(57)【要約】本開示は、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素の発現が増加または減少した遺伝子組換え細胞及び遺伝子組換え植物を提供する。本発明の遺伝子組換え細胞及び遺伝子組換え植物は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞または非組換え植物と比較して増加または減少する。また本開示は、遺伝子組換え細胞内にステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法、植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を低減させる方法、並びに、植物またはその少なくとも一部の或る細胞におけるステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法を提供する。【選択図】３３Ｅ
2022500023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して増加した遺伝子組換え細胞であって、
少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加した、遺伝子組換え細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子組換え細胞であって、
少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、
酵素をコードする少なくとも１つの追加の異種遺伝子をさらに発現し、
前記酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、遺伝子組換え細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記少なくとも１つの異種遺伝子をコードする核酸配列は、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、遺伝子組換え細胞。
【請求項４】
請求項１または２に記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、遺伝子組換え細胞。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子によりコードされる前記酵素、及び、該異種遺伝子をコードする核酸配列は、
（ａ）サポニンβ−アミリン合成酵素、及び、配列番号４５に記載の核酸配列、または、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６３に記載の核酸配列であるか、または、配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７４に記載の核酸配列であるか、または、配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、遺伝子組換え細胞。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子によりコードされる前記酵素、及び、そのアミノ酸配列は、
（ａ）サポニンβ−アミリン合成酵素、及び、配列番号４８に記載のアミノ酸配列、または配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６４に記載のアミノ酸配列、または配列番号６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、遺伝子組換え細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体は、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、遺伝子組換え細胞。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
（ａ）前記ステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド、デヒドロエスクレオシド、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｂ）前記ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｃ）前記トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｄ）前記トリテルペノイド系サポニンの前記生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の任意の組み合わせである、遺伝子組換え細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の遺伝子組換え細胞であって、
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量が改変された、遺伝子組換え細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記細胞は、植物細胞、酵母細胞、または藻類細胞を含む、遺伝子組換え細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記植物細胞は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目の植物の細胞を含む、遺伝子組換え細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の遺伝子組換え細胞であって、
（ａ）前記植物細胞がイネ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される、
（ｂ）前記植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される、
（ｃ）前記植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される、
（ｄ）前記植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される、
（ｅ）前記植物細胞がアオイ目の植物の細胞を含む場合、前記植物はカカオ属から選択される、
（ｆ）前記植物細胞がセリ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される、または、
（ｇ）前記植物細胞がフウチョウソウ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される、遺伝子組換え細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子組換え細胞であって、
（ａ）前記植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される、
（ｂ）前記植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、トマト、ワイルドトマト、ジャガイモ、ワイルドポテト、ナス、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、グランドチェリー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される、または、
（ｃ）前記植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される、遺伝子組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の遺伝子組換え細胞であって、
（ａ）前記植物細胞は、
（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、デヒドロトマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物の細胞であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたトマト植物の細胞である、
（ｂ）植物細胞は、
（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物の細胞であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたジャガイモ植物の細胞である、または、
（ｃ）植物細胞は、
（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物の細胞であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたナス科植物の細胞である、遺伝子組換え細胞。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記植物細胞は、葉の細胞、葉柄の細胞、植物の茎または幹の細胞、根の細胞、芽の細胞、塊茎の細胞、豆の細胞、穀物または穀粒の細胞、果実の細胞、木の実の細胞、マメの鞘の細胞、種子または種子の細胞、仮皮の細胞、包葉の細胞、または花の細胞を含む、遺伝子組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれかに記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記植物細胞は、植物またはその一部の細胞を含み、
前記植物の一部は、植物の葉、植物の葉柄、植物の茎または幹、植物の根、植物の芽、植物の塊茎、植物の豆、植物の穀物または穀粒、植物の果実、植物の木の実、植物のマメの鞘、植物の種子、植物の包葉、または植物の花を含む、遺伝子組換え細胞。
【請求項１７】
請求項１０に記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される、遺伝子組換え細胞。
【請求項１８】
請求項１０に記載の遺伝子組換え細胞であって、
前記藻類は、微細藻類、多細胞藻類、シアノバクテリア、珪藻類、緑藻植物（緑藻類）、紅藻植物（紅藻類）、褐藻植物（褐藻類）、ドナリエラ、クラミドモナス、またはヘマトコッカスから選択される、遺伝子組換え細胞。
【請求項１９】
セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え植物における前記ＣＳＬＧ遺伝子の発現と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物であって、
少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量が、対応する非組換え植物と比較して改変された、遺伝子組換え植物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記ＣＳＬＧ遺伝子は、内在性ＣＳＬＧ遺伝子を含む、遺伝子組換え植物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、突然変異を含み、
前記突然変異は、少なくとも１以上の点突然変異、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ａ）前記ＣＳＬＧ酵素は、安定性の向上、活性の増加、またはその両方を含み、前記含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して増加すること、または、
（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素は、安定性の低下、活性の低下、またはその両方を含み、前記含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して減少することである、遺伝子組換え植物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の遺伝子組換え植物であって、
（ａ）前記内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低下し、前記含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して減少すること、または、
（ｂ）前記内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、過剰発現し、前記含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して増加することである、遺伝子組換え植物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記内在性ＣＳＬＧ遺伝子が選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低下した場合、前記細胞は、前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子をさらに含み、
前記サイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子から選択されるか、または、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング系の構成要素である、遺伝子組換え植物。
【請求項２４】
請求項１９に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記ＣＳＬＧ遺伝子は、異種ＣＳＬＧ遺伝子を含み、
前記発現の改変は、前記異種遺伝子のデノボ発現を含む、遺伝子組換え植物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記発現の改変は、対応する非組換え細胞と比較して発現が増加することを含み、
前記含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加することを含む、遺伝子組換え植物。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、遺伝子組換え植物。
【請求項２７】
請求項１９〜２５のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、遺伝子組換え植物。
【請求項２８】
請求項１９〜２７のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現の改変は、
（１）前記核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、
（２）前記核酸配列内に欠失を導入すること、
（３）前記核酸配列内に挿入を導入すること、または、
（４）それらの任意の組み合わせを含み、
前記導入は、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、遺伝子組換え植物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の遺伝子組換え植物であって、
前記少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の前記発現の改変は、前記少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子を標的とするサイレンシング分子を導入することにより生じ、かつ、
（ａ）前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３０に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｂ）前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３４に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｃ）前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３８に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｄ）前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号６５または配列番号９３に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｅ）前記ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号９５に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、遺伝子組換え植物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体は、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、遺伝子組換え植物。
【請求項３１】
請求項１９〜３０のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
（ａ）前記ステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド、デヒドロエスクレオシド、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｂ）前記ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｃ）前記トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｄ）前記トリテルペノイド系サポニンの前記生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の任意の組み合わせである、遺伝子組換え植物。
【請求項３２】
請求項１９に記載の遺伝子組換え植物であって、
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量が改変された、遺伝子組換え植物。
【請求項３３】
請求項１９〜３２のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記植物は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目から選択される、遺伝子組換え植物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の遺伝子組換え植物であって、
（ａ）前記植物がイネ目の植物を含む場合、前記植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される、
（ｂ）前記植物がナデシコ目の植物を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される、
（ｃ）前記植物がナス目の植物を含む場合、前記植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される、
（ｄ）前記植物がマメ目の植物を含む場合、前記植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される、
（ｅ）前記植物がアオイ目の植物を含む場合、前記植物はカカオ属から選択される、
（ｆ）前記植物細胞がセリ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される、または、
（ｇ）前記植物がフウチョウソウ目の植物を含む場合、前記植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される、遺伝子組換え植物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の遺伝子組換え植物であって、
（ａ）前記植物がナデシコ目の植物を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される、
（ｂ）前記植物がナス目の植物を含む場合、前記植物は、トマト、ワイルドトマト、ジャガイモ、ワイルドポテト、ナス、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、グランドチェリー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される、または、
（ｃ）前記植物がマメ目の植物を含む場合、前記植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される、遺伝子組換え植物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の遺伝子組換え植物であって、
（ａ）前記植物は、
（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、デヒドロトマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたトマト植物である、
（ｂ）前記植物は、
（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたジャガイモ植物である、または、
（ｃ）前記植物は、
（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物であるか、または、
（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたナス科植物である、遺伝子組換え植物。
【請求項３７】
請求項２０〜３６のいずれかに記載の遺伝子組換え植物であって、
前記植物細胞は、葉の細胞、葉柄の細胞、植物の茎または幹の細胞、根の細胞、芽の細胞、塊茎の細胞、豆の細胞、穀物または穀粒の細胞、果実の細胞、木の実の細胞、マメの鞘の細胞、種子または種子の細胞、仮皮の細胞、包葉の細胞、または花の細胞を含む、遺伝子組換え植物。
【請求項３８】
遺伝子組換え細胞内にステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法であって、
（ａ）前記細胞内に少なくとも１つの異種遺伝子を導入する導入ステップであって、前記少なくとも１つの異種遺伝子がセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードしており、前記少なくとも１つの異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、該ステップと、
（ｂ）前記細胞内で前記少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる発現ステップと、を含み、
前記細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、少なくとも１つのステロイド系サポニン、または少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、
前記導入ステップは、
前記細胞内に少なくとも１つの追加の異種遺伝子を導入するステップであって、前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素をコードしており、前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、該ステップと、
前記細胞内で前記少なくとも１つの異種遺伝子を発現させるステップと、をさらに含む、方法。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の方法であって、
（ａ）前記少なくとも１つの異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、
（ｂ）前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、または、
（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせである、方法。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法であって、
前記導入ステップは、
前記少なくとも１つの細胞を、
（ａ）前記少なくとも１つの異種遺伝子、前記少なくとも１つの異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または前記少なくとも１つの異種遺伝子を含むベクター、
（ｂ）前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子、前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子を含むベクター、または、
（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせを用いて形質転換することを含み、
前記発現は、一過性発現または構成的発現を含む、方法。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法であって、
前記少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項４３】
請求項３８〜４２のいずれかに記載の方法であって、
前記コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項４４】
請求項３８〜４３のいずれかに記載の方法であって、
前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子によりコードされる前記酵素、及び、該異種遺伝子をコードする核酸配列は、
（ａ）サポニンβ−アミリン合成酵素、及び、配列番号４５に記載の核酸配列、または、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６３に記載の核酸配列であるか、または、配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７４に記載の核酸配列であるか、または、配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項４５】
請求項３８〜４３のいずれかに記載の方法であって、
前記少なくとも１つの追加の異種遺伝子によりコードされる前記酵素、及び、そのアミノ酸配列は、
（ａ）サポニンβ−アミリン合成酵素、及び、配列番号４８に記載のアミノ酸配列、または配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または、配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６４に記載のアミノ酸配列、または配列番号６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び８０％のカバレッジを有するそのホモログ、
（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７５に記載のアミノ酸配列、または配列番号７５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項４６】
請求項３８〜４５のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）前記トリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｂ）前記ステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド、デヒドロエスクレオシド、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｃ）前記ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｄ）前記トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項４７】
請求項３８〜４６のいずれかに記載の方法であって、
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量を改変するステップをさらに含む、方法。
【請求項４８】
請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法であって、
前記細胞は、植物細胞、酵母細胞、または藻類細胞を含む、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、
（ａ）前記植物細胞は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目から選択される植物の細胞を含む、
（ｂ）前記酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される、または、
（ｃ）前記藻類は、微細藻類、多細胞藻類、シアノバクテリア、珪藻類、緑藻植物（緑藻類）、紅藻植物（紅藻類）、褐藻植物（褐藻類）、ドナリエラ、クラミドモナス、またはヘマトコッカスから選択される、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、
（ａ）前記植物細胞がイネ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される、
（ｂ）前記植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される、
（ｃ）前記植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される、
（ｄ）前記植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される、
（ｅ）前記植物細胞がアオイ目の植物の細胞を含む場合、前記植物はカカオ属から選択される、
（ｆ）前記植物細胞がセリ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される、または、
（ｇ）前記植物細胞がフウチョウソウ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、
（ａ）前記植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される、
（ｂ）前記植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、トマト、ワイルドトマト、ジャガイモ、ワイルドポテト、ナス、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、グランドチェリー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される、または、
（ｃ）前記植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、前記植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される、方法。
【請求項５２】
植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を低減させる方法であって、
前記少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、
前記遺伝子組換えステップは、
（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を用いて前記少なくとも１つの植物細胞を形質転換するステップ、または、
（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、前記突然変異が、（１）前記核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）前記核酸配列内に欠失を導入すること、（３）前記核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、前記導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、
遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞における前記ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、対応する非組換え植物の細胞と比較して減少し、
前記遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少する、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、
前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列は、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、もしくは１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載の方法であって、
（ａ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列が配列番号３０に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列が配列番号３４に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｃ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列が配列番号３８に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｄ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列が配列番号６５または配列番号９３に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、
（ｅ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列が配列番号９５に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項５５】
請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）前記ステロイド系アルカロイド、前記ステロイド系サポニン、または前記トリテルペノイド系サポニンは、毒素または苦味化合物を含むか、ホルモン模倣特性を有するか、またはそれらの組み合わせであり、
（ｂ）前記ステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド、デヒドロエスクレオシド、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｃ）前記ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｄ）前記トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｅ）前記トリテルペノイド系サポニンの前記生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項５６】
請求項５２〜５５のいずれかに記載の方法であって、
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量を改変するステップをさらに含む、方法。
【請求項５７】
植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法であって、
前記少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、
前記遺伝子組換えステップは、
（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、前記突然変異が、（１）前記核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）前記核酸配列内に欠失を導入すること、（３）前記核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、前記導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、
（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記核酸配列を発現させるステップと、を含み、
遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物にと比較して増加する、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、
前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の前記核酸配列は、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、
配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、もしくは１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項５９】
請求項５７に記載の方法であって、
前記ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、
配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである、方法。
【請求項６０】
請求項５７〜５９のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）前記ステロイド系アルカロイド、前記ステロイド系サポニン、または前記トリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｂ）前記ステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド、デヒドロエスクレオシド、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｃ）前記ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｄ）前記トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｅ）前記トリテルペノイド系サポニンの前記生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、
（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項６１】
請求項５７〜６０のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）前記遺伝子組換え細胞における、前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の発現は、対応する非組換え植物の細胞と比較して増加する、
（ｂ）前記遺伝子組換え細胞における、前記ＣＳＬＧ酵素の活性は、対応する非組換え植物細胞と比較して増加する、
（ｃ）前記遺伝子組換え細胞における、前記ＣＳＬＧ酵素の安定性は、対応する非組換え植物の細胞と比較して向上する、または、
（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の任意の組み合わせである、方法。
【請求項６２】
請求項５７〜６１のいずれかに記載の方法であって、
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、
コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、
フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体
の含有量を改変するステップをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／８３１、１６４（２０１３年６月５日出願）に基づく優先権を主張する、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＩＬ２０１４／０５０４９７号（国際出願日は２０１４年６月２日）の国内段階出願として出願された、米国特許出願第１４／８９５、０５９号（２０１５年１２月１日出願）の継続部分出願である、米国特許出願第１６／１２３、２４８号（２０１８年９月６日出願）に基づく優先権を主張するものである。上記の各出願の開示内容は、参照により本明細書中に援用される。また、本出願は、イスラエル国特許出願第２６８２６９号（２０１９年７月２５日出願）に基づく優先権も主張するものである。上記の出願の開示内容は、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
植物界では、何十万種類もの低化合物が産生されており、その多くは属や科に固有のものである。３０万種以上の植物の特異的代謝物（ＳＭ）の膨大な構造多様性は、それらのコア構造の様々な修飾により生じる。植物のＳＭは最も頻繁にグリコシル化され、このグリコシル化は、特異的代謝物（ＳＭ）の区画化、活性、溶解性、安定性、及び毒性に大きな影響を与える。特異的代謝物（ＳＭ）は、低分子量の窒素含有有機化合物であり、一般的には複素環構造を有する。
【０００３】
サポニン−アルカロイド化合物の広範なグループは、植物界に広く分布し、サイトゾルのメバロン酸イソプレノイド生合成経路に由来する。サポニン及びステロイドアルカロイド（ＳＡ）は、植物が産生する特異的代謝物（ＳＭ）の２つの大きなクラスである。
【０００４】
サポニンは、無数の植物種と１００以上の科に見られる特異的代謝物（ＳＭ）の大きなグループであり、１以上のグリコシド部分で修飾された親油性トリテルペノイドまたはステロイド骨格（アグリコン）を表す。
【０００５】
サポニンは、その名前（ラテン語で石鹸を意味する）が示唆しているように、両親媒性構造を有するため、水溶液中では石鹸のような性質を示す。サポニンのユニークな物理化学的特性は、植物界において、抗真菌性、抗菌性及び殺虫性を含む幅広い機能を提供する。サポニンの活性は、アグリコンの構造に依存するが、多くの場合、結合した糖にさらに依存する。例えば、オレアノール酸やメジカゲン酸（ＭＡ）由来のサポニンは、Ｃ−２８位にカルボキシルが存在することに起因して溶血作用を示すが、アベナシンＡ−１は、殺菌性を示すためには、Ｃ−３位にＬ−アラビノースが結合していることを必要とする。さらに、コレステロール由来のステロイドサポニンは、植物界に広く存在し、その構造は非常に多様であり、Ｃ−５、６位が飽和しているもの（例えば、サラサポゲニン）もあるし、Ｃ−５、６位が不飽和のもの（例えば、ジオスゲニン）もある。
【０００６】
多くの報告が、抗炎症及び免疫増強（アジュバント）から抗癌特性に至るまでの、ヒトの健康及び医療用途に対するサポニンの利点を強調している。糖活性酵素（ＣＡＺＹ）糖転移酵素１（ＧＴ１）スーパーファミリーに属するＵＤＰ糖転移酵素（ＵＧＴ）メンバーは、サポニン及び他のすべての特異的代謝物（ＳＭ）クラスにおいて糖転移反応を行う。サポニンを装飾する最も一般的な糖類としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、及びＤ−フコースが挙げられる。
【０００７】
サポゲニンのＣ−３位に結合したグルクロン酸の存在は、ナデシコ目の種で特に一般的であるが、それに関与する酵素は依然として不明である。
【０００８】
したがって、トリテルペノイドサポニンを含むサポニン類を産生するための代謝経路に関与する酵素に関する知識、例えば、キレイン酸などにグルクロン酸を結合させるセルロース合成酵素様Ｇに関する知識に対する満たされていないニーズが依然として存在する。上記の知識が得られれば、自然に産生される産物の含有量を改変させるために、植物において鍵となる酵素を制御することができる。例えば、酵素を過剰に発現させたり、安定性を高めたりすることによって、天然の甘味料を大量に産生することができる。また、酵素を遺伝子レベルで下方制御することによって、植物産物（例えば、キノア）に苦味を加える化合物の産生を減少させることができる。さらに、高価値のサポニン（これに限定しないが、例えば、トリテルペノイドサポニン）を商業量で提供するために、異種系でこれらのサポニンを産生する方法に対する満たされていないニーズが依然として存在する。これらの高価値サポニンは、これに限定しないが、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。
【０００９】
加えて、アルカロイドなどの一部の特異的代謝物（ＳＭ）は、それらを産生する細胞にとって不可欠ではなく、生物の全体的な適応度に寄与するため、しばしば二次代謝産物と呼ばれる。アルカロイドは、一般的には複素環構造を有する、低分子量の窒素含有有機化合物であり、植物におけるそれらの生合成は、発生段階では、ストレス及び病原体に応答して厳密に制御されている。
【００１０】
例えば、ステロイドアルカロイド（ＳＡ）は、ナス目（Solanales order）の多数の植物に多く含まれていることから「ソラマメアルカロイド」とも呼ばれており、幅広い範囲の科の多数の植物に共通して存在することが分かっている。ステロイドアルカロイド（ＳＡ）は、多様な構造組成及び生物活性を有する。これらは低分子量の窒素含有コレステロール由来有機化合物であり、一般的には、Ｃ−２７コレスタン骨格と複素環窒素成分とから成る複素環構造を有する。
【００１１】
ナス属は、１３５０種と推定される顕花植物の中でも最大級の属であり、ナス科（ナス目）に属する種の約半分を代表する。ナス種としては、例えば、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ビタースイート（Solanum dulcamara）、ナス（Solanum melogena）などの食用植物が挙げられる、また、ナス科には、トウガラシ属（例えば、コショウ）などの様々な属が含まれる。ステロイドアルカロイド（ＳＡ）はまた、ユリ科の多くの種においても産生される。そのため、ステロイドアルカロイド（ＳＡ）は、広範な調査の対象となっている（Eich E. 2008. Solanaceae and Convolvulaceae - secondary metabolites: biosynthesis, chemotaxonomy, biological and economic significance: a handbook. Berlin: Springer）。
【００１２】
Ｃ−２７コレスタン骨格と複素環窒素成分とから成るステロイドアルカロイド（ＳＡ）は、サイトゾル内でコレステロールから合成されると考えられている。コレステロールからアルカミンＳＡへの変換には、いくつかの水酸化、酸化、及びアミノ基転移反応（上記のEich 2008）を必要とし、ほとんどの場合、さらにグリコシル化してステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）を形成する必要がある（Arnqvist L. et al. 2003. Plant Physiol. 131:1792-1799）。ＳＡのグリコシル化により、付加されたオリゴ糖部分の成分がアルカミンステロイド骨格（アグリコン）のＣ−３−β（Ｃ−３β）のヒドロキシル基に直接共役したステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）が産生される。ＳＧＡの生合成は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、及びＬ−アラビノースなどの様々なオリゴ糖部分でアグリコンを修飾するＵＤＰ−糖転移酵素（ＵＧＴ）をコードする遺伝子に依存し、最初の２つの単糖が主要な単位となる。
【００１３】
ステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）は、ナス科の数多くの植物、及び他の多くの植物科によって産生される。ＳＧＡの例としては、トマト（Solanum lycopersicu）のα−トマチン及びデヒドロトマチン、ジャガイモ（Solanum tuberosum）のα−カコニン及びα−ソラニン、ナス（Solanum melongena）のα−ソラマルギン及びα−ソラソニンが挙げられる。また、ＳＧＡは、トウガラシ属の様々な種類のコショウにも見られる。トマトでは１００種類以上のＳＧＡが確認されており（Itkin et al. , 2011, Plant Cell 23:4507-4525）、ジャガイモでは５０種類以上のＳＧＡが確認されている（Shakya and Navarre, 2008, J. Agric. Food Chem. 56:6949-6958）。ナスにも、少なくとも１種類のＳＧＡが含まれている（Friedmann, 2006, J. Agric. Food Chem. 54:8655-8681）。
【００１４】
ステロイドアルカロイド（ＳＡ）及びステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）は、広範囲の病原体から植物を保護する役割を果たしており、フィトアンチシピン（抗菌性化合物）として知られている。ＳＧＡは、細菌、真菌、卵菌、ウイルス、昆虫、及びより大型の動物などの、広範囲の病原体や捕食者に対する植物の耐性に寄与する。植物の食用部分に含まれるいくつかのＳＧＡは、その毒性作用に起因して、ヒトや他の哺乳類にとって抗栄養化合物と見なされる。例えば、ＳＧＡのα−カコニンとα−ソラニンはジャガイモに含まれる主要な毒性物質であり、胃腸障害や神経障害を引き起こす可能性があり、高濃度の場合にはヒトに対して致死的な影響を与える可能性がある。毒性の機序としては、膜の破壊、及びアセチルコリンエステラーゼ活性の阻害（Roddick J.G. 1989. Phytochemistry 28:2631-2634）がある。このような理由から、食用塊茎の新鮮重量において総ＳＧＡ濃度が２００ｍｇ／ｋｇを超えると、ヒトの消費に対して安全ではないと考えられる。
【００１５】
ステロイド系アルカロイドの生合成経路を解明し、その産生を制御する試みが行われている。特許文献１には、ソラニジンＵＤＰ−グルコースグルコシルトランスフェラーゼ（ＳＧＴ）という酵素をコードするジャガイモ由来のＤＮＡ配列が開示されている。また、特許文献１には、ＳＧＴの産生を阻害することによって、ナス科植物、例えばジャガイモにおけるグリコアルカロイドのレベルを低減するための手段及び方法がさらに開示されている。
【００１６】
同様に、特許文献２及び特許文献３には、ＵＤＰ−グルコース：ソラニジングルコシルトランスフェラーゼ（ＳＧＴ２）及びβ−ソラニン／β−カコニンラムノシルトランスフェラーゼ（ＳＧＴ３）をコードするジャガイモ由来の核酸配列がそれぞれ開示されている。また、特許文献２及び特許文献３には、この核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子、及びその使用、特に、ＳＧＴ２／ＳＧＴ３の産生を阻害し、それによって、ジャガイモなどのナス科植物における主要なステロイド系グリコアルカロイドα、α−カコニン、及びα−ソラニンのレベルを低減するための該核酸配列及びアンチセンス構築物の使用も開示されている。
【００１７】
近年、トマトのステロイドアルカロイドの代謝に関与すると考えられる３つの糖転移酵素が同定された（グリコアルカロイド代謝１−３（ＧＡＭＥ１−３））。より具体的には、ＧＡＭＥ１発現が改変されると、トマト植物のＳＡプロファイルが、繁殖部分及び栄養部分の両方で変化する。これらの遺伝子は、リコテトラオース部分を産生することにより、トマチジン（α−トマチンの前駆体）の代謝に部分的に関与していることが示唆されている（上記の「Itkin et al., 2011」）。
【００１８】
特許文献４は、ステロール配糖体転移酵素をコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニック生物または細胞を産生する方法を開示している。このトランスジェニック生物には、細菌、真菌、植物、動物が含まれ、これらは、野生型の生物または細胞と比べて、ステロイドグリコシド、ステロイドアルカロイド、及び／またはステロールグリコシドの産生量の増加を示す。この合成化合物は、植物の保護のためだけでなく、製薬業界や食品業界においても有用である。
【００１９】
特許文献５には、ナス科の植物、例えばジャガイモ（Solanum tuberosum）に由来するグリコアルカロイド生合成酵素をコードする遺伝子が開示されている。また、特許文献５には、このタンパク質をコードする遺伝子を使用した新規生物の産生／検出方法も開示されている。
【００２０】
特許文献６及び特許文献７は、ステロイド系サポニン及びステロイド系アルカロイドの生合成におけるキー遺伝子、並びに、その遺伝子発現を改変し、ステロイド系サポニン及びステロイド系アルカロイドを産生するための手段及び方法に関するものである。
【００２１】
本発明の優先日後に公開された本発明の発明者の論文には、ＳＧＡの生合成に関与する１０個の遺伝子の配列が記載されている。この１０個の遺伝子のうちの５〜７個の遺伝子は、第７染色体上にクラスターとして存在し、他の２個の遺伝子は、第１２染色体上の重複ゲノム領域に隣接して存在することが分かっている。系統的機能解析の結果、コレステロールから始まり、トマトのＳＧＡアグリコンに結合している四糖部分に至る、新規なＳＧＡ生合成経路が提案された（Itkin M. et al., 2013 Science 341(6142):175-179）。
【００２２】
また、植物のコレステロール生合成経路は、植物ステロール代謝と重複することが分かっている（Sonawane et al. 2016. Nat. Plants 3: 16205）。例えば、コレステロール（（３−β）−コレスト−５−エン−３−オール）は、すべての動物細胞膜の必須構造成分としてすべての動物細胞で生合成される脂質分子の一種であるステロール（または修飾ステロイド）であり、これは、膜構造の完全性及び流動性に必須であり、動物細胞が細胞壁なしで機能することを可能にしている。また、これは、ステロイドホルモン、胆汁酸、ビタミンＤ、サポニン、ＳＡ、ＳＧＡの生合成の前駆体でもある。コレスタノール（５−β−コレスタン−３−β−オール、コプロスタノール、５−β−コプロスタノール）は、糞便などの生体内に見られるコレステロール誘導体である。コレスタノールは、ほとんどの高等動物（鳥類及び哺乳類）の腸内でのコレステロールの生物水素化による、コレステロールの変換により産生される、炭素数２７のスタノールである。
【００２３】
植物はコレステロールをごく少量産生するが、植物ステロール（コレステロールやコレスタノールに類似する植物ステロールや植物スタノールを含む）も産生するため、腸管での再吸収においてコレステロールと競合し、その結果、コレステロールの再吸収を抑制する可能性がある。コレステロールは、医薬品、化粧品、及び他の用途の製造にしばしば使用される。植物性ステロールと植物性コレステロールとの両方を高レベルで産生することへの関心が高まっている。
【００２４】
例えば、トマト（例えば、Solanum lycopersicum、Solanum pennellii）では、α−トマチンとデヒドロトマチンとが主要なＳＧＡであり、これらは主に緑色組織（若葉、成熟葉、花芽、未成熟または成熟した緑色果実の皮や種子）に蓄積される。デヒドロトマチジン（すなわちトマチデノール）は、ＳＧＡ生合成において最初に産生されるＳＡアグリコンであり、これは、さらにＣ−５位で水素化されてトマチジンを形成する。両アグリコンは、さらにグリコシル化され（四糖部分、すなわちリコテトロース）、それぞれ、デヒドロトマチンとα−トマチンを産生する。このように、ＳＧＡ経路は、トマチジン由来のＳＧＡまたはグリコシル化されたデヒドロトマチン誘導体のいずれかを形成するために、デヒドロトマチジンで分岐する。注目すべきは、デヒドロトマチジンとトマチジンとの構造の差異は、Ｃ−５位での二重結合の有無のみである。デヒドロトマチジンからトマチジンへの変換は、従来は、仮説的なヒドロゲナーゼによって触媒される単一の反応であると仮定されていた。トマトのほとんどの組織では、α−トマチンに対するデヒドロトマチンの割合は、約２．５〜１０％である。トマトの果実が成熟して赤くなると、α−トマチンとデヒドロトマチンのプール大部分が、エスクレオシド（主要ＳＧＡ）とデヒドロエスクレオシド（マイナーＳＧＡ）にそれぞれ変換される。トマト果実が成熟して赤色期に達すると、α−トマチンとデヒドロトマチンのプール全体が、エスクレオシド（主要ＳＧＡ）とデヒドロエスクレオシド（少量ＳＧＡ）にそれぞれ変換される。
【００２５】
栽培されているジャガイモ（例えば、Solanum tuberosum）では、α−カコニンとα−ソラニンが、同一のアグリコンであるソラニジン（Ｃ−５、６の二重結合が存在する）を共有する主要なＳＧＡであり、それぞれカコトリオース部分とソラトリオース部位を有している。栽培されているジャガイモからはデミシジンやデミッシンが検出されないことから、これらの種は、ソラニジンをデミシジンに変換するヒドロゲナーゼ酵素を欠いていると示唆されている。活性ヒドロゲナーゼを含むと予測されるいくつかの野生ジャガイモ種（例えば、S. demissum、S. chacoense、S. commersonii）及びその体細胞雑種（S. brevidens、 S. tuberosum）は、デミシジンまたはそのグリコシル化型を産生し、デミシジンは、それらの主要なＳＧＡの１つとなる。
【００２６】
ナス（例えば、Solanum melongena）では、α−ソラマジンとα−ソラソニンが、ソラソジンアグリコン（Ｃ−５、６の二重結合が存在する）由来の最も豊富なＳＧＡである。一方、いくつかの野生のナス種、例えばS. dulcamara（ビタースウィート）は、ソラソジンアグリコンから、ソラズルシジンまたはそのグリコシル化型、ソラズルシンＡ及びβ−ソラズルシン（Ｃ−５、６二重結合が存在しない）を、主要なＳＧＡとして産生する。
【００２７】
多くのナス種（例えば、ナス）は、ＳＧＡに加えて、コレステロール由来の不飽和または飽和ステロイドサポニンも産生する。不飽和及び飽和ステロイドサポニンは、植物界に広く存在し、特に、単子葉植物、例えば、リュウゼツラン科（例えば、リュウゼツラン属やユッカ属）、アスパラガス科（例えば、アスパラガス）、ヤマノイモ科及びユリ科に多く含まれている。ＳＧＡと同様に、ステロイドサポニンの構造は非常に多様であり、Ｃ−５、６位が飽和しているものもあるし（例えば、サラサポゲニン）、不飽和のものもある（例えば、ジオスゲニン）。
【００２８】
すべての動物が産生する主要なステロールであるコレステロールは、ＳＧＡの生合成において重要な構成要素である。コレステロールから始まるＳＧＡ生合成の中核に関与するトマト及びジャガイモの一連の遺伝子であるＧＬＹＣＯＡＬＫＡＬＯＩＤＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ（ＧＡＭＥ）が、近年報告された。トマトのＳＧＡ生合成経路は、２つの主要部分に分けられる。第１の主要部分では、ＧＡＭＥ６、ＧＡＭＥ８、ＧＡＭＥ１１、ＧＡＭＥ４、及びＧＡＭＥ１２酵素の作用により、コレステロールからＳＡアグリコンが形成されると考えられる。第２の主要部分では、ＵＤＰ−糖転移酵素（ＵＧＴ）の作用により、ＳＧＡが産生される（トマトではＧＡＭＥ１、ＧＡＭＥ２、ＧＡＭＥ１７、ＧＡＭＥ１８、ジャガイモでは、ステロールアルカロイド・グリコシルト・ランスフェラーゼ（ＳＧＴ１）、ＳＧＴ２、ＳＧＴ３）
【００２９】
したがって、トリテルペノイドサポニンを含むサポニンを産生するための代謝経路に関与する酵素に関する知識、例えば、グルクロン酸をキレイン酸などに結合させるセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素に関する知識に対する満たされていないニーズが依然として存在する。上記の知識が得られれば、自然に産生される産物の含有量を改変させるために、植物において鍵となる酵素を制御することができる。例えば、酵素を過剰に発現させたり、安定性を高めたりすることによって、天然の甘味料を大量に産生することができる。また、酵素を遺伝子レベルで下方制御することによって、植物産物（例えば、キノア）に苦味を加える化合物の産生を減少させることができる。さらに、高価値のサポニン（これに限定しないが、例えば、トリテルペノイドサポニン）を商業量で提供するために、異種系でこれらのサポニンを産生する方法に対する満たされていないニーズが依然として存在する。これらの高価値サポニンは、これに限定しないが、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。
【００３０】
加えて、食物量の増加及び品質の改善に対する要求が増加し続けている。栄養価の向上と抗栄養物質の除去は、両方とも強く要求されている。作物の栽培化の過程で、抗栄養物質の濃度は育種によって減少したが、多くの作物は、依然として、かなりの量の抗栄養物質、特にステロイド系グリコアルカロイドを含んでいる。
【００３１】
もし、これらのＳＧＡの合成を操作することができれば、従来の育種や遺伝子操作によって、ＳＧＡの濃度及び組成が改変された作物を開発することができ、それにより、広範囲の昆虫やその他の病原体に対する内在性の化学的バリアを植物に付与することが可能となる。
【００３２】
加えて、植物ベースのコレステロールと、その逆に、植物コレステロールや他の植物ステロールの濃度を増加させた植物の両方に対する需要も存在する。
【００３３】
したがって、有益な、特に治療効果を有する、サポニン、ステロイド系アルカロイド、及びステロイド系グリコアルカロイドの産生を制御するための手段及び方法が求められており、そのような手段及び方法を有することは非常に有益であると考えられる。
【００３４】
以下に提供される開示は、いくつかの実施形態において、植物の特異的代謝物（ＳＭ）、より具体的にはサポニンがＵＧＴ１ファミリー酵素によって単にグリコシル化されるだけでないという知識を少なくとも記載することによって、上記の満たされていないニーズを満たす。一次細胞壁の生合成におけるその役割でよく知られているセルロース合成酵素（ＣＥＳＡ）に関連するタンパク質が、サポニンのＣ−３位へのグルクロン酸の結合を可能にすると思われる。新しい型のトリテルペノイド糖転移酵素活性を有するセルロース合成酵素様（ＣＳＬ）酵素に対する新機能分化を介した代謝進化は、その細胞内局在性の変化を伴い、それを小胞体（ＥＲ）に誘導した。また、このタンパク質の調節は、ステロイド系サポニンとステロイド系グリコアルカロイドの産生の厳密な制御をもたらしたが、遺伝子サイレンシングにより、コレステロールプールの蓄積がもたらされた。
【００３５】
また、以下に提供される開示は、いくつかの実施形態において、コレステロールを、ステロイドサポニン、トリテルペノイドサポニン、ステロイドアルカロイド、及びステロイドグリコアルカロイドに変換する生合成経路におけるキー遺伝子及び酵素の知識を少なくとも記載することによって、上記の満たされていないニーズを満たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】米国特許第５、９５９、１８０号明細書
【特許文献２】米国特許第７、３７５、２５９号明細書
【特許文献３】米国特許第７、４３９、４１９号明細書
【特許文献４】国際特許出願公開第ＷＯ  ００／６６７１６号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２／０１５９６７６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０１６７２７１号明細書
【特許文献７】国際出願公開第ＷＯ  ２０１２／０９５８４３号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１５／００１１００８号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１５／０００４７０４号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１３／０１３０３８９号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１２／００９４３８５号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１２／００３４６９８号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１１／０３００６３３号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００４／０１３３９３７号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００９／０２６４３２０号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００１／００３１７２４号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００３／００４９７８５号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００５／０１５８８６１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００７／０２６４７１６号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００９／０３２５２４７号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１０／０１９０２２３号明細書
【特許文献２２】米国特許第６、３２６、１７４号明細書
【特許文献２３】米国特許第４、９８７、０７１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３７】
一態様によれば、本開示は、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して増加した遺伝子組換え細胞であって、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加した、遺伝子組換え細胞を提供する。
【００３８】
別の態様によれば、本開示は、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え植物における前記ＣＳＬＧ遺伝子の発現と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物であって、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して改変された、遺伝子組換え植物を提供する。
【００３９】
さらに別の態様によれば、本開示は、遺伝子組換え細胞内にステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法であって、（ａ）前記細胞内に少なくとも１つの異種遺伝子を導入する導入ステップであって、前記少なくとも１つの異種遺伝子がセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードしており、前記少なくとも１つの異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、該ステップと、（ｂ）前記細胞内で前記少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる発現ステップと、を含み、前記細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、少なくとも１つのステロイド系サポニン、または少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加する、方法を提供する。
【００４０】
さらに別の態様によれば、本開示は、植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を低減させる方法であって、前記少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、前記遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を用いて前記少なくとも１つの植物細胞を形質転換するステップ、または、（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、前記突然変異が、（１）前記核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）前記核酸配列内に欠失を導入すること、（３）前記核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、前記導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞における前記ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、対応する非組換え植物の細胞と比較して減少し、前記遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少する、方法を提供する。
【００４１】
さらに別の態様によれば、本開示は、植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法であって、前記少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、前記遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、前記突然変異が、（１）前記核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）前記核酸配列内に欠失を導入すること、（３）前記核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、前記導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、（ｂ）前記ＣＳＬＧ酵素をコードする前記核酸配列を発現させるステップと、を含み、遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物にと比較して増加する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
ステロイド系グリコアルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニンを生産する方法及びその使用に関する主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に主張されている。しかしながら、これらのステロイド系グリコアルカロイド、ステロイド系サポニン、及びトリテルペノイド系サポニンを産生する方法及びその使用は、その目的、特徴、及び利点とともに、組織及び操作方法の両方について、以下の詳細な説明を添付の図面とともに参照することによって最もよく理解されるであろう。
【００４３】
【図１】ナス科の植物のトリテルペノイド生合成経路において、コレステロールからα−トマチンに至るまでのステロイド系グリコアルカロイドの生合成経路を提案している。破線及び実線の矢印は、それぞれ、経路中の複数または単一の酵素反応を表す。
【図２】ナス科の植物のステロイド系アルカロイド関連遺伝子の共発現解析の結果を要約している。トマト（ＳｌＧＡＭＥ１及びＳｌＧＡＭＥ４）及びジャガイモ（ＳｔＳＧＴ１及びＳｔＧＡＭＥ４）の「ベイト」の共発現遺伝子の共有されたホモログ。実線（ｒ値＞０．８）及び破線（ｒ値＞０．６３）で共発現遺伝子を結んでいる。＊は、トマトまたはジャガイモの７番染色体クラスターに位置している。Ｓｔ、Solanum tuberosum（ジャガイモ）；Ｓｌ、S.lycopersicum（トマト）である。遺伝子名の背景は、共発現が確認されたベイトに対応する（上記の凡例）。ＳＰ、セリンプロテアーゼ；ＰＩ、プロテアーゼ阻害剤；ＵＰＬ、ユビキチン・タンパク質リガーゼ；ＥＬＰ、エクステンシン様タンパク質；ＰＫ、プロテインキナーゼ；ＳＲ、ステロールレダクターゼ；ＲＬ、受容体様。
【図３】トマト及びジャガイモの重複ゲノム領域で同定された遺伝子及びその共発現の概略図である。ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１（７番染色体）及びＧＡＭＥ４（１２番染色体）をベイトとした共発現を、ジャガイモまたはトマトのいずれかで、ヒートマップの形態で示している（表５−８）。特定の遺伝子ファミリーを黒色の矢印で示し、他の遺伝子ファミリーの要素を白色の矢印で示している。
【図４Ａ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。ＧＡＭＥ８がサイレンシングされたトランスジェニック（ＲＮＡｉ）の葉には、野生型と比較して、２２−（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールが蓄積している。
【図４Ｂ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。ＧＡＭＥ１１がＶＩＧＳサイレンシングされた葉には、コレスタノール型のステロイドサポニン（ＳＴＳ）が蓄積している。
【図４Ｃ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。ＧＡＭＥ１２がＶＩＧＳサイレンシングされた葉には、ＳＴＳ（ｍ／ｚ＝７５３．４）が蓄積している。
【図４Ｄ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。ステロイド系アルカロイドのアグリコンであるトマチジンが、ＧＡＭＥ１がサイレンシングされたトランスジェニック葉に蓄積している。
【図４Ｅ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。４つの組換えトマトＧＡＭＥグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性アッセイの１つを示している。
【図４Ｆ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。４つの組換えトマトＧＡＭＥグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性アッセイの１つを示している。
【図４Ｇ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。４つの組換えトマトＧＡＭＥグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性アッセイの１つを示している。
【図４Ｈ】トマトのＧＡＭＥ遺伝子の機能解析結果を示す図である。４つの組換えトマトＧＡＭＥグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性アッセイの１つを示している。
【図５Ａ】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９の発現が改変されたジャガイモ植物株の塊茎の皮におけるソラニン／カコニンレベルを示す図の１つであり、ＧＡＭＥ９をサイレンシングした植物の塊茎におけるソラニンレベルを示す。
【図５Ｂ】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９の発現が改変されたジャガイモ植物株の塊茎の皮におけるソラニン／カコニンレベルを示す図の１つであり、ＧＡＭＥ９をサイレンシングした植物の塊茎におけるカコニンレベルを示す。
【図５Ｃ】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９の発現が改変されたジャガイモ植物株の塊茎の皮におけるソラニン／カコニンレベルを示す図の１つであり、ＧＡＭＥ９を過剰発現させた植物の塊茎におけるソラニンレベルを示す。
【図５Ｄ】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９の発現が改変されたジャガイモ植物株の塊茎の皮におけるソラニン／カコニンレベルを示す図の１つであり、ＧＡＭＥ９を過剰発現させた植物の塊茎におけるカコニンレベルを示す。
【図６】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９をサイレンシング（ＲＮＡｉ）または過剰発現（ＯＸ）させたジャガイモ植物株の葉におけるソラニン／カコニンレベルを示す図である。
【図７】野生型の植物と比較した、ＧＡＭＥ９がサイレンシングされたトマト植物株（ＲＮＡｉ、５８７１株）、または過剰発現されたトマト植物株（ＯＸ、５８７９株）の葉におけるトマチンレベルを示す図である。
【図８Ａ】トマトにおけるＧＡＭＥ１１ジオキシゲナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、葉のα−トマチンレベル（ｍ／ｚ＝１０３４．５）を示している。
【図８Ｂ】トマトにおけるＧＡＭＥ１１ジオキシゲナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、葉のコレスタノール型ステロイド系サポニン（ＳＴＳ）（ｍ／ｚ＝１３３１．６、１３３３．６、１１９９．６、１２０１．６（主要サポニン））を示している。
【図８Ｃ】トマトにおけるＧＡＭＥ１１ジオキシゲナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、ｍ／ｚ＝１３３１．６（１９．２８分）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示している。
【図８Ｄ】トマトにおけるＧＡＭＥ１１ジオキシゲナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、１９．２８分に溶出したサポニンの断片化パターン、及びＧＡＭＥ１１でサイレンシングされた葉における蓄積を示している。図８ＣのＭＳ／ＭＳクロマトグラムの、アステリスクが付された質量信号に対応している。
【図９Ａ】ＧＡＭＥ１８がサイレンシングされた成熟した緑色のトマトの果実から抽出された代謝物を示す図の１つであり、γ−トマチン標準物質（ｍ／ｚ＝７４０．５）に対応する、新たに蓄積した化合物のピークを示している。
【図９Ｂ】ＧＡＭＥ１８がサイレンシングされた成熟した緑色のトマトの果実から抽出された代謝物を示す図の１つであり、γ−トマチン標準物質（ｍ／ｚ＝７４０．５）に対応する、新たに蓄積した化合物のピークを示している。
【図９Ｃ】ＧＡＭＥ１８がサイレンシングされた成熟した緑色のトマトの果実から抽出された代謝物を示す図の１つであり、γ−トマチン標準物質（ｍ／ｚ＝７４０．５）に対応する、新たに蓄積した化合物のピークを示している。
【図９Ｄ】ＧＡＭＥ１８がサイレンシングされた成熟した緑色のトマトの果実から抽出された代謝物を示す図の１つであり、γ−トマチンペントシド（ｍ／ｚ＝８７２．５）に対応する、新たに蓄積された化合物のピークを示している。
【図９Ｅ】ＧＡＭＥ１８がサイレンシングされた成熟した緑色のトマトの果実から抽出された代謝物を示す図の１つであり、γ−トマチンペントシド（ｍ／ｚ＝８７２．５）に対応する、新たに蓄積した化合物のピークを示している。
【図１０Ａ】トマトにおけるＧＡＭＥ１２トランスアミナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、フラスタノール型のＳＴＳを蓄積している。
【図１０Ｂ】トマトにおけるＧＡＭＥ１２トランスアミナーゼのサイレンシングの効果を示した図である。ＧＡＭＥ１２がサイレンシングされた葉には、ＳＴＳ（ｍ／ｚ＝７５３．４）が蓄積されているが、ＷＴ（野生型）の葉にはわずかしか存在していない。
【図１０Ｃ】トマトにおけるＧＡＭＥ１２トランスアミナーゼのサイレンシングの効果を示した図である。ＧＡＭＥ１２がサイレンシングされた葉には、ＳＴＳ（ｍ／ｚ＝７５３．４）が蓄積されているが、ＷＴ（野生型）の葉にはわずかしか存在していない。
【図１０Ｄ】トマトにおけるＧＡＭＥ１２トランスアミナーゼのサイレンシングの効果を示した図の１つであり、１９．７１分におけるｍ／ｚ＝７５３．４のＭＳ／ＭＳスペクトル及び断片の解釈を示している。
【図１１Ａ】ＧＡＭＥ８をサイレンシングしたトマト植物の効果を示した図の１つであり、ＥＩ−ＧＣ／ＭＳで得られたクロマトグラム（質量範囲１７２．５−１７３．５）、ＭＳスペクトル、及び化合物の構造（トリメチルシリル誘導体）を示している。ＧＡＭＥ８をサイレンシングした葉には、２２−（Ｓ）−コレステロール及び２２−（Ｒ）−コレステロールが蓄積されている。
【図１１Ｂ】ＧＡＭＥ８をサイレンシングしたトマト植物の効果を示した図の１つであり、ＥＩ−ＧＣ／ＭＳで得られたクロマトグラム（質量範囲１７２．５−１７３．５）、ＭＳスペクトル、及び化合物の構造（トリメチルシリル誘導体）を示している。２２−（Ｒ）−コレステロールの市販の標準物質を用いて推定同定を確認した。
【図１１Ｃ】ＧＡＭＥ８をサイレンシングしたトマト植物の効果を示した図の１つであり、ＥＩ−ＧＣ／ＭＳで得られたクロマトグラム（質量範囲１７２．５−１７３．５）、ＭＳスペクトル、及び化合物の構造（トリメチルシリル誘導体）を示している。２２−（Ｓ）−コレステロールの市販の標準物質を用いて推定同定を確認した。
【図１１Ｄ】ＧＡＭＥ８をサイレンシングしたトマト植物の効果を示した図の１つであり、ＥＩ−ＧＣ／ＭＳで得られたクロマトグラム（質量範囲１７２．５−１７３．５）、ＭＳスペクトル、及び化合物の構造（トリメチルシリル誘導体）を示している。ＧＡＭＥ８がサイレンシングされた株には、ＷＴ（Ｑ）と比較して、両異性体が蓄積されている。
【図１２】植物ＣＹＰ４５０タンパク質ファミリーにおけるＧＡＭＥ遺伝子の系統樹の図である。枝上の番号は、各節を支持するブートストラップ反復の比率を示す。
【図１３】シクロアルテノール（Ｐａｒｔ  Ｉ）から、コレステロール（Ｐａｒｔ  ＩＩ）、トマチジン（Ｐａｒｔ  ＩＩＩ）、α−トマチンを含むステロイド系グリコアルカロイドを経てリコペロシド／エスクレオシド（Ｐａｒｔ  ＩＶ）に至る、ナス科植物における拡大された生合成経路の提案を示している。破線の矢印は、経路中の複数の酵素反応を表す。
【図１４Ａ】トマトにおけるＳＧＡ生合成の概要を示す図である。
【図１４Ｂ】ジャガイモにおけるＳＧＡ生合成の概要を示す図である。
【図１４Ｃ】ナスにおけるＳＧＡ生合成の概要を示す図である。
【図１４Ｄ】トマチジンからトマチジン３−Ｏ−グルクロニドの生成までの、ナス科植物におけるＳＧＡ生合成経路の提案部分を示す図である。ＧＡＭＥ１５セルロース合成酵素様Ｇ酵素が、トマチジンの水酸基の位置にグルクロン酸の付加を触媒している。
【図１５Ａ】ＬＣ−ＭＳにより測定した、野生型（非形質転換）及びＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉトマト株の葉における主要なＳＧＡレベルを示す図である。＃２１、＃２２、＃２３は、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉを遺伝子導入した３株の別個のトマトである。数値は、３つの生物学的複製の平均値±標準誤差を示す。アステリスクは、スチューデントのｔ検定によって算出した野生型試料に対する有意な変化を示している（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図１５Ｂ】ＬＣ−ＭＳにより測定した、野生型（非形質転換）及びＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉトマト株の緑色の果実における主要なＳＧＡレベルを示す図である。＃２１、＃２２、＃２３は、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉを遺伝子導入した３株の別個のトマトである。数値は、３つの生物学的複製の平均値±標準誤差を示す。アステリスクは、スチューデントのｔ検定によって算出した野生型試料に対する有意な変化を示している（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図１５Ｃ】ＬＣ−ＭＳにより測定した、野生型（非形質転換）及びＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉトマト株の赤い果実における主要なＳＧＡレベルを示す図である。＃２１、＃２２、＃２３は、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉを遺伝子導入した３株の別個のトマトである。数値は、３つの生物学的複製の平均値±標準誤差を示す。アステリスクは、スチューデントのｔ検定によって算出した野生型試料に対する有意な変化を示している（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図１６】ＬＣ−ＭＳにより測定した、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉ株の葉におけるα−ソラニン及びα−カコニンのレベルを示す図である。＃１、＃２、＃３は、ＧＡＭＥ１５ｉを遺伝子導入した３株の別個のじゃがいもである。数値は、平均値±標準誤差を表す（ｎ＝３）。スチューデントのｔ検定を用いて、トランスジェニック株が野生型の植物に対して有意に異なるかどうかを評価した（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。
【図１７】ＧＡＭＥ１５をサイレンシングした植物から得られたトマトの葉のコレステロール含有量を示す図である。数値は、３つの生物学的複製の平均値±標準誤差を示す。アステリスクは、スチューデントのｔ検定で算出した、野生型の（すなわち、形質変換されていない）葉と比較した場合の３つの独立した導入遺伝子の葉（＃２１、＃２２、＃２３）における有意な変化を示す（＊Ｐ値＜０．０５、＊＊Ｐ値＜０．０１、＊＊＊Ｐ値＜０．００１）。試料調製時にはエピコレステロールを内部標準物質として用い、相対的なコレステロール値を、内部標準物質と比較した試料中のコレステロールのピーク面積の比で表した。分析は、ＧＣ−ＭＳを用いて行った。
【図１８】ホウレンソウのサポニンの液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレーイオン化・四重極／飛行時間型質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）スキャンの図である。上の図は、陰イオン化モードで取得したホウレンソウの葉の抽出物のトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示している。赤色で表示されたクロマトグラムの断片は、試料に含まれるサポニンを示している。下の図は、クロマトグラムの拡大図であり、主要なサポニンには番号が付されている。この番号は、実施例１５で示した表１３に記載されている様々なＹｏｓｓｏｓｉｄｅを表している。
【図１９Ａ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。［Ｍ−Ｈ］１１９６３．５６＝−ｍ／ｚ範囲３００−１３００に由来する質量フラグメント。
【図１９Ｂ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。グルクロン酸残基の切断に由来する質量フラグメント、ｍ／ｚ範囲５０−１９００。
【図１９Ｃ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶの構造であり、矢印はフラグメントのパターンを示している。
【図１９Ｄ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。ＭＡに結合したグルクロン酸のフラグメントに由来するＭＳ／ＭＳピークの割り当てを示す表。
【図１９Ｅ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖａのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。［Ｍ−Ｈ］１３０５．５７１９０＝−ｍ／ｚ範囲３００−１４００に由来する質量フラグメント。
【図１９Ｆ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖａのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。グルクロン酸残基の切断に由来する質量フラグメント、ｍ／ｚ範囲５０−１９００。
【図１９Ｇ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖａのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖａの構造であり、矢印は断片パターンを示す。アセチル基の位置（赤で強調）は推定である。
【図１９Ｈ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。［Ｍ−Ｈ］１３０５．５７３７＝−ｍ／ｚ範囲３００−１４００に由来する質量フラグメント
【図１９Ｉ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。グルクロン酸残基の切断に由来する質量フラグメント、ｍ／ｚ範囲５０−１９００。
【図１９Ｊ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖの構造であり、矢印はフラグメントパターンを示す。
【図１９Ｋ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＸのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。［Ｍ−Ｈ］１４０７．６０６０＝−ｍ／ｚ範囲３００−１５００
【図１９Ｌ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＸのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。グルクロン酸残基の切断に由来する質量断片、ｍ／ｚ範囲５０−１９００。
【図１９Ｍ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＸのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＸの構造であり、矢印はフラグメンテーションパターンを示す。ペントースの構造及び結合場所は推定されている。
【図１９Ｎ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｘのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。［Ｍ−Ｈ］１４３７．６１５０＝−ｍ／ｚ範囲３００−１５００。
【図１９Ｏ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｘのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。グルクロン酸残基の切断に由来する質量フラグメント、ｍ／ｚ範囲５０−１９００。
【図１９Ｐ】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｘのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の結果及び構造を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｘの構造であり、矢印はフラグメント化パターンを示す。構造とペントースとの結合は推定である。
【図２０Ａ】共発現したサポニンβ−アミリン合成酵素（ＳＯＡＰ）遺伝子を含む、ホウレンソウのサポニンの生合成経路を示す図である。Ｃ−２０位（赤で強調）にグルクロン酸が結合したアセチル化トリテルペノイドサポニンであるＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖの生成に至る完全な生合成経路。ＳＯＡＰ酵素の活性による各生成物は緑色で表示されている。ＳＯＡＰ酵素は、ホウレンソウのサポニン生産に関与する酵素である。
【図２０Ｂ】共発現したサポニンβ−アミリン合成酵素（ＳＯＡＰ）遺伝子を含む、ホウレンソウのサポニンの生合成経路を示す図である。遺伝子共発現ネットワーク。赤色のドットはベイト（ＳＯＡＰ１、ＳＯＡＰ２、及びＳｏＣＹＰ７１６Ａ２６８ｖ２）を表し、緑色のドットで囲まれた円は全てのベイトと共発現している遺伝子を表している。拡大された注釈付きのドットは、ホウレンソウのウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）によってサイレンシングされた遺伝子を表す。
【図２０Ｃ】共発現したサポニンβ−アミリン合成酵素（ＳＯＡＰ）遺伝子を含む、ホウレンソウのサポニンの生合成経路を示す図である。ＳＯＡＰ１−４を一過性発現させた植物からのオレアノール酸、アウグスチン酸、メディカゲン酸の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）［ｍ／ｚ＝４５５．２０５（ＯＡ）、ｍ／ｚ＝４７１．２０５（ＡＡ）、ｍ／ｚ＝５０１．２０２（ＭＡ）、陰イオン化モード］を、ＳＯＡＰ１−２０、ＳＯＡＰ１−２を単独で発現させた植物、及び対照（空のベクター（ＥＶ）を保有するアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸透させた植物）と比較した。
【図２１】Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖの水素の重要な異種核多重結合（ＨＭＢＣ）の相関を示す図である。黒い矢印は、Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖの６つのメチル基のＨＭＢＣ相関を示す。赤い矢印は、他の重要な水素のＨＭＢＣ相関を示す。数字は、メディカゲン酸及び糖部分の炭素原子に対応する。詳細は表１を参照。表１は、スペクトルデータを２つの部分に分けて表にまとめたものである。第１の部分はメディカゲン酸の原子（アグリコン部分）に対応し、第２の部分は糖部分の原子に対応する。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ及びメディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニドの構造を、原子番号を付して図２１及び図３５Ｄにそれぞれ示している。表１において、ａｘ（軸方向）及びｅｑ（赤道方向）は、アグリコン及び糖の環構造におけるプロトンを示す。
【００４４】
表１．Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ（３−Ｏ−［β−Ｄ−キシロピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２８−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−４−アセチル−β−Ｄ−フコピラノシル］−メディカゲン酸）及びメディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニドについての１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータ
【００４５】
【表１−１】
2022500023.tif 000003
【００４６】
【表１−２】
2022500023.tif 000004
【００４７】
【図２２Ａ】アグリコン生合成の最初のステップに関与する遺伝子が、染色体上の近接した場所に位置していることを示す図である。オレアノール酸の生合成に関与する遺伝子が存在する染色体領域を模式的に示している。半透明の灰色のボックスには、ＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）（配列番号４２２）、ＣＹＰ７１６Ａ２６８（ＳＯＡＰ２；配列番号４６）、及びその切断された重複ＣＹＰ７１６Ａ２６８ｖ２（配列番号４７）が含まれる。濃い灰色でマークされた遺伝子は、トリテルペノイド系サポニンの生合成に直接は関与していない。
【図２２Ｂ】アグリコン生合成の最初のステップに関与する遺伝子が、染色体上の近接した場所に位置していることを示す図である。５つのホウレンソウのトランスクリプトームにおけるＳＯＡＰ１、ＳＯＡＰ２及びＣＹＰ７１６Ａ２６８ｖ２の発現パターン；ＳＯ４ＷＯＬＬＤ−長日期に生育した４週齢の植物の成熟葉；ＳＯ８ＷＯＬＳＬ−短日期に生育した８週齢の植物の成熟葉；ＳＯ４ＷＹＬＬＤ−長日期に生育した４週齢の植物の若葉；ＳＯ８ＷＯＬＳＬ−短日期に生育した８週齢の植物の若葉；ＳＯ４ＷＦＢＬＤ−長日期に生育した４週齢の植物の花芽。詳細は対象と方法を参照。
【図２３Ａ】ホウレンソウにおけるサイレンシング（ＶＩＧＳ）によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ７１２３Ａ２２３８）の機能的特徴を示すデータである。マグネシウム−ケラターゼサブユニットＨ（ＣＨＬＨ）をサイレンシングした植物で観察された萎黄病の表現型。ＣＨＬＨは対照として、かつ、ＶＩＧＳ遺伝子サイレンシングのマーカーとして使用された。一般的に、この遺伝子はＳＯＡＰ遺伝子やサポニン生合成には直接関係しないと言われている。ＥＶは空のベクターを意味し、対照の葉を表す。
【図２３Ｂ】ホウレンソウにおけるサイレンシング（ＶＩＧＳ）によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ７１２３Ａ２２３８）の機能的特徴を示すデータである。サイレンシングされた植物におけるＳＯＡＰ１及びＳＯＡＰ２の発現のリアルタイムｑＰＣＲ分析。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して、統計的に有意な差を示した；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２３Ｃ】ホウレンソウにおけるサイレンシング（ＶＩＧＳ）によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ７１２３Ａ２２３８）の機能的特徴を示すデータである。対照（ＣＨＬＨ）と比較した、ＳＯＡＰ１またはＳＯＡＰ２をサイレンシングした植物から得られたβ−アミリン［ｍ／ｚ＝２１８、主要なフラグメント］のガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の整列である。β−アミリンは、ＳＯＡＰ２をサイレンシングした植物でのみ検出され、そのさらなる変換が阻害されている。
【図２３Ｄ】ホウレンソウにおけるサイレンシング（ＶＩＧＳ）によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ７１２３Ａ２２３８）の機能的特徴を示すデータである。対照（ＣＨＬＨ）と比較した、ＳＯＡＰ１またはＳＯＡＰ２がサイレンシングされた植物からのＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶ［ｍ／ｚ＝１２２３３．２３、陰イオン化モード］の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）ＥＩＣの整列である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶの含有量は、ＳＯＡＰ１及びＳＯＡＰ２をサイレンシングした株では、それぞれ４０％及び３０％に減少した。
【図２４Ａ】ベンサミアナタバコにおける異種発現によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ；配列番号４５）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ２４１６Ａ２６８；配列番号４６）の機能的特徴を示すデータの図である。空のベクター（ＥＶ）単独及び基準の標準物質と比較した、ＳＯＡＰ１の一時的な発現によるβ−アミリン［ｍ／ｚ＝２１８、主要なフラグメント］のＧＣ−ＭＳ抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）。インプランタでの実験で得られたクロマトグラムのみを縮尺通りに表示している。
【図２４Ｂ】ベンサミアナタバコにおける異種発現によるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ；配列番号４５）及びＳＯＡＰ２（ＣＹＰ２４１６Ａ２６８；配列番号４６）の機能的特徴を示すデータの図である。空のベクター（ＥＶ）単独及び基準の標準物質と比較した、ＳＯＡＰ１及びＳＯＡＰ２の一時的な発現によるオレアノール酸［ｍ／ｚ＝２０３、主要なフラグメント］のＧＣ−ＭＳ  ＥＩＣの整列。インプランタでの実験で得られたクロマトグラムのみを縮尺に合わせている。ＧＣ−ＭＳ分析の詳細については「対象と方法」を参照。
【図２５】シトクロムＰ４５０候補遺伝子が（ＶＩＧＳ）サイレンシングされたホウレンソウにおける選択されたサポニンの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の分析結果を示すデータである。ＳＯＡＰ３（ＣＹＰ７２Ａ６５５；配列番号５１）、ＳＯＡＰ４（ＣＹＰ７２Ａ６５４；配列番号５３）、及び他の３つのＣＹＰ（ｐ４５０シトクロム遺伝子）をサイレンシングした植物における、選択されたサポニン化合物の相対的な含有量（正規化されたピーク面積）を示している。受託番号については、表１１を参照。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値を示す。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ａ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。ＳＯＡＰ３（ＣＹＰ７２Ａ６５５；配列番号５１）、ＳＯＡＰ４（ＣＹＰ７２Ａ６５４；配列番号５３）、及び追加の３つのシトクロムＰ４５０遺伝子をサイレンシングしたホウレンソウの葉における、選択されたトリテルペノイド系サポニン化合物の相対的な含有量（正規化されたピーク面積）であり、受託番号は表１１を参照。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して、統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｂ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。主要なフラグメントをマークした、ＡＡ−アウグスチン酸のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル。
【図２６Ｃ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。正確な質量測定、フラグメンテーションパターン、及び文献に基づいたサポニン化合物の推定構造。詳細は表１６を参照。
【図２６Ｄ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。ＳＯＡＰ３（ＣＹＰ７２Ａ６５５；配列番号５１）、ＳＯＡＰ４（ＣＹＰ７２Ａ６５４；配列番号５３）、及び追加の３つのシトクロムＰ４５０遺伝子をサイレンシングしたホウレンソウの葉における、選択されたトリテルペノイド系サポニン化合物の相対的な含有量（正規化されたピーク面積）であり、受託番号は表１１を参照。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して、統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｅ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。主要なフラグメントをマークした、ＡＡ−アウグスチン酸のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル。
【図２６Ｆ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。正確な質量測定、フラグメンテーションパターン、及び文献に基づいたサポニン化合物の推定構造。詳細は表１６を参照。
【図２６Ｇ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。ＳＯＡＰ３（ＣＹＰ７２Ａ６５５；配列番号５１）、ＳＯＡＰ４（ＣＹＰ７２Ａ６５４；配列番号５３）、及び追加の３つのシトクロムＰ４５０遺伝子をサイレンシングしたホウレンソウの葉における、選択されたトリテルペノイド系サポニン化合物の相対的な含有量（正規化されたピーク面積）であり、受託番号は表１１を参照。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して、統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｈ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。主要なフラグメントをマークした、ＡＡ−アウグスチン酸のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル。
【図２６Ｉ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。正確な質量測定、フラグメンテーションパターン、及び文献に基づいたサポニン化合物の推定構造。詳細は表１６を参照。
【図２６Ｊ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。ＳＯＡＰ３（ＣＹＰ７２Ａ６５５；配列番号５１）、ＳＯＡＰ４（ＣＹＰ７２Ａ６５４；配列番号５３）、及び追加の３つのシトクロムＰ４５０遺伝子をサイレンシングしたホウレンソウの葉における、選択されたトリテルペノイド系サポニン化合物の相対的な含有量（正規化されたピーク面積）であり、受託番号は表１１を参照。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して、統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２６Ｋ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。主要なフラグメントをマークした、ＡＡ−アウグスチン酸のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル。
