／又は化学的方法によって調製することができる。これらには典型的には、水又は水混和性有機溶媒中の脂質化カチオン性ペプチド化合物（例えば、第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド又はリピトイド）と、水又は水性緩衝液中の所望のポリアニオン性化合物（例えば、オリゴヌクレオチド）との迅速な混合が含まれる。これらの方法には、ピペッティングによる成分の単純な混合、又はＴミキサー、ボルテックスミキサー、若しくは構造の他の無秩序な混合を含むものなどのマイクロ流体混合プロセスを含み得る。本開示の組成物は、同様の方法で調製することができる。
【０２１６】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の複合体及び組成物を調製する方法であって、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるのは、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、並びに任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と接触させることを含む、組成物を調製する方法である。他の実施態様では、本明細書で提供されるのは、１つ又は複数のリピトイド、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と接触させることを含む、組成物を調製する方法である。
【０２１７】
いくつかの実施態様では、１つ又は複数のポリアニオン化合物、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む複合体を含む組成物を調製する方法は、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物、１つ又は複数のリン脂質、１つ又は複数の遮蔽脂質、及び任意選択で１つ又は複数の構造脂質を含む溶液を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物を含む溶液と接触させることを含む。特定の実施態様では、ポリアニオン性化合物は、核酸を含む。いくつかの実施態様では、１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物は、１つ又は複数の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実施態様では、１つ又は複数のカチオン性化合物は、１つ又は複数のリピトイドを含む。
【０２１８】
ポリマー、界面活性剤、標的化剤又は添加物の追加成分など、複合体及び組成物中の追加の成分を、ポリアニオン性化合物の主成分と脂質成分とが組み合わされる前、最中又は後で、組成物と混合し、組み合わせることができる。
【０２１９】
本明細書に記載の複合体及び組成物を調製するための特定のプロセス条件は、組成物の所望の物理的特性を提供するために、適切に調整又は選択することができる。例えば、最終組成物に影響を及ぼし得る組成物の成分を混合するためのパラメータは、限定されるものではないが、混合の順序、混合の温度、混合速度／率、流量、ストック溶液の濃度、成分（例えば、ペプチド：カーゴ）の質量比、及び溶媒を含み得る。
【０２２０】
複合体及びその製剤を使用する方法
上記のように、本明細書に記載の組成物は、細胞、特に細胞内環境へのポリアニオン性化合物の送達を容易にする。このように、組成物は、研究適用だけでなく、多くの臨床適用においても利用され得る。細胞へのポリアニオン性化合物の送達は、予防的、診断的、及び／又は治療的方法に関連するものなどの臨床適用に使用することができる。例えば、いくつかの実施態様では、適切な臨床適用は、ワクチン接種、がん免疫療法、タンパク質補充療法、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子編集、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法トランスフェクション、ｅｘ  ｖｉｖｏ幹細胞誘導を含み得る。ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、生物学的アッセイ及び試薬を含む、研究又は非臨床適用にも有用であり得る。
【０２２１】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法である。いくつかの実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体と接触させることを含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；並びに１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はそれらの塩を含む。さらに他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体と接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドを含む。前述の方法のいくつかの実施態様では、接触はエンドサイトーシスによるものである。
【０２２２】
さらに他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体を含む組成物と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体を含む組成物と接触させることを含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；並びに１つ又は複数の式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／若しくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物又はそれらの塩を含む。さらに他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体を含む組成物と接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び式（ＩＩ）の１つ又は複数のリピトイドを含む。
【０２２３】
