(57)【要約】本発明は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合する抗原結合分子；該抗原結合分子を含む組成物；ならびにそれを使用する方法に関する。本発明は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子を提供する。そのような抗原結合分子は、3つの異なる抗原に対する結合を通して、これらの抗原結合分子によって誘導される増強されたT細胞依存性細胞傷害活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD3およびCD137に結合することができるがCD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域を含む、抗原結合分子であって、
好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、5×10-6 M未満の平衡解離定数（KD）でCD137に結合する、前記抗原結合分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号：１５９のアミノ酸配列を含むCD3ε（CD3イプシロン）の細胞外ドメインの、少なくとも1個、2個、3個、もしくはそれよりも多いアミノ酸残基；ならびに／または
（ｂ）ヒトCD137のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC（配列番号：１５２）、好ましくはLQDPCSN、NNRNQI、および／もしくはGQRTCDIのアミノ酸配列を含むCD137のN末端領域の、少なくとも1個、2個、3個、もしくはそれよりも多いアミノ酸残基
に結合する、請求項１に記載の抗原結合分子。
【請求項３】
前記抗体可変領域が、以下のうちのいずれか1つを含む、請求項１または２に記載の抗原結合分子：
（ａ１）配列番号：１６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ２）配列番号：１７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ３）配列番号：１８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ４）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ５）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ６）配列番号：２０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ７）配列番号：２２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ８）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ９）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１０）配列番号：２４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１１）配列番号：２５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１２）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１３）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１４）配列番号：２７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１５）配列番号：２８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ｂ１）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ２）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６４のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６９のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７４のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ３）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ４）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ５）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６５のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７０のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７５のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ６）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３４のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４８のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ７）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５０のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ８）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ９）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１０）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３８のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５２のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１１）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３９のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５３のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１２）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１３）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１４）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１５）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｃ１）配列番号：２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ２）配列番号：３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ３）配列番号：４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ４）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ５）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ６）配列番号：６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ７）配列番号：８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ８）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ９）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１０）配列番号：１０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１１）配列番号：１１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１２）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１３）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１４）配列番号：１３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１５）配列番号：１４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１）配列番号：２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ２）配列番号：３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ３）配列番号：４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ４）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ５）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ６）配列番号：６の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ７）配列番号：８の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ８）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ９）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１０）配列番号：１０の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１１）配列番号：１１の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１２）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１３）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１４）配列番号：１３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１５）配列番号：１４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｅ）CD3に対する結合について、（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと競合する、抗体可変領域；
（ｆ）CD137に対する結合について、（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと競合する、抗体可変領域；
（ｇ）（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと同じCD3上のエピトープに結合する、抗体可変領域；
（ｈ）（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと同じCD137上のエピトープに結合する、抗体可変領域。
【請求項４】
（ａ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸26位のA、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27位のD、F、G、I、M、もしくはL；
アミノ酸28位のD、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸29位のFもしくはW；
アミノ酸30位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のF、I、N、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のA、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸33位のW；
アミノ酸34位のF、I、L、M、もしくはV；
アミノ酸35位のF、H、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸50位のE、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸51位のI、K、もしくはV；
アミノ酸52位のK、M、R、もしくはT；
アミノ酸52b位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸52c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のE、F、G、H、L、M、N、Q、W、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸57位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸58位のA、F、H、K、N、P、R、もしくはY；
アミノ酸59位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸60位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸61位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸62位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸63位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸64位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸65位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸93位のHもしくはR；
アミノ酸94位のF、G、H、L、M、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸95位のIもしくはV；
アミノ酸96位のF、H、I、K、L、M、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸97位のF、Y、もしくはW；
アミノ酸98位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸99位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100b位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100d位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100f位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100g位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100h位のA、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸100i位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸101位のA、D、F、I、L、M、N、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸102位のA、D、E、F、G、H、I K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
ならびに／または
（ｂ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸24位のA、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸25位のA、G、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸26位のA、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸27位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27b位のA、I、L、M、P、T、もしくはV；
アミノ酸27c位のA、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27d位のA、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸28位のG、N、S、もしくはT；
アミノ酸29位のA、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸30位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のI、L、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のF、W、もしくはY；
アミノ酸33位のA、F、H、L、M、Q、もしくはV；
アミノ酸34位のA、H、もしくはS；
アミノ酸50位のI、K、L、M、もしくはR；
アミノ酸51位のA、E、I、K、L、M、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸52位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸89位のA、G、K、S、もしくはY；
アミノ酸90位のQ；
アミノ酸91位のG；
アミノ酸92位のA、D、H、K、N、Q、R、S、もしくはT；
アミノ酸93位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸94位のA、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸95位のP；
アミノ酸96位のFもしくはY；および
アミノ酸97位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV
を含む、請求項３の（ａ１）〜（ａ１５）または（ｃ１）〜（ｃ１５）のいずれか1つに記載の抗原結合分子。
【請求項５】
以下の（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合分子：
（１）抗原結合分子が、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない；
（２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する；ならびに
（３）抗原結合分子が、配列番号：１のVH配列および配列番号：５７のVL配列を含む参照抗体と比較して、同等のまたは10倍、20倍、50倍、100倍低い、ヒトCD137に対する結合についてのKD値を有し、ここで、該KD値は、好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定される。
【請求項６】
CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合することができる抗体可変領域をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
【請求項７】
第３の抗原が、がん組織において特異的に発現している分子である、請求項６に記載の抗原結合分子。
【請求項８】
抗体Fc領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
【請求項９】
前記Fc領域が、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較してFcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項８に記載の抗原結合分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合分子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクターで形質転換されたかまたはそれをトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、多重特異性抗原結合分子または多重特異性抗体を作製する方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域を取得するかまたはスクリーニングする方法：
（ａ）複数の抗体可変領域を含むライブラリーを提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）において提供されたライブラリーを、第１の抗原としてのCD3またはCD137のいずれかと接触させ、第１の抗原に結合した抗体可変領域を収集する工程、
（ｃ）工程（ｂ）において収集された抗体可変領域を、CD3およびCD137のうちの第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗体可変領域を収集する工程、ならびに
（ｄ）以下の抗体可変領域：
（１）好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、約5×10-6 M未満もしくは5×10-6 M〜3×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD137に結合する、抗体可変領域；および／または
（２）好ましくはSPRによって以下の条件：
25℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、2×10-6 M〜1×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD3に結合する、抗体可変領域
を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合する抗原結合分子、ならびにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、血漿中での安定性が高く、有害反応をほとんど生じないため、医薬として注目されている（Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078（非特許文献１）およびEur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396（非特許文献２））。抗体は、抗原に結合する作用、およびアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有するだけでなく、ADCC（抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（抗体依存性細胞貪食作用）、またはCDC（補体依存性細胞傷害活性）などの、エフェクター細胞によって媒介される細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。特に、IgG1サブクラスの抗体は、がん細胞に対してエフェクター機能を示すため、多数の抗体医薬が、腫瘍学の分野において開発されている。
【０００３】
抗体がADCC、ADCP、またはCDCを発揮するためには、そのFc領域が、エフェクター細胞（NK細胞またはマクロファージなど）上に存在する抗体受容体（FcγR）および様々な補体成分に結合しなければならない。ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーとして、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、およびFcγRIIIbのアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65（非特許文献３））。これらのアイソフォームのうち、FcγRIa、FcγRIIa、およびFcγRIIIaは、その細胞内ドメインにITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは活性化シグナルを伝達する。対照的に、FcγRIIbのみが、その細胞内ドメインにITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは抑制シグナルを伝達する。FcγRのこれらのアイソフォームはすべて、免疫複合体などによる架橋によって、シグナルを伝達することが知られている（Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47（非特許文献４））。実際に、抗体ががん細胞に対してエフェクター機能を発揮する時には、エフェクター細胞膜上のFcγR分子が、がん細胞膜上に結合した複数の抗体のFc領域によってクラスターとなり、それによってエフェクター細胞を通して活性化シグナルが伝達される。その結果、殺細胞効果が発揮される。この点において、FcγRの架橋は、がん細胞近くに位置するエフェクター細胞に限られ、これは、免疫の活性化ががん細胞に限局化されることを示している（Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81（非特許文献５））。
【０００４】
天然型の免疫グロブリンは、その可変領域により抗原に結合し、その定常領域によりFcγR、FcRn、FcαR、およびFcεRなどの受容体または補体に結合する。FcRn（IgGのFc領域で相互作用する結合分子）の各分子は、抗体の各重鎖に１分子ずつ結合する。したがって、IgG型の抗体１分子に対して２分子のFcRnが結合することが報告されている。FcRnなどとは異なり、FcγRは、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメインで相互作用し、IgG型の抗体１分子に対して１分子のみのFcγRが結合する（J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477）。FcγRと抗体のFc領域との間の結合には、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメイン中のいくつかのアミノ酸残基、ならびにCH2ドメインのAsn 297（EUナンバリング）に付加された糖鎖が重要であることが見出されている（Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110（非特許文献６）、Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104（非特許文献７）、およびImmunol. (1995) 86, 319-324（非特許文献８））。この結合部位を中心に、様々なFcγR結合特性を有するFc領域バリアントがこれまでに研究されて、活性化FcγRに対するより高い結合活性を有するFc領域バリアントが得られている（WO2000/042072（特許文献１）およびWO2006/019447（特許文献２））。例えば、Lazarらは、ヒトIgG1のSer 239、Ala 330、およびIle 332（EUナンバリング）をそれぞれAsn、Leu、およびGluにより置換することによって、ヒトFcγRIIIa（V158）に対するヒトIgG1の結合活性を約370倍に増加させることに成功している（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010（非特許文献９）およびWO2006/019447（特許文献２））。この改変形態は、FcγIIbに対するFcγRIIIaの比（A/I比）の点で、野生型に比べて結合活性が約9倍になっている。あるいは、Shinkawaらは、Asn 297（EUナンバリング）に付加される糖鎖のフコースを欠損させることによって、FcγRIIIaに対する結合活性を約100倍に増加させることに成功している（J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473（非特許文献１０））。これらの方法によって、天然型ヒトIgG1と比較してヒトIgG1のADCC活性を大幅に改善することができる。
【０００５】
天然型のIgG型抗体は、典型的には、その可変領域（Fab）により1つのエピトープを認識して結合するため、1つの抗原にしか結合することができない。一方で、がんまたは炎症においては多種類のタンパク質が関与することが知られており、これらのタンパク質は、互いにクロストークしていることがある。例えば、免疫疾患では、いくつかの炎症性サイトカイン（TNF、IL1、およびIL6）が関与していることが知られている（Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10（非特許文献１１））。また、がんによる薬剤耐性の獲得の基となる1つのメカニズムとして、他の受容体が活性化することが知られている（Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51（非特許文献１２））。このような場合、1つのエピトープを認識する通常の抗体では、複数のタンパク質を阻害することができない。
【０００６】
複数の標的を阻害する分子として、1つの分子で2種類以上の抗原に結合する抗体（これらの抗体を二重特異性抗体と言う）が研究されている。天然型のIgG型抗体を改良することによって、2つの異なる抗原（第１の抗原および第２の抗原）に対する結合活性を付与することができる（mAbs. (2012) Mar 1, 4(2)）。そのため、そのような抗体は、これらの2種類以上の抗原を1つの分子で中和する作用だけでなく、細胞傷害活性を有する細胞をがん細胞に架橋することによって抗腫瘍活性を高める作用を有する。二重特異性抗体の分子形として、抗体のN末端またはC末端に抗原結合部位を付加した分子（DVD-Ig、TCB、およびscFv-IgG）、抗体の2つのFab領域が異なる配列を有する分子（共通L鎖二重特異性抗体およびハイブリッドハイブリドーマ）、1つのFab領域が2つの抗原を認識する分子（Two-in-one IgGおよびDutaMab）、ならびにCH3ドメインループを別の抗原結合部位として有する分子（Fcab）が、これまでに報告されている（Nat. Rev. (2010), 10, 301-316（非特許文献１３）およびPeds(2010), 23(4), 289-297（非特許文献１４））。これらの二重特異性抗体はいずれも、そのFc領域でFcγRと相互作用するため、抗体のエフェクター機能はそれにおいて保存されている。
【０００７】
二重特異性抗体により認識される抗原がすべて、がんにおいて特異的に発現している抗原であれば、抗原のいずれかに結合する二重特異性抗体は、がん細胞に対して細胞傷害活性を示すため、1つの抗原を認識する従来の抗体医薬よりも効率的な抗がん効果が期待できる。しかし、二重特異性抗体により認識される抗原のうちのいずれか1つが、正常組織において発現している場合、または免疫細胞において発現している細胞である場合は、FcγRとの架橋によって正常組織の障害またはサイトカインの放出が起こる（J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52（非特許文献１５））。その結果、強い有害反応が誘導される。
【０００８】
例えば、T細胞に発現しているタンパク質とがん細胞に発現しているタンパク質（がん抗原）とを認識する二重特異性抗体として、カツマキソマブ（catumaxomab）が知られている。カツマキソマブは、2つのFabで、それぞれがん抗原（EpCAM）およびT細胞に発現しているCD3ε鎖に結合する。カツマキソマブは、がん抗原とCD3εに同時に結合することによって、T細胞媒介性の細胞傷害活性を誘導し、がん抗原とFcγRに同時に結合することによって、NK細胞または抗原提示細胞（例えば、マクロファージ）媒介性の細胞傷害活性を誘導する。これらの2つの細胞傷害活性を使用することにより、カツマキソマブは、腹腔内投与によって悪性腹水症に対して高い治療効果を示しており、したがって欧州で承認されている（Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。さらに、カツマキソマブの投与によって、がん細胞に対して反応する抗体が出現した例が報告され、獲得免疫が誘導されることが実証された（Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85（非特許文献１７））。この結果から、T細胞媒介性の細胞傷害活性と、FcγRを介したNK細胞またはマクロファージなどの細胞によってもたらされる作用との両方を有するこのような抗体（これらの抗体を特に三機能性抗体と言う）は、強い抗腫瘍効果と獲得免疫の誘導が期待できるため、注目されている。
【０００９】
しかし、三機能性抗体は、がん抗原の非存在下でも、CD3εとFcγRに同時に結合するため、がん細胞が存在しない環境でもCD3εを発現しているT細胞をFcγRを発現している細胞に架橋して、様々なサイトカインを大量に産生させる。このようながん抗原非依存的な様々なサイトカインの産生の誘導に起因して、三機能性抗体の投与は現状、腹腔内経路に限られている（Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。三機能性抗体は、重篤なサイトカインストーム様の有害反応のゆえに、全身投与が非常に困難である（Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406（非特許文献１８））。
従来技術の二重特異性抗体は、両方の抗原、すなわち、第１の抗原であるがん抗原（EpCAM）および第２の抗原であるCD3εに、FcγRへの結合と同時に結合し得るため、FcγRおよび第２の抗原であるCD3εに同時に結合することによって引き起こされるこのような有害反応は、その分子構造的に回避することができない。
近年、FcγRに対する結合活性を低下させたFc領域を用いることで、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性を引き起こす改良型抗体が提供されている（WO2012/073985）。
しかしながら、このような抗体であっても、その分子構造を踏まえると、がん抗原に結合しつつ2つの免疫受容体、すなわち、CD3εおよびFcγRに作用することはできない。
有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、T細胞以外の細胞によって媒介される細胞傷害活性との両方を発揮する抗体は、まだ知られていない。
【００１０】
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要であると説明されている（Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284（非特許文献１９））。
【００１１】
CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8（非特許文献２０））。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の存続性を増強することができる（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733（非特許文献２１））。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22（非特許文献２２））。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合が関与していることが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22（非特許文献２３））。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がインビボでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6（非特許文献２４））。WO2015/156268（特許文献３）は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、かつ免疫細胞を活性化することができ、それによってCD137アゴニスト抗体の肝毒性有害事象が、抗体の抗腫瘍活性を保持しつつ避けられ得ることを記載している。WO2015/156268はさらに、この二重特異性抗体を、CD3アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する別の二重特異性抗体と組み合わせて用いることによって、抗腫瘍活性をさらに高めることができ、かつこれらの有害事象が避けられ得ることを記載している。CD137、CD3、および腫瘍特異的抗原（EGFR）に対する3つの結合ドメインを有する三重特異的抗体もまた、報告されている（WO2014/116846（特許文献４））。しかし、有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、CD137を介するT細胞および他の免疫細胞の活性化活性とを両方とも発揮する抗体は、まだ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2000/042072
【特許文献２】WO2006/019447
【特許文献３】WO2015/156268
【特許文献４】WO2014/116846
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
【非特許文献２】Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
【非特許文献３】Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
【非特許文献４】Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47
【非特許文献５】Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81
【非特許文献６】Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110
【非特許文献７】Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
【非特許文献８】Immunol. (1995) 86, 319-324
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010
【非特許文献１０】J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
【非特許文献１１】Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10
【非特許文献１２】Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51
【非特許文献１３】Nat. Rev. (2010), 10, 301-316
【非特許文献１４】Peds (2010), 23 (4), 289-297
【非特許文献１５】J. Immunol. (1999) Aug 1, 163 (3), 1246-52
【非特許文献１６】Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36 (6), 458-67
【非特許文献１７】Future Oncol. (2012) Jan 8 (1), 73-85
【非特許文献１８】Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56 (9): 1397-406
【非特許文献１９】Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284
【非特許文献２０】Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8
【非特許文献２１】Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733
【非特許文献２２】Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22
【非特許文献２３】Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
【非特許文献２４】Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
腫瘍特異的抗原（EGFR）結合ドメイン、CD137結合ドメイン、およびCD3結合ドメインを含む三重特異性抗体が、既に報告されている（WO2014116846）。しかし、このような分子形式を有する抗体は、3つの異なる抗原に同時に結合し得るため、本発明者らは、それらの三重特異性抗体が、CD3とCD137とに同時に結合することによって、CD3ε発現T細胞とCD137発現細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、DCなど）との間の架橋をもたらし得ると推測した。
さらに、CD8およびCD3εに対する二重特異性抗体は、それらを架橋するため、CD8陽性T細胞同士の間で相互の細胞傷害活性を誘導することが既に報告されている（Wong, Clin. Immunol. Immunopathol. 1991, 58(2), 236-250）。したがって、本発明者らは、T細胞上で発現している分子およびCD3εに対する二重特異性抗体もまた、該分子を発現する細胞とCD3εを発現する細胞とを架橋するため、T細胞同士の間で相互の細胞傷害活性を誘導するであろうと推測した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、CD3およびCD137に結合する抗原結合ドメイン、ならびにそれを使用する方法を提供する。本発明はまた、T細胞依存性細胞傷害活性を誘導する抗原結合分子をより効率的に取得する方法も提供する。
【００１６】
本発明者らは、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原、好ましくは、がん組織において特異的に発現している分子、より好ましくはグリピカン-3（GPC3）に結合する可変領域とを含む、抗原結合分子を調製することに成功した。本発明者らは、CD3および／またはCD137に対する結合活性を改善することにより、3つの異なる抗原に対する結合を通して、これらの抗原結合分子によって誘導される増強されたT細胞依存性細胞傷害活性を示す、抗原結合分子を調製することに成功した。そのような抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子を医薬として使用した場合に有害反応の原因となると考えられる、異なる細胞上で発現している抗原に対する従来の多重特異性抗原結合分子の結合から生じる異なる細胞間の架橋を回避することができつつ、免疫療法において使用することができる。
【００１７】
より具体的には、本発明は、以下に関する。
［１］CD3およびCD137に結合することができるがCD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域を含む、抗原結合分子であって、好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、5×10-6 M未満、5×10-7 M未満、5×10-8 M未満、または3×10-8 M未満の平衡解離定数（KD）でCD137に結合する、前記抗原結合分子。
[１Ａ]好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、5×10-6 M〜3×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD137に結合する、[１]の抗原結合分子。
[１Ｂ]好ましくはSPRによって以下の条件：
25℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、2×10-6 M〜1×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD3に結合する、[１]〜[１Ａ]の抗原結合分子。
[２]（ａ）配列番号：１５９のアミノ酸配列を含むCD3ε（CD3イプシロン）の細胞外ドメインの、少なくとも1個、2個、3個、もしくはそれよりも多いアミノ酸残基；ならびに／または
（ｂ）ヒトCD137のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC（配列番号：１５２）、好ましくはLQDPCSN、NNRNQI、および／もしくはGQRTCDIのアミノ酸配列を含むCD137のN末端領域の、少なくとも1個、2個、3個、もしくはそれよりも多いアミノ酸残基
に結合する、[１]〜[１Ｂ]の抗原結合分子。
[３]前記抗体可変領域が、1〜25アミノ酸の改変を有する抗体可変領域であり、改変されるアミノ酸が、ループ中のアミノ酸、FR3領域中のアミノ酸、または、抗体H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択されるアミノ酸である、[１]〜[２]の抗原結合分子。
[３Ａ]重鎖可変ドメイン（VH）および／または軽鎖可変ドメイン（VL）が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）から選択される1個または複数個のアミノ酸置換を含み、該1個または複数個のアミノ酸置換が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）に示されるようにCD3および／またはCD137に対して少なくとも0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、または2倍の結合親和性の増加を示す、 [１]〜[３]のいずれかの抗原結合分子。いくつかの態様において、抗体可変領域は、
（ａ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸26位のA、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27位のD、F、G、I、M、もしくはL；
アミノ酸28位のD、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸29位のFもしくはW；
アミノ酸30位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のF、I、N、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のA、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸33位のW；
アミノ酸34位のF、I、L、M、もしくはV；
アミノ酸35位のF、H、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸50位のE、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸51位のI、K、もしくはV；
アミノ酸52位のK、M、R、もしくはT；
アミノ酸52b位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸52c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のE、F、G、H、L、M、N、Q、W、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸57位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸58位のA、F、H、K、N、P、R、もしくはY；
アミノ酸59位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸60位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸61位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸62位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸63位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸64位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸65位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸93位のHもしくはR；
アミノ酸94位のF、G、H、L、M、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸95位のIもしくはV；
アミノ酸96位のF、H、I、K、L、M、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸97位のF、Y、もしくはW；
アミノ酸98位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸99位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100b位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100d位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100f位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100g位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100h位のA、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸100i位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸101位のA、D、F、I、L、M、N、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸102位のA、D、E、F、G、H、I K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
ならびに／または
（ｂ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸24位のA、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸25位のA、G、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸26位のA、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸27位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27b位のA、I、L、M、P、T、もしくはV；
アミノ酸27c位のA、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27d位のA、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸28位のG、N、S、もしくはT；
アミノ酸29位のA、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸30位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のI、L、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のF、W、もしくはY；
アミノ酸33位のA、F、H、L、M、Q、もしくはV；
アミノ酸34位のA、H、もしくはS；
アミノ酸50位のI、K、L、M、もしくはR；
アミノ酸51位のA、E、I、K、L、M、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸52位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸89位のA、G、K、S、もしくはY；
アミノ酸90位のQ；
アミノ酸91位のG；
アミノ酸92位のA、D、H、K、N、Q、R、S、もしくはT；
アミノ酸93位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸94位のA、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸95位のP；
アミノ酸96位のFもしくはY；および
アミノ酸97位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV
を含むことが好ましい。
［４］前記抗体可変領域が、以下のうちのいずれか1つを含む、［１］〜［３Ａ］のいずれかに記載の抗原結合分子：
