(57)【要約】  本発明は、脂質の総質量に対して６０％超のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）を含む、ＤＨＡに富む微生物オイル、およびヒトまたは動物用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための、前記微生物オイルの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む微生物オイルであって、当該微生物オイルが、脂質の総質量に対して少なくとも８０％のトリグリセリドと、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡとを含み、かつ、飽和脂肪酸含有量が脂質の総質量に対して２５％未満であることを特徴とする、微生物オイル。
【請求項２】
少なくとも６５％のＤＨＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物オイル。
【請求項３】
ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、かつ、ＤＨＡとＤＰＡとの組み合わせ含有量が脂質の総質量に対して少なくとも７０％であることを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物オイル。
【請求項４】
少なくとも７０％のＤＨＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物オイル。
【請求項５】
ＤＨＡとＤＰＡとの組み合わせ含有量が脂質の総質量に対して少なくとも８０％であることを特徴とする、請求項４に記載の微生物オイル。
【請求項６】
ＤＨＡ／ＤＰＡ比率が少なくとも４であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項７】
飽和脂肪酸含有量が脂質の総質量に対して１５％未満であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項８】
室温における粘度が５０Ｐａ・ｓ以下であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項９】
粘度が３０Ｐａ・ｓ未満であることを特徴とする、請求項７に記載の微生物オイル。
【請求項１０】
他のオイルと混合された、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物オイルを含むことを特徴とする、希釈された微生物オイル。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のオイルを含むことを特徴とする、微生物のバイオマス。
【請求項１２】
ヒトまたは動物用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオイルまたは請求項１１に記載のバイオマスの使用。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオイルを含むことを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）に富む微生物オイルであって、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡおよび脂質の総質量に対して少なくとも８０％のトリグリセリドを含有する微生物オイルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＡを含むオイルは様々な源から得られ、最もよく知られている源は、魚、オキアミおよび微細藻類などの微生物である。多くの株の微生物が、ＰＵＦＡ、特に、ω３やω６の表記でも表される、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を産生することが知られている。これらのＰＵＦＡは工業、特にヒトまたは動物用の食品、または化粧品において広く用いられており、これらの工業生産は長年にわたり改良が続けられてきた（ＷＯ１９９７／０３７０３２、ＷＯ２００１／０５４５１０、ＷＯ２０１３／１３６０２８、ＷＯ２０１５／００４４０２、ＵＳ２０１７／０１６０３６、ＵＳ２０１７／３３５３５６）。工業生産に適した株の選択基準は、高バイオマス生産性と、脂質における顕著なトリグリセリド（ＴＧ）蓄積と、高いＰＵＦＡ含有量である。今日では、多くの公知の工業用の株がこれら３つの基準を満たし、脂質中で３５％台、ベストケースでは５０％のＰＵＦＡ含有量を有する。
【０００３】
しかしながら、高ＰＵＦＡ含有量の濃縮オイルに対する要求、すなわち同等量のＰＵＦＡのために必要な単位用量の数を減らすことを可能とする濃縮オイルカプセルなどの濃縮製品の供給に対する要求がある。高ＰＵＦＡ含有量（例えば５５％超のＤＨＡ）のオイルを得るために、ＰＵＦＡを添加してオイルを富化することができ（ＵＳ２０１４／３２３５６９）、および／または、エタノールなどの溶媒の使用を伴ってトリグリセリドをエチルエステルに変換する方法によってオイルが濃縮される。エチルエステルは人工的な化学形態であり、自然界には存在しない。エチルエステルの形態での脂肪酸のバイオアベイラビリティは、トリグリセリドの形態での脂肪酸のバイオアベイラビリティよりはるかに低い（Ｇｈａｓｅｍｉｆａｒｄら、２０１４）。また、上記の方法は粗製オイルに含まれるビタミンおよび抗酸化物質を除去してしまう。その結果、濃縮オイルは酸化に対しより弱いものとなる。
【０００４】
