【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年11月24日(2009.11.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜ポリペプチドの化学選択的化学連結方法であって；無保護反応性基を有する第一アミノ酸を含有する脂質マトリックス組込み膜ポリペプチドを、化学選択的化学連結条件下、前記第一アミノ酸と化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有する第二アミノ酸を含有する連結ラベル剤と接触させて、前記第一アミノ酸と前記第二アミノ酸の間に共有結合を形成させることを含んでなる方法。
【請求項２】
前記化学選択的化学連結方法が、自然化学連結方法、オキシム形成連結方法、チオエステル形成連結方法、チオエーテル形成連結方法、ヒドラゾン形成連結方法、チアゾリジン形成連結方法、およびオキサゾリジン形成連結方法からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質マトリックスが、リオトロピック相を形成することができる脂質分子を含有している請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質マトリックスが、平坦な二重層膜、リポソーム、ミセル、または六方脂質相マトリックスからなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膜ポリペプチドがフォールドされている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記膜ポリペプチドが内在性膜ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記内在性膜ペプチドが膜貫通ポリペプチドである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膜貫通ポリペプチドが受容体である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記連結ラベル剤が一つ以上のアミノ酸を含有している請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記連結ラベル剤がペプチドを含有している請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが水溶性ペプチドである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが脂質に溶解性のペプチドである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドがポリペプチドを含有している請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが膜ポリペプチドである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが非天然のアミノ酸を含有している請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記非天然のアミノ酸が発色団を含有している請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発色団がアクセプタードナー共鳴エネルギー転移対のアクセプター部分である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発色団が、アクセプタードナー共鳴エネルギー転移対のドナー部分である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
脂質膜に埋め込まれるフォールドされた膜ポリペプチドに標識をつける方法であって；
化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する、脂質膜に埋め込まれたフォールドされた膜ポリペプチドを、前記脂質膜に埋め込まれたフォールドされたポリペプチドを前記アミノ酸に隣接する開裂部位で選択的に開裂する開裂試薬で開裂することによって生成させ；
次いで、 化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する連結ラベル剤を、前記脂質膜に埋め込まれたフォールドされたポリペプチドに、前記アミノ酸間に共有結合が形成される条件下で連結することにより、前記脂質膜に埋め込まれたポリペプチドに標識をつける；
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
前記開裂部位が、化学的開裂部位およびプロテアーゼ開裂部位からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一つに記載の方法によって製造された、脂質マトリックスに埋め込まれた標識化膜ポリペプチド。
【請求項２２】
ｉ）化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する連結ラベル剤および 
ii)脂質マトリックス内に埋め込まれた膜ポリペプチドであって、前記連結ラベル剤の前記無保護反応性基と化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する膜ポリペプチド
を成分として含有する組成物。
【請求項２３】
ｉ）化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する連結ラベル剤；および 
ii)脂質マトリックス内に埋め込まれたフォールドされたポリペプチドであって、開裂試薬によって開裂されると無保護反応性基を提供して、前記連結ラベル剤の前記無保護反応性基と化学選択的化学連結を行うことができるアミノ酸に直接隣接する開裂部位を含有するポリペプチド；
を成分として含有する組成物。
【請求項２４】
光学的に等方性の立方脂質相マトリックス内に埋め込まれたフォールドされた膜ポリペプチドであって、一つ以上のアミノ酸と一つの発色団を含有する検出可能な標識を含有する膜ポリペプチド。
【請求項２５】 
請求項２１に記載の脂質マトリックスに埋め込まれた標識化膜ポリペプチドが入っているキット。
【請求項２６】 
ｉ）化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有する連結ラベル剤および 
ii) 連結ラベル剤と化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有する少なくとも一つの非天然のアミノ酸を含有する脂質マトリックス内に埋め込まれた膜ペプチド
を成分として含有する組成物。
【請求項２７】 
前記膜ポリペプチドが、オキシム、チオエステル、チオエーテル、ヒドラゾン、チアゾリジンおよびオキサゾリジンからなる群から選択される非天然の骨格結合によって第二アミノ酸残基に共有結合される第一アミノ酸残基を含有している請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】 
前記膜ポリペプチドが内在性膜ポリペプチドである請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】 
前記内在性膜ポリペプチドが膜貫通ポリペプチドである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】 
前記膜貫通ポリペプチドが、受容体の一つ以上の脂質膜固定ドメインを含有している請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】 
前記膜貫通ポリペプチドが、イオンチャンネルの一つ以上の脂質膜固定ドメインを含有している請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】 
前記膜ポリペプチドが、検出可能な標識を有する非天然アミノ酸を含有している請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】 
脂質マトリックス内に埋め込まれた、オキシム、チオエステル、チオエーテル、ヒドラゾン、チアゾリジンおよびオキサゾリジンからなる群から選択される非天然の骨格結合によって共有結合された少なくとも二つのアミノ酸残基を有する膜ポリペプチド。
【請求項３４】 
膜ポリペプチドと連結ラベル剤との加速化学連結方法であって；無保護反応性基を有する第一アミノ酸を含有する膜ポリペプチドと、前記第一アミノ酸と化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有する第二アミノ酸を含有する連結ラベル剤とを、連結緩衝液内で混合することを含んでなり、その連結緩衝液が、ミセル形成脂質マトリックス、カオトロープ、緩衝剤、および前記第一アミノ酸と第二アミノ酸の化学選択的化学連結反応を触媒して前記第一アミノ酸と前記第二アミノ酸の間に共有結合を形成する化学連結触媒を成分として含有している方法。
【請求項３５】 
前記化学選択的化学連結方法が、自然化学連結法、オキシム形成連結法、チオエステル形成連結法、チオエーテル形成連結法、ヒドラゾン形成連結法、チアゾリジン形成連結法およびオキサゾリジン形成連結法からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】 
前記ミセル形成脂質マトリックスがドデシルホスホコリンである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】 
前記カオトロープが、尿素および塩化グアニジウムからなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】 
前記化学選択的化学連結法が自然化学連結法である請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】 
前記化学連結触媒がチオフェノールである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】 
膜ポリペプチドと連結ラベル剤との化学選択的化学連結法に用いる連結緩衝液であって；脂質マトリックスを形成できる脂質試薬、カオトロープ、緩衝剤、および選択的された化学選択的化学連結化学反応に用いる化学連結触媒を、成分として含有する連結緩衝液。
【請求項４１】 
前記膜質マトリックスが、平坦な脂質二重層膜、リポソーム、ミセルおよび立方脂質相からなる群から選択される請求項４０に記載の連結緩衝液。
【請求項４２】 
脂質マトリックスを形成することができる前記膜質試薬がドデシルホスホコリンである請求項４０に記載の連結緩衝液。
【請求項４３】 
前記カオトロープが、尿素および塩化グアニジウムからなる群から選択される請求項４０に記載の連結緩衝液。
【請求項４４】 
前記化学連結触媒がチオフェノールである請求項４０に記載の連結緩衝液。
【請求項４５】 
請求項４０に記載の成分が入っているキット。
【請求項４６】 
前記成分が、容器内で予め混合されている請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】 前記成分のうち一種以上が、前記キット内の別個の容器に入れて提供さ  れる請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】 
ポリペプチド開裂試薬がさらに入っている請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】 
化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する連結ラベル剤がさらに入っている請求項４５に記載のキット。
【請求項５０】 
化学選択的化学連結を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有する膜ポリペプチドがさらに入っている請求項４５に記載のキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
細胞膜は、水性コンパートメント間に障壁を形成することができる脂質で形成されている。細胞膜は、種々の膜タンパク質と結合する脂質分子の連続した二重プレートまたは二重層プレートで主として構成されている。リン脂質、スフィンゴ脂質および糖脂質が、膜を形成する脂質分子の三つの主要クラスを構成している。これらの脂質は、親水性（極性）ヘッドと疎水性（非極性）のテールをもうけているという点で両親媒性分子である。細胞の水性環境において、前記極性ヘッドの基は水の方を向き、一方、脂質の疎水性テールの基は互いに相互作用を行って、ラメラ二重層、およびわずかであるが脂質の組成と状態によって他の集合構造体を形成する。例えば膜脂質は、脂質と水分および温度によって、球形（小胞）、棒形（管）およびラメラ（プレート）を含む各種の異なる形態を形成することができる。これらの形態は、相互に作用して、ラメラ相（例えば二分子層プレート、密閉球体）、六方相（ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｐｈａｓｅ）（例えば棒体）または立方相（ｃｕｂｉｃ ｐｈａｓｅ）（例えば水性チャンネルで接続された球体、棒体もしくはラメラ）として分類される二次元または三次元の格子マトリックス構造体を形成する基本単位を示す。（Ｌｉｘｄｂｌｏｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉａ Ａｃｔａ，９８８巻、２２１〜２５６頁、１９８９年）。リン脂質の典型的な細胞膜二重層（ラメラ相）の断面は、約３０オングストローム（Å）の疎水性コア領域と、各々約１５Åの二つの界面領域とを有していると観察することができる（Ｗｈｉｔｅら、Ｃｕｒｒ，Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．，４巻、７８−８６頁、１９９４年）。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
タンパク質は、各種の方式で細胞と結合することができる。内在性膜タンパク質は、脂質二重層内に埋め込まれる少なくとも一種の成分を含有している。これら内在性膜タンパク質の非極性セグメントは、膜の表面に垂直の方向に、脂質二重層内に埋め込まれ、ポリペプチドの疎水性領域を構成し、脂肪酸連鎖または他のタイプの脂質連鎖と共有結合している。表在性膜タンパク質は、通常、これら内在性膜タンパク質との非共有相互作用によって、脂質二重層と結合している。さらに、いくつかの表在性膜タンパク質は、全体が水性相内に位置して、共有結合した脂肪酸または脂質の連鎖によって細胞膜に結合している。ミリスチン酸などの脂肪酸の連鎖が、タンパク質のアミノ末端のグリシンに、アミド結合によって翻訳時に結合されて、細胞膜の細胞質面に、前記タンパク質の局在化が起こる。また、プレニル基とパルミチン酸基が、翻訳後に、チオエーテル結合によって、システイン残基に結合して、細胞膜にタンパク質の局在化が起こる。この種の共有結合は、ヘテロトリメトリック（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｔｒｉｃ）Ｇタンパク質などの多種類の細胞シグナリングタンパク質の機能として重要である（Ｔａｍｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（１１）巻、２６２３〜２６３４頁、１９９０年；Ｍｏｒｅｌｌｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７４（４）巻、４４９〜４５７頁、１９９６年；Ｍｕｍｂｙ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９（２）巻、１４８〜１５４頁、１９９７年；Ｒｅｓｈ，Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，８（６）巻、４０３〜４１２頁、１９９６年；およびＢｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，９（１）巻、１５〜３５頁、１９９７年）。可溶性タンパク質類のＣ末端に見られるグリコシルホスファチジルイノシトールのアンカーは、これらのタンパク質を細胞表面膜に結合させる（Ｔｕｒｎｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８巻、１１３〜１２７頁、１９９４年）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
公知の内在性膜タンパク質の二つの主要クラスは、αヘリックスを脂質二重層に挿入するクラスと、βバレルストランドによって、脂質二重層内に孔を形成するクラスである（Ｍｏｎｔａｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．，６巻、４９９〜５１０頁、１９９６年；Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５９巻、３９３〜３４２頁、１９９６年およびＷｅｉｓｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７７巻、４９３〜５０９頁、１９９２年）。単一膜スパニングタンパク質（Ｓｉｎｇｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）すなわち単一パス膜タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ ｐａｓｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、一般に、その配列を、αヘリックス配置構成によって、脂質二重層中に固定する疎水性領域をもっている。複数膜スパニングタンパク質すなわち複数パス膜タンパク質は、脂質二重層を横切って出ていったり戻ったりするポリペプチド連鎖によって生成し、一般にαヘリックス構造および／またはβバレル構造の膜アンカーを利用する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
膜タンパク質の例としては、膜に結合した受容体、輸送タンパク質、酵素および免疫原がある。例えば、細胞膜に結合した受容体は、治療上特に重要な膜タンパク質の機能集団（ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）である。４種の基本的なスーパーファミリーが知られている。すなわち、酵素結合受容体、フィブロネクチン様受容体、７回膜貫通受容体およびイオンチャンネル受容体である。酵素結合受容体は単一パス膜タンパク質であり、基本的構造は、αヘリックスアンカードメインを通じてプラズマラメラを一回通過する単一ポリペプチド（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）で構成されている。酵素結合受容体の細胞外ドメインはホルモン／リガンドに結合しているが、そのカルボキシル端末ドメインは、ホルモン／リガンドの結合と受容体の凝集によって信号の伝達を促進する触媒部位を含有している。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
