(57)【要約】本出願は、移植片状態を決定するための方法およびシステムを提供する。一部の実施形態では、方法は、臓器を受けた臓器移植片レシピエントから生体試料を得るステップと、生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づいてコンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を同定し、それによって、１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出し、それによって、移植片状態を決定するステップとを含む。
2022500015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片状態を決定する方法であって、
（ａ）ドナーから臓器を受けた臓器移植片レシピエントから生体試料を得るステップと、
（ｂ）前記生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、
（ｄ）前記１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づき、コンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を検出し、それによって、１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｅ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出し、それによって、移植片状態を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記臓器が、同種供給源由来の固形臓器である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料中の、ドナーに対して特異的である前記多型核酸標的の量および循環型無細胞核酸中の前記多型核酸標的の総量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多型核酸標的が、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）１つまたは複数のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）１つまたは複数の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）１つまたは複数のコピー数バリアント、（ｖｉ）挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せが、ショートタンデムリピートと組み合わせた欠失挿入バリアント（ＤＩＰ−ＳＴＲ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多型核酸標的が、１つまたは複数のＳＮＰを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のＳＮＰが、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せがＡ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各多型核酸標的が、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＮＰが、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む、請求項４、６または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
臓器移植片レシピエント由来の前記生体試料が、体液であり、前記体液が、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便のうち１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記臓器ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／または前記ドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
ＶＩ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的をフィルタリング除外するステップと
ＶＩＩ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記残存多型核酸標的の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
ＶＩＩＩ）前記生体試料中の前記１つまたは複数の多型核酸標的における前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｄ）前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップが、
Ｉ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満である多型核酸標的ならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）前記生体試料中の前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエントも前記臓器ドナーも、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されておらず、前記（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
Ｉ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記１つまたは複数の多型核酸標的の量の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含む、ステップと、
ＩＩ）前記第１のクラスター中の前記多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルゴリズムが、（ｉ）固定カットオフ、（ｉｉ）動的クラスタリングおよび（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値のうち１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記無細胞核酸における前記１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、参照集団中の前記参照対立遺伝子の予測頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出し、
前記参照対立遺伝子の前記予測頻度が、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフ未満である場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフより大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている、請求項１４から１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記パーセンタイルが、少なくとも９０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動的クラスタリングアルゴリズムを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップが、
（ｉ）前記無細胞核酸中の前記１つまたは複数の多型核酸標的を、各前記多型核酸標的の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、
（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップと
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記動的クラスタリングアルゴリズムが、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多型核酸標的の１つまたは複数の各々の前記対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合に、前記個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムが、前記１つまたは複数の核酸を、ドナー特異的核酸として同定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記閾値が、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記閾値が、前記参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々の前記ホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量が、少なくとも１つのアッセイにおいて前記１つまたは複数の多型核酸標的を測定することによって検出され、
前記少なくとも１つのアッセイが、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記高スループット配列決定が、前記ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅または前記ＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
天然ゲノム核酸および前記天然配列と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するバリアントオリゴヌクレオチドに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅をさらに含み、
前記バリアントオリゴヌクレオチドが、既知量で前記増幅反応に付加され、
増幅された天然ゲノム核酸の量の、増幅されたバリアントオリゴヌクレオチドの量に対する比を決定するステップと、
前記比に、前記増幅反応に付加された前記バリアントオリゴヌクレオチドの量を乗じることによってゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体試料中の循環型無細胞核酸においてゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
前記ドナー特異的核酸フラクションおよびゲノムＤＮＡの前記総コピー数を乗じることによって前記ドナー特異的核酸の前記コピー数を決定するステップと
をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値より大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
翻訳後種々の時間での前記移植片状態をモニタリングするステップをさらに含み、
前記移植片状態が、早い時点および少なくとも１つの遅い時点を含み、すべての時点が移植後である１つまたは複数の時点でモニタリングされ、
前記早い時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションの、またはドナー特異的循環型無細胞核酸の前記コピー数の、前記少なくとも１つの遅い時点と比較した増大が、移植片拒絶の発生を示し、前記早い時点と前記少なくとも１つの遅い時点の間の時間間隔が、少なくとも７日である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記早い時点が、移植後０日〜１年の間であり、および／または前記遅い時点が、移植後７日〜５年の間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記臓器移植片レシピエントに、免疫抑制療法の投与を助言するステップまたは前記臓器移植片レシピエントの免疫抑制療法の修飾を助言するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
移植片状態を決定するシステムであって、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のプロセッサに連結されたメモリとを含む、システムであって、前記メモリは、
生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ａ）からの１つまたは複数の多型核酸標的の前記測定値に少なくとも基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または非存在を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の決定された存在または量に少なくとも基づいて前記臓器移植片レシピエントの移植片状態を決定するステップと
を含むプロセスを実施するように構成された命令のセットがエンコードされている、システム。
【請求項３６】
１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、前記１つまたは複数のプロセッサに、移植片状態を決定する方法を実施させるプログラム命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体であって、前記方法が、
（ａ）生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの前記測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップと
を含む、非一時的な機械可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／７２８，４７９号の優先権を主張しており、その全体の内容は、すべての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本技術は、一部、移植片拒絶を検出するために使用される方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
過去６０年の間に、固形臓器移植は、臨床実験として分類されるものから、日常的な信頼のできる医学的手順と考えられるものへと進展した。現在では、心臓、肺、腎臓および肝臓を含む多数の固形臓器を移植することが可能であり、米国で毎年数千の成功した固形臓器移植が実施されている。残念ながら、時折、レシピエントの免疫系が、移植された臓器を身体に対して外来と認識し、種々の免疫系機構を活性化して臓器を拒絶する。移植された臓器が、レシピエントによって拒絶される場合には、その早期段階で検出することが困難である命を脅かす状況を作り出す。患者を拒絶についてモニタリングすることは、困難なことであり、費用がかかり、侵襲的手順を必要とすることも多く、さらに、現在の監視方法は、適当な感度を欠いている。
【０００４】
本発明は、高感度であり、迅速であり、安価である、拒絶について臓器移植片患者をモニタリングする非侵襲性方法を提供することによってこれらの問題を解決する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本開示は、移植片状態を決定する方法であって。
（ａ）臓器を受けた臓器移植片レシピエントから生体試料を得るステップと、
（ｂ）生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
（ｃ）生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づき、コンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を同定し、それによって、１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｅ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出し、それによって、移植片状態を決定するステップと
を含む方法を提供する。
【０００６】
一部の実施形態では、臓器は、同種供給源由来の固形臓器である。一部の実施形態では、固形臓器は、腎臓、心臓、肺、膵臓、腸、胃または肝臓のうち１つである。
【０００７】
一部の実施形態では、多型核酸標的は、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）１つまたは複数のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）１つまたは複数の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）１つまたは複数のコピー数バリアント、（ｖｉ）１つまたは複数の挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せを含む。項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せは、ショートタンデムリピートと組み合わせた欠失挿入バリアント（複数可）（ＤＩＰ−ＳＴＲ）であり得る。一部の実施形態では、多型核酸標的は、１つまたは複数のＳＮＰを含む。一部の実施形態では、各多型核酸標的は、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する。一部の実施形態では、ＳＮＰは、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰは、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せが、Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない。
【０００９】
一部の実施形態では、臓器ドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、レシピエントの遺伝子型は、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、ドナー特異的対立遺伝子を同定する方法ステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定する方法ステップは、
Ｉ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的をフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する残存多型核酸標的の測定値からなるデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
ＩＩＩ）生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的における残存多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、レシピエントの遺伝子型は、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、ドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、ドナー特異的対立遺伝子を検出する方法ステップは、
Ｉ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満である多型核酸標的ならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）生体試料中の残存多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、レシピエントも臓器ドナーも、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されておらず、ドナー特異的対立遺伝子を検出する方法ステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定する方法ステップは、
Ｉ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する１つまたは複数の多型核酸標的の量の測定値からなるデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
第２のクラスターが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含む、ステップと、
ＩＩ）第１のクラスター中の多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、臓器移植片レシピエント由来の生体試料は、体液である。例えば、体液は、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便のうち１つまたは複数であり得る。
【００１３】
一部の実施形態では、臓器ドナーは、１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されていない。一部の実施形態では、レシピエントも、臓器ドナーも、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されていない。
【００１４】
本明細書において開示される方法において使用できるコンピュータアルゴリズムとして、以下：（ｉ）固定カットオフ、（ｉｉ）動的クラスタリングおよび（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値のうち１つまたは複数を挙げることができる。例えば、ある特定の実施形態では、試料中の無細胞核酸における１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、参照集団中の参照対立遺伝子の予測頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、固定カットオフアルゴリズムは、ドナー特異的核酸を検出でき、参照対立遺伝子の予測頻度は、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある。
【００１５】
一部の実施形態では、レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフ未満である場合に、固定カットオフアルゴリズムは、ドナー特異的核酸を検出する。一部の実施形態では、レシピエントは、代替対立遺伝子についてホモ接合性であり、１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフより大きい場合に、固定カットオフアルゴリズムは、ドナー特異的核酸を検出する。
【００１６】
一部の実施形態では、固定カットオフは、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照および／または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている。一部の実施形態では、固定カットオフは、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照および／または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている。一部の実施形態では、固定カットオフパーセンタイルは、少なくとも９０である。
【００１７】
一部の実施形態では、動的クラスタリングアルゴリズムを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップは、
（ｉ）無細胞核酸中の１つまたは複数の多型核酸標的を、各多型核酸標的の参照対立遺伝子および／または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、（ｉｉｉ）情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップとを含む。一部の実施形態では、動的クラスタリングアルゴリズムは、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムである。情報価値のある群は、情報価値のある多型核酸標的（例えば、情報価値のあるＳＮＰ）を含む、またはからなり、情報価値のない群は、情報価値のない多型核酸標的を含む、またはからなる。
【００１８】
多型核酸標的の１つまたは複数各々の対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合に、方法において使用される個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムが、１つまたは複数の核酸をドナー特異的核酸として同定する。一部の実施形態では、閾値は、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている。一部の実施形態では、閾値は、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である。
【００１９】
一部の実施形態では、方法は、生体試料中の、循環型無細胞核酸中の多型核酸標的の総量と比較した、ドナーに対して特異的である多型核酸標的の量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量を決定するステップが、少なくとも１つのアッセイにおいて１つまたは複数の多型核酸標的を測定することによって実施され、少なくとも１つのアッセイは、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）のうち少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、高スループット配列決定は、ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅またはＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の多型核酸標的の量は、１つまたは複数の多型核酸標的各々の各対立遺伝子の配列読取りに基づいて決定される。一部の実施形態では、ドナー特異的核酸フラクションが、所定の閾値より大きい場合に、移植片状態は拒絶として決定され、ドナー特異的核酸フラクションが、所定の閾値より小さい場合に、移植片状態は受容として決定される。
【００２０】
一部の実施形態では、方法は、天然ゲノム核酸および天然配列と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するバリアントオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴ）に対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅をさらに含み、
方法は、増幅された天然ゲノム核酸の量の、増幅されたバリアントオリゴヌクレオチドの量に対する比を決定するステップと、比に、増幅反応に付加されたバリアントオリゴヌクレオチドの量を乗じることによってゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、生体試料中の循環型無細胞核酸においてゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと、ドナー特異的核酸フラクションおよびゲノムＤＮＡの総コピー数を乗じることによってドナー特異的核酸のコピー数を決定するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、ドナー特異的核酸のコピー数が所定の閾値よりも大きい場合に、移植片状態は拒絶として決定され、および／またはドナー特異的核酸のコピー数が所定の閾値よりも小さい場合に、移植片状態が受容として決定される。
【００２１】
一部の実施形態では、移植片状態を検出する方法は、早い時点および早い時点の後の遅い時点を含む１つまたは複数の時点で、移植片レシピエントにおいてドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションを、および／またはドナー特異的循環型無細胞核酸のコピー数として決定するステップを含み、移植後のすべての時点について、早い時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションの、またはドナー特異的循環型無細胞核酸のコピー数の、遅い時点に対する増大が、移植片拒絶の発生を示す。多様な時点を、モニタリングしてもよく、変動は、移植された臓器の性質、レシピエントの健康または他の因子に応じて変わり得る。一部の実施形態では、早い時点と遅い時点の間の時間間隔は、少なくとも７日である。一部の実施形態では、早い時点は、移植後０日〜１年の間である。一部の実施形態では、遅い時点は、移植後７日〜５年の間である。
【００２２】
一部の実施形態では、方法は、試料中のドナー核酸の決定の結果に基づいて療法を提供するステップをさらに含む。例えば、方法は、臓器移植片レシピエントに投与を助言するステップもしくは免疫抑制療法を投与するステップまたは臓器移植片レシピエントの免疫抑制療法の修飾を助言するステップもしくは免疫抑制療法を修飾するステップをさらに含み得る。
【００２３】
また、本明細書において開示される方法の実施形態のいずれかを実施するシステムが本明細書において提供される。一部の実施形態では、移植片状態を決定するシステムは、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のプロセッサに連結されたメモリであって、インストラクションのセットを用いてコード化されたメモリとを含み得る。プロセスは、一部の実施形態では、
（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料は、同種ドナーから臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られるステップと、（ｂ）（ａ）由来の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に少なくとも基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の有無を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の決定された存在または量に少なくとも基づいて臓器移植片レシピエントの移植片状態を決定するステップとを含み得る。
【００２４】
また、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、１つまたは複数のプロセッサに、本明細書において開示される実施形態のうちいずれか１つにおける方法を実施させるプログラムインストラクションを含む非一時的な機械可読記憶媒体が、本開示において提供され、一部の実施形態では、非一時的な機械可読記憶媒体は、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、１つまたは複数のプロセッサに、（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸として存在する１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップとを含む方法を実施させるプログラムインストラクションを含み得る。
【００２５】
ある特定の実施形態を、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面においてさらに記載する。
【００２６】
図面は、本明細書の技術の実施形態を例示するものであり、限定するものではない。記載を明確にし、また分かりやすくするために、図面は正確な縮尺では作成されず、一部の事例では、特定の実施形態を理解しやすくするために、様々な側面が、誇張または拡大して示される場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、移植前の患者および移植後の患者におけるＳＮＰ対立遺伝子頻度の例示的な例を示す図である。水平な点線の黒線はそれぞれ、０．０１および０．９９の固定カットオフを表す。枠で囲んだ領域は、ドナーｃｆＤＮＡが対立遺伝子頻度に関与するＳＮＰを表す。
【図２】図２は、技術のある特定の実施形態が実施され得るシステムの例示的な実施形態を示す図である。
【図３】図３は、移植患者ｃｆＤＮＡのモデルにおける情報価値のあるＳＮＰのタイプを例示する図である。実線の矢印は、ドナーフラクションの計算のために使用される情報価値のあるＳＮＰのクラスターを示す。破線の矢印は、ドナーフラクションの計算に含まれない除外された情報価値のあるクラスターを示す。
【図４】図４は、情報価値のあるＳＮＰの類似の対立遺伝子頻度を示す図である。赤色および緑色データは、ドナーフラクションの計算に使用した情報価値のあるクラスターである。図面下部の第２のクラスターは、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーがヘテロ接合性であるＳＮＰである。図面下部の第３のクラスターは、レシピエントが１つの対立遺伝子についてホモ接合性であり、ドナーがもう１つの対立遺伝子についてホモ接合性であるＳＮＰである。
【図５】図５は、ドナーまたはレシピエントの遺伝子型に関する知見に基づいてドナーフラクション（ＤＦ）を計算するためのアプローチを示す図である。ドナーフラクションは、遺伝子型が不明である場合は本明細書に開示されるアプローチ１（ＤＦ１）を使用し、ドナーの遺伝子型が与えられている場合は本明細書に開示されるアプローチ２（ＤＦ２）を使用し、レシピエントの遺伝子型が与えられている場合は本明細書に開示されるアプローチ３（ＤＦ３）を使用し、両方の遺伝子型が与えられている場合は本明細書に開示されるアプローチ４（ＤＦ４）を使用して計算される。ＤＦ４は、情報価値のあるＳＮＰの最も正確な同定を表すことから、それを、他のすべてのアプローチを相関させるグラウンドトゥルースとして役立つようにＸ軸に置いた。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、情報価値のあるＳＮＰを分類するためのアプローチを示す図である。図６Ａは、ドナーフラクションの計算に含まれる情報価値のあるＳＮＰが、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーがヘテロ接合性であるＳＮＰ（ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの組合せ）、またはレシピエントがホモ接合性であり、ドナーが反対のホモ接合性であるＳＮＰ（ＡＡレシピエント／ＢＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＡドナーの組合せ）であることを示す。ドナーフラクションの計算から除外される情報価値のあるＳＮＰは、レシピエントがヘテロ接合性であり、ドナーがホモ接合性である場合（ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナー）である。情報価値のないＳＮＰは、ドナーおよびレシピエントがマッチする遺伝子型を有するＳＮＰ（ＡＡレシピエント／ＡＡドナー、ＢＢレシピエント／ＢＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー）である。各アプローチを試験した後、ＳＮＰを、情報価値のあるまたは情報価値のない、のいずれかとして分類する。これをそれぞれ、「ｏ」および「＋」の記号で示す。図６Ｂは、図６Ａを再度プロットして、低いおよび高いドナーフラクションでアプローチ１および２のパネルにおいて目に見える誤分類されたＳＮＰを強調する図である（円で囲まれているデータ点を参照されたい）。
【図７】図７は、ＤＦ１、ＤＦ２、またはＤＦ３を使用した５％未満のドナーフラクションの推定を示す図である。Ｘ軸の値は、ＤＦ４を使用して決定したドナーフラクションを表す。ドナーフラクションは、低いドナーフラクションの場合に過剰評価され得るが、これは、ＤＦ２の計算において行ったように、ドナーの遺伝子型の知見、ならびにＡＡレシピエント／ＡＡドナーおよびＢＢレシピエント／ＢＢドナーのレシピエント−ドナーの遺伝子型の組合せの除外を通して緩和することができる。
【図８】図８は、ＤＦ１、ＤＦ２、またはＤＦ３を使用した２５％より多くのドナーフラクションの推定を示す図である。Ｘ軸の値は、ＤＦ４を使用して決定したドナーフラクションを表す。ドナーフラクションは、高いドナーフラクションの場合に過小評価され得るが、これは、ＤＦ３の計算において行ったように、レシピエントの遺伝子型の知見、ならびにＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーのドナー−レシピエントの遺伝子型の組合せの除外を通して緩和することができる。
【図９】図９は、異なる参照対立遺伝子および代替対立遺伝子の組合せ（「Ｒｅｆ＿Ａｌｔ組合せ」）を有するＳＮＰのホモ接合性対立遺伝子頻度の中央値およびＭＡＤを示す図である。Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿Ｔ、またはＴ＿Ｃの組合せを有するＳＮＰではより高い中央値およびより高いＭＡＤが観察された。
【図１０】図１０は、Ｒｅｆ＿Ａｌｔ組合せの分布を示す図である。Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿Ｔ、およびＴ＿Ｃは、ｖ１．１パネルにおける参照および代替対立遺伝子の最も頻度の高い組合せ（すなわち、表１に開示されるパネルＡおよびパネルＢのサブセットの組合せ）であり、パネルの標的の７９．５％に起こる（２１９のドナーフラクションアッセイ中１７２）。
【図１１】図１１は、プライマー設計のために使用したパラメータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
用語「核酸」および「核酸分子」を、本開示全体を通して交換可能に使用することができる。この用語は、例えば、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短い阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非天然骨格などを含有するもの）、および／またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）に由来する任意の組成の核酸を指し、これらはすべて、一本鎖または二本鎖の形態であり得、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含することができる。核酸は、本明細書におけるプロセスを実施するのに有用な任意の形態（例えば、直鎖、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であってよく、または本技術の一部としてのその有用性を変更しない変動（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。ある特定の実施形態では、核酸は、プラスミド、ファージ、自立複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質中で、複製し得るまたは複製され得るその他の核酸であってもよく、あるいはそれらに由来してもよい。鋳型核酸は、一部の実施形態では、単一の染色体に由来し得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の１つの染色体に由来し得る）。特段の限定がない限り、この用語は、参照核酸に類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。別段の記載がない限り、特定の核酸配列は、明確に示す配列のみならず、また、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補配列も暗に包含する。具体的には、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合性塩基の残基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.  19:5081  (1991)；  Ohtsuka  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  260:2605-2608  (1985)；およびRossolini  et  al.,  Mol.  Cell.  Probes  8:91-98  (1994)）。用語核酸は、遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。この用語はまた、均等物として、ヌクレオチドのアナログから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログ、一本鎖（「センス」鎖または「アンチセンス」鎖、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）、および二本鎖ポリヌクレオチドも含むことができる。デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡについては、塩基シトシンは、ウラシルで置き換えられる。鋳型核酸は、鋳型として対象か���得られた核酸を使用して調製され得る。
【００２９】
用語「多型」または「多型核酸標的」とは、本明細書で使用される場合、同一ゲノム配列の異なる対立遺伝子内の配列変形形態を指す。多型を含有する配列は、「多型配列」と考えられる。１つまたは複数の多型の検出によって、単一ゲノム配列の異なる対立遺伝子の、または２つもしくはそれより多い個体間の区別が可能となる。本明細書で使用される場合、用語「多型マーカー」、「多型配列」、「多型核酸標的」とは、個体間でＤＮＡ配列において遺伝的変形形態を示すゲノムＤＮＡのセグメントを指す。このようなマーカーとして、これらに限定されないが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ショートタンデムリピート、例えば、ジ−、トリ−またはテトラ−ヌクレオチドリピート（ＳＴＲ）、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、コピー数バリアント、挿入、欠失、重複などが挙げられる。本技術に従う多型マーカーは、濃縮されたドナー特異的核酸試料においてレシピエントとドナー対立遺伝子間を特異的に区別するために使用でき、上記のマーカーのうち１つまたは複数を含み得る。
【００３０】
用語「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」とは、本明細書で使用される場合、同一ゲノム配列の異なる対立遺伝子内の単一ヌクレオチド残基に存在するポリヌクレオチド配列変形形態を指す。この変形形態は、タンパク質産生の際にゲノム配列が転写される場合に、ゲノム配列のコード領域または非コード領域内（すなわち、プロモーターまたはイントロン領域中）に生じ得る。１つまたは複数のＳＮＰの検出によって、単一ゲノム配列の異なる対立遺伝子の、または２つもしくはそれより多い個体間の区別が可能となる。
【００３１】
用語「対立遺伝子」とは、本明細書で使用される場合、染色体上の同一位置を占める、遺伝子またはＤＮＡの非コード領域のいくつかの代替形態のうちの１つである。用語対立遺伝子は、これらに限定されないが、細菌、ウイルス、真菌、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌（archeabacteria）を含む任意の生物に由来するＤＮＡを説明するために使用され得る。本明細書において開示される多型核酸標的は、染色体上の同一位置を占める遺伝子またはＤＮＡの非コード領域の２、３、４またはそれより多い代替形態を有し得る。２つの代替形態を有する多型核酸標的は、一般に、二対立遺伝子多型核酸標的と呼ばれる。本開示の目的上、一方の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と呼ばれ、もう一方は、代替対立遺伝子と呼ばれる。一部の実施形態では、参照対立遺伝子は、ゲノムリファレンスコンソーシアム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc）によって公開されたような、１つまたは複数の参照ゲノム中に存在する対立遺伝子である。一部の実施形態では、参照対立遺伝子は、参照ゲノムＧＲＣｈ３８中に存在する対立遺伝子である。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc/humanを参照のこと。一部の実施形態では、参照対立遺伝子は、参照ゲノムのうち１つまたは複数中に存在する対立遺伝子ではなく、例えば、参照対立遺伝子は、参照ゲノムのうち１つまたは複数において見られる対立遺伝子の代替対立遺伝子である。
【００３２】
用語「対立遺伝子の比」または「対立遺伝子比」とは、本明細書で使用される場合、試料中の一方の対立遺伝子の量と、もう一方の対立遺伝子の量の比を指す。
【００３３】
ＳＮＰに関して、用語「Ｒｅｆ＿Ａｌｔ」の組合せとは、ＳＮＰの参照対立遺伝子および代替対立遺伝子の組合せを指す。例えば、Ｃ＿ＧのＲｅｆ＿Ａｌｔとは、ＳＮＰについて参照対立遺伝子がＣであり、代替対立遺伝子がＧであることを指す。
【００３４】
用語「量」または「コピー数」とは、本明細書で使用される場合、分析物（例えば、総核酸またはドナー特異的核酸）の量または分量を指す。本技術は、混合レシピエント試料中のドナー特異的核酸の絶対量を決定するための組成物およびプロセスを提供する。量またはコピー数は、検出のために利用可能な分子数を表し、単位あたりのゲノム当量として表され得る。
【００３５】
用語「フラクション」とは、混合物または溶液中の物質の割合（例えば、レシピエントおよびドナー特異的核酸の混合物を含むレシピエント試料中のドナー特異的核酸の割合）を指す。フラクションは、１００のフラクションとして、ある分量が、別の分量に対してどの程度大きい／小さいものであるかを表すために使用されるパーセンテージとして表される場合もある。
【００３６】
用語「試料」とは、本明細書で使用される場合、核酸を含有する検体を指す。試料の例として、これらに限定されないが、当技術分野で十分に確立されたプロトコールを使用する、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、痰、脳脊髄液または粘膜分泌物）または他の身体滲出物、糞便物質（例えば、糞便）、個々の細胞またはその核酸を含有するこのような供給源の抽出物および細胞内構造、例えば、ミトコンドリアが挙げられる。
【００３７】
用語「血液」とは、本明細書で使用される場合、対象由来の血液試料または調製物を指す。この用語は、全血または血液の任意の画分、例えば、従来的に定義されるような血清および血漿を包含する。
【００３８】
用語「標的核酸」とは、本明細書で使用される場合、核酸が、ドナーまたはレシピエント由来無細胞核酸であるかを決定するために、本明細書において開示される方法を使用して検査される核酸を指す。
【００３９】
用語「配列特異的」または「遺伝子座特異的方法」とは、本明細書で使用される場合、配列組成に基づいてゲノム中の特定の位置（または遺伝子座）の核酸を調べる（例えば、定量化する）方法を指す。配列特異的または遺伝子座特異的方法によって、特定の領域または染色体の定量化が可能となる。
【００４０】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメント意味し、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコード領域に先行する領域およびコード領域に続く領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００４１】
本出願では、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書で使用される場合、この用語は、アミノ酸残基が、共有ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００４２】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸ミメティクスを指す。天然に存在するアミノ酸として、遺伝暗号によってコードされるものならびに後で修飾されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンがある。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される、一般に知られる三文字記号または一文字記号のいずれかによって本明細書において呼ばれ得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられている一文字コードによって呼ばれ得る。
【００４３】
「プライマー」は、本明細書で使用される場合、特定のゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅するために増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用できるオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列の増幅のためのＰＣＲプライマーのうち少なくとも１つは、配列に対して配列特異的である。
【００４４】
用語「鋳型」とは、本明細書における技術において増幅のために使用できる任意の核酸分子を指す。天然に二本鎖ではないＲＮＡまたはＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡにし、鋳型ＤＮＡとして使用できる。任意の二本鎖ＤＮＡまたは複数の異なる二本鎖ＤＮＡ分子を含有する調製物を、鋳型ＤＮＡ中に含有される目的の遺伝子座（単数または複数）を増幅するための鋳型ＤＮＡとして使用できる。
【００４５】
用語「増幅反応」とは、本明細書で使用される場合、核酸を１回または複数回コピーするプロセスを指す。実施形態では、増幅の方法として、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、自家持続配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換増幅またはスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。一部の実施形態では、例えば、デジタルＰＣＲによって核酸の単一分子が増幅される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「読取り」は、本明細書において記載される、または当技術分野で公知の任意の配列決定プロセスによってもたらされた短いヌクレオチド配列である。読取りは、核酸フラグメントの一方の末端から作製することができ（「単一末端読取り」）、時には、核酸の両末端から作製される（「二重末端読取り」）。ある特定の実施形態では、対象由来の試料の核酸配列読取りを「得ること」および／または１人または複数人の参照人物由来の生物学的検体の核酸配列読取りを「得ること」は、核酸を直接的に配列決定して、配列情報を得ることを含み得る。一部の実施形態では、「得ること」は、別のものによって核酸から直接的に得た配列情報を受けることを含み得る。
【００４７】
用語「カットオフ値」または「閾値」とは、本明細書で使用される場合、値が、生体試料の分類の２つまたはそれより多い状態（例えば、罹患と非罹患）を裁定するために使用される数値を意味する。例えば、パラメータがカットオフ値より大きい場合には、定量的データの第１の分類が行われる（例えば、ドナー無細胞核酸が、移植片レシピエントに由来する試料中に存在する、および／または移植片が拒絶される）、またはパラメータがカットオフ値よりも小さい場合には、定量的データの異なる分類が行われる（例えば、ドナー特異的無細胞核酸が移植片レシピエントに由来する試料中に存在しない、および／または移植片が受容される）。
