【手続補正書】
【提出日】平成21年12月15日(2009.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞と非内皮細胞（non-endothelial cells）とを含む微小凝集体（microaggregate）における内皮細胞対非内皮細胞の生存能力に関して処置（treatment）の効果を差異的に（differentially）決定する方法であって、該方法は、
前記微小凝集体を該処置と接触すること；
生細胞により排除される第一指示薬を添加すること、及び前記微小凝集体に存在する内皮細胞対非内皮細胞による該指示薬の取り込みを観察すること；及び
前記微小凝集体における内皮細胞対非内皮細胞の生存能力に関して前記処置の差異的効果を顕微鏡観察によって観察することを含む方法。
【請求項２】
前記微小凝集体は培養物に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は前記微小凝集体を顕微鏡観察のための表面に沈着することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一指示薬はファーストグリーンである、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記微小凝集体を、生細胞により排除されない第二指示薬で処理することをさらに含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記第一指示薬はファーストグリーンであり、前記第二指示薬はヘマチン［ヘマトキシリンの誤記］／エオシン（H／E）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
内皮細胞の死を特異的にもたらす薬剤を同定する方法であって、該方法は、
候補薬剤で、内皮細胞と非内皮細胞とを含む微小凝集体を処理すること；
効果をもたらすように該薬剤に十分な時間を及ぼさせること；
生存可能な細胞により排除される第一指示薬で該微小凝集体を処理すること；及び
該微小凝集体の内皮細胞対非内皮細胞によって取り込まれた指示薬を観察することを含み、
それによって、前記指示薬を取り込んだ内皮細胞が観察でき、内皮細胞の死を特異的にもたらす薬剤を示す、方法。
【請求項８】
前記第一指示薬はファーストグリーンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記観察ステップに先立ち、第二指示薬の溶液で前記微小凝集体を処理することをさらに含み、該溶液は前記第一指示薬に多大な視感度（visibility）をもたらす、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一指示薬はファーストグリーンであり、前記第二指示薬はヘマチン［ヘマトキシリンの誤記］／エオシン（H／E）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
死んだ内非細胞はブルーベリーパンケーキの外観と似ている、請求項６又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微小凝集体は、細かく切り刻んだ生検サンプルに一連の遠心分離ステップを施すことによって調製され、
前記分離された微小凝集体が形成されるまで該一連のクイックスピン遠心分離ステップが繰り返される、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
ベバシズマブは毛細血管細胞を含む細胞に対する直接的な影響を有さないが、マイクロクラスタ内で腫瘍細胞によって局所的に産生される血管内皮増殖因子（VEGF）と複合体（complexes）を形成することが知られている。VEGFは、ベバシズマブに反応する腫瘍において、内皮細胞の増殖及び生存に必要とされる。これらの結果は、VEGFの連続した存在が、毛細血管関連細胞の生存能力を維持するために必要とされることを示す。培養組織のVEGFをベバシズマブで阻害することは、VEGFに依存する毛細血管関連細胞の死をもたらす。ベバシズマブに反応する“ブルーベリーパンケーキ”クラスタを形成する腫瘍は、ベバシズマブを用いた臨床化学療法に応答する可能性が高く、一方で、“ブルーベリーパンケーキ”クラスタを形成しない腫瘍はベバシズマブを用いた臨床化学療法に応答する可能性は低い。また、記載されたアッセイシステムは、ベバシズマブ耐性微小毛細血管に対して作用するであろう、治療の形態を発見するために使用され得る。
