(57)【要約】がん患者における化学療法および免疫療法に対する化学感受性を増加させるための方法および試薬を本明細書において提供する。がんの処置を必要とする患者に、有効量のDKK3中和剤、例えば本明細書において提供されるDKK3中和抗体を投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。前記方法は、有効量の化学療法または免疫療法を前記患者に施す工程をさらに含むことができる。2022502517.tif 000016
2022502517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:7のVHCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:8のVHCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:9のVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域 (VH)、ならびに、SEQ ID NO:1のVLCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:2のVLCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3のVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域 (VL) ;または
SEQ ID NO:10のVHCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:11のVHCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:12のVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域 (VH)、ならびに、SEQ ID NO:4のVLCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:5のVLCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:6のVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域 (VL) 
を含む、モノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２】
SEQ ID NO:13に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:14に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項３】
SEQ ID NO:15に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:16に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項４】
SEQ ID NO:13に対して少なくとも95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:14に対して少なくとも95％の同一性を有する軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項５】
SEQ ID NO:15に対して少なくとも95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:16に対して少なくとも95％の同一性を有する軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項６】
SEQ ID NO:13の重鎖可変配列とSEQ ID NO:14の軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項７】
SEQ ID NO:15の重鎖可変配列とSEQ ID NO:16の軽鎖可変配列とによってコードされる、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項８】
SEQ ID NO:17に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:18に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項９】
SEQ ID NO:19に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:20に対して少なくとも70％、80％、または90％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１０】
SEQ ID NO:17に対して少なくとも95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:18に対して少なくとも95％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１１】
SEQ ID NO:19に対して少なくとも95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:20に対して少なくとも95％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１２】
SEQ ID NO:17の配列を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:18の配列を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１３】
SEQ ID NO:19の配列を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:20の配列を有する軽鎖可変配列とを含む、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１４】
ヒト化抗体である、請求項1記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１５】
前記抗体断片が、一価scFv(単鎖可変断片)抗体、二価scFv、Fab断片、F(ab’)2断片、F(ab’)3断片、Fv断片、または単鎖抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体がキメラ抗体または二重特異性抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１７】
前記抗体がIgG抗体または組換えIgG抗体または抗体断片である、請求項1〜16のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１８】
前記抗体が、画像化剤または細胞傷害剤とコンジュゲートまたは融合されている、請求項1〜17のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１９】
請求項1〜17のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープへの結合について競合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
ヒト化抗体である、請求項19記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２１】
前記抗体断片が、一価scFv(単鎖可変断片)抗体、二価scFv、Fab断片、F(ab’)2断片、F(ab’)3断片、Fv断片、または単鎖抗体である、請求項19または20記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２２】
前記抗体がキメラ抗体または二重特異性抗体である、請求項19〜21のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２３】
前記抗体がIgG抗体または組換えIgG抗体または抗体断片である、請求項19〜22のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２４】
前記抗体が、画像化剤または細胞傷害剤とコンジュゲートまたは融合されている、請求項19〜23のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２５】
請求項1〜17または19〜23のいずれか一項記載の抗体または抗体断片をコードする、ハイブリドーマまたは操作された細胞。
【請求項２６】
有効量のDKK3中和抗体または抗体断片を投与する工程を含む、がんを有する患者を処置する方法。
【請求項２７】
DKK3中和抗体または抗体断片が、請求項1〜24のいずれか一項記載の抗体または抗体断片である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
化学療法に対する感受性を増加させるための方法としてさらに定義される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
免疫療法に対する感受性を増加させるための方法としてさらに定義される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
がんが、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、または肉腫である、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
乳がんがトリプルネガティブ乳がんである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
がん転移を阻害する方法としてさらに定義される、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
がん成長を阻害する方法としてさらに定義される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも第2の抗がん療法を施す工程をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
第2の抗がん療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、外科手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
化学療法がゲムシタビンを含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、OX40アゴニスト、LAG3アンタゴニスト、4-1BBアゴニスト、またはTIM3アンタゴニストである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4アンタゴニストとPD1アンタゴニストの組み合わせである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4アンタゴニストとPDL1アンタゴニストの組み合わせである、請求項38記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、2018年10月15日に出願された米国仮出願第62/745,671号の優先権恩典を主張する。米国仮出願第62/745,671号の全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究に関する記載
本発明は米国立衛生研究所によって付与された助成金番号CA016672およびCA218495に基づいて政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表への言及
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を収録している。このASCIIコピーは2019年10月1日に作成され、UTFCP1395WO_ST25.txtと命名され、サイズが9.5キロバイトである。
【０００４】
1.分野
本発明は、概して、医学、免疫学、およびがん生物学の分野に関する。特に、本発明は、Dickkopf3(DKK3)を中和する抗体およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
2.関連技術の説明
腫瘍微小環境は多くのがんにとって重要な腫瘍進行メディエーターとして認識されており(Hwang et al., 2008; Kalluri & Zeisberg, 2006; Apte et al., 2004; Apte & Wilson, 2012; Bhowmick & Moses; 2005; Dvorak, 1986)、特に、膵管腺癌(PDAC)は腫瘍微小環境内にある高密度の線維性間質を特徴とする。この線維性間質は主として膵星細胞(PSC)からなり、膵星細胞(PSC)はPDACの増殖と転移を促進し(Apte & Wilson, 2012; Hwang et al., 2008; Xu et al., 2010)、治療剤に対するPDAC細胞応答を低減する(Hwang et al., 2008; Olive et al., 2009)。しかしながら、これらのプロセスにPSCが影響を及ぼす正確な機構は十分に理解されておらず、結果として、PDACの間質を標的とする臨床試験はほとんどが残念な結果となった(Bijlsma & van Laarhoven, 2015)。PDAC間質を標的とする以前の取り組みは、線維芽細胞を含む間質要素を大まかに排除することに向けられた。PSCによって作り出される特異的な腫瘍促進機構を阻害するもっと有効な戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
概要
一態様では、表1および表2からのクローン対(clone-paired)の重鎖CDR配列および軽鎖CDR配列を特徴とするモノクローナル抗体または抗体断片が提供される。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:1の軽鎖可変配列CDR1、SEQ ID NO:2の軽鎖可変配列CDR2、およびSEQ ID NO:3の軽鎖可変配列CDR3、ならびに、SEQ ID NO:7の重鎖可変配列CDR1、SEQ ID NO:8の重鎖可変配列CDR2、およびSEQ ID NO:9の重鎖可変配列CDR3を有する。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:4の軽鎖可変配列CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖可変配列CDR2、およびSEQ ID NO:6の軽鎖可変配列CDR3、ならびに、SEQ ID NO:10の重鎖可変配列CDR1、SEQ ID NO:11の重鎖可変配列CDR2、およびSEQ ID NO:12の重鎖可変配列CDR3を有する。様々な局面では、どのCDR配列も、1個または2個のアミノ酸置換により表1および表2のCDR配列と異なってよい。様々な局面では、どのCDR配列も、表1および表2のCDR配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性を有してよい。
【０００７】
一部の局面では、前記抗体または抗体断片は、表3からのクローン対配列に従う軽鎖可変配列と重鎖可変配列によってコードされる。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:13の核酸配列によってコードされる重鎖可変配列と、SEQ ID NO:14の核酸配列によってコードされる軽鎖可変配列とを有する。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:15の核酸配列によってコードされる重鎖可変配列と、SEQ ID NO:16の核酸配列によってコードされる軽鎖可変配列とを有する。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:13に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する核酸配列によってコードされる重鎖可変配列と、SEQ ID NO:14に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する核酸配列によってコードされる軽鎖可変配列とを有する。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:15に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する核酸配列によってコードされる重鎖可変配列と、SEQ ID NO:16に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する核酸配列によってコードされる軽鎖可変配列とを有する。
【０００８】
一部の局面では、前記抗体または抗体断片は、表4からのクローン対配列に従う軽鎖可変配列と重鎖可変配列を含む。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:17の重鎖可変配列とSEQ ID NO:18の軽鎖可変配列を含む。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:19の重鎖可変配列とSEQ ID NO:20の軽鎖可変配列を含む。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:17に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:18に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む。一局面では、前記抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:19に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する重鎖可変配列と、SEQ ID NO:20に対して少なくとも70％、80％、90％、または95％の同一性を有する軽鎖可変配列とを含む。
【０００９】
CDR配列に基づいて本明細書において定義された任意のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープへの結合について競合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片も本明細書において提供される。
【００１０】
一部の局面では、前記抗体または抗体断片はヒト化抗体である。一部の局面では、抗体断片は、一価scFv(単鎖可変断片)抗体、二価scFv、Fab断片、F(ab’)2断片、F(ab’)3断片、Fv断片、または単鎖抗体である。一部の局面では、前記抗体はキメラ抗体または二重特異性抗体である。一部の局面では、前記抗体はIgG抗体または組換えIgG抗体または抗体断片である。一部の局面では、前記抗体または抗体断片は画像化剤または細胞傷害剤とコンジュゲートまたは融合されている。
【００１１】
一態様では、本発明の態様の抗体または抗体断片をコードするハイブリドーマまたは操作された細胞が提供される。
【００１２】
一態様では、有効量のDKK3中和抗体または抗体断片を投与する工程を含む、がんを有する患者を処置する方法。一部の局面では、DKK3中和抗体または抗体断片は本発明の態様の抗体または抗体断片である。一部の局面では、がん患者は対照患者と比べて高レベルのDKK3を発現することが確かめられている。一部の局面では、がん患者は対照患者と比べて低レベルのDKK3を発現することが確かめられている。一部の局面では、がん患者は対照患者と比べて変化したレベルの、または異常レベルのDKK3を発現することが確かめられている。一部の局面では、がん患者は対照患者と比べて正常レベルのDKK3を発現することが確かめられている。
【００１３】
一部の局面では、前記方法は、化学療法に対する感受性を増加させるための方法としてさらに定義される。一部の局面では、前記方法は、免疫療法に対する感受性を増加させるための方法としてさらに定義される。一部の局面では、がんは膵臓がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、または肉腫である。乳がんはトリプルネガティブ乳がんでもよい。一部の局面では、前記方法は、がん転移を阻害する方法としてさらに定義される。さらに、または代わりに、一部の局面では、前記方法は、がん成長を阻害する方法としてさらに定義される。
【００１４】
一部の局面では、前記方法は、少なくとも第2の抗がん療法を施す工程をさらに含む。ある特定の局面では、第2の抗がん療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、外科手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。一局面では、化学療法はゲムシタビンを含む。ある特定の局面では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤を含む。ある特定の局面では、免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、OX40アゴニスト、LAG3アンタゴニスト、4-1BBアゴニスト、またはTIM3アンタゴニストである。ある特定の局面では、免疫チェックポイント阻害剤はCTLA-4アンタゴニストとPD1アンタゴニストの組み合わせである。ある特定の局面では、免疫チェックポイント阻害剤はCTLA-4アンタゴニストとPDL1アンタゴニストの組み合わせである。
【００１５】
本明細書で使用する「本質的に含まない」とは、指定された成分の観点からいうと、指定された成分がどれも、意図を持って組成物に処方されていない、および/または単に汚染物質としてもしくは微量にしか存在しないことを意味するために本明細書において用いられる。従って、組成物の意図されない汚染に起因する、指定された成分の総量は、0.05％よりかなり少なく、好ましくは0.01％より少ない。指定された成分の量を標準的な分析方法を用いて検出できない組成物が最も好ましい。
【００１６】
本明細書で使用する「1つの(a)」または「1つの(an)」とは1つまたは複数を意味することがある。本明細書中の特許請求の範囲において使用する場合、「含む(comprising)」という単語と共に用いられる時には「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は1つまたは複数を意味することがある。
【００１７】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢だけを指すか、または選択肢が互いに相容れないことを指すと明示されていない限り「および/または」を意味するために用いられるが、この開示は、選択肢だけと「および/または」を指す定義を裏付ける。本明細書で使用する「別の」は少なくとも第2の、またはそれより多くを意味することがある。
【００１８】
本願全体を通して「約」という用語は、ある値が、この値を求めるために用いられている装置、方法の誤差の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲の中で様々な修正および変更が当業者に明らかになるので例示にすぎないことが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を、本明細書において示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによってさらに深く理解され得る。
【００２１】
【図１Ａ】図1A〜G. DKK3はPDACにあるHPSCによって発現される。単一培養および共培養したHPSC細胞株およびPDAC細胞株におけるDKK3発現をRT-PCR(図1A)およびqPCR(図1B)によって測定した。縞模様のバーは、PDAC細胞と共培養した後のHPSCにおける発現を示している。(図1C)ヒトPDACおよび正常膵臓組織におけるDKK3発現をAffymetrixアレイによって求めた。(図1D)PDAC患者、慢性膵炎(CP)患者、または膵臓疾患がない患者に由来する血漿試料中での、およびHPSCに由来する条件培地(HPSC-CM)中でのDKK3レベルをELISAによって測定した。(図1E)ヒトPDAC組織マイクロアレイにおけるDKK3のIHC分析。100x倍率での代表的な視野を示した。挿入図の倍率は200xである。(図1F)PDACの遺伝子操作マウスモデル(GEMM)では、DKK3はCPおよび膵臓上皮内新生物(PanIN)病変部と、PDACへの進行を伴う発達初期に発現している。(図1G)PDACのGEMMおよびGEMM腫瘍から単離したがん細胞における相対発現をAffymetrixによって定量した。*p<0.05、***p<0.001。値は平均±SEMである。
【図１Ｂ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｃ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｄ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｅ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｆ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｇ】図1Aの説明を参照のこと。
【図２Ａ】図2A〜J. DKK3はHPSCおよびPDAC活性を刺激し、化学療法抵抗性を高める。(図2A)PBSまたはrhDKK3(10μg/ml)で処理した後にHPSC増殖をMTTによって測定した。HPSCにおいてDKK3をshDKK3によって発現停止した(図2B)。細胞増殖をMTTアッセイによって測定し(図2B)、24時間で遊走を確かめた(図2C)。対照細胞をスクランブルドshRNA (scrambled shRNA)でトランスフェクトした。(図2D)Panc1細胞をrhDKK3(10μg/ml)または無血清培地対照で処理し、24時間後に細胞遊走と浸潤を測定した。(図2E〜F)Panc1細胞のDKK3を安定して発現停止した。細胞増殖(図2E)および軟寒天におけるコロニー形成(図2F)を測定した。(図2G)HPSCに由来するCMで処理した後にBxPC3細胞遊走を測定した。または、HPSCのDKK3を発現停止した。DKK3を発現する化学感受性L3.6pl細胞においてゲムシタビン中での軟寒天コロニー形成(図2H)とアポトーシス(図2I)を確かめ、トランスフェクション対照と比較した。(図2J)DKK3を発現停止した化学療法抵抗性HS766T細胞においてゲムシタビン誘導性アポトーシスを測定した。*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001、****p<0.00001。
【図２Ｂ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｃ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｄ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｅ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｆ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｇ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｈ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｉ】図2Aの説明を参照のこと。
【図２Ｊ】図2Aの説明を参照のこと。
【図３Ａ】図3A〜F. PSCおよびPDAC細胞においてNF-κBがDKK3によって活性化され、DKK3を介した細胞活性刺激に必要である。(図3A)DKK3処理(10μg/ml)によって誘導されるp65およびIκBαのリン酸化をウェスタンブロッティングによって確かめた。相対タンパク質ローディングを抗β-アクチン抗体を用いて示した。(図3B)HPSCおよびPanc1細胞におけるWBによるp65活性化の時間経過。細胞を組換えDKK3(10μg/ml)で0〜24時間処理し、ベースラインと比べたバンド密度の変化を定量した。(図3C)DKK3は、変異lucレポーター(MT)があるHPSCおよびPDAC細胞においてNFκBルシフェラーゼレポーターを刺激する。リン酸化欠損IκBαMがあるPanc28において、DKK3によって誘導されるNFκB活性をルシフェラーゼレポーター(図3D)およびウェスタンブロッティング(図3E)によって測定した。図3CおよびDでは、3つのカラムの各セットにおいて、左は「PBS」であり、真ん中は「DKK3」であり、右は「TNFα」である。(図3F)Panc28およびPanc28/IκBαMの増殖をMTTアッセイによって測定した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、および****p<0.0001対PBS対照。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｅ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｆ】図3Aの説明を参照のこと。