バイオアベイラビリティを改善するために、エチルエステルをトリグリセリドに戻すことも可能である（「再形成された」トリグリセリド）。オイルの経時的安定性を向上させるために抗酸化物質を添加することもできる。しかしながら、この濃縮オイルは天然のオイルとはむしろ異なり、すなわちいくつかの変性プロセスを経て、その組成：脂肪酸プロファイル、ビタミン、色素および他の抗酸化分子は変化し、ＰＵＦＡから天然の保護を奪う結果となっている。しかしながら、ＰＵＦＡは、シス結合からトランス結合へ変化し得る敏感な分子、特に温度に敏感な分子である（Ｔｓｕｚｕｋｉ  Ｗ、２０１２）。トリグリセリドの再形成は不完全であり、このようにして処理されたオイルは、依然として様々な割合でエチルエステルを含有するため、未処理のオイルと相違することに留意すべきである。エステル交換（エチルエステルをトリグリセリドに変換すること）の間に放出されるエタノールは、一般的に蒸発によって除去される。それにもかかわらず、微量のエタノールは濃縮オイル中に残存する。
【０００５】
オイル処理プロセスの最小化が望まれる他の理由は、モノクロロプロパンジオール（２−ＭＣＰＤ、３−ＭＣＰＤ）およびグリシドールおよびこれらの誘導体（２−ＭＣＰＤ、３−ＭＣＰＤ、グリシドールの脂肪酸エステル）などの不純物の形成である。これら不純物の存在は、特に魚油の精製および脱臭工程後に検出されてきた（ＭｉｙａｚａｋｉおよびＫｏｙａｍａ、２０１７）。現時点では、濃縮プロセスが不純物の形成に及ぼす影響に関する利用可能な情報はほとんどない。しかしながら、エチルエステルからのトリグリセリドの再形成は、不純物の前駆体化合物であるジグリセリドの増加につながり得る。グリシドール（およびグリシドールエステル）のレベルは、食品におけるその含有量を制限する（ＥＵ）２０１８／２９０／ＥＣ規制の対象である：制限濃度が５００μｇ／ｋｇとされる幼児および乳児用の食品の調製を目的とする食用油を除き、食用油における濃度は１０００μｇ／ｋｇを超えてはならない。幼児および乳児用の製剤では、最大レベルはさらに低い：粉剤中７５μｇ／ｋｇであり、液剤中１０μｇ／ｋｇである。このレベルは、２０１９年にさらに下げられるであろう（散在中は５０μｇ／ｋｇおよび液剤中は６μｇ／ｋｇ）。最大ＭＣＰＤ濃度の評価は、オイルおよび幼児用食品について現在進行中である。現時点では、規制は植物性タンパク加水分解物および醤油のみに関する（制限：２０μｇ／ｋｇ）。
【０００６】
したがって、天然にＰＵＦＡに富み、その組成が産生微生物の脂溶性物質にできる限り近く、処理中に生成される不純物が最小であるオイルを得ることは重要である。これは、オイルをとりわけ食品製品にＤＨＡを組み込むことに適したものとする。その非常に低い３−ＭＣＰＤおよびグリシドール含有量と、その高ＤＨＡ含有量が組み合わされ、幼児および乳児を目的とした食品の調製に理想的なものとされる。
【０００７】
さらに、これら濃縮オイルは、一般的に、高価で環境に害のある処理プロセスによって得られる。
【０００８】
他の公知の解決手段は、ＰＵＦＡ産生の代謝経路の促進を求めて遺伝子組み換え微生物（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、２０１６）、またはより多くのＤＨＡを産生すると考えられる変異体（ＷＯ２０１７／０９８０４）を作製することにある。しかしながら、技術的解決手段の選択肢は、得られるオイルの用途によって、とりわけヒト用食品において限られている（Ｆｅｄｏｒｏｖａ−Ｄａｈｍｓ  Ｉ．ら、２０１１）。
【０００９】
抽出方法以外の処理を必要とすることなく、天然にＰＵＦＡが濃縮されたオイル、すなわち微生物によって産生され、ＰＵＦＡが基本的にトリグリセリドの形態であるオイルに対する要求が存在する。より詳しくは、高ＰＵＦＡ含有量および低飽和脂肪酸含有量のオイルに対する要求が存在する。オイルの品質に対する問いに加えて、低飽和脂肪酸含有量に対する関心は、より低粘度で、工業レベルでより使い易く、特に取り扱いにあたって要求されるエネルギーがより少ないオイルに向けられている。
【００１０】
本発明は、脂質の総質量に対して少なくとも６０％のＤＨＡを含む、高ＤＨＡ含有量のオイルによって、上記の要求を満たす。このオイルは、エチルエステルおよび微量の溶媒（エタノールまたはメタノール）の双方を含まず、（現在市場に流通する６０％超のＤＨＡを含むオイルと比べて）低減された量の３−ＭＣＰＤおよびグリシドールを含む。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む微生物オイルであって、当該微生物オイルが、脂質の総質量に対して少なくとも８０％のトリグリセリドと、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡとを含み、かつ、飽和脂肪酸含有量が脂質の総質量に対して２５％未満であることを特徴とする、微生物オイルに関する。
【００１２】
本発明はまた、他のオイルと混合された、トリグリセリドおよびＤＨＡに富む、本発明による微生物オイルを含む、希釈された微生物オイルに関する。
【００１３】
本発明の他の対象は、トリグリセリドおよびＤＨＡに富む、本発明によるオイルを含む、微生物のバイオマスである。
【００１４】
本発明はまた、ヒトまたは動物用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための、トリグリセリドおよびＤＨＡに富む、場合により希釈されていてもよい、本発明によるオイル、または、このオイルを含むバイオマスの使用に関する。
【００１５】
本発明の他の対象は、トリグリセリドおよびＤＨＡに富む、場合により希釈されていてもよい、本発明によるオイルを含むことを特徴とする食品である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明によるオイルは、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡ、有利には少なくとも６２％のＤＨＡ、より有利には少なくとも６５％のＤＨＡ、好ましくは６７％超のＤＨＡ、より優先的には少なくとも７０％のＤＨＡ、さらにより優先的には７５％のＤＨＡを含む微生物オイルである。
【００１７】
本発明によるオイルの上記特徴は、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるかにかかわらず、微生物のバイオマス中に存在するオイルおよび前記バイオマスから抽出されるオイルの双方に関する。
