(57)【要約】  菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と培養培地または市販の有機改良剤との混合物、消泡物質およびスクロースを含み、１２％未満の残留水分を有する、農業または獣医用の固体組成物。配合物の成分は、完成した固体製品の適切な湿潤性および、２〜８℃の温度での長期保存安定性を保証する。本発明は、植物および動物の病原体を防除し、種子発芽および植物生育を刺激するための固体組成物の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
農業または獣医用の固体組成物であって、前記固体組成物が１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロース、ならびに４）１２％未満の残留水分を含み、前記細菌は、固体組成物１グラムあたり１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜１０１２ｃｆｕの間で見られる、上記固体組成物。
【請求項２】
前記消泡物質が、脂肪酸エステルとエチレンオキシド−プロピレンオキシドのコポリマーとの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記消泡物質が、グラナポン（Ｇｌａｎａｐｏｎ）タイプである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記培養培地が、酵母エキス、カゼイン加水分解物、ペプトンおよびトリプトンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記市販の有機改良剤が、タンパク質加水分解物または糖蜜である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
植物および動物の病原体を防除するための、請求項１から５のいずれかに記載の固体組成物の使用。
【請求項７】
前記病原体が、寄生線虫である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記寄生線虫が、ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、ラドフォラス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）属、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属、ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）属、トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）属およびディクチオカウルス（Ｄｉｃｔｉｏｃａｕｌｕｓ）属に属する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記病原体が、真菌である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記真菌が、アルテルナリア・タバシナ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ）、アルテルナリア・ロンギペス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ）、ビポラリス・オリザエ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｏｒｙｚａｅ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペスタロチア・パルマルム（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、サロクラジウム・オリザエ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、およびチェラウィオプシス・パラドクサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｐａｒａｄｏｘａ）からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
種子発芽および植物生育を刺激するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の固体組成物の使用。
【請求項１２】
植物および動物の病原体を防除するための方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載の固体組成物の有効量を、それを必要とする植物または動物に、該植物または動物への前記組成物の適切な適用形態により投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項１３】
種子発芽および植物生育を刺激するための方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載の固体組成物の有効量を、種子または植物に、該種子または植物への前記組成物の適切な適用形態により投与することを特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野、特に、環境に影響を与えることなく植物および動物を保護することができる、より効率的な生物農薬および微生物バイオ肥料の組成物の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業における化学物質の使用に関連する問題、およびそれらが健康および環境に及ぼす悪影響は、絶え間なく増加している。一方、植物病原菌では、耐性が発達する。これら全てが、作物の収穫量を改善し、生産を増やすための有益な微生物の使用に対する関心を高めている。このようにして、食品の消費がより安全になり、環境が保護される。
【０００３】