【図４Ａ】図4A〜H. DKK3を中和すると腫瘍成長が阻害され、生存時間が延長する。ホタルルシフェラーゼで標識したBxPC3腫瘍細胞を、対照HPSCもしくはDKK3が安定して発現停止されたHPSCと共に、または無しで1:3腫瘍:間質比でヌードマウスに同所移植した。(図4A)注射して35日後の平均膵臓腫瘍量。(図4B)同系C57/BL6またはDKK3ヌルマウスに皮下移植したPanc02腫瘍細胞のIVIS画像化による腫瘍成長と、IHCによるKi67発現。DKK3欠損マウスをKPCマウスと交配させて、P48-Cre;Kras LSL-G12D;Trp53fl/fl;dkk3-/-子孫を作製した。(図4C〜D)野生型DKK3(左の線)、DKK3ヌル(最も右の線)、またはヘテロ接合性DKK3(真ん中の線)のマウスのカプラン・マイヤー生存曲線および生存表(survival table)。(図4E)DKK3-野生型マウス(瀕死、47日目)、またはDKK3ヘテロ接合性マウス(瀕死、63日目)、またはDKK3ヌルマウス(48日目の初期時点、または68日目の瀕死時)からの(図4C)からの腫瘍の代表的な画像。(図4F〜H)qPCRによるDKK3およびコラーゲンタイプI発現ならびにIHCによるKi67増殖指数を示した。*p<0.05。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｇ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｈ】図4Aの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5A〜H. DKK3遮断抗体はPSCおよびがん細胞の活性、化学療法抵抗性、ならびに腫瘍進行を阻害し、生存時間を改善した。HPSCおよびBxPC3細胞をDKK3 mAbクローンJM6-6-1およびJM8-12-1またはアイソタイプ対照mAbまたはPBSで処理した。(図5A〜B)FACSおよび48時間でのTranswell遊走アッセイによって測定した時のHPSCアポトーシスおよび遊走。(図5C)48時間でのTranswell遊走アッセイによって測定した時のrhDKK3 10μg/mlに応答したBxPC3遊走。(図5D)6日目のMTS増殖アッセイによって測定した時のゲムシタビン100μMに対するBxPC3耐性。HPSC-CM、膵星細胞条件培地、10μg/ml。PDACの同所性同時注射BxPC3+HPSCモデルを用いてDKK3 mAbクローンJM6-6-1またはJM8-12-1(5mg/kg i.p. 5日に1回)の効力を試験した。(図5E)全腫瘍進行をIVIS画像化によって3〜4日ごとに測定した。(図5F)原発膵臓腫瘍を除去した後、腹膜腔内にある転移性腫瘍をIVIS画像化によって示した。(図5G)DKK3 mAbクローンJM8-12(最も右の線)、対照mAb(真ん中の線)、またはPBS(最も左の線)で処置したマウスを示したカプラン・マイヤー生存曲線。(図5H)野生型DKK3(実線)またはDKK3欠損(「DKK3-KO」、破線)のKPCマウス(P48-Cre;Kras LSL-G12D;Trp53fl/fl)をDKK3 mAb JM6-6-1(5mg/kg i.p. 5日に1回)、PBS、または対照mAbで処置した。カプラン・マイヤー生存曲線をハザード比(ログランク検定)と共に示した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001対対照Ab。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｅ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｆ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｇ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｈ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６Ａ】図6A〜F. DKK3遮断は腫瘍免疫浸潤物の増加と関連し、チェックポイント阻害剤療法に対する応答を改善する。(図6A)T細胞を刺激し、DKK3(5〜10μg/mL)で処理し、増殖をCFSEアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ標識KPC細胞を用いた同系同所性モデルにおいて、腫瘍のCD3およびCD8発現をIHCによって調べ(図6B)、さらなるT細胞活性マーカーを定量PCRによって測定した(図6C)。このモデルのマウスを対照IgG、DKK3 mAb JM6-6-1、αCTLA4、または組み合わせJM6-6-1+αCTLA4で処置し、腫瘍成長をIVIS画像化によって25日および190日まで測定した(図6D)。この同所移植モデルにおける生存時間を(図6E)に示した。GEMM(図6F)を用いて、KPC/DKK3+/+(黒色の線)またはKPC/DKK3-/-(青色の線)マウスをαCTLA4または対照IgGで処置し、カプラン・マイヤー生存曲線を示した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｆ−１】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｆ−２】図6Aの説明を参照のこと。
【図７Ａ】図7A〜E. DKK3発現およびサイレンシング。(図7A)ウェスタンブロッティングによってDKK3タンパク質がHPSCおよびHPSC条件培地CM)の中に検出された。(図7B)HPSC、Panc1、およびHS766T細胞においてDKK3がshRNAまたはsiRNAによって発現停止された。(図7C)4人の患者に由来するHPSCにおけるRT-PCRによるDKK3発現。(図7D)HUVECおよびHPSCにおけるRT-PCRによるDKK3発現。(図7E)ヒトPDACにおけるIHCによるDKK3およびαSMA発現。
【図７Ｂ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｄ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｅ】図7Aの説明を参照のこと。
【図８Ａ】図8A〜H. HPSCおよびPDAC細胞におけるDKK3発現および機能。初代HPSC細胞株20AはPDAC患者に由来し、RT-PCRによって、HPSCとほぼ同じレベルでDKK3を発現した(図8A)。shRNAによるDKK3のサイレンシング(図8B)によって、MTSアッセイおよび細胞遊走によって細胞増殖の阻害が認められた(図8C〜D)。(図8E)BxPC3をrhDKK3(10μg/ml)で処理し、24時間後に細胞遊走と浸潤を測定した。(図8F〜G)HPSC増殖およびBxPC3遊走に対するDKK3効果の用量反応曲線。(図8H)rhDKK3およびHPSC-CMの中にあるDKK3のウエスタンブロット。***p<0.0001、****p<0.0001。
【図８Ｂ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｃ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｄ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｅ−１】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｅ−２】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｆ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｇ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｈ】図8Aの説明を参照のこと。
【図９】PDACの同系モデルにおけるDKK3発現。マウスPSC、Panc02細胞、およびDKK3-/-マウス(DKK3-KO)または対照C57/BL6野生型(WT)マウス(DKK3+/+)にある皮下注射Panc02細胞に由来する腫瘍において、DKK3発現をRT-PCRおよびqPCRによって求めた。MPSC=マウスPSC;NP=正常膵臓。
【図１０】DKK3の枯渇はPDACのP48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/+モデルにおける生存時間の改善と関連する。カプラン・マイヤー生存曲線を示した(ログランク検定)。左の線はDKK3 wt/p53+/-である。真ん中の線はDKK3-/-/p53+/-である。右の線はDKK3+/-/p53+/-である。
【図１１Ａ】図11A〜C. PDAC自発性モデルにおけるDKK3発現およびDKK3の細胞表面結合に対するDKK3  mAbの効果および同所性モデル。(図11A)野生型DKK3またはヘテロ接合性もしくはホモ接合性のDKK3ヌルである、P48-Cre;Kras LSL-G12D;Trp53fl/flおよびP48-Cre;Kras LSL-G12D;Trp53fl/+マウスに由来する膵臓腫瘍におけるDKK3発現をqPCRによって測定した。DKK3+/-ヘテロマウスにおけるDKK3 mRNAの相対発現はDKK3+/+マウスの53％である。(図11B)BxPC3またはL3.6pl細胞をHisタグ化rhDKK3(10μg/ml)と、またはHisタグ化rhDKK3(10μg/ml)とJM6-6-1(70μg/ml)とインキュベートすることによってDKK3細胞表面結合を評価した。陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別した。(図11C)同所性BxPC3腫瘍を有するマウスをDKK3 mAb JM6-6-1(5mg/kg i.p. 5日に一回)で処置した。全腫瘍進行をIVIS画像化によって3〜4日ごとに測定した。
【図１１Ｂ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１１Ｃ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１２Ａ】図12A〜D. マウスPSCにおけるDKK3発現と、生存時間に対するDKKC mAb処理の効果。(図12A)JM6-6-1 mAbを用いた、変性条件下および非変性条件下での組換えヒトDKK3およびマウスDKK3のウエスタンブロット分析。(図12B)マウスPSC(MPSC)または3T3細胞におけるマウスDKK3の発現をRT-PCRによって求めた。18Sをローディングコントロールとして使用した。(図12C)DKK3 mAbで処理したMPSCの増殖を7日目にMTSアッセイによって測定した。***p<0.001対PBS。(図12D)PDACのPdx1-Cre; Kras LSL-G12D;Trp53fl/+モデルをDKK3 mAb JM6-6-1または対照mAb JM4-74(5mg/kg i.p. q5d)で処置した。カプラン・マイヤー生存曲線を示した(ログランク検定)。0％生存率で、右の線はJM6-6-1であり、真ん中の線はPBSであり、左の線は対照Abである。
【図１２Ｂ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｃ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｄ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１３Ａ】図13A〜F. トリプルネガティブ乳がん(TNBC)におけるDKK3発現ならびに臨床アウトカムおよび細胞増殖との関連性。(図13A)TNBC線維芽細胞(BCF)、膵臓腺癌(PDAC)に由来するヒト膵星細胞(HPSC)、BxPC(PDACがん細胞)、および水対照においてDKK3発現をRT-PCRによって測定した。(図13B)TNBCに由来するBCF、ER陽性乳がん細胞、およびTNBCがん細胞株においてDKK3タンパク質をウェスタンブロッティングによって測定した。(図13C)TNBCに由来する患者由来異種移植片(PDX)腫瘍におけるDKK3タンパク質を組換えヒトDKK3(rhDKK3)およびHPSCに由来する条件培地(HPSC-CM)と比べて測定した。アクチンをローディングコントロールとして使用した。(図13D)TNBCヒト腫瘍におけるDKK3発現と患者生存時間との相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。データをTCGA、EGA、およびGEOからプールした。上の線は「低」であり、下の線は「高」である。(図13E)rhDKK3で処理したSUM159 TNBC細胞増殖を示した。上の線は「20μg/ml DKK3」であり、真ん中の線は「5μg/ml DKK3」であり、下の2つの線は「ビヒクル」および「2.5μg/ml DKK3」である。(図13F)TNBCの4T1マウスモデルをJM6-6-1で処置した。カプラン・マイヤープロットから、上記の処置によって生存時間が対照抗体4-74およびPBSと比べて延長したことが分かる。左の線はPBSである。真ん中の線は対照Ab4-74である。右の線はJM6-6-1である。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｃ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｄ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｅ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｆ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４Ａ】図14A〜C. DKK3 mAbによるTNBC同所性モデルの処置。(図14A)(ホタルルシフェラーゼで標識した)4T1 TNBC細胞を用いた同所性モデルをPBS、対照IgG Ab、または抗DKK3 mAb JM6-6-1(5mg/kg ip q5日)で処置した。処置開始後33日目に処置前の初期腫瘍サイズと比較して腫瘍成長をカリパスによって測定した。(図14B)処置開始後33日目にIVISを用いて4T1原発腫瘍および転移を画像化した。(図14C)処置開始後33日目にIVISによって、4T1転移からのルシフェラーゼシグナルを測定した。
【図１４Ｂ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｃ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１５Ａ】図15A〜E. 様々ながんタイプにおけるDKK3発現は臨床アウトカムと関連する。(図15A)ヒト卵巣がんにおけるDKK3発現と患者生存時間の相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。(図15B)ヒト胃がんにおけるDKK3発現と患者生存時間の相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。(図15C)ヒトPDACにおけるDKK3発現と患者生存時間の相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。(図15D)ヒト膀胱がんにおけるDKK3発現と患者生存時間の相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。(図15E)ヒト肉腫におけるDKK3発現と患者生存時間の相関関係をカプラン・マイヤープロットで示した。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｅ】図15Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
膵管腺癌(PDAC)の予後は惨憺たるものであり、その間質浸潤物が膵管腺癌の攻撃性に寄与するかどうかは不明である。本明細書において、Dickkopf-3(DKK3)は膵星細胞によって産生され、ヒトPDACの大部分に存在することが見出された。DKK3はパラクライン機構およびオートクライン機構によってNF-κB活性化を介してPDACの成長、転移、および化学療法抵抗性を刺激する。PDAC自発性モデルにおいてDKK3を遺伝子破壊すると腫瘍成長が阻害され、CD8+T細胞の腫瘍周囲浸潤が誘導され、生存時間が二倍を超えた。新規のDKK3遮断モノクローナル抗体で処置するとPDAC進行と化学療法抵抗性が阻害され、生存時間が延長した。DKK3阻害とチェックポイント制御阻害の組み合わせは処置単独よりも腫瘍成長を低減するのに効果的であり、生存時間の長続きする改善をもたらした。このことから、DKK3中和は単一の標的指向型薬剤として、またはがんに対する化学療法もしくは免疫療法と組み合わせて有効であることが示唆される。
【００２３】
I.Dickkopf-3(DKK3)
DKK3は、Wnt経路の調節に関与している可能性がある糖タンパク質dickkopf(Dkk)ファミリー(DKK1-4)の38kDaメンバーである(Macheda & Stacker, 2008; Moon et al., 2004; Taipale & Beachy, 2001)。DKKファミリーの最も良く特徴付けられたメンバーはDKK1であり、DKK1はWntシグナル伝達の天然可溶性阻害剤であり、腫瘍抑制因子の機能と関連する(Cowling et al., 2007; Shou et al., 2002)。DKK3は、他のDkkと、ユニークなN末端システインリッチドメインおよびC末端コリパーゼフォールド(fold)ドメインを共有するが、その他の点では、DNA配列、染色体群の位置に違いがあり、ひょっとすると、受容体およびシグナル伝達機構にも違いがある分岐したDkkファミリーメンバーである (Guder et al., 2006; Niehrs, 2006)。
【００２４】
DKK1とは対照的に、がんにおけるDKK3の機能的役割は腫瘍抑制因子または促進因子として作用すると相反する報告があり不明である。前立腺がんおよび骨肉腫においてDKK3は腫瘍抑制因子として述べられており、その過剰発現は腫瘍成長および転移を阻害する(Abarzua et al., 2005; Edamura et al., 2007; Hoang et al., 2004; Kuphal et al., 2006; Nozaki et al., 2001; Sakaguchi et al., 2009; Hsieh et al., 2004)。しかしながら、頭頚部がんと他の腫瘍における他のデータからDKK3はがんの攻撃性を高めることが示唆されている(Hoang et al., 2004; Katase et al., 2012; Nakamura et al., 2007; Wu et al., 2000)。DKK3のシグナル伝達機構に関する報告も同じように一致せず、Wntの効果が無かった研究、増強を示した研究、または阻害を示した研究がある(Hoang et al., 2004; Nakamura et al., 2007; Caricasole et al., 2003)。
【００２５】
最近の報告から、CD8+T細胞寛容の誘導を含む、DKK3の免疫調節的な役割が証明されている。外因性DKK3はT細胞活性を阻害し、DKK3機能がブロックされた時にはCD8T細胞増殖とIL-2産生が回復した(Meister et al., 2015; Lu et al., 2015)。しかしながら、相反する報告が肺がんモデルおよび膵臓がんモデルでのDKK3の免疫刺激作用についても述べているので(Suzawa et al., 2017; Uchida et al., 2015; Uchida et al., 2016)、腫瘍免疫応答におけるDKK3の正確な役割は全くといってよいほど不透明である。
【００２６】
II.本発明の局面
本明細書において、DKK3は、ほぼ全てのヒトPDACで発現するタンパク質だと突き止められ、PDAC自発性モデルではCPおよび前がん性PanIN病変部にも存在した。DKK3は、PDACの腫瘍関連間質中にあるPSCによって産生される分泌因子であり、オートクラインとパラクラインの両方で、PSC活性を刺激するだけでなくPDAC細胞の増殖、遊走、および浸潤を高めるようにも作用する。さらに、DKK3は、化学療法によって誘導されるアポトーシスを受けないようにがん細胞を保護する。これらの効果は、少なくとも部分的には、PSC細胞とPDAC細胞の両方でNF-κB活性化によって媒介される。PDACの異種移植片モデルおよび同系モデルにおいて遺伝子破壊と、mAbを用いた薬理学的枯渇によってDKK3を阻害すると、腫瘍の成長、転移が阻害され、化学療法に対する応答が改善し、生存時間が延長した。これらのデータから、DKK3がPDACにおいて腫瘍促進因子として作用し、有望な治療標的であるように思われる最初の証拠が得られる。
【００２７】
しかしながら、DKK3を破壊しても全てのDKK3ヌルマウスの死亡時に膵臓腫瘍があったので完治は認められなかったが、腫瘍は小さく、増殖性は低く、活発でない間質があった。このことが生存時間の延長に寄与した可能性が高い。治療アプローチとして、DKK3標的療法と、化学療法、標的指向型薬剤、または免疫療法を含む他の療法との組み合わせがDKK3中和単独よりも長続きする応答をもたらす可能性がある。別の潜在的なDKK3標的指向型用途はPDAC発達の初期段階で介入することである。同じ年齢で最大腫瘍量があった対照同腹子と比較して、KPC/DKK3-/-マウスには実質的に正常な膵臓があった。このことから、DKK3の非存在が腫瘍の開始または進行に影響を及ぼした可能性があることが示唆される。DKK3はまたcLGL-KrasG12V/BACEla-CreERTマウスのPanIn発達段階中にも発現した。このことから、DKK3は初期の時点で関与している可能性があることが示唆される。従って、初期のPDAC発達段階でDKK3をターゲティングすることは有効な予防戦略になる可能性がある。
【００２８】
他の報告は腫瘍抑制因子としてのDKK3について述べており、実際に、DKK3のアデノウイルスベクター送達が、前立腺、精巣、乳房、胃、さらにはPDACの異種移植片モデルにおける新規の処置アプローチとして提唱されている(Abarzua et al., 2005; Edamura et al., 2007; Hoang et al., 2004; Kuphal et al., 2006; Nozaki et al., 2001; Sakaguchi et al., 2009; Hsieh et al., 2004; Kawasaki et al., 2009; Tanimoto et al., 2007; Than et al., 2011; Uchida et al., 2014)。しかしながら、これらの研究に用いられたモデルには間質要素が無った。ところが、間質性線維芽細胞はPDACにおける主なDKK3供給源である。PSCがPDACの同時注射同所性モデルに存在しない時、DKK3遮断抗体は腫瘍進行に影響を及ぼさなかった。DKK3には前立腺間質細胞および網膜神経節およびミュラーグリア細胞に対する刺激作用もあった(Nakamura et al., 2007; Nakamura & Hackam, 2010; Zenzmaier et al., 2013)。網膜においてDKK3はWntシグナル伝達を増強し、このことはPDACのPSCにおける観察と一致する(Nakamura et al., 2007)。DKK3は、TGFβについて知られているものに似た、細胞コンテクスト依存的(cell context-dependent)な腫瘍進行において多種多様な、かつ相反することさえある役割を有すると考えられる(Padua & Massague, 2009。
【００２９】
PDACを含む様々な新生物にある腫瘍関連間質は免疫抑制性微小環境に寄与することがある。Kanedaら(2016)は、マクロファージ脂質キナーゼPI3KγがPDACにある免疫抑制性腫瘍微小環境を促進して、腫瘍進行、転移、および線維症の原因となることを示した。PI3Kγを阻害すると抗腫瘍性の免疫応答が回復し、腫瘍成長が減少し、生存が改善した。局所接着キナーゼ(FAK)もヒトPDAC試料における低レベルのCD8+T細胞浸潤および線維症と相関関係があることが示されている(Jiang et al., 2016)。PDACのKPCモデルにおいてFAK阻害剤で処置すると腫瘍成長が減少し、生存が改善した。さらに、以前は無応答性であったKPCモデルにおいてFAKを阻害するとT細胞免疫療法およびPD-1阻害剤に対する応答性が改善した。同様に、PSCによって産生されたDKK3はCD8+細胞傷害性T細胞を阻害し、KPCモデルにおいてDKK3を破壊すると細胞傷害性T細胞が腫瘍に強力に浸潤した。PDACの免疫応答性のある同系およびGEMMにおける抗DKK3 mAbを用いた腫瘍阻害は免疫不全異種移植片モデルと比較して有効であった。このことから、DKK3遮断効果がインタクトな免疫系の存在下でも増幅され得ることが示唆される。ホモ接合性またはヘテロ接合性のDKK3枯渇があるKPCマウスにおいて生存が同じだったという観察は予期せぬものであった。DKK3を部分的に破壊してもDKK3ヌルマウスとほぼ同じ程度のCD8+T細胞動員が得られるかどうかは不明であり、この疑問に取り組むために、もっと多くの研究が進行中である。はっきりしているのは、チェックポイント阻害剤療法がPDACのKPCモデルにおいて効果が無かったことであり、このことは臨床試験で認められた結果を反映している。しかしながら、遺伝子破壊またはmAbによる薬理学的遮断を用いたDKK3中和は免疫療法抵抗性を克服し、生存時間を有意に延ばすことができた。生存を改善するためには、DKK3遮断と免疫療法の組み合わせはDKK3遮断単独より優れていた。
【００３０】
DKK3が様々な新生物において腫瘍抑制因子または腫瘍促進因子として、このような広く多面的な効果をどのようにもつことができるのかは依然としてはっきりしていない。膵臓がんにおけるDKK3活性は少なくとも部分的にNF-κB活性化に依存するが、シグナル伝達機構は完全に解明されておらず、DKK3に対する受容体はしっかりと立証されていない。これらの疑問に関するさらなる洞察は多様なDKK3機能を理解するだけでなく、臨床試験でのDKK3標的療法の特異性を改善して、DKK3標的療法の効力を高め、毒性を最小限にするのにも重要であろう。
【００３１】
結論として、DKK3はPDACにおいて頻繁に発現しており、腫瘍の進行、転移、および少なくとも部分的にNF-κB活性化に依存する化学療法抵抗性を促進する。遺伝子破壊または薬理学的mAb遮断によるDKK3阻害は膵臓腫瘍成長を減速させることに効果があり、生存率が有意に改善された。さらに、DKK3阻害は抗CTLA-4阻害剤を用いた免疫療法に対する抵抗性を克服することができ、その結果として、生存の改善が長期間続いた。従って、DKK3は、単独療法として、または免疫療法と組み合わせて治療標的になり得る。
【００３２】
III.定義
「抗体」とは、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する時、この用語はインタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、単鎖(ScFv))、その変異体、天然変種、必要とされる特異性の抗原認識部位をもつ抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子の他の任意の改変された配置も包含する。
【００３３】
「抗体断片」はインタクトな抗体の一部しか含まず、一般的に、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、従って、抗原に結合する能力を保持している。この定義に包含される抗体断片の例には、(i)VL、CL、VH、およびCH1ドメインを有する、Fab断片;(ii)CH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFab断片であるFab'断片;(iii)VHおよびCH1ドメインを有するFd断片;(iv)VHおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインのC末端にある1つまたは複数のシステイン残基を有するFd'断片;(v)1つの抗体のVLおよびVHドメインを有するFv断片;(vi)VHドメインからなるdAb断片;(vii)単離されたCDR領域;(viii)ヒンジ領域にあるジスルフィド架橋によって連結された2つのFab'断片を含む二価断片であるF(ab')2断片;(ix)単鎖抗体分子(例えば、単鎖Fv;scFv);(x)同じポリペプチド鎖に重鎖可変ドメイン(VH)が軽鎖可変ドメイン(VL)とつながっている、2つの抗原結合部位がある「ダイアボディ」;(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む「直鎖抗体(linear antibody)」が含まれる。
【００３４】
「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの、ある部分が、特定の種に由来するか、または特定のクラスに属する抗体にある対応配列と相同であるが、鎖の残りのセグメントが、別の抗体にある対応配列と相同である抗体を指す。典型的に、これらのキメラ抗体では、軽鎖と重鎖の可変領域は、ある哺乳動物種に由来する抗体の可変領域を模倣するのに対して、定常部分は、別の種に由来する抗体にある配列と相同である。例えば、定常領域、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、可変領域は、都合よく、容易に入手できるハイブリドーマまたは非ヒト宿主生物由来B細胞を用いて、現在知られている供給源から得られてもよい。可変領域には調製のし易さという利点があり、特異性はその供給源の影響を受けないが、抗体が注射された時に、定常領域がヒトである場合、非ヒト供給源に由来する定常領域よりもヒト対象からの免疫応答を誘発する可能性が低い。しかしながら、上記の定義は、この特定の例に限定されない。
【００３５】
抗体の「定常領域」とは抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を単独で、または組み合わせて指す。軽鎖(CL)および重鎖(CH1、CH2、もしくはCH3、またはIgMおよびIgEの場合はCH4)の定常領域は重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動(transplacental mobility)、Fc受容体結合、補体結合などを付与する。慣例により、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠くなるにつれて、定常領域ドメインの数字が増える。
【００３６】
抗体の「可変領域」とは抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。軽鎖(VL)と重鎖(VH)部分の可変領域が抗原認識と特異性を決定する。VLとVHはそれぞれ、超可変領域とも知られる3つの相補性決定領域(CDR)でつながった4つのフレームワーク領域(FR)からなる。CDRは抗原の形状と相補性があり、抗原に対する抗体の親和性と特異性を決定する。VLとVHには6つのCDRがある。各鎖内のCDRはFRによって近くにまとめられ、他の鎖からのCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRの決定には少なくとも2種類の技法:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(Kabatナンバリングスキーム; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)を参照されたい);および(2)抗原抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ(Kabatによって示唆されたCDR-L1とCDR-H1にある挿入と欠失(インデル)の部位を補正するChothiaナンバリングスキーム; Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948を参照されたい)がある。他のナンバリングアプローチまたはスキームも使用することができる。本明細書で使用する時、CDRは、いずれかのアプローチによって、または両アプローチの組み合わせによって、または他の望ましいアプローチによって定義されたCDRを指すことがある。さらに、高度に保存されたコア、境界領域、および超可変領域の新たな定義を使用することができる。
【００３７】
本明細書で使用する「重鎖」という用語は、そのアミノ末端領域を介して免疫グロブリン軽鎖と結合する、大きな方の免疫グロブリンサブ単位を指す。重鎖は可変領域(VH)と定常領域(CH)を含む。定常領域はCH1、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインをさらに含む。IgE、IgM、およびIgYの場合、重鎖はCH4ドメインを含むが、ヒンジドメインを有さない。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)と分類され、これらの中には、いくつかのサブクラス(例えば、γ1〜γ4)があることを理解する。抗体の「クラス」を、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgG、またはIgEだと決定するのは、この鎖がどういったものであるかということである。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは十分に特徴付けられており、機能の専門化を付与することが知られている。
【００３８】
本明細書で使用する「軽鎖」という用語は、重鎖のアミノ末端領域と結合している、小さな方の免疫グロブリンサブ単位を指す。重鎖と同様に、軽鎖は可変領域(VL)と定常領域(CL)を含む。軽鎖はカッパまたはラムダ(κ、λ)と分類される。一対のこれらの軽鎖は一対の任意の様々な重鎖と結合して免疫グロブリン分子を形成することができる。軽鎖の意味の中には、カッパ定常領域(C-κ)と連結したラムダ可変領域(V-λ)またはラムダ定常領域(C-λ)と連結したカッパ可変領域(V-κ)がある軽鎖も包含される。
【００３９】
