(57)【要約】  本発明は、オルガノイドを作製する方法に関し、該方法は：(a)複数の組織特異的前駆細胞を容器に播種する工程；(b) (i)該細胞の凝集；および(ii) (i)で形成された凝集物の単一オルガノイドへの成熟を起こさせる工程を含むかまたは該工程からなり、ここで該方法は、該細胞または該凝集物をゲルに埋め込むことを含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)複数の組織特異的前駆細胞を容器に播種する工程；
(b) (i)該細胞の凝集；および
(ii) (i)で形成された凝集物の単一のオルガノイドへの成熟
を起こさせる工程
を含むまたは該工程からなるオルガノイドを作製する方法であって；
該細胞または該凝集物をゲルに埋め込むことを含まない、方法。
【請求項２】
(i)該オルガノイドが、神経オルガノイド、好ましくは中脳オルガノイドまたはパターン形成されない同質の脳オルガノイドであり、
該組織特異的前駆細胞が、ニューロン組織特異的前駆細胞、好ましくは小分子ニューロン前駆細胞(smNPC)であり；
(ii)該オルガノイドが、再現可能なもしくは同質のサイズおよび/または細胞組成を有し、同質は、好ましくは平均の20%未満またはそれ以下の標準偏差を意味する；
(iii)工程(b)が、
(b-i)凝集培地中で、好ましくは約2日間培養すること、ここで該凝集培地は好ましくはポリビニルアルコールを含む；
(b-ii)成熟培地で培養すること(culturing a maturation medium)；および
(b-iii)好ましくは(b-i)と(b-ii)の間に、腹側パターン形成培地中で、好ましくは約4日間培養すること
を含み；
(iv)該複数の細胞が、約100〜約1000000、好ましくは約10000細胞であり；および/または
(v)該容器が、マルチウェルプレートのウェルであり、ここで好ましくは該マルチウェルプレートの複数のウェルもしくはそれぞれのウェルに、複数の該細胞が播種され、複数のウェルもしくはそれぞれのウェルが1つの単一のオルガノイドを含むマルチウェルプレートが得られる、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記請求項のいずれか記載の方法により得られるオルガノイドまたは複数のオルガノイド。
【請求項４】
(a)該オルガノイド(1つまたは複数)が、(a)神経オルガノイド(1つまたは複数)、(a)好ましくは中脳オルガノイド(1つまたは複数)または(a)パターン形成されない同質の脳オルガノイド(1つまたは複数)であり；
(b)該オルガノイド(1つまたは複数)が、
(i)複数の同一中心の領域、好ましくは少なくとも3つの領域、ここでそれぞれの領域は、細胞組成および組織化に関して他の領域のいずれかとは異なる、を示し；および/または
(ii)該オルガノイド(1つまたは複数)が、組織特定的細胞活性、好ましくは神経オルガノイドの場合はニューロンにおける電気的活性を示し、および/または
(c)該複数のオルガノイドが構造および/またはサイズに関して同質である、
オルガノイドまたは複数のオルガノイドであって；
該オルガノイドまたは該複数が、好ましくは請求項２記載の方法により得られる、オルガノイドまたは複数のオルガノイド。
【請求項５】
複数のウェルがそれぞれ1つの単一オルガノイドを含むかまたはそれぞれのウェルが1つの単一オルガノイドを含み、好ましくは複数のオルガノイドまたはそれぞれのオルガノイドが、請求項３もしくは４で規定されるかまたは請求項１もしくは２記載の方法により得られる、マルチウェルプレート。
【請求項６】
オルガノイド作製のための組織特異的前駆細胞の使用であって、細胞または凝集物を埋め込むためにゲルが使用されず、好ましくは該組織特異的前駆細胞がニューロン組織特異的前駆細胞、好ましくは小分子ニューロン前駆細胞(smNPC)である、使用。
【請求項７】
分析のためのオルガノイドまたはスフェロイドを作製する方法であって、
(a)該オルガノイドまたはスフェロイドを染色する工程；
(b)該オルガノイドまたはスフェロイドを用いて組織透明化を実施する工程
を含むまたは該工程からなる、方法。
【請求項８】
(a)該染色が、
(i)抗体、好ましくは一次抗体および二次抗体を用いて実施され、ここで該一次抗体および/または該二次抗体を用いた染色が、約5〜約10日間、好ましくは約6日間実施される；
(ii)蛍光標識；
(iii)発光標識；
(iv)放射性標識を用いて実施され；
および/または
(b)該透明化が、ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジル(BABB)系透明化であり、好ましくは該透明化が、シクロオレフィン容器、より好ましくはシクロオレフィンマルチウェルプレート中で実施される、
請求項７記載の方法。
【請求項９】
(a)該方法が該オルガノイドもしくはスフェロイドの切片化を含まず、および/または該染色がホールマウント染色であり；および/または
(b)該オルガノイドが、請求項３もしくは４記載のオルガノイドであるかまたは請求項１もしくは２記載の方法により得られる、
請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
オルガノイドまたはスフェロイドを分析する方法であって、該方法が、請求項７〜９いずれか記載の方法；および
(c)染色および透明化されたオルガノイドもしくはスフェロイドの分析、好ましくは
(c-i)光学分析、ここで該光学分析は好ましくは顕微鏡検査および/または画像分析を含む；
(c-ii)RNA配列決定などの遺伝的分析；および/または
(c-iii)質量分析法もしくはウエスタンブロットなどのタンパク質分析、を含むかまたはそれからなる方法。
【請求項１１】
オルガノイドを調製および分析する方法であって、請求項１または２記載の方法および請求項１０記載の方法を含むかまたはそれらからなる、方法。
【請求項１２】
オルガノイド、オルガノイド形成および/またはオルガノイド特異的機能の調節因子を同定する方法であって、
(a) (i)好ましくは請求項３もしくは４記載のオルガノイドまたは請求項１もしくは２記載の方法により得られるオルガノイドに試験化合物を添加する工程；
(ii)組織特異的前駆細胞に試験化合物を添加した後に、請求項１もしくは２記載の方法を実施する工程；または
(iii)請求項１もしくは２記載の方法を実施する工程、ここで試験化合物は、請求項１もしくは２記載の方法を実施する間に1以上の時点で添加される；
(b)請求項１０記載の方法を実施する工程；
(c)該試験化合物の存在下の該分析の結果と、該試験化合物の非存在下の該分析の結果を比較する工程、ここで差は、調節因子を示す、
を含むかまたは該工程からなる、方法。
【請求項１３】
(a)該分析が、該オルガノイドの機能的向上、オルガノイド形成および/またはオルガノイド特異的機能を示す場合、該試験化合物がリード化合物であり、該方法が任意に、該リード化合物を開発して薬物を生じる工程をさらに含むかまたはさらに該工程からなり；あるいは
(b)該分析が、該オルガノイドの機能の低下および/またはオルガノイド形成およびまたはオルガノイド特異的機能との負の干渉を示す場合、これが、該試験化合物が毒性であることを示す、
請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
(a)自動化された様式；および/または
(b)好ましくはマルチウェルプレート、ピペッティングロボット、自動化された液体ハンドリング、プレートリーダーおよび/またはプレート輸送のための手段を使用したハイスループット形式
で実施される、請求項１、２または７〜１３いずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
(a)組織特異的前駆細胞、好ましくはニューロン組織特異的前駆細胞、より好ましくはsmNPC；および
(b)培地
を含むかまたはそれらからなるキットであって、該培地が、
(b-i)凝集培地、ここで該凝集培地は好ましくはポリビニルアルコールを含む；
(b-ii)成熟培地；および
(b-iii)任意に、腹側パターン形成培地
を含むかまたはそれらからなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(a)複数の組織特異的前駆細胞を容器に播種する工程；(b) (i)該細胞の凝集；および(ii) (i)で形成された凝集物の単一のオルガノイドへの成熟を起こさせる工程を含むかまたは該工程からなるオルガノイドを生成する方法に関し、ここで該方法は、該細胞または該凝集物をゲルに埋め込むことを含まない。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連のあるものとはみなされないが、それらの全体において参照により本明細書に援用される。より具体的に、全ての参照される文書は、それぞれ個々の文書が参照により援用されると特にかつ個々に示される場合と同程度に参照により援用される。
【０００３】
臓器様微小組織(「オルガノイド」)の形態の三次元(3D)細胞培養は、過去数年にわたり、急速に以下のことを見出した。2D細胞培養よりも厳密に、オルガノイドが細胞性ニッチを模倣する潜在能力は、薬物効力および毒性のより関連のある予測を提供し得る次世代のハイスループットスクリーニング(HTS)を発展させる見込みがある。これらは、特定の細胞性ニッチにおけるいくつかの細胞の種類の複雑な相互作用を伴うパーキンソン病、アルツハイマー病および他の障害などの特有のヒト疾患のより良いモデリングを可能にし得る。
【０００４】
しかしながら、当該技術分野の現在の状態は多くの種類のオルガノイドの生成を可能にする一方で、精密な標準化されたオルガノイド生成およびスクリーニングに必要とされる定量化方法が分かりにくくなっている。ほとんどの確立されたプロトコルは、予想可能な形態、細胞組成および局所的細胞組織化を伴わずに、複雑でさらに非常に不均一なオルガノイドを生じる。厄介なマトリックス埋め込み工程を含む義務的で広範囲な手動の取り扱いは、ほとんどのプロトコルを工業的大規模化について困難なものにする。さらに、既存の分析方法は、大規模化しない(例えば切片化および免疫染色、RNA配列決定)かまたはサイズおよび形態の測定値(Hou, Y., Konen, J., Brat, D.J., Marcus, A.I. & Cooper, L.A.D. TASI: A software tool for spatial temporal quantification of tumor spheroid dynamics. Sci Rep 8, 7248 (2018)；およびKang, A., Seo, H.I., Chung, B.G. & Lee, S.H. Concave microwell array-mediated three dimensional tumor model for screening anticancer drug-loaded nanoparticles. Nanomedicine 11, 1153-1161 (2015))もしくは全体的な細胞生存能力(Vlachogiannis, G. et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science 359, 920-926 (2018)をほとんどあてにしないかのいずれかであるが、細胞性分解能を有する情報を提供しない。最終的に、三次元ニッチに関して細胞-細胞相互作用を明らかにするデータは不足している。
【０００５】
先行技術の制限を考慮して、本発明の基礎となる技術的課題は、オルガノイドの生成、取扱いおよび/または分析のための向上された手段および方法の提供に見られ得る。
【０００６】
この技術的課題は、特許請求の範囲の主題により解決される。
【０００７】
従って、第1の局面において、本発明は、オルガノイドを生成する方法に関し、該方法は：(a)複数の組織特異的前駆細胞を容器に播種する工程；(b) (i)該細胞の凝集；および(ii) (i)で形成された凝集物の単一オルガノイドへの成熟を起こさせる工程を含むかまたは該工程からなり、ここで該方法は、該細胞または該凝集物をゲルに埋め込むことを含まない。
【０００８】
用語「オルガノイド」は、その当該技術分野で確立された意味を有する。したがって、該用語は、インビトロにおいて三次元で生成される臓器の小型化されたバージョンに関する。オルガノイドは、インビボにおいて天然の組織のものに似た微小解剖学および細胞機能を示す。典型的に、オルガノイドは、複数の臓器特異的細胞型を含み、ここで該細胞型は、典型的に層にある神経オルガノイドの場合に、画定される様式で空間的に組織化される。一般的に、複数の細胞型の該画定された空間的な組織化は、オルガノイドの形成の際に起こる自己組織化の結果である。オルガノイドは、好ましくは自己組織化マトリックス中で、互いに空間的および/または機能的に相互作用する異なる細胞型を含む。用語「自己組織化マトリックス」は、異なる細胞機能および同一性を有する細胞の空間的配置をいい、該配置は、部分的または全体的に、インビボで天然の組織において見られる細胞配置と似ている。また、該配置は、培養において延長された期間維持され得る。この文脈において「延長された期間」は、典型的に約100日より長いかまたは約200日より長い。
【０００９】
機能に関して、オルガノイドは一般的に、対応する臓器の1つ以上の特定の機能を反復し得る。
【００１０】
そのため、オルガノイドは、スフェロイドおよび凝集物とは異なる。スフェロイドは、典型的に、オルガノイドよりも小さいサイズ(直径約10〜約200μm)であり、明確な層などの明確な細胞組織化を欠損する細胞凝集物である。本発明によると、「スフェロイド」および「凝集物」は、同じ主題をいう。好ましくは、オルガノイドは、サイズに関してはスフェロイドよりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍大きい。サイズの好ましい基準は、最大断面の直径である。
【００１１】
