(57)【要約】  ＬＤＨＡ遺伝子内での、例えば二本鎖切断の導入である、編集のための組成物及び方法を提供する。高シュウ酸尿症を患う対象を治療するための組成物及び方法を提供する。【選択図】図２
2022502055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）又は一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘発する方法であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む組成物を細胞に送達することを含む、方法。
【請求項２】
ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させる方法であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む組成物を細胞に送達することを含む、方法。
【請求項３】
高シュウ酸尿症を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、
それによって高シュウ酸尿症を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項４】
高シュウ酸尿症が引き起こす末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、
それによって高シュウ酸尿症が引き起こす（ＥＳＲＤ）を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項５】
シュウ酸カルシウムの産生及び沈着、原発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症、血尿のうちのいずれかひとつを治療又は予防し、そして腎臓又は肝臓の移植の必要性を遅延又は改善させる方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は 
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、
それによって、シュウ酸カルシウムの産生及び沈着、原発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症、血尿のうちのいずれかひとつを治療又は予防し、そして腎臓又は肝臓の移植の必要性が遅延又は改善することを含む、方法。
【請求項６】
血清グリコール酸塩濃度を増加させる方法であって、それを必要とする対象に対して、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含むものである当該組成物を投与し、
それによって、血清グリコール酸塩濃度が増加することを含む、方法。
【請求項７】
対象において尿中のシュウ酸塩を減少させる方法であって、それを必要とする対象に対して、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、
それによって、対象の尿中のシュウ酸塩が減少することを含む、方法。
【請求項８】
ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸が投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は 
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む、組成物。
【請求項１０】
短鎖シングルガイドＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）（ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ｉ．
１．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つ；又は
２．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
３．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である；又は
４．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つ；又は
５．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つ；又は
６．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つ；又は
７．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つ、
を含むガイド配列と、
ｉｉ．ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分であって、当該ヘアピン領域は少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが欠如しており、また随意にｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが５’末端修飾及び３’末端修飾のうちの１又は複数を含むものである、当該ｓｇＲＮＡの保存部分と、
を含む、組成物。
【請求項１１】
配列番号２０２の配列を含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
５’末端修飾を含む、請求項１０又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’末端修飾を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが５’末端修飾及び３’末端修飾を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’尾部を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記３’尾部が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチドを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記３’尾部が約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０個、少なくとも１〜２個、少なくとも１〜３個、少なくとも１〜４個、少なくとも１〜５個、少なくとも１〜７個、又は少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’尾部を含まない、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヘアピン領域に修飾を含む、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
３’末端修飾と、前記ヘアピン領域の修飾とを含む、請求項１０から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
３’末端修飾と、前記ヘアピン領域の修飾と、５’末端修飾とを含む、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
５’末端修飾と、前記ヘアピン領域の修飾とを含む、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヘアピン領域は、少なくとも５個の連続したヌクレオチドが欠如している、請求項１０から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
当該少なくとも５〜１０個の欠如したヌクレオチドは、
ａ．ヘアピン１の範囲内にあるか；
ｂ．ヘアピン１及びヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”の範囲内にあるか；
ｃ．ヘアピン１及びヘアピン１の３’直近の２個のヌクレオチドの範囲内にあるか；
ｄ．ヘアピン１の少なくとも一部を含むか；
ｅ．ヘアピン２の範囲内にあるか；
ｆ．ヘアピン２の少なくとも一部を含むか；
ｇ．ヘアピン１及びヘアピン２の範囲内にあるか；
ｈ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｊ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含むか；
ｋ．ヘアピン１又はヘアピン２の範囲内にあり、随意にヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｌ．連続しているか；
ｍ．連続しており、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｎ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部とヘアピン２の一部とにわたるか；
ｏ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部と、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”とにわたるか；
ｐ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部と、ヘアピン１の３’直近の２個のヌクレオチドとにわたるか；
ｑ．５〜１０個のヌクレオチドからなるか；
ｒ．６〜１０個のヌクレオチドからなるか；
ｓ．５〜１０個の連続したヌクレオチドからなるか；
ｔ．６〜１０個の連続したヌクレオチドからなるか；又は
ｕ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、
請求項１０から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも１個のヌクレオチドが欠如しているものであるネクサス領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む、請求項１０から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
当該ネクサス領域内の当該欠如したヌクレオチドは、
ａ．ネクサス領域内の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチド；
ｂ．ネクサス領域内の、少なくとも又はちょうど、１〜２のヌクレオチド、１〜３のヌクレオチド、１〜４のヌクレオチド、１〜５のヌクレオチド、１〜６のヌクレオチド、１〜１０のヌクレオチド、又は１〜１５のヌクレオチド；及び
ｃ．ネクサス領域内の各ヌクレオチド、のうちのいずれか１つ又は複数を含む、
請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．
１．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つ；又は
２．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
３．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である；又は
４．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つ；又は
５．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つ；又は
６．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つ；又は
７．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つ、
を含むガイド配列を含み、また
ｂ．
１．  １もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
２．  １もしくは複数の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
３．  １もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位と１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位とにおける、ＹＡ修飾；
４．ｉ）２以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾、；又は
５．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が５’終端の５’末端からのヌクレオチド８にあるもしくはヌクレオチド８の後にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに随意に
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾、；又は
６．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位がガイド領域の３’終端ヌクレオチドの１３個のヌクレオチドの範囲内にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾、；又は
７．ｉ）５’末端修飾及び３’末端修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾、；又は
８．ｉ）ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の当該修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが含んでいない修飾を含むものである、ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は  