本明細書で使用する「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、または他の文法上の相当語句は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である少なくとも2つのヌクレオチドが共有結合したものを意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000などを含む、任意の長さの重合体である。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、場合によっては、少なくとも1つの異なる連結、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホルアミダート連結、ならびにペプチド核酸バックボーンおよび連結を有することがある核酸類似体が含まれる。天然ポリヌクレオチドと類似体の混合物を作製することができる。または、異なるポリヌクレオチド類似体の混合物および天然ポリヌクレオチドと類似体の混合物が作製されることがある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例:遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、cRNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーである。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでもよい。存在するのであれば、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体が組み立てられる前に付与されてもよく、重合体が組み立てられた後に付与されてもよい。ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによってさらに修飾されてもよい。この用語はまた二本鎖分子と一本鎖分子を両方とも含む。他で特定しない限り、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明のどの態様も、二本鎖型と、二本鎖型を構成すると知られているか、または予測されている2本のそれぞれの相補的一本鎖を両方とも包含する。ポリヌクレオチドは、4つのヌクレオチド塩基:アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびポリヌクレオチドがRNAの場合はチミンの代わりにウラシル(U)の特定の配列で構成される。従って、「ポリヌクレオチド配列」という用語はポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。特に定めのない限り、特定のポリヌクレオチド配列は、保存的に修飾されたその変種(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的にいえば、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって縮重コドン置換が行われる場合がある。
【００４０】
本明細書において使用する「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語はアミノ酸残基の重合体を指す。これらの用語はまた、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学的ミメティックであるアミノ酸重合体、ならびに天然アミノ酸重合体、修飾された残基を含有する重合体、および非天然アミノ酸重合体にも適用される。この場合では、「ポリペプチド」という用語は抗体またはその断片を包含する。
【００４１】
本明細書で使用する組換え核酸技術、微生物学、免疫学、抗体工学、ならびに分子生物学および細胞生物学の分野において使用する他の用語は、適用可能な技術分野の当業者により一般的に理解される。
【００４２】
IV.抗体および抗体の改変
一態様では、前記抗体は、キメラ抗体、例えば、異種の非ヒト、ヒト、またはヒト化配列(例えば、フレームワークおよび/または定常ドメイン配列)につなげられた、非ヒトドナーに由来する抗原結合配列を含む抗体である。外来抗体の可変領域はそのままにして、モノクローナル抗体の軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインを、ヒトに由来する類似ドメインと交換する方法が開発されている。または、「完全ヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウスにおいて産生される。げっ歯類、例えば、マウスアミノ酸配列とヒトアミノ酸配列が両方ともある抗体可変ドメインを組み換えにより構築することによって、モノクローナル抗体の可変ドメインを、よりヒト型に変換する方法も観察されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変CDRだけがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワークおよび定常領域はヒトアミノ酸配列に由来する(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,091,513号および同第6,881,557号を参照されたい)。げっ歯類に特有の、抗体内にあるアミノ酸配列を、ヒト抗体の対応する位置に見出されるアミノ酸配列と交換すると、治療的使用の間に重篤な免疫反応の可能性が低下すると考えられている。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は遺伝子変異または他の変化も受けることがあり、これにより、ハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性が変化してもよく、変化しなくてもよい。
【００４３】
様々な動物種においてポリクローナル抗体を産生するための方法ならびにヒト化、キメラ、および完全ヒトを含む様々なタイプのモノクローナル抗体を産生するための方法は当技術分野において周知であり、かなり予測することができる。例えば、以下の米国特許および特許出願:米国特許出願番号2004/0126828および2002/0172677;ならびに米国特許番号3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,196,265;4,275,149;4,277,437;4,366,241;4,469,797;4,472,509;4,606,855;4,703,003;4,742,159;4,767,720;4,816,567;4,867,973;4,938,948;4,946,778;5,021,236;5,164,296;5,196,066;5,223,409;5,403,484;5,420,253;5,565,332;5,571,698;5,627,052;5,656,434;5,770,376;5,789,208;5,821,337;5,844,091;5,858,657;5,861,155;5,871,907;5,969,108;6,054,297;6,165,464;6,365,157;6,406,867;6,709,659;6,709,873;6,753,407;6,814,965;6,849,259;6,861,572;6,875,434;および6,891,024は、このような方法を可能にする説明(enabling description)を提供し、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
ある特定の態様では、前記抗体はコンジュゲートである。コンジュゲートは、例えば、他のタンパク質(proteinatious)、炭水化物、脂質、または混合部分分子とコンジュゲートされた本発明の特異的結合剤(例えば、抗体)でもよい。このような抗体コンジュゲートには、1つまたは複数の重合体との連結を含む改変が含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、抗体は1つまたは複数の水溶性重合体に連結される。ある特定のこのような態様では、水溶性重合体に連結すると、抗体が、生理学的環境などの水性環境で沈殿する可能性が小さくなる。ある特定の態様では、治療用抗体が水溶性重合体に連結される。ある特定の態様では、当業者は、重合体/抗体コンジュゲートが患者を処置する際に用いられるかどうか、もしそうであれば、抗体の薬理学的プロファイル(例えば、半減期、投与量、活性、抗原性、および/または他の要因)を含むが、これに限定されない考慮すべき事項に基づいて適切な水溶性重合体を選択することができる。
【００４５】
さらなる態様では、コンジュゲートは、例えば、細胞傷害剤でもよい。このタイプの細胞傷害剤は、抗体を介した細胞傷害性を改善する可能性があり、細胞死を直接的または間接的に刺激するサイトカイン、放射性同位体、化学療法薬(プロドラッグを含む)、細菌毒素(例えば、シュードモナス属エキソトキシン、ジフテリア毒素など)、植物毒素(例えば、リシン、ゲロニンなど)、化学的コンジュゲート(例えば、マイタンシノイド毒素、カレカエマイシン(calechaemicin)など)、ラジオコンジュゲート(radioconjugate)、酵素コンジュゲート(例えば、RNaseコンジュゲート、グランザイム抗体指向性酵素/プロドラッグ療法(granzyme antibody-directed enzyme/prodrug therapy))などのような部分を含む。毒素をコードするポリヌクレオチドと、結合剤をコードするポリヌクレオチドを連結した後に、タンパク質細胞毒を特異的結合薬剤との融合タンパク質として発現させることができる。さらに別の選択肢では、特異的結合薬剤は望ましい細胞毒を含むように共有結合により改変することができる。
【００４６】
さらなる態様では、抗体またはその断片は、放射標識、蛍光標識、酵素(例えば、比色反応もしくは蛍光定量反応を触媒する酵素)、基質、固体マトリックス、または担体(例えば、ビオチンもしくはアビジン)を含むが、これに限定されないレポーター基とコンジュゲートすることができる。従って、本発明は、抗体分子を含む分子を提供し、この分子は、好ましくは、放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス、および担体からなる群より選択されるレポーター基をさらに含む。このような標識は当業者に周知であり、例えば、特に、ビオチン標識が意図される。このような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第3,817,837号;米国特許第3,850,752号;米国特許第3,996,345号、および米国特許第4,277,437号に記載されている。これらのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる。有用な他の標識には放射性標識、蛍光標識、および化学発光標識が含まれるが、これに限定されない。このような標識の使用に関する米国特許には、例えば、米国特許第3,817,837号;米国特許第3,850,752号;米国特許第3,939,350号、および米国特許第3,996,345号が含まれる。本発明の任意のペプチドが、これらの任意の標識のうちの1つ、2つ、またはそれより多くを含んでもよい。
【００４７】
A.モノクローナル抗体およびその産生
「単離された抗体」は、天然環境の成分から分離または回収されている抗体である。天然環境の汚染成分とは、診断または治療での抗体の使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含むことがある。特定の態様では、前記抗体は、(1)ローリー法によって求められた時に抗体の95重量％超まで、最も詳細には99重量％超まで;(2)スピニングカップシーケネーター(spinning cup sequenator)を用いてN末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで;または(3)クマシーブルーもしくは銀染色を用いて、変性条件下もしくは非変性条件下でのSDS-PAGEによって均一になるまで精製される。単離された抗体は、インサイチューで組換え細胞内にある抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程によって調製される。
【００４８】
基本4鎖抗体単位は、2本の同一の軽鎖(L)鎖と2本の同一の重(H)鎖で構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。IgM抗体は、5つの基本ヘテロ四量体単位と、J鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドからなり、従って、10個の抗原結合部位を含むのに対して、分泌型IgA抗体は重合して、2〜5つの、基本4鎖単位とJ鎖を含む多価集合体を形成することができる。IgGの場合、4鎖単位は一般的に約150,000ダルトンである。それぞれのL鎖は、1つの共有結合ジスルフィド結合によってH鎖に連結されるのに対して、2本のH鎖は、H鎖アイソタイプに応じて1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。それぞれのH鎖およびL鎖は、規則正しく間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれのH鎖には、N末端にある可変領域(VH)に続いて、α鎖およびγ鎖のそれぞれの場合は3つの定常ドメイン(CH)、μおよびアイソタイプの場合は4つのCHドメインがある。それぞれのL鎖には、N末端にある可変領域(VL)に続いて、その末端に定常ドメイン(CL)がある。VLはVHと共に整列され、CLは重鎖(CH1)の最初の定常ドメインと共に整列されている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変領域と重鎖可変領域の境界面を形成すると考えられている。VHおよびVLが一緒に対形成すると1つの抗原結合部位が形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, 71頁, 第6章を参照されたい。
【００４９】
どの脊椎動物種に由来するL鎖も、定常ドメイン(CL)のアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、はっきりと異なる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。重鎖(CH)の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。5つのクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖がある。γおよびαクラスは、CH配列および機能の比較的わずかな違いに基づいてサブクラスにさらに分けられ、ヒトは以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を発現する。
【００５０】
「可変」という用語は、Vドメインのある特定のセグメントが抗体間で配列の点で広範囲にわたって異なるという事実を指す。Vドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変領域の110アミノ酸範囲の全体にわたって均一に分布していない。そうではなく、V領域は、それぞれが9〜12アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性がある短い領域によって隔てられた、15〜30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる比較的変化しない区画からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、主としてβシート配置をとる4つのFRを含み、これらは、ループ接続を形成する、場合によってはβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によってつながっている。各鎖にある超可変領域はFRによって近くにまとめられ、他の鎖に由来する超可変領域と一緒になって抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照されたい)。定常ドメインは抗体と抗原の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、抗体依存性好中球食作用(ADNP)、および抗体依存性補体沈着(ADCD)への抗体の関与を示す。
【００５１】
「超可変領域」という用語が本明細書において用いられる時には、抗原結合を担う抗体アミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「CDR」に由来するアミノ酸残基(例えば、Kabatナンバリング方式:Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従って番号が付けられた時には、VLではおよそ約残基24-34(L1)、50-56(L2)、および89-97(L3)、VHではおよそ約31-35(H1)、50-65(H2)、および95-102(H3));ならびに/または「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基(例えば、Chothiaナンバリング方式; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))に従って番号が付けられた時には、VLでは残基24-34(L1)、50-56(L2)、および89-97(L3)、VHでは26-32(H1)、52-56(H2)、および95-101(H3))、ならびに/または「超可変ループ」/CDRに由来するアミノ酸残基(例えば、IMGTナンバリング方式; Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999)、Ruiz、M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000)に従って番号が付けられた時には、VLでは残基27-38(L1)、56-65(L2)、および105-120(L3)、VHでは27-38(H1)、56-65(H2)、および105-120(H3))を含む。任意で、AHo; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)に従って番号が付けられた時には、抗体は、以下の場所、VLでは28、36(L1)、63、74-75(L2)、および123(L3)、VsubHでは28、36(H1)、63、74-75(H2)、および123(H3)の1つまたは複数に対称的な挿入がある。
【００５２】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体からなる集団から得られた抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、起こり得る天然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して作られている。異なる決定基(例えば、エピトープ)に対して作られている異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上にある単一の決定基に対して向けられている。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されずに合成され得る点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に述べられたハイブリドーマ方法論によって調製されてもよく、抗原特異的B細胞、感染もしくは免疫化に応答する抗原特異的形質芽球のシングルセルソーティング、またはバルクソートされた(bulk sorted)抗原特異的コレクション中にあるシングル細胞からの連結された重鎖および軽鎖の捕獲の後に組換えDNA方法を用いて細菌細胞、真核生物の動物細胞または植物細胞(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)において作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５３】
B.ヒト化抗体およびその産生
上記の抗体またはその断片が治療を目的としている場合、免疫反応を減弱するために、これらを「ヒト化する」ことが望ましい場合がある。このようなヒト化抗体はインビトロ状況で研究されてもよく、インビボ状況で研究されてもよい。ヒト化抗体は、例えば、抗体の免疫原性部分を、対応しているが非免疫原性の部分と交換することによって作製され得る(すなわち、キメラ抗体)。PCT出願PCT/US86/02269;EP出願184,187;EP出願171,496;EP出願173,494;PCT出願WO86/01533;EP出願125,023; Sun et al.(1987); Wood et al.(1985); および Shaw et al.(1988);これらの参考文献の全てが参照により本明細書に組み入れられる。「ヒト化」キメラ抗体の総説はMorrison(1985;これも参照により本明細書に組み入れられる)によって提供されている。または、「ヒト化」抗体はCDRまたはCEA置換によって産生することができる。Jones et al.(1986)およびBeidler et al.(1988)。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。このために、GenBankデータベース内を検索することによって、マウスモノクローナル抗体のVHフレームワークおよびVLフレームワークと相同なヒトVH配列およびVL配列を特定することができる。次いで、相同性が最も高いヒト配列をヒト化用アクセプターとして選択する。次いで、選択されたヒトフレームワークの対応する位置にマウスモノクローナルのCDR配列を移す。
【００５４】
C.一般的方法
本発明のモノクローナル抗体にはいくつかの用途があると理解される。これらの用途には、DKK3の検出において使用するための、ならびに高レベルのDKK3に関連する疾患を処置するための診断キットの製造が含まれる。これらに関連して、このような抗体を診断剤もしくは治療剤に結び付ける、競合アッセイにおいて捕獲剤もしくは競合物質(competitor)として使用する、またはさらなる薬剤を取り付けることなく個々に使用することができる。前記抗体は、下記でさらに議論されるように変異または改変することができる。抗体を調製および特徴付ける方法は当技術分野において周知である(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;米国特許第4,196,265号を参照されたい)。
【００５５】
モノクローナル抗体(MAb)を作製する方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ線に沿って開始する。これらの両方法の最初の工程は適切な宿主の免疫化である。当技術分野において周知のように、ある特定の免疫化用組成物は免疫原性が異なる場合がある。従って、ペプチドまたはポリペプチド免疫原と担体と結合させることで成し遂げられ得るように宿主免疫系をブーストすることが必要なことが多い。例示的な、かつ好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも担体として使用することができる。ポリペプチドを担体タンパク質とコンジュゲートするための手段は当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル(maleimidobencoyl)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド(carbodiimyde)、およびbis-ビアゾ化ベンジジン(biazotizedbenzidine)を含む。これも当技術分野において周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる非特異的な免疫応答刺激剤を用いることで高めることができる。例示的な、かつ好ましいアジュバントには、動物では完全フロイントアジュバント(死滅結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有する非特異的な免疫応答刺激剤)、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれ、ヒトでは、ミョウバン、CpG、MFP59、および免疫賦活性分子の組み合わせ(「アジュバントシステム(Adjuvant System)」、例えば、AS01またはAS03)が含まれる。ナノ粒子ワクチン、または物理的送達系(例えば、脂質ナノ粒子もしくは金バイオリスティックビーズ)の中にあるDNAもしくはRNA遺伝子として送達される遺伝子コード抗原、および針、遺伝子銃、経皮エレクトロポレーション装置を用いて送達される遺伝子コード抗原を含めて、抗原特異的B細胞を誘導する、さらなる実験形態の接種が可能である。抗原遺伝子はまた、複製能力のある、または複製欠損のあるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、またはアルファウイルスレプリコン、またはウイルス様粒子よってコードされて運ぶこともできる。
【００５６】
抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリッドを作製するための方法は、通常、体細胞をミエローマ細胞と2:1の比率で混合する工程を含むが、この比率は、細胞膜の融合を促進する薬剤(化学的または電気的)の存在下で約20:1〜約1:1で変化することがある。場合によっては、初回工程としてヒトB細胞をエプスタイン-バーウイルス(EBV)で形質転換するとB細胞のサイズが増加し、相対的に大型のミエローマ細胞との融合が高まる。EBVによる形質転換効率は、形質転換培地中にCpGおよびChk2阻害剤薬物を用いることで高まる。または、ヒトB細胞は、IL-21およびヒトB細胞活性化因子(BAFF)、TNFスーパーファミリーのII型メンバーなどの、さらなる可溶性因子を含有する培地中で、トランスフェクトされたCD40リガンド(CD154)発現細胞株と共に共培養することによって活性化することができる。センダイウイルスを用いた融合方法が、Kohler and Milstein (1975; 1976)によって述べられており、37％(v/v)PEGなどのポリエチレングリコール(PEG)を用いた融合方法がGefter et al. (1977)によって述べられている。電気的に誘導される融合方法の使用も適しており(Goding, pp. 71-74, 1986)、効率をさらに良くするためのプロセスがある (Yu et al., 2008)。融合手順は、通常、生存可能なハイブリッドを約1x10-6〜1x10-8の低頻度で産生するが、最適化された手順を用いると1/200に近い融合効率を得ることができる(Yu et al., 2008)。しかしながら、生存可能な融合したハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、融合しなかった(infused)親細胞(特に、通常、無限に増殖し続ける融合しなかったミエローマ細胞)とは区別されるので、相対的に低い融合効率は問題を提起しない。選択培地は、一般的に、組織培養培地中でのヌクレオチド新規合成をブロックする薬剤を含有する培地である。例示的な、かつ好ましい薬剤はアミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンとメトトレキセートはプリンとピリミジンの両方の新規合成をブロックするのに対して、アザセリンはプリン合成しかブロックしない。アミノプテリンまたはメトトレキセートが用いられる場合、培地にはヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンとチミジンが加えられる(HAT培地)。アザセリンが用いられる場合、培地にはヒポキサンチンが加えられる。B細胞供給源が、EBVで形質転換されたヒトB細胞株であれば、ミエローマと融合しなかったEBV形質転換株を排除するためにウアバインが添加される。
【００５７】
好ましい選択培地は、HATまたはウアバインを含むHATである。HAT培地中では、ヌクレオチドサルベージ経路を動かすことができる細胞しか生き残ることができない。ミエローマ細胞はサルベージ経路の重要な酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)に欠損があり、生き残ることができない。B細胞は、この経路を動かすことができるが、培養状態では寿命は限られており、一般的に約2週間以内に死ぬ。従って、選択培地中で生き残ることができる唯一の細胞は、ミエローマ細胞とB細胞から形成されたハイブリッドである。融合に用いられるB細胞の供給源が、本明細書中のように、EBVで形質転換されたB細胞の株である場合、EBVで形質転換されたB細胞が薬物による死滅に対して感受性があるために、ハイブリッドの薬物選択にウアバインも用いられる場合がある。これに対して、使用されるミエローマパートナーはウアバイン耐性があることで選択される。
【００５８】
培養するとハイブリドーマ集団が得られ、この集団から特定のハイブリドーマが選択される。典型的に、ハイブリドーマの選択はマイクロタイタープレート内でのシングルクローン希釈によって細胞を培養し、その後に、望ましい反応性について個々のクローン上清を(約2〜3週間後に)試験することによって行われる。このアッセイは、感度が高く、簡単で、迅速でなければならず、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどがある。次いで、選択されたハイブリドーマは連続希釈されるか、フローサイトメトリーソーティングによってシングル細胞ソーティングされ、個々の抗体産生細胞株にクローニングされる。次いで、クローンはMAbを供給するように無期限に増殖することができる。これらの細胞株は2つの基本的なやり方でMAb産生に利用され得る。ハイブリドーマ試料は動物(例えば、マウス)に(多くの場合、腹腔内に)注射することができる。任意で、注射前に、動物は炭化水素、特に、油、例えば、プリスタン(テトラメチルペンタデカン)を用いて初回刺激される。このようにヒトハイブリドーマが用いられる場合、腫瘍拒絶反応を阻止するために、免疫無防備状態のマウス、例えば、SCIDマウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで、血清または腹水液などの動物の体液を軽くたたいて(tap)、高濃度のMAbを得ることができる。個々の細胞株をインビトロで培養することもでき、この場合、MAbは天然で培養培地に分泌され、培養培地から高濃度で容易に入手することができる。または、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで用いて、細胞上清中に免疫グロブリンを産生することができる。この細胞株は、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために無血清培地中で増殖するように合わせることができる。
【００５９】
どちらの手段で産生されたMAbも、所望であれば、濾過、遠心分離、および様々なクロマトグラフィー方法、例えば、FPLCまたはアフィニティクロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。本開示のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンもしくはパパインなどの酵素を用いた消化を含む方法によって、および/または化学的還元でジスルフィド結合を切断することによって精製モノクローナル抗体から得ることができる。または、本開示に包含されるモノクローナル抗体断片は自動ペプチド合成機を用いて合成することができる。