オルガノイドの生成に関して、細胞またはその凝集物は三次元(3D)培地で培養される必要があるという当該技術分野における一般的な理解がある。かかる3D培地の顕著な特徴は、該培地は固体または半固体、典型的にゲル様であり、および/または天然もしくは人工のヒドロゲルで構成されるということである。3D培地またはゲルの使用は、オルガノイドの培養のために必要不可欠であると考察される。用語「3D培地」および「ゲル」は、本開示において交換可能に使用される。該ゲルは、基底膜様マトリックス、マトリゲル、コラーゲン、デキストランおよび細胞外マトリックスから選択され得る。かかる材料は当該技術分野で周知であり、例えばSemin Cancer Biol. 2005 Oct;15(5):378-86, Matrigel: basement membrane matrix with biological activity; Kleinman HK1, Martin GR；およびGjorevski, N. et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature 539, 560-564 (2016)に記載される。
【００１２】
驚くべきことに、本発明者らは、一般的な理解とは反対に、上述の3D培地およびゲルはなくても済むということを見出した。3D培地またはゲルを不要にすることはいくつかの利点を含む。第1に、培養の間の材料の取り扱いは、自動化に対してより厄介でなくなり、より従順である。実際に、本発明による手順の高度な自動化は先例がない。第2に、ゲルの回避は、生成されたオルガノイドをより同質にすると理解される。以下により詳細に記載されるように、同質性の局面は、サイズを含むがそれに限定されない。本発明によるオルガノイドは、好ましくは約500μm〜約2mmのサイズおよび平均から約20%未満の標準偏差を有する。
【００１３】
(a)に従って細胞を播種する工程、続いて工程(b)は、該容器内の単一のオルガノイドの形成を提供する。以下により詳細に記載されるように、かつ本発明の方法は自動化およびハイスループットに従順であるということに注意して、マイクロウェルプレートのウェルなどの複数の容器は、自動化された様式でかつ同時に取り扱われ得、それにより本発明の方法の形式が可能になり、ここで複数の容器が取り扱われ、工程(a)および(b)の結果として、それぞれの容器は単一のオルガノイドを含む。
【００１４】
そうでなければ、細胞を播種する工程(a)および工程(b)は、当該技術分野で確立された手順に従い得る。本発明によるその好ましい態様を、以下にさらに記載する。
【００１５】
別の重要な特徴は、組織特異的前駆細胞の使用である。多くの例において当該技術分野で確立された方法は、胚性幹細胞または多能性細胞を使用するが、組織特異的前駆細胞の使用は、得られるオルガノイドの同質性を確実にするおよび/または増加する手段である。
【００１６】
播種する工程は、例えば所定の数の細胞を、凝集を引き起こさせる培地に添加することにより実行され得る。適切な培地は当該技術分野で公知であり、実施例においてより詳細に記載される。所定の容器に播種される細胞の好ましい数は、以下にさらに詳述される。
【００１７】
本発明の方法の実施の間に生じる段階のいずれも、3D培地またはゲルに埋め込まれない。特に、凝集物はゲルに埋め込まれない。これは、典型的に10〜15日の期間の後に凝集物のゲルへの埋め込みを規定する従来のプロトコルとは異なる。確立された意見とは反対に、本発明者らは、ゲルへの埋め込みはなくても済み、明らかな利点を提供することを示した。これらの利点は、大規模化およびハイスループットに対して従順な自動化された様式でオルガノイドの生成および取り扱いを実行する可能性を含む。
【００１８】
好ましい態様において、(i)該オルガノイドは、神経オルガノイド、好ましくは中脳オルガノイドまたはパターン形成されていない(non-patterned)同質の脳オルガノイドであり；該組織特異的前駆細胞は、ニューロン組織特異的前駆細胞、好ましくは小分子ニューロン前駆細胞(smNPC)であり；(ii)該オルガノイドは、再現可能もしくは同質のサイズおよび/または細胞組成を有し、同質は、好ましくは平均の20%未満またはそれ以下の標準偏差を意味し；(iii)工程(b)は、(b-i)凝集培地中で好ましくは約2日間培養すること、該凝集培地は好ましくはポリビニルアルコールを含む；(b-ii)成熟培地中で培養すること；および(b-iii)好ましくは(b-i)と(b-ii)の間に、腹側パターン形成培地中で好ましくは約4日間培養することを含み；(iv)該複数の細胞は、約100〜約1000000、好ましくは約10000細胞であり；および/または(v)該容器は、マルチウェルプレートのウェルであり、ここで好ましくは該マルチウェルプレートの複数のウェルまたはそれぞれのウェルに、複数の該細胞が播種され、複数のウェルまたはそれぞれのウェルが1つの単一オルガノイドを含むマルチウェルプレートが得られる。
【００１９】
このように、神経オルガノイドの生成に関する好ましい態様(i)において、特定の種類のニューロン前駆細胞、すなわち小分子ニューロン前駆細胞(smNPC)に好適さが与えられる。これらの特定のニューロン前駆細胞(例えばReinhardt, P. et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One 8, e59252 (2013)参照)は、培地において必要とされる因子に関して、小分子で十分であるという利点を有する。特に、タンパク質系成長因子は必要ない。用語「小分子」は、その当該技術分野で確立された意味を有する。このように、小分子は、典型的に1000Da未満、好ましくは900Da未満の分子量を有する低分子量有機化合物に関する。核酸、タンパク質、ポリペプチドおよび多糖などの生物学的大分子は、用語「小分子」に包含されない。
【００２０】
該中脳オルガノイドは、本発明によるその都合の良いかつ自動化された生成のために、「自動化中脳オルガノイド(AMO)」とも称される。
【００２１】
上述されるように、本発明による神経の第2の好ましい態様は、パターン形成されていない同質の脳オルガノイド(NABO)である。NABOを調製する場合、パターン形成因子無しで分化が行われる。結果的に、NABOは、特定の運命または中脳などの脳領域に方向づけられない。その代り、NABOは一般的なニューロンオルガノイドまたは一般的な脳様オルガノイドである。好ましくは、培養の28日後、NABOは、マーカーDCX、MAP2およびTubb3ならびにシナプス(シナプシン)により特徴付けられるような初期の分裂後および成熟ニューロンを含む。経時的に、NABOは、GFAPおよびS100発現により証明されるような星状細胞を含むグリア細胞を含むようにさらに成熟する。全体的に、NABOは、サイズおよび内部組織化の両方において高度な構造同質性を有する。成熟の際のパターン形成因子の非存在を除いて、NABOの調製はAMOの調製と対応する。
【００２２】
上述のsmNPCの定義において使用される場合、用語「培地」は、該smNPCの二次元培養に使用される培地をいう。さらに説明するために、該二次元培養は、細胞分裂により十分な量のsmNPCを生成するように働く。したがって、該二次元培養は典型的に、第1の局面による方法より先に起こる。すなわち、第1の局面の方法は、工程(a)より先に起こる工程として前述の二次元培養を含み得るが、含まなくてもよい。
【００２３】
かかることをいうと、本発明の第1の局面による方法について使用される場合、第1の局面の該方法の工程(a)も因子としてタンパク質またはペプチドを必要とせずに、小分子のみを必要とすることがsmNPCの重要な特徴である。これは、以下にさらに与えられる凝集培地の構成要素のリストからも明らかである。好ましい小分子は、スムーズンド(Smoothened)アゴニスト(SAG)およびCHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル)である。
【００２４】
本発明による特定の好ましい中脳オルガノイドは、ドーパミン作動性ニューロンを含む。該オルガノイドは、とりわけ中脳の黒質の挙動を模倣する。かかる性質を有するオルガノイドを生成するために、本明細書に開示される腹側パターン形成の工程が好ましい。
【００２５】
当該技術分野で確立されたゲルに埋め込む工程は、人力の介入を必要とする厄介なプロセスである。さらに、およびゲルドロップ内の凝集物の正確な配置は再現することが困難であることに注意すると、ゲルのドロップ内に配置された後のそれぞれの凝集物は、典型的に異なる環境を経験する。これらの制限および望ましくない変動は、第1の局面による方法により克服される。その直接的な結果として、および先に開示された好ましい態様の項目(ii)にしたがって、本発明の方法により得られるオルガノイドは、性質に関して高度に再現可能である。かかる同質性は、バッチ内変動およびバッチごとの変動の両方をいう。前者に関して、平均からの典型的な標準偏差は5%未満であり、後者に関して、平均からの典型的な標準偏差は25%未満、20%未満または15%未満である。同質性の程度を決定するために使用される好ましいパラメーターは、直径を含むサイズおよび/または細胞組成である。本明細書に含まれる実験データは、該同質性の証拠を提供する。向上された同質性は、向上された再現性および向上された予測可能性に付随する。
【００２６】
第1の局面の方法のさらなる特徴は、当該技術分野で確立されたバイオリアクター内のオルガノイド培養において一般的に実施されるような撹拌はなくても済むということである。したがって、好ましい態様において、該方法は撹拌することを含まない。
【００２７】
ゲルの使用を不要にすることに加えて、本発明者らは、凝集および成熟のための条件のさらなる最適化を行った。より具体的に、および先に開示される態様の項目(iii)に従って、凝集培地(その好ましい組成は以下にさらに記載される)中での培養は約2日間行う。これは、当該技術分野で確立されたプロトコルと比較して短い期間であり、当該技術分野で確立されたプロトコルは、細胞を、本明細書において「凝集培地」と称される同じ培地中に、延長された時間残すことを規定する。凝集培地中での培養の後に、成熟培地中での培養を続け、ここで中脳オルガノイドの生成の文脈において好ましい任意の介在工程は、腹側パターン形成培地中での培養を規定する。凝集培地から成熟培地へまたは任意に腹側パターン形成培地への好ましい早期の切り替えは、生成されるオルガノイドの同質性を高めるさらなる手段である。
【００２８】
さらに好ましい態様において、ウシ胎仔血清(FCS)は、凝集には使用されない。凝集を増大するために、好ましくは0.1%(w/v)〜1%(w/v)の濃度のポリビニルアルコール(PVA)を添加することが好ましい。
【００２９】
第1の局面の方法の項目(a)に従って播種される複数の細胞の好ましい細胞数は、項目(v)に与えられる。該複数の細胞を構成する例示的な細胞数は約9000細胞である。
【００３０】
好ましい自動化および/またはハイスループットの実行に従って、項目(vi)は、マルチウェルプレートの使用を規定する。重要なことに、好ましくはマルチウェルプレートのそれぞれのウェルは、1つの単一オルガノイドを含む。
【００３１】
これは、パラクリンシグナル伝達のための効果などのバッチ効果が生じないことにおいて有利である。パラクリンシグナル伝達が所望となる程度に、所定の容器またはウェル内に1つより多くのオルガノイドを配置するように、ワークフローは容易に変更され得る。
【００３２】
本発明によるオルガノイドの生成のためのプロトコルの特に好ましい実行が、実施例1の対応するサブセクションに与えられる。
【００３３】
第2の局面において、本発明は、前記請求項のいずれかに記載の方法により得られるオルガノイドまたは複数のオルガノイドに関する。
【００３４】
オルガノイドを生成する別個の方法のために、得られるオルガノイドは、先行技術のオルガノイドとは異なる。
【００３５】
これは、著しい程度の同質性を含む；実施例2のセクションタイトル「同質性」ならびに図1および8〜11参照。これらの図は、十分に画定された球形および半径などの幾何学的パラメーターの非常に狭い分布を特徴とする本発明のオルガノイドと比較して、複数の先行技術またはオルガノイドの形態学的不均一性およびサイズの不均一性を強調する顕微鏡画像を含む。
【００３６】
したがって、特にオルガノイドの集団にわたる先例のない同質性を考慮すると、本発明によるオルガノイドは、先行技術の任意のオルガノイドとは本質的に異なることが明らかである。該同質性は、先行技術のオルガノイドでは可能ではない使用を可能にし、かかる使用は、薬物スクリーニングおよび毒物学スクリーニング(実施例も参照)を含む。
【００３７】
サイズおよび/または形状の同質性を定量化するためのパラメーターは以下：
【数１】
2022500033.tif 000002
として定義される球形度Ψを含み、式中、Vpは、体積および粒子であり、Apは、粒子の表面積である。球でない任意の粒子は、1未満の球形度を有する。
【００３８】
好ましい態様において、本発明によるオルガノイドは、0.85〜1.0、より好ましくは0.9〜1.0およびさらにより好ましくは0.95〜1.0の球形度を有する。
【００３９】
二次元画像に基づいて同質性が決定される程度にまで、先に定義された球形度の二次元対応物が使用され得る。例を与えるために、内接円と外接円、すなわち考慮中の形状の内側に適合して囲い込むのにちょうど十分な円についての最大および最小のサイズのそれぞれの間の比である真円度が使用され得る。したがって、二次元対象の真円度は、R=ri/rcとして定義され得、式中riおよびrcは、内接円および外接円のそれぞれの半径である。
【００４０】
好ましい真円度の値は、0.85〜1.0、より好ましくは0.9〜1.0およびさらにより好ましくは0.95〜1.0である。
【００４１】
さらなる適切なパラメーターは、最大直径dの分布の幅、最大直径の変動係数(CV)、最大断面積Amaxの分布の幅および該最大断面積のCVである。本発明のNABOについてのAmaxのCVについての例示的なデータを図13に与える。
【００４２】
最大直径dの分布の幅に関して、本発明により得られる複数のオルガノイドにおいて測定される最大直径の90%は、最大直径の平均の+/-20%、より好ましくは+/-10%以内にあることが好ましい。Amaxの分布について、必要な変更を加えて同様のことが適用される。
【００４３】
dおよびAmaxの両方についてのCVの好ましい範囲は10%未満、5%未満、4%未満または約3%である。
【００４４】