【００１８】
本発明はまた、本発明によるオイルを、他のオイルと混合して含む、希釈されたオイルに関する。
【００１９】
本発明はまた、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるか、または希釈されたオイルであるかを問わず、本発明によるオイルを含む医薬品、化粧品または食品組成物に関する。
【００２０】
本発明はまた、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるか、または希釈されたオイルであるかを問わず、本発明によるオイルまたはこのオイルを含むバイオマスの、ヒトまたは動物用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための、使用に関する。
【００２１】
本発明によるオイルは、微生物起源のオイルであり、（バイオマスを作り出すための）細胞増殖と、高ＤＨＡ含有量のオイルの産生とを可能にする条件下で、増殖する微生物細胞のバイオマスから得られるオイルである。
【００２２】
本発明によるオイルは、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡ、有利には少なくとも６２％のＤＨＡ、より有利には少なくとも６５％のＤＨＡ、好ましくは６７％超のＤＨＡ、より優先的には少なくとも７０％のＤＨＡ、さらにより優先的には少なくとも７５％のＤＨＡを含む微生物オイルである。
【００２３】
好ましくは、本発明によるオイルは、飽和脂肪酸に対して、高含有量の不飽和脂肪酸を含む。本発明によるオイルに含まれる不飽和脂肪酸は、実質的にＤＨＡおよびＤＰＡ（ドコサペンタエン酸、Ｃ２２：５ｎ６）である。ＡＲＡ（アラキドン酸、Ｃ２０：４ｎ６）の含有量は、一般的に０．５％未満であり、さらには０．３％未満であり、有利には０．１％未満である。ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５ｎ３）の含有量は、一般的に１．５％未満であり、有利には１％未満であり、より有利には０．５％未満である。ＡＲＡおよびＥＰＡのパーセンテージは、脂質の総質量に対して与えられる。
【００２４】
有利には、ＤＨＡとＤＰＡとの組み合わせ含有量は、脂質の総質量に対して少なくとも７０％であり、有利には少なくとも７５％であり、より有利には少なくとも８０％であり、さらにより有利には少なくとも８５％である。特定のケースにおいて、ＤＨＡ＋ＤＰＡ総量は、最大で脂質の総質量の９０％を占める。少なくとも７０％である、最も高いＤＨＡ含有量のオイルにおいて、ＤＨＡとＤＰＡとの組み合わせ含有量は、少なくとも８０％、優先的には８５％である。
【００２５】
本発明によるＤＨＡに富むオイルにおいて、ＤＨＡ／ＤＰＡ比率は、好ましくは少なくとも３であり、より優先的には少なくとも４であり、４から９の範囲である。少なくとも７０％である、最も高いＤＨＡ含有量のオイルにおいて、ＤＨＡ／ＤＰＡ比率は有利には４から７である。
【００２６】
飽和脂肪酸含有量は、脂質の総質量に対して２５％未満であり、さらには２０％未満であり、より優先的には１５％未満であり、さらにより優先的には１０％未満である。
【００２７】
飽和脂肪酸は、実質的にパルチミン酸（Ｃ１６：０）である。他の飽和脂肪酸は、２％未満、さらには１％未満の含有量で存在し、特に、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）またはミリスチン酸（Ｃ１４：０）またはステアリン酸（Ｃ１８：０）である。有利には、パルミチン酸以外のＣ１０からＣ２２飽和脂肪酸、特にＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１７、Ｃ２０、Ｃ２１およびＣ２２の飽和脂肪酸は、互いに独立して、それぞれ０．１％未満の含有量で微量に存在するか、または存在しない（分析方法の不確実性を考慮した場合の０％も含む）。パーセンテージは、脂質の総質量に対して与えられる。
【００２８】
パルミチン酸の含有量は、好ましくは脂質の総質量の２０％未満であり、より優先的には１５％未満であり、さらにより優先的には１０％未満である。
【００２９】
少なくとも７０％である、最も高いＤＨＡ含有量のオイルにおいて、Ｃ１０からＣ２２の飽和脂肪酸の含有量は、好ましくは１５％未満であり、より優先的には１０％未満である。
【００３０】
本発明によるオイルの高ＤＨＡ含有量および低飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量を測定する一つの方法は、ＤＨＡ／ＳＦＡ比率を定めることである。
【００３１】
ＤＨＡ／ＳＦＡ比率は、有利には少なくとも２．５であり、優先的には少なくとも３であり、より優先的には少なくとも５であり、さらにより優先的には少なくとも６である。いくつかの場合において、ＤＨＡ／ＳＦＡ比率は、少なくとも８まで、さらには少なくとも９までであってもよい。少なくとも７０％である、最も高いＤＨＡ含有量のオイルにおいて、ＤＨＡ／ＳＦＡ比率は、少なくとも４であり、優先的には少なくとも６であり、より優先的には少なくとも８であり、最大で約９である。
【００３２】
飽和脂肪酸（ＳＦＡ）に対する多価不飽和脂肪酸の高含有量は、（ＤＨＡ＋ＤＰＡ）／ＳＦＡ比率によって測定することも可能である。
【００３３】
（ＤＨＡ＋ＤＰＡ）／ＳＦＡ比率は、有利には少なくとも２．５であり、優先的には少なくとも３であり、より優先的には少なくとも４であり、さらにより優先的には少なくとも５である。いくつかの場合において、（ＤＨＡ＋ＤＰＡ）／ＳＦＡ比率は、少なくとも８まで、さらには少なくとも９までであってもよい。少なくとも７０％である、最も高いＤＨＡ含有量のオイルにおいて、（ＤＨＡ＋ＤＰＡ）／ＳＦＡ比率は、少なくとも５であり、優先的には少なくとも７であり、より優先的には少なくとも１０であり、最大で約１１またはそれ以上である。
【００３４】
