(57)【要約】複数の異なる抗原（例えば、T細胞上のCD3、ならびにT細胞、NK細胞、および/またはDC細胞等の上のCD137）に結合することができるが、T細胞などの2つ以上の免疫細胞を非特異的に架橋しない抗原結合分子が提供される。そのような多重特異性抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子が薬物として用いられる場合の有害反応の原因となっていると考えられている、異なる細胞上で発現している抗原に対する従来の多重特異性抗原結合分子の結合から生じる異なる細胞（例えば、異なるT細胞）間の架橋を回避しつつ、免疫応答を調節および/または活性化できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）または（b）のいずれかを含む少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子：
（a）（i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第２の抗原結合ドメイン
であって、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、Fc領域、ジスルフィド結合、またはリンカーを介して連結され、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時には結合しない、
前記第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン；または
（b）（i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第２の抗原結合ドメイン
であって、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、Fc領域、ジスルフィド結合、またはリンカーを介して連結され、
第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時には結合せず、かつ
第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、
前記第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン。
【請求項２】
第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む第３の抗原結合ドメインをさらに含み、
第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか一方、またはFc領域に連結されている、請求項1記載の抗原結合分子。
【請求項３】
第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時には結合しない、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか1つまたは複数が、少なくとも1個のアミノ酸の改変を有し、
改変されるアミノ酸が、抗体重鎖可変（VH）領域中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびに軽鎖可変（VL）領域中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択される少なくとも1個のアミノ酸である、請求項1または2記載の抗原結合分子。
【請求項４】
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがFc領域を介して連結されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項５】
Fc領域が、野生型ヒトIgG1抗体のFc領域のものと比較して、FcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、請求項4記載の抗原結合分子。
【請求項６】
第３の抗原結合ドメインが、以下：
（i）第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのN末端との間、
（ii）第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのN末端との間、
（iii）第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのN末端との間、または
（iv）第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのN末端との間
のいずれかの連結を通じて、第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインのいずれかに連結されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項７】
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して、互いに連結され、
ただし、それぞれ、第１の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、それぞれのヒンジ領域中の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合によって互いに連結される場合には、該結合は、ヒンジ領域以外の任意の他の部分間に存在する結合、またはヒンジ領域間に存在するさらなる結合である、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項８】
第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域を含み、かつ第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインそれぞれのCH1領域中のEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基が、互いに連結されて結合を形成する、請求項7記載の抗原結合分子。
【請求項９】
第１の抗原が、T細胞上に特異的に発現している分子である、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項１０】
第２の抗原が、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子である、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項１１】
第１の抗原がCD3であり、かつ第２の抗原がCD137である、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項１２】
第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原が、がん細胞に特異的に発現している分子である、請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合分子。
【請求項１３】
（a）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを形成する1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を提供する工程であって、
（i）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時には結合しない、
（ii）第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時には結合せず；かつ第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原もしくは第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる；または
（iii）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原もしくは第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、
前記提供する工程；
（b）（a）における核酸を宿主細胞内に導入する工程；
（c）2つ以上のポリペプチドが作製されるように宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）抗原結合分子を得る工程
を含む、抗原結合分子を作製するための方法。
【請求項１４】
（i）および（ii）において定義されるように、第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない抗原結合ドメインの提供が、
−各々が第１の抗原または第２の抗原に結合する、その重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域において少なくとも1個のアミノ酸が改変された抗原結合ドメインのライブラリーを調製することであって、改変された可変領域が少なくとも1個のアミノ酸で互いに異なり、かつ改変が、重鎖可変（VH）領域中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102 位、ならびに軽鎖可変（VL）領域中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択される少なくとも1個のアミノ酸の改変である、前記調製すること；ならびに
−調製されたライブラリーから、第１の抗原および第２の抗原に対する結合活性を有するが、第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域を含む抗原結合ドメインを選択すること
を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して、互いに連結され、
ただし、それぞれ、第１の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、それぞれのヒンジ領域中の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合によって互いに連結される場合には、該結合は、ヒンジ領域以外の任意の他の部分間に存在する結合、またはヒンジ領域間に存在するさらなる結合である、請求項13または14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を調節および/または活性化できる抗原結合分子；該抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物；および該抗原結合分子を作製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、血漿中での安定性が高く、有害反応をほとんど生じないため、医薬として注目されている（Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078（非特許文献１）およびEur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396（非特許文献２））。抗体は、抗原に結合する作用、およびアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有するだけでなく、ADCC（抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（抗体依存性細胞貪食作用）、またはCDC（補体依存性細胞傷害活性）などの、エフェクター細胞によって媒介される細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。特に、IgG1サブクラスの抗体は、がん細胞に対してエフェクター機能を示すため、多数の抗体医薬が、腫瘍学の分野において開発されている。
【０００３】
抗体がADCC、ADCP、またはCDCを発揮するためには、そのFc領域が、エフェクター細胞（NK細胞またはマクロファージなど）上に存在する抗体受容体（FcγR）および様々な補体成分に結合しなければならない。ヒトでは、FcγRのタンパク質ファミリーとして、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、およびFcγRIIIbのアイソフォームが報告されており、それぞれのアロタイプも報告されている（Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65（非特許文献３））。これらのアイソフォームのうち、FcγRIa、FcγRIIa、およびFcγRIIIaは、その細胞内ドメインにITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは活性化シグナルを伝達する。対照的に、FcγRIIbのみが、その細胞内ドメインにITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）と呼ばれるドメインを有し、これは抑制シグナルを伝達する。FcγRのこれらのアイソフォームはすべて、免疫複合体などによる架橋によって、シグナルを伝達することが知られている（Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47（非特許文献４））。実際に、抗体ががん細胞に対してエフェクター機能を発揮する時には、エフェクター細胞膜上のFcγR分子が、がん細胞膜上に結合した複数の抗体のFc領域によってクラスターとなり、それによってエフェクター細胞を通して活性化シグナルが伝達される。その結果、殺細胞効果が発揮される。この点において、FcγRの架橋は、がん細胞近くに位置するエフェクター細胞に限られ、これは、免疫の活性化ががん細胞に限局化されることを示している（Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81（非特許文献５））。
【０００４】
天然型の免疫グロブリンは、その可変領域により抗原に結合し、その定常領域によりFcγR、FcRn、FcαR、およびFcεRなどの受容体または補体に結合する。FcRn（IgGのFc領域で相互作用する結合分子）の各分子は、抗体の各重鎖に１分子ずつ結合する。したがって、IgG型の抗体１分子に対して２分子のFcRnが結合することが報告されている。FcRnなどとは異なり、FcγRは、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメインで相互作用し、IgG型の抗体１分子に対して１分子のみのFcγRが結合する（J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477）。FcγRと抗体のFc領域との間の結合には、抗体のヒンジ領域およびCH2ドメイン中のいくつかのアミノ酸残基、ならびにCH2ドメインのAsn 297（EUナンバリング）に付加された糖鎖が重要であることが見出されている（Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110（非特許文献６）、Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104（非特許文献７）、およびImmunol. (1995) 86, 319-324（非特許文献８））。この結合部位を中心に、様々なFcγR結合特性を有するFc領域バリアントがこれまでに研究されて、活性化FcγRに対するより高い結合活性を有するFc領域バリアントが得られている（WO2000/042072（特許文献１）およびWO2006/019447（特許文献２））。例えば、Lazarらは、ヒトIgG1のSer 239、Ala 330、およびIle 332（EUナンバリング）をそれぞれAsn、Leu、およびGluにより置換することによって、ヒトFcγRIIIa（V158）に対するヒトIgG1の結合活性を約370倍に増加させることに成功している（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010（非特許文献９）およびWO2006/019447（特許文献２））。この改変形態は、FcγIIbに対するFcγRIIIaの比（A/I比）の点で、野生型に比べて結合活性が約9倍になっている。あるいは、Shinkawaらは、Asn 297（EUナンバリング）に付加される糖鎖のフコースを欠損させることによって、FcγRIIIaに対する結合活性を約100倍に増加させることに成功している（J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473（非特許文献１０））。これらの方法によって、天然型ヒトIgG1と比較してヒトIgG1のADCC活性を大幅に改善することができる。
【０００５】
天然型のIgG型抗体は、典型的には、その可変領域（Fab）により1つのエピトープを認識して結合するため、1つの抗原にしか結合することができない。一方で、がんまたは炎症においては多種類のタンパク質が関与することが知られており、これらのタンパク質は、互いにクロストークしていることがある。例えば、免疫疾患では、いくつかの炎症性サイトカイン（TNF、IL1、およびIL6）が関与していることが知られている（Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10（非特許文献１１））。また、がんによる薬剤耐性の獲得の基となる1つのメカニズムとして、他の受容体が活性化することが知られている（Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51（非特許文献１２））。このような場合、1つのエピトープを認識する通常の抗体では、複数のタンパク質を阻害することができない。
【０００６】
複数の標的を阻害する分子として、1つの分子で2種類以上の抗原に結合する抗体（これらの抗体を二重特異性抗体と言う）が研究されている。天然型のIgG型抗体を改良することによって、2つの異なる抗原（第１の抗原および第２の抗原）に対する結合活性を付与することができる（mAbs. (2012) Mar 1, 4(2)）。そのため、そのような抗体は、これらの2種類以上の抗原を1つの分子で中和する作用だけでなく、細胞傷害活性を有する細胞をがん細胞に架橋することによって抗腫瘍活性を高める作用を有する。二重特異性抗体の分子形として、抗体のN末端またはC末端に抗原結合部位を付加した分子（DVD-Ig、TCB、およびscFv-IgG）、抗体の2つのFab領域が異なる配列を有する分子（共通L鎖二重特異性抗体およびハイブリッドハイブリドーマ）、1つのFab領域が2つの抗原を認識する分子（Two-in-one IgGおよびDutaMab）、ならびにCH3ドメインループを別の抗原結合部位として有する分子（Fcab）が、これまでに報告されている（Nat. Rev. (2010), 10, 301-316（非特許文献１３）およびPeds(2010), 23(4), 289-297（非特許文献１４））。これらの二重特異性抗体はいずれも、そのFc領域でFcγRと相互作用するため、抗体のエフェクター機能はそれにおいて保存されている。
【０００７】
二重特異性抗体により認識される抗原がすべて、がんにおいて特異的に発現している抗原であれば、抗原のいずれかに結合する二重特異性抗体は、がん細胞に対して細胞傷害活性を示すため、1つの抗原を認識する従来の抗体医薬よりも効率的な抗がん効果が期待できる。しかし、二重特異性抗体により認識される抗原のうちのいずれか1つが、正常組織において発現している場合、または免疫細胞において発現している細胞である場合は、FcγRとの架橋によって正常組織の障害またはサイトカインの放出が起こる（J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52（非特許文献１５））。その結果、強い有害反応が誘導される。
【０００８】
例えば、T細胞に発現しているタンパク質とがん細胞に発現しているタンパク質（がん抗原）とを認識する二重特異性抗体として、カツマキソマブ（catumaxomab）が知られている。カツマキソマブは、2つのFabで、それぞれがん抗原（EpCAM）およびT細胞に発現しているCD3ε鎖に結合する。カツマキソマブは、がん抗原とCD3εに同時に結合することによって、T細胞媒介性の細胞傷害活性を誘導し、がん抗原とFcγRに同時に結合することによって、NK細胞または抗原提示細胞（例えば、マクロファージ）媒介性の細胞傷害活性を誘導する。これらの2つの細胞傷害活性を使用することにより、カツマキソマブは、腹腔内投与によって悪性腹水症に対して高い治療効果を示しており、したがって欧州で承認されている（Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。さらに、カツマキソマブの投与によって、がん細胞に対して反応する抗体が出現した例が報告され、獲得免疫が誘導されることが実証された（Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85（非特許文献１７））。この結果から、T細胞媒介性の細胞傷害活性と、FcγRを介したNK細胞またはマクロファージなどの細胞によってもたらされる作用との両方を有するこのような抗体（これらの抗体を特に三機能性抗体と言う）は、強い抗腫瘍効果と獲得免疫の誘導が期待できるため、注目されている。
【０００９】
しかし、三機能性抗体は、がん抗原の非存在下でも、CD3εとFcγRに同時に結合するため、がん細胞が存在しない環境でもCD3εを発現しているT細胞をFcγRを発現している細胞に架橋して、様々なサイトカインを大量に産生させる。このようながん抗原非依存的な様々なサイトカインの産生の誘導に起因して、三機能性抗体の投与は現状、腹腔内経路に限られている（Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67（非特許文献１６））。三機能性抗体は、重篤なサイトカインストーム様の有害反応のゆえに、全身投与が非常に困難である（Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406（非特許文献１８））。
従来技術の二重特異性抗体は、両方の抗原、すなわち、第１の抗原であるがん抗原（EpCAM）および第２の抗原であるCD3εに、FcγRへの結合と同時に結合し得るため、FcγRおよび第２の抗原であるCD3εに同時に結合することによって引き起こされるこのような有害反応は、その分子構造的に回避することができない。
近年、FcγRに対する結合活性を低下させたFc領域を用いることで、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性を引き起こす改良型抗体が提供されている（WO2012/073985）。
しかしながら、このような抗体であっても、その分子構造を踏まえると、がん抗原に結合しつつ2つの免疫受容体、すなわち、CD3εおよびFcγRに作用することはできず、1つの免疫受容体しか使用できないことから、十分に有効ではないことが証明されている（WO2014/116846（特許文献４））。さらに、サイトカイン放出症候群（CRS）またはサイトカインストームと呼ばれる、サイトカイン放出によって引き起こされる非常に重篤な有害事象が、CD3εのみに対して作用するそのような二重特異性抗体によって生じることが知られており、IL-6の誘導がCRSの主な原因の1つであり得ることが報告されている（Ferran, 1990, Eur J Immunol. Mar;20(3):509-15（非特許文献２６）、Frey, 2016, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2;2016(1):567-572（非特許文献２７））。
【００１０】
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要であると説明されている（Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284（非特許文献１９））。
【００１１】
CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8（非特許文献２０））。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の存続性を増強することができる（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733（非特許文献２１））。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22（非特許文献２２））。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合が関与していることが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22（非特許文献２３））。
【００１２】
さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がインビボでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6（非特許文献２４））。WO2015/156268（特許文献３）は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、かつ免疫細胞を活性化することができ、それによってCD137アゴニスト抗体の肝毒性有害事象が、抗体の抗腫瘍活性を保持しつつ避けられ得ることを記載している。WO2015/156268はさらに、この二重特異性抗体を、CD3アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する別の二重特異性抗体と組み合わせて用いることによって、抗腫瘍活性をさらに高めることができ、かつこれらの有害事象が避けられ得ることを記載している。CD137、CD3、および腫瘍特異的抗原（EGFR）に対する3つの結合ドメインを有する三重特異的抗体もまた、報告されている（WO2014/116846（特許文献４））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO2000/042072
【特許文献２】WO2006/019447
【特許文献３】WO2015/156268
【特許文献４】WO2014/116846
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
【非特許文献２】Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
【非特許文献３】Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
【非特許文献４】Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47
【非特許文献５】Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81
【非特許文献６】Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110
【非特許文献７】Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
【非特許文献８】Immunol. (1995) 86, 319-324
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010
【非特許文献１０】J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
【非特許文献１１】Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10
【非特許文献１２】Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51
【非特許文献１３】Nat. Rev. (2010), 10, 301-316
【非特許文献１４】Peds (2010), 23 (4), 289-297
【非特許文献１５】J. Immunol. (1999) Aug 1, 163 (3), 1246-52
【非特許文献１６】Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36 (6), 458-67
【非特許文献１７】Future Oncol. (2012) Jan 8 (1), 73-85
【非特許文献１８】Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56 (9): 1397-406
【非特許文献１９】Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284
【非特許文献２０】Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8
【非特許文献２１】Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733
【非特許文献２２】Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22
【非特許文献２３】Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
【非特許文献２４】Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6
【非特許文献２５】Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)
【非特許文献２６】Ferran et al., Eur J. Immunol 20(3):509-15 (1990)
【非特許文献２７】Frey et al., Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2016(1):567-572
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
有害反応を回避しつつ、標的抗原特異的な様式で、免疫細胞（例えば、T細胞）によって媒介される細胞傷害活性と、共刺激分子（例えば、CD137）を介したT細胞および/または他の免疫細胞の活性化活性との両方を発揮する抗体は、まだ知られていない。
本発明の目的は、低下したまたは最小の副作用を有しつつ、免疫細胞（例えば、T細胞）によって媒介される有効な標的特異的細胞死滅効果を示す、抗原結合分子を提供することである。本発明の別の目的は、当該抗原結合分子を含む医薬組成物、および当該抗原結合分子を作製するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
複数の異なる抗原（例えば、T細胞上のCD3、ならびにT細胞、NK細胞、および/またはDC細胞等の上のCD137）に結合できるが、例えばT細胞などの2つ以上の免疫細胞を非特異的に架橋しない、抗原結合分子が提供される。そのような多重特異性抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子が薬物として用いられる場合の有害反応の原因となっていると考えられている、異なる細胞上で発現している抗原への従来の多重特異性抗原結合分子の結合から生じる異なる細胞（例えば、異なるT細胞）間の架橋を回避しつつ、免疫応答を調節および/または活性化することができる。
【００１７】
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子の有効性を改善または増強する、非常に独特な構造形式を有する新たな抗原結合分子を提供する。独特な構造形式を有する新たな抗原結合分子は、抗原結合ドメインの数の増加を提供し、それにより、望ましくない有害反応の低下を伴って、エフェクター細胞および標的細胞上の各々の抗原に対する結合価および/または特異性の増加を与える。
さらなる局面において、本発明のこのような新たな独特な構造形式を有する抗原結合分子の1つは、それぞれがエフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞などの免疫細胞）上の第１および/または第２の抗原に結合する、（例えば、Fc、ジスルフィド結合、またはリンカー等を介して）一緒に連結されている少なくとも2つの第１および第２の抗原結合ドメイン（例えば、Fabドメイン）を含み、かつ標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の第３の抗原に結合する、第１または第２の抗原結合ドメインのいずれか1つに連結されている第３の（および任意で第４の）抗原結合ドメインをさらに含む。
【００１８】
さらなる局面において、本発明のこのような新たな独特な構造形式を有する抗原結合分子の1つは、それぞれがエフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞などの免疫細胞）上の第１および/または第２の抗原に結合する、（例えば、Fc、ジスルフィド結合、またはリンカー等を介して）一緒に連結されている少なくとも2つの第１および第２の抗原結合ドメイン（例えば、Fabドメイン）を含み、かつ標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の第３の抗原に結合する、第１または第２の抗原結合ドメインのいずれか1つに連結されている第３の（および任意で第４の）抗原結合ドメインをさらに含み、ここで、第１の抗原および/または第２の抗原に結合できる第１および第２の抗原結合ドメイン（例えば、Fabドメイン）はそれぞれ、少なくとも1個のアミノ酸変異を含み、このアミノ酸変異は、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に連結を作出し、それらを互いに近くに保持し、かつ、例えば、同じ単一エフェクター細胞へのシス抗原結合を促進する。
抗原結合分子は、異なる細胞（例えば、T細胞などのエフェクター細胞）間での望ましくない架橋に起因するオフターゲット副作用の低下または最小化を示しつつ、優れた有効性を示すことが本発明者らにより驚くべきことに見出された、そのような独特な構造形式を有する。
【００１９】
より具体的には、本発明は、以下に関する。
[１] （i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第２の抗原結合ドメイン
を含む少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子であって、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、Fc領域、ジスルフィド結合、またはリンカーを介して連結され、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合しない、
前記抗原結合分子。
[２] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む第３の抗原結合ドメインをさらに含み、第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか一方、またはFc領域に連結されている、[１]の抗原結合分子。
[３] （i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第２の抗原結合ドメイン
を含む少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子であって、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、Fc領域、ジスルフィド結合、またはリンカーを介して連結され、
第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合せず；
第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、
前記抗原結合分子。
[４] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む第３の抗原結合ドメインをさらに含む、[３]の抗原結合分子であって、第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか一方、またはFc領域に連結されている、前記抗原結合分子。
[５] （i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第３の抗原結合ドメイン
を含む少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子であって、
第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインに連結されており、
第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合せず、かつ
第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、
前記抗原結合分子。
[６] （i）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第１の抗原結合ドメイン；および
（ii）重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む、第２の抗原結合ドメイン
を含む少なくとも2つの抗原結合ドメインを含む、抗原結合分子であって、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、Fc領域、ジスルフィド結合、またはリンカーを介して連結され、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、
前記抗原結合分子。
[７] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域とを含む第３の抗原結合ドメインをさらに含む、[６]の抗原結合分子であって、第３の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか一方、またはFc領域に連結されている、前記抗原結合分子。
[７Ａ]以下の式によって表される、抗原結合分子：
2022501325.tif 000002
式中、
CがFc領域であり；
Oが1または0の整数であり；
B1およびB2の各々が以下：
（i）各々が、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、両方の抗原に同時には結合しない、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン；
（ii）一方の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、両方の抗原に同時には結合せず、かつ他方の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン；
（iii）各々が第１の抗原に結合することができる、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン；または
（iv）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン
であり；
各B1およびB2のmが1または0の整数であり、ただし、両方のmは同時に0ではなく；
A1およびA2の各々が以下：
（i）第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができる、同じ抗原結合ドメイン；
（ii）一方の抗原結合ドメインが、第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合することができ、かつ他方の抗原結合ドメインが、第１の抗原、第２の抗原、および第３の抗原とは異なる第４の抗原にできる、異なる抗原結合ドメイン
であり；
各A1およびA2のnが1または0の整数であり、ただし、mが0である場合、nは0であり；かつ
B1とCの間およびB2とCの間の波線の各々が、共有結合またはリンカーであり；
B1とA1の間およびB2とA2の間の波線の各々が、共有結合またはリンカーであり；かつ
B1とB2の間の波線が、B1およびB2を互いに近くに保持する1つまたは複数の結合であり、ただし：B1およびB2がそれぞれ、抗体重鎖ヒンジ領域を含み、かつB1およびB2が、それぞれのヒンジ領域中の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合によって互いに連結される場合には、該結合は、ヒンジ領域以外の任意の他の部分間に存在する結合、またはヒンジ領域間に存在するさらなる結合である。
[８] 第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合しない、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのいずれか1つまたは複数が、少なくとも1個のアミノ酸の改変を有する、[１]〜[５]のいずれか1つの抗原結合分子。
[９]改変が、少なくとも1個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失である、[８]の抗原結合分子。
[１０]改変が、第２の抗原に結合するVHおよび/もしくはVL領域のアミノ酸配列による第１の抗原に結合するVHおよび/もしくはVL領域のアミノ酸配列の一部の置換、または第１の抗原に結合するVHおよび/もしくはVL領域のアミノ酸配列内への第２の抗原に結合するVHおよび/もしくはVL領域のアミノ酸配列の挿入である、[９]の抗原結合分子。
[１１]挿入または置換されるアミノ酸の数が1〜25個である、[９]または[１０]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１２]改変されるアミノ酸が、重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域のCDR1、CDR2、CDR3、およびFR3領域の1つまたは複数におけるアミノ酸である、[８]〜[１１]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１３] 改変されるアミノ酸が、超可変領域（HVR）の1つまたは複数のループ中のアミノ酸である、[８]〜[１２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１４] 改変されるアミノ酸が、抗体重鎖可変（VH）領域中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびに軽鎖可変（VL）領域中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択される少なくとも1個のアミノ酸である、[８]〜[１３]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１５]第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがFc領域を介して連結される、[１]〜[１４]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１６] Fc領域が、野生型ヒトIgG1抗体のFc領域のものと比較して、FcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、[１５]の抗原結合分子。
[１７]第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン各々が、ヒンジ領域を含み、かつヒンジ領域中の1つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される、[１]〜[１４]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１８] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、リンカーを介して連結される、[１]〜[１４]のいずれか1つの抗原結合分子。
[１９] 抗原結合ドメインの各々が、Fab、Fab'、scFab、Fv、scFv、またはVHH構造を有する、[１]〜[１４]のいずれか1つの抗原結合分子。
[２０] 抗原結合ドメインの各々がFabを有する、[１]〜[１４]のいずれか1つの抗原結合分子。
[２１] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの各々が、一体となってF（ab'）2構造を形成する、Fabおよびヒンジ領域を含む、[１]〜[２０]のいずれか1つの抗原結合分子。
[２２] 第３の抗原結合ドメインが、以下：
（i）第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのN末端との間、
（ii）第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのN末端との間、
（iii）第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの重鎖可変（VH）領域を含むポリペプチドのN末端との間、または
（iv）第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのC末端と、第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインのいずれかの軽鎖可変（VL）領域を含むポリペプチドのN末端との間
のいずれかの連結を通じて、第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインのいずれかに連結されている、[２]、[４]、[５]および [７]〜[２１]のいずれか1つの抗原結合分子。
[２３] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して、互いに連結され、ただし、それぞれ、第１の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、それぞれのヒンジ領域中の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合によって互いに連結される場合には、該結合は、ヒンジ領域以外の任意の他の部分間に存在する結合、またはヒンジ領域間に存在するさらなる結合である、 [１]〜[２２]の抗原結合分子。
[２３Ａ] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの抗原結合をシス抗原結合（すなわち、同じ細胞上の抗原への結合）に限定する、[１]〜[２３]の抗原結合分子。
[２４] 少なくとも1つの結合が共有結合である、[２３]の抗原結合分子。
[２５]共有結合が、第１の抗原結合ドメイン中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメイン中のアミノ酸残基との直接架橋により形成される、[２４]の抗原結合分子。
[２６]架橋されるアミノ酸残基がシステインである、[２５]の抗原結合分子。
[２７]形成される共有結合がジスルフィド結合である、[２６]の抗原結合分子。
[２８]共有結合が、架橋剤を介する第１の抗原結合ドメイン中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメイン中のアミノ酸残基との架橋により形成される、[２４]の抗原結合分子。
[２９]架橋剤がアミン反応性架橋剤である、[２８]の抗原結合分子。
[３０]架橋されるアミノ酸残基がリジンである、[２９]の抗原結合分子。
[３１] 少なくとも1つの結合が非共有結合である、[２３]の抗原結合分子。
[３２] 非共有結合が、イオン結合、水素結合、または疎水結合である、[３１]の抗原結合分子。
[３３]第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのCH1領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのCH1領域中のアミノ酸残基との間に存在する、
[２３]〜[３２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[３４]前記アミノ酸残基が、CH1領域中のEUナンバリングによる119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、190位、191位、192位、194位、195位、197位、213位、および214位からなる群より選択される位置に存在する、[３３]の抗原結合分子。
[３５]前記アミノ酸残基が、CH1領域中のEUナンバリングによる191位に存在する、[３４]の抗原結合分子。
[３６] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのそれぞれのCH1領域中のEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基が、互いに連結され結合を形成する、[３５]の抗原結合分子。
[３７] 第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域、CH1領域、およびヒンジ領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域、CH1領域、およびヒンジ領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域を含み、かつ少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのヒンジ領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのヒンジ領域中のアミノ酸残基との間に存在する、[２３]〜[３２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[３８]前記アミノ酸残基が、ヒンジ領域中のEUナンバリングによる216位、218位、および 219位からなる群より選択される位置に存在する、[３７]の抗原結合分子。
[３９] 第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖（VL）可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのCL領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのCL領域中のアミノ酸残基との間に存在する、[２３]〜[３２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[４０] 前記アミノ酸残基が、CL領域中のEUナンバリングによる109位、112位、121位、126位、128位、151位、152位、153位、156位、184位、186位、188位、190位、200位、201位、202位、203位、208位、210位、211位、212位、および213位からなる群より選択される位置に存在する、[３９] の抗原結合分子。
[４１] 前記アミノ酸残基が、CL領域中のEUナンバリングによる126位に存在する、[４０]の抗原結合分子。
[４２] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのそれぞれのCL領域中のEUナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基が、互いに連結され結合を形成する、[４２]の抗原結合分子。
[４３] 第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのCH1領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのCL領域中のアミノ酸残基との間に存在し、連結され結合を形成する、[２３]〜[３２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[４４] 第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ少なくとも1つの結合が、第2の抗原結合ドメインのCH1領域中のアミノ酸残基と第1の抗原結合ドメインのCL領域中のアミノ酸残基との間に存在し、連結され結合を形成する、[２３]〜[３２]のいずれか1つの抗原結合分子。
[４５] 第１の抗原結合ドメインのCH1領域中のEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基および第２の抗原結合ドメインのCL領域中のEUナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基が、連結され結合を形成する、[４３]の抗原結合分子。
[４６] 第２の抗原結合ドメインのCH1領域中のEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基および第１の抗原結合ドメインのCL領域中のEUナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基が、連結され結合を形成する、[４４]の抗原結合分子。
[４７] CH1および/または軽鎖定常領域（CL）がヒトに由来する、[３３]〜[４６] のいずれか1つの抗原結合分子。
[４８] CH1領域のサブクラスが、γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、μ、δ、またはεである、[３３]〜[４６] のいずれか1つの抗原結合分子。
[４９] CL領域のサブクラスがκまたはλである、[３３]〜[４６] のいずれか1つの抗原結合分子。
[５０] 少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域または軽鎖可変（VL）領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域または軽鎖可変（VL）領域中のアミノ酸残基との間に存在する、[２３]〜[３２] のいずれか1つの抗原結合分子。
[５１] 少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのVH領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのVH領域中のアミノ酸残基との間に存在する、[５０] の抗原結合分子。
[５２] アミノ酸残基が、VH領域中のKabatナンバリングによる8位、16位、28位、74位、および82b位からなる群より選択される位置に存在する、[５１] の抗原結合分子。
[５３] 少なくとも1つの結合が、第１の抗原結合ドメインのVL領域中のアミノ酸残基と第２の抗原結合ドメインのVH領域中のアミノ酸残基との間に存在する、[５０] の抗原結合分子。
[５４]前記アミノ酸残基が、VL領域中のKabatナンバリングによる100位、105位、および107位からなる群より選択される位置に存在する、[５３] の抗原結合分子。
[５５] 第１の抗原が、T細胞上に特異的に発現している分子である、[１]〜[５４] のいずれかの抗原結合分子。
[５６] 第１の抗原がT細胞受容体複合体分子である、[１]〜[５５] のいずれか1つの抗原結合分子。
[５７] 第１の抗原がCD3、好ましくはヒトCD3である、[１]〜[５６] のいずれか1つの抗原結合分子。
[５８] 第２の抗原が、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子である、[１]〜[５７] のいずれか1つの抗原結合分子。
[５９] 第２の抗原が、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している共刺激分子である、[１]〜[５８] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６０] 第２の抗原がTNFRスーパーファミリー分子である、[１]〜[５９] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６１] 第２の抗原が CD137（4-1BB）である、[１]〜[６０] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６２] 第１の抗原がCD3であり、かつ第２の抗原がCD137である、[１]〜[６１] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６３] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる第３の抗原が、がん細胞に特異的に発現している分子である、[１]〜[６２] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６４] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる第３の抗原が、グリピカン-3（GPC3）である、[１]〜[６３] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１〜１１および６１のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５〜４８のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ａ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｂ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４６のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｃ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｄ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：４のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｅ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｆ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：６のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｇ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：７のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｈ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｈ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：９のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｉ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｊ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１１のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４８のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６５Ｋ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：６１のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４８のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含むVL領域
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６６] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１〜１１および６１のいずれか1つのアミノ酸配列を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５〜４８のいずれか1つのアミノ酸配列を有する配列を含むVL領域
を含む抗体と結合について競合する、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６７] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（a）配列番号：１〜１１および６１のいずれか1つのアミノ酸配列を有する配列を含むVH領域；および
（b）配列番号：４５〜４８のいずれか1つのアミノ酸配列を有する配列を含むVL領域
を含む抗体と同じエピトープに結合する、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６８] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、
（i）以下を含むVH領域：
（a）配列番号：１２〜２２および６２のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するHCDR1配列；
（b）配列番号：２３〜３３および６３のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するHCDR2配列；および/もしくは
（c）配列番号：３４〜４４および６４のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するHCDR3配列；ならびに/または
（ii）以下を含むVL領域：
（d）配列番号：４９〜５２のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するLCDR1配列；
（e）配列番号：５３〜５４および５６のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するLCDR2配列；および/もしくは
（f）配列番号：５７〜５８および６０のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも95％の配列同一性を有するLCDR3配列
