【手続補正書】
【提出日】平成22年3月26日(2010.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．）配列番号３および配列番号７よりなる群から選択されたΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離されたヌクレオチド配列、または
ｂ．）（ａ）に完全に相補的である単離されたヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号４で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
少なくとも１６８個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号２で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項４】
少なくとも１６０個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号６で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
適切な制御配列と作動的に結合する、請求項１に記載の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項６】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、形質転換されたヤロウィア種。
【請求項７】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ii）アラキドン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてアラキドン酸がエイコサペンタエン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサペンタエン酸を製造する方法。
【請求項８】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ii）ジホモ−γ−リノレン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサテトラエン酸を製造する方法。
【請求項９】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択された、二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ii）リノール酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてリノール酸がα−リノレン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程と
を含む、α−リノレン酸を製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
１０個の形質転換体中で、平均で総脂質の０．４％のＡＬＡおよび３９．６％のＬＡ（Ｃ１８：２）が生成された。これらの１０株中でＰｒＤ１７ＳがＬＡをＡＬＡに変換する変換効率は、平均率で約１％のみであった。
したがってＰｒＤ１７Ｓは、ここでＡＲＡからＥＰＡへの変換を触媒する単機能性Δ１７デサチュラーゼとして同定される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．ａ．）配列番号３および配列番号７よりなる群から選択されたΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離されたヌクレオチド配列、または
ｂ．）（ａ）に完全に相補的である単離されたヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、単離された核酸分子。
２．配列番号４で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
３．少なくとも１６８個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号２で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
４．少なくとも１６０個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号６で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
５．適切な制御配列と作動的に結合する、上記１に記載の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子。
６．上記１に記載の単離された核酸分子を含む、形質転換されたヤロウィア種。
７．ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ  ＬＧＡＭ  Ｓ(７)１よりなる群から選択される、上記６に記載の形質転換されたヤロウィア種。
８．ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）アラキドン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてアラキドン酸がエイコサペンタエン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサペンタエン酸を製造する方法。
９．ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デ
サチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）ジホモ−γ−リノレン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサテトラエン酸を製造する方法。
１０．ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択された、二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）リノール酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてリノール酸がα−リノレン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程と
を含む、α−リノレン酸を製造する方法。
１１．単離された核酸分子が、配列番号２、４、および６よりなる群から選択されたアミノ酸配列を有するΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、上記８または９に記載の方法。
１２．ａ．）単離された核酸分子が、配列番号３および配列番号７よりなる群から選択された核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
上記８または９に記載の方法。
１３．宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌綱、および真菌よりなる群から選択される、上記８または９に記載の方法。
１４．宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種よりなる群から選択された真菌である、上記１３に記載の方法。
１５．酵母が油性酵母である、上記１３に記載の方法。
１６．油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスよりなる群から選択される、上記１５に記載の方法。
１７．ヤロウィアが、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカＬＧＡＭ
Ｓ(７)１よりなる群から選択される、上記１６に記載の方法。