【００６０】
モノクローナルを作製するために分子クローニングアプローチが用いられる場合があることも意図される。関心対象の抗原で標識されたシングルB細胞を、常磁性ビーズ選択またはフローサイトメトリーソーティングを用いて物理的にソーティングすることができる。次いで、RNAをシングル細胞から単離し、抗体遺伝子をRT-PCRによって増幅することができる。または、抗原特異的なバルクソートされた細胞集団をマイクロベシクル内に隔離し、マッチした重鎖可変遺伝子および軽鎖可変遺伝子を、重鎖アンプリコンおよび軽鎖アンプリコンの物理的連結を用いて、または小胞から重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の共通バーコーティング(common barcoding)を用いてシングル細胞から回収することができる。シングル細胞からのマッチした重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はまた、RT-PCRプライマーと、転写物を細胞1つにつき1つのバーコードで特徴付けるためのバーコードを有する細胞透過性ナノ粒子で細胞を処理することによって抗原特異的B細胞集団から入手することもできる。抗体可変遺伝子はまたハイブリドーマ株のRNA抽出によって単離することもでき、抗体遺伝子をRT-PCRによって入手し、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。または、細胞株から単離されたRNAからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが調製され、適切な抗体を発現するファージミドが、ウイルス抗原を用いてパニングすることによって選択される。従来のハイブリドーマ技法より優れた、このアプローチの利点は、およそ約104倍の抗体を1回で産生およびスクリーニングすることができ、H鎖とL鎖の組み合わせによって新しい特異性が生まれ、それにより、適切な抗体を発見する可能性がさらに高まることである。
【００６１】
本開示において有用な抗体の産生を開示する他の米国特許には、コンビナトリアルアプローチを用いたキメラ抗体の産生について説明する米国特許第5,565,332号;組換え免疫グロブリン調製物について説明する米国特許第4,816,567号;および抗体-治療剤コンジュゲートについて説明する米国特許第4,867,973号が含まれ、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
【００６２】
本開示に従う抗体は第1の場合では結合特異性によって定義される場合がある。当業者は、当業者に周知の技法を用いて所定の抗体の結合特異性/親和性を評価することによって、このような抗体が本発明のクレームの範囲内にあるかどうか確かめることができる。例えば、所定の抗体が結合するエピトープは、抗原分子内に位置する3つ以上の(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20の)アミノ酸の単一の連続配列(例えば、ドメインにある直鎖エピトープ)からなってもよい。または、エピトープは、抗原分子内に位置する複数の非連続アミノ酸(またはアミノ酸配列)(例えば、コンホメーションエピトープ)からなってもよい。
【００６３】
当業者に公知の様々な技法を用いて、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質の中にある「1つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうか確かめることができる。例示的な技法には、例えば、日常的なクロスブロッキングアッセイ、例えば、Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載のアッセイが含まれる。クロスブロッキングは、ELISA、バイオレイヤー干渉法、または表面プラズモン共鳴などの様々な結合アッセイにおいて測定することができる。他の方法には、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63)、ペプチド切断分析、単一粒子再構成(single particle reconstruction)を用いた高分解能電子顕微鏡法、cryoEM、または断層撮影、結晶学研究およびNMR分析が含まれる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を使用することができる(Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496)。抗体が相互作用する、ポリペプチドの中にあるアミノ酸を特定するのに使用することができる別の方法は、質量分析法によって検出される水素/重水素交換である。大まかに言うと、水素/重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識し、その後に、抗体を、重水素で標識されたタンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質/抗体複合体を水に移す。抗体複合体によって保護されているアミノ酸の中にある交換可能なプロトンは、境界面の一部でないアミノ酸の中にある交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素と水素のバックエクスチェンジ(back-exchange)を受ける。結果として、タンパク質/抗体境界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し、従って、境界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に高い質量を示す可能性がある。抗体が解離した後に、標的タンパク質はプロテアーゼ切断と質量分析法分析に供され、それによって、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する、重水素で標識された残基が明らかになる。例えば、Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265Aを参照されたい。
【００６４】
「エピトープ」という用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する、抗原上にある部位を指す。B細胞エピトープは連続アミノ酸から形成されてもよく、タンパク質の三次フォールディングによって近接された非連続アミノ酸から形成されてもよい。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されたエピトープは典型的には変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、独特の空間コンホメーションに、典型的には少なくとも3アミノ酸、さらに通常は少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。
【００６５】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング(Antigen Structure-based Antibody Profiling)(ASAP)とも知られる改変補助プロファイリング(Modification-Assisted Profiling)(MAP)は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対して作られた多数のモノクローナル抗体(mAb)を分類する方法である(その全体が参照により本明細書に特に組み入れられるUS2004/0101920を参照されたい)。それぞれの分類は、別の分類によって表されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重複するユニークなエピトープを反映する場合がある。この技術を用いると、遺伝的に異なる抗体に特徴を集めることができるように、遺伝的に同一の抗体を迅速に選別することが可能になる。ハイブリドーマスクリーニングに適用された時に、MAPは、望ましい特徴を有するmAbを産生する、まれなハイブリドーマの特定を容易にする可能性がある。MAPは、本開示の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体グループに分けるのに使用され得る。
【００６６】
本開示は、同じエピトープまたはエピトープ部分に結合し得る抗体を含む。同様に、本開示はまた、標的またはその断片への結合について、本明細書に記載の任意の特定の例示的な抗体と競合する抗体も含む。抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうか、または結合について参照抗体と競合するかどうかは当技術分野において公知の日常的な方法を用いることで容易に確かめることができる。例えば、試験抗体が参照と同じエピトープに結合するかどうか確かめるために、参照抗体を飽和条件下で標的に結合させる。次に、試験抗体が標的分子に結合する能力を評価する。参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合できれば、参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方で、参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合できなければ、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
【００６７】
別の局面では、表1および表2に示した重鎖および軽鎖に由来するクローン対CDRを有するモノクローナル抗体が提供される。このような抗体は本明細書に記載の方法を用いて産生され得る。
【００６８】
別の局面では、前記抗体は可変配列によって定義される場合があり、可変配列は、さらなる「フレームワーク」領域を含む。これらは、完全可変領域をコードするか、または表す、表3および表4に提供される。さらに、抗体配列は、任意で、下記でさらに詳細に議論される方法を用いて、これらの配列から変化する場合がある。例えば、核酸配列は、(a)可変領域が軽鎖および重鎖の定常ドメインから分離されている場合がある、(b)核酸が、上記で示したものと異なるが、それによってコードされる残基に影響を及ぼさない場合がある、(c)核酸が、上記で示したものと、ある特定のパーセント分だけ、例えば、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の相同性だけ異なる場合がある、(d)核酸が、例えば、約0.02M〜約0.15M NaCl、約50℃〜約70℃の温度によって示される、低塩および/もしくは高温度条件により例示されるような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力のおかげで上記で示したものと異なる場合がある、(e)アミノ酸が、上記で示したものと、ある特定のパーセント分だけ、例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の相同性だけ異なる場合がある、または(f)アミノ酸が、(下記で議論される)保存的置換を許すことで上記で示したものと異なる場合がある点で上記で示したものと異なる場合がある。前記のそれぞれが、表3に示した核酸配列と表4のアミノ酸配列に適用される。
【００６９】
ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列を比較する場合、下記のように最大に一致するようにアラインメントされた時に2つの配列の中にあるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、2つの配列は「同一」だと言われる。2つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウ上で配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。本明細書で使用する「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約20の連続した位置、通常、30〜約75、40〜約50のセグメントを指す。このセグメントにおいて、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適にアラインメントされた後に2つの配列を比較することができる。
【００７０】
比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェア(DNASTAR, Inc., Madison, Wis.)のLasergeneスイートにあるMegalignプログラムを用いて行われる場合がある。このプログラムは、以下の参考文献:Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730に記載のいくつかのアラインメントスキームを取り入れている。
【００７１】
または、比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482の局所的同一性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似度法(similarity method)のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WisのGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA)、または検査によって行われる場合がある。
【００７２】
パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムのある特定の例はBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al.(1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLASTおよびBLAST2.0を、例えば、本明細書に記載のパラメータと共に用いて本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのパーセント配列同一性を求めることができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公的に入手することができる。抗体配列の再編成される性質と、各遺伝子の長さが変化することから、1つの抗体配列について複数回のBLAST検索が必要である。また、異なる遺伝子を手作業で集合させることも難しく、エラーを起こしやすい。配列分析ツールIgBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)によって、生殖系列V、D、およびJ遺伝子とのマッチ、再編成接合部における詳細、IgVドメインフレームワーク領域および相補性決定領域の線引きが特定される。IgBLASTはヌクレオチド配列またはタンパク質配列を分析することができ、配列をバッチ処理することができ、おそらく、最も良くマッチした生殖系列V遺伝子を逃す機会を最小限にするように、生殖系列遺伝子データベースおよび他の配列データベースと突き合わせて同時に検索することができる。
【００７３】
あるアプローチでは、「配列同一性パーセント」は、少なくとも20個の位置の比較ウィンドウにわたって2つの任意にアライメントされた配列を比較することによって求められる。2つの配列の最適アラインメントのために、比較ウィンドウにあるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して20パーセント以下、通常、5〜15パーセント、または10〜12パーセントの付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。パーセントは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じた位置の数を求めて、マッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を参照配列の中の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性パーセントを出すことによって計算される。
【００７４】
抗体を定義するさらに別の手法は、下記の任意の抗体およびその抗原結合断片の「誘導体」として定義することである。「誘導体」という用語は、抗原に免疫特異的に結合するが、「親」(または野生型)分子と比べて、1、2、3、4、5、またはそれより多いアミノ酸置換、付加、欠失、または修飾を含む、抗体またはその抗原結合断片を指す。このようなアミノ酸置換または付加は天然(すなわち、DNAによってコードされる)アミノ酸残基を導入してもよく、非天然アミノ酸残基を導入してもよい。「誘導体」という用語は、例えば、エフェクターまたは結合特性が強化された、または損なわれた変種Fc領域を有する抗体などを形成するように、例えば、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、またはCH4領域が変化した変種を包含する。さらに、「誘導体」という用語は、非アミノ酸修飾、例えば、グリコシル化される(例えば、マンノース、2-N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、5-N-アセチルノイラミン酸、5-グリコールノイラミン酸などの含有率が変化した)、アセチル化される、ペグ化される、リン酸化される、アミド化される、既知の保護基/ブロック基、タンパク質分解切断によって誘導体化される、細胞リガンドまたは他のタンパク質などに連結される場合があるアミノ酸を包含する。一部の態様では、炭水化物修飾を変えると、以下:抗体の可溶化、抗体の細胞下輸送および分泌の促進、抗体組み立ての促進、コンホメーションの完全性、および抗体を介したエフェクター機能の1つまたは複数が調節される。特定の態様では、炭水化物修飾を変えると、炭水化物修飾が無い抗体と比べて、抗体を介したエフェクター機能が高まる。抗体を介したエフェクター機能を変える炭水化物修飾は当技術分野において周知である(例えば、Shields, R. L. et al. (2002)「Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity」, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001)「Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII」, Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294を参照されたい)。炭水化物含有率を変える方法は当業者に公知である。例えば、Wallick, S. C. et al. (1988)「Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen」, J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989)「Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region」, J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995)「The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody」, Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003)「Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering」, Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002)「Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity」, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740を参照されたい。
【００７５】
ビーズベースもしくは細胞ベースのアッセイまたは動物モデルでのインビボ研究によって測定された時に、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、抗体依存性好中球食作用(ADNP)、または抗体依存性補体沈着(ADCD)機能において好ましいレベルの活性を与えるように操作された配列またはグリコシル化状態をもつ誘導抗体または抗体断片を作製することができる。
【００７６】
誘導抗体または抗体断片は、特異的な化学的切断、アセチル化、製剤設計(formulation)、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これに限定されない、当業者に公知の技法を用いて化学修飾によって修飾されてもよい。一態様では、抗体誘導体は、親抗体と類似する、または同一の機能を有する。別の態様では、抗体誘導体は親抗体と比べて変化した活性を示す。例えば、誘導抗体(またはその断片)は、親抗体よりもしっかりとエピトープに結合することができる、またはタンパク質分解に対する耐性が強い。
【００７７】
様々な態様において、発現の改善、交差反応性の改善、またはオフターゲット結合の減少などの様々な理由で、特定された抗体の配列を操作することが選択される場合がある。改変された抗体は、標準的な分子生物学的技法による発現またはポリペプチド化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。組換え発現方法は本文書の他の箇所で取り扱う。以下は、抗体操作のための関連する目標技法の一般的な議論である。
【００７８】
ハイブリドーマを培養し、次いで、細胞を溶解し、全RNAを抽出することができる。ランダムヘキサマーとRTを用いて、RNAのcDNAコピーを作製し、次いで、全てのヒト可変遺伝子配列を増幅すると予想されるPCRプライマーの多重混合物を用いてPCRを実行することができる。PCR産物をpGEM-TEasyベクターにクローニングし、次いで、標準的なベクタープライマーを用いた自動DNA配列決定によって配列決定することができる。ハイブリドーマ上清から収集した抗体を用いて結合および中和のアッセイを実行し、プロテインGカラムを用いたFPLCによって精製することができる。
【００７９】
組換え完全長IgG抗体は、クローニングベクターに由来する重鎖Fv DNAおよび軽鎖Fv DNAをIgGプラスミドベクターにサブクローニングし、トランスフェクションによって293(例えば、Freestyle)細胞またはCHO細胞に導入することによって作製することができる。抗体は293またはCHO細胞上清から収集および精製することができる。他の適切な宿主細胞系には、細菌、例えば、大腸菌、昆虫細胞(S2、Sf9、Sf29、HighFive)、植物細胞(例えば、ヒト様グリカンに合わせて操作されている、もしくは操作されていないタバコ)、藻類、または様々な非ヒトトランスジェニックの状況では、例えば、マウス、ラット、ヤギ、もしくはウシが含まれる。
【００８０】
後の抗体精製と宿主免疫化の両方を目的とする、抗体をコードする核酸の発現も意図される。抗体コード配列は天然RNAまたは修飾RNAなどのRNAでもよい。修飾RNAは、mRNAに高い安定性と低い免疫原性を付与し、それによって、治療に重要なタンパク質の発現を容易にする、ある特定の化学修飾を意図する。例えば、N1-メチル-プソイドウリジン(N1mΨ)は翻訳能力の点で他のいくつかのヌクレオシド修飾とこれらの組み合わせより優れている。翻訳の免疫/eIF2αリン酸化依存性阻害をオフにすることに加えて、組み込まれたN1mΨヌクレオチドは、mRNA上でのリボソームポージング(pausing)と密度を増やすことで翻訳プロセスの動態を激変させる。修飾mRNAのリボソームローディング(loading)が増加するので、修飾mRNAは、同じmRNA上でのリボソームリサイクリングまたは新規リボソーム動員を促進することで開始をもっと許容するようになる。このような修飾を用いると、RNA接種後に、インビボでの抗体発現を増強できるかもしれない。天然でも修飾されていてもRNAは裸のRNAとして送達されてもよく、脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルに入れられて送達されてもよい。
【００８１】
または、前記抗体をコードするDNAが同じ目的で用いられる場合がある。DNAは、設計された宿主細胞において活性があるプロモーターを含む発現カセットに含まれる。発現カセットは、都合よく、従来のプラスミドまたはミニベクターなどの複製可能なベクターに含まれる。ベクターにはウイルスベクターが含まれ、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスが意図される。抗体遺伝子をコードするレプリコン、例えば、VEEウイルスまたはシンドビスウイルスに基づくアルファウイルスレプリコンも意図される。このようなベクターの送達は、筋肉内経路、皮下経路、または皮内経路を介して針によって行われてもよく、インビボ発現が望ましい時には経皮エレクトロポレーションによって行われてもよい。
【００８２】
最終cGMP製造プロセスと同じ宿主細胞および細胞培養プロセスにおいて産生される抗体が迅速に入手できることにはプロセス開発プログラムの期間を短くする潜在能力がある。Lonzaは、少量(50gまで)の抗体をCHO細胞において迅速に産生するために、CDACF培地中で増殖したプールしたトランスフェクタントを利用する一般的方法を開発した。真の一過的な系よりわずかに遅いが、これらの利点には、高い産物濃度と、産生細胞株と同じ宿主およびプロセスの使用が含まれる。使い捨てのバイオリアクター:フェドバッチモードで操作する使い捨てのバッグバイオリアクター培養(5L作業体積(working volume))の内での、モデル抗体を発現するGS-CHOプールの増殖および生産性の例。トランスフェクションの9週間以内に2g/Lの収集抗体濃度に達した。
【００８３】
抗体分子は、例えば、mAbのタンパク質分解切断によって生じる断片(例えば、F(ab')、F(ab')2)、または、例えば、組換え手段によって生じる単鎖免疫グロブリンを含む。F(ab')抗体誘導体が一価であるのに対して、F(ab')2抗体誘導体は二価である。一態様では、このような断片を互いに、または他の抗体断片もしくは受容体リガンドと組み合わせて「キメラ」結合分子を形成することができる。重大なことに、このようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープと結合することができる置換基を含有してもよい。
【００８４】
関連する態様では、前記抗体は、開示された抗体の誘導体、例えば、開示された抗体にあるCDR配列と同一のCDR配列を含む抗体(例えば、キメラ抗体またはCDRを移植した抗体)である。または、保存的変化を抗体分子に導入するなどの改変が望まれる場合がある。このような変化を加える際に、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮される場合がある。相互作用的生物機能をタンパク質に付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性が当技術分野において一般に理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特徴は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、その結果として、これが、タンパク質と、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を定義すると受け入れられている。
【００８５】
親水性に基づいて、類似するアミノ酸を効果的に置換できることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号には、隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性(greatest local average hydrophilicity)はタンパク質の生物学的特性と相関関係にあることが述べられている。米国特許第4,554,101号に詳述されるように、アミノ酸残基には以下の親水性値が割り当てられている:塩基性アミノ酸:アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、およびヒスチジン(-0.5);酸性アミノ酸:アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、アスパラギン(+0.2)、およびグルタミン(+0.2);親水性、非イオン性アミノ酸:セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、およびスレオニン(-0.4)、含硫黄アミノ酸:システイン(-1.0)およびメチオニン(-1.3);疎水性非芳香族アミノ酸:バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、プロリン(-0.5±1)、アラニン(-0.5)、およびグリシン(0);疎水性芳香族アミノ酸:トリプトファン(-3.4)、フェニルアラニン(-2.5)、およびチロシン(-2.3)。
【００８６】
アミノ酸は、類似の親水性を有する別のアミノ酸で置換することができ、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質を生成することができると理解される。このような変化では、親水性値が±2以内のアミノ酸置換が好ましく、親水性値が±1以内のアミノ酸置換が特に好ましく、±0.5以内のアミノ酸置換がさらに特に好ましい。
【００８７】
上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。様々な前述の特徴を考慮に入れた例示的な置換が当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびスレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
【００８８】
本開示はまたアイソタイプ改変も意図する。異なるアイソタイプを持つようにFc領域を改変することによって異なる機能性を実現することができる。例えば、IgG1に変えることによって抗体依存性細胞傷害を高めることができ、クラスAに切り替えることで組織分布を改善することができ、クラスMに切り替えることで結合価を改善することができる。
【００８９】
代わりに、またはさらに、アミノ酸修飾と、IL-23p19結合分子のFc領域のC1q結合および/または補体依存性細胞傷害(CDC)機能を変える1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を組み合わせることが有用な場合がある。特に関心が高い結合ポリペプチドは、C1qに結合し、かつ補体依存性細胞傷害を示すものであるかもしれない。既存のC1q結合活性を有する、任意で、さらにCDCを媒介する能力を有するポリペプチドが、これらの活性の一方または両方が強化されるように改変される場合がある。C1qを変える、および/またはその補体依存性細胞傷害機能を改変するアミノ酸修飾が、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO/0042072において述べられている。
【００９０】