９．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８におけるＹＡ修飾；又は
１０．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ＹＡ部位が５’終端からのヌクレオチド８にあるもしくはヌクレオチド８の後にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１及びＨ２−１のうちの１もしくは複数における修飾；又は
１１．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８、及び９のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１及びＨ２−１のうちの１もしくは複数における修飾；又は
１２．ｉ）５’終端からのヌクレオチド６にもしくはヌクレオチド６の後に位置する１もしくは複数のヌクレオチドにおける、例えばＹＡ修飾等である修飾；
ｉｉ）１もしくは複数のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉｉ）Ｂ３、Ｂ４及びＢ５のうちの１もしくは複数における修飾であって、Ｂ６が２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、もしくは２’−ＯＭｅ以外の修飾を含むものである、修飾；
ｉｖ）ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が２’−フルオロ以外の修飾を含むものである、修飾；ならびに／もしくは
ｖ）Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、もしくはＮ１１における修飾であり、以下のうちの少なくとも１つが当てはまるものである修飾：
ａ．１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｂ．１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｃ．１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位と１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位とにおける、ＹＡ修飾；
ｄ．５’終端の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７もしくは１８のうちの少なくとも１つが２’−フルオロ修飾を含まない；
ｅ．５’終端の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つがホスホロチオエート結合を含まない；
ｆ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｇ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｈ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、又はＮ１７のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｉ．Ｈ１−１が修飾を含む；
ｊ．Ｈ２−１が修飾を含む；もしくは
ｋ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、修飾
から選択された１又は複数の修飾をさらに含む、組成物。
【請求項２８】
配列番号４５０を含む、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
細胞又は対象においてＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）又は一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘発する際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
細胞又は対象においてＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させる際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
対象において高シュウ酸尿症を治療又は予防する際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
対象において血清及び／又は血漿のグリコール酸塩濃度を増加させる際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
対象において尿中のシュウ酸塩濃度を減少させる際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
シュウ酸塩産生、器官におけるシュウ酸カルシウムの沈着、原発性高シュウ酸尿症、全身性シュウ酸症を含めたシュウ酸症、血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療もしくは予防する、及び／又は腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させる際に使用する、請求項９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
ａ．細胞もしくは対象におけるＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発すること；
ｂ．細胞もしくは対象におけるＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させること；
ｃ．対象における高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｄ．対象における原発性高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｅ．対象におけるＰＨ１、ＰＨ２及び／もしくはＰＨ３を治療もしくは予防すること；
ｆ．対象における腸内高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｇ．対象におけるシュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｈ．対象における血清及び／もしくは血漿のグリコール酸塩濃度を増加させること；
ｉ．対象における尿中シュウ酸塩濃度を減少させること；
ｊ．シュウ酸塩産生を減少させること；
ｋ．器官におけるシュウ酸カルシウムの沈着を減少させること；
ｌ．高シュウ酸尿症を減少させること；
ｍ．全身性シュウ酸症を含めて、シュウ酸症を治療もしくは予防すること；
ｎ．血尿を治療もしくは予防すること；
ｏ．末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を予防すること；ならびに／又は 
ｐ．腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させること、
をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、血清及び／又は血漿のグリコール酸塩レベルを増加させる、請求項１から８又は２９から３５のいずれか一項に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項３７】
前記組成物がＬＤＨＡ遺伝子の編集を結果として生じる、請求項１から８又は２９から３５のいずれか一項に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項３８】
編集は、編集された集団の百分率（編集率）として算出される、請求項３７に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項３９】
前記編集率は、集団のうちの３０から９９％までである、請求項３８に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項４０】
前記編集率は、集団のうちの３０から３５％、３５から４０％、４０から４５％、４５から５０％、５０から５５％、５５から６０％、６０から６５％、６５から７０％、７０から７５％、７５から８０％、８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、又は９５から９９％までである、請求項３８に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項４１】
前記組成物が尿中シュウ酸塩濃度を減少させる、請求項１から８又は２９から３５のいずれか一項に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項４２】
尿中シュウ酸塩の減少が、結果的に、腎臓結石及び／又は腎臓、肝臓、膀胱、心臓、皮膚もしくは目におけるシュウ酸カルシウム沈着を減少させる、請求項４１に記載の使用のための方法又は組成物。
【請求項４３】
ガイド配列は、
ａ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２；
ｂ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０；
ｃ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５及び４８；
ｄ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４；ならびに
ｅ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３及び１２３；
から選択される、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項４４】
組成物は、
ａ．配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のうちのいずれか１つ；又は
ｂ．配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１のうちのいずれか１つ；又は
ｃ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０から選択されるガイド配列；又は 
ｃ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５及び４８から選択されるガイド配列；
ｄ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６及び１８４
から選択されるガイド配列；ならびに
ｅ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３及び１２３から選択されるガイド配列；
を含むｓｇＲＮＡを含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項４５】
標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン１〜８のうちのいずれか１つにある、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項４６】
前記標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン１又は２にある、請求項４５記載の方法又は組成物。
【請求項４７】
前記標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン３にある、請求項４５記載の方法又は組成物。
【請求項４８】
前記標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン４にある、請求項４５記載の方法又は組成物。
【請求項４９】
前記標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン５又は６にある、請求項４５記載の方法又は組成物。
【請求項５０】
前記標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン７又は８にある、請求項４５記載の方法又は組成物。
【請求項５１】
ガイド配列は、ＬＤＨＡのポジティブ鎖における標的配列に対して相補的である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５２】
ガイド配列は、ＬＤＨＡのネガティブ鎖における標的配列に対して相補的である、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５３】
第１のガイド配列は、ＬＤＨＡ遺伝子のポジティブ鎖における第１の標的配列に対して相補的であり、また組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子のネガティブ鎖における第２の標的配列に対して相補的である第２のガイド配列をさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５４】
ガイドＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、また配列番号２００のヌクレオチド配列であって、そのヌクレオチドがガイド配列の３’末端においてガイド配列に続くものである配列番号２００のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５５】
ガイドＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、また配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３か、又は配列番号４００〜４５０のいずれか１つかのヌクレオチド配列をさらに含むものであって、配列番号２０１のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端においてガイド配列に続くものである、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５６】
ガイドＲＮＡは、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項５７】
前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のいずれか１つを含むガイド配列を含む、請求項５６記載の方法又は組成物。
【請求項５８】
前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のいずれか１つ又はその修飾バージョンを含み、随意に当該修飾バージョンが、配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１を含む、請求項５６記載の方法又は組成物。
【請求項５９】
ガイドＲＮＡは、配列番号３００のパターンに従って修飾され、そのＮが、全体として、表１のガイド配列（配列番号１〜８４及び１００〜１９２）のうちのいずれか１つである、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６０】
配列番号３００における各Ｎは、任意の天然の又は非天然のヌクレオチドであり、そのＮがガイド配列を形成し、またガイド配列がＣａｓ９をＬＤＨＡ遺伝子へと方向付ける、請求項５９記載の方法又は組成物。
【請求項６１】
ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１つ、ならびに配列番号２０１、配列番号２０２、又は配列番号２０３のヌクレオチドを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６２】
ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％又は９０％同一であるガイド配列を含む、請求項５６から６１のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６３】
前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８１、２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１から選択される配列を含む、請求項６２記載の方法又は組成物。
【請求項６４】
ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４記載の方法又は組成物。
【請求項６６】
ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項６４又は６５に記載の方法又は組成物。
【請求項６７】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６８】
前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１又は複数において修飾を含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項６９】
前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１又は複数において修飾を含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７０】
前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７１】
前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７２】
前記ガイドＲＮＡの５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７３】
前記ガイドＲＮＡの３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７４】
前記ガイドＲＮＡは、配列番号３００の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７５】
組成物は、薬理学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１から７４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７６】
ガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と結合する、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７７】
前記ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む、請求項７６記載の方法又は組成物。
【請求項７８】
前記陽イオン性脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル  オクタデカ−９，１２−ジエノアートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアートとも呼ばれる、請求項７７記載の方法又は組成物。
【請求項７９】
前記ＬＮＰは、中性脂質を含む、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８０】
前記中性脂質は、ＤＳＰＣである、請求項７９記載の方法又は組成物。
【請求項８１】
前記ＬＮＰは、ヘルパー脂質を含む、請求項７６から８０のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８２】
前記ヘルパー脂質はコレステロールである、請求項８１記載の方法又は組成物。
【請求項８３】
前記ＬＮＰは、ステルス脂質（ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｉｄ）を含む、請求項７６から８２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８４】
前記ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、請求項８３記載の方法又は組成物。
【請求項８５】
組成物は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をさらに含む、請求項１から８４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８６】
組成物は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１から８５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８７】
前記ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤はＣａｓ９である、請求項８５又は８６に記載の方法又は組成物。
【請求項８８】
組成物は、医薬製剤であり、また薬理学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１から８７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項８９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１００】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１２９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１３９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７５である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７７である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７８である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８０である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１６９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８１である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７０】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８２である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７１】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８４である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７３】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７４】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７５】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１２３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７６】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１３３である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７７】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１４９である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７８】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１５６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１７９】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１６６である、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８０】
ガイド配列は、配列番号２、９、１３、１６、２２、２４、２５、２７、３０、３１、３２、３３、３５、３６、４０、４４、４５、５３、５５、５７、６０、６１〜６３、６５、６７、６９、７０、７１、７３、７６、７８、７９、８０、８２〜８４、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５６及び１６６のいずれか１つを含む、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８１】
ガイド配列は、配列番号１００〜１０２、１０４〜１０８、１１０〜１２２、１２４〜１３２、１３４〜１４８、１５０〜１５５、１５７〜１６５、及び１６７〜１９２のいずれか１つを含む、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８２】
ガイド配列は、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のいずれか１つを含む、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８３】
ガイド配列は、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のいずれか１つを含む、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８４】
ガイドＲＮＡは、配列番号８６〜９０のいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８５】
ガイドＲＮＡは、配列番号８９を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８６】
ガイドＲＮＡは、配列番号１００１又は２００１を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８７】
ガイドＲＮＡは、配列番号１００５又は２００５を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８８】
ガイドＲＮＡは、配列番号１００７又は２００７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１８９】