重要なことに、かかる同質性は、型などの特定の形状および/または同質性を与え(impose)得る任意の種類のデバイスに頼らずに達成される。さらに説明するために、オルガノイドの生成の間および/またはその後に型、例えば3Dプリンターにより生成された型を利用することが考えられる。かかる型は、形状および/または同質性をオルガノイドに与え得、ここで該オルガノイドは、デバイス、例えば型の非存在下で、デバイス、例えば型により与えられた形状および/または同質性を示さないオルガノイドであり得る。結果的に、第1の局面の方法の好ましい態様において、型を使用しないことが理解される。同様に、本発明によるオルガノイドは、好ましくは生成の間またはその後に型により形付けられていないオルガノイドである。該デバイスまたは型がないことは、本発明の全ての局面の好ましい態様である。
【００４５】
第1の局面による容器は、型または形付けデバイスとして働かないことが理解される。好ましくは、容器の寸法は、オルガノイドのサイズよりも、例えば少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍大きい。「寸法」は、該容器の口径および/またはその深さであり得る。
【００４６】
好ましい態様において、(a)該オルガノイド(1つまたは複数)は、(a)神経オルガノイド(1つまたは複数)、好ましくは(a)中脳オルガノイド(1つまたは複数)または(a)パターン形成されていない同質の脳オルガノイド(1つまたは複数)であり；(b)該オルガノイド(1つまたは複数)は、(i)複数の同一中心の領域(zone)、好ましくは少なくとも3つの領域、ここでそれぞれの領域は、細胞組成および組織化に関して他の領域のいずれかと異なる、を示し；および/または(ii)該オルガノイド(1つまたは複数)は、組織特異的細胞活性、好ましくは神経オルガノイドの場合、ニューロンにおける電気活性を示し；および/または(c)該複数のオルガノイドは、構造および/またはサイズに関して同質であり；ここで該オルガノイドまたは該複数は、好ましくは第1の局面による方法により得られる。
【００４７】
これに関連して、本発明は、第2の局面において、オルガノイドまたは複数のオルガノイドを提供し、ここで(a)該オルガノイド(1つまたは複数)は、(a)神経オルガノイド、好ましくは(a)中脳オルガノイド(1つまたは複数)または(a)パターン形成されていない同質の脳オルガノイド(1つまたは複数)であり；(b)該オルガノイド(1つまたは複数)は、(i)複数の同一中心の領域、好ましくは少なくとも3つの領域、それぞれの領域は、細胞組成および組織化に関して他の領域のいずれかと異なる、を示し；および/または(ii)該オルガノイド(1つまたは複数)は、組織特異的細胞活性、好ましくは神経オルガノイドの場合、ニューロンにおける電気活性を示す。
【００４８】
上述の同一中心の領域は実施例においてさらに詳述される。4つの同一中心の領域の存在が特に好ましい。これは、図2aおよび2cに見られ得る。上述の4つの同一中心の領域の好ましい細胞組成は、実施例2のサブセクションタイトル「自動化された中脳オルガノイドは典型的な神経および中脳マーカーを発現し、構造組織化を示す」において本発明による中脳オルガノイドについて記載される。上述のものに関連して、本発明により生成されるオルガノイドは、好ましくは球状であるかまたは放射状の対称性を示す。
【００４９】
項目(ii)は、臓器様の挙動の上述の再現(recaptulation)を規定する。驚くべきことに、および実施例2のサブセクションタイトル「カルシウム画像化は全オルガノイドにわたる自発的かつ同時発生的な活性を明らかにする」により詳細に記載されるように、本発明の第2および第3の局面によるオルガノイドは、全オルガノイドにわたり機能的に連結される。好ましい神経オルガノイドの文脈において、全オルガノイドにわたり観察される組織特異的細胞活性は、電気活性、より具体的には、好ましくは同時的な様式で複数のニューロンを含む電気活性である。本発明によるオルガノイドは、組織特異的タンパク質を産生および任意に分泌することも好ましい。
【００５０】
組織特異的タンパク質のモニタリングに関して、オルガノイド内に存在する神経前駆細胞の量の変化を検出するために、SOX2に指向された抗体を使用し得る。オルガノイド内のより成熟した神経細胞の量の変化を検出するためにMAP2に指向された抗体を使用し得る。
【００５１】
第4の局面において、本発明は、マルチウェルプレートを提供し、ここで複数のウェルはそれぞれ1つの単一オルガノイドを含むかまたはそれぞれのウェルは1つの単一オルガノイドを含み、好ましくは複数のオルガノイドまたはそれぞれのオルガノイドは、第2もしくは第3の局面に従って定義され、および/または第1の局面による方法により得られる。
【００５２】
上で注意されるように、本発明の方法の好ましい実行は、複数の容器、典型的にはマルチウェルプレートのウェルの使用を含む。かかる形式で本発明の方法を実施する際に、第4の局面によるマルチウェルプレートは、かかる方法を実行する結果である。
【００５３】
第1の局面に関連して、本発明は、第5の局面において、オルガノイド生成のための組織特異的前駆細胞の使用を提供し、ここで細胞または凝集物を埋め込むためのゲルは利用されず、好ましくは、該組織特異的前駆細胞は、ニューロン組織特異的前駆細胞、好ましくは小分子ニューロン前駆細胞(smNPC)である。
【００５４】
上述の本明細書の背景セクションにおいて説明されるように、オルガノイドに関連する本ワークフローは、いくつかの欠点に苦しむ。これらの欠点の1つは、当該技術分野で確立されたゲルへの埋め込みである。これは上に開示される本発明の局面により取り扱われる。先行技術手順のさらなる欠点は、オルガノイドのサイズの結果および顕微鏡における不透明な外観である。その結果として、従来の染色または標識アプローチは、約50〜100μmの浸透深さを有するオルガノイドの表面の分析を可能にするが、一方でオルガノイドに含まれる全ての細胞の包括的な分析を可能にすることには失敗する。
【００５５】
本発明は、第6の局面において、分析のためにオルガノイドまたはスフェロイドを調製する方法を提供することによりこの欠点を取り扱い、該方法は：(a)該オルガノイドまたはスフェロイドを染色する工程；(b)該オルガノイドまたはスフェロイドを用いて組織透明化(clearing)を実行する工程を含むかまたは該工程からなる。
【００５６】
第6の局面のこの方法の工程(a)および(b)は任意の順序で実行され得る。かかることをいうと、工程(b)の前に工程(a)を実行することに好適さが与えられる。これは特に、以下により詳細に記載されるベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジル(BABB)系の透明化の好ましい態様に関して適用される。
【００５７】
染色および組織透明化の特に好ましい実行は、実施例1の対応するサブセクションに与えられる。
【００５８】
好ましい態様において、(a)該染色は、(i)抗体を用いて、好ましくは一次抗体を用いておよび二次抗体を用いて実施され、ここで該一次抗体および/または該二次抗体を用いた染色は、約5〜約10日、好ましくは約6日間実施される；該染色は、(ii)蛍光標識；(iii)発光標識；(iv)放射性標識を用いて実施され；および/または(b)該透明化は、(BABB)系透明化であり、ここで好ましくは、該透明化は、シクロオレフィン容器、より好ましくはシクロオレフィンマルチウェルプレート中で実行される。
【００５９】
実施例に記載されるように、抗体を用いて染色する目的で、好ましくは0.1%(w/v)〜1.0%(w/v)、より好ましくは0.5%(w/v)の濃度のTriton-X 100を含む溶液を使用する。これは、本発明により開発されたオルガノイドの染色に対する特異的な適合と同様である(amount)。
【００６０】
染色手順の好ましい持続時間、すなわち約5〜約10日、好ましくは約6日は、オルガノイドの染色に対するさらなる特異的な適合である。
【００６１】
BABB透明化は、例えばDent, J.A., Poison, A.G. & Klymkowsky, M.W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development 105, 61-74 (1989)に記載される。
【００６２】
より好ましくはないが他の透明化方法も使用され得る。例は、Xクラリティー(X-clarity)(Logos biosystems (2015): X-CLARITYTM Tissue Clearing System, User Manual, LBSM-0005 Ver 1.8, 205.05.28, www.logosbio.com)、CUBIC (Susaki, E.A. et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc 10, 1709-1727 (2015)、ScaleSQ (Hama, H. et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci 18, 1518-1529 (2015)およびClearT (Kuwajima, T. et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development 140, 1364-1368 (2013))である。
【００６３】
適切な標識としては、ファロイジン、DAPIなどの核対比染色、ルシフェラーゼおよび生/死染色、すなわち細胞が死んでいるかまたは生きているかを示す色素が挙げられる。下記の毒性スクリーニングに関して後者が好ましい。
【００６４】
染色および透明化の組合せのために、全ての細胞を分析に従順にするために該オルガノイドの切片化はもはや必要でない。すなわち、好ましい態様において、(a)該方法は、該オルガノイドもしくはスフェロイドの切片化を含まず、および/または該染色はホールマウント染色であり；および/または(b)該オルガノイドは、第2もしくは第3の局面のオルガノイドであるか、または第1の局面の方法により得られる。
【００６５】
第6の局面の方法に関連して、第7の局面において本発明は、オルガノイドまたはスフェロイドを分析する方法を提供し、該方法は、第6の局面の方法；および(c)染色および透明化されたオルガノイドまたはスフェロイドの分析、好ましくは(c-i)光学的分析、ここで該光学的分析は好ましくは顕微鏡検査および/または画像分析を含む；(c-ii)RNA配列決定などの遺伝的分析；および/または(c-iii)質量分析もしくはウエスタンブロットなどのタンパク質分析を含むかまたはそれらからなる。透明化工程のおかげで、好ましくは単一細胞分解能レベルでオルガノイドの全ての細胞を分析し得、好ましくは可視になり得る。
【００６６】
本発明の先に開示された局面、特に両方が自動化およびハイスループットに従順である第1の局面によるオルガノイドを生成する方法および第7の局面によるオルガノイドを分析する方法を考慮して、本発明は、オルガノイドの調製および分析の自動化されて統合された方法を可能にする。これは、オルガノイドを調製および分析する方法に関する第8の局面の主題であり、該方法は、第1の局面の方法および第7の局面の方法を含むかまたはそれらからなる。
【００６７】
背景のセクションにおいて説明されるように、オルガノイドは、徐々に、リード化合物のスクリーニング、毒性試験、疾患モデルおよび個人化薬物(personal medicine)を含む医学の分野における価値のあるツールであると認識されるようになっている。したがって、第9の局面において、本発明は、オルガノイド、オルガノイド形成および/またはオルガノイド特異的機能の調節因子を同定する方法を提供し、該方法は、(a)(i)好ましくは第2もしくは第3の局面のオルガノイドまたは第1の局面の方法により得られるオルガノイドに試験化合物を添加する工程；(ii)組織特異的前駆細胞に試験化合物を添加してその後に第1の局面の方法を実施する工程；あるいは(iii)第1の局面の方法を実施する工程、ここで試験化合物は、第1の局面の方法の該実施の間に1つ以上の時点で添加される；(b)第7の局面の方法を実施する工程；(c)該試験化合物の存在下の該分析の結果と該試験化合物の非存在下の該分析の結果を比較する工程、ここで差は調節因子を示す、を含むかまたは該工程からなる。
【００６８】
好ましい態様において、(a)該分析が該オルガノイドの機能的向上、オルガノイド形成および/またはオルガノイド特異的機能を示す場合、該試験化合物はリード化合物であり、該方法は任意に、該リード化合物を開発して薬物を生じる工程をさらに含むかまたはさらに該工程からなり；あるいは(b)該分析が該オルガノイドの機能の低下、および/またはオルガノイド形成および/またはオルガノイド特異的機能との負の干渉を示す場合、該分析は該試験化合物が毒性であることを示す。
【００６９】
用語「リード化合物」は、本明細書で使用する場合、任意に最終的に薬物になるための最適化に供され得る化合物をいう。代替的に、リード化合物自体は薬物であり得る。上述の最適化は、安定性、薬物動態学および薬力学の最適化を含み得る。さらに、リード化合物は、特定の分子標的と関連し得、すなわちリード化合物は、結合体、好ましくは標的分子の阻害剤、好ましくは疾患に関連のあるものであると認識されているオルガノイドに含まれる細胞中で生じる分子であり得る。
【００７０】
おそらく、必ずしもそれに関連があるわけではないが、毒性試験の上述の局面はまた、薬物開発の文脈において関連し得る。すなわち、1つは有用な薬物候補であるリード化合物を示し、別の1つは、おそらく高い用量で、毒性を示す2つの読出しの同時の存在があることが考えられる。かかる状況、すなわち低濃度での有益な効果および高濃度での毒性効果の下で、リード化合物または薬物は、治療濃度域(therapeutic window)を備える。
【００７１】
さらなる局面において、本発明は、第1の局面の方法により生成されるかまたは第2もしくは第3の局面に従って疾患モデルであると規定される1つ以上のオルガノイドの使用を提供する。モデル化される疾患は遺伝的疾患であり得る。また、疾患は、病原体および/または疾患誘導化合物の添加により誘導され得る。
【００７２】