例えば、C1q結合および/またはFcγR結合を改変し、それによって、CDC活性および/またはADCC活性を変えることによって、エフェクター機能が変化した抗体のFc領域を設計することができる。「エフェクター機能」は、(例えば、対象における)生物学的活性の活性化または減少を担っている。エフェクター機能の例には、C1q結合;補体依存性細胞傷害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞傷害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションなどが含まれるが、これに限定されない。このようなエフェクター機能は、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合することを必要とする場合があり、様々なアッセイ(例えば、Fc結合アッセイ、ADCCアッセイ、CDCアッセイなど)を用いて評価することができる。
【００９１】
例えば、C1q結合が改善し、FcγRIII結合が改善した(例えば、ADCC活性が改善し、CDC活性が改善した)抗体の変種Fc領域を作製することができる。または、エフェクター機能が低減するか、または失われることが望ましいのであれば、CDC活性が低減した、および/またはADCC活性が低減した変種Fc領域を設計することができる。他の態様では、(例えば、ADCC活性が改善したが、CDC活性が低減したFc領域変種を作製する目的で。逆もまた同じである)これらの活性のうち1つだけを増やしてもよく、任意で、他の活性も低減してもよい。
【００９２】
本開示の特定の態様は、シアル酸、ガラクトース、またはフコースを含まない実質的に均一なグリカンを含有する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。前記モノクローナル抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、これらは両方とも、それぞれ、重鎖定常領域または軽鎖定常領域に取り付けられてもよい。上記の実質的に均一なグリカンは重鎖定常領域に共有結合により取り付けられてもよい。
【００９３】
本開示の別の態様は、新規のFcグリコシル化パターンを有するmAbを含む。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、GNGNまたはG1/G2グリコフォームで表される実質的に均一の組成物中に存在する。Fcグリコシル化は治療用mAbの抗ウイルス特性および抗がん特性において重要な役割を果たしている。本開示は、インビトロでフコースフリー抗HIV mAbの抗レンチウイルス細胞性ウイルス阻害の増加を示した最近の研究と整合が取れている。コアフコースを欠く均一グリカンがある本開示のこの態様は、特定のウイルスを2分の1以下にする保護増加を示した。コアフコースを除去すると、ナチュラルキラー(NK)細胞によって媒介されるmAbのADCC活性が劇的に改善するが、多形核細胞(PMN)のADCC活性に対して反対の作用を有するようである。
【００９４】
GNGNまたはG1/G2グリコフォームで表される実質的に均一な組成物を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、実質的に均一なGNGNグリコフォームが無く、G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF、またはGNGNFXを含有するグリコフォームがある同じ抗体と比較して、FcγRIおよびFcγRIIIに対して高い結合親和性を示す。本開示の一態様において、前記抗体は、FcγRIから1x10-8M以下のKdで解離し、FcγRIIIから1x10-7M以下のKdで解離する。
【００９５】
Fc領域のグリコシル化は典型的にはN結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型は、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に取り付けられているものを指す。O結合型グリコシル化は、糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに取り付けられているものを指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも用いられることがある。炭水化物部分がアスパラギン側鎖ペプチド配列に酵素により取り付けられるための認識配列はアスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンであり、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。従って、ポリペプチド中に、これらのペプチド配列のいずれかが存在すると潜在的なグリコシル化部位となる。
【００９６】
グリコシル化パターンは、例えば、ポリペプチド中に見出される1つもしくは複数のグリコシル化部位を欠失させることによって、および/またはポリペプチドに存在しない1つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することによって変えられる場合がある。抗体のFc領域へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列のうちの1つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を変えることによって都合良く成し遂げられる(N結合型グリコシル化部位の場合)。例示的なグリコシル化変種は重鎖の残基Asn297のアミノ酸置換を有する。この変化はまた、元々のポリペプチドの配列への1つまたは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加または1つまたは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によって加えられる場合がある(O結合型グリコシル化部位の場合)。さらに、Asn297からAlaへの変化によってグリコシル化部位の1つを除去することができる。
【００９７】
ある特定の態様では、β(1,4)-N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnTIII)がGlcNAcをIL-23p19抗体に付加するように、前記抗体は、GnTIIIを発現する細胞内で発現される。このように抗体を産生する方法は、WO/9954342、WO/03011878、特許公報20030003097A1、およびUmana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999において提供される。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(クリスパー)などのゲノム編集技術を用いて、ある特定の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を増強または低減または排除するように細胞株を変えることができる。例えば、クリスパー技術を用いて、組換えモノクローナル抗体を発現するのに用いられる293またはCHO細胞において、グリコシル化酵素をコードする遺伝子を排除することができる。
【００９８】
製造性および安全性を向上させるように、ヒトB細胞から得られた抗体可変遺伝子配列を操作することができる。潜在的なタンパク質配列の傾向は、
1)不対Cys残基、
2)N結合型グリコシル化、
3)Asn脱アミド、
4)Asp異性化、
5)SYE切断、
6)Met酸化、
7)Trp酸化、
8)N末端グルタミン酸、
9)インテグリン結合、
10)CD11c/CD18結合、または
11)断片化
を含有する部位に関連する配列モチーフを検索することによって特定することができる。このようなモチーフは、組換え抗体をコードするcDNAの合成遺伝子を変えることによって排除することができる。
【００９９】
治療用抗体開発の分野におけるタンパク質工学の取り組みから、ある特定の配列または残基は溶解度の差と関連することがはっきりと明らかにされている(Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon. Chem., 21 (2), 385-392, 2010)。文献中での溶解度を変える変異からの証拠は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびセリンなどの、いくつかの親水性残基が、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、リジン、およびアルギニンなどの他の親水性残基よりもかなり有利にタンパク質溶解度に寄与することを示している。
【０１００】
生物物理学的特性が向上するように抗体を操作することができる。抗体をアンフォールディングする高温を利用して、見かけの融解温度の平均を用いて相対的安定性を求めることができる。示差走査熱量測定(DSC)では、温度の関数として、分子の熱容量、Cp(分子を1度温めるのに要する熱量)を測定する。DSCを利用して、抗体の熱安定性を研究することができる。mAbのDSCデータはmAb構造内にある個々のドメインのアンフォールディングを解明し、それによって、(Fab、CH2、およびCH3ドメインのアンフォールディングによって)サーモグラムに3つまでのピークを生じることがあるので特に興味深い。典型的に、Fabドメインのアンフォールディングによって最も強いピークが生じる。Fc部分のDSCプロファイルおよび相対的安定性はヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4サブクラスの特徴的な違いを示す(Garber and Demarest, Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757, 2007)。CD分光計を用いて行われる円二色性(CD)を利用して見かけの融解温度の平均を求めることもできる。抗体の遠紫外CDスペクトルを200〜260nmの範囲で0.5nm刻みで測定する。最終スペクトルは20のアキュムレーション(accumulation)の平均として求めることができる。残基楕円率(residue ellipticity)値はバックグラウンド減算後に計算することができる。抗体(0.1mg/mL)の熱アンフォールディングは235nm、25〜95℃および1℃/minの加熱速度でモニタリングすることができる。動的光散乱(DLS)を利用して凝集傾向を評価することができる。DLSは、タンパク質を含む様々な粒子のサイズを特徴付けるのに用いられる。系のサイズが分散していなければ、粒子の平均有効径を求めることができる。この測定値は粒子コアのサイズ、表面構造のサイズ、および粒子濃度に左右される。DLSは本質的には粒子による散乱光強度の変動を測定するので、粒子の拡散係数を求めることができる。市販のDLA計器にあるDLSソフトウェアは様々な直径の粒子集団を表示する。安定性研究を都合よくDLSを用いて行うことができる。試料のDLS測定値から、粒子の流体力学半径が大きくなるかどうか確かめることによって粒子が経時的に、または温度の変化と共に凝集するかどうかが分かる。粒子が凝集するのであれば、半径が大きな粒子の大きな集団を見ることができる。温度に左右される安定性はインサイチューで温度を制御することによって分析することができる。キャピラリー電気泳動(CE)法は、抗体安定性の特徴を求めるための実証済みの方法論を含む。iCEアプローチを利用して、脱アミド、C末端リジン、シアリル化、酸化、グリコシル化、およびタンパク質のpIを変えることができる、タンパク質に対する他の任意の変化による抗体タンパク質電荷変種を分解することができる。発現した抗体タンパク質はそれぞれ、Protein Simple Maurice機器を用いて、キャピラリーカラム(cIEF)の中でのハイスループット遊離溶液等電点電気泳動(high throughput, free solution isoelectric focusing)(IEF)によって評価することができる。等電点(pI)に集まった分子をリアルタイムモニタリングするためにホールカラム(whole-column)UV吸収検出を30秒ごとに行うことができる。このアプローチは、移動(mobilization)工程の必要を無くしながら、従来のゲルIEFの高分解能と、カラムベースの分離において見出される定量と自動化の利点を組み合わせている。この技法によって、発現抗体の同一��、純度、および不均一性プロファイルが再現性よく定量分析される。結果から、吸光度モードと天然蛍光検出モードを用いて、ならびに0.7μg/mLまでの検出感度を用いて、抗体上での電荷の不均一性および分子サイズが特定される。
【０１０１】
抗体配列の固有溶解度スコア(intrinsic solubility score)を求めることができる。固有溶解度スコアはCamSol Intrinsic(Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015)を用いて計算することができる。溶解度スコアを計算するために、scFvなどの各抗体断片のHCDR3にある残基 95-102(Kabatナンバリング)のアミノ酸配列をオンラインプログラムを通して評価することができる。実験室の技法を用いて溶解度を求めることもできる。溶液が飽和し、溶解度の限界に到達するまで凍結乾燥タンパク質を溶液に添加する、または適切な分子量カットオフがある微量濃縮器(microconcentrator)での限外濾過によって濃縮することを含めて様々な技法が存在する。最も単純明快な方法は非結晶沈殿物の誘導であり、これは、硫酸アンモニウムを用いたタンパク質沈殿を伴う方法を用いてタンパク質溶解度を測定する(Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007)。硫安沈殿によって、相対溶解度値に関する迅速かつ正確な情報が得られる。硫安沈殿は、くっきりとした水相と固相がある沈殿した溶液を生成し、比較的少量のタンパク質を必要とする。硫酸アンモニウムによる非結晶沈殿物の誘導を用いて行われる溶解度測定はまた様々なpH値で簡単に行うことができる。タンパク質溶解度は極めてpH依存性であり、pHは、溶解度に影響を及ぼす最も重要な外因性要因だとみなされる。
【０１０２】
一般的に、自己反応性クローンは個体発生中に負の選択によって排除されるはずだと考えられている。しかしながら、自己反応特性がある多くのヒト天然抗体は成人成熟レパートリーに存続することが明らかになった。自己反応特性は、病原体に対する多くの抗体の抗ウイルス機能を高めるのかもしれない。初期B細胞発達中の抗体内にあるHCDR3ループは正電荷に富むことが多く、自己反応性パターンを示すことが認められている(Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003)。(付着性HeLaまたはHEp-2上皮細胞を用いて)顕微鏡でヒト由来細胞との結合レベルを評価することによって、および(懸濁ジャーカットT細胞および293Sヒト胎児由来腎臓細胞を用いた)フローサイトメトリー細胞表面染色によって、ある特定の抗体を自己反応特性があるかどうか試験することができる。自己反応性はまた組織アレイにおける組織との結合の評価を用いて調べることもできる。
【０１０３】
最近の多くの研究において、血液ドナーに由来するヒトB細胞のB細胞レパートリーディープシークエンシングが大規模に行われている。ヒト抗体レパートリーの重要な部分に関する配列情報によって、健常ヒトに一般的にある抗体配列特徴の統計評価が容易になる。ヒト組み換え抗体可変遺伝子参照データベースにある抗体配列特徴に関する知識を用いると、抗体配列の位置特異的な「ヒト類似(Human Likeness)」(HL)度を見積もることができる。HLは、治療用抗体またはワクチンとしての抗体のような臨床利用での抗体開発に有用なことが示されている。この目的は、抗体のヒト類似を高めて、抗体薬物の有意に減少した効力につながる、または重大な健康上の影響を誘導し得る潜在的な副作用と抗抗体免疫応答を小さくすることである。全体として約4億の配列の、3人の健常ヒト血液ドナーの組み合わされた抗体レパートリーの抗体特徴を評価することができ、抗体の超可変領域に焦点を当てた新規の「相対ヒト類似」(rHL)スコアを作り出した。rHLスコアを用いると、ヒト(プラスのスコア)と非ヒト配列(マイナスのスコア)を容易に区別することができる。ヒトレパートリーに一般的にない残基を無くすように抗体を操作することができる。
【０１０４】
ある特定の態様では、本開示の抗体は精製されてもよい。本明細書で使用する「精製された」という用語は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、この場合、タンパク質は、天然に入手可能な状態と比べて任意の程度まで精製される。従って、精製されたタンパク質はまた、タンパク質が天然に生じ得る環境を含まないタンパク質も指す。「実質的に精製された」という用語が用いられる場合、この表示は、タンパク質またはペプチドが組成物の主要成分を形成している、例えば、組成物中にあるタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれより多くを構成する組成物を指す。
【０１０５】
タンパク質精製法は当業者に周知である。これらの技法は、あるレベルでは、細胞環境をポリペプチド画分と非ポリペプチド画分に粗分画(crude fractionation)することを伴う。他のタンパク質からポリペプチドを分離した後に、部分的もしくは完全に精製するために(または均一になるまで精製するために)クロマトグラフィー法および電気泳動法を用いて関心対象のポリペプチドがさらに精製されてもよい。純粋なペプチドの調製物に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー;ポリアクリルアミドゲル電気泳動;等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法には、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などを用いた沈殿、または熱変性と、それに続く遠心分離による沈殿;ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィー;ならびにこのような技法と他の技法の組み合わせが含まれる。
【０１０６】
本開示の抗体を精製する際に、原核生物発現系または真核生物発現系においてポリペプチドを発現させ、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ化部分に結合するアフィニティカラムを用いて他の細胞成分から精製されてもよい。当技術分野において一般に公知なように、様々な精製工程を行う順序が変えられてもよく、またはある特定の工程が省かれてもよく、それでもなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するために適切な方法をもたらすと考えられている。
【０１０７】
通常、完全な抗体は、抗体のFc部分に結合する薬剤(すなわち、プロテインA)を利用して分画される。または、適切な抗体の精製と選択を同時に行うために抗原が用いられることがある。このような方法では、多くの場合、カラム、フィルター、またはビーズなどの支持体に結合した選択薬剤が利用される。抗体は支持体に結合され、汚染物質は除去され(例えば、洗い流され)、条件(塩、熱など)を適用することによって抗体は放出される。
【０１０８】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は本開示を考慮すれば当業者に公知である。これらの方法は、例えば、活性画分の比活性を求める工程、またはSDS/PAGE分析によって画分の中にあるポリペプチドの量を評価する工程を含む。画分の純度を評価するための別の方法は、画分の比活性を計算し、これを初回抽出物の比活性と比較し、従って、純度の程度を計算する方法である。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、もちろん、発現されたタンパク質またはペプチドが、検出可能な活性を示しても示さなくても、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技法によって決まる。
【０１０９】
ポリペプチドの移動は、SDS/PAGEの異なる条件によって、時として大きく変化する場合があることが知られている(Capaldi et al., 1977)。従って、異なる電気泳動条件下では、精製された、または部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は変化する場合があることが理解される。
【０１１０】
V.疾患の処置
本発明の態様のある特定の局面は、高レベルのDKK3に関連する疾患または障害、例えば、膵管腺癌または乳がんなどのがんを予防または処置するのに使用することができる。DKK3の機能は任意の適切な薬物によって低減され得る。好ましくは、このような物質は抗DKK3抗体であろう。
【０１１１】
「処置」および「処置する」とは、対象への治療剤の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康に関連する状態の治療的利益を得ることを目的とした対象への手技もしくはモダリティの遂行を指す。例えば、処置は、単独で、あるいは化学療法、免疫療法、もしくは放射線療法の投与、外科手術の遂行、またはその任意の組み合わせと組み合わせて、DKK3を阻害する薬学的に有効な量の抗体の投与を含んでもよい。
【０１１２】
本明細書で使用する「対象」という用語は、本方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般的に対象はヒトであるが、当業者に理解されるように、対象は動物でもよい。従って、哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜(ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む)、および霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む)を含む他の動物が対象の定義の中に含まれる。
【０１１３】
本願全体を通して使用する「治療的利益」または「治療に有効な」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を増進する、または向上させる、どんなものでも指す。この用語には、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の低下が含まれるが、これに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍サイズの縮小、腫瘍の侵襲性の低下、がんの増殖速度の低下、または転移の阻止を含んでもよい。がんの処置はまた、がんのある対象の生存時間の延長も指すことがある。
【０１１４】
本明細書で使用する「がん」という用語は、固形腫瘍、転移がん、または非転移がんを説明するために用いられることがある。ある特定の態様では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽腔、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮において生じることがある。
【０１１５】
がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのがん:新生物、悪性;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞および紡錘体細胞の癌腫;小細胞癌;乳頭状癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;石灰化上皮腫(pilomatrix carcinoma);移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌;肝細胞癌;混合型肝細胞癌および胆管癌;小柱腺癌(trabecular adenocarcinoma);腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープ内腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;固形癌;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞(branchiolo-alveolar)腺癌;乳頭状腺癌;色素嫌性癌;好酸性癌(acidophil carcinoma);好酸性腺癌(oxyphilic adenocarcinoma);塩基好性癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞腺癌;乳頭状腺癌および濾胞腺癌;非被包性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma);副腎皮質癌;類内膜癌(endometroid carcinoma);皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳道腺癌(ceruminous adenocarcinoma);粘表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液性腺癌;印環細胞癌;浸潤性導管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;腺癌w/扁平上皮化生;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞腫;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍(lipid cell tumor)、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ(extra-mammary paraganglioma)、悪性;クロム親和細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑中の悪性黒色腫(malignant melanoma in giant pigmented nevus);類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣型横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミューラー混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性癌腫;テラトーマ、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル芽細胞歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;グリア芽細胞腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;未分化神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病(hodgkin's disease);ホジキン病(hodgkin's);側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、びまん性大細胞性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;明記された他の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;マスト細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;マスト細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;および毛様細胞性白血病でもよいが、これらに限定されない。それにもかかわらず、本発明はまた、非がん疾患(例えば、真菌感染、細菌感染、ウイルス感染、神経変性疾患、および/または遺伝性障害)を処置するのにも用いられ得る。
【０１１６】
阻害性抗体を含有する治療用組成物の臨床用途が試みられた場合、一般的に、意図された用途に適した薬学的組成物または治療用組成物を調製することが有益である。ある特定の態様では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含む場合がある。他の態様では、活性化合物は、約2％〜約75％の単位重量、または約25％〜約60％、例えば、その間で導き出せる任意の範囲を構成してもよい。
【０１１７】
本発明の態様の治療用組成物は、液体溶液または懸濁液として注射用組成物の形で有利に投与される。注射前に液体を添加して溶液または懸濁液するのに適した固体形態も調製され得る。これらの調製物はまた乳化することもできる。
【０１１８】
「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適宜、ヒトなどの動物に投与された時に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。抗体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は本開示を考慮すれば当業者に公知である。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与の場合、調製物は、FDAの生物製剤部(Office of Biological)の基準に求められるように無菌性、発熱性、一般安全性、および純度の基準を満たさなければならないことが理解される。
【０１１９】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」とは、任意のおよび全ての水溶液(例えば、水、アルコール/水溶液、食塩水、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど)、非水性溶媒(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチル)、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化物質、防腐剤(例えば、抗菌剤または抗真菌剤、アンチオキシダント、キレート剤、および希ガス)、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、液体(fluid)および栄養補充薬(nutrient replenisher)、当業者に公知の、このような同様の材料およびその組み合わせを含む。薬学的組成物中にある様々な成分のpHおよび正確な濃度は周知のパラメータに従って調節される。
【０１２０】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、投与、すなわち、適切な経路および処置レジメンに関連して前記で議論された望ましい応答を生じるように計算された所定量の治療用組成物を含有する。投与しようとする量は、処置の回数および単位用量に応じて、望ましい効果に左右される。患者または対象に投与される本発明の態様の組成物の実際の投与量は、身体的要因および生理学的要因、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、処置されている疾患のタイプ、疾患侵入の程度、以前の治療介入または同時治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量はまた、1回の投与につき約1μg/kg/体重〜約1000mg/kg/体重(このような範囲は、その間の用量を含む)またはそれより多い用量、およびその中から導き出せる任意の範囲も含んでよい。本明細書において列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例では、約5μg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。投与を担当する医者は、どんな状況でも、組成物中の活性成分の濃度と、個々の対象に適した用量を決定する。