本発明によるオイルは、実質的にトリグリセリドの形態である。トリグリセリドは脂質の総質量の少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９３％を占める。トリグリセリドの含有量は、例えば、薄層クロマトグラフィーによって分析される（Ｊｏｕｅｔら、２００３）。
【００３５】
本発明によるオイルの上記特徴は、粗製オイルであるか精製されたオイルであるかにかかわらず、微生物のバイオマス中に存在するオイルおよび前記バイオマスから抽出されるオイルの双方に関する。
【００３６】
特定の場合において、用いられるプロセスによっては、バイオマスからのオイルの抽出がＤＨＡおよびＤＰＡの含有量のわずかな上昇につながることがあり、低分子量飽和脂肪酸に比べてこれらＰＵＦＡを抽出するのに有利に働く。しかしながら、この濃縮はバイオマスに含まれるオイルの固有特性、特にトリグリセリド含有量を実質的に変更するものではない。いずれにせよ、本発明によるオイルは、例えばエステルの形態でのＰＵＦＡの添加、濃縮、および／またはパルチミン酸などの飽和脂肪酸の除去によるその脂肪酸含有量の実質的な変更を経ていないオイルである。
【００３７】
本発明の特定の実施形態によるオイルは、オイル１ｋｇあたり１０ｍｇ超、さらには３０ｍｇ／ｋｇ超、優先的には４０ｍｇ／ｋｇ超、さらにより優先的には６０ｍｇ／ｋｇ超、さらには少なくとも６５ｍｇ／ｋｇの天然カロテノイドを含む。含まれるカロテノイドは、主にアスタキサンチンおよびベータカロテンである。オイルは、２０ｍｇ／ｋｇ超、さらには３０ｍｇ／ｋｇ超、より優先的には４０ｍｇ／ｋｇ超のアスタキサンチンを含む。カンタキサンチンも含まれるが、少量である。ルテインおよびゼアキサンチンなどの他のカロテノイドが含まれてもよいが、使用される方法の検出限界で含まれる。「天然カロテノイド」との用語は、カロテノイドが添加されておらず、すなわちオイルが得られるバイオマスと同じバイオマスから得られ、オイルの抽出と同時にこのバイオマスから抽出されるものを意味する。天然カロテノイドは、従属栄養の発酵条件下にある株から、特に刺激を与えることなく、産生される。天然カロテノイドは、それゆえプロセスを通じて存在し、脂肪酸、とりわけＤＨＡを酸化から保護する。精製プロセスは色素を除去することがあるため、精製されたオイルは、カロテノイドを含んでいるとしても、より少ないカロテノイドを含んでいてよい。
【００３８】
オイルの色は、通常、ＡＯＣＳ  Ｃｃ−１３ｊ−９７規格（２０１７年改訂）に記載の方法に従って、分光光度計を用いて、ガードナーインデックスを測定することによって評価される。測定スケールは、透明（１）から濃赤／褐色（１８）までの１８グレードを含む。アスタキサンチンおよびベータカロテンを含むいくつかのカロテノイドは、濃度に応じてより濃くまたはより淡い色を呈する。したがって、カロテノイドの存在は高いガードナーインデックスにおいて反映される。本発明の特定の実施形態によるオイルは、８超さらには１０超、好ましくは１２から１７の間のガードナーインデックスを有する。
【００３９】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富むオイルの酸化は、（透明のオイルに対して）色が黄化する結果となり、それゆえガードナー値が高くなることがあるため、ガードナースケールは従来オイルの劣化を評価するために使われている。しかしながら、ＰＵＦＡに富むオイルの酸化は、アニシジンインデックスおよび過酸化インデックスによってより正確に測定される。本発明によるオイルは、低酸化製品を保証する低アニシジンインデックスおよび低過酸化インデックスと、カロテノイドの存在による高ガードナーインデックスとを有する。本発明によるオイルは、５未満、さらには２未満、好ましくは１．５未満のアニシジンインデックスを有し、また５未満、さらには１以下、好ましくは０．５以下の過酸化インデックスを有する。
【００４０】
本発明によるオイルは、かなり低い融解温度を有し、この融解温度はＤＨＡ含有量の増加に相関して低下する。融解温度は、ＩＳＯ６３２１規格に従って測定される。実際、１ｇの脂肪酸あたり６００ｍｇ超のＤＨＡ（または約６２％超のＤＨＡ）を含むオイルは、２０℃未満、さらには５℃以下の融解温度を有する。したがって、上記オイルは室温で液体である。１ｇの脂肪酸あたり７００ｍｇ超のＤＨＡ（または約７３％超のＤＨＡ）を含むオイルは、−５℃未満の融解温度を有する。低い融解温度は、オイルを、劣化を抑制するために冷蔵・冷凍しながら、液体の形態で保存することを可能にするため、保存および取り扱い（特に、ポンピング）を容易にする。保存中に凍結するオイルは、サンプリングのため、および混合物に添加するために加温されなければならない。しかしながら、温度は酸化を促進する要因である。
【００４１】
この特性はまた、２２℃において粘度計（Ｖｉｓｃｏｍａｎ、Ｇｉｌｓｏｎ）によって測定される粘性値において反映される。本発明によるオイルは、室温における粘性値が５０Ｐａ・ｓ以下であり、さらには４０未満であり、好ましくは３０未満である。
【００４２】
本発明によるオイルは、ＤＨＡに富むオイルを産生する微生物を培養することにより得られる。このようなオイルを得ることを可能とする微生物の株は工業株であり、すなわち、本発明によれば、株は、脂質含有量が乾燥物の少なくとも４５％、優先的には少なくとも約５０％を占め、そして、少なくとも５０ｇ／Ｌ、優先的には少なくとも７０ｇ／Ｌ、より優先的には少なくとも１００ｇ／Ｌの細胞密度での増殖能力を有する。
【００４３】
当業者は、主に、スラウストキトリド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、渦鞭毛藻（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、珪藻（ｄｉａｔｏｍｓ）、ユースティグマトファイト（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）に含まれるＰＵＦＡ産生微生物の工業株、特に、クリプテコジニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはオーランチオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のＤＨＡ産生微生物の工業株に精通している。