本発明の全ての方法の好ましい態様において、該方法は、(a)自動化様式で；および/または(b)ハイスループット形式で、好ましくはマルチウェルプレート、ピペッティングロボット、自動化液体ハンドブック、プレートリーダーおよび/またはプレート輸送のための手段を使用して実施される。
【００７３】
当該技術分野で確立されたマルチウェルプレート、例えば96、384または1536ウェルを有するプレートが使用され得る。
【００７４】
特定の好ましい態様において、市販のハイスループット設備は、本発明の方法を実施する際に直接使用され得、すなわちハードウェア調整は必要ない。
【００７５】
第10の局面において、本発明は、
(a)組織特異的前駆細胞、好ましくはニューロン組織特異的前駆細胞、より好ましくはsmNPC；(b)培地、該培地は、(b-i)凝集培地、該凝集培地は好ましくはポリビニルアルコールを含む；(b-ii)成熟培地；および(b-iii)任意に、腹側パターン形成培地を含むかまたはそれらからなる、
を含むかまたはそれらからなるキットを提供する。
【００７６】
凝集培地は、好ましくは、1:400希釈されたN2補充物、およびビタミンAを有さない1:200希釈されたB27補充物、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、200μMアスコルビン酸ならびに小分子SAG(0.5μM)およびCHIR 99021(3μM)で富化される1:1の比のDMEM-F12およびNeurobasal Mediumからなる。
【００７７】
好ましい腹側パターン形成培地は以下のとおりであり：CHIRが除去され、0.5ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)および1ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)が添加される以外は凝集培地と同じである。
【００７８】
好ましい成熟培地は以下のとおりであり：SAGが除去され、0.5〜1ng/mLトランスホーミング増殖因子β3(TGF-3)および100μMジブチリルサイクリックアデノシン一リン酸(dbcAMP)が添加される以外は腹側パターン形成培地と同じである。
【００７９】
本明細書、特に特許請求の範囲において特徴付けられる態様に関して、従属項において記載されるそれぞれの態様は、該従属項が従属するそれぞれの請求項(独立または従属)のそれぞれの態様と組み合されることが意図される。例えば、3つの選択肢A、BおよびCを記載する独立項1、3つの選択肢D、EおよびFを記載する従属項2ならびに請求項1および2に従属し、3つの選択肢G、HおよびIを記載する請求項3の場合、そうではないと具体的に記載されない限り、明細書は、組合せA、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I; A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、Iに対応する態様を明白に開示することが理解される。
【００８０】
同様に、ならびに独立項および/または従属項が選択肢を記載しない場合にも、従属項が複数の先行請求項を戻って参照する場合、それらにカバーされる主題の任意の組合せは、明示的に開示されると考えられることが理解される。例えば、独立項1、請求項1を戻って参照する従属項2ならびに請求項2および1の両方を戻って参照する従属項3の場合、請求項3および1の主題の組合せは、請求項3、2および1の主題の組合せと同様に明確かつ明白に開示されることに従う。請求項1〜3のいずれか1項を参照するさらなる従属項4が存在する場合、請求項4および1、請求項4、2および1、請求項4、3および1ならびに請求項4、3、2および1の主題の組合せは、明確かつ明白に開示されることに従う。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
図面は以下を示す：
【図１−１】図1：自動化は、同質の中脳オルガノイドのハイスループット適合性生成および分析を可能にする。aオルガノイド生成および光学分析を含む、本試験に使用される自動化HTS適合性ワークフローの概略的概観。
【図１−２】bオルガノイドサイズ(最大断面の面積)の測定により3つの独立の分化についての低い変動および類似した(parallel)成長速度論が明らかになる。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を示す、n≧20)。c AMOの形態学的同質性を示す光学顕微鏡検査画像。スケールバー：200μm。
【図１−３】dホールマウント染色および透明化後に神経マーカーMap2および神経前駆体マーカーSox2について染色された全オルガノイド(d 25)を示す共焦点切片の3Dレンダリング。下段：内部構造の視覚化のための切り抜き。スケールバー、100μm。
【図２−１】図2：自動化された中脳オルガノイドは典型的な神経および中脳のマーカーを発現し、構造組織化の徴候を示す。a単一の共焦点顕微鏡切片により示される場合、ドーパミン作動性中脳マーカーTHならびに前駆体マーカーNestinおよびSox2の発現は、25日目の全オルガノイド中に均一に分布される。点線のボックスはbに示される領域を示す。ここで、より高倍率の周辺オルガノイド領域は、ほとんどないが高密度の核を有する、コアから遠位の周辺に方向づけられた神経突起およびより近位のTH陽性ニューロンの放射状の構成の2つの異なる領域を明らかにする。
【図２−２】c DCXおよびBrn2の発現パターンはさらに、AMOのコア内のニューロン(DCX)および神経前駆体(Brn2)の同一中心領域への組織化を図示する。d(コアの周囲のニューロン(DCX)の周囲の組織化を強調するcにおける点線のボックスの拡大。e d25にAMO内で神経マーカーβ-チューブリンIII (TUBB33)を発現する高密度細胞ネットワークを示す蛍光共焦点画像の最大強度投影。f/g 中脳運命に向かう分化はさらに、25日目にTHと共に、Nurr1およびFoxa2の広く行き渡った発現により図示される。h/i AMOの継続的な成熟は、50日目のMap2陽性神経突起(h、右上の角は、Map2チャンネルなしの2つのシナプスの拡大を示す)および75日目のS100B/GFAP二重陽性星状細胞上のシナプス前のシナプトフィジン(synaptophysin)およびシナプス後のホマー(homer)の共局在により記されるシナプスの存在により示される。iスケールバー、100μm (a、c、e)、20μm (b、d、f、g、h、i)。
【図３−１】図3：定量的リアルタイムPCRは、経時的なAMOの成熟を示す。qPCRにより示されるAMOの発生の間の遺伝子発現の変化。AMOの継続的な成熟は、経時的な神経成熟(MAP2、NeuN、NEFL、TUBB3、TBR2、DCX、Syt1)、中脳(TH、GIRK2、NURR1、EN1、MIXL1)およびグリア(MBP、S100b、GLAST)マーカーの増加ならびに神経前駆体(Brn2、Sox1、Sox2、Pax6、Nestin)マーカーの減少により示される。(n=3の独立した分化、それぞれ2の技術的繰り返し、エラーバー=SEM)。
【図３−２】図3：定量的リアルタイムPCRは、経時的なAMOの成熟を示す。qPCRにより示されるAMOの発生の間の遺伝子発現の変化。AMOの継続的な成熟は、経時的な神経成熟(MAP2、NeuN、NEFL、TUBB3、TBR2、DCX、Syt1)、中脳(TH、GIRK2、NURR1、EN1、MIXL1)およびグリア(MBP、S100b、GLAST)マーカーの増加ならびに神経前駆体(Brn2、Sox1、Sox2、Pax6、Nestin)マーカーの減少により示される。(n=3の独立した分化、それぞれ2の技術的繰り返し、エラーバー=SEM)。
【図４】図4：カルシウム画像化により全オルガノイド中の自発的および同時の活性が明らかにされる。a AMOは、カルシウム活性の自発的な、オルガノイド全体のスパイク(organoid-wide spike)を示す。b光学的な断面の四分円への分割は、このカルシウム活性が全オルガノイドを通じて同時に起こっていることを示す。cこの同時性活性パターンは、単一細胞のレベルまで見られ得る。d均等に離れた単一細胞は、オルガノイド全体のスパイクよりも早いさらなるレベルの同時の活性を示す。e単一蛍光共焦点切片は、cおよびdにおいて測定された細胞の位置を示し、活性細胞の高密度ネットワークも示す。カルシウム動力学について動画2を参照されたい。スケールバー=100μm。
【図５−１】図5：RNA配列決定により、確立されたプロトコルと比較して、自動化された中脳オルガノイドにおいてバッチ内およびバッチ間のより低い変動性が明らかにされる。a 3つの独立した分化由来のAMOは、RNA配列決定データに基づくPCAプロットにおいて、Lancaster et al.によるプロトコルに従った1つのバッチ由来のiPSCオルガノイドよりも密接に一緒にクラスター化する。b PCAプロットの異なる群内の分散の定量化により、iPSC系Lancasterオルガノイドと比較して、AMOについて約6倍低い変動が明らかにされる。プレートの外側または内側からのオルガノイドの間で明らかな差はない。1群当たりn=8オルガノイド、n1外側=18およびn1内側=30を除く。
【図５−２】c 30日目AMOと45日目Lancasterオルガノイドの間の示差的遺伝子発現を示すプロット。AMO(点線のボックス)内で上方制御された遺伝子は、dにおけるGO項(term)分析に使用した。GO項分析により、AMO内で上方制御されたほとんどの遺伝子はニューロン成熟、特にシナプス活性に関連することが明らかにされる。GO項を意味論的類似性(semantic similarity)に基づいてグループ化するREVIGO (Supek, F., Bosnjak, M., Skunca, N. & Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PLoS One 6, e21800 (2011))による視覚化。それぞれのGO項は、円のサイズが項に含まれる遺伝子の数を示し、色が項の富化の有意さを示す円により表される。
【図６−１】図6：自動化されたホールマウント免疫染色は、定量的であり、自動化された中脳オルガノイドの高い同質性を明らかにする。a光学分析ワークフローは、3D凝集物中の細胞数の定量化を可能にする。凝集物中の蛍光細胞の数と本発明者らのワークフローにより測定されるその明るさの間の相関は、異なるサイズ(凝集物当たり100.000または200.000細胞、直径>800um)の大規模な3D凝集物について高度に線形である(R2>0.99)。n=3、エラーバー=SEM。
【図６−２】b本発明者らのHTS適合性光学分析ワークフローにより処理された全96ウェルプレート(左)およびハイコンテントイメージングにより達成された高い細胞分解能を示す単一オルガノイドの例示的単一平面共焦点画像(右)の概観。スケールバー=100μm。
【図６−３】c Sox2の例についての自動化された画像分析シークエンスの視覚化。画像は、AMOの中心を通る単一の自動的に取得された共焦点画像平面を示す。上の列：外観、と共に底の列は拡大図を提供する。c i/vi開始画像。c ii AMO検出についてまとめられた全ての3つのチャンネル。検出されたオルガノイド領域は緑色に塗られる。c iii/vii バックグラウンドを除去するための摺動パラボラ処理後のSox2チャンネル。c iv/viii検出した核を有するSox2チャンネル。c v サイズおよび明るさに従ってSox2+として選択された核(緑色)ならびに不採用となった核(赤色)。c ix hでマークされたものから選択された核、不採用となった核はマークされない。c x 核サイズおよび明るさ分布ならびに選択閾値を示す散乱プロット。スケールバー：100μm (c i)、上の列；70μm(c vi)、底の列。
【図６−４】d〜g) AMOは、AMOが含むSox2 (d/f)およびMap2 (e/g)陽性細胞の量に関して同質である。dおよびeにおいて、それぞれのドットは単一オルガノイドを表し、それぞれのプレートは独立した分化から生じる。連続した線は平均明るさ(すなわちMap2/Sox2含量)を表し、点線は1.5信頼区間に対応する。
【図６−５】fおよびgは、ドットプロットのデータを棒グラフとして要約する。(エラーバー=標準偏差、SD)。hそれぞれの画像化された共焦点平面において検出されたSox+核の数は、オルガノイドの形態に相関する。ハイコンテント画像分析ワークフローは、オルガノイドの直径が最大である(平面6〜10)多くの核およびオルガノイドの面積がより小さい第1/最後の平面におけるより少ない核を検出する。(エラーバー=SEM)。
【図７−１】図7：a)G418の濃度の増加とともにAMO中のアポトーシスcCasp3陽性細胞の増加を示す典型的なS字形状の用量応答曲線。x軸上のG418の対数濃度に対するy軸上の凝集物面積により標準化された凝集物中のcCasp3細胞の総数が示される。n≧3、エラーバー=SEM b) cCasp3シグナルはSox2との共局在をほとんど示さず、これはニューロン前駆体ではなく他のより成熟した細胞型が処理により主に影響を受けることを示す。アポトーシス細胞中のSox2+神経前駆体のパーセンテージは、阻害剤濃度に応じて増加するが、相対的に低いままであり、最大値は約15%である。n≧3、エラーバー=SEM
【図７−２】c)阻害剤濃度の増加に伴うAMO中のcCasp3+アポトーシス細胞の増加を示すハイコンテント光学分析パイプラインにより作成された例示的単一平面共焦点画像。本発明者らは、AMOを、培養の50日目で開始して、示される濃度のG418で4日間処理した。スケールバー=100μm。
【図８−１】図8：a) 形態およびサイズの両方において高レベルの同質性を示す、3つの完全に独立したバッチ/分化からの3つのAMOの代表的な写真。b)本発明者ら、続いてLancaster, M. A. et al. (Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379, doi:10.1038/nature12517 (2013))による最新式のプロトコルにより生成された全脳オルガノイド。自動液体取扱い系(ピペッティングロボット)の使用についてのプロトコルの最適化および標準化に関わらず、本発明者らは、高度に変動性の3D構造を得た。
