(57)【要約】  本発明は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質、及び該結合タンパク質の調製、適用に関する。前記抗原結合ドメインは、本文で限定されるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または前記アミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つｃＴｎＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有する。前記結合タンパク質はｃＴｎＩタンパク質の検出分野に適用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙであり、
Ｘ１はＲまたはＫであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＮまたはＱであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
好ましくは、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ１はＳであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ１はＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ２はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ１はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＹであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＦであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＹであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＦであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＤであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＥであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、各相補性決定領域の変異部位は、以下の変異の組み合わせのいずれかから選ばれる、
2022502090.tif 000016
2022502090.tif 000017
2022502090.tif 000018
ことを特徴とする抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項２】
前記結合タンパク質に少なくとも３つのＣＤＲｓが含まれ、或いは、前記結合タンパク質に少なくとも６つのＣＤＲｓが含まれ、
好ましくは、前記結合タンパク質は、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位の中の１つであり、
好ましくは、前記結合タンパク質は、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４、および／または、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項３】
前記結合タンパク質に抗体定常領域配列も含まれ、
好ましくは、前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域の配列から選ばれ、
好ましくは、前記定常領域の種源は、牛、馬、乳牛、豚、羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、コックファイティング、または人間であり、
好ましくは、前記定常領域はネズミに由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される、
ことを特徴とする請求項２に記載の抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項４】
単離された核酸分子であって、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質をコードする、
ことを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターによって形質転換される宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質を生成する方法であって、
培養培地中および適切な培養条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、培養培地または培養される宿主細胞からこのように生成される結合タンパク質を回収するステップを含む、
ことを特徴とする結合タンパク質を生成する方法。
【請求項８】
急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷を診断するための診断薬または試薬テストキットの調製における請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質の適用。
【請求項９】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法であって、
ａ）抗体/抗原結合反応が起こるのに十分な条件下で、前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原と請求項３に記載の結合タンパク質を接触させ、免疫複合体を形成するステップ、及び
ｂ）前記試験サンプルに前記トロポニンＩ抗原が存在することを示す前記免疫複合体の存在を検出するステップ、を含み、
好ましくは、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記結合タンパク質に結合される二次抗体も含まれ、
好ましくは、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記トロポニンＩ抗原に結合される二次抗体も含まれる、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法。
【請求項１０】
前記トロポニンＩ抗原は心筋トロポニンＩ抗原である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質を含む試薬テストキット。
【請求項１２】
心筋トロポニンＩに関連する疾患の診断における請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質の適用。
【請求項１３】
心筋トロポニンＩに関連する疾患を診断する方法であって、
Ａ）結合反応が起こるのに十分な条件下で、被験体からのサンプルと請求項１〜３のいずれかに記載の結合タンパク質を接触させ、結合反応を行うステップ、及び
Ｂ）結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップ、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンＩに関連する疾患が存在することを示す心筋トロポニンＩに関連する疾患を診断する方法。
【請求項１４】
前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、コロイド状金免疫技術、放射性免疫分析および／または酵素結合免疫技術に基づくものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿または心筋組織の少なくとも1つから選ばれる請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体は、哺乳動物であり、好ましくは霊長類動物であり、より好ましくは人間である請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記心筋トロポニンＩに関連する疾患は心血管疾患である請求項１２に記載の適用または請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記心筋トロポニンＩに関連する疾患は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷またはそれらの組合わせからなる群から選ばれる請求項１２に記載の適用または請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年１０月１０日に中国特許局に提出された出願番号が２０１８１１１８０３６２．８、名称が「ヒト心筋トロポニンＩに対する組換え抗体」の中国特許出願の優先権を主張し、その全部内容は援用により本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は免疫技術分野に関し、具体的に、ヒト心筋トロポニンＩに対する組換え抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
２０世紀８０年代以前、世界保健機関（ＷＨＯ）は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断基準の１つとして、常に心筋酵素スペクトル活性を使用していた。２０世紀８０年代後半、研究者は、トロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ、Ｔｎ）の感度と特異性がホスホクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ホスホクレアチンキナーゼイソ酵素（ＣＫ−ＭＢ）、乳酸デヒドロゲナーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどのバイオマーカーよりも高いと発見した。心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は心筋にのみ存在し、心筋細胞のマーカーであり、その異常な変化は、心臓の拡張機能と収縮機能に影響を与える可能性があり、心筋壊死の診断や心筋損傷の判定などにも使用でき、心筋細胞損傷の感度と特異性が最も強いマーカーの１つであり、ＡＭＩと急性冠症候群（ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＡＣＳ）の迅速な診断、ＡＣＳのリスク層別化の支援、その予後の反映の主要な生化学的マーカーとして認識されている。