【００４４】
脂質中のＰＵＦＡ含有量の分析は、当業者における標準的方法、特に、次の文献に記載の方法に従って実施される：Gas Chromatographic Quantification of Fatty Acid Methyl Esters: Flame Ionization Detection vs. Electron Impact Mass Spectrometry, Dodds et al., Lipids, Vol. 40, no. 4 (2005)（脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィー定量：水素炎イオン化検出法ｖｓ電子衝撃質量分析法、Ｄｏｄｄｓら、Ｌｉｐｉｄｓ第４０巻第４号（２００５））。
【００４５】
より具体的には、脂質の総質量に対して６０％超のＤＨＡを含むオイルを産生する、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ４０６２／７株および同ＣＣＡＰ４０６２／８株ならびにＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．ＣＣＡＰ４０８７／７株が挙げられる。本発明はまた、６０％超のＤＨＡを含むオイルを産生することが可能な上記株に関する。
【００４６】
オイルを製造するために使用される発酵マストを製造するための微生物の工業培養のプロセスは、独立栄養形態であるか、従属栄養形態であるか、混合栄養形態であり、いずれも当業者によく知られている。従属栄養形態または混合栄養形態での工業培養は、少なくとも５０ｇ／Ｌ、優先的には少なくとも７０ｇ／Ｌ、より優先的には少なくとも１００ｇ／Ｌの細胞密度を可能にする。
【００４７】
本発明によれば、「工業培養」とは、株の増殖およびＰＵＦＡ産生に適した培地で、さらに市場の要求に対応する十分な量の生産に適した体積で、株を培養することを意味する。
【００４８】
これらの工業培養は、非連続的な「回分」形態、半連続的な「半回分」形態または連続形態の発酵によって行われる。発酵槽は、１０００Ｌから２００ｍ３超の範囲の容積を持つ。
【００４９】
好適な培地は、好ましくは、炭素源と、窒素源と、リン源と、塩を含む、化学的に定義された培地である。「化学的に定義された培地」とは、各要素の内容がわかっている培地を意味する。有利には、培地は、多量のまたは複雑な有機物質を含まない。多量のまたは複雑な有機物質とは、混合物の形態の精製されていない有機物質であって、当該混合物中の様々な構成物質の正確な組成および濃度がわかっておらず、また制御されておらず、さらにバッチごとに大きなばらつきを示すことがあるものをいう。多量のまたは複雑な有機物質の例として、酵母エキス、またはタンパク質加水分解反応の産物であるペプトン、または海洋鉱物塩などの豊富な鉱物質、または各成分の濃度が決められていない、その他の複合増殖剤が挙げられる。
【００５０】
一般的に、工業培養プロセスは、バイオマスの生産を促進するための増殖工程と、それに続く、特に脂質およびＰＵＦＡの産生を促進するための蓄積工程とを含む。このプロセスは、ＷＯ２００１／０５４５１０に記載のプロセスに顕著にあてはまる。さらに最近では、バイオマスの生産とＰＵＦＡの産生とを同時に促進する培養条件を用いたプロセスが記載されており、特に、ＷＯ２０１２／０３５２６２、ＷＯ２０１５／００４４０２およびＷＯ２０１５／００４４０３に記載の培養方法が挙げられる。もちろん、当業者は、バイオマスの生産を促進するために、培養条件、特に、培地の組成、培養中に栄養素を加える条件、温度、酸素供給サイクル、および照明条件を適合させることが可能であろう。
【００５１】
工業培養の温度は、有利には１７℃超である。
【００５２】
本発明によれば、「バイオマス」とは、有利には、微生物細胞の培養により、特に上記の培養方法により生産される当該微生物細胞の集まりを意味し、ここで当該細胞はフィジカルインテグリティを保っていても保っていなくてもよい。したがって、前記バイオマスは、劣化した微生物細胞を０％から１００％の量で含んでいてもよいことが理解される。「劣化した」とは、微生物細胞のフィジカルインテグリティが、例えば均質化または酵素的溶解のプロセスの結果として溶解された微生物のように、変化させられていてもよいことを意味する。バイオマスは、一度生産されたら、このままとされてもよいし、培地から分離されてもよいし、乾燥させても乾燥させなくてもよいし、劣化させても劣化させなくてもよい。
【００５３】
バイオマスは、全体的または部分的に乾燥させられているか否かによって、１％から９０％の水分含有量を有していてもよい。
【００５４】
したがって、本発明はまた、既に説明したオイルを含む微生物のバイオマスに関する。
【００５５】
第１の実施形態によれば、バイオマスは、７０％から９０％、優先的には８０％から８５％の水分含有量を有する。これは、乾燥前に、培養された微生物を培地から分離するために、発酵マストを濾過した後に、培養された最適化された工業微生物から本質的になるバイオマスである場合に、特に該当する。
【００５６】
本発明の他の実施形態によれば、バイオマスは、全体的または部分的に乾燥させられており、１％から１０％、優先的には２％から７％の水分含有量を有する。
【００５７】
バイオマスは、保存のために、または、例えば食品サプリメントまたはヒトもしくは動物の消費用の食品の使用のために、パッケージされてもよい。
【００５８】
本発明によるオイルを、微生物の培養によって生産されるバイオマスから単離する方法は、当業者によく知られている。特に、スプリンクリングまたはマセレーションによって乾燥バイオマス（固相）に含まれるオイルを抽出する溶媒（液相）の使用に基づく固液抽出；細胞を予備溶解した後にデカンテーションまたは遠心分離によってオイルから水相を分離することに基づく液液抽出を挙げることができる。好ましくは、抽出は有機溶媒を用いずに行われる。特に、ＷＯ０１／５３５１２、ＷＯ０２／１０４２３、ＷＯ２０１４／１２２０９２、ＷＯ２０１５／０９２５４６およびＷＯ２０１５／０９５６９４を挙げることができる。