（ａ１）配列番号：１６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ２）配列番号：１７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ３）配列番号：１８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ４）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ５）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ６）配列番号：２０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ７）配列番号：２２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ８）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ９）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１０）配列番号：２４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１１）配列番号：２５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１２）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１３）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１４）配列番号：２７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１５）配列番号：２８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ｂ１）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ２）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６４のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６９のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７４のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ３）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ４）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ５）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６５のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７０のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７５のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ６）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３４のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４８のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ７）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５０のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ８）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ９）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１０）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３８のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５２のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１１）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３９のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５３のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１２）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１３）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１４）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１５）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｃ１）配列番号：２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ２）配列番号：３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ３）配列番号：４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ４）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ５）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ６）配列番号：６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ７）配列番号：８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ８）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ９）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１０）配列番号：１０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１１）配列番号：１１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１２）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１３）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１４）配列番号：１３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１５）配列番号：１４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１）配列番号：２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ２）配列番号：３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ３）配列番号：４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ４）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ５）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ６）配列番号：６の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ７）配列番号：８の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ８）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ９）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１０）配列番号：１０の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１１）配列番号：１１の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１２）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１３）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１４）配列番号：１３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１５）配列番号：１４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｅ）CD3に対する結合について、（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと競合する、抗体可変領域；
（ｆ）CD137に対する結合について、（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと競合する、抗体可変領域；
（ｇ）（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと同じCD3上のエピトープに結合する、抗体可変領域；
（ｈ）（ａ１）〜（ｄ１５）の抗体可変領域のいずれか1つと同じCD137上のエピトープに結合する、抗体可変領域。
[４Ａ]重鎖可変ドメイン（VH）および／または軽鎖可変ドメイン（VL）が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）から選択される1個または複数個のアミノ酸置換を含み、該1個または複数個のアミノ酸置換が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）に示されるようにCD3および／またはCD137に対して少なくとも0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、または2倍の結合親和性の増加を示す、 [４][ｃ１]〜[ｃ１５]の抗原結合分子。
[４Ｂ]前記抗体可変領域が、
（ａ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸26位のA、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27位のD、F、G、I、M、もしくはL；
アミノ酸28位のD、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸29位のFもしくはW；
アミノ酸30位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のF、I、N、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のA、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸33位のW；
アミノ酸34位のF、I、L、M、もしくはV；
アミノ酸35位のF、H、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸50位のE、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸51位のI、K、もしくはV；
アミノ酸52位のK、M、R、もしくはT；
アミノ酸52b位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸52c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のE、F、G、H、L、M、N、Q、W、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸57位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸58位のA、F、H、K、N、P、R、もしくはY；
アミノ酸59位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸60位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸61位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸62位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸63位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸64位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸65位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸93位のHもしくはR；
アミノ酸94位のF、G、H、L、M、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸95位のIもしくはV；
アミノ酸96位のF、H、I、K、L、M、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸97位のF、Y、もしくはW；
アミノ酸98位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸99位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100b位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100d位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100f位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100g位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100h位のA、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸100i位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸101位のA、D、F、I、L、M、N、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸102位のA、D、E、F、G、H、I K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
ならびに／または
（ｂ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸24位のA、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸25位のA、G、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸26位のA、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸27位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27b位のA、I、L、M、P、T、もしくはV；
アミノ酸27c位のA、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27d位のA、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸28位のG、N、S、もしくはT；
アミノ酸29位のA、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸30位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のI、L、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のF、W、もしくはY；
アミノ酸33位のA、F、H、L、M、Q、もしくはV；
アミノ酸34位のA、H、もしくはS；
アミノ酸50位のI、K、L、M、もしくはR；
アミノ酸51位のA、E、I、K、L、M、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸52位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸89位のA、G、K、S、もしくはY；
アミノ酸90位のQ；
アミノ酸91位のG；
アミノ酸92位のA、D、H、K、N、Q、R、S、もしくはT；
アミノ酸93位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸94位のA、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸95位のP；
アミノ酸96位のFもしくはY；および
アミノ酸97位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV
を含む、[４Ａ]の抗原結合分子。
[５］  以下の（１）〜（３）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する、［１］〜［４Ｂ］のいずれかの抗原結合分子：
（１）抗原結合分子が、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない；
（２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する；ならびに
（３）抗原結合分子が、配列番号：１のVH配列および配列番号：５７のVL配列を含む参照抗体と比較して、同等のまたは10倍、20倍、50倍、100倍低い、ヒトCD137に対する結合についてのKD値を有し、ここで、該KD値は、好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定される。
[６]CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合することができる抗体可変領域をさらに含む、[１]〜[５]のいずれか1つの抗原結合分子。
[７]第３の抗原が、がん組織において特異的に発現している分子である、[６]の抗原結合分子。
[７Ａ]第３の抗原が、グリピカン-3（GPC3）である、[６]〜[７]のいずれか1つの抗原結合分子。
[７Ｂ]グリピカン-3（GPC3）に結合することができる抗体可変領域が、配列番号：２０６のアミノ酸配列を有するVH配列および配列番号：２０７のアミノ酸配列を有するVL配列を含む、[７Ａ]の抗原結合分子。
[７Ｃ]以下の（１）〜（５）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する、[６]〜[７Ｂ]のいずれか1つの抗原結合分子：
（１）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化は誘導しない；
（２）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性は誘導しない；
（３）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカインの放出を誘導しない；
（４）抗原結合分子が、配列番号：１のVH配列および配列番号：５７のVL配列を含む参照抗体と比較して、同等のまたは2倍、5倍、10倍、20倍、もしくは100倍高い、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD137活性化および／または細胞傷害活性を誘導する；ならびに／または
（５）抗原結合分子が、第３の抗原およびCD3を標的とする参照二重特異性抗体と比較して、2倍、5倍、10倍、20倍、もしくは100倍高い、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導し、一方、PBMCからのサイトカイン（IL-6）放出は誘導しない。
[８]抗体Fc領域をさらに含む、[１]〜[７Ｃ]のいずれか1つの抗原結合分子。
[９]前記Fc領域が、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較してFcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、[８]の抗原結合分子。
[１０][１]〜[９]のいずれかに記載の抗原結合分子と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
[１０Ａ]がんの処置における使用のための、[１０]の医薬組成物または[１]〜[９]の抗原結合分子。
[１０Ｂ]がんの処置における使用に向けた薬の製造のための、[１０]の医薬組成物または[１]〜[９]の抗原結合分子の使用。
[１０Ｃ][１０]の医薬組成物または[５]〜[９]の抗原結合分子を、がんに罹患している哺乳動物対象に投与する工程を含む、がんを予防する、処置する、または抑制するための方法。
[１０Ｄ][１０]の医薬組成物または[５]〜[９]の抗原結合分子を、がんに罹患している哺乳動物対象に投与する工程を含む、対象において細胞傷害活性、好ましくはT細胞依存性細胞傷害活性を誘導するための方法。
[１０Ｅ][１０]の医薬組成物または[５]〜[９]の抗原結合分子を、がんに罹患している哺乳動物対象に投与する工程を含む、対象のがん細胞を低減させるかまたは死滅させるための方法。
[１０Ｆ][１０]の医薬組成物または[５]〜[９]の抗原結合分子を、がんに罹患している哺乳動物対象に投与する工程を含む、がん患者の寿命または生存率を延ばすための方法。
[１０Ｇ]前記がんが、第３の抗原、好ましくはグリピカン-3（GPC3）の発現または上方制御された発現を特徴とする、[１０Ａ]〜[１０Ｆ]のいずれかに記載の使用のための医薬組成物もしくは抗原結合分子、使用、または方法。
[１１][１]〜[９]のいずれかの抗原結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[１２][１１]に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[１３][１１]に記載のポリヌクレオチドまたは[１２]に記載の発現ベクターで形質転換されたかまたはそれをトランスフェクトされた、宿主細胞。
[１４][１３]の宿主細胞を培養する工程を含む、多重特異性抗原結合分子または多重特異性抗体を作製する方法。
[１５][１４]の方法によって作製された、多重特異性抗原結合分子または多重特異性抗体。
[１６]以下の工程を含む、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域を取得するかまたはスクリーニングする方法：
（ａ）複数の抗体可変領域を含むライブラリーを提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）において提供されたライブラリーを、第１の抗原としてのCD3またはCD137のいずれかと接触させ、第１の抗原に結合した抗体可変領域を収集する工程、
（ｃ）工程（ｂ）において収集された抗体可変領域を、CD3およびCD137のうちの第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗体可変領域を収集する工程、ならびに
（ｄ）以下の抗体可変領域：
（１）好ましくはSPRによって以下の条件：
37℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、約5×10-6 M未満もしくは5×10-6 M〜3×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD137に結合する、抗体可変領域；および／または
（２）好ましくはSPRによって以下の条件：
25℃、pH 7.4、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3；抗原結合分子がCM4センサーチップ上に固定化され、抗原がアナライトとなる
で測定した場合に、2×10-6 M〜1×10-8 Mの平衡解離定数（KD）でCD3に結合する、抗体可変領域
を選択する工程。
[１６Ａ]工程（ｃ）から（ｄ）までに、工程（ｃ）において収集された抗体可変領域に対して1個または複数個のアミノ酸改変を導入する工程をさらに含む、[１６]の方法。
[１７]工程（ａ）または工程（ｃ）から（ｄ）までにおける抗体可変領域が、1〜25アミノ酸の改変を有する抗体可変領域であり、改変されるアミノ酸が、ループ中のアミノ酸、FR3領域中のアミノ酸、または、抗体H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択されるアミノ酸である、[１６]または[１６Ａ]のいずれかの方法。
[１８]重鎖可変ドメイン（VH）および／または軽鎖可変ドメイン（VL）が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）から選択される1個または複数個のアミノ酸置換を含み、該1個または複数個のアミノ酸置換が、表１．３（ａ）〜表１．３（ｄ）に示されるようにCD3および／またはCD137に対して少なくとも0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、または2倍の結合親和性の増加を示す、 [１７]の方法。いくつかの態様において、抗体可変領域は、
（ａ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸26位のA、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27位のD、F、G、I、M、もしくはL；
アミノ酸28位のD、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸29位のFもしくはW；
アミノ酸30位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のF、I、N、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のA、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸33位のW；
アミノ酸34位のF、I、L、M、もしくはV；
アミノ酸35位のF、H、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸50位のE、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸51位のI、K、もしくはV；
アミノ酸52位のK、M、R、もしくはT；
アミノ酸52b位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸52c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のE、F、G、H、L、M、N、Q、W、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸57位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸58位のA、F、H、K、N、P、R、もしくはY；
アミノ酸59位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸60位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸61位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸62位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸63位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸64位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸65位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸93位のHもしくはR；
アミノ酸94位のF、G、H、L、M、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸95位のIもしくはV；
アミノ酸96位のF、H、I、K、L、M、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸97位のF、Y、もしくはW；
アミノ酸98位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸99位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100b位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100d位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100f位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100g位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100h位のA、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸100i位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸101位のA、D、F、I、L、M、N、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸102位のA、D、E、F、G、H、I K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
ならびに／または
（ｂ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸24位のA、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸25位のA、G、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸26位のA、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸27位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27b位のA、I、L、M、P、T、もしくはV；
アミノ酸27c位のA、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27d位のA、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸28位のG、N、S、もしくはT；
アミノ酸29位のA、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸30位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のI、L、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のF、W、もしくはY；
アミノ酸33位のA、F、H、L、M、Q、もしくはV；
アミノ酸34位のA、H、もしくはS；
アミノ酸50位のI、K、L、M、もしくはR；
アミノ酸51位のA、E、I、K、L、M、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸52位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸89位のA、G、K、S、もしくはY；
アミノ酸90位のQ；
アミノ酸91位のG；
アミノ酸92位のA、D、H、K、N、Q、R、S、もしくはT；
アミノ酸93位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸94位のA、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸95位のP；
アミノ酸96位のFもしくはY；および
アミノ酸97位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV
を含むことが好ましい。
別の局面において、本発明は、ヒトCD137のLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC（配列番号：１５２）、好ましくはLQDPCSN、NNRNQI、および／またはGQRTCDIのアミノ酸配列を含む、CD137のN末端領域の少なくとも1個、2個、3個、またはそれよりも多いアミノ酸残基に結合する抗原結合分子、例えば抗体に関する。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD3に対するそのアゴニスト活性によってT細胞を活性化することができ、かつ、CD137およびCD3に対するその共刺激アゴニスト活性によって、標的細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導し、T細胞の活性化、生存、およびメモリーT細胞への分化を強化することができる。一方、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないため、CD137とCD3との架橋によって引き起こされる有害事象を回避することができる。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子はまた、CD137に対するアゴニスト活性によって、CD137を発現する免疫細胞を活性化し、標的細胞への免疫応答を強化することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１．１】親和性成熟GPC3/Dual-Igバリアント三重特異性抗体のCD3アゴニスト活性の測定。プレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた選択された抗体による、E:T比 5で24時間、NFAT-luc2 Jurkatレポーター細胞と共培養したSK-pca60細胞株によって検出された、平均発光単位+/-標準偏差（s.d.）。抗体を、0.02、0.2、および2 nMで添加した。
【図１．２】親和性成熟GPC3/Dual-Igバリアント三重特異性抗体のCD137アゴニスト活性の測定。プレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた選択された抗体による、E:T比 5で5時間、CD137を過剰発現するJurkat NFκBレポーター細胞と共培養したSK-pca60細胞株によって検出された、平均発光単位+/-標準偏差（s.d.）。抗体を、0.5、2.5、および5 nMで添加した。
【図１．３ａ】選択されたGPC3/Dual-Ig三重特異性分子（プレート1）の存在下でのPBMCとの共培養による、GPC3を発現するSK-pca60細胞株に対する細胞傷害活性。およそ120時間で得られた平均細胞増殖抑制（％）値+/- s.d.をプロットした。
【図１．３ｂ】選択されたGPC3/Dual-Ig三重特異性分子（プレート2）の存在下でのPBMCとの共培養による、GPC3を発現するSK-pca60細胞株に対する細胞傷害活性。およそ120時間で得られた平均細胞増殖抑制（％）値+/- s.d.をプロットした。
【図１．３ｃ】選択されたGPC3/Dual-Ig三重特異性分子の存在下での、GPC3を発現するSK-pca60細胞株とPBMCとの共培養において測定された、サイトカイン（IFNγ）放出。共培養の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、IFNγの平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図１．３ｄ】選択されたGPC3/Dual-Ig三重特異性分子の存在下での、GPC3を発現するSK-pca60細胞株とPBMCとの共培養において測定された、サイトカイン（IL-2）放出。共培養の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、IL-2の平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図１．３ｅ】選択されたGPC3/Dual-Ig三重特異性分子の存在下での、GPC3を発現するSK-pca60細胞株とPBMCとの共培養において測定された、サイトカイン（IL-6）放出。共培養の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、IL-6の平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図２．１】三重特異性抗体（mAb AB）の設計および構築。
【図２．２】調製された三重特異性抗体の命名規則。
【図２．３ａ】GPC3陰性細胞に対する抗原非依存性のJurkat活性化。親CHO細胞を、E:T 5で24時間、NFAT-luc2 Jurkatレポーター細胞と共培養した。0.5、5、および50 nMでインキュベートされた様々な抗体形式の平均発光単位+/-標準偏差（s.d.）を図示するグラフ。
【図２．３ｂ】GPC3陰性細胞に対する抗原非依存性のJurkat活性化。CD137を過剰発現するCHO細胞を、E:T 5で24時間、NFAT-luc2 Jurkatレポーター細胞と共培養した。0.5、5、および50 nMでインキュベートされた様々な抗体形式の平均発光単位+/-標準偏差（s.d.）を図示するグラフ。
【図２．４ａ】PBMC溶液における抗原非依存性のサイトカイン（IFNγ）放出。PBMC溶液に3.2、16、および80 nMで添加した、親和性成熟GPC3/Dual-IgバリアントまたはGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、IFNγの平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図２．４ｂ】PBMC溶液における抗原非依存性のサイトカイン（TNFα）放出。PBMC溶液に3.2、16、および80 nMで添加した、親和性成熟GPC3/Dual-IgバリアントまたはGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、TNFαの平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図２．４ｃ】PBMC溶液における抗原非依存性のサイトカイン（IL-6）放出。PBMC溶液に3.2、16、および80 nMで添加した、親和性成熟GPC3/Dual-IgバリアントまたはGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体の上清を、48時間の時点で解析した。グラフは、IL-6の平均濃度+/- s.d.を示す。抗体を、評価のためにプレート1（上のパネル）およびプレート2（下のパネル）に分けた。
【図３．１ａ】ヒト化CD3/CD137マウスモデルにおけるLLC1/hGPC3異種移植片に対する抗体のインビボ有効性。Y軸は、腫瘍体積（mm3）を意味し、X軸は、腫瘍移植後の日数を意味する。
【図３．１ｂ】ヒト化CD3/CD137マウスモデルにおけるLLC1/hGPC3異種移植片に対する抗体のインビボ有効性。Y軸は、腫瘍体積（mm3）を意味し、X軸は、腫瘍移植後の日数を意味する。
【図３．１ｃ】血漿IL-6濃度。抗体注射の2時間後にマウスから採血し、Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Th1 Panelを用いて血漿IL-6濃度を測定した。
【図３．２】huNOGマウスモデルにおけるsk-pca-13a異種移植片に対する抗体のインビボ有効性。Y軸は、腫瘍体積（mm3）を意味し、X軸は、腫瘍移植後の日数を意味する。
【図３．３ａ】CD137上のH0868L0581 Fab接触領域のエピトープ。CD137アミノ酸配列におけるエピトープマッピング（黒色：H0868L0581から3.0オングストロームよりも近い、縞：4.5オングストロームよりも近い）。
【図３．３ｂ】CD137上のH0868L0581 Fab接触領域のエピトープ。結晶構造におけるエピトープマッピング（暗灰色の球：H0868L0581から3.0オングストロームよりも近い、薄灰色の棒：4.5オングストロームよりも近い）。
【図４】ジスルフィド結合リンカーによりビオチン標識されているC3NP1-27、CD3εペプチド抗原の設計を示す。
【図５】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は各クローンのCD3に対する特異性を意味する。
【図６】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのビーズELISAでのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、図5と同じプレートELISAでのCD3に対する特異性を意味する。
【図７】ヒトCD137アミノ酸配列とカニクイザルCD137アミノ酸配列との比較データを示す。
【図８】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのカニクイザルCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137に対する特異性を意味する。
【図９】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD3eに対する特異性を意味する。
【図１０】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3またはヒトFcを競合物として用いた。
【図１１Ａ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はヒトCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１１Ｂ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はカニクイザルCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１１Ｃ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD3に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１２．１】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、カニクイザルCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１２．２】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、カニクイザルCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１２．３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、カニクイザルCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、カニクイザルCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１４】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１５】各クローンのエピトープドメインを同定するための、CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ヒトCD137の各ドメインに対するELISAの反応を意味する。
【図１６】CD3およびCD137に対するファージディスプレイ親和性成熟で取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、カニクイザルCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１７．１】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．２】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．４】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．５】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１８Ａ】抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化B細胞からのIL-6分泌のメカニズムを図式的に示す図である。
【図１８Ｂ】活性化B細胞から分泌されるIL-6の産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD137媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフである。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。
【図１９Ａ】抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化Jurkat T細胞におけるルシフェラーゼ発現のメカニズムを図式的に示す図である。
【図１９Ｂ】活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示す一連のグラフである。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。
【図２０】各固定化抗体の存在下でヒトPBMC由来T細胞からのサイトカイン（IL-2、IFN-γ、およびTNF-α）放出を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、分泌された各サイトカインの濃度を意味し、X軸は、固定化された抗体の濃度を意味する。対照抗CD137抗体（B）、対照抗CD3抗体（CE115）、陰性対照抗体（Ctrl）、およびdual抗体のうちの1つ（H183L072）を、アッセイのために用いた。
【図２１】各二重特異性抗体によるGPC3陽性標的細胞（SK-pca60およびSK-pca13a）に対するT細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、細胞増殖抑制（CGI）の比率を意味し、X軸は、各二重特異性抗体の濃度を意味する。抗GPC3/Dual二重特異性抗体（GC33/H183L072）、陰性対照/Dual二重特異性抗体（Ctrl/H183L072）、抗GPC3/抗CD137二重特異性抗体（GC33/B）、および陰性対照/抗CD137二重特異性抗体（Ctrl/B）を、このアッセイのために用いた。5倍量のエフェクター（E）細胞を、腫瘍（T）細胞に加えた（ET5）。
【図２２】CD3eに対するCE115の細胞ELISAの結果を示すグラフである。
【図２３】EGFR_ERY22_CE115の分子形態を示す図である。
【図２４】EGFR_ERY22_CE115のTDCC（SK-pca13a）の結果を示すグラフである。
【図２５】結合量の比が0.8未満の抗体の例示的なセンサーグラムである。
【図２６】GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/dual-Fab抗体の同時結合のBiacore解析の結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各抗原に対する結合レスポンスを意味する。最初に、ヒトCD3（hCD3）をアナライトとして用い、次いで、hCD3（破線として示す）またはヒトCD137（hCD137）とhCD3との混合物（実線として示す）もアナライトとして用いた。
【図２７】各抗体のCD137陽性CHO細胞またはJurkat細胞に対するFACS解析の結果を示す一連のセンサーグラムである。図２７（ａ）および（ｃ）は、ヒトCD137陽性CHO細胞に対する結合の結果であり、図２７（ｂ）および（ｄ）は、親CHO細胞に対する結果である。図２７（ａ）および（ｂ）において、実線は、抗GPC3/dual抗体（GC33/H183L072、すなわちGPC33/H183L072）の結果を示し、塗りつぶしは、対照抗体（Ctrl）の結果を示す。図２７（ｃ）および（ｄ）において、実線、暗灰色での塗りつぶし、および薄灰色での塗りつぶしは、それぞれ、GPC3/CD137xCtrl三重特異性抗体、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体、およびCtrl/CtrlxCD3三重特異性抗体の結果を示す。図２７（ｅ）および（ｆ）は、Jurkat CD3陽性細胞に対する結合の結果である。図２７（ｅ）において、実線および塗りつぶしは、それぞれ、抗GPC3/dual抗体（GC33/H183L072、すなわちGPC33/H183L072）および対照抗体（Ctrl）の結果を示す。図２７（ｆ）において、実線、暗灰色での塗りつぶし、および薄灰色での塗りつぶしは、それぞれ、GPC3/CtrlxCD3三重特異性抗体、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体、およびCtrl/CD137xCtrl三重特異性抗体の結果を示す。
【図２８】活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、GPC3陽性標的細胞SK-pca60に対する様々な抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを提示する。6種類の三重特異性抗体、抗GPC3/Dual-Fab抗体（GPC3/H183L072）、および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。X軸は、各抗体の用いた濃度を意味する。
【図２９】活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、ヒトCD137陽性CHO細胞および親CHO細胞に対する様々な抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフを提示する。6種類の三重特異性抗体、抗GPC3/Dual-Fab抗体（GPC3/H183L072）、および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。X軸は、各抗体の用いた濃度を意味する。
【図３０】各可溶性抗体の存在下でヒトPBMCからのサイトカイン（IL-2、IFN-γ、およびTNF-α）放出を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、分泌された各サイトカインの濃度を意味し、X軸は、用いた抗体の濃度を意味する。Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体および対照/Dual-Fab抗体（Ctrl/H183L072）を、このアッセイのために用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
態様の説明
本発明において、「抗体可変領域」とは、通常、4つのフレームワーク領域（FR）およびそれが隣接する3つの相補性決定領域（CDR）によって構成されるドメインを含む領域を意味し、またその部分配列も、その部分配列が抗原の一部または全部に結合する活性を有する限り含む。特に、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体重鎖可変ドメイン（VH）を含む領域が好ましい。本発明の抗体可変領域は、任意の配列を有してもよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、およびこれらの非ヒト抗体のいずれかのヒト化によって得られたヒト化抗体、およびヒト抗体などの、任意の抗体に由来する可変領域であってもよい。「ヒト化抗体」は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも呼ばれ、非ヒト哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のCDRへ移植することによって取得される。CDRを同定するための方法は、当技術分野において公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；およびChothia et al., Nature (1989) 342: 877）。そのための一般的な遺伝子組換え手法もまた、当技術分野において公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023およびWO 96/02576参照）。
【００２２】
「CD3とCD137（4-1BB）に同時には結合しない」本発明の「抗体可変領域」とは、本発明の抗体可変領域が、CD3と結合している状態ではCD137に結合できず、逆に、可変領域が、CD137と結合している状態ではCD3に結合できないことを意味する。ここで、「CD3とCD137に同時には結合しない」という句には、CD3を発現する細胞とCD137を発現する細胞とを架橋しないこと、または、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しないことも含まれる。この句にはさらに、CD3およびCD137が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137には同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗体可変領域は、これらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型の抗体可変領域に由来する可変領域が含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
ここで、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよいし、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
【００２３】
アミノ酸改変は、単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が、組み合わせて用いられてもよい。
複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わせる改変の数は、特に限定されず、発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができる。組み合わせる改変の数は、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
組み合わせる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。
【００２４】
