(57)【要約】  本発明はアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）およびその用途に関するものであって、具体的に、前記菌株、その培養液などまたはそれから分離したＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善、緩和または治療用組成物、およびその食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善、緩和および治療用途、およびこれを用いた食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善、緩和および治療方法を提供し、これによって抗肥満効果のうちの体重減少およびグルコース恒常性調節はもちろん、褐色脂肪に与える影響および食欲調節ホルモンを分泌する効果を発揮する。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
【請求項２】
前記菌株は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
【請求項３】
請求項１のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、請求項３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項６に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項６に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１１】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１２】
前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、請求項１０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１４】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項１３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１５】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１６】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１７】
アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項１８】
前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項１９】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２０】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２１】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項２０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２２】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項２１に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２３】
アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を処理する段階を含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【請求項２４】
前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【請求項２５】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項２３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【請求項２６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を処理する段階を含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【請求項２７】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項２６に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【請求項２８】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項２７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互引用
本出願は２０１８年１０月１１日付韓国特許出願第１０−２０１８−０１２１１３７号および２０１９年１０月１０日付韓国特許出願第１０−２０１９−０１２５６７０号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
本発明は、食欲抑制および代謝性疾患予防、改善、緩和および治療効能を有するアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
肥満は高カロリー食餌のような食習慣の変化、運動不足などによって人体内過度な体脂肪が蓄積された状態で２型糖尿病、心血管疾患、肝疾患、各種癌の発病と関連していて臨床的重要性が非常に大きい。一方、腸内微生物は肥満と糖尿など代謝性疾患と深い相関関係があると知られており、特に糖尿病治療剤であるメトホルミンを処理したマウスの腸内にアッカーマンシアムシニフィラ菌株が増加し、この菌株を高脂肪食餌マウスに投与時、グルコース恒常性が改善されるのが明らかになるにつれて肥満治療剤としての可能性を注目されており、抗肥満製剤研究の新たなパラダイムを提示したことがある。
【０００４】
人の総細胞数の１０倍に近い腸内微生物のうちの抗肥満効能が検証されたアッカーマンシアムシニフィラ菌株の抗肥満効果機序を理解するための多様な研究が行われたが、従来の研究は抗肥満指標として体重減少、慢性代謝性炎症改善、損傷された障壁の復原または血中脂質指標改善などに焦点が合わせられている。
【０００５】
しかし、抗肥満効果は前記で言及した指標以外に多様な機序が存在し、特に褐色脂肪の誘導は体温維持恒常性メカニズムと連係して腸内微生物と相互作用するのが最近報告された。脂肪組織はエネルギーを中性脂肪の形態に貯蔵する白色脂肪とエネルギーを熱として放出する褐色脂肪に分けられ、褐色脂肪は組織特異的なＵＣＰ−１因子を通じてエネルギー消費を誘導することによってグルコース恒常性を調節しインスリン敏感度を高める機能を有している。
【０００６】
一方、食欲調節ホルモンであるグルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＬＰ−１）は食べ物摂取によって小腸から分泌されるホルモンで飽満感を増加させて、食欲を調節し、膵臓でインスリン分泌を誘導することによって血糖を調節する。
【０００７】
ＧＬＰ−１は、小腸（ｉｌｅｕｍ）および大腸（ｃｏｌｏｎ）に存在する腸内分泌細胞の一種であるＬ−ｃｅｌｌｓから分泌される。
【０００８】
前記ＧＬＰ−１は、糖尿病治療効果、肥満治療効果、心臓病治療効果、脳血管疾患および神経細胞炎症治療効果（Ｓａｌｃｅｄｏ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＧＬＰ−１）：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１２）  １６６，  １５８６−１５９９）、動脈硬化症治療効果（Ｂｕｒｇｍａｉｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＧＬＰ−１）  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｐｌｉｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧＬＰ−１（９−３７）  ａｎｄ  ＧＬＰ−１（２８−３７）  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｐｏｅ−／−ｍｉｃｅ．  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（２０１３）  ２３１，  ４２７−４３５）などと関連があると知られている。
【０００９】
また、ＧＬＰ−１は、膵臓でブドウ糖依存的インスリン分泌刺激、インスリン遺伝子発現増進、膵臓β細胞増殖増進効果、膵臓β細胞生存増進効果、グルカゴン分泌阻害効果、血糖降下などを通じて糖尿病治療効果を示すのに関与し、胃腸が空になる速度を遅らせ、食欲を抑制し、飽満感を増進させて食べ物摂取を抑制するのに関与して肥満治療効果を示すのに関与する。そして、局所貧血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）から心臓細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）保護効果および心臓麻痺の恐れがある患者の心臓機能向上効果を通じて心臓病治療効果を示す（Ｓｏｋｏｓ，  Ｇ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｊ．Ｃａｒｄ．Ｆａｉｌ．（２００６）  １２：６９４−６９９．，  Ｂａｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｔｈ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００８）  １１７：２３４０−２３５０．）。
【００１０】
前記ＧＬＰ−１は、Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＧＰＣＲｓ）の一種であるＴＧＲ５およびＧＰＲ１１９の活性化（Ｒｅｉｍａｎｎ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．（２００８）  ８：５３２−５３９；Ｌａｕｆｆｅｒ，  Ｌ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＰＲ１１９  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｏｌｅｏｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｌ−ｃｅｌｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００９）  ５８：１０５８−１０６６）またはα−ｇｕｓｔｄｕｃｉｎの活性化（Ｊａｎｇ，  Ｈ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７．  Ｇｕｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｕｓｔｄｕｃｉｎ  ａｎｄ  ｔａｓｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０４，  １５０６９１５０７４．）によって分泌が促進されると知られている。特に、褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）および筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）に発現されたＧ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）  ＴＧＲ５（ＧＰＲ１３１）の活性化はエネルギー消費を増加させて肥満治療効果を示し、肝疾患改善に関連があると知られており（Ｌｉｅｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＰＢＡ：Ａ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１３）  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）、動脈硬化症を抑制すると報告された（Ｐｏｌｓ  ＴＷＨ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＧＲ５  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２０１１）  １４、７４７）。