【００５９】
また、ＰＵＦＡに富むオイルのために微生物からの脂質抽出収率を向上させるための方法を好適に挙げることができる。この方法は、まず第１の温度で細胞溶解を行い、次に第１の温度よりも低い第２の温度で継続して細胞溶解を行い、その後、溶解バイオマスからオイルを機械的に分離（濾過、デカンテーション）することからなる。
【００６０】
細胞溶解は、酵素的溶解または機械的溶解（粉砕）によって行われる。溶解の第１のパートの温度は、好ましくは少なくとも５０℃であり、かつ、細胞溶解を促進しつつオイルの組成を劣化させる温度より低い温度、つまり８０℃より低く、好ましくはせいぜい７０℃に保たれる。
【００６１】
使用してもよい酵素は公知であり、特にＷＯ２０１５／０９５６８８、ＷＯ２０１１／１５３２４６、ＵＳ６７５００４８およびＷＯ２０１５／０９５６９４に記載されており、特に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社によってＡｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ３７０７１、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １０００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ＦＭ  ２．４  Ｌ、Ｐｒｏｔａｍｅｘ、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅの名称で市販されている酵素などのプロテアーゼまたはセルラーゼである。使用条件は供給業者によって推奨される条件であり、温度は最適な酵素活性のために推奨される温度であり、少なくとも５０℃から最大で７０℃であり、好ましくは約６５℃である。有利には、酵素的溶解は酸素の乏しい雰囲気下で行われる。
【００６２】
機械的溶解方法もまた公知であり、特にボールミル、ミキサー−分散機、高圧ホモジナイザー、ピンミルまたはインパクトミル、超音波、パルス電界による方法が知られている。特に、ボールミルとして、Ｎｅｔｚｓｃｈ／Ｄｉｓｃｕｓ−１０００、ＷＡＢ／ＥＣＭ−ＡＰ６０が挙げられ、高圧ホモジナイザーとして、ＧＥＡ／Ａｒｉｅｔｅが挙げられ、ミキサー−分散機として、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ／７００−Ｘが挙げられ、ピンミルとして、Ｈｏｓａｋａｗａ／Ｃｏｎｔｒａｐｌｅｘが挙げられ、インパクトミルとして、Ｎｅｔｚｓｃｈ／Ｃｏｎｄｕｘが挙げられる。
【００６３】
溶解の第１のパートは、特に酵素的溶解または粉砕サイクルの時間に関して、細胞溶解の従来技術によって推奨されている通常の条件で実施される。
【００６４】
溶解継続工程は、溶解バイオマスを事前に抽出することなく、実施条件を変更することによって溶解を完了させる。第２のパートにおける溶解温度は、第１のパートにおける溶解温度よりも少なくとも１０℃低い。好ましくは、溶解の第２のパートの温度は、４０℃以下であり、有利には５℃から４０℃の範囲内である。より低い温度で実施される溶解の第２のパート、または溶解の終了は、有利には少なくとも３０分、有利には最大で３０時間行われる。
【００６５】
溶解バイオマスからのオイルの機械的分離もまた、重力分離として当業者によく知られており、特にＷＯ０１／５３５１２に記載の遠心分離がよく知られている。連続分離、特に遠心プレートセパレータを用いることも可能である。そのようなセパレータは、ＷＯ２０１０／０９６００２に記載されているように、固体残渣と水を含む複合培地から連続的にオイルを抽出することが知られており、特にＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ社、Ｆｌｏｔｔｗｅｇ社またはＳＰＸ  Ｆｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓａｎｔｏｒｓｏ社によって市販されている。この連続的分離工程は、本発明によるオイルを得るための工程において好適である。
【００６６】
得られるオイルは、一般的に粗製オイル（ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ）と呼ばれるオイルであり、そのままでも使用でき、または、特に、悪臭を抑制することで保存を容易にするため、もしくは消費者がより受け入れ易いように色を変化させるために精製することもできる。精製工程、特に、脱ガム、浄化、脱臭は当業者によく知られている。これらの工程は（全体的にまたは部分的に）、リン脂質、色素、揮発性物質および遊離脂肪酸を除去する。実際に、これらの方法は、粗製オイルと比較して、得られる精製されたオイルの飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸またはトリグリセリドの相対含有量を実質的に変化させない。
【００６７】
本発明はまた、ＤＨＡに富む粗製オイルまたは精製されたオイルを収容するために適した容積の容器に含まれ、１Ｌ超の量の、有利には１０Ｌ超の、より具体的には２２０Ｌ台の量の、さらにより具体的には２０ｍ３台の量にパッケージされたオイルに関する。
【００６８】
ある容積のオイルまたはバイオマスを保持し、そして保存および輸送のために保護することが可能な容器が当業者によって用いられてもよい。容器の容積は、有利には、容器中の空気の存在を制限し、酸化を制限するようにパッケージされるオイルまたはバイオマスの容積と同じかそれより実質的に大きいであろう。容器は、光線、特にＵＶ光線による製品の劣化を防ぐために、有利には不透明であろう。有利には、容器は、オイルまたはバイオマスで満たされていない容積が不活性ガスで満たされうるように、気密であるであろう。