【００４８】
別段の明確な記載のない限り、用語「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」または「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」は、ドナーからレシピエントへの組織の移行を指す。一部の場合には、移植は、同種移植、すなわち、同一種の遺伝的に非同一なドナーからレシピエントへの臓器移植である。臓器移植片のドナーおよび／またはレシピエントは、ヒトまたは動物であり得る。例えば、動物は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ）、コンパニオン動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験検査動物（例えば、マウス、ラット、モルモットまたはトリ）、獣医学的に重要なまたは経済的に重要な動物であり得る。一部の実施形態では、移植されている臓器は、固形臓器である。固形臓器の限定されない例として、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、腸および肺が挙げられる。
【００４９】
用語「同種異系の」とは、同種の個体に由来するが、遺伝的に似ていない、したがって、免疫学的に適合しない組織または細胞を指す。同種移植片（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）はまた、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）とも呼ばれる。
【００５０】
用語「予測対立遺伝子頻度」とは、移植前のレシピエントにおける対立遺伝子頻度を指す。予測対立遺伝子頻度は、移植片を受けていない、単一の２倍体ゲノムを有する個体、例えば、非妊娠雌および雄の群において見られる対立遺伝子頻度から外挿され得る。一部の場合には、予測対立遺伝子頻度は、個体の群における対立遺伝子頻度の中央値または平均である。予測対立遺伝子頻度は、通常、ホモ接合性についておよそ０．５、代替対立遺伝子のホモ接合性についておよそ０、参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合におよそ１である。ドナーおよびレシピエントが同一遺伝子型のものである場合、レシピエント由来の移植後試料における対立遺伝子頻度は、予測対立遺伝子頻度と等しい。
【００５１】
用語「移植片状態」とは、ドナーから摘出され、レシピエント中に埋め込まれた後の臓器の健康状態を指す。移植片状態は、移植片拒絶および移植片受容を含む。移植片拒絶の間、レシピエントは、供与された臓器、例えば、同種移植片に対する免疫応答を開始し、これは、供与された臓器の組織傷害をもたらす。この傷害は、ドナー特異的無細胞核酸の存在を検出することによって検出され得る。移植片受容とは、臓器がレシピエント中に埋め込まれた後に、供与された臓器と関連する組織傷害が検出されないことを意味する。
【００５２】
互いに独立にまたは従属して重み付けできる可変条件下で収集された検出データに重要性を決定するまたは意味を与えるために、１つまたは複数の「予想アルゴリズム」が使用され得る。用語「変数」とは、本明細書で使用される場合、値または値のセットを有するアルゴリズムの因子、分量または関数を指す。例えば、変数は、増幅された核酸種のセットのデザイン、増幅された核酸種のセット数、試験されたドナー遺伝的寄与パーセントまたは試験されたレシピエント遺伝的寄与パーセントであり得る。用語「独立した」とは、本明細書で使用される場合、別のものによって影響を受けていないことまたは制御されていないことを指す。用語「従属した」とは、本明細書で使用される場合、別のものによって影響を受けているまたは制御されていることを指す。このような予想アルゴリズムは、本明細書においてより詳細に開示されるようなコンピュータを使用して実行され得る。
【００５３】
当業者は、任意の種類の方法または予想アルゴリズムを使用して、許容される感度および／または特異度内で本技術のデータに重要性を与えることができる。例えば、予想アルゴリズム、例えば、カイ二乗検定、ｚ検定、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ（分散分析）、回帰分析、ニューラルネット、ファジー論理、隠れマルコフモデル、多重モデル状態推定などを使用してもよい。本技術の種々の独立および／または従属変数を有するデータに重要性を与えるために、１つまたは複数の方法または予想アルゴリズムが決定され得る。また、本技術の種々の独立および／または従属変数を有するデータに重要性を与えないために、１つまたは複数の方法または予想アルゴリズムが決定され得る。１つまたは複数の予想アルゴリズムの結果（例えば、分析されたセット数、各セット中のヌクレオチド種の種類）に基づいて本明細書において記載される方法の種々の変数のパラメータを設計または変更してもよい。例えば、カイ二乗検定を検出データに適用することによって、ドナー特異的無細胞核酸の特定の範囲が、移植片拒絶を有するより高い尤度と相関していることが示唆され得る。
【００５４】
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムが試験されるように選択され得る。これらのアルゴリズムは、生データを用いてトレーニングされ得る。各新規生データ試料について、トレーニングされたアルゴリズムは、分類をその試料に割り当てる（例えば、移植片拒絶または移植片受容）。新規生データ試料の分類に基づいて、トレーニングされたアルゴリズムの性能は、感度および特異度に基づいて評価され得る。最後に、最高感度および／または特異度またはそれらの組合せを有するアルゴリズムが同定され得る。
詳細な説明
【００５５】
概要
本技術は、移植関連状態、例えば、移植片拒絶の進行をモニタリングするための非浸潤性手段として、レシピエント血液において見られるドナーＤＮＡを分析することに関する。本開示は、移植片拒絶の結果として生成される１つまたは複数の無細胞核酸の量を検出する方法を提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、移植片は、固形臓器移植片であり、組織傷害の際に生成される無細胞核酸は、ドナー特異的無細胞核酸である。一部の実施形態では、無細胞核酸は、固定カットオフアプローチ、動的クラスタリングアプローチまたは個々の多型核酸標的閾値アプローチのうち１つまたは複数を使用する１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づいてドナー特異的核酸である。これらのアプローチは、有利なことに、移植片状態決定の前に１つまたは複数の核酸標的についてドナーまたはレシピエントを遺伝子型同定する必要なく、ドナー特異的核酸が同定されることを可能にする。
【００５７】
したがって、本明細書において開示される方法は、移植片の状態、すなわち、移植片が拒絶されるか、受容されるかを好都合に、正確に決定するために使用され得る。
【００５８】
具体的実施形態
本明細書における技術の実施は、分子生物学の分野における日常的な技術を利用する。本明細書における技術において使用する一般的な方法を開示する基礎的教本として、Sambrook  and  Russell,  Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual  (3rd  ed.  2001)；  Kriegler,  Gene  Transfer  and  Expression:  A  Laboratory  Manual  (1990);  and  Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (Ausubel  et  al.,  eds.,  1994)）が挙げられる。
【００５９】
核酸について、大きさはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で示されている。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開ＤＮＡ配列から導かれた推定値である。タンパク質について、大きさはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示されている。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、導かれたアミノ酸配列から、または公開タンパク質配列から推定される。
【００６０】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van  Devanter  et.  al.,  Nucleic  Acids  Res.  12:  6159-6168  (1984)に記載されるような自動化シンセサイザーを使用して、Beaucage  &  Caruthers,  Tetrahedron  Lett.  22:  1859-1862  (1981)によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の技術分野で認識された戦略、例えば、Pearson  &  Reanier,  J.  Chrom.  255:  137-149  (1983)に記載されるような、未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して実施される。
【００６１】
試料
核酸を分析するための方法および組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、核酸断片の混合物中の核酸断片が分析される。核酸の混合物は、異なるヌクレオチド配列、異なる断片長、異なる起源（例えば、ゲノム起源、ドナー対レシピエント起源、細胞または組織起源、試料起源、対象起源など）またはそれらの組合せを有する２つまたはそれより多い核酸断片種を含み得る。
【００６２】
本明細書において記載される方法および装置において利用される核酸または核酸混合物は、対象から得られた試料から単離されることが多い。対象は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト動物を含めた、任意の生きているまたは生きていない生物であり得る。これらに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ科（例えば、ウシ）、ウマ科（例えば、ウマ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）およびヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ、ヤギ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（例えば、ブタ）、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含めた、任意のヒトまたは非ヒト動物が選択され得る。対象は雄または雌であり得る。
【００６３】
核酸は、任意の種類の適した生物学的検体または試料から単離され得る。試料の限定されない例として、当技術分野で十分に確立されたプロトコールを使用する、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物または他の身体滲出物、糞便物質（例えば、糞便）、個々の細胞またはその核酸を含有するこのような供給源の抽出物および細胞内構造、例えば、ミトコンドリアが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「血液」は、全血または血液の任意の画分、例えば、従来的に定義されるような血清および血漿などを包含する。血漿とは、抗凝固剤を用いて処置された血液の遠心分離に起因する全血の画分を指す。血液血清とは、血液試料が凝固した後に残存する流体の水様部分を指す。流体または組織試料は、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコールに従って収集されることが多い。血液について、適当な量の末梢血（例えば、３〜４０ミリリットルの間）が収集され、さらなる調製の前に標準手順に従って保管され得ることが多い。核酸が抽出される流体または組織試料は、無細胞であり得る。一部の実施形態では、流体または組織試料は、細胞要素または細胞残遺物を含有し得る。一部の実施形態では、胎児細胞またはがん細胞が試料中に含まれ得る。
【００６４】
試料は、不均一であることが多く、これは、試料中に１種類より多い核酸種が存在することを意味する。例えば、不均一核酸試料として、これらに限定されないが、（ｉ）ドナー由来およびレシピエント由来核酸、（ｉｉ）がんおよび非がん核酸、（ｉｉｉ）病原体および宿主核酸、より一般には、または（ｉｖ）突然変異核酸および野生型核酸を挙げることができる。試料は、１種より多い細胞型、例えば、ドナー細胞およびレシピエント細胞、がんおよび非がん細胞または病原体および宿主細胞が存在するので、不均一であり得る。一部の実施形態では、少数核酸種および多数核酸種が存在する。
【００６５】
一部の実施形態では、試料は、通常、移植後の１つまたは複数の時点で移植片状態をモニタリングするために採取される。時点は、移植後数日または数か月であり得る。一部の実施形態では、時点は、移植後７日〜１年の間、例えば、移植後１０日〜８ヶ月の間、または移植後１ヶ月〜６ヶ月の間である。一部の実施形態では、時点は、移植の１年記念日当日またはその後である。一部の実施形態では、１つまたは複数の試料は、ＳＮＰ対立遺伝子頻度のベースラインとして移植前に採取され、さらなる試料は、移植後に採取され、移植前および移植後試料における多型核酸標的頻度が比較されて、移植片状態を決定する。
【００６６】
一部の実施形態では、臓器移植片を受けた同一レシピエントから、一定期間にわたって複数の試料が採取される。試料採取の頻度は、変わり得る。例えば、試料は、毎週、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、１年に１回採取されてもよい。
【００６７】
試料の調製
血液試料
一部の実施形態では、移植片状態を検出するために使用される試料は、同種供給源から臓器を受けた臓器移植片レシピエント由来の血液試料である。対象からの血液の収集は、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコールに従って実施される。適当な量の末梢血、例えば、通常、５〜５０ｍｌの間が収集され、さらなる調製の前に標準手順に従って保管され得る。血液試料は、試料中に存在する核酸の分解または品質を最小にするように、当業者に公知の様式で収集、保管または輸送され得る。
【００６８】
血清または血漿試料
一部の実施形態では、試料は、血清試料または血漿試料である。レシピエント血液から血清または血漿を調製する方法は、当業者の間で周知である。例えば、移植片レシピエントの血液を、血液凝固を防ぐためにＥＤＴＡまたは特殊化された市販製品、例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）を含有するチューブに入れることができ、次いで、血漿を、遠心分離によって全血から得ることができる。他方、血清は、血液凝固後に遠心分離を用いて、または用いずに得てもよい。遠心分離が使用される場合には、通常、排他的にではないが、適当な速度、例えば、１，５００〜３，０００回ｇで実施される。血漿または血清は、さらなる遠心分離ステップに付され、その後、ＤＮＡ抽出用の新たなチューブに移される場合もある。
【００６９】
対象（例えば、移植片レシピエント）から得た血液から血清または血漿を調製する方法は、公知である。例えば、対象の血液（例えば、移植片レシピエントの血液）を、血液凝固を防ぐためにＥＤＴＡまたは特殊化された市販製品、例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）を含有するチューブに入れることができ、次いで、血漿を遠心分離によって全血から得ることができる。血清は、血液凝固後に遠心分離を用いて、または用いずに得てもよい。遠心分離が使用される場合には、通常、排他的にではないが、適当な速度、例えば、１，５００〜３，０００回ｇで実施される。血漿または血清は、さらなる遠心分離ステップに付され、その後、核酸抽出用の新たなチューブに移される場合もある。全血の無細胞の部分に加え、核酸を、対象由来の全血試料の遠心分離および血漿の除去後に得ることができるバフィーコート部分中に濃縮された細胞画分から回収してもよい。
【００７０】
一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数の方法によってドナー特異的核酸について、まず濃縮され得る、または相対的に濃縮され得る。例えば、ドナーとレシピエントＤＮＡの識別は、本技術の組成物およびプロセスを単独で、または他の識別因子と組み合わせて使用して実施され得る。これらの因子の例として、これらに限定されないが、ゲノム中に位置する多型間の単一ヌクレオチド相違が挙げられる。
【００７１】
特定の種の核酸について試料を濃縮するための他の方法は、２００７年５月３０日に出願されたＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０７／６９９９１号、２００７年６月１５日に出願されたＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７１２３２号、米国仮特許出願番号第６０／９６８，８７６号および同第６０／９６８，８７８号（出願人に譲渡された）、（２００５年１１月２８日に出願されたＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＥＰ０５／０１２７０７号）に記載されており、これらはすべて、これにより参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、レシピエント核酸は、試料から選択的に除去される（部分的、実質的に、ほとんど完全に、または完全に）。細胞性核酸単離および処理
【００７２】
生体試料からＤＮＡを抽出するための種々の方法が公知であり、移植片状態を決定する方法において使用され得る。ＤＮＡ調製の一般的な方法（例えば、Sambrook  and  Russell,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  3d  ed.,  2001によって記載される）をたどることができる；対象由来の血液試料からＤＮＡを得るために種々の市販の試薬またはキット、例えば、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡミニキットまたはＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）血液ＤＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＧＦＸ（商標）ゲノム血液ＤＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）も使用され得る。これらの方法のうち１つより多くのものの組合せも使用され得る。
【００７３】
一部の場合には、細胞性核酸が、試料から単離される。細胞を含有する試料は、細胞性核酸を単離するために、通常、溶解される。細胞溶解手順および試薬は、当技術分野で公知であり、一般に、化学的、物理的または電解的溶解方法によって実施され得る。例えば、化学的方法は、一般に、溶解剤を使用して、細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、続いて、カオトロピック塩を用いて処置する。物理的方法、例えば、凍結／解凍と、それに続く、粉砕、セルプレスなどの使用も有用である。高塩溶解手順もよく使用される。例えば、アルカリ溶解手順が利用されてもよい。後者の手順は、フェノール−クロロホルム溶液の使用を一時的に組み込み、３つの溶液に関与する代替フェノール−クロロホルム不含手順が利用され得る。後者の手順では、１種の溶液は、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡを含有する場合があり、第２の溶液は、０．２Ｎ  ＮａＯＨおよび１％  ＳＤＳを含有する場合があり、第３の溶液は、３Ｍ  ＫＯＡｃ、ｐＨ５．５を含有する場合がある。これらの手順は、その全文で本明細書に組み込まれる、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  N.Y.,  6.3.1-6.3.6  (1989)に見出すことができる。
【００７４】
移植片レシピエントからの無細胞ＤＮＡの単離
一部の実施形態では、無細胞核酸が、試料から単離される。用語「無細胞ＤＮＡ」はまた、「無細胞循環核酸」または「細胞外核酸」とも呼ばれ、供給源が細胞要素または細胞残遺物を含有する場合もあるが、検出可能な細胞を有さない供給源から単離された核酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「無細胞循環試料核酸を得る」は、試料を直接的に得ること（例えば、試料を収集すること）または試料を集めた別のものから試料を得ることを含む。理論によって制限されるものではないが、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞分解の産物である可能性があり、これは、スペクトル（例えば、「ラダー」）にわたって一連の長さを有することが多い細胞外核酸の基礎を提供する。
【００７５】
同種供給源から臓器を受けた移植片レシピエントから単離された無細胞核酸は、異なる核酸種を含む場合があり、したがって、ある特定の実施形態では、本明細書において「不均一」と呼ばれる。例えば、移植片レシピエント由来の血液血清または血漿は、レシピエント無細胞核酸（レシピエント特異的核酸とも呼ばれる）およびドナー無細胞核酸（ドナー特異的核酸とも呼ばれる）を含み得る。一部の例では、ドナー無細胞核酸は、時には、全無細胞核酸の約５％〜約５０％である（例えば、総無細胞核酸の約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９％が、ドナー特異的核酸である）。一部の実施形態では、試験試料中のドナー無細胞核酸のフラクションは、約１０％未満である。一部の実施形態では、試験試料中のドナー無細胞核酸のフラクションは、約５％未満である。一部の実施形態では、核酸中のドナー特異的無細胞核酸の多数は、約５００塩基対またはそれより少ない長さのものである（例えば、ドナー特異的核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約５００塩基対またはそれより少ない長さのものである）。一部の実施形態では、核酸中のドナー特異的核酸の多数は、約２５０塩基対またはそれより少ない長さのものである（例えば、ドナー特異的核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２５０塩基対またはそれより少ない長さのものである）。一部の実施形態では、核酸中のドナー特異的無細胞核酸の多数は、約２００塩基対またはそれより少ない長さのものである（例えば、ドナー特異的核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２００塩基対またはそれより少ない長さのものである）。一部の実施形態では、核酸中のドナー特異的無細胞核酸の多数は、約１５０塩基対またはそれより少ない長さのものである（例えば、ドナー特異的無細胞核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１５０塩基対またはそれより少ない長さのものである）。一部の実施形態では、ドナー特異的無細胞核酸の多数は、約１００塩基対またはそれより少ない長さのものである（例えば、ドナー特異的核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１００塩基対またはそれより少ない長さのものである）。
【００７６】
液体生体試料、例えば、血液または血清試料から無細胞ＤＮＡを単離する方法は周知である。１つの例示的例では、ｃｆＤＮＡを結合するために磁気ビーズが使用され、次いで、ビーズと結合しているｃｆＤＮＡが、洗浄され、磁気ビーズから溶出される。無細胞ＤＮＡを単離する例示的方法は、ＷＯ２０１７０７４９２６に記載されており、その全開示内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。無細胞ＤＮＡを単離するための市販のキットも利用可能である、例えば、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ（ＭＰＣ）核酸単離キットＩ、Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ（ＭＲ）ｃｃｆＤＮＡ血漿キット、ＱＩＡａｍｐ循環核酸（ＱＣＮＡ）キット。
【００７７】
無細胞核酸は、別の核酸と比較して異なる時点で単離されてもよく、各試料は、同一または異なる供給源に由来する。一部の実施形態では、無細胞核酸は、移植後異なる時点で同一レシピエントから単離される。ドナー無細胞核酸フラクションは、上記の各時点について決定され、時点間の比較は、移植片状態を明らかにすることができることが多い。例えば、ドナー特異的無細胞核酸フラクションの増大は、移植片拒絶を示す。核酸は、試料からの核酸精製または単離および／または核酸分子の増幅の結果であり得る。本明細書において記載されるプロセスのために提供される核酸は、１つの試料からの、または２つもしくはそれより多い試料からの（例えば、１つもしくはそれより多い、２つもしくはそれより多い、３つもしくはそれより多い、４つもしくはそれより多い、５つもしくはそれより多い、６つもしくはそれより多い、７つもしくはそれより多い、８つもしくはそれより多い、９つもしくはそれより多い、１０もしくはそれより多い、１１もしくはそれより多い、１２もしくはそれより多い、１３もしくはそれより多い、１４もしくはそれより多い、１５もしくはそれより多い、１６もしくはそれより多い、１７もしくはそれより多い、１８もしくはそれより多い、１９もしくはそれより多い、または２０もしくはそれより多い試料からの）核酸を含有し得る。一部の実施形態では、プールされた試料は、同一患者、例えば、移植片レシピエントに由来し得るが、異なる時点で採取される、または異なる組織種のものである。一部の実施形態では、プールされた試料は、異なる患者に由来し得る。以下にさらに記載されるように、一部の実施形態では、識別子は、試料の供給源を区別するために１つまたは複数の試料各々に由来する核酸に付着している。
【００７８】
本明細書において記載される方法を実施するための核酸は、ある特定の実施形態では、核酸を含有する試料（複数可）を処理することなく提供され得る。一部の実施形態では、本明細書において記載される方法を実施するための核酸は、核酸を含有する試料（複数可）を処理した後に提供される。例えば、核酸は、試料（複数可）から抽出、単離、精製または増幅され得る。用語「単離された」とは、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、天然に存在する場合には天然環境または外因的に発現される場合には宿主細胞）から回収され、したがって、その元の環境からヒト介入によって（例えば、「人の手によって」）変更される核酸を指す。単離された核酸は、供給源試料中に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）を有して提供される。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％よりも多く含まないものであり得る。用語「精製された」とは、本明細書で使用される場合、核酸が由来する試料供給源においてよりも少ない核酸種を含有する、提供された核酸を指す。核酸を含む組成物は、他の核酸種を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％よりも多く含まないものであり得る。用語「増幅された」とは、本明細書で使用される場合、試料中の核酸のヌクレオチド配列またはその一部と同一の、または実質的に同一のヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的に、または指数関数的に生成するプロセスに、試料の核酸を付すことを指す。
【００７９】
核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、例えば、加熱によって、またはアルカリを用いる処置によって、例えば、二本鎖ＤＮＡを変性させることによって生成し得る。一部の場合には、核酸は、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ様分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）による二本鎖ＤＮＡ分子のストランド侵入によって形成されるＤループ構造にある。Ｄループ形成は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質の添加によって、および／または例えば、当技術分野で公知の方法を使用する塩濃度の変更によって容易にされ得る。
【００８０】
一部の場合には、核酸は、当技術分野で公知の物理的または酵素的方法のいずれかを使用して断片化され得る。
【００８１】
ゲノムＤＮＡ標的配列
本明細書において提供される方法の一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸種が、時には、１つまたは複数のヌクレオチド配列種が、増幅および定量化のために標的化される。一部の実施形態では、標的化された核酸は、ゲノムＤＮＡ配列である。ある特定のゲノムＤＮＡ標的配列は、例えば、それらが所与のアッセイの特定の特徴の決定を可能にできるために使用される。ゲノムＤＮＡ標的配列は、本明細書において、所与のアッセイのマーカーと呼ばれることもある。一部の場合には、ゲノム標的配列は、本明細書において記載されるような多型である。一部の実施形態では、１つより多いゲノムＤＮＡ標的配列またはマーカーが、所与のアッセイの特定の特徴の決定を可能にできる。このようなゲノムＤＮＡ標的配列は、特定の「領域」のものであると考えられる。本明細書で使用される場合、「領域」は、ゲノム位置、例えば、特定の染色体、染色体ＤＮＡのストレッチまたは遺伝子座の記載に制限されるものではない。むしろ、用語「領域」は、特定のアッセイを示し得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列またはマーカーの収集物を同定するために本明細書において使用される。このようなアッセイとして、これらに限定されないが、ドナー特異的核酸の検出および定量化のためのアッセイ、レシピエント核酸の検出および定量化のためのアッセイ、総ＤＮＡの検出および定量化のためのアッセイ、メチル化ＤＮＡの検出および定量化のためのアッセイ、ドナー特異的核酸の検出および定量化のためのアッセイならびに消化効率の指標としての消化されたおよび／または未消化ＤＮＡの検出および定量化のためのアッセイを挙げることができる。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ標的配列は、特定のゲノム遺伝子座内にあると記載される。本明細書で使用される場合、ゲノム遺伝子座は、オープンリーディングフレームＤＮＡ、非転写ＤＮＡ、イントロン配列、エクストロン（ｅｘｔｒｏｎｉｃ）配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、フランキング配列または所与のゲノム遺伝子座と関連していると当業者によって考えられている任意の配列のうちいずれか、またはそれらの組合せを含み得る。
【００８２】
ドナー特異的無細胞核酸含量を決定する方法
一部の実施形態では、試料中のドナー特異的無細胞核酸の量は、決定される。一部の場合には、ドナー特異的核酸の量は、本明細書において記載される配列読取りカウントの定量化に基づいて決定される。定量化は、特定の標的部位を対象とする配列読取りを直接カウントすることによって、または競合ＰＣＲ（すなわち、本明細書において記載されるような、既知分量の競合オリゴヌクレオチドの同時増殖）によって、達成され得る。用語「量」とは、核酸に関して本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、絶対量（例えば、コピー数）、相対量（例えば、フラクションまたは比）、重量（例えば、グラム）および濃度（例えば、単位堆積あたりのグラム（例えば、ミリリットル）、モル単位）を含め、任意の適した測定値を指す。本明細書で使用される場合、何かの決定などの作用が、何か「によって誘発される」、「に従う」、または「に基づく」場合、これは、作用が、何かの少なくとも一部に少なくとも部分的に誘発される、従う、または基づくことを意味する。
【００８３】
一部の実施形態では、ドナー特異的無細胞核酸の相対量または割合が、多型配列の対立遺伝子比に従って、またはドナー特異的核酸に対して特異的な、レシピエント核酸に対して特異的でない１つまたは複数のマーカーに従って決定される。一部の場合には、試料中の、ドナー特異的無細胞核酸の、総無細胞核酸に対する量は、「ドナー特異的核酸フラクション」と呼ばれる。
【００８４】
多型ベースのドナー定量化アッセイ
ドナー特異的核酸含量（例えば、ドナー特異的核酸フラクション）の決定は時には、本明細書において記載されるような多型ベースのドナー定量化アッセイを使用して実施されることもある。この種類のアッセイによって、多型核酸標的配列（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））の対立遺伝子比に基づいて、移植片レシピエント由来の試料中のドナー特異的核酸の検出および定量化が可能となる。
【００８５】
一部の場合には、ドナー特異的対立遺伝子は、例えば、レシピエント核酸による混合物への主要な寄与と比較した場合の、試料中のドナーおよびレシピエント無細胞核酸の混合物への相対的に微量な寄与によって同定される。一部の場合には、ドナー特異的対立遺伝子は、以下に記載されるように、予測対立遺伝子頻度からの総無細胞核酸中の実測対立遺伝子頻度の偏差によって同定される。一部の場合には、レシピエント試料中のドナー特異的無細胞核酸の相対量は、多型部位の２つの対立遺伝子（参照対立遺伝子および代替対立遺伝子）各々について、参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングされた独特の配列読取りの総数のパラメータとして決定され得る。一部の場合には、レシピエント試料中のドナー特異的無細胞核酸の相対量は、濃縮された試料由来の各対立遺伝子の配列読取りの相対数のパラメータとして決定され得る。
【００８６】
多型核酸標的の選択
一部の実施形態では、多型核酸標的は、（ｉ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、（ｉｉ）挿入／欠失多型、（ｉｉｉ）制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｖ）ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｖ）可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖｉ）コピー数バリアント、（ｖｉｉ）挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉｉ）それらの（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せのうち１つまたは複数である。
【００８７】
多型マーカーまたは部位は、分岐が生じる遺伝子座である。多型形態はまた、遺伝子の異なる対立遺伝子として現れる。一部の実施形態では、多型核酸標的について２つの対立遺伝子があり、これらの多型核酸標的は、二対立遺伝子多型核酸標的と呼ばれる。一部の実施形態では、多型核酸標的について、３つ、４つまたはそれより多い対立遺伝子がある。
【００８８】
一部の実施形態では、これらの対立遺伝子のうち一方は、参照対立遺伝子と呼ばれ、他方は、代替対立遺伝子と呼ばれる。多型は、タンパク質、タンパク質改変、ＲＮＡ発現改変、ＤＮＡおよびＲＮＡメチル化、遺伝子発現およびＤＮＡ複製を変更する調節因子における相違、ならびにゲノム核酸またはオルガネラ核酸の変更の任意の他の顕在化によって観察され得る。
【００８９】
多数の遺伝子は、多型領域を有する。個体は、多型領域のいくつかの対立遺伝子バリアントのいずれか１つを有するので、個体は、遺伝子の多型領域の対立遺伝子バリアントの種類に基づいて同定され得る。これは、例えば、法医学的目的のために使用され得る。他の状況では、個体が有する対立遺伝子バリアントの同一性を知ることは重大である。例えば、ある特定の遺伝子における対立遺伝子の相違、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子は、骨髄移植における移植片拒絶または移植片対宿主病に関与している。したがって、遺伝子または遺伝子病変の多型領域の対立遺伝子バリアントの同一性を決定するための迅速な、高感度の、正確な方法を開発することが高度に望ましい。
【００９０】
一部の実施形態では、多型核酸標的は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、一般に、二対立遺伝子システムである、すなわち、任意の特定のマーカーについて、個体が有し得る２つの対立遺伝子があり、そのうち一方は、参照対立遺伝子と呼ばれ、もう一方は、代替対立遺伝子と呼ばれる。これは、ＳＮＰマーカーあたりの情報内容が、１０を超える対立遺伝子を有し得るマイクロサテライトマーカーと比較した場合に、比較的少ないことを意味する。ＳＮＰはまた、極めて集団特異的である傾向があり、１つの集団中の多型であるマーカーが、別のものではあまり多型ではないこともある。およそ１キロベース毎に見られるＳＮＰ（Wang  et  al.  (1998)  Science  280:1077-1082を参照のこと）は、極めて高密度の遺伝地図を作製する可能性を提供し、これは、目的の遺伝子または領域をハプロタイピングするシステムを開発するために極めて有用となり、ＳＮＰＳの性質のために、それらは実際、研究中の疾患表現型と関連している多型であり得る。ＳＮＰの低い突然変異比率はまた、それらを複雑な遺伝子形質を研究するための優れたマーカーにする。
【００９１】
ゲノミクスの焦点の多くは、多様な理由のために重要であるＳＮＰの同定であった。ＳＮＰは、間接試験（ハプロタイプの関連）および直接試験（機能的バリアント）を可能にする。ＳＮＰは、最も大量にあり、安定な遺伝的マーカーである。一般的な疾患は、一般的な遺伝的変更によって最良に説明され、ヒト集団における自然な変動は、疾患、療法および環境相互作用の理解を補助する。
【００９２】
一部の実施形態では、多型核酸マーカー標的は、表１または表６中の少なくとも１、２、３、４またはそれより多いＳＮＰを含む。これらのＳＮＰは、集団内の個体において頻繁に生じる代替対立遺伝子を有する。同様に、これらのＳＮＰは、多様であり、複数の集団において存在する。情報価値のある分析は、オフターゲット非特異的増幅の可能性の低い、これらのＳＮＰに対する特異的核酸プライマーを設計する可能性を示す。
【表１−１】
2022500015.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
2022500015.tif 000005
【００９３】
一部の実施形態では、移植片拒絶を決定するために選択された多型核酸標的は、表１（パネルＡおよび／またはパネルＢ）または表６中の多型核酸標的のいずれかの組合せである。
【００９４】
複数の多型核酸標的は、コレクションまたはパネル（例えば、標的パネル、ＳＮＰパネル、ＳＮＰコレクション）と呼ばれることもある。複数の多型標的は、２つまたはそれより多い標的を含み得る。例えば、複数の多型標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれより多い標的を含み得る。
【００９５】
一部の場合には、１０またはそれより多い多型核酸標的が、本明細書において記載される方法を使用して濃縮される。一部の場合には、５０またはそれより多い多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、１００またはそれより多い多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、５００またはそれより多い多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、約１０〜約５００の多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、約２０〜約４００の多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、約３０〜約２００の多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、約４０〜約１００の多型核酸標的が濃縮される。一部の場合には、約６０〜約９０の多型核酸標的が濃縮される。例えば、ある特定の実施形態では、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０の多型核酸標的が濃縮される。
【００９６】
情報価値のある多型核酸標的の同定
一部の実施形態では、複数の多型核酸標的のうちの少なくとも１つの多型核酸標的は、所与の試料中のドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値がある。ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値がある多型核酸標的は、情報価値のある標的、情報価値のある多型（例えば、情報価値のあるＳＮＰ）と呼ばれることもあり、一部の態様では、通常、ドナーとレシピエントの間で異なる。例えば、情報価値のある標的は、ドナーの１つの対立遺伝子およびレシピエントの異なる対立遺伝子を有し得る（例えば、レシピエントは、多型標的で対立遺伝子Ａを有し、ドナーは、多型標的部位で対立遺伝子Ｂを有する）。
【００９７】
一部の場合には、多型核酸標的は、ある特定のドナー／レシピエント遺伝子型組合せとの関連で情報価値がある。二対立遺伝子多型標的（すなわち、２つのあり得る対立遺伝子（例えば、Ａが参照対立遺伝子であり、Ｂが代替対立遺伝子である、または逆もまた同様であるＡおよびＢ））について、あり得るレシピエント／ドナー遺伝子型組合せとして、１）レシピエントＡＡ、ドナーＡＡ、２）レシピエントＡＡ、ドナーＡＢ、３）レシピエントＡＡ、ドナーＢＢ、４）レシピエントＡＢ、ドナーＡＡ、５）レシピエントＡＢ、ドナーＡＢ、６）レシピエントＡＢ、ドナーＢＢ、７）レシピエントＢＢ、ドナーＡＡ、８）レシピエントＢＢ、ドナーＡＢおよび９）レシピエントＢＢ、ドナーＢＢが挙げられる。遺伝子型ＡＡおよびＢＢは、ホモ接合性遺伝子型と考えられ、遺伝子型ＡＢは、ヘテロ接合性遺伝子型と考えられる。一部の場合には、情報価値のある遺伝子型組合せ（すなわち、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものであり得る多型核酸標的の遺伝子型組合せ）として、レシピエントが、ホモ接合性であり、ドナーが、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である組合せが挙げられる（例えば、レシピエントＡＡ、ドナーＡＢまたはレシピエントＢＢ、ドナーＡＢまたはレシピエントＡＡ、ドナーＢＢ）。このような遺伝子型組合せは、１型の情報価値のある遺伝子型と呼ばれ得る。一部の場合には、情報価値のある遺伝子型組合せ（すなわち、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値があり得る多型核酸標的の遺伝子型組合せ）として、レシピエントがヘテロ接合性であり、ドナーが、ホモ接合性である組合せが挙げられる（例えば、レシピエントＡＢ、ドナーＡＡまたはレシピエントＡＢ、ドナーＢＢ）。このような遺伝子型組合せは、２型の情報価値のある遺伝子型と呼ばれ得る。一部の場合には、情報価値のない遺伝子型組合せ（すなわち、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値があるものではない場合がある多型核酸標的の遺伝子型組合せ）として、レシピエントがヘテロ接合性であり、ドナーがヘテロ接合性である組合せが挙げられる（例えば、レシピエントＡＢ、ドナーＡＢ）。このような遺伝子型組合せは、情報価値のない遺伝子型または情報価値のないヘテロ接合体と呼ばれ得る。一部の場合には、情報価値のない遺伝子型組合せ（すなわち、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値があるものではない場合がある多型核酸標的の遺伝子型組合せ）として、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーがホモ接合性である組合せが挙げられる（例えば、レシピエントＡＡ、ドナーＡＡまたはレシピエントＢＢ、ドナーＢＢ）。このような遺伝子型組合せは、情報価値のない遺伝子型または情報価値のないホモ接合体と呼ばれ得る。一部の実施形態では、多型核酸標的のレシピエントの遺伝子型およびドナーの遺伝子型は両方とも、移植の前に決定される。ドナー特異的無細胞核酸の存在は、上記のように情報価値のある多型核酸標的を選択することならびに本明細書において記載されるアッセイを使用して多型核酸標的のドナー特異的対立遺伝子を検出および／または定量化することによって容易に決定され得る。
【００９８】
一部の実施形態では、個々の多型核酸標的および／または多型核酸標的のパネルは、例えば、マイナー対立遺伝子頻度、分散、分散の係数、ＭＡＤ値などといったある特定の基準に基づいて選択される。一部の場合には、多型核酸標的は、多型標的のパネル内の少なくとも１つの多型核酸標的が、試験される試料の多数について情報価値がある可能性が高いように選択される。さらに、一部の場合には、多型核酸標的の数（すなわち、パネル中の標的の数）が、少なくとも１つの多型核酸標的が、試験される試料の多数について情報価値がある可能性が高いように選択される。例えば、より多くの数の多型標的の選択は、一般に、少なくとも１つの多型核酸標的が、試験される試料の多数について情報価値のあるものであろう可能性を増大する。一部の場合には、多型核酸標的およびその数（例えば、濃縮のために選択される多型標的の数）は、試料の少なくとも約８０％〜約１００％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである、少なくとも約２〜約５０またはそれより多い多型核酸標的をもたらす。例えば、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多い多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９０％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９５％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９９％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９０％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも１０の多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９５％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも１０の多型核酸標的をもたらす。一部の場合には、多型核酸標的およびその数は、試料の少なくとも９９％について、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために情報価値のあるものである少なくとも１０の多型核酸標的をもたらす。
【００９９】
一部の実施形態では、個々の多型核酸標的は、幾分か、マイナー対立遺伝子頻度に基づいて選択される。一部の場合には、約１０％〜約５０％のマイナー対立遺伝子頻度を有する多型核酸標的が選択される。例えば、１５〜４９％、例えば、２０〜４９％、２５〜４５％、３５〜４９％または４０〜４０％の間の範囲のマイナー対立遺伝子頻度を有する多型核酸標的。一部の実施形態では、約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％または４９％のマイナー対立遺伝子対立遺伝子頻度を有する多型核酸標的が選択される。一部の実施形態では、約４０％またはそれより多いマイナー対立遺伝子頻度を有する多型核酸標的が選択される。一部の場合には、多型核酸標的のマイナー対立遺伝子頻度は、公開データベースから、または参照集団からの研究結果に基づいて同定され得る。
【０１００】
高いマイナー対立遺伝子頻度（例えば、０．４〜０．５）を有する複数の多型核酸標的（例えば、ＳＮＰ）（例えば、１００、２００、３００ほどなど）のパネルを分析することによって、著しい数の「情報価値のある」ドナーおよびレシピエントの遺伝子型組合せ（レシピエントの遺伝子型とは異なるドナーの遺伝子型を有する）が見られ得る（図１右側パネルに表示）。一部の実施形態では、バックグラウンドレシピエントホモ接合性対立遺伝子頻度に対する分子試料採取誤差の最小の影響のために対立遺伝子頻度の変化を決定するために、レシピエントが、１つの対立遺伝子についてホモ接合性であり、ドナーが、もう一方の対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型と比較して）１型の情報価値のある遺伝子型の多型核酸標的が使用される。一部の実施形態では、１つの参照対立遺伝子または１つの代替対立遺伝子について、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーがヘテロ接合性であるパネル中の多型核酸標的の約２５％が、情報価値がある。非関連ドナー／レシピエント対の場合には、情報価値のある多型核酸標的の比率が、より高いと予測されるであろう。一卵性双胎ドナー／レシピエント対は、情報価値のある遺伝子型組合せが存在しない例外であろう。
【０１０１】
一部の実施形態では、多型核酸標的は、多型核酸標的の周囲の領域のＧＣ含量および多型核酸標的の増幅効率に基づいて選択される。一部の実施形態では、ＧＣ含量は、１０％〜８０％、例えば、２０％〜７０％または２５％〜７０％、２１％〜６１％または３０％〜６１％の範囲にある。
【０１０２】
一部の実施形態では、多型核酸標的の個々の多型核酸標的および／またはパネルは、幾分か、個々の多型標的または多型標的のパネルの変動の程度に基づいて選択される。分散は、一部の場合には、ある特定の多型標的または多型標的のパネルについて特異的である場合があり、系統上の、実験上の、手順上のおよび固有の誤差またはバイアスに由来し得る（例えば、試料採取誤差、配列決定誤差、ＰＣＲバイアスなど）。個々の多型標的または多型標的のパネルの変動は、変動を評価するための当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができ、例えば、算出された分散、誤差、標準偏差、ｐ値、平均絶対偏差、中央値絶対偏差、中央値調整偏差（ＭＡＤスコア）、変動の係数（ＣＶ）などの点で表すことができる。一部の実施形態では、ある特定のＳＮＰの（例えば、ホモ接合性である場合）実測対立遺伝子頻度変動（すなわち、バックグラウンド対立遺伝子頻度）は、約０．００１〜約０．０１（すなわち、０．１％〜約１．０％）であり得る。例えば、実測対立遺伝子頻度変動は、約０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８または０．００９であり得る。一部の場合には、実測対立遺伝子頻度変動は、約０．００７である。
