【手続補正書】
【提出日】平成21年12月4日(2009.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の合成によるエラーコレクションのための方法であって、該方法は、
（ａ）オリゴヌクレオチド断片を、各断片が所望の長さの所望のヌクレオチド配列の一部を有するよう、得るステップと、
（ｂ）該オリゴヌクレオチド断片を増幅するステップと、
（ｃ）該増幅したオリゴヌクレオチド断片を、当該所望の長さを有するよう、第一セットの分子にアセンブルするステップと、
（ｄ）該第一セットの分子を変性するステップと、
（ｅ）該変性された分子を当該所望の長さを有するよう、第二セットの分子にアニーリングするステップと、
（ｆ）該第二セットの分子を複数のエンドヌクレアーゼと反応させ、それによって、配列エラーの部位で該第二セットの分子にブラントカットを導入し、前記所望の長さよりも短い長さの断片を含む第三セットの分子を産生し、ここで、当該複数のエンドヌクレアーゼは任意の配列エラーの部位で切断するようにさせるステップと、
（ｇ）断片を含む該第三セットの分子を該所望の長さの第四セットの分子にアセンブルし、それによって、当該第一セットの分子と比較して、第四セットの分子のエラー数が減少されるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の合成のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列と、一以上の合成のヌクレオチド配列とのハイブリッドを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記断片を合成するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、マイクロチップ上で断片を合成するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記所望のヌクレオチド配列の両鎖の部分を有するように意図された一セットの断片を合成するステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
さらに、アセンブルされる前に前記断片の前記配列に従って、前記オリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
増幅に先立って前記オリゴヌクレオチドが得られ各別（separate）の容器に保持され、前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、固有（unique）の配列を共有する、断片の各グループを各別（separate）の容器に保持されるステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、固有（unique）のアダプタープライマーを用いるステップを含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記増幅した断片を第一セットの分子にアセンブルするか、又は前記第三セットの分子を第四セットの分子にアセンブルするステップは、オーバーラップ‐イクステンションポリメラーゼ連鎖反応を用いることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
さらに、一以上のラウンドないし回数（round）の追加的なエラーコレクションによって、前記第四セットの分子を処理するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
さらに、一以上のポリメラーゼ連鎖反応によって前記第四セットの分子を増幅するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
さらに、前記第四セットの分子を、一以上のベクターにクローニングするステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
さらに、前記第四セットの分子をシーケンシングするステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
前記複数のエンドヌクレアーゼはT7エンドヌクレアーゼIを含む、請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
前記複数のエンドヌクレアーゼは３つのエンドヌクレアーゼを含む、請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
前記複数のエンドヌクレアーゼはマングビーン（Mung Bean）エンドヌクレアーゼ、T7エンドヌクレアーゼI及びE.coliエンドヌクレアーゼVを含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｆ）の反応はマンガンの存在下で実行される、請求項１〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
前記複数のエンドヌクレアーゼとの反応は、さらに、前記第二セットの分子をランダムにエラーがない（error-free）部位で切断する、請求項１〜１９のいずれか一項の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
発明の概要
