(57)【要約】  本発明はワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子に挿入されたＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列を含むワクシニアウイルスベクターを提供する。本発明はさらに該ワクシニアウイルスベクターを含む組成物、該組成物を使用した治療方法、該組成物の医療的使用、該ワクシニアウイルスベクターを含むキットに関する。本発明はさらにワクシニアウイルスのＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列に関する。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子に挿入されたＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列を含むワクシニアウイルスベクター。
【請求項２】
ネイティブのＢ５Ｒ遺伝子がインタクトのままである、請求項１に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項３】
ワクシニアウイルスのＮ１Ｌ遺伝子に挿入された生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項４】
生物学的に活性なタンパク質が、サイトカイン、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン受容体およびサイトカイン受容体フラグメントからなる群から選択される、請求項３に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項５】
生物学的に活性なタンパク質がサイトカインである、請求項４に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項６】
サイトカインが、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項７】
ＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列が図３１で定義される、請求項１および請求項３から５のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項８】
該生物学的に活性なタンパク質が免疫チェックポイント阻害剤分子である、請求項４に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項９】
該免疫チェックポイント阻害剤分子が、可溶性ＰＤ１、可溶性ＰＤ−Ｌ１、可溶性ＴＩＭ−３、可溶性ＣＴＬＡ−４、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項１０】
ＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列が図３１で定義される、請求項８または９に記載のワクシニアウイルスベクター。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１３】
癌の治療のためにそれを必要とする対象に請求項１１に記載の組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項１４】
癌の治療のためにそれを必要とする対象に請求項１２に記載の組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物および請求項１１に記載の組成物を別々に、続いてまたは同時に投与することを含む治療方法。
【請求項１６】
癌の治療に使用するための、請求項１１に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１７】
癌の治療に使用するための、請求項１２に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１８】
癌の治療における別個の、逐次的な、または同時の使用のための、請求項１２に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物、および請求項１１に記載のワクシニアウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１９】
ワクシニアウイルスのＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列。
【請求項２０】
請求項１から６のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤および／または緩衝剤を含むキット。
【請求項２１】
請求項８から９のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤および／または緩衝剤を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌の治療に使用するための修飾腫瘍溶解性ウイルス（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ）に関する。
【０００２】
新しい治療法の進歩にもかかわらず、多くの固形腫瘍タイプの患者の生存率は依然として最大の課題の１つである。より効果的な治療法が大いに必要とされている。腫瘍溶解性ウイルスは、従来の治療法に耐性のある癌の治療のための魅力的な治療法である(Wong et al.、Viruses 2、78-106(2010))。
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を特異的に標的にして殺すことができるウイルスである。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、宿主の抗腫瘍免疫応答の誘導と増幅に不可欠な危険信号を提供する。
【０００４】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、腫瘍溶解療法の魅力的な候補となる多くの特徴を備えた二本鎖ＤＮＡを持つウイルスである(Al Yaghchi C. et al.、Immunotherapy 7(12):1249-58(2015))。それは細胞内で急速に複製し、腫瘍内で効率的に広がり、感染した細胞を溶解することができる。さらに、ＶＶは広く研究されており、大きなクローニング能力とさまざまな天然および合成プロモーターを備えた明確な分子生物学を備えているため、異種核酸配列を運ぶためのベクターとして理想的である。ＶＶは、天然痘の根絶に使用した後の安全性プロファイルを十分に確立しており、そのため、制御されていない感染症の治療法をすぐに利用できる。さらに、固形腫瘍に一般的に見られる低酸素微小環境は、多くの種類の腫瘍溶解性ウイルスの複製と有効性に有害であるが、ＶＶはこの環境で効果的に複製する(Hiley et al.、Gene Therapy 17、281-287(2010))。ワクチン株または遺伝子組み換え株のいずれかを使用した初期の臨床結果は、抗腫瘍効果を示している(Haddad et al.、Annals of Surgical Oncology 19 Suppl 3、S665-674(2012);Park et al.、Lancet Oncol 9:533-542、2008;Breitbach et al.、Nature 477:99-102、2011))。
【０００５】
ワクシニアウイルスのさまざまな欠失変異体が報告されている。チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子とウイルス成長因子（ＶＧＦ）遺伝子が欠失したウエスタンリザーブ株変異体は、腫瘍抗原に対して免疫系を効率的にプライミングすることができる(McCart et al.、Cancer Res 61、8751-8757(2001))。さらに、異種遺伝子、例えばサイトカインをコードする遺伝子でウイルスを武装させると、抗腫瘍免疫応答をさらに活性化することができる。
【０００６】
細胞溶解を介して感染細胞からＶＶを放出すると、ウイルスは循環血液を介してより多くの細胞に局所的および遠隔的に感染することができる。感染性ＶＶには、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）と細胞外エンベロープウイルス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ；ＥＥＶ）の２つの主要な形態があり(Appleyard et al.、J.Gen. Virology 13、9-17(1971))、ＩＭＶはウイルスの最初の感染性形態であり、感染性の子孫の大部分を表している。ＥＥＶは宿主細胞タンパク質でコーティングされており、抗原的に比較的静かで、宿主内での広範囲かつ長距離の伝播を可能にする先天性（補体）および適応性（中和抗体）の全身性宿主防御に拮抗する能力がある(Smith、GL&Vanderplasschen、A &Law、M.、J.Gen.Virol。83、2915-2931(2002); Payne、LG&Kristensson、K、J.Gen.Virol.66(3)、643-646(1985))。ただし、ＥＥＶは、ＶＶのほとんどの株において少数しか生成されない（すべての感染性子孫の１％未満）。
【０００７】
６つの遺伝子がＥＥＶ特異的タンパク質をコードすることが知られている。これらは、Ａ５６Ｒ、Ｆ１３Ｌ、Ｂ５Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、およびＡ３３Ｒである。Ｂ５Ｒは、「ショートコンセンサスリピート」（ＳＣＲ）と呼ばれる５０?７０アミノ酸のリピートの４つのコピーを含む４２ｋＤａの糖タンパク質をコードする。Ｂ５Ｒを削除すると、プラークサイズが小さくなり、ＥＥＶ形成が大幅に減少する（≦１０倍）(Blasco、R.&Moss、B.、J.Virol.65、5910-5920(1991); Engelstad、M. &Smith、GL、Virology 194、627-637(1993))。Ｂ５Ｒの膜貫通および細胞質尾部内の配列は、タンパク質をラッピング膜にターゲティングするために重要である(Katz et al.、J.Virol.71、3178-3187(1997))。ＳＣＲ４、ＳＣＲ３、４、またはＳＣＲ  ２，３，４が削除された変異型ＶＶは小さなプラークを生成するが、野生型ウイルスの約５０倍の感染性ＥＥＶを生成し、コメット型のプラークを形成する(Sanderson et al.、J.Gen..Virol.79(6)、1415-1425(1998); Mathew et al.、J.Virol.72、2429-2438(1998))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍溶解性ウイルスの分野での進歩にもかかわらず、ワクシニアに基づく治療薬はまだ市場に出回っていない。したがって、癌の治療に使用するためのより効果的な形態の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに対する満たされていない必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子に挿入された、ＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（ＳＣＲ１−，ＳＣＲ２−，ＳＣＲ３−，ａｎｄ  ＳＣＲ４−ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｂ５Ｒ  ｇｅｎｅ）（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列を含むワクシニアウイルスベクター（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）が提供される。
【００１０】
該核酸配列は、天然、合成または組換えであり得る。それは、例えば、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、またはゲノム配列であり得る。単離することも、プラスミド、ベクター、宿主細胞の一部であることもできる。プラスミドは、染色体ＤＮＡとは独立して複製する能力を持つ環状染色体外ＤＮＡ分子（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。
【００１１】
「核酸」という用語は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれている、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用することができる。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語には、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体も含まれる。例えば、当技術分野で知られており、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であると見なされる。
【００１２】
「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いに縮重したバージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。核酸は、天然源から精製したもの、組換え発現システムを使用して生成し、任意に精製されたもの、化学的に合成されたものであることができる。例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖または骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。特に明記しない限り、核酸配列は５’から３’の方向に提示される。「核酸セグメント」という用語は、本明細書では、より長い核酸配列の一部である核酸配列を指すために使用される。多くの実施形態において、核酸セグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の残基を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；  化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）；挿入された塩基；修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、送達を促進または達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「非修飾核酸（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」を特に対象とする。
【００１３】
ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子は、ＥＥＶ形成に不可欠な膜タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）を持っている。Ｂ５Ｒ  ＯＲＦの欠失は、ＥＥＶの劇的な減少に起因し、その結果、ウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏで小さなプラークを生成し、ｉｎ  ｖｉｖｏで大幅に弱毒化される。Ｂ５Ｒの細胞外部分は、主に、補体調節タンパク質（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に存在する短いコンセンサスリピート（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔｓ；ＳＣＲ）に類似した４つのドメインで構成されている。本発明の部分的Ｂ５Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスの天然Ｂ５Ｒタンパク質のシグナルペプチド（ＳＰ）、ストーク領域（ＳＴＡＬＫ）、膜貫通領域（ＴＭ）および細胞質尾部（ＣＴ）をコードする核酸領域を適切に含む。
【００１４】
部分的なＢ５Ｒ遺伝子は、発現を駆動するための上流プロモーターを有する発現カセットの形態で存在し得る。したがって、第１の態様の核酸配列は、発現カセットの一部であり得る。発現カセットはベクターの一部であり得る。これは、プロモーター、オープンリーディングフレーム、および３’非翻訳領域を含む。プロモーターは、１または複数の特定の遺伝子の転写を開始する特定の配列を持つＤＮＡの領域である。ワクシニアにおける異種遺伝子の発現に使用されるプロモーターには、初期および後期の転写活性を制御するプロモーター、例えば、ｍＨ５、Ｈ５、Ｐ７．５およびＰＥ／Ｌが含まれる。本明細書で使用される異種遺伝子とは、ウイルスには通常見られない遺伝子である。修飾されたＨ５プロモーターであるｍＨ５は、主に初期の活性を持ち、天然に存在するＨ５よりも優れた安定性を示す。
【００１５】
適切には、プロモーターは、Ｈ５プロモーターまたはｐ７．５初期／後期合成またはｐＨ５Ｒプロモーターであり得る。発現カセットは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などのレポータータンパク質をさらに含み得る。第２のプロモーターは、レポータータンパク質の上流に提供され得、Ｈ５プロモーターまたはｐ７．５初期／後期合成またはｐＨ５Ｒプロモーターなどのレポータータンパク質の発現を駆動するために使用され得る。
【００１６】
