【手続補正書】
【提出日】平成22年7月5日(2010.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼを含むキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されるＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒し、前記セリンリコンビナーゼは、前記キメラタンパク質の構成において組換えを触媒するように選択され、または改良され、改良されたリコンビナーゼが自然に発生するものではない、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項２】
前記セリンリコンビナーゼが、
（ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）ならびに
（ｂ）（ａ）のセリンリコンビナーゼの変異タンパク質
である、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、
ヘキサヌクレオチドと結合する２指向性のジンクフィンガー結合ドメイン、９塩基対に結合する３指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、１２塩基対に結合する４指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、１５塩基対に結合する５指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン、１８塩基対に結合する６指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインからなる群より選択される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項４】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質が、
Ｔｎ３ＧＡＧＧＡＧであり、かつ、６塩基対配列ＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）と選好的に結合する２指向性のジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインとリンカーによって融合したＴｎ３由来のドメインを有する；および
Ｔｎ３Ｃｈ１５Ｇであり、かつ、Ｔｎ３に由来する変異セリンリコンビナーゼを有する
からなる群より選択される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項５】
Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＧ７０Ｓ、Ｄ１０２Ｙ、またはＥ１２４Ｑ；または、Ｔｎ３セリンリコンビナーゼ触媒ドメイン中のＩ１２Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｋ６５Ｒ、Ｍ７３Ｖ、Ｉ８０Ｍ、Ｖ１０８Ａ、Ｋ５３Ｅ、またはＫ１５１Ｍの変異のうち１つまたは複数の変異が、前記セリンリコンビナーゼに導入される、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項６】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、前記９塩基対配列ＧＧＡＧＧＧＧＴＧ（配列番号３）と結合する、または、前記９塩基対配列ＧＣＡＧＴＧＧＣＧ（配列番号４）と結合する、請求項４に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項７】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに、配列番号５〜配列番号７４から成る群から選択される配列ＡＮＮ、配列番号４４〜配列番号５３から成る群から選択される前記配列ＡＮＮ、配列番号７５〜配列番号１３１から成る群から選択される配列ＡＧＣ、配列番号７５〜配列番号８４から成る群から選択される前記配列ＡＧＣ、配列番号１３２〜配列番号１５６から成る群から選択される配列ＣＮＮ、配列番号１５７〜配列番号２６６から成る群から選択される前記配列ＧＮＮ、配列番号１５７〜配列番号１７２から成る群から選択される前記配列ＧＮＮ、配列番号２６７〜配列番号６２３および配列番号６５３〜配列番号７０５から成る群から選択される配列ＴＮＮ、配列番号２６７〜配列番号３１１から成る群から選択される前記配列ＴＮＮからなる群から選択されるトリヌクレオチドに結合している少なくとも１つの配列を含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインが、トリプレット結合ドメイン間に位置する少なくとも１つのオリゴペプチドリンカーを含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項９】
前記オリゴペプチドリンカーが、ＴＧＥＫＰ（配列番号６２４）、ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＥＫＰ（配列番号６２５）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号６２６）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号６２７）、ＧＧＲＧＲＧＲＧＲＱ（配列番号６２８）、ＱＮＫＫＧＧＳＧＤＧＫＫＫＱＨＩ（配列番号６２９）、ＴＧＧＥＲＰ（配列番号６３０）、ＡＴＧＥＫＰ（配列番号６３１）、およびＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＰ（配列番号７０６）からなる群から選択される、請求項８に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１０】
１から５の保存的アミノ酸置換による請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に由来するキメラリコンビナーゼタンパク質であって、前記保存的アミノ酸置換が各々、Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕから選択され、前記保存的アミノ酸置換に由来する前記キメラリコンビナーゼタンパク質は、前記未変異のキメラリコンビナーゼと同じ組換えに対するＤＮＡ配列特異性を有し、その基質に対する結合親和性が、前記未変異のキメラリコンビナーゼの基質に対する結合親和性の約８０％以上であり、そのＶｍａｘが、前記未変異のキメラリコンビナーゼのＶｍａｘの約８０％以上である、キメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１１】