前述の方法のいくつかの実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含み、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。特定の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含み、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。
【０２２４】
他の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体を含む組成物と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、任意選択で、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含み、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。特定の実施態様では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、１つ又は複数のポリアニオン性化合物と脂質成分とを含む複合体を含む組成物と細胞を接触させることを含み、ここで、脂質成分は、１つ又は複数の構造脂質；１つ又は複数のリン脂質；１つ又は複数の遮蔽脂質；及び１つ又は複数の脂質化カチオン性ペプチド化合物を含み、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。
【０２２５】
細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触されるいくつかの実施態様では、細胞はＨｅＬａ細胞である。細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触される他の実施態様では、本開示の複合体、又はその組成物、又はその製剤は、哺乳動物対象に投与される。哺乳動物の対象には、限定されるものではないが、ヒト又はマウスの対象が含まれ得る。細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで接触されるさらに他の実施態様では、細胞は、ヒト又はマウスの対象から得られる。
【０２２６】
細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触される前述の方法のいくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物は、注射によって投与され得る。特定の実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物は、注射（静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内）によって投与され得る。いくつかの実施態様では、複合体及び組成物は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）又は髄腔内注射によって投与される。他の実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物は、ボーラス注射又は静脈内注入によって投与される。細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触される他の実施態様では、本開示の複合体及び組成物は、経鼻又は経口吸入によって投与される。細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触されるいくつかの実施態様では、本明細書に記載の複合体及び組成物は経口投与される。細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触されるさらに他の実施態様では、複合体及び組成物は、粘膜への吸収を介して投与される（局所、肛門内、頬側、膣内などを含む）。
【０２２７】
上に開示された診断、予防及び治療例などの臨床適用は、使用されている特定の複合体及び／若しくは組成物に応じて適切に変更され得る投与計画（例えば、投与量レベル及び投与のための時間経過）、投与経路、複合体及び組成物が投与されている対象、並びに／又は所望の生理学的効果を含み得る。例えば、いくつかの実施態様では、本開示の方法は、複合体又は組成物を、０．００１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することを含む。
【実施例】
【０２２８】
本開示の主題は、限定としてではなく、本発明の例示として提供される以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【０２２９】
実施例１−核酸送達のための例示的な第三級アミノ脂質化カチオン性ペプチドの合成
以下の実施例は、本明細書に記載される式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の合成のための一般的なプロトコルを記述する。
2022502451.tif 000063
【０２３０】
以下の記述では、全てのＲａとＲｂは−Ｈである。全てのポリマーは、ブロモ酢酸と第一級アミンを使用して合成される。図２Ｂ−２Ｅは、本開示の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製するための、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６での第一級アミンの例示的な置換基のいくつかを提供する。
【０２３１】
固体支持体として、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂を使用する。樹脂上のＦｍｏｃ基を、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で脱保護する。次いで、アミノ樹脂をブロモ酢酸でアミド化する。続いて、臭化物を一級アミンで求核置換することにより、α炭素をアミノ化する。２つのステップが連続的に繰り返され、所望のカチオン性ペプチド配列が生成される。
【０２３２】
全ての反応と洗浄は、特に断りのない限り、室温で行われる。樹脂の洗浄とは、洗浄溶媒（通常はＤＭＦ又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を樹脂に添加し、樹脂を攪拌して均一なスラリーが得られるようにし、続いて樹脂から溶媒を完全に排出することを指す。樹脂が乾燥しているように見えるまで、反応容器のフリット底を通して真空濾過により溶媒を除去する。全ての合成において、樹脂スラリーは、フリット容器の底からアルゴンをバブリングすることによって攪拌される。