エラーコレクション（error correction）を備える核酸分子を合成するための方法が提供される。所望の完全長のヌクレオチド配列を有する分子の合成は、一般的に、所望の完全長のヌクレオチド配列の断片を有することを意図するオリゴヌクレオチドで開始し、任意に、他の所望のヌクレオチド、例えば、基質にオリゴヌクレオチドを結合するためのヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、所望の完全長の配列の両鎖用に合成されてよく、合成におけるオリゴヌクレオチドの使用の効率を高め、したがって、そのコストをコントロールする。オリゴヌクレオチドは増幅されて、所望の完全長のヌクレオチド配列を有することを意図する、第一セットの分子にアセンブル（assembled）される。所望のヌクレオチド配列にアセンブルされる分子（複数）のフィデリティを改善するために、オリゴヌクレオチドが、そのヌクレオチド配列に従ってグループ化されることが確実にされ得る。第一セットでの分子は変性されて、所望の完全長のヌクレオチド配列を有することを意図する、第二セットの分子を形成するようにアニールされる。第二セットでの分子は、例えば、配列エラーが存する、第二セットの分子にブラントカット（blunt cut）を形成する、エンドヌクレアーゼを、分子（複数）に混合することによって、第二セットでの分子に沿ってランダムで、より小さいセグメントに切断される。該より小さいセグメントは、所望の完全長のヌクレオチド配列を有することを意図する、一セットの分子にアセンブルされる。核酸分子の合成プロセスの終りの近くで、この手法で分子切断を促すことによって、従来の方法で得ることができるよりも、ヌクレオチド配列のエラーがほとんど無い、一セットの完全長の分子を得ることができる。
なお、ここに、まとめとして、本発明の好ましい実施の形態（形態シリーズI及び形態シリーズII）を示す。
形態シリーズI
（形態１）
核酸分子を合成するための方法であって、該方法は、
オリゴヌクレオチド断片を、各断片が所望のヌクレオチド配列を有するよう、得るステップと、
該オリゴヌクレオチド断片を増幅するステップと、
該増幅したオリゴヌクレオチド断片を、所望の長さを有するよう、第一セットの分子にアセンブルするステップと、
該第一セットの分子を変性するステップと、
該変性された分子を第二セットの分子にアニーリングするステップと、
所望の長さよりも短い長さを有するべく第三セットの分子を産生するように、該第二セットの分子をエンドヌクレアーゼと反応させるステップと、
該第三セットの分子を該所望の長さの第四セットの分子にアセンブルするステップと
を含む、方法。
（形態２）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列を含む、形態１の方法。
（形態３）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の合成のヌクレオチド配列を含む、形態１の方法。
（形態４）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列と、一以上の合成のヌクレオチド配列とのハイブリッドを含む、形態１の方法。
（形態５）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記断片を合成するステップをさらに含む、形態１の方法。
（形態６）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、マイクロチップ上で前記断片を合成するステップをさらに含む、形態５の方法。
（形態７）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記所望のヌクレオチド配列の両鎖用のアダプタープライマーを用いて、マイクロチップ上に前記断片を合成するステップをさらに含む、形態６の方法。
（形態８）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記所望のヌクレオチド配列の両鎖用の前記断片を合成するステップをさらに含む、形態５の方法。
（形態９）
さらに、前記断片の前記配列に従って、前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップを含む、形態１の方法。
（形態１０）
前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、各別（separate）の容器に、固有（unique）の配列を共有する、断片の各グループを配置するステップをさらに含む、形態９の方法。
（形態１１）
前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、固有（unique）のアダプタープライマーを用いるステップをさらに含む、形態９の方法。
（形態１２）
前記増幅したオリゴヌクレオチド断片を、所望の長さを有するよう第一セットの分子にアセンブルするステップは、一以上のオーバーラップ‐イクステンション（overlap-extension）ポリメラーゼ連鎖反応を用いることをさらに含む、形態１の方法。
（形態１３）
前記第三セットの分子を前記所望の長さの第四セットの分子にアセンブルするステップは、一以上のオーバーラップ‐イクステンションポリメラーゼ連鎖反応を用いることをさらに含む、形態１の方法。
（形態１４）
さらに、一以上のラウンドないし回数（round）の追加的なエラーコレクションによって、前記第四セットの分子を処理するステップを含む、形態１の方法。
（形態１５）
さらに、一以上のポリメラーゼ連鎖反応によって前記第四セットの分子を増幅するステップを含む、形態１の方法。
（形態１６）
さらに、前記第四セットの分子を、一以上のベクターにクローニングするステップを含む、形態１の方法。
（形態１７）
さらに、前記第四セットの分子を、一以上のベクターにクローニングするステップを含む、形態１５の方法。
（形態１８）
さらに、前記第四セットの分子をシーケンシングするステップを含む、形態１の方法。
（形態１９）
さらに、前記第四セットの分子をシーケンシングするステップを含む、形態１の方法。
（形態２０）
エラーコレクションの方法であって、該方法は、
エンドヌクレアーゼで、所望のヌクレオチド配列を有するよう、かつ、所望の長さを有するよう一セットの分子を反応するステップと、
該エンドヌクレアーゼで反応した分子のセットを、該所望の長さを有するよう第二セットの分子にアセンブルするステップとを含む方法。
