(57)【要約】  開示されるのは、対応する非修飾ポリメラーゼと比べて増大した５’−３’ストランド置換活性並びに実質的に低減した５’−３’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性を有する、ＤＮＡポリメラーゼである。該ポリメラーゼは、様々な開示されるプライマー伸長方法において有用である。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの生成に有用な、組換え核酸、ベクター及び宿主細胞を含む関連組成物も開示される。
2022500046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した５’−３’ストランド置換活性並びに実質的に低減した５’−３’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、１つ以上の変異又は変異の組合せを、配列番号１の下記の位置に対応する位置：
６８６、６９３、５１６、６３３、４１５、４２０、６３６、７５２、７６８、５２５、６９４、４９１、５１６、５１５、６６６、４０２、５５５、５８２、７３７、７５９、５２１、５４６、６６８、４５６、５０７、５７１、６５２、８３２、４９８、５２４、５９８、６１６、４４４、４９８、６６０、６７３、４９３、５１１、６４８、７４９及び６３５に含み、前記対照ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１、配列番号４０又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
配列番号１の対応する位置における前記１つ以上の変異又は変異の組合せが、
Ｉ６８６Ｖ、Ａ６９３Ｖ、Ｔ５１６Ｉ、Ｖ６３３Ｉ、Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、Ｖ７６８Ｍ、Ｒ５２５Ｇ、Ｆ６９４Ｓ、Ｑ４９１Ｈ、Ｔ５１６Ｓ、Ｓ５１５Ｆ、Ｔ６６６Ｍ、Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、Ｎ５８２Ｄ  Ａ７３７Ｔ、Ａ７５９Ｔ、Ｌ５２１Ｑ、Ｔ５４６Ａ、Ｎ６６８Ｓ、Ａ４５６Ｔ、Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、Ｓ６５２Ｆ、Ｓ５１５Ｆ、Ａ８３２Ｖ、Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ、Ｍ６１６Ｉ、Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ、Ｙ６７３Ｎ、Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ、Ｍ７４９Ｌ及び／又はＱ６３５Ｋ
から選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
ｉ．配列番号１の６８６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｉ．配列番号１の６９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｖ．配列番号１の６３３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖ．配列番号１の４１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉ．配列番号１の４２０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉｉ．配列番号１の６３６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉｉｉ．配列番号１の７５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｘ．配列番号１の７６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘ．配列番号１の５２５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｒ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉ．配列番号１の６９４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｆ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｉ．配列番号１の４９１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｉｉ．配列番号１の５１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｖ．配列番号１の６６６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖ．配列番号１の４０２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉ．配列番号１の５５５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉｉ．配列番号１の５８２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉｉｉ．配列番号１の７３７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｘ．配列番号１の７５９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘ．配列番号１の５２１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉ．配列番号１の５４６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｉ．配列番号１の６６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｉｉ．配列番号１の４５６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｖ．配列番号１の５０７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｋ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖ．配列番号１の５７１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉ．配列番号１の６５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉｉ．配列番号１の８３２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の４９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｘ．配列番号１の５２４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘ．配列番号１の５９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｒ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉ．配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｉ．配列番号１の４４４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号１の６６０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｖ．配列番号１の６７３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖ．配列番号１の４９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉ．配列番号１の５１１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉｉ．配列番号１の６４８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の７４９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、且つ／又は
ｘｘｘｉｘ．配列番号１の６３５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｑ以外の任意のアミノ酸である、
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
ｉ．配列番号１の６８６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖであり、
ｉｉ．配列番号１の６９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖであり、
ｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｉであり、
ｉｖ．配列番号１の６３３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｉであり、
ｖ．配列番号１の４１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｈであり、
ｖｉ．配列番号１の４２０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｄであり、
ｖｉｉ．配列番号１の６３６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｇであり、
ｖｉｉｉ．配列番号１の７５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓであり、
ｉｘ．配列番号１の７６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍであり、
ｘ．配列番号１の５２５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｇであり、
ｘｉ．配列番号１の６９４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓであり、
ｘｉｉ．配列番号１の４９１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｈであり、
ｘｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓであり、
ｘｉｖ．配列番号１の５１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｆであり、
ｘｖ．配列番号１の６６６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍであり、
ｘｖｉ．配列番号１の４０２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖであり、
ｘｖｉｉ．配列番号１の５５５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａであり、
ｘｖｉｉｉ．配列番号１の５８２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｄであり、
ｘｉｘ．配列番号１の７３７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔであり、
ｘｘ．配列番号１の７５９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔであり、
ｘｘｉ．配列番号１の５２１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｑであり、
ｘｘｉｉ．配列番号１の５４６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａであり、
ｘｘｉｉｉ．配列番号１の６６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓであり、
ｘｘｉｖ．配列番号１の４５６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔであり、
ｘｘｖ．配列番号１の５０７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｍであり、
ｘｘｖｉ．配列番号１の５７１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ａであり、
ｘｘｖｉｉ．配列番号１の６５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｆであり、
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の８３２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖであり、
ｘｘｉｘ．配列番号１の４９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｅであり、
ｘｘｘ．配列番号１の５２４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｖであり、
ｘｘｘｉ．配列番号１の５９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｇであり、
ｘｘｘｉｉ．配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｉであり、
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号１の４４４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｔであり、
ｘｘｘｉｖ．配列番号１の６６０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｋであり、
ｘｘｘｖ．配列番号１の６７３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉ．配列番号１の４９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｄであり、
ｘｘｘｖｉｉ．配列番号１の５１１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｓであり、
ｘｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の６４８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｉであり、
ｘｘｘｉｘ．配列番号１の７４９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｌであり、且つ／又は
ｘｌ．配列番号１の６３５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｋである、
請求項３に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、単一の変異及び／又は変異の組合せを、
ｉ．Ｉ６８６Ｖ及びＡ６９３Ｖ、
ｉｉ．Ｔ５１６Ｉ及びＶ６３３Ｉ、
ｉｉｉ．Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、及びＶ７６８Ｍ、
ｉｖ．Ｒ５２５Ｇ及びＦ６９４Ｓ、
ｖ．Ｑ４９１Ｈ及びＴ５１６Ｓ、
ｖｉ．Ｓ５１５Ｆ及びＴ６６６Ｍ、
ｖｉｉ．Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、及びＮ５８２Ｄ、
ｖｉｉｉ．Ａ７３７Ｔ及びＡ７５９Ｔ、
ｉｘ．Ｌ５２１Ｑ及びＴ５４６Ａ、
ｘ．Ｎ６６８Ｓ、
ｘｉ．Ａ４５６Ｔ、
ｘｉｉ．Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、及びＳ６５２Ｆ、
ｘｉｉｉ．Ｓ５１５Ｆ及びＡ８３２Ｖ、
ｘｉｖ．Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ及びＭ６１６Ｉ、
ｘｖ．Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ及びＹ６７３Ｎ、
ｘｖｉ．Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ及びＭ７４９Ｌ、並びに／又は
ｘｖｉｉ．Ｑ６３５Ｋ
から選択される配列番号１の対応する位置に含む、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号１又は配列番号４０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
配列番号１又は配列番号４０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記増大した５’−３’ストランド置換活性並びに実質的に低減した５’−３’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性が、高温で出現する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸が、Ｄ以外の任意のアミノ酸である、請求項１から８のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される、請求項９に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号１の５８０位に対応するアミノ酸が、Ｇである、請求項１０に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸が、Ｉ以外の任意のアミノ酸である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ及びＡからなる群から選択される、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸が、Ｋである、請求項１３に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする、組換え核酸。
【請求項１６】
配列番号４１と少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
プライマー伸長を行うための方法であって、
−請求項１から１４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型及びヌクレオシド三リン酸と、前記プライマーの伸長に好適な条件下で接触させ、それにより、伸長したプライマーを生成するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記プライマー伸長方法が、ストランド置換反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、又は、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、クロスプライミング増幅（ＣＳＡ）及びポリメラーゼ鎖置換反応（ＰＣＤＲ）から選択される増幅反応を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記条件が、高温を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
伸長したプライマーを生成するためのキットであって、
請求項１から１４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む、キット。
【請求項２１】
（ａ）プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器、
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器、及び
（ｃ）プライマー伸長に好適な緩衝液を提供する容器からなる群から選択される１つ以上の更なる容器をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、及びヌクレオシド三リン酸を含む、反応混合物。
【請求項２３】
第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２２に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権情報
本出願は、２０１８年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／７３０，９０８号に対する優先権を主張するものであり、その内容はあらゆる目的のための参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。２０１８年８月２９日に作成されたファイルＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿３１９３４−ＵＳ．ｔｘｔ、１５０，９００バイト、マシンフォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−ウィンドウズオペレーティングシステムに記されている配列表は、あらゆる目的のための参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、増大した５’−３’ストランド置換活性及び実質的に低減した５’−３’エキソ／エンドヌクレアーゼ活性を含む、改善された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びに核酸ポリヌクレオチド伸長及び増幅を含む種々の用途におけるそのようなポリメラーゼの使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝情報を世代から世代へと正確に伝達することの中核をなす役割である、ゲノムの複製及び維持を司る。ＤＮＡポリメラーゼは、細胞において、ＤＮＡの合成を司る酵素として機能する。これらは、Ｍｇ2+等の金属活性剤の存在下、コピーされているＤＮＡ鋳型又はポリヌクレオチド鋳型によって指示された順序で、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合する。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅を含む一連のＤＮＡ合成プロセスに関わる。各ＤＮＡ合成プロセス中に、ＤＮＡ鋳型は１回又は多くても数回コピーされて、同一の複製物を生成する。対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡ複製は、例えばポリメラーゼ連鎖反応中に等、何度も繰り返され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた最初の研究では、ＤＮＡ複製の各ラウンドの開始時にＤＮＡポリメラーゼを添加した（米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）。その後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、高温で成長する細菌から得ることができ、これらの酵素は一度だけ添加される必要があると判断された（米国特許第４，８８９，８１８号及び米国特許第４，９６５，１８８号を参照のこと）。ＰＣＲ中に高温で使用すると、これらの酵素は不可逆的に不活性化されない。結果として、各合成添加プロセスの開始時に新鮮な酵素を添加することなく、ポリメラーゼ連鎖反応の繰り返しサイクルを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ポリメラーゼは、組換えＤＮＡ研究における及び疾患の医療診断における多数の技法の鍵となる。特に診断用途では、標的核酸配列は、問題のＤＮＡ又はＲＮＡのごく一部でしかないこともあるため、標的核酸配列の存在下、増幅なしに検出することは困難であり得る。
【０００５】
ＤＮＡポリメラーゼの全体的な折り畳みパターンは、ヒトの右手に類似しており、掌、指及び親指の３つの異なったサブドメインを含有する。（Ｂｅｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２６０巻：第３５２〜３５５頁、１９９３年）；Ｐａｔｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３４巻：第５３５１〜５３６３頁、１９９５年を参照のこと）。指及び親指サブドメインの構造は、サイズ及び細胞機能が異なるポリメラーゼ間で大幅に変動するが、触媒的掌サブドメインは、全て重ね合わせることができる。例えば、入ってくるｄＮＴＰと相互作用し、化学触媒作用中の遷移状態を安定化させるモチーフＡは、哺乳動物ｐｏｌα及び原核生物ｐｏｌ  ＩファミリーＤＮＡポリメラーゼの間で、約１Åの平均偏差で重ね合わせることができる（Ｗａｎｇ  ら、Ｃｅｌｌ第８９巻：第１０８７〜１０９９頁、１９９７年）。モチーフＡは、構造的に、疎水性残基を主に含有する逆平行β−ストランドで開始し、α−ヘリックスまで続ける。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位の一次アミノ酸配列は、例外的に保存されている。モチーフＡの場合には、例えば、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号２２）は、例えば、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を含む、何百万年もの進化によって分離された生物由来のポリメラーゼにおいて保持されている。
