(57)【要約】  本発明は、マクロサイクル、グルコース模倣体、およびヒトインスリンまたはその類似体を含むグルコース感受性インスリン誘導体、ならびにそれらの医薬品使用を提供する。さらに、本発明は、こうしたグルコース感受性インスリン誘導体を含む医薬組成物、および糖尿病に関連する医学的状態の治療または予防のためのこうした化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン誘導体であって、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体、グルコース模倣体、および式Ｍ１のマクロサイクルＭを含むインスリン誘導体：
【化１】
2022501364.tif 000126
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【化２】
2022501364.tif 000127
から独立して選択され  
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す。
【請求項２】
前記グルコース模倣体が、β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
それぞれ前記マクロサイクルおよび前記グルコース模倣体が各々、前記ヒトインスリンまたは前記ヒトインスリン類似体に任意選択的なリンカーを介して結合し、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点が、
ａ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＡ鎖の１位におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基、
ｂ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基、および
ｃ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基またはアルファカルボン酸基と、から選択され、
前記マクロサイクルおよび前記グルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体上の前記同じ結合点に結合していないことを条件とする、請求項２に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記マクロサイクルが、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合し、かつ前記グルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基に結合する、請求項３に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記マクロサイクルＭが、リンカーを介して前記ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合し、前記リンカーが、式Ｌ１で示され、
【化３】
2022501364.tif 000128
式中、ＸはＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｐであり、式中、ｐは２〜４の整数であり、
式中、Ｙが、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、請求項４に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記グルコース模倣体が、リンカーを介して前記ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合し、上記のリンカーが、式Ｌ２で示され、
“−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−＃
式中、ｑは、１または２であり、
式中、ｒは、１または２であり、
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
前記インスリン誘導体が、二つのグルコース模倣体と式Ｍ１の二つのマクロサイクルＭとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
前記二つのマクロサイクルが、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合する、請求項７に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記二つのマクロサイクルＭが、三価リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合し、前記リンカーが、式Ｌ３で示され、
【化４】
2022501364.tif 000129
式中、Ｚが、ＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）３であり、
式中、Ｗは、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
前記二つのグルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位にあるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基またはイプシロンアミノ基に結合した三価リンカーを介して結合し、
前記リンカーが、
ａ）
【化５】
2022501364.tif 000130
および  
ｂ）
【化６】
2022501364.tif 000131
の群から選択されるか、または、
前記二つのグルコース模倣体が各々、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基および前記イプシロンアミノ基にそれぞれ結合した二価リンカーを介して結合し、
前記リンカーが、式Ｌ６および式Ｌ７で示され、
【化７】
2022501364.tif 000132
および
【化８】
2022501364.tif 000133
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃１は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボキシル酸基への結合点を示し、かつ  
式中、＃２は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基への結合点を示す、請求項９に記載のインスリン誘導体。
【請求項１１】
前記グルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＡ鎖の１位におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
前記インスリン誘導体が、
【化９】
2022501364.tif 000134
実施例２のＩＮＳ４、
【化１０】
2022501364.tif 000135
実施例３のＩＮＳ５、および
【化１１】
2022501364.tif 000136
実施例２５のＩＮＳ４１
の群から選択される、請求項１１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療および／または予防のための医薬組成物であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療有効量のインスリン誘導体を、薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１５】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）の治療および／または予防で使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グルコースはヒトのエネルギー恒常性において最も重要な成分であり、また制御されていない血糖は糖尿病の特徴である。糖尿病治療の主な目的は、血糖値を正常値に調節することであり、またインスリンは、この目的のために最も有効な薬剤である。しかしながら、インスリンを使用するグルコースの調節は、高血糖と低血糖との間の困難なバランスである。現代の血糖モニターを用いてさえも、低血糖は一般的に発生しており、様々なグルコース感受性インスリン送達システムが、機械的システム（ポンプ／センサー）または分子送達システムの両方の形態で状況の改善を試みて立案されている。したがって、グルコース調節生物活性（例えば、低血糖値におけるインスリンのより弱いグルコース低下活性）を有する、糖尿病関連ペプチドおよびタンパク質薬剤を配備することが有利であることになる。
【０００２】
グルコース感受性インスリン生物活性は、グルコース結合要素に加えて、血糖と競合するグルコース結合要素を結合する結合パートナーを有するインスリンを配備することによって達成することができ、そしてそれ故に、活性状態と不活性状態との間の平衡におけるインスリンフォールディングを制御する（国際特許公開公報第２０１６１４９２２２号、同第２０１０１０７５２０号）。インスリン誘導体上のグルコース結合要素が、同じインスリン上の結合パートナーを結合するとき、インスリンは、不活性または弱い活性の立体構造を獲得する。血糖値が増加するとともに、インスリン誘導体上の結合パートナーはグルコース結合剤から変位し、インスリンの立体構造が活性状態に変化する。
【０００３】
こうしたシステムは、何らかの形態でグルコース結合剤を組み込む必要がある。これが、小分子グルコース結合剤の新規設計の試みをもたらした。しかしながら、他の炭水化物との構造上の差異は非常に微妙であるため、水中での合理的な親和性および選択性を有してグルコースを結合することは、非常に困難な課題である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、グルコース感受性インスリン誘導体を提供する。本発明のインスリン誘導体は、マクロサイクルＭ、グルコース模倣体、およびヒトインスリンまたはその類似体を含む。マクロサイクルＭは、式Ｍ１で示され、
【０００５】
【化１】
2022501364.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【０００６】
【化２】
2022501364.tif 000003
から独立して選択され、
【０００７】
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す。
【０００８】
本発明のインスリン誘導体に含まれるマクロサイクルは、水性媒体中のグルコースに対して極めて高い親和性を示す。さらに、本発明のインスリン誘導体内に含まれるマクロサイクルは、他の構造的に類似した糖類（例えば、マンノースまたはフルクトース）に優るグルコースに対する前例のない選択性のレベルを示す。
【０００９】
理論に束縛されるものではないが、インスリン誘導体上のマクロサイクルＭがグルコース模倣体を同じインスリン上で結合すると、インスリンは不活性または弱い活性の立体構造を獲得すると考えられる。血糖値が増加するとともに、インスリン誘導体上のグルコース模倣体はマクロサイクルＭから変位し、インスリンの立体構造が活性状態に変化する。図１は、概略的な形態の原理を図示する（図１のインスリンにおける置換の位置を文字通りに解釈するべきではない）。
【００１０】
一態様では、本発明は、投与後に、グルコース濃度の関数としてインスリンを活性化する、インスリン誘導体の提供に関する。
【００１１】
一態様では、本発明は、例えば、グルコースが約３ｍＭ未満のレベルの低血糖レベルの状況中に、低い活性／可用性を有する、または活性／可用性を持たないインスリン誘導体の提供に関する。
【００１２】
一態様では、本発明は、例えば、グルコースが約１０ｍＭを上回る高血糖レベルに応答して、高い活性／可用性を有するインスリン誘導体の提供に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、グルコース感受性インスリン誘導体（Ｇｍ＝グルコース模倣体、Ｇ＝グルコース）の概略図である。グルコース感受性インスリン生物活性は、グルコース結合要素に加えて、血糖と競合するグルコース結合要素を結合する結合パートナー（グルコース模倣体、グルコシドなど）を有するインスリンを配備することによって達成することができ、そしてそれ故に、活性状態と不活性状態との間の平衡におけるインスリンフォールディングを制御する。
【図２】図２は、１０ｍＭのリン酸緩衝液中のＤ−グルコース（１０ｍＭ）で滴定された化合物６ｄ（５μＭ）の蛍光滴定（λｅｘ＝３１０ｎｍ）を示す。
【図３】白丸：３８０ｎｍでの測定された強度対Ｄ−グルコース濃度。破線：実験データ（１：１の結合モデル）に適合した等温線。計算したＫａ＝１４７５１．４８±６３７．３  Ｍ−１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、グルコース依存性の様式でインスリン受容体を活性化するグルコース感受性化合物に関する。
【００１５】
本発明の一態様では、本発明は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体、グルコース模倣体、およびグルコース結合剤を含むグルコース感受性インスリン誘導体に関する。
【００１６】
本発明の一態様では、グルコース結合剤は、マクロサイクルＭである。本発明の一態様では、マクロサイクルＭは、式Ｍ１で示され、
【００１７】
【化３】
2022501364.tif 000004
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【００１８】
【化４】
2022501364.tif 000005
から独立して選択され、
【００１９】
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体、二つのグルコース模倣体、および二つのグルコース結合剤を含むグルコース感受性インスリン誘導体に関する。
【００２１】
一般的な定義
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、それ故に「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小限の要素以外の異なる構造要素を有してもよい。化合物が定義された構造および／または機能的要素を含む限り、化合物はポリペプチドまたはその誘導体であってもよいということになる。「化合物」という用語はまた、本明細書の薬学的に関係のある形態を包含することも意味し、すなわち、本発明は、本明細書で定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステルにも関する。
【００２２】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の文脈で使用される場合、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸から成る。
【００２３】
「類似体」という用語は一般に、配列が参照アミノ酸配列と比較したときに一つ以上のアミノ酸変化を有するペプチドを指す。ある特定の変化を「含む」類似体は、それらの参照配列と比較したときにさらなる変化を含んでもよい。特定の実施形態では、類似体は、特定の変化を「有する」または「含む」。他の特定の実施形態では、類似体は、変化「から成る」。「から成る」または「から成っている」という用語が類似体に関連して使用される場合、例えば、類似体が、特定のアミノ酸変異の群から成るか、または成っている場合、当然のことながら、特定のアミノ酸変異は、類似体における唯一のアミノ酸変異である。対照的に、特定のアミノ酸変異の群を「含む」類似体は、追加的な変異を有してもよい。「類似体」はまた、Ｎ末端位置および／もしくはＣ末端位置におけるアミノ酸の伸長、並びに／またはＮ末端位置および／もしくはＣ末端位置におけるアミノ酸の切断も含んでもよい。
【００２４】
一般に、アミノ酸残基は、それらの完全な名称、それらの１文字コード、および／またはそれらの３文字コードによって特定されてもよい。これら三つのやり方は、完全に均等である。
【００２５】
「誘導体」という用語は一般に、化学修飾によって、特に一つ以上の置換基の共有結合によって、天然ペプチドまたはその類似体から調製されてもよい化合物を指す。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質原性（または天然）アミノ酸（その中でも、２０個の標準アミノ酸）だけでなく、非タンパク質原性（または非天然）アミノ酸も含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質の中へと天然に組み込まれるものである。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質中に見出されないか、または標準細胞機構によって産生されないかのいずれかである（例えば、それらは、翻訳後修飾に供されていない場合がある）。
【００２７】
以下では、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドの各アミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、しばしば側鎖と呼ばれる一つ以上の追加の基を含有する分子である。
【００２８】
以下では、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドの各炭水化物は、（別段の指定がない限り）Ｄ異性体を意味すると理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「（１−４Ｃ）アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐アルキル基を包含する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「（１−４Ｃ）アルコキシ」という用語は、１〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐アルコキシ基を包含する。
【００３１】
本明細書上記の化学式で使用される実線および破線は、例示目的のみのために使用されていることが容易に理解されるであろう（すなわち、本発明の化合物の相対的配向を表示するため）。これらは、示される化合物の絶対的な構成（すなわち、立体化学）を指すものではない。
【００３２】
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質もしくは配列またはそれらの原子の空間における配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれる。空間におけるそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。互いの鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は、「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が非対称な中心を有する場合、例えば、それが四つの異なる基に結合している場合、一対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その非対称中心の絶対的構成によって特徴付けることができ、またカーンおよびプレログのＲ配列規則およびＳ配列規則によって、または分子が偏光された光の平面を回転させる様式によって説明することができ、かつ右旋性または左旋性として指定することができる（すなわち、それぞれ（＋）または（−）異性体として）。キラル化合物は、個別のエナンチオマーとして、またはその混合物としてのいずれかで存在することができる。等しい比率のエナンチオマーを含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００３３】
本発明の化合物は、一つ以上の非対称な中心を持っていてもよく、したがってこうした化合物を、個々の（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として、またはそれらの混合物として生成することができる。別途示されていない限り、明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の説明または命名は、個々のエナンチオマーおよびそのラセミ体またはその他の混合物の両方を含むことが意図されている。立体化学の決定および立体異性体の分離の方法は、当技術分野で周知であり（“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１」の第４章の考察を参照）、例えば、光学活性出発物質からの合成またはラセミ体の分割による。本発明の化合物の一部は、幾何異性体中心（Ｅ-およびＺ−異性体）を有してもよい。本発明は、糖認識の能力を有するすべての光学、ジアステレオ異性体、および幾何異性体およびその混合物を包含することが理解されるべきである。
【００３４】
本発明のある特定のマクロサイクル化合物は、溶媒和された形態だけでなく溶媒和されていない形態（例えば、水和された形態など）で存在してもよいことも理解されるべきである。本発明が、糖認識の能力を有するすべてのこうした溶媒和された形態を包含することが理解されるべきである。ある特定の化合物は、多型を呈する場合があり、また本発明は糖認識の能力を有するすべてのこうした形態を包含することも理解されるべきである。
【００３５】
本発明のマクロサイクル化合物は、多数の異なる互変異性体で存在してもよく、また特定の式の化合物への参照は、こうしたすべての形態を含む。疑義を避けるために付言すると、化合物がいくつかの互変異性体のうちの一つにおいて存在することができ、かつ一つのみが具体的に説明または示されている場合には、すべての他の化合物は、それにもかかわらず所与の式によって受け入れられる。互変異性体の例としては、ケト形態、エノール形態、およびエノラート形態、例えば、以下の互変異性対：ケト／エノール、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、およびニトロ／アシニトロにおけるものが挙げられる。
【００３６】
アミン機能を含有する化合物はまた、Ｎ−オキシドも形成してもよい。アミン機能を含有する所与の式の化合物に対する本明細書での言及は、Ｎ−オキシドも含む。化合物がいくつかのアミン機能を含有する場合、一つ以上の窒素原子は酸化されてＮ−オキシドを形成してもよい。Ｎ−オキシドの特定の例は、三級アミンのＮ−オキシドまたは窒素含有複素環の窒素原子である。Ｎ−オキシドは、過酸化水素または過酸（例えば、ペルオキシカルボン酸）などの酸化剤で、対応するアミンを処理することによって形成することができる（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｙ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ｐａｇｅｓを参照）。より具体的には、Ｎ−オキシドは、Ｌ．Ｗ．Ｄｅａｄｙ（Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍ．１９７７，７，５０９〜５１４）の手順によって作製することができ、ここでアミン化合物は、例えばジクロロメタンなどの不活性溶媒中で、ｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）と反応する。
【００３７】
インスリン
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される二つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、二つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第一の架橋は、Ａ鎖の７位におけるシステインとＢ鎖の７位におけるシステインとの間であり、また第二の架橋は、Ａ鎖の２０位におけるシステインとＢ鎖の１９位におけるシステインとの間である。第三の架橋は、Ａ鎖の６位におけるシステインとＡ鎖の１１位におけるシステインとの間に存在する。
【００３８】
ヒトインスリンＡ鎖は、以下の配列、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）を有する一方、Ｂ鎖は、以下の配列、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）を有する。
【００３９】
人体では、このホルモンは、プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ  Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ  Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは、３１個のアミノ酸の接続ペプチドである）の構成にある、２４個のアミノ酸のプレペプチドに続いて８６個のアミノ酸を含むプロインスリンから成る一本鎖前駆体プロインスリン（プレプロインスリン）として合成される。Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ａｒｇは、Ａ鎖およびＢ鎖からの接続ペプチドの切断のための切断部位である。
【００４０】
本発明による「インスリン」は、本明細書では、ヒトインスリン、またはブタインスリンもしくはウシインスリンなどの別の種からのインスリンとして理解されるべきである。
【００４１】
「インスリンペプチド」、「インスリン化合物」、または「インスリン」という用語は、本明細書で使用される場合、インスリン活性を有する、ヒトインスリンまたはその類似体もしくは誘導体のいずれかであるペプチドを意味する。
【００４２】
インスリン類似体