ガイドＲＮＡは、配列番号１００８又は２００８を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９０】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０１４又は２０１４を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９１】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０２３又は２０２３を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９２】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０２７又は２０２７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９３】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０３２又は２０３２を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９４】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０４５又は２０４５を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９５】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０４８又は２０４８を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９６】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０６３又は２０６３を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９７】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０６７又は２０６７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９８】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０６９又は２０６９を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１９９】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７１又は２０７１を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２００】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７４又は２０７４を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０１】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７６又は２０７６を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０２】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７７又は２０７７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０３】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７８又は２０７８を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０４】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０７９又は２０７９を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０５】
ガイドＲＮＡは、配列番号１０８１又は２０８１を含むｓｇＲＮＡである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０６】
組成物は、単回用量として投与される、請求項１から２０５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０７】
組成物は、一回で投与される、請求項１から２０６のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０８】
単回用量の又は一回での投与により、
ａ．ＤＳＢを誘発する；及び／又は
ｂ．ＬＤＨＡ遺伝子の発現を減少させる；及び／又は 
ｃ．高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｄ．高シュウ酸尿症が引き起こすＥＳＲＤを治療もしくは予防する；及び／又は
ｅ．シュウ酸カルシウムの産生と沈着を治療もしくは予防する；及び／又は 
ｆ．原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２及びＰＨ３を含める）を治療もしくは予防する；及び／又は
ｇ．シュウ酸症を治療もしくは予防する；及び／又は 
ｈ．血尿を治療もしくは予防する；及び／又は 
ｉ．腸内高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｊ．シュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｋ．腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させる；及び／又は
ｌ．血清グリコール酸塩濃度を増加させる；及び／又は
ｍ．尿中のオキシレート（ｏｘｙｌａｔｅ）を減少させる、
請求項２０６又は２０７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２０９】
単回用量の又は一回での投与により、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５週の間、ａ）からｍ）のいずれか１つ又は複数が達成される、請求項２０８記載の方法又は組成物。
【請求項２１０】
単回用量の又は一回での投与により、持続的な効果が達成される、請求項２０８記載の方法又は組成物。
【請求項２１１】
持続的な効果を達成することをさらに含む、請求項１から２０８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２１２】
前記持続的な効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、又は少なくとも５年持続する、請求項２１０又は２１１に記載の方法又は組成物。
【請求項２１３】
組成物の投与により、尿中のシュウ酸塩の治療上関連のある減少が結果的にもたらされる、請求項１から２１２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２１４】
組成物の投与により、治療域の範囲内の尿中シュウ酸塩レベルが結果的にもたらされる、請求項１から２１３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２１５】
組成物の投与により、正常範囲の１００、１２０又は１５０％の範囲内のシュウ酸塩レベルが結果的にもたらされる、請求項１から２１４のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２１６】
高シュウ酸尿症であるヒト対象を治療する医薬の調製のための、請求項９から２１５のいずれか一項に記載の組成物又は製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２０１８年９月２８日出願の米国仮特許出願第６２／７３８，９５６号、２０１９年４月１５日出願の米国仮特許出願第６２／８３４，３３４号、及び２０１９年５月１日出願の米国仮特許出願第６２／８４１，７４０号の優先権の利益を主張し、これらそれぞれの内容は、あらゆる目的のために、それら全体として参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
シュウ酸塩は、通常、尿中で腎臓により老廃物として除去されるが、高シュウ酸尿症を患う対象においては増加する。高シュウ酸尿症には、原発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症、腸内高シュウ酸尿症、及びシュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症を含めて、いくつかのタイプがある。過剰なシュウ酸塩はカルシウムと結合して、腎臓及び他の器官においてシュウ酸カルシウムを形成することが可能である。シュウ酸カルシウムが堆積することで、広範なシュウ酸カルシウムの沈着（腎石灰症）又は腎臓及び膀胱の結石の形成（尿路結石症）を生じて、腎障害を招く可能性がある。高シュウ酸尿症のよくある腎臓合併症には、尿中の血液（血尿）、尿路感染症、腎障害、及び末期腎疾患（ＥＳＲＤ）が含まれる。高シュウ酸尿症患者の腎臓は、時間とともに、衰え始める可能性があり、そして血液中のシュウ酸塩レベルが上昇し得る。例えば全身性シュウ酸症である全身の組織におけるシュウ酸塩沈着が、血中シュウ酸塩レベルが高いことに起因して発生し得、そして少なくとも骨、心臓、皮膚及び目における合併症を招く可能性がある。腎障害は、特に高シュウ酸尿症を患う対象においては、小児を含めてあらゆる年齢で発生し得る。唯一の治療の選択肢として、腎透析又は腎臓／肝臓の両臓器の移植がある。
【０００３】
原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）は、幼児から高齢者まで全ての年齢の対象に影響を及ぼす稀な遺伝性疾患である。ＰＨには、３つの別個のタンパク質の発現を変える遺伝的欠陥に関与する３つの亜型が含まれる。ＰＨ１は、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ、すなわちＡＧＴ／ＡＧＴ１に関与する。ＰＨ２は、グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、すなわちＧＲ／ＨＰＲに関与し、そしてＰＨ３は、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ、すなわちＨＯＧＡに関与する。ＰＨ１においては、ＡＧＸＴ遺伝子によりコードされる酵素、アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ又はＡＧＴ１）において変異が見られる。通常、ＡＧＴが、肝臓のペルオキシソームにおいてグリオキシル酸塩をグリシンに変換する。ＰＨ１患者においては、変異ＡＧＴは、グリオキシル酸塩を分解できず、グリオキシル酸塩及びその代謝産物シュウ酸塩のレベルが増加する。ヒトは、シュウ酸塩を酸化できないため、ＰＨ１を患う対象でシュウ酸レベルが高いことで高シュウ酸尿症が引き起こされる。
【０００４】
対象が高シュウ酸尿症を患っているか否かを決定するために、２４時間尿が採取され得、そしてシュウ酸塩、グリコール酸塩及び他の有機酸のレベルを測定する。高シュウ酸尿症の遺伝型の確定診断のためには、遺伝子検査又は肝臓生検を実施することができる。例えば、Ｃｏｃｈａｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、（２０１２）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５：１７２９−３６を参照されたい。正常な健常対象においては、２４時間尿のシュウ酸塩及びグリコール酸塩のレベルは、４５ｍｇ／日未満であるが、高シュウ酸尿症の患者では、尿中シュウ酸塩のレベルは１００ｍｇ／日より高いのが典型である。例えば、Ｃｏｃｈａｔ  Ｐ．（２０１３）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：６４９−６５８を参照されたい。
【０００５】
正常な対象における血漿グリコール酸塩レベルは、典型的には４〜８マイクロモルであるが、高シュウ酸尿症患者のグリコール酸塩レベルは広範囲にわたる可能性があり、高シュウ酸尿症対象の２／３で上昇している。例えば、Ｍａｒａｎｇｅｌｌａ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４８：９８６−９８９を参照されたい。高シュウ酸尿症の遺伝子型をもつ患者の大部分は、いまや遺伝子検査で診断されるが、高シュウ酸尿症対象の治療反応を追跡するために用いる主要な方法は２４時間尿の検査である。同上。
【０００６】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、乳酸及びピルビン酸の恒常性ならびにグリオキシル酸塩及びシュウ酸塩の代謝の恒常性の両方を調節する、ほぼ全ての細胞に存在する酵素である。ＬＤＨは、四量体を形成する４種のポリペプチドから構成される。それぞれサブユニットの組成と組織分布とが異なるＬＤＨの５種のアイソザイムが同定されている。２つの最もよくある形態のＬＤＨは、ＬＤＨＡ遺伝子でコードされた筋肉（Ｍ）型と、ＬＤＨＢ遺伝子でコードされた心臓（Ｈ）型とである。肝細胞のペルオキシソームにおいて、ＬＤＨは、グリオキサル酸塩を、その後血漿中に分泌されて腎臓により排出されるシュウ酸塩へと変換することに関与する重要な酵素である。Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２６（８）：１９８３−１９９５。
【０００７】
