(57)【要約】  長い半減期を有する第ＶＩＩＩ因子を含む改善された凝固因子複合体に関連する方法および組成物が本明細書に開示される。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）凝固因子と、全長アルブミンまたはアルブミン断片に融合したフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ドメインを含む融合タンパク質と、アミノ酸リンカー、特に切断可能なアミノ酸リンカーと、を含む、凝固因子複合体が本明細書に開示される。【選択図】図１
2022501373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固因子複合体であって、
ａ．ａ．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）凝固因子またはＦＶＩＩＩ凝固因子断片もしくはその変異体と、
ｂ．ｂ．全長アルブミンまたはアルブミン断片もしくはその変異体、免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくはその変異体に融合した、フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む融合タンパク質と、を含む、凝固因子複合体。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、全長アルブミンまたはその断片もしくは変異体に結合されたフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項３】
前記アルブミンが、全長アルブミンである、請求項２に記載の凝固因子複合体。
【請求項４】
リンカーをさらに含む、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項５】
前記リンカーが、前記ＦＶＩＩＩ凝固因子またはその断片もしくは変異体と前記融合タンパク質との間にある、請求項４に記載の凝固因子複合体。
【請求項６】
前記リンカー中にクリックケミストリー部分を含む、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項７】
前記リンカー中にＰＥＧ部分を含む、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項８】
前記リンカー中に切断可能なアミノ酸部分をさらに含む、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項９】
前記アミノ酸リンカーが、トロンビン切断可能である、請求項８に記載の凝固因子複合体。
【請求項１０】
前記アミノ酸リンカーが、セリンおよびグリシンに富む、請求項８に記載の凝固因子複合体。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、アルブミンを含み、ＦＶＩＩＩ凝固因子またはその断片もしくは変異体と前記融合タンパク質との間の前記リンカーが、アルブミンのｃｙｓ３４を介して生じる、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項１２】
前記フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片と、前記アルブミンまたはアルブミン断片もしくはその変異体あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくはその変異体と、の間に１つ以上の切断可能なアミノ酸リンカーをさらに含む、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項１３】
前記リンカー中にクリックケミストリー部分、ＰＥＧ部分、および切断可能なアミノ酸部分を含む、請求項５に記載の凝固因子複合体。
【請求項１４】
前記アミノ酸リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ４）ｎリンカー、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ２）ｎリンカー、（ＧｌｙＳｅｒ５）ｎリンカー、（Ｇｌｙ）６リンカー、（Ｇｌｙ）８リンカー、
【化１】
2022501373.tif 000020
からなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５回の繰り返しを表す、請求項４に記載の凝固因子複合体。
【請求項１５】
前記Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔのｃｙｓ８８９、ｃｙｃ８９８、ｃｙｓ１０９９、およびｃｙｓ１１４２うちの１つ、２つ、３つ、または４つが、存在する場合、アラニンで置き換えられている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１６】
前記Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片が、セリン７６４からシステイン１０３１まで、セリン７６４からアスパラギン８６４まで（完全Ｄ’ドメイン）、セリン７６４からシステイン８６３まで、ロイシン７６５からシステイン８６３まで、ロイシン７６５からアスパラギン８６４まで、セリン７６６からシステイン８６３まで、セリン７６６からアスパラギン８６４まで、セリン７６４からアルギニン１０３５まで、セリン７６４からリジン１０３６まで、セリン７６４からセリン９００まで、セリン７６４からシステイン１０９９まで、セリン７６４からシステイン１１４２まで、セリン７６４からプロリン１１９７まで、およびセリン７６４からプロリン１２４０までからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１７】
前記Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片が、ＣＭ１１５である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凝固因子複合体。
【請求項１８】
前記融合タンパク質の前記Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片が、全長アルブミン、アルブミン断片もしくはその変異体、あるいは免疫グロブリンＦｃドメイン、またはＦｃ断片もしくはその変異体に共有結合により融合されている、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項１９】
前記ＦＶＩＩＩが、全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項２０】
前記ＦＶＩＩＩ断片が、Ｂ領域欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項２１】
前記ＦＶＩＩＩ凝固因子および前記融合タンパク質が、クリックケミストリーによって結合している、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項２２】
前記凝固因子複合体の半減期が、少なくとも４０時間より長い、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項２３】
前記凝固因子複合体の半減期が、少なくとも６０時間より長い、請求項１に記載の凝固因子複合体。
【請求項２４】
全長アルブミンまたはアルブミン断片もしくはその変異体、および／あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくは変異体に融合されたフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む、融合タンパク質。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が、全長アルブミンまたはアルブミン断片もしくは変異体に融合されたフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記融合が、共有結合である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記共有結合が、ペプチド結合である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、ＣＭ１１５である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、クリックケミストリー部分を含むリンカーを介してＦＶＩＩＩ凝固因子に共有結合している、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、切断可能なアミノ酸部分をさらに含むリンカーを介してＦＶＩＩＩ凝固因子に共有結合している、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
ＦＶＩＩＩと前記融合タンパク質との間の前記共有結合が、アルブミンのｃｙｓ３４を介して生じている、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
薬学的担体中の請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項３４】
ＦＶＩＩＩ凝固因子複合体を作製する方法であって、
ａ．ａ．フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を、全長アルブミン、アルブミン断片もしくはその変異体、あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくはその変異体に結合させて、融合タンパク質を形成すること、
ｂ．ｂ．前記ステップａ）の融合タンパク質を第ＦＶＩＩＩ因子凝固因子またはその断片もしくは変異体に結合させることを含み、ＦＶＩＩＩ凝固因子が、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片の受容体に結合し、それにより、凝固因子複合体が形成される、方法。
【請求項３５】
前記ＦＶＩＩＩ凝固因子および前記融合タンパク質が、クリックケミストリーによって結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質中で、フォン・ヴィレブランド因子の前記Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片が、全長アルブミン、アルブミン断片もしくはその変異体、あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片またはその誘導体に共有結合によって結合している、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＦＶＩＩＩ凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象を処置する方法であって、請求項１に記載の凝固因子複合体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
前記対象への前記凝固因子複合体の前記投与により、４０時間より長い前記凝固因子複合体の血中半減期が得られる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記凝固因子複合体が、注射により前記対象に投与される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記凝固因子複合体が、皮下注射により前記対象に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が、血友病Ａである、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／７３３，３７０号、および２０１９年３月２２日に出願された米国仮出願第６２／８２２，２１４号の利益を主張し、これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
血液凝固は、出血の事象において凝固のみが引き起こされるように、非常に複雑な一連のチェックおよびバランスによって制御される（Ｓｍｉｔｈ，Ｔｒａｖｅｒｓ，＆Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，２０１５）。傷害はこれらの酵素の活性化を引き起こし、反応の増幅カスケードをもたらし、これにより傷が塞ぐ。血友病は、これらのタンパク質の１つをコードする遺伝子の欠陥に起因しており、その結果、カスケードが早期に中止し、出血が続く。血友病の最も一般的な形態である血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病は、精製された因子濃縮物の注入、欠陥のある酵素の置き換え、および血液が凝固する能力を回復させることによって長い間処置されてきた。
【０００３】
因子の注入は非常に有効であり、小児期に死亡していた可能性のある罹患した個人が通常の平均寿命を有することが可能となる（Ｈｏｏｔｓ，２００３）。予防の使用を増加させることにより、すなわち、合理的なレベルの保護を維持するために定期的にスケジュールされた因子の注入により、これらの患者は本質的に正常な生活をすることができる（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これは、文字通りにも比喩的にも、費用をかけることなく実現できない。重度の血友病Ａを有する患者は、その疾患形態で欠いているタンパク質である第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の循環半減期が短いことに起因して、１日おきに因子を注入する必要がある。これにより、継続的な静脈アクセスおよびノンコンプライアンスなどの多くの問題が発生する。
【０００４】
別の非常に深刻な問題は、患者が注入されたＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を作るときに直面する（Ｋｅｍｐｔｏｎ＆Ｍｅｅｋｓ、２０１４年）。全血友病Ａ患者の約３０％は、治療中のある時点で抗体を作るが、約５％は、ＦＶＩＩＩ注入がもはや有効でなくなるほどの深刻な阻害剤の問題を引き起こす。これには、「バイパス」治療の使用が必要となる。第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は、凝固カスケードの開始物質の１つであり、プロセスにおけるＦＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）のいずれかの必要性を避けるために使用することができる。ＦＶＩＩａは、わずか２時間の循環半減期しか有さないため、これには、非常に高濃度のＦＶＩＩａおよび非常に頻繁な投与が必要となる。
【０００５】
これらおよび他の理由により、皮下で利用可能な半減期延長型因子（ＳＣＥＨＬ）が非常に望ましい（Ｐｉｐｅ，２０１０）。頻度が少ない皮下投与は、コンプライアンスを改善し、静脈アクセスの問題を解決し、患者をより少量の精製タンパク質に曝露し、おそらく阻害剤の形成を低減するはずである。
【０００６】
さらに、ＳＣＥＨＬタンパク質は、まだ処置を受けていない推定７０％の世界中の血友病患者に処置を拡大し得る。因子の費用は大きな問題であるが、血友病患者、特に小児に必要な複雑な医療サービスも同様である。因子は、単に皮下に注射されるのではなく、静脈内に注入される必要があるので、重度の疾患を有する小児は専門の血友病処置センターで最も頻繁に処置される。処置に対する明らかな障害は、彼らをセンターに週に数回送り届けなければならないことであり、特に発展途上国では、治療を手の届かないところ置くことになり得る。長期間持続し、皮下注射し得る因子は、これらの移動を低減するか、またはさらに排除し得る。
【０００７】
この問題は暫く前から認識されており、因子の半減期を延長するために多くの試みがなされた。治療用タンパク質の半減期を増加させるための２つの一般的な戦略がある。第１は、一般にＰＥＧ化と呼ばれるポリエチレングリコール鎖でタンパク質を修飾することである（Ｇｉｎｎ，Ｋｈａｌｉｌｉ，Ｌｅｖｅｒ，＆Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ，２０１４）。ＰＥＧ鎖は、タンパク質周囲の水和水を増加させ、特定の受容体および抗体に対する親和性を低減させる。第２の戦略は、標的タンパク質と免疫グロブリンのＦｃ部分またはヒト血清アルブミンのいずれかとの融合により胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）を利用することである（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。免疫グロブリンおよびアルブミンの両方は、ＦｃＲＮとの相互作用およびＦｃＲＮによる保護に起因して、長い循環半減期を有する。アルブミンまたは免疫グロブリンが様々な細胞中に取り込まれたとき、それらはＦｃＲＮに結合し、分解されずに表面にリサイクルされる。結果として、これらのタンパク質は両方とも数週間の半減期を有する。
【０００８】
これらの戦略は、血友病Ｂに関与するタンパク質であるヒト第ＩＸ因子の半減期を増加させるために成功裏に利用されている（Ｍａｎｎｕｃｃｉ＆Ｍａｎｃｕｓｏ，２０１４）。それらは、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することにあまり成功していない（Ｂｕｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＦＶＩＩＩ自体は、不安定なタンパク質であり、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の存在を必要とする。ｖＷＦがない場合のＦＶＩＩＩは、たった数分の半減期を有する。複合体の半減期はｖＷＦの半減期によって決定され、したがって、ＦＶＩＩＩに対する変更はわずかな影響しか与えず、半減期は１２時間から１８時間に増加する。
【０００９】
したがって、長い半減期の凝固複合体のための組成物および方法が必要とされている。他の改善の中でも、本発明は、フォン・ヴィレブランドの凝固因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ  ドメインが、並外れた半減期を有する改善された凝固因子複合体の作製に十分かつ有利であるという驚くべき発見を提供することによって、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１０】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）凝固因子と、全長アルブミンまたはアルブミン断片に融合したフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ドメインを含む融合タンパク質と、アミノ酸リンカー、特に切断可能なアミノ酸リンカーと、を含む、凝固因子複合体が本明細書に開示される。
【００１１】
他の改善の中でも、本発明は、フォン・ヴィレブランドの凝固因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔドメインが、並み外れた半減期を有する改善された凝固因子複合体の作製に十分かつ有利であるという驚くべき発見を提供する。したがって、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）凝固因子と、全長アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンＦｃドメイン、またはＦｃ断片に融合したフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む融合タンパク質と、を含む凝固因子複合体も開示される。いくつかの態様では、凝固因子複合体は、アミノ酸リンカーをさらに含むことができる。
【００１２】
凝固因子複合体を作製する方法であって、フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ドメインまたはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔを全長ヒトアルブミン、アルブミン断片もしくはその変異体、あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくはその変異体に導入して、融合タンパク質を形成することと、融合タンパク質を凝固因子ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）に導入することと、を含み、ＦＶＩＩＩがＤ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔの受容体に結合し、それにより、凝固因子複合体が形成される、方法も開示される。
【００１３】
本明細書に開示される凝固因子複合体を含むキットが開示される。
【００１４】
凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象を処置する方法であって、本明細書に開示される凝固因子複合体を対象に投与することを含む、方法も開示される。疾患は、例えば血友病であり得る。対象結果への凝固因子複合体の投与により、凝固因子単独の投与で得られる血中半減期よりも長い凝固因子複合体の血中半減期を得ることができる。凝固因子複合体は、注射（例えば、皮下注射）、吸入、鼻腔内、または経口により対象に投与することができる。
【００１５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】長い半減期の凝固第ＶＩＩＩ因子（変更された凝固因子を含む凝固因子複合体）の構築スキームを示す。
