【手続補正書】
【提出日】平成22年9月2日(2010.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質に結合した核酸オリゴマーを含む組成物であって、該融合タンパク質が、
(a)対象とするタンパク質を含む第一のドメインと
(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインとを含み；
該核酸オリゴマーが、
(c) PCR増幅配列である第一の核酸配列と
(d) 該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列とを含み；
該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である、前記組成物。
【請求項２】
前記核酸が一本鎖又は二本鎖DNAである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸相互作用モチーフがDNA結合ドメインである、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項４】
前記DNA結合ドメインがNF-κBのDNA結合ドメイン、croリプレッサーのDNA結合ドメイン、lacリプレッサーのDNA結合ドメイン、GAL4のDNA結合ドメイン、GCN4のDNA結合ドメイン、Lex-AのDNA結合ドメイン、Opaque-2のDNA結合ドメイン又は、TGAIaのDNA結合ドメインである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
前記第二の核酸配列が配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20又は配列番号21に示す配列を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項６】
前記第二の核酸配列が配列番号10、配列番号12又は配列番号13に示す配列を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴマーが、約50〜約500ヌクレオチドの長さである、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
前記対象とするタンパク質が膜貫通タンパク質、膜貫通イオンチャネルタンパク質、リガンド作動性イオンチャネルタンパク質、核ホルモン受容体タンパク質、細胞外シグナル伝達分子若しくは因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、抗体又は短鎖可変断片(scFv)である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記対象とするタンパク質が活性状態又は不活性状態のキナーゼである、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
前記キナーゼがヒトキナーゼである、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
前記キナーゼが非受容体チロシンキナーゼである、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
前記非受容体チロシンキナーゼが、ABL、ACK、CSK、MATK、FAK、PYK2、FES、FRK、JAK、SRC-A、SRC-B、TEC又はSYKチロシンキナーゼファミリーのメンバーである、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
前記キナーゼが受容体チロシンキナーゼである、請求項9記載の組成物。
【請求項１４】
前記受容体チロシンキナーゼが、ALK、AXL、DDR、EGFR、EPH、FGFR、INSR、MET、MUSK、PDGFR、PTK7、RET、ROR、ROS、RYK、TIE、TRK、VEGFR、AATYK又はSuRTK106チロシンキナーゼファミリーのメンバーである、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
配列番号1;配列番号2;配列番号3又は配列番号4に示すヌクレオチド配列を含む、核酸オリゴマー。
【請求項１６】
前記対象とするタンパク質及び前記核酸相互作用モチーフが互いに異なる、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
対象とするタンパク質を検出する方法であって：
融合タンパク質を検出可能な核酸オリゴマーと接触させることであって、該融合タンパク質が、対象とするタンパク質を含む第一のドメインと核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインとを含み、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフが互いに異なり、該核酸オリゴマーが該融合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含むこと；を含む、前記方法。
【請求項１８】
リガンドに結合する対象とするタンパク質を同定する方法であって、
固体支持体上に固定化されたリガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させることであって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
該核酸オリゴマーが該融合タンパク質に結合するかどうかを検出することと;を含み、それにより、結合した核酸オリゴマーの検出は、該対象とするタンパク質が該リガンドに結合することを示す、前記方法。
【請求項１９】
対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下及び不在下で、該対象とするタンパク質に結合する固定化参照リガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させることであって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
該核酸オリゴマーが該融合タンパク質に結合するかどうかを検出することと;を含み、試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での該固定化参照リガンドに結合した融合タンパク質の量の減少は、該試験化合物が該対象とするタンパク質に結合することを示す、前記方法。
【請求項２０】
対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値を決定する方法であって、
様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該対象とするタンパク質に結合する固定化参照リガンドを、(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質と接触させることであって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを加えることと;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
試験化合物の該様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において固体支持体上に保持された該融合タンパク質に結合する該核酸オリゴマーを検出し、又はその他の方法で定量することによって、競合結合曲線を得ることと;を含み、それにより、該対象とするタンパク質に対する該試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で該固定化参照リガンドに保持された該対象とするタンパク質が、試験化合物の不在下で保持された該対象とするタンパク質の50%である濃度である、前記方法。
【請求項２１】
前記核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)前記核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列、を含み、該第一の核酸配列は該第二の核酸配列に対して異種性である、請求項17〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
ATPにも結合する対象とするタンパク質に結合する試験化合物が、非ATP競合的結合剤として、ATP競合的結合剤として、又はATP競同的結合剤として、該対象とするタンパク質に結合するか否かを決定する方法であって、
a)ATPの存在下で、かつ該対象とするタンパク質の活性部位に結合する固定化された参照リガンドの存在下で、該対象とするタンパク質に対する該試験化合物のKdを測定すること；
b)ATPの不在下、固定化された参照リガンドの存在下で、該対象とするタンパク質に対する該試験化合物のKdを測定すること；を含み、
(i)ATPの不在下と比較してATPの存在下で試験化合物に対して測定されたKdの増加は、該試験化合物がATP競合的結合剤であることを示し；
(ii)ATPの不在下と比較してATPの存在下で試験化合物に対して測定されたKdの不変は、該試験化合物が非ATP競合的結合剤であることを示し；及び、
(iii)ATPの不在下と比較してATPの存在下で生じた試験化合物に対して測定されたKdの減少は、該試験化合物がATP競同的結合剤であることを示す、前記方法。
【請求項２３】
2つ以上の対象とするタンパク質に結合する試験化合物をウェル内で同定する方法であって、