を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６８Ａ] 第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの1つまたは複数が、表1.1に挙げられるような、HCDR1〜3を含むVH領域およびLCDR1〜3配列を含むVL領域を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６９]以下：
（a）配列番号：６７、７１、７３、７５、７８、８０および８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；
（b）配列番号：６８および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；
（c）配列番号：６９、７４、７６、７９、８１および８４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖；および
（d）配列番号：７０、７７および８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖
の1つまたは複数を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[６９Ａ]表2.2に挙げられるようなポリペプチド鎖を含む、[１]〜[６４] のいずれか1つの抗原結合分子。
[７０] [１]〜[６９]のいずれか1つの抗原結合分子および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
[７１] [１]〜[６９] の抗原結合分子のいずれか1つの1つまたは複数のポリペプチドをコードする、1つまたは複数のポリヌクレオチド。
[７２] [７１]のポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数のベクター。
[７３] [７２]のベクターを含む、細胞。
[７４] [７３]の細胞を培養する工程および培養上清から抗原結合分子を単離する工程を含む、抗原結合分子を作製するための方法。
[７５]（a）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを形成する1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を提供する工程であって、
（i）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合しない、または
（ii）第１の抗原結合ドメインが、第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１および第２の抗原の両方に同時には結合せず；かつ第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる；または
（iii）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがそれぞれ、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合することができる
提供する工程；
（b）核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つ以上のポリペプチドが作製されるように宿主細胞を培養する工程；および
（d）抗原結合分子を得る工程
を含む、抗原結合分子を作製するための方法。
[７６]工程（i）および（ii）において定義されるように、第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない抗原結合ドメインの提供が、
−各々が第１の抗原または第２の抗原に結合する、その重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域において少なくとも1個のアミノ酸が改変された抗原結合ドメインのライブラリーを調製する工程であって、改変された可変領域が少なくとも1個のアミノ酸で互いに異なる、工程；および
−調製されたライブラリーから、第１の抗原および第２の抗原に対する結合活性を有するが、第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域を含む抗原結合ドメインを選択する工程
を含む、[７５]の方法。
[７６Ａ]改変が、重鎖可変（VH）領域中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102 位、ならびに軽鎖可変（VL）領域中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位から選択される少なくとも1個のアミノ酸の改変である、[７６]の方法。
[７６Ｂ] （i）および（ii）において定義される第１の抗原および第２の抗原には同時には結合しない抗原結合ドメインが、それ自体で、異なる細胞上に各々発現している第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない抗原結合ドメインである、[７５]〜[７６Ａ] のいずれか1つの方法。
[７７]工程（a）が、第１および第２の抗原とは異なる、第３の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインを含む1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を提供する工程をさらに含む、[７５]〜[７６Ｂ] のいずれか1つの方法。
[７７Ａ]工程（c）で培養された宿主細胞が、抗体Fc領域をコードする核酸をさらに含む、[７５]〜[７６Ｂ] のいずれか1つの方法。
[７７Ｂ] Fc領域が、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域と比較して、FcγRに対する結合活性が低下しているFc領域である、[７７Ａ]の方法。
[７８] 第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、および/または第３の抗原結合ドメインが、1つの単一ヌクレオチドによってコードされる、[７５]〜[７７Ｂ] のいずれか1つの方法。
[７９] 工程（a）が、翻訳されると、第１および第２の抗原結合ドメインを互いに近くに連結する1つまたは複数の結合を導入する、1つまたは複数の変異を、第１および第２の抗原結合ドメインの各々をコードする核酸配列に導入する工程をさらに含む、[７５]〜[７８] のいずれか1つの方法。
[８０] 第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して、互いに連結され、ただし、それぞれ、第１の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが重鎖ヒンジ領域を含み、かつ第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、それぞれのヒンジ領域中の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合によって互いに連結される場合には、該結合は、ヒンジ領域以外の任意の他の部分間に存在する結合、またはヒンジ領域間に存在するさらなる結合である、 [７９]の方法。
[８１] 第１の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ第２の抗原結合ドメインが、重鎖可変（VH）領域およびCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常領域（CL）を含み、かつ1つまたは複数の変異が、
（i）第１の抗原結合ドメインのCH1領域中、および第２の抗原結合ドメインのCH1領域中；
（ii）第１の抗原結合ドメインのCH1領域中、および第２の抗原結合ドメインのCL領域中；
（iii）第１の抗原結合ドメインのCL領域中、および第２の抗原結合ドメインのCH1領域中；
（iv）第１の抗原結合ドメインのCL領域中、および第２の抗原結合ドメインのCL領域中；または
（v）第１の抗原結合ドメインのVH領域もしくはVL領域中、および第２の抗原結合ドメインのVH領域またはVL領域中
に存在する、[７９]または[８０]の方法。
[８２]1つまたは複数の変異が、システイン置換または挿入である、[７９]〜[８１] のいずれか1つの方法。
[８３] システインアミノ酸残基が、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのそれぞれのCH1領域におけるEUナンバリングによる191位に導入される、[７９]〜[８１] のいずれか1つの方法。
[８４]第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原ドメインがそれぞれ、異なる細胞上に各々発現している第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しないかどうかを決定するためのアッセイを実行する工程をさらに含む、[７９]〜[８３] のいずれか1つの方法。
[８５] 第１の抗原が、T細胞上に特異的に発現している分子である、[７５]〜[８４]のいずれか1つの方法。
[８６] 第１の抗原がT細胞受容体複合体分子である、[７５]〜[８４]のいずれか1つの方法。
[８７] 第１の抗原がCD3、好ましくはヒトCD3である、[７５]〜[８６]のいずれか1つの方法。
[８８] 第２の抗原が、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子である、[７５]〜[８７]のいずれか1つの方法。
[８９] 第２の抗原が、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している共刺激分子である、[７５]〜[８８]のいずれか1つの方法。
[９０] 第２の抗原がTNFRスーパーファミリー分子である、[７５]〜[８９]のいずれか1つの方法。
[９１] 第２の抗原が CD137（4-1BB）である、[７５]〜[９０]のいずれか1つの方法。
[９２] 第１の抗原がCD3であり、かつ第２の抗原がCD137である、[７５]〜[９１] のいずれか1つの方法。
[９３] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる第３の抗原が、がん細胞に特異的に発現している分子である、[７５]〜[９２] のいずれか1つの方法。
[９４] 第１の抗原および第２の抗原とは異なる第３の抗原が、グリピカン-3（GPC3）である、[７５]〜[９３] のいずれか1つの方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１．１】親和性成熟したGPC3/Dual-Igバリアント三重特異性抗体のCD137アゴニスト活性の測定の結果を示す。（a）選択された抗体の群による、CD137を過剰発現するJurkat NFκB受容体細胞と共培養したSK-pca60細胞株により検出された平均発光単位＋/−標準偏差（s.d.）。（b）（a）と同様に、抗体の他の群による、CD137を過剰発現するJurkat NFκB受容体細胞と共培養したSK-pca60細胞株により検出された平均発光単位＋/−標準偏差（s.d.）を第２のプレート中で分析した。
【図１．２】GPC3/Dual-Igバリアントの平均細胞傷害活性（細胞増殖抑制（％）値＋/− s.d.）を示す。SK-pca60を5 nMおよび10 nM、E：T 0.5での選択したGPC3/Dual-Ig三重特異性分子の存在下でPBMCと共培養し、リアルタイムxCELLigenceシステムを用いて分析した。120時間で取得した平均細胞増殖抑制（％）値＋/− s.d.を示したグラフにプロットした。
【図２．１】本発明の種々の抗体形式を図示する。各Fv領域のアノテーションは、表2.1に表示するものに対応する。図（a）は1＋2形式三価抗体を図示し、（b）はlinc技術を適用された1＋2三価抗体を図示し、（c）は2Fab二価抗体形式を図示し、かつ（d）は従来のIgGベースの二価抗体形式を図示する。
【図２．２．１】表2.2および表2.3に挙げた配列 IDの抗体形式および命名規則を図示する。
【図２．２．２】表2.2および表2.3に挙げた配列 IDの抗体形式および命名規則を図示する。
【図２．３】GPC3低発現がん細胞における、異なる抗体形式の細胞傷害活性の評価の結果を示す。（a）SK-pca60細胞株（左パネル）、Huh7細胞株（中央パネル）、およびNCI-H446（右パネル）細胞株におけるGPC3発現（黒色実線）のフローサイトメトリー分析からのヒストグラム。抗KLH抗体を対照として用いた（灰色ヒストグラム）。細胞傷害活性を比較する（b）は、1＋1形式でのGPC3/CD3およびGPC3/Dualの細胞傷害活性の比較を示し、細胞傷害活性を比較する（c）は、低GPC3発現Huh7細胞株（左パネル）およびNCI-H446（右パネル）細胞株における1＋1形式抗体と比較した1＋2三価抗体および2Fab抗体の細胞傷害活性の比較を示す。腫瘍細胞株をE：T比1でPBMCと共培養した。xCELLigenceシステムを用いてデータの取得を行い、値を72時間での細胞増殖抑制（％）の平均＋/− s.d.として表示した。
【図３．１】GPC3-Dual/Dual抗体などの1＋2形式での架橋の導入が毒性を低下できることを図式的に図示する。Linc-Igは、免疫細胞に対して主にシス型に結合を限定することができる。これに対して、1＋2三価形式は、腫瘍抗原結合とは独立して2つの免疫細胞間でのトランス型をもたらすことができた。これは、腫瘍抗原結合とは独立した2つの免疫細胞の架橋を引き起こし得、毒性を増加させる可能性がある。
【図３．２】各抗体の存在下でのGPC3陰性細胞に対する抗原非依存性細胞傷害活性を示す。CD137を過剰発現するCHOを、精製したインビトロ活性化T細胞とE：T 5で48時間共培養し、LDHアッセイを用いて分析した。1.25、5、および20 nMでインキュベートした異なる抗体形式の平均細胞溶解（％）＋/− s.d.を図示するグラフである。
【図３．３】NCI-H446細胞株における異なる抗体形式の細胞傷害活性（細胞増殖抑制）の評価の結果のグラフである。1＋2三価形式は、linc技術ありおよびなしで、1＋1形式より強い細胞傷害活性を示した。NCI-H446を、1、3、および10 nMでの種々の抗体形式とともに、E：T比0.5でPBMCと共培養した。xCELLigenceシステムを用いて、データの取得を行い、値を細胞増殖抑制（％）の平均＋/− s.d.として表示する。
【図３．４】図3.3において評価したNCI-H446細胞株における異なる抗体形式によるサイトカイン放出の評価の結果を示す。グラフは、サイトカインIFNγ（上段左）、IL-2（上段右）、およびTNFα（下段左）の平均濃度＋/− s.dを示す。E：T 1.0でPBMCと共培養した図3.3における共培養の上清を40時間の時点で分析した。抗体を0.6、2.5、および10 nMで加えた。
【図４】ジスルフィド結合リンカーによりビオチン標識されているC3NP1-27、CD3εペプチド抗原の設計を示す。
【図５】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は各クローンのCD3に対する特異性を意味する。
【図６】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたクローンのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのビーズELISAでのCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、図5と同じプレートELISAでのCD3に対する特異性を意味する。
【図７】ヒトCD137アミノ酸配列とカニクイザルCD137アミノ酸配列との比較データを示す。
【図８】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、各クローンのカニクイザルCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137に対する特異性を意味する。
【図９】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD3eに対する特異性を意味する。
【図１０】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3またはヒトFcを競合物として用いた。
【図１１Ａ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はヒトCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１１Ｂ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はカニクイザルCD137に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１１Ｃ】CD3およびCD137に対するファージディスプレイパニングアウトプットプールのファージELISAの結果を示すグラフである。Y軸はCD3に対する特異性を意味する。X軸は、パニングアウトプットプールを意味し、初期は、ファージディスプレイパニング前のプールであり、R1からR6は、それぞれラウンド1からラウンド6のファージディスプレイパニング後のパニングアウトプットプールを意味する。
【図１２．１】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１２．２】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１２．３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１４】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１５】各クローンのエピトープドメインを同定するための、CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGのELISAの結果を示すグラフである。Y軸は、ヒトCD137の各ドメインに対するELISAの反応を意味する。
【図１６】CD3およびCD137に対するファージディスプレイ親和性成熟で取得されたIgGのELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、各クローンのヒトCD137-Fcに対する特異性を意味し、X軸は、ヒトCD137またはCD3に対する特異性を意味する。
【図１７．１】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．２】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．３】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．４】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１７．５】CD3およびCD137に対するファージディスプレイで取得されたIgGの競合ELISAの結果を示す一連のグラフである。Y軸は、ビオチン-ヒトCD137-Fcまたはビオチン-ヒトFcに対するELISAの反応を意味する。過剰量のヒトCD3を競合物として用いた。
【図１８Ａ】抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化B細胞からのIL-6分泌のメカニズムを図式的に示す図である。
【図１８Ｂ】活性化B細胞から分泌されるIL-6の産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD137媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示すグラフである。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。
【図１９Ａ】抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体を介した活性化Jurkat T細胞におけるルシフェラーゼ発現のメカニズムを図式的に示す図である。
【図１９Ｂ】活性化Jurkat T細胞において発現するルシフェラーゼの産生のレベルによって、様々な抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3媒介性アゴニスト活性を評価した結果を示す一連のグラフである。Ctrlは、陰性対照ヒトIgG1抗体を示す。
【図２０】各固定化抗体の存在下でヒトPBMC由来T細胞からのサイトカイン（IL-2、IFN-γ、およびTNF-α）放出を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、分泌された各サイトカインの濃度を意味し、X軸は、固定化された抗体の濃度を意味する。対照抗CD137抗体（B）、対照抗CD3抗体（CE115）、陰性対照抗体（Ctrl）、およびdual抗体のうちの1つ（L183L072）を、アッセイのために用いた。
【図２１】各二重特異性抗体によるGPC3陽性標的細胞（SK-pca60およびSK-pca13a）に対するT細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）を評価した結果を示す一連のグラフである。Y軸は、細胞増殖抑制（CGI）の比率を意味し、X軸は、各二重特異性抗体の濃度を意味する。抗GPC3/Dual二重特異性抗体（GC33/H183L072）、陰性対照/Dual二重特異性抗体（Ctrl/H183L072）、抗GPC3/抗CD137二重特異性抗体（GC33/B）、および陰性対照/抗CD137二重特異性抗体（Ctrl/B）を、このアッセイのために用いた。5倍量のエフェクター（E）細胞を、腫瘍（T）細胞に加えた（ET5）。
【図２２】CD3eに対するCE115の細胞ELISAの結果を示すグラフである。
【図２３】EGFR_ERY22_CE115の分子形態を示す図である。
【図２４】EGFR_ERY22_CE115のTDCC（SK-pca13a）の結果を示すグラフである。
【図２５】結合量の比が0.8未満の抗体の例示的なセンサーグラムである。縦軸は、RU値（レスポンス）を示す。横軸は、時間を示す。
【図２６】Fabが互いに架橋されている改変抗体の例を示す。図は、野生型抗体（WT）と、抗体H鎖のCH1領域が互いに架橋されている改変抗体（HH型）、抗体L鎖のCL領域が互いに架橋されている改変抗体（LL型）、および抗体H鎖のCH1領域が抗体L鎖のCL領域と架橋されている改変抗体（HL型またはLH型）との間の構造的違いを図式的に示す。
【図２７】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図２８】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図２９】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３０】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３１】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３２】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３３】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３４】参考実施例15に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の重鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、および抗IL6R抗体の重鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３５】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３６】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３７】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３８】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図３９】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４０】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４１】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４２】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４３】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４４】参考実施例16に記載される、抗IL6R抗体（MRA）、抗IL6R抗体の軽鎖可変領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL.xxx-k0）、および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.xxx）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体によるバンド検出に適用した。
【図４５】参考実施例17に記載される、抗IL6R抗体（MRA）および抗IL6R抗体の軽鎖定常領域にシステイン置換を導入することによって作製された改変抗体（MRAL-k0.K126C）のプロテアーゼ処理の結果を示す。各プロテアーゼ処理抗体を、非還元キャピラリー電気泳動、続いて抗κ鎖抗体または抗ヒトFc抗体によるバンド検出に適用した。
【図４６】参考実施例17に記載される、抗体サンプルのプロテアーゼ処理によって取得された各バンドの分子量と、その推定構造との間の対応関係を示す。各分子の構造、分子が抗κ鎖抗体または抗Fc抗体と反応し得るかどうか（バンドが図45の電気泳動で検出されるかどうか）も記載される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
態様の説明
本発明において、「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全体に結合する活性を有する限りにおいて、各々が4つのフレームワーク領域（FR）およびそれが隣接する3つの相補性決定領域（CDR）を含む、抗体の重鎖可変（VH）領域の一部および/または軽鎖可変（VL）領域の一部を少なくとも含むドメインを意味する。具体的には、本発明では、軽鎖可変（VL）領域または重鎖可変（VH）領域を含む「抗原結合ドメイン」が好ましい。より具体的には、本発明では、軽鎖可変（VL）領域および重鎖可変（VH）領域を含む「抗原結合ドメイン」が好ましい。
【００２２】
本発明において、本発明における「抗原結合ドメイン」はまた、以下：
（i）重鎖可変（VH）領域および抗体重鎖定常領域のCH1領域；
（ii）重鎖可変（VH）領域、抗体重鎖定常領域のCH1領域、および 抗体重鎖のヒンジ領域；
（iii）軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常（CL）領域；
（iv）重鎖可変（VH）領域および 抗体重鎖定常領域のCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域；
（v）重鎖可変（VH）領域および 抗体重鎖定常領域のCH1領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常（CL）領域；
（vi）重鎖可変（VH）領域、抗体重鎖定常領域のCH1領域、および 抗体重鎖のヒンジ領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域；
（vii）重鎖可変（VH）領域、抗体重鎖定常領域のCH1領域、および抗体重鎖のヒンジ領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常（CL）領域；または
（viii）重鎖可変（VH）領域、ならびに軽鎖可変（VL）領域および軽鎖定常（CL）領域
を含むドメインも意味する。
【００２３】
本発明の抗原結合ドメインは、任意の配列を有してもよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、およびこれらの非ヒト抗体のいずれかのヒト化によって得られたヒト化抗体、およびヒト抗体などの、任意の抗体に由来する抗原結合ドメインであってもよい。「ヒト化抗体」は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも呼ばれ、非ヒト哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のCDRへ移植することによって取得される。CDRを同定するための方法は、当技術分野において公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；およびChothia et al., Nature (1989) 342: 877）。そのための一般的な遺伝子組換え手法もまた、当技術分野において公知である（欧州特許出願公開第EP 125023号およびWO 96/02576を参照）。
【００２４】
本発明において、「抗原結合分子」は、該分子が本発明の「抗原結合ドメイン」を含む限り、特に限定されない。抗原結合分子は、およそ5アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質をさらに含み得る。ペプチドまたはタンパク質は、生物に由来するペプチドまたはタンパク質に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドなどが用いられてもよい。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、抗体Fc領域を含む抗原結合分子である。本発明における「Fc領域」は、下記に定義される。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明の「抗原結合分子」は、ダイアボディ（diabody）（Db）、一本鎖抗体、またはsc(Fab')2のように、1つまたは複数のリンカーによって連結される単一のポリペプチド鎖中に重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域を含むが、Fc領域を欠いている、上記に定義される抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であってもよい。
【００２７】
用語「抗体断片」は本出願において用いられる場合、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を意味し得る。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2；ダイアボディ；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子（例えば、scFv）；一本鎖Fab（scFab）；単ドメイン抗体；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００２８】
用語「可変断片（Fv）」は本出願において用いられる場合、1対の抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）で構成される、抗原に結合する抗体由来部分の最小単位を指し得る。1988年に、SkerraおよびPluckthunは、細菌シグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し、大腸菌（E. coli）において該遺伝子の発現を誘導することによって、均一かつ活性な抗体が、大腸菌のペリプラズム画分から調製できることを見出した（Science (1988) 240(4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvでは、VHは、抗原に結合するようにVLと会合する。
【００２９】
用語「scFv」、「一本鎖抗体」、および「sc（Fv）2」は本出願において用いられる場合、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域は含まない単一ポリペプチド鎖の抗体断片を指す。概して、一本鎖抗体はまた、VHドメインとVLドメインとの間に、抗原結合を可能にすると考えられる望ましい構造を形成することができるポリペプチドリンカーも含む。一本鎖抗体は、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」においてPluckthunによって詳細に論じられている。国際特許公報WO 1988/001649；米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号も参照。特定の態様において、一本鎖抗体は二重特異性であり得るおよび/またはヒト化され得る。
【００３０】
用語「scFv」は本出願において用いられる場合、Fvを形成するVHおよびVLがペプチドリンカーによって一緒に連結されている一本鎖ポリペプチドを意味し得る（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883）。VHおよびVLは、ペプチドリンカーによってすぐ近くに保持することができる。
【００３１】
用語「sc（Fv）2」は本出願において用いられる場合、2つのVLおよび2つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカーなどのリンカーによって連結され、一本鎖を形成している一本鎖抗体を意味し得る（J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189）。2つのVHおよび2つのVLは、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。そのようなsc（Fv）2には好ましくは、例えば、the Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374に記載されているような単一抗原に存在する2つのエピトープを認識する二重特異性sc（Fv）2が含まれる。sc（Fv）2は、当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、sc（Fv）2は、ペプチドリンカーなどのリンカーによってscFvを連結することによって作製することができる。
本明細書において、sc（Fv）2は、抗体の2つのVH単位および2つのVL単位が、一本鎖ポリペプチドのN末端から始めてVH、VL、VH、およびVLの順番で配置されている形態（[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]）をとる。2つのVH単位および2つのVL単位の順番は、上記形態に限定されず、任意の順番で配置されてもよい。形態の例示的な順番を以下に挙げる。
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]
[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
[VH]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VL]
[VL]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VH]
[VL]-リンカー-[VH]-リンカー-[VL]-リンカー-[VH]
【００３２】
用語「Fab」、「F（ab'）2」、および「Fab'」は本出願において用いられる場合、下記のようなものを意味し得る。
「Fab」は、1つの軽鎖、ならびに1つの重鎖由来のCH1領域および可変領域からなる。野生型 Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。目的に応じて、野生型 Fab分子中のアミノ酸残基が置換、付加、または欠失によって変更され得るFabバリアントも含まれる。特定の態様において、Fabバリアントに含まれる変異アミノ酸残基（例えば、置換、付加、または挿入後のシステイン残基またはリジン残基）は、別の重鎖分子またはその一部（例えば、Fab分子）とジスルフィド結合を形成することができる。
【００３３】
scFabは、Fabを形成する1つの軽鎖ならびに1つの重鎖由来のCH1領域および可変領域がペプチドリンカーによって一緒に連結されている抗原結合ドメインである。軽鎖、ならびに重鎖由来のCH1領域および可変領域は、ペプチドリンカーによってすぐ近くに保持することができる。
【００３４】
「F（ab'）2」または「Fab」は、ペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼによって免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を処理することによって作製され、2つのH鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を消化することによって作製される抗体断片を指す。例えば、パパインは、2つのH鎖の各々のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でIgGを切断し、VL（L鎖可変領域）および CL（L鎖定常領域）を含むL鎖が、そのC末端領域でジスルフィド結合を介して、VH（H鎖可変領域）および CHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）を含むH鎖断片に連結されている、2つの相同な抗体断片を生じる。これら2つの相同な抗体断片はそれぞれ、Fab'と呼ばれる。
【００３５】
「F（ab'）2」は、ジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるように、2つの軽鎖と、CH1ドメインおよびCH2ドメインの一部の定常領域を含む2つの重鎖とからなる。例えば、本明細書において記載されるF（ab'）2は以下のように作製することができる。所望の抗原結合ドメインを含む全長モノクローナル抗体またはそのようなものが、ペプシンなどのプロテアーゼによって部分的に消化され；Fc断片が、プロテインAカラムの上への吸着によって取り除かれる。プロテアーゼは、pHなどの適切に設定される酵素反応条件下でF（ab'）2を作製するように選択的に全長抗体を切断できる限り、特に限定されない。そのようなプロテアーゼには、例えば、ペプシンおよびフィシンが含まれる。
【００３６】
用語「単ドメイン抗体」は本出願において用いられる場合、ドメインがそれ自体で抗原結合活性を発揮できる限り、その構造において特に限定されない。IgG抗体によって例示される通常の抗体は、可変領域がVHおよびVLの対形成によって形成される状態で抗原結合活性を発揮する。これに対して、単ドメイン抗体は、別のドメインと対形成することなく、それ自体のドメイン構造単独によって抗原結合活性を発揮できることが知られている。単ドメイン抗体は通常、相対的に低い分子量を有し、単量体の形態で存在する。
単ドメイン抗体の例としては、これらに限定されないが、軽鎖を天然に欠いている抗原結合分子、例えば、ラクダ科の動物のVHHおよびサメのVNAR、ならびに抗体VHドメインの全体もしくは一部または抗体VLドメインの全体もしくは一部を含む抗体断片が挙げられる。抗体 VH/VLドメインの全体または一部を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例としては、これらに限定されないが、例えば米国特許第6,248,516 B1号に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLに起源を持つ人工的に調製した単ドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの態様において、1つの単ドメイン抗体は、3つのCDR（CDR1、CDR2、およびCDR3）を有する。
【００３７】
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を作製することができる動物から、または単ドメイン抗体を作製することができる動物を免疫することによって取得することができる。単ドメイン抗体を作製することができる動物の例としては、これらに限定されないが、ラクダ類、および単ドメイン抗体を作製する能力ための遺伝子が導入されているトランスジェニック動物が挙げられる。ラクダ類には、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコ等が含まれる。単ドメイン抗体を作製する能力のための遺伝子が導入されているトランスジェニック動物の例としては、これらに限定されないが、国際公報第WO2015/143414号、または米国特許公報第US2011/0123527 A1号に記載されるトランスジェニック動物が挙げられる。ヒト化一本鎖抗体はまた、ヒト生殖系列配列またはそれに類似する配列を有する動物から取得された単ドメイン抗体のフレームワーク配列を置換することによっても、取得することができる。ヒト化単ドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）は、本発明の単ドメイン抗体の一態様である。
【００３８】
あるいは、単ドメイン抗体は、ELISAおよびパニング等によって単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリーから取得することができる。単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリーの例としては、これらに限定されないが、種々の動物またはヒトから取得されたナイーブ抗体ライブラリー（例えば、Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)および Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、種々の動物を免疫することによって取得された抗体ライブラリー（例えば、Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、および種々の動物またはヒトの抗体遺伝子から調製された合成抗体ライブラリー（例えば、Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43), Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657),およびAIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。
【００３９】
用語「Db」は本出願において用いられる場合、2つのポリペプチド鎖によって構成される二量体を意味し得る（例えば、Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP404,097;およびW093/11161）。これらのポリペプチド鎖は、同じポリペプチド鎖上のL鎖可変ドメイン（VL）およびH鎖可変ドメイン（VH）が互いに対形成できないように、例えば、およそ5残基の短いリンカーを通して連結される。
この短いリンカーのために、同じポリペプチド鎖上にコードされるVLおよびVHは、一本鎖Fvを形成することができず、その代わりに、別のポリペプチド鎖上の、それぞれVHおよびVLと二量体化して、2つの抗原結合部位を形成する。
【００４０】
本発明において、「Fc領域」とは、抗体分子中の、ヒンジまたはその一部、ならびにCH2およびCH3ドメインからなる断片を含む領域を指す。IgGクラスのFc領域は、それに限定されないが、例えば、システイン226（EU ナンバリング（本明細書においてEUインデックスとも言う））からC末端まで、またはプロリン230（EUナンバリング）からC末端までの領域を意味する。Fc領域は、好ましくは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を、ペプシンなどのタンパク質分解酵素で部分消化した後に、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって取得することができる。そのようなタンパク質分解酵素は、適宜設定される酵素の反応条件（例えば、pH）の下で制限的にFabまたはF(ab')2を形成するように全長抗体を消化することができる限り、特に限定されない。その例には、ペプシンおよびパパインが含まれ得る。
【００４１】
「第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができるが、第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない」本発明の「抗原結合ドメイン」とは、本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原と結合している状態では第２の抗原に結合できず、逆に可変領域が、第２の抗原と結合している状態では第１の抗原に結合できないことを意味する。この状況において、「第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しない」という句には、「抗原結合ドメイン」が、その単一の抗原結合ドメイン自体では、第１の抗原を発現する細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等のエフェクター細胞）を第２の抗原を発現する細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等のエフェクター細胞）と架橋しない、または各々が異なる細胞上に発現している第１の抗原および第２の抗原に同時には結合しないという意味も含まれる。この句にはさらに、第１の抗原および第２の抗原が可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していないか、または両方が同じ細胞上に存在する時には、抗原結合ドメインが、第１の抗原および第２の抗原の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上に発現している第１の抗原および第２の抗原には同時には結合することができない場合も含まれる。そのような抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインがこれらの機能を有している限り、特に限定されない。その例には、所望の抗原に結合するようにそのアミノ酸の一部を改変した、IgG型抗体に由来する抗原結合ドメインが含まれ得る。改変されるアミノ酸は、例えば、第１の抗原または第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン中の、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸から選択される。
この状況において、「異なる細胞上で発現している」という句は、単に、抗原が別々の細胞上で発現していることを意味する。そのような細胞の組み合わせは、例えば、T細胞と別のT細胞のように同じ種類の細胞であってもよく、またはT細胞とNK細胞のように異なる種類の細胞であってもよい。
【００４２】
本出願において、上記に定義される「第１の抗原と、第１の抗原とは異なる第２の抗原とに結合することができる」本発明の「抗原結合ドメイン」は、略語「Dual」または「dual」によって記載されてもよい。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインおよび第２の結合ドメインの両方が「Dual」である場合、「Dual/Dual」または「dual/dual」と表示され得る。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインおよび第２の結合ドメインの一方が「Dual」であり、もう一方の抗原結合ドメインが、1つの抗原、例えばCD3またはCD137のみに結合する（すなわち、第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合する）場合、「Dual/CD3、「CD3/Dual」、「Dual/CD137」、または「CD137/Dual」等と表示され得る。
さらなるいくつかの態様において、上記態様のうち、本発明の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインまたは第２の結合ドメインいずれかが、第１の抗原および第２の抗原とは異なる、第３の抗原（下記に定義される；例えば、GPC3）に結合することができる第３の抗原結合ドメインに連結されている場合、例えば、「GPC3-Dual/Dual」、「GPC3-Dual/CD3」、「GPC3-CD3/Dual」、「GPC3-Dual/CD137」、または「GPC3-CD137/Dual」等と表示され得る。
さらなるいくつかの態様において、上記態様のうち、（下記に定義されるように）「第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して、互いに連結される」場合、例えば、「Dual/CD3（linc）」、「CD3/Dual（linc）」、「Dual/CD137（linc）」、「CD137/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/CD3（linc）」、「GPC3-CD3/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/CD137（linc）」、または「GPC3-CD137/Dual（linc）」等と表示され得る。
【００４３】
本発明において、用語「第１の抗原または第２の抗原のいずれか一方のみに結合できる」は、（i）本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第１の抗原とは異なる第２の抗原のいずれか一方のみに対する結合活性を有し、第１または第２の抗原のうちもう一方の抗原に対する結合活性を有さないこと；（ii）本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第１の抗原とは異なる第２の抗原のいずれか一方に優先的な結合活性を有すること；（iii）本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第１の抗原とは異なる第２の抗原のいずれか一方に著しい結合活性（例えば、KDが、1×10-5 M未満、1×10-7 M未満、1×10-8 M未満、または1×10-9 M未満）を有する一方で、第１または第２の抗原のうちもう一方の抗原に対して、弱い結合活性（例えば、KDが、1×10-3 M超、1×10-4 M超、または1×10-5 M超である）を有すること；（iv）本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原または第１の抗原とは異なる第２の抗原のいずれか一方に対する結合活性を有する一方で、第１または第２の抗原のうちもう一方の抗原に対して、当技術分野において公知の方法、例えば、電気化学発光法（ECL）または表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いて決定される結合活性が検出不可能であること；（v）本発明の抗原結合ドメインが、第１の抗原とは異なる第２の抗原（第１の抗原）に対する結合と比較して、第１の抗原（第２の抗原）に対して1倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍、またはそれ以上高い結合活性を有することを意味する。
【００４４】
いくつかの態様において、第１または第２の抗原（例えば、CD3、CD137）に対する本発明の抗原結合ドメインの結合活性または親和性は、例えば、 Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃または37℃で評価される。抗ヒトFc（例えば、GE Healthcare）は、アミンカップリングキット（例えば、GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化される。抗原結合ドメインが抗Fcセンサー表面の上に捕捉され、次いで、抗原（例えば、組換えヒトCD3またはCD137）がフローセルの上にインジェクトされる。すべての抗原結合ドメインおよびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製される。センサー表面は各サイクル3 M MgCl2で再生させる。結合親和性は、例えば、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1：1結合モデルにフィットさせることによって決定される。いくつかの態様において、CD3結合親和性アッセイは、アッセイ温度が25℃に設定されている上述の条件で行われ、CD137結合親和性アッセイは、アッセイ温度が37℃に設定されること以外は同じ条件で行われた。
【００４５】
本発明のいくつかの態様において、「第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される」。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入することができる：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
【００４６】
本明細書では、上記（ii）の場合、2つのヒンジ領域間に導入された「少なくとも1つの結合」は、野生型抗体が各々の重鎖のヒンジ領域間に通常保有しているシステイン残基間の1つまたは複数のネイティブなジスルフィド結合以外の、1つまたは複数のさらなる結合である。例えば、IgG1抗体は、各々の重鎖のヒンジ領域間に2つのネイティブなジスルフィド結合を有し、IgG2およびIgG3は、各々の重鎖のヒンジ領域間により多くのジスルフィド結合を有する。そのようなシステイン残基の例としては、EUナンバリングによる226位および229位にあるシステイン残基が挙げられる。本発明において、上記（ii）の場合のヒンジ領域間に導入された「少なくとも1つの結合」は、IgG1、IgG2、またはIgG3等のヒンジ領域中の、そのような元から存在するジスルフィド結合以外の、1つまたは複数のさらなる結合である。
本発明において、上記（i）から（vi）の場合のいずれかにおいて、「少なくとも1つの結合」は、本発明の抗原結合分子が所望の性質を発揮する、達成する、および/または維持する範囲で、2つのCH1領域の各々の任意のアミノ酸位置；2つのヒンジ領域の各々の任意のアミノ酸位置；2つのCL領域の各々の任意のアミノ酸位置に導入することができる。
【００４７】
上記局面の態様において、第１および第２の抗原結合ドメインの少なくとも1つにおいて、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせる1つまたは複数（例えば、複数）のアミノ酸残基は、一次構造において互いから7アミノ酸以上隔てた位置に存在する。これは、上記の複数のアミノ酸残基の任意の2つのアミノ酸間に、該アミノ酸残基ではない6個以上のアミノ酸残基が存在することを意味する。ある特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせる複数のアミノ酸残基の組み合わせには、一次構造において7アミノ酸未満隔てた位置に存在するアミノ酸残基の対が含まれる。ある特定の態様において、第１および第２の抗原結合ドメインが3個以上の結合を介して互いに連結される場合、抗原結合ドメイン間の結合は、一次構造において7アミノ酸以上隔てた位置に存在するアミノ酸残基の対を含む、3個以上のアミノ酸残基から生じてもよい。
ある特定の態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインにおいて同じ位置に存在するアミノ酸残基は、互いに連結され、結合を形成する。ある特定の態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインにおいて異なる位置に存在するアミノ酸残基は、互いに連結され、結合を形成する。
【００４８】
抗原結合ドメイン中のアミノ酸残基の位置は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるKabatナンバリングまたはEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）により示すことができる。例えば、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間の結合を生じさせるアミノ酸残基が、抗原結合ドメインにおいて対応する同一の位置に存在する場合、これらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにより同じ番号として表示することができる。あるいは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間の結合を生じさせるアミノ酸残基が、抗原結合ドメインにおいて対応しない異なる位置に存在する場合、これらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにより異なる番号として表示することができる。
【００４９】
上記に記載のように、上記局面の態様において、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせるアミノ酸残基の少なくも1つは、定常領域内に存在する。ある特定の態様において、アミノ酸残基は、抗体重鎖定常領域のCH1領域内に存在し、例えば、CH1領域におけるEUナンバリングによる119位、122位、123位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、139位、140位、148位、150位、155位、156位、157位、159位、160位、161位、162位、163位、165位、167位、174位、176位、177位、178位、190位、191位、192位、194位、195位、197位、213位、および214位からなる群より選択される位置に存在する。例示的な態様において、アミノ酸残基は、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位に存在し、2つの抗原結合ドメインのCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基は互いに連結され、結合を形成する。
【００５０】
ある特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせるアミノ酸残基の少なくとも1つは、ヒンジ領域内に存在し、例えば、ヒンジ領域におけるEUナンバリングによる216位、218位、および219位からなる群より選択される位置に存在する。
ある特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせるアミノ酸残基の少なくとも1つは、軽鎖定常（CL）領域内に存在し、例えば、CL領域におけるEUナンバリングによる109位、112位、121位、126位、128位、151位、152位、153位、156位、184位、186位、188位、190位、200位、201位、202位、203位、208位、210位、211位、212位、および213位からなる群より選択される位置に存在する。例示的な態様において、アミノ酸残基は、CL領域におけるEUナンバリングによる126位に存在し、2つの抗原結合ドメインのCL領域におけるEUナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基は互いに連結され、結合を形成する。
【００５１】
上記に記載されるように、ある特定の態様において、第１の抗原結合ドメインのCH1領域中のアミノ酸残基および第２の抗原結合ドメインのCL領域中のアミノ酸残基は連結され、結合を形成する。例示的な態様において、第１の抗原結合ドメインのCH1領域におけるEUナンバリングによる191位にあるアミノ酸残基および第２の抗原結合ドメインのCL領域におけるEUナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基は連結され、結合を形成する。
【００５２】
上記に記載されるように、上記局面の態様において、抗原結合ドメイン間の結合を生じさせるアミノ酸残基の少なくとも1つは、重鎖（VH）可変領域および/または軽鎖可変（VL）領域内に存在する。ある特定の態様において、アミノ酸残基はVH領域内に存在し、例えば、VH領域におけるKabatナンバリングによる8位、16位、28位、74位、および82b位からなる群より選択される位置に存在する。ある特定の態様において、アミノ酸残基はVL領域内に存在し、例えば、VL領域におけるKabatナンバリングによる100位、105位、および107位からなる群より選択される位置に存在する。
【００５３】
本発明において、上記に記載されるような第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するように導入される「少なくとも1つの結合」は、これらに限定されないが、以下から選択される、任意の種類の結合であり得る：
（i）共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合など、アミノ酸間の直接架橋によって形成される共有結合；またはアミン反応性架橋剤を介するリジン残基間の共有結合など、架橋剤を介するアミノ酸間の架橋によって形成される共有結合等）；および/または
（ii）非共有結合（例えば、イオン結合、水素結合、または疎水結合等）。
【００５４】
本発明において、上記に記載されるような第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するように導入される「少なくとも1つの結合」は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持することができる。本明細書では、用語「第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する」は、限定されないが、下記のように説明される。