【図２６Ｌ】シトクロムＰ４５０遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）後にホウレンソウに蓄積するサポニンの特徴を示す図である。正確な質量測定、フラグメンテーションパターン、及び文献に基づいたサポニン化合物の推定構造。詳細は表１６を参照。
【図２７】ＣＹＰ  Ｐ４５０をサイレンシングしたホウレンソウ植物におけるサポニンのアグリコンのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。対照（ＣＨＬＨサイレンシング）並びにオレアノール酸及びメディカゲン酸の基準の標準物質と比較した、ＳＯＡＰ３単独、ＳＯＡＰ４単独、及びＣＹＰ２をサイレンシングした植物に蓄積されたサポニンから放出されたトリテルペノイドアグリコン［ｍ／ｚ＝２０３及び２６２；すべてのアミリン型アグリコンに共通するフラグメント］のＥＩＣである。各ＥＩＣの縮尺を、最も豊富なシグナルに対して正規化した。１−７の数字は検出された化合物の名前を表しており、それぞれ、１−オレアノール酸、２−ヘデラゲニン、３−アウグスチン酸、４−ギプソゲニン、５−バヨゲニン、６−不明、７−メディカゲン酸である。
【図２８Ａ】ＣＹＰ  Ｐ４５０をサイレンシングしたホウレンソウにおけるアグリコンの分析及び推定される特性を示す図である。ＦＩＧＵＲＥ２８Ａ）対照としてＳＯＡＰ３、ＳＯＡＰ４、ＣＹＰ２及びＣＨＬＨをサイレンシングした植物において検出されたサポゲニンの相対含有量。
【図２８Ｂ】ＣＹＰ  Ｐ４５０をサイレンシングしたホウレンソウにおけるアグリコンの分析及び推定される特性を示す図である。特徴的なアグリコンの構造。１−７の数字は検出された化合物の名前を表しており、それぞれ、１−オレアノール酸、２−ヘデラゲニン、３−アウグスチン酸、４−ギプソゲニン、５−バヨゲニン、６−不明、７−メディカゲン酸である。
【図２８Ｃ】ＣＹＰ  Ｐ４５０をサイレンシングしたホウレンソウにおけるアグリコンの分析及び推定される特性を示す図である。記載された化合物のフラグメンテーションパターンと、オレアノール酸及びメディカゲン酸の基準の標準物質のフラグメンテーションパターンとの比較。
【図２９】グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子がサイレンシングされた（ＶＩＧＳ）ホウレンソウにおける選択されたサポニンのＬＣ−ＭＳ分析を示す図である。ＳＯＡＰ６−９（それぞれ、配列番号５５、５７、５９、６１）、ＳｏＧＴ１（配列番号１１７［遺伝子］及び配列番号１１８［ポリペプチド］）、ＳｏＧＴ２（配列番号１１９［遺伝子］及び配列番号１２０［ポリペプチド］）がサイレンシングされた植物における選択されたサポニン化合物の相対含有量（正規化されたピーク面積）；受託番号については表１１を参照。グリコシルトランスフェラーゼに使用した配列を以下に示す。
【００４８】
ホウレンソウＧＴ１の核酸遺伝子の配列は以下の通りである。ａｔｇｇｃｃｇｃｃｔｃａａａｃａａａｇａｇｃａａａｇｃａａｇｃｔａｃａｔａｔｔｇｃｔａｔｇｔｔｔｃｃｔｔｇｇｔｔｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｔａｔａａａｃｃｃａｔｔｃａｔｃｃａｇｃｔｃｔｃｔａａｃａａｇｃｔｔｔｃｃｔｃｃｃａｔｇｇｃａｔｃｃａａａｔｃｔｃｔｔｔｃｔｔｃｔｃａａｔａｃｃａｇｇａａａｃａｔｔｇａｔｃｇｔａｔｃａａａｔｃｃｔｃｃｃｔｔａａｔｃｔｃｔｃａｃｃｔｃｃｃａａｃｃａｇｃｔｃａｔｃｃｃｃｃｔｃａｃｔａｔｔｃｃｃｃｃａａｃｔｇａａｇｇａｃｔｃｔｃｔｃｃｃａａｃｔｔｔｇａｃａｇｃａｇｃｔｃｔｇａａｇｔａａｃａｃｃｔｃａａａｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｃｔｃａｃａｃｔａｇｃａｃｔｔｇａｔｃａａａｔｇｃａｇｃｃｃｃａａｇｔｃａａａｇｃｔｃｔａｔｔｃｃｃｔｃａｃｃｃｃｃａｇｃｃａｃａａｇｔｔａｔｃｃｔｃｔｔｔｇａｔｔｔｔｇｃａｔａｔｃａｃｔｇｇｃｔｔｃｃｃｔｃａｇｔａｇｃｔｔｃｔｇａａｃｔａｇｇｃａｔｃａａａｇｃｔｇｔｔｃａｔｔｔｃａａｔａｃａｔｔｃｃｃａｇｃｔｇｔｔａｔｃａａｔｔｃａｔａｔｃｔｃａｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃａａｇａａｔｇａｃｔｇａｔｃｃａａａｔａａａｃｃａｃｃｇａｃａｔｔｔｇａｇｇａｃｔｔｇａａｇａａｃｃｃｔｃｃｔｃａａｇｇｃｔａｔｃｃｃａａａａｃｃｔｃａａｃｃｇｃｃｔｃａｇｔｇａａａａｃｃｔｔｃｇａａｇｃｔｃａａｇａｔｔａｃｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｔｃａａｇａｇｔｔｔｃｇａｔｇｇｃｇｇａｃｃｇｔｇｃｃａｔｔｔｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｇｃａｔｔｃａｃａａａｃａｇｃｔｇｔｇａｔｇｃｔａｔａｃｔｔｔａｃａｇｇａｃｃｔｇｃａａｔｇａａａｔａｇａａｇｇｔｃｃａｔｔｃａｔａｇａｔｔａｃｔｔｃａａｇａｃｃｃａａａｔａａａｔａａａｃｃａｃｔｇｃｔｔｔｔａｇｃｔｇｇｃｃｃａａｇｔｇｔｔｃｃｔｃｔａｃｃａｃｃｃｔｃｔｇｇｔｇａａｃｔｇｇａｔｇａａａａａｔｇｇｇａｇａｔｇｔｇｇｔｔａｇｇｔａａａｔｔｔｃｃｔｇａａａａｇｔｃａｇｔｃａｔａｔａｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇｇａａｇｃｇａｇａｃａｔａｃｔｔｇａａｔｇａｔｇｃｔｃａｇａｔｔｃａｇｇａｇｃｔｔａｃａｃｔｔｇｇｇｔｔｇｇａｇｃｔｃａｃｔｇｇｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔａｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔｇａａｔｔｔｔｇｇａａｃａａｇｔａａｃａｇｃａｃｃｇａｔｇｃｃｃａｃａａｔａａｇｃｔａｇａａｇｃａｔｃａｔｔａｃｃａｇａａｇｇａｔｔｔａｇａｇａｇａｇａａｔｃａａａｇａｃａｇｇｇｇｃｇｔｔｃｔｇｃａｔａ（配列番号１１７）。
【００４９】
ホウレンソウＧＴ１のアミノ酸タンパク質の配列は以下の通りである。ｍａａｓｎｋｅｑｓｋｌｈｉａｍｆｐｗｆａｙｇｈｉｎｐｆｉｑｌｓｎｋｌｓｓｈｇｉｑｉｓｆｆｓｉｐｇｎｉｄｒｉｋｓｓｌｎｌｓｐｐｎｑｌｉｐｌｔｉｐｐｔｅｇｌｓｐｎｆｄｓｓｓｅｖｔｐｑｔａｑｌｌｔｌａｌｄｑｍｑｐｑｖｋａｌｆｐｈｐｑｐｑｖｉｌｆｄｆａｙｈｗｌｐｓｖａｓｅｌｇｉｋａｖｈｆｎｔｆｐａｖｉｎｓｙｌｔｖｐｓｒｍｔｄｐｎｋｐｐｔｆｅｄｌｋｎｐｐｑｇｙｐｋｔｓｔａｓｖｋｔｆｅａｑｄｙｌｆｌｆｋｓｆｄｇｇｐｃｈｆｅｋｉｌａｆｔｎｓｃｄａｉｌｙｒｔｃｎｅｉｅｇｐｆｉｄｙｆｋｔｑｉｎｋｐｌｌｌａｇｐｓｖｐｌｐｐｓｇｅｌｄｅｋｗｅｍｗｌｇｋｆｐｅｋｓｖｉｙｃｓｆｇｓｅｔｙｌｎｄａｑｉｑｅｌｔｌｇｌｅｌｔｇｌｐｆｉｌｖｌｎｆｇｔｓｎｓｔｄａｈｎｋｌｅａｓｌｐｅｇｆｒｅｒｉｋｄｒｇｖｌｈｔｇｗｖｑｑｑｎｉｌａｈｒｓｉｇｃｆｌｔｈａｇｆｓｓｖｉｅｇｉｖｎｄｃｑｌａｆｌｐｌｋａｄｑｆｍｉａｋｌｆｓｇｄｌｋａｇｖｅｖｎｒｒｄｅｄｇｓｆａｋｅｄｉｆｅａｉｋｔｉｍｖｄｔｄｋｅｐｓｒｓｉｒｅｎｈｓｎｗｒｋｆｌｍｎｋｅｉｅａｓｙｉａｎｌａｈｅｌｋａｌｖｑｋａ（配列番号１１８）。
【００５０】
ホウレンソウＧＴ２核酸遺伝子の配列は以下の通りである。ａｔｇｔｇｔｇａｃｇａｃａａａａａａｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｔｇａｇｃａｔａｇｃａｔｔｔｔａｔｃｃｇｔｇｇｔｔｔｇｃｔｃｔｔｇｇｔｃａｃｃｔｔａｃｔｔｃａｔｔｔｃｔｃｃｇａｔｔａｇｃｃａａｃａａａｃｔｔｇｃａｃａａａａｔｇｇｔｃａｃａａｔｇｔｇｔｃｃｔａｔｔｔｔａｔｃｃｃａａｃｔａａｔａｃａｔｔａｃｃｔａｇａｔｔａｃｔｔｃｃｔｃａｃａａｃｃａｔｔａｃｃｃｔｇｇｃｃａｃｃｔｔａｃｔｔｔｃａｔｃｃｃｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｃｃａｃｃｃｇｔｔｇａｃｇｇｃｃｔｃｃｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｇａｇａｃｃａｃｃａａｃｇａｔｇｔｃｃｃｃｔｃｃｔｃｇｇｃｔａｔａｃａｃｃｔｔｃｔｔａｔｇａｃｔｇｃｃａｔｇｇａｔｔｔｇａｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａｔｃｇａｇｇｃｃｃａｔｔｔｇｇｔｔａｇｔａｔｃａａａｃｃｃｇａｔｇｔｔｇｔｔｔｔｃｔａｃｇａｃｔｔｔｇｃｔｔａｔｔｇｇａｔｔｃｃｃｇａｔｃｔａｇｃｃｃｇａａａａｃａｃｇｇｇｔｔｃａａｇｔｃａｇｔａｃｔｃｔａｃａｔｔａｃａｔｃｃｔａｔａｔａｇｃａａｇａｔｇｔｇｃｔｔａｔｔｔｔｇｃｃｃｃｃｇａｔｔｔｇａａｇｔｃｇｇｇｔｃａｔｃａｇｔｃｃａｃｔｇｇｇｇｃｃｇａａａｔｔａｔｔｇｃｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇｇｔｔｔｔｃｃｇｔｃｔｃａｇｃａｔｔｔｃｃｇｇａｔｇｃａａｇｃａｃａｃｇａｇｇｃｔｇａｇａｃｔｇｔｇｇｃａｇａｃｇｔａｇｇｔａａａｇａｇｃａａｇａｔｇｇａｔｔａｃａａｇｇｔａｔａａｃｔａｔｔｔｃｔｇａａａｇｇａｔｇｃｇｃａｔｔｇｃｔｔｔｔｇｇａａａａｔｇｃｇａｃｇｃａａｔｔｇｇａｇｔａａａｇａｇｔｔｇｔａａｇｇａｇａｔｇｇａａａａｇｇｔｇｔａｔａｔｔｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｇａａｇａｔａｔｔｔｇｇｔａａｇｔｃｔｇｔａｃｔａｃｔａｇｃａｇｇｔｃｃｔａｔｇｇｔｃｃｃｔａａａａｃｃｃｃａｔｃｔｔｃｃａａａｃｔｔｇａｔｇａａｔａｔｔｔｔｇａｔｇｇｔｔｇｇｃｔｔａｃｇｇｇｔｔｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔｇａｔｔｔａｔｔｇｔｇｃａｔｔｔｇｇｇａｇｔｇａａｔｇｔｇｔｔｃｔｃｇａａａｔｔａａｃｃａａｔｔｔｃａａｃａａｃｔｔｃｔｔｃｔｔｇｇａｃｔａｇａｇｃｔｃａｃａｇｇａａｇｇｃｃａｔｔｔｔｔｇｇｔｇｇｃｃａｔｇａａｇｃｃｇｃｃｔａａｇａａｇｔａｔｇａａａｃａａｔａｇａｇｔｃｇｇｃｃｔｔａｃｃａｇａａｇｇｇｔｔｔｇａｇａａｇａｇａａｃａａａａｇｇａａｇｇｇｇａａｔｃｇｔａｃａｔｇａｇｇｇｔｔｇｇｇｔｇｃａｇｃａａｃａａｃｔｇａｔａｔ（配列番号１１９）。
【００５１】
ホウレンソウＧＴ２アミノ酸遺伝子ポリペプチドは以下の通りである。ｍｃｄｄｋｋｓｓｖｌｓｉａｆｙｐｗｆａｌｇｈｌｔｓｆｌｒｌａｎｋｌａｑｎｇｈｎｖｓｙｆｉｐｔｎｔｌｐｒｌｌｐｈｎｈｙｐｇｈｌｔｆｉｐｖｔｖｐｐｖｄｇｌｐｌｒａｅｔｔｎｄｖｐｓｓａｉｈｌｌｍｔａｍｄｌｔｒｄｔｉｅａｈｌｖｓｉｋｐｄｖｖｆｙｄｆａｙｗｉｐｄｌａｒｋｈｇｆｋｓｖｌｙｉｔｓｙｉａｒｃａｙｆａｐｄｌｋｓｇｈｑｓｔｇａｅｉｉａｐｐｐｇｆｐｓｑｈｆｒｍｑａｈｅａｅｔｖａｄｖｇｋｅｑｄｇｌｑｇｉｔｉｓｅｒｍｒｉａｆｇｋｃｄａｉｇｖｋｓｃｋｅｍｅｋｖｙｉｄｙｃｅｋｉｆｇｋｓｖｌｌａｇｐｍｖｐｋｔｐｓｓｋｌｄｅｙｆｄｇｗｌｔｇｆｇａａｔｖｉｙｃａｆｇｓｅｃｖｌｅｉｎｑｆｑｑｌｌｌｇｌｅｌｔｇｒｐｆｌｖａｍｋｐｐｋｋｙｅｔｉｅｓａｌｐｅｇｆｅｋｒｔｋｇｒｇｉｖｈｅｇｗｖｑｑｑｌｉｌｑｈｐｓｖｇｃｆｉｔｈｃｇｖｇｓｌｓｅａｍｖｓｋｃｑｖｖｌｍｐｑａｖｄｑｆｉｎａｒｍｍｓｌｅｌｋｉｇｖｅｖｅｋｒｅｄｄｇｌｆｔｋｅａｖｈｋａｖｓｌｖｍｅｅｅｓｅｖａｋｅｍｒｖｓｈｄｋｗｒｅｆｌｌｑｅｇｌｅｄｓｙｉｓｓｆｉｑｓｌｒｑｌｔｉｇ（配列番号１２０）。
【００５２】
数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値を示す。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５３】
【図３０Ａ】サイレンシングされた（ＶＩＧＳ）グリコシルトランスフェラーゼを有するホウレンソウに蓄積されたサポニンの推定特性を示すデータである。ＳＯＡＰ６−ＳＯＡＰ９（それぞれ、配列番号５５、５７、５９、６１）及び他の２つのＧＴをサイレンシングした植物における選択された化合物の相対含有量。数値（±ＳＤ）は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング）と比較して統計的に有意な差を示した；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３０Ｂ】サイレンシングされた（ＶＩＧＳ）グリコシルトランスフェラーゼを有するホウレンソウに蓄積されたサポニンの推定特性を示すデータである。主要なフラグメントを示したＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図３０Ｃ】サイレンシングされた（ＶＩＧＳ）グリコシルトランスフェラーゼを有するホウレンソウに蓄積されたサポニンの推定特性を示すデータである。蓄積されたサポニンの推定構造は、正確な質量測定及びフラグメンテーションパターンに基づいている。
【図３１Ａ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。ＶＩＧＳでサイレンシングされたＳＯＡＰ１０（赤のトレース）または対照としてのＣＨＬＨ（黒のトレース）を有するホウレンソウの試料のＬＣ−ＭＳ分析。クロマトグラムの青色及び黄色の領域には、それぞれ脱アセチル化及びアセチル化したサポニンが含まれている。ホウレンソウの葉でＳＯＡＰ１０をサイレンシングすると、アセチル化したサポニンの生成が減少し、脱アセチル化したサポニンの蓄積が増加した。
【図３１Ｂ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。アシルトランスフェラーゼをＶＩＧＳでサイレンシングしたホウレンソウ、及び対照としてのＣＨＬＨを有するホウレンソウにおける、選択した脱アセチル化サポニン（Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶ及びＸＩＩ）及びそのアセチル化対応物（Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ及びＶＩＩ）の相対含有量。縦軸はｌｏｇ１０スケールである。
【図３１Ｃ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。ＶＩＧＳでサイレンシングされたホウレンソウ植物におけるアセチル化サポニンに対する脱アセチル化サポニンの比率。ＳＯＡＰ１０のサイレンシングにより、脱アセチル化サポニンの蓄積が増加した。
【図３１Ｄ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。インビトロでのＳＯＡＰ１０リコンビナントタンパク質の活性。基質（黒のトレース）−ホウレンソウ由来の脱アセチル化サポニンの精製画分、リコンビナントＳＯＡＰ１０をアセチル−ＣｏＡ存在下で基質と共にインキュベートしたインビトロ酵素アッセイ（オレンジのトレース）、及び、比較のためのホウレンソウ葉の抽出物（緑のトレース）中の、脱アセチル化サポニン（ｍ／ｚ  １１０１．５１）及びアセチル化対応物（ｍ／ｚ  １３１３．５２）のＥＩＣ。点線は、クロマトグラムの領域を、左側及び右側の脱アセチル化サポニン及びアセチル化サポニンに、それぞれ分けている。「Δｍ／ｚ＝４２．０１」は、アセチル化によって生じた化合物の分子量の違いを示している。（ＳｏＡＴ１（配列番号１０９［遺伝子］及び配列番号１１３［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ２（配列番号１１０［遺伝子］及び配列番号１３１［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ３（配列番号１１１［遺伝子］及び配列番号１１５［ポリペプチド］）、及びＳｏＡＴ４（配列番号１１２［遺伝子］及び配列番号１１６［ポリペプチド］）、機能的活性については表１５を参照。）
【図３１Ｅ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。インビトロでのＳＯＡＰ１０リコンビナントタンパク質の活性。基質（黒のトレース）−ホウレンソウ由来の脱アセチル化サポニンの精製画分、リコンビナントＳＯＡＰ１０をアセチル−ＣｏＡ存在下で基質と共にインキュベートしたインビトロ酵素アッセイ（オレンジのトレース）、及び、比較のためのホウレンソウ葉の抽出物（緑のトレース）中の、脱アセチル化サポニン（ｍ／ｚ  １２６３．５７）及びアセチル化対応物（ｍ／ｚ  １３０５．５８）のＥＩＣ。点線は、クロマトグラムの領域を、左側及び右側の脱アセチル化サポニン及びアセチル化サポニンに、それぞれ分けている。「Δｍ／ｚ＝４２．０１」は、アセチル化によって生じた化合物の分子量の違いを示している。（ＳｏＡＴ１（配列番号１０９［遺伝子］及び配列番号１１３［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ２（配列番号１１０［遺伝子］及び配列番号１３１［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ３（配列番号１１１［遺伝子］及び配列番号１１５［ポリペプチド］）、及びＳｏＡＴ４（配列番号１１２［遺伝子］及び配列番号１１６［ポリペプチド］）、機能的活性については表１５を参照。）
【図３１Ｆ】プランタ（ホウレンソウ）及びインビトロでのＳＯＡＰ１０アセチルトランスフェラーゼの特性を示す。インビトロでのＳＯＡＰ１０リコンビナントタンパク質の活性。基質（黒のトレース）−ホウレンソウ由来の脱アセチル化サポニンの精製画分、リコンビナントＳＯＡＰ１０をアセチル−ＣｏＡ存在下で基質と共にインキュベートしたインビトロ酵素アッセイ（オレンジのトレース）、及び、比較のためのホウレンソウ葉の抽出物（緑のトレース）中の、脱アセチル化サポニン（ｍ／ｚ  １３９５．６１）及びアセチル化対応物（ｍ／ｚ  ３１３７．６２）のＥＩＣ。点線は、クロマトグラムの領域を、左側及び右側の脱アセチル化サポニン及びアセチル化サポニンに、それぞれ分けている。「Δｍ／ｚ＝４２．０１」は、アセチル化によって生じた化合物の分子量の違いを示している。（ＳｏＡＴ１（配列番号１０９［遺伝子］及び配列番号１１３［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ２（配列番号１１０［遺伝子］及び配列番号１３１［ポリペプチド］）、ＳｏＡＴ３（配列番号１１１［遺伝子］及び配列番号１１５［ポリペプチド］）、及びＳｏＡＴ４（配列番号１１２［遺伝子］及び配列番号１１６［ポリペプチド］）、機能的活性については表１５を参照。）
【図３２Ａ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ１−４及び６−１０の発現のデータを示す図である。ＳＯＡＰ１−４単独、またはＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）を含まない９つのＳＯＡＰすべてを一過性発現させた植物から得られたメディカゲン酸及びその（ポリ）グリコシル化誘導体のＥＩＣ［ｍ／ｚ＝５０１．３２（ＭＡ）；ｍ／ｚ＝６６３．３８（ＭＡ＋ｈｅｘ）；ｍ／ｚ＝８２５．４３（ＭＡ＋２ｈｅｘ）；ｍ／ｚ＝９８７．４８（ＭＡ＋３ｈｅｘ）；ｍ／ｚ＝１１４９．５３（ＭＡ＋４ｈｅｘ）陰イオン化モード］を、対照と比較した。挿入図は、クロマトグラムの領域を２０倍に拡大したものである。
【図３２Ｂ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ１−４及び６−１０の発現のデータを示す図である。トリ−ヘキソシルメディカゲン酸のＭＳＥスペクトルを示す。矢印はヘキソシル部分の消失を示している。
【図３２Ｃ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ１−４及び６−１０の発現のデータを示す図である。ビス−ヘキソシルメディカゲン酸のＭＳＥスペクトルを示す。矢印はヘキソシル部分の消失を示している。
【図３２Ｄ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ１−４及び６−１０の発現のデータを示す図である。モノ−ヘキソシルメディカゲン酸のＭＳＥスペクトルを示す。矢印はヘキソシル部分の消失を示している。
【図３３Ａ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧｓ）後のホウレンソウの葉におけるＳＯＡＰ５の相対発現の分析。提示された値は、４つの独立した生物学的複製から得られた。ＳＯＡＰ５の発現を、対照（マグネシウムケラターゼサブユニットＨのみをサイレンシングした植物−ＣＨＬＨ）と比較した。
【図３３Ｂ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ＳＯＡＰ５及び他のグリコシルトランスフェラーゼをサイレンシングしたホウレンソウの葉におけるメディカゲン酸の蓄積量を対照（ＣＨＬＨ）と比較した。有意差が示された；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３３Ｃ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ＳＯＡＰ１−５を一過性発現させた植物から得られたメディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド［ｍ／ｚ＝６７７．３５（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］のＥＩＣを、ＳＯＡＰ１−４のみを発現させた植物及びコントロール（空ベクター  ＥＶ）と比較した。
【図３３Ｄ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ＳＯＡＰ１−５を発現する酵母、酵母対照（ＳＯＡＰ１−４＋ＳｏＵＧＤ１；ＳＯＡＰ５単独及びＥＶで形質転換した酵母細胞）と比較した、ＳＯＡＰ１−５＋ＳｏＵＧＤ１を発現する酵母からのＭＡ−３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６７７．３５、陰イオン化モード］のＥＩＣ。
【図３３Ｅ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ホウレンソウにおけるＳＯＡＰ５活性の模式図。ＳＯＡＰ５は、グルクロン酸（赤で強調）をＣ−３位のメディカゲン酸に結合させる。
【図３３Ｆ】セルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＳＯＡＰ５；配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）の技術的解析結果を示す図である。ＳＯＡＰ５がコードする酵素は、トリテルペノイドのアグリコンにグルクロン酸を結合させ、ホウレンソウのサポニン生合成経路において重要な役割を果たしている。ベンサミアナタバコにおけるホウレンソウサポニン生合成経路の再構成。１０のＳＯＡＰ遺伝子をすべて一過性発現させたベンサミアナタバコの葉の試料におけるＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ［ｍ／ｚ＝１３０５．５７、陰イオン化モード］のＥＩＣを、対照植物（ＥＶ）及びホウレンソウの葉の抽出物と比較した。
【図３４Ａ】ホウレンソウでＳＯＡＰ５をサイレンシング（ＶＩＧＳ）した結果を示すデータである。対照（ＣＨＬＨサイレンシング）及び野生型（ＷＴ）と比較した、ＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）をサイレンシングした植物からのメディカゲン酸のＥＩＣ［ｍ／ｚ＝５０１．３、陰イオン化モード］。インプランタ実験で得られたクロマトグラムのみを縮尺通りに表示している。
【図３４Ｂ】ホウレンソウでＳＯＡＰ５をサイレンシング（ＶＩＧＳ）した結果を示すデータである。植物に蓄積されたメディカゲン酸［２５Ｖ、陽イオンモード］のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を、基準の標準物質と比較した。ＭＡ−メディカゲン酸。
【図３５Ａ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）の一時的な発現を示すデータの図である。ＳＯＡＰ１−５（それぞれ、配列番号４５、４６、５１、５３及び６５）を一過性発現させた植物から得たメディカゲン酸及びメディカゲン酸３−グルクロニドのＥＩＣ［ｍ／ｚ＝５０１．３２（ＭＡ）；ｍ／ｚ＝６７７．３５（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］を、ＳＯＡＰ１−４（それぞれ、配列番号４５、４６、５１及び５３）を単独で発現させた植物、ＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）を単独で発現させた植物、及び対照（空ベクター  ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺の通り。
【図３５Ｂ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）の一時的な発現を示すデータの図である。フラグメントルートをマークしたＭＡ−３−ＧｌｃＡの構造。
【図３５Ｃ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）の一時的な発現を示すデータの図である。ＭＡ−３−ＧｌｃＡのＭＳ／ＭＳ［４５Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸部分の消失を示す。
【図３５Ｄ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）の一時的な発現を示すデータの図である。メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）の水素の重要なＨＭＢＣ相関を示している。黒い矢印は、ＭＡ−３−ＧｌｃＡの６つのメチル基のＨＭＢＣ相関を示す。赤い矢印は、ＭＡ−３−ＧｌｃＡの他の（選択された）水素のＨＭＢＣ相関を表す。数字は、メディカゲン酸及びグルクロン酸部分の炭素原子に対応する。詳細は表１を参照。
【図３６Ａ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。ＳＯＡＰ１／２／５を一過性発現させた植物から得られたオレアノール酸３−ＧｌｃＡのＥＩＣ［ｍ／ｚ＝６３１．３８（ＯＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］を、ＳＯＡＰ５を含まない同一のＳＯＡＰセットを発現させた植物、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺が異なる。
【図３６Ｂ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。ＳＯＡＰ１／２／３／５を一過性発現させた植物から得られたアウグスチン酸３−ＧｌｃＡのＥＩＣ［ｍ／ｚ＝６４７．３８（ＡＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］を、ＳＯＡＰ５を含まない同一のＳＯＡＰセットを発現させた植物、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺が異なる。
【図３６Ｃ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。ＳＯＡＰ１／２／４／５を一過性発現させた植物から得られたギプソゲン酸３−ＧｌｃＡのＥＩＣ［ｍ／ｚ＝６６１．３５（ＧＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］を、ＳＯＡＰ５を含まない同一のＳＯＡＰセットを発現させた植物、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺が異なる。
【図３６Ｄ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。図３６Ａからのグルクロン酸誘導体のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を示す［４０Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図３６Ｅ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。図３６Ｂからのグルクロン酸誘導体のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を示す［４０Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図３６Ｆ】ＳＯＡＰ５（配列番号６６）の基質特異性を示す図である（表１６参照）。図３６Ｃからのグルクロン酸誘導体のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を示す［４０Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図３７Ａ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の生成物を示す図である。クロマトグラムに示されたＳＯＡＰ遺伝子の組み合わせを一過性発現させた植物から得たＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｉ（ｍ／ｚ＝８２３．４２）のＥＩＣ。ＭＳ／ＭＳスペクトルについては、図４０Ｂを参照。
【図３７Ｂ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の生成物を示す図である。クロマトグラムに示されたＳＯＡＰ遺伝子の組み合わせを一過性発現させた植物から得たＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩ（ｍ／ｚ＝９６９．２７）のＥＩＣ。ＭＳ／ＭＳスペクトルについては、図４０Ｂを参照。
【図３７Ｃ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の生成物を示す図である。クロマトグラムに示されたＳＯＡＰ遺伝子の組み合わせを一過性発現させた植物から得たＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩＩ（ｍ／ｚ＝１１３１．５２）Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩ（ｍ／ｚ＝９６９．２７）のＥＩＣ。ＭＳ／ＭＳスペクトルについては、図４０Ｂを参照。
【図３７Ｄ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の生成物を示す図である。クロマトグラムに示されたＳＯＡＰ遺伝子の組み合わせを一過性発現させた植物から得たＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶ（ｍ／ｚ＝１２６３．５７）のＥＩＣ。ＭＳ／ＭＳスペクトルについては、図４０Ｂを参照。
【図３７Ｅ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の生成物を示す図である。クロマトグラムに示されたＳＯＡＰ遺伝子の組み合わせを一過性発現させた植物から得たＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ（ｍ／ｚ＝１３０５．５８）のＥＩＣ。ＭＳ／ＭＳスペクトルについては、図４０Ｂを参照。
【図３８Ａ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の主要な生成物の質量分析（ＭＳ）による同定を示す図である。ＭＡ−３−ＧｌｃＡに対するＳＯＡＰ６活性の生成物であるＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｉ（化合物７）のＭＳ／ＭＳ。
【図３８Ｂ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の主要な生成物の質量分析（ＭＳ）による同定を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｉに対するＳＯＡＰ７活性の生成物であるＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩ（化合物８）のＭＳ／ＭＳ。
【図３８Ｃ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の主要な生成物の質量分析（ＭＳ）による同定を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩに対するＳＯＡＰ８活性の生成物であるＹｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩＩ（化合物９）のＭＳ／ＭＳ。
【図３８Ｄ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の主要な生成物の質量分析（ＭＳ）による同定を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＩＩに対するＳＯＡＰ９活性の生成物であるＹｏｓｓｏｓｉｄ  ＩＶ（化合物１０）のＭＳ／ＭＳ。
【図３８Ｅ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ活性の主要な生成物の質量分析（ＭＳ）による同定を示す図である。Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  ＩＶに対するＳＯＡＰ１０活性の生成物であるＹｏｓｓｏｓｉｄ  Ｖ（化合物１１）のＭＳ／ＭＳ。
【図３９Ａ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ９活性の結果を示す図である。ＳＯＡＰ１−５＋ＳＯＡＰ９を一過性発現させた植物から得られたメディカゲン酸３−ＧｌｃＡ−Ｘｙｌ［ｍ／ｚ＝８０９．４０、陰イオン化モード］のＥＩＣを、ＳＯＡＰ１−５のみを発現させた植物及び対照（ＥＶ）と比較した。表１６参照。
【図３９Ｂ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ９活性の結果を示す図である。８０９．４（４５Ｖ）のＭＳ／ＭＳ、矢印はｇｌｃＡ−ｘｙｌ部分の消失を示す（ｍ／ｚ＝３０８．０７）。
【図３９Ｃ】ベンサミアナタバコにおけるＳＯＡＰ９活性の結果を示す図である。ＳＯＡＰ９生成物（化合物１０）の構造、矢印で示されたフラグメンテーションパターン。
【図４０Ａ】ＳＯＡＰ５を酵母で発現させた結果を示す図である。ＳＯＡＰ１−５を発現する植物、酵母対照、及びメディカゲン酸の基準の標準物質と比較した、ＳＯＡＰ１−５＋ＵＧＤ１（配列番号７４［遺伝子］及び配列番号７５［タンパク質］）を発現する酵母からのメディカゲン酸及びメディカゲン酸３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝５０１．３２（ＭＡ）；ｍ／ｚ＝６７７．３５（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］のＥＩＣ。クロマトグラムは縮尺通り。
【図４０Ｂ】ＳＯＡＰ５を酵母で発現させた結果を示す図である。酵母細胞から得られたメディカゲン酸３−ＧｌｃＡのＭＳ／ＭＳ［４５Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す。
【図４１Ａ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。ＳＯＡＰ１−５＋ＵＧＤ１を発現させた酵母から得られたオレアノール酸３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６３１．３８（ＯＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］のＥＩＣを、ＳＯＡＰ１−４＋ＵＧＤ単独、ＳＯＡＰ１−５単独、ＳＯＡＰ１−４、ＳＯＡＰ１−２、ＳＯＡＰ５単独で発現させた細胞、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺通り。
【図４１Ｂ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。ＳＯＡＰ１−５＋ＵＧＤ１を発現させた酵母から得られたギプソゲン酸３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６６１．３５（ＧＡ−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］のＥＩＣを、ＳＯＡＰ１−４＋ＵＧＤ単独、ＳＯＡＰ１−５単独、ＳＯＡＰ１−４、ＳＯＡＰ１−２、ＳＯＡＰ５単独で発現させた細胞、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺通り。
【図４１Ｃ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。ＳＯＡＰ１−５＋ＵＧＤ１を発現させた酵母から得られたバヨゲニン３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６６３．３７（バヨゲニン−３−ＧｌｃＡ）、陰イオン化モード］のＥＩＣを、ＳＯＡＰ１−４＋ＵＧＤ単独、ＳＯＡＰ１−５単独、ＳＯＡＰ１−４、ＳＯＡＰ１−２、ＳＯＡＰ５単独で発現させた細胞、及び対照（ＥＶ）と比較した。クロマトグラムは縮尺通り。
【図４１Ｄ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。図４１Ａのグルクロン酸誘導体のＭＳ／ＭＳ［４５Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図４１Ｅ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。図４１Ｂのグルクロン酸誘導体のＭＳ／ＭＳ［４５Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図４１Ｆ】酵母細胞におけるＳＯＡＰ５の基質特異性を示した図である。図４１Ｃのグルクロン酸誘導体のＭＳ／ＭＳ［４５Ｖ、陰イオン化モード］、矢印はグルクロン酸の消失を示す（ｍ／ｚ＝１７６．０３；ＧｌｃＡ−Ｈ２Ｏ）。
【図４２Ａ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。系統樹は、ホウレンソウ由来のＳＯＡＰ５と、ナデシコ目、アオイ科、セリ科、マメ目、及びナス目のＣＳＬＧタンパク質との密接な進化的関係を示している。系統樹は、セルロース合成酵素（ＣＥＳＡ）に属するタンパク質と、セルロース合成酵素様酵素（ＣＳＬＡ、ＣＳＬＢ、ＣＳＬＥ及びＣＳＬＧ）のいくつかのファミリーからなる。点線はＣＳＬＧタンパク質を含むクレードを囲み、吹き出しはＧＡＭＥ１５やマメ目のＣＳＬＧを含むホウレンソウＳＯＡＰ５に近縁のＣＳＬＧに対応している。
【図４２Ｂ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。メディカゲン酸は多くの種のＣＳＬＧによってグルクロン酸化される。ＳＯＡＰ１−４を単独で発現している植物及び対照（ＥＶ）と比較した、ホウレンソウ（ＳＯＡＰ５；配列番号６６）、キノア（ＣｑＣＳＬ；配列番号９６）、ビートルート（ＢｖＣＳＬ；配列番号９４）、アルファルファ（ＭｓＣＳＬ；配列番号９８）、ダイズ（ＧｍＣＳＬ；配列番号１００）、ウラルカンゾウ（ＧｕＣＳＬ；配列番号８１または配列番号１０２）、ミヤコグサ（ＬｊＣＳＬ；配列番号１０４）由来のＣＳＬＧタンパク質に結合したＳＯＡＰ１−４を一過性発現させたベンサミアナタバコの葉の試料のＭＡ−３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６７７．３５、陰イオン化モード］のＥＩＣ。
【図４２Ｃ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。セルロース合成酵素様Ｇタンパク質は、複数の植物種においてトリテルペノイドサポニンの生合成の鍵となる酵素である。β−アミリン（中央）はシトクロムＰ４５０（青丸）によって酸化され、ＣＳＬＧ（ピンクの丸）によって装飾された複数のアグリコン（１−バヨゲニン、２−セルジャン酸、３−オレアノール酸、４−メディカゲン酸、５−グリチルレチン酸、６−ソヤサポゲノールＡ、７−ソヤサポゲノールＢ）を生成し、他のグリコシルトランスフェラーゼは、トリテルペノイドサポニン（８−バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（アルファルファ）、９−セルジャン酸（キノア（C.quinoa））、１０−ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｏｓｉｄｅ  ＩＶ（B.vulgaris）、１１−Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ  Ｖ（ホウレンソウ）、１２−グリチルリチン（ウラルカンゾウ）、１３−ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（ミヤコグサ）、１４−ソヤサポニンＶＩ（ダイズ））を生成する。
【図４２Ｄ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。ウラルカンゾウにおけるグリチルリチンの生合成経路。強調された官能基は、特定の酵素の活性の結果である。
【図４２Ｅ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。４つの遺伝子を発現している試料（−ＵＧＴ７３Ｐ１２；（配列番号８４））、及び対照（ｂＡＳ（配列番号４５）＋ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号７６）＋ＣＹＰ７２Ａ１５４（配列番号７８））と比較した、グリチルリチン生合成経路の５つの遺伝子（ｂＡＳ（配列番号４５）＋ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号７６）＋ＣＹＰ７２Ａ１５４（配列番号７８）＋ＧｕＣＳＬ（配列番号８０ｏｒ配列番号１０３）、及びＵＧＴ７３Ｐ１２（配列番号８４））を一過性発現しているベンサミアナタバコの葉の試料から抽出したグリチルレチン酸３−Ｏ−グルクロニド及びグリチルリチン［ｍ／ｚ６４５．３６、ｍ／ｚ８２１．４０（負イオンモード）］の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の測定結果。
【図４２Ｆ】セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素のグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が、系統的に離れた目に属する種の間で保存されていることを示す図である。セルロース合成酵素様（ＣＳＬ）ポリペプチドの系統樹を、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）に特に重点を置いて提示している。青色の背景領域は、多くの植物目（ナデシコ目、マメ目、セリ目、アオイ目、ナス目）のＣＳＬＧ酵素からなる。ＣＳＬＧ酵素（青色の背景）の中で、関連するサブクレードとしては、トリテルペノイドアグリコンに対するグルクロノシルトランスフェラーゼ活性が証明されたＣＳＬＧ酵素（太字）を含む赤色で描かれたサブクラード（大豆、甘草、ミヤコグサ、アルファルファ、レッドビート、キノア、ホウレンソウ由来のＣＳＬＧ）、及び、ナス目（ジャガイモ、トマト、ビタースイート）のＣＳＬＧからなる青色で描かれたサブクレードなどが含まれる；太字の酵素はステロイド系アルカロイド及びステロイド系サポニンの生合成に関与している。
【図４３Ａ】キヌアにおけるサポニンのＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ分析を示す図である。キヌア（Chenopodium quinoa var. Read Head）の生後１ヶ月の植物の８０％メタノール抽出物の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）。半透明の四角は、サポニンを含むクロマトグラム領域を示す。推定される特徴については表１２を参照。
【図４３Ｂ】ビートルートにおけるサポニンのＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ分析を示す図である。ビートルート（Beta vulgaris var. Bohan）の生後１ヶ月のビーツの８０％メタノール抽出物の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）。半透明の四角は、サポニンを含むクロマトグラム領域を示す。推定される特徴については表１２を参照。
【図４３Ｃ】アルファルファにおけるサポニンのＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ分析を示す図である。アルファルファ（Medicago sativa）の生後２週間の苗の８０％メタノール抽出物の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）。半透明の四角は、サポニンを含むクロマトグラム領域を示す。推定される特徴については表１２を参照。
【図４４Ａ】レッドビートにおけるＣＳＬＧのウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を示す図である。レッドビートにおけるウイルス誘導遺伝子サイレンシング；ＥＶ−空のベクター、ＣＨＬＨ−マグネシウムキラーターゼサブユニットＨ、ＢｖＣＳＬ−ビートルートセルロース合成酵素様Ｇ（配列番号９５［遺伝子］、ＶＩＧｓサイレンシング配列  配列番号１０７）。
【図４４Ｂ】レッドビートにおけるＣＳＬＧのウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を示す図である。サイレンシングされたＢｖＣＳＬを有するレッドビート植物におけるトリテルペノイド系サポニン及びオレアノール酸の相対的な含有量（ピーク面積）の分析。縦軸はｌｏｇ１０スケールである。数値は３回の独立した生物学的実験の平均値。対照植物（ＣＨＬＨサイレンシング単独）と比較して統計的に有意な差を示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４４Ｃ】レッドビートにおけるＣＳＬＧのウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を示す図である。対照（ＣＨＬＨ及びＷＴ）及び基準の標準物質と比較した、ＢｖＣＳＬがサイレンシングされた植物から得られたオレアノール酸［ｍ／ｚ＝４５５．３５、陰イオン化モード］のＥＩＣ（代謝物の同定については、表１２のアルファルファを参照）。
【図４５Ａ】アルファルファの毛状根におけるＣＳＬＧのサイレンシングを示す図である。対照（ＥＶ）と比較した、サイレンシングされたアルファルファセルロース合成酵素様（ＭｓＣＳＬ）を有する毛状根の培養物から得られた、アグリコンに結合したグルクロン酸を含む代表的なサポニンのＥＩＣ。
【図４５Ｂ】アルファルファの毛状根におけるＣＳＬＧのサイレンシングを示す図である。サイレンシングされたＭｓＣＳＬを有するアルファルファの毛状根におけるトリテルペノイド系サポニンの分析。縦軸はｌｏｇ１０スケール。数値は５回の独立した生物学的実験の平均値。対照（ＥＶのみで形質転換した根）と比較して統計的に有意な差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ａｓＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡ）使用したａｓＲＮＡの配列を以下に記す。
【００５４】
ｃｔａｃｃｃａｃｔｃｔｔｃｃｇｃｔｔｃａｔａｇａｔａｔａａｔｃｃｃｃｔｃｃａｃａａｔａｇｇａｔｇａｃｔｔａｇａｇｃａａｇｔａｔａｔａｇａｔａａｔｇａｇｇａａａａｇｔｔｇａｃｃａａａｃａｔｔｔｃａｔｃａａａａｔｃｃｃｔｃａｃａｔｔｇａｇｔａｇｔｃｔｃｃａｔａａａｃｃａｃｃａａａｇａａｇｃａａａｃａａｔａｔｔｔａｔｔｇｔｇａｇｔａａｃａｃａａｔｃａｃｔｇｇｔｇｃｃａｔｇａｇｃａａｔｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃａａａａｔｔａａａｃｔｔａｃｃｃｔｇｃｔｃａｔａｔｔｔｃｔｔｔａｇｃｔｔａｔｃｔｔｔｇｔｃａａｔｔｇｃｔｔｔｇｔｃｃｇａｔａａａｇｔｇａａｔｔｔｔｇｃｃｔｔｇｔｔｃａａｃｃｃａａａｃｔｔｔｔｔｔｔｔｃｇｃｔｇｔｔｔｃｔａｔａａｔｔｇｃｇａａａａｃｇｃａｃｃｃａａｔｔｇａｔｔｔｔａｃａａｔｃｃｃａｃｔｔｃｔｔｔｇｔｔｃａｔｔｃｃａｃｃａａａｔｃａｔｃｇａｇｇａｇｃｃａｃｃａｇｔｔｇａａａｔｔａｃｃｔｃａａｔａｔａａｔｇａｔｇａａｔｔｔｇａｃｔｇｇａｔａｇａｔａｃａａｔａｃｔｇｔａａａｃａｃｔａｔａａａｃｃａａｇｇａｔｃｔｇｔａａｃｃｔｔｔｇｇａｔａｔａｃａｇｇｔａｔｔｃｃｃｔｔｃａａｇａａｇｃａａａｔｃｔｇａｇｇａａｃｇａａｔｃｃａｔａｔａａｇａｔｇｔａｇｇｃｔｇｔｔｇｃａａａｔｔｇｇｇｔｔｇｔｇｃｔｔａｃｃａａｇｔａａｃａａａａａｇｔｔａａａｃａａｔｇａａｔａｇｔｇｇｇｃａａｔｃｔｔｇａａａｇｇｃｃａｔａａｇｔｇａａｔｇｇｇｃｔａｔａｔｔｔａｇａｇａｔｔｇｃａａｇｃａａｃａａａａｇｔｔｃａｇａｔｇａｃｃａｃｔｔｔａｔｃｇｇｔｔｇａａｔｃａａｔｃｃｃｔｃｔｔｔｃａｔｇｔｃａｇｔｔｇｇａｇｃａｃａｔｃｃｔａａｇａａａｃａｔｇｇｔｃｔｔｔｔａｇｇｇｔａａａｇａｔａａｇｔｔｇａｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔａｃａａｔｇｇａｇｇａｇａｔａｇｃｃａｇｔａａｃｇｇｔａｃｔｃｔｃａａｇｔｔｔｔａｔａｇｃａｔａｃｇａｇａａｔｃｃｃａｃｃｔｃａｔｔａｃｃｃｃａａｔｔｔｇｔｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｔａｇｇａａｃａａｇａａｇｃｃａｃｔｔｃａｃａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｔａａａａｔｔａｃａｔｃｔｃｔｔｇａａａｔａｔｔｃｔｇｃｔｔｃｔｔａｇｔｔｔｇｔｔｇａｃｃａｃｇｔａａｃｇｃｔｔｔｔａｇｔｇａｔｔｃｔａｃａｔａｃａｔｇｔｔａｇａｃｔｔｇｃｃａａａｇｔｔｇｔａｔａｇａｇｃａｔｃａａｇｔａｇａｔａｇｔｃｃｃｃｔｔｔｔｔｇｇｔｔｔｇｇａｃｔｔｃｃａａａｇａｇｔａａｔ（配列番号１０８）。
【００５５】
【図４６Ａ】ＧｕＣＳＬＧによって触媒されるグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの形成を示す図である。ウラルカンゾウ由来のタンパク質を発現するベンサミアナタバコから得られた試料のグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドのＥＩＣ［ｍ／ｚ＝６４５．３６、陰イオン化モード］。ｂＡＳ−β−アミリン合成酵素（配列番号４８）、ＣＹＰ８８Ｄ６−β−アミリン１１−オキシダーゼ（配列番号７７）、ＣＹＰ７２Ａ１５４−１１−オキソ−ｂ−アミリン３０−オキシダーゼ（配列番号７９）、ＧｕＵＧＡＴ（配列番号８３）−グリチルレチン酸のグルクロニド化を行うことが報告されているグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＧＴ７３Ｐ１２（配列番号８５）−グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドにｇｌｃＡを転移するグリコシルトランスフェラーゼ、ＧｕＣＳＬ−セルロース合成酵素様Ｇ。
【図４６Ｂ】ＧｕＣＳＬＧによって触媒されるグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの形成を示す図である。ＭＳ／ＭＳは６５４．３６（グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの異性体１；５５Ｖ）である。
【図４６Ｃ】ＧｕＣＳＬＧによって触媒されるグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの形成を示す図である。ＭＳ／ＭＳ６５４．３６（異性体２；５５Ｖ）。
【図４６Ｄ】ＧｕＣＳＬＧによって触媒されるグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの形成を示す図である。グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの構造、及び矢印で示されたフラグメンテーションパターン。
【図４６Ｅ】ＧｕＣＳＬＧによって触媒されるグリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドの形成を示す図である。検出されたイオンによるグルクロン酸のクロスリングフラグメンテーションの命名法。
【図４７Ａ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。ウラルカンゾウ由来のタンパク質を発現させたベンサミアナタバコの試料のグリチルリチンのＥＩＣ（ｍ／ｚ＝８２１．４０、陰イオン化モード）。ｂＡＳ−ｂ−アミリン合成酵素［β−アミリン合成酵素］（配列番号４８）、ＣＹＰ８８Ｄ６−ｂ−アミリン１１オキシダーゼ（配列番号７６［遺伝子］及び配列番号７７［ポリペプチド］）、ＣＹＰ７２Ａ１５４−１１−オキソ−ｂ−アミリン４７−オキシダーゼ（配列番号７８［遺伝子］及び配列番号７９［ポリペプチド］）、ＧｕＵＧＡＴ（配列番号８２［遺伝子］及び配列番号８３［ポリペプチド］）−グリチルレチン酸のグルクロン化を行うことが報告されているグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＧＴ７３Ｐ１２−グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニドにｇｌｃＡを転移するグリコシルトランスフェラーゼ（配列番号８４［遺伝子］及び配列番号８５［ポリペプチド］）、ＧｕＣＳＬ−セルロース合成酵素様Ｇ（配列番号８０または配列番号１０３［遺伝子］及び配列番号８１または配列番号１０２［ポリペプチド］）。
【図４７Ｂ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。８２１．４０（異性体１）−ｂＡＳ（配列番号４５）＋ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号７７）＋ＣＹＰ７２Ａ１５４（配列番号７９）＋ＧｕＣＳＬ（配列番号８１または配列番号１０２）＋ＵＧＴ７３Ｐ１２（配列番号８５）の生成物のＭＳ／ＭＳ（６５Ｖ）。
【図４７Ｃ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。８２１．４０（異性体２）−ｂＡＳ（配列番号４５）＋ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号７７）＋ＣＹＰ７２Ａ１５４（配列番号７９）＋ＧｕＣＳＬ（配列番号８１または配列番号１０２）＋ＵＧＴ７３Ｐ１２（配列番号８５）の生成物のＭＳ／ＭＳ（６５Ｖ）。
【図４７Ｄ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。グリチルリチン基準標準物質、及び異性体１のＭＳ／ＭＳ。
【図４７Ｅ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。グリチルリチン基準標準物質、及び異性体２のＭＳ／ＭＳ。
【図４７Ｆ】ＧｕＣＳＬＧを必要とするベンサミアナタバコにおけるグリチルリチン（グリチルレチン酸３−Ｏ−ジグルクロニド）の形成を示す図である。グリチルリチンの構造、及び矢印で示した断片化パターン。
【図４８】ＳＯＡＰ５の構造を示す図である。シロイヌナズナのＡｔＣＥＳＡ１（配列番号６７）、ＡｔＣＥＳＡ３（配列番号６８）、及びホウレンソウのそれらのオーソログ（ＳｏＣＥＳＡ１（配列番号７０）及びＳｏＣＥＳＡ３（配列番号７１））のタンパク質配列を、ＳＯＡＰ５（配列番号６６）及びシロイヌナズナのその対応物であるＡｔＣＳＬＧｌ（配列番号６９）と共にアライメントした。
【図４９Ａ】ＳＯＡＰ５の予測される３Ｄ構造を示す図である。メディカゲン酸が酵素の活性部位に到達し（青−１、２、３）、脂質二重層の疎水性環境から離脱する（黄−４）ことを可能にするトンネルが予測されたＳＯＡＰ５の３Ｄモデル。
【図４９Ｂ】ＳＯＡＰ５の予測される立体構造を示す図である。メディカゲン酸が酵素の活性部位に到達し（青−１、２、３）、脂質二重層の疎水性環境から離脱する（黄−４）ことを可能にするトンネルが予測されたＳＯＡＰ５の３Ｄモデル。
【図４９Ｃ−１】ＳＯＡＰ５の予測される立体構造を示す図の１つである。図４９Ａで示したトンネルのプロファイル及び特性。
【図４９Ｃ−２】ＳＯＡＰ５の予測される立体構造を示す図の１つである。図４９Ａで示したトンネルのプロファイル及び特性。
【図５０Ａ】ＳＯＡＰ５の部位特異的変異誘発データを示す図である。陰性のＳＯＡＰ５、ＳＯＡＰ１−４単独、及び対照（ＥＶ）と比較した、ＳＯＡＰ５の変異体を有するＳＯＡＰ１−４を一過性発現させた植物から得られたメディカゲン酸［ｍ／ｚ＝５０１．３２］及びメディカゲン酸３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６７７．３５］のＥＩＣ。
【図５０Ｂ】ＳＯＡＰ５の部位特異的変異誘発データを示す図である。遊離ＭＡに対するＭＡ−３−ＧｌｃＡの比率として表した、ＳＯＡＰ５の変異体を発現させた植物におけるＭＡ及びＭＡ−３−ＧｌｃＡの蓄積。縦軸はｌｏｇ１０である。数値は３回の独立した生物学的実験の平均値。陰性のＳＯＡＰ５を発現している植物と比較して統計的に有意な差があることを示している；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５１−１】（Ａ）−（Ｆ）からなる、ＳＯＡＰ５を含む、小胞体（ＥＲ）膜に共局在しているＳＯＡＰタンパク質を示す顕微鏡写真である。ベンサミアナタバコの葉で一次的に共発現させたＳＯＡＰ５：ＲＦＰと、（Ａ）ＥＲ：ＧＦＰマーカー、（Ｂ）ゴルジ：ＧＦＰマーカー、（Ｃ）ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ、（Ｄ）ＳＯＡＰ２：ＧＦＰ、（Ｅ）ＳＯＡＰ３：ＧＦＰ及び（Ｆ）ＳＯＡＰ４：ＧＦＰとの共焦点画像。各パネルには、ＧＦＰ、ＲＦＰ、及び両方のチャンネルを合成した画像が含まれている。スケールバーは５０μｍ。
【図５１−２】（Ｇ）及び（Ｈ）からなる、ＳＯＡＰ５を含む、小胞体（ＥＲ）膜に共局在しているＳＯＡＰタンパク質を示す顕微鏡写真である。（Ｇ）保存されたモチーフ（赤色）、置換されたアミノ酸（青色、矢印で示す）、及び６つの膜貫通ドメインを示したＳＯＡＰ５のトポロジーモデル。（Ｈ）ＳＯＡＰ５を含む、小胞体（ＥＲ）膜に共局在しているＳＯＡＰタンパク質を示す顕微鏡写真である。示された構築物を発現させた細胞のＦＲＥＴインデックス。値は平均値±ＳＥ。ＧＦＰ及びＲＦＰを発現させた陰性対照（ＮＣ）と比較した有意差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５２−１】（Ａ）−（Ｄ）からなる、トリテルペノイドアグリコンの形成に関与するＳＯＡＰが小胞体（ＥＲ）に共在して存在することを示す顕微鏡写真である。ベンサミアナタバコの葉に一過性共発現させた蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びＲＦＰ）と融合したＳＯＡＰの共焦点画像。（Ａ）ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ２：ＲＦＰ。（Ｂ）ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ３：ＲＦＰ。（Ｃ）ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ４：ＲＦＰ。（Ｄ）ＳＯＡＰ２：ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ３：ＲＦＰ。パネルには、ＧＦＰ、ＲＦＰ、及び両方のチャンネルを合成した画像が含まれている。スケールバー−５０ピコメートル。
【図５２−２】（Ｅ）及び（Ｆ）からなる、トリテルペノイドアグリコンの形成に関与するＳＯＡＰが小胞体（ＥＲ）に共在して存在することを示す顕微鏡写真である。ベンサミアナタバコの葉に一過性共発現させた蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びＲＦＰ）と融合したＳＯＡＰの共焦点画像。（Ｅ）ＳＯＡＰ２−ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ４：ＲＦＰ。（Ｆ）ＳＯＡＰ３：ＧＦＰ＋ＳＯＡＰ４：ＲＦＰ。パネルには、ＧＦＰ、ＲＦＰ、及び両方のチャンネルを合成した画像が含まれている。スケールバー−５０ピコメートル。
【図５３】蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合したが、依然として活性を有するＳＯＡＰを示すデータである。陰性のＳＯＡＰ５、ＳＯＡＰ１−４単独、及び対照（ＥＶ）と比較した、ＳＯＡＰ１：ｅＧＦＰ、ＳＯＡＰ２：ｅＧＦＰ、ＳＯＡＰ３：ｍＲＦＰ、ＳＯＡＰ４：ｅＧＦＰ、ＳＯＡＰ５：ｍＲＦＰを一過性発現させたベンサミアナタバコ植物から得られたメディカゲン酸［ｍ／ｚ＝５０１．３２］及びメディカゲン酸３−ＧｌｃＡ［ｍ／ｚ＝６７７．３５］のＥＩＣである。ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ、ＳＯＡＰ２：ＧＦＰ、ＳＯＡＰ３：ＲＦＰ、ＳＯＡＰ４：ＧＦＰ、ＳＯＡＰ５：ＲＦＰを、陰性のＳＯＡＰ１−５、ＳＯＡＰ１−４単独、対照（ＥＶ）と比較した。
【図５４Ａ】蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合したが、依然として活性化しているＳＯＡＰを示す図である。示された構築物を発現させた細胞の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）指数。値は平均値±ＳＥ。遊離ＧＦＰ及びＲＦＰを発現させた陰性対照（ＮＣ）と比較した有意差をアステリスクで示した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５４Ｂ】蛍光タンパク質（ＦＰ）と融合したが、まだ活性化しているＳＯＡＰを示す図である。ＥＲ内でのタンパク質の位置の可能性を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下の詳細な説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細を記載している。しかしながら、当業者であれば、これらの具体的な詳細がなくても本発明を実施することができることが理解できるであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、及び構成要素は詳細に説明されていない。
【００５７】
具体的には、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して増加した遺伝子組換え細胞であって、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加した、遺伝子組換え細胞が開示される。いくつかの実施形態では、酵素をコードする少なくとも１つの追加の異種遺伝子をさらに発現し、前記酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００５８】
「ＣＳＬＧ」という用語は、Ｇファミリー由来のセルロース合成酵素様酵素を包含する。セルロース合成酵素様（ＣＳＬ）ファミリーには、例えばＡ、Ｂ、Ｅ、Ｇなどの、それぞれ異なる接尾辞を有するものがある。各ファミリーの接尾辞は、事前に特徴付けられたシロイヌナズナ由来のタンパク質に対する酵素の類似性に応じて基づいて付けられる。異なるファミリーのＣＳＬ酵素は、異なる技術的特徴を有する。本明細書を通じて使用される、Ａ、Ｂ、またはＥの接尾辞が付いていない用語「ＣＳＬ」は、いくつかの実施形態では、「ＣＳＬＧ」という用語と、互換的に使用することができ、すべて同一の意味及び性質を有する。
【００５９】
「ＣＳＬＧ」タンパク質は、いくつかの実施形態では、「ＧＡＭＥ１５」タンパク質及び「ＳＯＡＰ５」タンパク質を包含する。
【００６０】
本明細書では、６つの検査済みＣＳＬＧ遺伝子について説明する。いくつかの実施形態では、それらには、ＧＡＭＥ１５遺伝子と、それらがコードする酵素（トマト、野生トマト、ジャガイモ、野生ポテト、ナス、ピーマンの６種に由来する６つの酵素）が含まれる。これらは、グルクロン酸または他の糖部分を転移してステロイド系アルカロイドを産生するか、あるいは、グルクロン酸または他の糖部分をフロスタノール型サポニン（アグリコン）上に転移してステロイド系サポニンまたはその前駆体を産生するか、またはステロイド系アルカロイドまたはその前駆体を産生する（例えば、図１を参照）。
【００６１】
本明細書では、グルクロン酸をトリテルペノイドアグリコン上に転移する７つの検査済みＣＳＬＧ遺伝子（ＳＯＡＰ５遺伝子としても知られている）と、それがコードする酵素（ホウレンソウ、ウラルカンゾウ、レッドビート、キノア、アルファルファ、ダイズ、及びミヤコグサの７種に由来する７つの酵素）について説明する。「トリテルペノイドアグリコン」という用語は、いくつかの実施形態では、β−アミリンから誘導される化合物群を包含する。したがって、本明細書に開示されるＣＳＬＧ酵素は、ユニークな活性を提供する。
【００６２】
当業者であれば、細胞、例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、細菌細胞におけるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのうちの少なくとも１つの含有量を改変することは、内在性ＣＳＬＧ遺伝子を変異させることを含むか、ＣＳＬＧ遺伝子発現を調節することを含むか、あるいは、ＣＳＬＧ酵素を発現しない細胞に、または異種細胞で発現するＣＳＬＧ酵素の活性を補うために、異種ＣＳＬＧを添加することを含むことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物またはその一部に含まれている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子またはその任意の組み合わせの発現が改変される。この改変は、少なくとも１つの遺伝子を突然変異させることを含む。突然変異させることは、１以上の点突然変異の導入、ゲノム編集、細菌ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系の使用、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子またはポリヌクレオチドの発現は、例えば、欠失、挿入、または修飾によって、あるいは、ＣＳＬＧ遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子の導入によって、サイレンシング、抑制、または低減される。
【００６４】
少なくとも１つの遺伝子またはその組み合わせの発現を増加させることは、様々な手段によって達成することができ、そのすべてが本発明の範囲内に明示的に包含されることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧの発現の増強は、転写及び／または翻訳を増強する様々な分子（これに限定しないが、例えば、転写因子）を使用して、ゲノム及び／または転写レベルで影響を与えることができる。また、プロモータ、エンハンサーなどの追加を含む、少なくとも１つの遺伝子への突然変異の挿入も、その突然変異が遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらす限り、使用することができる。他の実施形態では、アゴニストなどを使用してタンパク質レベルで発現を増加させる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、これらの遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイドを産生する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子組換え細胞は、ステロイド系サポニンを産生する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子組換え細胞は、トリテルペノイド系サポニンを産生する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、それに対応する非組換え細胞と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、それに対応する非組換え細胞と比較して、少なくともステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、それに対応する非組換え細胞と比較して、少なくともトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素のホモログは、アミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する。ＣＳＬＧ酵素のホモログをコードする遺伝子は、核酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素のホモログは、アミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のカバレッジを有する。ＣＳＬＧ酵素のホモログをコードする遺伝子は、核酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のカバレッジを有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードする核酸配列は、（ａ）β−アミリン合成酵素、及び、配列番号４５に記載の核酸配列であるか、または配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６３に記載の核酸配列であるか、または配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７４に記載の核酸配列であるか、または配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）の任意の組み合わせである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列は、（ａ）β−アミリン合成酵素、及び、配列番号４８に記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６４に記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７５に記載のアミノ酸配列であるか、または配列番号７５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）の任意の組み合わせである。
【００７５】
異種発現とは、ある遺伝子またはその一部を、本質的にはその遺伝子またはその遺伝子断片を持たない宿主細胞または宿主生物（例えば、以下に限定しないが、植物細胞、酵母細胞、藻類または植物など）において発現させることを含む。異種宿主への遺伝子の挿入は、当該技術分野で知られている任意の組換えＤＮＡ技術によって行われてもよく、例えば、酵母の場合は交配によって行われてもよい。
【００７６】
トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体は、幅広い商業的用途があり、いくつかの実施形態では、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、（ａ）ステロイド系グリコアルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、ヒドロキシトマチン、アセトキシトマチン、ジヒドロキシトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、それらの誘導体、関連化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｂ）ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、それらの誘導体、関連化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｃ）トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲンニン３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｄ）トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは、（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の任意の組み合わせである。
【００７８】
いくつかの例示的な実施形態では、下流のステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドからなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、「含有量の改変」は、フィトステロール／フィトコレステロール／フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、「含有量の改変」は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量の増加を含む。
【００８１】
フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物細胞、酵母細胞、または藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えされた植物細胞は、植物またはその一部の細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、藻類細胞である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目の植物の細胞を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、（ａ）植物細胞がイネ目の植物の細胞を含む場合、植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される、（ｂ）植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される、（ｃ）植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される、（ｄ）植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される、（ｅ）植物細胞がアオイ目の植物の細胞を含む場合、植物はカカオ属から選択される、（ｆ）植物細胞がセリ目の植物の細胞を含む場合、植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される、あるいは、（ｇ）植物細胞がフウチョウソウ目の植物の細胞を含む場合、植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、（ａ）植物細胞がナデシコ目の植物の細胞を含む場合、植物は、ホウレンソウ、ビーツ、及びキノアからなる群から選択される、（ｂ）植物細胞がナス目の植物の細胞を含む場合、植物は、トマト、野生型トマト、ジャガイモ、野生型ポテト、ナス、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、グランドチェリー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される、あるいは、（ｃ）植物細胞がマメ目の植物の細胞を含む場合、植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたトマト植物の細胞である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したトマト植物の細胞である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたジャガイモ植物の細胞である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したジャガイモ植物の細胞である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたナス科植物の細胞である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物の細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したナス科植物の細胞である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、葉の細胞、葉柄の細胞、植物の茎または幹の細胞、根の細胞、芽の細胞、塊茎の細胞、豆の細胞、穀物または穀粒の細胞、果実の細胞、木の実の細胞、マメの鞘の細胞、種子または種子の細胞、仮皮の細胞、包葉の細胞、または花の細胞を含む。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物またはその一部の細胞を含み、植物の一部は、植物の葉、植物の葉柄、植物の茎または幹、植物の根、植物の芽、植物の塊茎、植物の豆、植物の穀物または穀粒、植物の果実、植物の木の実、植物のマメの鞘、植物の種子、植物の包葉、または植物の花を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、藻類は、微細藻類、多細胞藻類、シアノバクテリア、珪藻類、緑藻植物（緑藻類）、紅藻植物（紅藻類）、褐藻植物（褐藻類）、ドナリエラ、クラミドモナス、またはヘマトコッカスから選択される。
【００９５】
具体的には、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え植物におけるＣＳＬＧ遺伝子の発現と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物が、本明細書に開示されている。この遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して改変されている。
【００９６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子またはその任意の組み合わせの発現が改変され、発現の改変は、少なくとも１つの遺伝子を突然変異させることを含み、突然変異は、１以上の点突然変異の導入、ゲノム編集、細菌のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系の使用、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、それぞれ対応する非組換え細胞または非組換え植物と比較して増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドの発現は、選択的に増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのＣＳＬＧからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする少なくとも１つの転写可能なポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの細胞を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含む、形質転換された植物である。いくつかの実施形態では、形質転換された植物は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドの発現が選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または低下している。いくつかの実施形態では、形質転換された植物は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、その発現をサイレンシングするか、抑制するか、または低下させるために、欠失、挿入、または修飾によって選択的に編集されており、または、遺伝子組換え植物は、遺伝子編集された植物の子孫である。いくつかの実施形態では、形質転換された植物は、ＣＳＬＧ遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む、少なくとも１つの細胞を含む。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉分子及びアンチセンス分子から選択されるか、または、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング系の構成要素である。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、ＣＳＬＧ遺伝子の領域に実質的に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、形質転換された植物は、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子を標的としたサイレンシング分子を含む複数の細胞を含む。追加の実施形態では、植物細胞の大部分がサイレンシング分子を含む。
【０１００】
少なくとも１つの遺伝子またはその組み合わせの発現を阻害することは、様々な手段で達成され、それらはすべて本発明の範囲に明示的に包含されることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧの発現を阻害することは、以下に限定しないが、例えばアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、またはＤＮＡｚｙｍｅ分子を含む転写及び／または翻訳を阻害する様々な分子を用いて、ゲノム及び／または転写レベルで効果的に行うことができる。欠失、挿入、部位特異的な突然変異、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどを含む少なくとも１つの遺伝子に突然変異を導入することも、遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす限り、使用することができる。他の実施形態では、発現は、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素などを用いて、タンパク質レベルで抑制される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子は、内在性ＣＳＬＧ遺伝子を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、突然変異を含み、突然変異は、少なくとも１以上の点突然変異、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み、（ａ）発現したＣＳＬＧ酵素は、安定性の向上、活性の増加、またはその両方を含み、含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して増加すること、あるいは、（ｂ）発現したＣＳＬＧ酵素は、安定性の低下、活性の低下、またはその両方を含み、含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して減少することである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、（ａ）内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低下し、含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して減少すること、あるいは、（ｂ）内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、過剰発現し、含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して増加することである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子が選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低下した場合、細胞は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子をさらに含み、サイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子から選択されるか、または、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング系の構成要素である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子は、異種ＣＳＬＧ遺伝子を含み、発現の改変は、異種遺伝子のデノボ発現を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、発現の改変は、対応する非組換え細胞と比較して発現が増加することを含み、含有量の改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加することを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）遺伝子の発現の改変は、（１）核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）核酸配列内に欠失を導入すること、（３）核酸配列内に挿入を導入すること、あるいは、（４）それらの任意の組み合わせを含み、導入は、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現の改変は、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子を標的とするサイレンシング分子を導入することにより生じ、かつ、（ａ）ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３０に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｂ）ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３４に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｃ）ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号３８：に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｄ）ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号６５または配列番号９３に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、あるいは、（ｅ）ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列が配列番号９５に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１１３】
トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体は、幅広い商業的用途があり、いくつかの実施形態では、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、
（ａ）ステロイド系グリコアルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、ヒドロキシトマチン、アセトキシトマチン、ジヒドロキシトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、それらの誘導体、それらの経路中間体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｂ）ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、及びすべての関連化合物、それらの誘導体、それらの経路中間体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｃ）トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ジプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｄ）トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは、（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の任意の組み合わせである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変され、（ａ）少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する場合、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少するか、あるいは、（ｂ）少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少する場合、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する。
【０１１７】
ある実施形態では、ステロイド系サポニン、ステロイド系アラコイド、トリテルペノイド系サポニンのそれぞれが増加すると、他の成分の含有量が改変され得る。いくつかの実施形態では、改変は、含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、改変は、含有量の減少を含む。いくつかの実施形態では、改変は、一方の含有量の増加と、他方の含有量の減少とを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、植物は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、（ａ）植物がイネ目の植物を含む場合、植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される、（ｂ）植物がナデシコ目の植物を含む場合、植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される、（ｃ）植物がナス目の植物を含む場合、植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される、（ｄ）植物がマメ目の植物を含む場合、植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される、（ｅ）植物がアオイ目の植物を含む場合、植物は、カカオ属から選択される、（ｆ）植物がセリ目の植物を含む場合、植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される、あるいは、（ｇ）植物がフウチョウソウ目の植物を含む場合、植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、（ａ）植物がナデシコ目の植物を含む場合、植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される、（ｂ）植物がナス目の植物を含む場合、植物は、トマト、野生型トマト、ジャガイモ、野生型ポテト、ナス、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、グランドチェリー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される、あるいは、（ｃ）植物がマメ目の植物を含む場合、植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、デヒドロトマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたトマト植物である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−トマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トマチジン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、デヒドロトマチン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したトマト植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したトマト植物である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたジャガイモ植物である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−カコニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したジャガイモ植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したジャガイモ植物である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されたナス科植物である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、植物は、（ｉ）α−ソラソニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、α−ソラマルギン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加したナス科植物であるか、あるいは、（ｉｉ）フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少したナス科植物である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、植物細胞は、葉の細胞、葉柄の細胞、植物の茎または幹の細胞、根の細胞、芽の細胞、塊茎の細胞、豆の細胞、穀物または穀粒の細胞、果実の細胞、木の実の細胞、マメの鞘の細胞、種子または種子の細胞、仮皮の細胞、包葉の細胞、または花の細胞を含む。
【０１２８】
具体的には、本明細書に開示されているのは、遺伝子組換え細胞内にステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法であって、（ａ）細胞内に少なくとも１つの異種遺伝子を導入する導入ステップであって、少なくとも１つの異種遺伝子がセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードしており、少なくとも１つの異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、該ステップと、（ｂ）細胞内で少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる発現ステップと、を含み、細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、少なくとも１つのステロイド系サポニン、または少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加する、方法である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、導入ステップは、細胞内に少なくとも１つの追加の異種遺伝子を導入するステップであって、少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素をコードしており、少なくとも１つの追加の異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、このステップと、細胞内で少なくとも１つの異種遺伝子を発現させるステップと、をさらに含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、（ａ）少なくとも１つの異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、（ｂ）少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、あるいは、（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、導入ステップは、少なくとも１つの細胞を、（ａ）少なくとも１つの異種遺伝子、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または少なくとも１つの異種遺伝子を含むベクター、（ｂ）少なくとも１つの追加の異種遺伝子、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または少なくとも１つの追加の異種遺伝子を含むベクター、あるいは、（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせを用いて形質転換することを含み、発現は、一過性発現または構成的発現を含む。
【０１３２】
具体的には、植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を低減させる方法であって、少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を用いて少なくとも１つの植物細胞を形質転換するステップ、あるいは、（ｂ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、突然変異が、（１）核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）核酸配列内に欠失を導入すること、（３）核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞におけるＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、対応する非組換え植物の細胞と比較して減少し、遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少する、方法である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列が配列番号３０に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４２に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｂ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列が配列番号３４に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４３に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｃ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列が配列番号３８に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号４４に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｄ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列が配列番号６５または配列番号９３に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または、配列番号１０６に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、あるいは、（ｅ）ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列が配列番号９５に記載されている核酸配列である場合、サイレンシング分子は、配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列であるか、または配列番号１０７に記載の核酸配列またはその相補的配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、（ａ）ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンは、毒素または苦味化合物を含むか、ホルモン模倣特性を有するか、またはそれらの組み合わせであり、（ｂ）ステロイド系グリコアルカロイドは、α−トマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｃ）ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、関連化合物（すべてステロイド系サポニンのファミリー）、経路中間体及び誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｄ）トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲンニン３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｅ）トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである。
【０１３５】
ある実施形態では、以下に限定しないが、例えば、キノアのように苦味を有するトリテルペノイド系サポニンや、有毒であるトリテルペノイド系サポニンなどのトリテルペノイド系サポニンの還元が望まれる。還元が望まれるトリテルペノイド系サポニンの他の例には、毒性を有するトリテルペノイド系サポニン、またはホルモンを模倣するトリテルペノイド系サポニンが含まれる。したがって、ある実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの産生量の増加が有益であり、他の実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの産生量の減少が有益である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本方法は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変させるステップをさらに含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本方法は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレスタノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させるステップをさらに含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子組換え植物から抽出されたフィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を精製する精製ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィトステロールは、フィトコレステノールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物から抽出されたフィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体は、栄養剤または食品添加物、高付加価値のステロイド系化合物（例えば、プロビタミンＤ及び／またはジオスゲニン）、抗コレステロール剤（例えば、哺乳類または鳥類の腸内で食物コレステロールと競合する植物フィトステロール）、または化粧品を含む。
【０１３９】