【０１０３】
一部の場合には、ノイズの多い多型標的は、ドナー特異的核酸フラクションを決定するために選択される多型核酸標的のパネルから排除される。用語「ノイズの多い多型標的」または「ノイズの多いＳＮＰ」とは、（ａ）分析またはプロットされた場合に、データ点（例えば、実測ドナー特異的核酸フラクション、実測対立遺伝子頻度）間で著しい変動を有する標的またはＳＮＰ、（ｂ）著しい標準偏差（例えば、１、２または３より大きい標準偏差）を有する標的またはＳＮＰ、（ｃ）平均の著しい標準誤差を有する標的またはＳＮＰなどおよび前記のものの組合せを指す。ある特定の多型標的またはＳＮＰのノイズは、出発材料（例えば、核酸試料）の分量および／または品質によって生じることがあり、配列読取りを作製するために使用されるＤＮＡの調製または複製のためのプロセスの一部として生じることもあり、配列決定プロセスの一部として生じることもある。ある特定の実施形態では、いくつかの多型標的またはＳＮＰのノイズは、ＰＣＲベースの方法を使用して調製された場合に大きな比率を占めるある特定の配列に起因する。一部の場合には、いくつかの多型標的またはＳＮＰのノイズは、例えば、多型標的またはＳＮＰの周囲の、またはそれに隣接するある特定のヌクレオチド配列および／または塩基組成物などの部位の１つまたは複数の固有の特徴に起因する。約０．００５またはそれより大きい実測対立遺伝子頻度変動（例えば、ホモ接合性である場合）を有するＳＮＰは、ノイズが多いと考えられ得る。例えば、約０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１またはそれより大きい実測対立遺伝子頻度変動を有するＳＮＰは、ノイズが多いと考えられ得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、移植片状態を決定するために選択される１つまたは複数のＳＮＰの参照対立遺伝子および代替対立遺伝子組合せは、Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃ（第１の文字は、参照対立遺伝子を指し、第２の文字は、代替対立遺伝子を指す）のうちのいずれか１つではない。図９および実施例２に示されるように、上記の参照対立遺伝子および代替対立遺伝子組合せを有するＳＮＰは、より高い量のバイアスおよび可変性を示し、したがって、それらは、ドナーフラクションおよび移植片状態を決定するための本明細書において開示される方法において使用するのに適していない。
【０１０５】
一部の実施形態では、移植片状態を決定するために選択される１つまたは複数のＳＮＰは、以下の基準のうち１つもしくは複数またはすべてを満たす：
１．二対立遺伝子。
２．ＳＮＰは、プライマーアニーリング領域内に位置しない。
３．１０００のゲノムプロジェクトによって検証される。
４．ｒｅｆ＿ａｌｔ組合せは、Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴまたはＴ＿Ｃのいずれかではない。
５．マイナー対立遺伝子頻度は、少なくとも０．３である。
６．増幅される標的領域の配列が、独特であり、ゲノム中の別の場所に見ることができない。
【０１０６】
一部の実施形態では、個々の多型標的または多型標的のパネルの変動は、変動の係数（ＣＶ）を使用して表され得る。変動の係数（すなわち、平均によって除された標準偏差）は、例えば、レシピエントおよびドナー特異的核酸を含む単一レシピエント試料のいくつかのアリコートのドナー特異的核酸フラクションを決定することおよび平均ドナー特異的核酸フラクションおよび標準偏差を算出することによって決定され得る。一部の場合には、個々の多型核酸標的および／または多型核酸標的のパネルは、０．３０またはそれより小さい変動の係数（ＣＶ）でドナー特異的核酸フラクションが決定されるように選択される。例えば、一部の実施形態では、ドナー特異的核酸フラクションは、０．２５、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１またはそれよりも小さい変動の係数（ＣＶ）で決定され得る。一部の場合には、ドナー特異的核酸フラクションは、０．２０またはそれよりも小さい変動の係数（ＣＶ）で決定される。一部の場合には、ドナー特異的核酸フラクションは、０．１０またはそれよりも小さい変動の係数（ＣＶ）で決定される。一部の場合には、ドナー特異的核酸フラクションは、０．０５またはそれよりも小さい変動の係数（ＣＶ）で決定される。
【０１０７】
一部の実施形態では、対立遺伝子頻度は、試料中の多型核酸標的の１つまたは複数の対立遺伝子について決定される。これは、実測対立遺伝子頻度と呼ばれることもある。対立遺伝子頻度は、例えば、対立遺伝子（例えば、対立遺伝子Ｂ）について配列読取りの数をカウントすることおよびその遺伝子座（例えば、対立遺伝子Ｂ＋対立遺伝子Ａ）の配列読取りの総数によって除することによって決定され得る。一部の場合には、対立遺伝子頻度平均値、平均または中央値が決定される。一部の場合には、ドナー特異的核酸フラクションは、対立遺伝子頻度平均（例えば、２が乗じられた対立遺伝子頻度平均）に基づいて決定され得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、多型核酸標的（例えば、ＳＮＰ）のゲノム位置が配列決定された回数をカウントするために、多型核酸標的をカバーする定量化データ（例えば、配列決定データ）が使用される。それぞれ、多型核酸標的の参照対立遺伝子および代替対立遺伝子を含有する配列決定読取り数が、決定され得る。例えば、ＳＮＰをカバーするすべての配列決定読取りが、参照ＳＮＰ対立遺伝子を含有する場合には、ＳＮＰの参照対立遺伝子についてホモ接合性の試料中で、理想的には、約１．０（例えば、０．９９〜１．００）の参照ＳＮＰ対立遺伝子頻度があるであろう（図１左側パネル、上位群の対立遺伝子頻度）。試料が、参照および代替対立遺伝子両方についてヘテロ接合性である場合には、参照ＳＮＰ対立遺伝子の予測対立遺伝子頻度は、約０．５（例えば、０．４６〜０．５３）（図１左側パネル、中間群の対立遺伝子頻度）。試料が代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合には、予測参照ＳＮＰ対立遺伝子頻度は、０であろう（図１左側パネル、下位群の対立遺伝子頻度）。１．０、０．５および０のこれらの値は、理想化されており、測定値は、一般的にこれらの値に近づくが、実世界のＳＮＰ対立遺伝子頻度測定値は、生化学的誤差、配列決定誤差およびプロセス誤差によって影響を受ける。ヘテロ接合性対立遺伝子頻度の場合には、これらはまた、分子試料採取誤差によっても影響を受ける。
【０１０９】
一部の実施形態では、レシピエントの遺伝子型およびドナーの遺伝子型の両方が、移植の前に決定され、ドナー特異的対立遺伝子の存在が、容易に検出され、定量化され得るが、一部の場合には、ドナーおよびレシピエントの遺伝子型を同定することが、可能でない、または実用的ではない場合がある。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数の多型核酸標的について、ドナーおよび／またはレシピエントの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。一部の場合には、１つまたは複数の多型標的について、レシピエントの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。一部の場合には、１つまたは複数の多型標的について、ドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。一部の場合には、１つまたは複数の多型標的について、レシピエントの遺伝子型およびドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。一部の実施形態では、ドナーおよびレシピエントの遺伝子型は、多型核酸標的のいずれかについて、移植片状態決定の前に決定されない。一部の場合には、多型標的各々について、レシピエントの遺伝子型は、移植の前に決定されない。一部の場合には、多型標的各々について、ドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。一部の場合には、多型標的各々について、レシピエントの遺伝子型およびドナーの遺伝子型は、移植片状態決定の前に決定されない。
【０１１０】
一部の実施形態では、本開示は、ドナーの遺伝子型情報の不在下でさえ、ドナー特異的無細胞核酸を検出および／または定量化するために使用され得る方法およびシステムを提供する。移植の前にレシピエントを遺伝子型同定しなくてもよく、ドナーを遺伝子型同定しなくてもよいという利点は、特に、患者が移植後まで試験に付されておらず、その時点で、ドナーを位置付けることができず、レシピエントに由来する移植前試料が遺伝子型を同定するために利用できない状況においては途方もないものである。また、移植前に遺伝子型を同定する必要性を免除することは、患者情報の追跡における費用を節約する。特定の理論により制限されることなく、本発明は、移植後試料からのドナーおよびレシピエント両方の無細胞ＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡの混合物から、移植前のレシピエントの遺伝子型を決定できる。これは、移植前のＳＮＰ対立遺伝子頻度各々は、ヘテロ接合性（０．５）またはホモ接合性（０または１）の周辺にクラスター化するという事実に基づいている。ドナーとレシピエントの遺伝子型において相違がある場合には、ヘテロ接合性またはホモ接合性からの偏差（ドナーフラクションに比例して）があるであろう。ドナーとレシピエントの遺伝子型において一致がある場合には、混合無細胞ＤＮＡにおける対立遺伝子頻度は、移植前のレシピエントの遺伝子型における対立遺伝子頻度と同一となる。レシピエント−ドナー遺伝子型組合せのこれらの２つのカテゴリーは、以下にさらに例示される。
【０１１１】
ドナーとレシピエントの遺伝子型が異なる（対立遺伝子頻度のドナー特異的偏差をもたらす）：
ＡＡレシピエント／ＡＢドナー
ＡＡレシピエント／ＢＢドナー
ＡＢレシピエント／ＡＡドナー
ＡＢレシピエント／ＢＢドナー
ＢＢレシピエント／ＡＡドナー
ＢＢレシピエント／ＡＢドナー
【０１１２】
ドナーとレシピエントの遺伝子型が同一である（その結果、得られる対立遺伝子頻度は、「予測された」レシピエントの遺伝子型である）：
ＡＡレシピエント／ＡＡドナー
ＡＢレシピエント／ＡＢドナー
ＢＢレシピエント／ＢＢドナー
（左側の遺伝子型は、レシピエントを表し、右側の遺伝子型はドナーを表す。Ａは、参照対立遺伝子を表し、Ｂは、代替対立遺伝子を表す。）
【０１１３】
偏差は、ドナーの遺伝子型が、レシピエントの遺伝子型と一致する場合の、レシピエント由来の無細胞ＤＮＡ試料における対立遺伝子頻度（すなわち、予測対立遺伝子頻度）と、ドナーの遺伝子型が、レシピエントの遺伝子型と一致しない場合の、無細胞ＤＮＡ試料における対立遺伝子頻度（すなわち、実測対立遺伝子頻度）の間の相違である。一部の場合には、予測対立遺伝子頻度および実測対立遺伝子頻度について、対立遺伝子頻度平均値、平均または中央値が、決定され、偏差の算出のために使用される。
【０１１４】
したがって、代替対立遺伝子について、レシピエントがホモ接合性である（参照対立遺伝子頻度が、約０である、または０．００〜０．０３、０．００〜０．０２、例えば、０．００〜０．０１の範囲にある）ＳＮＰについては、偏差は、代替対立遺伝子について、ドナーがホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型と一致する）対立遺伝子頻度の平均または中央値対、参照対立遺伝子について、ドナーがヘテロ接合性またはホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型とは異なる）対立遺伝子頻度の平均または中央値における相違である。
【０１１５】
代替対立遺伝子について、レシピエントがヘテロ接合性である（参照対立遺伝子頻度が、約０．５である、または０．４０〜０．６０、０．４２〜０．５６もしくは０．４６〜０．５３の範囲にある）ＳＮＰについては、偏差は、代替対立遺伝子について、ドナーがヘテロ接合性である（レシピエントの遺伝子型と一致する）対立遺伝子頻度の平均または中央値対、ドナーが代替対立遺伝子についてホモ接合性である、または参照対立遺伝子についてホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型とは異なる）対立遺伝子頻度の平均または中央値における相違である。
【０１１６】
参照対立遺伝子について、レシピエントがホモ接合性である（参照対立遺伝子頻度が、約１．００である、または０．９７〜１．００もしくは０．９８〜１．００、例えば、０．９９〜１．００の範囲にある）ＳＮＰについては、偏差は、参照対立遺伝子について、ドナーがホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型と一致する）対立遺伝子頻度の平均または中央値対、代替対立遺伝子について、ドナーがヘテロ接合性またはホモ接合性である（レシピエントの遺伝子型とは異なる）対立遺伝子頻度の平均または中央値における相違である。
【０１１７】
特定の移植片ドナー／レシピエントが、一方または別のカテゴリーに属するか否かは、以下に記載されるような方法を使用することによって、ドナーを遺伝子型同定することなく、または移植片を受ける前のレシピエントを遺伝子型同定することなく、単一試料に基づいて決定され得る。
【０１１８】
これらの場合には、これらの方法は、通常のＳＮＰ対立遺伝子頻度（ホモ接合性代替対立遺伝子遺伝子型、ヘテロ接合性代替および参照対立遺伝子遺伝子型またはホモ接合性参照対立遺伝子遺伝子型と関連する対立遺伝子頻度）は、レシピエント対立遺伝子バックグラウンドから存在することを仮定する。これらの場合には、ドナー特異的核酸は、例えば、以下に記載されるような、固定カットオフアプローチ、動的クラスタリングアプローチおよび個々の多型核酸標的閾値アプローチのうち１つまたは複数を使用して同定され得る。表２は、これらの目的のために使用され得る種々の例示的アプローチの特徴を示す。一般に、このようなアプローチは、メモリとともに、および／またはマイクロプロセッサ制御装置によって、プロセッサ、マイクロプロセッサ、コンピュータシステムによって実施される。種々の実施形態では、アプローチは、本明細書において図２に関して記載される操作環境１１０において一連の事象またはステップとして実施される（例えば、方法またはプロセス）。
【表２】
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【０１１９】
固定カットオフ方法
一部の実施形態では、多型核酸標的が、情報価値があるか否か、および／またはドナー特異的無細胞核酸を検出するか否かを決定することは、レシピエントにおけるその実測対立遺伝子頻度を、固定カットオフ頻度に対して比較することを含む。一部の場合には、どの多型核酸標的が情報価値があるかを決定することは、各対立遺伝子頻度を、１つまたは複数の固定カットオフ頻度に対して比較することによって、情報価値のある遺伝子型を同定することを含む。固定カットオフ頻度は、移植片を受けていない対象の集団由来の１つまたは複数の適格データセットに基づく所定の閾値の値であり得、例えば、移植片を受けていない対象における実測対立遺伝子頻度の変動を表す。
【０１２０】
一部の場合には、情報価値のない遺伝子型から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、予測対立遺伝子頻度からの対立遺伝子頻度におけるパーセント（％）シフトとして表される。一般に、所与の対立遺伝子（例えば、対立遺伝子Ａ）の予測対立遺伝子頻度は、０（ＢＢ遺伝子型について）、０．５（ＡＢ遺伝子型について）および１．０（ＡＡ遺伝子型について）または任意の数的スケールでの同等の値である。レシピエントにおける多型核酸標的対立遺伝子頻度が、予測対立遺伝子頻度から逸脱し、このような偏差が、１つまたは複数の固定カットオフ頻度を超える場合には、多型核酸標的は、情報価値があると考えられ得る。偏差の程度は、一般に、ドナー特異的核酸フラクションに比例する（すなわち、高いドナー特異的核酸フラクションを有する試料において、予測対立遺伝子頻度からの大きな偏差が観察され得る）。予測対立遺伝子頻度と実測対立遺伝子頻度の間の偏差は、上記のように決定され得る。
【０１２１】
一部の場合には、移植前のレシピエントにおける多型核酸標的は、ホモ接合性であり、予測対立遺伝子頻度、参照対立遺伝子または代替対立遺伝子のいずれかは、例えば、０である。これらの状況では、移植片レシピエントにおける実測対立遺伝子頻度と予測対立遺伝子頻度の間の偏差は、実測対立遺伝子頻度に対して同等である。多型核酸標的は、実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフより大きい場合に、情報価値があると同定される。
【０１２２】
一部の場合には、固定カットオフは、アッセイに使用されるすべての多型核酸標的の実測対立遺伝子頻度のパーセンタイル値である。一部の実施形態では、パーセンタイル値は、９０、９５または９８パーセンタイル値である。
【０１２３】
一部の場合には、情報価値のないホモ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、予測対立遺伝子頻度の中央値からの対立遺伝子頻度における約０．５％またはそれより大きいシフトである。例えば、固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％またはそれより大きいシフトであり得る。一部の場合には、情報価値のないホモ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約１％またはそれより大きいシフトである。一部の場合には、情報価値のないホモ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約２％またはそれより大きいシフトである。一部の実施形態では、情報価値のないヘテロ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約１０％またはそれより大きいシフトである。例えば、固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％またはそれより大きいシフトであり得る。一部の場合には、情報価値のないヘテロ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約２５％またはそれより大きいシフトである。一部の場合には、情報価値のないヘテロ接合体から情報価値のある遺伝子型を同定するための固定カットオフは、対立遺伝子頻度における約５０％またはそれより大きいシフトである。
【０１２４】
標的特異的閾値方法
一部の実施形態では、多型核酸標的が、情報価値があるか否かを決定し、および／またはドナー特異的対立遺伝子を検出することは、その実測対立遺伝子頻度を、標的特異的閾値（例えば、カットオフ値）に対して比較することを含む。一部の実施形態では、標的特異的閾値頻度は、各多型核酸標的について決定される。通常、標的特異的閾値頻度は、対応する多型核酸標的の対立遺伝子頻度変動に基づいて決定される。一部の実施形態では、個々の多型標的の変動は、例えば、中央値絶対偏差（ＭＡＤ）によって表され得る。一部の場合には、各多型核酸標的のＭＡＤ値を決定することは、独特の（すなわち、標的特異的）閾値の値を生成し得る。中央値絶対偏差を決定するために、実測対立遺伝子頻度が、例えば、レシピエントのみ核酸試料（例えば、バフィーコート試料）の複数の複製物（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれより多い複製物）について決定され得る。各複製物における各多型標的は、通常、例えば、ＰＣＲおよび／または配列決定誤差のために、わずかに異なる実測対立遺伝子頻度を有する。中央値対立遺伝子頻度の値は、各多型標的について同定され得る。残存する複製物の中央値からの偏差は、算出され得る（すなわち、観察された対立遺伝子頻度と中央値対立遺伝子頻度の間の相違）。各多型核酸標的の中央値絶対偏差（ＭＡＤ）を提供するために、偏差の絶対値（すなわち、負の値が正になる）がとられ、絶対偏差の中央値の値が算出される。標的特異的閾値は、例えば、ＭＡＤの倍数（例えば、１×ＭＡＤ、２×ＭＡＤ、３×ＭＡＤ、４×ＭＡＤまたは５×ＭＡＤ）として割り当てられ得る。通常、少ない変動を有する多型標的は、低いＭＡＤを有し、したがって、より可変性の標的よりも低い閾値の値を有する。
【０１２５】
一部の実施形態では、標的特異的閾値は、アッセイにおいて使用される多型核酸標的の実測対立遺伝子頻度のパーセンタイル値である。一部の実施形態では、パーセンタイル値は、９０、９５または９８パーセンタイル値である。
【０１２６】
動的クラスタリングアルゴリズム
一部の実施形態では、多型核酸標的が、情報価値があるか否かを決定し、および／またはドナー特異的対立遺伝子を検出することは、動的クラスタリングアルゴリズムを含む。動的クラスタリングアルゴリズムの限定されない例として、Ｋ−ｍｅａｎｓ、親和性伝播、平均−シフト、スペクトルクラスタリング、ウォード階層的クラスタリング、凝集型クラスタリング、ＤＢＳＣＡＮ、混合ガウスおよびＢｉｒｃｈが挙げられる。ｈｔｔｐ：／／ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ．ｏｒｇ／ｓｔａｂｌｅ／ｍｏｄｕｌｅｓ／ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．ｈｔｍｌ＃ｋ−ｍｅａｎｓを参照のこと。このようなアルゴリズムは、メモリとともに、および／またはマイクロプロセッサ制御装置によって、プロセッサ、マイクロプロセッサ、コンピュータシステムを用いて実行され得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、動的クラスタリングアルゴリズムは、ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングである。ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムは、試料のセットを、ディスジョイントクラスターに分割し、各々は、クラスター中の試料の平均位置によって説明される。平均は、一般に、クラスター「重心」と呼ばれる。ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムは、慣性またはクラスター内平方和基準を最小にする重心を選択することを目的とする。ｋ−ｍｅａｎｓは、ロイドのアルゴリズムと呼ばれることも多い。基本的には、アルゴリズムは、３つのステップを有する。第１のステップは、最初の重心を選択し、最も基本的な方法は、データセットＸからｋ個の試料を選択することである。初期化後、ｋ−ｍｅａｎｓは、２つの他のステップ間をループすることからなる。第１のステップは、各試料をその最も近い重心に割り当てる。第２のステップは、これまでの重心各々に割り当てられた試料のすべての平均値をとることによって新規重心を作出する。古い重心と新しい重心の間の相違が演算され、アルゴリズムは、この値が閾値未満となるまで、これらの最後の２つのステップを繰り返す。言い換えれば、重心が有意に移動しなくなるまで反復する。
【０１２８】
一部の実施形態では、動的クラスタリングは、無細胞核酸中の１つまたは複数の多型核酸標的を、多型核酸標的各々の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいてレシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化することを含む。０または１に近い平均位置を有するホモ接合性群がクラスター化され、０．５に近い平均位置を有するヘテロ接合性群がクラスター化される。
【０１２９】
方法は、レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群に階層化することおよび情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定することをさらに含み得る。一部の実施形態では、レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群に階層化することは、群がドナー特異的対立遺伝子を含有するか否かに基づいており、情報価値のある群は、レシピエントゲノム中に存在しないドナーに由来する別個のドナー対立遺伝子を含む群であり、情報価値のない群は、ドナーに由来する対立遺伝子を含み、情報価値のあるＳＮＰは、より高い平均または中央値対立遺伝子頻度を有するクラスター内のものである。これらの情報価値のあるＳＮＰは、ドナー由来ｃｆＤＮＡのフラクション濃度を決定するために使用され得る。
【０１３０】
一部の実施形態では、ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングプロセスを、上記のように反復して、情報価値のあるＳＮＰＳのカットオフを同定する。カットオフを見出すために、（０、０．２５）の範囲の対立遺伝子頻度でＳＮＰでクラスタリングを実施する。これは、クラスター１（より低いクラスター）が、情報価値のないＳＮＰ（ドナーおよびレシピエント対立遺伝子一致）であり、クラスター２（より高いクラスター）が、情報価値のあるＳＮＰ（ドナーは、少なくとも１つの、レシピエントとは異なる対立遺伝子を有する）である２つのクラスターをもたらす。カットオフは、第１の／より低いクラスターの最大と、第２の／より高いクラスターの最小の平均値として算出される。
【０１３１】
一部の実施形態では、情報価値のあるＳＮＰは、実質的に以下の通りに決定される：ドナーフラクションの算出における第１のステップとして、対立遺伝子頻度を、まずミラーリングして、ミラーリングされた対立遺伝子頻度を生成する。ミラーリングされた対立遺伝子頻度は、対立遺伝子の対立遺伝子頻度の少ないほうの値である（１−対立遺伝子頻度）。これは、０．５より大きい対立遺伝子頻度を［０，０．５］の範囲にミラーリングし、同様のドナー−レシピエント遺伝子型組合せを一緒に群にする（例えば、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーとＢＢレシピエント／ＡＢドナー）。次いで、「情報価値のある」ＳＮＰは、ＳＮＰについて、ドナーの遺伝子型およびレシピエントの遺伝子型が異なっているＳＮＰとして同定される。参照対立遺伝子をＡとして、代替対立遺伝子をＢとして定義すると、情報価値のあるＳＮＰの３つのカテゴリーがある（図３および図４）：
１）情報価値のあるカテゴリー１は、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーがヘテロ接合性である「Ｈｏｍｏ−Ｈｅｔ」カテゴリー（例えば、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナー）を指す。
２）情報価値のあるカテゴリー２は、レシピエントがホモ接合性であり、ドナーが反対の対立遺伝子についてホモ接合性である「Ｈｏｍｏ−Ｏｐｐ  Ｈｏｍｏ」カテゴリー（例えば、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナー）を指す。これは、ドナーおよびレシピエントが無関係である場合に生じる。
３）情報価値のあるカテゴリー３は、レシピエントがヘテロ接合性であり、ドナーがホモ接合性である「Ｈｅｔ−Ｈｏｍｏ」カテゴリー（例えば、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナー）を指す。
【０１３２】
一部の実施形態では、ドナー特異的核酸を検出し、および／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するために選択された情報価値のあるＳＮＰは、カテゴリー３のＳＮＰを含まない。
【０１３３】
図３および図４に示されるデータは、ゲノムＤＮＡおよび非妊娠血漿ｃｆＤＮＡの９１種の混合物を利用して、ドナー−レシピエント混合物をシミュレートしている。ミラーリングされた対立遺伝子頻度は、カテゴリー１および２ではＳＮＰについてドナーフラクションが高いほど増大するが、カテゴリー３のＳＮＰについては、減少する（図４）。正の相関に焦点を合わせるために、カテゴリー３のＳＮＰを排除し、ドナーフラクションを算出するために情報価値のないものとして再分類する（図３および図４）。次いで、情報価値のないＳＮＰを同定し、異なるアプローチによって除去することができ、そのうちいくつかは、２ステップクラスタリング分析に依存する。クラスタリングが使用される場合には、第１のステップは、情報価値のないＳＮＰ（例えば、ＡＡレシピエント／ＡＡドナー）を、情報価値のあるＳＮＰ（例えば、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナー）から分離するより低いカットオフを決定するための、０から０．３の間のミラーリングされた対立遺伝子頻度の範囲でファジーＫ−ｍｅａｎｓの反復である。第２ラウンドのクラスタリングでは、所望の情報価値のあるＳＮＰの上界（例えば、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーおよびＡＡレシピエント／ＢＢドナーを、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＡＢドナーから分離する）を決定するために、このより低いカットオフと、０．４９の対立遺伝子頻度の間でハードＫ−ｍｅａｎｓクラスタリングを実施する。
【０１３４】
ドナーまたはレシピエントの遺伝子型の入手可能性に応じて４つの異なるアプローチが以下に詳述されている：
【０１３５】
１）アプローチ１（「ＤＦ１」）：
ドナーの遺伝子型もレシピエントの遺伝子型も知られていない場合には、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを使用して、情報価値のないＳＮＰ（ＡＡレシピエント／ＡＡドナー、ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナー組合せ）を同定し、除去する。２つのクラスターが、以下のレシピエント／ドナーの遺伝子型組合せを含有すると予測される：
ａ．クラスター１＝（ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＡドナー）。
ｂ．クラスター２＝（ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナー、ＡＢレシピエント／ＢＢドナー）。
クラスター１中のＳＮＰのみを、ドナーフラクション算出に関連するものとして保持する。
【０１３６】
したがって、ドナーの遺伝子型もレシピエントの遺伝子型も知られていない状況下で、ＤＦ１アプローチを使用して、移植片状態を決定する方法は、
Ｉ）生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
ＩＩ）生体試料中の１つまたは複数のＳＮＰの各対立遺伝子の量を測定して、１つまたは複数のＳＮＰの量の測定値からなるデータセットを作成するステップであって、「情報価値のある」ＳＮＰが、ＳＮＰについてドナーの遺伝子型およびレシピエントの遺伝子型が異なっているＳＮＰとして同定される、ステップと、
ＩＩＩ）第１のクラスターおよび第２のクラスター由来のデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、第１のクラスターが情報価値のあるＳＮＰを含み、第２のクラスターが、情報価値のないＳＮＰを含み、
情報価値のあるＳＮＰが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、
情報価値のないＳＮＰが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する、ステップと、
ＩＶ）ドナー特異的対立遺伝子を、情報価値のあるＳＮＰの存在に基づいて検出するステップと
を含む。一部の実施形態では、方法は、ドナー特異的核酸フラクションを、ドナー特異的対立遺伝子の量に基づいて決定するステップをさらに含む。
【０１３７】
２）アプローチ２（「ＤＦ２」）：
ドナーの遺伝子型のみが知られている場合には、ドナーが、０．５未満の（ミラーリングされていない）対立遺伝子頻度の代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合および０．５より大きい対立遺伝子頻度の参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合をフィルタリング除外する。これは、［０，０．５）対立遺伝子頻度範囲のＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーならびに（０．５，１］対立遺伝子頻度範囲のＡＡレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＡＡドナークラスターを排除する。
【０１３８】
したがって、ドナーの遺伝子型が知られているが、レシピエントの遺伝子型が知られていない状況下で、ＤＦ２アプローチを使用して、本開示は、
Ｉ）生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
ＩＩ）生体試料中の１つまたは複数のＳＮＰの各対立遺伝子の量を測定して、１つまたは複数のＳＮＰの量の測定値からなるデータセットを作成するステップと、
ＩＩＩ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満であるＳＮＰならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が、０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＶ）ドナー特異的対立遺伝子を、生体試料中の１つまたは複数のＳＮＰ中に残存するＳＮＰの存在に基づいて検出するステップと
を含む移植片状態を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ドナー特異的核酸フラクションを、ドナー特異的対立遺伝子の量に基づいて決定するステップをさらに含む。
【０１３９】
３）アプローチ３（「ＤＦ３」）：
レシピエントの遺伝子型のみが知られている場合には、レシピエントがヘテロ接合性である場合をフィルタリング除外する（その結果、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーが排除される）。次いで、残存するＳＮＰでクラスタリングを実施して、情報価値のないＳＮＰを除去する。２つのクラスターが、以下の遺伝子型組合せを含有すると予測される：
ａ．クラスター１：ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー。
ｂ．クラスター２：ＡＡレシピエント／ＢＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＡドナー。
両クラスター中のＳＮＰが、ドナーフラクション算出に関連し、組み合わされるべきである。
【０１４０】
したがって、レシピエントの遺伝子型が知られているが、ドナーの遺伝子型が知られていない状況下で、ＤＦ３アプローチを使用して、本開示は、
Ｉ）生体試料から無細胞核酸を単離し、
生体試料中の１つまたは複数のＳＮＰの各対立遺伝子の量を測定して、１つまたは複数のＳＮＰの量の測定値からなるデータセットを作成するステップと、
ＩＩ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在するＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩＩ）残存するＳＮＰのデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施して、両方とも情報価値のあるＳＮＰを含む、第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成するステップであって、第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在するＳＮＰを含み、第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
ＩＶ）ドナー特異的対立遺伝子を、生体試料中の１つまたは複数のＳＮＰ中に残存するＳＮＰの存在に基づいて検出するステップと
を含む移植片状態を決定する方法を提供する。
【０１４１】
一部の実施形態では、方法は、ドナー特異的対立遺伝子の量に基づいて、生体試料においてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む。
【０１４２】
４）アプローチ４（「ＤＦ４」）：
ドナーおよびレシピエント両方の遺伝子型が知られている場合には、すべての情報価値のあるＳＮＰが公知である。情報価値のないＳＮＰは正確に同定され、除外される。
【０１４３】
ひとたび、情報価値のないＳＮＰを除去すると、残存する情報価値のあるＳＮＰで中央値を算出する。次いで、ドナーフラクションを、情報価値のあるＳＮＰのミラーリングされた対立遺伝子頻度の中央値の補正係数Ｋ倍として推定する（ドナーフラクション＝Ｋ＊中央値（ミラーリングされた対立遺伝子頻度））。次いで、補正係数Ｋを、ドナーおよびレシピエントの間（情報価値のあるカテゴリー１および３）に１つの対立遺伝子の相違がある場合に使用する。次いで、Ｋを２に設定して、２倍体ゲノム中に２つの対立遺伝子があることを補正し、対立遺伝子頻度は、参照対立遺伝子である対立遺伝子のフラクションのみをカウントする。例として、１０％ドナーフラクションは、９０コピーのレシピエントＡＡ毎に１０コピーのドナーＡＢを有するが、対立遺伝子頻度は、５％（１０Ａドナー／（１０Ａドナー＋１０Ｂドナー＋９０Ａレシピエント＋９０Ａレシピエント））であり、ドナーフラクションを得るために２が乗じられる必要がある。
【０１４４】
理想的には、Ｋは、ドナーおよびレシピエントの間で２つの対立遺伝子の相違を有するカテゴリー２のＳＮＰには、１に設定されるべきである。カテゴリー１および２の情報価値のあるＳＮＰを分離するという潜在的な課題を考えると、補正係数は、カテゴリー１および２の両方の群化に適用される。カテゴリー１においてＳＮＰのより高い割合があるはずであるので、これは、ドナーフラクションの算出に大きな誤差をもたらさないはずである。さらに、移植片モニタリングにとって重要であるのはドナーフラクションの絶対値ではなく、移植手順から経過した時間にわたって増大するドナーフラクションの程度である。
【０１４５】
図５（ならびに図７および図８）に示されるデータは、ゲノムＤＮＡおよび非妊娠血漿ｃｆＤＮＡの８６種の混合物を利用して、ドナー−レシピエント混合物を刺激する。エラー！参照供給源が見られない。図５は、アプローチ１〜３によって算出されたドナーフラクションを、アプローチ４を使用する最も正確な決定のものと比較する。アプローチ１〜３は、高度に相関し（Ｒ２＞０．９７）、値が密接に一致し（勾配＝０．９７１〜０．９９６）、中程度のレベル（例えば、５％〜２５％）のドナーフラクションを測定するためのすべての戦略の間で全体的に優れた一致を示す。それはまた、ＳＮＰ対立遺伝子頻度のＫ−ｍｅａｎｓクラスタリングが、このような範囲で情報価値のあるＳＮＰを同定するために十分であることをことも示す。ドナーフラクションが極めて低いまたは極めて高くない限り、ドナーフラクションの算出においてドナーまたはレシピエントのいずれかの遺伝子型を承知していることにはほとんど利点がない。
【０１４６】
異なるＳＮＰ対立遺伝子頻度クラスターが互いに融合する可能性がある極めて低い（０．５％にまで下がった）および極めて高いドナーフラクション（３０％近く）では、情報価値のあるＳＮＰの誤分類があり得る（図６）。例えば、低いドナーフラクションでは、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーＳＮＰは、ＡＡレシピエント／ＡＡドナーＳＮＰ、情報価値のあるＳＮＰの検出において偽陰性とみなされ得る。これは、５％未満のドナーフラクションについて、ドナーフラクションの２％〜３％の平均値の過剰推定を引き起こす（図７、ＤＦ１およびＤＦ３パネル）。アプローチ２は、ドナーの遺伝子型の知識によってＡＡレシピエント／ＡＡドナーおよびＢＢレシピエント／ＢＢドナー組合せを除去するのでここでより正確であるはずである。これは、アプローチ２を使用する測定値において１に最も近い勾配を有することによって検証される（図７、ＤＦ２パネル）。
【０１４７】
より高いドナーフラクションでは、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーＳＮＰは、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーＳＮＰとして分類される可能性があり、ＢＢレシピエント／ＡＡドナーＳＮＰは、ＡＢレシピエント／ＢＢドナーとして分類され得る。それらは、ドナーフラクション算出にとって、このアプローチでは情報価値がないと考えられ、そのため、偽陰性のもう一つの原因となる。これは、１５％より大きいドナーフラクションについてドナーフラクションの２５％〜３０％の過少推定を引き起こす（図８）。レシピエントの遺伝子型の知識を有するアプローチ３は、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーＳＮＰの排除によってこの問題を除外し得る。これは、アプローチ３を使用する測定値において１に最も近い勾配を有することによって検証される（図８、ＤＦ３パネル）。
【０１４８】
移植片状態の決定
ドナー特異的無細胞ＤＮＡフラクション（「ドナーフラクション」）の算出
一部の実施形態では、ドナーフラクションは、すべての情報価値のあるＳＮＰにわたる頻度の中央値として算出される。
【０１４９】
一部の実施形態では、ドナーフラクションは、情報価値のあるＳＮＰの頻度に補正係数を乗じることによって得られる。いずれか１または２の補正係数が、情報価値のあるＳＮＰの種類に応じて適用される：ドナーがレシピエントとは異なる１つの対立遺伝子を有するように、ＳＮＰが同定され得る場合には、２の補正係数が適用され、ドナーがレシピエントとは異なる２つの対立遺伝子を有する場合とＳＮＰが同定され得る場合には、１の補正係数が適用される。ＳＮＰの種類は、通常、ドナーおよびレシピエント無細胞ＤＮＡの混合物から得られた対立遺伝子頻度を分析することによって決定でき、このような情報を得るためにドナーの遺伝子型は必要ではない。一部の実施形態では、ＳＮＰが、ドナーがレシピエントとは異なる１つの対立遺伝子を有するものであるか、または２つの対立遺伝子を有するものであるかは、レシピエントとドナーの間の関連性に基づいて決定できる。例えば、レシピエントが、ドナーの親である場合には、ドナーは、レシピエントとは異なる１つの対立遺伝子のみを有し得る。レシピエントおよびドナーが無関係である場合には、ＳＮＰの１／３が、ドナーが１つの異なる対立遺伝子を有する場合となり、それらのＳＮＰについて補正係数は２となる。ＳＮＰの他の２／３は、ドナーが２つの異なる対立遺伝子を有する場合となり、それらのＳＮＰについて補正係数は１となる。Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを使用して、ＳＮＰのそれらの２つのカテゴリーを分離することができる、または補正係数を適用するために上位の１／３と下位の２／３の群に、それらを簡単に分離してもよい。補正係数が適用された後、ドナーフラクションは、補正された情報価値のあるＳＮＰすべてにわたる中央値である。
【０１５０】
一部の実施形態では、フラクションまたは比率は、ある核酸の量について、別の核酸の量に対して決定され得る。一部の実施形態では、試料中の無細胞核酸の総量に対する試料中のドナー特異的無細胞核酸のフラクションが決定される。一般に、試料中の無細胞核酸の総量に対する試料中のドナー特異的無細胞核酸のフラクションを算出するために、以下の方程式を適用できる：
【０１５１】
ドナー特異的無細胞核酸のフラクション＝（ドナー特異的無細胞核酸の量）／［（総無細胞核酸の量）］
【０１５２】
ドナー特異的無細胞ＤＮＡのコピー数（「ドナー負荷」）の算出
一部の実施形態では、参照ゲノム核酸および参照ゲノム核酸と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するように設計され、１つまたは複数の多型核酸標的と同時増幅されるバリアントオリゴを使用して無細胞ＤＮＡ中のゲノムＤＮＡの総コピーが決定される。バリアントオリゴは、既知分量で増幅混合物に付加される。配列決定後、バリアントを含有する配列数が、参照ゲノム核酸を含有する配列数と比較され、２つの比率が決定される。バリアントオリゴの分量は既知であるので、バリアントオリゴの分量および参照ゲノム核酸を含有する配列数に対するバリアントを含有する配列数の比率に基づいてゲノムＤＮＡの総コピーが算出され得る。一実施形態では、参照ゲノム核酸は、ＡｐｏＥである。一実施形態では、参照ゲノム核酸は、ＲＮａｓＰである。
【０１５３】
一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡ中のゲノムＤＮＡの総コピー数とドナーフラクション数を乗じて、ドナーＤＮＡの総コピー数を生成し、これを使用して、移植片の状態を示す。高いドナーゲノムコピー数は、高い肥満度指数（ＢＭＩ）を有するレシピエントにおける低いフラクション濃度としてマスクされ得るので、またはドナー特異的無細胞ＤＮＡのコピー数の増大が、患者の体重が増加するのにつれた、減少または不変のフラクション濃度としてマスクされ得るので、ドナーＤＮＡの総コピー数は、一部の例では、拒絶のより良好な指標であり得る。
【０１５４】
移植片状態の決定
移植片状態、すなわち、移植片が拒絶されるか、受容されるかは、移植片患者においてドナーフラクションまたはドナー負荷をモニタリングすることによって決定され得る。
【０１５５】
一部の実施形態では、移植片患者のドナーフラクションまたはドナー負荷は、所定の閾値と比較され、移植片状態は、ドナーフラクションまたはドナー負荷が、所定の閾値未満である場合に受容として決定され、移植片状態は、ドナーフラクションまたはドナー負荷が、所定の閾値より大きい場合に拒絶として決定される。閾値は、臓器移植片を受けていない対照患者（複数可）、例えば、患者（複数可）における対立遺伝子頻度のバックグラウンドレベルに基づいて予め決定され得る。一部の実施形態では、対照患者は、移植状態が決定されるべきである対象と同一の性別、年齢および民族群内であるものであり、対照患者は、対象と同様のＢＭＩを有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、移植後の種々の時点で採取された試料について、ドナーフラクションまたはドナー負荷が決定される。ドナーフラクションまたはドナー負荷の経時的な増大は、移植片拒絶の徴候である。一部の実施形態では、移植片状態は、２つまたはそれより多い時点でモニタリングされる。２つまたはそれより多い時点は、早い時点および第１の時点後の遅い時点を含む場合があり、両時点は移植後である。一実施形態では、早い時点から遅い時点へのドナー特異的循環型無細胞核酸の増大が、移植片拒絶の発生を示す。一部の実施形態では、早い時点と遅い時点の間の時間間隔は、少なくとも７日である。一部の実施形態では、早い時点は、移植後０日〜１年の間である。一部の実施形態では、遅い時点は、移植後７日〜５年の間である。または他の時点が、使用されてもよい。試料採取は、移植片の性質、患者進行または他の因子に応じて変わり得る。一部の実施形態では、十分なものを毎週、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、１年毎に１回採取してもよく、２つまたはそれより多い時点について、ドナー特異的無細胞核酸フラクションが決定され、ドナー特異的無細胞核酸フラクションの増大が、移植片拒絶を経時的に示す。一部の実施形態では、移植片状態は、移植後最初の１年では、その後の年数よりも頻繁にモニタリングされる。例えば、試料は、最初の１年の間、移植片状態の分析のために、５よりも多い、６よりも多い、７よりも多い、８よりも多い、９よりも多いまたは１０よりも多い時点で採取され得る。
【０１５７】
以下にさらに記載されるように、一部の実施形態では、参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の量は、本明細書において記載される種々のアッセイによって決定され得る。一実施形態では、対立遺伝子（例えば、参照対立遺伝子または代替対立遺伝子）の量は、配列決定反応由来のその対立遺伝子の配列読取りに対応する。
【０１５８】
多型核酸標的の定量化
一部の実施形態では、多型核酸標的の量は、配列読取りに基づいて定量化される。ある特定の実施形態では、各対立遺伝子の参照ゲノム上の多型核酸標的にマッピングされる配列読取りの分量は、カウントまたは読取り密度と呼ばれる。ある特定の実施形態では、カウントは、多型核酸標的にマッピングされた配列読取りの一部またはすべてから決定される。
【０１５９】
カウントは、適した方法、操作または数学的プロセスによって決定され得る。カウントは、セグメントに対応するゲノム部分またはゲノム部分の群、ゲノムの部分領域（例えば、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域または他の染色体再配列）に対応する部分の群にマッピングされたすべての配列読取りの直接合計であることもあり、および／またはゲノムの対応する部分の群であることもある。
【０１６０】
一部の実施形態では、カウントは、生配列読取りおよび／またはフィルタリングされた配列読取りに由来する。ある特定の実施形態では、カウントは、数学的プロセスによって決定される。ある特定の実施形態では、カウントは、多型部位の２つの対立遺伝子（参照対立遺伝子および代替対立遺伝子）各々の参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングされた配列読取りの平均値、平均または合計である。一部の実施形態では、カウントは、不確実性値と関連している。カウントは、調整されることもある。カウントは、重み付けされた、除去された、フィルタリングされた、正規化された、調整された、平均された、平均として導かれた、中央値として導かれた、付加された、またはそれらの組合せの多型部位の２つの対立遺伝子（参照対立遺伝子および代替対立遺伝子）各々の参照ゲノム上の標的核酸配列と関連している配列読取りに従って調整され得る。
【０１６１】
配列読取り定量化は、読取り密度であることもある。読取り密度は、ゲノムの１つまたは複数のセグメントについて決定および／または生成され得る。ある特定の場合には、読取り密度は、１つまたは複数の染色体について決定および／または生成され得る。一部の実施形態では、読取り密度は、多型部位の２つの対立遺伝子（参照対立遺伝子および代替対立遺伝子）各々の参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングされた配列読取りのカウントの定量的程度を含む。読取り密度は、適したプロセスによって決定され得る。一部の実施形態では、読取り密度は、適した分布および／または適した分布関数によって決定される。分布関数の限定されない例として、確率関数、確率分布関数、確率密度関数（ＰＤＦ）、カーネル密度関数（カーネル密度推定）、累積分布関数、確率質量関数、離散確率分布、絶対連続単変量分布など、任意の適した分布またはそれらの組合せが挙げられる。読取り密度は、適した確率密度関数に由来する密度推定であり得る。密度推定は、観察されたデータに基づいて、基礎となる確率密度関数の推定を構築することである。一部の実施形態では、読取り密度は、密度推定（例えば、確率密度推定、カーネル密度推定）を含む。読取り密度は、ゲノムの１つまたは複数の部分各々の密度推定を生成することを含むプロセスに従って生成でき、各部分は、配列読取りのカウントを含む。部分またはセグメントにマッピングされた正規化されたおよび／または重み付けされたカウントについて、読取り密度を生成できる。一部の例では、部分またはセグメントにマッピングされた各読取りは、読取り密度、本明細書において記載された正規化プロセスから得られたその重みに等しい値（例えば、カウント）に寄与し得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分またはセグメントの読取り密度は調整される。読取り密度は、適した方法によって調整され得る。例えば、１つまたは複数の部分の読取り密度は、重み付けおよび／または正規化され得る。