【図８−２】c) Lancasterプロトコルの変更バージョンにも従うVelasco, S. et al. (Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature 570, 523-527, doi:10.1038/s41586-019-1289-x (2019))により公開された全脳オルガノイドはb)におけるものと同様の変動性の程度を示す。d)高い形態およびサイズの変動を示すMariani et al.3による脳オルガノイド。
【図９−１】図9：a)高度に秩序だった同質および再現可能な構造を示すAMOの内部構造の代表的な共焦点画像化写真。
【図９−２】b) Lancasterプロトコルの変更バージョンにより作成されたQuadrato, G. et al. (Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature 545, 48-53, doi:10.1038/nature22047 (2017))によるいくつかの全脳オルガノイドの概観。オルガノイドは全て同じ齢であるが、著しく異なる、無秩序かつ再現可能でない構造/内部組織化を示す。c) Lancaster, M. A. et al. (Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379, doi:10.1038/nature12517 (2013))による脳オルガノイドは、複雑ではあるが無作為的かつ再現可能でない組織化された構造を示す。d) Krefft, O., et al. (Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J Vis Exp, doi:10.3791/56768 (2018))による脳オルガノイドは、「標準化されかつ再現可能である」と記載されるが、不均一かつ予想できない構造を示す。
【図１０】図10：a) 高度に秩序だった同質かつ再現可能な構造を示すAMOの内部構造の代表的な共焦点画像化写真。b)本発明者らのものとほぼ同じであり、AMOよりも無秩序化された構造を示すプロトコルであるMonzel, A. S. et al. (Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports 8, 1144-1154, doi:10.1016/j.stemcr.2017.03.010 (2017))による中脳オルガノイドの概観。c)再現可能でない構造も示す最も周知の公開された中脳オルガノイドプロトコルであるJo, J. et al. (Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell 19, 248-257, doi:10.1016/j.stem.2016.07.005 (2016))による中脳オルガノイドの画像。
【図１１−１】図11：ここで、Velasco, S. et al. (Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature 570, 523-527, oi:10.1038/s41586-019-1289-x (2019))により、異なる最新式の/公開されたオルガノイドの細胞組成を分析した。a)当該技術分野において最も共通に使用されるプロトコルを依然として表すLancaster, M. A. et al. (Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379, doi:10.1038/nature12517 (2013))方法に従って自己パターン形成全脳オルガノイドを生成した。細胞組成の分析により、異なる試料の間で莫大な不均一性が明らかになった。オルガノイド中に存在することが主張されるいくつかの「重要な」細胞型(未成熟PN、青色のバー)は試験した試料の少数にのみ見られることが特に顕著である。
【図１１−２】b) Kadoshima, T. et al. (Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 20284-20289, doi:10.1073/pnas.1315710110 (2013))によるプロトコルの変更バージョンに従って、背側パターン形成前脳オルガノイドを生成した。Velasco, S. et al. (Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature 570, 523-527, oi:10.1038/s41586-019-1289-x (2019))は、これらが再現可能なモデルを表すことを主張する。実際にそれらは、a)におけるオルガノイドよりも再現可能であるが、グラフは依然として、単一試料の間、特に異なる細胞株の間で有意差を示す。
【図１２】図12：ホールマウント染色され透明化されたパターン形成されていない自動化された脳オルガノイド(NABO)の単一の光学共焦点切片(a〜c)または最大強度投影(d)。a/b)典型的な神経(DCX、Map2)および神経前駆体(Nestin、Brn2、Sox2)マーカーの発現は、オルガノイド中で均一に分布される。シナプスの存在は、シナプスマーカーシナプシンの発現により示される。経時的に、NABO成熟は、28日目(上パネル)から60日目(下パネル)までの神経およびシナプスのマーカーDCX、Map2およびシナプシンの発現の増加ならびに前駆体マーカーNestin、Brn2およびSox2の発現の減少によりさらに示される。c)後の時点(60日目)で、NABOは多くのGFAPおよびS100B陽性星状細胞を含み、それらの多くは両方のマーカーについて二重陽性である。d) NABOにおけるニューロンの高密度ネットワークを図示する成熟神経マーカーTUBB3の最大強度投影。
【図１３】図13：パターン形成されていない自動化された脳オルガノイド(NABO)は、それらのサイズおよび形態に関して高度に同質である。a)20の個々のオルガノイドのサイズ測定値(最大断面の面積)。いずれのドットも1つのオルガノイドを表し、線は全20個のオルガノイドの平均サイズに対応する。NABOのサイズ分布は、3%のみの変動係数を伴って非常にわずかな変動を示す。b)それらの同質なサイズおよび形態をさらに図示する9個のNABOの代表的な写真。スケールバー=200μm、a)およびb)に示される全てのオルガノイドは分析の前に45日間培養した。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【００８３】
実施例1
方法
smNPC培養
そうではないと示されない限り、全ての細胞およびオルガノイドを、37℃および5% CO2で維持した。本発明者らは、以前に記載されるように22わずかな改変を伴ってヒト小分子前駆細胞(smNPC)を培養した。簡潔に、本発明者らは、小分子スムーズンドアゴニスト(0.5μM、SAG, Cayman Chemical)およびCHIR 99021(3μM、Axon MedChem)を補充したN2B27培地中0.0125%(v/v) Matrigel (BD)コート6ウェルプレート(Sarstedt)内でsmNPCを成長させた。N2B27は、1:400希釈されたN2補充物(Thermo Fisher)、およびビタミンAなしの1:200希釈されたB27補充物(Thermo Fisher)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Thermo Fisher)、および200μMアスコルビン酸(Sigma-Aldrich)で富化された1:1の比のDMEM-F12(Thermo Fisher)およびNeurobasal培地(Thermo Fisher)からなった。典型的に、本発明者らは、培地を１日おきに交換した。細胞は、37Cで約15分間のアキュターゼ(accutase)処理(Sigma-Aldrich)を介して、1:10〜1:20の分割比で5〜7日毎に分割して、単一細胞溶液を生じた。消化を停止するために、細胞を、0.1% BSA (Thermo Fisher)を添加したDMEM-F12中に希釈して、1200gで2分間遠心分離した。細胞ペレットを新たなsmNPC培地(SAGおよびCHIRありのN2B27)に再懸濁して、Matrigelコート6ウェルプレート上で平板培養した。
【００８４】
AMO生成
アキュターゼによる消化後、本発明者らは、smNPC培地中、コニカル96ウェルプレート(Thermo Fisher)の各ウェル内に9000 smNPCを播種して、smNPCを2日間凝集させた。細胞間接着を増加させるために、本発明者らは、0.4%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)を添加した。2日目に開始して、SAGを継続して存在させてCHIR99021を除去することにより、2栄養補給(feeding)において4日間にわたり、細胞は腹側パターン形成を経験する。0.5ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF, PeproTech)および1ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF, PeproTech)の添加により、神経成熟の残りの間に成熟および細胞生存を増加させる。腹側化(ventralization)後、本発明者らは6日目にSAGを除去し、さらに0.5ng/mLトランスホーミング成長因子β3(TGFβ-3)および100μMジブチリルサイクリックアデノシン一リン酸(dbcAMP, Sigma-Aldrich)の添加により、中脳分化および成熟を支持した。5ng/mLアクチビンAの単回用量は6日目のみに添加した。所望の成熟度に応じて、成熟期間の持続時間は、100日以上まで延長し得る。
【００８５】
NABOの生成
自動化中脳オルガノイドと同様に、パターン形成されていない自動化脳オルガノイドを、十分に自動化された様式で、生成、維持および分析した。培地調製および培地のタイミングが異なるのみで、原理的なワークフローは同じままであり、種々の異なる、好ましくは神経構造の生成を適応させるための本発明の方法の柔軟さが示される。簡潔に、NABOを生成するための方法は以下のとおりである：
【００８６】
アキュターゼによる消化後、本発明者らは、smNPC培地中のコニカル96ウェルプレート(Thermo Fisher)の各ウェルに9000 smNPCを播種して、細胞を2日間凝集させた。細胞間接着を増加させるために、本発明者らは、播種培地に0.4%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)を添加した。smNPC培地は、小分子スムーズンドアゴニスト(0.5μM, SAG, Cayman Chemical)およびCHIR 99021 (3μM, Axon MedChem)を補充したN2B27培地に基づく。N2B27培地は、1:400希釈されたN2補充物(Thermo Fisher)、およびビタミンAなしの1:200希釈されたB27補充物(Thermo Fisher)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(Thermo Fisher)、および200μMアスコルビン酸(Sigma-Aldrich)で富化された1:1の比のDMEM-F12 (Thermo Fisher)およびNeurobasal培地(Thermo Fisher)からなった。2日目に開始して、培地からSAGおよびCHIRを抜き取り、1ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF, PeproTech)および1ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF, PeproTech)を添加することにより、凝集物は指向されない神経分化を経験する。これらの増殖因子は、神経成熟の残りの間に成熟および細胞生存を増加させる。所望の成熟度に応じて、成熟段階の持続時間は、100日以上まで延長され得る。分析のために、本明細書に開示されるように、オルガノイドをホールマウント染色して、光学的に透明化した。
【００８７】
オルガノイドのサイズ測定
AMOおよびNABOの両方のサイズ測定のために、本発明者らは、立体顕微鏡(Leica MZ10 F, camera: Leica DFC425 C)を使用して、無作為に選択されたオルガノイドの明視野画像を撮った。画像は、カスタム調整標準化ワークフローを使用して、ImageJ/Fiji (Schindelin, J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 9, 676-682 (2012))により処理した。自動閾値機能(auto threshold function)を使用して、オルガノイドをバックグラウンドから識別して、その後分析粒子きのう(analyze particles function)によりオルガノイドの面積の測定を行った。測定された面積は、オルガノイドの最大断面に対応する。さらなる分析のためにデータをマイクロソフトエクセルおよびGraphPad Prism v7.0 (Graphpad Software, Inc.)に出力した。
【００８８】
ホールマウント染色および透明化