フィブロネクチン様受容体は、特異的な触媒部位が細胞質ドメイン内に存在しないことを除いて酵素結合受容体と同じ全体構造を有している。クラス１のフィブロネクチン様受容体は、直角に連結してリガンド結合ポケットをつくる二つの７−ストランドβシートで形成された二つの修飾細胞外ドメインを含有している。クラス２のフィブロネクチン様受容体は、ホルモン様フィンガーを超えて延びる５−ストランドβシートの繰返し単位を形成しているという点でわずかに構造が異なっている。これらクラス１と２つの受容体は、構成要素として可溶性チロシンキナーゼに結合するプロリンリッチな細胞質傍膜の保存領域（ｃｏｎｓｅｒｅｄ ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含有し、この領域はリガンド／ホルモン結合と受容体の凝集によって活性化される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
膜タンパク質を研究しおよび／または膜タンパク質を、治療、目的、診断薬および薬物選別検定法などに活用するため各種の方法が使用されている。しかし、膜タンパク質を扱う際の最大の障害は、非膜タンパク質と異なり、それらの疎水性ポリペプチド連鎖の溶解性が低いこと、フォールドされていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）ポリペプチド連鎖から膜タンパク質をフォールドする（ｆｏｌｄ）ことが困難なことおよび定量分析を行うのに適切な環境内で過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）させて単離することが困難であることである（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６巻、３８０２〜３８０９頁、１９８１年およびＬｉａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８巻、９９４９〜９９５５頁、１９８３年）。例えば、膜貫通タンパク質全体をアンフォールドしたり（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）フォールドする（ｆｏｌｄｉｎｇ）ことは困難である。というのは、膜貫通タンパク質は、高度に疎水性であるので、アンフォールドな形態では脂質二重層に不溶性であり、そしてフォールドされた形態とアンフォールドな形態の両者が水性相に不溶性であるからである（Ｈａｌｔｉａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２４１巻、２９５〜３２２頁、１９９５年）。膜タンパク質のこの特徴は、膜タンパク質を、細胞の存在しない環境内で、合成し、標識をつけ、または他の方法で化学的に処理しようとするとき、特に問題である。しかし、膜タンパク質の個々の膜貫通セグメントは、固相化学反応によって化学的に合成され、次いで膜内に挿入されて、生物活性を有する天然産様構造が自然に組立てられている（Ｐｏｐｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９巻、４０３１〜４０３７頁、１９９０年；およびＧｒｏｖｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０７巻、５１０〜５２５頁、１９９２年）。しかし、今までの所、膜タンパク質は、標準的な化学合成法にとって扱いにくいので、固相合成は、ごく少数の短い膜貫通ペプチドセグメントの合成に限定されている。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、膜ポリペプチドの脂質マトリックス介助化学連結法と合成法およびその方法に用いる組成物、その方法によって産生される組成物ならびにそれら組成物を利用する検定法に関する。上記方法は、脂質マトリックスに組込まれた膜ポリペプチドを、一つ以上のアミノ酸を含有する連結ラベル剤（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｌａｂａｌ）と接触させることからなり、前記ポリペプチドとラベル剤は、化学選択的（ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）化学連結反応を行うことができる無保護反応性基を有するアミノ酸を含有している。自然の化学連結、オキシム形成連結、チオエステル形成連結、チオエーテル形成連結、ヒドラゾン形成連結、チアゾリジン形成連結およびオキサゾリジン形成連結などの連結反応を行うため、各種の化学選択的化学反応を利用できる。本発明の組成物には、本発明の脂質マトリックス介助化学連結方法によって製造される、全合成および半合成の脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチド（脂質マトリックスに埋め込まれた膜ペプチド）が含まれている。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
さらに、本発明には、化学選択的連結をしやすい残基に直接隣接するポリペプチドを開裂させる試薬で処理すると、化学選択的化学連結を行いやすい連結部位を含有させることができる脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの製造方法が含まれている。本発明のこの側面には、脂質マトリックス内に埋め込まれた膜ポリペプチドを、そのポリペプチドを特異的部位で選択的に開裂させて化学選択的化学連結を行いやすい無保護のＮ末端残基またはＣ末端残基を有する脂質マトリックス埋込み膜マトリックスを生成させる試薬と接触させることが含まれている。その開裂部位は、前記ポリペプチドに天然に存在しているかまたは前記ポリペプチドを、一つ以上のかような部位を含有するように工学的につくることができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
また、本発明には、脂質マトリックスに埋め込まれたフォールドされた膜ポリペプチドと直接または間接的に、相互に作用するリガンドを検出する方法が含まれている。本発明のこの側面では、リガンドと、脂質マトリックス介助化学連結法で製造されて、脂質マトリックスに埋め込まれた合成もしくは半合成の膜ポリペプチドとを接触させることを含んでおり、そしてそのリガンドおよび／または膜ポリペプチドは検出可能な標識を含有している。これらのリガンドは、天然に存在するリガンド、ならびに化学物ライブラリーなどの合成のまたは半合成の起源を含む多くの起源から得ることができる。この方法は、診断検定法、薬物開発のための新しい化合物の選別、およびプレフォールドされた（ｐｒｅｆｏｌｄｅｄ）膜タンパク質に対するリガンドの結合を利用するその外の構造や機能の検定法にとって特に有用である。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
さらに本発明は、ペプチドにキレート剤増感（ｃｈｅｌａｔｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）金属イオンプローブで、樹脂上にて標識をつける方法を提供するものである。この方法は、樹脂に結合されたペプチドの一つ以上のアミノ酸に金属イオンをキレート化できる双性イオンのキレート化剤の部分の標識で標識をつける方法である。またこの方法には、双性イオンキレート化剤の溶解度を増大することを含まれる。この方法では、不溶性の双性イオンキレート化剤に、その双性イオンキレート化剤の可溶性塩型を生成する可溶化剤を結合させる。また、本発明は、可溶性塩型の双性イオンキレート化剤を含有する組成物を提供する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の方法と組成物によれば、一つ以上の検出可能な標識を有する膜ポリペプチド及びその部位特異的標識化に対する新規なアクセスが可能となる。また、本発明の方法と組成物には多くの追加の用途がある。例えば、本発明の方法と組成物は膜ポリペプチドに結合するリガンドおよび受容体を有する領域を検定するのに利用できるので、高処理量の用途を含む、構造／機能の研究、薬物の選別／選択／設計および診断などに極めて有用である。本発明の方法と組成物は、従来、アクセスできなかった膜ポリペプチドのＦＲＥＴ分析を行うのに特に適している。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
【発明の実施の形態】
定義 
アミノ酸：２０種の遺伝コードされたアミノ酸、天然に見られるまれなまたは珍しいアミノ酸ならびに天然に存在しない修飾されたアミノ酸が含まれる。時には、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の文脈において、アミノ酸残基と呼称される。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
化学選択的化学連結反応：（１）第一の無保護のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドと（２）第二のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドとの共有連結を行う化学的選択反応。無保護のペプチドセグメントの連結に利用できるあらゆる化学選択的反応。
発色団：スペクトルの紫外光（２５０〜４００ｎｍ）〜可視光（４００〜７００ｎｍ）の領域内で光を吸収する化学部分。発蛍光団、色素および共鳴エネルギー転移系のドナーとアクセプターの部分を含む。ペプチド、ポリペプチド、炭水化物または脂質などの生物学的分子に天然に存在しているか（内因性）または付加される（外因性）。
開裂部位：標的ポリペプチドの二つのアミノ酸間のペプチド結合の加水分解反応を促進する化学薬剤またはプロテアーゼを含有する試薬で開裂させることができるアミノ酸配列。
ヒドラゾン化学連結反応：ヒドラジン部分を有する第一の無保護のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドと、アルデヒドまたはケトンの部分を有する第二の無保護のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドを連結して、連結部位にヒドラゾン部分を含有する連結生成物を生成する化学選択的反応。ヒドラゾン生成化学連結反応で生成したペプチドまたはポリペプチドの生成物の骨格構造は、天然にまたは組換え体の発現によって生成するペプチドまたはポリペプチドの骨格構造と区別することができる。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
ポリペプチド：三つ以上の単量体を含有する重合体であって、それら単量体はアミノ酸でありアミノ酸残基と呼称されるときもあり、アミド結合で連結されている。ペプチドまたはタンパク質と呼ばれることもある。天然のアミド結合または公知の非天然のペプチド骨格またはその混合物を含有していることがある。大きさの範囲は、３〜１０００個のアミノ酸残基であり、好ましくは３〜１００個のアミノ酸残基であり、より好ましくは１０〜６０個のアミノ酸残基であり、最も好ましくは２０〜５０個のアミノ酸残基である。ポリペプチドのセグメントまたは全体は、溶液合成法、段階的固相合成法、セグメント縮合法および収束縮合法を含む公知の合成法で製造することができる。また、ポリペプチドのセグメントまたは全体は細胞内でリポソームによってもしくは細胞なしの翻訳系で製造することも可能であり、またはより大きなポリペプチドセグメントのタンパク質分解反応で生成させることもできる。化学的方法とリポソーム法の組合せで合成することもできる。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】削除
【訂正の内容】
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明は、脂質マトリックス内に組み込まれた膜ポリペプチドまたは膜ペプチドのドメインの脂質マトリックス介助化学連結法と合成法およびそれに用いる組成物に関する。また本発明は本発明の方法で製造される組成物およびその組成物を利用する検定法に関する。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
本発明の脂質マトリックス介助化学連結法と合成法は、連結ラベル剤の、脂質マトリックスに埋め込まれた膜ポリペプチドへの化学選択的連結を行う。上記膜ポリペプチドと連結ラベル剤の成分は、選択的に反応して、連結部位（化学選択的連結部位とも呼ばれる）に共有結合を生成する無保護反応性基を有している。上記脂質マトリックスは、（１）膜ポリペプチドを、プレフォールドされた状態（ｐｒｅｆｏｌｄｅｄ ｓｔａｔｅ）に維持する環境を提供し、（２）化学選択的連結に用いる反応性基を配置するのに利用される。本発明のこの側面を、下記方式１で例示する。
方式１ 
Ｘn −Ｒ2 ＋Ｒ1 −ＭＰ→Ｘn −Ｒ3 −ＭＰ 
“Ｘn ”は一つ以上のアミノ酸を表す。“Ｒ1 ”と“Ｒ2 ”は、互いに化学選択的化学連結を行うことができる無保護の反応性基を表す。“ＭＰ”は、脂質マトリックスに埋め込まれる少なくとも一つの疎水性（非極性）領域を含有する膜ポリペプチドを表す。基を接続するダッシュ“−”は共有結合を示す。連結成分“Ｘn −Ｒ2 ”と“Ｒ1 −ＭＰ”の無保護反応性基間の化学選択的相互作用によって化学連結生成物“Ｘn −Ｒ3 −ＭＰ”（式中“Ｒ3 ”は、Ｘn −Ｒ2 とＲ1 −ＭＰの間の化学選択的化学連結反応で形成された共有結合を表す）。反応中間体と副生成物は記載していない。すべての連結成分を化学合成法、すなわちリポソームなしの合成法で製造すると、完全な合成製品を製造できる。半合成製品は、連結成分の少なくとも一部を生物学的合成法、すなわち、細胞内または細胞なしの翻訳系内でリポソームによって製造し、そしてその外の部分は化学合成法で製造することにより製造できる。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
与えられた連結化学反応の反応条件を選択して、脂質埋込み膜ポリペプチドと連結ラベル剤の成分との望ましい相互作用を維持する。例えば、ｐＨと温度、連結ラベル剤の水溶性、脂質に対するポリペプチドとラベル剤の比率や、脂質マトリックスの水分および組成を変えて連結反応を最適化することができる。脂質マトリックスおよび／または膜ポリペプチドを異なる程度に可溶化する試薬の添加または除外をさらに利用して、所望の連結反応の特異性と速度を制御することができる。すなわち、脂質マトリックスおよび／または膜ポリペプチドの可溶性を操作することによって、反応性基の露出と提示を制御することができる。反応条件は、所望の化学選択的反応生成物を一つ以上の内部対照および／または外部対照と比較して検定することによって容易に決定される。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
膜ポリペプチド連結成分は、好ましくは、脂質膜内の挿入と固定の両者を行うことができるアミノ酸配列を含有している。例えば、膜ポリペプチドは一般に、両親媒性αヘリックのような膜貫通構造を形成できるアミノ酸配列を含有しており、このアミノ酸配列は非極性残基が膜の内部と接触して帯電しているか、または極性残基が水性相と接触するように形成される。このタイプの膜ポリペプチド連結成分は、脂質二重層を横切るのに十分な長さなので、一般に１５〜２０個のアミノ酸より長い長さを有している。それら成分は、大きさが天然に存在する膜ポリペプチドの全長までの範囲内であり、そしてその膜ポリペプチドが脂質マトリックス内に組込むことができるならば、かような全長のポリペプチドに一つ以上のアミノ酸を追加して含んでいてもよい。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
膜ポリペプチド成分が組み込まれる脂質マトリックスとしては、リオトロピック相を形成できる天然脂質と合成脂質がある（すなわち、液晶相のような、水との相互作用によって秩序づけられた膜型構造が形成される）。これらの脂質としては、ラメラ二重層などの脂質凝集体を形成できるリン脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質および糖脂質などの極性脂質がある。好ましい脂質マトリックスは、安定な膜単層もしくは膜二重層およびその凝集相を形成する。特に重要なのは、安定な立方相を形成する脂質である（立方脂質相すなわちＣＬＰマトリックス）（Ｌｕｚａｔｔｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２１８巻、１０３１〜１０３４頁、１９６８年；およびＬｉｎｄｂｌｏｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，９８８巻、２２１〜２５６頁、１９８９年）。立方相は、脂質凝集体が三次元格子を形成する相である。その脂質凝集ユニットは、球形、棒形またはラメラ形などの各種の形をとることができる。対照的にラメラ液晶相は、無限発現（ｉｎｆｉｎｉｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のラメラユニットが規則的に積重ねられている一次元の周期性を示し、そして六方液晶相は、六方格子中に充填された無限長の棒状凝集体の二次元周期性を示す。したがって立方相は光学的に等方性であるが、ラメラ相と六方相は光学的に異方性である。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
連結ラベル剤の成分は一つ以上のアミノ酸を含有し、好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。連結ラベル剤の少なくとも一つのアミノ酸は、脂質マトリックスに埋め込まれた膜ポリペプチドが提供する相溶性反応性基と反応して共有結合を生成できる反応性基を提供する。また、連結ラベル剤は、例えば、複数パスの膜貫通ポリペプチドのモジュール連結と合成が所望の場合、膜ポリペプチド成分を含有していてもよい。また連結ラベル剤は、天然および／または非天然のペプチド骨格構造または非天然のアミノ酸残基などの天然ペプチドの配列と化学的に異なるアミノ酸残基、例えば連結ラベル剤および標的の脂質マトリックス埋込み膜ペプチドの化学的連結反応と両立できる発色団などの検出可能な部分を含有する非天然アミノ酸を含有していてもよい。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
また、本発明の脂質マトリックス、脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドおよび／または連結ラベル剤は、一つ以上の化学的タグを利用してもよい。この化学的タグは、合成工程、精製、支持マトリックスへの固定、検出などの部材など多くの目的に利用できる。特に重要なのは、発色団を含有する非天然アミノ酸が提供する化学タグである。この発色団としては、アクセプタードナー共鳴エネルギー転移対のアクセプター部分および／またはドナー部分である発色団がある。特に重要なのは、合成と精製のハンドルと、選別および診断検定法などに利用するため、脂質マトリックスまたは脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドを支持マトリックスに結合させるための検出可能なラベル剤と任意の化学的部分である。本願に記載されている各種のラベル剤はこの目的に適している。場合によっては、一つ以上の目的、例えば支持マトリックスへ結合させるためのハンドルとしておよび検出可能なラベル剤としての両方の目的のため、与えられた化学タグを利用することが有利であることは分かるであろう。化学的タグの例としては、金属結合タグ（例えばＨｉｓタグ）、炭水化物／基質結合タグ（例えばセルロースとキチンの結合ドメイン）、抗体と抗体フラグメントのタグ、同位体ラベル剤、ビオチンなどのハプテン類、および発色団を含有する各種の非天然アミノ酸がある。化学的タグは開裂可能なリンカーを含有していてもよい。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