【０２３３】
最初の樹脂脱保護フリット反応容器にＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂を充填する。樹脂にＤＭＦを添加し、この溶液を攪拌して樹脂を膨潤させる。次いで、ＤＭＦを排出する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加し、樹脂を攪拌し、樹脂を排出することによって、Ｆｍｏｃ基を除去する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加し、１５分間撹拌し、次いで排出する。次いで、樹脂をＤＭＦで６回洗浄する。
【０２３４】
アシル化／アミド化。次いで、ＤＭＦ中のブロモ酢酸を樹脂に添加し、続いてＤＭＦ中のＮ、Ｎ−ジイソプロプリカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加することにより、脱ブロックされたアミンをアシル化する（図３Ａ）。この溶液を室温で３０分間撹拌し、次いで排出する。このステップを２回繰り返す。次いで、樹脂をＤＭＦで２回、ＤＭＳＯで１回洗浄する。これが１つの完了した反応サイクルである。
【０２３５】
求核置換／アミノ化。アシル化された樹脂は、所望の第一級又は第二級アミンで処理され、α炭素上の臭素脱離基で求核置換を受ける（図３Ｂ）。このアシル化／置換サイクルは、所望のペプチド配列が得られるまで（図３Ｄ）繰り返される（図３Ｃ）。
【０２３６】
樹脂からのペプチド切断。乾燥させた樹脂を、テフロン（登録商標）でコーティングされたマイクロスターバーの入ったガラスシンチレーションバイアルに入れ、水中の９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加する。溶液を２０分間撹拌し、次いでポリエチレンフリットを装着した固相抽出（ＳＰＥ）カラムを通して濾過し、ポリプロピレンコニカル遠心チューブに入れる。
【０２３７】
樹脂を１ｍＬの９５％ＴＦＡで洗浄する。次に、合わせた濾液を、１：１のアセトニトリル：水から３回凍結乾燥する。凍結乾燥ペプチド（図３Ｅ）を、無水エタノールに５ｍｇ／ｍＬの濃度で、又はＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再溶解する。
【０２３８】
精製及び特徴づけ。再溶解した粗ペプチドを、分取ＨＰＬＣによって精製する。精製されたペプチドは、ＬＣ−ＭＳ分析によって特徴づけられる。
【０２３９】
実施例２−代表的なアミノ脂質化ペプトイドの合成及び特徴づけ
アミノ脂質化ペプトイドは、ブロモ酢酸及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて、上記の実施例１に記載のサブモノマー法によって合成された。固体支持体として、ポリスチレン支持ＭＢＨＡ  Ｆｍｏｃ−保護Ｒｉｎｋアミド（２００ｍｇ代表スケール、０．６４ｍｍｏｌ／ｇローディング、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）樹脂を使用した。ブロモアセチル化のために、樹脂を２Ｍブロモ酢酸と２ＭのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の１：１混合物と５分間混合した。アミン置換は、ＤＭＦ中のアミンの１Ｍ溶液を使用して１時間行った。合成後、９５：２．５：２．５のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：水：トリイソプロピルシランの混合物５ｍＬを使用して、室温で４０分間、粗ペプトイドを樹脂から切断した。樹脂を濾過により除去し、濾液をＢｉｏｔａｇｅＶ１０エバポレーターを使用して濃縮した。粗ペプトイドは、ＭｅＣＮの２５％水溶液からの凍結乾燥によってさらに濃縮された。純度及び同一性は、Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ＵＶ検出器とＷａｔｅｒｓＳＱＤ２質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムで、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ  Ｃ４カラムを用いて５−９５％の勾配でアッセイした。選択した粗ペプトイドは、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｐｒｅｐ  Ｃ４カラムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ２４８９  ＵＶ／可視検出器を備えた分取ＷａｔｅｒｓＰｒｅｐ１５０ＬＣシステムにより、０．１％ＴＦＡを含む水中５−４０％アセトニトリルの勾配を使用して３０分かけて精製した。
【０２４０】
表１Ａは、実施例２に記載の方法によって調製された代表的なアミノ脂質化ペプトイドを示す。表１Ｂは、表１Ａの調製されたアミノ脂質化ペプトイド化合物１−７２の特性評価データを示しており、予測される分子量、保持時間（分単位、λ＝２１８ｎｍでＵＰＬＣ−ＵＶ測定によって決定）、及び一次観測された質量電荷比（ｍ／ｚ、ＭＨ＋、エレクトロスプレーイオン化−質量分析による）を含む。アミノ脂質化及びＰＥＧ化ペプトイド化合物４８、５６、６４、及び７２のそれぞれについて、質量スペクトルには、ペプトイドに結合したＰＥＧ部分（平均分子量２０００ｇ／ｍｏｌ）の多分散性に起因するピークのいくつかの分布が含まれていた。これらのアミノ脂質化及びＰＥＧ化ペプトイド化合物について報告された質量電荷比のピークは、ピークのＭＨ２２＋分布の中心値であり、有効モノマー分離δ〜２２ｍ／ｚ（−ＯＣＨ２ＣＨ２−、エチレングリコール  分子量４４ｇ／ｍｏｌ）である。
【０２４１】
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【０２４２】
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【０２４３】
実施例３−ナノ粒子組成物を形成するための代表的なアミノ脂質化ペプトイドとオリゴヌクレオチドとの製剤
以下の実施例は、本明細書に記載される式（Ｉ）の第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物とオリゴヌクレオチドとの製剤のための一般的なプロトコルを記述する。
