(57)【要約】  さまざまな実施形態において開示されたWnt-活性化脂肪由来幹細胞装置、方法およびシステム（以下「WAADSC」）は、細胞集団の50%超において、Lrg5マーカーおよび／またはネスチンの発現上昇によって示される活性Wntシグナル伝達を有する間葉系幹細胞の単離され濃縮された細胞集団の生成を提供する。そのような自己細胞集団は、実施形態において、神経変性疾患を有する患者の脳室に注入されて、特定の疾患の進行を停止させ、および／または特定の症状を改善するなどの治療結果をもたらすことができる。
2022502080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を含む、間葉系幹細胞の組成物。
【請求項２】
脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞の少なくとも５０％がLrg5およびネスチンを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アクチビンＡと、bFGFと、シグナル伝達アミノ酸の組み合わせに、間葉系幹細胞を曝露することを含む、Wnt-活性化間葉系幹細胞の組成物を産生するための方法。
【請求項４】
脂肪組織から間葉系幹細胞を導出することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
中枢神経系の変性病変の治療にWnt-活性化間葉系幹細胞を適用する治療方法。
【請求項６】
前記Wnt-活性化間葉系幹細胞の適用は、更に、Wnt-活性化間葉系幹細胞を少なくとも1つの脳室に注入することを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
慢性閉塞性肺疾患の治療にWnt-活性化間葉系幹細胞を適用することを含む治療方法。
【請求項８】
前記Wnt-活性化間葉系幹細胞の適用は、更に、患者による吸入のためにWnt-活性化間葉系幹細胞を噴霧することを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Wnt-活性化間葉系幹細胞の適用は、更に、前記Wnt-活性化間葉系幹細胞を肺組織に注入することを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
糖尿病の治療のためにWnt-活性化間葉系幹細胞を適用することを含む治療方法。
【請求項１１】
前記Wnt-活性化間葉系幹細胞の適用は、更に、前記Wnt-活性化間葉系幹細胞を膵臓組織に注入することを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
関節炎の治療のためにWnt-活性化間葉系幹細胞を適用する治療方法。
【請求項１３】
前記Wnt-活性化間葉系幹細胞の適用は、更に、前記Wnt-活性化間葉系幹細胞を関節組織に注入することを含む請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１４】
脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を生成する方法であって、
抗生物質と解離酵素を加えた培地を含む培養フラスコ内で脂肪細胞を懸濁して、第１の懸濁液を生成する工程と、
前記第１の懸濁液をインキュベートする工程と、
前記第１の懸濁液を遠心分離する工程と、
第１の上清を除去する工程と、
培地および増殖因子を添加して、第２の懸濁液を生成する工程であって、前記増殖因子は、アクチビンＡおよび塩基性線維芽細胞増殖因子のうちの少なくとも１つを含む工程と、
第２の懸濁液をインキュベートする工程と、
第２の上清を除去する工程と、
前記培地と前記増殖因子を追加して、第３の懸濁液を生成する工程と、
少なくとも1つの組換え型細胞解離酵素を前記第３の懸濁液に適用する工程と、
前記第３の懸濁液を遠心分離する工程と、
第３の上清を除去する工程と、
前記培地と前記増殖因子を追加して、第４の懸濁液を生成する工程と、
前記第４の懸濁液を均質化する工程と、
前記培地と前記増殖因子を添加して、コンフルエントな脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を生成する工程とを含む方法。
【請求項１５】
前記脂肪細胞が、少なくとも１つの脂肪吸引手順から導出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コンフルエントな脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞をバッチ凍結して、少なくとも1回の凍結投与量を生成する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１回の凍結投与量は、少なくとも１回の治療投与量および少なくとも１回の品質管理投与量を含む請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