土壌には、総合的病害虫管理および農業生産性向上の様々な実践に含まれている生物防除体としての可能性を有する多くの微生物が存在する（Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，１７３３−１７４０）。
【０００４】
実験室条件下で特定の害虫に対して強力な生物防除活性を示すいくつかの微生物は、野外条件で同等の効率で使用することは容易ではない。これは、環境要因の存在と、そのニッチにおける他の生物との競争の両方に起因し、それらは、その生育、生理学、代謝、および遺伝子発現に影響を与える可能性がある（Ｋｈａｒｅ  ａｎｄ  Ａｒｏｒａ，ＮＫ  Ａｒｏｒａ（ｅｄ．），Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｆａｃｅｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｉａ  ２０１５）。これらの制限を克服するためには、生産から使用までの全ての段階で、生細胞の生存能力および活力を維持することができる培地中の配合物または組成物を確立することが必要である。適切に配合された細菌調製物は、最適な性能の可能性を高め、農産物の生産におけるそれらの商業的成功をもたらす（Ｂａｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ（２０１４）３７８：１−３３）。
【０００５】
物理的観点から、水和剤の形態の組成物がそれらの適用の要件を満たさなければならない。低い濡れ性は、粉末の形の配合物に見られる主要な問題の１つであり、これは塊の形成をもたらし、野外での適用において噴霧システムのノズルの閉塞を引き起こす。一般に、濡れとは、固相の表面上の気相が液相に置き換えられるプロセスであり、３つの相がしばらくの間共存するため、ある程度の混合が可能である。噴霧乾燥の特定の場合において、閉塞空気の含有量は、乾燥機の操作パラメータ、乾燥させるクリームの組成、およびその物理的特性によって変動し得る。粘度が高いと、クリーム中の空気が自由に出にくくなる。濃縮物を含むタンクの激しい撹拌は、調合物内の空気粒子の形成を促進する。クリームの温度もまた、乾燥させる濃縮物中により多くの空気量が共存するのを促進する。したがって、濡れ性の悪い配合物の形成を回避するためには、操作パラメータおよび乾燥されるクリームの組成の両方を考慮することが重要である（Ｂｈｅｓｈ  Ｒ．Ｂｈａｎｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｄｒｙｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２，６７１−６８４）。
【０００６】
菌株Ｃ−９２４の殺線虫活性は、欧州特許第０７７４９０６号で明らかにされた。この菌株は、ＡＰＩ−５０ＣＨリファレンスシステムを使用してコリネバクテリウム・パウロメタボルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）として分類され、１９９５年にオランダのバールンにあるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に寄託された（寄託番号ＣＢＳ６１３．９５）。その後、ツカムレラ・パウロメタボラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ）に再分類された同じ菌株Ｃ−９２４の広範な殺虫および抗寄生虫活性が確認され（欧州特許第１３５６７３３号）、したがってこれは動植物寄生虫の防除に使用されている。その後、同じ細菌株のバイオ肥料活性が確認された（欧州特許第２１５４１２１号）。
【０００７】
これまでに、前記微生物の２種の配合物、１つは液体および１つは固体が使用されてきた。液体配合物は、不利な点として、安定性がより低く、その適用のためにより多くの量が取り扱われる。これまで使用されてきた固体配合物は、液体より高い安定性を示すものの、濡れ性に困難を示し、塊を形成し、野外での適用に悪影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、生物農薬およびバイオ肥料としての特性を高めながら、野外での適用を容易にする物理的特性を備えた、言及された微生物の組成物を得ることが必要である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】微生物株Ｃ−９２４の発酵中の乾燥バイオマス濃度の経時変化を示す図である。
【図２】微生物株Ｃ−９２４および有機物の組成物の濡れ性に対する様々な物質の添加の影響を示す図である。使用した添加剤は、Ａ−アカシアガム、Ｂ−キサンタンガム、Ｃ−トラガカントガム、Ｄ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｅ−ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、Ｆ−ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、Ｇ−ゼラチン、Ｈ−アルギン酸ナトリウム、Ｉ−スクロース、Ｊ−硫酸アンモニウム、Ｋ−グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）、Ｌ−大豆レシチン、Ｍ−カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、Ｎ−ポリエチレングリコール６００（ＰＥＧ６００）、Ｏ−ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）、Ｐ−対照（添加剤なし）であった。最大値および最小値は、評価された添加剤の２つの濃度レベルである。
【図３】微生物株Ｃ−９２４および有機物の組成物の濡れ性に対するスクロース濃度の影響を示す図である。
