(57)【要約】本開示は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の調節物質、特に、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できるＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質に関する。【選択図】図１
2022500457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できるＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項２】
前記調節物質がまた、ＮＬＲＰ３のＰＹＤドメインに結合することもできる、請求項１に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項３】
前記調節物質が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、融合タンパク質、またはアプタマー分子、これらの組み合わせ、およびこれらそれぞれのフラグメントを含む群から選択される、請求項１または２に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項４】
前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる二重抗体であり、任意選択で、前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３に両方に結合できる組換えヒト化二重抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項５】
調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１に結合できる第１の抗体の１個または複数の結合領域およびＮＬＲＰ３に結合できる第２の抗体の１個または複数の結合領域を含む二重抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項６】
前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１に結合できる第１の抗体の１個または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＮＬＲＰ３に結合できる第２の抗体の１個または複数のＣＤＲを含む二重抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項７】
前記第１および／または第２の抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５または６に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項８】
前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる抗体フラグメントから選択され、任意選択で、前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ビスｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、およびＦａｂ３の１個または複数から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項９】
前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる組換えヒト化抗体または抗体フラグメントから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１０】
任意選択で、前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方から選択される１種または複数の抗原に対し産生される抗体または抗体フラグメントであり、、前記調節物質が、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方の全てまたは一部から選択される１種または複数の抗原に対して産生される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１１】
前記調節物質が、ＮＬＲＰ３、任意選択で、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質に結合したＮＬＲＰ３（以下、ＮＬＲＰ３免疫原）、およびＩＬ−１Ｒ１、任意選択で、組換えＩＬ−１Ｒ１から選択される１種または複数の抗原に対して産生された抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１２】
ＩＬ−１Ｒ１が、下記配列を含むＩＬ−１Ｒ１の細胞外ドメイン（以下、ＩＬ−１Ｒ１免疫原）を含む、請求項１０または１１に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）。
【請求項１３】
ＮＬＲＰ３が、ＫＬＨ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）、任意選択で、ＫＬＨ−リンカー−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）、さらに任意選択で、ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含む、請求項１０または１１に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１４】
前記調節物質が、産生可能であり、任意選択で、ＩＬ−１Ｒ１免疫原に対して産生され、配列：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）、
を含む第１の抗体の１個または複数の結合領域、および配列：
ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含むＮＬＲＰ３の免疫原対して増殖する１つまたは複数の結合領域の第２の抗体を含む、、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１５】
調節物質は、産生可能であり、任意選択で、ＩＬ−１Ｒ１免疫原に対し産生され、配列：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）、
を含む第２の抗体の１個または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列：
ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含むＮＬＲＰ３免疫原に対して産生された第２の抗体の１個または複数のＣＤＲを含む二重抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１６】
前記第１の抗体の重鎖ＣＤＲが、ＧＹＰＦＴＴＡＧ（配列番号６０）；ＭＮＴＱＳＥＶＰ（配列番号６１）；および／またはＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶ（配列番号６２）を含み、前記第１の抗体の軽鎖ＣＤＲが、ＱＳＩＳＤＹ（配列番号６３）；ＹＡＳ；および／またはＱＨＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号６４）を含む、請求項１５に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１７】
前記第２の抗体の重鎖ＣＤＲが、ＧＦＴＦＳＤＹＹ（配列番号６５）；ＩＳＤＧＧＴＹＴ（配列番号６６）；および／またはＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹ（配列番号６７）を含み、前記第２の抗体の軽鎖ＣＤＲが、ＴＧＡＶＴＴＳＮＹ（配列番号６８）；ＧＴＮ；およびＡＬＷＹＳＮＹＷＶ（配列番号６９）を含む、請求項１５または１６に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項１８】
前記二重抗体の軽鎖が、下記アミノ酸配列を有する、請求項４〜１７のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質：
ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ＊＊（配列番号５７）。
【請求項１９】
前記二重抗体の重鎖が、下記アミノ酸配列を有する、請求項４〜１８のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質：
ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫ＊＊（配列番号５９）。
【請求項２０】
前記調節物質が、ＮＬＲＰ３インフラマソームが、病因において重要な役割を果たすことが知られている炎症関連障害の治療または予防での使用のためのものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質。
【請求項２１】
炎症関連障害の治療および／または予防方法であって、
ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化および／またはシグナル伝達を抑制する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の治療有効量のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質を用意するステップ、および
治療有効量の前記化合物をこのような治療を必要としている対象に投与するステップ、を含む方法。
【請求項２２】
炎症関連障害の治療のための薬物の調製における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質の使用。
【請求項２３】
対象の炎症関連障害の少なくとも１つの症状を低減または防止または治療するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質の使用によりインフラマソーム経路の活性化を選択的に阻害および／または低減させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記調節物質が、前記調節物質の使用によりインフラマソーム経路の活性化を選択的に阻害および／または低減させることを含む、対象の炎症関連障害の少なくとも１つの症状の治療または予防で使用するためのものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症関連障害が、限定されないが、アテローム性動脈硬化症；加齢黄斑変性、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群などの炎症性の眼疾患；糖尿病；炎症性眼疾患；うつ；アルツハイマー病；パーキンソン病；炎症性腸疾患；関節リウマチ；加齢；皮膚科学的状態；および癌を含む、請求項２０に記載の使用のためのＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質、請求項２１に記載の炎症関連障害の治療および／または予防方法、請求項２２に記載の薬物の調製における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質の使用、請求項２３または２４に記載の炎症関連障害の少なくとも１つの症状を低減または防止または治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の調節物質、特に抗体およびそのフラグメントならびにアプタマー分子（タンパク質または他の細胞内標的に特異的に結合可能な二次および三次構造体を形成できる小型ＲＮＡ／ＤＮＡ分子）に関し、これらのそれぞれは、ＮＬＲＰ３インフラマソームのメンバーに結合特異性を有する。特に、本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソームシグナル伝達および活性化により媒介される炎症性疾患の治療または予防のための、このような抗体およびアプタマー、およびそれらのフラグメントの使用にまでさらに及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む刺激物質を含む多岐にわたる炎症を認識する一群のタンパク質複合体である。種々のインフラマソーム複合体が知られており、特に、ＮＬＲＰ３は、ＬＰＳ、細菌毒素、ダスト、ＡＴＰなどのストレスシグナル、結晶化および粒子状物質、コレステロール結晶、酸化ＬＤＬ、アミロイドベータ、プリオンタンパク質線維および原線維αシヌクレイン、剪断応力、圧力などのＮＬＲＰ３を活性化する様々なシグナルのために、最も研究されているインフラマソームである。
【０００３】
ＮＬＲＰ３（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＡＣＨＴ））、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、およびピリンドメイン含有タンパク質３インフラマソームは、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、炎症性眼疾患、ドライアイ症候群、緑内障、加齢黄斑変性などの他の眼疾患、うつ、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症性腸疾患、関節リウマチなどの関節炎状態、加齢、皮膚科学的状態および癌を含む多くの感染性疾患および極めて多くの変性炎症性型疾患に結びつけられている。
【０００４】
ＮＬＲＰ３タンパク質の主要な役割は、危険信号または異物を検知し、次に炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの分泌を活性化するカスパーゼ１にそのシグナルを中継することであり、その後、ＩＬ−１βは身体を保護するために炎症を開始する。ＩＬ−１βは、炎症過程における中心的役割のために、全てのサイトカイン中で最も研究されている。ＩＬ−１βを活性化することは身体にとって有用であるが、多くの疾患で、この炎症が制御されなくなり、疾患の病因となることがある。今日まで、ほとんどの治療戦略は、炎症を抑制するためにＩＬ−１βに対抗する治療薬の開発に注力されてきたが、我々がここで提案するように、このサイトカインの上流制御装置、すなわち、ＮＬＲＰ３インフラマソームを標的化することには多くの利点が存在する。
【０００５】
活性化の機序はまだ十分には理解されていないが、インフラマソームを介したＩＬ−１βのプロセッシングは、２つの経路を伴うことが示された。第一に、ＮＦκＢ経路は、トール様受容体（ＴＬＲ）および／またはＣＤ３６受容体を介してＤＡＭＰまたはＰＡＭＰにより活性化される。これは、プロ型のＩＬ−１βおよびＮＬＲＰ３の転写および発現をもたらす。
【０００６】
また、ＡＴＰなどのＤＡＭＰによるプリン受容体刺激が細胞内のカルシウムの増大および細胞膨潤を引き起こし、これが、細胞からのカリウム流出、リソソーム不安定化、膜易透化、ミトコンドリア損傷および続いて生じる活性酸素種の生成をもたらし、ＮＬＲＰ３活性化に繋がる、第２のシグナルも必要であると考えられる。他の研究は、酸化型ＬＤＬコレステロールは実際に、其れ自体、ＮＬＲＰ３活性化に必要な２つのシグナルとして機能できることが示された。全ての研究で、カリウム流出が、ＮＬＲＰ３活性化の唯一の共通因子であるように思われる。
【０００７】
ＮＬＲＰ３タンパク質はその後、ピリンドメインの同型相互作用を介してＡＳＣ（アポトーシス関連スペック様タンパク質）と相互作用する。ＡＳＣはその後、プロカスパーゼ１と相互作用し、カスパーゼ１の切断および活性化を生じ、これが次に、プロＩＬ−１βをその活性型に切断する。ＩＬ−１βはその後、切断されて、生物学的に活性な分泌型を産生する。
【０００８】
今日のインフラマソーム関連障害のための最良の治療は、インフラマソーム活動の主要産物であるＩＬ−１βを標的にしている。過去２０年間で、多くの抗ＩＬ−１β治療薬が開発されてきた。しかし、抗ＩＬ−１β治療薬にはいくつかの欠点がある。全ての抗サイトカイン薬に関し、日和見主義的生物ならびに日常的細菌感染症に対する宿主防御が主要な懸念になってきた。理由は、これらの感染症の無痛性で危険な性質のためである。抗ＩＬ−１β治療薬は、悪心、好中球増加症および有害アレルギー反応などの他の副作用がある。
ＩＬ−１β治療薬に勝る抗ＮＬＲＰ３療法のいくつかの利点は、以下の通りである：
【０００９】
ＮＬＲＰ３は、ＮＯＤ様受容体であるので、疾患の根本原因の認識、すなわち、異物／危険物質の認識は、応答の抑制に比べて、有利であり得る。これは、ＩＬ−１βが、疾患特異的刺激物質、例えば、酸化型ＬＤＬ、βアミロイドまたはαシヌクレインまたは特定の病原体により活性化されるＮＬＲＰ３経路を介して分泌されないことを意味するであろう。しかし、ＩＬ−１β活性化に関与する他の経路がないために、ＩＬ−１βは、それでも、極限状態（大規模または日和見感染症など）で必要とされる他の非疾患関連刺激物質に応答して他の経路を介して活性化され得る。
【００１０】
インフラマソームは、特殊な形の細胞死、ピロネクローシス（カスパーゼ１とは独立）およびパイロトーシスに関連付けられており、これらは、悪化した炎症の場合に起こり得る。従って、抗ＮＬＲＰ３療法はまた、このような死経路を減らし、これは、アテローム性動脈硬化症などの特定の疾患の病因に関与することが立証された。パイロトーシスは、酸化型ＬＤＬ反応する、この疾患のプラーク破綻のリスク因子である。
【００１１】
いくつかの以前に特徴付けられた小分子阻害剤は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム機能にも影響を与えることが最近示された。スルホニルウレア薬物であるグリブリドは、このような阻害剤の一例である。ＭＣＣ９５０（以下に示す）は、具体的なＮＬＲＰ３インフラマソームの小分子阻害剤の別の例である。
【化１】
2022500457.tif 000003
【００１２】
しかし、現在利用可能な阻害剤にはいくつかの問題がある。実際に、これらの現在利用可能なインフラマソーム機能の阻害剤の多くは、臨床的に成功しておらず、非特異的であり、重要な点は、極めて短い半減期であることである。
【００１３】
