(57)【要約】提供するのは、細胞または動物におけるＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物であり、特定の場合では、細胞または動物におけるＣＬＮ３タンパク質の発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物である。このような化合物、方法及び医薬組成物は、神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善するのに有用である。このような症状及び特質としては、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化が挙げられる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９０％相補的であり、前記修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つが、修飾糖を含み、及び／または前記修飾オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド結合の少なくとも１つが、修飾インターヌクレオシド結合である前記オリゴマー化合物。
【請求項２】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【請求項３】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記部分が、
配列番号１の５４９９〜５７０１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１４〜５６５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１９〜５５４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５３４〜５６４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５５９〜５６３１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号１の５５３４〜５５５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
と相補的である前記オリゴマー化合物。
【請求項４】
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である核酸塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項５】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号３〜５１の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【請求項６】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記部分が、
配列番号２の４８３７〜４９６４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８５２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４９２２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４９３２〜４９４９番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８５２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８９２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号２の４８９２〜４９０９番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
と相補的である前記オリゴマー化合物。
【請求項７】
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸塩基配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である核酸塩基配列を有する、請求項１、５または６のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項８に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項９または１０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項１２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、請求項１１に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−４’架橋を有する二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含み、前記２’−４’架橋が、−Ｏ−ＣＨ２−及び−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−から選択されている、請求項１１または１２のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項１４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、非二環式の修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項９に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、非二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、請求項９または１０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項１６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−ＭＯＥ修飾糖または２’−ＯＭｅ修飾糖を含む非二環式の修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項１４または１５のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥまたは２’−ＯＭｅを含む非二環式の修飾糖部分を含む、請求項９に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含む、請求項９に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、完全修飾型糖モチーフ領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項２０】
前記完全修飾型糖モチーフ領域が、７〜２０ヌクレオシド長である、請求項１９に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−デオキシヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個含む、請求項１９〜２０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項２２】
前記完全修飾型糖モチーフ領域の各ヌクレオシドが、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基または２’−ＯＣＨ３基を含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項２３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、糖代替部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項８〜１８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項２４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、モルホリノ及びＰＮＡから選択した糖代替部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、請求項２３に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾インターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む、請求項１〜２４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項２６】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合が、修飾インターヌクレオシド結合である、請求項２５に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２７】
少なくとも１つのインターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、請求項２５または２６に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む、請求項２５または２７に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２９】
前記インターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のいずれかである、請求項２５、２７または２８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項３０】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、請求項２６に記載のオリゴマー化合物。
【請求項３１】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項３２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項３３】
前記修飾核酸塩基が、５−メチルシトシンである、請求項３２に記載のオリゴマー化合物。
【請求項３４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のシトシン核酸塩基を含み、前記シトシン核酸塩基のそれぞれが、５−メチルシトシンである、請求項３２に記載のオリゴマー化合物。
【請求項３５】
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ヒトＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９５％相補的である、請求項１〜３４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項３６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜１８個、１２〜２０個、１４〜２０個、１６〜２０個または１７〜１９個の連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項３７】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１８個の連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項３８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１８個または２０個の連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜３５のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項３９】
前記修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項１〜３８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４０】
コンジュゲート部分とコンジュゲートリンカーとを含むコンジュゲート基を含む、請求項１〜３８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４１】
前記コンジュゲート基が、１〜３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含むＧａｌＮＡｃクラスターを含む、請求項４０に記載のオリゴマー化合物。
【請求項４２】
前記コンジュゲートリンカーが、単結合からなる、請求項４０または４１に記載のオリゴマー化合物。
【請求項４３】
前記コンジュゲートリンカーが切断可能である、請求項４０に記載のオリゴマー化合物。
【請求項４４】
前記コンジュゲートリンカーが、１〜３個のリンカーヌクレオシドを含む、請求項４２に記載のオリゴマー化合物。
【請求項４５】
前記コンジュゲート基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で、前記修飾オリゴヌクレオチドに結合している、請求項４１〜４４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４６】
前記コンジュゲート基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端で、前記修飾オリゴヌクレオチドに結合している、請求項４１〜４４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４７】
末端基を含む、請求項１〜４６のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４８】
一本鎖オリゴマー化合物である、請求項１〜４７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項４９】
リンカーヌクレオシドを含まない、請求項１〜４２または４４〜４８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項５０】
請求項４７または４９のいずれかに記載のオリゴマー化合物を含む二本鎖オリゴマー。
【請求項５１】
請求項１〜４９のいずれかに記載のオリゴマー化合物もしくは請求項５０に記載の二本鎖オリゴマーを含むか、または前記オリゴマー化合物もしくは前記二本鎖オリゴマーからなるアンチセンス化合物。
【請求項５２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ化合物である、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項５３】
前記ＲＮＡｉ化合物が、ｓｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項５２に記載のオリゴマー化合物。
【請求項５４】
請求項１〜４９もしくは請求項５２〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物、または請求項５０に記載の二本鎖オリゴマーと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項５５】
前記薬学的に許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記塩が、ナトリウム塩である、請求項５６または請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
請求項１〜５０のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチドのキラル的に富化された集団であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含み、前記集団において、特定の立体化学的配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている前記集団。
【請求項６０】
（Ｓｐ）配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項５９に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６１】
（Ｒｐ）配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項５９または６０に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６２】
前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが、独立して選択した特定の立体化学的配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項５９に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６３】
前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが（Ｓｐ）配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項６２に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６４】
前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが（Ｒｐ）配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項６２に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６５】
５’→３’方向でＳｐ−Ｓｐ−Ｒｐという配置である少なくとも３個の連続したホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、請求項５９または請求項６２に記載のキラル的に富化された集団。
【請求項６６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含み、前記修飾オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のすべてが、ステレオランダムである、請求項１〜５０のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド集団。
【請求項６７】
請求項５９〜６５のいずれかに記載のキラル的に富化された集団、または請求項６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む医薬組成物。
【請求項６８】
前記薬学的に許容される希釈剤が、人工脳脊髄液である、請求項５４または６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記修飾オリゴヌクレオチドと人工脳脊髄液から本質的になる、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
動物に、請求項５４または６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項７１】
ＣＬＮ３と関連する疾患の治療方法であって、ＣＬＮ３と関連する疾患である個体、または前記疾患を発症するリスクがある個体に、請求項５４または６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物を治療有効量投与することによって、前記ＣＬＮ３と関連する疾患を治療することを含む前記方法。
【請求項７２】
前記ＣＬＮ３と関連する疾患が、神経変性疾患である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記神経変性疾患が、バッテン病である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記症状または特質が、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記脳組織が、体性感覚皮質、視覚皮質、視床または海馬である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導する、請求項１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【請求項７８】
細胞におけるＣＬＮ３の発現の調節方法であって、前記細胞と、請求項１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３の発現を調節することを含む前記方法。
【請求項７９】
細胞におけるＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライシングの調節方法であって、前記細胞と、請求項１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３のスプライシングを調節することを含む前記方法。
【請求項８０】
細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングの誘導方法であって、前記細胞と、請求項１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することを含む前記方法。
【請求項８１】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項７８〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前の量と比べて減少させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前のパーセンテージと比べて低下させる、
請求項７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて低下させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて低下させる、
請求項７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前の量と比べて増加するか、または
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前のパーセンテージと比べて増大する、
請求項７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて増加するか、または
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて増大する、
請求項７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
ＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【請求項８７】
１５〜２５個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【請求項８８】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４及び／またはイントロン５であり、前記化合物が、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【請求項８９】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【請求項９０】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４及び／またはイントロン５であり、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【請求項９１】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４またはイントロン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、及び／またはそのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９２】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【請求項９３】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、及び／またはそのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９４】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９５】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン４であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９６】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９７】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン４とエキソン５に及び、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９８】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５とイントロン５に及び、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項９９】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【請求項１００】
請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１０１】
治療に用いるための、請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１００に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
対象の若年性バッテン病を治療するのに用いるための、請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１００に記載の医薬組成物であって、任意に、前記化合物が、前記対象において、運動協調性を改善し、及び／または神経障害を軽減することができる前記化合物または前記医薬組成物。
【請求項１０３】
前記バッテン病が、若年性バッテン病である、請求項１０２に記載の化合物または医薬組成物。
【請求項１０４】
請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１００に記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【請求項１０５】
請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１００に記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【請求項１０６】
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０７】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１８個の連結ヌクレオシドからなり、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
配列番号１の５４９９〜５７０１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１４〜５６５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１９〜５５４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５３４〜５６４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５５９〜５６３１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号１の５５３４〜５５５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
と相補的である核酸塩基配列を有する、請求項１に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０８】
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である核酸塩基配列を有し、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０９】
１８個または２０個の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９０％相補的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【請求項１１０】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【請求項１１１】
１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である核酸塩基配列を有し、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【請求項１１２】
１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【請求項１１３】
ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる、請求項１０６〜１１２のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１１４】
請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１５】
薬学的に許容される希釈剤を含む、請求項１００に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
前記薬学的に許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１１４または１１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、請求項１００または１１４〜１１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１８】
前記塩が、ナトリウム塩である、請求項１１７に記載の医薬組成物。
【請求項１１９】
治療に用いるための、請求項１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物、または請求項６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】
請求項１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１項に記載の化合物、または請求項６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれかに記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【請求項１２１】
請求項１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１項に記載の化合物、または請求項６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれかに記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【請求項１２２】
治療に用いるための、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載のキラル的に富化された集団、請求項６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または請求項６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２３】
請求項５９〜６５のいずれか１項に記載のキラル的に富化された集団、請求項６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または請求項６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【請求項１２４】
請求項５９〜６５のいずれか１項に記載のキラル的に富化された集団、請求項６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または請求項６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【請求項１２５】
ＣＬＮ３と関連する疾患の治療方法であって、ＣＬＮ３と関連する疾患である個体、または前記疾患を発症するリスクがある個体に、請求項１１０または１１４〜１１８のいずれか１項に記載の医薬組成物を治療有効量投与することによって、前記ＣＬＮ３と関連する疾患を治療することを含む前記方法。
【請求項１２６】
前記ＣＬＮ３と関連する疾患が、神経変性疾患である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記神経変性疾患が、バッテン病である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記症状または特質が、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記脳組織が、体性感覚皮質、視覚皮質、視床または海馬である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導する、請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１３２】
細胞におけるＣＬＮ３の発現の調節方法であって、前記細胞と、請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物、または請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３の発現を調節することを含む前記方法。
【請求項１３３】
細胞におけるＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライシングの調節方法であって、前記細胞と、請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物、または請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３のスプライシングを調節することを含む前記方法。
【請求項１３４】
細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングの誘導方法であって、前記細胞と、請求項１０６〜１１３のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物、または請求項８６〜９９のいずれか１項に記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することを含む前記方法。
【請求項１３５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記細胞と前記化合物との接触前の量と比べて減少させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記細胞と前記化合物との接触前のパーセンテージと比べて低下させる、
請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記細胞と前記化合物との接触前の量と比べて増加するか、
または前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記細胞と前記化合物との接触前のパーセンテージと比べて増大する、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。その配列表は、２０１９年９月１０日に作成されたＢＩＯＬ０３４３ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして提供されており、そのサイズは６８ＫＢである。電子形式の配列表内の情報は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
提供するのは、細胞または動物におけるＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物であり、特定の場合では、細胞または動物におけるＣＬＮ３タンパク質の発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物である。このような化合物、方法及び医薬組成物は、神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善するのに有用である。このような症状及び特質としては、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、身体組織における脂質性色素、例えばリポフスチンの過剰な蓄積に起因する神経変性障害群の一般名である。バッテン病は、若年性神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年性バッテン病、ｃＮＣＬ、シュピールマイヤーフォークト病またはＣＬＮ３バッテン病としても知られているが、バッテン病は、最も一般的なＮＣＬ障害である。バッテン病は、米国及び欧州において、２５，０００出生あたり１人ほどに見られ、他の多くの国でも世界的に報告されている。４〜８歳に発症し、症状としては、運動機能の進行性の喪失、発作、失明、認知機能の喪失及び精神医学的問題が挙げられ、３０歳になる前に死亡する。バッテン病は、ＣＬＮ３（ｃｅｒｏｉｄ−ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｎａｌ３遺伝子）の変異を原因とする常染色体劣性障害である。ＣＬＮ３では、４９個の変異が知られているが、バッテン病の症例の約８０％が、ＣＬＮ３遺伝子のエキソン７とエキソン８に及ぶ特定の欠失（ＣＬＮ３Δ７８）に起因する。ＣＬＮ３Δ７８という欠失は、フレームシフトを起こし、そのフレームシフトにより、エキソン９に未成熟終止コドンが現れる。この終止コドンにより、リソソームターゲティング配列がタンパク質から除去される。ＣＬＮ３Δ７８のトランケート型タンパク質産物は、長さが、野生型ＣＬＮ３タンパク質の長さの３３％であり、機能しないか、または部分的にしか機能しない。さらに、その短縮ｍＲＮＡに対して、ナンセンス変異依存分解系が働くことで、その短縮タンパク質産物は低レベルとなることが想定される。
【０００４】
バッテン病は、常染色体劣性リソソーム病である。バッテン病は、様々な器官における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積によって特徴付けられ、脳組織のみで、重篤な機能障害と細胞死が見られる。蓄積する脂質及びタンパク質は、主にミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣと、リポフスチン（加齢と関連する不溶性色素）で構成される。ＣＬＮ３は、リソソーム膜及びエンドソーム膜に局在する。ＣＬＮ３タンパク質の機能は、よくわかっていないが、多くの重要なプロセス、例えば、膜輸送、リン脂質分布、及び酸化ストレスに対する応答に関係している。現時点では、いずれのＮＣＬ障害にも、治療法はなく、患者の選択肢は、治療による、症状の管理に限られる（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｒａｋｈｅｊａ，Ｄｅｖ．Ｄｉｓａｂｉｌ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２０１３，１７，２５４−２５９を参照されたい）。
【０００５】
現時点では、若年性バッテン病のような神経変性疾患を治療するための許容可能な選択肢はない。したがって、本明細書の目的は、このような疾患を治療するための化合物、方法及び医薬組成物を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明で提供するのは、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物であり、特定の実施形態では、細胞または動物におけるＣＬＮ３タンパク質の発現を調節するための化合物、方法及び医薬組成物である。特定の実施形態では、その動物は、神経変性疾患である。特定の実施形態では、その動物は、若年性バッテン病である。特定の実施形態では、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節するのに有用な化合物は、オリゴマー化合物である。特定の実施形態では、そのオリゴマー化合物は、修飾オリゴヌクレオチドを含む。本発明で提供するのは、若年性バッテン病に対する治療用スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明で提供するのは、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できるオリゴマー化合物である。
【０００７】