本明細書で使用される場合、「インスリン類似体」という用語は、インスリンの一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または一つ以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、かつ／または一つ以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／もしくは挿入されている、修飾ヒトインスリンを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、置換、欠失、および付加（挿入を含む）を意味する。本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、ヒトインスリンの配列内のアミノ酸の置換または欠失を意味する。変異という用語は、ヒトインスリンの配列への付加、伸長、または延長を含まない。インスリン分子における変異は、鎖（ＡまたはＢ）、位置、および天然アミノ酸残基を置換するアミノ酸残基に対する１文字コードまたは３文字コードを記載して示される。
【００４４】
一実施形態では、インスリン類似体は、ヒトインスリンと比較して１０個未満のアミノ酸変異を含み、代替的に、ヒトインスリンと比較して９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個未満の変異を含む。本明細書で使用される場合、インスリン類似体に対する任意の変異は、インスリンペプチド単独に対する変異を意味し、インスリンペプチド／類似体に結合されたいかなる連結基も含まない。
【００４５】
「ｄｅｓＢ３０」または「Ｂ（１−２９）」は、Ｂ３０アミノ酸を欠く天然インスリンＢ鎖またはその類似体を意味し、また「Ａ（１−２１）」は、天然インスリンＡ鎖を意味する。それ故に、例えば、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、Ｂ鎖の３０位におけるアミノ酸が欠失しているヒトインスリン類似体である。
【００４６】
本明細書では、「Ａ１」、「Ａ２」、および「Ａ３」などの用語は、インスリンのＡ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位など（Ｎ末端から数えて）におけるアミノ酸を表す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３などの用語は、インスリンのＢ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位など（Ｎ末端から数えて）におけるアミノ酸を示す。アミノ酸に対して１文字コードを使用して、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ、およびＡ２１Ｑなどの用語は、Ａ２１位におけるアミノ酸がそれぞれＡ、Ｇ、およびＱであることを指定する。アミノ酸に対して３文字コードを使用すると、対応する表現は、それぞれＡ２１Ａｌａ、Ａ２１Ｇｌｙ、およびＡ２１Ｇｌｎである。
【００４７】
本明細書では、「アミノ酸残基」という用語は、形式上、ヒドロキシ基がカルボキシ基から除去されており、かつ／または形式上、水素原子がアミノ基から除去されている、アミノ酸である。
【００４８】
ｄｅｓＢ３０を含むヒトインスリン類似体を、インスリン誘導体の実施例で使用した。しかしながら、インスリン類似体の他の耐性変異、組み合わせ、変異数、配列延長／切断なども同様に、本発明を例示するために使用することが可能である。こうしたインスリン類似体の例は、Ｂ２８Ｄヒトインスリン、Ｂ２８Ｋ  Ｂ２９Ｐヒトインスリン、およびＢ３Ｋ  Ｂ２９Ｅヒトインスリンである。
【００４９】
一態様では、本発明のインスリン類似体は、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号３のＢ鎖）を含む。
【００５０】
一態様では、本発明のインスリン類似体は、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（配列番号１のＡ鎖および配列番号３のＢ鎖）を含む。
【００５１】
インスリン誘導体
【００５２】
本明細書で使用される場合、「インスリン誘導体」または「インスリン類似体の誘導体」という用語は、グルコース模倣体およびマクロサイクルが結合されるヒトインスリンまたはその類似体（インスリン類似体）を指す。言い換えれば、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンまたはその類似体、マクロサイクル、およびグルコース模倣体を含む。
【００５３】
一態様では、本発明のインスリン誘導体は、ヒトインスリンまたはその類似体、少なくとも一つのマクロサイクル、および少なくとも一つのグルコース模倣体を含む。
【００５４】
別の態様では、本発明のインスリン誘導体は、少なくとも二つのマクロサイクル、および少なくとも二つのグルコース模倣体を含む。
【００５５】
別の態様では、本発明のインスリン誘導体は、二つのマクロサイクル、および二つのグルコース模倣体を含む。
【００５６】
一態様では、マクロサイクルおよびグルコース模倣体はそれぞれ、リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に各々結合されてもよい。一態様では、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点は、
ａ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＡ鎖の１位におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基、
ｂ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基、および
ｃ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジンのイプシロンアミノ基またはアルファカルボン酸基、から選択される。
【００５７】
一態様では、マクロサイクルおよびグルコース模倣体は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体上の同じ結合点に結合しない。
【００５８】
マクロサイクル
本発明のインスリン誘導体内に含まれるマクロサイクルは、グルコースに対して高い親和性を示す。本発明のインスリン誘導体内に含まれるマクロサイクルは、他の構造的に類似した糖類（例えば、マンノース）に優るグルコースに対する選択性を示す。
【００５９】
本発明のインスリン誘導体内に含まれるマクロサイクルは、式Ｍ１：
【００６０】
【化５】
2022501364.tif 000006
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【００６１】
【化６】
2022501364.tif 000007
から独立して選択され、
【００６２】
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す。
【００６３】
一態様では、Ｒ１とＲ２とは同一である。一態様では、Ｒ１およびＲ２は−ＯＨである。別の態様では、Ｒ１およびＲ２は以下のものである。
【００６４】
【化７】
2022501364.tif 000008
さらなる態様では、Ｒ１およびＲ２は、以下のものである。
【００６５】
【化８】
2022501364.tif 000009
【００６６】
一態様では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は同一である。さらなる態様では、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９はエチルである。
【００６７】
グルコース模倣体
本明細書で使用される場合、「グルコース模倣体」という用語は、グルコースと構造的に類似し、かつマクロサイクルＭに結合する化合物を指す。言い換えれば、グルコース模倣体は、マクロサイクルＭに対して親和性を有する。
【００６８】
一態様では、本発明のインスリン誘導体に含まれるグルコース模倣体は、グルコシドである。さらなる態様では、本発明のインスリン誘導体に含まれるグルコース模倣体は、１−置換β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００６９】
リンカー
本発明によるインスリン誘導体は、マクロサイクルＭとヒトインスリン類似体との間のリンカー、および／またはヒトインスリン類似体とグルコース模倣体との間のリンカーをさらに含んでもよい。
【００７０】
本発明の文脈では、リンカーは、マクロサイクルおよびグルコース模倣体をそれぞれヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に共有結合するために使用される化学部分または残基である。それ故に、用語「−リンカー−」は、インスリン誘導体の化学単位を意味することが意図され、これは、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のアミノ酸残基に、およびマクロサイクルまたはグルコース模倣体にそれぞれ共有結合している。
【００７１】
結合点に応じて、リンカー末端の反応性は変化する場合がある。リンカーは、問題の産物に応じて、様々な形態を有してもよい。
【００７２】
マクロサイクルをヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に共有結合するために使用されるリンカーは、グルコース模倣体をヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に共有結合するために使用されるリンカーとは異なっていてもよい。
【００７３】
一実施形態では、リンカーは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−を含み、式中、ｐは１〜５の整数である。
【００７４】
一実施形態では、リンカーは−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２−トリアゾール−ＰｈＣＨ２である。一実施形態では、リンカーは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−である。
【００７５】
ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体とマクロサイクルおよびグルコース模倣体とのそれぞれ間の結合を生成するために、異なる長さおよび組成物を有する代替的なリンカーを採用することが可能である。
【００７６】
一態様では、マクロサイクルＭは、下記の式Ｌ１のリンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合される。
【００７７】
【化９】
2022501364.tif 000010
式中、ＸはＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｐであり、式中、ｐは２〜４の整数であり、
式中、Ｙは、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示し、
グルコース模倣体は、リンカーを介して、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基に結合され、前記リンカーは式Ｌ２で示され、
【００７８】
【化１０】
2022501364.tif 000011
式中、ｑは、１または２であり、
式中、ｒは、１または２であり、
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す。
【００７９】
第二の態様では、インスリン誘導体は、二つのグルコース模倣体および式Ｍ１の二つのマクロサイクルＭを含み、二つのマクロサイクルは、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合され、かつ二つのグルコース模倣体は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるアルファカルボン酸基および／またはリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基に結合される。二つのグルコース模倣体は、三価リンカーを介して、ヒトインスリンもしくはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基もしくはイプシロンアミノ基に結合されてもよく、または二つのグルコース模倣体の各々は、ヒトインスリンもしくはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位における、それぞれ、リジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基およびイプシロンアミノ基に結合された二価リンカーを介して、結合されてもよい。
【００８０】
一態様では、二つのマクロサイクルＭをヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に連結する三価リンカーは、式Ｌ３で示され、
【００８１】
【化１１】
2022501364.tif 000012
式中、Ｚは、ＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）３であり、
式中、Ｗは、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す。
【００８２】
一態様では、二つのグルコース模倣体をヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基に連結する三価リンカーは、式Ｌ４で示され、
【００８３】
【化１２】
2022501364.tif 000013
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃１は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボキシル酸基への結合点を示す。
【００８４】
一態様では、二つのグルコース模倣体をヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基に連結する三価リンカーは、式Ｌ５で示され、 
【００８５】
【化１３】
2022501364.tif 000014
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃２は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基への結合点を示す。
【００８６】
一態様では、二つのグルコース模倣体をヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基およびイプシロンアミノ基にそれぞれ連結する二価リンカーは、それぞれ式Ｌ６およびＬ７で示され、
【００８７】
【化１４】
2022501364.tif 000015
【００８８】
【化１５】
2022501364.tif 000016
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃１は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボキシル酸基への結合点を示し、かつ  
式中、＃２は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基への結合点を示す。
【００８９】
ヒトインスリンおよびインスリン類似体の生成
ポリペプチド、例えば、インスリンの生成は、当技術分野で周知である。インスリンまたはインスリン類似体は、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、ｔ−ＢｏｃもしくはＦｍｏｃ化学または他の十分に確立した技法を使用する固相ペプチド合成によって生成されてもよい（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９を参照）。インスリンまたはインスリン類似体はまた、類似体をコードするＤＮＡ配列を含有し、かつ好適な栄養培地内で、インスリン類似体の発現を許容する条件下で、インスリン類似体を発現する能力を有する宿主細胞を培養することを含む方法によって生成されてもよい。ヒトインスリンおよびヒトインスリン類似体の生成では、いくつかの組み換え方法が使用されてもよい。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの微生物におけるインスリンの生成に使用されてもよい方法の例は、例えば、国際特許公開公報第２００８／０３４８８１号に開示されている。
【００９０】
典型的には、インスリンまたはインスリン類似体は、例えば、欧州特許第１２４６８４５号または国際特許公開公報第２００８／０３４８８１号に開示される周知の技法によって、問題のインスリン類似体またはその前駆体をコードするＤＮＡ配列を、好適な宿主細胞内で発現させることによって生成される。
【００９１】
インスリンまたはインスリン類似体は、細胞培養培地から回収され、そしてクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製用等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿））、または抽出を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々な手順によって精製されてもよい（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）。好ましくは、インスリンまたはインスリン類似体は、抗インスリン類似体抗体カラム上で親和性クロマトグラフィーによって精製される。高速液体クロマトグラフィーなどの従来の化学的精製手段によって、追加的な精製は達成されてもよい。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法が、当技術分野で公知であり、また本明細書に記載の［インスリンまたはインスリン類似体の精製に適用されてもよい（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を参照）。
【００９２】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステル、および一つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤（複数可）を含む医薬組成物にも関する。こうした組成物は、当技術分野で公知のとおりに調製されてもよい。
【００９３】
「賦形剤」という用語は、活性治療成分（複数可）以外の任意の成分を幅広く指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であってもよい。賦形剤は、例えば、担体、希釈剤、希釈剤、錠剤補助剤として様々な目的を果たす場合があり、かつ／または活性物質の投与および／もしくは吸収を改善するように機能する場合がある。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、等張性調節剤、キレート剤および安定剤である。様々な賦形剤を伴った薬学的に活性成分の製剤化は、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第２１版（２００５）および任意のその後の版）を参照）。
【００９４】
本発明の組成物は、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤の形態であってもよい。液体製剤は、溶液または懸濁液であってもよい。別の方法として、これは、固形製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物であってもよい。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、治療剤などの第二の活性成分をさらに含んでもよく、これは併用療法の場合に投与を単純化する場合がある。
【００９６】
薬学的適応
糖尿病
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病（妊娠中）、および高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。この用語は、膵臓が産生するインスリンの量が不十分であるか、または身体の細胞がインスリンに適切に応答できず、それ故に細胞がグルコースを吸収するのを妨げる、代謝障害に対して使用される。結果として、グルコースは、血液中に蓄積する。
【００９７】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）および若年発症糖尿病とも呼ばれる１型糖尿病は、通常は絶対的インスリン欠乏をもたらすＢ細胞破壊によって引き起こされる。
【００９８】
非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および成人発症糖尿病としても知られる、２型糖尿病は、主なインスリン抵抗性、それ故に相対的なインスリン欠乏および／またはインスリン抵抗性を伴う主なインスリン分泌不全に関連している。
【００９９】
他の適応
一実施形態では、本発明による化合物は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、または１型糖尿病の治療または予防のための医薬の調製に使用される。
【０１００】
別の実施形態では、本発明による化合物は、２型糖尿病における疾患の進行を遅延または予防するための医薬として使用される。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、化合物は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、または１型糖尿病の治療または予防のための医薬として使用するためのものである。
【０１０２】
さらなる実施形態では、本発明は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、または１型糖尿病の治療または予防のための方法に関し、方法は、こうした治療を必要としている患者に、こうした治療のための有効量の本発明による化合物を投与することを含む。
【０１０３】
投与の方法
「治療」という用語は、参照される疾患、障害、または状態の予防および最小化の両方を含むことを意味する（すなわち、「治療」は、文脈によって別段の指示がないか、または明確に矛盾しない限り、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物の予防的投与および治療的投与の両方を指す。
【０１０４】
投与の経路は、本発明の化合物を体内の所望のまたは適切な場所に、例えば非経口的に（皮下、筋肉内、または静脈内など）効果的に輸送する任意の経路であってもよい。あるいは、本発明の化合物は、経口、肺、直腸内、経皮、口腔内、舌下、または経鼻で投与することができる。
【０１０５】
非経口投与については、本発明の化合物は、公知のインスリンの製剤と類似的に製剤化される。さらに、非経口投与については、本発明の化合物は、公知のインスリンの投与と類似的に投与され、医師は、この手順に精通している。
【０１０６】
投与される本発明の化合物の量、本発明の化合物を投与する頻度の決定、および任意選択で別の抗糖尿病化合物と一緒に、どの本発明の化合物（複数可）を投与するかの選択は、糖尿病の治療に精通している医師と相談して決定される。
【０１０７】
本発明は、以下の非限定的実施形態によってさらに説明される：
【０１０８】
１．  インスリン誘導体であって、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体、グルコース模倣体、および式Ｍ１のマクロサイクルＭを含むインスリン誘導体
【０１０９】
【化１６】
2022501364.tif 000017
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【０１１０】
【化１７】
2022501364.tif 000018
から独立して選択され、
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す。
【０１１１】
２．  インスリン誘導体が、式Ｍ１の二つのグルコース模倣体と二つのマクロサイクルＭとを含む、実施形態１に記載のインスリン誘導体。
【０１１２】
３．  Ｒ１およびＲ２が以下のものである、実施形態１〜２のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１３】
【化１８】
2022501364.tif 000019
【０１１４】
４．  Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の各々がエチルである、実施形態１〜３のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１５】
５．  マクロサイクルおよびグルコース模倣体がそれぞれ、任意選択的なリンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点が、
ａ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＡ鎖の１位におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基、
ｂ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基、および
ｃ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基、から選択され、
マクロサイクルおよびグルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体上の同じ結合点に結合されていないことを条件とする、実施形態１〜４のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１６】
６．  マクロサイクルＭが、リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、前記リンカーが、
＊−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−トリアゾール−ＰｈＣＨ２−＃であり、