【００１１】
また、肥満患者に過度に蓄積された中性脂肪は脂肪組織だけでなく、肝や筋肉に貯蔵されてインスリン抵抗性を誘導する。したがって、過度に貯蔵された中性脂肪の消耗が根本的な肥満とこれによる代謝性疾患の予防および治療になり得る。脂肪細胞は大きく白色脂肪、褐色脂肪細胞、およびベージュ脂肪細胞に分類される。白色脂肪細胞は中性脂肪の大きな脂肪球に貯蔵されて主に腹部で多く発見され、健康に否定的な役割を果たすと知られている。褐色脂肪は白色脂肪細胞に比べて多くのミトコンドリアと小さい大きさの脂肪球を含有しており、熱発生を通じた体温維持と適切な運動によって誘導できると報告されている。褐色脂肪細胞が多く含有されるように誘導したマウスは高脂肪食餌による肥満に対して相対的に体重減少と熱量消耗の増加を誘導して肥満と代謝性疾患に効果的であった。また、褐色脂肪ではＵＣＰ−１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）タンパク質が多く発現され、これは脂肪細胞で熱量の貯蔵でない熱量消耗で熱発生に決定的な役割を果たすと知られている。褐色脂肪と共にベージュ脂肪細胞も重要な脂肪細胞と認識されている。ベージュ脂肪細胞は健康に有害な白色脂肪細胞から運動や寒さなどの刺激によって誘導され、白色脂肪細胞の形質は減少されるが、褐色脂肪細胞の特徴を有するようになって、ＵＣＰ−１の発現の増加を示すようになる。これらのベージュ脂肪細胞もマウスから発見される褐色脂肪細胞と同様に肥満および代謝疾患に有益であると知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１８０９１７２号明細書
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１５−０１３３６４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような背景下で、本発明者らは代謝性疾患を効果的に予防および治療するための目的で現在抗肥満研究に用いられている標準菌株、アッカーマンシアムシニフィラ菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ；米国菌株銀行、寄託番号：ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）と健康な韓国人糞便から分離した分離菌株アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３５３０）を用いてアッカーマンシアムシニフィラが褐色脂肪活性に影響を与えるＵＣＰ−１因子を高め、小腸で食欲調節ホルモンＧＬＰ−１発現を誘導するのを確認した。
【００１４】
また、本発明者はこの過程がホストのＩＬ−６サイトカインに依存的に誘導されるのを明らかにし、最終的に抗肥満機序でＧＬＰ−１の分泌誘導を促進するアッカーマンシアムシニフィラ菌株培養液、菌体、上澄液、その抽出物または分画物、または菌株に由来したターゲットタンパク質を糾明して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰのアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株を提供する。当該菌株に対する具体的な情報は次の通りである。
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ
受託日付：２０１８０５２５
【００１６】
本発明の前記菌株は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含む。
【００１７】
また、本発明は、前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）菌株またはその培養液を有効性分として含む食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明の用語「培養液」はアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）菌株が試験管内で成長および生存できるように栄養分を供給することができる培地に前記菌株を一定期間培養して得られる前記菌株、その代謝物、余分の栄養分などを含む全体培地を意味するが、菌株培養後に菌株を除去した上澄液、これらの抽出物および分画物を全て含む概念である。前記培養液中の菌体を除去した液体を「上澄液」とも言い、培養液を一定時間静置して下層に沈んだ部分を除いた上層の液体のみを取るか、ろ過を通じて菌体を除去するか、培養液を遠心分離して下部の沈殿を除去し上部の液体のみを取って獲得することができる。
【００１９】
前記「菌体」は本発明の菌株自体を意味するものであって、醗酵食品から分離して選別した菌株自体または前記菌株を培養して培養液から分離した菌株を含む。前記菌体は培養液を遠心分離して下層に沈んだ部分を取って獲得することができ、または重力によって培養液の下層に沈むので一定時間静置してから上部の液体を除去することによって獲得することができる。
【００２０】
また、本発明のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）菌株培養液、菌体または上澄液の抽出物はエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ；ＥｔＯＡｃ）またはエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ、ｅｔｈｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＥｔＯＨ）で抽出した抽出物であってもよいが、これに限定されない。さらに、本発明のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株培養液、菌体または上澄液の分画物はエチルアセテート抽出物をメタノールで分画した分画物であってもよいが、これに限定されない。本発明のアッカーマンシアムシニフィラ（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）菌株培養液、上澄液または抽出物の分画物は当業界に広く知られている通常の分画方法によって収得でき、例えば、陰イオン交換カラムまたはサイズカラムなどを用いたクロマトグラフィー法によって収得できる。
【００２１】
本発明の「代謝性疾患」は慢性的な代謝障害によって耐糖能障害、糖尿、脂肪肝、高血圧、異常脂質血症、肥満、心血管系アテローム動脈硬化症などの様々な疾患が一個人に１または２以上現れることを意味し、一例として耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患および肥満から選択されたいずれか一つであり得る。
【００２２】
本発明によってＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、褐色脂肪の活性増加が誘導されて前記代謝性疾患に有利な効果を示すことができ、さらに前記代謝性疾患が予防、改善または治療できる。
【００２３】
発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物を提供する。
【００２４】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質はＬＣ／ＭＳ−ＭＳを通じて本発明の効能分画内タンパク質ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎを実施する時、既存菌株のＮＣＢＩ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇを通じて確認され、その情報は以下の通りである。
Ｇｅｎｅ：Ａｍｕｃ＿１６３１
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｂ２ＵＭ０７
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｍｅ−Ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ
Ｏｒｇａｎｉｓｍ：Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ
【００２５】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質はアッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したものであってもよく、具体的に、前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株はＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であってもよい。
【００２６】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質以外にも前記配列の変異体も本発明の範囲内に含まれると見なす。変異体は塩基配列またはアミノ酸配列は変化するが、配列番号２のアミノ酸配列と類似の機能的特性を有する塩基配列からなるアミノ酸配列からなるタンパク質である。具体的に、本発明によるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２７】
また、本発明は前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質をコーディングする遺伝子を提供する。本発明の遺伝子はＢ２ＵＭ０７タンパク質をそれぞれコーディングするゲノムＤＮＡとｃＤＮＡを全て含む。好ましく、前記遺伝子は配列番号２のタンパク質を暗号化する塩基配列を含むことができる。
【００２８】
また、前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。具体的に、前記遺伝子は配列番号２のタンパク質を暗号化する塩基配列と６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【００２９】
発明の他の様相は、本発明によるＢ２ＵＭ０７タンパク質をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。本発明の「組換え」という用語は、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するかまたはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号されたタンパク質を発現する細胞を指して称するものである。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子切片を、センスまたはアンチセンス形態のうちの一つに発現することができる。また、組換え細胞は天然状態の細胞で発見される遺伝子を発現することができ、しかし前記遺伝子は変形されたものであって人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。