ヒト化抗体型治療薬の開発は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム用の小分子阻害剤より多くの利点があることが明らかになるであろう。
小分子阻害剤に勝るヒト化抗体のいくつかの利点は次の通りである：
・ヒト免疫系による非認識。
・循環中で非ヒト抗体よりも長い半減期。
・小分子阻害剤より高い特異性。
・これまで小分子薬物を逃れてきた難易度の高い標的との相互作用。この最良の例は、わずかな荷電ポケットを有する大きく、多くの場合平らな表面を特徴とするタンパク質−タンパク質相互作用である。
・最も多く臨床試験に入るｍＡｂであるキメラおよびヒト化ｍＡｂは、特に腫瘍学の分野で、小分子薬（５％）を含む新規化学物質（ＮＣＥ）より高い認証成功率（それぞれ、１８％および２４％）を有する。
・生物製剤の商業化の可能性は極めて有望である。処方薬および非処方箋薬の総販売高中の生物製剤のシェアは、２００４年の１２％から２０１１年の１９％に拡大した。さらに興味深いのは、生物学的製剤は、２００４年の医薬品売上高のトップ１００中の１７％を占め、２０１１年には、３４％を占めた。世界の生物製剤市場は、２０２５年までに、ほぼ４０億ドルに達すると推定されている。
・生物製剤は、小分子薬物より良好な全体的経済的利益をもたらすと思われる。
・研究はまた、生物製剤の損耗率は、小分子よりも小さいことを示している。小分子薬物の７．１％の成功率に過ぎないのに比較して、前臨床試験に入る生物製剤の２４．４％が最終的に市販される。
・生物製剤は、開発の全ての段階で小分子より良好な性能を示し、フェーズ２で驚くべき１１６％の成功率であった。
【００１４】
ＮＬＲＰ３（ＮＡＬＰ３およびクリオピリンとしても知られている）は、細胞質タンパク質であり、従って、このタンパク質を標的にするために、いずれの治療薬も、細胞に入る必要がある。ヒト化抗体は、サイズが極めて大きく、サイトゾルへ入るのは困難であることがわかるであろう。小型抗体フラグメントの開発はまた、このような課題を克服する可能性を提示し、この場合、抗体フラグメントはＦａｂフラグメントであってよく、これは、抗体の抗原結合フラグメント、またはペプチドリンカーにより結合された抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質である、単鎖可変フラグメントである。以下でさらに考察されるように、本発明者らは、追加の戦略を考案し、治療抗体またはアプタマーおよびそれらのフラグメントが細胞中に入ることができるのを確実にした。
【００１５】
種々の薬剤を用いてＮＬＲＰ３インフラマソームまたは関連分子の標的化を記載する分野でいくつかの報告がある。例えば、ＷＯ２０１３／００７７６３Ａ１は、アクネの予防／治療方法で使用するための細胞内局在化およびＮＬＲＰ３を含むインフラマソーム群のメンバーへの細胞質ゾル結合可能な阻害剤を開示している。
【００１６】
米国特許出願公開第２００８０００８６５２Ａ１号は、特に、クリオピリン（ＮＰＲＬ３）シグナル伝達の調節を介して、免疫応答およびアジュバント活性を調節する方法および組成物を開示している。クリオピリン調節タンパク質、またはクリオピリンシグナル経路成分を標的とするヒト化抗体が言及され、クリオピリン抗体を作製する方法が開示される。
【００１７】
ＷＯ２００２０２６７８０Ａ２は、ＰＡＡＤドメイン含有ポリペプチドに結合する抗体、ならびに抗ＰＡＡＤ抗体を投与することによる炎症を含む種々の病態を治療する方法を開示している。単鎖抗体、キメラ、二官能性、ヒト化抗体、ならびにその抗原結合フラグメントも言及される。
【００１８】
ＷＯ２０１１１０９４５９Ａ２は、ＡＳＣまたはＮＬＲＰ１などの哺乳動物インフラマソームの成分に特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む組成物を提供することにより、皮膚／毛髪の炎症性疾患を治療する方法を開示している。ＡＳＣおよびＮＰＲＬ１に対する市販の抗体が言及されている。
【００１９】
ＥＰ２３５０３１５Ｂ１は、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣおよび／またはカスパーゼ１の発現レベルの測定を含む、アテローム性動脈硬化症の早期診断のための方法およびキットを開示している。発現レベルは、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖを含む抗体フラグメントなどの抗体を含む方法により測定され得る。
【００２０】
ＷＯ２０１３１１９６７３Ａ１は、ＮＬＲＰ１（ＮＡＬＰ−１）、ＡＳＣ、およびカスパーゼ１などの少なくとも１種のインフラマソームタンパク質のレベルを測定することを含む、ＣＮＳ傷害を有すると疑われる患者を評価する方法を開示している。ＮＰＲＬ−１、ＡＳＣおよびカスパーゼ１に対する市販の抗体が言及されている。
【００２１】
ＷＯ２００７０７７０４２Ａ１は、ＮＡＬＰ３インフラマソーム阻害剤の投与を含む、痛風または偽痛風の治療方法を開示している。ＮＡＬＰ３インフラマソーム阻害剤は、ＮＡＬＰ３インフラマソームの下流で作用するとして記載され、ＩＬ−１の活性を阻害する抗体中から選択される。
【００２２】
ＷＯ２０１３１３８７９５Ａ１は、Ｓｕｒｆ＋透過性ポリペプチドおよび細胞内標的に結合する抗体または抗体模倣部分（ＡＡＭ部分）を含む融合タンパク質を開示し、融合タンパク質は細胞中に侵入し、細胞内標的に結合し、標的と細胞内の別のタンパク質との間の結合を阻害する。
【００２３】
本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの新規で有効な調節物質を提供する。このような調節物質には、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方を標的とする二重抗体（ｂｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはアプタマー、それらのフラグメントを含む。二重抗体は、最初に、急速な内部移行を誘発するＩＬ−１Ｒ１に結合することにより細胞に入り、一旦内部移行すると、二重抗体は次に細胞内タンパク質ＮＬＲＰ３を標的として、ＮＬＲＰ３インフラマソームの構築を阻害し、次に、細胞からのＩＬ−１β分泌を妨害して、炎症の開始／増幅を低減させる。
【発明の概要】
【００２４】
従って、本発明の第１の態様では、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できるＮＬＲＰ３インフラマソーム調節物質が提供される。
【００２５】
任意選択で、調節物質はまた、ＮＬＲＰ３のＰＹＤドメインに結合することもできる。
【００２６】
任意選択で、調節物質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、融合タンパク質、またはアプタマー分子、これらの組み合わせ、およびこれらそれぞれのフラグメントを含む群から選択される。
【００２７】
調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる二重抗体であってもよい。任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる組換えヒト化二重抗体である。
【００２８】
任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１に結合できる第１の抗体の１個または複数の結合領域およびＮＬＲＰ３に結合できる第２の抗体の１個または複数の結合領域を含む二重抗体である。任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１に結合できる第１の抗体の１個または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＮＬＲＰ３に結合できる第２の抗体の１個または複数のＣＤＲを含む二重抗体である。任意選択で、第１および／または第２の抗体はモノクローナル抗体である。
【００２９】
任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる抗体フラグメントから選択される。任意選択で、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ビスｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、およびＦａｂ３の１個または複数から選択される。
【００３０】
任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に結合できる組換えヒト化抗体または抗体フラグメントから選択される。
【００３１】
任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方から選択される１種または複数の抗原に対して産生された抗体または抗体フラグメントである。任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方の全部または一部から選択される１種または複数の抗原に対して産生される。任意選択で、調節物質は、ＮＬＲＰ３、任意選択で、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質に結合したＮＬＲＰ３（以下、ＮＬＲＰ３免疫原）、およびＩＬ−１Ｒ１、任意選択で、組換えＩＬ−１Ｒ１から選択される１種または複数の抗原に対して産生される。
【００３２】
任意選択で、ＩＬ−１Ｒ１の細胞外ドメイン（以下、ＩＬ−１Ｒ１免疫原）は、下記配列を含む：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）。
（＊または＊＊は、本明細書全体を通して停止コドンを意味する）。
【００３３】
任意選択で、ＮＬＲＰ３の免疫原は、下記配列を含む：
ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）。
【００３４】
任意選択で、ＮＬＲＰ３免疫原は、任意選択で、配列ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）のＮ末端に結合した、配列ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）に結合した担体タンパク質を含む。
【００３５】
ペプチドに結合した担体タンパク質は、ペプチドがより強力な免疫応答を生成するのを支援することが当該技術分野において既知である。任意選択で、担体タンパク質はＫＬＨである。
【００３６】
任意選択で、担体タンパク質は、リンカーを介して配列ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）に結合され、任意選択で、リンカーはヒドラジド−Ａｈｘである。
【００３７】
任意選択で、ＮＬＲＰ３の免疫原は、ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）である。
【００３８】
当該技術分野において理解されているように、ヒドラジドは、４個の置換基を有し、それらの少なくとも１個がアシル基である、窒素−窒素共有結合を特徴とする有機化合物の部類である。Ａｈｘは、６炭素直鎖アミノヘキサン酸リンカーを意味する。
【００３９】
任意選択で、調節物質は産生可能であり、任意選択で、ＮＬＲＰ３免疫原およびＩＬ−１Ｒ１免疫原から選択される１種または複数の免疫原に対し産生され、ＩＬ−１Ｒ１免疫原は配列：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）。
（＊は、停止コドンを意味する）
を含み、ＮＬＲＰ３の免疫原は、配列：
ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含む。
【００４０】
任意選択で、調節物質は、産生可能であり、任意選択で、ＩＬ−１Ｒ１免疫原に対し産生され、配列：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）、
（＊は、停止コドンを意味する）
を含む第１の抗体の１個または複数の結合領域、および配列：
ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含むＮＬＲＰ３免疫原に対して産生された第２の抗体の１個または複数の結合領域を含む二重抗体である。
【００４１】
任意選択で、調節物質は、産生可能であり、任意選択で、ＩＬ−１Ｒ１免疫原に対し産生され、配列：
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）、
（＊は、停止コドンを意味する）
を含む第１の抗体の１個または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列：
ＫＬＨ−ヒドラジド−Ａｈｘ−ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）を含むＮＬＲＰ３免疫原に対して産生された第２の抗体の１個または複数のＣＤＲを含む二重抗体である。
【００４２】
任意選択で、第１および／または第２の抗体はモノクローナル抗体である。
【００４３】
任意選択で、第１の抗体（ＩＬ−１Ｒ１に対する）の重鎖のコンセンサス配列は、
【化２】
2022500457.tif 000004
である。
【００４４】
任意選択で、第１の抗体の重鎖ＣＤＲは、
【化３】
2022500457.tif 000005
を含む。
【００４５】
任意選択で、第１の抗体（ＩＬ−１Ｒ１に対する）の軽鎖のコンセンサス配列は、
【化４】
2022500457.tif 000006
である。
【００４６】
任意選択で、第１の抗体の軽鎖ＣＤＲは、
【化５】
2022500457.tif 000007
を含む。
【００４７】
任意選択で、第２の抗体（ＮＬＲＰ３に対する）の重鎖のコンセンサス配列は、
【化６】
2022500457.tif 000008
である。
【００４８】
任意選択で、第２の抗体の重鎖ＣＤＲは、
【化７】
2022500457.tif 000009
を含む。
【００４９】
任意選択で、第２の抗体（ＮＬＲＰ３に対する）の軽鎖のコンセンサス配列は、
【化８】
2022500457.tif 000010
である。
【００５０】
任意選択で、第２の抗体の軽鎖ＣＤＲは、
【化９】
2022500457.tif 000011
を含む。
【００５１】
任意選択で、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３に同時に結合できる。任意選択で、または追加して、調節物質は、ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３に逐次的に結合できる。
【００５２】
任意選択で、本発明の二重特異性抗体の軽鎖は、下記アミノ酸配列を有する：
ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ＊＊（配列番号５７）。
【００５３】
任意選択で、本発明の二重特異性抗体の重鎖は、下記アミノ酸配列を有する：ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫ＊＊（配列番号５９）。
【００５４】
ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に「同時に結合」は、前記ＩＬ−１Ｒ１および／またはＮＬＲＰ３が複合体として形成される場合であっても、またはそれらが複合体として形成されない場合であっても、調節物質がＩＬ−１Ｒ１および／またはＮＬＲＰ３のそれぞれに結合できることを意味する。
【００５５】
第２の態様では、本発明は、ＮＬＲＰ３インフラマソームが病因において重要な役割を果たすことが知られている炎症関連障害の治療または予防での使用のための、本明細書で定義の調節物質を提供する。
【００５６】
調節物質としての二重特異性抗体の利点は、単一抗体より低い、従って、より少ない毒性の濃度で使用でき、それにより、細胞傷害性の可能性を低減できるということである。二重特異的であることにより、より安定で、より純度の高い抗体を可能にする。
【００５７】
生物学的であることにより、より長い半減期を有し、従って、小分子阻害剤に勝る大きな利点を与える。
【００５８】
第３の態様では、本発明は、炎症関連障害の治療および／または予防方法を提供し、該方法は、次のステップを含む：
ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化および／またはシグナル伝達を抑制する、本発明の第１の態様の治療有効量の調節物質を用意するステップ、および
治療有効量の前記化合物をこのような治療を必要としている対象に投与するステップ、を含む方法。
【００５９】
第４の態様では、本発明は、炎症関連障害の治療のための薬物の調製における、本発明の第１の態様の調節物質の使用を提供する。
【００６０】
第５の態様では、本発明は、対象の炎症関連障害の少なくとも１つの症状を低減または防止または治療するための方法を提供し、該方法は、本発明の第１の態様の調節物質の使用によりインフラマソーム経路の活性化を選択的に阻害および／または低減することを含む。
【００６１】
任意選択で、調節物質は、対象の炎症関連障害の少なくとも１つの症状の治療または予防に使用するためのものであり、該方法は、本発明の第１の態様の調節物質の使用によりインフラマソーム経路の活性化を選択的に阻害および／または低減することを含む。
【００６２】
任意選択で、ＩｎｆｌａＭａｂは、限定されないが、アテローム性動脈硬化症などの全身状態の疾患修飾作用を有し得、それにより、炎症を防止／抑制し、従って、プラーク蓄積および／またはプラーク破裂を防止し、その結果、心筋梗塞のリスクを減らす。
【００６３】
任意選択で、ＩｎｆｌａＭａｂは、限定されないが、緑内障などの眼疾患の疾患修飾作用を有し得、それにより、炎症を防止し／抑制し、眼圧を下げ、および／または網膜神経節細胞および軸索の損失を防止し、視神経を保護し、視力を保護し、および／または失明を防ぐ。
【００６４】
任意選択で、ＩｎｆｌａＭａｂは、限定されないが、アルツハイマー病などの神経学的状態の疾患修飾作用を有し得、それにより、炎症を防止／抑制し、アミロイドプラーク沈着を低減／抑制し、および／または認知障害を防止する。
【００６５】
本発明の第１の態様の調節物質は、炎症に関連する多疾病罹患または併存症の個体で有用であり得る。
【００６６】