【０１６２】
無細胞核酸の濃縮
一部の実施形態では、多型核酸標的を濃縮した後、本明細書に記載する方法を使用してドナー特異的無細胞核酸を同定する。一部の実施形態では、濃縮することは、複数の多型核酸標的を増幅することを含む。一部の場合では、濃縮することは、増幅反応において増幅産物を生成することを含む。多型標的の増幅は、核酸を増幅するための本明細書に記載する任意の方法または当技術分野で公知の方法（例えば、ＰＣＲ）によって達成され得る。一部の場合では、増幅反応は、単一の容器（例えば、チューブ、コンテナ、プレート上のウェル）中で実施され、これは本明細書において多重化増幅と呼ばれることがある。
【０１６３】
ドナー特異的無細胞核酸の量を定量化し、移植片状態を評価するための他の方法と共に使用することができる。試料核酸を調製する処理前または処理後の対象に由来する核酸試料中のドナー特異的核酸の量を決定することができる。ある特定の実施形態では、試料核酸を処理し、調製した後の試料中のドナー特異的核酸の量を決定し、この量をさらなる評価のために利用する。一部の実施形態では、アウトカムは、試料核酸中のドナー特異的核酸のフラクションの寄与の程度を加減する（例えば、カウント数を調整する、試料を除去する、コールを行う、またはコールを行わない）ことを含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、臓器移植を受けた移植片レシピエントに由来する試料からの無細胞核酸を、濃縮した後、ドナー特異的無細胞核酸を決定する、またはドナー特異的フラクションを定量化することができる。一部の場合では、濃縮方法は、増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づくアプローチを含み得る。
【０１６５】
ヌクレオチド配列の増幅
多くの場合では、当技術分野で周知である（上に列挙し、以下により詳細に記載する）いくつかの核酸増幅手順のいずれかを使用して、本明細書における技術の核酸配列を増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列と相補的である配列を含有する核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成である。核酸増幅は、試料中に存在する標的配列の量が非常に少ない場合に特に有益である。標的配列を増幅することおよび合成されたアンプリコンを検出することによって、目的の生物またはウイルスに属する試料中の核酸の検出をより確実にするためにアッセイの最初に必要な標的配列がより少なくてすむことから、アッセイの感度を大きく改善することができる。
【０１６６】
多様なポリヌクレオチド増幅法が十分に確立されており、多くの場合研究において使用されている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的方法は、当技術分野で周知であり、したがって、本明細書において詳細には記載しない。ＰＣＲ法、プロトコール、およびプライマー設計原理の再検討に関しては、例えば、Innis,  et  al.,  PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press,  Inc.  N.Y.,  1990を参照されたい。ＰＣＲ試薬およびプロトコールはまた、販売元、例えばＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓからも利用可能である。
【０１６７】
ＰＣＲは、熱安定な酵素による自動化されたプロセスとして最も普通に行われる。このプロセスでは、反応混合物の温度を、変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸長反応領域を通して自動的に循環させる。この目的のために特に適合させた機械が市販されている。
【０１６８】
ポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は通常、本技術の実践において使用されるが、当業者は、レシピエント血液試料中に見出されるゲノム配列の増幅が、任意の公知の方法、例えばその各々が十分な増幅を提供するリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅、および自家持続配列複製法または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によって達成され得ることを認識するであろう。より最近開発された分岐ＤＮＡ技術もまた使用して、特定のメチル化パターンを表す本明細書における技術の特定のゲノム配列の存在を定量的に実証しても、またはレシピエント血液中のこの特定のゲノム配列の量を定量的に決定してもよい。臨床試料中の核酸配列の直接定量化のための分岐ＤＮＡシグナル増幅の再検討に関しては、Nolte,  Adv.  Clin.  Chem.  33:201-235,  1998を参照されたい。
【０１６９】
本明細書における技術の組成物およびプロセスはまた、デジタルＰＣＲと共に実践する場合、特に有用である。デジタルＰＣＲは、Ｋａｌｉｎｉｎａおよび同僚（Kalinina  et  al.,  "Nanoliter  scale  PCR  with  TaqMan  detection."  Nucleic  acids  Research.  25;  1999-2004,  (1997)）によって初めて開発され、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ（Digital  PCR.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  96;  9236-41,  (1999)）によってさらに開発された。胎児診断での使用のためのデジタルＰＣＲの適用は、Ｃａｎｔｏｒら（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ０５０２３０９１Ａ２号）によって最初に記載され、その後Ｑｕａｋｅら（米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号）によって記載され、それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれている。デジタルＰＣＲは、単一分子レベルでの核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）増幅を利用し、低コピー数の核酸を定量化するための高感度の方法を提供する。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、核酸のデジタル分析のためのシステムを提供する。
【０１７０】
用語「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、または「増幅すること」は、核酸のコピーを増幅するための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスを指す。増幅は時には、核酸の「指数関数的」増加を指す。しかし、本明細書で使用する場合「増幅すること」はまた、選択した核酸の数の線形的増加を指し得るが、１回の単一プライマー伸長ステップとは異なる。一部の実施形態では、プレ増幅としても公知の限定的な増幅反応を実施することができる。プレ増幅は、少ないサイクル数、例えば１０サイクルが実施されることにより限定された量の増幅が起こる方法である。プレ増幅は、一部の増幅を可能にし得るが、対数期の前に増福を停止させ、通常、所望のヌクレオチド配列の約５００コピーを産生する。プレ増幅の使用はまた、例えば標準的なＰＣＲ反応における枯渇した反応物に関連する不正確性も制限することができ、同様にヌクレオチド配列または核酸の存在量による増幅の偏りを低減させ得る。一部の実施形態では、線形または指数関数的増幅の前置きとして、１回のプライマー伸長を実施してもよい。
【０１７１】
任意の適した増幅技術を利用することができる。ポリヌクレオチドの増幅として、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））；Ｑ−ベータレプリカーゼまたは鋳型依存的ポリメラーゼの使用に基づく増幅法（米国特許出願公開第２００５０２８７５９２号を参照されたい）；ヘリカーゼ依存的等温増幅（Vincent  et  al.,  "Helicase-dependent  isothermal  DNA  amplification".  EMBO  reports  5  (8):  795-800  (2004)）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；好熱性ＳＤＡ核酸配列に基づく増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）、および転写関連増幅（ＴＡＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅法の非限定的な例として、標準的なＰＣＲ、ＡＦＬＰ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ（ＩＳＨ）、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ−ＰＣＲ）、ロングＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、単細胞ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、それらの組合せ等が挙げられる。例えば、ある特定の実施形態ではデジタルＰＣＲを使用して増幅を達成することができる（例えば、Kalinina  et  al.,  "Nanoliter  scale  PCR  with  TaqMan  detection."  Nucleic  acids  Research.  25;  1999-2004,  (1997);  Vogelstein  and  Kinzler  (Digital  PCR.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  96;  9236-41,  (1999)；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ０５０２３０９１Ａ２号；米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照されたい）。デジタルＰＣＲは、単一分子レベルで核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）増幅を利用し、低コピー数の核酸を定量化するための高感度の方法を提供する。核酸のデジタル増幅および分析のためのシステムが利用可能である（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ＰＣＲを実行するための試薬およびハードウェアは市販されている。
【０１７２】
増幅プロセスの一般的な説明を本明細書に示す。プライマーおよび核酸を接触させると、例えば相補配列が互いにアニーリングする。プライマーは、目的の配列またはその近傍（例えば、隣接する、接する等）の核酸にアニーリングすることができる。一部の実施形態では、セット中のプライマーは、目的の核酸配列からの約１０〜３０ヌクレオチド内でハイブリダイズして、増幅産物を産生する。一部の実施形態では、プライマーは、目的の核酸配列内でハイブリダイズする。
【０１７３】
酵素の機能性にとって必要な成分を含有する反応混合物をプライマー−核酸ハイブリッドに添加すると、適切な条件下で増幅が起こり得る。増幅反応の成分として、これらに限定されないが、例えばプライマー（例えば、個々のプライマー、プライマー対、プライマーセット等）、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰ等が挙げられ得る。一部の実施形態では、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば検出可能な標識（例えば、蛍光または比色分析標識）を含有するアナログを、例えば使用してもよい。ポリメラーゼは、当業者が選択することができ、熱サイクル増幅のポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｑ−Ｂｉｏ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５’−３’エキソ活性を欠くＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの組換え切断型）；ＳｕｒｅＰｒｉｍｅ（商標）ポリメラーゼ（「ホットスタート」ＰＣＲのための化学改変Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）；  Ａｒｒｏｗ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（高感度のロングテンプレート増幅））、および熱安定性増幅のためのポリメラーゼ（例えば、ウェブＵＲＬ"gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf"に記載される転写媒介増幅（ＴＭＡ）のためのＲＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。例えば、他の酵素成分、例えば転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応のための逆転写酵素を添加することができる。
【０１７４】
ＰＣＲ条件は、プライマー配列、核酸の存在量、および所望の増幅量に依存し得ることから、当業者は、利用可能ないくつかのＰＣＲプロトコールから選択することができる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；ならびにPCR  Protocols  :A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Innis  et  al.,  eds,  1990を参照されたい。デジタルＰＣＲもまた、当技術分野で公知であり；例えば、参照により本明細書に組み込まれている、２００７年２月２日に出願された米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照されたい）。ＰＣＲは通常、熱安定性酵素によって自動化プロセスとして行われる。このプロセスでは、反応混合物の温度は、変性ステップ、プライマーアニーリングステップ、および伸長反応ステップを通して自動的に循環される。一部のＰＣＲプロトコールはまた、活性化ステップおよび最終伸長ステップも含む。この目的のために特に適合させた機械が市販されている。本明細書に記載する実施形態にとって適切であり得るＰＣＲプロトコールの非限定的な例は、試料を９５℃で５分間処置するステップ；９５℃で４５秒間および６８℃で３０秒間の３５サイクルを繰り返すステップ；ならびに次いで試料を７２℃で３分間処置するステップである。終了したＰＣＲ反応は、さらなる作用が望まれるまで、必要に応じて４℃で維持することができる。多くの場合、市販のサーマルサイクラーを使用して複数のサイクルが実施される。当業者に公知で選択される適切な等温増幅プロセスもまた、ある特定の実施形態では適用してもよい。
【０１７５】
一部の実施形態では、増幅産物は、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ等、および前述の組合せを含み得る。増幅産物は、本明細書における核酸配列、またはその相補体と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列を有することが多い。増幅産物における「実質的に同一な」ヌクレオチド配列は、一般的に増幅されるヌクレオチド配列種またはその相補体に対して高度の配列同一性（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より高い配列同一性）を有し、変形形態は時には、伸長および／もしくは増幅のために使用したポリメラーゼの非忠実度、または増幅のために使用したプライマーに付加された追加のヌクレオチド配列の結果である。
【０１７６】
プライマー
核酸の検出、増幅、定量化、配列決定および分析にとって有用なプライマーを提供する。本明細書で使用する場合、用語「プライマー」は、目的の特異的領域またはその近傍（例えば、隣接する）で標的核酸にハイブリダイズまたはアニーリングすることが可能なヌクレオチド配列を含む核酸を指す。プライマーは、例えば、標的核酸ヌクレオチド配列の特異的決定、または標的核酸（例えば、配列の有無、または配列のコピー数）もしくはその特徴の検出を可能にすることができる。プライマーは天然に存在しても、または合成であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「特異的」または「特異性」は、１つの分子と別の分子、例えば標的ポリヌクレオチドのためのプライマーとの結合またはハイブリダイゼーションを指す。すなわち、「特異的」または「特異性」は、それらの２つの分子のいずれかと他の分子との認識、接触、または複合体形成が実質的に少ないことと比較した、２つの分子間の認識、接触、および安定な複合体の形成を指す。本明細書で使用する場合、用語「アニーリングする」は、２つの分子間の安定な複合体の形成を指す。用語「プライマー」、「オリゴ」、または「オリゴヌクレオチド」は、プライマーを指す場合、本文書全体を通して交換可能に使用され得る。
【０１７７】
プライマー核酸は、適切なプロセスを使用して設計および合成することができ、目的のヌクレオチド配列にハイブリダイズするために（例えば、核酸が液相にある、または固体の支持体に結合している場合）、および本明細書に記載する分析プロセスを実施するために適切な任意の長さの核酸であり得る。プライマーは、標的ヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。一部の実施形態では、プライマーは、約１０〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約７０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ヌクレオチドの長さであり得る。プライマーは、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、標識されたヌクレオチド）、またはその混合物で構成され得る。本明細書に記載する実施形態と共に使用するために適切なプライマーは、公知の技術を使用して合成および標識され得る。プライマーは、Beaucage  and  Caruthers,  Tetrahedron  Letts.,  22:1859-1862,  1981によって初めて記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、Needham-VanDevanter  et  al.,  Nucleic  acids  Res.12:6159-6168,  1984に記載されるように自動シンセサイザーを使用して化学的に合成してもよい。プライマーの精製は、例えば、Pearson  and  Regnier,  J.  Chrom.,  255:137-149,  1983に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によって、または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行うことができる。
【０１７８】
プライマー核酸配列（天然に存在するまたは合成）のすべてまたは部分は、一部の実施形態では、標的核酸と実質的に相補的であり得る。本明細書において言及されるように、配列に関して「実質的に相補的な」とは、互いにハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、変動する量の配列ミスマッチを許容するように変更することができる。互いに５５％もしくはそれより多く、５６％もしくはそれより多く、５７％もしくはそれより多く、５８％もしくはそれより多く、５９％もしくはそれより多く、６０％もしくはそれより多く、６１％もしくはそれより多く、６２％もしくはそれより多く、６３％もしくはそれより多く、６４％もしくはそれより多く、６５％もしくはそれより多く、６６％もしくはそれより多く、６７％もしくはそれより多く、６８％もしくはそれより多く、６９％もしくはそれより多く、７０％もしくはそれより多く、７１％もしくはそれより多く、７２％もしくはそれより多く、７３％もしくはそれより多く、７４％もしくはそれより多く、７５％もしくはそれより多く、７６％もしくはそれより多く、７７％もしくはそれより多く、７８％もしくはそれより多く、７９％もしくはそれより多く、８０％もしくはそれより多く、８１％もしくはそれより多く、８２％もしくはそれより多く、８３％もしくはそれより多く、８４％もしくはそれより多く、８５％もしくはそれより多く、８６％もしくはそれより多く、８７％もしくはそれより多く、８８％もしくはそれより多く、８９％もしくはそれより多く、９０％もしくはそれより多く、９１％もしくはそれより多く、９２％もしくはそれより多く、９３％もしくはそれより多く、９４％もしくはそれより多く、９５％もしくはそれより多く、９６％もしくはそれより多く、９７％もしくはそれより多く、９８％もしくはそれより多く、または９９％もしくはそれより多く相補的である標的およびプライマー配列が含まれる。
【０１７９】
標的核酸配列と実質的に相補的なプライマーはまた、標的核酸配列の相補体と実質的に同一である。すなわちプライマーは、核酸のアンチセンス鎖と実質的に同一である。本明細書において言及されるように、配列に関して「実質的に同一な」とは、互いに５５％もしくはそれより多く、５６％もしくはそれより多く、５７％もしくはそれより多く、５８％もしくはそれより多く、５９％もしくはそれより多く、６０％もしくはそれより多く、６１％もしくはそれより多く、６２％もしくはそれより多く、６３％もしくはそれより多く、６４％もしくはそれより多く、６５％もしくはそれより多く、６６％もしくはそれより多く、６７％もしくはそれより多く、６８％もしくはそれより多く、６９％もしくはそれより多く、７０％もしくはそれより多く、７１％もしくはそれより多く、７２％もしくはそれより多く、７３％もしくはそれより多く、７４％もしくはそれより多く、７５％もしくはそれより多く、７６％もしくはそれより多く、７７％もしくはそれより多く、７８％もしくはそれより多く、７９％もしくはそれより多く、８０％もしくはそれより多く、８１％もしくはそれより多く、８２％もしくはそれより多く、８３％もしくはそれより多く、８４％もしくはそれより多く、８５％もしくはそれより多く、８６％もしくはそれより多く、８７％もしくはそれより多く、８８％もしくはそれより多く、８９％もしくはそれより多く、９０％もしくはそれより多く、９１％もしくはそれより多く、９２％もしくはそれより多く、９３％もしくはそれより多く、９４％もしくはそれより多く、９５％もしくはそれより多く、９６％もしくはそれより多く、９７％もしくはそれより多く、９８％もしくはそれより多く、または９９％もしくはそれより多く同一であるヌクレオチド配列を指す。２種のヌクレオチド配列が実質的に同一であるか否かを決定するための１つの試験は、共有される同一のヌクレオチド配列のパーセントを決定することである。
【０１８０】
プライマーの配列および長さは、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションに影響を及ぼし得る。プライマーと標的核酸との間のミスマッチの程度に応じて、低、中または高ストリンジェンシー条件を使用して、プライマー／標的のアニーリングを達成することができる。本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を指す。ハイブリダイゼーション反応温度条件最適化のための方法は、当業者に公知であり、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  N.Y.,  6.3.1-6.3.6  (1989)に見出すことができる。水性および非水性法がその参考文献に記載されており、いずれかを使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の比限定的な例として、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、５０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例として、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、５５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例として、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄がある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄であることが多い。ストリンジェンシー条件は、６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳと、それに続く、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳでの１回または複数回の洗浄であることがより多い。ストリンジェントハイブリダイゼーション温度はまた、例えば、ある特定の有機溶媒、ホルムアミドの添加によって変更（すなわち、低下）することができる。ホルムアミドのような有機溶媒は、二本鎖ポリヌクレオチドの熱安定性を低減し、その結果、ストリンジェントな条件を維持し、熱不安定性であり得る核酸の有用な寿命を延長しながら、より低い温度でハイブリダイゼーションを実施することができる。プライマーの特徴をプローブおよびオリゴヌクレオチド、例えば本明細書において提供される競合的および阻害性オリゴヌクレオチドなどに適用することができる。
【０１８１】
本明細書で使用する場合、語句「ハイブリダイズすること」またはその文法的変形形態は、低、中もしくは高ストリンジェンシー条件下で、または核酸合成条件下での第１の核酸分子の第２の核酸分子に対する結合を指す。ハイブリダイズすることは、第１の核酸分子が第２の核酸分子に結合する例、第１および第２の核酸分子が相補的である例を含み得る。本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」は、相補配列を有さない核酸分子に対するハイブリダイゼーションと比較して、プライマーと相補的である配列を有する核酸分子に対するプライマーの核酸合成条件下での優先的ハイブリダイゼーションを指す。例えば、特異的ハイブリダイゼーションは、プライマーと相補的である標的核酸配列に対するプライマーのハイブリダイゼーションを含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、プライマーは、固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列と相補的、または固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列と実質的に相補的であり得るヌクレオチドサブ配列を含み得る（アラインさせた場合にプライマーハイブリダイゼーション配列相補体と例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より多く同一である）。プライマーは、固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列と相補的ではないまたは実質的に相補的ではないヌクレオチドサブ配列を含有し得る（例えば、固相プライマーハイブリダイゼーション配列と相補的なまたは実質的に相補的なプライマーにおけるヌクレオチドサブ配列の３’または５’末端）。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、プライマーは、改変、例えば１つもしくは複数のイノシン、塩基脱落部位、ロックド核酸、副溝結合剤、二重鎖安定化剤（例えば、アクリジン、スペルミジン）、Ｔｍ改変剤、またはプライマーもしくはプローブの結合特性を変化させる任意の改変剤を含有し得る。ある特定の実施形態では、プライマーは、検出可能な分子またはエンティティ（例えば、標識された競合オリゴヌクレオチドに関して上記のようなフルオロフォア、放射性同位元素、比色分析剤、粒子、酵素等）を含有し得る。
【０１８４】
プライマーはまた、標的核酸のサブ配列または別のプライマーにハイブリダイズし、例えば分子ビーコンのように、プライマー、標的核酸、または両方の検出を促進するポリヌクレオチド配列も指し得る。本明細書で使用する場合、用語「分子ビーコン」は、ある特定の特異的条件下に限って検出可能であり、それによってそれを特異的かつ情報価値のあるシグナルとして機能させることが可能である検出可能な分子を指す。検出可能な特性の非限定的な例は、光学的特性、電気的特性、磁気的特性、化学的特性、および公知のサイズの開口部を通しての時間または速度である。
【０１８５】
一部の実施形態では、プライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列と相補的である。一部の場合では、フォワードおよびリバースプライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列の５’および３’末端にハイブリダイズする。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズするプライマーは、プライマーの結合のための対応するゲノムＤＮＡ標的配列と競合するように設計した競合オリゴヌクレオチドにもハイブリダイズする。一部の場合では、プライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列および対応する競合オリゴヌクレオチドに同じまたは同様のハイブリダイゼーション効率でハイブリダイズするかまたはアニーリングする。一部の場合では、ハイブリダイゼーション効率は異なる。ゲノムＤＮＡ標的アンプリコンと競合アンプリコンとの間の比を、反応の間、測定することができる。例えば、比が２８サイクルでは１：１であるが、３５サイクルでは２：１である場合、これは、増幅反応の終了の間、１つの標的（すなわち、ゲノムＤＮＡ標的または競合体）のプライマーが、他よりも急速に再アニーリングしているか、または変性が他よりも有効ではないことを示し得る。
【０１８６】
一部の実施形態では、プライマーはセットで使用される。本明細書で使用する場合、増幅プライマーセットは、所与の領域に関するフォワードおよびリバースプライマーの１つまたは複数の対である。このように、例えば、領域１（すなわち、標的１ａおよび１ｂ）に関する核酸標的を増幅するプライマーは、プライマーセットであると考えられる。領域２（すなわち、標的２ａおよび２ｂ）に関する核酸標的を増幅するプライマーは、異なるプライマーセットであると考えられる。一部の実施形態では、特定の領域内の標的を増幅するプライマーセットはまた、対応する競合オリゴヌクレオチドも増幅する。複数のプライマー対は、ある特定の実施形態ではプライマーセットを構成し得る（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００対）。一部の実施形態では、各セットがプライマー対を含む複数のプライマーセットを使用してもよい。
【０１８７】
一部の場合では、遺伝子座特異的増幅法を使用することができる（例えば、遺伝子座特異的増幅プライマーを使用する）。一部の場合では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチを使用することができる。一部の場合では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチを、ユニプレックスシーケンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）の使用、および捕捉プローブ配列のアンプリコンへの組み込み後、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定を含み得る。一部の場合では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチを、３プライマーシステムおよびインデックス付きシーケンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、ある特定の遺伝子座特異的フォワードＰＣＲプライマーに組み込まれた第１の捕捉プローブを有するプライマーおよび遺伝子座特異的リバースＰＣＲプライマーに組み込まれたアダプター配列と共に、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）の使用、それによってアンプリコンを生成した後、第２のＰＣＲを行って、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定のためにリバース捕捉配列および分子インデックスバーコードを組み込むことを含み得る。一部の場合では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチを、４プライマーシステムおよびインデックス付きシーケンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、遺伝子座特異的フォワードおよび遺伝子座特異的リバースＰＣＲプライマーの両方に組み込まれたアダプター配列を有するプライマーと共にマルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）の使用、その後に第２のＰＣＲを行って、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定のためにフォワードおよびリバース捕捉配列の両方ならびに分子インデックスバーコードを組み込むことを含み得る。一部の場合では、マイクロ流体アプローチを使用することができる。一部の場合では、アレイに基づくマイクロ流体アプローチを使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、低い多重度での増幅ならびにインデックスおよび捕捉プローブの組み込みのためにマイクロ流体アレイ（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）の使用、その後の配列決定を含み得る。一部の場合では、エマルジョンマイクロ流体アプローチ、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲなどを使用することができる。
【０１８８】
一部の場合では、ユニバーサル増幅法を使用することができる（例えば、ユニバーサルまたは非遺伝子座特異的増幅プライマーを使用する）。一部の場合では、ユニバーサル増幅法を、プルダウンアプローチと組み合わせて使用することができる。一部の場合では、方法は、ユニバーサルに増幅された配列決定ライブラリーからのビオチン化ウルトラマープルダウン（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔまたはＩＤＴのビオチン化プルダウンアッセイ）を含み得る。例えば、そのようなアプローチは、標準的なライブラリーの調製、プルダウンアッセイにより選択された領域の濃縮、および二次的なユニバーサル増幅ステップを含み得る。一部の場合では、プルダウンアプローチを、ライゲーションに基づく方法と組み合わせて使用することができる。一部の場合では、方法は、配列特異的アダプターライゲーション（例えば、ＨＡＬＯＰＬＥＸ  ＰＣＲ、Ｈａｌｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を伴うビオチン化ウルトラマープルダウンを含み得る。例えば、そのようなアプローチは、制限酵素消化断片を捕捉するための選択子プローブの使用、その後の捕捉された産物のアダプターとのライゲーション、およびユニバーサル増幅、その後の配列決定を含み得る。一部の場合では、プルダウンアプローチを、伸長およびライゲーションに基づく方法と組み合わせて使用することができる。一部の場合では、方法は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）伸長およびライゲーションを含み得る。例えば、そのようなアプローチは、配列アダプターと組み合わせた分子反転プローブの使用、その後のユニバーサル増幅および配列決定を含み得る。一部の場合では、相補的ＤＮＡを合成し、増幅なしで配列決定することができる。
【０１８９】
一部の場合では、伸長およびライゲーションアプローチを、プルダウン成分なしで実施することができる。一部の場合では、方法は、遺伝子座特異的フォワードおよびリバースプライマーハイブリダイゼーション、伸長、ならびにライゲーションを含み得る。そのような方法は、増幅なしで、ユニバーサル増幅または相補的ＤＮＡ合成、その後の配列決定をさらに含み得る。そのような方法は、一部の場合では分析の間のバックグラウンド配列を低減させるかまたは除外することができる。
【０１９０】
一部の場合では、必要に応じた増幅成分と共にまたは増幅成分を伴わずに、プルダウンアプローチを使用することができる。一部の場合では、方法は、ユニバーサル増幅なしで捕捉プローブの完全な組み込みを伴う改変プルダウンアッセイおよびライゲーションを含み得る。例えば、そのようなアプローチは、制限酵素消化断片を捕捉するための改変選択子プローブの使用、その後の捕捉された産物のアダプターとのライゲーション、必要に応じた増幅、および配列決定を含み得る。一部の場合では、方法は、環状一本鎖ライゲーションと組み合わせたアダプター配列の伸長およびライゲーションを伴うビオチン化プルダウンアッセイを含み得る。例えば、そのようなアプローチは、目的の領域（すなわち、標的配列）を捕捉するための選択子プローブの使用、プローブの伸長、アダプターのライゲーション、一本鎖環状ライゲーション、必要に応じた増幅、および配列決定を含み得る。一部の場合では、配列決定結果の分析により、バックグラウンドから標的配列を分離することができる。
【０１９１】
一部の実施形態では、核酸を、本明細書に記載する１つまたは複数の配列に基づく分離方法を使用して選択ゲノム領域（例えば、染色体）から断片に関して濃縮する。配列に基づく分離は一般的に、目的の断片（例えば、標的および／または参照断片）に存在し、試料の他の断片には実質的に存在しないかまたは他の断片はごくわずかな量でしか存在しない（例えば、５％またはそれ未満）ヌクレオチド配列に基づく。一部の実施形態では、配列に基づく分離は、分離された標的断片および／または分離された参照断片を生成することができる。分離された標的断片および／または分離された参照断片を、通常、核酸試料中の残存する断片から単離し、取り出す。一部の場合では、分離された標的断片および分離された参照断片をまた、相互に単離し、取り出す（例えば、分離アッセイコンパートメントにおいて単離する）。一部の場合では、分離された標的断片および分離された参照断片を、一緒に単離する（例えば、同じアッセイコンパートメントにおいて単離する）。一部の実施形態では、未結合断片を、示差的に除去または分解または消化することができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、選択的核酸捕捉プロセスを使用して、核酸試料から、標的および／または参照断片を分離し、取り出す。市販の核酸捕捉システムとして、例えば、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢＥＡＤＡＲＲＡＹプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；および関連のプラットフォームが挙げられる。そのような方法は通常、標的または参照断片のヌクレオチド配列の部分またはすべてに対する捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み、固相（例えば、固相アレイ）および／または溶液に基づくプラットフォームの使用を含むことができる。選択されたゲノム領域または座位（例えば、第２１、１８、１３、ＸもしくはＹ染色体のうちの１つ、または参照の染色体）に由来する核酸断片に優先的にハイブリダイズするように、捕捉オリゴヌクレオチド（時には、「おとり」と呼ぶ）を、選択するかまたは設計することができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の、長さに基づく分離の方法を使用して、核酸を、特定の核酸断片の長さ、範囲の長さ、または特定の閾値もしくはカットオフを下回るもしくは上回る長さについて濃縮する。核酸断片の長さは通常、断片中のヌクレオチドの数を指す。また、核酸断片の長さは時には、核酸断片のサイズとも呼ぶ。一部の実施形態では、長さに基づく分離の方法を、個々の断片の長さを測定することなく実施する。一部の実施形態では、長さに基づく分離の方法を、個々の断片の長さを決定するための方法と併せて実施する。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、サイズ分画の手順を指し、分画されたプールの全部または一部を、単離（例えば、留保）および／または分析することができる。サイズ分画の手順は、当技術分野で公知である（例えば、アレイ上での分離、分子ふるいによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除カラム）による分離、およびマイクロ流体技術に基づくアプローチ）。一部の場合では、長さに基づく分離のアプローチとして、断片の環状化、化学物質による処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、質量分析、および／またはサイズに特異的な核酸増幅を挙げることができる。
【０１９４】
本明細書に記載する方法と共に使用することができるある特定の長さに基づく分離の方法は、例えば選択的配列タグ付けアプローチを使用する。そのような方法では、断片サイズ種（例えば、短い断片）核酸を、長いおよび短い核酸を含む試料中で選択的にタグ付けする。そのような方法は通常、インナープライマーおよびアウタープライマーを含むネステッドプライマーセットを使用して核酸増幅反応を実施することを含む。一部の場合では、インナーの１つまたは両方をタグ付けして、それによってタグを標的増幅産物上に導入することができる。アウタープライマーは一般的に、（インナー）標的配列を保持する短い断片にはアニーリングしない。インナープライマーは、短い断片にアニーリングし、タグおよび標的配列を保持する増幅産物を生成することができる。通常、長い断片のタグ付けは、例えばアウタープライマーの前回のアニーリングおよび伸長によるインナープライマーの伸長の阻止を含む機構の組合せを通して阻害される。タグ付けされた断片の濃縮は、例えば、一本鎖核酸のエキソヌクレアーゼ消化および少なくとも１つのタグに対して特異的な増幅プライマーを使用するタグ付け断片の増幅を含む種々の任意の方法によって達成することができる。
【０１９５】
本明細書に記載する方法と共に使用することができる別の長さに基づく分離の方法は、核酸試料をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿に供することを含む。方法の例としては、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４０４１７号およびＷＯ２０１０／１１５０１６号に記載される方法が挙げられる。この方法は一般的に、小さい（例えば、３００ヌクレオチド未満）核酸を実質的に沈殿させることなく、大きい核酸を実質的に沈殿させるために十分な条件下、１つまたは複数の一価の塩の存在下で核酸試料をＰＥＧと接触させることを伴う。
【０１９６】
本明細書に記載する方法と共に使用することができる別のサイズに基づく濃縮方法は、例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用するライゲーションによる環状化を含む。短い核酸断片は通常、長い断片よりも高い効率で環状化することができる。非環状化配列を、環状化配列から分離することができ、濃縮された短い断片をさらなる分析のために使用することができる。
【０１９７】
多型核酸標的を検出するためのアッセイ
一部の実施形態では、１つまたは複数の多型核酸標的を、当技術分野で公知の１つまたは複数のアッセイを使用して決定することができる。検出、定量化、配列決定等の方法の非限定的な例として、質量改変アンプリコン（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析およびエレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析）の質量検出、プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（商標）；Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．）、直接ＤＮＡシーケンシング、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの分子反転プローブ（ＭＩＰ）技術、制限断片長多型（ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、パイロシーケンシング分析、ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、ダイナミック対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレート色素、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシーケンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイミニシーケンシング、アレイドプライマー伸長（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長、Ｔａｇアレイ、コード化ミクロスフェア、ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、蛍光偏光、比色分析オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロックプローブ、インベーダーアッセイ、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識されたプローブを使用するハイブリダイゼーション、クローニングおよび配列決定、電気泳動、ハイブリダイゼーションプローブおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）の使用、デジタルＰＣＲ、ナノポアシーケンシング、チップ、ならびにそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、各増幅核酸種の量は、質量分析、プライマー伸長、配列決定（例えば、任意の適切な方法、例えばナノポアまたはパイロシーケンシング）、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲまたはＱＲＴ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、それらの組合せ等によって決定される。
【０１９８】
一部の実施形態では、アッセイは、本明細書に記載するように、配列決定反応である。配列決定、マッピング、および関連する分析方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照により組み込まれている米国特許出願公開第２００９／００２９３７７号）。そのようなプロセスのある特定の態様を、本明細書において以下に記載する。
【０１９９】
一部の実施形態では、レシピエント試料中のドナー特異的無細胞核酸の相対的存在量は、多型の部位の対立遺伝子（参照対立遺伝子および１つまたは複数の代替対立遺伝子）の各々に関して参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングしたユニークな配列の読取りの総数のパラメータとして決定することができる。一部の実施形態では、アッセイは高スループット配列決定である。一部の実施形態では、アッセイはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である。一部の実施形態では、アッセイはマイクロアレイ分析である。
【０２００】
一部の実施形態では、配列決定プロセスは、本明細書に記載するように合成による配列決定方法である。通常、合成による配列決定方法は、複数の合成サイクルを含み、それによって相補的ヌクレオチドが一本鎖鋳型に付加され、各サイクルの間に同定される。サイクル数は、一般的に読取りの長さに対応する。一部の場合では、多型標的は、増幅プライマー配列および多型標的部位（例えば、ＳＮＰ）を読取りに含めるために必要な読取りの長さが最小（すなわち、最少のサイクル数）となるように選択される。一部の場合では、増幅プライマー配列は、約１０〜約３０ヌクレオチドを含む。例えば、増幅プライマー配列は、一部の実施形態では、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９ヌクレオチドを含み得る。一部の場合では、増幅プライマー配列は、約２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＳＮＰ部位は、増幅プライマーの３’末端から１ヌクレオチド塩基の位置（すなわち、隣接する）〜約３０塩基の位置内に位置する。例えば、ＳＮＰ部位は、増幅プライマー末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９ヌクレオチド内であり得る。読取りの長さは、増幅プライマー配列および多型配列または位置を含む任意の長さであり得る。一部の実施形態では、読取りの長さは、約１０ヌクレオチドの長さ〜約５０ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、読取りの長さは、約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４５ヌクレオチドの長さであり得る。一部の場合では、読取りの長さは約３６ヌクレオチドである。一部の場合では、読取りの長さは約２７ヌクレオチドである。このように、一部の場合では、合成による配列決定方法は、約３６サイクルを含み、時には約２７サイクルを含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、複数の試料は、単一のコンパートメント（例えば、フローセル）において配列決定され、これは時には本明細書において試料の多重化と呼ばれる。このように、一部の実施形態では、ドナー特異的核酸フラクションは、多重化アッセイにおいて複数の試料に関して決定される。例えば、ドナー特異的核酸フラクションは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００個、またはそれより多くの試料に関して決定され得る。一部の場合では、ドナー特異的核酸フラクションは、約１０個またはそれより多くの試料に関して決定される。一部の場合では、ドナー特異的核酸フラクションは、約１００個またはそれより多くの試料に関して決定される。一部の場合では、ドナー特異的核酸フラクションは、約１０００個またはそれより多くの試料に関して決定される。
【０２０２】