【００５５】
上記局面の態様において、上記に記載されるような第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するように導入される「少なくとも1つの結合」は、2つの結合ドメイン（すなわち、上記に記載の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン）を空間的に近い位置で保持することができる。結合を介する第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間の連結によって、本発明の抗原結合分子は、2つの抗原結合ドメイン間に導入されたさらなる結合を有さないという点でのみ本発明の抗原結合分子とは異なる対照抗原結合分子よりも近い位置で、2つの抗原結合ドメインを保持することができる。いくつかの態様において、用語「空間的に近い位置」または「より近い位置」には、上記に記載される第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインがより短い距離でおよび/または低下した柔軟性で保持されるという意味が含まれる。
【００５６】
結果として、本発明の抗原結合分子の2つの抗原結合ドメイン（すなわち、上記に記載の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン）は、同じ単一の細胞上に発現している抗原に結合する。換言すると、本発明の抗原結合分子の2つの抗原結合ドメイン（すなわち、上記に記載の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメイン）のそれぞれは、異なる細胞上に発現している抗原に結合せず、異なる細胞の架橋を引き起こさない。本出願において、本発明の抗原結合分子のそのような抗原結合様式は「シス結合」と呼ばれ得る一方、抗原結合分子の2つの抗原結合ドメインのそれぞれが、異なる細胞の架橋を引き起こすように、異なる細胞上に発現している抗原に結合する、抗原結合分子の抗原結合様式は、「トランス結合」と呼ばれ得る。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、「シス結合」様式で同じ単一の細胞上に発現している抗原に優先的に結合する。
【００５７】
上記局面の態様において、上記に記載されるような結合を介する第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間の連結によって、本発明の抗原結合分子は、免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、またはDC細胞等）の望ましくない架橋および活性化を低下および/または抑制することができる。すなわち、本発明のいくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインは、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意のシグナル伝達分子（例えば、第１の抗原）に結合し、かつ本発明の抗原結合分子の第２の抗原結合ドメインもまた、T細胞などの免疫細胞上に発現している任意のシグナル伝達分子（例えば、第１の抗原、または第１の抗原と異なる第２の抗原）に結合する。したがって、本発明の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、例えばT細胞などの同じ単一の免疫細胞上（すなわち、シス結合様式）、または例えばT細胞などの異なる免疫細胞上（すなわち、トランス結合様式）に発現している第１または第２のシグナル伝達分子のいずれかに結合することができる。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、例えばT細胞などの異なる免疫細胞上に発現しているシグナル伝達分子にトランス結合様式で結合する場合、例えばT細胞などのそのような異なる免疫細胞は架橋され、ある特定の状況において、例えばT細胞などの免疫細胞のそのような架橋は、T細胞などの免疫細胞の望ましくない活性化を引き起こす可能性がある。
【００５８】
一方で、本発明の抗原結合分子、すなわち、2つの抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子、の別の態様の場合において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインのどちらも、例えばT細胞などの同じ単一の免疫細胞上に発現しているシグナル伝達分子に「シス結合」様式で結合することができ、抗原結合分子を介する例えばT細胞などの異なる免疫細胞の架橋を低減し、免疫細胞の望ましくない活性化を回避することができる。
本出願において、上記の特徴、すなわち、「第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインが、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを互いに近くに保持する少なくとも1つの結合を介して互いに連結される」は、略語「linc」で記載され得る。この略語を用いると、いくつかの態様において、本発明の上記抗原結合分子は、例えば、「Dual/CD3（linc）、「CD3/Dual（linc）」、「Dual/CD137（linc）」、「CD137/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/CD3（linc）、「GPC3-CD3/Dual（linc）」、「GPC3-Dual/CD137（linc）」、または「GPC3-CD137/Dual（linc）」等と表示されてもよい。
【００５９】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメイン、重鎖可変（VH）領域、軽鎖可変（VL）領域、重鎖定常領域のCH1、軽鎖定常（CL）領域、抗体重鎖のヒンジ領域、およびFc領域の任意の1つまたは複数の部分において1つまたは複数のアミノ酸の改変を含むことができる（下記に記載）。1つのアミノ酸改変が、単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が、組み合わせて用いられてもよい。複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わせる改変の数は、特に限定されず、発明の目的を達成できる範囲内で適宜設定することができる。組み合わせる改変の数は、例えば、2個以上30個以下、好ましくは2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
【００６０】
組み合わせる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。可変領域中の1個または複数個のアミノ酸残基が、抗原結合活性が維持される限り、改変されるアミノ酸残基として許容される。可変領域中のアミノ酸を改変する場合、結果として生じた可変領域は、対応する未改変の抗体の結合活性を好ましくは維持し、好ましくは、例えば、改変前よりも50％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは100％以上高い結合活性を有するが、本発明による可変領域はそれらに限定されない。結合活性は、アミノ酸改変によって上昇していてもよく、例えば、改変前の結合活性の2倍、5倍、または10倍であってもよい。
【００６１】
アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、重（H）鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびに軽（L）鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。重（H）鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびに軽（L）鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。また、アミノ酸改変時に、抗原結合活性を上昇させるアミノ酸がさらに導入されてもよい。
【００６２】
本発明において、本明細書において用いられる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列（「相補性決定領域」もしくは「CDR」）が超可変であり、かつ/または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原に接触する残基（「抗原接触部」）を含有する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。概して、抗体は、6つのHVR：VHにおける3つ（H1、H2、H3）およびVLにおける3つ（L1、L2、L3）を含む。本明細書における例示的なHVRは、以下を含む：
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；ならびに
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ。
特に示されない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、上記のKabat et al.に従って、本明細書においてナンバリングされる。
【００６３】
本発明において、「ループ」とは、免疫グロブリンのβバレル構造の維持に関与しない残基を含有する領域を意味する。
本発明において、アミノ酸改変とは、置換、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせを意味する。本発明において、アミノ酸改変は、アミノ酸変異と互換的に用いられ、それと同じ意味で用いられ得る。
【００６４】
アミノ酸残基の置換は、例えば、以下の（a）〜（c）のいずれかを改変する目的で、別のアミノ酸残基での置き換えによって実施される：（a）シート構造またはらせん構造を有する領域のポリペプチドバックボーン構造；（b）標的部位の電荷もしくは疎水性；および（c）側鎖のサイズ。
アミノ酸残基は、一般的な側鎖の性質に基づいて以下のグループに分類される：（1）疎水性残基：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、およびIle；（2）中性親水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、およびGln；（3）酸性残基：AspおよびGlu；（4）塩基性残基：His、Lys、およびArg；（5）鎖の配向に影響する残基：GlyおよびPro；ならびに（6）芳香族残基：Trp、Tyr、およびPhe。
【００６５】
これらのグループの各々内でのアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれ、一方、これらのグループのうちの1つにおけるアミノ酸残基の別のグループにおけるアミノ酸残基による置換は、非保存的置換と呼ばれる。
本発明による置換は、保存的置換であってもよく、または非保存的置換であってもよい。あるいは、保存的置換と非保存的置換とが組み合わされてもよい。
【００６６】
アミノ酸残基の改変にはまた、第１の抗原または第２の抗原に結合する抗体可変領域において、その改変が抗原に対する結合を喪失させないアミノ酸のランダム改変によって得られたものからの、第１の抗原および第２の抗原に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができない可変領域の選択；ならびに、所望の抗原に対して結合活性を有することが以前に知られているペプチドを上述の領域に挿入する改変も含まれる。
所望の抗原に対する結合活性を有することが以前に知られているペプチドの例としては、以下の表に示されるペプチドが挙げられる。
【００６７】
【表Ａ】
2022501325.tif 000003
【００６８】
ヒトCD3εの異なるエピトープに結合するいくつかの抗体が、当技術分野において公知であり、例えば、抗体OKT3（例えば、Kung, P. et al, Science 206 (1979) 347-349; Salmeron, A. et al, J Immunol 147 (1991) 3047-3052; US9226962B2を参照）、抗体UCHT1（例えば、Callard,R.E. et al, Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505; Arnett et al. PNAS 2004を参照）、または抗体SP34（ヒトカニクイザルCD3交差反応性；例えば、Pessano, S. et al, EMBO J 4 (1985) 337-344, Conrad M.L., et. al, Cytometry A 71 (2007) 925-933を参照）である。WO2015181098A1は、ヒトおよびカニクイザルのT細胞に特異的に結合し、ヒトT細胞を活性化し、抗体OKT3、抗体UCHT1、および/または抗体SP34と同じエピトープには結合しない、ヒトカニクイザル交差反応性抗体も記載する。
【００６９】
WO2015068847A1（本明細書において参照により組み入れられる）は、Dual-Fabを調製する方法、および異なる目的タンパク質に結合できることが公知のペプチドの例を記載しており、ここで、そのようなペプチドは、ヒトCD3などの第１の抗原に結合する抗体の可変領域に挿入されると、第２の抗原結合部位として機能し得る。具体的には、WO2015068847A1は、以下を記載する：
実施例3−インテグリンおよびCD3に結合するが、同時には結合しない、抗CD3抗体。
実施例4−TLR2およびCD3に結合するが、同時には結合しない、抗CD3抗体。
実施例8−IgAおよびCD3に結合するが、同時には結合しない、抗CD3抗体。
実施例9−CD154およびCD3に結合するが、同時には結合しない、抗CD3抗体。
加えて、WO2015068847A1は、第１の抗原結合部位のCD3への結合能を消失させずに、抗原結合部位を配置することができる、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内の多数の部位を記載する。上記に記載の実施例、ならびに、種々の長さ（3、6、または9残基）のGGSペプチドが3つの異なるVH部位に（CDR2、FR3、またはCDR3に）挿入された実施例6に記載の実験を参照されたい。
【００７０】
本発明において、上記に記載される重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域における改変は、当技術分野において公知の改変と組み合わされてもよい。例えば、可変領域のN末端グルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は、当業者によく知られている修飾である。したがって、その重鎖可変（VH）領域のN末端にグルタミンを有する本発明の抗原結合分子は、このN末端グルタミンがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含有してもよい。
【００７１】
本発明において、抗原結合分子の抗原結合ドメインにおける重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域は、例えば、抗原結合、薬物動態、安定性、または抗原性を改善するためのアミノ酸改変をさらに有してもよい。本発明において、抗原結合分子の抗原結合ドメインにおける重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域は、抗原に対してpH依存的な結合活性を有し、それによって抗原に繰り返し結合することができるように、改変されてもよい（WO2009/125825）。
【００７２】
また、本発明において、標的組織特異的な化合物の濃度によって抗原結合活性を変化させるアミノ酸改変（WO2013/180200）が、例えば、第３の抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合する抗原結合分子の第３の抗原結合ドメインにおける重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域に加えられてもよい。
【００７３】
本発明において、抗原結合分子の抗原結合ドメインにおける重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域は、例えば、結合活性の増強、特異性の改善、pIの低下、pH依存的な抗原結合特性の付与、結合の熱安定性の改善、溶解性の改善、化学修飾に対する安定性の改善、糖鎖に由来する不均一性の改善、免疫原性の低下のためのインシリコ予測もしくはインビトロT細胞ベースアッセイの使用によって同定されたT細胞エピトープの回避、または制御性T細胞を活性化するためのT細胞エピトープの導入を目的として、さらに改変されてもよい（mAbs 3:243-247, 2011）。
【００７４】
本発明において、本発明の抗原結合ドメインおよび/または抗原結合分子が、抗原に結合することができるかどうか、および「抗原に結合できるが、任意の他の抗原に結合しない」かどうかは、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。これは、例えば、電気化学発光法（ECL法）によって判定することができる（BMC Research Notes 2011, 4:281）。
【００７５】
具体的には、例えば、本発明の低分子抗原結合分子に関して、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、sulfo-tag（Ru錯体）で標識された抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原の各々）と混合し、混合物を、ストレプトアビジン固定化プレートの上に加える。この操作において、ビオチン標識された被験抗原結合分子は、プレート上のストレプトアビジンに結合する。sulfo-tagから光を発生させ、その発光シグナルを、Sector Imager 600または2400（MSD K.K.）などを用いて検出し、それにより、抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原の各々）に対する、上述の被験抗原結合分子の結合を確認することができる。
【００７６】
あるいは、このアッセイは、ELISA、FACS（蛍光活性化細胞選別）、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などによって実施されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
【００７７】
具体的には、アッセイは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づく相互作用解析機器であるBiacore（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて実施することができる。Biacore解析機器には、Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、またはCなどの任意の機種が含まれる。CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、またはAuチップなどの任意のBiacore用センサーチップを、センサーチップとして用いることができる。プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgG-Fab、抗ヒトL鎖抗体、抗ヒトFc抗体、抗原タンパク質、または抗原ペプチドなどの、本発明の抗原結合分子を捕捉するためのタンパク質を、アミンカップリング、ジスルフィドカップリング、またはアルデヒドカップリングなどのカップリング法によって、センサーチップ上に固定化する。その上に抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原の各々）をアナライトとしてインジェクトし、相互作用を測定してセンサーグラムを取得する。この操作において、抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原）の濃度は、アッセイサンプルの相互作用の強さ（例えば、KD）に従って数μMから数pMの範囲内で選択することができる。
【００７８】
あるいは、抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原）を、抗原結合分子の代わりにセンサーチップ上に固定化して、次に、該抗原と評価されるべき抗原結合分子サンプルとを相互作用させてもよい。本発明の抗原結合ドメインおよび/または抗原結合分子が抗原（例えば、第１の抗原、第２の抗原、または第３の抗原）に対する結合活性を有するかどうかは、相互作用のセンサーグラムから算出された解離定数（KD）値に基づいて、または抗原結合分子サンプルの作用前のレベルに対する、作用後のセンサーグラムの増加の程度に基づいて、確認することができる。
【００７９】
いくつかの態様において、抗原（例えば、CD3、CD137）に対する本発明の抗原結合分子（抗体）の結合親和性は、例えば、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃または37℃で評価される。抗ヒトFc（例えば、GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（例えば、GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化する。抗原結合分子（抗体）を抗Fcセンサー表面の上に捕捉させ、次いで、抗原（例えば、組換えヒトCD3またはCD137）をフローセルの上にインジェクトする。すべての抗原結合分子（抗体）およびアナライトは、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製される。センサー表面は、サイクル毎に3 M MgCl2で再生させる。結合親和性は、例えば、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1：1結合モデルにフィットさせることによって決定される。いくつかの態様において、CD3結合親和性アッセイは、アッセイ温度が25℃に設定されている同じ条件で行われ、CD137結合親和性アッセイは、アッセイ温度が37℃に設定されること以外同じ条件で行われる。
【００８０】
ALPHAScreenは、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
【００８１】
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。センサーチップ表面上に捕捉されたリガンドに結合したアナライトの量（アナライトを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化の量）を、センサーグラムから決定することができる。しかし、結合量はリガンドの量にも依存するため、比較は、実質的に同じ量のリガンドの量を用いる条件下で行わなければならない。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
【００８２】
本発明の抗原結合分子が「第１の抗原と第２の抗原に同時には結合しない」かどうかは、抗原結合分子が第１の抗原および第２の抗原の両方に対する結合活性を有することを確認すること；次いで、この結合活性を有する可変領域を含む抗原結合分子に、第１の抗原または第２の抗原のいずれかを予め結合させること；および次いで、上述の方法によってもう1つのものに対するその結合活性の有無を判定すること、によって確認することができる。あるいは、これはまた、ELISAプレート上またはセンサーチップ上に固定化された第１の抗原または第２の抗原のいずれかに対する抗原結合分子の結合が、溶液中へのもう1つのものの添加によって阻害されるかどうかを判定することによって、確認することもできる。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の第１の抗原または第２の抗原のいずれかに対する結合は、もう1つに対する抗原結合分子の結合によって、少なくとも50％、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害される。
【００８３】
1つの局面において、1つの抗原（例えば、第１の抗原）を固定化している間に、第１の抗原に対する抗原結合分子の結合の阻害を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、BIACOREなど）によって、他の抗原（例えば、第２の抗原）の存在下で決定することができる。別の局面において、第２の抗原を固定化している間に、第２の抗原に対する抗原結合分子の結合の阻害もまた、第１の抗原の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合が、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上阻害されるならば、本発明の抗原結合分子は、第１の抗原と第２の抗原に同時には結合しないと判定される。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
【００８４】
1つの態様において、抗原結合分子の第２の抗原（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子の第１の抗原（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(第１の抗原)/ KD(第２の抗原)）を算出し、第２の抗原（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(第１の抗原)/ KD(第２の抗原)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、第１の抗原（アナライト）濃度を、上記の競合測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
【００８５】
1つの局面において、1つの抗原（例えば、第１の抗原）を固定化している間に、第１の抗原に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱を、先行技術において公知の方法（すなわち、ELISA、ECLなど）によって、他の抗原（例えば、第２の抗原）の存在下で決定することができる。別の局面において、第２の抗原を固定化している間に、第２の抗原に対する抗原結合分子の結合シグナルの減弱もまた、第１の抗原の存在下で決定することができる。上述の2つの局面のうちのいずれか1つが実施される時に、結合シグナルが、少なくとも50％、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、またはいっそうより好ましくは95％以上減弱されるならば、本発明の抗原結合分子は、第１の抗原と第２の抗原に同時には結合しないと判定される（参考実施例２−５、３−９、および４−４参照）。
いくつかの態様において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも少なくとも1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、または100倍高い。
好ましい様式において、アナライトとしてインジェクトされる抗原の濃度は、固定化される他の抗原の濃度よりも100倍高く、結合は、少なくとも80％阻害される。
【００８６】
1つの態様において、抗原結合分子の第２の抗原（固定化）結合活性についてのKD値に対する抗原結合分子の第１の抗原（アナライト）結合活性についてのKD値の比（KD(第１の抗原)/ KD(第２の抗原)）を算出し、第２の抗原（固定化）濃度よりもKD値の比（KD(第１の抗原)/ KD(第２の抗原)）の10倍、50倍、100倍、または200倍高い、第１の抗原（アナライト）濃度を、上記の測定のために用いることができる。（例えば、KD値の比が0.1である場合は、1倍、5倍、10倍、または20倍高い濃度を選択することができる。さらに、KD値の比が10である場合は、100倍、500倍、1000倍、または2000倍高い濃度を選択することができる。）
【００８７】
具体的には、例えば、ECL法を用いる場合、ビオチン標識された被験抗原結合分子、sulfo-tag（Ru錯体）で標識された第１の抗原、および標識されていない第２の抗原を準備する。被験抗原結合分子が、第１の抗原および第２の抗原に結合することができるが、第１の抗原と第２の抗原に同時には結合しない場合、被験抗原結合分子と標識された第１の抗原との混合物をストレプトアビジン固定化プレート上に添加すること、およびその後の発光によって、sulfo-tagの発光シグナルが、標識されていない第２の抗原の非存在下で検出される。対照的に、発光シグナルは、標識されていない第２の抗原の存在下で減少する。この発光シグナルの減少を定量して、相対的な結合活性を決定することができる。この解析は、標識された第２の抗原および標識されていない第１の抗原を用いて、同様に実施され得る。
【００８８】
ALPHAScreenの場合、被験抗原結合分子は、競合する第２の抗原の非存在下で第１の抗原と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第２の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用について第１の抗原と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、第１の抗原をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、第１の抗原をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合（one-site competition）モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）用いて解析される。この解析は、タグ付けされた第２の抗原およびタグ付けされていない第１の抗原を用いて、同様に解析され得る。
【００８９】
あるいは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた方法が用いられてもよい。FRETとは、励起エネルギーが、近接して位置する2つの蛍光分子の間で互いに、電子共鳴によって直接移動する現象である。FRETが起こると、ドナー（励起状態を有する蛍光分子）の励起エネルギーがアクセプター（ドナーの近くに位置するもう1つの蛍光分子）に移動するため、ドナーから放射される蛍光が消失し（正確には、蛍光の寿命が短縮し）、代わりにアクセプターから蛍光が放射される。この現象の使用によって、第１の抗原と第２の抗原に同時に結合するか否かを解析することができる。例えば、蛍光ドナーを有する第１の抗原および蛍光アクセプターを有する第２の抗原が、被験抗原結合分子に同時に結合すると、ドナーの蛍光は消失し、一方、アクセプターから蛍光が放射される。そのため、蛍光波長の変化が観察される。そのような抗体は、第１の抗原と第２の抗原に同時に結合するものと確認される。他方で、第１の抗原、第２の抗原、および被験抗原結合分子の混合が、第１の抗原と結合した蛍光ドナーの蛍光波長を変化させないならば、この被験抗原結合分子は、第１の抗原および第２の抗原に結合することができるが、第１の抗原と第２の抗原に同時には結合しない抗原結合ドメインとみなすことができる。
【００９０】
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズ上のストレプトアビジンに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされた第１の抗原を、アクセプタービーズに結合させる。被験抗原結合分子は、競合する第２の抗原の非存在下で第１の抗原と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない第２の抗原は、被験抗原結合分子との相互作用について第１の抗原と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合活性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いたポリペプチドのビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、第１の抗原をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、第１の抗原をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
【００９１】
タグ付けは、GSTタグ付けに限定されず、ヒスチジンタグ、MBP、CBP、Flagタグ、HAタグ、V5タグ、c-mycタグなどであるがそれらに限定されない、任意のタグで実施されてもよい。被験抗原結合分子のドナービーズへの結合は、ビオチン-ストレプトアビジン反応を用いた結合に限定されない。特に、被験抗原結合分子がFcを含む場合、可能な方法には、ドナービーズ上のプロテインAまたはプロテインGなどのFc認識タンパク質を介して被験抗原結合分子を結合させることが含まれる。
【００９２】
また、第１の抗原および第２の抗原が、可溶性タンパク質のように細胞膜上に発現していない時、または両方が同じ細胞上に存在する時には、可変領域が、第１の抗原と第２の抗原に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現している第１の抗原と第２の抗原に同時には結合することができない場合もまた、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
具体的には、第１の抗原および第２の抗原に対する同時の結合を検出するためのECL-ELISAにおいて陽性であると確認されている被験抗原結合分子をまた、第１の抗原を発現する細胞および第２の抗原を発現する細胞と混合する。被験抗原結合分子は、抗原結合分子およびこれらの細胞が互いに同時に結合しない限り、異なる細胞上で発現している第１の抗原および第２の抗原に同時には結合できないことが示され得る。このアッセイは、例えば、細胞ベースのECL-ELISAによって実施することができる。第１の抗原を発現する細胞を、予めプレート上に固定化する。被験抗原結合分子をそれに結合させた後に、第２の抗原を発現する細胞をプレートに添加する。第２の抗原を発現する細胞上でのみ発現している異なる抗原は、この抗原に対するsulfo-tagで標識された抗体を用いて検出される。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、いかなるシグナルも観察されない。
【００９３】
あるいは、このアッセイは、ALPHAScreen法によって実施されてもよい。被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合した第１の抗原を発現する細胞およびアクセプタービーズに結合した第２の抗原を発現する細胞と混合する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、シグナルが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、シグナルは観察されない。
あるいは、このアッセイは、Octet相互作用解析法によって実施されてもよい。最初に、ぺプチドタグを付加した第１の抗原を発現する細胞を、ペプチドタグを認識するバイオセンサーに結合させる。第２の抗原を発現する細胞および被験抗原結合分子を、ウェルに入れて、相互作用について解析する。抗原結合分子が、それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子および第２の抗原を発現する細胞のバイオセンサーへの結合によって引き起こされる大きな波長シフトが観察される。抗原結合分子がこれらの抗原に同時には結合しない場合は、被験抗原結合分子のみのバイオセンサーへの結合によって引き起こされる小さな波長シフトが観察される。
【００９４】
結合活性に基づくこれらの方法の代わりに、生物活性に基づくアッセイが実施されてもよい。例えば、第１の抗原を発現する細胞および第２の抗原を発現する細胞を、被験抗原結合分子と混合して培養する。それぞれ2つの細胞上で発現している2つの抗原は、抗原結合分子がこれらの2つの抗原に同時に結合する場合は、被験抗原結合分子を介して相互に活性化される。そのため、抗原のそれぞれの下流のリン酸化レベルの増加などの活性化シグナルの変化を、検出することができる。あるいは、サイトカインの産生が、活性化の結果として誘導される。そのため、産生されるサイトカインの量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。あるいは、第２の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害活性が、活性化の結果として誘導される。あるいは、レポーター遺伝子の発現が、活性化の結果として、第２の抗原または第１の抗原のシグナル伝達経路の下流で活性化されるプロモーターによって誘導される。そのため、細胞傷害活性または産生されるレポータータンパク質の量を測定し、それによって、2つの細胞に同時に結合するか否かを確認することができる。
【００９５】
本発明において、例えば、天然型IgGに由来するFc領域を、本発明の「Fc領域」として用いることができる。ここで、天然型IgGとは、天然に見出されるIgGと同一のアミノ酸配列を含有し、免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。天然型ヒトIgGとは、例えば、天然型ヒトIgG1、天然型ヒトIgG2、天然型ヒトIgG3、または天然型ヒトIgG4を意味する。天然型IgGにはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。遺伝子多型に基づく複数のアロタイプ配列が、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、およびヒトIgG4抗体の定常領域としてSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されており、それらはいずれも、本発明において用いることができる。特に、ヒトIgG1の配列は、EUナンバリング356〜358位のアミノ酸配列として、DELまたはEEMを有してもよい。
【００９６】
抗体Fc領域は、例えば、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMタイプのFc領域として見出される。例えば、天然型ヒトIgG抗体に由来するFc領域を、本発明の抗体Fc領域として用いることができる。例えば、天然型IgGの定常領域、具体的には、天然型ヒトIgG1を起源とする定常領域（配列番号：４９８）、天然型ヒトIgG2を起源とする定常領域（配列番号：４９９）、天然型ヒトIgG3を起源とする定常領域（配列番号：５００）、または天然型ヒトIgG4を起源とする定常領域（配列番号：５０１）に由来するFc領域を、本発明のFc領域として用いることができる。天然型IgGの定常領域にはまた、自然発生的にそれに由来するバリアントなども含まれる。
【００９７】
本発明のFc領域は、特に好ましくは、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているFc領域である。ここで、Fcγ受容体（本明細書においてFcγRとも言う）とは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域に結合することができる受容体を指し、Fcγ受容体遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIb、およびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）、およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）；ならびに、任意の未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプも含まれるが、それらに限定されない。FcγRには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが含まれる。FcγRは、これらの分子に限定されず、任意の生物に由来してもよい。マウスFcγRには、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、およびFcγRIII-2（CD16-2）、ならびに任意の未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されない。そのようなFcγ受容体の好ましい例には、ヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）、および／またはFcγRIIIb（CD16）が含まれる。
【００９８】
FcγRは、ITAM（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）を有する活性型受容体およびITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ）を有する抑制型受容体の形態で見出される。FcγRは、活性型FcγR（FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、およびFcγRIIIb）と抑制型FcγR（FcγRIIb）とに分類される。
FcγRIのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3およびNP_000557.1に記載されている；FcγRIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1およびAAH20823.1に記載されている；FcγRIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1およびAAI46679.1に記載されている；FcγRIIIaのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1およびAAH33678.1に記載されている；ならびにFcγRIIIbのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1およびAAI28563.1に記載されている（RefSeq登録番号）。FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン（H型）またはアルギニン（R型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990）。FcγRIIbには、FcγRIIbの232番目のアミノ酸がイソロイシン（I型）またはスレオニン（T型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)）。FcγRIIIaには、FcγRIIIaの158番目のアミノ酸がバリン（V型）またはフェニルアラニン（F型）によって置換された2種類の遺伝子多型が存在する（J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)）。FcγRIIIbには、2種類の遺伝子多型（NA1型およびNA2型）が存在する（J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)）。
【００９９】
Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることは、FACS、ELISA形式、ALPHAScreen（増幅発光近接ホモジニアスアッセイスクリーン）、または表面プラズモン共鳴（SPR）現象に基づくBIACORE法などの、周知の方法によって確認することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAScreen法は、2種類のビーズ（ドナーおよびアクセプター）を用いるALPHAテクノロジーによって、以下の原理に基づいて実施される：ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の生物学的相互作用によりこれら2つのビーズが近接して位置する時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ中のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素は、ドナービーズ周辺に拡散し、それに近接して位置するアクセプタービーズに到達すると、それによってビーズにおける化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子との間の相互作用がない場合には、ドナービーズによって産生される一重項酸素がアクセプタービーズに到達しない。したがって、化学発光反応は起きない。
【０１００】
例えば、ビオチン標識された被験抗原結合分子を、ドナービーズに結合させ、一方、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ付けされたFcγ受容体を、アクセプタービーズに結合させる。競合する変異Fc領域を有する抗原結合分子の非存在下では、野生型Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体と相互作用して、520〜620 nmのシグナルを生成する。タグ付けされていない変異Fc領域を有する抗原結合分子は、Fcγ受容体との相互作用について、野生型Fc領域を有する抗原結合分子と競合する。競合の結果として引き起こされる蛍光の減少を定量し、それによって相対的な結合親和性を決定することができる。スルホ-NHS-ビオチンなどを用いた抗原結合分子（例えば、抗体）のビオチン化は、当技術分野において公知である。例えば、Fcγ受容体をコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドとをインフレームで融合すること；および、結果として生じた融合遺伝子を、その発現が可能なベクターを保有する細胞などによって発現させ、その後グルタチオンカラムを用いて精製することを含む、適宜採用される方法によって、Fcγ受容体をGSTでタグ付けすることができる。得られたシグナルは、好ましくは、例えば、非線形回帰解析に基づく一部位競合モデルに適合したソフトウェアGRAPHPAD PRISM（GraphPad Software, Inc., San Diego）を用いて解析される。
【０１０１】
その間の相互作用を観察する物質の一方（リガンド）を、センサーチップの金薄膜上に固定化する。金薄膜とガラスとの境界面で全反射するように、センサーチップの裏側から光を当てる。結果として、反射光の一部に、反射強度が低下した部位（SPRシグナル）が形成される。その間の相互作用を観察する物質の他方（アナライト）を、センサーチップの表面上にインジェクトする。アナライトがリガンドに結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加して、センサーチップ表面上の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に、結合した分子が解離すると、シグナルは元の位置に戻る）。Biacoreシステムは、シフトの量、すなわち、センサーチップ表面上の質量変化を縦座標にプロットし、質量の時間依存的変化をアッセイデータとして表示する（センサーグラム）。カイネティクス、すなわち、結合速度定数（ka）および解離速度定数（kd）は、センサーグラムのカーブから決定することができ、一方、親和性（KD）は、これらの定数の比から決定することができる。阻害アッセイもまた、BIACORE法において好適に用いられる。阻害アッセイの例は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010に記載されている。
【０１０２】
本明細書において、Fcγ受容体に対する結合活性が低下しているとは、被験抗原結合分子が、上記の解析方法に基づいて、Fc領域を含む対照抗原結合分子の結合活性と比較して、例えば、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、または15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合活性を示すことを意味する。
IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体のFc領域を有する抗原結合分子を、対照抗原結合分子として適宜用いることができる。Fc領域の構造は、配列番号：５０２（RefSeq登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、配列番号：５０３（RefSeq登録番号AAB59393.1のN末にA付加）、配列番号：５０４（RefSeq登録番号CAA27268.1のN末にA付加）、または配列番号：５０５（RefSeq登録番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載されている。ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域のバリアントを有する抗原結合分子を試験物質として用いる場合には、このある特定のアイソタイプの抗体のFc領域を有する抗原結合分子を対照として用いて、バリアントにおける変異の、Fcγ受容体に対する結合活性への効果を試験する。Fcγ受容体に対する結合活性が低下していることがこのように確認されたFc領域バリアントを有する抗原結合分子が、適宜調製される。
【０１０３】
例えば、231A〜238S欠失（WO 2009/011941）、C226S、C229S、P238S、(C220S)（J.Rheumatol (2007) 34, 11）、C226S、C229S（Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54）、C226S、C229S、E233P、L234V、またはL235A（Blood (2007) 109, 1185-1192）（これらのアミノ酸はEUナンバリングに従って定義される）バリアントが、そのようなバリアントとして当技術分野において公知である。
【０１０４】
その好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、および332位のアミノ酸のいずれかの置換による、ある特定のアイソタイプの抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。Fc領域の起源である抗体のアイソタイプは、特に限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4モノクローナル抗体を起源とするFc領域が、適宜用いられ得る。天然型ヒトIgG1抗体を起源とするFc領域が、好適に用いられる。
例えば、EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（a）L234F、L235E、およびP331S、
（b）C226S、C229S、およびP238S、
（c）C226SおよびC229S、ならびに
（d）C226S、C229S、E233P、L234V、およびL235A
のいずれかによる、または231〜238位のアミノ酸配列の欠失による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【０１０５】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（e）H268Q、V309L、A330S、およびP331S、
（f）V234A、
（g）G237A、
（h）V234AおよびG237A、
（i）A235EおよびG237A、ならびに
（j）V234A、A235E、およびG237A
のいずれかによる、IgG2抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【０１０６】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（k）F241A、
（l）D265A、および
（m）V264A
のいずれかによる、IgG3抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【０１０７】
EUナンバリングに従って定義される、構成アミノ酸の以下の置換群（数字は、EUナンバリングに従って定義されるアミノ酸残基の位置を表し；数字の前に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表し；および数字の後に位置する一文字アミノ酸表記は、置換前のアミノ酸残基を表す）：
（n）L235A、G237A、およびE318A、
（o）L235E、ならびに
（p）F234AおよびL235A
のいずれかによる、IgG4抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子もまた、適宜用いられ得る。
【０１０８】
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、および331位のアミノ酸のいずれかの、カウンターパートのIgG2またはIgG4のFc領域における対応するEUナンバリングの位置のアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。
【０１０９】
その他の好ましい例には、以下の構成アミノ酸：EUナンバリングに従って定義される234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数の、異なるアミノ酸での置換による、天然型ヒトIgG1抗体のFc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。234位、235位、および297位のアミノ酸のいずれか1つまたは複数がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
【０１１０】
その他の好ましい例には、EUナンバリングに従って定義される265位の構成アミノ酸の、異なるアミノ酸での置換による、IgG1抗体Fc領域に由来するFc領域を有する抗原結合分子が含まれる。置換後に存在するアミノ酸の種類は、特に限定されない。265位のアミノ酸がアラニンによって置換されているFc領域を有する抗原結合分子が、特に好ましい。
【０１１１】
いくつかの態様において、抗原結合分子は、半減期が増加していてもよく、母体IgGの胎児への移動を担う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）胎児性Fc受容体（FcRn）への結合が増加していてもよい（US2005/0014934A1（Hinton et al.）に記載されている）。それらの抗原結合分子は、Fc領域のFcRnへの結合を増加させる1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。そのようなFcバリアントには、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数の位置での置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するものが含まれる（米国特許第7,371,826号）。Fc領域バリアントの他の例に関する、Duncan, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号および同第5,624,821号；ならびにWO 1994/29351も参照。
【０１１２】
別の態様において、活性成分は、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおける、コアセルベーション技術によってまたは界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルによってそれぞれ調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。さらに別の態様において、本発明の抗原結合分子は、例えば、半減期もしくは安定性を向上させるため、または抗体を他の方法で改良するために、「異種分子」とコンジュゲートさせてもよい。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに連結されてもよい。1つまたは複数のPEG分子に連結された抗体断片、例えばFab'は、本発明の例示的な態様である。さらに別の態様において、本発明の抗原結合分子は、胎児性Fc受容体に結合できるドメイン、例えばアルブミンタンパク質、好ましくは、ヒト血清アルブミンとの融合によって薬物動態が改善されていてもよい；例えば、Muller, Dafne, et al. Journal of Biological Chemistry 282.17 (2007): 12650-12660;およびBiotechnol Lett (2010) 32:609-622を参照。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明の「抗原結合分子」は、例えば、（i）Fc領域と連結される、第１の抗原結合ドメイン、および第１の抗原結合ドメインとは異なる第２の抗原結合ドメイン；（ii）Fc領域と連結される、そのC末端で第１の抗原結合ドメインのN末端と連結される第３の抗原結合ドメイン、および第１の抗原結合ドメインとは異なる第２の抗原結合ドメイン；（iii）Fc領域と連結される、そのC末端で第２の抗原結合ドメインのN末端と連結される第３の抗原結合ドメイン、および第２の抗原結合ドメインとは異なる第１の抗原結合ドメイン、を含む多重特異性抗原結合分子であり得る。
【０１１４】
多重特異性抗原結合分子の会合には、Ｆｃ領域の第２の定常ドメイン（CH2）または第３の定常ドメイン（CH3）の間の界面に電荷反発を導入することによって、意図されない第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインの重（H）鎖間の会合を抑制する技術を、適用することができる（WO2006/106905）。
CH2またはCH3の界面に電荷反発を導入することによって意図されない第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインの重（H）鎖間の会合を抑制する技術において、重（H）鎖定常ドメイン間の界面で互いに接触するアミノ酸残基の例には、1つのCH3ドメインにおけるEUナンバリング356位の残基、EUナンバリング439位の残基、EUナンバリング357位の残基、EUナンバリング370位の残基、EUナンバリング399位の残基、およびEUナンバリング409位の残基、ならびにもう1つのCH3ドメインにおけるそれらのパートナー残基が含まれ得る。
【０１１５】
より具体的には、例えば、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗原結合分子として、2つの重（H）鎖CH3ドメインを含む抗原結合分子を調製することができる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。
【０１１６】
抗原結合分子は、さらに、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗原結合分子として、調製することができる。
【０１１７】
ペア（１）〜（３）に記載される各アミノ酸残基は、会合したH鎖においてそのパートナーの近くに位置している。当業者は、所望のH鎖CH3ドメインまたはH鎖定常ドメインについて、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、ペア（１）〜（３）の各々に記載されるアミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、その位置のアミノ酸残基を適宜改変することができる。
【０１１８】
上記の抗原結合分子において、「電荷を有するアミノ酸残基」の各々は、好ましくは、例えば、以下の群（a）および（b）のいずれかに含まれるアミノ酸残基から選択される：
（a）グルタミン酸（E）およびアスパラギン酸（D）；ならびに
（b）リジン（K）、アルギニン（R）、およびヒスチジン（H）。
【０１１９】
上記の抗原結合分子において、「同種の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のすべてが、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であることを意味する。「反対の電荷を有する」という句は、例えば、2つ以上のアミノ酸残基の中の少なくとも1つのアミノ酸残基が、群（a）および（b）のいずれか1つに含まれるアミノ酸残基であってもよく、一方、残りのアミノ酸残基は、他の群に含まれるアミノ酸残基であることを意味する。
【０１２０】
好ましい態様において、抗原結合分子は、第１のH鎖CH3ドメインと第２のH鎖CH3ドメインとがジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
上述のように、本発明に従って改変されるアミノ酸残基は、上述の抗体可変領域または抗体定常領域におけるアミノ酸残基に限定されない。当業者は、ポリペプチドバリアントまたは異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリングなどに従い、界面を構成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、その位置のアミノ酸残基を改変することができる。
【０１２１】
本発明の多重特異性抗原結合分子の会合はまた、当技術分野において公知の代替技術によって実施することもできる。重鎖可変（VH）領域に存在するアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖によって置換し（ノブ）、もう1つの重鎖可変（VH）領域に存在するそのパートナーのアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖によって置換する（ホール）。アミノ酸配列の異なるFcドメインのポリペプチドが効率的に会合するように、ノブをホール中に配置することができる（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）。