具体的には、植物またはその少なくとも一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法であって、少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を突然変異させるステップであって、突然変異が、（１）核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）核酸配列内に欠失を導入すること、（３）酸配列内に挿入を導入すること、あるいは、（４）それらの任意の組み合わせを含み、導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、（ｂ）ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸を発現ステップと、を含み、遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する、方法。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、（ａ）ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンは、毒素または苦味化合物を含むか、ホルモン模倣特性を有するか、またはそれらの組み合わせであり、（ｂ）ステロイド系グリコアルカロイドは、α−トマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソラマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｃ）ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｄ）トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲンニン３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、（ｅ）トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、（ａ）遺伝子組換え細胞における、ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、対応する非組換え植物の細胞と比較して増加する、（ｂ）遺伝子組換え細胞における、ＣＳＬＧ酵素の活性は、対応する非組換え植物細胞と比較して増加する、（ｃ）遺伝子組換え細胞における、ＣＳＬＧ酵素の安定性は、対応する非組換え植物の細胞と比較して向上する、あるいは、（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の任意の組み合わせである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本方法は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変させるステップをさらに含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本方法は、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を低減させるステップをさらに含む。
【０１４４】
本明細書に記載の各可能性は、本発明の個別の実施形態を表している。
【０１４５】
遺伝子組換え細胞・遺伝子組換え植物
【０１４６】
本明細書には、ステロイド系グリコアルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニンの代謝経路（ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニンの生合成経路）における重要な遺伝子の発現が改変された、遺伝子組換え細胞及び遺伝子組換え植物が開示されている。これらの遺伝子の発現を改変させると、ステロイド系アルカロイドのプロファイル、ステロイド系サポニンのプロファイル、またはトリテルペノイドのプロファイルも付随して改変される。非限定的な例では、ステロイド系アルカロイドの産生レベルが改変されることによって、病原菌に対する抵抗性が向上したステロイド系アルカロイドの含有量が増加した改良植物、または、植物の食用部分におけるこれらの二次化合物の含有量が減少した植物が得られ、その結果、抗栄養成分が減少または除去された改良作物を生産することができる。代替的に、または追加的に、別の非限定的な例では、本明細書に開示された遺伝子の発現の制御は、例えば栄養、化粧品、または製薬業界におけるさらなる使用のための、所望のステロイド系アルカロイドまたは植物由来のコレステロールの産生のために使用され得る。別の非限定的な例では、本明細書には、ナス目及び他の目の作物である植物を生産するための手段及び方法が開示されている。これらの植物は、食用部分に一般的に存在する有害な量のステロイド系アルカロイドを含まない。このように、本明細書に開示されている細胞及び植物は、栄養学的及び商業的に重要な価値を有する。
【０１４７】
本明細書では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路に関与する共発現遺伝子の配列が開示されている。本発明はさらに、この経路における重要な遺伝子を開示しており、その遺伝子の発現を改変されると、ステロイド系アルカロイドプロファイル、ステロイド系サポニンプロファイル、またはトリテルペノイドプロファイルが付随して改変される。一例として、ステロイド系アルカロイドの産生レベルを改変することによって、病原菌に対する抵抗性が向上したステロイド系アルカロイドの含有量が増加した改良植物、または、植物の食用部分におけるこれらの二次化合物の含有量が減少した植物が得られ、その結果、改良作物を生産することができる。代替的に、または追加的に、１つの非限定的な例では、本発明で明らかにされた遺伝子の発現の制御は、例えば栄養、化粧品、または製薬業界におけるさらなる使用のための、所望のステロイド系アルカロイド、植物由来のコレステロールまたは他のフィトステロールの産生のために使用され得る。したがって、本発明の細胞及び植物は、このように重要な栄養学的、化粧品的、薬学的、及び商業的価値を有する。
【０１４８】
本明細書では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、細菌細胞、昆虫細胞）及び少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物が開示されており、この遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニンの生合成経路内の酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現している。これらの酵素は、いくつかの実施形態では、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、及びアシルトランスフェラーゼを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現し、酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される。図１は、コレステロールから始まるナス科の植物（ここではトマト）のトリテルペノイド生合成経路におけるステロイド系アルカロイド及びステロイド系サポニンの非限定的な例を示している。当業者は、この経路が、サポニンアグリコン及びグリコシル化ステロイド系アルカロイド生合成中間体及びグリコシル化サポニン生合成中間体の産生を包含し、これにより、ステロイド系アルカロイド（例えば、α−トマチン）またはステロイド系サポニン（例えば、ウットロシドＢ）が産生されることを認識するであろう。図２０Ａは、ホウレンソウにおけるトリテルペノイド系サポニン経路の非限定的な例を示している。当業者は、この経路がサポニンアグリコン及びグリコシル化サポニン生合成中間体の産生を包含し、これにより、トリテルペノイド系サポニン（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＶ（ヨッソシドＶ）；化合物１１）が産生されることを認識するであろう。
【０１５０】
ステロイド系アルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニン生合成経路における遺伝子の少なくとも１つの発現を改変させると、いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドプロファイルまたはその経路の中間体、ステロイド系サポニンプロファイルまたはその経路の中間体、またはトリテルペノイド系サポニンプロファイルまたはその経路の中間体に、付随した改変が生じる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞における発現は、対応する非組換え細胞と比較して増加している。いくつかの実施形態では、発現の増加は、細胞内に以前には存在しなかった酵素をコードする遺伝子からのデノボ発現を含む。いくつかの実施形態では、発現の増加は、細胞内に既に存在する遺伝子の発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、発現の増加は、コードされた酵素の量の増加をもたらす。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドのプロファイルの改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドまたはその生合成中間体の増加を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドのプロファイルの改変は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドまたはその生合成中間体の減少を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンのプロファイルの改変は、少なくとも１つのステロイド系サポニンまたはその生合成中間体の増加を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンのプロファイルの改変は、少なくとも１つのステロイド系サポニンまたはその生合成中間体の減少を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンのプロファイルの改変は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンまたはその生合成中間体の増加を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンのプロファイルの改変は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンまたはその生合成中間体の減少を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードするヌクレオチド配列を、異種細胞（例えば、以下に限定しないが、植物細胞、藻類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞など）または生物（例えば、以下に限定しないが、植物など）に導入することによって、少なくとも１つの酵素の発現が増加し、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの産生量が増加する。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニン生合成経路の少なくとも１つの酵素をコードするヌクレオチド配列を、異種細胞または生物に導入することによって、異種細胞（例えば、以下に限定しないが、植物細胞、藻類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞など）または生物（例えば、以下に限定しないが、植物など）が天然には産生していないステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニンが産生される。
【０１５５】
本明細書の記載を通して、遺伝子組換え細胞及びその使用について説明する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、藻類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞のいずれかから選択される。当業者であれば、本明細書に開示された遺伝子及び核酸配列を使用して、哺乳類細胞などの真核細胞、または細菌などの原核細胞を遺伝子組換えして、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法を知ることができるであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に開示された遺伝子及び核酸配列を使用して、無細胞のインビトロシステムで少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生することができるであろう。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は植物細胞であり、植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物細胞または酵母細胞であり、植物細胞または酵母細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は酵母細胞であり、酵母細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は藻類細胞であり、藻類細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は昆虫細胞であり、昆虫細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は細菌であり、細菌は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物またはその一部で構成される植物細胞であり、この植物細胞は、植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物またはその一部で構成される植物細胞であり、植物細胞は、植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの産生を減少させるために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物またはその一部で構成される植物細胞であり、植物細胞は、植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド性アルカロイド、ステロイド性サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの産生を増加させるために使用される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、異種発現は、１つの植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を、第２の植物種で発現させることを含む（例えば、下記の実施例２３を参照）。いくつかの実施形態では、異種発現は、或る植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を酵母細胞で発現させることを含む（例えば、下記の実施例２１を参照）。いくつかの実施形態では、異種発現は、或る植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を藻類細胞で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、異種発現は、或る植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を、細菌細胞で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、異種発現は、或る植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を昆虫細胞で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、異種発現は、或る植物種からの少なくとも１つの異種植物遺伝子を、異なる種の植物の細胞で発現させることを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択される酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも２つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも３つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも４つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも５つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択される少なくとも６つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも７つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択される少なくとも８つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択される少なくとも９つの酵素をコードする１以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路から選択された少なくとも１０の酵素をコードする２以上の異種遺伝子を発現させることにより、その経路によって産生されるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されるか、または少なくとも１つのその生合成中間体の含有量が改変されるか、あるいは、その組み合わせである。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して増加した遺伝子組換え細胞が本明細書に開示されている。この遺伝子組み換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加している。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、酵素をコードする少なくとも１つの追加の異種遺伝子をさらに発現し、酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ及び異種サポニンβ−アミリン合成酵素を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種のＣＳＬＧ及び少なくとも１つの異種シトクロムＰ４５０を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ及び１、２、または３つの異種シトクロムＰ４５０を発現する。一部の実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ、異種サポニンβ−アミリン合成酵素、及び１、２、または３つの異種シトクロムＰ４５０を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種のＣＳＬＧ及び少なくとも１つの異種のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ及び少なくとも１、２、３、または４つの異種グリコシルトランスフェラーゼを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ、異種サポニンβ−アミリン合成酵素、及び少なくとも１、２、３、または４つの異種グリコシルトランスフェラーゼを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ、異種サポニンβ−アミリン合成酵素、少なくとも１、２、または３つの異種シトクロムＰ４５０、及び少なくとも１、２、３、または４つの異種グリコシルトランスフェラーゼを発現する。
【０１６１】
いくつかの例では、必要な基質が利用できるように、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの経路に特に属さない追加の遺伝子を、同種または異種の遺伝子で発現させることが必要であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路の基質の産生に必要な酵素をコードする異種遺伝子を発現する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、Ｃ−２ヒドロキシラーゼ、Ｃ−２３オキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、アシルトランスフェラーゼ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）から選択される酵素をコードする異種遺伝子が、遺伝子組換え細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、Ｃ−２ヒドロキシラーゼ、Ｃ−２３オキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）から選択される酵素をコードする異種遺伝子が、遺伝子組換え細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＢＡＨＤ−アシルトランスフェラーゼ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）から選択される酵素をコードする異種遺伝子が、遺伝子組換え細胞内で発現される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、サポニンβ−アミリン合成酵素活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、シトクロムＰ４５０活性を有する２つの酵素をコードする少なくとも２つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、シトクロムＰ４５０活性を有する３つの酵素をコードする少なくとも３つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素は、Ｃ−２ヒドロキシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素は、Ｃ−２３オキシダーゼ活性を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、サポニンβ−アミリン合成酵素活性、シトクロムＰ４５０活性、及びＣＳＬＧ活性を有する酵素をコードする異種遺伝子を発現し、シトクロムＰ４５０酵素は、Ｃ−２ヒドロキシラーゼ活性を提供する酵素、Ｃ−２３オキシダーゼ活性を提供する酵素、シトクロムＰ４５０活性、Ｃ−２ヒドロキシラーゼ活性及びＣ−２３オキシダーゼ活性を提供する酵素の組み合わせ、を含んでいてもよい。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、またはキシロシルトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする複数の異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される、グリコシルトランスフェラーゼをコードする複数の異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、当該技術分野で知られている既知のグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせから選択される、グリコシルトランスフェラーゼをコードする複数の異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性をコードする異種遺伝子、及び、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性をコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性をコードする異種遺伝子、及び、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性をコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性をコードする異種遺伝子、及び、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、当該技術分野で知られている任意のグリコシルトランスフェラーゼ、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性をコードする異種遺伝子を発現する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、アシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ベンジルアルコールアセチル、アントシアニン−Ｏ−ヒドロキシ−シンナモイル、アントラニレート−Ｎ−ヒドロキシ−シンナモイル／ベンゾイル、デアセチルビンドリンアセチルトランスフェラーゼ、（ＢＡＨＤ）アシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性を提供する酵素をコードする異種遺伝子、及び、アセチルトランスフェラーゼ活性をコードする酵素をコードする異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ＣＳＬＧ活性を提供する酵素をコードする異種遺伝子、及び、ＢＡＨＤアセチルトランスフェラーゼ活性をコードする酵素をコードする異種遺伝子を発現する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、トリテルペノイド系サポニン基質に対する酵素活性をコードする異種遺伝子を発現し、この酵素は、グリコシルトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、トリテルペノイド系サポニン基質に対する酵素活性をコードする異種遺伝子を発現し、この酵素は、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１を含む。いくつかの実施形態では、例えば、細胞が細菌細胞である場合、異種遺伝子は、スクアレインエポキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物が本明細書に開示されている。この遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの細胞が異種ＣＳＬＧ遺伝子を含み、発現の改変が異種遺伝子のデノボ発現を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物が本明細書に開示されている。この遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの細胞はが異種ＣＳＬＧ遺伝子を含み、発現の改変が、機能的であってもよく非機能的であってもよい内在性遺伝子の存在下での異種遺伝子の発現を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物における異種ＣＳＬＧ遺伝子の発現は、対応する非組換え細胞と比較して増加し、その遺伝子組換え植物の細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その代謝物、その誘導体、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して改変される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、トリテルペノイド系サポニン生合成経路に関与する酵素の配列である。この生合成経路は、サポニンアグリコン及びグリコシル化サポニン、及びグリコシル化トリテルペノイド系サポニンの産生を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、トリテルペノイド系サポニンの生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の配列である。この生合成経路は、サポニンアグリコン及びグリコシル化サポニン、及びグリコシル化トリテルペノイド系サポニンを産生し、そのようなものとしては、これに限定しないが、例えば、３−Ｏ−［β−Ｄ−キシロピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル］−２８−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（→４）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−４−アセチル−β−Ｄ−フコピラノシル］−メディカゲン酸（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＶ（ヨッソシドＶ）；化合物１１）、３−Ｏ−［β−Ｄ−キシロピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル］−２８−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フコピラノシル］−メディカゲン酸（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＩＶ（ヨッソシドＩＶ）；化合物１０）、３−Ｏ−［β−Ｄ−グルクロノピラノシル］−２８−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フコピラノシル］−メディカゲン酸（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＩＩＩ（ヨッソシドＩＩＩ）；化合物９）、３−Ｏ−［β−Ｄ−グルクロノピラノシル］−２８−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フコピラノシル］−メディカゲン酸（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＩＩ（ヨッソシドＩＩ）；化合物８）、及び、３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２８−Ｏ−β−Ｄ−フコピラノシル−メディカゲン酸（ＹｏｓｓｏｓｉｄｅＩ（ヨッソシドＩＩ）；化合物７）（図２０Ａ参照）を含む。
【０１７１】
例えば、これに限定しないが、実施例において詳細に説明される化合物１１のホウレンソウ・トリテルペノイド生合成経路で活性化する酵素が挙げられる。実施例２０に提供される表１６は、ＣＳＬＧ酵素がメディカゲン酸にグルクロン酸を付加してトリテルペノイド系サポニンであるメディカゲン酸３−グルクロニドを作る、ホウレンソウ生合成経路中の酵素のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。実施例２４において開示される表１９は、シロイヌナズナから単離されたＣＳＬＧのアミノ酸配列を提供する。実施例において開示される表１７は、他の植物種からのＣＳＬＧのホモログの核酸配列及びアミノ酸配列を提供する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる酵素をコードする異種遺伝子の配列を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる２つの酵素をコードする少なくとも２つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる３つの酵素をコードする少なくとも３つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる４つの酵素をコードする少なくとも４つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる５つの酵素をコードする少なくとも５つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる６つの酵素をコードする少なくとも６つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる７つの酵素をコードする少なくとも７つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる８つの酵素をコードする少なくとも８つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる９つの酵素をコードする少なくとも９つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる１０の酵素をコードする少なくとも１０の異種遺伝子を発現する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）遺伝子の発現が、対応する非組換え植物におけるＣＳＬＧ遺伝子の発現と比較して改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物が本明細書に開示されている。この遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して改変されている。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子は、内在性ＣＳＬＧ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子は、異種ＣＳＬＧ遺伝子を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる酵素をコードする異種遺伝子の配列を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる２つの酵素をコードする少なくとも２つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる３つの酵素をコードする少なくとも３つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる４つの酵素をコードする少なくとも４つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる５つの酵素をコードする少なくとも５つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる６つの酵素をコードする少なくとも６つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる７つの酵素をコードする少なくとも７つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる８つの酵素をコードする少なくとも８種類の異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる９つの酵素をコードする少なくとも９つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路に含まれる１０の酵素をコードする少なくとも１０の異種遺伝子を発現する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、β−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、複数のシトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、複数のグリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせから選択される酵素を含む、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路中の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、β−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、複数のシトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、複数のグリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせから選択される酵素を含む、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路中の酵素をコードし、さらに、生合成経路の基質を提供するために必要な少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、β−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、複数のシトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、複数のグリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせを含むステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドの生合成経路中の酵素をコードし、さらに、これに限定しないが例えばＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１などの生合成経路の基質を提供するために必要な異種遺伝子を発現させる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド／ステロイド系サポニン／トリテルペノイド系サポニン生合成経の酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現し、この少なくとも１つの異種遺伝子はＣＳＬＧ酵素をコードする。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子が、Ｃ２−ヒドロキシラーゼまたはＣ−２３オキシダーゼを含むシトクロムＰ４５０をコードするか、フルクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、またはＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含むグリコシルトランスフェラーゼをコードするか、ベンジルアルコールアセチル、アントシアニン−Ｏ−ヒドロキシ−シンナモイル、アントラニレート−Ｎ−ヒドロキシ−シンナマイオール／ベンゾイル、またはデアセチルビンドリン（ＢＡＨＤ）アセチルトランスフェラーゼをコードするか、あるいは、それらの組み合わせである。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、異種遺伝子または遺伝子の発現は、対応する非組換え細胞と比較して、発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現の増加は、対応する非組換え細胞における酵素の含有量と比較して、その遺伝子によってコードされる酵素の含有量の増加をもたらす。当業者であれば、いくつかの実施形態では、発現量の増加は、遺伝子の過剰発現を含み、その結果、対応する非組換え細胞と比較して、遺伝子によってコードされる酵素の存在量が増加することを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、発現の増加は、細胞または生物、これに限定しないが、例えば、植物細胞、植物、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌細胞などでは自然に見られない遺伝子の発現、及びその結果としての酵素活性または活性の産生を含む。
【０１８０】
当業者であれば、いくつかの実施形態では、対応する非組換え細胞が、異種遺伝子を発現しないかまたは過剰に発現しない対照細胞を提供することを理解できるであろう。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、異種細胞における遺伝子または遺伝子の発現は、遺伝子または遺伝子の一過性発現を含む。いくつかの実施形態では、異種細胞における遺伝子または遺伝子の発現は、遺伝子または遺伝子の構成的発現を含む。いくつかの実施形態では、異種細胞での遺伝子または遺伝子の発現は、遺伝子または遺伝子の一過性発現、遺伝子または遺伝子の構成的発現、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１８２】
当業者であれば、一過性発現とは、核酸が真核細胞、例えば植物細胞や酵母細胞に導入された後に短時間で発現する、遺伝子の一時的な発現を意味することを理解できるであろう。逆に、構成的発現（安定発現とも呼ばれる）は、遺伝子の継続的な発現を包含する。
【０１８３】
当業者であれば、「遺伝子」という用語が、ＲＮＡまたはポリペプチドの産生に必要なコード化配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を包含することを理解できるであろう。ポリペプチドは、完全長のコード配列またはその一部によってコードされる。遺伝子の「一部」は、その遺伝子の断片を意味する。断片の大きさは、数ヌクレオチドから、遺伝子配列全体から１ヌクレオチドを除いたものまで様々である。したがって、「遺伝子の少なくとも一部を含む核酸配列」は、その遺伝子の断片を含むか、または、遺伝子全体を含む。
【０１８４】
当業者であれば、「遺伝子」という用語は、任意選択で、構造遺伝子のコード領域を包含し、遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さに対応するように、５´末端及び３´末端の両方のコード領域に隣接して、いずれかの末端に約１ｋｂの距離で位置する配列を含むことを理解できるであろう。コード領域の５´に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５´非翻訳配列と呼ばれる。また、コード領域の３´または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３´非翻訳配列と呼ばれる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード領域を含むＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード領域だけでなく、遺伝子のエクソン及び任意の介在イントロンを含む上流領域及び下流領域を有するＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、上流領域及び下流領域は、非コード制御領域を含む。いくつかの実施形態では、上流領域及び下流領域は、これに限定しないが、例えば、プロモータ、エンハンサー、及びサイレンサーなどの制御配列を含む。制御配列の非限定的な例としては、これに限定しないが、ＡＧＧＡボックス、ＴＡＴＡボックス、Ｉｎｒ、ＤＰＥ、ＺｍＵｂｉ１、ＰｖＵｂｉ１、ＰｖＵｂｉ２、ＣａＭＶ、３５Ｓ、ＯｓＡｃｔ１、ｚＥ１９、Ｅ８、ＴＡ２９、Ａ９、ｐＤＪ３Ｓ、Ｂ３３、ＰＡＴ１、ａｌｃＡ、Ｇ−ｂｏｘ、ＡＢＲＥ、ＤＲＥ、及びＰＣＮＡが挙げられる。
【０１８６】
調節領域は、いくつかの実施形態では、細胞、これに限定しないが、例えば、酵母、藻類、昆虫、細菌、または本明細書に記載されている植物細胞または植物内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。調節領域は、いくつかの実施形態では、植物細胞内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。調節領域は、いくつかの実施形態では、藻類細胞内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。制御領域は、いくつかの実施形態では、酵母細胞内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。制御領域は、いくつかの実施形態では、昆虫細胞内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。制御領域は、いくつかの実施形態では、細菌内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、遺伝子は、その遺伝子のエクソン及び任意の介在イントロンを含むその遺伝子のコード領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、その制御配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、遺伝子プロモータを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、そのエンハンサー領域を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、５´非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、３´非コード化配列を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、当業者であれば、ＤＮＡが、遺伝子のコード領域だけでなく、上流配列及び下流配列を有する遺伝子を含むことを理解できるであろう。他の実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を含む。当業者であれば、ｃＤＮＡは、逆転写酵素の作用によりＲＮＡから逆転写された合成ＤＮＡを包含することを理解できるであろう。ｃＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であってよく、ＲＮＡ配列の一部と実質的に同一の配列、またはＲＮＡ配列の一部と相補的な配列のいずれかまたは両方を有する鎖を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡは、上流調節配列及び下流調節配列を含むことができる。さらに他の実施形態では、ＤＮＡは、ＣＤＳ（完全コード配列）を含む。当業者であれば、ＣＤＳが、完全長のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含することを理解できるであろう。ＣＤＳは、通常、開始コドン（「ＡＴＧ」）で始まり、最初のフレーム内停止コドン（「ＴＡＡ」、「ＴＡＧ」、「ＴＧＡ」）で終わる（またはその１つ前で終わる）。当業者であれば、一実施形態では、ｃＤＮＡがＣＤＳを含むことを認識できるであろう。
【０１８９】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、及び「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、直線状または分岐状であり、任意選択で、合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーまたはそれらのハイブリッドであってもよい。また、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含される。
【０１９０】
本明細書では、「相補的」または「その相補体」という用語を、相補的領域の全体にわたって別の指定されたポリヌクレオチドとワトソン＆クリック塩基対を形成することができるポリヌクレオチドの配列を指すために使用している。この用語は、ポリヌクレオチドのペアにはそれらの配列のみに基づいて適用されるが、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する特定の条件のセットには適用されない。
【０１９１】
本明細書で使用するとき、「構築物」という用語は、目的のポリヌクレオチドを含む、人工的に組み立てられたまたは単離された核酸分子を指す。一般に、構築物は、目的のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、場合によっては目的の遺伝子でもあるマーカー遺伝子、及び適切な調節配列を含むことができる。構築物に制御配列を含めることは任意選択であり、例えば、宿主細胞の制御配列を使用する状況では、そのような配列は必要とされないことを理解すべきである。制御要素としては、これに限定しないが、プロモータ、エンハンサー、複製起点、転写終結配列、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。「構築物」という用語は、ベクターを含むが、これに限定されるものと見なすべきではない。
【０１９２】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方の機能によって制御されるように、単一の核酸断片上の核酸配列が連結していることを指す。例えば、プロモータは、そのプロモータがそのコード配列の発現を調節することができる場合（すなわち、コード配列がプロモータの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で制御配列に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」及び「機能的に連結された」という用語は、互換的に使用することができ、すべて同一の意味及び性質を有する。
【０１９３】
本明細書で使用するとき、「プロモータ要素」、「プロモータ」、「プロモータ配列」という用語は、一般にＤＮＡポリマーのコード領域の５´末端に位置する（すなわち、先行する）ＤＮＡ配列を指す。自然界で知られているほとんどのプロモータの位置は、転写領域よりも前にある。プロモータは、遺伝子の発現を活性化するスイッチとして機能する。遺伝子が活性化されると、その遺伝子は転写される、あるいは転写に関与すると言われる。転写は、遺伝子からｍＲＮＡを合成する。したがって、プロモータは、転写制御要素としての役割を果たすとともに、遺伝子のｍＲＮＡへの転写を開始するための場所を提供する。
【０１９４】
異種遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、構成的発現または調節された（一過性の）発現を指示するプロモータの制御下で、例えば、植物細胞、藻類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または細菌において発現される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物全体またはその一部である。調節された発現は、時間的または空間的に調節された発現、及び他の形態の誘導性または抑制性の発現を含む。時間的とは、例えば植物細胞培養物の特定の成長速度が得られた時点などの特定の時点で、発現が誘導されることを意味する（例えば、プロモータは、定常期または発達の特定の段階でのみ誘導される）。空間的とは、プロモータが、特定の器官、組織、または細胞でのみ活性化されることを意味する（例えば、植物の場合、プロモータは、根、葉、表皮、孔辺細胞などでのみ活性化される）。調節された発現の他の例は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌に対して化学的または物理的な刺激を加えることによって、活性が誘導または抑制されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは、構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド生合成経路の異種遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ）の調節された発現は、植物細胞に対して化学的または物理的刺激を加えることによって遺伝子発現を誘導または抑制することを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド生合成経路の異種遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ）の調節された発現は、酵母細胞に対して化学的または物理的な刺激を加えることによって遺伝子の発現を誘導または抑制することを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド生合成経路の異種遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ）の調節された発現は、藻類細胞に対して化学的または物理的な刺激を加えることによって遺伝子発現を誘導または抑制することを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド生合成経路の異種遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ）の調節された発現は、昆虫細胞に対して化学的または物理的な刺激を加えることによって遺伝子発現を誘導または抑制することを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド生合成経路の異種遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ）の調節された発現は、細菌に対して化学的または物理的な刺激を加えることによって遺伝子発現を誘導または抑制することを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、発現は、環境、ホルモン、化学、及び／または発生のシグナルの制御下にある。植物細胞のそのようなプロモータには、（１）熱、（２）光、（３）アブシジン酸、ジャスモン酸メチルなどのホルモン、（４）創傷、または（５）サリチル酸、キトサン、金属などの化学物質によって制御されるプロモータが含まれる。構成的プロモータは、広範囲の条件下で、広範囲の細胞における発現を誘導する。植物細胞において異種ポリペプチドを発現させるのに有用な構成的植物プロモータの例としては、これに限定しないが、単子葉植物を含むほとんどの植物組織において構成的な高レベルの発現を付与するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータ、ノパリン合成酵素プロモータ、及びオクトピン合成酵素プロモータが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモータは、誘導性プロモータである。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、誘導性植物プロモータとしては、これに限定しないが、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、及びＣＵＰ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵母プロモータは、構成的プロモータである。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、構成的な酵母プロモータとしては、ＰＧＫ１、ＴＤＨＳ、ＡＤＨ１、ＣＹＣ１、ＡＣＴ１、及びＴＥＦ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、藻類プロモータは、誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される藻類プロモータは、光、ｐＨ、塩分濃度、温度、または栄養分の変更によって調節される。いくつかの実施形態では、誘導性藻類プロモータは、窒素レベル、窒素ストレス、または窒素飢餓に応答する。いくつかの実施形態では、藻類プロモータは、構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、昆虫細胞に使用するための誘導性プロモータは、環境または栄養のシグナルに応答する。
【０１９６】
発現カセットは、通常、「発現ベクター」と呼ばれる、少なくとも１つの異種遺伝子を含むＤＮＡまたはＲＮＡ構築物中に提供され、これは、任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルスは）であり、細胞内でポリヌクレオチドを複製する自律的単位として作用するか（すなわち、それ自体の制御下で複製することができる）、または、宿主細胞染色体への挿入により複製可能となり、それに別のポリヌクレオチド断片を付着させて、付着した断片の複製及び／または発現をもたらすことができる。適切なベクターとしては、これに限定しないが、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、植物ウイルス、人工染色体などが挙げられる。発現カセットは、少なくとも１つの複製系も有するＤＮＡ構築物中に提供してもよい。複製系に加えて、多くの場合は、少なくとも１つのマーカーが存在し、これは、１以上の宿主に有用であるか、または個々の宿主に対して異なるマーカーが存在する。
【０１９７】
別の実施形態では、選択遺伝子は、抗生物質や除草剤などの選択剤に対する耐性を付与する選択マーカーを提供する。形質転換される可能性のある細胞は、選択剤に暴露される。生残細胞の集団は、一般に、耐性が付与された遺伝子が組み込まれ、細胞生存を可能にするのに十分なレベルで発現している細胞である。細胞は、外因性ＤＮＡが安定して組み込まれていることを確認するために、さらに検査される。
【０１９８】
有用な選択マーカー遺伝子としては、例えばカナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ  ＩＶ）、ｎｐｔＩＩ、ｈｐｔ、ａａｄＡ、及びゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４）などの抗生物質に対する耐性、または、グルホシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）及びグリホサート（ＥＰＳＰＳ）などの除草剤に対する耐性を付与したものが挙げられる。別の実施形態では、選択遺伝子は、代謝拮抗薬である。一実施形態では、代謝拮抗薬は、ｄｈｆである。
【０１９９】
形質転換体を視覚的に同定する能力を提供するスクリーニング可能なマーカー、例えば、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｉｄＡ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの着色タンパク質や蛍光タンパク質を発現する遺伝子、または、様々な発色基質が知られているβ−グルクロニダーゼやｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）を発現する遺伝子など、を使用してもよい。また、スクリーニング可能なマーカーと選択可能なマーカーとの組み合わせは、形質転換細胞の同定に有用であると考えられる。
【０２００】
一実施形態では、選択遺伝子は、増殖のための基質となるか、または形質転換された組織の増殖及び分化を誘導する非毒性物質を条件とする陽性選択可能なマーカー遺伝子である。
【０２０１】
一実施形態では、選択剤への曝露を生き延びた植物細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア付けされた細胞を再生培地中で培養し、植物に成長させてもよい。成長した植物体は、約８５％の相対湿度、６００ｐｐｍのＣＯ２、及び２５〜２５０マイクロアインシュタインｍ２／ｓの光に制御された環境制御チャンバ内で、土壌を用いない植物成長用混合物に移して寒さに慣れさせた後に、成長ための温室または成長チャンバに移す。植物は、成長チャンバまたは温室のいずれかで成長させることが好ましい。植物は、初期組織に応じて、形質転換体が同定されてから約６週間〜１０ヶ月後に再生される。再生中、細胞は、約１９〜２８℃の固形培地上で植物に成長する。再生した植物は、シュート及び根の発達段階に達した後、さらなる成長と検査のために温室に移される。当業者に知られている従来の植物育種法を用いて植物に受粉させ、種子を作る。
【０２０２】
形質転換された植物から子孫を回収し、外因性組換えポリヌクレオチドの発現を検査する。有用なアッセイとしては、例えばサザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法などの「分子生物学的」アッセイ、ＲＮＡ（例えば、二本鎖ＲＮＡ）またはタンパク質産物の存在を、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法）または酵素機能などによって検出する「生化学的」アッセイ、葉または根のアッセイなどの植物の一部のアッセイ、再生植物の全体の用語型を分析することによるアッセイが挙げられる。
【０２０３】
当業者であれば、コードされた核酸配列を比較的無傷の状態で導入するための適切なベクターを選択することができるであろう。したがって、コードされた核酸が導入された宿主細胞、例えば植物プロトプラストを産生する任意のベクターで十分である。ベクターの選択、あるいはベクターの使用の有無は、通常、選択された形質転換の方法によって導かれる。
【０２０４】
植物細胞の場合、マーカーは、（ａ）抗生物質、毒素、重金属、特定の糖などの殺生物剤に対する保護をコードするか、（ｂ）補助要求性宿主に原栄養を与えることで相補性を提供するか、または、（ｃ）植物内での新規化合物の産生により可視用語型を提供する。いくつかの実施形態では、使用される遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ニトリラーゼ、及びゲンタマイシン耐性遺伝子が挙げられる。植物の宿主を選択するための適切なマーカーとしては、これに限定しないが、インジゴ産生を可能にするβ−グルクロニダーゼ、可視光産生を可能にするルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質及びその変異体、カナマイシン耐性またはＧ４１８耐性を提供するＮＰＴＩＩ、ハイグロマイシン耐性を提供にするＨＰＴ、及び、グリホサート耐性を提供する変異ＡＲＯＡ遺伝子などが挙げられる。
【０２０５】
酵母細胞の場合、マーカーとしては、補助要求性宿主に原栄養を与えることにより相補性を提供するマーカー、これに限定しないが、例えば、必要な相補的活性をコードするＨＩＳ、ＬＥＵ、ＴＲＰ、及びＵＲＡマーカー遺伝子など、が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵母マーカーは、酵母に対して毒性を有する化合物に対する抵抗性を提供し、そのようなものとしては、これに限定しないが、例えば、Ｇ４１８に対する抵抗性を提供するｋａｎＭＸ４、ノーセオスリシンに対する抵抗性を提供するｎａｔＭＸ４、ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を提供するｈｐｈＭＸ４、グルホシネートに対する抵抗性を提供するｐａｔＭＸ３、及び、ゼオシンに対する抵抗性を提供するＺＥＯなど、が挙げられる。
【０２０６】
プロモータ活性は、そのプロモータに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列、その相同体、その変異体、またはその断片の転写の程度を包含する。プロモータ活性は、産生されたＲＮＡ転写物の量を例えばノーザンブロット法によって測定することによって直接的に測定してもよいし、または、例えばレポーター遺伝子がプロモータに連結されている場合などには、ＲＮＡ転写物でコードされている産物を測定することによって間接的に測定してもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子は、プロモータに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモータへの作動可能な連結は、一過性発現をもたらす。いくつかの実施形態では、プロモータへの作動可能な連結は、構成的発現をもたらす。いくつかの実施形態では、或る異種遺伝子が構成的プロモータに作動可能に連結され、別の異種遺伝子が一過性発現を提供するプロモータに作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含み、ポリヌクレオチドは、任意選択でベクター内に含まれる。
【０２０８】
本明細書で使用するとき、「エンハンサー」という用語は、プロモータの活性を刺激することができるＤＮＡ配列を指し、プロモータの生来の要素であってもよいし、プロモータのレベルや組織特異性を高めるために挿入された異種の要素であってもよい。
【０２０９】
本明細書で使用するとき、「発現」という用語は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の産生を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は少なくとも１つの異種遺伝子を発現し、機能的最終産物はｍＲＮＡを含み、このｍＲＮＡが転写されて、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを含む機能的最終産物を産生する。
【０２１０】
「遺伝子組換え細胞」という用語は、人間によって遺伝子組換えされた細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、酵素をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドで、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を形質転換することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、トリテルペノイド系サポニン生合成経路において、活性な酵素をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドで、植物細胞または酵母細胞を形質転換することを含む。本明細書で使用するとき、「遺伝子組換え細胞」及び「対応する未組換え細胞」は、それぞれ、遺伝子組換え細胞及び遺伝子組換えを欠く同一の種類の細胞を指す。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、「遺伝子組換え細胞」及び「対応する非組換え細胞」は、それぞれ、同一の種類の遺伝子組換え植物細胞及び対応する未組換え植物細胞である。他の実施形態では、「遺伝子組換え細胞」及び「対応する未組換え細胞」は、それぞれ、同一の種類の遺伝子組換え酵母細胞及び対応する未組換えの酵母細胞である。
【０２１２】
「遺伝子組換え植物」という用語は、人間によって遺伝子組換えされた少なくとも１つの細胞を含む植物を指す。遺伝子組換えは、例えば、内在性ポリヌクレオチドまたは目的の遺伝子に対して突然変異、欠失、挿入、転移性因子などを導入することによる、内在性遺伝子の組み換えを含む。追加的または代替的に、遺伝子組換えは、異種ポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換することを含む。本明細書で使用するとき、「遺伝子組換え植物」及び「対応する未組換え植物」は、それぞれ、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物、及び組換えを欠く同一の種類の植物を指す。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞の懸濁液及び遺伝子組換え細胞に由来する組織培養物も包含される。細胞懸濁液または組織培養物は、所望のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの産生のために使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または組織培養物は、ＣＳＬＧ酵素の発現が改変された少なくとも１つの細胞を有する遺伝子組換え植物を再生するために使用される。
【０２１４】
当業者であれば、いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物の種子をさらに包含し、種子から成長した植物は、対応する未組換えの種子またはそれから成長した植物と比較して、少なくとも１つの細胞における少なくとも１つのＣＳＬＧの発現が改変されており、それによって、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変された少なくとも１つの細胞を有することを理解できるであろう。
【０２１５】
形質転換技術が組織培養の使用を必要とする場合、形質転換された細胞は、当業者によく知られている技術を用いて植物に再生される。再生された植物は、次いで、従来の育種技術を用いて、栽培し、同一のまたは異なる植物品種と交配させて種子を作り、その後、適切な条件下で選択される。
【０２１６】
当業者であれば、遺伝子組換え植物は、人間によって遺伝子組換えされた少なくとも１つの細胞を含む植物を包含することを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、本明細書に記載された異種遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドで、少なくとも１つの植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を形質転換することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、それぞれが酵素をコードする２以上の異種遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドで、少なくとも１つの植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を形質転換することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、酵素をコードする複数の異種遺伝子をコードする複数の異種ポリヌクレオチドで、少なくとも１つの植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を形質転換することを含む。
【０２１７】
当業者であれば、少なくとも１つの植物細胞を異種ポリヌクレオチドまたは複数の異種ポリヌクレオチドで形質転換することを含む遺伝子組換え植物が、いくつかの実施形態では、「トランスジェニック植物」と呼ばれることを理解できるであろう。
【０２１８】
当業者であれば、「遺伝子組換え植物」と「対応する非組換え植物」との比較は、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物と、組み換えを欠いた同一の種類の植物との比較を包含することを理解できるであろう。
【０２１９】
当業者であれば、本明細書で開示される植物に関連して使用するとき、「トランスジェニック」という用語は、その細胞の１以上に少なくとも１つの異種の転写可能なポリヌクレオチドを含む植物を包含することを理解できるであろう。当業者であれば、本明細書に開示される酵母に関連して使用するとき、「トランスジェニック」という用語は、少なくとも１つの異種の転写可能なポリヌクレオチドを含む酵母を包含することを理解できるであろう。「トランスジェニック材料」という用語は、少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞、複数の細胞または組織を含む植物またはその一部を広く包含する。したがって、「トランスジェニック植物」と「対応する非トランスジェニック植物」との比較、または「異種の転写可能なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を含む発現が改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物」と「対応する非組み換え植物」との比較は、「トランスジェニック植物」または「遺伝子組換え植物」と、異種の転写可能なポリヌクレオチドを欠いた同一の種類の植物との比較を包含する。当業者であれば、いくつかの実施形態では、「転写可能なポリヌクレオチド」が、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ分子に転写されるポリヌクレオチドを含むことを理解できるであろう。
【０２２０】
「形質転換体」または「形質転換細胞」という用語は、一次形質転換細胞及びその細胞に由来する培養物を移植回数に関係なく含む。すべての子孫は、意図的または不注意な突然変異に起因して、ＤＮＡの含有量が正確に同一ではない場合がある。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同一の機能を有する突然変異体の子孫は、形質転換体の定義に含まれる。
【０２２１】
細胞の形質転換は、安定的であってもよいし、一過性であってもよい。「一過性の形質転換」または「一過性に形質転換された」という用語は、宿主細胞のゲノムへの外因性ポリヌクレオチドの組み込みを欠くときに、１以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを指す。対照的に、「安定的な形質転換」または「安定的に形質転換された」という用語は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに導入し、組み込むことを指す。「安定形質転換体」という用語は、１以上の外因性ポリヌクレオチドをゲノムまたはオルガネラＤＮＡに安定的に組み込んだ細胞を指す。本明細書に開示された核酸、構築物、及び／またはベクターで形質転換された生物またはその細胞は、安定的な形質転換だけでなく、一過性の形質転換も可能であることを理解されたい。
【０２２２】
当業者であれば、「構築物」という用語は、目的のポリヌクレオチドを含む、人工的に組み立てられた、または単離された核酸分子を包含することを理解できるであろう。一般に、構築物は、目的のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、場合によっては目的の遺伝子でもあるマーカー遺伝子、及び適切な調節配列を含むことができる。構築物中に調節配列を含めることは任意選択であり、例えば、そのような配列は、宿主細胞の調節配列が使用される状況では必要とされないことを理解されたい。構築物という用語は、ベクターを含むが、これに限定されるものと見なすべきではない。
【０２２３】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、少なくとも１つの植物細胞を異種ポリヌクレオチドまたは複数の異種ポリヌクレオチドで形質転換することを含む。当業者であれば、少なくとも１つの植物細胞を異種ポリヌクレオチドまたは複数の異種ポリヌクレオチドで形質転換することを含む遺伝子組換え植物が、いくつかの実施形態では、「トランスジェニック植物」と呼ばれることを理解できるであろう。
【０２２４】
ウイルスベクターは、形質転換抵抗性がより高い植物（例えば、大豆またはインゲンマメ）の形質転換に有用である。いくつかの実施形態では、ビーンポッドモットルウイルス（ＢＰＭＶ；コモウイルス属）ベクターなどのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現及びウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）に使用される（Zhang et al. (May 2010) Plant Physiol. 153: 52-65 ["Zhang 2010"]）。細胞の形質転換は、例えば、バイオリステック法、または直接的なＤＮＡラビング接種により行われる（Zhang 2010）。
【０２２５】
一実施形態では、植物の形質転換は、遺伝子銃または生物学的粒子送達システム（バイオリステック法）を使用して外因性ＤＮＡ（導入遺伝子）を細胞に送達することにより行われる（Rech et al. (2008) Nature Protocols 3(3): 410-418 ["Rech 2008"]）。いくつかの実施形態では、プラスミドを設計し、植物（例えば、大豆、豆、綿）の頂端分裂組織に、微粒子でコーティングしたＤＮＡを衝突させ、その後、インビトロで培養し、トランスジェニック植物を選択する（Rech 2008）。他の実施形態では、未分化植物細胞のカルス、または未熟胚の群を、インビトロで、ゲル培地で培養する。いくつかの実施形態では、この細胞を、その後、オーキシンやジベレリンなどの一連の植物ホルモンで処理することにより植物が得られる。ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせは、上記のようなトランスジェニック植物または植物細胞を用いて産生することができる。
【０２２６】
タンパク質の「一過性発現」は、当技術分野で知られている様々な手段によって達成することができる。一実施形態では、タンパク質の一過性発現は、遺伝子組換えウイルスの使用によって達成される。いくつかの実施形態では、アグロインフィルトレーションを使用して、植物、分離した葉、または植物の別の部分における遺伝子の一過性発現を誘導する。アグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス）の懸濁液を、例えば、直接注入または真空濾過によって植物に導入するか、または、多孔質支持体上に固定化された植物細胞（植物細胞パック）と接触させる。バクテリアは、Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡの導入を介して、植物細胞に目的の遺伝子を導入する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、藻類の形質転換の方法は、上述した方法のいずれかを含む。一実施形態では、藻類の形質転換は、ガラスビーズ支援型形質転換、粒子銃媒介型（バイオリステック）形質転換、細胞壁を弱めるためのセルロース分解酵素による処理、または相同組換えを用いて達成される。
【０２２８】
別の態様では、本明細書に開示された核酸は、藻類に形質転換することができる。一実施形態では、藻類は、単細胞藻類である。別の実施形態では、藻類は、多細胞藻類である。一実施形態では、藻類は、シアノバクテリウム、珪藻、クラミドモナス、ドナリエラ、またはヘマトコッカスである。遺伝子は、藻類で過剰発現させることができる。ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを、このようなトランスジェニック藻類を用いて産生することができる。藻類の形質転換のための方法は、当技術分野でよく知られており、特許文献８〜特許文献１４に完全に記載されている（これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、微細藻類の培養は当技術分野でよく知られており、「Vuppaladadiyam et al., (2018) "Microalgae cultivation and metabolites production: a comprehensive review." Biofuls, Bioprod. Bioref. 12:304-324」に記載されている（この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２９】
別の態様では、本明細書に開示された核酸は、酵母に形質転換することができる。遺伝子は、酵母で過剰発現させることができる。酵母の形質転換のための方法は、当技術分野でよく知られており、特許文献１５〜特許文献２１に完全に記載されている（これらの特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせは、このようなトランスジェニック酵母を用いて産生することができる。
【０２３０】
別の実施形態では、本明細書に開示された核酸は、ウイルスに形質転換することができる。別の実施形態では、核酸は、ウイルスで過剰発現させることができる。ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせは、このようなウイルスの過剰発現によって製造することができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、細菌系では、発現させるポリペプチドの意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。一実施形態では、大量のポリペプチドが望まれる。一実施形態では、タンパク質産物の高レベルの発現を誘導するベクター、場合によっては疎水性シグナル配列との融合体として、発現した産物を、タンパク質産物が容易に精製される細菌のペリプラズムまたは培養液に誘導するベクターが望まれる。一実施形態では、特定の融合タンパク質は、ポリペプチドの回収を助けるために、特定の切断部位で操作される。一実施形態では、そのような操作に適応可能なベクターとしては、これに限定しないが、ｐＥＴシリーズの大腸菌発現ベクター（Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 1990）が挙げられる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路の基質の産生に必要な酵素をコードする。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個数の異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個数の酵素をコードし、各遺伝子は、単一の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個数の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン経路の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個数の酵素と、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路の基質の産生に必要な追加の酵素とをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン経路の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個数の酵素と、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路の基質の産生に必要な追加の複数の酵素とをコードする。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、単一の連続したポリヌクレオチド配列を包含し、他の実施形態では、この用語は、複数の連続したヌクレオチド配列を包含する。
【０２３５】
本明細書に開示された共発現遺伝子アレイに基づいて、コレステロールから、例えばα−トマチンへの経路が提案される（図１）。コレステロールは、ＧＡＭＥ７によってＣ２２位が水酸化された後、ＧＡＭＥ８によってＣ２６位が水酸化されることが、以前に記載されている（特許文献５）。２２，２６−ジヒドロキシコレステロールは、次いで、Ｃ１６で水酸化され、Ｃ２２で酸化され、その後、ＧＡＭＥ１１及びＧＡＭＥ６によってＥリングが閉じられ、フロスタノール型アグリコンが形成される。この反応順序は、ＧＡＭＥ１１をサイレンシングしたときに、Ｃ１６及びヘミアセタールのＥリングでの水酸化を欠くコレスタノール型サポニンが蓄積されるという本明細書中の知見からも裏付けられる（図８Ａ−図８Ｄ）。フロスタノール中間体は、ＧＡＭＥ４によって酸化され、ＧＡＭＥ１２によって触媒されるアミノ基転移の基質である２６−アルデヒドとなる。Ｃ２２のアミノ窒素が求核攻撃を受けるとトマチデノールが産生し、これが脱水素されてトマチジンとなる。トマチジンは、その後、ＧＡＭＥ１によってＴ−Ｇａｌに変換される（Itkin et al., 2011 supra）。Ｔ−ＧａｌはＧＡＭＥ１７によってグリコシル化されてγ−トマチンとなり、さらにＧＡＭＥ１８によってグリコシル化されてβ１−トマチンとなり、最終的にＧＡＭＥ２によってα−トマチンに変換される（図１）。
【０２３６】
本明細書に記載されているように、生合成経路に関与する酵素及び／または他のタンパク質の発現を改変することよって、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系グリコアルカロイド、ステロイド系サポニンのレベルを改変することができる。
【０２３７】
ジャガイモ植物において、クラスタ化した酵素をコードする遺伝子と共発現した単一の遺伝子をサイレンシングすると、ステロイド系グリコアルカロイドであるα−カコニンとα−ソラニンの含有量が有意に減少し、逆にこの遺伝子を過剰発現させると、これらの物質の含有量が有意に増加した（図５及び図６）。この遺伝子は、ＡＰ２ドメインを含むコード配列を含むことが見出され、したがって、ＧＡＭＥ９によってコードされた転写因子（本明細書ではＧＡＭＥ９−転写因子と称する）であると仮定された。
【０２３８】
本発明によれば、ＧＡＭＥ９転写因子をコードする遺伝子、２‐オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ＢＨＬＨ）転写因子をコードする遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え植物であって、対応する未組換え植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変された遺伝子組換え植物が提供される。本明細書中で、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（ＧＡＭＥ１１）について例示したように、本発明の遺伝子の発現を操作することは、ステロイド系サポニン合成の操作をさらにもたらすことができる。
【０２３９】
したがって、さらなる態様によれば、ＧＡＭＥ９転写因子をコードする遺伝子、２‐オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ＢＨＬＨ）転写因子をコードする遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの細胞を含む遺伝子組換え生物であって、未組換えまたは未編集の生物と比較して、ステロイド系サポニン及び／またはステロイド系アルカロイド、それらのグリコシル化誘導体または他の誘導体、それらの代謝物、またはそれらの生合成中間体から選択される少なくとも１つの化合物の含有量が改変された遺伝子組換え生物が提供される。
【０２４０】
予期せぬことに、本発明は、ステロイド系アルカロイド生合成経路に関与する酵素及び／または転写因子の発現を調節することによって、ジャガイモ塊茎中のＳＧＡレベルを大幅に低下させることができることが分かった。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、
遺伝子組換え植物中の、ＧＡＭＥ９転写因子をコードする遺伝子、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、ＢＨＬＨ転写因子をコードする遺伝子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の発現が、対応する未組換えまたは未編集の植物における発現と比べて抑制され、これにより、遺伝子組換え植物は、対応する未組換え植物と比べて、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０２４２】
化合物１１のホウレンソウのトリテルペノイド生合成経路において活性な遺伝子及びそれをコードする酵素は、実施例において詳細に説明される。実施例２０で提供される表１７は、これらの酵素のアミノ酸配列及び核酸配列と、それらをコードする遺伝子を示す。実施例２４で提供される表１９は、シロイヌナズナから単離された追加のＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列を示す。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４６に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号８０に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９７に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９９に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０３に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０５に記載されている。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４６に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号８０に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９７に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９９に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０１に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０３に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０５に記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のカバレッジを有する核酸配列を含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４６に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号８０に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９７に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号９９に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０１に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号１０５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成酵素、ステロイド系サポニン生合成酵素、またはトリテルペノイド系サポニン生合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上の少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成酵素、ステロイド系サポニン生合成酵素、トリテルペノイド系サポニン生合成酵素、またはそれらの組み合わせをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０２５２】
当業者であれば、配列の相同性は、共通の祖先からの系図に起因する配列の類似性を包含することを理解できるであろう。相同の生物学的構成要素（遺伝子、タンパク質、構造）はホモログと呼ばれる。ヌクレオチドまたはタンパク質の配列が関連している程度。２つの配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミノ酸）の間の類似性は、配列相同性の割合及び／または正しい置換の割合で表すことができる。
【０２５３】
当業者であれば、「ホモログ」という用語は、共通の祖先のＤＮＡまたはポリペプチド（タンパク質）配列からの系図によって、それぞれ、第２の遺伝子またはポリペプチド（タンパク質）と関連している遺伝子またはポリペプチド（タンパク質）を包含することを理解できるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子のホモログは、その遺伝子と同様のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子のホモログは、その遺伝子によってコードされるものと同一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子のホモログは、その遺伝子によってコードされるものと同一の機能的特性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子のホモログは、その遺伝子によってコードされるポリペプチドと同様のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、ポリペプチドのホモログは、そのポリペプチドと同様のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのホモログは、そのポリペプチドと同一の機能的特性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのホモログは、そのポリペプチドと同様の機能的特性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのホモログは、そのポリペプチドと同一のドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのホモログは、そのポリペプチドと同様のドメインを含む。
【０２５４】
当業者であれば、パーセント相同性またはパーセント同一性は、これに限定しないが、例えばＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して、デフォルトのパラメータを用いて決定できることを理解できるであろう。また、ホモログは、オーソログ、欠失、挿入、またはアミノ酸置換を含む置換変異体を指してもよい。いくつかの実施形態では、配列同一性または相同性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥ、及びＨＨｐｒｅｄなどの任意のタンパク質または核酸配列アライメントアルゴリズムを用いて決定することができる。
【０２５５】
当業者であれば、ホモログは、いくつかの実施形態では、同一の活性を有し得ることを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、ＳＯＡＰ遺伝子のホモログは、対応するＳＯＡＰ遺伝子と同一の活性を有する。いくつかの実施形態では、ＳＯＡＰポリペプチドのホモログは、対応するＳＯＡＰポリペプチドと同一の酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、ＳＯＡＰ５のホモログは、ＳＯＡＰ５と同一の酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＡＭＥ遺伝子のホモログは、対応するＧＡＭＥ遺伝子と同一の活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＡＭＥポリペプチドのホモログは、対応するＧＡＭＥポリペプチドと同一の酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＡＭＥ１５のホモログは、ＧＡＭＥ１５と同一の酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子のホモログは、セルロース合成酵素様Ｇ活性を有する酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子のホモログは、グルクロン酸転移酵素活性を有する酵素をコードする。いくつかのの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子のホモログは、セルロース合成酵素様Ｇ活性及びグルクロン酸転移酵素活性を有する酵素をコードする。図４２Ａ及び４２Ｆは、セルロース合成酵素様酵素の系統樹を示し、セルロース合成酵素様Ｇの下位の系統群は、本明細書に記載のＳＯＡＰ５及びＧＡＭＥ１５酵素を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、異種ＣＳＬＧ遺伝子に加えて、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードする核酸配列を含み、追加の遺伝子は、（ａ）β−アミリン合成酵素、及び、配列番号４５に記載の核酸配列、または、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６３に記載の核酸配列、または、配列番号６３に記載の核酸配列に対して８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７４に記載の核酸配列、または、配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせ、をコードする。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、あるいは、配列番号３０、３２、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、異種ＣＳＬＧ遺伝子に加えて、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードする核酸配列を含み、追加の遺伝子は、（ａ）β−アミリン合成酵素、及び、配列番号４５に記載の核酸配列、または、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｂ）シトクロムＰ４５０、及び、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ、及び、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列、または、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｄ）アセチルトランスフェラーゼ、及び、配列番号６３に記載の核酸配列、または、配列番号６３に記載の核酸配列に対して８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、（ｅ）ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、及び、配列番号７４に記載の核酸配列、または、配列番号７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、あるいは、（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の任意の組み合わせ、をコードする。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、またはそれらの組み合わせから選択される配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される酵素をコードする異種遺伝子の核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、またはそれらの組み合わせから選択される配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する核酸配列を含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される酵素をコードする異種遺伝子の核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、またはそれらの組み合わせから選択されたる核酸配列を含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５から選択される配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する核酸配列は、コドン最適化遺伝子配列を含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、遺伝子を最適化することは、コドン使用量を宿主遺伝子のコドンバイアスに適合させることを含み、一実施形態では、宿主は植物である。いくつかの実施形態では、遺伝子を最適化することは、コドン使用量を宿主遺伝子のコドンバイアスに適応させることを含み、一実施形態では、宿主は酵母である。いくつかの実施形態では、遺伝子を最適化することは、コドン使用量を宿主遺伝子のコドンバイアスに適応させることを含み、一実施形態では、宿主は藻類である。コドン最適化遺伝子配列は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように、少なくとも１つの異種遺伝子の翻訳効率を向上させることによって、生体におけるタンパク質発現レベルを向上させる。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、酵母における発現のためのコドン最適化を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、藻類における発現のためのコドン最適化を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、植物細胞における発現のためのコドン最適化を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、「最適化された」という用語は、所望の改変を包含し、一実施形態では遺伝子発現の改変であり、別の実施形態ではタンパク質発現の改変である。一実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の最適化された制御である。別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の増加である。この態様及び一実施形態では、野生型と比較して、遺伝子発現の２倍から１０００倍の増加が企図される。別の実施形態では、遺伝子発現の２倍から５００倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の２倍から１００倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の２倍から５０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の２倍から２０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の２倍から１０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の３倍から５倍の増加が企図される。
【０２６７】
別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、特定の環境条件下での遺伝子発現の増加であってもよい。別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の低下を含んでいてもよく、これは、一実施形態では特定の環境条件下でのみであってもよい。
【０２６８】
別の実施形態では、最適化された遺伝子発現は、遺伝子発現の持続時間の増加である。この態様及び一実施形態では、野生型と比較して、遺伝子発現の持続時間が２倍から１０００倍に増加することが企図される。別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の２倍から５００倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の２倍から１００倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の２倍から５０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の２倍から２０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の２倍から１０倍の増加、別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の３倍から５倍の増加が企図される。別の実施形態では、遺伝子発現の持続時間の増加は、非ベクター発現対照における遺伝子発現と比較されるか、または代替的に、野生型ベクター発現対照における遺伝子発現と比較される。
【０２６９】
当業者であれば、いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え細胞で発現することを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、細胞は、２以上の異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、酵素をコードする２つ以上の異種遺伝子が遺伝子組換え細胞で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、ポリヌクレオチド配列は１以上の遺伝子を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え細胞で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、各ポリヌクレオチド配列は１つの単一の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え細胞で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、各ポリヌクレオチド配列は１以上の遺伝子を含む。
【０２７０】
全体を通して開示されているように、いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物またはその一部を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞は、酵母細胞を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞は、藻類細胞を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞は、昆虫細胞を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞は、細菌を含む。
【０２７１】