通常、配列の読取りをモニタリングし、低品質の配列の読取りを除外するためにフィルタリングする。本明細書で使用する場合、用語「フィルタリング」は、データの部分またはデータセットを検討から除外すること、およびデータサブセットを保持することを指す。配列の読取りは、これらに限定されないが、重複するデータ（例えば、重複するまたはオーバーラップするマッピングされた読取り）、情報価値のないデータ、過大表示されているもしくは過小表示されている配列、ノイズの多いデータ等、または前述の組合せを含む、任意の適切な判断基準に基づく除去のために選択することができる。フィルタリングプロセスは、１つまたは複数の読取りおよび／または読取り対（例えば、不調和な読取り対）を検討から除外することを含むことが多い。読取り数、読取り対、および／または情報価値のあるＳＮＰの有無に関して分析したデータセットからの候補ＳＮＰを含む読取りを低減させることは、しばしば、データセットの複雑性および／または次元性を低減させ、時には情報価値のあるＳＮＰを検索および／または識別する速度を２桁またはそれより大きく増加させる。
【０２０３】
核酸検出および／または定量化はまた、例えば、ＰＣＲの間もしくは後に組み込まれる蛍光標識で蛍光標識された核酸の固体の支持体アレイに基づく検出、溶液中もしくは固相に捕捉された蛍光標識された分子の単一分子検出、または例えばＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴもしくはＭＩＳＥＱプラットフォームを使用する配列決定などの他の配列決定技術、または例えばＰＡＣＢＩＯシーケンサー、ＨＥＬＩＣＯＳシーケンサーなどの機器を使用する単一分子シーケンシング技術、またはナノポアシーケンシング技術を含み得る。
【０２０４】
一部の場合では、配列決定検出プロセスを含む方法によって生成された核酸定量化を、異なる検出プロセス（例えば、質量分析）を含む方法によって生成された核酸定量化と比較してもよい。そのような比較は、２つのアウトカム（例えば、核酸定量化）間の相関の測定値であるＲ２値を使用して表され得る。一部の場合では、核酸定量化（例えば、ドナーコピー数の定量化）は、異なる検出プロセス（例えば、配列決定および質量分析）を使用して生成された定量化に関して高度に相関する（すなわち、高いＲ２値を有する）。一部の場合では、異なる検出プロセスを使用して生成された核酸定量化に関するＲ２値は、約０．９０〜約１．０の間であり得る。例えば、Ｒ２値は、約０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９であり得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、多型核酸標的は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である。ＲＦＬＰ検出は、酵素で核酸を切断することよって実施しても、切断産物にハイブリダイズするプローブによって評価してもよく、このように、対立遺伝子に対応するユニークなサイズの制限断片を定義する。ＲＦＬＰを使用して、ドナー無細胞核酸を検出することができる。例示的な例として、ホモ接合性レシピエントが、ヘテロ接合性ドナーから移植を受けた後に、制限断片長多型プローブにハイブリダイズする特定の制限酵素によって生成された単一の断片のみを有する場合、レシピエントにおける無細胞核酸は、酵素によって生成された同じプローブにハイブリダイズする２つの異なるサイズの断片を有するであろう。したがって、ＲＦＬＰを検出することを使用して、ドナー特異的無細胞核酸の存在を同定することができる。
【０２０６】
ポリヌクレオチド配列決定のための技術もまた十分に確立されており、関連する研究分野において広く実践されている。例えば、ポリヌクレオチド配列決定の基本的原理および一般的技術は、分子生物学および組換え遺伝子学に関する様々な研究報告書および論文、例えば、Wallace  et  al.、前記；Sambrook  and  Russell、前記、およびAusubel  et  al.、前記に記載されている。研究所においてルーチン的に実践されるＤＮＡ配列決定方法を、手作業または自動のいずれかで、本技術を実践するために使用することができる。本技術の方法を実践するためにポリヌクレオチド配列の変化を検出するために適切な追加の手段としては、これらに限定されないが、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、および電気泳動が挙げられる。
【０２０７】
プライマー伸長反応の使用もまた、本明細書における技術の方法に適用することができる。プライマー伸長反応は、例えば、デオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの、ＳＮＰ部位に隣接する領域にハイブリダイズするプライマー伸長プライマーへの組み込みによってＳＮＰ対立遺伝子を識別することによって作動する。プライマーはポリメラーゼによって伸長する。プライマー伸長ＳＮＰは、質量分析によって、またはビオチンなどのタグ付け部分によって物理的に検出することができる。ＳＮＰ部位は、特定の標識によってタグ付けされるか、または特定の質量を有するプライマー伸長産物を生成する相補的デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドによってのみ伸長することから、ＳＮＰ対立遺伝子を識別および定量化することができる。
【０２０８】
逆転写および増幅される核酸は改変核酸であり得る。改変核酸は、ヌクレオチドアナログを含むことができ、ある特定の実施形態では、検出可能な標識および／または捕捉剤を含む。検出可能な標識の例には、これらに限定されないが、フルオロフォア、放射性同位元素、比色分析剤、発光剤、化学発光剤、光散乱剤、酵素等が挙げられる。捕捉剤の例としては、これらに限定されないが、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡまたはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応基／相補性化学反応基（例えば、スルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／イソトリオシアネート、アミン／スクシンイミジルエステル、およびアミン／ハロゲン化スルホニル）対等から選択される結合対に由来する作用物質が挙げられる。ある特定の実施形態では、捕捉剤を有する改変核酸を固体の支持体に固定化することができる。
【０２０９】
質量分析は、本明細書における技術のポリヌクレオチド、例えばＰＣＲアンプリコン、プライマー伸長産物、または標的核酸から切断される検出子プローブの検出のための特に有効な方法である。ポリヌクレオチド配列の存在は、検出されたシグナルの質量を目的のポリヌクレオチドの予想される質量と比較することによって検証される。特定のポリヌクレオチド配列に関する相対的シグナル強度、例えばスペクトル上の質量ピークは、特異的対立遺伝子の相対的集団を示し、このように、データから直接対立遺伝子比の計算を可能にする。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）標準ｉＰＬＥＸ（商標）アッセイおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用する遺伝子タイピング法の概要に関しては、その両方が参照により本明細書に組み込まれている、Jurinke,  C.,  Oeth,  P.,  van  den  Boom,  D.,  "MALDI-TOF  mass  spectrometry:  a  versatile  tool  for  high-performance  DNA  analysis."  Mol.  Biotechnol.  26,  147-164  (2004)；およびOeth,  P.  et  al.,  "iPLEXTM  Assay:  Increased  Plexing  Efficiency  and  Flexibility  for  MassARRAY(R)  System  through  single  base  primer  extension  with  mass-modified  Terminators."  SEQUENOM  Application  Note  (2005)を参照されたい。増幅プロセスの間に切断され、質量分析によって検出される切断可能な検出子プローブを使用して標的核酸を検出および定量化することの概要に関しては、参照により本明細書に組み込まれている、２００７年１２月４日に出願された米国特許出願第１１／９５０，３９５号を参照されたい。
【０２１０】
使用するために適切な種々の配列決定技術としては、これらに限定されないが、合成による配列決定、可逆性ターミネーターに基づく配列決定、４５４シーケンシング（Ｒｏｃｈｅ）（Margulies,  M.  et  al.  2005  Nature  437,  376-380）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））配列決定技術、ＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単一分子シーケンシング、化学物質感受性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイ、電子顕微鏡配列決定技術、デジタルＰＣＲ、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（またはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）またはＳＯＬｉＤシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ配列決定技術（Harris  T  D  et  al.  2008  Science,  320,  106-109）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ．ＴＭ．）技術、およびナノポアシーケンシング（Soni  GV  and  Meller  A.  2007  Clin  Chem  53:  1996-2001）が挙げられる。これらの方法の多くは、並行して高次多重化で検体から単離された多くの核酸分子の配列決定を可能にする（Dear  Brief  Funct  Genomic  Proteomic  2003;  1:  397-416）。
【０２１１】
核酸断片のクローン的に増大させたまたは非増幅単一分子の配列決定を可能にする多くの配列決定プラットフォームを、ドナー特異的無細胞核酸を検出するために使用することができる。ある特定のプラットフォームは、例えば、（ｉ）色素改変プローブのライゲーションによる配列決定（環状ライゲーションおよび切断を含む）、（ｉｉ）パイロシーケンシング、および（ｉｉｉ）単一分子シーケンシングを含む。ヌクレオチド配列種、増幅核酸種、およびそこから生成された検出可能な産物は、そのような配列分析プラットフォームによるヌクレオチド配列を分析する目的にとって「試験核酸」と考えることができる。
【０２１２】
ライゲーションによる配列決定は、塩基対形成ミスマッチに対するＤＮＡリガーゼの感受性に依存する核酸配列決定方法である。ＤＮＡリガーゼは、正確に塩基対形成されたＤＮＡの末端を一緒に接合する。ＤＮＡリガーゼが正確に塩基対形成したＤＮＡ末端のみを一緒に接合する能力を、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーの混合プールと組み合わせると、蛍光検出による配列決定が可能となる。標識同定後に切断することができる切断可能なリンカーを含有するプライマーを含めることによって、より長い配列の読取りを得ることができる。リンカーでの切断により、標識を除去し、ライゲーションしたプライマーの末端で５’リン酸塩を再生し、別のラウンドのライゲーションのためのプライマーを調製する。一部の実施形態では、プライマーを１つより多くの蛍光標識（例えば、１つの蛍光標識、２、３、または４つの蛍光標識）によって標識してもよい。
【０２１３】
ライゲーションによる配列決定に基づいて当業者が使用することができるシステムの例は、一般的に以下のステップを含む。クローン性のビーズ集団を、試験核酸（「鋳型」）、増幅反応成分、ビーズ、およびプライマーを含有するエマルジョンマイクロリアクターにおいて調製することができる。増幅後、鋳型を変性させ、ビーズの濃縮を実施して、伸長した鋳型を有するビーズを、望ましくないビーズ（例えば、伸長していない鋳型を有するビーズ）から分離する。選択されたビーズ上の鋳型は、３’改変を受けて、スライドへの共有結合が可能となり、改変ビーズをスライドガラス上に沈着させることができる。沈着チャンバーは、ビーズローディングプロセスの間にスライドを１つ、４つ、または８つのチャンバーにセグメント化する能力を提供する。配列分析に関して、プライマーはアダプター配列にハイブリダイズする。４色の色素標識されたプローブのセットは、配列決定プライマーに対するライゲーションに関して競合する。プローブライゲーションの特異性は、ライゲーションシリーズの間の４番目および５番目毎の塩基のインターロゲーションによって達成される。ライゲーション、検出、および切断の５〜７ラウンドは、５番目毎の位置で色を記録し、ラウンドの回数は使用するライブラリーのタイプによって決定される。各ラウンドのライゲーション後、５’方向に１塩基オフセットの新しい相補的プライマーを、別の一連のライゲーションのために置く。プライマーリセットおよびライゲーションラウンド（１ラウンドあたり５〜７ライゲーションサイクル）を連続５回繰り返して、単一のタグに関して配列２５〜３５塩基対を生成する。メイトペアードシーケンシングでは、このプロセスを、第２のタグに関して繰り返す。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載するプロセスによって、例えば、異種核酸を本明細書に記載するプロセスによって生成された第１の増幅産物にライゲーションすること、および第１の増幅産物を生成するために最初に使用した同じまたは異なる固体の支持体を使用してエマルジョン増幅を実施することによって、生成された増幅産物を指数関数的に増幅することができる。そのようなシステムをまた使用して、指数関数的増幅プロセスを迂回すること、およびスライドガラス上で本明細書に記載する固体の支持体を直接選別することによって、本明細書に記載するプロセスによって直接生成された増幅産物を分析することができる。
【０２１４】
パイロシーケンシングは、ヌクレオチド組み込み時に放出されたピロリン酸の検出に依存する、合成による配列決定に基づく核酸配列決定方法である。一般的に合成による配列決定は、一度に１つのヌクレオチド、その配列が求められる鎖と相補的であるＤＮＡ鎖を合成することを含む。試験核酸を、固体の支持体に固定化し、配列決定プライマーとハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸（phosphsulfate）、およびルシフェリンと共にインキュベートしてもよい。ヌクレオチド溶液を逐次的に添加し、除去する。ヌクレオチドの正確な組み込みにより、ピロリン酸が放出され、これは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼと相互作用し、ＡＴＰを産生し、ルシフェリン反応を刺激し、化学発光シグナルを産生し、配列決定を可能にする。
【０２１５】
パイロシーケンシングに基づいて当業者が使用することができるシステムの例は、一般的に以下のステップ：アダプター核酸を試験核酸にライゲーションし、試験核酸をビーズにハイブリダイズさせるステップ；試験核酸中のヌクレオチド配列をエマルジョン中で増幅するステップ；ピコリットルマルチウェル固体の支持体を使用してビーズを選別するステップ；および増幅されたヌクレオチド配列を、パイロシーケンシング方法論を使用して配列決定するステップ（例えば、Nakano  et  al.,  "Single-molecule  PCR  using  water-in-oil  emulsion;"  Journal  of  Biotechnology  102:  117-124  (2003)）を含む。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載するプロセスによって、例えば本明細書に記載するプロセスによって生成された第１の増幅産物に異種核酸をライゲーションすることによって、生成された増幅産物を指数関数的に増幅することができる。
【０２１６】
ある特定の単一分子シーケンシング実施形態は、合成による配列決定の原理に基づき、一分子型蛍光共鳴エネルギー移動（一分子型ＦＲＥＴ）を、それによってヌクレオチド組み込み成功の結果として光子が放出される機構として利用する。放出された光子は、全内部反射顕微鏡（ＴＩＲＭ）と併せて強化または高感度冷却型電荷結合素子を使用して検出されることが多い。光子は、配列決定プロセスの結果として合成された成長しつつある核酸鎖への組み込みのために、導入された反応溶液が正確なヌクレオチドを含有する場合に限って放出される。ＦＲＥＴに基づく単一分子シーケンシングの場合、エネルギーは２つの蛍光色素、時にはポリメチンシアニン色素Ｃｙ３およびＣｙ５の間をロングレンジ双極子相互作用を通して移動する。ドナーは、その特異的励起波長で励起され、励起状態エネルギーが非放射性にアクセプター色素へと移動し、次に励起される。アクセプター色素は最終的に、光子の放射放出によって基底状態に戻る。エネルギー移動プロセスにおいて使用される２つの色素は、一分子型ＦＲＥＴにおいて「一分子」を表す。Ｃｙ３はドナーフルオロフォアとして使用されることが多く、第１の標識されたヌクレオチドとして組み込まれることが多い。Ｃｙ５はアクセプターフルオロフォアとして使用されることが多く、第１のＣｙ３標識されたヌクレオチドの組み込み後の連続するヌクレオチド付加のためのヌクレオチド標識として使用される。フルオロフォアは一般的に、エネルギー移動が首尾よく起こるために、各々の１０ナノメートル以内に存在する。
【０２１７】
単一分子シーケンシングに基づいて使用することができるシステムの例は、一般的にプライマーを試験核酸にハイブリダイズさせて複合体を生成すること；複合体を固相に会合させること；蛍光分子によってタグを付けたヌクレオチドによってプライマーを繰り返し伸長させること；および各繰り返し後の蛍光共鳴エネルギー移動シグナルの画像を捕捉することを含む（例えば、米国特許第７，１６９，３１４号；Braslavsky  et  al.,  PNAS  100(7):  3960-3964  (2003)を参照されたい）。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載するプロセスによって生成された増幅産物を直接配列決定することができる。一部の実施形態では、放出された線形増幅産物を、例えば固体の支持体、ビーズまたはスライドガラス上に存在する固定化された捕捉配列と相補的な配列を含有するプライマーにハイブリダイズさせることができる。プライマー−放出された線形増幅産物複合体と固定化された捕捉配列とのハイブリダイゼーションにより、放出された線形増幅産物は、一分子型ＦＲＥＴに基づく合成による配列決定のために固体の支持体に固定化される。プライマーは、固定化された核酸を有するスライドの表面の最初の参照画像を生成することができるように蛍光であることが多い。最初の参照画像は、真のヌクレオチド組み込みが起こっている位置を決定するために有用である。「プライマーのみ」の参照画像において最初に同定されなかったアレイの位置において検出された蛍光シグナルは、非特異的蛍光として廃棄する。プライマー−放出された線形増幅産物複合体の固定化後、結合した核酸は、ａ）１つの蛍光標識されたヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼ伸長、ｂ）適切な顕微鏡、例えばＴＩＲＭを使用する蛍光の検出、ｃ）蛍光ヌクレオチドの除去、およびｄ）異なる蛍光標識されたヌクレオチドによってステップａに戻ること、の繰り返しステップによって並行して配列決定されることが多い。
【０２１８】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列決定は、固相単一ヌクレオチドシーケンシング方法およびプロセスによるものであり得る。固相単一ヌクレオチドシーケンシング方法は、試料核酸および固体の支持体を、試料核酸の単一分子が固体の支持体の単一分子にハイブリダイズする条件下で接触させることを含む。そのような条件は、固体の支持体分子および試料核酸の単一分子を「マイクロリアクター」に提供することを含み得る。そのような条件はまた、試料核酸分子が固体の支持体上の固相核酸にハイブリダイズすることができる混合物を提供することを含み得る。本明細書に記載する実施形態において有用な単一ヌクレオチドシーケンシング方法は、２００８年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／０２１，８７１号に記載されている。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、ナノポアシーケンシング検出法は、（ａ）配列決定のための核酸（「基本核酸」、例えば連結したプローブ分子）を配列特異的検出子と、検出子が基本核酸の実質的に相補的なサブ配列に特異的にハイブリダイズする条件下で接触させるステップと、（ｂ）検出子からシグナルを検出するステップと、（ｃ）検出されたシグナルに従って基本核酸の配列を決定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、基本核酸にハイブリダイズした検出子は、基本核酸がポアの中を通過する際に検出子がナノポア構造と干渉すると基本核酸から解離し（例えば、逐次的に解離している）、基本配列から解離した検出子が検出される。一部の実施形態では、基本核酸から解離した検出子は、検出可能なシグナルを放出し、基本核酸にハイブリダイズした検出子は、異なる検出可能なシグナルを放出するか、または検出可能なシグナルを放出しない。ある特定の実施形態では、核酸（例えば連結したプローブ分子）中のヌクレオチドは、特異的ヌクレオチド（「ヌクレオチドの代表」）に対応する特異的ヌクレオチド配列に置換され、それによって増大した核酸を生じ（例えば、米国特許第６，７２３，５１３号）、検出子は増大した核酸中でヌクレオチドの代表にハイブリダイズし、これは基本核酸として役立つ。そのような実施形態では、ヌクレオチドの代表は、バイナリまたはより高次の配置で配置され得る（例えば、Soni  and  Meller,  Clinical  Chemistry  53(11):  1996-2001  (2007)）。一部の実施形態では、核酸は増大せず、増大した核酸を生じず、基本核酸として直接役立ち（例えば、連結したプローブ分子は非増大の基本核酸として役立つ）、検出子は基本核酸と直接接触する。例えば、第１の検出子は第１のサブ配列にハイブリダイズしてもよく、第２の検出子は第２のサブ配列にハイブリダイズしてもよく、第１の検出子および第２の検出子は各々が互いに区別され得る検出可能な標識を有し、第１の検出子および第２の検出子からのシグナルは、検出子が基本核酸から解離すると互いに区別することができる。ある特定の実施形態では、検出子は、基本核酸にハイブリダイズする領域（例えば、２つの領域）を含み、これは約３〜約１００ヌクレオチドの長さ（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチドの長さ）であり得る。検出子はまた、基本核酸にハイブリダイズしないヌクレオチドの１つまたは複数の領域を含み得る。一部の実施形態では、検出子は、分子ビーコンである。検出子は、本明細書に記載する標識から独立して選択される１つまたは複数の検出可能な標識を含むことが多い。各検出可能な標識は、各標識によって生成されるシグナル（例えば、磁気、電気、化学、光学等）を検出することが可能な任意の簡便な検出プロセスによって検出することができる。例えば、ＣＤカメラを使用して検出子に連結された１つまたは複数の区別可能な量子ドットからのシグナルを検出することができる。
【０２２０】
ある特定の配列分析実施形態では、読取りを使用してより大きいヌクレオチド配列を構築してもよく、これは異なる読取りにおけるオーバーラップする配列を同定することによって、および読取りにおける同定配列を使用することによって促進することができる。そのような配列分析方法および読取りからより大きい配列を構築するためのソフトウェアは、当業者に公知である（例えば、Venter  et  al.,  Science  291:  1304-1351  (2001)）。ある特定の配列分析実施形態では、特定の読取り、部分的ヌクレオチド配列構築物、および完全なヌクレオチド配列構築物を、試料核酸内のヌクレオチド配列間で比較してもよく（すなわち、内部比較）、または参照配列と比較してもよい（すなわち、参照比較）。内部比較は時には、試料核酸が、複数試料からまたは配列変動を含有する単一試料供給源から調製される状況で実施される。参照比較は時には、参照ヌクレオチド配列が既知であり、目的が、試料核酸が参照ヌクレオチド配列と実質的に同様のもしくは同じ、または異なるヌクレオチド配列を含有するか否かを決定することである場合に実施される。配列分析は、当業者に公知の配列分析装置および成分によって促進される。
【０２２１】
本明細書において提供される方法は、複数の核酸中の核酸種（例えば、ヌクレオチド配列種、増幅された核酸種、および前述から生成された検出可能な産物）の高スループット検出を可能にする。多重化は、１つより多くの核酸種の同時検出を指す。質量分析と併せて多重化反応を実施するための一般的な方法は公知である（例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、第５，５４７，８３５号、および国際特許出願公開番号ＷＯ９７／３７０４１号を参照されたい）。多重化は、各々の個々の標的核酸種に関して異なる質量分析の解析を実施しなければならない場合と比較して、複数の核酸種（例えば、一部は異なる配列の変動を有する）を１回という少ない質量スペクトルで同定することができるという利点を提供する。本明細書において提供される方法は、一部の実施形態では、配列の変動を高速かつ正確に分析するための高スループットの高度に自動化されたプロセスに適している。一部の実施形態では、本明細書における方法は、単一の反応において高レベルで多重化され得る。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、多重化される核酸種の数としては、これらに限定されないが、約１〜約５００（例えば、約１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１１、１１〜１３、１３〜１５、１５〜１７、１７〜１９、１９〜２１、２１〜２３、２３〜２５、２５〜２７、２７〜２９、２９〜３１、３１〜３３、３３〜３５、３５〜３７、３７〜３９、３９〜４１、４１〜４３、４３〜４５、４５〜４７、４７〜４９、４９〜５１、５１〜５３、５３〜５５、５５〜５７、５７〜５９、５９〜６１、６１〜６３、６３〜６５、６５〜６７、６７〜６９、６９〜７１、７１〜７３、７３〜７５、７５〜７７、７７〜７９、７９〜８１、８１〜８３、８３〜８５、８５〜８７、８７〜８９、８９〜９１、９１〜９３、９３〜９５、９５〜９７、９７〜１０１、１０１〜１０３、１０３〜１０５、１０５〜１０７、１０７〜１０９、１０９〜１１１、１１１〜１１３、１１３〜１１５、１１５〜１１７、１１７〜１１９、１２１〜１２３、１２３〜１２５、１２５〜１２７、１２７〜１２９、１２９〜１３１、１３１〜１３３、１３３〜１３５、１３５〜１３７、１３７〜１３９、１３９〜１４１、１４１〜１４３、１４３〜１４５、１４５〜１４７、１４７〜１４９、１４９〜１５１、１５１〜１５３、１５３〜１５５、１５５〜１５７、１５７〜１５９、１５９〜１６１、１６１〜１６３、１６３〜１６５、１６５〜１６７、１６７〜１６９、１６９〜１７１、１７１〜１７３、１７３〜１７５、１７５〜１７７、１７７〜１７９、１７９〜１８１、１８１〜１８３、１８３〜１８５、１８５〜１８７、１８７〜１８９、１８９〜１９１、１９１〜１９３、１９３〜１９５、１９５〜１９７、１９７〜１９９、１９９〜２０１、２０１〜２０３、２０３〜２０５、２０５〜２０７、２０７〜２０９、２０９〜２１１、２１１〜２１３、２１３〜２１５、２１５〜２１７、２１７〜２１９、２１９〜２２１、２２１〜２２３、２２３〜２２５、２２５〜２２７、２２７〜２２９、２２９〜２３１、２３１〜２３３、２３３〜２３５、２３５〜２３７、２３７〜２３９、２３９〜２４１、２４１〜２４３、２４３〜２４５、２４５〜２４７、２４７〜２４９、２４９〜２５１、２５１〜２５３、２５３〜２５５、２５５〜２５７、２５７〜２５９、２５９〜２６１、２６１〜２６３、２６３〜２６５、２６５〜２６７、２６７〜２６９、２６９〜２７１、２７１〜２７３、２７３〜２７５、２７５〜２７７、２７７〜２７９、２７９〜２８１、２８１〜２８３、２８３〜２８５、２８５〜２８７、２８７〜２８９、２８９〜２９１、２９１〜２９３、２９３〜２９５、２９５〜２９７、２９７〜２９９、２９９〜３０１、３０１〜３０３、３０３〜３０５、３０５〜３０７、３０７〜３０９、３０９〜３１１、３１１〜３１３、３１３〜３１５、３１５〜３１７、３１７〜３１９、３１９〜３２１、３２１〜３２３、３２３〜３２５、３２５〜３２７、３２７〜３２９、３２９〜３３１、３３１〜３３３、３３３〜３３５、３３５〜３３７、３３７〜３３９、３３９〜３４１、３４１〜３４３、３４３〜３４５、３４５〜３４７、３４７〜３４９、３４９〜３５１、３５１〜３５３、３５３〜３５５、３５５〜３５７、３５７〜３５９、３５９〜３６１、３６１〜３６３、３６３〜３６５、３６５〜３６７、３６７〜３６９、３６９〜３７１、３７１〜３７３、３７３〜３７５、３７５〜３７７、３７７〜３７９、３７９〜３８１、３８１〜３８３、３８３〜３８５、３８５〜３８７、３８７〜３８９、３８９〜３９１、３９１〜３９３、３９３〜３９５、３９５〜３９７、３９７〜４０１、４０１〜４０３、４０３〜４０５、４０５〜４０７、４０７〜４０９、４０９〜４１１、４１１〜４１３、４１３〜４１５、４１５〜４１７、４１７〜４１９、４１９〜４２１、４２１〜４２３、４２３〜４２５、４２５〜４２７、４２７〜４２９、４２９〜４３１、４３１〜４３３、４３３〜４３５、４３５〜４３７、４３７〜４３９、４３９〜４４１、４４１〜４４３、４４３〜４４５、４４５〜４４７、４４７〜４４９、４４９〜４５１、４５１〜４５３、４５３〜４５５、４５５〜４５７、４５７〜４５９、４５９〜４６１、４６１〜４６３、４６３〜４６５、４６５〜４６７、４６７〜４６９、４６９〜４７１、４７１〜４７３、４７３〜４７５、４７５〜４７７、４７７〜４７９、４７９〜４８１、４８１〜４８３、４８３〜４８５、４８５〜４８７、４８７〜４８９、４８９〜４９１、４９１〜４９３、４９３〜４９５、４９５〜４９７、４９７〜５０１）が挙げられる。
【０２２３】
多重化アッセイによって分解した質量スペクトルを達成するための設計方法は、プライマーおよびオリゴヌクレオチド設計方法および反応設計方法を含み得る。多重化アッセイにおけるプライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計に関して、プライマーの設計に関して同じ一般的ガイドライン、例えば偽プライミングおよびプライマー二量体を回避することが、一重化反応についても当てはまり、多重化反応ではより多くのプライマーのみが含まれる。質量分析適用に関して、１つのアッセイに関する質量スペクトル中の分析対象ピークは、休止ピークおよび他の任意の副産物ピークを含む、そのアッセイが多重化される任意のアッセイの産物から十分に分解される。同様に、分析対象ピークは最適には、ユーザーが指定した質量ウィンドウ内に、例えば５，０００〜８，５００Ｄａの範囲内に入る。一部の実施形態では、多重分析を、例えば染色体異常の質量分析検出に適合させてもよい。ある特定の実施形態では、多重分析を、本明細書に記載する様々な単一ヌクレオチドまたはナノポアに基づく配列決定方法に適合させてもよい。商業生産されたマイクロ反応チャンバーまたはデバイスまたはアレイまたはチップを使用して、多重分析を促進することができ、これらは市販されている。
【０２２４】
ヌクレオチド配列の読取りを得るための追加の方法
一部の実施形態では、１つの個体からの１つの核酸試料を配列決定する。ある特定の実施形態では、各生体試料が１つの個体または２つもしくはそれより多くの個体に由来する２つまたはそれより多くの生体試料からの核酸試料をプールし、プールを配列決定する。後者の実施形態では、各生体試料由来の核酸試料は、１つまたは複数のユニークな同定タグによって同定されることが多い。
【０２２５】
一部の実施形態では、ゲノムのフラクションが配列決定され、これは時には決定されたヌクレオチド配列によってカバーされるゲノムの量として表される（例えば、１未満のカバレッジ「倍率」）。ゲノムが約１倍のカバレッジで配列決定される場合、ゲノムのヌクレオチド配列のおおよそ１００％が読取りにより表示される。ゲノムはまた、冗長性をもたせて配列決定することができ、この場合、ゲノムの所与の領域を、２つもしくはそれより多くの読取りまたはオーバーラップする読取りがカバーすることができる（例えば、１より大きいカバレッジ「倍率」）。一部の実施形態では、ゲノムを、約０．１倍〜約１００倍カバレッジ、約０．２倍〜２０倍カバレッジ、または約０．２倍〜約１倍カバレッジ（例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍カバレッジ）で配列決定する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、１回のランにおいて配列決定される核酸プールのフラクションを、配列決定の前にさらに副選択する。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づく技術（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用する）を使用して、ある特定の染色体（例えば、可能性がある異数性染色体および試験する異数性に関係しない他の染色体）由来の核酸配列に関して最初に副選択することができる。一部の実施形態では、核酸を、サイズによって分画し（例えば、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーによって、またはマイクロ流体に基づくアプローチによって）、ある特定の例では、ドナー特異的核酸を、より低い分子量を有する核酸（例えば、３００塩基対未満、２００塩基対未満、１５０塩基対未満、１００塩基対未満）に関して選択することによって濃縮することができる。一部の実施形態では、ドナー特異的核酸を、ホルムアルデヒドの添加などによってレシピエントバックグラウンドの核酸を抑制することによって濃縮することができる。一部の実施形態では、予め選択した核酸のプールの部分またはサブセットをランダムに配列決定する。一部の実施形態では、配列決定の前に核酸を増幅する。一部の実施形態では、配列決定の前に核酸の部分またはサブセットを増幅する。
【０２２７】
一部の場合では、配列決定ライブラリーを、配列決定プロセスの前または間に調製する。配列決定ライブラリーを調製するための方法は当技術分野で公知であり、市販のプラットフォームをある特定の適用のために使用してもよい。ある特定の市販のライブラリープラットフォームは、本明細書に記載するある特定のヌクレオチド配列決定プロセスと適合性であり得る。例えば、１つまたは複数の市販のライブラリープラットフォームは、合成による配列決定プロセスと適合性であり得る。一部の場合では、ライゲーションに基づくライブラリー調製方法を使用する（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＴＲＵＳＥＱ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）。ライゲーションに基づくライブラリー調製方法は、通常、最初のライゲーションステップでインデックス配列を組み込むことができるメチル化アダプター設計を使用し、しばしば単一読取りシーケンシング、ペアードエンドシーケンシング、および多重化シーケンシングのための試料を調製するために使用することができる。一部の場合では、トランスポゾンに基づくライブラリー調製方法を使用する（例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  ＮＥＸＴＥＲＡ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。トランスポゾンに基づく方法は通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転位を使用して、単一チューブ中での反応においてＤＮＡの断片化およびタグ付けを同時に行い（しばしば、プラットフォームに特異的なタグおよび必要に応じたバーコードの組み込みを可能にする）、シーケンサーで使用することができるライブラリーを調製する。
【０２２８】
本明細書に記載する方法を実施するために適切な任意の配列決定方法を利用することができる。一部の実施形態では、高スループット配列決定方法を使用する。高スループット配列決定方法は一般的に、フローセル内で大量に並行して配列決定されたクローン的に増幅されたＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を含む（例えば、Metzker  M  Nature  Rev  11:31-46  (2010);Volkerding  et  al.  Clin  Chem  55:641-658  (2009)に記載されるように）。そのような配列決定方法はまた、デジタルの定量的情報を提供することができ、各配列の読取りは、個々のクローン的なＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を表す計数可能な「配列タグ」または「カウント」である。高スループット配列決定技術としては、例えば、可逆的ダイターミネーターによる合成による配列決定、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによる配列決定、パイロシーケンシング、およびリアルタイム配列決定が挙げられる。
【０２２９】
高スループット配列決定方法のために利用されるシステムは市販されており、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬＩＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ配列決定技術、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．のハイブリダイゼーションによる配列決定プラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、およびＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの合成による配列決定プラットフォーム、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのライゲーションによる配列決定プラットフォームが挙げられる。Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ技術およびナノポアシーケンシングもまた、高スループット配列決定アプローチにおいて使用することができる。
【０２３０】
一部の実施形態では、第一世代の技術、例えば、自動化サンガー配列決定を含むサンガー配列決定などを本明細書において提供される方法において使用することができる。開発中の核酸の撮像技術（例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））の使用を含む追加の配列決定技術も本明細書において企図される。様々な配列決定技術の例を以下に記載する。
【０２３１】
配列の読取りの長さは、特定の配列決定技術に関連することが多い。例えば、高スループット方法は、塩基対（ｂｐ）のサイズが数十から数百まで変化し得る配列の読取りを提供する。例えば、ナノポアシーケンシングは、塩基対のサイズが数何十から数百、数千まで変化し得る配列の読取りを提供することができる。一部の実施形態では、配列の読取りは、約１５ｂｐ〜９００ｂｐ長（例えば、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、または約５００ｂｐ）の平均、中央値、または平均の長さのものである。一部の実施形態では、配列の読取りは、約１０００ｂｐまたはそれより多くの平均、中央値、または平均の長さのものである。
【０２３２】
一部の実施形態では、核酸は、蛍光シグナルまたは配列タグ情報を含み得る。シグナルまたはタグの定量化を、多様な技術、例えば、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、遺伝子チップ分析、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光測定法による分析、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、レーザー走査細胞数測定、親和性クロマトグラフィー、手作業バッチモードによる分離、電場懸濁、配列決定、およびそれらの組合せなどにおいて使用してもよい。
【０２３３】
アダプター
一部の実施形態では、核酸（例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲアンプリコン、試料核酸）は、アダプター配列および／またはその相補体を含み得る。アダプター配列はしばしば、ある特定の配列決定方法、例えば本明細書に記載する合成による配列決定プロセスなどにとって有用である。アダプターは時には、配列決定アダプターまたはアダプターオリゴヌクレオチドと呼ばれる。アダプター配列は通常、固体の支持体（例えば、フローセル）へのつなぎにとって有用な１つまたは複数の部位を含む。アダプターはまた、配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位（すなわち、配列決定反応において使用されるプライマーに対して相補的な配列）および以下に記載される識別子（例えば、インデックス）を含み得る。アダプター配列は、核酸の５’および／または３’末端に位置することができ、時にはより大きい核酸配列内に位置することができる。アダプターは、任意の長さおよび任意の配列であり得、アダプターの設計に関する当技術分野の標準的な方法に基づいて選択してもよい。
【０２３４】
１つまたは複数のアダプターオリゴヌクレオチドを、アダプター配列を核酸に組み込むために適切な任意の方法によって核酸（例えば、ＰＣＲアンプリコン）に組み込むことができる。例えば、ＰＣＲアンプリコン（すなわち、増幅産物）を生成するために使用されるＰＣＲプライマーは、アダプター配列またはその相補体を含み得る。このように、１つまたは複数のアダプター配列を含むＰＣＲアンプリコンを、増幅プロセスの間に生成することができる。一部の場合では、１つまたは複数のアダプター配列を、アダプター配列を核酸につなぐために適切な任意のライゲーション方法によって、核酸（例えば、ＰＣＲアンプリコン）にライゲーションすることができる。ライゲーションプロセスは、例えば、平滑末端ライゲーション、増幅プロセスの間にＴａｑポリメラーゼによって生成された３’アデノシン（Ａ）オーバーハングおよび３’チミン（Ｔ）オーバーハングを有するライゲートアダプターを活用するライゲーション、ならびに他の「付着末端」ライゲーションを含み得る。ライゲーションプロセスは、アダプター配列が核酸の各末端にハイブリダイズするが、互いとはハイブリダイズしないように最適化することができる。
【０２３５】
一部の場合では、アダプターライゲーションは、二方向性であり、このことは、核酸の両方の末端がその後の配列決定プロセスにおいて配列決定されるように、アダプター配列が核酸につながれることを意味する。一部の場合では、アダプターライゲーションは、単方向性であり、このことは、核酸の１つの末端がその後の配列決定プロセスにおいて配列決定されるように、アダプター配列が核酸につながれることを意味する。単方向性および二方向性のライゲーションスキームの例は、その全開示が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１７００５８３５０号に記載される通りである。
【０２３６】
識別子
一部の実施形態では、核酸（例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲアンプリコン、試料核酸、配列決定アダプター）は識別子を含み得る。一部の場合では、識別子は、アダプター配列内またはそれに隣接して位置する。識別子は、核酸標的配列の特定の起源または態様を同定することができる任意の特徴であり得る。例えば、識別子（例えば、試料識別子）は、特定の核酸標的配列が由来する試料を同定することができる。別の例では、識別子（例えば、試料アリコート識別子）は、特定の核酸標的配列が由来する試料アリコートを同定することができる。別の例では、識別子（例えば、染色体識別子）は、特定の核酸標的配列が由来する染色体を同定することができる。識別子は、本明細書においてタグ、インデックス、バーコード、同定タグ、インデックスプライマー等と呼ばれ得る。識別子は、ヌクレオチドのユニークな配列（例えば、配列に基づく識別子）、検出可能な標識、例えば以下に記載する標識（例えば、識別子標識）、および／または特定の長さのポリヌクレオチド（例えば、長さに基づく識別子；サイズに基づく識別子）、例えばスタッファー配列であり得る。試料のコレクションまたは複数の染色体の識別子は例えば、各々ヌクレオチドのユニークな配列を含み得る。識別子（例えば、配列に基づく識別子、長さに基づく識別子）は、ある特定の標的ゲノム配列を他の標的ゲノム配列と区別するために適切な任意の長さの識別子であり得る。一部の実施形態では、識別子は、約１〜約１００ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、識別子は、独立して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、識別子は、６ヌクレオチドの配列を含有する。一部の場合では、識別子は、配列決定プロセス、例えば本明細書においてさらに詳細に記載する合成による配列決定プロセスなどのためのアダプター配列の一部である。一部の場合では、識別子は、単一のヌクレオチドの反復配列（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣ）であり得る。そのような識別子は、例えば本明細書に記載するように、ナノポア技術を使用して検出され、互いに区別され得る。
【０２３７】
一部の実施形態では、分析は、識別子を分析すること（例えば、検出すること、計数すること、カウントを処理すること等）を含む。一部の実施形態では、検出プロセスは、識別子を検出すること、および時には核酸の他の特徴（例えば、配列）を検出しないことを含む。一部の実施形態では、計数するプロセスは、各識別子を計数することを含む。一部の実施形態では、識別子は、検出され、分析され、および／または計数される核酸の唯一の特徴である。
【０２３８】
データの処理および正規化
一部の実施形態では、多型核酸標的の量を表すために使用される配列の読取りのデータを、さらに処理し（例えば、数学的および／または統計学的に操作し）、かつ／または示して、アウトカムを得るのを促進することができる。ある特定の実施形態では、より大きいデータセットを含むデータセットは、さらなる分析を促進するために、前処理が役立つ場合がある。データセットの前処理は時には、重複し、かつ／または情報価値のない部分または参照ゲノムの部分（例えば、情報価値のないデータを有する参照ゲノムの部分、重複するマッピングされた読取り、カウント数の中央値がゼロである部分、過大表示されているまたは過小表示されている配列）の除去を含む。理論により制限されることなく、データの処理および／または前処理は、（ｉ）ノイズの多いデータを除去し、（ｉｉ）情報価値のないデータを除去し、（ｉｉｉ）重複するデータを除去し、（ｉｖ）より大きいデータセットの複雑性を低下させ、かつ／または（ｖ）データの１つの形態から１つもしくは複数の他の形態への転換を促進することができる。本明細書では、用語「前処理」および「処理」は、データまたはデータセットに関して利用する場合には、まとめて「処理」と呼ぶ。処理によって、データにさらなる分析を容易に行うことができ、一部の実施形態では、アウトカムをもたらすことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数またはすべての処理方法（例えば、正規化の方法、部分的フィルタリング、マッピング、妥当性確認等、またはそれらの組合せ）が、メモリと併せたプロセッサ、マイクロプロセッサ、コンピュータにより、かつ／またはマイクロプロセッサが制御する装置により実施される。
【０２３９】
用語「ノイズの多いデータ」は、本明細書で使用する場合、（ａ）分析またはプロットした場合にデータ点間に顕著な分散を示すデータ、（ｂ）顕著な標準偏差を有する（例えば、３標準偏差よりも大きい）データ、（ｃ）平均の顕著な標準誤差を有するデータ等、および上記の組合せを指す。ノイズの多いデータは、時には出発物質（例えば、核酸試料）の分量および／または品質に起因して発生し、時には配列の読取りを得るために使用するＤＮＡを調製または複製するための処理の一部から発生する。特定の実施形態では、ノイズは、ＰＣＲに基づく方法を使用して調製する場合の、過大表示されている特定の配列から生じる。本明細書に記載する方法は、ノイズの多いデータの寄与を低下させるまたは排除することができ、したがって、ノイズの多いデータの、得られたアウトカムに対する作用を低下させる。
【０２４０】
用語「情報を与えないデータ」、「情報を与えない、参照ゲノムの部分」、および「情報を与えない部分」は、本明細書で使用する場合、所定の閾値の値とは顕著に異なる数値、または値のあらかじめ定義された値の限界範囲の外側に存在する数値を有する部分、またはそこから誘導されたデータを指す。用語「閾値」および「閾値の値」は、本明細書では、適格なデータセットを使用して計算される任意の数を指し、遺伝子の変動または遺伝子の変更（例えば、コピー数の変更、異数性、微小重複、微小欠失、染色体異常等）の診断の限界として役立つ。特定の実施形態では、本明細書に記載する方法により得られた結果が閾値を上回り、対象が、コピー数の変更を有すると診断される。一部の実施形態では、閾値の値または値の範囲はしばしば、（例えば、参照および／または対象から得られた）配列の読取りのデータを数学的および／または統計学的に操作することによって計算され、特定の実施形態では、閾値の値または値の範囲を得るために操作される配列の読取りのデータは、（例えば、参照および／または対象から得られた）配列の読取りのデータである。一部の実施形態では、不確実性の値を決定する。不確実性の値は、一般に分散または誤差の尺度であり、分散または誤差の任意の適切な尺度であってよい。一部の実施形態では、不確実性の値は、標準偏差、標準誤差、計算した分散、ｐ値または平均絶対偏差（ＭＡＤ）である。一部の実施形態では、不確実性の値を、本明細書に記載する方式に従って計算することができる。
【０２４１】
本明細書に記載するデータセットを処理するために、任意の適切な手順を利用することができる。データセットを処理するために使用するのに適切な手順の非限定的な例として、フィルターをかけること、正規化すること、加重すること、ピークの高さをモニタリングすること、ピークの面積をモニタリングすること、ピークのエッジをモニタリングすること、ピークレベル分析、ピーク幅分析、ピークエッジ位置分析、ピーク横許容範囲（ｐｅａｋ  ｌａｔｅｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、面積比を決定すること、データを数学的に処理すること、データを統計学的に処理すること、統計学的アルゴリズムを適用すること、一定の変数を用いて分析すること、最適化された変数を用いて分析すること、データをプロットし、パターンまたは傾向を識別して、さらなる処理を行うこと等、および上記の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、種々の特徴（例えば、ＧＣ含有量、重複する、マッピングされた読取り、セントロメア領域、テロメア領域等、およびそれらの組合せ）、ならびに／または変数（例えば、対象の性、対象の年齢、対象の倍数性、がん細胞核酸のパーセント寄与、胎仔の性別、母体の年齢、母体の倍数性、胎仔核酸のパーセント寄与等、またはそれらの組合せ）に基づいて、データセットは処理される。特定の実施形態では、本明細書の記載に従ってデータセットを処理することによって、大きいおよび／または複雑なデータセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。複雑なデータセットの非限定的な例として、異なる年齢および民族性の背景の１つまたは複数の試験対象および複数の参照対象から生成された配列の読取りのデータが挙げられる。一部の実施形態では、データセットは、それぞれの試験対象および／または参照対象について、数千〜数百万個の配列の読取りを含むことができる。
