【手続補正書】
【提出日】平成22年2月22日(2010.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一培地において支持物質上で結膜前駆細胞を含む組織の細胞を培養することを含む、結膜組織系を生成するための方法であって、該単一培地は、
（ａ）ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地、またはＨａｍ  Ｆ−１２（１：１）培地と、
（ｂ）ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミン、およびウシ胎仔血清からなる群から選択される栄養血清と、
（ｃ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）と、
（ｄ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、
（ｅ）インスリンと、
（ｆ）亜セレン酸ナトリウムと、
（ｇ）トランスフェリンと、
（ｈ）抗生物質または抗生物質の混合物と、
を含み、該単一培地は、該支持物質上で該結膜前駆細胞が増殖および増幅して結膜組織系を形成するのを支持する、
方法。
【請求項２】
前記栄養血清が、ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミンおよびウシ胎仔血清からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＧＦが、ヒトＥＧＦまたは組換えヒトＥＧＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスフェリンが、ヒトトランスフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単一培地が、さらにジメチルスホキシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗生物質または抗生物質の混合物が、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単一培地が、
（ａ）１５％〜２０％の栄養血清と、
（ｂ）５〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）２〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）１〜１０μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）１〜１０μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）１〜１０μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記単一培地が、
（ａ）２０％の栄養血清と、
（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）５μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）５μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）５μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記単一培地が、さらに０．１％のジメチルスルホキシドを含む、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持物質が、生体適合性の膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体適合性の膜が、羊膜である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記羊膜が、ヒト羊膜である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養するステップが、前記羊膜の基底膜側の表面で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養するステップが、支持細胞なしで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
結膜前駆細胞を含む前記組織が、前記結膜の円蓋部に由来する組織の単離されたバイオプシーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
損傷または罹患した患者の眼の眼球表面を治療するための系であって、
（ｉ）結膜前駆細胞を含む組織のバイオプシーを単離するための手段と、
（ｉｉ）該単離された前駆細胞を支持物質上で培養するのを可能にするように構成された支持物質と、
（ｉｉｉ）単一培地であって、
（ａ）ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地、またはＨａｍ  Ｆ−１２（１：１）培地と、
（ｂ）ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミン、およびウシ胎仔血清からなる群から選択される栄養血清と、