【０１２１】
活性化合物は非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路を介した注射用に、または腹腔内経路を介した注射用にも製剤化することができる。典型的に、このような組成物は液体溶液または懸濁液として調製することができる。注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができる。調製物はまた乳化することもできる。
【０１２２】
注射使用に適した薬学的形態には、滅菌した水溶液または分散液;ゴマ油、ピーナッツ油、またはプロピレングリコール水溶液を含む製剤;および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌した散剤が含まれる。すべての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液状でならなければならない。剤形はまた製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。
【０１２３】
タンパク質性組成物は中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、(タンパク質の遊離アミノ基と形成された)酸添加塩、および無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩も、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得ることができる。
【０１２４】
薬学的組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒を含んでもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによって可能になる。
【０１２５】
ある特定の態様では、本発明の態様の組成物および方法は、DKK3に対する抗体または抗体断片を、第2のまたはさらなる療法、例えば化学療法または免疫療法と組み合わせて含む。このような療法は、DKK3の上昇に関連する任意の疾患の処置において適用することができる。例えば、疾患はがんでもよい。
【０１２６】
併用療法を含む前記方法および組成物は治療効果もしくは保護効果を高める、および/または別の抗がん療法もしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増大させる。治療的および予防的な方法および組成物は、望ましい効果、例えば、がん細胞の死滅および/または細胞過剰増殖の阻害を実現するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。このプロセスは、細胞を抗体または抗体断片および第2の療法と接触させる工程を伴ってもよい。組織、腫瘍、または細胞が、前記薬剤(すなわち、抗体もしくは抗体断片または抗がん剤)の1つまたは複数を含む1種類または複数種の組成物または薬理学的製剤と接触されてもよく、組織、腫瘍、および/または細胞を2つ以上の別個の組成物または製剤と接触させることで接触されてもよい。この場合、ある組成物が、1)抗体もしくは抗体断片、2)抗がん剤、または3)抗体もしくは抗体断片と抗がん剤の両方を提供する。また、このような併用療法が化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と共に使用できることも意図される。
【０１２７】
「接触された」および「曝露された」という用語は細胞に適用された時には、治療用構築物と化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞とじかに並べて配置されるプロセスを説明するために本明細書において用いられる。細胞を死滅させるために、例えば、両薬剤が、細胞を死滅させるか、または細胞の分裂を阻止するのに有効な組み合わされた量で細胞に送達される。
【０１２８】
抗体は、抗がん処置の前、抗がん処置の間、抗がん処置の後に、または抗がん処置と比べて様々な組み合わせで投与されてもよい。投与は同時から数分〜数日〜数週間に及ぶ間隔で行われてもよい。前記抗体または抗体断片が抗がん剤とは別に患者に提供される態様では、2種類の化合物が患者に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、一般的には、有効な期間がそれぞれの送達の間に終わらないようにするだろう。このような場合、どちらかの療法を施して約12〜24時間以内または72時間以内に、より詳細には、どちらかの療法を施して約6〜12時間以内に、抗体療法と抗がん療法が患者に提供され得ることが意図される。状況によっては、処置のための期間を大幅に延ばすことが望ましい場合もある。この場合、それぞれの投与の間の期間は数日(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)である。
【０１２９】
ある特定の態様では、処置の経過は1〜90日またはそれより長く(このような範囲は、その間の日を含む)続く。ある薬剤が1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられてもよく、別の薬剤が1日目〜90日目の任意の日に(このような範囲は、その間の日を含む)またはその任意の組み合わせで与えられることが意図される。1日(24時間の期間)の中で、患者には1回または複数回の薬剤投与が行われてもよい。さらに、処置の経過の後、抗がん処置が施されない期間があることが意図される。この期間は、患者の状態、例えば、患者の予後、体力、健康状態などに応じて1〜7日、および/または1〜5週間、および/または1〜12ヶ月以上(このような範囲は、その間の日を含む)続くことがある。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。
【０１３０】
様々な組み合わせが使用され得る。以下の例について、抗体療法は「A」であり、抗がん療法は「B」である。
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【０１３１】
患者への本発明の態様の任意の化合物または療法の投与は、薬剤の毒性がもしあれば毒性を考慮して、このような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従う。従って、一部の態様では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。
【０１３２】
A.化学療法
多種多様な化学療法剤が本発明の態様に従って使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの処置において投与される化合物または組成物を意味するために用いられる。これらの薬剤または薬物は、細胞内での活性状態、例えば、細胞周期に影響を及ぼすかどうか、どの段階で影響を及ぼすかによって分類される。または、薬剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことで染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられる場合がある。
【０１３３】
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド(cyclosphosphamide);アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(特に、ブラタシンおよびブラタシノン(bullatacinone));カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン(callystatin);CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン(carzelesin)、およびビセレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン(pancratistatin);サルコジクチン(sarcodictyin);スポンギスタチン(spongistatin);ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質(例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンγ1およびカリチアマイシンω1;ディネミシン(dynemicin)Aを含むディネミシン;ビスホスホネート、例えば、クロドロネート;エスペラミシン;ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質(antiobiotic)クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン;抗副腎剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エポシロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシン(ansamitocin);ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK多糖複合体;ラゾキサン;リゾキシン(rhizoxin);シゾフィラン(sizofiran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特に、T-2毒素、ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridin)A、およびアングイジン(anguidine));ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン(例えば、CPT-11);トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;カペシタビン;PARP阻害剤、例えば、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、BMN673、イニパリブ、CEP9722、またはABT888(ベリパラブ(veliparab));CDK4/6阻害剤、例えば、リボシクリブ、パルボシクリブ、アデマシクリブ(ademaciclib)、またはトリラシクリブ(trilaciclib);アンドロゲン阻害剤および抗アンドロゲン薬、例えば、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、スピロノラクトン、オキセンドロン、酢酸オサトロン(osateroneacetate)、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、トピルタミド(topilutamide)、エンザルタミド、アパルタミド、ジエノゲスト、ドロスピレノン、メドロゲストン、酢酸ノメゲストロール、プロメゲストン、トリメゲストン(trimegeston)、ケトコナゾール、酢酸アビラテロン、セビテロネル(seviteronel)、アミノグルテチミド、フィナステリド、デュタステリド、エプリステリド、アルファトラジオール(alfatradiol)、ノコギリヤシ(Serenoa repens)抽出物、メドロゲストン、およびビフラノール(bifluranol);カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン(plicomycin)、ゲムシタビエン(gemcitabien)、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金(transplatinum)、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含���れる。
【０１３４】
B.放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた他の要因には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射(米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号)、ならびにUV照射などの他の形態のDNA損傷因子も意図される。これらの要因が全て、DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範な損傷に影響を及ぼす可能性が高い。X線の線量範囲は、長期の場合(3〜4週間)は50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量まで及ぶ。放射性同位体の線量範囲は多種多様であり、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって決まる。
【０１３５】
C.免疫療法
当業者は、免疫療法が前記態様の方法と組み合わせて、または前記態様の方法と共に使用され得ることを理解する。がん処置の文脈において、免疫療法は、一般的に、がん細胞をターゲティングおよび破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に頼る。このような例はリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面にある、何らかのマーカーに特異的な抗体でもよい。抗体が単独で療法のエフェクターとして働いてもよく、実際に細胞死滅に影響を及ぼす他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)にコンジュゲートされ、単なるターゲティング薬剤として働いてもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１３６】
免疫療法の一局面では、腫瘍細胞は、ターゲティングすることができる何らかのマーカー、すなわち、他の細胞の大多数に存在しないマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはどれも、本発明の態様の状況におけるターゲティングに適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、CD20、がん胎児抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。サイトカイン、例えば、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、ケモカイン、例えば、MIP-1、MCP-1、IL-8、および増殖因子、例えば、FLT3リガンドを含む免疫刺激分子も存在する。
【０１３７】
現在研究中の、または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物(米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、ならびにTNF(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998);遺伝子療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号);ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185(Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 米国特許第5,824,311号)である。1種類または複数種の抗がん療法が本明細書に記載の抗体療法と共に用いられ得ることが意図される。
【０１３８】
一部の態様では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の場合がある。免疫チェックポイントはシグナルを強くするか(例えば、補助刺激分子)、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイントはシグナルを強くするか(例えば、補助刺激分子)、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントタンパク質には、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3(CD276とも知られる)、B and T lymphocyte attenuator(BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)(CTLA-4。CD152とも知られる)、CXCL9、CXCR5、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質(glucocorticoid- induced tumour necrosis factor receptor-related protein) (GITR)、HLA-DRB1、ICOS (CD278とも知られる)、HLA-DQA1、HLA-E、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO1)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3。CD223とも知られる)、Merチロシンキナーゼ(MerTK)、NKG7、OX40(CD134とも知られる)、programmed death 1(PD-1)、programmed death-ligand 1(PD-L1。CD274とも知られる)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains(TIGIT)、T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3(TIM-3)、V-domain Ig suppressor of T cell activation(VISTA。C10orf54とも知られる)、および4-1BB(CD137)が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1 axisおよび/またはCTLA-4を標的とする。
【０１３９】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、低分子、組換え型のリガンドもしくは受容体、または抗体、例えば、ヒト抗体(例えば、国際特許公報WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012;両方とも参照により本明細書に組み入れられる)の場合がある。既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤またはその類似体が用いられることがあり、特に、キメラ化型、ヒト化型、またはヒト型の抗体が用いられることがある。当業者が知っているように、本開示において言及された、ある特定の抗体について別の名前および/または同等の名前が用いられることがある。このような別の名前および/または同等の名前は本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはMK-3475およびペンブロリズマブという別の名前および/または同等の名前でも知られることが分かっている。
【０１４０】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-1リガンド結合パートナーはPD-L1および/またはPD-L2である。別の態様では、PD-L1結合アンタゴニストは、PD-L1とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-L1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様では、PD-L2結合アンタゴニストは、PD-L2とそのリガンド結合パートナーの結合を阻害する分子である。特定の局面では、PD-L2結合パートナーはPD-1である。前記アンタゴニストは抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドでもよい。例示的な抗体は米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号、および同第8,008,449号に記載されており、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において提供される方法において使用するための他のPD-1 axisアンタゴニストが、米国特許出願公開第2014/0294898号、同第2014/022021号、および同第2011/0008369号に記載のように当技術分野において公知であり、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４１】
一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは抗PD-1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)である。一部の態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)と融合したPD-L1またはPD-L2の細胞外部分またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。一部の態様では、PD-1結合アンタゴニストはAMP-224である。ニボルマブはMDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO(登録商標)とも知られ、WO2006/121168に記載の抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブはMK-3475、Merck3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)、およびSCH-900475とも知られ、WO2009/114335に記載の抗PD-1抗体である。CT-011はhBATまたはhBAT-1とも知られ、WO2009/101611に記載の抗PD-1抗体である。AMP-224はB7-DCIgとも知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載のPD-L2-Fc融合可溶性受容体である。
【０１４２】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD152とも知られる細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4(CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全cDNA配列はGenBankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞表面に見出され、抗原提示細胞の表面にあるCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして働く。CTLA4はT細胞補助刺激タンパク質であるCD28に類似し、両分子とも、抗原提示細胞上にある、B7-1とも呼ばれるCD80と、B7-2とも呼ばれるCD86に結合する。CTLA4は阻害シグナルをT細胞に伝達するのに対して、CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は調節性T細胞の中にも見出され、その機能にとって重要である可能性がある。T細胞受容体およびCD28を介してT細胞が活性化されると、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現が増加する。
【０１４３】
一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本方法における使用に適した抗ヒト-CTLA-4抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、米国特許第8,119,129号;PCT公開番号WO01/14424、WO98/42752、WO00/37504(トレメリムマブとも知られるCP675,206;以前はチシリムマブ(ticilimumab));米国特許第6,207,156号;Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA, 95(17):10067-10071;Camacho et al. (2004) J Clin Oncology, 22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206);およびMokyr et al.(1998) Cancer Res, 58:5301-5304に開示される抗CTLA-4抗体を、本明細書において開示される方法において使用することができる。前述した刊行物のそれぞれの開示は参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4への結合について、これらの当技術分野において認められている任意の抗体と競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際特許出願番号WO2001014424、WO2000037504、および米国特許第8,017,114号に記載され、全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４４】
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy(登録商標)とも知られる)またはその抗原結合断片および変種である(例えば、WO01/14424を参照されたい)。他の態様では、前記抗体はイピリムマブの重鎖および軽鎖CDRまたはVRを含む。従って、一態様では、前記抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインと、イピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様では、前記抗体は、前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープへの結合について競合する、および/または前述した抗体と同じ、CTLA-4上のエピトープに結合する。別の態様では、前記抗体は、上述した抗体と少なくとも約90％の可変領域アミノ酸配列同一性(例えば、イピリムマブと少なくとも約90％、95％、または99％の可変領域同一性)を有する。CTLA-4を調節するための他の分子には、CTLA-4リガンドおよび受容体、例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5844905号、同第5885796号、ならびに国際特許出願番号WO1995001994およびWO1998042752に記載のCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびにイムノアドヘシン、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8329867号に記載のイムノアドヘシンが含まれる。
【０１４５】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD223とも知られるリンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)である。ヒトLAG-3の完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP-002277を有する。LAG-3は、活性化T細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、および形質細胞様樹状細胞の表面に見出される。LAG-3は、抗原提示細胞の表面にあるMHCクラスIIに結合すると「オフ」スイッチとして働く。LAG-3を阻害するとエフェクターT細胞とインヒビター調節性T細胞が両方とも活性化される。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗LAG-3抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-LAG-3抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗LAG-3抗体を使用することができる。例示的な抗LAG-3抗体はレラトリマブ(relatlimab)(BMS-986016とも知られる)またはその抗原結合断片および変種(例えば、WO2015/116539を参照されたい)である。他の例示的な抗LAG-3抗体には、TSR-033(例えば、WO2018/201096を参照されたい)、MK-4280、およびREGN3767が含まれる。MGD013は、WO2017/019846に記載の抗LAG-3/PD-1二重特異性抗体である。FS118は、WO2017/220569に記載の抗LAG-3/PD-L1二重特異性抗体である。
【０１４６】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、C10orf54とも知られるV-domain Ig suppressor of T cell activation(VISTA)である。ヒトVISTAの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_071436を有する。VISTAは白血球上に見出され、T細胞エフェクター機能を阻害する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗VISTA3抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-VISTA抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗VISTA抗体を使用することができる。例示的な抗VISTA抗体は、JNJ-61610588(オンバチリマブ(onvatilimab)とも知られる)(例えば、WO2015/097536、WO2016/207717、WO2017/137830、WO2017/175058を参照されたい)である。VISTAはまた、PD-L1とVISTAを両方とも選択的にターゲティングする低分子CA-170によって阻害することもできる(例えば、WO2015/033299、WO2015/033301を参照されたい)。
【０１４７】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質はインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)である。ヒトIDOの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_002155を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は低分子IDO阻害剤である。例示的な低分子には、BMS-986205、エパカドスタット(INCB24360)、およびナボキシモド(navoximod)(GDC-0919)が含まれる。
【０１４８】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質はCD38である。ヒトCD38の完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_001766を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CD38抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒトCD38抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗CD38抗体を使用することができる。例示的な抗CD38抗体はダラツムマブ(例えば、米国特許第7,829,673号を参照されたい)である。