第１の態様の一実施形態では、核酸配列は、ベクター中に存在し得る。本明細書で使用されるベクターは、発現または複製のために核酸配列を細胞またはウイルスに導入するための構築物を指す。それは、組換え構築物、例えば、プラスミド、ウイルス、または細胞またはウイルスへの導入時に核酸配列の発現または複製が可能な任意の他の構築物を指す。
【００１７】
したがって、プラスミドを使用して、発現カセットを宿主細胞に導入することができる。プラスミドはまた、宿主細胞においてポリペプチドを発現するために使用され得る。例えば、宿主細胞は、そのポリペプチドを発現するために、特定のポリペプチドをコードすることができるプラスミドでトランスフェクトされ得る。
【００１８】
発現カセットは、ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入することができる。任意の好適な部位特異的組換えまたは遺伝子挿入技術を使用することができる。適切には、挿入は、相同組換えを使用して行われる。例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘまたはＦｌｐ／ＦＲＴシステムなどの、任意の適切な相同組換えシステムを使用することができる。例えば、組み込み部位は、レポータータンパク質をコードする核酸配列の周り、および部分的Ｂ５Ｒ遺伝子の発現を駆動するプロモーター領域の上流で、発現カセットに追加され得る。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、ワクシニアウイルスベクターは、図３１のいずれか１つに示される配列と実質的に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であるヌクレオチド配列を含む。２０％を超える同一性（例えば、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）を有するヌクレオチド配列は相同配列と見なされる。本明細書で使用される場合、実質的に相同とは、少なくとも６０％または７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列を指す。本発明の一実施形態では、配列は、図３１のいずれかに示される配列配列セットと少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）の相同性を有する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、相同性および同一性という用語は交換可能に使用される。相同性を決定するための配列比較は、容易に入手可能な配列比較ソフトウェアを使用して実行することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ（Ausubel et al.、1999 Short Protocols in Molecular Biology、4th Ed-Chapter 18を参照）およびＦＡＳＴＡ(Altschul et al.、1990 J.Mol.Biol.403-410)が含まれるが、これらに限定はされない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡはどちらも、オフライン検索とオンライン検索に使用できる（Ausubel et al.、1999、Short Protocols in Molecular Biology、pages 7-58 to 7-60を参照）。
【００２１】
本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスベクターは、図３１のいずれかに記載されている配列と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。例えば、２つの核酸配列のパーセント同一性の計算は、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実行され得る（例えば、ギャップは、最適な整列のために第１および第２の核酸配列の一方または両方に導入され得る。同一でない配列は、比較のために無視できる）。
【００２３】
特定の実施形態において、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。最初の配列の位置が２番目の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。２つのシーケンス間のシーケンスの比較と同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実行できる。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ  １２０重量残基表を使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１−１７）のアルゴリズムを使用してギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４として決定できる。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。
【００２４】
本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスベクターは、図３１のいずれかに記載されている配列と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）最初に製造されたときに関連していた成分、および／または（２）製造、調製、および／または人間の手によって製造された成分の少なくともいくつかから分離された物質および／または実体（ｅｎｔｉｔｙ）を指す（自然界および／または実験環境であるかどうかにかかわらず）。単離された物質および／または実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上で、それらが最初に共にあった他のコンポーネントから分離される。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上の純度である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸のストリングである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも３?５個のアミノ酸を含み得、それらのそれぞれは、少なくとも１つのペプチド結合を介して他のものに結合している。当業者は、ポリペプチドが、「非天然」アミノ酸またはそれにもかかわらず、必要に応じてポリペプチド鎖に組み込むことができる他の実体を含むことがあることを理解するであろう。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸のストリング）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）を含み得、および／または他の方法で処理または修飾され得る。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生されるような完全なポリペプチド鎖（シグナル配列の有無にかかわらず）であり得るか、またはその特徴的な部分であり得ることを理解するであろう。当業者は、タンパク質が、例えば、１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結されているか、または他の手段によって連結されている、複数のポリペプチド鎖を含むことがあることを理解するであろう。ポリペプチドは、１−アミノ酸、ｄ−アミノ酸、またはその両方を含み得、当技術分野で知られている様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含み得る。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、それらの生物学的に活性な部分、および／またはその特徴的な部分である。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、それらの生物学的に活性な部分、および／またはその特徴的な部分である。
【００２８】
ワクシニアには複数の菌株があり、人間と動物に対してさまざまなレベルの病原性がある。１９５０年代には、天然痘撲滅プログラムの一環として、世界中で多くのウイルス株が使用された。世界のさまざまな地域でさまざまな株が使用された。たとえば、ニューヨーク市保健委員会（ＮＹＣＢＯＨ）株とその派生株であるワイスは米国で一般的であり、コペンハーゲン（ＣＰＮ）とリスター株はヨーロッパで優勢だった。好ましい実施形態では、ワクシニア株はリスター株である。
【００２９】
ワクシニアウイルスベクターは、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ欠損）ワクシニアウイルスである。本明細書で使用されるＴＫ欠損ワクシニアウイルスは、内因性チミジンキナーゼ（ＴＫ）の欠如と一致する表現型を示すワクシニアウイルスを指す。ＴＫ欠損ワクシニアウイルスは、宿主細胞によって産生されるチミジンキナーゼに依存している。チミジンキナーゼは、腫瘍細胞で構成され産生されるが、正常細胞では産生されない。したがって、ＴＫ欠損ワクシニアウイルスは、特にＥＧＦＲ／Ｒａｓ／ＥＲＫ経路の活性化により、腫瘍細胞内で選択的に生存することができる。
【００３０】
ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子（Ｌ０９０）を相同組換えの標的にするために、本発明のベクターを作製するために使用される発現カセットは、ＴＫ遺伝子および／またはＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子に相補的な追加の配列を備え得る。例えば、追加の配列は、発現カセットの上流端および下流端にそれぞれ提供され得る。言い換えれば、ＴＫ遺伝子の左側（Ｌ０８９）を標的とするためにＴＫレフトアーム（Ｌアーム）が提供され得、ＴＫ遺伝子の右側（Ｌ０９１）を標的とするためにＴＫライトアーム（Ｒアーム）が提供され得る。次に、部分的なＢ５Ｒ遺伝子および遺伝子挿入要素を含む実際の発現カセットは、ワクシニアウイルスのＴＫ領域への挿入の準備ができているＴＫ−ＬアームとＴＫ−Ｒアームとの間に配置され得る。発現カセットはワクシニアウイルスベクターのトランスフォーメーションの前にシャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）に挿入することができる。
【００３１】
したがって、発現カセットは、以下の核酸配列要素から構成され得る：
【００３２】
ＩＮＴ−ＰＲＯ−ＲＥＰ−ＩＮＴ−ＰＲＯ−ＳＰ−ＳＴＣ
【００３３】
ここで、ＩＮＴは遺伝子挿入エレメント、ＰＲＯはオプションのプロモーター、ＲＥＰはレポータータンパク質をコードするオプションの核酸配列、ＳＰはシグナルペプチドをコードする核酸配列、ＳＴＣは上で定義した本発明の部分的なＢ５Ｒ遺伝子をコードする核酸である。オプションのプロモーターは、オプションのレポータータンパク質をコードする配列が存在する場合にのみ存在する。シグナルペプチド（ＳＰ）ドメインは、ＳＰ（シグナルペプチド）がウイルスに感染した細胞でのタンパク質合成後に部分的なＢ５Ｒ遺伝子（ＳＴＣ）の修飾を指示するため、組換えウイルスによって発現されるタンパク質には現れない。シグナルタンパク質（ＳＰ）は、部分的なＢ５Ｒタンパク質が発現し、翻訳後修飾を受けた後、ＳＴＣから切断される。
【００３４】
一実施形態では、発現カセットは、以下の要素から構成され得る：
【００３５】
Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＲＦＰ−Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＳＰ＋ＳＴＣ
【００３６】
ここで、遺伝子挿入要素はＬｏｘｐ部位であり、プロモーターはＨ５プロモーターであり、オプションのレポータータンパク質はＲＦＰである。
【００３７】
したがって、ＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４−ドメインが欠失したＢ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列は、ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子に挿入される外因性配列（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。
【００３８】
本明細書に記載の不活化は、転写または転写後レベルでの遺伝子のサイレンシング、遺伝子の欠失、遺伝子の突然変異、核酸配列の挿入による遺伝子の破壊、またはウイルス完全に機能する遺伝子産物を作成できないようにする他の方法を指す。遺伝子の不活化は部分的または完全であることができる。本明細書に記載されるように、本発明のワクシニアウイルスにおけるＴＫ遺伝子の不活化は、部分的Ｂ５Ｒ遺伝子をコードする核酸配列の挿入によって引き起こされる。挿入は、本明細書に記載されるような相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって促進され得る。
【００３９】
本発明のワクシニアウイルスベクターは、部分的Ｂ５Ｒ遺伝子をコードする核酸配列をワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子に挿入することにより、上記のように調製することができる。部分的なＢ５Ｒ核酸配列の挿入は、部位特異的組換えの任意の適切な方法によって達成され得る。しかし、相同組換えは、この目的のために一般的に適用可能な方法である。
【００４０】
一実施形態では、ワクシニアウイルスベクターの天然のＢ５Ｒ遺伝子はインタクト（ｉｎｔａｃｔ）のままであり得る。
【００４１】
本発明のワクシニアウイルスベクターは、さらなるタンパク質をコードする追加の核酸配列をさらに含み得る。適切には、タンパク質は、生物学的に活性なタンパク質であり得る、すなわち、それは治療効果を有し、および／またはそれはレポータータンパク質であり得る。タンパク質をコードする核酸配列が、部位特異的組換えによってワクシニアウイルスベクターに挿入されるに便利である。
【００４２】
任意の便利な部位特異的組換えまたは遺伝子挿入技術を使用することができる。適切には、挿入は、相同組換えを使用して行われる。標的配列への核酸配列の挿入は、当業者に周知の方法によって容易にすることができる。たとえば、方法は以下に開示されている；Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16。
【００４３】
レポーター遺伝子を除去するための、例えばＣｒｅ−Ｌｏｘ、またはＦｌｐ／ＦＲＴシステムなど、任意の適切な相同組換えシステムを使用することができる。遺伝子挿入エレメントは、タンパク質をコードする核酸配列の周り、およびタンパク質の発現を駆動するプロモーター領域の上流の発現カセットに加えることができる。
【００４４】
ワクシニアウイルスベクターのＮ１Ｌ遺伝子にさらに異種タンパク質を挿入することが適切である場合がある。ワクシニアウイルスのＮ１Ｌ遺伝子（Ｌ０２５）を相同組換えの標的にするために、発現カセットは、Ｎ１Ｌ遺伝子および／またはＮ１Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子に相補的な追加の配列を備えていてもよい。例えば、追加の配列は、発現カセットの上流端および下流端にそれぞれ提供され得る。言い換えれば、Ｎ１Ｌレフトアーム（Ｌアーム）は、Ｎ１Ｌ遺伝子および／または次の遺伝子（Ｌ０２４）の左側を、Ｎ１Ｌライトアーム（Ｒアーム）は、Ｎ１Ｌ遺伝子および／または次の遺伝子（Ｌ０２６）の右側を標的とするために提供され得る。次に、タンパク質をコードする核酸配列および遺伝子挿入要素を含む実際の発現カセットは、ワクシニアウイルスのＮ１Ｌ遺伝子への挿入の準備ができているＮ１Ｌ  ＬアームとＮ１Ｌ  Ｒアームとの間に位置し得る。発現カセットは、ワクシニアウイルスベクターの形質転換の前にシャトルベクターに適切に挿入され得る。
【００４５】
したがって、発現カセットは、以下の核酸配列要素から構成され得る：
【００４６】
ＩＮＴ−ＰＲＯ−ＲＥＰ−ＩＮＴ−ＰＲＯ−Ｘ
【００４７】
ここで、ＩＮＴは遺伝子挿入エレメント、ＰＲＯはオプションのプロモーター、ＲＥＰはレポータータンパク質をコードするオプションの核酸配列、Ｘは異種タンパク質（たとえば生物学的に活性なタンパク質）をコードする核酸配列である。オプションのプロモーターは、オプションのレポータータンパク質をコードする配列が存在する場合にのみ存在する。異種タンパク質は、抗癌活性、例えば細胞増殖抑制、細胞毒性、または免疫原性活性を有する治療用タンパク質であり得る。
【００４８】
本明細書で使用されるポリペプチドは、ペプチド結合によって一緒に結合された複数のアミノ酸残基を指す。それは、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドと交換可能に使用され、糖タンパク質およびそれらの誘導体を含む。「ポリペプチド」という用語はまた、元のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドの類似体および誘導体を包含することを意図している。本明細書で使用される異種ポリペプチドは、自然界でウイルスによって通常は発現されない任意のポリペプチドを指す。異種ポリペプチドは生物学的に活性であり得る。本明細書で使用される生物学的に活性なポリペプチドは、生物学的機能または活性を有するポリペプチドを指す。
【００４９】