（ｃ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）と、
（ｄ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、
（ｅ）インスリンと、
（ｆ）亜セレン酸ナトリウムと、
（ｇ）トランスフェリンと、
（ｈ）抗生物質または抗生物質の混合物と、
を含み、該単一培地が、該支持物質上で該結膜前駆細胞が増殖および増幅して結膜組織系を形成するのを支持する、単一培地、と、
（ｉｖ）該結膜組織系を該患者の眼の前記損傷または罹患した眼球表面に移植するための手段と、
を含む系。
【請求項１７】
前記栄養血清が、ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミンおよびウシ胎仔血清からなる群より選択される、請求項１６に記載の系。
【請求項１８】
前記ＥＧＦが、ヒトＥＧＦまたは組換えヒトＥＧＦである、請求項１６に記載の系。
【請求項１９】
前記トランスフェリンが、ヒトトランスフェリンである、請求項１６に記載の系。
【請求項２０】
前記単一培地が、さらにジメチルスホキシドを含む、請求項１６に記載の系。
【請求項２１】
前記抗生物質または抗生物質の混合物が、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の系。
【請求項２２】
前記単一培地が、
（ａ）１５％〜２０％の栄養血清と、
（ｂ）５〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）２〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）１〜１０μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）１〜１０μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）１〜１０μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む、請求項１６に記載の系。
【請求項２３】
前記単一培地が、
（ａ）２０％の栄養血清と、
（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）５μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）５μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）５μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む請求項１６に記載の系。
【請求項２４】
前記単一培地が、さらに０．１％のジメチルスルホキシドを含む、請求項２２または請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記支持物質が、生体適合性の膜である、請求項１６に記載の系。
【請求項２６】
前記生体適合性の膜が、羊膜である、請求項２５に記載の系。
【請求項２７】
前記羊膜が、ヒト羊膜である、請求項２６に記載の系。 
【請求項２８】
前記培養が、前記羊膜の基底膜側の表面で行われる、請求項２６に記載の系。
【請求項２９】
前記培養が、支持細胞なしで行われる、請求項１６に記載の系。
【請求項３０】
結膜前駆細胞を含む前記組織が、前記結膜の円蓋部に由来する組織のバイオプシーによって単離される、請求項１６に記載の系。
【請求項３１】
損傷または罹患した患者の眼の眼球表面を治療するための結膜組織系であって、請求項１に記載の方法によって生成される、結膜組織系。
【請求項３２】
前記損傷または罹患した眼球表面が、アルカリ熱傷、化学熱傷、熱による熱傷、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、神経栄養性角膜炎、眼瘢痕性類天疱瘡（ＯＣＰ）、翼状片切除、緑内障手術、線維柱帯切除術、セクトン手術、網膜剥離、斜視手術、結膜母斑、持続漏出性線維柱帯切除小水疱、または上輪部角結膜炎に起因する、請求項３１に記載の結膜組織系。
【請求項３３】
前記結膜組織系が、角膜または角膜に隣接する部分に移植される、請求項１６または請求項３２に記載の系。
【請求項３４】
前記移植される結膜組織系を前記患者の眼に接着するために無菌の組織接着剤が使用される、請求項１６または請求項３３に記載の系。
【請求項３５】
前記無菌の組織接着剤が、２−シアノアクリル酸イソアミルである、請求項３４に記載の系。
【請求項３６】
前記組織のバイオプシーが、前記患者から単離される、請求項１６に記載の系。
【請求項３７】
前記損傷または罹患した眼球表面が、アルカリ熱傷、化学熱傷、熱による熱傷、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、神経栄養性角膜炎、眼瘢痕性類天疱瘡（ＯＣＰ）、翼状片切除、緑内障手術、線維柱帯切除術、セクトン手術、網膜剥離、斜視手術、結膜母斑、持続漏出性線維柱帯切除小水疱、または上輪部角結膜炎に起因する、請求項３６に記載の系。
