【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年5月27日(2010.5.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
Ａ．以下：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
Ｂ．トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ；
Ｃ．配列番号１のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
Ｄ．第一の部分タンパク質および／または第二の部分タンパク質を検出し、
融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドモチーフを含まない
ことを特徴とする、上記プロセス。
【請求項２】
γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
Ａ．以下：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
Ｂ．トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ；
Ｃ．配列番号１のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
Ｄ．第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を測定し、
ここにおいて、融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドモチーフを含まないことを特徴とする、上記プロセス。
【請求項３】
ペプチドモチーフは、カスパーゼ切断部位である、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
第一のヌクレオチド配列は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）またはその部分をコードし、ペプチドモチーフは、ＮＰＴＹおよび／またはＶＥＶＤである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
第一のヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列から得られたタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
第二のヌクレオチド配列は、ヒトＡＰＰのシグナルペプチド（配列番号５）、ＳＵＣ２のシグナルペプチド（配列番号１２）、または、ＢＭ４０のシグナルペプチド（配列番号１３）をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
プロモーターは、哺乳動物細胞、Ｃ．エレガンス、酵母またはショウジョウバエにおける発現のためのプロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
プロモーターは、ＣＭＶ、ＨＳＶ  ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＬＴＲ、ｕｎｃ１１９、ｕｎｃ５４、ｈｓｐ１６−２、Ｇ0Ａ１、ｓｅｌ−１２、ＡＤＨ１、ＧＡＬ１、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＭＴ、Ａｃ５またはＤｓ４７プロモーターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
細胞は、真核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
細胞は、非ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
細胞は、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｈ９、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｎ２Ａ、ＳＬ−２または酵母細胞である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
細胞は、Ｃ．エレガンスの細胞である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
細胞は、トランスジェニックＣ．エレガンスの構成成分である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１６】
細胞は、サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１７】
融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
さらなるコードヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の３’末端に位置する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
さらなるコードヌクレオチド配列は、第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現され、第二の部分タンパク質の検出に用いることができるタンパク質をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
さらなるコードヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインを含むタンパク質をコードする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
さらなるコードヌクレオチド配列は、ＧＡＬ４結合ドメインと、ＶＰ１６の転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４−ＶＰ１６）とからなるタンパク質をコードする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
細胞は、レポータープラスミドとコトランスフェクションされており、レポータープラスミドは、レポーター遺伝子を調節可能なプロモーターの制御下に含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
調節可能なプロモーターは、転写活性化ドメインによって活性化可能である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
レポータープラスミドは、ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、Ｕｒａ３、Ｈｉｓ３またはＬａｃＺに関するレポーター遺伝子をコードし、調節可能なプロモーターは、ＧＡＬ４結合部位と、ＨＩＶの最小プロモーターを含む、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
トランスジーンは、配列番号１４、または、配列番号１８をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
トランスジーンは、ベクター中に存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
組換えベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１＋である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
細胞中で内因性のγ−セクレターゼ活性が検出されない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２９】
細胞は、ｃＤＮＡライブラリーを用いてコトランスフェクションされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
ヒトもしくは非ヒト組織、または、ヒトもしくは非ヒト細胞から製造されたｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーに存在する、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
ａ）γ−セクレターゼの活性が検出可能な細胞を同定し、そして
ｂ）この細胞からγ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを単離する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを同定するための、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のプロセスの使用。
【請求項３２】
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３'末端における、ＤＮＡ結合ドメイン、および、転写活性化ドメインをコードする少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列
を含み、
コードされている融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドモチーフを含まない
ことを特徴とする、トランスジーン。
【請求項３３】
第一のヌクレオチド配列は、ＡＰＰまたはＡＰＰの部分をコードする、請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３４】