【０２４４】
標準的な製剤では、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を、無水エタノールに０．５ｍｇ／ｍＬ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験用）又は５ｍｇ／ｍＬ（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用）の濃度で溶解する。得られた溶液は、室温では安定しているが、−２０℃で保存する必要がある。核酸カーゴは、ＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅを含まない水に、最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験用）又は１ｍｇ／ｍＬ（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用）で溶解する。これらの溶液は、−２０℃又は−７８℃で長期間保存する必要がある。
【０２４５】
ナノ粒子製剤を調製するために、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を、核酸と約１：１（ペプチド化合物：カーゴ）と２０：１の間の質量比でピペッティングすることによって混合する。製剤化の前に、第三級アミノ脂質化及び／又はＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物並びにカーゴ（核酸など）を、エタノール及び酸性緩衝液（０．１ＭのＨＣｌでｐＨ５．５に調整されたＰＢＳ）でそれぞれ体積比１：３に希釈し、最終的なカーゴ濃度を約０．０５ｍｇ／ｍＬから０．２ｍｇ／ｍＬにすることを目標とする。
【０２４６】
実施例４−代表的なｍＲＮＡ／ペプトイド製剤の物理的特性の特徴づけ
実施例２に記載の例示的なアミノ脂質化カチオン性ペプトイド１−３６をホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）ｍＲＮＡと組み合わせてナノ粒子組成物を形成させ、治療及び／又は予防目的のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。実施例３のプロトコルに従って製剤を調製し、単純なピペッティングによって混合した。
【０２４７】
ｍＲＮＡ／ペプトイド複合体の体積平均粒子サイズ／直径（ｎｍ）及び製剤内のサイズ多分散指数（ＰＤＩ）を決定するために、ペプトイド：カーゴの質量比が５：１のｍＲＮＡ／ペプトイド製剤を、動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価した。例示的な化合物の各製剤のｍＲＮＡカプセル化のパーセンテージを、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による粒子の溶解の前後のＱｕｂｉｔ  ＲＮＡ  ＨＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素の蛍光によって決定した。結果を以下の表２に示す。
【０２４８】
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【０２４９】
実施例５−代表的なＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／アミノ脂質化カチオン性ペプトイド製剤による処理後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤の有効性を、培養細胞にホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子を送達する能力に基づいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。実施例２のアミノ脂質化カチオン性ペプトイド１−３６を、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡと５：１のｗ／ｗ比で個別に組み合わせ、得られた粒子を（１００μＬの総量中）１００ｎｇ／ウェルの用量で培養ＨｅＬａ細胞に添加した。得られたルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を、処理の６時間後と２４時間後に発光プレートリーダーによって測定した。以下の表３は、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡ／アミノ脂質ペプトイド製剤について、２つの時点で観察されたルシフェラーゼの発現を示している。
【０２５０】
2022502451.tif 000087
【０２５１】
また、実施例２の例示的なアミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物１−１８について、ペプトイド：ｍＲＮＡ質量比が２：１、３．５：１、５：１及び７．５：１において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのルシフェラーゼ発現測定を実施した。観察されたルシフェラーゼの発現は、発光プレートリーダーによって、図４に示される平均生物発光量（ＲＬＵ）として測定された。
【０２５２】
実施例６−多成分脂質製剤中の代表的なＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド複合体による処理後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
多成分脂質製剤中のｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイドの有効性を、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養ＨｅＬａ細胞に送達する能力に基づいて評価した。脂質成分の質量百分率が異なる３つの脂質製剤を、アミノ脂質化ペプトイドに対してコレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）（ペプトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００、５０：１６５：３２：２、６３：０：３５：２及び４２：２３：３３：２）を使用して調製した。次いで、アミノ脂質化ペプトイドの基本製剤の各々を、７：１又は１０：１の質量比（ペプトイド：カーゴ）でｍＲＮＡと組み合わせた。この実施例で評価された６つの脂質製剤の組成を以下の表４に示す。アミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物の代わりにリピトイド１を使用する製剤を、比較のために表４と同じ質量百分率で調製した。