異種タンパク質は、サイトカインまたは抗腫瘍免疫を促進するために抑制性サイトカインを中和するように作用するタンパク質、例えば、抗体、またはフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメント、サイトカイン受容体またはサイトカイン受容体フラグメントであることができる。
【００５０】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。抗体分子は、ジスルフィド結合によって結合された２つの同一の重鎖（Ｈ）と２つの同一の軽鎖（Ｌ）で構成されている。各重鎖はＦｃポリペプチドを含む。２つのＦｃポリペプチド重鎖は二量体化して抗体分子のＦｃ領域を形成する。「Ｆｃ領域」という用語は、ＣＨ１−ＣＬドメイン対を形成する軽鎖（ＣＬ）の定常部分と相互作用する重鎖（ＣＨ１）の第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）、およびＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む、様々な免疫グロブリン定常ドメインのポリペプチドは、本発明に従って二量体化ドメインとして使用することができる。
【００５１】
いくつかの抗体エフェクター機能は、リンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの多くの細胞の表面にあるＦｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃ領域の結合によって媒介される。ＦｃＲｓは抗体アイソタイプに対する特異性によって定義される。たとえば、ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃｙＲと呼ばれる。
【００５２】
本明細書で言及される「抗体フラグメント」は、全長抗体の任意の部分を意味する。抗体フラグメントの例には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディおよびＦｄフラグメントが含まれる。
【００５３】
「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインが連結されているＦｖフラグメントを指す。１つまたは複数のｓｃＦｖフラグメントを他の抗体フラグメント（たとえば重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結して、１つまたは複数の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成することができる。
【００５４】
異種タンパク質は、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインであり得る。他の適切な異種タンパク質には、抗原提示増強分子（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＨＳＰ９６）、またはＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１抗体）などの免疫チェックポイント阻害阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例には、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブが含まれる。抗ＰＤ−１抗体の例には、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、およびセミプリマブが含まれる。他の適切なＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１阻害剤には、抗体のフラグメントの融合タンパク質、例えば、ＰＤ−１リガンドプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、たとえばＡＭＰ−２２４の細胞外ドメインに融合した抗体のＦｃドメインが含まれる。他の免疫チェックポイント阻害阻害剤には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。免疫チェックポイント阻害阻害剤分子は可溶性がある。免疫チェックポイント阻害阻害剤は、免疫チェックポイント阻害分子と呼ばれることもある。
【００５５】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。抗体分子は、ジスルフィド結合によって結合された２つの同一の重鎖（Ｈ）と２つの同一の軽鎖（Ｌ）で構成されている。各重鎖はＦｃポリペプチドを含む。２つの重鎖からの２つのＦｃポリペプチドは二量体化して、抗体分子のＦｃ領域を形成する。「Ｆｃ領域」という用語は、ＣＨ１−ＣＬドメイン対を形成する軽鎖（ＣＬ）の定常部分と相互作用する重鎖（ＣＨ１）の第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）と、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む。
【００５６】
いくつかの抗体エフェクター機能は、たとえばリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの多くの細胞の表面にあるＦｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃ領域の結合によって媒介される。ＦｃＲは抗体アイソタイプに対する特異性によって定義される。たとえば、ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃｙＲと呼ばれる。
【００５７】
本明細書で言及される「抗体フラグメント」は、全長抗体の任意の部分を意味する。抗体フラグメントの例には、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ  ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディおよびＦｄフラグメントが含まれる。
【００５８】
「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインが連結されているＦｖフラグメントを指す。１つまたは複数のｓｃＦｖフラグメントを他の抗体フラグメント（たとえば重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結して、１つまたは複数の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成することができる。
【００５９】
一実施形態では、異種タンパク質をコードする発現カセットは、以下の要素から構成され得る：
【００６０】
ＦＲＴ−Ｈ５−ＲＦＰ−ＦＲＴ−Ｈ５−Ｘ
【００６１】
ここで、遺伝子挿入エレメントはＦＲＴサイト、プロモーターはＨ５プロモーター、オプションのレポータータンパク質はＲＦＰである。いくつかのさらなる実施形態において、異種タンパク質（Ｘ）は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦなどのインターロイキンであり得る。
【００６２】
さらなる実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−１５／受容体融合遺伝子であり得る。ＩＬ−１５／受容体融合遺伝子は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体融合タンパク質をコードすることができる。例えば、融合タンパク質は、可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒアルファ複合体であり得る。理論に縛られることなく、ＩＬ−１５は免疫応答を増強するための免疫療法剤として大きな可能性を秘めている。ただし、ＩＬ−１５の活動は、サイトカインが細胞結合高親和性ＩＬ−１５Ｒａｌｐｈａによって、ＩＬ−１５Ｒｂｅｔａと共通のガンマ鎖を発現する標的細胞に伝達されるという独特のメカニズムによって媒介される。したがって、投与されたＩＬ−１５単独の有効性は、遊離ＩＬ−１５Ｒａｌｐｈａの利用可能性によって制限される可能性がある。可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａｌｐｈａ複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１５半減期とバイオアベイラビリティを大幅に向上させ、ＩＬ−１５活性を最大化する可能性がある。
【００６３】
本明細書におけるＩＬ−１２への言及は、ＩＬ−１２Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４０４７７３．１Ｇ１：１５１２８２１４）および／またはＩＬ−１２Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ００８８４７．１  Ｇｌ：１１１９２０３４）を含む。成熟したＩＬ−１２タンパク質には両方のサブユニットが含まれている。本明細書におけるＩＬ−２１への言及は、アイソフォーム１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６８５７５．１／ＧＩ：１１１４１８７５）および／またはアイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１９３９３５．１／ＧＩ：３３３０３３７６７）を含む。本明細書におけるＧＭ−ＣＳＦへの言及は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７３８６８．２／Ｇｌ：１４２７８７０９を含む。本明細書におけるＩＬ−１５への言及は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１４４０７．１を含む。一般的に、配列はヒトの配列である。
【００６４】
本明細書で使用されるレポーターポリペプチドは、その発現が、宿主細胞またはウイルスにおける核酸配列、発現カセットまたはベクターの存在を示すポリペプチドを指す。レポーターポリペプチドの例には、蛍光ポリペプチド、化学発光ポリペプチド、生物発光ポリペプチド、リン光ポリペプチド、ならびに酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の一実施形態では、レポーターポリペプチドは蛍光ポリペプチドである。蛍光ポリペプチドには、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
しかしながら、患者の癌の治療のための臨床使用において、発現カセットがレポータータンパク質を含まないことが好ましい。
【００６７】
制限部位は、制限酵素によって認識および切断される特定のヌクレオチド配列である。制限酵素の例は、ＳａｉＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＭｌｕＩである。ＢａｍＨＩ制限部位はＢａｍＨＩによって認識される制限部位である。他の酵素の制限部位も同様に命名されている。
【００６８】
本発明の一実施形態では、核酸配列またはベクターは、１つまたは複数の制限部位を含む。本発明の好ましい実施形態は、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩ制限部位を含む核酸配列またはベクターである。
【００６９】
本発明の一実施形態では、核酸配列またはベクターは、ワクシニアウイルス内に含まれる。本発明の特定の実施形態において、核酸配列は、図３１のいずれか１つに示される式を有する。
【００７０】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様のワクシニアウイルスベクターを含む組成物が提供される。この態様による本発明の実施形態では、組成物は、任意に、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。したがって、本発明は、本明細書に記載されるような医薬組成物を含む。
【００７１】
組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口（頬側または舌下を含む）、局所（頬側、舌下または経皮を含む）、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、動脈内、髄腔内、胸膜内、眼内、心臓内、腹腔内または皮内経路を含む）による投与に適合させることができる。
【００７２】
非経口投与に適合した医薬組成物には、製剤を意図されたレシピエントの血液と実質的に等張にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が包含される。
【００７３】
注射可能な溶液に使用できる賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が含まれる。組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルで提供され得、そして滅菌液体、例えば注射用水を使用前に添加することのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００７４】
医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、臭気剤、塩（本発明の物質自体が薬学的に許容される塩の形態で提供され得る）、緩衝液、コーティング剤または抗酸化剤を含み得る。それらはまた、本発明の物質に加えて、治療的に活性な薬剤を含み得る。
【００７５】
本発明の第３の態様によれば、癌の治療のためにそれを必要とする対象に本発明の第２の態様の組成物を投与することを含む治療方法が提供される。組成物は、任意に、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、および／または緩衝剤と共に処方され得る。したがって、組成物は、医薬組成物として処方することができる。
【００７６】
本発明のこの態様の実施形態は、癌の治療に使用するために本明細書で定義されるワクシニアウイルスベクターを含む組成物にまで及ぶ。そのような実施形態は、癌の治療に使用するための薬剤の製造における本明細書で定義されるような核酸配列またはワクシニアウイルスベクターを含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、対象は、人間を含む動物を指す。動物には、マウス、ラット、ニワトリなどの家禽、ウシ、ヤギ、鹿、ヒツジなどの反芻動物、およびブタ、ネコ、イヌ、およびヒト、チンパンジー、ゴリラ、サルなどの霊長類などの他の動物が含まれ得る。
【００７８】
治療上有効な量は、腫瘍崩壊を誘発するのに十分な用量である。送達および投与のための用量は、動物の疾患モデルを使用して、または任意にヒトの臨床試験において、経験的に決定された現在の既存のプロトコルに基づくことができる。最初の研究用量は、例えば、マウスについての、本明細書に記載の動物研究に基づくことができる。用量は、治療が予防的であるか治療的であるか、治療が向けられる疾患の種類、発症状態、進行度、重症度、頻度、期間、または確率、望ましい臨床エンドポイント、以前のまたは同時の治療、対象の全体的な健康状態、年齢、性別、人種または免疫学的能力、および当業者によって評価される他の要因に応じて変化する。投与量、数、頻度または期間は、治療または治療の有害な副作用、合併症または他の危険因子、ならびに対象の状態によって示されるように、比例して増加または減少し得る。当業者は、治療的または予防的利益を提供するのに十分な量を提供するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得る要因を理解するであろう。
【００７９】
本発明のこの態様の実施形態では、本発明の方法は、対象に追加の癌治療を適用することをさらに含む。本明細書で使用される癌治療は、医学的または物理的手段による癌の治療を指す。追加の癌治療は、化学療法、生物学的治療、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、および／または手術、およびそれらの組み合わせを含む。
【００８０】
本明細書に開示される本発明の方法および使用は、対象が治療の対象となる疾患を有すると同定された直後、または数日、数ヶ月、または数年後に実施することができる。
【００８１】
この方法には、さまざまなスケジュールでウイルスを投与することが含まれる。ウイルスの単回投与は、１、２、５、１０、１５、２０、または２４時間にわたって対象または腫瘍に投与され得る。ウイルスは、１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上の日数または数週間にわたって投与することができる。注射の間隔は、１、２、３、４、５、６、７日または数週間にすることができる。典型的には、複数の用量が、腫瘍の近くなど、または静脈内投与の場合、対象の血流またはリンパ系の特定の入口点など、同じ一般的な標的領域に投与される。ワクシニアウイルスベクターは、２、３、４、５、またはそれ以上の回数投与することができる。ワクシニアウイルスベクターは、腫瘍を切除する前に、さまざまなスケジュールと用量で投与することができる。
【００８２】
本発明の方法および使用はまた、ウイルスの１つ、２つ、３つ、または４つの異なる実施形態を別々に、逐次的にまたは同時に投与することを含み得る。第１の異種タンパク質をコードする核酸配列を含む第１のウイルスおよび第２の異種タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のウイルスは、別々に、逐次的に、または同時に投与され得る。ウイルスの異なる実施形態のその後の投与間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２４時間であり得る。