【０００６】
よく保存されていることに加えて、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は、比較的易変性であり、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に低減させることなく、ある特定のアミノ酸置換を収容することができることも示されている。（例えば、Ｐａｔｅｌらの米国特許第６，６０２，６９５号を参照されたい）。そのような変異体ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、核酸合成反応を含む診断及び研究用途において、種々の選択的な利点を供与することができる。
【０００７】
ストランド置換は、ＤＮＡの合成中に遭遇した下流のＤＮＡを、分解するよりもむしろ置き換える、ポリメラーゼの能力を指す。ストランド置換複製中に、唯一のＤＮＡストランドが一度に複製される。ストランド置換合成は、一本鎖ＤＮＡを放出し、次いでこれがコピーされて二本鎖ＤＮＡとなる。多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、迅速且つ前進的なプライマー伸長ＤＮＡ合成を呈するが、非効率的なストランド置換ＤＮＡ合成を呈する。本開示は、高温で改善されたストランド置換活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供し、これは、改善された５’−３’ストランド置換活性及び実質的に低減した５’−３’エキソ／エンドヌクレアーゼ活性をもたらす。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で提供されるのは、Ｐｈｉ  ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのような顕著なストランド置換活性を有するその他のＤＮＡポリメラーゼが機能しない場合に、高温で改善されたストランド置換活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。本開示は、改善された５’−３’ストランド置換活性及び実質的に低減したエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性をもたらす、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインにおける変異について記述する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、減少した５’−３’エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を有する。本明細書で記述される変異は、密接に関連するＤＮＡポリメラーゼの既存の三次元構造に基づいて予測され得なかった予想外の利点を提供し、思い返してみても、本明細書で記述される変異体ポリメラーゼがストランド置換活性の増強を実証するであろうことは、予測不可能であった。
【０００９】
一態様では、本明細書で提供されるのは、対応する非修飾対照ポリメラーゼに比べて増大した５’−３’ストランド置換活性及び実質的に低減した５’−３’エキソ／エンドヌクレアーゼ活性を含む改善された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びにそのようなＤＮＡポリメラーゼを作製及び使用する方法である。いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した５’−３’ストランド置換活性を有する。いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して実質的に低減した５’−３’エキソ／エンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、該対照ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１の４６位に対応するアミノ酸に変異を有することを除き、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の４６位に対応するアミノ酸に、グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）からグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）変異を含む。Ｇ４６Ｅ変異は、５’−３’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性を損ない、これは、ストランド置換酵素にとって望ましくない。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善された又は変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４１の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
６８６、６９３、５１６、６３３、４１５、４２０、６３６、７５２、７６８、５２５、６９４、４９１、５１６、５１５、６６６、４０２、５５５、５８２、７３７、７５９、５２１、５４６、６６８、４５６、５０７、５７１、６５２、８３２、４９８、５２４、５９８、６１６、４４４、４９８、６６０、６７３、４９３、５１１、６４８、７４９及び６３５。
【００１１】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
Ｉ６８６Ｖ、Ａ６９３Ｖ、Ｔ５１６Ｉ、Ｖ６３３Ｉ、Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、Ｖ７６８Ｍ、Ｒ５２５Ｇ、Ｆ６９４Ｓ、Ｑ４９１Ｈ、Ｔ５１６Ｓ、Ｓ５１５Ｆ、Ｔ６６６Ｍ、Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、Ｎ５８２Ｄ  Ａ７３７Ｔ、Ａ７５９Ｔ、Ｌ５２１Ｑ、Ｔ５４６Ａ、Ｎ６６８Ｓ、Ａ４５６Ｔ、Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、Ｓ６５２Ｆ、Ａ８３２Ｖ、Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ、Ｍ６１６Ｉ、Ａ４４４Ｔ、Ｍ６６０Ｋ、Ｙ６７３Ｎ、Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ、Ｍ７４９Ｌ及び／又はＱ６３５Ｋ。
【００１２】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
６８６、６９３、５１６、６３３、４１５、４２０、６３６、７５２、７６８、５２５、６９４、４９１、５１６、５１５、６６６、４０２、５５５、５８２、７３７、７５９、５２１、５４６、６６８、４５６、５０７、５７１、６５２、８３２、４９８、５２４、５９８、６１６、４４４、４９８、６６０、６７３、４９３、５１１、６４８、７４９及び６３５。
【００１３】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
Ｉ６８６、Ａ６９３、Ｔ５１６、Ｖ６３３、Ｑ４１５、Ｅ４２０、Ｅ６３６、Ｎ７５２、Ｖ７６８、Ｒ５２５、Ｆ６９４、Ｑ４９１、Ｔ５１６、Ｓ５１５、Ｔ６６６、Ｅ４０２、Ｖ５５５、Ｎ５８２、Ａ７３７、Ａ７５９、Ｌ５２１、Ｔ５４６、Ｎ６６８、Ａ４５６、Ｋ５０７、Ｔ５７１、Ｓ６５２、Ａ８３２、Ｄ４９８、Ｌ５２４、Ｒ５９８、Ｍ６１６、Ａ４４４、Ｄ４９８、Ｍ６６０、Ｙ６７３、Ｅ４９３、Ｔ５１１、Ｍ６４８、Ｍ７４９及び／又はＱ６３５。
【００１４】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、
ｉ．配列番号１の６８６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｉ．配列番号１の６９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｖ．配列番号１の６３３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖ．配列番号１の４１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉ．配列番号１の４２０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉｉ．配列番号１の６３６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｖｉｉｉ．配列番号１の７５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｉｘ．配列番号１の７６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘ．配列番号１の５２５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｒ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉ．配列番号１の６９４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｆ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｉ．配列番号１の４９１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｑ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｖ．配列番号１の５１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖ．配列番号１の６６６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉ．配列番号１の４０２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉｉ．配列番号１の５５５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｖｉｉｉ．配列番号１の５８２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｉｘ．配列番号１の７３７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘ．配列番号１の７５９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉ．配列番号１の５２１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｉ．配列番号１の５４６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｉｉ．配列番号１の６６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｎ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｖ．配列番号１の４５６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖ．配列番号１の５０７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉ．配列番号１の５７１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉｉ．配列番号１の６５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の８３２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｉｘ．配列番号１の４９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘ．配列番号１の５２４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉ．配列番号１の５９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｒ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｉ．配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号１の４４４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｖ．配列番号１の６６０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖ．配列番号１の６７３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉ．配列番号１の４９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉｉ．配列番号１の５１１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の６４８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｉｘ．配列番号１の７４９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍ以外の任意のアミノ酸であり、且つ／又は
ｘｌ．配列番号１の６３５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｑ以外の任意のアミノ酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、
ｉ．配列番号１の６８６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖであり、
ｉｉ．配列番号１の６９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖであり、
ｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉであり、
ｉｖ．配列番号１の６３３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉであり、
ｖ．配列番号１の４１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｈであり、
ｖｉ．配列番号１の４２０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄであり、
ｖｉｉ．配列番号１の６３６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇであり、
ｖｉｉｉ．配列番号１の７５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓであり、
ｉｘ．配列番号１の７６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍであり、
ｘ．配列番号１の５２５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇであり、
ｘｉ．配列番号１の６９４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓであり、
ｘｉｉ．配列番号１の４９１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｈであり、
ｘｉｉｉ．配列番号１の５１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓであり、
ｘｉｖ．配列番号１の５１５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｆであり、
ｘｖ．配列番号１の６６６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍであり、
ｘｖｉ．配列番号１の４０２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖであり、
ｘｖｉｉ．配列番号１の５５５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａであり、
ｘｖｉｉｉ．配列番号１の５８２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄであり、
ｘｉｘ．配列番号１の７３７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔであり、
ｘｘ．配列番号１の７５９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔであり、
ｘｘｉ．配列番号１の５２１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｑであり、
ｘｘｉｉ．配列番号１の５４６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａであり、
ｘｘｉｉｉ．配列番号１の６６８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓであり、
ｘｘｉｖ．配列番号１の４５６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔであり、
ｘｘｖ．配列番号１の５０７位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｍであり、
ｘｘｖｉ．配列番号１の５７１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ａであり、
ｘｘｖｉｉ．配列番号１の６５２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｆであり、
ｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の８３２位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖであり、
ｘｘｉｘ．配列番号１の４９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｅであり、
ｘｘｘ．配列番号１の５２４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖであり、
ｘｘｘｉ．配列番号１の５９８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇであり、
ｘｘｘｉｉ．配列番号１の６１６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉであり、
ｘｘｘｉｉｉ．配列番号１の４４４位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔであり、
ｘｘｘｉｖ．配列番号１の６６０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋであり、
ｘｘｘｖ．配列番号１の６７３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
ｘｘｘｖｉ．配列番号１の４９３位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄであり、
ｘｘｘｖｉｉ．配列番号１の５１１位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｓであり、
ｘｘｘｖｉｉｉ．配列番号１の６４８位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉであり、
ｘｘｘｉｘ．配列番号１の７４９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌであり、且つ／又は
ｘｌ．配列番号１の６３５位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
Ｉ６８６Ｖ、Ａ６９３Ｖ、Ｔ５１６Ｉ、Ｖ６３３Ｉ、Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、Ｖ７６８Ｍ、Ｒ５２５Ｇ、Ｆ６９４Ｓ、Ｑ４９１Ｈ、Ｔ５１６Ｓ、Ｓ５１５Ｆ、Ｔ６６６Ｍ、Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、Ｎ５８２Ｄ  Ａ７３７Ｔ、Ａ７５９Ｔ、Ｌ５２１Ｑ、Ｔ５４６Ａ、Ｎ６６８Ｓ、Ａ４５６Ｔ、Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、Ｓ６５２Ｆ、Ｓ５１５Ｆ、Ａ８３２Ｖ、Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ、Ｍ６１６Ｉ、Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ、Ｙ６７３Ｎ、Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ、Ｍ７４９Ｌ及び／又はＱ６３５Ｋ。
【００１７】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
６８６、６９３、５１６、６３３、４１５、４２０、６３６、７５２、７６８、５２５、６９４、４９１、５１６、５１５、６６６、４０２、５５５、５８２、７３７、７５９、５２１、５４６、６６８、４５６、５０７、５７１、６５２、５１５、８３２、４９８、５２４、５９８、６１６、４４４、４９８、６６０、６７３、４９３、５１１、６４８、７４９及び６３５。
【００１８】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に、１つ以上の変異、又は変異の組合せを含む：
Ｉ６８６Ｖ、Ａ６９３Ｖ、Ｔ５１６Ｉ、Ｖ６３３Ｉ、Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、Ｖ７６８Ｍ、Ｒ５２５Ｇ、Ｆ６９４Ｓ、Ｑ４９１Ｈ、Ｔ５１６Ｓ、Ｓ５１５Ｆ、Ｔ６６６Ｍ、Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、Ｎ５８２Ｄ  Ａ７３７Ｔ、Ａ７５９Ｔ、Ｌ５２１Ｑ、Ｔ５４６Ａ、Ｎ６６８Ｓ、Ａ４５６Ｔ、Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、Ｓ６５２Ｆ、Ｓ５１５Ｆ、Ａ８３２Ｖ、Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ、Ｍ６１６Ｉ、Ａ４４４Ｔ、Ｍ６６０Ｋ、Ｙ６７３Ｎ、Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ、Ｍ７４９Ｌ及び／又はＱ６３５Ｋ。
【００１９】
いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号４０の下記の位置に対応する位置に、単一の変異及び又は変異の組合せを含む：
ｉ．Ｉ６８６Ｖ及びＡ６９３Ｖ、
ｉｉ．Ｔ５１６Ｉ及びＶ６３３Ｉ、
ｉｉｉ．Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、及びＶ７６８Ｍ、
ｉｖ．Ｒ５２５Ｇ及びＦ６９４Ｓ、
ｖ．Ｑ４９１Ｈ及びＴ５１６Ｓ、
ｖｉ．Ｓ５１５Ｆ及びＴ６６６Ｍ、
ｖｉｉ．Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ、及びＮ５８２Ｄ、
ｖｉｉｉ．Ａ７３７Ｔ及びＡ７５９Ｔ、
ｉｘ．Ｌ５２１Ｑ及びＴ５４６Ａ、
ｘ．Ｎ６６８Ｓ、
ｘｉ．Ａ４５６Ｔ、
ｘｉｉ．Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ、及びＳ６５２Ｆ、
ｘｉｉｉ．Ｓ５１５Ｆ及びＡ８３２Ｖ、
ｘｉｖ．Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ及びＭ６１６Ｉ、
ｘｖ．Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ及びＹ６７３Ｎ、
ｘｖｉ．Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ及びＭ７４９Ｌ、並びに／又は