少なくとも１回の凍結投与量を解凍して、解凍投与量を生成する工程と、
前記解凍投与量に滅菌生理食塩水を添加して、第５の懸濁液を得る工程と、
第５の懸濁液を遠心分離する工程と、
第５の上清を除去する工程と、
前記滅菌生理食塩水を添加して第６の懸濁液を得る工程と、
第６の懸濁液を遠心分離する工程と、
第６の上清を除去する工程と、
注入可能な量の滅菌生理食塩水を加えて、注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を生成する工程を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を少なくとも1つの脳室に注入する工程を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を膵臓組織に注入する工程を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を肺組織に注入する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を心臓組織に注入する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を関節組織に注入する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記注入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を噴霧して、吸入可能な投与量の脂肪由来のWnt-活性化間葉系幹細胞を生成する工程をさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記バッチ凍結は、さらに、
第２の組換え型細胞解離酵素を適用する工程と、
細胞数と生存率を評価する工程とを含み、
前記細胞数が最小しきい値より大きい場合に、
HBSS中で遠心分離により洗浄する工程と、
凍結バイアル中の洗浄された投与量を保護剤とともに等分する工程と、
前記等分された洗浄投与量を液体窒素の気相において凍結して、少なくとも1つの凍結投与量を得る工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地が基礎培地および培地サプリメントを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記基礎培地が、DMEM-F12、RPMI、WilliamsまたはABStem培地のうちの１つを含む、請求項２６に記載の方法。 
【請求項２８】
前記培地サプリメントが、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、ビトロネクチン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アルギニンおよびタウリンの混合物を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗生物質がペニシリンおよびストレプトマイシン細胞培養物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
前記解離酵素が、１UI/mLの濃度のディスパーゼおよび２mg/mLの濃度のコラゲナーゼを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記アクチビンＡが５ng/mLの濃度に調製され、前記塩基性線維芽細胞増殖因子が１０ng/mLの濃度に調製される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖因子が、アクチビンＡおよび線維芽細胞増殖因子の両方を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの組換え型細胞解離酵素がTrypLEを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の懸濁液と、第２の懸濁液と、第３の懸濁液の遠心分離は約２５０Ｇで実施される、請求項１４に記載の方法。 
【請求項３５】
前記第１の懸濁液のインキュベーションは一晩中行われ、前記第２の懸濁液のインキュベーションは４８時間行われる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、脂肪由来幹細胞を使用する自己由来療法に関し、より詳細には、WNT-活性化脂肪由来幹細胞装置、方法およびシステムを含む。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の疾患は、頭部外傷または脳卒中にともなう脳損傷、脊髄の損傷、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、ならびに様々な他の神経系疾患および機能不全を含む、広範な病変や苦痛を含んでいる。このような疾患は、極度に衰弱性であり、治療および治癒的療法の追及は、医師にとって、同様に科学者にとっても大きな課題を提示する。最近、幹細胞療法が利用可能になっており、神経系修復を含む種々の疾患の治療においてある程度の有望性が示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