トランスジーンは、配列番号１４をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項３２または３３に記載のトランスジーン。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含むベクター。
【請求項３６】
ベクターは、ベクターｐＤＢＴｒｐまたはｐｃＤＮＡ３．１＋である、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
細胞が、請求項３５または３６に記載のベクターでトランスフェクションされる、トランスジェニック細胞の製造プロセス。
【請求項３８】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンは、Ｃ．エレガンスの性腺にマイクロインジェクションされる、トランスジェニックＣ．エレガンスの生産プロセス。
【請求項３９】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む細胞。
【請求項４０】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む、トランスジェニックＣ．エレガンス。
【請求項４１】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む酵母細胞。
【請求項４２】
ａ）請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーン；
ｂ）ｃＤＮＡライブラリー、および、
ｃ）レポータープラスミド、
を含む細胞。
【請求項４３】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを同定するための、請求項４２に記載の細胞の使用。
【請求項４４】
１）請求項４２に記載の細胞を製造し、そして、
２）第二の部分タンパク質が形成されているかどうかを決定する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼのｃＤＮＡを同定するプロセス。
【請求項４５】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性の阻害剤を同定するためのプロセスにおける、請求項４２に記載の細胞の使用。
【請求項４６】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって：
Ａ．トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を製造する工程、ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、以下の成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および
ｄ）場合により、さらなる非コードおよび／またはコードヌクレオチド配列；
を有し、
コードされている融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドモチーフを含まない
ことを特徴とする、トランスジーンを含み、
トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子、および、場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを有するレポータープラスミドを含み、
ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、トランスジーンを発現し、場合により、ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現する；
Ｂ．トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を、調べようとする物質とインキュベートする工程、および、
Ｃ．第二の部分タンパク質の量を測定する工程、
を含む、上記プロセス。
【請求項４７】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって、
Ａ．以下の成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５'末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
を含み、
コードされている融合タンパク質が、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種または
それ以上のペプチドモチーフを含まない
ことを特徴とする、トランスジーンを用いる、
Ｂ．このトランスジーンおよびレポータープラスミド、ならびに、場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを細胞に組み込ませ、調査しようとする物質の存在下で、トランスジーンによってコードされた融合タンパク質、および、場合により、ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現させ、
Ｃ．融合タンパク質が、
ａ）切断され、その結果として、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質が形成され、または、
ｂ）細胞に存在するγ−セクレターゼによって配列番号１のアミノ酸配列内で切断されず、その結果として、検出可能な量の第一および／または第二の部分タンパク質が形成されない、
Ｄ．第二の部分タンパク質の量を測定する、
上記プロセス。
【請求項４８】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質を同定するプロセスであって、調べようとする物質の存在下で、シグナルペプチドおよび配列番号１を含む融合タンパク質をコードするトランスジーンを発現させ、調べようとする物質の、形成された第二の部分タンパク質の量に対する効果を測定し、第二の部分タンパク質は、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含み、
融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドモチーフを含まない
ことを特徴とする、上記プロセス。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載のトランスジーン、ベクターまたは細胞を含む、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を検出するための試験キット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
実施例１０：酵母におけるバックグラウンドの改善
シグナルペプチドの交換によるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６発現の増加は、酵母株ＭａＶ２０３における、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３およびｌａｃＺレポーターシステムの非特異的な活性化の大きな増加と関連していた。酵母はγ−セクレターゼ活性がないため、これは、細胞のプロテアーゼによるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の非特異的プロセシングと、活性なＧＡＬ４／ＶＰ１６の放出による可能性が最も高い。
γ−セクレターゼ切断部位の近傍へＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインを移動することによって、Ｃ１００の膜貫通ドメインと、ＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインのアミノ末端との間の部位での、Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６で検出された非特異的なタンパク質分解的切断を実質的に除去した。
レポーターシステムのＧＡＬ４／ＶＰ１６依存性の活性化を試験することによって、ＭａＶ２０３での様々なコンストラクトの切断を試験した。
ＭａＶ２０３のＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６での形質転換により、Ｕｒａ+、Ｈｉｓ-の表現型が示された（実施例４を参照）。ＳＰシグナルペプチドをＳＰ２ペプチドで置き換えること（ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６を得る）によって発現レベルが増加することにより、全ての読み出しが、全長ＧＡＬ４タンパク質（プラスミドｐＣＬ１によってコードされた；クロンテック・ラボラトリーズ）を構成的に発現するポジティブコントロールのＭａＶ２０３で検出されたレベルと同様のレベルまで強く活性化された。
それに対して、ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６に匹敵するレベルでＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を発現するＭａＶ２０３細胞は、Ｕｒａ-、Ｈｉｓ-の表現型を示し、空のベクターコントロールで形質転換されたＭａＶ２０３も同様であった。
従って、酵母では、ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を高度に発現させることができるが、それでもなおＧＡＬ４依存性レポーターの極めて低い非特異的な活性化を示した。ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００タンパク質の高いレベルの発現、それにあわせて非特異的な切断／レポーター活性化の低いバックグラウンドは、驚異的に最適化されたシグナル／ノイズ比を有する読み出しシステムの必要条件である。