【０１２２】
この技術に加えて、当技術分野において公知のさらなる代替技術が、本発明の多重特異性抗原結合分子を形成させるために用いられてもよい。1つの重（H）鎖のCH3の一部を、その対応するIgA由来の配列に変換し、もう1つの重（H）鎖のCH3におけるその相補的な部分を、その対応するIgA由来の配列に変換する。結果として生じた鎖交換操作ドメインCH3を用いることにより、配列が異なるポリペプチド間の効率的な会合を、相補的CH3会合によって引き起こすことができる（Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010）。当技術分野において公知のこの技術の使用によって、目的の多重特異性抗原結合分子も、効率的に形成させることができる。
【０１２３】
あるいは、多重特異性抗原結合分子は、例えば、WO2011/028952に記載されているような抗体のCH1-CL会合およびVH-VL会合を用いた抗体調製技術、WO2008/119353およびWO2011/131746に記載されているような別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術（Fabアーム交換）、WO2012/058768およびWO2013/063702に記載されているような抗体重鎖CH3ドメイン間の会合を制御する技術、WO2012/023053に記載されているような2種類の軽鎖および1種類の重鎖から構成される二重特異性抗体を調製する技術、またはChristoph et al.（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013)）に記載されているような1本のH鎖および1本のL鎖からなる抗体の半分子を各々が発現する2つの細菌細胞株を用いて二重特異性抗体を調製する技術によって、形成され得る。これらの会合技術に加えて、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する軽鎖を、それぞれ、第１のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖および第２のエピトープに結合する可変領域を形成する重鎖に会合させる、公知の異種軽鎖会合技術であるCrossMabテクノロジー（Scaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 11187-11192）もまた、本発明によって提供される多重特異性または多重パラトピック抗原結合分子を調製するために用いることができる。
【０１２４】
別々に調製されたモノクローナル抗体を用いて二重特異性抗体を調製する技術の例には、重鎖CH3ドメインにおける特定のアミノ酸を置換したモノクローナル抗体を還元条件下に置くことによって抗体のヘテロ二量体化を促進して、所望の二重特異性抗体を取得することを含む方法が含まれ得る。この方法にとって好ましいアミノ酸置換部位の例には、CH3ドメインにおけるEUナンバリング392位の残基およびEUナンバリング397位の残基が含まれ得る。さらに、二重特異性抗原結合分子はまた、第１のH鎖CH3ドメインにおける以下のアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択される1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が同種の電荷を有する抗体の使用によって、調製することもできる：（１）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング356位および439位のアミノ酸残基；（２）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング357位および370位のアミノ酸残基；ならびに（３）H鎖CH3ドメインに含有される、EUナンバリング399位および409位のアミノ酸残基。二重特異性抗原結合分子はまた、1つ〜3つのペアのアミノ酸残基が、第１のH鎖CH3ドメインにおける同種の電荷を有するアミノ酸残基のペア（１）〜（３）に対応するように、かつ第１のH鎖CH3ドメインにおける対応するアミノ酸残基とは反対の電荷を有するように、第１のH鎖CH3ドメインとは異なる第２のH鎖CH3ドメインにおけるアミノ酸残基のペア（１）〜（３）から選択されている抗体の使用によって、調製することもできる。
【０１２５】
目的の多重特異性抗原結合分子を効率的に形成させることができない場合であっても、本発明の多重特異性抗原結合分子は、産生された抗原結合分子の中から目的の多重特異性抗原結合分子を分離、精製することによって取得され得る。例えば、以前に報告された方法には、2種類のホモ二量体および目的のヘテロ二量体化抗体をイオン交換クロマトグラフィーによって別々に精製できるように、2種類のH鎖の可変ドメインにアミノ酸置換を導入して、等電点の差を付与することが含まれる（WO2007114325）。プロテインAに結合することができるマウスIgG2aのH鎖およびプロテインAに結合することができないラットIgG2bのH鎖からなるヘテロ二量体化抗体を精製するためにプロテインAを用いる方法が、ヘテロ二量体を精製するための方法として以前に報告されている（WO98050431およびWO95033844）。あるいは、IgGのプロテインA結合部位を構成するEUナンバリング435位および436位のアミノ酸残基を、異なるプロテインA結合の強度を提供する、TyrおよびHisなどのアミノ酸に置換してもよく、結果として生じたH鎖を、各H鎖とプロテインAとの相互作用を変化させるために用いる。結果として、ヘテロ二量体化抗体のみを、プロテインAカラムの使用によって効率的に精製することができる。
【０１２６】
これらの技術の複数、例えば2つ以上を、組み合わせて用いてもよい。また、これらの技術は、会合させたい2つの重（H）鎖に適宜別々に適用させることもできる。本発明の抗原結合分子は、このように改変された形態に基づくがそれとは別に、同一のアミノ酸配列を有する抗原結合分子として調製されてもよい。
【０１２７】
アミノ酸配列の改変は、当技術分野において公知の様々な方法によって行うことができる。行われてもよいこれらの方法の例には、部位特異的変異誘発（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275；Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367；およびKunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発などの方法が含まれ得るが、それらに限定されない。
【０１２８】
本発明の抗原結合分子は、上述のアミノ酸改変に加えて、追加的な改変をさらに含有することができる。追加的な改変は、例えば、アミノ酸置換、欠失、および修飾、ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。
例えば、本発明の抗原結合分子は、分子の意図される機能を実質的に変化させることなく、さらに任意に改変することができる。そのような変異は、例えば、アミノ酸残基の保存的置換によって行うことができる。あるいは、本発明の抗原結合分子の意図される機能を変化させる改変であっても、そのような改変によって変化した機能が本発明の目的の範囲内である限り、実施されてもよい。
【０１２９】
本発明によるアミノ酸配列の改変にはまた、翻訳後修飾も含まれる。具体的には、翻訳後修飾とは、糖鎖の付加または欠失を指すことができる。例えば、IgG1型の定常領域を有する本発明の抗原結合分子は、EUナンバリング297位に、糖鎖で修飾されたアミノ酸残基を有することができる。修飾における使用のための糖鎖構造は、限定されない。概して、真核細胞が発現する抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。したがって、以下の細胞が発現する抗体は、通常、いくつかの糖鎖で修飾されている：
哺乳動物の抗体産生細胞；および
抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞。
ここで、真核細胞には、酵母および動物細胞が含まれる。例えば、CHO細胞またはHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターでの形質転換のための典型的な動物細胞である。他方、本発明の抗体には、その位置に糖鎖修飾がない抗体も含まれる。糖鎖で修飾されていない定常領域を有する抗体は、これらの抗体をコードする遺伝子の、大腸菌などの原核細胞における発現によって取得することができる。
【０１３０】
本発明による追加的な改変は、より具体的には、例えば、Fc領域における糖鎖へのシアル酸の付加であってもよい（mAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27）。
【０１３１】
本発明の抗原結合分子が、Fc領域を有する場合、例えば、FcRnに対する結合活性を改善するアミノ酸置換（J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56；J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24；Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69；Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9；WO2006/019447；WO2006/053301；およびWO2009/086320）、または抗体の不均一性もしくは安定性を改善するためのアミノ酸置換（(WO2009/041613)）を加えてもよい。
【０１３２】
「抗体」という用語が本出願において用いられる場合、最も広い意味に解釈され、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体バリアント、抗体断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの任意の抗体をも含む。
【０１３３】
「抗体」という用語が本出願において用いられる場合、その抗原の種類、その起源などによって限定されず、任意の抗体であってもよい。抗体の起源の例には、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、およびウサギ抗体が含まれ得るが、特にそれらに限定されることはない。
【０１３４】
抗体は、当業者によく知られている方法によって調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）によって産生させてもよい。あるいは、モノクローナル抗体を、ファージディスプレイ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)；およびMarks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、モノクローナル抗体を、単一のB細胞クローンから単離してもよい（N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)）。
【０１３５】
ヒト化抗体はまた、再構成ヒト抗体とも呼ばれる。具体的には、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体のCDRを移植したヒト抗体からなるヒト化抗体が、当技術分野において公知である。ヒト化抗体を取得するための一般的な遺伝子組換え手法もまた、公知である。具体的には、例えば、オーバーラップ伸長PCRが、マウス抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、当技術分野において公知である。
【０１３６】
連結された3つのCDRおよび4つのFRを各々が含む抗体可変ドメインをコードするDNA、およびヒト抗体定常ドメインをコードするDNAを、可変ドメインDNAが定常ドメインDNAとインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入して、ヒト化抗体発現用ベクターを調製することができる。インサートを有するこれらのベクターを宿主に移入して、組換え細胞を樹立する。次いで、ヒト化抗体をコードするDNAの発現のために組換え細胞を培養して、ヒト化抗体を培養細胞の培養物中に産生させる（欧州特許公開番号EP 239400および国際公開番号WO1996/002576参照）。
【０１３７】
必要な場合は、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、FRのアミノ酸残基を置換してもよい。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植において用いられるPCR法の応用によって、FRのアミノ酸配列を変異させることができる。
【０１３８】
所望のヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子のすべてのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開番号WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、およびWO1996/033735参照）を免疫動物として用いるDNA免疫によって、取得することができる。
【０１３９】
加えて、ヒト抗体ライブラリーを用いたパニングによって、ヒト抗体を取得する技術も公知である。例えば、ヒト抗体V領域を、ファージディスプレイ法によってファージの表面上に、一本鎖抗体（scFv）として発現させる。抗原結合scFvを発現するファージを、選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析して、抗原結合ヒト抗体のV領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原結合scFvのDNA配列を決定した後、V領域配列を、所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させ、次いで、適切な発現ベクターに挿入して、発現ベクターを調製することができる。発現ベクターを、ヒト抗体をコードする遺伝子の発現のために上記に列挙される好ましい発現細胞に移入して、ヒト抗体を取得する。これらの方法は、当技術分野において既知である（国際公開番号WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、およびWO1995/015388参照）。
【０１４０】
ファージディスプレイ技術に加えて、例えば、無細胞翻訳システムを用いた技術、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術、およびエマルジョンを用いた技術が、ヒト抗体ライブラリーを用いたパニングによって、ヒト抗体を取得するための技術として公知である。例えば、終止コドンの除去などにより、リボソームを介してmRNAと翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むリボソームディスプレイ法、ピューロマイシンなどの化合物を用いて、翻訳されたタンパク質を遺伝子配列に共有結合させることを含むcDNAもしくはmRNAディスプレイ法、または核酸結合タンパク質を用いて、遺伝子と翻訳されたタンパク質との複合体を形成させることを含むCISディスプレイ法を、無細胞翻訳システムを用いた技術として用いることができる。ファージディスプレイ法、および大腸菌ディスプレイ法、グラム陽性細菌ディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、哺乳動物細胞ディスプレイ法、ウイルスディスプレイ法などを、細胞またはウイルスの表面上に抗原結合分子を提示する技術として用いることができる。例えば、エマルジョンに封入された遺伝子および翻訳関連分子を用いたインビトロウイルスディスプレイ法を、エマルジョンを用いた技術として用いることができる。これらの方法は、当技術分野において既知である（Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92；Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e127；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10；Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8；Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21 (4): 247-55；Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5；MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18；およびMethods Mol Biol. 2012; 911: 183-98）。
【０１４１】
本発明の抗原結合分子の各抗原結合ドメインに含まれる抗体可変領域の1つは、2つの異なる抗原に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合できない。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子の各抗原結合ドメインに含まれる抗体可変領域の1つは、第１の抗原に結合することができるが、第２の抗原に結合しない。
第１の抗原結合ドメインおよび/または第２の抗原結合ドメインが結合する「第１の抗原」または「第２の抗原」は好ましくは、例えば、免疫細胞表面分子（例えば、T細胞表面分子、NK細胞表面分子、樹状細胞表面分子、B細胞表面分子、NK T細胞表面分子、MDSC細胞表面分子、およびマクロファージ表面分子）、または腫瘍細胞、腫瘍血管、および間質細胞等だけでなく、正常組織にも発現している抗原（インテグリン、組織因子、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、METケモカイン受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、CD44、フィブロネクチン、DR5、TNFRSF等）である。
「第１の抗原」または「第２の抗原」の組み合わせに関して、好ましくは、第１の抗原および第２の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞の表面上に発現している分子である。「第１の抗原」および「第２の抗原」の組み合わせの別の態様において、好ましくは、第１の抗原および第２の抗原のいずれか一方は、例えば、T細胞上に特異的に発現している分子であり、もう一方の抗原は、免疫細胞上に発現しかつ予め選択した抗原とは異なる分子である。
【０１４２】
T細胞上で特異的に発現している分子の具体例には、CD3およびT細胞受容体が含まれる。特に、CD3が好ましい。例えば、ヒトCD3の場合には、本発明の抗原分子が結合するCD3中の部位は、ヒトCD3を構成するγ鎖、δ鎖、またはε鎖の配列中に存在する任意のエピトープであってもよい。特に、ヒトCD3複合体におけるε鎖の細胞外領域中に存在するエピトープが好ましい。CD3を構成するγ鎖、δ鎖、およびε鎖の構造のポリヌクレオチド配列は、NM_000073.2、NM_000732.4、およびNM_000733.3であり、そのポリペプチド配列は、NP_000064.1、NP_000723.1、およびNP_000724.1である（RefSeq登録番号）。他の抗原の例としては、Fcγ受容体、TLR、レクチン、IgA、免疫チェックポイント分子、TNFスーパーファミリー分子、TNFRスーパーファミリー分子、およびNK受容体分子が挙げられる。
【０１４３】
1つの態様において、第１の抗原は、T細胞上に特異的に発現している分子、好ましくはCD3など、より好ましくはヒトCD3などのT細胞受容体複合体分子である。別の態様において、第２の抗原は、T細胞または任意の他の免疫細胞上に発現している分子、好ましくは免疫細胞上の細胞表面調節因子、より好ましくはT細胞上に発現している共刺激分子、およびさらにより好ましくは、これらに限定されないが、ヒトCD137（4-1BB）、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLを含む「TNFスーパーファミリー」または「TNF受容体スーパーファミリー」のタンパク質である。1つの好ましい態様において、第１の抗原はCD3であり、かつ第２の抗原はCD137である。本明細書において、第１の抗原および第２の抗原は互換的に定義される。
【０１４４】
本明細書において、用語「CD137」は、4-1BBとも呼ばれ、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーである。TNFスーパーファミリーまたはTNF受容体スーパーファミリーに属する因子の例としては、CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、およびGITRLが挙げられる。
【０１４５】
本発明のいくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、上述の「第１の抗原」および「第２の抗原」とは異なる、「第３の抗原」に結合する第３の抗原結合ドメインをさらに含む。本発明の第３の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインは、任意の抗原を認識する抗原結合ドメインであり得る。本発明の第３の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインは、がん組織において特異的に発現している分子を認識する抗原結合ドメインであり得る。
【０１４６】
本明細書において、「第３の抗原」は、特に限定されず、任意の抗原であってもよい。抗原の例には、17-IA、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、アディポネクチン、ADPリボシルシクラーゼ-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アレルゲン、α1-アンチケモトリプシン（antichemotrypsin）、α1-アンチトリプシン、α-シヌクレイン、α-V/β-1 アンタゴニスト、アミニン（aminin）、アミリン、アミロイドβ、アミロイド免疫グロブリン重鎖可変領域、アミロイド免疫グロブリン軽鎖可変領域、アンドロゲン、ANG、アンジオテンシノーゲン、アンジオポエチンリガンド-2、抗Id、アンチトロンビンIII、炭疽、APAF-1、APE、APJ、アポA1、アポ血清アミロイドA、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン（Artemin）、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドA、心房性ナトリウム利尿ペプチドB、心房性ナトリウム利尿ペプチドC、av/b3インテグリン、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽菌（Bacillus anthracis）防御抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-ミクログロブリン、βラクタマーゼ、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、Bリンパ球刺激因子（BlyS）、BMP、BMP-2（BMP-2a）、BMP-3（オステオゲニン）、BMP-4（BMP-2b）、BMP-5、BMP-6（Vgr-1）、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BMPR-II（BRK-3）、BMPs、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ウシ成長ホルモン、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、Bリンパ球細胞接着分子、C10、C1インヒビター、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a（補体5a）、CA125、CAD-8、カドヘリン-3、カルシトニン、cAMP、炭酸脱水酵素-IX、がん胎児性抗原（CEA）、がん関連抗原、カルジオトロフィン-1、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/エオタキシン、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/エオタキシン-2、CCL25/TECK、CCL26/エオタキシン-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受容体、CINC、CKb8-1、クローディン18、CLC、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）毒素、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補体因子3（C3）、補体因子D、コルチコステロイド結合グロブリン、コロニー刺激因子-1受容体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/ラングカイン（Lungkine）、CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β、CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、シスタチンC、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、崩壊促進因子、Delta様タンパク質リガンド4、des(1-3)-IGF-1（脳IGF-1）、Dhh、DHICAオキシダーゼ、Dickkopf-1、ジゴキシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、DKl、DNAM-1、Dnアーゼ、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EGF様ドメイン含有タンパク質7、エラスターゼ、エラスチン、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、エンドシアリン、エンドセリン受容体、エンドトキシン、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシニ（eotaxini）、EpCAM、エフリンB2/EphB4、Epha2チロシンキナーゼ受容体、上皮成長因子受容体（EGFR）、ErbB2受容体、ErbB3チロシンキナーゼ受容体、ERCC、EREG、エリスロポエチン（EPO）、エリスロポエチン受容体、E-セレクチン、ET-1、Exodus-2、RSVのFタンパク質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受容体、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-塩基性、フィブリン、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子-10、フィブロネクチン、FL、FLIP、Flt-3、FLT3リガンド、葉酸受容体、卵胞刺激ホルモン（FSH）、フラクタルカイン（CX3C）、フリーの重鎖、フリーの軽鎖、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受容体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15（MIC-1）、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14/CDMP-1）、GDF-6（BMP-13/CDMP-2）、GDF-7（BMP-12/CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDNF、ゲルソリン、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gHエンベロープ糖タンパク質、GITR、グルカゴン、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド1受容体、Glut 4、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、糖タンパク質ホルモン受容体、糖タンパク質IIb/IIIa（GP IIb/IIIa）、グリピカン-3、GM-CSF、GM-CSF受容体、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF（G-CSF）、GRO/MGSA、成長ホルモン放出因子、GRO-β、GRO-γ、H. ピロリ（H. pylori）、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、ヘパリン補因子II、肝増殖因子（hepatic growth factor）、炭疽菌防御抗原、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、E型肝炎、ヘプシジン、Her1、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV）gB糖タンパク質、HGF、HGFA、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、HIVエンベロープタンパク質、例えばGP120、HIV MIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖タンパク質、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（hGH）、ヒト血清アルブミン、ヒト組織型プ���スミノーゲンアクチベーター（t-PA）、ハンチンチン、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受容体、IL-11、IL-11受容体、IL-12、IL-12受容体、IL-13、IL-13受容体、IL-15、IL-15受容体、IL-16、IL-16受容体、IL-17、IL-17受容体、IL-18（IGIF）、IL-18受容体、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-2、IL-2受容体、IL-20、IL-20受容体、IL-21、IL-21受容体、IL-23、IL-23受容体、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体、IL-31、IL-31受容体、IL-3受容体、IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-5受容体、IL-6、IL-6受容体、IL-7、IL-7受容体、IL-8、IL-8受容体、IL-9、IL-9受容体、免疫グロブリン免疫複合体、免疫グロブリン、INF-α、INF-α受容体、INF-β、INF-β受容体、INF-γ、INF-γ受容体、I型IFN、I型IFN受容体、インフルエンザ、インヒビン、インヒビンα、インヒビンβ、iNOS、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2、インスリン様成長因子結合タンパク質、インテグリン、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα4/β1、インテグリンα-V/β-3、インテグリンα-V/β-6、インテグリンα4/β7、インテグリンα5/β1、インテグリンα5/β3、インテグリンα5/β6、インテグリンασ（αV）、インテグリンαθ、インテグリンβ1、インテグリンβ2、インテグリンβ3（GPIIb-IIIa）、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン（kalliklein）、カリクレイン（Kallikrein）11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、カリスタチン、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ケラチノサイト増殖因子2（KGF-2）、KGF、キラー免疫グロブリン様受容体、kitリガンド（KL）、Kitチロシンキナーゼ、ラミニン5、LAMP、LAPP（アミリン、膵島アミロイドポリペプチド）、LAP（TGF-1）、潜伏関連ペプチド、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受容体、LECT2、Lefty、レプチン、黄体形成（leutinizing）ホルモン（LH）、ルイス-Y抗原、ルイス-Y 関連抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受容体、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物質、黄体形成（Luteinizing）ホルモン、リンホタクチン、リンホトキシンβ受容体、リゾスフィンゴ脂質受容体、Mac-1、マクロファージ-CSF（M-CSF）、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、マスピン、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I（MCAF）、M-CSF、MDC、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、メグシン（megsin）、Mer、METチロシンキナーゼ受容体ファミリー、メタロプロテアーゼ（METALLOPROTEASES）、膜糖タンパク質OX2、メソテリン、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、微生物タンパク質、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、単球誘引タンパク質、単球コロニー抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、ムチン（Mud）、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、ミエリン関連糖タンパク質、骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-I）、NAIP、ナノボディ、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-カドヘリン、NCAM、ネプリライシン、神経細胞接着分子、ニューロセルピン、神経成長因子（NGF）、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-6、ニューロピリン1、ニュールツリン、NGF-β、NGFR、NKG20、N-メチオニルヒト成長ホルモン、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受容体、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質3型（NS3）、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受容体、骨誘導因子、オステオポンチン、OX40L、OX40R、酸化LDL、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤成長因子、胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）、胎盤性ラクトゲン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1、血小板増殖因子、plgR、PLP、様々なサイズのポリグリコール鎖（例えば、PEG-20、PEG-30、PEG40）、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシト
ニン、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシン、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）F、Ret、レチキュロン（reticulon）4、リウマチ因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、スクレロスチン、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン1-リン酸受容体1、ブドウ球菌リポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子（SCF）、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン-1、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質-72）、TARC、TB、TCA-3、T-細胞受容体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、Pan特異的TGF-β、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-βRl（ALK-5）、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、トロンビン、トロンボポエチン（TPO）、胸腺間質性リンホプロテイン（Thymic stromal lymphoprotein）受容体、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2/DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2/TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R/TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF/TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF12A、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ/TRADE）、TNFRSF19L（RELT)、TNFRSF1A（TNF Rl CD120a/p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b/p75-80）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRSF25（DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII/TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35/TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6 （Fas Apo-1/APT1/CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68/TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8 （CD30）、TNFRSF9（4-1 BB CD137/ILA）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFSF10 （TRAIL Apo-2リガンド/TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンドODF/OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド/DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド/LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンドAITRリガンド/TL6）、TNFSF1A（TNF-aコネクチン（Conectin）/DIF/TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa/TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC/p33）、TNFSF4（OX40リガンドgp34/TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンドCD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP）、TNFSF6（FasリガンドApo-1リガンド/APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンドCD70）、TNFSF8（CD30リガンドCD153）、TNFSF9（4-1 BBリガンドCD137リガンド）、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝産物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、トランスフォーミング成長因子（TGF）、例えばTGF-αおよびTGF-β、膜貫通糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP-2、栄養膜糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子（TNF）、腫瘍関連抗原CA 125、ルイスY関連糖質を発現する腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VAP-1、血管内皮増殖因子（VEGF）、バスピン（vaspin）、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1（flt-1）、VEFGR-2、VEGF受容体（VEGFR）、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VitB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ウィルブランド因子（vWF）、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/リンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、ならびにグリピカン-3（GPC3）が含まれる。
【０１４７】
本発明において、本発明の抗原結合分子中の第３の抗原結合ドメインは、上述の「第１の抗原」および「第２の抗原」とは異なる「第３の抗原」に結合する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する。いくつかの態様において、第３の抗原は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、またはイヌに由来する細胞または臓器上に特異的に発現している分子である。第３の抗原は、好ましくは、細胞または臓器上に全身的には発現していない分子である。第３の抗原は、好ましくは、例えば、腫瘍細胞特異的抗原であり、また、細胞の悪性化に伴って発現する抗原、および細胞の悪性形質転換中に細胞表面またはタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も含む。その具体例には、ALK受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、KS 1/4膵臓がん抗原、卵巣がん抗原（CA125）、前立腺酸リン酸（prostatic acid phosphate）、前立腺特異的抗原（PSA）、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラノーマ抗原（HMW-MAA）、前立腺特異的膜抗原、がん胎児性抗原(CEA)、多型上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、およびLEA）、バーキットリンパ腫抗原38.13、CD19、ヒトBリンパ腫抗原CD20、CD33、メラノーマ特異的抗原（例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、およびガングリオシドGM3）、腫瘍特異的移植抗原（TSTA）、T抗原、ウイルスにより誘導される腫瘍抗原（例えば、DNA腫瘍ウイルスおよびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原）、結腸CEA、腫瘍胎児性抗原α-フェトプロテイン（例えば、腫瘍胎児性栄養膜糖タンパク質5T4および腫瘍胎児性膀胱腫瘍抗原）、分化抗原（例えば、ヒト肺がん抗原L6およびL20）、線維肉腫抗原、ヒトT細胞白血病関連抗原Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳がん抗原（例えば、EGFR（上皮成長因子受容体））、NY-BR-16、NY-BR-16およびHER2抗原（p185HER2）、多型上皮ムチン（PEM）、悪性ヒトリンパ球抗原APO-1、胎児赤血球において見出されるI抗原などの分化抗原、成人赤血球において見出される初期内胚葉I抗原、移植前の胚または胃がんにおいて見出されるI（Ma）、乳腺上皮において見出されるM18、M39、骨髄細胞において見出されるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸がんにおいて見出されるD156-22、TRA-1-85（血液型H）、精巣および卵巣がんにおいて見出されるSCP-1、結腸がんにおいて見出されるC14、肺がんにおいて見出されるF3、胃がんにおいて見出されるAH6、Yハプテン、胚性がん細胞において見出されるLey、TL5（血液型A）、A431細胞において見出されるEGF受容体、膵臓がんにおいて見出されるE1シリーズ（血液型B）、胚性がん細胞において見出されるFC10.2、胃がん抗原、腺がんにおいて見出されるCO-514（血液型Lea）、腺がんにおいて見出されるNS-10、CO-43（血液型Leb）、A431細胞のEGF受容体において見出されるG49、結腸がんにおいて見出されるMH2（血液型ALeb/Ley）、結腸がんにおいて見出される19.9、胃がんムチン、骨髄細胞において見出されるT5A7、メラノーマにおいて見出されるR24、胚性がん細胞において見出される4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびM1:22:25:8、4細胞期〜8細胞期の胚において見出されるSSEA-3およびSSEA-4、皮膚T細胞リンパ��関連抗原、MART-1抗原、シアリルTn（STn）抗原、結腸がん抗原NY-CO-45、肺がん抗原NY-LU-12バリアントA、腺がん抗原ART1、腫瘍随伴関連脳-精巣がん抗原（腫瘍神経抗原MA2および腫瘍随伴性神経抗原）、神経腫瘍学的腹部抗原2（NOVA2）、血液細胞がん抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-C1（がん／精巣抗原CT7）、MAGE-B1（MAGE-XP抗原）、MAGE-B2（DAM6）、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b、MAGE-X2、がん-精巣抗原（NY-EOS-1）、YKL-40、ならびにこれらのポリペプチドの任意の断片、ならびにその修飾された構造（前述の修飾されたリン酸基、糖鎖など）、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、シアリルSSEA-1（SLX）、HER2、PSMA、CEA、ならびにCLEC12Aが含まれる。
【０１４８】
1つの好ましい態様において、第３の抗原は、がん組織において特異的に発現している分子、好ましくはグリピカン-3（GPC3）である。
【０１４９】
1つの局面において、本発明の抗原結合分子は、下記の（1）〜（4）からなる群より選択される少なくとも1つの特徴を有する。
（1）第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインの少なくとも1つが、配列番号：１５９のアミノ酸配列を含むCD3ε（イプシロン）の細胞外ドメインに結合する。
（2）本発明の抗原結合分子が、CD137に対するアゴニスト活性を有する。
（3）本発明の抗原結合分子が、CD3への結合を通じてT細胞の活性化を誘導し、第３の抗原（例えば、がん細胞上の腫瘍抗原）の分子を発現する細胞に対し細胞傷害活性を示すが、第３の抗原を発現する細胞の存在とは独立して（すなわち、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下で）、CD3シグナル伝達を介するT細胞の活性化またはCD137を発現する免疫細胞の活性化を誘導しない、および
（4）本発明の抗原結合分子が、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下でPBMCからのサイトカインの放出を誘導しない。
【０１５０】
「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」という用語が本出願において用いられる場合、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子を指し、ここで0％の活性化とは、CD137を発現する非活性化細胞のバックグラウンドレベル（例えば、IL6分泌など）である。様々な具体例において、本出願における医薬組成物としての使用のための「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」は、細胞の活性を少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。
【０１５１】
「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」という用語が本出願において用いられる場合、CD137を発現する細胞、組織、または生体に添加された時に、CD137を発現する細胞を少なくとも約5％、具体的には少なくとも約10％、またはより具体的には少なくとも約15％活性化する抗体または抗原結合分子も指し、ここで100％の活性化とは、生理学的条件下で等モル量の結合パートナーによって達成される活性化のレベルである。様々な具体例において、本出願における医薬組成物としての使用のための「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」は、細胞の活性を少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、750％、または1000％活性化することができる。
【０１５２】
いくつかの態様において、「結合パートナー」という用語は、CD137に結合することが知られており、かつCD137を発現する細胞の活性化を誘導する分子を意味する。さらなる態様において、結合パートナーの例には、WO2005/035584A1に記載されているウレルマブ（Urelumab）（CAS登録番号934823-49-1）およびそのバリアント、WO2012/032433A1に記載されているウトミルマブ（Utomilumab）（CAS登録番号1417318-27-4）およびそのバリアント、ならびに様々な公知のCD137アゴニスト抗体が含まれる。ある特定の態様において、結合パートナーの例には、CD137リガンドが含まれる。さらなる態様において、抗CD137アゴニスト抗体または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」によるCD137を発現する細胞の活性化は、IL6分泌を特徴決定するELISAを用いて判定され得る（例えば、本明細書における参考実施例５−２参照）。結合パートナーとして用いられる抗CD137抗体または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」、および測定のための抗体濃度は、参考実施例５−２を参照とすることができ、ここで100％の活性化とは、抗体または抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。さらなる態様において、配列番号：１４２の重鎖アミノ酸配列および配列番号：１４４の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を、結合パートナーとして、測定のために30 μg/mLで用いることができる（例えば、本明細書における参考実施例５−２参照）。
【０１５３】
非限定的な態様として、本発明は、Fc領域を含む「CD137アゴニスト抗体」または「CD137に対するアゴニスト活性を有する抗原結合分子」を提供し、該Fc領域は、抑制性Fcγ受容体に対する結合活性が増強している。
【０１５４】
非限定的な態様として、CD137アゴニスト活性は、その表面上にCD137を発現することが公知である、B細胞を用いて確認することができる。非限定的な態様として、HDLM-2 B細胞株を、B細胞として用いることができる。CD137の活性化の結果として、IL-6の発現が誘導されるため、CD137アゴニスト活性は、産生されるヒトインターロイキン-6（IL-6）の量によって評価することができる。この評価において、IL-6の量を用いることにより0％バックグラウンドレベルとしての非活性化B細胞からのIL-6発現の増加量を評価することによって、評価される分子が、何％のCD137アゴニスト活性を有するかを判定することが可能である。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、CD3への結合を通じてT細胞の活性化を誘導し、第３の抗原（例えば、がん細胞上の腫瘍抗原）の分子を発現する細胞に対し細胞傷害活性を示すが、第３の抗原を発現する細胞の存在とは独立して（すなわち、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下で）、T細胞の活性化またはCD137を発現する免疫細胞の活性化を誘導しない。抗原結合分子が、CD3への結合を通じてT細胞の活性化を誘導し、第３の抗原の分子を発現する細胞に対し細胞傷害活性を示すかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下で、第３の抗原を発現する細胞とT細胞を共培養し、CD3シグナル伝達を介するT細胞活性化をアッセイすることによって、判定することができる。T細胞活性化は、例えば、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する組換えT細胞を用いること、および、T細胞の活性化の指標として、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性を検出することによって、アッセイすることができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下で第３の抗原を発現する細胞と共培養した時に、抗原結合分子の用量に依存した様式でのレポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性の検出は、抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導することを示す。
【０１５６】
同様に、抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞の存在とは独立して（すなわち、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下で）、CD137を発現する細胞に対するCD3シグナル伝達を介するT細胞の活性化を誘導しないかどうかは、例えば、抗原結合分子の存在下で、CD137を発現する細胞とT細胞を共培養し、上記のようにT細胞のCD3活性化をアッセイすることによって、判定することができる。CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性がないか、または検出限界よりも下であるか、または陰性対照のものよりも下であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定される。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、CD3とCD137に同時に結合する抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。1つの局面において、CD3シグナル伝達に応答してレポーター遺伝子を発現する組換えT細胞を、抗原結合分子の存在下でCD137を発現する細胞と共培養した時に、レポーター遺伝子の発現またはレポーター遺伝子産物の活性が、最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であるならば、抗原結合分子は、CD137を発現する細胞に対するT細胞の活性化を誘導しないと判定され、ここで100％の活性化とは、第３の抗原の分子を発現する細胞に対する同じ抗原結合分子によって達成される活性化のレベルである。
【０１５７】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、第３の抗原の分子を発現する細胞の非存在下では、PBMCからのサイトカイン放出を誘導しない。抗原結合分子が、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でサイトカインの放出を誘導しないかどうかは、例えば、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCと抗原結合分子とをインキュベートすること、ならびに、当技術分野において公知の方法を用いて、PBMCから培養上清中に放出されたIL-2、IFNγ、およびTNFαなどのサイトカインを測定することによって判定することができる。第３の抗原を発現する細胞の非存在下で抗原結合分子とインキュベートしたPBMCの培養上清において、有意なレベルのサイトカインが検出されないか、または有意なサイトカイン発現の誘導が起こらないならば、抗原結合分子は、第３の抗原を発現する細胞の非存在下でPBMCからのサイトカイン放出を誘導しないと判定される。
【０１５８】
1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、第１の抗原（CD3）と第２の抗原（CD137）に同時に結合する抗原結合分子によって達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なレベルのサイトカインが検出されない」とはまた、サイトカイン濃度のレベルが最大でも約50％、30％、20％、10％、5％、または1％であることを指し、ここで100％とは、第３の抗原の分子を発現する細胞の存在下で達成されるサイトカイン濃度である。1つの局面において、「有意なサイトカイン発現の誘導が起こらない」とはまた、サイトカイン濃度増加のレベルが、抗原結合分子を添加する前の各サイトカインの濃度の最大でも5倍、2倍、または1倍であることを指す。
【０１５９】
いくつかの態様において、CD137への結合に関する限り、本発明の抗原結合分子は、CD137への結合について、以下からなる群より選択される抗体と競合する：
（a）配列番号：１０４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２４のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（b）配列番号：１１９のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（c）配列番号：１１４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２９のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（d）配列番号：１０４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１３１のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（e）配列番号：１１４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１３４のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（f）配列番号：１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（g）配列番号：２のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（h）配列番号：３のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（i）配列番号：４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（j）配列番号：５のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（k）配列番号：６のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（l）配列番号:7のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号:45のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（m）配列番号：８のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（n）配列番号：９のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（o）配列番号：１０のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（p）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、ならびに