【図４】微生物株Ｃ−９２４、アゾトバクター・クロコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｃｏｃｃｕｍ）ＩＮＩＦＡＴ１２、およびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｃ１６をそれぞれ含む組成物で処理されたトウモロコシ種子の発芽率を示す図である。対照は未処理の種子である。Ｄｕｎｃａｎ検定に従い、異なる文字はｐ＜０．０５の統計的に有意な差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、より効率的な、生物農薬およびバイオ肥料として証明された特性を有する微生物の固体組成物を提供することによって、上記で提起された課題を解決する。本発明は、１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロース、ならびに４）１２％未満の残留水分を含む、農業または獣医用の固体組成物を提供する。前記組成物において、細菌（菌株Ｃ−９２４）は、固体組成物１グラムあたり１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜１０１２ｃｆｕの間で見られる。
【００１１】
前記組成物は、製品の安定性を維持し、濡れ時間を短縮するため、より効果的である。この組成物は製品の適用をより実現可能にし、これは土壌の肥沃度を高めて、その土壌で栽培される植物のより満足のいく発達のためにそれを調整し、線虫および植物病原性真菌の攻撃から植物を保護し、動物の胃腸の動物性線虫を防除する。
【００１２】
上記のように、本発明の組成物の活性成分を構成する菌株Ｃ−９２４は、ブダペスト条約により、寄託番号ＣＢＳ６１３．９５で寄託されている。本発明は、細菌、植物病原性真菌および線虫の防除、ならびに植物生育の刺激のための、前記微生物株を含む最適化された固体組成物を開示する。最適化は、製品の安定性を向上させながら、最終的な適用での再懸濁性を促進することによって達成された。本発明において、配合物は、１０分未満の濡れ時間を有することが実証されている。
【００１３】
本発明の目的において、「消泡物質」という用語は、微生物発酵における泡の形成を阻害または低減するために使用される任意の物質である。本発明の一実施形態において、消泡物質は、脂肪酸エステルとエチレンオキシド−プロピレンオキシドのコポリマーとの混合物である。特定の実施形態において、消泡物質は、オーストリアのＢｕｓｓｅｔｔｉ＆Ｃｏ，ＧｍｂＨによって供給されるもの等のグラナポン（Ｇｌａｎａｐｏｎ）タイプのものである。
【００１４】
本発明の一実施形態において、固体組成物の一部を形成する培養培地は、酵母エキス、カゼイン加水分解物、ペプトンおよびトリプトンからなる群から選択される。別の実施形態において、タンパク質加水分解物および糖蜜等の有機改良剤は、固体組成物の一部を形成する。本発明の固体組成物を得るために、目的の微生物（菌株Ｃ−９２４）の濃縮物は、最初に、微生物の生育に一般的に使用される培養培地、または市販の有機改良剤と混合される。
【００１５】
本発明に関連して、「固体組成物」は、微生物の濃縮物として、微生物の発酵プロセスから採取されたバイオマスの配合および乾燥させるプロセスから生じる任意の固体製品として理解される。これらの特性を備えた固体組成物の例は、水和剤である。
【００１６】
製品の配合のために、バイオマスは、アミノ酸（好ましくは酵母エキス、ペプトン、トリプトンまたはカゼイン加水分解物）および炭水化物（好ましくはスクロース、グルコースまたは糖蜜）が豊富な培地での深部発酵によって得られる。培養条件は高密度培養を可能にし、採取は対数期の最終段階で行われ、次の乾燥段階のために準備された細胞が得られる。バイオマスの採取は、遠心分離または精密濾過により行われ、洗浄を行って、本発明では「クリーム」とも呼ばれる微生物濃縮物の配合の段階の前に培養培地の残留物を除去する。
【００１７】
本発明の範囲の限定を構成することなく、その具体化において、組成物の製造は、２つの段階、すなわち微生物濃縮物またはクリームの配合の第１段階、および噴霧乾燥の第２段階で実施された。配合段階では、まず培養培地、スクロース、消泡物質を混合し、混合物の熱処理を行って不要な微生物負荷を低減し、続いて微生物の濃縮バイオマスを添加した。第２段階では、配合されたクリームを、目的の微生物の高い生存率を保証する入口および出口温度の条件下で、噴霧乾燥機で乾燥させた。最後に、製品の安定性を保証するために、製品を低残留湿度と低酸素含有量を促進する条件下で包装した。
【００１８】
別の態様において、本発明は、１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロース、ならびに４）１２％未満の残留湿度を含む固体組成物の、植物および動物の病原体を防除するための使用を開示する。
【００１９】
本発明の一実施形態において、菌株Ｃ−９２４の前記固体組成物で防除される病原体は、寄生線虫である。特定の実施形態において、寄生線虫は、ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、ラドフォラス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）属、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属、ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）属、トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）属およびディクチオカウルス（Ｄｉｃｔｉｏｃａｕｌｕｓ）属に属する。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、前記固体組成物で防除される病原体は、真菌である。特定の実施形態において、真菌は、アルテルナリア・タバシナ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｔａｂａｃｉｎａ）、アルテルナリア・ロンギペス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｌｏｎｇｉｐｅｓ）、ビポラリス・オリザエ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｏｒｙｚａｅ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペスタロチア・パルマルム（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、サロクラジウム・オリザエ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、およびチェラウィオプシス・パラドクサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｐａｒａｄｏｘａ）からなる群から選択される。