シュウ酸塩産生の増加により、腎臓におけるシュウ酸カルシウム結晶の沈殿、及び腎疾患が結果としてもたらされる。高シュウ酸尿症が進行すると、全ての組織でシュウ酸塩が沈着する。遺伝性乳酸デヒドロゲナーゼＭ−サブユニット欠損症を患う対象は、障害性の肝機能又は肝臓乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）発現量を抑制もしくは減少させることを示唆する肝臓特異的表現型を示さず、グリオキシル酸塩からシュウ酸塩への変換に関与する提案したこの重要な酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼＭサブユニットの欠損に起因する有害作用なしに高シュウ酸尿症を患う対象においてシュウ酸塩の蓄積を予防する可能性がある。この仮説は、遺伝子操作した高シュウ酸尿症マウスモデルと、高シュウ酸尿症をエチレングリコール（ＥＧ）で化学的に誘発したマウスモデルとにおいて試験された。Ｋａｎｎｏ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １７３，８９−９８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３４，３２６−３２９；及びＴｓｕｊｉｎｏ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６，６６１−６６５を参照されたい。
【０００８】
ＬＤＨは、シュウ酸塩産生の最終段階において重要であるため、高シュウ酸尿症マウスモデルにおいてＬＤＨＡサイレンシングを介在するために、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基との結合を介して肝細胞に方向付けられるＬＤＨＡ  ｓｉＲＮＡを用いた。Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２６（８）：１９８３−１９９５を参照されたい。このＬＤＨＡ  ｓｉＲＮＡでマウスを処置することにより、結果として肝臓ＬＤＨの減少と、効率的なシュウ酸塩の減少とがもたらされ、遺伝子操作した高シュウ酸尿症マウスモデルと化学的に誘発した高シュウ酸尿症マウスモデルとの両方においてシュウ酸カルシウム結晶沈着が予防された。同上。マウスにおいて肝臓ＬＤＨが抑制されることにより、循環肝臓酵素の急激な上昇、乳酸アシドーシス又は労作性ミオパシーは結果的にもたらされなかった。
【０００９】
ＬＤＨＡを阻害することで高シュウ酸尿症の患者を治療するという着想は、非ヒト霊長類と、肝臓が最大８０％のヒト肝細胞から構成されているヒト化キメラマウスとの両方をＬＤＨＡ  ｓｉＲＮＡで処置することによりさらに裏付けられている。同上。
【００１０】
したがって、以下の実施形態を提供する。一部の実施形態においては、本開示は、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を実質的に減少又はノックアウトさせて、それによってＬＤＨの産生が実質的に減少又は除去されて、それによって尿中シュウ酸塩が減少して血清グリコール酸塩が増加する、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム等であるＲＮＡガイド型（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ）のＤＮＡ結合剤をもつガイドＲＮＡを用いた組成物及び方法を提供する。ＬＤＨＡ遺伝子を改変することによるＬＤＨ産生の実質的な減少又は除去は、高シュウ酸尿症の長期的又は永続的な治療となり得る。
【発明の概要】
【００１１】
以下の実施形態を提供する。
実施形態０１  ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）又は一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘発する方法であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む組成物を細胞に送達することを含む、方法。
実施形態０２  ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させる方法であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む組成物を細胞に送達することを含む、方法。
実施形態０３  高シュウ酸尿症を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、それによって高シュウ酸尿症を治療又は予防することを含む、方法。
実施形態０４  高シュウ酸尿症が引き起こす末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、それによって高シュウ酸尿症が引き起こす（ＥＳＲＤ）を治療又は予防することを含む、方法。
実施形態０５  シュウ酸カルシウムの産生及び沈着、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２及びＰＨ３を含む）、シュウ酸症、血尿、腸内高シュウ酸尿症、シュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症のうちのいずれかひとつを治療又は予防し、そして腎臓又は肝臓の移植の必要性を遅延又は改善させる方法であって、それを必要とする対象に、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、それによってシュウ酸カルシウムの産生及び沈着、原発性高シュウ酸尿症、シュウ酸症、血尿のうちのいずれかひとつを治療又は予防し、そして腎臓又は肝臓の移植の必要性が遅延又は改善することを含む、方法。
実施形態０６  血清グリコール酸塩濃度を増加させる方法であって、それを必要とする対象に対して、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、それによって血清グリコール酸塩濃度が増加することを含む、方法。
実施形態０７  対象において尿中のシュウ酸塩を減少させる方法であって、それを必要とする対象に対して、組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含むものである当該組成物を投与し、それによって対象の尿中のシュウ酸塩が減少することを含む、方法。
実施形態０８  ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸が投与される、上記した実施形態のうちのいずれか一つの方法。
実施形態０９  
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイドＲＮＡと、随意に
ｂ．ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤、又はＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、
を含む、組成物。
実施形態１０  短鎖シングルガイドＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）（ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つ；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つ；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つ；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つを含むガイド配列；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つを含むガイド配列；
を含むガイド配列と、
ｂ．ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分であって、当該ヘアピン領域は少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが欠如しており、また随意にｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが５’末端修飾及び３’末端修飾のうちの１又は複数を含むものである、当該ｓｇＲＮＡの保存部分と、
を含む、組成物。
実施形態１１  配列番号２０２の配列を含む、実施形態１０の組成物。
実施形態１２  ５’末端修飾を含む、実施形態１０又は実施形態１１の組成物。
実施形態１３  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’末端修飾を含む、実施形態１０から１２のいずれか一つの組成物。
実施形態１４  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが５’末端修飾及び３’末端修飾を含む、実施形態１０から１３のいずれか一つの組成物。
実施形態１５  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’尾部を含む、実施形態１０から１４のいずれか一つの組成物。
実施形態１６  ３’尾部が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチドを含む、実施形態１５の組成物。
実施形態１７  ３’尾部が約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０個、少なくとも１〜２個、少なくとも１〜３個、少なくとも１〜４個、少なくとも１〜５個、少なくとも１〜７個、又は少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、実施形態１５の組成物。
実施形態１８  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが３’尾部を含まない、実施形態１０から１７のいずれか一つの組成物。
実施形態１９  ヘアピン領域に修飾を含む、実施形態１０から１８のいずれか一つの組成物。
実施形態２０  ３’末端修飾と、ヘアピン領域の修飾とを含む、実施形態１０から１９のいずれか一つの組成物。
実施形態２１  ３’末端修飾と、ヘアピン領域の修飾と、５’末端修飾とを含む、実施形態１０から２０のいずれか一つの組成物。
実施形態２２  ５’末端修飾と、ヘアピン領域の修飾とを含む、実施形態１０から２１のいずれか一つの組成物。
実施形態２３  ヘアピン領域は、少なくとも５個の連続したヌクレオチドが欠如している、実施形態１０から２２のいずれか一つの組成物。
実施形態２４  当該少なくとも５〜１０個の欠如したヌクレオチドは、
ａ．ヘアピン１の範囲内にあるか；
ｂ．ヘアピン１及びヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”の範囲内にあるか；
ｃ．ヘアピン１及びヘアピン１の３’直近の２個のヌクレオチドの範囲内にあるか；
ｄ．ヘアピン１の少なくとも一部を含むか；
ｅ．ヘアピン２の範囲内にあるか；
ｆ．ヘアピン２の少なくとも一部を含むか；
ｇ．ヘアピン１及びヘアピン２の範囲内にあるか；
ｈ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｊ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含むか；
ｋ．ヘアピン１又はヘアピン２の範囲内にあり、随意にヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｌ．連続しているか；
ｍ．連続しており、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”を含むか；
ｎ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部とヘアピン２の一部とにわたるか；
ｏ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部と、ヘアピン１とヘアピン２との間の“Ｎ”とにわたるか；
ｐ．連続しており、また少なくともヘアピン１の一部と、ヘアピン１の３’直近の２個のヌクレオチドとにわたるか；
ｑ．５〜１０個のヌクレオチドからなるか；
ｒ．６〜１０個のヌクレオチドからなるか；
ｓ．５〜１０個の連続したヌクレオチドからなるか；
ｔ．６〜１０個の連続したヌクレオチドからなるか；又は
ｕ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、
実施形態１０から２３のいずれか一つの組成物。
実施形態２５  少なくとも１個のヌクレオチドが欠如しているものであるネクサス領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む、実施形態１０から２４のいずれか一つの組成物。
実施形態２６  ネクサス領域内の当該欠如したヌクレオチドは、
ａ．ネクサス領域内の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチド；
ｂ．ネクサス領域内の、少なくとも又はちょうど、１〜２のヌクレオチド、１〜３のヌクレオチド、１〜４のヌクレオチド、１〜５のヌクレオチド、１〜６のヌクレオチド、１〜１０のヌクレオチド、又は１〜１５のヌクレオチド；及び
ｃ．ネクサス領域内の各ヌクレオチド、のうちのいずれか１つ又は複数を含む、
実施形態２５の組成物。
実施形態２７  修飾されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．
ｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つ；又は
ｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択されるガイド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９もしくは２０個の連続したヌクレオチド；又は
ｉｉｉ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一である；又は
ｉｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０のうちのいずれか１つ；又は