任意選択で、本発明の前述のいずれかの、ＩｎｆｌａＭａｂとして表記される調節物質は、軽鎖の２つの対および重鎖の２つの対から構成され、Ｎ末端に融合されたｓｃＦｖドメインを有し、ジスルフィド結合を介して一緒に複合体化された、２１０キロダルトン（ｋＤａ）の二重特異的マウス抗体である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「炎症関連障害」は、限定されないが、アテローム性動脈硬化症；加齢黄斑変性、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群、糖尿病、炎症性眼疾患などの炎症性眼状態、うつ、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、加齢、皮膚科学的状態および癌が挙げられる。
【００６８】
任意選択で、対象はヒトなどの哺乳動物である。
【００６９】
用語の「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは物質と解釈されるべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、またはそのフラグメント、機能的等価物またはホモログであり得る。この用語は、天然または全合成または部分合成であるかどうかに関わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。従って、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン、または等価物を含むキメラ分子が包含される。
【００７０】
全抗体のフラグメントは、抗原結合の機能を実行できる。このような結合フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１抗体ドメインを含むＦａｂフラグメント；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：２個の結合Ｆａｂ’フラグメントを含む二価のフラグメント；単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが合体して抗原結合部位を形成可能とするペプチドリンカーにより結合される；または遺伝子融合により構築される多価性のまたは多重特異性フラグメントであり得る二重または三重特異性抗体である。
【００７１】
本発明で使用するための抗体またはポリペプチドのフラグメントは通常、少なくとも５〜７個の連続アミノ酸、多くの場合、少なくとも約７〜９個の連続アミノ酸、典型的には、少なくとも約９〜１３個の連続アミノ酸、より好ましくは、少なくとも約２０〜３０個の連続アミノ酸および最も好ましくは、少なくとも約３０〜４０またはそれ超の連続アミノ酸の一続きのアミノ酸残基を意味する。
【００７２】
用語の「抗体」は、「ヒト化」されている抗体を含む。ヒト化抗体を作製する方法は、当技術分野において既知である。
【００７３】
アプタマーは、特異的標的分子に結合するペプチド分子である。アプタマーは、小分子と生物製剤との間の範囲にある。それらは、サイズ、合成のし易さおよび変更の観点で、抗体治療薬に対して、大きな利点を示す。
【００７４】
本明細書に記載の調節物質は、ＥＬＩＳＡなどのアッセイで使用して、ヒト血液または組織試料からＮＬＲＰ３を検出可能である。従って、さらなる態様では、本発明は、本発明の第１の態様の１種または複数の調節物質を含むキットを提供する。任意選択で、キットは、前記キットの使用のための説明書をさらに含む。任意選択で、キットは、ヒト細胞中の、血液または組織試料中のＮＬＲＰ３を検出するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＩＬ−１Ｒ１  ＦＣの、４〜２０％変性、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量マーカーは、キロダルトンで示される。
【図２】ＵＵＣ  ＩＬ―１Ｒに対する１回目の採取血のスクリーニングを示すグラフである。
【図３】ＵＵＣ  ＩＬ−１Ｒに対する２回目の採取血のスクリーニングを示すグラフである。
【図４】融合スクリーニング後の結果を示すグラフである。
【図５】１回目のプロトクローン２４ウェルスクリーニングのグラフである。
【図６】ＬＤ１スクリーニング結果のグラフである。
【図７】２４ウェルプレートスクリーニング結果のグラフである。
【図８】Ｆ２３７  ５Ｄ１−１Ａ８からの最終選択ハイブリドーマのグラフである。
【図９】Ｆ２３７  ５Ｄ１−１Ａ８最終２４ウェルスクリーニングからの最終選択ハイブリドーマのグラフである。
【図１０】ＴＨＰ１細胞中へのＩＬ−１Ｒ１内部移行の免疫蛍光法画像である。ＬＰＳおよびＡＴＰで処理してＩＬ−１Ｒ１の発現を誘導したＴＨＰ１マクロファージから取得した蛍光顕微鏡画像である。
【図１１】ＴＨＰ１細胞中へのＩＬ−１Ｒ１内部移行のフローサイトメトリーの図である。
【図１２】Ｉｇ可変ドメインプライマーのいくつかの組み合わせを用いたＰＣＲの結果を示す。
【図１３】ＣＤＲループの図式表現である。（参考文献：Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）ＰＭＩＤ：１２４７７５０１）。
【図１４】ＣＤＲループの図式表現である（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）ＰＭＩＤ：１２４７７５０１）。
【図１５】ＮＬＲＰ３の構造を示す図である。Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎ，Ｔ．；Ｆｉｎｋ，Ｓ．Ｌ．；Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｂ．Ｔ．（２００９）．”Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ：Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７（２）：９９−１０９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２０７０．ＰＭＣ  ２９１０４２３．ＰＭＩＤ  １９１４８１７８．およびＤａｇｅｎａｉｓ，Ｍ．；Ｓｋｅｌｄｏｎ，Ａ．；Ｓａｌｅｈ，Ｍ．（２０１１）．”Ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：Ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｏｆ  Ｄｒ．Ｊｕｒｇ  Ｔｓｃｈｏｐｐ”．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．１９（１）：５−１２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄ．２０１１．１５９．ＰＭＣ  ３２５２８２３．ＰＭＩＤ２２０７５９８６．ｈｔｔｐ：／／ｊｏｎｌｉｅｆｆｍｄ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ｃｅｌｌｕｌａｒ−ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ−ｂｌｏｇ／ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ−ａｒｅ−ｌａｒｇｅ−ｃｏｍｐｌｅｘ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．
【図１６】ＣＬＵＳＴＡＬ０（１．２．４）を用いたヒトおよびマウスＮＡＬＰ（ＮＬＲＰ）タンパク質のＣ末端ドメインのコンセンサス配列の配列アラインメントの図である。
【図１７】Ｐｒｏｔｅａｎ  ３Ｄバージョン１４．０．１を用いて二次構造的の特徴を示すＮＬＲＰ３  ＰＤＢ：３ＱＦ２に整列させたペプチドＦＵＳ＿７４６＿００１（黄色）のＮｏｖａｆｏｌｄ予測構造の図である。
【図１８】高レベルのＮＬＲＰ３  ｍＡｂを発現した免疫化マウスのグラフである。
【図１９】ＵＵＣ  ＮＬＲＰ３に対する１回目の採取血のスクリーニングを示すグラフである。
【図２０】ＵＵＣ  ＮＬＲＰ３に対する２回目の採取血のスクリーニングを示すグラフである。
【図２１】融合スクリーニング後の結果を示すグラフである。
【図２２】１回目のプロトクローン２４ウェルスクリーニングのグラフである。
【図２３】ＬＤ１スクリーニング結果のグラフである。
【図２４】２４ウェルプレートスクリーニング結果のグラフである。
【図２５】Ｆ２２６からの最終選択ハイブリドーマのグラフである。
【図２６】ドットブロット分析の結果を示す図である。
【図２７】ウェスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２８】Ｉｇ可変ドメインプライマーのいくつかの組み合わせを用いたＰＣＲの結果を示す。
【図２９】ＣＤＲループの図式表現である（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）ＰＭＩＤ：１２４７７５０１）。
【図３０】ＣＤＲループの図式表現である（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）ＰＭＩＤ：１２４７７５０１）。
【図３１】ＩｎｆｌａＭａｂの二重特異性設計およびプラスミドマップを示す図である。
【図３２】ＩｎｆｌａＭａｂの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。分子量マーカーは、キロダルトンで示される。
【図３３】ＩｎｆｌａＭａｂはＩＬ−１β放出を防止する。（注記、「Ｕｌｓｔｅｒ  Ａｂ」は、「ＩｎｆｌａＭａｂ」および「二重特異的Ａｂ」と同義である）。
【図３４】ＩｎｆｌａＭａｂはＴＨＰ１細胞注のカスパーゼ１の活性化を防止する。
【図３５】Ｉｎｆｌａｍａｂの内部移行を示す図である。
【図３６】ＩｎｆｌａＭａｂは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）からのＩＬ−１β分泌を抑制することを示す。
【図３７】ＩＬ−１βは、ＬＰＳ攻撃によりインビボで抑制されるが、ＴＮＦαは抑制されないことを示す。
【図３８】ＩｎｆｌａＭａｂは、アテローム性動脈硬化症ａｐｏＥ−／−モデルで、プラークサイズをインビボで低減させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
特定の使用または治療方法では、本発明の調節物質、例えば、二重特異性抗体は、下記を含むステップに従って作用する：
１．抗体の細胞中への内部移行および侵入を可能とするために、二重特異性抗体をＩＬ−１Ｒ１に対し標的化するステップ。
２．ＮＬＲＰ３インフラマソーム構築およびそれに続く細胞からのＩＬ−１β放出を阻害し、その結果、炎症を減らすために抗体をＮＬＲＰ３に対し標的化するステップ。
３．ＩＬ−１Ｒ１の内部移行を誘発し、その結果、ＩＬ−１β結合のために利用可能なＩＬ−１Ｒ１を少なくし、炎症の可能性および増幅をさらに抑制させるために、抗体をＩＬ−１Ｒ１に対し標的化するステップ。
【００７７】
本発明の第１の態様のこのような調節物質は、驚くべきことに、ＮＬＲＰ３タンパク質部分だけではなく、全体としてインフラマソームに対する追加の抑制効果をもたらし、従って、インフラマソーム関連疾患のより効果的な阻害剤を提供することになる。
【００７８】
実施例
・ＩＬ−１Ｒ１  ＦＣ融合体の一過性発現（実施例１）
・ＩＬ−１Ｒ１に対するモノクローナル抗体の生成（実施例２）
・ＩＬ−１Ｒ１モノクローナル抗体配列決定結果報告（実施例３）
・ＮＬＲＰ３ペプチド合成（実施例４）
・ＮＬＲＰ３に対するモノクローナル抗体の生成（実施例５）
・ＮＬＲＰ３モノクローナル抗体配列決定結果報告（実施例６）
・ＩｎｆｌａＭａｂデザイン（実施例７）
・ＩｎｆｌａＭａｂ一過性発現（実施例８）
・アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患のためのＩｎｆｌａＭａｂ（実施例９）
【００７９】
実施例１：ＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃ融合体の一過性発現
ＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃを一過性に発現させ、ＨＥＫ２９３細胞中で精製した。精製タンパク質のサイズおよび純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより評価し、エンドトキシンレベルを検査した。最終的に、タンパク質の活性をＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【００８０】
インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）Ｆｃ融合タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞中に遺伝子導入した。その後、標準的クロマトグラフィー技術を用いて、発現したＦｃ融合タンパク質を細胞培養上清から精製した。精製生成物の濃度および純度を決定した。
【００８１】
ＨＥＫ２９３細胞の一過性遺伝子導入およびタンパク質の精製
ＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（実施例１Ａ参照）を合成し、哺乳動物一過性発現プラスミドｐＤ２６１０−ｖ１（ＤＮＡ２．０）に挿入した。ＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃを、ＨＥＫ２９３細胞ベース一過性発現を用いて発現させ、得られた抗体含有細胞培養上清を遠心分離および濾過により清澄化した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィーを介して、細胞培養上清から２ロットのＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃを精製した（ＡＫＴＡクロマトグラフィー装置を使用）。精製されたタンパク質は、リン酸緩衝食塩水中に透析／緩衝液交換された。組換えタンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにより判定され、＞９５％であると決定された（図１）。タンパク質濃度は、吸光度を測定することにより決定された（１．０ｍｇ／ｍｌ＝１．３７のＡ２８０）。精製生成物の詳細は、表１にまとめられている。
図１は、ＩＬ−１Ｒ１  ＦＣの、４〜２０％変性、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分子量マーカーは、キロダルトンで示される。レーンは次の通りである：
【表１】
2022500457.tif 000012
【表２】
2022500457.tif 000013
略語は次記の通り；ＮＤ、測定せず。
【００８２】
実施例１Ａ：ＩＬ−１Ｒ１  Ｆｃアミノ酸配列
ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＮＦＱＫＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＨＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＴＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ＊（配列番号１）
【００８３】
実施例２：ＩＬ−１Ｒ１に対するモノクローナル抗体の生成
このプロジェクトの目的は、ＩＬ−１Ｒ１に対するモノクローナル抗体を生成することである。５匹のマウス集団に免疫し、陽性免疫応答に関しスクリーニングされた。融合に好適する候補の選定後、脾細胞をパートナー細胞と融合して、ハイブリドーマ集団を産生した。この集団は、一連の限界希釈およびスクリーニングアッセイを受けて、完全なモノクローナル細胞株を産生した。
【００８４】
細胞株命名法
産物名「Ｆ２３７  ５Ｄ１−１Ａ８−２Ａ５」は、１０種の選択したモノクローナルハイブリドーマ細胞株の１つを指す。名称は、各段階での産生経路を記述する要素からなる。融合後スクリーニングおよび各限界希釈から選択された各ハイブリドーマは、ハイブリドーマが選択されたプレート番号およびプレート上のウェル位置に相当する番号が付与される（すなわち、５Ｄ１−１Ａ８−２Ａ５）。この命名法は、それぞれ個別のハイブリドーマの由来を追跡し、スクリーニング過程の明確な区別を可能とする。
【００８５】
【表３】
2022500457.tif 000014
１これは融合およびスクリーニング後に全ての培養物に対し使用された培地である。
【表４】
2022500457.tif 000015
【表５】
2022500457.tif 000016
【００８６】
装置
・ＣＯ２細胞培養静置インキュベーター（ＳＡＮＹＯ）
・プレートリーダーＳｕｎｒｉｓｅ（Ｔｅｃａｎ）
・Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ４０Ｒ遠心分離機
・Ｇｒａｎｔ−Ｂｉｏ  Ｍｕｌｔｉｓｈａｋｅｒ  ＰＳＵ  ２０
【００８７】
方法
抗原調製
免疫原（ＩＬ−１Ｒ１）が精製されると、これらの溶液を無菌ＥＦ−ＰＢＳ中で２００μｇ／ｍｌに希釈し、６００μｌを免疫用に、および１５０μｌを追加免疫およびＥＬＩＳＡスクリーニング用に分取した。これらの分割量を標識し、−２０℃で貯蔵した。
【００８８】
免疫
５匹のＢａｌｂＣマウス集団に、２００μｌの１：１のフロイント完全アジュバント（シグマ）および本明細書で調製した６００μｌのＩＬ−１Ｒ１の乳剤を皮下に免疫した。１回目の免疫の２週間後に、この集団に、元の注射と同体積および濃度のフロイント不完全アジュバント（シグマ）のみを代わりに用いた２回目の注射により免疫した。２回目の免疫の１週間後に、マウスに耳パンチ（ＮＰ、ＲＰ、ＬＰ、ＬＲＰ、２ＬＰ）により目印を付けて、予備的結果を得るために試験採取血を本明細書に記載のようにスクリーニングした。２回目の免疫の３週間後に、集団に２回目の注射と同じ方法で３回目の免疫を行った。３回目の免疫の１週間後に、試験採取血をスクリーニングし、その後、ＲＰの耳標を有するマウスを融合のために選択した。
【００８９】
試験採取血のＥＬＩＳＡ
尾部採取血を５匹のＢａｌｂＣマウス集団から取得し、８０００ｒｐｍ、室温で１０分間の遠心分離を行った。各マウスから血清を収集し、スクリーニングと同じ日にプレートに加え、−２０℃で貯蔵した。このスクリーニングを融合に好適なマウスを選択するために２回実施した。
【００９０】