【請求項３８】
損傷または罹患した患者の眼の眼球表面を治療するための系であって、
（ｉ）結膜前駆細胞を含む組織のバイオプシーを単離するための手段と、
（ｉｉ）該単離された前駆細胞を支持物質上で培養するのを可能にするように構成された支持物質と、
（ｉｉｉ）単一培地であって、該支持物質上で該結膜前駆細胞が増殖および増幅して結膜組織系を形成するのを支持する、単一培地、と、
（ｉｖ）該結膜組織系を該患者の眼の前記損傷または罹患した眼球表面に移植するための手段であって、前記移植される結膜組織系を該損傷または罹患した眼球表面に接着するために無菌の組織接着剤が使用される、手段と、
を含む系。
【請求項３９】
前記単一培地が、
（ａ）ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地、またはＨａｍ  Ｆ−１２（１：１）培地と、
（ｂ）ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミン、およびウシ胎仔血清からなる群から選択される栄養血清と、
（ｃ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）と、
（ｄ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、
（ｅ）インスリンと、
（ｆ）亜セレン酸ナトリウムと、
（ｇ）トランスフェリンと、
（ｈ）抗生物質または抗生物質の混合物と、
を含む、請求項３８に記載の系。
【請求項４０】
前記栄養血清が、ノックアウト血清、熱不活化ヒト血清、ヒト臍帯血血清、ヒト血清アルブミンおよびウシ胎仔血清からなる群より選択される、請求項３９に記載の系。
【請求項４１】
前記単一培地が、さらにジメチルスホキシドを含む、請求項３９に記載の系。
【請求項４２】
前記単一培地が、
（ａ）１５％〜２０％の栄養血清と、
（ｂ）５〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）２〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）１〜１０μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）１〜１０μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）１〜１０μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む、請求項３９に記載の系。
【請求項４３】
前記単一培地が、
（ａ）２０％の栄養血清と、
（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、
（ｃ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、
（ｄ）５μｇ／ｍｌのインスリンと、
（ｅ）５μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムと、
（ｆ）５μｇ／ｍｌのトランスフェリンと、
を含む請求項３９に記載の系。
【請求項４４】
前記単一培地が、さらに０．１％のジメチルスルホキシドを含む、請求項４２または請求項４３に記載の系。
【請求項４５】
前記支持物質が、生体適合性の膜である、請求項３８に記載の系。
【請求項４６】
前記生体適合性の膜が、羊膜である、請求項４５に記載の系。
【請求項４７】
前記羊膜が、ヒト羊膜である、請求項４６に記載の系。
【請求項４８】
前記培養が、前記羊膜の基底膜側の表面で行われる、請求項４６に記載の系。
【請求項４９】
前記組織のバイオプシーが、前記結膜の円蓋部から単離される、請求項３８に記載の系。
【請求項５０】
前記組織のバイオプシーが、前記患者から単離される、請求項３８に記載の系。
【請求項５１】
前記損傷または罹患した眼球表面が、アルカリ熱傷、化学熱傷、熱による熱傷、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、神経栄養性角膜炎、眼瘢痕性類天疱瘡（ＯＣＰ）、翼状片切除、緑内障手術、線維柱帯切除術、セクトン手術、網膜剥離、斜視手術、結膜母斑、持続漏出性線維柱帯切除小水疱、または上輪部角結膜炎に起因する、請求項３８に記載の系。
【請求項５２】
前記結膜組織系が、前記角膜または前記眼球表面の前記角膜に隣接する部分に移植されるように構成される、請求項３８に記載の系。
【請求項５３】
前記無菌の組織接着剤が、２−シアノアクリル酸イソアミルである、請求項３８に記載の系。
【請求項５４】
損傷または罹患した患者の眼の眼球表面を治療するための系であって、該患者の眼の該損傷または罹患した眼球表面に組織系を移植するための手段を含み、該移植される組織系を該損傷または罹患した眼球表面に接着するために無菌の組織接着剤が使用される、治療系。
【請求項５５】
実施例および図面を参照して、本明細書に実質的に記述されるとおりの上記の請求項に従って結膜組織系を生成するための系。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