【図２−１】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２ＤＣＭ１１０の生成および精製を示す。図２Ａは、ＣＭ１１０がＥｘｐｉ２９３細胞の上清に蓄積することを示す。図２Ｂは、ＣＭ１１０が、ヒト血清アルブミンアフィニティーカラムを使用して細胞上清から精製されていることを示す。
【図２−２】図２Ｃは、精製からの画分のＳＤＳゲル分析を示す。Ｍ分子量マーカー、粗−細胞上清、フロー−アフィニティーカラムからのフロースルー、溶出液−ＣＭ１１０がアフィニティーカラムから２Ｍ  ＭｇＣｌ２で溶出した。図２Ｄは、ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００ゲル濾過カラムを通過したタンパク質を示す。
【図３−１】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、ＣＭ１１０およびＦＶＩＩＩの標識を示す。図３Ａは、ＣＭ１１０がＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ＰＥＧ１２−ＴＣＯで標識され、続いてフルオレセイニルテトラジンと反応し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動したことを示す。標準曲線に対して標識化合物の蛍光を測定することにより、ＣＭ１１０あたり１０分子のＮＨＳ−Ｐ１２−Ｔｅｔが得られた。
【図３−２】図３Ｂは、ＦＶＩＩＩがフルオレセイニルマレイミドで標識され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動したことを示す。標準曲線との比較により、ＦＶＩＩＩあたり１．４分子が得られた。図３Ｃは、標識されたＦＶＩＩＩのトロンビン処理を示す。ドメインＡ１およびＡ２は両方とも標識される。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＣＭ１１０およびＦＶＩＩＩの複合体であるＣＭ２１１の形成を示す。図４Ａは、ＣＭ２１１がＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムから約４３０，０００ダルトンの分子量で現れることを示す。図４Ｂは、ＣＭ２１１のＳＤＳゲル電気泳動を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、高塩濃度によって、ＣＭ２１１から遊離ＦＶＩＩＩが放出されないことを示す。図５Ａは、ＣＭ２１１を０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２で処理し、次いで、０．２５  Ｍ  ＣａＣｌ２を含む緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムで泳動したことを示す。ＦＶＩＩＩ活性はすべて、高分子量の範囲のままである。図５Ｂは、ＣＭ２１１を０．８Ｍ  ＮａＣｌで処理し、次いで、０．８Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムで実施したことを示す。ＦＶＩＩＩ活性はすべて、高分子量の範囲のままである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＭ２１１は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中の活性化部分トロンボプラスチン時間を修正する。図６Ａは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中のＦＶＩＩＩを示す。図６Ｂは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中のＣＭ２１１を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、トロンビン生成試験におけるＣＭ２１１。図７Ａは、ＣＭ２１１がＦＶＩＩＩと同量のトロンビンを生成することを示す。図７Ｂは、トロンビン生成試験において、ＣＭ２１１がＦＶＩＩＩと同じ曲線下面積（ＡＵＣ）を有することを示す。ＦＶＩＩＩ対照は、３，２４６の曲線下面積を有する２０９ｎＭトロンビンを生成した。
【図８】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃはマウスの研究を示す。図８Ａは、９２時間のＣＭ１１０半減期の測定を示す。図８Ｂは、５５時間のＣＭ２１１半減期の測定を示す。図８Ｃは、ＣＭ２１１の皮下利用可能性試験を示す。
【図９】図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、ｖＷＦのＤ’断片のみを含むＣＭ１１０ｓｈｏｒｔの生成および精製を示す。図９Ａは、１）分子量マーカー、２）対照Ｅｘｐｉ２９３細胞由来の上清、３）ｐＣＭ１１０ｓｈｏｒｔＤ’でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞の上清、および４）アルブミンアフィニティーカラムから溶出され、かつ、抗アルブミン抗体でプロービングされたタンパク質のＳＤＳゲル電気泳動を示す。図９Ｂは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅサイズ排除カラムでの、アフィニティーカラムから溶出したタンパク質のクロマトグラフィーを示す。図９Ｃは、Ｄ’のみを含む精製ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔのＳＤＳゲル電気泳動を示す。
【図１０】トロンビンによる処理後のＣＭ２１１の様々な成分の放出の概略図。
【図１１】遊離アルブミンおよびＤ’の放出を示す、Ｄ’のみを含むＣＭ１１０ｓｈｏｒｔのトロンビンによる切断。
【図１２】Ｄ’のみを含むＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ中に単一の遊離スルフヒドリルのみが存在することの実証。パネル１２Ａ：Ｄ’のみを含むＣＭ１１０ｓｈｏｒｔへのフルオレセインマレイミドの取り込みの測定、およびこのＣＭ１１０ｓｈｏｒｔあたり１つのフルオレセインを実証するための計算。パネル１２Ｂ：標識がアルブミン断片で留まっていることを示す、Ｄ’のみを含む蛍光標識されたＣＭ１１０ｓｈｏｒｔをトロンビンによる処理。
【図１３】クリックケミストリーを使用して切断可能なトロンビンペプチドを化学リンカーに組み込む、ＣＭ２１１ｓの構築スキーム。
【図１４】すべてのＦＶＩＩＩ活性が複合体の形成に伴って高分子量に移動することを示す、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＩｎｃｒｅａｓｅでのＣＭ２１１ｓのクロマトグラフィー。
【図１５】標識および非標識ＣＭ１１５のＳＤＳアクリルアミドゲル。パネル１５Ａ。タンパク質のゲル染色。第１列：分子量マーカー、第２列：ブランク、第３列：ＣＭ１１５、第４列：トロンビンで処理されたＣＭ１１５、第６列：ヒトアルブミン。パネル１５Ｂ。蛍光標識Ａｌｅｘａ４８８を示す同じゲル。第１列：分子量マーカー、第２列：ブランク、第３列：ＣＭ１１５、第４列：トロンビンで処理されたＣＭ１１５、第６列：ヒトアルブミン。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載の材料、組成物、および方法は、本明細書に含まれる開示された主題の特定の態様の以下の詳細な説明ならびに実施例および図を参照することによって、より容易に理解することができる。
【００１８】
本材料、組成物、および方法が開示および記載される前に、以下に記載される態様は、特定の合成方法または特定の試薬に限定されず、したがって、当然に変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は特定の態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されるべきである。
【００１９】
また、本明細書を通して、様々な刊行物が参照されている。開示された事項が関連する技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示内容全体が参照により本出願に組み込まれる。開示された参考文献はまた、その参考文献が依拠している文中で論じられている、その中に含まれる材料について、参照により個別かつ具体的に本明細書に組み込まれる。
【００２０】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義される幾つかの用語に言及する。
【００２１】
明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの他の形態の単語は、例えば、他の添加剤、成分、またはステップを含むがこれらに限定せず、それらを除外することを意図しないことを意味する。
【００２２】
説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「酵素」についての言及は、２つ以上のそのような酵素の混合物を含み、「プロバイオティクス」についての言及は、２つ以上のそのようなプロバイオティクスの混合物などを含む。
【００２３】
「任意選択の」または「任意選択に」とは、後で説明する事象または状況が発生し得る、または発生し得ないことを意味し、該説明には、事象または状況が発生する場合および発生しない場合が含まれる。
【００２４】
本明細書では、範囲は、「約」を用いた一方の特定の値から、および／または「約」を用いた他方の特定の値までを表すことができる。「約」とは、記載される値の５％以内を意味する。そのような範囲が表される場合、別の実施形態には、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までが含まれる。同様に、先行する「約」を使用することにより値が近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を成すことが理解されよう。さらに、各範囲の端点は、他の端点と関連している場合も、他の端点とは独立している場合でも、有意であることが理解されるであろう。また、本明細書に開示される多くの値があり、各値はまた、その値自体に加えて、「約」を用いたその特定の値としても本明細書に開示されていることが理解される。例えば、「５」という値が開示されていれば、「約５」も開示されている。
【００２５】
ポリペプチドの断片または変異体およびそれらの任意の組み合わせが本明細書に開示される。タンパク質はポリペプチドである。ポリペプチドの「断片」には、本明細書の他の箇所で論じられる特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が含まれるが、天然に存在する全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まれない。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の「変異体」には、参照配列または天然に存在する配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むポリペプチドが含まれる。天然に存在しない変異体は、当該技術分野で既知である変異誘発技術を使用して生成することができる。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。本発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子について言及する場合の任意の「断片」または「変異体」には、凝固因子複合体中のＦＶＩＩＩの半減期の延長が得られるように、参照ポリペプチドの特性のうちの少なくともいくつか（例えば、ＦＶＩＩＩ変異体もしくは断片の凝固活性、またはｖＷＦ断片に対するＦＶＩＩＩ結合活性、またはアルブミン断片によるリサイクル活性）を保持する任意のポリペプチドが含まれることが理解され、本明細書で企図される。
【００２６】
本明細書で「ＦＶＩＩＩ」とも称される「第ＶＩＩＩ因子」は、止血に関与する血中糖タンパク質である。したがって、第ＶＩＩＩ因子は凝固因子である。天然に存在するヒトＦＶＩＩＩは、２，３５１個のアミノ酸を含み、該アミノ酸は、分子量が１７０，０００〜２８０，０００ダルトンの範囲の複数の形態へとプロセシングされる。２，０００超の既知の変異がある。このような変異は、ＦＶＩＩＩの変異体の例を提供する。これらは、血漿から精製するか、または組換えＤＮＡ技術によって生成されてもよい。ＦＶＩＩＩは、本明細書に示されるか、または当該技術分野で既知であるように、全長型またはＢ領域欠失型の単鎖または他の変形物であり得る（Ｌｉｅｕｗ，Ｊ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７：８，６７−７３（ＦＶＩＩＩに関する教示のために、その全体が参照により組み込まれる）。
【表１】
2022501373.tif 000003
【００２７】
したがって、一態様では、ＦＶＩＩＩの凝固活性を保持する「第ＶＩＩＩ因子凝固因子断片」および「第ＶＩＩＩ因子凝固因子変異体」が本明細書に開示される。本明細書で使用される場合、「ＦＶＩＩＩ凝固因子断片」は、全長ＦＶＩＩＩ配列と比較して切断されたアミノ酸配列を含むＦＶＩＩＩを指す。ＦＶＩＩＩ凝固因子断片には、本明細書の他の箇所で論じられる特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が含まれるが、天然に存在する全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）を含まない。「ＦＶＩＩＩ凝固因子変異体」は、参照配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、天然に存在する全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）またはその断片を含むＦＶＩＩＩポリペプチドを指す。
【００２８】
本明細書で使用される「アルブミン断片」という用語は、本明細書に記載されるように、融合タンパク質および凝固因子複合体の半減期を延長する能力を保持しながら、全長未満のアルブミンを含む任意のアルブミンポリペプチドを意味する（例えば、翻訳されたタンパク質のアルブミンのアミノ酸残基２５〜６０９を含む配列番号８の断片およびシグナル配列を構成するアミノ酸１〜２４が、翻訳中に切断される）。開示されたアルブミンおよびアルブミン断片は、アルブミン中の遊離スルフヒドリルであるシステイン３４を含むことができる。
【００２９】
「アルブミン変異体」という用語は、融合タンパク質の半減期を延長する能力を保持する、配列番号８に関連する１つ以上の挿入、置換、または欠失を含む、全長アルブミンおよびその断片を含む任意のアルブミンポリペプチドを指す。
【００３０】
置換に起因して任意の遊離システインを欠いているかまたは遊離システインが存在しないかのいずれかであるＤ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔと対形成した場合、アルブミンのシステイン３４は唯一の遊離スルフヒドリルであり得る。アルブミン断片および変異体は当業者に既知である。例えば、Ｏｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２００９），Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ，Ｂｕｌｌ．３２（４），５２７−５３４は、７７個のアルブミン変異体が既知であり、これらのうちの２５個がドメインＩＩＩにおいて変異があることを開示している。カルボキシ末端におけるＣ末端の１７５個のアミノ酸を欠いている天然断片は半減期が短いことが示されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，３６７−３７２）。Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）は、マウスモデルを使用して天然に存在するヒトアルブミン断片および変異体の半減期を研究し、Ｋ５４１ＥおよびＫ５６０Ｅが低減した半減期を有し、Ｅ５０１ＫおよびＥ５７０Ｋが増加した半減期を有し、Ｋ５７３Ｅが半減期にほとんど影響を与えないことを見出した（Ｉｗａｏ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｂ．Ｂ．Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １７７４，１５８２−１５９０）。Ｇａｌｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２５，２７−３２は、天然変異体Ｅ５０５Ｋを開示している。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）は、天然変異体Ｋ５３６Ｅを開示している。Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１６，４１１−４１８は、天然変異体Ｋ５７４Ｎを開示している。Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，４４１３−４４１７は、天然変異体Ｄ５５０Ｇを開示している。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，８２２５−８２２９は、天然変異体Ｄ５５０Ａを開示している。アルブミン断片および変異体に関する教示のために、これらはすべて、その全体が参照により組み込まれる。
【００３１】
本明細書では「ｖＷＦ」とも称される「フォン・ヴィレブランド因子」は、止血に関与する血中糖タンパク質である。基本的な全長ｖＷＦモノマーは、２０５０個のアミノ酸のタンパク質である。すべてのモノマーは、第ＶＩＩＩ因子（フォン・ヴィレブランド因子Ｄ型ドメイン）に結合し、残基７６４〜１２７０（配列番号３に記載）を含むＤ’Ｄ３ドメイン、血小板およびヘパリンの結合に関与するＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、コラーゲンに結合するＡ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびシスチンノットドメインを含む、特定の機能を有する多くの特定のドメインを含む。
【００３２】
本明細書で使用される「内因性ｖＷＦ」という用語は、血漿中に天然に存在するｖＷＦ分子を示す。内因性ｖＷＦ分子は、多量体であり得るが、単量体または二量体でもあり得る。血漿中の内因性ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩに結合し、ＦＶＩＩＩと非共有結合複合体を形成する。
【００３３】
本明細書で使用される「ｖＷＦ断片（ｖＷＦ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ｖＷＦ断片（ｖＷＦ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」または「ｖＷＦ変異体（ｖＷＦ  ｖａｒｉａｎｔ）またはＶＷＦ変異体（ＶＷＦ  ｖａｒｉａｎｔｓ）」という用語は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、ＦＶＩＩＩの半減期を延長する能力を保持する、任意のｖＷＦ断片または変異体を意味する。ｖＷＦ断片または変異体は、全長ｖＷＦによってＦＶＩＩＩに通常提供される少なくとも１つ以上の特性、例えば、ＦＶＩＩＩａへの早期活性化の防止、阻害、および／もしくは低減、早期タンパク質分解の防止、阻害、および／もしくは低減、早期除去をもたらし得るリン脂質膜との会合の防止、阻害、および／もしくは低減、裸の（ｎａｋｅｄ）ＦＶＩＩＩに結合することができるがｖＷＦ結合ＦＶＩＩＩには結合することができないＦＶＩＩＩ除去受容体への結合の防止、阻害、および／もしくは低減、ならびに／またはＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖との相互作用を保持することができる。本明細書で使用される「ｖＷＦ断片」という用語には、全長または成熟ｖＷＦタンパク質が含まれない。特定の実施形態では、本明細書で使用される「ｖＷＦ断片」には、ＶＷＦタンパク質のＤ’ドメインおよびＤ３ドメインが含まれるが、ｖＷＦタンパク質のＡｌドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、ＣＩドメイン、Ｃ２ドメイン、およびＣＫドメインは含まれない。すなわち、ｖＷＦ断片は、セリン７６４からフェニルアラニン１２７０までのすべての残基を含むが、これらに限定されない、ｖＷＦのセリン７６４からフェニルアラニン１２７０までの任意の残基を含むことができる。ｖＷＦ断片は、本明細書で「Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ」と称される、ｖＷＦ断片が全長Ｄ’Ｄ３ドメイン未満（すなわち、セリン７６４からフェニルアラニン１２７０未満）を含む実施形態が存在することが理解され、本明細書で企図される。特定の一実施形態では、本明細書で使用される「ｖＷＦ断片」には、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔが含まれる。本明細書に開示される開示のＤ’Ｄ３、Ｄ’、またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片は、ＦＶＩＩＩに結合してＦＶＩＩＩの半減期を延長する能力を保持するＤ’Ｄ３、Ｄ’、またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔアミノ酸配列の変異体（すなわち、アミノ酸置換、欠失、または挿入）をさらに含むことができることが本明細書で企図される。
【００３４】