【００３０】
前記「ベクター」は、細胞内に伝達するＤＮＡ断片、核酸分子を指す時に使用される。ベクターはＤＮＡを複製させ、宿主細胞で独立的に再生産できる。また、本発明は、前記組換えベクターに形質転換された形質転換体を提供する。ベクターを大腸菌で形質切換させる方法としてはＣａＣｌ２バッファーを用いた適格細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）使用、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃法（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）などの当業界に通常知られている方法を使用することができる。前記形質転換大腸菌を培養する方法は当業界で通常使用される大腸菌の培養法を用いることができる。
【００３１】
本発明による薬学的組成物は、人間を含む哺乳動物に多様な経路で投与できる。本発明の用語「投与」とは、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味し、投与方式は通常使用される全ての方式であってもよく、例えば、経口、皮膚、静脈、筋肉、皮下などの経路で投与でき、好ましくは、経口で投与できる。本発明の薬学的組成物はそれぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形、または軟膏剤、エアゾール、経皮剤、坐剤および滅菌注射用液などの非経口剤形などに剤形化して使用できる。本発明の薬学的組成物は、薬剤学的に適し生理学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤などの補助剤を追加的に含有するものであってもよい。
【００３２】
本発明の薬学的組成物に含まれる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトル、キシリトール、エリスリトール、マルチト−ル、デンプン、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用することができる。
【００３３】
本発明の薬学的組成物を人間に適用する具体例において、本発明の薬学的組成物は単独で投与できるが、一般に投与方式と標準薬剤学的慣行（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を考慮して選択された薬剤学的担体と混合されて投与できる。例えば、本発明のアッカーマンシアムシニフィラ菌株含有組成物は、デンプンまたはラクトースを含有する錠剤形態に、または単独または賦形剤を含有するカプセル形態に、またはうまみを出すか色を帯びるようにする化学薬品を含有するエリキシルまたは懸濁剤形態に経口、口腔内または舌下投与できる。
【００３４】
本発明の薬学的組成物の投与容量は患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって変わり、医師または薬剤師の判断によって一定時間間隔で１日１回乃至数回に分割投与することもできる。例えば、有効成分含量を基準にして１日投与量が０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜３００ｍｇ／ｋｇであってもよい。前記投与量は平均的な場合を例示したものであって、個人的な差によってその投与量が高いか低くてもよい。
【００３５】
本発明のまた他の一例は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株ＳＮＵＧ−６１０２７（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品を提供する。
【００３６】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であり得る。
【００３７】
本発明によってＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、褐色脂肪の活性増加が誘導されて前記代謝性疾患に有利な効果を示すことができ、さらに前記代謝性疾患が緩和または治療できる。
【００３８】
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品を提供する。
【００３９】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であり得る。
【００４０】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質はアッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したものであってもよく、具体的に、前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株はＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であってもよく、具体的な内容は前記前述の通りである。
【００４１】
前記健康機能性食品は、各種飲料、醗酵乳、食品添加剤などであってもよい。
【００４２】
前記健康機能性食品に含まれている有効性分としてのアッカーマンシアムシニフィラ菌株の含量は食品の形態、所望の用途などによって適切に特別な制限がなく、例えば、全体食品重量の０．０１〜１５重量％で加えることができ、健康飲料組成物は１００ｍｌを基準にして０．０２〜１０ｇ、好ましくは０．３〜１ｇの比率で加えることができる。
【００４３】
本発明の健康機能食品のうちの飲料には指示された比率で必須成分として前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株を含有すること以外に液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。
【００４４】
前述の天然炭水化物の例はモノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖などのジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなどのおよびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前述のもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００４５】
前記以外に、本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。
【００４６】
その他に、本発明の健康機能食品は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率はあまり重要ではないが、本発明の健康機能食品１００重量部当り０〜約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００４７】
本発明は、アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途を提供する。
【００４８】
本発明の用途に使用される前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むものであってもよい。
【００４９】
本発明の用途が適用される前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であり得る。
【００５０】
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途を提供する。
【００５１】
本発明の用途に使用される前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したものであってもよい。
【００５２】
本発明の用途に使用される前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であってもよい。
【００５３】
本発明は、アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を処理する段階を含む食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法を提供する。
【００５４】
本発明の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法に使用される前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むものであってもよい。
【００５５】
本発明の方法が適用される前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であり得る。
【００５６】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を処理する段階を含む食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法を提供する。
【００５７】
本発明の方法に使用される前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したものであってもよい。
【００５８】
本発明の方法に使用される前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であってもよい。
【発明の効果】
【００５９】
本発明は、アッカーマンシアムシニフィラの抗肥満効果のうちの体重減少およびグルコース恒常性調節以外に褐色脂肪の活性化効果および食欲調節ホルモンＧＬＰ−１分泌能を確認し、このような効能がホストの特定サイトカイン、ＩＬ−６に依存的であるのを確認した。また、本発明では、ＧＬＰ−１誘導能力が顕著に増加された新規アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）を発掘し、アッカーマンシアムシニフィラ菌株培養液から分離されたＢ２ＵＭ０７（Ｐ９）タンパク質が顕著に優れたＧＬＰ−１誘導能力、体内グルコース恒常性維持能力および体重減少効果を示すのを確認した。したがって、前記新規アッカーマンシアムシニフィラ菌株およびＢ２ＵＭ０７タンパク質は、食欲抑制または代謝性疾患の治療または予防に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１−１】高脂肪食餌マウスモデルにアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ）菌株投与後、肝と褐色脂肪重量改善効果を実験した結果である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】ｑＰＣＲを用いてアッカーマンシアムシニフィラ菌株によるＵＣＰ−１発現および褐色脂肪関連マーカー増加を確認した実験結果である。
【図３−１】ｑＰＣＲを用いてアッカーマンシアムシニフィラ菌株による小腸内ＩＬ−６サイトカイン増加およびＧＬＰ−１増加を確認した実験結果である。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４−１】アッカーマンシアムシニフィラ菌株による褐色脂肪発現および発熱反応がＩＬ−６サイトカインに依存的であるのを確認した実験結果である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図４−４】図４−３の続きである。