【００２１】
本発明はまた、１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロースを含み；また１２％未満の残留湿度を有する固体組成物の、種子発芽および植物生育を刺激するための使用を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロースを含み；また１２％未満の残留水分を有する固体組成物の有効量を、それを必要とする土壌または動物に、前記植物または動物への組成物の適切な適用形態により投与することを特徴とする、植物および動物の病原菌を防除するための方法を含む。
【００２３】
植物の場合、「組成物の適切な適用形態」は、自動灌漑システム、または噴霧器もしくは他の機器による灌漑等、組成物の懸濁液が植物の根系に利用可能となる全ての手段として定義される。動物に使用する場合、「組成物の適切な適用形態」は、食事の一部としての固体組成物もしくはその懸濁液の供給、または直接経口経路による投与を指す。
【００２４】
１）最大９２．４％の、菌株Ｃ−９２４の細菌濃縮物と微生物の生育および発達のための培養培地または市販の有機改良剤との混合物；２）１．８％〜６．６％の消泡物質；３）０．８％〜３％のスクロースを含み；１２％未満の残留湿度を有する固体組成物の有効量を、種子または植物に、前記種子または植物への組成物の適切な適用形態により投与することを特徴とする、種子発芽および植物生育を刺激するための方法もまた、本発明の一部である。
【００２５】
種子の場合、「組成物の適切な適用形態」は、種子を本発明の固体組成物の懸濁液と接触させる全ての手段として定義される。例えば、種子への組成物の適切な適用形態は、前記組成物へのそれらの浸漬である。
【００２６】
例
例１．バイオマスの生成。
寄託番号がＣＢＳ６１３．９５である細菌株Ｃ−９２４のバイオマスを、以下の組成の培養培地でバッチシステムでの深部発酵によって得た：酵母エキス、５９ｇ／Ｌ；スクロース、１７０ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物、４．８ｇ／Ｌおよび消泡物質グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）、１ｇ／Ｌ。発酵は、５０Ｌの作業容量の発酵槽で、３６℃、５００ｒｐｍの撹拌、培養培地１リットルあたり１．５リットルの空気の通気、および１バールの発酵槽のガラス内圧力で行った。添加された全スクロースが消費されるまで、培養を７２時間維持し、その後、それを少なくとも４時間定常期に置いた。管状遠心分離機での遠心分離により微生物を採取し、培養上清を除去した。得られたバイオマスを、乾燥させるクリームまたは細菌濃縮物の配合に使用した。図１に、得られた生育速度を示す。前記の図に示されているパラメータにより、乾燥バイオマス濃度の値が１００ｇ／Ｌを超えているため、高密度の生育が観察され得、これにより後続の乾燥プロセスのための細胞のより良い準備が可能となる。
【００２７】
例２．組成物の濡れ性を改善するための添加剤の選択。
濡れ性によって測定された、細菌株Ｃ−９２４の配合物の物理的特性における異なる添加剤の発生率の評価を行った。例１に記載されているようにバイオマスを得た。評価した添加剤は、アカシアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ＳＤＳ、ポリソルベート８０（ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（ｔｗｅｅｎ２０）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、スクロース、硫酸アンモニウム、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）（Ｂｕｓｓｅｔｔｉ＆Ｃｏ，ＧｍｂＨ、オーストリア）、大豆レシチン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール６００（ＰＥＧ６００）およびポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）であった。微生物（細菌株Ｃ−９２４）の濃度が８．４％〜９．２％（ｗ／ｗ）で、培養培地（酵母エキス）が７６％〜８５％（ｗ／ｗ）である組成物を生成した。添加剤は、キサンタンガムを除いて、一方は最小（２．３％（ｗ／ｗ））、他方は最大（１０．５％（ｗ／ｗ））の２つの濃度レベルで添加した。キサンタンガムの場合、この添加剤が乾燥するために配合されたクリームまたは濃縮物に与える高粘度に起因して、最小値は０．２３％、最大値は１．２％（ｗ／ｗ）であった。対照として、９．５％（ｗ／ｗ）のバイオマスおよび８５．５％（ｗ／ｗ）の酵母エキスの組成で、添加物を含まない配合物を使用した。配合されたクリームを、３７±１℃の熱交換器によってインラインで予熱された噴霧乾燥機で乾燥させ、１３０±２℃の入口温度および６０℃〜６２℃の間の出口温度で乾燥させた。得られた組成物を真空シーラーで３層材料（ポリエチレン、アルミニウムおよびポリエステル）に充填した。乾燥後の組成物の残留水分は、平均５％であった。それに応じて、組成物の濡れ性を評価し、国際農薬分析法協議会（ＣＩＰＡＣ）によりＣＩＰＡＣ  ＭＴ５３．３において説明される方法によって決定した。