スクリーニングの前日に、１μｇ／ｍｌのＩＬ−１Ｒ１含有５０ｍＭのナトリウムカーボネートコーティング緩衝液（ｐＨ９．５）の１００μｌ／ウェルを加えることによりＭａｘｉ  Ｓｏｒｐプレートをコートした。ＡＰＯ−Ａ１を同じコーティングバッファー中で１μｇ／ｍｌに希釈することにより、別のコーティング溶液を調製した。２つのウェルに陽性および陰性の結果を示す各試料を添加することが可能なように、これらの溶液をプレートの交互の列に加えた。このプレートを４℃の静止状態で一晩インキュベートした。
【００９１】
翌朝、コーティングバッファーを除去し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（４．０％ｗ／ｖのセミスキムミルク粉末、１ｘＰＢＳ）を加え、１５０ｒｐｍ、室温下で２時間撹拌した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％ｖ／ｖのツイーン２０）で３回洗浄した。ＰＢＳを各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、１μｌの各試験採取血血清を各陽性および陰性ウェルに加えた。プレートを１５０ｒｐｍ（Ｇｒａｎｔ  Ｓｈａｋｅｒ）で２時間、室温でインキュベートした。その後、これらの試料を取り出し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。１：５０００希釈ＧＡＭ−ＨＲＰ（シグマ、ＵＫ）の１００μｌ／ウェルを加え、プレートを１５０ｒｐｍで撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。二次抗体を除去し、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回、ＰＢＳ中で１回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。ウェル当り５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを加え、直ちにプレートをＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
【００９２】
第２の試験採取血ＥＬＩＳＡスクリーニング後に、ＲＰの耳標を有するマウスを最大の陽性免疫応答を発現することにより、融合用として選択した。
【００９３】
追加免疫注射
３回目で、最終免疫の１週間後に、追加免疫注射を、１００μｌの２００μｇ／ｍｌの分取ＩＬ−１Ｒ１を、アジュバントなしでＢａｌｂＣマウスＲＰに投与した。
【００９４】
融合Ｆ２３７
融合の１週間前に、ＳＰ２細胞を液体窒素から取り出し、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミンを補充した１０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭ中で、３ｘ１２ｍｌのＴ７５フラスコが融合を行う日に７５％〜９０％の集密的になるまで継代培養した。融合の日に、フラスコをタッピングすることによりＳＰ２細胞を取り出し、１０００ｒｐｍ、３７℃で５分間遠心分離した。細胞を２０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭに再懸濁し、再度遠心分離し、１０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭに再懸濁した。ＳＰ２細胞をＳＦＭ中のステリリンチューブ中に３７℃、６％ＣＯ２下で必要になるまで貯蔵した。
【００９５】
安楽死後、最強の免疫応答を示したマウスから脾臓を無菌で取り出した。脾細胞を脾臓の両端を穿孔することにより細いゲージの注射針で抽出し、１０〜１５ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭでフラッシングした。脾細胞をステリリンチューブに移し、３７℃、１３００ｒｐｍで５分の遠心分離により２０ｍｌの無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、穏やかに上清を除去した。脾細胞をステリリンチューブ中の１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。
【００９６】
３７℃で貯蔵したＳＰ２細胞を用いて、ＳＰ２細胞を脾細胞に添加した。このＳＰ２／脾細胞培養物を３７℃、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄後、１ｍｌのＰＥＧをＳＰ２／脾細胞培養物に滴加し、その間、３分間にわたり連続的に撹拌した。１ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭを融合混合物に加え、４分間撹拌した。１０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭを新しい培養物に添加し、３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。その後、この細胞を３７℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを２００ｍＬのＨＡＴＲ培地中に再懸濁し、２００μｌ／ウェルで１０ｘ  ９６ウェル培養プレートに播種し、これを、スクリーニングの前に、６％ＣＯ２下、３７℃で１１日間インキュベートした。
【００９７】
融合後スクリーニングおよびＬＤ後スクリーニング
融合の１１日後、プロトクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２０ｘ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのＡＰＯ−Ａ１を用いて特異性の陰性対照として本明細書に記載のようにコートした。コーティング溶液を除去し、本明細書に記載のようにプレートをブロックした。１６０μｌの上清を１０個の融合プレート、限界希釈プレート、または２４ウェルプレートの各ウェルから取り出し、５０μｌの１ｘＰＢＳ含有の新しい９６ウェル培養プレートに移すことにより、試料を調製した。ブロッキングの２時間後に、ブロッキング溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。各希釈プレートからの試料を１００μｌ／ウェルの濃度で、コーティング抗原の特異性を明らかにするために、各希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートの２列毎に１列に添加することにより、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＥＬＩＳＡ毎に２つのウェルを陰性対照としての１００μｌの１ｘＰＢＳと共にインキュベートした。これらの試料を１５０ｒｐｍで２時間、室温でインキュベートした。
【００９８】
限界希釈
２４ウェルプレート中でハイブリドーマ集団が増殖され、十分に成長すると、二次スクリーニングを実施し、限界希釈のラウンドで最も特異的で、最も高産生性集団を選択した。
【００９９】
両方の限界希釈を１〜３プロトクローンに対し、それぞれ、２〜４ｘ  ９６ウェルプレートに、２００μｌ培養液／ウェル中の１細胞／ウェルで播種することにより実施した。２４ウェルプレート中の各培養物を計数することにより、プレートを調製し、中間希釈として、１０ｘに希釈し、その後、４０ｍｌ中の２００細胞に希釈した。培養物を２００μｌ／ウェルで播種し、ウェルが８０％〜９０％集密的になるまで、３７℃、６％ＣＯ２で７〜１０日間、インキュベートさせた。両方の限界希釈の各ウェルを本明細書に記載のようにＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０１００】
最終クローン選択
第２の限界希釈後に、１０種のクローンを２４ウェルプレート中での増殖のために選択した。各クローンを、各ウェルが８０％〜９０％集密的になるまで、３７℃、６％ＣＯ２で６日間増殖させた。クローンが２４ウェルプレート中で十分に確立されると、各クローンの１ｍｌ／ウェルを、凍結保存のために、５ｍｌの新しい１０％ＨＡＴＲ  ＤＭＥＭを含むＴ２５フラスコに移した。
【０１０１】
モノクローナル細胞株の凍結保存
クローンがＴ２５フラスコ中で十分に確立されると（８０％〜９０％集密度）、各５ｍｌの培養物を１０００ｒｐｍ、３７℃で５分間遠心分離し、１ｍｌの新しい１０％ＤＭＥＭ  ＨＡＴＲ培地中に再懸濁した。各１ｍｌの培養物を１：１比率のＦＣＳ／ＤＭＳＯの３００μｌを含むクライオバイアルに移した。このバイアルを密閉し、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ中に入れ、短期間の貯蔵のために、−７０℃の冷凍庫に移した。
【０１０２】
配列決定のための細胞調製
クローンＦ２３７  ５Ｄ１−１Ａ８−２Ａ５から産生した抗ＩＬ−１Ｒ１を配列決定のために選択した。Ｔ２５フラスコ中で培養物が集密的になると、上清を廃棄した。２ｍｌの新しい培地中への細胞の掻き取りにより細胞を取り出し、７，６００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。その後、上清を廃棄し、ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、ｍＲＮＡ抽出の準備ができるまで−７０℃中に置いた。
【０１０３】
免疫および試験採取血のスクリーニング
マウスのコロニーをＩＬ−１Ｒ１免疫原（社内でＣＨＯ細胞中で産生）で免疫し、定期的な試験採取血を１１週の期間にわたり取得した。ＥＬＩＳＡを使って、試験採取血をＩＬ−１Ｒ１  ｍＡｂ発現レベルに関しスクリーニングし、ｐＨｒｏｄｏ蛍光アッセイを用いて内部移行能力に関しスクリーニングした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｐ３５３６９  ａｎｄ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｍ４２８０？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＧＢ）。
【０１０４】
結果試験
採取血１
２回目免疫の１週間後に、尾部採取血をそれぞれ５匹のマウスから取得し、産生されたポリクローナル抗体の融合に好適な動物および相対的特異度の決定のために、ＩＬ−１ＲおよびＡＰＯ−Ａ１に対しスクリーニングした（図２参照）。
【０１０５】
試験採取血２
尾部採取血からの血清のスクリーニング後に、ＲＰ耳標を有するマウスが、最良の免疫応答を示したために、その脾細胞の融合パートナーＳＰ２培養物との融合のために選択された（図３参照）。
【０１０６】
融合後スクリーニング
各プレートのウェルが７０％〜８０％の集密度に達すると、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＰＯ−Ａ１に対しプレートをスクリーニングした。最高の応答を生成するハイブリドーマ集団を２４ウェルプレート中の増殖により選択した（図４参照）。
【０１０７】
１回目の２４ウェルプレートスクリーニング
クローンが、融合後スクリーニングから選択され、増殖とそれに続く、限界希釈の第１のラウンドに対し好適なプロトクローンを決定する二次スクリーニングのために２４ウェルプレート中に整列された（図５参照）。
【０１０８】
限界希釈法１スクリーニング
１回目の限界希釈プレートが集密的になると、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＰＯ−Ａ１に対し限界希釈がスクリーニングされた。１１種のハイブリドーマ集団が、最も高く、最も特異的応答を示した、Ｆ２３７  ２Ｈ１２、Ｆ２３７  ５Ｄ１、およびＦ２３７  ７Ｅ６から選択された。
【０１０９】
２回目の２４ウェルプレートスクリーニング
クローンが２４ウェルプレート中で集密的になると、各クローンは、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＰＯ−Ａ１に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。Ｆ２３７−５Ｄ１−１Ａ８が、４ｘ９６ウェルプレートに全体にわたり２回目のラウンドの限界希釈に対し選択された（図７参照）。
【０１１０】
限界希釈２スクリーニング
各プレートのウェルが７０％〜８０％の集密度に達すると、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１Ｒ１およびＡＰＯ−Ａ１に対しプレートをスクリーニングした。最高の応答および最大の特異性を生成するハイブリドーマ集団を２４ウェルプレート中の増殖および凍結保存のために選択した（図８参照）。
【０１１１】
ＴＨＰ１細胞中へのＩＬ−１Ｒ１の内部移行を免疫蛍光法により画像化した。
ＬＰＳおよびＡＴＰで処理してＩＬ−１Ｒ１の発現を誘導したＴＨＰ１マクロファージから取得した蛍光顕微鏡画像である（図１０参照）。ＩＬ−１Ｒ１に対する試験抗体を含むいくつかの異なるマウス由来のマウス血清と共に細胞をインキュベートし、これをｐＨｒｏｄｏ（商標）色素（細胞内で蛍光を発する唯一の色素）に結合した。強力なＩＬ−１Ｒ１免疫反応性がＴＨＰ１細胞の核および細胞質中で観察された。ｘ×４０倍率でのＩＬ−１Ｒ１およびＤＡＰＩ染色。対照細胞のみで処理された二次抗体では、染色は観察されなかった。画像は、２つの異なる実験で使用された４つの異なるウェル由来である。融合ハイブリドーマおよびクローニング段階に進めるために、最良のマウスが選択された。
【０１１２】
ＴＨＰ１マクロファージ（図１１参照）は、ＬＰＳおよびＡＴＰで処理され、ＩＬ−１Ｒ１の発現を誘導した。ＩＬ−１Ｒ１に対する試験モノクローナル抗体を含むいくつかのマウス由来のマウス血清と共に細胞をインキュベートし、これをｐＨｒｏｄｏ（商標）色素（細胞内で蛍光を発する唯一の色素）に結合し、フローサイトメトリーで分析した。対照二次抗体のみで処理した細胞（ｉｉ）に比べて、ＩＬ−１Ｒ１抗体処理細胞（ｉ）中でより多くの蛍光が観察された。このデータおよび図３からのデータを用いて、融合ハイブリドーマおよびクローニング段階に進めるために、最良のマウスが選択された。
【０１１３】
結論
このプロジェクトの目的は、ＩＬ−１Ｒ１に対する一連の抗体を産生することであった。マウスが免疫され、スクリーニングされると、ＲＰが融合用として選択された。１０個のモノクローナルハイブリドーマ細胞株が２回のラウンドの限界希釈から産生された。各集団は、ＩＬ−１Ｒ１に対する最高の生成および最高の特異性により選択された。これらの最終的細胞株は、凍結されており、この細胞株により発現された抗体は、配列決定される。
【０１１４】
実施例３：ＩＬ−１Ｒ１モノクローナル抗体配列決定
ｍＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞ペレットから抽出された。総ＲＮＡは、従来のＲＮＡ抽出プロトコルを用いてペレットから抽出された。細胞ペレットをＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０試薬を用いてホモジナイズした。クロロホルムの添加時に、ホモジネートは水相と有機相に分離し、総ＲＮＡが水相に単離された。イソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、続けて、エタノール洗浄および水中への可溶化を行った。
【０１１５】
ＲＴ−ＰＣＲ
オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写によりＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲ反応は、可変ドメインプライマーを用いて設定し、次のバンド（図１２参照）を与えるモノクローナル抗体ＤＮＡのＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅した
【０１１６】
ＶＨおよびＶＬ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１に挿入し、ＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、陽性形質転換体に対しＰＣＲによりスクリーニングした。選択コロニーを採取し、ＡＢＩ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、ＤＮＡ配列決定法により分析した。結果は下記に示す。
【０１１７】
配列決定結果
重鎖
ＶＨアミノ酸配列アラインメント
【化１０】
2022500457.tif 000017
ＶＨ１．１（配列番号２）
ＶＨ１．４（配列番号３）
ＶＨ１．３（配列番号４）
ＶＨ２．１（配列番号５）
ＶＨ２．５（配列番号６）
ＶＨ２．３（配列番号７）
ＶＨ１．２（配列番号８）
ＶＨ２．４（配列番号９）
コンセンサス（配列番号７）
【０１１８】
【化１１】
2022500457.tif 000018
ＶＨコンセンサスアミノ酸配列：
【化１２】
2022500457.tif 000019
可変ドメインは、太字で強調されている。
ＩＭＧＴナンバリングシステムにより決定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、下線を引いている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２（１９９９））（図１３参照）。
【０１１９】
図１３のアミノ酸描影法の凡例：
青色網掛円は、抗体の大部分の疎水性である位置でのフレームワーク１〜３中の疎水性（非極性）残基である。
黄色網掛円は、プロリン残基である。
四角は、ＣＤＲの開始および終了位置でキーとなる残基である。
フレームワーク中の赤色のアミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【０１２０】
軽鎖
ＶＬアミノ酸配列アラインメント：
【化１３】
2022500457.tif 000020
ＶＫ１．１（配列番号１０）
ＶＫ１．５（配列番号１１）
ＶＫ１．３（配列番号１２）
ＶＫ１．４（配列番号１３）
ＶＫ２．１（配列番号１４）
ＶＬ２．６（配列番号１５）
コンセンサス（配列番号１２）
【０１２１】
【化１４】
2022500457.tif 000021
ＶＬコンセンサスアミノ酸配列：
【化１５】
2022500457.tif 000022
可変ドメインは、太字で強調されている。
ＩＭＧＴナンバリングシステムにより決定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、下線を引いている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２（１９９９））（図１４参照）。