さらに、当業者であれば、いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が、遺伝子組換え植物で発現することを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、植物は、２以上の異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え植物で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、ポリヌクレオチド配列は１以上の遺伝子を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え植物で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、各ポリヌクレオチド配列は１つの単一の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、酵素をコードする２以上の異種遺伝子が遺伝子組換え植物で発現される場合、複数のポリヌクレオチド配列を使用することにより複数の異種遺伝子をコードしてもよく、各ポリヌクレオチド配列は１以上の遺伝子を含む。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、ステロイド系アルカロイド生合成酵素、ステロイド系サポニン生合成酵素、及び／またはトリテルペノイド生合成酵素のアミノ酸配列を含む。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３３に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３５に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３９に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４８に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４９に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５０に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５２に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５６に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５８に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６０に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６２に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６４に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６６に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６９に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号８１に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９４に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９６に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９８に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１００に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０２に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０４に記載されている。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１００に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のカバレッジを有する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号６９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号８１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号９８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１００に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、配列番号１０４に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４から選択される配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４から選択される配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、コードされたＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列はβ−アミリン合成酵素をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列、あるいは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列はシトクロムＰ４５０をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列はグリコシルトランスフェラーゼをコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、あるいは、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列はアセチルトランスフェラーゼをコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、あるいは、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、コードされた少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列は、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１をコードし、配列番号７４に記載のアミノ酸配列、あるいは、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つの内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つの内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が、対応する非組換え細胞と比較して改変され、その遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え細胞と比較して改変されている。
【０２８３】
内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現を改変させると、ステロイド系アルカロイド生合成経路、ステロイド系サポニン生合成経路、及び／またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路に影響を与え、いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドのプロファイルまたはその経路の中間体、ステロイド系サポニンのプロファイルまたはその経路の中間体、またはトリテルペノイド系サポニンのプロファイルまたはその経路の中間体に、それぞれ付随した改変をもたらす。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞における発現の改変は、対応する非組換え細胞と比較してＣＳＬＧ遺伝子の発現が増加することを含む。いくつかの実施形態では、発現の増加は、コードされた酵素の量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の増加は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドまたはその中間体の増加を含むステロイド系アルカロイドプロファイルの改変をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の増加は、少なくとも１つのステロイド系サポニンまたはその中間体の増加を含むステロイド系サポニンプロファイルの改変をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の増加は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンまたはその中間体の増加を含むトリテルペノイド系サポニンプロファイルの改変をもたらす。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞における発現の改変は、対応する非組換え細胞と比較してＣＳＬＧ遺伝子の発現が低下することを含む。いくつかの実施形態では、発現の減少は、コードされた酵素の量の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の低下は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドまたはその中間体の減少を含むステロイド系アルカロイドプロファイルの改変をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の低下は、少なくとも１つのステロイド系サポニンまたはその中間体の減少を含むステロイド系サポニンプロファイルの改変をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の低下は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンまたはその中間体の減少を含むトリテルペノイド系サポニンプロファイルの改変をもたらす。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの細胞は、植物またはその一部に含まれる植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が改変された少なくとも１つの細胞は、ＣＳＬＧ遺伝子の突然変異の結果である。いくつかの実施形態では、突然変異は、少なくとも１以上の点突然変異、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み、ＣＳＬＧ酵素は、安定性の向上、活性の増加、またはその両方を含み、含有量の改変は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して増加することである。いくつかの実施形態では、突然変異は、少なくとも１以上の点突然変異、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含み、ＣＳＬＧ酵素は、安定性の低下、活性の低下、またはその両方を含み、含有量の改変は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が、対応する非組換え植物と比較して減少することである。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現が改変され、改変は、ＣＳＬＧ遺伝子を突然変異させることを含み、突然変異は、１以上の点突然変異、挿入、欠失、またはゲノム編集の導入、または細菌のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系の使用、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬＳＧ酵素をコードする遺伝子の発現が、対応する非組換え植物における発現と比較して増加し、これにより、遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＣＬＳＧ酵素をコードする遺伝子の発現が、対応する非組換え植物における発現と比較して減少し、これにより、遺伝子改変植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０２８９】
ＣＳＬＧ遺伝子への、欠失、挿入、部位特異的変異、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどを含む突然変異の挿入は、例えば、遺伝子発現の上方制御、発現したＣＳＬＧ酵素の安定性の向上、ＣＳＬＧ酵素の活性の増加、遺伝子発現の下方制御、発現したＣＳＬＧ酵素の安定性の低下、ＣＳＬＧ酵素の活性の低下、またはＣＳＬＧ酵素の活性の消失などのために利用することができる。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、突然変異したＣＳＬＧ遺伝子は、ＣＳＬＧ遺伝子の核酸配列に少なくとも１つの突然変異を有するポリヌクレオチドを含み、そのＣＳＬＧ遺伝子の核酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列またはその相補的配列である。
【０２９１】
当業者であれば、遺伝子組換え植物は、人間によって遺伝子組換えされた少なくとも１つの細胞を含む植物を包含することを理解できるであろう。遺伝子組換えは、例えば、内在性ポリヌクレオチドまたは目的の遺伝子に対して突然変異、欠失、挿入、転移性因子などを導入することによる、内在性遺伝子の組み換えを含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えは、異種ポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換することを含む。当業者であれば、少なくとも１つの植物細胞を異種ポリヌクレオチドまたは複数の異種ポリヌクレオチドで形質転換することを含む遺伝子組換え植物が、いくつかの実施形態では、同一の意味及び性質を有する「トランスジェニック植物」または「遺伝子組換え植物」と呼ばれることを理解できるであろう。
【０２９２】
内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現を改変することは、いくつかの実施形態では、対応するタンパク質をコードする核酸分子に１以上の点突然変異を導入することによって達成することができる。突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて導入することができる（例えば、「Wu Ed., 1993 Meth. In Enzymol. Vol. 217, San Diego: Academic Press; Higuchi, "Recombinant PCR" in Innis et al. Eds., 1990 PCR Protocols, San Diego: Academic Press, Inc」を参照）。このような突然変異誘発は、特定の所望のアミノ酸の挿入、欠失または置換を導入するために用いることができる。標的突然変異誘発のためのいくつかの技術は、ゲノム中の二本鎖切断（ＤＳＢ）の標的誘導と、それに続く、変異性ＤＮＡ修復に基づいている。これらの方法によってゲノム編集のために最も一般的に使用されるのは、ジンクフィンガーヌクレアーゼを含むカスタム設計されたヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼ、及びキサントモナス由来の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）酵素である。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現を改変する場合、改変は、ＣＳＬＧ遺伝子を突然変異させることを含む。この突然変異は、ＣＳＬＧ遺伝子のコード領域、ＣＳＬＧ遺伝子の制御配列、またはそれらの組み合わせ中に存在する。
【０２９４】
保存的変異体または非保存的変異体を産生するために、様々な種類の突然変異誘発を用いて、ＣＳＬＧ及びそれがコードする酵素を改変することができる。任意の利用可能な突然変異誘発方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、部位特異的点突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ランダム点突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、インビトロまたはインビボでの相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ギャップを有する二重鎖ＤＮＡを用いた突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、点ミスマッチ修復を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、制限選択及び制限精製を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、欠失突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、全遺伝子合成による突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、二本鎖切断修復を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、キメラ構築物による突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、メガヌクレアーゼによる突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）による突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）による突然変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、当業者に知られている任意の他の突然変異誘発方法を含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、突然変異誘発は、天然に存在する分子及び／または突然変異した分子に関する既知の情報によって誘導される。例として、この既知の情報は、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などを含む。いくつかの実施形態では、突然変異誘発は、本質的にランダムである。いくつかの実施形態では、突然変異誘発方法は、ＤＮＡシャッフリングである。
【０２９６】
当業者であれば、クラスタ化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）系が、細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ原核生物適応免疫系に基づくゲノム操作ツールを含むことを理解できるだろう。このＲＮＡに基づく技術は、非常に特異的であり、カスタマイズ可能なスモールノンコーディングＲＮＡによって導かれるゲノムＤＮＡの標的切断を可能にし、それにより、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）の両方のメカニズムによる遺伝子改変をもたらす（Belhaj K. et al., 2013. Plant Methods 2013, 9:39）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、当分野で既知の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及び／またはＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、予め選択された部位で切断するために新たに作製されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及び／またはＣａｓタンパク質を含む。当業者であれば、「シングルガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、及び「ｇＲＮＡ」という用語が、互換的に使用することができ、すべて同一の性質及び意味を有することを理解できるであろう。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランスコードされたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるキメラＲＮＡ分子を包含することができる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ＧＡＭＥ１５  ＤＮＡの予め選択された領域に相補的であり、ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）ヌクレアーゼタンパク質を予め選択された標的部位を「標的化」する。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、相補的なｃｒＲＮＡ配列の長さは、１９〜２２ヌクレオチド長、例えば、標的部位に相補的な１９〜２２個の連続ヌクレオチドである。別の実施形態では、ＤＮＡの領域に相補的なｃｒＲＮＡ配列の長さは、約１５〜３０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ＤＮＡの領域に相補的なｃｒＲＮＡの配列の長さは、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ＤＮＡの領域に相補的なｃｒＲＮＡ配列の長さは、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ分子の５´末端に位置する。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で１００％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも８０％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも８５％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも９０％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも９５％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも９７％の相補的を含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、予め選択された標的配列内で少なくとも９９％の相補的を含む。別の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、１００〜３００ヌクレオチド長であり、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形成するＣａｓ９タンパク質の結合部位を提供する。
【０２９９】
一実施形態では、突然変異誘発系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣａｓヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子とを含み、ｇＲＮＡ分子は、予め選択された内在性標的部位内で結合し、それによって、Ｃａｓヌクレアーゼが予め選択された内在性標的部位内のＤＮＡを切断するように誘導する。
【０３００】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチドの領域、例えば予め選択された内在性標的部位に相補的または実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ配列（「ｇＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）と、ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質とを含む酵素系を含む。
【０３０１】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、または、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、またはそれらの誘導体を含む。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に由来する、操作された及び／またはプログラムされたヌクレアーゼ系を含む。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、操作された及び／または突然変異したＣａｓタンパク質を含む。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、操作された及び／またはプログラムされたガイドＲＮＡを含む。
【０３０２】
当業者であれば、ガイドＲＮＡが、例えば予め選択された内在性標的部位などの標的ＤＮＡ配列の領域に対して相補的または実質的に相補的な領域以外のヌクレオチド配列を含み得ることを理解できるであろう。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡキメラを含む。
【０３０３】
別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相同染色体上の予め選択された内在性標的部位に相補的であり、かつそれに結合するドメインを含む。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、少なくとも１つの相同染色体上の多型対立遺伝子に相補的であり、かつそれに結合するドメインを含む。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、両方の相同染色体上の予め選択された内在性標的部位に相補的であり、かつそれに結合するドメインを含む。別の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、両方の相同染色体上の多型対立遺伝子に相補的であり、かつそれに結合するドメインを含む。
【０３０４】
Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を作ることができるＲＮＡガイドのＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。「Ｃａｓ酵素」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド」という用語と互換的に使用することができ、すべての同一の性質及び意味を有する。一実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃ２ｃｌ、ＣａｓＸ、ＮｇＡｇｏ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、及びそれらの改変版からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１Ｂを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ４を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ５を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ６を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ７を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ８を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１０を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｐｆ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｙ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｙ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｙ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｅ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｅ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｃ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｃ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓａ５を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｎ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｍ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｍ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｍ４を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｍ５を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｍ６を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｍｒ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｍｒ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｍｒ４を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｍｒ５を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｍｒ６を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｂ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｂ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｂ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ１７を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ１４を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ１０を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｆ２を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｆ３を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｓｆ４を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃｐｆ１を含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃ２ｃｌを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、ＣａｓＸを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、ＮｇＡｇｏを含む。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓのホモログである。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓオルソログである。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、改変されたＣａｓ酵素である。別の実施形態では、Ｃａｓ酵素は、当分野で知られている任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。
【０３０５】
当業者であれば、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」という用語は、すべて同一の意味と性質を有する互換性のあるものであり、ＺＦＮは、ＤＮＡの二本鎖切断が可能な少なくとも１つのヌクレアーゼに作動可能に連結された少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質分子を包含することを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ系は、当分野で既知のＺＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦＮ系は、予め選択された部位を切断するために新たに作製されたＺＦＮを含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、予め選択された内在性標的部位で二本鎖切断を生じさせる。いくつかの実施形態では、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの亜鉛フィンガーを含み、ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結されている。別の実施形態では、亜鉛フィンガーのＤＮＡ結合ドメインは、キメラタンパク質分子のＮ末端に位置し、ＤＮＡ切断ドメインは、キメラタンパク質分子のＣ末端に位置する。別の実施形態では、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、キメラタンパク質分子のＣ末端に位置し、ＤＮＡ切断ドメインは、キメラタンパク質分子のＮ末端に位置する。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおける、例えば本明細書に開示されたような予め選択された内在性標的部位などの標的遺伝子座に結合することができる領域を包含する。別の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの相同染色体上の予め選択された内在性標的部位に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの相同染色体上の多型対立遺伝子に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、両相同染色体上の予め選択された内在性標的部位に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、両方の相同染色体上の多型対立遺伝子に結合するタンパク質ドメインを含む。
【０３０７】
当業者であれば、「キメラタンパク質」という用語が、２以上のＤＮＡ断片を作動的に連結することによって作製されたＤＮＡ分子から発現されたタンパク質を説明するために使用されていることを理解できるだろう。ＤＮＡ断片は、同一の種に由来するものであってもよいし、異なる種に由来するものであってもよい。また、ＤＮＡ断片は、同一の遺伝子に由来するものであってもよいし、異なる遺伝子に由来するものであってもよい。当業者であれば、ＺＦＮの「ＤＮＡ切断ドメイン」という用語が、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおける、ヌクレオチド鎖の核酸間の化学結合を破壊することができる領域を包含することを理解できるであろう。切断ドメインを含むタンパク質の例としては、制限酵素、トポイソメラーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、ＤＮＡｓｅｓなどが挙げられる。
【０３０８】
当業者であれば、エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼと同様に特定のＤＳＢ標的部位に結合して切断するメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅｓ）とも呼ばれる）が含まれ、メガヌクレアーゼのＤＳＢ標的部位は一般的に約１８ｂｐ以上であることを理解できるであろう。メガヌクレアーゼのドメイン、構造及び機能は、例えば、「Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001 ) Nucleic Acids Res 29:960-9」、「Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26」、「Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95」、及び「Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764」を参照されたい。いくつかの例では、天然に存在する変異体、及び／または操作された誘導体メガヌダーゼが使用される。任意のメガヌダーゼを使用することができ、そのようなものとしては、これに限定しないが、ｌ−Ｓｃｅｌ、ｌ−Ｓｃｅｌｌ、ｌ−Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ−ＳｃｅｌＶ、ｌ−ＳｃｅＶ、ｌ−ＳｃｅＶＩ、ｌ−ＳｃｅＶＩＩ、ｌ−Ｃｅｕｌ、ｌ−ＣｅｕＡＩＩＰ、ｌ−Ｃｒｅｌ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂｌＰ、ｌ−ＣｒｅｐｓｂｌｌＰ、ｌ−ＣｒｅｐｓｂｌｌｌＰ、ｌ−ＣｒｅｐｓｂｌＶＰ、ｌ−Ｔｌｉｌ、ｌ−Ｐｐｏｌ、Ｐｌ−Ｐｓｐｌ、Ｆ−Ｓｃｅｌ、Ｆ−Ｓｃｅｌｌ、Ｆ−Ｓｕｖｌ、Ｆ−Ｔｅｖｌ、Ｆ−Ｔｅｖｌｌ、ｌ−Ａｍａｌ、ｌ−Ａｎｉｌ、ｌ−Ｃｈｕｌ、ｌ−Ｃｍｏｅｌ、ｌ−Ｃｐａｌ、ｌ−Ｃｐａｌｌ、Ｉ−Ｃｓｍｌ、ｌ−Ｃｖｕｌ、ｌ−ＣｖｕＡＩＰ、ｌ−Ｄｄｉｌ、ｌ−Ｄｄｉｌｌ、ｌ−Ｄｉｒｌ、ｌ−Ｄｍｏｌ、ｌ−Ｈｍｕｌ、ｌ−Ｈｍｕｌｌ、ｌ−ＨｓＮＩＰ、ｌ−Ｌｌａｌ、ｌ−Ｍｓｏｌ、ｌ−Ｎａａｌ、ｌ−Ｎａｎｌ、ｌ−ＮｃｌｌＰ、ｌ−ＮｇｒＩＰ、ｌ−Ｎｉｔｌ、ｌ−Ｎｊａｌ、ｌ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、ｌ−Ｐａｋｌ、ｌ−ＰｂｏｌＰ、Ｉ−ＰｃｕｌＰ、ｌ−ＰｃｕＡＩ、ｌ−ＰｃｕＶＩ、ｌ−ＰｇｒＩＰ、ｌ−ＰｏｂｌＰ、ｌ−Ｐｏｒｌ、ｌ−ＰｏｒｌｌＰ、ｌ−ＰｂｐＩＰ、ｌ−ＳｐＢｅｔａｌＰ、Ｉ−Ｓｃａｌ、ｌ−ＳｅｘｌＰ、ｌ−ＳｎｅｌＰ、ｌ−Ｓｐｏｍｌ、ｌ−ＳｐｏｍＣＰ、ｌ−ＳｐｏｍｌＰ、ｌ−ＳｐｏｍｌｌＰ、ｌ−ＳｑｕｌＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３ｌ、ｌ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、ｌ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、ｌ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、ｌ−ＴｄｅｌＰ、ｌ−Ｔｅｖｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌｌｌ、ｌ−ＵａｒＡＰ、ｌ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、ｌ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、ｌ−ＶｉｎＩＰ、ｌ−ＺｂｉｌＰ、Ｐｌ−Ｍｔｕｌ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、Ｐｌ−Ｐｆｕｌ、Ｐｌ−Ｐｆｕｌｌ、Ｐｌ−Ｐｋｏｌ、Ｐｌ−Ｐｋｏｌｌ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａｌＰ、Ｐｌ−Ｓｃｅｌ、Ｐｌ−Ｔｆｕｌ、Ｐｌ−Ｔｆｕｌｌ、Ｐｌ−Ｔｈｙｌ、Ｐｌ−Ｔｌｉｌ、Ｐｌ−Ｔｌｉｌｌ、またはそれらの活性変異体や断片が挙げられる。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを用いて、植物または他の生物のゲノム内の特定の標的配列において二本鎖切断を行うことができる。ＴＡＬエフェクターは、転写活性化因子（ＴＡＬ）エフェクターまたはその機能的な部分を、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋｌ）の触媒ドメインに融合させることによって作製することができる。ユニークなモジュール型ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン��、任意のＤＮＡ認識特異性を潜在的に有するタンパク質の設計を可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターのヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。「WO 2010/079430」、「Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107」「Scholze & Boch (2010) Virulence 1 :428-432」、「Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761」、「Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704」、「Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148」（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ系は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含み、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、予め選択された内在性標的部位内で結合し、それによって、ＤＮＡ切断ドメインを標的化して、予め選択された内在性標的部位内でＤＮＡを切断する。
【０３１０】
当業者であれば、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」、「ＴＡＬＥＮ」、及び「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」という用語は、互換的に使用することができ、すべて同一の性質及び意味を有することを理解できるであろう。ＴＡＬＥＮは、その標的部位、例えば本明細書に開示されたような予め選択された内在性標的部位を認識して切断することができるヌクレアーゼを包含する。別の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥドメインとヌクレオチド切断ドメインとを含む融合タンパク質を含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、１以上のＴＡＬＥ反復モジュールを介して、配列特異的な方法でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを含む。当業者であれば、ＴＡＬＥ反復モジュールは、植物のＤＮＡ配列を認識する約３４個の可変数のアミノ酸反復を含むことを認識できるであろう。さらに、反復モジュールは、新しいＤＮＡ配列を標的とするために、単純な暗号にしたがって再配列させることができる。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、少なくとも１つの相同性染色体上の予め選択された内在性標的部位に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、少なくとも１つの相同染色体上の多型対立遺伝子に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、両方の相同染色体上の予め選択された内在性標的部位に結合するタンパク質ドメインを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、両方の相同染色体上の多型対立遺伝子に結合するタンパク質ドメインを含む。
【０３１１】
一実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、３０個を超える反復モジュールを含む。別の実施形態では、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質は、Ｎ末端ドメイン、１以上のＴＡＬＥ反復モジュールとそれに続く半反復モジュール、リンカー、及びヌクレオチド切断ドメインを含む。
【０３１２】
エチルメチルスルホン酸（ＥＭＳ）などの薬剤を使用する化学的突然変異誘発法を用いて点変異の集団を得て、サイレンシングまたはダウンレギュレーションされるＣＳＧＬ遺伝子の突然変異体をスクリーニングすることができる。植物の場合は、自然集団からの遺伝子移入に基づく方法を用いることができる。培養種と野生種とを繰り返し交配し、野生ゲノムの所定の断片を含む植物を単離する。例えばトウモロコシやキンギョソウなどの特定の種の植物は、天然のトランスポゾンを有している。これらのトランスポゾンは、トランスポゾンの配列内にトランスポザーゼが存在する自律的なものと、トランスポザーゼを有していない非自律的なものとがある。当業者であれば、トランスポゾンを「ジャンプ」させて、突然変異を生じさせることができる。あるいは、１以上の所定の位置にランダムなヌクレオチドを有する核酸配列を合成することにより、ランダムなアミノ酸置換を生じさせることもできる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子の発現は、それらの制御配列に１以上の点突然変異を導入することによって改変することができる。いくつかの実施形態では、異種ＣＳＬＧ遺伝子の発現は、それらの制御配列に１以上の点突然変異を導入することによって改変することができる。
【０３１４】
当業者であれば、「調節配列」は、コーディング配列の上流（５´非コーディング配列）、内部、または下流（３´非コーディング配列）に位置し、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡの処理または安定性、あるいは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指すことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、調節配列は、プロモータを含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、翻訳リーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、イントロンを含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化認識配列を含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、ＲＮＡプロセシング部位を含む。いくつかの実施形態では、調節配列は、エフェクター結合部位を含む。いくつかの実施形態では、制御配列は、ステムループ構造を含む。
【０３１５】
当業者であれば、「プロモータ」は、コーディング配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、コーディング配列は、プロモータ配列の３´に位置する。当業者であれば、異なるプロモータが、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示することは、理解できるであろう。いくつかの実施形態では、プロモータは、構成的プロモータ、すなわち、ほとんどの細胞型において、ほとんどの時間で遺伝子を発現させるプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、制御されたプロモータ、すなわち、散発的な特定の刺激に応答して遺伝子を発現させるプロモータを含む。さらに、多くの場合、調節配列の正確な境界はまだ完全には定義されていないことが認識されている。
【０３１６】
当業者であれば、「３´非コード配列」または「転写ターミネーター」という用語が、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指すことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、３´非コード配列は、ポリアデニル化認識配列を含む。いくつかの実施形態では、３´非コード配列は、ｍＲＮＡプロセシングに影響を与えることができる制御シグナルをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、３´非コード配列は、遺伝子発現に影響を与えることができる制御シグナルをコードする配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３´末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を与える。いくつかの実施形態では、３´非コード配列の変異は、遺伝子の転写に影響を与える。いくつかの実施形態では、３´非コード配列における変異は、ＲＮＡプロセシングに影響する。いくつかの実施形態では、３´非コード配列における変異は、遺伝子の安定性に影響を与える。いくつかの実施形態では、３´非コード配列における変異は、関連するコード化配列の翻訳に影響を与える。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現が、対応する非組換え植物における発現と比較して低減し、それによって、遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して低減する。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、ＣＬＳＧ酵素をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有するトランスジェニック植物である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＣＬＳＧ酵素をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドの発現は、選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低減される。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＣＳＬＧ酵素をコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、その発現をサイレンシング、抑制、または低減するために、欠失、挿入、または修飾によって選択的に編集されているか、または、遺伝子組換え植物は、遺伝子編集された植物の子孫である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、ＣＳＬＧ遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子は、選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低減され、改変された含有量は、対応する非組換え植物と比較した、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量の低減、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量の低減、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量の低減を含む。内在性ＣＳＬＧ遺伝子が、選択的にサイレンシングされるか、抑制されるか、または発現が低減される場合、上記の細胞は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子をさらに含み、そのサイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉分子またはアンチセンス分子から選択されるか、あるいは、そのサイレンシング分子は、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング系の構成要素である。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載された核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３０に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３２に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３４に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３６に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号３８に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号４０に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号６５に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号８０に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号９３に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号９５に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号９７に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号９９に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態はでは、トランスジェニック植物は、配列番号１０１に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号１０３に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、配列番号１０５に記載の核酸配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、サイレンシング分子はＲＮＡ干渉分子及びアンチセンス分子からなる群から選択されるか、または、サイレンシング分子はウイルス誘導遺伝子サイレンシング系の構成要素である。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載された核酸配列、またはその相補的配列を有するＣＳＬＧ遺伝子の領域に対して実質的に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、植物または植物細胞におけるＣＳＬＧの発現をサイレンシング、抑制、または低減するアンチセンス分子は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、またはその相補的配列を有するＣＳＬＧ遺伝子の領域に対して実質的に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、植物または植物細胞におけるＣＳＬＧの発現をサイレンシング、抑制、または低減するアンチセンス分子は、配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、植物または植物細胞におけるＣＳＬＧの発現をサイレンシング、抑制、または低減するＶＩＧ分子は、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号１０６、または配列番号１０７に記載されたヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、またはその相補的配列内の核酸配列を有するＣＳＬＧ断片を標的とする。いくつかの実施形態では、上記の植物細胞を含む遺伝子組換え植物は、トリテルペノイド系サポニン、その代謝物、その誘導体、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えまたは遺伝子編集された植物は、ＣＳＬＧ遺伝子を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を含む少なくとも１つの細胞を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉分子及びアンチセンス分子からなる群から選択される。これらの実施形態では、遺伝子組換え植物は、ステロイド系アルカロイドまたはその生合成中間体、ステロイド系サポニンまたはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニンまたはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０３２６】
ＣＳＬＧ遺伝子を標的とするサイレンシング分子は、当業者に知られているようにして設計することができる。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、ＣＳＬＧ遺伝子の領域、これに限定しないが、例えば、トマト、野生型トマト、ジャガイモ、野生型ポテト、及びナスにおいて本明細書に開示されているＧＡＭＥ１５またはそのホモログ、に対して実質的に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド含む。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、ＣＳＬＧ遺伝子の領域、例えば、甘草、シロイヌナズナ、レッドビート、キノア、アルファルファ、大豆、またはミヤコグサにおいて本明細書に開示されているＳＯＡＰ５またはそのホモログ、に対して実質的に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、アンチセンスＲＮＡである。
【０３２８】
いくつかの例示的な実施形態では、サイレンシング分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。いくつかの実施形態では、サイレンシング分子は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、スペーサーによって分離されている。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、イントロンである。さらに他の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの発現は、１つのプロモータに由来する。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの発現は、２つのプロモータに由来する。２つのプロモータは、互いに同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、低分子二本鎖ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現のサイレンシングまたは低減を包含する。これは、動物や植物における、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスであり、その二重鎖領域における、サイレンシングされた遺伝子の配列と相同な阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）によって開始される。この遺伝子は、生物に対して内在性であっても外因性であってもよく、染色体に組み込まれていてもよく、または、ゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能の全体または一部を阻害すると考えられる。
【０３３０】
一般的に、ＲＮＡｉ分子という用語は、センス配列とアンチセンス配列との両方を含む一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子を指す。例えば、ＲＮＡ干渉分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってよく、アンチセンス領域は、標的核酸分子に対する相補性を有する。あるいは、ＲＮＡｉ分子は、自己相補的なセンス領域と、標的核酸分子に対する相補性を有するアンチセンス領域とを有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであってよい。または、ＲＮＡｉ分子は、２以上のループ構造、並びに、自己相補的なセンス領域と、標的核酸分子に対する相補性を有するアンチセンス領域とを含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。この環状一本鎖ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理することにより、ＲＮＡｉを媒介可能な活性分子を生成することができる。
【０３３１】
アンチセンス技術は、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子が、標的センスＤＮＡまたはＲＮＡ鎖と相互作用するプロセスである。センス鎖は、５´〜３´のｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。センス鎖に対して相補的な鎖、すなわちミラー鎖は、アンチセンスと呼ばれる。アンチセンス鎖がセンスｍＲＮＡ鎖と相互作用すると、その二重らせんは細胞にとって異物である認識され、分解され、その結果、タンパク質の産生量が減少したり、タンパク質が産生されなくなったりする。ＤＮＡはすでに二本鎖の分子であるが、アンチセンス技術を適用することにより、三本鎖を形成することができる。
【０３３２】
当業者であれば、本明細書で使用するとき、「相補的」または「その相補体」という用語は、相補的領域の全体にわたって別の特定のポリヌクレオチドとワトソン＆クリック塩基対を形成することができるポリヌクレオチドの配列を包含するために使用されることを理解できるであろう。この用語は、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する特定の条件セットではなく、それらの配列のみに基づいてポリヌクレオチド対に適用される。
【０３３３】
ＣＳＬＧの細胞及び／または組織レベルのアンチセンス調節は、少なくとも１つのアンチセンス化合物、例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ロック核酸（ＬＮＡ）、アプタマーなどで、細胞または組織を形質転換することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、分子は、化学的に修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス分子は、アンチセンスＤＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡ類似体である。
【０３３４】
ＲＮＡアンチセンス鎖には、触媒的なものであってもよいし、非触媒的なものであってもよい。触媒的なアンチセンス鎖（リボザイムとも呼ばれる）は、ＲＮＡ分子を特定の配列で切断する。非触媒的なＲＮＡアンチセンス鎖は、さらなるＲＮＡプロセシングを阻害する。
【０３３５】
ＣＳＬＧ遺伝子の細胞及び／または組織レベルのアンチセンス調節は、少なくとも１つのアンチセンス化合物、例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＶＩＧ、アプタマーなどで、生物の細胞または組織を形質転換することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、分子は、化学的に修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス分子は、アンチセンスＤＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡ類似体である。
【０３３６】
ＲＮＡｉとは、特定の遺伝子産物を標的とし、その遺伝子の転写後のサイレンシングをもたらすために、相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することを指す。この現象は、シノラブディス・エレガンスにおいて、「Guo and Kemphues (1995, Cell, 81(4):611-620)」によって最初に報告され、その後、「Fire et al. (1998, Nature 391:806-811)」によって、インビトロＲＮＡｐｒｅｐに存在するセンス鎖とアンチセンス鎖とがアニーリングして形成されたｄｓＲＮＡの存在が、干渉活性が生じる原因であることが発見された。
【０３３７】
植物と動物の両方において、ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られている。この短鎖ヌクレオチドＲＮＡの配列は、抑制される標的遺伝子と相同である。このように、短鎖ヌクレオチド配列は、多成分ヌクレアーゼであるＲＩＳＣに特定のｍＲＮＡの破壊を指示するガイド配列として機能しているように思われる。
【０３３８】
ＲＮＡｉを開始するために使用されるｄｓＲＮＡは、天然ソースから単離してもよいし、または、ＤＮＡから転写するなどの既知の手段を用いて生成してもよい。標的配列に対するＲＮＡｉ分子を生成するためのプラスミド及びベクターは、以下に例示するように、現在、容易に入手可能である。
【０３３９】
ｄｓＲＮＡは、２つの別個の鎖としてベクターから転写することができる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡを生成するために使用されるＤＮＡの２つの鎖は、それぞれが少なくとも部分的に相補的な配列のＤＮＡ鎖と形成する、同一のまたは２つの異なる二重鎖に属し得る。このようにしてｄｓＲＮＡが生成されると、転写されるＤＮＡ配列は２つのプロモータに挟まれ、一方のプロモータは一方の鎖の転写を制御し、他方のプロモータは相補的な他方の鎖の転写を制御する。これらの２つのプロモータは、互いに同一であってもようし、互いに異なっていてもよい。あるいは、単一のプロモータが、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを有する一本鎖のヘアピンポリヌクレオチドの転写を誘導し、それらをアニールして２本鎖ＲＮＡを生成することもできる。
【０３４０】
阻害は、ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝的抑制の標的とされる点で、配列特異的である。標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子が、阻害のために好ましい。また、標的配列に相対する挿入、欠失、及び単一点突然変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが分かっている。したがって、配列相同性は、当分野で既知の配列比較及びアラインメントアルゴリズムによって最適化することができる（「Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991」を参照）。そして、例えば、デフォルトパラメータを用いて、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、「University of Wisconsin Genetic Computing Group」）によって、ヌクレオチド配列間の差異のパーセントを計算することができる。阻害ＲＮＡと標的遺伝子の部分とは、９０％以上の配列相同性、またはさらには、１００％の配列相同性があることが好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義してもよい。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基であり得る。使用することができるｄｓＲＮＡの長さに上限はない。例えば、ｄｓＲＮＡの長さは、遺伝子の約２１塩基対（ｂｐ）から遺伝子の全長またはそれ以上までの範囲をとることができる。
【０３４１】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、低分子二本鎖ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現のサイレンシングまたは低減を意味する。これは、動物や植物における、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスであり、その二重鎖領域における、サイレンシングされた遺伝子の配列と相同な阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）によって開始される。この遺伝子は、生物に対して内在性であっても外因性であってもよく、染色体に組み込まれていてもよく、または、ゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能の全体または一部を阻害すると考えられる。
【０３４２】
当業者であれば、ＲＮＡｉ分子という用語が、センス配列とアンチセンス配列との両方を含む一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子を指すことを理解できるであろう。例えば、ＲＮＡ干渉分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってよく、アンチセンス領域は、標的核酸分子に対する相補性を有する。あるいは、ＲＮＡｉ分子は、自己相補的なセンス領域と、標的核酸分子に対する相補性を有するアンチセンス領域とを有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであってよい。または、ＲＮＡｉ分子は、２以上のループ構造、並びに、自己相補的なセンス領域と、標的核酸分子に対する相補性を有するアンチセンス領域とを含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。この環状一本鎖ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理することにより、ＲＮＡｉを媒介可能な活性分子を生成することができる。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用してＣＳＬＧ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることにより、植物またはその細胞またはその一部において、そのレベルを低減させることができる。植物と動物の両方において、ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られている。この短鎖ヌクレオチドＲＮＡの配列は、抑制される標的遺伝子と相同である。このように、短鎖ヌクレオチド配列は、多成分ヌクレアーゼであるＲＩＳＣに特定のｍＲＮＡの破壊を指示するガイド配列として機能しているように思われる。
【０３４４】
ＲＮＡｉを開始するために使用されるｄｓＲＮＡは、天然ソースから単離してもよいし、または、ＤＮＡから転写するなどの既知の手段を用いて生成してもよい。標的配列に対するＲＮＡｉ分子を生成するためのプラスミド及びベクターは、以下に例示するように、現在、容易に入手可能である。
【０３４５】
いくつかの例示的な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＣＳＬＧを標的とする。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用してＣＳＬＧ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることにより、植物またはその細胞またはその一部において、そのレベルを低減させることができる。植物と動物の両方において、ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られている。この短鎖ヌクレオチドＲＮＡの配列は、抑制される標的遺伝子と相同である。このように、短鎖ヌクレオチド配列は、多成分ヌクレアーゼであるＲＩＳＣに特定のｍＲＮＡの破壊を指示するガイド配列として機能しているように思われる。
【０３４７】
ＲＮＡｉを開始するために使用されるｄｓＲＮＡは、天然ソースから単離してもよいし、または、ＤＮＡから転写するなどの既知の手段を用いて生成してもよい。標的配列に対するＲＮＡｉ分子を生成するためのプラスミド及びベクターは、以下に例示するように、現在、容易に入手可能である。
【０３４８】
ｄｓＲＮＡは、２つの別個の鎖としてベクターから転写することができる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡを生成するために使用されるＤＮＡの２つの鎖は、それぞれが少なくとも部分的に相補的な配列のＤＮＡ鎖と形成する、同一のまたは２つの異なる二重鎖に属し得る。このようにしてｄｓＲＮＡが生成されると、転写されるＤＮＡ配列は２つのプロモータに挟まれ、一方のプロモータは一方の鎖の転写を制御し、他方のプロモータは相補的な他方の鎖の転写を制御する。これらの２つのプロモータは、互いに同一であってもようし、互いに異なっていてもよい。あるいは、単一のプロモータが、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを有する一本鎖のヘアピンポリヌクレオチドの転写を誘導し、それらをアニールして２本鎖ＲＮＡを生成することもできる。
【０３４９】
阻害は、ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝的抑制の標的とされる点で、配列特異的である。標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子が、阻害のために好ましい。また、標的配列に相対する挿入、欠失、及び単一点突然変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが分かっている。したがって、配列相同性は、当分野で既知の配列比較及びアラインメントアルゴリズムによって最適化することができる（「Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991」を参照）。そして、例えば、デフォルトパラメータを用いて、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、「University of Wisconsin Genetic Computing Group」）によって、ヌクレオチド配列間の差異のパーセントを計算することができる。阻害ＲＮＡと標的遺伝子の部分とは、９０％以上の配列相同性、またはさらには、１００％の配列相同性があることが好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義してもよい。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基であり得る。使用することができるｄｓＲＮＡの長さに上限はない。例えば、ｄｓＲＮＡの長さは、遺伝子の約２１塩基対（ｂｐ）から遺伝子の全長またはそれ以上までの範囲をとることができる。
【０３５０】
ＣＳＬＧの発現をダウンレギュレートすることができる別の薬剤は、共抑制分子である。共抑制（co-suppression）とは、転写後のメカニズムであり、導入遺伝子と内在性遺伝子との両方がサイレンシングされることである。
【０３５１】
ＣＳＬＧの発現をダウンレギュレートすることができる別の薬剤は、ＣＳＬＧのｍＲＮＡ転写産物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡ酵素分子である。ＤＮＡ酵素は、一本鎖と二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである。ＤＮＡ酵素の一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡ酵素は、１５個のデオキシリボヌクレオチドを含む触媒ドメインを有し、その両側に、それぞれ７〜９個のデオキシリボヌクレオチドを含む２つの基質認識ドメインが隣接している。このタイプのＤＮＡ酵素は、基質であるＲＮＡをプリン：ピリミジン結合部で効果的に切断することができる（ＤＮＡ酵素についてのレビューは、「Khachigian, L. M. (2002) Curr Opin Mol Ther 4, 119-121」を参照されたい）。
【０３５２】
一本鎖及び二本鎖の標的切断部位を認識する、操作された人工ＤＮＡ酵素の構築及び増幅の例は、特許文献２２に開示されている。
【０３５３】
「酵素核酸分子」または「酵素オリゴヌクレオチド」という用語は、基質結合領域において、特定の遺伝子標的に対して相補性を有し、かつ、ＣＳＬＧの標的ＲＮＡを特異的に切断して遺伝子をサイレンシングする酵素活性を有する核酸分子を指す。相補性領域は、酵素核酸分子の標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーション及びその後の切断を可能にする。酵素核酸という用語は、例えば、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素と互換的に使用される。本願に記載される特定の酵素核酸分子は、それに限定されるものではなく、本明細書に開示される酵素核酸分子は、１以上の標的核酸領域に相補的な特定の基質結合部位を必要とし、その基質結合部位内またはその周囲に、分子に対して核酸切断及び／または連結活性を付与するヌクレオチド配列を有する。特許文献２３には、そのような分子の例が開示されている。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子またはそれを標的とするサイレンシング分子は、その遺伝子またはそのサイレンシング分子の発現に必要なすべての要素を含む発現ベクターの一部を形成する。いくつかの実施形態では、発現は、構成的プロモータによって制御される。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、植物組織に特異的である。これらの実施形態では、組織特異的プロモータは、根特異的プロモータ、塊茎特異的プロモータ、葉特異的プロモータ、及び果実特異的プロモータからなる群から選択される。根特異的プロモータは、例えば、「Martinez, E. et al. 2003. Curr. Biol. 13:1435-1441」に記載されている。果実特異的プロモータは、とりわけ、「Estornell L.H et al. 2009」、「Plant Biotechnol. J. 7:298-309」、及び「Fernandez A. I. Et al. 2009 Plant Physiol. 151:1729-1740」に記載されている。塊茎特異的プロモータは、例えば、「Rocha-Sosa M, et al., 1989. EMBO J. 8:23-29」及び「McKibbin R.S. et al., 2006. Plant Biotechnol J. 4(4):409-18」に記載されている。葉特異的なプロモータは、例えば、「Yutao Yang, Guodong Yang, Shijuan Liu, Xingqi Guo and Chengchao Zheng. Science in China Series C: Life Sciences. 46: 651-660」に記載されている。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、３´非コード配列に制御要素をさらに含む。本明細書で使用するとき、「３´非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、または、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与える制御シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３´末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を与える。異なる３´非コード配列の使用は、「Ingelbrecht I L et al. 1989. Plant Cell 1:671-680」によって例示されている。
【０３５６】
当業者であれば、本明細書に記載された核酸配列及び形質転換ベクターの様々な構成要素が、核酸または核酸断片の発現をもたらすように、作動可能に連結されることを理解できるであろう。本明細書に開示される構築物及びベクターの構成要素を作動可能に連結するための技術は、当業者によく知られている。そのような技術としては、例えば、１以上の制限酵素部位を含む合成リンカーなどのリンカーの使用が挙げられる。
【０３５７】
変異ＣＳＬＧ遺伝子、遺伝子を標的とするサイレンシング分子の存在、及び／または遺伝子の過剰発現の検出は、当業者に既知の分子遺伝学の標準的な方法を用いて行われる。
【０３５８】
遺伝子またはサイレンシング分子の発現を測定するためには、核酸が発現する器官からｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを取得する必要がある。その試料は、検出プロセスの前に、さらに処理してもよい。例えば、細胞または組織の試料中のポリヌクレオチドを、試料の他の構成要素から分離してもよいし、または、増幅してもよい。或る生物から取得したすべての試料は、任意の種類のさらなる処理に供したものも含めて、その生物から取得したものと見なされる。
【０３５９】
遺伝子やサイレンシング分子の検出には、通常、候補となる改変された生物から取得したポリヌクレオチドの増幅を必要とする。ＤＮＡを増幅する方法は、当業者に知られている。ＤＮＡを増幅する方法は、当業者に知られている。最も一般的に使用されるＤＮＡ増幅方法は、ＰＣＲ法である（ポリメラーゼ連鎖反応；例えば、「PCR Basics: from background to Bench, Springer Verlag, 2000; Eckert et al., 1991. PCR Methods and Applications 1:17」を参照）。別の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅及び自己持続型配列複製、及び核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子またはそのサイレンシング分子を含む核酸配列は、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与し、これらの実施形態では、トランスジェニック細胞または植物は、抗生物質または除草剤に対する耐性にしたがって選択される。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、内在性ＣＳＬＧ遺伝子が選択的に過剰発現され、改変された含有量は、対応する非組換え植物と比較した、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量の増加を含む。
【０３６２】
ＣＳＬＧ遺伝子の過剰発現は、当業者に知られているような任意の方法によって生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、過剰発現され、少なくともＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの転写可能なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を含有する遺伝子組換え植物またはその一部であり、遺伝子組換え植物またはその一部は、対応する非遺伝子組換え植物と比較して、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、植物細胞内でのそれらの発現を可能にするＤＮＡ構築物に組み込まれる。植物での使用に適したＤＮＡ構築物は、当業者に知られている。一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プロモータ、エンハンサー、複製起点、転写終結配列、ポリアデニル化シグナルなどからなる群から選択される少なくとも１つの発現調節要素を含む。
【０３６４】
本明細書に開示されるＤＮＡ構築物は、達成すべき結果に応じて設計される。
【０３６５】
作物植物では、その食用部分（これに限定しないが、例えば、果実、種子、根、葉、塊茎など）において、有毒なステロイド系アルカロイドまたはステロイド系グリコアルカロイド、またはそれらの誘導体、代謝物、生合成中間体の含有量を減少させることが望まれている。一方、植物の非食用部分（これに限定しないが、例えば、非食用の根や葉）において、有毒なステロイド系グリコアルカロイドまたはその生合成中間体の含有量を豊富にすることは、広範囲の病原体に対する植物の抵抗性に寄与する。例示的な実施形態では、ステロイド系グリコアルカロイドを過剰に発現させた植物は、製薬産業においてそれらを産生するために使用することができる。
【０３６６】
作物植物では、ステロイド系サポニンの調節も望まれている。当業者であれば、いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンを調節することにより、ある化合物から、これに限定しないが、例えば、食品、化粧品、医薬品業界向けの、高価値の製品を作り出すことができることを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの調節により、病原体に対する植物の保護、これに限定しないが、例えば、細菌、昆虫、ウイルスに対する保護に役立つ化合物が植物中に産生される。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの調節は、植物から抗栄養化合物を除去することである。
【０３６７】
作物植物では、食用部分（これに限定しないが、例えば、果実や種子など）において、毒性、苦味、ホルモン模倣トリテルペノイド系サポニンやその生合成中間体を低減させることが望まれている。一方、甘味のあるトリテルペノイド系サポニンまたはその生合成中間体の含有量を豊富にすることは有益であり、このことは、天然甘味料の産生に利用することができる。ＱＳ−２１などのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させた植物は、製薬業界向けのアジュバントの産生に利用することができる。
【０３６８】
さらに別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、少なくともＣＳＬＧ遺伝子の発現が増強された遺伝子組換え植物または遺伝子編集植物であり、その遺伝子組換え植物または遺伝子編集植物は、対応する非組換え植物または非編集植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、少なくとも１つのステロイド系サポニン、または少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの量が増加する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、少なくともＣＳＬＧ遺伝子の発現が減少した遺伝子組換え植物または遺伝子編集植物であり、その遺伝子組換え植物または遺伝子編集植物は、対応する非組換え植物または非編集植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの量が減少し、かつ、少なくとも１つのステロイド系サポニンの量が減少し、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの量が減少する。
【０３６９】
本明細書及び後述の実施例では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、及び／またはトリテルペノイド系サポニンの生合成経路に関与する酵素または他のタンパク質をコードする少なくとも１つの異種遺伝子（これに限定しないが、例えば、異種ＣＳＬＧ）を提供するか、または、トリテルペノイド合成経路の内在性遺伝子（これに限定しないが、例えば、ＣＳＬＧ遺伝子）を改変して、コードされている酵素の発現、活性または安定性を改変することによって、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体のレベル（含有量）を改変することができる。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、植物細胞において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、藻類細胞において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、酵母において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、昆虫細胞において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、細菌において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、植物において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。いくつかの実施形態では、植物の一部において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量が改変される。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０３７３】
例えば、いくつかの実施形態では、以下の実施例で例示するように、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、またはそれらの任意の組み合わせの発現量を増加させた遺伝子組換え細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）を含む遺伝子組換え植物またはその一部が使用される。他の実施形態では、実施例に示すように、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１の発現を低減させるかまたはサイレンシングすると、対応するトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体のレベルが低下することが示されている。
【０３７４】
ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、及びその生合成中間体
【０３７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、インビトロ生合成系は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が減少する。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物またはその一部においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されている少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を減少させる方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されているような少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を増加させる方法である。
【０３７７】
ステロイド系アルカロイドの生合成経路において、ステロイド系アルカロイドは、フロスタノール型サポニンアグリコンの形成後、ステロイド系サポニンから分岐する（図１）。酸化、転移、環形成などを少なくとも部分的に伴うさらなる段階を経て、ステロイド系アルカロイドが生合成される（図１）。
【０３７８】
ステロイド系グリコアルカロイドの例としては、これに限定しないが、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−シャオニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、細菌を含む。
【０３８０】
いくつかの例示的な実施形態では、下流のステロイド系グリコアルカロイドは、エスクレオシド及びデヒドロエスクレオシドからなる群から選択される。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−トマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、トマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、デヒドロトマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−カコニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソラニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソラソニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソルマルギンの含有量が増加する。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−トマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、トマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、デヒドロトマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−カコニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソラニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソラソニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−ソルマルギンの含有量が減少する。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つステロイド系アルカロイドの含有量が増加し、かつ、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が減少する。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、デヒドロトマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−カコニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラソニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソルマルギンを産生することを含む。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、植物細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、酵母細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、藻類細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、昆虫細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生する方法は、細菌において少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物またはその一部を含む。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、デヒドロトマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−カコニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラソニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソルマルギンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、コレステロールを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、２２−ヒドロキシコレステロールを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、２２、２６−ジヒドロキシコレステロールを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、フロスタノール型サポニンアグリコンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、フロスタノール−２６−アルデヒドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、２６−アミノフロスタノールを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチデノールを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチジンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチジンガラクトシドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、γ−トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、β−１−トマチンを産生することを含む。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチン、デヒドロトマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、トマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、デヒドロトマチンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−カコニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソラソニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系アルカロイドを産生する方法は、α−ソルマルギンを産生することを含む。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−トマチン、デヒドロトマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−トマチンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、トマチンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、デヒドロトマチンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−カコニンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−ソラニンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−ソラソニンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、α−ソルマルギンの含有量を減少させることを含む。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−トマチン、デヒドロトマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−トマチンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、トマチンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、デヒドロトマチンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−カコニンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−ソラニンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−ソラソニンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、α−ソルマルギンの含有量を増加させることを含む。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドと、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体との両方の含有量が改変される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドと、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体との両方の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドと、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体との両方の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が減少し、かつ、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量を測定可能に改変することなく、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が改変される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を測定可能に改変することなく、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が改変される。
【０３９１】
「中間体」という用語は、いくつかの実施形態では、「生合成中間体」という用語と互換的に使用することができ、すべて同一の性質及び意味を有する。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む（図１参照）。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、コレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、フロストナル−２６−アルデヒドを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、２６−アミノフロスタノールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、トマチデノールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、トマチジンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、トマチジンガラクトシドを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、γ−トマチンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、β−１−トマチンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、コレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、フロスタノール−２６−アルデヒドを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、２６−アミノフロスタノールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、トマチデノールを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、トマチジンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、トマチジンガラクトシドを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、γ−トマチンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、β−１−トマチンを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともコレステロールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくとも２２−ヒドロキシコレステロールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくとも２２，２６−ジヒドロキシコレステロールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともフロスタノール型サポニンアグリコンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともフロストナル−２６−アルデヒドの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくとも２６−アミノフロスタノールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともトマチデノールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、トマチジンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともトマチジンガラクトシドの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともγ−トマチンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少させる方法は、少なくともβ−１−トマインの含有量を減少させることを含む。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくとも２２−ヒドロキシコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくとも２２，２６−ジヒドロキシコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともフロスタノール型サポニンアグリコンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともフロストナル−２６−アルデヒドの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくとも２６−アミノフロスタノールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともトマチデノールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、トマチジンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともトマチジンガラクトシドの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともγ−トマチンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を増加させる方法は、少なくともβ−１−トマインの含有量を増加させることを含む。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０３９９】