【図４−５】図４−４の続きである。
【図４−６】図４−５の続きである。
【図４−７】図４−６の続きである。
【図４−８】図４−７の続きである。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１発現はバクテリア分泌物質によることであるのを確認した実験結果である（ＥＬＩＳＡ）。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１発現は短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）でない他の要素によることであるのを確認した実験結果である（ＧＣ−ＭＳ）。
【図７Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラの大きさ分画によるＧＬＰ−１発現能を確認した実験結果である。
【図７Ｂ】ＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ、３００Ｋ）にタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；ＰＫ）を処理した後、ＧＬＰ−１発現を確認した実験結果である。
【図８−１】陰イオン交換カラムとサイズカラムを用いたＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ）の分画化およびＧＬＰ−１誘導分画実験結果である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９−１】ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを用いたアッカーマンシアムシニフィラのＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ、ｍ２−ｍ４、Ｇ１７−Ｇ２０）タンパク質定性分析実験結果である。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０−１】純粋精製した候補タンパク質によるＧＬＰ−１誘導能を確認した実験結果である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１−１】ターゲットタンパク質の腹腔投与時体内グルコース恒常性能力を確認した実験結果である。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１１−３】図１１−２の続きである。
【図１２−１】ターゲットタンパク質の口腔投与時体内グルコース恒常性能力を確認した実験結果である。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、本発明を下記の実施例または実験例によってさらに詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらのみに限定されるのではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１．高脂肪食餌マウスモデルにアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ）菌株投与後、肝と褐色脂肪重量減少効果分析
アッカーマンシアムシニフィラ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５、Ａｋｋ）菌株を０．５％ムチン（ｍｕｃｉｎ）添加ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）固体培地で７２時間嫌気培養した後、スタックを確保した。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに高脂肪食餌（６０％脂肪）飼料摂取と同時に菌株を４×１０８ＣＦＵ／２００μｌ／ｍｏｕｓｅ濃度で毎日経口投与した（ＨＦ＋Ａｋｋ、ｎ＝８／グループ）。低脂肪食餌（１０％脂肪）飼料（ＬＦ）と高脂肪食餌飼料（ＨＦ）のみ摂取したグループを対照群として使用した。１４週後、対照群と菌株投与グループを比較した。１６時間絶食後、脂肪組織と肝組織を採取、組織重量を測定した（図１Ａ）。
【００６３】
その結果、ＨＦ群と比較してＨＦ＋Ａｋｋ群の鼠経脂肪組織（ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、ｉｇＷＡＴ）および副睾丸脂肪組織（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、ＥｐｉＷＡＴ）重量は有意的変化がなかったが、褐色脂肪組織（ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ  ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、ｉＢＡＴ）重量は有意的に減少するのを確認した。また、褐色脂肪（ｉＢＡＴ）および肝組織重量を体重と相関関係分析をした時（図１Ｂ）、褐色脂肪および肝組織重量が体重と有意的に比例するのを確認することによって、褐色脂肪と肝重量の減少現象はアッカーマンシアムシニフィラの標的組織である可能性を提示した。
【００６４】
また、ヘマトキシリンエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を通じて褐色脂肪組織および肝組織の脂肪大きさをグループ別に比較した結果、アッカーマンシアムシニフィラ投与群で対照群に比べて褐色脂肪組織および肝組織の脂肪大きさが顕著に減少したことが観察された（図１ＣおよびＤ）。
【００６５】
したがって、実験結果、アッカーマンシアムシニフィラが褐色脂肪組織の重量および脂肪大きさ減少および肝組織重量減少に寄与するのを確認した（図１Ａ〜Ｄ）。
【００６６】
実施例２．アッカーマンシアムシニフィラ菌株によるＵＣＰ−１発現および褐色脂肪関連マーカー増加
褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）で、褐色脂肪活性化マーカーであるｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＣＰ−１）をｉｍｍｕｎｏ−ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＨＣ）染色をしてグループ別に比較した（図２Ａ）。組織のＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡ合成後、ＵＣＰ−１の遺伝子発現をｑＰＣＲで確認し、褐色脂肪分化関連マーカー（ＣＩＤＥＡ、ＰＲＤＭ１６、ＰＰＡＲＧＣ１α、Ａｐｅｌｉｎ）も確認した（図２Ｂ）。
【００６７】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラを投与した高脂肪誘導マウスで褐色脂肪組織の褐色脂肪関連マーカーが非投与群より有意的に増加したのを確認し、褐色脂肪活性に関与するＵＣＰ−１因子を組織染色した結果からも増加が確認されてアッカーマンシアムシニフィラの褐色脂肪誘導機序を確認した。
【００６８】
実施例３．アッカーマンシアムシニフィラ菌株による小腸および大腸内ＩＬ−６サイトカイン増加およびＧＬＰ−１増加
小腸（ｉｌｅｕｍ）組織と大腸（ｃｏｌｏｎ）組織のＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成後、免疫サイトカインマーカー（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−１０）の発現程度をグループ別に比較した（図３Ａ、Ｂ）。
【００６９】
マウス腸細胞株（ＣＴ２６  ｃｅｌｌ）にラクトバシラス３種（ＫＣＴＣ２１８０、ＫＣＴＣ３１１２、ＫＣＴＣ１０４８）とビフィドバクテリウム３種（ＫＣＴＣ３１２７、ＫＣＴＣ３１２８、ＫＣＴＣ３３５２）またはアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋ）を処理時、ＩＬ−６サイトカインの発現能を比較した。Ｅ．ｃｏｌｉからの脂質多糖類（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）を陽性対照群として使用した（図３Ｃ）。
【００７０】
小腸組織で腸分泌食欲調節ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の発現を誘導する関連遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）をｑＰＣＲで確認した（図３Ｄ）。
【００７１】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラ投与によってマウス小腸および大腸細胞内ＩＬ−６サイトカインが有意的に増加し、血清内食欲調節ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の発現が有意的に増加したのを確認した（図３Ａ〜３Ｄ）。特に、マウス腸細胞株でアッカーマンシアムシニフィラは他のラクトバシラスおよびビフィドバクテリウム菌株に比べて顕著に増加されたＩＬ−６水準を示した。
【００７２】
実施例４．アッカーマンシアムシニフィラ菌株による褐色脂肪発現および発熱反応がＩＬ−６サイトカインに依存的なのかどうか
アッカーマンシアムシニフィラの褐色脂肪活性化効能がＩＬ−６サイトカイン依存的なのかどうかを確認した。
【００７３】
このために、６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６  Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（ＷＴ）マウスとＩＬ−６遺伝子欠乏マウス（ＩＬ−６ＫＯ）マウスにそれぞれ高脂肪食餌（６０％  ｈｉｇｈ  ｆａｔ；ＨＦ）飼料摂取と同時に菌株を４×１０８ＣＦＵ／２００μｌ／ｍｏｕｓｅ濃度で毎日経口投与した（ＩＬ−６ＫＯ群はｎ＝６、それ以外の群はｎ＝８／グループ）。低脂肪食餌（１０％  ｌｏｗ  ｆａｔ；ＬＦ）飼料と高脂肪食餌飼料のみ摂取したグループを対照群として使用した。１４週後、ＷＴマウスとＩＬ−６ＫＯマウスで高脂肪食餌のみ行ったグループと菌株投与グループを比較した。
【００７４】
１６時間絶食後、褐色脂肪組織を分離してＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成した後、ＵＣＰ−１発現をｑＰＣＲで確認した（図４Ａ）。デジタル温度計（ＴＥＳＴＯ９２５）を使用して直腸温度を測定した（図４Ｂ）。褐色脂肪の皮膚温度を熱画像カメラ（ＦＬＩＲ）を用いて測定した（図４ＣおよびＤ）。
【００７５】
血清内ＧＬＰ−１濃度を測定するために５時間朝に空腹を誘導した後、２ｇ／ｋｇ濃度でグルコースを口腔投与した。１０分後、眼窩採血を通じてｐｌａｓｍａを採血してＧＬＰ−１の半減期を抑制する１μｇ／ｍｌ  ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（６０１９；Ｔｏｃｒｉｓ）が添加された冷たく維持されたチューブに入れた。遠心分離（４，０００Ｘｇ、１０ｍｉｎ）後、上清液を−８０℃に凍結した。その後、マウスＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを通じてＧＬＰ−１発現を測定した（図４Ｅ）。
【００７６】
小腸（ｉｌｅｕｍ）組織と大腸（ｃｏｌｏｎ）組織内ＧＬＰ−１発現を誘導する関連遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）をＷＴマウスとＩＬ−６ＫＯマウスでｑＰＣＲで確認した（図４Ｆ〜Ｈ）。