【０１２２】
図１４のアミノ酸描影法の凡例：
青色網掛円は、抗体の大部分の疎水性である位置でのフレームワーク１〜３中の疎水性（非極性）残基である。
黄色網掛円は、プロリン残基である。
四角は、ＣＤＲの開始および終了位置でキーとなる残基である。
フレームワーク中の赤色のアミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
ＶＨ配列決定結果：
ＶＨ１．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号１６）
ＶＨ１．１アミノ酸配列：
ＭＥＷＳＣＶＭＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＡ（配列番号２）
ＶＨ１．３  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ（配列番号１７）
ＶＨ１．３アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＡ（配列番号４）
ＶＨ１．４  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡ（配列番号１８）
ＶＨ１．４アミノ酸配列：
ＭＥＣＳＣＶＭＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＲＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＦＰＬＡ（配列番号３）
ＶＨ２．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＣ（配列番号１９）
ＶＨ２．１アミノ酸配列：
ＭＧＷＶＷＮＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＶ（配列番号５）
ＶＨ１．２  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号２０）
ＶＨ１．２アミノ酸配列：
ＭＤＷＶＷＴＬＰＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号８）
ＶＨ２．３  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＧＣＣ（配列番号２１）
ＶＨ２．３アミノ酸配列：
ＭＧＷＶＷＮＬＰＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＡ（配列番号７）
ＶＨ２．４  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号２２）
ＶＨ２．４アミノ酸配列：
ＭＤＷＬＷＮＬＰＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＡ（配列番号９）
ＶＨ２．５  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＧＴＣ（配列番号２３）
ＶＨ２．５アミノ酸配列：
ＭＧＷＶＷＴＬＰＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＰＶＹＰＬＶ（配列番号６）
【０１２３】
ＶＬ配列決定結果：
ＶＫ１．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号２４）
ＶＫ１．１アミノ酸配列：
ＭＲＡＰＡＱＦＬＧＬＬＬＬＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号１０）
ＶＫ１．３  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡ（配列番号２５）
ＶＫ１．３アミノ酸配列：
ＭＲＳＰＡＱＦＬＧＬＬＬＦＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号１２）
ＶＫ１．４  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡ（配列番号２６）
ＶＫ１．４アミノ酸配列：
ＭＲＳＰＡＱＦＬＧＬＬＬＦＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号１３）
ＶＫ１．５  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号２７）
ＶＫ１．５アミノ酸配列：
ＭＲＡＰＡＱＬＬＧＬＬＬＦＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＮＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号１１）
ＶＫ２．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡ（配列番号２８）
ＶＫ２．１アミノ酸配列：
ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＦＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号１４）
ＶＫ２．６  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡ（配列番号２９）
ＶＫ２．６アミノ酸配列：
ＭＶＳＴＡＱＦＬＧＬＬＬＦＷＴＳＡＳＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号１５）
【０１２４】
実施例４−ＮＬＲＰ３抗原合成
ＮＬＲＰ３インフラマソームの形成を抑制できる抗体応答を生成するＮＬＲＰ３に対するペプチド（抗原）の設計
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、哺乳動物細胞中で炎症性の刺激に反応して形成される不均一タンパク質複合体であり、その形成を調節し、弱める能力は、一連の炎症性疾患に対する重要な治療潜在力を有し得る。ＮＡＬＰ３タンパク質配列由来の、ＮＬＲＰ３インフラマソーム複合体中の他のタンパク質成分へのＮＡＬＰ３の結合を遮断できる抗体を生成するはずのペプチドが設計される。
【０１２５】
ＮＬＲＰ３活性化は、ＮＬＲＰタンパク質のＡＳＣとの自己集合により起こり、これは、ＣＡＲＤ、ＰＹＤおよびカスパーゼ１ドメインのヘテロ複合体である。ＮＬＲＰ３およびＡＳＣは、それらそれぞれのＰＹＤドメインを通して相互作用し、ＰＹＤドメインは、大きな比率の高度に保存された荷電アミノ酸残基を含み、これが相互作用して、静電相互作用を形成し、複合体を安定化する（図１５参照）。
【０１２６】
図１６は、ＣＬＵＳＴＡＬ０（１．２．４）を用いたヒトおよびマウスＮＡＬＰ（ＮＬＲＰ）タンパク質のＣ末端ドメインのコンセンサス配列の配列アラインメントを示す図である。赤は、部位特異的変異誘発によるＮＬＲＰ／ＡＳＣ相互作用に不可欠であると認められる残基を示す（Ｖａｊｊｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。
【０１２７】
ペプチド選択は、広範に研究され、ＡＳＣとの相互作用に関与している１〜６１の配列領域に注力された（Ｖａｊｊｈａｌａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。この領域はまた、結晶学により十分にモデル化され、多くのＰＤＢ構造がこのドメインに対して利用可能である。ＰＮＬＲＰ３のＰＹＲドメインからなるＰＤＢモデル３ＱＦ２を、最も有用なＰＤＢ構造的基準として選択した。初期ペプチド候補配列は、可能なエピトープとしての利便性および視認性、およびまた、マウスとヒト配列との間の類似性の程度を基準に選択されたが、他のＮＬＲＰ変種との差異は保持された。これら初期の３種のペプチドは、ＮｏｖａＦｏｌｄを用いて、３Ｄ構造にモデル化された。
【０１２８】
ＮｏｖａＦｏｌｄ分析
ＮｏｖａＦｏｌｄは、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲアルゴリズム：テンプレートベーススレッディング（ＰＤＢから）および第一原理法の組み合わせを使用して、タンパク質またはペプチドの折り畳みを予測する３Ｄタンパク質モデル化ソフトウェアである。この状況では、親タンパク質内でインサイツ配列により示されることが既知のペプチド内の二次構造的特徴の存在を予測するために使用される。これは、親タンパク質内の折り畳みおよび近接度をベースにした関係を最も良く反映し、抗体中の免疫原性タンパク質の潜在能力を最大化するのを支援し、完全長タンパク質中の対応するエピトープに対する完全活性化抗体をもたらす、ペプチド配列の選択の最適化を支援できる。
【０１２９】
ペプチドのモデル化および整列
ＮｏｖａＦｏｌｄを用いて４種の別個の配列をモデル化し、得られた最高得点のモデルを評価した後、ＰＤＢ：３ＱＦ２に示されるように、親ＮＬＲＰ３構造に整列させた。
【表６】
2022500457.tif 000023
【０１３０】
モデル化および比較は、ペプチドＦＵＳ＿７４６＿００１がペプチド免疫原として使用するのに好ましい候補であることを示す。親タンパク質のモデルと最大の整列を示すことに加えて、それは、二次構造の予測での高い類似性も示し、利用可能なエピトープ標的である。ＮｏｖａＦｏｌｄ予測構造を用いたペプチドＦＵＳ＿７４６＿００１整列を図１７に示す。
【０１３１】
結論
ソフトウェアのモデル化は、常に、確定的ではなく、推奨として受け取られるべきであり、親分子内で見つかるべき強い二次構造的特徴が既知でない場合は特に、この基準で解釈されるべきである。しかし、これを念頭に置いても、このモデル化は、ペプチドＦＵＳ＿７４６＿００１、配列ＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧＱＴＥＫＡＤＨＶＤ（配列番号３０）は、親タンパク質への整列および予測された抗原性を基準にして、このプロジェクトの免疫原として選択するための最良の候補であろう。ペプチドはまた、マウスとヒト配列との間のほんのわずかの差異点を示し、これは、望ましい特徴でもある、これらの種間で交差反応性を許容し、他方で、他のＮＬＲＰ型に対する交差反応性を最小化する、マウスの抗体応答の生成を支援する。注記：ＫＬＨへの架橋のためには、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を付加することが推奨される。
参考文献
【０１３２】
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，２００８．Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３  Ｊａｎ．９（４０）．
Ｖａｊｊｈａｌａ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｉｒａｍｓ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｍ．（２０１２）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｙｒｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＡＳＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｌｏｗ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＬＲＰ３  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，４１７３２−４１７４３．
【０１３３】
ＮＬＲＰ３抗原合成
ｂｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ，Ｔｅｘａｓにより、追加のＣ末端システイン残基を介して、マレイミドカップリングを用いてＫＬＨに結合し、ＮＬＲＰ３ペプチドを合成した。
ＮＬＲＰ３免疫原を免役したマウスからの１回目の採取血のＥＬＩＳＡスクリーニング結果（図１８参照）。
【０１３４】
実施例５−ＮＬＲＰ３に対するモノクローナル抗体の生成
５匹のマウス集団に免疫し、陽性免疫応答に関しスクリーニングされた。融合に好適する候補の選定後、脾細胞をパートナー細胞と融合して、ハイブリドーマ集団を産生した。この集団は、一連の限界希釈およびスクリーニングアッセイを受けて、完全なモノクローナル細胞株を産生した。
【０１３５】
細胞株命名法
産物名「Ｆ２２６  ７Ａ７−１Ｅ１−２Ｄ５」は、１０種の選択したモノクローナルハイブリドーマ細胞株の１つを指す。名称は、各段階での産生経路を記述する要素からなる。融合後スクリーニングおよび各限界希釈から選択された各ハイブリドーマは、ハイブリドーマが選択されたプレート番号およびプレート上のウェル位置に相当する番号が付与された（すなわち、７Ａ７−１Ｅ１−２Ｄ５）。この命名法は、それぞれ個別のハイブリドーマの由来を追跡し、スクリーニング過程の明確な区別を可能とする。
【０１３６】
【表７】
2022500457.tif 000024
１これは融合およびスクリーニング後に全ての培養物に対し使用された培地である。
【０１３７】
材料
【表８】
2022500457.tif 000025
【表９】
2022500457.tif 000026
【０１３８】
装置
・ＣＯ２細胞培養静置インキュベーター（ＳＡＮＹＯ）
・プレートリーダーＳｕｎｒｉｓｅ（Ｔｅｃａｎ）
・Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ４０Ｒ遠心分離機
・Ｇｒａｎｔ−Ｂｉｏ  Ｍｕｌｔｉｓｈａｋｅｒ  ＰＳＵ  ２０
【０１３９】
方法
抗原調製
免疫原、ＮＬＲＰ３ペプチド−ＫＬＨ複合体（ｂｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ，Ｔｅｘａｓ）が受け入れられると、これらの溶液を無菌ＥＦ−ＰＢＳ中で４００μｇ／ｍｌに希釈し、６００μｌを免疫用に、および１５０μｌを追加免疫およびＥＬＩＳＡスクリーニング用に分取した。これらの分割量を標識し、−２０℃で貯蔵した。
【０１４０】
免疫
５匹のＢａｌｂＣマウス集団に、２００μｌの１：１のフロイント完全アジュバント（シグマ）および本明細書で調製した６００μｌの分取量のＮＬＲＰ３ペプチド−ＫＬＨ複合体の乳剤を皮下に免疫した。１回目の免疫の２週間後に、この集団に、元の注射と同体積および濃度のフロイント不完全アジュバント（シグマ）のみを代わりに用いた２回目の注射により免疫した。２回目の免疫の１週間後に、マウスに耳パンチ（ＮＰ、ＲＰ、ＬＰ、ＬＲＰ、２ＬＰ）により目印を付けて、予備的結果を得るために試験採取血を本明細書に記載のようにスクリーニングした。２回目の免疫の３週間後に、集団に２回目の注射と同じ方法で３回目の免疫を行った。３回目の免疫の１週間後に、試験採取血をスクリーニングし、その後、ＲＰを融合のために選択した。
【０１４１】
試験採取血のＥＬＩＳＡ
尾部採取血を5匹のＢａｌｂＣマウス集団から取得し、８０００ｒｐｍ、室温で１０分間の遠心分離を行った。各マウスから血清を収集し、スクリーニングと同じ日にプレートに加え、−２０℃で貯蔵した。このスクリーニングを融合に好適なマウスを選択するために２回実施した。
【０１４２】
スクリーニングの前日に、１μｇ／ｍｌの遊離ＮＬＲＰ３ペプチド含有５０ｍＭのナトリウムカーボネートコーティング緩衝液（ｐＨ９．５）の１００μｌ／ウェルを加えることによりＭａｘｉ  Ｓｏｒｐプレートをコートした。ＡＰＯ−Ａ１を同じコーティングバッファー中で１μｇ／ｍｌに希釈することにより、別のコーティング溶液を調製した。２つのウェルに陽性および陰性の結果を示す各試料を添加することが可能なように、これらの溶液をプレートの交互の列に加えた。このプレートを４℃の静止状態で一晩インキュベートした。
【０１４３】
翌朝、コーティングバッファーを除去し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（４．０％ｗ／ｖのセミスキムミルク粉末、１ｘＰＢＳ）を加え、１５０ｒｐｍ、室温下で２時間撹拌した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％ｖ／ｖのツイーン２０）で３回洗浄した。ＰＢＳを各ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、１μｌの各試験採取血血清を各陽性および陰性ウェルに加えた。プレートを１５０ｒｐｍ（Ｇｒａｎｔ  Ｓｈａｋｅｒ）で２時間、室温でインキュベートした。その後、これらの試料を取り出し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。１：５０００希釈ＧＡＭ−ＨＲＰ（シグマ、ＵＫ）の１００μｌ／ウェルを加え、プレートを１５０ｒｐｍで撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。二次抗体を除去し、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回、ＰＢＳ中で１回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。ウェル当り５０μｌの１Ｍ  ＨＣｌを加え、直ちにプレートをＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１４４】
第２の試験採取血ＥＬＩＳＡスクリーニング後に、ＲＰを最大の陽性免疫応答を発現することにより、融合用として選択した。
【０１４５】
追加免疫注射
３回目で、最終免疫の１週間後に、追加免疫注射を、１００μｌの２００μｇ／ｍｌの分取ＩＬ−１Ｒを、アジュバントなしでＢａｌｂＣマウスＲＰに投与した。
【０１４６】
融合Ｆ２２６
融合の１週間前に、ＳＰ２細胞を液体窒素から取り出し、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミンを補充した１０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭ中で、３ｘ１２ｍｌのＴ７５フラスコが融合を行う日に７５％〜９０％の集密的になるまで継代培養した。
融合の日に、フラスコをタッピングすることによりＳＰ２細胞を取り出し、１０００ｒｐｍ、３７℃で５分間遠心分離した。細胞を２０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭに再懸濁し、再度遠心分離し、１０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭに再懸濁した。ＳＰ２細胞をＳＦＭ中のステリリンチューブ中に３７℃、６％ＣＯ２下で必要になるまで貯蔵した。