脂質マトリックスに埋め込まれる膜ポリペプチドの化学連結を行う脂質マトリックスが開発されると、プレフォールドされた膜ポリペプチドの新規な部位特異的連結、検出可能な標識化およびモジュール合成が行える。前記脂質マトリックスは、化学連結部位の挿入、フォールディングおよび提示を行うための適正な環境を提供するだけではなく、脂質マトリックス内に膜ポリペプチド成分を埋め込むと、脂質マトリックス自体が化学連結反応の特異性を制御する新規な成分として活用される。例えば、膜ポリペプチドの連結部位は、脂質マトリックスの脂質膜二重層内に埋め込まれるように選択される。この場合、疎水性連結ラベル剤の化学連結の方が、親水性連結ラベル剤の化学連結より好ましい。あるいは、連結部位は、親水性連結ラベル剤の連結が選好されるように膜の外側にあってもよい。脂質マトリックス成分を、連結部位の配置と組合せて活用することによって次のように変えてもよい。すなわち、例えば密封膜小胞（例えばリポソーム）によって、二つの水性相に仕切るように設計された脂質膜系を構築してもよく、この場合、連結部位は膜の一方の側で露出されるように選択される。連結部位の露出をさらに調節して、脂質マトリックスを、各種の程度に可溶化する試薬を添加または除くことによって連結反応の速度および／または程度を調節することができる。さらに連結部位の露出と反応性の程度は、ｐＨや温度などの反応条件、および連結ペプチドの水溶性、脂質マトリックスの水分と組成によって制御することができる。したがって、連結部位が埋め込まれる脂質膜に対する連結部位の位置と配向によって、連結ラベル剤の溶解性、脂質マトリックスの一体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）と組成、連結反応の特異性と速度を制御することができる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
また、各種の化学開裂部位が知られており、限定されないが、インテインタンパク質スプライシング要素（Ｄｏｎａｌｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５（６）巻、４６２６−４６３０頁、１９９７年）および臭化シアン開裂部位がある。スプライスできないが代わりにどちらかのスプライスジャンクションのペプチド結合を開裂するインテインを構築できる（Ｘｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５（１９）巻、５１４６〜５１５３頁、１９９６年およびＣｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１巻、２２１５９〜２２１６８頁、１９９６年）。例えばサッカロミセス・セレビジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＶＭＡＩ遺伝子由来のインテイン配列は、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノールまたはシステインなどのチオールの存在下、低温にて、そのＮ末端で自己開裂反応を受けるように修飾することができる（Ｃｈｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，１９２巻、２７１〜２８１頁、１９９７年）。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
臭化シアン（ＣｎＢｒ）は、ポリペプチド配列の内部メチオニン（Ｍｅｔ）残基を開裂する。ＣｎＢｒによる開裂によって、二つ以上のフラグメントが生成し、それらフラグメントは、活性化されたα−カルボキシル官能性を有する元のポリペプチド配列の中のＣ末端残基を含有し、例えば、内部Ｍｅｔ残基における臭化シアンによる開裂によって、Ｃ末端ホモセリンラクトンを有するフラグメントが生成する。いくつかのポリペプチドの場合、これらのフラグメントは、フォールディング条件下で再結合して、フォールドされたポリペプチド様構造を生成し、この構造はこれらセグメント間の反応を促進して、妥当な収率（４０〜６０％のことが多い）の完全な長さのポリペプチド連鎖が生成する（この場合、その完全な長さのポリペプチド連鎖は、臭化シアンによる開裂を受けたＭｅ残基が存在していたところにはホモセリン残基を含有している）（Ｗｏｏｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１巻、３２００８〜３２０１５頁、１９９６年）。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
化学選択的連結部位を生成する開裂部位を含有していることは、膜ペプチドが、脂質膜中への挿入、特定の選択された膜中への挿入、検出および／または精製を容易に行えるようにするかまたはその効力を向上するため必要な情報を含むキャップ形成、シグナルタイプなどのリーダー配列に適合しているとき特に有利である。例えば、膜ポリペプチドを、脂質膜マトリックス中に埋め込んだ後に開裂すると、適正にフォールドされたポリペプチドを選択することができ、かつ適正な挿入とフォールディングを開始するのに必要であるが一旦疎水性固定配列が脂質マトリックス内に埋め込まれればもはや必要でない配列を取り除くことができる。また、その開裂部位は、適正に組込まれてフォールドされたポリペプチドの検出および／または精製を行うために使用できる。例えば、膜ポリペプチドが膜外に露出されるように設計された開裂部位を含有するように選択されると、脂質膜内で適当な配置形態を有し、従って開裂部位が膜外に露出されているポリペプチドは、水溶性開裂試薬例えば水溶性エンドプロテアーゼが、水性条件下で利用されると、開裂に対して最高の感度を示すようである。また化学選択的連結部位を生成する開裂部位は、精製のハンドルまたはタグが融合ポリペプチドの一部として含まれているとき、それの合成後の精製を容易にするため、含有させてもよい。したがって、化学選択的連結部位を生成するよう設計された開裂部位が含まれていることは多くの目的のために利用できる。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
方式１−２に例示した化学連結法に適切な膜ポリペプチドと連結ラベル剤の成分の組合せは、新規に設計するが、または好冷性、中温性および好熱性の微生物を含む、ウィルス、真核細胞、原核細胞および始原菌の系由来の膜タンパク質系を含む実質的に公知の膜タンパク質系、および、特に二つの主要クラスの膜タンパク質すなわちαヘリックスを膜質二重層に挿入する膜タンパク質と、βバレルストランドによって孔を形成する膜タンパク質から誘導することができる。その例としては、膜関連受容体、輸送タンパク質（例えば、カリウム、ナトリウム、プロトン、塩化物のチャンネル、孔などのイオンチャンネルやその他のチャンネル；ＴＥＸＡＮ薬物輸送体、ミニ−ＴＥＸＡＮＳとＡＢＣの薬物輸送体などの活性輸送体、ならびにＨ＋／グルコース対向輸送体などの対向輸送体）；酵素（例えば、ロイコトリエンＣ４シンターゼ）；および免疫原（例えば腫瘍転移関連抗原）がある。特に重要なのは、チロシンキナーゼ、セリン−トレオニンキナーゼおよびグアニレートシクラーゼのファミリーの酵素連結受容体を含む、酵素連結受容体、フィブロネクチン様受容体、７回膜貫通受容体およびイオンチャンネル受容体である。チロシンキナーゼファミリーの受容体の例としては、上皮増殖因子、インスリン、血小板由来の成長因子および神経成長因子がある。セリンキナーゼファミリーの受容体の例としては成長因子のβファミリーがある。グアニレートシクラーゼファミリーの受容体例としては、心房性ナトリウム利尿因子に応答して、環式ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を生成する受容体がある。７回膜貫通受容体の例としては、カテコールアミン類、ヒスタミン類、プロスタグランジン類などに結合する膜タンパク質およびオプシン類、バソプレシン、ケモカインおよびメラノコルチン（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）の受容体がある。イオンチャンネル受容体の例は、リガンドおよび電位−依存性チャンネル膜タンパク質受容体が代表的なものであるが、アセチルコリン活性化ナトリウムチャンネル、グリシンとγ−アミノイソ酪酸活性化塩化物チャンネルおよびセロトニンとグルタメートの活性化カルシウムチャンネル、および環式ヌクレオチド依存性チャンネルのファミリー（ｃＡＭＰとｃＧＭＰ）、およびカルシウムの貯蔵量を調節するイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）と環式ＡＤＰ−リボースの受容体のファミリーがある。当業技術者は、上記のおよび追加の膜ポリペプチドの核酸配列および／またはアミノ酸配列を、各種のゲノムおよびタンパク質関連のデータベースで確認できることが分かっている。公的にアクセスできるデータベースの例としては、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２６（１）巻、１〜７頁、１９９８年；ＵＳＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ 米国メリーランド州ベセスダ）、ＴＩＧＲ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔａ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，米国メリーランド州ロックビル）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｂ���ｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＵＳＡ）およびｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ ａｎｄ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｏｏｔｅｉｎ ｃａｔａｂａｓｅ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｘｆｏｒｍａｔｉｃｓ，スイス国ジュネーブ）がある。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
膜ポリペプチドと連結ラベル剤成分の組合せとそれらそれぞれの連結部位を選択する場合、相補的な化学選択的組合せは、標的ポリペプチドの構造を、その機能に関連して、当該技術分野で公知で本願に記載されている生物学的方法、熱力学方法、計算による方法および構造による方法などの１つ以上の日常的な方法を使用して分析することによって確認することができる。上記情報を使用して、天然の構造中に存在し、および／または合成型の分子中に工学的につくられた一つ以上の、化学選択的結合部位を選択する。特に、構造と機能の情報は、類似のアミノ酸配列とドメインを有する他のポリペプチド、好ましくは、少なくなくてもある種の構造と機能の情報が知られている他のポリペプチドとの相同性の比較を含む標準の方法で得ることができる（公知の三次元構造の膜ポリペプチドの代表的リストについては、Ｐｒｅｕｓｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５巻、１２〜１４頁、１９９８年参照）。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
連結部位が一つだけであること（ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ）、連結成分の安定性、連結反応の特異性と完全性、および脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの連結生成物の安定性と機能は、選択方法の考慮すべき事項である。特に、連結成分の対は、連結反応の選択性および連結生成物の脂質マトリックス内での安定性が最高になるように設計することが好ましい。この設計には、連結成分の化学選択的連結部位を脂質マトリックス内に組み込んで生成させるのに利用する一つ以上の開裂部位を含有するリンカー配列またはキャップ形成配列の設計が含まれる。例えば、突然変異誘発法、熱力学的方法、計算による方法、モデリング法および／または対象の標的ポリペプチドに関する機能および／または構造の情報を明らかにする方法はこの目的に利用できる。これらの技法としては、免疫学的分析法とクロマトグラフ分析法、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）、円二色性（ＣＤ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、電子とＸ線の結晶学、電子顕微鏡法、ラマンレーザー分析法などがあり、これらの技法は、膜ポリペプチド系を設計し特性を決定するのは通常活用される（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６巻、３６５〜３８７頁、１９９６年；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｓｔｒａｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１１９（１）巻、１４９〜１５７頁、１９９７年；Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７２巻、２６６〜２７頁、１９９７年；Ｈａｌｔｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３（３２）巻、９７３１〜９７４０頁、１９９４年；Ｓｗｏｒｄｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８９（１）巻、２１５〜２１９頁、１９９３年；Ｗａｌｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６（４）巻、８０８〜８１９頁、１９９７年；Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈら、Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３巻、４０５〜４５０頁、１９９４年；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７０（４）巻、１７９６〜１８０２頁、１９９６年；Ｓａｍｉら Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０５（１）巻、１４８〜１５４頁、１９９２年；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３７（１）巻、１〜４頁、１９９４年；Ｗａｔｔｓら、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂ．Ｂｉｏｌ．，１２（３）巻、２３３〜２４６頁、１９９５年；Ｂｌｏｏｍ，Ｍｏ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６９（５）巻、１６３１〜１６３２頁１９９５年；およびＧｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｍｅｒｉｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２２（３）巻、７８４〜７８８頁、１９９４年参照）。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
構造の情報が、即座に入手することができない場合、化学選択的化学連結成分は、当該技術分で公知の各種の方法によって確認し、二次元でモデル化（ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を行うことができる。例えば、脂質膜二重層を横切り従って残基が約１５〜２０個より多い両親媒性αヘリックスセグメントは、二次構造予報アルゴリズム（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を利用して、一次構造中に確認することができる。１５〜２０個の残基より大きいセグメントは、スーパーファミリーのメンバー間の配列類似性に基づいて選択され、次に、一つ以上の連結部位が、元の二次元モデルの一部であるかまたは一部でない連結ラベル剤との相溶性について確認される（例えば、Ｒｅｉｔｈｍｅｉｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５（４）巻、４９１〜５００頁、１９９５年；Ｄｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｇ．，７（１０）巻、１２２１〜１２２９頁、１９９４年参照）。好ましい方法は、膜ポリペプチドのモデリングおよび／または予報を行うのに適切な一つ以上のコンピュータプログラムの助けをかりた相同モデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）とデータベースアラインメント（ｄａｔａｂａｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）である。例えば、プログラム“ＴｍＰｒｅｄ”と“Ｔｏｐ Ｐｒｅｄ II”は、膜を横切る領域とその配向を予測するのに利用することができ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔのデータベースに存在する膜貫通タンパク質に関するデータベースの統計的分析結果に基づいている（Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２５巻、４８７〜４９４頁、１９９２年；Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３４７巻、１６６頁、１９９３年；およびＣｌａｒｏｓら、Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，１０（６）巻、６８５〜６８６頁、１９９４年）。その外のプログラムも使用することができ、“ＤＡＳ”（Ｃｓｅｒｚｏら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０（６）巻、６７３〜６７６頁、１９９７年）；“ＰＨＤｈｔｍ”（Ｒｏｓｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４巻、５２１〜５３３頁、１９９５年）；および“ＳＯＳＵＩ”（東京農工大学、生物工学部、Ｍｉｔａｋｕ研究室）がある。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