また、提供するのは、神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善するのに有用な方法である。特定の実施形態では、その神経変性疾患は、若年性バッテン病である。特定の実施形態では、症状及び特質には、運動タスク能力欠陥、運動技能障害、運動協調性障害、ミトコンドリアサブユニットＣ  ＡＴＰａｓｅの細胞内蓄積、ＧＦＡＰの活性化及びアストロサイトの活性化が含まれる。特定の実施形態では、これらの症状の改善により、運動タスク能力が改善し、運動技能が改善し、運動協調性が改善し、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積が低減され、ＧＦＡＰの活性化が低減され、アストロサイトの活性化が低減される。特定の実施形態では、本発明で提供するのは、バッテン病を治療するための修飾オリゴヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】エキソン７及び８の欠失という最も一般的な変異である。図１Ａには、ＣＬＮ３遺伝子の概略が示されている。ＣＬＮ３遺伝子は、１５個のエキソンを含む。一般的な変異は、患者の８５％における、エキソン７及び８の欠失（Δ７８）である。図１Ｂには、リソソーム膜内に位置するＣＬＮ３タンパク質の概略が示されている。ＣＬＮ３タンパク質は、アミノ酸を４３８個有するとともに、膜貫通セグメントを６個含むリソソーム膜タンパク質である。ＣＬＮ３タンパク質のアミノ末端セグメント及びカルボキシ末端セグメントの両方とも、リソソームの細胞質内に位置すると予測され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、１、２、３、４、５、６という順序である６つの推定膜貫通セグメントは、ｃ−１−ｌ−２−ｃ−３−ｌ−４−ｃ−５−ｌ−６−ｃというアミノ酸配列によって連結されており、式中、ｌは、内腔に位置するアミノ酸配列を示し、ｃは、細胞質内に位置するアミノ酸配列を示している。
【図２】ＣＬＮ３エキソン７及び８の欠失により、トランケート型タンパク質が生じる。ＣＬＮ３Δｅｘ７８遺伝子とＣＬＮ３Δｅｘ７８タンパク質の概略が示されている。ＣＬＮ３Δｅｘ７８遺伝子は、エキソン１〜６、９及び１０〜１５を含む。エキソン７及び８の欠失により、フレームシフト変異が起こり、エキソン９に終止コドンが現れ、それにより、ナンセンス変異依存分解が行われるか、またはトランケート型タンパク質であるＣＬＮ３Δｅｘ７８タンパク質が生じる。ＣＬＮ３Δｅｘ７８タンパク質は、アミノ酸を１８１個有し、推定膜貫通セグメント１、２及び３を含み、リソソームターゲティング配列が欠損している。ＣＬＮ３Δｅｘ７８タンパク質のアミノ末端セグメントは、リソソーム外に位置すると予測され、カルボキシ末端セグメントは、その内腔に位置すると予測されている。ＣＬＮ３Δｅｘ７８タンパク質のＣ末端がトランケートされていることにより、ＣＬＮ３タンパク質のＣ末端に位置するリソソームターゲティング配列が欠損している。アミノ末端からカルボキシ末端方向の順で、３つの膜貫通セグメントが、ｃ−１−ｌ−２−ｃ−３−ｌというアミノ酸配列によって連結されており、式中、ｌは、内腔に位置するアミノ酸配列を示し、ｃは、細胞質内に位置するアミノ酸配列を示している。
【図３】Ａ〜Ｅは、スプライシングを改変するためのスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）であり、スプライシングを改変するための修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））の概要が示されている。Ａには、修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）の特徴の特定の例、すなわち、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングの改変、修飾核酸、短いオリゴマー、安定したＲＮａｓｅ  Ｈ耐性、安全かつ低毒性、多くの細胞に自由に取り込まれること、他の小児疾患の治療用としてＦＤＡに認可されていることが示されている。Ｂには、修飾糖２’Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）を含む第１の修飾核酸塩基が、修飾インターヌクレオシド結合（ホスホロチオエート（ＰＳ））によって、第２の核酸塩基に連結されている修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）の一部分の例が描かれた構造図が示されている。Ｃには、遺伝子、その遺伝子のｍＲＮＡへの転写、及びそのｍＲＮＡへの修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の結合の概略が示されている。Ｄには、ＦＤＡに認可された修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）薬であるＳＰＩＮＲＡＺＡ（登録商標）（ヌシネルセン）注射剤（１２ｍｇ／５ｍＬ）のＦＤＡニュースリリースの例が示されており、ＦＤＡは、脊髄性筋萎縮症用の初めての薬物を認可し、新たな療法は、希少疾患のアンメットメディカルニーズに対応するものである。Ｅには、ＦＤＡに認可された修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）薬であるＥＸＯＮＤＹＳ５１（登録商標）（エテプリルセン）注射剤のＦＤＡニュースリリースの例が示されており、ＦＤＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用の初めての薬物に対して迅速認可を行った。
【図４】Ａ〜Ｃは、ＣＬＮ３Δｅｘ７８リーディングフレームを修正するためのＳＳＯである。Ａは、エキソン１〜６及びエキソン９〜１５を含むＣＬＮ３Δｅｘ７８  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの概略である。エキソン１〜６及び９〜１５は、ボックスとして示されており、各エキソン間のイントロンは、線として示されており、スプライシングは、エキソン間に斜線として示されている。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の例は、くし状の図で示されており、ＧＣＡＧＣ・・・という核酸塩基配列を含むＳＳＯの一部が、エキソン５の一部に結合している例が含まれる。その修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が結合すると、エキソン４からエキソン６までのスプライシング（斜線）によって示されているように、エキソン５がスキッピングされる。Ｂには、エキソン１〜４、６及び９〜１５を含むＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ｍＲＮＡの概略が示されている。Ｃは、３４０個のアミノ酸のタンパク質であるＣＬＮ３Δｅｘ５７８タンパク質の概略であり、４つの膜貫通セグメントが、リソソーム膜内に位置すると予測されている。モデル化に基づき、ＣＬＮ３Δｅｘ５７８タンパク質のアミノ末端セグメント及びカルボキシ末端セグメントの両方とも、リソソームの細胞質内に位置すると予測され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、１、３、５、６という順序である４つの膜貫通セグメントが、ｃ−１−ｌ−３−ｃ−５−ｌ−６−ｃというアミノ酸配列によって連結されており、式中、ｌは、内腔に位置するアミノ酸配列を示し、ｃは、細胞質内に位置するアミノ酸配列を示している。
【図５Ａ】ＳＳＯの誘導による、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、及びエキソン５スキッピングのためのＳＳＯ候補のスクリーニングである。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）１〜３３（配列番号３〜３５に対応する）に関して、修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、ＳＳＯ）の誘導による、マウスＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを調べた試験から得られたアラインメント図が示されている。マウスＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列との相補的配列をそれぞれ含むＳＳＯ１〜３３の、ｍＣＬＮ３エキソン５領域及び周囲のｐｒｅ−ｍＲＮＡイントロンにおけるマップの概略である。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の位置は、番号の付された線１〜３３として、マウスＣＬＮ３（ｍＣＬＮ３）ｐｒｅ−ｍＲＮＡの上に表されている。イントロン４及びイントロン５は、黒線によって表されており、エキソン５（ｍＣＬＮ３エキソン５）は、灰色のボックスによって表されており、その灰色のボックスは、エキソン５を示しており、線は、挟み込んでいるイントロンを示している。示されているイントロン４標的領域は、配列番号２の４，８０７〜４，８６６番目のヌクレオチドであり、エキソン５は、配列番号２の４，８６７〜４，９４６番目のヌクレオチドであり、示されているイントロン５標的領域は、配列番号２の４，９４７〜４，９８４番目のヌクレオチドである。
【図５Ｂ】ＳＳＯの誘導による、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、及びエキソン５スキッピングのためのＳＳＯ候補のスクリーニングである。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）１〜３３（配列番号３〜３５に対応する）に関して、修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、ＳＳＯ）の誘導による、マウスＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを調べた試験から得られたデータが示されている。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）１〜３３のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの候補スクリーニングの結果が示されている。各レーンの上部に示されている修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を個々にトランスフェクションしたマウスＣＬＮ３Δ７８／Δ７８細胞から抽出したＲＮＡに対して、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、その産物をアクリルアミドゲル上で分離した。エキソン５がスキッピングされたパーセンテージが、ゲルの下に示されている。「Ｍ」は、モック処置細胞を示しており、「ＵＴ」は、未処置細胞を示している。上のバンド（Δｅｘ７８）は、エキソン９に未成熟終止コドンを含む、疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８  ＲＮＡを表している。下のバンド（Δｅｘ５７８）は、エキソン５、７及び８が欠損しているとともに、エキソン６を有し、エキソン９〜１５においてリーディングフレームが修復されたＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡを表している。エキソン５、７及び８がスキッピングされている転写産物のパーセンテージ（Δｅｘ５７８（％））の定量数値は、［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］として求めたものであり、ゲルの下に示されており、実施例１の表１に記載されている。
【図５Ｃ】ＳＳＯの誘導による、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、及びエキソン５スキッピングのためのＳＳＯ候補のスクリーニングである。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）１〜３３（配列番号３〜３５に対応する）に関して、修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、ＳＳＯ）の誘導による、マウスＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを調べた試験から得られたアラインメント図が示されている。マウスＳＳＯ−２６（ＳＳＯ２６、ＳＳＯ＃２６、化合物ＩＤ７３０５００、配列番号２８）と、マウスＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列（配列番号２の４，９２７〜４，９６１番目のヌクレオチド）との配列アラインメント図が示されている。そのｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列では、エキソン５は大文字で示されており、イントロン５は小文字で示されており、矢印は、５’スプライス部位を示している。
【図５Ｄ】ＳＳＯの誘導による、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、及びエキソン５スキッピングのためのＳＳＯ候補のスクリーニングである。図５Ａの特定の修飾オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ解析の結果が示されている。ＰＢＳ（−）または示されている修飾オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）５００μｇでＩＣＶ処置してから２週間後に、成体のホモ接合型ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスから、ＲＮＡから作製した海馬ｃＤＮＡから増幅したＣＬＮ３スプライシング産物を単離した。
【図５Ｅ】ＳＳＯの誘導による、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、及びエキソン５スキッピングのためのＳＳＯ候補のスクリーニングである。図５Ｄの解析時のＣＬＮ３Δｅｘ５／７／８のＲＴ−ＰＣＲ産物のパーセンテージ定量値（［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００）のグラフが示されている。エラーバーは、標準誤差を表している。コントロールで処置した（−）試料と比較して、一元ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定を行った。Ｆ（７，１３）は、３１．３６であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１であり、Ｎは、ゲル上と同様に２〜３匹のマウスである。マウス１３は、ＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８であった。
【図６】ＣＬＮ３Δ７８ノックインマウスであり、実施例５で論じられているＣＬＮ３Δ７８ノックインマウスモデルの概略が示されており、これらのマウスが、８〜１２週間目までに運動タスク能力欠陥が現れ、ミトコンドリアサブユニットＣ  ＡＴＰａｓｅで構成された自家蛍光性貯蔵物質の細胞内蓄積、アストロサイトの活性化が見られることが示されている。このマウスモデルは、例えば、Ｃｏｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：２７０９で論じられている。
【図７】送達解析であり、ＳＳＯは、ＣＮＳの全体にわたって分布することである。実施例４に論じられているような、新生仔マウスにおける修飾オリゴヌクレオチドマウスＳＳＯ−２６の分布のアッセイの結果が示されている。修飾オリゴヌクレオチドの送達の解析により、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が、ＣＮＳの全体にわたって分布することが明らかになった。修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６を脳室内（ＩＣＶ）注射すると、脳における広範な送達が見られる。ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおいて、ＳＳＯ−２６を新生仔へのＩＣＶ注射によって投与し、注射から３週間後に、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の送達を解析した。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の免疫蛍光及び核マーカーのヘキスト染色によって、修飾オリゴヌクレオチドの分布を解析した。Ａには、生後１日目（Ｐ１）に修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６の脳室内（ＩＣＶ）注射によって、新生仔のＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスを処置し、注射から３週間後に、送達解析を行った概略が示されている。Ｂには、右から左の順に、海馬、体性感覚皮質（ｓｓ皮質）及び視床における送達解析結果が示されている。組織ごとに４枚の画像が１０倍率で示されている。各画像セットの左側の列には、修飾オリゴヌクレオチドを検出するための免疫蛍光染色結果が示されており、各画像セットの右側の列には、修飾オリゴヌクレオチドを検出するためのヘキスト染色結果が示されている。各組織の上の行には、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た画像が示されており、各組織の下の行には、ＳＳＯで処置しなかったＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８未処置）から得た画像が示されている。Ｃには、６０倍率の結果が示されている。処置したマウスでは、海馬、体性感覚皮質及び視床において、修飾オリゴヌクレオチドの染色が見られたが、未処置のマウスの修飾オリゴヌクレオチドパネルでは、シグナルは検出されなかった。ヘキスト染色を用いた場合には、処置マウス及び未処置マウスの組織のいずれでも、同程度の染色レベルが見られることから、画像化した組織は、ほぼ同じ数の細胞を含むことが示されている。
【図８】マウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のｉｎ  ｖｉｖｏ試験であり、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のｉｎ  ｖｉｖｏ試験の概略が示されており、実施例７で論じられている実験のタイムラインが示されている。ネイキッド修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６またなネイキッドコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号９７）のいずれかをマウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。８週齢時に挙動解析を行い（ロータロッドテスト及びポールテスト）、解析を１９週齢時に行った（スプライシング及び組織診断）。
【図９】Ａ〜Ｃは、ＳＳＯが、ｉｎ  ｖｉｖｏでエキソンスキッピングを最長で１９週間誘導することであり、実施例７に示されている実験結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでエキソンスキッピングを最長で１９週間誘導することが示されている。Ａには、タイムラインの概略が示されており、マウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６またはコントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃ（コントロール、配列番号９７）のいずれかをマウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。エキソンスキッピング解析（スプライシング解析）を１９週齢時に行った。Ｂには、処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（遺伝子型：ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）の海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析結果が示されている。左側の４つのレーンには、ＳＳＯ−Ｃで処置した個々のマウスの結果が示されており、右側の４つのレーンには、ＳＳＯ−２６で処置した個々のマウスの結果が示されている。上のバンド（Δｅｘ７８）は、エキソン９に未成熟終止コドンを含む、疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８  ＲＮＡを表している。下のバンド（Δｅｘ５７８）は、エキソン５、７及び８が欠損しているとともに、エキソン６を有し、エキソン９〜１５のリーディングフレームが修復されたＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡを表している。上のバンドは、ＳＳＯ−Ｃ処置マウスとＳＳＯ−２６処置マウスの両方に存在するが、下のバンドは、ＳＳＯ−２６処置マウスのみに見られる。Ｃには、ＳＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）における、エキソン５を有さないｍＲＮＡを表す転写産物のパーセンテージ（エキソン５がスキッピングされた割合（％））［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］のグラフが示されている。
【図１０】Ａ〜Ｃは、ＳＳＯ−２６が、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積を低減することであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、海馬におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積を低減することが示されている。Ａには、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−ＣのいずれかをＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールのオリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。マウスを１９週間目に殺処分し、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積について解析した（解析）。Ｂには、海馬の組織切片の染色画像が示されている。左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た切片の画像が示されている。上の行には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣ（サブユニットＣ）に対して染色を行った画像が示されており、下の列には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣに対して染色を行った画像を、ヘキストで核染色を行った画像と重ねたもの（サブユニットＣヘキスト）が示されている。Ｃには、Ｂの３列の画像のそれぞれについて、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色が陽性である画像面積の、画像総面積に対するパーセンテージ（サブユニットＣ面積のパーセンテージ）のグラフが示されている。Ｃのデータは、実施例７の表７に示されている。
【図１１】Ａ〜Ｃは、ＳＳＯ−２６が、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積を低減することであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、視床におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積を低減することが示されている。Ａには、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−ＣのいずれかをＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。マウスを１９週間目に殺処分し、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積について解析した（解析）。Ｂには、視床の組織切片の染色画像が示されている。左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た切片の画像が示されている。上の行には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣ（サブユニットＣ）に対して染色を行った画像が示されており、下の列には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣに対して染色を行った画像を、ヘキストで核染色を行った画像と重ねたもの（サブユニットＣヘキスト）が示されている。Ｃには、Ｂの３列の画像のそれぞれについて、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色が陽性である画像面積の、画像総面積に対するパーセンテージ（サブユニットＣの面積のパーセンテージ）のグラフが示されている。Ｃのデータは、実施例７の表７に示されている。
【図１２】Ａ〜Ｂは、ＳＳＯ−２６が、アストロサイトの活性化を減弱することであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、アストロサイトの活性化を減弱することが示されている。修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６は、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおけるアストロサイトの活性化を低減する。図１０で論じられているようにしてマウスを処置し、１９週間目に殺処分した。Ａは、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ（ＳＳＯ−Ｃ）または修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のいずれかで新生仔として処置した１９週齢のＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの体性感覚（ｓｓ）皮質、視覚皮質及び視床におけるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の解析であり、その処置マウスから得た体性感覚皮質（ｓｓ皮質、上の行）、視覚皮質（中央の行）及び視床（下の行）の組織切片をＧＦＡＰについて染色したものの画像が示されている。左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た切片の画像が示されている。Ｂは、対応する領域におけるＧＦＡＰ蓄積の定量解析であり、平均±標準誤差として示されており、Ａの３つの染色体性感覚皮質組織切片画像のそれぞれについて、ＧＦＡＰに対する染色が陽性である面積の、総画像面積に対するパーセンテージ（ＧＦＡＰ（面積のパーセンテージ））のグラフが示されている。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡとダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。Ｃは、対応する領域におけるＧＦＡＰ蓄積の定量解析であり、平均±標準誤差として示されており、Ａの３つの染色視覚皮質組織切片画像のそれぞれについて、ＧＦＡＰに対する染色が陽性である面積の、総画像面積に対するパーセンテージ（ＧＦＡＰ（面積のパーセンテージ））のグラフが示されている。Ｄには、Ａの３つの染色視床組織切片画像のそれぞれについて、ＧＦＡＰに対する染色が陽性である面積の、総画像面積に対するパーセンテージ（ＧＦＡＰ（面積のパーセンテージ））のグラフが示されている。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡとダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図１３】Ａ〜Ｃは、ＳＳＯ−２６が、運動技能を改善し（ロータロッド）、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６による処置が、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおける運動欠損を和らげることであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、運動挙動を改善し、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、運動技能を改善する（ロータロッド）ことが示されている。Ａは、Ｐ１／２（生後１日目または２日目）にＳＳＯ−ＣまたはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの運動機能について、加速ロータロッドにおいて、８週齢時に評価したものであり、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−Ｃ（コントロール、配列番号９７）のいずれかをＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。加速ロータロッドによるロータロッド解析を８週齢時に行った（挙動）。Ｂは、ロータロッド装置の写真である。Ｃは、左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドで処置したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、コントロールのオリゴヌクレオチドで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）の落下潜時（落下潜時（秒））のグラフである。加速ロータロッドでの落下潜時は、平均±標準誤差としてプロットした。＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。Ｃのデータは、実施例７の表６に示されている。
【図１４】Ａ〜Ｃは、ＳＳＯ−２６による処置が、ポールテストでの成果を改善し、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６による処置が、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおける運動欠損を和らげることであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６による処置が、運動挙動を改善し、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６による処置が、ポールテストでの成果を改善することが示されている。Ａは、Ｐ１／２に、ＳＳＯ−ＣまたはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの運動機能について、垂直ポールテストで、８週齢時に評価したものであり、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−ＣのいずれかをＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールのオリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。ポールテストでの成果は、垂直ポールテスト（回転）を８週齢時に行ったものである（挙動）。Ｂは、ポールテストの写真である。Ｃは、左から右に向かって、コントロールオリゴヌクレオチドで処置したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）の回転時間（回転時間（秒））のグラフである。垂直ポールにおいて、１８０°回転して下を向くまでの平均時間が、平均±標準誤差としてプロットされている。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて求めた。＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。Ｃのデータは、実施例７の表６に示されている。
【図１５】Ａ〜Ｂは、ＳＳＯ−２６が、最長で２６週間、エキソン５の安定したスプライシングを誘導することであり、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６が、最長で２６週間、エキソン５の安定したスプライシングを誘導することが示されている。図１０で論じられているようにして、マウスを修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６または修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃのいずれかで処置し、追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。エキソン５スキッピングの解析を２６週齢時に行った。Ａには、左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（レーン１〜４、ＣＬＮ３＋／Δ７８）、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（レーン５〜８、Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（レーン９〜１１、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）の海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析結果が示されている。ＦＬと表記されている上のバンドは、完全長の野生型ＣＬＮ３転写産物のものであり、そのバンドの真下にΔｅｘ７８と表記されているバンドは、疾患と関連するＣＬＮ３Δ７８転写産物のものであり、Δｅｘ５７８と表記されている一番下のバンドは、疾患と関連する修飾型ＣＬＮ３Δ７８  ＲＮＡのものであり、エキソン５がスプライシングによって除外されたものである。Ｂには、左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドで処置したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、コントロールオリゴヌクレオチドで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）、またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）における、エキソン５を有さないｍＲＮＡを表す転写産物のパーセンテージ（エキソン５がスキッピングされた割合（％））のグラフが示されている。このデータは、実施例５の表４に示されている。
【図１６】Ａ〜Ｃは、ＣＬＮ３  ＷＴ／Δ７８線維芽細胞におけるｈＣＬＮ  ＳＳＯの作用であり、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することであり、実施例９で論じられている実験の結果が示されている。実施例９には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節する修飾オリゴヌクレオチドの例が示されている。この図には、ＣＬＮ３  ＷＴ／Δ７８線維芽細胞（ＣＬＮ３＋／Δ７８）におけるｈＣＬＮ３修飾オリゴヌクレオチドの作用の解析結果が示されている。Ａでは、ヒトＣＬＮ３において、エキソン５スキッピングを最も誘導する修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が特定されている。灰色のボックスは、エキソン５を示しており、線は、挟み込んでいるイントロンを示している。ｈＣＬＮ３エキソン５  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの上に、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の位置が、番号の付された線１〜４０として表されており、ヒト修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）＃１〜４０（配列番号５７〜９０に対応する）の概略が示されており、それらのＳＳＯはそれぞれ、ｈＣＬＮ３エキソン５領域及び周辺のｐｒｅ−ｍＲＮＡイントロンにおけるヒトＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列と相補的な配列を含む。イントロン４及びイントロン５は、小文字で示されており、エキソン５は、灰色ボックスに囲まれた大文字で示されている（示されている標的領域は、ｃｇｔｇｇｔｔｇｇｇａｇｇｇｔｔｇｔｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔｃａｃｔｃｔａｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃｃｃａｇＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＧｇｔｃｔｇｇｇｔｇａｇｇｇｔａｇｔｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｇｇｇｃａｇｇａｇｃｔｇａｇａａａｇｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｔｇｇｃ（配列番号９８）という配列を有し、イントロン４は、配列番号１の５，４４９〜５，５５８番目のヌクレオチドを含み、エキソン５は、配列番号１の５，５５９〜５，６３８番目のヌクレオチドを含み、イントロン５は、配列番号１５の５，６３９〜５，７０１番目のヌクレオシドを含む）。３’スプライス部位（３’ｓｓ）及び５’スプライス部位（５’ｓｓ）が矢印で示されている。示されている修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を個別にトランスフェクションしたヒトＣＬＮ３＋／Δ７８線維芽細胞から抽出したＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その産物をアクリルアミドゲル上で分離した。Ｂには、アクリルアミドゲルの２枚の画像が示されており、ＣＬＮ３＋／Δ７８線維芽細胞におけるエキソン５スキッピングが示されている。示されている修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を個別にトランスフェクションしたヒトＣＬＮ３＋／Δ７８細胞から抽出したＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、その産物をアクリルアミドゲル上で分離した。エキソン５がスキッピングされたパーセンテージが、ゲルの下に示されている。「Ｍ」は、モック処置細胞を示しており、「ＵＴ」は、未処置細胞を示している。これらの線維芽細胞は、完全長の野生型ＣＬＮ３  ＲＮＡ（ＦＬ）と、疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８転写産物の両方を発現する。ＦＬと表記されている上のバンドは、完全長の野生型ＣＬＮ３転写産物のものであり、そのＦＬバンドの真下にΔｅｘ５と表記されているバンドは、エキソン５がスプライシングによって除外された修飾型ＦＬ  ＲＮＡのものである。Δｅｘ７８と表記されている次のバンドは、疾患と関連するＣＬＮ３Δ７８／Δ７８  ＲＮＡのものであり、Δｅｘ５７８と表記されているその次のバンドは、疾患と関連する修飾型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８  ＲＮＡのものであり、エキソン５がスプライシングによって除外されたものである。各レーンには、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の番号に対応する番号が上に付されている。エキソン５がスキッピングされたパーセンテージの定量数値は、［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］によって算出されており、Δｅｘ７５８ＣＬＮ３転写産物を、Δｅｘ５７８ＣＬＮ３転写産物とΔ７８  ＣＬＮ３転写産物との合計で除して、１００を乗じたものである。エキソン５がスキッピングされたパーセンテージは、ゲルの下に示されているとともに、実施例９の表１０に示されている。
【図１７】図１〜１６に描かれているとともに、本明細書で論じられている実験に関する結論の概略が示されている。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導して、ＣＬＮ３Δ７８リーディングフレームを修正する。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、（マウスの）新生仔に１回ＩＣＶ注射後、ＣＮＳの全体にわたって広く分布する。修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６は、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積と、ＧＦＡＰの活性化を低減する。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）による処置は、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおける運動協調性を改善する。
【図１８】ＣＬＮ３バッテン病の症状、特質及び原因の概略が示されている。発症は、４〜１０歳である。症状は、失明、発作、学習遅延、言語障害及び運動協調性の喪失である。細胞の特質は、脳における自家蛍光性物質の蓄積の加速である。原因は、ＣＬＮ３の変異である。主な変異は、エキソン７及び８の欠失であり、その欠失により、リーディングフレームシフトと中途終止コドンが生じる。
【図１９】修飾核酸、１５〜２５ヌクレオチド長、安定かつＲＮａｓｅ  Ｈ耐性、低毒性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、多くの細胞に自由に取り込まれ、相補的塩基対合によって、標的ｍＲＮＡに結合して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングを変化させるという修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））の概観が示されている。