【００７７】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラ投与によって発現が増加する褐色脂肪関連遺伝子ＵＣＰ−１はＩＬ−６遺伝子欠乏マウスで発現が増加しなかった（図４Ａ）。また、褐色脂肪部位の皮膚表面温度を赤外線カメラで測定または肛門体温計で測定時にもＩＬ−６ＫＯマウスでは褐色脂肪活性化による熱発生が現れないのを確認した（図４Ｂ〜４Ｄ）。また、ＷＴマウスとは異なり、ＩＬ−６ＫＯマウスでは血清内ＧＬＰ−１濃度がむしろ減少し、ＧＬＰ−１の発現を誘導する遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）水準にも変化がなくて、小腸内食欲調節ホルモンＧＬＰ−１の増加もＩＬ−６に依存的であるのを確認した（図４Ｅ〜Ｈ）。
【００７８】
実施例５．アッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１発現はバクテリア分泌物質によることであるのを確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
Ａｋｋ菌株（アッカーマンシアムシニフィラＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）またはアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株を０．５％ムチン（ｍｕｃｉｎ）培地に培養後、液体培養のために０．１％または５％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）添加ＢＨＩ培地に３６時間培養した。
【００７９】
ＧＬＰ−１を分泌するＮＣＩ−Ｈ７１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２５１）細胞株をコラーゲンがコーティングされた９６−ｗｅｌｌプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でｓｅｅｄｉｎｇ後、細胞間グルコースに対する細胞代謝同期化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）をするために０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加されたＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２時間培養した。その後、Ａｋｋ菌株（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）またはアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７の菌ペレット（菌株対細胞比率：１：２０）または培養上清液（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；ＣＦＳ）を１０％ｖ／ｖ濃度で処理した。２時間後上清液を獲得して上清液内ＧＬＰ−１発現程度をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを通じて測定した（図５Ａ）。ＧＬＰ−１発現効能を濃度別に確認するために前記のような方法でＳＮＵＧ−６１０２７菌株の培養上清液を１０〜１００％ｖ／ｖ濃度で、または対照群（ｃｏｎ）としてビフィドバクテリウムビフィダム（ＫＢＬ４８３；韓国人糞便由来分離菌株）を１０〜１００％ｖ／ｖ濃度で処理後、２時間後に上清液を獲得して上清液内ＧＬＰ−１発現を確認した（図５Ｂ）。
【００８０】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラの生菌と上清液をＧＬＰ−１誘導細胞株（Ｌ細胞）に処理した時、生菌処理時にはＧＬＰ−１が測定されない反面、上清液処理時にはＧＬＰ−１が高く発現されるのを確認し、その発現水準はＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５よりＳＮＵＧ−６１０２７菌株で有意的に顕著な増加を示した（図５Ａ）。また、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株の培養上清液処理時のＧＬＰ−１の発現水準は濃度依存的に増加した（図５Ｂ）。
【００８１】
実施例６．アッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１発現は短鎖脂肪酸でない他の要素によることであるのを確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
アッカーマンシアムシニフィラ分泌短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ、ＳＣＦＡ）分析のためにＧＣ−ＭＳを用いて代表的な短鎖脂肪酸、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）の発現を確認した（図６Ａ）。アセテートとプロピオネート（１ｍＭ、１０ｍＭ）と菌株培養上清液（１００％ｖ／ｖ）を処理後２時間後、ＧＬＰ−１発現程度を確認した（図６Ｂ）。
【００８２】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラはアセテートとプロピオネートを分泌するのを確認した（図６Ａ）。しかし、アセテートとプロピオネートによって誘導されるＧＬＰ−１はアッカーマンシアムシニフィラの培養上清液によって発現されるＧＬＰ−１より顕著に少なかった（図６Ｂ）。したがって、アッカーマンシアムシニフィラによって誘導されるＧＬＰ−１はアセテートとプロピオネート以外の要素が関与するのが分かった。
【００８３】
実施例７．サイズフィルター、陰イオン交換カラムとサイズカラムを用いたＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ）の分画化およびＧＬＰ−１誘導分画確認
培養液内活性物質を分離するために大きさ別フィルターを用いて各分画を確保した。その後、これを濃縮した後、ＧＬＰ−１誘導能を確認した時、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの間の分画で高い水準のＧＬＰ−１が発現されるのを確認した。また、効能分画（１００Ｋ〜３００Ｋ、３０Ｋ〜１００Ｋ）内タンパク質を除去するために、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；ＰＫ）を１００μｇ／ｍｌ濃度で５５℃で１時間処理後、９０℃で１０分間非活性化後、ＧＬＰ−１発現を測定した。その結果、タンパク質が除去された分画ではＧＬＰ−１発現が誘導されないのを確認し、これを通じて分画内タンパク質によってＧＬＰ−１が誘導されるのを確認した。アッカーマンシアムシニフィラ上清液の１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ（１００Ｋ）を再び分画化するためにＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（ＭｏｍｏＱ  ５／５０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。８０μｇ／ｍｌの１００Ｋ分画が注入され、１ｍｌ／ｍｉｎの速度でサンプルを分画化した。その後、各分画をＬ細胞に処理した後、ＧＬＰ−１発現程度を測定した。実験結果、ｍ２−ｍ４分画で高い含量のＧＬＰ−１が発現されるのを確認した（図８Ａ）。
【００８４】
その後、ｍ２−ｍ４分画を３０Ｋフィルターで濃縮した後、濃縮されたサンプルを再びＧＰＣサイズカラム（ＧＰＣ／ＳＥＣ）を用いてＦＰＬＣを行った。分画にはｈｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを使用して３ｍｌ／ｍｉｎの速度でサンプルを分画化した。同様の方法で各分画をＬ細胞に処理、ＧＬＰ−１発現能を確認した。実験結果、Ｇ１７−Ｇ２０分画でＧＬＰ−１が高い水準で発現されるのを確認した（図８Ｂ）。
【００８５】
実施例８．ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを用いたアッカーマンシアムシニフィラのＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ、ｍ２−ｍ４、Ｇ１７−Ｇ２０）タンパク質定性分析
アッカーマンシアムシニフィラ上清液から確保された、Ｓａｍｐｌｅ１）１００Ｋ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、Ｓａｍｐｌｅ２）ＭｏｎｏＱ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、Ｓａｍｐｌｅ３）ＧＰＣ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅをＬＣ／ＭＳ−ＭＳを通じて定性分析した。上清液の基本培地で発見できるｂｏｖｉｎｅ関連タンパク質は除き、各分画で確認されるタンパク質個数を確認した。
【００８６】
このために、大きさフィルターを通じて確保した各サンプルに対する定性分析を行い、最後に濃縮されたと思われるＧＰＣ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ内発現するタンパク質またはペプチド１０種をｉｎｔｅｎｓｉｔｙ別に羅列し、他の分画内発現程度と比較した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｎａｎｏｆｌｏｗ  Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １００／Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）分析機器を使用した。Ｍａｘｑｕａｎｔソフトウェア１．５を用いてｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇされ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅを用いてａｎｎｏｔａｔｉｏｎをすることによってタンパク質を定性分析した。総タンパク質とペプチドはｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ＜１％未満であるもののみ選定した。
【００８７】
実験結果、候補タンパク質が最も濃縮されたと思われるＳａｍｐｌｅ３）Ｇ１７−Ｇ２０分画で１０個のタンパク質を確認した（図９Ａ、Ｂ）。
【００８８】
実施例９．純粋精製した候補タンパク質によるＧＬＰ−１誘導能確認
アッカーマンシアムシニフィラ濃縮分画に由来したタンパク質１０種をクローニング後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞で発現してタンパク質を純粋分離した。タンパク質１０種のうちの１種（Ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）はクローニングで有効な発現ベクターを得られなくて以下の段階で除いた。その後、発現後分離したタンパク質９種をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて純粋分離されたのを確認した。Ａｍｕｃ１１００はアッカーマンシアムシニフィラ由来抗肥満機能が知られたタンパク質であって（Ｐｌｏｖｉｅｒ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（２０１７）２３：１０７−１１３）陽性対照群として使用された。分離された各タンパク質をＬ細胞に処理してＧＬＰ−１発現を確認した。
【００８９】