（q）配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体。
【０１６０】
いくつかの態様において、CD137への結合に関する限り、本発明の抗原結合分子は、以下からなる群より選択される抗体と同じCD137分子のエピトープに結合する：
（a）配列番号：１０４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２４のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（b）配列番号：１１９のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（c）配列番号：１１４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１２９のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（d）配列番号：１０４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１３１のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（e）配列番号：１１４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：１３４のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（f）配列番号：１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（g）配列番号：２のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（h）配列番号：３のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（i）配列番号：４のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（j）配列番号：５のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（k）配列番号：６のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（l）配列番号：７のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（m）配列番号：８のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（n）配列番号：９のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（o）配列番号：１０のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４６のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、
（p）配列番号：１１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体、ならびに
（q）配列番号：６１のアミノ酸配列を有するVH領域および配列番号：４８のアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体。
【０１６１】
いくつかの態様において、CD137への結合に関する限り、本発明の抗原結合分子は、上記（a）〜（q）のいずれか1つと同等な活性を有し得る。本明細書において、「同等の活性」は、上記（a）〜（q）のいずれか1つの結合活性の70％以上、好ましくは 80％以上、およびより好ましくは 90％以上である、CD137アゴニスト活性を指す。
【０１６２】
本発明の試験抗原結合分子が、上記に挙げるようなある特定の抗体と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2者の競合に基づいて評価することができる。2者間の競合は、クロスブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）などによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするために用いるCD137タンパク質を、候補競合抗体の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、本発明の抗原結合分子をそこに添加する。ウェル中のCD137タンパク質に結合している本発明の抗原結合分子の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗体（試験抗体）の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する試験抗体の親和性が高ければ高いほど、CD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した本発明の抗原結合分子の量は少なく、かつCD137タンパク質でコーティングされたウェルに結合した試験抗体の量は多い。
【０１６３】
ウェルに結合した本発明の抗原結合分子の量は、抗原結合分子を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗原結合分子は、アビジン/ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。本発明の抗原結合分子は、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
【０１６４】
さらに、試験抗体が、本発明の抗原結合分子の種とは異なる種に由来する定常領域を有する場合、ウェルに結合した本発明の抗原結合分子の量を、その抗原結合分子の定常領域を認識する標識された抗体を用いることによって測定することができる。あるいは、試験抗体および本発明の抗原結合分子が、同じ種に由来するが異なるクラスに属する場合には、ウェルに結合した2者の量を、個々のクラスを区別する抗体を用いて測定することができる。
【０１６５】
本発明の候補抗原結合分子が、本発明の候補競合抗原結合分子の非存在下で行われる対照実験において得られる結合活性と比較して、少なくとも20％、好ましくは少なくとも20％〜50％、およびさらにより好ましくは少なくとも50％、抗CD137抗体の結合をブロックすることができる場合、本発明の候補競合抗原結合分子は、抗CD137抗体と同じエピトープに実質的に結合する抗原結合分子であるか、または同じエピトープへの結合について競合する抗原結合分子である。
【０１６６】
別の態様において、試験抗体または抗原結合分子が別の抗体または抗原結合分子と競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
【０１６７】
エピトープの空間的立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる（Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, G. E. Morris (ed.), Vol. 66 (1996)を参照）。
【０１６８】
試験抗体または抗原結合分子が、CD137リガンドと共通のエピトープを共有するかどうかもまた、同じエピトープに対する試験抗体または抗原結合分子とCD137リガンドとの間の競合に基づいて評価することができる。抗体または抗原結合分子とCD137リガンドとの間の競合は、上述のクロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。別の態様において、試験抗体または抗原結合分子がCD137リガンドと競合的にまたは交差競合的に結合する能力は、当技術分野において公知のBIAcore解析またはフローサイトメトリーなどの標準的な結合アッセイを用いて、当業者が適宜決定することができる。
【０１６９】
いくつかの態様において、CD137への結合に関する限り、本発明の抗原結合分子の好都合な例には、以下からなる群より選択される抗体が結合するヒトCD137エピトープと同じエピトープに結合する抗原結合分子が含まれる：
ヒトCD137タンパク質における
SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：１５４）を含む領域を認識する抗体、
DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC配列（配列番号：１４９）を含む領域を認識する抗体、
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAEC配列（配列番号：１５２）を含む領域を認識する抗体、および
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC配列（配列番号：１４７）を含む領域を認識する抗体。
【０１７０】
標的とされるがん抗原に応じて、当業者は、がん特異的抗原結合ドメインに含まれる重鎖可変領域および軽鎖可変領域について、がん抗原に結合する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を適宜選択することができる。抗原結合ドメインが結合するエピトープが、複数の異なる抗原に含有されている場合、該抗原結合ドメインを含有する抗原結合分子は、該エピトープを有する様々な抗原に結合し得る。
【０１７１】
「エピトープ」とは、抗原における抗原決定基を意味し、本明細書において開示される抗原結合分子中の様々な結合ドメインが結合する抗原部位を指す。したがって、例えば、エピトープを、その構造に従って定義することができる。あるいは、エピトープを、該エピトープを認識する抗原結合分子の抗原結合活性に従って定義してもよい。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合、エピトープを、該エピトープを形成するアミノ酸残基によって特定化することができる。あるいは、エピトープが糖鎖である場合、エピトープは、その特異的な糖鎖構造によって特定化することができる。
【０１７２】
直鎖状エピトープとは、その一次アミノ酸配列が認識されるエピトープを含有するエピトープである。そのような直鎖状エピトープは、典型的には、その特異的配列中に少なくとも3個、および最も一般的には少なくとも5個、例えば、約8〜10個または6〜20個のアミノ酸を含有する。
【０１７３】
直鎖状エピトープとは対照的に、「立体構造エピトープ」とは、エピトープを含有する一次アミノ酸配列が、認識されるエピトープの唯一の決定基ではないエピトープである（例えば、立体構造エピトープの一次アミノ酸配列は、エピトープを規定する抗体によって必ずしも認識されない）。立体構造エピトープは、直鎖状エピトープと比較してより多くの数のアミノ酸を含有し得る。立体構造エピトープを認識する抗体または抗原結合分子は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子がフォールディングして三次元構造を形成する時に、立体構造エピトープを形成するアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖が整列し、エピトープが抗体によって認識可能になる。エピトープの立体構造を決定するための方法には、例えば、X線結晶学、二次元核磁気共鳴分光法、部位特異的スピン標識、および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、それらに限定されない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.)参照。
【０１７４】
試験抗原結合分子によるがん特異的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法の例を、以下に示す。以下の実施例に従って、別の結合ドメインによる標的抗原中のエピトープの結合を評価するための方法もまた、適宜実施することができる。
【０１７５】
例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、抗原分子中の直鎖状エピトープを認識するかどうかは、例えば、以下に述べるように確認することができる。例えば、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドを、上記の目的で合成する。ペプチドは、化学合成することができ、または、細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードするがん特異的抗原のcDNA中の領域を用いて、遺伝子操作技術によって取得することができる。次いで、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子を、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を含む直鎖状ペプチドに対するその結合活性について評価する。例えば、固定化された直鎖状ペプチドを抗原として用いて、ELISAにより、ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性を評価することができる。あるいは、直鎖状ペプチドに対する結合活性を、該直鎖状ペプチドががん特異的抗原発現細胞に対する抗原結合分子の結合を阻害するレベルに基づいて、評価することができる。直鎖状ペプチドに対する抗原結合分子の結合活性は、これらの試験によって実証することができる。
【０１７６】
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含有する試験抗原分子が、立体構造エピトープを認識するかどうかは、以下のように確認することができる。例えば、がん特異的抗原に対する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、接触時にがん特異的抗原発現細胞に強く結合するが、がん特異的抗原の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む固定化された直鎖状ペプチドには実質的に結合しない。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、抗原として抗原発現細胞を用いたELISAまたは蛍光活性化細胞選別（FACS）の抗原発現細胞に対する結合活性と比較して、結合活性が80％以下、概して50％以下、好ましくは30％以下、および特に好ましくは15％以下であることを意味する。
【０１７７】
ELISA形式において、抗原発現細胞に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性を、酵素反応によって生じたシグナルのレベルを比較することによって、定量的に評価することができる。具体的には、抗原発現細胞が固定化されたELISAプレートに、試験抗原結合分子を添加する。次いで、細胞に結合した試験抗原結合分子を、試験抗原結合分子を認識する酵素標識された抗体を用いて検出する。あるいは、FACSを用いる場合は、試験抗原結合分子の希釈系列を調製し、抗原発現細胞に対する抗原結合力価を決定して、抗原発現細胞に対する試験抗原結合分子の結合活性を比較することができる。
【０１７８】
緩衝液などに懸濁した細胞の表面上に発現している抗原に対する試験抗原結合分子の結合は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。公知のフローサイトメーターには、例えば、以下のデバイスが含まれる：
FACSCanto（商標）II
FACSAria（商標）
FACSArray（商標）
FACSVantage（商標） SE
FACSCalibur（商標）（すべてBD Biosciencesの商品名である）
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC（すべてBeckman Coulterの商品名である）。
【０１７９】
上述の抗原に対する抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合活性をアッセイするための適している方法には、例えば、以下の方法が含まれる。最初に、抗原発現細胞を、試験抗原結合分子と反応させ、次いで、これを、FITC標識された二次抗体で染色し、FACSCalibur（BD）を用いる。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって得られた蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した抗体の量を反映する。すなわち、結合した試験抗原結合分子の量によって表される試験抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
【０１８０】
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が、別の抗原結合分子と共通のエピトープを共有するかどうかは、同じエピトープに対する2つの分子間の競合に基づいて評価することができる。抗原結合分子間の競合は、クロスブロッキングアッセイなどによって検出することができる。例えば、競合ELISAアッセイは、好ましいクロスブロッキングアッセイである。
【０１８１】
具体的には、クロスブロッキングアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングしている抗原を、候補競合抗原結合分子の存在下または非存在下でプレインキュベートし、次いで、試験抗原結合分子をそれに添加する。ウェル中の抗原に結合した試験抗原結合分子の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合抗原結合分子の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する競合抗原結合分子の親和性が高ければ高いほど、抗原でコーティングされたウェルに対する試験抗原結合分子の結合活性は低い。
【０１８２】
抗原を介してウェルに結合した試験抗原結合分子の量は、抗原結合分子を予め標識することによって、容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識された抗原結合分子は、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を用いて測定することができる。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を用いるクロスブロッキングアッセイは、「競合ELISAアッセイ」と呼ばれる。抗原結合分子はまた、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識することもできる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
候補競合抗原結合分子が、競合抗原結合分子の非存在下で実施される対照実験における結合活性と比較して少なくとも20％、好ましくは少なくとも20〜50％、およびより好ましくは少なくとも50％、抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子の結合をブロックすることができる場合、試験抗原結合分子は、競合抗原結合分子が結合する同じエピトープに実質的に結合するか、または同じエピトープへの結合について競合すると判定される。
【０１８３】
本発明の抗原結合ドメインを含む試験抗原結合分子が結合するエピトープの構造が、既に同定されている場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、エピトープを形成するペプチド中へのアミノ酸変異の導入によって調製されるペプチドに対する2つの抗原結合分子の結合活性を比較することによって、評価することができる。
【０１８４】
そのような結合活性を測定するための方法として、例えば、変異が導入されている直鎖状ペプチドに対する試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性は、上記のELISA形式での比較によって測定される。ELISA法の他にも、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子をカラムに通過させること、および次いで、溶出液中の溶出された抗原結合分子を定量することによって、カラムに結合した変異体ペプチドに対する結合活性を決定することができる。例えば、GST融合ペプチドの形態で、変異体ペプチドをカラムに吸着させるための方法が、公知である。
【０１８５】
あるいは、同定されたエピトープが立体構造エピトープである場合、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子が共通のエピトープを共有するかどうかは、以下の方法によって評価することができる。最初に、抗原結合ドメインが標的とする抗原を発現する細胞、および変異が導入されたエピトープを有する抗原を発現する細胞を調製する。これらの細胞をPBSなどの適切な緩衝液に懸濁することによって調製される細胞懸濁液に、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を添加する。次いで、細胞懸濁液を緩衝液で適宜洗浄し、試験抗原結合分子および対照抗原結合分子を認識することができるFITC標識された抗体をそれに添加する。標識された抗体で染色された細胞の蛍光強度および数を、FACSCalibur（BD）を用いて決定する。試験抗原結合分子および対照抗原結合分子は、適している緩衝液を用いて適宜希釈し、所望の濃度で用いる。例えば、それらを、10μg/ml〜10 ng/mlの範囲内の濃度で用いてもよい。CELL QUEST Software（BD）を用いた解析によって決定された蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した標識された抗体の量を反映する。すなわち、結合した標識された抗体の量によって表される試験抗原結合分子および対照抗原結合分子の結合活性を、幾何平均値の決定によって測定することができる。
【０１８６】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、配列番号：１６０に記載される重鎖可変領域配列および／または配列番号：１６１に記載される軽鎖可変領域配列からなる鋳型配列中に1個または複数個のアミノ酸の改変を導入することによって生じたアミノ酸配列を含み、改変される1個または複数個のアミノ酸は、以下の位置：
H鎖：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、および100g（Kabatナンバリング）；ならびに
L鎖：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、および96（Kabatナンバリング）
から選択され、
改変された重鎖可変領域配列のHVR-H3は、
アミノ酸98位のAla、Pro、Ser、Arg、His、またはThr；
アミノ酸99位のAla、Ser、Thr、Gln、His、またはLeu；
アミノ酸100位のTyr、Ala、Ser、Pro、またはPhe；
アミノ酸100a位のTyr、Val、Ser、Leu、またはGly；
アミノ酸100b位のAsp、Ser、Thr、Leu、Gly、またはTyr；
アミノ酸100c位のVal、Leu、Phe、Gly、His、またはAla；
アミノ酸100d位のLeu、Phe、Ile、またはTyr；
アミノ酸100e位のGly、Pro、Tyr、Gln、Ser、またはPhe；
アミノ酸100f位のTyr、Ala、Gly、Ser、またはLys；
アミノ酸100g位（Kabatナンバリング）のGly、Tyr、Phe、またはVal
から選択される少なくとも1個のアミノ酸を含む。
【０１８７】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、（a）配列番号：１１５、１０４、１１９、もしくは１１４のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域；（b）配列番号：１２４〜１３０のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域；または（c）（a）のアミノ酸配列を含むVH領域および（b）のアミノ酸配列を含むVL領域を含む。
【０１８８】
本発明の抗原結合分子は、当業者に一般に知られている方法によって作製することができる。例えば、本発明の抗原結合分子を、以下に示す抗体調製方法に従ってまたはそれを参照して調製することができるが、本発明の抗原結合分子を調製するための方法は、それに限定されない。ポリペプチドをコードする単離された遺伝子の適切な宿主中への移入による抗体調製のために、宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが、当技術分野において公知である。これらの発現系のすべてを、本発明の抗原結合分子の単離に適用することができる。宿主細胞として真核細胞を用いる場合には、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞を、適宜用いることができる。具体的には、動物細胞の例には、以下の細胞が含まれ得る：
（１）哺乳類細胞、例えばCHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、COS（サル腎臓細胞株）、骨髄腫細胞（Sp2/O、NS0など）、BHK（ベビーハムスター腎臓細胞株）、HEK293（剪断されたアデノウイルス(Ad)5 DNAを伴うヒト胎児腎臓細胞株）、PER.C6細胞（アデノウイルス5型(Ad5) E1AおよびE1B遺伝子で形質転換されたヒト胎児網膜細胞株）、Hela、およびVero（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)）；
（２）両生類細胞、例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；ならびに
（３）昆虫細胞、例えばsf9、sf21、およびTn5。
本発明の抗原結合分子はまた、大腸菌（mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225）または酵母（WO2000023579）を用いて調製することもできる。大腸菌を用いて調製された抗体および抗原結合分子は、糖鎖が付加されていない。他方、酵母を用いて調製された抗体および抗原結合分子は、糖鎖が付加されている。
【０１８９】
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードする、抗体重鎖をコードするDNA、および抗体の軽鎖をコードするDNAを発現させる。可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖または軽鎖をコードするDNAは、例えば、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメインをコードするDNAを取得すること、および、該ドメイン中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の異なるアミノ酸をコードするように、適宜置換を導入することによって、取得することができる。
【０１９０】
あるいは、ある特定の抗原に対して当技術分野において公知の方法によって調製された抗体可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換されたタンパク質をコードするDNAを、予め設計し、化学合成して、可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAを取得してもよい。アミノ酸置換部位および置換の種類は、特に限定されない。アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、89〜97位が好ましい。H鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変ドメイン中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
アミノ酸改変は、置換に限定されず、欠失、付加、挿入、もしくは修飾、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１９１】
可変ドメイン中の1個または複数個のアミノ酸残基が目的の異なるアミノ酸によって置換された重鎖をコードするDNAはまた、別々の部分DNAとして作製することができる。部分DNAの組み合わせの例には、可変ドメインをコードするDNAと定常ドメインをコードするDNA；およびFabドメインをコードするDNAとFcドメインをコードするDNAが含まれるが、それらに限定されない。同様に、軽鎖をコードするDNAもまた、別々の部分DNAとして作製することができる。
【０１９２】
これらのDNAは、以下の方法によって発現させることができる：例えば、重鎖可変領域をコードするDNAを、重鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、重鎖発現ベクターを構築する。同様に、軽鎖可変領域をコードするDNAを、軽鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込んで、軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖および軽鎖の遺伝子を、単一のベクターに組み込んでもよい。
【０１９３】
目的の抗体をコードするDNAは、発現制御領域、例えば、エンハンサーおよびプロモーターの制御下で発現するように、発現ベクターに組み込む。次に、結果として生じた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。この場合には、適切な宿主と発現ベクターを、組み合わせて用いることができる。
【０１９４】
ベクターの例には、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、およびpCR-Scriptが含まれる。これらのベクターに加えて、例えば、pGEM-T、pDIRECT、またはpT7も、cDNAのサブクローニングおよび切り出しの目的で用いることができる。
【０１９５】
特に、本発明の抗体を作製する目的でベクターを用いるためには、発現ベクターが有用である。例えば、宿主がJM109、DH5α、HB101、またはXL1-Blueなどの大腸菌である場合は、発現ベクターは、大腸菌における効率的な発現を可能にするプロモーター、例えば、lacZプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWard et al., Nature (1989) 341, 544-546；およびFASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBetter et al., Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターを有することが不可欠である。そのようなベクターの例には、上述のベクター、ならびにpGEX-5X-1（Pharmacia製）、「QIAexpress system」（Qiagen N.V.製）、pEGFP、およびpET（この場合、宿主は好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21である）が含まれる。
【０１９６】
ベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列を含有してもよい。大腸菌のペリプラズムにおける産生の場合には、pelBシグナル配列（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4397）を、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列として用いることができる。ベクターは、例えば、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法、またはDEAE-デキストラン法の使用によって、宿主細胞に移入することができる。
【０１９７】
大腸菌用の発現ベクターに加えて、本発明の抗原結合分子を作製するためのベクターの例には、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen Corp.製）、pEGF-BOS (参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、およびpCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL製）、およびpBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1およびpMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、およびpAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen Corp.製）、pNV11、およびSP-Q01）、ならびに枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608およびpKTH50）が含まれる。
【０１９８】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、またはHEK293細胞などの動物細胞における発現を目的として、ベクターは、細胞内発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMulligan et al., Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CAGプロモーター（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGene. (1991) 108, 193）、またはCMVプロモーターを有することが不可欠であり、より好ましくは、形質転換された細胞をスクリーニングするための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）によりマーカーとして働くことができる薬剤耐性遺伝子）を有する。このような性質を有するベクターの例には、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。加えて、遺伝子コピー数を増加させる目的で、EBNA1タンパク質を共発現させてもよい。この場合、複製起点OriPを有するベクターを用いる（Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203；およびBiotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7）。
【０１９９】
遺伝子を安定的に発現させ、かつ細胞内の遺伝子コピー数を増加させるように意図される例示的な方法には、核酸合成経路が欠損したCHO細胞を、それを相補するものとして働くDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOI）で形質転換すること、および遺伝子増幅においてメトトレキセート（MTX）を用いることが含まれる。遺伝子を一過性に発現させるように意図される例示的な方法には、SV40 T抗原遺伝子をその染色体上に有するCOS細胞を用いて、SV40の複製起点を有するベクター（pcDなど）で細胞を形質転換することが含まれる。ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）などに由来する複製起点もまた、用いることができる。宿主細胞系において遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、またはジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子などの選択マーカーを含有することができる。
【０２００】
本発明の抗原結合分子は、例えば、形質転換された細胞を培養すること、次いで、分子形質転換された細胞内からまたはその培養液から抗体を分離することによって、回収することができる。本発明の抗原結合分子は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、C1q、FcRn、プロテインAおよびプロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ならびにゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いることによって、分離し、精製することができる。
【０２０１】
ノブ-イントゥ-ホールテクノロジー（WO1996/027011；Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；およびMerchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681）または電荷反発の導入によってH鎖間の意図されない会合を抑制する技術（WO2006/106905）などの上述の技術を、多重特異性抗原結合分子を効率的に調製するための方法に適用することができる。
【０２０２】
本発明者らはまた、2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをより効率的に取得する方法を開発することにも成功した。
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
上記の方法において、抗原結合ドメインを抗原と接触させる工程の数は、特に限定されない。いくつかの態様において、本発明のスクリーニングの方法は、目的の抗原の数が2つ以上である場合、3つ以上の接触させる工程を含んでもよい。さらなる態様において、本発明のスクリーニングの方法は、抗原結合ドメインを目的の抗原の1つまたは複数の各々と接触させる、2つ以上の工程を含んでもよい。この場合、抗原結合ドメインを、任意の順序で各抗原と接触させることができる。例えば、抗原結合ドメインを、各抗原と連続的に2回以上接触させてもよく、または、最初に1つの抗原と1回以上接触させ、次いで、同じ抗原と再び接触させる前に他の抗原と接触させてもよい。本発明のスクリーニングの方法が、抗原結合ドメインを抗原と接触させる、3つ以上の工程を含む場合でも、該方法は、任意の連続的な2つの接触させる工程の間に、収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
【０２０３】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインをスキャフォールドと融合させて、抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋することによって形成される、融合ポリペプチドである。
【０２０４】
いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、バクテリオファージである。いくつかの態様において、本発明のスキャフォールドは、リボソーム、RepAタンパク質、またはDNAピューロマイシンリンカーである。
【０２０５】
いくつかの態様において、溶出は、上記の工程（b）および（c）において、酸溶液、塩基溶液、DTT、またはIdeSである溶出溶液を用いて行われる。
いくつかの態様において、本発明の上記の工程（b）および（c）において用いられる溶出溶液は、EDTAまたはIdeSである。
【０２０６】
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインをスクリーニングする方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（b）’工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を翻訳する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
【０２０７】
いくつかの態様において、本発明の目的の少なくとも2つ以上の異なる抗原に結合する抗原結合ドメインを作製するための方法は、
（a）複数の抗原結合ドメインを含むライブラリーを提供する工程、
（b）工程（a）において提供されたライブラリーを、目的の第１の抗原と接触させ、第１の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、
（c）工程（b）において収集された抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原と接触させ、第２の抗原に結合した抗原結合ドメインを収集する工程、および
（d）工程（c）において収集された抗原結合ドメインをコードする遺伝子を増幅し、候補抗原結合ドメインを同定する工程、
（e）工程（d）において選択された候補抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、Fc領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結する工程、
（f）上記の工程（d）において取得されたポリヌクレオチドが機能的に連結されているベクターが導入された細胞を培養する工程、ならびに
（g）上記の工程（f）において培養された細胞の培養液から、抗原結合分子を収集する工程
を含み、該方法は、工程（b）と工程（c）の間に、工程（b）において収集された抗原結合ドメインをコードする核酸を増幅する工程を含まない。
【０２０８】
1つの態様において、抗原結合ドメインのライブラリー中の抗原結合ドメインの各々は、第１の抗原（例えば、CD3またはCD137）または第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；または第１の抗原がCD137である場合にはCD3）に各々結合する重鎖および軽鎖可変領域の一方または両方のいずれかにおいて少なくとも1個のアミノ酸改変を有し、ここで、ライブラリー中の各抗原結合ドメインは、そのように互いに変更されている少なくとも1個のアミノ酸において、その他のものとは異なる。
【０２０９】
本発明において、1つのアミノ酸改変が単独で用いられてもよく、または複数のアミノ酸改変が組み合わせて用いられてもよい。複数のアミノ酸改変を組み合わせて用いる場合、組み合わされる改変の数は、特に限定されず、例えば、2個以上30個以下、好ましくは 2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、または2個以上3個以下である。
組み合わされる複数のアミノ酸改変は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのみに加えられてもよく、または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方に適宜分配されてもよい。
【０２１０】
上記に既に記載しているように、アミノ酸改変にとって好ましい領域の例には、可変領域中の溶媒に露出している領域およびループが含まれる。その中でも、CDR1、CDR2、CDR3、FR3、およびループが好ましい。具体的には、H鎖可変領域中のKabatナンバリング31〜35位、50〜65位、71〜74位、および95〜102位、ならびにL鎖可変領域中のKabatナンバリング24〜34位、50〜56位、および89〜97位が好ましい。H鎖可変領域中のKabatナンバリング31位、52a〜61位、71〜74位、および97〜101位、ならびにL鎖可変領域中のKabatナンバリング24〜34位、51〜56位、および89〜96位がより好ましい。
【０２１１】
アミノ酸残基の改変にはまた、第１の抗原（例えば、CD3もしくはCD137）または第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；もしくは第１の抗原がCD137である場合にはCD3）に結合する抗体可変領域中の上述の領域におけるアミノ酸のランダム改変；および、第１の抗原（例えば、CD3もしくはCD137）または第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；もしくは第１の抗原がCD137である場合にはCD3）に対する結合活性を有することが以前に知られているペプチドの上述の領域への挿入も含まれる。本発明の抗原結合分子は、第１の抗原（例えば、CD3またはCD137）および第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；または第１の抗原がCD137である場合にはCD3）に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することはできない可変領域を、このように改変された抗原結合分子の中から選択することによって、取得することができる。
【０２１２】
可変領域が、第１の抗原（例えば、CD3またはCD137）および第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；または第１の抗原がCD137である場合にはCD3）に結合することができるが、これらの抗原に同時には結合することができないかどうか、ならびにさらに、可変領域が、第１の抗原（例えば、CD3またはCD137）および第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；または第１の抗原がCD137である場合にはCD3）のいずれか一方が細胞上に存在し、他方の抗原が単独で存在するか、抗原の両方が各々単独で存在するか、または抗原の両方が同じ細胞上に存在する場合には、第１の抗原（例えば、CD3またはCD137）および第２の抗原（例えば、第１の抗原がCD3である場合にはCD137；または第１の抗原がCD137である場合にはCD3）の両方に同時に結合することができるが、各々が異なる細胞上で発現しているこれらの抗原に同時には結合することができないかどうかもまた、上述の方法に従って確認することができる。
【０２１３】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、および CH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iii）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iv）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２１４】
いくつかの態様において、そのように製造された抗原結合分子は、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入される：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
いくつかの態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結する上記結合は、例えば、上記（i）から（vi）のポリペプチドの各々に少なくとも1つのアミノ酸改変（例えば、システインまたはリジンへの置換）を導入することによって作出することができる。
【０２１５】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、および CH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iv）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（v）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２１６】
いくつかの態様において、そのように作製された抗原結合分子は、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入される：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
いくつかの態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結する上記結合は、例えば、上記（i）から（vi）のポリペプチドの各々に少なくとも1つのアミノ酸改変（例えば、システインまたはリジンへの置換）を導入することによって作出することができる。
【０２１７】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、および CH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iv）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（v）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２１８】
いくつかの態様において、そのように製造された抗原結合分子は、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入される：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
いくつかの態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結する上記結合は、例えば、上記（i）から（vi）のポリペプチドの各々に少なくとも1つのアミノ酸改変（例えば、システインまたはリジンへの置換）を導入することによって作出することができる。
【０２１９】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、および CH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２２０】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、および CH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２２１】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iv）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（v）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２２２】
いくつかの態様において、そのように製造された抗原結合分子は、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入される：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と、第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と、第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
いくつかの態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結する上記結合は、例えば、上記（i）から（vi）のポリペプチドの各々に少なくとも1つのアミノ酸改変（例えば、システインまたはリジンへの置換）を導入することによって作出することができる。
【０２２３】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iv）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（v）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；ならびに
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２２４】
いくつかの態様において、そのように作製された抗原結合分子は、少なくとも1つの結合を介して互いに連結される、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結するための少なくとも1つの結合は、以下のいずれか1つまたは複数に導入される：
（i）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；
（ii）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域と第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖のヒンジ領域との間；
（iii）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（iv）第１の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域と第２の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域との間；
（v）第１の抗原結合ドメインの軽鎖定常（CL）領域と第２の抗原結合ドメインの抗体重鎖定常のCH1領域との間；および/または
（vi）第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域と第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域との間。
いくつかの態様において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを連結する上記結合は、例えば、上記（i）から（vi）のポリペプチドの各々に少なくとも1つのアミノ酸改変（例えば、システインまたはリジンへの置換）を導入することによって作出することができる。
【０２２５】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第１の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
【０２２６】
1つの局面において、本出願はまた、本発明の抗原結合分子を作製するための方法も提供する。方法は、例えば、以下：
（a）少なくとも：
（i）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域、および任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ；CH1、ヒンジ、およびCH2；CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；
（ii）任意で重鎖定常領域（例えば、CH1；CH1およびヒンジ）をさらに含んでもよい、第３の抗原結合ドメインの重鎖可変（VH）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸；および
（iii）任意で軽鎖定常（CL）領域をさらに含んでもよい、第２の抗原結合ドメインの軽鎖可変（VL）領域を含む、ポリペプチドをコードする核酸
を提供する工程；
（b）（a）で作製した核酸を宿主細胞に導入する工程；
（c）2つのポリペプチドが発現されるように、宿主細胞を培養する工程；
（d）工程（c）で培養された細胞の培養液から抗原結合分子を収集する工程
を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、上記に記載される方法によって調製された抗原結合分子である。
1つの局面において、本発明のスクリーニングの方法は、少なくとも2つ以上の異なる目的抗原に結合する抗原結合ドメインを、より効率的に獲得することを可能にする。
【０２２７】
本出願において、「ライブラリー」とは、複数の抗原結合分子、複数の抗原結合ドメイン、抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプチド、抗原結合ドメインを含む複数の融合ポリペプチド、またはこれらをコードする複数の核酸もしくはポリヌクレオチドを指す。ライブラリー中に含まれる、複数の抗原結合分子、複数の抗原結合ドメイン、または抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプチド、または抗原結合ドメインを含む複数の融合ポリペプチドは、配列が互いに異なり、単一の配列を有さない、抗原結合分子、抗原結合ドメイン、または融合ポリペプチドである。いくつかの態様において、本発明のライブラリーは、デザインライブラリーである。さらなる態様において、デザインライブラリーは、WO2016/076345に開示されるようなデザインライブラリーである。
【０２２８】
本発明の1つの態様において、本発明の抗原結合分子または抗原結合ドメインと異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを調製することができる。1つの態様において、融合ポリペプチドは、例えば、ウイルスコートタンパク質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、およびpVI、ならびにそのバリアントからなる群より選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合した、本発明の抗原結合分子または抗原結合ドメインを含むことができる。
【０２２９】
1つの態様において、本発明は、これらの抗原結合分子または抗原結合ドメインのいずれかおよび異種ポリペプチドを各々含む、配列が互いに異なる複数の融合ポリペプチドから本質的になるライブラリーを提供する。具体的には、本発明は、例えば、ウイルスコートタンパク質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、およびpVI、ならびにそのバリアントからなる群より選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合した、これらの抗原結合分子または抗原結合ドメインのいずれかを各々含む、配列が互いに異なる複数の融合ポリペプチドから本質的になるライブラリーを提供する。本発明の抗原結合分子または抗原結合ドメインは、二量体化ドメインをさらに含み得る。1つの態様において、二量体化ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領領域とウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との間に位置することができる。この二量体化ドメインには、少なくとも1つの二量体化配列、および／または1個または複数個のシステイン残基を含む配列が含まれ得る。この二量体化ドメインは、好ましくは、重鎖可変領域または定常領域のC末端に連結することができる。二量体化ドメインは、抗体可変領域がウイルスコートタンパク質成分との融合ポリペプチド成分として調製される（二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンが存在しない）かどうかに応じて、または、抗体可変領域が主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに調製される（例えば、二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンが存在する）かどうかに応じて、様々な構造をとることができる。抗体可変領域が、主にウイルスコートタンパク質成分との融合ポリペプチドとして調製される場合は、1つまたは複数のジスルフィド結合および／または単一の二量体化配列によって二価提示がもたらされる。
【０２３０】
本明細書に記載されるような配列が互いに異なる複数の抗原結合分子または抗原結合ドメインにおける、「配列が互いに異なる」という用語は、ライブラリー中の個々の抗原結合分子または抗原結合ドメインが、別個の配列を有することを意味する。具体的には、ライブラリー中の別個の配列の数は、ライブラリー中の配列が異なる独立クローンの数を反映し、「ライブラリーサイズ」と言ってもよい。通常のファージディスプレイライブラリーのライブラリーサイズは、106〜1012であり、リボソームディスプレイ法などの当技術分野においての公知の技術の適用によって、1014まで拡大することができる。しかし、ファージライブラリーのパニング選択において使用されるファージ粒子の実際の数は、通常、ライブラリーサイズよりも10〜10,000倍大きい。この過剰倍数は、「ライブラリー当量数」とも呼ばれ、10〜10,000の個々のクローンが、同じアミノ酸配列を有し得ることを表す。したがって、本発明において記載される「配列が互いに異なる」という用語は、ライブラリー当量数を除外したライブラリー中の個々の抗原結合分子が、別個の配列を有することを意味し、より具体的には、ライブラリーが、106〜1014、好ましくは107〜1012、より好ましくは108〜1011、特に好ましくは108〜1010の、配列が互いに異なる抗原結合分子または抗原結合ドメインを有することを意味する。
【０２３１】
本明細書に記載されるような「ファージディスプレイ」とは、ファージ、例えば、繊維状ファージの粒子表面上に、バリアントポリペプチドをコートタンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質として提示する手法を指す。ランダム化されたタンパク質バリアントの大きなライブラリーを、標的抗原に高親和性で結合する配列について迅速にかつ効率的にスクリーニングすることができるため、ファージディスプレイは有用である。ファージ上でのペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを、特異的結合特性を有するものについてスクリーニングするために用いられてきた。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために用いられている（Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. (1992) 3, 355-362；およびその中で引用されている参照文献）。一価ファージディスプレイは、各ファージ粒子が融合タンパク質の1個または0個のコピーを提示するように、タンパク質またはペプチドのライブラリーを遺伝子IIIまたはその一部に融合させること、および融合タンパク質を、野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で低レベルで発現させることを含む。一価ファージは、多価ファージよりも低いアビディティー効果を有し、そのため、ファージミドベクターを用いて内在性のリガンド親和性に基づいてスクリーニングされ、これは、DNA操作を単純化する（Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216）。