種々の実施形態において本明細書に開示されるWNT-活性化脂肪由来幹細胞装置、方法およびシステム（WNT-ACTIVATED ADIPOSE-DERIVED STEM CELL APPARATUSES, METHODS AND SYSTEMS）（以下、「WAADSC」と呼ぶ）は、集団の５０％超におけるLrg 5マーカーおよび/またはネスチン（Nestin）の高度発現によって実証される活性Wntシグナル伝達を有する間葉系幹細胞の、単離されかつ濃縮された集団の生成を提供する。このような自家移植性（autologous）細胞集団（以下、自己細胞集団）は、いくつかの実施形態において、神経変性疾患を有する患者の脳室に注入されて、特定の疾患の進行を停止させ、および/またはその特定の症状を改善するなどの治療結果をもたらすことができる。他の実施形態において、このような自己細胞集団は、静脈注射、動脈注射、関節内注射などを含むがこれらに限定されないその他の方法で投与され得る。
【０００４】
一実施形態において、少なくとも５０％の間葉系幹細胞がLrg 5およびネスチンを発現するような、脂肪組織由来のWnt-活性化間葉系幹細胞の組成物が開示されている。
【０００５】
一実施形態において、脂肪組織由来のWnt-活性化間葉系幹細胞の組成物を製造する方法が開示され、この方法は、間葉系幹細胞を、アクチビンＡ、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、および必須および非必須アミノ酸の全てに加えて、高濃度のロイシン、アルギニンおよびタウリンに存在するシグナル伝達アミノ酸の組み合わせに曝露することを含む。
【０００６】
一実施形態において、変性中枢神経系病変の治療のためにWnt-活性化間葉系幹細胞を適用することを含む治療方法が開示される。別の実施形態は、慢性閉塞性肺疾患、関節炎、糖尿病などの、但しこれらに限定されない様々な他のいかなる疾患の治療のためのWnt-活性化間葉系幹細胞の応用を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
添付の付属物および/または図面は、本明細書に従う様々な非限定的、例示的、革新的な態様を示す。
【図１】WAADSCの一実施形態においてWnt-活性化脂肪由来幹細胞を収集し、処理し、調製し、投与する全体的プロセスのための論理フローの一例を示す図である。
【図２】WAADSCの一実施形態における組織収集論理フローの一例を示す図である。
【図３】WAADSCの一実施形態における組織処理論理フローの一例を示す図である。
【図４】WAADSCの一実施形態における細胞増殖および継代のための論理フローの一例を示す図である。
【図５】WAADSCの一実施形態におけるバッチ凍結のための論理フローの一例を示す図である。
【図６】WAADSCの一実施形態における投与量送達論理フローの一例を示す図である。
【図７】一実施形態におけるWAADSC培養の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
脂肪由来幹細胞を使用する自己由来療法のためのいくつかのアプローチは、例えば、約７〜８％の脂肪間葉系幹細胞、７〜８％の血液前駆体、および残部約８５％の線維芽細胞、筋細胞、血管内皮細胞および血球の混合物を含む様々な形態の細胞の混合物に基づく。このプロセスは、分画遠心分離(differential centrifugation)による臨床操作を使用しても良い。
【０００９】
この混合物から特定の幹細胞画分を増殖するためのある方法は、動物血清および任意の増殖因子（growth factor）を含有する細胞培養培地を含むプラスチック容器内における培養に基づく。このような方法は、細胞を、汚染およびゲノム不安定性などの様々なリスクにさらすインビトロ（in-vitro）操作時間を延長するおそれがある。このような方法はまた、MSC（Mesenchymal Stem Cells：間葉系幹細胞）の骨形成/軟骨形成集団に偏る（bias）傾向にある。他の方法は、Mesencult （登録商標）などの市販の無血清培地を使用し、同様に、主に骨形成/軟骨形成/脂肪形成性のCD44/CD105陽性集団をもたらし得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞の生成は、アクチビンＡと、mTOR経路を刺激するシグナル伝達アミノ酸の組合せとの組合せに基づいて、迅速な増殖を促進し得る。このような方法は、集団の５０％超（例えば、９９％まで、またはそれ以上）におけるLrg 5マーカーの高度な発現によって示される活性Wntシグナル伝達を有する間葉系幹細胞の濃縮集団を単離および増殖させることができる。