ｘｖｉｉ．Ｑ６３５Ｋ。
【００２０】
いくつかの実施形態では、該変異は、配列番号１又は配列番号４０のアミノ酸５１５〜５１６、５２１〜５２５、６３３〜６３６、６６６〜６６８、及び６９３〜６９４に対応する一次アミノ酸配列中の下記の「ホットスポット」又はストレッチに位置付けられている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼはさらに、配列番号４０と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号４０の４６位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼはさらに、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号１の５８０位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、該改善されたＤＮＡポリメラーゼはさらに、配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一）であるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１の７０９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、配列番号１の７０９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、及びＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号１の７０９位に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｋである。
【００２４】
種々のＤＮＡポリメラーゼ  は、本発明に従う変異に適している。特に好適なのは、様々な種の好熱性細菌由来の野生型又は天然に存在する熱安定性ポリメラーゼ、及び、アミノ酸置換、挿入若しくは欠失又はその他の修飾によってそのような野生型又は天然に存在する酵素から誘導された合成熱安定性ポリメラーゼを含む、熱安定性ポリメラーゼである。ポリメラーゼの例示的な非修飾形態は、例えば、ＣＳ５、ＣＳ６若しくはＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、又は、それと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する、機能性ＤＮＡポリメラーゼを含む。その他の非修飾ポリメラーゼは、例えば、下記の種の好熱性細菌のいずれか由来のＤＮＡポリメラーゼ（又はそのようなポリメラーゼと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能性ＤＮＡポリメラーゼ）を含む：テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）；サーマス・アクアチクス；サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；サーマス種ｓｐｓ１７；サーマス種Ｚ０５、テルモトガ・ネオポリターナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）；サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又は  バチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）。好適なポリメラーゼは、逆転写酵素（ＲＴ）活性及び／又はリボヌクレオチド若しくはその他の２’−修飾ヌクレオチド等の非在来型ヌクレオチドを組み込む能力を有するものも含む。
【００２５】
効率的な逆転写活性を保有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ  は、ＲＴ−ＰＣＲ、とりわけ単一酵素ＲＴ−ＰＣＲを実施するために特に向いているが、効率的な逆転写活性を保有する熱活性であるが熱安定性ではないＤＮＡポリメラーゼも、本発明に従う変異に適している。例えば、増大した逆転写酵素効率、不一致耐性、伸長速度、及び／又はＲＴ阻害剤の耐性といった属性は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＴステップに有用であり、このステップは、熱活性であるが熱安定性ではないＤＮＡポリメラーゼを不活性化するであろう温度で実施する必要はない。ＲＴステップの後、ＰＣＲ増幅ステップを実施するために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加してもよいし、又は反応混合物に既に含まれていてもよい。例えば、実施例で記述されるように、本明細書で記述される改善されたＤＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型の伸長及び増幅に好適な緩衝液中でのＲＴステップの前に、第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ  と組み合わせることができる。好適な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｇｅｌｆａｎｄ  らの米国特許第４，８８９，８１８号、並びに米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号において記述されており、これらは参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている。いくつかの実施形態では、該第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（デオキシ−ヌクレオシド三リン酸：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）である。いくつかの実施形態では、該第２の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、後述のように、可逆的に不活性化された熱安定性ポリメラーゼである。一実施形態では、該可逆的に不活性化された熱安定性ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）である。この第２の方法論は、ＲＴステップ中に完全に活性にならないような化学的に修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（又は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを不活性化するためのその他のホットスタート技術）を使用することにより、とりわけ有益となるであろう。効率的な逆転写活性を保有する、熱活性であるが熱安定性ではないＤＮＡポリメラーゼの例は、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）（Ｃｈｙ；配列番号３９）由来のＤＮＡポリメラーゼである。例えば、米国特許第６，４６８，７７５号及び同第６，３９９，３２０号を参照のこと。
【００２６】
いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、以下からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する：
（ａ）サーマス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）（配列番号１）、
（ｂ）サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（配列番号２）、
（ｃ）ａ  サーマス・フィリフォルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）（配列番号３）、
（ｄ）サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）（配列番号４）、
（ｅ）サーマス種ｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）（配列番号５）、
（ｆ）サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）（配列番号６）、及び
（ｇ）サーマス・カルドフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）（配列番号７）
（ｈ）カルボキシドテルムス・ヒドロゲノフォルマンスＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｃｈｙ）（配列番号３９）。
【００２７】
いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、テルモトガＤＮＡポリメラーゼである。例えば、いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、以下からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する：
（ａ）テルモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）（配列番号３４）、
（ｂ）テルモトガ・ネオポリターナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）（配列番号３５）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、配列番号４０又は配列番号４２と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、５８０位に置換をさらに含むＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０位のアミノ酸は、Ｇである。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、７０９位に置換をさらに含むＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、７０９位のアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、７０９  位のアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ及びＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼであり、７０９位のアミノ酸は、Ｋである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ又はＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃ２１又はＣ２１  Ｇ４６Ｅポリメラーゼ（配列番号４０）である。いくつかの実施形態では、該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、配列番号４０又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
変異体又は改善されたポリメラーゼは、その他の非置換修飾を含むことができる。１つのそのような修飾は、酵素を不活性化するが、典型的にはポリヌクレオチド伸長に使用される温度等の高温でのインキュベーション時には酵素を活性化するように逆転される、熱可逆性の共有結合修飾である。そのような熱可逆性の修飾のための例示的な試薬は、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号において記述されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている。
【００３１】
種々の他の態様では、本開示は、本明細書で記述されるような変異体又は改善されたＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、該組換え核酸を含むベクター、及び該ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。そのような発現ベクターを含む宿主細胞は、該組換え核酸の発現に好適な条件下で該宿主細胞を培養することによって、該変異体又は改善されたポリメラーゼを生成するための、本発明の方法において有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び／又はキットに含有されてよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの実施形態は、上記及び本明細書で記述される通りである。
【００３２】
また別の態様では、ポリヌクレオチド伸長を行うための方法が提供される。方法は、概して、増大したストランド置換活性及び実質的に低減した５’−３’エキソヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼ活性を有する本明細書で記述されるＤＮＡポリメラーゼを、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型及びヌクレオシド三リン酸と、該プライマーの伸長に好適な条件下で接触させ、それにより、伸長したプライマーを生成するステップを含む。該ポリヌクレオチド鋳型は、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型であり得る。ヌクレオチド三リン酸は、例えば、リボヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチド等の非在来型ヌクレオチドを含むことができる。さらに、該プライマー及び／又は鋳型は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。いくつかの変形形態では、該ポリヌクレオチド伸長方法は、該変異体又は改善されたＤＮＡポリメラーゼを、プライマー対、該ポリヌクレオチド鋳型及び該ヌクレオシド三リン酸と、該ポリヌクレオチドの増幅に好適な条件下で接触させるステップを含む、ポリヌクレオチド増幅のための方法である。該ポリヌクレオチド伸長反応は、例えば、ＰＣＲ、等温伸長、又はシークエンシング（例えば、４５４シークエンシング反応）であり得る。該ポリヌクレオチド鋳型は、あらゆる種類の生体試料由来であり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、該プライマー伸長方法は、ストランド置換反応、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、又は、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、クロスプライミング増幅（ＣＳＡ）及びポリメラーゼ鎖置換反応（ＰＣＤＲ）から選択される増幅反応を含む。いくつかの実施形態では、該プライマーの伸長に好適な条件は、高温を含む。
【００３４】
任意選択で、該プライマー伸長反応は、参照又は非修飾ポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤を含む。該阻害剤は、参照又は非修飾（対照）ポリメラーゼの核酸伸長速度及び／又はストランド置換活性を阻害することができる。いくつかの実施形態では、該阻害剤は、ヘモグロビン、又はその分解産物である。例えば、いくつかの実施形態では、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマトポルフィリン又はビリルビン等のヘム分解産物である。いくつかの実施形態では、該阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。その他の実施形態では、該阻害剤は、ヘパリン又はメラニンである。ある特定の実施形態では、該阻害剤は、挿入染料である。いくつかの実施形態では、該挿入染料は、［２−［Ｎ−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］+である。いくつかの実施形態では、該挿入染料は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］+である。いくつかの実施形態では、該挿入染料は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリデン］−１−フェニル−キノリニウム］+ではない。いくつかの実施形態では、伸長に好適な条件は、Ｍｇ++を含む。いくつかの実施形態では、伸長に好適な条件は、Ｍｎ++を含む。
【００３５】
本開示は、そのようなポリヌクレオチド伸長方法において有用なキットも提供する。概して、該キットは、本明細書で記述されるような変異体又は改善されたＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む。ある特定の実施形態では、該キットは、１種以上の更なる試薬を提供する１つ以上の更なる容器をさらに含む。例えば、特異的な変形形態では、該１つ以上の更なる容器は、ヌクレオシド三リン酸；ポリヌクレオチド伸長に好適な緩衝液；及び／又はポリヌクレオチド伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な１つ以上のプライマー若しくはプローブポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチド鋳型は、あらゆる種類の生体試料由来であり得る。
【００３６】
さらに提供されるのは、本明細書で記述されるポリメラーゼを含む反応混合物である。該反応混合物は、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、標識ヌクレオシド三リン酸、非在来型ヌクレオシド三リン酸を含む）、緩衝液、塩、標識（例えば、フルオロフォア）も含有することができる。いくつかの実施形態では、該反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含む。ある特定の実施形態では、該反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン及びビリルビン等のヘム分解産物を含む。その他の実施形態では、該反応混合物は、ヘパリン又はその塩を含む。任意選択で、該反応混合物は、挿入染料（上記又は本明細書の他の箇所で記述されているものを含むがこれらに限定されない）を含む。ある特定の実施形態では、該反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含有する。その他の実施形態では、該鋳型核酸は、ＲＮＡであり、該反応混合物は、ヘパリン又はその塩を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、該反応混合物は、２つ以上のポリメラーゼを含む。例えば、いくつかの実施形態では、該反応混合物は、本明細書で記述されるような増大したストランド置換活性を有する改善されたＤＮＡポリメラーゼ、及び増大した逆転写効率（例えば、ＲＮＡ鋳型を伸長させる活性の増大）を有する別のポリメラーゼを含む。一実施形態では、該反応混合物は、本明細書で記述されるような増大したストランド置換活性を有する改善されたＤＮＡポリメラーゼと、第２の熱安定性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼとのブレンドを含む。該第２の熱安定性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、酵素が、逆転写ステップに好適な温度では非活性であるが、例えば、約９０oＣ  から１００oＣの高温で最大約１２分間の期間にわたる好適な条件下では活性化されるような、上記されている通りの可逆的に修飾されたポリメラーゼであり得る。例えば、ホットスタートＰＣＲ反応における、不可逆的に不活性化された熱安定性ポリメラーゼの活性化のための好適な条件が提供される。好適な第２の熱安定性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼの例は、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号において記述されている。
【００３８】
更なる実施形態が本明細書に記述される。
【００３９】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様である本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料のみを記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。
【００４０】
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００４１】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に組み込まれ得る任意のモノマー単位を指す。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、下記の２０種の天然又は遺伝的にコードされたアルファ−アミノ酸：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を含む。「Ｘ」残基が未定義である場合には、これらは「任意のアミノ酸」として定義されるべきである。これらの２０種の天然アミノ酸の構造は、Ｓｔｒｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５th版、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２００２年）において示され、これは、参照により組み込まれている。セレノシステイン及びピロリシン等の更なるアミノ酸は遺伝的にコードされていてもよい（Ｓｔａｄｔｍａｎ（１９９６年）「Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６５巻：第８３〜１００頁及びＩｂｂａら（２００２年）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ」、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．第１２巻（第１３号）：第Ｒ４６４〜Ｒ４６６頁、これらはいずれも参照により組み込まれている）。「アミノ酸］という用語は、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、修飾された側鎖及び／又は骨格を有する）、及びアミノ酸類似体も含む。例えば、Ｚｈａｎｇら（２００４年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第１０１巻（第２４号）：第８８８２〜８８８７頁、Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００４年）「Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｃｏｄｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第１０１巻（第２０号）：第７５６６〜７５７１頁、Ｉｋｅｄａら（２００３年）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．第１６巻（第９号）：第６９９〜７０６頁、Ｃｈｉｎら（２００３年）「Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ第３０１巻（第５６３５号）：第９６４〜９６７頁、Ｊａｍｅｓら（２００１年）「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎ���ｎｇ  ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ  ｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．第１４巻（第１２号）：第９８３〜９９１頁、Ｋｏｈｒｅｒら（２００１年）「Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９８巻（第２５号）：第１４３１０〜１４３１５頁、Ｂａｃｈｅｒら（２００１年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｎ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｔｏｘｉｃ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１８３巻（第１８号）：第５４１４〜５４２５頁、Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら（２０００年）「Ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻（第５１号）：第４０３２４〜４０３２８頁、及びＢｕｄｉｓａら（２００１年）「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｛ｂｅｔａ｝−（ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）ａｌａｎｉｎｅｓ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．第１０巻（第７号）：第１２８１〜１２９２頁を参照されたく、これらはそれぞれ参照により組み込まれている。
