【手続補正書】
【提出日】平成22年6月30日(2010.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記組成物が３ピコメートルから３マイクロメートルにわたるサイズの平均径を持つ粒子群を含む、請求項１−９のいずれか一項の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
一般に、組成物中の各粒子群の粒子は、水性環境で可溶性である。いくつかの実施形態では、生分解性粒子が粒子群で使用される。他の実施形態では、粒子は、非生分解性物質から作られるか、あるいは生分解性物質と非生分解性物質の組み合わせから作られる。例えば、粒子は、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）（PLGA）、ポリアルキレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、メタクリレート、ペプチド、タンパク質、プロテイノイドミクロスフェア（proteinoid microspheres）、脂質、リポソーム、もしくは多糖類から作ることができる。本発明の粒子で使用され得る多糖類は、セルロースおよび誘導体化セルロース（例えば、様々な低級アルキル置換基を持つセルロース）、または、糖類、リンゴ酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、もしくはα-ケトグルタル酸、フマル酸塩などの他のポリマーを含む。また、粒子は、ヒドロキシプロピルメタクリレート、無水マレイン酸や無水コハク酸塩などのホモポリマーもしくは混合ポリマーといったポリマーも含むことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｄは、フルオレセイン（102）の分子量および有効サイズが376ダルトンである、現在利用可能な手順に従って、フルオレセインナトリウム（102）を用いて実行された網膜血管の血管造影の特性を図示する。フルオレセインナトリウム（102）は橙褐色で、492 nmの最大λabsと518 nmの最大λemを有する。網膜（106）は、外側網膜血管を含む脈絡膜を内側網膜血管から分離する。図１Ａは、フルオレセインと血漿タンパク質（104）の混合物（100A）を示す図であり、フルオレセイン分子（102）の20-30%は結合しておらず、70-30%は血漿タンパク質（104）に結合している様を図示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、正常な網膜（100B）におけるフルオレセイン（102）の動態を図示し、自由フルオレセイン分子（102）が脈絡膜血管から脈絡膜中に漏出し、バックグラウンド蛍光を引き起こす様を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、脈絡膜もしくは外側血液網膜関門（100C）からの漏出を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、内側（100D）血液網膜関門からの漏出を示す。従って、図１ＣおよびＤは、異なるフルオレセイン漏出パターンと、異なる程度の血液網膜関門機能不全を図示する。
【図２Ａ】図２Ａ−Ｄは、現在利用可能な手順に従ってインドシアニングリーン（202; ICG）によって実行された血管造影を図示し、有効サイズ（30-70 kDa）の概念を説明する。わずか775ダルトンの分子量を持つ小さなインドシアニングリーン分子（202）の98%が、大きなタンパク質であるリポタンパク質とリン脂質（204）に結合している。インドシアニングリーン（202）は、800 nmの最大λabsと825 nmの最大λemを持つ緑色を有することに留意すべきである。この図では、網膜（206）が、外側網膜血管を含む脈絡膜を内側網膜血管から分離している。図２Ａは、インドシアニングリーン分子（202）と血漿タンパク質、および他の血漿粒子（204）の混合物（200A）を示し、インドシアニングリーン分子（202）のほとんど全てが血漿タンパク質と他の血漿粒子（204）に結合している様を図示する。
【図２Ｂ】図２Ｂに示される通り、これらの大きなタンパク質（204）は、通常、正常な網膜において血液網膜関門からのICG（202）の漏出を防ぐ。
【図２Ｃ】図２Ｃは、脈絡膜もしくは外側血液網膜関門（200C）からの漏出を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、内側（200D）血液網膜関門からの漏出を示す。従って、図２ＣおよびＤは、異なる蛍光漏出パターンと、異なる程度の血液網膜関門機能不全を図示する。
【図３】図３は、本発明の一実施形態である、異なるサイズの粒子（302、312、314、316）に結合した一連のフルオロフォアを含む組成物（300B）を図示し、粒子は大きな白丸であらわされ、フルオロフォアは小さな点であらわされる（302、304、306、308）。図示される通り、最終組成物は、異なるフルオロフォア（302、304、306、308）と異なるサイズの粒子との一連の個々の混合物（300A）から作られる。混合してフルオロフォアを粒子（310）に結合させた後、三種のフルオロフォアが異なるサイズの粒子（たとえば約500ダルトンから1ミクロンにわたるサイズを持つ、312、314、316）に結合する。一種のフルオロフォア（302）は結合せず、最小粒子種を構成する。従って、組成物（300Ｂ）は多数の粒子種を含み、制御されたサイズの各々で、異なる標識（もしくはフルオロフォア）（302、312、314、316）を持ち、標識もしくはフルオロフォアのタイプは、ビーズのサイズを示す。