【０００４】
正常な人の血液中のｃＴｎＩの含有量は一般に０．３μｇ／Ｌ未満である。虚血または低酸素症などにより心筋細胞膜の完全性が損なわれると、遊離ｃＴｎＩが細胞膜を血流にすばやく浸透させることができる。したがって、発症初期で、ヒトの血液中のｃＴｎＩ及びその変化傾向の迅速、高感度、正確な測定は、急性心筋梗塞の診断、急性冠症候群のリスク層別化、さまざまな要因によって引き起こされる心筋損傷の監視などに対して重要な臨床的な意義を有する。ｃＴｎＩレベルを検出するための臨床方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光、コロイド金などがあり、様々な方法にはそれぞれ長所と短所があるが、ｃＴｎＩの特異性に対するモノクローナル抗体を必要とする。
【０００５】
従来のｃＴｎＩ抗体は、活性が低く、親和性が悪いため、ｃＴｎＩタンパク質の検出にうまく適用できないため、本分野では、ｃＴｎＩに効果的かつ特異的に結合して検出する抗体に対して強い需要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原結合ドメインを含む新規の単離された結合タンパク質に関し、且つ該結合タンパク質の調製、適用などの側面を研究する。
【０００７】
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙであり、
Ｘ１はＫまたはＲであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＱまたはＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬである。
【０００８】
１つの重要な利点は、前記結合タンパク質が強力な活性を有し、ヒトｃＴｎＩタンパク質との高い親和性を持つことである。
【０００９】
１つまたは複数の実施形態において、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ１はＳであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ１はＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ２はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ１はＴである。
【００１０】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＹである
【００１１】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＦである
【００１２】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＹである
【００１３】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＦである
【００１４】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＴである。
【００１５】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＴである。
【００１６】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＴである。
【００１７】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＳである。
【００１８】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＳである。
【００１９】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＳである。
【００２０】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＤである。
【００２１】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＥである。
【００２２】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＩである。
【００２３】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＬである。
【００２４】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＩである。
【００２５】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＩである。
【００２６】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＬである。
【００２７】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＬである。
【００２８】
１つまたは複数の実施形態において、各相補性決定領域の変異部位は、以下の変異の組み合わせのいずれかから選ばれる。
2022502090.tif 000002
2022502090.tif 000003
2022502090.tif 000004
【００２９】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質に少なくとも３つのＣＤＲ（例えば重鎖の３つのＣＤＲ、或いは軽鎖の３つのＣＤＲ）が含まれ、或いは、前記結合タンパク質に少なくとも６つのＣＤＲが含まれる。
【００３０】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は可変領域と定常領域を含む完全な抗体である。
【００３１】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は、例えばナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位の中の１つなど、抗体の「機能フラグメント」である。
【００３２】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４、および／または、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含む。
【００３３】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質に抗体定常領域配列も含まれる。
【００３４】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域の配列から選ばれる。
【００３５】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域の種源は、牛、馬、乳牛、豚、羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、コックファイティング、または人間である。
【００３６】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域はネズミに由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される。
【００３７】
本開示はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、上記のような結合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【００３８】
本開示はまた、上記のような核酸分子を含むベクターに関する。
【００３９】
本開示はまた、上記のようなベクターによって形質転換される宿主細胞に関する。
【００４０】
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。
【００４１】
本開示はまた、上記のような結合タンパク質を生成する方法に関し、前記方法は、
培養培地中および適切な培養条件下で上記のような宿主細胞を培養し、培養培地または培養される宿主細胞からこのように生成される結合タンパク質を回収するステップ、を含む。
【００４２】
本開示はまた、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷を診断するための診断薬または試薬テストキットの調製における上記のような結合タンパク質の適用に関する。
【００４３】
本開示はまた、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法に関し、
ａ）抗体/抗原結合反応が起こるのに十分な条件下で、前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原と上記のような結合タンパク質を接触させて、免疫複合体を形成するステップ、及び
ｂ）前記試験サンプルに前記トロポニンＩ抗原が存在することを示す前記免疫複合体の存在を検出するステップ、を含み、
この実施形態において、前記結合タンパク質は信号強度を示すインジケーターでラベル付けでき、前記免疫複合体が簡単に検出されるようにする。
【００４４】
１つまたは複数の実施形態において、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記結合タンパク質に結合される二次抗体も含まれる。
【００４５】