このために、合成されたターゲットタンパク質をＩＰＴＧ誘導プロモーターがあるｐＥＴ−２１ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入後、ｈｉｓ−ｔａｇを通じて純粋精製した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌを通じて確認した。合成されたプラスミドをＢＬ２１  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎして培養させることによってタンパク質を大量生産、分離し、タンパク質濃度を測定後、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞株に処理した。
【００９０】
実験結果、興味深くＢ２ＵＫＷ８（Ｐ１）、Ｂ２ＵＲＭ２（Ｐ５）、Ｂ２ＵＭ０７（Ｐ９）タンパク質によってＧＬＰ−１の発現が誘導されるのを確認し、特にＢ２ＵＭ０７タンパク質の場合、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ全てでＡｍｕｃ１１００タンパク質より顕著に高い水準でＧＬＰ−１を誘導するのを確認した（図１０Ｃ）。
【００９１】
実施例１０．ターゲットタンパク質の体内グルコース恒常性能力確認（正常食餌、腹腔投与）
発掘されたターゲットタンパク質によって体内グルコース恒常性能力が向上されるか確認するために、Ｐ１（Ｂ２ＵＫＷ８）、Ｐ５（Ｂ２ＵＫＷ８）、Ｐ９（Ｂ２ＵＭ０７）タンパク質を正常食餌マウスに腹腔で１００μｇ／ｍｏｕｓｅ濃度で一週間投与後、耐糖性テストを行った。
【００９２】
このために、効能タンパク質３種（Ｐ１、Ｐ５、Ｐ９）を正常食餌マウスに１００μｇ／２００μｌ濃度で毎日腹部投与後、７日後、投与しないグループと体重を比較し（ｎ＝８／グループ、図１１Ｃ）、投与１４日後、グルコースを２ｇ／ｋｇ濃度で口腔投与後、１５分〜１２０分間血糖を測定して時間別耐糖性テストを行った（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【００９３】
実験結果、結果、Ｐ９（Ｂ２ＵＭ０７）投与グループが他のグループに比べて有意的に血糖が低く維持されるのを確認した。これは従来耐糖能があると知られたアッカーマンシアムシニフィラ由来Ａｍｕｃ１１００タンパク質より効果的と示された。Ｐ１（Ｂ２ＵＫＷ８）とＰ５（Ｂ２ＵＫＷ８）は耐糖能傾向性のみ確認されたが、Ｐ９グループの場合、体重減少も有意的に確認された（図１１Ｃ）。
【００９４】
実施例１１．ターゲットタンパク質の体内グルコース恒常性能力確認（高脂肪食餌、口腔投与）
発掘されたターゲットタンパク質によって体内グルコース恒常性能力が向上されるか確認するために、Ｐ９（Ｂ２ＵＭ０７）タンパク質を高脂肪食餌マウスに口腔で１００μｇ／ｍｏｕｓｅ濃度で８週間投与後、耐糖性テストを行った。グルコースを口腔投与（２ｇ／ｋｇ）後、１５分〜１２０分間血糖を測定した。
【００９５】
実験結果、Ｐ９（Ｂ２ＵＭ０７）投与グループは高脂肪食餌マウスグループに比べて有意的な体重増加抑制効果を示し、その効果はＡｍｕｃ１１００投与グループより大きく示された（図１２Ａ）。また、グルコース投与３０分後、高脂肪食餌マウスグループに比べて有意的にグルコース恒常性能力が調節されるのを確認した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。
【受託番号】
【００９６】
ＫＣＴＣ１３５３０ＢＰ
2022502067.tif 000003
【図１−１】
2022502067.tif 000004
【図１−２】
2022502067.tif 000005
【図２】
2022502067.tif 000006
【図３−１】
2022502067.tif 000007
【図３−２】
2022502067.tif 000008
【図３−３】
2022502067.tif 000009
【図４−１】
2022502067.tif 000010
【図４−２】
2022502067.tif 000011
【図４−３】
2022502067.tif 000012
【図４−４】
2022502067.tif 000013
【図４−５】
2022502067.tif 000014
【図４−６】
2022502067.tif 000015
【図４−７】
2022502067.tif 000016
【図４−８】
2022502067.tif 000017
【図５】
2022502067.tif 000018
【図６】
2022502067.tif 000019
【図７Ａ】
2022502067.tif 000020
【図７Ｂ】
2022502067.tif 000021
【図８−１】
2022502067.tif 000022
【図８−２】
2022502067.tif 000023
【図９−１】
2022502067.tif 000024
【図９−２】
2022502067.tif 000025
【図１０−１】
2022502067.tif 000026
【図１０−２】
2022502067.tif 000027
【図１１−１】
2022502067.tif 000028
【図１１−２】
2022502067.tif 000029
【図１１−３】
2022502067.tif 000030
【図１２−１】
2022502067.tif 000031
【図１２−２】
2022502067.tif 000032
【図１２−３】
2022502067.tif 000033
【配列表】
2022502067000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月21日(2021.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
【請求項２】
前記菌株は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
【請求項３】
請求項１のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１分泌増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、請求項３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項６に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項６に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１１】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１２】
前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１分泌増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、請求項１０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１４】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項１３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１５】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１６】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１３に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
【請求項１７】
アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項１８】
前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項１９】
前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、請求項１７に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２０】
配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２１】
前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、請求項２０に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【請求項２２】
前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項２１に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
このような背景下で、本発明者らは代謝性疾患を効果的に予防および治療するための目的で現在抗肥満研究に用いられている標準菌株、アッカーマンシアムシニフィラ菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ；米国菌株銀行、寄託番号：ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）と健康な韓国人糞便から分離した分離菌株アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３５３０）を用いてアッカーマンシアムシニフィラが褐色脂肪活性に影響を与えるＵＣＰ−１因子を高め、小腸で食欲調節ホルモンＧＬＰ−１分泌を誘導するのを確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明によってＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１分泌増加、褐色脂肪の活性増加が誘導されて前記代謝性疾患に有利な効果を示すことができ、さらに前記代謝性疾患が予防、改善または治療できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明によってＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１分泌増加、褐色脂肪の活性増加が誘導されて前記代謝性疾患に有利な効果を示すことができ、さらに前記代謝性疾患が緩和または治療できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
前述の天然炭水化物の例はモノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖などのジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなどのポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前述のもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明の方法に使用される前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であってもよい。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
（２）前記菌株は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、（１）に記載のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）。