【０２４２】
特定の実施形態では、データ処理を、任意の数のステップで行うことができる。例えば、一部の実施形態では、単一の処理手順のみを使用して、データを処理することができ、特定の実施形態では、１つもしくは複数、５つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、または２０個もしくはそれ超の処理ステップ（例えば、１つもしくは複数の処理ステップ、２つもしくはそれ超の処理ステップ、３つもしくはそれ超の処理ステップ、４つもしくはそれ超の処理ステップ、５つもしくはそれ超の処理ステップ、６つもしくはそれ超の処理ステップ、７つもしくはそれ超の処理ステップ、８つもしくはそれ超の処理ステップ、９つもしくはそれ超の処理ステップ、１０個もしくはそれ超の処理ステップ、１１個もしくはそれ超の処理ステップ、１２個もしくはそれ超の処理ステップ、１３個もしくはそれ超の処理ステップ、１４個もしくはそれ超の処理ステップ、１５個もしくはそれ超の処理ステップ、１６個もしくはそれ超の処理ステップ、１７個もしくはそれ超の処理ステップ、１８個もしくはそれ超の処理ステップ、１９個もしくはそれ超の処理ステップ、または２０個もしくはそれ超の処理ステップ）を使用して、データを処理することができる。一部の実施形態では、処理ステップは、２回またはそれ超回繰り返される同じステップであり得（例えば、２回またはそれ超回フィルターをかける、２回またはそれ超回正規化する）、特定の実施形態では、処理ステップは、同時または順次に行われる２つまたはそれ超の異なる処理ステップであり得る（例えば、フィルターをかけ、正規化する；正規化し、ピークの高さおよびエッジをモニタリングする；フィルターをかけ、正規化し、参照に対して正規化し、統計学的に操作して、ｐ値を決定する等）。一部の実施形態では、同じまたは異なる処理ステップの任意の適切な数および／または組合せを利用し、配列の読取りのデータを処理して、アウトカムを得るのを促進することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載する判断基準によりデータセットを処理することによって、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。
【０２４３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の処理ステップは、１つまたは複数の正規化ステップを含むことができる。正規化は、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である適切な方法により行うことができる。特定の実施形態では、正規化は、異なるスケールで測定された値を、概念的に共通のスケールに調整することを含む。特定の実施形態では、正規化は、調整された値の確率分布をアラインメントにもち込むための高度な数学的調整を含む。一部の実施形態では、正規化は、分布を正規分布に合わせることを含む。特定の実施形態では、正規化は、特定の全体的な影響（例えば、誤差および異常）の作用を排除する方法で、異なるデータセットについて正規化された対応する値を比較するのを可能にする数学的調整を含む。特定の実施形態では、正規化は、スケーリングを含む。正規化は時には、所定の変数または式による１つまたは複数のデータセットの除算を含む。正規化は、場合によって、所定の変数または式による１つまたは複数のデータセットの除算を含む。正規化法の非限定的な例は、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、中央値のカウント数（中央値のビンカウント数、中央値の部分カウント数）による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ  ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所加重散布図平坦化）、主成分による正規化、リピートマスクキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化リピートマスクキング（ＧＣＲＭ）、ｃＱｎ、ならびに／またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、コピー数の変更の存在または非存在（例えば、異数性、微小重複、微小欠失）の決定は、正規化法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、中央値のカウント数（中央値のビンカウント数、中央値の部分カウント数）による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ  ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所加重散布図平坦化）、主成分による正規化、リピートマスクキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化リピートマスクキング（ＧＣＲＭ）、ｃＱｎ、当技術分野で公知の正規化法、ならびに／またはこれらの組合せ）を利用する。例えば、ＬＯＥＳＳ正規化、主成分正規化およびハイブリッド正規化法などの利用できる正規化プロセスのある特定の例を、本明細書の下記においてより詳細に記載する。特定の正規化プロセスの態様は、例えば、各々、参照により本明細書において組み込まれている国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５２９１３号および同ＷＯ２０１５／０５１１６３号にも記載されている。
【０２４４】
任意の適切な数の正規化を使用することができる。一部の実施形態では、データセットを、１回もしくは複数回、５回もしくはそれ超回、１０回もしくはそれ超回、または２０回またはそれ超回さえ正規化することができる。データセットを、任意の適切な特徴または変数（例えば、試料データ、参照データ、または両方）を表示する値（例えば、正規化値）に対して正規化することができる。使用することができるデータの正規化のタイプの非限定的な例として、１つまたは複数の選択された試験部分または参照部分についての未加工カウント数データを、その上で、選択された部分または区分がマッピングされる染色体またはゲノム全体に対してマッピングされるカウント数の総数に対して正規化すること；１つまたは複数の選択された部分についての未加工カウント数データを、その上で、選択された部分がマッピングされる１つもしくは複数の部分または染色体についての参照のカウント数の中央値に対して正規化すること；未加工カウント数データを、あらかじめ正規化されたデータまたはそれらの誘導値に対して正規化すること；およびあらかじめ正規化されたデータを、１つまたは複数のその他の所定の正規化変数に対して正規化することが挙げられる。データセットの正規化は時には、所定の正規化変数として選択された特徴または特性に応じて、統計学的誤差を単離する作用を有する。また、データセットの正規化は時には、異なるスケールを有するデータのデータとしての特徴の比較を、データに共通のスケール（例えば、所定の正規化変数）を与えることによって可能にする。一部の実施形態では、統計学的に誘導された値に対する１回または複数回の正規化を利用して、データの差を最小化し、異常値データの重要性を減少させることができる。部分または参照ゲノムの部分を正規化値に関して正規化することを時には、「部分に関する正規化」と呼ぶ。
【０２４５】
特定の実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の数学的および／または統計学的な操作を含むことができる。任意の適切な数学的および／または統計学的な操作を、単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載するデータセットを分析および／操作することができる。任意の適切な数の数学的および／または統計学的な操作を使用することができる。一部の実施形態では、データセットを、数学的および／または統計学的に、１回もしくは複数回、５回もしくはそれ超回、１０回もしくはそれ超回、または２０回もしくはそれ超回操作することができる。使用することができる数学的および統計学的な操作の非限定的な例として、加算、減算、乗算、除算、代数関数、最小二乗推定量、曲線近似、微分方程式、有理多項式、二重多項式、直交多項式、ｚスコア、ｐ値、カイ値、ｐｈｉ値、ピークレベルの分析、ピークのエッジの場所の決定、ピーク面積比の計算、染色体レベルの中央値の分析、平均絶対偏差の計算、残余の二乗の合計、平均、標準偏差、標準誤差等、またはそれらの組合せが挙げられる。数学的および／または統計学的な操作を、配列の読取りのデータまたはそれらの処理された生成物の全部または一部に対して行うことができる。統計学的に操作することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例として、未加工カウント数、フィルターをかけたカウント数、正規化されたカウント数、ピークの高さ、ピークの幅、ピークの面積、ピークのエッジ、ラテラルトレランス（ｌａｔｅｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、Ｐ値、レベルの中央値、平均レベル、ゲノム領域内のカウント数の分布、核酸種の相対的な表示等、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０２４６】
一部の実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の統計学的アルゴリズムの使用を含むことができる。任意の適切な統計学的アルゴリズムを、単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載するデータセットを分析および／操作することができる。任意の適切な数の統計学的アルゴリズムを使用することができる。一部の実施形態では、１つもしくは複数、５つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、または２０個もしくはそれ超の統計学的アルゴリズムを使用して、データセットを分析することができる。本明細書に記載する方法と共に使用するのに適切な統計学的アルゴリズムの非限定的な例として、主成分分析、決定木、対立仮説、多重比較、オムニバス検定、ベーレンス−フィッシャー検定、ブートストラッピング、有意性の独立性検定を組み合わせるためのフィッシャー法、帰無仮説、第一種の過誤、第二種の過誤、直接検定、１標本Ｚ検定、２標本Ｚ検定、１標本ｔ検定、対応のあるｔ検定、等分散を有する２標本併合型ｔ検定、不等分散を有する２標本非併合型ｔ検定、１比率ｚ検定、２比率ｚ検定併合型、２比率ｚ検定非併合型、１標本カイ二乗検定、分散の一様性についての２標本Ｆ検定、信頼区間、信頼区間（ｃｒｅｄｉｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）、有意性、メタ分析、単回帰、ロバスト線形回帰等、または上記の組合せが挙げられる。統計学的アルゴリズムを使用して分析することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例として、未加工カウント数、フィルターをかけたカウント数、正規化されたカウント数、ピークの高さ、ピークの幅、ピークのエッジ、ラテラルトレランス、Ｐ値、レベルの中央値、平均レベル、ゲノム領域内のカウント数の分布、核酸種の相対的な表示等、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０２４７】
特定の実施形態では、複数（例えば、２つもしくはそれ超）の統計学的アルゴリズム（例えば、最小二乗回帰、主成分分析、線形判別分析、二次判別分析、バギング、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシンモデル、ランダムフォレスト、分類木モデル、Ｋ最近傍、ロジスティック回帰および／もしくは平滑化）、ならびに／または（例えば、本明細書では操作と呼ぶ）数学的および／もしくは統計学的な操作を利用することによって、データセットを分析することができる。一部の実施形態では、複数の操作の使用により、アウトカムをもたらすために使用することができるＮ次元空間を生成することができる。特定の実施形態では、複数の操作を利用することによりデータセットを分析することによって、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。例えば、複数の操作を参照データセットに対して使用することによって、参照試料の状況（例えば、選択された遺伝子の変動コピー数の変更について陽性または陰性）に応じて、遺伝子の変動／遺伝子の変更および／またはコピー数の変更の有無を表示するために使用することができるＮ次元空間（例えば、確率プロット）を生成することができる。実質的に類似する一連の操作を使用する試験試料の分析を使用して、試験試料のそれぞれについてＮ次元の点を生成することができる。試験対象のデータセットの複雑性および／または次元性は時には、参照データから生成されたＮ次元空間と容易に比較することができる単一の値またはＮ次元の点に単純化される。参照対象のデータが存在するＮ次元空間に属する試験試料データは、参照対象の遺伝子の状況に実質的に類似する遺伝子の状況を示す。参照対象のデータが存在するＮ次元空間の外側に存在する試験試料データは、参照対象の遺伝子の状況に実質的に類似しない遺伝子の状況を示す。一部の実施形態では、参照は、正倍数体であるか、または別段に、遺伝子の変動／遺伝子の変更および／またはコピー数の変更および／または医学的状態を有していない。
【０２４８】
一部の実施形態では、データセットが、計数され、任意選択でフィルターをかけ正規化し、必要に応じて重み付けした後で、フィルターをかけ、かつ／または正規化する、かつ／または重み付けする１つまたは複数の手順により、これらの処理されたデータセットをさらに操作することができる。特定の実施形態では、フィルターをかけ、かつ／または正規化する、かつ／または重み付けする１つまたは複数の手順によりさらに操作されているデータセットを使用して、プロファイルを生成することができる。一部の実施形態では、時には、フィルターをかけ、かつ／または正規化する、かつ／または重み付けする１つまたは複数の手順により、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。複雑性および／または次元性が低下したデータセットに基づいてアウトカムを提供できる。一部の実施形態では、例えば、重み付けによってさらに操作した処理したデータのプロファイルプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムの提供を促進する。例えば、重み付けされたデータのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムを提供できる。
【０２４９】
部分にフィルターをかけることまたは加重することは、分析における１つまたは複数の適切な点で行うことができる。例えば、配列の読取りを、参照ゲノムの部分に対してマッピングする前または後に、部分にフィルターをかけるまたは加重することができる。一部の実施形態では、個々のゲノム部分についての実験の偏りを決定する前または後に、部分にフィルターをかけるまたは加重することができる。特定の実施形態では、レベルを計算する前または後に、部分にフィルターをかけるまたは加重することができる。
【０２５０】
一部の実施形態では、データセットが、計数され、任意選択でフィルターをかけられ、正規化され、任意選択で加重された後に、これらの処理されたデータセットを、１つまたは複数の数学的および／または統計学的な（例えば、統計学的関数または統計学的アルゴリズムによる）操作により操作することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の選択された部分、染色体、または染色体の部分についてＺスコアを計算することによって、処理されたデータセットをさらに操作することができる。一部の実施形態では、Ｐ値を計算することによって、処理されたデータセットをさらに操作することができる。特定の実施形態では、数学的および／または統計学的な操作は、倍数性および／または少量の種のフラクション（例えば、がん細胞核酸のフラクション：胎仔フラクション）に関する１つまたは複数の仮定を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の統計学的および／または数学的な操作によりさらに操作して処理したデータのプロファイルのプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムの提供を促進する。統計学的および／または数学的に操作したデータのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。統計学的および／または数学的に操作したデータのプロファイルのプロットに基づいてもたらされたアウトカムはしばしば、倍数性および／または少量の種のフラクション（例えば、がん細胞核酸のフラクション：胎仔フラクション）に関する１つまたは複数の仮定を含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、データの分析および処理は、１つまたは複数の仮定の使用を含むことができる。適切な数またはタイプの仮定を利用して、データセットを分析または処理することができる。データの処理および／または分析のために使用することができる仮定の非限定的な例として、対象の倍数性、がん細胞の寄与、母体の倍数性、胎仔の寄与、参照集団中の特定の配列の存在率、民族性背景、血縁の家族における選択された医学的状態の存在率、異なる患者から得られた未加工カウント数のプロファイル間の平行度および／またはＧＣ正規化リピートマスクキング（例えば、ＧＣＲＭ）後のラン、ＰＣＲの不自然な結果を意味する同一の一致（例えば、同一塩基の位置）、核酸定量化アッセイ（例えば、胎仔定量化アッセイ（ＦＱＡ））に固有の仮定、双子に関する仮定（例えば、双子の両方のうち、一方のみが罹患している場合、有効な胎仔フラクションは、測定された全胎仔フラクションの５０％のみである（三つ子、四つ子等についても同様））、ゲノム全体を一様にカバーする無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）等、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【０２５２】
正規化されたカウント数プロファイルに基づいて、遺伝子の変動／遺伝子の変更および／またはコピー数の変更の有無のアウトカムを信頼性の所望のレベル（例えば、９５％またはそれ超の信頼性のレベル）で予測することが、マッピングされた配列の読取りの品質および／または深さでは可能でない事例では、１つまたは複数の追加の数学的操作のアルゴリズムおよび／または統計学的予測アルゴリズムを利用して、データ分析および／またはアウトカムの提供に有用な追加の数値を生成することができる。用語「正規化されたカウント数プロファイル」は、本明細書で使用する場合、正規化されたカウント数を使用して生成されたプロファイルを指す。正規化されたカウント数および正規化されたカウント数プロファイルを生成するために使用することができる方法の例を、本明細書に記載する。上記で述べたように、計数されるに至った、マッピングされた配列の読取りを、試験試料のカウント数または参照試料のカウント数に関して正規化することができる。一部の実施形態では、正規化されたカウント数プロファイルは、プロットして示すことができる。
【０２５３】
ウィンドウ（静止したまたはスライディング）に対して正規化すること、重み付け、偏り関係を決定すること、ＬＯＥＳＳ正規化、主成分正規化、ハイブリッド正規化、プロファイルを生成することおよび比較を実施することなどの、利用できる処理ステップおよび正規化法の限定されない例を、本明細書の下記においてより詳細に記載する。
【０２５４】
ウィンドウに対する正規化（静止またはスライディング）
特定の実施形態では、処理ステップは、静止したウィンドウに対して正規化することを含み、一部の実施形態では、処理ステップは、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウに対して正規化することを含む。用語「ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、分析のために選ばれた１つまたは複数の部分を指し、時には、比較のための参照として使用される（例えば、正規化および／またはその他の数学的もしくは統計学的な操作ために使用される）。用語「静止したウィンドウに対して正規化する」は、本明細書で使用する場合、試験対象のデータセットと参照対象のデータセットとを比較するために選択された１つまたは複数の部分を使用する正規化の処理を指す。一部の実施形態では、選択された部分を利用して、プロファイルを生成する。静止したウィンドウは一般に、操作および／または分析の間に変化しない所定の一連の部分を含む。用語「移動するウィンドウに対して正規化する」および「スライディングウィンドウに対して正規化する」は、本明細書で使用する場合、選択された試験部分のゲノム領域に限局される部分（例えば、直近の周囲部分、隣接する部分または区分等）に対して行われる正規化を指し、この場合、１つまたは複数の選択された試験部分は、選択された試験部分の直近の周囲の部分に対して正規化される。特定の実施形態では、選択された部分を利用して、プロファイルを生成する。スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウの正規化はしばしば、隣接する試験部分に向けて繰り返し移動またはスライディングさせ、新たに選択された試験部分を、新たに選択された試験部分の直近の周囲のまたは新たに選択された試験部分に隣接する部分に対して正規化することを含み、この場合、隣接するウィンドウは、共通する１つまたは複数の部分を有する。特定の実施形態では、複数の選択された試験部分および／または染色体を、スライディングウィンドウ処理により分析することができる。
【０２５５】
一部の実施形態では、スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウに対して正規化することによって、１つまたは複数の値を生成することができ、この場合、それぞれ値は、ゲノムの異なる領域（例えば、染色体）から選択された異なる一連の参照部分に対する正規化の結果を表示する。特定の実施形態では、生成された１つまたは複数の値は、累積合計（例えば、選択された部分、ドメイン（例えば、染色体のパート）または染色体にわたり正規化されたカウント数プロファイルの積分の数的な推定値）である。スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウの処理により生成された値を使用して、プロファイルを生成し、アウトカムに到達するのを促進することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分の累積合計を、ゲノムの位置の関数として示すことができる。時には、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウの分析を使用して、ゲノムを微小欠失および／または微小重複の有無について分析する。特定の実施形態では、１つまたは複数の部分の累積合計を示すことを使用して、コピー数の変更（例えば、微小欠失、微小重複）の領域の有無を識別する。  
【０２５６】
加重
一部の実施形態では、処理ステップは、加重を含む。用語「加重される」、「加重する」もしくは「加重関数」、またはそれらの文法上の派生語もしくは相当語句は、本明細書で使用する場合、特定のデータセットの特徴または変数の影響を、その他のデータセットの特徴または変数に比して変化させる（例えば、１つもしくは複数の部分または参照ゲノムの部分中に含有されるデータの有意性および／または寄与を、参照ゲノムの選択された１つまたは複数の部分中のデータの品質または有用性に基づいて増加または減少させる）ために利用することがあるデータセットの一部または全部の数学的操作を指す。一部の実施形態では、加重関数を使用して、比較的小さな測定値の分散を有するデータの影響を増加させること、および／または比較的大きな測定値の分散を有するデータの影響を減少させることができる。例えば、過小表示されているまたは低い品質の配列データを有する参照ゲノムの部分の「加重を減らし」て、データセットに対する影響を最小化することができ、一方、参照ゲノムの選択された部分の「加重を増やし」て、データセットに対する影響を増加させることもできる。加重関数の非限定的な例が、［１／（標準偏差）２］である。重み付け部分は、時には、部分依存性を除去する。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分を固有関数（ｅｉｇｅｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（例えば、固有関数（ｅｉｇｅｎｆｕｎｃｔｉｏｎ））により重み付けする。一部の実施形態では、固有関数は、部分を直交固有部分により置きかえることを含む。重み付けステップは、時には、正規化ステップと実質的に同様に実施する。一部の実施形態では、データセットを所定の変数（例えば、重み付け変数）によって調整する（例えば、除する、乗する、付加する、差し引く）。一部の実施形態では、データセットは、所定の変数（例えば、加重変数）により除算される。しばしば、所定の変数（例えば、最小化目的関数、Ｐｈｉ）を選択して、データセットの異なるパートに異なる加重を加える（例えば、特定のデータのタイプの影響を増加させ、一方、その他のデータのタイプの影響を減少させる）。
【０２５７】
偏り関係
一部の実施形態では、処理ステップは、偏り関係を決定することを含む。例えば、１つまたは複数の関係を、局所的なゲノムの偏りの推定値と、偏り頻度との間で生成することができる。本明細書で使用される「関係」という用語は、２つまたはそれ超の変数または値の間の数学的関係および／またはグラフ的関係を指す。関係は、適切な数学的処理および／またはグラフ的処理により生成することができる。関係の非限定的な例は、関数、相関、分布、線形式または非線形式、直線、回帰、適合させた回帰など、またはこれらの組合せの数学的表示および／またはグラフ表示を含む。場合によって、関係は、適合させた関係を含む。一部の実施形態では、適合させた関係は、適合させた回帰を含む。場合によって、関係は、２つまたはそれ超の変数または値であって、重み付き変数または重み付き値を含む。一部の実施形態では、関係は、適合させた回帰を含み、ここで、関係の１つまたは複数の変数または値が重み付けされている。場合によって、回帰は、重み付き様式で適合させる。場合によって、回帰は、重み付けされずに適合させる。ある特定の実施形態では、関係の生成は、プロッティングまたはグラフ作成を含む。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、関係を、ＧＣ密度とＧＣ密度頻度との間で生成する。一部の実施形態では、試料についての（ｉ）ＧＣ密度と、（ｉｉ）ＧＣ密度頻度との関係を生成することにより、試料ＧＣ密度関係を提示する。一部の実施形態では、参照についての（ｉ）ＧＣ密度と、（ｉｉ）ＧＣ密度頻度との関係を生成することにより、参照ＧＣ密度関係を提示する。一部の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値がＧＣ密度である場合、試料偏り関係は、試料ＧＣ密度関係であり、参照偏り関係は、参照ＧＣ密度関係である。参照ＧＣ密度関係および／または試料ＧＣ密度関係のＧＣ密度は、局所的なＧＣ含有量についての表示（例えば、数学的表示または定量的表示）であることが多い。
【０２５９】
一部の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値と偏り頻度との関係は、分布を含む。一部の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値と偏り頻度との関係は、適合させた関係（例えば、適合させた回帰）を含む。一部の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値と偏り頻度との関係は、線形適合回帰または非線形適合回帰（例えば、多項式回帰）を含む。ある特定の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値と偏り頻度との関係は、重み付き関係を含み、ここで、局所的なゲノムの偏りの推定値および／または偏り頻度は、適切な処理により重み付けされる。一部の実施形態では、重み付き適合させた関係（例えば、重み付き適合）は、四分位回帰、パラメータ付きの確率分布、または補間を有する経験的分布を含む処理により得ることができる。ある特定の実施形態では、試験試料、参照基準、またはこれらの一部についての、局所的なゲノムの偏りの推定値と偏り頻度との関係は、多項式回帰を含み、局所的なゲノムの偏りの推定値は、重み付けされている。一部の実施形態では、重み付き適合モデルは、分布値を重み付けすることを含む。分布値は、適切な処理により重み付けすることができる。一部の実施形態では、分布のテールの近傍に位置する値には、分布中央値に近い値より小さな重みを施す。例えば、局所的なゲノムの偏りの推定値（例えば、ＧＣ密度）と、偏り頻度（例えば、ＧＣ密度頻度）との分布については、重みを、所与の局所的なゲノムの偏りの推定値についての偏り頻度に従って決定し、ここで、分布の平均に近接した偏り頻度を含む局所的なゲノムの偏りの推定値には、平均から遠い偏り頻度を含む局所的なゲノムの偏りの推定値より大きな重みを施す。
【０２６０】
一部の実施形態では、処理ステップは、試験試料の配列の読取りの局所的なゲノムの偏りの推定値を、参照基準（例えば、参照ゲノムまたはその一部）の局所的なゲノムの偏りの推定値と比較することにより配列の読取りのカウント数を正規化することを含む。一部の実施形態では、配列の読取りのカウント数は、試験試料の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度を、参照基準の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度と比較することにより正規化する。一部の実施形態では、配列の読取りのカウント数は、試料偏り関係と参照偏り関係とを比較することにより正規化し、これにより、比較を生成する。
【０２６１】
配列の読取りのカウント数は、２つまたはそれ超の関係の比較に従って正規化され得る。ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超の関係について比較し、これにより、配列の読取り中の局所的な偏りを低減する（例えば、カウント数を正規化する）ために使用される比較を提示する。適切な方法により、２つまたはそれ超の関係について比較することができる。一部の実施形態では、比較は、第１の関係に第２の関係を加算すること、第１の関係から第２の関係を減算すること、第１の関係に第２の関係を乗算すること、および／または第１の関係を第２の関係で除算することを含む。ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超の関係の比較は、適切な線形回帰および／または非線形回帰の使用を含む。ある特定の実施形態では、２つまたはそれ超の関係の比較は、適切な多項式回帰（例えば、三次多項式回帰）を含む。一部の実施形態では、比較は、第１の回帰に第２の回帰を加算すること、第１の回帰から第２の回帰を減算すること、第１の回帰に第２の回帰を乗算すること、および／または第１の回帰を第２の回帰で除算することを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の関係について、多重回帰の推論フレームワークを含む処理により比較する。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の関係について、適切な多変量分析を含む処理により比較する。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の関係について、基底関数（例えば、ブレンディング関数、例えば、多項式基底、フーリエ基底など）、スプライン、放射基底関数、および／またはウェーブレットを含む処理により比較する。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、試験試料および参照基準についての偏り頻度を含む、局所的なゲノムの偏りの推定値の分布を、多項式回帰を含む処理により比較するが、ここで、局所的なゲノムの偏りの推定値は、重み付けされている。一部の実施形態では、多項式回帰を、（ｉ）比の各々が、参照基準の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度および試料の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度を含む比と、（ｉｉ）局所的なゲノムの偏りの推定値との間で生成する。一部の実施形態では、多項式回帰を、（ｉ）参照基準の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度の、試料の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度に対する比と、（ｉｉ）局所的なゲノムの偏りの推定値との間で生成する。一部の実施形態では、試験試料および参照基準の読取りについての局所的なゲノムの偏りの推定値の分布の比較は、参照基準および試料についての、局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度の対数比（例えば、ｌｏｇ２比）を決定することを含む。一部の実施形態では、局所的なゲノムの偏りの推定値の分布の比較は、参照基準についての、局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度対数比（例えば、ｌｏｇ２比）を、試料についての局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度の対数比（例えば、ｌｏｇ２比）で除算することを含む。
【０２６３】
比較に従ったカウント数を正規化することでは、あるカウント数は調整されるが、他のカウント数は調整されないことが典型的である。カウント数を正規化することでは、ある場合には、全カウント数が調整され、ある場合には、いかなる配列の読取りのカウント数も調整されない。配列の読取りについてのカウント数は、ある場合には、加重係数を決定することを含む処理により正規化し、ある場合には、処理は、加重係数の直接的な生成および活用を含まない。比較に従ったカウント数を正規化することは、場合によって、各配列の読取りのカウント数についての加重係数を決定することを含む。加重係数は、配列の読取りに特異的であり、特異的配列の読取りのカウント数へと適用されることが多い。加重係数は、２つまたはそれ超の偏り関係の比較（例えば、参照偏り関係と比較した試料偏り関係）に従って決定することが多い。正規化されたカウント数は、カウント数値を、加重係数に従って調整することにより決定することが多い。加重係数に従ったカウント数の調整は、場合によって、配列の読取りについてのカウント数に加重係数を加算すること、配列の読取りについてのカウント数から加重係数を減算すること、配列の読取りについてのカウント数に加重係数を乗算すること、および／または配列の読取りについてのカウント数を加重係数で除算することを含む。加重係数および／または正規化されたカウント数は、場合によって、回帰（例えば、回帰直線）から決定する。正規化されたカウント数は、場合によって、参照基準の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度（例えば、参照ゲノム）と、試験試料の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度との間の比較の結果として得られる、回帰直線（例えば、適合させた回帰直線）から直接得る。一部の実施形態では、試料の読取りの各カウント数を、（ｉ）読取りの局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度の、（ｉｉ）参照基準の局所的なゲノムの偏りの推定値の偏り頻度と比較した比較に従って、正規化されたカウント数値として提示する。ある特定の実施形態では、試料について得られる配列の読取りのカウント数を正規化し、配列の読取り中の偏りを低減する。
【０２６４】
機械、システム、ソフトウェアおよびインターフェース
本明細書に記載するある特定のプロセスおよび方法（例えば、配列決定読取りを得ることおよびフィルタリングすること、多型核酸標的が情報価値があるか否かを決定すること、または固定カットオフ、動的ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングもしくは個々の多型核酸標的閾値を使用して、１つもしくは複数の無細胞核酸がドナー特異的核酸であるか否かを決定すること）はしばしば、コンピュータ、マイクロプロセッサ、ソフトウェア、モジュールまたは他の機械がなければ実施することができない。本明細書に記載する方法は、通常、コンピュータ実行方法であり、方法の１つまたは複数の部分は、時として、１つまたは複数のプロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ）、コンピュータ、システム、装置、または機械（例えば、マイクロプロセッサ制御式機械）によって実施される。
【０２６５】
使用するのに適したコンピュータ、システム、装置、機械およびコンピュータプログラム製品は、コンピュータ可読記憶媒体を含む、またはそれとともに利用されることが多い。コンピュータ可読記憶媒体の限定されない例として、メモリ、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、フラッシュメモリデバイス等が挙げられる。コンピュータ可読記憶媒体は、一般に、コンピュータハードウェアであり、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であることが多い。コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読伝送媒体ではなく、後者は、それ自体伝送シグナルである。
【０２６６】
本明細書に開示される移植片状態を決定するための方法の実施形態のいずれかを実施するように構成されたコンピュータシステムを本明細書において提供する。一部の実施形態では、本開示は、移植片状態を決定するためのシステムであって、１つもしくは複数のプロセッサと、非一時的な機械可読記憶媒体および／または１つもしくは複数のプロセッサに連結されたメモリであって、（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップとを含むプロセスを実施するように構成されたインストラクションのセットを用いてコード化されたメモリまたは非一時的な機械可読記憶媒体を含むシステムを提供する。
【０２６７】
一部の実施形態では、インストラクションのセットは、多型核酸標的が情報価値があるか否かを決定する、ならびに／または例えば上記の固定カットオフアプローチ、動的クラスタリングアプローチ、および／もしくは個々の多型核酸標的閾値アプローチのうちの１つもしくは複数に従って試験対象の試料から試料中のドナー特異的無細胞核酸を検出するためのインストラクションをさらに含む。一部の場合では、実験の偏りを低減させるためのインストラクションは、配列の読取りのＧＣ正規化された定量化に従う。
【０２６８】
また、記憶された実行可能なプログラムを有するコンピュータ可読記憶媒体が本明細書において提供され、本明細書において記載される方法を実施するようにマイクロプロセッサに指示する。また、記憶された実行可能なプログラムモジュールを有するコンピュータ可読記憶媒体も本明細書において提供され、プログラムモジュールは、マイクロプロセッサに本明細書において記載される方法の一部を実施するように指示する。また、記憶された実行可能なプログラムを有するコンピュータ可読記憶媒体を含むシステム、機械、装置およびコンピュータプログラム製品が本明細書において提供され、プログラムは、マイクロプロセッサに本明細書において記載される方法を実施するように指示する。また、記憶された実行可能なプログラムモジュールを有するコンピュータ可読記憶媒体を含む、システム、機械および装置も提供され、プログラムモジュールは、マイクロプロセッサに本明細書において記載される方法の一部を実施するように指示する。一部の実施形態では、プログラムモジュールは、（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、（ｂ）演算システムによって、（ａ）の測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップとを含むプロセスを実施するようにマイクロプロセッサに指示する。コンピュータ可読記憶媒体に記憶された実行可能なプログラムは、多型核酸標的が情報価値のあるか否かを決定するように、ならびに／または例えば上記の固定カットオフアプローチ、動的クラスタリングアプローチ、および／もしくは個々の多型核酸標的閾値アプローチのうちの１つもしくは複数に従って、試験対象の試料から試料中のドナー特異的無細胞核酸を検出するようにマイクロプロセッサにさらに指示することができる。
【０２６９】
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合に、１つまたは複数のプロセッサに方法を実施させるプログラムインストラクションを含む非一時的な可読記憶媒体を提供し、方法は、（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、（ｂ）演算システムによって、（ａ）の測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップを含む。プログラムのインストラクションは、多型核酸標的が情報価値があるか否かを決定する、ならびに／または例えば上記の固定カットオフアプローチ、動的クラスタリングアプローチ、および／もしくは個々の多型核酸標的閾値アプローチのうちの１つもしくは複数に従って試験対象の試料から試料中のドナー特異的無細胞核酸を検出するための、１つまたは複数のプロセッサのインストラクションをさらに含み得る。
【０２７０】
非一時的な機械可読記憶媒体は、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合に、１つまたは複数のプロセッサに方法を実施させるプログラムインストラクションをさらに含み、方法は、実験の偏りを低減させる調整プロセスによってゲノム部分の各々に関して定量化された配列の読取りを調整するステップを含み、調整プロセスは、多型核酸標的各々に関して配列の読取りの正規化された定量化を生成する。
【０２７１】
このように、コンピュータプログラム製品も提供される。コンピュータプログラム製品は、その中で具体化されるコンピュータ可読プログラムコード、本明細書において記載される方法または方法の一部を実装するのに実行されるよう適合させたコンピュータ可読プログラムコードを含むコンピュータ使用型媒体を含むことが多い。コンピュータ使用型媒体および可読プログラムコードは、伝送媒体ではない（すなわち、それ自体伝送シグナル）。コンピュータ可読プログラムコードは、プロセッサ、コンピュータ、システム、装置または機械によって実行されるように適合されることが多い。
【０２７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法（例えば、配列決定読取りを得ることおよびフィルタリングすること、多型核酸標的が情報価値があるか否かを決定すること、または固定カットオフ、動的ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリング、もしくは個々の多型核酸標的閾値を使用して１つもしくは複数の無細胞核酸がドナー特異的核酸であるか否かを決定すること）は、自動化された方法により実施される。一部の実施形態では、本明細書に記載する方法の１つまたは複数のステップは、マイクロプロセッサおよび／もしくはコンピュータにより行われる、ならびに／またはメモリと併せて行われる。一部の実施形態では、自動化された方法は、本明細書に記載の方法を実施するソフトウェア、モジュール、マイクロプロセッサ、周辺機器、および／またはそのようなものを含む機械に具体化される。本明細書で使用する場合、ソフトウェアとは、本明細書に記載するように、マイクロプロセッサにより実施されたときにコンピュータの操作を行う、コンピュータ可読プログラムインストラクションを指す。
【０２７３】
配列の読取り、カウント数、レベル、および／または測定値は、「データ」または「データセット」と呼ばれる場合もある。一部の実施形態では、データまたはデータセットは、１つまたは複数の特徴または変数（例えば、配列に基づく（例えば、ＧＣ含有量、特異的ヌクレオチド配列等）、機能特異的（例えば、発現した遺伝子、がん遺伝子等）、場所に基づく（ゲノム特異的、染色体特異的、部分または部分特異的）等およびそれらの組合せ）により特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、データまたはデータセットは、１つまたは複数の特徴または変数に基づく２次元またはそれより多くの次元を有するマトリックスに組織化することができる。マトリックスに組織化されたデータは、任意の適切な特徴または変数を使用して組織化することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の特徴または変数により特徴付けられるデータセットは、計数後に処理される場合もある。
【０２７４】
機械、ソフトウェア、およびインターフェースが、本明細書に記載する方法を実施するのに使用できる。機械、ソフトウェア、およびインターフェースを使用して、ユーザーは、特定の情報、プログラム、または処理（例えば、配列の読取りのマッピング、マッピングされたデータの処理、および／またはアウトカムアウトカムの提供）を使用するためのオプションを入力、要求、照会、または決定することができ、例えば統計分析アルゴリズム、統計的有意性アルゴリズム、統計的アルゴリズム、反復ステップ、妥当性の確認アルゴリズム、および図形表示の実施が含まれ得る。一部の実施形態では、データセットは、インプット情報としてユーザーが入力可能であり、ユーザーは、適するハードウェアメディア（例えば、フラッシュドライブ）により１つもしくは複数のデータセットをダウンロードすることができ、ならびに／またはユーザーは、後続する処理のために、および／もしくはアウトカムを得るために、１つのシステムから別のシステムにデータセットを送信することができる（例えば、シーケンサーからコンピュータシステムに、配列の読取りのマッピング用として配列の読取りデータを送信する；マッピングされた配列データを、処理用として、ならびにアウトカムおよび／またはレポートの取得用としてコンピュータシステムに送信する）。
【０２７５】
システムは、１つまたは複数の機械を一般的に含む。各機械は、１つまたは複数のメモリ、１つまたは複数のマイクロプロセッサ、およびインストラクションを含む。システムが２つまたはそれ超の機械を含む場合、機械の一部または全部は同一の場所に位置し得るか、機械の一部または全部は異なる場所に位置し得るか、全ての機械は１つの場所に位置し得るか、および／または全ての機械は異なる場所に位置し得る。システムが２つまたはそれ超の機械を含む場合、機械の一部もしくは全部はユーザーと同じ場所に位置し得るか、機械の一部もしくは全部はユーザーと異なる場所に位置し得るか、全ての機械はユーザーと同じ場所に位置し得るか、および／または全ての機械はユーザーとは異なる１つもしく複数の場所に位置し得る。
【０２７６】
システムは、演算機械および配列決定装置または機械を含む場合があり、この場合、配列決定装置または機械は、身体由来の核酸を入手し、配列の読取りを生成するように構成され、演算装置は、配列決定装置または機械から得られた読取りを処理するように構成される。演算機械は、配列の読取りから分類結果を決定するように構成され得る。
【０２７７】
ユーザーは、例えばソフトウェアに照会を行うことができ、ソフトウェアは、次にインターネットにアクセスしてデータセットを取得することができ、ある特定の実施形態では、プログラム可能なマイクロプロセッサは、与えられたパラメータに基づいて、適するデータセットを取得するように催促され得る。また、プログラム可能なマイクロプロセッサは、与えられたパラメータに基づいてマイクロプロセッサにより選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーを催促する場合もある。プログラム可能なマイクロプロセッサは、インターネット、他の内部または外部の情報等を経由して見出される情報に基づき、マイクロプロセッサにより選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーを催促し得る。オプションは、１つまたは複数のデータ特性セレクション、１つまたは複数の統計的アルゴリズム、１つまたは複数の統計分析アルゴリズム、１つまたは複数の統計的有意性アルゴリズム、反復ステップ、１つまたは複数の妥当性確認アルゴリズム、ならびに方法、機械、装置、コンピュータプログラムまたは記憶された実行可能なプログラムを有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体の１つまたは複数の図形表示を選択するために選ばれ得る。
【０２７８】
本明細書が取り上げるシステムは、コンピュータシステムの一般的なコンポーネント、例えばネットワークサーバー、ラップトップシステム、デスクトップシステム、ハンドヘルドシステム、パーソナルデジタルアシスタント、公衆コンピュータ（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｋｉｏｓｋ）等を含み得る。コンピュータシステムは、ユーザーがデータをシステムに入力できるようにする１つまたは複数のインプット手段、例えばキーボード、タッチスクリーン、マウス、音声認識手段、または他の手段等を含み得る。システムは、ディスプレイスクリーン（例えば、ＣＲＴまたはＬＣＤ）、スピーカー、ファックス機、プリンター（例えば、レーザー式、インクジェット式、インパクト式、白黒またはカラープリンター）、または情報の視覚的、聴覚的および／もしくはハードコピーアウトプットを提供するのに有用な他のアウトプット（例えば、結果および／またはレポート）を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数のアウトプットをさらに含み得る。
【０２７９】