【０１４７】
安楽死後、最強の免疫応答を示したマウスから脾臓を無菌で取り出した。脾細胞を脾臓の両端を穿孔することにより細いゲージの注射針で抽出し、１０〜１５ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭでフラッシングした。脾細胞をステリリンチューブに移し、３７℃、１３００ｒｐｍで５分の遠心分離により２０ｍｌの無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、穏やかに上清を除去した。脾細胞をステリリンチューブ中の１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。
【０１４８】
３７℃で貯蔵したＳＰ２細胞を用いて、ＳＰ２細胞を脾細胞に添加した。このＳＰ２／脾細胞培養物を３７℃、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄後、１ｍｌのＰＥＧをＳＰ２／脾細胞培養物に滴加し、その間、３分間にわたり連続的に撹拌した。１ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭを融合混合物に加え、４分間撹拌した。１０ｍｌのＳＦＭ  ＤＭＥＭを新しい培養物に滴加し、３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。その後、この細胞を３７℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを２００ｍＬのＨＡＴＲ培地中に再懸濁し、２００μｌ／ウェルで１０ｘ  ９６ウェル培養プレートに播種し、これを、スクリーニングの前に、６％ＣＯ２下、３７℃で１１日間インキュベートした。
【０１４９】
融合後スクリーニングおよびＬＤ後スクリーニング
融合の１１日後、プロトクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２０ｘ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂ９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌのＡＰＯ−Ａ１を用いて特異性の陰性対照としてセクション０で記載のようにコートした。コーティング溶液を除去し、本明細書に記載のようにプレートをブロックした。１６０μｌの上清を１０個の融合プレート、限界希釈プレート、または２４ウェルプレートの各ウェルから取り出し、５０μｌの１ｘＰＢＳ含有の新しい９６ウェル培養プレートに移すことにより、試料を調製した。ブロッキングの２時間後に、ブロッキング溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。各希釈プレートからの試料を１００μｌ／ウェルの濃度で、コーティング抗原の特異性を明らかにするために、各希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートの２列毎に１列に添加することにより、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＥＬＩＳＡ毎に２つのウェルを陰性対照としての１００μｌの１ｘＰＢＳと共にインキュベートした。これらの試料を１５０ｒｐｍで２時間、室温でインキュベートした。
【０１５０】
限界希釈
２４ウェルプレート中でハイブリドーマ集団が増殖され、十分に成長すると、二次スクリーニングを実施し、限界希釈のラウンドで最も特異的で、最も高産生性集団を選択した。
【０１５１】
両方の限界希釈を１〜３プロトクローンに対し、それぞれ、２〜４ｘ  ９６ウェルプレートに、２００μｌ培養液／ウェル中の１細胞／ウェルで播種することにより実施した２４ウェルプレート中の各培養物を計数することにより、プレートを調製し、中間希釈として、１０ｘに希釈し、その後、４０ｍｌ中の２００細胞に希釈した。培養物を２００μｌ／ウェルで播種し、ウェルが８０％〜９０％集密的になるまで、３７℃、６％ＣＯ２で７〜１０日間、インキュベートさせた。両方の限界希釈の各ウェルをセクション０に記載のようにＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０１５２】
最終クローン選択
第２の限界希釈後に、１０種のクローンを２４ウェルプレート中での増殖のために選択した。各クローンを、各ウェルが８０％〜９０％集密的になるまで、３７℃、６％ＣＯ２で６日間増殖させた。クローンが２４ウェルプレート中で十分に確立されると、各クローンの１ｍｌ／ウェルを、凍結保存のために、５ｍｌの新しい１０％ＨＡＴＲ  ＤＭＥＭを含むＴ２５フラスコに移した。
【０１５３】
モノクローナル細胞株の凍結保存
クローンがＴ２５フラスコ中で十分に確立されると（８０％〜９０％集密度）、各５ｍｌの培養物を１０００ｒｐｍ、３７℃で５分間遠心分離し、１ｍｌの新しい１０％ＤＭＥＭ  ＨＡＴＲ培地中に再懸濁した。各１ｍｌの培養物を１：１比率のＦＣＳ／ＤＭＳＯの３００μｌを含むクライオバイアルに移した。このバイアルを密閉し、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ中に入れ、短期間の貯蔵のために、−７０℃の冷凍庫に移した。
【０１５４】
配列決定のための細胞調製
クローンＦ２２６  ７Ａ７−１Ｅ１−２Ｄ５から産生した抗ＮＬＲＰ３を配列決定のために選択した。Ｔ２５フラスコ中で培養物が集密的になると、上清を廃棄した。２ｍｌの新しい培地中への細胞の掻き取りにより細胞を取り出し、７，６００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。その後、上清を廃棄し、ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、ｍＲＮＡ抽出の準備ができるまで−７０℃中に置いた。
【０１５５】
免疫および試験採取血のスクリーニング
マウスのコロニーをＮＬＲＰ３ペプチド−ＫＬＨ複合体（生物情報学でデザインし、ｂｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ，Ｔｅｘａｓにより合成）で免疫し、定期的な試験採取血を１１週の期間にわたり取得した。その後、試験採取血を抗原に対しスクリーニングした。
【０１５６】
陽性マウスの特定時に、融合を実施し、次に、ハイブリドーマクローン由来の上清を検証した。その後、特異的抗体を限界希釈およびクローニングに供し、ＮＬＲＰ３に対する安定なハイブリドーマ細胞株を産生した。
【０１５７】
ＥＬＩＳＡを用いて標的タンパク質−ＮＬＲＰ３−に対して抗体をスクリーニングし、少なくともバックグラウンドの３倍のシグナルを有するクローンを選択した。２４個のクローンからの抗体を選択し、さらに社内試験を実施して、最良の６個のクローンを選出した。
【０１５８】
結果
試験採取血１
２回目免疫の１週間後に、尾部採取血をそれぞれ５匹のマウスから取得し、産生されたポリクローナル抗体の融合に好適な動物および相対的特異度の決定のために、非コンジュゲートＮＬＲＰ３ペプチドおよびＡＰＯ−Ａ１に対しスクリーニングした（図１９参照）。
【０１５９】
試験採取血２
尾部採取血からの血清のスクリーニング後に、２ＲＰが、最良の免疫応答を示したために、その脾細胞の融合パートナーＳＰ２培養物との融合のために選択された（図２０参照）。
【０１６０】
融合後スクリーニング
各プレートのウェルが７０％〜８０％の集密度に達すると、ＥＬＩＳＡにより、ＮＬＲＰ３ペプチドおよびＡＰＯ−Ａ１に対しプレートをスクリーニングした。最高の応答を生成するハイブリドーマ集団を２４ウェルプレート中の増殖により選択した（図２１参照）。
【０１６１】
１回目の２４ウェルプレートスクリーニング
クローンが、融合後スクリーニングから選択され、増殖とそれに続く、限界希釈の第１のラウンドに対し好適なプロトクローンを決定する二次スクリーニングのために２４ウェルプレート中に整列された。３個のクローンが選択され、限界希釈が調製された（図２２参照）。
【０１６２】
限界希釈法１スクリーニング
１回目の限界希釈プレートが集密的になると、ＥＬＩＳＡにより、ＮＬＲＰ３ペプチドおよびＡＰＯ−Ａ１に対し限界希釈がスクリーニングされた。３１種のハイブリドーマ集団が、最も高く、最も特異的応答を示した、Ｆ２２６  ５Ｂ７および７Ａ７から選択された。３Ｄ４由来のクローンは好適しなかった（図２３参照）。
【０１６３】
２回目の２４ウェルプレートスクリーニング
クローンが２４ウェルプレート中で集密的になると、各クローンは、ＮＬＲＰ３ペプチドおよびＡＰＯ−Ａ１に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。Ｆ２２６  ５Ｂ７−１Ｅ１０、５Ｂ７−１Ｇ２、７Ａ７−１Ｃ４および７Ａ７−１Ｅ１が、２ｘ  ９６ウェルプレート全体にわたり２回目のラウンドの限界希釈に対しクローン毎に選択された（図２４参照）。
【０１６４】
限界希釈２スクリーニング
各プレートのウェルが７０％〜８０％の集密度に達すると、ＥＬＩＳＡにより、ＮＬＲＰ３ペプチドおよびＡＰＯ−Ａ１に対しプレートをスクリーニングした。最高の応答および最大の特異性を生成する２４種のハイブリドーマ集団を２４ウェルプレート中の増殖および凍結保存のために選択した（図２５参照）。
【０１６５】
ドットブロット分析を図２６に示す。ＴＨＰ−１マクロファージ由来のタンパク質溶解物を用いてドットブロットを実施し、融合ハイブリドーマ細胞株（Ａ２５＝陽性対照：市販の抗ＮＬＲＰ３モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａ２６＝陰性対照：ＰＢＳ）からの最良の２４クローンから収集した抗ＮＬＲＰ３モノクローナル抗体含有上清を試験した。クローン６、１１、１５、１６、１８および２０を選択し、ウェスタンブロッティングでさらに試験した。
【０１６６】
ウェスタンブロット分析を図２７に示す。ＴＨＰ−１マクロファージ由来のタンパク質溶解物を用いてウェスタンブロットを実施し、未処理（レーン１）およびＬＰＳおよびＡＴＰで刺激した（レーン２、（タンパク質ラダーレーン３））融合ハイブリドーマ細胞株からの最良の６クローンから収集した抗ＮＬＲＰ３モノクローナル抗体含有上清を試験した。クローン１８を、配列決定用に選択し、二重特異的モノクローナル抗体開発に使用した。
【０１６７】
結論
このプロジェクトの目的は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの構築を妨害するのに機能的である、ＮＬＲＰ３に対する一連の抗体を産生することであった。マウスが免疫され、スクリーニングされると、２ＲＰが融合用として選択された。２４種のモノクローナルハイブリドーマ細胞株が２回のラウンドの限界希釈から産生された。各集団は、ＮＬＲＰ３に対する最高の生成および最高の特異性により選択された。クローンＦ２２６  ７Ａ７−１Ｅ１−２Ｄ５が、ＮＬＲＰ３構築の防止に対し最も活性であることがインビトロアッセイで示された。これらの最終的細胞株は、凍結されており、この７Ａ７−１Ｅ１−２Ｄ５により発現された抗体は、二重特異的ＩｎｆｌａＭａｂの産生における次の段階のために配列決定される。
【０１６８】
実施例６−ＮＬＲＰ３モノクローナル配列決定
ｍＲＮＡは、２０１６年２月２３日に、ハイブリドーマ細胞ペレットから抽出された。総ＲＮＡは、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄの自社製ＲＮＡ抽出プロトコルを用いてペレットから抽出された（実施例３参照）。
【０１６９】
ＲＴ−ＰＣＲ
オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写によりＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲ反応は、可変ドメインプライマーを用いて設定し、次のバンド（図２８参照）を与えるモノクローナル抗体ＤＮＡのＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅した
【０１７０】
ＶＨおよびＶＬ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ配列決定ベクターｐＣＲ２．１に挿入し、ＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、陽性形質転換体に対しＰＣＲによりスクリーニングした。選択コロニーを採取し、ＡＢＩ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、ＤＮＡ配列決定法により分析した。結果は下記に示す。
【０１７１】
配列決定結果
重鎖
ＶＨアミノ酸配列アラインメント
【化１６】
2022500457.tif 000027
ＶＨ１．１（配列番号３３）
ＶＨ３．７（配列番号３４）
ＶＨ３．４（配列番号３５）
ＶＨ３．１（配列番号３６）
ＶＨ３．５（配列番号３６）
ＶＨ３．８（配列番号３６）
コンセンサス（配列番号３６）
【０１７２】
【化１７】
2022500457.tif 000028
ＶＨコンセンサスアミノ酸配列：
【化１８】
2022500457.tif 000029
可変ドメインは、太字で強調されている。
ＩＭＧＴナンバリングシステムにより決定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、下線を引いている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２（１９９９））（図２９参照）。
【０１７３】
図２９のアミノ酸描影法の凡例：
青色網掛円は、抗体の大部分の疎水性である位置でのフレームワーク１〜３中の疎水性（非極性）残基である。
黄色網掛円は、プロリン残基である。
四角は、ＣＤＲの開始および終了位置でキーとなる残基である。
フレームワーク中の赤色のアミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【０１７４】
軽鎖
ＶＬアミノ酸配列アラインメント：
【化１９】
2022500457.tif 000030
ＶＬ１．１（配列番号３７）
ＶＬ１．６（配列番号３８）
ＶＬ１．２（配列番号３９）
ＶＬ１．７（配列番号４０）
ＶＬ１．４（配列番号４１）
ＶＬ１．５（配列番号４２）
コンセンサス（配列番号４３）
【０１７５】
【化２０】
2022500457.tif 000031
ＶＬコンセンサスアミノ酸配列：  
【化２１】
2022500457.tif 000032
可変ドメインは、太字で強調されている。
ＩＭＧＴナンバリングシステムにより決定される相補性決定領域（ＣＤＲ）には、下線を引いている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２（１９９９））（図３０参照）。
【０１７６】
図３０のアミノ酸描影法の凡例：
青色網掛円は、抗体の大部分の疎水性である位置でのフレームワーク１〜３中の疎水性（非極性）残基である。
黄色網掛円は、プロリン残基である。
四角は、ＣＤＲの開始および終了位置でキーとなる残基である。
フレームワーク中の赤色のアミノ酸は、構造的に保存されたアミノ酸である。
【０１７７】
ＶＨ配列決定結果：
ＶＨ１．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧ（配列番号４４）
ＶＨ１．１アミノ酸配列：
ＭＮＦＧＬＳＬＶＦＬＶＬＶＬＫＧＡＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫ（配列番号３３）
ＶＨ３．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号４５）
ＶＨ３．１  アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号３６）
ＶＨ３．４  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号４６）
ＶＨ３．４  アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＲＶＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号３５）
ＶＨ３．５  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号４７）
ＶＨ３．５  アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号３６）
ＶＨ３．７  ＤＮＡ配列：
ＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号４８）
ＶＨ３．７  アミノ酸配列：
ＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号３３）
ＶＨ３．８  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号４９）
ＶＨ３．８  アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡ（配列番号３６）
【０１７８】
ＶＬ配列決定結果：
ＶＬ１．１  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５０）
ＶＬ１．１アミノ酸配列：
ＭＡＷＩＳＬＩＦＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＶＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＴＥＥＬＳＬ（配列番号３７）
ＶＬ１．２  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５１）
ＶＬ１．２アミノ酸配列：
ＭＡＷＴＳＬＬＬＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＣＰＰＳＳＥＫＬＳＬ（配列番号３９）
ＶＬ１．４  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＴＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５２）
ＶＬ１．４アミノ酸配列：
ＭＡＷＩＰＬＬＦＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＩＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＬＥＫＬＳＬ（配列番号４１）
ＶＬ１．５  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５３）
ＶＬ１．５アミノ酸配列：
ＭＡＷＩＳＬＬＬＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＴＥＥＬＳＬ（配列番号４２）
ＶＬ１．６  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５４）
ＶＬ１．６アミノ酸配列：
ＭＡＷＩＳＬＩＦＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＳＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＹＰＰＳＴＫＥＬＳＬ（配列番号３８）
ＶＬ１．７  ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧ（配列番号５５）
ＶＬ１．７アミノ酸配列：
ＭＡＷＴＳＬＬＦＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＡＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＣＰＰＳＴＥＫＬＳＬ（配列番号４０）
【０１７９】
実施例７−ＩｎｆｌａＭａｂ設計−ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の両方に対する二重特異性抗体の開発
モノクローナル抗体ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３の可変ドメイン配列の配列を決定した。
【０１８０】
ＩｇＧ２ａマウス定常ドメイン配列を有するＩＬ−１Ｒ１抗体を用いて抗体を構築した短いリンカーを重鎖のＣ末端に付加し、リンカー（ＧＧＧＧＳ）３を有するｓｃＦｖフォーマットのＮＬＰＲ３可変ドメインを結合して二重特異性を作り出した。ＤＮＡおよびアミノ酸配列は以下で見つけることができる。
【０１８１】
構築物をＡＴＵＭベクターｐＤ２６１０−ｖ５に挿入し、配列決定のより検証した。図３１は、ＩｎｆｌａＭａｂの二重特異性設計およびプラスミドマップを示す。
【０１８２】
設計した二重特異性抗体配列
軽鎖ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＴＣＴＣＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＧＡＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＡＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＴＣＧＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＧＡＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＣＴＴＧＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＴＣＡＡＣＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＡ（配列番号５６）
軽鎖アミノ酸配列：
ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ＊＊（配列番号５７）
重鎖ＤＮＡ配列：
ＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＡＡＧＴＧＣＣＴＡＡＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＧＣＧＴＧＴＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＡＡＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＴＴＣＧＧＡＣＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＧＡＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＧＣＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡ（配列番号５８）
重鎖アミノ酸配列：
ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫ＊＊（配列番号５９）
【０１８３】
実施例８−ＩｎｆｌａＭａｂ（ＩＬ−１Ｒ１およびＮＬＲＰ３に対して二重特異性）一過性発現
目標は、ＩｎｆｌａＭａｂベクターＤＮＡのＥｘｐｉＣＨＯ細胞への一過性遺伝子導入を実施することであった。培養後、発現したＩｎｆｌａＭａｂを培養上清から精製し、ＱＣ分析を精製タンパク質に対し実施した。
【０１８４】
ＩｎｆｌａＭａｂは、軽鎖の２つの対および重鎖の２つの対から構成され、Ｎ末端に融合されたｓｃＦｖドメインを有し、ジスルフィド結合を介して一緒に複合体化された、２１０キロダルトン（ｋＤａ）の二重特異的マウス抗体である。ＩｎｆｌａＭａｂをコードする哺乳動物発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。その後、発現した抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性クロマトグラフィーを介して清澄化培養上清から精製した。精製抗体の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを用いて測定し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。
【０１８５】
配列
ＩｎｆｌａＭａｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、哺乳動物一過性発現プラスミドｐＤ２６１０−ｖ５（Ａｔｕｍ）に挿入した。
プラスミドＩｎｆｌａＭａｂ：
＞ＩｎｆｌａＭａｂ軽鎖（理論ＭＷ＝２６．７ｋＤａ）
ＭＶＳＳＡＱＦＬＧＬＬＬＬＣＦＱＧＴＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＲＶＳＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＳＷＹＱＱＲＳＨＥＳＰＲＬＩＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＰＥＤＶＧＶＹＹＣＱＨＧＨＳＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号５７）
＞ＩｎｆｌａＭａｂ重鎖（理論ＭＷ＝７９．３ｋＤａ）
ＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＲＫＰＧＥＴＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＡＧＬＱＷＶＱＫＭＳＧＫＧＬＫＷＩＧＷＭＮＴＱＳＥＶＰＫＹＡＥＥＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＡＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＹＦＮＷＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫＧＳＡＧＧＳＧＧＤＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＹＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＶＳＴＭＶＫＬＬＳＳＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫ（配列番号５９）
【０１８６】
ＣＨＯ細胞の一過性遺伝子導入
懸濁適応（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｄａｐｔｅｄ）ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）を通常の方法で、３７℃、８％ＣＯ２下、１３５ｒｐｍで撹拌しながら、５００ｍｌのエルレンマイヤーベントフラスコ中で、２〜３日毎に１．０〜３．０ｘ１０５個の細胞／ｍｌで培養した。Ｐｕｒｅｌｉｎｋ  Ｈｉｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）を用いて、製造業者の説明書に従って、遺伝子導入用のプラスミドＤＮＡを単離した。Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ光度計を用いて、製造業者の説明書に従い、ＤＮＡを定量した。
【０１８７】
遺伝子導入の２４時間前に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を４．０ｘ１０６個の細胞／ｍｌの濃度でＥｘｐｉＣＨＯ発現培地中に播種し、１３５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２下で、一晩増殖させた。遺伝子導入の日に、２５０ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ発現培地中で最終密度の６．０ｘ１０６個の細胞／ｍｌに希釈した。１．０μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡおよび０．３２％（ｖ／ｖ）Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、４％（ｖ／ｖ）ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に別々に希釈した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯ／Ｏｐｔｉｐｒｏ複合体をプラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｐｒｏ複合体に滴加した。遺伝子導入混合物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞に直ちに添加した。遺伝子導入した細胞を１３５ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。
【０１８８】
遺伝子導入の２０時間後、培養物に０．６％（ｖ／ｖ）ＥｘｉＣＨＯエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）および２４％ＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）を補充した。細胞の生存率を厳密に監視し、室温、４０００ｒｐｍで４０分間の遠心分離により８日目に培養物を回収した。
【０１８９】
ＩｎｆｌａＭａｂの精製
ＡＫＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィー装置を用いて精製を行った。使用前に、１ＭのＮａＯＨを用いて全てのＡＫＴＡ装置を完全に消毒した。遠心分離後に、濾過した（０．２２μｍ）細胞培養上清を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（洗浄バッファーと平衡化されている）を備えたＡＫＴＡシステムに適用した。充填後、カラムを２０カラム体積の洗浄バッファーで洗浄した。結合抗体を１０カラム体積の溶出バッファーで段階溶出した。全ての溶出画分をトリスｐＨ９．０バッファーで中和した。溶出ピークに相当する溶出画分をＰＢＳへの一晩の透析のために選択した。抗体の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドミディゲルにより判定して、＞９５％であった。
【０１９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３２参照）
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）を精製された抗体に対し標準的方法で実施した。分子量マーカーは、キロダルトンで示される。図３２のレーンは次の通りである：
【表１０】
2022500457.tif 000033
【０１９１】
ＩｎｆｌａＭａｂは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの分析により判定して、≧９５％である。還元条件下で、抗体の重鎖および軽鎖の両方は、目視可能であり、それぞれ約８０および２７ｋＤａの予測された分子量で観察された。非還元条件の場合は、ただ１つのより大きいバンドおよびいくつかのより小さいバンドが観察された。追加のバンド（不純物）は、非グリコシル化されたＩｇＧおよびＩｇＧ分解生成物の結果の可能性がある（例えば、単一の［部分的］軽鎖、２つの重鎖および１つの軽鎖、２つの重鎖、２つの重鎖と１つの軽鎖の組み合わせ）。
【０１９２】
精製されたＩｎｆｌａＭａｂの評価
精製されたＩｎｆｌａＭａｂをＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ  分光光度計および吸光係数３３０、６８５Ｍ−１ｃｍ−１（または１．０ｍｇ／ｍｌ＝Ａ２８０の１．７［ＭＷ＝１８４，２７６Ｄａを仮定して］）を用いて、製造業者の説明書に従って定量した。０．３リットルの遺伝子導入細胞培養上清から合計１７．５ｍｇのＩｎｆｌａＭａｂを精製した。
【表１１】
2022500457.tif 000034
【０１９３】
まとめ：ＩｎｆｌａＭａｂ
材料：精製抗体
起源：チャイニーズハムスター（学名：モンゴルキヌゲネズミ）卵巣細胞株（ハムスターまたは動物成分添加せず）で産生
【表１２】
2022500457.tif 000035
無害、非感染性。研究用途限定。
【０１９４】
ＩｎｆｌａｍａｂはＩＬ−１β放出を防止する（図３３ａおよびｂ参照）。図３３ａおよびｂに関し、ＴＨＰ１細胞は、９６ウェルプレート中、１００，０００個の細胞／２００μｌの完全培地で培養された。ＰＭＡ（１００μｇ／ｍｌで７２時間）を用いてＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させた。24時間の静置後、分化したＴＨＰ１細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で3時間刺激し、ＭＣＣ９５０（１μＭ）または０．００２５ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｎｇ／ｍｌの用量依存方式でＩＬ−１Ｒ１／ＮＬＲＰ３  Ａｂを用いて（図３３ａ）、またはＩＬ−１Ｒ１／ＮＬＲＰ３  Ａｂ（１ｎＭ）を用いて（図３３ｂ）、またはＩｇＧ対照抗体を用いて、３０分間処理し、続けて、ＡＴＰ（５ｍＭ）で1時間処理した。上清中のＩＬ−１β放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１９５】
ＩｎｆｌａＭａｂはＴＨＰ１細胞中のカスパーゼ１の活性化を防止する（図３４参照）。図３４に関し、ＴＨＰ１細胞は、９６ウェルプレート中、１００，０００個の細胞／２００μｌの完全培地で培養された。ＰＭＡ（１００μｇ／ｍｌで７２時間）を用いてＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させた。２４時間の静置後、分化したＴＨＰ１細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間刺激し、ＩＬ−１Ｒ１／ＮＬＲＰ３  Ａｂ（１μｇ／ｍｌ）を用いて３０分間処理し、続けて、ＡＴＰ（５ｍＭ）で１時間処理した。カスパーゼ１の非細胞傷害性蛍光標識阻害剤（ＦＡＭ−ＦＬＩＣＡ）およびＤＡＰＩ（核染色）を用いて細胞を染色することにより、カスパーゼ１活性化を評価した。細胞をＬＰＳ単独（陰性対照）、ＬＰＳ＋ＡＴＰ（陽性対照）、マウスＩｇＧ２ａ（１μｇ／ｍｌ、Ａｂ対照）、またはＩＬ−１ｒ／ＮＬＲＰ３二重特異的Ａｂ（１μｇ／ｍｌ、実験用）で処理した。各群の代表的共焦点画像を示す。緑色＝活性カスパーゼ１および青色＝Ｄａｐｉ／核染色。
【０１９６】
Ｉｎｆｌａｍａｂの内部移行（図３５参照）。図３５に関し、ＴＨＰ１細胞は、９６ウェルプレート中、１００，０００個の細胞／２００μｌの完全培地で培養された。ＴＨＰ１細胞の分化は、ＰＭＡ（１００μｇ／ｍｌで７２時間）により誘導された。２４時間の静置後、分化したＴＨＰ１細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間刺激し、ｐＨｒｏｄｏ  ｒｅｄ標識ＩＬ−１ｒ／ＮＬＲＰ３  Ａｂ（１μｇ／ｍｌ）を用いて３０分間処理し、続けて、ＡＴＰ（５ｍＭ）で１時間処理した。内部移行した場合のみに蛍光を発するｐＨｒｏｄｏ  ｒｅｄ標識二重特異的Ａｂを用いて、Ａｂの内部移行を追跡した。（Ａ）代表的共焦点画像は、分化したＴＨＰ１細胞中のｐＨｒｏｄｏ  ｒｅｄ標識二重特異的Ａｂの内部移行を示す。（Ｂ）代表的共焦点画像は、Ａｂを内在化させなかったＴＨＰ１細胞（緑色のみ）と比較して、二重特異的Ａｂ（赤色、白色矢印）を内部移行させたＴＨＰ１細胞中のカスパーゼ１活性化（緑色）の有意な減少を示す。
【０１９７】
実施例９−アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患のためのＩｎｆｌａＭａｂ
材料および方法
ＢＭＤＭインビトロ培養
骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脛骨および大腿骨から単離した。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を得るために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、８％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、１％ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）および２０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中、２０ｎｇ／ｍｌのｇｍ−ＣＳＦ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）の存在下で７日間培養した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を得るために、細胞を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１％のピルベートおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）中、２０ｎｇ／ｍＬのｍ−ＣＳＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で７日間培養した。