【００８３】
例えば、免疫チェックポイント阻害剤をコードする核酸配列を含む第１のウイルスは、サイトカインをコードする核酸配列を含む第２のウイルスに続いて投与され得る。
【００８４】
免疫チェックポイント阻害タンパク質は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。免疫チェックポイント阻害タンパク質は可溶性であることができる。
【００８５】
サイトカインは、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−α、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００８６】
一実施形態では、生物学的に活性なタンパク質が可溶性ＰＤ１であるワクシニアウイルスベクターが、生物学的に活性なタンパク質がＩＬ−１２であるワクシニアウイルスベクターに続いて投与される。
【００８７】
本発明の方法および使用はまた、ウイルスおよび異種タンパク質を別々に、逐次的にまたは同時に投与することを含み得る。逐次的な投与の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２４時間であり得る。例えば、サイトカインをコードする核酸配列を含むウイルスに続いて抗体を投与することができる。
【００８８】
本発明の第１または第２の態様または異種タンパク質の別個の、逐次的にまたは同時の投与は、投与が静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、鼻腔内または皮下である任意の便利な経路によって達成され得る。本発明の第１または第２の態様および異種タンパク質は、組み合わせた調製物として調製することができ、または別個の成分として調製することができる。
【００８９】
この方法には、異なるウイルス濃度でウイルスを投与することが含まれる。特定の態様において、対象は、少なくとも５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２以上のウイルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）で、さまざまな値とその間の範囲を含み投与される。ウイルスの投与量は、０．１  ｍＬ、１  ｍＬ、２  ｍＬ、３  ｍＬ、４  ｍＬ、５  ｍＬ、６  ｍＬ、７  ｍＬ、８  ｍＬ、９  ｍＬ、１０  ｍＬ以上で、その間のすべての値と範囲を含んで投与できる。投与量は、時間の経過とともに、または個別の注射によって拡大することができる。
【００９０】
特定の実施形態では、対象は、癌および／または腫瘍を有するヒトである。癌は、胃腸癌、気道癌、泌尿生殖器癌、造血癌、肉腫、腺癌、扁平上皮癌、または非悪性腫瘍／過形成であり得る。腫瘍は、治療前は切除不能であり、治療後に切除可能である場合がある。腫瘍は、再発性、原発性、転移性、および／または多剤耐性腫瘍である場合がある。特定の局面において、腫瘍は膵臓上または膵臓内に位置している。他の局面において、腫瘍は、神経内分泌腫瘍、内分泌腫瘍、末梢中枢神経系腫瘍、脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、肝臓腫瘍、胸腺腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、睾丸癌腫瘍、膀胱腫瘍、直腸癌腫瘍、黒色腫あるいは乳癌腫瘍であり得る。
【００９１】
本発明に開示される組成物および方法は、異なるタイプの遺伝子治療、例えば、腫瘍抑制遺伝子治療、自殺遺伝子治療、ウイルスベクター、予防接種戦略、抗血管新生療法、アポトーシス促進遺伝子治療および遺伝子置換療法において使用され得る。“Oncolytic Viruses for Cancer Therapy: Overcoming the Obstacles” (Wong et al. Viruses 2010, 2, 78-106)は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
本発明に開示される組成物および方法は、癌の治療における追加の治療手段または方法、例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、分子癌療法、または本明細書に記載の本発明の核酸とは異なる遺伝子の投与であり得るさらなる遺伝子療法と組み合わせて使用され得る。
【００９３】
本発明の第４の態様によれば、ワクシニアウイルスのＳＣＲ１−、ＳＣＲ２−、ＳＣＲ３−、およびＳＣＲ４ドメイン欠失Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ５Ｒ  ＳＣＲ１−  ＳＣＲ２−  ＳＣＲ３−  ＳＣＲ４−）をコードする核酸配列が提供される。
【００９４】
本発明の第５の態様によれば、本明細書で定義されるワクシニアウイルスベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤および／または緩衝液とを含むキットが提供される。したがって、このキットは癌の治療に有用である。キットは、化学療法剤などのさらなる治療剤、および／または使用説明書をさらに含み得る。
【００９５】
本開示は、新規の組換えワクシニアウイルス発現ベクターおよび癌治療およびワクチン接種におけるその応用について記載している。本発明のベクター（ＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣと名付けられた）は、天然痘の予防のために何億人もの人々に安全に使用されてきたワクチン株リスターワクシニアウイルスに由来し、より具体的には１つのウイルス遺伝子（チミジンキナーゼ遺伝子）の欠失を含む。この新規変異ＶＶは、その親ウイルスよりも１０?３０倍多くの感染性ＥＥＶを生成するが、変異ＶＶの総計での複製は弱められない。
【００９６】
本開示の一実施形態において、複製能力のあるリスター株ワクシニアウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣ）は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）領域のＢ５Ｒ遺伝子（ＳＴＣ）の一部およびインタクトなＢ５Ｒ遺伝子を含むと記載され、これはより良いコメットテール（ｃｏｍｅｔ  ｔａｉｌ）形成、プラークの通常のサイズでのＥＥＶ産生を示す。部分的なＢ５Ｒ遺伝子（ＳＴＣ）は、Ｂ５Ｒ遺伝子はインタクトのままワクシニアウイルスゲノムの非生体領域に挿入できる。このような修飾により、修飾されたウイルスはＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣと同じ機能を有する。ＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで強化された抗腫瘍効果を有する。治療遺伝子ＩＬ−２１で武装した（ａｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ＩＬ−２１）ＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、抗腫瘍免疫を改善する。ＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、ＩＬ−１２などの他の治療遺伝子を有することができる。ＶＶ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、局所投与（腫瘍内注射）および全身投与（静脈内注射）することができる。
【００９７】
本開示の一実施形態では、ウイルス遺伝子の特定の操作、チミジンキナーゼ領域への部分的Ｂ５Ｒ遺伝子（ＳＴＣ）の挿入、および癌治療へのその使用を伴う、リスター株ＶＶに由来する新規ＶＶベクターが記載される。
【００９８】
元のＢ５Ｒ遺伝子を元の位置に保持したまま変異Ｂ５Ｒ遺伝子（ＳＴＣ）をＴＫ領域に導入すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常なプラークサイズを生成するウイルスが作成される。これは、ウイルスの拡散を改善するために重要である。この修飾により、より多くのＥＥＶが生成され、ウイルスが長距離に拡散する能力が向上する。したがって、この修飾は、本開示に示されるように、ウイルスの抗腫瘍効力を増強し、静脈内送達により適したウイルスを作り出す。
【００９９】
腫瘍溶解性ウイルスの静脈内送達は、インビボでの抗腫瘍効果を改善するために望ましい。なぜなら、静脈内送達ウイルスは、患者内の原発腫瘍に加えて、転移性および循環腫瘍細胞をより容易に標的とすることが期待できるからである。本開示の重要な利点は、腫瘍溶解性ウイルスをより効果的に静脈内に送達できることである。本明細書に記載の変異ウイルスは、ＥＥＶを形成する能力が増強されており、ワクシニアウイルスのＥＥＶ形態は、免疫介在性ウイルスクリアランスに対して本質的により耐性があるため、さらに有利である。本開示は、腫瘍向性（ＴＫおよびＮ１Ｌ欠失による）ＶＶを修飾して、修飾ＶＶ内にウイルスＢ５Ｒ遺伝子のＳＴＣ領域の第２のコピーを組み込むことにより、ＥＥＶ形成を増強し得る一方で、オリジナルの全長Ｂ５Ｒ領域の発現を保持する。この開示は、臨床的に静脈内送達されたときにまだ有効性を実証していない、静脈内送達可能な腫瘍溶解性ウイルス療法の前進を表す。修飾されたウイルスはまた、原発部位と転移部位の両方で腫瘍に対する免疫応答を増強するために、さらなる導入遺伝子を組み込むことができる。
【０１００】
本発明の第２およびその後の態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて第１の態様と同様である。
【０１０１】
本発明は、添付の図面を参照することにより説明されるが、これは例示のみを目的として含まれており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、ｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣシャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）の発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を示している。上のパネルは、Ｂ５Ｒタンパク質とｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ  ＳＴＣおよびＳ−ＳＴＣシャトルベクターの発現カセットの構造を示している。シグナルペプチド（ＳＰ）を含む発現ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴ（ＳＴＣ）およびシグナルペプチド（ＳＰ）を含むＳＣＲＩ−ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴ（Ｓ−ＳＴＣ）。下のパネルは、ｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ  ＳＴＣシャトルベクターの発現カセットであり、マーカー遺伝子ＲＦＰとＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＴＣ（ＳＴＣ）の両方がＨ５プロモーターによって駆動される。シグナルペプチド（ＳＰ）を含むＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴ（ＳＴＣ）の発現はＨ５プロモーターによって駆動され、シグナルペプチド（ＳＰ）を含むＳＣＲＩ−ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴ（Ｓ−ＳＴＣ）はネイティブＢ５Ｒプロモーターによって駆動される。マーカー遺伝子ＲＦＰはＨ５プロモーターによって駆動される。ＳＰ＝Ｂ５Ｒ遺伝子のシグナルペプチド。ｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびｐＧＥＭＴ−Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣシャトルベクターの相同組換えセクション。ＴＫ  Ｌアームは、ＴＫ遺伝子の左側（Ｌ０８９）をターゲットにする。ＴＫ    Ｒアームは、ＴＫ遺伝子の右側（Ｌ０９１）をターゲットにする。発現カセットはＴＫ  ＬアームとＴＫ  Ｒアームの間に位置する。
【０１０３】
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのワクシニアウイルスのプラークとコメットテールの形成の比較を示している。６ウェルプレート内のＣＶ−１細胞を、希釈したコントロールウイルスＶＶＬ１５、組換えＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ−ＳＴＣ、組換えＶＶＬ１５  Ｂ５ＲＳ−ＳＴＣに感染させた。感染の３日後、感染した細胞を前述のようにクリスタルバイオレットを使用して染色した。プレートを写真スキャンした。
【０１０４】
【図３】図３は、発現カセットとＴＫ−ＳＴＣシャトルベクターおよび相同組換えを示している。上のパネル：最初のＨ５プロモーター（左から）がＲＦＰ式を駆動し、２番目のＨ５プロモーターがＳＴＣを駆動する。ＳＰ：シグナルペプチド（Ｂ５Ｒから）；ＳＴＣ：Ｓｔａｌｋ（Ｓ）、ＴＭ（Ｔ）、ＣＴ（Ｃ）。ＴＭはＢ５Ｒタンパク質の膜貫通ドメインであり、ＣＴはＢ５Ｒタンパク質の細胞質尾部である。下のパネル：ＴＫ−ＳＴＣシャトルベクターの相同組換えセクション。ＴＫレフトアーム（Ｌアーム）はＴＫ遺伝子の左側（Ｌ０８９）をターゲットにし、ＴＫライトアーム（Ｒアーム）はＴＫ遺伝子の右側（Ｌ０９１）をターゲットにする。発現カセット（Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＲＦＰ−Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＳＰ＋ＳＴＣ）は、ＴＫ領域のＴＫＬアームとＴＫ−Ｒアームの間に位置する。
【０１０５】
【図４】図４は、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスの確認を示している。Ａ：ＶＶＬ１５  ＲＦＰウイルス。Ｂ：ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルス。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣプラーク精製の最終ラウンドでは、ＣＶ１細胞のウェル内のすべてのコロニーでＲＦＰが発現していることが確認された。ＣＶ１溶解物から抽出されたウイルスＤＮＡからＰＣＲによってＳＴＣ遺伝子と下流のＴＫ遺伝子の一部を増幅するために特異性のプライマーペアを使用した。ＰＣＲ産物はＶＶＬ１５ＲＦＰ  ＤＮＡには存在しなかったが、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣ  ＤＮＡには存在した。これは、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣでのＴＫ遺伝子の欠失と、ＴＫ領域でのＳＴＣの存在を示している。Ｂ５Ｒ遺伝子のＳＰ上のフォワードプライマーとＢ５Ｒ細胞質尾部のリバースプライマーをＰＣＲで使用して、Ｂ５Ｒ遺伝子全体と変異型Ｂ５Ｒ  ＳＴＣを増幅した。完全長のＢ５ＲはＶＶＬ１５  ＲＦＰとＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣに存在したが、変異体ＳＰ−ＳＴＣは予想どおりＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣにのみ存在していた。
【０１０６】
【図５】図５は、ワクシニアウイルスのプラークの比較を示している。６ウェルプレート中のＣＶ−１細胞を、希釈したコントロールウイルスＶＶＬ１５  ＲＦＰ、組換えＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣに感染させ、アガロースゲルで覆った。３日後、アガロースゲルを除去し、クリスタルバイオレットを使用して細胞を染色した。プレートは左に示すように写真スキャンされた。プラークのサイズは、右に示す画像Ｊを使用して測定した。
【０１０７】
【図６】図６は、ワクシニアウイルスのプラークとコメットテールの形成の比較を示している。６ウェルプレート中のＣＶ−１細胞は、コントロールウイルスＶＶＬ１５  ＲＦＰおよび組換えＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣに感染された。感染の３日後、クリスタルバイオレットを使用して細胞を染色し、プレートを写真スキャンした。
【０１０８】
【図７】図７は、ＣＶ１細胞株におけるＶＶＬ１５  ＲＦＰおよびＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣウイルスによるＥＥＶ産生を示している。０．０１  ＰＦＵ／細胞ＶＶを使用して、６ウェルプレートのＣＶ−１細胞に感染させた。細胞培養培地と感染細胞を感染の４８時間後と７２時間後に別々のチューブに集め、ウイルスをそれぞれタイトレート（ｔｉｔｒａｔｅ）した。産生されたＥＥＶの比率は、細胞培養培地から回収されたウイルスの総量を感染細胞から回収されたウイルスの総量と比較することによって計算された。
【０１０９】