試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを2つ以上の融合タンパク質と接触させることであって、各融合タンパク質が独立して(a)該2つ以上の対象とするタンパク質の1つだけを含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含み、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
2つ以上の核酸オリゴマーを加えることであって、該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれが、該2つ以上の融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する核酸配列を含むことと;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又はその他の方法で定量することと;を含み、試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化参照リガンドに結合した2つ以上の融合タンパク質のそれぞれの量の減少は、該試験化合物が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合することを示す、前記方法。
【請求項２４】
2つ以上の対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値をウェル内で決定する方法であって、
様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを2つ以上の融合タンパク質とウェル内で接触させることであって、各融合タンパク質が独立して(a)該2つ以上の対象とするタンパク質の1つだけを含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含み、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
2つ以上の核酸オリゴマーを加えることであって、該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれが、該2つ以上の融合タンパク質の1つだけの核酸相互作用モチーフに独立して結合する核酸配列を含むことと;
未結合の核酸オリゴマー及び/又は未結合の融合タンパク質を除去することと;
試験化合物の該様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において固体支持体上に保持された該2つ以上の融合タンパク質に結合する該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又はその他の方法で定量することによって、競合結合曲線を得ることと;を含み、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに対する前記試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で参照リガンドに固定化されて保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが、試験化合物の不在下で保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれの50%である濃度である、前記方法。
【請求項２５】
前記核酸オリゴマーが放射標識、蛍光標識又はビオチン化されている、請求項23又は24記載の方法。
【請求項２６】
前記参照リガンドがSB202190、スタウロスポリン、プルバラノールB、SU5402、イマチニブメシレート、SU6668、イレッサ又はPD-173955である、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定するためのキットであって、
(a) 核酸オリゴマーに結合する融合タンパク質であって、(i)前記対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(ii)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメインを含み、該対象とするタンパク質と該核酸相互作用モチーフとが互いに異なり、該核酸オリゴマーが該融合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む、前記融合タンパク質;及び、
(b) 該対象とするタンパク質に結合する参照リガンド； 
を含む、前記キット。
【請求項２８】
前記核酸オリゴマーが、(a)PCR増幅配列である核酸配列であって、該PCR増幅配列が前記融合タンパク質の核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列に対して異種性である前記核酸配列をさらに含む、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
対象とするタンパク質に結合する試験化合物を同定するためのキットを製造する方法であって、
(a)該対象とするタンパク質を含む第一のドメイン、及び(b)核酸相互作用モチーフを含む第二のドメイン、を含む融合タンパク質をクローニングし発現させることであって、該対象とするタンパク質及び該核酸相互作用モチーフは互いに異なることと;
該融合タンパク質の該核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含む核酸オリゴマーを合成することと
を含む、前記製造方法。
【請求項３０】
前記対象とするタンパク質に結合する参照リガンドを固体支持体に固定化することをさらに含む、請求項29記載の製造方法。
【請求項３１】
前記核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)前記核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列、を含み、該第一の核酸配列が該第二の核酸配列に対して異種性である、請求項29又は30記載の製造方法。
【請求項３２】
試験化合物が、2つ以上の対象とするタンパク質に結合するか否かをウェル内で決定する方法であって、
(i)核酸オリゴマーを該2つ以上の対象とするタンパク質に接触させるステップであって、該対象とするタンパク質のそれぞれが核酸相互作用モチーフを含み、かつ該核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該PCR増幅配列が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに特異である、前記ステップ；
(ii)試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、該2つ以上の対象とするタンパク質とウェル内で接触させるステップであって、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが該核酸オリゴマーに結合する、前記ステップ；
(iii)未結合の融合タンパク質を除去するステップ;及び、
(iv)該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又はその他の方法で定量するステップ;を含み、
試験化合物の不在と比較した、試験化合物の存在下での固定化参照リガンドに結合した2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれの量の減少は、該試験化合物が2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合することを示す、前記方法。
【請求項３３】
2つ以上の対象とするタンパク質に対する試験化合物のKd値をウェル内で決定する方法であって、
(i)核酸オリゴマーを該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに接触させるステップであって、該対象とするタンパク質のそれぞれが核酸相互作用モチーフをさらに含み、かつ該核酸オリゴマーが(a)PCR増幅配列である第一の核酸配列、及び(b)該核酸相互作用モチーフに結合する第二の核酸配列を含み、該PCR増幅配列が該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに特異である、前記ステップ；
(ii) 様々な濃度の試験化合物の存在下及び不在下で、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれに結合する固定化参照リガンドを、該2つ以上の対象とするタンパク質とウェル内で接触させるステップであって、該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが該核酸オリゴマーに結合する、前記ステップ；
(iii)未結合の融合タンパク質を除去するステップ;及び、
(iv)試験化合物の該様々な濃度のそれぞれ及びその不在下において固体支持体上に保持された該2つ以上の融合タンパク質に結合する該2つ以上の核酸オリゴマーのそれぞれを検出し、又はその他の方法で定量することによって、競合結合曲線を得るステップ;を含み、それにより、該2以上の対象とするタンパク質のそれぞれに対する該試験化合物のKd値は、試験化合物の存在下で該固定化参照リガンドに保持された該2つ以上の対象とするタンパク質のそれぞれが、試験化合物の不在下で保持された該それぞれの2以上の対象とするタンパク質の50%である濃度である、前記方法。
【請求項３４】
前記ステップ(ii)におけるウェルが、前記核酸相互作用モチーフに結合する核酸配列を含み、かつPCR増幅配列を欠失しているPCRサイレント核酸オリゴマーをさらに含む、請求項32又は33記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸相互作用モチーフがNFkBである、請求項32〜34のいずれか1項記載の方法。