【００４２】
さらに例証すると、アミノ酸は、典型的には、置換若しくは非置換アミノ基、置換若しくは非置換カルボキシ基、及び１つ以上の側鎖若しくは基、又はこれらの基の類似体を含む、有機酸である。例示的な側鎖は、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、又はこれらの基の任意の組合せを含む。その他の代表的なアミノ酸は、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、その他の分子と共有結合的に又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能な及び／又は光切断可能なアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸を含むがこれらに限定されない。
【００４３】
「生体試料」という用語は、生物から得られる様々な種類の試料を包含し、診断アッセイ又は監視アッセイで使用され得る。この用語は、尿、尿沈渣、血液、唾液及び生物学的起源のその他の液体試料、固形組織試料、例えば、生検標本又はそれ由来の組織培養物若しくは細胞、並びにそれらの子孫を包含する。この用語は、試薬による処置、可溶化、沈降、又はある特定の成分の富化によって等、それらの調達後に何らかの手法で操作された試料を包含する。この用語は、臨床試料を包含し、細胞培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織試料も含む。
【００４４】
「変異体」という用語は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの文脈では、対応する機能性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチド、典型的には組換えを意味する。
【００４５】
「非修飾形態」という用語は、変異体ポリメラーゼの文脈では、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼを定義することを目的として本明細書で使用される用語であり、「非修飾形態」という用語は、該変異体ポリメラーゼを特徴付けるとして特定されている１つ以上のアミノ酸位置におけるものを除き、該変異体ポリメラーゼのアミノ酸配列有する機能性ＤＮＡポリメラーゼを指す。故に、（ａ）その非修飾形態及び（ｂ）１つ以上の指定されたアミノ酸置換の観点から、変異体ＤＮＡポリメラーゼへの言及は、指定されたアミノ酸置換を例外として、それ以外の変異体ポリメラーゼが、特定されたモチーフにおける非修飾形態と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「非修飾ポリメラーゼ」（並びにしたがって、増大した逆転写酵素効率、不一致耐性、伸長速度並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤の耐性を有する修飾形態も）は、更なる変異を含有して、所望の機能性、例えば、ジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、染料標識ヌクレオチド、変調５’−ヌクレアーゼ活性、変調３’−ヌクレアーゼ（又は校正）活性等の組み込みの改善を提供し得る。したがって、本発明を本明細書で記述されるように行う際には、ＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態が予め決定されている。ＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態は、例えば、野生型及び／若しくは天然に存在するＤＮＡポリメラーゼ、又は既に意図的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼの非修飾形態は、好ましくは、種々の好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、野生型と同一の実質的な配列を有するその機能的バリアント、又は天然に存在する熱安定性ポリメラーゼである。そのようなバリアントは、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号及び同第７，１４８，０４９号において記述されているキメラＤＮＡポリメラーゼ等、例えばキメラＤＮＡポリメラーゼを含み得、これらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。ある特定の実施形態では、ポリメラーゼの非修飾形態は、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。
【００４６】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱に対して安定であり、耐熱性であり、かつ、二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間にわたり高温に曝された場合に、続いてポリヌクレオチド伸長反応を行うのに充分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）されない、酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号及び同第４，９６５，１８８号に例示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）等の温度サイクル反応で使用するのに好適である。本明細書での目的のための不可逆的な変性は、酵素活性の永久的かつ完全な喪失を指す。熱安定性ポリメラーゼでは、酵素活性は、鋳型核酸ストランドに相補的であるポリヌクレオチド伸長産物を形成するために適切な方式での、ヌクレオチドの組合せの触媒作用を指す。好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、テルモトガ・マリティマ、サーマス・アクアチクス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、サーマス・フィリフォルミス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス、バチルス・カルドテナクス、テルモトガ・ネオポリターナ、及びサーモシフォ・アフリカヌス由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００４７】
「熱活性」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲ反応における逆転写又はアニール／伸長ステップに一般に使用される温度（すなわち、４５〜８０℃）で触媒特性を維持する酵素を指す。熱安定性酵素は、核酸変性に必要な高温に曝された場合に、不可逆的に不活性化されず変性もしないものである。熱活性酵素は、熱安定性であってもなくてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌、モロニーマウス白血病ウイルス、及びトリ骨髄芽球症ウイルスを含むがこれらに限定されない、好熱性種由来又は中温性種由来のＤＮＡ又はＲＮＡ依存性であり得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「キメラ」タンパク質は、そのアミノ酸配列が、少なくとも２種の異なったタンパク質由来のアミノ酸配列のサブ配列の融合産物を表す、タンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列の直接操作によって生成されるのではなく、むしろ、キメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。ある特定の実施形態では、例えば、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態は、サーマス種ＤＮＡポリメラーゼに由来するアミノ末端（Ｎ末端）領域及びＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼに由来するカルボキシ末端（Ｃ末端）領域からなるキメラタンパク質である。Ｎ末端領域は、Ｎ末端（アミノ酸１位）から内部アミノ酸まで伸長する領域を指す。同様に、Ｃ末端領域は、内部アミノ酸からＣ末端まで伸長する領域を指す。
【００４９】
用語「アプタマ」とは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている、米国特許第５，６９３，５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマ及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用は、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｓ．ら（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ：Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．及びＤｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２１１〜２１９頁（２００３年））でも論じられている。
【００５０】
変異体ＤＮＡポリメラーゼの文脈では、別の配列の「対応」（例えば、領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置等）は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号に従う番号付けの慣例に基づき、次いで、配列同一性のパーセンテージを最大化する方式で配列を整列させる。「［具体的な配列］の［Ｘ］位に対応する」アミノ酸は、指定された配列の同等のアミノ酸と整列している、目的のポリペプチドのアミノ酸を指す。概して、本明細書で記述されるように、ポリメラーゼのある位置に対応するアミノ酸は、本明細書で記述されるようなＢＬＡＳＴ等の整列アルゴリズムを使用して決定することができる。所与の「対応する領域」内の全ての位置が同一である必要はないため、対応する領域内の一致しない位置は、「対応する位置」とみなされ得る。したがって、本明細書で使用される場合、指定されたＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸［Ｘ］位に対応するアミノ酸位置」は、その他のＤＮＡポリメラーゼ並びに構造的相同体及びファミリーにおける整列に基づき、同等の位置を指す。本発明のいくつかの実施形態では、アミノ酸位置の「対応」は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３９の１つ以上のモチーフを含むポリメラーゼの領域ごとに決定される。ポリメラーゼポリペプチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３９と異なる場合（例えば、アミノ酸における変化又はアミノ酸の添加若しくは欠失によって）、本明細書で論じられるような改善された活性に関連する特定の変異は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は３９におけるものと同じ位置番号にはないことがある。これを、例えば表１に例証する。
【００５１】
「組換え」とは、本明細書で使用される場合、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。本明細書中の用語「組換え核酸」とは、本来、一般にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、自然界では通常見られない形態で形成された核酸を意味する。したがって、直鎖状（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍ）である単離された変異体ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常は連結されていないＤＮＡ分子を連結することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、どちらも本発明の目的のための組換え体であると考えられる。一度組換え核酸が作製されて宿主細胞に再導入されると、これは非組換え的に、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作よりも宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて複製するであろうことが理解される。しかしながら、そのような核酸は、一度組換え的に生成され続いて非組換え的に複製されたが、本発明の目的のためには依然として組換え体であると考えられる。「組換えタンパク質」は、組換え技術、すなわち、上で示すような組換え核酸の発現を用いて作製されるタンパク質である。
【００５２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるときに「作動可能に連結」される。例えば、プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合はコード配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合はコード配列に作動可能に連結する。
【００５３】
用語「宿主細胞」とは、細胞培養で増殖する場合、単一細胞の原核生物及び真核生物（例えば、細菌、酵母、放線菌）の両方、並びに高次の植物又は動物由来の単一細胞を指す。
【００５４】
用語「ベクター」とは、外来ＤＮＡの断片をその中に挿入され得る、典型的には二本鎖のＤＮＡの断片を指す。ベクターは、又は例えば、プラスミド起源であってもよい。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有する。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡと定義され、これは、宿主細胞中に天然には存在しないＤＮＡであって、例えば、ベクター分子を複製し、選択マーカ若しくはスクリーニング可能マーカをコードし、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを好適な宿主細胞に輸送するために使用される。宿主細胞内に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立して、又は宿主染色体ＤＮＡと同時に複製することができ、ベクター及びその挿入されたＤＮＡのコピーをいくつか生成することができる。加えて、ベクターはまた、挿入されたＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又はそうでなければ挿入されたＤＮＡからＲＮＡコピーへの多数の複製を引き起こす、必要な要素を含有することもできる。いくつかの発現ベクターは、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含有し、これは、発現したｍＲＮＡの半減期を増加させ、及び／又はｍＲＮＡからタンパク質分子への翻訳を可能にする。このようにして、挿入されたＤＮＡによりコードされたｍＲＮＡ及びポリペプチドの多くの分子を、迅速に合成することができる。
【００５５】
「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドモノマーを指すのに加えて、文脈が明確に別のことを示すのでない限り、本明細書では、該ヌクレオチドが使用されている特定の文脈（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）ごとに機能的に同等である誘導体及び類似体を含むその関連する構造的バリアントを指すと理解されるものとする。
【００５６】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー、又はそれらの類似体に対応させることができるポリマーを指す。これは、ＲＮＡ及びＤＮＡ、並びにそれらの合成形態、修飾された（例えば、化学的に又は生化学的に修飾された）形態、並びに混合ポリマー（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡサブユニットの両方を含む）等のヌクレオチドのポリマーを含む。例示的な修飾は、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上の類似体による置換、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸等）等のヌクレオチド間修飾を含む。水素結合及びその他の化学的相互作用を介して指定された配列と結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する、合成分子も含まれる。典型的には、ヌクレオチドモノマーは、ホスホジエステル結合を介して結合されるが、核酸の合成形態は、その他の結合（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５４巻：第１４９７〜１５００頁、１９９１年）において記述されているようなペプチド核酸を含むことができる。核酸は、例えば、染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーであることができる又はそれらを含むことができる。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖又は三本鎖であることができ、いかなる特定の長さにも限定されない。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明白に指示されている任意の配列に加えて、相補的配列を任意選択で含む又はコードする。
【００５７】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約１７５の核酸モノマー単位、より典型的には約８〜１００の核酸モノマー単位、さらにいっそう典型的には約１０〜約５０の核酸モノマー単位（例えば、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、該オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用を含む多くの要因によって決まることになる。オリゴヌクレオチドは、既存の若しくは天然配列の単離、ＤＮＡ複製若しくは増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、或いは、Ｎａｒａｎｇ  ら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻：第９０〜９９頁、１９７９年）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻：第１０９〜１５１頁、１９７９年）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第２２巻：第１８５９〜１８６２頁、１９８１年）のジエチルホスホルアミダイト法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１０３巻：第３１８５〜３１９１頁、１９８１年）のトリエステル法；自動化合成法；若しくは米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法、又は当業者に公知であるその他の方法等の方法による、直接化学合成を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって、任意選択で調製される。これらの参考文献は全て、参照により組み込まれている。
【００５８】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド伸長が開始される条件下（例えば、適切な緩衝液中、必須のヌクレオシド三リン酸（コピーされている鋳型によって指示されるような）及びポリメラーゼの存在、並びに好適な温度又は温度のサイクル（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のように）を含む条件下）に置くと、鋳型指向性核酸合成の開始点として作用することができる、ポリヌクレオチドを指す。さらに例証すると、プライマーは、ｄｅ  ｎｏｖｏＲＮＡ合成及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写関連プロセス（例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）等）の開始剤として含み、様々なその他のオリゴヌクレオチド媒介合成プロセスにおいて使用することもできる。プライマーは、典型的には、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレチオド）である。プライマーの適切な長さは、該プライマーの意図される使用によって決まるが、典型的には６〜４０ヌクレチオド、より典型的には１５〜３５ヌクレチオドの範囲である。短いプライマー分子は、概して、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より冷たい温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマー延長を起こすために、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的でなくてはならない。ある特定の実施形態では、「プライマー対」という用語は、増幅される核酸配列の５’末端の補体とハイブリダイズする５’センスプライマー（時に「フォワード」と呼ばれる）、及び増幅される配列の３’末端とハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（時に  「リバース」と呼ばれる）（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現される又はＲＮＡである場合）を含む、プライマーのセットを意味する。プライマーは、所望ならば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能な標識を組み込むことによって標識することができる。例えば、有用な標識は、32Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡアッセイで一般に使用されるような）、ビオチン、又は、抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能であるハプテン及びタンパク質を含む。
【００５９】
「従来型」又は「天然」という用語は、核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドに言及する場合、記述されているポリヌクレオチドにおいて天然に存在するもの（すなわち、ＤＮＡについては、これらはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰである）を指す。加えて、ｄＩＴＰ、及び７−デアザ−ｄＧＴＰは、ｄＧＴＰの代わりに高頻度で利用され、７−デアザ−ｄＡＴＰは、シークエンシング等のｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ合成反応においてｄＡＴＰの代わりに利用され得る。集合的に、これらはｄＮＴＰと称され得る。
【００６０】