式中、ｍは、１〜５の整数であり、
＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点である、実施形態１〜５のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１７】
７．  グルコース模倣体が、リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、前記リンカーが、
“−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−＃であり、
式中、ｎは、０〜５の整数であり、
“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点である、実施形態１〜６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１８】
８．  ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体が、ヒトインスリン類似体ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、実施形態１〜７のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１１９】
９．  グルコース模倣体が、β−Ｄ−グルコピラノシドである、実施形態１〜８のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１２０】
１０．  インスリン誘導体が、
実施例１のＢ１−マクロサイクルＢ２９−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリン８と、
実施例２のＢ１−マクロサイクルＡ１−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２と、
実施例３のＢ２９−マクロサイクルＡ１−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１３と、
実施例４のＢ１−ビス−マクロサイクルＢ２９−ビス−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１４と、から選択される、実施形態１〜９のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１２１】
１１．  糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療のための医薬組成物であって、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の治療有効量のインスリン誘導体を、薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【０１２２】
１２．  医薬として使用するための、実施形態１１に記載の医薬組成物。
【０１２３】
１３．  糖尿病を有する患者の治療において使用するための、実施形態１１に記載の医薬組成物。
【０１２４】
本発明は、以下の非限定的実施形態によってなおさらに説明される。
【０１２５】
１４．  ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体、グルコース模倣体、および式Ｍ１のマクロサイクルを含むインスリン誘導体であって、
【０１２６】
【化１９】
2022501364.tif 000020
式中、Ｒ１およびＲ２は、−ＯＨ、
【０１２７】
【化２０】
2022501364.tif 000021
から独立して選択され、
式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は独立して、水素、ハロゲン、（１−４Ｃ）アルキルおよび（１−４Ｃ）アルコキシから独立して選択され、
式中、Ｒ３は、式Ｍ１のマクロサイクルの結合点を示す、インスリン誘導体。
【０１２８】
１５．  グルコース模倣体が、グルコシドである、実施形態１４に記載のインスリン誘導体。
【０１２９】
１６．  グルコース模倣体が、β−Ｄ−グルコピラノシドである、実施形態１５に記載のインスリン誘導体。
【０１３０】
１７．  Ｒ１およびＲ２が−ＯＨである、実施形態１４〜１６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１３１】
１８．  Ｒ１およびＲ２が以下のものである、実施形態１４〜１６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１３２】
【化２１】
2022501364.tif 000022
【０１３３】
１９．  Ｒ１およびＲ２が以下のものである、実施形態１４〜１６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１３４】
【化２２】
2022501364.tif 000023
【０１３５】
２０．  Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の各々がエチルである、実施形態１４〜１９のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１３６】
２１．  マクロサイクルおよびグルコース模倣体がそれぞれ、任意選択的なリンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点が、
ａ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＡ鎖の１位におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基、
ｂ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基、および
ｃ）ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基またはアルファカルボン酸基と、から選択され、
マクロサイクルおよびグルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体上の同じ結合点に結合されていないことを条件とする、実施形態１〜４のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１３７】
２２．  マクロサイクルが、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合され、かつ二つのグルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基に結合される、実施形態２１に記載のインスリン誘導体。
【０１３８】
２３．  マクロサイクルＭが、リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、上記のリンカーが、式Ｌ１で示され、
【０１３９】
【化２３】
2022501364.tif 000024
式中、ＸはＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｐであり、式中、ｐは２〜４の整数であり、
式中、Ｙは、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、実施形態２２に記載のインスリン誘導体。
【０１４０】
２４．  グルコース模倣体が、リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体に結合され、前記リンカーが、式Ｌ２で示され、
“−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−＃
式中、ｑは、１または２であり、
式中、ｒは、１または２であり、
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、実施形態２３に記載のインスリン誘導体。
【０１４１】
２５．  ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体が、ヒトインスリン類似体ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、実施形態１４〜２４のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１４２】
２６．  インスリン誘導体が、
実施例１のＩＮＳ１
【０１４３】
【化２４】
2022501364.tif 000025
と；
実施例５のＩＮＳ９と、
実施例８のＩＮＳ１８と、
実施例９のＩＮＳ２１と、
実施例１２のＩＮＳ２８と、
実施例１４のＩＮＳ３０と、
実施例１８のＩＮＳ３４と、
実施例１９のＩＮＳ３５と、
実施例２０のＩＮＳ３６と、
実施例２１のＩＮＳ３７と、
実施例２２のＩＮＳ３８と、の群から選択される、実施形態２５に記載のインスリン誘導体。
【０１４４】
２７．  インスリン誘導体が、二つのグルコース模倣体と式Ｍ１の二つのマクロサイクルＭとを含む、実施形態１４〜２２のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１４５】
２８．  二つのマクロサイクルが、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合される、実施形態２７に記載のインスリン誘導体。
【０１４６】
２９．  二つのマクロサイクルＭが、三価リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の１位におけるアルファアミノ基に結合され、前記リンカーが、式Ｌ３で示され、
【０１４７】
【化２５】
2022501364.tif 000026
式中、Ｚは、ＣＨ２−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）３であり、
式中、Ｗは、ＣＨ２−、（ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）、または−Ｐｈ−ｐａｒａ−ＣＨ２−であり、
式中、＊は、マクロサイクルＭへの結合点を示し、かつ  
式中、＃は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体への結合点を示す、実施形態２８に記載のインスリン誘導体。
【０１４８】
３０．  二つのグルコース模倣体が、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基および／またはイプシロンアミノ基に結合される、実施形態２９に記載のインスリン誘導体。
【０１４９】
３１．  二つのグルコース模倣体が、三価リンカーを介してヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基またはイプシロンアミノ基に結合され、
前記リンカーが、
ａ）
【０１５０】
【化２６】
2022501364.tif 000027
および  
ｂ）
【０１５１】
【化２７】
2022501364.tif 000028
の群から選択され、
または、二つのグルコース模倣体が各々、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボン酸基およびイプシロンアミノ基にそれぞれ結合された二価リンカーを介して結合され、
前記リンカーが、式Ｌ６および式Ｌ７で示され、
【０１５２】
【化２８】
2022501364.tif 000029
および
【０１５３】
【化２９】
2022501364.tif 000030
式中、“は、グルコース模倣体への結合点を示し、かつ  
式中、＃１は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のアルファカルボキシル酸基への結合点を示し、かつ  
式中、＃２は、ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体のＢ鎖の２９位におけるリジン（Ｋ）のイプシロンアミノ基への結合点を示す、実施形態３０に記載のインスリン誘導体。
【０１５４】
３２．  ヒトインスリンまたはヒトインスリン類似体が、ヒトインスリン類似体ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、実施形態２７〜３１のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１５５】
３３．  インスリン誘導体が、
実施例１０のＩＮＳ２２と、
実施例１３のＩＮＳ２９と、
実施例１６のＩＮＳ３２と、
実施例１７のＩＮＳ３３と、の群から選択される実施形態３２に記載のインスリン誘導体。
【０１５６】
３４．  インスリン誘導体が、実施例２５のＩＮＳ４１である、実施形態１４に記載のインスリン誘導体。
【０１５７】
３５．  インスリン誘導体が、実施例３のＩＮＳ５である、実施形態１４に記載のインスリン誘導体。
【０１５８】
３６．  インスリン誘導体が、実施例２のＩＮＳ４である、実施形態１に記載のインスリン誘導体。
【０１５９】
３７．  インスリン誘導体が、インスリン受容体に結合する能力を有する、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６０】
３８．  インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースの存在下において、グルコースが存在しないときより高いインスリン受容体親和性を有する、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６１】
３９．  インスリン誘導体が、２０ｍＭのグルコースの存在下において、グルコースが存在しないときより少なくとも２倍高いインスリン受容体親和性を有する、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６２】
４０．  糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療および／または予防のための医薬組成物であって、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載の治療有効量のインスリン誘導体を、薬学的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【０１６３】
４１．  医薬として使用するための、実施形態４０の医薬組成物。
【０１６４】
４２．  糖尿病の治療および／または予防において使用するための、実施形態４０の医薬組成物。
【０１６５】
４３．  医薬として使用するための、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６６】
４４．  糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）の治療および／または予防で使用するための、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６７】
４５．  糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）の治療および／または予防のための方法で使用するための、実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体。
【０１６８】
４６．  糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、およびメタボリックシンドローム（メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群）の治療および／または予防のための方法であって、それを必要とする患者への有効量の実施形態１４〜３６のいずれか一つに記載のインスリン誘導体の投与を含む、方法。
【０１６９】
［実施例］
化学構造は、化学名が曖昧でない限り、すべての最終生成物について、および中間生成物についても示されている。最終生成物および一部の中間体は、それらの構造に加えて、以下のセクションで化学名とともにリストされる。しかしながら、これらの化学名は、生成物を明確に定義する完全な化学名ではなく、また読み易くするためにのみ提供される。ＰＥＧリンカーのナンバリングに使用される命名法は文献によって異なり、本明細書では、ＰＥＧ３は、三つのエチレン基を有するＰＥＧリンカーを示し、ＰＥＧ４は、四つのエチレン基を有するＰＥＧリンカーを示す、などとしている。
【０１７０】
材料および方法
略語リスト
ＣＶ          カラム体積
ＤＢＵ        １，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ７−エン
ＤＣＭ        ジクロロメタン
ＤＩＣ        Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＦ        Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ              ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ            酢酸エチル
ＤＩＰＥＡ            Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ       炭酸９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジル
ＨＢＴＵ              ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ              １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＮＳｕ            Ｍ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＲＭＳ              高分解能質量分析
ＬＣＭＳ              液体クロマトグラフィー質量分析
ＭｅＣＮ              アセトニトリル
ＮＭＲ        核磁気共鳴
ＮＭＰ        Ｎ−メチル−ピロリドン
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高速クロマトグラフィー
ＴＥＭＰＯ            （２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル  
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ＴＨＰＴＡ            トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン
【０１７１】
ビルディングブロックの調製
【０１７２】
化合物１の調製
【０１７３】
【化３０】
2022501364.tif 000031
３，４−ジアミノ安息香酸（４１．０ｇ、０．２６９ｍｏｌ）を、飽和ＮａＨＣＯ３（０．４０Ｌ）およびアセトニトリル（０．４０Ｌ）と混合し、褐色のスラリーを得た。次に、固体のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（９９．９９ｇ、０．２９６ｍｏｌ）を５分間にわたり少しずつ添加した。不均質な懸濁液を室温で１６時間攪拌し、その後１ＭのＨＣｌ（水溶液）で酸性化した。固体をフリット上に収集し、冷たいジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）、ヘキサン（３×１００ｍＬ）、次いでＭｅＯＨ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。褐色の固体（１０１ｇ、０．２６９ｍｏｌ、１００％）。この中間体（１０．０ｇ、０．０２７ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（８．１８１ｇ、０．０５３ｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（２０．２５９ｇ、０．０５３ｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１８．６１０ｍＬ、０．１０７ｍｏｌ）中に溶解した。不均質なスラリーを室温で９０分間攪拌し、その後溶媒を真空中で除去して、粘稠な油を得た。油をＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）中に溶解し、そして急速に攪拌している水（２００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）との混合物へと添加した。約２分後、沈殿物が形成され、そしてジエチルエーテル（１００ｍＬ）をフラスコに加えた。１０分間攪拌した後、固体１を濾過によって収集し、そして水（３×１０ｍＬ）とジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で洗浄した後、真空下で１６時間乾燥させた。
１Ｈ  ＮＭＲ：  （５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．９４（ｓ、１Ｈ）、８．１４（ｄｄ、Ｊ＝１７．７、８．４Ｈｚ、２Ｈ）、８．０１−７．９３（ｍ、１Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．８７−７．６８（ｍ、６Ｈ）、７．６８−７．６１（ｍ、１Ｈ）、７．５４（ｄｔ、Ｊ＝１１．５、７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、６．８９（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４６（ｓ、２Ｈ）、４．４４（ｓ、２Ｈ）、４．３１（ｓ、１Ｈ）、３．４０（ｓ、７Ｈ）、３．０３（ｓ、７Ｈ）、２．５０（ｓ、４Ｈ）。
【０１７４】
化合物２ａの調製
【０１７５】
【化３１】
2022501364.tif 000032
【０１７６】
ＮａＨ（３．８０９ｇ、０．０９５ｍｏｌ、鉱油中６０％）をシュレンク管（１００ｍＬ）に添加し、窒素下に定置した。３×２５ｍＬの６０〜８０℃の石油エーテルで、固体を洗浄することにより、鉱油を除去した。洗浄したＮａＨを、無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中に懸濁し、そして氷浴中で冷却しながら約１０分間激しく攪拌した。固体トリフルオロアセトアミド（１６．１４７ｇ、０．１４３ｍｏｌ）を、窒素向流下で少しずつ添加した。混合物を５分間攪拌した後、室温まで温めた。気体の放出が完全に停止したら（１時間以内）、固体１，３，５−トリブロモメチル−２，４，６−トリエチルベンゼン（７．００ｇ、０．０１６ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を窒素向流下で少しずつ添加し、そして得られた白色懸濁液を室温で攪拌した。約１８時間後、懸濁液を０．５ＭのＨＣｌ（１５０ｍＬ）の中へと注ぎ、そして淡いオレンジ色の沈殿物をフリット上で収集した。固体を水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空下で一晩乾燥させた（約１０−２ｍｂａｒ）。オフホワイトの固体（７．９１０ｇ、０．０１５ｍｏｌ、９３％）。中間体アセトアミド（４．９０ｇ、０．００９ｍｏｌ）を、メタノール（３８．６ｍＬ）および水（３８．６ｍＬ）中に溶解した。ＮａＯＨ（１．０５ｇ、３．１５０ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を攪拌して、６５℃で約１８時間攪拌した。固体Ｂｏｃ２Ｏ（７．２８７ｇ、０．０３３ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．５３４ｍＬ、０．０２６ｍｏｌ）を追加し、そして反応物を周囲温度でさらに４時間攪拌した。反応混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）、１ＭのＮａＯＨ（２００ｍＬ）および食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を濃縮乾固し、結果として得られた粗生成物をＭＰＬＣ（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＤＣＭ中０〜５０％ＭｅＯＨを用いる）によって精製した。無色固体２ａ（４．８２０ｇ、０．００９ｍｏｌ、９６％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ｍ．ｂｒ  ４．３３（９Ｈ、ＡｒＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、ＮＨ）、ｑ．  ２．７１（６Ｈ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、ＡｒＣＨ２ＣＨ３）、ｓ．  １．４４（２７Ｈ、ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、ｔ．  １．１９（９Ｈ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、ＡｒＣＨ２ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １５５．５（ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、１４３．９、１３２．６（Ａｒ）、７９．７（ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、３８．９  ＡｒＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、２８．６（ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３）、２３．０（ＡｒＣＨ２ＣＨ３）、１６．７（ＡｒＣＨ２ＣＨ３）。
【０１７７】
化合物２ｂの調製
【０１７８】