可変領域中の1個または複数個のアミノ酸残基が、抗原結合活性が維持される限り、改変されるアミノ酸残基として許容される。可変領域中のアミノ酸を改変する場合、結果として生じた可変領域は、対応する未改変の抗体の結合活性を好ましくは維持し、好ましくは、例えば、改変前よりも50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは100％以上高い結合活性を有するが、本発明による可変領域はそれらに限定されない。結合活性は、アミノ酸改変によって上昇していてもよく、例えば、改変前の結合活性の2倍、5倍、または10倍であってもよい。
【００２５】
アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。また、アミノ酸改変時に、抗原結合活性を上昇させるアミノ酸がさらに導入されてもよい。
【００２６】
本明細書において用いられる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列（「相補性決定領域」もしくは「CDR」）が超可変であり、かつ/または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原に接触する残基（「抗原接触部」）を含有する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。概して、抗体は、6つのHVR：VHにおける3つ（H1、H2、H3）およびVLにおける3つ（L1、L2、L3）を含む。本明細書における例示的なHVRは、以下を含む：
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ。
特に示されない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、上記のKabat et al.に従って、本明細書においてナンバリングされる。
【００２７】
本発明において、「ループ」とは、免疫グロブリンのβバレル構造の維持に関与しない残基を含有する領域を意味する。
本発明において、アミノ酸改変とは、置換、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせを意味する。本発明において、アミノ酸改変は、アミノ酸変異と互換的に用いられ、それと同じ意味で用いられ得る。
【００２８】
アミノ酸残基の置換は、例えば、以下の（a）〜（c）のいずれかを改変する目的で、別のアミノ酸残基での置き換えによって実施される：（a）シート構造またはらせん構造を有する領域のポリペプチドバックボーン構造；（b）標的部位の電荷もしくは疎水性；および（c）側鎖のサイズ。
アミノ酸残基は、一般的な側鎖の性質に基づいて以下のグループに分類される：（1）疎水性残基：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、およびIle；（2）中性親水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、およびGln；（3）酸性残基：AspおよびGlu；（4）塩基性残基：His、Lys、およびArg；（5）鎖の配向に影響する残基：GlyおよびPro；ならびに（6）芳香族残基：Trp、Tyr、およびPhe。
【００２９】
これらのグループの各々内でのアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれ、一方、これらのグループのうちの1つにおけるアミノ酸残基の別のグループにおけるアミノ酸残基による置換は、非保存的置換と呼ばれる。
本発明による置換は、保存的置換であってもよく、または非保存的置換であってもよい。あるいは、保存的置換と非保存的置換とが組み合わされてもよい。
【００３０】
アミノ酸残基の改変にはまた、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域において、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸のランダム改変によって得られたものからの、CD3およびCD137に結合することができるがこれらの抗原に同時には結合することができない可変領域の選択；ならびに、所望の抗原に対して結合活性を有することが以前に知られているペプチドを上述の領域に挿入する改変も含まれる。
【００３１】
本発明の抗体可変領域において、上述の改変は、当技術分野において公知の改変と組み合わされてもよい。例えば、可変領域のN末端グルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は、当業者によく知られている修飾である。したがって、その重鎖のN末端にグルタミンを有する本発明の抗体は、このN末端グルタミンがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含有してもよい。
【００３２】
そのような抗体可変領域は、例えば、抗原結合、薬物動態、安定性、または抗原性を改善するためのアミノ酸改変をさらに有してもよい。本発明の抗体可変領域は、抗原に対してpH依存的な結合活性を有し、それによって抗原に繰り返し結合することができるように、改変されてもよい（WO2009/125825）。
【００３３】
また、例えば、第３の抗原に結合するそのような抗体可変領域に対して、標的組織特異的な化合物の濃度に従って抗原結合活性を変化させるアミノ酸改変が加えられてもよい（WO2013/180200）。
【００３４】
可変領域は、例えば、結合活性の増強、特異性の改善、pIの低下、pH依存的な抗原結合特性の付与、結合の熱安定性の改善、溶解性の改善、化学修飾に対する安定性の改善、糖鎖に由来する不均一性の改善、免疫原性の低下のためのインシリコ予測もしくはインビトロT細胞ベースアッセイの使用によって同定されたT細胞エピトープの回避、または制御性T細胞を活性化するためのT細胞エピトープの導入を目的として、さらに改変されてもよい（mAbs 3:243-247, 2011）。
【００３５】
本発明の抗体可変領域が「CD3およびCD137に結合することができる」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。
これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
具体的には、例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子の、CD3およびCD137に結合することができる領域、例えば、Fab領域から構成される低分子抗体、またはその一価抗体（通常の抗体が有する2つのFab領域のうち1つが欠けている抗体）を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3またはCD137と混合し、混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加する。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それによって、CD3またはCD137に対する被験抗原結合分子の上述の領域の結合を確認することができる。
あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
【００３６】
具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本発明の抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上にCD3またはCD137をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、CD3またはCD137の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。
【００３７】
あるいは、CD3またはCD137を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化して、次に、評価したい抗体サンプルを相互作用させてもよい。本発明の抗原結合分子の抗体可変領域がCD3またはCD137に対する結合活性を有するかどうかを、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルを上回る、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて、確認することができる。
【００３８】
いくつかの態様において、目的の抗原（すなわち、CD3またはCD137）に対する本発明の抗体可変領域の結合活性または親和性を、例えば、Biacore T200機器（GE Healthcare）またはBiacore 8K機器（GE Healthcare）を用いて、37℃（CD137について）または25℃（CD3について）で評価する。抗ヒトFc（例えば、GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（例えば、GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗原結合分子または抗体可変領域を、抗Fcセンサー表面上に捕捉し、次いで、抗原（CD3またはCD137）をフローセル上にインジェクトする。抗原結合分子または抗体可変領域の捕捉レベルは、200レゾナンスユニット（RU）を目指してもよい。組換えヒトCD3またはCD137を、2倍連続希釈によって調製した400〜25 nMでインジェクトし、その後解離させてもよい。すべての抗原結合分子または抗体可変領域およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製する。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生させる。結合親和性は、例えば、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）またはBiacore 8K Evaluation software（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定する。本発明の抗原結合ドメインの特異的結合活性または親和性を評価するために、KD値を算出する。
【００３９】
ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
【００４０】
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
【００４１】
本発明の抗原結合分子が「CD3とCD137に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子がCD3およびCD137の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、CD3またはCD137のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化されたCD3またはCD137のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子のCD3またはCD137のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。
【００４２】
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
【００４３】
1つの局面において、1つの抗原（例えば、CD3）を固定化している間に、CD3に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、CD137）の存在下で決定することができる。別の局面において、CD137を固定化している間に、CD137に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、CD3の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本発明の抗原結合分子は、CD3とCD137に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
1つの態様において、抗原結合分子のCD137（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子のCD3（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）を算出し、CD137（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(CD3)/ KD(CD137)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、CD3（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
【００４４】
具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識されたCD3、および標識されていないCD137を準備する。被験抗原結合分子が、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識されたCD3との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていないCD137の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていないCD137の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識されたCD137および標識されていないCD3を用いて、同様に実施され得る。
【００４５】
ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合するCD137の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていないCD137は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされたCD137およびタグ付けされていないCD3を用いて、同様に解析され得る。
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、CD3とCD137に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有するCD3および蛍光アクセプターを有するCD137が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、CD3とCD137に同時に結合するものと確認される。他方で、CD3、CD137、および被験抗原結合分子の混合が、CD3と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。
【００４６】
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたCD3を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第２の抗原の非存在下でCD3と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第２の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用についてCD3と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、CD3をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、CD3をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
【００４７】
タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。
【００４８】
また、CD3およびCD137が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、CD3とCD137に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
具体的には、CD3およびCD137に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現しているCD3およびCD137に同時には結合できないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。CD3を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、CD137を発現する細胞をプレートに添加する。CD137を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。
あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合したCD3を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合したCD137を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。
あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ぺプチドタグを付加したCD3を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。CD137を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子およびCD137を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。
【００４９】
結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、CD137を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、CD137またはCD3のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。
【００５０】
1つの態様において、細胞性細胞傷害活性は、T細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）である。別の態様において、細胞傷害活性は、その表面上にCD3またはCD137を発現する細胞に対する細胞性細胞傷害活性である。本発明の抗体（または抗原結合分子）の（細胞性）細胞傷害活性またはTDCCは、当技術分野において公知の任意の適している方法によって評価することができる。例えば、TDCCは、実施例２．３．２に記載されるようなリアルタイム細胞増殖抑制アッセイによって測定することができる。このアッセイにおいては、標的細胞を、96ウェルプレート上で試験抗体の存在下でT細胞（例えば、PBMC）または増大させたT細胞とインキュベートし、標的細胞の増殖を、当技術分野において公知の方法によって、例えば、適している解析機器（例えば、xCELLigence Real-Time Cell Analyzer）を用いることによってモニタリングする。細胞増殖抑制率（CGI：％）は、CGI（％）＝100−（CIAb×100／CINoAb）として与えられる式に従って、セルインデックス値から決定される。「CIAb」は、特定の実験時間での抗体を含むウェルのセルインデックス値を表し、「CINoAb」は、抗体を含まないウェルの平均セルインデックス値を表す。抗体のCGI率が高い、すなわち、有意に陽性の値を有するならば、抗体がTDCC活性を有するということができる。
【００５１】
好ましい局面において、T細胞活性化は、その活性化に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する操作されたT細胞株（例えば、Jurkat / NFAT-RE Reporter Cell Line（T Cell Activation Bioassay, Promega））を用いる方法などの、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。この方法においては、標的細胞（例えば、CD3を発現する細胞およびCD137を発現する細胞）を、試験抗体の存在下でT細胞と培養し、次いで、レポーター遺伝子の発現産物のレベルまたは活性を、適切な方法によってT細胞活性化の指標として測定する。レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、ルシフェラーゼとその基質との間の反応から生じる発光を、T細胞活性化の指標として測定してもよい。上記のように測定されたT細胞活性化がより高いならば、試験抗体は、より高いT細胞活性化活性を有すると判定される。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、第３の抗原の分子を発現する細胞に対する同じ抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。
【００５２】
1つの態様において、抗原結合分子がサイトカインの放出を誘導しないかどうかは、例えば、PBMCと抗原結合分子とをインキュベートすること、ならびに、当技術分野において公知の方法を用いて、PBMCから培養上清中に放出されたIL-2、IFNγ、およびTNFαなどのサイトカインを測定することによって判定することができる。抗原結合分子とインキュベートしたPBMCの培養上清において、有意なレベルのサイトカインが検出されないか、または有意なサイトカイン発現の誘導が起こらないならば、抗原結合分子は、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しないと判定される。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるサイトカイン濃度のレベルを指し、ここで100％とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるサイトカイン濃度のレベルを指し、ここで100％とは、第３の抗原の分子を発現する細胞の存在下で達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なサイトカイン発現の誘導が起こらない」とはまた、抗原結合分子を添加する前の各サイトカインの濃度の最大でも5倍、2倍、または1倍である、サイトカイン濃度増加のレベルを指す。
【００５３】
本発明において、「Fc領域」とは、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも言う））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味するが、それに限定されない。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
【００５４】
いくつかの態様において、「抗原結合分子」は、本発明の「抗体可変領域」を含む限り、特に限定されない。抗原結合分子は、およそ5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質をさらに含んでもよい。ペプチドまたはタンパク質は、生物に由来するペプチドまたはタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドなどが用いられてもよい。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明の「抗原結合分子」は、「抗体可変領域」を含む分子に特に限定されるわけではない。ある特定の態様において、可変領域を含む抗体以外であり、2つの異なる抗原に結合することができる抗原結合分子、例えば、アフィボディなどが、当業者に一般的に知られている方法によって取得されてもよい（PLoS One. 2011;6(10):e25791；PLoS One. 2012;7(8):e42288；J Mol Biol. 2011 Aug 5;411(1):201-19；Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Aug 23;108(34):14067-72）。
【００５６】
本発明の抗原結合分子の好ましい例には、抗体Fc領域を含む抗原結合分子が含まれ得る。
【００５７】
本発明において、例えば、天然型IgGに由来するFc領域を、本発明の「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本発明において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356〜358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。
【００５８】
抗体Fc領域は、例えば、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMタイプのFc領域として見出される。例えば、天然型ヒトIgG抗体に由来するFc領域を、本発明の抗体Fc領域として用いることができる。例えば、天然型IgGの定常領域、具体的には、天然型ヒトIgG1を起源とする定常領域（配列番号：２０８）、天然型ヒトIgG2を起源とする定常領域（配列番号：２０９）、天然型ヒトIgG3を起源とする定常領域（配列番号：２１０）、または天然型ヒトIgG4を起源とする定常領域（配列番号：２１１）に由来するFc領域を、本発明のFc領域として用いることができる。天然型IgGの定常領域にはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。
【００５９】
本発明のFc領域は、特に好ましくは、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である。ここで、Fcγ受容体（本明細書においてFcγRとも言う）とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域に結合することができる受容体を指し、Fcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）；ならびに、任意の未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプも含まれるが、それらに限定されない。FcγRには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。FcγRは、これらの分子に限定されず、任意の生物に由来してもよい。マウスFcγRには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、およびFcγRIII-2（CD16-2）、ならびに任意の未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。そのようなFcγ受容体の好ましい例には、ヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）、および／またはFcγRIIIb（CD16）が含まれる。
【００６０】
FcγRは、ITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）を有する活性型受容体およびITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）を有する抑制型受容体の形態で見出される。FcγRは、活性型FcγR（FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、およびFcγRIIIb）と抑制型FcγR（FcγRIIb）とに分類される。
FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3およびNP_000557.1に記載されている；FcγRIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1およびAAH20823.1に記載されている；FcγRIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1およびAAI46679.1に記載されている；FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1およびAAH33678.1に記載されている；ならびにFcγRIIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1およびAAI28563.1に記載されている（RefSeq登録番号）。FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン（H型）またはアルギニン（R型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990）。FcγRIIbには、FcγRIIbの232番目のアミノ酸がイソロイシン（I型）またはスレオニン（T型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)）。FcγRIIIaには、FcγRIIIaの158番目のアミノ酸がバリン（V型）またはフェニルアラニン（F型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)）。FcγRIIIbには、2種類の遺伝子多型（NA1型およびNA2型）が存在する（J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)）。
【００６１】
Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることは、FACS、ELISA形式、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、または表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などの、周知の方法によって確認することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAScreen法は、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
【００６２】
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたFcγ受容体を、アクセプタービーズに結合させる。競合する変異Fc領域を有する抗原結合分子の非存在下では、野生型Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない変異Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体との相互作用について、野生型Fc領域を有する抗原結合分子と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合親和性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いた抗原結合分子（例えば、抗体）のビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、Fcγ受容体をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
【００６３】
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
【００６４】
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているとは、被験抗原結合分子が、上記の解析方法に基づいて、Fc領域を含む対照抗原結合分子の結合活性と比較して、例えば、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合活性を示すことを意味する。
IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFc領域を有する抗原結合分子を、対照抗原結合分子として適宜用いることができる。Fc領域の構造は、配列番号：２１２（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、配列番号：２１３（RefSeq登録番号AAB59393.1のN末にA付加）、配列番号：２１４（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末にA付加）、または配列番号：２１５（RefSeq登録番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載されている。ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域のバリアントを有する抗原結合分子を試験物質として用いる場合には、このある特定のアイソタイプの抗体のFc領域を有する抗原結合分子を対照として用いて、バリアントにおける変異の、Fcγ受容体に対する結合活性への効果を試験する。Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることがこのように確認されたFc領域バリアントを有する抗原結合分子が、適宜調製される。
【００６５】
例えば、231A〜238S欠失（WO 2009/011941）、C226S、C229S、P238S、(C220S)（J.Rheumatol (2007) 34, 11）、C226S、C229S（Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）、C226S、C229S、E233P、L234V、またはL235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）（これらのアミノ酸はEUナンバリングに従って定義される）バリアントが、そのようなバリアントとして当技術分野において公知である。
その好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位のアミノ酸のいずれかの置換による、ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。Fc領域の起源である抗体のアイソタイプは、特に限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を起源とするFc領域が、適宜用いられ得る。天然型ヒトIgG1抗体を起源とするFc領域が、好適に用いられる。
例えば、EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（a）L234F、L235E、およびP331S、
（b）C226S、C229S、およびP238S、
（c）C226SおよびC229S、ならびに
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A
のいずれかによる、または231〜238位のアミノ酸配列の欠失による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【００６６】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S、
（f）V234A、
（g）G237A、
（h）V234AおよびG237A、
（i）A235EおよびG237A、ならびに
（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれかによる、IgG2抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【００６７】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（k）F241A、
（l）D265A、および
（m）V264A
のいずれかによる、IgG3抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【００６８】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（n）L235A、G237A、およびE318A、
（o）L235E、ならびに
（p）F234AおよびL235A
のいずれかによる、IgG4抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【００６９】
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、および331位のアミノ酸のいずれかの、カウンターパートのIgG2またはIgG4のFc領域における対応するEUナンバリングの位置のアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。
【００７０】
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数の、異なるアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
【００７１】
その他の好ましい例には、EUナンバリングに従って定義される265位の構成アミノ酸の、異なるアミノ酸での置換による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。265位のアミノ酸がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
【００７２】
本発明の「抗原結合分子」の１つの好ましい形は、例えば、本発明の抗体可変領域を含む多重特異性抗体であり得る。
【００７３】
多重特異性抗体の会合には、抗体H鎖の第２の定常ドメイン（CH2）または第３の定常ドメイン（CH3）の間の界面に電荷反発を導入することによって、意図されないH鎖間の会合を抑制する技術を、適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に電荷反発を導入することによって意図されないH鎖間の会合を抑制する技術において、H鎖定常ドメイン間の界面で互いに接触するアミノ酸残基の例には、1つのCH3ドメインにおけるEUナンバリング356位の残基、EUナンバリング439位の残基、EUナンバリング357位の残基、EUナンバリング370位の残基、EUナンバリング399位の残基、およびEUナンバリング409位の残基、ならびにもう1つのCH3ドメインにおけるそれらのパートナー残基が含まれ得る。
【００７４】
より具体的には、例えば、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗原結合分子として、2つのH鎖CH3ドメインを含む抗体を調製することができる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。
【００７５】
抗体は、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗体として、さらに調製することができる。
【００７６】
ペア（１）〜（３）に記載される各アミノ酸残基は、会合したH鎖においてそのパートナーの近くに位置している。当業者は、所望のH鎖CH3ドメインまたはH鎖定常ドメインについて、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、ペア（１）〜（３）の各々に記載されるアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、その位置のアミノ酸残基を適宜改変することができる。
【００７７】
上記の抗体において、「電荷を有するアミノ酸残基」の各々は、好ましくは、例えば、以下の群（a）および（b）のいずれかに含まれるアミノ酸残基から選択される：
（a）グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）；ならびに
（b）リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
【００７８】
上記の抗体において、「同種の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のすべてが、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であることを意味する。「反対の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基の中の少なくとも1つのアミノ酸残基が、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であってもよく、一方、残りのアミノ酸残基は、他の群に含まれるアミノ酸残基であることを意味する。
【００７９】
好ましい態様において、抗体は、第１のH鎖CH3ドメインと第２のH鎖CH3ドメインとがジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明に従って改変されるアミノ酸残基は、上述の抗体可変領域または抗体定常領域におけるアミノ酸残基に限定されない。当業者は、ポリペプチドバリアントまたは異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、界面を構成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、その位置のアミノ酸残基を改変することができる。
【００８０】
本発明の多重特異性抗体の会合はまた、当技術分野において公知の代替技術によって実施することもできる。１つの抗体H鎖の可変ドメインに存在するアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖によって置換し（ノブ）、もう1つのH鎖の可変ドメインに存在するそのパートナーのアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖によって置換する（ホール）。アミノ酸配列の異なるFcドメインのポリペプチドが効率的に会合するように、ノブをホール中に配置することができる（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
【００８１】
この技術に加えて、当技術分野において公知のさらなる代替技術が、本発明の多重特異性抗体を形成させるために用いられてもよい。1つの抗体のH鎖のCH3の一部を、その対応するIgA由来の配列に変換し、もう1つのH鎖のCH3におけるその相補的な部分を、その対応するIgA由来の配列に変換する。結果として生じた鎖交換操作ドメインCH3を用いることにより、配列が異なるポリペプチド間の効率的な会合を、相補的CH3会合によって引き起こすことができる（Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010）。当技術分野において公知のこの技術の使用によって、目的の多重特異性抗体も、効率的に形成させることができる。
【００８２】
あるいは、多重特異性抗体は、例えば、WO2011/028952に記載されているような抗体のCH1-CL会合およびVH-VL会合を用いた抗体調製技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されているような別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術（Fabアーム交換）、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されているような抗体重鎖CH3ドメイン間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されているような2種類の軽鎖および1種類の重鎖から構成される二重特異性抗体を調製する技術、またはChristoph et al.（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）に記載されているような1本のH鎖および1本のL鎖からなる抗体の半分子を各々が発現する2つの細菌細胞株を用いて二重特異性抗体を調製する技術によって、形成され得る。これらの会合技術に加えて、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖を、それぞれ、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖に会合させる、公知の異種軽鎖会合技術であるCrossMabテクノロジー（Scaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 11187-11192）もまた、本発明によって提供される多重特異性または多重パラトピック抗原結合分子を調製するために用いることができる。別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術の例には、重鎖CH3ドメインにおける特定のアミノ酸を置換したモノクローナル抗体を還元条件下に置くことによって抗体のヘテロ二量体化を促進して、所望の二重特異性抗体を取得することを含む方法が含まれ得る。この方法にとって好ましいアミノ酸置換部位の例には、CH3ドメインにおけるEUナンバリング392位の残基およびEUナンバリング397位の残基が含まれ得る。さらに、二重特異性抗体はまた、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体の使用によって、調製することもできる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。二重特異性抗体はまた、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗体の使用によって、調製することもできる。
【００８３】
目的の多重特異性抗体を効率的に形成させることができない場合であっても、本発明の多重特異性抗体は、産生された抗体の中から目的の多重特異性抗体を分離、精製することによって取得され得る。例えば、以前に報告された方法には、2種類のホモ二量体および目的のヘテロ二量体化抗体をイオン交換クロマトグラフィーによって別々に精製できるように、2種類のH鎖の可変ドメインにアミノ酸置換を導入して、等電点の差を付与することが含まれる（WO2007114325）。プロテインAに結合することができるマウスIgG2aのH鎖およびプロテインAに結合することができないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量体化抗体を精製するためにプロテインAを用いる方法が、ヘテロ二量体を精製するための方法として以前に報告されている（WO98050431およびWO95033844）。あるいは、IgGのプロテインA結合部位を構成するEUナンバリング435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA結合の強度を提供する、TyrおよびHisなどのアミノ酸に置換してもよく、結果として生じたH鎖を、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させるために用いる。結果として、ヘテロ二量体化抗体のみを、プロテインAカラムの使用によって効率的に精製することができる。
【００８４】
これらの技術の複数、例えば2つ以上を、組み合わせて用いてもよい。また、これらの技術は、会合させたい2つのH鎖に適宜別々に適用させることもできる。本発明の抗原結合分子は、このように改変された形態に基づくがそれとは別に、同一のアミノ酸配列を有する抗原結合分子として調製されてもよい。
【００８５】
アミノ酸配列の改変は、当技術分野において公知の様々な方法によって行うことができる。行われてもよいこれらの方法の例には、部位特異的変異誘発（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275；Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367；およびKunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発などの方法が含まれ得るが、それらに限定されない。
【００８６】
本発明の「抗原結合分子」は、本発明の「抗体可変領域」を構成する重鎖および軽鎖の両方を単一のポリペプチド鎖中に含むが、定常領域が欠けている、抗体断片であってもよい。そのような抗体断片は、例えば、ダイアボディ（diabody）（Db）、一本鎖抗体、またはsc(Fab')2であってもよい。
【００８７】
Dbは、2本のポリペプチド鎖によって構成される二量体である（例えば、Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)；EP404,097；およびW093/11161）。これらのポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上のL鎖可変ドメイン（VL）およびH鎖可変ドメイン（VH）が互いにペア形成できないほど短い、例えば、およそ5残基のリンカーを通して連結されている。
この短いリンカーのために、同じポリペプチド鎖上にコードされるVLおよびVHは、一本鎖Fvを形成することができず、その代わりに、別のポリペプチド鎖上のVHおよびVLとそれぞれ二量体化して、2つの抗原結合部位を形成する。
【００８８】
一本鎖抗体の例には、sc(Fv)2が含まれる。sc(Fv)2は、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して連結された4つの可変ドメイン、すなわち、2つのVLおよび2つのVHによって構成される1つの鎖を有する一本鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。これらの2つのVHおよびVLは、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。その好ましい例には、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374において開示されるような、同じ抗原中に存在する2種類のエピトープを認識する二重特異性sc(Fv)2が含まれる。sc(Fv)2は、当業者に一般的に知られている方法によって調製することができる。例えば、sc(Fv)2は、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して2つのscFvを接続することによって調製することができる。
【００８９】
本明細書に記載されるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの構成の例には、2つのVHおよび2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端から開始してVH、VL、VH、およびVL（すなわち、[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]）の順序で整列している抗体が含まれる。2つのVHと2つのVLの順序は、上記の構成に特に限定されず、任意の配置の順序であってもよい。その例にはまた、以下の配置も含まれ得る：
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]、
[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]、
[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]、
[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]、および
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]。
【００９０】
sc(Fv)2の分子形態はまた、WO2006/132352においても詳細に記載されている。その中の記載に基づいて、当業者は、本明細書において開示される抗原結合分子を調製するために、所望のsc(Fv)2を適宜調製することができる。
【００９１】
本発明の抗原結合分子は、PEGなどの担体ポリマーまたは抗がん剤などの有機化合物とコンジュゲートされてもよい。また、所望の効果を生じることを目的とした糖鎖付加配列の挿入によって、本発明の抗原結合分子に糖鎖を好適に付加することができる。
【００９２】
例えば、遺伝子工学によって導入することができる任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996において開示されるリンカー）を、抗体可変ドメインを連結するためのリンカーとして用いることができる。本発明において、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは、特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。その長さは、好ましくは5アミノ酸以上であり（上限は、特に限定されず、通常30アミノ酸以下、好ましくは20アミノ酸以下である）、特に好ましくは15アミノ酸である。sc(Fv)2が3つのペプチドリンカーを含有する場合、用いられるこれらのペプチドリンカーのすべては、同じ長さを有してもよく、または異なる長さを有してもよい。
【００９３】
ペプチドリンカーの例には、
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：２１６）、
Ser-Gly-Gly-Gly（配列番号：２１７）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：２１８）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：２１９）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：２２０）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：２２１）、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：２２２）、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：２２３）、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：２１８）)n、および
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：２１９）)n、
（ここで、nは1以上の整数である）が含まれ得る。
しかし、ペプチドリンカーの長さまたは配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００９４】
