【手続補正書】
【提出日】平成22年3月26日(2010.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3'末端に隣接している標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増殖するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端に隣接して位置する標的配列にアニーリングすると遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる3'領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチド、及び任意選択で鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングは、前記オリゴヌクレオチドの遅延された3'伸長の存在下での標的配列の3'末端からの伸長による鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルの複製によって安定化しており；
（b）3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドの結果的に安定化したアニーリングにより、鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まり、
（c）鋳型オリゴヌクレオチド及び/または第3のオリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用して増幅が起こり、3'末端に隣接する標的配列が選択的に増幅される段階と
を含む方法。
【請求項２】
前記選択的増幅が、分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から増幅するものであり、３’末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングが、分子内に組み込まれている標的配列への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングと比較して安定化されており、分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、３’末端に隣接した標的配列にアニーリングされた際の標的オリゴヌクレオチドの３’伸長の効率が高まる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択的増幅が、異なる３’末端を有する分子の混合集団の存在下で、３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から増幅するものであり、3'末端に隣接する標的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングが、3'末端に隣接する非相補的配列への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングと比較すると安定化しており、3'末端に隣接する非相補的配列にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチドの伸長と比較して、３’末端に隣接した標的配列にアニーリングされた際の鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長の効率が高まる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子が、分子の切断の結果物であり、該切断が任意選択で配列特異的制限エンドヌクレアーゼによるものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドの3'伸長を遅延させる鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が、
（i）3'末端ヌクレオチドミスマッチの取込み、
（ii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの取込み、
（iii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における欠失の取込み、
（iv）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における挿入の取込み、
（v）（i）〜（iv）の改変の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
3'末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から選択的に増幅するための方法であって、
（i）試料を、
（a）核酸分子の3'末端に隣接する標的配列に実質的に相補的な3'領域；及び
（b）鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接して位置する標的配列にアニーリングすると、遊離の5'テイルが形成されるような核酸配列を含む5'テイルであって、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルに相補的な配列を取り込む標的配列の3'末端の伸長のための鋳型となって、5'テイルに相補的な配列が標的配列に付加される5'テイル；及び
（c）前記鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する3'領域における改変、または3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する鋳型オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ領域における改変
を有する鋳型オリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（ii）試料を、鋳型オリゴヌクレオチドと反対方向にプライムするための第2のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iii）DNA試料を、鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルとヌクレオチド配列を共有し、3'伸長が妨げられずに進行する第3のオリゴヌクレオチドに接触させる段階と；
（iv）試料の増幅を実行する段階であって、
（a）鋳型オリゴヌクレオチドの遮断された3'伸長の存在下で、またはそれに続く複製が妨げられるもしくは遮断される鋳型オリゴヌクレオチドの妨げられていない3'伸長の存在下で、鋳型オリゴヌクレオチドが3'末端に隣接する標的配列にアニーリングする場合は、試料中の核酸分子への鋳型オリゴヌクレオチドのアニーリングに続いて鋳型オリゴヌクレオチドの5'テイルが複製され；