上記のように、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、ｖＷＦのセリン７６４からフェニルアラニン１２７０までのＤ’Ｄ３配列（配列番号３）全体未満のＤ’Ｄ３配列の任意の部分を含むか、またはそれからなり得る。したがって、特定の一実施形態では、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔには、完全なＤ３ドメイン（配列番号５）は含まれない。あるいは、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、Ｄ３ドメインの任意の部分（例えば、配列番号４に記載のＤ’のみ）を含まず、ｖＷＦタンパク質のＡｌドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂｌドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、ＣＩドメイン、Ｃ２ドメイン、およびＣＫドメインも含まない。すなわち、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、ＦＶＩＩＩに結合し、完全Ｄ’Ｄ３未満であるが、特にインビボでＦＶＩＩＩ半減期を延長する能力を保持する限り、システイン８６３を含むＤ’ドメインの少なくとも９７個の連続するアミノ酸、およびその変異体を含むことができる。Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔドメインの例には、セリン７６４からシステイン１０３１まで、セリン７６４からアスパラギン８６４まで（配列番号４に記載される完全Ｄ’ドメイン）セリン７６４からシステイン８６３まで、ロイシン７６５からシステイン８６３まで、ロイシン７６５からアスパラギン８６４まで、セリン７６６からシステイン８６３まで、セリン７６６からアスパラギン８６４まで、セリン７６４からアルギニン１０３５まで、セリン７６４からリジン１０３６まで、セリン７６４からセリン９００まで、セリン７６４からシステイン１０９９まで、セリン７６４からシステイン１１４２まで、セリン７６４からプロリン１１９７まで、およびセリン７６４からプロリン１２４０までが含まれ得るが、これらに限定されない。他のｖＷＦ断片および変異体は、当業者に既知であり、本明細書に開示されている。
【００３５】
Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、典型的には、非共有結合によりＦＶＩＩＩに結合するが、本明細書に開示されるリンカーを介して切断可能な共有結合によってＦＶＩＩＩに直接結合することもできることが理解および企図される。
【００３６】
ｖＷＦのＤ’Ｄ３領域は、多数のジスルフィド架橋、およびＤ３ドメインに存在し、かつ、Ｄ’ドメイン（セリン７６４からアスパラギン８６４まで）に存在しない、７つの不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）システインを有することが理解され、本明細書で企図される。残基８８９および８９８のシステインは、合成および分泌に重要であると当該技術分野で理解されている。残基１０９９および１１４２のシステインは、二量体化に重要である。残基１２２２、１２２５、および１２２７にある残りの３つの不対システインは、鎖中の他のシステインと可変的に対形成している。不対システインの数は、複数の遊離スルフヒドリルが存在することを意味する。１つ以上のＤ’Ｄ３システインをアラニンまたはこれらのシステインを有しないＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ構築物で置き換えることにより、この問題を改善または解消し、アルブミンのｃｙｓ３４に対応するシステインを唯一の遊離スルフヒドリルとして残存させることができる。
【００３７】
したがって、不対システイン（すなわち、残基８８９、８９８、１０９９、１１４２、１２２２、１２２５、および／または１２２７におけるシステイン）が除去されているか、またはＤ’Ｄ３もしくはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片の必要に応じて、アラニンの代わりに置換されているＤ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片は、残基８８９、８９８、１０９９、１１４２、１２２２、１２２５、または１２２７のいずれも含まず、したがって、利用可能な遊離スルフヒドリルを有していない。このことは、アルブミンまたはアルブミン断片と対形成したときに、唯一利用可能なスルフヒドリルが、ｃｙｓ３４に対応するアルブミン断片中にあることを意味する。このような構築物は、高度に均質な生成物の利点を有し、リンカー、標識、またはタグを付加するための単一の部位を提供する。
【００３８】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、天然では結合されていない第２のアミノ酸配列に結合された、第１のアミノ酸配列を含むことができる。一実施形態では、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、一例では、アルブミン、アルブミン断片、Ｆｃドメイン、またはＦｃ断片への、フォン・ヴィレブランド因子断片、例えば、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔの融合を指す。この融合は、例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合などの別の種類の共有結合を生成する遺伝子構築物により達成することができる。
【００３９】
「修飾分子」が本明細書に開示される。修飾分子は、凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の凝固増強活性を保持しながら融合タンパク質と相互作用し得るように凝固因子を修飾することができる任意の分子である。例えば、ＦＶＩＩＩはポリエチレングリコール鎖で修飾し、脂肪酸でキャッピングすることができる。修飾分子の様々な例が本明細書で論じられている。
【００４０】
「修飾凝固因子」は、十分な凝固活性を保持しながら融合タンパク質と相互作用することができるように修飾分子によって修飾された凝固因子を指す。修飾凝固因子はまた、本明細書では誘導体化ＦＶＩＩＩと称することができる。修飾凝固因子は、例えば、アルブミンが、修飾ＦＶＩＩＩに結合された脂肪酸に結合にするか、または架橋剤を使用して共有結合して、修飾凝固因子複合体、例えば、本発明の第ＶＩＩＩ因子複合体を形成することができる形式で、適切なサイズのリンカーによってヒトアルブミンに結合されたＤ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔの融合タンパク質に結合することができる。修飾凝固因子はまた、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔを含む融合タンパク質に結合できるように、新しい追加のコード配列をＦｃ配列などのＦＶＩＩＩコード配列に追加することによるなど、遺伝子修飾因子を含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。
【００４２】
半減期は、対象に投与された量の半分が動物での循環および／または他の組織から除去されるのに必要な時間によって表されてもよい。
【００４３】
本明細書で使用される「半減期制限因子」または「ＦＶＩＩＩ半減期制限因子」という用語は、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が野生型ＦＶＩＩＩと比較して１．５倍または２倍より長くなるのを妨げる因子を示す。例えば、全長または成熟ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦ複合体が１つ以上のｖＷＦ除去経路によってシステムから除去されるように誘導することにより、ＦＶＩＩＩ半減期制限要因として機能し得る。一例では、内因性ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩ半減期制限要因である。別の例では、ＦＶＩＩＩタンパク質に非共有結合した全長組換えｖＷＦ分子は、ＦＶＩＩＩ半減期制限因子であり得る。
【００４４】
本明細書で使用される「相互作用する」または「結合される」という用語は、一実施形態では、共有結合または非共有結合を指す。「共有結合された」または「共有結合」という用語は、例えば、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、または１つ以上のアミノ酸を指す。別の実施形態では、「相互作用する」または「結合される」とは、本明細書に開示されるタンパク質またはタンパク質断片が、典型的には共有結合により、互いに結合される２つのタンパク質またはタンパク質断片間、例えば、ＦＶＩＩＩとアルブミンとの間、および／またはＤ’Ｄ３もしくはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔとアルブミンとの間のリンカーによって接続されることを意味する。第１のアミノ酸は、第２のアミノ酸に直接結合または並置することができ、あるいは、介在配列は、第１の配列を第２の配列に共有結合させることができる。「結合された」という用語は、Ｃ末端またはＮ末端における第１のアミノ酸配列の第２のアミノ酸配列への融合を意味することができるだけでなく、第１のアミノ酸配列全体（または第２のアミノ酸配列）の第２のアミノ酸配列（または、それぞれ、第１のアミノ酸配列）中の任意の２つのアミノ酸への挿入も含む。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に結合することができる。本明細書で使用される場合、リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド、または任意の化学部分、例えば、ジスルフィド結合またはクリックケミストリー結合であり得る。リンカーがペプチドまたはポリペプチドである場合、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ４）ｎリンカー、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ２）ｎリンカー、（ＧｌｙＳｅｒ５）ｎリンカー、（Ｇｌｙ）６リンカー、（Ｇｌｙ）８リンカー、
【化１】
2022501373.tif 000004
（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または任意の数の繰り返しを表す）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知である任意の好適なペプチドまたはポリペプチドリンカーであり得る。さらに、本明細書では、リンカーはトロンビンによって切断可能であり得、例えば、リンカーは、ＬＴＰＲＧＶＲＬ（配列番号９）などのトロンビン切断配列を含み得ることが企図される。これらのトロンビン部位の一方または両方はまた、第Ｘａ因子切断部位で置換され、ＬＴＰＲＧＶＲＬに代えて、配列ＩＤＧＲまたはＩＥＧＲ（配列番号１０）を用いることができる。
【００４５】
本明細書に開示される凝固因子複合体は、予防的に使用することができる。本明細書で使用される場合、「予防的処置」という用語は、出血症状の前に、または出血症状を予防、抑制、または低減するための通常の活動中に一貫して、分子を投与することを指す。一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または受けようとしているところである。凝固因子複合体は、予防として手術の前または後に投与することができる。凝固因子複合体は、急性出血症状を制御するために、手術中または手術後に投与することができる。手術には、肝移植、肝切除、歯科処置、または幹細胞移植が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の凝固因子複合体はまた、オンデマンド（「発症時（ｅｐｉｓｏｄｉｃ）」とも称される）処置に使用することができる。「オンデマンド処置」または「発症時処置」という用語は、出血症状の症状に反応して、または出血を引き起こし得る活動の前に、キメラ分子を投与することを指す。一態様では、オンデマンド（発症時）処置は、損傷後などの出血が始まるとき、または手術前などの出血が予想されるときに対象に与えることができる。別の態様では、オンデマンド処置は、コンタクトスポーツなどの出血のリスクを高める活動の前に行うことができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「急性出血」という用語は、根本的な原因に関係なく、出血症状を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠乏症）、血小板障害、または凝固因子に対する抗体の作成に起因する抵抗性を有し得る。
【００４８】
本明細書で使用される処置する（ｔｒｅａｔ）、処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）は、例えば、疾患もしくは状態の重症度の低減、疾患の経過期間の低減、疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状の改善、必ずしも疾患もしくは状態を治癒することなく、疾患もしくは状態を有する対象に有益な効果を提供すること、または疾患もしくは状態に関連する１つ以上の症状の予防を指す。
【００４９】
一実施形態では、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本発明の凝固因子複合体を投与することによって、対象におけるＦＶＩＩＩトラフレベルを少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄＬで維持することを意味する。別の実施形態では、処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、ＦＶＩＩＩトラフレベルを約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬ、または約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬで維持することを意味する。疾患または状態の処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）はまた、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病患者におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％に匹敵するレベルに維持することを含むことができる。処置に必要な最小トラフレベルは、１つ以上の既知の方法で測定することでき、各人について調整（増加または減少）することができる。
【００５０】
凝固因子複合体
ヒトアルブミンは、本明細書に記載の融合タンパク質の構築に有用な一連の特性を有する。これは、胎児性Ｆｃ受容体に結合することによって融合タンパク質の半減期を延長する能力があり、脂肪酸およびビリルビンを含む多くの小分子に結合する。さらに、ヒトアルブミンは、様々なリガンドを結合するために利用することができる単一の露出したスルフヒドリル基を有する。本明細書で利用されるように、これらの特性は、皮下的に利用可能なＦＶＩＩＩの延長された半減期の構築を可能にする。本明細書に開示される凝固因子複合体は、凝固因子または修飾凝固因子と、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンＦｃ領域、またはＦｃ断片に融合された第１のタンパク質を含む融合タンパク質と、修飾分子と、を含み、該修飾分子は、融合タンパク質による結合が可能になり、それにより、修飾凝固因子が作られる形式で、凝固因子に結合し、修飾凝固因子および融合タンパク質は、少なくとも２つの独立した部位で、例えば、修飾凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩと融合タンパク質のアルブミンとの間の共有結合クリックケミストリー結合部位、および融合タンパク質のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔとＦＶＩＩＩとの間の第２の非共有相互作用部位で相互作用する。修飾分子はまた、融合タンパク質の凝固因子への結合を可能にするか、または凝固因子と融合タンパク質との間の化学反応を引き起こす形式で、融合タンパク質に結合することができる。凝固因子および修飾分子の組み合わせは、本明細書では、修飾凝固因子、例えば、修飾第ＶＩＩＩ因子と称し得る。
【００５１】
特定の実施形態では、全長アルブミンまたはアルブミン断片もしくはその変異体、および／あるいは免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ断片もしくは変異体に融合された、フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含む融合タンパク質が本明細書に開示される。融合タンパク質は、全長アルブミンまたはアルブミン断片もしくは変異体に融合されたフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含むことができる。融合は、共有結合、例えば、ペプチド結合であり得る。融合タンパク質は、クリックケミストリー部分を含むリンカーを介してＦＶＩＩＩ凝固因子に共有結合させることができる。上記の融合タンパク質は、薬学的担体中に含めることができる。融合タンパク質は、血友病Ａを処置するために使用することができる。融合タンパク質はまた、切断可能なアミノ酸をさらに含むリンカーを介してＦＶＩＩＩ凝固因子に共有結合させることができる。ＦＶＩＩＩと融合タンパク質との間の共有結合は、アルブミンのｃｙｓ３４を介して生じさせることができる。
【００５２】
本明細書で「ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔまたはＣＭ１１０ｓ」と称される特定の融合タンパク質が本明細書で開示される。ＣＭ１１０は、本明細書に開示されるヒトフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ドメインまたはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片のいずれかを含む。Ｃｍ１１０は、リンカー（例えば、配列番号７に記載の５６アミノ酸のグリシンセリンに富むリンカーなど）
と、全長ヒトアルブミン、アルブミン変異体もしくはその断片、ならびに／あるいは免疫グロブリンＦｃドメイン、またはＦｃ変異体またはその断片と、を含む。
【００５３】
リンカーの長さは、例えば、１０アミノ酸〜１００アミノ酸の範囲であり得、したがって、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸長であり得る。リンカーの例には、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ４）ｎリンカー、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ２）ｎリンカー、（ＧｌｙＳｅｒ５）ｎリンカー、（Ｇｌｙ）６リンカー、（Ｇｌｙ）８リンカー、
【化２】
2022501373.tif 000005
であり、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５回の繰り返しを表す。
【００５４】
Ｄ’Ｄ３およびＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含むＣＭ１１０を区別するために、ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔは、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片を含むＣＭ１１０ｓを指すために使用される。ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ（ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ７６４〜８６３ＬＷＡ）の特定の一例は、配列番号６に記載され、これは、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２、セリン７６４からシステイン８６３を含むＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ、５６アミノ酸リンカー（配列番号７）、ヒトアルブミンのアミノ酸２５〜６０９（配列番号８に記載）を含む。実施例に示されるように、ＣＭ１１０またはＣＭ１１０ｓは、６Ｘ  ｈｉｓタグを有するかまたは有さずに、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２および７６４〜１２４７を含むプラスミドｐＣＭ１１０もしくはｐＣＭ１１０ｓまたはアミノ酸１〜２２および７６４〜８６３を含むｐＣＭ１１０ｓｈｏｒｔと、５６アミノ酸リンカーと、ヒトアルブミンのアミノ酸２５〜６０９と、から形成することができる。凝固因子複合体ＣＭ２１１もまた、本明細書に開示される。ＣＭ２１１は、ＣＭ１１０、ＣＭ１１０ｓ（Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔを有する）、例えば、セリン７６４からシステイン１０３１まで、セリン７６４からアスパラギン８６４まで（配列番号４に記載の完全Ｄ’ドメイン）、セリン７６４からシステイン８６３まで、ロイシン７６５からシステイン８６３まで、レスシン７６５からアスパラギン８６４まで、セリン７６６からシステイン８６３まで、セリン７６６からアスパラギン８６４まで、セリン７６４からアルギニン１０３５まで、セリン７６４からリジン１０３６まで、セリン７６４からセリン９００まで、セリン７６４からシステイン１０９９まで、セリン７６４からシステイン１１４２まで、およびセリンからプロリン１２４０まで、ならびにＦＶＩＩＩを含む。ＣＭ２１１がＣＭ１１０ｓから構成される場合、ＣＭ２１１はＣＭ２１１ｓｈｏｒｔまたはＣＭ２１１ｓと称し得る。本発明のＣＭ２１１ｓは、本明細書に示されるクリックケミストリーにより形成することができる。実施例に記載されるように、高タンパク質濃度は、分子の効率的なライゲーションを助けることができる。