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられる架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベラート（DSS）、ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート（BS3）、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)（DSP）、ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)（DTSSP）、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)（EGS）、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)（スルホ-EGS）、ジスクシンイミジルタルトラート（DST）、ジスルホスクシンイミジルタルトラート（スルホ-DST）、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（BSOCOES）、またはビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン（スルホ-BSOCOES）である。
これらの架橋剤は、市販されている。
4つの抗体可変ドメインを連結するためには、3つのリンカーが通常必要である。用いられるこれらのリンカーのすべては、同じリンカーであってもよく、または異なるリンカーであってもよい。
【００９５】
F(ab')2は、2本の軽鎖、ならびに、鎖間ジスルフィド結合が2本の重鎖の間で形成されるように定常領域（CH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分）を含有する2本の重鎖を含む。本明細書において開示されるポリペプチド会合体を構成するF(ab')2は、好ましくは、例えば、所望の抗原結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムに吸着したFc断片を除去することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびフィシンが含まれ得る。
【００９６】
本発明の抗原結合分子は、上述のアミノ酸改変に加えて、追加的な改変をさらに含有することができる。追加的な改変は、例えば、アミノ酸置換、欠失、および修飾、ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。
例えば、本発明の抗原結合分子は、分子の意図される機能を実質的に変化させることなく、さらに任意に改変することができる。そのような変異は、例えば、アミノ酸残基の保存的置換によって行うことができる。あるいは、本発明の抗原結合分子の意図される機能を変化させる改変であっても、そのような改変によって変化した機能が本発明の目的の範囲内である限り、実施されてもよい。
【００９７】
本発明によるアミノ酸配列の改変にはまた、翻訳後修飾も含まれる。具体的には、翻訳後修飾とは、糖鎖の付加または欠失を指すことができる。例えば、IgG1型の定常領域を有する本発明の抗原結合分子は、EUナンバリング297位に、糖鎖で修飾されたアミノ酸残基を有することができる。修飾における使用のための糖鎖構造は、限定されない。概して、真核細胞が発現する抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。したがって、以下の細胞が発現する抗体は、通常、いくつかの糖鎖で修飾されている：
哺乳動物の抗体産生細胞；および
抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞。
ここで、真核細胞には、酵母および動物細胞が含まれる。例えば、CHO細胞またはHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターでの形質転換のための典型的な動物細胞である。他方、本発明の抗体には、その位置に糖鎖修飾がない抗体も含まれる。糖鎖で修飾されていない定常領域を有する抗体は、これらの抗体をコードする遺伝子の、大腸菌などの原核細胞における発現によって取得することができる。
【００９８】
本発明による追加的な改変は、より具体的には、例えば、Fc領域における糖鎖へのシアル酸の付加であってもよい（mAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27）。
【００９９】
本発明の抗原結合分子が、Fc領域を有する場合、例えば、FcRnに対する結合活性を改善するアミノ酸置換（J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56；J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24；Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69；Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9；WO2006/019447；WO2006/053301；およびWO2009/086320）、または抗体の不均一性もしくは安定性を改善するためのアミノ酸置換（(WO2009/041613)）を加えてもよい。
【０１００】
本発明において、「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体バリアント、抗体断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの任意の抗体をも含む。
【０１０１】
本発明の抗体は、その抗原の種類、その起源などによって限定されず、任意の抗体であってもよい。抗体の起源の例には、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、およびウサギ抗体が含まれ得るが、特にそれらに限定されることはない。
【０１０２】
抗体は、当業者によく知られている方法によって調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）によって産生させてもよい。あるいは、モノクローナル抗体を、ファージディスプレイ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)；およびMarks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、モノクローナル抗体を、単一のB細胞クローンから単離してもよい（N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)）。
【０１０３】
ヒト化抗体はまた、再構成ヒト抗体とも呼ばれる。具体的には、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体のCDRを移植したヒト抗体からなるヒト化抗体が、当技術分野において公知である。ヒト化抗体を取得するための一般的な遺伝子組換え手法もまた、公知である。具体的には、例えば、オーバーラップ伸長PCRが、マウス抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、当技術分野において公知である。
【０１０４】
連結された3つのCDRおよび4つのFRを各々が含む抗体可変ドメインをコードするDNA、およびヒト抗体定常ドメインをコードするDNAを、可変ドメインDNAが定常ドメインDNAとインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入して、ヒト化抗体発現用ベクターを調製することができる。インサートを有するこれらのベクターを宿主に移入して、組換え細胞を樹立する。次いで、ヒト化抗体をコードするDNAの発現のために組換え細胞を培養して、ヒト化抗体を培養細胞の培養物中に産生させる（欧州特許公開番号EP 239400および国際公開番号WO1996/002576参照）。
【０１０５】
必要な場合は、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、FRのアミノ酸残基を置換してもよい。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植において用いられるPCR法の応用によって、FRのアミノ酸配列を変異させることができる。
【０１０６】
所望のヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子のすべてのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開番号WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、およびWO1996/033735参照）を免疫動物として用いるDNA免疫によって、取得することができる。
【０１０７】
加えて、ヒト抗体ライブラリーを用いたパニングによって、ヒト抗体を取得する技術も公知である。例えば、ヒト抗体V領域を、ファージディスプレイ法によってファージの表面上に、一本鎖抗体（scFv）として発現させる。抗原結合scFvを発現するファージを、選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析して、抗原結合ヒト抗体のV領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原結合scFvのDNA配列を決定した後、V領域配列を、所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させ、次いで、適切な発現ベクターに挿入して、発現ベクターを調製することができる。発現ベクターを、ヒト抗体をコードする遺伝子の発現のために上記に列挙される好ましい発現細胞に移入して、ヒト抗体を取得する。これらの方法は、当技術分野において既知である（国際公開番号WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、およびWO1995/015388参照）。
【０１０８】
ファージディスプレイ技術に加えて、例えば、無細胞翻訳システムを用いた技術、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術、およびエマルジョンを用いた技術が、ヒト抗体ライブラリーを用いたパニングによって、ヒト抗体を取得するための技術として公知である。例えば、終止コドンの除去などにより、リボソームを介してmRNAと翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むリボソームディスプレイ法、ピューロマイシンなどの化合物を用いて、翻訳されたタンパク質を遺伝子配列に共有結合させることを含むcDNAもしくはmRNAディスプレイ法、または核酸結合タンパク質を用いて、遺伝子と翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むCISディスプレイ法を、無細胞翻訳システムを用いた技術として用いることができる。ファージディスプレイ法、および大腸菌ディスプレイ法、グラム陽性細菌ディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、哺乳動物細胞ディスプレイ法、ウイルスディスプレイ法などを、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術として用いることができる。例えば、エマルジョンに封入された遺伝子および翻訳関連分子を用いたインビトロウイルスディスプレイ法を、エマルジョンを用いた技術として用いることができる。これらの方法は、当技術分野において既知である（Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92；Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e127；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8；Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21 (4): 247-55；Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5；MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18；およびMethods Mol Biol. 2012; 911: 183-98）。
【０１０９】
本発明の第３の抗原に結合する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であり得る。本発明の第３の抗原に結合する可変領域は、がん組織において特異的に発現している分子を認識する可変領域であり得る。
【０１１０】
本明細書において、「第３の抗原」は、特に限定されず、任意の抗原であってもよい。抗原の例には、17-IA、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、アディポネクチン、ADPリボシルシクラーゼ-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アレルゲン、α1-アンチケモトリプシン（antichemotrypsin）、α1-アンチトリプシン、α-シヌクレイン、α-V/β-1 アンタゴニスト、アミニン（aminin）、アミリン、アミロイドβ、アミロイド免疫グロブリン重鎖可変領域、アミロイド免疫グロブリン軽鎖可変領域、アンドロゲン、ANG、アンジオテンシノーゲン、アンジオポエチンリガンド-2、抗Id、アンチトロンビンIII、炭疽、APAF-1、APE、APJ、アポA1、アポ血清アミロイドA、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン（Artemin）、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドA、心房性ナトリウム利尿ペプチドB、心房性ナトリウム利尿ペプチドC、av/b3インテグリン、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽菌（Bacillus anthracis）防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-ミクログロブリン、βラクタマーゼ、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、Bリンパ球刺激因子（BlyS）、BMP、BMP-2（BMP-2a）、BMP-3（オステオゲニン）、BMP-4（BMP-2b）、BMP-5、BMP-6（Vgr-1）、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BMPR-II（BRK-3）、BMPs、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ウシ成長ホルモン、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、Bリンパ球細胞接着分子、C10、C1インヒビター、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a（補体5a）、CA125、CAD-8、カドヘリン-3、カルシトニン、cAMP、炭酸脱水酵素-IX、がん胎児性抗原（CEA）、がん関連抗原、カルジオトロフィン-1、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/エオタキシン、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/エオタキシン-2、CCL25/TECK、CCL26/エオタキシン-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受容体、CINC、CKb8-1、クローディン18、CLC、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）毒素、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補体因子3（C3）、補体因子D、コルチコステロイド結合グロブリン、コロニー刺激因子-1受容体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/ラングカイン（Lungkine）、CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β、CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、シスタチンC、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、崩壊促進因子、Delta様タンパク質リガンド4、des(1-3)-IGF-1（脳IGF-1）、Dhh、DHICAオキシダーゼ、Dickkopf-1、ジゴキシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、DKl、DNAM-1、Dnアーゼ、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EGF様ドメイン含有タンパク質7、エラスターゼ、エラスチン、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、エンドシアリン、エンドセリン受容体、エンドトキシン、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシニ（eotaxini）、EpCAM、エフリンB2/EphB4、Epha2チロシンキナーゼ受容体、上皮成長因子受容体（EGFR）、ErbB2受容体、ErbB3チロシンキナーゼ受容体、ERCC、EREG、エリスロポエチン（EPO）、エリスロポエチン受容体、E-セレクチン、ET-1、Exodus-2、RSVのFタンパク質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受容体、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-塩基性、フィブリン、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子-10、フィブロネクチン、FL、FLIP、Flt-3、FLT3リガンド、葉酸受容体、卵胞刺激ホルモン（FSH）、フラクタルカイン（CX3C）、フリーの重鎖、フリーの軽鎖、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受容体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15（MIC-1）、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14/CDMP-1）、GDF-6（BMP-13/CDMP-2）、GDF-7（BMP-12/CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDNF、ゲルソリン、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gHエンベロープ糖タンパク質、GITR、グルカゴン、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド1受容体、Glut 4、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、糖タンパク質ホルモン受容体、糖タンパク質IIb/IIIa（GP IIb/IIIa）、グリピカン-3、GM-CSF、GM-CSF受容体、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF（G-CSF）、GRO/MGSA、成長ホルモン放出因子、GRO-β、GRO-γ、H. ピロリ（H. pylori）、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、ヘパリン補因子II、肝増殖因子（hepatic growth factor）、炭疽菌防御抗原、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、E型肝炎、ヘプシジン、Her1、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV）gB糖タンパク質、HGF、HGFA、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、HIVエンベロープタンパク質、例えばGP120、HIV MIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖タンパク質、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（hGH）、ヒト血清アルブミン、ヒト組織型プ���スミノーゲンアクチベーター（t-PA）、ハンチンチン、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受容体、IL-11、IL-11受容体、IL-12、IL-12受容体、IL-13、IL-13受容体、IL-15、IL-15受容体、IL-16、IL-16受容体、IL-17、IL-17受容体、IL-18（IGIF）、IL-18受容体、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-2、IL-2受容体、IL-20、IL-20受容体、IL-21、IL-21受容体、IL-23、IL-23受容体、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体、IL-31、IL-31受容体、IL-3受容体、IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-5受容体、IL-6、IL-6受容体、IL-7、IL-7受容体、IL-8、IL-8受容体、IL-9、IL-9受容体、免疫グロブリン免疫複合体、免疫グロブリン、INF-α、INF-α受容体、INF-β、INF-β受容体、INF-γ、INF-γ受容体、I型IFN、I型IFN受容体、インフルエンザ、インヒビン、インヒビンα、インヒビンβ、iNOS、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2、インスリン様成長因子結合タンパク質、インテグリン、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα4/β1、インテグリンα-V/β-3、インテグリンα-V/β-6、インテグリンα4/β7、インテグリンα5/β1、インテグリンα5/β3、インテグリンα5/β6、インテグリンασ（αV）、インテグリンαθ、インテグリンβ1、インテグリンβ2、インテグリンβ3（GPIIb-IIIa）、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン（kalliklein）、カリクレイン（Kallikrein）11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、カリスタチン、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ケラチノサイト増殖因子2（KGF-2）、KGF、キラー免疫グロブリン様受容体、kitリガンド（KL）、Kitチロシンキナーゼ、ラミニン5、LAMP、LAPP（アミリン、膵島アミロイドポリペプチド）、LAP（TGF-1）、潜伏関連ペプチド、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受容体、LECT2、Lefty、レプチン、黄体形成（leutinizing）ホルモン（LH）、ルイス-Y抗原、ルイス-Y 関連抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受容体、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物質、黄体形成（Luteinizing）ホルモン、リンホタクチン、リンホトキシンβ受容体、リゾスフィンゴ脂質受容体、Mac-1、マクロファージ-CSF（M-CSF）、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、マスピン、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I（MCAF）、M-CSF、MDC、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、メグシン（megsin）、Mer、METチロシンキナーゼ受容体ファミリー、メタロプロテアーゼ（METALLOPROTEASES）、膜糖タンパク質OX2、メソテリン、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、微生物タンパク質、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、単球誘引タンパク質、単球コロニー抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、ムチン（Mud）、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、ミエリン関連糖タンパク質、骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-I）、NAIP、ナノボディ、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-カドヘリン、NCAM、ネプリライシン、神経細胞接着分子、ニューロセルピン、神経成長因子（NGF）、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-6、ニューロピリン1、ニュールツリン、NGF-β、NGFR、NKG20、N-メチオニルヒト成長ホルモン、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受容体、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質3型（NS3）、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受容体、骨誘導因子、オステオポンチン、OX40L、OX40R、酸化LDL、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤成長因子、胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）、胎盤性ラクトゲン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1、血小板増殖因子、plgR、PLP、様々なサイズのポリグリコール鎖（例えば、PEG-20、PEG-30、PEG40）、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシト
ニン、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシン、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）F、Ret、レチキュロン（reticulon）4、リウマチ因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、スクレロスチン、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン1-リン酸受容体1、ブドウ球菌リポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子（SCF）、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン-1、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質-72）、TARC、TB、TCA-3、T-細胞受容体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、Pan特異的TGF-β、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-βRl（ALK-5）、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、トロンビン、トロンボポエチン（TPO）、胸腺間質性リンホプロテイン（Thymic stromal lymphoprotein）受容体、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2/DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2/TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R/TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF/TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF12A、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ/TRADE）、TNFRSF19L（RELT)、TNFRSF1A（TNF Rl CD120a/p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b/p75-80）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRSF25（DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII/TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35/TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6 （Fas Apo-1/APT1/CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68/TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8 （CD30）、TNFRSF9（4-1 BB CD137/ILA）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFSF10 （TRAIL Apo-2リガンド/TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンドODF/OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド/DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド/LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンドAITRリガンド/TL6）、TNFSF1A（TNF-aコネクチン（Conectin）/DIF/TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa/TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC/p33）、TNFSF4（OX40リガンドgp34/TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンドCD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP）、TNFSF6（FasリガンドApo-1リガンド/APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンドCD70）、TNFSF8（CD30リガンドCD153）、TNFSF9（4-1 BBリガンドCD137リガンド）、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝産物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、トランスフォーミング成長因子（TGF）、例えばTGF-αおよびTGF-β、膜貫通糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP-2、栄養膜糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子（TNF）、腫瘍関連抗原CA 125、ルイスY関連糖質を発現する腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VAP-1、血管内皮増殖因子（VEGF）、バスピン（vaspin）、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1（flt-1）、VEFGR-2、VEGF受容体（VEGFR）、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VitB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ウィルブランド因子（vWF）、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/リンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、ならびにXPD含まれる。
【０１１１】
T細胞上で特異的に発現している分子の具体例には、CD3およびT細胞受容体が含まれる。特に、CD3が好ましい。例えば、ヒトCD3の場合には、本発明の抗原結合分子が結合するCD3中の部位は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の配列中に存在する任意のエピトープであってもよい。特に、ヒトCD3複合体におけるε鎖の細胞外領域中に存在するエピトープが好ましい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、およびε鎖の構造のポリヌクレオチド配列は、配列番号：２２４（NM_000073.2)、２２６（NM_000732.4）、および２２８（NM_000733.3）に示され、そのポリペプチド配列は、配列番号：２２５（NP_000064.1)、２２７（NP_000723.1）、および２２９（NP_000724.1）に示される（RefSeq登録番号を括弧内に示す）。
【０１１２】
本発明の抗原結合分子中に含まれる抗体の２つの可変領域のうちの１つは、上述の「CD3」および「CD137」とは異なる「第３の抗原」に結合する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する細胞または臓器上に特異的に発現している分子である。第３の抗原は、好ましくは、細胞または臓器上に全身的には発現していない分子である。第３の抗原は、好ましくは、例えば、腫瘍細胞特異的抗原であり、また、細胞の悪性化に伴って発現する抗原、および細胞の悪性形質転換中に細胞表面またはタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も含む。その具体例には、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓がん抗原、卵巣がん抗原（CA125）、前立腺酸リン酸（prostatic acid phosphate）、前立腺特異的抗原（PSA）、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラノーマ抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、がん胎児性抗原(CEA)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原CD20、CD33、メラノーマ特異的抗原（例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、およびガングリオシドGM3）、腫瘍特異的移植抗原（TSTA）、T抗原、ウイルスにより誘導される腫瘍抗原（例えば、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、結腸CEA、腫瘍胎児性抗原α-フェトプロテイン（例えば、腫瘍胎児性栄養膜糖タンパク質5T4および腫瘍胎児性膀胱腫瘍抗原）、分化抗原（例えば、ヒト肺がん抗原L6およびL20）、線維肉腫抗原、ヒトT細胞白血病関連抗原Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えば、EGFR（上皮成長因子受容体））、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1、胎児赤血球において見出されるI抗原などの分化抗原、成人赤血球において見出される初期内胚葉I抗原、移植前の胚または胃がんにおいて見出されるI（Ma）、乳腺上皮において見出されるM18、M39、骨髄細胞において見出されるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸がんにおいて見出されるD156-22、TRA-1-85（血液型H）、精巣および卵巣がんにおいて見出されるSCP-1、結腸がんにおいて見出されるC14、肺がんにおいて見出されるF3、胃がんにおいて見出されるAH6、Yハプテン、胚性がん細胞において見出されるLey、TL5（血液型A）、A431細胞において見出されるEGF受容体、膵臓がんにおいて見出されるE1シリーズ（血液型B）、胚性がん細胞において見出されるFC10.2、胃がん抗原、腺がんにおいて見出されるCO-514（血液型Lea）、腺がんにおいて見出されるNS-10、CO-43（血液型Leb）、A431細胞のEGF受容体において見出されるG49、結腸がんにおいて見出されるMH2（血液型ALeb/Ley）、結腸がんにおいて見出される19.9、胃がんムチン、骨髄細胞において見出されるT5A7、メラノーマにおいて見出されるR24、胚性がん細胞において見出される4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、4細胞期〜8細胞期の胚において見出されるSSEA-3およびSSEA-4、皮膚T細胞リンパ腫関連抗原、MART-1抗原、シアリルTn（STn）抗原、結腸がん抗原NY-CO-45、肺がん抗原NY-LU-12バリアントA、腺がん抗原ART1、腫瘍随伴関連脳-精巣がん抗原（腫瘍神経抗原MA2および腫瘍随伴性神経抗原）、神経腫瘍学的腹部抗原2（NOVA2）、血液細胞がん抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-C1（がん／精巣抗原CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b、MAGE-X2、がん-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40、ならびにこれらのポリペプチドの任意の断片、ならびにその修飾された構造（前述の修飾されたリン酸基、糖鎖など）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シアリルSSEA-1（SLX）、HER2、PSMA、CEA、ならびにCLEC12Aが含まれる。
【０１１３】
本明細書において、用語「CD137」は、4-1BBとも呼ばれ、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。TNFスーパーファミリーまたはTNF受容体スーパーファミリーに属する因子の例としては、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLが挙げられる。
【０１１４】
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）可変領域が、配列番号：１５９のアミノ酸配列を含むCD3ε（イプシロン）の細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカインの放出を誘導しない。
【０１１５】
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）可変領域が、配列番号：１５９のアミノ酸配列を含むCD3ε（イプシロン）の細胞外ドメインに結合する、
（２）抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する、
（３）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化は誘導しない、および
（４）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカインの放出を誘導しない。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下の（１）〜（２）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する：
（１）抗原結合分子が、CD137に対する結合についてCD137リガンドと競合しない、および
（２）抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞の細胞傷害活性は誘導しない。
【０１１６】
1つの局面において、本発明の「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」とは、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子を指し、ここで0％の活性化とは、CD137を発現する非活性化細胞のバックグラウンドレベル（例えば、IL6分泌など）である。様々な具体例において、本発明の医薬組成物としての使用のためのCD137アゴニスト抗体は、細胞の活性を少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。
１つの局面において、本発明の「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」とはまた、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子を指し、ここで100％の活性化とは、生理学的条件下で等モル量の結合パートナーによって達成される活性化のレベルである。様々な具体例において、本発明の医薬組成物としての使用のためのCD137アゴニスト抗体は、細胞の活性を少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。いくつかの態様において、本明細書において用いられる「結合パートナー」とは、CD137に結合し、かつCD137を発現する細胞の活性化を誘導することが知られている分子である。さらなる態様において、結合パートナーの例には、WO2005/035584A1に記載されているウレルマブ（Urelumab）（CAS登録番号934823-49-1）およびそのバリアント、WO2012/032433A1に記載されているウトミルマブ（Utomilumab）（CAS登録番号1417318-27-4）およびそのバリアント、ならびに様々な公知のCD137アゴニスト抗体が含まれる。ある特定の態様において、結合パートナーの例には、CD137リガンドが含まれる。さらなる態様において、抗CD137アゴニスト抗体による、CD137を発現する細胞の活性化は、IL6分泌を特徴決定するELISAを用いて判定されてもよい（例えば、本明細書における参考実施例５−２参照）。結合パートナーとして用いられる抗CD137抗体および測定のための抗体濃度は、参考実施例５−２を参照とすることができ、ここで100％の活性化とは、抗体によって達成される活性化のレベルである。さらなる態様において、配列番号：１４２の重鎖アミノ酸配列および配列番号：１４４の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を、結合パートナーとして測定のために30μg/mLで用いることができる（例えば、本明細書における参考実施例５−２参照）。いくつかの態様において、抗CD137アゴニスト抗体によるCD137を発現する細胞の活性化は、例えば、CD137シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する組換えT細胞を用いること、および、T細胞の活性化の指標としてレポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性を検出することによって、判定されてもよい。CD137シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を抗原結合分子と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、陰性対照のものより10％、20％、30％、40％、50％、90％、100％、またはそれよりも大きく上回っているならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導すると判定される（例えば、本明細書における実施例２．２参照）。
【０１１７】
非限定的な態様として、本発明は、Fc領域を含む「CD137アゴニスト抗体」を提供し、該Fc領域は、抑制性Fcγ受容体に対する結合活性が増強している。
【０１１８】
非限定的な態様として、CD137アゴニスト活性は、その表面上にCD137を発現することが公知である、B細胞を用いて確認することができる。非限定的な態様として、HDLM-2 B細胞株を、B細胞として用いることができる。CD137の活性化の結果として、IL-6の発現が誘導されるため、CD137アゴニスト活性は、産生されるヒトインターロイキン-6（IL-6）の量によって評価することができる。この評価において、IL-6の量を用いることにより0％バックグラウンドレベルとしての非活性化B細胞からのIL-6発現の増加量を評価することによって、評価される分子が、何％のCD137アゴニスト活性を有するかを判定することが可能である。
【０１１９】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するが、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導しない。抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導するかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下で、第３の抗原を発現する細胞とT細胞を共培養し、T細胞のCD3活性化をアッセイすることによって、判定することができる。T細胞活性化は、例えば、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する組換えT細胞を用いること、および、T細胞の活性化の指標として、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性を検出することによって、アッセイすることができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下で第３の抗原を発現する細胞と共培養した時に、抗原結合分子の用量に依存した様式でのレポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性の検出は、抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導することを示す。同様に、抗原結合分子が、CD137を発現する細胞に対するT細胞のCD3活性化を誘導しないかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下で、CD137を発現する細胞とT細胞を共培養し、上記のようにT細胞のCD3活性化をアッセイすることによって、判定することができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性がないか、または検出限界よりも下であるか、または陰性対照のものよりも下であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定される。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、第３の抗原の分子を発現する細胞に対する同じ抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でサイトカインの放出を誘導しないかどうかは、例えば、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCと抗原結合分子とをインキュベートすること、ならびに、当技術分野において公知の方法を用いて、PBMCから培養上清中に放出されたIL-2、IFNγ、およびTNFαなどのサイトカインを測定することによって判定することができる。第３の抗原を発現する細胞の非存在下で抗原結合分子とインキュベートしたPBMCの培養上清において、有意なレベルのサイトカインが検出されないか、または有意なサイトカイン発現の誘導が起こらないならば、抗原結合分子は、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCからのサイトカイン放出を誘導しないと判定される。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、第３の抗原の分子を発現する細胞の存在下で達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なサイトカイン発現の誘導が起こらない」とはまた、サイトカイン濃度増加のレベルが、抗原結合分子を添加する前の各サイトカインの濃度の最大でも5倍、2倍、または1倍であることを指す。
【０１２１】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、以下からなる群より選択される抗体と、CD137に対する結合について競合するか、またはCD137上の同じエピトープに結合する：
（ａ１）配列番号：１６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ２）配列番号：１７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ３）配列番号：１８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ４）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ５）配列番号：１９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ６）配列番号：２０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：４８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ７）配列番号：２２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ８）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ９）配列番号：２３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１０）配列番号：２４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１１）配列番号：２５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：３９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１２）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：７１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１３）配列番号：２６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１４）配列番号：２７に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ａ１５）配列番号：２８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号：４２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、配列番号：５６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、配列番号：６３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号：６８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、および配列番号：７３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）；