【００２８】
図２は、驚くべきことに、２つの試験濃度（２．３％および１０．５％）で消泡物質グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）を添加すると、組成物の濡れ時間が１０分未満に短縮されることを示しており、これは、組成物の物理的特性、ひいては既存の灌漑システムへのその適用性に極めて有利である。
【００２９】
例３．組成物の濡れ性に対するグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）濃度の影響。
グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の濃度が組成物の濡れ性に及ぼす影響を評価するために、有機物の存在下および非存在下の２つの実験を行い、さらに消泡物質グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の濃度を０〜６．６％の間で変動させた。酵母エキスを、第１の実験の配合物に含めた。これは、２３．５％の乾燥バイオマス、６７．１％の酵母エキス、１．１％のスクロースの濃度で行い、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）は０〜６．６％であった。第２の実験の組成物は酵母エキスを含まず、９０．６％の乾燥バイオマス、１．１％のスクロース、および０〜６．６％のグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の濃度を有していた。例１に記載されているようにバイオマスを得た。乾燥プロセスは、例２に記載されているように、８０℃の出口温度を使用して行った。測定された応答変数は、ＣＩＰＡＣ  ＭＴ５３．３手法による濡れ性であった。表１は、酵母エキスが配合物に含まれている第１の実験で得られた結果を示す。得られた結果は、１．８％以上のグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）濃度から、１分未満の濡れ性が達成されることを示している。
【表１】
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【００３０】
表２は、酵母エキスが配合物に含まれていない第２の実験で得られた結果を示す。収集された結果は、１．８％以上のグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の濃度から、１０分未満の濡れ性が達成されることを示している。
【表２】
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【００３１】
両方の表で得られた結果は、１．８％以上のグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）濃度により、濡れ時間が１０分未満に短縮されることを示しており、この時間は、酵母エキスが配合物中に存在する場合はより短くなる。６．６％を超えるグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の濃度を有する組成物が調製される場合、得られる粉末の流動性の低下が認められ、これは製品の物理的特性に有害である。
【００３２】
例４．固体組成物の濡れ性に対するスクロース濃度の影響。
製品の濡れ性に対するスクロース濃度の影響を評価した。２３．５％の乾燥バイオマス、２％のグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）、６７％の酵母エキス、０〜３．３％のスクロースの基本組成で、乾燥させる様々な種類のクリームを調製した。例１に記載されているようにバイオマスを得た。クリームは、４０％の総固形分濃度で調製した。乾燥は、入口温度が１３０±２℃、出口温度が８０℃の噴霧乾燥機で行った。測定された応答変数は、ＣＩＰＡＣ  ＭＴ５３．３手法による濡れ性であった。
【００３３】
図３は、スクロース濃度が０．８〜３％の場合、１０分未満の濡れ性が達成されることを示しており、これは、この種の製品にとって望ましい時間である。
【００３４】
例５．生物活性アッセイのための組成物の調製。
Ｃ−９２４株の細菌を含む乾燥させるクリームは、３０％に等しい全固形分濃度で調製した。最初に酵母エキスおよびスクロースを、各配合物を調製するのに必要な量でクリームに添加し、得られた湿潤バイオマスの添加を可能にする量のプロセス水において各配合物で使用するグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）の総量の１５％を添加した。得られた混合物を、温度制御された撹拌槽内で均質化した。それらを９５℃で１時間加熱した。続いて、それらを１５℃未満の温度に冷却した。前記温度に達したときに、得られた湿潤バイオマスおよび残りのグラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）を各配合物に添加し、それを少なくとも１時間撹拌し続けた。
【００３５】
得られた混合物を噴霧乾燥機で乾燥させた。このために、乾燥させる混合物を、３７±１℃の熱交換器によってインラインで予熱し、１３０±２℃の空気入口温度および８０℃の出口温度で乾燥させた。製品が取り出された場所の相対湿度は５５％未満であり、温度は２２℃〜２６℃の間であった。得られた組成物を真空シーラーで３層材料（ポリエチレン、アルミニウム、ポリエステル）に充填した。
【００３６】
調製した配合物の最終組成は次の通りであった。
−配合物１：微生物を使用しない対照。乾燥バイオマス０％；酵母エキス９０．４％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
−配合物２：乾燥バイオマス２．３％；酵母エキス８８．２％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