【００５５】
凝固因子
ｖＷＦは、非常に大きな分子であり、これらの大きな分子の大きな多量体複合体として循環する（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，＆Ｄｅｎｉｓ，２０１５）。これは非常に大きいので、マクロファージに取り込まれ、粒子として消化される。ＦＶＩＩＩを保護するＤ’Ｄ３と呼ばれるｖＷＦのより小さな断片を工学的操作する試みは成功しており、この断片をＦｃ領域に融合することによって、その半減期が劇的に増加する。（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００５６】
ｖＷＦおよびＦＶＩＩＩの結合定数は、約０．３ｎＭである（Ｏｒｌｏｖａ，Ｋｏｖｎｉｒ，Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，Ｇａｂｉｂｏｖ，＆Ｖｏｒｏｂｉｅｖ，２０１３）。Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．によって作られたＤ’Ｄ３−Ｆｃ融合の測定された結合定数は、１．５ｎＭである。内因性ＦＶＩＩＩは、ｖＷＦに堅固に結合するが可逆的に結合するため、溶液中には常に約１〜２パーセントの遊離ＦＶＩＩＩが存在している。マウスおよびヒトの両方で、ｖＷＦはＦＶＩＩＩよりも約５０倍高い濃度で存在する。ｖＷＦの低い結合定数と非常に高い濃度との間で、ＦＶＩＩＩは、Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２４，４４５−４４２，（２０１４）に示されるＤ’Ｄ３−Ｆｃ融合から離れて迅速に競合することができる。
【００５７】
これらの問題の１つの解決策は、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔをアルブミンまたは免疫グロブリンＦｃドメイン（またはアルブミンまたはＦｃドメインの任意の半減期延長断片または変異体）に融合させ、それにより、本明細書で言及される「融合タンパク質」を作製することによって見出される。アルブミンは、血中に最も豊富にあるタンパク質である（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９５）。循環中のその１９日の半減期は、本明細書に記載されるように、ＦｃＲＮに結合する能力によって決定されるそれは２つの主要な役割を果たす。１つ目は血液の浸透圧を維持することであり、２つ目は疎水性分子を輸送することである。
【００５８】
アルブミンは、脂肪酸の主要な輸送体である。例えば、インスリンの半減期を増加させるために成功裏に使用されている戦略は、インスリンを１４炭素脂肪酸であるミリスチン酸にコンジュゲートさせることである。この分子は、インスリンデテミルと呼ばれる（Ｐｈｉｌｉｐｓ＆Ｓｃｈｅｅｎ，２００６）。注入されたとき、脂肪酸はアルブミンに素早く結合し、インスリンの半減期を４分から５時間に増加させる。
【００５９】
免疫グロブリンは、ＦｃＲＮへの結合によっても媒介される半減期の延長を有することができる。アルブミンおよびＦｃ領域は、ＦｃＲＮ上の別々の部位に結合する。
【００６０】
これらの２つの概念の組み合わせは、長い既存の半減期の問題を解決し、非常に必要な解決策を提供するために、新しい分子で本明細書に開示される（図１）。例えば、最初に、ＦＶＩＩＩは、例えば、ポリエチレングリコール鎖で修飾され、脂肪酸によってキャッピングすることができる。本明細書で言及される「修飾分子」のこの例は、「修飾凝固因子」の例を作り出す。したがって、一実施形態では、修飾凝固因子を作製するために、脂肪酸がＦＶＩＩＩ分子から突き出している。修飾凝固因子はまた、本明細書では誘導体化ＦＶＩＩＩまたはＦ８Ｆと称することができる。次いで、アルブミンが修飾ＦＶＩＩＩに結合された脂肪酸に結合して、本発明の修飾凝固因子複合体、例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子複合体を形成することができる形式で、修飾凝固因子は、適切なサイズのリンカーによってヒトアルブミンに結合されたＤ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔの融合タンパク質に結合することができる。Ｄ’Ｄ３ドメインまたはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、修飾ＦＶＩＩＩ上の同族部位に結合することができ、脂肪酸はアルブミンに結合することができる。修飾凝固因子は、２つのポイントで融合タンパク質に結合することができ、その両方とも強い結合定数を有する。さらに、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔが最適な半減期延長のために第ＶＩＩＩ因子結合部位で適切にまたは最適に配向され得るように、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔを融合タンパク質中のアルブミンに接続するリンカーの長さは、長くするまたは短くするのいずれかで変更することができる。
【００６１】
このように、ネイティブｖＷＦが修飾ＦＶＩＩＩに対して有効に競合することができる可能性は非常に低く、アルブミンへの結合により、半減期が大きく増加する。
【００６２】
別の代替は、免疫グロブリンＦｃ領域をそのコード配列に追加することにより、ＦＶＩＩＩを遺伝子修飾することである。Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔおよびＦｃ領域を含む融合タンパク質をコードする第２の遺伝子を同じ細胞にトランスフェクトすることができる。次いで、細胞合成機構により、スルフヒドリル結合を介して、修飾ＦＶＩＩＩとＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ含有融合タンパク質とが結合する。最小のｖＷＦサイズとしてＤ’Ｄ３を有するそのような構築物は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５００２３９５９号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される本発明は、ＵＳ２０１５００２３９５９の教示における教示とは反対に、Ｄ３を含まないＤ’などのＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔをＤ’Ｄ３の代わりに置き換え、有効なＦＶＩＩＩ結合、例えば非共有結合を保持することができる。
【００６３】
修飾凝固因子および融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の部位で相互作用することができる。一実施形態では、修飾凝固因子および融合タンパク質は、両方の分子上の２つの独立した部位で相互作用する。「独立した部位」とは、一方または両方の分子の重複しない領域または別個の領域を意味する。
【００６４】
修飾凝固因子の少なくとも１つの結合部位は、天然の結合部位であり得る。別言すれば、結合部位は、凝固因子上で自然に発生し、その修飾の一部ではない。修飾凝固因子上の他の１つ以上の結合部位は、その部位中の１つ以上のアミノ酸が凝固因子に対して天然またはネイティブではないように修飾することができる。
【００６５】
融合タンパク質は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の一緒に融合されるタンパク質を含むことができる。例えば、第１の融合タンパク質は、フォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ドメインまたはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔを含むことができる。ｖＷＦの変異体および断片は、当業者に既知であり、本明細書で企図される。そのような例は、米国特許第９，１２５，８９０号、および米国特許出願２０１４／０３５７５６４および同２０１３／１２０９３９に記載される。第２のタンパク質は、アルブミンまたは免疫グロブリンＦｃ断片を含むことができる。一例では、免疫グロブリンＦｃ断片は、修飾凝固因子に特異的な一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を含むことができる。ｓｃＦｖは、修飾凝固因子の修飾部位に特異的であり得る。
【００６６】
当業者が本開示を考慮して理解するように、この二重結合戦略は、必要なＦｃＲＮサイクリングを維持しながら他の多くの方法で達成することができる。アルブミンはビリルビンなどの非常に様々なリガンドに結合することが既知であるため（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９５）、他のリガンドが修飾分子中の脂肪酸に置き換わることができる。
【００６７】
別の実施形態は、アルブミン／脂肪酸対の代わりに抗体／小分子セットを使用することである。同族モノクローナル抗体を有する多くの小分子があり、これらは生物学的標本中の小分子の検出に使用されることが多い（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｓｉｄｈｕ，Ｄｕｂｅｌ，＆ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，２０１１）。Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ、アミノ酸スペーサー、免疫グロブリンのＦｃ領域、および小分子、例えば、ニトロチロシンに特異的な一本鎖可変領域を有する分子を構築することができる。次いで、修飾分子は、マレイミド−ＰＥＧ１０００−ニトロチロシンの形態をとることができる。これは、二重の結合効果およびＦｃＲＮサイクリングを有するが、免疫グロブリンベースのリサイクルを使用する。
【００６８】
ＦＶＩＩＩを修飾する同様の戦略を使用する別の代替手段を使用して、凝固因子と融合タンパク質の間に共有結合を作ることができる。クリックケミストリーまたは生体直交化学（ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、複雑な化学環境で互いにのみ反応するように設計された分子を説明する。非常に様々なこれらの化合物が開発されており、銅触媒を必要とするものもあり、ひずみ誘導（ｓｔｒａｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ）反応で作動するものもある。複合体中の第２の結合部位を確立するために脂肪酸結合を使用するのとは異なり、これらはインビボで非常に安定した共有結合を形成する。
【００６９】
分子内結合の数学は、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｅｎによって説明され（Ｋｒａｍｅｒ＆Ｋａｒｐｅｎ，１９９８）、Ｚｈｏｕによってより詳細に説明されている（Ｚｈｏｕ，２００６）。結合は、個々の解離定数および有効局所濃度の関数になる。融合タンパク質中のアルブミンと修飾ＦＶＩＩＩとの間の結合は、例えば、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片と修飾ＦＶＩＩＩとを結合させる。次いで、Ｄ’Ｄ３またはＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ断片の局所濃度が非常に高くなり、内因性ｖＷＦの有意な結合が妨げられる。
【００７０】
この二重結合戦略は、Ｙｅｅ，ｅｔ  ａｌ．が直面した問題を克服する。（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本明細書で修飾凝固因子複合体と称される、融合タンパク質へのＦＶＩＩＩの結合によって作られた新しい分子は、ＦＶＩＩＩまたは他の長い半減期のＦＶＩＩＩ分子のいずれによっても提供されないいくつかの望ましい特徴を有する。第１に、非常に堅固な結合または共有結合により、融合タンパク質からの修飾ＦＶＩＩＩの解離がほとんどなく、投与されたＦＶＩＩＩが通常のｖＷＦの大きなプールへと失われるのを防ぐことが保証される。第２に、修飾凝固因子複合体を内因性ｖＷＦから引き離し、融合タンパク質を使用して半減期を延長することにより、非常に長い半減期を得ることができる。第３に、遊離ＦＶＩＩＩではなく修飾凝固複合体を投与することにより、阻害剤形成の発生を低減することができる。第４に、アルブミンをＦＶＩＩＩに直接結合させるのではなく、融合タンパク質に結合させることにより、ＦＶＩＩＩ活性が維持される。アルブミンをＦＶＩＩＩに直接融合させることにより、不活性な分子が得られる（Ｐｏｗｅｌｌ，２０１４）。アルブミンがＦＶＩＩＩと直接接触しないように配置することは、ＦｃＲＮによる効率的なリサイクルに役立つはずである。第５に、修飾ＦＶＩＩＩは、皮下投与することができる。第６に、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔは、凝固因子複合体の形成における利点を提供する。最後に、これは、阻害剤形成の発生をさらに低減することができる、ヒト細胞系で生成される完全にヒトのタンパク質であり得る。
【００７１】
修飾凝固第ＶＩＩＩ因子を含む凝固因子複合体の半減期は、凝固因子単独と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００％、またはそれ以上であり得る。凝固因子複合体はまた、未修飾の凝固因子と比較した場合、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍、またはそれ以上長い半減期を有する。より具体的には、凝固因子複合体の半減期は、ＦＶＩＩＩタンパク質単独の半減期よりも少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、もしくは少なくとも約１２倍、またはそれ以上長い。一実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩの半減期よりも約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍、または約１．５倍〜約１０倍長い。別の実施形態では、凝固因子複合体中のＦＶＩＩＩの半減期は、野生型ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩタンパク質単独と比較して、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約７倍、または約６倍〜約８倍延長される。他の実施形態では、凝固因子複合体の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間であり、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。さらに他の実施形態では、凝固因子複合体の半減期は、約１５時間〜約２週間、約１６時間〜約１週間、約１７時間〜約１週間、約１８時間〜約１週間、約１９時間である。約１週間、約２０時間〜約１週間、約２１時間〜約１週間、約２２時間〜約１週間、約２３時間〜約１週間、約２４時間〜約１週間、約３６時間〜約１週間、約４８時間〜約１週間、約６０時間〜約１週間、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日、または約２４時間〜約２日である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、対象あたりの凝固因子複合体の平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週間）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日である。一態様では、凝固因子の半減期は、少なくとも６０時間、７２時間（３日）、８４時間、９６時間（４日）、１０８時間、１２０時間（５日）、６日、７日（１週間）、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日である。
【００７３】
修飾分子
本明細書に開示される「修飾分子」は、凝固因子を修飾し、該凝固因子を融合タンパク質と相互作用することができるようにする任意の分子を含むことができる。修飾分子は、例えば、脂肪酸を含むことができる。修飾分子は、例えば、ポリエチレングリコール鎖を介して、修飾凝固因子に結合することができる。融合タンパク質の第１および第２のタンパク質は、例えば、リンカーを介して、一緒に結合することができる。修飾凝固因子は、１つ以上の修飾アミノ酸を含み得る。さらに、またはあるいは、融合タンパク質は修飾アミノ酸を含むことができる。例えば、本発明の凝固因子複合体は、いくつかの実施形態では、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによって互いに結合されたアミノ酸から構成され得、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知である化学修飾技術によって修飾されてもよい。このような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献で詳しく説明されている。
【００７４】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド中のどの場所でも生じさせることができる。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは異なる程度で存在してもよいことが理解されるであろう。所与のポリペプチドはまた、多くの種類の修飾を含んでもよい。
【００７５】
ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として、分枝状であってもよく、分枝を有するまたは有さない環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝状環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じてよいし、または合成方法によって作製されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファー−ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が含まれる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００７６】
ＦＶＩＩＩは、表１に示す一般構造マレイミド−ＰＥＧｎ−Ｘの多くの修飾分子によって修飾することができる。このような様々な修飾分子を使用することができる。例えば、マレイミド−ＰＥＧの様々な修飾は、ＰＥＧ−マレイミド誘導体に関する開示のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８２８，４０１号に提示されるものなど、当業者に既知である。本発明の例では、この修飾は、ＦＶＩＩＩの活性に対して観察された影響を及ぼさなかった。修飾分子の例を表１に示す。
【００７７】
表１：ＦＶＩＩＩを修飾するために使用される分子
マレイミド−ＰＥＧ５０００−ビオチン
マレイミド−ＰＥＧ１０００−フルオレセインイソチオシアネート
マレイミド−ＰＥＧ１０００−ラウレート
マレインディー−ＰＥＧ１０００−ミリステート
マレイミド−ＰＥＧ４−６−メチルテトラジン
マレイミド−ＰＥＧ３−トランスシクロオクテン
マレイミド−ＰＥＧ９−トランスシクロオクテン
マレイミド−ＰＥＧ５０００−トランスシクロオクテン
マレイミド−ＰＥＧ５０００−６−メチルテトラジン
マレイミド−ＰＥＧ３−アジド
マレイミド−ＰＥＧ１０００−アジド
フルオレセイニルマレイミド
凝固因子を修飾するための化学部分は、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどから選択してもよい。凝固因子は、分子内のランダムな位置または分子内の所定の位置で修飾してもよく、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の結合した化学部分を含んでもよい。
【００７８】
ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝状または非分状であってもよい。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造を容易にするために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子が記載された分子量よりも多いこと、いくつかは少ないことを示す）。所望の治療プロファイル（例えば、所望の持続放出の時間、（もしあれば生物学的活性に対する）効果、取り扱いの容易性、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）に応じて、他のサイズを使用することができる。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａ平均分子量を有してもよい。
【００７９】