予期せぬことに、本開示は、酵素（例えば、ステロイド系アルカロイド生合成経路の酵素）をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように細胞または植物を遺伝的に改変することによって、細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞）、細菌、または植物において、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、または生合成中間体の含有量を増加させることができることが分かった。他の実施形態では、本明細書に記載及び例示されているのは、植物細胞内の少なくとも１つの内在性遺伝子（これに限定しないが、例えば、ＣＳＬＧ遺伝子）を遺伝子的に改変して、その発現、活性、安定性、またはそれらの任意の組み合わせを調節する方法である。以下の実施例は、ステロイド系アルカロイド生合成経路の一部であることがこれまで知られていなかった酵素活性及び酵素を開示する。この知見がなければ、ステロイド系アルカロイド化合物の産生は不可能であった。
【０４００】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド代謝経路は、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞、あるいは、植物またはその一部においてこれらの化合物の含有量が増加した植物を生産することができる。いくつかの実施形態では、有用なステロイド系アルカロイドの含有量が増加した植物、これに限定しないが、例えば、作物植物が生産される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞（これに限定しないが、例えば、植物細胞、酵母、または藻類細胞）または植物（これに限定しないが、作物植物）または植物の一部を生産するための手段及び方法である。代替的または追加的に、本明細書に開示される遺伝子の発現を制御することは、例えば製薬産業においてさらに使用する所望のステロイド系アルカロイドの生産のために、あるいは、食品または他の栄養補助食品（これに限定しないが、例えば、甘味料など）の生産のために使用することができる。いくつかの実施形態では、これらの高価値アルカロイドは、精製され、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。本明細書に開示される細胞及び植物は、栄養学的、薬学的、及び商業的に重要な価値を有する化合物を含有する。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドの誘導体は、ステロイド系アルカロイドのグリコシル化誘導体を含む。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、対応する非組換え細胞と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。いくつかの実施形態では、含有量の改変は、含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも２つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも３つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも４つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも５つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも６つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも１つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも２つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも３つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも４つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも５つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも６つの誘導体の含有量が増加する。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも１つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも２つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも３つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも４つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドのまたはステロイド系アルカロイドの少なくとも５つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドのまたはステロイド系アルカロイドの少なくとも６つの代謝産物の含有量が増加する。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも１つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも３つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも４つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも５つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの少なくとも６つの生合成中間体の含有量が増加する。
【０４０７】
当業者であれば、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体に関する「含有量」及び「レベル」という用語は、対照細胞または対照植物と比較した、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物中の化合物の量、例えば、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量を包含することを認識できるであろう。この文脈では、「含有量」及び「レベル」という用語は、互換的に使用することができ、すべて同一の意味及び性質を有する。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系アルカロイドは、栄養剤、化粧品、医薬品、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるステロイド系アルカロイドを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系アルカロイドを含む。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系アルカロイドを含む。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が増加したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるステロイド系アルカロイドを含む。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、α−トマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、デヒドロトマチンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、α−カコニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、α−ソラニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、α−ソラソニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、α−ソルマルギンの含有量が増加する。当業者であれば、いくつかの実施形態では、１つのステロイド系アルカロイドの含有量が増加する場合には、追加のステロイド系アルカロイド、または中間体、またはそれらの組み合わせも同一の時間の細胞内で増加し得ることを理解できるであろう。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞）、または遺伝子組換え植物の一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加する。生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加する。生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、フロスタノール−２６−アルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、２６−アミノフロスタノールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、トマチデノールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイドアルキロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、トマチジンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、トマチジンガラクトシドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、γ−トマチンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、β−１−トマチンを含む。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において含有量が減少したステロイド系アルカロイドは、苦味を有する化合物または毒素を含む。いくつかの実施形態では、含有量が減少したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系アルカロイドを含む。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、含有量が減少したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系アルカロイドを含む。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が減少したステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるステロイド系アルカロイドを含む。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、α−トマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、デヒドロトマチンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、α−カコニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、α−ソラニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、α−ソラソニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、α−ソルマルギンの含有量が減少する。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少する。生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、フルソタノール型サポニンアグリコンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、フロスタノール−２６−アルデヒドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、２６−アミノフロスタノールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、トマチデノールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、トマチジンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、トマチジンガラクトシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、γ−トマチンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイドの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、β−１−トマチンを含む。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させ、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変することを含む。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させ、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることを含む。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変され、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４３４】
ステロイド系サポニン、その誘導体、代謝物、及びその生合成中間体
【０４３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、インビトロ生合成系は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、任意の組み合わせのうち、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が減少する。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞においてステロイド系サポニンを産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物またはその一部においてステロイド系サポニンを産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されている少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を減少させる方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されているような少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を増加させる方法である。
【０４３７】
ステロイド系サポニンは、フロスタノール型のサポニンアグリコンの形成後、ステロイド系アルカロイドから分岐する（図１）。
【０４３８】
一般的に使用されているサポニンの命名法では、トリテルペノイド系サポニン（トリテルペンサポニンとも呼ばれる）とステロイド系サポニンとを区別しているが、これは、そのアグリコンの構造と生化学的背景に基づいている。どちらのタイプのサポニンも、ステロール生合成の中心的な代謝産物である２，３−オキシドスカレンに由来すると考えられている。フィトステロール同化作用において、２，３−オキシドスカレンは、主にシクロアルテノールに環化される。「ステロイド系サポゲニン」は、シクロアルテノール形成の下流のフィトステロール経路の中間体に由来すると考えられている。
【０４３９】
ステロイド系サポニンの例としては、これに限定しないが、ウットロシドＢ、トマトリサイド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、細菌を含む。
【０４４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ウットロシドＢ、トマトリサイド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ウットロシドＢの含有量が増加する。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの誘導体は、ステロイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０４４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ウットロシドＢ、トマトリサイド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ウットロシドＢの含有量が減少する。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が増加し、かつ、ウットロシドＢ、トマトリサイド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が減少する。
【０４４５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢを産生することを含む。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、植物細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、酵母細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、藻類細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、昆虫細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生する方法は、細菌において少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物またはその一部を含む。
【０４４７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢ、トマトリサイド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢを産生することを含む。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてステロイド系サポニンを産生する方法は、ウットロシドＢを産生することを含む。
【０４４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ウットロシドＢの含有量を減少させることを含む。
【０４５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンは、ウットロシドＢを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンは、トマトシドを含む。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンと、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が改変される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンと、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンと、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が減少し、かつ、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニン中間体の含有量を測定可能に改変することなく、ステロイド系サポニンの含有量が改変される。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの含有量を測定可能に改変することなく、ステロイド系サポニン中間体の含有量が改変される。
【０４５２】
「中間体」という用語は、いくつかの実施形態では、「生合成中間体」という用語と互換的に使用することができ、すべて同一の性質及び意味を有する。
【０４５３】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、コレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、コレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともコレステロールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくとも２２−ヒドロキシコレステロールの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくとも２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともフロスタノール型サポニンアグリコンを減少させることを含む。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくとも２２−ヒドロキシコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくとも２２，２６−ジヒドロキシコレステロールの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともフロスタノール型サポニンアグリコンの含有量を増加させることを含む。
【０４５９】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンの生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４６０】
予期せぬことに、本開示は、酵素（例えば、ステロイド系サポニン生合成経路の酵素）をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように細胞または植物を遺伝的に改変することによって、細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞）、細菌、または植物において、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させることができることが分かった。他の実施形態では、本明細書に記載及び例示されているのは、植物細胞内の少なくとも１つの内在性遺伝子（これに限定しないが、例えば、ＣＳＬＧ遺伝子）を遺伝子的に改変して、その発現、活性、安定性、またはそれらの任意の組み合わせを調節する方法である。以下の実施例は、ステロイド系サポニン生合成経路の一部であることがこれまで知られていなかった酵素活性及び酵素を開示する。この知見がなければ、ステロイド系サポニン化合物の産生は不可能であった。
【０４６１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニン代謝経路は、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞、あるいは、植物またはその一部においてこれらの化合物の含有量が増加した植物を生産することができる。いくつかの実施形態では、有用なステロイド系サポニンの含有量が増加した植物、これに限定しないが、例えば、作物植物が生産される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞（これに限定しないが、例えば、植物細胞、酵母、または藻類細胞）または植物（これに限定しないが、作物植物）または植物の一部を生産するための手段及び方法である。代替的または追加的に、本明細書に開示される遺伝子の発現を制御することは、例えば製薬産業においてさらに使用するための所望のステロイド系サポニンの生産のために、あるいは、食品または他の栄養補助食品（これに限定しないが、例えば、甘味料など）の生産のために使用することができる。いくつかの実施形態では、これらの高価値サポニンは、精製され、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。本明細書に開示される細胞及び植物は、栄養学的、薬学的、及び商業的に重要な価値を有する化合物を含有する。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、対応する非組換え細胞と比較して、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。いくつかの実施形態では、含有量の改変は、含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加している。
【０４６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも２つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも３つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも４つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも５つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも６つのステロイド系サポニンの含有量が増加する。
【０４６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも１つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも２つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも３つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも４つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも５つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも６つの誘導体の含有量が増加する。
【０４６５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも１つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも２つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも３つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも４つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンのまたはステロイド系サポニンの少なくとも５つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンのまたはステロイド系サポニンの少なくとも６つの代謝産物の含有量が増加する。
【０４６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも１つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも３つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも４つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも５つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの少なくとも６つの生合成中間体の含有量が増加する。
【０４６７】
当業者であれば、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体に関する「含有量」及び「レベル」という用語は、対照細胞または対照植物と比較した、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物中の化合物の量、例えば、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量を包含することを認識できるであろう。この文脈では、「含有量」及び「レベル」という用語は、互換的に使用することができ、すべて同一の意味及び性質を有する。
【０４６８】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系サポニンは、栄養剤、化粧品、医薬品、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系サポニンを含む。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系サポニンを含む。
【０４７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。
【０４７１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ウットロシドＢの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トマトシドの含有量が増加する。
【０４７２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４７３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む。
【０４７４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において含有量が減少したステロイド系サポニンは、苦味を有する化合物または毒素を含む。いくつかの実施形態では、含有量が減少したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。いくつかの実施形態では、含有量が減少したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のステロイド系サポニンを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。
【０４７５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が増加したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。
【０４７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が減少したステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを含む。
【０４７７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ウットロシドＢの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トマトシドの含有量が減少する。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、２２−ヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、２２，２６−ジヒドロキシコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む。
【０４８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させ、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変することを含む。
【０４８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させ、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることを含む。
【０４９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０４９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０４９２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変され、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４９３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０４９４】
トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、及びその生合成中間体
【０４９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、インビトロ生合成系は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が減少する。
【０４９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせを産生することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されている少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を減少させる方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されているような少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量を増加させる方法である。
【０４９７】
一般的に使用されているサポニンの命名法では、トリテルペノイド系サポニン（トリテルペンサポニンとも呼ばれる）とトリテルペノイド系サポニンとを区別しているが、これは、そのアグリコンの構造と生化学的背景に基づいている。どちらのタイプのサポニンも、ステロール生合成の中心的な代謝産物である２，３−オキシドスカレンに由来すると考えられている。フィトステロール同化作用において、２，３−オキシドスカレンは、主にシクロアルテノールに環化される。「トリテルペノイド系サポニン」は２，３−オキシドスクアレンの代替環化によってフィトステロール経路から分岐し、「ステロイド系サポゲニン」は、シクロアルテノール形成の下流のフィトステロール経路の中間体に由来すると考えられている（図３Ａ参照）。
【０４９８】
サポニンは、ダンマラン型サポニン、チルカラン型サポニン、ルパン型サポニン、オレアナン型サポニン、タラキサスタン型サポニン、ウルサン型サポニン、ホパン型サポニン、ククルビタン型サポニン、シクロアルタン型サポニン、ラノスタン型サポニン、及びステロイド型サポニンからなる群から選択することができる。アグリコン骨格のサポゲニン類も同様に分類することができ、ダンマラン型サポニン、チルカラン型サポニン、ルパン型サポニン、オレアナン型サポニン、タラキサスタン型サポニン、ウルサン型サポニン、ホパン型サポニン、ククルビタン型サポニン、シクロアルタン型サポニン、ラノスタン型サポニン、及びステロイド型サポニンからなる群から選択することができる。
【０４９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される「トリテルペノイド系サポゲニン」は、ダンマラン型サポゲニン、チルカラン型サポゲニン、ルパン型サポゲニン、オレアナン型サポゲニン、ウルサン型サポゲニン、及びホパン型サポゲニンからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生されるトリテルペノイド系サポゲニンは、ダンマラン型サポゲニン、チルカラン型サポゲニン、ルパン型サポゲニン、オレアナン型サポゲニン、ウルサン型サポゲニン、またはホパン型サポゲニンである。
【０５００】
トリテルペノイド系サポゲニンは、一般的に、四環式または五環式の骨格を有する。いくつかの実施形態では、サポゲニン構築ブロックは、それ自体が複数の修飾を有していてもよく、そのようなものとしては、これに限定しないが、例えば、βアミリン、ルペオール、及びダンマレンジオールなどの前駆体サポゲニン骨格のヒドロキシル基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基などの小さな官能基などが挙げられる。
【０５０１】
「トリテルペン」と「トリテルペノイド」という用語は、互換的に使用することができ、同一の意味及び性質を有する。トリテルペノイド系サポニンは、複数の機能を有しており、これに限定しないが、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。
【０５０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトリテルペノイド系サポゲニンは、天然に存在するトリテルペノイド系サポゲニンと構造的に関連する、天然ではない新たなトリテルペノイド化合物も包含する。これらの天然ではない新たなトリテルペノイド系サポゲニンは、合成真核生物宿主細胞、例えば、植物細胞または酵母細胞の遺伝子操作後に得られる新規化合物であってもよい。
【０５０３】
トリテルペノイド系サポニン及びその生合成中間体の例を下記の表２に示す。
【０５０４】
【表２−１】
2022500023.tif 000005
【０５０５】
【表２−２】
2022500023.tif 000006
【０５０６】
【表２−３】
2022500023.tif 000007
【０５０７】
【表２−４】
2022500023.tif 000008
【０５０８】
【表２−５】
2022500023.tif 000009
【０５０９】
【表２−６】
2022500023.tif 000010
【０５１０】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの誘導体は、トリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０５１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０５１２】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、化合物７を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、化合物８を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、化合物９を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、化合物１０を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、化合物１１を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、グリチルリチン（化合物１４）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、バヨゲニン（化合物２５）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、セルジャン酸（化合物２６）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）を含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンは、ＱＳ−２１アジュバントを含む。
【０５１３】
トリテルペノイド系サポニンの含有量を改変することは、いくつかの実施形態では、これに限定しないが、例えば、甘味料であるグリチルリチン（化合物１４）を産生する能力において、商業的に有益であり得る。いくつかの実施形態では、味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニンを産生することは、商業的に有益である。他の実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの含有量を改変することは、これに限定しないが、例えば、植物のナデシコ目のキノア植物から産生されるキノアにおいて、苦味のあるトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少されるかまたは除去するのに有益であると考えられる。他の実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの含有量を改変することは、これに限定しないが、例えば、ホルモン模倣特性を有するトリテルペノイド系サポニンを減少されるかまたは除去するのに有益であり得る。
【０５１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物７の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物８の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物９の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物１０の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物１１の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量が増加する。
【０５１５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させた遺伝子組換え細胞は、細菌を含む。
【０５１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物７の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物８の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物９の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物１０の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物１１の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量が増加する。
【０５１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物７の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物８の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物９の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物１０の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、化合物１１の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量が減少する。
【０５１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加し、かつ、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が減少する。
【０５１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物７を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物８を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物９を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１０を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１１を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルリチン（化合物１４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン（化合物２５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸（化合物２６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ＱＳ−２１アジュバントを産生することを含む。
【０５２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、植物細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、酵母細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、藻類細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、昆虫細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、細菌において少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物またはその一部を含む。
【０５２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物７を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物８を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物９を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１０を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１１を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルリチン（化合物１４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン（化合物２５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸（化合物２６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ＱＳ−２１アジュバントを産生することを含む。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物７を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物８を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物９を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１０を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、化合物１１を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルリチン（化合物１４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン（化合物２５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸（化合物２６）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）を産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡを産生することを含む。いくつかの実施形態では、インビトロ翻訳系においてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ＱＳ−２１アジュバントを産生することを含む。
【０５２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物７の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物８の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物９の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物１０の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物１１の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量を減少させることを含む。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物７の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物８の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物９の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物１０の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物１１の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量を増加させることを含む。
【０５２５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンと、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が改変される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンと、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンと、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体との両方の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が減少し、かつ、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン中間体の含有量を測定可能に改変することなく、トリテルペノイド系サポニンの含有量が改変される。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの含有量を測定可能に改変することなく、トリテルペノイド系サポニン中間体の含有量が改変される。
【０５２６】
「中間体」という用語は、いくつかの実施形態では、「生合成中間体」という用語と互換的に使用することができ、すべて同一の性質及び意味を有する。
【０５２７】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０５２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、化合物１を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態はでは、遺伝子組換え細胞は、化合物２を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、メディカゲン酸（化合物５）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、オレアノール酸（化合物３）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、オレアノール酸−３ＧｌｃＡを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、アウグスチン酸（化合物４）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、グリチルレチン酸（化合物１３）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。
【０５２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、化合物１を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態はでは、遺伝子組換え細胞は、化合物２を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、メディカゲン酸（化合物５）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、オレアノール酸（化合物３）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、オレアノール酸−３ＧｌｃＡを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、アウグスチン酸（化合物４）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡを含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、グリチルレチン酸（化合物１３）を含む少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。
【０５３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、かつ、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０５３１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくとも化合物１を減少させることを含む。いくつかの実施形態はでは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくとも化合物２を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともメディカゲン酸（化合物５）を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともオレアノール酸（化合物３）を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともオレアノール酸−３ＧｌｃＡを減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともアウグスチン酸（化合物４）を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともアウグスチン酸−３ＧｌｃＡを減少させることを含む。いくつかの実施形態はでは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を減少させる方法は、少なくともグリチルレチン酸（化合物１３）を減少させることを含む。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくとも化合物１を増加させることを含む。いくつかの実施形態はでは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくとも化合物２を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともメディカゲン酸（化合物５）を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともオレアノール酸（化合物３）を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともオレアノール酸−３ＧｌｃＡを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともアウグスチン酸（化合物４）を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともアウグスチン酸−３ＧｌｃＡを増加させることを含む。いくつかの実施形態はでは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、少なくともグリチルレチン酸（化合物１３）を増加させることを含む。
【０５３３】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０５３４】
予期せぬことに、本開示は、酵素（例えばトリテルペノイド系サポニン生合成経路の酵素）をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現するように細胞または植物を遺伝的に改変することによって、細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞）、細菌、または植物において、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させることができることが分かった。他の実施形態では、本明細書に記載及び例示されているのは、植物細胞内の少なくとも１つの内在性遺伝子（これに限定しないが、例えば、ＣＳＬＧ遺伝子）を遺伝子的に改変して、その発現、活性、安定性、またはそれらの任意の組み合わせを調節する方法である。以下の実施例では、トリテルペノイド系サポニン生合成経路の一部であることがこれまで知られていなかった酵素活性及び酵素を開示する。この知見がなければ、トリテルペノイド系サポニン化合物の産生は不可能であった。
【０５３５】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン代謝経路は、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞、あるいは、植物またはその一部においてこれらの化合物の含有量が増加した植物を生産することができる。いくつかの実施形態では、有用なトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加した植物、これに限定しないが、例えば、作物植物が生産される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加した細胞（これに限定しないが、例えば、植物細胞、酵母、または藻類細胞）または植物（これに限定しないが、作物植物）または植物の一部を生産するための手段及び方法である。代替的または追加的に、本明細書に開示される遺伝子の発現を制御することは、例えば製薬産業においてさらに使用するための所望のトリテルペノイド系サポニンの生産のために、あるいは、食品または他の栄養補助食品（これに限定しないが、例えば、甘味料など）の生産のために使用することができる。いくつかの実施形態では、これらの高価値サポニンは、精製され、例えば、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。本明細書に開示される細胞及び植物は、栄養学的、薬学的、及び商業的に重要な価値を有する化合物を含有する。
【０５３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、対応する非組換え細胞と比較して、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。いくつかの実施形態では、含有量の改変は、含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、その生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの含有量が増加している。
【０５３７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも２つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも３つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも４つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも５つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも６つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する。
【０５３８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも１つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも２つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも３つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも４つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも５つの誘導体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも６つの誘導体の含有量が増加する。
【０５３９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも１つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも２つの代謝物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも３つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも４つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンのまたはトリテルペノイド系サポニンの少なくとも５つの代謝産物の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンのまたはトリテルペノイド系サポニンの少なくとも６つの代謝産物の含有量が増加する。
【０５４０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも１つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも３つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも４つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも５つの生合成中間体の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞、あるいは、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも６つの生合成中間体の含有量が増加する。
【０５４１】
当業者であれば、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体に関する「含有量」及び「レベル」という用語は、対照細胞または対照植物と比較した、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物中の化合物の量、例えば、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の量を包含することを認識できるであろう。この文脈では、「含有量」及び「レベル」という用語は、互換的に使用することができ、すべて同一の意味及び性質を有する。
【０５４２】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したトリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗発癌剤、コレステロール低下剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、摂食阻害剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを含む。いくつかの実施形態では、含有量が増加したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５４３】
いくつかの実施形態では、含有量が増加したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５４４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が増加したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５４５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、化合物７の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、化合物８の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、化合物９の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、化合物１０の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、化合物１１の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、グリチルリチン（化合物１４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、バヨゲニン（化合物２５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、セルジャン酸（化合物２６）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量が増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、ＱＳ−２１アジュバントの含有量が増加する。当業者であれば、いくつかの実施形態では、１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加する場合には、追加のトリテルペノイド系サポニン、または中間体、またはそれらの組み合わせも同一の時間の細胞内で増加し得ることを理解できるであろう。
【０５４６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞）、または遺伝子組換え植物の一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加する。生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部は、トリテルペノイド系サポニンの少なくとも２つの生合成中間体の含有量が増加する。生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０５４７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、化合物１を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、化合物２を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、メディカゲン酸（化合物５）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、オレアノール酸（化合物３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、オレアノール酸−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、アウグスチン酸（化合物４）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞（例えば、植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、細菌）、あるいは、遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が増加し、生合成中間体は、グリチルレチン酸（化合物１３）を含む。
【０５４８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む植物またはその一部において含有量が減少したトリテルペノイド系サポニンは、苦味を有する化合物または毒素を含む。いくつかの実施形態では、含有量が減少したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを含む。いくつかの実施形態では、含有量が減少したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５４９】
いくつかの実施形態では、含有量が減少したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において含有量が減少したトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０５５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、化合物７の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、化合物８の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、化合物９の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、化合物１０の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、化合物１１の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、グリチルリチン（化合物１４）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、バヨゲニン（化合物２５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、セルジャン酸（化合物２６）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）の含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡの含有量が減少する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、ＱＳ−２１アジュバントの含有量が減少する。当業者であれば、いくつかの実施形態では、１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が減少する場合には、追加のトリテルペノイド系サポニン、または中間体、またはそれらの組み合わせも同一の時間の細胞内で減少し得ることを理解できるであろう。
【０５５２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも２つのトリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少する。生合成中間体は、化合物１、化合物２、メディカゲン酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、アウグスチン酸（化合物４）、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡ、グリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０５５３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、化合物１を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、化合物２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、メディカゲン酸（化合物５）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、オレアノール酸（化合物３）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、オレアノール酸−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、アウグスチン酸（化合物４）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、アウグスチン酸−３ＧｌｃＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子組換え植物細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部において、トリテルペノイド系サポニンの生合成中間体の含有量が減少し、生合成中間体は、グリチルレチン酸（化合物１３）を含む。
【０５５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０５５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０５５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０５６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０５６２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることを含む。
【０５６３】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、未組換え細胞または未組換え植物と比較して、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させ、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることを含む。
【０５６４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５６５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０５６６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５６７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペ系ノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物またはその一部の少なくとも１つの細胞を遺伝子組換えすることを含み、遺伝子組換えされた植物細胞は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少する。
【０５６８】
植物、植物の一部、及び細胞
【０５６９】
いくつかの実施形態では、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む本明細書に記載の細胞または生物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、それぞれ対応する非組換え細胞または非トランスジェニック植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド経路、ステロイド系サポニン経路、またはトリテルペノイド合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子組換えされた内在性遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド合成経路、ステロイド系サポニン合成経路、またはトリテルペノイド合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド合成経路、ステロイド系サポニン合成経路、またはトリテルペノイド合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子組換えされた内在性遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、減少している。全体を通して記載されているように、当業者は、内在性遺伝子の組換えは、これに限定しないが、本明細書に詳細に記載されているように、遺伝子の発現を増加させること、遺伝子の発現を減少させること、遺伝子を突然変異させること、またはそれらの組み合わせを含むことを理解できるであろう。
【０５７０】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子を含む、本明細書に記載の細胞または生物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、それぞれ対応する非組換え細胞または非組換え植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド合成経路、ステロイド系サポニン合成経路、またはトリテルペノイド合成経路のＣＳＬＧ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子組換えされた内在性ＣＳＬＧ遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド合成経路、ステロイド系サポニン合成経路、またはトリテルペノイド合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、増加している。他の実施形態では、ステロイド系アルカロイド合成経路、ステロイド系サポニン合成経路、またはトリテルペノイド合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子組換えされた内在性ＣＳＬＧ遺伝子を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの遺伝子組換え細胞を含む遺伝子組換え植物またはその一部は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して、減少している。
【０５７１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０５７２】
いくつかの実施形態では、例えば、少なくともサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素を通常は発現しない、及び／または、特定のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、特定のステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、特定のトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を通常は産生しない細胞、植物種、またはその一部は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、あるいは、それらの任意の組み合わせを発現するように遺伝子組み換えされる。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素を通常は発現しない、及び／または、特定のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、特定のステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、特定のトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を通常は産生しない細胞、植物種、または植物の一部は、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、それらの任意の組み合わせを産生するように遺伝子組み換えされる。他の実施形態では、所与の量のサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせを通常発現する細胞、植物種、または植物の一部は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、あるいは、それらの任意の組み合わせを過剰発現するように遺伝子組み換えされる。他の実施形態では、所与の量のサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせを通常発現する細胞、植物種、または植物の一部は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、あるいは、それらの組み合わせの発現を低下または抑制するように遺伝子組み換えされる。
【０５７３】
他の実施形態では、所与の量のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を通常産生する細胞、植物種、または植物の一部は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、あるいは、それらの組み合わせを過剰発現するように遺伝子組み換えされることにより、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、またはそれらの任意の組み合わせの産生量が増加する。
【０５７４】
他の実施形態では、所与の量のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を通常産生する細胞、植物種、または植物の一部は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの任意の組み合わせの発現を低下または抑制するように遺伝子組み換えされることにより、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、それらの任意の組み合わせの産生量が低減する。
【０５７５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物の種子が本明細書に開示され、その種子から生育した植物は、対応する非組換え植物の種子から生育した植物と比較して、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素を発現し、それにより、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の発現または過剰発現を含む、及び／または、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加する。
【０５７６】
本明細書に開示される細胞は、これに限定しないが、例えば、酵母、藻類、昆虫、細菌、及び植物細胞などの多数の品種を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、細菌を含む。
【０５７７】
一般に、ほとんどの酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び細菌は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを本質的には合成しない。いくつかの実施形態では、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌においてステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌の遺伝子組換えは、トリテルペノイド系サポニン生合成経路の前駆体、基質、またはそれらの組み合わせを産生するために必要な酵素の導入を含む。例えば、出芽酵母を遺伝子組み換えすることにより、トリテルペノイド系サポニン生合成経路の基質に必要な前駆体を産生するために、異種ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩを発現させた下記の実施例１４を参照されたい。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド生合成経路、ステロイド系サポニン生合成経路、またはトリテルペノイド生合成経路の前駆体、基質、またはそれらの組み合わせを産生するために、少なくとも１つの異種遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、ステロイド系アルカロイド生合成経路、ステロイド系サポニン生合成経路、またはトリテルペノイド生合成経路の前駆体、基質、またはそれらの組み合わせを産生するために、少なくとも１つの異種遺伝子を発現し、ステロイド系アルカロイド生合成経路、ステロイド系サポニン生合成経路、またはトリテルペノイド生合成経路の酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる。
【０５７８】
いくつかの実施形態では、細胞は、微生物を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス目のものである。いくつかの実施形態では、酵母はサッカロミセス目のものであり、かつ、サッカロミセス属（例えば、出芽酵母）、シゾサッカロミセス属、ピチア属（例えば、ピチア酵母）、ハンセヌラ属（例えば、Hansenula polymorpha）、ヤロウイア属（例えば、Yarrowia lipollytica）、クリベロマイセス属（例えば、クリベロマイセス・ラクチス）、及びカンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス、トルラ酵母）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される。いくつかの実施形態では、酵母は、出芽酵母またはカンジダ・アルビカンスから選択される。
【０５７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、遺伝子組換え酵母を利用することができる。
【０５８０】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、藻類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、これらに限定しないが、例えば緑藻植物（緑藻類）、紅藻植物（紅藻類）、または褐藻植物（褐藻類）などの様々な藻類のいずれかである。いくつかの実施形態では、緑藻植物は、クラミドモナス目またはクロレラ目のものである。いくつかの実施形態では、緑藻植物は、クラミドモナス目のものであり、クラミドモナス属（例えば、コナミドリムシ）及びドナリエラ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、緑藻植物は、クロレラ目に属し、クロレラ属から選択される。
【０５８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、遺伝子組換え藻類を利用することができる。
【０５８２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え細胞は、細菌細胞である。一実施形態では、細菌細胞は、大腸菌細胞である。別の実施形態では、細胞は、Acremonium rutilum、ニホンコウジカビ、Yarrowia lipolytica、Bacillus sp．JPJ、Brevundimonas sp．SGJ、E．herbicola、シトロバクター・フロインディ、Symbiobacterium、または緑膿菌の細胞である。別の実施形態では、細菌細胞は、乳製品の発酵に関与する細菌である。一実施形態では、細菌は、乳酸連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌はラクトバシラスである。一実施形態では、ラクトバシラスは、ラクトバチルス・ブルガリカスである。別の実施形態では、細菌は、ラクトコッカスまたはロイコノストックである。
【０５８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法に、遺伝子組換え細菌を利用することができる。
【０５８４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。
【０５８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少している。
【０５８６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。
【０５８７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子組換え植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加している。
【０５８８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、非組換え細胞または非組換え植物と比較して、増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変させることと、を含む。
【０５８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を産生する方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、非組換え細胞または非組換え植物と比較して、増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることと、を含む。
【０５９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物細胞、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップであって、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている、該遺伝子組換えステップを含む。
【０５９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させる方法は、少なくとも１つの植物細胞、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップであって、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加している、該遺伝子組換えステップを含む。
【０５９２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物細胞、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップであって、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている、該遺伝子組換えステップを含む。
【０５９３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つの植物細胞、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップであって、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少している、該遺伝子組換えステップを含む。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物細胞である。植物細胞は、後述するように、広範囲の植物から得ることができる。植物細胞は、葉細胞、葉柄細胞、植物の茎または柄細胞、根細胞、芽細胞、塊茎細胞、豆細胞、穀物または穀粒細胞、果実細胞、ナッツ細胞、マメ細胞、種子または種子細胞、包葉細胞、カルス細胞、及び花細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、したがって、植物の葉、植物の葉柄、植物の茎または柄、植物の根、植物の芽、植物の塊茎、植物の豆、植物の穀物または穀粒、植物の果実、植物のナッツ、植物のマメ、植物の種子、植物の包葉、植物のカルス、または植物の花に含まれていてもよい。
【０５９５】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物またはその一部とは独立して、培養で育てられる。植物及びその一部を培養する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、「Ochoa-Villarreal M, Howat S, Hong S, et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Rep. 2016; 49(3):149-158」を参照されたい。この内容はその全体が本明細書に組み込まれている。
【０５９６】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物またはその一部とは独立して、培養で育てられ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために本明細書に提供される方法で利用される。遺伝子組換え細胞の懸濁液及び遺伝子組換え細胞に由来する組織培養物も、本明細書に記載の範囲に包含される。細胞懸濁液及び組織培養物は、所望のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、所望のステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、所望のトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の産生のために使用することができ、これらはその後、細胞または成長培地から抽出される。あるいは、遺伝子組換え植物の細胞及び／または組織を用いて、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の発現または過剰発現を改変させたトランスジェニック植物を再生することができ、したがって、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１、セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）は、それぞれ対応する非組換え細胞または非組換え植物と比較して、細胞内または植物内で発現または過剰発現する。したがって、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。
【０５９７】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物に含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物に含まれ、植物は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために本明細書に提供される方法に利用されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物組織に含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物組織に含まれ、植物組織は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために本明細書に提供される方法に利用されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物器官に含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物器官に含まれ、植物器官は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために本明細書に提供される方法に利用されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物の一部に含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物の一部に含まれ、植物の一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するために本明細書に提供される方法に利用されている。
【０５９８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、葉細胞、葉柄細胞、植物の茎または柄細胞、根細胞、芽細胞、塊茎細胞、豆細胞、穀物または穀粒細胞、果実細胞、ナッツ細胞、マメ細胞、種子または種子細胞、包葉細胞、カルス細胞、または花細胞を含む植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、植物の葉、植物の葉柄、植物の茎または柄、植物の根、植物の芽、植物の塊茎、植物の豆、植物の穀物または穀粒、植物の果実、植物のナッツ、植物のマメ、植物の種子、植物の包葉、植物のカルス、または植物の花、またはそれらの組み合わせに含まれる植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物の一部に含まれ、植物の一部は、葉、葉柄、植物の茎または柄、根、芽、塊茎、豆、穀物または穀粒、果実、ナッツ、マメ科植物、種子または種、包葉、カルス、または花を含む。
【０５９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法に、遺伝子組換え植物細胞を利用することができる。
【０６００】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換え植物細胞（例えば、培養植物細胞）を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は、植物または植物器官、植物組織、または植物の一部に含まれる。いくつかの実施形態では、「植物」という用語は、すべての同一の意味及び品質を有する「植物の一部」という用語と互換的に使用されてもよい。
【０６０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞、植物、植物器官、植物組織、または植物の一部が、本明細書に記載のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法に利用されてもよい。
【０６０２】
遺伝子組換え細胞、植物、植物の一部に含まれるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニン、それらの誘導体、それらの代謝物、またはそれらの生合成中間体の含有量は、以下に例示するように、または当業者に知られているように、測定される。
【０６０３】
いくつかの実施形態では、子孫植物は、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、少なくとも１つの祖先植物と比較して、増加している。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される植物、植物細胞、植物組織、または植物の一部は、ナデシコ目、ナス目、ナス目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、イネ目、シソ目、ウリ目、キク目、キントラノオ目、バラ目、ブナ目、ムクロジ目、ヤシ目、ツツジ目、リンドウ目、キンポウゲ目、ショウガ目、ユキノシタ目、ブドウ目、マツ目、ミズキ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、及びユリ目から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物または植物細胞、植物組織または植物の一部は、ナデシコ目、ナス目、ナス目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、イネ目、シソ目、ウリ目、キク目、キントラノオ目、バラ目、ブナ目、ムクロジ目、ヤシ目、ツツジ目、リンドウ目、キンポウゲ目、ショウガ目、ユキノシタ目、ブドウ目、マツ目、ミズキ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、及びユリ目から選択される植物からの細胞を含む。
【０６０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物、植物細胞、植物組織、または植物の一部は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目の植物からの細胞を含む。
【０６０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物または植物細胞または植物組織または植物部分は、ナデシコ目に属し、ホウレンソウ属（例えば、ホウレンソウ）、アカザ属（例えば、キノア）、ベータ属（例えば、ビートルート）、レウム属（例えば、Rheum hybridum、ルバーブ、Rheum ribes）、ドウカンソウ属（例えば、ドウカンソウ）、サポナリア属（例えば、カウハーブ）、及びジプソフィラ属（例えば、シュッコンカスミソウ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カリオフィラ属植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される。