HTS適合様式で3Dにおけるタンパク質発現を分析するために、本発明者らは、Lee et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue 579 clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep 6, 18631 (2016) に基づいたホールマウント染色プロトコルをオルガノイドに適合させて、該プロトコルを自動化液体取扱い系における使用のために最適化した。4% PFA (VWR)で10〜15分の固定後、本発明者らは、オルガノイドを、一次および二次抗体(Alexa Fluor二次抗体、Thermo Fisher)でそれぞれ6日間染色した。本発明者らは、抗体をブロッキングおよび浸透化溶液(PBS (Sigma-Aldrich)中6% BSA、0.5% Triton-X 100 (Roth)、0.1%(w/v)アジ化ナトリウム(Sigma-Aldrich))中に希釈して、それを2日毎に新しくした。一次抗体と二次抗体のインキュベーションの間、ならびに染色手順後に、本発明者らは、PBS中0.1% Triton X-100を用いて1時間で5回、オルガノイドを洗浄した。この極端に長い染色手順により、オルガノイドの大きなサイズおよび高密度に関わらず、抗体はオルガノイドに十分に浸透する。顕微鏡照明による十分な透過を可能にするために、ホールマウント染色手順の後にBABB系組織透明化、Dent, J.A., Polson, A.G. & Klymkowsky, M.W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development 105, 61-74 (1989)を続ける。第1に、オルガノイドを、メタノール(Roth)シリーズ(25%、50%、70%、90%、100%、それぞれ15分)により段階的に脱水した。次いで、オルガノイドを、有機溶媒耐性シクロオレフィン96ウェルプレート(「Screenstar」, Greiner Bio-One)に移した。試料を、1:1メタノール/389 BABB(安息香酸ベンジル(Sigma-Aldrich)およびベンジルアルコール(Sigma-Aldrich)1:1)中で30分間インキュベートして、続いて画像化のためにBABB中に維持した。本発明者らは、共焦点切片の3DレンダリングのためにImaris v8.4 (Bitplane, Oxford Instruments)を使用した(図1d)。
【００８９】
定量的リアルタイムPCR
本発明者らは、定量的リアルタイムPCR(qPCR)分析のために、製造業者の指示書に従ってNucleoSpin RNA XSキット(Macherey-Nagel)を使用して、RNA単離を行った。オルガノイドの齢に応じて、本発明者らは、下流の分析のための十分なRNAを得るために、1つのバッチから32(d6)、24(d16)または18(d30)のオルガノイドをプールした。本発明者らは、NanoDrop 8000分光光度計(Thermo Fisher)を使用してRNA濃度および純度を決定して、1反応当たり1000ng RNAを使用して、標準的なプロトコルに従って逆転写を行った。遺伝子発現の定量化のために、本発明者らは、製造業者の指示書に従って、Biomark 48.48一体化流体回路(IFC) Delta Geneアッセイ(Fluidigm)を使用した。簡潔に、14サイクルのプレ増幅後、試料をエクソヌクレアーゼI (New England Biolabs)処理(37℃、30分および80℃、15分)に供し、DNA懸濁バッファ(TEKnova)により20倍希釈した。試料(二連)およびアッセイ混合物を48.48マイクロ流動ICFチップに負荷し、BioMark リアルタイムPCRリーダー(Fluidigm)上でランさせ、ここで試料を増幅して、製造業者の指示書に従って測定した。BioMark リアルタイムPCR分析ソフトウェア4.3.1(Fluidigm)標準設定を使用してデータ分析を行った。さらなる処理のためにデータをマイクロソフトエクセル、およびプロット化のためにGraphPad Prism v7.0に移した。GAPDHはハウスキーピング遺伝子として機能した。
【００９０】
カルシウム画像化
カルシウム画像化のために、本発明者らは、オルガノイド培地に希釈した10μM細胞浸透Fluo-4 AM (Thermo Fisher)をオルガノイドに添加して、37℃で60分間インキュベートした。Dragonflyスピニングディスク共焦点顕微鏡(Andor, Oxford Instruments)を、10Hzの周波数で4分間使用して、画像化を行った。ImageJ/Fiji (Schindelin, J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 9, 676-682 (2012))を使用してデータ分析を行った。第1に、図4に示されるように異なるROIを画定した。次いで、これらのROI中の平均蛍光強度を経時的に測定して、GraphPad Prism v7.0を使用してプロットした。ImageJ/Fiji (Schindelin, J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 9, 676-682 (2012))により映像を集合させ、10Hzで4分の実時間を20秒の作動時間に圧縮するようにフレーム速度を加速させた。
【００９１】
iPSC培養
以前に記載された健常対照株45と共に、0.0125%(v/v) Matrigelコート6ウェルプレート中、改変されたFTDA培地(Frank, S., Zhang, M., Scholer, H.R. & Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PLoS One 7, e41958 (2012))を使用して、フィーダー不使用でヒトiPSC培養を行った45。FTDA培地は、1%ヒト血清アルブミン(Biological Industries)、1%化学的に画定された脂質濃縮物(Life Technologies)、0.1%インスリン-トランスフェリン-セレン(BD)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを補充されたDMEM-F12からなった。本発明者らは、iPSCに毎日栄養供給して、それぞれの培地交換前に10ng/mL FGF2 (PeproTech GmbH)、0.2ng/mL TGFβ3 (PeproTechGmbH)、50nM Dorsomorphin (Santa Cruz)、5ng/mLアクチビンA(eBioscience)、20nM C59 (Tocris)を添加した。本発明者らは、37℃で約10分間アキュターゼを使用して、3〜5日毎にiPSCを単一細胞として分割した。本発明者らは、播種される6ウェルプレートの1ウェル当たり600.000細胞を、0.1% BSAを有するDMEM-F12に移し、1200gで2分間遠心分離した。本発明者らは、1:2000 ROCK阻害剤Y-27632 (tebu-bio)を補充した新たなFTDA培地中に細胞ペレットを再懸濁して、iPSCを、Matrigelコート6ウェルプレート上で平板培養した。
【００９２】
iPSC系オルガノイド培養
iPSC由来オルガノイド生成について、本発明者らは、わずかな変更を有するLancaster et al.のプロトコル(Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379 (2013))に従って。簡潔に、本発明者らは、アキュターゼ処理によりiPSCを単一細胞に解離して、低FGF幹細胞培地(播種日に凝集を容易にするためのみでノックアウト血清代替品(KOSR、Thermo Fisher) 1:5、ウシ胎仔血清(Biochrom) 1:33.3、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、1%非必須アミノ酸(NEAA, Thermo Fisher)、β-メルカプトエタノール(Thermo Fisher) 1:143、4ng/μL FGF2、50μm ROCK阻害剤Y-27632および0.4% PVAを有するDMEM-F12)中、コニカル96ウェルプレート中の1ウェル当たり9000細胞を平板培養した。本発明者らは、培地を1日おきに交換して、FGF2およびY-27632を6日目に抜き取った。8日目に神経誘導が開始され(神経誘導培地：KOSR 1:5、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、1% 439非必須アミノ酸、N2補充物1:100およびヘパリン(Sigma-Aldrich) 1μg/mLを有するDMEM-F12)、1日おきに培地を交換して6日間継続した。13日目に、本発明者らは、凝集物を30μL matrigel滴に埋め込み、それらを、大脳オルガノイド分化培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、1% NEAA、N2補充物1:200、ビタミンAなしB27補充物1:100、インスリン(Sigma-Aldrich) 1:4000およびβ-メルカプトエタノール1:285714を有するDMEM-F12およびNeurobasal 1:1)中6cm2懸濁組織培養皿(Sarstedt)に移した。本発明者らは、培養皿を37℃および5% CO2で振盪器上に配置し、1日おきにオルガノイドに栄養供給した。20日目に、B27補充物をビタミンAありのB27(Thermo Fisher)で置き換え、オルガノイドを30/45日目まで培養した。
【００９３】
RNA配列決定
単一オルガノイドのRNAを単離するために、本発明者らは、製造業者の指示書に従ってDirect-zol-96 RNAキット(Zymo Research)を使用した。本発明者らは、標準的なプロトコルにより、NanoDrop 8000分光光度計を使用してRNA濃度および純度、ならびにBioanalyzer (Agilent Technologies)を用いてRNA完全性を評価した。次いで、NEBNextポリ(A)磁気単離モジュール(NEB)に続けて鎖特異的cDNA NGSライブラリー調製(NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina, NEB)を使用してmRNAを富化した。D1000 ScreenTape (Agilent 2200 TapeStation)を使用して、得られたライブラリーのサイズを調整して、および(und)NEBNext Library Quant Kit for Illumina (NEB)を使用して定量した。等モルのプールしたライブラリーを、95%>=Q30スコアの平均Qスコア分布を生じるv2化学を使用して、NextSeq 500 System (Illumina)上で単一読出しモード(75サイクル)において配列決定して、次いでデマルチプレックス(demultiplexed)して、bcl2fastq v2.20変換ソフトウェア(Illumina)によりFASTQファイルに変換した。
【００９４】
RNA配列決定分析
本発明者らは、RNA配列決定読出しを、デフォルト入力パラメーターを使用して、TopHat2アライナー(v2.1.1)46によりヒトゲノムhg19とアラインした。マッピングプロセスにおいてEnsembl (version GRCh37.87)からの遺伝子アノテーションを使用した。それぞれの遺伝子にマッピングされた読出しの数を、「htseq-count-mo 464 de union-stranded no」とともに、PythonパッケージHTSeq (v0.7.2) (Anders, S., Pyl, P.T. & Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166-169 (2015))を使用して計数した。主成分分析および示差的発現分析を、RパッケージDESeq2 (v1.18.1)を使用して、生の計数を使用して実施した。データ点と重心の間の平均距離を使用して、グループ内の分散を計算した。Benjamini-Hochberge多重検定調整(Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological) 57, 289-300 (1995))を使用して、|log2FC|>2およびFDR<0.05の場合に、遺伝子は脱制御(deregulated)されているとみなされた。遺伝子オントロジー(GO)項の富化は、バイオインフォマティクスウェブサーバーGorilla (Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D. & Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics 10, 48 (2009)により分析してREViGO40により視覚化した。全てのRNA配列決定データはNCBI GEOデータベースに寄託した。
【００９５】
ホールマウント染色および透明化の定量
本発明者らの画像化ワークフローがどのくらい定量的かを評価するために、本発明者らは希釈実験を行った。本発明者らは、標識されていないsmNPCと、異なるパーセンテージ(1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%)のCellTracker濃赤色色素(Life technologies)標識細胞(標準的なプロトコルに従い標識、色素濃度1:20000)を混合し、それらを、0.4% PVAを有するsmNPC維持培地内で凝集させた。定量に対する全体的な凝集物サイズの影響を調べるために、本発明者らは、合計100.000および200.000細胞を有する凝集物を生成した。凝集の1日後、凝集物を4% PFAで固定して、BABB系組織透明化に供し、画像化して、下記のように分析した。
【００９６】
ハイコンテントイメージングおよび分析