上記のように、ポリエチレングリコールは分枝状構造を有してもよい。分枝状ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；ａｎｄ  Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載され、それらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能性ドメインまたは抗原ドメインへの影響を考慮して、タンパク質に結合する必要がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ  ０４０１  ３８４に開示される方法（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦに結合する）など、当業者に利用可能な多くの結合方法がある。塩化トレシルを使用したＧＭ−ＣＳＦのペグ化の報告している、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介して、アミノ酸残基を介して共有結合されてもよい。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含んでもよく、遊離カルボキシル基を有するものは、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含んでもよい。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として使用されてもよい。Ｎ末端基またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が治療目的に好ましい。
【００８１】
上記で示唆したように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基のいずれかへの結合を介してタンパク質に結合されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に結合することができる。ポリエチレングリコールをタンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）またはタンパク質の２種類以上のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびそれらの組み合わせ）に結合させるために、１つ以上の反応化学を使用してもよい。
【００８２】
Ｎ末端で化学的に修飾されたタンパク質を特に所望してもよい。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として使用して、様々なポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによる）、反応混合物中のタンパク質（ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、実施されるペグ化反応の種類、および選択したＮ末端ペグ化タンパク質の取得方法から選択してもよい。Ｎ末端ペグ化調製物を取得する（すなわち、必要に応じて、この部分を他のモノペグ化部分から分離する）方法は、ペグ化タンパク質分子集団からＮ末端ペグ化材料を精製することであってもよい。Ｎ末端修飾で化学的に修飾された選択的なタンパク質は、特定のタンパク質での誘導体化に利用可能な異なる種類の第一級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用する還元的アルキル化によって達成されてもよい。適切な反応条件下での、ポリマーを含むカルボニル基によるＮ末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【００８３】
上記で示したように、本発明の凝固因子のペグ化は、任意の数の手段によって達成されてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的にまたは介在リンカーのいずれかによって分子に結合されてもよい。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させるための、リンカーのないシステムは、Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）、米国特許第４，００２，５３１号、米国特許第５，３４９，０５２号、ＷＯ９５／０６０５８、およびＷＯ９８／３２４６６に記載され、それらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
介在リンカーなしでポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に直接結合するための１つのシステムは、トレシルクロリドを使用してモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を修飾することによって生成される、トレシル化ＭＰＥＧを使用する。タンパク質をトレシル化されたＭＰＥＧと反応させると、ポリエチレングリコールがタンパク質のアミン基に直接結合する。したがって、本発明は、本発明のタンパク質を２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生成される、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。
【００８５】
ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用してタンパク質に結合することができる。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１２，４６０号は、ポリエチレングリコールをタンパク質に接続するためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールがリンカーによってタンパク質に結合しているタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートはまた、タンパク質をＭＰＥＧ−スクシンイミジルコハク酸塩、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および様々なＭＰＥＧ−コハク酸誘導体などの化合物と反応させることによって生成することができる。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させるため多くの追加のポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の反応化学を使用して生成されたペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
本発明の修飾凝固因子に結合したポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）はまた、変動してもよい。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に結合されてもよい。同様に、タンパク質分子あたりのポリエチレングリコール部分の、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０などの範囲内の平均置換度。置換度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）で論じられている。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養から回収および精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。タンパク質をリフォールディングするための周知の技術を、ポリペプチドが単離および／または精製中に変性した場合に活性コンフォメーションを再生するために使用してもよい。
【００８８】
本発明の修飾凝固因子複合体の存在および量は、当該技術分野で知られている周知イムノアッセイであるＥＬＩＳＡを使用して決定してもよい。本発明の修飾分子を検出／定量化するのに有用である１つのＥＬＩＳＡプロトコルでは、ＥＬＩＳＡプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティングするステップ、非特異的結合を防ぐためにプレートをブロッキングするステップ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄するステップ、本発明の分子を含む溶液を（１つ以上の異なる濃度で）添加するステップ、検出可能な標識に結合した二次抗治療用タンパク質特異的抗体を添加するステップ（本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知である）、および二次抗体の存在を検出するステップを含む。このプロトコルの代替形式では、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングされてもよく、標識された二次試薬は、抗ヒトアルブミンスーパーファミリー特異的抗体であってもよい。
【００８９】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片および変異体
本発明はさらに、本明細書に記載の凝固因子複合体の断片、ならびに修飾凝固因子、修飾分子、または融合タンパク質などの凝固因子複合体の個々の成分の断片に関する。これらの修飾には、活性もしくは半減期を増加させるような方法で分子を修飾する本明細書に開示される修飾、または分子の特性を増強するか、もしくは他の理由でそれを望ましいものにする他の修飾が含まれ得る。
【００９０】
１つ以上のアミノ酸の欠失が１つ以上の機能の修飾または喪失をもたらす場合でも、複合体の十分な凝固機能は依然として保持され得る。したがって、本明細書に開示される分子の断片には、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチドのアミノ酸配列から１つ以上の残基が欠失されたポリペプチドが含まれ、本明細書で企図される。
【００９１】
本出願は、本明細書に記載の参照ポリペプチド配列（例えば、凝固因子、修飾分子、または融合タンパク質）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドまたはその断片を含むタンパク質に関する。
【００９２】
「変異体」は、参照核酸またはポリペプチドとは異なるがその本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたは核酸を指す。一般に、変異体は全体的に非常に類似しており、多くの領域で参照核酸またはポリペプチドと同一である。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「変異体」とは、タンパク質の既知配列とは配列が異なるが、本明細書の他の箇所に記載されているか、またはその他では当該技術分野で既知であるように、その少なくとも１つの機能特性および／または治療特性（例えば、治療活性および／または凝固を含むがこれに限定されない、生物学的活性）を保持する。一般に、変異体は全体的に非常に類似しており、多くの領域で、目的のタンパク質またはアルブミンスーパーファミリータンパク質のアミノ酸配列と同一である。
【００９４】
本発明はまた、例えば、凝固因子自体、融合タンパク質、または修飾分子のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなるタンパク質に関する。これらのポリペプチドの断片（例えば、本明細書に記載のそれらの断片）も提供される。本発明に包含されるさらなるポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、結合したＤＮＡを６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーション、続いて０．２倍のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、約５０〜６５℃で１回以上洗浄）、高ストリンジェント条件下（例えば、結合したＤＮＡを６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃で濾過するハイブリダイゼーション、続いて０．１倍のＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで、約６８℃で１回以上の洗浄）、または当業者に既知である他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６．３．１−６．３．６  頁および２．１０．３頁を参照のこと）で、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸分子の補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
【００９５】
本発明の照会アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、主題のポリペプチド配列は、照会アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５個のアミノ酸変化を含んでもよいことを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、照会配列と同一であることが意図される。言い換えれば、照会アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中の最大５％のアミノ酸残基を挿入、削除、または別のアミノ酸で置換してもよい。参照配列のこれらの変化は、参照配列の残基の中に個別に散在するか、または参照配列内の１つ以上の隣接基に散在する、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のいずれの場所で生じてもよい。
【表２】
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【００９６】
機能または免疫学的同一性の大きな変化は、表２のものほど保存されていない置換を選択すること、すなわち、（ａ）置換領域において、例えばシート若しくはヘリックス構造として、ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位において、分子の電荷若しくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持する効果が、より著しく異なる残基を選択することにより行われる。通常、タンパク質の性質を最も変更すると予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えばセリル若しくはスレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニル）で（により）置換される；（ｂ）システイン若しくはプロリンが任意の他の残基で（により）置換される；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えばリジル、アルギニル若しくはヒスチジル）が、負電荷残基（例えばグルタミル若しくはアスパルチル）で（により）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が、側鎖を有しない残基（例えばグリシン）で（により）（この場合（ｅ）部位の数を硫酸化および／若しくはグリコシル化のために増加することで）置換される、ものである。
【００９７】
例えば、生物学的および／または化学的に類似している別のアミノ酸残基での１つのアミノ酸残基の置換は、保存的置換として当業者に既知である。例えば、保存的置換はある疎水性残基を別の疎水性残基で、またはある極性残基を別の極性残基で置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。それぞれの明示的に開示された配列の、そのような保存的置換バリエーションは、本明細書において提供するモザイクポリペプチドに含まれる。
【００９８】
置換または欠失突然変異誘発を用いて、Ｎグリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯグリコシル化（Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）用の部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失もまた、望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つを欠失すること、または、１つをグルタミニル若しくはヒスチジル残基で置換することにより、達成することができる。
【００９９】
開示された組成物に組み込むことができる様々なアミノ酸およびペプチド類似体が存在すると理解されている。例えば、Ｌアミノ酸とは異なる官能性置換基を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体、および、ペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子への、選択したアミノ酸のチャージ、および、例えば、アンバーコドンを利用する、遺伝子構造の改変により、類似体アミノ酸を部位特異的な方法でペプチド鎖に挿入することにより、ポリペプチド鎖に速やかに組み込むことができる。
【０１００】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介して接続していない分子を作製することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合には、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ  ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−，ｃｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）において見出され、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などの結合原子間に２つ以上の原子を有することができると理解されている。
【０１０１】
アミノ酸類似体および類似体およびペプチド類似体は多くの場合、例えば、より経済的な製造、高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、潜在能、有効性など）、変化した特異性（例えば、生物学的活性のより広いスペクトル）、低減した抗原性などの、増強された、または望ましい特性を有する。
【０１０２】
Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないため、Ｄ−アミノ酸を使用して、より安定したペプチドを作製することができる。同じ種類のＤ−アミノ酸を有するコンセンサス配列の、１個以上のアミノ酸のシステム置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）を使用して、より安定したペプチドを作製することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを合わせて環化する、または結合することができる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに制限するのに有益であり得る。
【０１０３】
実際上は、任意の特定のポリペプチドが、例えば、凝固因子または断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定することができる。照会配列（本発明の配列）と対照配列との間の最良の全体的一致を決定するための好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも称され、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、照会配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列または両方ともアミノ酸配列のいずれかである。上記グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントとして表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは、マトリクス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダム化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００、または対象のアミノ酸配列の長さ、どちらか短い方である。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において変化を含んでもよい。サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの所望の特性または活性を変化させない変化を含むポリヌクレオチド変異体が特に好ましい。遺伝暗号の縮重によるサイレント置換によって生成されたヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されたポリペプチド変異体を利用することができる。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡのコドンを、酵母またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主が好むコドンに変更するために）、生成することができる。
【０１０５】
天然に存在する変異体は「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す。（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで変動することができ、本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術または直接合成によって生成されてもよい。
【０１０６】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、本発明のポリペプチドの特性を改善または変更するために変異体を生成してもよい。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に喪失することなく、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。例として、Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、最大１０倍高い活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０１０７】