【化３２】
2022501364.tif 000033
予め乾燥させた２００ｍＬのシュレンク管に、磁気攪拌器、および化合物２ａ（１．２６６ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を充填し、次いで窒素雰囲気下に定置した。２−クロロピリジン（１．７ｍＬ、２０．２１ｍｍｏｌ）および無水ＤＣＭ（７０ｍＬ）を、シリンジを介して添加し、無色の均質な溶液を得た。トリフリン酸無水物（１．５ｍＬ、１０．１１ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら（４００ｒｐｍ）２分間にわたって周囲温度で滴下して添加した。反応混合物の小さいアリコート（約５０ｍＬ）を引き抜き、かつＴＬＣ（ＳｉＯ２、ガソリン中５０％のＥｔ２Ｏ）によって分析する前に、反応物を３０分間攪拌し、出発物質（Ｒｆ＝０．２４）の完全な消費と２ｂ（Ｒｆ＝０．５）への変換が明らかになった。溶媒をロータリーエバポレーター上で除去して、オフホワイトの固体を得た。固体を、Ｅｔ２Ｏ（×２  １５ｍＬ）を用いて抽出し、アルミナプラグ（２０ｍｍ×２０ｍｍ）を通過させ、さらに２０ｍＬのＥｔ２Ｏで溶出した。無色の濾液を蒸発乾固させ、残渣をヘキサンから再結晶させた。無色結晶性固体２ｂ（０．４３５ｇ、１．３３ｍｍｏｌ、５９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、トルエン−ｄ６）δ  ｓ．  ３．９３（６Ｈ、ＡｒＣＨ２ＮＣＯ）、ｍ．  ２．５１−２．３７（６Ｈ、ＡｒＣＨ２ＣＨ３）、ｍ．  ０．９６−０．８６（９Ｈ、ＡｒＣＨ２ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、トルエン−ｄ６）１４３．２、１３２．６（Ａｒ）、１２４．０（ＮＣＯ）、４０．４（ＡｒＣＨ２ＮＣＯ）、２２．８（ＡｒＣＨ２ＣＨ３）、１６．０（ＡｒＣＨ２ＣＨ３）。
【０１７９】
【化３３】
2022501364.tif 000034
【０１８０】
化合物３の調製
化合物１（３．３０８ｇ、５．４４３ｍｍｏｌ）および無水ＤＩＰＥＡ（１．２７０ｍＬ、７．２５８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解した。１１−アジド−３，６，９−トリオキサンウンデカン−１−アミン（１．０００ｍＬ、４．５３６ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。室温で１６時間攪拌した後、反応混合物を真空下で濃縮して、褐色の残渣を得た。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、５０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで溶出した。画分を含有する生成物を組み合わせ、かつ蒸発乾固して、無色の無定形の固体３（２．５０ｇ、４．３５ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ：  （４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ７．７４（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．４５（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．３８（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．２６（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．０５（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）、６．８４（ｓ、１ＨＡｒＨ）、６．６５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１ＨＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、４．４９（ｓ、１Ｈ、Ｆｌｕ−ＣＨ２）、４．１８（ｓ、２Ｈ、Ｆｌｕ−ＯＣＨ２）、３．６８−３．４５（ｍ、１４Ｈ、ＯＣＨ２）、３．２７（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２ＨＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、１．３４（ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｎ３ＣＨ２）。
【０１８１】
化合物４の調製
【０１８２】
【化３４】
2022501364.tif 000035
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリス［トリス（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−エチル）メチル］−３，３’，３’’−（１−アミノメタントリイル）−トリプロパンアミド（７．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ、Ａｌｌｉｃｈｅｍ（Ｇ２アミン））および化合物１（５．３１０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２１０ｍＬ）中に溶解した。トリエチルアミン（２．２３ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１８時間攪拌させた。反応混合物を、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、そして得られた懸濁液を濾過した。得られた濾液を真空下で濃縮し、そして残渣を、ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中で１２０ｇのＣ１８カートリッジへと装填し、逆相クロマトグラフィー（水勾配中の７０〜１００％アセトン）により精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、かつ蒸発乾固して、オフホワイトの無定形の固体４（７．６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ：  （４００ＭＨｚ、（ＣＤＣｌ３）：  δ  １．４３（ｓ、８１Ｈ、Ｃ（２６）Ｈ３）、１．９５（ｍ、１８Ｈ、Ｃ（２３）Ｈ２）、２．１１（ｔ，
Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、Ｃ（１８）Ｈ２）、２．１７（ｍ、１８Ｈ、Ｃ（２２）Ｈ２）、２．２５（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、Ｃ（１９）Ｈ２）、４．２７（ｍ、３Ｈ、Ｃ（７）ＨおよびＮＨ２）、４．４７（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ（８）Ｈ２）、６．０８（ｓ、３Ｈ、ＮＨ）、６．７６（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（１３）Ｈ）、７．２６−７．３１（ｍ、２Ｈ、Ｃ（４）Ｈ）、７．３８（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ（３）Ｈ）、７．５７−７．６９（ｍ、２Ｈ、Ｃ（５）Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（２）Ｈ）、７．７５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ、Ｃ（２）Ｈ）、７．７８（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（１５）Ｈ）、８．５４（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ：  （１００ＭＨｚ、（ＣＤＣｌ３）：δ２８．０（Ｃ２６）、２９．８（Ｃ２２）、２９．９（Ｃ２３）、３１．８（Ｃ１９）、３２．２（Ｃ１８）、４７．２（Ｃ７）、５３．４（Ｃ１７）、５７．４（Ｃ２１）、６７．３（Ｃ８）、８０．６（Ｃ２５）１１６．６（Ｃ１２）、１１９．９（Ｃ２），１２２．６（Ｃ１０）、１２４．６（Ｃ１４）、１２５．３（Ｃ４）、１２６．０（Ｃ１５）、１２６．８（Ｃ１３）、１２７．０（Ｃ５）、１２７．６（Ｃ３）、１４１．３（Ｃ１）、１４３．８（Ｃ６）、１４５．３（Ｃ１１）、１５４．９（Ｃ９）、１６６．６（Ｃ１６）、１７２．７（Ｃ２４）、１７３．１（Ｃ２０）；
ＩＲ：λｍａｘ（ｃｍ−１）２９７７、２９６３、１７５２、１７２３、１６８９、１６３７、１５３５、１３６７、１２４２、１１５１、１０９８、８４４；
ＨＲＭＳ：  （ＥＳＩ＋）実測値［Ｍ＋２Ｎａ］２＋：  ９２１．０２５２。
【０１８３】
化合物５ａの調製
【０１８４】
【化３５】
2022501364.tif 000036
フラスコの中へと、１−アミノ−３，６，９−トリオキサドデカン−１２−オイック酸（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ）（１０．０ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加した。混合物を、氷浴（０℃）中で冷却した。塩化チオニル（７．２５ｍＬ、９９．４ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。混合物を加熱して還流し（３時間）、周囲温度まで冷まし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ、白色沈殿物を生成）で希釈した。固体を真空濾過によって単離し、そして真空下で乾燥して、純粋な塩酸塩エステル１ｂ（８．０９ｇ、２５．６ｍｍｏｌ、収率６８％、白色の固体５ａ）を得、これを次のステップでそのまま使用した。
【０１８５】
化合物５ｂの調製
【０１８６】
【化３６】
2022501364.tif 000037
化合物１（１．１００ｇ、２．０１４ｍｍｏｌ）および無水ＤＩＰＥＡ（０．７０２ｍＬ、４．０２８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（７０ｍＬ）中に溶解した。無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解された化合物５ａ（０．７６３ｇ、２．４１７ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。室温１５０ｍＬで１６時間攪拌した後、飽和ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）を添加した。得られた懸濁液を、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして蒸発乾固させた。得られた残渣を、最小限の沸騰ＥｔＯＡｃから再結晶させて、ワックス状の固体５ｂ（１．０３ｇ、１．６２ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
【０１８７】
化合物６ａの調製
【０１８８】
【化３７】
2022501364.tif 000038
シュレンク管に、攪拌棒、化合物４（０．９３３ｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）、化合物２ｂ（０．１００ｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）および無水ピリジン（０．１４７ｍＬ、１．８３３ｍｍｏｌ）を充填した。次いで、混合物を５時間、５０℃に加熱した。無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中に溶解した化合物３（０．２２８ｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応物をさらに１２時間攪拌した。反応混合物を、真空下で濃縮し、そして粗残渣を、５ｍＬのＭｅＣＮ中、１２０ｇのＣ１８カートリッジに装填し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（１ＣＶ  ８５％アセトン／Ｈ２Ｏ、１０ＣＶ  ８５〜９５％アセトン／Ｈ２Ｏ、２ＣＶ  ９５％アセトン）によって精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、かつ蒸発乾固して、オフホワイトの無定形の固体（４５８ｍｇ、４６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ：  （４００ＭＨｚ、（ＣＤ３ＯＤ）：δ８．０２−７．４６（１９Ｈ、ｂｒ．ｍ、ＡｒＨ）、７．４６−７．１１（１４Ｈ、ｂｒ．ｍ、ＡｒＨ）、４．６０−４．３０（１２Ｈ、ｂｒ．ｍ、ＮＨＣＨ２ＰｈおよびＦｍｏｃＨ）、４．１９（３Ｈ、ｂｒ．ｓ、ＮＨＣＨ２ＰｈおよびＦｍｏｃＨ），３．７１−３．５５（１４Ｈ、ｍ、ＰＥＧＣＨ２）、３．３３（２Ｈ、ｍ、ＰＥＧＣＨ２）、２．８５（６Ｈ、ｂｒ．ｓ、ＣＨ２）、２．３５−１．８６（９６Ｈ、ｍ，デンドリマーＣＨ２）、１．４２（１６２Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、１．２３（９Ｈ、ｂｒ．ｓ、ＣＨ３）；
ＨＲＭＳ：  （ＥＳＩ＋）Ｃ２４４Ｈ３５２Ｎ２１Ｏ５７Ｎａ３２＋に対する計算値：１５２０．８４０７、実測値［Ｍ＋３Ｎａ］３＋：  １５２０．８３９５。
【０１８９】
化合物６ｂの調製
【０１９０】
【化３８】
2022501364.tif 000039
化合物６ａ（２．４００ｇ、０．５３４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２６ｍＬ）中に溶解し、そして室温かつ窒素下でＤＢＵ（０．４７９ｍＬ、３．２０４ｍｍｏｌ）を用いて処理した。１時間後、反応混合物を真空下で濃縮してＤＣＭを除去し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解し、ＨＣｌ（５０ｍＬ、１Ｍ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で有機相を乾燥し、濾過し、そして得られた濾液を真空下で濃縮した。粗残渣を、５ｍＬのＭｅＣＮ中で、１２０ｇのＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８  １３５カートリッジに装填し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（７０〜１００％のＭｅＯＨ：水勾配）によって精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、かつ蒸発乾固して、淡い黄色の無定形の固体６ｂ（１．５６ｇ、０．４０８ｍｍｏｌ、７６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．９１（ｓ、２Ｈ）、７．４１（ｓ、７Ｈ）、７．３８（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２３（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．１０（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｓ、６Ｈ）、３．７１−３．５５（ｍ、１４Ｈ）、３．５１（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．９６−２．７２（ｍ、６Ｈ）、２．２８−２．１３（ｍ、４８Ｈ）、２．１３−２．０３（ｍ、１２Ｈ）、２．０１−１．８３（ｍ、３６Ｈ）、１．４２（ｓ、１６２Ｈ）、１．３１−１．１５（ｍ、９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７５．５、１７４．４、１７０．２、１７０．１、１５８．０、１５７．９、１４５．１、１４１．８、１４１．４、１３３．９、１３２．８、１３２．３、１２９．９、１２９．７、１２４．９、１２４．５、１１８．９、１１８．４、１１７．３、１１７．０、８１．６、７１．６、７１．５、７１．３、７１．１、７０．６、５９．３、５８．７、５１．７、４０．９、３９．３、３２．５、３２．２、３０．７、３０．４、２８．４、２３．９、１７．０。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  Ｃ１９９Ｈ３２８Ｎ２１Ｏ５１に対する必要とされる計算値：１２７６．１２３９、実測値：１２７６．１３０５。
【０１９１】
化合物６ｃの調製
【０１９２】
【化３９】
2022501364.tif 000040
化合物６ｂ（１．０５７ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン中に溶解し、窒素下で５０℃に加熱した。別個のナシ型フラスコ内に化合物２ｂ（０．１０８ｇ、０．３３１ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（１１．５００ｍＬ）中に溶解し、そしてシリンジポンプを介して添加した（１．２ｍＬ／時間）。添加が完了した後、反応混合物を真空下で濃縮し、トルエン（５０ｍＬ）を用いて共沸して残留ピリジンを除去して、オレンジ色の固体を得た。粗生成物を、５ｍＬのＭｅＣＮ中、１２０ｇのＣ１８カートリッジの上へ置き、そして逆相フラッシュクロマトグラフィー（８０〜１００％アセトン：水勾配）によって精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、かつ蒸発乾固して、淡いオレンジ色の無定形の固体６ｃ（０．７０ｇ、０．１６９ｍｍｏｌ、６１％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０９−７．８６（ｍ、６Ｈ）、７．６４（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．５８（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４（ｓ、６Ｈ）、４．５７−４．２４（ｍ、１２Ｈ）、３．６９−３．５４（ｍ、１２Ｈ）、３．５３−３．４５（ｍ、２Ｈ）、３．３４−３．３０（ｍ、２Ｈ）、３．０７−２．８２（ｍ、６Ｈ）、２．８０−２．６８（ｍ、６Ｈ）、２．３３−２．０４（ｍ、６０Ｈ）、２．０４−１．８０（ｍ、３６Ｈ）、１．４１（ｓ、１６２Ｈ）、１．２８−１．１１（ｍ、１８Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．３、１７４．２、１７３．１、１６８．３、１６８．０、１５７．１、１５６．０、１５５．９、１４３．２、１４３．２、１４３．１、１３５．８、１３５．４、１３３．０、１３３．０、１３２．７、１３２．５、１２９．９、１２９．２、１２８．８、１２８．１、１２４．７、１２４．６、１２１．０、１２０．９、８０．３、７０．３、７０．３、７０．２、７０．０、６９．８、６９．３、５８．１、５７．５、５７．４、５０．４、３９．６、３７．６、３７．４、３１．１、３０．９、３０．９、２９．４、２９．１、２７．１、２２．３、１５．５、１５．４、１５．３。
ＨＲＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  Ｃ２１７Ｈ３４９Ｎ２４Ｏ５４に対する必要とされる計算値：１３８５．１７６８、実測値：１３８５．１８２４。
【０１９３】
化合物６ｄの調製
【０１９４】
【化４０】
2022501364.tif 000041
化合物６ｃ（３３４．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８．００ｍＬ）およびＴＦＡ（５．５０ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）中に溶解し、室温で１６時間攪拌した。反応混合物を水（９０ｍＬ）の中へと注ぎ、そしてＤＣＭを真空下で蒸発させた。得られた白色の固体を、遠心分離によって収集した。ペレットを水（３０ｍＬ）中に再懸濁（ホモジネートした）し、そして遠心分離した。上清をデカントし、そして得られた固体を高真空下で乾燥して、オフホワイトの固体６ｄを得た。２５０ｍｇ、０．０７９６ｍｍｏｌ、９９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中の重水素化リン酸緩衝液）δ  ７．７８−７．６０（ｍ、６Ｈ）、７．５２−７．４１（ｍ、３Ｈ）、７．３３（ｓ、３Ｈ）、４．５５−４．０７（ｍ、１２Ｈ）、３．７０−３．３８（ｍ、１４Ｈ）、３．２４（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．０２−２．９４（ｍ、１Ｈ）、２．８１−２．４６（ｍ、１２Ｈ）、２．２６−２．１１（ｍ、１２Ｈ）、２．１０−１．８６（ｍ、４８Ｈ）、１．８６−１．６３（ｍ、３６Ｈ）、１．２３−０．７９（ｍ、１８Ｈ）。
【０１９５】
化合物７ａの調製
【０１９６】
【化４１】
2022501364.tif 000042
【０１９７】
化合物７ａを、化合物５ｂおよび化合物２ｂを使用して化合物６ａと類似の様式で調製した。
【０１９８】
化合物７ｂの調製
【０１９９】
【化４２】
2022501364.tif 000043
【０２００】
化合物７ｂを、化合物７ａを使用して化合物６ｂと類似の様式で調製した。
【０２０１】
化合物７ｃの調製
【０２０２】
【化４３】
2022501364.tif 000044
【０２０３】
化合物７ｃを、化合物７ｂを使用して化合物６ｃと類似の様式で調製した。
【０２０４】
化合物７ｄの調製
【０２０５】
【化４４】
2022501364.tif 000045
化合物７ｃ（４２１．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）および０．５ＭのＮａＯＨ（水溶液）（１０ｍＬ）中に溶解し、そして２時間攪拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、そして得られた懸濁液を、０．１ＭのＨＣｌ（ａｑ）を使用してｐＨへと取り、次いでＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機抽出物を組み合わせ、そしてＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで蒸発乾固して、オフホワイトの固体７ｄ（４２０．１ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
【０２０６】
Ｏ−スクシンイミジルＰＥＧ−β−Ｄ−グルコピラノシドカルボキシレート８の調製
【０２０７】
【化４５】
2022501364.tif 000046
スクシンイミジルエステルβ−Ｄ−グルコピラノシドＰＥＧ３  ８は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（１当量）での形質転換によって、ＤＭＦ中に溶解されたカルボン酸（Ｓｕｓｓｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から調製される。
【０２０８】
Ｏ−２，３，４，６−テトラアセチル−ジエチレングリコール−β−Ｄ−グルコピラノシド９の調製
【０２０９】
【化４６】
2022501364.tif 000047
２５ｍＬのジクロロエタン中のＯ−ペルアセチル−アルファ−ブロモ−Ｄ−グルコピラノシド（３ｇ、７．３ｍｍｏｌ）に、ジエチレングリコール（８．９ｇ、８３．７ｍｍｏｌ）および２スプーンのモルシーブ（ｍｏｌ  ｓｉｅｖｅ）、次いで炭酸銀（３．６ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を一晩激しく攪拌した。混合物を、６０ｍＬのトルエンで希釈し、そしてセライトを通して濾過して固体を除去し、次いで溶液を、食塩水で２回および水で１回洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥し、そして真空中で濃縮した。油性の粗残渣を、エーテルで粉砕し、そして白色の結晶が形成された。これらを、ジエチルエーテルで２回洗浄し、次いでデシケーター内で乾燥させて、９が提供された。
【０２１０】
Ｏ−ペルアセチル−ジエチレングリコール−β−グルコピラノシドカルボン酸１０の調製
【０２１１】
【化４７】
2022501364.tif 000048
アセトン（５０ｍＬ）中のグルコシド９（１．３ｇ、２．９７９ｍｍｏｌ）の混合物に、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）を添加し、そして混合物を氷浴中で冷却した。次いでＴＥＭＰＯ（９．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＮａＢｒ  ３０．３８４ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてトリクロロイソシアヌル酸（１．３８ｇ、５．９５８ｍｍｏｌ）を約２０分間にわたって小さいアリコートで加えた。次いで、反応物を一晩（１８時間）攪拌させた。次いで、部分的に真空中で濃縮し、そしてＨＣｌで酸性化し、次いで、ＤＣＭで５回抽出し（相分離を助けるために塩をいくらか加える）、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして濃縮乾固して白色の固体とした。
【０２１２】
Ｏ−スクシンイミジルＯ−ペルアセチル−ジエチレングリコール−ベータ−グルコピラノシドカルボキシレート１１の調製
【０２１３】
【化４８】
2022501364.tif 000049
ＴＨＦ（３ｍＬ）中のカルボン酸１０（４００ｍｇ、０．８８８ｍｍｏｌ）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１４３ｍｇ、１．２４３ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（１７９ｍｇ、１．４２１ｍｍｏｌ）で処理し、一晩攪拌し、１１をインスリンアシル化のために粗形態で使用した。
【０２１４】