システムでは、インプットおよびアウトプット構成成分は、コンポーネントの中でもとりわけ、プログラムインストラクションを実行するマイクロプロセッサ、ならびにプログラムコードおよびデータを保管するメモリを含み得る中央処理ユニットと接続され得る。一部の実施形態では、処理は、単一の地理的箇所に所在する単一のユーザーシステムとして実施され得る。ある特定の実施形態では、処理は、マルチユーザーシステムとして実施され得る。マルチユーザーで実施される場合、複数の中央処理ユニットが、ネットワークによって接続され得る。ネットワークは、建物の一部内の一部門、建物全体に波及するようにローカルであり、複数の建物にまたがり、１つの領域にまたがり、国全体にまたがり、または世界規模であり得る。ネットワークは個人的であり、プロバイダーにより所有、および管理され得る、またはユーザーが情報を入力および取り出すためにウェブページにアクセスするような、インターネットに基づくサービスとして実施され得る。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、ユーザーにとってローカルまたはリモートであり得る１つまたは複数の機械を含む。１つの場所または複数の場所にある１つ超の機械に、ユーザーはアクセスでき、データは、連続しておよび／または並行してマッピングおよび／または処理され得る。したがって、適する構成および制御法が、ローカルネットワーク、リモートネットワーク、および／または「クラウド」コンピューティングプラットフォーム等において、複数の機械を使用してデータをマッピングおよび／または処理するのに利用できる。
【０２８０】
システムは、一部の実施形態では、コミュニケーションインターフェースを含み得る。コミュニケーションインターフェースは、コンピュータシステムと１つまたは複数の外部デバイスの間で、ソフトウェアおよびデータを移送できるようにする。コミュニケーションインターフェースの非限定的な例として、モデム、ネットワークインターフェース（イーサーネットカード等）、コミュニケーションポート、ＰＣＭＣＩＡスロットとカード等が挙げられる。コミュニケーションインターフェース経由で移送したソフトウェアおよびデータは、一般的にシグナルの形態を取り、これは、電子シグナル、電磁気シグナル、光学シグナル、および／またはコミュニケーションインターフェースにより受信される他のシグナルであり得る。シグナルは、多くの場合、チャネルを介してコミュニケーションインターフェースに提供される。チャネルは、多くの場合、シグナルを担持し、ワイヤーまたはケーブル、ファイバーオプティックス、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンク、および／または他のコミュニケーションチャネルを使用して実施され得る。したがって、１つの例では、コミュニケーションインターフェースは、シグナル検出モジュールにより検出できるシグナル情報を受信するのに使用できる。
【０２８１】
データは、マニュアルインプットデバイスまたはダイレクトデータ入力デバイス（ＤＤＥ）を含むが、これらに限定されない、適するデバイスおよび／または方法によりインプットできる。マニュアルデバイスの非限定的な例として、キーボード、コンセプトキーボード、タッチ感応式スクリーン、ライトペン、マウス、トラックボール、ジョイスティック、グラフィックタブレット、スキャナー、デジタルカメラ、ビデオデジタイザー、および音声認識デバイスが挙げられる。ＤＤＥの非限定的な例として、バーコードリーダー、磁気ストリップコード、スマートカード、磁気インク文字認識、光学式文字認識、光学式マーク認識、およびターンアラウンドドキュメントが挙げられる。
【０２８２】
一部の実施形態では、配列決定装置または機械からのアウトプットは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たすことができる。ある特定の実施形態では、核酸捕捉プロセス（例えば、ゲノム領域起源データ）からのアウトプットは、インプットデバイスを介してインプットでありうるデータとして働きうる。ある特定の実施形態では、核酸断片サイズ（例えば、長さ）および核酸捕捉プロセス（例えば、ゲノム領域起源データ）からのアウトプットの組合せは、インプットデバイスを介してインプットでありうるデータとして働きうる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列の読取りは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たすことができる。ある特定の実施形態では、シミュレーションデータは、インシリコ処理により生成され、またシミュレーション後のデータは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たすことができる。用語「インシリコ」とは、コンピュータを使用して行う研究および実験を指す。インシリコ処理は、本明細書に記載する処理により、配列の読取りをマッピングすること、およびマッピングされた配列の読取りを処理することを含むが、これらに限定されない。
【０２８３】
システムには、本明細書に記載する処理または処理の部分を行うために有用なソフトウェアを含むことができ、ソフトウェアは、かかる処理を行う１つまたは複数のモジュールを含み得る（例えば、配列決定モジュール、論理処理モジュール、データディスプレイ組織化モジュール）。用語「ソフトウェア」は、コンピュータにより実行されると、コンピュータ操作を行う、コンピュータ読取り可能プログラムのインストラクションを指す。１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能なインストラクションは、実行されると、１つまたは複数のマイクロプロセッサに本明細書に記載する方法を実施させることができる実行可能なコードとして提供される場合もある。
【０２８４】
本明細書に記載するモジュールは、ソフトウェアとして存在し得、ソフトウェアに組み込まれたインストラクション（例えば、処理、ルーチン、サブルーチン）が、マイクロプロセッサにより実施または行われ得る。例えば、モジュール（例えば、ソフトウェアモジュール）は、特定の処理またはタスクを行うプログラムの一部であり得る。用語「モジュール」は、より大型の機械またはソフトウェアシステムで使用できる自己完結型の機能ユニットを指す。モジュールは、モジュールの機能を実施する一連のインストラクションを含み得る。モジュールは、データおよび／または情報を変換することができる。データおよび／または情報は、適する形態であり得る。例えば、データおよび／または情報は、デジタルまたはアナログであり得る。ある特定の実施形態では、データおよび／または情報は、場合により、パケット、バイト、符号、またはビットであり得る。一部の実施形態では、データおよび／または情報は、任意の収集、集積された、または使用可能なデータまたは情報であり得る。データおよび／または情報の非限定的な例として、適するメディア、画像、ビデオ、音声（例えば、周波数、可聴または非可聴）、番号、定数、値、物体、時間、機能、インストラクション、マップ、参照、配列、読取り、マッピングされた読取り、レベル、範囲、閾値、シグナル、ディスプレイ、表示、またはそれらの変換物が挙げられる。モジュールは、データおよび／または情報を受け入れまたは受信し、データおよび／または情報を第２の形態に変換し、第２の形態を機械、周辺機器、コンポーネント、または別のモジュールに提供または移送することができる。モジュールは、１つまたは複数の下記の非限定的な機能を行うことができる：例えば、配列の読取りをマッピングする、カウント数を得る、部分を集積する、レベルを得るまたは決定する、カウント数プロファイルを得る、正規化する（例えば、読取りの正規化、カウント数の正規化等）、正規化されたカウント数プロファイルまたは正規化されたカウント数のレベルを得る、２つまたはそれ超のレベルを比較する、不確実性の値を得る、予想されるレベルおよび予想される範囲（例えば、予想されるレベル範囲、閾値範囲、および閾値レベル）を得るまたは決定する、レベルに調整を施す（例えば、第１のレベルの調整、第２のレベルの調整、染色体もしくはその部分のプロファイルの調整、および／またはパディング）、識別情報を得る（例えば、コピー数の変更、遺伝子の変動／遺伝子の変更または染色体異数性を識別する）、分類する、プロットする、および／または結果を決定する。マイクロプロセッサは、ある特定の実施形態では、モジュール内でインストラクションを実施することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサは、モジュールまたはモジュール群内でインストラクションを実施するように要求される。モジュールは、データおよび／または情報を別のモジュール、機械、またはソースに提供することができ、ならびにデータおよび／または情報を別のモジュール、機械、またはソースから受信することができる。
【０２８５】
コンピュータプログラム製品は、実体的なコンピュータ読取り可能メディアに組み込まれる場合もあれば、また非一時的コンピュータ読取り可能メディアに実体的に組み込まれる場合もある。モジュールは、コンピュータ読取り可能メディア（例えば、ディスク、ドライブ）上またはメモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ）内に保管される場合もある。モジュールからのインストラクションを実施する能力を有するモジュールおよびマイクロプロセッサは、ある機械内または異なる機械内に所在し得る。モジュールに関するインストラクションを実施する能力を有するモジュールおよび／またはマイクロプロセッサは、ユーザーと同じ場所（例えば、ローカルネットワーク）、またはユーザーとは異なる場所（例えば、リモートネットワーク、クラウドシステム）に所在し得る。方法が、２つまたはそれ超のモジュールと併せて実施される複数の実施形態では、モジュールは、同一機械内に所在してもよく、１つまたは複数のモジュールは、物理的な場所が同一である異なる機械内に所在してもよく、１つまたは複数のモジュールは、物理的な場所が異なる、異なる機械内に所在してもよい。
【０２８６】
機械は、一部の実施形態では、モジュール内のインストラクションを実施する少なくとも１つのマイクロプロセッサを含む。配列の読取り定量化（例えば、カウント）には、本明細書に記載する方法を実施するように構成されたインストラクションを実行するマイクロプロセッサからアクセスする場合がある。マイクロプロセッサがアクセスする配列の読取り定量化は、システムのメモリ内にあってもよく、カウント数は、その取得後にアクセス可能およびシステムのメモリ内に配置可能である。一部の実施形態では、機械はマイクロプロセッサ（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサ）を含み、同マイクロプロセッサは、モジュールからの１つまたは複数のインストラクション（例えば、処理、ルーチン、および／またはサブルーチン）を行うおよび／また実施することができる。一部の実施形態では、機械は、並行同調化作動型のマイクロプロセッサ等の複数のマイクロプロセッサを含む。一部の実施形態では、機械は、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、保管デバイス、および／または保管ネットワーク（例えば、クラウド））と共に稼働する。一部の実施形態では、機械はモジュール（例えば、１つまたは複数のモジュール）を含む。モジュールを含む機械は、多くの場合、１つまたは複数のデータおよび／または情報を、他のモジュールから受信し、またそれに対して移送することができる。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、機械は周辺機器および／またはコンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、機械は、データおよび／または情報を、他のモジュール、周辺機器、および／またはコンポーネントに対して、およびこれらから移送することができる１つまたは複数の周辺機器またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、機械は、データおよび／または情報を提供する周辺機器および／またはコンポーネントと相互作動する。ある特定の実施形態では、周辺機器およびコンポーネントは、機械がある機能を実施するのを支援する、またはモジュールと直接相互作動する。周辺機器および／またはコンポーネントの非限定的な例として、適したコンピュータ周辺機器、Ｉ／Ｏもしくは保管方法、またはデバイスが挙げられ、これにはスキャナー、プリンター、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＴ、またはＣＲＴ）、カメラ、マイクロフォン、パッド（例えば、ｉｐａｄ、タブレット）、タッチスクリーン、スマートフォン、携帯電話、ＵＳＢ  Ｉ／Ｏデバイス、ＵＳＢ大容量記憶デバイス、キーボード、コンピュータマウス、デジタルペン、モデム、ハードドライブ、ジャンプドライブ、フラッシュドライブ、マイクロプロセッサ、サーバー、ＣＤ、ＤＶＤ、グラフィックカード、特殊Ｉ／Ｏデバイス（例えば、シーケンサー、フォトセル、光電子増倍管、光学読取り装置、センサー等）、１つまたは複数のフローセル、流体ハンドリングコンポーネント、ネットワークインターフェースコントローラー、ＲＯＭ、ＲＡＭ、無線転送方法およびデバイス（ブルートゥース（登録商標）、ＷｉＦｉ等）、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）、インターネット、コンピュータおよび／または別のモジュールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８８】
プログラムインストラクションを含むソフトウェアは、多くの場合、コンピュータ可読媒体に記録されたプログラムインストラクションを含有するプログラム製品上に提供され、そのような媒体として、これらに限定されないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、および磁気テープを含む磁気媒体；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、光磁気ディスクを含む光学式媒体、フラッシュメモリーデバイス（例えば、フラッシュドライブ）、ＲＡＭ、フロッピー（登録商標）ディスク等、ならびにプログラムインストラクションが記録可能である他のそのような媒体が挙げられる。オンラインで実施する際には、組織により維持されるサーバーおよびウェブサイトは、ソフトウェアダウンロードをリモートユーザーに提供するように構成することができ、またはリモートユーザーは、組織により維持されるリモートシステムにアクセスして、遠隔的にソフトウェアにアクセスすることができる。ソフトウェアはインプット情報を取得または受信することができる。ソフトウェアは、データを具体的に取得または受信するモジュール（例えば、配列の読取りデータおよび／またはマッピングされた読取りデータを受信するデータ受信モジュール）を含んでもよく、データを具体的に処理する（例えば、受信したデータを処理する処理モジュール（例えば、アウトカムおよび／またはレポートをフィルタリングする、正規化する、提供する）モジュール）を含み得る。用語、インプット情報を「取得する」および「受信する」とは、ローカルもしくはリモートサイトからコンピュータ通信手段により、ヒトがデータ入力することにより、または任意の他のデータ受信方法により、データ（例えば、配列の読取り、マッピングされた読取り）を受信することを指す。インプット情報は、受信した場所と同じ場所で生成される場合もあれば、異なる場所で生成され、受信場所に伝送される場合もある。一部の実施形態では、インプット情報は、処理される前に修正される（例えば、処理しやすいフォーマット（例えば、表形式）に配置される）。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、ソフトウェアは１つまたは複数のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、データを処理するのに、および／または有限列のインストラクションに従って、アウトカムもしくはレポートを得るのに使用することができる。アルゴリズムは、多くの場合、タスクを完了するための規定されたインストラクションのリストである。初期状態から開始し、インストラクションは、規定された一連の連続した状態を経由して進行し、最終的に最終エンディング状態で終了する演算について記載し得る。１つの状態から次の状態への移行は必ずしも確定的ではない（例えば、一部のアルゴリズムには、偶然性が組み込まれる）。例として、アルゴリズムは、これらに限定されないが、サーチアルゴリズム、ソーティングアルゴリズム、統合アルゴリズム、数値アルゴリズム、グラフアルゴリズム、ストリングアルゴリズム、モデリングアルゴリズム、計算型幾何アルゴリズム、コンビナトリアルアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、クリプトグラフィーアルゴリズム、データ圧縮アルゴリズム、パージングアルゴリズム等であり得る。アルゴリズムは、１つのアルゴリズムまたは組み合わせて作動する２つもしくはそれより多くのアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、任意の適切な複雑性クラス、および／またはパラメータ化された複雑性のものであってもよい。アルゴリズムは計算および／またはデータ処理するのに使用することができ、一部の実施形態では、確定的または確率的／予測的なアプローチで使用することができる。アルゴリズムは、適切なプログラミング言語の使用により、演算環境内で実施可能であり、そのような言語の非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｆｏｒｔｒａｎ等がある。一部の実施形態では、アルゴリズムは、許容誤差、統計分析、統計的有意性、および／または他の情報もしくはデータセットとの比較（例えば、ドナー特異的核酸を決定するために本明細書に記載するアルゴリズム、例えば、固定カットオフアルゴリズム、動的クラスタリングアルゴリズム、または個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムを使用する際に適用可能）を含むように構成または修正され得る。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムが、ソフトウェア内で使用するために実施され得る。これらのアルゴリズムは、一部の実施形態では、生データを用いてトレーニング可能である。新しい生データ試料毎に、トレーニングされたアルゴリズムは、代表的な処理済みデータセットまたは結果を生成し得る。処理済みのデータセットは、処理された親データセットと比較して複雑性が低減されたものの場合もある。処理済みのセットに基づき、一部の実施形態では、感度および特異性に基づきトレーニングされたアルゴリズムの性能を評価することができる。最高の感度および／または特異性を有するアルゴリズムが、ある特定の実施形態では、識別および利用され得る。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、シミュレーションされた（またはシミュレーション）データが、例えばアルゴリズムをトレーニングするまたはアルゴリズムを試験することによりデータ処理を補助することができる。一部の実施形態では、シミュレーションされたデータには、配列の読取りの異なるグルーピングの、仮想的な様々なサンプリングが含まれる。シミュレーションされたデータでは、何が真の母集団から予想されるか、またはアルゴリズムを試験する、および／または正しい分類を割り当てる際に何に歪みが生じ得るか、が基準となり得る。また、シミュレーションされたデータは、本明細書では、「仮想」データとも呼ばれる。シミュレーションは、ある特定の実施形態では、コンピュータプログラムにより行われ得る。シミュレーションされたデータセットを使用する際の１つの考え得るステップは、識別された結果の信頼度を評価すること、例えばランダムサンプリングが、どのくらい良好にオリジナルデータと一致するか、またはオリジナルデータを最好に代表するか、評価することである。１つのアプローチは、確率値（ｐ値）を計算することであり、この値は、ランダム試料が選択された試料より良好なスコアを有する確率を推定する。一部の実施形態では、経験的モデルが評価される場合があり、この場合、少なくとも１つの試料が参照試料と一致することを前提とする（分解変動の有無を問わない）。一部の実施形態では、例えばポアソン分布等の別の分布が、確率分布を規定するのに使用することができる。
【０２９２】
システムは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサを含み得る。マイクロプロセッサは、コミュニケーションバスと接続され得る。コンピュータシステムは、メインメモリ、多くの場合ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含み得、二次メモリも含むことができる。一部の実施形態では、メモリは、非一時的コンピュータ読取り可能保管メディアを含む。二次メモリは、例えばハードディスクドライブおよび／またはリムーバブルストレージドライブを含み、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学式ディスクドライブ、メモリカード等がこれに該当し得る。リムーバブルストレージドライブは、多くの場合、リムーバブルストレージユニットから読み取る、および／またはこれに書き込む。リムーバブルストレージユニットの非限定的な例として、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光学式ディスク等が挙げられ、例えばリムーバブルストレージドライブにより、読取りおよび書き込み可能である。リムーバブルストレージユニットは、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータを内蔵するコンピュータ使用可能ストレージメディアを含み得る。
【０２９３】
マイクロプロセッサは、システム内でソフトウェアを実施可能である。一部の実施形態では、マイクロプロセッサは、ユーザーが行うことができる、本明細書に記載するタスクを自動的に行うようにプログラムされ得る。したがって、マイクロプロセッサまたはかかるマイクロプロセッサにより実施されるアルゴリズムは、ユーザーによる監視またはインプットを、ほとんどまたはまったく必要としないと考えられる（例えば、ソフトウェアは、機能を自動的に実施するようにプログラムされ得る）。一部の実施形態では、処理はあまりにも複雑であり、一人の個人であっても、また個人の群であっても、遺伝子の変動または遺伝子の変更の有無を決定するのに十分短いタイムフレーム内で処理を行うことは不可能である。
【０２９４】
一部の実施形態では、二次メモリは、コンピュータプログラムまたは他のインストラクションをコンピュータシステムにロードできるようにするために、他の類似した手段を含み得る。例えば、システムは、リムーバブルストレージユニットおよびインターフェースデバイスを含み得る。かかるシステムの非限定的な例として、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（ビデオゲームデバイスに見出されるもの等）、リムーバブルメモリチップ（ＥＰＲＯＭまたはＰＲＯＭ等）、および関連するソケット、ならびにソフトウェアおよびデータをリムーバブルストレージユニットからコンピュータシステムに移動できるようにする、他のリムーバブルストレージユニットおよびインターフェースが挙げられる。
【０２９５】
図２は、本明細書に記載する様々なシステム、方法、アルゴリズム、およびデータ構造の実施が可能である演算環境１１０の非限定的な例を示す。演算環境１１０は、適切な演算環境の１つの例に過ぎず、本明細書に記載するシステム、方法、およびデータ構造の使用の範囲または機能性について何らかの制限を示唆するようには意図されない。また、演算環境１１０は、演算環境１１０に示すコンポーネントの任意の１つまたはその組合せと関連する何らかの依存性または要件を有するものと解釈してはならない。図１に示すシステム、方法、およびデータ構造のサブセットは、ある特定の実施形態で利用することができる。本明細書に記載するシステム、方法、およびデータ構造は、非常に多くの他の汎用または専用の演算システム環境またはコンフィギュレーションと共に運用可能である。適切であり得る公知の演算システム、環境、および／またはコンフィギュレーションの例として、これらに限定されないが、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、シンクライアント、シッククライアント、携帯式またはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサに基づくシステム、セットトップボックス、プログラム可能な民生用電子機器、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記システムまたはデバイスのいずれかを含む分散型演算環境等が挙げられる。
【０２９６】
図２のオペレーティング環境１１０はコンピュータ１２０の形態の汎用演算デバイスを含み、これには、処理ユニット１２１、システムメモリ１２２、およびシステムメモリ１２２を含む様々なシステムコンポーネントを処理ユニット１２１に作動可能に連結させるシステムバス１２３が含まれる。コンピュータ１２０のプロセッサが、単一の中央処理ユニット（ＣＰＵ）または並列処理環境と一般的に呼ばれる複数の処理ユニットを含むように、処理ユニット１２１は１つのみ存在し得るか、または１つより多く存在し得る。コンピュータ１２０は、従来型コンピュータ、分散型コンピュータ、またはあらゆる他の種類のコンピュータであり得る。
【０２９７】
システムバス１２３は、メモリバスまたはメモリコントローラー、周辺バス、および様々なバスアーキテクチャーのいずれかを使用するローカルバスを含む、数種類のバス構造のいずれかであり得る。また、システムメモリは、単にメモリと呼ばれる場合もあり、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）１２４およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。立ち上げ時等に、コンピュータ１２０内のエレメント間の情報移送に役立つ基本ルーチンを含む基本入出力システム（ＢＩＯＳ）１２６は、ＲＯＭ１２４に保管される。コンピュータ１２０は、図示しないがハードディスクから読み出し、これに書き込むハードディスクドライブインターフェース１２７、リムーバブル磁気ディスク１２９から読み出す、またはこれに書き込む磁気ディスクドライブ１２８、およびリムーバブル光学式ディスク１３１、例えばＣＤ  ＲＯＭまたは他の光学式媒体から読み出す、またはこれに書き込む光学式ディスクドライブ１３０をさらに含み得る。
【０２９８】
ハードディスクドライブ１２７、磁気ディスクドライブ１２８、および光学式ディスクドライブ１３０は、ハードディスクドライブインターフェース１３２、磁気ディスクドライブインターフェース１３３、および光学式ディスクドライブインターフェース１３４により、システムバス１２３とそれぞれ接続される。ドライブおよびその関連するコンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読インストラクション、データ構造、プログラムモジュール、およびコンピュータ１２０用の他のデータの不揮発性の保管を提供する。コンピュータがアクセス可能なデータを保管することができる、あらゆる種類のコンピュータ可読媒体、例えば磁気カセット、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク、ベルヌーイカートリッジ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）等が、オペレーティング環境内で使用することができる。
【０２９９】
いくつかのプログラムモジュールが、オペレーティングシステム１３５、１つまたは複数のアプリケーションプログラム１３６、他のプログラムモジュール１３７、およびプログラムデータ１３８を含む、ハードディスク、磁気ディスク１２９、光学式ディスク１３１、ＲＯＭ１２４、またはＲＡＭ上に保管され得る。ユーザーは、コマンドおよび情報を、インプットデバイス、例えばキーボード１４０およびポインティングデバイス１４２を通じてパーソナルコンピュータ１２０に入力することができる。他のインプットデバイス（図示せず）として、マイクロフォン、ジョイスティック、ゲームパッド、サテライトディシュ、スキャナー等を挙げることができる。これらおよび他のインプットデバイスが、多くの場合、システムバスに連結したシリアルポートインターフェース１４６を経由して処理ユニット１２１と接続されるが、他のインターフェース、例えばパラレルポート、ゲームポート、またはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）により接続される場合もある。モニター１４７または他の種類のディスプレイデバイスも、インターフェース、例えばビデオアダプター１４８を介してシステムバス１２３と接続される。モニターに加えて、コンピュータは通常、他の周辺アウトプットデバイス（図示せず）、例えばスピーカーおよびプリンターを含む。
【０３００】
コンピュータ１２０は、１つまたは複数のリモートコンピュータ、例えばリモートコンピュータ１４９との論理接続を使用して、ネットワーク化した環境内で作動可能である。これらの論理接続は、コンピュータ１２０もしくはその一部と連結している通信デバイスにより、または他の方式で達成され得る。図１ではメモリストレージデバイス１５０しか示さなかったが、リモートコンピュータ１４９は、別のコンピュータ、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、クライアント、ピアデバイス、または他の一般的なネットワークノードであり得、通常、コンピュータ１２０と関連して上記エレメントの多くまたはすべてを含む。図１に示す論理接続として、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）１５１およびワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）１５２が挙げられる。そのようなネットワーク環境は、オフィスネットワーク、全社的コンピュータネットワーク、イントラネット、およびインターネットでは普通であり、そのいずれも典型的なネットワークである。
【０３０１】
ＬＡＮ−ネットワーク環境で使用する場合、コンピュータ１２０は、通信デバイスの一種であるローカルネットワーク１５１と、ネットワークインターフェースまたはアダプター１５３を介して接続される。ＷＡＮ−ネットワーク環境で使用する場合、コンピュータ１２０は、多くの場合、通信デバイスの一種であるモデム１５４、またはワイドエリアネットワーク１５２全体にわたり通信を確立するために他の任意の種類の通信デバイスを含む。モデム１５４は、内部または外部であってもよいが、シリアルポートインターフェース１４６を介してシステムバス１２３と接続される。ネットワーク化された環境では、パーソナルコンピュータ１２０またはその一部と関連して示されるプログラムモジュールは、リモートメモリストレージデバイス内に保管され得る。示すようなネットワーク接続は非限定的な例であり、またコンピュータ間の通信リンクを確立するための他の通信デバイスも使用することができると認識される。
【０３０２】
変換
上記のように、データは１つの形態から別の形態に変換される場合もある。用語「変換された」、「変換」、およびその文法的な派生物または同等物は、本明細書で使用する場合、物理的な出発物質（例えば、試験対象および／または参照対象試料の核酸）から物理的な出発物質のデジタル表示（例えば、配列の読取りデータ）へのデータの変更を指し、一部の実施形態では、結果を提供するのに利用できる１つもしくは複数の数値への、またはデジタル表示の図形表示へのさらなる変換を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の数値および／またはデジタル的に表示されたデータの図形表示は、試験対象の物理的なゲノムの状況を表すのに利用できる（例えば、ゲノムの挿入、重複、または欠失の有無を仮想的に表すまたは可視的に表す；医学的状態と関連した配列の物理量の変動の有無を表す）。仮想表示は、１つもしくは複数の数値、または出発物質のデジタル表示の図形表示にさらに変換される場合もある。これらの方法は、物理的な出発物質を、数値もしくは図形表示に、または試験対象核酸の物理的状況表示に変換することができる。
【０３０３】
一部の実施形態では、データセットを変換すると、データの複雑性および／またはデータの次元数が低減し、これによりアウトカムの提供を促進する。データセットの複雑性は、物理的な出発物質を出発物質の仮想表示に変換するプロセスの際に低減する場合もある（例えば、物理的な出発物質を表す配列の読取り）。適切な特徴または変数が、データセットの複雑性および／または次元数を低減するのに利用することができる。データ処理するための標的特徴として使用するのに選択することができる特徴の非限定的な例として、ＧＣ含有量、断片サイズ（例えば、循環型無細胞断片の長さ、その読取りまたは適切な表示（例えば、ＦＲＳ））、断片配列、特定の遺伝子またはタンパク質の同定、がん、疾患、遺伝性の遺伝子／形質、染色体異常の同定、生物学的カテゴリー、化学的カテゴリー、生化学的カテゴリー、遺伝子またはタンパク質のカテゴリー、遺伝子オントロジー、タンパク質オントロジー、同時制御された遺伝子、細胞シグナル伝達遺伝子、細胞周期遺伝子、上記遺伝子に関連するタンパク質、遺伝子バリアント、タンパク質バリアント、同時制御された遺伝子、同時制御されたタンパク質、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、タンパク質構造データ等、および上記の組合せが挙げられる。データセットの複雑性および／または次元数の低減に関する非限定的な例として；複数の配列の読取りのプロファイルプロットへの低減、複数の配列の読取りの数値への低減（例えば、対立遺伝子頻度、正規化した値、Ｚスコア、ｐ値）；複数の分析方法の確率プロットもしくは単一ポイントへの低減；導き出された数量の主成分分析等、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０３０４】
本発明の例示的な実施形態：
１．移植片状態を決定する方法であって：
（ａ）ドナーから臓器を受けた臓器移植片レシピエントから生体試料を得るステップと、
（ｂ）生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
（ｃ）生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づき、コンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を同定し、それによって、１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｅ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出し、それによって、移植片状態を決定するステップと
を含む、方法。
【０３０５】
２．臓器が、同種供給源由来の固形臓器である、実施形態１に記載の方法。
【０３０６】
２．１．生体試料中の、ドナーに対して特異的である多型核酸標的の量および循環型無細胞核酸中の多型核酸標的の総量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む、実施形態１または２に記載の方法。
【０３０７】
３．前記多型核酸標的が、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）コピー数バリアント、（ｖｉ）挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組合せを含む、実施形態１または２に記載の方法。
【０３０８】
４．項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せが、ショートタンデムリピートと組み合わせた欠失挿入バリアント（ＤＩＰ−ＳＴＲ）である、実施形態３に記載の方法。
【０３０９】
５．前記多型核酸標的が、１つまたは複数のＳＮＰを含む、実施形態３に記載の方法。
【０３１０】
５．１．１つまたは複数のＳＮＰが、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せがＡ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない、実施形態５に記載の方法。
【０３１１】
６．各多型核酸標的が、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【０３１２】
７．ＳＮＰが、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む、実施形態３、５または６のいずれかに記載の方法。
【０３１３】
８．臓器移植片レシピエント由来の生体試料が体液である、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【０３１４】
９．体液が、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便のうち１つまたは複数である、実施形態１〜７に記載の方法。
【０３１５】
１０．臓器ドナーの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【０３１６】
１０．１．レシピエントの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
ＩＶ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的をフィルタリング除外するステップと
Ｖ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する残存多型核酸標的の測定値からなるデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的における残存多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、実施形態１０に記載の方法。
【０３１７】
１１．レシピエントの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態１〜１０に記載の方法。
【０３１８】
１１．１．ドナーの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップが、
Ｉ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満である多型核酸標的ならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在し、ドナー対立遺伝子頻度が０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）生体試料中の残存多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、実施形態１１に記載の方法。
【０３１９】
１２．レシピエントの遺伝子型も臓器ドナーの遺伝子型も、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態１〜１１に記載の方法。
【０３２０】
１２．１．（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
Ｉ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する１つまたは複数の多型核酸標的の量の測定値からなるデータセットでコンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
第２のクラスターが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せでレシピエントおよびドナー中に存在する多型核酸標的を含む、ステップと、
ＩＩ）第１のクラスター中の多型核酸標的の存在に基づいてドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、実施形態１２に記載の方法。
【０３２１】
１３．アルゴリズムが、（ｉ）固定カットオフ、（ｉｉ）動的クラスタリングおよび（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値のうち１つまたは複数である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０３２２】
１４．試料中の無細胞核酸における１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、参照集団中の参照対立遺伝子の予測頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出し、
参照対立遺伝子の予測頻度が、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある、実施形態１３に記載の方法。
【０３２３】
１５．レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフ未満である場合に、固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、実施形態１４に記載の方法。
【０３２４】
１５．１．レシピエントが、代替対立遺伝子についてホモ接合性であり、１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフより大きい場合に、固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、実施形態１５に記載の方法。
【０３２５】
１６．固定カットオフが、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、実施形態１３〜１５．１のいずれかに記載の方法。
【０３２６】
１７．固定カットオフが、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている、実施形態１３〜１５．１に記載の方法。
【０３２７】
１８．パーセンタイルが、少なくとも９０である、実施形態１７に記載の方法。
【０３２８】
１９．動的クラスタリングアルゴリズムを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップが、
（ｉ）無細胞核酸中の１つまたは複数の多型核酸標的を、多型核酸標的各々の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、
（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、
（ｉｉｉ）情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップと
を含む、実施形態１３に記載の方法。
【０３２９】
２０．動的クラスタリングアルゴリズムが、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムである、実施形態１９に記載の方法。
【０３３０】
２１．多型核酸標的の１つまたは複数の各々の対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合に、個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムが、１つまたは複数の核酸をドナー特異的核酸として同定する、実施形態１３に記載の方法。
【０３３１】
２２．閾値が、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、実施形態２１に記載の方法。
【０３３２】
２３．閾値が、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である、実施形態２２に記載の方法。
【０３３３】
２５．前記移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量が、少なくとも１つのアッセイにおいて１つまたは複数の多型核酸標的を測定することによって検出され、
少なくとも１つのアッセイが、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
【０３３４】
２６．高スループット配列決定が、ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅またはＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む、実施形態２５に記載の方法。
【０３３５】
２７．天然ゲノム核酸および天然配列と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するバリアントオリゴに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅をさらに含み、
バリアントオリゴが、既知量で増幅反応に付加され、
増幅された天然ゲノム核酸の量の、増幅されたバリアントオリゴの量に対する比を決定するステップと、
比に、増幅反応に付加されたバリアントオリゴの量を乗じることによってゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
をさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
【０３３６】
２８．生体試料中の循環型無細胞核酸においてゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
ドナー特異的核酸フラクションおよびゲノムＤＮＡの総コピー数を乗じることによってドナー特異的核酸のコピー数を決定するステップと
をさらに含む、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。
【０３３７】
２９．１つまたは複数の多型核酸標的の量が、１つまたは複数の多型核酸標的各々の各対立遺伝子の配列の読取りに基づいて決定される、実施形態２５に記載の方法。
【０３３８】
３０．同種供給源が、腎臓、心臓、肺、膵臓、腸、胃、および肝臓移植片の少なくとも１つに由来する、実施形態１〜２９のいずれかに記載の方法。
【０３３９】
３１．ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも大きい場合に、移植片状態が拒絶として決定され、
ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも小さい場合に、移植片状態が受容として決定される、実施形態２４に記載の方法。
【０３４０】
３２．ドナー特異的核酸のコピー数が所定の閾値よりも大きい場合に、移植片状態が拒絶として決定され、
ドナー特異的核酸のコピー数が所定の閾値よりも小さい場合に、移植片状態が受容として決定される、実施形態１〜３０のいずれかに記載の方法。
【０３４１】
３３．移植片状態が、早い時点および早い時点より後の遅い時点を含み、すべての時点が移植後である１つまたは複数の時点でモニタリングされ、
遅い時点と比較した、早い時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションの増大、またはドナー特異的循環型無細胞核酸のコピー数の増大が、移植片拒絶の発生を示し、早い時点と遅い時点の間の時間間隔が、少なくとも７日である、先行する実施形態のいずれかに記載の移植片状態を検出する方法。
【０３４２】
３４．早い時点が、移植後０日〜１年の間である、実施形態３３に記載の方法。
【０３４３】
３５．遅い時点が、移植後７日〜５年の間である、実施形態３３に記載の方法。
【０３４４】
３６．臓器移植片レシピエントに、免疫抑制療法の投与を助言するステップまたは臓器移植片レシピエントの免疫抑制療法の修飾を助言するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０３４５】
３７．先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法を実施するためのシステム。
【０３４６】
３８．移植片状態を決定するシステムであって、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のプロセッサに連結されたメモリであって、
（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ａ）からの１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に少なくとも基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の有無を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の決定された存在または量に少なくとも基づいて臓器移植片レシピエントの移植片状態を決定するステップと
を含むプロセスを実施するように構成されたインストラクションのセットを用いてコード化されたメモリとを含む、システム。
【０３４７】
３９．前記多型核酸標的が、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）１つまたは複数のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）１つまたは複数の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）１つまたは複数のコピー数バリアント、（ｖｉ）１つまたは複数の挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せを含む、実施形態３８に記載のシステム。
【０３４８】
４０．前記多型核酸標的が、１つまたは複数のＳＮＰを含む、実施形態３８に記載のシステム。
【０３４９】
４０．１．１つまたは複数のＳＮＰが、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せがＡ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない、実施形態４０に記載のシステム。
【０３５０】
４１．多型核酸標的各々が、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する、実施形態３８に記載のシステム。
【０３５１】
４２．ＳＮＰが、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む、実施形態３８〜４１のいずれかに記載のシステム。
【０３５２】
４３．臓器移植片レシピエント由来の生体試料が、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便からなる群から選択される、実施形態３８〜４２のいずれかに記載のシステム。
【０３５３】
４４．臓器ドナーの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態３８〜４３のいずれかに記載のシステム。
【０３５４】
４４．１．レシピエントの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、ＤＦ３による、実施形態４４に記載のシステム。
【０３５５】
４５．レシピエントの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態３８〜４４のいずれかに記載のシステム。
【０３５６】
４５．１．ドナーの遺伝子型が、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、方法が、ＤＦ２によるドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップを含む、実施形態４５に記載のシステム。
【０３５７】
４６．レシピエントの遺伝子型も臓器ドナーの遺伝子型も、移植片状態決定の前に１つまたは複数の多型核酸標的について知られていない、実施形態３８〜４５のいずれかに記載のシステム。
【０３５８】
４６．１．ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、ＤＦ１による、実施形態４６に記載のシステム。