【０６０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物または植物細胞または植物組織または植物部分は、ナス目に属し、タバコ属（例えば、ベンサミアナタバコ）、ナス属（例えば、トマト、野生型トマト）、ジャガイモ（S. chacoense、S. tuberosum）、ナス、ビタースイート、トウガラシ属（例えば、トウガラシ）、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物は、ナス科植物を含む。いくつかの実施形態では、ナス科植物は、トマト、野生型トマト、ジャガイモ（S. chacoense、S. tuberosum）、トウガラシ、ビタースイート、及びナスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナス科またはナス目の植物は、グランドチェリー、ナス、ジャガイモ、トマト、野生型トマト、野生型ポテト、ペッパー、ピーマン、カイエンペッパー、チリペッパー、ピメント、タバスコペッパー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、植物はマメ目に属し、グリシリザ属（例えば、ウラルカンゾウ、スペインカンゾウ［甘草］）、メディカゴ属（例えば、アルファルファ、タルウマゴヤシ）、キラヤ属（例えば、キラヤ）、ダイズ属（例えば、ダイズ［ダイズ］）、ハス属（例えば、ミヤコグサ）、シセル属（例えば、ヒヨコマメ［ヒヨコマメ、ガルバンゾマメ］）、インゲンマメ属（例えば、インゲンマメ［インゲンマメ、コモンマメ、フレンチマメ］）、エンドウ属（例えば、エンドウ［エンドウ］）、ラッカセイ属（例えば、ラッカセイ［ピーナッツ］）、ルピナス属（例えば、ルピナス・アルバス［ルピナス］）、及びアカシア属である。いくつかの実施形態では、マメ目の植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される。
【０６０９】
いくつかの実施形態では、植物はアオイ目に属し、カカオ属（例えば、カカオ）から選択される。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、植物はセリ目に属し、ニンジン属（例えば、ノラニンジン）、オランダミツバ属（例えば、セロリ）、パセリ属（例えば、パセリ）、オタネニンジン属（例えば、オタネニンジン）、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属（例えば、ツボクサ）からなる群から選択される。
【０６１１】
いくつかの実施形態では、植物はフウチョウソウ目に属し、シロイヌナズナ属（例えば、シロイヌナズナ）、アブラナ属（例えば、ヤセイカンラン［キャベツ］、カラシナ［ホワイトマスタード］、クロガラシ［ブラックマスタード］、セイヨウアブラナ）、フウチョウボク属（例えば、ケッパー［ケッパー］）、及びパパイヤ属（例えば、パパイヤ［パパイヤ］）からなる群から選択される。
【０６１２】
いくつかの実施形態では、植物はイネ目に属し、イネ属（例えば、イネ及びアフリカイネ［米］）、オオムギ属（例えば、オオムギ［大麦］）、カラスムギ属（例えば、オーツ麦［オーツ麦］、アウェナストリゴサ）、及びコムギ属（例えば、スペルト小麦［スペルト］）からなる群から選択される。
【０６１３】
いくつかの実施形態では、植物はシソ目に属し、アキギリ属（例えば、チア［チア］）、ゴマ属（例えば、ゴマ［ゴマ］）、及びオリーブ属（例えば、オリーブ［オリーブ］）からなる群から選択される。
【０６１４】
いくつかの実施形態では、植物はウリ目に属し、カボチャ属（例えば、これに限定しないが、ペポカボチャ、セイヨウカボチャ、Cucurbita argyrosperma、またはニホンカボチャを含むカボチャ）から選択される。
【０６１５】
いくつかの実施形態では、植物はキク目に属し、ヘリアンサス属（例えば、ヒマワリ［ヒマワリ］、Helianthus verticallatus［渦巻きヒマワリ］、キクイモ［エルサレムアーティチョーク］）、ヨモギ属（例えば、クソニンジン）、Ｇａｌａｔｅｌｌａ（シオン）属（例えば、Galatella sedifolia）、タンポポ属（例えば、セイヨウタンポポ［タンポポ］）から選択される。
【０６１６】
いくつかの実施形態では、植物はキントラノオ目に属し、アマ属（例えば、アマニ［アマニ］）、オヒルギ属（例えば、オヒルギ）、トウダイグサ属（ミドリサンゴ）、トウゴマ属（トウゴマ［トウゴマ］）、メヒルギ属（メヒルギ）、及びヤエヤマヒルギ属（ヤエヤマヒルギ）からなる群から選択される。
【０６１７】
いくつかの実施形態では、植物はバラ目に属し、サクラ属（例えば、アーモンド［アーモンド］、Prunus amygdalus）及びアサ属（例えば、Cannabis sativaを含むアサ）からなる群から選択される。
【０６１８】
いくつかの実施形態では、植物はブナ目に属し、ハシバミ属（例えば、これに限定しないがセイヨウハシバミなどを含む、ヘーゼル／ヘーゼルナッツ／コブナッツ／フィルバートナッツ）、カバノキ属（例えば、シラカンバ［シルバーバーチ］、ヨーロッパダケカンバ［white or downy birch］、シラカンバ）、及びクルミ属（例えば、樫ぐるみ［ペルシャグルミまたはセイヨウグルミ］、黒ぐるみ［黒ぐるみ］、バターナット［バターナット］）からなる群から選択される。
【０６１９】
いくつかの実施形態では、植物はムクロジ目に属し、カシューナッツ属（例えば、カシューナッツ［カシュー］）、カイノキ属（例えば、ピスタチオ［ピスタチオ］）、ミカン属（多数の種及び雑種）、トチノキ属（例えば、セイヨウトチノキ、トチノキ）、及びペガヌム属からなる群から選択される。
【０６２０】
いくつかの実施形態では、植物はヤシ目に属し、ココヤシ属（例えば、ココヤシ［ココナッツ］）から選択される。
【０６２１】
いくつかの実施形態では、植物はツツジ目に属し、イズセンリョウ属から選択される。
【０６２２】
いくつかの実施形態では、植物は、リンドウ目に属し、キョウチクトウ属（例えば、キョウチクトウ）、リンドウ属（例えば、リンドウマクロフィラ）、ニチニチソウ属（例えば、ニチニチソウ）、インドジャボク属、及びキナ属からなる群から選択される。
【０６２３】
いくつかの実施形態では、植物はキンポウゲ目に属し、クロタネソウ属（例えば、ニオイクロタネソウ）、ケシ属、ハナビシソウ属（例えば、ハナビシソウ）、オウレン属、メギ属、及びカラマツソウ属からなる群から選択される。
【０６２４】
いくつかの実施形態では、植物はショウガ目に属し、オオホザキアヤメ属（例えば、オオホザキアヤメ）から選択される。
【０６２５】
いくつかの実施形態では、植物はユキノシタ目に属し、カランコエ属（例えば、コダカラベンケイ）から選択される。
【０６２６】
いくつかの実施形態では、植物はブドウ目に属し、ブドウ属（例えば、ヨーロッパブドウ［ブドウ］）から選択される。
【０６２７】
いくつかの実施形態では、植物はマツ目に属し、イチイ属（例えば、タイヘイヨウイチイ、ヨーロッパイチイ、イチイ、カナダイチイ、フロリダイチイ）から選択される。
【０６２８】
いくつかの実施形態では、植物は、ミズキ目に属し、カンレンボク属（例えば、カンレンボク）から選択される。いくつかの実施形態では、植物は、クサスギカズラ目に属し、リュウゼツラン属（例えば、アオノリュウゼツラン、アガベ・アテナータ、テキーラ）、クサスギカズラ属（例えば、アスパラガス）、またはイトラン属（例えば、イトラン）から選択される。いくつかの実施形態では、植物は、ヤマノイモ目に属し、Ｂｏｒｄｅｒｅａ属、ヤマノイモ属、Ｅｐｉｐｅｔｒｕｍ属、Ｒａｊａｎｉａ属、ステノメリス属、またはティムス属から選択される。いくつかの実施形態では、植物は、ユリ目に属し、ユリ科（例えば、Clintonia borealis、ノモカリス・アペルタ、カロコルツスカタリナエ、Streptopus lariceolatusなど）から選択される。
【０６２９】
当業者であれば、植物の品種改良は、繁殖のために望ましい特性を有する植物を単に選択することから、遺伝学や染色体の知識を利用した方法、さらに複雑な分子技術まで、様々な手法で達成され得ることを理解できるであろう。
【０６３０】
当業者であれば、「ハイブリッド植物」という用語は、対象となる２つの植物を交配し、種子または組織によって繁殖させ、その後、植物を成長させることによって生成された植物を包含することを理解できるであろう。植物を有性交配する場合、受粉は、交配、自家受粉、または、形質転換されていない植物または別の形質転換された植物との戻し交配を含み得る。ハイブリッド植物は、第一世代及び第二世代の植物を含む。
【０６３１】
生物学的活性
【０６３２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素と同一または類似の活性を有する内在性酵素を含む。他の実施形態では、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素と同一または類似の活性を有する内在性酵素を含んでいない。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞または遺伝子組換え植物は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成酵素の活性が改変された内在性酵素を含む。
【０６３３】
いくつかの実施形態では、異種遺伝子によってコードされる少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの組み合わせは、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物に存在する内在性のサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧタンパク質と比較して、改変されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内在性サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ酵素、またはそれらの組み合わせは、非遺伝子組換え細胞または非遺伝子組換え植物に存在する内在性のサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧタンパク質と比較して、改変されている。
【０６３４】
当業者であれば、「生物学的活性」という用語が、アッセイによって測定できるタンパク質に関連する任意の活性を指すことを認識するであろう。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の生物活性は、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を、細胞内及び植物内で生合成するために必要な酵素活性を有している。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の生物学的活性は、植物の少なくとも一部における、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量に影響を与える。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、酵素活性の増加を含む。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、酵素活性の低下を含む。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、ポリペプチドの安定性の向上を含む。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、ポリペプチドの安定性の低下を含む。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、酵素ポリペプチドの発現が増加して高レベルになることを含む。いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、酵素ポリペプチドの発現の減少を含む。
【０６３５】
いくつかの実施形態では、酵素の生物学的活性は、対照酵素と比較して、改変されている。
【０６３６】
いくつかの実施形態では、改変された生物活性は、（ａ）サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の酵素活性の増加、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の安定性の向上、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の酵素活性の低下、あるいは、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の安定性の低下を含む。
【０６３７】
いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の生物学的活性が増加する。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の生物学的活性が低下する。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素は、安定性が向上している。いくつかの実施形態では、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素は、安定性が低下している。
【０６３８】
いくつかの実施形態では、改変された生物学的活性は、遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物に内在性酵素が存在する場合、その生物学的活性と比較して、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の酵素活性の増加、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の安定性の向上、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の酵素活性の低下、あるいは、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素の安定性の低下を含む。
【０６３９】
トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック酵母細胞、トランスジェニック藻類細胞、トランスジェニック昆虫細胞、及びトランスジェニック細菌
【０６４０】
少なくとも１つの異種遺伝子によってコードされる酵素をコードするポリヌクレオチドのクローニングは、当業者に知られている任意の方法によって行うことができる。この酵素は、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロンオキシルトランスフェラーゼまたはＣＳＬＧ酵素を含む。本明細書に記載の少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ酵素をコードするポリヌクレオチドのクローニングは、当業者に知られている任意の方法によって行うことができる。特定の実施形態では、ＣＳＬＧ酵素をコードするポリヌクレオチドのクローンが作製される。様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、所望の細胞または生物において所望の遺伝子を発現させることができる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、細胞内でＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻類細胞、または細菌においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、植物細胞においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、酵母細胞においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、植物細胞または酵母細胞においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、藻類細胞においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、昆虫細胞においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、細菌においてＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、様々なＤＮＡ構築物を使用することにより、細胞内で異種ＣＳＬＧ遺伝子を発現させる。いくつかの実施形態では、細胞が植物細胞である場合、ＣＳＬＧ遺伝子は異種遺伝子である。いくつかの実施形態では、細胞が植物細胞である場合、ＣＳＬＧ遺伝子は相同遺伝子であり、発現が改変（例えば、増加または減少）されるか、または、ＣＳＬＧ遺伝子が突然変異することによりＣＳＬＧ酵素の活性が改変される。いくつかの実施形態では、細胞が植物細胞である場合、植物細胞は、植物またはその一部に含まれる。
【０６４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子は、遺伝子の発現に必要なすべての要素と任意の調節要素を含む発現ベクターの一部を含む。
【０６４２】
いくつかの実施形態では、発現は、構成的プロモータによって制御される。他の実施形態では、発現は、一過性プロモータによって制御される。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、細胞、または、植物または植物組織に対して特異的である。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモータは、根特異的プロモータ、塊茎特異的プロモータ、葉特異的プロモータ、及び果実特異的プロモータからなる群から選択される。根特異的プロモータは、例えば、「Martinez, E. et al. 2003. Curr. Biol. 13:1435-1441」に記載されている。果実特異的プロモータは、とりわけ、「Estornell L.H et al. 2009. Plant Biotechnol. J. 7:298-309」及び「Fernandez A. I. Et al. 2009 Plant Physiol. 151:1729-1740」に記載されている。塊茎特異的プロモータは、例えば、「Rocha-Sosa M, et al., 1989. EMBO J. 8:23-29」及び「McKibbin R.S. et al., 2006. Plant Biotechnol J. 4(4):409-18」に記載されている。葉特異的なプロモータ、例えば、「Yutao Yang, Guodong Yang, Shijuan Liu, Xingqi Guo and Chengchao Zheng. Science in China Series C: Life Sciences. 46: 651-660」に記載されている。したがって、いくつかの実施形態では、プロモータは、酵母特異的プロモータを含む。したがって、いくつかの実施形態では、プロモータは、藻類特異的プロモータを含む。
【０６４３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、３´非コード配列に制御要素をさらに含む。本明細書で使用するとき、「３´非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、及び、ｍＲＮＡの処理または遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３´末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を与えることを特徴とする。植物の場合、異なる３´非コード配列の使用は、「Ingelbrecht I L et al. (1989. Plant Cell 1:671-680)」に例示されている。
【０６４４】
当業者であれば、本明細書に記載された核酸配列及び形質転換ベクターの様々な構成要素が、核酸または核酸断片の発現をもたらすように、作動可能に連結されることを理解できるであろう。本明細書に記載の構築物及びベクターの構成要素を作動的に連結する技術は、当業者にはよく知られている。そのような技術には、例えば１以上の制限酵素部位を含む合成リンカーなどのリンカーの使用が含まれる。
【０６４５】
当業者であれば、「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方の機能によって制御されるように、単一の核酸断片上の核酸配列が連結していることを指す。例えば、プロモータは、そのプロモータがそのコード配列の発現を調節することができる場合（すなわち、コード配列がプロモータの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で制御配列に作動可能に連結することができる。
【０６４６】
本明細書で開示されている教示にしたがって植物を形質転換する方法は、当業者に知られている。本明細書で使用するとき、「形質転換」または「形質転換」という用語は、発現ベクターを含むＤＮＡ構築物などの外来ＤＮＡが受容細胞に入り、その受容細胞を、形質転換された、遺伝的に改変された、またはトランスジェニック細胞に改変するプロセスを表す。形質転換は、核酸配列が生物のゲノムに組み込まれ、安定的な遺伝性の形質を表す安定的なものであってもよいし、または、核酸配列が形質転換された細胞によって発現されるがゲノムに組み込まれず、一過性の形質を表す一過性のものであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、細胞内に安定的に形質転換される。
【０６４７】
本発明の遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、所望の少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧの含有量が改変し、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように産生された遺伝子組換え細胞または遺伝子組換え植物は、一般的に、まず、遺伝子またはタンパク質の発現に基づいて選択される。少なくとも１つの異種遺伝子からコードされる酵素を発現する細胞または植物を同定し、次いで、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ、及び／または、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を分析する。
【０６４８】
いくつかの実施形態では、まず、所望の少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変された遺伝子組換え植物を、本明細書の教示にしたがって、遺伝子またはタンパク質の発現に基づいて選択する。次いで、遺伝子またはタンパク質の発現が増強または異常な植物について、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を分析する。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０６４９】
少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、またはＣＳＬＧ遺伝子、及び／または、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の検出は、当業者に知られている分子遺伝学の標準的な方法を用いて行われる。同様に、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の精製及び／または検出は、当業者に知られている分子遺伝学またはタンパク質化学の標準的な方法を用いて行われる。
【０６５０】
遺伝子を検出するためには、核酸を発現する細胞または植物からｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを取得する必要がある。その試料は、検出プロセスの前に、さらに処理してもよい。例えば、細胞または組織の試料中のポリヌクレオチドを、試料の他の構成要素から分離してもよいし、または、増幅してもよい。或る生物から取得したすべての試料は、任意の種類のさらなる処理に供したものも含めて、その生物から取得したものと見なされる。
【０６５１】
遺伝子またはサイレンシング分子の発現を検出するためには、核酸を発現する器官からｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを取得する必要がある。その試料は、検出プロセスの前に、さらに処理してもよい。例えば、細胞または組織の試料中のポリヌクレオチドを、試料の他の構成要素から分離してもよいし、または、増幅してもよい。或る生物から取得したすべての試料は、任意の種類のさらなる処理に供したものも含めて、その生物から取得したものと見なされる。
【０６５２】
いくつかの実施形態では、遺伝子の検出には、候補となる遺伝子組換え細胞、遺伝子組換え植物またはその一部から取得したポリヌクレオチドの増幅を必要とする。いくつかの実施形態では、植物の一部は、植物の器官、または植物の組織を含む。
【０６５３】
ＤＮＡを増幅する方法は、当業者に知られている。最も一般的に使用されるＤＮＡ増幅方法は、ＰＣＲ法である（ポリメラーゼ連鎖反応；例えば、「PCR Basics: from background to Bench, Springer Verlag, 2000; Eckert et al., 1991. PCR Methods and Applications 1:17」を参照）。別の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅及び自己持続型配列複製、及び核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【０６５４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、ＣＳＬＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む核酸配列は、いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択可能なマーカーは、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与し、これらの実施形態では、トランスジェニック細胞または植物は、抗生物質または除草剤に対する耐性にしたがって選択される。
【０６５５】
育種
【０６５６】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子編集による育種、導入遺伝子の使用、遺伝子または遺伝子の一過性発現の使用、分子マーカーの使用、またはそれらの任意の組合せを含む形質転換技術が、改変された発現を有する植物の育種に使用される。形質転換技術が組織培養の使用を必要とする場合、当業者によく知られた技術にしたがって、形質転換された細胞を植物に再生する。再生された植物は、その後、従来の育種技術を用いて同一または異なる植物品種と交配して種子を生産した後、適切な条件で選択される。
【０６５７】
ステロイド系アルカロイド及び／またはステロイド系サポニンの含有量は、以下に例示するように測定され、当業者には公知である。
【０６５８】
いくつかの実施形態では、子孫植物は、その祖先の植物の少なくとも１つと比較して、抗栄養成分または毒素の含有量の減少を含む。いくつかの実施形態では、子孫植物は、その祖先の植物の少なくとも１つと比較して、植物病原体、害虫、または捕食動物に対する改善された耐性を有する。
【０６５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物は、上述した目のいずれかの作物植物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される植物は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、または、ユリ目の作物植物を含む。
【０６６０】
いくつかの実施形態では、植物がイネ目の作物植物である場合、植物は、イネ属、オオムギ属、カラスムギ属、及びコムギ属からなる群から選択される。
【０６６１】
いくつかの実施形態では、植物がナデシコ目の作物植物である場合、植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、レウム属、ドウカンソウ属、サポナリア属、及びジプソフィラ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナデシコ目の植物は、ホウレンソウ、ビートルート、及びキノアからなる群から選択される。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、植物がナス目の作物植物である場合、植物は、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、ヒヨス属、ダチュラ属、及びオオカミナスビ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、植物がナス目の作物植物である場合、植物は、トマト、野生型トマト、ジャガイモ、野生種ジャガイモ、トウガラシ、ナスビ、ズルカマラ、及びベンサミアナタバコからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナス目の植物は、グランドチェリー、ナス、ジャガイモ、トマト、ペッパー、ピーマン、トウガラシ、チリペッパー、パプリカ、タバスコペッパー、タバコ、及びビタースイートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ナス目の植物は、ナス科の植物を含む。
【０６６３】
いくつかの実施形態では、植物がマメ目の植物である場合、植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、ダイズ属、ハス属、シセル属、インゲンマメ属、エンドウ属、ラッカセイ属、ルピナス属、及びアカシア属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マメ目の植物は、アルファルファ、大豆、ミヤコグサ、及び甘草からなる群から選択される。
【０６６４】
いくつかの実施形態では、植物がアオイ目の植物である場合、植物は、カカオ属から選択される。
【０６６５】
いくつかの実施形態では、植物がセリ目の植物である場合、植物は、ニンジン属、オランダミツバ属、パセリ属、オタネニンジン属、ミシマサイコ属、キヅタ属、及びツボクサ属からなる群から選択される。
【０６６６】
いくつかの実施形態では、植物がフウチョウソウ目の植物である場合、植物は、シロイヌナズナ属、アブラナ属、フウチョウボク属、及びパパイヤ属からなる群から選択される。
【０６６７】
いくつかの実施形態では、植物は、本明細書に記載の任意の目、科、属、または種の植物である。
【０６６８】
当業者であれば、植物の品種改良は、繁殖のために望ましい特性を有する植物を単に選択することから、遺伝学や染色体の知識を利用した方法、さらに複雑な分子技術まで、様々な手法で達成され得ることを理解できるであろう。
【０６６９】
当業者であれば、「ハイブリッド植物」という用語は、対象となる２つの植物を交配し、種子または組織によって繁殖させ、その後、植物を成長させることによって生成された植物を包含することを理解できるであろう。植物を有性交配する場合、受粉のステップは、交配、自家受粉、または、形質転換されていない植物若しくは別の形質転換された植物との戻し交配を含み得る。ハイブリッド植物は、第一世代及び第二世代の植物を含む。本明細書には、非限定的な例として、植物の抵抗性を向上させること、植物の抗栄養特性を低下させること、植物の毒素または苦味の化合物を減少させること、植物の医薬特性を向上させること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、植物の形質を操作し改善するための方法が開示されている。
【０６７０】
バイオマーカー
【０６７１】
当業者であれば、「バイオマーカー」という用語は、生物において測定可能な物質を含み、この物質の存在が、対象の生物学的状態または状態を示すことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存在は、対象の化合物または化合物群の存在を示す。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの濃度は、対象の化合物または化合物群の濃度を示す。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの濃度は、生物の表現型を示す。
【０６７２】
ＣＳＬＧ酵素は、多くの植物に含まれるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、及びトリテルペノイド系サポニンの生合成に必須の役割を果たすことが、本明細書に開示されている。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ遺伝子の発現レベルは、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、または生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、または生合成中間体、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、または生合成中間体、あるいは、それらの組み合わせを産生する植物の能力を示す。
【０６７３】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、及びトリテルペノイド系サポニンの産生方法
【０６７４】
本明細書では、遺伝子組換え細胞、あるいは、遺伝子組換え植物細胞を含む植物または遺伝子組換え植物の一部を含む植物の一部においてステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法を提供する。この方法は、細胞内にポリヌクレオチド配列を導入する導入ステップであって、当該ポリヌクレオチド配列が、任意選択でベクターに含まれ、当該ポリヌクレオチド配列が、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含み、当該酵素が、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される、該ステップと、当該細胞内で少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる発現ステップと、を含む。いくつかの実施形態では、導入されたポリヌクレオチド配列は、複数のポリヌクレオチド配列を含み、各ポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含み、当該酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、導入されたポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上のポリヌクレオチド配列を含み、各ポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含み、当該酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、導入されたポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上のポリヌクレオチド配列を含み、各ポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする異種遺伝子を１つのみ含み、当該酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、導入されたポリヌクレオチド配列は、酵素をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上の異種遺伝子の任意の組み合わせをそれぞれ含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上のポリヌクレオチド配列を含み、当該酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）からなる群から選択される。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列は、細胞に導入されて発現し、これにより、遺伝子組換え細胞においてコードされた酵素が発現することを理解できるであろう。
【０６７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、遺伝子組換え細胞内にステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法であって、（ａ）細胞内に少なくとも１つの異種遺伝子を導入する導入ステップであって、少なくとも１つの異種遺伝子がセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードしており、少なくとも１つの異種遺伝子が任意選択でベクターに含まれている、該ステップと、（ｂ）細胞内で少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる発言ステップと、を含み、細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、少なくとも１つのステロイド系サポニン、または少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加する。
【０６７６】
いくつかの実施形態では、導入ステップは、細胞内に少なくとも１つの追加の異種遺伝子を導入するステップであって、少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素をコードしており、少なくとも１つの追加の異種遺伝子が任意選択でベクター内に含まれている、該ステップと、細胞内で少なくとも１つの追加の異種遺伝子を発現させるステップと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）少なくとも１つの異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、（ｂ）少なくとも１つの追加の異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されているか、または、（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせである。
【０６７７】
いくつかの実施形態では、導入ステップは、少なくとも１つの細胞を、（ａ）少なくとも１つの異種遺伝子、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または少なくとも１つの異種遺伝子を含むベクター、（ｂ）少なくとも１つの追加の異種遺伝子、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、または少なくとも１つの追加の異種遺伝子を含むベクター、または、（ｃ）上記の（ａ）と（ｂ）の組み合わせを用いて形質転換することを含み、発現は、一過性発現または構成的発現を含む。
【０６７８】
ＣＳＬＧ酵素をコードするセルロース合成酵素様Ｇの核酸配列は、全体を通して詳細に記載され、実施例に例示されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。ＣＳＬＧ酵素をコードするセルロース合成酵素様Ｇの核酸配列は、全体を通して詳細に記載され、実施例に例示されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０６７９】
ＣＳＬＧ酵素をコードするセルロース合成酵素様Ｇの核酸配列は、全体を通して詳細に記載され、実施例に例示されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列であるか、または、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０６８０】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、コードされるＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、コードされるＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０６８１】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、コードされるＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列であるか、または、３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０６８２】
ＧＡＭＥタンパク質であるＧＡＭＥ１及びＧＡＭＥ４を、本明細書の実施例に記載されているように、ジャガイモまたはトマトのベイトとして使用した。ＧＡＭＥ１またはＧＡＭＥ４と共発現させた遺伝子を表５−８に示し、ステロイド系アルカロイド経路の酵素及びステロイド系サポニン経路の酵素の一部を、図１に示し、全体を通して詳細に説明し、実施例において例示した。図２０Ａに提示したトリテルペノイド系サポニン経路のＳＯＡＰ酵素をそれぞれコードするＳＯＡＰ核酸配列を、全体を通して詳細に説明し、実施例において例示した。
【０６８３】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、少なくとも１つの追加の異種遺伝子をコードする核酸配列は、β−アミリン合成酵素をコードし、４５に記載の核酸配列、または４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、シトクロムＰ４５０をコードし、４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、または４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、グリコシルトランスフェラーゼをコードし、５５、５７、５９、６１のいずれか１つに記載の核酸配列、または５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、アシルトランスフェラーゼをコードし、６３に記載の核酸配列、または６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１をコードし、７４に記載の核酸配列、または７４に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログ、または、それらの任意の組み合わせである。
【０６８４】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、コードされる少なくとも１つの追加の異種遺伝子のアミノ酸配列は、β−アミリン合成酵素をコードし、当該アミノ酸配列は、４８に記載のアミノ酸配列、または４８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有し、かつ少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、シトクロムＰ４５０をコードし、当該アミノ酸配列は、４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または４９、５２、または５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、グリコシルトランスフェラーゼをコードし、当該アミノ酸配列は、５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、アシルトランスフェラーゼをコードし、当該アミノ酸配列は、６４に記載のアミノ酸配列、または６４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１をコードし、当該アミノ酸配列は、７５に記載のアミノ酸配列、または７５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、または、それらの任意の組み合わせである。
【０６８５】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法において、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンは、抗栄養剤、化粧品剤、医薬剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法において、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンは、抗栄養剤、化粧品剤、医薬剤、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０６８６】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、トリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗癌剤、低コレステロール剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、防虫剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、トリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗癌剤、低コレステロール剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、防虫剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０６８７】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、ステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、ステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０６８８】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンを産生する方法において、ステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、ステロイド系アルカロイドは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０６８９】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０６９０】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０６９１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、植物細胞、酵母細胞、または藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、植物細胞または酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、藻類細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、細胞は、細菌を含む。
【０６９２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子が、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに動作可能に連結されている。
【０６９３】
いくつかの実施形態では、導入ステップは、少なくとも１つの細胞を、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換することを含み、発現は、一過性発現または構成的発現を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞のＤＮＡに統合されている。いくつかの実施形態では、ベクターに含まれるポリヌクレオチドの一部は、宿主細胞のＤＮＡに統合されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞のＤＮＡには統合せず、宿主細胞内で別の実体として複製している。
【０６９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物細胞を産生するために使用される発現ベクターは、アグロバクテリウムベクター及び非アグロバクテリウムベクターの両方を含む。アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入は、ＤＮＡを植物の染色体に導入するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの本質的な能力を利用するものであり、「G. Gheysen, G. Angenon, and M. Van Montagu, 1998, Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications in K. Lindsey (Ed.), Transgenic Plant Research, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, pp.1-33; and in H. A. Stafford (2000), Botanical Review 66:99-118」に詳細に記載されている。形質転換法の第２の群は、アグロバクテリウムによって媒介されない形質転換であり、これらの方法は、直接遺伝子導入法として知られている。概要は、「P. Barcelo and P. A. Lazzeri(1998)、Direct gene transfer: chemical, electrical and physical methods in K. Lindsey (Ed.), Transgenic Plant Research, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, pp.35-55」に提供されている。方法としては、パーティクル・ガン・デリバリー、マイクロインジェクション、無傷の細胞のエレクトロポレーション、ポリエチレングリコールによって媒介されるプロトプラスト形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソームによって媒介される形質転換、シリコンウィスカーによって媒介される形質転換などが含まれる。適切な対照植物には、本明細書でトランスジェニック植物を生成するために使用される親系統の、遺伝的に改変されていない植物、すなわち非トランスジェニック植物が含まれる。
【０６９５】
遺伝子を導入した毛状根の培養物は、リゾビウム・リゾゲネスという病原菌によって形質転換することで得られる。毛状根の培養物の確立に用いられるプロトコルは、アグロバクテリウムによる感染に対する植物種の感受性と同様に様々である（「Toivounen et al. 1993; Vanhala et al. 1995」）。形質転換に用いられるアグロバクテリウム株は、根の形態や毛状根の培養物の二次代謝産物の蓄積の程度に大きな影響を与えることが知られている。プロトプラストなどを用いた系統的なクローンセレクションにより、高収量かつ安定した、単一細胞由来の毛根クローンを見出だすことが可能である。これが可能であるのは、毛根の培養物が、より大きな体細胞のバリエーションを有しているためである。形質転換のもう一つの可能性は、ウイルスベクターの使用である（「Turpen 1999」）。
【０６９６】
器官形成または胚形成のいずれかによってその後のクローン増殖が可能な任意の植物組織または植物細胞が、目的の発現ベクターで形質転換されてもよい。「器官形成」という用語は、分裂の中心から芽及び根が順次発生するプロセスを意味し、「胚形成」という用語は、体細胞からであろうと配偶子からであろうと、芽及び根が（連続してではなく）協働して発生するプロセスを意味する。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種のために利用可能であり、かつ、形質転換される特定の種に最も適したクローン増殖システムによって異なる。例示的な組織ターゲットには、プロトプラスト、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、根部分裂組織）、及び誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織、胚軸分裂組織）が含まれる。
【０６９７】
いくつかの実施形態では、上記で詳細に説明したような酵素をコードするポリヌクレオチド配列または少なくとも１つの異種遺伝子を含むベクターが、本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、上記で詳細に説明したような酵素をコードするポリヌクレオチド配列または少なくとも異種遺伝子を含む宿主細胞（これらに限定しないが、例えば植物細胞、酵母、または藻類細胞など）か、または、全体を通して記載したような酵素をコードするポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの異種遺伝子を含むベクターである。
【０６９８】
いくつかの実施形態では、「ベクター」という用語は、操作可能に、または連続的に連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を包含する。ベクターは、これらに限定しないが、例えばファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミド、または人工染色体などを含む任意の適切なタイプのものであってよい。特定のベクターは、そのベクターが導入された宿主細胞内で自律的に複製することができる（例えば、宿主細胞内で機能する複製の起点を有するベクターなど）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、いくつかの実施形態では、ベクターは、対象の特定の遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。適切なベクターは、必要に応じて、かつ、特定の宿主生物（例えば、植物細胞、酵母細胞または藻類細胞）によって、プロモータ、エンハンサー、ターミネーター配列などの制御配列を有する。
【０６９９】
一般的に、本開示による組換えベクターは、少なくとも１つの「酵素をコードする異種遺伝子」または「酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む発現カセット」を含む。発現カセットは一般にＤＮＡ構築物であり、いくつかの実施形態では、（転写方向の５´から３´に向けて）プロモータ領域と、転写開始領域と動作可能に連結された、詳細に上述した本開示の酵素、ホモログ、変異体、またはその断片をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むポリヌクレオチド配列と、ＲＮＡポリメラーゼの停止シグナル及びポリアデニル化シグナルを含む終結配列とを含む。これらの領域はすべて、形質転換される植物細胞、酵母細胞または藻類細胞などの生物学的細胞において機能可能であるべきということが理解される。好ましくはＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む転写開始領域とポリアデニル化シグナルを含むプロモータ領域は、形質転換されるべき生物学的細胞に固有のものであってもよく、その領域が生物学的細胞において機能している場合には、代替の供給源に由来するものであってもよい。
【０７００】
「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主システム」、「発現システム」、または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、組換えベクターが導入された細胞を包含する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫にも言及することが意図されていることを理解すべきである。突然変異や環境の影響のいずれかに起因して特定の改変が後の世代で発生するため、そのような子孫が親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞や培養された細胞株であってもよく、生体組織または生物の中に存在する細胞であってもよい。宿主細胞は、真菌、植物、または藻類由来のものであってもよい。
【０７０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、上述のベクターで形質転換されたトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物由来の細胞である。
【０７０２】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、コードされた酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）を含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、複数の酵素が異種遺伝子によってコードされ、コードされた酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）の組み合わせを含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するにおけるいくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上の酵素が異種遺伝子によってコードされ、コードされた酵素は、サポニンβ−アミリン合成酵素、シトクロムＰ４５０、グリコシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼＩ、またはセルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）の組み合わせを含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、コードされた酵素は、ＣＳＬＧを含む。
【０７０３】
いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、Ｃ２−ヒドロキシラーゼを含むか、またはＣ−２３オキシダーゼである。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、フルクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、またはＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、ベンジルアルコールアセチル、アントシアニン−Ｏ−ヒドロキシ−シンナモイル、アントラニレート−Ｎ−ヒドロキシ−シンナマイオール／ベンゾイル、デアセチルビンドリン（ＢＡＨＤ）アセチルトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、コードされたシトクロムＰ４５０は、Ｃ２−ヒドロキシラーゼを含むか、Ｃ−２３オキシダーゼであるか、またはそれらの組み合わせである、グリコシルトランスフェラーゼは、フルクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼであるか、またはそれらの組み合わせを含む、アシルトランスフェラーゼは、ベンジルアルコールアセチル、アントシアニン−Ｏ−ヒドロキシ−シンナモイル、アントラニレート−Ｎ−ヒドロキシ−シンナマイオール／ベンゾイル、デアセチルビンドリン（ＢＡＨＤ）アセチルトランスフェラーゼを含む、あるいは、コードされた酵素は、これらの酵素のいずれかの組み合わせを含み、追加の酵素が、ポリヌクレオチド配列に任意選択で含まれる。
【０７０４】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含む。複数の異種遺伝子が発現されるいくつかの実施形態では、当業者は、ポリヌクレオチド配列が、上記で詳細に説明したように、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれかに記載の核酸配列の組み合わせを含んでいてもよいことを理解できるであろう。複数の異種遺伝子が発現されるいくつかの実施形態では、当業者は、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有する核酸配列を含んでいてもよいことを理解できるであろう。
【０７０５】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含む。複数の異種遺伝子が発現されるいくつかの実施形態では、当業者は、ポリヌクレオチド配列が、上記で詳細に説明したように、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列の組み合わせを含んでいてもよいことを理解できるであろう。複数の異種遺伝子が発現されるいくつかの実施形態では、当業者は、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４６、４７、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列を含んでいてもよいことを理解できるであろう。
【０７０６】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列の酵素のアミノ酸配列をコードしている、あるいは、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％の相同性を有するアミノ酸配列の酵素のアミノ酸配列をコードしている。
【０７０７】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列の酵素のアミノ酸配列をコードしている、あるいは、少なくとも１つの異種遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４８、４９、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列の酵素のアミノ酸配列をコードしている。
【０７０８】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、これに限定しないが、例えば植物細胞、酵母、または藻類細胞などの遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して、増加している。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを製産生する方法におけるいくつかの実施形態では、これに限定しないが、例えば植物細胞、酵母、藻類細胞、昆虫細胞、または細菌などの遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して、増加している。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加している植物細胞を含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加している酵母細胞を含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加している藻類細胞を含む。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、遺伝子組換え細胞は、少なくともステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え細胞と比較して増加した植物細胞を含み、その植物細胞は、植物またはその一部を含む。
【０７０９】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、産生されるステロイド系アルカロイドは、抗栄養剤、化粧品剤、医薬剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ステロイド系アルカロイドは、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドを含む、または、ステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、産生されるステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０７１０】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、α−トマチンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、トマチンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、デヒドロトマチンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、α−カコニンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、α−ソラニンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、α−ソラソニンを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生する方法において、生成されるステロイド系アルカロイドは、α−ソルマルギンを含む。
【０７１１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンを産生する方法において、産生されるステロイド系サポニンは、抗栄養剤、化粧品剤、医薬剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、ステロイド系アルカロイドは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンを産生する方法において、産生されるステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０７１２】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニンを産生する方法において、産生されるステロイド系サポニンは、ウットロシドＢを含む。いくつかの実施形態はでは、ステロイド系サポニンを産生する方法において、産生されるステロイド系サポニンは、トマトシドを含む。
【０７１３】
トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、産生されるトリテルペノイド系サポニンは、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗癌剤、低コレステロール剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、防虫剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、または、トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、トリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０７１４】
トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、化合物７を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、化合物８を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、化合物９を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、化合物１０を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、化合物１１を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、グリチルリチン（化合物１４）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、バヨゲニン（化合物２５）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、セルジャン酸（化合物２６）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）を含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡを含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡを含む。トリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、製造されるトリテルペノイド系サポニンは、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０７１５】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を、それぞれ、非組換え細胞または非組換え植物と比較して、増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、改変させることと、を含む。
【０７１６】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を、それぞれ、非組換え細胞または非組換え植物と比較して、増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、または、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、減少させることと、を含む。
【０７１７】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列が導入される細胞は、植物細胞または酵母細胞を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列が導入される細胞は、藻類細胞を含む。本明細書に記載されるように遺伝子組み換えされ得る植物細胞及び酵母細胞については、上記で詳細に開示されている。それらと同一の植物細胞及び酵母細胞は、いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において使用されてもよい。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列が導入される細胞は、植物細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞または細菌を含む。
【０７１８】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、いくつかの実施形態では、細胞は、葉細胞、葉柄細胞、植物の茎または柄細胞、根細胞、芽細胞、塊茎細胞、豆細胞、穀物若しくは穀粒細胞、果実細胞、ナッツ細胞、マメ細胞、種子または種子細胞、包葉細胞、カルス細胞、または花細胞を含む植物細胞を含む。
【０７１９】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、いくつかの実施形態では、酵母細胞、藻類細胞、または植物細胞は、本明細書に記載の目、属、または種である。例えば、これに限定しないが、植物細胞は、イネ目、ナデシコ目、ナス目、マメ目、アオイ目、セリ目、フウチョウソウ目、クサスギカズラ目、ヤマノイモ目、またはユリ目の植物からの細胞を含み、または、酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される。
【０７２０】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するいくつかの実施形態では、ナデシコ目の植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、及びレウム属からなる群から選択される、ナス目の植物は、タバコ属、ナス属、及びトウガラシ属からなる群から選択される、マメ目の植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、キラヤ属、ダイズ属、及びハス属からなる群から選択される、セリ目の植物は、オタネニンジン属、ニンジン属、オランダミツバ属、及びパセリ属からなる群から選択される、イネ目の植物は、イネ属（例えば、イネ及びアフリカイネ［米］）、オオムギ属（例えば、オオムギ［大麦］）、カラスムギ属（例えば、オーツ麦［オーツ麦］、アウェナストリゴサ）、及びコムギ属（例えば、スペルト小麦［スペルト］）からなる群から選択される、または、フウチョウソウ目の植物は、シロイヌナズナ属（例えば、シロイヌナズナ）、アブラナ属（例えば、ヤセイカンラン［キャベツ］、カラシナ［ホワイトマスタード］、クロガラシ［ブラックマスタード］、セイヨウアブラナ）、フウチョウボク属（例えば、ケッパー［ケッパー］）、及びパパイヤ属（例えば、パパイヤ［パパイヤ］）からなる群から選択される。
【０７２１】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、ナス目の植物は、ベンサミアナタバコ、トマト、ジャガイモ、ナス、野生型トマト、野生型ジャガイモ、ズルカマラ、及びトウガラシからなる種の群から選択される、マメ目の植物は、ウラルカンゾウ、アルファルファ、タルウマゴヤシ、キラヤ、ダイズ、及びミヤコグサからなる種の群から選択される、アオイ目の植物は、カカオ属から選択される、セリ目の植物は、オタネニンジン、ノラニンジン、セロリ、及びパセリからなる種の群から選択される、植物は、カカオ種から選択される、イネ目の植物は、イネ属（例えば、イネ及びアフリカイネ［米］）、オオムギ属（例えば、オオムギ［大麦］）、カラスムギ属（例えば、オーツ麦［オーツ麦］、アウェナストリゴサ）、及びコムギ属（例えば、スペルト小麦［スペルト］）からなる群から選択される、または、フウチョウソウ目の植物は、シロイヌナズナ属（例えば、シロイヌナズナ）、アブラナ属（例えば、ヤセイカンラン［キャベツ］、カラシナ［ホワイトマスタード］、クロガラシ［ブラックマスタード］、セイヨウアブラナ）、フウチョウボク属（例えば、ケッパー［ケッパー］）、及びパパイヤ属（例えば、パパイヤ［パパイヤ］）からなる属の群から選択される。
【０７２２】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法におけるいくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属、ヤロウイア属、クリベロマイセス属、またはカンジダ属から選択される。いくつかの実施形態では、酵母は、出芽酵母またはカンジダ・アルビカンスである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、当該方法は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを精製することをさらに含む。
【０７２３】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイドを精製する方法は、これらに限定しないが、例えばカラム液体クロマトグラフィー、分取中圧液体クロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣなど、当該技術分野で知られている標準的な精製技術を含む。これらの技術は、植物、その一部または植物細胞からステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを精製する実施形態で使用されてもよい。また、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを精製することなく、植物細胞または植物の一部をそのまま使用してもよい。
【０７２４】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンが酵母細胞で産生されると、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンが細胞から分泌される。いくつかの実施形態では、分泌されたステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンは、酵母細胞の培地から精製される。
【０７２５】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンは、当該技術分野で知られている方法を用いて、植物細胞、植物の一部、植物、藻類、酵母、昆虫細胞、または細菌の培養物から抽出される。
【０７２６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する方法が、本明細書で提供される。この方法は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生する植物、植物の一部、コロニー、器官、組織、または細胞から、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを抽出することをさらに含む。葉、葉柄、植物の茎または柄、根、芽、塊茎、豆、穀物または穀粒、果実、ナッツ、マメ科植物、種子または種、包葉、カルス、あるいは花を含む。
【０７２７】
植物、植物の一部、植物細胞内のステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニンの含有量を改変する方法
【０７２８】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え植物、遺伝子組換え植物の一部または遺伝子組換え植物細胞において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を改変する方法が、本明細書に開示されている。この方法は、植物、その一部または細胞におけるＣＳＬＧ遺伝子を遺伝子組み換えすることを含み、遺伝子組み換えは、ＣＳＬＧ遺伝子の発現を増加させること、発現したＣＳＬＧ酵素の活性を増加させること、発現したＣＳＬＧ酵素の安定性を向上させること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。この植物、植物の一部または植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え植物、植物の一部または植物細胞と比較して、増加している。他の実施形態では、遺伝子組換え植物、遺伝子組換え植物の一部または遺伝子組換え植物細胞において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を改変する方法が、本明細書に開示されている。この方法は、植物、その一部、または細胞におけるＣＳＬＧ遺伝子を遺伝子組み換えすることを含み、遺伝子組み換えは、ＣＳＬＧ遺伝子の発現を減少または消失させること、発現したＣＳＬＧ酵素の活性を低下させること、発現したＣＳＬＧ酵素の安定性を低下させること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。この植物、植物の一部または植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が、対応する非組換え植物、植物の一部、または植物細胞と比較して、減少している。
【０７２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に詳細に記載されている遺伝子組換え植物は、本明細書に開示されている少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が改変されている。
【０７３０】
特定の実施形態では、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を低減させる方法であって、少なくとも１つの植物細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする核酸遺伝子配列を標的とする少なくとも１つのサイレンシング分子を用いて少なくとも１つの植物細胞を形質転換するステップ、あるいは、（ｂ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を突然変異させるステップであって、変異誘発が、（１）核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）核酸配列内に欠失を導入すること、（３）核酸配列内に挿入を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、遺伝子組換え細胞におけるＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現は、対応する非組換え植物細胞と比較して減少し、遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１種のトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して減少する、該方法が、本明細書に開示されている。
【０７３１】
特定の実施形態では、植物またはその一部の少なくとも１つの細胞における、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法であって、少なくとも１つの植物細胞の遺伝子を組み換える遺伝子組換えステップを含み、遺伝子組換えステップは、（ａ）セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸配列を突然変異させるステップであって、変異誘発が、（１）核酸配列内に１以上の点突然変異を導入すること、（２）核酸配列内に欠失を導入すること、（３）核酸配列内に欠失を導入すること、または、（４）それらの任意の組み合わせを含み、導入が、コード配列または非コード配列を突然変異させることを含む、該ステップと、を含み、（ｂ）ＣＳＬＧをコードする核酸配列を発現させるステップと、を含み、遺伝子組換え細胞を含む植物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が、対応する非組換え植物と比較して増加する、該方法が、本明細書に開示されている。
【０７３２】
ステロイド系アルカロイド生合成酵素、ステロイド系サポニン生合成酵素、またはトリテルペノイド系サポニン生合成酵素（例えばこれに限定しないがＣＳＬＧ酵素など）をコードする少なくとも１つの核酸配列を突然変異させる方法は、上記の「Genetically Modified Cells & Genetically Modified Plants」のヘッダにおいて詳細に説明されている。同様に、ステロイド系アルカロイド生合成酵素、ステロイド系サポニン生合成酵素、またはトリテルペノイド系サポニン生合成酵素をコードする核酸配列、（例えば、ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸配列）を標的とした少なくとも１つのサイレンシング分子で植物細胞を形質転換する方法は、上記の「Genetically Modified Cells & Genetically Modified Plants」のヘッダの下に詳細に記載されている。これらの方法はその全体が本明細書に組み込まれており、遺伝子組換え植物またはその一部に含まれる遺伝子組換え細胞を生産するために使用される方法は、特定の実施形態において、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドの含有量を減少または増加させるために使用される方法と同一の方法であることを、当業者は理解できるであろう。これは特に、記載されている遺伝子組換え植物またはその一部は、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の少なくとも１つの含有量が改変されているためである。
【０７３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのサイレンシング分子がＣＳＬＧ酵素をコードする核酸遺伝子配列を標的とする場合、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素をコードする核酸遺伝子配列が突然変異している場合、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを増加させる方法または減少させる方法において、ＣＳＬＧ酵素のアミノ酸配列は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、あるいは、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、６６、８１、９４、９６、９８、１００、１０２、または１０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０７３４】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの誘導体は、それぞれ、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンのグリコシル化誘導体を含む。
【０７３５】
いくつかの実施形態では、突然変異は、非コード領域における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、コード領域における突然変異を含む。非コード領域における突然変異の非限定的な例は、ＣＳＬＧ遺伝子の発現を増加または減少させる突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、ＣＳＬＧ遺伝子の過剰発現を含み、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量が増加している。過剰発現のための方法は、本明細書に詳細に記載されており、当業者は、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列を含む構築物に構成的または誘導的プロモータが組み込まれてもよいことを理解できるであろう。いくつかの実施形態では、突然変異は、ＣＳＬＧ遺伝子の発現の低下を含み、遺伝子組換え植物細胞は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの減少を含む。発現を低下させるために核酸配列を特異的に標的化する方法は、全体を通して詳細に説明されており、当業者は、特定の実施形態において、発現の低下が、少なくとも１つのステロイド性アルカロイド、ステロイド性サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量の低下をもたらすことを理解できるであろう。
【０７３６】
いくつかの実施形態では、ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子のステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法において、ＣＳＬＧ酵素をコードする遺伝子の発現量が、遺伝子組換え植物細胞において、対応する非組換え植物細胞と比較して増加している、コードされたＣＳＬＧ酵素の活性が、遺伝子組換え植物細胞において、対応する非組換え植物細胞と比較して増加している、コードされたＣＳＬＧ酵素の安定性が、遺伝子組換え植物細胞において、対応する非組換え植物細胞と比較して増加している、または、それらの任意の組み合わせである。ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニン生合成経路の遺伝子（これに限定しないが、例えばＣＳＬＧ遺伝子など）をコードする核酸を突然変異させる方法は、上記に詳細に記載されており、酵素の安定性、活性またはそれらの組み合わせを増加させるためのコード領域の突然変異、及び／または、過剰発現のためのＣＳＬＧ遺伝子を発現する核酸配列の突然変異を含む。当業者であれば、特定の実施形態において、それらの突然変異の方法が本明細書でも使用され得ることを理解できるであろう。
【０７３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系アルカロイドの含有量を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイドの含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを減少させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むステロイド系アルカロイドの含有量を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイドの含有量と比較して、消失させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド性アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイドの含有量と比較して、消失させることを含む。
【０７３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、またはβ−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０７３９】
いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドが消失しているか、または、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイドは、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせが消失しているか、または、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせが消失しているか、または、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを減少させる方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドと少なくとも１つのステロイド系アルカロイド中間体との組み合わせを消失させることを含む。
【０７４０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドを増加させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系アルカロイドを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイドの含有量と比較して、増加させることを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドを含むステロイド系アルカロイドを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、α−トマチン、トマチン、デヒドロトマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系アルカロイドを増加させることを含む。
【０７４１】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、フロスタノール−２６−アルデヒド、２６−アミノフロスタノール、トマチデノール、トマチジン、トマチジンガラクトシド、γ−トマチン、β−１−トマチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成中間体を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、それらの組み合わせを増加させることを含む。
【０７４２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニンを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系サポニンの含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニンを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系サポニンの含有量と比較して、消失させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を減少させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系サポニンの含有量と比較して、消失させることを含む。
【０７４３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコンを含む。
【０７４４】
いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系サポニンは、ウットロシドＢ、トマトシドまたはそれらの組み合わせが消失しているか、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのステロイド系アルカロイド生合成中間体は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコンが消失しているか、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンを減少させる方法は、少なくとも１つのステロイド系サポニンと少なくとも１つのステロイド系サポニン生合成中間体との組み合わせを消失させることを含む。
【０７４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系サポニンを増加させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニンを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるステロイド系サポニンの含有量と比較して、増加させることを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、ウットロシドＢ、トマトシド、またはそれらの組み合わせを含むステロイド系サポニンを増加させることを含む。
【０７４６】
いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、コレステロール、２２−ヒドロキシコレステロール、２２，２６−ジヒドロキシコレステロール、フロスタノール型サポニンアグリコン、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのステロイド系サポニン生合成中間体を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、それらの組み合わせを増加させることを含む。
【０７４７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニンを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるトリテルペノイド系サポニンの含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物またはそれらの組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニンを、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるトリテルペノイド系サポニンの含有量と比較して、消失させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量と比較して、減少させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を減少させる方法は、毒素、苦味化合物、またはそれらの組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体を、非組換え植物細胞を含む植物またはその一部におけるトリテルペノイド系サポニンの含有量と比較して、消失させることを含む。
【０７４８】
いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、減少したトリテルペノイド系サポニン中間体は、化合物１、化合物２、薬原酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、オーガスチック酸（化合物４）、オーガスチック酸−３ＧｌｃＡ、またはグリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを減少させる方法は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンと１つのトリテルペノイド系サポニン生合成中間体との組み合わせを減少させることを含む。
【０７４９】
いくつかの実施形態では、減少した少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンは、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせが消失しているか、または、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、減少したトリテルペノイド系サポニン中間体は、化合物１、化合物２、薬原酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、オーガスチック酸（化合物４）、オーガスチック酸−３ＧｌｃＡ、またはグリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせが消失しているか、または、ほぼ消失している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを減少させる方法は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンと１つのトリテルペノイド系サポニン生合成中間体との組み合わせを消失させることを含む。
【０７５０】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗癌剤、低コレステロール剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、防虫剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニンを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニンを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、トリテルペノイド系サポニンであるグリチルリチン（化合物１４）を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンの含有量を増加させる方法は、トリテルペノイド系サポニンであるＱＳ−２１アジュバントを増加させることを含む。
【０７５１】
いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、化合物１、化合物２、薬原酸（化合物５）、オレアノール酸（化合物３）、オレアノール酸−３ＧｌｃＡ、オーガスチック酸（化合物４）、オーガスチック酸−３ＧｌｃＡ、またはグリチルレチン酸（化合物１３）、またはそれらの任意の組み合わせを含むトリテルペノイド系サポニン生合成中間体を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、それらの組み合わせを増加させることを含む。
【０７５２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変させることと、を含む。
【０７５３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させる方法は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を増加させることと、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を減少させることと、を含む。
【０７５４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が改変されている。
【０７５５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、少なくとも１つのステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が減少し、かつ、フィトステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、フィトコレステロール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、コレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、フィトコレステノール、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量が増加している。
【０７５６】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、あるいは、トリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変する（増加または減少させる）方法において、当該方法は、少なくとも１つの植物細胞の遺伝子を組み換えることを含み、いくつかの実施形態では、当該植物細胞は、葉細胞、葉柄細胞、植物の茎または柄細胞、根細胞、芽細胞、塊茎細胞、豆細胞、穀物若しくは穀粒細胞、果実細胞、ナッツ細胞、マメ細胞、種子または種子細胞、包葉細胞、カルス細胞、または花細胞を含む。
【０７５７】
いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイド、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、ステロイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体、またはトリテルペノイド系サポニン、その誘導体、その代謝物、またはその生合成中間体の含有量を改変する（増加または減少させる）方法において、当該方法は、少なくとも１つの植物細胞を遺伝子的に改変することを含み、いくつかの実施形態では、植物細胞は、本明細書に詳細に記載されている目、属、または種を含む。例えば、ポ配列ス目、カリオフィラ目、ソラナレス目、ファバレス目、マルバレス目、アピ配列ス目、ブラシカレス目、アスパラガス目、ディオスコレ配列ス目、またはリリ配列ス目の植物からの細胞を含む植物細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【０７５８】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を改変する方法におけるいくつかの実施形態では、ナデシコ目の植物は、ホウレンソウ属、アカザ属、ベータ属、及びレウム属からなる群から選択される。ナス目の植物は、タバコ属、ナス属、トウガラシ属からなる群から選択される。マメ目の植物は、グリシリザ属、メディカゴ属、キラヤ属、ダイズ属、及びハス属からなる群から選択される、セリ目の植物は、オタネニンジン属、ニンジン属、オランダミツバ属、及びパセリ属からなる群から選択される、イネ目の植物は、イネ属（例えば、イネ及びアフリカイネ［米］）、オオムギ属（例えば、オオムギ［大麦］）、カラスムギ属（例えば、オーツ麦［オーツ麦］、アウェナストリゴサ）、及びコムギ属（例えば、スペルト小麦［スペルト］）からなる群から選択される、または、フウチョウソウ目の植物は、シロイヌナズナ属（例えば、シロイヌナズナ）、アブラナ属（例えば、ヤセイカンラン［キャベツ］、カラシナ［ホワイトマスタード］、クロガラシ［ブラックマスタード］、セイヨウアブラナ）、フウチョウボク属（例えば、ケッパー［ケッパー］）、及びパパイヤ属（例えば、パパイヤ［パパイヤ］）からなる群から選択される。
【０７５９】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を改変する方法におけるいくつかの実施形態では、ナス目の植物は、ベンサミアナタバコ、トマト、ジャガイモ、ナス、野生型トマト、野生型ジャガイモ、ズルカマラ、及びトウガラシからなる種の群から選択される、マメ目の植物は、ウラルカンゾウ、アルファルファ、タルウマゴヤシ、キラヤ、ダイズ、及びミヤコグサからなる種の群から選択される、アオイ目の植物は、カカオ属から選択される、セリ目の植物は、オタネニンジン、ノラニンジン、セロリ、及びパセリからなる種の群から選択される、または、植物は、カカオ種から選択される。
【０７６０】
ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、及びトリテルペノイド系サポニンのインビトロでの産生方法
【０７６１】
インビトロシステムは当該技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるトリテルペノイド系サポニンの産生方法において使用されるインビトロ翻訳システムは、「rabbit reticulocyte lysate」、「wheat germ extract」、または「E. coli cell-free system」を含む。無細胞システムを使用するための詳細な方法は、当該技術分野で知られ、自由に利用することができ、これに限定しないが、例えば以下のウェブサイト「https://www.thermofisher.com/il/en/home/references/ambion-tech-support/large-scale-transcription/general-articles/the-basics-in-vitro-translation.html」で得られる情報を含む。
【０７６２】