染色および透明化の後、本発明者らは、プレートを1分間、水平面を外して60°傾けることにより、ウェル内の均一な凝集物の配置を達成した。Operettaハイコンテント画像作成器(Perkin Elmer)において画像取得を行い、画像をHarmony 4.1ソフトウェアで分析した。本発明者らは、549μmの総スタック(stack)について36.6μmの平面間の間隔で、3つのチャンネル(DAPI、Sox2-488およびMAP2-647)において合計16の共焦点平面を取得し、全オルガノイドの高さをカバーした。それぞれの画像平面上のオルガノイド領域を画定するために、全ての3つのチャンネルを合計して、メジアンフィルターでフィルターをかけ、小さな局在化した特徴を除去し、明るい領域を、「画像領域発見」機能により同定した。10および3ピクセルのそれぞれの拡張(dilation)および侵食(erosion)工程によりオルガノイド領域の縁をきれいにした後、本発明者らは、最低300の任意明るさ単位(abu)および4000μm2のサイズを有する領域を選択することにより、真のオルガノイドを同定した。一般的なバックグラウンドからSox2+核をよりよく単離するために、本発明者らは、488チャンネル中各画像平面にわたり2の曲率設定を有する摺動パラボラアルゴリズムを走らせた。次いで、「核発見」機能、アルゴリズム「M」によりそれぞれのオルガノイド領域内で核を同定し、核が10um2より大きく、1200abuよりも明るい場合にSox2+であるとさらに選択した。本発明者らは、さらなる定量から6000abuよりも明るく70μm2よりも大きい核を省くことにより、画像アーティファクト、小さなほこりの粒子および重なった核を除外した。最終出力のために、488中の核および647中のオルガノイド領域の数および総明るさを、各ウェル中の全ての平面および全ての視野について合計し、さらなるアノテーション、分析およびプロット化のためにマイクロソフトエクセルおよびTIBCO Spotfireに移した。本発明者らは、ほこりの粒子、不適切な配置のために不完全に画像化されたオルガノイドまたは培養もしくは下流の処理の間に損傷を受けたかもしくは損なわれたオルガノイドを含むウェル由来のデータを省いた。プレート1、2および3は、同じ凍結バッチの別々に融解および培養された細胞の独立の分化を表す。
【００９７】
パッチクランプによる単一細胞の電気生理学的分析
AMOの形態(高い光学密度およびほとんどの細胞体は、少なくとも10〜20μmの深さに局在するという事実)のために、完全な(intact)凝集物に対してパッチクランプ測定を行うことは技術的に不可能であった。そのため、オルガノイドを1mg/mlトリプシンで処理し、次いで機械的に分散させて、単一細胞を得た。これらを、PDLコートカバーガラス上に播種し、AMO培地中で1〜3日間培養した(本発明者らは、解離の時点のAMOの齢を記載した)。パッチクランプ技術の全細胞構成を使用して、単離した細胞から経膜的な電流を記録した(Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. & Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391, 85-100 (1981))。Sutter P1000 (Sutter Instrument company)ピペットプラー上でパッチピペットを、ホウケイ酸ガラスから生成した。ピペット溶液を充填した際に、ピペットは4〜6MΩの先端抵抗を有した。EPC-10増幅器(HEKA Elektronik)およびPatchmaster aqusitionソフトウェア(HEKA Elektronik)を使用して記録を行った。一連の抵抗、液体接合電位、ピペットおよび全細胞のキャパシタンスを電子的に消した。槽溶液は(mM)：NaCl 140、KCl 2.4、MgCl2 1.2、CaCl2 2.5、HEPES 10、Dグルコース10、pH7.4を含み、ピペット溶液は(mM): Kアスパラギン酸125、NaCl 10、EGTA 1、MgATP 4、HEPES 10、Dグルコース10、pH7.4 (KOH)を含んだ。本発明者らは、全ての実験を室温で行った。電流-電圧の関係(I-V曲線)の記録は、-70mVの保持電位で、電圧クランプモードで行った。誘起された活動電位の記録は、電流クランプモードで行った。Patcher's Power Tool routine for IgorPro (WaveMetrics)、SciDAVis (http://scidavis.sourceforge.net/)およびOrigin Pro 2019 (Origin Lab)を使用してデータを分析した。I-V曲線の形状を明らかにするために、ピーク振幅に対して単一の跡を標準化し、次いで平均した。
【００９８】
3D毒物学アッセイ
50日目に、本発明者らは、AMOを、培養培地に直接添加した増加濃度(0、5、50、100、250、500、1000μg/mL)のG418で処理した。2日後、本発明者らは、培地を新しくし(同じ阻害剤濃度を含む)、合計4日の処理の後に凝集物を固定した。固定、cCasp3およびSox2についてのホールマウント免疫染色ならびにBABB系透明化は上述のように行った。cCasp3染色の個々の明るさ、形態およびバックグラウンド特徴に適応させるようにわずかな変更を加えたハイコンテント分析のセクションに概略される工程の後に、画像分析を続けた。簡潔に、先に記載されるようにAMOおよびSox2+細胞を同定した後、AMOのそれぞれの共焦点切片にわたり10の曲率設定を有する摺動パラボラアルゴリズムを走らせて、cCasp3チャンネルをバックグラウンド補正した。本発明者らは、647チャンネルにおける「核発見」機能、アルゴリズム「M」によりアポトーシス細胞を同定し、該細胞が11μm2よりも大きく、100μm2よりも小さく、2700abuよりも明るい場合にさらにcCasp3+であると選択した。本発明者らは、細胞が同時の両方のフィルターについての基準を満たす場合に、細胞をSox2/cCasp3二重陽性であるとみなした。結果をマイクロソフトエクセルに出力し、再フォーマットして、次いでプロット化、データ分析およびIC50計算のためにGraphPad Prism v8.0.2に移した。
【００９９】
実施例2
結果
自動化により同質な中脳オルガノイドのハイスループット適合性生成が可能になる
スクリーニング適用は、予想可能な生理学的パラメーター内で作動する生物学的系を必要とする。分化の際の細胞不均一性を制限するために、本発明者らは、多能性幹細胞(PSC)由来小分子神経前駆細胞(smNPC)から開始してヒト神経中脳オルガノイドを生成した(Reinhardt, P. et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One 8, e59252 (2013))。これらの細胞の神経限定的発生能力は、オルガノイド形成に必要とされる自己組織化を依然として可能にする(Di Lullo, E. & Kriegstein, A.R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci 18, 573-584 (2017); およびMonzel, A.S. et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports 8, 1144-1154 (2017))が、PSC系プロトコルと比較してより同質なオルガノイドをもたらす。驚くべきことに、matrigel埋め込みは、なくても済むことが明らかになり、自動化液体取扱い系(ALHS)を使用することにより標準化された機械応力がぞうであるようにmatrigel埋め込みのバッチごとに変動性を低減する。得られる自動化された中脳オルガノイド(AMO)はPSC由来凝集物よりも構造的に複雑ではないが、該オルガノイドは、サイズ分布(図1b、1バッチ内の平均変動係数(CV)3.56%；最小2.2%、最大5.6%)、形態(図1c)ならびに細胞組成および組織化(図2)においてバッチ内およびバッチ間変動性をほとんど示さず、HTSアプローチについて該オルガノイドを理想的にする。さらに、本発明者らのワークフローは、1ウェル当たり1つのオルガノイドを生成し、他のオルガノイドとは独立して維持され、そのためにバイオリアクター系戦略(Quadrato, G. et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature 545, 48-53 (2017))において観察されるパラクリンシグナル伝達のためにバッチ効果を最小化する。パラクリンシグナル伝達が望ましい場合、本発明者らのワークフローはまた、1ウェル当たりいくつかのオルガノイドを適応させ得る。
【０１００】
自動化された中脳オルガノイドは典型的な神経および中脳のマーカーを発現し、構造的組織化を示す
本発明者らの大規模AMO(>500μm直径)におけるタンパク質局在を特徴づけるためならびに細胞分解能でおよびHTS適合性様式でのそれらの神経/中脳分化の効率を評価するために、本発明者らは、オルガノイドにおける使用のためにLee et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue 579 clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep 6, 18631 (2016)による拡張された3D染色プロトコルを適合し、これと、ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジル(BABB)系組織透明化を組み合わせた(Dent, J.A., Polson, A.G. & Klymkowsky, M.W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development 105, 61-74 (1989))。本発明者らは、BABB系透明化が、異なる透明化プロトコルと比較して、最も早くかつ最も有効な方法の両方であることを明らかにしたことを見出した。ホールマウント染色および透明化の組合せにより、共焦点画像化を介した全オルガノイドの3D再構成が可能になり、さらに詳細な3D定量化および分析、例えば典型的な組織切片化手順を使用しては実施し得ないオルガノイド全体を通した神経突起の追跡が可能になる(図1d参照)。
【０１０１】
免疫染色の結果は、単一の共焦点光学切片(図2a、b、c、d、f、g、h、j)または最大強度投影(MIP、図2e)のいずれかとして示す。25日目に既に、AMOは、Map2 (Shafit-Zagardo, B. & Kalcheva, N. Making sense of the multiple MAP-2 transcripts and their role in the neuron. Mol Neurobiol 16, 149-162 (1998))(図1d)、βチューブリンIII (TUBB3)(Leandro-Garcia, L.J. et al. Tumoral and tissue-specific expression of the major human beta tubulin isotypes. Cytoskeleton (Hoboken) 67, 214-223 (2010))(図2e)およびdoublecortin (Gleeson, J.G., Lin, P.T., Flanagan, L.A. & Walsh, C.A. Doublecortin is a microtubule-associated protein and is expressed widely by migrating neurons. Neuron 23, 257-271 (1999))(DCX、図2cおよび2d) の発現で示されるように多くのニューロンを含む。チロシンヒドロキシラーゼの存在(TH、図2aおよび2b)、ドーパミン合成の律速酵素(Nagatsu, T. Tyrosine hydroxylase: human isoforms, structure and regulation in physiology and pathology. Essays Biochem 30, 15-35 (1995))、および転写因子Nurr1およびFoxa2の発現(Hegarty, S.V., Sullivan, A.M. & O'Keeffe, G.W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol 379, 123-138 (2013))(図2fおよび2g)は、本発明者らのオルガノイドのドーパミン作動性中脳分化と一致する。全ての神経オルガノイドに共通してみられるように、AMOは、Sox2 (Ellis, P. et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Dev Neurosci 26, 148-165 (2004))(図1d、図2aおよびb)、Brn2 (Dominguez, M.H., Ayoub, A.E. & Rakic, P. POU-III transcription factors (Brn1, Brn2, and Oct6) influence neurogenesis, molecular identity, and migratory destination of upper-layer cells of the cerebral cortex. Cereb Cortex 23, 2632-2643 (2013))(図2cおよびd)およびより一般的な神経マーカーネスチン(nestin) (Hendrickson, M.L., Rao, A.J., Demerdash, O.N. & Kalil, R.E. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One 6, e18535 (2011))(図2aおよび2b)の92発現(ex 92 pression)により同定される神経前駆体の集団を保持する。
【０１０２】
経時的に、AMOはさらに成熟する。50日目に、Map2陽性神経突起上での頻繁に互いに共局在化するシナプス前マーカーシナプトフィジンおよびシナプス後マーカーホマーの発現(Tadokoro, S., Tachibana, T., Imanaka, T., Nishida, W. & Sobue, K. Involvement of unique leucine-zipper motif of PSD-Zip45 (Homer 1c/vesl-1L) in group 1 metabotropic glutamate receptor clustering. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13801-13806 (1999)) (図2h)は、シナプスの存在を示す。インビボにおいてグリア形成(gliogenesis)はニューロン形成に続くので(Miller, F.D. & Gauthier, A.S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron 54, 357-369 (2007))、本発明者らは、ニューロンの初期形成の後の星状細胞の出現を予想する。結果的に、AMOは、75日目に、GFAPおよびS100b二重陽性星状細胞を含む(Gotz, M., Sirko, S., Beckers, J. & Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia 63, 1452-1468 (2015))(図2j)。