【図２０】Ａ及びＢに、治療的アプローチの概観が示されている。Ａには、そのアプローチに関する概観が示されている。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを促して、そのｍＲＮＡのリーディングフレームを修復することができる。リーディングフレームの修正により、ＣＬＮ３の機能が部分的に修復されることになる。Ｂには、そのアプローチの概略が示されており、左から右に向かって、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び提案されているタンパク質のモデルが示されている。図には、ＣＬＮ３、ＣＬＮ３Δｅｘ７８、及び修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）によって誘導されるＣＬＮ３Δ５７８アイソフォームが示されている。エキソンはボックスとして示されており、イントロンは線として示されており、スプライシングは斜線として示されている。エキソン５スキッピングにより、エキソン６にフレームシフトが生じ、エキソン９で修正が行われる。ＣＬＮ３Δ７８細胞におけるエキソン５スキッピングにより、ＣＬＮ３Δ５７８  ｍＲＮＡが産生され、このｍＲＮＡは、野生型ＣＬＮ３  ｍＲＮＡよりも短く、ＣＬＮ３Δ７８  ｍＲＮＡよりも短いが、フレームシフトにより生じる、ＣＬＮ３Δ７８の未成熟終止コドンを含まなくなる。提案されているタンパク質モデルが、予測される膜タンパク質とともに示されており、このモデルは、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）により誘導されるエキソンスキッピングに起因するものである。上記のフレームシフトは、エキソン５のスキッピングによって修正される。この修正により、膜貫通セグメント１〜６を含む野生型の完全長タンパク質と比べて、膜貫通セグメント１、３、５及び６のみを含む短いタンパク質が産生されるが、このタンパク質は、未成熟終止コドンが原因で、膜貫通セグメント１、２及び３しか含まない機能異常のＣＬＮ３Δ７８タンパク質よりも長い。
【図２１】Ａ〜Ｉは、ＳＳＯ−２６が、最長で２６週間、安定なエキソン５スプライシングを誘導することであり、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のＣＬＮ３  ＲＮＡ発現の調節についてのアッセイ結果が示されている。Ｐ１に、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃまたは修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置してから３週間後（Ａ〜Ｃ）、１９週間後（Ｄ〜Ｆ）及び２６週間後（Ｇ〜Ｉ）に、ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。これらの図には、実施例７に論じられている実験の結果が示されており、ＳＳＯ−２６は、エキソン５スプライシングを誘導することが示されている。Ａは、ＳＳＯ−２６をマウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与し（Ｐ１、処置）、スプライシング解析を３週齢時に行ったものである。Ｂは、エキソンスキッピング解析（スプライシング解析）を３週齢時に行ったものである。処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析である。左側の５つのレーンには、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）で処置したＣＬＮ３＋／Δ７８（ＣＬＮ３＋／Δ７８）マウスから得られた結果が示されており、右側の７つのレーンには、ＳＳＯ−２６で処置した個々のＣＬＮ３＋／Δ７８マウスの結果が示されている。ＦＬと表記されている上のバンドは、完全長の野生型ＣＬＮ３転写産物のものであり、そのＦＬバンドの真下にΔｅｘ５と表記されているバンドは、エキソン５がスプライシングによって除外された修飾型ＦＬ  ＲＮＡのものである。Δｅｘ７８と表記されている次のバンドは、疾患と関連するＣＬＮ３Δ７８／Δ７８転写産物のものであり、Δｅｘ５７８と表記されているその次のバンドは、疾患と関連する修飾型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８  ＲＮＡのものであり、エキソン５がスプライシングによって除外されたものである。下のバンド（Δｅｘ５７８）は、エキソン５、７及び８が欠損しているとともに、エキソン６を有し、エキソン９〜１５のリーディングフレームが修復されたＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡのものである。上のバンドと、Δｅｘ５のバンドは、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウスのみに存在する。Ｃは、右パネルに、ＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）及びＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−２６）における、エキソン５を有さないｍＲＮＡである転写産物のパーセンテージを［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］として算出した値（エキソン５スキッピングの割合（％））のグラフが示されている。Ｄ〜Ｆには、実施例７に示されている実験の結果が示されており、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、最長で１９週間、エキソンスキッピングを誘導することが示されている。Ｄには、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−Ｃのいずれかをマウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。エキソンスキッピング解析（スプライシング解析）を１９週齢時に行った。Ｅには、処置したマウスの海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析結果が示されている。マウスの遺伝子型が、ゲルの上に示されている。左側の８つのレーンには、ＳＳＯ−Ｃで処置した個々のマウスの結果が示されており、右側の４つのレーンには、ＳＳＯ−２６で処置した個々のマウスの結果が示されている。左側の４つのレーンには、ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（ＣＬＮ３＋／Δ７８）の結果が示されており、右側の８つのレーンには、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）の結果が示されている。ＦＬと表記されている上のバンドは、完全長の野生型ＣＬＮ３転写産物のものである。Δｅｘ７８と表記されている中央のバンドは、エキソン９に未成熟終止コドンを含む、疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８  ＲＮＡのものである。Δｅｘ５７８と表記されている下のバンドは、エキソン５、７及び８が欠損しているとともに、エキソン６を有し、エキソン９〜１５のリーディングフレームが修復されたＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡのものである。ＦＬのバンドは、ＳＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに存在し、下のΔ５７８のバンドは、ＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスのみで見られる。Ｆには、ＳＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）における、エキソン５を有さないｍＲＮＡである転写産物のパーセンテージ（エキソン５がスキッピングされた割合（％））を［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］として算出した値のグラフが示されている。Ｇ〜Ｉには、実施例７で論じられている実験の結果が示されており、ＳＳＯ−２６が、エキソン５の安定したスプライシングを最長で２６週間誘導することが示されている。Ｇには、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−Ｃのいずれかをマウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。エキソンスキッピング解析（スプライシング解析）を２６週齢時に行った。Ｈには、処置したマウスの海馬から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析結果が示されている。マウスの遺伝子型が、ゲルの上に示されている。左側の８つのレーンには、ＳＳＯ−Ｃで処置した個々のマウスの結果が示されており、右側の４つのレーンには、ＳＳＯ−２６で処置した個々のマウスの結果が示されている。左側の４つのレーンには、ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（ＣＬＮ３＋／Δ７８）の結果が示されており、右側の８つのレーンには、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）の結果が示されている。ＦＬと表記されている上のバンドは、完全長の野生型ＣＬＮ３転写産物のものである。Δｅｘ７８と表記されている中央のバンドは、エキソン９に未成熟終止コドンを含む、疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８  ＲＮＡのものである。Δｅｘ５７８と表記されている下のバンドは、エキソン５、７及び８が欠損しているとともに、エキソン６を有し、エキソン９〜１５のリーディングフレームが修復されたＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡのものである。ＦＬのバンドは、ＳＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに存在し、下のΔ５７８のバンドは、ＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マ���スのみで見られる。Ｉには、ＳＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）またはＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）における、エキソン５を有さないｍＲＮＡである転写産物のパーセンテージ（エキソン５がスキッピングされた割合（％））を［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］として算出した値のグラフが示されている。データは、平均±標準誤差を示している。＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である（一元ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定）。このデータは、実施例５の表４に示されている。
【図２２】Ａ〜Ｅは、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６による処置によって、変異マウスの脳におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積が低減されることであり、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣに対する免疫蛍光染色結果であり、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃまたは修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のいずれかで、生後１日目または２日目（Ｐ１または２）に処置した１９週齢のＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの海馬（Ｂ及びＣ）ならびに視床（Ｄ及びＥ）において、核をヘキストで染色した。示されているのは、実施例７で論じられている実験の結果であり、ＳＳＯ−２６が、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣを低減することが示されている。Ａには、タイムラインの概略が示されており、ＳＳＯ−２６またはＳＳＯ−ＣのいずれかをＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に投与した（Ｐ１、処置）。追加のコントロールとして、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスに、コントロールのオリゴヌクレオチドを生後１日目に注射した。マウスを１９週間目に殺処分し、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積について解析した（解析）。Ｂには、海馬におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積の定量解析結果が示されており、海馬の組織切片の染色画像が示されている。左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た切片の画像が示されている。上の行には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣ（サブユニットＣ）に対して染色を行った画像が示されており、下の列には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣに対して染色を行った画像を、ヘキストで核染色を行った画像と重ねたもの（サブユニットＣ＋ヘキスト）が示されている。Ｃには、Ｂの３列の画像のそれぞれについて、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色が陽性である画像面積の、画像総面積に対するパーセンテージ（サブユニットＣの面積のパーセンテージ）のグラフが示されている。Ｃのデータは、実施例７の表７に示されている。Ｄは、視床におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積の定量解析結果であり、視床の組織切片の染色画像が示されている。左から右に向かって、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（＋／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、コントロールのオリゴヌクレオチドを注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−Ｃ）から得た切片の画像、及びＳＳＯ−２６を注射したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（Δ７８／Δ７８  ＳＳＯ−２６）から得た切片の画像が示されている。上の行には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣ（サブユニットＣ）に対して染色を行った画像が示されており、下の列には、ＡＴＰ合成酵素サブユニットＣに対して染色を行った画像を、ヘキストで核染色を行った画像と重ねたもの（サブユニットＣ＋ヘ��スト）が示されている。Ｅには、Ｄの３列の画像のそれぞれについて、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色が陽性である画像面積の、画像総面積に対するパーセンテージ（サブユニットＣの面積のパーセンテージ）のグラフが示されている。カラムとバーは、平均±標準誤差を表している。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡとダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。Ｄ及びＥのデータは、実施例７の表７に示されている。
【図２３】図１〜２２に示されているとともに、本明細書で論じられているデータから導かれた結論の概略が示されている。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導し、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおいて、ＣＬＮ３Δ７８のリーディングフレームを修正し、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、（マウスにおいて、）１回、新生仔へＩＣＶ注射後、ＣＮＳの全体にわたって広く分布する。修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスにおいて、神経病変を低減し、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの運動協調性を改善する。
【図２４】図１〜２４に示されているとともに、本明細書で論じられている実験の一般的概要が示されている。幼児が罹患する致命的な神経変性疾患であるＣＬＮ３バッテン病に対する有効な治療法を開発する差し迫ったニーズが存在する。今回の研究では、我々は、バッテン病の治療方法を作成する目的で、変異型遺伝子に誘導される短い修飾核酸配列を用いて、バッテン病の最も一般的な原因の発現を治療の標的とする新規アプローチの開発及び試験を行った。
【図２５】実施例８に従って、ＣＬＮ３核酸に相補的な修飾オリゴヌクレオチドで処置した後のマウスの生存期間のグラフが示されている。線は、グラフの右側（１２０日）において、上から下の順で、（１）未処置のＣＬＮ３＋／＋マウス、（２）コントロールの修飾オリゴヌクレオチドで処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウス、（３）修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ−２６）で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス、（４）コントロールの修飾オリゴヌクレオチドで処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスから得たデータを表している。凡例は、上から下の順で、（１）コントロールのＣＬＮ３＋／＋未処置マウス（ｎ＝３３）、（２）修飾オリゴヌクレオチド（コントロール）で処置したＣＬＮ３＋／Δ７８マウス（ｎ＝１８）、（３）修飾オリゴヌクレオチド（コントロール）で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（ｎ＝１４）、（４）修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ−２６）で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（ｎ＝１０）である。
【図２６Ａ】ＣＬＮ３  ＲＮＡのリーディングフレームを修正する目的で、修飾オリゴヌクレオチドの誘導によって、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８のエキソン５をスキッピングすることの概略が示されている。ＣＬＮ３Δ７８  ＲＮＡのリーディングフレームの修正例を示す概略図が示されている。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８は、エキソン７及び８が欠損しているＣＬＮ３  ＲＮＡ（ＣＬＮ３Δ７８）を示している。ＣＬＮ３Δｅｘ５／７／８は、エキソン５、７及び８が欠損しているＣＬＮ３  ＲＮＡであって、修飾オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ−ｅｘ５）と接触した後のＣＬＮ３  ＲＮＡを示している。これらの３つのｍＲＮＡのそれぞれから翻訳されるＣＬＮ３タンパク質の長さの予測値が、図の右側に示されている。ＣＬＮ３、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８（Δ７８）、及び修飾オリゴヌクレオチドによって誘導されたＣＬＮ３Δｅｘ５／７／８（Δ５７８）のスプライシング済みｐｒｅ−ｍＲＮＡアイソフォームである。ＣＬＮ３Δｅｘ７／８において、修飾オリゴヌクレオチドによって、エキソン５のスキッピングが誘導されると、リーディングフレームが修正され、中途終止コドンが除去される。そのタンパク質産物におけるアミノ酸（ａａ）が示されており、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８では、終止コドンの前に、フレームシフトが生じたａａ残基が２８個含まれ、ＣＬＮ３Δｅｘ５／７／８では、エキソン９におけるフレームの修正前には、フレームシフトが生じたａａが２９個含まれる。エキソンはボックスとして示されており、イントロンは線として示されており、スプライシングは斜線として示されている。終止コドンと、リソソームターゲティングシグナル（ＬＴＳ）をコードする領域が表記されている。
【図２６Ｂ】ヒト修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）１〜４０番（配列番号５７〜９０に対応する）の概略が示されており、各ＳＳＯは、ヒトＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソン５領域及び周辺のｐｒｅ−ｍＲＮＡイントロンと相補的な配列を含む。これらの修飾オリゴヌクレオチドをアッセイして、ヒト線維芽細胞において最もＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導する修飾オリゴヌクレオチドを特定した。灰色のボックスは、エキソン５を示しており、バーは、挟み込んでいるイントロンを示している。
【図２６Ｃ】図１６の説明及び実施例９で論じられているような、ＣＬＮ３＋／Δ７８線維芽細胞におけるエキソン５スキッピングを示すアクリルアミドゲル画像が２枚示されている。示されている修飾オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしたヘテロ接合型ｈＣＬＮ３＋／Δ７／８線維芽細胞から抽出したＲＮＡに対して、放射性ＲＴ−ＰＣＲを行った。グラフにおけるエキソン５スプライシングのパーセンテージの定量値は、［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００として算出されており、対応するレーンの下方に示されている。モックで処置したコントロール（Ｍ）が含まれている。
【図２６Ｄ】ＳＳＯ−２０（ＡＳＯ−２０）及びＳＳＯ−２８（ＡＳＯ−２８）の核酸塩基配列と、標的ｈＣＬＮ３領域とのアラインメント図が示されている。エキソン配列は大文字であり、イントロン配列は小文字である。
【図２６Ｅ】漸増用量のＳＳＯ−２０及びＳＳＯ−２８（０〜１００ｎＭ）で処置したホモ接合型ｈＣＬＮ３Δｅｘ７／８細胞（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析の画像が２枚示されている。スプライシング産物が示されている。そのＲＴ−ＰＣＲ解析は本質的に、実施例１０におけるように、ｈＣＬＮ３ｅｘ４Ｆ（５’ＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣ−３’）（配列番号５２）及びｈＣＬＮ３ｅｘ１０Ｒ（５’ＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＣＣ−３’）（配列番号５３）というプライマーを用いて行った。グラフ（右）は、用量の対数に対するものとして、エキソン５がスキッピングされたパーセンテージを表している。可変勾配による非線形回帰を用いてデータをフィッティングした後、半最大効果濃度（ＥＣ５０）を算出することによって、その修飾オリゴヌクレオチドの効能を求めた。
【図２７】ヒトＣＬＮ３指向性の修飾オリゴヌクレオチドを用いた、用量依存的なエキソン５スキッピングのアッセイ結果が示されている。Ａには、３．１２５〜２００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２０（ＡＳＯ−２０）またはＳＳＯ−２８（ＡＳＯ−２８）で処置したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８ヒト線維芽細胞株から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析結果の写真が示されている。スプライシング産物が表記されている。Ｂには、エキソン５スキッピングの定量値を［エキソン５がスキッピングされた産物／（エキソン５含有産物＋エキソン５がスキッピングされた産物）×１００］として算出した値（エキソン５がスキッピングされた割合（％））を、用量の対数に対して示したグラフと、半最大効果濃度（ＥＣ５０）が示されている。
【図２８】マウス細胞において、マウスＣＬＮ３指向性修飾オリゴヌクレオチドを用いた、用量依存的なエキソン５スキッピングのアッセイ結果が示されている。Ａには、ＳＳＯ−２６（ＡＳＯ−２６）と標的ＣＬＮ３領域との配列のアラインメント図が示されている。ＣＬＮ３のエキソンヌクレオチドは大文字で示されており、イントロンヌクレオチドは小文字で示されている。Ｂには、漸増濃度のＳＳＯ−２６（０．３９１ｎＭ〜２００ｎＭ）をトランスフェクションしたホモ接合型ｍＣＬＮ３Δｅｘ７／８細胞から抽出したＲＮＡのエキソン５スプライシングのＲＴ−ＰＣＲ解析結果の写真が示されている。Ｂには、エキソン５スキッピングの定量値のグラフが示されており、用量の対数に対するものとして、エキソン５がスキッピングされたパーセンテージが示されている。可変勾配による非線形回帰を用いて、データをフィッティングした後、半最大効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。
【図２９Ａ】処置したマウスのＣＮＳにおける修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のエキソン５スキッピング活性の解析結果が示されている。Ｐ１またはＰ２に、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃ（コントロール）またはＳＳＯ−２６で処置した１９週齢のＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８マウス及びＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスの皮質、視床及び線条体から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析画像が示されている。
【図２９Ｂ】処置したマウスのＣＮＳにおける修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のエキソン５スキッピング活性の解析結果が示されている。Ｐ１またはＰ２に、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃ（コントロール）またはＳＳＯ−２６で処置した１９週齢のＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８マウス及びＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスの脳幹、脊髄及び腎臓から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析画像が示されている。
【図２９Ｃ】処置したマウスのＣＮＳにおける修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のエキソン５スキッピング活性の解析結果が示されている。図２９Ａの解析におけるエキソン５スキッピングの定量値の棒グラフが示されている。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって求めた。＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１である。
【図２９Ｄ】処置したマウスのＣＮＳにおける修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６のエキソン５スキッピング活性の解析結果が示されている。図２９Ｂの解析におけるエキソン５スキッピングの定量値の棒グラフが示されている。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１であり、ｎ．ｓ．は、有意差なしである。
【図３０】修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したマウスの体重を、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃの場合と比較して解析した棒グラフが示されている。Ａには、Ｐ１またはＰ２に、ＳＳＯ−ＣまたはＳＳＯ−２６で処置した２カ月齢の雄及び雌のヘテロ接合型マウス及び変異マウスの体重の解析結果が示されている。Ｂには、Ｐ１またはＰ２に、ＳＳＯ−ＣまたはＳＳＯ−２６で処置した４．５カ月齢の雄及び雌のヘテロ接合型マウス及び変異マウスの体重の解析結果が示されている。Ｈｅｔは、ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスを示し、Ｍｕｔは、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスを示している。
【図３１Ａ】修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。Ｐ１またはＰ２に、コントロールＡＳＯ−Ｃで処置した１９週齢のヘテロ接合型マウスと、ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−２６で処置したホモ接合型ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスの海馬、視床及び皮質における、ＳＣＭＡＳに対する免疫蛍光染色結果（緑色）及び核に対する免疫蛍光染色結果（ヘキストで染色。青色）である。海馬及び皮質に関しては、ＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８  ＡＳＯ−ＣのＮは７であり、Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８  ＡＳＯ−ＣのＮは６であり、Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８  ＡＳＯ−２６のＮは７である。視床に関しては、Ｎは５である。スケールバーは、１００μｍである。
【図３１Ｂ】修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。図３１ＡにおけるＳＣＭＡＳの定量解析結果である。カラムとバーは、平均±標準誤差を表している。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１である。
【図３１Ｃ】修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。新生仔として、コントロールＡＳＯ（ＡＳＯ−Ｃ）またはＡＳＯ−２６で処置した１９週齢のＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８マウス及びＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスの視床及び皮質におけるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の解析写真である。スケールバーは、１００μｍである。
【図３１Ｄ】（下部）：修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。対応する領域におけるＧＦＡＰの蓄積の定量解析結果のグラフであり、平均±標準誤差として示されている。Ｎは、５〜６匹のマウスであり、ｎは、４５〜６４枚の画像フィールド／マウスである。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって求めた。＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図３１Ｅ】修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。Ｐ１または２に、ＡＳＯ−ＣまたはＡＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスの運動活性について、加速ロータロッドにおいて、２カ月齢時に評価した。加速ロータロッドでの落下潜時を平均±標準誤差としてプロットした（左）。ＡＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは３９であり、ＡＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは３４であり、ＡＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは３１である。
【図３１Ｆ】修飾オリゴヌクレオチドＡＳＯ−２６（ＳＳＯ−２６）による処置が、ＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウスにおいて、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素（ＳＣＭＡＳ）のサブユニットＣを低減することを示す実験結果を示している。運動協調性を評価するための垂直ポールテスト結果である。垂直ポールで、１８０°回転して下を向くまでの平均時間を平均±標準誤差としてプロットした（右）。ＡＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３＋／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは１９であり、ＡＳＯ−Ｃで処置したＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは１７であり、ＡＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δｅｘ７／８／Δｅｘ７／８マウスでは、Ｎは１９である。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて求めた。＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上記の一般的な説明及び下記の詳細な説明はいずれも、例示及び説明するためのものに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本明細書では、別段の具体的な記載のない限り、単数形が使われている際には、複数形が含まれる。本明細書で使用する場合、別段の記載のない限り、「または」が使われている際には、「及び／または」を意味する。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形態が使われている際には、限定ではない。また、別段の具体的な記載のない限り、「要素」または「成分」のような用語には、１つの単位を含む要素及び成分と、２つ以上のサブユニットを含む要素及び成分が含まれる。
【００１０】
本明細書で用いられている、節の見出しは、系統立ててまとめるためのものに過ぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈すべきではない。本願で引用されている文書または文書の一部（その文書としては、特許、特許出願、論文、書籍及び専門書が挙げられるが、これらに限らない）はいずれも、参照により、本明細書で論じられているその文書の一部、及びその全体が明示的に援用される。
【００１１】
定義
具体的な定義が示されていない限り、分析化学、合成有機化学、医薬品化学及び薬化学と関連して用いられている命名法、ならびに分析化学、合成有機化学、医薬品化学及び薬化学の手順及び技法のうち、本明細書に記載されている命名法、手順及び技法は、当該技術分野において周知かつ広く用いられているものである。認められる場合、本開示の全体において言及されている特許、出願、公開出願及びその他の刊行物、ならびにその他のデータはいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００１２】