（３）（１）のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（４）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（５）前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、（３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（６）配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（７）前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、（６）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（８）前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、（７）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（９）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（６）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物。
（１０）（１）のアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１１）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（１０）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１２）前記アッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物は、ＩＬ−６増加、ＧＬＰ−１発現増加、および褐色脂肪の活性増加のうちのいずれか一つ以上を誘導することを特徴とする、（１０）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１３）配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を有効性分として含む、食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１４）前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、（１３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１５）前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、（１４）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１６）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（１３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の改善または緩和用健康機能性食品。
（１７）アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（１８）前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、（１７）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（１９）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（１７）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（２０）配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（２１）前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、（２０）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（２２）前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、（２１）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和のための用途。
（２３）アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）、またはその培養液、上澄液、抽出物または分画物を処理する段階を含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
（２４）前記アッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）は、配列目録１の塩基配列からなる１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことを特徴とする、（２３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
（２５）前記代謝性疾患は、耐糖能障害、糖尿、動脈硬化、高脂血症、高コレステロール症、脂肪肝、心血管疾患または肥満であることを特徴とする、（２３）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
（２６）配列番号２のアミノ酸配列からなるＢ２ＵＭ０７タンパク質を処理する段階を含む、食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
（２７）前記Ｂ２ＵＭ０７タンパク質は、アッカーマンシアムシニフィラ菌株に由来したことを特徴とする、（２６）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
（２８）前記アッカーマンシアムシニフィラ菌株は、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株（受託番号ＫＣＴＣ  １３５３０ＢＰ）であることを特徴とする、（２７）に記載の食欲抑制または代謝性疾患の予防、治療、改善または緩和方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
【図１−１】高脂肪食餌マウスモデルにアッカーマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｋｋ）菌株投与後、肝と褐色脂肪重量改善効果を実験した結果である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】ｑＰＣＲを用いてアッカーマンシアムシニフィラ菌株によるＵＣＰ−１発現および褐色脂肪関連マーカー増加を確認した実験結果である。
【図３−１】ｑＰＣＲを用いてアッカーマンシアムシニフィラ菌株による小腸内ＩＬ−６サイトカイン増加およびＧＬＰ−１増加を確認した実験結果である。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４−１】アッカーマンシアムシニフィラ菌株による褐色脂肪発現および発熱反応がＩＬ−６サイトカインに依存的であるのを確認した実験結果である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図４−４】図４−３の続きである。
【図４−５】図４−４の続きである。
【図４−６】図４−５の続きである。
【図４−７】図４−６の続きである。
【図４−８】図４−７の続きである。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１分泌はバクテリア分泌物質によることであるのを確認した実験結果である（ＥＬＩＳＡ）。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１分泌は短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）でない他の要素によることであるのを確認した実験結果である（ＧＣ−ＭＳ）。
【図７Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でアッカーマンシアムシニフィラの大きさ分画によるＧＬＰ−１分泌能を確認した実験結果である。
【図７Ｂ】ＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ、３００Ｋ）にタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；ＰＫ）を処理した後、ＧＬＰ−１分泌を確認した実験結果である。
【図８−１】陰イオン交換カラムとサイズカラムを用いたＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ）の分画化およびＧＬＰ−１誘導分画実験結果である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９−１】ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを用いたアッカーマンシアムシニフィラのＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ、ｍ２−ｍ４、Ｇ１７−Ｇ２０）タンパク質定性分析実験結果である。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０−１】純粋精製した候補タンパク質によるＧＬＰ−１誘導能を確認した実験結果である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ）。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１−１】ターゲットタンパク質の腹腔投与時体内グルコース恒常性能力を確認した実験結果である。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１１−３】図１１−２の続きである。
【図１２−１】ターゲットタンパク質の口腔投与時体内グルコース恒常性能力を確認した実験結果である。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
小腸組織で腸分泌食欲調節ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌を誘導する関連遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）をｑＰＣＲで確認した（図３Ｄ）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラ投与によってマウス小腸および大腸細胞内ＩＬ−６サイトカインが有意的に増加し、血清内食欲調節ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分泌が有意的に増加したのを確認した（図３Ａ〜３Ｄ）。特に、マウス腸細胞株でアッカーマンシアムシニフィラは他のラクトバシラスおよびビフィドバクテリウム菌株に比べて顕著に増加されたＩＬ−６水準を示した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
１６時間絶食後、褐色脂肪組織を分離してＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを合成した後、ＵＣＰ−１発現をｑＰＣＲで確認した（図４Ａ）。デジタル温度計（ＴＥＳＴＯ９２５）を使用して直腸温度を測定した（図４Ｂ）。褐色脂肪組織の皮膚温度を熱画像カメラ（ＦＬＩＲ）を用いて測定した（図４ＣおよびＤ）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