さらに、増殖された集団中の細胞の５０％超がネスチンを発現する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、このようにして得られたWnt-活性自己細胞集団は、次いで、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、または種々の他の神経系疾患および機能不全などの神経変性疾患を持つ患者の脳室に注入され得る。他の実施形態では、このような自己細胞集団は、静脈注射、動脈注射、関節内注射などを含むがこれらに限定されない他の方法で投与され得る。例えば、このような細胞集団を使用する関節炎治療は罹患関節へ細胞を注入することによって達成される。治療は、次のような種々の可能なメカニズムによって、これらの疾患の特定の症状を改善することができる。すなわち、(a)神経型における間葉系幹細胞の分化および脳における組込み；(b)栄養性パラクリン効果およびニューロン新生の刺激；および/または(c)抗炎症性パラクリン効果を含むメカニズムである。被験者の少なくとも一人における海馬容積の増加が観察された。分画遠心分離(differential centrifugation)による臨床操作を用いる実施形態は、治療の安全性および効率を高めることができる。別の実施形態は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、心臓疾患、関節炎、糖尿病などの、ただしこれらに限定されない、様々な他の疾患のいずれかの治療のためのWnt-活性化間葉系幹細胞の適用を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、作用のメカニズムは、移植されたLrg 5陽性間葉系幹細胞のセクレトーム（細胞分泌物）およびオートクリン（自己分泌）活性によるニューロン栄養サポートおよび可塑性(plasticity)を含む。
【００１３】
図1は、WAADSCの一実施形態においてWnt-活性化脂肪由来幹細胞を収集し、処理し、調製し、投与するための全体的プロセスの論理フローの一例を示す。組織は、特定温度に維持された容器（例えば、Credocube）および／または組織が分配される培地内容物からなる収集キットを使用することによって収集することができる（101）。次いで、収集された組織を、細胞の増殖（expansion）および継代（passaging）（110）に備えて処理する（105）。一旦十分な細胞数が達成されると、バッチ凍結が実行される（115）。使用前に、品質管理（ＱＣ）バイアルを使用して試験を実施するなど、ロットリリース（出荷許可）プロセス（120）を行うことができる。次いで、ロットリリースプロセスにおいて適切な品質を有する投与量が送達される（125）。
【００１４】
図２は、WAADSCの一実施形態における組織収集論理フローの一例を示す。容器（例えば、CredoCube）からなる収集キットは、特定の温度（例えば、４〜８℃）にプライミングされ（201）、組織収集に先立って、例えば収集プロセスの1日前に、収集サイトに送達される（205）。例えば、一実施態様では、キットは、それぞれ５０〜１００mlの容量を有する４〜６個の容器を含むことができる。容器は、それらの全容積の一部（例えば３０％）まで、抗生物質を含む培地で充填される（210）。一実施態様では、培地は、ABStem培地サプリメント（培地添加物）を加えたABstem基礎培地であってもよい。別の実施態様では、培地は、例えば、市販の基礎培地（例えば、DMEM、DMEM-F12、RPMI、Williams、ABstem）に、例えば、インスリン、亜セレン酸ナトリウムおよびビトロネクチンを含む組成物を補足し、生理学的濃度および超生理学的濃度のＬ-ロイシン（例えば、０．１２〜１．２g/L）、Ｌ-アルギニン（例えば、０．３５〜２g/L）およびタウリン（例えば、１．０〜２．５g/L）が含まれるものであってもよい。一実施態様では、前記抗生物質は、1x（１倍）の濃度で使用されるペニシリンおよびストレプトマイシン細胞培養グレード（例えば、ThermoFisherカタログ#10378016）であっても良い。次いで、組織（例えば、脂肪組織）が収集され（215）、組織は、培地容器内にその総容積の一部、例えば、７５〜８０％まで分配される（220）。一実施態様では、脂肪組織を脂肪吸引（liposuction）手順によって収集することができる。次いで、容器は、対応する患者のドキュメンテーション、ラベリングなどと共に収集キット中に配置され、輸送に備える（225）。
【００１５】