（ｂ１）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ２）配列番号：１７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６４のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６９のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７４のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ３）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ４）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ５）配列番号：１９のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３３のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４７のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６５のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７０のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７５のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ６）配列番号：２０のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３４のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：４８のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ７）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５０のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ８）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ９）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３７のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１０）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３８のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５２のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１１）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：３９のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５３のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１２）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６６のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：７１のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７６のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１３）配列番号：２６のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４０のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１４）配列番号：２７のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４１のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｂ１５）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むHCDR1、配列番号：４２のアミノ酸配列を含むHCDR2、配列番号：５６のアミノ酸配列を含むHCDR3、配列番号：６３のアミノ酸配列を含むLCDR1、配列番号：６８のアミノ酸配列を含むLCDR2、および配列番号：７３のアミノ酸配列を含むLCDR3；
（ｃ１）配列番号：２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ２）配列番号：３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ３）配列番号：４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ４）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ５）配列番号：５に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ６）配列番号：６に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ７）配列番号：８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ８）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ９）配列番号：９に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１０）配列番号：１０に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１１）配列番号：１１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１２）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１３）配列番号：１２に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１４）配列番号：１３に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｃ１５）配列番号：１４に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８に対して少なくとも70％、80％、または90％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１）配列番号：２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ２）配列番号：３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５９の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ３）配列番号：４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ４）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ５）配列番号：５の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６０の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ６）配列番号：６の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ７）配列番号：８の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ８）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ９）配列番号：９の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１０）配列番号：１０の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１１）配列番号：１１の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１２）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：６１の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１３）配列番号：１２の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１４）配列番号：１３の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）；
（ｄ１５）配列番号：１４の重鎖可変ドメイン（VH）、および配列番号：５８の軽鎖可変ドメイン（VL）。
【０１２２】
試験抗体が、ある特定の抗体と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2つの抗体間の競合に基づいて評価することができる。抗体間の競合は、クロスブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）などによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするために用いるCD137タンパク質を、候補競合抗体の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、本発明の抗CD137抗体をそれに添加する。ウェル中のCD137タンパク質に結合した本発明の抗CD137抗体の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗体（試験抗体）の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する試験抗体の親和性が高いほど、CD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した本発明の抗CD137抗体の量は少なく、かつCD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した試験抗体の量は多い。
【０１２３】
ウェルに結合した抗体の量は、抗体を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗体は、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。抗体は、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
【０１２４】
さらに、試験抗体が、本発明の抗CD137抗体の種とは異なる種に由来する定常領域を有する場合、ウェルに結合した抗体の量を、その抗体の定常領域を認識する標識された抗体の使用によって測定することができる。あるいは、抗体が、同じ種に由来するが異なるクラスに属するならば、ウェルに結合した抗体の量を、個々のクラスを区別する抗体を用いて測定することができる。
【０１２５】
候補抗体が、候補競合抗体の非存在下で行われる対照実験において得られる結合活性と比較して少なくとも20％、好ましくは少なくとも20％〜50％、およびさらにより好ましくは少なくとも50％、抗CD137抗体の結合をブロックすることができるならば、候補競合抗体は、本発明の抗CD137抗体と同じエピトープに実質的に結合する抗体、または同じエピトープへの結合について競合する抗体のいずれかである。
【０１２６】
別の態様において、試験抗体が別の抗体と競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
【０１２７】
エピトープの空間的立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる（Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, G. E. Morris (ed.), Vol. 66 (1996)参照）。
【０１２８】
試験抗体が、CD137リガンドと共通のエピトープを共有するかどうかもまた、同じエピトープに対する試験抗体とCD137リガンドとの間の競合に基づいて評価することができる。抗体とCD137リガンドとの間の競合は、上述のようなクロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。別の態様において、試験抗体がCD137リガンドと競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
【０１２９】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の好都合な例には、以下からなる群より選択される抗体が結合するヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
ヒトCD137タンパク質における
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：１５４）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：１４９）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：１５２）を含む領域を認識する抗体、および
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：１４７）を含む領域を認識する抗体。
【０１３０】
標的とされるがん抗原に応じて、当業者は、がん特異的抗原結合ドメインに含まれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域について、がん抗原に結合する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を適宜選択することができる。抗原結合ドメインが結合するエピトープが、複数の異なる抗原に含有されている場合、該抗原結合ドメインを含有する抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
【０１３１】
「エピトープ」とは、抗原における抗原決定基を意味し、本明細書において開示される抗原結合分子中の様々な結合ドメインが結合する抗原部位を指す。したがって、例えば、エピトープを、その構造に従って定義することができる。あるいは、エピトープを、該エピトープを認識する抗原結合分子の抗原結合活性に従って定義してもよい。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合、エピトープを、該エピトープを形成するアミノ酸残基によって特定化することができる。あるいは、エピトープが糖鎖である場合、エピトープは、その特異的な糖鎖構造によって特定化することができる。
【０１３２】
直鎖状エピトープとは、その一次アミノ酸配列が認識されるエピトープを含有するエピトープである。そのような直鎖状エピトープは、典型的には、その特異的配列中に少なくとも3個、および最も一般的には少なくとも5個、例えば、約8〜10個または6〜20個のアミノ酸を含有する。
【０１３３】
直鎖状エピトープとは対照的に、「立体構造エピトープ」とは、エピトープを含有する一次アミノ酸配列が、認識されるエピトープの唯一の決定基ではないエピトープである（例えば、立体構造エピトープの一次アミノ酸配列は、エピトープを規定する抗体によって必ずしも認識されない）。立体構造エピトープは、直鎖状エピトープと比較してより多くの数のアミノ酸を含有し得る。立体構造エピトープを認識する抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子がフォールディングして三次元構造を形成する時に、立体構造エピトープを形成するアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖が整列し、エピトープが抗体によって認識可能になる。エピトープの立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴分光法、部位特異的スピン標識、および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、それらに限定されない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.)参照。
【０１３４】
試験抗原結合分子によるがん特異的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法の例を、以下に示す。以下の実施例に従って、別の結合ドメインによる標的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法もまた、適宜実施することができる。
【０１３５】
例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、抗原分子中の直鎖状エピトープを認識するかどうかは、例えば、以下に述べるように確認することができる。例えば、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドを、上記の目的で合成する。ペプチドは、化学合成することができ、または、細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードするがん特異的抗原のcDNA中の領域を用いて、遺伝子操作技術によって取得することができる。次いで、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子を、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドに対するその結合活性について評価する。例えば、固定化された直鎖状ペプチドを抗原として用いて、ELISAにより、ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性を評価することができる。あるいは、直鎖状ペプチドに対する結合活性を、該直鎖状ペプチドががん特異的抗原発現細胞に対する抗原結合分子の結合を阻害するレベルに基づいて、評価することができる。直鎖状ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性は、これらの試験によって実証することができる。
【０１３６】
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原分子が、立体構造エピトープを認識するかどうかは、以下のように確認することができる。例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、接触時にがん特異的抗原発現細胞に強く結合するが、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む固定化された直鎖状ペプチドには実質的に結合しない。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、抗原として抗原発現細胞を用いたELISAまたは蛍光活性化細胞選別（FACS）の抗原発現細胞に対する結合活性と比較して、結合活性が80％以下、概して50％以下、好ましくは30％以下、および特に好ましくは15％以下であることを意味する。
【０１３７】
ELISA形式において、抗原発現細胞に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性を、酵素反応によって生じたシグナルのレベルを比較することによって、定量的に評価することができる。具体的には、抗原発現細胞が固定化されたELISAプレートに、試験抗原結合分子を添加する。次いで、細胞に結合した試験抗原結合分子を、試験抗原結合分子を認識する酵素標識された抗体を用いて検出する。あるいは、FACSを用いる場合は、試験抗原結合分子の希釈系列を調製し、抗原発現細胞に対する抗原結合力価を決定して、抗原発現細胞に対する試験抗原結合分子の結合活性を比較することができる。
【０１３８】
緩衝液などに懸濁した細胞の表面上に発現している抗原に対する試験抗原結合分子の結合は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。公知のフローサイトメーターには、例えば、以下のデバイスが含まれる：
FACSCanto（商標）II
FACSAria（商標）
FACSArray（商標）
FACSVantage（商標） SE
FACSCalibur（商標）（すべてBD Biosciencesの商品名である）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC（すべてBeckman Coulterの商品名である）。
【０１３９】
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性をアッセイするための適している方法には、例えば、以下の方法が含まれる。最初に、抗原発現細胞を、試験抗原結合分子と反応させ、次いで、これを、FITC標識された二次抗体で染色し、FACSCalibur（BD）を用いる。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって得られた蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した抗体の量を反映する。すなわち、結合した試験抗原結合分子の量によって表される試験抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
【０１４０】
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、別の抗原結合分子と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2つの分子間の競合に基づいて評価することができる。抗原結合分子間の競合は、クロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。
【０１４１】
具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングしている抗原を、候補競合抗原結合分子の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、試験抗原結合分子をそれに添加する。ウェル中の抗原に結合した試験抗原結合分子の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗原結合分子の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する競合抗原結合分子の親和性が高いほど、抗原でコーティングされたウェルに対する試験抗原結合分子の結合活性は低い。
【０１４２】
抗原を介してウェルに結合した試験抗原結合分子の量は、抗原結合分子を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗原結合分子は、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。抗原結合分子はまた、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することもできる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
候補競合抗原結合分子が、競合抗原結合分子の非存在下で実施される対照実験における結合活性と比較して少なくとも20％、好ましくは少なくとも20〜50％、およびより好ましくは少なくとも50％、抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合をブロックすることができる場合、試験抗原結合分子は、競合抗原結合分子が結合する同じエピトープに実質的に結合するか、または同じエピトープへの結合について競合すると判定される。
【０１４３】
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が結合するエピトープの構造が、既に同定されている場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、エピトープを形成するペプチド中へのアミノ酸変異の導入によって調製されるペプチドに対する2つの抗原結合分子の結合活性を比較することによって、評価することができる。
【０１４４】
そのような結合活性を測定するための方法として、例えば、変異が導入されている直鎖状ペプチドに対する試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性は、上記のELISA形式での比較によって測定される。ELISA法の他にも、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子をカラムに通過させること、および次いで、溶出液中の溶出された抗原結合分子を定量することによって、カラムに結合した変異体ペプチドに対する結合活性を決定することができる。例えば、GST融合ペプチドの形態で、変異体ペプチドをカラムに吸着させるための方法が、公知である。
【０１４５】
あるいは、同定されたエピトープが立体構造エピトープである場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、以下の方法によって評価することができる。最初に、抗原結合ドメインが標的とする抗原を発現する細胞、および変異が導入されたエピトープを有する抗原を発現する細胞を調製する。これらの細胞をPBSなどの適切な緩衝液に懸濁することによって調製される細胞懸濁液に、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を添加する。次いで、細胞懸濁液を緩衝液で適宜洗浄し、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を認識することができるFITC標識された抗体をそれに添加する。標識された抗体で染色された細胞の蛍光強度および数を、FACSCalibur（BD）を用いて決定する。試験抗原結合分子および対照抗原結合分子は、適している緩衝液を用いて適宜希釈し、所望の濃度で用いる。例えば、それらを、10μg/ml〜10 ng/mlの範囲内の濃度で用いてもよい。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって決定された蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した標識された抗体の量を反映する。すなわち、結合した標識された抗体の量によって表される試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
【０１４６】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、
（ａ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸26位のA、D、E、I、G、K、L、M、N、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27位のD、F、G、I、M、もしくはL；
アミノ酸28位のD、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸29位のFもしくはW；
アミノ酸30位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のF、I、N、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のA、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸33位のW；
アミノ酸34位のF、I、L、M、もしくはV；
アミノ酸35位のF、H、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸50位のE、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸51位のI、K、もしくはV；
アミノ酸52位のK、M、R、もしくはT；
アミノ酸52b位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸52c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のE、F、G、H、L、M、N、Q、W、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸57位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸58位のA、F、H、K、N、P、R、もしくはY；
アミノ酸59位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸60位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸61位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸62位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸63位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸64位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸65位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸93位のHもしくはR；
アミノ酸94位のF、G、H、L、M、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸95位のIもしくはV；
アミノ酸96位のF、H、I、K、L、M、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸97位のF、Y、もしくはW；
アミノ酸98位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸99位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100b位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100c位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100d位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100f位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100g位のA、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸100h位のA、D、E、G、H、I、L、M、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸100i位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸101位のA、D、F、I、L、M、N、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸102位のA、D、E、F、G、H、I K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
ならびに／または
（ｂ）以下の位置（すべてKabatナンバリングによる）の各々に、その位置について示される以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個を含む、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
アミノ酸24位のA、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸25位のA、G、N、P、S、T、もしくはV；
アミノ酸26位のA、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸27位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27a位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27b位のA、I、L、M、P、T、もしくはV；
アミノ酸27c位のA、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、もしくはY；
アミノ酸27d位のA、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸27e位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸28位のG、N、S、もしくはT；
アミノ酸29位のA、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、W、もしくはY；
アミノ酸30位のA、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、もしくはY；
アミノ酸31位のI、L、Q、S、T、もしくはV；
アミノ酸32位のF、W、もしくはY；
アミノ酸33位のA、F、H、L、M、Q、もしくはV；
アミノ酸34位のA、H、もしくはS；
アミノ酸50位のI、K、L、M、もしくはR；
アミノ酸51位のA、E、I、K、L、M、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸52位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸53位のA、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、もしくはY；
アミノ酸54位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸55位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、もしくはY；
アミノ酸56位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸89位のA、G、K、S、もしくはY；
アミノ酸90位のQ；
アミノ酸91位のG；
アミノ酸92位のA、D、H、K、N、Q、R、S、もしくはT；
アミノ酸93位のA、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、もしくはY；
アミノ酸94位のA、D、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、もしくはV；
アミノ酸95位のP；
アミノ酸96位のFもしくはY；および
アミノ酸97位のA、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、もしくはV
を含む。
【０１４７】
本発明の抗原結合分子は、当業者に一般に知られている方法によって作製することができる。例えば、抗体を、以下に示す方法によって調製することができるが、本発明の抗体を調製するための方法は、それに限定されない。ポリペプチドをコードする単離された遺伝子の適切な宿主中への移入による抗体調製のために、宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが、当技術分野において公知である。これらの発現系のすべてを、本発明の抗原結合分子の単離に適用することができる。宿主細胞として真核細胞を用いる場合には、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞を、適宜用いることができる。具体的には、動物細胞の例には、以下の細胞が含まれ得る：
（１）哺乳類細胞、例えばCHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、COS（サル腎臓細胞株）、骨髄腫細胞（Sp2/O、NS0など）、BHK（ベビーハムスター腎臓細胞株）、HEK293（剪断されたアデノウイルス(Ad)5 DNAを伴うヒト胎児腎臓細胞株）、PER.C6細胞（アデノウイルス5型(Ad5) E1AおよびE1B遺伝子で形質転換されたヒト胎児網膜細胞株）、Hela、およびVero（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）；
（２）両生類細胞、例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；ならびに
（３）昆虫細胞、例えばsf9、sf21、およびTn5。
抗体はまた、大腸菌（mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225）または酵母（WO2000023579）を用いて調製することもできる。大腸菌を用いて調製された抗体は、糖鎖が付加されていない。他方、酵母を用いて調製された抗体は、糖鎖が付加されている。
【０１４８】
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードする、抗体重鎖をコードするDNA、および抗体の軽鎖をコードするDNAを発現させる。可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖または軽鎖をコードするDNAは、例えば、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメインをコードするDNAを取得すること、および、該ドメイン中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の異なるアミノ酸をコードするように、適宜置換を導入することによって、取得することができる。
【０１４９】
あるいは、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換されたタンパク質をコードするDNAを、予め設計し、化学合成して、可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAを取得してもよい。アミノ酸置換部位および置換の種類は、特に限定されない。アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
アミノ酸改変は、置換に限定されず、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１５０】
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAはまた、別々の部分DNAとして作製することができる。部分DNAの組み合わせの例には、可変ドメインをコードするDNAと定常ドメインをコードするDNA；およびFabドメインをコードするDNAとFcドメインをコードするDNAが含まれるが、それらに限定されない。同様に、軽鎖をコードするDNAもまた、別々の部分DNAとして作製することができる。
【０１５１】
これらのDNAは、以下の方法によって発現させることができる：例えば、重鎖可変ドメインをコードするDNAを、重鎖定常ドメインをコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、重鎖発現ベクターを構築する。同様に、軽鎖可変ドメインをコードするDNAを、軽鎖定常ドメインをコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖および軽鎖の遺伝子を、単一のベクターに組み込んでもよい。
【０１５２】
目的の抗体をコードするDNAは、発現制御領域、例えば、エンハンサーおよびプロモーターの制御下で発現するように、発現ベクターに組み込む。次に、結果として生じた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。この場合には、適切な宿主と発現ベクターを、組み合わせて用いることができる。
【０１５３】
ベクターの例には、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、およびpCR-Scriptが含まれる。これらのベクターに加えて、例えば、pGEM-T、pDIRECT、またはpT7も、cDNAのサブクローニングおよび切り出しの目的で用いることができる。
【０１５４】
特に、本発明の抗体を作製する目的でベクターを用いるためには、発現ベクターが有用である。例えば、宿主がJM109、DH5α、HB101、またはXL1-Blueなどの大腸菌である場合は、発現ベクターは、大腸菌における効率的な発現を可能にするプロモーター、例えば、lacZプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWard et al., Nature (1989) 341, 544-546；およびFASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBetter et al., Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターを有することが不可欠である。そのようなベクターの例には、上述のベクター、ならびにpGEX-5X-1（Pharmacia製）、「QIAexpress system」（Qiagen N.V.製）、pEGFP、およびpET（この場合、宿主は好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21である）が含まれる。
【０１５５】
ベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列を含有してもよい。大腸菌のペリプラズムにおける産生の場合には、pelBシグナル配列（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4397）を、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列として用いることができる。ベクターは、例えば、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法、またはDEAE-デキストラン法の使用によって、宿主細胞に移入することができる。
【０１５６】
大腸菌用の発現ベクターに加えて、本発明のポリペプチドを作製するためのベクターの例には、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen Corp.製）、pEGF-BOS (参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、およびpCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL製）、およびpBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1およびpMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、およびpAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen Corp.製）、pNV11、およびSP-Q01）、ならびに枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608およびpKTH50）が含まれる。
【０１５７】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、またはHEK293細胞などの動物細胞における発現を目的として、ベクターは、細胞内発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMulligan et al., Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CAGプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGene. (1991) 108, 193）、またはCMVプロモーターを有することが不可欠であり、より好ましくは、形質転換された細胞をスクリーニングするための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）によりマーカーとして働くことができる薬剤耐性遺伝子）を有する。このような性質を有するベクターの例には、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。加えて、遺伝子コピー数を増加させる目的で、EBNA1タンパク質を共発現させてもよい。この場合、複製起点OriPを有するベクターを用いる（Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203；およびBiotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7）。
【０１５８】
遺伝子を安定的に発現させ、かつ細胞内の遺伝子コピー数を増加させるように意図される例示的な方法には、核酸合成経路が欠損したCHO細胞を、それを相補するものとして働くDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOI）で形質転換すること、および遺伝子増幅においてメトトレキセート（MTX）を用いることが含まれる。遺伝子を一過性に発現させるように意図される例示的な方法には、SV40 T抗原遺伝子をその染色体上に有するCOS細胞を用いて、SV40の複製起点を有するベクター（pcDなど）で細胞を形質転換することが含まれる。ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）などに由来する複製起点もまた、用いることができる。宿主細胞系において遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、またはジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子などの選択マーカーを含有することができる。
【０１５９】
抗体は、例えば、形質転換された細胞を培養すること、次いで、分子形質転換された細胞内からまたはその培養液から抗体を分離することによって、回収することができる。抗体は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、C1q、FcRn、プロテインAおよびプロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いることによって、分離し、精製することができる。
【０１６０】
ノブ-イントゥ-ホールテクノロジー（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）または電荷反発の導入によってH鎖間の意図されない会合を抑制する技術（WO2006/106905）などの上述の技術を、多重特異性抗体を効率的に調製するための方法に適用することができる。
【０１６１】
本発明は、さらに、本発明の抗原結合分子を作製するための方法を提供し、具体的には、2つの異なる抗原（第１の抗原および第２の抗原）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域（この可変領域を第１の可変領域と言う）と、CD3およびCD137とは異なる第３の抗原に結合する可変領域（この可変領域を第２の可変領域と言う）とを含む抗原結合分子を作製するための方法であって、第１の可変領域の多様なアミノ酸配列を含有する抗原結合分子ライブラリーを調製する工程を含む、方法を提供する。
【０１６２】
その例には、以下の工程を含む作製方法が含まれ得る：
（i）各々がCD3またはCD137に結合するその抗体可変領域において少なくとも1個のアミノ酸が改変された抗原結合分子のライブラリーを調製する工程であって、該改変された可変領域の少なくとも1個のアミノ酸が互いに異なる、工程；
（ii）調製されたライブラリーから、CD3およびCD137に対する結合活性を有するが、CD3とCD137に同時には結合しない可変領域を含む抗原結合分子を選択する工程；
（iii）工程（ii）において選択された抗原結合分子の可変領域をコードする核酸と、第３の抗原に結合する抗原結合分子の可変領域をコードする核酸とを含む宿主細胞を培養して、CD3およびCD137に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合しない抗体可変領域と、第３の抗原に結合する可変領域とを含む抗原結合分子を発現させる工程；ならびに
（iv）宿主細胞培養物から抗原結合分子を回収する工程。
【０１６３】
この作製方法において、工程（ii）は、以下の選択工程であってもよい：
（v）調製されたライブラリーから、CD3およびCD137に対する結合活性を有するが、各々が異なる細胞上で発現しているCD3とCD137に同時には結合しない可変領域を含む抗原結合分子を選択する工程。
【０１６４】
工程（i）において用いられる抗原結合分子は、これらの分子が抗体可変領域を各々含む限り、特に限定されない。抗原結合分子は、Fv、Fab、もしくはFab'などの抗体断片であってもよく、またはFc領域を含有する抗体であってもよい。
【０１６５】
改変されるアミノ酸は、例えば、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域における、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
【０１６６】
本発明において、1つのアミノ酸改変が、単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が、組み合わせて用いられてもよい。
複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わせる改変の数は、特に限定されず、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
組み合わされる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。
【０１６７】
アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
【０１６８】
アミノ酸残基の改変にはまた、CD3またはCD137に結合する抗体可変領域中の上述の領域におけるアミノ酸のランダム改変；および、CD3またはCD137に対する結合活性を有することが以前に知られているペプチドの上述の領域への挿入も含まれる。本発明の抗原結合分子は、CD3およびCD137に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができない可変領域を、このように改変された抗原結合分子の中から選択することによって、取得することができる。
【０１６９】
可変領域が、CD3およびCD137に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができないかどうか、ならびにさらに、可変領域が、CD3およびCD137のいずれか一方が細胞上に存在し、他方の抗原が単独で存在するか、抗原の両方が各々単独で存在するか、または抗原の両方が同じ細胞上に存在する場合には、CD3およびCD137の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているこれらの抗原に同時には結合することができないかどうかもまた、上述の方法に従って確認することができる。
【０１７０】
本発明は、さらに、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、DNAまたはRNAなどの任意の形態であってもよい。
【０１７１】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。ベクターの種類は、ベクターを受ける宿主細胞に従って、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述のベクターのいずれかを用いることができる。
【０１７２】
本発明は、さらに、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述の宿主細胞のいずれかを用いることができる。
【０１７３】
本発明はまた、本発明の抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の抗原結合分子に薬学的に許容し得る担体を添加することによって、当技術分野において公知の方法に従って製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、水または任意の他の薬学的に許容し得る溶液を伴う無菌性溶液または懸濁液の非経口注射の形態で用いることができる。例えば、医薬組成物は、抗原結合分子を、薬理学的に許容し得る担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などとの適切な組み合わせで、一般に認められた製薬実施に要求される単位剤形で混合して、製剤化され得る。担体の具体例には、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセタート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、サッカライド、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、および無機塩が含まれ得る。そのような調製物における活性成分の量は、指示された範囲内の適切な用量が達成され得るように決定される。
【０１７４】
注射用の無菌組成物は、注射用蒸留水などのビヒクルを用いて、従来の製薬実施に従って製剤化することができる。注射用の水溶液の例には、生理食塩水、グルコースならびに他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウム）を含有する等張液が含まれる。これらの溶液は、適切な溶解補助剤、例えば、アルコール（具体的には、エタノール）もしくはポリアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート80（商標）もしくはHCO-50と組み合わせて用いられ得る。
【０１７５】
油性溶液の例には、ゴマ油および大豆油が含まれる。これらの溶液は、溶解補助剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いられ得る。溶液は、さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、ならびに酸化防止剤と混合され得る。このように調製された注射液は、通常、適切なアンプル中に充填される。本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与される。その剤形の具体例には、注射剤、鼻腔内投与剤、経肺投与剤、および経皮投与剤が含まれる。注射の例には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれ、それを通して医薬組成物を全身にまたは局所に投与することができる。
【０１７６】
投与方法は、患者の年齢および症状に応じて適宜選択することができる。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の用量は、例えば、1用量につき体重1kgあたり0.0001〜1000 mgの範囲内で選択することができる。あるいは、用量は、例えば、1患者あたり0.001〜100000 mgの範囲内で選択することができるが、必ずしもこれらの数値に限定されない。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などに応じて変動するが、当業者は、用量および方法を適宜選択することができる。
【０１７７】
本発明はまた、本発明の抗原結合分子を投与する工程を含む、がんを処置するための方法、がんの処置における使用のための本発明の抗原結合分子、がんの治療剤の作製における本発明の抗原結合分子の使用、および、本発明の抗原結合分子を使用する工程を含む、がんの治療剤を作製するためのプロセスも提供する。