１つまたは複数の実施形態において、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記トロポニンＩ抗原に結合される二次抗体も含まれる。
【００４６】
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記のような結合タンパク質を含む試薬テストキットに関する。
【００４７】
１つまたは複数の実施形態において、前記トロポニンＩ抗原は心筋トロポニンＩ抗原である。
【００４８】
本開示はまた、心筋トロポニンＩに関連する疾患の診断における本文に記載の結合タンパク質の適用に関する。
【００４９】
本開示はまた、心筋トロポニンＩに関連する疾患を診断する方法に関し、
Ａ）結合反応が起こるのに十分な条件下で、被験体からのサンプルと本開示に記載の結合タンパク質を接触させて結合反応を行うステップ、及び
Ｂ）結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップ、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンＩに関連する疾患が存在することを示す。
【００５０】
１つまたは複数の実施形態において、前記方法は蛍光免疫技術、化学発光技術、コロイド状金免疫技術、放射性免疫分析および／または酵素結合免疫技術に基づくものである。
【００５１】
１つまたは複数の実施形態において、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿または心筋組織の少なくとも1つから選ばれる。
【００５２】
１つまたは複数の実施形態において、前記被験体は、例えば人間のような霊長類動物などの哺乳動物である。
【００５３】
１つまたは複数の実施形態において、前記の心筋トロポニンＩに関連する疾患は心血管疾患である。
【００５４】
１つまたは複数の実施形態において、前記の心筋トロポニンＩに関連する疾患は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷またはそれらの組合わせからなる群から選ばれる。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本開示は、本開示のいくつかの実施形態に対する以下の説明及びそこに含まれる実施例の詳細な内容を通じて、より容易に理解されることができる。
【００５６】
本開示をさらに説明する前に、これらの実施形態は必然的に多様であるため、本開示は前記特定の実施形態に限定されないことを分かるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲でのみ定義されるので、本明細書に使用される用語は、限定としてではなく、特定の実施形態を説明するためのものだけであることも分かるべきである。
【００５７】
名詞の定義
「抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質」は、一般にＣＤＲ領域を含むすべてのタンパク質／タンパク質フラグメントを指す。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、及びこれらの抗体の抗原化合物結合フラグメントを含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体および抗体の最小認識単位、及びこれらの抗体とフラグメントの単鎖誘導体を含む。抗体のタイプには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤを選択することができる。なお、「抗体」という用語は、天然に存在する抗体と非天然に存在する抗体を含み、例えばキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）およびヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、並びに関連する合成アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を含む。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と同じ意味で使用できる。
【００５８】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることができる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることができる。これらのドメインは、通常、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を有する。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる超可変領域、及び３つの相補性決定領域を分離するフレームワーク領域からなる。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲は、例えばＫａｂａｔ（《免疫に重要なタンパク質の配列》（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、Ｅ．Ｋａｂａｔ等、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、（１９８３）参照）とＣｈｏｔｈｉａでは精確に定義された。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置決め及び位置合わせする役割を果たし、前記ＣＤＲは主に抗原との結合を担当する。
【００５９】
本文で使用される場合、「フレームワーク領域」、「アーキテクチャ領域」または「ＦＲ」は、抗体可変ドメインにおけるＣＤＲと定義される領域を除いた領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに細分化できる。
【００６０】
通常の場合で、重鎖と軽鎖の可変領域ＶＬ／ＶＨは、以下の番号のＣＤＲとＦＲを、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４というの組み合わせ並列で接続することにより得られる。
【００６１】
本文で使用される場合、ポリペプチドまたは核酸に関連する「精製された」または「単離された」という用語は、ポリペプチドまたは核酸がその天然培地またはその天然形態にないことを意味する。このため、「単離された」という用語は、その元の環境から、例えばそれが天然に存在する場合、自然環境から採取されたポリペプチドまたは核酸を含む。例えば、単離されたポリペプチドには通常、通常はそれに結合するか、通常はそれに混合するか、溶液中の少なくともいくつかのタンパク質または他の細胞成分が含まれない。単離されたポリペプチドには、細胞溶解物に含まれる天然に存在する前記ポリペプチド、精製または部分的に精製された形態の前記ポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞によって発現または分泌される前記ポリペプチド、及び異種宿主細胞または培養物中の前記ポリペプチドが含まれる。核酸に関連して、用語単離されたまたは精製されたという用語は、例えば前記核酸が天然のゲノムの背景にないことを示す（例えばベクターでは、発現カセットとして、プロモーターに連結され、または異種宿主細胞に人工的に導入される）。
【００６２】
本文に使用されるように、「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」という用語は、２対の異なる重／軽鎖と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド結合タンパク質を指す。二重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの接続などの様々な方法によって生成できる。
【００６３】
本文に使用されるように、「配列同一性」という用語は、少なくとも２種の異なる配列間の類似性を指す。このパーセントの同一性は、例えば基本的なローカル比較検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎなどのアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓなどのアルゴリズムという標準的なアルゴリズムによって決定できる。１つまたは複数の実施形態において、１セットのパラメータは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックス及びギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５であってもよい。１つまたは複数の実施形態において、２種類のアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することもでき、このアルゴリズムにＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残差テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。パーセント同一性は通常、同様な長さの配列を比較することによって計算される。
【００６４】
本文に使用されるように、「親和性」という用語は、結合タンパク質または抗体の抗原結合ドメインが抗原または抗原エピトープとの結合強度を指す。親和性はＫＤ値で測定でき、ＫＤ値が小さいほど親和性が高くなる。
【００６５】
本開示の例示的な実施形態
本開示は抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質に関し、前記抗原結合ドメインは以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＡ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｆ−Ｘ２−Ｔ−Ｆ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙであり、