したがって、本発明は、所望の機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療活性）を有するポリペプチド変異体をさらに含む。非常に好ましい実施形態では、本発明は、凝固因子に対する修飾に提供し、該修飾は、延長された半減期などの機能的活性の増加を可能にする。
【０１０８】
凝固因子注入を必要とする疾患を有する対象を処置する方法であって、本明細書に開示される凝固因子複合体を対象に投与することを含む、方法も開示される。疾患は、例えば血友病Ａであり得る。対象結果に凝固因子複合体を投与することにより、凝固因子単独の投与の際に得られる血中半減期よりも長い、凝固因子複合体の血中半減期をもたらすことができる。凝固因子複合体は、注射（皮下注射を含む）、吸入、鼻腔内、または経口により対象に投与することができる。
【０１０９】
本発明の修飾凝固因子複合体またはその製剤は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射または静脈内注入を含む任意の従来の方法によって投与されてもよい。処置は、ある期間にわたって単回投与または複数回投与から構成されてもよい。
【０１１０】
本明細書に開示される凝固因子複合体は、１つ以上の許容可能な担体とともに、医薬製剤として存在することができる。担体は、凝固因子複合体と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。
【０１１１】
製剤は、単位剤形で好都合に提供されてもよく、薬学分野での周知方法のいずれかによって調製されてもよい。そのような方法は、凝固因子複合体を１つ以上の副成分を構成する担体と関連付けるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは細分された固体担体またはその両方と均一かつ密接に結合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１１２】
キット
凝固因子複合体を含むキットも本明細書に開示される。本発明の製剤または組成物は、凝固因子複合体の延長された貯蔵寿命について言及した説明書または添付文書と一緒に包装されるか、またはキットに含まれてもよい。例えば、そのような説明書または添付文書は、本発明の凝固因子複合体の延長された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）または延長された（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）貯蔵寿命を考慮して、時間、温度、および光などの推奨される保存条件に対処し得る。そのような説明書または添付文書はまた、管理された病院外、診療所外、またはオフィス状態外の場所での使用を必要とし得る製剤の保存の容易性などの、本発明の凝固因子複合体の特定の利点に対処し得る。上記のように、本発明の製剤は、水性形態であってもよく、治療活性を実質的に失うことなく、理想的とは言えない状況下で保存されてもよい。
【０１１３】
処置方法
本発明の凝固因子複合体および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。それらは、本発明の他の凝固因子複合体および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与されてもよい。組み合わせは、併用して、例えば、混合物として、別々であるが同時に投与されてもよいし、または逐次的に投与されてもよい。これには、組み合わせた薬剤が治療用混合物として一緒に投与される提供、および組み合わせた薬剤が別々に、しかし同時に、例えば、同じ個体への別々の静脈内ラインを介して投与される手順も含まれる。「組み合わせて」投与することは、最初に与えられ、続いて２番目に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１１４】
特定の態様では、本発明の方法で使用される凝固因子複合体は、緩衝液、糖および／または糖アルコール（トレハロースおよびマンニトールを含むがこれらに限定されない）、安定剤（グリシンなど）、および界面活性剤（ポリソルベート８０など）を含む製剤に含めることができる。
【０１１５】
さらなる実施形態では、製剤は、ナトリウム、ヒスチジン、カルシウム、およびグルタチオンをさらに含んでもよい。
【０１１６】
一態様では、凝固因子複合体を含む製剤は、投与前に凍結乾燥される。凍結乾燥は、当該技術分野で一般的な技術を使用して行われ、開発中の組成物のために最適化されるべきである（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２１：１９１−２００，（２００４）ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：２４３−９（１９９６）。
【０１１７】
医薬製剤を調製する方法は、以下のステップのうちの１つ以上を含むことができる：凍結乾燥の前に、本明細書に記載の安定剤を上記混合物に添加すること、凍結乾燥の前に、それぞれが本明細書に記載される増量剤、浸透圧調節剤、および界面活性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を上記前記混合物に添加すること。凍結乾燥製剤は、一態様では、少なくとも１つ以上の緩衝液、増量剤、および安定剤からなる。この態様では、界面活性剤の有用性は、凍結乾燥工程中または再構成中の凝集が問題となる場合に評価および選択される。凍結乾燥中に製剤を安定範囲内のｐＨに維持するために、適切な緩衝剤を含む。
【０１１８】
凍結乾燥材料の標準的な再構成プラクティスは、注射用の純水または滅菌水（ＷＦＩ）の量（典型的には、凍結乾燥中に除去される体積に等しい）を添加することであるが、抗菌剤の希釈溶液が、非経口投与用の医薬品の製造に使用される場合もある（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１−１３５４（１９９２））。
【０１１９】
凍結乾燥材料は、水溶液として再構成してもよい。様々な水性担体、例えば、注射用の滅菌水、複数回投与使用のための防腐剤を含む水、または適切な量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合した活性化合物を含む水性懸濁液）。様々な態様では、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、かつ、限定するものではないが、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり、分散剤または湿潤剤は、例えば、天然に存在するホスファチド、例えば、かつ、限定するものではないが、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、かつ、限定するものではないが、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、かつ、限定するものではないが、ヘプタデカエチル−エンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオイエート、あるいはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、かつ、限定するものではないが、ポリエチレンソルビタンモノオイエートである。様々な態様では、水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えば、かつ、限定するものではないが、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含む。
【０１２０】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、注射器または他の貯蔵容器を使用して投与するための液体製剤である。さらなる実施形態では、これらの液体製剤は、水溶液として再構成される本明細書に記載の凍結乾燥材料から生成される。さらなる態様では、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む。「薬学的に」または「薬理学的に」許容されるとの句は、安定であり、凝集および切断生成物などのタンパク質分解を阻害し、さらに、以下で説明する当該技術分野で周知である経路を使用して投与されたときにアレルギーまたは他の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」には、上記に開示された薬剤を含む、任意かつすべての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【０１２１】
凝固因子複合体の単回または複数回投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよび形式で行われる。疾患の予防、抑制、軽減、または処置のために、適切な投与量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存する。
【０１２２】
さらなる実施形態では、かつ、上記のいずれかに従って、血友病Ａなどの凝固疾患の処置は、凝固因子複合体の単独または別の薬剤との組み合わせでの初期の処置、続いて、凝固因子複合体および／または他の薬剤の１回以上の反復投与を伴ってもよい。最初の投与およびその後の反復投与の特性は、処置される疾患に部分的に依存するであろう。
【０１２３】
さらなる態様では、凝固因子複合体は、０．５ＩＵ／ｋｇ〜２００ＩＵｋｇの範囲の用量で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、凝固因子複合体は、１〜１９０、５〜１８０、１０〜１７０、１５〜１６０、２０〜４５０、２５〜１４０、３０〜１３０、３５〜１２０、４０〜１１０、４５〜１００、５０〜９０、５５〜８０、または６０〜７０Ｉｕ／ｋｇの範囲の用量で投与される。さらなる実施形態では、かつ、上記のいずれかに従って、凝固因子複合体は、約１ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇの用量で対象に投与することができる。さらにさらなる別の実施形態では、凝固因子複合体は、１．５ＩＵ／ｋｇ〜１５０ＩＵ／ｋｇ、２ＩＵ／ｋｇ〜５０ＩＵ／ｋｇ、５ＩＵ／ｋｇ〜４０ＩＵ／ｋｇ、１０ＩＵ／ｋｇ〜２０ＩＵ／ｋｇ、１０ＩＵ／ｋｇ〜１００ＩＵｋｇ、２５ＩＵ／ｋｇ〜７５ＩＵ／ｋｇ、および４０ＩＵｋｇ〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。さらに別の実施形態では、凝固因子複合体は、２、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ＩＵ／ｋｇで投与される。理解され、かつ、本明細書でさらに議論されるように、凝固因子複合体の適切な投与量は、適切な用量反応データと併せて血中レベル用量を決定するための確立されたアッセイを使用することにより確認してもよい。
【０１２４】
特定の例において、本発明の複合体は、血友病Ａを処置するために筋肉に注入または投与することができる。凝固因子複合体の組成物は、本明細書に記載される医薬製剤に含めることができる。そのような製剤は、経口、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、膣、直腸、または頭蓋内注射によって投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内注射、または注入技術が含まれる。皮下、静脈内、皮内、筋肉内、乳腺内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注射による投与、および／または特定の部位への外科的移植も企図される。一般に、組成物は、パイロジェン、およびレシピエントに有害であり得る他の不純物を本質的に含まない。
【０１２５】
一態様では、本発明の製剤は、薬物製品の治療的循環レベルを維持するために、最初のボーラスとそれに続く連続注入によって投与される。別の例として、本発明の化合物は、一回用量として投与される。当業者は、良好な医療行為および個々の患者の臨床状態によって決定される、有効な投与量および投与計画を容易に最適化するであろう。投与経路は、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与によることができるが、これらに限定されない。投与の頻度は、薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存する。最適な医薬製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２，第１４３５−１７１２頁を参照されたい（その開示は、すべての目的のために、特に製剤、経路、および医薬品の投与量に関連するすべての教示のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのような製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボ除去速度に影響を与える。投与経路に応じて、好適な用量が体重、体表面積、または臓器サイズに従って計算される。適切な用量反応データと組み合わせて血中レベル用量を決定するための確立されたアッセイを使用することにより、適切な投与量を確認してもよい。最終的な投与計画は、薬物の作用を変更する様々な要因、例えば、薬物の比活性、損傷の重症度および患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性別、および食事、感染症の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因を考慮して、担当医によって決定される。例として、本発明の凝固因子複合体の典型的な用量は、約５０ＩＵ／ｋｇであり、５００μｇ／ｋｇに等しい。研究が行われるに従って、様々な疾患および状態についての適切な投与量レベルおよび処置期間に関するさらなる情報が明らかになるであろう。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、凝固因子複合体は、対象のみに投与される。いくつかの実施形態では、凝固因子複合体は、１つ以上の他の凝固因子と組み合わせて対象に投与される。
【０１２７】
さらなる実施形態では、凝固因子複合体は、対象に１日１回以下で投与される。さらなる実施形態では、凝固因子複合体は、対象に、１日おきに１回以下、３日おきに１回以下、４日おきに１回以下、５日おきに１回以下、１週間に１回以下、２週間おきに１回以下、月に１回以下で投与される。さらにさらなる実施形態では、凝固因子複合体は、対象に１日２回以下で投与される。
【０１２８】
本発明を一般的に説明してきたが、該本発明は、例示として提供され、限定することを意図していない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【０１２９】
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明および以下の例示的な実施例を使用して、本発明で見出される変更を行い、利用し、付随する特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指し示し、本開示の残り部分を制限するものとして何ら解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１３０】
実施例１．ＣＭ１１０の合成および生成。
合成タンパク質ＣＭ１１０は、ＦＶＩＩＩを分解および非特異的結合から保護し、内因性ｖＷＦから引き離し、血中半減期を延長するように設計される。特定の実施形態では、タンパク質は、ｖＷＦのＤ’Ｄ３領域、５６アミノ酸のグリシン、セリンに富むリンカー、および全長のヒトアルブミンから構成される。このタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をＧｅｎｅ  Ａｒｔによって合成し、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．４ＴＯＰＯに挿入した。このプラスミドをヒト胎児腎臓細胞株Ｅｘｐｉ２９３に一過的にトランスフェクトすることにより、４日間にわたる培養で細胞上清中にかなりの量のタンパク質が生成された（図２Ａ）。ＨＳＡアフィニティーカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンパク質を上清から直接精製した（図２Ｂ）。このタンパク質の予測分子量は１２４，７４４であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約１２５，０００で泳動することが見られた（図２Ｃ）。タンパク質を較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００ゲル濾過カラムに通過させ、タンパク質は２５０，０００の分子量を示したが、これは、該タンパク質が、溶液中では１２５，０００ユニットの二量体として機能することを示唆している（図２Ｄ）。
【０１３１】
フォン・ヴィレブランドの因子は、バイベル・パラーデ小体において高度に規則正しいポリマーを天然で形成し、分泌されたときに、一連の多量体として血液を移動する。Ｄ’Ｄ３領における２つの遊離スルフヒドリルをこれらの多量体の初期形成に利用した。これらは、ネイティブｖＷＦにおけるシステイン１０９９およびシステイン１１４２に対応する。より高い重合体の形成を防ぐために、これらのシステインをＤ’Ｄ３構築体においてアラニンに変異させた。
【０１３２】
実施例２クリック試薬によるＦＶＩＩＩおよびＣＭ１１０の標識。
二次タンパク質を生成し、ｖＷＦのＤ’Ｄ３領域に結合するＦＶＩＩＩの天然の能力を利用する方法が本明細書に開示される。このようにして、２つのタンパク質が適切な複合体を形成し、次いで、該複合体が化学的に架橋される。可能な限り多くのＦＶＩＩＩを複合体に指向させるために、過剰のＤ’Ｄ３含有試薬を利用した。このような状況では、二官能性架橋剤により、ポリマーが形成されることが多く、機能性複合体の収率を低減させる。クリックケミストリー剤は、互いにのみ反応し、ポリマー形成を防ぐように設計される。トランスシクロオクテンおよびメチルテトラジンの反応ペアは、早くて定量的な反応性という適切な特性を有する。
【０１３３】
ｖＷＦのＤ’Ｄ３領域は多数のジスルフィド架橋を有するが、いくつかの遊離スルフヒドリル、特に、ｃｙｓ１０９９およびｃｙｓ１１４２に対応するものを有する。これらは、通常はｖＷＦによって形成される規則正しいポリマーの形成に重要である。初期の構築物では、ＣＭ１１０の望ましくないポリマーが溶液中で形成された。これらのシステインをアラニンで置き換えることにより、この問題が解消され、アルブミンのｃｙｓ３４に対応するシステインが唯一の一貫して遊離したスルフヒドリルとして残存した。様々なマレイミドベースのクリック試薬を試したが、この方法を使用してＣＭ１１０の約５０％しか修飾することができなかった。このシステインにおいて標識されたタンパク質の試験もまた、その標識された対応物との結合が非常に不十分であるようであった。
【０１３４】
Ｎ−ヒドロキシコハク酸ベースの試薬であるＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＴＣＯを使用した。ＰＥＧポリマーの長さは、短い３ＰＥＧユニットまたは長い５０ＰＥＧユニットであり得る。ライゲーション効率は、この構築体では約１０〜１５単で最高であった。ＮＨＳは第一級アミンと反応し、通常、任意のタンパク質においていくつかのアミンを修飾する。ＣＭ１１０をＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＴＣＯで処理し、次いで、標識タンパク質をＢＯＤＩＰＹ−テトラジンで処理した。図３Ａは、ＣＭ１１０がこのように効率的に標識され、２５０ｋｄタンパク質分子あたり約１０分子のＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＴＣＯが組み込まれることを示している（図３Ｂ）。
【０１３５】
ＣＭ１１０をトリス−（２カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した後に、マレイミドベースの試薬で標識することを試みることは、より効率的なライゲーションへの別の経路である。ＣＭ１１０を１００μＭ  ＴＣＥＰで１時間処理し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムで実施したとき、これは１２５，０００のモノマー分子量で現れた。フルオレセインマレイミドによる標識により、ＣＭ１１０あたり１分子のフルオレセインが組み込まれることが実証された。マレイミド−ＰＥＧ４−ＭｅＴＥＴで標識したＦＶＩＩＩおよびマレイミド−ＰＥＧ３−ＴＣＯで標識したＣＭ１１０での試験ライゲーションは、実質的により良好なライゲーション効率を示唆している。
【０１３６】
ＦＶＩＩＩは、重鎖に２つおよび軽鎖に１つの３つの遊離スルフヒドリルを有する。ＦＶＩＩＩをフルオレセイニルマレイミドで処理したとき、主に重鎖が標識されることが見出された（図３Ｃ）。標識されたＦＶＩＩＩをトロンビンで処置することにより、重鎖のｃｙｓ３１０およびｃｙｓ６９２の両方が標識されることが実証された。
【０１３７】
実施例３−ＣＭ２１１の形成。
複合体形成のために、ＦＶＩＩＩをマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジン（ｍａｌ−Ｐ４−ｔｅｔ）で標識した。重要なことに、標識することは、ＣｏａｔｅｓｔアッセイにおけるＦＶＩＩＩの活性に影響を与えない。標準的な脱塩カラムで実施したときに、任意のサイズのＰＥＧ含有分子が標識されたタンパク質から十分に分離されないことが多いことが見出されたので、標識後、ＦＶＩＩＩを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４  ｍＭ  ＣａＣｌ２中のＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００に通過させた。