「非在来型」又は「修飾された」という用語は、核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに言及する場合、従来型塩基、ヌクレオシド、又は特定のポリヌクレオチドにおいて天然に存在するヌクレオチドの、修飾、誘導又は類似体を含む。ある特定の非在来型ヌクレオチドは、従来型ｄＮＴＰと比較して、リボース糖の２’位で修飾されている。故に、ＲＮＡについて、天然に存在するヌクレオチドは、リボヌクレオチド（すなわち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、集合的にｒＮＴＰ）であるが、これらのヌクレオチドは、糖の  ２’位にヒドロキシル基を有し、これは比較するとｄＮＴＰ中に存在しないため、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼのための基質としての非在来型ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、非在来型ヌクレオチドは、核酸シークエンシングのためのターミネータとして使用される化合物を含むがこれらに限定されない。例示的なターミネータ化合物は、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と称される化合物を含むがこれらに限定されない。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、ｄｄＮＴＰと総称される。ターミネータ化合物の更なる例は、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体を含む（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び同第２００５／００３７３９８号を参照されたく、これらはいずれも参照により組み込まれている）。その他の非在来型ヌクレオチドは、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［α−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α−ボラノ］−ｄＮＴＰ、［α］−メチル−ホスホネートｄＮＴＰ、及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）を含む。非在来型塩基は、32Ｐ、33Ｐ又は35Ｓ等の放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ビオチン等のハプテン標識；又はストレプトアビジン若しくはアビジン等の酵素標識で標識されていてよい。蛍光標識は、フルオレセインファミリーの染料等の負に荷電された染料、又はローダミンファミリーの染料等の電荷中性である染料、又はシアニンファミリーの染料等の正に荷電された染料を含み得る。フルオレセインファミリーの染料は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥを含む。ローダミンファミリーの染料は、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド及びＴＡＭＲＡで標識された種々の染料又はヌクレオチドは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって販売されている。シアニンファミリーの染料は、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７を含み、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌａｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって販売されている。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウ上で比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内の配列の一部は、２つの配列の最適な整列のために、参照配列（添加も欠失も含まない）と比較して添加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して一致した位置の数を産出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを産出することによって、算出される。
【００６２】
「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈では、同じである２つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列は、比較ウィンドウ上で、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は手動整列及び視覚的検査により測定される場合には指定された領域上で、最大対応に合わせて比較及び整列される場合、特定されたパーセンテージの、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基（例えば、特定された領域上で少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性））を有するならば、互いに「実質的に同一」である。配列は、それらが少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％同一であるならば、互いに「実質的に同一」である。これらの定義は、試験配列の補体も指す。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドである領域上、又はより典型的には、長さが１００〜５００又は１０００ヌクレオチド以上である領域上に存在する。
【００６３】
「類似性」又は「類似性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列の文脈では、比較ウィンドウ上で、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は手動整列及び視覚的検査により測定される場合には指定された領域上で、最大対応に合わせて比較及び整列される場合、特定されたパーセンテージの、保存的アミノ酸置換によって定義されるものと同じ又は類似のいずれかであるアミノ酸残基（例えば、特定された領域上で６０％の類似性、任意選択で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％類似）を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列は、それらが互いに少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％類似であるならば、互いに「実質的に類似」である。任意選択で、この類似性は、長さが少なくとも約５０アミノ酸である領域上、又はより典型的には、長さが少なくとも約１００〜５００又は１０００アミノ酸以上である領域上に存在する。
【００６４】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが一般に使用され、又は代替的なパラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性パーセントを算出する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、さらに通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの言及を含み、この中で、配列が、２つの配列を最適に整列させた後で同じ数の隣接位置の参照配列と比較する。比較のための配列整列方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．第２巻：第４８２頁、１９７０年）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：第４４３頁、１９７０年）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似法についての研究（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８５巻：第２４４４頁、１９８８年）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、又は手動整列及び視覚的検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５年付録）を参照のこと）によって行われ得る。
【００６６】
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻：第３３８９〜４０２頁、１９７７年）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：第４０３〜１０頁、１９９０年）において記述されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して一般に利用可能である（インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと）。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するか又はそれを満たす、問い合わせ配列における長さの短いワードＷを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近傍のワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ら、上記）。これらの最初の近傍のワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシード値として機能する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア；常に０超）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア；常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積整列スコアがその最大の実績値から量Ｘだけ減少する場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因してゼロ以下になる場合、又はいずれかの配列の終端に達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、並びに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８９巻：第１０９１５頁、１９８９年を参照のこと）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトで使用する。
【００６７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９０巻：第５８７３〜８７頁、１９９３年を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合に、参照配列に類似していると見なされる。
【００６８】
「逆転写効率」という用語は、所与の逆転写反応においてｃＤＮＡとして逆転写されるＲＮＡ分子の割合を指す。ある特定の実施形態では、本発明の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、これらのＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態に比べて改善された逆転写効率を有する。すなわち、これらの変異体ＤＮＡポリメラーゼは、特定の反応条件のセット下で、それらの非修飾形態よりも高い割合のＲＮＡ鋳型を逆転写する。理論に制限されることなく、より高い割合のＲＮＡ鋳型を逆転写する、本明細書で記述される変異体ＤＮＡポリメラーゼの能力は、増大した逆転写活性、例えば、増大したヌクレオチド組み込み速度及び／又は増大した酵素の処理能力に起因し得る。逆転写効率は、例えば、ＲＮＡ鋳型を使用してＰＣＲ反応の交点（Ｃｐ）を測定し、該Ｃｐ値を、（ＵがＴで置き換えられていることを除き）同じ配列のＤＮＡ鋳型が増幅されている対照反応のＣｐ値と比較することによって測定することができ、ここで、ＲＮＡ及びＤＮＡ増幅は、一般的なプライマーセット及び例えば例において記述されたものと同じポリメラーゼを使用する。試験ポリメラーゼは、該試験ポリメラーゼが、ＲＮＡが鋳型として使用される際に対照ポリメラーゼと比較して減少したＣｐ値を有するが、ＤＮＡが鋳型として使用される際に対照ポリメラーゼに比べて実質的に変化していないＣｐ値を有する場合に、改善されたＲＴ効率を有する。いくつかの実施形態では、本発明のポリメラーゼは、Ｃｐが、ＲＮＡ鋳型上の対応する対照ポリメラーゼよりも少ない、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の単位であるような、改善されたＲＴ効率を有する。
【００６９】
「不一致耐性」という用語は、１つ以上のヌクレオチドを核酸に（例えば、共有結合的に）結合することによって鋳型依存性方式で核酸（例えば、プライマー又はその他のオリゴヌクレオチド）を伸長させる場合に不一致含有配列に耐える、ポリメラーゼの能力を指す。「３’不一致耐性」という用語は、伸長される核酸（例えば、プライマー又はその他のオリゴヌクレオチド）が、プライマーの３’末端ヌクレオチドにおいてその鋳型との不一致を有する場合に不一致含有（ほぼ相補的な）配列に耐える、ポリメラーゼの能力を指す。鋳型との不一致は、プライマーの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドに、又はプライマーの配列内の別の位置に位置付けられていてもよい。
【００７０】
「不一致識別」という用語は、１つ以上のヌクレオチドを核酸に（例えば、共有結合的に）結合することによって鋳型依存性方式で核酸（例えば、プライマー又はその他のオリゴヌクレオチド）を伸長させる場合に不一致含有配列から完全に相補的な配列を区別する、ポリメラーゼの能力を指す。「３’−不一致識別」という用語は、伸長される核酸（例えば、プライマー又はその他のオリゴヌクレオチド）が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して核酸の３’末端において不一致を有する場合に不一致含有（ほぼ相補的な）配列から完全に相補的な配列を区別する、ポリメラーゼの能力を指す。「不一致」という用語は、別途相補的な二重形成（又は潜在的に二重形成）配列のストレッチ内における、１つ以上の塩基不対合（又は「非相補的な塩基対立」）の存在を指す。
【００７１】
用語「Ｃｐ値」又は「交点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）」値は、入力された標的核酸の定量を可能にする値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って決定することができる（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３８巻、第２号、２００５年２月、第２８７〜２９３頁）。二次導関数法では、Ｃｐは、二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは対数線形フェーズ（ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ  ｐｈａｓｅ）の始まりに相当する。二次導関数法は、リアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を算出し、１つの値だけが得られる。元のＣｐ法は、例えば多項式関数による、強度値の局所的に定義された微分可能な近似に基づく。次いで、三次導関数が計算される。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐは、対数線形領域中の補助線に対する平行線の交点により決定されるフィットポイント法（ｆｉｔ  ｐｏｉｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて決定することもできる（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅら、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第３８巻、第２号、２００５年２月、第２８７〜２９３頁）。Ｃｐ値は、Ｒｏｃｈｅにより提供されたＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ機器により、二次導関数最大値法に従って計算することによって提供される。
【００７２】
用語「ＰＣＲ効率」とは、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、式：％ＰＣＲ効率＝１０(-傾き)−１）×１００を用いて各条件について算出し、式中、傾きはｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐとを用いる線形回帰により算出した。ＰＣＲ効率は、完全に一致した又は不一致のプライマー鋳型を用いて測定することができる。
【００７３】
「核酸伸長速度」という用語は、生体触媒（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ等の酵素）が、１つ以上のヌクレオチドを核酸に（例えば、共有結合的に）結合することによって鋳型依存性又は鋳型非依存性方式で核酸（例えば、プライマー又はその他のオリゴヌクレオチド）を伸長させる速度を指す。例証すると、本明細書で記述されるある特定の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、これらのＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態に比べて改善された核酸伸長速度を有し、それによって、所与の反応条件のセット下、これらの非修飾形態よりも高い速度でプライマーを伸長させることができる。
【００７４】
「ＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤の耐性」という用語は、対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性又は逆転写活性を阻害するであろう量の阻害剤の存在下で、活性（ポリメラーゼ又は逆転写活性）を維持するポリメラーゼの能力を指す。いくつかの実施形態では、改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼ活性を本質的に排除するであろう量の阻害剤の存在下で、ポリメラーゼ又は逆転写活性がある。
【００７５】
「５’−ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも１つの発光標識部分を含み、５’−ヌクレアーゼ反応において使用されて標的核酸検出を達成する、オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブは、単一の発光部分（例えば、蛍光染料等）のみを含む。ある特定の実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、プローブが、選択された条件下でヘアピン構造を形成することができるような、自己相補性の領域を含む。さらに例証すると、いくつかの実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、少なくとも２つの標識部分を含み、２つの標識のうちの１つがオリゴヌクレオチドから切断又は別様に分離された後に、増大した強度の放射線を放つ。ある特定の実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、２つの異なる蛍光染料、例えば、５’末端レポーター染料及び３’末端クエンチャ染料又は部分で標識される。いくつかの実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、末端位置以外に又はそれらに加えて、１つ以上の位置で標識されている。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、レポーター染料からの蛍光発光が少なくとも部分的にクエンチされるような２つのフルオロフォアの間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長ステップの間に、例えば、鋳型核酸と結合している５’−ヌクレアーゼプローブは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの５’〜３’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによって、レポーター染料の蛍光発光は、もはやクエンチされない。例示的な５’−ヌクレアーゼプローブは、米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，９９４，０５６号及び米国特許第６，１７１，７８５号においても記述されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている。その他の実施形態では、５’ヌクレアーゼプローブは、２種以上の異なるレポーター染料及び３’末端クエンチャ染料又は部分で標識されていてよい。
【００７６】
用語「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動」とは、少なくとも２つのクロモフォア、ドナークロモフォアとアクセプタクロモフォア（クエンチャと呼ばれる）との間のエネルギー移動を指す。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプタにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプタは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。アクセプタは、「ダーク」クエンチャである場合、移動されたエネルギーを光以外の形態で散逸させる。特定のフルオロフォアがドナー又はアクセプタとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対のその他の要素の性質に依存する。一般的に使用されるドナー−アクセプタ対は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、及びＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．、ミシガン州デクスタ）を包含する。
【００７７】
「ストランド置換活性」という用語は、合成中に遭遇した下流のＤＮＡを置き換える、ポリメラーゼの能力を指す。英国王立化学会は、「ストランド置換」という用語を、次のように定義している。「インタクトな二重鎖ＤＮＡ中のその補体とヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成した壊れた３’一本鎖ＤＮＡ分子の拒絶。元の二重鎖におけるワトソン・クリック対合が修復される。拒絶された３’一本鎖ＤＮＡ分子がその元の補体とリアニールして、２つのインタクトな二重鎖分子を再形成する。」いくつかの実施形態では、この用語は、ストランド変位増幅（ＳＤＡ）と呼ばれる等温増幅法を含む。
【００７８】
「高温」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子の融解温度を上回る温度を指す。融解温度（Ｔｍ）は、ＤＮＡストランドの半分がランダムコイル又は一本鎖（ｓｓＤＮＡ）状態である温度として定義される。当技術分野で周知のように、Ｔｍは、ＤＮＡ分子の長さ及びその特異的なヌクレオチド配列によって決まる。高温の典型的な例は、６０°Ｃ以上、例えば、約６０°Ｃ〜約９５°Ｃ等、ＰＣＲ変性、アニーリング及び伸長反応において遭遇する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、下記のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の間で配列同一性を提供する：サーマス  種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）；サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリフォルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；サーマス・カルドフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）；デイノコッカス・ラディオデュランスＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｒａ）；テルモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）；テルモトガ・ネオポリターナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）；サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｆ）；バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）；及び  バチルス・カルドテナクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）。（Ａ）ポリメラーゼＩ酵素全体（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）上での配列同一性；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０−８３４に対応するポリメラーゼサブドメイン上での配列同一性。
【図２】図２は、種々のサーマス種ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の間で配列同一性を提供する：サーマス  種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）；サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリフォルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；及びサーマス・カルドフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）。（Ａ）ポリメラーゼＩ酵素全体（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）上での配列同一性；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメイン上での配列同一性。