【図８】図８は、膵臓癌細胞株におけるＶＶＬ−ＤＤおよびＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスによるＥＥＶ産生を示している。０．０１  ＰＦＵ／細胞ＶＶを使用して、６ウェルプレートの細胞を感染させた。細胞培養培地と感染細胞を感染後１８、２４、４８時間に別々のチューブに集め、ウイルスをそれぞれタイトレートした。産生されたＥＥＶの比率は、細胞培養培地から回収されたウイルスの総量を感染細胞から回収されたウイルスの総量と比較することによって計算された。ＴＢ１１８３１：マウス膵臓癌細胞株、ＳＴＵＩＴ−２およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２はヒト膵臓癌細胞株である。
【０１１０】
【図９】図９は、肺がん細胞株におけるＶＶＬ−ＤＤおよびＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスによるＥＥＶ産生を示している。０．０１  ＰＦＵ／細胞ＶＶを使用して、６ウェルプレート中の細胞に感染させた。細胞培養培地と感染細胞を感染後１８、２４、４８時間に別々のチューブに集め、ウイルスをそれぞれタイトレートした。産生されたＥＥＶの比率は、細胞培養培地から回収されたウイルスの総量を感染細胞から回収されたウイルスの総量と比較することによって計算された。ＬＬＣ：マウス肺がん細胞株。Ｈ４６０、Ｈ１２９９ＭＩＡおよびＡ５４９はヒト肺がん細胞株である。
【０１１１】
【図１０】図１０は、ＣＶ１細胞株における複製ＶＶＬ１５  ＲＦＰおよびＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣウイルスを示している。ＰＦＵ／細胞におけるウイルス力価は、１  ＰＦＵ／腫瘍細胞による感染の２４、４８および７２時間後に収集されたウイルス溶解物に対してＴＣＩＤ５０アッセイを実施することによって決定された。各アッセイは３回行った。
【０１１２】
【図１１】図１１は、ＶＶＬ１５  ＲＦＰウイルスとＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣウイルスの溶解力の比較を示している。ＭＴＳアッセイを実施して、細胞株ＣＶ１、ＣＴ２６、およびＤＴ６６０６に対するＶＶＬ１５  ＲＦＰおよびＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣウイルスの細胞毒性を測定した。グラフは、対応するウイルスの用量反応（細胞死の割合）曲線（図示せず）から得られたＥＣ５０値（細胞の５０％を殺すために使用されるウイルス用量）のプロットである。
【０１１３】
【図１２】図１２は、結腸癌モデルにおいて、ＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣがＶＶＬ１５  ＲＦＰよりも効果的であることを示している。同系ＣＴ２６皮下脇腹モデルは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫応答性マウス（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ）で確立された。腫瘍体積が平均１００ｍｍ３に達したとき、１ｘ１０８  ＰＦＵのウイルスまたは同等量のビヒクルバッファー（５０  μｌのＰＢＳ）の１日量（合計５）をＩＴ注射した（グループあたりｎ＝５−７）。腫瘍の成長は、週に２回のノギス測定によって追跡された。
【０１１４】
【図１３】図１３は、膵臓がんモデルにおいて、ＶＶＬ１５ＴＫ  ＳＴＣがＶＶＬ１５  ＲＦＰよりも効果的であることを示している。同系のＤＴ６６０６皮下脇腹モデルは、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスで確立された。腫瘍体積が平均１００ｍｍ３に達したとき、１ｘ１０８  ＰＦＵのウイルスまたは同等量のビヒクルバッファー（５０  μｌのＰＢＳ）の１日量（合計５）をＩＴ注射した（グループあたりｎ＝５−７）。腫瘍の成長は、週に２回のノギス測定によって追跡された。
【０１１５】
【図１４】図１４は、発現カセットとｍＩＬ−２１またはｈＩＬ−２１を発現するＮ１Ｌシャトルベクターおよび相同組換えを示している。Ｃｒｅリコンビナーゼによって切除されたＲＦＰを含む修飾ＶＶ  ＴＫ−ＳＴＣを使用して、Ｎ１Ｌ領域にサイトカイン導入遺伝子を発現するウイルスを作成した。Ｎ１Ｌシャトルベクター内におけるｍＩＬ−２１またはｈＩＬ−２１およびＲＦＰの発現は、Ｈ５プロモーターによって駆動された。ＲＦＰとそのプロモーターＨ５はＦＲＴに隣接していたため、ＲＦＰとそのプロモーターＨ５は、最終修飾ウイルスのＦＲＴに作用するフリッパーゼによって切除され、修飾されたマーカーフリーウイルスを作成できる。
【０１１６】
【図１５】図１５は、ＶＴＫ−ＳＴＣ  ｈＩＬ−２１ウイルスにおけるｈＩＬ−２１発現の確認を示している。ＣＶ−１細胞におけるｈＩＬ−２１の発現は、野生型ＶＶ（ＶＶ  ＷＴ）、ＴＫ−ＳＴＣ  ＶＶ（ＣＴＲＬ）、ＶＶＬ１２  Ｎ１Ｌ  ｈＩＬ−２１（ｈＨＩＬ２１）、およびＴＫ  ＳＴＣｈＩＬ−２１の感染から３日後にＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１１７】
【図１６】図１６は、ＴＫ−ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１ウイルスにおけるｍＩＬ−２１発現の確認を示している。示された感染後時間でのＤＴ６６０６細胞におけるｍＩＬ−２１の発現をＥＬＩＳＡによって測定した。使用したすべてのウイルスはＴＫおよびＮ１Ｌ遺伝子が欠失している。ｍＩＬ２１はウイルス感染後の細胞で発現する。ｄ＝削除。
【０１１８】
【図１７】図１７は、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスの皮下に確立されたＤＴ６６０６腫瘍内のＶＶの存在を示している。触知可能になったら、マウスを経口胃管栄養法によりＣＡＬ１０１（１０ｍｇ／Ｋｇ）で治療し、３時間後、Ｂ５Ｒの修飾第２コピーを含まないＶＶＬΔＴＫΔＮ１ＬまたはＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌの１ｘ１０８  ＰＦＵ／注射を使用した静脈内注射を行った。最後の治療から１、３、５日後に投与し、腫瘍を切除し、ｑＰＣＲを使用してウイルス負荷を分析した（ｎ＝３／グループ）。スチューデントアンペアードＴ検定を使用して、２つのグループのウイルス量を比較した（＊  ｐ＞０．０５）。
【０１１９】
【図１８】図１８は、免疫応答性シリアハムスターに腹腔内に確立されたＳＨＰＣ６腫瘍を示している。ハムスターは、腫瘍移植後４、６、および８日目に、１ｘ１０７  ＰＦＵ／注射のＶＶＬΔＴＫΔＮ１ＬまたはＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌで治療された。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘ）検定を使用したカプランマイヤー生存分析を使用して生存を評価した（ｎ＝１０／グループ）。
【０１２０】
【図１９】図１９は、免疫応答性のシリアンハムスターに腹腔内に確立されたＳＨＰＣ６腫瘍を示している。ハムスターは、腫瘍移植後４、６、および８日目に、１ｘ１０７  ＰＦＵ／注射ＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１ＬおよびＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣ−ΔＮ１Ｌ−ｈＩＬ２１で治療された。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘ）検定を使用したカプランマイヤー生存分析を使用して生存を評価した（ｎ＝１０／グループ）。
【０１２１】
【図２０】図２０は、ＣａＩｌ０１（マクロファージの一過性阻害剤）とＶＶの組み合わせによる癌の治療を示している。ＣａＩ１０１は、ワクシニアウイルス、ＰＢＳ、ＴＫ  ＳＴＣコントロールウイルス（ＳＴＣ  Ｃｔｒｌ）およびＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１（ＳＴＣ  ＶＶＩ２１）の静脈内注射の３時間前に強制経口投与された。腫瘍の大きさは週に２回測定された。
【０１２２】
【図２１】図２１は、ＣａＩｌ０１、抗ＰＤ１抗体およびＶＶの組み合わせによる癌の治療を示している。ＣａＩ１０１は、ＰＢＳ、ＴＫ  ＳＴＣコントロールウイルス（ＳＴＣ  Ｃｔｒｌ）およびＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１（ＳＴＣ  ＶＶＩ２１）の静脈内注射の３時間前に強制経口投与された。腫瘍の大きさは週に２回測定された。ＶＶＬ−ＤＤはＶＶＤＴＫ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれ、ＶＶＬ−ＤＤＳＴＣはＶＶＤＴＫ−ＳＴＣ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれる。
【０１２３】
【図２２】図２２は、ＴＫ−ＳＴＣ  ｍＩＬ−１２ウイルスにおけるｍＩＬ−１２発現の確認を示している。Ｓｕｉｔ−２細胞におけるｍＩＬ−１２の発現は、ＴＫ−ＳＴＣワクシニアウイルス（ｄＴＫ−ＳＴＣ−ｄＮ１Ｌ）、ＴＫ−ＳＴＣ  ｍＩＬ−１２（ｄＴＫ−ＳＴＣ−ｄＮ１Ｌ−ｍＩＬ−１２）の感染から３日後にＥＬＩＳＡによって測定された。ＶＶＬ−ＤＤはＶＶＤＴＫ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれ、ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣはＶＶＤＴＫ−ＳＴＣ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれる。
【０１２４】
【図２３】図２３は、ＴＫ−ＳＴＣ  ｈＩＬ−１２ウイルスにおけるｈＩＬ−１２発現の確認を示している。ＣＦ  Ｐａｃ１細胞におけるｍＩＬ−１２の発現は、ＴＫ−ＳＴＣワクシニアウイルス（ｄＴＫ−ＳＴＣ−ｄＮ１Ｌ）、ＴＫ−ＳＴＣ  ｈＩＬ−１２（ｄＴＫ−ＳＴＣ−ｄＮ１Ｌ−ｈＩＬ−１２）の感染から３日後にＥＬＩＳＡによって測定された。ＶＶＬ−ＤＤはＶＶＤＴＫ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれ、ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣはＶＶＤＴＫ−ＳＴＣ−ＤＮ１Ｌとも呼ばれる。
【０１２５】
【図２４】図２４は、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスの皮下に確立されたＬＬＣ肺がん腫瘍を示している。触知可能になったら、マウスを１、３、５、７、９、１１日目に腫瘍内ＰＢＳで、または１、４、７日目に２００μg／注射で腹腔内投与したαＰＤ−１抗体で、または１ｘ１０８ＰＦＵ／注射の腫瘍内注射の、１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２（７、９、１１日目のＰＢＳの腹腔内注射が続く）、または１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２と続く７、９、１１日目のαＰＤ−１抗体の腹腔内注射で治療した。腫瘍の成長をモニターし、各グループの最初の動物が死亡するまで示した。ボンフェローニ事後検定を使用した双方向ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での有意性を比較した。
【０１２６】
【図２５】図２５は、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスの皮下に確立されたＬＬＣ肺がん腫瘍を示している。触知可能になったら、マウスを１、３、５、７、９、１１日目に腫瘍内ＰＢＳで、または１、４、７日目に２００μg／注射で腹腔内投与したαＰＤ−１抗体で、または１ｘ１０８ＰＦＵ／注射の腫瘍内注射の、１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２（７、９、１１日目のＰＢＳの腹腔内注射が続く）、または１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２と続く７、９、１１日目のαＰＤ−１抗体の腹腔内注射で治療した。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘ）検定を使用したカプランマイヤー生存分析を使用して生存を評価した（ｎ＝１０／グループ）。
【０１２７】
【図２６】図２６は、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスの皮下に確立されたＬＬＣ肺がん腫瘍を示している。触知可能になったら、マウスを１、３、５、７、９、１１日目に腫瘍内ＰＢＳで、または１、４、７日目に２００μg／注射で腹腔内投与したαＰＤ−１抗体で、または１ｘ１０８ＰＦＵ／注射の腫瘍内注射の、１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２（７、９、１１日目のＰＢＳの腹腔内注射が続く）、１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２と続く７、９、１１日目のαＰＤ−１抗体、または１、３、５日目のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２と続く７、９、１１日目のＶＶＬΔＴＫΔＮ１Ｌ−ｓＰＤ1（可溶性ＰＤ１を発現）の腹腔内注射で治療した。腫瘍の成長をモニターし、各グループの最初の動物が死亡するまで示した。
【０１２８】
【図２７】図２７は、免疫応答性Ｃ５７／ＢＩ６マウスの皮下に確立されたＣＭＴ６４肺がん腫瘍を示している。触知可能になったら、マウスを１、３、５、７、９、１１日目に腫瘍内ＰＢＳで、または１、３、５日目に１ｘ１０８ＰＦＵ／注射のＶＶＬΔＴＫ−ＳＴＣΔＮ１Ｌ−ｍＩＬ１２と続く７、９、１１日目のＶＶＬΔＴＫΔＮ１Ｌ−ｓＰＤ１、またはその逆で治療した。腫瘍の成長をモニターし、各グループの最初の動物が死亡するまで示した。
【０１２９】
【図２８】図２８は、核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列を含む、図１からの構築物Ｂ５Ｒ−Ｓ−ＳＴＣの核酸配列を示す。構築物Ｂ５Ｒ−Ｓ−ＳＴＣは、示されているようにドメインＳＰ−ＳＣＲ１−ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴ−Ｈ５−ＲＦＰを含む（ａ）シグナルペプチドドメインＳＰはアミノ酸残基１?１９からなる。（ｂ）ドメインＳＣＲ１はアミノ酸残基２０−７２からなる。（ｃ）ドメインＳＴＡＬＫはアミノ酸残基２３７−２７５からなる。（ｄ）膜貫通ドメインＴＭはアミノ酸残基２７６−３０３からなる。（ｅ）Ｃ末端ドメインＣＴはアミノ酸残基３０４−３１７からなる。構築物Ｂ５Ｒ−Ｓ−ＳＴＣのアミノ酸残基の番号付けは、未修飾のＢ５Ｒ遺伝子によってコードされるネイティブＢ５Ｒタンパク質のアミノ酸配列に関して与えられる。（ｆ）Ｈ５プロモーターは示されている核酸配列を有する。（ｇ）存在する場合、構築物によって発現される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）は、示される核酸配列によってコードされるアミノ酸残基１?２２５からなる。ドメインＨ５−ＲＦＰは、シングルＨ５プロモーターにより置換されることができる。（ｈ）ＳＰ（ａａ  １−１９）−ＳＣＲ１（ａａ  ２０−７２）−ＳＴＡＬＫ（ａａ  ２３７−２７５）−ＴＭ（ａａ  ２７６−３０３）−ＣＴ（ａａ  ３０４−３１７）。
【０１３０】
【図２９】図２９は、核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列を含む、図１からの構築物Ｂ５Ｒ−ＳＴＣの核酸配列を示す。構築物Ｂ５Ｒ−ＳＴＣは、示されるドメイン（Ｈ５−ＲＦＰ−Ｈ５）−ＳＰ−ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴを含む。オプションのドメインＨ５−ＲＦＰ−Ｈ５は、存在する場合には示されるように核酸配列によってコードされるアミノ酸残基１−２２５からなる構築物により発現される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする核酸配列（ｂ）の端のＨ５プロモーター（ａ）および（ｃ）の核酸配列の２つのコピーからなる。ドメインＨ５−ＲＦＰ−Ｈ５は、シングルＨ５プロモーターで置き換えることができる。（ｄ）シグナルペプチドドメインＳＰは、アミノ酸残基１−１９からなる。（ｅ）ドメインＳＴＡＬＫはアミノ酸残基２３７−２７５からなる。（ｆ）膜貫通ドメインＴＭはアミノ酸残基２７６−３０３からなる。（ｇ）Ｃ末端ドメインＣＴはアミノ酸残基３０４−３１７からなる。構築物Ｂ５Ｒ−ＳＴＣのアミノ酸残基の番号付けは、未修飾のＢ５Ｒ遺伝子によってコードされるネイティブＢ５Ｒタンパク質のアミノ酸配列に関して与えられる。
【０１３１】