いくつかの実施形態では、インビトロシステムにおいてステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法が、本明細書に開示されている。この方法は、（ａ）シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ７）遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ８）遺伝子、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（ＧＡＭＥ１１）遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ６）遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ４）遺伝子、トランスアミナーゼ（ＧＡＭＥ１２）遺伝子、トマチジンＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１）遺伝子、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＥ１７）遺伝子、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＥ１８）遺伝子、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ／キシロシルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＥ２／ＳＧＴ３）遺伝子、及びセルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＣＳＬＧ遺伝子またはＧＡＭＥ１５遺伝子）をコードする核酸配列（この核酸配列は、任意選択でベクター内に含まれている）を組み合わせること、（ｂ）当該遺伝子を発現させること、及び、（ｃ）発現した酵素の組み合わせを一緒にインキュベートすること、を含み、当該インキュベーションの生成物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを含む。
【０７６３】
いくつかの実施形態では、上記の核酸配列は、エチレン応答性エレメント結合因子１３（ＧＡＭＥ９）及び／またはＢＨＬＨ転写因子をさらに含む。
【０７６４】
いくつかの実施形態では、インビトロシステムにおいてステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法が、本明細書に開示されている。この方法は、（ｄ）シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ７）遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ８）遺伝子、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（ＧＡＭＥ１１）遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ６）遺伝子、及びセルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＣＳＬＧ遺伝子またはＧＡＭＥ１５遺伝子）をコードする核酸配列（この核酸配列は、任意選択でベクター内に含まれている）を組み合わせること、（ｅ）遺伝子を発現させること、及び、（ｆ）発現した酵素の組み合わせを一緒にインキュベートすること、を含み、当該インキュベーションの生成物は、少なくとも１つのステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニンまたはそれらの組み合わせを含む。例えば、これに限定しないが、図１、図８Ｄ、図１３、及び図１４Ａ−１４Ｄに示されている生合成経路及びそれによって得られる中間体及び産生物を参照されたい。
【０７６５】
いくつかの実施形態では、生合成ＧＡＭＥ遺伝子及び／またはＣＳＬＧ遺伝子は、コンストラクトを作製するために、本明細書で詳細に記載されているように、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに対して動作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０７６６】
いくつかの実施形態では、生合成ＧＡＭＥ遺伝子及び／またはＣＳＬＧ遺伝子は、コンストラクトを作製するために、本明細書で詳細に記載されているように、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに対して動作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ステロイド系アルカロイドまたはステロイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０７６７】
特定の実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生するインビトロの方法は、エスクレオシドまたはデヒドロエスクレオシドから選択されるステロイド系アルカロイドを産生することを含む。特定の実施形態では、ステロイド系アルカロイドを産生するインビトロの方法は、α−トマチン、トマチン、α−カコニン、α−ソラニン、α−ソラソニン、α−ソルマルギン、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるステロイド系アルカロイドを産生することを含む。
【０７６８】
特定の実施形態では、ステロイド系サポニンを産生するインビトロの方法は、ウットロシドＢ、トマトシドまたはそれらの任意の組み合わせから選択されるステロイド系サポニンを産生することを含む。
【０７６９】
いくつかの実施形態では、インビトロシステムにおいてトリテルペノイド系サポニンを産生する方法が、本明細書に開示されている。この方法は、（ｇ）サポニンβ−アミリン合成酵素遺伝子（ＳＯＡＰ１）、シトクロムＰ４５０遺伝子（ＳＯＡＰ２）、Ｃ−２ヒドロキシラーゼを発現するシトクロムＰ４５０遺伝子（ＳＯＡＰ３）、Ｃ−２３オキシダーゼを発現するシトクロムＰ４５０遺伝子（ＳＯＡＰ４）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼを発現するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＯＡＰ６）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを発現するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＯＡＰ７）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを発現するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＯＡＰ８）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼまたはキシロシルトランスフェラーゼを発現するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＯＡＰ９）、アシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＯＡＰ１０）、及びセルロース合成酵素様Ｇ遺伝子（ＣＳＬＧ）、をコードする核酸配列（この核酸配列は、任意選択でベクター内に含まれている）を組み合わせること、（ｈ）遺伝子を発現させること、及び、（ｉ）発現した酵素の組み合わせを一緒にインキュベートすること、を含み、当該インキュベーションの生成物は、少なくとも１つのトリテルペノイド系サポニンを含む。
【０７７０】
いくつかの実施形態では、生合成ＳＯＡＰ遺伝子及び／またはＣＳＬＧ遺伝子は、コンストラクトを作製するために、本明細書で詳細に記載されているように、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに対して動作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも５５％のカバレッジを有するそのホモログである。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも５５％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０７７１】
いくつかの実施形態では、生合成ＳＯＡＰ遺伝子及び／またはＣＳＬＧ遺伝子は、コンストラクトを作製するために、本明細書で詳細に記載されているように、プロモータ、転写終結配列、またはそれらの組み合わせに対して動作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生する方法において、ＣＳＬＧ遺伝子をコードする核酸配列は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、または１０５のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、６５、８０、９３、９５、９７、９９、または１０１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログであることが好ましい。
【０７７２】
いくつかの実施形態では、他のトリテルペノイド系サポニン生合成酵素をコードする核酸遺伝子配列は、（ａ）β−アミリン合成酵素遺伝子をコードする核酸配列が、配列番号４５に記載の核酸配列、または、配列番号４５に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｂ）シトクロムＰ４５０遺伝子をコードする核酸配列が、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号４６、５１、または５３のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、（ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする核酸配列が、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは、配列番号５５、５７、５９、または６１のいずれか１つに記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである、及び、（ｄ）アシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列が、配列番号６３に記載の核酸配列、または、配列番号６３に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性及び少なくとも８０％のカバレッジを有するそのホモログである。
【０７７３】
特定の実施形態において、トリテルペノイド系サポニンを産生するインビトロの方法は、甘味料、発泡剤、乳化剤、防腐剤、抗癌剤、低コレステロール剤、抗炎症剤、抗酸化剤、生物学的アジュバント、抗微生物剤、殺虫剤、防虫剤、抗真菌剤、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。
【０７７４】
特定の実施形態では、トリテルペノイド系サポニンを産生するインビトロの方法は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）（化合物６）、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、グリチルリチン（化合物１４）、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（化合物１５）、バヨゲニン（化合物２５）、バヨゲニン−ヘキサＡ−ヘキサ−ヘキサ（化合物３１）、セルジャン酸（化合物２６）、セルジャン酸−ヘキサＡ−ヘキサ（化合物３２）、ソヤサポゲノールＡ（化合物２９）、ソヤサポゲノールＢ（化合物３０）、ソヤサポゲノールＡ−ヘキサＡ−ヘキサ−ペント（化合物３４）、ソヤサポニンＶＩ（化合物３５）、ベタブルガロシドＩＶ（化合物３３）、ヘデラゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲニン−３ＧｌｃＡ、ギプソゲン酸−３ＧｌｃＡ、ＱＳ−２１アジュバント、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるトリテルペノイド系サポニンを産生することを含む。
【０７７５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明確に示さない限り、複数形も含むことを意図している。例えば、単数形の「分子」という用語は、分子の複数形も含む。
【０７７６】
本出願の全体を通じて、本発明の様々な実施形態を範囲形式で示すことがある。範囲形式での記載は単に利便性及び簡潔性のためのであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲に関する記載は、可能な部分範囲のすべて、並びに、その範囲内に含まれる個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、１から６までという範囲の記述は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６まで、・・・、という部分的な範囲、並びに、その範囲内に含まれる個々の数（例えば、１、２、３、４、５、及び６）を具体的に開示したものと見なされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０７７７】
本明細書において数値範囲を指定している場合は常に、指定された数値範囲内に含まれるすべての数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定数と第２の指定数と「の間の範囲」という用語、及び第１の指定数「から」第２の指定数「までの範囲」という用語は、本明細書では相互交換的に使用されており、第１の指定数及び第２の指定数、並びにこれらの間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。
【０７７８】
さらに、当業者であれば、本明細の全体を通じて使用される「〜を含む（comprising）」という用語は、本明細書に開示された遺伝子組換えまたは遺伝子編集植物、これらにおける遺伝子の発現を改変する方法、及び、これらにおけるＳＡ及び／またはＳＧＡの産生を改変する方法が、記載された要素を含むが、任意選択の他の要素を除外しないことを意味することを意図していることを理解できるであろう。したがって、「〜からなる（consisting of）」は、他の要素の形跡以上のものを除外することを意味するものとする。当業者であれば、いくつかの実施形態では、「〜を含む（comprising）」という用語が使用されているが、その用語は「〜からなる（consisting of）」という用語に置き換えてもよく、このような置き換えは、具体的に記載されていない要素の包含範囲を狭めることになることを理解できるであろう。
【０７７９】
以下の例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、これらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。また、これらは、決して、本明細書に開示された遺伝子組換え細胞及び遺伝子組換え植物、ステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンを産生するための細胞及び植物の使用、あるいは、植物またはその一部におけるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、またはトリテルペノイド系サポニンの含有量を増加または減少させるための方法の広い範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本明細書に開示された範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形及び修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【０７８０】
実施例１：実施例２〜１３の材料及び方法
【０７８１】
植物材料、処理、及び遺伝子導入植物の作製
【０７８２】
トマト（Solanum lycopersicum、栽培品種マイクロ・トム（Micro Tom））及びジャガイモ（Solanum tuberosum、栽培品種デジレー（Desiree））植物を、既報（前掲の「Itkin et al., 2001」）のように採取した。ジャガイモでは、緑色部分が乾燥し始めた際に、成熟塊茎（第３段階）を採取し、汚れを洗い落として乾燥し、４℃の完全暗所で保存した。
【０７８３】
対応するＧＡＭＥ９  ＤＮＡ断片をｐＫ７ＧＷＩＷＧ２（ＩＩ）バイナリーベクター及びｐＪＣＶ５２バイナリーベクターにそれぞれ導入することにより、ＧＡＭＥ９サイレンシング（ＲＮＡｉ）コンストラクト及び過剰発現（ＯＸ）コンストラクトを作製した。Ｉｔｋｉｎら（前掲の「2011」）の既報に従い、トマト及びジャガイモにおけるＧＡＭＥ９のサイレンシング及び過剰発現の遺伝子導入系を作製し、組織抽出物を調製し、解析した。
【０７８４】
以下の表３に、本明細書記載のコンストラクトの作製に用いたオリゴヌクレオチドを示す。ＧＡＭＥ４サイレンシング（ＲＮＡｉ；ＧＡＭＥ４ｉ）コンストラクト、ＧＡＭＥ４過剰発現（ＧＡＭＥ４ｏｅ）コンストラクト及びＧＡＭＥ８サイレンシングコンストラクトは、既報（前掲の「Itkin et al., 2001」；「WO 2012/095843」）のように作製した。
【０７８５】
表３：コンストラクトの作製に用いたオリゴヌクレオチド
【０７８６】
【表３】
2022500023.tif 000011
【０７８７】
共発現解析
【０７８８】
共発現解析においてトマトＧＡＭＥ１（Ｓｏｌｙｃ０７ｇ０４３４９０）及びそのジャガイモのオルソログＳＧＴ１（ＰＧＳＣ００３ＤＭＧ４０００１１７４９）を「ベイト（baits）」として用い、共発現遺伝子（各「ベイト」別）のリスト（ｒ値≧０．８で降順にソート）を作成した。次いで、２つの相同遺伝子を同定した（トマトにおけるＳｏｌｙｃ１２ｇ００６４６０及びジャガイモにおけるＰＧＳＣ０００３ＤＭＧ４０００２４２７４）。これらは「ベイト」遺伝子と高い相関があった（両種においてｒ値＞０．９）．それらの遺伝子は、ＧＬＹＣＯＡＬＫＡＬＯＩＤ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ４（ＧＡＭＥ４、「WO 2012/095843」）と同定した。ＧＡＭＥ４遺伝子を「ベイト」として、前述の（ＧＡＭＥ１）共発現解析にさらに加えた。両種におけるＧＡＭＥ１（ＳＧＴ１）及びＧＡＭＥ４の共発現のリストを用い、共発現相関ネットワークを作成した。解析は次のように行った。異なる組織、器官（果肉、皮、種子、根、葉、芽、花、花粉）、及び生育段階（合計２５の試験）から得られたトマトＲＮＡｓｅｑトランスクリプトームデータ（前掲の「Itkin et al., 2011」）、並びに異なる組織及び器官（合計４０の試験）から得られたジャガイモＲＮＡｓｅｑトランスクリプトームデータ（「US 2012/0159676」）を用いた。まず、Ｒスクリプトを用い、共発現解析（各種ごと）を行い、Ｐｅｒｌスクリプトを用い、共発現遺伝子のリストをＦＡＳＴＡファイルとして作成した。最後に、ＢＬＡＳＴａｌｌツール（「Camacho C. et al., 2009. BMC Bioinform 10:421」）を用い、これら２種間に共通のホモログを見出した。ホモログ類似性のｔｂｌａｓｔｘ基準としては、ｐ値＞０．０５、最小２５ヌクレオチド、及び少なくとも６０パーセントの類似性を、各遺伝子についての全体的な相同性として設定した。共発現ネットワークは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプログラム（「Shannon P. et al., 2003. Genome Res. 13:2498-2504」）によって可視化した。
【０７８９】
系統発生解析
【０７９０】
Ｍｕｓｃｌｅアルゴリズムを用いてタンパク質配列をアライメントし、系統樹を解析し、ＳｅａＶｉｅｗ  ｖ４．３．５プログラムにより、ＰｈｙＭＬ  ３．０による最尤法（「Exposito-Rodriguez M et al., 2008. BMC Plant Biol. 8:131」）を用い、以下の設定で可視化した。モデル−ＬＧ；近似尤度比検定（ａＬＲＴ）下平−長谷川様式（ＳＨ様式）の手順を統計的検定として用い、ブランチサポートを算出した（ブランチサポート−ａＬＲＴ（ＳＨ様式））；不変座位−最適化；座位間の進化速度変化−最適化；系統樹探索操作−ＮＮＩ及びＳＰＲに最適；開始系統樹−ＢｉｏＮＪ、樹形最適化。枝上の番号は、各節を支持するブートストラップ反復の比率を示す。この系統樹の作成に用いたタンパク質の受託番号及び器官名を以下の表４に示す。系統樹は図１２に示す。
【０７９１】
表４：系統樹の作成に用いた配列の受託番号
【０７９２】
【表４−１】
2022500023.tif 000012
【０７９３】
【表４−２】
2022500023.tif 000013
【０７９４】
代謝物の分析
【０７９５】
植物組織抽出物の調製並びにＵＰＬＣ−ｑＴＯＦ−ＭＳ及びトマトの葉のフィトステロール含量による半極性化合物（ステロイド系アルカロイド及びステロイド系サポニンを含む）のプロファイリングを、既報（前掲の「Itkin et al., 2011」）のように行った。
【０７９６】
定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ
【０７９７】
ＲＮＡを単離し、定量的リアルタイムＰＣＲを既報（前掲の「Itkin et al., 2011」）のように行った。また、ジャガイモ試料の内在性対照として、ＴＩＰ４１遺伝子（２３）を用いた。オリゴヌクレオチドは、上記の表３に記載した。
【０７９８】
組換え酵素の産生
【０７９９】
ＧＡＭＥ２、ＧＡＭＥ１７、及びＧＡＭＥ１８をｃＤＮＡから増幅し、ＢａｍＨ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉ（ＧＡＭＥ２、ＧＡＭＥ１８）またはＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ（ＧＡＭＥ１７）制限部位を用いてｐＡＣＹＣＤＵＥＴ−１にサブクローニングし、インサートをシークエンシングによって確認した。得られたプラスミド、ｐＡＣ−ＧＡＭＥ２／１７／１８を大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３に形質転換した。ＧＡＭＥ酵素を発現させるため、新鮮な終夜培養物を、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを含む２ｘＹＴ培地２５ｍＬ中で１：１００に希釈し、Ａ６００ｎｍが０．４となるまで、３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートし、ＧＡＭＥ酵素を発現させた。次いで、ＩＰＴＧを濃度が０．５ｍＭとなるように添加し、インキュベーションを１８℃及び２５０ｒｐｍで終夜継続した。翌日、遠心分離によって細胞を採取し、ペレットを、１５％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含むｐＨ＝７．０の５０ｍＭトリスＨＣｌ  ２ｍＬ中に再懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊した後、不溶性物質を遠心分離によって除去し、可溶性分画を酵素の特性評価に用いた。タンパク質は、さらなる解析まで−２０℃で保存した。
【０８００】
基質の調製
【０８０１】
加水分解するため、α−トマチン３５ｍｇを１Ｎ  ＨＣｌ  ３  ｍＬに溶解し、１００℃で１５分間インキュベートした。次いで、溶液を氷上に置き、溶液のｐＨが９．０になるまでＮＨ３を加えた。溶液を水飽和ブタノール４ｍＬで抽出した。ブタノール相を真空下で蒸発乾固させ、残存したペレットをメタノール１ｍＬに溶解し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。α−トマチンの分解物を、Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×２１．２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、米国）により、２５％アセトニトリル水溶液及び０．１％ギ酸によるアイソクラティック溶出を用いて分離した。化合物を３１００質量検出器（Ｗａｔｅｒｓ）で検出し、採取した。分画を凍結乾燥し、化合物の純度をＬＣ−ＭＳで確認した。生成物を同定するため、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＰＤＡ検出器に連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５  ＨＰＬＣと、次いで正イオン化モードで稼働させたＱＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｖ４．００．００質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，ＭＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，英国）とを用い、四重極飛行時間型質量分析法に連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）を行った。Ｃ１８プレカラム（２．０×４ｍｍ；ＡＪＯ−４２８６；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、米国）に取り付けた分析用カラムＬｕｎａ  ３μｍ  Ｃ１８（２）１００Å；１５０×２．０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、米国）を用いた。脱気した溶離液Ａ［超純水：ギ酸（１０００：１、ｖ／ｖ）］及び溶離液Ｂ［アセトニトリル：ギ酸（１０００：１、ｖ／ｖ）］を流量０．１９ｍＬ／分で用いた。グラジエントを溶離液Ｂ５％で開始し、４５分間で溶離液Ｂを７５％まで直線的に増加させ、その後カラムを洗浄し、次の注入前に１５分間平衡化した。注入量は５μＬとした。この手順により、数ミリグラムの純粋なγ−トマチン（トマチジン−ガラクトシド−グルコシド、Ｔ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ）及びβ１−トマチン（トマチジン−ガラクトシド−ジグルコシド、Ｔ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）を得た。トマチジンガラクトシド（Ｔ−Ｇａｌ）は、Ｔ−Ｇａｌ−Ｇｌｕによる強い混入のため、このようには精製できなかった。そこで、既報（前掲の「Itkin et al., 2011」）のように、トマチジン５ｍｇを、反応混合物１ｍＬ中で、ＧＡＭＥ１及びＵＤＰ−ガラクトースと共にインキュベートした。Ｔ−Ｇａｌを、固相抽出により、ＵＤＰ−ガラクトースから精製した。Ｗａｔｅｒｓ  ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ  ３  ｃｃカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を１００％メタノール６ｍＬでコンディショニングした後、超純水４ｍＬで洗浄した。１０％メタノールを添加した反応混合物を充填し、次いでカートリッジを超純水４ｍＬで洗浄した。化合物を７５％メタノール超純水溶液（ｖ：ｖ）１ｍＬ及び１００％メタノール０．４ｍＬで溶出した。完全に乾燥したペレットが得られるまで、高速真空濃縮器を用い、１つにまとめた溶出物から溶媒を除去した。
【０８０２】
酵素アッセイ
【０８０３】
基質Ｔ−Ｇａｌ、β１−及びγ−トマチンを、１ｍＭとなるように、５０％ＤＭＳＯに溶解した。５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含むｐＨ  ＝  ７．０の５０ｍＭトリスＨＣｌ中で、最終反応体積１００μＬ中、５μｇ／ｍＬの酵素、８ｍＭ  ＵＤＰ−キシロース、及び０．０２ｍＭ基質を用い、酵素アッセイを行った。撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした後、メタノール及び０．１％ギ酸３００μＬを加えて反応を停止した後、短時間のボルテックスと１５分間の超音波処理を行った。次いで、抽出物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＳＲＰ４、Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ）で濾過し、ＬＣ−ＭＳ（上記参照）によって分析した。生成物の量をＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおけるピーク面積によって測定し、空のｐＡＣＹＣＤＵＥＴ−１を保有する大腸菌の酵素調製品の対照インキュベーションと比較した。検出に用いた質量は、α−トマチン（Ｃ５０Ｈ８３ＮＯ２１；ｍ／ｚ＝１０３４．５５（［Ｍ＋Ｈ］＋））、β１−トマチンＴ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（Ｃ４５Ｈ７５ＮＯ１７；ｍ／ｚ＝９０２．５１（［Ｍ＋Ｈ］））、β２−トマチン（Ｃ４４Ｈ７３ＮＯ１６；ｍ／ｚ＝８７２．５０（［Ｍ＋Ｈ］＋））、γ−トマチンＴ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ（Ｃ３９Ｈ６５ＮＯ１２；ｍ／ｚ＝７４０．４６（［Ｍ＋Ｈ］））、及びＴ−Ｇａｌ（Ｃ３３Ｈ５５ＮＯ７；ｍ／ｚ＝５７８．４１（［Ｍ＋Ｈ］））であった。
【０８０４】
ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）試験
【０８０５】
既報（「Orzaea D et al., 2009. Plant Physiol. 150:1122-1134」；「Li R et al., 2006 J. Mass Spec. 41:1-22」）のようにして、ＧＡＭＥ遺伝子の断片を含むベクターを構築し、ＶＩＧＳ試験を行った。空ベクター及びヘルパーベクターｐＴＲＶ１を含むアグロバクテリウムに感染させた植物を、対照として用いた。ｐＴＲＶ２＿ＤＲ＿ＧＷベクターの作製に用いたオリゴヌクレオチドは、上記の表３に示した。
【０８０６】
ワイルドトマト種の遺伝子配列解析
【０８０７】
３つのトマト野生種（すなわち、ソラナム・ペネリ（Solanum pennellii）、カラントトマト（S. pimpinellifolium）、及びソラナム・ケミエレウスキィ（S. chmielewskii））の部分的なリシークエンシングによって得られたゲノムデータ（Dr.Arnaud G. Bovy、未発表データ）を、トマトの７番及び１２番染色体上のＳＧＡ生合成遺伝子クラスターにアライメントする配列（コンティグ）の有無について解析した。ＴｏｐＨａｔツールキット（「Trapnell C. 2012. Nat. Protoc. 7:562-578」）を用い、野生種の読み取りを、リファレンスゲノムとして、トマトゲノム（ＩＴＡＧ  ２．４）にマッピングした。マップされた読み取りを、ＩＧＶゲノムブラウザ（「Robinson J T et al., 2011. Nat. Biotechnol. 29:24-26」）で可視化した。既存の栽培トマトの７番及び１２番染色体の配列の遺伝子クラスターに対し、３つの野生種由来のコンティグの配列を組み立ててアライメントするため、ＣＬＣワークベンチ、ＣＡＰ３  ＢＷＡ及びＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェアパッケージの組み合わせと、自家Ｐｅｒｌスクリプトとを用いた。
【０８０８】
実施例２：ＳＧＡ生合成に関連する遺伝子
【０８０９】
ＳＧＡ生合成に関連する遺伝子を見出すため、トマト及びジャガイモのトランスクリプトームデータを用いた共発現解析を行った。ジャガイモまたはトマトのいずれかにおける「ベイト」としてのＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１（７番染色体）及びＧＡＭＥ４（１２番染色体）の共発現を、以下の表５〜８にヒートマップの形式で示す。ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１（７番染色体）またはＧＡＭＥ４（１２番染色体）のいずれかと高度に共発現する遺伝子は、大きなフォント及び太字で示す。
【０８１０】
表５：受託番号、推定タンパク質、及び共発現ｒ値−トマト、７番染色体
【０８１１】
【表５−１】
2022500023.tif 000014
【０８１２】
【表５−２】
2022500023.tif 000015
【０８１３】
表６：受託番号、推定タンパク質、及び共発現ｒ値−ジャガイモ、７番染色体
【０８１４】
【表６】
2022500023.tif 000016
【０８１５】
表７：受託番号、推定タンパク質、及び共発現ｒ値−トマト、１２番染色体
【０８１６】
【表７】
2022500023.tif 000017
【０８１７】
表８：受託番号、推定タンパク質、及び共発現ｒ値−ジャガイモ、１２番染色体
【０８１８】
【表８】
2022500023.tif 000018
【０８１９】
各種由来の１６の遺伝子が、ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１と共発現した（表９、図２）。これらの遺伝子のうちの１つは、以前ＧＬＹＣＯＡＬＫＡＬＯＩＤ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ４（ＧＡＭＥ４）と呼ばれていたもので、シトクロムＰ４５０タンパク質の８８Ｄサブファミリーのメンバーをコードする（図３）。ＧＡＭＥ４及びＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１は、トマト及びジャガイモにおいて、極めて類似の発現プロファイルを示す（「WO 2010/095843」）。トマト及びジャガイモにおけるＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１及びＧＡＭＥ４遺伝子は、それらと共発現した遺伝子のいくつかと物理的に近くなるように、７番及び１２番染色体に位置している（図２）。
【０８２０】
ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１共発現遺伝子のクラスターは、７番染色体上の約２００Ｋｂｐのゲノム領域に広がっている。ＧＡＭＥ１と共に、トマトのクラスターは、７つの共発現遺伝子から構成されている。これらには、３つのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ［ＧＡＭＥ２（ジャガイモではＳＧＴ３と呼ぶ）、ＧＡＭＥ１７、及びＧＡＭＥ１８］、７２ＡサブファミリーのシトクロムＰ４５０（ＧＡＭＥ６）、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（ＧＡＭＥ１１）、及びセルロース合成酵素様タンパク質（ＧＡＭＥ１５）が含まれる。ジャガイモでは、ＧＡＭＥ１７及びＧＡＭＥ１８  ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼをコードするトマトの遺伝子のホモログがないため、このクラスターは５つの共発現遺伝子を含むものと考えられる。４つの組換えクラスター化トマトＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼによって、酵素活性アッセイを行った。ＧＡＭＥ１７及びＧＡＭＥ１８は、基質としてトマチジンガラクトシド（Ｔ−Ｇａｌ）及びγ−トマチン（Ｔ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ）とそれぞれインキュベートした際、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を示した。一方、ＧＡＭＥ２は、基質としてβ１−トマチン（Ｔ−Ｇａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）とインキュベートした際、ＵＤＰ−キシロシルトランスフェラーゼ活性を示した（図４Ｅ、４Ｆ、及び４Ｇ）。ＧＡＭＥ１は、トマトにおいて、トマチジンＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼとして作用することが、既報において示されている（前掲の「Itkin et al., 2011」）。４つの組換えＵＧＴ酵素を単一の試験管内で、トマチジン及び全てのグリコシド供与体（ＵＤＰ−ガラクトース、−グルコース及び−キシロース）とインキュベートすると、最終的なＳＧＡ生成物であるα−トマチンの蓄積が認められた（図４Ｈ）。
【０８２１】
推定転写因子をコードする２つの遺伝子は、ＧＡＭＥ１／ＳＧＴ１及びＧＡＭＥ４と共発現した遺伝子の中から同定され（図４）、ＧＡＭＥ９と呼ばれる１つの遺伝子は、トマトＩＤ  Ｓｏｌｙｃ０１ｇ０９０３４０及びジャガイモＩＤ  ＰＧＳＣ０００３ＤＭＧ４０００２５９８９によって同定された。この遺伝子はエチレン応答性要素結合因子１３と呼ばれ、推定上のＡＰ２ドメインを含む。もう一方の遺伝子は、トマトＩＤ  Ｓｏｌｙｃ０３ｇ０４６５７０及びジャガイモＩＤ  ＰＧＳＣ０００３ＤＭＧ４０００１２２６２によって同定されたＢＨＬＨ−転写因子である。
【０８２２】
表９：図２に示したジャガイモ及びトマトの両者における既知及び推定ステロイド系アルカロイド関連遺伝子と共発現させたホモログの詳細
【０８２３】
トマト及びジャガイモの配列は、Ｓｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（solgenomics.net）から入手した。共発現のｒ値≧０．８。ＴＣＯＮ番号：ＲＮＡｓｅｃデータの組み立てにおいて本発明者らによって付与されたコンティグ参照名。Ｎ／Ａ：なし。
【０８２４】
【表９】
2022500023.tif 000019
【０８２５】
実施例３：ＧＡＭＥ９転写因子の機能解析
【０８２６】
対応するＧＡＭＥ９  ＤＮＡ断片をｐＫ７ＧＷＩＷＧ２（ＩＩ）バイナリーベクター及びｐＪＣＶ５２バイナリーベクターにそれぞれ導入することにより、ＧＡＭＥ９サイレンシング（ＲＮＡｉ）コンストラクト及び過剰発現（ＯＸ）コンストラクトを作製した。それぞれのＧＡＭＥ９サイレンシングコンストラクト及び過剰発現コンストラクトによって形質転換した遺伝子導入トマト及びジャガイモ系を、既報（前掲の「Itkin et al., 2011」）のように作製した。Ｉｔｋｉｎら（前掲の「2011」）の既報のように、組織抽出物を調製し、解析した。配列番号１８は、ＧＡＭＥ９  ＲＮＡｉサイレンシング分子の配列を示す。遺伝子導入及び野生型トマト植物及び／またはジャガイモ植物の葉及び／または塊茎から得た抽出物に対し、ＵＰＬＣ−ＴＱ−ＭＳを用いたステロイド系アルカロイドの代謝プロファイリングを行った。ＧＡＭＥ９をコードする遺伝子がサイレンシングされたジャガイモ系（ＧＡＭＥ９−ＲＮＡｉ系）のジャガイモの塊茎の皮から得た抽出物では、α−ソラニン及びα−カコニンの低下が認められた（それぞれ図５Ａ及び５Ｂ）。ジャガイモのＧＡＭＥ９−過剰発現系の葉は、野生型に比べ、より高レベルのα−ソラニン（図５Ｃ）及びα−カコニン（図５Ｄ）を含んでいた。同様の蓄積パターンがジャガイモの葉で認められ、ＲＮＡｉ系ではα−カコニン及びα−ソラニンの量が低下し、ＧＡＭＥ９−転写因子を過剰発現する系では、これらのステロイド系アルカロイドの量が増加した（図６）。
【０８２７】
トマトでは、ＧＡＭＥ９−転写因子（５８７９と呼ばれる）を過剰反応する系の葉の抽出物が、野生型植物から得た葉の抽出物中の量に比べ、より高レベルのα−トマチンを含んでいた。逆に、ＧＡＭＥ９−転写因子（５８７１系）の発現をダウンレギュレーションさせたところ、α−トマチン含有量が著しく低下した。
【０８２８】
実施例４：ＧＡＭＥ遺伝子の機能特性評価
【０８２９】
ＧＡＭＥ１１サイレンシング植物
【０８３０】
ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）は、植物の各種器官の遺伝子を全体的にサイレンシングすることが可能な、一般的に用いられる手法である（「Dinesh-Kumar S P et al., 2003. Methods Mol Biol 236:287-294」）。配列番号１９は、ＧＡＭＥ１１  ＲＮＡｉサイレンシング分子の配列を示す。
【０８３１】
クラスター中の推定ジオキシゲナーゼであるＧＡＭＥ１１をＶＩＧＳでサイレンシングしたものを用いてトマトの葉を分析したところ、α−トマチンレベルが著しく低下し、いくつかのコレスタノール型ステロイド系サポニンが蓄積されていることが判明した。
【０８３２】
トマトのＧＡＭＥ１１ジオキシゲナーゼをサイレンシングすると、葉のα−トマチンレベル（ｍ／ｚ＝１０３４．５）が減少し（図８Ａ）、コレスタノール型ステロイド系サポニン［すなわち、ＳＴＳｓ；ｍ／ｚ＝１３３１．６、１３３３．６、１１９９．６、１２０１．６（主要サポニン）］が蓄積する（図８Ｂ）。図８Ｃは、ｍ／ｚ＝１３３１．６（１９．２８分）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図８Ｄは、ＧＡＭＥ１１をサイレンシングした葉に蓄積する、１９．２８分で溶出するサポニンのフラグメンテーションパターンを示す。図８ＣのＭＳ／ＭＳクロマトグラムにおいて、対応する質量シグナルをアステリスクで示した。元素組成及びフラグメンテーションパターンによると、化合物は、（フロスタノール型サポニンに比べて）水酸基１つとＥ環がなく、そのためＥ環の互変異性化及びマクラファティ転位の代わりに複数の水分子の消失を伴うフラグメンテーションをもたらす、コレスタノール型サポニンであることがわかる。
【０８３３】
ＧＡＭＥ１８サイレンシング植物
【０８３４】
α−トマチンの四糖類部分の形成におけるＧＡＭＥ１８の役割は、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）アッセイにおいて、ＧＡＭＥ１８をサイレンシングした果実では、対照試料には存在しなかったγ−トマチンが蓄積されたことから支持される（図９）。
【０８３５】
ＧＡＭＥ１８をサイレンシングした成熟緑色果実から抽出した代謝物のうち、γ−トマチン標準物質（ｍ／ｚ＝７４０．５）（図９Ａ〜Ｃ）及びγ−トマチンペントシド（ｍ／ｚ＝８７２．５）（図９Ｄ〜９Ｅ）に対応する、新たに蓄積した化合物のピークが検出された。
【０８３６】
ＧＡＭＥ１２サイレンシング植物
【０８３７】
トマトのＧＡＭＥ１２トランスアミナーゼをサイレンシングしたところ、フロスタノール型ステロイド系サポニンが蓄積した（図４Ｄ）。図１０Ａは、ＧＡＭＥ１２をサイレンシングした葉においてＳＴＳ（ｍ／ｚ＝７５３．４）が蓄積することを示す。一方、ＳＴＳは、野生型の葉では少量のみが存在する（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、１９．２８分におけるｍ／ｚ＝７５３．４のＭＳ／ＭＳスペクトルを、フラグメントの説明と共に示す。ＭＳ／ＭＳ試験で認められた特徴的な質量フラグメントから判断した、１９．７１分のおけるＳＴＳについて提案される構造を図１０Ｄに示す。
【０８３８】
ＧＡＭＥ７及びＧＡＭＥ８の機能
【０８３９】
強固に共発現し、ゲノムの他の箇所に位置する遺伝子についても、機能的な検討を行った。ＧＡＭＥ７及びＧＡＭＥ８と呼ばれる２つの遺伝子は、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ７２サブファミリーに属する。ＧＡＭＥ７は両種（ジャガイモ及びトマト）で共発現したのに対し、ＳｔＧＡＭＥ８ａ及びＳｔＧＡＭＥ８ｂはジャガイモでＳｔＳＧＴ１及びＳｔＧＡＭＥ４と強く共発現した。現在、本発明者らは、ＧＡＭＥ７についてのＳＧＡ関連活性を実証できていないが、ＧＡＭＥ６については、ＳＧＡの代謝への関与が示唆されている（「US 20120159676」）。さらに、ＧＡＭＥ８をサイレンシングしたトマトの葉では、ＳＧＡの生合成経路（図１）において中間体として提案されている２２−（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールが蓄積された（図１１Ａ〜１１Ｄ）。ＧＡＭＥ８をサイレンシングした系では、野生型（図１１Ｄ）に比べ、両異性体を蓄積する。（Ｒ）異性体がより多いことから、ＧＡＭＥ８の基質である可能性が高い。
【０８４０】
図１２は、植物ＣＹＰ４５０タンパク質ファミリーにおけるＧＡＭＥ遺伝子の系統樹を示す。枝上の番号は、各節を支持するブートストラップ反復の比率を示す。
【０８４１】
実施例５：ナス科植物で提案されている生合成経路
【０８４２】
トマトに関する図１３（点線の矢印は経路における複数の酵素反応を表す）の概略図に示したように、ナス科植物では、拡張した生合成経路が提案されている。この経路は、便宜上４つの部分に分けることができる。パートＩでは、一連の反応（例えば、ＳＳＲ２、ＳＭＯ３、ＳＭ０４によって触媒される）により、シクロアルテノールがコレステロールに変換される。副産物には、トリテルペノイド及びフィトステロールが含まれる。パートＩＩでは、一連の反応（例えば、ＧＡＭＥ１１、ＧＡＭＥ６、ＧＡＭＥ４、ＧＡＭＥ１２、ＧＡＭＥ２５によって触媒される）により、コレステロールがトマチン（アグリコン）に変換される。副産物には、ステロイド系サポニン（例えば、ウットロシド（uttroside）Ｂ）が含まれる。パートＩＩＩでは、一連の反応（例えば、ＧＡＭＥ１、ＧＡＭＥ１７、ＧＡＭＥ１８、ＧＡＭＥ２によって触媒される）により、トマチンがステロイド系グリコアルカロイド（例えば、α−トマチン）に変換される。パートＩＶでは、一連の反応により、緑色のトマトのステロイド系グリコアルカロイド（例えば、α−トマチン）が赤色のトマトのリコペロシド（lycoperosides）及び／またはエスクレオシド（esculeosides）（例えば、エスクレオシドＡ）に変換される。
【０８４３】
実施例６：トマト、ジャガイモ、及びナスにおけるステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）生合成に関与する経路
【０８４４】
トマト、ジャガイモ、及びナスにおけるセルロース合成酵素様遺伝子（ＧＡＭＥ１５）は、ステロイド系グリコアルカロイド（ＳＧＡ）の生合成（図１４Ａ〜１４Ｃ）に関連することが確認されている。この遺伝子は、その他のＳＧＡ生合成遺伝子（例えば、ＧＡＭＥ４、ＧＡＭＥ１２）及びＳＧＡ生合成の制御因子（例えば、ＧＡＭＥ９）とも、強く共発現されることが示されている。図１４Ｄは、ナス科植物において提案された経路の非限定的な例を示す。例えば、これに限定されるものではないが、当業者であれば、ＧＡＭＥ１５のグルクロン酸トランスフェラーゼ活性によるトマチジンからのトマチジン３−Ｏ−グルクロニドの産生が、この経路に包含されることを認識するであろう。特定の実施形態において、ＧＡＭＥ１５酵素は、ナス科植物、例えば、これらに限定されるものではないが、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ズルカマラ（Solanum dulcamara）、及びナス（Solanum melogena）に存在するＧＡＭＥ１５を含む。
【０８４５】
配列は以下のように同定された。
【０８４６】
セルロース合成酵素様＿トマト
【０８４７】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴ
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【０８４８】
セルロース合成酵素様（トマト）
【０８４９】
ＭＫＫＴＭＥＬＮＫＳＴＶＰＱＰＩＴＴＶＹＲＬＨＭＦＩＨＳＩＩＭＬＡＬＩＹＹＲＶＳＮＬＦＫＦＥＮＩＬＳＬＱＡＬＡＷＡＬＩＴＦＧＥＦＳＦＩＬＫＷＦＦＧＱＧＴＲＷＲＰＶＥＲＤＶＦＰＥＮＩＴＣＫＤＳＤＬＰＰＩＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＡＤＤＧＧＣＰＬＳＬＹＡＭＥＱＡＣＬＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＮＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＤＤＤＲＶＬＫＮＤＤＦＡＡＥＭＫＥＩＫＬＫＹＥＥＦＱＱＫＶＥＨＡＧＥＳＧＫＩＮＧＮＶＶＰＤＲＡＳＬＩＫＶＩＮＥＲＥＮＥＫＳＶＤＤＭＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＦＮＲＬＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＭＳＮＡＰＹＶＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＩＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＳＤＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＲＫＡＬＹＴＳＰＧＶＫＥＡＹＬＳＳＰＥＫＨＦＧＲＳＫＲＦＬＡＳＬＥＥＫＮＧＹＶＫＡＤＫＶＩＳＥＤＩＩＥＥＡＫＭＬＡＴＣＡＹＥＤＧＴＨＷＧＱＥＩＧＹＳＹＤＣＨＬＥＳＴＦＴＧＹＬＬＨＣＫＧＷＴＳＴＹＬＹＰＤＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＩＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＬＳＳＲＭＲＴＬＱＣＭＣＹＡＹＬＭＹＦＴＬＹＳＷＧＭＶＭＹＡＳＶＰＳＩＧＬＬＦＤＦＱＶＹＰＥＶＨＤＰＷＦＡＶＹＶＩＡＦＩＳＴＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＥＧＧＳＶＫＴＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＬＫＡＩＹＤＫＩＶＧＴＱＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＬＰＬＩＡＦＳＶＬＮＬＶＧＦＩＶＧＡＮＨＶＦＩＴＭＮＹＡＧＶＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＶＳＦＬＫＶＳ［配列番号３１］。
【０８５０】
セルロース合成酵素様（solanum pennellii）
【０８５１】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＣＴＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＧＴＣＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＣＧＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＧＡＧＴＡＧＴＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＡＡ［配列番号３２］。
【０８５２】
セルロース合成酵素様（solanum pennellii）
【０８５３】
ＭＫＫＴＭＥＬＮＫＳＴＶＰＱＰＩＴＴＶＹＲＬＨＭＦＩＨＳＩＩＭＬＡＬＩＹＹＲＶＳＮＬＦＫＦＥＮＩＬＳＬＱＡＬＡＷＬＬＩＴＦＧＥＦＳＦＩＬＫＷＦＦＧＱＧＴＲＷＲＰＶＥＲＤＶＦＰＥＮＩＴＣＫＤＳＤＬＰＰＩＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＡＤＤＧＧＣＰＬＳＬＹＡＭＥＱＡＣＬＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＫＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＤＤＤＲＶＬＫＮＤＤＦＡＡＥＭＫＥＩＫＬＫＹＥＥＦＱＱＮＶＥＨＡＧＥＳＧＫＩＮＧＮＶＶＰＤＲＡＳＬＩＫＶＩＮＥＲＥＮＥＫＳＶＤＤＬＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＦＮＲＬＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＭＳＮＡＰＹＶＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＩＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＳＤＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＲＫＡＬＹＴＳＰＧＶＫＥＡＹＬＳＳＰＥＫＨＦＧＲＳＫＫＦＬＡＳＬＥＥＫＮＧＹＶＫＡＤＫＶＩＳＥＤＩＩＥＥＡＫＩＬＡＴＣＡＹＥＤＧＴＨＷＧＱＥＩＧＹＳＹＤＣＨＬＥＳＴＦＴＧＹＬＬＨＣＫＧＷＴＳＴＹＬＹＰＤＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＩＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＬＳＳＲＭＲＴＬＱＣＭＣＹＡＹＬＭＹＦＴＬＹＳＷＧＭＶＭＹＡＳＶＰＳＩＧＬＬＦＧＦＱＶＹＰＥＶＨＤＰＷＦＡＶＹＶＩＡＦＩＳＴＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＥＧＧＳＶＫＴＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＬＫＡＩＹＤＫＩＶＧＴＱＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＬＰＬＩＡＦＳＶＬＮＬＶＧＦＩＶＧＡＮＨＶＦＩＴＭＮＹＡＧＶＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＶＳＦＬＫＶＳ［配列番号３３］。
【０８５４】
セルロース合成酵素様（ジャガイモ）
【０８５５】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＣＴＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＴＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＡＡ［配列番号３４］。
【０８５６】
セルロース合成酵素様（ジャガイモ）
【０８５７】
ＭＥＬＮＫＳＴＶＰＱＰＩＴＴＩＹＲＬＨＭＦＩＨＳＩＩＭＶＡＬＩＹＹＲＶＳＮＬＦＫＦＥＮＩＬＳＬＱＡＬＡＷＶＬＩＴＦＧＥＦＳＦＩＬＫＷＦＦＧＱＧＴＲＹＲＰＶＥＲＤＶＦＰＥＮＩＴＣＫＤＳＤＬＰＰＩＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＡＤＤＧＧＣＰＬＳＬＹＡＭＥＥＡＣＶＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＫＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＤＤＥＲＶＬＫＮＤＤＦＤＡＥＭＫＥＩＫＬＫＹＥＥＦＱＱＮＶＥＲＡＧＥＳＧＫＩＮＧＮＶＶＰＤＲＡＳＦＩＫＶＩＮＤＲＫＡＥＳＥＫＳＡＤＤＬＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＦＮＲＬＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＭＳＮＡＰＹＩＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＩＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＳＤＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＲＫＡＬＹＴＳＰＧＶＫＥＥＹＬＳＳＰＥＫＨＦＧＲＳＫＫＦＬＡＳＬＥＥＫＮＧＹＶＫＡＥＫＶＩＳＥＤＩＶＥＥＡＫＴＬＡＴＣＡＹＥＤＧＴＨＷＧＱＥＩＧＹＳＹＤＣＨＬＥＳＴＦＴＧＹＬＬＨＣＫＧＷＲＳＴＹＬＹＰＤＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＩＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＦＳＳＲＭＫＴＬＱＣＭＣＹＡＹＬＩＹＦＴＬＹＳＷＧＭＶＬＹＡＳＶＰＳＩＧＬＬＦＧＦＱＶＹＰＤＶＨＤＰＷＦＡＶＹＶＩＡＦＩＳＡＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＤＧＧＳＦＫＳＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＬＫＡＩＬＤＲＩＩＧＴＥＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＶＰＬＩＡＦＳＬＬＮＬＶＧＦＩＶＧＡＮＨＶＦＩＴＭＮＹＡＧＶＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＶＳＦＬＫＶＳ［配列番号３５］。
【０８５８】
セルロース合成酵素様（solanum chacoense）
【０８５９】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＴＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＴＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＡＡ［配列番号３６］。
【０８６０】
セルロース合成酵素様（solanum chacoense）
【０８６１】
ＭＫＫＴＭＥＬＮＫＳＴＶＰＱＰＩＴＴＩＹＲＬＨＭＦＶＨＳＩＩＭＡＡＬＩＹＹＲＶＳＮＬＦＫＦＥＮＩＬＳＬＱＡＬＡＷＶＬＩＴＦＧＥＦＳＦＩＬＫＷＦＦＧＱＧＴＲＷＲＰＶＥＲＤＶＦＰＥＮＩＴＣＫＤＳＤＬＰＰＩＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＡＤＤＧＧＣＰＬＳＬＹＡＭＥＥＡＣＶＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＫＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＤＤＤＲＶＬＫＮＤＤＦＤＡＥＭＫＥＩＫＬＫＹＥＥＦＱＱＮＶＥＲＡＧＥＳＧＫＩＮＧＮＶＶＰＤＲＡＳＦＩＫＶＩＮＤＲＫＴＥＳＥＫＳＡＤＤＬＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＦＮＲＬＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＭＳＮＡＰＹＩＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＩＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＳＤＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＲＫＡＬＹＴＳＰＧＶＫＥＥＹＬＳＳＰＥＫＨＦＧＲＳＫＫＦＬＡＳＬＥＥＫＮＧＹＶＫＡＥＫＶＩＳＥＤＩＶＥＥＡＫＴＬＡＴＣＡＹＥＤＧＴＨＷＧＱＥＩＧＹＳＹＤＣＨＬＥＳＴＦＴＧＹＬＬＨＣＫＧＷＴＳＴＹＬＹＰＤＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＩＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＬＳＳＲＭＫＴＬＱＣＭＣＹＡＹＬＩＹＦＴＬＹＳＷＧＭＶＬＹＡＳＩＰＳＩＧＬＬＦＧＦＱＶＹＰＥＶＨＤＰＷＦＡＶＹＶＩＡＦＩＳＴＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＥＧＧＳＦＫＳＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＬＫＡＩＬＤＫＩＩＧＴＥＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＶＰＬＩＡＦＳＬＬＮＬＶＧＦＩＶＧＡＮＨＶＦＩＴＭＮＹＡＧＶＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＶＳＦＬＫＶＳ［配列番号３７］。
【０８６２】
セルロース合成酵素様（ナス）
【０８６３】
ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＴＡＡＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＡＴＡＴＡＣＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴＡＴＣＡＣＧＴＴＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＧＡＧＣＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＡＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＴＣＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＴＴＡＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＴＴＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＣＡＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＣＧＧＡＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＣＣＧＧＡＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＡＴＣＧＧＴＴＡＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＴＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＡ［配列番号３８］。
【０８６４】
セルロース合成酵素様（ナス）
【０８６５】
ＭＫＫＱＭＥＬＮＲＳＶＶＰＱＰＩＴＴＩＹＲＬＨＭＦＩＨＡＬＩＭＬＡＬＩＹＹＲＶＳＮＬＡＫＦＥＮＩＬＳＬＱＡＬＡＷＡＬＩＴＬＧＥＬＣＦＩＶＫＷＦＦＧＱＧＴＲＷＲＰＶＤＲＤＶＦＰＥＮＩＴＣＰＤＳＥＬＰＰＩＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＳＤＤＧＧＣＰＬＴＬＹＡＭＥＥＡＣＳＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＫＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＥＤＤＲＶＬＫＳＤＤＦＶＳＥＭＫＥＭＫＳＫＹＥＥＦＱＱＮＶＤＲＡＧＥＳＧＫＩＫＧＤＶＶＰＤＲＰＡＦＬＫＶＬＮＤＲＫＴＥＮＥＫＳＡＤＤＬＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＴＨＲＲＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＩＳＮＡＰＹＩＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＩＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＰＤＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＫＫＡＬＹＴＳＰＧＬＫＤＥＹＬＳＳＰＥＫＨＦＧＴＳＲＫＦＩＡＳＬＥＥＮＮＹＶＫＱＥＫＶＩＳＥＤＩＩＥＥＡＫＲＬＡＴＣＡＹＥＤＧＴＨＷＧＱＥＡＮＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＩＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＦＫＳＲＭＲＴＬＱＶＬＣＹＡＹＬＭＹＦＳＬＹＳＷＧＭＶＬＨＡＳＶＰＳＩＧＬＬＳＧＩＫＩＹＰＥＶＹＤＰＷＦＶＶＹＶＩＡＦＩＳＴＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＥＧＧＳＶＫＴＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＶＫＡＩＶＤＫＩＩＧＴＱＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＶＰＬＩＴＦＳＶＬＮＬＶＧＦＬＶＧＩＮＱＶＬＩＴＭＫＦＡＧＶＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＶＳＦＬＫＤＳ［配列番号３９］。
【０８６６】
セルロース合成酵素様（トウガラシ（capsicum annuum））
【０８６７】
ＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＡＴＡＣＴＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＡＴＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＣＴＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＧＧＧＧＧＣＴＴＡＴＣＡＣＣＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＣＴＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＡＣＧＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＴＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＡＣＡＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＴＡＣＴＧＧＴＣＴＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＧＡＴＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＣＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＧＧＣＴＡＴＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＡＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＡＴＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＡＡ［配列番号４０］。
【０８６８】
セルロース合成酵素様（トウガラシ（capsicum annuum））
【０８６９】
ＭＥＬＮＲＣＴＶＱＱＰＴＴＡＩＹＲＬＨＭＦＬＨＳＬＩＭＬＡＬＶＹＹＲＬＳＮＬＦＹＦＥＮＶＬＴＬＱＡＦＡＷＧＬＩＴＬＧＥＩＣＦＩＶＫＷＦＦＧＱＧＴＲＷＲＰＶＶＲＥＶＦＬＤＮＩＴＣＱＤＳＥＬＰＡＬＤＶＭＶＦＴＡＮＰＫＫＥＰＩＶＤＶＭＮＴＶＩＳＡＭＡＬＤＹＰＴＤＫＬＡＶＹＬＡＤＤＧＧＣＰＬＴＬＹＡＭＥＥＡＣＳＦＡＫＬＷＬＰＦＣＲＫＹＧＩＫＴＲＣＰＫＡＦＦＳＰＬＧＥＤＤＲＩＬＫＮＤＤＦＶＡＥＭＫＥＩＫＬＫＹＥＥＦＱＱＮＶＮＬＡＧＥＳＧＫＩＫＧＤＶＶＰＤＲＡＳＦＩＫＶＩＮＤＲＫＭＥＮＫＫＳＡＤＤＩＴＫＭＰＬＬＶＹＶＳＲＥＲＲＦＮＳＲＨＨＦＫＧＧＳＡＮＡＬＬＲＶＳＧＩＭＳＮＡＰＹＬＬＶＬＤＣＤＦＦＣＨＤＰＴＳＡＲＫＡＭＣＦＨＬＤＰＫＬＳＰＳＬＡＹＶＱＦＰＱＶＦＹＮＶＳＫＳＤＩＹＤＶＫＩＲＱＡＹＫＴＩＷＨＧＭＤＧＩＱＧＰＶＬＳＧＴＧＹＦＬＫＲＫＡＬＹＴＳＰＧＬＫＤＥＹＬＩＳＰＥＫＨＦＧＳＳＲＫＦＩＡＳＬＥＥＮＮＧＹＶＫＱＥＫＬＩＴＥＤＩＩＥＥＡＫＴＬＳＴＣＡＹＥＤＧＴＲＷＧＥＥＩＧＹＴＹＮＣＨＬＥＳＴＦＴＧＹＬＬＨＣＫＧＷＴＳＴＹＬＹＰＥＲＰＳＦＬＧＣＡＰＶＤＭＱＧＦＳＳＱＬＴＫＷＶＡＡＬＴＱＡＧＬＳＨＬＮＰＩＴＹＧＭＫＳＲＩＫＴＩＱＣＬＣＹＡＹＬＭＹＦＳＬＹＳＷＧＭＶＬＨＡＳＶＰＳＩＳＬＬＬＧＩＱＶＹＰＥＶＹＤＰＷＦＡＶＹＶＬＡＦＩＳＴＩＬＥＮＭＳＥＳＩＰＥＧＧＳＶＫＴＷＷＭＥＹＲＡＬＭＭＭＧＶＳＡＩＷＬＧＧＶＫＡＩＶＥＫＩＩＧＴＱＧＥＫＬＹＬＳＤＫＡＩＤＫＥＫＬＫＫＹＥＫＧＫＦＤＦＱＧＩＧＩＬＡＶＰＬＩＴＦＳＡＬＮＬＶＧＦＭＶＧＡＮＱＶＩＬＴＭＫＦＥＡＬＬＧＱＬＬＶＳＳＦＦＶＦＶＶＶＴＶＶＩＤＶＬＳＦＬＫＤＳ［配列番号４１］。
【０８７０】
それぞれの植物においてＧＡＭＥ１５をサイレンシングするため、以下の配列を作製した。
【０８７１】
トマトにおいてＧＡＭＥ１５サイレンシングに用いた領域
【０８７２】
ＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＧＣ［配列番号４２］。
【０８７３】
ジャガイモにおいてＧＡＭＥ１５サイレンシングに用いた領域
【０８７４】
ＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＣＣＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧ［配列番号４３］。
【０８７５】
ナスにおいてＧＡＭＥ１５サイレンシングに用いた領域
【０８７６】
ＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＧＡＣＡＡＡＴＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＡＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧ［配列番号４４］。
【０８７７】
トマト及びジャガイモにおけるＧＡＭＥ１５遺伝子に対するＲＮＡｉ系を作製した。ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉ遺伝子導入トマト植物では、葉においてα−トマチン及び下流ＳＧＡの著しい低下が見られ、ＧＡＭＥ１５をサイレンシングした緑色果実においてα−トマチンは検出されなかった。さらに、トマト果実の発育段階（例えば、催色期（breaker）及び赤色果実）中では、エスクレオシドまたは他のＳＧＡは検出されなかった。また、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉトマト植物の葉及び緑色果実において、ＳＧＡの前駆体であるコレステロールの１５〜２０倍の増加が認められた。ジャガイモでは、ＧＡＭＥ１５をサイレンシングしたところ、α−カコニン及びα−ソラニンが大きく低下し、これらの系統のコレステロールの貯留が増加した。
【０８７８】
実施例７：ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉ遺伝子導入トマト、ジャガイモ及びナス植物の作製
【０８７９】
選択した断片（サイレンシング配列、配列番号４２（トマト）、配列番号４３（ジャガイモ）、及び配列番号４４（ナス））をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に（ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩによって）導入し、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ酵素混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、この断片をｐＫ７ＧＷＩＷＧ２（ＩＩ）バイナリーベクターにさらにサブクローニングすることにより、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉコンストラクトを作製した。既報（「Itkin et al. 2011. The Plant Cell 23:4507-25」；「Sonawane et al. 2018. PNAS 115(23): E5418-E5428」）のようにして、ベクターをトマト、ジャガイモ及びナスに形質転換した。正のＧＡＭＥ２５がダウンレギュレーションされた系を、ＬＣ−ＭＳ分析にさらに用いた。
【０８８０】
実施例８：ＧＡＭＥ１５をサイレンシングしたトマト植物はＳＧＡプロファイルの激しい低下を示した
【０８８１】
ＳＧＡ代謝におけるＧＡＭＥ１５の正確な役割を解明するため、上記のトマトサイレンシング配列（配列番号４２）を用い、ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉ（ＧＡＭＥ１５ｉ）遺伝子導入トマト系（＃２１、＃２２及び＃２３）を作製した。
【０８８２】
ＧＡＭＥ１５−ＲＮＡｉの葉では、野生型トマトの葉に比べ、α−トマチンの著しい低下が見られた（図１５Ａ）。さらに、引き続き、ＧＡＭＥ１５ｉ果実のＳＧＡプロファイルを、野生型のものと、異なる発育及び成熟の段階で比較した。トマトにおいて緑色から赤色果実に変化する間に、α−トマチンはエスクレオシド及びリコペロシドに変換され、一方、デヒドロトマチンはデヒドロエスクレオシド及びデヒドロリコペロシドに変換される（図１４Ａ）。
【０８８３】
ＧＡＭＥ１５ｉ緑色及び赤色果実は、ＳＧＡ（例えば、α−トマチンまたはエスクレオシドＡ）の痕跡を示さず、ＧＡＭＥ１５ｉサイレンシングにより、トマトの果実において、ＳＧＡが完全に喪失したことが示唆された（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。
【０８８４】
実施例９：ＧＡＭＥ１５発現を変化させるとジャガイモにおけるＳＧＡに大きな影響を及ぼす
【０８８５】
トマトと同様に、上記のジャガイモサイレンシング配列（配列番号４３）を用い、ジャガイモ（＃１、＃２、及び＃３）においてもＧＡＭＥ１５ｉをサイレンシングし、ジャガイモＳＧＡ代謝に対する影響を解明した。
【０８８６】
ジャガイモにおいてＧＡＭＥ１５をサイレンシングしたところ、ジャガイモの葉組織における主要ＳＧＡであるα−カコニン（影付きバー）及びα−ソラニン（白抜きバー）が、野生型ジャガイモの葉組織に比べ、大幅に低下した（図１６）。
【０８８７】
実施例１０：ＧＡＭＥ１５をサイレンシングしたトマトの葉におけるコレステロールの高蓄積
【０８８８】
コレステロールは、ＳＧＡの生合成において重要な前駆体としての役割を果たす（「Sonawane et al., 2016, Nat. Plants 3: 16205」）。ＧＡＭＥ１５ｉをサイレンシングしたトマト植物においてＳＧＡが著しく低下し、その後完全な喪失が認められたことから、これらの植物におけるコレステロールレベルを調べた。ＧＡＭＥ１５ｉをサイレンシングしたトマト植物の葉において、野生型トマト植物の葉に比べ、コレステロール（ＳＧＡ前駆体）の約１５〜２０倍の増加が認められた（図１７）。
【０８８９】
実施例１１：ＧＡＭＥ１５発現を変化させ、ナスにおけるＳＧＡへの影響を観察する
【０８９０】
ジャガイモと同様に、上記のナスサイレンシング配列（配列番号４４）を用い、ナスにおいてもＧＡＭＥ１５ｉをサイレンシングし、ナスＳＧＡ代謝に対する影響を解明した。
【０８９１】
ナスにおいてＧＡＭＥ１５をサイレンシングする影響を、α−ソラニン及び／またはα−ソラマルギンのレベルの低下について、野生型ナスと比較した（図１４Ｃ）。
【０８９２】
実施例１２：トマト、ジャガイモ、及びナスにおけるＧＡＭＥ１５の過剰発現
【０８９３】
さらに、トマト、ジャガイモ、及び／若しくはナス植物の遺伝子を組み換えるか、または遺伝子を編集し、ＧＡＭＥ１５を過剰発現させた。
【０８９４】
トマト植物においてα−トマチン並びにエスクレオシド及び／またはリコペロシド（図１４Ａ）の産生を増加させるため、トマト植物の遺伝子を組み換えるか、または遺伝子を編集し、ＧＡＭＥ１５を過剰発現させた。
【０８９５】
ジャガイモ植物においてα−ソラニン及び／またはα−カコニン（図１４Ｂ）の産生を増加させるため、ジャガイモ植物の遺伝子を組み換えるか、または遺伝子を編集し、ＧＡＭＥ１５を過剰発現させた。
【０８９６】
ナス植物においてα−ソラソニン及び／またはα−ソラマルギン（図１４Ｂ）の産生を増加させるため、ナス植物の遺伝子を組み換えるか、または遺伝子を編集し、ＧＡＭＥ１５を過剰発現させた。
【０８９７】
実施例１３：ＳＧＡのレベル及び組成が変更された植物及び作物
【０８９８】
前述の内容に基づき、古典的な育種または遺伝子工学（例えば、遺伝子組換えまたは遺伝子導入植物、及び遺伝子編集植物など）によって、様々な昆虫及び他の病原体に対する障壁を植物に付与し、かつ／または抗栄養化合物（例えば、ジャガイモからカコニン及び／またはソラニン）を除去し、ＳＧＡのレベル及び組成を変更した、ナス科植物（例えば、トマト、ジャガイモ、ナス、及び／またはペッパー植物）及び／または作物が作製される。
【０８９９】
さらに、高コレステロールまたは高フィトステロールトマト系は、高価値のステロイド系化合物（例えば、プロビタミンＤ及び／またはジオスゲニン）を合成生物学ツールなどによって工学的に作り出すのに用いられる。
【０９００】
また、高フィトステロール（例えば、フィトコレステロール）系は、化粧品に用いられる成分を産生するのに用いられる。
【０９０１】
他の例では、ナス科植物（例えば、トマト、ジャガイモ、ナス、及び／またはペッパー植物）及び／または作物は、ＳＧＡのレベルを高め、かつ／またはフィトステロールのレベルを下げて作製される。
【０９０２】
実施例１４：実施例１４〜２５の材料及び方法
【０９０３】
サポニンの分析の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及びタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）パラメータ
【０９０４】
試料から得た４つの生物学的複製物（ｎ＝４）を、代謝分析に用いた。簡潔に説明すると、凍結粉末化した植物組織１００ｍｇを、内部標準物質（ポナステロンＡ、Ｃ＝１．５μｇ／ｍＬ）を混合した８０％メタノール３００μＬで抽出し、短時間ボルテックスした後、室温で２０分間超音波処理した。抽出物を１４０００×ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍのフィルターで濾過した。試料を、ＳＹＮＡＰＴ−Ｇ２  ｑＴＯＦ検出器（タンデム四重極／飛行時間型質量分析計、Ｗａｔｅｒｓ）に連結したＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ）で構成された高分解能ＵＰＬＣ／ｑＴＯＦシステムを用いて分析した。代謝物の分離は、１００ｍｍ×内径２．１ｍｍ、１．７μｍのＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ）で行った。移動相の組成は０．１％ギ酸を含むアセトニトリル：水（５：９５、ｖ／ｖ；移動相Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（移動相Ｂ）であった。流量は０．３ｍＬ／分であり、カラム温度は３５℃に維持した。
【０９０５】
以下の直線グラジエントを用い、ホウレンソウ、ビートルート（Beta vulgaris）中のトリテルペノイド系サポニン、酵母細胞中及びＳＯＡＰ１０を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたトリテルペノイドの分析を行った。移動相Ａを５分間で１００％から８５％とし、移動相Ａを２分間で８５％から７５％とし、移動相Ａを７５％で３分間維持し、グラジエントを継続し、移動相Ａを１０分間で６５％とし、移動相Ａを２分間で６５％から４０％とし、移動相Ａを４０％から１分間で移動相Ｂを１００％とした後、移動相Ｂを１００％で３．５分間し、その後０．５分内に初期状態（移動相Ａ１００％）に戻し、移動相Ａ１００％で１分間コンディショニングした。
【０９０６】
キノア（Chenopodium quinoa）及びアルファルファ（Medicago sativa）のトリテルペノイド系サポニンを分析するため、以下の４０分間のグラジエントを用いた。移動相Ａを２２分間で１００％から７２％とし、移動相Ａを１４分間で７２％から０％とし、移動相Ｂを１００％で２分間維持した後、０．５分内に初期状態（移動相Ａ１００％）に戻し、移動相Ａ１００％で１．５分間コンディショニングした。
【０９０７】
以下の設定を用いた。キャピラリー２ｋＶ；コーン２７  Ｖ；ソース温度を１４０℃、脱溶媒和を４５０℃、脱溶媒ガス流量を８００Ｌ／時間に設定した。アルゴンを衝突ガスとして用いた。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を、陰イオン化モード、ｍ／ｚ範囲５０〜１６００Ｄａで用いた。ギ酸ナトリウムを用いて質量分析（ＭＳ）システムを較正し、Ｌｅｕ−エンケファリンをロックマスとして用いた。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、装置を制御し、正確な質量及び元素組成を算出した。また、１５種の標準代謝物の混合物を１０個の試料のそれぞれの後に注入し、品質対照として用いた。データの取得は、試料中の全ての検出可能な成分由来の正確な質量前駆体及びフラグメントイオンの情報を記録するエネルギー勾配によるＭＳＥモードで行った。ＭＳＥモードは、２つの機能をすばやく切り替える。１つ目は低エネルギーの正確な質量前駆体イオンスペクトルを取得することであり、２つ目は高エネルギーの正確な質量フラグメントイオンスペクトルを取得することである。衝突エネルギーは、低エネルギーの機能については４ｅＶ、高エネルギーの機能については１５〜５０ｅＶの勾配に設定した。
【０９０８】
ベンサミアナタバコ（N. benthamiana）中のウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis）酵素の生成物の分離には、別のグラジエントを用いた。移動相Ａを７５％、５分間で開始した後、移動相Ａを１５分間で７５％から５０％とし、移動相Ａを２分間で５０％から３０％とし、移動相Ａを３０％から移動相Ｂを１００％とし、移動相Ｂを１００％で３．５分間維持した後、０．５分以内に初期状態（移動相Ａ７５％）に戻し、移動相Ａ７５％で１分間コンディショニングした。流量は０．３ｍＬ／分であり、カラム温度は３５℃に維持した。試料は、Ｉｍｐａｃｔ  ＨＤ  ＵＨＲ−ＱｑＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ）に連結したＵＰＬＣ（１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で構成された高分解能ＵＰＬＣ／ｑＴＯＦシステムを用いて分析した。代謝物の分離は、１００ｍｍ×内径２．１ｍｍ、１．７μｍのＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ）で行った。移動相の組成は０．１％ギ酸を含むアセトニトリル：水（５：９５、ｖ／ｖ；移動相Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（移動相Ｂ）であった。ＥＳＩを、陰イオン化モード、ｍ／ｚ範囲５０〜１６００Ｄａにおいて、以下のパラメータで用いた。乾燥ガス２００°Ｃ、８Ｌ／分；ネブライザ：２Ｂａｒ；キャピラリー：４．２ｋＶ。
【０９０９】
代謝物は、標準化合物の保持時間及び質量フラグメントを比較することによって同定した。対応する標準物質がない場合は、保持時間、元素組成及びフラグメンテーションパターンを文献に記載のもの（表１４）と比較することによって推定して同定した。ホウレンソウ中のトリテルペノイド系サポニンの相対定量を、ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）プログラムを用いて行った。各試料中のサポニンのピーク面積は、試料の取り扱いに起因するばらつきを低減するため、内標準物質のピーク面積に対して標準化した。
【０９１０】
ホウレンソウトリテルペノイド系アグリコンのガスクロマトグラフ−質量（ＧＣ−ＭＳ）分析
【０９１１】
粉末化した凍結組織（２００ｍｇ）を、８０％ＭｅＯＨ６００μＬで３回抽出した。採取した分画を高速真空（２５℃、７８ｍｂａｒ、終夜（Ｏ／Ｎ））で蒸発させた。乾燥残渣を、２Ｍ  ＨＣｌ  ５０％  ＭｅＯＨ溶液５００μＬに溶解し、６５℃で５時間加熱した。加水分解した試料を、高速真空（５０℃、７８ｍｂａｒ、１．５時間）で蒸発乾固した。乾燥残渣をトルエン：ＭｅＯＨ（３：２；ｖ／ｖ）２００μＬに溶解し、トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ２）７５μＬを加えた。メチル化混合物を室温で４０分間インキュベートして蒸発乾固し、ＭＳＴＦＡ８０μＬに再懸濁し、室温で２０分間、６５℃で１０分間インキュベートした。試料をガラスインサートに移し、１μＬを、前述（３１）したようにして、ＧＣ−ＭＳに注入した。ＧＣ−ＭＳシステムは、ＣＯＭＢＩ  ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）と、プログラム昇温気化（ＰＴＶ）注入器を備えた微量ＧＣ超ガスクロマトグラフと、ＤＳＱ四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）とから構成されていた。ＧＣは、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍのＺｅｂｒｏｎ  ＺＢ−５  ｍｓ  ＭＳカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で行った。ＰＴＶスプリット法を、以下のように行った。試料は、一定温度スプリットレスモードで分析した。ＰＴＶ注入口温度は２８０℃に設定した。分析物は、以下のクロマトグラフィー条件を用いて分離した。ヘリウムをキャリアガスとして流量１．２ｍＬ／分で用いた。１７０℃で開始した温度グラジエントをこの温度で１．５分間維持し、２８０℃まで３７℃／分で昇温した後、３００℃まで１．５℃／分で昇温し、３００℃で５．０分間維持した。溶離液を、イオン化電圧７０ｅＶの電子衝撃モードでフラグメント化した。再構築したイオンクロマトグラム及び質量スペクトルを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）を用いて評価した。化合物は、保持時間指標及び質量スペクトルを、同じ装置で分析した正式な標準物質に対して生成されたもの、及び文献（「E. Biazzi et al., CYP72A67 Catalyzes a Key Oxidative Step in Medicago truncatula Hemolytic Saponin Biosynthesis. Molecular Plant. 8, 1493-1506 (2015)」）で報告されたものと比較することによって同定した。
【０９１２】
ＮＭＲ分析用のサポニンの精製
【０９１３】
システムは、既報（「B. Khakimov, L. H. Tseng, M. Godejohann, S. Bak, S. B. Engelsen, Screening for Triterpenoid Saponins in Plants Using Hyphenated Analytical Platforms. Molecules. 21, pii: E1614 (2016)」）のように、クォータナリポンプ、オートサンプラー、ダイオードアレイ検出器、Ｂｒｕｋｅｒ／Ｓｐａｒｋ  Ｐｒｏｓｐｅｋｔ  ＩＩ  ＬＣ−ＳＰＥシステム（Ｓｐａｒｋ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＵＰＬＣシステムと、Ｂｒｕｋｅｒ  ＮＭＲ  ＭＳ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＢＮＭＩ−ＨＰ）を介して連結されたＩｍｐａｃｔ  ＨＤ  ＵＨＲ−ＱｑＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）とから構成された。ＭＳスペクトルは、ネガティブモードで、ｍ／ｚ  ５０〜１７００において取得した。較正は、各クロマトグラフィー測定の開始時及び終了時に注入される１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウム（ＮａＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、自動的に行なった。分離は、ＸＢｒｉｄｇｅ  ＬＣカラム（ＢＥＨ  Ｃ１８，粒径５μｍ、及び２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）で行った。クロマトグラフィー条件は以下の通りであった。流量０．９ｍＬ／ｍｉｎで、移動相Ａ（５％ＡＣＮ＋０．１％ＦＡ）７４％及び移動相Ｂ（１００％ＡＣＮ＋０．１％ＦＡ）２６％の溶媒組成を、６０分で移動相Ａ７０％とする直線グラジエントを開始した後、６２分で移動相Ｂを１００％とする別の直線グラジエントを行い、移動相Ｂ１００％を３分間維持した後、６５．５分で移動相Ａを７４％とする直線グラジエントを行い、４．５分間維持して平衡化する。サポニンは、予め設定した時間幅でＳＰＥカートリッジに採取し、トラッピングは、強度の閾値によって開始した。ヨッソシド（Ｙｏｓｓｏｓｉｄｅ）ＩＶ（ｍ／ｚ  １２６３．５８、閾値２０００００、時間幅１８〜２３分）、ヨッソシドＸＩＩ（ｍ／ｚ  １２３３．５７、閾値５８０００、時間幅２７〜３２分）、ヨッソシドＶａ（ｍ／ｚ  １３０５．５９、閾値２０００００、時間幅３２〜４０分）、ヨッソシドＸ（ｍ／ｚ  １４３７．６４、閾値１５００００、時間幅４０〜４８分）及びヨッソシドＶ（ｍ／ｚ  １３０５．５９、閾値２０００００、時間幅５４〜６５分）。このトラッピング法では、カートリッジへの分析物の保持を高めるため、溶離液がＳＰＥカートリッジを通過する前に、補充流量２．５ｍＬ／分の水を溶離液に加えた。トラッピングには、ＧＰ樹脂を充填した、１０ｍｍ×２ｍｍのＳＰＥカートリッジを用いた。各カートリッジには同じ化合物を５回ロードし、１つのサポニンのトラッピングに５〜１０個のカートリッジを用いた。ＮＭＲ測定の前に、ＳＰＥカートリッジを窒素流で乾燥させ、各カートリッジの分画を重水素化メタノール１５０μＬで溶出させた。試料は９６ウェルプレートに溶出させた。同じ化合物を含む溶離液をプールし、窒素流下で乾燥し、凍結乾燥し、Ｄ２Ｏ  ２００μＬに再懸濁し、再び凍結乾燥して微量のＨ２Ｏを除去した。乾燥化合物を、３−プロピオン−２，２，３，３−ｄ４酸ナトリウム塩（ＴＭＳＰ、１Ｈ及び１３Ｃスペクトルの内部化学シフト基準として用いた）を０．０１％添加した９０％ＭｅＯＤ−ｄ４と１０％Ｄ２Ｏとの混液６０μＬに溶解し、１．７ｍｍのＮＭＲ試験管に移した。
【０９１４】
ＮＭＲ法
【０９１５】
ＮＭＲスペクトルは、シールドグラジエントコイルを備えた１．７ｍｍのＴＸＩ−ｚ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ及び５ｍｍのＴＣＩ−ｘｙｚ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＮＥＯ−６００  ＮＭＲ分光計で記録した。全てのスペクトルを２９３Ｋで取得した。ヨッソシドＶのＮＭＲデータは１．７ｍｍのＣｒｙｏＰｒｏｂｅ及び５ｍｍのＣｒｙｏＰｒｏｂｅの両方で記録し、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）のスペクトルは５ｍｍのＣｒｙｏＰｒｏｂｅで取得した（５ｍｍのプローブ中に１．７ｍｍの試験管を保持するための、特殊なＮＭＲスピナータービンを用いた）。
【０９１６】
１Ｈ及び１３Ｃの化学シフトの帰属は、別々の１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ手法に基づき、全てパルス磁場勾配選択を用いた。
【０９１７】
アグリコン単位の構造及び立体化学は、１Ｄ  １Ｈ及び１３Ｃ、２Ｄ等核ＣＯＳＹ並びに２Ｄ異核ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルによって決定した。単糖単位の同定には、帰属を完結し、個々の糖単位内の１Ｈシグナル間の結合性を詳細に描写するため、２Ｄ等核ＴＯＣＳＹスペクトルも記録する必要があった。ＨＭＢＣスペクトルにおいて認められた、２〜３結合分離れた１Ｈと１３Ｃとの間の相関関係を、ヨッソシドＶについては図２１に、ＭＡ−３−ＧｌｃＡについては図３５Ｄに示す。
【０９１８】
１Ｈ  １Ｄ  ＮＭＲスペクトルは、１６ｋのデータポイント及び２．５秒のリサイクル遅延を用いて取得した。１３Ｃスペクトル編集ＤＥＰＴＱ  ＮＭＲスペクトルは、６５ｋのデータポイント及び３秒のリサイクル遅延を用いて取得した。
【０９１９】
２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルは、１６３８４−８１９２（ｔ２）×４００−５１２（ｔ１）のデータポイントを用いて取得した。２Ｄ  ＴＯＣＳＹスペクトルは、等方性混合時間１００〜３００ｍ秒を用いて取得した。本試験で用いたＴ−ＲＯＥＳＹ試験は、ＲＯＥＳＹ試験におけるＴＯＣＳＹの移行を効果的に抑制するＴＯＣＳＹ−ｌｅｓｓ  ＲＯＥＳＹであった。２Ｄ  Ｔ−ＲＯＥＳＹスペクトルは、スピンロックパルス１００〜４００ｍ秒を用いて記録した。
【０９２０】
２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルは、４０９６（ｔ２）×４００−５１２（ｔ１）のデータポイントを用いて記録した。多重度編集ＨＳＱＣにより、正相関を生じさせるメチル基及びメチン基を、負のピークとして現れるメチレン基から区別することができる。遠隔カップリングを進展させるためのＨＭＢＣ遅延を設定し、ＪＨ，Ｃ＝８Ｈｚの遠隔カップリングを観察した。
【０９２１】
化学シフトの帰属は、ＨＭＢＣ結合性（図２１及び図３５Ｄ）及びＴＯＣＳＹの相関（データ提示なし）由来の情報の組み合わせに基づいて行った。
【０９２２】
ヨッソシドＶ及びＭＡ−３−ＧｌｃＡの１Ｈ及び１３Ｃの化学シフト値は、表１に示す。予想通り、これら２つの化合物のアグリコン単位の化学シフト値はよく一致し、同様のＨＭＢＣ相関パターンが認められる（図２１及び図３５Ｄ）。アキシアルまたはエクアトリアルへのプロトンの帰属は、観察された隣接するＪカップリングに基づいて行い、大きな値（＞１０Ｈｚ）は、アキシアルプロトンを示し、ＲＯＥＳＹスペクトルで認められた相関によってさらに支持される。
【０９２３】
アグリコン領域のＨＭＢＣの相関は、他のトリテルペノイド系サポニン（「H. Schroder et al., A triterpene saponin from Herniaria glabra. Phytochemistry. 34,1609-13 (1993)」；「E. P. Mazzola et al., Utility of coupled-HSQC experiments in the intact structural elucidation of three complex saponins from Blighia sapida. Carbohydr Res. 346, 759-68 (2011)」）において認められたものとよく一致している。ＭＡ−３−ＧｌｃＡにおけるメディカゲン酸とグルクロン酸との間の結合部位は、ＧｌｃＡのアノマー水素とアグリコンのＣ３との間の強いＨＭＢＣ結合性、並びにＭＡ−Ｈ３／ＧｌｃＡのアノマーＣ１との間に認められた相補的な相関（図１８Ｄ中の赤矢印）によって支持された。同様に、糖単位間の結合部位は、１つの糖のアノマー水素／炭素間、並びにＦｕｃ−Ｒｈａ−Ｇｌｃ間のグリカン間の矢印によって示されるような、直接結合したグリカンのプロトン／炭素間に認められた、相補的な３結合ＨＭＢＣ結合性（図２１）に基づいて決定した。ＧｌｃＡとアグリコンとの間に先に認められた相関がないこと、並びにＧｌｃＡ内のＪカップリングがないことで示されるように、ヨッソシドＶ（ＧｌｃＡに結合したＸｙｌ）におけるキシロースの付加により、ＧｌｃＡの立体配座空間は制限されていると考えられる。しかしながら、化学シフトの予測は、ヨッソシドＶにおけるＧｌｃＡの帰属をさらに支持するものである。
【０９２４】
ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリの作成及びデータ解析
【０９２５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリは、若干の変更を加え、既報（「S. Zhong et al., High-throughput illumina strand-specific RNA sequencing library preparation Cold Spring Harb Protoc. 8, 940-9 (2011)」）のように作成した。簡潔に説明すると、全ＲＮＡ  ５μｇを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたポリ（Ａ）ＲＮＡの取得に用い、９４℃で５分間断片化し、溶出させた。第１鎖ｃＤＮＡは、ランダムプライマー及びｄＮＴＰを用いた逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成し、一方、第２鎖ｃＤＮＡは、ｄＵＴＰを用いたＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を用いて生成した。末端修復（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、Ｋｌｅｎｏｗ３'−５'（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によるｄＡ−テーリング及びアダプターライゲーション（Ｑｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、ＮＥＢ）の後、ｄＵＴＰ含有第２鎖をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によって消化した。得られた第１鎖アダプターライゲーションｃＤＮＡを１４サイクルのＰＣＲ濃縮（ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＮＥＢ）に用いた。インデックス付きライブラリをプールし、ｔｈｅ  Ｃｒｏｗｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｈｅ  Ｎａｎｃｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の単一レーン上で配列決定した（ペアエンド、１２５ｂｐ）。ＦａｓｔＱＣ（「S. W. Wingett, S. Andrews, FastQ Screen: A tool for multi-genome mapping and quality control. Version 2. F1000Res. 7, 1338 (2018)」）を用い、生データの品質を評価した。Ｔｏｐｈａｔ  ｖ２．０．１３（「C. Trapnell, L. Pachter, S. L. Salzberg, TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-11 (2009)」）を用い、生の読み取りを、ホウレンソウリファレンスゲノムのバージョン１．０．１（The Beta vulgaris resource（http://bvseq.boku.ac.at/Genome/Download/index.shtml））に対してアライメントした。ＨＴＳｅｑ（「S. Anders S, P. T. Pyl, W. Huber, HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, 166-9 (2015)」）を用いて定量を行った後、ＤＥＳｅｑ２（「M. I. Love, W. Huber, S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014)」）を用いて標準化及び差次的遺伝子発現解析を行った。
【０９２６】
共発現解析
【０９２７】
ＣｏＥｘｐＮｅｔＶｉｚソフトウェア（「O. Tzfadia, T. Diels, S. De Meyer, K. Vandepoele, A. Aharoni,Y. Van de Peer, CoExpNetViz: Comparative Co-Expression Networks Construction and Visualization Tool. Front Plant Sci. 6, 1194 (2016)」）を用いて共発現解析を行った。簡潔に説明すると、低いパーセンタイル順位の相関閾値を５、高いパーセンタイル順位の相関閾値を９５に設定した共発現解析において、ホウレンソウｂＡＳ（ＳＯＡＰ１）、ＣＹＰ７１６Ａ２６８（ＳＯＡＰ２）及びＣＹＰ７１６Ａ２６８ｖ２（ＳＯＡＰ２様）を「ベイト」として用いた。共発現した遺伝子を、各ベイトの相関係数（ｒ＞０．９；ＰＣＣ）に従い、さらにフィルタリングした（表１４）。解析は、異なる組織及び生育段階（ＳＯ４ＷＯＬＬＤ−長日に発育した４週齢の植物の成熟葉；ＳＯ８ＷＯＬＳＬ−短日に発育した８週齢の植物の成熟葉；ＳＯ４ＷＹＬＬＤ−長日に発育した４週齢の植物の若葉；ＳＯ８ＷＯＬＳＬ−短日に発育した８週齢の植物の若葉；ＳＯ４ＷＦＢＬＤ−長日に発育した４週齢の植物の花芽）のホウレンソウＲＮＡ−Ｓｅｑトランスクリプトームデータを用いて行った。共発現ネットワークは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェア（「P. Shannon P et al., Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13, 2498-504 (2003)」）によって可視化した。
【０９２８】
クローニング
【０９２９】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の使用説明書に従い、全てのＰＣＲ増幅ステップに用いた。クローニング用の制限酵素及びＴ４リガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。アガロースゲルから切り出したＤＮＡを、Ｇｅｌ／ＰＣＲ抽出キット（Ｈｙ−Ｌａｂｓ）を用いて精製した。他の異種宿主に形質転換する前に、大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプラスミドの単離に用いた。ＡｃｃｕＰｒｅｐ（商品名）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、プラスミドＤＮＡを大腸菌培養物から単離した。クローニングに用いたプライマーのリストについては、表１１を参照されたい。
【０９３０】
ＶＩＧＳのコンストラクトの作製
【０９３１】
ホウレンソウ中の候補遺伝子をサイレンシングするため、全ての遺伝子配列（２００〜４００ｂｐ）を、ホウレンソウの葉のｃＤＮＡテンプレートから増幅した。精製した増幅産物を、ＳａｃＩによって消化された組換えｐＴＲＶ２ベクター（ＥｃｏＲＩによって挿入された約２００ｂｐのマグネシウムキラターゼサブユニットＨ）に挿入した。
【０９３２】
ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄシステム及びベンサミアナタバコ（N. benthamiana）における発現
【０９３３】
同じアグロバクテリウム株由来の複数の遺伝子をベンサミアナタバコにおいて一過性に発現させるため、ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄ  ３．０（ＧＢ）システム（「M. Vazquez-Vilar et al., GB3.0: a platform for plant bio-design that connects functional DNA elements with associated biological data. Nucleic Acids Res. 45, 2196-2209 (2017)」）を用い、複数のコンストラクトを作製した。最初のステップで、ＢｓａＩ及びＢｓｍＢＩ制限部位を取り出し、それらをｐＵＰＤ２  ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄエントリーベクターに挿入することにより、全てのＣＤＳと、トマトユビキチンプロモータ及びターミネータとを馴化させた。次のステップで、遺伝子をターミネータ及びプロモータと共に、ｐＤＧＢ３α１またはｐＤＧＢ３α２  ＧＢベクターにサブクローニングした。第１レベルのαベクターにより、ベンサミアナタバコにおいて単一遺伝子が一過性に発現する。続いて、ｐＤＧＢ３α１：ＳＯＡＰ１をｐＤＧＢ３α２：ＳＯＡＰ２と組み合わせてｐＤＧＢ３Ω１：ＳＯＡＰ１＋ＳＯＡＰ２とし、ｐＤＧＢ３α１：ＳＯＡＰ３をｐＤＧＢ３α２：ＳＯＡＰ４と組み合わせてｐＤＧＢ３Ω２：ＳＯＡＰ３＋ＳＯＡＰ４とした。オメガベクターの組み合わせにより、ベンサミアナタバコにおいてメディカゲン酸の産生をもたらす４つの遺伝子が発現する。他の遺伝子、セルロース合成酵素様Ｇ（ＳＯＡＰ５）、グリコシルトランスフェラーゼ（ＳＯＡＰ６−９）及びアシルトランスフェラーゼ（ＳＯＡＰ１０）を、アルファベクターにおいて用いた。キノア（C. quinoa）、ビートルート（B. vulgaris）、ミヤコグサ（L. japonicus）、ダイズ（Glycine max（G. max））、アルファルファ（M. sativa）及びウラルカンゾウ（G. uralensis）を、同じ手法でクローニングした。ｃＤＮＡテンプレートを作製するため、２週齢の実生（ミヤコグサ、ダイズ、アルファルファ及びウラルカンゾウ）、成熟葉（ビートルート）または花芽の周りの葉（キノア）から抽出したＲＮＡを用いた。
【０９３４】
酵母系（ｐＥＳＣ）へのクローニング
【０９３５】
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）におけるＳＯＡＰ１（ｂＡＳ）、ＣＹＰ（ＳＯＡＰ２−４）及びＣＳＬＧ（ＳＯＡＰ５）の発現のため、目的の配列を保有する、クローニングしたｐＤＧＢ３αベクターから配列を増幅し、精製した増幅産物を、一連のｐＥＳＣ（ＡｍｐＲ）プラスミドに挿入し、１つのプラスミドから２つの遺伝子を同時に発現させた。ＮｏｔＩ／ＳａｃＩ制限酵素を用いてＳＯＡＰ１を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素を用いてＳＯＡＰ２を、それぞれｐＥＳＣ−ＨＩＳプラスミドに挿入した。ＮｏｔＩ／ＳａｃＩ制限酵素を用いてＳＯＡＰ３を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いてＳＯＡＰ４を、それぞれｐＥＳＣ−ＬＥＵプラスミドに挿入した。ＮｏｔＩ／ＳａｃＩ制限酵素を用いてＳＯＡＰ５を、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いてＳｏＵＧＤ１を、それぞれｐＥＳＣ−ＬＥＵプラスミドに挿入した。