また連結成分とその相補的対は、連結された生成物および／または連結前の反応成分をシミュレートするために、それらを原子レベルにて三次元でモデル化することによって選択することができる。第一にモデル化されるポリペプチドと既知構造のポリペプチドの間の配列のアライメントを確認する。第二に、骨格構造をこのアライメントに基づいて生成させる。これは、通常、最も相同の構造の骨格であるが、ハイブリッドの骨格も利用できる。第三に、次いで側鎖をモデル内に配置する。モンテカルロ法、ツリー検索アルゴリズムなどの各種の方法を利用して多数の可能な配置構成を有するロトマー（ｒｏｔｏｍｅｒ）側鎖をモデル化することができる。モデル化すべきポリペプチドが、既知の構造に対して挿入部または欠失部を有している場合、ループは再モデル化（ｒｅ−ｍｏｄｅｌ）されるかまたは最初からモデル化される。構造内に類似の固定点を有するループのデータベース検索を利用して、これらループを組み立てることが多いが、エネルギーベースの最初からのモデル化法も利用できる。次に、通常、エネルギー最小化法を、時には、分子動力学を組合わせて用いて、最終構造の最適化を行う。次にモデルの質を、目視検査を含めて、評価して、モデルの構造の側面が、その分子の機能的側面について分かっていることと矛盾しないことを確認する。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
三次元のモデルは、膜ポリペプチドをモデル化するのに適切なコンピュータプログラムを利用してつくることが好ましい［７ＴＭ（１９９５年）ｖｏｌ．５におけるＶｒｉｅｎｄ Ｇ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ＧＰＣＲｓ”］。この目的のために適切なコンピュータプログラムの例としては、“Ｗｈａｔ Ｉｆ”（Ｖｒｉｅｎｄ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．８巻、５２〜５６頁１９９０年；ＥＭＢＬ，ドイツ、６Ｔ１１７ ハイデルベルク、メイヤーホッフストラッセ１から入手可能）および“Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ”（Ｎ，ＭｕｌｆｏｒｄおよびＬＭＳａｖａｇｅ編．Ｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｅｗ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：６２９〜６．３７（ＩＢＣ ＢＩＯ ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ）中のＰｅｉｔｓｃｈ ＭＣとＨｅｒｚｙｋ Ｐ．（１９９６年）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”；Ｐｅｉｔｓｃｈら，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ．４巻１６１〜１６４頁、１９９６年；Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＭＲ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＫＬ，Ａｐｐｌｅ ＲＯ，Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ＤＦ編 Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７７〜１８６頁（Ｓｐｉｎｇｅｒ，１９９７年）中のＰｅｉｔｓｃｈら（“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｏｒｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ”）がある。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
脂質マトリックス介助化学選択的連結法に影響し、従って相溶性連結部位の選択に影響する因子は、可溶性タンパク質について知られている因子とほぼ等しい（Ｗｏｏｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７１巻、３２００８〜３２０１５頁、１９９６年）。第一に、二次構造は、大部分のαヘリックスとβシート内の連結部位が連結されやすいという点で決定的に重要ではない。また大部分のターンにおける連結部位もＯＫであるが、βターンの先端に対応する連結部位はあまり好ましくない。第二に、連結部位は、脂質環境内でフォールドされた形態のポリペプチドを安定化するのに必要な位置にあるフォールドされたポリペプチドに埋め込まれているかまたはその内部にあるのではなくて、フォールドされたポリペプチドの表面に位置している方が好ましい。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６５】
従って、化学選択的連結成分とその相補的対の選択は、帯電している化合物または高極性の帯電していない化合物を、膜の中の油状炭化水素中に暴露および／または移動させる熱力学的コストを考慮して行う。例えば、脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの部位特異的開裂によって生成するように設計された連結部位の配置は、連結選択性が得られるように設計されるのみならず、前駆体および最終的連結生成物が、脂質マトリックス内で十分安定であるように設計される。本発明のこの側面において、膜貫通セグメントの大部分のアミノ酸側鎖は非極性でなければならない（例えばＡｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ）。従って、天然に存在する連結部位残基を有する位置または工学的に連結部位残基を置換もしくは挿入するため標的にされる残基の位置を選択して、αヘリックス膜アンカー間に見られる疎水性充填相互作用などの好ましい疎水性相互作用を維持する。さらに、膜貫通セグメントのポリペプチド骨格の非常に極性のＣＯＮＨ基（ペプチド結合）は、それらを炭化水素中に移動させるためのコストを下げるため、水素結合（Ｈ結合）に参画するように選択される（例えば、Ｒｏｓｅｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１巻、６２１〜６２５頁、１９８８年参照）。従って、相溶性連結部位を選択する際、このＨ結合は、すべてのペプチド結合が内部に水素結合を有しているαヘリックスを維持することによって最も容易に達成される。また、このＨ結合は、βストランドがβバレルなどの密閉構造（ｃｌｏｓｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成するならば、ポーリンタイプの膜貫通タンパク質を得るためβシートを維持することによって達成することもできる。既知の三次元構造のすべての膜ポリペプチドはこれらの原理に従うので、化学選択的化学連結部位は、フォールドされた膜貫通ポリペプチドが望ましい場合、これらの原理に従うように選択および／または設計することができる。場合によっては、適切に配置された陽電荷のリシン残基を用いて、膜全体の配向を制御することができる（Ｗｈｉｔｌｅｙら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．Ｔ（１２）巻、８５８〜８６２頁、１９９４年）。
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６６】
また、相溶性連結成分の対とそれらの化学選択的化学連結部位は、連結部位を走査することによって確認できる。これは、特定の連結化学反応を受けやすいアミノ酸残基を、部位特異的なネストされた（ｎｅｓｔｅｄ）および／またはランダムの突然変異誘発によって、対象の標的膜ポリペプチドまたはそのドメインをコードする、細胞系内もしくは無細胞系内のＤＮＡ中に導入し、次いでその突然変異ＤＮＡを発現させ、次いで機能性の連結相溶性の置換部分もしくは挿入部分を含有する膜ポリペプチドを選別する、遺伝子的方法によって行われる。あるいは、突然変異膜ポリペプチドは化学的に合成してもよく、または遺伝子的合成と化学的合成を組み合せて利用してもよい。組換えＤＮＡを利用するかおよび／または化学合成を利用するかにかかわらず、連結部位走査を受けるポリペプチドは、好ましくは、膜貫通横切りセグメントまたは膜貫通ポリペプチドドメインなどの、脂質膜に挿入できる少なくとも一つの膜固定セグメントを含有している。一つ以上の機能的突然変異を含有する膜ポリペプチドと連結ラベル剤を次に合成して、方式１〜２に例示した化学選択的連結の相溶性対の一つ以上を生成させる。それら連結成分を次に、対象の適当な連結化学反応に付して、脂質マトリックス内に適切に挿入されてフォールドされた連結膜ポリペプチドを選別する。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
連続部位走査法によって、多量の相溶性連結成分の迅速かつ高処理量の選別を行うことができるだけでなく、膜ポリペプチドと連結ラベル成分の対の新しい組合せによって形成される新規でかつ多様な組換え、合成および半合成の分子を迅速に選別できる。例えば、膜ポリペプチドと連結ラベル成分は、異なるアミノ酸配列および異なる非天然の側鎖置換基などの化学構造の多様性を示す混合物またはライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、特定の位置に異なる化学物質を含有するペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはランダムに異なるペプチドもしくはポリペプチドの特定のセットを含有している。このような成分は、組換え法で発現させるか、ファージディスプレイライブラリーから誘導するか、化学合成で誘導するか、またはフラグメントとその組合せから誘導してもよい。モジュール交差膜ポリペプチドと連結成分（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）も、Ｋｅｎｔらの国際特許願公開第ＷＯ９９／１１６５５号に記載されているモジュール法を利用して構築できる。本発明のこの実施態様では、同じクラスまたはファミリーの異なる親膜ポリペプチド由来の一つ以上の機能タンパク質モジュールを含有する二つ以上のペプチドセグメントを交差化学選択的に化学連結して、一つ以上の脂質マトリックス埋込みハイブリッド膜ポリペプチドを生成させることによって、脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドを生成させる。このようにして、同じクラスまたはファミリーの膜ポリペプチドの異なるメンバーから機能ドメインなどを導入して、連結部位の情報および構造、機能の情報を含め、非常に多様なライブラリーを生成させることができる。従って、連結部位の走査によって、一つ以上の連結成分の対を迅速に選別し選択することが、上記方式１〜２に示されている反応成分の相溶性でかつ多様な組合せを確認するのに特に適切であることは明らかである。
【誤訳訂正３８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
クローン化全体の目的を達成するため、標的膜ポリペプチドの保存モチープに対応する相補的オリゴヌクレオチドおよび／または縮重オリゴヌクレオチドを設計して、ｃＤＮＡの反応および／またはＰＣＲ反応におけるプライマーとして役立てることができる。プライマー設計のための鋳型は、多くの起源から得ることができる。例えば発現される配列タグ（ＥＳＴ）を含む配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＴＩＧＲ、ＥｘＰＡＳｙおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎのデータバンクなどの各種のデータベースから入手できる。相同性の比較は、多数のアライメントの多数のアラインメントのいずれか一つを利用して、各種のアルゴリズムに基づいた配列中に、最良のプライマーを見つけるためサーチエンジンの利用する容易に入手できるプログラムを実施して行った。市販の配列分析結果のパッケージが多数あり、例えばＬａｓｅｒｇｅｎｅ，ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ，ＤＮＡＳＩＳ，Ｇｅｎｅ ＪｏｃｋｅｙII、Ｇｅｍｅ Ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍａｃｐｌａｓｍａｐ，Ｐｌａｓｍｉｄ ＡＲＴＩＳＴ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ，ＤＮＡ／ＲＡＮ ＢｕｉｌｄｅｒおよびＱｕａｎｔａがある（例えば、Ｓｉｍｏｎ Ｒ．Ｓｗｉｎｄｅｌｌ編“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ”、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９６年参照）。
上記情報を利用して、縮重プライマー、ネストされた／マルチプレックスプライマー、部位特異的突然変異誘発、制限酵素部位などを設計することができる。プライマーは相同性の情報に基づいて設計することができ、そしてコンピュータプログラムもプライマーの設計に利用できる。自動的にプライマーを選択する“Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４．０”（ｃｌｏｎｅ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）がその例である。増幅されたｃＤＮＡおよび／またはＰＣＲフラグメントを利用して、増幅されたフラグメントの放射能または非放射能の標識化とライブラリーのスクリーニングによって、全長のクローンを単離することができる。
【誤訳訂正３９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
宿主細胞内で標的膜ポリペプチドを発現させるために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または上記のモジュールアセンブリー（ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ）のための機能均等物を、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたコーティング配列を転写および翻訳するのに必要な要素を含有しているベクター中に挿入する。上記コーディング配列を含有し、標的遺伝子産物を発現する宿主細胞は、標準方法で確認することができる。例えば、これらの方法としては限定されないがＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッド形成；“マーカー”遺伝子の機能の存在の有無；宿主細胞内でのｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；およびイムノアッセイまたは遺伝子産物の生物活性によって測定される遺伝子産物検出がある。
【誤訳訂正４０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
化学合成法を利用する場合、ペプチドまたはポリペプチドは、線状、環式、または分枝状でもよく、限定されないが遺伝子がコードする２０種のＬ−アミノ酸で構成されていることが多い。無細胞系における生体外抑圧突然変異誘発法も、非天燃アミノ酸をポリペプチドに導入するのに利用できる（例えば、Ｃｌｏａｄら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３巻、１０３３〜１０３８頁、１９９６年；およびＴｕｒｃａｔｔｉら、Ｊ．ＢｉＯ．Ｃｈｅｍ．，２７１巻、１９９９１〜１９９９８頁１９９６年参照）。また、かような化学合成法は、通常のアミド結合、Ｎ−もしくはＣ−アルキル置換基、側鎖修飾部分、およびジスルフィドの架橋と側鎖のアミド結合もしくはエステル結合などの拘束部分の代わりに、Ｄ−アミノ酸類、他の非天然アミノ酸類、オキシム、ヒドラゾン、エーテル、チアゾリジン、オキサゾリジン、エステルもしはアルキルの骨格結合を含めて、新規のもしくは異例の化学的部分を組み込むことができる（例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９（４）巻、４１２〜４２６頁、１９９８年参照。この文献には、ペプチドおよびポリペプチドを化学合成するのに用いる各種の化学反応が概説されている）。
【誤訳訂正４１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７６】
例えば、天然ペプチドの骨格構造を有するポリペプチドの天然の化学連結と合成はＫｅｎｔらの国際特許願公開第ＷＯ９６／３４８７８号に開示されている（また、Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６巻、７７〜７７９頁、１９９７頁およびＴａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、１２４８５〜１２４８９頁、１９９５年参照）。非天然のペプチド骨格も公知の方法で製造することができる（例えば、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６巻、２２１〜２２５頁、１９９２年；Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６巻、３０〜３４頁、１９９４年；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９１巻、６５８４〜６５８８頁、１９９４年；Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．，３６（４８）巻、８８７１〜８８７４頁、１９９５年；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，５（４）巻、３３３〜３３８頁、１９９４年；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１６）巻、９１８４〜９１８９頁、１９９８年およびＴａｍら、国際特許願公開第ＷＯ９５／００８４６号参照）。Ｋｅｎｔら、国際特許願公開第ＷＯ９８／２８４３４号に開示されている拡張全化学連結法と合成法（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を利用することもできる。
【誤訳訂正４２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
さらに、固相支持体を使って、三つ以上の無保護のペプチドセグメントを化学連結することによって、組立てられたポリペプチドを迅速に合成する方法であって、ペプチドセグメントの反応性官能性はいずれも保護基で一次的にマスクする必要がなくしかも収量が改善されてかつ中間生成物の取扱いが容易である方法がＣａｎｎｅらの国際特許願公開第ＷＯ９８／５６８０７号に開示されている。簡単に述べると、この方法は、Ｎ末端のシステインとＣ末端のチオ酸を有する別の無保護ペプチドセグメントと反応するＣ端末のα−チオエステルを含有する、第一固相に結合された無保護ペプチドセグメントによって、Ｎ末端からＣ末端への方向に、ペプチドセグメントの固相逐次化学連結を行う。また、これらの方法は、Ｃ末端からＮ末端の方向へ、固相天然化学連結法を行うこともできる。また、大きいポリペプチドは、ペプチドセグメントを、そのペプチドセグメントに保護基を必要とせずに、水溶液内ペプチドセグメントを、固相支持体上に化学連結することによって合成することができる。バッチ式と連続流操作式および同じ工程内で複数ペプチドの合成を行う各種のペプチド合成機が市販されており、容易に自動化される。
【誤訳訂正４３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