【０１４９】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD278とも知られるICOSである。ヒトICOSの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_036224を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ICOS抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-ICOS抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗ICOS抗体を使用することができる。例示的な抗ICOS抗体には、JTX-2011(例えば、WO2016/154177、WO2018/187191を参照されたい)およびGSK3359609(例えば、WO2016/059602を参照されたい)が含まれる。
【０１５０】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質はT cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains(TIGIT)である。ヒトTIGITの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_776160を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗TIGIT抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒトTIGIT抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗TIGIT抗体を使用することができる。例示的な抗TIGIT抗体はMK-7684(例えば、WO2017/030823、WO2016/028656を参照されたい)である。
【０１５１】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD134とも知られるOX40である。ヒトOX40の完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_003318を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗OX40抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-OX40抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗OX40抗体を使用することができる。例示的な抗OX40抗体はPF-04518600(例えば、WO2017/130076を参照されたい)である。ATOR-1015は、CTLA4とOX40を標的とする二重特異性抗体である(例えば、WO2017/182672、WO2018/091740、WO2018/202649、WO2018/002339を参照されたい)。
【０１５２】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、TNFRSF18およびAITRとも知られるグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質(GITR)である。ヒトGITRの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_004186を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗GITR抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-GITR抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗GITR抗体を使用することができる。例示的な抗GITR抗体はTRX518(例えば、WO2006/105021を参照されたい)である。
【０１５３】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、HAVCR2とも知られるT-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3(TIM3)である。ヒトTIM3の完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_116171を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗TIM3抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-TIM3抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗TIM3抗体を使用することができる。例示的な抗TIM3抗体には、LY3321367(例えば、WO2018/039020を参照されたい)、MBG453(例えば、WO2015/117002を参照されたい)、およびTSR-022(例えば、WO2018/085469を参照されたい)が含まれる。
【０１５４】
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントタンパク質は、CD137、TNFRSF9、およびILAとも知られる4-1BBである。ヒト4-1BBの完全タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_001552を有する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗4-1BB抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。本発明の方法において使用するのに適した抗ヒト-4-1BB抗体(またはそれに由来するVHドメインおよび/もしくはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。または、当技術分野において認められている抗4-1BB抗体を使用することができる。例示的な抗4-1BB抗体はPF-05082566(ウトミルマブ(utomilumab);例えば、WO2012/032433を参照されたい)である。
【０１５５】
一部の態様では、免疫療法は、エクスビボで作製した自己抗原特異的T細胞の移入を伴う養子免疫治療になる場合がある。養子免疫治療に用いられるT細胞は、抗原特異的T細胞を拡大するか、または遺伝子工学によってT細胞をリダイレクション(redirection)することによって作製することができる(Park, Rosenberg et al. 2011)。腫瘍特異的T細胞の単離および移入は黒色腫治療に成功したことが示されている。T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)を遺伝子移入することによって首尾良く発生した(Jena, Dotti et al. 2010)。CARは、1つの融合分子の形で1つまたは複数のシグナル伝達ドメインと結合したターゲティング部分からなる合成受容体である。一般的に、CARの結合部分は、モノクローナル抗体の軽鎖断片および可変断片が可動性リンカーによってつながった単鎖抗体(scFv)の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾良く用いられてきた。第1世代CARのシグナル伝達ドメインはCD3ζの細胞質領域またはFc受容体γ鎖に由来する。CARを用いることで、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な新生物に由来する腫瘍細胞の表面に発現している抗原にT細胞は首尾良くリダイレクションされた(Jena, Dotti et al. 2010)。
【０１５６】
一態様では、本願は、養子T細胞療法とチェックポイント阻害剤を含む、がんを処置するための併用療法を提供する。一局面では、養子T細胞療法は自己由来T細胞および/または同種異系T細胞を含む。別の局面では、自己由来T細胞および/または同種異系T細胞は腫瘍抗原に対してターゲティングするようにされている。
【０１５７】
D.外科手術
がんがある人のうち約60％が何らかのタイプの外科手術を受ける。外科手術には、予防手術、診断または病期決定のための手術、根治手術、および緩和手術が含まれる。根治手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去、摘出、および/または破壊される切除を含み、本発明の態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法と併用され得る。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除の他に、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡により管理された手術(モース術)が含まれる。
【０１５８】
がん細胞、がん組織、または腫瘍の一部または全てを摘出する際に体内に空洞が形成されることがある。処置は、この場所に、さらなる抗がん療法を灌流するか、直接注射するか、または局所適用することによって達成される場合がある。このような処置は、例えば、1日ごとに、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに、もしくは7日ごとに、または1週間ごとに、2週間ごとに、3週間ごとに、4週間ごとに、および5週間ごとに、または1ヶ月ごとに、2ヶ月ごとに、3ヶ月ごとに、4ヶ月ごとに、5ヶ月ごとに、6ヶ月ごとに、7ヶ月ごとに、8ヶ月ごとに、9ヶ月ごとに、10ヶ月ごとに、11ヶ月ごとに、または12ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置はまた投与量が異なる処置でもよい。
【０１５９】
E.他の薬剤
処置の治療効力を改善するために、本発明の態様のある特定の局面と共に他の薬剤が用いられる場合があることが意図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合のアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞分裂阻害剤および分化薬剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによって細胞間シグナル伝達を増やすと、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用が高まるだろう。他の態様では、処置の抗過剰増殖効力を改善するために細胞分裂阻害剤または分化薬剤が本発明の態様のある特定の局面と併用することができる。本発明の態様の効力を改善するために細胞接着阻害剤が意図される。細胞接着阻害剤の例は局所接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。さらに、処置効力を改善するために、抗体c225などのアポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の薬剤が本発明の態様のある特定の局面と併用できることが意図される。
【０１６０】
VI.キット
前記態様の様々な局面では、治療剤ならびに/または他の治療剤および送達薬剤を備えるキットが想定される。一部の局面では、本発明の態様は、態様の療法を調製および/または投与するためのキットを意図する。キットは、本発明の態様の任意の薬学的組成物を含有する1つまたは複数の密封したバイアルを含んでもよい。キットは、例えば、前記態様の成分を調製する、製剤化する、および/もしくは投与するために、または本発明の方法の1つもしくは複数の工程を実施するために少なくとも1種類のDKK3抗体ならびに試薬を含んでもよい。一部の態様では、キットはまた、キットの成分と反応しない容器である適切な容器、例えば、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、注射器、瓶、またはチューブも備えてよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作られてもよい。
【０１６１】
キットは、本明細書において説明される方法の手順工程を概説する指示書をさらに備えてもよく、本明細書に記載のものと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に公知である。指示書の情報は、コンピュータを用いて実行された時に、薬学的に有効な量の治療剤を送達する現実または仮想の手順を表示する機械可読指示書を備えるコンピュータ可読媒体の中にあってもよい。
【実施例】
【０１６２】
VII.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者が発見した技法が本発明の実施において十分に機能することを示し、従って、本発明を実施するための好ましい態様を構成すると考えられると当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を加えることができ、それでもなお、類似または同様の結果を得ることができると当業者に理解されるはずである。
【０１６３】
材料および方法
細胞培養
細胞は実験前にマイコプラズマフリーであることが確認された。HPSCが治験審査委員会(Institutional Review Board)の方針および実施に従って、残ったPDAC手術組織から開発され、以前に述べられている(Hwang et al., 2008)。細胞純度は、α-SMA、ビメンチン、およびデスミンに対する免疫組織化学ならびに形態およびOil Red O陽性染色によって確かめた。PDAC細胞株は、American Type Culture Collection(CFPAC、BxPC3、Capan2、MiaPaca2、MPanc96、HS766t、Panc1、SU86.86、ASPC-1、HPAFII、HPAC、CapanI)、Dr. I. J. Fidler (L3.6pl, Department of Cancer Biology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center)、およびDr. C. Logsdon (Panc3、PSN1、Panc48、Panc28) (Li et al., 2003; Frazier et al., 1990; Yamada et al., 1986)から入手した。MDA1およびMDA2初代ヒトPDAC細胞株はマウス異種移植片モデルにおいて継代することによって開発した。KPCマウス膵臓がん細胞は、Dr. S. Ullrich(Department of Immunology, MD Anderson Cancer Center)の厚意により提供されたPDACの遺伝子操作KPCマウスモデル(Hingorani et al., 2005)において見出された腫瘍から単離した。MOH細胞はDr. R. Mohamed (Wayne State University, Detroit, MI)から入手した。全ての細胞を10％胎仔ウシ血清/ダルベッコ変法イーグル培地中で37℃で、5％CO2の加湿雰囲気中で維持した。HUVEC細胞はAmerican Type Culture Collectionから入手し、15％FBS、1mMピルビン酸ナトリウム(Sigma, St. Louis, MO)、1×ビタミン溶液(Thermo Fisher, Waltham, MA)、1×非必須アミノ酸、および10ng/mL bFGF(Thermo Fisher, Waltham, MA)を含有する最小必須培地(Thermo Fisher, Waltham, MA)に溶解した0.5％ゼラチンAでコーティングしたプレート上で培養した。共培養研究のために、HPSCおよびPDAC細胞を10-cm Transwell coculture system(Corning Incorporated, Lowell, MA)の中で培養し、96時間後にRNA単離のために細胞を収集した。
【０１６４】
RT-PCR
RNeasy mini kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて全RNAを細胞から単離し、Quantitect reverse transcription kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いてcDNAを全RNAから合成した。DKK3転写物は、特異的プライマーペアDKK3:
2022502517.tif 000004
を用いて増幅した。Collagen1(COL1A1)転写物は、特異的プライマーペア:
2022502517.tif 000005
を用いて増幅した。qPCRは、I-cycler IQ multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad, Hercule, CA)において内部標準として18s(プライマーペア
2022502517.tif 000006
)を用いて行った。
【０１６５】
ウェスタンブロッティング
HPSCによってDKK3が分泌されることを確認するために、以前に述べられたように(Kalluri & Zeisberg, 2006)、CMを収集し、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad Laboratories)によって測定し、50μgのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド(SDS-PAGE)ゲルにローディングし、ヤギ抗ヒトDKK3抗体(Abcam, Cambridge, MA)に対してブロットした。DKK3によって活性化された経路を評価するために、HPSCから血清を一晩欠乏させ、10μg/ml rhDKK3で処理した。タンパク質溶解産物をSDS-PAGEによって分離し、全p65およびリン酸化p65(Cell Signaling)ならびに全IκBαおよびリン酸化IκBα(Cell Signaling)に対してブロットした。
【０１６６】
免疫組織化学的分析
一次ウサギ抗マウスDKK3抗体はProteintech Incから入手した。ヤギ抗ヒトDKK3はAbcamから入手した。ウサギ抗ヤギ二次抗体はJackson ImmunoResearch Laboratoriesから入手した。マウスα-SMA、Ki67、CD3、およびCD8に対するモノクローナル抗体は、それぞれ、Abcam、ThermoScientific、Santa Cruz、およびBioLegendから購入した。スライドを盲検方式で評価し、専任のGI病理学者(H.W.)によってスコア付けした。
【０１６７】
ELISAによるDkk3血漿レベル
PDACまたはCP(または正常対照)の患者に由来する血漿試料を治験審査委員会によって認可されたプロトコールの下で入手した。DKK3レベルを、RayBio(登録商標)Human DKK-3 ELISA Kit(RayBiotech, Inc, Norcross, GA)を用いて、製造業者により提供された説明書に従って検出した。
【０１６８】
DKK3の発現およびサイレンシング
ヒトpcDNA3.1/V5-His A-DKK3構築物はDr.Lin Zhang(Department of Pharmacology & Chemical Biology, University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh PA)(Yue et al., 2008)の厚意により提供された。
【０１６９】
shDKK3(Open Biosystems, Huntsville, AL)を用いたレンチウイルストランスフェクションによって、およびsiDKK3(Qiagen, Valencia, CA)を用いたトランスフェクションによってDKK3を発現停止した。HPSCにおける安定したDKK3サイレンシングは、リポフェクタミン2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いたレンチウイルスプラスミド対照ベクターまたはshDKK3(HPSC-shControlもしくはHPSC-shDKK3)をパッケージングベクターと293T細胞にコトランスフェクションすることによって成し遂げられた。ウイルス上清(200μl)を8μg/mLのポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)と共に6ウェルプレートにあるHPSCに2日間添加し、安定して形質導入された細胞を1μg/mLピューロマイシンで選択した。HPSCおよびPDAC細胞におけるDKK3の一過的サイレンシングが5nM siDKK3と3μLのHiperfect薬剤の混合物を用いたトランスフェクションによって、製造業者の推奨(Qiagen, Valencia, CA)に従って成し遂げられた。
【０１７０】
細胞ベースのアッセイ
細胞増殖をMTSアッセイ(Promega, Madison, WI)によって測定した。組換えヒトDKK3(R&D, Minneapolis, MN)による刺激を用いた細胞遊走と浸潤の研究を、6.5mm Transwell(登録商標)と8.0μm孔メンブレンインサート(Corning Incorporated)およびBioCoat Matrigel-coated invasion chambers(BD Biosciences, Bedford, MA)を用いて行った。
【０１７１】
軟寒天での増殖を評価するために細胞を低融点アガロース培養皿に播種し、14日間増殖させた。p-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット(Sigma, St. Louis, MO)で染色した後に10個の高倍率視野でコロニー総数を数えた。
【０１７２】
説明したように、DKK3は比較的化学療法抵抗性のHS766TではsiRNA(Qiagen)を用いて発現停止され、化学感受性のL3.6plでは過剰発現していた。ゲムシタビンの存在下で細胞生存率を軟寒天コロニー形成によって求めた。アポトーシスをフローサイトメトリーによって求めた。手短に述べると、細胞を70％エタノールで固定し、洗浄し、200μLの染色用緩衝液(50μg/mLヨウ化プロピジウムおよび50単位/mL RNAseを含むPBS)に再懸濁した。ヨウ化プロピジウムで染色された細胞をFACSによって検出し、sub-G1％をアポトーシス細胞のパーセントとして計算した。
【０１７３】
逆相タンパク質アッセイ(RPPA)
2人の異なる患者(HPSC、HPSC-20Aim)からの初代HPSC細胞株を6ウェルディッシュの中で5×105細胞/ウェルで3回繰り返してプレーティングし、組換えヒトDKK3(10μg/mL)またはPBSのいずれかで20分間処理した。ワールドワイドウェブ上でmdanderson.org/education-and-research/resources-for-professionals/scientific-resources/core-facilities-and-services/functional-proteomics-rppa-core/index.htmlに記載のように、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター(University of Texas MD Anderson Cancer Center)機能プロテオームコア施設(Functional Proteomic core facility)(Houston, TX)において細胞を溶解し、調製し、分析した。試料の段階希釈液をニトロセルロースコーティングスライド上に配置し、220の検証済みの抗体に対して操作した。
【０１７４】
NF-κB活性
ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてNF-κB活性を求めた。簡単に述べると、96ウェルプレート中にある、lenti-NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物(Arumugam et al., 2006)を安定発現する細胞を無血清条件でrhDKK3(10μg/mL)で5時間処理した。ルシフェラーゼシグナルが、D-ルシフェリンホタルカリウム塩(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)およびIVIS(登録商標)イメージングシステム(Xenogen Corp., Alameda, CA)を用いて検出された。
【０１７５】
結合アッセイ
フローサイトメトリーを用いてDKK3の細胞表面結合を行った。手短に述べると、BxPC3またはL3.6pl細胞(0.5×106)をHis標識rhDKK3(10μg/mL)と、またはHis標識rhDKK3(10μg/mL)とJM6-6-1(70μg/mL)と30分間インキュベートした。結合緩衝液(PBSに溶解した3％BSA)で洗浄した後に、細胞を1:100抗His抗体(abCam)で30分間染色した後に、Dylight488コンジュゲート二次抗体で20分間染色した。細胞を2％パラホルムアルデヒドで固定し、BD FACSCaliburによる蛍光シグナル検出に供した。
【０１７６】
PDACマウスモデル
ヌードマウスおよびC57BL/6マウスをJackson Laboratoryから入手し、米国農務省、保健社会福祉省、およびNIHの現行の規制と規格に従って、国際実験動物管理評価認定協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)によって認可された施設において維持した。全ての動物処置が、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって審査および認可された。
【０１７７】
HPSCと同時注射したホタルルシフェラーゼ標識BxPC3がん細胞(BxPC3-FL)を用いるPDAC同所性マウスモデルは以前に述べられている(Hwang et al., 2008)。マウスに、50μLのHBSSに溶解したBxPC3-FL(1×106/マウス)とHPSC-shControlまたはHPSC-shDKK3を1:0または1:3の腫瘍:間質比で膵臓内注射し、腫瘍成長をIVIS画像化(Hwang et al., 2008)を用いてモニタリングした。さらに、Dr. C. Niehrs(Barrantes Idel et al., 2006)によって提供された同系免疫応答性DKK3ヌルモデルを使用し、これに、PDACのGEMM(Pdx1-Cre; Kras LSL-G12D;Trp53R172H/+)(Hingorani et al., 2005; Hingorani et al., 2003)において生じた腫瘍から単離し、ルシフェラーゼで標識したマウスPDAC細胞(「KPC細胞」と名付けた)を注射した。
【０１７８】
DKK3中和mAbの効果を評価する実験において、発がん性Kras発現を標的とする膵臓特異的プロモーターの点で異なるPDACの2種類のGEMM(Hingorani et al., 2005; Hingorani et al., 2003)を使用した(Pdx1-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53R172H/+およびP48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl)。膵臓がん発達に対するDKK3遺伝子破壊の効果を評価するために、DKK3ヌルマウスをP48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53R172HまたはP48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/flマウス(Hingorani et al., 2005; Hingorani et al., 2003)と交配させ、子孫を瀕死になるまでモニタリングした。マウスを安楽死させた後に組織および血液試料を収集した。高レベルの変異Kras(cLGL-KrasG12V/BAC Ela-CreERT)を発現するPDACの遺伝子操作マウスモデル(Ji et al., 2009)を用いて様々なPDAC発達段階でDKK3発現を評価した。
【０１７９】
DKK3-mAb
DKK3に対する中和mAbは、A/Jマウスを精製組換えヒトDKK-3/His(R&D)で免疫化することによって作製した。初回スクリーニングをELISAハイスループットスクリーニングを用いて行った。これから、30超のハイブリドーマクローンが強力かつ特異的なDKK3結合を示した。抗DKK3 mAbハイブリドーマをサブクローニングした後、12種類の精製mAbを機能アッセイによってさらに試験した。最も効果的なクローンのうち2つ(JM6-6-1およびJM8-12-1)を用いてデータを示した。非特異的IgG1アイソタイプ対照クローンを陰性対照として使用した。
【０１８０】
T細胞分裂アッセイ
Histopaque1077(Sigma)を用いた密度遠心分離によってバフィーコートから末梢血単核球(PBMC)を入手し、pan T-cell isolation kit(Miltenyi Biotec)を用いてCD3+T細胞を単離した。細胞をCFSE(Invitrogen)で標識し、96ウェルプレートの中でCD3/CD28ヒトT細胞アクチベータービーズ(Life Technologies)と1:1で組み合わせた。DKK3またはHPSC-CMを添加し、96時間後に、系列を明らかにするために細胞をCD3、CD4、およびCD8に対して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。データを増殖中のCD3+T細胞に対するパーセントとして報告した。
【０１８１】
統計解析
少なくとも3回の独立した実験から結果を示し、平均±SEMで示した。両側スチューデントt検定を用いてデータを解析した、有意差はp<0.05だと定義された。カプラン・マイヤー法(ログランク)を用いて生存分析を行った。GraphPad Prism 6を用いて全ての統計解析を行った。
【０１８２】
実施例1-PDACおよびTNBCにおけるDKK3過剰発現
ヒトPSC(HPSC)および20種類のPDAC細胞株におけるDKK3発現を逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって調べた(図1A)。HPSCにおける発現が最強であり、7種類の細胞(HS766T、Panc1、SU86.86、Psn1、Panc48、Panc28、およびMDA1)での発現は最小であり、試験したがん細胞株の大部分(21のうち14)において発現はなかった。HPSC条件培地(HPSC-CM)のウェスタンブロッティングによって確認した時にDKK3はHPSCによって分泌されている(図7A)。異なる患者からの4種類のHPSC調製物におけるDKK3発現は似ていた(図7C)。
【０１８３】
DKK3発現はトリプルネガティブ乳がん(TNBC)線維芽細胞においてRNA(図13A)レベルおよびタンパク質(図13B)レベルでも認められた。DKK3発現はER陽性乳がん細胞およびTNBCがん細胞株においてタンパク質レベルで認められなかった(図13B)。DKK3発現は、TNBCに由来する、いくつかの患者由来異種移植片腫瘍に存在した(図13C)。TNBC(図13D)、卵巣がん(図15A)、胃がん(図15B)、PDAC(図15C)、膀胱がん(図15D)、および肉腫(図15E)を含む様々なヒト腫瘍における高いDKK3発現は患者生存時間の短縮と相関することが見出された。最後に、SUM159 TNBC細胞を処理すると細胞増殖が用量依存的に増加した(図13E)。