Ｄ−グルコピラノシド−１−ＰＥＧ４−アジド１２の調製
【０２１５】
【化４９】
2022501364.tif 000050
Ｄ−グルコピラノシド−１−ＰＥＧ４−アジド１２は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，３５２８に記載のように調製した。
【０２１６】
化合物１３の調製
【０２１７】
【化５０】
2022501364.tif 000051
５０ｍＬのフラスコに、化合物１（５００ｍｇ、１．０１７ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−アミノ−４−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−オキソプロピル）ヘプタンジオエート（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ＮＴＮ１９６３、５６０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、および無水トルエン（１０ｍＬ）を充填した。スラリーを蒸発乾固させ、そして残渣を無水ピリジン（５ｍＬ）およびＤＣＭ（３ｍＬ）中に再溶解した。混合物を５０℃で１６時間攪拌した。溶媒を除去して、粘稠な褐色の油を得た。これはＥｔＯＡｃと１ＭのＨＣｌ水溶液との間で分配された。有機相を水で、その後食塩水で洗浄した。組み合わされた有機画分を濃縮し、その後シリカゲル上で吸収させ、そしてフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ（２０／５０％）によって精製して、１３を得た（４６７ｍｇ、０．６１２ｍｍｏｌ、６０％）。１Ｈ  ＮＭＲ：  （４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ７．７９（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．６４（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．４３（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．３４（ｓ、３Ｈ、ＡｒＨ）、６．７８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ）、６．６０（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）、６．３０（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）、４．５６（ｓ、２Ｈ、Ｆｌｕ−ＣＨ２Ｏ）、４．２８（ｓ、１Ｈ、Ｆｌｕ−ＣＨ２）、４．０８（ｓ、２Ｈ）、２．３０（ｄｄ、Ｊ＝８．８、６．７Ｈｚ、６Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｏ））、２．１６−２．０４（ｍ、６Ｈ、ＣＣＨ２）、１．４４（ｓ、２４Ｈ、Ｃ（ＣＨ３）３）。
【０２１８】
化合物１４の調製
【０２１９】
【化５１】
2022501364.tif 000052
化合物１３（２．３６ｇ、３．０６ｍｍｏｌ、２．０当量）および化合物２ｂ（０．５０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＴＨＦ（２０．６ｍＬ）中に溶解し、５０℃へと２時間加熱した。次いで、化合物３（１．３２ｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１．５当量）を固体として添加し、そして反応物を５０℃で一晩放置した。ＤＢＵ（１．４ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ、６．０当量）を、不均質な反応混合物に添加した。溶媒を除去し、そして残渣を、ＤＣＭを使用してＣ１８の上へと乾燥装填し、次いで１２０ｇのＣ１８カートリッジの上へと装填し、そして逆相フラッシュクロマトグラフィー（５０〜１００％のＭｅＯＨ：水勾配）によって精製した。画分を含有する生成物を、ＴＬＣによって同定し、そして真空下で濃縮して、淡いピンク色の固体を得た。純粋でない画分を組み合わせ、そして再精製して、１４（８５９ｍｇ、３２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．３５（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．３２（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．１７（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０６（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．４８（ｓ、６Ｈ）、３．６７−３．５５（ｍ、１２Ｈ）、３．５１（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３１（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．８６（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、６Ｈ）、２．２３（ｄｄ、Ｊ＝９．５、６．５Ｈｚ、１２Ｈ）、２．０５（ｄｄ、Ｊ＝９．５、６．５Ｈｚ、１２Ｈ）、１．４１（ｓ、５４Ｈ）、１．２２（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．６、１７０．４、１７０．３、１５８．１、１４５．２、１４２．０、１３３．９、１３３．５、１２９．５、１２５．０、１２５．０、１１８．５、１１８．４、１１７．１、８１．８、７１．６、７１．５、７１．３、７１．１、７０．６、５９．３、５１．７、４９．８、４０．９、４０．３、３９．３、３０．８、３０．６、２８．４、２３．９、１６．９。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  Ｃ９１Ｈ１４１Ｎ１５Ｏ２１に対する必要とされる計算値：８９０．０２１３、実測値：８９０．０２０６。
【０２２０】
化合物１５の調製
【０２２１】
【化５２】
2022501364.tif 000053
化合物１４（０．８２０ｇ、０．４６１ｍｍｏｌ、１．０等量）を無水ピリジン（１９２ｍＬ）中に溶解し、そして窒素下で４５℃に加熱した。別個のナシ型バイアル内に、化合物２ｂ（０．１８１ｇ、０．５５３ｍｍｏｌ、１．２当量）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１９．２ｍＬ）中に溶解し、そしてシリンジポンプを介して化合物１４の溶液に添加した（速度：２．０ｍＬ／時間、１０時間添加）。反応混合物を真空下で濃縮して、トルエン（１００ｍＬ）を用いて共沸して、オレンジ色の固体を得た。粗残渣をＭｅＣＮ（２ｍＬ）中に溶解し、そしてＣ１８カートリッジの上へと装填し、そして逆相フラッシュクロマトグラフィー（６０〜１００％アセトン：水勾配）によって精製した。画分を含有する生成物を、ＴＬＣによって同定し、そして真空下で濃縮して、オレンジ色／ピンク色の固体を得た（０．３７２ｇ、３８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０１（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．６２（ｓ、２Ｈ）、７．５８−７．５１（ｍ、３Ｈ）、４．５５−４．３０（ｍ、１２Ｈ）、３．６４−３．５２（ｍ、１２Ｈ）、３．５３−３．４８（ｍ、２Ｈ）、３．４６−３．３６（ｍ、２Ｈ）、２．９２−２．８１（ｍ、６Ｈ）、２．７８−２．６６（ｍ、６Ｈ）、２．２９−２．２０（ｍ、１２Ｈ）、２．１１−２．０４（ｍ、１２Ｈ）、１．４３（ｓ、５４Ｈ）、１．１８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１８Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．６、１６９．７、１５８．４、１５８．３、１５７．２、１４４．５、１３６．８、１３４．３、１３３．９、１３１．５、１３０．２、１２９．９、１２９．５、１２５．６、１２５．５、１２５．２、１２２．３、８１．７、７１．７、７１．５、７１．４、７１．３、７１．１、７０．６、５９．５、５１．７、４０．９、３８．８、３８．７、３０．８、３０．６、２８．４、２４．２、２３．６、１６．６。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  Ｃ１０９Ｈ１６２Ｎ１８Ｏ２４に対する必要とされる計算値：１０５４．１０２１、実測値：１０５４．１０２８。
【０２２２】
化合物１６の調製
【０２２３】
【化５３】
2022501364.tif 000054
化合物１５（１９０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（９ｍＬ）およびＴＦＡ（６．２ｍＬ、８１ｍｍｏｌ）中に溶解し、そして室温で１６時間攪拌した。反応混合物を水（９０ｍＬ）の中へと注ぎ、そして懸濁液を窒素で３０分間沸き立たせて、あらゆるＣＨ２Ｃｌ２を除去した。得られた白色の固体を、遠心分離によって収集した。ペレットを水（３０ｍＬ）中に再懸濁し、そして遠心分離した。上清をデカントし、そして得られた固体を水（２５ｍＬ）中に再懸濁し、ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨ７．４に中和した。すべての材料を確実に完全に可溶性にするために、添加と添加の間に超音波処理が必要とされた。所望のｐＨで均質になると、溶液を０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターに通し、次いで凍結乾燥して１６を得た（１７０ｍｇ、９９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、１００ｍＭのリン酸緩衝液および２ｍＭのＤＭＦを有する）δ  ７．９１−７．２２（ｍ、９Ｈ）、４．３２（ｂｒ．ｓ、１２Ｈ）、３．７２−３．３２（ｍ、１４Ｈ）、３．２１（ｓ、２Ｈ）、２．６２（ｂｒ．ｓ、１２Ｈ）、２．０４（ｂｒ．ｓ、１２Ｈ）、１．９１（ｂｒ．ｓ、１２Ｈ）、１．０４（ｂｒ．ｓ、１８Ｈ）。
【０２２４】
化合物１７の調製
【０２２５】
【化５４】
2022501364.tif 000055
市販の２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタン−１−アミンを使用して化合物３として調製された。白色の固体１７（３．２ｇ、７１％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．９７（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８７−７．５６（ｍ、４Ｈ）、７．５６−７．１７（ｍ、５Ｈ）、６．７９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、４．２７（ｓ、１Ｈ）、３．７０−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．５４（ｑ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５−３．２５（ｍ、２Ｈ）。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ２８Ｈ３１Ｎ６Ｏ５に対する必要とされる計算値：５３１．２３５１、実測値：５３１．２３６２。
【０２２６】
化合物１８の調製
【０２２７】
【化５５】
2022501364.tif 000056
化合物１７、白色の固体１８（０．７８ｇ、８６％）を使用して化合物１４について記載したように調製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４＋ＣＤＣｌ３）δ  ７．３６−７．２９（ｍ、３Ｈ）、７．２２（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．１０（ｄｄ、Ｊ＝５．０、２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．０７（ｄｄ、Ｊ＝５．０、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．４８（ｓ、６Ｈ）、３．６９−３．６０（ｍ、８Ｈ）、３．５４（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５（ｑ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ）、２．３０−２．２１（ｍ、１２Ｈ）、２．１１−２．０２（ｍ、１２Ｈ）、１．４３（ｓ、５４Ｈ）、１．２３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、９Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４＋ＣＤＣｌ３）δ  １７４．５、１７０．１、１７０．０、１６９．９、１５７．９、１５７．８、１４４．９、１４１．６、１４１．５、１３３．６、１３３．１、１３３．０、１３２．１、１２９．５、１２９．４、１２５．０、１２４．９、１１８．５、１１８．４、１１６．９、１１６．９、８１．８、７１．３、７１．２、７０．９、７０．５、５９．１、５９．０、５１．５、４０．７、３９．２、３０．８、３０．７、３０．５、２８．４、２３．７、１６．９。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  Ｃ８９Ｈ１３７Ｎ１５Ｏ２０に対する必要とされる計算値：８６８．００８２、実測値：８６８．００８５。
【０２２８】
化合物１９の調製
【０２２９】
【化５６】
2022501364.tif 000057
化合物１８を使用して化合物１５について記載したように調製して、白色の固体１９を得た（４４９ｍｇ、４８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０３（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９−７．９１（ｍ、３Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．６５（ｓ、２Ｈ）、７．５９（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．５４−４．３５（ｍ、１２Ｈ）、３．６８−３．６２（ｍ、６Ｈ）、３．６０（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．４９（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５（ｔ、Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．９４−２．８３（ｍ、６Ｈ）、２．８３−２．７１（ｍ、６Ｈ）、２．３３−２．２３（ｍ、１２Ｈ）、２．１２−２．０６（ｍ、１２Ｈ）、１．４５（ｓ、５４Ｈ）、１．２３−１．１６（ｍ、１８Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．６、１６９．８、１６９．７、１５８．４、１５８．３、１５７．３、１４４．５、１３６．９、１３４．３、１３３．９、１３３．９、１３１．５、１３０．４、１３０．０、１２９．６、１２５．６、１２５．５、１２２．６、１２２．４、８１．７、７１．５、７１．５、７１．１、７０．７、５９．５、５１．７、４０．９、３８．８、３８．７、３０．８、３０．６、２８．４、２３．６、１６．６、１６．６。
ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  Ｃ１０７Ｈ１５８Ｎ１８Ｏ２３に対する必要とされる計算値：１０３１．５８７４、実測値：１０３１．５８８９。
【０２３０】
化合物２０の調製
【０２３１】
【化５７】
2022501364.tif 000058
化合物１９を使用して化合物１６について記載したように調製して、白色の固体２０を得た（３８０ｍｇ、９４％）。純度は、１Ｈ  ＮＭＲ分光法を使用したＤＭＦ内部標準に対する相対積分によって、約７５重量％でアッセイした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、１００ｍＭのリン酸緩衝液および２ｍＭのＤＭＦを有する）δ  ８．０７−７．２０（ｍ、９Ｈ）、４．２７（ｓ、１２Ｈ）、３．６１−３．３３（ｍ、１０Ｈ）、３．１９（ｓ、２Ｈ）、２．５５（ｓ、１２Ｈ）、２．０３（ｓ、１２Ｈ）、１．９０（ｓ、１２Ｈ）、１．００（ｓ、１８Ｈ）。
【０２３２】
化合物２１、Ｇ１マクロサイクルプロピルアジドの調製
【０２３３】
【化５８】
2022501364.tif 000059
【０２３４】
ステップ１：化合物２１ａの調製
【０２３５】
【化５９】
2022501364.tif 000060
化合物１を無水ＴＨＦ（１１０．５ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＩＰＥＡ（４．１ｍＬ、２３．７３１ｍｍｏｌ）を添加しながら攪拌した。３−アジドプロピルアミン（０．７５０ｇ、６．７４２ｍｍｏｌ）を添加し、そして均質な溶液を一晩攪拌した。溶媒を乾燥まで除去して、ピンク色の固体を得、これをＤＣＭ（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（約１０ｍＬ）中に懸濁し、そして加温して溶液を得た。溶液を、ロータリーエバポレーター上で濃縮し、白色の固体を沈殿させる。沈殿物を収集し、ＤＣＭ（２×３ｍＬ）で洗浄し、次いでガソリン（２×５ｍＬ）で洗浄し、次いで高真空下で乾燥して、オフホワイトの固体２１ａ（１．８ｇ、３．９４ｍｍｏｌ、５９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．５７（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．４８−８．４０（ｍ、２Ｈ）、８．２１（ｓ、１Ｈ）、８．１３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、８．０６（ｓ、１Ｈ）、７．４７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２−５．１４（ｍ、２Ｈ）、５．０５−４．９５（ｍ、２Ｈ）、４．０８（ｄｔ、Ｊ＝１０．３、６．８Ｈｚ、４Ｈ）、４．００−３．９１（ｍ、１Ｈ）、２．５２（ｐ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）。
【０２３６】
ステップ２：化合物２１ｂの調製
【０２３７】
【化６０】
2022501364.tif 000061
化合物６ａにより、化合物４（２．３５８ｇ、３．０５５ｍｍｏｌ）、２１ａ（１．０４６ｇ、２．２９１ｍｍｏｌ）、および２ｂ（５００ｍｇ、１．５２７ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、オフホワイトの無定形の固体２１ｂ（１．１７ｇ、０．５０３ｍｍｏｌ、３３％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．３１−７．００（ｍ、３３Ｈ）、４．４３−３．９７（ｍ、１５Ｈ）、３．３７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．３０（ｍ、２Ｈ）、２．７６（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．２５−２．１９（ｍ、１２Ｈ）、２．１０−２．０３（ｍ、１２Ｈ）、１．７９（ｐ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）１．３９（ｓ、５４Ｈ）、１．１８−１．１２（ｍ、９Ｈ）。
【０２３８】
【化６１】
2022501364.tif 000062
【０２３９】
ステップ３：化合物２１ｃの調製
化合物６ｂにより、化合物２１ｂ（１．１７ｇ、０．５０３ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、オフホワイトの無定形の固体化合物２１ｃ（０．７０２ｇ、０．４２３ｍｍｏｌ、８４％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．３６（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．２５（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．５０（ｓ、６Ｈ）、３．４２（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．３９（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．８８（ｑ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、６Ｈ）、２．３１−２．２０（ｍ、１２Ｈ）、２．１２−２．０１（ｍ、１２Ｈ）、１．８５（ｐ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．４３（ｓ、５４Ｈ）、１．２４（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．６、１７０．４、１７０．４、１５８．１、１５８．１、１４５．１、１４２．０、１４１．９、１３３．９、１３３．５、１３２．４、１２９．７、１２９．５、１２５．０、１２５．０、１１８．５、１１８．３、１１７．０、８１．８、５９．３、５０．２、３９．３、３８．３、３０．８、３０．６、２９．８、２８．３、２３．９、１６．９。ＨＲＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ８６Ｈ１３０Ｎ１５Ｏ１８に対する必要とされる計算値：１６６０．９７１８、実測値：１６６０．９７２３。
【０２４０】
ステップ４：化合物２１ｄの調製
【０２４１】
【化６２】
2022501364.tif 000063
化合物６ｃにより化合物２１ｃ（７４０ｍｇ、０．４４５ｍｍｏｌ）および２ｂ（１７５ｍｇ、０．５３５ｍｍｏｌ）から作製され、溶媒に２０％のＤＭＦを添加して、４５℃に加熱した。生成物は、白色の無定形の固体化合物２１ｄ（０．２５４ｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、２９％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０５（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．５７（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．４７（ｓ、６Ｈ）、４．４２（ｓ、６Ｈ）、３．４８−３．３９（ｍ、４Ｈ）、２．９４−２．８０（ｍ、６Ｈ）、２．８０−２．７１（ｍ、６Ｈ）、２．３３−２．２３（ｍ、１２Ｈ）、２．１３−２．０５（ｍ、１２Ｈ）、１．８８（ｐ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．４５（ｓ、５４Ｈ）、１．２０（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、１８Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７４．６、１６９．８、１６９．７、１５８．３、１５８．２、１５７．３、１５７．２、１４４．５、１４４．５、１３６．５、１３６．３、１３４．２、１３４．１、１３３．８、１３３．８、１３１．３、１３０．４、１３０．０、１２９．５、１２５．４、１２５．１、１２４．９、１２２．６、１２２．４、８１．７、５９．４、５０．２、３８．８、３８．４、３０．８、３０．７、３０．６、２９．８、２８．４、２３．６、１６．６、１６．６。ＨＲＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  Ｃ１０４Ｈ１５０Ｎ１８Ｏ２１に対する必要とされる計算値：９９４．５６９０、実測値：９９４．５６８４。
【０２４２】
ステップ５：化合物２１、Ｇ１マクロサイクルプロピルアジドの調製
【０２４３】
【化６３】
2022501364.tif 000064
化合物６ｄにより、化合物２１ｄ（２４０ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）から作製された。生成物は、ＮａＯＨでｐＨ７．５に中和された後に単離され、そして白色の無定形の固体２１として凍結乾燥された（１８７ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ、８７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中の重水素化リン酸緩衝液）δ  ８．１２−７．１２（ｍ、９Ｈ）、４．４１−３．９２（ｍ、１２Ｈ）、３．３３（ｍ、４Ｈ）、２．６６−２．２６（ｍ、１２Ｈ）、２．２０−１．５２（ｍ、２６Ｈ）、１．３１−０．７４（ｍ、１８Ｈ）。
【０２４４】
化合物２２、Ｇ２マクロサイクルＰＥＧ３アジドの調製
【０２４５】
【化６４】
2022501364.tif 000065
【０２４６】
ステップ１：化合物２２ａの調製
【０２４７】
【化６５】
2022501364.tif 000066