別段に示されていない限り、下記の用語は、以下の意味である。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「２’−デオキシヌクレオシド」は、天然のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られるように、２’−Ｈ（Ｈ）デオキシリボシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。特定の実施形態では、２’−デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含んでよく、あるいは、ＲＮＡ核酸塩基（ウラシル）を含んでもよい。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「２’−置換ヌクレオシド」は、２’−置換糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用する場合、糖部分に関する「２’−置換」は、ＨまたはＯＨ以外の２’−置換基を少なくとも１つ含む糖部分を意味する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「５−メチルシトシン」は、５位に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「投与」は、医薬剤を動物に供給することを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「動物」は、ヒトまたはヒト以外の動物を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物がその標的核酸とハイブリダイズしたことに起因するいずれかの検出可能及び／または測定可能な変化を意味する。特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸、またはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量または発現が、そのアンチセンス化合物の非存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比べて低下することである。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス化合物」は、少なくとも１つのアンチセンス活性をもたらすことができるオリゴマー化合物を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、治療に関連する「改善」とは、少なくとも１つの症状が、その治療を行わない場合の同じ症状と比べて改善することを意味する。特定の実施形態では、改善は、症状の重症度もしくは頻度の低下、発症の遅延、または症状の重症度もしくは頻度の進行の減速である。特定の実施形態では、その症状または特質は、運動機能／運動協調性の不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である。特定の実施形態では、これらの症状の改善により、治療した動物またはヒトにおいて、未治療の動物またはヒトと比べて、運動機能が改善し、発作が低減され、失明が減少するかまたは視力が改善し、認知機能が改善し、精神医学的問題が軽減し、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積が低減され、脳組織機能が改善し、脳組織細胞死のレベルが低下し、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積が低減され、脳組織におけるリポフスチンの蓄積が低減され、脳組織におけるアストロサイトの活性化が低減され、平均生存期間が長くなる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「二環式ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」は、二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「二環式糖」または「二環式糖部分」は、２つの環を含む修飾糖部分であって、その第２の環が、第１の環の原子のうちの２つを連結する架橋によって形成されることによって、二環式構造を形成する修飾糖部分を意味する。特定の実施形態では、その二環式糖部分の第１の環は、フラノシル部分である。特定の実施形態では、その二環式糖部分は、フラノシル部分を含まない。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「切断可能な部分」は、生理的条件下、例えば、細胞、動物またはヒトの内部で切断される結合手または原子団を意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「ＣＬＮ３遺伝子」は、ｃｅｒｏｉｄ−ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｎａｌ３タンパク質及びいずれかのｃｅｒｏｉｄ−ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｎａｌ３タンパク質アイソフォームをコードする遺伝子を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「ＣＬＮ３Δ７８」は、エキソン７及び８の全部または一部に及ぶ欠失を有するＣＬＮ３遺伝子を意味する。特定の実施形態では、ＣＬＮ３Δ７８における欠失は、フレームシフトを起こし、そのフレームシフトにより、エキソン９に未成熟終止コドンが現れる。特定の実施形態では、ＣＬＮ３Δ７８のトランケート型タンパク質産物は、長さが野生型の３３％である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関する「相補的」とは、そのオリゴヌクレオチド及び別の核酸の核酸塩基配列を反対の向きでアラインメントしたときに、そのオリゴヌクレオチドまたはその領域のうちの１つ以上の核酸塩基の少なくとも７０％と、その別の核酸またはその領域のうちの１つ以上の核酸塩基が、互いと水素結合できることを意味する。相補的核酸塩基は、互いと水素結合を形成できる核酸塩基を意味する。相補的核酸塩基対としては、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）、５−メチルシトシン（ｍＣ）とグアニン（Ｇ）が挙げられる。相補的オリゴヌクレオチド及び／または相補的核酸では、各ヌクレオシドの核酸塩基が相補的である必要はない。むしろ、多少のミスマッチが許容される。本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関する「完全に相補的な」または「１００％相補的な」とは、オリゴヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、すなわち、そのオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドの核酸と相補的であることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲート基」は、オリゴヌクレオチドに直接結合している原子団を意味する。コンジュゲート基は、コンジュゲート部分と、そのコンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに結合させるコンジュゲートリンカーを含む。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲートリンカー」は、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに連結する結合を少なくとも１つ含む単結合または原子団を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲート部分」は、コンジュゲートリンカーを介して、オリゴヌクレオチドに結合している原子団を意味する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関連する「連続した」とは、ヌクレオシド、核酸塩基、糖部分またはインターヌクレオシド結合が、互いと直接隣接することを指す。例えば、「連続した核酸塩基」は、配列内で、互いと直接隣接する核酸塩基を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「拘束エチル」もしくは「ｃＥｔ」、または「ｃＥｔ修飾糖」は、二環式のβ−Ｄリボシル糖部分であって、その二環式糖の第２の環が、そのβ−Ｄリボシル糖部分の４’−炭素と２’−炭素を連結する架橋によって形成されており、その架橋部が、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’という式を有し、その架橋部のメチル基が、Ｓ配置であるβ−Ｄリボシル二環式糖部分を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ｃＥｔヌクレオシド」は、ｃＥｔ修飾糖を含むヌクレオシドを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「キラル的に富化された集団」とは、同じ分子式の複数の分子であって、特定のキラル中心がステレオランダムであった場合の集団内の分子のうち、その特定のキラル中心が特定の立体化学的配置であると予測される分子の数またはパーセンテージよりも、同じ特定のキラル中心が同じ特定の立体化学的配置である分子の、集団内における数またはパーセンテージが大きい複数の分子を意味する。キラル的に富化された分子集団であって、各分子内にキラル中心を複数有する分子集団は、ステレオランダムなキラル中心を１つ以上含み得る。特定の実施形態では、それらの分子は、修飾オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、それらの分子は、修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「エキソン５のアミノ酸」は、ＣＬＮ３タンパク質のうち、ＣＬＮ３  ＲＮＡのエキソン５に対応する部分を意味する。「エキソン１０のアミノ酸」は、ＣＬＮ３タンパク質のうち、ＣＬＮ３  ＲＮＡのエキソン１０に対応する部分を意味する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ギャップマー」とは、１つ以上のヌクレオシドを有する外側領域の間の位置でのＲＮａｓｅ  Ｈによる切断を補佐する複数のヌクレオシドを有する内側領域を含む修飾オリゴヌクレオチドであって、その内側領域を構成するヌクレオシドが、外側領域を構成する１つのヌクレオシドまたは複数のヌクレオシドとは化学的に異なるものである修飾オリゴヌクレオチドを意味する。その内側領域は、「ギャップ」と称される場合もあり、その外側領域は、「ウイング」と称される場合もある。別段に示されていない限り、「ギャップマー」は、糖モチーフを指す。別段に示されていない限り、ギャップマーのギャップのヌクレオシドの糖部分は、非修飾２’−デオキシリボシルである。したがって、「ＭＯＥギャップマー」という用語は、両方のウイングに２’−ＭＯＥヌクレオシドの糖モチーフを有するとともに、２’−デオキシヌクレオシドのギャップを有するギャップマーを示す。別段に示されていない限り、ＭＯＥギャップマーは、１つ以上の修飾インターヌクレオシド結合及び／または修飾核酸塩基を含んでよく、このような修飾部分は、修飾糖部分のギャップマーパターンに必ずしも従うわけではない。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ホットスポット領域」は、標的核酸上の核酸塩基のうち、オリゴマー化合物の媒介により、その標的核酸の量または活性が調節されやすい範囲である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なオリゴヌクレオチド及び／または核酸が対合またはアニーリングすることを意味する。特定の機序に限定されないが、最も一般的なハイブリダイゼーション機序は、水素結合を伴うものであり、その水素結合は、相補的な核酸塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合であってよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「インターヌクレオシド結合」という用語は、オリゴヌクレオチド中の隣接するインターヌクレオシド間の共有結合である。本明細書で使用する場合、「修飾インターヌクレオシド結合」は、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合以外のいずれかのインターヌクレオシド結合を意味する。「ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合」は、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合の非架橋酸素原子のうちの１つが、硫黄原子に置き換わっている修飾インターヌクレオシド結合である。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「リンカーヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチドをコンジュゲート部分に直接または間接的に連結するヌクレオシドを意味する。リンカーヌクレオシドは、オリゴマー化合物のコンジュゲートリンカー内に位置する。リンカーヌクレオシドは、オリゴマー化合物のオリゴヌクレオチドと連続していても、そのオリゴヌクレオチド部分の一部とはみなされない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「非二環式の修飾糖部分」は、その糖の２つの原子の間に架橋を形成して第２の環を形成するものではない修飾（置換など）を含む修飾糖部分を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ミスマッチ」または「非相補的」とは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチド（すなわち標的核酸）をアラインメントしたときに、第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、第２のオリゴヌクレオチドの対応する核酸塩基と相補的ではないことを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「調節」、「調節する」または「調節すること」とは、分子の量もしくは質、機能または活性が、調節前の分子の量もしくは質、機能または活性と比較したときに変化することを意味する。例えば、調節としては、遺伝子発現の変化、すなわち、増加（刺激もしくは誘導）または減少（阻害もしくは低下）のいずれかが挙げられる。さらなる例として、ＲＮＡ分子の発現の調節には、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位の選択を変化させて、その結果、特定のスプライスバリアントの絶対量または相対量を、調節しない場合の量と比べて変化させることを含めることができる。例えば、細胞または動物におけるＣＬＮ３  ＲＮＡの発現の調節には、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位の選択を変化させて、その結果、細胞または動物における特定のＣＬＮ３スプライスバリアントの絶対量または相対量を、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物におけるその特定のＣＬＮ３スプライスバリアントの絶対量または相対量と比べて変化させることを含めることができる。さらなる例では、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現の調節は、処置試料の細胞または動物における、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡの量を、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物における、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡの量と比べて増加させることを意味する。さらなる例では、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現の調節は、処置試料の細胞または動物における、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡのパーセンテージを、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物における、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡのパーセンテージと比べて増大させることを意味する。エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ＲＮＡのパーセンテージは、例えば、細胞または動物における全ＣＬＮ３  ｍＲＮＡ（エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ、及びエキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡ）に対して、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３  ｍＲＮＡのパーセンテージを算出することによって求めてよい（例えば、［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］）。ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現を調節することのさらなる例としては、スプライシングの改変、ＣＬＮ３スプライシングの改変、ＣＬＮ３  ＲＮＡのリーディングフレームの改変、例えば、ＣＬＮ３Δｅｘ７８のリーディングフレームの修正、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングの促進、例えば、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを促進して、ｍＲＮＡのリーディングフレームを修復すること、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８またはＣＬＮ３＋／Δ７８細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピング、ＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライススイッチング、ＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの変更、エキソン５のスプライシングの誘導が挙げられる。
【００４３】
細胞または動物におけるＣＬＮ３タンパク質の発現の調節は、ＣＬＮ３タンパク質の量または質を、調節前のＣＬＮ３タンパク質の量または質と比べて変化させることを意味する。さらなる例では、ＣＬＮ３タンパク質の発現の調節は、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物における、ＣＬＮ３タンパク質の活性、またはエキソン５のアミノ酸が欠損しているＣＬＮ３タンパク質の量と比べて、ＣＬＮ３タンパク質の活性を増大させるか、またはエキソン５のアミノ酸が欠損しているＣＬＮ３タンパク質の量を増加させることを意味する。さらなる例では、ＣＬＮ３タンパク質の発現の調節は、細胞または動物における、エキソン５のアミノ酸が欠損しているＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージを、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物におけるＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージと比べて増大させることを意味する。エキソン５のアミノ酸が欠損しているＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージは、例えば、細胞または動物における全ＣＬＮ３タンパク質（エキソン５を含むＣＬＮ３タンパク質、及びエキソン５が欠損しているＣＬＮ３タンパク質）に対して、エキソン５が欠損しているＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージを算出して、１００倍することによって求めてよい。あるいは、例えば、エキソン７及び８が欠損しているＣＬＮ３タンパク質と、エキソン５、７及び８が欠損しているＣＬＮ３タンパク質の合計に対する、エキソン５、７及び８が欠損しているＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージを１００倍する［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］。さらなる例では、ＣＬＮ３タンパク質の発現の調節は、未処置試料またはコントロール試料の細胞または動物における、ＣＬＮ３タンパク質の活性、またはエキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４もしくはエキソン１５のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量もしくはパーセンテージと比べて、ＣＬＮ３タンパク質の活性を増大させるか、またはエキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４もしくはエキソン１５のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量もしくはパーセンテージを増大させることを意味する。ヘテロ接合型細胞（例えばＣＬＮ３＋／Δ５細胞）について、エキソン１０、エキソン１１、エキソン１２、エキソン１３、エキソン１４もしくはエキソン１５のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量またはパーセンテージを算出する際には、野生型タンパク質、すなわち完全長タンパク質を考慮に入れてもよい。すなわち、例えば、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質のパーセンテージは、例えば、［＋ｅｘ１０／（−ｅｘ１０  ＋  ＋ｅｘ１０）］×１００］（エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質と、エキソン１０のアミノ酸が欠失しているＣＬＮ３タンパク質との合計に対する、エキソン１０のアミノ酸を含む全ＣＬＮ３タンパク質）として算出してよい。あるいは、この算出には、エキソン７及び８が欠損しているＣＬＮ３タンパク質のみを含めてもよく、例えば、［＋エキソン１０ａａΔ５７８／（＋エキソン１０ａａΔ５７８  ＋  −エキソン１０Δ５７８  ＋  −エキソン１０Δ７８）］×１００］（エキソン��０のアミノ酸を含み、かつエキソン５、７及び８が欠失している全ＣＬＮ３タンパク質と、エキソン１０のアミノ酸が欠損しており、かつエキソン５、７及び８が欠損しているＣＬＮ３タンパク質と、エキソン１０のアミノ酸が欠失しており、かつエキソン７及び８が欠失しているＣＬＮ３タンパク質の合計に対する、エキソン１０のアミノ酸を含み、かつエキソン５、７及び８が欠失している全ＣＬＮ３タンパク質）となる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ＭＯＥ」は、メトキシエチルを意味する。「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ修飾糖」は、リボシル糖部分の２’−ＯＨ基と置き換わった２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を意味する。本明細書で使用する場合、「２’−ＭＯＥヌクレオシド」は、２’−ＭＯＥ修飾糖を含むヌクレオシドを意味する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「モチーフ」は、オリゴヌクレオチドにおける非修飾及び／または修飾型の糖部分、核酸塩基及び／またはインターヌクレオシド結合のパターンを意味する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「神経変性疾患」は、機能または構造の進行性の喪失（運動機能の喪失及びニューロンの死滅を含む）を特徴とする状態を意味する。特定の実施形態では、その神経変性疾患は、若年性神経セロイドリポフスチン症（バッテン病）、及びバッテン病としても知られる若年性バッテン病である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「核酸塩基」は、非修飾核酸塩基または修飾核酸塩基を意味する。本明細書で使用する場合、「非修飾核酸塩基」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）またはグアニン（Ｇ）である。本明細書で使用する場合、「修飾核酸塩基」は、修飾されていないＡ、Ｔ、Ｃ、ＵまたはＧ以外の原子団であって、少なくとも１つの非修飾核酸塩基と対合できる原子団である。「５−メチルシトシン」は、修飾核酸塩基である。ユニバーサル塩基は、上記の５つの非修飾核酸塩基のうちのいずれか１つと対合できる修飾核酸塩基である。本明細書で使用する場合、「核酸塩基配列」は、核酸またはオリゴヌクレオチドにおける連続した核酸塩基の順序であって、糖またはインターヌクレオシド結合のいずれの修飾からも独立した順序を意味する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基と糖部分を含む化合物を意味する。その核酸塩基と糖部分はそれぞれ独立して、修飾されていないか、または修飾されている。本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオシド」は、修飾核酸塩基及び／または修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドには、核酸塩基が欠損している脱塩基ヌクレオシドが含まれる。「連結ヌクレオシド」は、連続した配列で連結されているヌクレオシドである（すなわち、連結されているヌクレオシドの間には、追加のヌクレオシドは存在しない）。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「オリゴマー化合物」は、オリゴヌクレオチドと、任意に、１つ以上の追加の構造部（コンジュゲート基または末端基など）を意味する。オリゴマー化合物は、その第１のオリゴマー化合物と相補的である第２のオリゴマー化合物と対合していても、対合していなくてもよい。「一本鎖オリゴマー化合物」は、不対合のオリゴマー化合物である。「二本鎖オリゴマー」という用語は、相補的な核酸塩基配列を有する２つのオリゴマー化合物によって形成された二本鎖を意味する。二本鎖オリゴマーの各オリゴマー化合物は、「二本鎖化オリゴマー化合物」と称することもある。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、インターヌクレオシド結合を介して連結された連結ヌクレオシド鎖を意味し、その各ヌクレオシドとインターヌクレオシド結合部は、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。別段に示されていない限り、オリゴヌクレオチドは、８〜５０個の連結ヌクレオシドからなる。本明細書で使用する場合、「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのヌクレオシドまたはインターヌクレオシド結合部が修飾されているオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する場合、「非修飾オリゴヌクレオチド」は、いずれのヌクレオシド修飾部またはインターヌクレオシド修飾部を含まないオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で論じられている修飾オリゴヌクレオチドには、例えば、本明細書の実施例及び図面の説明で論じられているように、例えば、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＳＯ、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、治療用スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド、スプライススキッピングオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、動物に投与する際に使用するのに適するいずれかの物質を意味する。特定のこのような担体は、医薬組成物を、例えば、対象が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤及びロゼンジ剤として調合可能にする。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、滅菌水、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝液または滅菌人工脳脊髄液である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩を意味する。薬学的に許容される塩は、親化合物の所望の生物学的活性を維持させるとともに、望ましくない毒性作用をその化合物に付与しない。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、対象に投与するのに適する物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、オリゴマー化合物と、滅菌水溶液を含んでよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の細胞株におけるｆｒｅｅ  ｕｐｔａｋｅアッセイで活性を示す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」は、体外にある時の形態が、動物またはその細胞の中で、異なる形態に変換される治療剤を意味する。典型的には、動物の体内でのプロドラッグの変換は、細胞もしくは組織内の酵素（例えば、内因性酵素もしくはウイルス酵素）または化学物質の作用によって、及び／または生理的条件によって促される。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ」は、転写産物のＲＮＡを意味し、別段の定めのない限り、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及び成熟ｍＲＮＡを含む。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡｉ化合物」は、少なくとも部分的に、ＲＩＳＣまたはＡｇｏ２を介して作用して、標的核酸及び／または標的核酸によってコードされるタンパク質を調節するアンチセンス化合物を意味する。ＲＮＡｉ化合物としては、二本鎖ｓｉＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ模倣体を含む）が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ化合物は、標的核酸の量、活性及び／またはスプライシングを調節する。ＲＮＡｉ化合物という用語には、ＲＮａｓｅ  Ｈを介して作用するアンチセンス化合物は含まれない。
【００５７】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドに関する「自己相補的」とは、少なくとも部分的に、そのオリゴヌクレオチド自体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「標準的な細胞アッセイ」は、実施例３に記載されているアッセイと、その合理的な変形形態を意味する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「標準的なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ」は、実施例７に記載されている実験と、その合理的な変形形態を意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、分子式が同一の分子の集団に関する「ステレオランダムなキラル中心」は、立体化学的配置がランダムであるキラル中心を意味する。例えば、ステレオランダムなキラル中心を含む分子の集団では、（Ｓ）配置のステレオランダムなキラル中心を有する分子の数は、（Ｒ）配置のステレオランダムなキラル中心を有する分子の数と同じであり得るが、必ずしも同じとは限らない。立体化学的配置を制御するようには設計されていない合成方法に起因するときには、キラル中心の立体化学的配置は、ランダムとみなす。特定の実施形態では、ステレオランダムなキラル中心は、ステレオランダムなホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「糖部分」は、非修飾糖部分または修飾糖部分を意味する。本明細書で使用する場合、「非修飾糖部分」は、ＲＮＡに見られるような２’−ＯＨ（Ｈ）リボシル部分（「非修飾ＲＮＡ糖部分」）、またはＤＮＡに見られるような２’−Ｈ（Ｈ）デオキシリボシル部分（「非修飾ＤＮＡ糖部分」）を意味する。非修飾糖部分は、１’位、３’位及び４’位のそれぞれに１個の水素、３’位に１個の酸素、５’位に２個の水素を有する。本明細書で使用する場合、「修飾糖部分」または「修飾糖」は、修飾フラノシル糖部分または糖代替部分を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「糖代替部分」は、オリゴヌクレオチドにおいて核酸塩基を別の基（インターヌクレオシド結合部、コンジュゲート基または末端基など）に連結できる、フラノシル部分以外を有する修飾糖部分を意味する。糖代替部分を含む修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内の１つ以上の位置に導入でき、そのようなオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴマー化合物または標的核酸とハイブリダイズできる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「標的核酸」及び「標的ＲＮＡ」は、アンチセンス化合物が作用を及ぼすように設計されている核酸を意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「標的領域」は、標的核酸の部分のうち、オリゴマー化合物がハイブリダイズするように設計されている部分を意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「末端基」は、オリゴヌクレオチドの末端に共有結合している化学基または原子団を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、動物に治療効果をもたらす、医薬剤の量を意味する。例えば、治療有効量により、疾患の症状が改善される。
【００６７】
特定の実施形態
【００６８】
本開示は、以下の番号付けされた非限定的な実施形態を提供する。
【００６９】
実施形態１．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９０％相補的であり、前記修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの少なくとも１つが、修飾糖を含み、及び／または前記修飾オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド結合の少なくとも１つが、修飾インターヌクレオシド結合である前記オリゴマー化合物。
【００７０】
実施形態２．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【００７１】
実施形態３．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記部分が、
配列番号１の５４９９〜５７０１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１４〜５６５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１９〜５５４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５３４〜５６４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５５９〜５６３１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号１の５５３４〜５５５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
と相補的である前記オリゴマー化合物。
【００７２】
実施形態４．前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である核酸塩基配列を有する、実施形態１〜３のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００７３】
実施形態５．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号３〜５１の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物。
【００７４】
実施形態６．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の連続した核酸塩基の部分を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記部分が、
配列番号２の４８３７〜４９６４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８５２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４９２２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４９３２〜４９４９番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８５２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号２の４８９２〜４９５４番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号２の４８９２〜４９０９番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
と相補的である前記オリゴマー化合物。
【００７５】
実施形態７．前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸塩基配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である核酸塩基配列を有する、実施形態１、５または６のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００７６】
実施形態８．前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００７７】
実施形態９．前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態８に記載のオリゴマー化合物。
【００７８】
実施形態１０．前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【００７９】
実施形態１１．前記修飾オリゴヌクレオチドが、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態９または１０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００８０】
実施形態１２．前記修飾オリゴヌクレオチドが、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、実施形態１１に記載のオリゴマー化合物。
【００８１】
実施形態１３．前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−４’架橋を有する二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含み、前記２’−４’架橋が、−Ｏ−ＣＨ２−及び−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−から選択されている、実施形態１１または１２のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００８２】
実施形態１４．前記修飾オリゴヌクレオチドが、非二環式の修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態９に記載のオリゴマー化合物。
【００８３】
実施形態１５．前記修飾オリゴヌクレオチドが、非二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または少なくとも１８個含む、実施形態９または１０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００８４】
実施形態１６．前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−ＭＯＥ修飾糖または２’−ＯＭｅ修飾糖を含む非二環式の修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態１４または１５のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００８５】
実施形態１７．前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥまたは２’−ＯＭｅを含む非二環式の修飾糖部分を含む、実施形態９に記載のオリゴマー化合物。
【００８６】
実施形態１８．前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含む、実施形態９に記載のオリゴマー化合物。
【００８７】
実施形態１９．前記修飾オリゴヌクレオチドが、完全修飾型糖モチーフ領域を含む、実施形態１〜９のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００８８】
実施形態２０．前記完全修飾型糖モチーフ領域が、７〜２０ヌクレオシド長である、実施形態１９に記載のオリゴマー化合物。
【００８９】
実施形態２１．前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−デオキシヌクレオシドを少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個含む、実施形態１９〜２０のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００９０】
実施形態２２．前記完全修飾型糖モチーフ領域の各ヌクレオシドが、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基または２’−ＯＣＨ３基を含む、実施形態１９〜２１のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００９１】
実施形態２３．前記修飾オリゴヌクレオチドが、糖代替部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態８〜１８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００９２】
実施形態２４．前記修飾オリゴヌクレオチドが、モルホリノ及びＰＮＡから選択した糖代替部分を含む修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む、実施形態２３に記載のオリゴマー化合物。
【００９３】
実施形態２５．前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾インターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む、実施形態１〜２４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００９４】
実施形態２６．前記修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合が、修飾インターヌクレオシド結合である、実施形態２５に記載のオリゴマー化合物。
【００９５】
実施形態２７．少なくとも１つのインターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、実施形態２５または２６に記載のオリゴマー化合物。
【００９６】
実施形態２８．前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む、実施形態２５または２７に記載のオリゴマー化合物。
【００９７】
実施形態２９．前記インターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のいずれかである、実施形態２５、２７または２８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【００９８】
実施形態３０．前記修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、実施形態２６に記載のオリゴマー化合物。
【００９９】
実施形態３１．前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である、実施形態１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１００】
実施形態３２．前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１０１】
実施形態３３．前記修飾核酸塩基が、５−メチルシトシンである、実施形態３２に記載のオリゴマー化合物。
【０１０２】
実施形態３４．前記修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のシトシン核酸塩基を含み、前記シトシン核酸塩基のそれぞれが、５−メチルシトシンである、実施形態３２に記載のオリゴマー化合物。
【０１０３】
実施形態３５．前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ヒトＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９５％相補的である、実施形態１〜３４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１０４】
実施形態３６．前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜１８個、１２〜２０個、１４〜２０個、１６〜２０個または１７〜１９個の連結ヌクレオシドからなる、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０１０５】
実施形態３７．前記修飾オリゴヌクレオチドが、１８個の連結ヌクレオシドからなる、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０１０６】
実施形態３８．前記修飾オリゴヌクレオチドが、１８個または２０個の連結ヌクレオシドからなる、実施形態１〜３５のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１０７】
実施形態３９．前記修飾オリゴヌクレオチドからなる、実施形態１〜３８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１０８】
実施形態４０．コンジュゲート部分とコンジュゲートリンカーとを含むコンジュゲート基を含む、実施形態１〜３８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１０９】