（b）増幅が第2及び第3のオリゴヌクレオチドと共に進行し、複製された5'テイルにより3'末端に隣接して位置する標的配列を選択的に増幅する段階と
を含む方法。
【請求項７】
前記選択的増幅が、分子内に組み込まれている標的配列を含む分子の存在下で３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から増幅するものであり、鋳型オリゴヌクレオチドの５’テイルの複製が、鋳型オリゴヌクレオチドが分子内に組み込まれている標的配列にアニーリングする場合には生じず、分子内に組み込まれている標的配列の増幅が進行しない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択的増幅が、３’末端の混合集団の存在下で３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子を試料から増幅するものであり、鋳型オリゴヌクレオチドの５’テイルの複製が、鋳型オリゴヌクレオチドが３’末端に隣接する非相補配列にアニーリングする場合には生じず、３’末端に隣接した非相補的配列の増幅が進行しない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
３’末端に隣接する標的配列を有する核酸分子が、分子の切断の結果物であり、切断が任意選択で配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
鋳型オリゴヌクレオチドの3'伸長を遮断する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における改変が、
（i）1つまたは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物のその3'末端での取込み、
（ii）3'末端非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物と3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの取込み、
（iii）3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数の脱塩基部位の取込み、及び
（iv）1つまたは複数の脱塩基部位と3'末端に近接する鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せの取込み
からなる群から選択される、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の非伸長性部分もしくはヌクレオチド類似物が、
（i）2',3'ジデオキシヌクレオチド、
（ii）3' C3、C18または他の長さのスぺーサー、
（iii）3'リン酸化ヌクレオチド、
（iv）ペプチド核酸塩基、
（v）アミンリンカー、
（vi）ウラシル_DNAグリコシラーゼで処理された1つまたは複数のウラシル、
（vii）RNA、
（viii）1つまたは複数の2' O-メチルRNA残基、及び
（ix）（i）〜（viii）の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
3'伸長を可能にするが、前記オリゴヌクレオチドの3'領域における複製を妨げるまたは遮断する3'領域における改変が、
（i）1つまたは複数の塩基類似物の鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域内の挿入、
（ii）1つまたは複数のRNAヌクレオチドの挿入、
（iii）1つまたは複数の脱塩基部位の挿入、及び
（iv）（i）〜（iii）の任意の組合せ
からなる群から選択される、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸分子の3'末端を含む試料中の核酸分子の3'末端が、試料を隣接カッター制限エンドヌクレアーゼで消化した結果物であり、任意選択で、前記鋳型オリゴヌクレオチドの３’伸長を遮断する３’領域内の改変が、その３’末端における１つ若しくは複数の塩基類似物の挿入、１つ若しくは複数の脱塩基部位の挿入、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
鋳型オリゴヌクレオチドが、標的配列の3'伸長を遮断する3'領域における改変をさらに取り込んでいる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
改変が、鋳型オリゴヌクレオチドの3'領域における1つまたは複数の塩基類似物の取込みである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
鋳型オリゴヌクレオチドが、3'末端ヌクレオチドミスマッチ、1つまたは複数の脱塩基部位及び1つまたは複数の塩基類似物を取り込んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第2のオリゴヌクレオチドが追加の鋳型オリゴヌクレオチドである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
切断及び非切断DNAを含むDNA試料から切断DNAを選択的に増幅するためのキットであって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に従って定義された（i）鋳型オリゴヌクレオチド、（ii）第2のオリゴヌクレオチド、及び（iii）第3のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１９】
制限エンドヌクレアーゼが配列特異的メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであり、HpaII、HhaI、BstuI、NotI、SmaI、SacII、GlaI及びBisIからなる群から選択される、請求項４又は９に記載の方法。
【請求項２０】
制限エンドヌクレアーゼが、試料中の核酸分子における制限部位の存在または不在を区別するように選ばれる、請求項４又は９に記載の方法。
【請求項２１】
単一ヌクレオチド多型若しくは突然変異の検出のため、単純ヌクレオチド反復における不安定性の検出のため、又は核酸分子のメチル化状態を判定するために使用する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
欠失または挿入が制限酵素認識部位と認識部位の外側に限定された距離で位置するその切断部位との間で起きる、試料中の核酸分子における欠失または挿入の存在または不在を検出するための方法であって、
（i）試料を、認識部位の外側に限定された距離で切断部位を有する制限酵素で消化する段階と；
（ii）3'末端に隣接するヌクレオチド配列が欠失または挿入の存在または不在に依存し、3'または5'方向のどちらかへの切断部位の移動が、それぞれ欠失または挿入の存在下で起こる、切断によって生成される3'末端に隣接するヌクレオチド配列を決定する段階と
を含む方法。
【請求項２３】
段階（ii）が請求項３または８に記載の方法により実現される、請求項２２に記載の方法。