【図３】図３は、実施例で記述されているアッセイ設計を示す。４つの相補的オリゴヌクレオチドオリゴＡ（緑色）、オリゴＢ（薄青色）、オリゴＣ（暗青色）及びロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴＤ（赤色）を互いにアニールした。オリゴＡはオリゴＢに対して相補的であり、重合反応を開始する。オリゴＢは、鋳型であり、５’末端にＦＡＭ−蛍光レポーターを有する。オリゴＣは、オリゴＢに対して相補的であり、３’末端にＢＨＱクエンチャを有する。ロックド核酸オリゴＤは、鋳型オリゴＢに対して相補的であり、高エネルギーハードルとして役立つ。ポリメラーゼ、Ｍｇ2+及びヌクレオチドが、アニールされた混合物に添加されると、重合反応は、オリゴＡを伸長させ、新たに合成されたストランドがＬＮＡオリゴＤ及びオリゴＣを置き換え、故に、蛍光プローブからクエンチャを放出する。サイクルの完了時に蛍光シグナルが産生される。
【図４Ａ】図４Ａは、対照Ｇ４６Ｅ  Ｃ２１クローンと比較して増大したストランド置換活性を有する変異体ポリメラーゼを発現した細菌コロニー（クローン）を加えたウェルの結果を示す。プレート６は、Ｇ４６Ｅ  Ｃ２１クローンについての結果を示す（プレート６の全てのウェルは、元のＧ４６Ｅ  Ｃ２１クローンを含有していた）。プレート１は、下記のクローンについての増大したストランド置換活性を示し、これらをその後シークエンシングした：Ｆ２４（Ｉ６８６Ｖ及びＡ６９３Ｖ変異を含む）、Ｌ３（Ｔ５１６Ｉ及びＶ６３３Ｉ変異を含む）、及びＰ１９（Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ及びＶ７６８Ｍ変異を含む）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、プレート２〜５についての結果を示す。プレート６（上記）は、これら全ての実験について対照として役立った。プレート２は、下記のクローンについての増大したストランド置換活性を、クローンについてのその後のシークエンシング結果とともに示す：Ｍ２２（Ｒ５２５Ｇ及びＦ６９４Ｓ変異を含む）、Ｇ９（Ｑ４９１Ｈ及びＴ５１６Ｓ変異を含む）、Ｎ１９（Ｓ５１５Ｆ及びＴ６６６Ｍ変異を含む）、及びＮ７（Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ及びＮ５８２Ｄ変異を含む）。プレート３は、下記のクローンについての増大したストランド置換活性を、クローンについてのその後のシークエンシング結果とともに示す：Ａ２４（Ａ７３７Ｔ及びＡ７５９Ｔ変異を含む）、Ｆ２１（Ｌ５２１Ｑ及びＴ５４６Ａ変異を含む）、Ｇ１０（Ｎ６６８Ｓ変異を含む）、及びＩ１４（Ａ４５６Ｔ変異を含む）。プレート４は、下記のクローンについての増大したストランド置換活性を、クローンについてのその後のシークエンシング結果とともに示す：Ｇ２３（Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ及びＳ６５２Ｆ変異を含む）、及びＫ１２（Ｓ５１５Ｆ及びＡ８３２Ｖ  変異を含む）。プレート５は、下記のクローンについての増大したストランド置換活性を、クローンＣ６（Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ及びＭ６１６Ｉ変異を含む）、Ｇ２０（Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ及びＹ６７３Ｎ変異を含む）、Ｇ２３（Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ及びＭ７４９Ｌ変異を含む）、及びＨ２１（Ｑ６３５Ｋ変異を含む）についてのその後のシークエンシング結果とともに示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本明細書で記述される変異体ポリメラーゼが、実質的に低減したエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有することを示すデータを提供する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本明細書で記述される変異体ポリメラーゼが、実質的に低減したエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有することを示すデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
本開示は、ポリメラーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸が、機能性ＤＮＡポリメラーゼに比べて変異型となった、改善されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。本明細書で記述されるＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼの非修飾形態に比べて増大したストランド置換活性、並びに／又は増大した不一致耐性、伸長速度、並びにＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤の耐性を有する、活性酵素である。ある特定の実施形態では、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、親酵素としての優れた又は同等の性能のために、より低濃度で使用され得る。いくつかの実施形態では、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、非修飾又は対照ポリメラーゼに比べて実質的に同じＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を保持しながら、増大したストランド置換活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、実質的に低減したエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、減少した５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００８１】
増大したストランド置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、例えば、より高温でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び等温増幅（ストランド変位増幅（ＳＤＡ）等）において、並びに、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、クロスプライミング増幅（ＣＳＡ）及びポリメラーゼ鎖置換反応（ＰＣＤＲ）等のＤＮＡ増幅のための技法において有用である。したがって、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、組換えＤＮＡ研究及び疾患の医療診断における用途を含む、ポリヌクレオチド伸長を伴う様々な用途において有用である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２９及び／又は配列番号３８のモチーフをさらに含む。
【００８３】
このモチーフは、多くのファミリーＡ型ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、特に好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの「指」ドメイン（Ｌアルファヘリックス）内に存在する（Ｌｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１７巻：第７５１４〜７５２５頁、１９９８年）。例えば、図１は、数種の細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの「指」ドメインからの領域のアミノ酸配列整列を示す：バチルス・カルドテナクス、バチルス・ステアロサーモフィルス、デイノコッカス・ラディオデュランス、サーモシフォ・アフリカヌス、テルモトガ・マリティマ、テルモトガ・ネオポリターナ、サーマス・アクアチクス、サーマス・カルドフィルス、サーマス・フィリフォルミス、サーマス・フラバス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、及びサーマス・サーモフィルス。示される通り、上記のモチーフに対応するネイティブ配列は、これらのポリメラーゼのそれぞれに存在し、ポリメラーゼのこの領域について保存された機能を指し示している。図２は、これらのＤＮＡポリメラーゼの間で配列同一性を提供する：
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善された活性及び／又は特徴を有するポリメラーゼは、そうでなければ、例えば、上記に挙げた好熱性細菌の種のいずれかに由来のポリメラーゼ等の野生型若しくは天然に存在するＤＮＡポリメラーゼであるか、又はそのような野生型若しくは天然に存在するＤＮＡポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０又は４２と、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。一変形形態では、ポリメラーゼの非修飾形態は、サーマス属の種に由来する。本発明のその他の実施形態では、非修飾ポリメラーゼは、サーマス以外の好熱性種、例えば、テルモトガに由来する。多数の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための完全な核酸及びアミノ酸配列が利用可能である。サーマス・アクアチクス（Ｔａｑ）（配列番号２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号６）、サーマス種Ｚ０５（配列番号１）、サーマス種ｓｐｓ１７（配列番号５）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号３４）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号３３）ポリメラーゼのそれぞれの配列は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０６２００号パンフレットで公開されており、これは参照により本明細書に組み込まれている。サーマス・フラバス由来のＤＮＡポリメラーゼについての配列（配列番号４）は、Ａｋｈｍｅｔｚｊａｎｏｖ及びＶａｋｈｉｔｏｖ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻：第５８３９頁、１９９２年）で公開されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。サーマス・カルドフィルス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号７）は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６２５８４において見られる。サーマス・フィリフォルミス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、例えば、米国特許第４，８８９，８１８号において提供される方法及び表１で提供される配列情報を使用して、ＡＴＣＣ寄託番号４２３８０から回収することができる。サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３５）は、ＧｅｎｅＳｅｑ特許データベース受託番号Ｒ９８１４４及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／０９４５１号パンフレットからであり、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている。バチルス・カルドテナクス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３７は、例えば、Ｕｅｍｏｒｉら（Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（東京）第１１３巻（第３号）第：４０１〜４１０頁、１９９３年；スイスプロットデータベース受託番号Ｑ０４９５７並びにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１２９８２及びＢＡＡ０２３６１も参照のこと）において記述されており、これらはそれぞれ参照により組み込まれている。本明細書で記述されるように修飾され得るＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態の例は、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号、同第６，３４６，３７９号、同第７，０３０，２２０号、同第６，８８１，５５９号、同第６，７９４，１７７号、同第６，４６８，７７５号、及び米国特許第７，１４８，０４９号、同第７，１７９，５９０号、同第７，４１０，７８２号、同第７，３７８，２６２号においても記述されており、これらはそれぞれ参照により組み込まれている。代表的な完全長ポリメラーゼ配列は、配列表においても提供される。
【００８５】
以前に修飾された（例えば、アミノ酸置換、添加又は欠失によって）機能性ＤＮＡポリメラーゼも、本明細書で記述される変異に適している。いくつかの実施形態では、そのような機能的修飾ポリメラーゼは、配列番号４０若しくは配列番号４２のアミノ配列を含むか、又は配列番号４０若しくは配列番号４２との実質的な配列同一性若しくは類似性、例えば、配列番号４０又は配列番号４２との、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、好適な非修飾ＤＮＡポリメラーゼは、野生型又は天然に存在するポリメラーゼの機能的バリアントも含む。そのようなバリアントは、典型的には、野生型又は天然に存在するポリメラーゼとの実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％の配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することになる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述されるポリメラーゼは、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｚ０５（配列番号１）の１〜２９１位に対応する）も含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述されるポリメラーゼは、キメラポリメラーゼである、すなわち、２種以上の酵素由来のポリペプチド領域を含んでいる。そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号において記述されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。特に好適なのは、キメラＣＳファミリーＤＮＡポリメラーゼであり、これは、ＣＳ５（配列番号２７）及びＣＳ６（配列番号２８）ポリメラーゼ、並びに、配列番号２７又は配列番号２８との実質的なアミノ酸配列同一性又は類似性（典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びより典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性）を有するそれらのバリアントを含む。ＣＳ５及びＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５及びテルモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素及びＣ末端３’−５’エキソヌクレアーゼのＮ末端５’−ヌクレアーゼドメイン並びにＴｍａ酵素のポリメラーゼドメインを含む。これらの酵素は、効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長させることができ、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、並びにフルオレセイン及びシアニン染料ファミリー標識ｄＮＴＰも組み込むことができる。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼも、効率的なＭｇ2+活性化ＰＣＲ酵素である。ＣＳ５及びＣＳ６キメラポリメラーゼは、例えば、米国特許第７，１４８，０４９号においてさらに記述されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、単一アミノ酸置換である。本明細書で提供されるＤＮＡポリメラーゼは、非修飾ポリメラーゼに比べて、活性部位において１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述されるポリメラーゼは、次の通りの配列番号３８のアミノ酸モチーフ（Ｚ０５（配列番号１）のＤ５８０Ｘ変異に対応する）をさらに含む：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ
（本明細書では１文字コードで
Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎとも称される）（配列番号３８）、ここで、
Ｘ7は、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＴｈｒ（Ｔ）であり、
Ｘ8は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）以外のアミノ酸である。
【００９０】
配列番号３８によって特徴付けられる変異は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号において詳細に論じられている。そのような機能的バリアントポリメラーゼは、典型的には、野生型又は天然に存在するポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０及び４２）との実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述されるポリメラーゼは、次の通りの配列番号２９のアミノ酸モチーフ（Ｚ０５（配列番号１）のＩ７０９Ｘ変異に対応する）をさらに含む：
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｘ14−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書では１文字コードでＸ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌとも称される）（配列番号２９）、ここで、
Ｘ1は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり、
Ｘ2は、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＴｙｒ（Ｙ）であり、
Ｘ3は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＭｅｔ（Ｍ）以外の任意のアミノ酸であり、
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）又はＡｓｐ（Ｄ）であり、
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり、
Ｘ6は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｍｅｔ（Ｍ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり、
Ｘ7は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり、
Ｘ8は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり、
Ｘ9は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり、
Ｘ10は、Ｇｌｙ（Ｇ）又はＡｌａ（Ａ）であり、
Ｘ11は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり、
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｈｒ（Ｔ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり、
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＨｉｓ（Ｈ）であり、
Ｘ14は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＴｈｒ（Ｔ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、そのような機能的バリアントポリメラーゼは、典型的には、野生型又は天然に存在するポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０又は４２）との実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３８及び配列番号２９に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号３８のＸ8位に、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号３８のＸ8位にグリシン（Ｇ）を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２９のＸ3位に、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）又はアラニン（Ａ）を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２９のＸ3位にリジン（Ｋ）を含む。
【００９４】
同定された部位の１つ以上における他の好適なアミノ酸置換は、例えば、本明細書でさらに記述される又は別途当業者に公知であるアッセイにおけるポリヌクレオチド伸長性能の部位特異的変異導入及び決定の公知の方法、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号及び同第２００９／０２８０５３９号で記述されているアミノ酸置換を使用して、決定することができる。
【００９５】
ＤＮＡポリメラーゼの正確な長さは変動するため、Ｘ8（配列番号３８）及びＸ3（配列番号２９）に対応する正確なアミノ酸位置は、使用される特定の変異体ポリメラーゼに応じて変動し得る。アミノ酸及び核酸配列整列プログラムは、容易に利用可能であり（例えば、上記で言及したものを参照のこと）、本明細書で同定された特定のモチーフを考慮すると、本発明に従う修飾のための正確なアミノ酸（及び対応するコドン）の同定を援助する働きをする。Ｘ8及びＸ3に対応する位置は、代表的なキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを表す表１に示される。
【００９６】
【表１】
2022500046.tif 000003
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス  種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）又はそのバリアント（例えば、Ｄ５８０Ｇ変異等を担持する）に由来する。上記で言及したように、サーマス種  Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｘ8位は５８０位のアスパルテート（Ｄ）に対応し、Ｘ3位は７０９位のイソロイシン（Ｉ）に対応する。故に、本発明のある特定の変形形態では、変異体ポリメラーゼは、サーマス  種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（又は、配列番号１と実質的に同一である、例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、ＤＮＡポリメラーゼ）に比べて、Ｄ５８０及び／又はＩ７０９に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。ある特定の実施形態では、配列番号１の５８０位のアミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択され得る。故に、いくつかの実施形態では、配列番号１の５８０位のアミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）である。さらに、ある特定の実施形態では、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｉではない。いくつかの実施形態では、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ又はＨから選択される。いくつかの実施形態では、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡである。いくつかの実施形態では、配列番号１の７０９位のアミノ酸は、Ｋである。