【０２３２】
「ファージミド」とは、細菌の複製起点、例えばColE1、およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターを指す。当技術分野において公知の任意のバクテリオファージ、例えば、繊維状バクテリオファージまたはλ型（lambdoid）バクテリオファージに由来するファージミドを、適宜用いることができる。通常、プラスミドはまた、抗生物質耐性についての選択マーカーも含有する。これらのベクターにクローニングされたDNA断片は、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを保有する細胞が、ファージ粒子の産生に必要なすべての遺伝子を所有している時、プラスミドの複製パターンは、ローリングサークル複製にシフトして、1本のプラスミドDNA鎖のコピーおよびパッケージファージ粒子を形成する。ファージミドは、感染性または非感染性のファージ粒子を形成することができる。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるように、遺伝子融合によって異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子またはその断片を含む、ファージミドが含まれる。
【０２３３】
「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含み、かつ複製することができる、二本鎖複製型バクテリオファージを意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、繊維状バクテリオファージ、例えば、M13、f1、fd、もしくはPf3ファージまたはその誘導体、またはλ型ファージ、例えば、λ、21、phi80、phi81、82、424、434、もしくは任意の他のファージまたはその誘導体である。
【０２３４】
「コートタンパク質」という用語は、少なくともその一部がウイルス粒子の表面上に存在する、タンパク質を指す。機能上の観点からは、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルスの構築過程でウイルス粒子に結合し、他の宿主細胞のウイルス感染までそれと結合したままである、任意のタンパク質である。コートタンパク質は、より大きいコートタンパク質であってもよく、またはより小さいコートタンパク質であってもよい。より小さいコートタンパク質は、通常、好ましくは、1ビリオンあたり少なくともおよそ5個、より好ましくは少なくともおよそ7個、さらに好ましくは少なくともおよそ10個またはそれよりも多いタンパク質コピーで、ウイルスキャプシドに存在するコートタンパク質である。より大きいコートタンパク質は、1ビリオンあたり数十、数百、または数千のコピーで存在し得る。より大きいコートタンパク質の例には、繊維状ファージp8タンパク質が含まれる。
【０２３５】
本明細書に記載されるような「リボソームディスプレイ」とは、それによってバリアントポリペプチドをリボソーム上に提示する手法を指す（Nat. Methods 2007 Mar;4(3):269-79、Nat. Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92、Methods Mol. Biol. 2004;248:177-89）。好ましくは、リボソームディスプレイ法は、バリアントポリペプチドをコードする核酸が、大腸菌secMのような適切なリボソーム失速配列を有する（J. Mol. Biol. 2007 Sep14;372(2):513-24）か、または終止コドンを有さないことを必要とする。好ましくは、バリアントポリペプチドをコードする核酸はまた、スペーサー配列も有する。本明細書において用いられる場合、「スペーサー配列」という用語は、バリアントポリペプチドに融合して、バリアントポリペプチドが翻訳後にリボソームトンネルを通過するようにさせる、かつバリアントポリペプチドがその機能を発現することを可能にするペプチドをコードする、一連の核酸を意味する。インビトロ翻訳システムのいずれか、例えば、大腸菌S30システム、PUREsystem、ウサギ網状赤血球ライセートシステム、または小麦胚芽無細胞翻訳システムを、リボソームディスプレイに用いることができる。
【０２３６】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、当技術分野において公知の方法（例えば、EP266032に記載されている手法などの固相手法を用いたホスホトリエステル、ホスファイト、もしくはホスホラミダイト化学；またはFroeshler et al., Nucl. Acids. Res. (1986) 14, 5399-5407に記載されているデオキシヌクレオチドH-ホスホナート中間体を介した方法）によって化学合成される、短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、下記のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、ならびに固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. (1989) 28, 716-734に記載されている。遺伝子の全核酸配列が公知である場合、またはコード鎖に対して相補的な核酸配列が利用可能である場合は、これらの方法が用いられる。あるいは、標的アミノ酸配列が公知である場合は、各アミノ酸残基をコードする公知のかつ好ましい残基を用いて、可能な核酸配列が適宜推測され得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムを用いて、または沈殿法によって精製することができる。
【０２３７】
「核酸の増幅」という用語は、核酸のモル数を増加させる実験手順を指す。非限定的な態様として、核酸には、一本鎖RNA（ssRNA）、二本鎖DNA（dsDNA）、または一本鎖DNA（ssDNA）が含まれる。非限定的な態様として、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法が、核酸を増幅する方法として一般的に用いられるが、核酸を増幅できる任意の方法を用いることができる。あるいは、核酸ベクターを宿主細胞中に導入すると、核酸を宿主細胞において増幅させることができる。非限定的な態様として、エレクトロポレーション、ヒートショック、ベクターを有するファージもしくはウイルスの感染、または化学試薬を、核酸を細胞中に導入するために用いることができる。あるいは、DNAの転写、またはmRNAの逆転写およびその後のその転写もまた、核酸を増幅することができる。非限定的な態様として、ファージミドベクターの大腸菌中への導入が、結合ドメインをコードする核酸を増幅するために一般的に用いられるが、PCRもまた、ファージディスプレイ技術において用いることができる。リボソームディスプレイ、cDNAディスプレイ、mRNAディスプレイ、およびCISディスプレイにおいては、PCR法または転写が、核酸を増幅するために一般的に用いられる。
【０２３８】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」という用語は、互いに連結された2つのセグメントを有するポリペプチドを指す。ポリペプチド中のこれらのセグメントは、特性が異なる。この特性は、例えば、インビトロまたはインビボの活性などの生物学的性質であり得る。あるいは、この特性は、単一の化学的または物理的性質、例えば、標的抗原に対する結合または反応の触媒作用であり得る。これらの2つのセグメントは、単一のペプチド結合を通して直接、または1個または複数個のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介してのいずれかで連結されてもよい。通常、これらの2つのセグメントおよびリンカーは、同じリーディングフレームに位置する。好ましくは、ポリペプチドの2つのセグメントは、異種のまたは異なるポリペプチドから得られる。
【０２３９】
「抗原結合ドメインをスキャフォールドと融合させることによって形成される融合ポリペプチド」における「スキャフォールド」という用語は、抗原結合ドメインと該抗原結合ドメインをコードする核酸とを架橋する分子を指す。非限定的な態様として、ファージディスプレイにおけるファージコートタンパク質、リボソームディスプレイにおけるリボソーム、mRNAまたはcDNAディスプレイにおけるピューロマイシン、CISディスプレイにおけるRepAタンパク質、ウイルスディスプレイにおけるウイルスコートタンパク質、哺乳動物細胞ディスプレイにおける哺乳動物細胞膜アンカータンパク質、酵母ディスプレイにおける酵母細胞膜アンカータンパク質、細菌ディスプレイまたは大腸菌ディスプレイにおける細菌細胞膜アンカータンパク質などを、各ディスプレイ方法論においてスキャフォールドとして用いることができる。
【０２４０】
本発明において、「1個または複数個のアミノ酸」という用語は、特定の数のアミノ酸に限定されず、2種類以上のアミノ酸、5種類以上のアミノ酸、10種類以上のアミノ酸、15種類以上のアミノ酸、または20種類のアミノ酸であってもよい。
【０２４１】
融合ポリペプチドの提示に関して、抗原結合分子または抗原結合ドメインの可変領域の融合ポリペプチドを、細胞、ウイルス、リボソーム、DNA、RNA、またはファージミド粒子の表面上に様々な形態で提示することができる。これらの形態には、一本鎖Fv断片（scFv）、F(ab)断片、およびこれらの断片の多価形態が含まれる。多価形態は、好ましくは、ScFv、Fab、およびF(ab')の二量体であり、これらを、本明細書においてそれぞれ、(ScFv)2、F(ab)2、およびF(ab')2と言う。多価形態の提示が好ましく、それは、恐らく1つには、提示される多価形態が、通常、低親和性クローンの同定を可能にし、かつ／または、選択の過程において稀なクローンのより効率的な選択を可能にする複数の抗原結合部位を有するためである。
【０２４２】
抗体断片を含む融合ポリペプチドをバクテリオファージの表面上に提示するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、WO1992001047および本明細書に記載されている。他の関連した方法が、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、および1993019172に記載されている。当業者は、これらの方法を適宜用いることができる。他の公開文献（H.R.Hoogenboom & G.Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388、WO1993006213、およびWO1993011236）は、ファージの表面上に提示された様々な抗原に対する人工的に再配置された可変領域遺伝子レパートリーを用いた、抗体の同定を開示している。
【０２４３】
scFvの形態での提示のためにベクターを構築する場合、このベクターは、抗原結合分子または抗原結合ドメインの軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む。概して、抗原結合分子または抗原結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成分をコードする核酸配列と融合している。抗原結合分子または抗原結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を通して抗原結合分子または抗原結合ドメインの重鎖可変領域の核酸に連結される。ペプチドリンカーは、概して、およそ5〜15個のアミノ酸を含有する。任意で、例えば、精製または検出に有用なタグをコードする追加的な配列が、抗原結合分子または抗原結合ドメインの軽鎖可変領域をコードする核酸配列もしくは抗原結合分子または抗原結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列、またはその両方の3'末端と融合していてもよい。
【０２４４】
F(ab)の形態での提示のためにベクターを構築する場合、このベクターは、抗原結合分子または抗原結合ドメインの可変領域および抗原結合分子の定常領域をコードする核酸配列を含む。軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、軽鎖定常領域をコードする核酸配列と融合している。抗原結合分子または抗原結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列は、重鎖定常CH1領域をコードする核酸配列と融合している。概して、重鎖可変領域および定常領域をコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列と融合している。重鎖可変領域および定常領域は、好ましくは、ウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合産物として発現させ、一方、軽鎖可変領域および定常領域は、重鎖-ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現させる。重鎖と軽鎖とは、共有結合または非共有結合を通して互いと会合していてもよい。任意で、例えば、精製または検出に有用なポリペプチドタグをコードする追加的な配列が、抗原結合分子または抗原結合ドメインの軽鎖定常領域をコードする核酸配列もしくは抗原結合分子または抗原結合ドメインの重鎖定常領域をコードする核酸配列、またはその両方の3'末端と融合していてもよい。
【０２４５】
宿主細胞へのベクター移入に関して、上記のように構築されたベクターを、増幅および／または発現のために宿主細胞に移入する。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、当技術分野において公知の形質転換法によって、宿主細胞に移入することができる。ベクターが、ウイルスなどの感染性粒子である場合、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのインサートを有する複製可能な発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクション、および当技術分野において公知の手法によるファージ粒子の産生によって、融合タンパク質がファージ粒子の表面上に提示される。
【０２４６】
複製可能な発現ベクターは、様々な方法の使用によって、宿主細胞に移入することができる。非限定的な態様において、ベクターは、WO2000106717に記載されているようにエレクトロポレーションによって細胞に移入することができる。細胞を、37℃で、任意でおよそ6〜48時間（または600 nmでのODが0.6〜0.8に達するまで）、標準的な培養培地において培養する。次に、培養培地を遠心分離し、（例えば、デカンテーションによって）培養上清を除去する。精製の初期段階では、細胞ペレットを、好ましくは緩衝液（例えば、1.0 mM HEPES（pH 7.4））中に再懸濁する。次に、懸濁液を再び遠心分離して、上清を除去する。得られた細胞ペレットを、例えば、5〜20％ V/Vに希釈されたグリセリン中に再懸濁する。上清の除去のために、懸濁液を再び遠心分離して、細胞ペレットを得る。細胞ペレットを、水または希釈されたグリセリン中に再懸濁する。結果として生じた懸濁液の測定された細胞密度に基づいて、最終細胞密度を、水または希釈されたグリセリンを用いて所望の密度に調整する。
【０２４７】
好ましいレシピエント細胞の例には、エレクトロポレーションに応答することができる大腸菌株SS320（Sidhu et al., Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363）が含まれる。大腸菌株SS320は、稔性エピソーム（F'プラスミド）またはXL1-BLUEをMC1061細胞中に移入するのに十分な条件下での、MC1061細胞とXL1-BLUE細胞とのカップリングによって調製された。大腸菌株SS320は、寄託番号98795で、ATCC（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia）に寄託されている。この株におけるファージ複製を可能にする任意のF'エピソームを、本発明において用いることができる。適切なエピソームは、ATCCに寄託されている株から取得してもよく、または市販の製品として取得してもよい（TG1、CJ236、CSH18、DHF'、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18など）。
【０２４８】
エレクトロポレーションにおけるより高いDNA濃度（およそ10倍）の使用によって、形質転換頻度が改善し、宿主細胞を形質転換するDNAの量が増加する。高い細胞密度の使用もまた、効率を改善する（およそ10倍）。移入されるDNAの量の増加によって、より大きな多様性、およびより多くの数の配列が異なる独立クローンを有するライブラリーが生じ得る。形質転換された細胞は、通常、抗生物質を含有する培地上での増殖の有無に基づいて選択される。
【０２４９】
本発明は、さらに、本発明の抗原結合分子をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、DNAまたはRNAなどの任意の形態であってもよい。
【０２５０】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。ベクターの種類は、ベクターを受ける宿主細胞に従って、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述のベクターのいずれかを用いることができる。
【０２５１】
本発明は、さらに、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、当業者が適宜選択することができる。例えば、上述の宿主細胞のいずれかを用いることができる。
【０２５２】
本発明はまた、本発明の抗原結合分子と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の抗原結合分子に薬学的に許容し得る担体を添加することによって、当技術分野において公知の方法に従って製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、水または任意の他の薬学的に許容し得る溶液を伴う無菌性溶液または懸濁液の非経口注射の形態で用いることができる。例えば、医薬組成物は、抗原結合分子を、薬理学的に許容し得る担体または媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などとの適切な組み合わせで、一般に認められた製薬実施に要求される単位剤形で混合して、製剤化され得る。担体の具体例には、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセタート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、サッカライド、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、および無機塩が含まれ得る。そのような調製物における活性成分の量は、指示された範囲内の適切な用量が達成され得るように決定される。
【０２５３】
注射用の無菌組成物は、注射用蒸留水などのビヒクルを用いて、従来の製薬実施に従って製剤化することができる。注射用の水溶液の例には、生理食塩水、グルコースならびに他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウム）を含有する等張液が含まれる。これらの溶液は、適切な溶解補助剤、例えば、アルコール（具体的には、エタノール）もしくはポリアルコール（例えば、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート80（商標）もしくはHCO-50と組み合わせて用いられ得る。
【０２５４】
油性溶液の例には、ゴマ油および大豆油が含まれる。これらの溶液は、溶解補助剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いられ得る。溶液は、さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコールおよびフェノール）、ならびに酸化防止剤と混合され得る。このように調製された注射液は、通常、適切なアンプル中に充填される。本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与される。その剤形の具体例には、注射剤、鼻腔内投与剤、経肺投与剤、および経皮投与剤が含まれる。注射の例には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が含まれ、それを通して医薬組成物を全身にまたは局所に投与することができる。
【０２５５】
投与方法は、患者の年齢および症状に応じて適宜選択することができる。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の用量は、例えば、1用量につき体重1kgあたり0.0001〜1000 mgの範囲内で選択することができる。あるいは、用量は、例えば、1患者あたり0.001〜100000 mgの範囲内で選択することができるが、必ずしもこれらの数値に限定されない。用量および投与方法は、患者の体重、年齢、症状などに応じて変動するが、当業者は、用量および方法を適宜選択することができる。
【０２５６】
本発明はまた、本発明の抗原結合分子を投与する工程を含む、がんを処置するための方法、がんの処置における使用のための本発明の抗原結合分子、がんの治療剤の作製における本発明の抗原結合分子の使用、および、本発明の抗原結合分子を使用する工程を含む、がんの治療剤を作製するためのプロセスも提供する。
【０２５７】
本明細書において用いられるアミノ酸の三文字表記および対応する一文字表記は、以下のように定義される：アラニン：AlaおよびA、アルギニン：ArgおよびR、アスパラギン：AsnおよびN、アスパラギン酸：AspおよびD、システイン：CysおよびC、グルタミン：GlnおよびQ、グルタミン酸：GluおよびE、グリシン：GlyおよびG、ヒスチジン：HisおよびH、イソロイシン：IleおよびI、ロイシン：LeuおよびL、リジン：LysおよびK、メチオニン：MetおよびM、フェニルアラニン：PheおよびF、プロリン：ProおよびP、セリン：SerおよびS、スレオニン：ThrおよびT、トリプトファン：TrpおよびW、チロシン：TyrおよびY、ならびにバリン：ValおよびV。
【０２５８】
本明細書に記載される局面の1つまたはその2つ以上の任意の組み合わせもまた、当業者の技術常識に基づいて技術的矛盾が生じない限り、本発明に含まれることを、当業者は理解すべきである。
【０２５９】
本明細書において引用される参照文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２６０】
本発明は、以下の実施例に関連してさらに例示される。しかし、本発明は、以下の実施例によって限定されるようには意図されない。
【０２６１】
[実施例１]腫瘍細胞に対するインビトロ細胞傷害活性の改善のための、親Dual-Fab H183L072に由来する親和性成熟バリアントのスクリーニング
１．１．親和性成熟バリアントの配列
Dual-Fab H183L072（表13に記載するように、重鎖：配列番号：１２３；軽鎖：配列番号：１２４）の結合親和性を増加させるために、H183L072を鋳型として用いて、1,000個を上回るバリアントを作製した。抗体をExpi293（Invitrogen）で発現し、プロテインA精製、続いてゲル濾過が必要な場合にはゲル濾過によって、精製した。表1.1および1.2bに挙げた11個のバリアント（配列番号：１〜６４）をさらなる分析のために選択し、結合親和性を、下記に記載されるBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて、実施例１．２．２において25℃および/または37℃で評価した。
【０２６２】
【表１．１】
2022501325.tif 000004
【０２６３】
【表１．２ａ】
2022501325.tif 000005
【０２６４】
【表１．２ｂ】
2022501325.tif 000006
2022501325.tif 000007
2022501325.tif 000008
【０２６５】
１．２．親和性成熟バリアントの結合動態情報
１．２．１．ヒトCD3およびCD137の発現および精製
ヒトCD3複合体（ヒトCD3egリンカー）のγサブユニットおよびεサブユニットを29-merリンカーによって連結し、Flag-タグをγサブユニットのC末端に融合させた（表1.2a）。この構築物を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD3egリンカーを発現する馴化培地を、Q HP樹脂（GE healthcare）を充填したカラムを用いて濃縮し、次いで、FLAG-タグ親和性クロマトグラフィーに適用した。ヒトCD3egリンカーを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD3egリンカーを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
【０２６６】
そのC末端にヘキサヒスチジン（His-タグ）およびビオチンアクセプターペプチド（BAP）を有するヒトCD137細胞外ドメイン（ECD）（表1.2a）を、FreeStyle293F細胞株（Thermo Fisher）を用いて一過性に発現させた。ヒトCD137 ECDを発現する馴化培地をHisTrap HPカラム（GE healthcare）に適用し、イミダゾール（Nacalai）を含有する緩衝液で溶出した。ヒトCD137 ECDを含有する画分を収集し、続いて、1×D-PBSで平衡化したSuperdex 200ゲル濾過カラム（GE healthcare）に供した。次いで、ヒトCD137 ECDを含有する画分をプールし、-80℃で保管した。
【０２６７】
１．２．２．ヒトCD3およびCD137に対する親和性測定
ヒトCD3に対するDual-Fab抗体（Dual-Ig）の結合親和性を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて25℃で評価した。抗ヒトFc（GE Healthcare）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセルの上に固定化した。抗体を抗Fcセンサー表面の上に捕捉し、次いで、組換えヒトCD3またはCD137をフローセルの上にインジェクトした。すべての抗体およびアナライトを、20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05％ Tween 20、0.005％ NaN3を含有するACES pH 7.4において調製した。センサー表面は、3M MgCl2でサイクル毎に再生させた。結合親和性は、Biacore T200 Evaluation software、version 2.0（GE Healthcare）を用いて、データをプロセシングし、1:1結合モデルにフィットさせることによって決定させた。CD137結合親和性アッセイを、アッセイ温度を37℃に設定したことを除いて、同じ条件で行った。組換えヒトCD3およびCD137に対するDual-Fab抗体の結合親和性を表１．３に示す。
【０２６８】
【表１．３】
2022501325.tif 000009
【０２６９】
これらの11個のバリアントとは別に、表１には、発明者らが親和性成熟プロセスから同定した2個の他のバリアント：クローンH883およびH1647L0581も含まれた。H883バリアントはCD3結合を保持し、CD137結合は検出を下回る。そして、H1647L0581のようなバリアントはCD137結合を保持したが、CD3結合は検出を下回ることが示される。したがって、バリアントH883およびH1647L0581は、それぞれCD3またはCD137に主に結合するバインダーとして下記に記載される実施例3において用いることができる。
【０２７０】
１．３．二重特異性抗体および三重特異性抗体の調製
腫瘍抗原グリピカン-3を標的とする抗GPC3抗体（重鎖：配列番号：４９６；軽鎖：配列番号：４９７）、または陰性対照であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）（本明細書においてCtrlと名づけられる）抗体を抗標的結合アームとして用い、（Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26; 110(13): 5145-5150）に記載される方法によるFab-アーム交換（FAE）を用いて、実施例1.1および1.2に記載される抗体を作製した。4つの抗体すべての分子形式は、従来のIgGと同じ形式である（図2.1d）。例えば、抗GPC3/H1643L581は、GPC3、CD3、およびCD137に結合することができる三重特異性抗体である。実施例1.1に記載の11個のバリアントのうちどのDual-Ig三重特異性バリアントが、CD137活性に起因する細胞傷害活性の向上に寄与するかを特定するために、GPC3およびCD3に結合することができる二重特異性抗体である抗GPC3/CD3ε（参考実施例6）を対照として含んだ。作製されたすべての抗体は、Fcγ受容体に対する親和性が減弱されているサイレントFcを含む。
【０２７１】
１．４．インビトロでの親和性成熟バリアントのCD137アゴニスト活性の評価
どの抗体バリアントが親和性成熟の結果として強いCD137アゴニスト活性をもたらし得たかを評価するために、エフェクター細胞としてGloResponse（商標）NF-κB-Luc2/CD137 Jurkat細胞株（Promega #CS196004）を用い、細胞膜上にヒトGPC3を発現するSK-pca60細胞株（参考実施例13）を標的細胞として用いた。4.0×103細胞/ウェルのSK-pca60細胞（標的細胞）および2.0×104細胞/ウェルのNF-κB-Luc2/CD137 Jurkat（エフェクター細胞）の両方を、白底96ウェルアッセイプレート（Costar、3917）の各ウェルにE：T比5で加えた。抗体を0.5 nMおよび5 nMの濃度で各ウェルに加え、37℃、5％ CO2で37℃にて5時間インキュベートした。表れたルシフェラーゼを、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、G7940）で、製造業者の説明書にしたがって検出した。GloMax（登録商標）Explorer System（Promega #GM3500）用いて、発光（単位）を検出し、Graphpad Prism 7を用いて、捕捉値をプロットした。
【０２７２】
図1.1では、抗体バリアントは、GPC3/H0868L581およびGPC3/H1643L0581バリアントをプレート間対照とするプレート 1（図1.1a）およびプレート 2（図1.1b）に分けられた。両方のプレート中のすべてのバリアントは、GPC3/CD3εと比較して検出可能なCD137アゴニスト活性を有する。したがって、プレート 1（図1.1a）では、GPC3/H1643L581、GPC3/H1571L581、およびGPC3/H1573L581が、より強いCD137アゴニスト活性をもたらした上位バリアントであり、プレート 2（図1.1b）では、GPC3/H1572L581、GPC3/H0868L581、およびGPC3/H1595L0581がより強いCD137アゴニスト活性をもたらし、これに対して、GPC3/H888L581およびGPC3/H1673L581などのバリアントはより弱いCD137活性を示した。
【０２７３】
１．５．親和性成熟バリアントのインビトロ細胞傷害活性の評価
これらの抗体バリアントの順位付けについての知見を拡大適用するために、前述の代表的な強いバリアントおよび弱いバリアントを、ヒト末梢血単核細胞を用いたSK-pca60細胞に対する細胞傷害活性の評価に供した。
【０２７４】
１．５．１．凍結ヒト PBMCの調製
PBMCを含有するクライオバイアルを、37℃の水浴中に置き、細胞を解凍した。次いで、細胞を、9 mLの培地（標的細胞を培養するために用いられる培地）を含有する15 mLファルコンチューブ中に分注した。次いで、細胞懸濁液を、1,200 rpmで5分間、室温での遠心分離に供した。上清を緩やかに吸引し、新鮮な温めた培地を再懸濁のために添加して、ヒトPBMC溶液として用いた。
【０２７５】
１．５．２．抗GPC3親和性成熟Dual-Ig三重特異性抗体を用いたTDCC活性の測定
図1.2は、抗GPC3親和性成熟Dual-Ig三重特異性抗体のTDCC活性を示す。細胞傷害活性は、xCELLigence Real-Time Cell Analyzer（Roche Diagnostics）を用いて、細胞増殖抑制率によって評価された。SK-pca60細胞株を標的細胞として用いた。標的細胞をディッシュから剥離し、細胞を3.5×103細胞/ウェルに調整することによって100 μL/ウェルの分割量で、細胞をE-plate 96（Roche Diagnostics）にプレーティングし、xCELLigence Real-Time Cell Analyzerを用いて、細胞増殖の測定を開始した。24時間後、プレートを取り出し、各濃度（5または10 nM）に調製した各々の抗体50 μLをプレートに加えた。室温で15分の反応後、（実施例1.5.1）で調製した50 μLの新鮮なヒトPBMC溶液をエフェクター：標的比0.5（すなわち、1.75×103細胞/ウェル）で加え、細胞増殖の測定を、xCELLigence Real-Time Cell Analyzerを用いて再開した。反応は、5％二酸化炭素ガス条件下で37℃にて行われた。CD137シグナル伝達は、T細胞生存を増強し、かつ活性化誘導細胞死を抑制することから、TDCCアッセイを低E：T比で行った。また、一部の細胞株では、CD137活性化が寄与する優れた細胞傷害活性を観察するために、期間の延長が必要とされ得る。細胞株に応じて、PBMCの添加のおよそ72時間または120時間後に、下記の式を用いて、細胞増殖抑制（CGI）率（％）を決定した。計算で用いられるxCELLigence Real-Time Cell Analyzerから得られたセルインデックス値は、抗体の添加直前のセルインデックス値を1として定義した正規化値であった。
細胞増殖抑制率（％）＝（A−B）×100／（A−1）
Aは、抗体を追加していないウェル（標的細胞およびヒトPBMCのみを含有する）におけるセルインデックス値の平均値を表し、Bは、標的ウェルのセルインデックス値の平均値を表す。試験は三連で実施した。
【０２７６】
図1.1に示すように、GPC3/CD3εより強い細胞傷害活性を有する親和性成熟バリアントには、GPC3/H1643L581、GPC3/H1571L581、およびGPC3/H1595L581が、両方の濃度において含まれた。これは、CD137への結合が、GPC3/CD3εと比較したこれらのバリアントによる細胞傷害活性の改善の一因となることを示唆する。GPC3/H0868L581、GPC3/H1572L581などのバリアントは、5 nMでGPC3/CD3εより弱い細胞傷害活性を示した。したがって、Skpca60a細胞株においてより強いJurkat活性化および細胞傷害活性を一貫して示した抗GPC3/H1643L581が、異なる抗体形式を用いて有効性を向上させるさらなる最適化のために選択された。
【０２７７】
[実施例２] 細胞傷害活性は、1＋2三価形式、一価GPC3、二価Dual Fab、および2Fab抗体を用いて改善される
２．１．1＋2三価および2Fab抗体の作製および配列
固形腫瘍における標的抗原発現は、高度に不均一である可能性があり、抗原発現が低い腫瘍領域は、CD3またはCD137の十分な架橋をもたらさない可能性がある。具体的には、CD137受容体クラスター形成は、有効なアゴニスト活性に重大な意味を持つ（Trends Biohem Sci. 2002 Jan;27(1)19-26）。本発明者らは、Skpca60細胞株より低いGPC3発現を有する内在性がん細胞株を選択した（図2.3a）。GPC3発現の分析のために、10 μg/mLの抗GPC3抗体（黒色ヒストグラム）または10 μg/mLの陰性対照抗体（灰色ヒストグラム）を各細胞株とともに4℃にて30分間インキュベートし、FACS緩衝液（PBS中に2％ FBS、2mM EDTA）で洗浄した。次いで、ヤギF（ab'）2 抗ヒト IgG、マウスads-PE（Southern Biotech、Cat. 2043-09）を加え、4℃にて30分間インキュベートし、FACS緩衝液で洗浄した。データの取得を、FACS Verse（Becton Dickinson）で行い、その後、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて解析を行った。図2.3aに示すように、Huh7およびNCI-H446などの内在性がん細胞株は、SK-pca60トランスフェクタント細胞よりはるかに低いGPC3発現を有する（参考実施例13）。
【０２７８】
図2.3bに示すように、Huh7細胞株において3 nMおよび10 nMの両方で、ならびにNCI-H446細胞株において5 nMおよび10 nMの両方で、それぞれGPC3/CD3εと比較した時に、GPC3/Dualによる有効性の有意な改善を観察することはできない。両細胞株をPBMCとともにE：T 1で72時間共培養し、実施例1.5.2における記載と同様にxCELLigenceを用いて実施した。これは、GPC3/DualがGPC3/CD3εより優れていた実施例1.1（図1.2）で観察されたものと対照的である。SK-pca60細胞株では、GPC3発現はアゴニスト活性のためのCD137の架橋結合に十分である可能性がある。注目すべきことに、GPC3の発現が最も低いHuh7細胞株では、GPC3/DualがGPC3/CD3εより弱いインビトロ有効性を示すことを観察することができる（図2.3b）。これは、Dual-Ig由来のCD137アゴニスト活性は有効性を改善させるのに不十分であり、細胞傷害活性の弱さはDual-IgクローンのCD3親和性の弱さを原因とする可能性があることを示唆する（表1.3）。したがって、特に、腫瘍抗原発現が低い腫瘍細胞における、1＋1形式（図2.1d）でのDual-Igの有効性を改善させることは重要である。
【０２７９】
CD137アゴニスト活性の増加を通じて細胞傷害活性を改善するためには、CD137のクラスター形成は重大な意味を持つ。複数のCD137分子への結合は、1＋2三価形式（図2.1a）を設計することによって増加する。1＋2形式とは別に、発明者らは2Fab形式（図2.1c）も検討した。膜上の標的からT細胞までのエピトープ距離（epitope distance）は、恐らくより効率的な細胞溶解性シナプス（cytolytic synapse）の形成または標的とT細胞との間のより近い密着のために、溶解の効力を決定できることが、以前に示された（Cancer Immunol Immunther. 2010 Aug;59(8):1197-209）。腫瘍標的Fab（Fv A）およびエフェクター標的Fab（Fv B）を含有する2Fab形式（図2.1c）は、実施例1で分析した従来のIgG型（図2.1d）抗体と比較して、腫瘍細胞とエフェクター細胞との間のより近接かつより強固な結合をもたらすことができる。したがって、発明者らは、2Fab形式がDual-Igの有効性も改善できるかどうか調査したいと考えた。1＋2三価抗体および2Fab抗体はどちらも、CrossMab技術を利用することによって作製され、Fcγ受容体に対する親和性が減弱されているサイレントFcで構成された。1＋2三価形式（図2.1a）では、GPC3の一価腫瘍抗原結合、二価CD3結合、および二価CD137結合特性を含むGPC3-Dual/Dualは、H1643L581を含有する2つのFabに起因した（図2.1a、2.2a、および表2.1、2.2）。2Fab形式では、GPC3の一価腫瘍抗原結合、一価CD3結合、および一価CD137結合を含むGPC3-Dualは、抗エフェクター標的アームのためのH1643L581を含有する1つのFabに起因した（図2.1c、2.2c、および表2.1、2.2）。すべての抗体は、実施例1.1にしたがって、Expi293細胞（Invitrogen）での一過性発現によって発現させ、精製した。
【０２８０】
２．２．GPC3陽性がん細胞株に対する1＋2三価抗体および2Fab抗体の細胞傷害活性
1＋2三価抗体の効力を評価するために、0.6、2.5、および10 nMの抗体を用いて実施例1.5.2に記載のように、TDCCを行った。
【０２８１】
有効性の比較のために、GPC3/Dualと称される、実施例1で用いられる従来のIgG形式（図2.1d）GPC3/H1643L0581がこのアッセイに含まれた。図2.3cに示すように、1＋2三価GPC3-Dual/Dualは、PBMCとE：T 1で120時間共培養した時に、Huh7細胞株において2.5 nMでGPC3/Dualより強いTDCC活性を示した。2Fab GPC3/Dual抗体は、従来のIgG形式GPC3/Dualと比較してより優れたTDCC活性を示さなかった。図2.3bでも同様に、1＋2三価GPC3-Dual/Dualは、PBMCとE：T 1で72時間共培養したNCI-H446がん細胞においてより強いTDCC活性を示した。しかしながら、2Fab形式は、1＋2三価GPC3-Dual/Dualと同様の活性を示した。
【０２８２】
[実施例３] 1＋2三価形式は、CD3および/またはCD137に結合する2つFabを架橋させることによって制限することができる、免疫細胞による抗体非依存性細胞傷害活性をもたらす
1＋2三価抗体形式（図2.1a）は1＋1形式（図2.1d）より強い細胞傷害活性を示すが、1＋2三価抗体は二価CD3および二価CD137結合を含む。発明者らは、図3.1に図示するように、CD137および/またはCD3発現免疫細胞は、腫瘍抗原、すなわちGPC3への結合の非存在下で互いに架橋される可能性があると考えた。これは、抗原非依存性の毒性をもたらす可能性があった。したがって、発明者らは、種々の位置にシステイン置換を導入する（すなわち、linc技術；参考実施例15〜17）ことによって、Dual/Dual Fabの間に1対のジスルフィド結合を導入した。発明者らは、これによって、立体障害または2つのFab間の距離の結果として、トランス結合が低下し、主にシス結合がもたらされると考える。
【０２８３】
３．１．架橋した三価抗体（linc-Ig）の作製および配列
三価抗体を、CrossMabを利用し、種々の位置にシステイン置換を導入することによって作製した（実施例2および参考実施例 15〜17）。1対のジスルフィド結合をDual/Dual FabのS191C（Kabatナンバリング）に導入した。Fc領域は、FcγRサイレントであり、脱グリコシル化された。三重特異性抗体における各Fv領域の標的抗原を表2.1に示した。結合ドメインの各々の命名規則を図2.2に示し、対応する配列番号を表2.2および2.3に示す。例えば、GPC3-Dual/Dualは、1つの抗GPC3 Fabならびに2つのDualバリアントFab H1643L0581およびH1643L0581を含む。別の例では、GPC3-CD3/CD3は、1つの抗GPC3 Fabおよび2つのDualバリアント対照 Fab、H883およびH883を含む。最後に、GPC3-Dual/CD137は、1つの抗GPC3 Fab、1つのDualバリアントFab H1643L0581、および1つのCD137結合Fab  H1647L0581を含む。すべての抗体は、実施例1.1にしたがって、Expi293細胞（Invitrogen）での一過性発現によって三価形態として発現され、精製された。
【０２８４】
【表２．１】
2022501325.tif 000010
【０２８５】
【表２．２】
2022501325.tif 000011
【０２８６】
【表２．３】
2022501325.tif 000012
2022501325.tif 000013
2022501325.tif 000014
2022501325.tif 000015
【０２８７】
３．２．GPC3陰性細胞株における1＋2三価形式対1＋2三価（linc）形式の比較
1＋2三価GPC3-Dual/Dualにより観察される潜在的毒性を評価するために、製造業者の説明書にしたがって乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイ（Promega）を用いて、CD137を過剰発現するCHO細胞株を、精製した活性化T細胞とともにE：T 5で48時間共培養した。T細胞を、EasySepヒト T細胞単離キット（STEMCELL Technologies）を用いてPBMCから精製し、50 U/mLの組換えヒト IL-2（STEMCELL technologies）を追加した抗CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）で7日間培養した。
【０２８８】
図3.2に示すように、1＋2三価GPC3-Dual/Dual形式は、GPC3発現の非存在下でも、用量依存的に強い細胞溶解を示す。より強い殺滅は、Ctrl-Dual/Dual分子でも観察される。より重要なことには、191C-191C架橋を有する1＋2三価抗体（linc）は、CD137を発現するCHO細胞の溶解の低下を示した。具体的には、GPC3-Dual/Dual（linc）は、抗体濃度を5 nMから20 nMに増加させると、有意な溶解を示さなかった（12％から16％）。しかしながら、GPC3-Dual/Dual（1＋2）は、抗体濃度を5 nMから20 nMに増加させると、33％から51％に増加した。このデータは、三価分子への架橋の導入は免疫細胞間のトランス結合を低下させ、よって、意図的ではない腫瘍抗原非依存性毒性を低下させ得ることを示唆する。
【０２８９】
３．３．GPC3陽性がん細胞に対するLinc三価形式を用いるインビトロ有効性およびサイトカイン放出の測定
発明者らは次に、種々の1＋2三価linc-Ig形式（図2.1b）を比較する実施例1.1に記載のxCELLigenceを用いてインビトロTDCC活性を調べ、ここで、発明者らはNCI-H446細胞をPBMCとE：T比 0.5で共培養した。図3.3は、GPC3-Dual/Dual（linc）、GPC3-Dual/CD137（linc）、およびGPC3-CD3/CD3（linc）が1、3、および10 nMで従来のGPC3/Dual（1＋1）より強いTDCC活性を示したことを示した。注目すべきことに、GPC3/Dual（1＋1）は、より高いGPC3発現を有するSK-pca60細胞株とは異なり、NCI-H446細胞株ではGPC3/CD3ε（1＋1）より弱いTDCC活性を示した（図2.3a）。これは、標的抗原発現が、アゴニスト活性に必要とされるCD137クラスター形成に制限をもたらす可能性があることを示す。linc-Igバリアントによるより強いTDCC活性は、エフェクター細胞上での受容体クラスター形成は細胞傷害活性の効力を増加させる可能性があることを示唆する。
【０２９０】
興味深いことに、GPC3-CD137/Dualは、GPC3-Dual/CD137およびGPC3/Dual（1＋1）（図2.1d）よりはるかに弱いTDCC活性を示した。これは、GPC3/Dual（2Fab）がGPC3/Dual（1＋1）より強いTDCCを示す（図2.3b、3.3）ことから、腫瘍とエフェクター細胞との間の距離が重大な意味を持つことを立証したことを示唆する。加えて、CD3結合FabとDual-Fabとの間の架橋の結果としての立体障害またはアクセシビリティの低下もまた、GPC3-CD3/Dual（linc）バリアントの弱いTDCCに寄与している可能性がある。したがって、T細胞上でのCD3結合に向けての距離およびアクセシビリティは、効力のための細胞溶解性免疫シナプスの形成に重大な意味を持つ可能性がある。
【０２９１】
抗体をサイトカイン放出についても評価した。総サイトカイン放出を、cytometric bead array（CBA）ヒト Th1/T2サイトカインキットII（BD Biosciences #551809）を用いて評価した。IL-2、IL-6、IFNγ、およびTNFαを評価した。図3.4に示すように、E：T 1で共培養したNCI-H446およびPBMCとGPC3/Dualとのインキュベーションは、発明者らが40時間での細胞培養からの上清を分析した時に、弱いIL-2、IFNγ、およびTNFαサイトカイン産生を示す。図3.3に関連して、GPC3/Dual（1＋1）のサイトカイン放出はGPC3/CD3ε（1＋1）より高くなく、従来の1＋1 IgG形式は、GPC3腫瘍抗原発現が低い場合には、腫瘍細胞株において効力を改善するのに十分ではない可能性があることを示唆した。
【０２９２】
GPC3-Dual/Dual、GPC3-Dual/CD137は、最も強いIL-2、IFNγ、およびTNFα産生を示した。例えば、IL-2およびIFNγ産生はGPC3/Dualのものより少なくとも10倍多く、TNFα産生はGPC3/Dual抗体のものより少なくとも3倍多かった。注目すべきことに、GPC3-Dual/DualおよびGPC3-CD3/CD3の両抗体のTDCC活性は図3.3において同様の強さであったにもかかわらず、GPC3-Dual/DualはGPC3-CD3/CD3より強いサイトカイン産生を示し、機能的なCD137会合が、観察されたサイトカイン放出の増加を担っていることを示唆した。同様に、GPC3/Dual（2Fab）は、GPC3-Dual/CD137より、特に抗体濃度2.5 nMで、わずかに弱いIL-2およびIFNγサイトカイン放出を示す。これは、二価CD137の会合がIL-2およびIFNγ産生の増加に寄与し得ることを示唆し得る。加えて、TDCC活性と相関して、GPC3-CD137/Dualは最も弱いサイトカイン放出を示した。
【０２９３】
全体として、GPC3-Dual/Dual（linc）、GPC3-Dual/CD137（linc）抗体は、GPC3腫瘍標的発現が低い腫瘍細胞株においてGPC3/Dual（1＋1）と比較してTDCC活性の有意な改善の最も望ましいプロファイルを示し（IL-2およびIFNγおよびTNFαの増加と相関する）、臨床用途のためにこれらの抗体形式をさらに評価および開発するための強い論理的根拠を提供した。
【０２９４】
［参考実施例１］dual FabファージディスプレイライブラリーからのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
１．１．  GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
参考実施例１２において合成された抗体ライブラリー断片を用いて、ファージディスプレイのためのdual Fabライブラリーを構築した。dualライブラリーは、H鎖は参考実施例１２に示すように多様化しているが、L鎖は元の配列GLS3000（配列番号：８５）に固定したライブラリーとして調製した。FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えること、および（参考実施例１２中の）表２７に示すようにCDRをさらに多様化させることによってCE115HA000から生じたH鎖ライブラリー配列を、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託して、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。得られた抗体ライブラリー断片を、PCRによって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入した。GLS3000を、L鎖としては選択した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌へ移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
【０２９５】
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（国際特許出願の国内公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（国際特許出願番号WO2015046554の国内公表参照）。
【０２９６】
１．２．  ダブルラウンド選択でのCD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、参考実施例１．１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（図４、C3NP1-27と呼ばれる；アミノ酸配列：配列番号：１９４、Genscriptが合成）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびSS-ビオチン化されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ss-ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。ss-ヒトCD137-Fcは、ヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137に対してEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation Kit（PIERCE, カタログ番号21445）を用いることによって調製した。ビオチン化は、取扱説明書に従って実施した。
【０２９７】
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
【０２９８】
具体的には、ファージ溶液を、250 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび495μLのTBSを添加し、室温で15分間インキュベートし、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０２９９】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パニングの第２ラウンドにおいては、250 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パニングの第３ラウンドおよび第６ラウンドにおいては、62.5 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
パニングの第４、第５、および第７ラウンドにおいては、62.5 pmolのss-ヒトCD137-Fcを、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、TBSTで3回、次いでTBSで2回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
【０３００】
１．３．  ファージによって提示されたFabドメインの、CD3εまたはヒトCD137に対する結合
ファージを含有する培養上清を、上記の方法によって得られた大腸菌の各96シングルコロニーから、一般的な方法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に従って回収した。ファージを含有する培養上清を、以下の手順によってELISAに供した：ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner, カタログ番号781990）を、ビオチン標識された抗原（ビオチン標識されたCD3εペプチドまたはビオチン標識されたヒトCD137-Fc）を含有する10μLのTBSで、4℃で一晩または室温で1時間コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄して、結合していない抗原を除去した。次いで、ウェルを、80μLのTBS/2％スキムミルクで1時間以上ブロッキングした。TBS/2％スキムミルクの除去後に、調製された培養上清を各ウェルに添加し、ファージに提示された抗体が各ウェルに含有される抗原に結合するように、室温で1時間、プレートを放置した。各ウェルをTBSTで洗浄し、次いで、HRP/Anti M13（GE Healthcare 27-9421-01）を各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、TMB single solution（ZYMED Laboratories, Inc.）をウェルに添加した。各ウェルにおける溶液の発色反応を、硫酸の添加によって終了させた。次いで、発色を、450 nmでの吸光度に基づいてアッセイした。結果を図５に示す。
図５に示すように、クローンはすべて、ヒトCD3εに対する結合を示したが、ヒトCD137に対するパニング手順を5回実施したにもかかわらず、ヒトCD137に対する結合を示さなかった。これは、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレートでのこのファージELISA解析の感受性がより低いことに依存している可能性があり、したがって、ストレプトアビジンコーティングビーズでのファージELISAもまた実施した。
【０３０１】
１．４．  ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137に対する結合（ファージビーズELISA）
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、0.625 pmolのss-ヒトCD137-Fcを磁気ビーズに添加して、室温で10分間以上インキュベートし、次いで、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライした。各々12.5μLのFabを提示するファージ溶液を、12.5μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で30分間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図６に示す。
【０３０２】
いくつかのクローンは、ヒトCD137に対する明らかな結合を示した。この結果は、ヒトCD3εおよびCD137の両方に結合するいくつかのFabドメインがまた、ファージディスプレイパニング戦略で、この設計されたライブラリーから取得されたことを示した。それでもなお、ヒトCD137に対する結合は、CD3εペプチドと比較してまだ弱かった。各々のヒトCD137結合クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅して、DNA配列を解析した。結果は、結合クローンがすべて、同じVH配列を有することを示し、これは、1つのFabクローンのみが、ヒトCD137およびCD3εの両方に対する結合を示したことを意味した。これを改善するために、次の実験において、ダブルラウンド選択をまたファージディスプレイ戦略に適用した。
【０３０３】
［参考実施例２］ダブルラウンド選択法でのdual Fabファージディスプレイライブラリーからの、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
２．１．  GLS3000軽鎖を伴う重鎖ファージディスプレイライブラリーの構築
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン（配列番号：９１）をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染によって産生させ、次いで、0.002％アラビノースの存在下、25℃で（このファージライブラリーをDAライブラリーと名づける）、または0.02％アラビノースの存在下、20℃で（このファージライブラリーをDXライブラリーと名づける）一晩インキュベートした。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015/046554参照）。
【０３０４】
２．２．  ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインを、参考実施例２．１．において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27：配列番号：１９４）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
【０３０５】
ヒトCD137およびCD3εに結合するずっとより多くのFabドメインを作製するために、ダブルラウンド選択をまた、ファージディスプレイパニングに、パニングラウンド2およびその後のラウンドで適用した。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。磁気ビーズ自体またはヒトIgG1 Fc領域に結合する抗体を提示するファージを排除するために、磁気ビーズおよびビオチン標識されたヒトFcについてのサブトラクションを実施した。
【０３０６】
具体的には、パニングラウンド1で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。DAライブラリーまたはDXライブラリーのファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、8 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインも添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。
【０３０７】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で2回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで1回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンの添加後に、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０３０８】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、パニング手順の次のラウンドからは、CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する抗体を提示するファージを回収するためにダブルラウンド選択を実施した。