脂質マトリックス成分は、リオトロピック相（例えば水と相互に作用したときの液晶相）を形成することができる天然および／または合成の脂質を含有していてもよい。特に重要なのは、リオトロピック結晶相を形成することができる脂質の混合物を含めて、ラメラ二重層などの脂質凝集体を形成できるリン脂質、リゾリン脂質、スフィンゴ脂質および糖脂質などの極性脂質である。かような脂質の例としては、限定されないが不溶性で非膨潤性の両親媒性脂質、不溶性で膨潤性の両親媒性脂質、およびリオトロピック液晶相を形成することができる各種の可溶性両親媒性脂質がある。不溶性で非膨潤性の両親媒性脂質の例としては、トリグリセリド類、ジグリセリド類、長連鎖のプロトン化脂肪酸類、長連鎖の直鎖アルコール類、長連鎖の直鎖アミン類、長連鎖のアルデヒド類、フィトール類、レチノール類、ビタミンＡ、ビタミンＫ、ビタミンＥ、コレステロール、デスモステロール、シトステロール、ビタミンＤ、非イオン化ホスファチジン酸、非常に短い連鎖の酸のステロールエステル類、酸またはアルコールの部分が、炭素原子４個未満の長さのワックス類（例えばオレイン酸メチル）およびセレミド類がある。不溶性で膨潤性の両親媒性脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオ脂質、プラスマローゲン類、イオン化フォスファチジン酸、セレブロシド類、ホスファチジルセリン、モノグリセリド類、酸性セッケン類、α−ヒドロキシ脂肪酸類、グリセロールのモノエーテル類、細胞膜もしくは細胞小器官から抽出されたリン脂質類と糖脂質類の混合物（植物の糖脂質類とスルホリピド類）、スルホセレブロシド類、スフィンゴシン（塩基型）がある。リオトロピック液晶相を形成することができる可溶性の両親媒性脂質の例としては、長連鎖脂肪酸類の塩類、多種類の通常のアニオン、カチオンおよび非イオンの界面活性剤類、リゾレシチン、パルミトイル補酵素Ａもしくはオレイル補酵素Ａおよび補酵素Ａの他の長連鎖チオエステル類、ガングリオシド類、ならびにスフィンゴシン（酸型）がある。
【誤訳訂正４４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
これらの脂質は、市販の原料を含む各種の原料から得ることができ、または当該技術分野で公知の方法で細胞から産生されて、精製されたミセル、リポソーム小胞、ＣＬＰマトリックスもしくは連続ラメラ膜として製造される（例えばＤ．Ｈａｃｃｈａｍ論“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ４．１〜６７２頁（米国ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）内のＳｍａｌｌ，Ｄ．Ｍ．（１９８６年）”Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｌｋａｎｅｓ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ”；Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，６４（１−３）巻、３５〜４３頁、１９９３年；ＭｃＮａｍｅｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７（５）巻、４６６〜４７５頁、１９８９年；Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎら、Ｍａｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ａｎａｌ．，２８巻、１１５〜１５０頁、１９８２年；Ｇｒａｈａｍ，ＪＭ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９巻、９７〜１０８頁、１９９３年；およびＫｉｎｎｅＳａｆｆｒａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７２巻、３〜１７頁、１９８９年；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９３巻、７３０４〜７３１４頁、１９８９年；Ｚｕｍｂｕｃｈｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，６４０巻、２５２〜２６２頁、１９８Ｘ年；ＥｒｉＫｓｏｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９１巻、８４６頁、１９８５年；Ｓｅｄｄｏｎら、Ｐｒｏｇ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，８１巻、１８９頁１９９０年；および米国特許第５，５５４，６５０号参照）。
【誤訳訂正４５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８８】
脂質抽出による再構成は、水溶性相を、脂質−有機溶媒可溶性相から分離するため、単離された膜ポリペプチドを、適当な有機溶媒系、例えばヘキサンおよび緩衝水溶液中の脂質マトリックスに添加することによって実施できる。上記の溶媒／界面活性剤による可溶化法の場合と同様に、一つ以上の再構成条件、例えば温度、ｐＨ、水分および／または有機溶媒の含量、イオン濃度、還元剤または酸化剤（存在している場合）ならびに界面活性剤：脂質、界面活性剤：ポリペプチドおよび脂質：ポリペプチドそれぞれの比率を調節して工程を最適化することができる。次に、膜ポリペプチドを含有する抽出された脂質相を利用し、得られる脂質マトリックスによって、音波処理、重層、押出し、遠心分離などの標準方法で、脂質の単層、二重層、リポソーム、ミセルまたはＣＬＰを製造することができる。脂質を抽出することによって脂質マトリックス内で膜ポリペプチドを再構成する適切な方法を利用できる（例えば、Ｍｏｎｔａｌら、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１４巻、１〜７９頁、１９８１年；Ａｙａｌａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，８１０（２）巻、１１５〜１２２頁、１９８５年；Ｍｏｎｔａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７巻、６９２９頁、１９９０年；Ｐｕｎら、Ｂｉｏｓｅｎ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １０（５）巻、４６３〜４７６頁、１９９５年参照）。例えば、脂質を獲得し調製するため先に述べたように、抽出を最適化するため、溶媒系を、特定の脂質−膜ポリペプチドに対して選択することができる。膜ポリペプチドを脂質マトリックス内に組み込む可溶化法の場合のように、界面活性剤および／または塩類を含有しているかまたは含有していない選択された溶媒の一連の量を利用して、最適の脂質抽出システムを監視して選択して、膜ポリペプチドを含有する抽出された脂質相を得ることができる。
【誤訳訂正４６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９８】
他の検出可能な標識が方式１−２に例示した方法に追加される一方法によって、膜ポリペプチド、脂質マトリックスおよび／またはそのポリペプチドに対するリガンドに組み込むことができる。この実施態様では、検出可能な部分が一般に化学連結の後に導入される。これは、標的分子の反応性基と結合すると共有結合を形成する反応性物質を使って化学修飾を行うことによって実施できる。例えば、ペプチドもしくはポリペプチドの連結成分は、化学修飾によって検出可能な標識にカップリングさせるのに適切ないくつもの反応性基または反応性を得るために修飾された基、例えばチオール基、アルデヒド基、アミノ基を含有していてもよい［“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，米国フロリダ州ポカ・ラトン、１９８４年）中のＬｕｎｄｂｌａｄらの報告］。また、上記の基を所望の位置に導入および／または所望の位置から削除するため、部位特異的突然変異誘発および／または化学合成を利用できる。ビオチン−アビジン系またはストレプタピジン系のビオチオニル化プローブ、抗体、抗体フラグメント、炭化水素結合ドメイン、発蛍光団などの色素を含む発色団、レクチン、核酸ハイブリッド形成プローブ、薬物、毒素などを含む多種類の検出可能な標識を、この方式ジカップリングさせることができる。例えば、発蛍光団、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）またはビオチニンなどの低分子量のハプテンを、ハプテニル化試薬およびビオチニル化試薬を利用することによって、膜ポリペプチドまたは連結ラベル成分に化学的に結合させることができる。次に、そのハプテニル化されたポリペプチドは、蛍光分光法、マススペクトロメトリーなどを用いて直接検出できるか、または、ハプテンに選択的に結合する標識された試薬を第二の検出試薬として用いて間接的に検出できる。通常使用される二次検出試薬としては、蛍光色素などの検出可能なマーカーで標識された抗体、抗体フラグメント、アビジン類およびストレプトアビジン類がある。
【誤訳訂正４７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９９】
その反応性基によっては、化学修飾は可逆でも不可逆であってもよい。ペプチドおよびポリペプチド内で標的とされる通常の反応性基はチオール基であり、そのチオール基は、不可逆の修飾を行ってより安定な生成物を生成するハロアセチルおよびマレイミドの標識化試薬で化学修飾を行うことができる。例えば、生理的ｐＨ範囲（ｐＨ６．５〜８．０）における、スルフヒドリル基と、α−ハロケトン類、アミド類および酸類との反応は公知であり、この反応によって、ペプチドおよびポリペプチドの中にあるシステインの特異的修飾を行うことができる［“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”９８〜１００頁（米国、カリフォルニア州サンディエゴ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９９６年内のＭｅｒｍａｓｏｎからの報告］、また、検出可能な標識の共有結合は、条件を変えることによって、例えば光親和性標識化を行った後、適当な波長の光を照射することによってトリガーすることができる。光親和性標識化法の場合、標識は、蛍光または放射能の標識であることが多いが、光を照射されると（通常、紫外光）化学的に反応性になり、標識すべき分子の適当な基と共有結合を形成する基を含有している。この目的を達成するために適切な、重要クラスの光反応性基はアリールアジド類であり、これは、光を照射されると、短寿命であるが反応性が高いニトレン類を生成する。光活性化させることが可能かまたは“ケージ化された（ｃａｇｅｄ）”アミノ酸のせん光分解反応も、紫外光で光分解されるまで生物学的に不活性なペプチドを標識するのに使用することができる。各種のケージング試薬（ｃａｇｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）例えばｏ−ニトロベンジル化合物の誘導体を使用して、前記アミノ酸を修飾し、当該技術分野の標準法に従って検出することができる（Ｂ．Ｈｅｒｍａｎｙ Ｊ．Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ編“Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”２７−８５頁、１９９３年のＫａＯＳの報告）。ニトロベンジル基は、生物学的に活性な分子中に、エーテル、チオエーテル、エステル（リン酸エステルを含む）、アミンまたはヘテロ原子（通常Ｏ、ＳまたはＮ）に対する類似の結合を介して、合成によって組み込むことができる。ケージ化された発蛍光団は、蛍光の光活性化（ＰＡＦ）の試験に使用できる。この試験はホトブリーチングの蛍光回復（ｆｌｕｒｖｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｉ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）（ＦＲＡＰ）に類似の試験である。リシンのε−アミノ基、チロシンのフェノール、グルタミン酸のγ−カルボン酸またはシスティンのチオールにケージ化された発蛍光団は、ケージ化されたアミノ酸を、配列中に、特異的に組み込むのに利用できる。α−アミンにケージ化されているアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンも、選択的に光分解させて重合体内または溶液内に活性アミノ酸を生成することができるＮ末端にケージ化されたヘプチドまたはケージ化された中間体を製造するのに利用できる（Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，９２巻、６３３３頁、１９７０年）。その窒素原子が立体的に込み合ったリングの部分を形成するニトロキシド化合物（−Ｎ−Ｏ）などの、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）のリポーター種として作用する不対電子を有するグルーピング（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を導入するスピン標識法も使用できる（Ｏｈらの前掲文献）。
【誤訳訂正４８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０２】
ＦＲＥＴ検定を行う場合、脂質マトリックスに組み込まれる膜ポリペプチドは、ドナー〜アクセプター系の少なくとも一つの発色団を含有するように設計される。そのドナー分子は、検出するための蛍光分子（または発光分子）である。アクセプター分子は蛍光分子でも非蛍光分子でもよい。従って、ドナー〜アクセプター系の場合、少なくとも二つの発色団が提供される。すなわち第一発色団は脂質埋込み膜ポリペプチドによって提供され、第二発色団は膜ポリペプチド、脂質マトリックスまたは膜ポリペプチドに対するリガンドによって提供される。
【誤訳訂正４９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
また、ドナー〜アクセプターの対が二つ以上含まれていてよい。例えば膜ポリペプチドは  一つ以上のドナーおよび／またはアクセプターの分子を含有していてもよく、好ましくは少なくとも一つのドナー分子が一つの発色団を含有している。リガンドも同様に一つ以上のドナーまたはアクセプターの分子を含有していてもよい。また脂質膜マトリックスは、一つ以上のドナー分子もしくはアクセプター分子、ならびに対象の標的ポリペプチドのリガンドである、マトリックスが形成した脂質および／または溶媒のアクセス可能なチャンネルに組み込まれる二次分子を含有していてもよい。この二次分子は、例えば標的膜ポリペプチドが７回膜貫通受容体系の一部または全部を含有しているときのＧタンパク質である。
【誤訳訂正５０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２６】
以下の実施例は本発明の各種側面を示す。これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
略語 
ＡＧＲＰ             アグーチ関連タンパク質 
ＡＭＣＡ−Ｘ         ６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸 
Ｂｏｃ               ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル 
ＣＬＰ               立方脂質相マトリックス 
ＤＩＥＡ             ジイソプロピルエチレンアミン 
ＤＭＦ               Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド 
ＤＭＳＯ             ジメチルスルホキシド 
ＤＮＰ               ジニトロフェニル 
ＤＯＰＣ             ジオレオイルホスファチジルコリン 
ＤＰＣ               ドデシルホスホコリン 
ＥＤＴＡ             エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩 
ＥＳ／ＭＳ           エレクトロスプレーマススペクトロメトリー 
Ｆｍｏｃ             ９−フルオレニルメトキシカルボニル 
ＦＲＥＴ             蛍光共鳴エネルギー移動 
ＨＢＴＵ             ０−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート 
ＨＥＰＥＳ           ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸 
ＨＦ                 フッ化水素 
ｈＩＬ−８           ヒトインターロイキン８ 
ＨＰＬＣ             高速液体クロマトグラフィー 
ＩＲＫｌ             インワードレクチファイングカリウムチャンネル孔（ｉｎｗａｒｄ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｏｒｅ）
ＫＣＳＡ             ストレプトマイセス・リビダンス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）のカリウムイオンチャンネル孔 
ＬＵＶ               大きな単膜リポソーム 
ＭＡＬＤＩ           マトリックス介助レーザー離脱（マススペクトロメトリー）
ＭＢＨＡ             メチルベンズヒドリルアミン 
ＭＣ４               メラノコルチン（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）
ＭＯ                 １−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール（Ｃ１８：１，｛ｃｉｓ｝−９）
ＯＧ                 β−オクチルグルコピラノシド 
ＰＡＭ               フェニル（アセトアミド）メチル、すなわち＝ＯＣＨ2 Ｃ6 Ｈ4 ＣＨ2 ＣＯＮＨＣＨ2 Ｃ6 Ｈ4 −（ポリスチレン）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ     ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 ＴＡＭＲＡ           カルボキシテトラメチルローダミン 
ＴＣＥＰ             トリスカルボキシエチルホスフィン 
ＴＦＡ               トリフルオロ酢酸 
ＴＦＥ               トリフルオロエタノール 
ＴＴＨＡ             トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸
実施例１
バクテリオロドプシン膜ポリペプチドの設計と合成 