実施形態４１．前記コンジュゲート基が、１〜３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含むＧａｌＮＡｃクラスターを含む、実施形態４０に記載のオリゴマー化合物。
【０１１０】
実施形態４２．前記コンジュゲートリンカーが、単結合からなる、実施形態４０または４１に記載のオリゴマー化合物。
【０１１１】
実施形態４３．前記コンジュゲートリンカーが、切断可能である、実施形態４０に記載のオリゴマー化合物。
【０１１２】
実施形態４４．前記コンジュゲートリンカーが、１〜３個のリンカーヌクレオシドを含む、実施形態４２に記載のオリゴマー化合物。
【０１１３】
実施形態４５．前記コンジュゲート基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で、前記修飾オリゴヌクレオチドに結合している、実施形態４１〜４４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１１４】
実施形態４６．前記コンジュゲート基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端で、前記修飾オリゴヌクレオチドに結合している、実施形態４１〜４４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１１５】
実施形態４７．末端基を含む、実施形態１〜４６のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１１６】
実施形態４８．一本鎖オリゴマー化合物である、実施形態１〜４７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１１７】
実施形態４９．リンカーヌクレオシドを含まない、実施形態１〜４２または４４〜４８のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１１８】
実施形態５０．実施形態４７または４９のいずれかに記載のオリゴマー化合物を含む二本鎖オリゴマー。
【０１１９】
実施形態５１．実施形態１〜４９のいずれかに記載のオリゴマー化合物もしくは実施形態５０に記載の二本鎖オリゴマーを含むか、または前記オリゴマー化合物もしくは前記二本鎖オリゴマーからなるアンチセンス化合物。
【０１２０】
実施形態５２．前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ化合物である、実施形態１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１２１】
実施形態５３．前記ＲＮＡｉ化合物が、ｓｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、実施形態５２に記載のオリゴマー化合物。
【０１２２】
実施形態５４．実施形態１〜４９もしくは実施形態５２〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物、または実施形態５０に記載の二本鎖オリゴマーと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【０１２３】
実施形態５５．前記薬学的に許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、実施形態５４に記載の医薬組成物。
【０１２４】
実施形態５６．前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、実施形態５４に記載の医薬組成物。
【０１２５】
実施形態５７．前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、実施形態５５に記載の医薬組成物。
【０１２６】
実施形態５８．前記塩が、ナトリウム塩である、実施形態５６または実施形態５７に記載の医薬組成物。
【０１２７】
実施形態５９．実施形態１〜５０のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチドのキラル的に富化された集団であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含み、前記集団において、特定の立体化学的配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている前記集団。
【０１２８】
実施形態６０．（Ｓｐ）配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態５９に記載のキラル的に富化された集団。
【０１２９】
実施形態６１．（Ｒｐ）配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態５９または６０に記載のキラル的に富化された集団。
【０１３０】
実施形態６２．前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが、独立して選択した特定の立体化学的配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態５９に記載のキラル的に富化された集団。
【０１３１】
実施形態６３．前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが（Ｓｐ）配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態６２に記載のキラル的に富化された集団。
【０１３２】
実施形態６４．前記ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のそれぞれが（Ｒｐ）配置である修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態６２に記載のキラル的に富化された集団。
【０１３３】
実施形態６５．５’→３’方向でＳｐ−Ｓｐ−Ｒｐという配置である少なくとも３個の連続したホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する修飾オリゴヌクレオチドが富化されている、実施形態５９または実施形態６２に記載のキラル的に富化された集団。
【０１３４】
実施形態６６．前記修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含み、前記修飾オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のすべてが、ステレオランダムである、実施形態１〜５０のいずれかに記載の修飾オリゴヌクレオチド集団。
【０１３５】
実施形態６７．実施形態５９〜６５のいずれかに記載のキラル的に富化された集団、または実施形態６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む医薬組成物。
【０１３６】
実施形態６８．前記薬学的に許容される希釈剤が、人工脳脊髄液である、実施形態５４または６７に記載の医薬組成物。
【０１３７】
実施形態６９．前記修飾オリゴヌクレオチドと人工脳脊髄液から本質的になる、実施形態６８に記載の医薬組成物。
【０１３８】
実施形態７０．動物に、実施形態５４または６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【０１３９】
実施形態７１．ＣＬＮ３と関連する疾患の治療方法であって、ＣＬＮ３と関連する疾患である個体、または前記疾患を発症するリスクがある個体に、実施形態５４または６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物を治療有効量投与することによって、前記ＣＬＮ３と関連する疾患を治療することを含む前記方法。
【０１４０】
実施形態７２．前記ＣＬＮ３と関連する疾患が、神経変性疾患である、実施形態７１に記載の方法。
【０１４１】
実施形態７３．前記神経変性疾患が、バッテン病である、実施形態７２に記載の方法。
【０１４２】
実施形態７４．前記神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善する、実施形態７３に記載の方法。
【０１４３】
実施形態７５．前記症状または特質が、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である、実施形態７４に記載の方法。
【０１４４】
実施形態７６．前記脳組織が、体性感覚皮質、視覚皮質、視床または海馬である、実施形態７５に記載の方法。
【０１４５】
実施形態７７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導する、実施形態１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
【０１４６】
実施形態７８．細胞におけるＣＬＮ３の発現の調節方法であって、前記細胞と、実施形態１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３の発現を調節することを含む前記方法。
【０１４７】
実施形態７９．細胞におけるＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライシングの調節方法であって、前記細胞と、実施形態１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３のスプライシングを調節することを含む前記方法。
【０１４８】
実施形態８０．細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングの誘導方法であって、前記細胞と、実施形態１〜５３のいずれかに記載のオリゴマー化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することを含む前記方法。
【０１４９】
実施形態８１．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態７８〜８０のいずれかに記載の方法。
【０１５０】
実施形態８２．前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前の量と比べて減少させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前のパーセンテージと比べて低下させる、
実施形態７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【０１５１】
実施形態８３．前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて低下させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて低下させる、
実施形態７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【０１５２】
実施形態８４．前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前の量と比べて増加するか、または
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記細胞と前記オリゴマー化合物との接触前のパーセンテージと比べて増大する、
実施形態７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【０１５３】
実施形態８５．前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて増加するか、または
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記オリゴマー化合物と接触させていない細胞と比べて増大する、
実施形態７８〜８１のいずれかに記載の方法。
【０１５４】
実施形態８６．ＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【０１５５】
実施形態８７．１５〜２５個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【０１５６】
実施形態８８．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４及び／またはイントロン５であり、前記化合物が、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【０１５７】
実施形態８９．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる前記化合物。
【０１５８】
実施形態９０．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４及び／またはイントロン５であり、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【０１５９】
実施形態９１．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５、イントロン４またはイントロン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、及び／またはそのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６０】
実施形態９２．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を少なくとも１つ及び／またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む前記化合物。
【０１６１】
実施形態９３．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、及び／またはそのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６２】
実施形態９４．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６３】
実施形態９５．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン４であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６４】
実施形態９６．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン５であり、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６５】
実施形態９７．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、イントロン４とエキソン５に及び、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６６】
実施形態９８．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、ヒトＣＬＮ３核酸の標的領域のうちの等しい長さの部分と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ＣＬＮ３核酸の標的領域が、エキソン５とイントロン５に及び、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６７】
実施形態９９．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、または前記オリゴヌクレオチドからなる化合物であって、前記ヌクレオシドのそれぞれが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含み、そのインターヌクレオシド結合のそれぞれが、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である前記化合物。
【０１６８】
実施形態１００．実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物を含む医薬組成物。
【０１６９】
実施形態１０１．治療に用いるための、実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態１００に記載の医薬組成物。
【０１７０】
実施形態１０２．対象の若年性バッテン病を治療するのに用いるための、実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態１００に記載の医薬組成物であって、任意に、前記化合物が、前記対象において、運動協調性を改善し、及び／または神経障害を軽減することができる前記化合物または前記医薬組成物。
【０１７１】
実施形態１０３．前記バッテン病が、若年性バッテン病である、実施形態１０２に記載の化合物または医薬組成物。
【０１７２】
実施形態１０４．実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態１００に記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【０１７３】
実施形態１０５．実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態１００に記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【０１７４】
実施形態１０６．前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０１７５】
実施形態１０７．前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１８個の連結ヌクレオシドからなり、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
配列番号１の５４９９〜５７０１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１４〜５６５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５１９〜５５４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５３４〜５６４６番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、
配列番号１の５５５９〜５６３１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分、または
配列番号１の５５３４〜５５５１番目の核酸塩基のうちの等しい長さの部分
と相補的である核酸塩基配列を有する、実施形態１に記載のオリゴマー化合物。
【０１７６】
実施形態１０８．前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である核酸塩基配列を有し、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである、
実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０１７７】
実施形態１０９．１８個または２０個の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、ＣＬＮ３核酸のうちの等しい長さの部分と少なくとも９０％相補的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【０１７８】
実施形態１１０．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【０１７９】
実施形態１１１．１２〜５０個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個または１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列全体にわたって測定した場合に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸塩基配列と少なくとも９０％相補的である核酸塩基配列を有し、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【０１８０】
実施形態１１２．１８個の連結ヌクレオシドからなるとともに、配列番号５７〜９６の核酸塩基配列のうちのいずれかの核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾ヌクレオシドが、２’−ＭＯＥを含む非二環式の修飾糖部分を含み、
前記修飾オリゴヌクレオチドの各修飾インターヌクレオシド結合が、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、
その各シトシン核酸塩基が、５−メチルシトシンである前記オリゴマー化合物。
【０１８１】
実施形態１１３．ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導できる、実施形態１０６〜１１２のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０１８２】
実施形態１１４．実施形態１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【０１８３】
実施形態１１５．薬学的に許容される希釈剤を含む、実施形態１００に記載の医薬組成物。
【０１８４】
実施形態１１６．前記薬学的に許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、実施形態１１４または１１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１８５】
実施形態１１７．前記オリゴマー化合物または前記二本鎖オリゴマーの修飾オリゴヌクレオチドが、塩である、実施形態１００または１１４〜１１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１８６】
実施形態１１８．前記塩が、ナトリウム塩である、実施形態１１７に記載の医薬組成物。
【０１８７】
実施形態１１９．治療に用いるための、実施形態１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物、または実施形態６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１８８】
実施形態１２０．実施形態１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれかに記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【０１８９】
実施形態１２１．実施形態１〜４９もしくは１０６〜１１３のいずれか１つに記載の化合物、または実施形態６７〜６９もしくは１１４〜１１８のいずれかに記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【０１９０】
実施形態１２２．治療に用いるための、実施形態５９〜６５のいずれか１つに記載のキラル的に富化された集団、実施形態６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または実施形態６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物。
【０１９１】
実施形態１２３．実施形態５９〜６５のいずれか１つに記載のキラル的に富化された集団、実施形態６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または実施形態６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物の、医薬の製造への使用。
【０１９２】
実施形態１２４．実施形態５９〜６５のいずれか１つに記載のキラル的に富化された集団、実施形態６６に記載の修飾オリゴヌクレオチド集団、または実施形態６７〜６９のいずれかに記載の医薬組成物の、バッテン病を治療するための医薬の製造への使用。
【０１９３】
実施形態１２５．ＣＬＮ３と関連する疾患の治療方法であって、ＣＬＮ３と関連する疾患である個体、または前記疾患を発症するリスクがある個体に、実施形態１１０または１１４〜１１８のいずれか１つに記載の医薬組成物を治療有効量投与することによって、前記ＣＬＮ３と関連する疾患を治療することを含む前記方法。
【０１９４】
実施形態１２６．前記ＣＬＮ３と関連する疾患が、神経変性疾患である、実施形態１２５に記載の方法。
【０１９５】
実施形態１２７．前記神経変性疾患が、バッテン病である、実施形態１２６に記載の方法。
【０１９６】
実施形態１２８．前記神経変性疾患の症状または特質を少なくとも１つ改善する、実施形態１２７に記載の方法。
【０１９７】
実施形態１２９．前記症状または特質が、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である、実施形態１２８に記載の方法。
【０１９８】
実施形態１３０．前記脳組織が、体性感覚皮質、視覚皮質、視床または海馬である、実施形態１２９に記載の方法。
【０１９９】
実施形態１３１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導する、実施形態１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物。
【０２００】
実施形態１３２．細胞におけるＣＬＮ３の発現の調節方法であって、前記細胞と、実施形態１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物、または実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３の発現を調節することを含む前記方法。
【０２０１】
実施形態１３３．細胞におけるＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライシングの調節方法であって、前記細胞と、実施形態１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物、または実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３のスプライシングを調節することを含む前記方法。
【０２０２】
実施形態１３４．細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングの誘導方法であって、前記細胞と、実施形態１０６〜１１３のいずれか１つに記載のオリゴマー化合物、または実施形態８６〜９９のいずれか１つに記載の化合物を接触させることによって、前記細胞におけるＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導することを含む前記方法。
【０２０３】
実施形態１３５．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態１３２〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態１３６．前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子の量を、前記細胞と前記化合物との接触前の量と比べて減少させるか、または
前記細胞における、エキソン５を含むＣＬＮ３  ｍＲＮＡ分子のパーセンテージを、前記細胞と前記化合物との接触前のパーセンテージと比べて低下させる、
実施形態１３２〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態１３７．
前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質の量が、前記細胞と前記化合物との接触前の量と比べて増加するか、
または前記細胞における、エキソン１０のアミノ酸を含むＣＬＮ３タンパク質分子のパーセンテージが、前記細胞と前記化合物との接触前のパーセンテージと比べて増大する、
実施形態１３２〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
Ｉ．特定のオリゴヌクレオチド
特定の実施形態では、本発明で提供するのは、連結ヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物である。オリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であっても、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡまたは非修飾ＤＮＡに対する修飾を少なくとも１つ含む。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド（修飾糖部分及び／または修飾核酸塩基を含むヌクレオシド）を少なくとも１つ、及び／または修飾インターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含む。
【０２０７】
Ａ．特定の修飾ヌクレオシド
修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分、修飾核酸塩基、または修飾糖部分及び修飾核酸塩基の両方を含む。
【０２０８】
１．特定の糖部分
特定の実施形態では、修飾糖部分は、非二環式の修飾糖部分である。特定の実施形態では、修飾糖部分は、二環式または三環式の糖部分である。特定の実施形態では、修飾糖部分は、糖代替部分である。このような糖代替部分は、他の種類の修飾糖部分の置換に対応する置換を１つ以上含んでよい。
【０２０９】
特定の実施形態では、修飾糖部分は、置換基を１つ以上有するフラノシル環を含む非二環式の修飾糖部分であり、その置換基には、そのフラノシル環のうちの２つの原子を架橋して、二環式構造を形成させるものは存在しない。このような非架橋置換基は、そのフラノシルのいずれの位置にあってもよく、２’位、４’位及び／または５’位にある置換基が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、非二環式の修飾糖部分の、１つ以上の非架橋置換基は、分岐状のものである。非二環式の修飾糖部分に適する２’−置換基の例としては、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３（「ＯＭｅ」または「Ｏ−メチル」）及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３（「２’−ＭＯＥ」）が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、２’−置換基は、ハロ、アリル、アミノ、アジド、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０置換アルコキシ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０置換アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ（Ｒｍ）−アルキニル、Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、各Ｒｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１０アルキルである）、ならびにＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．６，５３１，５８４、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，８５９，２２１及びＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．６，００５，０８７に記載されているような２’−置換基の中から選択されている。これらの２’−置換基の特定の実施形態は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ、チオアルキル、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルの中から独立して選択した１つ以上の置換基でさらに置換されていることができる。非二環式の修飾糖部分に適する４’−置換基の例としては、アルコキシ（例えばメトキシ）、アルキル、及びＭａｎｏｈａｒａｎらのＷＯ２０１５／１０６１２８に記載されているような基が挙げられるが、これらに限らない。非二環式の修飾糖部分に適する５’−置換基の例としては、５’−メチル（ＲまたはＳ）、５’−ビニル及び５’−メトキシが挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、非二環式の修飾糖部分は、２つ以上の非架橋糖置換基、例えば２’−Ｆ−５’−メチル糖部分、ならびに、ＭｉｇａｗａらのＷＯ２００８／１０１１５７及びＲａｊｅｅｖらのＵＳ２０１３／０２０３８３６に記載されている修飾糖部分及び修飾ヌクレオシドを含む。
【０２１０】
特定の実施形態では、２’−置換非二環式修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２及びＮ−置換アセトアミド（ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））（式中、各Ｒｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１０アルキルである）から選択した非架橋２’−置換基を含む糖部分を含む。
【０２１１】
特定の実施形態では、２’−置換ヌクレオシドである非二環式修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２及びＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３（「ＮＭＡ」）から選択した非架橋２’−置換基を含む糖部分を含む。
【０２１２】
特定の実施形態では、２’−置換非二環式修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＨ３及びＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択した非架橋２’−置換基を含む糖部分を含む。
【０２１３】
特定の修飾糖部分は、フラノシル環の２つの原子を架橋して、第２の環を形成することにより、二環式糖部分をもたらす置換を含む。特定のこのような実施形態では、その二環式糖部分は、４’フラノース環原子と２’フラノース環原子の間に架橋を含む。４’から２’までを架橋するこのような糖置換基の例としては、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（「ＬＮＡ」）、４’−ＣＨ２−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（「ＥＮＡ」）、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」という）、４’−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−２’、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束ＭＯＥ」または「ｃＭＯＥ」）及びその類似体（例えば、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．７，３９９，８４５、ＢｈａｔらのＵ．Ｓ．７，５６９，６８６、ＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．７，７４１，４５７及びＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．８，０２２，１９３を参照されたい）、４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’及びその類似体（例えば、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，２７８，２８３を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’及びその類似体（例えば、ＰｒａｋａｓｈらのＵ．Ｓ．８，２７８，４２５を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、ＡｌｌｅｒｓｏｎらのＵ．Ｓ．７，６９６，３４５及びＡｌｌｅｒｓｏｎらのＵ．Ｓ．８，１２４，７４５を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照されたい）、４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びその類似体（例えば、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，２７８，４２６を参照されたい）、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、４’−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、ならびに４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、各Ｒ、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｈ、保護基またはＣ１−Ｃ１２アルキルである）（例えば、ＩｍａｎｉｓｈｉらのＵ．Ｓ．７，４２７，６７２を参照されたい）が挙げられるが、これらに限らない。
【０２１４】
特定の実施形態では、このような４’から２’までの架橋部は独立して、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択した１〜４個の連結基を含み、
式中、
ｘは、０、１または２であり、
ｎは、１、２、３または４であり、
各Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、
各Ｊ１及びＪ２は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環式ラジカル、置換複素環式ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキルまたは保護基である。
【０２１５】
さらなる二環式糖部分は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３、Ａｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，８３６２−８３７９、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．７，０５３，２０７、ＩｍａｎｉｓｈｉらのＵ．Ｓ．６，２６８，４９０、ＩｍａｎｉｓｈｉらのＵ．Ｓ．６，７７０，７４８、ＩｍａｎｉｓｈｉらのＵ．Ｓ．ＲＥ４４，７７９、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．６，７９４，４９９、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．６，６７０，４６１、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．７，０３４，１３３、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．８，０８０，６４４、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．８，０３４，９０９、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．８，１５３，３６５、ＷｅｎｇｅｌらのＵ．Ｓ．７，５７２，５８２、ＲａｍａｓａｍｙらのＵ．Ｓ．６，５２５，１９１、ＴｏｒｓｔｅｎらのＷＯ２００４／１０６３５６、ＷｅｎｇｅｌらのＷＯ１９９９／０１４２２６、ＳｅｔｈらのＷＯ２００７／１３４１８１、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．７，５４７，６８４、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．７，６６６，８５４、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，０８８，７４６、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．７，７５０，１３１、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，０３０，４６７、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，２６８，９８０、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，５４６，５５６、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，５３０，６４０、ＭｉｇａｗａらのＵ．Ｓ．９，０１２，４２１、ＳｅｔｈらのＵ．Ｓ．８，５０１，８０５、Ａｌｌｅｒｓｏｎらの米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号、及びＭｉｇａｗａらのＵＳ２０１５／０１９１７２７を参照されたい。
【０２１６】
特定の実施形態では、二環式糖部分、及びそのような二環式糖部分が導入されたヌクレオシドは、異性体の配置によってさらに定義されている。例えば、ＬＮＡヌクレオシド（本明細書に説明されている）は、α−Ｌ配置であっても、β−Ｄ配置であってもよい。
【化１】
2022500079.tif 000003
【０２１７】
α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）またはα−Ｌ−ＬＮＡの二環式ヌクレオシドは、アンチセンス活性を示すオリゴヌクレオチドに導入されてきている（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。本明細書では、二環式ヌクレオシドという一般的な記載には、両方の異性体配置が含まれる。所定の二環式ヌクレオシド（例えばＬＮＡまたはｃＥｔ）の位置が、本発明の例示の実施形態で特定されている場合、別段の定めのない限り、それらはβ−Ｄ配置である。
【０２１８】
特定の実施形態では、修飾糖部分は、１つ以上の非架橋糖置換基と、１つ以上の架橋糖置換基（例えば、５’−置換糖と４’−２’架橋糖）を含む。