【０３０９】
具体的には、パニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０３１０】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０３１１】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたCD3εを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、抗体を提示するファージをヒトCD137からCD3εに移すために、37℃で30分間、室温で60分間、4℃で一晩、次いで室温で60分間インキュベートした。
【０３１２】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０３１３】
パニングの第３ラウンドおよび第４ラウンドにおいては、洗浄の数をTBSTで5回、次いでTBSで2回に増加させた。ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、C3NP1-27抗原を、ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原の代わりに用い、溶出は、CD3εペプチドとビオチンとの間のジスルフィド結合を切断するためにDTT溶液で実施した。正確には、TBSで2回洗浄した後、500μLの25 mM DTT溶液を添加して、ビーズを室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを、回収されたファージ溶液に添加して、室温で15分間インキュベートした。
【０３１４】
２．３．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
ラウンド3およびラウンド4でのDAおよびDXライブラリーの各パニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。29のVH配列が取得されたため、そのすべてをIgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ファージミドベクターに特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。GLS3000を軽鎖として用い、その発現プラスミドは、参考実施例１２．２．に示すように調製した。
【０３１５】
調製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137（配列番号：１９５）およびカニクイザル（cyno（カニクイザル）と呼ばれる）CD137（配列番号：９２）に対するその結合能力を評価した。図７は、ヒトCD137とカニクイザルCD137との間のアミノ酸配列の差を示す。それらの間では8個の残基が異なっている。
【０３１６】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。
【０３１７】
その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表１０および図１９に示す。その中で、クローンDXDU01_3#094、DXDU01_3#072、DADU01_3#018、DADU01_3#002、DXDU01_3#019、およびDXDU01_3#051は、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対する結合を示した。他方、ヒトCD137に対して最も強い結合を示したDADU01_3#001は、カニクイザルCD137に対する結合を示さなかった。
【０３１８】
【表３】
2022501325.tif 000016
【０３１９】
２．４．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD3εに対する結合
各抗体をまた、ELISAに供して、CD3εに対するその結合能力も評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300/TBSを含むブロッキング緩衝液を添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した後、100 ngの精製されたIgGを各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。
【０３２０】
その後、各ウェルをTBSTで洗浄し、TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、表４および図９に示す。すべてのクローンは、CD3εペプチドに対する明らかな結合を示した。これらのデータから、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも結合するFabドメインを、参考実施例１において実施された従来のファージディスプレイパニング手順よりも高いヒット率で、設計されたDual Fab抗体ファージディスプレイライブラリーによりダブルラウンド選択手順で効率的に取得できたことがわかる。
【０３２１】
【表４】
2022501325.tif 000017
【０３２２】
２．５．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
6つの抗体（DXDU01_3#094（#094）、DADU01_3#018（#018）、DADU01_3#002（#002）、DXDU01_3#019（#019）、DXDU01_3#051（#051）、およびDADU01_3#001（#001 またはdBBDu_126））を、さらに評価するために選択した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（重鎖が配列番号：９３、軽鎖が配列番号：９４）（Bと省略される）を、対照抗体として用いた。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
最初に、MyOne-T1ストレプトアビジンビーズを、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcまたはビオチン標識されたヒトFcと混合して、室温で10分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加して、磁気ビーズをブロッキングした。混合溶液を、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルに分注して、室温で60分間以上インキュベートした。その後、磁気ビーズを、TBSによって1回洗浄した。100 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのヒトCD3εペプチドまたは62.5 pmolのフリーのヒトFcまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１０および表５に示す。
【０３２３】
【表５】
2022501325.tif 000018
【０３２４】
ヒトCD137-Fcに対する結合の、フリーのCD3εペプチドによる阻害が、すべての試験された抗体において観察されたが、対照抗CD137抗体においては観察されず、かつ阻害は、フリーのFcドメインによっては観察されなかった。この結果から、それらの取得された抗体が、CD3εペプチドの存在下ではヒトCD137-Fcに結合できなかったこと、換言すると、これらの抗体は、ヒトCD137とCD3εに同時には結合しないことが実証される。したがって、2つの異なる抗原であるCD137およびCD3εに結合することができるが、同時には結合しないFabドメインを、設計されたライブラリーおよびファージディスプレイダブルラウンド選択で取得するのに成功したことが証明された。
【０３２５】
［参考実施例３］ダブルラウンド代替的選択またはクアドラプルラウンド選択での、dual Fabライブラリーからの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
３．１．  カニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得する効率を改善するためのパニング戦略
参考実施例２において、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得することに成功したが、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137に対するよりも弱かった。それを改善するための考慮すべき戦略の1つは、異なる抗原を異なるパニングラウンドで用いることになる、ダブルラウンド選択を伴う代替的パニングである。この方法によって、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対する選択圧を、好ましい抗原の組み合わせであるCD3εとヒトCD137、CD3εとカニクイザルCD137、またはヒトCD137とカニクイザルCD137で、各ラウンドにおいてdual Fabライブラリーにかけることができた。それを改善するためのもう1つの戦略は、1つのパニングラウンドにおいてすべての必要な抗原を用いることができる、トリプルまたはクアドラプルラウンド選択である。
【０３２６】
参考実施例２のダブルラウンド選択手順において、抗体を提示するファージを第１の抗原から第２の抗原に移動させるために、一晩のインキュベーションを用いた。この方法は良好に働いたが、第１の抗原に対する親和性が第２の抗原に対するよりも強い場合、移動がほとんど起きない可能性がある（例えば、このdualライブラリーにおいて第１の抗原がCD3εであった場合）。これに対処するために、塩基溶液での結合ファージの溶出もまた実施した。各パニング手順のキャンペーン名および条件を、表６に記載する。
【０３２７】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、参考実施例１．１．において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（アミノ酸配列：配列番号：８６）、ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27；アミノ酸配列：配列番号：１９４）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3εとビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD3δとのヘテロ二量体（CD3ed-Fcと名づける、アミノ酸配列：配列番号：９５、９６）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたカニクイザルCD137（カニクイザルCD137と名づける）を、抗原として用いた。
【０３２８】
【表６】
2022501325.tif 000019
【０３２９】
３．２．  ダブルラウンド選択および代替的パニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
キャンペーンDU05と名づけたパニング条件を、ダブルラウンド選択および代替的パニングで、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、表６に示すように実施した。
ヒトCD137-Fcを偶数のラウンドにおいて用い、カニクイザルCD137-Fcを奇数のラウンドにおいて用いた。ダブルラウンド選択の詳細なパニング手順は、参考実施例２に示すものと同じであった。DU05キャンペーンにおいては、ダブルラウンド選択をパニングの第１ラウンドから実施した。
【０３３０】
３．３．  塩基溶出ダブルラウンド選択および代替的パニングでの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
参考実施例２に示す異なる抗原での以前のダブルラウンド選択においては、IdeSまたはDTTが、抗体とビオチンとの間のリンカー領域を切断したため、抗体を提示するファージは、その第１の抗原との複合体として溶出され、したがって第１の抗原もまた、ダブルラウンド選択の第２サイクルに持ってこられ、第２の抗原と競合する。第１の抗原の持ち込みを抑制するために、結合抗体の抗原からの解離を誘導し、かつ従来のファージディスプレイパニングにおいて非常に普及している方法である、塩基緩衝液での溶出もまた実施した（キャンペーンDS01と名づける）。
パニングラウンド1の詳細なパニング手順は、参考実施例２に示すものと同じであった。ラウンド1においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcでの従来のパニングを実施した。
パニングラウンド1において、ヒトCD137に結合するFabを提示するファージが蓄積されたため、パニングラウンド2からは、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを取得するために、塩基溶出ダブルラウンド選択を実施した。
【０３３１】
具体的には、パニングラウンド2で、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチドを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０３３２】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.1M トリエチルアミンF（TEA, Wako 202-02646）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、500μLの0.1 M TEAを添加して、ビーズを室温で10分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。100μLの1Mトリス-HCl（pH 7.5）を添加して、ファージ溶液を15分間中和した。
【０３３３】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、CD3εに結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD137にも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。500 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液、50μLのTBS、および250μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。  
【０３３４】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。0.5 mLの1 mg/mLトリプシンを添加したビーズを、室温で15分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０３３５】
パニングの第４ラウンドおよび第６ラウンドのダブルラウンド選択の第２サイクルにおいては、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcの代わりに用いた。パニングのラウンド4からラウンド6を通して、250 pmolのビオチン標識されたヒトまたはカニクイザルのCD137-Fcを、ダブルラウンド選択の第２サイクルにおいて用いた。
【０３３６】
３．４．  クアドラプルラウンド選択での、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインの取得
以前のダブルラウンド選択においては、パニングの1ラウンドにおいて2つの異なる抗原しか用いることができなかった。この限界を突破するために、クアドラプルラウンド選択をまた実施した（表６に示す、キャンペーンMP09およびMP11との名称）。
MP09およびMP11両方のパニングラウンド1、ならびにMP09のパニングラウンド2において、ダブルラウンド選択を実施した。
【０３３７】
具体的には、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。268 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０３３８】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０３３９】
このパニング手順の第１サイクルにおいて、カニクイザルCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮されたため、次いで、ファージの感染および増幅の前に、CD3εにも結合する抗体を提示するファージを回収するための第２サイクルパニング手順に進んだ。IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０３４０】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０３４１】
MP09のパニングキャンペーンの第２ラウンドにおいては、表６に示すように、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクルパニング抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、トリプシンによる溶出を伴って、第２サイクルパニング抗原として用いた。
【０３４２】
クアドラプルパニングを、MP09キャンペーンのパニングラウンド3およびラウンド4において、ならびにMP11キャンペーンのパニングラウンド2およびラウンド3において実施した。
【０３４３】
MP09キャンペーンのパニングラウンド3およびMP11キャンペーンのラウンド2において、磁気ビーズを、2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄した。ファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。500 pmolのビオチン標識されたヒトIgG1 Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加して、室温で60分間以上インキュベートし、次いで、上清を回収した。250 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。
【０３４４】
室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０３４５】
IdeSプロテアーゼをファージ溶液から除去するために、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０３４６】
クアドラプルラウンド選択の第３サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。250 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。
【０３４７】
クアドラプルラウンド選択の第４サイクルにおいて、40μLのヘルパーファージM13KO7（1.2E+13 pfu）および200μLの10％ PEG-2.5 M NaClを添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。500 pmolのビオチン標識されたCD3ed-Fcを、新たな磁気ビーズに添加して、室温で15分間インキュベートし、次いで、2％スキムミルク/TBSを添加した。室温で60分間以上ブロッキングした後、磁気ビーズを、TBSで3回洗浄した。回収されたファージ溶液および500μLの8％ BSAブロッキング緩衝液を、ブロッキングされた磁気ビーズに添加し、次いで、室温で60分間インキュベートした。
【０３４８】
ビーズを、TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、1 mLのTBSで2回洗浄した。20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび395μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。トリプシン処理したファージ溶液から回収されたファージを、対数増殖期（OD600：0.4〜0.7）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を回収した。
【０３４９】
MP09キャンペーンのパニングラウンド4およびMP11キャンペーンのラウンド3においては、ビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、第１サイクル抗原として用い、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、第３サイクル抗原として用いた。
【０３５０】
３．５．  ファージによって提示されたFabドメインの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合（ファージELISA）
Fabを提示するファージ溶液を、参考実施例３．２、３．３、および３．４におけるパニング手順を通して調製した。最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。
【０３５１】
TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、またはビオチン標識されたCD3εペプチドを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。TBSTで1回洗浄した後、各々250 nLのFabを提示するファージ溶液を、24.75μLのTBSとともにウェルに添加し、各Fabを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈した抗M13(p8) Fab-HRPを、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、LumiPhos-HRP（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１１に示す。
【０３５２】
ヒトCD137、カニクイザルCD137、およびCD3εの各抗原に対する結合が、各パニングアウトプットファージ溶液において観察された。この結果は、塩基溶出を伴うダブルラウンド選択が、IdeS溶出法を伴う以前のダブルラウンド選択と同様に働いたこと、および、代替的パニングを伴うダブルラウンド選択がまた、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを取得するために良好に働いたことを示した。これらの方法は、3つの異なる抗原に結合するFabドメインを収集するが、それでもなお、カニクイザルCD137に対する結合は、ヒトCD137と比較してまだ弱かった。他方、MP09またはMP11キャンペーンにおいては、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合が、同じラウンド時点で観察され、かつカニクイザルCD137に対するその結合は、他のキャンペーンよりも高かった。この結果から、クアドラプルラウンド選択が、3つの異なる抗原に結合するFabドメインをより効率的に濃縮できることが実証された。
【０３５３】
３．６．  取得されたFabドメインを有するIgGの調製
各パニングアウトプットプールから、96クローンを採集し、そのVH遺伝子配列を解析した。32クローンを、そのVH配列がすべての解析されたプールの中で2回よりも多く出現したため、選択した。そのVH遺伝子を、PCRによって増幅し、IgG形式に変換した。各クローンのVH断片を、ライブラリー中のH鎖に特異的に結合するプライマー（配列番号：１９６および１９７）を用いたPCRによって増幅した。増幅されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをクローン変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
【０３５４】
各パニングアウトプットプールのVH遺伝子もまた、IgG形式に変換した。ファージミドベクターライブラリーを、各パニングアウトプットプールDU05、DS01、およびMP11の大腸菌から調製し、NheIおよびSalI制限酵素で消化して、VH遺伝子を直接抽出した。抽出されたVH断片を、既にヒトIgG1 CH1-Fc領域を有する動物発現プラスミド中に組み込んだ。調製されたプラスミドを大腸菌中に導入し、各パニングアウトプットプールから、192または288コロニーを採集して、そのVH配列を解析した。MP09および11キャンペーンにおいては、異なるVH配列を有するクローンを、可能な限り採集した。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。これらのサンプルをバルク変換IgGと呼んだ。GLS3000を軽鎖として用いた。
【０３５５】
３．７．  取得された抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
調製されたバルク変換IgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
【０３５６】
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。2％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、IgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１２に示す。
【０３５７】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パニング手順から取得されたため、代替的パニングを伴うダブルラウンド選択、塩基溶出を伴うダブル選択、およびクアドラプルラウンド選択のいずれもが、すべて期待されたように働いたことがわかる。特に、ヒトCD137に結合したクアドラプルラウンド選択由来のすべてのクローンの大部分は、他の2つのパニング条件と比較して、カニクイザルCD137に対して同等レベルの結合を示した。それらのパニング条件においては、恐らくCD3εおよびヒトCD137の両方に対する結合を示したクローンの取得がより少なく、それは主に、このキャンペーンにおいて、互いに同じVH配列を有するクローンを故意に採集することを可能な限りしなかったためである。各タンパク質に対してより良好な結合を示し、かつ互いに異なるVH配列を有した54クローンを、選択してさらに評価した。
【０３５８】
３．８．  精製されたIgG抗体の、そのCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137結合活性についての評価
精製されたIgG抗体の結合能力を評価した。参考実施例３．５における32のクローン変換IgG、および参考実施例３．６において選択された54のバルク変換IgGを用いた。
【０３５９】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、白色丸底PSプレート（Corning, 3605）の各ウェルにアプライし、0.625 pmolのビオチン標識されたCD3εペプチド、2.5 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、2.5 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fc、または0.625 pmolのビオチン標識されたヒトFcを磁気ビーズに添加して、室温で15分間以上インキュベートした。
【０３６０】
TBSTで1回洗浄した後、50 ng/μLの精製されたIgGの各々25μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、各サンプルを、96ウェルプレート（Corning, 3792黒色丸底PSプレート）に移し、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１３に示す。多くのクローンが、ヒトCD137およびカニクイザルCD137の両方に対して同等レベルの結合を示し、CD3εに対する結合もまた示した。
【０３６１】
３．９．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
参考実施例３．７においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した37の抗体を、さらに評価するために選択した。参考実施例２．３において取得された7つの抗体もまた、評価した（これら7つのクローンを、表７におけるように改名した）。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。参考実施例２．５に記載されるBと名づけた抗ヒトCD137抗体を、対照抗体として用いた。
【０３６２】
【表７】
2022501325.tif 000020
【０３６３】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、125、12.5、もしくは1.25 pmolのフリーのCD3εペプチドまたはTBSと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１４および表８に示す。
【０３６４】
【表８】
2022501325.tif 000021
2022501325.tif 000022
【０３６５】
対照抗CD137抗体B以外のすべての試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
【０３６６】
３．１０．  CD3εおよびヒトCD137に対して取得されたFabドメインを有するIgGのヒトCD137エピトープの評価
参考実施例３．８における21の抗体を、さらに評価するために選択した（表１０）。精製された抗体を、ELISAに供して、ヒトCD137のその結合エピトープを評価した。
エピトープを解析するために、WO2015/156268に記載されているように、断片化ヒトCD137と抗体のFc領域との融合タンパク質を作製し、そのドメインは、Cys-Cysによって形成される構造によって隔てられ、CRDと呼ばれる（表９参照）。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質は、表９に示すアミノ酸配列を含み、それぞれの遺伝子断片は、完全長ヒトCD137-Fc融合タンパク質（配列番号：９０）をコードするポリヌクレオチドからPCRによって取得し、当業者に知られている方法によって動物細胞における発現用のプラスミドベクターに組み込んだ。断片化ヒトCD137-Fc融合タンパク質を、WO2015/156268に記載されている方法によって抗体として精製した。
【０３６７】
【表９】
2022501325.tif 000023
【０３６８】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.4％ block Ace、1％ BSA、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。1.25 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fc、ヒトCD137ドメイン1-Fc、ヒトCD137ドメイン1/2-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3-Fc、ヒトCD137ドメイン2/3/4-Fc、ヒトCD137ドメイン3/4-Fc、およびヒトFcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。1250 ngの精製されたIgGを、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を図１５に示す。
【０３６９】
各クローンは、ヒトCD137の異なるエピトープドメインを認識した。ドメイン1/2のみを認識する抗体（例えば、dBBDu183、dBBDu205）、ドメイン1/2およびドメイン2/3の両方を認識する抗体（例えば、dBBDu193、dBBDu 202、dBBDu222)、ドメイン2/3、2/3/4、および3/4のいずれもを認識する抗体（例えば、dBBDu139、dBBDu217), ヒトCD137ドメインを広く認識する抗体（dBBDu174）、ならびに各々の分離したヒトCD137ドメインには結合しない抗体（例えば、dBBDu126）。この結果から、いくつかのヒトCD137エピトープに対する多くのdual binding抗体を、この設計されたライブラリーおよびダブルラウンド選択手順により取得できることが実証される。
【０３７０】
dBBDu126の実際のエピトープ領域は、このELISAアッセイによって決定することができないが、dBBDu126は、参考実施例２．３に記載されるようにカニクイザルCD137と交差反応できないため、ヒトとカニクイザルとが異なる残基を有する位置を認識すると推定することができる。図７に示すように、ヒトとカニクイザルとの間には8つの異なる位置があり、カニクイザルCD137／ヒトCD137ハイブリッド分子に対する結合アッセイおよび結合複合体の結晶構造解析によって、75E（ヒトにおいては75G）が、カニクイザルCD137に対するdBBDu126の結合を干渉する原因として同定された。結晶構造からも、dBBDu126は、ヒトCD137のCRD3領域を主に認識することが明らかである。
【０３７１】
【表１０】
2022501325.tif 000024
【０３７２】
［参考実施例４］設計された軽鎖ライブラリーを有するdual Fabライブラリー由来のCD3εおよびヒトCD137に結合する抗体ドメインの親和性成熟
４．１．  取得された重鎖を伴う軽鎖ライブラリーの構築
CD3εおよびヒトCD137の両方に結合する多くの抗体が、参考実施例３において取得されたが、ヒトCD137に対するその親和性はまだ低かったため、その親和性を改善する親和性成熟を実施した。
【０３７３】
13のVH配列、dBBDu_179、183、196、197、199、204、205、167、186、189、191、193、および222を、親和性成熟のために選択した。それらのうち、dBBDu_179、183、196、197、199、204 、および205は、同じCDR3配列を有するが、異なるCDR1または2配列を有するため、これら7つのファージミドを混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製した。dBBDu_191、193、および222の3つのファージミドもまた混合して、軽鎖Fabライブラリーを作製したが、それらは異なるCDR3配列を有していた。軽鎖ライブラリーのリストを、表１１に示す。
【０３７４】
【表１１】
2022501325.tif 000025
【０３７５】
参考実施例１２に記載される合成された抗体VLライブラリー断片を、配列番号：１９８および１９９のプライマーでのPCR法によって増幅した。増幅されたVL断片を、SfiIおよびKpnI制限酵素によって消化して、13のVH断片を各々有するファージミドベクター中に導入した。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌に移入して、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を調製した。
【０３７６】
Fabドメインを提示するファージライブラリーを、構築されたファージミドを保有する大腸菌から、FkpAシャペロン遺伝子をコードするヘルパーファージM13KO7TC/FkpAの感染、およびそれに続く、0.002％アラビノースとの25℃で一晩のインキュベーションによって作製した。M13KO7TCは、ヘルパーファージ上のpIIIタンパク質のN2ドメインとCTドメインとの間にトリプシン切断配列のインサートを有するヘルパーファージである（日本特許出願公表番号2002-514413参照）。M13KO7TC遺伝子中へのインサート遺伝子の導入は、既に他所で開示されている（WO2015046554参照）。
【０３７７】
４．２．  ダブルラウンド選択での、CD3εおよびヒトCD137に結合するFabドメインの取得
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に結合するFabドメインを、参考実施例４．１において構築されたdual Fabライブラリーから同定した。ジスルフィド結合リンカーを通してビオチン標識されたCD3εペプチド抗原（C3NP1-27）、ビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したヒトCD137（ヒトCD137-Fcと名づける）、およびビオチン標識されたヒトIgG1 Fc断片に融合したカニクイザルCD137（カニクイザルCD137-Fcと名づける）を、抗原として用いた。
【０３７８】
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保有する大腸菌から、ファージを産生させた。2.5 M NaCl/10％ PEGを、ファージを産生した大腸菌の培養液に添加し、沈殿したファージのプールをTBSで希釈して、ファージライブラリー溶液を取得した。次に、BSA（最終濃度：4％）を、ファージライブラリー溶液に添加した。パニング法は、磁気ビーズ上に固定化された抗原を用いた一般的なパニング法を参照して行った（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9；J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203；Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20；およびMol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。用いた磁気ビーズは、NeutrAvidinコーティングビーズ（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）またはストレプトアビジンコーティングビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin）であった。
【０３７９】
具体的には、ファージ溶液を、100 pmolのヒトCD137-Fcおよび4 nmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合して、室温で60分間インキュベートした。磁気ビーズを、フリーのストレプトアビジン（Roche）を含む2％スキムミルク/TBSによって室温で60分間以上ブロッキングして、TBSで3回洗浄し、次いで、インキュベートされたファージ溶液と混合した。室温で15分間のインキュベーション後に、ビーズを、10分間TBST（0.1％ Tween 20を含有するTBS；TBSはTakara Bio Inc.から入手可能であった）で3回洗浄し、次いでさらに、10分間、1 mLのTBSで2回洗浄した。FabRICATOR（IdeS、IgGのヒンジ領域に対するプロテアーゼ、GENOVIS）（IdeS溶出キャンペーンと名づける）を用いて、抗体を提示するファージを回収した。
【０３８０】
その手順においては、20μLの10単位/μL Fabricatorを80μLのTBS緩衝液とともに添加して、ビーズを37℃で30分間懸濁し、直後に磁気スタンドを用いてビーズを分離して、ファージ溶液を回収した。5μLの100 mg/mLトリプシンおよび400μLのTBSを添加して、室温で15分間インキュベートした。回収されたファージ溶液を、対数増殖期（OD600：0.4〜0.5）の大腸菌株ER2738に添加した。株を37℃で1時間穏やかに撹拌培養することを通して、大腸菌株にファージを感染させた。感染した大腸菌を、225 mm×225 mmのプレートに接種した。次に、接種した大腸菌の培養液からファージを回収して、ファージライブラリー溶液を調製した。
【０３８１】
このパニングラウンド1手順において、ヒトCD137に結合する抗体を提示するファージが濃縮された。パニングの第２ラウンドにおいては、160 pmolのC3NP1-27を、ビオチン標識された抗原として用い、洗浄は、2分間TBSTで7回、次いで2分間TBSで3回実施した。溶出は、25 mM DTTで、室温で15分間実施し、次いでトリプシンによって消化した。
【０３８２】
パニングの第３ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
【０３８３】
パニングの第４ラウンドにおいては、16または80 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを、抗原として用い、洗浄は、10分間TBSTで7回、次いで10分間TBSで3回実施した。溶出は、ラウンド1と同じようにIdeSで実施した。
【０３８４】
４．３．  取得されたFabドメインを有するIgGの、ヒトCD137およびカニクイザルCD137に対する結合
各パニングアウトプットプールのFab遺伝子を、IgG形式に変換した。調製された哺乳動物発現プラスミドを大腸菌中に導入し、各パニングアウトプットプールから、96コロニーを採集して、そのVHおよびVL配列を解析した。それぞれ、ライブラリー2におけるVH配列の大部分は、dBBDu_183に集中しており、ライブラリー6におけるVH配列の大部分は、dBBDu_193に集中していた。各大腸菌コロニーから調製されたプラスミドを、参考実施例９の方法による動物細胞における発現に用いた。
【０３８５】
調製されたIgG抗体を、ELISAに供して、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対するその結合能力を評価した。
【０３８６】
最初に、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート（384ウェル, Greiner）を、ビオチン標識されたCD3εペプチド、ビオチン標識されたヒトCD137-Fc、またはビオチン標識されたカニクイザルCD137-Fcを含有する20μLのTBSで、室温で1時間以上コーティングした。プレートの各ウェルをTBSTで洗浄することによって、プレートに結合していないビオチン標識された抗原を除去した後、ウェルを、20μLのブロッキング緩衝液（2％スキムミルク/TBS）で1時間以上ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を、各ウェルから除去した。1％スキムミルク/TBSで2倍希釈した、10 ng/μLのIgGを含有する哺乳動物細胞上清の各々20μLをウェルに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System（KPL）を添加した各ウェルにおける溶液の発色反応を、Blue Phos Stop Solution（KPL）を添加することによって終了させた。次いで、発色を、615 nmでの吸光度によって測定した。測定結果を図１６に示す。
【０３８７】
CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して結合を示した多くのIgGクローンが、各パニング手順から取得された。より良好な結合を示した96クローンを選択し、さらに評価した。
【０３８８】
４．４．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3εおよびヒトCD137に対する同時の結合の評価
参考実施例４．３においてCD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137のいずれにも対して明らかな結合を示した96の抗体を、さらに評価するために選択した。精製された抗体を、ELISAに供して、CD3εおよびヒトCD137に対するその同時の結合能力を評価した。
【０３８９】
最初に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズであるMyOne-T1ビーズの20μgを、0.5x block Ace、0.02％ Tween、および0.05％ ProClin 300を含むブロッキング緩衝液で3回洗浄し、次いで、このブロッキング緩衝液で、室温で60分間以上ブロッキングした。TBSTで1回洗浄した後、磁気ビーズを、黒色丸底PSプレート（Corning, 3792）の各ウェルにアプライした。0.625 pmolのビオチン標識されたヒトCD137-Fcを添加して、室温で10分間インキュベートした。その後、磁気ビーズをTBSによって1回洗浄した。250 ngの精製されたIgGを、62.5、6.25、もしくは0.625 pmolのフリーのCD3εまたは62.5 pmolのフリーのヒトIgG1 Fcドメインと混合し、次いで、各ウェル中の磁気ビーズに添加し、各IgGを各ウェル中のビオチン標識された抗原に結合させるように、室温で1時間、プレートを静置した。その後、各ウェルをTBSTで洗浄した。TBSで希釈したヤギ抗ヒトκ軽鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（BETHYL, A80-115AP）を、各ウェルに添加した。プレートを10分間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、APS-5（Lumigen）を各ウェルに添加した。2分後に、各ウェルの蛍光を検出した。測定結果を、図１７および表１２に示す。大部分の試験されたクローンのヒトCD137に対する結合は、過剰量のフリーのCD3εペプチドによって阻害され、dual Fabライブラリーで取得された抗体は、CD3εとヒトCD137に同時には結合しなかったことが実証された。
【０３９０】
【表１２】
2022501325.tif 000026
2022501325.tif 000027
2022501325.tif 000028
【０３９１】
４．５．  取得されたFabドメインを有するIgGの、CD3ε、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する親和性の評価
参考実施例４．４において取得された各IgGの、ヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する結合を、Biacore T200を用いて確認した。参考実施例４．４における結果により、16の抗体を選択した。センサーチップCM3（GE Healthcare）に、アミンカップリングによって適切な量のsure protein A（GE Healthcare）を固定化した。選択された抗体をチップにより捕捉して、抗原としてのヒトCD3ed、ヒトCD137、およびカニクイザルCD137に対する相互作用を可能にした。用いたランニング緩衝液は、20 mmol/l ACES、150 mmol/l NaCl、0.05％(w/v) Tween20、pH 7.4であった。すべての測定を25℃で実施した。抗原は、ランニング緩衝液を用いて希釈した。
【０３９２】
ヒトCD137に関しては、4000、1000、250、62.5、および15.6 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、各濃度の抗原を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
【０３９３】
カニクイザルCD137に関しては、4000、1000、および250 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で300秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で10秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で10秒間ロードした。
【０３９４】
ヒトCD3edに関しては、1000、250、および62.5 nMの抗原濃度で、選択された抗体をその結合について評価した。希釈された抗原溶液、およびブランクであるランニング緩衝液を、30μL/分の流速で120秒間ロードして、抗原の各々を、センサーチップ上に捕捉された抗体と相互作用させた。次いで、ランニング緩衝液を、30μL/分の流速で180秒間流し、抗体からの抗原の解離を観察した。次に、センサーチップを再生するために、10 mmol/L グリシン-HCl、pH 1.5を30μL/分の流速で30秒間ロードし、50 mmol/L NaOHを流速30μL/分で30秒間ロードした。
【０３９５】
結合速度定数ka（1/Ms）および解離速度定数kd（1/s）などのカイネティックパラメータを、測定によって得られたセンサーグラムに基づいて算出した。解離定数KD（M）を、これらの定数から算出した。各パラメータは、Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare）を用いて算出した。結果を表１３に示す。
【０３９６】
【表１３】
2022501325.tif 000029
2022501325.tif 000030
2022501325.tif 000031
【０３９７】
［参考実施例５］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製およびそのヒトCD137アゴニスト活性の評価
５．１．  抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD137二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、以下の手順によって作製した。WO2005/035584A1に記載されている抗ヒトCD137抗体（H鎖が配列番号：９３、L鎖が配列番号：９４）（Bと省略される）コードする遺伝子を、対照抗体として用いた。抗体の抗ヒトGPC3側は、重鎖可変領域H0000（配列番号：１３９）および軽鎖可変領域GL4（配列番号：１４０）を共有した。
【０３９８】
参考実施例４および表１３に記載される16のdual-Ig Fabを、候補dual-Ig抗体として用いた。これらの分子について、H鎖とL鎖との間の会合を調節するため、および二重特異性抗体を効率的に取得するために、Schaeferら（Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192）によって報告されたCrossMab技術を用いた。より具体的には、ヒトGPC3に対するFabのVHドメインおよびVLドメインを交換することによって、これらの分子を作製した。異種会合の促進のために、ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーを、抗体H鎖の定常領域に対して用いた。ノブ-イントゥ-ホールテクノロジーとは、ノブがホール中に配置されるように、H鎖のうちの1つのCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置換し（ノブ）、かつもう1つのH鎖のCH3領域中のアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置換する（ホール）ことによる、H鎖のヘテロ二量体化の促進を通して、目的のヘテロ二量体化抗体の調製を可能にする技術である（Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383）。
【０３９９】
以後、ノブ修飾が導入されている定常領域をKnと示し、ホール修飾が導入されている定常領域をH1と示す。さらに、WO2011/108714に記載されている修飾を用いて、Fcγ結合を低下させた。具体的には、234、235、および297位（EUナンバリング）のアミノ酸をAlaに置換する修飾を導入した。446位のGlyおよび447位のLys（EUナンバリング）を、抗体H鎖のC末端から除去した。ヒスチジンタグを、Kn Fc領域のC末端に付加し、FLAGタグを、H1 Fc領域のC末端に付加した。上述の修飾を導入することによって調製された抗ヒトGPC3 H鎖は、GC33(2)H-G1dKnHS（配列番号：１４１）であった。調製された抗ヒトCD137 H鎖は、BVH-G1dHIFS（配列番号：１４２）であった。抗体L鎖GC33(2)L-k0（配列番号：１４３）およびBVL-k0（配列番号：１４４）を、それぞれ、抗ヒトGPC3側および抗CD137側に共通して用いた。Dual抗体のH鎖およびL鎖もまた、表１３に示す。BVH-G1dHIFSおよびBVL-k0と同じように、それぞれ、各dual抗体クローンのVHを、G1dHIFS（配列番号：１５６）CH領域に融合させ、各dual抗体クローンのVLを、k0（配列番号：１５７）CL領域に融合させた。表１５に示す組み合わせを有する抗体を発現させて、目的の二重特異性抗体を取得した。無関連である抗体を、対照として用いた（Ctrlと省略される）。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例９」に従って精製した。
【０４００】
５．２．  抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD137アゴニスト作用の評価
ヒトCD137についてのアゴニスト活性を、ELISAキット（R&D systems, DY206）を用いたサイトカイン産生に基づいて評価した。抗ヒトGPC3/Dual-Fab抗体のCD3ε結合ドメインの作用を避けるために、CD3εもGPC3も発現しないが、CD137を構成的に発現するB細胞株HDLM-2を用いた。HDLM-2を、20％ FBSを含有するRPMI-1640培地に8×105細胞/mlの密度で懸濁した。GPC3を発現するマウスがん細胞株CT26-GPC3（参考実施例１３）を、同じ培地に4×105細胞/mlの密度で懸濁した。同じ体積の各細胞懸濁液を混合し、混合された細胞懸濁液を、96ウェルプレート中に200 μl/ウェルの体積で播種した。抗GPC3/Ctrl抗体、抗GPC3/抗CD137抗体、および参考実施例５．１において調製された8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体を、各々30μg/ml、6μg/ml、1.2μg/ml、0.24μg/mlで添加した。細胞を、37℃および5％ CO2の条件下で3日間培養した。培養上清を収集し、上清中に含有されるヒトIL-6の濃度をHuman IL-6 DuoSet ELISA（R&D systems, DY206）で測定して、HDLM-2の活性化を評価した。ELISAは、キットの製造業者（R&D systems）により提供される説明書に従うことによって行った。
【０４０１】
結果として（図１８および表１４）、8つの抗GPC3/Dual-Fab抗体のうち7つは、抗体濃度に依存して、抗GPC3/抗CD137抗体と同様にHDLM-2のIL-6産生の活性化を示した。表１４において、Ctrlと比較したアゴニスト活性とは、Ctrlの存在下でのバックグラウンドレベルを超えるhIL-6分泌の増加レベルを意味する。この結果に基づいて、これらのDual-Fab抗体は、ヒトCD137に対してアゴニスト活性を有すると考えられた。
【０４０２】
【表１４】
2022501325.tif 000032
【０４０３】
［参考実施例６］抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のヒトCD3εアゴニスト活性の評価
６．１．  抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の調製
ヒトIgG1定常領域を有する、抗ヒトGPC3/Ctrl二重特異性抗体および抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体を、参考実施例５．１において作製し、抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3ε二重特異性抗体もまた、同じ構築物として調製した。参考実施１０において作製されたCE115 VH（配列番号：１４５）およびCE115 VL（配列番号：１４６）を、抗ヒトCD3ε抗体の重鎖および軽鎖に用いた。組み合わせを有する抗体を表１５に示す。これらの抗体を、FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させ、「参考実施例９」に従って精製した。
【０４０４】
【表１５】
2022501325.tif 000033
【０４０５】
６．２．  抗ヒトGPC3/Dual-Fab三重特異性抗体のインビトロGPC3依存性CD3アゴニスト作用の評価
ヒトCD3に対するアゴニスト活性を、GloResponse（商標） NFAT-luc2 Jurkat Cell Line（Promega, CS#176401）をエフェクター細胞として用いることによって評価した。Jurkat細胞は、ヒト急性T細胞白血病に由来するヒトTリンパ球細胞の不死化された細胞株であり、それ自体上でヒトCD3を発現する。NFAT luc2_jurkat細胞においては、CD3活性化からのシグナルによって、ルシフェラーゼの発現が誘導された。細胞膜上にヒトGPC3を発現するSK-pca60細胞株（参考実施例１３）を、標的細胞として用いた。
【０４０６】
5.00E+03個のSK-pca69細胞（標的細胞）および3.00E+04個のNFAT-luc2 Jurkat細胞（エフェクター細胞）を両方とも、白底96ウェルアッセイプレート（Costar, 3917）の各ウェルに添加し、次いで、0.1、1、または10 mg/Lの濃度の、10μLの各抗体を各ウェルに添加して、5％ CO2の存在下、37℃で24時間インキュベートした。発現したルシフェラーゼを、Bio-Glo luciferase assay system（Promega, G7940）で、付属の説明書に従って検出した。検出には2104 EnVIsionを用いた。結果を図１９に示す。
【０４０７】
大部分のDual Fabクローンは、明らかなCD3εアゴニスト活性を示し、そのうちのいくつかは、CE115抗ヒトCD3ε抗体と同等レベルの活性を示した。Dual-Fabドメインに対するCD137結合活性の付加は、CD3εアゴニスト活性の喪失を誘導しなかったこと、ならびに、Dual-Fabドメインが、1つのドメインのみによって、ヒトCD3εおよびCD137の2つの異なる抗原に対する結合だけではなく、ヒトCD3εおよびCD137の両方のアゴニスト活性も示したことが実証された。
【０４０８】
重鎖dBBDu_186を有するいくつかのDual-Fabドメインは、他のものよりも弱いCD3εアゴニスト活性を示した。これらの抗体はまた、参考実施例４．５のbiacore解析において、ヒトCD3εに対してより弱い親和性を示した。このDual Fabライブラリー由来のDual-FabのCD3εアゴニスト活性は、ヒトCD3εに対するその親和性のみに依存することが実証され、これは、CD3εアゴニスト活性がこのライブラリー設計において保持されていたことを意味する。
【０４０９】
［参考実施例７］PBMC T細胞サイトカイン放出アッセイにおけるDual-Fab抗体のヒトCD3ε/ヒトCD137相乗活性の評価
７．１．  抗体調製
WO2005/035584A1に記載されている抗CD137抗体（Bと省略される）、参考実施例５．１に記載されるCtrl抗体、および参考実施例７に記載される抗CD3εCE115抗体を、単一抗原特異的な対照として用いた。表１３に記載されるDual-FabであるH183L072（重鎖：配列番号：１０４、軽鎖：配列番号：１２４）を、さらなる評価のために選択し、 FreeStyle293細胞（Invitrogen）における一過性発現によって発現させて、「参考実施例９」に従って精製した。
【０４１０】
７．２．  PBMC T細胞アッセイ
CD3εおよびCD137の活性化に対するDual-Fab抗体の相乗効果を調べるために、cytometric bead array（CBA） Human Th1/T2 Cytokine kit II（BD Biosciences #551809）を用いて、総サイトカイン放出を評価した。CD137の活性化に関連して、IL-2（インターロイキン-2）、IFNγ（インターフェロンγ）、およびTNFα（腫瘍壊死因子-α）を、凍結状態で購入した凍結ヒト末梢血単核細胞（PBMC）（STEMCELL）より単離されたT細胞から、評価した。
【０４１１】
７．２．１．  凍結ヒトPBMCの調製およびT細胞の単離
PBMCを含有するクライオバイアルを、37℃の水浴に置いて、細胞を解凍した。次いで、細胞を、9 mLの培地（標的細胞を培養するために用いられる培地）を含有する15 mL falconチューブ中に分注した。次いで、細胞懸濁液を、1,200 rpmで5分間、室温での遠心分離に供した。上清を穏やかに吸引し、再懸濁のために新鮮な温めた培地を添加して、ヒトPBMC溶液として用いた。T細胞を、Dynabeads Untouched Human T cell kit（Invitrogen #11344D）を用いて製造業者の説明書に従って単離した。
【０４１２】
７．２．２．  サイトカイン放出アッセイ
30μg/mLおよび10μg/mLの、参考実施例７．１において調製された抗体を、maxisorp 96ウェルプレート（Thermofisher #442404）上に一晩コーティングした。1.00E+05個のT細胞を、抗体を含有する各ウェルに添加して、37℃で72時間インキュベートした。プレートを、1,200 rpmで5分間遠心分離して、上清を収集した。製造業者の説明書に従ってCBAを行い、結果を図２０に示す。
【０４１３】
dual-FabであるH183L072抗体のみが、T細胞によるIL-2分泌を示した。抗CD137（B）も抗CD3ε抗体（CE115）も、単独でT細胞からのIL-2の誘導をもたらさなかった。加えて、抗CD137抗体単独は、サイトカインの検出をもたらさなかった。抗CD3ε抗体と比較すると、Dual-Fab抗体は、TNFαのレベルの増加およびIFNγの同様の分泌をもたらした。これらの結果は、dual-Fab抗体が、T細胞の機能的活性化のためにCD3εおよびCD137の両方の相乗的活性化を惹起できたことを示唆する。
【０４１４】
［参考実施例８］抗GPC3/Dual-Fab三重特異性抗体の細胞傷害活性の評価
８．１．  抗GPC3/dual-Fabおよび抗GPC3/CD137二重特異性抗体の調製