化合物１（７．００ｇ、８．５５ｍｍｏｌ、１．０等量）を無水ＴＨＦ（８５．５ｍＬ）中に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３．０ｍＬ、１７ｍｍｏｌ、２．０等量）を添加した。Ｎ３−（ＰＥＧ）２−ＮＨ２（１．９４ｇ、１１．１ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、室温で攪拌する。反応混合物を真空下で濃縮し、次いでＲＰ  ＭＰＬＣ用にＭｅＣＮ中に溶解した。画分を含有する生成物を組み合わせて、真空下で濃縮した。シリカゲルの上へとＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨを用いて乾燥装填し、次いでＮＰ  ＭＰＬＣにより精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、そして真空下で濃縮してオレンジ色の油状物を得た。ガソリン／ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＥｔＯＡｃの添加により、沈殿が生じた。濾過によって収集された沈殿物を、ガソリンで洗浄して、オフホワイトの固体化合物２２ａ（３．２１０ｇ、６．０５０ｍｍｏｌ、７１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．９７（ｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８７−７．５６（ｍ、５Ｈ）、７．５６−７．１７（ｍ、５Ｈ）、６．７９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、４．２７（ｓ、１Ｈ）、３．７０−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．５４（ｑ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．３５−３．２５（ｍ、２Ｈ）。ＨＲＭＳ  ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ２８Ｈ３１Ｎ６Ｏ５に対する必要とされる計算値：５３１．２３５１、実測値：５３１．２３６２。
【０２４８】
ステップ２：化合物２２ｂの調製
【０２４９】
【化６６】
2022501364.tif 000067
化合物２１ａおよび化合物４から化合物６ａと同様に作製される。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．９９−７．４４（ｍ、１７Ｈ）、７．４４−７．１４（ｍ、１６Ｈ）、４．４４（ｓ、６Ｈ）、４．３３（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、４．１３（ｂｒ．ｓ、３Ｈ）、３．６３−３．５５（ｍ、８Ｈ）、３．５１（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．２５（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．８１（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．２４−２．０３（ｍ、６０Ｈ）、１．９４−１．８２（ｍ、３６Ｈ）、１．３８（ｓ、１６２Ｈ）、１．１９−１．１０（ｍ、９Ｈ）。
【０２５０】
ステップ３：化合物２２ｃの調製
【０２５１】
【化６７】
2022501364.tif 000068
化合物６ｂにより、化合物２２ｂ（２．７５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、オフホワイトの無定形の固体化合物２２ｃ（１．５２ｇ、０．４０３ｍｍｏｌ、６５％）として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．３９（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．２９（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．１４（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｓ、６Ｈ）、３．６７−３．６２（ｍ、８Ｈ）、３．５４（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３４（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．８９（ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、６Ｈ）、２．２７−２．２２（ｍ、１２Ｈ）、２．２１−２．１５（ｍ、３６Ｈ）、２．１２−２．０７（ｍ、１２Ｈ）、１．９９−１．８８（ｍ、３６Ｈ）、１．４３（ｓ、１６２Ｈ）、１．２５（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７５．５、１７４．４、１７０．３、１７０．１、１５８．０、１５８．０、１４５．２、１４１．９、１４１．５、１３３．９、１３２．９、１３２．４、１２９．９、１２９．７、１２４．９、１２４．５、１１８．９、１１８．４、１１７．４、１１７．１、８１．７、７１．５、７１．４、７１．１、７０．７、５９．４、５８．７、５１．７、４０．９、３９．３、３２．５、３２．２、３０．７、３０．５、２８．４、２３．９、１７．０。ＨＲＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  Ｃ１９７Ｈ３２４Ｎ２１Ｏ５０に対する必要とされる計算値：１２６１．４４８５、実測値：１２６１．４５０９。
【０２５２】
ステップ４：化合物２２ｄの調製
【０２５３】
【化６８】
2022501364.tif 000069
化合物６ｃにより化合物２２ｃ（１．５０ｇ、０．３９６ｍｍｏｌ）および２ｂ（１５６ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）から作製され、溶媒に２０％のＤＭＦを添加して、４５℃に加熱した。生成物は、白色の無定形の固体化合物２２ｄ（０．９４ｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、５８％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０７（ｓ、１Ｈ）、８．０３（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１−７．９５（ｍ、３Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．６６（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４（ｓ、４Ｈ、ＮＨ信号がゆっくりと交換し、そのため積分は変化する）、４．５７−４．３３（ｍ、１２Ｈ）、３．７１−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．５３（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．３６（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．８７（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．７８（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．２９−２．２３（ｍ、１２Ｈ）、２．２３−２．１７（ｍ、３６Ｈ）、２．１５−２．０９（ｍ、１２Ｈ）、２．００−１．９０（ｍ、３６Ｈ）、１．４４（ｓ、１６２Ｈ）、１．２４−１．１４（ｍ、１８Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  １７５．６、１７５．５、１７４．４、１６９．７、１６９．４、１６９．３、１５８．４、１５８．３、１５７．３、１５７．２、１４４．５、１４４．５、１４４．４、１３７．１、１３６．７、１３４．３、１３４．３、１３４．０、１３３．８、１３１．２、１３１．２、１３０．５、１３０．２、１２９．４、１２６．１、１２５．９、１２５．４、１２５．２、１２２．７、１２２．２、８１．６、７１．５、７１．４、７１．１、７０．６、５９．５、５９．４、５８．８、５８．７、５１．７、４０．９、３８．９、３８．８、３８．７、３８．７、３２．４、３２．２、３０．７、３０．７、３０．４、２８．４、２３．６、１６．８、１６．７、１６．６。ＨＲＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  Ｃ２１５Ｈ３４５Ｎ２４Ｏ５３に対する必要とされる計算値：１３７１．１７００、実測値：１３７１．１７２０。
【０２５４】
ステップ５：化合物２２の調製
【０２５５】
【化６９】
2022501364.tif 000070
化合物６ｄにより、化合物２２ｄ（５００ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、黄色の無定形の固体化合物２２（３７６ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ、９９％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中の重水素化リン酸緩衝液）δ  ８．０１−７．６７（ｍ、６Ｈ）、７．６７−７．４９（ｍ、２Ｈ）、７．４３（ｓ、１Ｈ）、４．５５−４．２１（ｍ、１２Ｈ）、３．９２−３．４７（ｍ、８Ｈ）、３．４７−３．２９（ｍ、２Ｈ）、２．８２−２．５５（ｍ、１２Ｈ）、２．４３−２．１８（ｍ、１２Ｈ）、２．１８−２．００（ｍ、４８Ｈ）、２．００−１．７２（ｍ、３６Ｈ）、１．３６−０．８０（ｍ、１８Ｈ）。
【０２５６】
化合物２３  Ｇ２マクロサイクルＰＥＧ５アジドの調製
【０２５７】
【化７０】
2022501364.tif 000071
【０２５８】
ステップ１：化合物２３ａの調製
【０２５９】
【化７１】
2022501364.tif 000072
化合物３ａにより、化合物１（３．９７５ｇ、６．４７０ｍｍｏｌ）および１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン−１−アミン（２．５４６ｇ、９．７０５ｍｍｏｌ）から作製された。褐色の油状物（３．９３３ｇ、６．３５７ｍｍｏｌ、９８％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  ７．７５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．６７−７．５５（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．５０（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．３９（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．３４−７．２７（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．１５（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、６．８９（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、６．６９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、４．５２（ｓ、１Ｈ、Ｆｌｕ−ＣＨ）、４．２４（ｓ、２Ｈ、Ｆｌｕ−ＯＣＨ２）、３．７０−３．４６（ｍ、１６Ｈ、ＯＣＨ２）、３．２８（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ、（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２）、１．３７（ｄｄ、Ｊ＝１１．８、７．０Ｈｚ、２Ｈ、Ｎ３ＣＨ２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ  １６７．２６（Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、１４３．８０、１４１．４５、１２７．８９、１２７．２６、１２５．１４、１２０．１０（Ａｒ）、７７．３６、７０．５７、７０．４９、７０．４６、７０．４３、７０．４２、７０．２２、７０．０３、６９．９２（ＯＣＨ２）、５５．６６（Ｆｌｕ−ＯＣＨ２）、５０．６６（Ｆｌｕ−ＣＨ）、３９．８０（Ｎ３ＣＨ２）、３８．７２（ＮＨＣＨ２）。
【０２６０】
ステップ２：化合物２３ｂの調製 
【０２６１】
【化７２】
2022501364.tif 000073
化合物６ａにより、化合物４ａ（３．２４ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）、２３ａ（８３６ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、および２ｂ（２９５ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、オフホワイトの無定形の固体２３ｂ（１．７７ｇ、０．３８７ｍｍｏｌ、４３％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０２−７．４８（ｍ、１８Ｈ）、７．４６−７．１１（ｍ、１５Ｈ）、４．４６（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、４．３４（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、４．１５（ｂｒ．ｓ、３Ｈ）、３．５４−３．４４（ｍ、１８Ｈ）、３．２５（ｄｄ、Ｊ＝５．６、４．４、２Ｈ）、２．８０（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．３５−２．０４（ｍ、６０Ｈ）、２．０４−１．８０（ｍ、３６Ｈ）、１．４１（ｓ、１６２Ｈ）、１．２５−１．１１（ｍ、９Ｈ）。
【０２６２】
ステップ３：化合物２３ｃの調製
【０２６３】
【化７３】
2022501364.tif 000074
化合物６ｂにより、化合物２３ｂ（１．７６ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）から作製された。生成物は、オフホワイトの無定形の固体２３ｃ（１．１４ｇ、０．２９、７６％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．４６−７．３７（ｍ、３Ｈ）、７．２９（ｄ、Ｊ＝２．１、２Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝２．０、１Ｈ）、７．２１（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．１、２Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．０、１Ｈ）、４．５１（ｓ、６Ｈ）、３．６６−３．５１（ｍ、１６Ｈ）、３．３６−３．３４（ｍ、４Ｈ）、２．９４−２．８２（ｍ、６Ｈ）、２．２９−２．１４（ｍ、４８Ｈ）、２．１３−２．０６（ｍ、１２Ｈ）、１．９９−１．８９（ｍ、３６Ｈ）、１．４４（ｓ、１６２Ｈ）、１．３０−１．２１（ｍ、９Ｈ）。
【０２６４】
ステップ４：化合物２３ｄの調製
【０２６５】
【化７４】
2022501364.tif 000075
化合物６ｃにより、化合物２３ｃ（５００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および２ｂ（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）から作製され、溶媒に２０％のＤＭＦを添加して、４５℃に加熱のみした。生成物を白色の無定形の固体２３ｄ（０．８６ｇ、０．１９ｍｍｏｌ、７０％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．１１−７．８７（ｍ、６Ｈ）、７．６６（ｄ、Ｊ＝８．５、２Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ）、７．４５（ｓ、６Ｈ、ＮＨ信号がゆっくりと交換し、そのため積分は変化する）、４．５６−４．３４（ｍ、１２Ｈ）、３．６４−３．５６（ｍ、１６Ｈ）、３．５２−３．４６（ｍ、２Ｈ）、３．３５−３．３２（ｍ、２Ｈ）、２．９０（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．７８（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、２．２９−２．１７（ｍ、４８Ｈ）、２．１５−２．０８（ｍ、１２Ｈ）、１．９９−１．９１（ｍ、３６Ｈ）、１．４３（ｓ、１６２Ｈ）、１．２４−１．１７（ｍ、１８Ｈ）。
ＨＲＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  Ｃ２１９Ｈ３５０Ｎ２４Ｏ５５に対する必要とされる計算値：１４００．５２０９、実測値：１４００．５２３２。
【０２６６】
ステップ５：化合物２３の調製
【０２６７】
【化７５】
2022501364.tif 000076
化合物６ｄにより、化合物２３ｄ（７５０ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を白色の無定形の固体２３（５７０ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ、９９％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中の重水素化リン酸緩衝液）δ  ８．０８−７．７３（ｍ、６Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ）、７．５０−７．４３（ｍ、１Ｈ）、４．５９−４．１９（ｍ、１２Ｈ）、３．７５−３．４２（ｍ、１６Ｈ）、３．３６−３．２１（ｍ、２Ｈ）、３．１７−３．０５（ｍ、２Ｈ）、２．８２−２．５３（ｍ、１２Ｈ）、２．３５−２．２１（ｍ、１２Ｈ）、２．１５−２．００（ｍ、４８Ｈ）、１．９８−１．７６（ｍ、３６Ｈ）、１．３０−０．９０（ｍ、１８Ｈ）。
【０２６８】
化合物２４、Ｇ１マクロサイクルＰＥＧ５アジドの調製
【０２６９】
【化７６】
2022501364.tif 000077
【０２７０】
ステップ１：化合物２４ａの調製
【０２７１】
【化７７】
2022501364.tif 000078
化合物６ａにより、化合物２３ａ（２．３６ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）、Ｇ１デンドリマーアミン＝ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−アミノ−４−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−オキソプロピル）ヘプタンジオエート（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ＮＴＮ１９６３）（１．４２ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）および２ｂ（５００ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）から作製された。生成物はオフホワイトの無定形の固体（１．５８ｇ、０．６４ｍｍｏｌ、４２％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０１−７．４０（ｍ、２１Ｈ）、７．３０（ｔ、Ｊ＝７．５、７Ｈ）、７．２６−７．１（ｍ、７Ｈ）、４．５６−４．２４（ｍ、１２Ｈ）、４．１９−４．０２（ｍ、３Ｈ）、３．６７−３．３９（ｍ、１８Ｈ）、３．２９−３．２０（ｍ、２Ｈ）、２．８０（ｄ、Ｊ＝９．０、６Ｈ）、２．２４（ｄｄ、Ｊ＝９．４、６．４、１２Ｈ）、２．１３−１．９７（ｍ、１２Ｈ）、１．４０（ｓ、５４Ｈ）、１．１５（ｔ、ＪＪ＝７．３、９Ｈ）。
【０２７２】
ステップ２：化合物２４ｂの調製
【０２７３】
【化７８】
2022501364.tif 000079
化合物６ｂにより、化合物２４ａ（１．５５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を、オフホワイトの無定形の固体２４ｂ（１．１１ｇ、０．６１、９８％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ７．３９（ｓ、１Ｈ（部分的に交換されたＮＨ））、７．３３（ｄ、Ｊ＝８．３、３Ｈ）、７．２３（ｄ、Ｊ＝２．０、１Ｈ）、７．１８（ｄ、Ｊ＝２．０、２Ｈ）、７．０７（ｄｄｄ、Ｊ＝８．１、４．１、１．９、３Ｈ）、４．４９（ｓ、６Ｈ）、３．７０−３．５４（ｍ、１６Ｈ）、３．５１（ｄ、Ｊ＝５．５、２Ｈ）、３．３５−３．２５（ｍ、２Ｈ）、２．９９−２．７２（ｍ、６Ｈ）、２．３９−２．１６（ｍ、１２Ｈ）、２．０８（ｄｄ、Ｊ＝９．５、６．１、１２Ｈ）、１．４４（ｓ、５４Ｈ）、１．２４（ｔ、Ｊ＝７．３、９Ｈ）。
【０２７４】
ステップ３：化合物２４ｂの調製
【０２７５】
【化７９】
2022501364.tif 000080
化合物６ｃにより、化合物２４ａ（５００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）および２ｂ（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）から作製され、溶媒に２０％のＤＭＦを添加して、４５℃に加熱した。生成物は、白色の無定形の固体２４ｂ（０．３３ｇ、０．１５３ｍｍｏｌ、５８％）として単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．０３−７．９４（ｍ、３Ｈ）、７．９４−７．８７（ｍ、３Ｈ）、７．６２（ｓ、１Ｈ）、７．５６（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．１、３Ｈ）、４．４８（ｓ、４Ｈ）、４．４３（ｓ、８Ｈ）、３．６０−３．３３（ｍ、１８Ｈ）、３．３０−３．２８（ｍ、２Ｈ）、２．９６−２．８３（ｍ、６Ｈ）、２．７７（ｄ、Ｊ＝７．８、６Ｈ）、２．３２−２．２３（ｍ、１２Ｈ）、２．１０（ｔｄ、Ｊ＝７．５、４．７、１２Ｈ）、１．４５（ｓ、５４Ｈ）、１．２５−１．１４（ｍ、１８Ｈ）。ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ１１１Ｈ１６４Ｎ１８Ｏ２５に対する必要とされる計算値：２１５１．５、実測値：２１５１．５。
【０２７６】
ステップ４：化合物２４、Ｇ１マクロサイクルＰＥＧ５アジドの調製 
【０２７７】
【化８０】
2022501364.tif 000081
化合物６ｄにより、化合物２４ｂ（３３０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）から作製された。生成物を白色の無定形の固体２４（２８１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ、９９％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ中の重水素化リン酸緩衝液）δ  ７．９０−７．５６（ｍ、６Ｈ）、７．４５−７．２５（ｍ、３Ｈ）、４．４８−４．０７（ｍ、１２Ｈ）、３．７１−３．１３（ｍ、１８Ｈ）、３．１３−３．０１（ｍ、２Ｈ）、２．７０−２．４４（ｍ、１２Ｈ）、２．３５−２．２１（ｍ、１２Ｈ）、２．０８−２．０１（ｍ、１２Ｈ）、２．０１−１．８４（ｍ、１２Ｈ）、１．１２−０．９１（ｍ、１８Ｈ）。
【０２７８】
化合物２５、Ｇ０マクロサイクルＰＥＧ４アジドの調製
【０２７９】
【化８１】
2022501364.tif 000082
【０２８０】
ステップ１：化合物２５ａの調製
【０２８１】
【化８２】
2022501364.tif 000083
エチル３，４−ジアミノ安息香酸エチル（２５．０ｇ、０．１３９ｍｏｌ）をＴＨＦ（２８０ｍＬ）中に溶解した。トリエチルアミン（２３．２ｍＬ、０．１６６ｍｏｌ）およびＢｏｃ２Ｏ（３３．３ｇ、０．１５３ｍｏｌ、１．１当量）を添加した。室温で１６時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、そして粗固体を高温ジエチルエーテル／ガソリン４０−６０（５：９５、５００ｍＬ）中で粉砕し、濾過し、ガソリン４０−６０（１００ｍＬ）で洗浄し、そして高真空下で乾燥して、生成物を淡い褐色の固体（３４．８ｇ、８９．５％）として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ  ７．８３（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．１５（ｓ、１Ｈ）、４．３０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、４．２６（ｓ、２Ｈ）、１．５０（ｓ、１０Ｈ）、１．３５（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、４Ｈ）。
【０２８２】
ステップ２：化合物２５ｂの調製
【０２８３】
【化８３】
2022501364.tif 000084
Ｎ２雰囲気下で、２５ａ（１７．０ｇ、６０ｍｍｏｌ）および２ｂ（３．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）および無水ＤＭＦ（９．９ｍＬ）中に溶解した。無水ピリジン（７．３ｍＬ、９１ｍｍｏｌ、９当量）を添加し、そして反応物を４０℃で１８時間攪拌した。反応物を室温まで冷まし、そして溶媒を真空下で除去した。次いで、粗油を１ＭのＨＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）で沈殿させ、濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、そして高真空下で乾燥して、生成物２５ｂ（１１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ、９９％）を淡い褐色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．４４（ｓ、３Ｈ）、８．２１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、３Ｈ）、８．１８（ｓ、３Ｈ）、７．７４（ｓ、３Ｈ）、７．７０（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．１Ｈｚ、３Ｈ）、７．０７（ｔ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、３Ｈ）、４．３７（ｂｒ．ｓ、６Ｈ）、４．２７（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）、２．８０（ｑ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、６Ｈ）、１．３９（ｓ、２７Ｈ）、１．２９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、９Ｈ）、１．１８（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、９Ｈ）。