−配合物３：乾燥バイオマス４．５％；酵母エキス８５．９％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
−配合物４：乾燥バイオマス２２．６％；酵母エキス６７．８％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
−配合物５：乾燥バイオマス４５．２％；酵母エキス４５．２％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
−配合物６：乾燥バイオマス９０．４％；酵母エキス０％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％。
【００３７】
残留水分は常に５％であった。得られた組成物は、各成分の以下の濃度範囲を満たしていた：酵母エキスおよび乾燥バイオマスの混合物が９２．４％以下；グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）が１．８％〜６．６％の間；スクロースが０．８％〜３％の間；水（残留水分）が１２％未満。細菌株Ｃ−９２４からなる使用された微生物は、１０１０〜１０１２ｃｆｕ／組成物グラムの間の濃度であった。
【００３８】
例６．微生物株Ｃ−９２４の組成物の殺線虫効果のインビトロ評価。
有機物／微生物の比率が変動する菌株Ｃ−９２４を含む組成物の殺線虫効果を評価するために、実験室レベルでの方法を行った。有機物として、酵母エキスを使用した。この実験で使用された組成物は、例５に記載されたものである。インビトロ活性の判定基準として、各組成物の卵孵化の阻害および幼体の死亡率を評価した。この評価は、様々な線虫種で行った。
【００３９】
標本は、フィトネマトーデス（ｐｈｙｔｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）（サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、ラドフォラス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ  ｓｉｍｉｌｉｓ）、プラチレンクス・コフェアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｕｓ  ｃｏｆｆｅａｅ））が侵入した植物の根から、反芻動物の第四胃から（ヘモンクス・コントルタス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）およびトリコストロンギルス・コルブリフォルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｉｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ））、ならびに動物肺虫（ｚｏｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）が侵入した羊の肺から（ジクチオカウルス・ビビパルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｖｉｖｉｐａｒｕｓ））抽出した。標本を１％次亜塩素酸ナトリウム溶液に３分間入れ、次いで滅菌脱イオン水で３回または４回洗浄して、次亜塩素酸の残留物を除去した。幼体は、滅菌脱イオン水で２８℃で２〜６日間インキュベートされた卵から得た。試料は、２４ウェルの無菌培養プレートで実施される試験を展開する直前に準備した。ウェルあたり平均１００個の卵（または１００個の幼体）を配置した。
【００４０】
菌株Ｃ−９２４の各組成の効果を知るために、全ての場合において、最初に脱イオン水に懸濁し、細菌を遠心分離によって採取し、洗浄し、５×１０４ｃｆｕ／ウェルの細胞密度に達するまで水−１％ペプトンに懸濁した。
【００４１】
卵を置いたら、プレートを顕微鏡で観察し、各ウェルで幼体の存在の可能性を検証した。各ウェルに、０．１ｍｌの量の各配合物を加え、滅菌脱イオン水で１ｍｌまでの量にした。対照は別のプレートに配置した。これらは、同じ数の卵または幼体を水−ペプトンのみに含んでいた。いずれの場合も３つの複製を配置した。
【００４２】
卵の活動試験では、評価は９６時間で行い、顕微鏡下で各ウェルにおいてこの時間中に出現した幼体をカウントした。試験開始時に配置された卵の総数を考慮して卵孵化率を計算し、対照として使用した組成物１の孵化率に関して各処理の孵化阻害率を決定した。
【００４３】
幼体の活動試験では、評価は７２時間のインキュベーション後に行った。続いて、幼体を滅菌脱イオン水に移し、さらに２４時間インキュベートした後、顕微鏡下で生きた幼体および死んだ幼体の数の最終的なカウントを行った。この試験では、試験終了後に幼体の生存率を計算し、対照配合物によってもたらされたものに関して、その減少を決定した。
【００４４】
どちらの試験でも、最も効果的な組成物を選択するための判定基準は、卵孵化の阻害の増加、および幼体生存率の５０％以上の減少であった。卵孵化の阻害の評価結果を表３に示す。値は、３つの複製の平均を表す。
【表３】
2022502437.tif 000004
【００４５】
卵孵化の阻害に関して、組成物３、４、５、および６は、動物肺虫（ｚｏｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）およびフィトネマトーデス（ｐｈｙｔｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の両方で５０％を超える防除を示した。最良の結果は組成物４で得られた。一方、幼体死亡率の評価結果を表４に示す。
【表４】
2022502437.tif 000005
【００４６】
幼体死亡率に関して、組成物３、４、５、および６は、５０％を超える幼体の死滅をもたらす判定基準を満たした。この場合、組成物４が最大の効果を示すものであった。
【００４７】
例７．微生物株Ｃ−９２４の組成物の殺線虫効果のインビボ評価。
Ａ）ポット管理された条件
サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に対する組成物の殺線虫活性を、インビボ条件下（容量１ｋｇのポット）で測定した。この実験で使用された組成物は、例５に記載されたものであった。フィトネマトーデス（ｐｈｙｔｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の攻撃を受けやすい品種ＵＣ８２１３のトマト植物を使用した。各組成物に５０の植物を使用した。滅菌砂および泥炭の１：１混合物を基質として使用し、組成物を最初に適用する３日前に、各ポットあたり１０００個の線虫の卵を侵入させた。６．２５ｇの量の各固体組成物を秤量し、５Ｌの水に懸濁した。ポットあたり１００ミリリットルを適用した。処理において、組成物の適用は３回行った。最初の適用は苗の移植の７日前、２回目の適用は移植の１４日後、３回目の適用は２回目の適用の２１日後に行った。
【００４８】
苗を植えてから４０日後、線虫の攻撃によって根に生じた被害を、ＢｒｉｄｇｅおよびＰａｇｅの侵入度の尺度を使用して評価した（Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．２６，Ｉｓｓ．３，１９８０）。各組成物で処理された植物の侵入度の値を統計的に比較した。得られた結果を表５に示す。
【表５】
2022502437.tif 000006
【００４９】
ポットでの殺線虫活性試験で得られた結果によると、組成物３、４、５、および６は、他の配合物を与えられた植物と比較した場合、統計的に有意な差で、根の線虫攻撃による損傷が少ないことが実証された。組成物４および５で処理された植物は、害虫による攻撃に対して最高レベルの保護を示した植物であった。
【００５０】
Ｂ）野外条件
研究対象の組成物の殺線虫活性を、０．１ｈａの保護された作物ハウスの条件で決定した。土壌の最初の侵入は、指標植物の無作為サンプリングおよび植え付けから評価した。ＢｒｉｄｇｅおよびＰａｇｅのスケールの結果に従って、７以上の高レベルの初期侵入を有する保護された作物ハウスを選択した。線虫の攻撃を受けやすい３０１９という名前のトマト雑種の植物を使用した。組成物は、無作為ブロック設計に従って適用した。各組成物の濃縮溶液を調製し、５００ｇの各組成物を５０Ｌの水に懸濁した。これらの懸濁液から、各ブロックに適用する前に１：８希釈液を調製し、最初の適用では、各苗の移植が行われる領域に１００ｍＬを適用した。２回目および３回目の適用では、植物の発達に応じて、植物ごとに２００ｍＬ〜３００ｍＬの前記希釈液を供給した。適用スキームは、ポット条件下での試験で使用されたものと同様であり、１回の適用は苗を畝間に移植する７日前、２回目の適用は移植の１４日後、３回目の適用は２回目の適用の２１日後であった。根の損傷は、７０日間の栽培で、ＢｒｉｄｇｅおよびＰａｇｅのスケールによって各配合物で処理された植物の総数で評価した。損傷値を統計的に比較した。各処理における収穫量も、果実の総重量から評価した（栽培サイクルの終了時、１２５日）。得られた結果を表６に示す。
【表６】
2022502437.tif 000007
【００５１】
野外条件下での試験では、組成物４、５、および６は、線虫の攻撃による損傷の最大の防除を示した。組成物４の場合、もたらされた侵入度は、配合物１を与えられた植物にもたらされた侵入度の５０％であった。これらの結果と収量に関して得られた結果との間にも一致があり、組成物４では、対照として使用された配合物１よりも１７２５％多くの果実を得ることができた。
【００５２】
例８．植物病原性真菌に対する細菌株Ｃ−９２４を含む組成物の活性の評価。
植物病原性真菌に対する活性試験を、固形培養培地を含むペトリ皿で行った。真菌の接種は、培地がまだ液体である（温度が４０℃に近い）ときに行った。培地が固化したら、各組成物１ｍｇ／ｍＬの懸濁液で湿らせた濾紙のディスクを各プレートの中央に設置し、３０℃でインキュベートした。この実験で使用された組成物は、例５に記載されている。各処理には３つのペトリ皿を使用した。５日後、各処理の阻害ゾーンを評価し、真菌の種類ごとに同じ組成物に対応する阻害ゾーンの値を平均した。得られた結果を表７に示す。
【表７】
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【００５３】
これらの結果により、表７に示される全ての植物病原性真菌に対する、菌株Ｃ−９２４を含む固体組成物の拮抗活性が実証される。特に、組成物４、５および６は、植物病原性真菌に対してより大きな生育阻害のハローを生成した。
【００５４】
例９．最大の生物学的活性を有する組成物の安定性の実証。
生物活性実験で得られた満足のいく結果は、２２．６％の乾燥バイオマス；６７．８％の酵母エキス；１．４％のスクロース；グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％、５％の残留湿度からなる組成物４で製造された８つのロットのリアルタイム安定性研究へとつながった。噴霧乾燥機の出口温度は８０℃であった。バッチを２℃〜８℃の温度で保管した。バッチの安定性の指標は、２４ヶ月の保管が完了するまで、製造の開始時および様々な時点で分析した。
【００５５】
乾燥バイオマス２２．６％；酵母エキス６７．８％；１．４％のスクロース；グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％；および５％の残留湿度を含む組成物は、表８に見られるように、２℃〜８℃の間の温度で、棚で少なくとも２４ヶ月の安定性を維持することが示された。
【表８】
2022502437.tif 000009
【００５６】
例１０．最高の生物活性を有する組成物のバイオ肥料能力の実証。