【０２５３】
2022502451.tif 000088
【０２５４】
細胞培養：ＨｅＬａ細胞を、処理の１８時間前に、１０％のＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１００μＬのＤＭＥＭの１０，０００ウェルに播種し、付着させた。トランスフェクションの直前に、培地を１００μＬの新鮮な血清含有ＤＭＥＭに交換した。
【０２５５】
ｍＲＮＡの調製：トランスフェクション実験のためのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡは、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）法を使用して社内で調製した。
【０２５６】
ｍＲＮＡ製剤：脂質混合物は、アミノ脂質化ペプトイド（化合物２、及び６−１８）又はリピトイド１（エタノール中５ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（５ｍｇ／ｍＬ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ、５ｍｇ／ｍＬ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００、０．５ｍｇ／ｍＬ）のマスターストックを使用して、上記の比率に従って調製した。残りの量を考慮して（かつ総脂質とｍＲＮＡの有効比率を調整するために）、１００％エタノールを加えた。次いで、この脂質混合物の８μＬを、酸性化ＰＢＳ（ｐＨ５．５）に溶解された１５ｎｇ／μＬの濃度のｍＲＮＡの２４μＬに添加した。混合後、得られた溶液１０μＬを、９６ウェルプレートの対応するウェルに添加した。全ての処理は三通りで行われ、値は平均値として表した。ＨｅＬａ細胞を得られた溶液で６時間処理し、その後培地を新しいＤＭＥＭに交換した。陰性対照として、ＨｅＬａ細胞をｍＲＮＡのみの溶液で処理した。Ｌｉｐｏ条件のために、ｍＲＮＡは、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて製剤化された。
【０２５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング：イメージングの前に、Ｄ−ルシフェリンの３０ｍｇ／ｍＬ溶液１０μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉＤ３プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用してプレート全体の発光を測定した。図５は、脂質製剤の各々について観察された平均生物発光（ＲＬＵ）の棒グラフを示している。
【０２５８】
実施例７−多成分脂質製剤中の代表的なＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド複合体による処理後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
アミノ脂質化ペプトイド１−７２と、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）との製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達効率を評価するために、ＨｅＬａ細胞に対して４１：２３：３３：３のペプトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比、及び１０：１のペプトイド：Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡ比で追加の実験を行った。
【０２５９】
実施例６に記載のプロトコルを、多成分脂質製剤のアミノ脂質化ペプトイド１−７２の全パネル評価に利用した。簡潔には、ＨｅＬａ細胞を製剤により６時間処理し（ウェルあたり５０ｎｇのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ）、その後培地を新しいＤＭＥＭに交換した。イメージングの前に、Ｄ−ルシフェリンの３０ｍｇ／ｍＬ溶液１０μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉＤ３プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用してプレート全体の発光を測定した。アミノ脂質化ペプトイド化合物１−７２について観察された平均発光（ＲＬＵ）を図６Ａ（化合物１−３６）及び図６Ｂ（化合物３７−７２）に示す。全ての処理は三通りで行われ、値は平均値として表した。
【０２６０】
実施例８−代表的なＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／アミノ脂質化多成分脂質製剤の皮下投与後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ全身発現。
アミノ脂質化ペプトイド化合物を、皮下注射投与によるＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）へのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達効率についてさらに評価した。Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡ  ２μｇ、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）を含むアミノ脂質化ペプトイド１−７２を含む多成分脂質製剤は、４１：２３：３３：３のペプトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比及び１０：１のペプトイド：Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡ比で調製された。製剤を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈注射を介して投与し（約２μｇのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／用量）、得られた生物発光を６時間後に定量化した。