Ｘ１はＫまたはＲであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＱまたはＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬである。
【００６６】
１つまたは複数の実施形態において、前記抗原結合ドメインは以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と、少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩと、ＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌ、例えば１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、２×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、３×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、４×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、４．５×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、６×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、８×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、９×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、３×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、７×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、または９×１０−１０ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、或いは８．３０×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ≦ＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌ、またはＫＤ≦１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、２×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、３×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、４×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、４．５×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、６×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、８×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、９×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、３×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、７×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、または９×１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。
【００６７】
親和性は本開示の明細書における方法に従って測定される。
【００６８】
１つまたは複数の実施形態において、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ１はＳであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ１はＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ２はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ１はＴである。
【００６９】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＹである。
【００７０】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＦである。
【００７１】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＹである。
【００７２】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＦである。
【００７３】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＴである。
【００７４】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＴである。
【００７５】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＴである。
【００７６】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＳである。
【００７７】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＳである。
【００７８】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＳである。
【００７９】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＤである。
【００８０】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＥである。
【００８１】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＩである。
【００８２】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＬである。
【００８３】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＩである。
【００８４】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＩである。
【００８５】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＬである。
【００８６】
１つまたは複数の実施形態において、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＬである。
【００８７】
１つまたは複数の実施形態において、各相補性決定領域の変異部位は、以下の変異の組み合わせのいずれかから選ばれる。
2022502090.tif 000005
2022502090.tif 000006
2022502090.tif 000007
【００８８】
１つまたは複数の実施形態において、本開示に記載される結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ１は、それぞれ独立して本開示に限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載される結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ２は、それぞれ独立して本開示に限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載される結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ３は、それぞれ独立して本開示に限定されるアミノ酸を表す。
【００８９】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質に少なくとも３つのＣＤＲ（例えば重鎖の３つのＣＤＲ、或いは軽鎖の３つのＣＤＲ）が含まれ、或いは、前記結合タンパク質に少なくとも６つのＣＤＲが含まれる。
【００９０】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は可変領域と定常領域を含む完全な抗体である。
【００９１】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は、例えばナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位の中の１つなど、抗体の「機能フラグメント」である。
ｓｃＦｖ（ｓｃ＝単鎖）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）。
【００９２】
本開示に記載の「機能フラグメント」は、特にｃＴｎＩに対して親抗体と同じ特異性を有する抗体フラグメントを指す。上記の機能フラグメント以外、半減期が延長された任意のフラグメントも含まれる。
【００９３】
これらの機能フラグメントは通常、ソース抗体と同じ結合特異性を持つ。当業者は、本開示の説明に記載の内容から、本開示の抗体フラグメントは例えば酵素消化の方法（ペプシンまたはパパイン）および／または二硫化物結合の化学的還元および分割の方法によって上記の機能フラグメントを得ることができると推測する。
【００９４】
抗体フラグメントはまた、当業者に知られている組換え遺伝子技術または例えばＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどによって販売されている自動ペプチドシンセサイザーを通じて、ペプチド合成によって得られてもよい。