ｖ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、及び４８のうちのいずれか１つ；又は
ｖｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のうちのいずれか１つ；又は
ｖｉｉ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のうちのいずれか１つ、
を含むガイド配列を含み、また
ｂ．
１．  １もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
２．  １もしくは複数の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
３．  １もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位と１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位とにおける、ＹＡ修飾；
４．ｉ）２以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は
５．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が５’終端の５’末端からのヌクレオチド８にあるもしくはヌクレオチド８の後にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに随意に
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は
６．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位がガイド領域の３’終端ヌクレオチドの１３個のヌクレオチドの範囲内にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は
７．ｉ）５’末端修飾及び３’末端修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は
８．ｉ）ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の当該修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが含んでいない修飾を含むものである、ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；又は
９．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１及び８におけるＹＡ修飾；又は
１０．ｉ）１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ＹＡ部位が５’終端からのヌクレオチド８にあるもしくはヌクレオチド８の後にあるものである、当該ＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１及びＨ２−１のうちの１もしくは複数における修飾；又は
１１．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４及び１０のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８及び９のうちの１もしくは複数におけるＹＡ修飾；ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１及びＨ２−１のうちの１もしくは複数における修飾；又は
１２．ｉ）５’終端からのヌクレオチド６にもしくはヌクレオチド６の後に位置する１もしくは複数のヌクレオチドにおける、例えばＹＡ修飾等である修飾；
ｉｉ）１もしくは複数のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉｉ）Ｂ３、Ｂ４及びＢ５のうちの１もしくは複数における修飾であって、Ｂ６が２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、もしくは２’−ＯＭｅ以外の修飾を含むものである、修飾；
ｉｖ）ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が２’−フルオロ以外の修飾を含むものである、修飾；ならびに／もしくは
ｖ）Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、もしくはＮ１１における修飾であり、以下のうちの少なくとも１つが当てはまるものである修飾：
ｉ．１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉ．１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾；
ｉｉｉ．１もしくは複数のガイド領域ＹＡ部位と１もしくは複数の保存領域ＹＡ部位とにおける、ＹＡ修飾；
ｉｖ．５’終端の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７もしくは１８のうちの少なくとも１つが２’−フルオロ修飾を含まない；
ｖ．５’終端の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つがホスホロチオエート結合を含まない；
ｖｉ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｖｉｉ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｖｉｉｉ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、又はＮ１７のうちの少なくとも１つが２’−ＯＭｅ修飾を含まない；
ｉｘ．Ｈ１−１が修飾を含む；
ｘ．Ｈ２−１が修飾を含む；もしくは
ｘｉ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、修飾
から選択された１又は複数の修飾をさらに含む、組成物。
実施形態２８  配列番号４５０を含む、実施形態２７の組成物。
実施形態２９  細胞又は対象においてＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）又は一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘発する際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３０  細胞又は対象においてＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させる際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３１  対象において高シュウ酸尿症を治療又は予防する際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３２  対象において血清及び／又は血漿のグリコール酸塩濃度を増加させる際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３３  対象において尿中のシュウ酸塩濃度を減少させる際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３４  シュウ酸塩産生、器官におけるシュウ酸カルシウムの沈着、原発性高シュウ酸尿症、全身性シュウ酸症を含めたシュウ酸症、血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療もしくは予防する、及び／又は腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させる際に使用する、実施形態９から２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３５
ａ．細胞もしくは対象におけるＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発すること；
ｂ．細胞もしくは対象におけるＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させること；
ｃ．対象における高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｄ．対象における原発性高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｅ．対象におけるＰＨ１、ＰＨ２及び／もしくはＰＨ３を治療もしくは予防すること；
ｆ．対象における腸内高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｇ．対象におけるシュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症を治療もしくは予防すること；
ｈ．対象における血清及び／もしくは血漿のグリコール酸塩濃度を増加させること；
ｉ．対象における尿中シュウ酸塩濃度を減少させること；
ｊ．シュウ酸塩産生を減少させること；
ｋ．器官におけるシュウ酸カルシウムの沈着を減少させること；
ｌ．高シュウ酸尿症を減少させること；
ｍ．全身性シュウ酸症を含めて、シュウ酸症を治療もしくは予防すること；
ｎ．血尿を治療もしくは予防すること；
ｏ．末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を予防すること；ならびに／又は
ｐ．腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させること、
をさらに含む、実施形態１から８のいずれかの方法。
実施形態３６  組成物が、血清及び／又は血漿のグリコール酸塩レベルを増加させる、実施形態１から８又は２９から３５のいずれか１つの使用のための方法又は組成物。
実施形態３７  組成物がＬＤＨＡ遺伝子の編集を結果として生じる、実施形態１から８又は２９から３５のいずれか１つの使用のための方法又は組成物。
実施形態３８  編集は、編集された集団の百分率（編集率）として算出される、実施形態３７の使用のための方法又は組成物。
実施形態３９  編集率は、集団のうちの３０から９９％までである、実施形態３８の使用のための方法又は組成物。
実施形態４０  編集率は、集団のうちの３０から３５％、３５から４０％、４０から４５％、４５から５０％、５０から５５％、５５から６０％、６０から６５％、６５から７０％、７０から７５％、７５から８０％、８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、又は９５から９９％までである、実施形態３８の使用のための方法又は組成物。
実施形態４１  組成物が尿中シュウ酸塩濃度を減少させる、実施形態１から８又は２９から３５のいずれか１つの使用のための方法又は組成物。
実施形態４２  尿中シュウ酸塩の減少が、結果的に、腎臓結石及び／又は腎臓、肝臓、膀胱、心臓、皮膚もしくは目におけるシュウ酸カルシウム沈着を減少させる、実施形態４１の使用のための方法又は組成物。
実施形態４３  ガイド配列は、
ａ．配列番号１〜８４及び１００〜１９２；
ｂ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０；
ｃ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５及び４８；
ｄ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４；ならびに
ｅ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３及び１２３；
から選択される、実施形態１から４２のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態４４  組成物は、
ａ．配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のうちのいずれか１つ；又は
ｂ．配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１のうちのいずれか１つ；又は
ｃ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８及び８０から選択されるガイド配列；又は
ｄ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５及び４８から選択されるガイド配列；
ｅ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６及び１８４
から選択されるガイド配列；ならびに
ｆ．配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３及び１２３から選択されるガイド配列；
を含むｓｇＲＮＡを含む、実施形態１から４３のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態４５  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン１〜８のうちのいずれか１つにある、実施形態１から４４のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態４６  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン１又は２にある、実施形態４５の方法又は組成物。
実施形態４７  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン３にある、実施形態４５の方法又は組成物。