前記キメラリコンビナーゼタンパク質が、少なくとも１つの追加のドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１２】
前記追加のドメインが、精製タグ、酵素ドメイン、リガンド結合ドメイン、細胞透過性ドメイン、及び蛍光または生物発光を介して検出できる光の生成を触媒する酵素ドメインである、請求項１１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離された核酸配列。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）前記キメラリコンビナーゼタンパク質が前記ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインにより特異的に結合されているＤＮＡ部位で部位特異的組換えを触媒するように、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインに作動可能に連結されたセリンリコンビナーゼ、および
（ｉｉ）キメラリコンビナーゼＴｎ３ＧＡＧＧＡＧ、
から成る群から選択されるキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする、単離された核酸配列と、
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも９５％同一である、単離および精製された核酸配列であって、前記核酸配列が前記配列の活性を塩基の置換が行われるまで保持しており、かつ、前記核酸配列によりコードされるタンパク質の任意の活性および核酸レベルで発現される前記核酸配列の任意の活性を含む核酸配列と
から成る群から選択される、単離された核酸配列。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項１６】
発現ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１３もしくは１４に記載の核酸配列、または請求項１５もしくは１６に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質に結合している、少なくとも２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記部位がスペーサーによって分離されている、工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡと前記キメラリコンビナーゼとを、少なくとも一つのキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で接触させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断され、部位特異的組換えが起こる、工程と
を含む、部位特異的組換えを行う方法。
【請求項２０】
部位特異的組換え事象が、反転、組込み、または分離である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の各々が少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と、
（ｂ）前記第１の配列および第２の配列と、少なくとも一つの前記キメラリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件において接触させる工程であって、第１の配列および第２の配列の両方の鎖が切断され、第１の配列および第２の配列が関与する部位特異的組換えが行われる工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項２２】
前記第１の配列および前記第２の配列を伴って行われる組換え事象が、一部のＤＮＡが失われるかまたは付加され、かつ、産物の部位が少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとの反応に適合する基質ではない、非保存的組換え事象であるか、または適合する組換え部位の１つの対または両方の対のいずれかが、一方向性の組換えに適しているカセット交換である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）第１の配列および第２の配列からなる２つのＤＮＡ配列を提供する工程であって、前記第１の配列および前記第２の配列の一方が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼに結合している部位をその中に有し、かつ、前記第１の配列および前記第２の配列のもう一方が、少なくとも１種類の天然に存在するセリンリコンビナーゼに結合する部位をその中に有する工程と、
（ｂ）前記第１の配列および前記第２の配列と前記少なくとも一つのキメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼとを、前記キメラリコンビナーゼおよび前記天然に存在するセリンリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で接触させる工程であって、前記第１の配列と前記第２の配列の両方の鎖が切断され、前記第１の配列および前記第２の配列が関与する部位特異的組換え事象がおこる、工程と
を含む、部位特異的組換え事象を行う方法。
【請求項２４】
（ａ）組換えのための２つの部位をその中に有するＤＮＡ配列を提供する工程であって、各部位が、
（ｉ）キメラリコンビナーゼ半部位の最適な結合部位と比較して、実質的に低い親和性で前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼと結合している、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼのための変異結合部位と、
（ｉｉ）最適に結合している少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼ半部位のための結合部位とを含み、これらの部位が、少なくとも１種類の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼと特異的に結合し、これらの部位がスペーサーによって分離されている、工程と