図３は、WAADSCの一実施形態における組織処理論理フローの一例を示す。製造施設に収集キットが到着すると、患者情報が記録され、コード化され、その後のプロセスで使用されるラベルを生成するために使用され得る（305）。収集された組織は、次いで、遠心分離等によって、輸送培地から抽出される（310）。一実施態様では、遠心分離は、約２５０Ｇで約５分間実施される。遠心分離に続いて、油（例えば、黄色油状物質）からなる上部層は水性上清と共に、吸引などによって除去される（315）。次いで、ペレット化された組織は再懸濁され、抗生物質およびディスパーゼ（Dispase）を加えた培地とともに細胞培養フラスコ中に配置（例えば、フラスコ当たり１〜５グラム）される（320）。一実施態様では、抗生物質（例えば、1xの濃度のペニシリンおよびストレプトマイシン細胞培養グレード）を加えた約２５〜３０mlの培地（例えば、ABStem培地サプリメントを加えたABstem基礎培地）を、１UI/mLのディスパーゼまたは２mg/mLのコラゲナーゼIVと共に用いることができる。一実施態様では、インスリン（例えば、０．０５〜０．２g/L）、亜セレン酸ナトリウム（例えば、０．００１−０．０１０ng/L）、ビトロネクチン（例えば、２５〜１００ng/L）、Ｌ-ロイシン（例えば、０．１２〜１．２g/L）、Ｌ-アルギニン（例えば、０．３５〜２g/L）およびタウリン（例えば、１．０〜２．５g／L）を含む組成物で補足された基礎培地（例えば、DMEM-F12、RPMI、Williams、ABstem）の培養表面の約0．３〜０．５mL/cm2に、抗生物質（例えば、1xの濃度のペニシリンおよびストレプトマイシン細胞培養グレード）を加えたものを、１UI/mLディスパーゼ または２mg/mlコラゲナーゼIVと共に使用することができる。一実施態様では、ディスパーゼまたはコラゲナーゼは、培地中の特定の濃度（例えば、１UI/mL）に調製され、例えば、0.1ミクロンのフィルターを通して滅菌濾過された粉末を含むことができる。次いで、フラスコは、ディスパーゼを用いて約３７℃で一晩、またはコラゲナーゼを用いて３０分間〜１時間インキュベートされる。次いで、懸濁液が収集され、円錐管（例えば５０mL）に移されて、遠心分離（例えば、２５０Ｇで）された後、上清を除去し、遠心分離を再び繰り返す（330）。上記のような新鮮な培地組成物を、ディスパーゼまたはコラゲナーゼを除いて、増殖因子および抗生物質と共に加える（例えば、細胞培養表面の０．５mL/cm2まで）（335）。一実施態様では、増殖因子は、凍結保存状態（例えば、−２０℃未満、または４℃で1週間まで）の予め作成されたストックアリコート（貯蔵された等量分割単位試料）から、新鮮な培地に直接添加することができる。実施態様では、増殖因子は、アクチビンＡを例えば、約５ng/mL （例えば、ストック溶液が５μg/mlで、培地１ml当たり１μlで使用され得る）；および、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を例えば、約１０ng/mL （例えば、ストック溶液は５μg/mlであり、培地１ml当たり１μlで使用され得る）を含んでも良い。次いで、細胞懸濁液はインキュベーションのためにインキュベータに移される（340）。一実施態様では、インキュベーションは４８時間行われ、および/または月−水−金スケジュールを継続する。その後、吸引等によって上清が除去され、接着細胞が十分にコンフルエント（培��容器の接着面を覆い尽くした）状態に達するまで新鮮な培地が添加される。一実施態様では、培地は、基礎培地（例えば、DMEM-F12、RPMI、Williams、ABstem）に、例えば、インスリン（例えば、０．０５〜０．２g/L）、亜セレン酸ナトリウム（例えば、０．００１〜０．０１０ng/L）、ビトロネクチン（例えば、２５〜１００ng/L）、Ｌ-ロイシン（例えば、０．１２〜１．２g/L）、Ｌ-アルギニン（例えば、０．３５〜２g/L）およびタウリン（例えば、１．０〜２．５g/L）を含む組成物ならびに増殖因子（例えば、アクチビンＡを5ng/mlおよびbFGFを10ng/mL）を補足したものであって、抗生物質を含まない。一実施態様では、培地は、ABStem培地サプリメントを加えたABStem基礎培地、ならびに増殖因子（例えば、アクチビンＡおよび/またはFGF）を含み得るが、抗生物質を含まなくてよい。
【００１６】
図４は、WAADSCの一実施形態における細胞の増殖および継代のための論理フローの一例を示す。一実施態様では、コンフルエント状態に到達した後、約1週間後に、細胞を酵素的に解離して、継代のためにより大きな容器に移す（401）。一実施態様では、TrypLE （登録商標）や同様の組換え型細胞解離酵素を、細胞を解離するために（例えば、５〜１０分間）適用することができる。一実施態様では、TrypLE （例えば、ThermoFisher カタログ#12604013）が希釈されることなくそのまま使用される。細胞懸濁液を次に円錐管（例えば、５０mL）に移し、約２５０Ｇで遠心分離する（405）。上清が除去され新鮮な培地 （例えば、DMEM-F12、RPMI、Williams、ABstem）と交換される（410）。この培地は、インスリン（例えば、０．０５〜０．２g/L）、亜セレン酸ナトリウム（例えば、０．００１〜０．０１０ng/L）、ビトロネクチン（例えば、２５〜１００ng/L）、L-ロイシン（例えば、０．１２〜１．２g/L）、L-アルギニン（例えば、０．３５〜２g/L）及びタウリン（例えば、１．０〜２．５ g/L）を含む組成物と、増殖因子（例えば、アクチビンＡを５ng/mlおよびbfgfを１０ng/mL）で補足されている。次に細胞懸濁液は均質化され、患者ＩＤでラベルづけされた新たな細胞培養容器に分配される（例えば、１：４、１：６、などの比率で）（415）。増殖因子を含む培地を添加してもよい（例えば、培養容器の０．４mL/cm２まで）（420）。所望のコンフルエント度が達成されたかどうかが判定される（425）。否の場合には、培養物の供給を継続してもよい（例えば、月−水−金スケジュールで）。そうでなければ、適切なコンフルエント状態が達成されると、プロセスはバッチ凍結に進むことができる（430）。