バクテリオロドプシンは、ハロバクテリアの紫膜内で光駆動プロトンポンプとして機能し、特徴的な７本らせん構造のモチーフを有している。バクテリオロドプシンは哺乳類のビジョン受容体（ｖｉｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）すなわちロドプシンを含むレチナール結合タンパク質のファミリーの一部である。バクテリオロドプシンは、完全に変性された状態から、機能的天然タンパク質にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）させることができ、その原子構造は知られている。また、脂質膜中に組込まれると、独立して、膜二重層を横切るαヘリックスを形成するバクテリオロドプシンのセグメントも設計することができる（Ｈｕｎｔら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，５９巻４００頁１９９１年）。
【誤訳訂正５１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２７】
バクテリオロドプシンの第一膜貫通αヘリックスとその第一細胞外ループ由来の膜ポリペプチド（バクテリオロドプシンの残基５〜４２に相当する）を、天然化学連結用に選択する。その膜ポリペプチドペプチドを修飾して、Ｎ末端のＴｈｒ残基（バクテリオロドプシンのＴｈｒ５に相当する）を、天然化学連結のための連結部位として働くＣｙｓ残基で置換する（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６巻７７６〜７７９頁１９９５年）。
【誤訳訂正５２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２９】
バクテリオロドプシンの膜ポリペプチド３（配列番号：３）を、Ｃ末端のＬｙｓのε−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護することを除いて、確立された側鎖保護戦略を用い、Ｂｏｃ化学反応のｉｎｓｉｔｕ中和プロトコルを利用してＭＢＨＡ樹脂上で合成した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４０巻１８０〜１９３頁１９９２年）。機械利用ペプチド合成は、確立されたプロトコルにしたがって、特注改造されたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成機で実施した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒらの前掲文献）。Ｃ末端ＬｙｓのＦｍｏｃ保護基を、ペプチドを合成した後、ＤＭＦ中２０％のピペリジンとともに、インキュベートすることによって除き、次いで２−イミノＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス）を添加することによって、遊離アミノ基にＮ−イミノビオチン基を結合させる。そのペプチドを、１０％のｐ−クレゾールの存在下でＨＦで０℃にて１ｈｒ処理することによって膜保護すると同時に、樹脂から開裂させる。粗製ペプチドを、ジエチルエーテル中に沈澱させ、７５％Ｂ（アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）に溶解し、次いで凍結乾燥させる。ポリペプチド３（配列番号：３）を、分取逆相ＨＰＬＣ（４５〜７０％Ｂ、１０ｍｌ／ｍｉｎで６０分間かけて行う）で精製し、次いでエレクトロスプレーＭＳで特性を決定する［ＭＷ実測値５０８０±１ＫＤ、ＭＷ計算値５０８０ＫＤ（平均同位体組成物（ａｖｅｒａｇｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ））］。勾配ＨＰＬＣを、Ｒａｉｎｉｎデュアルポンプ高圧混合システムで、ＶｙｄａｃＣ−４セミ分取カラム（１０μｍ粒径、１ｃｍ×２５ｃｍ）またはＶｙｄａｃＣ−４分取りカラム（１０μｍ粒径、２．２ｃｍ×２５ｃｍ）を用い、２１４ｎｍＵＶ検出によって実施した。エレクトロスプレーマススペクトルを、ＳｃｉｅｘＡＰＩ−１四重極イオンスプレー質量分析計を用いて得た。ＭＡＬＤＩのマススペクトルはｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ｘｙｚ ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ装置を使用して得た。
【誤訳訂正５３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３０】
実施例２
連結ラベル剤の設計と合成 
脂質マトリックス組込み膜ペプチド（配列番号：２）に自然化学連結するため設計されたＣ末端チオエステル修飾連結ラベル剤のペプチドＥＡＱＬ（配列番号：４）を、先に述べたようにして、ＲＡＭチオエステル生成樹脂上に手作業で合成し、開裂させ次いで脱保護した。粗製ペプチドをジエチルエーテル中に沈澱させ、５０％Ｂに溶解し次に凍結乾燥した。得られたペプチドを、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（２５−４５％Ｂ、４５分間にわたって１０ｍｌ／ｍｉｎで実施）で精製し、次にエレクトロスプレーＭＳで特性を決定した［ＭＷ実測値６４７±１ＫＤ、ＭＷ計算値６４７（平均同位体組成物）］。
【誤訳訂正５４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３１】
実施例３
ＣＬＰマトリックスの製造およびバクテリオロドプシン膜ポリペプチドの組込み 
膜ポリペプチド３（配列番号：３）と混合した立方脂質相マトリックスを、標準プロトコルにしたがって、脂質マトリックス成分をＨａｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ１３ ｔａｂｌｅ−ｔｏｐ遠心分離機で遠心分離することによって製造した。具体的に述べると、７５μｇの膜ポリペプチド３（配列番号：３）を、２％ＯＧを含有するｐＨ８の２００ｍＭトリス緩衝液３μｌに溶解する。これらのポリペプチド溶液を、１４．２ｍｇのＭＯが入っている１．７ｍｌエッペンドルフ試験管に加える。次に２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）１．５μｌを加えて、脂質：水の比率を低下させる。その混合物を約２５℃にて３ｈｒ、１２，０００ｒｐｍで遠心分離させる（ｓｐｉｎ）。ＣＬＰが生成したことが、光学的に透明なゲル様相が生成することによって示される。これらの相は、室温にて、少なくとも２ヶ月間、光学的に透明のままである。５１４．５ｎｍで励起されたオフレゾナンスラマンスペクトルを利用して、膜ポリペプチドを添加してもＣＬＰの膜二重層の構造を乱さないを立証する。このことは、ＣＬＰ中に膜ポリペプチドが存在しない場合と存在している場合の、２８８５ｃｍ-1と２８４５ｃｍ-1におけるＣ−Ｈ伸縮モードの強度比が変わらないことで示される（Ｒａｚｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，８４巻１２３〜１３８頁１９９６年）。
【誤訳訂正５５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３２】
実施例４
ＣＬＰマトリックス組込みバクテリオロドプシン膜ポリペプチドのアフィニティー精製およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析 
バクテリオロドプシン膜ポリペプチド３（配列番号：３）を含有するＣＬＰ（ＭＯ）を、ＯＧ３３ｍｇを含有する水１００μｌを添加することによって可溶化する。分析中、不必要な連結反応が起こるのを防止するため、可溶化中に、２０％β−メルカプトエタノールを添加する。可溶化された相のｐＨを、０．２ＭのＮａＯＨを使用して９．５に調節する。ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４１５）を、可溶化相に加え、室温にて１ｈｒインキュベートする。その磁気ビーズを、２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液（ｐＨ９．５）で５回洗浄し、各洗浄後に磁気分離によって分離する。磁気ビーズを、５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を溶解して得た飽和溶液中に再懸濁させる。磁気ビーズ／マトリックス懸濁液１ｍｌずつを試料スライド上に直接堆積させ次いで風乾する。得られたこれら試料生成物を、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｓｓｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍの飛行時間型質量分析計を使って分析する。スペクトルはすべて、ペプチド標品を使用して内部校正がなされ、２５ショットの平均値を示す。
【誤訳訂正５６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３３】
実施例５
ＣＬＰマトリックス組込みバクテリオロドプシン膜ポリペプチドのプロテアーゼによる開裂 
ＣＬＰマトリックス組込みバクテリオロドプシン膜ペプチド３（配列番号：３）のプロテアーゼによる開裂は、５０％グリセリンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2 中にＸａ因子（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を溶解して得た１ｍｇ／ｍｌ溶液１．５μｌ（ｐＨ８）をＣＬＰに加えて実施する。得られた混合物をプラスチック製ピペットの先端で徹底的に混合し、次いでＣＬＰを１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離させて光学的に透明な相を生成させる。一夜インキュベートしてＣＬＰ組込み開裂生成物が生成した後の開裂の程度は、上記のようなＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーによって測定される。
【誤訳訂正５７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３４】
実施例６
ＣＬＰマトリックス組込みバクテリオロドプシン膜ポリペプチドの天然化学連結（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）
ＣＬＰ組込みポリペプチドの天然化学連結を以下のようにして実施する。連結ラベル剤ペプチドＥＡＱＬ（配列番号：４）約１０μｇを２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）１μｌに溶解し、次いでＣｙｓ末端膜貫通ポリペプチド（配列番号：２）を含有するＣＬＰに添加し、次いで０．５μｌのチオフェノールと３ｍｇの ＭＯを加えて、ＣＬＰの生成に適合する適当な脂質：水の比率を維持する。混合物を小ピペットの先端を使って徹底的に混合する。次にＣＬＰを、１５分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離して光学的に透明な相を生成させる。ＣＬＰの一部を、特定の時間間隔で取り出し、上記のＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーによって、連結の進行を監視する。
【誤訳訂正５８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３５】
バクテリオロドプシン膜ポリペプチド５：化学連結で標識されたＣｙｓ修飾バクテリオロドプシンαヘリックス１と第一細胞外ループ（配合番号：５）：
ＥＡＱＬＣＧＲＰＥＷＩＷＬＡＬＧＴＡＬＭＧＬＧＴＬＹＦＬＶＫＧＭＧＶＳＤＰＤＡＫＫ。
【誤訳訂正５９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３６】
図３は、プロテアーゼによる開裂と、天然化学連結を利用して標識されたＣＬＰマトリックス組込み膜ポリペプチドが生成されることを図式的に示している。ＣＬＰの脂質二重層中に組込んだ後、プロテアーゼ認識部位を含有するＮ末端ポリペプチドがＸａ因子による開裂によって除去される（Ａ）。バクテリオロドプシンのＮ末端（Ｉｌｅ４はＬｅｕ４で置換して連結を最適化する）に相当する連結ペプチドを次に、膜貫通ポリペプチドに連結して、完全なバクテリオロドプシンＮ−末端を得る（Ｂ）。ＣＬＰ内の開裂の程度と進行は、Ｎ−イミノビオチンラベル剤を通じて磁気ビーズに吸着される膜貫通ポリペプチドのＭＡＬＤＩマススペクトルを得ることによって測定される（Ｃ）。
【誤訳訂正６０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３７】
図４は、プロテアーゼで開裂し次に、その残基に、選択された連結ペプチドを化学連結することによる遊離無保護Ｎ末端システインが生成するのを監視する典型的なＭＡＬＤＩマススペクトルの出力を示す。スペクトルＡは、ＣＬＰ中に組込み、次にそのＣＬＰをＯＧ／２０％β−メルカプトエタノール中に溶解した後のポリペプチド３（配列番号：３）のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。そのスペクトルは、未開裂ポリペプチド３（配列番号：３）の質量（ｍａｓｓ）に相当する一つの大きなピークをｍ／ｚ＝５０８０に示す。小さい方のピークはアフィニティービーズからの不純物を示し、タンパク質の存在しない場合のスペクトルにも存在している（データは示していない）。スペクトルＢは、同じポリペプチドを、Ｘａの因子で一夜開裂した後のマススペクトルを示す。ｍ／ｚ＝４２２０に大きいピークが出現したのに付随してｍ／ｚ＝５０８０における大きなピークが消失したのは、Ｘａ因子プロテアーゼによるＣｙｓ−キャッピング配列ＧＫＧＹＩＥＧＲがほとんど完全に除去されてポリペプチド２（配列番号：２）が生成したことと一致している。
【誤訳訂正６１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３８】
スペクトルＣ、ＤおよびＥはそれぞれ、５％チオフェノールを含有する２倍過剰の連結ペプチド４（配列番号：４）をＣｙｓ末端膜ポリペプチド２（配列番号：２）に加えて、２５分間；７５分間および一夜インキュベートした後の連結産物の出現を監視している。ｍ／ｚ＝４２２０におけるピークが徐々に消失し、これに付随してｍ／ｚ＝４６６１にピークが増大しているのは、αヘリカル膜貫通ポリペプチド２（配列番号：２）と連結ペプチド４（配列番号：４）の間に天然アミド結合が生成する経過を示している。ＭＡＬＤＩマススペクトルから判断されるように、Ｃｙｓがキャップされた（Ｃｙｓ−ｃａｐｐｅｄ）膜貫通ポリペプチドから、完全に連結された膜貫通ポリペプチド（配列番号：５）への変換は９０％を超えて完了している。
【誤訳訂正６２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３９】
実施例６−２
立方脂質相中に組み込まれた膜ポリペプチドの逆相ＨＰＬＣによる精製 
膜ポリペプチドの化学連結を、上記のようにして膜ポリペプチド１（配列番号：１）と膜ポリペプチド４（配列番号：４）で実施して、ＣＬＰ組込み膜ポリペプチド５（配列番号：５）を得る。連結が完了した後、全ＣＬＰを、５０ｍＭギ酸を含有する８５％イソプロパノール水溶液５０μｌに溶解する。次に、その溶液を、等しい容積の５０ｍＭ水性ギ酸で希釈する。
【誤訳訂正６３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４０】
Ｃ18逆相ＨＰＬＣカラムを、４５％（６：３：１／イソプロパノール／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを含有する水）と平衡状態にする。溶解したＣＬＰ２０μｌを上記カラムに注入し、４５％のイソプロパノール／アセトニトリル／０．１ＴＦＡを含有する水で、無勾配で溶出した。連結された膜ポリペプチド５（配列番号：５）は無勾配溶離が１０分間なされた後、溶出され、ＥＳ／ＭＳによって明確に同定される。ＭＯは１６〜２０分の間に、無勾配で溶出される。膜ポリペプチド５（配列番号：５）を凍結乾燥で単離する。
【誤訳訂正６４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
実施例７
バクテリオロドプシン膜ポリペプチドのＣＬＰマトリックス内の位置 
ＣＬＰ内のチャンネルは水性緩衝液で満たされており、そこでの脂質：界面活性剤比は３００：１であり、過剰の界面活性剤は脂質二重層相に吸収される。その上に、完全な連結は、界面活性剤が存在しない場合にも観察される（データは示してない）。ペプチド１は極端に疎水性のペプチドであるので、６ＭグアニジウムＨＣｌ／２００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）に溶解しない。したがって、有意な量のこのペプチドは水性チャンネルに溶解しそうもない。さらに、１ｍｇのペプチドを同じ大きさのＣＬＰ中に組込んだ後、ＣＬＰを１２，０００ｒｐｍで長時間遠心分離した後、疎水性ペプチドの目視可能な凝集は全く観察されない。ペプチド１がリポソーム内で独立してフォールドしてαヘリカル膜貫通ペプチドになるという、ＣＤＦＴＩＲ分光法とタンパク質分解保護試験による従来の観察結果を総合すると（Ｈｕｎｔら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，５９巻４００の１９９１年）、ペプチド１の開裂と連結は、膜二重層中に組込まれたペプチドで行われると解釈することが妥当である。
【誤訳訂正６５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４３】
実施例８
ＣＬＰマトリックス内のバクテリオロドプシン膜ポリペプチドの発色団の標識化とＦＲＥＴ分析 
まずバクテリオロドプシン膜ポリペプチド１（配列番号：１）をＴＴＨＡクマリンで標識し、次にそのチオエステル連結ラベル剤すなわちペプチド４（配列番号：４）をＴＥＸＡＳ ＲＥＤで標識することによって、発色団で標識されたＣＬＰマトリックス埋込みバクテリオロドプシン膜ポリペプチドを構築してＦＲＥＴで分析する。
膜ポリペプチド１（配列番号：１）と連結ラベル剤ペプチド４（配列番号：４）を、確立された側鎖保護戦略を用いるＢｏｃ化学反応に対するｉｎｓｉｔｕ中和化のプロトコルを使って、ＰＡＭチオエステル生成樹脂上とカルボキシ生成樹脂上それぞれで合成する。クマリン−ランタニド錯体を有する膜貫通バクテリオロドプシンは以下のとおりである。
【誤訳訂正６６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４５】
樹脂上の遊離アミノ基の標識化：  ポリペプチドのＮ末端にカップリングを行う場合、Ｎ末端をＢｏｃで保護されたペプチド樹脂をＤＭＦ内で平衡状態にする。その末端のＢｏｃ基を、ＴＦＡで処理する（２回×１分間）ことによって除き、ＤＭＦ、ＤＭＦ中１０％のＤＩＥＡ、次いでＤＭＦで洗浄する。リシン残基に対してカップリングを行う場合、ε−Ｆｍｏｃ保護Ｂｏｃリシンを標的ポリペプチド連鎖内に、連鎖組立て中、組込む。そのＦｍｏｃ基は、チオエステル生成樹脂上の標的ポリペプチドを、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理（２回×５分間）するか、または２倍過剰のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン）で１分間処理することによって除去する。得られたポリペプチドをＤＭＦで洗浄する。
【誤訳訂正６７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４６】