【図３０】図３０は、核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列を含む、図２および３からの構築物ＴＫ−ＳＴＣの核酸配列を示す。構築物は、ドメイン（Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＲＦＰ−Ｌｏｘ−Ｈ５）−ＳＰ−ＳＴＡＬＫ−ＴＭ−ＣＴを含む。ドメイン（Ｌｏｘｐ−Ｈ５−ＲＦＰ−Ｌｏｘ−Ｈ５）は、２つのＬｏｘｐ要素（ａ）と（ｄ）、Ｈ５プロモーター（ｂ）および（ｅ）、および存在する場合、アミノ酸残基１?２２５からなる構築物によって発現される赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（ｃ）をコードするオプションの核酸配列からなる。ＬｏｘｐエレメントとＨ５プロモーターは、示された核酸配列を有する。（ｆ）シグナルペプチドドメインＳＰは、アミノ酸残基１−１９からなる。（ｇ）ドメインＳＴＡＬＫはアミノ酸残基２３７−２７５からなる。（ｈ）膜貫通ドメインＴＭはアミノ酸残基２７６−３０３からなる。（ｉ）Ｃ末端ドメインＣＴはアミノ酸残基３０４−３１７からなる。構築物ＴＫ−ＳＴＣのアミノ酸残基の番号付けは、未修飾Ｂ５Ｒ遺伝子によってコードされるネイティブＢ５Ｒタンパク質のアミノ酸配列に関して与えられる。
【０１３２】
【図３１】図３１は、（ａ）構築物ＳＴＣの核酸配列、および（ｂ）コードされた対応するアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
材料および方法：
細胞株：使用したすべての腫瘍細胞株は、ＡＴＣＣまたはＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ細胞株サービスユニットから、または協力者から提供されたものとして、私たちの研究室に保管された。すべてのヒト癌細胞株は、ＳＴＲアッセイによって遺伝子型が決定された。この研究で使用されたマウス腫瘍細胞株は次のとおりである：結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６はＢＡＬＢ／ｃ株に由来した。ＤＴ６６０６（膵臓癌）は、膵臓を条件とするＫ−Ｒａｓおよびｐ５３遺伝子に変異があるＣ５７ＢＬ／６系統のトランスジェニックマウスに由来する。これは、Ｄａｖｉｄ  Ｔｕｖｅｓｏｎ教授（ＣＲＵＫ、ケンブリッジ研究所、ケンブリッジ、英国）からの親切な贈り物であった。ＣＶ１は、米国ＶＡのＡＴＣＣから入手したアフリカングリーンモンキーの「正常な」腎臓細胞株であり、ウイルスの大量生産を促進するためのストック細胞株として、またすべてのウイルスのタイトレートアッセイで使用された。
【０１３４】
ウイルス：ＶＶＬ１５は、ｌａｃＺレポーターおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子をワクシニアウイルスのリスターワクチン株（ＶＶリスター）のＴＫ領域に、それぞれ合成初期／後期およびｐ７．５プロモーターの制御下で、先に記載されたインビトロ細胞内組換え技術を使用して挿入することによって構築された(Hung,CF et al.、Gene Ther 14、20-29(2007))。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＲＦＰは、ＴＫ遺伝子の代わりにＲＦＰを使用して先に構築された（データは公開されていない）。
【０１３５】
ＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ−ＳＴＣシャトルベクターの構築：
ＲＦＰは、Ｈ５−ＲＦＰフォワードプライマー（５−ＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＡ−３’）（ＢｇＬＩＩに下線が引かれている）およびＨ５  ＲＦＰリバースプライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’）（Ｍ１ＵＩ、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに下線が引かれている）で、ＤｓＲｅｄプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＰＣＲにより増幅された。ＳＰ＋ＳＴＣ＋Ｂ５Ｒライトアームは、レフトアームフォワードプライマー（５’−ＡＡＧＣＴＴ  ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＣ−３’）（ＨｉｎｄＩＩＩサイトに下線が引かれている）とライトアームリバースプライマー（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＡＴＡ−３’）（ＳｍａＩおよびＢｇＬＩＩサイトには下線が引かれている）で、ＷＲ−ＳＴＣゲノム（スペイン、Ｒａｆｅａｌ  Ｂｌａｓｃｏ）からのＰＣＲにより増幅された。Ｂ５Ｒレフトアームは、フォワードプライマー（５’−ＴＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＴＡＴＧＡＣＣＧ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＡＴＡ−３’）を使用してＶＶリスターゲノムから増幅された（ＳｍａＩおよびＢｇＬＩＩサイトには下線が引かれている）。すべてのＰＣＲ産物は、製造元の指示に従ってｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされた。正しいシーケンスは、シーケンシングによって検証された。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒレフトアームは、ＢｇＬＩＩおよびＳｍａＩ制限酵素でリニアライズされた（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）。Ｈ５−ＲＦＰ−Ｈ５は、ＢｇＬＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用してｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｈ５−ＲＦＰＨ５からリリースされた。Ｂ５Ｒライトアームは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ制限酵素を使用してｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒライトアームからリリースされた。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−レフトアームは、ＢｇＬＩＩおよびＳｍａＩ制限酵素でリニアライズされた。Ｈ５−ＲＦＰ−Ｈ５（ＢｇＬＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）、ＳＴＣ＋Ｂ５Ｒライトアーム（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＳｍａＩ）をリニアライズされたｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ  Ｂ５Ｒレフトアーム（ＢｇＬＩＩ＋ＳｍａＩ）にライゲーションした。得られたシャトルベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒレフトアーム＋Ｈ５−ＲＦＰ−Ｈ５＋ＳＴＣ＋Ｂ５Ｒライトアームをシーケンシングによって検証した。以下、シャトルベクターをＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  ＳＴＣシャトルベクターと表記する。ＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  ＳＴＣシャトルベクターの発現カセットを図１に示す。
【０１３６】
ＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣシャトルベクターの構築：
Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ（シグナルペプチド／ＳＰ＋ＳＣＲ１＋ｓｔａｌｋ＋膜貫通ドメイン＋細胞質尾部／ＳＴＣ：ＳＰ−ＳＣＲ１−ＳＴＣ）。レフトアームおよびＳＰ＋ＳＣＲ１は、プライマーＢ５Ｒレフトアームフォワード（５’−ＴＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＴＡＴＧＡＣＣＧ−３’）およびＢ５Ｒ  ＳＣＲ１リバース（５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＣ−３’）を使用してＶＶリスターゲノムからＰＣＲによって増幅された（ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位には下線が引かれている）。ＳＴＣは、Ｂ５Ｒストークプライマーフォワード（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡ−３’）（ＨｉｎｄＩＩＩサイトに下線が引かれている）および細胞質尾部リバースプライマー（５’−ＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧ−３’）（ＢｇＬＩＩサイトに下線が引かれている）を使用したＰＣＲによって増幅された。Ｈ５−ＲＦＰは、フォワードプライマー（５’−ＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣ−３’）（ＢｇＬＩＩサイトに下線が引かれている）およびリバースプライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’）（Ｍ１ＵＩサイトに下線が引かれている）を使用したＰＣＲによって増幅された。Ｂ５Ｒライトアームは、Ｂ５Ｒライトアームフォワードプライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴ−３’）（Ｍ１ＵＩサイトに下線が引かれている）およびＢ５Ｒライトアームリバースプライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴ−３’）（ＸｈｏＩサイトに下線が引かれている）を使用したＰＣＲによって増幅された。）。すべてのＰＣＲ産物は、製造元の指示に従ってｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされた。正しいシーケンスは、シーケンシングによって検証された。ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒレフトアーム＋ＳＰ＋ＳＣＲ１はＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でリニアライズされた。ＳＴＣは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇＬＩＩ制限酵素を使用してｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−ＳＴＣからリリースされた。Ｈ５−ＲＦＰは、ＢｇＬＩＩおよびＭ１ＵＩ制限酵素を使用してｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｈ５−ＲＦＰからリリースされた。Ｂ５Ｒライトアームは、Ｍ１ＵＩとＸｈｏＩ制限酵素を使用してｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒライトアームからリリースされた。消化されたＳＴＣ（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢｇＬＩＩ）、Ｈ５−ＲＦＰ（ＢｇＬＩＩ＋Ｍ１ＵＩ）およびＢ５Ｒライトアーム（Ｍ１ＵＩ＋ＸｈｏＩ）をリニアライズされたｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒレフトアーム＋ＳＰ＋ＳＣＲ１（ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｈｏＩ）にライゲーションした。得られたシャトルベクターｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ−Ｂ５Ｒレフトアーム＋ＳＰ＋ＳＣＲ１＋ＳＴＣ＋Ｈ５−ＲＦＰ＋Ｂ５Ｒライトアームをシーケンシングによって検証した。以下、シャトルベクターをＶＶＬ１５  Ｂ５ＲＳ−ＳＴＣシャトルベクターと呼ぶ。ＶＶＬ１５  Ｂ５ＲＳ−ＳＴ���シャトルベクターの発現カセットを図１に示す。
【０１３７】
ＴＫ−ＳＴＣシャトルベクターの構築：
ＬｏｘＰ部位に隣接するＲＦＰを含むＴＫ指向シャトルベクター（ＴＫ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）は以前に構築された(Yuan、M。et al.、Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))。Ｂ５Ｒ遺伝子のシグナルペプチド（ＳＰ）は、フォワードプライマー（５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＣＧ−３’）（ＰａｃＩに下線が引かれている）およびリバースプライマー（５’−ＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣ−３’）（ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに下線が引かれている）を使用したＰＣＲによって増幅された。Ｂ５Ｒ  ＳＴＣフラグメント（ＳＴＡＬＫ＋ＴＭ＋ＴＣ）は、フォワードプライマー（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＡＡＣＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡ−３’）（ＨｉｎｄＩＩＩには下線が引かれている）およびリバースプライマー（５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＣＴ−３’）（ＮｈｅＩには下線が引かれている）を使用したＰＣＲによって増幅された。ＳＰフラグメントは、ｐＥＧＭＴｅａｓｙ−ＳＰとして指定されたｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにクローン化された。ＳＴＣフラグメントをｐＧＥＭＴｅａｓｙ−ＳＰのＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩサイトにクローニングして、ｐＥＧＭＴｅａｓｙ−ＳＰ＋ＳＴＣを取得した。ＳＰ＋ＳＴＣは、ＰａｃＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を使用してｐＥＧＭＴｅａｓｙ−ＳＰ＋ＳＴＣからリリースされ、ＬｏｘＰサイトに隣接するＲＦＰを含むＴＫ指向シャトルベクターのＰａｃＩおよびＮｈｅＩサイトにクローン化された。結果のシャトルベクターは、ＴＫ  ＳＴＣシャトルベクターと呼ばれる。ＴＫ  ＳＴＣシャトルベクターの発現カセットを図３に示す。
【０１３８】
サイトカインＮ１Ｌ−ｍＩＬ−１２およびＮ１Ｌ−ｈＩＬ１２シャトルベクターの構築：
相同組換えのためにＦＲＴ部位に隣接するＲＦＰを含むＮ１Ｌ指向シャトルベクターは以前に生成され(Yuan et al.、Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))、このシャトルベクターは以後Ｎ１Ｌシャトルベクターと呼ばれる。ｍＩＬ−１２およびｈＩＬ−１２をＮ１ＬシャトルベクターのＰｍｅＩおよびＮｈｅＩサイトにクローニングして、Ｎ１Ｌ−ｍＩＬ−１２およびＮ１Ｌ−ｈＩＬ１２シャトルベクターを取得した（図２２）。
【０１３９】
Ｎ１Ｌ−ｍＩＬ−２１およびＮ１Ｌ−ｈＩＬ２１シャトルベクターの構築：
ｍＩＬ−２１およびｈＩＬ−２１をＮ１ＬシャトルベクターのＳａＩＩおよびＢｇＩＩＩサイトにクローニングして、Ｎ１Ｌ−ｍＩＬ−２１およびＮ１Ｌ−ｈＩＬ２１シャトルベクターを取得した（図１４）。
【０１４０】
前述のＣａｓ９を介した相同組換え：
簡単に説明すると、３×１０５  ＣＶ−１細胞をトランスフェクションの前日に６ウェルプレートの１つのウェルに播種した。ｇＲＮＡベクター（Ｎ１Ｌ領域を標的とするためのＮＩＬｇＲＮＡ、ＴＫ領域を標的とするためのＴＫ  ｇＲＮＡ）を、Ｃａｓ９とともに６ウェルプレートのＣＶ−１細胞にコトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされたウェルを０．０１ＰＦＵ／細胞のバックボーンウイルスに感染させた。相同組換えのためのシャトルベクターは、ウイルス感染の２時間後に感染したウェルにトランスフェクトされた。２４時間後に細胞を回収し、プラーク精製のために−８０℃で凍結した。
【０１４１】
目的のウイルスの精製：
Ｃａｓ９を介した相同組換えから収集した細胞溶解物を解凍し、この溶解物の１  μｌを使用して、８０?９０％のコンフルエンスまで増殖したＣＶ１細胞を含む６ウェルプレートの６ウェルすべてに感染させた。この低いウイルス量は、十分に分離されたＰＦＵの出現を確実にする。さらに４８時間後、各ウェルを緑色の光の下で注意深く精査し、赤色に蛍光を発するウイルスＰＦＵを探した。陽性コロニーが特定されると、それらの位置がプレートの下面に細い先端の油性ペンでマークされた。ウェルから培地を吸引した後、コロニーを２０μｌチップで注意深く採取された。次に、チップを２５０  μｌの５％ＦＣＳ  ＣＭを含むクライオチューブに沈めた。さらに凍結融解サイクルを行った後、５?２０  μｌのこのウイルス溶液を、以前と同様にＣＶ１細胞を含む新しい６−ＷＰの各ウェルに添加した。このプロセスは、すべてのＰＦＵが赤く蛍光を発するまで、つまりすべてのウイルスコロニーが組換えウイルスによるものになるまで繰り返された。一般に、組換えウイルスの純粋なバッチを取得するには、６?１０ラウンドのプラーク精製が必要だった。この時点で、ウイルス溶解物をスクレープハーベスティングし、ウイルスＤＮＡをカラムベースのシステム（すなわち、ＱｉａｇｅｎのＢｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を介して抽出した。ウイルスの純度は、抽出されたウイルスＤＮＡからの標的遺伝子のＰＣＲ増幅によって確認された。その存在は、親ウイルスであるＶＶＬによる汚染を示す(Wang et al.、J Clin Invest 119、1604-1615(2009))。