【００９８】
例示的なサーマス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、アミノ酸置換Ｉ７０９Ｋ（又はＩ７０９Ｒ、Ｉ７０９Ｓ、Ｉ７０９Ｇ、Ｉ７０９Ａ）、及び／又はＤ５８０Ｇを含むものを含む。
【００９９】
本発明者らは、上記されている配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸における置換が、対照ポリメラーゼと比較して、改善された（すなわち、増大した）逆転写効率、増大したＲＴ−ＰＣＲ活性（例えば、ＤＮＡ鋳型におけるＰＣＲ効率を損なうことなくＲＮＡ鋳型のより効率的な増幅）、Ｍｇ2+の存在下での増大したＲＴ−ＰＣＲ効率、阻害剤（例えば、ヘミン及び／又はヘパリン等のヘモグロビンの分解産物）の存在下での増大した逆転写酵素活性、増大した伸長速度及び改善された３’−不一致耐性を有するＤＮＡポリメラーゼをもたらし得ることを示した。米国特許出願公開第２０１２−０２５８５０１号を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。故に、本明細書で記述される配列番号１の７０９位に対応するアミノ酸に置換を含む改善されたポリメラーゼも、上記されている改善された特性を有するであろうと予想される。
【０１００】
本明細書で記述される変異及び置換に加えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その他の非置換修飾も含むことができる。そのような修飾は、例えば、ポリヌクレオチド伸長を含む用途において更なる利点を付与するための、当技術分野で公知の共有結合修飾を含むことができる。例えば、１つのそのような修飾は、酵素を不活性化するが、典型的にはポリヌクレオチド伸長に使用される温度等の高温でのインキュベーション時には酵素を活性化するように逆転される、熱可逆性の共有結合修飾である。そのような熱可逆性の修飾のための例示的な試薬は、米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号において記述されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている。
【０１０１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対応する非修飾ポリメラーゼ（例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼが誘導される対応するバリアント）をコードするＤＮＡ配列を、部位特異的変異導入と一般に称される技法を使用することによって等、変異させることによって構築され得る。ポリメラーゼの非修飾形態をコードしている核酸分子は、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって変異させることができる。（例えば、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ及びＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）第１４章；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０年を参照のこと）。
【０１０２】
非限定的な例として、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のトランスフォーマー部位特異的変異導入キットにおいて利用される２つのプライマーシステムは、部位特異的変異体を、ポリメラーゼの非修飾形態をコードしているポリヌクレオチドに導入するために用いられてよい。このシステムにおける標的プラスミドの変性後、２つのプライマーは該プラスミドに同時にアニールされ、これらのプライマーのうちの一方は、所望の部位特異的変異を含有し、他方は、該プラスミドの別の点に変異を含有し、制限部位の排除をもたらす。次いで、これらの２つの変異と密接に関連する第２のストランド合成を行い、得られたプラスミドを大腸菌のｍｕｔＳ株に形質転換する。プラスミドＤＮＡを、形質転換された細菌から単離し、関連する制限酵素で制限し（それにより、変異していないプラスミドを線形化し）、次いで、大腸菌に再形質転換する。このシステムは、一本鎖ファージミドのサブクローニングも産生も必要なしに、発現プラスミドにおいて直接変異の産生を可能にする。２つの変異の密接な関連及びその後の変異していないプラスミドの線形化は、高い変異効率をもたらし、最小限のスクリーニングを可能にする。最初の制限部位プライマーの合成後、この方法は、変異部位当たり１つのみの新しいプライマー種類の使用を必要とする。各位置の変異体を別個に調製するよりもむしろ、所与の部位において同時に所望の変異の全てを導入するために、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーのセットを合成することができる。形質転換体は、変異体クローンを同定及び選別するために変異誘発領域を経由してプラスミドＤＮＡをシークエンシングすることによって、スクリーニングすることができる。次いで、各変異体ＤＮＡを制限し、例えば、変異検出増強ゲル（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）で等、電気泳動によって分析して、配列においてその他の変更は出現していないことを（非変異誘発対照とのバンドシフト比較によって）確認することができる。代替として、ＤＮＡ領域全体をシークエンシングして、標的領域の外側で更なる変異事象が出現していないことを確認することができる。
【０１０３】
１を超えるアミノ酸で置換されているＤＮＡポリメラーゼは、種々の手法で産生され得る。ポリペプチド鎖内ですぐ近くに位置付けられているアミノ酸の場合には、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して、それらを同時に変異させてよい。しかしながら、アミノ酸が互いに若干離れて位置付けられている（例えば１０を超えるアミノ酸によって分離されている）ならば、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを産生することはさらに困難である。代わりに、２つの代替的な方法のうちの１つを用いてよい。第１の方法では、置換される各アミノ酸について別個のオリゴヌクレオチドが産生される。次いで、オリゴヌクレオチドを、一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールし、該鋳型から合成されたＤＮＡの第２のストランドが、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。代替的な方法は、所望の変異体を生成するために２ラウンド以上の変異導入を伴う。第１のラウンドは、単一の変異体について記述される通りである：非修飾ポリメラーゼをコードしているＤＮＡが、鋳型に使用され、第１の所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドが、この鋳型にアニールされ、次いで、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子が産生される。変異導入の第２のラウンドは、変異導入の第１のラウンドにおいて鋳型として生成された変異型ＤＮＡを利用する。故に、この鋳型は、１つ以上の変異を既に含有する。次いで、更なる所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドを、この鋳型にアニールし、得られたＤＮＡのストランドが、今度は変異導入の第１及び第２のラウンド両方からの変異をコードする。この結果として生じたＤＮＡは、変異導入の第３のラウンドなどにおいて、鋳型として使用することができる。代替として、Ｓｅｙｆａｎｇ及びＪｉｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３２４巻：第２８５〜２９１頁、２００４年）の多重部位変異導入法を利用してよい。
【０１０４】
したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸も提供される。ＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を使用して、様々なベクターを作製することができる。宿主細胞に適合する種に由来する任意のベクター含有レプリコン及び制御配列を、本発明の実践において使用することができる。概して、発現ベクターは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸と作動可能に連結された転写及び翻訳調節核酸領域を含む。用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に好適な制御配列には、プロモータ、任意選択でオペレータ配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。加えて、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を増強するために正のレトロ調節エレメント（ＰＲＥ）を含有してよい（Ｇｅｌｆａｎｄ  ら米国特許第４，６６６，８４８号を参照のこと）。転写及び翻訳調節核酸領域は、概して、ポリメラーゼを発現するために使用される宿主細胞に適切となる。様々な宿主細胞について、多数の種類の適切な発現ベクター及び好適な調節配列が、当技術分野で公知である。概して、転写及び翻訳調節配列は、例えば、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサ又はアクチベータ配列を含み得る。典型的な実施形態では、調節配列は、プロモータ並びに転写開始及び停止配列を含む。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含有するポリリンカー領域も含む。ある特定の実施形態では、「融合フラッグ」は、タグ／フラッグ配列、例えば「Ｈｉｓタグ」の、精製及び所望ならばその後の除去を容易にするために使用される。しかしながら、これらは概して、「加熱ステップ」が用いられ得る中温性宿主（例えば、大腸菌）由来の熱活性及び／又は熱安定性タンパク質を精製する場合には不必要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び目的のポリメラーゼをコードするＤＮＡを含有する好適なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手順を使用して調製される。単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びＤＮＡ  断片を、当技術分野で周知のように、所望のベクターを産生するために特異的な順序で、切断し、合わせ、一緒にライゲーションする（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、第２版、１９８９年）を参照のこと）。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカ遺伝子を含有する。選択遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変動することになる。好適な選択遺伝子は、例えば、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含むことができ、これらのベクターで形質転換された細胞がこれらの抗生物質の存在下で成長できるようにする。
【０１０６】
本発明の一態様では、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を、単独で又はベクターと組み合わせてのいずれかで、細胞に導入する。「に導入する」又は本明細書における文法的同等物が意味するのは、核酸が、その後の核酸の統合、増幅及び／又は発現に好適な方式で細胞に入ることである。導入の方法は、標的細胞型に大きく左右される。例示的な方法は、ＣａＰＯ4沈殿、リポソーム融合、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染等を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、原核生物は、典型的には、本発明の最初のクローニングステップのための宿主細胞として使用される。これらは、大量のＤＮＡの迅速生成のため、部位特異的変異導入に使用される一本鎖ＤＮＡ鋳型の生成のため、多くの変異体を同時にスクリーニングするため、及び産生された変異体のＤＮＡシークエンシングのために、特に有用である。好適な原核生物宿主細胞は、大腸菌Ｋ１２  株９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３，６０６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）及び大腸菌Ｂを含むが、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９等の大腸菌の多くのその他の株、並びに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア・マルセッセン（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等のその他の腸内細菌科、及び種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を含む、原核生物の多くのその他の種及び属は、いずれも宿主として使用され得る。原核生物宿主細胞又は堅い細胞壁を有するその他の宿主細胞は、典型的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記の第１．８２節に記述されるような塩化カルシウム法を使用して形質転換される。代替として、これらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物形質転換技法は、例えば、Ｄｏｗｅｒ、ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ第１２巻：第２７５〜２９６頁（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、１９９０年）；Ｈａｎａｈａｎ  ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２０４巻：第６３頁、１９９１年で説明されている。大腸菌の形質転換に典型的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩｌ８、ｐＵＣ１１９及びブルースクリプトＭ１３を含み、これらは全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、上記の第１．１２〜１．２０節において記述されている。しかしながら、多くのその他の好適なベクターも利用可能である。
【０１０８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘発する又は引き起こすための適切な条件下で培養することによって、生成される。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に好適な条件下で培養する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、上記を参照のこと）。ラムダｐＬプロモータ含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に好適な宿主細胞は、大腸菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３６０６）を含む（米国特許第５，０７９，３５２号及びＬａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ第２巻：第２７５〜８７頁、１９９３年を参照されたく、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれている）。発現後、ポリメラーゼを採取し、単離することができる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製するための方法は、例えば、Ｌａｗｙｅｒら、上記に記述されている。精製したら、増大したストランド置換活性、改善されたＲＴ効率、増大した不一致耐性、伸長速度並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤の耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの能力を試験することができる（例えば、実施例で記述されるように）。
【０１０９】
本発明の改善されたＤＮＡポリメラーゼは、そのような酵素活性が必要である又は望ましい任意の目的のために使用されてよい。したがって、本発明の別の態様では、ポリメラーゼを使用するポリヌクレオチド伸長（例えば、ＰＣＲ）の方法が提供される。ポリヌクレオチド伸長に好適な条件は、当技術分野で公知である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、上記を参照のこと。また、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９年も参照のこと）。概して、プライマーを、標的核酸にアニール、すなわち、ハイブリダイズして、プライマー鋳型複合体を形成する。プライマー鋳型複合体を、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と、好適な環境で接触させて、プライマーの３’末端への１つ以上のヌクレオチドの添加を可能にし、それにより、標的核酸と相補的な伸長したプライマーを生成する。プライマーは、例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。加えて、ヌクレオシド三リン酸は、従来型ヌクレオチド、非在来型ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識ヌクレオチド）、又はそれらの混合物であり得る。いくつかの変形形態では、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含む。ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対を使用する核酸増幅に好適な条件も、当技術分野で公知である（例えば、ＰＣＲ増幅法）。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記；ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９年を参照のこと）。その他の相互に排他的でない実施形態では、ポリヌクレオチド伸長反応は、ＲＮＡ鋳型の逆転写を含む（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）。いくつかの実施形態では、改善されたポリメラーゼは、４５４シークエンシングにおける使用を見出している（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、第４３７巻、第３７６〜３８０頁）。
【０１１０】
任意選択で、該プライマー伸長反応は、参照又は非修飾ポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤を含む。該阻害剤は、例えば、参照又は非修飾（対照）ポリメラーゼの核酸伸長速度及び／又は逆転写効率を阻害することができる。いくつかの実施形態では、該阻害剤は、ヘモグロビン、又はその分解産物である。例えば、いくつかの実施形態では、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマトポルフィリン又はビリルビン等のヘム分解産物である。いくつかの実施形態では、該阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。その他の実施形態では、該阻害剤は、ヘパリンである。ある特定の実施形態では、該阻害剤は、挿入染料である。ある特定の実施形態では、該阻害剤は、ポリメラーゼ阻害剤として記述されてきたメラニンである。例えば、Ｅｋｈａｒｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．第２７１巻（第３号）：第７２６〜３０頁（２０００年）を参照のこと。
【０１１１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば血液等のポリメラーゼ阻害剤を含む試料から単離されたポリヌクレオチド鋳型の存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、血液の主成分であるヘモグロビンの存在下、又はヘモグロビン分解産物の存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。ヘモグロビンは、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン及びビリルビン等の種々のヘム分解産物に分解され得る。故に、ある特定の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン及びビリルビンを含むがこれらに限定されないヘモグロビン分解産物の存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。ある特定の実施形態では、該ヘモグロビン分解産物は、ヘミンである。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約０．５〜２０．０μＭ、約０．５〜１０．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約１．０〜１０．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、又は約２．０〜３．０μＭのヘミンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。その他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、２０．０、又は２０μＭを超えるヘミンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。ヘモグロビンの分解産物は、鉄キレート剤及び紫色色素を含む。故に、いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、鉄キレート剤及び／又は紫色色素の存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。その他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼによって同じ鋳型の伸長を阻害するであろう量のヘモグロビン分解産物の存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。