【００９５】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４、および／または、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含む。
【００９６】
説明する必要があるものとして、本出願の上記に開示されたアミノ酸配列以外、フレームワーク領域の種源は人間であってもよく、ヒト化抗体を構成するようにする。
【００９７】
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は抗体定常領域配列をさらに含む。
【００９８】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域の配列から選ばれる。
【００９９】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域び種源は、牛、馬、乳牛、豚、羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、コックファイティング、または人間である。
【０１００】
１つまたは複数の実施形態において、前記定常領域はネズミに由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される。
【０１０１】
本開示はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、上記のような結合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【０１０２】
本開示はまた、上記のような核酸分子を含むベクター関する。
【０１０３】
本開示は、上記のような核酸分子をコードする少なくとも１つの核構築物をさらに含み、例えばプラスミドであり、さらに発現プラスミドであり、本出願の一実施例において該ベクターの構築方法を説明する。
【０１０４】
本開示はまた、上記のようなベクターによって形質転換される宿主細胞に関する。
【０１０５】
前記宿主細胞は、例えば哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。
【０１０６】
１つまたは複数の実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１０７】
本開示はまた、上記のような結合タンパク質を生成する方法に関し、前記方法は、
培養培地中および適切な培養条件下で上記のような宿主細胞を培養し、培養培地または培養される宿主細胞からこのように生成される結合タンパク質を回収するステップを含む。
【０１０８】
本開示はまた、上記のような結合タンパク質急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷を診断するための診断薬または試薬テストキットの調製における上記のような結合タンパク質の適用に関する。
【０１０９】
本開示は、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法に関し、
ａ）抗体/抗原結合反応が起こるのに十分な条件下で、前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原と上記のような結合タンパク質を接触させて、免疫複合体を形成するようにするステップ、及び
ｂ）前記試験サンプルに前記トロポニンＩ抗原が存在することを示す免疫複合体の存在を検出するステップ、を含み、
この実施形態において、前記結合タンパク質は信号強度を示すインジケーターでラベル付けでき、前記免疫複合体が簡単に検出されるようにする。
【０１１０】
１つまたは複数の実施形態において、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記結合タンパク質に結合される二次抗体も含まれ、
この実施形態において、前記結合タンパク質は、ｃＴｎＩの異なる抗原エピトープに結合するために、一次抗体の形で前記二次抗体と抗体ペアを形成し、
前記の二次抗体は信号強度を示すインジケーターでラベル付けでき、前記免疫複合体が簡単に検出されるようにする。
【０１１１】
１つまたは複数の実施形態において、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記トロポニンＩ抗原に結合される二次抗体も含まれ、
この実施形態において、前記結合タンパク質は前記二次抗体の抗原として、前記の二次抗体は信号強度を示すインジケーターでラベル付けでき、前記免疫複合体が簡単に検出されるようにする。
【０１１２】
１つまたは複数の実施形態において、前記信号強度を示すインジケーターは、蛍光物質、量子ドット、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン、放射性同位元素、放射性造影剤、常磁性イオン蛍光ミクロスフェア、電子高密度物質、化学発光マーカー、超音波造影剤、光増感剤、コロイド状金または酵素の中のいずれかを含む。
【０１１３】
１つまたは複数の実施形態において、前記蛍光物質は、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４０５、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５５５、Ａｌｅｘａ  ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６−ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フェリン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレゾールソリッドパープル、クレソルブルーパープル、ブリリアントクレソルブルー、Ｐ−アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、サクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウムトリビスピリジルジアミン、ユーロピウムクリプテートまたはキレート、ジアミン、ジアントシアニン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａブルー染料、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトリン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドの中のいずれかを含む。
【０１１４】
１つまたは複数の実施形態において、前記放射性同位元素は１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ及び８３Ｓｒの中のいずれかを含む。
【０１１５】
１つまたは複数の実施形態において、前記酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼのいずれかが含まれる。
【０１１６】
１つまたは複数の実施形態において、前記蛍光ミクロスフェアは、内部に希土類蛍光イオンユーロピウムが包まれるポリスチレン蛍光ミクロスフェアである。
【０１１７】
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記のような結合タンパク質を含む試薬テストキットに関する。
【０１１８】
１つまたは複数の実施形態において、前記トロポニンＩ抗原は心筋トロポニンＩ抗原である。
【０１１９】
本開示はまた、心筋トロポニンＩに関連する疾患の診断における本文に記載の結合タンパク質の適用に関する。
【０１２０】
本文に使用されるように、「心筋トロポニンＩに関連する疾患」という用語は、タンパク質またはコード核酸を含む心筋トロポニンＩをマーカーとして使用する疾患を指す。特に、本開示の１つまたは複数の実施形態において、心筋トロポニンＩに関連する疾患は、血中の心筋トロポニンＩのレベルの上昇を特徴とする疾患を指してもよい。本開示の１つまたは複数の実施形態において、心筋トロポニンＩに関連する疾患は、心筋組織または心筋細胞における心筋トロポニンＩのレベルの低下を特徴とする疾患を指してもよい。
【０１２１】
本開示はまた、心筋トロポニンＩに関連する疾患を診断する方法に関し、
Ａ）結合反応が起こるのに十分な条件下で、被験体からのサンプルと本開示に記載の結合タンパク質を接触させて結合反応を行うステップ、及び
Ｂ）結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップ、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンＩに関連する疾患が存在することを示す。
【０１２２】
１つまたは複数の実施形態において、前記方法は蛍光免疫技術、化学発光技術、コロイド状金免疫技術、放射性免疫分析および／または酵素結合免疫技術に基づくものである。
【０１２３】
１つまたは複数の実施形態において、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿または心筋組織の少なくとも1つから選ばれる。
【０１２４】
１つまたは複数の実施形態において、前記被験体は、例えば人間のような霊長類動物などの哺乳動物である。
【０１２５】
１つまたは複数の実施形態において、前記心筋トロポニンＩに関連する疾患は心血管疾患である。
【０１２６】
１つまたは複数の実施形態において、前記心筋トロポニンＩに関連する疾患は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷またはそれらの組合わせからなる群から選ばれる。
【０１２７】
以下、実施例を組み合わせ、本開示の実施形態を詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本開示を説明するためのものだけであり、本開示の範囲を制限するものと見されるべきではないことを理解する。実施例に具体的な条件が示されない場合、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に従って実行する。用いられる試薬または機器はメーカーの指示がない場合、いずれも市販によって取得できる従来の製品である。