【０１３８】
ＣＭ１１０をＮＨＳ−ＰＥＧ１２−ＴＣＯで標識し、同じ緩衝液中でＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００で濾過した。標識されたＣＭ１１０および標識されたＦＶＩＩＩを含む画分をプールし、水で１〜２に希釈して塩を１５０  ｍＭに低減させ、次いでスピンフィルターで２００μｌに濃縮した。スピンフィルターを１００μｌの同じ緩衝液で洗浄し、濃縮溶液とともにプールした。これにより、ＣＭ１１０では約５ｍｇ／ｍｌ、ＦＶＩＩＩでは１ｍｇ／ｍｌの溶液が生成された。効率的なライゲーションには、１ｍｇ／ｍｌより大きい高タンパク質濃度が重要であった。室温で２時間インキュベートした後、溶液を再びＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００を通して濾過した（図４Ａ）。ＣＭ２１１とここで称される複合体は、遊離ＣＭ１１０のピーク前に現れ、本質的にすべてのＦＶＩＩＩユニットが複合体に含まれていた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００カラムでの溶出量から、ＣＭ２１１は、１分子のＦＶＩＩＩおよびＣＭ１１０二量体から構成され、４３０，０００の分子量を有するようであった。
【０１３９】
ＣＭ２１１をＳＤＳゲル上で泳動したとき、いくつかのバンドが現れる（図４Ｂ）。８０，０００マーカー付近の最も低い分子量バンドは、ＦＶＩＩＩに対応する。次に高いのは遊離ＣＭ１１０である。次に高いのは、ライゲートされたＣＭ１１０およびＦＶＩＩＩ鎖である。イムノブロッティング実験により、低分子量種および高分子量種における重鎖および軽鎖の両方、ならびにアルブミンが存在することが確認される。これは、予想通り、ＣＭ２１１がライゲートされた材料およびライゲートされていない材料の混合物から構成されていることを示した。これは、全体の不十分なライゲーション、または一緒にライゲートされた様々な種の集まりが原因であり得る。
【０１４０】
これを解決する試みを図５に示す。血漿からＦＶＩＩＩの精製では、０．２５  Ｍ  ＣａＣｌ２を添加することによってＦＶＩＩＩおよびｖＷＦを解離させることができる。全体的に不十分なライゲーションが存在する場合、複合体をＣａＣｌ２で処理することにより、遊離ＦＶＩＩＩが放出されるはずである。複合体が非標識ＣＭ１１０および非標識ＦＶＩＩＩで形成されている場合、遊離ＦＶＩＩはカルシウムの存在下で放出される。
【０１４１】
ＣＭ２１１を高カルシウムで処理した場合、遊離ＦＶＩＩＩは放出されないが、これは、バンドの不均一性が混合ライゲーションの結果であることを示唆している（図５Ａ）。ＦＶＩＩＩは重鎖および軽鎖から構成されるが、おそらく混合グリコシル化のために、ＳＤＳゲル上にそれぞれの複数のバンドが存在する。同様に、ＣＭ２１１を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む緩衝液でクロマトグラフィーを実施したとき、遊離ＦＶＩＩＩは放出されない（図５Ｂ）。これらはまた、ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦ結合を破壊する状態である。
【０１４２】
実施例４−比活性。
他の状況におけるＦＶＩＩＩの修飾は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）などの凝固アッセイに対するＣｏａｔｅｓｔアッセイにおける分子の比活性の相違をもたらす。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイは、２段階アッセイであり、ＦＶＩＩＩを活性化するために活性化第ＩＸ因子およびトロンビンを含む。次いで、第Ｘ因子は、ＩＸａおよびＸの結合によって活性化されたＦＶＩＩＩの量に比例して活性化される。次いで、Ｘａは、発色基質を加水分解する。ＡＰＴＴは、内因性凝固経路全体の活性化および機能化に依存して、凝血塊を形成する。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイで測定した場合、ＣＭ２１１は、ほとんどの組換えＦＶＩＩＩと同様、約８，５００  Ｉｕ／ｍｇの比活性を有する。ＡＰＴＴで測定した場合、比活性は約６．５倍低くなるが、これは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中でＡＰＴＴを正常化するために、より多くのＣｏａｔｅｓｔユニットが必要であることを意味している（図６Ａ、６Ｂ）。ＣｏａｔｅｓｔユニットとＡＰＴＴユニットとの間の不一致は、この分子の設計で予想されるように、ＦＶＩＩＩからのＤ’Ｄ３の解離が遅いことを示唆している。したがって、トロンビン生成アッセイにおいておよびマウスでの実験のために、ＡＰＴＴアッセイに従って比活性を定義した。
【０１４３】
実施例５−トロンビン生成
トロンビン生成は、凝固カスケードの主な目的である。ＣＭ２１１をＦＶＩＩＩ欠乏血漿に様々な濃度で添加して、トロンビン生成を測定した。ＡＰＴＴアッセイで決定された比活性を使用して、適切な比活性により、トロンビン生成自体および曲線下面積の両方によって測定されたトロンビン生成が修正される（図７Ａ、７Ｂ）。
【０１４４】
実施例６−マウス研究。
ヒトアルブミンは、ヒトでは１９日以上の半減期を有するが、マウスではたった２日の半減期しか有さない。本発明は、ＦＶＩＩＩの半減期を延長するためにＣＭ１１０を使用したので、ヒト胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）を発現し、マウスアルブミンの生成をノックアウトしてあるマウスモデルを採用した。特定のマウスは、Ｂ６．ＣｇＡｌｂｅｍ１２ＭｖｗＦｃｇｒｔｔｍ１ＤｃｒＴｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／Ｍｖｗｊである。これらのマウスは、ヒトにおけるアルブミンの適切な半減期を再現する。ＣＭ１１０の１０ｍｇ／ｍｌ溶液をＴｇ３２マウスに静脈内注射し、翌月にわたって崩壊をモニタリングしたとき、ＣＭ１１０は９２時間の半減期を有することが見出された（図８Ａ）。ヒトＦＶＩＩＩは、これらのマウスにおいて約４時間の半減期を有する。
【０１４５】
ＣＭ２１１の半減期を測定するためのこれらの同じマウス。ＣＭ２１１の２０個のＡＰＴＴユニットをこれらのマウスに静脈内注射して、半減期を測定した。示された時点で採血し、ヒトＦＶＩＩＩ免疫活性アッセイを使用してＣＭ２１１を測定した。図８Ｂは、５匹の別々のマウスからのデータを示す。ＣＭ２１１は、これらのマウスにおいて約５５時間の半減期を有する（図８Ｂ）。
【０１４６】
ＦｃＲＮはまた、皮下タンパク質のバイオアベイラビリティの提供に関与していることが既知であるため、同じマウスにおいて２０個のＡＰＴＴユニットを皮下注射することにより、ＣＭ２１１を試験した。第ＶＩＩＩ因子活性は、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイを使用してマウスの血液で容易に測定され、注射後８〜２４時間でピークに達した（図８Ｃ）。
【０１４７】
実施例７ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔの合成および生成。
合成タンパク質ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔは、ＦＶＩＩＩを分解および非特異的結合から保護し、内因性ｖＷＦから引き離し、その血中半減期を延長するように設計された。特定の実施形態では、タンパク質は、ｖＷＦのＤ’領域またはＤ’およびＤ３の断片、５６アミノ酸のグリシン、セリンに富むリンカー、ならびに全長ヒトアルブミンから構成される。このタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をＧｅｎｅ  Ａｒｔによって合成し、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．４ＴＯＰＯに挿入した。このプラスミドをヒト胎児腎臓細胞株Ｅｘｐｉ２９３に一過的にトランスフェクトすることにより、４日間にわたる培養で細胞上清中にかなりの量のタンパク質が生成された（図９Ａ）。ＨＳＡアフィニティーカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンパク質を上清から直接精製した（図９Ａ）。タンパク質は、８５，３１０の予測された分子量を有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約８５，０００で泳動することが見られた（図９Ａ）。タンパク質を較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００ゲル濾過カラムに通過させ、タンパク質は８５，０００の分子量を示したが、これは、該タンパク質が、溶液中で、モノマーとして機能することを示唆している（図９Ｂ）。
【０１４８】
フォン・ヴィレブランドの因子は、バイベル・パラーデ小体において自然に高度に規則正しいポリマーを形成し、分泌されたときに、多量体の選択として血液を移動する。Ｄ’断片は、不対システインを有さず、したがって、これらの多量体を形成しない。
【０１４９】
実施例８ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔはトロンビンによって切断される
トロンビンは、ＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化し、これをＦＩＸａおよびＦＸに結合できることを可能にする。ＣＭ２１１ｓは、図１０に示すように、トロンビン生成に反応して遊離ＦＶＩＩＩを放出するように設計した。トロンビンによる活性化時に、ｖＷＦ断片がＦＶＩＩＩから完全に放出されるように、２つのトロンビン切断部位をＤ‘とＣＭ１１０ｓ中のアルブミンとの間のアミノ酸リンカーに組み込んだ。図１１は、トロンビンで処理することにより、ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔを遊離アルブミン、Ｄ’プラスリンカー、および遊離Ｄ’に切断することができることを示している。
【０１５０】
ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔのトロンビン処理はまた、別の重要な分子特性を示すことができる。図１２のパネルＡでは、ＣＭ  １１０ｓｈｏｒｔを１ｍＭフルオレセイニルマレイミドで１時間処理した。標準曲線との比較により、ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔの分子あたり１分子のフルオレセインしか組み込まれないことを示している。図１２のパネルＢは、トロンビン処理後に、すべての蛍光がアルブミン断片に留まっていることを示している。これらの結果は、ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔには単一の遊離スルフヒドリルしか存在せず、それがアルブミンのｃｙｓ３４に対応するシステイン２２４であることを示している。
【０１５１】
実施例９−クリックケミストリーリンカーへの切断可能なペプチドの組み込みおよびＣＭ２１１ｓの形成。
二次タンパク質を生成し、ｖＷＦのＤ’領域に結合するＦＶＩＩＩの天然の能力を利用する方法が本明細書に開示される。このようにして、２つのタンパク質が適切な複合体を形成し、次いで、該複合体が化学的に架橋される。可能な限り多くのＦＶＩＩＩを複合体に指向させるために、過剰のＤ’含有試薬を使用することができる。このような状況では、二官能性架橋剤により、ポリマーが形成されることが多く、機能性複合体の収率を低減させる。クリックケミストリー剤は、互いにのみ反応し、ポリマー形成を防ぐように設計される。トランスシクロオクテンおよびメチルテトラジンの反応ペアは、早くて定量的な反応性という適切な特性を有する。
【０１５２】
天然タンパク質とは異なる反応性を有するＦＶＩＩＩを導入することにより、血液凝固の全体的な調節が妨げられないことが望ましくあり得る。例えば、アルブミンが、活性化後に化学結合によってＦＶＩＩＩに結合したままである場合、それはＦＶＩＩＩ活性の自然な崩壊を妨げ、さらなる血液凝固を促進し得る。この問題の可能性を排除するために、トロンビン切断可能なペプチドをクリックケミストリーリンカーに導入することができる。図１３は、トロンビン切断部位をリンカーに組み込むためのスキームを示す。このペプチドをＮ−ヒドロキシスクシンイミド−ＰＥＧ９−ＴＣＯで処理して、ＴＣＯ標識されたペプチドを作製することができる。これを、マレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンで以前に標識したＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ（またはＣＭ１１０）と混合することができる。ＴＣＯとメチルテトラジンとの反応により、末端システインを有するペプチドを含むＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ分子が作製される。マレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンで処理して、末端メチルテトラジンを含むペプチドで標識されたＣＭ１１０ｓｈｏｒｔを作成することができる。次いで、この分子を、マレイミド−ＰＥＧ９−ＴＣＯで以前に標識されたＦＶＩＩＩと混合することができる。上記のプロセスはまた、ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ（総称してＣＭ１１０ｓ）の代わりにＣＭ１１０で使用することができる。クリックケミストリーペアの反応により、ＣＭ２１１ｓ（ＣＭ２１１およびＣＭ２１１ｓｈｏｒｔの両方）が作製された。図１４は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅでクロマトグラフィーを行ったとき、すべてのＦＶＩＩＩ活性が非常により早く溶出することを示しており、ＣＭ２１１ｓの形成が成功したことを示している。ＣＭ１１０およびＣＭ１１０ｓｈｏｒｔにおけるトロンビン切断部位と同様に、切断可能なペプチドを第Ｘａ因子切断部位を用いて構築することもできる。
【０１５３】
実施例１０修飾ＦＶＩＩＩおよびＤ’ｓｈｏｒｔ含有融合タンパク質の遺伝子融合。
免疫グロブリンＦｃ領域のコード配列を追加するように、ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を修飾することができる。Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ、例えば、第２の免疫グロブリンＦｃ領域に結合されるｖＷＦの断片であるＤ’をコードする第２の遺伝子を作製することができる。これらの２つの遺伝子を別々のプラスミドまたは単一のバイシストロン性プラスミドに挿入することができる。これらの２つの配列が転写されてタンパク質に翻訳されたとき、細胞はジスルフィド結合を介してそれらを一緒に結合する。このような融合は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００２３９５９号に開示される方法では、Ｄ’Ｄ３の代わりに、Ｄ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ、例えば、Ｄ’を用いることによって作製することができる。
【０１５４】
実施例１１システインが挿入されたＦＶＩＩＩの使用
ＣＭ１１０ｓの結合に使用するための新しいシステインを挿入するように、第ＶＩＩＩ因を修飾することができる（Ｒａｄｔｋｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．５，１０２−１０８，（２００７），Ｍｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６，２７０−２７９，（２０１０））。例えば、リジン１０８４をシステインに変異させることにより、分子の表面に新しい結合が配置され、活性に影響はない。この変異を使用して、６０ＫＤＰＥＧ分子をＦＶＩＩＩに結合した。同様に、新しいシステインを使用して、マレイミド−ＰＥＧ９−トランスシクロオクテンなどのクリックケミストリー標的を結合させることができる。次いで、これをマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンで修飾されたＣＭ１１０と反応させることができる。クリックペアの反応により、ｃｙｓ３１０またはｃｙｓ６９２以外の結合を使用してＣＭ２１１ｓが合成される。
【０１５５】
実施例１２ＦＶＩＩＩの炭水化物側鎖への、ＣＭ１１０ｓの部位特異的付加
ＦＶＩＩＩは、ＯおよびＮの両方が結合した複数のグリコシル化部位を有する（Ｏｒｌｏｖａ，２０１３）。これらのグリコシル化部位は、クリックケミストリーベースの炭水化物の結合部位として使用でき、したがって、ＣＭ１１０ｓのアンカーとして使用することができる。例えば、Ｎ８は、Ｂドメインの小さな断片のみを含み、単一のＯ−グリコシル化部位のみを保持する工学的操作されたＦＶＩＩＩである（Ｔｈｉｍ，２０１０）。Ｏ−グリカンに特異的な一連の酵素を使用して、Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ、２０１３））は、大きなＰＥＧ分子をその部位に特異的に結合させることができた。同様のアプローチを使用して、クリックケミストリー可能なグリカンを挿入することができる（Ｚｈａｎｇ，２０１３）。最初にＦＶＩＩＩを脱シアル化した後、ＳＴ３ＧａｌＩを使用して、アジドシアル酸を単一のＯ−グリカン部位に特異的に付加させることができる。次いで、クリックケミストリーパートナーであるＢＣＮ（ビシクロオクチン）またはＤＢＣＯ（ジベンジルシクロオクテン）により、アジドを標的化することができる。
【０１５６】
実施例１３ＣＭ１１５の合成および生成
合成タンパク質ＣＭ１１５（配列番号１１で表される）は、ＦＶＩＩＩを分解および非特異的結合から保護し、内因性ｖＷＦから引き離し、血中半減期を延長するように設計される。特定の実施形態では、ＣＭ１１５タンパク質は、ｖＷＦの特定のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ領域、６８アミノ酸のグリシン、セリンに富むリンカー、および全長ヒトアルブミンから構成することができる。このタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列をＧｅｎｅ  Ａｒｔによって合成し、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．４ＴＯＰＯに挿入した。このプラスミドをヒト胎児腎臓細胞株Ｅｘｐｉ２９３に一過的にトランスフェクトすることにより、４日間にわたる培養で細胞上清中にかなりの量のタンパク質が生成された。
【０１５７】
ＨＳＡアフィニティーカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンパク質を上清から直接精製した。このタンパク質は、１２２，７１４の予測された分子量を有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約１１０，０００で泳動することが見られた（図１５Ａ）。ＣＭ１１５をトロンビンで処理したとき、いくつかの断片が作られ、フォン・ヴィレブランド断片がアルブミンから分離される。ＣＭ１１５をマレイミド−Ａｌｅｘａ４８８で標識し、トロンビンで処理したとき、すべての標識がアルブミン断片とともに残存し（図１５Ｂ）、アルブミンのシステイン３４のみが標識されることを示している。
【０１５８】
実施例１４ＣＭ１１５の第ＶＩＩＩ因子への結合−
上記のようにして生成されたＣＭ１１５を、１００μＭマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンで１時間処理した。未反応のマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンを、４０ｋｄの分子量のカットオフスピンカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。次いで、この標識されたＣＭ１１５を、１．５ｍＭ  ＴＣＯで標識された切断可能なペプチドと反応させた。未反応のペプチドを同様のスピンカラムで除去した。次いで、ＣＭ１１５−ペプチドを１００μＭマレイミド−ＰＥＧ４−メチルテトラジンで処理し、再び、未反応の標識をスピンカラムを使用して除去した。
【０１５９】
次いで、この標識されたＣＭ１１５ペプチドを、ＴＣＯ標識されたシステイン修飾ＦＶＩＩＩと反応させることができる。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーおよび０．２５Ｍ塩化カルシウムを含む緩衝液を使用して、ＣＭ１１５−ＦＶＩＩＩコンジュゲートを上記のようにして精製することができる。
【０１６０】
材料および方法
ＦＶＩＩＩ（Ｂ領域欠失）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｗｈｏｌｅｓａｌｅから購入した。
【０１６１】
ＦＶＩＩＩ活性アッセイ−ＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｍａｔｉｃ  ＦＶＩＩＩ発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用して測定した。
【０１６２】
ゲル電気泳動−試料を４〜１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓ勾配ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で泳動した。
【０１６３】