ＡＣＭＸ−Ｘキレート化錯体蛍光プローブ：  Ｎ末端をＢｏｃで保護されたポリペプチド樹脂をＤＭＦ内で平衡状態にする。膜ポリペプチド（配列番号：１）内のリシン３６のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中２０％のピペリジンで１０分間処理することによって除去する。次に１０ｍｇのＡＭＣＡ−Ｘ（約２倍過剰）を１５０μｌのＤＭＳＯに溶解し、０．０１ｍｍｏｌのドレインされたペプチド樹脂に１ｈｒかけて添加する。未反応のＡＭＣＡ−ＸをＤＭＳＯとＤＭＦで洗い流す。上記カップリング反応の前後でのニンヒドリン試験の結果は＞９５％の反応効率を示した。
約０．０３ｍｍｏｌのＴＴＨＡ−ＴＦＡ塩を、約２０％のＤＩＥＡを含有するＨＢＴＵのＤＭＦ溶液（０．５Ｍ）に等モル量で溶解し、次にペプチド樹脂に一夜カップリングを行った。得られた樹脂をＤＭＦとジクロロメタンで洗浄し、次いで乾燥する。ＨＦによる樹脂の開裂およびペプチドの精製を標準の手順で実施する（Ｓｃｈｎｏｅｌｚｅｒ １９９２年の前掲文献）。ランタニドイオン類（Ｅｕ3+、Ｔｂ3+またはＳｍ3+）で錯体化する場合、ペプチドを、３倍過剰の水性塩化ランタニドを含有する５０％アセトニトリルに溶解する。金属の組込みはＥＳ／ＭＳ分析によって監視する。錯体化されたペプチドの吸収スペクトルは、３２９ｎｍに吸収最大値を示した。
【誤訳訂正６８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４９】
バクテリオロドプシン膜ポリペプチド３（配列番号：３）を、最小限の量の正味ＴＦＥに溶解し、次いで卵黄レシチンリポソーム小胞の水性緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）による懸濁液に、脂質：タンパク質比＝１０００：１で添加する。リポソーム脂質膜内への膜ポリペプチドの組込みは、トリプトファンの蛍光発光（３００ｎｍより高い）を監視することによって観察する。得られたプロテオリポソームを４８，０００ｇでペレット化し、次いで少量ずつ−８０℃で凍結させる。
【誤訳訂正６９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５１】
実施例１０ 
ミセルに組込まれたバクテリオロドプシン膜ポリペプチドの化学連結 
３００μｇの膜ポリペプチド２（配列番号：２）と５０μｇのＣ末端をα−チオエステルで修飾された連結ポリペプチド４（配列番号：４）を、１０％のＡｍｍｏｎｙｘ−ＬＯ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシド）と１μｌのチオフェノールを含有する１００μｌの１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解する。得られた溶液を、エッペンドルフ試験管内で、２４ｈｒ室温で撹拌する。連結の経過は、分析用逆相ＨＰＬＣで監視する。連結された膜ポリペプチドを、セミ分取逆相ＨＰＬＣを使用して単離して、連結生成物［膜ポリペプチド５（配列番号：５）］であることを、エレクトロスプレーマススペクトロメトリーを用いる質量分析によって確認する。
【誤訳訂正７０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５６】
ＭＣ４受容体（配列番号：６）を過剰発現する真核ＨＥＫ２９３細胞は以下のようにして構築される。ＭＣ４受容体の遺伝子のコーディング領域を、一本鎖部位特異的突然変異誘発を実施するためバクテリオファージＭ１３中にサブクローン化する（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前掲文献）。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（ｋｕｎｋａｌ，１９８４年；ＺｏｌｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８７年）、生体外突然変異誘発キットＭｕｔａ−ＧｅｎｅＴ４（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ；米国カリフォルニア州バーキュレス）を利用してＸａ因子部位を生成させる（変異受容体遺伝子ｐＧＲＦＮ−ＭＣ４−８ａを含有するバクテリオファージＭ１３ベクター）。Ｘａ因子開裂部位の存在は、一本鎖ＤＮＡの配列を決定することによって確認される［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；米国オハイオ州クリーグランド）］。変異ＭＣ４受容体をコードするＤＮＡを、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズベッド）中にサブクローン化して、ＭＣ４受容体発現構造体ｐＧＲＦＮ−ＭＣ４−８ｂをつくる。この構造体を、標準のプロトコルにしたがって［ＬｉｐｆｅｃｔＡｍｉｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；米国メリーランド州ガイサーズバーグ）］、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナサス）中にトランスフェクトして細胞系ＣＧＲＦＮ−ＭＣ４−８ａが得られる。
【誤訳訂正７１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５８】
ＭＣ４膜ポリペプチド（配列番号：６）をＸａ因子で開裂させ、次にＭＣ４受容体連結ラベル剤（配列番号：７）に自然化学連結させるため、組換えＭＣ４受容体（配列番号：６）を含有する膜パッチを、Ｘａ因子プロテアーゼを標的としないプロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニン（２ｇ／ｍＬ）、Ｎ［Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシン］−アグマチン（１０μｇ／ｍＬ）およびペプスタチンＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０μｌの１００ｍＭトリス／ｐＨ８中に懸濁させる。２μｌのＸａ因子溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、次にその懸濁液を一夜、室温（約２５℃）でインキュベートする。膜パッチを、４８，０００ｘｇで沈降させ、次に１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄する。ＭＣ４（配列番号：６）をＸａ因子で開裂して、以下に示すＭＣ４受容体膜ポリペプチドＸａ因子開裂産物（配列番号：８）を得る。
【誤訳訂正７２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６０】
膜パッチの開裂されたＭＣ４（配列番号：８）とＭＣ４連結ラベル剤（配列番号：７）の化学連結を、ＡＭＣＡ−Ｘ／ＴＴＨＡ／Ｅｕ3+ありまたはなしで以下のように実施する。Ｃ末端チオエステルを含有するＭＣ４連結ラベル剤（配列番号：７）の２ｍＭ溶液を、１％のチオフェノールを含有する１．５Ｍ塩化グアニジウム／１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）内に加え、次いで一夜インキュベートする。そのとき、蛍光で標識されているかまたは天然のＣ−末端チオエステルを含有するＭＣ４連結ラベル剤（配列番号：７）を、１％チオフェノール含有１．５Ｍ塩化グアジニウム／１００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）に添加する。ＡＭＣＡ−Ｘ／ＴＴＨＡ／Ｅｕ3+キレートによる標識化は、以下のような改変を行って、実施例８に記載したようにして実施する。一夜インキュベートした後、修飾されたＭＣ４受容体含有膜をＰＢＳで洗浄し、次いで少量ずつ−８０℃で凍結する。連結生成物は、部位特異的蛍光ラベル剤ありまたはなしの、半合成脂質マトリックス埋込みＭＣ４受容体に相当する以下のアミノ酸配列（配列番号：９）を有している。
【誤訳訂正７３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６３】
実施例１２
発色団で標識したメラノコルチン受容体ＭＣ４のＦＲＥＴ分析 
ｃｓ１２４／ＴＴＨＡ／Ｔｂ+3キレートまたはＡＭＣＡ−Ｘ／ＴＴＨＡ／Ｅｕ+3キレートで標識したＭＣ４受容体のＦＲＥＴ分析を以下のようにして実施する。ｃｓ１２４／ＴＴＨＡ／Ｔｂ+3キレートまたはＡＭＣＡ−Ｘ／ＴＴＨＡ／Ｅｕ+3キレートを保有する受容体を含有する膜パッチを、実施例１１の場合のようにして構築して、２００μｌキュベット内のＰＢＳ中に懸濁させる。ＭＣ４受容体リガンドＡＧＲＰを、実施例１１に記載の手順にしたがって、ＴＡＭＲＡ（Ｔｂ+3キレートと対になっている）またはＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（Ｅｕ+3キレートと対になっている）で標識する。ヒトのＡＧＲＰ配列（配列番号：１０）は下記のとおりである。
ＭＬＴＡＡＶＬＳＣＡＬＬＬＡＬＰＡＴＲＧＡＱＭＧＬＡＰＭＥＧＩＲＲ
ＰＤＱＡＬＬＰＥＬＰＧＬＧＬＲＡＰＬＫＫＴＴＡＥＱＡＥＥＤＬＬＱＥ
ＡＱＡＬＡＥＶＬＤＬＱＤＲＥＰＲＳＳＲＲＣＶＲＬＨＥＳＣＬＧＱＱＶ
ＰＣＣＤＰＣＡＴＣＹＣＲＦＦＮＡＦＣＹＣＲＫＬＧＴＡＭＮＰＳＲＴ
ＴＡＭＲＡで標識したＡＧＲＰまたはＴＥＸＡＳ ＲＥＤ
で標識したＡＧＲＰを、ＰＢＳ溶液の貯蔵品からキュベット中にタイトレート（ｔｉｔｒａｔｅ）し、次に、Ｘｅフラッシュランプを備えたＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３分光蛍光光度計で蛍光スペクトルをとった。発光は５μｓ後、４００ｎｍと７００ｎｍの間で１ｍｓ間検出する。
リガンド結合のインヒビターを選別するため、可能性のあるインヒビターを添加し、蛍光スペクトルの形態の変化を監視する。あるいは、蛍光発光の減衰を、ＴＡＭＲＡの場合は５４３ｎｍでまたはＴＥＸＡＳ ＲＥＤの場合は６１４ｎｍで監視する。クエンチング天然リガンドをそのインヒビターで置換すると、この波長での蛍光の寿命がのびる。
【誤訳訂正７４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６４】
実施例１３
インワード−レクチファイングカリウムチャンネル孔ＩＲＫ１の全合成およびトキシンリガンドとそれとの相互作用のＦＲＥＴ分析 
チャンネル孔ＩＲＫ１の全合成用ポリペプチドと発色団による標識化は、ストレプトマイセス・リビダンスの相同カリウムチャンネルの三次元構造に基づいて（Ｄｏｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０巻，６９〜７７頁，１９９８年）、かつ、毒素結合に適応するように（Ｍａｃｋｉｎｎｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０巻，１０６頁，１９９８年）設計される。そのポリペプチドは、Ｎ末端ドメインが外ヘリックスをもたらしそしてＣ末端ドメインが内ヘリックスで孔ヘリックスを生成するように構築される。グリシン残基を、ＩＲＫ１の１２０位に配置して化学連結を容易にする。段階的合成用のポリペプチドとＩＲＫ１の連結生成物は下記の配列番号で表される。
ＩＲＫ１Ｎ末端ドメインのポリペプチド（配列番号：１１）：
ＭＴＩＦＩＴＡＦＬＧＳＷＦＦＦＧＬＬＷＹＡＶＡＹＩＨＫＤＬＰＥＦＨＰＳＡＮＨＴＧ 
ＩＲＫ１Ｃ末端ドメインのポリペプチド（配列番号：１２）：
ＣＶＥＮＩＮＧＬＴＳＡＦＬＦＳＬＥＴＱＶＴＩＧＹＧＦＲＣＶＴＥＱＣＡＴＡＩＦＬＬＩＦＱＳＩＬＧＶＩＩＮＳＦＭＣＧＡＩＬＡＫＩＳＲＰＫ
全合成の／連結されたＩＲＫ１のポリペプチド（配列番号：１３）：
ＭＴＩＦＩＴＡＦＬＧＳＷＦＦＦＧＬＬＷＹＡＶＡＹＩＨＫＤＬＰＥＦＨＰＳＡＮＨＴＧＣＶＥＡＩＮＳＬＴＤＡＦＬＦＳＬＥＴＱＶＴＩＧＹＧＦＲＣＶＴＥＱＣＡＴＡＩＦＬＬＩＦＱＳＩＬＧＶＩＩＮＳＦＭＣＧＡＩＬＡＫＩＳＲＰＫ 
【誤訳訂正７５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６６】
精製するため、粗製ポリペプチドを正味ＴＦＥに溶解し、次に、１００ｍＭ酢酸塩を含有する６Ｍ塩化グアニジニウム（ｐＨ４）の２当量で中和する。その物質を、４５％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含有する１００％アセトニトリル）に対し平衡状態にした１インチＩＤのＣ４分取ＨＰＬＣカラム中に注入する。そのカラムを、４５％緩衝液で無勾配にて、１０ｍｌ／ｍｉｎで１５分間、操作した後、ペプチドを４５％緩衝液から７５％緩衝液までの勾配で６０分間１０ｍｌ／ｍｉｎにて溶離する。画分を、５ｍｌ毎に集め、純度をＥＳ／ＭＳで分析する。
ＩＲＫ１のＣ末端（１２０〜１８６）（配列番号：１２）は、確立された側鎖保護戦略を利用するＢｏｃ化学のｉｎ ｓｉｔｕ中和プロトコルを利用してアミド生成ＭＢＨＡ樹脂上で合成される。これらのポリペプチドを、１０％ｖ／ｖ ｐ−クレゾールの存在下、ＨＦで、０℃にて１ｈｒ処理することによって、脱保護し、同時に樹脂から開裂される。得られた粗製ポリペプチドを沈降させ、冷エーテル内で３回洗浄し、次いで正味ＴＦＡに溶解する。そのＴＦＡをＲｏｔａｖａｐで除き、残留物を正味ＴＦＥに溶解して透明な溶液を生成させる。そのＴＦＥ溶液を、０．１％ＴＦＡ含有５０％水性アセトニトリルで１０倍に希釈し、次いで凍結乾燥する。
【誤訳訂正７６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６９】
合成ＬＰＫ１カリウムチャンネルに結合するように設計されたアギトキシンリガンド（ａｇｉｔｏｘｉｎ ｌｉｇａｎｄ）（配列番号：１４）は、既知のチャンネル−トキシン相互作用部位を考慮する化学合成法によって構築される（Ｄｏｙｌｅらの前掲文献；Ｓａｖａｒｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７巻，５４０７〜５４１６頁，１９９８年）。ＴＥＸＡＳ ＲＥＤラベル剤を、アギトキシン２（配列番号：１４）のＣ末端のリシン（残基３９）に、実施例８に記載の手順にしたがって結合させる。前記トキシンすなわちＩＲＫ１アギトキシン２リガンド（配列番号：１４）は下記のアミノ酸配列を有している。
ＧＶＰＩＮＶＳＣＴＧＳＰＱＣＩＫＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＲＫＣＨＣＴＰＫ 
【誤訳訂正７７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７０】
前記ＩＲＫ１トキシンペプチドは、逆相ＨＰＬＣで処理し、２Ｍ塩化グアニジニウム／１００ｍＭトリス、ｐＨ８．６（８ｍＭシスチン／１ｍＭシステインを含有）内でフォールドさせ、次に分取逆相ＨＰＬＣ（２５〜４５％Ｂ（イソプロパノール／アセトニトリル、２：１））で４５分間、１０ｍｌ／ｍｉｎで処理することによって精製される。
【誤訳訂正７８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７１】
凍結乾燥されたＩＲＫ１トキシンを次に、ランタニドイオンキレートで標識されたＩＲＫ１膜ポリペプチド（配列番号：１３）を含有するＣＬＰマトリックスと混合して平衡になるまでスピンする。得られた透明な赤色のゲルとともにＳｐｅｘ−Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ３Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒの固体試料ホルダーに塗布し、次いで、エネルギー移動の存在していることが、ゲルに関する３０ｎｍで励起された４５０ｎｍ〜６００ｎｍの蛍光スペクトルを得ることによって確認される。次に、小分子のアンタゴニストの水溶液をＣＬＰ中に混合し、そして、前記トキシンの前記チャンネルからの移動が蛍光の減少によって観察される。
【誤訳訂正７９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７２】
実施例１４
エス・リビダンスのＣＬＰ組込みカリウムイオンチャネルの化学連結 
ストレプトマイセス・リビダンスのカリウムイオンチャンネル孔（ＫＣＳＡ）の膜を横切るドメイン用に利用するペプチドは、既知のＫＣＳＡの構造（Ｄｏｙｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０巻，６９〜７７頁，１９９８年）に基づいて設計される。連結に利用されるＮ末端膜貫通ドメイン(配列番号：１５)は外ヘリックスが生成するように設計されているが、Ｃ末端の膜貫通ドメイン（配列番号：１６）は内ヘリックスと孔ヘリックスを生成するよう設計されている。この連結の設計によって、天然に存在するＫＣＳＡの切頭形バージョン（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）が得られ、膜を横切るドメイン形の細胞外部分の機能性が分離される。また、連結部位に天然のペプチド骨格を生成させる目的を達成するため、天然の化学連結を行いやすい化学選択的基を導入すべく、システインが、ペプチド合成中に、天然に存在するＫＣＳＡ（１６０残基）のＡｌａ５４の代わりに組み込まれる。Ｎ末端、Ｃ末端および最終の連結生成物の配列を以下に示す。
【誤訳訂正８０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７６】
ＣＬＰマトリックス中に組みこむため、５０ｍｇのＭＯを、クロロホルム：メタノール＝２：１の液２ｍｌに溶解する。その溶液に２ｍｇのＤＯＰＣを添加する。７０μｇのＮ末端ペプチド（配列番号：１５）と９０μｇのＣ末端ペプチド（配列番号：１６）それぞれを１５０μｌのＴＦＥに溶解し、ガラス製バイアルびん内で１０分間で６０℃まで加熱する。得られた両溶液を次に混合する。その混合溶液を、溶媒をアルゴンガスで吹き飛ばすことによって乾燥し、次いで減圧下で一夜放置して乳白色の薄膜が得られる。その乾燥薄膜に、３５μｌのリン酸ナトリウム（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）と０．５μｌのチオフェノールを添加する。生成した混合物を、透明相の生成するのが観察されるまで２．５ｈｒ遠心分離する。その反応混合物を一夜放置する。翌日、その相に、２０％β−メルカプトエタノールを含有するＴＦＥ１００μｌを添加する。得られた相を、短時間撹拌し、次いで卓上遠心分離器で１０分間遠心分離する。次に、０．１％水性ＴＦＡ中の緩衝液Ｃ（６：３：１のイソプロパノール／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ含有の水）１５０μｌを添加する。残留沈澱を正味ＴＦＡに溶解する。得られた溶液を濾過し、スパチュラチップ量（Ｓｐａｔｕｌａ ｔｉｐ）のＴＣＥＰを加えて、試料を還元する。最後に、上記溶解した反応混合物を、緩衝液Ｃ内で平衡状態にしたジビニルベンゼンを充填したＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）カラム内に注入する。溶出ピーク部分を収集し、それら画分をＭＡＬＤＩマススペクトルで分析する（図１０参照）。
【誤訳訂正８１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７８】
実施例１６
ミセル組込みインフルエンザＭ２イオンチャンネルの化学連結 