【００６９】
本発明によるオイルは、その最終的な使用のために他のオイルと混合することできる。この希釈は、希釈後のオイルの組成におけるＤＨＡおよび他の不飽和脂肪酸の総含有量を変化させる。しかしながら、希釈のために使用されるオイルの脂肪酸プロファイルを考慮して、最終オイル中の、本発明によるＤＨＡに富むオイル由来の脂肪酸と希釈オイル由来の脂肪酸との相対パーセンテージを特定することは依然可能である。
【００７０】
したがって、本発明はまた、他のオイルと混合された本発明によるオイルを含む、希釈されたオイルに関する。本発明によるＤＨＡに富むオイルを希釈するために使用されるこのオイルは、一般的にまた好ましくは、ヒトおよび動物用の食品の消費に適したベジタブルオイルである。特に、ヒマワリオイル、ナタネオイル、ダイズオイル、クルミオイル、ゴマオイル、ヘンプオイル、ヘーゼルナッツオイル、アルガンオイル、オリーブオイル、アマニオイル、または食品用途に適した他のオイルが挙げられる。添加されるオイルは、他のＰＵＦＡ、特にＡＲＡおよび／またはＥＰＡを含むオイル、特に微生物起源の他のオイルまたは魚油であってもよい。
【００７１】
本発明はまた、本発明による粗製オイル、精製されたオイル、または希釈されたオイルを含む組成物、または本発明によるバイオマスを含む組成物に関する。
【００７２】
本発明による組成物は、一つまたはそれ以上の賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、食品、医薬組成物、化粧品組成物および工業用組成物を含む前記組成物に、当該組成物の保存および使用のための所望の特性を付与するために本発明において用いられる一つの成分または複数の成分の混合物である。賦形剤は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の合併症をもたらすことなくヒトおよび動物の組織に接触させて使用され、薬局方によってその特性が知られている医薬組成物に添加される場合には、「薬学的に許容可能な」賦形剤と表現される。有機ベースまたは無機ベース、有機酸または無機酸、ｐＨバッファ、安定剤、酸化防止剤、付着剤、剥離剤、コーティング剤、外相成分、制御された剥離成分、界面活性剤、保湿剤、充填剤、軟化剤、またはそれらの組み合わせなど種々の賦形剤を用いてもよい。
【００７３】
目的に応じて、本発明による組成物は、特に医薬組成物、化粧品組成物、栄養補助組成物または食品である。
【００７４】
食品は、ヒト用および動物用の双方を意図し、固体組成物、ペースト状組成物、液状組成物を含む。特に、一般食品、牛乳、飲料、治療用飲料および栄養飲料を含む液体製品、機能性食品、サプリメント、栄養補助食品、未熟児用調合ミルクを含む新生児用調合ミルク、妊婦または授乳婦用食品、成人用食品、高齢者用食品および動物用飼料を挙げることができる。
【００７５】
本発明によるＤＨＡに富む粗製オイルまたは精製されたオイル、または当該オイルを含むバイオマスは、そのまま直接使用することもでき、または、当業者にとって公知の用途に従って、オイル、スプレッド、他の脂質成分、飲料、ダイズ系ソース、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム）、ベーカリー製品、例えば（カプセルまたはタブレット形態の）栄養サプリメントの形態の栄養製品、ビタミンサプリメント、食品サプリメント、エネルギードリンクなどの飲料のために希釈される粉末、または乳児用製剤のためのミルク粉末、完成品または半製品の粉末状食品等の添加剤として添加することもできる。
【００７６】
動物飼料もまた当業者に知られている。動物飼料は、特に、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギなどの家畜用のもの、または魚介類や養殖魚のための養魚用のものが意図される。
【００７７】
ＤＨＡに富むオイルを含む医薬組成物もまた当業者に知られており、オイルは単独で、または他の医療用製品と組み合わせて使用される。
【００７８】
本発明による粗製オイルまたは精製されたオイル、または当該オイルを含むバイオマスは、単回投与組成物の形態、特に経口投与に適したタブレット、カプセル、粉末、顆粒の形態で配合されてもよい。
【００７９】
本発明によるＤＨＡに富む粗製オイルまたは精製されたオイル、または当該オイルを含むバイオマスの利点は、これらの混合物および組成物をより少ない量で使用できる点である。
【００８０】
本発明はまた、本発明による粗製オイル、精製されたオイル、または希釈されたオイル、またはそれを含むバイオマスの、ヒトまたは動物用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための使用に関する。
【００８１】
このような使用は当業者によく知られており、特に、ＷＯ２０１０／１０７４１５およびＤＳＭ社のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍ．ｃｏｍ／ｍａｒｋｅｔｓ／ｆｏｏｄａｎｄｂｅｖｅｒａｇｅｓ／ｅｎ＿ＵＳ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ−ｌｉｐｉｄｓ／ｌｉｆｅ−ｄｈａ．ｈｔｍｌ）に記載されている。
【実施例】
【００８２】
実施例１：スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）の高ＤＨＡ含有バイオマスの脂肪酸プロファイル
スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ−ＦＣＣＢ１８９７、ＦＣＣＢ１８００、ＣＣＡＰ４０６２／８）の株を、三角フラスコ中のＡＴＣＣ７９０（改良）培地中で増殖させた。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．の株（特に、ＣＣＡＰ４０８７／７株）について、同様に結果を得た。
【００８３】