【０１２８】
実施例１
本実施例は、ヒト心筋トロポニンＩに対する組換え抗体の例示的な調製方法を提供する。
【０１２９】
Ｓ１０、発現プラスミドの構築
本実施例における制限エンドヌクレアーゼ、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼはＴａｋａｒａ会社から購入し、
ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＲＮＡ抽出試薬テストキットはＴＯＹＯＢＯ会社から購入し、
ＢＤ  ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ試薬テストキットはＴａｋａｒａ会社から購入し、
ｐＭＤ−１８ＴベクターはＴａｋａｒａ会社から購入し、
プラスミド抽出試薬テストキットは天根会社から購入し、
プライマー合成と遺伝子配列決定はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社により完成される。
【０１３０】
Ｓ１１、プライマーの設計と合成
重鎖と軽鎖を増幅する５’ＲＡＣＥ上流プライマー、
重鎖と軽鎖を増幅する５’ＲＡＣＥプライマー、
ＳＭＡＲＴＥＲ  ＩＩ  Ａ  オリゴヌクレオチド：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ＜３’、
５’−ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  プライマー（５’−ＣＤＳ）：
５’＞（Ｔ）２５ＶＮ＜３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、ｏｒＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ、ｏｒＣ）、
ユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）：
５’＞ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’
ネストユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’、
軽鎖遺伝子を増幅する下流プライマー、
ｍｋＲ、
５’＞ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ＜３’。
重鎖遺伝子を増幅する下流プライマー、
ｍＨＲ、
５’＞  ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ＜３’。
【０１３１】
Ｓ１２、抗体可変領域遺伝子のクローニングと配列決定
Ａｎｔｉ−ｃＴｎＩ  ８Ｃ４モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からミドルＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ試薬テストキット及び試薬テストキットにおけるＳＭＡＲＴＥＲ  ＩＩ  Ａオリゴヌクレオチドと５’−ＣＤＳプライマーを使用して第一鎖ｃＤＮＡ合成を行い、得られた第一鎖ｃＤＮＡ生成物をＰＣＲ増幅テンプレートとして使用する。軽鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネストユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍｋＲプライマーで増幅され、重鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネストユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＨＲプライマーで増幅される。軽鎖のプライマーペアは約０．８ＫＢのターゲットバンドを増幅し、重鎖のプライマーペアは約１．４ＫＢのターゲットバンドを増幅する。アガロースゲル電気泳動で精製して回収し、生成物をｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでＡ添加反応を行った後ｐＭＤ−１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、細菌が成長した後、それぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子を取って４つのクローンをクローニングして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社に送って配列決定を行う。
【０１３２】
Ｓ１３、ＣＴＮＩ  ８Ｃ４抗体可変領域遺伝子の配列分析
上記の配列決定で得られた遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入れて分析し、且つＶＮＴＩ１１．５ソフトウェアを使用して分析し、重鎖と軽鎖プライマーペアにより増幅された遺伝子がすべて正しいものであることを分析して判定し、軽鎖により増幅された遺伝子フラグメントの中で、ＶＬ遺伝子配列は３４２ｂｐであり、ＶｋＩＩ遺伝子家族に属し、その前に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアにより増幅された遺伝子フラグメントの中で、ＶＨ遺伝子配列は３５７ｂｐであり、ＶＨ１遺伝子家族に属し、その前に５７ｂｐのリーダーペプチド配列を有する。
【０１３３】
Ｓ１４、組換え抗体発現プラスミドの構築
ｐｃＤＮＡＴＭ３．４ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターは構築された組換え抗体真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素制限部位に導入されており、且つｐｃＤＮＡ３．４Ａ発現ベクターと呼ばれ、後続で３．４Ａ発現ベクターと略称され、上記ｐＭＤ−１８Ｔにおける抗体可変領域遺伝子配列決定結果に応じて、ＣＴＮＩ  ８Ｃ４抗体のＶＬとＶＨ遺伝子特異性プライマーを設計し、両端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素制限部位と保護塩基が付き、プライマーは以下の通りであり、
Ｃ８Ｃ４−ＨＦ：
５’＞ＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣ＜３’、
Ｃ８Ｃ４−ＨＲ：５’＞ＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ＜３’、
Ｃ８Ｃ４−ＬＦ：５’＞ＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧ＜３’、
Ｃ８Ｃ４−ＬＲ：  ５’＞ＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ＜３’、
ＰＣＲ増幅方法によって０．７５ＫＢの軽鎖遺伝子フラグメントと１．４２ｋｂの重鎖遺伝子フラグメントを増幅する。重鎖と軽鎖遺伝子フラグメントには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重酵素消化を使用し、３．４ＡベクターにはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重酵素消化を採用し、フラグメントとベクターを精製して回収した後、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子をそれぞれ３．４Ａ発現ベクターに接続し、それぞれ重鎖と軽鎖の組換え発現プラスミドを取得する。
【０１３４】
プラスミドを超純水で４００ｎｇ／ｍｌに希釈し、遠心チューブでＣＨＯ細胞１．４３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを調整し、１００ｕｌのプラスミドと７００ｕｌの細胞を混合し、エレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行い、１０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ含有の培養培地に移し、３７度のシェーカーに培養し（８％ＣＯ２、振幅１５０）、毎日サンプルを採取して細胞の生存率を検出し、細胞の生存率が５０％未満の場合、細胞培養上清を遠心分離する。
【０１３５】
ｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムでアフィニティーと精製を行う。４μｇの精製された抗体を取り、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、２８ＫＤの軽鎖（配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される）、５０ＫＤの重鎖（配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される）の２つのバンドが表示される。
【０１３６】
実施例２
実施例１で得られた抗体（配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１及び１２で示される軽鎖と重鎖を含む）は分析によって、重鎖の相補性決定領域（ＷＴ）：
ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｙ（Ｘ１）−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｔ（Ｘ１）−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｙ（Ｘ２）−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｋ（Ｘ１）−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｙ（Ｘ２）−Ｇ−Ｓ−Ｔ（Ｘ３）−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙである。
軽鎖の相補性決定領域：
ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｄ（Ｘ１）−Ｉ−Ｔ−Ｑ（Ｘ２）−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｓ（Ｘ１）−Ｓ−Ｒ−Ｉ（Ｘ２）−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｎ（Ｘ１）−Ｔ−Ｉ（Ｘ２）−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はすべて変異部位である。
【０１３７】
2022502090.tif 000008
【０１３８】
本発明者らは、ＷＴ中のＣＤＲ部位に対して上記変異を行い、より良好な活性を有する抗体を得るようにする。
【０１３９】
コーティング液でＣＴＮＩ品質管理製品組換え抗原を１ｕｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートのコーティングを行い、穴当たり１００ｕＬ、４°Ｃで一晩、翌日、洗浄液で２回洗浄し、軽くたたいて乾かし、ブロッキング溶液（２０％ＢＳＡ＋８０％ＰＢＳ）、穴当たり１２０ｕＬ、３７°Ｃで、１ｈ、軽くたたいて乾かし、希釈されたｃＴｎＩモノクローナル抗体を加え、１００ｕＬ／穴、３７°Ｃで、３０ｍｉｎ、洗浄液で５回洗浄し、軽くたたいて乾かし、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを加え、穴当たり１００ｕＬ、３７°Ｃで、３０ｍｉｎ、洗浄液で５回洗浄し、軽くたたいて乾かし、発色性液体Ａ液（５０ｕＬ／穴）を加え、発色性液体Ｂ液（５０ｕＬ／穴）を加え、１０ｍｉｎ、停止液を加え、５０ｕＬ／穴、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ（６３０ｎｍ参照）でのＯＤ値を読み取る。
【０１４０】
2022502090.tif 000009
【０１４１】
表２から分かるように、変異１の活性効果が最も良好であるため、変異１をフレームワーク配列としてより良い力価の変異部位（スクリーニングによって得られた抗体活性が変異１と類似し、抗体活性が±１０％であることを確保する）をスクリーニングし、結果の一部は以下の通りである。
【０１４２】
2022502090.tif 000010
2022502090.tif 000011
【０１４３】
親和性分析
ＡＭＣセンサーを使用して、精製された抗体をＰＢＳＴで１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、ＣＴＮＩ品質管理製品組換えタンパク質（自社の抗原）をＰＢＳＴで段階希釈し、７６９．２ｎｍｏｌ／ｍｌ、３８４．６ｎｍｏｌ／ｍｌ、１９２．３ｎｍｏｌ／ｍｌ、９６．２ｎｍｏｌ／ｍｌ、４８．１ｎｍｏｌ／ｍｌ、２４ｎｍｏｌ／ｍｌ、１２ｎｍｏｌ／ｍｌ、０ｎｍｏｌ／ｍｌ、
実行プロセスは以下の通りであり、緩衝液１（ＰＢＳＴ）で６０ｓ平衡化し、抗体溶液で抗体を３００ｓ硬化し、緩衝液２（ＰＢＳＴ）で１８０ｓインキュベートし、抗原溶液で４２０ｓ結合し、緩衝液２で１２００ｓ解離し、１０ｍＭ  ｐＨ  １．６９  ＧＬＹ溶液及び緩衝液３でセンサーを再生し、データを出力する。（ＫＤは平衡溶液親和性定数である親和性を示し、ＫＯＮは結合速度を示し、ｋｄｉｓは解離速度を示す。）
【０１４４】
2022502090.tif 000012
2022502090.tif 000013
【０１４５】
表４から分かるように、表３にリストされた変異部位は、抗体の親和性にほとんど影響を与えない。
【０１４６】
上記結果を検証するために、ＷＴをフレームワーク配列として上記の実験を繰り返し、変異部位の親和性を検証し、結果の一部は以下の通りである。
【０１４７】
2022502090.tif 000014
【０１４８】
2022502090.tif 000015
【０１４９】
表５と表６から分析するように、抗体活性を有することを確保する前提で、上記変異部位も一定の親和性を有する。
【０１５０】
最後に説明すべきものとして、以上の実施例は、本開示の技術案を制限するものではなく、説明するためのものだけであり、以上の各実施例を参照して本開示を詳細に説明したが、当業者にとって、依然として以上の各実施例に記載の技術的解決手段を修正するか、或いはその中の一部又は全部の技術的特徴を等価切替することができ、これらの修正又は等価切替は、対応的な技術案の本質が本開示の各実施例の技術案の範囲を逸脱させないことが理解すべきである。
【０１５１】
産業上の利用可能性
本開示による心筋トロポニンＩに結合される抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質は、特定の重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含む。該結合タンパク質は、心筋トロポニンＩタンパク質を特異的に認識して結合することができ、高い感度と特異性を有し、特に、該結合タンパク質はヒトｃＴｎＩタンパク質と高い親和性を有する。それにより、心筋トロポニンＩに関連する疾患の検出と診断を実現する。
【配列表】
2022502090000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月29日(2021.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙであり、
Ｘ１はＲまたはＫであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＮまたはＱであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
好ましくは、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ１はＳであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ１はＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ２はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ１はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＹであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１では、Ｘ１はＦであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＹであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２では、Ｘ２はＦであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＴであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＹであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３では、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＳであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＤであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１では、Ｘ１はＥであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２では、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、前記相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、各相補性決定領域の変異部位は、以下の変異の組み合わせのいずれかから選ばれる、
2022502090.tif 000019
2022502090.tif 000020
2022502090.tif 000021
ことを特徴とする抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項２】
前記結合タンパク質に少なくとも３つのＣＤＲｓが含まれ、或いは、前記結合タンパク質に少なくとも６つのＣＤＲｓが含まれ、
好ましくは、前記結合タンパク質は、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位の中の１つであり、
好ましくは、前記結合タンパク質は、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４、および／または、配列が順次ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項３】
前記結合タンパク質に抗体定常領域配列も含まれ、
好ましくは、前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれかの定常領域の配列から選ばれ、
好ましくは、前記定常領域の種源は、牛、馬、乳牛、豚、羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、コックファイティング、または人間であり、
好ましくは、前記定常領域はネズミに由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項４】
前記結合タンパク質は信号強度を示すインジケーターでラベル付けられる、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質をコードする、
ことを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターによって形質転換される宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質を生成する方法であって、