【０１１２】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ヘパリンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。ヘパリンは、一般に、血液から単離された試料中に抗凝固剤として存在する。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約１．０〜４００ｎｇ／μｌ、１．０〜３００ｎｇ／μｌ、１．０〜２００ｎｇ／μｌ、５．０〜４００ｎｇ／μｌ、５．０〜３００ｎｇ／μｌ、５．０〜２００ｎｇ／μｌ、１０．０〜４００ｎｇ／μｌ、１０．０〜３００ｎｇ／μｌ、又は１０．０〜２００ｎｇ／μｌのヘパリンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎｇ／μｌ、又は４００ｎｇ／μｌを超えるヘパリンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。その他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼによって同じ鋳型の伸長を阻害するであろう量のヘパリンの存在下で、鋳型を伸長させるために使用され得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善されたポリメラーゼは、ストランド置換反応において使用される。いくつかの実施形態では、該ストランド置換反応は、ＤＮＡ鋳型、１つ以上のプライマー、及び本明細書で記述される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物中で行われる。反応混合物は、典型的には、４つ全ての標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）並びに二価カチオン及び一価カチオンを含有する緩衝液を含有する。例示的なカチオンは、例えば、Ｍｇ2+を含むが、Ｍｎ2+又はＣｏ2+等のその他のカチオンもＤＮＡポリメラーゼを活性化することができる。その他の実施形態では、該ストランド置換反応は、本発明の熱活性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。特定の実施形態では、本明細書で記述される改善されたポリメラーゼは、高温でより効率的なストランド置換反応を可能にしながら、同時に減少したエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、該改善されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して増大したストランド置換活性を有する。本明細書で記述される配列番号１又は配列番号４０の対応する位置におけるアミノ酸置換が、増大したストランド置換活性をもたらし得ることは、これまで認められていなかった。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、該改善されたポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型を使用するポリメラーゼ活性における実質的な減少なしに、ＲＮＡ鋳型を使用して逆転写効率を増大させた。故に、いくつかの実施形態では、改善されたＤＮＡ  ポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較した場合、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性における実質的な減少なしに、増大したＲＴ効率を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善されたＤＮＡポリメラーゼ  は、対照ポリメラーゼと実質的に同じであるＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。故に、いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善されたＤＮＡポリメラーゼ  は、対照ポリメラーゼの活性の少なくとも約９０％、例えば、対照ポリメラーゼの活性の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、又はそれ以上である、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する。該ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、例えば、ＤＮＡ鋳型を増幅し、本明細書で記述されるようにＣｐ値を決定することによって、測定することができる。故に、いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡが鋳型として使用される際に対照ポリメラーゼと比較して減少したＣｐ値として測定される、改善されたＲＴ効率を有するが、ＤＮＡが鋳型として使用される際に対照ポリメラーゼに比べて実質的に変化していないＣｐ値を有する。例えば、ＤＮＡ鋳型を増幅する場合、該改善されたＤＮＡポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して、１．０未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、又は０．１未満だけ異なるＣｐ値を有し得る。いくつかの実施形態では、該ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性は、実施例で記述されるように決定される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明の改善されたポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型を伸長させるために必要とされる反応時間を低減させることによって、逆転写効率を増大させる。例えば、本明細書で記述される改善されたポリメラーゼは、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写するために必要とされる反応時間を、対照ポリメラーゼと比較して有意に短縮することができ、それにより、逆転写酵素効率を増大させる。理論に制限されることなく、該改善されたポリメラーゼは、例えば、ヌクレオチド組み込みの速度を増大させる及び／又はポリメラーゼの処理能力を増大させる等、ＲＮＡ鋳型上の酵素の活性を増大させること、それにより、ＲＮＡ鋳型又はＲＮＡ鋳型の集団の伸長時間を有効に短縮することによって、ＲＴ効率を増大させることができる。最初のＲＴステップのための反応時間は、典型的には、非修飾又は対照ポリメラーゼを使用する場合、摂氏６５度でおよそ３０分間以上である。故に、いくつかの実施形態では、該改善されたポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに、摂氏６５度にて、約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約８分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、又は約２分未満で転写する  ことができる。いくつかの実施形態では、該改善されたポリメラーゼは、ＨＣＶ遺伝子型Ｉｂ  ５’ＮＴＲの最初の８００塩基を含有するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物ＪＰ２−５に由来するＲＮＡ鋳型を、ｃＤＮＡに、対照ポリメラーゼよりも短い時間で又は速く転写することができる。例えば、該改善されたポリメラーゼは、ＨＣＶ  ＪＰ２−５  ＲＮＡ鋳型の２４０塩基を、完全長ｃＤＮＡに、同一の反応条件下、対照ポリメラーゼよりも約１５秒短い、３０秒短い、１分短い、２分短い、３分短い、４分短い、５分短い、又は約１０分短い時間で転写することができる。いくつかの実施形態では、該改善されたポリメラーゼは、ＨＣＶ  ＪＰ２−５  ＲＮＡ鋳型の２４０塩基を、完全長ｃＤＮＡに、対照ポリメラーゼよりも速く、例えば、同一の反応条件下、対照ポリメラーゼよりも約５秒、１０秒、１５秒、３０秒、４５秒、又は６０秒以上速く、転写することができる。いくつかの実施形態では、該反応条件は、実施例で記述されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書で記述される改善されたポリメラーゼを、ＲＮＡ鋳型と、上記されている反応混合物中、摂氏６５度で約２分間にわたって接触させる。実施例で記述されるように、伸長ステップに続いて、伸長された鋳型のＰＣＲ増幅を行うことができる。
【０１１７】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいて最も効率的なＲＴ活性は、二価金属イオン活性剤としてＭｎ2+を使用して実現された。しかしながら、反応物中にＭｎ2+が存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は低くなることが周知である。変異を産生しようとしているのでない限り、より高い忠実度を維持することが概して好まれる。幸いにも、ほとんどの従来型のシークエンシング、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ用途は、検出システムが概して  産物の集団を見ていることから、高忠実度条件を必要としない。次世代シークエンシング、デジタルＰＣＲ等の出現とともに、産物の忠実度はより重要となり、より高い忠実度のＤＮＡ合成を可能にする方法が重大である。二価金属イオン活性剤としてＭｇ2+を使用して効率的なＲＴ活性を実現することは、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を実質的に増大させ、核酸標的のより信頼性が高いコピーを可能にするための卓越した手法である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の改善されたポリメラーゼは、実施例で記述されるように、二価金属イオン活性剤としてＭｇ2+を使用して、ＲＮＡ鋳型の効率的な伸長及び／又は増幅を可能にする。
【０１１８】
本明細書で記述されるポリメラーゼは、増大した不一致耐性を有することもできるため、該ポリメラーゼは、標的鋳型の変形の可能性があるが、鋳型が標的鋳型における変形にかかわらずそれでもなお増幅されることが所望される方法における使用を見出している。そのような鋳型の例は、例えば、ウイルス、細菌、又はその他の病原体配列を含むことができる。多くの実施形態では、個体（ヒト又は非ヒト動物）が感染した正確なウイルスバリアントにかかわらず、該個体がウイルス又はその他の感染を有するか否かを単純に決定することが望ましい。例として、個体に感染している特定のウイルスが  変異を有し、プライマーハイブリダイゼーション部位において不一致をもたらしている場合であっても、本発明のポリメラーゼを使用してＨＣＶを増幅し、ＨＣＶの存在を検出するために、プライマー対を使用することができる。
【０１１９】
標的核酸は、生体又は合成源から生じ得る。標的は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。概して、アンプリコンが産生される場合、該アンプリコンはＤＮＡで構成されることになるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドも該アンプリコンに組み込まれ得る。ＲＮＡを検出したい場合、増幅プロセスは、典型的には、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む、逆転写の使用を伴うことになる。
【０１２０】
具体的な標的配列は、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボＢ１９ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マーレーバレー脳炎ウイルス及びクンジンウイルス）、細菌核酸（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、マイコバクテリア、真菌核酸、又は動物若しくは植物由来の核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、該標的核酸は、動物（例えば、ヒト）核酸であるか、又は、動物（例えば、ヒト）試料に由来する（すなわち、ウイルス又はその他の病原性生物核酸は、動物生検、血液試料、尿試料、糞便試料、唾液等由来の試料中に存在し得る）。いくつかの実施形態では、該標的核酸は、例えば、疾患（例えば、がん、糖尿病等）に関連するバリアントを含み得るヒトの遺伝領域である。いくつかの実施形態では、本発明のポリメラーゼは不一致耐性を有することから、そのような酵素は、例えば、多様な関連配列が標的配列内にあり得る場合に特に有用である。例として、本発明は、ウイルス病原体を検出するために使用することができ、ここで、該ウイルス病原体は、それらのゲノムにおいてほとんどの若しくは全ての考えられるウイルスゲノムを増幅する単一のプライマー又はその小さなセットを設計することを困難若しくは不可能にするための、又は、配列の変形が公知である若しくは起こる可能性が高いがん若しくはその他の疾患遺伝子マーカにおいて、十分な変形を有する。
【０１２１】
本明細書で記述される改善されたポリメラーゼを使用して伸長産物又は増幅産物を検出するためのその他の方法は、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合染料又は蛍光二本鎖ヌクレオチド挿入染料の使用を含む。蛍光二本鎖ＤＮＡ結合染料の例は、サイバーグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む。二本鎖ＤＮＡ結合染料は、プライマー伸長産物及び／又は増幅産物を測定するための融解曲線分析と併せて使用され得る。融解曲線分析は、搭載ソフトウェア（ＳＤＳ  ２．１）を用いるＡＢＩ  ５７００／７０００（９６ウェルフォーマット）又はＡＢＩ  ７９００（３８４ウェルフォーマット）機器等のリアルタイムＰＣＲ機器で実施することができる。代替として、融解曲線分析を、エンドポイント分析として実施することができる。融点分析の例示的な方法は、米国特許出願公開第２００６／０１７２３２４号で記述されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれている。
【０１２２】
本発明の別の態様では、本明細書で記述されるプライマー伸長方法において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、該キットは、使いやすさのために区画化されており、本発明に従って改善されたＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含有する。更なる試薬を提供する１つ以上の更なる容器が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、該キットは、ヘパリン若しくはその塩を含む、又はヘパリンを溶液中に放出する、採血管、容器又はユニットを含むこともできる。該採血ユニットは、ヘパリン化管であり得る。そのような更なる容器は、例えば、核酸増幅手順（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング手順、又はＤＮＡ標識手順において使用するための試薬を含む、上記されている方法に従うプライマー伸長手順において使用するための当業者によって認識される任意の試薬又はその他のエレメントを含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、該キットは、プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は、該５’センスプライマー及び対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を提供する容器をさらに含む。その他の相互に排他的でない変形形態では、該キットは、ヌクレオシド三リン酸（従来型及び／又は非在来型）を提供する１つ以上の容器を含む。具体的な実施形態では、該キットは、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、及び／又は例えば、フルオレセイン若しくはシアニン染料ファミリーｄＮＴＰ等の標識ｄＮＴＰを含む。また他の相互に排他的でない実施形態では、該キットは、プライマー伸長反応に好適な緩衝液を提供する１つ以上の容器を含む。
【０１２３】
本発明の別の態様では、本明細書で記述されるように、増大した逆転写酵素効率、不一致耐性、伸長速度並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤の耐性を有するポリメラーゼを含む、反応混合物が提供される。該反応混合物は、例えば、核酸増幅手順（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング手順、又はＤＮＡ標識手順において使用するための試薬をさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、該反応混合物は、プライマー伸長反応に好適な緩衝液を含む。該反応混合物は、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識リボヌクレオチド、非在来型ヌクレオチド）、塩（例えば、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+を含む）、標識（例えば、フルオロフォア）を含有することもできる。いくつかの実施形態では、該反応混合物は、プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は、該５’センスプライマー及び対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を含有する。いくつかの実施形態では、該反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、及び／又は例えば、フルオレセイン若しくはシアニン染料ファミリーｄＮＴＰ等の標識ｄＮＴＰを含有する。いくつかの実施形態では、該反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含む。ある特定の実施形態では、該反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン及びビリルビン等のヘム分解産物を含む。その他の実施形態では、該反応混合物は、ヘパリン又はその塩を含む。ある特定の実施形態では、該反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含有する。その他の実施形態では、該鋳型核酸は、ＲＮＡであり、該反応混合物は、ヘパリン又はその塩を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、該反応混合物は、２つ以上のポリメラーゼを含む。例えば、いくつかの実施形態では、該反応混合物は、対照ポリメラーゼと比較して増大した逆転写酵素効率を有する第１のＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを含む。該第２のＤＮＡポリメラーゼは、野生型若しくは非修飾ポリメラーゼであり得るか、又は増大したＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する改善されたポリメラーゼであり得る。そのような反応混合物は、増大した逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼの両方を提供することにより、ＲＮＡ鋳型の増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）に有用である。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は、特許請求される発明を例示するために供与されるのであって、限定するものではない。
【０１２６】
実施例１ライブラリー産生
手短に述べると、このスクリーニングプロセスにおけるステップは、ライブラリー産生、変異体酵素の発現及び部分精製、所望の特性の酵素のスクリーニング、ＤＮＡシークエンシング、クローン精製、並びに選択された候補変異体の更なる特徴付けを含んでいた。これらのステップのそれぞれを以下でさらに記述する。
【０１２７】
クローンライブラリー産生：Ｃ２１  ＤＮＡポリメラーゼのＧ４６Ｅ変異をコードする核酸を、エラープローンＰＣＲ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のためのＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ（商標）ランダム変異導入キットを使用するエラープローン（変異原性）ＰＣＲに曝した。ＰＣＲ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）クローニングシステム（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用してクローン化して、変異原性ライブラリーを作成した。クローン化されたインサートを、化学的に適格性があるＬＫ４細胞に形質転換した。次いで、ライブラリーを、発現された変異体ポリメラーゼのストランド置換活性の向上についてスクリーニングした。
【０１２８】
アッセイ設計：アッセイ設計を図３に示す。４つの相補的オリゴヌクレオチドオリゴＡ（緑色）、オリゴＢ（薄青色）、オリゴＣ（暗青色）及びロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴＤ（赤色）を互いにアニールした。オリゴＡはオリゴＢに対して相補的であり、該重合反応を開始する。オリゴＢは、鋳型であり、５’末端にＦＡＭ−蛍光レポーターを有する。オリゴＣは、オリゴＢに対して相補的であり、３’末端にＢＨＱクエンチャを有する。ロックド核酸オリゴＤは、鋳型オリゴＢに対して相補的であり、高エネルギーハードルとして役立つ。ポリメラーゼ、Ｍｇ2+及びヌクレオチドが、アニールされた混合物に添加されると、重合反応は、オリゴＡを伸長させ、新たに合成されたストランドがＬＮＡオリゴＤ及びオリゴＣを置き換え、故に、蛍光プローブからクエンチャを放出する。サイクルの完了時に蛍光シグナルが産生される。熱サイクリング条件は次の通りであった：
変性  ９５oＣ  ３”
アニーリング  ６０oＣ  ５’’
伸長  ６５oＣ  ３０”
３０サイクル
【０１２９】
クローン化されたＰＣＲ断片をシークエンシングして、任意の単一クローン中に存在する変異を決定した。
【０１３０】
ヌクレアーゼ活性。ヌクレアーゼ活性を決定するために、ｄＮＴＰを添加することなく伸長反応を行った。ｄＮＴＰが反応物中に存在しない場合、蛍光シグナルにおけるいかなる増大も、酵素のヌクレアーゼ活性に起因する。蛍光シグナルの増大が観察されないならば、酵素は、皆無若しくはそれに近い、又は実質的に低減した、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０１３１】
結果：親Ｇ４６Ｅ  Ｃ２１ポリメラーゼと比較して増大したストランド置換活性を有する、若干数のクローンが同定された。個々の細菌コロニー（クローン）を含む代表的なプレートを、図４Ａ及び４Ｂに示す。要約すると、増大したストランド置換活性を有する下記のクローンをシークエンシングし、変異を指し示す（ここで、最初の番号は図４Ａ及び４Ｂに示されるプレート番号に対応し、文字番号（例えば、Ｆ２４）はプレート上のウェルに対応する）：
プレート１＿クローンＦ２４：変異：Ｉ６８６Ｖ及びＡ６９３Ｖ
プレート１＿クローンＬ３：変異：Ｔ５１６Ｉ及びＶ６３３Ｉ
プレート１＿クローンＰ１９：変異：Ｑ４１５Ｈ、Ｅ４２０Ｄ、Ｅ６３６Ｇ、Ｎ７５２Ｓ、Ｖ７６８Ｍ
プレート２＿クローンＭ２２：変異：Ｒ５２５Ｇ及びＦ６９４Ｓ
プレート２＿クローンＧ９：変異：Ｑ４９１Ｈ及びＴ５１６Ｓ
プレート２＿クローンＮ１９：変異：Ｓ５１５Ｆ及びＴ６６６Ｍ
プレート２＿クローンＮ７：変異：Ｅ４０２Ｖ、Ｖ５５５Ａ及びＮ５８２Ｄ
プレート３＿クローンＡ２４：変異：Ａ７３７Ｔ及びＡ７５９Ｔ
プレート３＿クローンＦ２１：変異：Ｌ５２１Ｑ及びＴ５４６Ａ
プレート３＿クローンＧ１０：変異：Ｎ６６８Ｓ
プレート３＿クローンＩ１４：変異：Ａ４５６Ｔ
プレート４＿クローンＧ２３：変異：Ｋ５０７Ｍ、Ｔ５７１Ａ及びＳ６５２Ｆ
プレート４＿クローンＫ１２：変異：Ｓ５１５Ｆ及びＡ８３２Ｖ
プレート５＿クローンＣ６：変異：Ｄ４９８Ｅ、Ｌ５２４Ｖ、Ｒ５９８Ｇ及びＭ６１６Ｉ
プレート５＿クローンＧ２０：変異：Ａ４４４Ｔ、Ｄ４９８Ｅ、Ｍ６６０Ｋ及びＹ６７３Ｎ
プレート５＿クローンＧ２３：変異：Ｅ４９３Ｄ、Ｔ５１１Ｓ、Ｍ６４８Ｉ及びＭ７４９Ｌ
プレート５＿クローンＨ２１：変異：Ｑ６３５Ｋ
【０１３２】
変異は、ポリメラーゼドメイン全体に広がる。これらの変異は、一次アミノ酸配列中の下記の「ホットスポット」又はストレッチ：５１５〜５１６、５２１〜５２５、６３３〜６３６、６６６〜６６８、６９３〜６９４を含む。
【０１３３】
ヌクレアーゼ活性：図５Ａ及び５Ｂは、ｄＮＴＰを伸長反応物に添加しなかった２つのプレートからの結果を示す。クローンの大部分は、いかなる蛍光シグナルも示さない。ウェルのいくつかは蛍光シグナルを示すが、バックグラウンドレベルであり、０．５相対蛍光単位（ＲＦＵ）よりも高くはないことに留意されたい。
【０１３４】
この例は、上記されている変異体ポリメラーゼが、Ｇ４６Ｅ親酵素と比較して増大した又は増強されたストランド置換活性を有することを実証するものである。該変異体ポリメラーゼは、高温でも機能する（すなわち、これらは、９５oＣの変性温度、６０oＣのアニーリング温度、及び６５oＣの伸長温度に耐える。加えて、該変異体ポリメラーゼは、極めて少ない  エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を呈する。
【０１３５】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な修正又は変更が当業者に提案されており、本明細書の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての公報、配列受託番号、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2022500046.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
2022500046.tif 000009
【図４Ｂ−２】
2022500046.tif 000010
【図４Ｂ−３】
2022500046.tif 000011
【図４Ｂ−４】
2022500046.tif 000012
【図５Ａ】
2022500046.tif 000013
【図５Ｂ】
2022500046.tif 000014
【配列表】
2022500046000001.app
【国際調査報告】
2022500046.tif 000015
2022500046.tif 000016
2022500046.tif 000017