血清内ＧＬＰ−１濃度を測定するために５時間朝に空腹を誘導した後、２ｇ／ｋｇ濃度でグルコースを口腔投与した。１０分後、眼窩採血を通じてｐｌａｓｍａを採血してＧＬＰ−１の半減期を抑制する１μｇ／ｍｌ  ｄｉｐｒｏｔｉｎ  Ａ（６０１９；Ｔｏｃｒｉｓ）が添加された冷たく維持されたチューブに入れた。遠心分離（４，０００Ｘｇ、１０ｍｉｎ）後、上清液を−８０℃に凍結した。その後、マウスＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを通じてＧＬＰ−１分泌を測定した（図４Ｅ）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
小腸（ｉｌｅｕｍ）組織と大腸（ｃｏｌｏｎ）組織内ＧＬＰ−１分泌を誘導する関連遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）をＷＴマウスとＩＬ−６ＫＯマウスでｑＰＣＲで確認した（図４Ｆ〜Ｈ）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラ投与によって発現が増加する褐色脂肪関連遺伝子ＵＣＰ−１はＩＬ−６遺伝子欠乏マウスで発現が増加しなかった（図４Ａ）。また、褐色脂肪部位の皮膚表面温度を赤外線カメラで測定または肛門体温計で測定時にもＩＬ−６ＫＯマウスでは褐色脂肪活性化による熱発生が現れないのを確認した（図４Ｂ〜４Ｄ）。また、ＷＴマウスとは異なり、ＩＬ−６ＫＯマウスでは血清内ＧＬＰ−１濃度がむしろ減少し、ＧＬＰ−１の分泌を誘導する遺伝子（ｇｃｇ、ｐｃｓｋ１、ｐｃｓｋ２）水準にも変化がなくて、小腸内食欲調節ホルモンＧＬＰ−１の増加もＩＬ−６に依存的であるのを確認した（図４Ｅ〜Ｈ）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
実施例５．アッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１分泌はバクテリア分泌物質によることであるのを確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
Ａｋｋ菌株（アッカーマンシアムシニフィラＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）またはアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７菌株を０．５％ムチン（ｍｕｃｉｎ）培地に培養後、液体培養のために０．１％または５％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）添加ＢＨＩ培地に３６時間培養した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
ＧＬＰ−１を分泌するＮＣＩ−Ｈ７１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２５１）細胞株をコラーゲンがコーティングされた９６−ｗｅｌｌプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でｓｅｅｄｉｎｇ後、細胞間グルコースに対する細胞代謝同期化（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）をするために０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加されたＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２時間培養した。その後、Ａｋｋ菌株（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）またはアッカーマンシアムシニフィラＳＮＵＧ−６１０２７の菌ペレット（菌株対細胞比率：１：２０）または培養上清液（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；ＣＦＳ）を１０％ｖ／ｖ濃度で処理した。２時間後上清液を獲得して上清液内ＧＬＰ−１分泌程度をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを通じて測定した（図５Ａ）。ＧＬＰ−１分泌効能を濃度別に確認するために前記のような方法でＳＮＵＧ−６１０２７菌株の培養上清液を１０〜１００％ｖ／ｖ濃度で、または対照群（ｃｏｎ）としてビフィドバクテリウムビフィダム（ＫＢＬ４８３；韓国人糞便由来分離菌株）を１０〜１００％ｖ／ｖ濃度で処理後、２時間後に上清液を獲得して上清液内ＧＬＰ−１分泌を確認した（図５Ｂ）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラの生菌と上清液をＧＬＰ−１誘導細胞株（Ｌ細胞）に処理した時、生菌処理時にはＧＬＰ−１が測定されない反面、上清液処理時にはＧＬＰ−１が高く分泌されるのを確認し、その分泌水準はＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５よりＳＮＵＧ−６１０２７菌株で有意的に顕著な増加を示した（図５Ａ）。また、ＳＮＵＧ−６１０２７菌株の培養上清液処理時のＧＬＰ−１の分泌水準は濃度依存的に増加した（図５Ｂ）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
実施例６．アッカーマンシアムシニフィラによるＧＬＰ−１分泌は短鎖脂肪酸でない他の要素によることであるのを確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
アッカーマンシアムシニフィラ分泌短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ、ＳＣＦＡ）分析のためにＧＣ−ＭＳを用いて代表的な短鎖脂肪酸、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）の生産を確認した（図６Ａ）。アセテートとプロピオネート（１ｍＭ、１０ｍＭ）と菌株培養上清液（１００％ｖ／ｖ）を処理後２時間後、ＧＬＰ−１分泌程度を確認した（図６Ｂ）。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
実験結果、アッカーマンシアムシニフィラはアセテートとプロピオネートを分泌するのを確認した（図６Ａ）。しかし、アセテートとプロピオネートによって誘導されるＧＬＰ−１はアッカーマンシアムシニフィラの培養上清液によって誘導されるＧＬＰ−１より顕著に少なかった（図６Ｂ）。したがって、アッカーマンシアムシニフィラによって誘導されるＧＬＰ−１はアセテートとプロピオネート以外の要素が関与するのが分かった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
実施例７．サイズフィルター、陰イオン交換カラムとサイズカラムを用いたＧＬＰ−１誘導分画（１００Ｋ）の分画化およびＧＬＰ−１誘導分画確認
培養液内活性物質を分離するために大きさ別フィルターを用いて各分画を確保した。その後、これを濃縮した後、ＧＬＰ−１誘導能を確認した時、１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの間の分画で高い水準のＧＬＰ−１が分泌されるのを確認した。また、効能分画（１００Ｋ〜３００Ｋ、３０Ｋ〜１００Ｋ）内タンパク質を除去するために、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；ＰＫ）を１００μｇ／ｍｌ濃度で５５℃で１時間処理後、９０℃で１０分間非活性化後、ＧＬＰ−１分泌を測定した。その結果、タンパク質が除去された分画ではＧＬＰ−１分泌が誘導されないのを確認し、これを通じて分画内タンパク質によってＧＬＰ−１が誘導されるのを確認した。アッカーマンシアムシニフィラ上清液の１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ（１００Ｋ）を再び分画化するためにＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（ＭｏｍｏＱ  ５／５０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。８０μｇ／ｍｌの１００Ｋ分画が注入され、１ｍｌ／ｍｉｎの速度でサンプルを分画化した。その後、各分画をＬ細胞に処理した後、ＧＬＰ−１分泌程度を測定した。実験結果、ｍ２−ｍ４分画で高い含量のＧＬＰ−１が分泌されるのを確認した（図８Ａ）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
その後、ｍ２−ｍ４分画を３０Ｋフィルターで濃縮した後、濃縮されたサンプルを再びＧＰＣサイズカラム（ＧＰＣ／ＳＥＣ）を用いてＦＰＬＣを行った。分画にはｈｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを使用して３ｍｌ／ｍｉｎの速度でサンプルを分画化した。同様の方法で各分画をＬ細胞に処理、ＧＬＰ−１分泌能を確認した。実験結果、Ｇ１７−Ｇ２０分画でＧＬＰ−１が高い水準で分泌されるのを確認した（図８Ｂ）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
実施例９．純粋精製した候補タンパク質によるＧＬＰ−１誘導能確認
アッカーマンシアムシニフィラ濃縮分画に由来したタンパク質１０種をクローニング後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞で発現してタンパク質を純粋分離した。タンパク質１０種のうちの１種（Ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）はクローニングで有効な発現ベクターを得られなくて以下の段階で除いた。その後、発現後分離したタンパク質９種をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて純粋分離されたのを確認した。Ａｍｕｃ１１００はアッカーマンシアムシニフィラ由来抗肥満機能が知られたタンパク質であって（Ｐｌｏｖｉｅｒ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｐａｓｔｅｕｒｉｚｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（２０１７）２３：１０７−１１３）陽性対照群として使用された。分離された各タンパク質をＬ細胞に処理してＧＬＰ−１分泌を確認した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
実験結果、興味深くＢ２ＵＫＷ８（Ｐ１）、Ｂ２ＵＲＭ２（Ｐ５）、Ｂ２ＵＭ０７（Ｐ９）タンパク質によってＧＬＰ−１の分泌が誘導されるのを確認し、特にＢ２ＵＭ０７タンパク質の場合、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ全てでＡｍｕｃ１１００タンパク質より顕著に高い水準でＧＬＰ−１を誘導するのを確認した（図１０Ｃ）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
実験結果、Ｐ９（Ｂ２ＵＭ０７）投与グループが他のグループに比べて有意的に血糖が低く維持されるのを確認した。これは従来耐糖能があると知られたアッカーマンシアムシニフィラ由来Ａｍｕｃ１１００タンパク質より効果的と示された。Ｐ１（Ｂ２ＵＫＷ８）とＰ５（Ｂ２ＵＫＷ８）は耐糖能傾向性のみ確認されたが、Ｐ９グループの場合、体重減少も有意的に確認された（図１１Ｃ）。
【国際調査報告】
2022502067.tif 000034
2022502067.tif 000035
2022502067.tif 000036
2022502067.tif 000037
2022502067.tif 000038
2022502067.tif 000039