【０１４２】
予備調査により、ＳＴＣを発現する純粋な組換えウイルスの生成の可能性が確認されたら、５０μｌのウイルス溶解物をＣＶ１細胞を含むＴ１７５フラスコに加え、約３０  ｍｌの５％ＦＣＳ  ＣＭ中で８０?９０％のコンフルエンスまで再び増殖させました。細胞と培地は４８時間後にスクレープハーベスティングされ、「一次ウイルス増殖物」として保持された。
【０１４３】
ＴＫ  ＳＴＣ  ＶＡＣＶの検証：
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＶＡＣＶ  ＤＮＡを抽出した。ＴＫ領域へのＳＴＣの挿入を確認するために、ＳＰ−ＳＴＣのＳＰ部分をターゲットとするフォワードプライマーは（５’−ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＣＧ−３’）、ＴＫ遺伝子のライトアーム側をターゲットとするリバースプライマーは（５’−ＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴ−３’）であった。Ａ４６ＲおよびＡ４７Ｌ遺伝子にまたがるコントロールＤＮＡフラグメントは、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＧＡ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧ−３’）を使用したＰＣＲによって増幅された。Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  ＲｅｄｄｙＭｉｘ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘをすべてのＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１４４】
変異体Ｎ１Ｌ  ＶＡＣＶの検証：
ＣＶ−１細胞は精製されたプラークに感染された。感染した細胞は、感染の２日後に採取された。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用して、製造元のプロトコルに従ってＶＡＣＶＤＮＡを抽出した。Ｎ１Ｌ遺伝子の欠失を確認するために、Ｎ１Ｌ遺伝子とＬ０２６遺伝子にまたがるＤＮＡ断片を、フォワードプライマー（５’−ＴＡＴＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧＡＣＣＧＴ−３’）（Ｎ１Ｌ遺伝子内）とリバースプライマー（５’−ＣＣＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＡ−３’）（Ｌ０２６遺伝子内）を使用したＰＣＲによって増幅した。Ａ４６ＲおよびＡ４７Ｌ遺伝子にまたがるコントロールＤＮＡフラグメントは、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＧＡ−３’）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧ−３’）を使用したＰＣＲによって増幅された。Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  ＲｅｄｄｙＭｉｘ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘをすべてのＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１４５】
Ｃｒｅリコンビナーゼを使用したＲＦＰの切除：
ｐＣＡＧ−Ｃｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ製）を６ウェルプレートの１ウェルのＣＶ−１細胞にトランスフェクトした。ｐＣＡＧ−Ｃｒｅによるトランスフェクションの２４時間後、ＣＶ−１細胞を１００?２００ＰＦＵのＣｒｅ−ＲＦＰＶＡＣＶに感染させた。２日後、ＲＦＰ陰性プラークを採取し、６ウェルプレートのＣＶ−１細胞に感染させて、ＲＦＰ陰性プラークを精製した。次に、ＲＦＰ陰性プラークを採取し、２日ごとに蛍光顕微鏡でＲＦＰ陽性プラークが見られなくなるまでＣＶ−１細胞を感染させた。ＣｒｅリコンビナーゼによるウイルスからのＲＦＰの切除は、ＲＦＰ遺伝子のＰＣＲによってテストされた。
【０１４６】
Ｆｌｐリコンビナーゼを使用したＲＦＰの切除：
ｐＣＡＧ−ＦＩｐｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ製）を６ウェルプレートの１ウェルのＣＶ−１細胞にトランスフェクトした。ｐＣＡＧ−ＦＩｐｅによるトランスフェクションの２４時間後、ＣＶ−１細胞を１００?２００ＰＦＵのＦｌｐ−ＲＦＰＶＡＣＶに感染させました。２日後、ＲＦＰ陰性プラークを採取し、６ウェルプレートのＣＶ−１細胞に感染させて、ＲＦＰ陰性プラークを精製した。次に、ＲＦＰ陰性プラークを採取し、２日ごとに蛍光顕微鏡でＲＦＰ陽性プラークが見られなくなるまでＣＶ−１細胞を感染させました。
【０１４７】
ＶＶＬ−ＤＤおよびＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスの生成：
ＲＦＰを使用しないＶＶＬ−ＤＤウイルスの生成については、以前に説明されている(Yuan、M.et al.、Mol Ther-Meth Clin D 2(2015))。ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣは、ＶＶＬ−ＤＤウイルスと同じ方法で作成されたが、ＴＫシャトルの代わりにＴＫ−ＳＴＣシャトルベクター（図３）を使用した(Yuan、M.et al.、Mol Ther-Meth Clin D 2 (2015))。ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスは、Ｎ１Ｌが欠失し、ＴＫ領域にＳＴＣが挿入されたＦＲＰ陰性ウイルスである。
【０１４８】
酵素免疫測定法：
ｍＩＬ−１２、ｈＩＬ−１２、ｍＩＬ−２１、およびｈＩＬ−２１の発現は、製造元の指示に従って酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）によって検出された。
【０１４９】
大量のウイルス産生：
上記の一次ウイルス増殖物を２回急速に凍結融解し、ＣＶ１細胞を含む３６?４０個のＴ１７５フラスコに感染するのに必要な５％ＦＣＳ  ＣＭの必要量中に希釈した（８０?９０％のコンフルエンス）。４８時間後、感染したＣＶ１細胞を掻き取り、２，０００  ｒｐｍ（４℃）の速度で遠心分離を繰り返し、単一のペレットに収集した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、１２ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９）バッファーに再懸濁し、後日精製するために−８０℃で保存した。
【０１５０】
ウイルス精製：
上記の濃縮したウイルス溶解物懸濁液を２回凍結融解し、ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に移し、６０回のストロークでホモジナイズした。次にそれを３０秒間超音波処理した。２，０００  ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、上清（放出されたビリオン粒子を含む）を収集し、１０  ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩバッファーで総量３０ｍｌに希釈した。溶液は４つに分けられた。それぞれを３６ｍｌのベックマン超遠心管内の１７ｍｌの３６％グルコース溶液上に穏やかに層状にし、４℃で８０分間１３，５００ｒｐｍで遠心分離した。得られたペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩで合計１６ｍｌに再懸濁し、再び４つに分割し、別の４つのグルコース勾配に注意深く重ねた。今回は表面近くの２５％ｗ／ｍから各チューブの底から４０％まで段階的に変化した。２回目の超遠心分離を行った。これは、マウスに静脈内投与すると毒性を示す可能性のある粒子状の細胞破片をさらに除去するために必要だった。最終ペレットを１?４ｍｌのウイルス再懸濁バッファー（ＰＢＳ；１０％グリセロール；１３８  ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ  ７．４）に再懸濁した。精製されたウイルスのサンプルは、以下に説明するようにＴＣＩＤ５０アッセイを介してタイトレートされた。
【０１５１】
ウイルス複製
細胞は、増殖速度に応じて、ウェルあたり２から４×１０５細胞で、１０％ＦＣＳを含む培地の６ウェルプレートの３つのウェルに播種し、１６?１８時間後に１  ＰＦＵ／細胞のワクシニアウイルスに感染させた。サンプルは、最大１４４時間まで２４時間間隔で３回づつ収集された。ウイルス複製は、以前に記載されたように(Wang、Y.et al.、J.Clin.Invest.119、1604-1615(2009))、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）によって検出された。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス細胞毒性の評価
細胞は、成長速度に応じて、９６ウェルプレート中で、１×１０３および１×１０４細胞／ウエルで播種し、１６?１８時間後にウイルスを感染させた。ウイルス感染後６日目の細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定し、ＥＣ５０値（腫瘍細胞の５０％を殺すウイルス用量）を前述のように計算した(Wang、Y. et al.、J.Clin.Invest.119、1604-1615(2009))。すべてのアッセイは少なくとも３回実施された。
【０１５３】
異なる株のＶＶを比較するためのｉｎｖｉｖｏ有効性実験：
側腹部腫瘍は１−５ｘ１０６癌細胞の皮下注射により処置群あたり１０匹のマウスで確立され、直径０．４?０．５センチメートルに到達させ、次いでマウスを腫瘍サイズによって再編成し、１，３，５日または１、２、３、４、５日に、３回の５０μｌのＩＴ注射により、１．０×１０７ＰＦＵ（ヌードマウス）または１×１０８ＰＦＵ（免疫応答性マウス）またはＰＢＳを与えた。腫瘍体積を週に２回、評価した（体積＝（長さ×幅２×ＴＴ）／６）。評価は腫瘍体積が１．００  ｃｍ３に達したとき、または３か月間存在していたときにマウスを犠牲にするまで続けられた。４?５週齢の雄マウス系統ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６は、Ｈａｒｌａｎ  ＵＫＬｔｄから入手した。
【０１５４】
膵臓および結腸直腸側腹部腫瘍モデルに対するＶＶＬ組換え体のＩＴ注射の有効性：
２×１０６ＣＴ２６細胞または３×１０６ＤＴ６６０６細胞をＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６雄マウスの剃毛右脇腹の皮下に移植した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達した後、それら３つのグループに無作為に分け、５０  μｌのＰＢＳ中のウイルスの１×１０８  ＰＦＵまたは５０  μｌのＰＢＳビヒクルバッファコントロールを、表３に示した治療スケジュールに従って注射した（スケジュール１および２）。腫瘍体積を週２回のノギス測定によりモニターし、マウスの体重を週１回測定した。
【０１５５】
膵臓腫瘍モデルに対するＶＶＬ組換え体のＩＶ注射の有効性：
３×１０６ＤＴ６６０６を、皮下Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの剃毛右脇腹の皮下に移植した。ＤＴ６６０６細胞（３×１０６細胞／マウス）を８週齢の雄Ｃ５７／ＢＩ６マウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍が触知可能となったとき、マウスは治療群に層別化された。マウスは１，３，５日に、強制経口投与を介して１０ｍｇ／ｋｇのＣＡＬ１０１又はビヒクルバッファを投与され、３時間後に１×１０８ＰＦＵ／注射でウイルス（またはＰＢＳ）注射され、週二回腫瘍増殖が測定された。ウイルスはＰＢＳに再懸濁され、尾静脈から静脈内注射された。αＰＤ−１抗体を最終濃度２００μg／マウスでＰＢＳに再懸濁し、３、６、８日目に注射した。腫瘍体積を週２回のノギス測定でモニターし、マウスの体重を毎週測定した。
【０１５６】
シリアンハムスターの播種性膵臓腫瘍モデルに対する腹腔内（ＩＰ）注射ＶＶＬ組換え体の有効性：
１×１０７  ＳＨＰＣ６細胞を、シリアンハムスターの右下の腹腔内に接種した。４日後、群当たり１０匹のハムスターに５００  μｌのＰＢＳまたは２×１０７ＰＦＵのウイルスの腹腔内注射を、０、２、４日にした。ハムスターの生存をモニターした。
【０１５７】
腫瘍におけるウイルス量を評価するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応：
ウイルスＤＮＡ抽出は、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔを使用して実施した。ウイルスゲノムのコピー数の定量は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓが提供するＴａｑＭａｎRＰＣＲシステムを使用して達成された。ＶＶの定量のために、プライマーとプローブはワクシニアウイルス後期転写因子１（ＶＬＴＦ−１）遺伝子用に設計された。フォワード；５’−ＡＡＣＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡＡＴＣＣ、リバース；５’−ＴＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴ、プローブ；シーケンスＡＴＴＴＴＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＣ。プライマーはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから提供された。標準はＶＶＴＶＶ  ＤＮＡで、サンプルあたり４０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとして使用した。ウイルスゲノムのコピー数は、ロードされた全ＤＮＡによって正規化された。
【０１５８】
統計分析：
特に明記されていない限り、比較統計分析にはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用した。アンペアードスチューデントｔ検定を使用して、二重条件の比較を行いました。複数の条件または時間などの追加の変数について、それぞれ１元配置分散分析または２元配置分散分析が実行された。事後検定（一元配置分散分析の場合はＫｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ、二元配置分散分析の場合はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）で、実験内の特定の条件のペアを比較した。生存データは、グループ間の差異が統計的に有意であるかどうかを示すために、ログランク分析を使用したカプランマイヤープロットとして表された。
【０１５９】
実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＶＬ１５、ＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ  ＶＶのプラークとコメットテールの形成の比較
ＶＶＬ１５ウイルスよりも多くのＥＥＶを生成するウイルスを生成するために、ＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ  ＶＶが作成された。ＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣウイルスのＢ５Ｒ−ＳＴＣまたはＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣのＢ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣは、それぞれＢ５Ｒ遺伝子の全長を置き換える（図１）。６ウェルプレート中のＣＶ−１細胞を、等量のコントロールウイルスＶＶＬ１５、ＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣ、およびＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ  ＶＶに感染させた。感染の３日後、感染細胞を前述のようにクリスタルバイオレットを使用して染色した。  ＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ  ＶＶは、ＶＶＬ１５と比較してより多くのＥＥＶを生成したことを示す、より小さなサイズのプラークとより多くのコメットテールを形成した（図２）。
【０１６０】