【０１８４】
間質線維芽細胞とがん細胞の間のクロストークは以前に述べられている(Kalluri & Zeisberg, 2006; Mueller & Fusenig, 2004)。HPSC細胞とPDAC細胞の共培養が、どちらか一方の細胞集団におけるDKK3発現に影響を及ぼすかどうか調べた。定量RT-PCR(qPCR)から、単培養中のL3.6plおよびBxPC3細胞におけるDKK3発現は極めて少ないか全く無く、これに対してPanc1細胞における発現はHPSCにほぼ等しいことが確認された(図1B)。HPSCとPanc1細胞またはL3.6pl細胞を共培養すると、HPSCにおけるDKK3発現がHPSC単独培養と比較して3倍増加した(図1B、白色の縞模様のバー)。BxPC3との共培養後にHPSCによるDKK3発現は増加しなかった。反対に、HPSCとの共培養後にがん細胞におけるDKK3発現は変化しなかった。従って、HPSCはDKK3を高い基底値で発現し、がん細胞と共培養した時にDKK3はさらに増えるが、PDAC細胞は極めて少ないレベルのDKK3を発現し、DKK3はHPSCに曝露されても変化しない。
【０１８５】
ヒトPDACおよび正常膵臓(n=10/群)におけるDKK3発現をAffymetrix遺伝子発現プロファイリング(Logsdon et al., 2003)を用いて評価した。これにより、PDACにおけるレベルは正常膵臓の4.5倍であることが示された(図1C)。ヒトPDACの組織マイクロアレイにおいてDKK3発現は119の試料のうち118(99％)で確認され、69の試料(58％)において中程度から高い発現が確認された(図1E)。大部分の試料は、DKK3が主に間質において発現することを示したが、非常に濃い染色があるいくつかの試料は癌腫領域でも同程度の染色を示した。この発現は、PSCの1マーカーであるが唯一のマーカーではないαSMA陽性細胞に限定されなかった(図7E)。DKK3はHUVEC細胞でも発現している(図7D)。DKK3を血漿中で調べた時に、PDAC患者の平均レベルは健常ボランティアよりも有意に高かった(20.64ng/mL対18.36ng/mL, p<0.01; 図1D)。DKK3血清中レベルは慢性膵炎(CP)患者およびPDAC患者において似ていた。HPSC-CM中のDKK3レベルは血漿中レベルの10倍であった。このことから、局所腫瘍微小環境のDKK3は末梢循環と比べて高濃度である可能性があることが示唆される。
【０１８６】
PDAC発達の初期段階でのDKK3発現を評価するために、高レベルの変異Kras(cLGL-KrasG12V/BAC Ela-CreERT)を発現するPDACの遺伝子操作マウスモデル(GEMM)を調べた(Ji et al., 2009)。このモデルではマウスは2ヶ月以内にCPと初期膵臓上皮内新生物(PanIN)病変部を発症し、4ヶ月以内にCPと後期PanIN病変部を発症し、6ヶ月以内に転移を伴う浸潤性PDACを発症する。膵臓疾患がない対照マウスと比較して、DKK3発現は2ヶ月でCPと初期PanINにおいて18倍、4ヶ月でCPと後期PanINにおいて21倍になった(図1Fおよび1G)。マウスは6ヶ月で浸潤性PDACを発症した時に、DKK3発現は対照のほぼ20倍になった。対照的に、このモデルにおいて形成した浸潤性膵臓腫瘍から単離したがん細胞におけるDKK3発現は最低であった(図1G)。このことから、DKK3は主として間質細胞に由来することが分かる。
【０１８７】
実施例2-DKK3はPDACおよび星状細胞の活性を阻害する
DKK3が主としてHPSCによって産生されるという知見に基づいて、DKK3がHPSC活性において機能的な役割を有するかどうかを調べた。10μg/mLの組換えヒトDKK3(rhDKK3)で48時間または72時間処理するとHPSC増殖がPBS対照と比較して有意に増加した(図2A)。HPSCにおける安定したDKK3サイレンシング(HPSC-shDKK3;図7B)によって、細胞増殖が6日目までに対照細胞と比較して67％低下し(p<0.00001;図2B)、細胞遊走が対照の16.3％まで低下した(p<0.00001;図2C)。他の患者に由来する初代HPSCにおいてDKK3発現が確認され、DKK3が発現停止された時に増殖および遊走に対する同様の阻害作用が観察された(図8A〜D)。
【０１８８】
次に、DKK3がPDAC細胞に対してパラクライン効果があるかどうかを調べた。Panc1細胞をrhDKK3(10μg/mL)で処理すると遊走がほぼ100％増加し、浸潤が3倍増加した(p<0.0001対PBS対照;図2D)。BxPC3細胞を用いた場合に同様の結果が観察され、遊走(p<0.001)と浸潤(p<0.0001)が対照と比較して誘導された(図8E)。HPSCおよびBxPC3機能アッセイにおいてrhDKK3を試験する初回用量反応実験の結果を図8F〜Gに示した。
【０１８９】
他のほとんどのPDAC細胞株とは異なりPanc1は中程度のレベルのDKK3を発現し、安定したDKK3サイレンシングによって、対照shRNAでトランスフェクトされた細胞と比較して細胞増殖が阻害され(図2E)、軟寒天での増殖能力がほぼ完全に無くなった(図2F)。このことから、DKK3は足場非依存性増殖にとって重大な意味を持つことが示唆される。
【０１９０】
HPSCによって分泌されたDKK3の効果が組換えDKK3の効果と類似するかどうか確認するために、細胞を、shControlまたはshDKK3でトランスフェクトされたHPSCに由来する条件培地(CM)で処理した。HPSC-shControlに由来するCMで処理したBxPC3細胞の遊走は無血清培地対照と比較して87％増加し、これに対して、HPSC-shDKK3に由来するCMを用いた遊走は培地対照に類似した(図2G)。ウェスタンブロッティングによるrhDKK3およびHPSC-CMの中にあるDKK3の比較を図8Hに示した。要約すると、DKK3はパラクライン方式でPDAC細胞の遊走、浸潤、足場非依存性増殖を促進し、より小さな程度で増殖を促進ように作用する。
【０１９１】
実施例3-DKK3はゲムシタビン化学療法抵抗性を誘導する
HPSCはPDACにおいて化学療法抵抗性を強化する分泌因子を産生する(Hwang et al., 2008)。従って、DKK3がこの現象に寄与し得るかどうかを調べた。L3.6pl細胞はゲムシタビンに対する感受性が比較的高く、ごくわずかなDKK3を発現するのに対して、Panc1およびHS766Tはゲムシタビンに対する抵抗性が比較的高く、中程度のレベルのDKK3を発現する(Arumugam et al., 2009)。DKK3を化学感受性L3.6pl細胞において発現させると、ゲムシタビンの存在下での軟寒天におけるコロニー形成は対照と比較して>90％増加し(p<0.001;図2H)、これにはアポトーシス低下が伴った(p<0.01;図2I)。化学療法抵抗性が比較的高いHS766T細胞(HS766T-siDKK3)においてDKK3を一過的に発現停止させた(図7)。これらの細胞におけるゲムシタビン存在下でのアポトーシス率は対照細胞と比較して2倍になった(p<0.01;図2J)。まとめると、DKK3はゲムシタビン化学療法抵抗性に寄与する。
【０１９２】
実施例4-DKK3のオートクライン効果およびパラクライン効果はNF-κB活性化によって媒介される
HPSCおよびPDACに対するDKK3効果の機構を調べるために、ハイスループット抗体ベースのRPPA分析を、PBSまたはrhDKK3のいずれかで20分間処理した初代HPSC細胞株(HPSCおよびHPSC20Aim)ならびにPDAC細胞(Panc1、BxPC3、およびL3.6pl)に対して行った。教師なしクラスタリング(unsupervised clustering)から、DKK3処理によって最も活性化された経路の1つがNF-κB-p65であることが明らかになり、これはウエスタンブロット分析を用いて確認された(図3A)。HPSCおよびPDAC細胞においてDKK3で刺激すると、NF-κBによって調節されるIκBαリン酸化も誘導された。これにより、DKK3がNF-κB活性化を誘導するというさらなる証拠が得られた。HPSCおよびPanc1におけるp65リン酸化のピークはrhDKK3で刺激して15〜30分後に生じた(図3B)。NF-κB依存性プロモーター活性の誘導を確認するために、HPSC、Panc1、BxPC3、およびL3.6pl細胞を野生型(WT)または変異(MT)κB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物のいずれかでトランスフェクトし、DKK3で刺激した。デュアルルシフェラーゼアッセイの結果から、DKK3は、野生型レポーターがある細胞ではNF-κBプロモーター活性を誘導するが、変異レポーターがある細胞では誘導しないことが分かった(図3C)。TNFαを陽性対照として使用した。PDACにおけるNF-κB活性化に対するDKK3効果をさらに証明するために、変異IκBαを安定発現し、かつNF-κBを活性化することができない、リン酸化に欠陥があるPanc28膵臓がん細胞(Panc28/IκBαM; Dr. P. Chiaoからの寄贈品)を使用した(Niu et al., 2007)。親Panc28細胞をDKK3で刺激すると、NF-κBプロモーター活性がPBS対照の33％分だけ誘導された。これに対してPanc28/IκBαM細胞では誘導は認められなかった。これらの結果はウエスタンブロット分析によって裏付けられた(図3E)。最後に、DKK3のNF-κB依存性効果がPDAC細胞機能に影響を及ぼすかどうかを調べた。DKK3で処理するとPanc28増殖が用量依存的に刺激された。しかしながら、Panc28/IκBαMの増殖はDKK3によって誘導されなかった。このことから、細胞増殖に対するDKK3を介した効果にはNF-κBが必要なことが示唆される(図3F)。まとめると、これらの結果から、DKK3はHPSC細胞とPDAC細胞の両方でNF-κBを活性化し、NF-κBを阻害すると、PDAC細胞活性のDKK3を介した誘導がブロックされることが証明された。
【０１９３】
実施例5-HPSCにおけるDKK3サイレンシングによってインビボで腫瘍成長が阻害される
HPSCをルシフェラーゼ標識BxPC3細胞と同時注射したPDAC同所性マウスモデルを用いると、HPSCの存在が原発腫瘍の成長増加と遠隔転移を用量依存的に刺激することが見出された(Hwang et al., 2008)。腫瘍進行におけるDKK3の役割を評価するために、ヌードマウスに、BxPC3細胞を単独で、またはHPSC-shDKK3または対照細胞(HPSC-shControl)と組み合わせて1:0または1:3の腫瘍対間質比で同所注射した。以前の観察と一致して、HPSCとBxPC3を両方とも注射したマウスは、BxPC3単独注射よりも大きな原発腫瘍を発症し、高い腹膜転移率を示した(図4A)、しかしながら、HPSC-shDKK3と同時移植するとHPSC-shControlとの同時移植と比較して原発膵臓腫瘍は有意に小さくなり、腫瘍サイズは67％縮小し(p<0.05、図4A)、腹膜転移の発生率は少なくなった(25％対31％)。免疫調節におけるDKK3の役割を示唆する最近の報告を考慮して、DKK3効果を免疫応答性PDACモデルにおいて調べた。最初に同系移植モデルを使用し、ルシフェラーゼ標識マウス膵臓がん細胞Panc02(DKK3陰性;図9)をDKK3-/-マウスまたは対照C57/BL6マウスに注射した。腫瘍成長は対照マウス(図4B)では指数関数的であったが、DKK3-/-マウスでは成長は有意に阻害され、22日でのルシフェラーゼシグナルは1/3.8に減少し(p<0.05)、Ki67陽性細胞は対照と比較してかなり少なくなった(図4B)。合わせると、これらのデータは膵臓腫瘍の成長および転移におけるDKK3の刺激的な役割を裏付けている。
【０１９４】
実施例6-PDAC自発性モデルにおいてDKK3を枯渇させると生存時間が延長する
免疫応答性モデルにおけるPDACに及ぼすDKK3の影響をさらに調べるために、PDACのKPCモデルにおいてDKK3を除去した。C57/BL6バックグラウンドのDKK3欠損マウス(DKK3-/-マウス、C. Niehrs, Mainz Germanyからの寄贈品)は広範囲にわたって特徴付けられており、わずかな生理学的変化しかなく、1年でがん発達の証拠がない(Barrantes Idel et al., 2006)。KPCマウスと交配させた時に、結果として得られた子孫であるP48-Cre; Kras LSL-G12D;Trp53fl/fl;dkk3-/- (「KPC/DKK3-/-」と名付けた)ならびにそのDKK3ヘテロ接合性同腹子およびDKK3野生型同腹子(KPC/DKK3+/-およびKPC/DKK3+/+)は出生時は正常表現型であった。マウスを瀕死になるまでモニタリングし、次いで、安楽死させ、生存時間を計算した。DKK3を完全に、または部分的に枯渇させた時(KPC/DKK3-/-またはKPC/DKK3+/-)、全生存時間の中央値は野生型DKK3マウスと比較して有意に延びた(KPC/DKK3-/-については68日、KPC/DKK3+/-については63日、これに対してKPC/DKK3-/-については47日;p=0.0002;図4C〜D)。実際に、野生型DKK3マウスの死亡率は、少なくとも部分的DKK3枯渇のあるマウスの5倍であった(HR0.21、95％CI 0.09〜0.47およびHR0.19、95％CI 0.08〜0.46;p=0.0002;図4D)。ヘテロ接合性Trp53がある同様のKPCモデルには悪性度の低い疾患があり、生存時間の中央値が延びた(P48-Cre;Kras LSL-G12D;Trp53fl/+;dkk3-/-)。このゆっくりと成長するモデルにおいてDKK3を除去した時に、インタクトなDKK3があるマウスまたはDKK3が枯渇したマウスとの間の生存時間の中央値の相違は顕著であり、生存時間が2倍超 (83日対177日、p<0.0001)、死亡率が25倍の相違があった(HR0.04、p<0.0001;図10)。
【０１９５】
DKK3状態に関係なく全マウスにおいて、H&E染色によって、DKK3破壊による生存時間の差にもかかわらず安楽死の時に膵臓癌が存在することが確認された(図4E)。予想通り、qPCRによって測定した時に、DKK3発現は対照KPC/DKK3+/+(黒色バー)マウスと比較してホモ接合性KPC/DKK3-/-マウス(赤色バー)では実質的に存在せず、ヘテロ接合性KPC/DKK3+/-マウス(青色バー)では中間レベルであった(図4F)。
【０１９６】
しかしながら、α-SMAおよびコラーゲンのIHC分析によって示されたようにDKK3破壊によって活性化間質含有量は低減し(図4Eおよび4G)、KPC/DKK3-/-マウスの腫瘍におけるKi67増殖指数はKPC/DKK3+/+マウスと比較して有意に低下した(22％対33％、p<0.0001;図4E〜F)。Ki67の低減はDKK3破壊の程度と用量依存的な相関関係があり、KPC/DKK3+/+マウスでの発現が最高であり、KPC/DKK3-/-マウスでは最低であった。まとめると、これらのデータから、DKK3発現レベルに関係なく全てのKPCマウスにおいて最終的に膵臓腫瘍が発症することが分かる。しかしながら、DKK3発現が低下すると腫瘍の増殖性は低下し、活性化間質は少なくなる。
【０１９７】
DKK3ヘテロ接合性KPCマウス群を調べた時に生存時間はDKK3-/-マウスと驚くほど似ていた(図4C〜D;63日対68日、p=NS)。だが、qPCRによるDKK3発現はKPC/DKK3+/-腫瘍の方が有意に高かった(0=0.003)。DKK3ヘテロ接合性マウスにおけるDKK3発現はqPCRによってKPC/DKK3+/+の62％であった(図4F)。ヘテロ接合性DKK3+/-発現がある、悪性度の低いP48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/+モデルでは、DKK3は同じようにDKK3+/+マウスの52.7％であった(図11)。これらの結果から、中程度のDKK3枯渇でも、このPDACモデルにおいて生存時間を延ばすのに有効なことが示唆される。
【０１９８】
次いで、DKK3がPDAC発達の初期段階に寄与する程度を確かめた。KPC/DKK3-/-マウスを、KPC/DKK3+/+マウスが死亡する年齢(生存時間の中央値、47日)とほぼ同じ年齢(48日)で安楽死させた。この時点で、KPC/DKK3-/-マウスは健康なように見え、膵臓組織のH&E染色はほぼ正常であり、いくつかの局所性の異形成領域があったが、PanINまたは浸潤癌の病巣は無かった(図4E)。これに対して、KPC/DKK3+/+マウスは膵臓癌があり瀕死であった。予想通り、α-SMA染色時には極めて少ない活性化間質が認められ、Ki67増殖指数は同じ年齢のKPC/DKK3wtマウスで認められるものよりも有意に小さかった(赤色の斜線で埋めたバー、p=0.001;図4E〜G)。しかしながら、マウスが瀕死の時に収集した腫瘍において示されたように、時が経つにつれて活性化間質および細胞増殖は増加した(生存時間の中央値、68日)。これらの知見から、DKK3は膵臓腫瘍形成の初期段階に関与する可能性があり、DKK3の破壊は新生物の発達を遅延するが、がん形成を完全に阻止しないことが示唆される。
【０１９９】
DKK3枯渇マウスにおいて腫瘍が形成する場合、腫瘍はゆっくりと成長し、増殖指数は小さく、活性化間質含有量は少なくなる。このことが全生存期間の改善に寄与するのかもしれない。DKK3ヘテロ接合性腫瘍におけるα-SMAおよびKi67の組織学および発現はDKK3ヌルマウスと似ており、図4Eおよび4Gに示した。
【０２００】
実施例7-中和抗体でDKK3を阻害するとPSCおよびがん細胞の機能が抑制され、化学療法に対する応答が強化され、生存時間が延長する
DKK3遮断の治療可能性をさらに評価するために、ヒトDKK3に対する新規のモノクローナル抗体(mAb、クローンJM6-6-1およびJM8-12-1;表1-4)を作製し、HPSC細胞およびPDAC細胞の機能に対する、これらの効力を試験した。HPSCをJM6-6-1またはJM8-12-1で処理すると、無関係のアイソタイプ対照mAbと比較して増殖停止が70〜80倍誘導され(p<0.01およびp<0.001;図5A)、遊走が5〜11倍阻害された(p<0.0001;図5B)。BxPC3がん細胞をJM6-6-1またはJM8-12-1で処理すると、DKK3を介した遊走誘導を逆転できず(p<0.001;図5C)、がん細胞におけるDKK3を介したゲムシタビン化学療法抵抗性誘導も抑制された(図5D)。このアッセイでは、HPSC-CMで処置した、ゲムシタビン中でのBxPC3細胞の生存時間は対照と比べて200％増加したが、どちらか一方のDKK3 mAbクローンを添加するとゲムシタビンに対する感受性が回復し、増殖速度は培地対照と似ていた(図5D)。PDAC細胞上でのDKK3の細胞表面結合をフローサイトメトリーによって評価した。これにより、JM6-6-1の添加はrhDKK3とPDAC細胞との結合をブロックするのに有効なことが確認された(図11B)。
【０２０１】
(表１)DKK3抗体の軽鎖可変配列のCDR
2022502517.tif 000007
【０２０２】
(表２)DKK3抗体の重鎖可変配列のCDR
2022502517.tif 000008
【０２０３】
(表３)抗体可変領域のヌクレオチド配列
2022502517.tif 000009
【０２０４】
(表４)抗体可変領域のタンパク質配列
2022502517.tif 000010
【０２０５】
以前に述べられたPDACの同所性同時移植ヌードマウスモデルと、ルシフェラーゼ標識BxPC3がん細胞と混合したヒトPSC(1:3の腫瘍:PSC比)を用いてDKK3 mAbの効力をインビボで試験した。マウスをリン酸緩衝食塩水(PBS)、アイソタイプ対照mAb、またはDKK3 mAb(クローンJM6-6-1;5mg/kg i.p. 5日に1回)で処置し、腫瘍成長をIVIS画像化によって追跡した。PBSまたは対照mAb群と比較して、JM6-6-1 mAb群は、4週間の処置を完了した後に安楽死させた33日目まで、22日目でのベースライン腫瘍シグナルと比較して有意な腫瘍成長阻害を示した(p<0.01;図5E)。PBSおよび対照mAb群の腫瘍は22日目から急速に成長し、ルシフェラーゼシグナルが8倍増加した。HPSCが無くBxPC3のみに由来する腫瘍は、PBSまたはアイソタイプ対照mAbと比較してJM6-6-1 mAb処置に応答して有意な変化を示さなかった(図11C)。このことから、JM6-6-1は、標的DKK3が、このモデルに存在し、HPSCによって産生される時だけ有効なことが示唆される。膵臓腫瘍が取り出された後に、腹膜腔を検査すると、JM6-6-1で処置したマウスではルシフェラーゼシグナルによって測定した時に、PBSまたは対照mAbと比較して転移性疾患体積が1/6.5になったことも明らかになった(p<0.05、図5F)。さらに、DKK3抗体JM6-6-1によってTNBCの4T1マウスモデルを処置すると生存時間が改善した(図13F)。
【０２０６】
別の生存実験では、JM8-12で処置すると(5mg/kg i.p. 5日に1回)、生存時間の中央値が対照群と比較して有意に改善した(JM8-12の場合は50日、PBSの場合は36日、対照mAbの場合は41日;p<0.0001;図5G)。PBS対照群と比較した、JM8-12 mAbで処置したマウスのハザード比は0.26であった。このことから、このPDAC異種移植片同所性モデルにおいて、抗DKK3 mAbによる処置は腫瘍成長および転移の減少と生存時間の延長に関連することが分かった。
【０２０７】
PDACのKPCモデルにおけるDKK3遺伝子破壊によって生存時間の有意な改善が観察されたので(図4)、このモデルにおいてmAbによるDKK3の薬理学的中和も有効かどうか確かめようと努力した。ヒトDKK3とマウスDKK3はBLAST分析によって83％のタンパク質配列相同性を有し、従って、JM6-6-1が宿主DKK3と交差反応する可能性が高いと予想した。交差反応性が非変性ウエスタンブロットによって確認された。このことから、JM6-6-1はマウスDKK3を認識するが、ヒトDKK3より弱く認識することが分かった(図12A)。JM6-6-1は、DKK3を発現するマウス膵臓から単離したPSCの増殖を阻害した(図12B〜C)。KPCマウス(P48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl)をJM6-6-1で処置した時に(赤色の実線、図5H)、生存時間の中央値はPBSまたはアイソタイプ対照mAbと比較して43日から61.5日と43％増加した(p=0.005、HR0.24、95％CI0.01〜0.30;図5H)。対照的に、DKK3を欠くKPC/DKK3-/-マウス(P48-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl;dkk3-/-)では、PBSまたは対照mAb処置(黒色および青色の破線;それぞれ、57日および57日;p=NS)と比較して、JM6-6-1は生存時間に対して影響を及ぼさなかった(赤色の破線;58日)。このことから、JM6-6-1効果はDKK3に特異的である可能性が高いことが分かる。以前の結果と一致して、PBSまたはアイソタイプ対照mAbで処置したKPC/DKK3-wtマウス(黒色および青色の実線;43日および46日;p=0.004およびp=0.007)と比較して、KPCマウスにおけるDKK3遺伝的枯渇は生存時間の改善と関連した(黒色の破線;57日)。興味深いことに、JM6-6-1で処置したKPC/DKK3+/+マウスの生存時間の中央値はKPC/DKK3-/-マウスよりも長かったが(61.5対57日)、この差は統計的に有意でなかった。このことから、生存時間を改善するのに、mAbを用いたDKK3の薬理学的中和は遺伝子破壊と似ていることが示唆される。JM6-6-1は、発がん性Krasを動かすためにPdx1プロモーターを利用する別の広く受け入れられているPDACのGEMMモデル(Pdx1-Cre;KrasLSL-G12D;Trp53fl/fl)を用いた、より大きな試料サイズを用いた別の実験において同じように有効であった(図12D)。しかしながら、このモデルは、以前に報告されたように(Lampson et al., 2012; Westphalen & Olive, 2012)、良性パピローマを発症しやすかった。従って、パピローマを発症しない、さらに膵臓特異的なP48-Cre対立遺伝子を用いたKPCモデルを用いて後の研究を行った。
【０２０８】
DKK3 mAbを用いたTNBC同所性モデルの処置も試験した。ホタルルシフェラーゼで標識した4T1 TNBC細胞を用いた同所性モデルを、PBS、対照抗体、またはJM6-6-1で処置した。処置を開始して33日後に腫瘍成長を測定し、処置前の初期腫瘍サイズと比較した。JM6-6-1処置マウスの腫瘍は対照と比較して有意に小さかった(図14A)。原発腫瘍およびあらゆる転移を検出するためにマウスの画像化も行った(図14B)。4T1転移からのルシフェラーゼシグナルの定量から、JM6-6-1処置によって転移が阻止されたことが分かる(図14C)。
【０２０９】
実施例8-DKK3遮断は腫瘍免疫浸潤物の増加と関連し、チェックポイント阻害剤療法に対する応答を改善する
DKK3は免疫モジュレーターであることが示されており、T細胞寛容と関連する。CD3+T細胞をインビトロで組換えDKK3で刺激した時に、培地単独と比較して4.7〜11.5倍の細胞増殖阻害が観察された(図6A;p<0.07)。ルシフェラーゼ標識KPC細胞をDKK3-/-または対照C57/BL6マウスに移植した同系同所性モデルに由来する膵臓腫瘍においてCD3発現細胞とCD8発現細胞を分析した。IHCによって、DKK3-/-マウスでは、対照と比較してCD3+細胞が2.4倍増加したことが証明された(図6B)。CD8+細胞は、C57/BL6マウスに由来する腫瘍ではめったに認められなかったが、DKK3-/-マウスに由来する腫瘍の周辺部では一貫して特定され、発現がほぼ4倍増加した(図6B)。さらなるT細胞活性マーカーをqPCRによって測定した。これから、DKK3-/-腫瘍ではグランザイムBおよびIL-2が有意に増加し(それぞれ、p=0.005およびp=0.01)、IFN-γおよびCD25が増加したが、これらは統計的に有意でないことが分かった(それぞれ、p=0.09およびp=0.07;図6C)。これらのデータから、DKK3はT細胞増殖を阻害し、DKK3枯渇は膵臓腫瘍におけるCD3+およびCD8+T細胞の数および活性の増加と関連したことが示唆される。
【０２１０】
PDACは一般に免疫チェックポイント療法抵抗性であった。いくつかの研究から、これは免疫抑制性微小環境に起因し得ると示唆される(Johnson et al., 2017; Laheru & Jaffee, 2005; Zheng et al., 2013; Jiang & Hegde, 2016; Jiang et al., 2017; Kaneda et al., 2016; Jiang et al., 2016)。DKK3操作がチェックポイント阻害剤に対する応答に影響を及ぼすことができるかどうか確かめるために、同系同所性C57/BL6モデルのマウスをアイソタイプ対照IgG、DKK3 mAb JM6-6-1、α-CTLA4、またはJM6-6-1とα-CTLA4の組み合わせで処置した。α-CTLA4単独による処置は対照Ab処置と同等であり、ルシフェラーゼシグナルによる腫瘍成長に対する効果は無かった(図6D)。JM6-6-1単独で処置すると22日以降に対照IgGまたはα-CTLA4と比較して成長阻害が起こった(p<0.01)。JM6-6-1+α-CTLA4を用いた組み合わせ群のマウスは8日後に腫瘍成長阻害を示し、腫瘍成長阻害は18日目の後には極めて有意であった(p<0.0001)。200日目まで追加経過観察すると(図6D、右)、JM6-6-1および組み合わせJM6-6-1+α-CTLA4群において全群の腫瘍がゆっくりした速度ではあるが成長し続けた(図6D)。4つの処置群の生存時間を図6Eに示した。JM6-6-1単独の生存時間の中央値はIgG対照と比較して有意に長かったが(75日対30日、p=0.01)、α-CTLA4処置(p=0.32)と同等であった。組み合わせ処置JM6-6-1+α-CTLA4は生存時間の極めて有意な改善と関連し(p=0.004)、この群では生存時間の中央値に達しなかった(図6E)。組み合わせ処置群の生存時間はまたJM6-6-1単独と比較しても有意に優れていた(p=0.04)。組み合わせ処置群では、マウスの80％が生存し、800日で健康なように見え、選択的に屠殺された(electively sacrificed)。JM6-6-1群では、選択的に屠殺された726日にマウスの20％がなお生存した。200日後にIVIS画像化を行わなかったが、その時点で、生き残っているマウスの腫瘍からのシグナルは極めて小さく(図6D)、JM6-6-1群および組み合わせ群の残ったマウスからの腫瘍において肉眼的腫瘍は特定されなかった。
【０２１１】
これらの研究結果をさらに裏付けるために、α-CTLA4の効果をPDACのKPC/DKK3-/-モデルでの生存研究において試験した(図6F)。インタクトなDKK3がある野生型KPCマウスにおいて、対照IgGおよびα-CTLA4はPBSと比較して生存時間に影響を及ぼさなかった(黒色の線、生存時間の中央値43〜48.5日)。以前に観察されたように、KPC/DKK3-/-マウスの生存時間の中央値はKPC/DKK3+/+マウスと比較して有意に改善した(57対43日、p=0.004)。KPC/DKK3-/-マウスをα-CTLA4で処置した時に、生存時間は68日まで増加した。これは、PBSで処置した野生型DKK3と比較して58％の改善に相当する(p=0.0003; HR 0.20、95％ CI 0.004〜0.13)。DKK3破壊へのα-CTLA4の添加はまた、KPC/DKK3-/-マウスではDKK3破壊単独より優位に立って生存時間を改善した(68対57日; p=0.02; HR 0.32、95％ CI 0.03〜0.59)。要約すると、モノクローナルAbを用いた薬理学的処置または遺伝子破壊によってDKK3を枯渇させると、チェックポイント阻害剤免疫療法に対するPDAC応答が改善し、生存時間が有意に改善した。
【０２１２】
本明細書において開示および請求された方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して説明されたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法ならびに本明細書に記載の方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかである。さらに具体的には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的および生理学的に関連している、ある特定の薬剤を使用することができ、それと同時に、同一の結果または類似の結果が得られることは明らかである。当業者に明らかな、このような類似の代用および変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内だと考えられる。
【０２１３】
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に記載のものを補足する他の詳細を示す程度まで、参照により本明細書に特に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ−１】
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【図６Ｆ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ−１】
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【図８Ｅ−２】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【配列表】
2022502517000001.app
【国際調査報告】
2022502517.tif 000100
2022502517.tif 000101
2022502517.tif 000102
2022502517.tif 000103