培養が静止期になったら、遠心分離によってバイオマスを回収し、その後ＧＣ−ＦＩＤ（ＩＳＯ１２９６６−２規格に適合した方法）によりバイオマスの脂肪酸組成を分析する前に、バイオマスを凍結乾燥させた。
【００８４】
改良ＡＴＣＣ７９０培地の組成：
酵母エキス  ５．０ｇ／Ｌ
ペプトン  ５．０ｇ／Ｌ
Ｄ＋グルコース  ３０．０ｇ／Ｌ
海塩  ２０ｇ／Ｌ
【００８５】
バイオマスに含まれる脂肪酸の組成を第１表に示す。結果は総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表す。ＳＦＡは飽和脂肪酸を指す。
【００８６】
【表１】
2022500048.tif 000002
【００８７】
実施例２：高ＤＨＡ含有株の発酵培養
培養は、専用の自動化システムおよびコンピュータステーションによる監視を備えた１〜５Ｌの発酵槽（バイオリアクター）中で行った。培養は、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉの２株を用い、２つの異なる培養プロトコルで行った。系は、塩基（実施例ｂ１およびｂ２についてはＮＨ４ＯＨ、実施例ａについてはＮａＯＨ）の添加によりｐＨ５に調整し、窒素供給を行いながら（実施例ｂ１およびｂ２について）、培養期間全体にわたってｐＨ調整を行った。培養温度は、３０℃、その後２２℃、最終的に培養の終期に１８℃とした。
【００８８】
ＣＣＡＰ４０６２／７株を、実施例ａおよびｂ１について使用し、ＦＣＣＢ１８９７株を、実施例ｂ２について使用した。
【００８９】
培地の組成を第２表に示す。
【００９０】
【表２】
2022500048.tif 000003
【００９１】
グルコースの添加は、炭素：窒素：リン（ＣＮＰ）のモル比率が５３３：１１：１である強化溶液の形態で行われ（実施例ａ）、またはグルコースのみを含む溶液で行った（実施例ｂ１およびｂ２）。
【００９２】
培養モニタリング：
総バイオマス濃度は、乾燥質量を測定することによってモニターした（測定前に、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルタで濾過し、その後１０５℃で、最小で２４時間オーブン乾燥させた）。脂肪酸分析は、バイオマスについては、ＩＳＯ１２９６６−２に準拠した方法に従って、またオイルについては、欧州薬局方９．０（２．４．２９．）に従って行った。
【００９３】
ａ、ｂ１およびｂ２条件下で得られたバイオマスの脂肪酸プロファイルを第３表に示す。結果は総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表す。
【００９４】
【表３】
2022500048.tif 000004
【００９５】
実施例３：工業条件での培養
１０ｍ３または１８０ｍ３のタンクなどの工業用サイズの発酵槽中で、培地ｂ、および炭素：窒素：リン（ＣＮＰ）のモル比率が５３３：０．４：１である強化溶液の形態でのグルコース添加により、実施例２と同様の条件で増殖させたとき、高ＤＨＡ含有株は、同様の脂肪酸組成を有するバイオマスを生産する。
【００９６】
１０ｍ３または１８０ｍ３のタンク中で培養した後のＣＣＡＰ４０６２／７株バイオマスの脂肪酸プロファイルを第４表に示す。結果は総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表す。
【００９７】
【表４】
2022500048.tif 000005
【００９８】
実施例４：高ＤＨＡ含有株のバイオマスからのオイル抽出
ＷＯ２０１５／０９５６９４（実施例９）に記載の方法に従って、実施例３（１８０ｍ３のタンク）のバイオマスからオイルを抽出した。このオイルの脂肪酸組成は、表４に示したバイオマスの脂肪酸組成と同様である。
【００９９】
実施例５：高ＤＨＡ含有株のバイオマスからのオイル抽出
以下の手順に従って、実施例３と同じ条件で生産されたバイオマスの抽出を行った：
（ａ）６５℃の温度で４時間の、酵素的手段（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製のＡｌｃａｌａｓｅ  ２．５ＬまたはＡｌｃａｌａｓｅ  ２．４ＬまたはＮｏｖｏｚｙｍ  ３７０７１）による細胞溶解、
（ｂ）５から４０℃に温度を下げながら、３０分から３０時間、引き続き溶解、
（ｃ）遠心プレートセパレータによるオイルの機械的分離。
【０１００】
抽出収率は、バイオマスから抽出された脂質の６０％である。
【０１０１】
バイオマスから抽出されたオイルの脂質プロファイルを第６表に示す。結果は総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表す。
【０１０２】
【表５】
2022500048.tif 000006
【０１０３】
実施例６：オイル品質：抗酸化物質および不純物
実施例３の条件に従って、いくつかの従属栄養発酵を行った。実施例５の条件に従って、発酵マストからオイルを抽出した。以下の方法に従って、ＬＣ／ＤＡＤによって、抽出されたオイル中のカロテノイドを測定した：アスタキサンチン（エステル形態を含む）、参照法：ＤＳＭ  １．５版、２００９年；鹸化ベータカロテン（シス型およびトランス型の合計）、参照法：ＥＮ  １２８２３−２：２０００；カンタキサンチン、参照法：ロシュインデックスＮｏ．２２６４；ルテインおよびゼアキサンチン、参照法：ロシュインデックスＮｏ．２２６４。
【０１０４】
【表６】
2022500048.tif 000007
【０１０５】
グリシドールならびに２−および３−ＭＣＰＤなどの不純物も同じバッチにおいてアッセイした。
【０１０６】
【表７】
2022500048.tif 000008
【０１０７】
実施例７：粘度
実施例５と同様の条件下で生産され、抽出されたオイルの粘度を、粘度計（Ｖｉｓｃｏｍａｎ、Ｇｉｌｓｏｎ）によって、異なる温度で測定した。融解温度はＩＳＯ６３２１規格に従って評価した。
【０１０８】
【表８】
2022500048.tif 000009
【０１０９】
参考文献
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