【０１７８】
本明細書において用いられるアミノ酸の三文字表記および対応する一文字表記は、以下のように定義される：アラニン：AlaおよびA、アルギニン：ArgおよびR、アスパラギン：AsnおよびN、アスパラギン酸：AspおよびD、システイン：CysおよびC、グルタミン：GlnおよびQ、グルタミン酸：GluおよびE、グリシン：GlyおよびG、ヒスチジン：HisおよびH、イソロイシン：IleおよびI、ロイシン：LeuおよびL、リジン：LysおよびK、メチオニン：MetおよびM、フェニルアラニン：PheおよびF、プロリン：ProおよびP、セリン：SerおよびS、スレオニン：ThrおよびT、トリプトファン：TrpおよびW、チロシン：TyrおよびY、ならびにバリン：ValおよびV。
【０１７９】
本明細書に記載される局面の1つまたはその2つ以上の任意の組み合わせもまた、当業者の技術常識に基づいて技術的矛盾が生じない限り、本発明に含まれることを、当業者は理解すべきである。
【０１８０】
本明細書において引用される参照文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１８１】
本発明は、以下の実施例に関連してさらに例示される。しかし、本発明は、以下の実施例によって限定されるようには意図されない。
【実施例】
【０１８２】
［実施例１］腫瘍細胞に対するインビトロ細胞傷害活性の改善のための、親Dual-Fab H183L072に由来する親和性成熟バリアントのスクリーニング
１．１．親和性成熟バリアントの配列
親Dual-Fab H183L072（重鎖：配列番号：１；軽鎖：配列番号：５７）の結合親和性を増加させるために、H183L072を鋳型として用いて、可変領域に単一のまたは複数の変異を導入することにより、1,000個よりも多いDual-Fabバリアントを生成した。抗体を、Expi293（Invitrogen）で発現させ、プロテインA精製、続いて、ゲル濾過が必要な場合にはゲル濾過によって精製した。複数の変異を有する15個の示されたバリアントの配列を、表１．１および１．２に列記し、結合動態を、実施例１．２．２において、下記のBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃ および／または37℃で評価する。可変領域上の単一の変異による、ヒトCD137およびヒトCD3に対する親和性の変化の倍率を、表１．３に列記する。
【０１８３】
【表１．１ａ】
2022502010.tif 000002
【０１８４】
【表１．１ｂ】
2022502010.tif 000003
【０１８５】
【表１．２ａ】
2022502010.tif 000004
【０１８６】
【表１．２ｂ】
2022502010.tif 000005
2022502010.tif 000006
2022502010.tif 000007
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【０１８７】
【表１．３ａ】
2022502010.tif 000009
【０１８８】
【表１．３ｂ】
2022502010.tif 000010
【０１８９】
【表１．３ｃ】
2022502010.tif 000011
【表１．３ｄ】
2022502010.tif 000012
【０１９０】
表１．３ａ〜１．３ｄにおいては、Kabatナンバリングによる変異した位置およびそれぞれの位置の元のアミノ酸を、上の2列に示す。値は、一番左の列に示した変異の各々を各位置中に導入した時の、親和性の変化倍率を表す。
【０１９１】
１．２．親和性成熟バリアントの結合動態情報
１．２．１．ヒトCD3およびCD137の発現および精製
ヒトCD3複合体（ヒトCD3egリンカー）のγサブユニットおよびεサブユニットを29-merリンカーによって連結し、Flag-タグをγサブユニットのC末端に融合させた（配列番号：８４、表1.1aおよび1.2a）。この構築物を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD3egリンカーを発現する馴化培地を、Q HP樹脂（GE healthcare）を充填したカラムを用いて濃縮し、次いで、FLAG-タグ親和性クロマトグラフィーに適用した。ヒトCD3egリンカーを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD3egリンカーを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
【０１９２】
そのC末端にヘキサヒスチジン（His-タグ）およびビオチンアクセプターペプチド（BAP）を有するヒトCD137細胞外ドメイン（ECD）（配列番号：２０１、表1.1aおよび1.2a）を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD137 ECDを発現する馴化培地をHisTrap HPカラム（GE healthcare）に適用し、イミダゾール（Nacalai）を含有する緩衝液で溶出した。ヒトCD137 ECDを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD137 ECDを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
【０１９３】
１．２．２．ヒトCD3およびCD137に対する親和性測定
ヒトCD3に対するDual-Fab抗体（Dual-Ig）の結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃で評価した。抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化した。抗体を抗Fcセンサー表面の上に捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137をフローセルの上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、3M MgCl2でサイクル毎に再生させた。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定させた。CD137結合親和性アッセイを、アッセイ温度を37℃に設定したことを除いて、同じ条件で行った。組換えヒトCD3およびCD137に対するDual-Fab抗体の結合親和性を表１．４に示す。
【０１９４】
【表１．４】
2022502010.tif 000013
【０１９５】
１．３．二重特異性抗体および三重特異性抗体の調製
Dual-Igバリアントの有効性を評価するために、腫瘍抗原を認識する1つのアームと、エフェクター細胞、主にT細胞を認識する別のアームとを有する、二重特異性抗体または三重特異性抗体を生成した。腫瘍抗原グリピカン-3（GPC3）を標的とする抗GPC3（重鎖：配列番号：２０６；軽鎖：配列番号：２０７）、または陰性対照であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）（本明細書においてCtrlと名づけられる）抗体を、抗標的結合アームとして用い、実施例１．１および１．２に記載される抗体を、（Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Mar 26; 110(13): 5145-5150）に記載されている方法によるFab-アーム交換（FAE）を用いて生成した。二重特異性抗体または三重特異性抗体の分子形式は、従来のIgGと同じ形式である。例えば、GPC3/H1643L581は、GPC3、CD3、およびCD137に結合することができる三重特異性抗体である。実施例１．１に記載されるどのDual-Ig三重特異性バリアントが、CD137活性に起因する細胞傷害活性の向上に寄与するかを特定するために、GPC3およびCD3に結合することができるGPC3/CD3ε二重特異性抗体（表１．１）を、対照として含めた。生成したすべての抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱したサイレントFcを含む。
【０１９６】
［実施例２］腫瘍細胞に対する、親Dual-Fab H183L072に由来する親和性成熟バリアントによるインビトロ細胞傷害活性の評価
２．１．インビトロでの親和性成熟バリアントのCD3アゴニスト活性の評価
親和性成熟の結果としてCD3アゴニスト活性を評価するために、NFAT-luc2 Jurkatルシフェラーゼアッセイを実施する。簡潔に述べると、細胞膜上にヒトGPC3を発現する4×103細胞/ウェルのSK-pca60細胞（参考実施例１３）を、標的細胞として用い、0.02、0.2、および2 nMの三重特異性抗体の存在下で24時間、2.0×104細胞/ウェルのNFAT-luc2 Jurkat細胞（E:T比 5）と共培養した。バリアントを、図１．１の上のパネルのプレート1および図１．１の下のパネルのプレート2に分けた。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、G7940）で、製造業者の説明書に従って検出した。GloMax（登録商標）Explorer System（Promega #GM3500）を用いて、発光（単位）を検出し、Graphpad Prism 7を用いて、捕捉値をプロットした。親三重特異性抗体GPC3/H183L072および二重特異性抗体GPC3/CD3εを、2 nMの濃度で含めた。図１．１は、大部分のバリアントが類似したCD3アゴニスト活性を有することを示した。特に2 nMで、バリアントは、親H183L072と類似した活性を有する。図１．１の上のパネルは、プレート1におけるすべてのバリアントが類似したCD3アゴニスト活性を有することを示した。図１．１の下のパネルは、プレート2におけるバリアントのうち、H1610L939がわずかにより弱いCD3アゴニスト活性を有し、他方、H2591L581が最も強いCD3アゴニスト活性を有することを示した。
【０１９７】
２．２．インビトロでの親和性成熟バリアントのCD137アゴニスト活性の評価
どの抗体バリアントが親和性成熟の結果として強いCD137アゴニスト活性をもたらし得たかを評価するために、エフェクター細胞としてGloResponse（商標）NF-κB-Luc2/CD137 Jurkat細胞株（Promega #CS196004）を用い、上記と同様に、SK-pca60細胞株（参考実施例13）を標的細胞として用いた。4.0×103細胞/ウェルのSK-pca60細胞（標的細胞）および2.0×104細胞/ウェルのNF-κB-Luc2/CD137 Jurkat（エフェクター細胞）の両方を、白底96ウェルアッセイプレート（Costar、3917）の各ウェルにE：T比5で加えた。抗体を0.5 nM、2.5nM、および5 nMの濃度で各ウェルに加え、37℃、5％ CO2で37℃にて5時間インキュベートした。表れたルシフェラーゼを、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、G7940）で、製造業者の説明書にしたがって検出した。GloMax（登録商標）Explorer System（Promega #GM3500）用いて、発光（単位）を検出し、Graphpad Prism 7を用いて、捕捉値をプロットした。
【０１９８】
図１．２においては、抗体バリアントを、プレート1（図１．２の上のパネル）およびプレート2（図１．２の下のパネル）に分けた。両方のプレートにおけるすべてのバリアントは、陰性対照として用いたGPC3/CD3εと比較して、検出可能なCD137アゴニスト活性を有する。親和性成熟前の親抗体であるGPC3/H183L072もまた、両方のプレートにおいて対象として用いた。図１．２において、すべてのバリアントは、CD137結合についての親和性成熟後に、親抗体GPC3/H183L072よりも強いCD137アゴニスト抗体を示した。したがって、プレート1（図１．２の上のパネル）におけるGPC3/H1643L581およびGPC3/H868L581ならびにプレート2（図１．２の下のパネル）におけるGPC3/H2594L581およびGPC3/H2591L581は、より強いCD137アゴニスト活性をもたらした上位バリアントであった。これに対して、プレート1におけるGPC3/H1550L918ならびにプレート2におけるGPC3/H1610L581およびGPC3/H1610L939などのバリアントは、より弱いCD137活性を示した。
【０１９９】
まとめると、図１．１および１．２は、バリアントのうち、プレート1におけるGPC3/H1643L581、GPC3/H868L581およびプレート2におけるGPC3/H2591L581が、Jurkat細胞において同様に強い活性を有するように見えるのに対して、GPC3/H1610L939は、より弱い活性を有することを示す。
【０２００】
２．３．親和性成熟バリアントのインビトロ細胞傷害活性の評価
CD3、CD137活性化についての知見をインビトロ細胞傷害活性に拡大適用するために、前述の親和性成熟バリアントを、ヒト末梢血単核細胞を用いたSK-pca60細胞に対するT細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）の活性の評価に供した。
【０２０１】
２．３．１．凍結ヒトPBMCの調製
商業的に購入したPBMCを含有するクライオバイアル（STEMCELL Technologies.）を、37℃の水浴中に置き、細胞を解凍した。次いで、細胞を、9 mLの培地（標的細胞を培養するために用いられる培地）を含有する15 mLファルコンチューブ中に分注した。次いで、細胞懸濁液を、1,200 rpmで5分間、室温での遠心分離に供した。上清を静かに吸引し、新鮮な温めた培地を再懸濁のために添加して、ヒトPBMC溶液として用いた。
【０２０２】
２．３．２．抗GPC3親和性成熟Dual-Fab三重特異性抗体を用いたTDCC活性の測定
細胞傷害活性を、PBMCの存在下でxCELLigence Real-Time Cell Analyzer（Roche Diagnostics）を用いて腫瘍細胞増殖抑制率を観察することによって評価した。図１．３は、抗GPC3親和性成熟Dual-Fab三重特異性抗体のTDCC活性を示す。SK-pca60細胞株を、標的細胞として用いた。標的細胞をディッシュから剥離し、細胞を3.5×103細胞/ウェルに調整することによって100μL/ウェルの分割量で、細胞をE-plate 96（Roche Diagnostics）にプレーティングし、xCELLigence Real-Time Cell Analyzerを用いて、細胞増殖の測定を開始した。24時間後に、プレートを取り出して、各濃度（5 nMから開始した3倍系列希釈、すなわち、0.19、0.56、1.67、および5 nM）に調製したそれぞれの抗体50μLを、プレートに加えた。室温で15分間の反応後に、（実施例２．３．１）において調製された50μLの新鮮なヒトPBMC溶液を、0.5のエフェクター：標的比（すなわち、1.75×103細胞/ウェル）で加え、細胞増殖の測定を、xCELLigence Real-Time Cell Analyzerを用いて再開した。反応は、5％二酸化炭素ガスの条件下、37℃で実施した。CD137シグナル伝達は、T細胞生存を増強し、かつ活性化誘導細胞死を阻止するため、TDCCアッセイを低いE：T比で実施した。CD137活性化が寄与する優れた細胞傷害活性を観察するために、期間の延長が必要とされる場合がある。よって、PBMCの添加のおよそ120時間後に、下記の式を用いて、細胞増殖抑制（CGI）率（％）を決定した。計算において用いたxCELLigence Real-Time Cell Analyzerから得られたセルインデックス値は、抗体添加の直前の時点のセルインデックス値を1として定義した正規化値であった。
細胞増殖抑制率（％）＝（A−B）×100／（A−1）
Aは、抗体を添加していないウェル（標的細胞およびヒトPBMCのみを含有する）におけるセルインデックス値の平均値を表し、Bは、標的ウェルのセルインデックス値の平均値を表す。試験は三連で実施した。
【０２０３】
上記の実施例でのように、親和性成熟バリアントを2プレートに分け、GPC3/H1643L581を、図１．３における参照のために内部プレート対照とした。大部分のバリアントは同様のTDCC活性を示すが、両方のプレートにおいて、バリアントのうち、H1643L581が、0.56 nMおよび1.67 nMのより低い濃度で相対的により強いTDCC活性を示したことを観察することができる。0.56 nMの濃度で、図１．３ａは、GPC3/H2591L581が相対的により弱いことを示し、他方、図１．３ｂは、GPC3/H1610L939が相対的により弱いことを示した。
【０２０４】
２．３．３．抗GPC3親和性成熟Dual-Fab三重特異性抗体を用いたサイトカイン放出の測定
抗体のインビトロ効力をさらに確認するために、それらをまた、サイトカイン放出についても評価した。実施例２．３．２において同様に実施したTDCCアッセイ由来の48時間での上清を採取して、サイトカインの存在について評価した。大部分の抗体は、図１．１におけるGPC3/CD3εと同様のCD3アゴニスト活性を示すため、GPC3/CD3εをこのアッセイに加えて、CD137との相乗活性の結果としてのサイトカイン放出を評価した。同様に、GPC3/H1643L581を、内部プレート対照として用いた。総サイトカイン放出を、cytometric bead array（CBA） Human Th1/T2 Cytokine kit II（BD Biosciences #551809）を用いて評価した。IFNγ（図１．３ｃ）、IL-2（図１．３ｄ）、およびIL-6（図１．３ｅ）を評価した。
【０２０５】
図１．３ｃおよび１．３ｄに示すように、GPC3/H2591L581およびGPC3/H1643L581は、プレート1において5 nMおよび1.67 nMで高いIFNγおよびIL-2をもたらした上位2バリアントである。プレート2において、GPC3/H1610L939、GPC3/H2594L581、およびGPC3/H1643L581は、5 nMで相対的に強いサイトカイン放出を示す。しかし、GPC3/H1643L581のみが、1.67 nMでより強いサイトカイン放出を示す。図１．３ｅに示すIL-6レベルについて言うと、0.56 nMおよび0.19 nMでより低いIL-6のレベルを示したGPC3/H2591L581以外は、すべてのバリアントが、プレート1におけるGPC3/CD3εと同様のレベルを示した。同様にプレート2においては、すべてのバリアントが、GPC3/H1643L581と同様のサイトカイン放出レベルを示す。まとめると、Dual Fabバリアントは、IL-6レベルを有意に増加させることなく、GPC3/CD3εと比較して改善されたIFNγおよびIL-2を示すことができる。
【０２０６】
まとめると、親和性成熟バリアントは、サイトカイン放出に対応するTDCC活性を惹起することができる、より強いCD137アゴニスト活性を示す。特に、バリアントは、GPC3/CD3εと比べて改善されたIFNγおよびIL-2のレベルを示した。
【０２０７】
［実施例３］GPC3/CD3/ヒトCD137（2＋1）三重特異性抗体および抗GPC3/Dual（1＋1）三重特異性抗体のオフターゲット細胞傷害活性の評価
３．１．抗GPC3/CD137xCD3（2＋1）三重特異性抗体の調製
標的非依存性の細胞傷害活性およびサイトカイン放出を調べるために、CrossMabおよびFAEテクノロジーを利用することによって、三重特異性抗体を生成した（図２．１および２．２）。各アームが2つの結合ドメインを有し、その結果、1つの分子中に4つの結合ドメインを有する四価IgG様分子である抗体A（mAb A）を、上述のようなCrossMabで生成した。二価IgGである抗体B（mAb B）は、従来のIgGと同じ形式である。mAb AおよびmAb Bの両方のFc領域は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱したサイレントなFcγRであり、脱グリコシル化され、かつFAEに適用可能である。6つの三重特異性抗体を構築した。6つの三重特異性抗体における各Fv領域の標的抗原を、表２．１に示す。mAb A、mAb B、およびmAb ABの結合ドメインの各々の命名規則を、図２．２に示す。それぞれの三重特異性抗体であるmAb ABを生成するためのmAb AとmAb Bのペア、およびその配列番号を、表２．２および表２．２に示す。WO2005/035584A1に記載された抗体CD3D(2)_i121（AN121と省略される）を、抗CD3抗体として用いた。表２に記載された三重特異性抗体を、上記の方法によって発現させ、精製した。
【０２０８】
【表２．１】
2022502010.tif 000014
【０２０９】
【表２．２】
2022502010.tif 000015
【０２１０】
【表２．３】
2022502010.tif 000016
【０２１１】
３．２．GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体の結合の評価
三重特異性抗体のヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて37℃で評価した。抗ヒトFc抗体（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗Fcセンサー表面上に抗体を捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137を、フローセル上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生させた。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定した。
【０２１２】
三重特異性抗体の組換えヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、表２．４に示す。
【０２１３】
【表２．４】
2022502010.tif 000017
【０２１４】
３．３．GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のヒトCD137発現細胞に対するオフターゲット細胞傷害活性の評価
2＋1形式の三重特異性抗体GPC3/CD137xCD3、GPC3/CtrlxCD3、または親Dual-Fab H183L072に由来する1＋1形式のGPC3/H183L072は、標的細胞であるGPC3を発現するSK-pca60の存在下でJurkat細胞の用量依存的活性化をもたらした（参考実施例１５−５；図２８）。2＋1形式の三重特異性形式のみが、hCD137を発現するCHOの存在下でJurkat細胞活性化をもたらしたが、GPC3/H183L072を用いた1＋1形式の三重特異性形式はもたらさなかったこともまた、示された（参考実施例１５−６；図２９）。これは、2＋1形式が、T細胞の腫瘍抗原非依存性活性化を潜在的にもたらし得ることを示唆した。
【０２１５】
H183L072の親和性成熟が、潜在的なオフターゲット細胞傷害活性をもたらし得るかどうかを調べるために、hCD3発現Jurkat細胞をhCD137発現CHO細胞と共培養し、三重特異性2＋1抗体形式に対して比較する同じ評価に、親和性成熟バリアントを供した。5.0×103細胞/ウェルのhCD137発現CHO（図２．３ｂ）または親CHO（図２．３ａ）を、0.5、5、および50 nMの三重特異性抗体の存在下で24時間、2.5×104個のNFAT-luc2 Jurkat細胞と共培養した。図２．３ａは、親CHO細胞と共培養した場合に、すべての三重特異性抗体によりJurkat細胞の非特異的活性化がないことを示した。しかし、GPC3/CD137xCD3およびCtrl/CD137xCD3は両方とも、hCD137発現CHO細胞の存在下でJurkat細胞を活性化できることが観察された。1＋1形式の親和性成熟バリアントは、hCD137発現CHO細胞と共培養した場合にJurkat細胞の活性化をもたらさなかった。まとめると、これは、三重特異性形式GPC3/CD137xCD3は、CD137結合の親和性成熟後でさえもGPC3/Dual（1＋1）形式のものとは異なり、標的または腫瘍抗原の結合とは独立して、Jurkat細胞活性化をもたらし、オフターゲット細胞傷害活性を生じ得ることを示唆する。
【０２１６】
３．４．GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体およびGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のPBMCからのオフターゲットサイトカイン放出の評価
オフターゲット毒性についての三重特異性形式の比較をまた、ヒトPBMC溶液を用いて評価した。簡潔に述べると、実施例２．３．１に記載されるように調製された2.0×105個のPBMCを、標的細胞の非存在下で、80、16、および3.2 nMの三重特異性抗体と48時間インキュベートした。IL-2はいずれの抗体によっても検出されなかったため、上清におけるIL-6、IFNγ、およびTNFαのレベルを、図２．４ａ〜２．４ｃに示す。サイトカイン放出の測定を、実施例２．３．３に記載されるものと同様に実施した。実施例２と同様に、親和性成熟バリアントを2プレートに分けた。図２．４に示すように、GPC3/CD137xCD3は、PBMCからのIFNγ（図２．４ａ）、TNFα（図２．４ｂ）、およびIL-6（図２．４ｃ）の放出をもたらしたが、抗GPC3/Dual-Fabはもたらさなかった。これらの結果は、GPC3/CD137xCD3三重特異性形式が、標的細胞の非存在下でPBMCの非特異的活性化をもたらしたことを示唆する。最後に、データは、Dual-Fab三重特異性1＋1形式が、オフターゲット毒性を伴わずに標的特異的エフェクター細胞活性化を付与できることを示した。
【０２１７】
［実施例４］GPC3/CD3ε二重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab（1＋1）三重特異性抗体のインビボ有効性の評価
４．１．抗GPC3/Dual-Fab、GPC3/CD3ε、およびGPC3/CD137二重特異性抗体の調製
インビボ有効性研究のための抗体を、実施例１．３に記載されるように生成した。実施例１において用いた抗GPC3/Dual-FabおよびGPC3/CD3εに加えて、抗CD137抗体を、実施例１．３においてFAEが実施される前に実施例１．１において生成された抗体（表１．１）でのように、二価形態として生成して、GPC3/CD137を取得した。ヒト化huNOGマウス研究について言うと、抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱したヒトFcを含む。これに対して、CD137/CD3ダブルヒト化マウス研究のためには、抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱したマウスFcを含む。
【０２１８】
４．２．CD137/CD3ダブルヒト化マウスの生成
ヒトCD137ノックイン（KI）マウス株を、マウス胚性幹細胞を用いてマウス内在性Cd137ゲノム領域をヒトCD137ゲノム配列で置き換えることによって生成した。ヒトCD3 EDG置換マウスは、CD3複合体の3つの成分CD3e、CD3d、およびCD3gがすべて、そのヒトカウンターパートCD3E、CD3D、およびCD3Gで置き換えられている株として確立された（Scientific Rep. 2018; 8: 46960）。CD137/CD3ダブルヒト化マウス株を、ヒトCD137 KIマウスをヒトCD3 EDG置換マウスと交配することによって確立した。
【０２１９】
４．３．LLC1/hGPC3細胞株の調製
マウスがん細胞株LL/2（LLC1）（ATCC）に、pCXND3-hGPC3をトランスフェクトし、500μg/ml G418での単一細胞クローン単離を行った。選択されたクローン（LLC1/hGPC3）の、hGPC3の発現を確認した。
【０２２０】
４．４．hCD3/hCD137マウスでの抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビボ有効性の評価
実施例４．１において調製された抗体を、そのインビボ有効性について担腫瘍モデルを用いて評価した。
インビボ有効性評価のために、以下「hCD3/hCD137マウス」と呼ばれる、実施例４．２において確立されたCD3/CD137ダブルヒト化マウスを用いた。
ヒトGPC3の安定な発現を有するLLC1/hGPC3細胞を、hCD3/hCD137マウス中に移植して、腫瘍形成が確認されたhCD3/hCD137マウスを、GPC3/H1643L0581、GPC3/CD137、またはGPC3/CD3ε抗体の投与によって処置した。
【０２２１】
より具体的には、LLC1/hGPC3モデルを用いたGPC3/H1643L0581の薬物有効性試験において、下記の試験を行った。LLC1/hGPC3（1×106細胞）を、hCD3/hCD137マウスの鼠径部皮下領域中に移植した。移植の日を、0日目と定義した。移植後9日目に、マウスを、その体重および腫瘍サイズに従ってランダム化して群に分けた。ランダム化の日に、GPC3/H1643L0581、GPC3/CD137、またはGPC3/CD3ε抗体を、6 mg/kgで尾静脈を通して静脈内投与した。併用療法群は、6 mg/kgのGPC3/CD3εおよび6 mg/kgのGPC3/CD137抗体で処置した。抗体は、1回のみ投与した。腫瘍体積および体重を、3〜4日毎に抗腫瘍試験システム（ANTES version 7.0.0.0）で測定した。
【０２２２】
結果として、抗腫瘍活性は、GPC3/CD3ε群およびGPC3/CD137群よりもGPC3/H1643L0581群において、より明らかに観察された（図３．１ａ）。
別のインビボ有効性評価において、LLC/hGPC3細胞を、hCD3/hCD137マウスの右側腹部中に移植した。9日目に、マウスを、その腫瘍体積および体重に基づいてランダム化して群に分け、ビヒクルまたは実施例４．１において調製された抗体をi.v.注射した。腫瘍体積を、週2回測定した。IL-6解析のために、処置の2時間後にマウスから採血した。血漿サンプルを、Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Th1 Panelにより製造業者のプロトコールに従って解析した。図３．１ｂおよび３．１ｃに示すように、GPC3/Dual群は、GPC3/CD3ε群と比較してより強い抗腫瘍活性、およびより少ないIL-6産生を示した。
【０２２３】
４．５．HuNOGマウスでの抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビボ有効性の評価
実施例４．１において調製された抗GPC3/Dual-Fab抗体、GPC3/CD3ε二重特異性抗体、およびGPC3/CD137二重特異性抗体の抗腫瘍活性を、sk-pca-13aヒト肝がんモデルにおいて試験した。GPC3/CD3ε二重特異性抗体をまた、GPC3/CD137二重特異性抗体との組み合わせでも試験した。sk-pca-13a細胞を、NOGヒト化マウスの皮下に移植した。
sk-pca-13a細胞株を取得するためには、ヒトGPC3遺伝子を、当業者によく知られている方法によってヒト肝臓腺がん細胞株SK-HEP-1（ATCC No. HTB-52）の染色体中に組み込んだ。
【０２２４】
NOG雌マウスを、In-Vivo Scienceから購入した。ヒト化のために、マウスを、亜致死的に放射線照射し、続いて1日後に、100,000個のヒト臍帯血細胞（ALLCELLS）を注射した。16週間後に、sk-pca-13a細胞（1×107細胞）をMatrigel（商標） Basement Membrane Matrix（Corning）と混合して、ヒト化NOGマウスの右側腹部に移植した。移植の日を、0日目と定義した。19日目に、マウスに、腫瘍体積および体重に基づいてランダム化して、ビヒクル（0.05％ Tweenを含有するPBS）、5 mg/kg GPC3/CD3ε、5 mg/kg GPC3/H1643L0581、または5 mg/kg GPC3/CD3εと5 mg/kg GPC3/CD137との組み合わせのいずれかをi.v.注射した。
【０２２５】
結果として、抗GPC3/Dual-Fab（GPC3/H1643L0581）は、GPC3/CD3εよりも強い抗腫瘍活性を示した（図３．２）。
【０２２６】
［実施例５］H0868L0581/hCD137複合体のX線結晶構造解析
５．１．共結晶解析のための抗体の調製
H0868L581を、hCD137タンパク質との共結晶解析のために選択した。二価抗体を、Expi293 Expression system（Thermo Fisher Scientific）を用いて一過性にトランスフェクトし、発現させた。培養上清を採取し、MabSelect SuRe親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare）およびその後のSuperdex200（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した。 
【０２２７】
５．２．ヒトCD137の細胞外ドメイン（24〜186）の発現および精製
第Xa因子切断可能リンカーを介してFcに融合したヒトCD137の細胞外ドメイン（CD137-FFc、配列番号：８１）を、キフネンシンの存在下でHEK293細胞において発現させた。培養培地由来のCD137-FFcを、親和性クロマトグラフィー（HiTrap MabSelect SuRe column, GE Healthcare）およびサイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column, GE healthcare）によって精製した。Fcを第Xa因子で切断して、結果として生じたCD137細胞外ドメインを、タンデムに接続されたゲル濾過カラム（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg, GE healthcare）およびプロテインAカラム（HiTrap MabSelect SuRe 1ml, GE Healthcare）でさらに精製し、その後、Benzamidine Sepharose樹脂（GE Healthcare）を用いて精製した。CD137細胞外ドメインを含有する画分をプールして、-80℃で保管した。
【０２２８】
５．３．H0868L0581および抗CD137対照抗体のFab断片の調製
結晶構造解析のための抗体を、Expi293 Expression system（Thermo Fisher Scientific）を用いて一過性にトランスフェクトし、発現させた。培養上清を採取し、MabSelect SuRe親和性クロマトグラフィー（GE Healthcare）およびその後のSuperdex200（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した。H0868L0581および公知の抗CD137対照抗体（以下137Ctrlと呼ばれる、重鎖は配列番号：８２、軽鎖は配列番号：８３）のFab断片を、Lys-C（Roche）での制限消化と、それに続く、Fc断片を除去するためのプロテインAカラム（MabSlect SuRe, GE Healthcare）、カチオン交換カラム（HiTrap SP HP, GE Healthcare）、およびゲル濾過カラム（Superdex200 16/60, GE Healthcare）上へのローディングを用いた、従来の方法によって調製した。Fab断片を含有する画分をプールして、-80℃で保管した。
【０２２９】
５．４．H0868L0581 Fab、137Ctrl、およびヒトCD137複合体の調製
精製されたCD137を、脱グリコシル化のためにGST-タグ融合エンドグリコシダーゼF1（社内）と混合し、続いて、ゲル濾過カラム（HiLoad 16/600 Superdex 200 pg, GE healthcare）およびプロテインAカラム（HiTrap MabSelect SuRe 1ml, GE Healthcare）を用いたCD137の精製を行った。精製されたCD137を、H0868L0581 Fabと混合した。複合体を、ゲル濾過カラム（Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE healthcare）によって精製し、その後、精製されたH0868L0581 FabおよびCD137複合体を、137Ctrlと混合した。三成分複合体を、25 mM HEPES pH7.3、100 mM NaClで平衡化されたカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex200 10/300 increase, GE Healthcare）によって精製した。
【０２３０】
５．５．結晶化
精製された複合体を、約10 mg/mLまで濃縮し、21℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法によって結晶化を実施した。リザーバー溶液は、0.1Mトリス塩酸塩 pH8.5、25.0％ v/vポリエチレングリコールモノメチルエーテル550からなった。
【０２３１】
５．６．データ収集および構造決定
X線回折データを、SLSでのX06SAによって測定した。測定の最中には、結晶を、-178℃の窒素流に常に置いて凍結状態に維持し、結晶を一回に0.25度回転させながら、ビームラインに付属したEiger X16M（DECTRIS）を用いて合計で1440枚のX線回折画像を収集した。セルパラメータの決定、 回折スポットの指数付け、および回折画像から得られた回折データのプロセシングは、autoPROC program（Acta. Cryst. 2011, D67: 293-302）、XDS Package（Acta. Cryst. 2010, D66: 125-132）、およびAIMLESS（Acta. Cryst. 2013, D69: 1204-1214）を用いて行い、最終的に、最大で3.705オングストローム解像度の回折強度データが得られた。結晶学データの統計を、表２．５に示す。
構造を、プログラムPhaserでの分子置換によって決定した（J. Appl. Cryst. 2007, 40: 658-674）。検索モデルは、公開された結晶構造（PDBコード：4NKIおよび6MI2）に由来した。モデルは、Cootプログラム（Acta Cryst. 2010, D66: 486-501）で作り、プログラムRefmac5（Acta Cryst. 2011, D67: 355-367）およびPHENIX（Acta Cryst. 2010, D66: 213-221）で精密化した。77.585〜3.705オングストロームの回折強度データについての結晶学的信頼度因子（R）は、22.33％であり、フリーR値は27.50％であった。構造精密化の統計を、表２．５に示す。
【０２３２】
【表２．５】
2022502010.tif 000018
【０２３３】
５．７．H0868L0581 FabおよびCD137の相互作用部位の特定
H0868L0581 Fab、137Ctrl、およびCD137の三成分複合体の結晶構造を、3.705オングストローム解像度で決定した。図３．３ａおよび３．３ｂでは、H0868L0581 Fab接触領域のエピトープを、それぞれCD137アミノ酸配列においておよび結晶構造においてマッピングしている。エピトープは、結晶構造においてH0868L0581 Fabの任意の部分から4.5オングストロームの距離内に位置する1個または複数個の原子を含有するCD137のアミノ酸残基を含む。加えて、3.0オングストローム内のエピトープを、図３．３ａおよび３．３ｂにおいて強調表示している。
【０２３４】
図３．３ａおよび３．３ｂに示すように、結晶構造により、H0868L0581 Fabの重鎖と軽鎖との間に形成されるポケットに結合したCD137のCRD1におけるL24〜N30、特にL24〜S29が、CD137のN末端がポケットの深部に対して方向付けられる様式で深く埋められていることが示された。加えて、CD137中のCRD1におけるN39〜I44およびCRD2におけるG58〜I64が、H0868L0581 Fabの重鎖CDRによって認識された。CRDとは、WO2015/156268に記載されているようにCRD参照と呼ばれる、Cys-Cysにより形成される構造によって隔てられるドメインの名称である。
【０２３５】
本発明者らは、ヒトCD137のN末端領域、特にL24〜N30を認識する抗ヒトCD137抗体を特定し、この領域に対する抗体が細胞上のCD137を活性化できることもまた特定した。
【０２３６】
［参考実施例１］dual FabファージディスプレイライブラリーからのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
１．１．  GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
参考実施例１２において合成された抗体ライブラリー断片を用いて、ファージディスプレイのためのdual Fabライブラリーを構築した。dualライブラリーは、H鎖は参考実施例１２に示すように多様化しているが、L鎖は元の配列GLS3000（配列番号：８５）に固定したライブラリーとして調製した。FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えること、および（参考実施例１２中の）表２７に示すようにCDRをさらに多様化させることによってCE115HA000から生じたH鎖ライブラリー配列を、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託して、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。得られた抗体ライブラリー断片を、PCRによって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入した。GLS3000を、L鎖としては選択した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌へ移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
【０２３７】
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（国際特許出願の国内公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（国際特許出願番号WO2015046554の国内公表参照）。
【０２３８】
１．２．  ダブルラウンド選択でのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、参考実施例１．１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（図４、C3NP1-27と呼ばれる；アミノ酸配列：配列番号：１９４、Genscriptが合成）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびSS-ビオチン化されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ss-ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。ss-ヒトCD137-Fcは、ヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137に対してEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation Kit（PIERCE, カタログ番号21445）を用いることによって調製した。ビオチン化は、取扱説明書に従って実施した。
【０２３９】
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
【０２４０】
具体的には、ファージ溶液を、250 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび495μLのTBSを添加し、室温で15分間インキュベートし、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０２４１】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パニングの第２ラウンドにおいては、250 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パニングの第３ラウンドおよび第６ラウンドにおいては、62.5 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パニングの第４、第５、および第７ラウンドにおいては、62.5 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
【０２４２】
１．３．  ファージによって提示されたFabドメインの、CD3εまたはヒトCD137に対する結合
ファージを含有する培養上清を、上記の方法によって得られた大腸菌の各96シングルコロニーから、一般的な方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に従って回収した。ファージを含有する培養上清を、以下の手順によってELISAに供した：ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner, カタログ番号781990）を、ビオチン標識された抗原（ビオチン標識されたCD3εペプチドまたはビオチン標識されたヒトCD137-Fc）を含有する10μLのTBSで、4℃で一晩または室温で1時間コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、80μLのTBS/2％スキムミルクで1時間以上ブロッキングした。TBS/2％スキムミルクの除去後に、調製された培養上清を各ウェルに添加し、ファージに提示された抗体が各ウェルに含有される抗原に結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、HRP/Anti M13（GE Healthcare 27-9421-01）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。結果を図５に示す。
図５に示すように、クローンはすべて、ヒトCD3εに対する結合を示したが、ヒトCD137に対するパニング手順を5回実施したにもかかわらず、ヒトCD137に対する結合を示さなかった。これは、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレートでのこのファージELISA解析の感受性がより低いことに依存している可能性があり、したがって、ストレプトアビジンコーティングビーズでのファージELISAもまた実施した。
【０２４３】
１．４．  ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137に対する結合（ファージビーズELISA）
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、0.625 pmolのss-ヒトCD137-Fcを磁気ビーズに添加して、室温で10分間以上インキュベートし、次いで、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライした。各々12.5μLのFabを提示するファージ溶液を、12.5μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で30分間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図６に示す。
【０２４４】
いくつかのクローンは、ヒトCD137に対する明らかな結合を示した。この結果は、ヒトCD3εおよびCD137の両方に結合するいくつかのFabドメインがまた、ファージディスプレイパニング戦略で、この設計されたライブラリーから取得されたことを示した。それでもなお、ヒトCD137に対する結合は、CD3εペプチドと比較してまだ弱かった。各々のヒトCD137結合クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅して、DNA配列を解析した。結果は、結合クローンがすべて、同じVH配列を有することを示し、これは、1つのFabクローンのみが、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示したことを意味した。これを改善するために、次の実験において、ダブルラウンド選択をまたファージディスプレイ戦略に適用した。
【０２４５】
［参考実施例２］ダブルラウンド選択法でのdual Fabファージディスプレイライブラリーからの、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
２．１．  GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン（配列番号：９１）をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015/046554参照）。
【０２４６】
２．２．  ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、参考実施例２．１．において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27：配列番号：１９４）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
【０２４７】
ヒトCD137およびCD3εに結合するずっとより多くのFabドメインを作製するために、ダブルラウンド選択をまた、ファージディスプレイパニングに、パニングラウンド2およびその後のラウンドで適用した。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
【０２４８】
具体的には、パニングラウンド1で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。DAライブラリーまたはDXライブラリーのファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、8 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインも添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。
【０２４９】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で2回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで1回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンの添加後に、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０２５０】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、パニング手順の次のラウンドからは、CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する抗体を提示するファージを回収するためにダブルラウンド選択を実施した。
【０２５１】
具体的には、パニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０２５２】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０２５３】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたCD3εを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、抗体を提示するファージをヒトCD137からCD3εに移すために、37℃で30分間、室温で60分間、4℃で一晩、次いで室温で60分間インキュベートした。
【０２５４】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０２５５】
パニングの第３ラウンドおよび第４ラウンドにおいては、洗浄の数をTBSTで5回、次いでTBSで2回に増加させた。ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、C3NP1-27抗原を、ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原の代わりに用い、溶出は、CD3εペプチドとビオチンとの間のジスルフィド結合を切断するためにDTT溶液で実施した。正確には、TBSで2回洗浄した後、500μLの25 mM DTT溶液を添加して、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを、回収されたファージ溶液に添加して、室温で15分間インキュベートした。
【０２５６】
２．３．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
ラウンド3およびラウンド4でのDAおよびDXライブラリーの各パニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。29のVH配列が取得されたため、そのすべてをIgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。GLS3000を軽鎖として用い、その発現プラスミドは、参考実施例１２．２．に示すように調製した。
【０２５７】
調製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137（配列番号：１９５）およびカニクイザル（cyno（カニクイザル）と呼ばれる）CD137（配列番号：９２）に対するその結合能力を評価した。図７は、ヒトCD137とカニクイザルCD137との間のアミノ酸配列の差を示す。それらの間では8個の残基が異なっている。
【０２５８】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。
【０２５９】
その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表１０および図１９に示す。その中で、クローンDXDU01_3#094、DXDU01_3#072、DADU01_3#018、DADU01_3#002、DXDU01_3#019、およびDXDU01_3#051は、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対する結合を示した。他方、ヒトCD137に対して最も強い結合を示したDADU01_3#001は、カニクイザルCD137に対する結合を示さなかった。
【０２６０】
【表３】
2022502010.tif 000019
【０２６１】
２．４．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD3εに対する結合