【０２８４】
ステップ３：化合物２５ｃの調製
【０２８５】
【化８４】
2022501364.tif 000085
２５ｂ（１１．１ｇ、９．５０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（６２ｍＬ）およびＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸（７７．１ｍＬ、１．０モル）を５分間にわたって添加し、そして反応物を室温で３時間攪拌した。反応混合物を、窒素流下で濃縮し、そして粗油を飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１５００ｍＬ）で沈殿し、濾過し、水で洗浄した。次いで、粗固体をＥｔ２Ｏで洗浄し、そして高真空下で乾燥して、オフホワイトの固体として生成物２５ｃ（８．０ｇ、９．２ｍｍｏｌ、９７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．８２−７．６８（ｍ、６Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、３Ｈ）、７．１８（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．０Ｈｚ、３Ｈ）、６．４７（ｓ、３Ｈ）、４．７９（ｓ、６Ｈ）、４．３９−４．２７（ｍ、６Ｈ）、４．２０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）、２．８７−２．６６（ｍ、６Ｈ）、１．２４（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、９Ｈ）、１．１５（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ４５Ｈ５８Ｎ９Ｏ９＋に対する必要とされる計算値：８６８．４、実測値：８６８．４。
【０２８６】
ステップ４：化合物２５ｄの調製
【０２８７】
【化８５】
2022501364.tif 000086
Ｎ２雰囲気下で、２５ｃ（５．００ｇ、６ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＭＦ（４１７ｍＬ）中に溶解し、そして無水ピリジン（９６０ｍＬ）を４５℃に加熱した。次いで、２ｂ（２．２６ｇ、７ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４１ｍＬ）中に溶液として１０時間かけて添加し、そして反応混合物を４５℃でさらに６時間攪拌した。次いで、反応混合物を真空下で濃縮し、そして粗残渣を１ＭのＨＣｌ水溶液（１０００ｍＬ）で沈殿させ、濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。次いで、粗固体をＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、Ｃ１８上の上へと乾燥装填し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（０．１％ギ酸を有する４５％〜８０％のＭｅＣＮ：水）によって精製した。生成物を含有する画分を組み合わせ、かつ真空下で濃縮して、オフホワイトの固体として生成物（４．２ｇ、４ｍｍｏｌ、６１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．２２（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、３Ｈ）、８．０８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、３Ｈ）、７．８９（ｓ、３Ｈ）、７．６０（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、３Ｈ）、７．５３（ｓ、３Ｈ）、６．４９（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、３Ｈ）、６．３５（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、３Ｈ）、４．３６−４．２４（ｍ、１８Ｈ）、２．８０（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、６Ｈ）、２．６７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、６Ｈ）、１．３１（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、９Ｈ）、１．１９−１．１０（ｍ、１８Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ６３Ｈ７９Ｎ１２Ｏ１２＋に対する必要とされる計算値：１１９５．５、実測値：１１９５．５。
【０２８８】
ステップ５：化合物２５ｅの調製
【０２８９】
【化８６】
2022501364.tif 000087
２５ｄ（４．９ｇ、４．１０ｍｍｏｌ、１当量）をエタノール（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中に懸濁し、そして４０℃に加熱した。水酸化ナトリウム（０．２４６ｇ、６．１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、そして反応物を４０℃で１６時間攪拌した。反応物を室温まで冷まし、有機溶媒を真空下で除去した。次いで、粗生成物を１ＭのＨＣｌ水溶液（４００ｍＬ）で沈殿させ、濾過し、１ＭのＨＣｌ水溶液で洗浄し、そして乾燥させた。次いで、粗固体をアセトン／水中に溶解し、Ｃ１８の上へと乾燥装填し、逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分を組み合わせ、そして溶媒を真空下で除去して、白色の固体として生成物２５ｅ（１．７ｇ、１．４６ｍｍｏｌ、３６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．１８（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、２Ｈ）、８．１７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６（ｓ、２Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．５９−７．５２（ｍ、３Ｈ）、７．５０（ｓ、２Ｈ）、７．４６（ｓ、１Ｈ）、６．４８−６．４２（ｍ、３Ｈ）、６．３６−６．２７（ｍ、３Ｈ）、４．３３−４．２１（ｍ、１６Ｈ）、２．８３−２．７１（ｍ、６Ｈ）、２．６８−２．５８（ｍ、６Ｈ）、１．２８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）、１．１１（ｔｄ、Ｊ＝７．３、６．９、２．４Ｈｚ、１８Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ５９Ｈ７１Ｎ１２Ｏ１２＋に対する必要とされる計算値：１１３９．５、実測値：１１３９．５。
【０２９０】
ステップ６：化合物２５ｆの調製
【０２９１】
【化８７】
2022501364.tif 000088
Ｎ２雰囲気下で、２５ｅ（３００ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＢＴＵ（９７ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ、１．１当量）、およびＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（３９ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ、１．１当量）を無水ＤＭＦ（８．５ｍＬ）中に溶解した。ＤＩＰＥＡ（８０μＬ、０．４６０ｍｍｏｌ、２等量）を添加し、そして反応混合物を室温で１５分間攪拌した。１１−アジド−３，６，９−トリオキサンウンデカン−１−アミン（１００ｕＬ、０．４６３ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、そして反応物を室温で１６時間攪拌した。反応混合物を水の中へと注ぎ、沈殿物を濾過し、水で洗浄し、そしてアセトンを用いてＲＢＦに移した。溶媒を真空下で除去し、そして粗残渣をアセトン／水中で３０ｇのＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８カートリッジの上へと装填し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（５０〜１００％のアセトン：水勾配）によって精製した。画分を含有する生成物を組み合わせ、そして溶媒を真空下で除去して白色の固体を得て、これを真空下でさらに乾燥させて、白色の固体として生成物２５ｆ（２４０ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ、７６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール−ｄ４）δ  ８．２３（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．９４（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７９（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．４９−４．４０（ｍ、１２Ｈ）、４．３５（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、４Ｈ）、３．６７−３．５８（ｍ、１２Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．９１−２．７１（ｍ、１２Ｈ）、１．３９（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、６Ｈ）、１．２０（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１８Ｈ）。
【０２９２】
ステップ７：化合物２５、Ｇ０マクロサイクルＰＥＧ４アジドの調製
【０２９３】
【化８８】
2022501364.tif 000089
２５ｆ（０．２２ｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、１．０当量）をエタノール（５ｍＬ）およびメタノール（０．５ｍＬ）中に溶解した。１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５．５ｍＬ）を添加し、そして４０℃で３時間攪拌した。有機溶媒を真空下で除去して水溶液を得、次いでこれを１Ｍの塩酸水溶液に注いだ。得られた懸濁液を遠心分離し、水をデカントし、固体を水で洗浄した。次いで、固体を再度遠心分離し、水をデカントし、そして固体を、アセトンを用いてＲＢＦに移した。溶媒を真空下で除去し、そして高真空下で乾燥して、白色の固体として２５（１９０ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、９０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ８．４１（ｓ、２Ｈ）、８．３７（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．３１−８．２３（ｍ、２Ｈ）、８．２１（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．１３（ｓ、２Ｈ）、８．１１（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５２（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３（ｄｄ、Ｊ＝８．６、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．５８−６．４２（ｍ、３Ｈ）、６．２９（ｄ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、３Ｈ）、４．３２（ｓ、１２Ｈ）、３．６０−３．４９（ｍ、１１Ｈ）、２．８１−２．５４（ｍ、１２Ｈ）、１．１６（ｄｄ、Ｊ＝９．２、４．３Ｈｚ、１８Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ６５Ｈ８３Ｎ１６Ｏ１４＋に対する必要とされる計算値：１３１１．６、実測値：１３１１．６。
【０２９４】
本発明のインスリン誘導体の調製
【０２９５】
実施例１：Ｂ１−ベンジル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＢ２９−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ１の調製
【０２９６】
【化８９】
2022501364.tif 000090
【０２９７】
実施例１のインスリン誘導体ＩＮＳ１は、下記に記載されるように調製される。
【０２９８】
ステップ１：Ｂ１−４−エチニル−ベンジルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２の調製（スキーム１）
【０２９９】
【化９０】
2022501364.tif 000091
ＤｅｓＢ３０ヒトインスリンは、０．１Ｍ酢酸中に溶解され、またｐＨは、８Ｍの酢酸を使用して４に調節される。Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）中の４−エチニル−ベンズアルデヒド（１．５当量）を添加し、そして混合物を３０分間攪拌する。ＮＭＰ中のアルファ−ピコリンボラン（６当量Ｏを添加し、かつ混合物を２時間攪拌する一方で、ｐＨは、８Ｍの酢酸の添加により、４の近くに保たれる。ＬＣＭＳは、所望の生成物の形成を示し、ｐＨは２に調節され、そして生成物は、水中の０．１％のＴＦＡを緩衝液Ａとして、かつアセトニトリル中の０．１％のＴＦＡを緩衝液Ｂとして使用した、Ｃ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製された。生成物（ＩＮＳ２（スキーム１））を凍結乾燥によって単離した。
【０３００】
ステップ２：ＩＮＳ３の調製（スキーム２）
【０３０１】
【化９１】
2022501364.tif 000092
【０３０２】
上記で調製されたようなマクロサイクル−ＰＥＧ−アジド６ｄは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解され、そして不活性雰囲気（窒素）下で、酢酸を使用してｐＨ７．８に調節された２Ｍトリエチルアミン中に溶解されたアルキンインスリンＩＮＳ２（スキーム１、１当量）と反応し、触媒としてＣｕＩ（０．１当量）およびリガンドとしてトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ、２当量）と反応する。反応にＬＣＭＳが続き、そして生成物ＩＮＳ３（スキーム２）は、実施例１のステップ１に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。
【０３０３】
ステップ３：化合物ＩＮＳ１の調製
【０３０４】
【化９２】
2022501364.tif 000093
活性エステル８（１．２当量）を、０．２Ｍの炭酸ナトリウム中にｐＨ１０．５で溶解されたＢ１−マクロサイクル−インスリンＩＮＳ３（スキーム２）と反応させる。反応にＬＣＭＳが続き、そして実施例１のＢ１−マクロサイクルＢ２９−グリコシドＩＮＳ１が、実施例１のステップ１に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。ＬＣＭＳの測定値１８５８．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８５８．６。
【０３０５】
実施例２：Ｂ１−ベンジル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＡ１−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ４の調製
【０３０６】
【化９３】
2022501364.tif 000094
ｐＨ７．５で０．１Ｍの重炭酸ナトリウム中のＢ１−マクロサイクル−インスリンＩＮＳ３（スキーム２、実施例１のステップ２のように調製）を、グルコシド活性エステル８と反応させる。反応にＬＣＭＳが続き、そして実施例２のＢ１−マクロサイクルＡ１−グルコシドＩＮＳ４は、実施例１のステップ１に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。
【０３０７】
実施例３：Ｂ２９−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＡ１−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ５の調製
【０３０８】
【化９４】
2022501364.tif 000095
上記のように調製されたカルボキシマクロサイクルＰＥＧ  ７ｄは、グルコシド８について記載したようにスクシンイミジルエステルとして活性化され、実施例１に記載されるように、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンとｐＨ１０．５で反応する。反応にＬＣＭＳが続き、そしてＢ２９−マクロサイクル誘導体は、上述のＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。Ｂ２９−マクロサイクル誘導体を、実施例３に記載されるように、ｐＨ７．５でベータ−グリコシド活性エステル８と反応させる。反応にＬＣＭＳが続き、そして粗生成物は、９５％のＴＦＡを用いた３０分間の処理によって脱保護される。実施例３のＢ２９−マクロサイクルＡ１−グルコシドＩＮＳ５は、実施例１のステップ１に記載されるようなＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。
【０３０９】
実施例４：Ｂ１−ベンジル−３，５−ビス−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＢ２９−ベンゾイル−３，５−メチルアミノ−ビス−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ６の調製
【０３１０】
【化９５】
2022501364.tif 000096
インスリンＩＮＳ６上のＭに対する結合点＝＊
【０３１１】
【化９６】
2022501364.tif 000097
インスリンＩＮＳ８上のＭに対する結合点＝＊
【０３１２】
Ｂ１−３，５−ビス−エチニル−ベンジルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、３，５−ビス−エチニル−ベンズアルデヒドおよびｄｅｓＢ３０ヒトインスリンから、化合物ＩＮＳ２の調製と類似して還元アルキル化によって生成される（スキーム４）。ビス−アルキンＩＮＳ７を、化合物ＩＮＳ３について記載したような条件下でマクロサイクルアジド６ｄと反応させ、反応にＬＣＭＳが続き、そして中間体ＩＮＳ８を、実施例１のステップ１に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離する。活性エステルグルコシド８は、３，５−ビス−アミノメチル−安息香酸と反応する。精製された生成物は、グルコシド８について記載したようにスクシンイミジルエステルとして活性化され、そしてＩＮＳ３について記載したようにｐＨ１０．５でインスリン中間体ＩＮＳ８と反応する。反応にＬＣＭＳが続き、そして実施例４のＢ１−ビス−マクロサイクルＢ２９−ビス−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ６が、実施例１のステップ１に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用して単離される。
【０３１３】
実施例５：Ｂ１−ベンジル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＢ２９−アセチルエチレングリコール−Ｄ−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ９の調製
【０３１４】
【化９７】
2022501364.tif 000098
【０３１５】
ステップ１：ＩＮＳ２を、ｐＨ１１の氷浴上で０．１ＭのＮａ２ＣＯ３中に溶解し、そしてＴＨＦ中の活性エステル１１で１０分間処理した。ＩＮＳ１０を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１５６４．２５［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１５６４．２４。
【０３１６】
【化９８】
2022501364.tif 000099
【０３１７】
ステップ２：ＩＮＳ１０を、３３％のＭｅＯＨで０．２ＭのＫ２ＣＯ３中に溶解し、そして３０分間攪拌した。ＩＮＳ１１を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１５２２．２１［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１５２２．２１。
【０３１８】
【化９９】
2022501364.tif 000100
【０３１９】
ステップ３：ＩＮＳ１１（４．１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）およびマクロサイクルアジド６ｄ（３．５７９ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を、２ＭのＥｔ３Ｎ／ＣＨ３ＣＯＯＨ水性緩衝液ｐＨ７（０．６ｍＬ）およびＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）中に溶解し、水（０．３ｍＬ）でさらに希釈し、そして混合物を脱気した。        混合物を、ＴＨＰＴＡ（０．０１５ｍｇ、５ｍｏｌ％）で、およびスパチュラ先端量のＣｕＩで処理し、１０分間放置した。ＩＮＳ９を、実施例１の記載と同様のＨＰＬＣによって単離し、ＬＣＭＳの測定値は１８４６．８［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値は１８４７．０であった。
【０３２０】
実施例８：Ｂ１−メチル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９−ＰＥＧ４−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ１８の調製
【０３２１】
【化１００】
2022501364.tif 000101
【０３２２】
ステップ１：ＤｅｓＢ３０ヒトインスリン（１．７１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、０．１ＭのＡｃＯＨ／水（５ｍＬ）＋ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中に溶解した。プロピナル（２９ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１５分間攪拌し、次いでより多くのプロピナル（１５ｍｇ）で処理し、３０分間攪拌した。ＤＭＦ中のアルファ−ピコリンボラン（１９２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を１時間攪拌した。ＩＮＳ１９を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１４３６．８［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１４３７．１。
【０３２３】
【化１０１】
2022501364.tif 000102
ステップ２：ＩＮＳ１９（１５０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液ｐＨ１１．５（３ｍＬ）中に溶解し、そしてグルコシド活性エステル８と１時間反応させた。ＩＮＳ２０を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１５１７．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１５１７．７。
【０３２４】
【化１０２】
2022501364.tif 000103
【０３２５】
ステップ３：ＩＮＳ２０（１１ｍｇ、１．８ｕｍｏｌ）およびマクロサイクルアジド６ｄ（８．３ｍｇ、２．４ｕｍｏｌ）を、２ＭのトリエタノールアミンｐＨ７．０（０．４ｍＬ）＋ＤＭＳＯ（０．８ｍＬ）中に溶解した。ＴＨＰＴＡ（０．２３６ｍｇ、０．５４ｕｍｏｌ）を添加し、そして混合物を慎重に脱気した。ＣｕＩ（０．００３ｍｇ、０．０１８ｕｍｏｌ）を添加し、そして混合物を９０分間攪拌した。ＩＮＳ１８を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１８４３．５［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８４３．４。
【０３２６】