培養培地中および適切な培養条件下で請求項７に記載の宿主細胞を培養し、培養培地または培養される宿主細胞からこのように生成される結合タンパク質を回収するステップを含む、
ことを特徴とする結合タンパク質を生成する方法。
【請求項９】
急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷を診断するための診断薬または試薬テストキットの調製における請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質の適用。
【請求項１０】
試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法であって、
ａ）抗体/抗原結合反応が起こるのに十分な条件下で、前記試験サンプル中のトロポニンＩ抗原と請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質を接触させ、免疫複合体を形成するステップ、及び
ｂ）前記試験サンプルに前記トロポニンＩ抗原が存在することを示す前記免疫複合体の存在を検出するステップ、を含み、
好ましくは、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記結合タンパク質に結合される二次抗体も含まれ、
好ましくは、ステップａ）において、前記免疫複合体に前記トロポニンＩ抗原に結合される二次抗体も含まれる、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法。
【請求項１１】
前記トロポニンＩ抗原は心筋トロポニンＩ抗原である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の結合タンパク質を含む試薬テストキット。
【請求項１３】
好ましくは、前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、コロイド状金免疫技術、放射性免疫分析および／または酵素結合免疫技術に基づくものであり、
好ましくは、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿または心筋組織の少なくとも1つから選ばれる請求項１０又は１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）であり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）であり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）であり、
Ｘ１はＫまたはＲであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）であり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＱまたはＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）であり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）であり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
本開示の例示的な実施形態
本開示は抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質に関し、前記抗原結合ドメインは以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含み、または、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つ心筋トロポニンＩとＫＤ≦３．３３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ１はＧ−Ｆ−Ｔ−Ｘ１−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｓであり、
Ｘ１はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ２はＩ−Ｓ−Ｘ１−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋであり、
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＨ３はＡ−Ｒ−Ｘ１−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｘ２−Ｇ−Ｓ−Ｘ３−Ｆ−Ｍ−Ｄ−Ｙであり、
Ｘ１はＫまたはＲであり、Ｘ２はＹ、ＰまたはＦであり、Ｘ３はＴまたはＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ１はＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｘ１−Ｉ−Ｔ−Ｘ２−Ｙ−Ｌ−Ｎであり、
Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＱまたはＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ２はＩ−Ｙ−Ｙ−Ｘ１−Ｓ−Ｒ−Ｘ２−Ｈ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｓであり、
Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＩまたはＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ−ＶＬ３はＱ−Ｑ−Ｇ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｐ−Ｌ−Ｔであり、
Ｘ１はＮまたはＨであり、Ｘ２はＩまたはＬである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
Ｓ１１、プライマーの設計と合成
重鎖と軽鎖を増幅する５’ＲＡＣＥ上流プライマー、
重鎖と軽鎖を増幅する５’ＲＡＣＥプライマー、
ＳＭＡＲＴＥＲ  ＩＩ  Ａ  オリゴヌクレオチド：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
５’−ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  プライマー（５’−ＣＤＳ）：
５’＞（Ｔ）２５ＶＮ＜３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、ｏｒＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ、ｏｒＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
ユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）：
５’＞ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ネストユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、
軽鎖遺伝子を増幅する下流プライマー、
ｍｋＲ、
５’＞ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）。
重鎖遺伝子を増幅する下流プライマー、
ｍＨＲ、
５’＞  ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
Ｓ１４、組換え抗体発現プラスミドの構築
ｐｃＤＮＡTM３．４ＴＯＰＯ(R)ベクターは構築された組換え抗体真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素制限部位に導入されており、且つｐｃＤＮＡ３．４Ａ発現ベクターと呼ばれ、後続で３．４Ａ発現ベクターと略称され、上記ｐＭＤ−１８Ｔにおける抗体可変領域遺伝子配列決定結果に応じて、ＣＴＮＩ  ８Ｃ４抗体のＶＬとＶＨ遺伝子特異性プライマーを設計し、両端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素制限部位と保護塩基が付き、プライマーは以下の通りであり、
Ｃ８Ｃ４−ＨＦ：
５’＞ＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、
Ｃ８Ｃ４−ＨＲ：５’＞ＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、
Ｃ８Ｃ４−ＬＦ：５’＞ＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、
Ｃ８Ｃ４−ＬＲ：  ５’＞ＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ＜３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、
ＰＣＲ増幅方法によって０．７５ＫＢの軽鎖遺伝子フラグメントと１．４２ｋｂの重鎖遺伝子フラグメントを増幅する。重鎖と軽鎖遺伝子フラグメントには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重酵素消化を使用し、３．４ＡベクターにはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重酵素消化を採用し、フラグメントとベクターを精製して回収した後、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子をそれぞれ３．４Ａ発現ベクターに接続し、それぞれ重鎖と軽鎖の組換え発現プラスミドを取得する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2022502090000001.app
【国際調査報告】
2022502090.tif 000022
2022502090.tif 000023
2022502090.tif 000024
2022502090.tif 000025