【０２１９】
特定の実施形態では、修飾糖部分は、糖代替部分である。特定のこのような実施形態では、その糖部分の酸素原子は、例えば、硫黄原子、炭素原子または窒素原子で置き換えられている。特定のこのような実施形態では、このような修飾糖部分は、本明細書に記載されているような架橋置換基及び／または非架橋置換基も含む。例えば、特定の糖代替部分は、４’−硫黄原子と、２’位の置換基（例えば、ＢｈａｔらのＵ．Ｓ．７，８７５，７３３及びＢｈａｔらのＵ．Ｓ．７，９３９，６７７を参照されたい）及び／または５’位の置換基を含む。
【０２２０】
特定の実施形態では、糖代替部分は、５個以外の原子を有する環を含む。例えば、特定の実施形態では、糖代替部分は、６員のテトラヒドロピラン（「ＴＨＰ」）を含む。このようなテトラヒドロピランは、さらに修飾または置換されていてもよい。このような修飾テトラヒドロピランを含むヌクレオシドとしては、ヘキシトール核酸（「ＨＮＡ」）、アニトール核酸（「ＡＮＡ」）、マンニトール核酸（「ＭＮＡ」）（例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ，ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，１０，８４１−８５４を参照されたい）、フルオロＨＮＡ
【化２】
2022500079.tif 000004
（「Ｆ−ＨＮＡ」。例えば、ＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．８，０８８，９０４、ＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．８，４４０，８０３、ＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．８，７９６，４３７及びＳｗａｙｚｅらのＵ．Ｓ．９，００５，９０６を参照されたい。Ｆ−ＨＮＡは、Ｆ−ＴＨＰまたは３’−フルオロテトラヒドロピランと称することもできる）、及び以下の式を有する追加の修飾ＴＨＰ化合物を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限らない。
【化３】
2022500079.tif 000005
式中、独立して、当該修飾ＴＨＰヌクレオシドのそれぞれにおいて、
Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｔ３及びＴ４はそれぞれ独立して、その修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残部に連結するインターヌクレオシド連結基であるか、またはＴ３及びＴ４のうちの１つは、その修飾ＴＨＰヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの残部に連結するインターヌクレオシド連結基であり、Ｔ３及びＴ４のうちのもう一方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、または５’もしくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり、
Ｒ１及びＲ２のそれぞれは独立して、水素、ハロゲン、置換または非置換のアルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮの中から選択されており、そのＸは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１であり、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３はそれぞれ、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０２２１】
特定の実施形態では、上記の式中、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７がそれぞれＨである修飾ＴＨＰヌクレオシドを提供する。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７のうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７のうちの少なくとも１つは、メチルである。特定の実施形態では、上記の式中、Ｒ１及びＲ２のうちの１つがＦである修飾ＴＨＰヌクレオシドを提供する。特定の実施形態では、Ｒ１はＦであり、Ｒ２はＨであり、特定の実施形態では、Ｒ１はメトキシであり、Ｒ２はＨであり、特定の実施形態では、Ｒ１はメトキシエトキシであり、Ｒ２はＨである。
【０２２２】
特定の実施形態では、糖代替部分は、６個以上の原子と２つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシドと、そのヌクレオシドをオリゴヌクレオチドにおいて用いることが報告されている（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０、ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎらのＵ．Ｓ．５，６９８，６８５、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎらのＵ．Ｓ．５，１６６，３１５、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎらのＵ．Ｓ．５，１８５，４４４及びＳｕｍｍｅｒｔｏｎらのＵ．Ｓ．５，０３４，５０６を参照されたい）。本明細書で使用する場合、「モルホリノ」という用語は、下記の構造を有する糖代替部分を意味する。
【化４】
2022500079.tif 000006
【０２２３】
特定の実施形態では、モルホリノは、例えば、上記のモルホリノ構造から、様々な置換基を付加または改変することによって修飾されていてよい。このような糖代替部分は、本明細書では、「修飾モルホリノ」という。
【０２２４】
特定の実施形態では、糖代替部分は、非環式部分を含む。このような非環式糖代替部分を含むヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの例としては、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、非環式ブチル核酸（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，１１，５８５３−５８６５を参照されたい）、ならびにＭａｎｏｈａｒａｎらのＷＯ２０１１／１３３８７６に記載されているヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限らない。
【０２２５】
修飾ヌクレオシドで使用できる多くの他の二環式糖、三環式糖及び糖代替環系は、当該技術分野において知られている。
【０２２６】
２．特定の修飾核酸塩基
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を含まないヌクレオシド（脱塩基ヌクレオシドという）を１つ以上含む。
【０２２７】
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、アルキル置換ピリミジン、アルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン及びＯ−６置換プリンから選択されている。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、２−アミノプロピルアデニン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−Ｎ−メチルグアニン、６−Ｎ−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−リボシルウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、８−アザプリン及びその他の８−置換プリン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−Ｎ−イソブチリルグアニン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチル４−Ｎ−ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、プロミスキャス塩基、サイズ拡張型塩基、ならびにフルオロ化塩基から選択されている。さらなる修飾核酸塩基としては、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン及び９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇクランプ）のような三環式ピリミジンが挙げられる。修飾核酸塩基としては、そのプリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンに置き換わっているものも挙げてよい。さらなる核酸塩基としては、ＭｅｒｉｇａｎらのＵ．Ｓ．３，６８７，８０８に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，２７３−２８８に開示されているもの、及びＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８，１６３−１６６  ａｎｄ  ４４２−４４３に開示されているものが挙げられる。
【０２２８】
上記の修飾核酸塩基のうちの特定の塩基の調製、及びその他の修飾核酸塩基を教示している刊行物としては、ＭａｎｏｈａｒａらのＵＳ２００３／０１５８４０３、ＭａｎｏｈａｒａｎらのＵＳ２００３／０１７５９０６、ＤｉｎｈらのＵ．Ｓ．４，８４５，２０５、ＳｐｉｅｌｖｏｇｅｌらのＵ．Ｓ．５，１３０，３０２、ＲｏｇｅｒｓらのＵ．Ｓ．５，１３４，０６６、ＢｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒらのＵ．Ｓ．５，１７５，２７３、ＵｒｄｅａらのＵ．Ｓ．５，３６７，０６６、ＢｅｎｎｅｒらのＵ．Ｓ．５，４３２，２７２、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，４３４，２５７、ＧｍｅｉｎｅｒらのＵ．Ｓ．５，４５７，１８７、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，４５９，２５５、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，４８４，９０８、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，５０２，１７７、ＨａｗｋｉｎｓらのＵ．Ｓ．５，５２５，７１１、ＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓらのＵ．Ｓ．５，５５２，５４０、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，５８７，４６９、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，５９４，１２１、ＳｗｉｔｚｅｒらのＵ．Ｓ．５，５９６，０９１、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，６１４，６１７、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，６４５，９８５、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，６８１，９４１、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，８１１，５３４、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，７５０，６９２、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，９４８，９０３、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，５８７，４７０、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，４５７，１９１、ＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．５，７６３，５８８、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＵ．Ｓ．５，８３０，６５３、ＣｏｏｋらのＵ．Ｓ．５，８０８，０２７、Ｃｏｏｋらの６，１６６，１９９及びＭａｔｔｅｕｃｃｉらのＵ．Ｓ．６，００５，０９６が挙げられるが、これらに限らない。
【０２２９】
３．特定の修飾インターヌクレオシド結合
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、いずれかのインターヌクレオシド結合を用いて、連結し合っていてよい。インターヌクレオシド連結基の２つの主な種類は、リン原子の有無によって定義される。リンを含む代表的なインターヌクレオシド結合としては、ホスホジエステル結合（「Ｐ＝Ｏ」）（非修飾結合または天然の結合ともいう）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート及びホスホロチオエート（「Ｐ＝Ｓ」）、ならびにホスホロジチオエート（「ＨＳ−Ｐ＝Ｓ」）を含むリン酸塩が挙げられるが、これらに限らない。リンを含まない代表的なインターヌクレオシド連結基としては、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）、シロキサン（−Ｏ−ＳｉＨ２−Ｏ−）及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられるが、これらに限らない。修飾インターヌクレオシド結合は、天然のリン酸塩結合と比べて、そのオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を変化させる目的で、典型的には増大させる目的で用いることができる。特定の実施形態では、キラル原子を有するインターヌクレオシド結合は、ラセミ混合物として、または別々のエナンチオマーとして調製できる。リンを含むかまたはリンを含まないインターヌクレオシド結合の調製方法は、当業者には周知である。
【０２３０】
キラル中心を有する代表的なインターヌクレオシド結合としては、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限らない。キラル中心を有するインターヌクレオシド結合を含む修飾オリゴヌクレオチドは、ステレオランダムなインターヌクレオシド結合を含む修飾オリゴヌクレオチドの集団として、または特定の立体化学的配置のホスホロチオエートインターヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドの集団として調製できる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、そのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合のすべてがステレオランダムであるホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を含む。このような修飾オリゴヌクレオチドは、各ホスホロチオエートインターヌクレオシドの立体化学的配置がランダムに選択される合成方法を用いて作製できる。しかしその一方では、当業者に充分に認識されているように、個々のオリゴヌクレオチド分子のそれぞれの個々のホスホロチオエートはそれぞれ、立体配置が定められている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド集団においては、独立して選択した特定の立体化学的配置である特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を１つ以上含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている。特定の実施形態では、その特定の配置の特定のホスホロチオエートインターヌクレオシドは、その集団内の分子の少なくとも６５％に存在する。特定の実施形態では、その特定の配置の特定のホスホロチオエートインターヌクレオシドは、その集団内の分子の少なくとも７０％に存在する。特定の実施形態では、その特定の配置の特定のホスホロチオエートインターヌクレオシドは、その集団内の分子の少なくとも８０％に存在する。特定の実施形態では、その特定の配置の特定のホスホロチオエートインターヌクレオシドは、その集団内の分子の少なくとも９０％に存在する。特定の実施形態では、その特定の配置の特定のホスホロチオエートインターヌクレオシドは、その集団内の分子の少なくとも９９％に存在する。このようなキラル的に富化された修飾オリゴヌクレオチド集団は、当該技術分野において知られている合成方法、例えば、Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ  １２５，８３０７（２００３）、Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．４２，１３４５６（２０１４）及びＷＯ２０１７／０１５５５５に記載されている方法を用いて作製できる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド集団においては、（Ｓｐ）配置である示されているホスホロチオエートを少なくとも１つ有する修飾オリゴヌクレオチドが富化されている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド集団においては、（Ｒｐ）配置であるホスホロチオエートを少なくとも１つ有する修飾オリゴヌクレオチドが富化さている。特定の実施形態では、（Ｒｐ）ホスホロチオエート及び／または（Ｓｐ）ホスホロチオエートを含む修飾オリゴヌクレオチドはそれぞれ、以下の式のうちの１つ以上を含み、式中、「Ｂ」は、核酸塩基を示している。
【化５】
2022500079.tif 000007
【０２３１】
別段に示されていない限り、本明細書に記載されている修飾オリゴヌクレオチドのキラルなインターヌクレオシド結合は、ステレオランダムであることも、特定の立体化学的配置であることもできる。
【０２３２】
中性インターヌクレオシド結合としては、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、アミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、メトキシプロピル及びチオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）が挙げられるが、これらに限らない。さらなる中性インターヌクレオシド結合としては、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、スルフィド、スルホン酸エステル及びアミドを含む非イオン結合が挙げられる（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３  ａｎｄ  ４，４０−６５を参照されたい）。さらなる中性インターヌクレオシド結合としては、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２を混合した成分部分を含む非イオン結合が挙げられる。
【０２３３】
Ｂ．特定のモチーフ
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含む修飾ヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む修飾ヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾インターヌクレオシド結合を１つ以上含む。このような実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの修飾型、非修飾型及び異なる修飾を有する糖部分、核酸塩基及び／またはインターヌクレオシド結合によって、パターンまたはモチーフが定められる。特定の実施形態では、糖部分、核酸塩基及びインターヌクレオシド結合のパターンはそれぞれ、互いから独立している。したがって、修飾オリゴヌクレオチドは、その糖モチーフ、核酸塩基モチーフ及び／またはインターヌクレオシド結合モチーフによって説明し得る（本明細書で使用する場合、核酸塩基モチーフは、核酸塩基の配列から独立した、核酸塩基への修飾を説明するものである）。
【０２３４】
１．特定の糖モチーフ
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、定められたパターンまたは糖モチーフで配置された修飾糖部分及び／または非修飾糖部分を１種類以上含む。特定の場合では、このような糖モチーフとしては、本明細書で論じられている修飾糖部分のいずれもが挙げられるが、これらに限らない。
【０２３５】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２つの外側領域、すなわち「ウイング」と、中央、すなわち内側の領域、すなわち「ギャップ」によって定められているギャップマーモチーフを有する領域を含むか、またはその領域からなる。ギャップマーモチーフの３つの領域（５’ウイング、ギャップ及び３’ウイング）は、ヌクレオシドの連続した配列を形成し、その配列においては、その各ウイングのヌクレオシドの糖部分のうちの少なくともいくつかは、そのギャップのヌクレオシドの糖部分のうちの少なくともいくつかとは異なる。具体的には、各ウイングのヌクレオシドの糖部分のうち、少なくとも、ギャップに最も近い糖部分（５’ウイングの３’最末端ヌクレオシド及び３’ウイングの５’最末端ヌクレオシド）は、隣接するギャップヌクレオシドの糖部分とは異なることで、ウイングとギャップとの境界（すなわち、ウイング／ギャップ接合部）を画定する。特定の実施形態では、そのギャップ内の糖部分は、互いに同じものである。特定の実施形態では、そのギャップは、そのギャップの他のヌクレオシドのうちの１つ以上の糖部分とは異なる糖部分を有するヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、その２つのウイングの糖モチーフは、互いに同じものである（対称ギャップマー）。特定の実施形態では、その５’ウイングの糖モチーフは、その３’ウイングの糖モチーフとは異なるものである（不斉ギャップマー）。
【０２３６】
特定の実施形態では、ギャップマーのウイングは、１〜５個のヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングの各ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングのヌクレオシドの少なくとも１つは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングのヌクレオシドの少なくとも２つは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングのヌクレオシドの少なくとも３つは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングのヌクレオシドの少なくとも４つは、修飾ヌクレオシドである。
【０２３７】
特定の実施形態では、ギャップマーのギャップは、７〜１２個のヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーのギャップの各ヌクレオシドは、修飾されていない２’−デオキシヌクレオシドである。
【０２３８】
特定の実施形態では、そのギャップマーは、デオキシギャップマーである。特定の実施形態では、各ウイング／ギャップ接合部のギャップ側にあるヌクレオシドは、修飾されていない２’−デオキシヌクレオシドであり、各ウイング／ギャップ接合部のウイング側にあるヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、そのギャップの各ヌクレオシドは、修飾されていない２’−デオキシヌクレオシドである。特定の実施形態では、ギャップマーの各ウイングの各ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。
【０２３９】
本明細書では、ギャップマーの３つの領域の長さ（ヌクレオシド数）は、［５’ウイング内のヌクレオシド数］−［ギャップ内のヌクレオシド数］−［３’ウイング内のヌクレオシド］という表記を用いて示されていることがある。すなわち、５−１０−５ギャップマーは、各ウイング内の５つの連結ヌクレオシドと、ギャップ内の１０個の連結ヌクレオシドからなる。このような表記の後に、具体的な修飾部が示されている場合、その修飾部は、各ウイングの各糖部分内の修飾であり、ギャップヌクレオシドは、修飾されていないデオキシヌクレオシド糖を含む。すなわち、５−１０−５ＭＯＥギャップマーは、５’ウイング内の５つの連結されたＭＯＥ修飾ヌクレオシドと、ギャップ内の１０個の連結されたデオキシヌクレオシドと、３’ウイング内の５つの連結されたＭＯＥヌクレオシドからなる。
【０２４０】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＭＯＥギャップマーである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、３−１０−３ＢＮＡギャップマーである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、３−１０−３ｃＥｔギャップマーである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、３−１０−３ＬＮＡギャップマーである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、５−１０−５ＯＭｅ／ＭＯＥギャップマーである。特定の実施形態では、５−１０−５ＯＭｅ／ＭＯＥギャップマーは、ｍｅｅｅｍ−１０−ｍｍｍｍｍというモチーフを有し、式中、ｍは、２’−ＭＯＥ修飾部分を表し、ｅは、２’−ＯＭｅ修飾部分を表している。
【０２４１】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、完全修飾型糖モチーフを有する領域を含むか、またはその領域からなる。このような実施形態では、その修飾オリゴヌクレオチドの完全修飾型領域の各ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、完全修飾型糖モチーフを有する領域を含むか、またはその領域からなり、その完全修飾型領域内の各ヌクレオシドは、同じ修飾糖部分を含む（均一修飾型糖モチーフ）。特定の実施形態では、その均一修飾型糖モチーフは、７〜２０ヌクレオシド長である。特定の実施形態では、その均一修飾型糖モチーフの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシド、糖代替部分または二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、均一修飾型糖モチーフの各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基または２’−ＯＣＨ３基のいずれかを含む。特定の実施形態では、完全修飾型糖モチーフを少なくとも１つ有する修飾オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオシドも少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個有してもよい。
【０２４２】
特定の実施形態では、その修飾オリゴヌクレオチド全体の各ヌクレオシドが、修飾糖部分を含む（完全修飾型オリゴヌクレオチド）。特定の実施形態では、完全修飾型オリゴヌクレオチドは、異なる２’−修飾部を含む。特定の実施形態では、完全修飾型オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシド、糖代替部分または二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、完全修飾型オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基と、少なくとも１つの２’−ＯＣＨ３基のいずれかを含む。
【０２４３】
特定の実施形態では、完全修飾型オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、同じ２’−修飾部を含む（均一修飾型オリゴヌクレオチド）。特定の実施形態では、均一修飾型オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシド、糖代替部分または二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、均一修飾型オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基または２’−ＯＣＨ３基のいずれかを含む。
【０２４４】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分を含むヌクレオシドを少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−置換ヌクレオシド、糖代替部分、二環式ヌクレオシドまたは２’−デオキシヌクレオシドである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基、２’−Ｈ（Ｈ）デオキシリボシル糖部分、またはｃＥｔ修飾糖を含む。
【０２４５】
２．特定の核酸塩基モチーフ
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、定められたパターンまたはモチーフで配置された修飾核酸塩基及び／または非修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、各核酸塩基が修飾されている。特定の実施形態では、修飾されている核酸塩基はない。特定の実施形態では、各プリンまたは各ピリミジンが修飾されている。特定の実施形態では、各アデニンが修飾されている。特定の実施形態では、各グアニンが修飾されている。特定の実施形態では、各チミンが修飾されている。特定の実施形態では、各ウラシルが修飾されている。特定の実施形態では、各シトシンが修飾されている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのシトシン核酸塩基のいくつかまたはすべては、５−メチルシトシンである。特定の実施形態では、そのシトシン核酸塩基はすべて、５−メチルシトシンであり、その修飾オリゴヌクレオチドの他の核酸塩基はすべて、非修飾核酸塩基である。
【０２４６】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基のブロックを含む。特定のこのような実施形態では、そのブロックは、そのオリゴヌクレオチドの３’末端にある。特定の実施形態では、そのブロックは、そのオリゴヌクレオチドの３’末端から３ヌクレオシド内にある。特定の実施形態では、そのブロックは、そのオリゴヌクレオチドの５’末端にある。特定の実施形態では、そのブロックは、そのオリゴヌクレオチドの５’末端から３ヌクレオシド内にある。
【０２４７】
特定の実施形態では、ギャップマーモチーフを有するオリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを含む。特定のこのような実施形態では、修飾核酸塩基を含む１つのヌクレオシドは、ギャップマーモチーフを有するオリゴヌクレオチドの中央のギャップ内にある。特定のこのような実施形態では、当該ヌクレオシドの糖部分は、２’−デオキシリボシル部分である。特定の実施形態では、その修飾核酸塩基は、２−チオピリミジン及び５−プロピンピリミジンから選択されている。
【０２４８】
３．特定のインターヌクレオシド結合モチーフ
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、定められたパターンまたはモチーフで配置された修飾インターヌクレオシド結合及び／または非修飾インターヌクレオシド結合を含む。特定の実施形態では、各インターヌクレオシド連結基は、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合（Ｐ＝ｏ）である。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド連結基は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合（Ｐ＝ｓ）である。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合及びホスホジエステルインターヌクレオシド結合から独立して選択されている。特定の実施形態では、各ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合は、ステレオランダムなホスホロチオエート、（Ｓｐ）ホスホロチオエート及び（Ｒｐ）ホスホロチオエートから独立して選択されている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの糖モチーフは、ギャップマーであり、そのギャップ内のインターヌクレオシド結合はすべて修飾されている。特定のこのような実施形態では、そのウイング内のインターヌクレオシド結合のいくつかまたはすべては、修飾されていないホスホジエステルインターヌクレオシド結合である。特定の実施形態では、その末端のインターヌクレオシド結合は、修飾されている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの糖モチーフは、ギャップマーであり、そのインターヌクレオシド結合モチーフは、少なくとも１つのウイング内に、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合を少なくとも１つ含み、その少なくとも１つのホスホジエステル結合は、末端のインターヌクレオシド結合ではなく、残りのインターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合である。特定の実施形態では、そのインターヌクレオシド結合モチーフは、ｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓである。特定のこのような実施形態では、そのホスホロチオエートインターヌクレオシドはすべて、ステレオランダムである。特定の実施形態では、そのウイング内のホスホロチオエートインターヌクレオシドはすべて、（Ｓｐ）ホスホロチオエートであり、そのギャップは、Ｓｐ、Ｓｐ、Ｒｐモチーフを少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、そのインターヌクレオシド結合モチーフは、Ｓｐ−ｏ−ｏ−ｏ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｒｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｒｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐである。特定の実施形態では、そのインターヌクレオシド結合モチーフは、Ｓｐ−ｏ−ｏ−ｏ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｒｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐ−Ｓｐである。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド集団において、このようなインターヌクレオシド結合モチーフを含む修飾オリゴヌクレオチドが富化されている。
【０２４９】
Ｃ．特定の長さ
活性を消失させずに、オリゴヌクレオチドの長さを増減させることが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆらの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、卵母細胞注入モデルで、１３〜２５核酸塩基長の一連のオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの切断を誘導する能力について試験した。オリゴヌクレオチドの末端近くに８個または１１個のミスマッチ塩基を有する２５核酸塩基長のオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないオリゴヌクレオチドよりも低い程度であったものの、標的ｍＲＮＡの所定の切断を誘導できた。同様に、１３個の核酸塩基のオリゴヌクレオチド（１個または３個のミスマッチを有するものを含む）を用いたところ、標的の所定の切断が行われた。
【０２５０】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（修飾オリゴヌクレオチドを含む）は、様々な範囲の長さのいずれであることもできる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｘ〜Ｙ個の連結ヌクレオシドからなり、式中、Ｘは、その範囲の最小ヌクレオシド数を表し、Ｙは、その範囲の最大ヌクレオシド数を表す。特定のこのような実施形態では、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０から選択されており、ただし、Ｘ≦Ｙとする。例えば、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜１３個、１２〜１４個、１２〜１５個、１２〜１６個、１２〜１７個、１２〜１８個、１２〜１９個、１２〜２０個、１２〜２１個、１２〜２２個、１２〜２３個、１２〜２４個、１２〜２５個、１２〜２６個、１２〜２７個、１２〜２８個、１２〜２９個、１２〜３０個、１３〜１４個、１３〜１５個、１３〜１６個、１３〜１７個、１３〜１８個、１３〜１９個、１３〜２０個、１３〜２１個、１３〜２２個、１３〜２３個、１３〜２４個、１３〜２５個、１３〜２６個、１３〜２７個、１３〜２８個、１３〜２９個、１３〜３０個、１４〜１５個、１４〜１６個、１４〜１７個、１４〜１８個、１４〜１９個、１４〜２０個、１４〜２１個、１４〜２２個、１４〜２３個、１４〜２４個、１４〜２５個、１４〜２６個、１４〜２７個、１４〜２８個、１４〜２９個、１４〜３０個、１５〜１６個、１５〜１７個、１５〜１８個、１５〜１９個、１５〜２０個、１５〜２１個、１５〜２２個、１５〜２３個、１５〜２４個、１５〜２５個、１５〜２６個、１５〜２７個、１５〜２８個、１５〜２９個、１５〜３０個、１６〜１７個、１６〜１８個、１６〜１９個、１６〜２０個、１６〜２１個、１６〜２２個、１６〜２３個、１６〜２４個、１６〜２５個、１６〜２６個、１６〜２７個、１６〜２８個、１６〜２９個、１６〜３０個、１７〜１８個、１７〜１９個、１７〜２０個、１７〜２１個、１７〜２２個、１７〜２３個、１７〜２４個、１７〜２５個、１７〜２６個、１７〜２７個、１７〜２８個、１７〜２９個、１７〜３０個、１８〜１９個、１８〜２０個、１８〜２１個、１８〜２２個、１８〜２３個、１８〜２４個、１８〜２５個、１８〜２６個、１８〜２７個、１８〜２８個、１８〜２９個、１８〜３０個、１９〜２０個、１９〜２１個、１９〜２２個、１９〜２３個、１９〜２４個、１９〜２５個、１９〜２６個、１９〜２９個、１９〜２８個、１９〜２９個、１９〜３０個、２０〜２１個、２０〜２２個、２０〜２３個、２０〜２４個、２０〜２５個、２０〜２６個、２０〜２７個、２０〜２８個、２０〜２９個、２０〜３０個、２１〜２２個、２１〜２３個、２１〜２４個、２１〜２５個、２１〜２６個、２１〜２７個、２１〜２８個、２１〜２９個、２１〜３０個、２２〜２３個、２２〜２４個、２２〜２５個、２２〜２６個、２２〜２７個、２２〜２８個、２２〜２９個、２２〜３０個、２３〜２４個、２３〜２５個、２３〜２６個、２３〜２７個、２３〜２８個、２３〜２９個、２３〜３０個、２４〜２５個、２４〜２６個、２４〜２７個、２４〜２８個、２４〜２９個、２４〜３０個、２５〜２６個、２５〜２７個、２５〜２８個、２５〜２９個、２５〜３０個、２６〜２７個、２６〜２８個、２６〜２９個、２６〜３０個、２７〜２８個、２７〜２９個、２７〜３０個、２８〜２９個、２８〜３０個または２９〜３０個の連結ヌクレオシドからなる。
【０２５１】
Ｄ．特定の修飾オリゴヌクレオチド
特定の実施形態では、上記の修飾部（糖、核酸塩基、インターヌクレオシド結合）が修飾オリゴヌクレオチドに導入されている。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、その修飾モチーフと全体の長さによって特徴付けられる。特定の実施形態では、このようなパラメーターはそれぞれ、互いから独立している。すなわち、別段に示されていない限り、ギャップマー糖モチーフを有するオリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド結合は、修飾されていても、修飾されていなくてもよく、また、その修飾糖部分のギャップマー修飾パターンに従っていても、従っていなくてもよい。例えば、糖ギャップマーのウイング領域内のインターヌクレオシド結合は、互いに同じであっても、異なってもよく、その糖モチーフのギャップ領域のインターヌクレオシド結合と同じであっても、異なってもよい。同様に、このような糖ギャップマーオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分のギャップマーパターンとは独立した修飾核酸塩基を１つ以上含んでよい。別段に示されていない限り、すべての修飾部分は、核酸塩基配列から独立している。
【０２５２】
Ｅ．特定の修飾オリゴヌクレオチド集団
その修飾オリゴヌクレオチド集団の修飾オリゴヌクレオチドがすべて、同じ分子式である修飾オリゴヌクレオチド集団は、ステレオランダムな集団であることも、キラル的に富化された集団であることもできる。ステレオランダムな集団においては、すべての修飾オリゴヌクレオチドのキラル中心はすべて、ステレオランダムである。キラル的に富化された集団では、少なくとも１つの特定のキラル中心は、その集団の修飾オリゴヌクレオチドにおいては、ステレオランダムではない。特定の実施形態では、キラル的に富化された集団の修飾オリゴヌクレオチドは、β−Ｄリボシル糖部分について富化されており、そのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合はすべて、ステレオランダムである。特定の実施形態では、キラル的に富化された集団の修飾オリゴヌクレオチドは、β−Ｄリボシル糖部分と、特定の立体化学的配置である少なくとも１つの特定のホスホロチオエートインターヌクレオシド結合の両方について富化されている。