実施例９：Ｂ１−ベンジル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＢ２９−アセチルジエチレングリコール−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２１の調製
【０３２７】
【化１０３】
2022501364.tif 000104
ＩＮＳ２１を、グルコシドを作製するためのトリエチルエングリコール、およびマクロサイクルアジド６ｄを使用して、ＩＮＳ９と同様に調製した。ＩＮＳ２１  ＬＣＭＳ測定値１８５５．７［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８５５．９。
【０３２８】
実施例１０：Ｂ１−ベンジル−３，５−ビス−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９−Ｎε−プロパノイル、Ｃα−アミノメチル−ビス−トリアゾリル−ＰＥＧ４−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２２の調製
【０３２９】
【化１０４】
2022501364.tif 000105
ステップ１：ＤｅｓＢ３０ヒトインスリン（１２０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアミン（１００ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）、エタノール（１ｍＬ）、および０．１Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ７（１ｍＬ）の混合物中に溶解し、ＴＦＡを用いてｐＨ７．０に調節した。アクロモバクター・リチカス（ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ（４０ｕＬ、６．３ｍｇ／ｍＬ）の溶液を添加し、そして混合物を一晩放置した。ＩＮＳ２３を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１４３６．５［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１４３６．９。
【０３３０】
【化１０５】
2022501364.tif 000106
【０３３１】
ステップ２：ＩＮＳ２３（３００ｍｇ、５２ｕｍｏｌ）を、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液ｐＨ１１（１５ｍＬ）内に溶解し、そしてＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解されたＯ−スクシンイミジルペンチネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｅｎｔｙｎａｔｅ）（１０．１ｍｇ、５１ｕｍｏｌ）で処理した。反応を１時間放置し、ＩＮＳ２４を実施例１に記載されるようにＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１４５６．６［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１４５６．９。
【０３３２】
【化１０６】
2022501364.tif 000107
【０３３３】
ステップ３：ＩＮＳ２４（９７ｍｇ、１７ｕｍｏｌ）を、ＩＮＳ３について記載したようにＴＨＰＴＡおよびＣｕＩを使用して化合物１２（１２．７ｍｇ、３３ｕｍｏｌ）と反応させた。ＩＮＳ２５を、実施例１に記載したようにＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１６４７．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１６４７．６。
【０３３４】
【化１０７】
2022501364.tif 000108
【０３３５】
ステップ４：ＩＮＳ２５（８５ｍｇ、１３ｕｍｏｌ）を、５０％のアセトニトリル／水（１．２ｍＬ）中に溶解し、そして３，５−ジエチニルベンズアルデヒド（３．１ｍｇ、２１ｕｍｏｌ）で処理した。ｐＨを、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３を使用して４に調節した。ＮａＣＮＢＨ３（４ｍｇ、６５ｕｍｏｌ）を添加し、そして混合物を一晩放置した。ＩＮＳ２６を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１３４５．７［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１３４５．９。
【０３３６】
【化１０８】
2022501364.tif 000109
【０３３７】
ステップ５：ＩＮＳ２６（２４ｍｇ、４ｕｍｏｌ））、化合物１６（２０ｍｇ、１１ｕｍｏｌ）、ＴＨＰＴＡ（１ｍｇ）、およびメチル−β−Ｄ−グリコピラノシド（２０ｍｇ）を、２ＭのＥｔ３Ｎ／ＡｃＯＨ（１ｍＬ）＋ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解し、そして脱気した。スパチュラ先端量のＣｕＩで処理し、２時間放置した。ＩＮＳ２２を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１７１１．５［Ｍ＋６Ｈ］６＋、計算値１７１１．７。
【０３３８】
実施例１１：Ｂ１−ベンジル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ２マクロサイクルＢ２９−アセチル−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２７の調製
【０３３９】
【化１０９】
2022501364.tif 000110
ＩＮＳ２７は、グルコシドを作製するためのエチレングリコール、およびマクロサイクルアジド６ｄを使用して、ＩＮＳ９と同様に調製された。ＩＮＳ２７  ＬＣＭＳの測定値１８３８．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８３８．２。
【０３４０】
実施例１２：Ｂ１−メチル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ３−Ｇ１マクロサイクルＢ２９−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２８の調製
【０３４１】
【化１１０】
2022501364.tif 000111
ＩＮＳ２０（３６．４ｍｇ、６ｕｍｏｌ）および化合物２０（１４．５ｍｇ、７．８ｕｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（４ｍＬ）＋２ＭトリエチルアミンｐＨ７．０（３ｍＬ）に溶解した。ＴＨＰＴＡ（０．７８ｍｇ、１．８ｕｍｏｌ）を添加し、そしてフラスコを脱気した。ＣｕＩ（０．０１１ｍｇ、０．０６ｕｍｏｌ）を添加し、そして混合物を１時間放置した。ＩＮＳ２８を、実施例１の記載と同様にＨＰＬＣによって単離した。ＬＣＭＳの測定値１５５９．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１５５９．５。
【０３４２】
実施例１３：Ｂ１−ベンジル−３，５−ビス−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９−Ｃα−エチレンジアミン−メチルトリアゾリル−ＰＥＧ４−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ２９
【０３４３】
【化１１１】
2022501364.tif 000112
Ｎ，Ｎ−ジプロピニル−エチレンジアミンを、ＩＮＳ２３について記載したように酵素カップリングによって、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン中のＢ２９のＣαにコンジュゲートした。アジドＰＥＧ４グルコシド１２は、ＩＮＳ３について記載したようにアルキンに二重コンジュゲートされ、そして生成物のＢ１は、ＩＮＳ２６について記載したように３，５−ジエチニルベンズアルデヒドで還元的にアルキル化された。生成物を、ＩＮＳ２２の合成について記載したようにＧ１マクロサイクルＰＥＧ４アジド（化合物１６）とコンジュゲートし、そして生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１７１１．８［Ｍ＋６Ｈ］６＋、計算値１７１１．９。
【０３４４】
実施例１４：Ｂ１−メチル−４−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３０
【０３４５】
【化１１２】
2022501364.tif 000113
ＩＮＳ３０は、ＩＮＳ９について記載したようにＩＮＳ２０およびＧ１マクロサイクルＰＥＧ４アジド１６から調製され、そしてＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣにより精製された。ＬＣＭＳの測定値１５６８．１［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１５６８．３  
【０３４６】
実施例１５：Ｂ１−メチル−４−トリアゾリル−プロピル−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−アセチル−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３１
【０３４７】
【化１１３】
2022501364.tif 000114
ＩＮＳ３１を、１−アセチル−グルコシドおよびＧ１マクロサイクルプロピルアジド２１からＩＮＳ１８として調製し、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１５２４．２［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１５２４．３。
【０３４８】
実施例１６：Ｂ１−ベンジル−３，５−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−ベンゾイル−３，５−トリアゾリル−ＰＥＧ４−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３２
【０３４９】
【化１１４】
2022501364.tif 000115
ＩＮＳ３２は、ＩＮＳ２３について記載したようにスクシンイミジル３，５−ジエチニル安息香酸を使用してＢ２９中でｄｅｓＢ３０ヒトインスリンをアシル化することによって調製され、その後続いて、ＩＮＳ３について記載されるグルコシドＰＥＧ４アジド１２と反応し、続いて、ＩＮＳ２６について記載したように３，５−ジエチニルベンズアルデヒドを使用して還元アルキル化した。生成物を、ＩＮＳ２２の合成について記載したようにＧ１マクロサイクル−ＰＥＧ４−アジド（化合物１６）へとコンジュゲートし、そして生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１７１７．３［Ｍ＋６Ｈ］６＋、計算値１７１７．６。
【０３５０】
実施例１７：Ｂ１−ベンジル−３，５−トリアゾリル−プロピル−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−Ｂ２９−ベンゾイル−３，５−トリアゾリル−ＰＥＧ４−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３３
【０３５１】
【化１１５】
2022501364.tif 000116
ＩＮＳ３３は、ＩＮＳ３２について記載したようにｄｅｓＢ３０ヒトおよびスクシンイミジル３，５−ジエチニル安息香酸から調製され、続いてＩＮＳ３について記載したようにグルコシドＰＥＧ４アジド１２と反応し、その後続いてＩＮＳ２６について記載したように３，５−ジエチニルベンズアルデヒドを使用して還元アルキル化した。生成物を、ＩＮＳ３２の合成について記載したようにＧ１マクロサイクル−プロピルアジド（化合物２１）へとコンジュゲートし、そして生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１６７７．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋、計算値１６７８．２。
【０３５２】
実施例１８：Ｂ１−メチル−トリアゾリル−プロピル−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３４
【０３５３】
【化１１６】
2022501364.tif 000117
ＩＮＳ３４を、ＩＮＳ９について記載したようにＩＮＳ２０およびＧ１マクロサイクルプロピルアジド２１から調製した。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１９３０．７［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１９３０．７。
【０３５４】
実施例１９：Ｂ１−プロパノイル−トリアゾリル−ＰＥＧ３−Ｇ２マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３５
【０３５５】
【化１１７】
2022501364.tif 000118
Ａ１−Ｂｏｃ  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（ＥＰ０１３２７７０）を、ＩＮＳ２０について記載したようにグルコシドＰＥＧ３活性エステル８と反応させた。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製し、そしてスクシンイミジルペンチネートを使用してＢ１をアシル化し、そして生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。生成物を、ＩＮＳ９について記載したようにＧ２−マクロサイクルＰＥＧ３アジド２２とコンジュゲートさせた。ＬＣＭＳの測定値１８４３．１［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８４３．０。
【０３５６】
実施例２０：Ｂ１−プロパノイル−トリアゾリル−ＰＥＧ５−Ｇ２マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３６
【０３５７】
【化１１８】
2022501364.tif 000119
Ａ１−Ｂｏｃ  ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを、ＩＮＳ２０について記載したようにグルコシドＰＥＧ３活性エステル８と反応させた。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製し、そしてスクシンイミジルペンチネートを使用してＢ１をアシル化し、そして生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。生成物を、ＩＮＳ９について記載したようにＧ２−マクロサイクルＰＥＧ５アジド２３とコンジュゲートさせた。ＬＣＭＳの測定値１８６０．７３［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１８６０．６。
【０３５８】
実施例２１：Ｂ１−メチル−トリアゾリル−ＰＥＧ５−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３７
【０３５９】
【化１１９】
2022501364.tif 000120
ＩＮＳ３７を、ＩＮＳ９について記載したようにＩＮＳ２０およびＧ２マクロサイクルＰＥＧ５アジド２４から調製した。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１９７１．３［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１９７１．２。
【０３６０】
実施例２２：Ｂ１−メチル−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ０マクロサイクルＢ２９Ｎε−ＰＥＧ３−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３８
【０３６１】
【化１２０】
2022501364.tif 000121
ＩＮＳ３８を、ＩＮＳ９について記載したようにＩＮＳ２０およびＧ０マクロサイクルＰＥＧ４アジド２５から調製した。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１８４５．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１８４５．６。
【０３６２】
実施例２３：Ｂ１−メチル−トリアゾリル−ＰＥＧ４−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎεアセチル−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ３９
【０３６３】
【化１２１】
2022501364.tif 000122
ＩＮＳ３９を、１−アセチル−グリコシドおよびＧ１マクロサイクルＰＥＧ４アジド１６を使用してＩＮＳ１８として調製した。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１９３４．４［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１９３４．７。
【０３６４】
実施例２４：Ｂ１−メチル−トリアゾリル−ＰＥＧ３−Ｇ１マクロサイクルＢ２９Ｎε−アセチル−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ４０
【０３６５】
【化１２２】
2022501364.tif 000123
１−アセチル−グリコシドおよびＧ１マクロサイクルＰＥＧ３アジド２０を使用して、ＩＮＳ４０をＩＮＳ１８として調製した。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１９２３．６［Ｍ＋４Ｈ］４＋、計算値１９２３．６。
【０３６６】
実施例２５：Ｂ２９−プロパニオール−トリアゾリル−プロピル−Ｇ１マクロサイクルＡ１−アセチル−グリコシドｄｅｓＢ３０ヒトインスリンＩＮＳ４１
【０３６７】
【化１２３】
2022501364.tif 000124
ＤｅｓＢ３０ヒトインスリンｖａｒは、Ｂ２９でスクシンイミジル４−ペンチネート（ｐｅｎｔｙｎａｔｅ）（ｐＨ１０．５）と反応し、そしてＡ１で、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣにより精製された生成物である、スクシンイミジルＯ−ペルアセチル−１−アセチル−グルコシド（ｐＨ８．５）と反応した。Ｏ−アセチルは、１：１のＭｅＯＨ＋１００ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液を使用して、鹸化によって除去された。生成物を、ＩＮＳ３１と同様にＧ１マクロサイクルプロピルアジド２１と反応させた。生成物を、ＩＮＳ１について記載したようにＨＰＬＣによって精製した。ＬＣＭＳの測定値１５３２．７［Ｍ＋５Ｈ］５＋、計算値１５３２．７。
【０３６８】
グルコース感受性インスリン受容体活性化
【０３６９】
実施例２６：蛍光滴定によるマクロサイクルのグルコース親和性
所与のマクロサイクルの光学特性（蛍光）は、非結合状態とグルコース結合状態との間で変化する。マクロサイクルを、関連するグルコース濃度範囲内でグルコースで滴定し、かつシステムの蛍光の変化を測定することは、それ故にグルコース結合に対する結合曲線を与えることができ、これはグルコース結合定数Ｋａ（および変位定数Ｋｄ）を決定するために使用することができる。
【０３７０】
すべての溶液を、１０ｍＭのリン酸緩衝液溶液を使用してｐＨ７．４に維持した。滴定は、３１０ｎｍの励起波長を有するＨｏｒｉｂａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｕｅｔｔａ蛍光分光計を使用して実施し、かつ３２０〜５５０ｎｍからの放射をモニタリングした。励起および放射スリット幅／バンド幅を５ｎｍに設定した。すべての点は、０．５秒の積分時間および５つの蓄積を使用して取得された。
【０３７１】
溶液１−化合物６ｄの原液：
２ｍｇの化合物６ｄ（Ｍｗ＝３５４０ｇ／ｍｏｌ）を５．６ｍＬの超高純度Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＰＢ）中に溶解した。化合物６ｄの純度を、Ｄ２Ｏ中のＤＭＦの公知の濃度を内部標準として使用して、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって以前にアッセイした。純度を８０％（４０μＭ）で較正した。次いで、これを４倍に希釈して、化合物６ｄの１０μＭの溶液を得た。
【０３７２】
溶液２−Ｄ−グルコースおよび化合物６ｄの原液：
Ｄ−グルコース（１８８．１６ｍｇ）を１ｍＬの１０ｍＭのＰＢ中に溶解し、そして一晩静置して、αアノマーとβアノマーとの平衡化を可能にした。これは逐次的に希釈されて、２０ｍＭのＤ−グルコースの原液を得た。この溶液の２５０μＬを、２５０μＬの化合物６ｄ原液と組み合わせて、１０ｍＭのＤ−グルコース／５μＭの化合物６ｄを得た。
【０３７３】
３ｍＬのキュベット内で、１５００μＬの溶液１を、１５００μＬの１０ｍＭのリン酸緩衝液で希釈して、５μＭの溶液を得た。これを溶液２で滴定した。滴定剤溶液（溶液２）の各添加に対して、添加の前に等価体積をキュベットから除去して、セル体積を一定（３０００μＬ）に保持した。各添加物を１分間攪拌し、次いで攪拌を停止して、試料が取得前に平衡化するために１分間置いた。添加量（単位μＬ）：０、１０、１０、１０、１０、１０、２０、２０、５０、１００、１００。
【０３７４】
データを図２および図３に示す。
【０３７５】
計算値Ｋａ＝１４７５１．４８±６３７．３  Ｍ−１、Ｋｄ化合物６ｄ＝１／１４７５１Ｍ−１＝６８ｕＭ。
グルコース親和性は、以下に対して同様に測定された。
化合物２１、Ｋｄ＝８９ｕＭ
化合物２２、Ｋｄ＝１３２ｕＭ
化合物２３、Ｋｄ＝７８ｕＭ
化合物２４、Ｋｄ＝１３１ｕＭ
【０３７６】
マクロサイクルはすべて、どのリンカーが備えられているかにかかわらず、１００ｕＭ（Ｋｄ）付近の親和性でグルコースに結合する。
【０３７７】
実施例２７：グルコースの非存在下または存在下でのヒトインスリン受容体（ｈＩＲ−Ａ）に対する親和性を決定するためのアッセイ
インスリン誘導体のグルコース感受性を測定するために、ヒトインスリン受容体に対するインスリン誘導体の親和性を、グルコースが存在しない状態で、または２０ｍＭのグルコースが存在する状態で測定した。
【０３７８】
インスリン受容体の調製
ヒトインスリン受容体Ａ（ｈＩＲ−Ａ）を過剰発現させるＢＨＫ細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、および１０％のグリセロール中に溶解させた。クリアになった細胞溶解物を、９０分間、小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）−アガロース（小麦胚芽由来レクチン−アガロース、Ｌ１３９４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてバッチ吸収した。受容体を２０体積の５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄し、その後、受容体を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５Ｍのｎ−アセチルグルコサミン、および１０％グリセロールで溶出した。すべての緩衝液は、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する。
【０３７９】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）結合アッセイ
ＳＰＡ  ＰＶＴ抗マウスビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０から成るＳＰＡ結合緩衝液中で希釈した。ＳＰＡビーズをＩＲ特異性抗体８３−７および可溶化半精製ｈＩＲ−Ａを用いてインキュベートした。５０００ｃｐｍの１２５Ｉ−（Ｔｙｒ３１）−インスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）の１０％の結合を達成するように受容体濃度を調節した。冷たいリガンドの希釈系列を９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅに添加し、続いてトレーサー（１２５Ｉ−インスリン、５０００ｃｐｍ／ウェル）および最後に受容体／ＳＰＡ混合物を添加した。グルコース感受性を試験するために、結合実験を、２０ｍＭグルコースの非存在下または存在下で設定した。プレートを２２℃で２２．５時間穏やかに揺動させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で計数した。ヒトインスリンと比較した類似体に対する相対親和性を計算し、そして相対親和性の０から２０ｍＭグルコースへの増加は、類似体のグルコース感受性（ＨＩＲグルコース因子）に反映された。実験は、１．５％のヒト血清アルブミンの存在下で実施された。
【０３８０】
データを表１に示す。
【０３８１】
結果は、本発明のインスリン誘導体（一つの位置におけるグルコース結合剤マクロサイクルに加えて、別の位置におけるグルコシドで構成されたグルコース感受性スイッチを有するインスリン）が、グルコースが存在しないときよりも２０ｍＭのグルコースの存在下でより高いインスリン受容体親和性を有することを示す。ＩＮＳ２７、ＩＮＳ３１、ＩＮＳ３９、およびＩＮＳ４０は、最も弱いグルコース感受性を示し、リンカーの長さがインスリンコンジュゲートのグルコース感受性に影響を及ぼすことを実証している。
【０３８２】
【表１】
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【０３８３】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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