（形態２１）
DNAアセンブリのための方法であって、該方法は、
オーバーラップを有する二本鎖DNA断片を合成するステップと、
エキソヌクレアーゼで該断片を反応させることによって、一本鎖のオーバーラップ（複数）を生成するステップと、
一本鎖結合タンパク質と反応させることによって該オーバーラップ（複数）をアニーリングするステップと、
DNAポリメラーゼでギャップを埋めるステップと、
DNAリガーゼでニックをシーリングするステップとを含む方法。
形態シリーズII
（形態１）
核酸分子の合成によるエラーコレクションのための方法であって、該方法は、
（ａ）オリゴヌクレオチド断片を、各断片が所望の長さの所望のヌクレオチド配列の一部を有するよう、得るステップと、
（ｂ）該オリゴヌクレオチド断片を増幅するステップと、
（ｃ）該増幅したオリゴヌクレオチド断片を、当該所望の長さを有するよう、第一セットの分子にアセンブルするステップと、
（ｄ）該第一セットの分子を変性するステップと、
（ｅ）該変性された分子を当該所望の長さを有するよう、第二セットの分子にアニーリングするステップと、
（ｆ）該第二セットの分子を複数のエンドヌクレアーゼと反応させ、それによって、配列エラーの部位で該第二セットの分子にブラントカットを導入し、前記所望の長さよりも短い長さの断片を含む第三セットの分子を産生し、ここで、当該複数のエンドヌクレアーゼは任意の配列エラーの部位で切断するようにさせるステップと、
（ｇ）断片を含む該第三セットの分子を該所望の長さの第四セットの分子にアセンブルし、それによって、当該第一セットの分子と比較して、第四セットの分子のエラー数が減少されるステップと
を含む、方法。
（形態２）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列を含む、形態１の方法。
（形態３）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の合成のヌクレオチド配列を含む、形態１又は２の方法。
（形態４）
前記所望のヌクレオチド配列は、一以上の自然に生じる遺伝子配列と、一以上の合成のヌクレオチド配列とのハイブリッドを含む、形態１の方法。
（形態５）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記断片を合成するステップを含む、形態１〜４のいずれかの方法。
（形態６）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、マイクロチップ上で断片を合成するステップを含む、形態１〜５のいずれかの方法。
（形態７）
前記オリゴヌクレオチド断片を得るステップは、前記所望のヌクレオチド配列の両鎖の部分を有するように意図された一セットの断片を合成するステップを含む、形態１〜６のいずれかの方法。
（形態８）
さらに、アセンブルされる前に前記断片の前記配列に従って、前記オリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップを含む、形態１〜７のいずれかの方法。
（形態９）
増幅に先立って前記オリゴヌクレオチドが得られ各別（separate）の容器に保持され、前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、固有（unique）の配列を共有する、断片の各グループを各別（separate）の容器に保持されるステップを含む、形態１〜８のいずれかの方法。
（形態１０）
前記増幅されたオリゴヌクレオチド断片をグループ化するステップは、固有（unique）のアダプタープライマーを用いるステップを含む、形態９の方法。
（形態１１）
前記増幅した断片を第一セットの分子にアセンブルするか、又は前記第三セットの分子を第四セットの分子にアセンブルするステップは、オーバーラップ‐イクステンションポリメラーゼ連鎖反応を用いることを含む、形態１〜１０のいずれかの方法。
（形態１２）
さらに、一以上のラウンドないし回数（round）の追加的なエラーコレクションによって、前記第四セットの分子を処理するステップを含む、形態１〜１１のいずれかの方法。
（形態１３）
さらに、一以上のポリメラーゼ連鎖反応によって前記第四セットの分子を増幅するステップを含む、形態１〜１２のいずれかの方法。
（形態１４）
さらに、前記第四セットの分子を、一以上のベクターにクローニングするステップを含む、形態１〜１３のいずれかの方法。
（形態１５）
さらに、前記第四セットの分子をシーケンシングするステップを含む、形態１〜１４のいずれかの方法。
（形態１６）
前記複数のエンドヌクレアーゼはT7エンドヌクレアーゼIを含む、形態１〜１５のいずれかの方法。
（形態１７）
前記複数のエンドヌクレアーゼは３つのエンドヌクレアーゼを含む、形態１〜１６のいずれかの方法。
（形態１８）
前記複数のエンドヌクレアーゼはマングビーン（Mung Bean）エンドヌクレアーゼ、T7エンドヌクレアーゼI及びE.coliエンドヌクレアーゼVを含む、形態１７の方法。
（形態１９）
前記ステップ（ｆ）の反応はマンガンの存在下で実行される、形態１〜１８のいずれかの方法。
（形態２０）
前記複数のエンドヌクレアーゼとの反応は、さらに、前記第二セットの分子をランダムにエラーがない（error-free）部位で切断する、形態１〜１９のいずれかの方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
次いで、変性された分子１１２のセットは、所望のヌクレオチド配列を有することを意図した、第二セットの完全長の分子１１８を得るようにアニールされる。一セットのそのような完全長の分子１１８の範囲内に、一以上の配列エラーを有する、一以上の分子１２０、及び、いかなる配列エラーも有しない、一以上の分子（不図示）が存在することを技術者は予期し得る。完全長分子１１２の変性されたセットは、任意の手法、例えば、分子１１２を冷却することによってアニールすることができる。