参考実施例６に記載される抗GPC3またはCtrl抗体、およびDual-Fab（H183L072）または抗CD137抗体を使用し、Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26; 110(13): 5145-5150に記載されている方法に従うFabアーム交換（FAE）を用いて、抗GPC3/dual-Fab、抗GPC3/CD137、Ctrl/H183L072、およびCtrl/CD137抗体の4つの抗体を生成した。4つの抗体すべての分子形式は、従来のIgGと同じ形式である。抗GPC3/ H183L072は、GPC3、CD3、およびCD137に結合することができる三重特異性抗体であり、抗GPC3/CD137は、GPC3およびCD137に結合することができる二重特異性抗体であり、Ctrl/H183L072およびCtrl/CD137 は、対照として用いた。生成した4つの抗体はすべて、Fcγ受容体に対して減弱した親和性を有し（L235R、G236R、S239K）、かつ脱グリコシル化した（N297A）サイレントFcからなる。
【０４１５】
８．２．  T細胞依存性細胞傷害活性（TDCC）アッセイ
細胞傷害活性を、参考実施例１０．５．２に記載されるようにxCELLigence Real-Time Cell Analyzer（Roche Diagnostics）を用いた細胞増殖抑制の比率によって評価した。両方ともGPC3を発現するトランスフェクタント細胞株である1.00E+04個のSK-pca60またはSK-pca13aを、標的（Tと省略される）細胞として用い（それぞれ、参考実施例１３および１０）、参考実施例７．２．１に記載されるように調製された5.00E+04個の凍結ヒトPBMCエフェクター（Eと省略される）細胞と共培養した。これは、腫瘍細胞に対して5倍量のエフェクター細胞を加えたことを意味し、そのためここではET 5と記載する。抗GPC3/H183L072抗体およびGPC3/CD137抗体を、0.4、5、および10 nMで添加した一方、Ctrl/H183L072抗体およびCtrl/CD137抗体は、各ウェル10 nMで添加した。細胞傷害活性の測定は、参考実施例１０．５．２に記載されるのと同様に実施した。反応は、5％二酸化炭素ガスの条件下、37℃で実施した。PBMCの添加の72時間後に、細胞増殖抑制（CGI）率（％）を、参考実施例１０．５．２に記載される式を用いて決定し、図２１に示すようにグラフにプロットした。参考実施例６．２においてJurkat細胞に対してCD3活性化を示した抗GPC3/H183L072 dual-Fab抗体は、GPC3発現細胞の強い細胞傷害活性を、すべての濃度で両方の標的細胞株においてもたらしたが、CD3活性化を示さなかった対照/H183L072 dual-Fab抗体および抗GPC3/CD137抗体はもたらさず、Dual-Fab三重特異性抗体が細胞傷害活性をもたらし得ることが示唆された。
【０４１６】
［参考実施例９］抗体発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
アミノ酸置換またはIgG変換を、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene Corp.）、PCR、またはIn fusion Advantage PCRクローニングキット（Takara Bio Inc.）等を用いて当業者に一般に公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを当業者に一般に公知の方法によって配列決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎がん細胞由来HEK293H株（Invitrogen Corp.）またはFreeStyle293細胞（Invitrogen Corp.）に一過性に導入し、抗体を発現させた。rProtein A Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて当業者に一般に公知の方法によって、各抗体を得られた培養上清から精製した。精製抗体の濃度について、分光光度計を用いて280 nmで吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
【０４１７】
［参考実施例１０］抗ヒトおよび抗カニクイザルCD3ε抗体CE115の作製
１０．１．  ヒトCD3を発現する細胞およびカニクイザルCD3を発現する細胞で免疫したラットを用いたハイブリドーマの作製
各SDラット（雌、免疫開始時6週齢、Charles River Laboratories Japan, Inc.）を、ヒトCD3εγまたはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞で以下の通り免疫した：0日目（初回免疫日を0日目と定義した）に、フロイント完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、ヒトCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。14日目に、フロイント不完全アジュバント（Difco Laboratories, Inc.）とともに、カニクイザルCD3εγを発現する5×107個のBa/F3細胞をラットに腹腔内投与した。その後、1週間おきに合計4回、ヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞またはカニクイザルCD3εγを発現するBa/F3細胞を5×107個、交互にラットに腹腔内投与した。CD3εγの最終投与1週間後（49日目）に、ブースターとしてヒトCD3εγを発現するBa/F3細胞をラットに静脈内投与した。その3日後に、ラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞SP2/0とを、PEG1500（Roche Diagnostics K.K.）を用いた常法に従い融合した。融合細胞、すなわちハイブリドーマを、10％FBSを含むRPMI1640培地（以下、10％ FBS/RPMI1640と称す）中で培養した。
【０４１８】
融合の翌日に、（１）融合細胞を半流動培地（Stemcell Technologies, Inc.）に懸濁した。ハイブリドーマを選択培養するとともに、コロニー化を実施した。
【０４１９】
融合後9日目または10日目に、ハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10％ FBS/RPMI1640、2重量％ HAT 50×濃縮物（Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.）、および5重量％ BM-Condimed H1（Roche Diagnostics K.K.））を含む96-ウェルプレートに、1コロニー/ウェルで播種した。3〜4日の培養後、各ウェルの培養上清を回収し、培養上清中のラットIgG濃度を測定した。ラットIgGを含むことが確認された培養上清について、ヒトCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞またはヒトCD3εγを発現しない付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、ヒトCD3εγに特異的に結合する抗体を産生するクローンについてスクリーニングした（図２２）。さらに、カニクイザルCD3εγを発現する付着Ba/F3細胞を用いる細胞ELISAによって、サルCD3εγとの交差反応性についてもクローンを評価した（図２２）。
【０４２０】
１０．２．  抗ヒトおよび抗サルCD3εキメラ抗体の作製
各ハイブリドーマ細胞から、RNeasy Mini Kits（Qiagen N.V.）を用いてトータルRNAを抽出し、SMART RACE cDNA Amplification Kit（BD Biosciences）を用いてcDNAを合成した。作製したcDNAをPCRで用いて、抗体の可変領域遺伝子をクローニングベクターに挿入した。各DNA断片のヌクレオチド配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Inc.）およびDNAシーケンサーABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems, Inc.）を用いて、それに含まれる添付説明書に記載の方法に従い決定された。CE115 H鎖可変ドメイン（配列番号：１６２）およびCE115 L鎖可変ドメイン（配列番号：１６３）のCDRおよびFRは、Kabatナンバリングに従って決定された。
【０４２１】
ヒト抗体IgG1鎖定常ドメインに連結させたラット抗体H鎖可変ドメインを含むキメラ抗体H鎖をコードする遺伝子、およびヒト抗体カッパ鎖定常ドメインに連結させたラット抗体L鎖可変ドメインを含むキメラ抗体L鎖をコードする遺伝子を、動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。作製した発現ベクターを用いて、CE115キメラ抗体の発現および精製を行った（参考実施例1）。
【０４２２】
１０．３．  EGFR_ERY22_CE115の作製
次に、がん抗原（EGFR）に対するIgGを基本骨格として用いて、一方のFabをCD3ε結合ドメインに置き換えた形の分子を作製した。この操作において、基本骨格とするIgGのFcとして、上述した場合と同様に、FcgR（Fcγ受容体）に対する結合活性が減弱されたサイレント型Fcを用いた。EGFR結合ドメインとして、セツキシマブの可変領域を構成するセツキシマブ-VH（配列番号：１６４）およびセツキシマブ-VL（配列番号：１６５）を用いた。抗体H鎖定常ドメインとして、C末端のGlyおよびLysを除去したIgG1に由来するG1d、D356KおよびH435Rの変異を導入したG1dに由来するA5、およびK439Eの変異を導入したG1dに由来するB3を用い、それぞれセツキシマブ-VHと組み合わせ、セツキシマブ-VH-G1d（配列番号：１６６）、セツキシマブ-VH-A5（配列番号：１６７）、およびセツキシマブ-VH-B3（配列番号：１６８）を参考実施例９の方法に従って作製した。抗体H鎖定常ドメインをH1と名づけた場合、可変ドメインとしてセツキシマブ-VHを持つ抗体のH鎖に対応する配列はセツキシマブ-VH-H1で表した。
【０４２３】
この文脈において、アミノ酸の改変は、例えば、D356Kで表す。最初のアルファベット（D356KのDに該当）は、改変前のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。このアルファベットに続く数字（D356Kの356に該当）は、この改変残基のEUナンバリング位置を意味する。最後のアルファベット（D356KのKに該当）は、改変後のアミノ酸残基の一文字表記で表すアルファベットを意味する。
【０４２４】
EGFRに対するFabのVHドメインとVLドメインとの間の交換によって、EGFR_ERY22_CE115（図２３）を作製した。具体的には、前述の方法と同様の方法で付加した適切な配列によるプライマーを用いて、PCR法等の当業者に一般に公知の方法により、EGFR ERY22_Hk（配列番号：１６９）、EGFR ERY22_L（配列番号：１７０）、CE115_ERY22_Hh（配列番号：１７１）、またはCE115_ERY22_L（配列番号：１７２）をコードする各ポリヌクレオチドが挿入された一連の発現ベクターが作製された。
【０４２５】
発現ベクターは以下の組み合わせでFreeStyle 293-F細胞に導入され、各目的分子を一過性に発現させた：
・目的分子：EGFR_ERY22_CE115
・発現ベクターに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：EGFR ERY22_Hk、EGFR ERY22_L、CE115_ERY22_Hh、およびCE115_ERY22_L。
【０４２６】
１０．４．  EGFR_ERY22_CE115の精製
得られた培養上清をAnti FLAG M2カラム（Sigma-Aldrich Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、0.1 mg/mL FLAGペプチド（Sigma-Aldrich Corp.）で溶出した。目的分子を含む画分をHisTrap HPカラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加し、該カラムを洗浄し、続いて、イミダゾールの濃度勾配で溶出した。目的分子を含む画分を限外濾過によって濃縮した。その後、この画分をSuperdex 200カラム（GE Healthcare Japan Corp.）に添加した。単量体画分のみを溶出液から回収し、各精製目的分子を得た。
【０４２７】
１０．５．  ヒト末梢血単核球を用いた細胞傷害活性の測定
１０．５．１．  ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の作製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5,000単位、Novo Nordisk A/S）を予め100μL充填した注射器を用いて、各健常人ボランティア（成人）から50 mLの末梢血を採取した。末梢血をPBS（-）で2倍希釈し、次いで4等分し、そして15 mLのFicoll-Paque PLUSを予め充填しかつ予め遠心操作を行ったLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227290、Greiner Bio-One GmbH）に加えた。該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分、室温）の後、単核球画分層が分取された。10％FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地（Sigma-Aldrich Corp.；以下10％FBS/D-MEMと呼ぶ）で単核球画分中の細胞を1回洗浄した。その後、該細胞を10％FBS/D-MEMで4×106細胞/mLの細胞密度に調整した。このように調製した細胞溶液を、ヒトPBMC溶液として以後の試験に用いた。
【０４２８】
１０．５．２．  細胞傷害活性の測定
細胞傷害活性は、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（Roche Diagnostics）を用いて、細胞増殖抑制率に基づいて評価された。標的細胞には、SK-HEP-1細胞株にヒトEGFRを強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株を用いた。SK-pca13aをディッシュから剥離し、100μL/ウェル（1×104細胞/ウェル）でE-Plate 96プレート（Roche Diagnostics）に播種し、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用いて生細胞のアッセイを開始した。翌日、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレートを取り出し、各濃度（0.004、0.04、0.4、および4 nM）に調整した各抗体50μLを該プレートに添加した。室温にて15分間反応させた後、前述の１０．５．１で調製したヒトPBMC溶液50μL（2×105細胞/ウェル）をそれに加えた。このプレートをxCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに再セットし、生細胞のアッセイを開始した。反応は、5％CO2および37℃の条件下でヒトPBMCの添加の72時間後に行われた。細胞増殖抑制率（％）を下式によりセルインデックス値から決定した。抗体の添加直前のセルインデックス値を1として、それに対して正規化した後の数値を、この算出でセルインデックス値として用いた。
細胞増殖抑制率（％）＝（A−B）×100／（A−1）
式中、Aは、抗体を追加していないウェル（標的細胞およびヒトPBMCのみ）の平均セルインデックス値を表し、Bは、各抗体を追加したウェルの平均セルインデックス値を表す。試験は三連で実施した。
【０４２９】
ヒト血液から調製したPBMCをエフェクター細胞として用いて、CE115を含むEGFR_ERY22_CE115の細胞傷害活性を測定した。結果として、極めて強い活性が確認された（図２４）。
【０４３０】
［参考実施例１１］CD3および第２の抗原に結合する抗体の作製のための抗体改変
１１．１．  第２の抗原に結合できるペプチドの挿入部位および長さの試験
一方の可変領域（Fab）を通じてがん抗原に結合することができかつもう一方の可変領域を通じて第１の抗原CD3および第２の抗原に結合することができるが、CD3および第２の抗原に同時に結合することができない、Dual binding Fab分子を取得するための試験を実施した。CD3ε結合抗体CE115の重鎖のループにGGSペプチドを挿入し、一方のFabにEGFR結合ドメインを持ちかつもう一方のFabにCD3結合ドメインを持つ各ヘテロ二量化抗体を参考実施例９に従って作製した。
【０４３１】
具体的には、CDR2中のK52BとS52cとの間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７３/１７２）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：１７５）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７４/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：１７７）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE33 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７６/１７２）を作製した。同様に、FR3中のD72とD73との間（ループ）にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７８/１７２）、この位置にGGSGGSペプチド（配列番号：１７５）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１７９/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチド（配列番号：１７７）を挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８０/１７２）を作製した。加えて、CDR3中のA99とY100との間にGGSを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８１/１７２）、この位置にGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８２/１７２）、およびこの位置にGGSGGSGGSペプチドを挿入したEGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L（配列番号：１６９/１７０/１８３/１７２）を作製した。
【０４３２】
１１．２．  GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3εへの結合の確認
作製した各抗体のCD3εへの結合活性をBiacore T100を用いて確認した。ビオチン化CD3εエピトープペプチドをストレプトアビジンによってCM5チップに固定化し、作製した抗体をそれにアナライトとして注入し、その結合親和性を解析した。
【０４３３】
その結果を表１６に示す。CD3εに対するCE35、CE36、CE37、CE38、およびCE39の結合親和性は、親抗体であるCE115と同等であった。このことは、第２の抗原に結合するペプチドがこれらのループ中に挿入できることを示した。結合親和性は、GGSGGSGGSを挿入したCE36またはCE39では低下しなかった。このことは、これらの部位への少なくとも9アミノ酸までのペプチドの挿入はCD3εに対する結合活性に影響を与えないことを示した。
【０４３４】
【表１６】
2022501325.tif 000034
【０４３５】
これらの結果によって、このようなペプチド挿入CE115を用いて、第２の抗原に結合する抗体を取得することにより、CD3および第２の抗原に結合できるが、これらの抗原に同時には結合しない抗体を作製できることが示された。
この文脈において、挿入または置換で使用するためのペプチドのアミノ酸配列を、部位特異的変異誘発法（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1985）82, 488-492）またはオーバーラップ伸長PCR法などの当技術分野において公知の方法に従ってランダムに改変し、上述の方法に従って各改変体の結合活性等を比較して、アミノ酸配列の改変後であっても目的の活性を示すことのできる挿入または置換部位、ならびにこの部位のアミノ酸の種類および長さを決定することによって、ライブラリーを作製することができる。
【０４３６】
［参考実施例１２］CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のためのライブラリー設計
１２．１．  CD3および第２の抗原に結合する抗体の取得のための抗体ライブラリー（Dual Fab Libraryとも呼ぶ）
第１の抗原としてCD3（CD3ε）を選択する場合、CD3（CD3ε）および任意の第２の抗原に結合する抗体を取得する方法の例として、以下の6つの方法が挙げられる：
１．第１の抗原に結合するFabドメインに第２の抗原に結合するペプチドまたはポリペプチドを挿入する工程を伴う方法（この方法には、WO2016076345A1の実施例３または４に示されたペプチド挿入、あるいはAngew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5; 52（32）: 8295-8に例示されるG-CSF挿入方法もまた含まれる）、ここで、結合するペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドを提示するライブラリーから取得されてもよく、または天然に存在するタンパク質の全体またはその一部を使用してもよい；
２．WO2016076345A1の実施例５で示されたような、Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
３．CD3に結合することが既知のFabドメインから部位特異的変異誘発法によって作製した抗体の使用によってCD3に対する結合活性を維持するアミノ酸を同定する工程、および任意の第２の抗原に対する結合活性を指標として用いることによって、同定されたアミノ酸が出現する抗体ライブラリーから該抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程を伴う方法；
４．Fabループをより長い長さに改変する（延長）ことを可能にする位置に種々のアミノ酸が出現するような抗体ライブラリーを作製する工程、および指標として抗原に対する結合活性を用いることによって、抗体ライブラリーから任意の第２の抗原に対する結合活性を有するFabを取得する工程をさらに伴う3の方法；
５．糖鎖付加配列（例えば、NxSおよびNxT、式中、xはP以外のアミノ酸である）が出現するように抗体を改変し、糖鎖受容体が認識する糖鎖をそれに付加する（例えば、ハイマンノース型糖鎖をそれに付加することによって、ハイマンノース受容体によって認識される；ハイマンノース型糖鎖は抗体発現時にキフネンシンの添加によって得られることが公知である（mAbs. 2012 Jul-Aug; 4（4）: 475-87））工程をさらに伴う、1、2、3、または  4の方法；および
６．種々のアミノ酸に改変可能であると認められるループまたは部位にCys、Lys、または非天然アミノ酸を挿入することまたはこれらの部位をCys、Lys、または非天然アミノ酸と置換することによって、共有結合によりそれぞれが第２の抗原に結合するドメイン（ポリペプチド、糖鎖、またはTLRアゴニストに代表される核酸）をそれに付加する工程をさらに伴う1、2、3、または4の方法（この方法は、抗体薬物コンジュゲートに代表され、共有結合によるCys、Lys、または非天然アミノ酸への結合のための方法である（mAbs 6: 1, 34-45; January/February 2014; WO2009/134891 A2;およびBioconjug Chem. 2014 Feb 19; 25（2）: 351-61に記載されている））。
第１の抗原および第２の抗原に結合するが、これらの抗原に同時には結合しないDual binding Fabが、これらの方法のいずれかの使用によって得られ、当業者に一般に公知の方法、例えば、共通L鎖、CrossMab、またはFabアーム交換法によって、任意の第３の抗原に結合するドメインと組み合わせることができる。
【０４３７】
１２．２．  部位特異的変異誘発法を用いたCD3（CD3ε）結合抗体の1アミノ酸改変抗体の作製
CD3（CD3ε）結合抗体のテンプレート配列としてVHドメインCE115HA000（配列番号：１８４）およびVLドメインGLS3000（配列番号：１８５）を選択した。各ドメインを、参考実施例９により抗原結合に関与すると推定される部位でのアミノ酸改変に供した。また、pE22Hh（L234A、L235A、N297A、D356C、T366S、L368A、およびY407Vの改変、C末端のGK配列の欠失、ならびにDYKDDDDK配列（配列番号：２００）の付加による天然IgG1 CH1およびそれ以降の配列に由来する配列；配列番号：１８６）をH鎖定常ドメインとして用い、カッパ鎖（配列番号：１８７）をL鎖定常ドメインとして用いた。改変部位を表１７に示す。CD3（CD3ε）結合活性評価のために、各1アミノ酸改変抗体をワンアーム抗体（Fabドメインの1つを欠く天然に存在するIgG抗体）として取得した。具体的には、H鎖改変の場合、定常ドメインpE22Hhに連結させた改変H鎖、およびKn010G3（C220S、Y349C、T366W、およびH435Rの改変を有する216位からC末端までの天然に存在するIgG1アミノ酸配列；配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ鎖に3'側で連結させたGLS3000をL鎖として用いた。L鎖改変の場合、カッパ鎖に3'側で連結させた改変L鎖をL鎖として用い、pE22Hhに3'側で連結させたCE115HA000、およびKn010G3をH鎖として用いた。これらの配列をFreeStyle 293細胞で発現させかつ精製した（参考実施例９の方法を利用した）。
【０４３８】
【表１７】
2022501325.tif 000035
【０４３９】
１２．３．  CD3に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
項目１２．２で構築、発現および精製した各1アミノ酸改変体をBiacore T200（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて評価した。アミンカップリング法によって、適切な量のCD3εホモ二量体タンパク質をセンサーチップCM4（GE Healthcare Japan Corp.）の上に固定化した。次いで、適切な濃度を有する抗体をアナライトとしてそれにインジェクトし、センサーチップ上でCD3εホモ二量体タンパク質と相互作用させた。次いで、10 mmol/Lグリシン-HCl（pH 1.5）のインジェクトによって、センサーチップを再生した。アッセイを25℃で行い、HBS-EP+（GE Healthcare Japan Corp.）をランニングバッファーとして用いた。アッセイ結果から、アッセイにおいて得られた結合量およびセンサーグラムについてシングルサイクルカイネティックモデル（1:1 binding RI＝0）を用いて解離定数KD（M）を算出した。各パラメータをBiacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare Japan Corp.）を用いて算出した。
【０４４０】
１２．３．１．  H鎖の改変
表１８は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000の結合量に対する各H鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、CE115HA000を含む抗体の結合量をXと定義し、H鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図２５に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表１９は、CE115HA000に対する各H鎖改変体の解離定数 KD（M）の比（＝CE115HA000のKD値/改変体のKD値）を示す。
表１８に示されたZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変の抗体であるCE115HA000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
【０４４１】
【表１８】
2022501325.tif 000036
【０４４２】
【表１９】
2022501325.tif 000037
【０４４３】
１２．３．２．  L鎖の改変
表２０は、対応する未改変の抗体であるGLS3000の結合量に対する各L鎖改変体の結合量の比の結果を示す。具体的には、GLS3000を含む抗体の結合量をXと定義し、L鎖1アミノ酸改変体の結合量をYと定義した時の、Z（結合量の比）＝Y/Xの値を用いた。図２５に示すように、0.8未満のZではセンサーグラムにおいて非常に少量の結合量が観察され、解離定数KD（M）が正確に算出できない可能性が示唆された。表２１は、GLS3000に対する各L鎖改変体の解離定数KD（M）の比を示す。
表２０において示されるZが0.8以上の場合には、改変体は、対応する未改変抗体であるGLS3000と比べて結合を維持していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸が出現するように設計された抗体ライブラリーは、Dual Fab Libraryとして機能することができる。
【０４４４】
【表２０】
2022501325.tif 000038
【０４４５】
【表２１】
2022501325.tif 000039
【０４４６】
１２．４．  ECM（細胞外マトリックス）に対する1アミノ酸改変抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）は、細胞外構成成分であり、インビボで様々な部位に存在する。そのため、ECMに強く結合する抗体は、血中動態が悪くなる（半減期が短くなる）ことが知られている（WO2012093704 A1）。よって、ECM結合が増強されていないアミノ酸が、抗体ライブラリー中に出現するアミノ酸として選択されることが好ましい。
【０４４７】
各抗体を、参考実施例１．２に記載された方法によりH鎖改変体またはL鎖改変体として取得した。次に、そのECM結合を参考実施例１４の方法に従って評価した。各改変体のECM結合値（ECL反応）を、同一プレート内でまたは同一実施日に得られた抗体MRA（H鎖: 配列番号：１８９、L鎖: 配列番号：１９０）のECM結合値で割り、その結果生じる値を表２２（H鎖）および２３（L鎖）に示す。表２２および２３に示すように、いくつかの改変はECM結合を増強する傾向を有することが確認された。
表２２（H鎖）および２３（L鎖）に示す値のうち、複数の改変によるECM結合増強の作用を考慮し、10倍までを有効値としてDual Fab Libraryに採用した。
【０４４８】
【表２２】
2022501325.tif 000040
【０４４９】
【表２３】
2022501325.tif 000041
【０４５０】
１２．５．  ライブラリーの多様性を増強するためのペプチドの挿入部位および長さについての試験
参考実施例１１は、CD3（CD3ε）への結合を失うことなく、GGS配列を用いてペプチドを各部位に挿入できることを示した。Dual Fab Libraryでループ延長が可能となれば、その結果生じるライブラリーはより多種類の分子を含み（またはより広範な多様性を有し）、多様な第２の抗原に結合するFabドメインの取得が可能になる可能性がある。したがって、ペプチド挿入を原因とする結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CD3εに対する結合活性を増強するV11L/D72A/L78I/D101Q改変をCE115HA000配列に加えて、pE22Hhにさらに連結させた。参考実施例１１と同様に、この配列へのGGSリンカーの挿入によって分子を作製し、そのCD3結合を評価した。Kabatナンバリングで99位と100位との間にGGS配列を挿入した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。具体的には、上述のGGSリンカーを含むH鎖およびKn010G3（配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：１８７）に連結させたGLS3000（配列番号：１８５）をL鎖として採用した。これらの配列は、参考実施例９に従って発現および精製を行った。
【０４５１】
１２．６．  GGSペプチドを挿入したCE115抗体のCD3に対する結合の確認
GGSペプチドを挿入した改変抗体のCD3εに対する結合を、参考実施例１１に記載の方法によりBiacoreを用いて確認した。表２４に示すように、結果は、ループにGGSリンカーを挿入できることが明らかにした。特に、GGSリンカーは、抗原結合に重要であるH鎖CDR3領域に挿入することができ、CD3εへの結合は、3、6、および9アミノ酸挿入のいずれの結果でも維持された。この試験はGGSリンカーを用いて実施されたが、GGS以外の種々のアミノ酸が出現する抗体ライブラリーも許容され得る。
【０４５２】
【表２４】
2022501325.tif 000042
【０４５３】
１２．７．  NNSヌクレオチド配列を用いたH鎖CDR3への挿入についてのライブラリーの試験
参考実施例１２．６は、GGSリンカーを用いて3、6、または9アミノ酸を挿入できることを示し、3、6、または9アミノ酸の挿入を有するライブラリーを作製して、ファージディスプレイ法によって代表される通常の抗体取得法の使用によって第２の抗原に結合する抗体を取得できると推論した。よって、NNSヌクレオチド配列（全種類のアミノ酸の出現を可能にする）を用いて6アミノ酸挿入部位に種々のアミノ酸が出現する場合にも、CDR3への6アミノ酸の挿入がCD3への結合を維持できるかどうかについて試験を実施した。結合活性の低下が推定されることを踏まえ、CE115HA000のものより高いCD3ε結合活性を有するCE115HA340配列（配列番号：１９３）のCDR3中の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸が挿入されるようにNNSヌクレオチド配列を用いて、プライマーを設計した。抗体分子をワンアーム抗体として発現させた。
【０４５４】
具体的には、上述の改変H鎖およびKn010G3（配列番号：１８８）をH鎖として用い、カッパ配列（配列番号：１８７）に連結させたGLS3000（配列番号：１８５をL鎖として採用した。これらの配列を参考実施例９に従って発現および精製した。得られた改変抗体を、参考実施例１２．６に記載された方法によってその結合について評価した。結果を表２５に示す。結果は、アミノ酸を延長した部位に種々のアミノ酸が出現した場合であっても、CD3（CD3ε）に対する結合活性が維持されることを明らかにした。表２６は、参考実施例１０に記載された方法により非特異的結合の増強の有無をさらに評価する結果を示す。結果として、CDR3の伸長したループに正電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸が多く含まれる場合に、ECMへの結合は増強された。したがって、正電荷を持つ側鎖を有する3個以上のアミノ酸がループ内に出現するべきではないことが望まれた。
【０４５５】
【表２５】
2022501325.tif 000043
【０４５６】
【表２６】
2022501325.tif 000044
【０４５７】
１２．８．  Dual Fab Libraryの設計および構築
参考実施例１２に記載の試験に基づき、CD3および第２の抗原に結合する抗体を取得するための抗体ライブラリー（Dual Fab Library）を以下のように設計した：
ステップ１：CD3（CD3ε）への結合能を維持するアミノ酸を選択する（CD3への結合量がCE115HA000の80％以上を確保する）；
ステップ２：改変前と比較してMRAの10倍以内のECM結合を保持するアミノ酸を選択する；
ステップ３：H鎖CDR3内の99位と100位（Kabatナンバリング）との間に6アミノ酸を挿入する。
Fabの抗原結合部位は、ステップ１のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。Fabの抗原結合部位は、ステップ１および３のみを実施することによっても多様化することができる。そのため、その結果生じるライブラリーは、第２の抗原に結合する抗原結合分子を同定するために用いることができる。ステップ２を行わないライブラリー設計であっても、取得された分子をECM結合についてアッセイおよび評価することが可能である。
【０４５８】
このように、Dual Fab Libraryでは、FR（フレームワーク）にV11L/L78I変異を加えかつ表２７に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来する配列をH鎖として用い、表２８に示すようにCDRを多様化することによるGLS3000に由来する配列をL鎖として用いた。これらの抗体ライブラリー断片は、当業者に一般に公知のDNA合成方法によって合成することができる。Dual Fab Libraryは、（1）H鎖が表２７に示したように多様化され、L鎖が元の配列GLS3000または参考実施例１２に記載されたCD3ε結合を増強させたL鎖に固定されているライブラリー、（2）H鎖が元の配列（CE115HA000）または参考実施例１に記載されたCD3ε結合を増強させたH鎖に固定され、L鎖が表２８に示したように多様化されているライブラリー；および（3）H鎖が表２７に示したように多様化され、L鎖が表２８に示したように多様化されているライブラリーとして作製される可能性がある。FR（フレームワーク）にV11L/L78I 変異を加えかつ表２７に示すようにCDRをさらに多様化することによるCE115HA000に由来するH鎖ライブラリー配列は、DNA合成会社であるDNA2.0, Inc.に委託し、抗体ライブラリー断片（DNA断片）を取得した。取得した抗体ライブラリー断片は、PCR法によって増幅されたファージディスプレイ用ファージミドに挿入された。GLS3000をL鎖として選択した。構築したファージディスプレイ用ファージミドをエレクトロポレーションによって大腸菌に移入し、抗体ライブラリー断片を保有する大腸菌を作製した。
表２８に基づき、発明者らは、表２９に示すようにGLS3000について新たな多様化ライブラリーを設計した。L鎖ライブラリー配列は、GLS3000に由来し、表２９に示すように多様化した（DNAライブラリー）。DNAライブラリーはDNA合成会社によって構築された。次いで、種々のGLS3000由来配列を含むL鎖ライブラリーおよび種々のCE115HA000由来配列を含むH鎖ライブラリーをファージミドに挿入し、ファージディスプレイライブラリーを構築した。
【０４５９】
【表２７】
2022501325.tif 000045
【０４６０】
【表２８】
2022501325.tif 000046
【０４６１】
【表２９】
2022501325.tif 000047
【０４６２】
［参考実施例１３］実験細胞株
当業者に周知の方法によって、ヒトGPC3遺伝子をマウス結腸がん細胞株CT-26（ATCC No. CRL-2638）の染色体に組み込み、高発現CT26-GPC3細胞株を取得した。製造者推奨の方法によってQIFIキット（Dako）を用いて、ヒトGPC3（2.3×105/細胞）の発現レベルを決定した。ヒトGPC3遺伝子を維持するために、これらの組換え細胞株を、CT26-GPC3用に200μg/mlでジェネティシン（GIBCO）を加えることによるATCC推奨培地中で培養した。培養後、2.5 g/Lトリプシン-1 mM EDTA（ナカライテスク）を用いて、これらの細胞を剥離し、次いで、各実験に用いた。ここでは、形質転換細胞株をSKpca60aと呼ぶ。
当業者に周知の方法によって、ヒトCD137遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-DG44の染色体に組み込み、高発現CHO-hCD137細胞株を取得した。製造者の指示書によってPE抗ヒトCD137（4-1BB）抗体（BioLegend, Cat. No. 309803）を用いて、ヒトCD137の発現レベルをFACS解析により決定した。NCI-H446 細胞株およびHuh7細胞株はそれぞれ、RPMI1640（Gibco）中およびDMEM（低グルコース）中で維持した。培地は両方とも、10%ウシ胎児血清（Bovogen Biologicals）、100ユニット/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを補充し、細胞を、37℃および5％ CO2の条件下で培養した。
【０４６３】
［参考実施例１４］ECM（細胞外マトリックス）に対する抗体の結合の評価
ECM（細胞外マトリックス）に対する各抗体の結合を、WO2012093704 A1を参照して以下の手法により評価した：ECMフェノールレッドフリー（BD Matrigel #356237）をTBSで2 mg/mLに希釈し、氷上で冷却したECLアッセイ用のプレート（L15XB-3、MSD K.K.、高結合）の各ウェルの中心に5μL/ウェルで液滴添加した。次いで、プレートをプレートシールで覆い、4℃で一晩静置した。ECM固定化プレートを室温に戻した。ECLブロッキングバッファー（0.5％BSAおよび0.05％Tween 20を追加したPBS）を150μL/ウェルでプレートに加え、プレートを室温で2時間以上または4℃で一晩静置した。次いで、各抗体サンプルをPBS-T（0.05％Tween 20を追加したPBS）で9μg/mLに希釈した。二次抗体をECLDB（0.1％BSAおよび0.01％Tween 20を追加したPBS）で2μg/mLに希釈した。20μLの抗体溶液および30μLの二次抗体溶液を、10μL/ウェルで分注したECLDBを含む丸底プレートの各ウェルに添加し、遮光しながら室温で1時間撹拌した。ECLブロッキングバッファーを、ECLブロッキングバッファーを含むECMプレートを反転させることによって除去した。このプレートに対して、前述の抗体および二次抗体の混合溶液を50μL/ウェルで添加した。次いで、プレートを、遮光しながら、室温で1時間静置した。プレートを反転させることによってサンプルを除去し、次いで、READバッファー（MSD K.K.）を150μL/ウェルでプレートに添加し、続いて、Sector Imager 2400（MSD K.K.）を用いてsulfo-tagの発光シグナルを検出した。
【０４６４】
〔参考実施例１５〕重鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体の評価
参考実施例１５．１  重鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体の評価
抗ヒトIL6R中和抗体、MRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：２０１）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：２０２））の重鎖可変領域および定常領域を、表面に構造的に露出した任意のアミノ酸残基をシステインに置換させる試験に供した。
MRAの重鎖可変領域（MRAH、配列番号：２０３）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表30に示すMRAの重鎖可変領域のバリアントを作製した。MRAの重鎖可変領域のこれらのバリアントをMRAの重鎖定常領域（G1T4、配列番号：２０４）とそれぞれ連結し、MRAの重鎖のバリアントを作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者に公知の方法によって作製した。
【０４６５】
加えて、MRAの重鎖定常領域（G1T4、配列番号：２０４）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表31に示すMRAの重鎖定常領域のバリアントを作製した。MRAの重鎖定常領域のこれらのバリアントをMRAの重鎖可変領域（MRAH、配列番号：２０３）とそれぞれ連結し、MRAの重鎖のバリアントを作製し、当業者に公知の方法によって、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを作製した。
上記で作製したMRA重鎖バリアントをMRA軽鎖と組み合わせた。表32に示す結果として生じるMRAバリアントを、当業者に公知の方法によってFreeStyle293細胞（Invitrogen）またはExpi293細胞（Life technologies）を用いる一過性発現によって発現させ、当業者に公知の方法によってプロテインAで精製した。
【０４６６】
【表３０】
2022501325.tif 000048
2022501325.tif 000049
【０４６７】
【表３１】
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【０４６８】
【表３２】
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【０４６９】
参考実施例１５．２  重鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体のプロテアーゼ媒介性Fab断片化の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化を引き起こすプロテアーゼを用いて、参考実施例 15.1で作製したMRAバリアントが、それらの断片化を阻害するようなプロテアーゼ耐性を獲得したかどうかを調べた。用いたプロテアーゼはLys-C（エンドプロテイナーゼLys-C Sequencing Grade）（SIGMA; 11047825001）であった。2 ng/μLプロテアーゼ、100 μg/mL抗体、80％ 25 mM Tris-HCl pH 8.0、20％ PBS、および35℃の条件下で2時間、または2 ng/μLプロテアーゼ、20 μg/mL抗体、80％ 25 mM Tris-HCl pH 8.0、20％ PBS、および35℃の条件下で1時間、反応を実施した。次いで、サンプルを非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にWes（Protein Simple）を用い、検出にHRP標識抗κ鎖抗体（abcam; ab46527）を用いた。
【０４７０】
結果を図27〜34に示す。MRAのLys-C処理は重鎖ヒンジ領域の切断を引き起こし、150 kDa付近でのIgGのバンドの消失および50 kDa付近でのFabのバンドの出現をもたらした。参考実施例 15.1で作製したMRAバリアントでは、プロテアーゼ処理後に、一部は96 kDa付近に出現するFab二量体のバンドを示し、一部は150 kDa付近で検出される未消化IgGのバンドを示した。プロテアーゼ処理後に得られた各バンドの面積を、Wes専用のソフトウェア（Compass for SW；Protein Simple）を用いてアウトプットし、未消化IgG、Fab二量体等のバンド面積のパーセンテージを計算した。各バンドの計算されたパーセンテージを表33に示す。
【０４７１】
【表３３】
2022501325.tif 000056
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【０４７２】
この結果から、重鎖可変領域または重鎖定常領域におけるシステイン置換が、表34に示すMRAバリアントにおける重鎖ヒンジ領域のプロテアーゼ耐性を改善したことが認められた。あるいは、この結果は、Fab二量体がFab-Fab間の共有結合によって形成されたことを示唆した。
【０４７３】
【表３４】
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2022501325.tif 000061
【０４７４】
〔参考実施例１６〕軽鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体の評価
実施例１６．１  軽鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体の評価
抗ヒトIL6R中和抗体、MRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：２０１）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：２０２））の軽鎖可変領域および定常領域を、表面に構造的に露出した任意のアミノ酸残基をシステインに置換させる試験に供した。
MRAの軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：２０５）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表35に示すMRAの軽鎖可変領域のバリアントを作製した。MRAの軽鎖可変領域のこれらのバリアントをMRAの軽鎖定常領域（k0、配列番号：２０６）とそれぞれ連結し、MRAの軽鎖のバリアントを作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者に公知の方法によって作製した。
加えて、MRAの軽鎖定常領域（k0、配列番号：２０６）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表36に示すMRAの軽鎖定常領域のバリアントを作製した。MRAの軽鎖定常領域のこれらのバリアントをMRAの軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：２０５）とそれぞれ連結し、MRAの軽鎖のバリアントを作成し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者に公知の方法によって作製した。
上記で作製したMRA軽鎖バリアントをMRA重鎖と組み合わせた。表37に示す結果として生じるMRAバリアントを、当業者に公知の方法によってFreeStyle293細胞（Invitrogen）またはExpi293細胞（Life technologies）を用いる一過性発現によって発現させ、当業者に公知の方法によってプロテインAで精製した。
【０４７５】
【表３５】
2022501325.tif 000062
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【０４７６】
【表３６】
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【０４７７】
【表３７】
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【０４７８】
参考実施例１６．２  軽鎖中の種々の位置にシステイン置換を有する抗体のプロテアーゼ媒介性Fab断片化の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化を引き起こすプロテアーゼを用いて、実施例 16.1で作製したMRAバリアントが、それらの断片化を阻害するようなプロテアーゼ耐性を獲得したかどうかを調べた。用いたプロテアーゼはLys-C（エンドプロテイナーゼLys-C Sequencing Grade）（SIGMA; 11047825001）であった。2 ng/μLプロテアーゼ、100 μg/mL抗体、80％ 25 mM Tris-HCl pH 8.0、20％ PBS、および35℃の条件下で2時間、または2 ng/μLプロテアーゼ、20 μg/mL抗体、80％ 25 mM Tris-HCl pH 8.0、20％ PBS、および35℃の条件下で1時間、反応を実施した。次いで、サンプルを非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にWes（Protein Simple）を用い、検出にHRP標識抗κ鎖抗体（abcam; ab46527）を用いた。
【０４７９】
結果を図35〜44に示す。MRAのLys-C処理は重鎖ヒンジ領域の切断を引き起こし、150 kDa付近でのIgGのバンドの消失および50 kDa付近でのFabのバンドの出現をもたらした。参考実施例16.1で作製したMRAバリアントでは、プロテアーゼ処理後に、一部は96 kDa付近に出現するFab二量体のバンドを示し、一部は150 kDa付近で検出される未消化IgGのバンドを示した。プロテアーゼ処理後に得られた各バンドの面積を、Wes専用のソフトウェア（Compass for SW；Protein Simple）を用いてアウトプットし、未消化IgG、Fab二量体等のバンド面積のパーセンテージを計算した。各バンドの計算されたパーセンテージを表38に示す。
【０４８０】
【表３８】
2022501325.tif 000071
2022501325.tif 000072
2022501325.tif 000073
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【０４８１】
この結果から、軽鎖可変領域または軽鎖定常領域におけるシステイン置換が、表39に示すMRAバリアントにおける重鎖ヒンジ領域のプロテアーゼ耐性を改善したことが認められた。あるいは、この結果は、Fab二量体がFab-Fab間の共有結合によって形成されたことを示唆した。
【０４８２】
【表３９】
2022501325.tif 000075
【０４８３】
〔参考実施例１７〕システイン置換を有する抗体を評価する方法の研究
参考実施例１７．１  軽鎖中にシステイン置換を有する抗体の作製
抗ヒト IL6R中和抗体、MRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：２０１）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：２０２））の軽鎖定常領域（k0、配列番号：２０６）においてKabatナンバリングによる126位にあるアミノ酸残基をシステインで置換し、MRAの軽鎖定常領域のバリアント、k0.K126C（配列番号：４１７）を作製した。このMRAの軽鎖定常領域のバリアントをMRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：２０５）と連結し、MRAの軽鎖のバリアントを作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者に公知の方法によって作製した。
上記で作製したMRA軽鎖バリアントをMRA重鎖と組み合わせた。結果として生じるMRAバリアント MRAL-k0.K126C（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：２０１）、軽鎖可変領域：MRAL（配列番号：２０５）、軽鎖定常領域：k0.K126C（配列番号：４１７））を、当業者に公知の方法によってFreeStyle293細胞（Invitrogen）またはExpi293細胞（Life technologies）を用いる一過性発現によって発現させ、当業者に公知の方法によってプロテインAによって精製した。
【０４８４】
参考実施例１７．２  軽鎖中にシステイン置換を有する抗体のプロテアーゼ媒介性キャピラリー電気泳動の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化を引き起こすプロテアーゼを用いて、参考実施例17.1で作製したMRA軽鎖バリアントが、その断片化を阻害するようなプロテアーゼ耐性を獲得したかどうかを調べた。用いたプロテアーゼはLys-C（エンドプロテイナーゼLys-C Sequencing Grade）（SIGMA; 11047825001）であった。0.1、0.4、1.6、または6.4 ng/μLプロテアーゼ、100 μg/mL抗体、80％ 25 mM Tris-HCl pH 8.0、20％ PBS、および35℃の条件下で2時間、反応を実施した。次いで、サンプルを非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にWes（Protein Simple）を用い、検出にHRP標識抗κ鎖抗体（abcam；ab46527）またはHRP標識抗ヒトFc抗体（Protein Simple; 043-491）を用いた。
【０４８５】
結果を図45に示す。Lys-Cで処理したMRAでは、抗κ鎖抗体による検出は、150 kDa付近でのバンドの消失および50 kDa付近での新たなバンドの出現を示し、低Lys-C濃度では、113 kDaでのわずかなバンドの出現も示した。抗ヒトFc抗体による検出は、150 kDa付近でのバンドの消失および61 kDa付近での新たなバンドの出現を示し、低Lys-C濃度では、113 kDaでのわずかなバンドの出現も示した。一方、参考実施例17.1で作製したMRAバリアントでは、150 kDa付近でのバンドはほとんど消失せず、新たなバンドが96 kDa付近に出現した。抗ヒトFc抗体による検出は、150 kDa付近でのバンドはほとんど消失せず、新たなバンドが61 kDa付近に出現し、低Lys-C濃度では、113 kDaでもわずかなバンドが出現したことを示した。上記の結果は、図46に示すように、150 kDa付近でのバンドはIgGであり、113 kDa付近でのバンドは、重鎖ヒンジが一度切断されている1アーム形態であり、96 kDa付近でのバンドはFab二量体であり、61 kDa付近でのバンドはFcであり、50 kDa付近でのバンドはFabであったことを示唆した。
【図１．１】
2022501325.tif 000076
【図１．２】
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【図２．１】
2022501325.tif 000078
【図２．２．１】
2022501325.tif 000079
【図２．２．２】
2022501325.tif 000080
【図２．３】
2022501325.tif 000081
【図３．１】
2022501325.tif 000082
【図３．２】
2022501325.tif 000083
【図３．３】
2022501325.tif 000084
【図３．４】
2022501325.tif 000085
【図４】
2022501325.tif 000086
【図５】
2022501325.tif 000087
【図６】
2022501325.tif 000088
【図７】
2022501325.tif 000089
【図８】
2022501325.tif 000090
【図９】
2022501325.tif 000091
【図１０】
2022501325.tif 000092
【図１１Ａ】
2022501325.tif 000093
【図１１Ｂ】
2022501325.tif 000094
【図１１Ｃ】
2022501325.tif 000095
【図１２．１】
2022501325.tif 000096
【図１２．２】
2022501325.tif 000097
【図１２．３】
2022501325.tif 000098
【図１３】
2022501325.tif 000099
【図１４】
2022501325.tif 000100
【図１５】
2022501325.tif 000101
【図１６】
2022501325.tif 000102
【図１７．１】
2022501325.tif 000103
【図１７．２】
2022501325.tif 000104
【図１７．３】
2022501325.tif 000105
【図１７．４】
2022501325.tif 000106
【図１７．５】
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【図１８Ａ】
2022501325.tif 000108
【図１８Ｂ】
2022501325.tif 000109
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2022501325.tif 000111
【図２０】
2022501325.tif 000112
【図２１】
2022501325.tif 000113
【図２２】
2022501325.tif 000114
【図２３】
2022501325.tif 000115
【図２４】
2022501325.tif 000116
【図２５】
2022501325.tif 000117
【図２６】
2022501325.tif 000118
【図２７】
2022501325.tif 000119
【図２８】
2022501325.tif 000120
【図２９】
2022501325.tif 000121
【図３０】
2022501325.tif 000122
【図３１】
2022501325.tif 000123
【図３２】
2022501325.tif 000124
【図３３】
2022501325.tif 000125
【図３４】
2022501325.tif 000126
【図３５】
2022501325.tif 000127
【図３６】
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【図３７】
2022501325.tif 000129
【図３８】
2022501325.tif 000130
【図３９】
2022501325.tif 000131
【図４０】
2022501325.tif 000132
【図４１】
2022501325.tif 000133
【図４２】
2022501325.tif 000134
【図４３】
2022501325.tif 000135
【図４４】
2022501325.tif 000136
【図４５】
2022501325.tif 000137
【図４６】
2022501325.tif 000138
【配列表】
2022501325000001.app
【国際調査報告】
2022501325.tif 000139
2022501325.tif 000140
2022501325.tif 000141