【図１−１】ＨＡＭ上の結膜細胞培養の特徴づけ。図１Ａは、ＨＡＭを押し出している結膜細胞の３日齢の培養物を示す。図１Ｂは、ＨＡＭ上の１４日齢の細胞のコンフルエントな培養を示す。図１Ｃは、培養部分のサイトケラチンＡＥ１による免疫蛍光染色を示す。
【図１−２】ＨＡＭ上の結膜細胞培養の特徴づけ。図１Ｄは、培養部分のサイトケラチンＡＥ３による免疫蛍光染色を示す。図１Ｅは、２０日齢培養物のホールマウントのＰＡＳ染色を示す。ＰＡＳは、杯細胞をマゼンタ色に染色する。
【図２】結膜組織系および結膜バイオプシー内のＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ４の発現。ＭＵＣ５ＡＣ（１０３塩基対）（レーン３、７）およびＭＵＣ４（１０２塩基対）（レーン４、８）マーカーをそれぞれ用いる結膜培養細胞および結膜バイオプシーの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析。レーン１は、１ｋ塩基ＤＮＡサイズのマーカーである。レーン２と６は、培養結膜細胞と結膜バイオプシー、それぞれのＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）である。レーン５は、反応混合物にｃＤＮＡを付加されなかった陰性対照である。
【図３−１】化学外傷作成と移植のウサギモデルで、外傷、移植、治療を示す。図３Ａは、ウサギの正常な眼を示す。図３Ｂは、ウサギの結膜に配置された飽和ＮａＯＨ濾過紙を示す。図３Ｃは、移植直前の外傷部位を示す。
【図３−２】化学外傷作成と移植のウサギモデルで、外傷、移植、治療を示す。図３Ｄと３Ｅは、移植された部位を示す。図３Ｆは、施された外傷とフォローアップを有する対照眼を示し、外傷のトレースを示す。図３Ｇは、治療した外傷を示す。
【図４−１】外傷への移植の効果の評価およびｉｎ  ｖｉｖｏで保持され、残存するヒト細胞の検出。図４Ａは、ＰＡＳ（杯細胞を検出するために）で染色した正常なウサギ結膜部分を示す。杯細胞はマゼンタ色に染色。図４Ｂは、外傷部位を示し、杯細胞がなく、かつ上皮がはげ落ちたことを示す。図４Ｃは、ＨＡＭだけを眼の上に移植する場合、眼内の上皮がない創傷治癒を示す。図４Ｄは、外傷だけで移植片のない眼内の創傷治癒を示す。図４Ｅは、培養結膜細胞を有する組織系を移植した後の外傷部位のヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。図４Ｆは、移植部位の移植したヒト細胞およびウサギ細胞のＰＡＳ染色を示す。図４Ｇおよび４Ｈは、移植部位で検出されたヒト細胞（茶色で示す）の抗ヒトミトコンドリア抗体陽性を示す。図４Ｉは、ウサギ結膜の上皮下のゾーンに移動したヒト細胞を示す。
【図４−２】外傷への移植の効果の評価およびｉｎ  ｖｉｖｏで保持され、残存するヒト細胞の検出。図４Ａは、ＰＡＳ（杯細胞を検出するために）で染色した正常なウサギ結膜部分を示す。杯細胞はマゼンタ色に染色。図４Ｂは、外傷部位を示し、杯細胞がなく、かつ上皮がはげ落ちたことを示す。図４Ｃは、ＨＡＭだけを眼の上に移植する場合、眼内の上皮がない創傷治癒を示す。図４Ｄは、外傷だけで移植片のない眼内の創傷治癒を示す。図４Ｅは、培養結膜細胞を有する組織系を移植した後の外傷部位のヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。図４Ｆは、移植部位の移植したヒト細胞およびウサギ細胞のＰＡＳ染色を示す。図４Ｇおよび４Ｈは、移植部位で検出されたヒト細胞（茶色で示す）の抗ヒトミトコンドリア抗体陽性を示す。図４Ｉは、ウサギ結膜の上皮下のゾーンに移動したヒト細胞を示す。
【図４−３】外傷への移植の効果の評価およびｉｎ  ｖｉｖｏで保持され、残存するヒト細胞の検出。図４Ａは、ＰＡＳ（杯細胞を検出するために）で染色した正常なウサギ結膜部分を示す。杯細胞はマゼンタ色に染色。図４Ｂは、外傷部位を示し、杯細胞がなく、かつ上皮がはげ落ちたことを示す。図４Ｃは、ＨＡＭだけを眼の上に移植する場合、眼内の上皮がない創傷治癒を示す。図４Ｄは、外傷だけで移植片のない眼内の創傷治癒を示す。図４Ｅは、培養結膜細胞を有する組織系を移植した後の外傷部位のヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。図４Ｆは、移植部位の移植したヒト細胞およびウサギ細胞のＰＡＳ染色を示す。図４Ｇおよび４Ｈは、移植部位で検出されたヒト細胞（茶色で示す）の抗ヒトミトコンドリア抗体陽性を示す。図４Ｉは、ウサギ結膜の上皮下のゾーンに移動したヒト細胞を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2009527250.tif 000001
【図１−２】
2009527250.tif 000002
【図２】
2009527250.tif 000003
【図３−１】
2009527250.tif 000004
【図３−２】
2009527250.tif 000005
【図４−１】
2009527250.tif 000006
【図４−２】
2009527250.tif 000007
【図４−３】
2009527250.tif 000008