【０９３６】
ｐＥＴ−２８ｂへのクローニング及び大腸菌における発現
【０９３７】
ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ制限部位を用い、ＳＯＡＰ１０をｐＥＴ−２８ｂ（ＫａｎＲ）ベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現させた。
【０９３８】
ＳＯＡＰ１０によるＩｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ
【０９３９】
ｐＥＴ−２８ｂ：ＳＯＡＰ１０で形質転換した細菌細胞を、ＬＢ培地において３７℃で培養した。培養物がＡ６００＝０．６に達したとき、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）２００μＭにより、１５℃で２４時間、タンパク質発現を誘導した。１０％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及びリゾチーム１００ｍｇ／ｍＬを含む５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０中で、超音波処理によって細菌細胞を溶解した。
【０９４０】
ＳＯＡＰ１０酵素アッセイにおける基質として、ホウレンソウデスアセチルサポニンの分画を用いた。２００μＬの管中で、細胞溶解物６μＬを、６．１８ｍＭアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）２μＬ及びサポニン基質（１０μｇ）２ｍＬと混合した。反応を２８℃で２．５時間行った。ＳＯＡＰ１０と混合しない細胞溶解物を、対照として用いた。メタノール２０μＬを添加して反応を停止した後、短時間ボルテックスした。最後に、上記のように、抽出物を１４０００×gで１０分間遠心分離し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０９４１】
ＶＩＧＳの手順
【０９４２】
ウイルス誘導遺伝子サイレンシングを、既報（「M. Senthil-Kumar, K. S. Mysore, Tobacco rattle virus-based virus-induced gene silencing in Nicotiana benthamiana. Nat Protoc. 9, 1549-62 (2014)」）のように行った。簡潔に説明すると、サイレンシングのための配列を保有するｐＴＲＶ１コンストラクト及びｐＴＲＶ２コンストラクトを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＧＶ３１０１）の電気穿孔細胞に形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ及びゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートにおいて２８℃で培養した。抗生物質を添加したＬＢ培地１０ｍＬにシングルコロニーを接種し、２８℃で終夜培養した。細胞を３０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを浸透媒体（１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１００μＭアセトシリンゴン）５ｍＬに再懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを浸透媒体１０ｍＬに再び再懸濁し、室温で２時間インキュベートした。１ｍＬの無針シリンジを用い、アグロバクテリウムの懸濁液（各株についてＯＤ６００＝０．３）を１週齢のホウレンソウ子葉（植物ごとに１つ）の下側に浸透させた。植物を１６時間の光周期、２３℃で生育させた。２週間後に、マグネシウムキラターゼサブユニットＨ（ＣＨＣＬ）のサイレンシングの最初の兆候が見られた。組織の採取の前に、植物をさらに２週間生育させた。葉を採取し、液体窒素中で凍結し、後の加工処理用に−８０℃で保存した。生物学的複製物は、全て異なる植物から得た４枚の葉で構成した。以下の表１０は、赤カブ及びホウレンソウにおいてＣＳＬＧのサイレンシングに用いたホウレンソウ及び赤カブの核酸配列を示す。
【０９４３】
表１０：ＶＩＧ配列
【０９４４】
【表１０】
2022500023.tif 000020
【０９４５】
ＳＯＡＰ５の部位特異的突然変異誘発
【０９４６】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、製造業者の使用説明書に従って、ＳＯＡＰ５の部位特異的突然変異誘発を行った。
【０９４７】
遺伝子発現解析−ｑＰＣＲ
【０９４８】
各ＶＩＧＳサイレンシング系について３つ／４つの生物学的複製物（ｎ＝３／４）を用い、遺伝子発現解析を行った。トリゾール法（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、ＲＮＡの単離を行った。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理したＲＮＡを逆転写した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ  ｓソフトウェア（ＮＣＢＩ）によって遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計した。内在性対照として、翻訳伸長因子アルファ１（ＥＦ１−α）遺伝子を用いた。使用したオリゴヌクレオチドを表１１に示す。
【０９４９】
表１１：使用したプライマーのリスト
【０９５０】
【表１１−１】
2022500023.tif 000021
【０９５１】
【表１１−２】
2022500023.tif 000022
【０９５２】
【表１１−３】
2022500023.tif 000023
【０９５３】
【表１１−４】
2022500023.tif 000024
【０９５４】
【表１１−５】
2022500023.tif 000025
【０９５５】
【表１１−６】
2022500023.tif 000026
【０９５６】
【表１１−７】
2022500023.tif 000027
【０９５７】
【表１１−８】
2022500023.tif 000028
【０９５８】
【表１１−９】
2022500023.tif 000029
【０９５９】
ベンサミアナタバコ（Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）における一過性発現及び候補遺伝子のスクリーニング
【０９６０】
ｐＤＢＧ３αコンストラクト及びｐＤＢＧ３Ωコンストラクトを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＧＶ３１０１）の電気穿孔細胞に形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシン（ｐＤＢＧ３α）５０μｇ／ｍＬまたはスペクチノマイシン（ｐＤＢＧ３Ω）２００μｇ／ｍＬ、及びゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートにおいて２８℃で培養した。抗生物質を添加したＬＢ培地１０ｍＬにシングルコロニーを接種し、２８℃で終夜培養した。細胞を３０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを浸透媒体（１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１００μＭアセトシリンゴン）５ｍＬに再懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを浸透媒体１０ｍＬに再び再懸濁し、室温で２時間インキュベートした。１ｍＬの無針シリンジを用い、アグロバクテリウムの懸濁液（各株についてＯＤ６００＝０．３）をベンサミアナタバコの葉の下側に浸透させた。浸透前に、植物を１６時間の光サイクル下で４〜５週間生育させた。浸透から４日後に葉を採取し、液体窒素中で凍結し、後の加工処理用に−８０℃で保存した。生物学的複製物は、全て異なるタバコ植物から得た数枚の葉で構成した。
【０９６１】
Ｓ．セレビシエＷＡＴ  １１におけるＳＯＡＰ遺伝子の発現及び代謝物の抽出
【０９６２】
Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ（商品名）酵素形質転換システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、ｐＥＳＣコンストラクトをサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＷＡＴ１１に形質転換した。１つの遺伝子（ＳＯＡＰ５）、２つの遺伝子（ＳＯＡＰ１〜２）、４つの遺伝子（ＳＯＡＰ１〜４）、５つの遺伝子（ＳＯＡＰ１〜５またはＳＯＡＰ１〜４＋ＳｏＵＧＤ１）及び６つの遺伝子（ＳＯＡＰ１〜５＋ＳｏＵＧＤ１）を発現させるｐＥＳＣベクターの様々な組み合わせによって、酵母細胞を形質転換した。形質転換した酵母を、適切なアミノ酸及び２％グルコースを添加したＳＤ最小培地で培養した。コロニーをスクリーニングし、導入遺伝子の存在をＰＣＲによって確認した。遺伝子発現を誘導するため、２％ガラクトースを添加した最小培地に形質転換細胞を移し、３０℃で２４時間培養した。培養物を７００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットをＨ２Ｏ  １ｍLに再懸濁し、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、８０００×ｇで１分間遠心分離した。細胞ペレットを秤量し、同量の水と２倍量のガラスビーズ（直径５００μｍ）とを加え、１分間のボルテックスを５回行い、その都度、ボルテックスの間に細胞を氷上に１分間保持した。溶解細胞をメタノール５００μＬと混合し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、澄明な上清を採取し、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で終夜乾燥した。乾燥残渣を８０％メタノール１５０μＬに溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０９６３】
細胞内局在化及び共焦点顕微鏡分析
【０９６４】
ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄシステム（前掲の「M. Vazquez-Vilar et al., (2017)」）を用い、蛍光タンパク質（ＦＰ）との融合において検討したタンパク質を発現させるプラスミドを作製した。ＳＯＡＰ１：ＧＦＰ、−ＧＦＰまたは−ＲＦＰと融合したＳＯＡＰ２〜４、及びＳＯＡＰ５：ＲＦＰを用いた。細胞コンパートメントマーカーとして、ＡＢＲＣ（ＥＲ‐ｇｋ  ＣＤ３−９５５及びＧ‐ｇｋ  ＣＤ３‐９６３）から得たプラスミドを用いた（「B. K. Nelson, X. Cai, A. Nebenfuhr, A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-36 (2007)」）。
【０９６５】
ホウレンソウセルロース合成酵素様Ｇの細胞内局在化試験のため、ベンサミアナタバコ表皮細胞において、ＥＲまたはゴルジマーカーと共に、ＳＯＡＰ５：ＲＦＰを一過性に発現させた。細菌の吸光度Ａ６００ｎｍとして０．１５を、各アグロバクテリウム株の浸透に用いた。浸透の７２時間後に、葉片（直径約０．４ｃｍ）を採取し、共焦点顕微鏡法により、以下のパラメータを用いて蛍光を分析した。蛍光はＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ａ１顕微鏡で観察し、４８８ｎｍのレーザーで励起してＧＦＰ（ＥＲまたはゴルジマーカー）の画像を取得し、５６１ｎｍで赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）シグナルの画像を取得した。シグナル−ノイズ比を高めるため、各走査画素を４回サンプリングし、平均した。同じパラメータを用い、ＳＯＡＰ遺伝子の共局在化を確認した。
【０９６６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析
【０９６７】
ＦＲＥＴ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラグイン（「M. Hachet-Haas et al., FRET and colocalization analyzer a method to validate measurements of sensitized emission FRET acquired by confocal microscopy and available as an ImageJ Plug-in. Microsc Res Tech. 69, 941-56 (2006)」）ＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪを用い、平均ＦＲＥＴインデックス（すなわち、閾値を適用してバックグラウンドノイズを除去した後の各画素においてＦＲＥＴに起因する、受容体、ｍＲＦＰ融合タンパク質、強度の平均）を算出した。平均ＦＲＥＴインデックスは、近接性／相互作用について試験対象となる各タンパク質の組み合わせに対し、３つの独立した画像について算出した。ＧＦＰ及びＲＦＰを発現する細胞のみを用い、供与体及び受容体のブリードスルーを算出した。
【０９６８】
系統発生解析
【０９６９】
ＮＣＢＩ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）の非冗長タンパク質データベースにおいてＢｌａｓｔｐオプションを用い、様々な問い合わせ配列によって相同性検索を行った。Ｍｕｓｃｌｅアルゴリズムを用いてタンパク質配列をアライメントし、ＲＡｘＭＬ高速ブートストラッピングとそれに続くＭＬ検索により、系統樹を推測した（「A. Stamatakis, RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics. 30, 1312-3 (2014)」）。最終的な系統樹の尤度を、座位間の進化速度の不均質性のＧＡＭＭＡモデル下で評価し、最適化した。ＧＡＭＭＡモデルパラメータは、最大０．１０００００００００対数尤度単位の精度で評価した。ＲＡｘＭＬの高速ブートストラップオプションを用い、１０００個のブートストラップの複製を行った。用いた置換行列はＤＡＹＨＯＦＦであった。ｉＴＯＬ（「I. Letunic, P. Bork, Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic Acids Res. 44, W242-5 (2016)」）によって系統発生樹を可視化した。
【０９７０】
アルファルファ（M. sativa）毛状根におけるＭｓＣＳＬのサイレンシング
【０９７１】
ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄシステムを用い、３５Ｓプロモータ下でＭｓＣＳＬを標的とするアンチセンスＲＮＡと、３５Ｓ：ＫａｎＲカセットとを有するベクターｐＤＢＧ３α２を作製した。アルファルファの形質転換及び遺伝子導入毛状根の作製を、既報（「A. Boisson-Dernier, M. Chabaud, F. Garcia, G. Becard, C. Rosenberg, D. G. Barker, Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol Plant Microbe Interact. 14, 695-700 (2001)」）のように行った。Ａｒｑｕａ１の代わりに、アグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）のＡＴＣＣ１５８３４株を用いた。遺伝子導入根を採取し、粉砕し、代謝物を上記のように抽出した。
【０９７２】
テンプレートベースのタンパク質構造モデリング
【０９７３】
ＲａｐｔｏｒＸ（「M. Kallberg et al., Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server. Nature Protocols. 7, 1511-1522 (2012)」）を用い、サイクリック−ジ−ＧＭＰ及びＵＤＰとの複合体におけるロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）の結晶構造をテンプレート（ＰＤＢエントリ：４Ｐ００）として用い（「J. L. Morgan, J. T. McNamara, J. Zimmer, Mechanism of activation of bacterial cellulose synthase by cyclic di-GMP. Nat Struct Mol Biol. 21, 489-96 (2014)」）、ＳＯＡＰ５の相同性モデルを作製した。最良のモデルを、チャネル、トンネル及び細孔の位置の特定並びに特性評価を自動的に行うための汎用ツールキットであるＭＯＬＥ２．５（「L. Pravda et al., MOLEonline: a web-based tool for analyzing channels, tunnels and pores (2018 update). Nucleic Acids Res. 46, W368-W373 (2018)」）のテンプレートとして用いた。ＳＯＡＰ５の膜貫通トポロジーを表すスキームを、Ｐｒｏｔｔｅｒ（「U. Omasits, C. H. Ahrens, S. Muller, B. Wollscheid, Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30, 884-6 (2014)」）で作成した。
【０９７４】
実施例１５：ホウレンソウにおけるトリテルペノイド系サポニン生合成経路
【０９７５】
目的：ナデシコ目（Caryophyllales）の一種であるホウレンソウ（Spinacia oleracea）におけるトリテルペノイド系サポニン生合成経路、特に、トリテルペノイド系サポニンのグリコシル化に関与する酵素を見出すこと。
【０９７６】
方法：液体クロマトグラフィー−質量分析法を、ホウレンソウの葉におけるサポニンの分析に用いた。上記の材料及び方法を参照されたい。
【０９７７】
結果：
【０９７８】
ホウレンソウの葉を分析したところ（ＬＣ−ＭＳを使用）、アグリコンとしてメディカゲン酸を含む２０を超える分子を含む複合型トリテルペノイド系サポニン混合物（図１８、図１９Ａ〜１９Ｐ、表１２）が明らかとなり、それらのおよそ半分がアセチル化されていた。以下の表１３は、図１８の下方の走査によって同定された各化合物についての詳細を示す。以下の表１２では、以下の用語を用いる。試料−試料が由来する試験／遺伝子型の種類；保持時間−分単位の保持時間；推定名−推定代謝物の同定；分子式−代謝物またはそのＦＡ付加物の分子式；理論ｍ／ｚ−イオン［Ｍ−Ｈ］−、［Ｍ＋Ｈ］＋について算出した理論的モノアイソトピック質量；実測ｍ／ｚ−実測された質量；ｍ／ｚ誤差（ｐｐｍ）−理論値と実測ｍ／ｚ値とのｐｐｍ単位の差；ＭＳ／ＭＳフラグメント−イオン［Ｍ−Ｈ］−、［Ｍ＋Ｈ］＋から得たフラグメント；ＭＳ／ＭＳ  ＣＥ  （ｅＶ）−フラグメンテーションに用いた衝突エネルギー；ＵＶ／Ｖｉｓ−ＵＶ／Ｖｉｓ吸収極大。ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル（２００〜６００ｎｍ）は、材料及び方法に記載したＬＣ条件において、Ａｃｑｕｉｔｙ  ２９９６  ＰＤＡ検出器を備えたＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ）装置で取得した。（Ｓ）−標準化合物によって確認された同定；（ＮＭＲ）−ＮＭＲによって確認された同定；ＭＡ−メディカゲン酸；ＡＡ−アウグスチン酸（２−ヒドロキシオレアノール酸）；Ｂ−バヨゲニン；ＰＧ−ポリガラゲニン；ＯＡ−オレアノール酸；Ｇ−ギプソゲニン；ＧＡ−ギプソゲン酸；Ｈ−ヘデラゲニン；ＧｈＡ−グリチルレチン酸；ｈｅｘＡ−ヘキスロン酸；ｈｅｘ−ヘキソース；ｄｈｅｘ−デオキシヘキソース；ｐｅｎｔ−ペントース；ＧｌｃＡ−グルクロン酸；Ａｃ−アセチル。
【０９７９】
表１２：質量分析に基づく試験した植物中のトリテルペノイド系サポニンの同定
【０９８０】
【表１２−１】
2022500023.tif 000030
【０９８１】
【表１２−２】
2022500023.tif 000031
【０９８２】
【表１２−３】
2022500023.tif 000032
【０９８３】
【表１２−４】
2022500023.tif 000033
【０９８４】
表１３：ホウレンソウ中のサポニン組成の要約
【０９８５】
【表１３】
2022500023.tif 000034
【０９８６】
質量分析法フラグメンテーション分析並びに一連の１Ｄ及び２Ｄ−ＮＭＲ試験によって、最も豊富なホウレンソウサポニン（ここではヨッソシドＶと呼ぶ）の構造が確立した。このサポニンは、Ｃ−３位のヒドロキシに結合したグルクロン酸及びキシロースと、Ｃ−２８のカルボキシルに結合したアセチルフコース、ラムノース及びグルコースとを有するメディカゲン酸（アグリコン）を含む（図２０Ａ〜２０Ｃ、図２１）。
【０９８７】
要約：ホウレンソウにおいて１１種のトリテルペノイド系サポニンが同定され、ヨッソシドＶが最も豊富であった。
【０９８８】
実施例１６：ホウレンソウトランスクリプトームデータを用いたサポニン生合成遺伝子の同定
【０９８９】
目的：トリテルペノイド系サポニン生合成経路におけるトリテルペノイド系アグリコン生合成遺伝子を同定すること。
【０９９０】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【０９９１】
結果：異なる含有量のサポニンを発現する５種のホウレンソウ組織からトランスクリプトームデータを作成し、高サポニン含有試料及び低サポニン含有試料間で異なる発現量、並びに既知のトリテルペノイド系アグリコン生合成遺伝子（「E. Biazzi et al., CYP72A67 Catalyzes a Key Oxidative Step in Medicago truncatula Hemolytic Saponin Biosynthesis. Molecular Plant. 8, 1493-1506 (2015)」）に対する相同性に基づき、遺伝子候補を選択した。
【０９９２】
候補のうち、サポニンβ−アミリン合成酵素（ＳｏｂＡＳ；ＳＯＡＰ１と呼ぶ；Ｓｐ＿１０７６２０＿ｋｐｎｈ；配列番号４５［遺伝子配列］、配列番号４８［ポリペプチド配列］）、シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ２６８（ＳＯＡＰ２；Ｓｐ＿１０７６６０＿ｋｉｑｇ；配列番号４６［遺伝子配列］、配列番号４９［ポリペプチド配列］）、及びＣＹＰ７１６Ａ２６８ｖ２（ＳＯＡＰ２様；Ｓｐ＿１０７６７０＿ｐｔｑｘ；配列番号４７［遺伝子配列］、配列番号６［ポリペプチド配列］）を含む３つの遺伝子位置を調べたところ、代謝遺伝子クラスターの形態における、それらの密接な物理的遺伝子位置が明らかとなった（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
【０９９３】
ホウレンソウにおけるＳＯＡＰ１及びＳＯＡＰ２のウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）アッセイの結果、サポニン含有量が低下し（図２３Ａ〜２３Ｄ）、その一方でベンサミアナタバコにおいては、それらを過剰発現させたところ、β−アミリン及びオレアノール酸が産生した（図２４Ａ及び２４Ｂ）。
【０９９４】
概要：これらの結果は、これらの遺伝子がホウレンソウサポニン生合成に関与していることを示す有力な証拠をもたらすものである。
【０９９５】
実施例１７：さらなるサポニン生合成遺伝子の同定のための共発現解析及びコードされた酵素の特性評価
【０９９６】
目的：トリテルペノイド系サポニン生合成経路において、さらなるトリテルペノイド系アグリコン生合成遺伝子を同定すること。
【０９９７】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【０９９８】
結果：ＳＯＡＰ１、ＳＯＡＰ２及びＳＯＡＰ２様ヌクレオチド（配列番号４５〜４７のヌクレオチド配列が発現された）を、後に共発現解析（ｒ＞０．９；ピアソン相関係数−ＰＣＣ）においてベイトとして用い、ＶＩＧＳを用いた機能特性評価のため、さらに、ｐ４５０シトクロムをコードする５つの遺伝子、グリコシルトランスフェラーゼをコードする８つの遺伝子、及びアシルトランスフェラーゼをコードする５つの遺伝子を同定した（図２０Ａ及び２０Ｂ；表１４）。ＳＯＡＰ１、Ｓｏａｐ２、及びＳＯＡＰ２様ヌクレオチドは、それぞれ配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０のポリペプチド配列をコードする。これらの試験により、ＣＹＰ７２Ａ６５５（ＳＯＡＰ３；Ｓｐ＿０８５３４０＿ｍｅｅｋ；配列番号５１［ヌクレオチド］、配列番号５２［ポリペプチド］）及びＣＹＰ７２Ａ６５４（ＳＯＡＰ４；Ｓｐ＿０４０３５０＿ｗｄｎｙ；配列番号５３［ヌクレオチド］、配列番号５４［ポリペプチド］）が、ヨッソシドアグリコンの生合成に関与していることが明らかとなった（図２５）。以下の表１４において、用いられる用語には以下のものがある：共発現した遺伝子（coexpressed gene）−共発現相関係数が０．９超である遺伝子；アノテーション（annotation）−シロイヌナズナ属プロテオーム（ＴＡＩＲ１０）に対するブラスト解析に基づく遺伝子機能予測；及びアミノ酸配列（aa seq）−共発現した遺伝子のアミノ酸配列
【０９９９】
表１４：３種のベイトＳＯＡＰ１、ＳＯＡＰ２及びＳＯＡＰ２様によるホウレンソウ遺伝子の共発現解析
【１０００】
【表１４−１】
2022500023.tif 000035
【１００１】
【表１４−２】
2022500023.tif 000036
【１００２】
【表１４−３】
2022500023.tif 000037
【１００３】
【表１４−４】
2022500023.tif 000038
【１００４】
【表１４−５】
2022500023.tif 000039
【１００５】
【表１４−６】
2022500023.tif 000040
【１００６】
【表１４−７】
2022500023.tif 000041
【１００７】
【表１４−８】
2022500023.tif 000042
【１００８】
【表１４−９】
2022500023.tif 000043
【１００９】
【表１４−１０】
2022500023.tif 000044
【１０１０】
【表１４−１１】
2022500023.tif 000045
【１０１１】
【表１４−１２】
2022500023.tif 000046
【１０１２】
【表１４−１３】
2022500023.tif 000047
【１０１３】
【表１４−１４】
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【１０１４】
【表１４−１５】
2022500023.tif 000049
【１０１５】
【表１４−１６】
2022500023.tif 000050
【１０１６】
【表１４−１７】
2022500023.tif 000051
【１０１７】
【表１４−１８】
2022500023.tif 000052
【１０１８】
【表１４−１９】
2022500023.tif 000053
【１０１９】
【表１４−２０】
2022500023.tif 000054
【１０２０】
【表１４−２１】
2022500023.tif 000055
【１０２１】
【表１４−２２】
2022500023.tif 000056
【１０２２】
【表１４−２３】
2022500023.tif 000057
【１０２３】
【表１４−２４】
2022500023.tif 000058
【１０２４】
【表１４−２５】
2022500023.tif 000059
【１０２５】
【表１４−２６】
2022500023.tif 000060
【１０２６】
【表１４−２７】
2022500023.tif 000061
【１０２７】
【表１４−２８】
2022500023.tif 000062
【１０２８】
【表１４−２９】
2022500023.tif 000063
【１０２９】
【表１４−３０】
2022500023.tif 000064
【１０３０】
【表１４−３１】
2022500023.tif 000065
【１０３１】
【表１４−３２】
2022500023.tif 000066
【１０３２】
【表１４−３３】
2022500023.tif 000067
【１０３３】
【表１４−３４】
2022500023.tif 000068
【１０３４】
【表１４−３５】
2022500023.tif 000069
【１０３５】
【表１４−３６】
2022500023.tif 000070
【１０３６】
【表１４−３７】
2022500023.tif 000071
【１０３７】
【表１４−３８】
2022500023.tif 000072
【１０３８】
【表１４−３９】
2022500023.tif 000073
【１０３９】
【表１４−４０】
2022500023.tif 000074
【１０４０】
【表１４−４１】
2022500023.tif 000075
【１０４１】
【表１４−４２】
2022500023.tif 000076
【１０４２】
【表１４−４３】
2022500023.tif 000077
【１０４３】
【表１４−４４】
2022500023.tif 000078
【１０４４】
【表１４−４５】
2022500023.tif 000079
【１０４５】
【表１４−４６】
2022500023.tif 000080
【１０４６】
【表１４−４７】
2022500023.tif 000081
【１０４７】
【表１４−４８】
2022500023.tif 000082
【１０４８】
【表１４−４９】
2022500023.tif 000083
【１０４９】
【表１４−５０】
2022500023.tif 000084
【１０５０】
【表１４−５１】
2022500023.tif 000085
【１０５１】
【表１４−５２】
2022500023.tif 000086
【１０５２】
【表１４−５３】
2022500023.tif 000087
【１０５３】
【表１４−５４】
2022500023.tif 000088
【１０５４】
【表１４−５５】
2022500023.tif 000089
【１０５５】
【表１４−５６】
2022500023.tif 000090
【１０５６】
【表１４−５７】
2022500023.tif 000091
【１０５７】
【表１４−５８】
2022500023.tif 000092
【１０５８】
【表１４−５９】
2022500023.tif 000093
【１０５９】
【表１４−６０】
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【１０６０】
【表１４−６１】
2022500023.tif 000095
【１０６１】
【表１４−６２】
2022500023.tif 000096
【１０６２】
【表１４−６３】
2022500023.tif 000097
【１０６３】
【表１４−６４】
2022500023.tif 000098
【１０６４】
【表１４−６５】
2022500023.tif 000099
【１０６５】
【表１４−６６】
2022500023.tif 000100
【１０６６】
【表１４−６７】
2022500023.tif 000101
【１０６７】
【表１４−６８】
2022500023.tif 000102
【１０６８】
【表１４−６９】
2022500023.tif 000103
【１０６９】
【表１４−７０】
2022500023.tif 000104
【１０７０】
【表１４−７１】
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【１０７１】
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【表１４−２７１】
2022500023.tif 000305
【１２７１】
【表１４−２７２】
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【１２７２】
【表１４−２７３】
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【１２７３】
【表１４−２７４】
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【１２７４】
【表１４−２７５】
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【１２７５】
【表１４−２７６】
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【１２７６】
【表１４−２７７】
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【１２７７】
【表１４−２７８】
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【１２７８】
【表１４−２７９】
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【１２７９】
【表１４−２８０】
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【１２８０】
【表１４−２８１】
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【１２８１】
【表１４−２８２】
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【１２８２】
【表１４−２８３】
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【１２８３】
【表１４−２８４】
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【１２８４】
【表１４−２８５】
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【１２８５】
【表１４−２８６】
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【１２８６】
【表１４−２８７】
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【１２８７】
【表１４−２８８】
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【１２８８】
【表１４−２８９】
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【１２８９】
【表１４−２９０】
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【１２９０】
【表１４−２９１】
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【１２９１】
【表１４−２９２】
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【１２９２】
【表１４−２９３】
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【１２９３】
【表１４−２９４】
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【１２９４】
【表１４−２９５】
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【１２９５】
【表１４−２９６】
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【１２９６】
【表１４−２９７】
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【１２９７】
【表１４−２９８】
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【１２９８】
【表１４−２９９】
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【１２９９】
【表１４−３００】
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【１３００】
【表１４−３０１】
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【１３０１】
【表１４−３０２】
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【１３０２】
【表１４−３０３】
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【１３０３】
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【１３０４】
【表１４−３０５】
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【１３０５】
【表１４−３０６】
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【１３０６】
【表１４−３０７】
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【１３０７】
【表１４−３０８】
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【１３０８】
【表１４−３０９】
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【１３０９】
【表１４−３１０】
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【１３１０】
【表１４−３１１】
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【１３１１】
【表１４−３１２】
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【１３１２】
【表１４−３１３】
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【１３１３】
【表１４−３１４】
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【１３１４】
【表１４−３１５】
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【１３１５】
【表１４−３１６】
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【１３１６】
【表１４−３１７】
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【１３１７】
【表１４−３１８】
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【１３１８】
【表１４−３１９】
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【１３１９】
【表１４−３２０】
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【１３２０】
【表１４−３２１】
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【１３２１】
【表１４−３２２】
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【１３２２】
【表１４−３２３】
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【１３２３】
【表１４−３２４】
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【１３２４】
【表１４−３２５】
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【１３２５】
【表１４−３２６】
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【１３２６】
【表１４−３２７】
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【１３２７】
【表１４−３２８】
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【１３２８】
【表１４−３２９】
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【１３２９】
【表１４−３３０】
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【１３３０】
【表１４−３３１】
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【１３３１】
【表１４−３３２】
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【１３３２】
【表１４−３３３】
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【１３３３】
【表１４−３３４】
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【１３３４】
【表１４−３３５】
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【１３３５】
【表１４−３３６】
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【１３３６】
【表１４−３３７】
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【１３３７】
【表１４−３３８】
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【１３３８】
【表１４−３３９】
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【表１４−３４０】
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【１３４０】
【表１４−３４１】
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【１３４１】
【表１４−３４２】
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【１３４２】
【表１４−３４３】
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【１３４３】
【表１４−３４４】
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【１３４４】
【表１４−３４５】
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【１３４５】
【表１４−３４６】
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【１３４６】
【表１４−３４７】
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【１３４７】
【表１４−３４８】
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【１３４８】
【表１４−３４９】
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【１３４９】
【表１４−３５０】
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【１３５０】
【表１４−３５１】
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【１３５１】
【表１４−３５２】
2022500023.tif 000386
【１３５２】
【表１４−３５３】
2022500023.tif 000387
【１３５３】
【表１４−３５４】
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【１３５４】
【表１４−３５５】
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【１３５５】
【表１４−３５６】
2022500023.tif 000390
【１３５６】
【表１４−３５７】
2022500023.tif 000391
【１３５７】
【表１４−３５８】
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【１３５８】
【表１４−３５９】
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【１３５９】
【表１４−３６０】
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【１３６０】
【表１４−３６１】
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【１３６１】
【表１４−３６２】
2022500023.tif 000396
【１３６２】
【表１４−３６３】
2022500023.tif 000397
【１３６３】
【表１４−３６４】
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【１３６４】
【表１４−３６５】
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【１３６５】
【表１４−３６６】
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【１３６６】
【表１４−３６７】
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【１３６７】
【表１４−３６８】
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【１３６８】
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【１３６９】
【表１４−３７０】
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【１３７０】
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【１３７１】
【表１４−３７２】
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【１３７２】
【表１４−３７３】
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【１３７３】
【表１４−３７４】
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【１３７４】
【表１４−３７５】
2022500023.tif 000409
【１３７５】
【表１４−３７６】
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【１３７６】
【表１４−３７７】
2022500023.tif 000411
【１３７７】
【表１４−３７８】
2022500023.tif 000412
【１３７８】
【表１４−３７９】
2022500023.tif 000413
【１３７９】
【表１４−３８０】
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【１３８０】
【表１４−３８１】
2022500023.tif 000415
【１３８１】
【表１４−３８２】
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【１３８２】
【表１４−３８３】
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【１３８３】
【表１４−３８４】
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【１３８４】
【表１４−３８５】
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【１３８５】
【表１４−３８６】
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【１３８６】
【表１４−３８７】
2022500023.tif 000421
【１３８７】
【表１４−３８８】
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【１３８８】
【表１４−３８９】
2022500023.tif 000423
【１３８９】
【表１４−３９０】
2022500023.tif 000424
【１３９０】
【表１４−３９１】
2022500023.tif 000425
【１３９１】
【表１４−３９２】
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【１３９２】
【表１４−３９３】
2022500023.tif 000427
【１３９３】
【表１４−３９４】
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【１３９４】
【表１４−３９５】
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【１３９５】
【表１４−３９６】
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【１３９６】
【表１４−３９７】
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【１３９７】
【表１４−３９８】
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【１３９８】
【表１４−３９９】
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【１３９９】
【表１４−４００】
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【１４００】
【表１４−４０１】
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【１４０１】
【表１４−４０２】
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【１４０２】
【表１４−４０３】
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【１４０３】
【表１４−４０４】
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【１４０４】
【表１４−４０５】
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【１４０５】
【表１４−４０６】
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【１４０６】
【表１４−４０７】
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【１４０７】
【表１４−４０８】
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【１４０８】
【表１４−４０９】
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【１４０９】
【表１４−４１０】
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【１４１０】
【表１４−４１１】
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【１４１１】
【表１４−４１２】
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【１４１２】
【表１４−４１３】
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【１４１３】
【表１４−４１４】
2022500023.tif 000448
【１４１４】
【表１４−４１５】
2022500023.tif 000449
【１４１５】
【表１４−４１６】
2022500023.tif 000450
【１４１６】
【表１４−４１７】
2022500023.tif 000451
【１４１７】
【表１４−４１８】
2022500023.tif 000452
【１４１８】
【表１４−４１９】
2022500023.tif 000453
【１４１９】
【表１４−４２０】
2022500023.tif 000454
【１４２０】
【表１４−４２１】
2022500023.tif 000455
【１４２１】
【表１４−４２２】
2022500023.tif 000456
【１４２２】
【表１４−４２３】
2022500023.tif 000457
【１４２３】
【表１４−４２４】
2022500023.tif 000458
【１４２４】
【表１４−４２５】
2022500023.tif 000459
【１４２５】
【表１４−４２６】
2022500023.tif 000460
【１４２６】
【表１４−４２７】
2022500023.tif 000461
【１４２７】
【表１４−４２８】
2022500023.tif 000462
【１４２８】
【表１４−４２９】
2022500023.tif 000463
【１４２９】
【表１４−４３０】
2022500023.tif 000464
【１４３０】
【表１４−４３１】
2022500023.tif 000465
【１４３１】
【表１４−４３２】
2022500023.tif 000466
【１４３２】
【表１４−４３３】
2022500023.tif 000467
【１４３３】
【表１４−４３４】
2022500023.tif 000468
【１４３４】
【表１４−４３５】
2022500023.tif 000469
【１４３５】
【表１４−４３６】
2022500023.tif 000470
【１４３６】
【表１４−４３７】
2022500023.tif 000471
【１４３７】
【表１４−４３８】
2022500023.tif 000472
【１４３８】
ＳＯＡＰ３及びＳＯＡＰ４発現のダウンレギュレーションによってメディカゲン酸由来サポニンの蓄積が低下し、グリコシル化中間体（アウグスチン酸、バヨゲニン及びヘデラゲニン）が蓄積した（図２５、図２６Ａ〜２６Ｌ、図２７、図２８Ａ〜２８Ｃ）。
【１４３９】
蓄積した経路中間体の構造から、ＳＯＡＰ３（配列番号５２）はＣ−２ヒドロキシラーゼ、ＳＯＡＰ４（配列番号５４）はＣ−２３オキシダーゼであることが示された（図２０Ａ）。ＣＹＰ２（ＣＹＰ７２Ａ６５６；Ｓｐ＿１４８２３０＿ｄｇｒａ）（配列番号７２［遺伝子］及び配列番号７３［ポリペプチド］）も同定され、これらはＳＯＡＰ４に対して高い相同性を示し（アミノ酸レベルでほぼ９２％）、サポニン生合成経路において同じ活性を呈するものと考えられる。また、以下がサイレンシングされた植物では、サポニン含有量の低下が認められた：ＳＯＡＰ６（ＵＧＴ７４ＢＢ２；Ｓｐ＿１７０９３０＿ｈｊｇｑ；配列番号５５［遺伝子］及び配列番号５６［ポリペプチド］）、ＳＯＡＰ７（ＵＧＴ７９Ｋ１；Ｓｐ＿０２０８２０＿ｙｅａｕ；配列番号５７［遺伝子］及び配列番号５８［ポリペプチド］）、ＳＯＡＰ８（ＵＧＴ７９Ｌ２；Ｓｐ＿１１３７００＿ｓｕｘｈ；配列番号５９［遺伝子］及び配列番号６０［ポリペプチド］）及びＳＯＡＰ９（ＵＧＴ７３ＢＳ１；Ｓｐ＿１７０３２０＿ｄｍｑｉ；配列番号６１［遺伝子］及び配列番号６２［ポリペプチド］）グリコシルトランスフェラーゼ（図２９）。
【１４４０】
同じ植物では、特定の糖、すなわち、デオキシヘキソース（ＳＯＡＰ６（配列番号５６）及びＳＯＡＰ７（配列番号５８））、ヘキソース（ＳＯＡＰ８（配列番号６０））及びペントース（ＳＯＡＰ９（配列番号６２））が欠如した経路中間体が蓄積した（図３０Ａ〜３０Ｃ）。さらに、５つの共発現アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）のうちの１つ（すなわち、ＳＯＡＰ１０；Ｓｐ＿１２５８００＿ｋｚｗｓ；配列番号６３［遺伝子］、配列番号６４［ポリペプチド］）のＶＩＧＳの結果、アセチル化サポニンに対するデスアセチルサポニンの比が増加した（２０から８０％）（図３１Ａ〜３１Ｃ）。次いで、大腸菌において発現した組換えＳＯＡＰ１０のアシルトランスフェラーゼ活性は、２つのデオキシヘキソースがＣ−２８位に結合したヨッソシドＩＶ及びその他のヨッソシド（例えば、ヨッソシドＶＩ及びヨッソシドＸＩＩ）をアセチル化することから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【１４４１】
実施例１８：ＳＯＡＰ遺伝子の検証
【１４４２】
目的：９つの遺伝子全て［すなわち、β−アミリン合成酵素（ｂＡＳ；ＳＯＡＰ１；配列番号４５）；シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０ｓ；ＳＯＡＰ２、３、４；それぞれ配列番号４６、５１、５３）；ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴｓ；ＳＯＡＰ６、７、８、９；それぞれ配列番号５５、５７、５９、６１）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ；ＳＯＡＰ１０；配列番号６３）］の機能を検証すること。
【１４４３】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１４４４】
結果：対照とする９つの遺伝子（ＳＯＡＰ１〜４及び６〜１０）は、ベンサミアナタバコの葉において一過性発現した。最初の４種の生合成遺伝子（ＳＯＡＰ１〜ＳＯＡＰ４）を発現させたところ、メディカゲン酸が産生した（図２０Ａ）。奇妙なことに、９つの遺伝子全てが共発現しても、ホウレンソウの葉で以前に検出されたいずれのサポニンも産生されなかった。それにもかかわらず、ホウレンソウの葉には通常存在しないメディカゲン酸及びグリコシル化誘導体［ＭＡ＋ｈｅｘ；ＭＡ＋２  ×  ｈｅｘ、ＭＡ＋３  ×  ｈｅｘ］が検出された（図３２Ａ〜３２Ｄ）。
【１４４５】
要約：メディカゲン酸の再構成が実現された一方で、９つの遺伝子ＳＯＡＰ１〜４及び６〜１０が発現しても、いずれのサポニンも産生されなかった。
【１４４６】
実施例１９：サポニン生合成経路の構成要素としてのセルロース合成酵素様Ｇホウレンソウホモログの解析
【１４４７】
目的：サポニンの生合成経路の再構成に必要な、欠損している１つまたは複数の遺伝子を同定すること。
【１４４８】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１４４９】
結論：この時点で、サポニン生合成経路を再構築するための、少なくとも１つの酵素が存在していないことが分かった。欠損している１つまたは複数の酵素を同定する試みとして、共発現解析によって得られた遺伝子のリストを改訂した。糖代謝に関連すると思われる共発現セットにおける全てのベイトで共発現された唯一の遺伝子は、セルロース合成酵素様Ｇホウレンソウホモログ（ＳｏＣＳＬＧ）（「T. Richmond, Higher plant cellulose synthases, Genome Biology. 1, 3001.1-3001.6 (2000).」）であった。この機能予測に基づくと、サポニン生合成へのその寄与の可能性は低いものと考えられたが、その経路内の機能について検討した。
【１４５０】
注目すべきことに、ＳｏＣＳＬＧをサイレンシングしたところ、ホウレンソウの葉においてメディカゲン酸の高い蓄積が認められ（図３３Ａ〜３３Ｆ、図３４Ａ及び３４Ｂ）、トリテルペノイド系サポニン生合成における役割が示唆された。次に、ベンサミアナタバコの葉において、ＳｏＣＳＬＧ（配列番号６５または９３）をＳＯＡＰ１〜４（それぞれ配列番号４５、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５３）と共に一過性発現した。５つの酵素全ての活性を合わせると、ホウレンソウトリテルペノイド系サポニン生合成経路における最初のグリコシル化中間体であるメディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニド（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ）が産生した（図２０Ａ〜２０Ｃ及び図３２Ａ〜３３Ｆ、図３５Ａ〜３５Ｃ）。
【１４５１】
さらに、ＣＳＬＧ（ＳＯＡＰ５、Ｓｐ＿０７６６９０＿ｅｊｃｍ（配列番号６５または９３［遺伝子］、配列番号６６［ポリペプチド］）とｂＡＳ（ＳＯＡＰ１；配列番号４５）及びＣＹＰ４５０（ＳＯＡＰ２［配列番号４６］）、ＳＯＡＰ３［配列番号５１］及びＳＯＡＰ４［配列番号５３］）との組み合わせ発現により、ＳＯＡＰ５［配列番号６６］は、メディカゲン酸の他に、オレアノール酸、アウグスチン酸、ヘデラゲニン、ギプソゲニン及びギプソゲン酸などの他のトリテルペノイド系アグリコンをグルクロン酸抱合できることが示されたが、これらはホウレンソウでは有意な量が検出されることはなかった（図３６Ａ〜３６Ｆ）。ＳＯＡＰ５（ＳｏＣＳＬＧ）は、ホウレンソウサポニングルクロン酸トランスフェラーゼとして同定された。逆に、ＳＯＡＰ５（配列番号６５または９３）の発現を阻害したところ、いくつかの実施形態において、これらに限定されるものではないが、メディカゲン酸、オレアノール酸、アウグスチン酸、ヘデラゲニン、ギプソゲニン、及びギプソゲン酸などのトリテルペノイド系アグリコンのグルクロン酸抱合が低下または阻害される結果となった。
【１４５２】
ＳＯＡＰ５がホウレンソウサポニン経路において確かに欠損している構成要素であるか否かを検討するため、ベンサミアナタバコの葉において、１０のＳＯＡＰ遺伝子全て（表１６を参照）の組み合わせを一過性発現した。代謝物の分析によると、最も豊富なホウレンソウサポニンヨッソシドＶの存在が示され、自然の経路において必要な全てのステップ及び酵素が同定されたことが示された（図３３Ａ〜３３Ｆ）。
【１４５３】
要約：ホウレンソウサポニンヨッソシドＶ（化合物１１）の自然の経路において必要な全てのステップの酵素が同定され、異種植物系で機能的に活性であることが示された。
【１４５４】
実施例２０：トリテルペノイド生合成経路の特徴
【１４５５】
目的：ホウレンソウサポニン代謝経路のさらなる詳細を解明すること。
【１４５６】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１４５７】
結果：ＳＯＡＰ５（配列番号６６）をホウレンソウサポニングルクロン酸トランスフェラーゼと同定することによって、経路をさらに解明することができた。ＳＯＡＰ６（配列番号５６）は、フコースをアグリコンのＣ−２８位のカルボキシル基に結合させるＭＡ−３−ＧｌｃＡに直接作用し、ヨッソシドＩ（化合物７）を産生することが分かった。実際に、これによって、ＳＯＡＰ６は、トリテルペノイド代謝に関与する、特性が解明された初のフコシルトランスフェラーゼとなっている（「T. Louveau et al., Analysis of two new arabinosyltransferases belonging to the carbohydrate-active enzyme (CAZY) glycosyl transferase family 1 provides insights into disease resistance and sugar donor specificity. The Pant Cell. 30, 3038-3057 (2018).」）（図３７Ａ〜３７Ｆ、図３８Ａ〜３８Ｅ）。
【１４５８】
ＳＯＡＰ７（配列番号５７）の発現により、他の６種のＳＯＡＰ１〜６遺伝子（表１６参照）と共に発現したときのみ、ヨッソシドＩＩ生成物が産生した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に基づくと、ＳＯＡＰ７（配列番号５８）は、ラムノースをヨッソシドＩのフトースに転移させるグリコシルトランスフェラーゼである（図３７Ａ〜３７Ｆ、図３８Ａ〜３８Ｅ）。ヨッソシドＩＩは、Ｃ−２８位に結合したフコース及びラムノースを有するアグリコンのみを基質として受け入れるグルコシルトランスフェラーゼであるＳＯＡＰ８（配列番号６０）によって、ヨッソシドＩＩＩにさらに変換される（図２０Ａ、図３７Ａ〜３７Ｆ、図３８Ａ〜３８Ｅ）。ＳＯＡＰ９（配列番号６１［遺伝子］、配列番号６２［ポリペプチド］）の発現により、ＳＯＡＰ９は、ＭＡにＣ−３で結合したグルクロン酸にペントースを結合させるキシロシルトランスフェラーゼであることが示された。ＳＯＡＰ９の場合、その活性にとって、Ｃ−２８のトリテルペノイド骨格を修飾する糖部分は重要ではない（図３９Ａ〜３９Ｃ）。ｉｎ  ｐｌａｎｔａ試験及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、ＳＯＡＰ１０は、アセチル基をフコース部分に転移させる、ホウレンソウにおけるサポニン生合成の最終ステップに関与していることが示された（図３１Ａ〜３１Ｆ）。比較に用いたアセチルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、下記の表１５に示す。
【１４５９】
表１５：アセチルトランスフェラーゼ酵素のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
【１４６０】
【表１５−１】
2022500023.tif 000473
【１４６１】
【表１５−２】
2022500023.tif 000474
【１４６２】
【表１５−３】
2022500023.tif 000475
【１４６３】
本発明者らの知る限り、ＳＯＡＰ１０（配列番号６４）は、アシルトランスフェラーゼのうちの、ベンジルアルコールアセチル−、アントシアニン−Ｏ−ヒドロキシ−シンナモイル−、アントラニル酸−Ｎ−ヒドロキシ−シンナモイル／ベンゾイル−、デアセチルビンドリンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＨＤ）スーパーファミリーの中で、トリテルペノイド系サポニン生合成への関与が報告された初のメンバーである。
【１４６４】
以下の表１６は、ホウレンソウにおいて化合物１１（ヨッソシドＶ）を産生する生合成トリテルペノイド系サポニン生合成経路を構成する、１０種の酵素のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列、並びにこれらの酵素をコードする遺伝子を示す。
【１４６５】
表１６：ホウレンソウにおけるトリテルペノイド生合成経路酵素のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
【１４６６】
【表１６−１】
2022500023.tif 000476
【１４６７】
【表１６−２】
2022500023.tif 000477
【１４６８】
【表１６−３】
2022500023.tif 000478
【１４６９】
【表１６−４】
2022500023.tif 000479
【１４７０】
【表１６−５】
2022500023.tif 000480
【１４７１】
【表１６−６】
2022500023.tif 000481
【１４７２】
【表１６−７】
2022500023.tif 000482
【１４７３】
【表１６−８】
2022500023.tif 000483
【１４７４】
【表１６−９】
2022500023.tif 000484
【１４７５】
要約：本試験により、数々の驚くべき詳細が明らかとなった。例えば、キラヤ（Quillaja saponaria）由来の強力なワクチンアジュバントであるＱＳ−２１（「D.J. Marciani, Is fucose the answer to the immunomodulatory paradox of Quillaja saponins? Int Immunopharmacol. 29, 908-913 (2015).」）の生合成経路においてキラヤ酸を修飾するフコシルトランスフェラーゼについての相同性に基づく検索において、ＳＯＡＰ６は、テンプレートの役割を果たす可能性がある。また、アシルトランスフェラーゼのＢＡＨＤスーパーファミリーのメンバーであるＳＯＡＰ１０は、トリテルペノイド系サポニン生合成に関与している。
【１４７６】
実施例２１：酵母におけるトリテルペノイド中間体の産生
【１４７７】
目的：酵母サッカロミセス・セレビシエの場合に、さらなる異種系において、トリテルペノイド中間体を産生すること。
【１４７８】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１４７９】
結果：ＭＡ−３−ＧｌｃＡの産生におけるさらなる植物酵素の関与を除外するため、本発明者らは、サッカロミセス・セレビシエにおいてＳＯＡＰ５を発現させた（図３３Ｄ）。酵母はアミリン型トリテルペノイドもＵＤＰ−グルコン酸も産生しないため、ＳＯＡＰ５活性に必須の基質を得るためには、これらの前駆体を産生する酵素の発現が必要であった（「P. Arendt et al., An endoplasmic reticulum-engineered yeast platform for overproduction of triterpenoids. Metabolic Engineering. 40, 165-175 (2017)」；「 T. Oka, Y. Jigami, Reconstruction of de novopathway for synthesis of UDP-glucuronic acid and UDP-xylose from intrinsic UDP-glucose in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Journal. 273, 2645-2657 (2006)」）。
【１４８０】
酵母においてＳＯＡＰ１、２、３、及び４を発現させたところ、メディカゲン酸が産生した（図４０Ａ〜４０Ｂ）。しかしながら、ＳＯＡＰ５の添加は、メディカゲン酸３−Ｏ−グルクロニドの産生には不十分であった（図３３Ａ〜３３Ｆ）。ＳＯＡＰ５に活性化糖を提供するため、ＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−グルクロン酸への変換を触媒する、ホウレンソウ（ＳｏＵＧＤ１、Ｓｐ＿１８９８３０＿ｐｓｃａ）由来のＵＤＰ−グルコース６−デヒドロゲナーゼ１を発現させた（配列番号７４［遺伝子］及び配列番号７５［ポリペプチド］）。
【１４８１】
ＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＣＡＡＧＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＧＣＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＣＣＣＡＡＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＧＧＡＴＴＧＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＧＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＴＡＣＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＧＣＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＡ（配列番号７４）。
【１４８２】
ＭＶＫＩＣＣＩＧＡＧＹＶＧＧＰＴＭＡＶＩＡＬＫＣＰＫＩＥＶＶＶＶＤＩＳＶＳＲＩＴＡＷＮＳＥＱＬＰＩＹＥＰＧＬＤＤＶＶＫＥＣＲＧＲＮＬＦＦＳＴＤＶＥＫＨＶＡＥＡＤＩＶＦＶＳＶＮＴＰＴＫＴＴＧＬＧＡＧＫＡＡＤＬＴＹＷＥＳＡＡＲＭＩＡＤＶＳＫＳＤＫＩＶＶＥＫＳＴＶＰＶＫＴＡＥＡＩＥＫＩＬＴＨＮＳＫＧＩＮＹＱＩＬＳＮＰＥＦＬＡＥＧＴＡＩＱＤＬＦＨＰＤＲＶＬＩＧＧＲＥＴＰＡＧＬＫＡＶＱＡＬＫＤＶＹＡＱＷＶＰＤＥＲＩＬＴＴＮＬＷＳＡＥＬＳＫＬＡＡＮＡＦＬＡＱＲＩＳＳＶＮＡＭＳＡＬＣＥＡＴＧＡＤＶＴＱＶＡＹＡＶＧＫＤＳＲＩＧＱＫＦＬＮＡＳＶＧＦＧＧＳＣＦＱＫＤＩＬＮＬＶＹＩＣＥＣＮＧＬＰＥＶＡＥＹＷＫＱＶＩＫＶＮＤＹＱＫＮＲＦＶＮＲＶＶＡＳＭＦＮＴＶＳＮＫＫＩＡＶＬＧＦＡＦＫＫＤＴＧＤＴＲＥＴＰＡＩＤＶＣＫＧＬＬＧＤＫＡＲＬＳＩＹＤＰＱＶＴＥＤＱＩＱＲＤＬＴＭＮＫＦＤＷＤＨＰＩＨＬＱＰＴＳＰＴＴＶＫＱＶＳＶＶＷＤＡＹＥＡＴＫＤＡＨＡＶＣＩＬＴＥＷＤＥＦＫＫＬＤＹＫＲＩＦＤＮＭＱＫＰＡＦＶＦＤＧＲＮＩＶＮＡＤＥＬＲＱＩＧＦＩＶＹＳＩＧＫＰＬＤＳＷＬＫＤＭＰＡＶＡ（配列番号７５）。
【１４８３】
その結果、他の５つの遺伝子全てと共にＳＯＡＰ５を発現する酵母細胞のみが、ＭＡ−３−ＧｌｃＡを産生することができた（図３３Ａ〜３３Ｆ、図４０Ａ〜４０Ｂ）。ベンサミアナタバコのアッセイと同様に、ＳＯＡＰ５は、酵母細胞において、トリテルペノイド中間体（オレアノール酸、ギプソゲン酸及びバヨゲニン）をグルクロン酸抱合することができた（図４１Ａ〜４１Ｆ）。
【１４８４】
要約：元の酵素とは異種の系において、トリテルペノイド中間体を産生しかつグルクロン酸抱合することが可能であることが示された。
【１４８５】
実施例２２：さらなる植物種におけるセルロース合成酵素様酵素の検討
【１４８６】
目的：非ホウレンソウ植物種における機能性セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）酵素を同定し、解析すること。
【１４８７】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１４８８】
結果：Ｃ−３位のヒドロキシルを介してサポニンアグリコンに結合したグルクロン酸は、植物、特に、ナデシコ亜綱（Caryophyllidae）、原始的なバラ亜目（Rosidae）及びキク亜目（Asteridae）において見られる多くのサポニンについて共通の特徴である（「M. Henry, Saponins and Phylogeny: Example of the "Gypsogenin group" Saponins. Phytochem Rev. 4, 89-94 (2005)」）。ＣＳＬＧ酵素によるグルクロン酸のトリテルペノイド骨格への抱合がホウレンソウ及びその科に限定されるものであるか否かを調べるため、ＣＳＬＧタンパク質の系統発生解析を、コケ、裸子植物、及び顕花植物を含む、７０を超える植物種において行った。ホウレンソウＳＯＡＰ５は、ナデシコ目（Caryophyllales）、アオイ目（Malvales）、セリ目（Apiales）、及びマメ目（Fabales）由来のＣＳＬＧタンパク質に関連していることが明らかとなった（図４２Ａ〜４２Ｅ）。
【１４８９】
選択した種及び公表データのサポニンプロファイリングにより、ダイズ（Glycine max）、アルファルファ（Medicago sativa）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）及びカンゾウ（ウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis））並びにビートルート（Beta vulgaris）及びキノア（Chenopodium quinoa）のようなナデシコ目（Caryophyllales）の種において、グルクロニド−オレアナン型サポニンの存在が示された（図４３Ａ〜４３Ｃ）。
【１４９０】
次いで、ホウレンソウＳＯＡＰ５のうちの最も近いホモログを、前述の種の全てからクローニングし、ベンサミアナタバコにおいて、ＳＯＡＰ１〜４と共に、一過性に発現させた。試験した全てのＣＳＬＧ酵素について、ＭＡ−３−ＧｌｃＡの産生が認められた（図４２Ａ〜４２Ｅ）。以下の表１７は、これらのＳＯＡＰ５ホモログの核酸配列及びアミノ酸配列を示す。
【１４９１】
表１７：ＳＯＡＰ５セルロース合成酵素様Ｇホモログ（グルクロン酸トランスフェラーゼ活性を有する）
【１４９２】
【表１７−１】
2022500023.tif 000485
【１４９３】
【表１７−２】
2022500023.tif 000486
【１４９４】
【表１７−３】
2022500023.tif 000487
【１４９５】
【表１７−４】
2022500023.tif 000488
【１４９６】
【表１７−５】
2022500023.tif 000489
【１４９７】
【表１７−６】
2022500023.tif 000490
【１４９８】
ホウレンソウＳＯＡＰ５の場合と同様にビートルートＣＳＬＧ（ＢｖＳＯＡＰ５）をサイレンシングしたところ、サポニンのレベルが低下し、オレアノール酸の蓄積が上昇した（図４４Ａ〜４４Ｃ）。同様に、アルファルファ毛状根中においてＣＬＳＧの発現を抑制したところ、グルクロン酸が結合したサポニンの蓄積が低下した（図４５Ａ及び４５Ｂ）。
【１４９９】
要約：これらの結果は、サポニン生合成経路内の酵素の異種機能性を示すものである。
【１５００】
実施例２３：カンゾウ由来のセルロース合成酵素様Ｇを用いたグリチルリチンの異種産生
【１５０１】
目的：ＣＳＬＧグルクロノシルトランスフェラーゼ活性を見出すことにより、数々のグルクロニド型トリテルペノイド系サポニンの生合成経路における大きな知見の不足が埋められる。現在までに部分的にしか解読されていないこのような経路の１つでは、カンゾウで産生され、Ｃ−３位に２つのグルクロン酸部分で修飾されたグリチルレチン酸からなるトリテルペノイド系サポニンである、グリチルリチンを産生する。グリチルリチン（すなわちＧＬ）及びその単一のグルクロン酸抱合誘導体であるグリチルレチン酸モノグルクロニド（すなわちＧＡＭＧ）は、伝統的な中国及び日本の医学で長く使用され、現在では食品、化粧品及び医薬品産業で使用されている重要な天然物である。これらの分子は血糖指数がゼロの低カロリー甘味料で、ＧＡＭＧはスクロースよりも９４１倍甘く、ＧＬよりも５倍甘い（「K. Mizutani, T. Kuramoto, Y. Tamura, N. Ohtake, S. Doi, M. Nakaura, O. Tanaka, Sweetness of glycyrrhetic acid 3-O-beta-D-monoglucuronide and the related glycosides. Biosci Biotechnol Biochem. 58, 554-5 (1994)」）。ＧＬ及びＧＡＭＧの商業生産は、現在では入手が限られている野生のウラルカンゾウと、非効率的な工業的加工処理に依拠している。最初のグルクロン酸のアグリコンへの結合を触媒する酵素が同定されていないため、異種系におけるＧＬ及びＧＡＭＧの持続可能な産生は、その重要性にも関わらず、現在のところ不可能である（「Y. Nomura et al., Functional specialization of UDP-glycosyltransferase 73P12 in licorice to produce a sweet triterpenoid saponin, glycyrrhizin. Plant J. doi: 10.1111/tpj.14409 (2019)」）。そこで、異種系においてグリチルリチンを産生することが目標となった。
【１５０２】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１５０３】
結果：サポニンのうちのいくつか、特にマメ科の植物によって産生されるものは、それらの特有の特性のため、重要性が高い。Ｃ−３位の２つのグルクロン酸部分によって修飾されたグリチルレチン酸からなるトリテルペノイドであるグリチルリチンはウラルカンゾウによって産生され、ノンカロリー甘味料及び薬剤として多くのアジア諸国で広く使用されている。グリチルリチン産生に関与する５つの酵素のうち４つは、既に特性が解明されている（ｂＡＳ、ＣＹＰ８８Ｄ６及びＣＹＰ７２Ａ１５４、ＵＧＴ７３Ｐ１２）が、最初のグルクロン酸をアグリコンに結合する役割を果たす酵素は不明であった（「Y. Nomura et al., Functional specialization of UDP-glycosyltransferase 73P12 in licorice to produce a sweet triterpenoid saponin, glycyrrhizin. Plant J. doi: 10.1111/tpj.14409 (2019).」）。ここで疑問となるのは、カンゾウ由来のセルロース合成酵素様Ｇ（ＧｕＣＳＬ）が、この反応を行うことができるか否かということであった。
【１５０４】
ウラルカンゾウ由来のセルロース合成酵素を同定し、異種系における発現に用いた。発現された遺伝子及びコードされたポリペプチドのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、下記の表１８に示す。
【１５０５】
表１８：ウラルカンゾウにおけるトリテルペノイドグリチルリチン生合成経路の構成要素
【１５０６】
【表１８−１】
2022500023.tif 000491
【１５０７】
【表１８−２】
2022500023.tif 000492
【１５０８】
【表１８−３】
2022500023.tif 000493
【１５０９】
【表１８−４】
2022500023.tif 000494
【１５１０】
【表１８−５】
2022500023.tif 000495
【１５１１】
【表１８−６】
2022500023.tif 000496
【１５１２】
【表１８−７】
2022500023.tif 000497
【１５１３】
ベンサミアナタバコにおいてホウレンソウｂＡＳ（ＳｏＳＯＡＰ１；配列番号４５）、ＧｕＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号７６）、ＧｕＣＹＰ７２Ａ１５４（配列番号７８）、及びＧｕＣＳＬ（配列番号８０）を発現させたところ、グリチルレチン酸３−Ｏ−モノグルクロニド（ＧＡ−３−ＧｌｃＡ）が産生した（図４６Ａ〜４６Ｅ）。一方、グリチルレチン酸の連続する２段階のグルクロン酸抱合を触媒し、グリチルリチンを産生するものと考えられている既報のＧｕＵＧＡＴ（配列番号８２）は、今回行ったアッセイにおいて、ＧｌｃＡをアグリコンに結合することはできなかった（「G. Xu, W. Cai, W. Gao, C Liu, A novel glucuronosyltransferase has an unprecedented ability to catalyse continuous two-step glucuronosylation of glycyrrhetinic acid to yield glycyrrhizin. New Phytol. 212, 123-35 (2016).」）。
【１５１４】
ＧｕＵＧＴ７３Ｐ１２（配列番号８４）は、２番目のＧｌｃＡを結合させることが以前示されていたが、これをＧｕＣＳＬ及び他の酵素と共に一過性発現させると、ベンサミアナタバコにおける最終産物としてグリチルリチンが産生された（図４７Ａ〜４７Ｆ）。これらのアッセイによると、ＧｕＣＳＬ（配列番号８１）は、２番目のグルクロン酸部分をＧＡ−３−ＧｌｃＡに付加することができるが、効率が非常に低いことも示された。
【１５１５】
さらに、異種系（ベンサミアナタバコ）において、キラヤ（Q. saponaria）由来のＱＳ−２１の生合成における最初のグリコシル化ステップは、グルクロン酸をＣ−３位のキラヤ酸に結合させるＣＳＬＧによって行われ得ることが示されるであろう。
【１５１６】
要約：セルロース合成酵素様Ｇ酵素によって行われる新たな形態の生合成反応が見いだされたことにより、異種系（植物または真菌）において、重要な特化した代謝物の経路と、それらの持続可能な産生とを操作する上で有益な戦略がもたらされる。
【１５１７】
実施例２４：セルロース合成酵素様Ｇの構造解析
【１５１８】
目的：セルロース合成酵素様Ｇ（ＣＳＬＧ）の構造を解析し、古典的なセルロース合成酵素Ａ（ＣＥＳＡ）と比較すること。
【１５１９】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１５２０】
結果：系統発生解析によると、ＣＳＬＧは、セルロース生合成を媒介する古典的なセルロース合成酵素Ａ（ＣＥＳＡ）と進化的に異なることが示された（約３０％のアミノ酸配列類似性）。しかしながら、これら２つのタンパク質群には、いくつかの共通の構造的特徴がある。ホウレンソウＳＯＡＰ５  ＣＳＬＧタンパク質をテンプレートベースで三次構造をモデル化して得られた予測３Ｄモデルによると、それは、アミノ末端の脂質二重層（ＴＭＤ）と、カルボキシ末端の別の４つのＴＭＤとを横断する、２つのドメインからなることが示された（「M. Kallberg et al., Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server. Nature Protocols. 7, 1511-1522 (2012).」）。脂質二重層から突出した４４５アミノ酸長のループが、膜貫通ドメイン間に位置している（図４８、図４９Ａ）。ホウレンソウＳＯＡＰ５酵素、シロイヌナズナ属由来のセルロース合成酵素様Ｇ酵素、並びにシロイヌナズナ属由来のセルロース合成酵素Ａサブユニット及びホウレンソウ中のそれらのオルソログを、以下の表１９に示す。また、Ａ、Ｂ、及びＥファミリー由来の他のセルロース合成酵素様遺伝子を示す。現在の理解では、Ａ、Ｂ、及びＥファミリー由来のセルロース合成酵素様遺伝子は、それぞれ全く異なる活性を有する。本明細書に示した研究までは、数少ないＣＳＬが知られていただけで、ＣＳＬＧファミリー由来のＣＳＬは皆無であったが、今回の研究において、ＣＳＬの特性が解明された。解析したものは、β−グルカン及びヘミセルロースの糖代謝、生合成に関与している。いずれのＣＳＬも（それが属するファミリーであるにも関わらず）、トリテルペノイドに作用できることは、全く示されていなかった。したがって、実施例を通して示した結果は、セルロース合成酵素様酵素について、驚くべき予想外の活性をもたらすものであった。
【１５２１】
表１９：シロイヌナズナ属ＣＳＬＧ酵素及びＣＥＳＡ酵素のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列
【１５２２】
【表１９−１】
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【１５２３】
【表１９−２】
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【１５２４】
【表１９−３】
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【１５２５】
【表１９−４】
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【１５２６】
【表１９−５】
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【１５２７】
【表１９−６】
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【１５２８】
【表１９−７】
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【１５２９】
【表１９−８】
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【１５３０】
トリテルペノイド系アグリコンの酵素活性部位への通路を形成するものと考えられる３つのチャネルと、グルクロン酸抱合物の出口通路であり得る１つのチャネルも検出された（図４９Ａ〜４９Ｃ）。セルロース合成酵素Ａ（ＣＥＳＡ）タンパク質において、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、多糖類鎖を膜を介して細胞外空間へと通過させることを可能とする細孔を形成する。ＣＥＳＡにおける膜外ドメインは、酵素活性部位と、このようなタンパク質全てに保存され、基質及び／または受容体結合への関与が予測される４つのモチーフ、すなわち、ＤＤ、ＤＣＤ、ＥＤ及びＱＶＬＲＷとを保持している（「L. Sethaphong et al., Tertiary model of a plant cellulose synthase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 18, 7512-7 (2013).」）（図４８−赤色のボックス）。ホウレンソウ由来のＣＥＳＡ及びＳＯＡＰ５のアミノ酸配列のアライメントにより、ＥＤ（ＳＯＡＰ５中：ＥＳ）及びＱＶＬＲＷ（ＳＯＡＰ５中：ＱＬＩＫＷ）モチーフは、ＳＯＡＰ５には保存されていないことが示された（図４８）。
【１５３１】
ＣＥＳＡ型アミノ酸モチーフの存在がＳＯＡＰ５活性に影響を及ぼし得るか否かを確認するため、ＳＯＡＰ５の以下のような３つの突然変異型を作製した：（ｉ）セリン４４２をアスパラギン酸で置換したもの（Ｓ４４２Ｄ）、（ｉｉ）リジン４８３をアルギニンで置換したもの（Ｋ４８３Ｒ）及び（ｉｉｉ）両者を置換したもの（Ｓ４４２Ｄ／Ｋ４８３Ｒ）。突然変異タンパク質をＳＯＡＰ１〜４と共にベンサミアナタバコにおいて発現させたところ、ＳＯＡＰ５中のこれらのモチーフの修飾により、酵素性能が変化することが示された。野生型ＳＯＡＰ５はメディカゲン酸プール全体をＭＡ−３−ＧｌｃＡに変換し（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ：ＭＡ比：０：１）、ＳＯＡＰ５−Ｓ４４２ＤまたはＳＯＡＰ５−Ｋ４８３Ｒは依然として効果的にＭＡをグルクロン酸抱合し得る（それぞれＭＡ−３−ＧｌｃＡ：ＭＡ比０．０３：１及び０．０９：１）のに対し、ＳＯＡＰ５−Ｓ４４２Ｄ／Ｋ４８３Ｒは、ＭＡを部分的にプロセシングできたのみであった（ＭＡ−３−ＧｌｃＡ：ＭＡ比０．９０：１）（図５０Ａ及び５０Ｂ）。本発明者らの所見によれば、中性アミノ酸が負に帯電したアミノ酸に変化することによって、アニオン性基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）の結合に影響を及ぼすのに加え、酵素活性部位において立体障害を引き起こし、そのため酵素効率を同時に低下させることが示される。酵素が発達する際の活性部位におけるアミノ酸の変化（Ｓ４４２Ｄ及びＫ４８３Ｒ）が、ＵＤＰ−Ｇｌｃの代わりにＵＤＰ−ＧｌｃＡを受け入れるために不可欠となり、その結果、ＣＥＳＡタンパク質の新機能獲得をもたらした可能性がある。
【１５３２】
要約：ＣＥＳＡの重要なアミノ酸残基の違いにより、ＣＳＬＧ酵素活性に対して酵素の機能分化がもたらされるものと考えられる。その新たなトリテルペノイド関連機能に不可欠なＣＳＬＧのもう１つの特徴は、小胞体（ＥＲ）への局在化であった。
【１５３３】
実施例２５：トリテルペノイド系サポニン生合成経路の細胞内局在化
【１５３４】
目的：トリテルペノイド系サポニン生合成経路の細胞内局在化について調査すること。
【１５３５】
方法：上記の材料及び方法を参照されたい。
【１５３６】
結果：トリテルペノイド系サポニン生合成経路の細胞内局在化について検討した。ＥＲ膜系は、ステロイド及びトリテルペノイドなどの特化した代謝物の産生に関連する環境である。スクアレン合成酵素、スクアレンエポキシダーゼ、オキシドスクアレンシクラーゼ及び既知のＣＹＰ４５０のほとんどを含むトリテルペノイド生合成に関与する多くの酵素は膜結合型であり、ＥＲ区画内で作用する（「C.A. Hasemann et al., Structure and function of cytochromes P450: a comparative analysis of three crystal structures. Structure. 1, 41-62 (1995)」; 「K. B. Linscott, T. D. Niehaus, X. Zhuang, S. A. Bell, J. Chappell, Mapping a kingdom-specific functional domain of squalene synthase. BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1861, 1049-1057 (2016)」; 「M. Christen et al., Structural insights on cholesterol endosynthesis: Binding of squalene and 2,3-oxidosqualene to supernatant protein factor. Journal of Structural Biology. 190, 261-270 (2015)」; 「R. Thoma et al., Insight into steroid scaffold formation from the structure of human oxidosqualene cyclase, Nature. 7013, 118-22 (2004).」）。
【１５３７】
蛍光レポーターに融合したＳＯＡＰ５（ＳＯＡＰ５：ｍＲＦＰ）を細胞区画マーカー（ＧＦＰと融合したＥＲマーカー）と共に一過性発現させたところ、ＥＲネットワークへの局在化が示された（図５１Ａ〜５１Ｆ）。以前の報告では、発芽ダイズ種子由来のミクロソーム分画は、ソヤサポゲノールＢをグルクロン酸抱合することが可能なタンパク質を含むことが示されており、ＳＯＡＰ５の膜貫通局在化を支持するものである（「Y. Kurosawa, H. Takahara, M Shiraiwa, UDP-glucuronic acid:soyasapogenol glucuronosyltransferase involved in saponin biosynthesis in germinating soybean seeds. Planta. 215, 620-9 (2002)」）．次に、ＳＯＡＰ１、２、３、４及び５の蛍光標識型を様々な組み合わせで発現させ、試験した全てのタンパク質のＥＲ共局在化を確認した（図３５Ａ〜３５Ｆ、図５２Ａ〜５２Ｆ）。全ての融合タンパク質を同時に発現させた葉において多量のＭＡ−３−ＧｌｃＡが検出され、確認した蛍光シグナルが、機能的、したがって適切に折りたたまれて細胞内に局在化したタンパク質によって生じたことが示された（図５３）。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用い、ＳＯＡＰ１〜５タンパク質は互いに近接して位置しており、このため相互作用する可能性があることも認められた（図５４Ａ〜５４Ｂ）。試験したタンパク質が正確に共局在化していることから、中間体の拡散を低下させることによって行った反応の高い効率性を説明することができる。
【１５３８】
要約：これらの試験により、少なくとも酵素ＳＯＡＰ１〜５が、ＥＲ中で互いに近接して局在化していることが示された。
【１５３９】
実施例からの全般的な結論
【１５４０】
トマト、ジャガイモ、ナス、及びホウレンソウにおけるステロイド系アルカロイド、ステロイド系サポニン、及びトリテルペノイド系サポニン生合成についてのこれらの試験の結果、トリテルペノイド系サポニン複合体臣龔郥邈뗧꾷苣貮뗧馁苣몁볤邭苣讦蟥鞁胣릉胦閩뻤銂ꇨ蒁胣螤郥讞苣蚃菣ꒂ菣뮳苣ꮃ苣궃苣覃迥뎁苣蚃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃臣龔郥邈뗧꾷苣ꎧ飦鞁臣芀볯ꒁ臣낕臣讂鯧ꮁ뇥馁苣鞼꣧麡臣趤觧꺨臣誁臣ꚁ胣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣낂菣뎂菣꺁苣ꮃ苣궃菣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂臣鞁臣膀苣ꮃ菣벃苣袐裦떅듧颧볯뾂菣醃苣ꪳ臣趉뻤꺁臣蒁ꧦ붃臣讦蟥閁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣릉賥鞁臣ꎻ골ꦉ臣낂菣뎂苣ꮃ賥貁胣醼臣꺁菣ꆂ菣ꪃ菣궂냦隌觧뮴胦떅듧螃菣뾂菣벃苣袼‱慦業祬䌠牡潢票牤瑡ⵥ捁楴敶攠婮浙獥䐠瑡扡獡覼볯ꎼ볯몼볯覼臣麱臣讂볯뒼臣袂臣ꚁ駩骮髧ꮁꇨ辂苣讂苣醁臣꾁臣蒁臣ꢁ臣벨飦閁苣讂胣鎁臣ꖟꛨ꾁臣鶁苣辁胣隻臣릉賥鞁臣ꎻ골ꦉ볯뎼볯覼臣ꊖ胩鞁臣ꎼ볯겼藩ꂴ臣ꒁ臣ꚁ臣覂臣讂ꧦ붃臣讦蟥閁苣讂臣ꎁ臣醁臣ꪁ苣节臣ꢁ胨袁苣貂苣芀臣龁胣릉鳦꺁볯꾼볯낼볯閃苣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ臣讦臣ꂁ臣貂胣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃臣隳菩蚈苣ꊂ苣膃菣隌迥붃臣鶈臣ꊼ볯ꢼ볯ꊂ苣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣袼볯꾼볯낼볯邼볯꺁觧Ꞁꧨꆾ臣몤臣貂臣芀郥颧臣膀볯ꆼ볯ꖼ볯閼臣膀觧骮臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苣蚃菣ꒂ菣뮳苣ꮃ苣궃苣覃迥뎁苣蚃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃苣낂菣뎂苣ꮃ賥鞁뻥讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣Ꞽ볯궼볯醼볯꺁苣ꪃ苣랂菣隌臣膀苣ꮃ苣궃菣뢅臣ꊻ꟧袼苣ꮃ苣궃菣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂듦Ꞁ볯銂郥肂胣閁苣ꮁ胣릂菣궃苣覃돧ꊂ菣ꮂ菣ꒂ菣誏臣릂菣궃苣覃돧떂菣讃菣꺁駧뺏臣躽룤馁苣鎁臣讁苣膀ꃦ誤觥膀賥Ʝ鏥膀迥뎁賥겖鏥ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣膀ꓦꦉ苣것苣蚃菣벃菣膀菣ꎂ菣뎂菣릂菣궃菣ꮃ胣뎂菣릂苣躃菣ꮃ胣閃苣袃苣것苣뾂菣벃菣膀迥뎁菣ꎂ菣릂菣궃菣ꮃ臣ꮐ鳦辇苣鞢諥閁臣讂雦龁臣讉돦貁苣龁苣閁苣讂胣ં䐼噉邀볯閼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꪃ菣ꮃ菣躃苣覃苣ꮃ苣궃菣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂臣鞁臣꺁볯뎼볯Ꞽ苣뎃菣꾂돨뮴胦貁뫤뎃ꓥꮁꛨ蒁臣閁苣龁臣ꢁ臣膀볯궼臣낂菣뎂苣ꮃ賥貁胣閃苣龃菣벃볯讞볯Ꞽ볯ꮁ苣ꎁ臣邙껥蒚臣財苣貂苣辂臣ꞁ臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣꺁ꃥ誑臣膀믤꺁꣧麡臣蚃菣骃菣ꒂ菣誏臣뎼볯꺁뿤뺣臣誁臣ꚁ胣ꚸ臣ꮁ믤꺁꣧麡臣릂菣궃苣覃돧ꊂ菣ꮂ菣ꒂ菣誏臣込臣龁臣릂菣궃苣覃돧떂菣讃菣ꮁ臣蒁臣龩菨馁苣ꎼ볯겼藩ꂴ苣讦蟥馁臣ꎁ臣醁臣ꪁ苣节臣ꢁ胨袁苣貂苣芀臣覂臣膀闦醰臣蒁룤膦臣趤觧꺁菣궃苣릂臣醼臣膀臣ꪁ苣ꆁ胣내菨膣苣讧꿧馁苣뮂菣궃菣릂郥邈ꧦ讧臣誁臣讂藩ꂴ듦Ꞁ臣膀蓧ꊖ뿤ꪁ胣늘뻥ꮁ觧隌臣龁룤ꎀ臣ꎻ골ꦉ苣ꎔ铧馁苣龁苣ꮁ胣蒁臣ꮁ臣ꚁ胣鞹臣随苣貂苣讁胣ꢁ臣ꎁ臣膀鿥겜髧ꪁ뻤貁迦鮾臣貂苣芀볯꾼볯낼볯貁臣ꢁ苣ꦁ臣隻臣貵럨뾂菣醃苣ꪳ臣ꢁ苣ꮁ胣내菨ꪳ鿥ꪳ볯떼볯뒼臣肱鳥隌臣讂볯ꞁ臣ꪁ臣膀菣Ꚃ菣뎃苣Ꚃ볯늼蛨ꮁ藥肱鳥隌臣龁臣ꢁ臣膀臣꺁雦龁臣龩菨꺁駧钁臣肸ꯧꞁ臣誂胣릊軧蒚臣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣ꎔ铧ꮁ雩馁苣鎁苣覂臣떅듧鎖臣ꦉ郧蒚뿨ꖎ胦꺁蟩膦胦銂ꓧ蚔臣ꚁ臣讂胣鎁臣ꦉ郧蒚뿨ꖎ胦꾁臣龁胣袃菣袃臣誁臣讂臩鶼귥꾂菣릂苣벃臣鞁臣꺁볯ꆼ볯ꖼ臩鶼귥ꮁ雩鞁臣膀臩鶼귥것菣ꮃ臣节迥ꂘ臣貂臣芀臣貂臣ꞁ胣ꢅ臣꺁ꓦꦉ菣뎂苣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣꾁듧麃ꏥ骤돧麡迥뎁돧뾂菣醃苣ꪳ臣閃苣랂菣隌臣ꊖ胩鞁臣蒁臣貁胣낂菣꾂菣뎃藩袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂믤隤臣膀믤鶬觧ꮁ꿥鞁臣鲽铧馁苣鎁苣뺁臣ꪜ雩몤臣芁臣龁菣뎂苣ꮃ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣벃苣袼臣ꪁ苣ꆁ볯꾼볯낼볯覼臣貐껥閁苣龁胣ꊼ볯ꢼ볯讞苣랂菣袃菣뎃苣閃苣ꦃ菣벂臣뎼볯꺁뿤뺣臣ꊖ胩馁苣鎁臣貁ꓥ蒁룤릖臣膀菣Ꚃ菣뎃苣Ꚃ菣ꪃ菣ꮃ菣躃苣覃돧떂菣讃菣꺁볯銈볯颼菣뎂菣릂菩蚈苣ꊂ苣膃菣隌臣讂볯꾼볯낼볯邼臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣몤臣貂臣袂臣ꪁ胣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣꺁苣랂菣隌臣ꒁ臣ꚁ臣놠釥貁臣讁臣龁胣낂菣꾂菣뎃藩놊郥ꢁ郥颧臣膀菣ꪃ菣ꮃ菣躃苣覃돧떂菣讃菣ꮁ臣醁苣ꊂ苣膃菣隌菣뎂菣릂菣ꆃ苣뎃臣膀닦芙雨ꢁ臣ꚁ臣覜諥Ꞁ胣设臣낁胣궂菣ꒃ铧ꖝ臣랼諥ꪁ苣鶃菣뎃菣꾂菣뎃苣뢂菣邃菣袃臣芁苣膀苣辁鿧覂苣龁볯뎼裢銼볯꺁苣뢂菣邃菣袃듦Ꞁ臣ꢁ臣ꚁ蟩膦臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 겜ꃧ뚩臣袂苣낁胣骤臣꺁苣ꮃ苣궃菣覃黥袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃臣龔郥邈뗧꾷臣誁臣讂룤뎶苣讟苣讂臣ꢁ臣袂苣膀ꏩ膓迥뎁賥겖鏥ꎔꗦ醐臣꺁ꯩꆾ胥ꎻ골ꦉ볯设臣낁胣낂菣膃菣ꪃ菣뎃胣붂菣떂菣讃菣膀볯뎼裢銼볯ꊂ苣ꖃ菣뎃菣覼臣膌뛧꾏菨ꪁ铧龔臣龁苣ꮁ胣趤觧뺁臣꾁藩趯臣龁臣隻臣龜ꃦ내菨뮳苣낕꣧趓뷤馁苣誸臣膀蓧麡臣Ꚉ闧貁苣龁苣閁苣讂胣閁苣ꮁ胣겜ꃧ뚩臣袂苣낁胣趤觧袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃铧袐裦貵럨薆臣薆鳥Ꞁ臩鶼귥銂鏦鲽臣ꚁ胣覜鯧ꪁ菣ꪃ菣ꮃ菣躃苣覃돧떂菣讃菣膀뻤袁臣膀臣貂臣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣궸鯥ꮂ菣뺂苣궸臣낂菣膃菣ꪃ菣뎃苣鞢諥閁臣讂胣뺁臣꾁胣ꚋ臣ꖋ臣辁臣鮜臣鞁臣ꪁ臣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃苣躽룤閁臣讂胣设臣낁胣鎁苣ꮁ駩骮臣讂苣꺁臣꾁臣蒁臣膀苣躃苣궸臣鎁臣袂臣ꪁ苣鶃菣뎃苣躽룤閁臣讂臣ꢁ臣꾔迦閁苣讂胣貐꟦ꮁ胣鮜臣鞁臣ꪁ臣릂菣궃苣覃돧ꊂ菣ꮂ菣ꒂ菣誏臣込臣龁臣릂菣궃苣覃돧떂菣讃菣銂뷤许臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀꿦ꂴ迥뎁诨뎑賥袐觧貁뷤许臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 릂菣궃苣覃돧ꊂ菣ꮂ菣ꒂ菣膀苣蚃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃胣誏臣袃菣蚃菣骃菣ꒂ菣뮳苣鶃菣뎃苣ꎔ铧馁苣龁苣꺁臩鶼귥蒵迦袁듧麃臣릉껥꺁觧뒾迥뎁臣貂苣꺁뷤ꢔ臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣设ꓧ鞁胣겪飦鞁臣趁臣貁胣鎁臣ꞁ胣骤臣꺁ꓥꊽ胣꺽迦膀ꓥ뒛胣誏臣貐귧ꦉ臣膀뷥궥胨ꮁ臣鶀臣꺵臣뚁臣ꢁ臣芁苣蚁胣랅뷤蒚臣龮雦ꊽ藦꺁觥낿臣겪飦꾁胣겜駧躘臣肸裨蒚臣Ꞁ돨銂苣辁ꇨ鞁臣蒁苣龁苣膀믤薀臣膀迧ꢜ臣ꖟ귨銂뿥ꢔ臣讂臣ꢁ臣袂苣膀臩ꚺ臣ꚩ꣩銂ꇨ蚁臣ꢁ臣辁胣讁臣肸裨蒚臣芦뿥銂胩놄臣讂臣ꢁ臣辁胣鎁臣袂臣ꪁ藥鎽髧ꪁ껥붖뷥讅苣颧胣ꪁ铧钀臣龁苣ꮁ껥鎘臣覤뷥鞁胣讁臣込臣龁臣ꦁ뿥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁臩鲿迥뎁ꓥꊽ臣膀雩몤臣貂臣龮雦ꊽ藦꺁귧ꆾ觧꺁蓦뎑苣蒯鯥薆臣蚐꟨閁苣讂臣趁臣芁苣膀臣꺁苣蚁臣辄鯥閁苣ꚁ臣讂胣겜飦내鯦ꞁ铧蒁苣貂臣麪돦뺁臣꾁铧麪臣膀ꫨ躘苣꺛髧ꢁ臣膀駩骮苣꺛髧ꢁ臣讂苣꺁臣꾁臣蒁臣ꢁ苣蚐꟨閁苣龁臣芀꟦薀臣讖ꓧ閁苣龁ꧦ붃苣財臣龁苣꺁触떮胣邝雦膀迥뎁苣蚃菣鞃臣膀鳦몙飦讁苣뢀蓨馁苣鎁臣ꪁ臣膀꟦薀臣ꎻ鯦꺁뷥讅苣ꢁ苣鎁臣貁臣趁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀럦颻臣릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣膀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ꺁鳧꺁닧麥臣蒯鯥薆臣芁苣袂臣ꪁ藥ꚁ臣鎁臣袂臣ꪁꓥꊽ迥뎁ꓥ뒛苣늶뻧馁苣鎁臣銂蓦뎛臣ꚁ臣讂臣ꢁ苣蚐꟨閁苣龁臣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††ਠ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔲〰㈰⸳楴≦㈾㈰㔲〰㈰⸳楴쉦゠〰〵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㈱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꖼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㐱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꚼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯Ꞽ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꢼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯꒼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔲〰㈰⸳楴≦㈾㈰㔲〰㈰⸳楴쉦゠〰㈵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꆼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㈲〵〰㌲琮晩㸢〲㈲〵〰㌲琮晩ꃂ〰㔰㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣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