【０１０３】
一般的に、AMO内の異なる細胞型(すなわちニューロン、星状細胞および神経前駆体)は、神経ロゼットなどの局在化した構造を形成しないが、むしろAMOの中心の周りの4つの同一中心領域において組織化される(図2aおよび2c)。TH+/ネスチン+/DCX+細胞プロセスの円周に方向づけられた層である最も外側の領域4は、高密度の核ををほとんど含まない。細胞の方向は、オルガノイドのコアにより近くにある下にある領域3で変化し、TH+ドーパミン作動性でDCX+のニューロンは明確な放射状の組織化を示す(図2bおよび2c)。放射状に組織化されたニューロンのこの領域とコアを分ける領域2は、円周に方向づけられたDCX+ニューロンを含みBrn2+神経前駆体をほとんど含まない(図2cおよび2d)。コア自体である領域1は、主として神経前駆体を含み、ニューロンをほとんど含まない。中心から所定の距離内で、異なる細胞型は、微小組織の全半径(radius)の周囲に均一に分布される。HTS適合性の文脈において、この半径対称性は、光学的定量化をウェル中の微小組織の方向とは独立したものにするので、局所的に無作為的に分岐するサブドメインを有するより複雑であり、さらにより不均一なオルガノイドを生じるプロトコルに対する利点である。
【０１０４】
AMOの超構造分析(図S2)は、神経線維に取り囲まれたニューロン細胞体と一致する高密度3D細胞構造を明らかにする免疫蛍光データを支持する。高倍率で神経線維を分析すると、規則的な間隔が開けられた神経フィラメントおよび微小管が同定され得る。さらに、シナプス小胞の特徴的なサイズおよび局在化を有する小胞は、これらの神経線維内に頻繁に見られる。
【０１０５】
さらなる定量的リアルタイムPCR(qPCR)分析は、神経前駆体マーカー(Brn2、ネスチン、Pax6、Sox1、Sox2)の同時の減少を伴う、異なる発生段階での種々の神経(DCX、Map2、NEFL、NeuN、TBR2、TUBB3、Syt1)、中脳(EN1、GIRK2、MIXL1、NURR1、TH)およびグリア特異的(GLAST、MBP、S100b)マーカーの発現レベルの増加を示し、経時的な神経中脳成熟が確認される(図3)。
【０１０６】
カルシウム画像化は全オルガノイドにわたる自発的かつ同時の活性を明らかにする
AMO内の個々の細胞の機能的連結を評価するために、本発明者らは、ニューロンの活性をスパイクする(spiking)ための読出しとして使用され得るFluo-4アセトキシメチルエステル(AM)系カルシウム画像化を行った(Grienberger, C. & Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron 73, 862-885 (2012))。個々の細胞の自発的活性に加えて、本発明者らは、全ての分析されたオルガノイド(n=5)においてオルガノイド全体にわたる同時および周期的なカルシウムスパイクを観察した。この挙動をさらに特徴付けるために、本発明者らは、異なる目的の領域(ROI)を定義し、それぞれの領域での経時的な蛍光強度の変化を評価した(図4)。全オルガノイドを測定することにより、約30秒の周期でFluo-4の明るさにおいて2つの連続したスパイクが明らかにされる(図4a)。本発明者らが測定された領域を4つの四分円にさらに分割する場合、本発明者らは、全ての4つの生じたROIにおいて同時のスパイク活性を見る(図4b)。この類似した活性パターンは、オルガノイドの多くの構造レベルで、単一細胞についてさえも見られ得る(図4c)。時間尺度を変えることにより、全体的なオルガノイド全体のスパイクに加えて、選択された単一細胞の間の同時性のさらなるレベルが明らかになる(図4d)。超構造レベルのシナプス小胞(図S2)および免疫染色によるシナプス(図2h)ならびにqPCRによるシナプトタグミン1(Syt1)(図3)の存在と共に考えると、カルシウム画像化の結果は、AMO内の機能的に連結されたニューロンの存在を支持する。同時のスパイクパターンにより、いくつかのニューロンだけでなく、実際に全オルガノイドが機能的に連結されることが示唆される。
【０１０７】
RNA配列決定により、確立されたプロトコルと比較して、自動化された中脳オルガノイドにおいてバッチ内およびバッチ間のより低い変動性が明らかになる
遺伝子発現レベルでのAMOの変動を検査するために、本発明者らは、AMOの3つの異なるバッチおよび、対照としてLancaster et al. (Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379 (2013))からの確立されたプロトコルに従って手動で生成されたiPSC由来のオルガノイドの1つのバッチからの単一オルガノイドのRNA配列決定を行った。iPSC由来オルガノイドはそれらの神経成熟に入る前に最初に神経前駆体の期間を経験する必要があるので、本発明者らは、より均等な比較のために、30日目にAMOならびに30日目および45日目にiPSC由来オルガノイドの配列決定を行った。この比較により、AMOにおける主成分分析(PCA、図5a)により測定された全ゲノム発現レベルの分散はiPSC由来オルガノイドよりも約4倍低い(図5b)ので、AMOは、現在の標準的なプロトコルよりもバッチ内およびバッチ間での再現性がより高いことが明らかになった。
【０１０８】
45日目のiPSC由来オルガノイド(図5c)と比較して30日目のAMOにおいて有意に上方制御された(padj.<0.05)遺伝子のさらなる遺伝子オントロジー(GO)(Ashburner, M. et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 25, 25-29 (2000)；およびSupek, F., Bosnjak, M., Skunca, N. & Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PLoS One 6, e21800 (2011))分析は、ニューロン成熟、特にシナプス活性に関連するGO項をほぼ排他的に生じ(図5d、GO項の完全なリストおよびさらなる分析について、表1参照)、AMOは確立されたオルガノイドよりも早く成熟することが示された。
【０１０９】
スクリーニング設定において、プレートの縁のウェルはしばしば、プレートの中心にさらに向かって配置されるものとは異なる読出しを示す(「縁効果」)(Malo, N., Hanley, J.A., Cerquozzi, S., Pelletier, J. & Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol 24, 167-175 (2006))。そのため、本発明者らは、1つのAMOバッチについて96ウェルプレートの半分を配列決定することを決定し、プレート内のウェルの位置から生じる差について試験した(群「1内側」=中心プレート 対 「1外側」=図5a/bの縁)。AMOはプレート上のそれらの位置とは独立してクラスター化し、これは、AMOは、遺伝子発現レベルにおいて、測定可能な縁効果を示さないことを示す。一緒にすると、RNA配列決定の結果は、標準的iPSC系プロトコルと比較して、AMOのより高い同質性およびより早いニューロン成熟を示す。
【０１１０】
自動化されたホールマウント免疫染色は、高度に定量的であり166、自動化された中脳オルガノイドの同質性を明らかにする
全オルガノイドの免疫蛍光系スクリーニング適合性技術が報告されているが、該技術は、大きなオルガノイドの外側の層における細胞のみを検出し得る(Vergara, M.N. et al. Three-dimensional automated reporter quantification (3D-ARQ) technology enables quantitative screening in retinal organoids. Development 144, 3698-3705 (2017))か、約100μmの直径の小さい凝集物を使用し得る(Verissimo, C.S. et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife 5 (2016))かまたは抗体および蛍光証明がより容易に浸透し得る嚢胞性オルガノイド(Czerniecki, S.M. et al. High-Throughput Screening Enhances Kidney Organoid Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell 22, 929-940 e924 (2018))を使用し得る。対照的に、本発明者らのワークフローは、3D細胞検出についての用量応答アッセイ(図6a)により強調されるように、単一細胞分解能および高い感度を用いて高密度の全体の大規模オルガノイド(>800μm直径)の定量化を可能にする。本発明者らは、蛍光色素により追跡された細胞と、標識されない細胞を既知の割合で混合し、それらを凝集させ、それらを透明化し、次いで共焦点ハイコンテントイメージング系においてそれらを分析した。追跡された細胞の量と測定された明るさの間の得られた関係は、高度に線形であり(R2>0.99)、これは本発明者らの光学HTS 3Dホールマウント分析ワークフローの定量的な性質を示す。
【０１１１】
次いで、本発明者らは、タンパク質レベルでAMOの同質性を示した。十分に自動化された96ウェル系AMOホールマウント光学分析(図6b左)は、HTS適合性様式で豊富な繊維状構造(神経マーカーMap2)および核マーカー(Sox2)の両方を検出する能力を示す(図6b右、1つのオルガノイド由来の単一切片)。Sox2などの核マーカーを使用して、本発明者らの技術は、それぞれの画像化された共焦点平面についてSox2+の核の明るさを同定、計数および合計することにより単一細胞分解能で定量化を可能にする(図6c/d/f/h)。Map2などの繊維状の豊富なシグナルは、それぞれの共焦点平面についての全体的な平均明るさを合計することにより、オルガノイド中で定量化され得る(図6e/g)。独立した分化からの3つの96ウェルプレートの比較により、バッチ内およびバッチ間のAMOの均一な細胞組成が明らかになった(図6d〜g)(平均CVSox2=5%、CVMap2=9%)。
【０１１２】
位置的分析により、Sox2レベルではなく、Map2レベルについてのプレート位置の効果(縁効果)が検出され、縁のウェルと比較して、プレートの中心のオルガノイドのMap2明るさは10%低減した(図S3)。RNA配列決定結果における縁効果がないことと共に考えると、これは、タンパク質の特定のサブセットのみが縁の条件により変化し、一方で細胞プロセスの大部分は、プレートを通じて均一であることを示し得る(プレートの内側および縁のオルガノイドの間の示差的遺伝子発現のリストについて、表2参照)。
【０１１３】
自動化された中脳オルガノイドにより、十分に自動化されたハイスループットスクリーニング形式で、単一細胞レベルでの特定の細胞サブ集団における毒性評価が可能になる
薬物効果を定量化するための本発明者らのワークフローの能力を評価するために、本発明者らは、AMOを、増加濃度の既知の細胞傷害性化合物G418で処理し、Sox2と共に、アポトーシスマーカー切断カスパーゼ3(cCasp3)について染色した。アポトーシスcCasp3+細胞の数を、対数的薬物濃度に対してプロットすることにより、339μg/mLのIC50を有する典型的なS字状用量応答曲線(図7a)が明らかになり、これは公開された値と一致する(Delrue, I., Pan, Q., Baczmanska, A. K., Callens, B. W. & Verdoodt, L. L. M. Determination of the Selection Capacity of Antibiotics for Gene Selection. Biotechnol J 13, e1700747, doi:10.1002/biot.201700747 (2018))。cCasp3とSox2の間の共局在化分析(図7b)により、該ワークフローは、細胞型特異的毒性を3Dで評価するためにも使用され得ることが示される。これは、G418が他の(より成熟した)細胞型以外のSox2+神経前駆体に主として影響しないことも示す。アポトーシス細胞中の前駆体の一部はより高い阻害剤濃度とともに増加するが、それは、最大で15%のみの低いレベルのままである。図7cは、阻害剤濃度の増加に伴うcCasp3シグナルの増加を示すハイコンテント画像の例を示す。本発明者らは、この実験について全AMOを染色、画像化および分析したが、本発明者らは、分析の間に、単一共焦点平面のみを考慮することによりほぼ同じ結果を生じることを理解した。これは、大規模な薬物スクリーニングキャンペーンにおいて、必要な画像化時間および費用をかなり低減するために使用され得る。最終的に、本発明者らは、患者由来iPSCに由来した第2の独立したsmNPC株からもAMOを生成し、異なる遺伝的バックグラウンドを有する異なる細胞株についての本発明者らのワークフローの適用可能性を確認した。
【０１１４】
同質性-本発明のAMO、本発明のNABOおよび先行技術のオルガノイド
AMOは全体的な形態およびサイズに関して、他の公開された脳オルガノイドよりも有意に同質である
図8および説明参照。
【０１１５】
最新式の脳オルガノイドの内部組織化/構造は、AMOと比較して大きく変動性であり予測できない
図9および説明参照。
【０１１６】
他の中脳オルガノイドのみと比較して、AMOは依然として最も高いレベルの同質性を示す
図10および説明参照。
【０１１７】
細胞組成の分析により最新式のオルガノイドにおける大きな変動性が明らかになる
図11および説明参照。
【０１１８】
本発明のNABO
図12および説明参照。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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