各抗体をまた、ELISAに供して、CD3εに対するその結合能力も評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300/TBSを含むブロッキング緩衝液を添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した後、100 ngの精製されたIgGを各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。
【０２６２】
その後、各ウェルをTBSTで洗浄し、TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表４および図９に示す。すべてのクローンは、CD3εペプチドに対する明らかな結合を示した。これらのデータから、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも結合するFabドメインを、参考実施例１において実施された従来のファージディスプレイパニング手順よりも高いヒット率で、設計されたDual Fab抗体ファージディスプレイライブラリーによりダブルラウンド選択手順で効率的に取得できたことがわかる。
【０２６３】
【表４】
2022502010.tif 000020
【０２６４】
２．５．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
6つの抗体（DXDU01_3#094（#094）、DADU01_3#018（#018）、DADU01_3#002（#002）、DXDU01_3#019（#019）、DXDU01_3#051（#051）、およびDADU01_3#001（#001 またはdBBDu_126））を、さらに評価するために選択した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（重鎖が配列番号：９３、軽鎖が配列番号：９４）（Bと省略される）を、対照抗体として用いた。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたはビオチン標識されたヒトFcと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その後、磁気ビーズを、TBSによって1回洗浄した。100 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのヒトCD3εペプチドまたは62.5 pmolのフリーのヒトFcまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１０および表５に示す。
【０２６５】
【表５】
2022502010.tif 000021
【０２６６】
ヒトCD137-Fcに対する結合の、フリーのCD3εペプチドによる阻害が、すべての試験された抗体において観察されたが、対照抗CD137抗体においては観察されず、かつ阻害は、フリーのFcドメインによっては観察されなかった。この結果から、それらの取得された抗体が、CD3εペプチドの存在下ではヒトCD137-Fcに結合できなかったこと、換言すると、これらの抗体は、ヒトCD137とCD3εに同時には結合しないことが実証される。したがって、2つの異なる抗原であるCD137およびCD3εに結合することができるが、同時には結合しないFabドメインを、設計されたライブラリーおよびファージディスプレイダブルラウンド選択で取得するのに成功したことが証明された。
【０２６７】
［参考実施例３］ダブルラウンド代替的選択またはクアドラプルラウンド選択での、dual Fabライブラリーからの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
３．１．  カニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得する効率を改善するためのパニング戦略
参考実施例２において、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得することに成功したが、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137に対するよりも弱かった。それを改善するための考慮すべき戦略の1つは、異なる抗原を異なるパニングラウンドで用いることになる、ダブルラウンド選択を伴う代替的パニングである。この方法によって、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対する選択圧を、好ましい抗原の組み合わせであるCD3εとヒトCD137、CD3εとカニクイザルCD137、またはヒトCD137とカニクイザルCD137で、各ラウンドにおいてdual Fabライブラリーにかけることができた。それを改善するためのもう1つの戦略は、1つのパニングラウンドにおいてすべての必要な抗原を用いることができる、トリプルまたはクアドラプルラウンド選択である。
【０２６８】
参考実施例２のダブルラウンド選択手順において、抗体を提示するファージを第１の抗原から第２の抗原に移動させるために、一晩のインキュベーションを用いた。この方法は良好に働いたが、第１の抗原に対する親和性が第２の抗原に対するよりも強い場合、移動がほとんど起きない可能性がある（例えば、このdualライブラリーにおいて第１の抗原がCD3εであった場合）。これに対処するために、塩基溶液での結合ファージの溶出もまた実施した。各パニング手順のキャンペーン名および条件を、表６に記載する。
【０２６９】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、参考実施例１．１．において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27；アミノ酸配列：配列番号：１９４）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3εとビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3δとのヘテロ二量体（CD3ed-Fcと名づける、アミノ酸配列：配列番号：９５、９６）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたカニクイザルCD137（カニクイザルCD137と名づける）を、抗原として用いた。
【０２７０】
【表６】
2022502010.tif 000022
【０２７１】
３．２．  ダブルラウンド選択および代替的パニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
キャンペーンDU05と名づけたパニング条件を、ダブルラウンド選択および代替的パニングで、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、表６に示すように実施した。
ヒトCD137-Fcを偶数のラウンドにおいて用い、カニクイザルCD137-Fcを奇数のラウンドにおいて用いた。ダブルラウンド選択の詳細なパニング手順は、参考実施例２に示すものと同じであった。DU05キャンペーンにおいては、ダブルラウンド選択をパニングの第１ラウンドから実施した。
【０２７２】
３．３．  塩基溶出ダブルラウンド選択および代替的パニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
参考実施例２に示す異なる抗原での以前のダブルラウンド選択においては、IdeSまたはDTTが、抗体とビオチンとの間のリンカー領域を切断したため、抗体を提示するファージは、その第１の抗原との複合体として溶出され、したがって第１の抗原もまた、ダブルラウンド選択の第２サイクルに持ってこられ、第２の抗原と競合する。第１の抗原の持ち込みを抑制するために、結合抗体の抗原からの解離を誘導し、かつ従来のファージディスプレイパニングにおいて非常に普及している方法である、塩基緩衝液での溶出もまた実施した（キャンペーンDS01と名づける）。
パニングラウンド1の詳細なパニング手順は、参考実施例２に示すものと同じであった。ラウンド1においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcでの従来のパニングを実施した。
パニングラウンド1において、ヒトCD137に結合するFabを提示するファージが蓄積されたため、パニングラウンド2からは、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、塩基溶出ダブルラウンド選択を実施した。
【０２７３】
具体的には、パニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０２７４】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.1M トリエチルアミンF（TEA, Wako 202-02646）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、500μLの0.1 M TEAを添加して、ビーズを室温で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。100μLの1Mトリス-HCl（pH 7.5）を添加して、ファージ溶液を15分間中和した。
【０２７５】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、CD3εに結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD137にも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。  
【０２７６】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０２７７】
パニングの第４ラウンドおよび第６ラウンドのダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcの代わりに用いた。パニングのラウンド4からラウンド6を通して、250 pmolのビオチン標識されたヒトまたはカニクイザルのCD137-Fcを、ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいて用いた。
【０２７８】
３．４．  クアドラプルラウンド選択での、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
以前のダブルラウンド選択においては、パニングの1ラウンドにおいて2つの異なる抗原しか用いることができなかった。この限界を突破するために、クアドラプルラウンド選択をまた実施した（表６に示す、キャンペーンMP09およびMP11との名称）。
MP09およびMP11両方のパニングラウンド1、ならびにMP09のパニングラウンド2において、ダブルラウンド選択を実施した。
【０２７９】
具体的には、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。268 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０２８０】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０２８１】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、カニクイザルCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０２８２】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０２８３】
MP09のパニングキャンペーンの第２ラウンドにおいては、表６に示すように、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクルパニング抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、トリプシンによる溶出を伴って、第２サイクルパニング抗原として用いた。
【０２８４】
クアドラプルパニングを、MP09キャンペーンのパニングラウンド3およびラウンド4において、ならびにMP11キャンペーンのパニングラウンド2およびラウンド3において実施した。
【０２８５】
MP09キャンペーンのパニングラウンド3およびMP11キャンペーンのラウンド2において、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。250 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０２８６】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０２８７】
IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０２８８】
クアドラプルラウンド選択の第３サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０２８９】
クアドラプルラウンド選択の第４サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。
【０２９０】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０２９１】
MP09キャンペーンのパニングラウンド4およびMP11キャンペーンのラウンド3においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクル抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、第３サイクル抗原として用いた。
【０２９２】
３．５．  ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合（ファージELISA）
Fabを提示するファージ溶液を、参考実施例３．２、３．３、および３．４におけるパニング手順を通して調製した。最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。
【０２９３】
TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたCD3εペプチドを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、各々250 nLのFabを提示するファージ溶液を、24.75μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１１に示す。
【０２９４】
ヒトCD137、カニクイザルCD137、およびCD3εの各抗原に対する結合が、各パニングアウトプットファージ溶液において観察された。この結果は、塩基溶出を伴うダブルラウンド選択が、IdeS溶出法を伴う以前のダブルラウンド選択と同様に働いたこと、および、代替的パニングを伴うダブルラウンド選択がまた、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを取得するために良好に働いたことを示した。これらの方法は、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを収集するが、それでもなお、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137と比較してまだ弱かった。他方、MP09またはMP11キャンペーンにおいては、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合が、同じラウンド時点で観察され、かつカニクイザルCD137に対するその結合は、他のキャンペーンよりも高かった。この結果から、クアドラプルラウンド選択が、3つの異なる抗原に結合するFabドメインをより効率的に濃縮できることが実証された。
【０２９５】
３．６．  取得されたFabドメインを有するIgGの調製
各パニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。32クローンを、そのVH配列がすべての解析されたプールの中で2回よりも多く出現したため、選択した。そのVH遺伝子を、PCRによって増幅し、IgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ライブラリー中のH鎖に特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをクローン変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
【０２９６】
各パニングアウトプットプールのVH遺伝子もまた、IgG形式に変換した。ファージミドベクターライブラリーを、各パニングアウトプットプールDU05、DS01、およびMP11の大腸菌から調製し、NheIおよびSalI制限酵素で消化して、VH遺伝子を直接抽出した。抽出されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを大腸菌中に導入し、各パニングアウトプットプールから、192または288コロニーを採集して、そのVH配列を解析した。MP09および11キャンペーンにおいては、異なるVH配列を有するクローンを、可能な限り採集した。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをバルク変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
【０２９７】
３．７．  取得された抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
調製されたバルク変換IgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
【０２９８】
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。2％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、IgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１２に示す。
【０２９９】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パニング手順から取得されたため、代替的パニングを伴うダブルラウンド選択、塩基溶出を伴うダブル選択、およびクアドラプルラウンド選択のいずれもが、すべて期待されたように働いたことがわかる。特に、ヒトCD137に結合したクアドラプルラウンド選択由来のすべてのクローンの大部分は、他の2つのパニング条件と比較して、カニクイザルCD137に対して同等レベルの結合を示した。それらのパニング条件においては、恐らくCD3εおよびヒトCD137の両方に対する結合を示したクローンの取得がより少なく、それは主に、このキャンペーンにおいて、互いに同じVH配列を有するクローンを故意に採集することを可能な限りしなかったためである。各タンパク質に対してより良好な結合を示し、かつ互いに異なるVH配列を有した54クローンを、選択してさらに評価した。
【０３００】
３．８．  精製されたIgG抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
精製されたIgG抗体の結合能力を評価した。参考実施例３．５における32のクローン変換IgG、および参考実施例３．６において選択された54のバルク変換IgGを用いた。
【０３０１】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチド、2.5 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、2.5 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、または0.625 pmolのビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。
【０３０２】
TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１３に示す。多くのクローンが、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対して同等レベルの結合を示し、CD3εに対する結合もまた示した。
【０３０３】
３．９．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
参考実施例３．７においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した37の抗体を、さらに評価するために選択した。参考実施例２．３において取得された7つの抗体もまた、評価した（これら7つのクローンを、表７におけるように改名した）。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。参考実施例２．５に記載されるBと名づけた抗ヒトCD137抗体を、対照抗体として用いた。
【０３０４】
【表７】
2022502010.tif 000023
【０３０５】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、125、12.5、もしくは1.25 pmolのフリーのCD3εペプチドまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１４および表８に示す。
【０３０６】
【表８】
2022502010.tif 000024
2022502010.tif 000025
【０３０７】
対照抗CD137抗体B以外のすべての試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
【０３０８】
３．１０．  CD3εおよびヒトCD137に対して取得されたFabドメインを有するIgGのヒトCD137エピトープの評価
参考実施例３．８における21の抗体を、さらに評価するために選択した（表１０）。精製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137のその結合エピトープを評価した。
エピトープを解析するために、WO2015/156268に記載されているように、断片化ヒトCD137と抗体のFc領域との融合タンパク質を作製し、そのドメインは、Cys-Cysによって形成される構造によって隔てられ、CRDと呼ばれる（表９参照）。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、表９に示すアミノ酸配列を含み、それぞれの遺伝子断片は、完全長ヒトCD137-Fc融合タンパク質（配列番号：９０）をコードするポリヌクレオチドからPCRによって取得し、当業者に知られている方法によって動物細胞における発現用のプラスミドベクターに組み込んだ。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を、WO2015/156268に記載されている方法によって抗体として精製した。
【０３０９】
【表９】
2022502010.tif 000026
【０３１０】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ヒトCD137ドメイン1-Fc、ヒトCD137ドメイン1/2-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3/4-Fc、ヒトCD137ドメイン3/4-Fc、およびヒトFcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１５に示す。
【０３１１】
各クローンは、ヒトCD137の異なるエピトープドメインを認識した。ドメイン1/2のみを認識する抗体（例えば、dBBDu183、dBBDu205）、ドメイン1/2およびドメイン2/3の両方を認識する抗体（例えば、dBBDu193、dBBDu 202、dBBDu222)、ドメイン2/3、2/3/4、および3/4のいずれもを認識する抗体（例えば、dBBDu139、dBBDu217), ヒトCD137ドメインを広く認識する抗体（dBBDu174）、ならびに各々の分離したヒトCD137ドメインには結合しない抗体（例えば、dBBDu126）。この結果から、いくつかのヒトCD137エピトープに対する多くのdual binding抗体を、この設計されたライブラリーおよびダブルラウンド選択手順により取得できることが実証される。
【０３１２】
dBBDu126のCD137結合エピトープ領域は、このELISAアッセイによって決定することができないが、dBBDu126は、参考実施例２．３に記載されるようにカニクイザルCD137と交差反応できないため、ヒトとカニクイザルとが異なる残基を有する位置を認識すると推定することができる。図７に示すように、ヒトとカニクイザルとの間には8つの異なる位置があり、カニクイザルCD137／ヒトCD137ハイブリッド分子に対する結合アッセイおよび結合複合体の結晶構造解析によって、75E（ヒトにおいては75G）が、カニクイザルCD137に対するdBBDu126の結合を干渉する原因として同定された。結晶構造からも、dBBDu126は、ヒトCD137のCRD3領域を主に認識することが明らかである。
【０３１３】
【表１０】
2022502010.tif 000027
【０３１４】
［参考実施例４］設計された軽鎖ライブラリーを有するdual Fabライブラリー由来のCD3εおよびヒトCD137に結合する抗体ドメインの親和性成熟
４．１．  取得された重鎖を伴う軽鎖ライブラリーの構築
CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する多くの抗体が、参考実施例３において取得されたが、ヒトCD137に対するその親和性はまだ低かったため、その親和性を改善する親和性成熟を実施した。
【０３１５】
13のVH配列、dBBDu_179、183、196、197、199、204、205、167、186、189、191、193、および222を、親和性成熟のために選択した。それらのうち、dBBDu_179、183、196、197、199、204 、および205は、同じCDR3配列を有するが、異なるCDR1または2配列を有するため、これら7つのファージミドを混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製した。dBBDu_191、193、および222の3つのファージミドもまた混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製したが、それらは異なるCDR3配列を有していた。軽鎖ライブラリーのリストを、表１１に示す。
【０３１６】
【表１１】
2022502010.tif 000028
【０３１７】
参考実施例１２に記載される合成された抗体VLライブラリー断片を、配列番号：１９８および１９９のプライマーでのPCR法によって増幅した。増幅されたVL断片を、SfiIおよびKpnI制限酵素によって消化して、13のVH断片を各々有するファージミドベクター中に導入した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌に移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
【０３１８】
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染、およびそれに続く、0.002％アラビノースとの25℃で一晩のインキュベーションによって作製した。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015046554参照）。
【０３１９】
４．２．  ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、参考実施例４．１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
【０３２０】
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。
【０３２１】
具体的には、ファージ溶液を、100 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、10分間TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、10分間、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。
【０３２２】
その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび400μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間静かに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０３２３】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パニングの第２ラウンドにおいては、160 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、2分間TBSTで7回、次いで2分間TBSで3回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
【０３２４】
パニングの第３ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
【０３２５】
パニングの第４ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
【０３２６】
４．３．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
各パニングアウトプットプールのFab遺伝子を、IgG形式に変換した。調製された哺乳動物発現プラスミドを大腸菌中に導入し、各パニングアウトプットプールから、96コロニーを採集して、そのVHおよびVL配列を解析した。それぞれ、ライブラリー2におけるVH配列の大部分は、dBBDu_183に集中しており、ライブラリー6におけるVH配列の大部分は、dBBDu_193に集中していた。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。
【０３２７】
調製されたIgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
【０３２８】
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。1％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、10 ng/μLのIgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１６に示す。
【０３２９】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パニング手順から取得された。より良好な結合を示した96クローンを選択し、さらに評価した。
【０３３０】
４．４．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
参考実施例４．３においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した96の抗体を、さらに評価するために選択した。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
【０３３１】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。250 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのCD3εまたは62.5 pmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１７および表１２に示す。大部分の試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
【０３３２】
【表１２】
2022502010.tif 000029
2022502010.tif 000030
2022502010.tif 000031
【０３３３】
４．５．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する親和性の評価
参考実施例４．４において取得された各IgGの、ヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合を、Biacore T200を用いて確認した。参考実施例４．４における結果により、16の抗体を選択した。センサーチップCM3（GE Healthcare）に、アミンカップリングによって適切な量のsure protein A（GE Healthcare）を固定化した。選択された抗体をチップにより捕捉して、抗原としてのヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する相互作用を可能にした。用いたランニング緩衝液は、20 mmol/l ACES、150 mmol/l NaCl、0.05％(w/v) Tween20、pH 7.4であった。すべての測定を25℃で実施した。抗原は、ランニング緩衝液を用いて希釈した。
【０３３４】
ヒトCD137に関しては、4000、1000、250、62.5、および15.6 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、各濃度の抗原を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
【０３３５】
カニクイザルCD137に関しては、4000、1000、および250 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
【０３３６】
ヒトCD3edに関しては、1000、250、および62.5 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で120秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で30秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で30秒間ロードした。
【０３３７】
結合速度定数ka（1/Ms）および解離速度定数kd（1/s）などのカイネティックパラメータを、測定によって得られたセンサーグラムに基づいて算出した。解離定数KD（M）を、これらの定数から算出した。各パラメータは、Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いて算出した。結果を表１３に示す。
【０３３８】
【表１３】
2022502010.tif 000032
2022502010.tif 000033
2022502010.tif 000034
【０３３９】
［参考実施例５］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製およびそのヒトCD137アゴニスト活性の評価
５．１．  抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、以下の手順によって作製した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（H鎖が配列番号：９３、L鎖が配列番号：９４）（Bと省略される）コードする遺伝子を、対照抗体として用いた。抗体の抗ヒトGPC3側は、重鎖可変領域H0000（配列番号：１３９）および軽鎖可変領域GL4（配列番号：１４０）を共有した。
【０３４０】
参考実施例４および表１３に記載される16のdual-Ig Fabを、候補dual-Ig抗体として用いた。これらの分子について、H鎖とL鎖との間の会合を調節するため、および二重特異性抗体を効率的に取得するために、Schaeferら（Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192）によって報告されたCrossMab技術を用いた。より具体的には、ヒトGPC3に対するFabのVHドメインおよびVLドメインを交換することによって、これらの分子を作製した。異種会合の促進のために、ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーを、抗体H鎖の定常領域に対して用いた。ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーとは、ノブがホール中に配置されるように、H鎖のうちの1つのCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置換し（ノブ）、かつもう1つのH鎖のCH3領域中のアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置換する（ホール）ことによる、H鎖のヘテロ二量体化の促進を通して、目的のヘテロ二量体化抗体の調製を可能にする技術である（Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383）。
【０３４１】
以後、ノブ修飾が導入されている定常領域をKnと示し、ホール修飾が導入されている定常領域をH1と示す。さらに、WO2011/108714に記載されている修飾を用いて、Fcγ結合を低下させた。具体的には、234、235、および297位（EUナンバリング）のアミノ酸をAlaに置換する修飾を導入した。446位のGlyおよび447位のLys（EUナンバリング）を、抗体H鎖のC末端から除去した。ヒスチジンタグを、Kn Fc領域のC末端に付加し、FLAGタグを、H1 Fc領域のC末端に付加した。上述の修飾を導入することによって調製された抗ヒトGPC3 H鎖は、GC33(2)H-G1dKnHS（配列番号：１４１）であった。調製された抗ヒトCD137 H鎖は、BVH-G1dHIFS（配列番号：１４２）であった。抗体L鎖GC33(2)L-k0（配列番号：１４３）およびBVL-k0（配列番号：１４４）を、それぞれ、抗ヒトGPC3側および抗CD137側に共通して用いた。Dual抗体のH鎖およびL鎖もまた、表１３に示す。BVH-G1dHIFSおよびBVL-k0と同じように、それぞれ、各dual抗体クローンのVHを、G1dHIFS（配列番号：１５６）CH領域に融合させ、各dual抗体クローンのVLを、k0（配列番号：１５７）CL領域に融合させた。表１５に示す組み合わせを有する抗体を発現させて、目的の二重特異性抗体を取得した。無関連である抗体を、対照として用いた（Ctrlと省略される）。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例９」に従って精製した。
【０３４２】
５．２．  抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD137アゴニスト作用の評価
ヒトCD137についてのアゴニスト活性を、ELISAキット（R&D systems, DY206）を用いたサイトカイン産生に基づいて評価した。抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3ε結合ドメインの作用を避けるために、CD3εもGPC3も発現しないが、CD137を構成的に発現するB細胞株HDLM-2を用いた。HDLM-2を、20％ FBSを含有するRPMI-1640培地に8×105細胞/mlの密度で懸濁した。GPC3を発現するマウスがん細胞株CT26-GPC3（参考実施例１３）を、同じ培地に4×105細胞/mlの密度で懸濁した。同じ体積の各細胞懸濁液を混合し、混合された細胞懸濁液を、96ウェルプレート中に200 μl/ウェルの体積で播種した。抗GPC3/Ctrl抗体、抗GPC3/抗CD137抗体、および参考実施例５．１において調製された8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体を、各々30μg/ml、6μg/ml、1.2μg/ml、0.24μg/mlで添加した。細胞を、37℃および5％ CO2の条件下で3日間培養した。培養上清を収集し、上清中に含有されるヒトIL-6の濃度をHuman IL-6 DuoSet ELISA（R&D systems, DY206）で測定して、HDLM-2の活性化を評価した。ELISAは、キットの製造業者（R&D systems）により提供される説明書に従うことによって行った。
【０３４３】
結果として（図１８および表１４）、8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体のうち7つは、抗体濃度に依存して、抗GPC3/抗CD137抗体と同様にHDLM-2のIL-6産生の活性化を示した。表１４において、Ctrlと比較したアゴニスト活性とは、Ctrlの存在下でのバックグラウンドレベルを超えるhIL-6分泌の増加レベルを意味する。この結果に基づいて、これらのDual-Fab抗体は、ヒトCD137に対してアゴニスト活性を有すると考えられた。
【０３４４】
【表１４】
2022502010.tif 000035
【０３４５】
［参考実施例６］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のヒトCD3εアゴニスト活性の評価
６．１．  抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/Ctrl二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、参考実施例５．１において作製し、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体もまた、同じ構築物として調製した。参考実施１０において作製されたCE115 VH（配列番号：１４５）およびCE115 VL（配列番号：１４６）を、抗ヒトCD3ε抗体の重鎖および軽鎖に用いた。組み合わせを有する抗体を表１５に示す。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例９」に従って精製した。
【０３４６】
【表１５】
2022502010.tif 000036
【０３４７】
６．２．  抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD3アゴニスト作用の評価
ヒトCD3に対するアゴニスト活性を、GloResponse（商標） NFAT-luc2 Jurkat Cell Line（Promega, CS#176401）をエフェクター細胞として用いることによって評価した。Jurkat細胞は、ヒト急性T細胞白血病に由来するヒトTリンパ球細胞の不死化された細胞株であり、それ自体上でヒトCD3を発現する。NFAT luc2_jurkat細胞においては、CD3活性化からのシグナルによって、ルシフェラーゼの発現が誘導された。細胞膜上にヒトGPC3を発現するSK-pca60細胞株（参考実施例１３）を、標的細胞として用いた。
【０３４８】
5.00E+03個のSK-pca60細胞（標的細胞）および3.00E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞（エフェクター細胞）を両方とも、白底96ウェルアッセイプレート（Costar, 3917）の各ウェルに添加し、次いで、0.1、1、または10 mg/Lの濃度の、10μLの各抗体を各ウェルに添加して、5％ CO2の存在下、37℃で24時間インキュベートした。発現したルシフェラーゼを、Bio-Glo luciferase assay system（Promega, G7940）で、付属の説明書に従って検出した。検出には2104 EnVIsionを用いた。結果を図１９に示す。
【０３４９】
大部分のDual Fabクローンは、明らかなCD3εアゴニスト活性を示し、そのうちのいくつかは、CE115抗ヒトCD3ε抗体と同等レベルの活性を示した。Dual-Fabドメインに対するCD137結合活性の付加は、CD3εアゴニスト活性の喪失を誘導しなかったこと、ならびに、Dual-Fabドメインが、1つのドメインのみによって、ヒトCD3εおよびCD137の2つの異なる抗原に対する結合だけではなく、ヒトCD3εおよびCD137の両方のアゴニスト活性も示したことが実証された。
【０３５０】
重鎖dBBDu_186を有するいくつかのDual-Fabドメインは、他のものよりも弱いCD3εアゴニスト活性を示した。これらの抗体はまた、参考実施例４．５のbiacore解析において、ヒトCD3εに対してより弱い親和性を示した。このDual Fabライブラリー由来のDual-FabのCD3εアゴニスト活性は、ヒトCD3εに対するその親和性のみに依存することが実証され、これは、CD3εアゴニスト活性がこのライブラリー設計において保持されていたことを意味する。
【０３５１】
［参考実施例７］PBMC T細胞サイトカイン放出アッセイにおけるDual-Fab抗体のヒトCD3ε/ヒトCD137相乗活性の評価
７．１．  抗体調製
WO2005/035584A1に記載されている抗CD137抗体（Bと省略される）、参考実施例５．１に記載されるCtrl抗体、および参考実施例７に記載される抗CD3εCE115抗体を、単一抗原特異的な対照として用いた。表１３に記載されるDual-FabであるH183L072（重鎖：配列番号：１０４、軽鎖：配列番号：１２４）を、さらなる評価のために選択し、 FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させて、「参考実施例９」に従って精製した。
【０３５２】
７．２．  PBMC T細胞アッセイ
CD3εおよびCD137の活性化に対するDual-Fab抗体の相乗効果を調べるために、cytometric bead array（CBA） Human Th1/T2 Cytokine kit II（BD Biosciences #551809）を用いて、総サイトカイン放出を評価した。CD137の活性化に関連して、IL-2（インターロイキン-2）、IFNγ（インターフェロンγ）、およびTNFα（腫瘍壊死因子-α）を、凍結状態で購入した凍結ヒト末梢血単核細胞（PBMC）（STEMCELL）より単離されたT細胞から、評価した。
【０３５３】
７．２．１．  凍結ヒトPBMCの調製およびT細胞の単離
PBMCを含有するクライオバイアルを、37℃の水浴に置いて、細胞を解凍した。次いで、細胞を、9 mLの培地（標的細胞を培養するために用いられる培地）を含有する15 mL falconチューブ中に分注した。次いで、細胞懸濁液を、1,200 rpmで5分間、室温での遠心分離に供した。上清を静かに吸引し、再懸濁のために新鮮な温めた培地を添加して、ヒトPBMC溶液として用いた。T細胞を、Dynabeads Untouched Human T cell kit（Invitrogen #11344D）を用いて製造業者の説明書に従って単離した。
【０３５４】
７．２．２．  サイトカイン放出アッセイ
30μg/mLおよび10μg/mLの、参考実施例７．１において調製された抗体を、maxisorp 96ウェルプレート（Thermofisher #442404）上に一晩コーティングした。1.00E+05個のT細胞を、抗体を含有する各ウェルに添加して、37℃で72時間インキュベートした。プレートを、1,200 rpmで5分間遠心分離して、上清を収集した。製造業者の説明書に従ってCBAを行い、結果を図２０に示す。
【０３５５】
dual-FabであるH183L072抗体のみが、T細胞によるIL-2分泌を示した。抗CD137（B）も抗CD3ε抗体（CE115）も、単独でT細胞からのIL-2の誘導をもたらさなかった。加えて、抗CD137抗体単独は、サイトカインの検出をもたらさなかった。抗CD3ε抗体と比較すると、Dual-Fab抗体は、TNFαのレベルの増加およびIFNγの同様の分泌をもたらした。これらの結果は、dual-Fab抗体が、T細胞の機能的活性化のためにCD3εおよびCD137の両方の相乗的活性化を惹起できたことを示唆する。
【０３５６】
［参考実施例８］抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の細胞傷害活性の評価
８．１．  抗GPC3/dual-Fabおよび抗GPC3/CD137二重特異性抗体の調製
参考実施例６に記載される抗GPC3またはCtrl抗体、およびDual-Fab（H183L072）または抗CD137抗体を使用し、Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26; 110(13): 5145-5150に記載されている方法に従うFabアーム交換（FAE）を用いて、抗GPC3/dual-Fab、抗GPC3/CD137、Ctrl/H183L072、およびCtrl/CD137抗体の4つの抗体を生成した。4つの抗体すべての分子形式は、従来のIgGと同じ形式である。抗GPC3/ H183L072は、GPC3、CD3、およびCD137に結合することができる三重特異性抗体であり、抗GPC3/CD137は、GPC3およびCD137に結合することができる二重特異性抗体であり、Ctrl/H183L072およびCtrl/CD137 は、対照として用いた。生成した4つの抗体はすべて、Fcγ受容体に対して減弱した親和性を有するサイレントFcからなる。
【０３５７】
８．２．  T細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）アッセイ
細胞傷害活性を、参考実施例１０．５．２に記載されるようにxCELLigence Real-Time Cell Analyzer（Roche Diagnostics）を用いた細胞増殖抑制の比率によって評価した。両方ともGPC3を発現するトランスフェクタント細胞株である1.00E+04個のSK-pca60またはSK-pca13aを、標的（Tと省略される）細胞として用い（それぞれ、参考実施例１３および１０）、参考実施例７．２．１に記載されるように調製された5.00E+04個の凍結ヒトPBMCエフェクター（Eと省略される）細胞と共培養した。これは、腫瘍細胞に対して5倍量のエフェクター細胞を加えたことを意味し、そのためここではET 5と記載する。抗GPC3/H183L072抗体およびGPC3/CD137抗体を、0.4、5、および10 nMで添加した一方、Ctrl/H183L072抗体およびCtrl/CD137抗体は、各ウェル10 nMで添加した。細胞傷害活性の測定は、参考実施例１０．５．２に記載されるのと同様に実施した。反応は、5％二酸化炭素ガスの条件下、37℃で実施した。PBMCの添加の72時間後に、細胞増殖抑制（CGI）率（％）を、参考実施例１０．５．２に記載される式を用いて決定し、図２１に示すようにグラフにプロットした。参考実施例６．２においてJurkat細胞に対してCD3活性化を示した抗GPC3/H183L072 dual-Fab抗体は、GPC3発現細胞の強い細胞傷害活性を、すべての濃度で両方の標的細胞株においてもたらしたが、CD3活性化を示さなかった対照/H183L072 dual-Fab抗体および抗GPC3/CD137抗体はもたらさず、Dual-Fab三重特異性抗体が細胞傷害活性をもたらし得ることが示唆された。
【０３５８】
［参考実施例９］抗体発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
アミノ酸置換またはIgG変換を、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene Corp.）、PCR、またはIn fusion Advantage PCRクローニングキット（Takara Bio Inc.）等を用いて当業者に一般に公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを当業者に一般に公知の方法によって配列決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎がん細胞由来HEK293H株（Invitrogen Corp.）またはFreeStyle293細胞（Invitrogen Corp.）に一過性に導入し、抗体を発現させた。rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて当業者に一般に公知の方法によって、各抗体を得られた培養上清から精製した。精製抗体の濃度について、分光光度計を用いて280 nmで吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
【０３５９】
［参考実施例１０］抗ヒトおよび抗カニクイザルCD3ε抗体CE115の作製
１０．１．  ヒトCD3を発現する細胞およびカニクイザルCD3を発現する細胞で免疫したラットを用いたハイブリドーマの作製
各SDラット（雌、免疫開始時6週齢、Charles River Laboratories Japan, Inc.）を、ヒトCD3εγまたはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞で以下の通り免疫した：0日目（初回免疫日を0日目と定義した）に、フロイント完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、ヒトCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。14日目に、フロイント不完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、カニクイザルCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。その後、1週間おきに合計4回、ヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞またはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞を5×107個、交互にラットに腹腔内投与した。CD3εγの最終投与1週間後（49日目）に、ブースターとしてヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞をラットに静脈内投与した。その3日後に、ラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞SP2/0とを、PEG1500（Roche Diagnostics K.K.）を用いた常法に従い融合した。融合細胞、すなわちハイブリドーマを、10％FBSを含むRPMI1640培地（以下、10％ FBS/RPMI1640と称す）中で培養した。
【０３６０】
融合の翌日に、（１）融合細胞を半流動培地（Stemcell Technologies, Inc.）に懸濁した。ハイブリドーマを選択培養するとともに、コロニー化を実施した。
【０３６１】