【００１７】
図５は、WAADSCの一実施形態におけるバッチ凍結論理フローの一例を示す。培養物は、TrypLEを用いるなどして解離されても良い（501）。次に、細胞カウントおよび生存率評価が行われ （505）、細胞数が十分であるかどうかについて判定される（510）。例えば、一実施態様では、細胞数が十分かどうかは、投与されるべき投与回数および/または投与毎の所望の細胞数に基づくことができる。細胞数が十分であると判定された場合、遠心分離による追加的な洗浄が、例えば、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中で実施されてもよい（515）。投与量が患者ＩＤラベル付冷結保存バイアル（容器）内に等分される（520）。一実施態様では、製造者の指示により使用されるCryostor CS5（登録商標）培地（例えば、BioLife Solutions製 １０mLバイアル、Part #205373）のような保護剤を含めても良い。多数（例えば、4つ）のより小さい追加バイアル、例えば、１バイアルあたり約１０６個の細胞/バイアルを含むバイアルが、品質管理、保持、等のためにメインバッチから準備される（525）。次に、投与量のロットは、液体窒素デュワー（容器）の蒸気相のような凍結環境に移送される（530）。細胞数が不十分である場合（510）、細胞の全部または一部は、より大きな細胞培養容器に再播種される（535）。次に、インスリン（例えば、０．０５〜０．２g/L）、亜セレン酸ナトリウム（例えば、０．００１〜０．０１０ng/L）、ビトロネクチン（例えば、２５〜１００ng/L）、L-ロイシン（例えば、０．１２〜１．２g/L）、L-アルギニン（例えば、０．３５〜２g/L）およびタウリン（例えば、１．０〜２．５g/L）で補足された培地（例えば、DMEM-F12、RPMI、Williams、ABstem）と、増殖因子（例えば、アクチビンＡを５ng/mlおよびbfgfを１０ng/mL）が添加され（540）、十分な程度のコンフルエント状態が達成されるまで増殖を行なう。
【００１８】
いくつかの実施形態では、投与量送達に先立って、1つまたは複数のＱＣ検査および/またはロットリリース手順が行われ得る。例えば、ＱＣバイアルを用いて、投与量の品質の判定を支援するための試験を行うことができる。一実施態様では、ロットリリースのためのＱＣ標準は、以下に挙げる1つまたは複数を含むことができる；生存率＞７５％（例えば、トリパンブルー染色によって測定される）；無菌性（例えば、ＵＳＰ７１無菌性試験によって測定される）；マイコプラズマ陰性試験結果（例えば、Sigma-Aldrichおよび/またはVenorGemマイコプラズマ検出キットで測定される）；エンドトキシン含量（例えば、ＵＳＢ８５エンドトキシン試験によって判定される）；表現型試験（phenotype testing）（例えば、＞５０％のLrg 5陽性細胞を同定するため）；など。
【００１９】
図６は、WAADSCの一実施形態における投与量送達論理フローの一例を示す。投与量を極低温貯蔵庫から取り出し、室温で解凍する （例えば、約１０分間）（601）。バイアルからの識別情報が患者と一致することを確認する（605）。バイアルの内容物を所定量（例えば、１０mL）の滅菌生理食塩水と共に無菌遠心分離管に移送する（610）。一実施態様では、滅菌生理食塩水は、ＵＳＰ（米国薬局方）および/または医療グレードの滅菌生理食塩水であり得る。次いで、遠心分離を例えば２５０Ｇで５分間行う（615）。次いで上清を除去し、より多くの滅菌生理食塩水（例えば、１０mL）を添加し、細胞ペレットを再懸濁させる（620）。その後、再び遠心分離が、例えば２５０Ｇで５分間、実施される（625）。上清を再び除去し、投与量を、患者に注入される最終的な滅菌生理食塩水の量（例えば、５mL）に再懸濁する（630）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、注入された生成物は、例えば、約７〜８％の脂肪間葉系幹細胞、約７〜８％の血液前駆体、および残部（約８５％）に線維芽細胞、筋細胞、血管内皮細胞および血液細胞の混合物を含む様々な形態の細胞の混合物を含む。いくつかの実施形態では、生成物は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、または種々の他の神経系疾患および機能不全のような神経変性疾患の治療用途として、患者の脳室に注入され得る。脳室に注入されると、神経型における間葉系幹細胞の分化および脳への組み込み、栄養性パラクリン効果およびニューロン新生の刺激、オートクリン効果、抗炎症性パラクリン効果などのいくつかの治療作用メカニズムが生じ得る。