実施例２：ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスの生成
修飾されたＶＶＬ１５−Ｂ５Ｒ−ＳＴＣおよびＶＶＬ１５  Ｂ５Ｒ  Ｓ−ＳＴＣ  ＶＶ（図１）は、対照ウイルスＶＶＬ１５よりも小さいサイズのプラークとより多くのコメットテール（図２）を形成した。バックボーンウイルスＶＶＬ１５と比較して通常のプラークサイズとより多くのＥＥＶを生成する修飾されたＶＶを作成するために、図３に示すように、ＶＶＬ  ＴＫ−ＳＴＣワクシニアウイルスが生成された。ＳＴＣはＴＫ遺伝子（Ｓｔａｌｋ、ＴＭおよびＣＴ）を置き換え、このウイルスはＢ５Ｒの完全なコピーを保持する。ＶＶＬ  ＴＫ−ＳＴＣワクシニアウイルスの精製では、プラーク精製の最終ラウンドの目視検査（赤色蛍光灯下）により、感染したＣＶ１細胞のウェル内のすべてのプラークがＳＴＣ−ＴＫシャトルベクターからのＲＦＰを発現していることが確認された（図４）。ウイルスの検証には、ＣＶ１ライセートから抽出したウイルスＤＮＡからＰＣＲによってＳＴＣ遺伝子とＴＫ下流遺伝子の一部を増幅するための特定のプライマーペアを使用した。ＰＣＲ産物はＶＶＬ１５  ＲＦＰ  ＤＮＡには存在しなかったが、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣ  ＤＮＡには存在した。これは、ＴＫ遺伝子がＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣでは欠失して、ＳＴＣがＴＫ領域にあることを示している。Ｂ５Ｒ遺伝子のＳＰに対して設計されたフォワードプライマーとＢ５Ｒ細胞質尾部を認識するリバースプライマーをＰＣＲで使用して、Ｂ５Ｒ遺伝子全体とＳＴＣを増幅した。予想どおり全長Ｂ５ＲはＶＶＬ１５  ＲＦＰとＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣに存在したが、ＳＴＣはＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣにのみ存在していた（図４）。
【０１６１】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＶＬ１５  ＴＫ−ＲＦＰとＶＶＬ  ＴＫ−ＳＴＣ  ＶＶのプラークとコメットテールの形成の比較
ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子のコピーをそのまま保持し、ＴＫ遺伝子領域に追加のＳＴＣ挿入部を有し、腫瘍選択性のためにウイルスＴＫを不活性化する。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスのプラークとコメットテールの形成を評価するために、６ウェルプレートのＣＶ−１細胞に等量のコントロールウイルスＶＶＬ１５  ＴＫ−ＲＦＰとＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣを感染させた。感染の３日後、感染した細胞を前述のようにクリスタルバイオレットを使用して染色し、プレートを写真スキャンした（図５および６）。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣは、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＲＦＰと比較して、通常のサイズのプラークを生成し（図５）、より多くのコメットテールを生成した（図６）。
【０１６２】
実施例４：組換えＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣにおけるＥＥＶ産生の評価
ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスとそのコントロールウイルスで生成されたＥＥＶを定量化するために、０．０１  ｐｆｕ／細胞のワクシニアウイルスを使用して６ウェルプレートのＣＶ−１細胞に感染させた。細胞培養培地と感染細胞を感染の４８時間後と７２時間後に別々のチューブに集め、ウイルスをそれぞれタイトレートした。生成されたＥＥＶの量は、細胞培養培地中のＶＶの総量を感染細胞によって生成されたＶＶの総量と比較することによって計算された。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣは、親ウイルスＶＶＬ１５  ＲＦＰと比較して、感染後４８時間で１０倍のＥＥＶを生成し、７２時間の時点で３０倍のＥＥＶを生成する（図７）。
【０１６３】
実施例５：組換えＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣにおけるＥＥＶ産生の評価
組換えＶＶＬ−ＤＤおよびＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスが作成された。ＶＶＬ−ＤＤは、ＴＫおよびＮ１Ｌ領域が欠失したウイルスである（ＶＶΔＴＫ−ΔＮＩＬとも呼ばれる）。ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣは、ＴＫおよびＮ１Ｌ領域が欠失し、ＳＴＣがＴＫ領域に挿入されたウイルスである（ＶＶΔＴＫ−ＳＴＣ−ΔＮ１  Ｌとも呼ばれる）。ＶＶＬ−ＤＤ  ＳＴＣウイルスとそのコントロールウイルス（ＶＶＬ−ＤＤ）で生成されたＥＥＶを定量化するために、０．０１  ｐｆｕ／細胞のワクシニアウイルスを６ウェルプレートの細胞に使用した。細胞培養培地と感染細胞を感染の４８時間後と７２時間後に別々のチューブに集め、ウイルスをそれぞれタイトレートした。生成されたＥＥＶの量は、細胞培養培地中のＶＶの総量を感染細胞によって生成されたＶＶの総量と比較することによって計算された。
【０１６４】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＶの複製および細胞毒性の比較
ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣとその親ＶＶＬ１５  ＲＦＰウイルスの複製を比較した（図１０）。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣは、ＣＴ２６（マウス結腸癌細胞株）およびＤＴ６６０６（マウス膵臓癌細胞株）癌細胞株において、ＶＶＬ１５  ＲＦＰよりも効果的に複製する。
ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣおよびＶＶＬ１５  ＲＦＰの細胞毒性は、ＣＶ１、ＣＴ２６、およびＤＴ６６０６細胞株で測定された（図１０）。ＤＴ６６０６細胞の２つのウイルス間で細胞毒性に有意差はなかった。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣは、ＣＶ−１およびＣＴ２６細胞の死滅において、親のＶＶＬ１５  ＲＦＰよりも有意に強力だった（図１１）。
【０１６５】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＶＶの抗腫瘍効力の比較
ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスの抗腫瘍効力をテストするために、ＣＴ２６結腸癌ＣＴ２６（図１２）およびＤＴ６６０６膵臓癌モデル（図１３）の皮下モデルを使用した。ＶＶＬ１５  ＲＦＰおよびＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスを腫瘍内に注射した（図１２および１３）。ＣＴ２６腫瘍モデルの場合、１日目、３日目、および５日目に２ｘ１０７  ＰＦＵ／注射のウイルスを３回投与した。ＤＴ６６０６腫瘍モデルの場合、指定された時点で２ｘ１０８  ＰＦＵ／注射のウイルスを５回投与した（図１３）。ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣは、コントロールウイルスＶＶＬ１５  ＲＦＰと比較して改善された抗腫瘍効果を一貫して示した。
【０１６６】
実施例８：ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスを発現するヒトＩＬ−２１（ｈＩＬ−２１）およびマウスＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）の作成
抗腫瘍免疫を改善するために、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスは、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、ＮＫ細胞およびＴ細胞刺激性サイトカインで武装した（ａｒｍｅｄ）。ヒトＩＬ−２１（ｈＩＬ−２１）およびマウスＩＬ−２１（ｍＩＬ−２１）を発現するウイルスは、図１４に示すように、ＲＦＰが削除されたＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスを使用して作成され、ｈＩＬ−２１およびｍＩＬ−２１がＮ１Ｌ領域にクローン化された（図１４）。感染細胞におけるウイルスによるｈＩＬ−２１およびｍＩＬ−２１の発現が確認された（図１５および１６）。
【０１６７】
実施例９：ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１ウイルスの静脈内注射は、ｍＩＬ−２１を含まない対照ウイルスと比較して優れた抗腫瘍能力を示す
静脈内注射後のＶＶの持続性を延長するために、マクロファージ機能の一過性阻害剤であるＣａｌｌ０１を、ＶＶを静脈内注射する３時間前に送達した（ｉｖ）。ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１の抗腫瘍効力は、皮下ＤＴ６６０６腫瘍モデルでテストされた。ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１のＩＶ送達は、非武装の（ｕｎａｒｍｅｄ）ＴＫ  ＳＴＣコントロールウイルス（ｍＩＬ−２１発現なし）と比較して改善された抗腫瘍効力を示す（図１６）。注射後の腫瘍におけるワクシニアウイルスＤＮＡの蓄積は、１、３、および５日目に与えられた３回の注射の最後の５日後にｑＰＣＲを使用して決定された（１ｘ１０８  ＰＦＵ／注射）（図１７）。ＳＴＣウイルスは、コントロールウイルスと比較してより高いレベルに蓄積した。ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１の抗腫瘍効力は、シリアのハムスターの腹膜播種ＳＨＰＣ６膵臓癌モデルでテストされた。ＴＫ  ＳＴＣ  Ｎ１  Ｌ欠失ウイルスの腹腔内送達は、ＴＫドメインにＳＴＣが存在しなかった対照ウイルスと比較して改善された有効性を示している（図１８）。さらに、ＴＫ−ＳＴＣ−Ｎ１  ＬをＩＬ−２１で武装させると、シリアンハムスターの腹膜播種性膵臓癌を治療することができる（図１９）。
【０１６８】
実施例１０：チェックポイント阻害剤抗ＰＤ−１抗体は、ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１ウイルスの抗腫瘍効果を改善する
抗ＰＤ−１抗体は、さまざまな種類の腫瘍における抗腫瘍免疫を強化するために広く使用されており、臨床的証拠は、一部の癌患者の生存率の大幅な改善を示している。抗ＰＤ１抗体がＴＫＳＴＣ  ｍＩＬ−２１の抗腫瘍効力を増強できるかどうかを調べるために、抗ＰＤ１抗体をＣａｌｌ０１およびＶＶのｉｖ注射と組み合わせて使用した。抗ＰＤ１抗体は、ＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１ウイルスの抗腫瘍力を劇的に改善する（図２１）。Ｃａｌｌ０１と抗ＰＤ１抗体の組み合わせを使用して腫瘍を治療した場合、治療計画にＴＫ  ＳＴＣ  ｍＩＬ−２１（ＳＴＣ  ＶＶＩ２１）を含めると、Ｃａｌ１０１と抗ＰＤ１抗体の組み合わせの抗腫瘍効果が大幅に向上した（図２１）。
【０１６９】
実施例１１：ＴＫ  ＳＴＣウイルスを発現するヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）およびマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）の作成
抗腫瘍免疫を改善するために、ＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスをインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）で武装した。これは適応性および自然免疫系のほとんどの細胞を刺激する。ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）およびマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）発現ウイルスは、図１４に示すＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣ発現ＩＬ−２１を作成するのと同じ戦略で、ＲＦＰ欠失を伴うＶＶＬ１５  ＴＫ−ＳＴＣウイルスを使用して作成された。ｈＩＬ−１２およびｍＩＬ−１２はＮ１Ｌ領域にクローン化された（図１４）。ウイルスによる感染細胞でのｍＩＬ−１２およびｈＩＬ−１２の発現が確認された（図２２および２３）。
【０１７０】
実施例１２：ＴＫ  ＳＴＣウイルスを発現するＩＬ−１２は、腫瘍内投与後の肺癌モデルにおいて有効であり、チェックポイント阻害剤抗ＰＤ１抗体の抗腫瘍効果を増強した
皮下肺癌モデルは、ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）を使用して免疫応答性マウスで確立された。マウスは、腫瘍内ＳＴＣ−ｍＩＬ１２ウイルス（１×１０８  ＰＦＵ／注射で１、３，５日に三回処理した）。必要に応じて、α−ＰＤ１抗体を７、９、１１日目に投与した（２０  μｇ／マウス）。ＳＴＣ−ｍＩＬ１２ウイルスは、腫瘍増殖率の低下において、ＰＢＳまたはα−ＰＤ１抗体療法単独よりも効果的だった。ウイルス治療へのα−ＰＤ１抗体の追加は、長期的な有効性をさらに高めた（図２４および２５）。
【０１７１】
実施例１３
第１にＩＬ１２を発現し、第２に可溶性ＰＤ１を発現するウイルスの連続使用は、ＩＬ１２を発現するウイルス、続いてα−ＰＤ１抗体を使用するのと同じくらい効果的である。可溶性ＰＤ１を発現するウイルスの使用は、α−ＰＤ１抗体の使用と同じくらい効果的だった（図２６）。
【０１７２】
実施例１４
異なる免疫調節分子を特定の順序で発現するウイルスの投与は重要である（図２７）、すなわち、ｍＩＬ−１２を発現するウイルスは、可溶性ＰＤ１（ｓＰＤ１）を発現するウイルスの前に送達されなければならない。それらが逆に与えられる場合には、優れた抗腫瘍効果は失われる。
【図１】
2022502066.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2022502066.tif 000008
【図８−１】
2022502066.tif 000009
【図８−２】
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【図９】
2022502066.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2022502066.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2022502066.tif 000029
【図２８（ａ）】
2022502066.tif 000030
【図２８（ｂ）】
2022502066.tif 000031
【図２８（ｃ）】
2022502066.tif 000032
【図２８（ｄ）】
2022502066.tif 000033
【図２８（ｅ）】
2022502066.tif 000034
【図２８（ｆ）】
2022502066.tif 000035
【図２８（ｇ）】
2022502066.tif 000036
【図２８（ｈ）】
2022502066.tif 000037
【図２９（ａ）】
2022502066.tif 000038
【図２９（ｂ）】
2022502066.tif 000039
【図２９（ｃ）】
2022502066.tif 000040
【図２９（ｄ）】
2022502066.tif 000041
【図２９（ｅ）】
2022502066.tif 000042
【図２９（ｆ）】
2022502066.tif 000043
【図２９（ｇ）】
2022502066.tif 000044
【図３０（ａ）】
2022502066.tif 000045
【図３０（ｂ）】
2022502066.tif 000046
【図３０（ｃ）】
2022502066.tif 000047
【図３０（ｄ）】
2022502066.tif 000048
【図３０（ｅ）】
2022502066.tif 000049
【図３０（ｆ）】
2022502066.tif 000050
【図３０（ｇ）】
2022502066.tif 000051
【図３０（ｈ）】
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【図３０（ｉ）】
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【図３１】
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【配列表】
2022502066000001.app
【国際調査報告】
2022502066.tif 000055
2022502066.tif 000056
2022502066.tif 000057
2022502066.tif 000058