【０１９８】
インフラマソーム活性化アッセイ
インビトロ刺激のために、０．１ｘ１０６細胞／ウェルを９６ウェル平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）に加えた。細胞は、最初に、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）で２時間初回刺激を受け、その後、ＭＣＣ９５０（１μＭ、Ａｄｉｐｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）の存在下または非存在下でコレステロール結晶（２ｍｇ／ｍＬ）を追加の４時間にわたり添加された。上清を、製造業者のプロトコルによる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いたサイトカイン産生の分析に使用した。
【０１９９】
インビボＬＰＳ攻撃
雌ａｐｏＥ−／−マウスに、０．２５％のコレステロールおよび１５％のカカオバター（ＳＤＳ，Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を含む西洋型食餌を治療の１週間前および実験期間中を通して与えた。食餌および水を自由に摂取させた。食餌供給の１週間後、マウスの腹腔内注射により、１０日目および１４日目にＰＢＳまたはＩｎｆｌａＭａｂ（１００μｇまたは２００μｇ）を投与した。食餌の２週後、および１週間治療マウスの静脈内にＬＰＳ（５０μｇ／ｋｇ、サルモネラミネソタＲ５９５、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を投与し、０．５、１、２および４時間後に血液を収集した。４時間後にマウスを屠殺し、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの血清レベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【０２００】
アテローム性動脈硬化症
雌ａｐｏＥ−／−マウスに、０．２５％のコレステロールおよび１５％のカカオバター（ＳＤＳ，Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を含む西洋型食餌を手術の２週間前および実験期間中を通して与えた。食餌供給の２週後、以前に記載（ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｔｈｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００１；１０３（８）：１１６４−１１７０）のように、これらのマウス中に血管周囲カラーを留置することにより、頸動脈プラーク形成を誘導した。病変発生の４週間の間、マウスにＰＢＳ（対照）またはＩｎｆｌａＭａｂ（１００μｇ）を週３回注射した。実験中を通して、毎週マウスの体重を測定し、血液試料を尾静脈経由で取得した。酵素比色分析法（Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて血清中の総コレステロールレベルを決定した。Ｐｒｅｃｉｐａｔｈ（Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ）を内部標準として用いた。Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ血糖計（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌｍｅｒｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、マウスの空腹時血糖値を、ＩｎｆｌａＭａｂによる治療開始の２週後に測定した。脂質プロファイリングのために、３匹のマウスからプールした血清試料を使用し（ｎ＝３試料／群）、これを６倍に希釈し、血漿リポタンパク質の分画をＡＫＴＡ−ＦＰＬＣを用いて実施した。各画分では、コレステロールＣＨＯＤ−ＰＡＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）試薬と共にインキュベーションすることにより、総コレステロールレベルを決定した。吸光度は、４９２ｎｍで測定した。
【０２０１】
治療の４週後、マウスを麻酔し、インサイツ潅流した後、頸動脈を収集し、ＯＣＴ化合物（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ；Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。（免疫）組織学的解析解析のために、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０Ｓクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、近位方向で１０μｍの横断凍結切片を調製した。
【０２０２】
組織学および形態計測
凍結切片を通常の方法で、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびエオシン（Ｍｅｒｃｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて染色した。頸動脈のヘマトキシリン−エオシン染色切片を用いて形態計測分析（Ｌｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を実施した。各頸動脈に対し、動脈のカラー近位の病変の初出位置から病変の完全消失位置まで、病変サイズを１００μｍ毎に定量化した。解析した切片の数は、マウス毎に５〜１５切片の範囲であり、それから平均プラークサイズおよびプラーク体積を計算した。最大プラークサイズを有する切片を最大狭窄を有するプラークとしてアノテートした。頸動脈中の病変含量の定量化のために、最大病変を有する４個の連続した断面を使用した。脂質含量を決定するために、切片をＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。ラットモノクローナルＭＯＭＡ−２抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いて、病変のマクロファージ含量を評価した。シリウスレッド染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてコラーゲンを可視化した。ナフトールＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた凍結切片の染色により、マスト細胞および好中球を可視化した。最大の病変数を含む２つの連続した断面中のマスト細胞および好中球の数をマニュアルで評価した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＲＥ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＭＯＭＡ−２およびコラーゲン陽性面積をＬｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ画像解析ソフトウエアにより定量化した。全ての形態計測分析を盲検オペレーターにより実施した（Ｔ．ｖ．ｄ．Ｈ．）。
【０２０３】
フローサイトメトリー
屠殺時に、血液および脾臓を単離し、７０μｍのセルストレーナーを通して臓器をすり潰すにすることにより、単細胞懸濁液を得た。ＡＣＫ溶解バッファー（０．１５ＭのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）を用いて血液および脾細胞懸濁液から赤血球を取り除いた。免疫細胞集団をフローサイトメトリーにより関連抗体を用いて解析した（表４）。細胞を指示マーカーに対する抗体および生死細胞判定用の固定可能細胞生存率測定用試薬７８０と共にインキュベートした。全ての抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。フローサイトメトリー解析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で実施し、取得したデータはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使って解析した。
【表１３】
2022500457.tif 000036
【０２０４】
結果
この試験では、ＩｎｆｌａＭａｂが、マクロファージ由来のマウス骨髄からのＩＬ−１β分泌を特異的に、用量依存的に抑制することを示した。特異性は、これらの同じ細胞で、ＴＮＦαの分泌に対して効果がないことを観察することにより、確認した（図３６参照）。ＩｎｆｌａＭａｂはまた、ａｐｏｅ−／−マウスで示されるように、インビボでのＩＬ−１β分泌を特異的に抑制することも示した。特異性は、これらのマウスではＴＮＦαの分泌に対して効果がないことを観察することにより、確認した（図３７参照）。
【０２０５】
ＩｎｆｌａＭａｂは、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患において疾患修飾作用を有することをさらに示した。ＩｎｆｌａＭａｂは、アテローム性動脈硬化症のａｐｏｅ−／−マウスモデルで、プラークのインビボ発達のサイズを抑制することも明らかになった。この試験では、頸動脈プラークの断面は、プラークの開始部から末端まで、８０μｍ毎に作成された。これらのプラークのサイズは、平方μｍで測定され、各プラークからの最も大きい病変（最大狭窄）、およびこれらのプラークの平均サイズ（平均プラークサイズ）も同様にプロットした（図３８参照）。図３８ａは、病変サイズの減少に向かう傾向を示し、図３８は、病変サイズの有意な減少（約３５％）を示す。
【０２０６】
下記の表５および６は、中膜サイズ（中膜平滑筋層のサイズ）を示す列を含み、予測通り、これに対し効果は示されていない。管腔サイズは、血流のためにまだ開いている動脈の領域であり、対照ＩｇＧに比べて、ＩｎｆｌａｍｍＡｂ（ＩｎｆｌａＭａｂ）群でほとんどの場合有意に大きい。プラークがＩｎｆｌａｍｍＡｂ群ではより小さいので（「プラーク」の列参照）、これは道理にかなう。総血管面積は、プラーク＋中膜＋管腔であり、従って、総血管表面の領域であり、これは、ＩｎｆｌａｍｍＡｂ群と、対照ＩｇＧとの間で差異はない。このため、我々は、動脈の外向きのリモデリングは存在しないと結論付けることができ、これは、肯定的な発見である。
【表１４】
2022500457.tif 000037
2022500457.tif 000038
【表１５】
2022500457.tif 000039
【０２０７】
これらのマウスの心臓は、大動脈根プラーク分析および組織学、例えば、マクロファージ含量の調査のために、切片が作成される。屠殺時に、単球サブセットのために、血液、脾臓および腹膜細胞に対しフローサイトメトリー分析が実施される。血漿コレステロールレベルを含む他の測定が実施される。マウス重量％および全身白血球レベル（血液学分析）を測定したが、ＩｎｆｌａＭａｂと対照群との間の差異は認められなかった。
【０２０８】
まとめると、これらの結果は、アテローム性動脈硬化症／冠動脈疾患を予防／治療するために、ＩｎｆｌａＭａｂの使用を支持する証拠を提供する。実際に、これらのデータは、ＩｎｆｌａＭａｂがまた、プラーク破裂のリスクを低減し、急性冠症候群および／または心筋梗塞を防止し得ることを示唆する。
【０２０９】
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、アテローム性動脈硬化症および従って冠動脈疾患、プラーク破裂および急性冠症候群／心筋梗塞に結びつけられてきた（下記の裏付けを与える参考文献を参照されたい）。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、特殊な形の細胞死、ピロネクローシス（Ｂｅｒｇｓｂａｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）（カスパーゼ１とは独立）およびパイロトーシス（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００７）に関連付けられており、これらは、悪化した炎症の場合に起こり得る。従って、抗ＮＬＲＰ３療法はまた、このような細胞死経路を減らすと思われ、この経路は、アテローム性動脈硬化症などの特定の疾患の病因に関与することが知られている。パイロトーシスは、心臓イベントに繋がる酸化型ＬＤＬに反応する、この疾患のプラーク破綻のリスク因子である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。プラークサイズ、可能なプラーク破裂および可能な心臓イベントを低減するためのＮＬＲＰ３インフラマソームの標的化は、従って、正当化される。
【０２１０】
ＩｎｆｌａＭａｂは、ＢＭＤＭ中のＩＬ−１β分泌を抑制する（図３６参照）。二重特異的ＩＬ−１Ｒ１／ＮＬＲＰ３抗体であるＩｎｆｌａＭａｂは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）からのＩＬ−１βを用量依存的に抑制する。ＢＭＤＭは、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）で３時間刺激され、ＭＣＣ９５０で（もしくはＭＣＣ９５０無しで）またはＩｎｆｌａｍａｂで３０分処理され、続けて、ミョウバン（５０μｇ／ｍｌ）で１時間処理された。上清中のＩＬ−１β放出をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２１１】
ＩＬ−１βは、ＬＰＳ攻撃によりインビボで抑制されるが、ＴＮＦαは抑制されない（図３７参照）。雌ａｐｏＥ−／−マウスは、西洋型食餌の１週間後、腹腔内注射により、ＰＢＳまたはＩｎｆｌａＭａｂ（１００μｇまたは２００μｇ）を１０日目および１４日目に投与された。食餌の２週後、および１週間治療マウスの静脈内にＬＰＳ（５０μｇ／ｋｇ）を投与し、（ａ）ＩＬ−１β、および（ｂ）ＴＮＦαをＥＬＩＳＡで測定した。
【０２１２】
アテローム性動脈硬化症調査：ＩｎｆｌａＭａｂは、アテローム性動脈硬化症インビボａｐｏｅ−／−モデルで、プラークサイズをインビボで低減させる（図３８参照）。雌ａｐｏＥ−／−マウスに西洋型食餌供給の２週後、血管周囲カラーを留置することにより、頸動脈プラーク形成を誘導した。マウスに、ＰＢＳまたはＩｎｆｌａＭａｂ（１００μｇまたは２００μｇ）を週３回、４週間にわたり腹腔内注射した。その後、冷凍切片を作製するために、頸動脈を収集した。各頸動脈に対し、動脈のカラー近位の病変の初出位置から病変の完全消失位置まで、病変サイズを８０μｍ毎に定量化した。
【０２１３】
本発明は、本明細書で記載の実施形態に限定されるのもではないが、本発明の範囲を逸脱することなく、修正または変更できる。
【図１】
2022500457.tif 000040
【図２】
2022500457.tif 000041
【図３】
2022500457.tif 000042
【図４】
2022500457.tif 000043
【図５】
2022500457.tif 000044
【図６】
2022500457.tif 000045
【図７】
2022500457.tif 000046
【図８】
2022500457.tif 000047
【図９】
2022500457.tif 000048
【図１０】
2022500457.tif 000049
【図１１（ｉ）】
2022500457.tif 000050
【図１１（ｉｉ）】
2022500457.tif 000051
【図１２】
2022500457.tif 000052
【図１３】
2022500457.tif 000053
【図１４】
2022500457.tif 000054
【図１５】
2022500457.tif 000055
【図１６】
2022500457.tif 000056
【図１７】
2022500457.tif 000057
【図１８】
2022500457.tif 000058
【図１９】
2022500457.tif 000059
【図２０】
2022500457.tif 000060
【図２１】
2022500457.tif 000061
【図２２】
2022500457.tif 000062
【図２３】
2022500457.tif 000063
【図２４】
2022500457.tif 000064
【図２５】
2022500457.tif 000065
【図２６】
2022500457.tif 000066
【図２７】
2022500457.tif 000067
【図２８】
2022500457.tif 000068
【図２９】
2022500457.tif 000069
【図３０】
2022500457.tif 000070
【図３１】
2022500457.tif 000071
【図３２】
2022500457.tif 000072
【図３３ａ】
2022500457.tif 000073
【図３３ｂ】
2022500457.tif 000074
【図３４】
2022500457.tif 000075
【図３５】
2022500457.tif 000076
【図３６】
2022500457.tif 000077
【図３７ａ】
2022500457.tif 000078
【図３７ｂ】
2022500457.tif 000079
【図３８ａ】
2022500457.tif 000080
【図３８ｂ】
2022500457.tif 000081
【手続補正書】
【提出日】令和3年9月7日(2021.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2022500457000001.app
【国際調査報告】
2022500457.tif 000082
2022500457.tif 000083
2022500457.tif 000084