【０２６１】
図７Ａ及び７Ｂは、平均生物発光（ＲＬＵ）として定量化された試験マウスにおけるＦｌｕｃのｉｎ  ｖｉｖｏ全身発現を示す。
【０２６２】
実施例９−代表的なＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ／リピトイド１多成分脂質製剤の投与後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現。
コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシエチレングリコール−２０００（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）と組み合わせて、リピトイド、特にリピトイド１を含む多成分脂質製剤が、Ｆｌｕｃ  ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達する実行可能性を評価するために、さらなる実験を行った。
【０２６３】
具体的には、４つの脂質成分の様々な比率を次の範囲内（質量百分率）で評価した。２０−８０％リピトイド１；６−４０％コレステロール；１０−５３％ＤＯＰＥ；総脂質成分（リピトイド１、コレステロール、ＤＯＰＥ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）とｍＲＮＡの比率は５：１から８：１の間；これらの実験では、ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量百分率は２％で一定に保たれた。多成分製剤の調製及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物発光アッセイのための実施例６に記載のプロトコルを利用した。
【０２６４】
９６の固有の製剤を、脂質成分をエタノールで予備混合し、そのエタノール性脂質溶液をＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ水溶液と複合体化することによって調製した。水溶液の体積に対するエタノールの比率は、３：１の水：エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に維持した。各脂質成分の濃度は、水溶液に対するエタノールの一定比率内で独立して調整した。
【０２６５】
ＨｅＬａ細胞を製剤により６時間処理し（ウェルあたり５０ｎｇのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ）、その後培地を新しいＤＭＥＭに交換した。イメージングの前に、Ｄ−ルシフェリンの３０ｍｇ／ｍＬ溶液１０μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉＤ３プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用してプレート全体の発光を測定した。全ての測定は三通りで行われ、値は平均値として表した。
【０２６６】
図８Ａは、９６の製剤のそれぞれについて測定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物発光強度（ＲＬＵ）の表を示す。図８Ａの異なる象限は、４つの異なるコレステロール：ＤＯＰＥ比（左上の象限で０．５：１；右上の象限で１：１；左下の象限で１．５：１；及び右下の象限で２：１）を表す。リピトイド１の９６の製剤のそれぞれについて観察された生物発光に基づいて、特定の製剤がより優れたｍＲＮＡ送達効率を示すことが観察された。
【０２６７】
上記の９６の製剤の最初の調査において観察された結果に基づいて、２つの製剤がさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価のために選択された。最初の調査で１つの製剤を試験した（製剤Ａ、リピトイド：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比は５０：１６：３２：２及び総脂質成分とｍＲＮＡの比は７：１）。２番目の製剤は、実験データを２次回帰モデルに適合させ、グローバル最大値を得ることに基づいて選択された（製剤Ｂ、脂質：コレステロール：ＤＯＰＥ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００の質量比は６３：０：３５：２及び総脂質成分とｍＲＮＡの比は６．１２）。
【０２６８】
さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価において、リピトイド製剤Ａ及びＢは、ＨｅＬａ細胞へのそれらのＦｌｕｃ  ｍＲＮＡ送達効率について、送達ビヒクルなしのｍＲＮＡ（ｍＲＮＡのみ）、市販の脂質ナノ粒子製剤中のｍＲＮＡ（対照ＬＮＰキット）、及びｍＲＮＡのみを含むリピトイド１（リピトイド１）のそれと比較して評価された。上記と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション及び生物発光測定のためのプロトコルを採用した。
【０２６９】
図８Ｂは、上記の各処理（ｍＲＮＡのみ、対照ＬＮＰキット、リピトイド１、リピトイド製剤Ａ及びリピトイド製剤Ｂ）並びに陰性対照としての未処理ＨｅＬａ細胞について記録された生物発光強度（ＲＬＵ）の棒グラフを示す。図８Ｂに示されるように、リピトイド製剤Ａ及び製剤Ｂは両方とも、リピトイド１単独よりも高い生物発光強度を示した。
【図１】
2022502451.tif 000098
【図２Ａ−２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｅ】
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【図４】
2022502451.tif 000101
【図５】
2022502451.tif 000102
【図６Ａ】
2022502451.tif 000103
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2022502451.tif 000105
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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