インフルエンザＭ２イオンチャンネルの全化学合成を、ミセル仲介連結（ｍｉｃｅｌｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行うため以下のＭ２ペプチドを利用して、実施例１５に記載したようにして実施する。チオエステル生成樹脂上で合成されたＮ末端ペプチドは下記の配列（配列番号：２１）を有している。
ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳＲＣＮＤＳＳＤＰＬＶＶＡＡＳＩＩＧＩＬ
ＨＬＩＬＷＩＬＤＲＬＦＦＫ 
この配列はＭ２の残基１〜４９に相当する。標準樹脂ＯＣＨ2ＰＡＭ上で合成されたＣ末端ペプチドは下記配列（配列番号：２２）を有している。
ＣＩＹＲＦＦＥＨＧＬＫＲＧＰＳＴＥＧＶＰＥＳＭＲＥＥＹＲＫＥＱＱＳＡＶ
ＤＡＤＤＳＨＦＶＳＩＥＬＥ 
この配列はＭ２の残基５０〜９７に相当する。ＨＩＶ ｖｐｕイオンチャンネルの場合と同様に、反応は３ｈｒ後に完了し、反応で連結される初期ペプチドの９５％を超える収率で連結生成物（Ｍ２残基１〜９７）が得られる。セミ分取逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリーを利用する質量分析によって、下記予想配列（配列番号：２３）に相当する質を有する連結生成物が確認された。
ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳＲＣＮＤＳＳＤＰＬＶＶＡＡ
ＳＩＩＧＩＬＨＬＩＬＷＩＬＤＲＬＦＦＫＣＩＹＲＦＦＥＨＧＬＫ
ＤＧＰＳＴＥＧＶＰＥＳＭＰＥＥＹＲＫＥＱＱＳＡＶＤＡＤＤＳＨ
ＥＶＳＩＥＬＥ 
ＤＰＣミセルに組み込まれたＭ２連結生成物を分析用超遠心分離機にかけたところ、Ｍ２がオリゴマー化して四量体になっていることを示している 
【誤訳訂正８２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７９】
実施例１７
ヒトＩＬ−８ケモカイン類の全化学合成と樹脂上での標識化および溶液中での二量体化のＦＲＥＴ分析 
ヒトＩＬ−８（ｈＩＬ−８）はα（ＣＸＣ）ケモカインファミリーのメンバーであり、その二量体化する特性は十分に研究されている（Ｒａｊａｒａｔｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８７巻８９〜１０５頁，１９９７年）。ｈＩＬ−８は、合成され、そして、溶液内で二量体化する特性を確認し、その膜ポリペプチド受容体ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２で検定するため、樹脂上、ＦＲＥＴの対で標識される。ＦＲＥＴの対ＴＴＨＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂ3+ラベル剤（ドナー）とＴＡＭＲＡ（アクセプター）が、この目的を達成するのに適切であるとして選択される標識化システムの一例である。
【誤訳訂正８３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８０】
ヒトＩＬ−８の全化学合成とヒトＩＬ−８の樹脂上での蛍光標識化を行うのに必要なペプチドは、このタンパク質の公表されているアミノ酸配列を利用して設計される。合成と標識化の設計を行うため、追加のリジン残基が蛍光プローブが樹脂上で結合するようにＣ末端に付加され、そしてシステイン連結部位が配列の中央部に選択され、その結果として３３個と４０個のアミノ酸を有する二つのポリペプチドが生成する。
【誤訳訂正８４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８１】
ｈＩＬ−８（１−３３）Ｎ末端ペプチド（配列番号：２４）
ＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨ
ｈＩＬ−８（３４−７３）Ｃ末端ペプチド（配列番号：２５）
ＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳＫ合成全長ｈＩＬ−８（１−７３）（配列番号：２６）
ＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳ
ＧＰＨＣＡＮＴＥＨＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲ
ＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳＫ 
ｈＩＬ−８のＮ末端チオエステルペプチド（１〜３３）を、先に述べたように合成し、脱保護し次いで開裂させる（例えば実施例１３参照）。得られた粗製ペプチドを、精製するため、まず６Ｍ塩化グアニジニウム／０．１Ｍ酢酸ナトリウｐＨ４．０に溶解し、次いで、１０％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ含有の１００％アセトニトリル）内で平衡状態にしたＣ４逆相分取カラム中に注入する。１０％緩衝液Ｂを用い無勾配で１３ｍＬ／ｍｉｎにて１５分間操作することによってグアニジニウムを、溶離させる。３０％から５０％までの勾配（６０分間）を使用してペプチドを溶出させる。画分を６ｍＬ毎に収集し、純度をＥＳ／ＭＳで分析し、次いで凍結乾燥する。
【誤訳訂正８５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８２】
アクセプターで標識したＣ末端ペプチドｈＩＬ−８（３４−７３−ＴＡＭＲＡ）をＭＢＨＡ樹脂上で合成し、次に、実施例８に記載したのと同様にして、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステルを使用して標識する。得られたポリペプチドを次に、Ｎ末端ペプチドに対して行ったのと類似の方式で脱保護し、開裂し次いで精製する。ドナーで標識したＣ末端ペプチドｈＩＬ−８−ＴＴＨＡ−ｃｓ１２４を以下のようにして調製する。リシン７３のＦｍｏｃ側鎖を、２０％ピペリジン（２回×５分間）で除去し、次にＤＭＦで十分に洗浄する。ＴＴＨＡのＴＥＡ塩１０当量を０．５Ｍ ＨＢＴＵに溶解し（ＴＴＨＡ：ＨＢＴＵのモル比＝１：１）、３．５モル当量のＤＩＥＡで中和し、次に樹脂に加える。これは、ニンヒドリンが鮮やかに呈色するまで３ｈｒカップリングさせる。樹脂上でｃｓ１２４をＴＴＨＡにカップリングするため、ＴＴＨＡ当たり１当量ＨＢＴＵを、樹脂に４当量のＤＩＥＡとともに加えて、１分間活性化させる。活性化された樹脂に、ＤＭＦに溶解した１０モル当量のｃｓ１２４を加えて、３ｈｒカップリングさせる。過剰のｃｓ１２４をＤＭＦで洗い流し、次に樹脂を先に述べたようにしてＨＦで開裂させる。標識されたＣ末端ペプチドｈＩＬ−８（３４−７３−ＴＴＨＡ−ｃｓ１２４）を先に述べたようにして精製する。
【誤訳訂正８６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８３】
上記の精製Ｎ末端ペプチドと、標識された精製Ｃ末端ペプチド各々との化学連結を、触媒として０．１％チオフェノールを含有する溶液（６Ｍ塩化グアニジニウム／０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭペプチド）内で実施する。反応は１６ｈｒ後に完了する。両方の連結生成物を、β−メルカプトエタノール（２０％）で、ｐＨ８．６にて２０分間処理して、ヒスチジン残基に残っているどのＤＮＰ保護基も除去する。溶液のｐＨを４．０まで下げ、ＴＣＥＰを添加して、どのジスルフィドも還元し、その反応混合物を、１０％緩衝液Ｂ内で平衡状態にしたＣ４逆相セミ分取カラムに注入する。連結生成物を、３０％緩衝液Ｂから５０％干渉液Ｂまでの勾配を利用して６０分間かけて溶離させる。画分を１．５ｍＬずつ収集し、純度をＥＳ−ＭＳで分析し、次に凍結乾燥する。
【誤訳訂正８７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８４】
まず、凍結された連結生成物を、６Ｍ塩化グアニジニウム／０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０に溶解し、次に０．１ＭトリスｐＨ８．０で２Ｍまで希釈することによって、ＴＡＭＲＡで標識されたｈＩＬ−８ポリペプチドをフォールドさせる。最終ペプチド濃度は１ｍｇ／ｍＬである。８ｍＭのシステインと１ｍＭのシスチンのレドックス緩衝液を添加してジスルフィドのシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を補助する。１６ｈｒ後にフォールディング反応が完了する。このフォールドされた生成物を、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。所望の生成物を含有する画分をＥＳ−ＭＳで確認する。４ａｍｕの損失が、二つのジスルフィド架橋の存在とそのため起こる４個のプロトンの損失を確証している。そのフォールドされた生成物を凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で貯蔵する。ＴＴＨＡ−ｃｓ１２４で標識したｈＩＬ−８ポリペプチドを類似の方式でフォールドさせる。
【誤訳訂正８８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８６】
タンパク質複合体（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）内のドナーラベル剤とアクセプターラベル剤と間の距離は、下記式に従って測定される蛍光の寿命から求めることができる（Ｉ．Ｄ．ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＲ．Ａ．Ｄｗｅｋ著 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ １９８４年、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，１１４〜１１５頁）。二つのプローブ間のエネルギー移動の効率（Ｅ）は、ドナーの寿命（τD ）を、アクセプターの存在下でのドナーの寿命（τDA）と、式Ｅ＝１−（τDA／τD ）を使用して比較することによって求められる。この効率は次にフォルスター距離（Ｒo ）に関連があり、式：Ｒ＝Ｒo｛（１−Ｅ）／Ｅ｝１／６を利用して、前記二つのラベル剤間の平均距離（Ｒ）を決定する。
【誤訳訂正８９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８７】
等しい濃度（３０μＭ）のドナー：ｈＩＬ−８（１−７３−ＴＴＨＡ−ｃｓ１２４−Ｔｂ3+）とアクセプター：ｈＩＬ−８（１−７３−ＴＡＭＲＡ）を混合し、次に４８８ｎｍにおける寿命を測定する。この濃度で、二量体化定数が約１０μＭの場合、そのタンパク質の大部分が溶液内で二量体化される。減衰曲線（ｄｅｃａｙ ｃｕｒｕｅ）はバイ−エクスポーネンシャルな（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｃｉａｌ）減衰を示す。この減衰の大きな成分は、０．２２ｍｓというより短い寿命を有し、ドナーとアクセプター間の複合体の寿命（ＴDA）に相当する。ドナー発光の蛍光の寿命の低下は、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギーの移動、すなわちＦＲＥＴが原因である。この減衰の小さな成分は約１ｍｓの寿命を有し、単量体ドナーのタンパク質またはそれ自身による複合体内のドナータンパク質に相当する。時間の経過とともに起こる５７０ｎｍの発光の損失も測定され、その損失は単相減衰（ｓｉｎｇｌｅ ｐｈａｓｅ ｄｅｃａｙ）を示し寿命は０．２４ｍｓである。この波長では、ＦＲＥＴが原因で起こるアクセプターの発光の減衰だけが観察される。この寿命は、４８８ｎｍで測定される寿命と類似している。最後にドナーだけ（３０μＭ）の４８８ｎｍの蛍光発光の減衰を、３４２ｎｍで励起した後、時間の経過とともに監視する。この減衰曲線はモノ−エクスポーネンシャルな減衰を示し、寿命の計算値は０．９４ｍｓ（τD ）である。
【誤訳訂正９０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８８】
測定された寿命と上記式を利用して、エネルギー移動の効率（Ｅ）が７５％で距離（Ｒ）が約５０Åであると観察される。この距離は、複合体の先に測定されたＮＭＲ構造に基づいた距離の妥当な推定値である。この構造の二つのＣ末端間の距離は４０Åである。追加のリシン側鎖を考慮すると、５０Åという推定値は妥当であろう。これらの結果は、これらのタンパク質がフォールドされて溶液内で二量体を形成していることを示している。また、これらの結果は、さらに、高感度のＦＲＥＴ分析を実施するための特異性、純度および収量を提供する樹脂上での標識化の利点を示している。
【誤訳訂正９１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８９】
実施例１８ 
ｅｍｒＥ輸送体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）のミセル仲介化学連結 
ミセル仲介化学連結法が、下記ｅｍｒ輸送タンパク質（配列番号：２７）の全化学合成に利用される。
ＭＮＰＹＩＹＬＧＧＡＩＬＡＥＶＩＧＴＴＬＭＫＦＳＥＧＦＴＲＬ
ＷＰＳＶＧＴＨＣＹＣＡＳＦＷＬＬＡＱＴＬＡＹＩＰＴＧＩＡＹ
ＡＩＷＳＧＶＧＩＶＬＩＳＬＬＳＷＧＦＦＧＱＲＬＤＬＰＡＨＧ
ＭＭＬＩＣＡＧＶＬＩＩＮＬＬＳＲＳＴＰＨ 
Ｎ末端ｅｍｒＥペプチドセグメント１（配列番号：２８）：
ＭＮＰＹＩＹＬＧＧＡＩＬＡＥＶＬＧＴＴＬＭＫＦＳＥＧＦＴＲＬＷＰＳＶＧＴＩＩＣＹおよび
中央のｅｍｒＥペプチドセグメント２（配列番号：２９）：
Ｃ（Ａｃｍ）ＡＳＦＷＬＬＡＱＴＬＡＹＡＩＷＳＧＶＧＩＶＬＩＳＬＬＳＷＧＦＦＧＱＲＬＤＬＰＡＩＩＧＭＭＬＩ
をチオエステル生成樹脂上で合成し、そして
Ｃ末端のｅｍｒＥペプチドセグメント３（配列番号：３０）：
ＣＡＧＶＬＩＩＮＬＬＳＲＳＴＰＨ
を標準樹脂ＭＢＨＡ樹脂上で合成する。ｅｍｒＥペプチドセグメント２チオエステルとｅｍｒＥペプチドセグメント３各々３．５ｍｇずつを、共に、５μｌＴＦＥと３５０μｌの水に溶解する。１０ｍｇのＤＰＣ粉末を添加する。得られた透明溶液を液体窒素中で凍結させ、次に５ｈｒ凍結乾燥して、ペプチドを散在させたＤＰＣのミセルマトリックスが得られる。８Ｍの尿素と４μｌのチオフェノールを含有する４００μｌの２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を、上記脂質マトリックスに添加して、前記ペプチドセグメント類の透明溶液を得る。連結を行ってから２日後、連結混合物を、２ｍｌＴＦＥ、２０％のβ−メルカプトエタノールを含有する水２ｍｌの溶液に添加し、２０分間インキュベートする。得られた溶液を、２０％酢酸水溶液にＴＣＥＰ（１５ｍｇ／ｍｌ）を溶解した溶液で酸性にして、セミ分取逆相ＨＰＬＣカラムに注入する。所望の第一連結生成物（ｅｍｒＥセグメント２とｅｍｒＥセグメント３の連結生成物）を含有する画分をエレクトロスプレーマススペクトロメトリーで確認し、一夜凍結乾燥する。
【誤訳訂正９２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９０】
Ｎ末端の“Ａｃｍ”（アセトアミドメチル）基を除くため、上記の生成した凍結乾燥／連結されたｅｍｒＥペプチドセグメント（ｅｍｒＥセグメント２とｅｍｒＥセグメント３の連結生成物、約２ｍｇ）を、５０μｌのＴＦＥと３５０μｌの０．５Ｍ酢酸に溶解する。次に、Ａｃｍ基を１．５モル過剰量（全システイン濃度に対して）の酢酸第二水銀［Ｈｇ（ＣＨ3 ＣＯ2 ）2］で１ｈｒ処理して除く。得られた溶液を、β−メルカプトエタノール中２０％にし、分析用逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、ステップ勾配法で精製する。所望の連結生成物を含有する画分をエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって確認し、次に一夜凍結乾燥する。
【誤訳訂正９３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９１】
得られた、脱保護された連結されたｅｍｒＥペプチドセグメント（ｅｍｒＥセグメント２とｅｍｒＥセグメント３の連結生成物）と、最後のｅｍｒＥセグメント１チオエステルの等量ずつを、ともに５０μｌのＴＦＥと３５０μｌの水に溶解する。５ｍｇのＤＰＣ粉末を添加する。得られた透明溶液を液体窒素内で凍結し、次いで数ｈｒ凍結乾燥して、ペプチドを散在させたＤＰＣのミセルマトリックスが得られる。その脂質マトリックスに、８Ｍの尿素と２μｌのチオフェノールを含有する２００μｌの２５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、前記ペプチドセグメント類の透明溶液が得られる。連結を行ってから１日後、その連結混合物を、１．４ｍｌのＴＦＥ、０．７ｍｌのβ−メルカプトエタノール、０．７ｍｌのピペリジンおよび１．４ｍｌの水からなる溶液に添加し、次いで２０分間インキュベートして、残っているいずれの保護基も除去する。得られた溶液を、１５ｍｇ／ｍｌのＴＣＥＰを２０％酢酸水溶液に溶解した溶液で酸性にし、セミ分取逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、次いで線形勾配法で精製する。所望の連結生成物（配列番号：２７）を含有する画分をエレクトロスプレーマススペクトロメトリーで確認し、次いで一夜凍結乾燥する。
【誤訳訂正９４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜Ｄ】
脂質二重層に結合している各種の膜ポリペプチドを示す。
【図２】
脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの各種化学連結の図式を示す。
【図３Ａ〜Ｃ】
脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの部位特異的プロテアーゼ開裂と天然化学連結を示す図式を示す。
【図４】
部位特異的開裂によって無保護Ｎ末端システインの遊離残基を生成し次に、この残基に選択された連結ラベル剤を天然化学連結させるのを監視する典型的なマトリックス介助レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）マススペクトルの出力を示す。
【図５】
脂質マトリックス埋込み膜ポリペプチドの共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）検定法のドナー〜アクセプター発色団の対の標識化の図式を示す。
【図６】
イオンチャンネルのＦＲＥＴ検定法を示す。
【図７】
イオンチャンネルのＦＲＥＴ近接検定法を示す。
【図８】
イオンチャンネルに関するＮＭＲによる構造活性関連（ＳＡＲ）検定法を示す。
【図９】
ドデシルホスホコリン（ＤＰＣ）ミセル内で連結を開始したＯｈｒの時点のＨＩＶｖｐｕイオンチャンネル前駆体のＮ末端ペプチドとＣ端末ペプチド、および前記連結を開始してかつ３ｈ後の時点の連結生成物の、逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリーを利用する質量分析の結果を示す。
【図１０】
１−モノオレオイル−ｒａｃグリセロール（Ｃ１８：１，｛ｃｉｓ｝−９）（ＭＯ）立方脂質相（ＣＬＰ）中の連結開始時のエス・リビダンスカリウムイオンチャンネル（ＫＣＳＡ）の前駆体のＮ−末端ペプチドとＣ末端ペプチドおよび一夜連結を行った後の連結生成物の、ゲル浸透ＨＰＬＣと、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを利用する質量分析の結果を示す。