融合後9日目または10日目に、ハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10％ FBS/RPMI1640、2重量％ HAT 50×濃縮物（Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.）、および5重量％ BM-Condimed H1（Roche Diagnostics K.K.））を含む96-ウェルプレートに、1コロニー/ウェルで播種した。3〜4日の培養後、各ウェルの培養上清を回収し、培養上清中のラットIgG濃度を測定した。ラットIgGを含むことが確認された培養上清について、ヒトCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞またはヒトCD3εγを発現しない付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、ヒトCD3εγに特異的に結合する抗体を産生するクローンについてスクリーニングした（図２２）。さらに、カニクイザルCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、サルCD3εγとの交差反応性についてもクローンを評価した（図２２）。
【０３６２】
１０．２．  抗ヒトおよび抗サルCD3εキメラ抗体の作製
各ハイブリドーマ細胞から、RNeasy Mini Kits（Qiagen N.V.）を用いてトータルRNAを抽出し、SMART RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences）を用いてcDNAを合成した。作製したcDNAをPCRで用いて、抗体の可変領域遺伝子をクローニングベクターに挿入した。各DNA断片のヌクレオチド配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Inc.）およびDNAシーケンサーABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems, Inc.）を用いて、それに含まれる添付説明書に記載の方法に従い決定された。CE115 H鎖可変ドメイン（配列番号：１６２）およびCE115 L鎖可変ドメイン（配列番号：１６３）のCDRおよびFRは、Kabatナンバリングに従って決定された。
【０３６３】
ヒト抗体IgG1鎖定常ドメインに連結させたラット抗体H鎖可変ドメインを含むキメラ抗体H鎖をコードする遺伝子、およびヒト抗体カッパ鎖定常ドメインに連結させたラット抗体L鎖可変ドメインを含むキメラ抗体L鎖をコードする遺伝子を、動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。作製した発現ベクターを用いて、CE115キメラ抗体の発現および精製を行った（参考実施例1）。
【０３６４】
１０．３．  EGFR_ERY22_CE115の作製
次に、がん抗原（EGFR）に対するIgGを基本骨格として用いて、一方のFabをCD3ε結合ドメインに置き換えた形の分子を作製した。この操作において、基本骨格とするIgGのFcとして、上述した場合と同様に、FcgR（Fcγ受容体）に対する結合活性が減弱されたサイレント型Fcを用いた。EGFR結合ドメインとして、セツキシマブの可変領域を構成するセツキシマブ-VH（配列番号：１６４）およびセツキシマブ-VL（配列番号：１６５）を用いた。抗体H鎖定常ドメインとして、C末端のGlyおよびLysを除去したIgG1に由来するG1d、D356KおよびH435Rの変異を導入したG1dに由来するA5、およびK439Eの変異を導入したG1dに由来するB3を用い、それぞれセツキシマブ-VHと組み合わせ、セツキシマブ-VH-G1d（配列番号：１６６）、セツキシマブ-VH-A5（配列番号：１６７）、およびセツキシマブ-VH-B3（配列番号：１６８）を参考実施例９の方法に従って作製した。抗体H鎖定常ドメインをH1と名づけた場合、可変ドメインとしてセツキシマブ-VHを持つ抗体のH鎖に対応する配列はセツキシマブ-VH-H1で表した。
【０３６５】
この文脈において、アミノ酸の改変は、例えば、D356Kで表す。最初のアルファベット（D356KのDに該当）は、改変前のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。このアルファベットに続く数字（D356Kの356に該当）は、この改変残基のEUナンバリング位置を意味する。最後のアルファベット（D356KのKに該当）は、改変後のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。
【０３６６】
EGFRに対するFabのVHドメインとVLドメインとの間の交換によって、EGFR_ERY22_CE115（図２３）を作製した。具体的には、前述の方法と同様の方法で付加した適切な配列によるプライマーを用いて、PCR法等の当業者に一般に公知の方法により、EGFR ERY22_Hk（配列番号：１６９）、EGFR ERY22_L（配列番号：１７０）、CE115_ERY22_Hh（配列番号：１７１）、またはCE115_ERY22_L（配列番号：１７２）をコードする各ポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
【０３６７】
発現ベクターは以下の組み合わせでFreeStyle 293-F細胞に導入され、各目的分子を一過性に発現させた：
目的分子：EGFR_ERY22_CE115
発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EGFR ERY22_Hk、EGFR ERY22_L、CE115_ERY22_Hh、およびCE115_ERY22_L。
【０３６８】
１０．４．  EGFR_ERY22_CE115の精製
得られた培養上清をAnti FLAG M2カラム（Sigma-Aldrich Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma-Aldrich Corp.）で溶出した。目的分子を含む画分をHisTrap HPカラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、イミダゾールの濃度勾配で溶出した。目的分子を含む画分を限外濾過によって濃縮した。その後、この画分をSuperdex 200カラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加した。単量体画分のみを溶出液から回収し、各精製目的分子を得た。
【０３６９】
１０．５．  ヒト末梢血単核球を用いた細胞傷害活性の測定
１０．５．１．  ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の作製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5,000単位、Novo Nordisk A/S）を予め100μL充填した注射器を用いて、各健常人ボランティア（成人）から50 mLの末梢血を採取した。末梢血をPBS（-）で2倍希釈し、次いで4等分し、そして15 mLのFicoll-Paque PLUSを予め充填しかつ予め遠心操作を行ったLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227290、Greiner Bio-One GmbH）に加えた。該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分、室温）の後、単核球画分層が分取された。10％FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地（Sigma-Aldrich Corp.；以下10％FBS/D-MEMと呼ぶ）で単核球画分中の細胞を1回洗浄した。その後、該細胞を10％FBS/D-MEMで4×106細胞/mLの細胞密度に調整した。このように調製した細胞溶液を、ヒトPBMC溶液として以後の試験に用いた。
【０３７０】
１０．５．２．  細胞傷害活性の測定
細胞傷害活性は、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（Roche Diagnostics）を用いて、細胞増殖抑制率に基づいて評価された。標的細胞には、SK-HEP-1細胞株にヒトEGFRを強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株を用いた。SK-pca13aをディッシュから剥離し、100μL/ウェル（1×104細胞/ウェル）でE-Plate 96プレート（Roche Diagnostics）に播種し、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用いて生細胞のアッセイを開始した。翌日、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレートを取り出し、各濃度（0.004、0.04、0.4、および4 nM）に調整した各抗体50μLを該プレートに添加した。室温にて15分間反応させた後、前述の１０．５．１で調製したヒトPBMC溶液50μL（2×105細胞/ウェル）をそれに加えた。このプレートをxCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに再セットし、生細胞のアッセイを開始した。反応は、5％CO2および37℃の条件下でヒトPBMCの添加の72時間後に行われた。細胞増殖抑制率（％）を下式によりセルインデックス値から決定した。抗体の添加直前のセルインデックス値を1として、それに対して正規化した後の数値を、この算出でセルインデックス値として用いた。
細胞増殖抑制率（％）＝（A−B）×100／（A−1）
式中、Aは、抗体を追加していないウェル（標的細胞およびヒトPBMCのみ）の平均セルインデックス値を表し、Bは、各抗体を追加したウェルの平均セルインデックス値を表す。試験は三連で実施した。
【０３７１】
ヒト血液から調製したPBMCをエフェクター細胞として用いて、CE115を含むEGFR_ERY22_CE115の細胞傷害活性を測定した。結果として、極めて強い活性が確認された（図２４）。
【０３７２】
［参考実施例１１］CD3および第２の抗原に結合する抗体の作製のための抗体改変
１１．１．  第２の抗原に結合できるペプチドの挿入部位および長さの試験
一方の可変領域（Fab）を通じてがん抗原に結合することができかつもう一方の可変領域を通じて第１の抗原CD3および第２の抗原に結合することができるが、CD3および第２の抗原に同時に結合することができない、Dual binding Fab分子を取得するための試験を実施した。CD3ε結合抗体CE115の重鎖のループにGGSペプチドを挿入し、一方のFabにEGFR結合ドメインを持ちかつもう一方のFabにCD3結合ドメインを持つ各ヘテロ二量化抗体を参考実施例９に従って作製した。
【０３７３】
具体的には、CDR2中のK52BとS52cとの間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７３/１７２）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：１７５）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７４/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：１７７）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE33 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７６/１７２）を作製した。同様に、FR3中のD72とD73との間（ループ）にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７８/１７２）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：１７５）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７９/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：１７７）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８０/１７２）を作製した。加えて、CDR3中のA99とY100との間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８１/１７２）、この位置にGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８２/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８３/１７２）を作製した。
【０３７４】
１１．２．  GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3εへの結合の確認
作製した各抗体のCD3εへの結合活性をBiacore T100を用いて確認した。ビオチン化CD3εエピトープペプチドをストレプトアビジンによってCM5チップに固定化し、作製した抗体をそれにアナライトとして注入し、その結合親和性を解析した。
【０３７５】
その結果を表１６に示す。CD3εに対するCE35、CE36、CE37、CE38、およびCE39の結合親和性は、親抗体であるCE115と同等であった。このことは、第２の抗原に結合するペプチドがこれらのループ中に挿入できることを示した。結合親和性は、GGSGGSGGSを挿入したCE36またはCE39では低下しなかった。このことは、これらの部位への少なくとも9アミノ酸までのペプチドの挿入はCD3εに対する結合活性に影響を与えないことを示した。
【０３７６】
【表１６】
2022502010.tif 000037
【０３７７】
これらの結果によって、このようなペプチド挿入CE115を用いて、第２の抗原に結合する抗体を取得することにより、CD3および第２の抗原に結合できるが、これらの抗原に同時には結合しない抗体を作製できることが示された。
この文脈において、挿入または置換で使用するためのペプチドのアミノ酸配列を、部位特異的変異誘発法（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1985）82, 488-492）またはオーバーラップ伸長PCR法などの当技術分野において公知の方法に従ってランダムに改変し、上述の方法に従って各改変体の結合活性等を比較して、アミノ酸配列の改変後であっても目的の活性を示すことのできる挿入または置換部位、ならびにこの部位のアミノ酸の種類および長さを決定することによって、ライブラリーを作製することができる。
【０３７８】
［参考実施例１２］CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のためのライブラリー設計
１２．１．  CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のための抗体ライブラリー（Dual Fab Libraryとも呼ぶ）
第１の抗原としてCD3（CD3ε）を選択する場合、CD3（CD3ε）および任意の第２の抗原に結合する抗体を取得する方法の例として、以下の6つの方法が挙げられる：
１．第１の抗原に結合するFabドメインに第２の抗原に結合するペプチドまたはポリペプチドを挿入する工程を伴う方法（この方法には、WO2016076345A1の実施例３または４に示されたペプチド挿入、あるいはAngew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5; 52（32）: 8295-8に例示されるG-CSF挿入方法もまた含まれる）、ここで、結合するペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドを提示するライブラリーから取得されてもよく、または天然に存在するタンパク質の全体またはその一部を使用してもよい；
２．WO2016076345A1の実施例５で示されたような、Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
３．CD3に結合することが既知のFabドメインから部位特異的変異誘発法によって作製した抗体の使用によってCD3に対する結合活性を維持するアミノ酸を同定する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、同定されたアミノ酸が出現する抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
４．Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および指標として抗原に対する結合活性を用いることによって、抗体ライブラリーから任意の第２の抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程をさらに伴う3の方法；
５．糖鎖付加配列（例えば、NxSおよびNxT、式中、xはP以外のアミノ酸である）が出現するように抗体を改変し、糖鎖受容体が認識する糖鎖をそれに付加する（例えば、ハイマンノース型糖鎖をそれに付加することによって、ハイマンノース受容体によって認識される；ハイマンノース型糖鎖は抗体発現時にキフネンシンの添加によって得られることが公知である（mAbs. 2012 Jul-Aug; 4（4）: 475-87））工程をさらに伴う、1、2、3、または  4の方法；および
６．種々のアミノ酸に改変可能であると認められるループまたは部位にCys、Lys、または非天然アミノ酸を挿入することまたはこれらの部位をCys、Lys、または非天然アミノ酸と置換することによって、共有結合によりそれぞれが第２の抗原に結合するドメイン（ポリペプチド、糖鎖、またはTLRアゴニストに代表される核酸）をそれに付加する工程をさらに伴う1、2、3、または4の方法（この方法は、抗体薬物コンジュゲートに代表され、共有結合によるCys、Lys、または非天然アミノ酸への結合のための方法である（mAbs 6: 1, 34-45; January/February 2014; WO2009/134891 A2;およびBioconjug Chem. 2014 Feb 19; 25（2）: 351-61に記載されている））。
第１の抗原および第２の抗原に結合するが、これらの抗原に同時には結合しないDual binding Fabが、これらの方法のいずれかの使用によって得られ、当業者に一般に公知の方法、例えば、共通L鎖、CrossMab、またはFabアーム交換法によって、任意の第３の抗原に結合するドメインと組み合わせることができる。
【０３７９】
１２．２．  部位特異的変異誘発法を用いたCD3（CD3ε）結合抗体の1アミノ酸改変抗体の作製
CD3（CD3ε）結合抗体のテンプレート配列としてVHドメインCE115HA000（配列番号：１８４）およびVLドメインGLS3000（配列番号：１８５）を選択した。各ドメインを、参考実施例９により抗原結合に関与すると推定される部位でのアミノ酸改変に供した。また、pE22Hh（L234A、L235A、N297A、D356C、T366S、L368A、およびY407Vの改変、C末端のGK配列の欠失、ならびにDYKDDDDK配列（配列番号：２００）の付加による天然IgG1 CH1およびそれ以降の配列に由来する配列；配列番号：１８６）をH鎖定常ドメインとして用い、カッパ鎖（配列番号：１８７）をL鎖定常ドメインとして用いた。改変部位を表１７に示す。CD3（CD3ε）結合活性評価のために、各1アミノ酸改変抗体をワンアーム抗体（Fabドメインの1つを欠く天然に存在するIgG抗体）として取得した。具体的には、H鎖改変の場合、定常ドメインpE22Hhに連結させた改変H鎖、およびKn010G3（C220S、Y349C、T366W、およびH435Rの改変を有する216位からC末端までの天然に存在するIgG1アミノ酸配列；配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ鎖に3'側で連結させたGLS3000をL鎖として用いた。L鎖改変の場合、カッパ鎖に3'側で連結させた改変L鎖をL鎖として用い、pE22Hhに3'側で連結させたCE115HA000、およびKn010G3をH鎖として用いた。これらの配列をFreeStyle 293細胞で発現させかつ精製した（参考実施例９の方法を利用した）。
【０３８０】
【表１７】
2022502010.tif 000038
【０３８１】
１２．３．  CD3に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
項１２．２で構築、発現および精製した各1アミノ酸改変体をBiacore T200（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて評価した。アミンカップリング法によって、適切な量のCD3εホモ二量体タンパク質をセンサーチップCM4（GE Healthcare Japan Corp.）の上に固定化した。次いで、適切な濃度を有する抗体をアナライトとしてそれにインジェクトし、センサーチップ上でCD3εホモ二量体タンパク質と相互作用させた。次いで、10 mmol/Lグリシン-HCl（pH 1.5）のインジェクトによって、センサーチップを再生した。アッセイを25℃で行い、HBS-EP+（GE Healthcare Japan Corp.）をランニングバッファーとして用いた。アッセイ結果から、アッセイにおいて得られた結合量およびセンサーグラムについてシングルサイクルカイネティックモデル（1:1 binding RI＝0）を用いて解離定数KD（M）を算出した。各パラメータをBiacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて算出した。
【０３８２】
１２．３．１．  H鎖の改変
表１８は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000の結合量に対する各H鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、CE115HA000を含む抗体の結合量をXと定義し、H鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図２５に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表１９は、CE115HA000に対する各H鎖改変体の解離定数 KD（M）の比（＝CE115HA000のKD値/改変体のKD値）を示す。
表１８に示されたZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
【０３８３】
【表１８】
2022502010.tif 000039
【０３８４】
【表１９】
2022502010.tif 000040
【０３８５】
１２．３．２．  L鎖の改変
表２０は、対応する未改変の抗体であるGLS3000の結合量に対する各L鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、GLS3000を含む抗体の結合量をXと定義し、L鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図２５に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表２１は、GLS3000に対する各L鎖改変体の解離定数KD（M）の比を示す。
表２０において示されるZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変抗体であるGLS3000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
【０３８６】
【表２０】
2022502010.tif 000041
【０３８７】
【表２１】
2022502010.tif 000042
【０３８８】
１２．４．  ECM（細胞外マトリックス）に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）は、細胞外構成成分であり、インビボで様々な部位に存在する。そのため、ECMに強く結合する抗体は、血中動態が悪くなる（半減期が短くなる）ことが知られている（WO2012093704 A1）。よって、ECM結合が増強されていないアミノ酸が、抗体ライブラリー中に出現するアミノ酸として選択されることが好ましい。
【０３８９】
各抗体を、参考実施例１．２に記載された方法によりH鎖改変体またはL鎖改変体として取得した。次に、そのECM結合を参考実施例１４の方法に従って評価した。各改変体のECM結合値（ECL反応）を、同一プレート内でまたは同一実施日に得られた抗体MRA（H鎖: 配列番号：１８９、L鎖: 配列番号：１９０）のECM結合値で割り、その結果生じる値を表２２（H鎖）および２３（L鎖）に示す。表２２および２３に示すように、いくつかの改変はECM結合を増強する傾向を有することが確認された。
表２２（H鎖）および２３（L鎖）に示す値のうち、複数の改変によるECM結合増強の作用を考慮し、10倍までを有効値としてDual Fab Libraryに採用した。
【０３９０】
【表２２】
2022502010.tif 000043
【０３９１】
【表２３】
2022502010.tif 000044
【０３９２】
１２．５．  ライブラリーの多様性を増強するためのペプチドの挿入部位および長さについての試験
参考実施例１１は、CD3（CD3ε）への結合を失うことなく、GGS配列を用いてペプチドを各部位に挿入できることを示した。Dual Fab Libraryでループ延長が可能となれば、その結果生じるライブラリーはより多種類の分子を含み（またはより広範な多様性を有し）、多様な第２の抗原に結合するFabドメインの取得が可能になる可能性がある。したがって、ペプチド挿入を原因とする結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CD3εに対する結合活性を増強するV11L/D72A/L78I/D101Q改変をCE115HA000配列に加えて、pE22Hhにさらに連結させた。参考実施例１１と同様に、この配列へのGGSリンカーの挿入によって分子を作製し、そのCD3結合を評価した。Kabatナンバリングで99位と100位との間にGGS配列を挿入した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。具体的には、上述のGGSリンカーを含むH鎖およびKn010G3（配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：１８７）に連結させたGLS3000（配列番号：１８５）をL鎖として採用した。これらの配列は、参考実施例９に従って発現および精製を行った。
【０３９３】
１２．６．  GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3に対する結合の確認
GGSペプチドを挿入した改変抗体のCD3εに対する結合を、参考実施例１１に記載の方法によりBiacoreを用いて確認した。表２４に示すように、結果は、ループにGGSリンカーを挿入できることが明らかにした。特に、GGSリンカーは、抗原結合に重要であるH鎖CDR3領域に挿入することができ、CD3εへの結合は、3、6、および9アミノ酸挿入のいずれの結果でも維持された。この試験はGGSリンカーを用いて実施されたが、GGS以外の種々のアミノ酸が出現する抗体ライブラリーも許容され得る。
【０３９４】
【表２４】
2022502010.tif 000045
【０３９５】
１２．７．  NNSヌクレオチド配列を用いたH鎖CDR3への挿入についてのライブラリーの試験
参考実施例１２．６は、GGSリンカーを用いて3、6、または9アミノ酸を挿入できることを示し、3、6、または9アミノ酸の挿入を有するライブラリーを作製して、ファージディスプレイ法によって代表される通常の抗体取得法の使用によって第２の抗原に結合する抗体を取得できると推論した。よって、NNSヌクレオチド配列（全種類のアミノ酸の出現を可能にする）を用いて6アミノ酸挿入部位に種々のアミノ酸が出現する場合にも、CDR3への6アミノ酸の挿入がCD3への結合を維持できるかどうかについて試験を実施した。結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CE115HA000のものより高いCD3ε結合活性を有するCE115HA340配列（配列番号：１９３）のCDR3中の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸が挿入されるようにNNSヌクレオチド配列を用いて、プライマーを設計した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。
【０３９６】
具体的には、上述の改変H鎖およびKn010G3（配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：１８７）に連結させたGLS3000（配列番号：１８５をL鎖として採用した。これらの配列を参考実施例９に従って発現および精製した。得られた改変抗体を、参考実施例１２．６に記載された方法によってその結合について評価した。結果を表２５に示す。結果は、アミノ酸を延長した部位に種々のアミノ酸が出現した場合であっても、CD3（CD3ε）に対する結合活性が維持されることを明らかにした。表２６は、参考実施例１０に記載された方法により非特異的結合の増強の有無をさらに評価する結果を示す。結果として、CDR3の伸長したループに正電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸が多く含まれる場合に、ECMへの結合は増強された。したがって、正電荷を持つ側鎖を有する3個以上のアミノ酸がループ内に出現するべきではないことが望まれた。
【０３９７】
【表２５】
2022502010.tif 000046
【０３９８】
【表２６】
2022502010.tif 000047
【０３９９】
１２．８．  Dual Fab Libraryの設計および構築
参考実施例１２に記載の試験に基づき、CD3および第２の抗原に結合する抗体を取得するための抗体ライブラリー（Dual Fab Library）を以下のように設計した：
ステップ１：CD3（CD3ε）への結合能を維持するアミノ酸を選択する（CD3への結合量がCE115HA000の80％以上を確保する）；
ステップ２：改変前と比較してMRAの10倍以内のECM結合を保持するアミノ酸を選択する；
ステップ３：H鎖CDR3内の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸を挿入する。
Fabの抗原結合部位は、ステップ１のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。Fabの抗原結合部位は、ステップ１および３のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。ステップ２を行わないライブラリー設計であっても、取得された分子をECM結合についてアッセイおよび評価することが可能である。
【０４００】
このように、Dual Fab Libraryでは、FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えかつ表２７に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来する配列をH鎖として用い、表２８に示すようにCDRを多様化することによるGLS3000に由来する配列をL鎖として用いた。これらの抗体ライブラリー断片は、当業者に一般に公知のDNA合成方法によって合成することができる。Dual Fab Libraryは、（1）H鎖が表２７に示したように多様化され、L鎖が元の配列GLS3000または参考実施例１２に記載されたCD3ε結合を増強させたL鎖に固定されているライブラリー、（2）H鎖が元の配列（CE115HA000）または参考実施例１に記載されたCD3ε結合を増強させたH鎖に固定され、L鎖が表２８に示したように多様化されているライブラリー；および（3）H鎖が表２７に示したように多様化され、L鎖が表２８に示したように多様化されているライブラリーとして作製される可能性がある。FR（フレームワーク）にV11L/L78I 変異を加えかつ表２７に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来するH鎖ライブラリー配列は、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託し、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。取得した抗体ライブラリー断片は、PCR法によって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入された。GLS3000をL鎖として選択した。構築したファージディスプレイ用ファージミドをエレクトロポレーションによって大腸菌に移入し、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を作製した。
表２８に基づき、発明者らは、表２９に示すようにGLS3000について新たな多様化ライブラリーを設計した。L鎖ライブラリー配列は、GLS3000に由来し、表２９に示すように多様化した（DNAライブラリー）。DNAライブラリーはDNA合成会社によって構築された。次いで、種々のGLS3000由来配列を含むL鎖ライブラリーおよび種々のCE115HA000由来配列を含むH鎖ライブラリーをファージミドに挿入し、ファージディスプレイライブラリーを構築した。
【０４０１】
【表２７】
2022502010.tif 000048
【０４０２】
【表２８】
2022502010.tif 000049
【０４０３】
【表２９】
2022502010.tif 000050
【０４０４】
［参考実施例１３］実験細胞株
当業者に周知の方法によって、ヒトGPC3遺伝子をマウス結腸がん細胞株CT-26（ATCC No. CRL-2638）の染色体に組み込み、高発現CT26-GPC3細胞株を取得した。製造者推奨の方法によってQIFIキット（Dako）を用いて、ヒトGPC3（2.3×105/細胞）の発現レベルを決定した。ヒトGPC3遺伝子を維持するために、これらの組換え細胞株を、CT26-GPC3用に200μg/mlでジェネティシン（GIBCO）を加えることによるATCC推奨培地中で培養した。培養後、2.5 g/Lトリプシン-1 mM EDTA（ナカライテスク）を用いて、これらの細胞を剥離し、次いで、各実験に用いた。ここでは、形質転換細胞株をSKpca60aと呼ぶ。
当業者に周知の方法によって、ヒトCD137遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-DG44の染色体に組み込み、高発現CHO-hCD137細胞株を取得した。製造者の指示書によってPE抗ヒトCD137（4-1BB）抗体（BioLegend, Cat. No. 309803）を用いて、ヒトCD137の発現レベルをFACS解析により決定した。NCI-H446 細胞株およびHuh7細胞株はそれぞれ、RPMI1640（Gibco）中およびDMEM（低グルコース）中で維持した。培地は両方とも、10%ウシ胎児血清（Bovogen Biologicals）、100ユニット/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを補充し、細胞を、37℃および5％ CO2の条件下で培養した。
【０４０５】
［参考実施例１４］ECM（細胞外マトリックス）に対する抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）に対する各抗体の結合を、WO2012093704 A1を参照して以下の手法により評価した：ECMフェノールレッドフリー（BD Matrigel #356237）をTBSで2 mg/mLに希釈し、氷上で冷却したECLアッセイ用のプレート（L15XB-3、MSD K.K.、高結合）の各ウェルの中心に5μL/ウェルで液滴添加した。次いで、プレートをプレートシールで覆い、4℃で一晩静置した。ECM固定化プレートを室温に戻した。ECLブロッキングバッファー（0.5％BSAおよび0.05％Tween 20を追加したPBS）を150μL/ウェルでプレートに加え、プレートを室温で2時間以上または4℃で一晩静置した。次いで、各抗体サンプルをPBS-T（0.05％Tween 20を追加したPBS）で9μg/mLに希釈した。二次抗体をECLDB（0.1％BSAおよび0.01％Tween 20を追加したPBS）で2μg/mLに希釈した。20μLの抗体溶液および30μLの二次抗体溶液を、10μL/ウェルで分注したECLDBを含む丸底プレートの各ウェルに添加し、遮光しながら室温で1時間撹拌した。ECLブロッキングバッファーを、ECLブロッキングバッファーを含むECMプレートを反転させることによって除去した。このプレートに対して、前述の抗体および二次抗体の混合溶液を50μL/ウェルで添加した。次いで、プレートを、遮光しながら、室温で1時間静置した。プレートを反転させることによってサンプルを除去し、次いで、READバッファー（MSD K.K.）を150μL/ウェルでプレートに添加し、続いて、Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いてsulfo-tagの発光シグナルを検出した。
［参考実施例１５］抗GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体のオフターゲット細胞傷害活性の評価
（１５−１）抗GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体の調製
標的非依存性細胞傷害活性およびサイトカイン放出を調べるために、CrossMabおよびFAEテクノロジーを利用することによって、三重特異性抗体を生成した（図２．１）。各アームが2つの結合ドメインを有し、その結果、1つの分子中に4つの結合ドメインを有する四価IgG様分子である抗体A（mAb A）を、上述のようなCrossMabにより生成した。二価IgGである抗体B（mAb B）は、従来のIgGと同じ形式である。mAb AおよびmAb Bの両方のFc領域は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱したサイレントなFcγRであり、脱グリコシル化され、かつFAEに適用可能であった。6つの三重特異性抗体を構築した。6つの三重特異性抗体における各Fv領域の標的抗原を、表３０に示した。mAb A、mAb B、およびmAb ABの結合ドメインの各々の命名規則を、図２．２に示す。6つの三重特異性抗体であるmAb ABの各々を生成するためのmAb AおよびmAb Bのペア、ならびにその配列番号を、それぞれ表３１および表３２に示した。WO2005/035584A1に記載された抗体CD3D(2)_i121（AN121と省略される）を、抗CD3ε抗体として用いた。6つの三重特異性抗体をすべて、上記の方法によって発現させ、精製した。
【０４０６】
【表３０】
2022502010.tif 000051
【０４０７】
【表３１】
2022502010.tif 000052
【０４０８】
【表３２】
2022502010.tif 000053
（１５−２）GPC3/CD3/ヒトCD137三重特異性抗体の結合の評価
三重特異性抗体のヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、用いて37℃で評価した。三重特異性抗体のヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて37℃で評価した。抗ヒトFc抗体（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗Fcセンサー表面上に抗体を捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137を、フローセル上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、サイクル毎に3M MgCl2で再生させた。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software, version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定した。
三重特異性抗体の組換えヒトCD3およびCD137に対する結合親和性を、表３３に示す。
【０４０９】
【表３３】
2022502010.tif 000054
（１５−３）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fabの、ヒトCD137およびCD3に対する同時結合の評価
Biacoreタンデムブロッキングアッセイ（Biacore in-tandem blocking assay）を行って、三重特異性抗体またはDual-Fab抗体のCD3およびCD137の両方に対する同時結合を特徴決定した。アッセイは、Biacore T200機器（GE Healthcare）上で、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において25℃で行った。抗ヒトFc抗体（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗Fcセンサー表面上に抗体を捕捉し、次いで、8μM CD3をフローセル上にインジェクトし、その後、8μM CD3の存在下での8μM CD137の同一のインジェクションを行った。第２のインジェクションに対する結合レスポンスの増加は、異なるパラトープに対する結合を示し、したがって、同時の結合相互作用を示した。一方、第２のインジェクションに対する結合レスポンスの増強がないか減少したことは、同じまたはオーバーラップするまたは隣接するパラトープに対する結合を示し、したがって、同時ではない結合相互作用を示した。
【０４１０】
このアッセイの結果を、図２６に示し、そこでは、GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体は、CD3およびCD137に対する同時結合特性を示したが、抗GPC3/Dual-Fab抗体は示さなかった。
【０４１１】
（１５−４）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の、ヒトCD137発現CHO細胞またはJurkat細胞に対する結合の評価
図２７は、FACS解析によって判定された、三重特異性抗体およびDual-Fab抗体の、参考実施例１３において生成されたhCD137トランスフェクタント、親CHO細胞、またはJurkat細胞上に発現しているhCD3（参考実施例６−２）に対する結合を示す。簡潔に述べると、三重特異性抗体およびDual-Fab抗体を、各細胞株と2時間、室温でインキュベートして、FACS緩衝液（PBS中、2％ FBS、2mM EDTA）で洗浄した。次いで、Goat F(ab')2 anti-Human IgG, Mouse ads-PE（Southern Biotech, カタログ2043-09）を添加し、30分間4℃でインキュベートして、FACS緩衝液で洗浄した。データの獲得を、FACS Verse（Becton Dickinson）で行い、その後、FlowJo software（Tree Star）を用いた解析を行った。
【０４１２】
図２７は、50 nMの抗GPC3/H183L072（黒線）抗体が、Ctrl抗体（灰色塗りつぶし）と比べて、hCD137トランスフェクタント上のhCD137に特異的に結合する（図２７ａ）が、CHO親細胞に対しては結合が観察されない（図２７ｂ）ことを示す。同様に、2 nMの抗GPC3/CD137xCD3（暗灰色塗りつぶし）および抗GPC3/CD137xCtrl（黒線）三重特異性抗体は、Ctrl/CtrlxCD3三重特異性対照抗体（薄灰色、塗りつぶし）と比べて、トランスフェクタント細胞上のhCD137に対する特異的結合を示した（図２７ｃ）。CHO親細胞においては、非特異的結合は観察されなかった（図２７ｄ）。
【０４１３】
50 nMの、図２７ｅにおける抗GPC3/H183L072（黒線）抗体および図２７ｆにおけるGPC3/CD137xCD3（暗灰色塗りつぶし）またはGPC3/CD137xCtrl（黒線）三重特異性抗体は両方とも、そのそれぞれの対照（薄灰色塗りつぶし）と比べて、Jurkat細胞上に発現しているCD3に結合することが示された。
【０４１４】
（１５−５）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の、ヒトGPC3発現細胞に対するT細胞上のCD3活性化の評価
三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の両方の形式が、標的依存的様式でエフェクター細胞を活性化することができるかどうかを調べるために、参考実施例６−２に記載されるようにNFAT-luc2 Jurkatルシフェラーゼアッセイを実施した。5.00E+03個のSK-pca60細胞（参考実施例１３）を標的細胞として用いて、0.1、1、および10 nMの三重特異性抗体またはDual-Fab抗体の存在下で24時間、2.50E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞と共培養した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を、Bio-Glo luciferase assay system（Promega, G7940）により、製造業者の説明書に従って検出した。発光（単位）は、GloMax（登録商標） Explorer System（Promega #GM3500）を用いて検出し、捕捉された値を、Graphpad Prism 7を用いてプロットした。図２８に示すように、GPC3/CD137xCD3、GPC3/CtrlxCD3、または抗GPC3/H183L072などの抗GPC3結合および抗CD3結合の両方から構成される三重特異性抗体のみが、標的細胞の存在下で、Jurkat細胞の用量依存的な活性化をもたらした。注目すべきことに、参考実施例（１５−４）におけるFACS解析によるJurkat細胞に対する抗GPC3/H183L072抗体の結合はより弱いにもかかわらず、抗GPC3/H183L072抗体は、GPC3/CD137xCD3またはGPC3/CtrlxCD3抗体と同様の程度のJurkat活性化を惹起することができた。全体的に、三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体は両方とも、エフェクター細胞の標的依存性活性化をもたらすことができる。
【０４１５】
（１５−６）GPC3/CD137xCD3三重特異性抗体および抗GPC3/Dual-Fab抗体の、ヒトCD137発現細胞に対するT細胞上のCD3活性化の評価
三重特異性抗体形式および抗GPC3/Dual-Fab抗体が両方とも、hCD137発現細胞とhCD3発現エフェクター細胞との架橋をもたらすことができるかどうかを調べるために、参考実施例（１５−５）に記載されるように、5.00E+03個のhCD137発現CHOを、0.1、1、および10 nMの三重特異性抗体の存在下で24時間、2.50E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞と共培養した。図２９は、親CHO細胞と共培養した時に、すべての三重特異性抗体によるJurkat細胞の非特異的な活性化がないことを示した。しかし、GPC3/CD137xCD3およびCtrl/CD137xCD3三重特異性抗体は両方とも、hCD137発現CHO細胞の存在下でJurkat細胞を活性化できることが観察された。抗GPC3/H183L072抗体は、hCD137発現CHO細胞と共培養した時に、Jurkat細胞の活性化をもたらさなかった。10 nMの抗GPC3/H183L072抗体は、10 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約0.96％の発光を示し、1 nMの抗GPC3/H183L072抗体は、1 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約1.93％の発光を示した。参考実施例１５−５において評価されたGPC3陽性細胞に対するCD3活性化と比較した場合、10 nMまたは1 nMの抗GPC3/H183L072抗体を用いた時には、約1.36％または1.89％の発光が、CD137陽性細胞に対して検出されたが、10 nMおよび1 nMのGPC3/CD137xCD3三重特異性抗体は、それぞれ、GPC3陽性細胞に対するものと比較して約127.77％および107.22％の発光を、CD137陽性細胞に対して示した。
まとめると、これは、CD3とCD137に同時に結合する三重特異性形式GPC3/CD137xCD3は、CD3とCD137に同時には結合しない抗GPC3/Dual-Fab形式とは異なり、標的または腫瘍抗原の結合とは独立して、hCD137発現細胞に対するJurkat細胞活性化をもたらし、オフターゲット細胞傷害活性を生じ得ることを示唆する。参考実施例８、１５−５、および１５−６に示すそれらの結果から、CD3とCD137に同時には結合しない抗体のみが、標的抗原発現細胞を特異的に死滅させ得ることがわかる。
【０４１６】
（１５−７）Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体およびCtrl/Dual-Fab抗体の、PBMCからのオフターゲットサイトカイン放出の評価
オフターゲット毒性についての三重特異性抗体形式とDual-Fab抗体との比較をまた、ヒトPBMC溶液を用いて評価した。簡潔に述べると、参考実施例（７−２−１）に記載されるように調製された2.00E+05個のPBMCを、80、16、および3.2 nMの三重特異性抗体またはDual-Fab抗体と、標的細胞の非存在下で48時間インキュベートした。上清におけるIL-2、IFNγ、およびTNFαを、参考実施例（７−２−２）に記載されるようなサイトカイン放出アッセイを用いて測定した。図３０に示すように、Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体は、PBMCからのIL-2、IFNγ、およびTNFαの放出をもたらし得るが、Ctrl/Dual-Fab抗体はもたらさない。80 nM Ctrl/Dual-Fab抗体は、80 nM Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体のものの約50％のIL-2濃度を示し、16 nMの抗体を用いた時には、10％未満のIL-2濃度が観察された。IFNγおよびTNFαについて言うと、Ctrl/Dual-Fab抗体は、各抗体濃度において、Ctrl/CD137xCD3三重特異性抗体でのものの10％未満のIL-2濃度を示した。
これらの結果は、Ctrl/CD137xCD3三重特異性形式が、標的細胞の非存在下でPBMCの非特異的活性化をもたらしたことを示唆する。最後に、データは、Dual-Fab形式が、オフターゲット毒性を伴わずに標的特異的エフェクター細胞活性化を付与できることを示した。
【産業上の利用可能性】
【０４１７】
本発明は、CD3およびCD137（4-1BB）に結合することができるが、CD3とCD137に同時には結合することができない、抗原結合分子を提供する。本発明の抗原結合分子は、3つの異なる抗原に対する結合を通して、これらの抗原結合分子によって誘導される増強されたT細胞依存性細胞傷害活性を示す。
【図１．１】
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【図１．２】
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【図１．３ａ】
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【図１．３ｂ】
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【図１．３ｃ】
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【図１．３ｄ】
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【図１．３ｅ】
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【図２．１】
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【図２．２】
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【図２．３ａ】
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【図２．３ｂ】
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【図２．４ａ】
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【図２．４ｂ】
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【図２．４ｃ】
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【図３．１ａ】
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【図３．１ｂ】
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【図３．１ｃ】
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【図３．２】
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【図３．３ａ】
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【図３．３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２．１】
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【図１２．２】
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【図１２．３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７．１】
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【図１７．２】
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【図１７．３】
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【図１７．４】
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【図１７．５】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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