実施形態４８  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン４にある、実施形態４５の方法又は組成物。
実施形態４９  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン５又は６にある、実施形態４５の方法又は組成物。
実施形態５０  標的配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子のエキソン７又は８にある、実施形態４５の方法又は組成物。
実施形態５１  ガイド配列は、ＬＤＨＡのポジティブ鎖における標的配列に対して相補的である、実施形態１から５０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５２  ガイド配列は、ＬＤＨＡのネガティブ鎖における標的配列に対して相補的である、実施形態１から５０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５３  第１のガイド配列は、ＬＤＨＡ遺伝子のポジティブ鎖における第１の標的配列に対して相補的であり、また組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子のネガティブ鎖における第２の標的配列に対して相補的である第２のガイド配列をさらに含む、実施形態１から５０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５４  ガイドＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、また配列番号２００のヌクレオチド配列であって、そのヌクレオチドがガイド配列の３’末端においてガイド配列に続くものである配列番号２００のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１から５３のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５５  ガイドＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、また配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３か、又は配列番号４００〜４５０のいずれか１つかのヌクレオチド配列をさらに含むものであって、配列番号２０１、配列番号２０２、又は配列番号２０３のヌクレオチドがガイド配列の３’末端においてガイド配列に続くものである、実施形態１から５４のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５６  ガイドＲＮＡは、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１から５５のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態５７  ｓｇＲＮＡは、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のいずれか１つを含むガイド配列を含む、実施形態５６の方法又は組成物。
実施形態５８  ｓｇＲＮＡは、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のいずれか１つ又はその修飾バージョンを含み、随意に当該修飾バージョンが、配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１を含む、実施形態５６の方法又は組成物。
実施形態５９  ガイドＲＮＡは、配列番号３００のパターンに従って修飾され、そのＮが、全体として、表１のガイド配列（配列番号１〜８４及び１００〜１９２）のうちのいずれか１つである、実施形態１から５８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６０  配列番号３００における各Ｎは、任意の天然の又は非天然のヌクレオチドであり、そのＮがガイド配列を形成し、またガイド配列がＣａｓ９をＬＤＨＡ遺伝子へと方向付ける、実施形態５９の方法又は組成物。
実施形態６１  ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１つ、ならびに配列番号２０１、配列番号２０２、又は配列番号２０３のヌクレオチドを含む、実施形態１から６０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６２  ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％又は９０％同一であるガイド配列を含む、実施形態５６から６１のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６３  ｓｇＲＮＡは、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８１、２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１から選択される配列を含む、実施形態６２の方法又は組成物。
実施形態６４  ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１から６３のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６５  少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４の方法又は組成物。
実施形態６６  ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態６４又は６５の方法又は組成物。
実施形態６７  ２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４から６６のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６８  ガイドＲＮＡの５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１又は複数において修飾を含む、実施形態６４から６７のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態６９  ガイドＲＮＡの３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１又は複数において修飾を含む、実施形態６４から６８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７０  ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、実施形態６４から６９のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７１  ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、実施形態６４から７０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７２  ガイドＲＮＡの５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４から７１のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７３  ガイドＲＮＡの３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４から７２のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７４  ガイドＲＮＡは、配列番号３００の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４から７３のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７５  組成物は、薬理学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、実施形態１から７４のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７６  ガイドＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と結合する、実施形態１から７５のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態７７  ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む、実施形態７６の方法又は組成物。
実施形態７８  陽イオン性脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル  オクタデカ−９，１２−ジエノアートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアートとも呼ばれる、実施形態７７の方法又は組成物。
実施形態７９  ＬＮＰは、中性脂質を含む、実施形態７６から７８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８０  中性脂質はＤＳＰＣである、実施形態７９の方法又は組成物。
実施形態８１  ＬＮＰは、ヘルパー脂質を含む、実施形態７６から８０のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８２  ヘルパー脂質はコレステロールである、実施形態８１の方法又は組成物。
実施形態８３  ＬＮＰは、ステルス脂質（ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｉｄ）を含む、実施形態７６から８２のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８４  ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、実施形態８３の方法又は組成物。
実施形態８５  組成物は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をさらに含む、実施形態１から８４のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８６  組成物は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１から８５のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８７  ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤はＣａｓ９である、実施形態８５又は８６の方法又は組成物。
実施形態８８  組成物は、医薬製剤であり、また薬理学的に許容可能なキャリアをさらに含む、実施形態１から８７のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態８９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態９９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１００  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１０９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号２９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１１９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号３９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１２９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号４９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１３９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号５９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１４９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号６９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１５９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７５である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７７である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７８である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号７９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８０である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１６９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８１である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７０  