【図４】図４は、血管における機能不全の程度、もしくは、血液網膜関門などの様々な血液関門における機能不全の程度を評価するための本発明の組成物の有用性を図示する。利用される組成物（300B）は、図３で示されたものと同じである、この概略図で図示される同じ標識粒子（302、312、314、316）を有する。従って、健常な血管（400A）では、実質的に標識粒子は全く血管から漏れず、原則的に機能不全は全く存在せず、機能不全の程度は、例えばステージ0もしくは（機能不全無し）と標識され得る。最軽度機能不全が存在する場合（400B）は、非常に小さなビーズ（302）が血管から漏れる。これは、ある小さな程度の機能不全が存在することを示唆し、これは、例えば最軽度もしくはステージ1の機能不全と格付けされ得る。中等度の機能不全が存在する場合（400C）は、非常に小さな粒子だけでなく、やや大きなビーズ（302および312）が血管から漏れる。これは、いくらか大きな程度の機能不全が存在することを示唆し、これは、例えば、中等度もしくはステージ2の機能不全と標識され得る。重度の機能不全が存在する場合（400D）は、小さな前述の粒子（302および312）だけでなく、いくらか大きな粒子（314）が血管から漏れる。これは、より大きな程度の機能不全が存在することを示唆し、これは、例えば、重度もしくはステージ3の機能不全と標識され得る。最重度の機能不全が存在する場合（400E）は、小さな粒子（302、312、314）だけでなくかなり大きな粒子（316）が血管から漏れ、さらに大きな程度の機能不全が存在し、これは、例えば、最重度もしくはステージ4の機能不全と標識され得る。
【図５】図５は、異なる発色団を持つ、異なるサイズの粒子製剤の分離を示すin-vitro実験を図示し、分離は0.2ミクロンの孔径を持つ膜による濾過によって実現された。0.2ミクロン未満のサイズのPLGA粒子結合フルオレセインと、0.2ミクロンより大きなサイズのPLGA粒子結合インドシアニングリーン（ICG）、および両方のタイプの粒子の混合物から構成される三セットの染料／混合物が作られた。各セットを二分量に等分して試験した。一分量目は0.2ミクロンフィルタで濾過し、二分量目は濾過しなかった。画像の下列は、左から右に、無濾過フルオレセイン‐PLGA粒子、無濾過フルオレセイン‐PLGAおよびインドシアニングリーン‐PLGAの粒子混合物、および無濾過インドシアニングリーン‐PLGA粒子を示す。画像の上列は、左から右に、濾過フルオレセイン‐PLGA粒子（自由にフィルタを通過する）、フルオレセイン‐PLGA粒子は自由にフィルタを通過し、一方インドシアニングリーン‐PLGA粒子は捕捉された、濾過混合物、および、フィルタに完全に捕捉された、濾過インドシアニングリーン‐PLGA粒子を示す。このin vitro実験は、選択的漏出の概念を説明する。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、現在利用可能なインドシアニングリーン（ICG）の手順（図６Ａ）、および、PLGA粒子結合インドシアニン（ICG）を用いる本発明の手順（図６Ｂ）を用いて得られる血管造影画像を比較する。図６Ａでは、2.5 mgのICGを含む1 mlの生理食塩水がウサギに投与された。
【図６Ｂ】図６Ｂでは、2.5 mgのICG粒子（3.3% ICG負荷）を含む1 mlの生理食塩水がウサギに投与された。その後、ウサギ網膜における染料および／または粒子のin vivo動態が観察された。図６Ｂに示される通り、粒子結合ICGは、より明るく鮮明な画像を生じた。自由ICGは組織に結合するが、粒子結合ICGは組織に結合しないので、粒子結合ICGの使用は、改良された、鮮明で明確な血管画像をもたらす。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、現在利用可能な自由フルオレセイン血管造影（図７Ａ）、もしくは、粒子結合フルオレセインを利用する本発明の手順（図７Ｂ）を用いて得られる血管造影画像を比較する。二種のフルオレセイン製剤がウサギに投与され、ウサギ網膜における染料／粒子のin vivo動態が観察された。
【図７Ｂ】示される通り、粒子結合フルオレセインは、有意なバックグラウンドのない画像を生じた。自由フルオレセインは組織に結合するが、粒子結合フルオレセインは組織に結合しないので、粒子結合フルオレセインの使用は、バックグラウンド蛍光のない、改良された、鮮明で明確な血管画像をもたらす。
【図８Ａ】図８Ａ−Ｆは、ウサギに組成物の混合物を投与した後の、網膜における異なるサイズの標識群の選択的漏出を図示する。図８Ａ−Ｃは、ICG結合粒子と自由フルオレセインの混合物の投与後の健康な網膜血管の血管造影画像である。図８Ａは、正常なウサギ網膜においてICG結合粒子と自由フルオレセインの両方から検出された蛍光を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂでは、ICG結合粒子が検出された。
【図８Ｃ】図８Ｃでは、フルオレセイン結合粒子が検出された。
【図８Ｄ】図８Ｄ−Ｆは、ICG結合粒子と自由フルオレセインの混合物をウサギに投与した後の、軽度機能不全の網膜血液関門の血管造影画像である。軽度網膜血液関門機能不全は、LPS（リポ多糖類20ナノグラム）の硝子体内注射によりブドウ膜炎（Uvietis）を誘発することによってウサギに誘発された。図８Ｄは、軽度機能不全ウサギ網膜血液関門において、ICG結合粒子および自由フルオレセインの両方から検出された蛍光を示す。正常なウサギ網膜では（図８Ａ−Ｃ）、染料は全く漏出せず、一方軽度機能不全血液網膜関門モデルでは、小さな非結合フルオレセイン粒子が網膜血管から漏出し（図８Ｄおよび８Ｆの緑色）、一方粒子結合ICG（図８Ｄおよび８Ｅの赤）は漏出しなかったことに留意すべきである。
【図８Ｅ】図８Ｅでは、ICG結合粒子が検出された。
【図８Ｆ】図８Ｆでは、自由フルオレセインが検出された。