線虫および真菌に対して最大の効果を示した菌株Ｃ−９２４の固体組成物（配合物４）のトウモロコシ植物におけるバイオ肥料活性を確認するために、苗を植える７日前および７日後に土壌接種を行った。配合物から得られた水和剤を、１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁した。適用量は、ポットあたり１００ｍＬであった。陽性対照として、植物生育刺激細菌シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｃ１６およびアゾトバクター・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）ＩＮＩＦＡＴ１２で処理された植物を使用した。陰性対照として、接種されていない植物を使用した。複製の数は、処理あたり２０の植物であった。種子は、１ｄｍ３の容量のポットに、ネストあたり１つの種子、ポットあたり４つのネストの割合で、深さ３センチメートルで播種した。
【００５７】
播種時に細菌Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｃ１６（２．７×１０１０ｃｆｕ／ｍＬの濃度）およびＡ．クロオコッカム（Ａ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）ＩＮＩＦＡＴ１２（４．５×１０１０ｃｆｕ／ｍＬの濃度）を適用した。両方の菌株を、２ｋｇ／ｈａの用量で、事前にふるいにかけられた腐植土と細菌溶液との固体混合物で使用した。
【００５８】
評価した変数は次の通りであった。
−播種後７日で発芽した種子の割合。
−根の首から葉の旗の葉腋までの植物の高さ（ｃｍ単位、植物を植えてから７日後および３５日後に測定）。
−茎の高さ２ｃｍでの植物の茎の直径（ｍｍ）。
【００５９】
図４に見られるように、種子を播種してから７日後、選択したＣ−９２４固体組成物で処理した植物で最も高い発芽率（９５．６％）が得られた。残りの処理（Ａ．クロコッカム（Ａ．ｃｈｒｏｃｏｃｃｕｍ  ＩＮＩＦＡＴ１２またはＰ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｃ１６を接種した植物）では、接種していない対照と同様の値が得られた。
【００６０】
変数「植物の高さ」については、表９に見られるように、Ｃ−９２４を含む固体組成物を使用した場合に（統計的に有意な差を伴う）最良の結果が得られた。
【表９】
2022502437.tif 000010
【００６１】
茎の直径に関しては、実験の最初の３週間は、対照を含めて植物間に差はなかった（表１０）。２８日後、Ｃ−９２４の固体組成物が存在するバリアントでは、この変数の最良の値が得られることが分かった。これらの値は、接種なしの対照、および陽性対照として使用された互いに類似した植物生育刺激細菌で処理された植物で得られた値よりも高かった（統計的有意性を伴って）。
【表１０】
2022502437.tif 000011
【００６２】
これらの結果から、Ｃ−９２４を含む組成物は、種子の発芽および生育を刺激することにより、植物の茎の高さおよび太さによって評価されるバイオ肥料活性を有すると結論付けられる。
【００６３】
例１１．いくつかの微生物培養培地を用いた菌株Ｃ−９２４の組成物の殺線虫効果の評価。
例５の配合物４と同様の組成物の、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に対する殺線虫活性をインビボで決定した。この組成物４は、殺線虫、殺菌、および生育促進活性に関して最良の結果が得られるため選択された。この実験で評価された同様の組成物は、微生物の異なる培養培地を含み、以下の通りであった：
−組成物４Ａ（対照）：乾燥バイオマス２２．６％；酵母エキス６７．８％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％
−組成物４Ｂ：乾燥バイオマス２２．６％。カゼイン加水分解物６７．８％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％
−組成物４Ｃ：乾燥バイオマス２２．６％。ペプトン６７．８％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％
−組成物４Ｄ：乾燥バイオマス２２．６％。トリプトン６７．８％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％
−組成物４Ｅ（微生物を含まない対照）：乾燥バイオマス０％。酵母エキス９０．４％、スクロース１．４％、グラナポンＤＧ−１５８（Ｇｌａｎａｐｏｎ  ＤＧ−１５８）３．２％
【００６４】
全ての組成物は５％の残留水分を有していた。フィトネマトーデス（ｐｈｙｔｏｎｅｍａｔｏｄｅｓ）の攻撃を受けやすい品種ＵＣ８２１３のトマト植物を使用した。各組成物に５０の植物を使用した。基質として、滅菌砂および泥炭の１：１混合物を使用し、組成物を最初に適用する３日前に、ポットあたり１０００個の線虫の卵を侵入させた。６．２５ｇの量の固体組成物のそれぞれを秤量し、５Ｌの水に懸濁した。それらを、ポットあたり１００ｍＬの割合で適用した。組成物の適用は３回行った。１回目は苗の移植の７日前、２回目は播種後１４日、そして最後の適用は２回目から２１日後であった。植えてから４０日後、線虫の根への攻撃によりもたらされた被害を、ＢｒｉｄｇｅおよびＰａｇｅの侵入度の尺度を使用して評価した。各組成物で処理された植物の侵入グラドロジー（ｇｒａｄｏｌｏｇｙ）の値を統計的に比較した。苗を植えてから４０日後に得られた結果を表１１に示す。
【表１１】
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【００６５】
ポットでのこの殺線虫活性試験で得られた結果によると、組成物４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄの適用は、微生物を含まない組成物で処理された植物（４Ｅ）と比較すると根の線虫の攻撃による影響がより少なく、統計的に有意な差があることが実証された。使用した培養培地に関係なく、試験したＣ−９２４の組成物の間で活性に差はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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