【０２５３】
Ｆ．核酸塩基配列
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（非修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド）は、その核酸塩基配列によってさらに説明される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドまたは特定した対照核酸（標的核酸など）と相補的である核酸塩基配列を有する。特定のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの一領域が、第２のオリゴヌクレオチドまたは特定した対照核酸（標的核酸など）と相補的である核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの一領域または全長の核酸塩基配列は、第２のオリゴヌクレオチドまたは核酸（標的核酸など）と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である。
【０２５４】
ＩＩ．特定のオリゴマー化合物
特定の実施形態では、本発明で提供するのは、オリゴヌクレオチド（修飾オリゴヌクレオチドまたは非修飾オリゴヌクレオチド）と、任意に、１つ以上のコンジュゲート基及び／または末端基からなるオリゴマー化合物である。コンジュゲート基は、１つ以上のコンジュゲート部分と、そのコンジュゲート部分をそのオリゴヌクレオチドに連結するコンジュゲートリンカーからなる。コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの末端のいずれかもしくは両方、及び／または内部のいずれかの位置に結合していてよい。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドの２’位に結合している。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端のいずれかまたは両方に結合しているコンジュゲート基は、末端基である。特定のこのような実施形態では、コンジュゲート基または末端基は、オリゴヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端に結合している。特定のこのような実施形態では、コンジュゲート基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合している。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの３’末端の近くに結合している。特定の実施形態では、コンジュゲート基（または末端基）は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合している。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの５’末端の近くに結合している。
【０２５５】
末端基の例としては、コンジュゲート基、キャッピング基、リン酸塩部分、保護基、修飾ヌクレオシドまたは非修飾ヌクレオシド、及び独立して修飾されているかまたは修飾されていない２つ以上のヌクレオシドが挙げられるが、これらに限らない。
【０２５６】
Ａ．特定のコンジュゲート基
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のコンジュゲート基に共有結合している。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、結合しているオリゴヌクレオチドの特性の１つ以上（薬力、薬物動態、安定性、結合性、吸収性、組織分布、細胞分布、細胞取り込み、帯電及びクリアランスが挙げられるが、これらに限らない）を改変する。特定の実施形態では、コンジュゲート基は、結合しているオリゴヌクレオチドに、新たな特性を付与する（例えば、そのオリゴヌクレオチドの検出を可能にするフルオロフォアまたはレポーター基）。特定のコンジュゲート基及びコンジュゲート部分は、以前に説明されており、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、アダマンタン酢酸、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）、トコフェロール基（Ｎｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１５，４，ｅ２２０及びＮｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，１６，７３４−７４０）、またはＧａｌＮＡｃクラスター（例えばＷＯ２０１４／１７９６２０）である。
【０２５７】
１．コンジュゲート部分
コンジュゲート部分としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、糖鎖、ビタミン部分、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸塩、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フルオロフォア及び色素が挙げられるが、これらに限らない。
【０２５８】
特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フィンゴリモド、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸塩、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生剤を含む。
【０２５９】
２．コンジュゲートリンカー
コンジュゲート部分は、コンジュゲートリンカーを介して、オリゴヌクレオチドに結合している。特定のオリゴマー化合物では、そのコンジュゲートリンカーは、化学的な単結合である（すなわち、そのコンジュゲート部分は、単結合を介して、オリゴヌクレオチドに直接結合している）。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、ヒドロカルビル鎖のような鎖構造、またはエチレングリコール、ヌクレオシドもしくはアミノ酸単位のような繰り返し単位のオリゴマーを含む。
【０２６０】
特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノから選択した基を１つ以上含む。特定のこのような実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、アルキル基、アミノ基、オキソ基、アミド基及びエーテル基から選択した基を含む。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、アルキル基及びアミド基から選択した基を含む。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、アルキル基及びエーテル基から選択した基を含む。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、リン部分を少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、リン酸塩基を少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、そのコンジュゲートリンカーは、中性連結基を少なくとも１つ含む。
【０２６１】
特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、上記のコンジュゲートリンカーを含め、二官能性連結部分、例えば、コンジュゲート基を親化合物（本発明で提供するオリゴヌクレオチドなど）に結合するのに有用であることが当該技術分野において知られている二官能性連結部分である。概して、二官能性連結部分は、官能基を少なくとも２つ含む。その官能基のうちの一方は、親化合物の特定の部位と反応するように選択されており、もう一方は、コンジュゲート基と反応するように選択されている。二官能性連結部分で用いられる官能基の例としては、求核基と反応する求電子基、及び求電子基と反応する求核基が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、二官能性連結部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル及びアルキニルから選択した基を１つ以上含む。
【０２６２】
コンジュゲートリンカーの例としては、ピロリジン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及び６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）が挙げられるが、これらに限らない。他のコンジュゲートリンカーとしては、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、または置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、これらに限らず、その好ましい置換基の非限定的なリストには、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれる。
【０２６３】
特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、リンカーヌクレオシドを１〜１０個含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、リンカーヌクレオシドを２〜５個含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、リンカーヌクレオシドをきっかり３個含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、ＴＣＡモチーフを含む。特定の実施形態では、このようなリンカーヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、このようなリンカーヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。特定の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、修飾されていない。特定の実施形態では、リンカーヌクレオシドは、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択した、任意に保護された複素環型塩基を含む。特定の実施形態では、切断可能な部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン、アデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、グアニン及び２−Ｎ−イソブチリルグアニンから選択したヌクレオシドである。典型的には、リンカーヌクレオシドは、標的組織に到達後、オリゴマー化合物から切断されるのが望ましい。したがって、リンカーヌクレオシドは典型的には、互いに連結されているとともに、切断可能な結合を介して、そのオリゴマー化合物の残部に連結されている。特定の実施形態では、このような切断可能な結合は、ホスホジエステル結合である。
【０２６４】
本明細書では、リンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの一部とはみなさない。したがって、所定の数または範囲の連結ヌクレオシドからなり、及び／または対照核酸との相補率が所定の値であるオリゴヌクレオチドをオリゴマー化合物が含み、そのオリゴマー化合物が、リンカーヌクレオシドを含むコンジュゲートリンカーを含むコンジュゲート基も含む実施形態では、それらのリンカーヌクレオシドは、そのオリゴヌクレオチドの長さには含まれず、対照核酸に対するオリゴヌクレオチドの相補率を求めるのには使用されない。例えば、オリゴマー化合物は、（１）８〜３０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドと、（２）その修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドと連続している１〜１０個のリンカーヌクレオシドを含むコンジュゲート基を含んでよい。このようなオリゴマー化合物における、連続した連結ヌクレオシドの総数は、３１個以上である。あるいは、オリゴマー化合物は、８〜３０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、かつコンジュゲート基を含まなくてもよい。このようなオリゴマー化合物における、連続した連結ヌクレオシドの総数は、３０個以下である。別段に示されていない限り、コンジュゲートリンカーは、１０個以下のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、５個以下のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、３個以下のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、２個以下のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、コンジュゲートリンカーは、１個以下のリンカーヌクレオシドを含む。
【０２６５】
特定の実施形態では、コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドから切断されるのが望ましい。例えば、特定の状況では、特定のコンジュゲート部分を含むオリゴマー化合物は、特定の種類の細胞に、より多く取り込まれるが、そのオリゴマー化合物が取り込まれたら、コンジュゲート基が切断されて、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチド、すなわち親オリゴヌクレオチドが放出されるのが望ましい。したがって、特定のコンジュゲートリンカーは、切断可能な部分を１つ以上含んでよい。特定の実施形態では、切断可能な部分は、切断可能な結合である。特定の実施形態では、切断可能な部分は、切断可能な結合を少なくとも１つ含む原子団である。特定の実施形態では、切断可能な部分は、切断可能な結合を１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以上有する原子団を含む。特定の実施形態では、切断可能な部分は、細胞、またはリソソームのような細胞内コンパートメントの中で選択的に切断される。特定の実施形態では、切断可能な部分は、ヌクレアーゼのような内因性酵素によって選択的に切断される。
【０２６６】
特定の実施形態では、切断可能な結合部分は、アミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバミン酸塩、またはジスルフィドの中から選択されている。特定の実施形態では、切断可能な結合部分は、ホスホジエステルのエステルの一方または両方である。特定の実施形態では、切断可能な部分は、リン酸塩またはホスホジエステルを含む。特定の実施形態では、切断可能な部分は、オリゴヌクレオチドと、コンジュゲート部分またはコンジュゲート基との間のリン酸塩結合である。
【０２６７】
特定の実施形態では、切断可能な部分は、１つ以上のリンカーヌクレオシドを含むか、または１つ以上のリンカーヌクレオシドからなる。特定のこのような実施形態では、その１つ以上のリンカーヌクレオシドは、互いに連結されており、及び／または切断可能な結合を介して、そのオリゴマー化合物の残部に連結されている。特定の実施形態では、このような切断可能な結合は、修飾されていないホスホジエステル結合である。特定の実施形態では、切断可能な部分は、リン酸塩インターヌクレオシド結合によって、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドまたは５’末端ヌクレオシドのいずれかに結合しているとともに、リン酸塩またはホスホロチオエートのインターヌクレオシドによって、そのコンジュゲートリンカーまたはコンジュゲート部分の残部に共有結合している２’−デオキシヌクレオシドである。特定のこのような実施形態では、その切断可能な部分は、２’−デオキシアデノシンである。
【０２６８】
Ｂ．特定の末端基
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、末端基を１つ以上含む。特定のこのような実施形態では、オリゴマー化合物は、安定化５’−リン酸塩を含む。安定化５’−リン酸塩としては、５’−ホスホネートが挙げられるが、これに限らず、その５’−ホスホネートとしては、５’−ビニルホスホネートが挙げられるが、これに限らない。特定の実施形態では、末端基は、脱塩基ヌクレオシド及び／または逆位ヌクレオシドを１つ以上含む。特定の実施形態では、末端基は、２’−連結ヌクレオシドを１つ以上含む。特定のこのような実施形態では、その２’−連結ヌクレオシドは、脱塩基ヌクレオシドである。
【０２６９】
ＩＩＩ．二本鎖オリゴマー
特定の実施形態では、本明細書に記載されているオリゴマー化合物は、標的核酸の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、第２のオリゴマー化合物と対合して、二本鎖オリゴマーを形成する。このような二本鎖オリゴマーは、標的核酸と相補的である領域を有する第１のオリゴマー化合物と、その第１のオリゴマー化合物と相補的である領域を有する第２のオリゴマー化合物を含む。特定の実施形態では、二本鎖オリゴマーの第１のオリゴマー化合物は、（１）修飾オリゴヌクレオチドまたは非修飾オリゴヌクレオチド、及び任意にコンジュゲート基と、（２）第２の修飾オリゴヌクレオチドまたは非修飾オリゴヌクレオチド、及び任意にコンジュゲート基を含むか、それらからなる。二本鎖オリゴマーのオリゴマー化合物のいずれかまたは両方は、コンジュゲート基を含んでもよい。二本鎖オリゴマーの各オリゴマー化合物のオリゴヌクレオチドは、非相補的なオーバーハングヌクレオシドを含んでもよい。
【０２７０】
ＩＶ．アンチセンス活性
特定の実施形態では、本明細書で提供する修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴマー化合物及び二本鎖オリゴマーは、標的核酸とハイブリダイズすることにより、少なくとも１つのアンチセンス活性をもたらすことができ、このようなオリゴマー化合物及び二本鎖オリゴマーは、アンチセンス化合物と称し得る。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標準的な細胞アッセイにおいて、標的核酸の量または活性を２５％以上調節、低減または増大させる場合に、アンチセンス活性を有する。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、１つ以上の標的核酸に選択的に作用を及ぼす。このようなアンチセンス化合物は、１つ以上の標的核酸とハイブリダイズすることにより、１つ以上の所望のアンチセンス活性をもたらすとともに、１つ以上の非標的核酸とハイブリダイズしないか、または顕著な望ましくないアンチセンス活性をもたらすような形では、１つ以上の非標的核酸とハイブリダイズしない核酸塩基配列を含む。
【０２７１】
特定のアンチセンス活性では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、その標的核酸を切断するタンパク質がリクルートされる。例えば、特定のアンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈの媒介により、標的核酸を切断させる。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。このようなＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＤＮＡは、非修飾ＤＮＡである必要はない。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を誘導するのに充分に「ＤＮＡ様」である。特定の実施形態では、ギャップマーのギャップ内の１つ以上の非ＤＮＡ様ヌクレオシドは、耐性を有する。
【０２７２】
特定のアンチセンス活性では、アンチセンス化合物またはアンチセンス化合物の一部は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれることにより、最終的に、標的核酸を切断させる。例えば、特定のアンチセンス化合物は、アルゴノートによって標的核酸を切断させる。ＲＩＳＣに取り込まれるアンチセンス化合物は、ＲＮＡｉ化合物である。ＲＮＡｉ化合物は、二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であっても、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）であってもよい。
【０２７３】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズしても、標的核酸を切断するタンパク質はリクルートされない。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸のスプライシングが改変される。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸と、タンパク質またはその他の核酸との結合相互作用が阻害される。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸の翻訳が改変される。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的ＲＮＡとハイブリダイズすると、エキソンスキッピングが行われる。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、標的核酸の量または活性が増減する。特定の実施形態では、アンチセンス化合物が標的核酸とハイブリダイズすると、スプライシングが改変されて、そのｍＲＮＡにおいてエキソンが除去される。スプライス部位のこの改変は、例えば、スプライススイッチングまたはスプライススキッピングと称することができ、エキソンを除去させる、スプライス部位の改変は、エキソンスキッピングまたはエキソン（番号）スキッピングと称することができる。特定の実施形態では、スプライス部位の改変、すなわちエキソンスキッピングにより、未成熟終止コドンを除去し得る。特定の実施形態では、スプライス部位の改変、すなわちエキソンスキッピングにより、フレームシフトを除去してよく、特定の実施形態では、フレームシフトの除去により、未成熟終止コドンを除去し得る。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを改変し、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、修飾核酸を含むか、または修飾核酸からなり、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、短いオリゴマーであり、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、安定しているとともに、ＲＮａｓｅ  Ｈ耐性を有し、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、安全かつ低毒性であり、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、多くの細胞に自由に取り込まれ、いくつかの実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、他の小児疾患の治療用として、ＦＤＡに認可されている。
【０２７５】
アンチセンス活性は、直接または間接的に観察してよい。特定の実施形態では、アンチセンス活性の観察または検出には、標的核酸もしくはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量の変化、核酸もしくはタンパク質のスプライスバリアントの比率の変化、及び／または細胞もしくは動物における表現型の変化の観察または検出が伴う。
【０２７６】
Ｖ．特定の標的核酸
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、標的核酸と相補的である領域を含むオリゴヌクレオチドを含むか、またはそのオリゴヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、その標的核酸は、内因性ＲＮＡ分子である。特定の実施形態では、その標的核酸は、タンパク質をコードする。特定のこのような実施形態では、その標的核酸は、イントロン領域、エキソン領域及び非翻訳領域を含む成熟ｍＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍＲＮＡから選択されている。特定の実施形態では、その標的ＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、その標的核酸は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡである。特定のこのような実施形態では、その標的領域は、全体がイントロン内にある。特定の実施形態では、その標的領域は、イントロン／エキソン接合部に及ぶ。特定の実施形態では、その標的領域は、少なくとも５０％がイントロン内にある。特定の実施形態では、その標的核酸は、レトロ遺伝子のＲＮＡ転写産物である。特定の実施形態では、その標的核酸は、非コードＲＮＡである。特定のこのような実施形態では、標的である非コードＲＮＡは、長い非コードＲＮＡ、短い非コードＲＮＡ、イントロンＲＮＡ分子から選択されている。
【０２７７】
Ａ．標的核酸との相補性／ミスマッチ
活性を消失させずに、ミスマッチ塩基を導入するのが可能である。例えば、Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ  ２００１）は、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡとの相補性が１００％であるとともに、ｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡとのミスマッチを３つ有するオリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を減少できることを示した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。Ｍａｈｅｒ及びＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、ウサギ網赤血球アッセイにおいて、２つまたは３つのタンデムオリゴヌクレオチドの配列でそれぞれ構成された一連のタンデムな１４核酸塩基のオリゴヌクレオチド、２８核酸塩基のオリゴヌクレオチド及び４２核酸塩基のオリゴヌクレオチドが、ヒトＤＨＦＲの翻訳を阻止する能力について試験した。その３つの１４核酸塩基のオリゴヌクレオチドのそれぞれのみが、翻訳を阻害できた。ただし、２８核酸塩基または４２核酸塩基のオリゴヌクレオチドよりも控えめなレベルであった。
【０２７８】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの全長にわたって、標的核酸と相補的である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸と９９％、９５％、９０％、８５％または８０％相補的である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの全長にわたって、標的核酸と少なくとも８０％相補的であり、標的核酸と１００％、すなわち完全に相補的な領域を含む。特定の実施形態では、完全に相補的な領域は、６〜２０核酸塩基長、１０〜１８核酸塩基長または１８〜２０核酸塩基長である。
【０２７９】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対してミスマッチである核酸塩基を１つ以上含む。特定の実施形態では、標的に対するアンチセンス活性は、このようなミスマッチによって低下するが、非標的に対する活性は、より多い量低下する。したがって、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの選択性が向上されている。特定の実施形態では、ミスマッチは、ギャップマーモチーフを有するオリゴヌクレオチド内に特異的に配置されている。特定の実施形態では、そのミスマッチは、そのギャップ領域の５’末端から１つ目、２つ目、３つ目、４つ目、５つ目、６つ目、７つ目または８つ目の位置にある。特定の実施形態では、そのミスマッチは、そのギャップ領域の３’末端から９つ目、８つ目、７つ目、６つ目、５つ目、４つ目、３つ目、２つ目、１つ目の位置にある。特定の実施形態では、そのミスマッチは、そのウイング領域の５’末端から１つ目、２つ目、３つ目または４つ目の位置にある。特定の実施形態では、そのミスマッチは、そのウイング領域の３’末端から４つ目、３つ目、２つ目または１つ目の位置にある。
【０２８０】
Ｂ．ＣＬＮ３
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、標的核酸と相補的である領域を含むオリゴヌクレオチドを含むか、またはそのオリゴヌクレオチドからなり、その標的核酸は、ＣＬＮ３である。特定の実施形態では、ＣＬＮ３核酸は、配列番号１（２８４２７６００〜２８４４４６２０番目のヌクレオチドがトランケートされたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０１０３９３．１６の相補体）または配列番号２（４４３１９０７５〜４４３３３９５５位のヌクレオチドがトランケートされたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４３３．８の相補体）に示されている配列を有する。
【０２８１】
特定の実施形態では、ＣＬＮ３核酸は、配列番号９９（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿００１０４２４３２．１）、配列番号１００（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿００００８６．２）または配列番号１０１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿００１２８６１１０．１）に示されている配列を有する。
【０２８２】
特定の実施形態では、細胞と、配列番号１または配列番号２と相補的なオリゴマー化合物を接触させると、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節され、特定の実施形態では、ＣＬＮ３  ｍＲＮＡの活性が調節され、特定の実施形態では、ＣＬＮ３タンパク質の活性または量が調節される。特定の実施形態では、細胞と、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１と相補的なオリゴマー化合物を接触させると、ＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節され、特定の実施形態では、ＣＬＮ３  ｍＲＮＡの活性が調節され、特定の実施形態では、ＣＬＮ３タンパク質の活性または量が調節される。特定の実施形態では、細胞と、配列番号１または配列番号２と相補的なオリゴマー化合物を接触させると、神経変性疾患の症状または特質が１つ以上改善する。特定の実施形態では、細胞と、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１と相補的なオリゴマー化合物を接触させると、神経変性疾患の症状または特質が１つ以上改善する。特定の実施形態では、その症状または特質は、運動機能不良、発作、失明、認知機能不良、精神医学的問題、脳組織における自家蛍光性のセロイド脂質性色素の蓄積、脳組織機能障害、脳組織細胞死、脳組織におけるミトコンドリアＡＴＰ合成酵素サブユニットＣの蓄積、脳組織におけるリポフスチンの蓄積、または脳組織におけるアストロサイトの活性化である。特定の実施形態では、細胞と、配列番号１または配列番号２と相補的な修飾オリゴヌクレオチドを接触させると、運動機能が改善し、神経障害が減少し、凝集体の数が減少する。特定の実施形態では、細胞と、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１と相補的な修飾オリゴヌクレオチドを接触させると、運動機能が改善し、神経障害が減少し、凝集体の数が減少する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、修飾オリゴヌクレオチドからなる。
【０２８３】
Ｃ．特定の組織における特定の標的核酸
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、標的核酸と相補的である領域を含むオリゴヌクレオチドを含むか、またはそのオリゴヌクレオチドからなり、その標的核酸は、薬理学的に関連する組織で発現する。特定の実施形態では、その薬理学的に関連する組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）を含む細胞及び組織である。このような組織としては、皮質、脊髄、海馬、脳橋、小脳、黒質、赤核、延髄、視床及び後根神経節のような脳組織が挙げられる。
【０２８４】
ＶＩ．特定の医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書に記載するのは、１つ以上のオリゴマー化合物を含む医薬組成物である。特定の実施形態では、その１つ以上のオリゴマー化合物はそれぞれ、修飾オリゴヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、その医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、滅菌生理食塩水と、１つ以上のオリゴマー化合物を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、その滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のオリゴマー化合物と、滅菌水を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、その滅菌水は、医薬品グレードの水である。特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のオリゴマー化合物と、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、その滅菌ＰＢＳは、医薬品グレードのＰＢＳである。特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のオリゴマー化合物と、人工脳脊髄液を含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、その人工脳脊髄液は、医薬品グレードのものである。
【０２８５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、修飾オリゴヌクレオチドと、人工脳脊髄液を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、修飾オリゴヌクレオチドと、人工脳脊髄液からなる。特定の実施形態では、医薬組成物は、修飾オリゴヌクレオチドと、人工脳脊髄液から本質的になる。特定の実施形態では、その人工脳脊髄液は、医薬品グレードのものである。
【０２８６】
特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のオリゴマー化合物と、１つ以上の賦形剤を含む。特定の実施形態では、賦形剤は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンから選択されている。
【０２８７】
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、医薬組成物または医薬製剤を調製するために、薬学的に許容される活性及び／または不活性な物質に添加混合し得る。医薬組成物を調合するための組成物及び方法は、多くの基準（投与経路、疾患の程度または投与用量が挙げられるが、これらに限らない）によって決まる。
【０２８８】
特定の実施形態では、オリゴマー化合物を含む医薬組成物には、そのオリゴマー化合物の薬学的に許容される塩のいずれか、そのオリゴマー化合物のエステル、またはそのようなエステルの塩が含まれる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを１つ以上含むオリゴマー化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物に投与すると、生物活性のある代謝物またはその残留物を（直接または間接的に）もたらすことができる。したがって、例えば、本開示は、オリゴマー化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、及びその他の生物学的に同等な物質に対するものでもある。好適な薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、プロドラッグは、オリゴヌクレオチドに結合しているコンジュゲート基を１つ以上含み、そのコンジュゲート基は、体内の内因性ヌクレアーゼによって切断される。
【０２８９】
様々な方法における核酸療法で、脂質部分が用いられている。特定のこのような方法では、カチオン性脂質と中性脂質の混合物で作られた予め形成済みのリポソームまたはリポプレックスに、オリゴマー化合物のような核酸を導入する。特定の方法では、中性脂質の非存在下で、モノカチオン性脂質またはポリカチオン性脂質とのＤＮＡ複合体を形成する。特定の実施形態では、脂質部分は、医薬剤の特定の細胞または組織への分布を増大させるように選択する。特定の実施形態では、脂質部分は、医薬剤の脂肪組織への分布を増大させるように選択する。特定の実施形態では、脂質部分は、医薬剤の筋肉組織への分布を増大させるように選択する。
【０２９０】
特定の実施形態では、医薬組成物は、送達システムを含む。送達システムの例としては、リポソーム及びエマルジョンが挙げられるが、これらに限らない。特定の送達システムは、特定の医薬組成物（疎水性化合物を含む医薬組成物を含む）を調製するのに有用である。特定の実施形態では、ジメチルスルホキシドのような特定の有機溶媒が用いられている。
【０２９１】
特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明の１つ以上の医薬剤を所定の種類の組織または細胞に送達するように設計された組織特異的な送達分子を１つ以上含む。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、組織特異的な抗体で被覆されたリポソームを含む。
【０２９２】
特定の実施形態では、医薬組成物は、共溶媒システムを含む。特定のこのような共溶媒システムは、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー及び水相を含む。特定の実施形態では、このような共溶媒システムは、疎水性化合物に用いられている。このような共溶媒システムの非限定的な例は、ＶＰＤ共溶媒システムであり、このシステムは、ベンジルアルコールを３％（ｗ／ｖ）、非極性界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（商標）を８％（ｗ／ｖ）、及びポリエチレングリコール３００を６５％（ｗ／ｖ）含む無水エタノールの溶液である。このような共溶媒システムの比率は、その溶解性及び毒性の特徴をあまり大きく変化させなければ、かなり変化させてよい。さらに、共溶媒成分の内訳が変更されていてもよく、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（商標）の代わりに、他の界面活性剤が用いられていてもよく、ポリエチレングリコールの割合の大きさが変更されていてもよく、ポリエチレングリコールが、その他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンに置き換えられていてもよく、デキストロースが、その他の糖または多糖に置き換わっていてもよい。
【０２９３】
特定の実施形態では、医薬組成物は、経口投与用に調製されている。特定の実施形態では、医薬組成物は、口腔内投与用に調製されている。特定の実施形態では、医薬組成物は、注射（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、髄腔内（ＩＴ）注射、脳室内（ＩＣＶ）注射など）による投与用に調製されている。特定のこのような実施形態では、医薬組成物は、担体を含み、水のような水性溶液、またはハンクス液、リンゲル液もしくは生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝剤中に調合されている。特定の実施形態では、その他の成分（例えば、溶解性を補助するか、または成分保存剤として機能する成分）が含まれている。特定の実施形態では、適切な液体担体、懸濁化剤などを用いて、懸濁注射剤が調製されている。注射用の特定の医薬組成物は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回用量用容器で供給する。注射用の特定の医薬組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり、懸濁化剤、安定剤及び／または分散剤のような製剤化剤を含んでよい。注射用の医薬組成物で用いるのに適する特定の溶媒としては、親油性溶媒、ならびに脂肪油（ゴマ油など）、合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなど）及びリポソームが挙げられるが、これらに限らない。
【０２９４】