【０３５９】
４７．ドナー特異的核酸が、（ｉ）固定カットオフアプローチ、（ｉｉ）動的クラスタリングアプローチ、および（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値アプローチのうち１つまたは複数を使用して検出される、実施形態３８または実施形態４６に記載のシステム。
【０３６０】
４８．試料中の無細胞核酸における１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、対立遺伝子の予測対立遺伝子頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、固定カットオフアプローチが、ドナー特異的核酸を検出し、
参照対立遺伝子の予測頻度が、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
レシピエントが、代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある、実施形態４７に記載のシステム。
【０３６１】
４９．レシピエントが、参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度が、固定カットオフよりも大きい場合に、固定カットオフアプローチが、ドナー特異的核酸を検出する、実施形態４７に記載のシステム。
【０３６２】
５０．固定カットオフが、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、実施形態４７に記載のシステム。
【０３６３】
５１．固定カットオフが、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的の参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている、実施形態４７〜５０のいずれかに記載のシステム。
【０３６４】
５２．パーセンタイルが９０である、実施形態５１に記載のシステム。
【０３６５】
５３．動的クラスタリングアプローチを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップが、
（ｉ）無細胞核酸中の１つまたは複数の多型核酸標的を、多型核酸標的各々の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、
（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、
（ｉｉｉ）情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップと
を含む、実施形態４７に記載のシステム。
【０３６６】
５４．動的クラスタリングアプローチが、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムを使用する、実施形態４７に記載のシステム。
【０３６７】
５５．多型核酸標的の１つまたは複数各々の対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合、個々の多型核酸標的閾値アプローチが、１つまたは複数の核酸を、ドナー特異的核酸として同定する、実施形態４８に記載のシステム。
【０３６８】
５６．閾値が、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、実施形態５５に記載のシステム。
【０３６９】
５７．閾値が、参照集団中の１つまたは複数の多型核酸標的各々のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である、実施形態５５または５６に記載のシステム。
【０３７０】
５８．生体試料中の、ドナーに対して特異的である多型核酸標的の量および循環型無細胞核酸中の多型核酸標的の総量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む、実施形態３８〜５７のいずれかに記載のシステム。
【０３７１】
５９．前記移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量を決定するステップが、少なくとも１つのアッセイにおいて１つまたは複数の多型核酸標的プロファイルを測定することによって実施され、
少なくとも１つのアッセイが、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である、実施形態３８〜５８のいずれかに記載のシステム。
【０３７２】
６０．高スループット配列決定が、ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅またはＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む、実施形態５９に記載のシステム。
【０３７３】
６１．ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも大きい場合に、移植片状態が拒絶として決定され、
ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも小さい場合に、移植片状態が受容として決定される、実施形態３８に記載のシステム。
【０３７４】
６２．移植片状態が、第１の時点および第１の時点の後の第２の時点でモニタリングされ、いずれの時間も移植後であり、
第２の時点に対して、第１の時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸の増大が、移植片拒絶の発生を示し、第１の時点と第２の時点の間の時間間隔が、少なくとも７日である、実施形態３８に記載の移植片状態を検出するシステム。
【０３７５】
６３．第１の時点が、移植後７日〜１年の間である、実施形態６２に記載のシステム。
【０３７６】
６４．第２の時点が、移植後１４日〜２年の間である、実施形態６２または６３に記載のシステム。
【０３７７】
６５．１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、１つまたは複数のプロセッサに移植片状態を決定する方法を実施させるプログラムインストラクションを含む非一時的な機械可読記憶媒体であって、方法が
（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップと
を含む、非一時的な機械可読記憶媒体。
【０３７８】
本発明を行うための特定の態様の以下の実施例は、説明目的に限って提供され、本発明の範囲をいかなるようにも制限することは意図しない。
【実施例】
【０３７９】
（実施例１）
移植片拒絶を決定するためのＳＮＰパネルの開発
血液試料を肝臓移植片レシピエントから様々な時点：移植前、移植の２日後、および９日後に採取する。血液試料を、血液凝固を防止するためにＥＤＴＡを含有するチューブまたは専用の市販製品、例えばＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、およびＮ．Ｊ．）に入れる。細胞を、冷蔵遠心分離機を使用して１，０００〜２，０００×ｇでの１０分間の遠心分離によって血漿から分離する。得られた上清は血漿であり、これを滅菌ピペットによってきれいなバイアルに直ちに移す。血漿試料を−２０℃で保存し、使用時に解凍する。
【０３８０】
血漿試料を、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＱＣＮＡ）キットを使用して処理し、無細胞ＤＮＡを産生する。
【０３８１】
ＰＣＲ反応を、ＳＮＰパネルに対して特異的なプライマー（ＳＮＰおよびそれぞれのプライマー（第１のプライマーおよび第２のプライマー）の配列を表３および表４に提供する）によってセットアップして、ＳＮＰを増幅する。加えて、天然のＲＮＡｓＰと比較して単一ヌクレオチド置換を有するＲＮＡｓＰバリアントオリゴおよび天然のＡｐｏＥと比較して単一ヌクレオチド置換を有するＡｐｏＥバリアントオリゴも同様に、ＳＮＰパネルと同時に増幅される既知量でＰＣＲ反応に添加する。ＲＮＡｓＰおよびＡｐｏＥバリアントオリゴの配列を表５に提供する。
【０３８２】
第１のプライマーおよび第２のプライマーからなるプライマー対を使用してＳＮＰの各々を配列決定し、その配列を表５に提供する。増幅産物を配列決定し、ＳＮＰを含む増幅産物のコピー数を決定して、ＳＮＰの各々に関する参照対立遺伝子および代替対立遺伝子の相対頻度を計算する。
【０３８３】
ＳＮＰは、ｉ）ＳＮＰの対立遺伝子の頻度分布が、レシピエントが参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、ドナーが代替対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であることを示している場合、およびｉｉ）予測頻度からの代替対立遺伝子頻度のパーセント（％）シフトとして表される代替対立遺伝子頻度が、固定カットオフ頻度よりも大きい場合、情報価値のあるＳＮＰとして選択される。次いで、ドナーフラクションを、選択した情報価値のあるＳＮＰの代替対立遺伝子頻度に基づいて決定する。
【０３８４】
増幅された天然のＲＮＡｓＰおよびＲＮＡｓＰバリアント、ならびに増幅された天然のＡｐｏＥおよびＡｐｏＥバリアントを、配列決定によって定量化し、それぞれの天然の核酸のバリアントオリゴに対する比を計算する。ｃｆＤＮＡ中のゲノムＤＮＡの総コピーを、以下の式に基づいて決定する：
【０３８５】
ｃｆＤＮＡ中のゲノムＤＮＡの総コピー数＝増幅された天然のＡｐｏＥ（またはＲＮＡｓＰ）の量の、増幅されたＡｐｏＥ（またはＲＮＡｓＰ）バリアントの量に対する比×増幅前に添加したバリアントオリゴの量
【０３８６】
ドナー特異的無細胞核酸のコピー数＝ｃｆＤＮＡ中のゲノムＤＮＡの総コピー数×ドナー特異的核酸フラクション
【０３８７】
様々な時点で採取した血液試料に由来する血漿試料由来のドナー特異的無細胞核酸の量を、上記のように決定し、比較する。移植後の試料中のドナー特異的無細胞核酸の量が移植前の試料のベースラインレベルよりも大きく、ドナー特異的無細胞核酸の量が時間と共に増加し、すなわち、遅い時点からの試料中のレベルが、移植前の早い時点からの試料中のレベルよりも大きい場合、移植片は拒絶されている。
【表３−１】
2022500015.tif 000007
【表３−２】
2022500015.tif 000008
【表３−３】
2022500015.tif 000009
【表３−４】
2022500015.tif 000010
【表３−５】
2022500015.tif 000011
【表３−６】
2022500015.tif 000012
【表３−７】
2022500015.tif 000013
【表４−１】
2022500015.tif 000014
【表４−２】
2022500015.tif 000015
【表５−１】
2022500015.tif 000016
【表５−２】
2022500015.tif 000017
【０３８８】
（実施例２）
感度が改善されたＳＮＰパネルの設計
上記のパネルＡにおける２２６個のＳＮＰを含む移植モニタリングｖ１  ２２８ｐｌｅｘパネルは、臓器移植患者におけるドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ−ｃｆＤＮＡ）を非侵襲性の検出のために設計された高度に多重化されたＰＣＲに基づく標的濃縮である。パネルは、ドナーフラクションを測定するための２２６個のＳＮＰおよびＤＮＡインプットのコピーの総量を測定するための２つの合成競合体を標的とする。ドナーフラクション、すなわちレシピエント血漿中でドナー由来であるｃｆＤＮＡのパーセントを、臓器傷害および急性拒絶のバイオマーカーとして使用する。移植片拒絶および移植片におけるその後の細胞損傷の過程において、ｄｄ−ｃｆＤＮＡが放出され、ドナーフラクションが増加する。ＰＣＲ反応中で使用されるＤＮＡの量が不十分である場合、ドナーフラクションの測定は精度を失うことから、総コピーを、ドナーフラクション測定の品質管理測定値として使用する。
【０３８９】
総コピーおよびドナーフラクションの両方を測定するために使用した重要な変数は、２２８個の標的各々に関する対立遺伝子頻度である。これは、参照対立遺伝子のカウント、参照および代替対立遺伝子カウントの両方の合計に対する比である。単一の個体からのＤＮＡを有する純粋な試料では、二対立遺伝子ＳＮＰのみが対立遺伝子頻度０（代替対立遺伝子についてホモ接合性）、０．５（参照および代替対立遺伝子についてヘテロ接合性）、または１（参照対立遺伝子についてホモ接合性）を有し得る。臓器移植患者に関して、ｃｆＤＮＡは、ドナーおよびレシピエントｃｆＤＮＡの混合物である。ドナーフラクションは、「情報価値のある」ＳＮＰから決定されるが、対立遺伝子頻度は、ドナーおよびレシピエントの遺伝子型の差により、０、０．５、または１からシフトする。これは、例えばレシピエントが対立遺伝子についてホモ接合性であり（例えば、ＡＡ）、レシピエントが異なる対立遺伝子についてヘテロ接合性（例えば、ＡＢ）またはホモ接合性（例えば、ＢＢ）である場合に起こる。
【０３９０】
ｖ１パネル（ｖ１パネルは表１におけるＳＮＰパネルＡ、および実施例２に記載されるようにＤＮＡインプットのコピーの総量を測定するための２つの合成競合体を指す）の特徴付けの際に、ＳＮＰのある特定のカテゴリーが、より高い量の偏りおよびその対立遺伝子頻度の可変性を有することが決定された。ホモ接合性ＳＮＰの場合、対立遺伝子頻度は、０または１に等しいはずである。バックグラウンドは、０または１からの偏りの中央値として定義される。これは部分的に配列決定エラーまたはＰＣＲエラーによって引き起こされる。可変性は、エラーフリー測定においてホモ接合性対立遺伝子頻度の中央値絶対偏差（ＭＡＤ）であり、これは０であろう。これらの二対立遺伝子ＳＮＰを参照および代替対立遺伝子のその組合せ（Ｒｅｆ＿Ａｌｔと省略される）によって分類すると、Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿Ｔ、およびＴ＿Ｃは、ホモ接合性ＳＮＰに関して最高の中央値およびＭＡＤを有し（図９）、パネルの７８．５％を表す（図１０）ことが観察される。これらのＲｅｆ＿Ａｌｔの組合せは、検出することができるドナーフラクションに対する下限として役立つ。
【０３９１】
これは、低レベルのドナーフラクションに関する感度を改善するためにより低いバックグラウンドＲｅｆ＿Ａｌｔの組合せのみを有するｖ２パネルの開発の動機となった。ｖ２パネルはｖ１パネルからの４７個のＳＮＰを保持し、すべてが所望のＲｅｆ＿Ａｌｔの組合せ（Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿Ｔ、またはＴ＿Ｃのいずれでもない）を有する３２８の新しいアッセイを含める。
【０３９２】
設計プロセスにおける第１のステップは、ユニバーサルな個々の同定パネルとして役立ち得るＳＮＰを同定することである。目標は、集団（例えば、アジア、ヨーロッパ、アフリカ等）によらず、ｄｄ−ｃｆＤＮＡをレシピエントｃｆＤＮＡから区別することが可能であることである。ＡＬｌｅｌｅ  ＦＲＥｑｕｅｎｃｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＡＬＦＲＥＤ、サイト：http://afred.med.yale.edu/afred/sitesWithfst.asp）は、ヒト集団における対立遺伝子頻度データを提供する。固定指数（ＦＳＴ）は、総遺伝子の分散と比較して亜集団に含有される総遺伝子の分散の割合である。低い値はほとんどの集団において同様の遺伝子の分散を有するＳＮＰを得るために望ましい。パネル開発の第１のステップは、少なくとも５０の集団に基づいて０．０６よりも低いＦＳＴを有するＳＮＰを得るためにこのデータベースをフィルタリングすることであった。ＳＮＰにさらにフィルタリングを行って、０．４の最少平均ヘテロ接合性（可能性がある最大値は０．５である）を確保した。これは、パネル中の「情報価値のある」ＳＮＰの割合を増加させ、ドナーフラクションの測定における信頼度を増加させる。このフィルタリングは、３６１８個のＳＮＰをもたらした。
【０３９３】
ＦＡＳＴＡ配列を、ｄｂＳＮＰからこれらのＳＮＰに関して得た（サイト：ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/dbSNP.cgi?list=rslist）。平均すると、これは、ＳＮＰの上流および下流の両方でＳＮＰプラス５００ｂｐを含む１００１ｂｐのフランキング配列を提供した。これらの配列を、図１１に示すパラメータと共にプライマー設計ツールＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３（サイト：probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）において使用して、各ＳＮＰに関する候補プライマーを得た。
【０３９４】
ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３を通しての処理により、設計の判断基準を満たす２６４５個のアッセイがもたらされた。これらのＳＮＰを、ｄｂＳＮＰデータベースから得た追加の特徴に基づいてさらにフィルタリングした。以下の判断基準のすべてを満たす場合、ＳＮＰを選択した：
１．二対立遺伝子性。
２．ＳＮＰはプライマーアニーリング領域内に位置しない。
３．１０００人ゲノムプロジェクトによって検証されている。
４．ｒｅｆ＿ａｌｔ組合せは、Ａ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿Ｔ、またはＴ＿Ｃのいずれでもない。
５．マイナー対立遺伝子頻度が少なくとも０．３である。
６．増幅された標的領域の配列はユニークであり、ゲノムの他所で見出すことができない。
【０３９５】
結果は、総コピー計算に関して２つのアッセイおよびドナーフラクション測定値に関して３７５個のアッセイを含む３７７ｐｌｅｘパネルである。ドナーフラクションアッセイは、ｖ１パネルからの４７個のプライマーおよび３２８個の新たに設計されたプライマーからなる。このパネルをさらにフィルタリングして、低い深度、高い対立遺伝子頻度偏り（純粋な試料による試験において０、０．５、または１からの偏差）を有する、またはアラインメントもしくはオンターゲットの比（非アラインまたはオフターゲット読取りを、プライマーの各々の最初の１８ｂｐに再度アラインさせることから決定した）を低下させるために有意な役割を有するアッセイを除去後、１９８ｐｌｅｘ（総コピーに関して２、ドナーフラクションに関して１９６）（表６）を得た。表７は、除外されたＳＮＰを列挙し、その除外理由を提供する。第１のプライマーおよび第２のプライマーをプライマー対として使用して、表６および７の同じ行におけるＳＮＰを含有する領域を増幅した。
【表６−１】
2022500015.tif 000018
【表６−２】
2022500015.tif 000019
【表６−３】
2022500015.tif 000020
【表６−４】
2022500015.tif 000021
【表６−５】
2022500015.tif 000022
【表６−６】
2022500015.tif 000023
【表６−７】
2022500015.tif 000024
【表７−１】
2022500015.tif 000025
【表７−２】
2022500015.tif 000026
【表７−３】
2022500015.tif 000027
【表７−４】
2022500015.tif 000028
【表７−５】
2022500015.tif 000029
【表７−６】
2022500015.tif 000030
【表７−７】
2022500015.tif 000031
【表７−８】
2022500015.tif 000032
【表７−９】
2022500015.tif 000033
【表７−１０】
2022500015.tif 000034
【表７−１１】
2022500015.tif 000035
【表７−１２】
2022500015.tif 000036
【表７−１３】
2022500015.tif 000037
【表７−１４】
2022500015.tif 000038
【図１】
2022500015.tif 000039
【図２】
2022500015.tif 000040
【図３】
2022500015.tif 000041
【図４】
2022500015.tif 000042
【図５】
2022500015.tif 000043
【図６】
2022500015.tif 000044
【図７】
2022500015.tif 000045
【図８】
2022500015.tif 000046
【図９】
2022500015.tif 000047
【図１０】
2022500015.tif 000048
【図１１】
2022500015.tif 000049
【配列表】
2022500015000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月10日(2021.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または量を、移植片状態を決定するための指標とする方法であって、
（ａ）ドナーから臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られた生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
（ｂ）前記生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づき、コンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を検出し、それによって、前記１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｄ）前記１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出するステップと
を含み、前記ドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または量が、前記移植片状態を決定するための指標となる、方法。
【請求項２】
前記臓器が、同種供給源由来の固形臓器である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料中の、ドナーに対して特異的である前記多型核酸標的の量および循環型無細胞核酸中の前記多型核酸標的の総量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多型核酸標的が、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）１つまたは複数のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）１つまたは複数の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）１つまたは複数のコピー数バリアント、（ｖｉ）挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せが、ショートタンデムリピートと組み合わせた欠失挿入バリアント（ＤＩＰ−ＳＴＲ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多型核酸標的が、１つまたは複数のＳＮＰを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のＳＮＰが、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せがＡ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各多型核酸標的が、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＮＰが、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む、請求項４、６または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
臓器移植片レシピエント由来の前記生体試料が、体液であり、前記体液が、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便のうち１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記臓器ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｃ）ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／または前記ドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
ＶＩ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的をフィルタリング除外するステップと
ＶＩＩ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記残存多型核酸標的の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
ＶＩＩＩ）前記生体試料中の前記１つまたは複数の多型核酸標的における前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｃ）前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップが、
Ｉ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満である多型核酸標的ならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）前記生体試料中の前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエントも前記臓器ドナーも、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されておらず、前記（ｃ）ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
Ｉ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記１つまたは複数の多型核酸標的の量の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含む、ステップと、
ＩＩ）前記第１のクラスター中の前記多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルゴリズムが、（ｉ）固定カットオフ、（ｉｉ）動的クラスタリングおよび（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値のうち１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記無細胞核酸における前記１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、参照集団中の前記参照対立遺伝子の予測頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出し、
前記参照対立遺伝子の前記予測頻度が、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフ未満である場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフより大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている、請求項１４から１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記パーセンタイルが、少なくとも９０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動的クラスタリングアルゴリズムを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップが、
（ｉ）前記無細胞核酸中の前記１つまたは複数の多型核酸標的を、各前記多型核酸標的の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、
（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップと
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記動的クラスタリングアルゴリズムが、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多型核酸標的の１つまたは複数の各々の前記対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合に、前記個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムが、前記１つまたは複数の核酸を、ドナー特異的核酸として同定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記閾値が、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記閾値が、前記参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々の前記ホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量が、少なくとも１つのアッセイにおいて前記１つまたは複数の多型核酸標的を測定することによって検出され、
前記少なくとも１つのアッセイが、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記高スループット配列決定が、前記ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅または前記ＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
天然ゲノム核酸および前記天然配列と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するバリアントオリゴヌクレオチドに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅をさらに含み、
前記バリアントオリゴヌクレオチドが、既知量で前記増幅反応に付加され、
増幅された天然ゲノム核酸の量の、増幅されたバリアントオリゴヌクレオチドの量に対する比を決定するステップと、
前記比に、前記増幅反応に付加された前記バリアントオリゴヌクレオチドの量を乗じることによってゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体試料中の循環型無細胞核酸においてゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
前記ドナー特異的核酸フラクションおよびゲノムＤＮＡの前記総コピー数を乗じることによって前記ドナー特異的核酸の前記コピー数を決定するステップと
をさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値より大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
翻訳後種々の時間での前記移植片状態をモニタリングするステップをさらに含み、
前記移植片状態が、早い時点および少なくとも１つの遅い時点を含み、すべての時点が移植後である１つまたは複数の時点でモニタリングされ、
前記早い時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションの、またはドナー特異的循環型無細胞核酸の前記コピー数の、前記少なくとも１つの遅い時点と比較した増大が、移植片拒絶の発生を示し、前記早い時点と前記少なくとも１つの遅い時点の間の時間間隔が、少なくとも７日である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記早い時点が、移植後０日〜１年の間であり、および／または前記遅い時点が、移植後７日〜５年の間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
移植片状態を決定するシステムであって、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のプロセッサに連結されたメモリとを含む、システムであって、前記メモリは、
生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ａ）からの１つまたは複数の多型核酸標的の前記測定値に少なくとも基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または非存在を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の決定された存在または量に少なくとも基づいて前記臓器移植片レシピエントの移植片状態を決定するステップと
を含むプロセスを実施するように構成された命令のセットがエンコードされている、システム。
【請求項３５】
１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、前記１つまたは複数のプロセッサに、移植片状態を決定する方法を実施させるプログラム命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体であって、前記方法が、
（ａ）生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの前記測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップと
を含む、非一時的な機械可読記憶媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、１つまたは複数のプロセッサに、本明細書において開示される実施形態のうちいずれか１つにおける方法を実施させるプログラムインストラクションを含む非一時的な機械可読記憶媒体が、本開示において提供され、一部の実施形態では、非一時的な機械可読記憶媒体は、１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、１つまたは複数のプロセッサに、（ａ）生体試料から単離された循環型無細胞核酸として存在する１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップとを含む方法を実施させるプログラムインストラクションを含み得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
移植片状態を決定する方法であって、
（ａ）ドナーから臓器を受けた臓器移植片レシピエントから生体試料を得るステップと、
（ｂ）前記生体試料から無細胞核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記生体試料中の１つまたは複数の多型核酸標的の各対立遺伝子の量を測定するステップと、
（ｄ）前記１つまたは複数の多型核酸標的の測定値に基づき、コンピュータアルゴリズムを使用してドナー特異的対立遺伝子を検出し、それによって、１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｅ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて組織傷害を検出し、それによって、移植片状態を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記臓器が、同種供給源由来の固形臓器である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生体試料中の、ドナーに対して特異的である前記多型核酸標的の量および循環型無細胞核酸中の前記多型核酸標的の総量に基づいてドナー特異的核酸フラクションを決定するステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記多型核酸標的が、（ｉ）１つまたは複数のＳＮＰ、（ｉｉ）１つまたは複数の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、（ｉｉｉ）１つまたは複数のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、（ｉｖ）１つまたは複数の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、（ｖ）１つまたは複数のコピー数バリアント、（ｖｉ）挿入／欠失バリアントまたは（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記項目（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかの組合せが、ショートタンデムリピートと組み合わせた欠失挿入バリアント（ＤＩＰ−ＳＴＲ）である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記多型核酸標的が、１つまたは複数のＳＮＰを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記１つまたは複数のＳＮＰが、参照対立遺伝子と代替対立遺伝子の組合せがＡ＿Ｇ、Ｇ＿Ａ、Ｃ＿ＴおよびＴ＿Ｃからなる群から選択されるＳＮＰを含まない、項目６に記載の方法。
（項目８）
各多型核酸標的が、１５％〜４９％のマイナー集団対立遺伝子頻度を有する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＳＮＰが、表１または表６中の配列番号の少なくとも１、２、３または４つまたはそれより多いＳＮＰを含む、項目４、６または８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
臓器移植片レシピエント由来の前記生体試料が、体液であり、前記体液が、血液、血清、血漿、唾液、涙、尿、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液、痰および糞便のうち１つまたは複数を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記臓器ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を同定するステップおよび／または前記ドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
ＶＩ）１）ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的をフィルタリング除外するステップと
ＶＩＩ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記残存多型核酸標的の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在するＳＮＰを含む、ステップと、
ＶＩＩＩ）前記生体試料中の前記１つまたは複数の多型核酸標的における前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記レシピエントの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られておらず、前記ドナーの遺伝子型が、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について知られており、前記（ｄ）前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップが、
Ｉ）１）ＡＡレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５未満である多型核酸標的ならびに２）ＢＢレシピエント／ＢＢドナーおよびＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在し、前記ドナー対立遺伝子頻度が０．５より大きいＳＮＰをフィルタリング除外するステップと、
ＩＩ）前記生体試料中の前記残存多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記レシピエントも前記臓器ドナーも、前記移植片状態決定の前に前記１つまたは複数の多型核酸標的について遺伝子型を同定されておらず、前記（ｄ）ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップおよび／またはドナー特異的核酸フラクションを決定するステップが、
Ｉ）第１のクラスターおよび第２のクラスターを形成する前記１つまたは複数の多型核酸標的の量の測定値からなるデータセットで前記コンピュータアルゴリズムを実施するステップであって、
前記第１のクラスターが、ＡＡレシピエント／ＡＢドナー、ＢＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＡレシピエント／ＢＢドナーまたはＢＢレシピエント／ＡＡドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含み、
前記第２のクラスターが、ＡＢレシピエント／ＡＢドナー、ＡＢレシピエント／ＡＡドナーまたはＡＢレシピエント／ＢＢドナーの遺伝子型組合せで前記レシピエントおよび前記ドナー中に存在する多型核酸標的を含む、ステップと、
ＩＩ）前記第１のクラスター中の前記多型核酸標的の存在に基づいて前記ドナー特異的対立遺伝子を検出するステップと
を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記アルゴリズムが、（ｉ）固定カットオフ、（ｉｉ）動的クラスタリングおよび（ｉｉｉ）個々の多型核酸標的閾値のうち１つまたは複数を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記試料中の前記無細胞核酸における前記１つまたは複数の多型核酸標的の参照対立遺伝子の実測頻度と、参照集団中の前記参照対立遺伝子の予測頻度の間の偏差が、固定カットオフよりも大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出し、
前記参照対立遺伝子の前記予測頻度が、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．００〜０．０３、
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合に０．４０〜０．６０、または
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性である場合に０．９７〜１．００
の範囲にある、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記レシピエントが、前記参照対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフ未満である場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記レシピエントが、前記代替対立遺伝子についてホモ接合性であり、前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照対立遺伝子の前記実測対立遺伝子頻度が、前記固定カットオフより大きい場合に、前記固定カットオフアルゴリズムが、ドナー特異的核酸を検出する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、項目１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記固定カットオフが、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の前記参照または代替対立遺伝子のホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値に基づいている、項目１４から１７に記載の方法。
（項目２０）
前記パーセンタイルが、少なくとも９０である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記動的クラスタリングアルゴリズムを使用して１つまたは複数の無細胞核酸をドナー特異的核酸として同定するステップが、
（ｉ）前記無細胞核酸中の前記１つまたは複数の多型核酸標的を、各前記多型核酸標的の参照対立遺伝子または代替対立遺伝子の実測対立遺伝子頻度に基づいて、レシピエントホモ接合性群およびレシピエントヘテロ接合性群に階層化するステップと、
（ｉｉ）レシピエントホモ接合性群を、情報価値のない群および情報価値のある群にさらに階層化するステップと、
（ｉｉｉ）前記情報価値のある群中の１つまたは複数の多型核酸標的の量を測定するステップと
を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記動的クラスタリングアルゴリズムが、動的Ｋ−ｍｅａｎｓアルゴリズムである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記多型核酸標的の１つまたは複数の各々の前記対立遺伝子頻度が、閾値よりも大きい場合に、前記個々の多型核酸標的閾値アルゴリズムが、前記１つまたは複数の核酸を、ドナー特異的核酸として同定する、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
前記閾値が、参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々のホモ接合性対立遺伝子頻度に基づいている、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記閾値が、前記参照集団中の前記１つまたは複数の多型核酸標的の各々の前記ホモ接合性対立遺伝子頻度の分布のパーセンタイル値である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記移植片ドナー由来の１つまたは複数の循環型無細胞核酸の量が、少なくとも１つのアッセイにおいて前記１つまたは複数の多型核酸標的を測定することによって検出され、
前記少なくとも１つのアッセイが、高スループット配列決定、キャピラリー電気泳動またはデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記高スループット配列決定が、前記ＳＮＰに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅または前記ＳＮＰを含有するプローブ配列を使用する標的化されたハイブリダイゼーションを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
天然ゲノム核酸および前記天然配列と比較して単一ヌクレオチド置換を含有するバリアントオリゴヌクレオチドに対して特異的に設計されたフォワードおよびリバースプライマーを使用する標的化された増幅をさらに含み、
前記バリアントオリゴヌクレオチドが、既知量で前記増幅反応に付加され、
増幅された天然ゲノム核酸の量の、増幅されたバリアントオリゴヌクレオチドの量に対する比を決定するステップと、
前記比に、前記増幅反応に付加された前記バリアントオリゴヌクレオチドの量を乗じることによってゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
をさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記生体試料中の循環型無細胞核酸においてゲノムＤＮＡの総コピー数を決定するステップと
前記ドナー特異的核酸フラクションおよびゲノムＤＮＡの前記総コピー数を乗じることによって前記ドナー特異的核酸の前記コピー数を決定するステップと
をさらに含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸フラクションが所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、項目３に記載の方法。
（項目３１）
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値より大きい場合に、前記移植片状態が拒絶として決定され、
前記ドナー特異的核酸の前記コピー数が所定の閾値よりも小さい場合に、前記移植片状態が受容として決定される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
翻訳後種々の時間での前記移植片状態をモニタリングするステップをさらに含み、
前記移植片状態が、早い時点および少なくとも１つの遅い時点を含み、すべての時点が移植後である１つまたは複数の時点でモニタリングされ、
前記早い時点から得られたドナー特異的循環型無細胞核酸フラクションの、またはドナー特異的循環型無細胞核酸の前記コピー数の、前記少なくとも１つの遅い時点と比較した増大が、移植片拒絶の発生を示し、前記早い時点と前記少なくとも１つの遅い時点の間の時間間隔が、少なくとも７日である、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記早い時点が、移植後０日〜１年の間であり、および／または前記遅い時点が、移植後７日〜５年の間である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記臓器移植片レシピエントに、免疫抑制療法の投与を助言するステップまたは前記臓器移植片レシピエントの免疫抑制療法の修飾を助言するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
移植片状態を決定するシステムであって、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のプロセッサに連結されたメモリとを含む、システムであって、前記メモリは、
生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ａ）からの１つまたは複数の多型核酸標的の前記測定値に少なくとも基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸の存在または非存在を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の決定された存在または量に少なくとも基づいて前記臓器移植片レシピエントの移植片状態を決定するステップと
を含むプロセスを実施するように構成された命令のセットがエンコードされている、システム。
（項目３６）
１つまたは複数のプロセッサによって実行された場合、前記１つまたは複数のプロセッサに、移植片状態を決定する方法を実施させるプログラム命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体であって、前記方法が、
（ａ）生体試料から単離された前記循環型無細胞核酸内の１つまたは複数の多型核酸標的の測定値を得るステップであって、前記生体試料が、同種ドナーからの臓器を受けた臓器移植片レシピエントから得られる、ステップと、
（ｂ）演算システムによって、（ａ）からの前記測定値に基づいて１つまたは複数のドナー特異的循環型無細胞核酸を検出するステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数のドナー特異的核酸の存在または量に基づいて移植片状態を決定するステップと
を含む、非一時的な機械可読記憶媒体。
【国際調査報告】
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