【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年4月14日(2010.4.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０４】
分子モデリング  −  グリコスフィンゴ脂質類の最少エネルギー配座異性体は、バイオグラフ（Biograf）分子モデリングプログラム（Molecular Simulations Inc.製）内で、Silicon Graphics 4D／35TGワークステーションを用いてドライディング−ＩＩ力場（Mayo et al., 1990）で予測した。部分原子電荷を電荷平衡法（RappeとGoddard III, 1991）を使って生成し、クーロン相互作用は距離依存電子誘導定数（ε＝３．５ｒ）とした。さらに、特別水素結合項を用い、その中で最大相互作用（Ｄｈｂ）を−４ｋｃａｌ ｍｏｌ-1に設定した。Glcβ1Cer結合の二面角は次のように定義した：グルコース末端からΦ＝ H-1- C-1 - O-1 - C-1、Ψ＝ C-1 - O-1 - C-1 - C-2 およびθ＝O-1 - C-1 - C-2 - C-3（Nyholm と Pascher, 1993 を参照)。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３０】
【図１Ａ】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のＥＩ／ＭＳ。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークＡのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図１Ｂ】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のＥＩ／ＭＳ。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークＢのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図２Ａ】ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図２Ｂ】ペンタグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図３Ａ】六糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図３Ｂ】五糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図４】ウサギ胸腺グリコスフィンゴ脂質の酵素分解を示す。シリカゲルの薄層プレートはＣ／Ｍ／Ｈ2Ｏ（容量比は６０：３５：８）で展開した。ＡとＢは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｃは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後に得たもの）、レーン３：β４−ガラクトシダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン４：シアリダーゼおよびβ４−ガラクトシダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド、レーン５：ヒト赤血球由来の参照用グリコスフィンゴ脂質類（ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミドおよびグロボシド）、レーン６：β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン７：シアリダーゼ、β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド。
【図５】ウサギ胸腺ヘプタグリコシルセラミド NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの部分酸加水分解後に得たＴＬＣ産物を示す。展開溶媒は図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃと同じである。Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｂは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後）、レーン３：ペンタグリコシルセラミド、レーン４：加水分解物、レーン５：参照用グリコスフィンゴ脂質類（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃと同じ）。
【図６Ａ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ヘキサグリコシルセラミドおよびペンタグリコシルセラミド（Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図６Ｂ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ペンタグリコシルセラミドおよびテトラグリコシルセラミド（GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer および Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図７】Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで検出した分離グリコスフィンゴ脂質を示す薄層クロマトグラムであり、Ｂはそこに放射線標識したヘリコバクター ピロリ０３２株を結合させた分離グリコスフィンゴ脂質を示すオートラジオグラムである。アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck製）上で、クロロフォルム／メタノール／水の容量比が６０：３５：８の溶媒系を用いてグリコスフィンゴ脂質を分離した。結合アッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。オートラジオグラフィは７２時間行った。各レーンは以下のグリコスフィンゴ脂質を含んでいた。  レーン１）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg；  レーン２）Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ５グリコスフィンゴ脂質）、４μg;   レーン３）Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン４）Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ６ ２型 グリコスフィンゴ脂質)、４μg；  レーン５）GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン６）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg；  レーン７）GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ｘ２ グリコスフィンゴ脂質)、４μg；  レーン８）NeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-x2）、４μg；  レーン９）Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｈ５ ２型 グリコスフィンゴ脂質）、４μg；  レーン１０）NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（シアリルネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg。
【図８Ａ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。アノマー性に違いがあるものの、アセトアミド基の有無、末端糖の４−ＯＨ基の軸配座または赤道配座、ならびに末端α３−結合化合物の環の形成する平面構造がβ３−結合した対応化合物の平面構造よりも少し上に位置することは、図８Ａ〜８Ｃに示したグリコスフィンゴ脂質類のみならず、ウサギ胸腺から誘導したGlcNAcβ3-末端を有する構造体（図９Ａを参照）とも重要な立体構造上の類似点が存在することを示し、バクテリア付着因子に対してこれらが示す類似した親和性を説明した。一方、内部GlcNAcβ3のアセトアミド基は結合に必須であった（図８Ｃと図８Ｄを参照）。
【図８Ｂ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図８Ｃ】ヘリコバクター ピロリに結合するグリコスフィンゴ脂質であるGalα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図８Ｄ】ヘリコバクター ピロリに結合しないグリコスフィンゴ脂質であるGalα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4GlcβCer について予測した、最少エネルギー配座異性体。最少エネルギー立体配座のオリゴ糖部分を上から見た図である。
【図９Ａ】結合活性を有するグリコスフィンゴ脂質である GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。Ｂ５の内部GlcNAcにおけるアセトアミド成分の脱Ｎ−アセチル化（図８Ａ，８Ｂ，８Ｃおよび８Ｄ）は結合能を完全に除去するという発見と共に、結合エピトープが図８Ｃに示したＢ５の末端三糖からなるものでなければならないことが分かった。これは末端Ｎ−アセチルガラクトサミンのアセトアミド基が必須ではないためである。
【図９Ｂ】結合活性を有するグリコスフィンゴ脂質であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4-GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を有しているが、その親和性は低下している。
【図９Ｃ】結合活性を有していないグリコスフィンゴ脂質であるNeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を完全に失っている。
【図９Ｄ】結合活性を有していないグリコスフィンゴ脂質であるGalα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer について予測した、最小エネルギー配座異性体。このグリコスフィンゴ脂質はヘリコバクター ピロリに対する結合能を完全に失っている。
【図１０】七糖化合物であるNeuGlcα3Galβ4-GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerの最小エネルギー配座異性体であって、互いに対して９０°回転させた２種投影図である。シアリル酸のグリコリル成分の末端炭素原子および２つのGlcNAc残基のアセトアミド基のメチル炭素原子は、配向を分かりやすくするために黒で示した。GlcβCer結合については、図示するために長鎖の立体構造を任意で選択したが、ここに示したものよりも最小結合配列であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3のほうが近接するGlcβCer立体構造中の付着因子に対してより露出した状態にあると考えられる。
【図１１】ヒト胃粘膜から得た上皮細胞、ヒト顆粒球およびヒト赤血球のそれぞれより単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分の薄層クロマトグラムであり、Ｂはモノクローナル抗体ＴＨ２を結合させたもので、ＣはE. cristagalli 由来のレクチンを結合させたものである。Ａは同じ画分を４−メトキシベンザアルデヒドで染色した。オートラジオグラフィは１２時間行った。レーン１〜６には、血液型がＡである５人から提供されたヒト胃粘膜から得た上皮細胞より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を８０μｇずつアプライし、レーン７にはヒト顆粒球より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を４０μｇアプライし、レーン８にはヒト赤血球より単離した全非酸性グリコスフィンゴ脂質画分を４０μｇアプライした。オーバーレイアッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。