特定の条件下では、本明細書で開示する特定の化合物は、酸として機能する。このような化合物は、プロトン化（遊離酸）形態、イオン化（アニオン）形態、またはイオン化され、カチオンを伴う（塩）形態で描画または記載されている場合があるが、このような化合物の水溶液は、上記のような形態の間で平衡状態にある。例えば、水溶液中のオリゴヌクレオチドのリン酸塩結合は、遊離酸形態、アニオン形態及び塩形態の間で平衡状態にある。別段に示されていない限り、本明細書に記載されている化合物には、上記のような形態がすべて含まれるように意図されている。さらに、特定のオリゴヌクレオチドは、このような結合をいくつか有し、その各結合は、平衡状態にある。したがって、溶液中のオリゴヌクレオチドは、複数の位置における形態がすべて平衡状態にある集合体で存在する。「オリゴヌクレオチド」という用語には、このような形態がすべて含まれるように意図されている。描かれている構造には、やむを得ず、１つの形態が示されている。しかしその一方で、別段に示されていない限り、このような図面には、上記と同様に、対応する形態が含まれるように意図されている。本明細書では、化合物の遊離酸の後に、「またはその塩」という語句が続く構造には、完全または部分的にプロトン化されるか／脱プロトン化されるか／カチオンを伴い得る上記のような形態がすべて明示的に含まれる。特定の場合では、１つ以上の所定のカチオンが特定されている。
【０２９５】
特定の実施形態では、本明細書で開示するオリゴマー化合物は、ナトリウム水溶液中に存在する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、カリウム水溶液中に存在する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、人工ＣＳＦ中に存在する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、ＰＢＳ中に存在する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、水中に存在する。特定のこのような実施形態では、その溶液のｐＨは、所望のｐＨとなるように、ＮａＯＨ及び／またはＨＣｌで調整されている。
【０２９６】
非限定的な開示及び参照による援用
本明細書に列挙されている文献及び特許出願はそれぞれ、参照により、その全体が援用される。
【０２９７】
本明細書に記載されている特定の化合物、組成物及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明されている一方で、下記の実施例は、本明細書に記載されている化合物を例示する役割を果たすに過ぎず、その化合物を限定するようには意図されていない。本願に示されている参考資料、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などはそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０２９８】
本出願に添付されている配列表には、必要に応じて「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のいずれかとして各配列が示されているが、実際には、これらの配列は、化学修飾をいずれかに組み合わせたものによって修飾してもよい。修飾オリゴヌクレオチドを説明するために、上記のように「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」と称しているのは、特定の場合では、任意であることを当業者は容易に認識するであろう。例えば、２’−ＯＨ糖部分とチミン塩基を含むヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ（ＤＮＡの２’−Ｈの１つが２’−ＯＨに置き換わっている）または修飾塩基を有するＲＮＡ（ＲＮＡのウラシルがチミン（メチル化ウラシル）に置き換わっている）として記載できる。したがって、本明細書で提供する核酸配列（配列表内の核酸配列が挙げられるが、これらに限らない）には、天然または修飾型のＲＮＡ及び／またはＤＮＡをいずれかに組み合わせたものを含む核酸が含まれるように意図されており、その核酸としては、修飾核酸塩基を有する核酸が挙げられるが、これらに限らない。さらなる例として、かつ以下に限定されるものではないが、「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」という核酸塩基配列を有するオリゴマー化合物には、修飾されているか、修飾されていないかにかかわらず、このような核酸塩基配列を有するいずれのオリゴマー化合物も含まれ、その化合物としては、ＲＮＡ塩基を含む化合物（「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」という配列を有する化合物など）、「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」のように、いくつかのＤＮＡ塩基と、いくつかのＲＮＡ塩基を有する化合物、及び「ＡＴｍＣＧＡＵＣＧ」（式中、ｍＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す）のように、他の修飾核酸塩基を有するオリゴマー化合物が挙げられるが、これらに限らない。
【０２９９】
本明細書に記載されている特定の化合物（例えば修飾オリゴヌクレオチド）は、不斉中心を１つ以上有するので、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び絶対立体化学の観点で（Ｒ）もしくは（Ｓ）として、糖アノマーにおけるようにαもしくはβとして、またはアミノ酸におけるように（Ｄ）もしくは（Ｌ）などとして定義し得る他の立体異性配置が生じる。本明細書で提供する化合物のうち、特定の立体異性配置を有するものとして描写または記載されている化合物には、その示されている化合物のみが含まれる。本明細書で提供する化合物のうち、立体化学が定義されていないものとして描写または説明されている化合物には、他に断りがない限り、そのステレオランダムな形態及び光学的に純粋な形態を含め、考え得るあらゆる異性体が含まれる。同様に、別段に示されていない限り、その化合物の互変異性体も含まれる。別段に示されていない限り、本明細書に記載されている化合物には、対応する塩形態が含まれるように意図されている。
【０３００】
本明細書に記載されている化合物には、１つ以上の原子が、その示されている元素の非放射性同位体または放射性同位体に置き換わっている変形形態が含まれる。例えば、水素原子を含む本明細書の化合物には、１Ｈ水素原子のそれぞれが重水素に置換されたあらゆる考え得るケースが含まれる。本明細書の化合物に含まれる同位体置換としては、１Ｈの２Ｈまたは３Ｈへの置換、１２Ｃの１３Ｃまたは１４Ｃへの置換、１４Ｎの１５Ｎへの置換、１６Ｏの１７Ｏまたは１８Ｏへの置換、及び３２Ｓの３３Ｓ、３４Ｓ、３５Ｓまたは３６Ｓへの置換が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、非放射性同位体置換により、治療ツールまたは研究ツールとして用いる際に有益である新たな特性をオリゴマー化合物に付与し得る。特定の実施形態では、放射性同位体置換により、その化合物が、研究目的または画像診断などの診断目的においてに適する化合物となり得る。
【実施例】
【０３０１】
下記の実施例は、本開示の特定の実施形態を例示するものであり、限定するものではない。さらに、具体的な実施形態が示されている場合、本発明者は、それらの具体的な実施形態の一般的適用を企図している。例えば、特定のモチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示によって、同じモチーフまたは類似のモチーフを有する追加のオリゴヌクレオチドが合理的に網羅される。また、例えば、特定の高親和性の修飾が特定の位置に見られる場合、別段に示されていない限り、同じ位置にある他の高親和性の修飾は、好適なものとみなす。
【０３０２】
実施例１：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８細胞）において、マウスＣＬＮ３に及ぼす作用
マウス核酸と相補的な修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））を設計し、ＣＬＮ３Δ７８がホモ接合型であるマウス細胞株（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）におけるＣＬＮ３  ＲＮＡの発現の調節に対して、その修飾オリゴヌクレオチドが及ぼす作用について試験した。エキソン７及びエキソン８が欠損しているＣＬＮ３変異を２コピー含む胎生１５日のＣＬＮ３Δｅｘ７８（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）マウス胚の組織から、ＣＬＮ３Δ７８がホモ接合型であるＣ３３４Ｅ細胞（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）を作製した。簡潔に述べると、マウスを安楽死させ、胚を取り出した。眼の上方で、横断切片を作製して、脳組織を単離し、頭骨を除去した。組織を細かく切断し、０．０１％トリプシン中でインキュベートしてから、ＤＭＥＭ（高グルコース）＋１０％ＦＢＳ＋１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で培養した。続いて、付着した分裂細胞を増殖させて増やした。上記のＳＳＯが、ＣＬＮ３  ＲＮＡのスプライシングを調節して、エキソン５のスキッピングを誘導することによって、ＣＬＮ３  ＲＮＡの活性を調節する能力について試験した。
【０３０３】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に、表１に列挙されている１００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）をトランスフェクションした。未処置のコントロール細胞には、修飾オリゴヌクレオチドまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのいずれも導入しなかった一方で、モックトランスフェクション細胞には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみを導入した。４８時間後、その細胞から全ＲＮＡを回収し、ｍＣＬＮ３ｅｘ４Ｆ（５’−ＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣ−３’）（配列番号５４）及びｍＣＬＮ３ｅｘ１０Ｒ（５’−ＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ−３’）（配列番号５５）というプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、スプライシングを解析した。ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲルで解析し、ホスホイメージャー解析（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量した（図５）。
【０３０４】
下記の表１の修飾オリゴヌクレオチドは、均一修飾型オリゴヌクレオチドである。そのオリゴヌクレオチドは、１８核酸塩基長である。各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。各インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。各オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、下記の表に列挙されている。「開始部位」は、そのオリゴヌクレオチドがマウスＣＬＮ３核酸の配列と相補的であるヌクレオシドのうちの５’最末端ヌクレオシドを示している。「終止部位」は、そのマウスＣＬＮ核酸の配列において、そのオリゴヌクレオチドが相補的であるヌクレオシドのうちの３’最末端ヌクレオシドを示している。
【０３０５】
下記の表１に列挙されている各修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２（マウスＣＬＮ３。４４３１９０７５〜４４３３３９５５番目のヌクレオチドがトランケートされたマウスＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４３３．８の相補体）と相補的である。表１に列挙されている修飾オリゴヌクレオチドは、マウスＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソン５及び／またはエキソン５を挟み込んでいるイントロンと相補的である。各修飾オリゴヌクレオチドにおけるＣＬＮ３の発現の調節は、エキソン５スキッピングとして列挙されている。各修飾オリゴヌクレオチドにおいて、各アッセイで検出されたエキソン５スキッピングのパーセンテージは、全ＣＬＮ３  ＲＮＡ（すなわち、ＣＬＮΔｅｘ７８  ＲＮＡ及びＣＬＮ３Δｅｘ５７８の転写産物の合計）に対するＣＬＮ３Δｅｘ５７８  ＲＮＡ（エキソン５がスキッピングされたＲＮＡ）のパーセンテージ（×１００）として算出されている。
【０３０６】
下に示されているように、マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、マウスＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節された。マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、疾患と関連するΔｅｘ７８  ＣＬＮ３を発現する細胞において、エキソン５スキッピングが誘導された。マウス細胞の処置またはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスの処置に関連して本明細書で論じられているような「ＳＳＯ−２６」は、表１の修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６を指す。
表１
マウスＣＬＮ３Δ７８／Δ７８細胞において、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドを用いた場合のマウスＣＬＮ３の活性
【表１−１】
2022500079.tif 000008
【表１−２】
2022500079.tif 000009
【０３０７】
実施例２：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＣＬＮ３＋／＋細胞）において、マウスＣＬＮ２に及ぼす作用
実施例１に記載されているようにして、マウス核酸と相補的な修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））を設計し、実施例１と同じ条件で、その修飾オリゴヌクレオチドが、野生型ＣＬＮ３を発現するマウス細胞株（２０８ｅ）におけるＣＬＮ３  ＲＮＡに及ぼす作用について試験した。表２には、発現の調節、すなわちエキソン５スキッピングが、完全長（ＦＬ）ＲＮＡと、エキソン５がスキッピングされた転写産物の合計に対する、エキソン５がスキッピングされた（Δｅｘ５）ＣＬＮ３のパーセンテージ（×１００）として示されている。Ｎ．Ｄ．は、データを収集しなかったことを示している。
【０３０８】
下に示されているように、マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、マウスＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節された。マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、野生型ＣＬＮ３を発現する細胞において、エキソン５スキッピングが誘導された。
表２
マウス野生型ＣＬＮ３＋／＋細胞において、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドを用いた場合のマウスＣＬＮ３の活性
【表２】
2022500079.tif 000010
【０３０９】
実施例３：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８細胞）において、マウスＣＬＮ２に及ぼす作用
マウス核酸と相補的な追加の修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））を設計し、ＣＬＮ３Δ７８（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）がホモ接合型であるマウス細胞株におけるＣＬＮ３  ＲＮＡに、その修飾オリゴヌクレオチドが及ぼす作用について試験した。
【０３１０】
実施例１の方法を用いて、Ｃ３３４Ｅ細胞に、表３に列挙されている２００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
【０３１１】
下記の表３の修飾オリゴヌクレオチドは、均一修飾型オリゴヌクレオチドである。そのオリゴヌクレオチドは、１８核酸塩基長である。各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ基を有する。各インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。各オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、下記の表に列挙されている。「開始部位」は、そのオリゴヌクレオチドがマウスＣＬＮ３核酸の配列と相補的であるヌクレオシドのうちの５’最末端ヌクレオシドを示している。「終止部位」は、そのマウスＣＬＮ核酸の配列において、そのオリゴヌクレオチドが相補的であるヌクレオシドのうちの３’最末端ヌクレオシドを示している。
【０３１２】
下記の表３に列挙されている各修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２（マウスＣＬＮ３。４４３１９０７５〜４４３３３９５５番目のヌクレオチドがトランケートされたマウスＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０３９４３３．８の相補体）と相補的である。表３に列挙されている修飾オリゴヌクレオチドは、マウスＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソン５及び／またはエキソン５を挟み込んでいるイントロンと相補的である。下に示されているように、マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、マウスＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節された。マウスＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、疾患と関連するΔｅｘ７８  ＣＬＮ３を発現する細胞において、エキソン５スキッピングが誘導された。
【０３１３】
表３には、発現の調節、すなわちエキソン５スキッピングが、完全長（ＦＬ）ＲＮＡと、エキソン５がスキッピングされた転写産物の合計に対する、エキソン５がスキッピングされた（Δｅｘ５）ＣＬＮ３のパーセンテージ（×１００）として示されている。
表３
マウスＣＬＮ３  ＲＮＡと相補的であるスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス細胞における活性
【表３】
2022500079.tif 000011
【０３１４】
実施例４：マウスＣＮＳにおける修飾オリゴヌクレオチドの分布
図７には、修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）がＣＮＳにおいて広く分布していることが示されている。修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６（ＳＳＯ２６、ＳＳＯ−２６、化合物ＩＤ  ７３０５００、配列番号２８とも称する）を新生仔へのＩＣＶ注射によって、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに投与し、注射から３週間後に、修飾オリゴヌクレオチドの送達を解析した。その修飾オリゴヌクレオチドの免疫蛍光染色結果が、各画像セットの左側の４つのパネルに示されている一方で、ヘキスト（核）染色結果が右側に示されている。図７Ｂには、ＳＳＯ−２６で処置したＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（上）と、未処置のＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウス（下）の海馬、体性感覚皮質及び視床におけるそれぞれの対の１０倍画像が示されている。図７Ｃには、同じ組織の６０倍画像が示されている。処置したマウスでは、海馬、体性感覚皮質及び視床においてオリゴヌクレオチドが染色された。未処置のマウスのオリゴヌクレオチドパネルでは、シグナルは検出されず、ヘキスト染色では、同程度のレベルの染色が見られることから、画像化した組織は、ほぼ同じ数の細胞を含むことが示されている。
【０３１５】
実施例５：バッテン病のマウスモデルにおいて、マウスＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導するための修飾オリゴヌクレオチド
上記の表１〜３に示されている修飾オリゴヌクレオチドをバッテン病のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで試験した（図６）。そのマウスモデルは、マウスＣＬＮ３遺伝子のうち、バッテン病の症例の大半の原因であるＣＬＮ３Δｅｘ７８という欠失に対応する１ｋｂの領域にゲノムＤＮＡの欠失を有する（Ｃｏｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１（２２）：２７０９−２７２１，２００２）。これらのホモ接合型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスでは、８〜１２週齢までに、運動タスク能力欠陥を含む、バッテン病の症状が現れる。
【０３１６】
ホモ接合型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に、マウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６またはコントロールの修飾オリゴヌクレオチドを５００μｇ注射し、３週目、１９週目及び２６週目に、スプライシングを解析した。そのコントロールの修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ−Ｃ）は、いずれの既知のマウス遺伝子との相補性も１００％ではない。ＳＳＯ−Ｃは、ＴＴＡＧＴＴＴＡＡＴＣＡＣＧＣＴＣＧ（配列番号９７、化合物ＩＤ４３９２７２）という配列を有し、その各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドであり、各インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、各シトシン核酸塩基は、５−メチルシトシンである。Ｎ．Ｄ．は、その条件においては、データを収集しなかったことを示している。実験の１９週目までのタイムラインが、図８の概略図に示されている。図９及び１１、ならびに下記の表４に示されている結果には、１回用量の修飾オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、最長で２６週間、マウスＣＬＮ３のスプライシングを調節することによって、マウスＣＬＮ３の発現を調節できることが示されている。
表４
バッテン病のマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）の作用
【表４】
2022500079.tif 000012
【０３１７】
実施例６：バッテン病のマウスモデルにおいて、ヒトＣＬＮ３エキソン５のスキッピングを誘導するための修飾オリゴヌクレオチド
上記の修飾オリゴヌクレオチドをバッテン病のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで試験した。
【０３１８】
ホモ接合型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、８週齢において、修飾オリゴヌクレオチドを５００μｇ注射し、２週間後に、ＣＬＮ３のスプライシングを解析した。その結果から、エキソン５またはエキソン５を挟み込んでいるイントロンと相補的ないくつかのスプライススイッチングオリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＬＮ３のスプライススイッチングを誘導できることが示されている。
表５
バッテン病のマウスモデルにおけるスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの作用
【表５】
2022500079.tif 000013
【０３１９】
実施例７：修飾オリゴヌクレオチドは、バッテン病のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて、症状を改善する
図６及び上記の実施例５で論じられているホモ接合型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスに、ＩＣＶ注射によって、生後１日目に、マウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６またはコントロールの修飾オリゴヌクレオチドを２５μｇ注射した。８週間後に、その処置マウス及びコントロールマウスの挙動を評価した。コントロールオリゴヌクレオチドを用いて、ヘテロ接合型マウス（ＣＬＮ３＋／Δ７８）の挙動も試験した。
【０３２０】
マウスは、加速ロータロッドテストで評価し、そのテストでは、時間とともにロッドを加速させ、落下潜時を記録した。マウスは、垂直ポールテストでも評価し、このテストでは、マウスが、ポールの最上部まで登り、回転するまでの時間を記録する。これらの運動機能試験は、Ｋａｒｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ａｎｄ  Ｔｏｘ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，５５（１）：６９−８３，２００３に詳細に説明されている。結果は、図１３及び１４に示されており、下記の表６に数値化されている。ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスをマウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したところ、運動症状が、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウスの状態まで回復した。
表６
バッテン病のマウスモデルにおける修飾オリゴヌクレオチドスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの挙動面での作用
【表６】
2022500079.tif 000014
【０３２１】
１９週間後、マウスを殺処分し、組織を組織診断によって解析した。海馬及び視床から得た組織において、ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色（１：１００、Ａｂｃａｍ  Ａｂ１８１２４３）と、核に対するヘキスト染色を行った（図１５を参照されたい）。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０という共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２０倍の対物倍率を用いて、画像を解析した。画像は、０．７４μｍ間隔の垂直方向のｚスタックとして収集し、Ｚｅｎというソフトウェアを用いて、最大値投影像として投影処理した。ＡＴＰａｓｅサブユニットＣに対する染色が陽性であった総面積を画像の総面積と比較した。ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスをスプライススイッチングオリゴヌクレオチドで処置すると、脳組織におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積が低減される（図１０、１１及び２２）。
表７
修飾オリゴヌクレオチドが、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの脳組織におけるＡＴＰａｓｅサブユニットＣの蓄積に及ぼす作用
【表７】
2022500079.tif 000015
【０３２２】
体性感覚皮質、視覚皮質及び視床を含む脳組織において、抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ、Ｚ０３３４、１：２５０）を用いて、ＧＦＡＰに対する染色を行うことによって、アストロサイトの活性化についても解析した。続いて、組織を３回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ＋１０％ヤギ血清で希釈した抗ウサギビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、ＢＡ−９４００、１：２，０００）中で２時間インキュベートした。組織を洗浄し、ＡＢＣ増幅キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）中で２時間インキュベートした。組織を洗浄し、好適な反応が生じるまで、０．０５％ＤＡＢ溶液中でインキュベートした。続いて、組織を３回洗浄し、マウントし、キシレンに１０分浸漬した。次に、ＤＰＸという封入剤を用いて、その薄切片にカバースリップを載せた。ＤＡＢ染色では、スライドをＬｅｉｃａ  ＤＭ６０００Ｂというスライド走査型顕微鏡において２０倍で走査した。続いて、ＩｍａｇｅＪを用いた画像閾値解析（図１６）のために、画像をそれぞれの領域から、２，４００×２，４００ピクセルの寸法で抽出した。そのデータは、下記の表に示されている。ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスをスプライススイッチングオリゴヌクレオチドで処置すると、脳組織におけるアストロサイトの活性化が低減される。
表８
修飾オリゴヌクレオチドが、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの脳組織におけるアストロサイトの活性化に及ぼす作用
【表８】
2022500079.tif 000016
【０３２３】
実施例８：修飾オリゴヌクレオチドは、バッテン病の重症マウスモデルにおいて、生存期間を改善する
ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスと、凝集する傾向がある型のヒトアミロイド前駆タンパク質をコードするｈＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡを発現するマウスを交配することによって、バッテン病の重症マウスモデルを作製した。加えて、野生型（ＣＬＮ３＋／＋）及びヘテロ接合型（ＣＬＮ３＋／Δ７８）のバックグラウンドを持つマウスに、Ｖ７１７Ｆ、Ｋ６７０Ｎ及びＭ６７１Ｌを有するｈＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡを導入した。ｈＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡを発現するＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスでは、ｈＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡを発現するＣＬＮ３＋／＋マウスと比べて、リソソームにおけるｈＡＰＰの蓄積が増大し、その結果、早期死亡リスクが上昇する。
【０３２４】
コントロールのオリゴヌクレオチド及びマウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６を用いた場合のＣＬＮ３Δ７８／Δ７８／ｈＡＰＰ６９５マウスの生存期間を、生後１日目における２５μｇの修飾オリゴヌクレオチドのＩＣＶ注射による投与後に追跡した。未処置のＣＬＮ３＋／＋／ｈＡＰＰ６９５マウスと、生後１日目に、コントロールのオリゴヌクレオチドでＩＣＶ注射によって処置したＣＬＮ３＋／Δ７８／ｈＡＰＰ６９５マウスの生存期間も追跡した。生存曲線は、図２５に示されており、概要は、下記の表９に示されている。Δ７８／Δ７８  ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８／ｈＡＰＰマウスをマウス修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したところ、生存期間が、ヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８／ｈＡＰＰ６９５マウスで見られた生存期間のレベルまで長くなった。生存期間中央値は、所定の処置群のマウスの５０％が死亡するまでの期間であり、その値は、下記の表に報告されている。ＣＬＮ３核酸と相補的な修飾オリゴヌクレオチドで、ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスを処置したところ、その修飾オリゴヌクレオチドで処置しなかったＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスと比べて、生存期間中央値が長くなった。
表９
バッテン病の重症マウスモデルにおける、修飾オリゴヌクレオチドによる生存期間の延長
【表９】
2022500079.tif 000017
【０３２５】
実施例９：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ヒトＣＬＮ３＋／Δ７８細胞）において、ヒトＣＬＮ３に及ぼす作用
ヒト核酸と相補的な修飾オリゴヌクレオチド（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ））を設計し、ＣＬＮΔｅｘ７８がヘテロ接合型であるヒト線維芽細胞株（ＣＬＮ３＋／Δ７８）におけるＣＬＮ３  ＲＮＡに、その修飾オリゴヌクレオチドが及ぼす作用について試験した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に、表１０に列挙されている１００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）をトランスフェクションした。未処置のコントロール細胞には、修飾オリゴヌクレオチドまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのいずれも導入しなかった一方で、モックトランスフェクション細胞には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみを導入した。４８時間後、全ＲＮＡを細胞から回収し、ｈＣＬＮ３ｅｘ４Ｆ（５’−ＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣ−３’）（配列番号５２）及びｈＣＬＮ３ｅｘ９Ｒ（５’−ＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号５６）というプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＣＬＮ３Δｅｘ７８及びＣＬＮ３Δｅｘ５７８の転写産物を特定した。そのＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動によって解析し、ホスホイメージャー解析（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量したが、その結果は、下記の表１０に示されている。
【０３２６】
下記の表１０の修飾オリゴヌクレオチドは、均一修飾型オリゴヌクレオチドである。そのオリゴヌクレオチドは、１８核酸塩基長である。各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥヌクレオシドである。各インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。各オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、下記の表に列挙されている。「開始部位」は、そのオリゴヌクレオチドがヒトＣＬＮ３核酸の配列と相補的であるヌクレオシドのうちの５’最末端ヌクレオシドを示している。「終止部位」は、そのヒトＣＬＮ核酸の配列において、そのオリゴヌクレオチドが相補的であるヌクレオシドのうちの３’最末端ヌクレオシドを示している。
【０３２７】
表１０の各修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１（ヒトＣＬＮ３核酸、２８４２７６００〜２８４４４６２０番目のヌクレオチドがトランケートされたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿０１０３９３．１６の相補体）と相補的である。表１０に列挙されている修飾オリゴヌクレオチドは、ヒトＣＬＮ３  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソン５及び／またはエキソン５を挟み込んでいるイントロンと相補的である。各修飾オリゴヌクレオチドにおけるＣＬＮ３  ＲＮＡの発現の調節は、エキソン５スキッピングとして列挙されている。各修飾オリゴヌクレオチドにおいて、各アッセイで検出された、エキソン５スキッピングのパーセンテージは、全ＣＬＮ３  ＲＮＡに対するＣＬＮΔ５７８  ＲＮＡ（エキソン５がスキッピングされたＲＮＡ）のパーセンテージ（すなわち、［Δ５７８／（Δ５７８＋Δ７８）］×１００］）として算出されている。
【０３２８】
下に示されているように、ヒトＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、ヒトＣＬＮ３  ＲＮＡの発現が調節された。ヒトＣＬＮ３と相補的な修飾オリゴヌクレオチドによって、野生型ＣＬＮ３及び疾患と関連する短縮型のＣＬＮ３Δｅｘ７８を発現する細胞において、エキソン５スキッピングが誘導された。ヒト細胞またはヒト修飾オリゴヌクレオチドによる処置に関連して本明細書で論じられている「ＳＳＯ−２０」は、表１０の修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２０を指し、「ＳＳＯ−２８」は、表１０の修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２８を指す。
表１０
ヒト線維芽細胞（ＣＬＮ３＋／Δ７８）において、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドを用いた場合のヒトＣＬＮ３の活性
【表１０−１】
2022500079.tif 000018
【表１０−２】
2022500079.tif 000019
【０３２９】
実施例１０：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＬＮ３に及ぼす用量依存的な作用
ホモ接合型ＣＬＮ３ｄ７８患者細胞株（ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８）において、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２０及びＳＳＯ−２８を用量応答アッセイで評価した（図２６Ｅ）。ｈＣＬＮ３ｅｘ４Ｆ（５’ＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣ−３’）（配列番号５２）及びｈＣＬＮ３ｅｘ１０Ｒ（５’ＣＴＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＣＣ−３’）（配列番号５３）というプライマーを用いて、本質的に本明細書で示されているようにして、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。下記の表１１には、用量の対数に対するものとして、エキソン５がスキッピングされたパーセンテージが示されている。
表１１
ヒトホモ接合型ＣＬＮ３ｄ７８患者細胞株において、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドを用いた場合のヒトＣＬＮ３の活性
【表１１】
2022500079.tif 000020
【０３３０】
３．１２５〜２００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２０及びＳＳＯ−２８で処置したヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８ヒト線維芽細胞株において、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２０及びＳＳＯ−２８を用量応答アッセイで評価した。その結果は、図２７に示されている。
【０３３１】
０．３９１〜２００ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したマウスＣＬＮ３Δｅｘ７／８マウス細胞株において、修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６を用量応答アッセイで評価した。その結果は、図２８に示されている。
【０３３２】
実施例１１：ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する２’−ＭＯＥ均一修飾型オリゴヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、マウスＣＬＮ３に及ぼす作用
修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６と、コントロールの修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃを処置マウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。処置後、ＲＮＡを１９週齢のヘテロ接合型ＣＬＮ３＋／Δ７８マウス及びホモ接合型ＣＬＮ３Δ７８／Δ７８マウスの皮質、視床、線条体、脳幹、脊髄及び腎臓から抽出した。エキソン５スキッピングの定量により、処置マウスのＣＮＳにおいて、広範な修飾オリゴヌクレオチド活性が見られた（図２９）。
【０３３３】
修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−２６で処置したところ、マウスの体重は、マウスを２カ月齢及び４．５カ月齢の時点に評価した場合、生後１日目または２日目に修飾オリゴヌクレオチドＳＳＯ−Ｃで処置した場合と比べて、有意には変化しなかった（図３０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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