オートクリン効果、栄養性パラクリン効果、および/または抗炎症性パラクリン効果はまた、他の治療用途においても生じ得る。例えば、いくつかの実施形態では、生成物は、関節炎、腱炎、滑液包炎、および/または他の関節障害の治療のためなどとして、関節、靭帯、腱、滑液包（bursa）等に注入され得る。いくつかの実施形態では、生成物は、心臓疾患、心不全などの治療のために、静脈内および/または筋肉内に注入され得る。いくつかの実施形態では、生成物は、糖尿病および関連障害の治療のためなどとして、内分泌系、消化器系などの器官、例えば、膵臓などに注入され得る。いくつかの実施形態では、生成物は、COPD（慢性閉塞性肺疾患）および/または他の呼吸器障害の治療のためなどとして、吸入のために噴霧されおよび/または静脈内におよび/または呼吸系の組織に注入され得る。
【００２１】
図７は、SOX9発現（約５０％）およびLrg 5発現（９０％より大きい）をともなうWAADSC培養の一例を示す。
【００２２】
様々な問題に対処し技術を進歩させるために、WNT-活性化脂肪由来幹細胞装置、方法およびシステムに係るこの出願の全体 （カバーページ、タイトル、見出し、分野、背景、概要、図面の簡単な説明、発明の詳細な説明、特許請求の範囲、要約、図面、付属物、その他）は、特許請求の範囲に記載された発明を実施する様々な実施形態を例示的に示している。ここに述べた本出願の利点および特徴は、実施形態の代表的なサンプルに過ぎず、網羅的および/または排他的ではない。それらは、理解を助けるためにのみ提示され、特許請求される原理を教示している。これらは、特許請求の範囲に記載された発明のすべてを表すものではないことを理解されたい。このように、本開示のいくつかの態様は、本明細書では説明されていない。代替的な実施形態が本発明の特定の部分について提示されていないこと、あるいは、記載されていないさらなる代替の実施形態がある部分について取得可能であることは、これらの代替的な実施形態の放棄と見なされるべきではない。本発明と原理を同じくするもしくは同等の原理を有する多くの記述されない多くの実施形態が組み込まれても良いことを理解すべきである。したがって、他の実施形態が利用されてもよく、機能的、論理的、動作的、組織的、構造的、および/またはトポロジー的な変更が、本開示の範囲および/または精神から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。このように、全ての実施例および/または実施形態は、本開示全体にわたって非限定的であるとみなされる。また、本明細書で説明した実施形態に関して、スペースおよび繰り返しを減少させる目的のため以外では、本明細書で議論されていないものと比較して推論を行うべきではない。例えば、図面および/または全体にわたって記載された任意のプロセスステップおよび/または特徴セットの任意の組み合わせの論理的および/またはトポロジー的な構造は、固定された動作順序および/または配置に限定されず、むしろ、開示された順序は例示的であり、順序とは無関係に、全ての均等物が本開示により考慮されることが理解されるべきである。このように、これらの特徴のいくつかは、単一の実施形態において同時に存在することができないという点で、相互に矛盾していてもよい。同様に、いくつかの特徴は、本発明の一の態様に適用可能であって、他の実施態様には適用できない。さらに、本開示は、現在特許請求されていない他の発明を含んでいる。本願出願人は、そのような発明を請求すること、追加的な出願をすること、継続出願をすること、一部継続出願をすること、分割出願をすること、等の権利を含め、現在請求の範囲に記載されていない発明におけるすべての権利を留保している。このように、本開示の利点、実施形態、実施例、機能、特徴、論理的、動作的、組織的、構造的、トポロジー的及び／又はその他の態様は、特許請求の範囲に規定された開示に対する限定又は特許請求の範囲の均等物に対する限定とみなされるべきではない。
【００２３】
特許開示文書としての本出願は、様々な新規な革新を含む発明態様（以下、「開示」という）を記載し、著作権、マスクワーク、および/または他の知的財産保護の対象となる主題を含む。当該知的財産の各所有者は、公開された特許庁ファイル/記録に現れる限り、本開示を誰かがファクシミリ再生することに異議を唱えないが、それ以外では全ての権利を保有する。
【００２４】
この出願は、2018年9月19日に出願され「WNT-活性化脂肪由来幹細胞装置、方法およびシステム」と題する先の米国仮特許出願シリアル番号第62/733,427号 （米国代理人整理番号161867-7001（P002Z））の正式出願であり、上記米国仮特許出願に対する米国特許法１１９（ｅ）条のもとでの優先権を主張する。前述の出願の内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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