本発明のさらに他の一視点では、以下の形態を提供することができる：
［形態１］
少なくとも生存可能な内皮細胞と、自然な周辺の生存可能な非内皮細胞（natively surrounding viable non-endothelial cells）とを含んで構成される分離された微小凝集体（microaggregate）であって、該微小凝集体は顕微鏡観察に適切な表面に提示（displayed）される、分離された微小凝集体。
［形態２］
前記内皮細胞は毛細血管の内皮細胞である、形態１に記載の微小凝集体。
［形態３］
前記周辺細胞は腫瘍細胞である、形態１に記載の微小凝集体。
［形態４］
形態１に記載の微小凝集体の調製方法であって、該方法は、細かく切り刻んだ生検サンプルに一連の遠心分離ステップを施すことを含み、
各ステップにおいて、該サンプルは50−500xgの力を受けるようにもたらされ、次いで、直ちに1xgに戻され、このようにして細胞クラスタペレット及び上澄みを得て、該上澄みを除去し、該ペレットを再懸濁して、
前記分離された微小凝集体が形成されるまで該一連の遠心分離ステップが繰り返される、方法。
［形態５］
微小凝集体の細胞の生存能力に関して処置（treatment）の効果を決定する方法であって、該方法は、
少なくとも生存可能な内皮細胞と、自然な周辺の生存可能な非内皮細胞とを含んで構成される少なくとも一つの微小凝集体を含む組成物を該処置と接触すること、及び
前記微小凝集体の細胞の生存能力に関して前記処置の効果を顕微鏡観察によって観察することを含む方法。
［形態６］
前記構成物は前記微小凝集体の培養物である、形態５に記載の方法。
［形態７］
前記方法は前記微小凝集体を顕微鏡観察のための表面に沈着することを含む、形態５に記載の方法。
［形態８］
前記観察ステップは、生細胞により排除される第一指示薬を添加すること、及び前記微小凝集体に存在する細胞による該指示薬の取り込みを観察することを含む、形態５に記載の方法。
［形態９］
前記観察ステップは、生細胞により排除される第一指示薬を添加すること、及び前記微小凝集体に存在する細胞による該指示薬の取り込みを観察することを含む、形態７に記載の方法。
［形態１０］
前記第一指示薬は前記微小凝集体の前記培養物に添加される、形態６に記載の方法。
［形態１１］
前記第一指示薬は顕微鏡観察に適切な表面上の前記微小凝集体に添加される、形態７に記載の方法。
［形態１２］
前記微小凝集体を、生細胞により排除されない第二指示薬で処理することをさらに含む、形態１０に記載の方法。
［形態１３］
前記微小凝集体を、生細胞により排除されない第二指示薬で処理することをさらに含む、形態１１に記載の方法。
［形態１４］
前記第二指示薬が顕微鏡観察に適切な表面上に提示される前記微小凝集体に添加される、形態１３に記載の方法。
［形態１５］
前記第一指示薬はファーストグリーンである、形態８に記載の方法。
［形態１６］
前記第一指示薬はファーストグリーンであり、前記第二指示薬はヘマチン［ヘマトキシリンの誤記］／エオシン（H／E）である、形態１２に記載の方法。
［形態１７］
前記微小凝集体の周辺細胞は腫瘍細胞である、形態５に記載の方法。
［形態１８］
前記微小凝集体の周辺細胞は正常細胞である、形態５に記載の方法。
［形態１９］
内皮細胞の死を特異的にもたらす薬剤を同定する方法であって、該方法は、
候補薬剤で、少なくとも生存可能な内皮細胞と、自然な周辺の生存可能な非内皮細胞とを含んで構成される微小凝集体を処理すること、
効果をもたらすように該薬剤に十分な時間を及ぼさせること、
生存可能な細胞により排除される第一色素で該微小凝集体を処理すること、及び
該微小凝集体の細胞による該色素の取り込み又は取り込みの欠損を観察することを含み、
それによって、前記微小凝集体の前記周辺細胞ではなく、前記微小凝集体の前記内皮細胞内で前記色素の取り込みに作用する薬剤が、内皮細胞の死を特異的にもたらす薬剤として同定される、方法。
［形態２０］
前記観察ステップに先立ち、第二色素の溶液で前記微小凝集体を処理することをさらに含み、該溶液は前記第一色素に多大な視感度（visibility）をもたらす、形態１９に記載の方法。