トロンビン生成アッセイ−トロンビン生成を、蛍光発生Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎトロンビン生成キットおよびＤｉａｐｈａｒｍａからの試薬を使用して測定し、ＢｉｏＴｅｋ  ＦＬ−６００プレートリーダーで測定した。ＣＭ２１１を使用したトロンビン生成では、既知濃度のタンパク質をＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＦＶＩＩＩ欠損血漿に希釈した。各アッセイはまた、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ基質およびＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ｌｏｗ  ＲＣを含んだ。すべての試薬はＤｉａｐｈａｒｍａからである。
【０１６４】
活性化部分トロンボプラスチン時間−ＴｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅＳｉｒｏｎ  ＬＩＳ液（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用し、Ｌａｂｏｍｅｄ  ＳＣＯ−２０００  凝固計で、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定した。
【０１６５】
ＣＭ１１０の生成および精製−コンパニオンタンパク質であるＣＭ１１０は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３領域、リンカー（例えば、５６アミノ酸のグリシンセリンに富むアミノ酸リンカー）、および全長ヒトアルブミンから構成される。プラスミドｐＣＭ１１０は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２および７６４〜１２４７、５６アミノ酸リンカー、ヒトアルブミンのアミノ酸２５〜６０９、および６Ｘ  ｈｉｓタグを含む。プラスミドｐＣＭ１１０ＲＭは、ｖＷＦにおけるｃｙｓ１０９９およびｃｙｓ１１４２に対応するシステインに代えて置換されたアラニンを含む。プラスミドｐＣＭ１１０ＲＭＨＭは、アラニン変異を有するが、Ｈｉｓタグを欠失していた。アルブミンアフィニティーカラムは、ＨｉｓＴＲＡＰ精製よりも非常に効率的であったため、記載のすべての作業はプラスミドｐＣＭ１１０ＲＭＨＭを使用する。
【０１６６】
ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔの生成および精製−コンパニオンタンパク質であるＣＭ１１０ｓｈｏｒｔは、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のＤ’Ｄ３ｓｈｏｒｔ領域（例えば、セリン７６４からシステイン１０３１、セリン７６４からアスパラギン８６４（完全Ｄ’ドメイン）、セリン７６４からシステイン８６３、ロイシン７６５からシステイン８６３、ロイシン７６５からアスパラギン８６４、セリン７６６からシステイン８６３、セリン７６６からアスパラギン８６４、セリン７６４からアルギニン１０３５、セリン７６４からリジン１０３６、セリン７６４からセリン９００、セリン７６４からシステイン１０９９、セリン７６４からシステイン１１４２、およびセリンからプロリン１２４０）、リンカー（例えば、５６アミノ酸のグリシンセリンに富むアミノ酸リンカー）、および全長ヒトアルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンＦｃドメイン、またはＦｃ断片から構成される。１つの例示的なＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ（ＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ７６４〜８６３ＬＷＡ）は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２および７６４〜８６３、５６アミノ酸リンカー、および全長ヒトアルブミンを含む。プラスミドｐＣＭ１１０ｓｈｏｒｔは、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２および７６４〜８６３、５６アミノ酸リンカー、ヒトアルブミンのアミノ酸２５〜６０９、および６Ｘ  ｈｉｓタグを含む。プラスミドｐＣＭ１１０ｓｈｏｒｔＨＭではＨｉｓタグを削除した。アルブミンアフィニティーカラムは、ＨｉｓＴＲＡＰ精製よりも非常に効率的であったため、記載のすべての作業はプラスミドｐＣＭ１１０ＨＭを使用する。
【０１６７】
ＣＭ１１５の生成および精製−コンパニオンタンパク質であるＣＭ１１５は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のＤ‘およびＤ３領域の特定の部分（セリン７６４からプロリン１１９７まで）、リンカー（例えば、２つのトロンビン認識部位を含む、６８アミノ酸のグリシンセリンに富むリンカー）、および全長アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンＦｃドメイン、またはＦｃ断片から構成される。１つの例示的なＣＭ１１５（ＣＭ１１５ＥＭ）は、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２および７６４〜１１９７、６８アミノ酸リンカー、および全長ヒトアルブミン（配列番号１１）を含む。プラスミドＣＭ１１５ＥＭは、ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸１〜２２、７６４〜１１９７、６８アミノ酸のリンカー、および全長アルブミンのアミノ酸２５〜６０９を含む。
【０１６８】
Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により、各構築体をコドン最適化し、合成し、およびｐｃＤＮＡ３．４ＴＯＰＯに挿入した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｍａｃｈ１  Ｔ１コンピテント細菌（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にトランスフェクトし、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｈｉｐｕｒｅプラスミドフィルターキットを使用して精製した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキットを製造元の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って使用して、精製したプラスミドをＥｘｐｉ２９３ＨＥＫ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にトランスフェクトした。
【０１６９】
トランスフェクション後の４日間、培地を回収し、７，５００×ｇで２０分間遠心分離して細胞および細胞破片を除去した。清澄化した上清（５００ｍｌ）を、５０ｍｌのＳｕｐｅｒｌｏｏｐを備えたＡｋｔａ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＰＯＲＯＳ  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＨＳＡ  １０Ｘ１００ｍｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に、３ｍｌ／分の流速で直接アプライした。試料全体をアプライした後、カラムをさらに１０カラム体積の同じ緩衝液で洗浄した。２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む同じ緩衝液を使用して、ＣＭ１１０またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔをカラムから溶出した。次いで、ＣＭ１１０またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔをＺｅｂａ  １０ｍｌスピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に通過させて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２に平衡化した。約１５ｍｇのＣＭ１１０を５００ｍｌの培養液から定期的に回収する。ＣＭ１１０を同様の量で回収される。タンパク質測定と組み合わせたＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＨＳＡ  Ｅｌｉｓａキット（Ａｂｃａｍ）を使用して、ＣＭ１１０またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔを定量化する。ＣＭ１１０は、５５重量％のアルブミンである。実施例７に示されるＣＭ１１０ｓｈｏｒｔは、８０重量％のアルブミンである。ＣＭ１１５は、５５重量％のアルブミンである。
【０１７０】
クリックケミストリー−メチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミド（Ｔｅｔ−Ｐ４−ｍａｌ）およびトランス−シクロオクテン−ＰＥＧ１２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＴＣＯ−Ｐ１２−ＮＨＳ）をＢｒｏａｄｐｈａｒｍから入手し、ジメチルスルホキシドに１０ｍＭで溶解させ、液体窒素中で保存した。
【０１７１】
ＣＭ１１０（またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２中の５ｍｇ／ｍｌでの０．５ｍｌを、１ｍＭ  ＴＣＯ−Ｐ１２−ＮＨＳで、室温、暗所で２時間処理した。次いで、この溶液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡化した、較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（１０Ｘ３００ｍｍ）にアプライした。ＣＭ１１０（またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ）を含む画分をＡ２８０によって同定し、プールした。
【０１７２】
Ｂ領域欠失第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ｗｈｏｌｅｓａｌｅから入手した。約６，０００ＩＵを、３つの２，０００ＩＵバイアルから直接的に１ｍｌの水に溶解した。Ｔｅｔ−Ｐ４−ｍａｌを添加して０．１ｍＭとし、溶液を暗所、室温で、２時間インキュベートした。０．５ｍｌのアリコートを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（１０Ｘ３００）に通過させ、画分をＡ２８０によって収集し、ＦＶＩＩＩ活性についてアッセイした。Ｃｏａｍａｔｉｃ  ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用して、第ＶＩＩＩ因子活性を測定した活性を含む画分をプールした。
【０１７３】
標識されたＣＭ１１０（またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ）およびＦＶＩＩＩを合わせ、水で１〜２に希釈してＮａＣｌを１５０ｍＭに低減させ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心フィルター（Ｕｌｔａｒａｃｅｌ−３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して０．２ｍｌに濃縮した。フィルターを０．１ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２ですすぎ、これを元の溶液に添加した。溶液を暗所で室温で２時間インキュベートした。
【０１７４】
溶液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（１０Ｘ３００）にアプライした。ＦＶＩＩＩ活性を含む画分をプールし、液体窒素で凍結した。
【０１７５】
標識取り込みの測定−全く上記の通りであるが、フルオレセイニルマレイミド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用して、既知濃度をＦＶＩＩＩのＩＵによってインキュベートすることにより、ＦＶＩＩＩ標識取り込みを測定した。ＣＭ１１０またはＣＭ１１０ｓｈｏｒｔ標識を、上記のように標識し、次いで１ｍＭのｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ−テトラジンと反応させることにより推定した。いずれの場合も、標識後、溶液を小さなＺｅｂａスピンカラムに通過させて、遊離標識を除去した。蛍光をＢｉｏＴｅｋ  ＦＬ−６００で読み取った。
【０１７６】
蛍光標識されたＦＶＩＩＩを１Ｕのトロンビン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。ゲル電気泳動緩衝液を添加して反応を停止し、試料を４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル上で泳動した。
【０１７７】
マウス研究−すべてのマウスの実験をＪａｃｋｓｏｎ研究所で行った。０．２ｍｌの適切なタンパク質溶液を静脈内または皮下注射することにより、半減期および機能研究を行った。ＦＶＩＩＩの機能および半減期研究では、溶液は、Ｃｏａｔｅｓｔアッセイにより測定されるように１００ＩＵ／ｍｌを含んだ。ＣＭ１１０半減期測定では、溶液は１０ｍｇ／ｍｌを含んだ。ＣＭ２１１では、溶液は、ＡＰＴＴで測定されるように１００Ｕを含み、これは、Ｃｏａｔｅｓｔによる約６００Ｕ／ｍｌに相当する。
【０１７８】
参考文献
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Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ．，Ｂｒｅｗｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｍａｕｓｅｒ−Ｂｕｎｓｃｈｏｔｅｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｋｅｙ，Ｎ．Ｓ．，Ｋｉｔｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｌｌｉｎａｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１９（１），ｅ１−ｅ４７．
Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．，Ｋｊａｌｋｅ，Ｍ．，Ｋａｒｐｆ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｌｌｉｎｇ，Ｋ．Ｗ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｌｍ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂ−ｄｏｍａｉｎ  Ｏ−ｇｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＦＶＩＩＩ（Ｎ８−ＧＰ）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｆｕｌｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１２１（１１），２１０８−２１１６．
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ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｌｉｅｒ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｔａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｄｒａｇｅｒ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ＦｃＲｎ  Ｒｅｓｃｕｅｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ＶＷＦ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＦＶＩＩＩ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，１０（４），ｅ０１２４９３０−２３．
Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，＆Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．（２０１３）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，４５２（２），２９３−３０１．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０４２／ＢＪ２０１３００２５
Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ｋｏｓｚｅｌａｋ，Ｍ．Ｅ．，Ｍａｓｔｒｉ，Ｍ．，＆Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．（２００１）．Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  Ｃｏｐｐｅｒ  Ｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｆａｃｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒ−Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  †．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３４），１０２９３−１０３００．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｉ０１０３５３ｑ
Ｙｅｅ，Ａ．，Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｇｕ，Ｓ．，Ｋｒｅｔｚ，Ｃ．Ａ．，ＭｃＧｅｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｃａｒｒ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄ’Ｄ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ，１２４（３），４４５−４５２．
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（２０１３）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｚｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８，７１４５−７１５９．
Ｚｈｏｕ，Ｈ．−Ｘ．（２００６）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏ−Ｒｉｃｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ＳＨ３  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９１（９），3170-3181．
【０１７９】
【数１−１】
2022501373.tif 000007
【数１−２】
2022501373.tif 000008
【数２−１】
2022501373.tif 000009
【数２−２】
2022501373.tif 000010
【数３】
2022501373.tif 000011
【数４】
2022501373.tif 000012
【数５】
2022501373.tif 000013
【数６】
2022501373.tif 000014
【数７】
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【数８】
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【数９】
2022501373.tif 000017
【数１０】
2022501373.tif 000018
【数１１】
2022501373.tif 000019
【図１】
2022501373.tif 000021
【図２−１】
2022501373.tif 000022
【図２−２】
2022501373.tif 000023
【図３−１】
2022501373.tif 000024
【図３−２】
2022501373.tif 000025
【図４】
2022501373.tif 000026
【図５】
2022501373.tif 000027
【図６】
2022501373.tif 000028
【図７】
2022501373.tif 000029
【図８】
2022501373.tif 000030
【図９】
2022501373.tif 000031
【図１０】
2022501373.tif 000032
【図１１】
2022501373.tif 000033
【図１２】
2022501373.tif 000034
【図１３】
2022501373.tif 000035
【図１４】
2022501373.tif 000036
【図１５】
2022501373.tif 000037
【配列表】
2022501373000001.app
【国際調査報告】
2022501373.tif 000038
2022501373.tif 000039
2022501373.tif 000040