（ｂ）前記ＤＮＡ配列と少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼとを前記少なくとも１種類のキメラリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒する条件下で反応させる工程であって、前記ＤＮＡ配列の両方の鎖が前記キメラリコンビナーゼと特異的に結合する二つの部位の間で切断されることにより部位特異的組換えが行われ、部位特異的組換え事象が組み込みであり、組み込みの結果が安定するようにキメラリコンビナーゼ半部位のための変異結合部位のホモ二量体が組換えに対して非機能的に形成される、工程と
を含む、ＤＮＡ分子において安定な組込みを行う方法。
【請求項２５】
（ａ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第１の部位をその中に有する第１のＤＮＡ配列を提供する工程と、
（ｂ）少なくとも１種類の請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼと反応性である、組換えのための第２の部位をその中に有する第２のＤＮＡ配列を、前記第１の部位と前記第２の部位が機能的に直交するように提供する工程と、
（ｃ）前記第１のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第１のキメラリコンビナーゼと反応させ、前記第２のＤＮＡ配列を前記少なくとも１種類の第２のキメラリコンビナーゼと反応させて組換えをもたらす工程と
を含む、ＤＮＡ分子において組換えを行う方法。
【請求項２６】
カセット交換を実行するために、前記組換えのための第１の部位かまたは前記組換えのための第２の部位のいずれかでの組込みに続いて、組込みに用いられていない前記第１および前記第２の部位の一方で切除が行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
組換えの結果が反転、または分離となる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミドと、
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する、第２のプラスミドであって、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なり、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミドと
を生成する工程と、
（ｂ）第１の遺伝子のコード領域および第２の遺伝子のコード領域を、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位で隣接することにより２つのカセットを構築する工程と、
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と、
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項２９】
（ａ）２つのプラスミド、
（ｉ）第１の触媒ドメインおよび第１のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第１の抗生物質抵抗性遺伝子を発現する第１のプラスミドであって、前記第１のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第１の遺伝子の内在性隣接配列と結合する、第１のプラスミドと、
（ｉｉ）第２の触媒ドメインおよび第２のジンクフィンガードメインを含み、請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼを発現し、かつ第２の抗生物質抵抗性遺伝子を発現している第２のプラスミドであって、前記第２のキメラリコンビナーゼは変異または選択されて第２の遺伝子の内在性隣接配列と結合し、前記第１の触媒ドメインと前記第２の触媒ドメインが異なり、かつ前記第１のジンクフィンガードメインと前記第２のジンクフィンガードメインが異なるように、かつ、前記第１および前記第２の抗生物質抵抗性遺伝子が２つの異なる抗生物質に対する抵抗性を付与する第２のプラスミドと
を生成する工程と、
（ｂ）第１のカセットが第１の内在性隣接領域に隣接される第１の遺伝子を含み、第２のカセットが第２の内在性隣接領域に隣接される第２の遺伝子を含む２つのカセットを、２つのキメラリコンビナーゼによるプラスミド内切除を防ぐように、請求項１に記載の第１のキメラリコンビナーゼおよび請求項１に記載の第２のキメラリコンビナーゼの１つと各々が結合している非反復ホモ二量体部位をその中に含む前記２つの内在性隣接領域の各々により構築する工程と、
（ｃ）各プラスミドに１つのカセットを挿入して、カセットをその中に含む２つのプラスミドを生成する工程と、
（ｄ）細菌宿主に、カセットを含む前記第１のプラスミドおよびカセットを含む前記第２のプラスミドを、組換えが起こるように同時導入する工程と
を含む、カセット交換を促進する方法。
【請求項３０】
前記組換えが、プラスミド内カセット交換、染色体遺伝子とプラスミドの間、導入ＤＮＡと染色体遺伝子の間、またはカセット交換により促進される切除である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）ゲノム中に有害遺伝子を有する個体に、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸をその中に含む組成物を投与する工程であって、前記部位特異的リコンビナーゼは、発現されると、前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除く、工程と、
（ｂ）発現される前記部位特異的リコンビナーゼに前記有害遺伝子をゲノムから特異的に取り除かせる工程と、
を含む、有害遺伝子が組換え切除により取り除かれる遺伝子治療のための方法において用いるための、請求項１に記載の部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸。
【請求項３２】
（ａ）治療有効量の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質、または治療有効量の請求項１に記載のキメラリコンビナーゼタンパク質をコードする核酸配列と、
（ｂ）医薬品として許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項３３】
前記核酸配列が遺伝子治療のための送達系に組み込まれている、請求項１１９に記載の医薬組成物。