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８２である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７１  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７２  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号８４である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７３  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７４  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１０９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７５  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１２３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７６  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１３３である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７７  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１４９である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７８  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１５６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１７９  配列番号１〜８４及び１００〜１９２から選択される配列は、配列番号１６６である、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８０  ガイド配列は、配列番号２、９、１３、１６、２２、２４、２５、２７、３０、３１、３２、３３、３５、３６、４０、４４、４５、５３、５５、５７、６０、６１〜６３、６５、６７、６９、７０、７１、７３、７６、７８、７９、８０、８２〜８４、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５６及び１６６のいずれか１つを含む、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８１  ガイド配列は、配列番号１００〜１０２、１０４〜１０８、１１０〜１２２、１２４〜１３２、１３４〜１４８、１５０〜１５５、１５７〜１６５、及び１６７〜１９２のいずれか１つを含む、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８２  ガイド配列は、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、６２、６６、６８、７０、７３、７５、７６、７７、７８、８０、１０３、１０９、１２３、１３３、１４９、１５３、１５６、及び１８４のいずれか１つを含む、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８３  ガイド配列は、配列番号１、５、７、８、１４、２３、２５、２７、３２、４５、４８、１０３、及び１２３のいずれか１つを含む、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８４  ガイドＲＮＡは、配列番号８６〜９０のいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８５  ガイドＲＮＡは、配列番号８９を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８６  ガイドＲＮＡは、配列番号１００１又は２００１を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８７  ガイドＲＮＡは、配列番号１００５又は２００５を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８８  ガイドＲＮＡは、配列番号１００７又は２００７を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１８９  ガイドＲＮＡは、配列番号１００８又は２００８を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９０  ガイドＲＮＡは、配列番号１０１４又は２０１４を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９１  ガイドＲＮＡは、配列番号１０２３又は２０２３を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９２  ガイドＲＮＡは、配列番号１０２７又は２０２７を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９３  ガイドＲＮＡは、配列番号１０３２又は２０３２を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９４  ガイドＲＮＡは、配列番号１０４５又は２０４５を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９５  ガイドＲＮＡは、配列番号１０４８又は２０４８を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９６  ガイドＲＮＡは、配列番号１０６３又は２０６３を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９７  ガイドＲＮＡは、配列番号１０６７又は２０６７を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９８  ガイドＲＮＡは、配列番号１０６９又は２０６９を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態１９９  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７１又は２０７１を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２００  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７４又は２０７４を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０１  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７６又は２０７６を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０２  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７７又は２０７７を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０３  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７８又は２０７８を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０４  ガイドＲＮＡは、配列番号１０７９又は２０７９を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０５  ガイドＲＮＡは、配列番号１０８１又は２０８１を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１から８８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０６  組成物は、単回用量として投与される、実施形態１から２０５のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０７  組成物は、一回で投与される、実施形態１から２０６のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０８  単回用量の又は一回での投与により、
ａ．ＤＳＢを誘発する；及び／又は
ｂ．ＬＤＨＡ遺伝子の発現を減少させる；及び／又は
ｃ．高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｄ．高シュウ酸尿症が引き起こすＥＳＲＤを治療もしくは予防する；及び／又は
ｅ．シュウ酸カルシウムの産生と沈着を治療もしくは予防する；及び／又は
ｆ．原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２及びＰＨ３を含める）を治療もしくは予防する；及び／又は
ｇ．シュウ酸症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｈ．血尿を治療もしくは予防する；及び／又は
ｉ．腸内高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｊ．シュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する；及び／又は
ｋ．腎臓もしくは肝臓の移植の必要性を遅延もしくは改善させる；及び／又は
ｌ．血清グリコール酸塩濃度を増加させる；及び／又は
ｍ．尿中のオキシレート（ｏｘｙｌａｔｅ）を減少させる、
実施形態２０６又は２０７のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２０９  単回用量の又は一回での投与により、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５週の間、ａ）からｍ）のいずれか１つ又は複数が達成される、実施形態２０８の方法又は組成物。
実施形態２１０  単回用量の又は一回での投与により、持続的な効果が達成される、実施形態２０８の方法又は組成物。
実施形態２１１  持続的な効果を達成することをさらに含む、実施形態１から２０８のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２１２  持続的な効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、又は少なくとも５年持続する、実施形態２１０又は２１１の方法又は組成物。
実施形態２１３  組成物の投与により、尿中のシュウ酸塩の治療上関連のある減少が結果的にもたらされる、実施形態１から２１２のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２１４  組成物の投与により、治療域の範囲内の尿中シュウ酸塩レベルが結果的にもたらされる、実施形態１から２１３のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２１５  組成物の投与により、正常範囲の１００、１２０又は１５０％の範囲内のシュウ酸塩レベルが結果的にもたらされる、実施形態１から２１４のいずれか１つの方法又は組成物。
実施形態２１６  高シュウ酸尿症であるヒト対象を治療する医薬の調製のための、実施形態９から２１５のいずれかの組成物又は製剤の使用。
【００１２】
高シュウ酸尿症であるヒト対象を治療する医薬の調製のための、先述の実施形態のいずれかの組成物又は製剤の使用もまた開示する。高シュウ酸尿症の治療に使用する、又はＬＤＨＡ遺伝子を修飾（例えば、ＬＤＨＡ遺伝子にインデルを形成する、又はＬＤＨＡ遺伝子にフレームシフトもしくはナンセンス変異を形成すること）する際に使用する、先述の組成物又は製剤のいずれかもまた開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＬＤＨＡを標的とするあるｓｇＲＮＡのオフターゲット解析を示す。
【図２】図２は、ＰＨＨにおける、ＬＤＨＡを標的とするあるｓｇＲＮＡの編集率％の用量反応曲線を示す。
【図３】図３は、ＰＣＨにおける、ＬＤＨＡを標的とするあるｓｇＲＮＡの編集率％の用量反応曲線を示す。
【図４】図４は、ＰＨＨにおける、ＬＤＨＡ標的化修飾ｓｇＲＮＡ（表２に列記した）のウエスタンブロット解析を示す。
【図５】図５は、ＡＧＴ欠損マウスにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の尿中シュウ酸塩レベルを示す。
【図６】図６は、１５週の試験での、ＡＧＴ欠損マウスにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の尿中シュウ酸塩レベルを示す。
【図７】図７は、１５週の試験での、ＡＧＴ欠損マウスにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでの修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後のウエスタンブロット解析を示す。
【図８】図８は、ＡＧＴ欠損マウスの肝臓における、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＤＨＡタンパク質の免疫組織化学染色を示す。
【図９】図９は、表１９に表す編集レベルとタンパク質レベルとの間の相関を示す。
【図１０】図１０は、例示的なｓｇＲＮＡ配列における１０個の保存領域ＹＡ部位に１から１０の印を付けている（配列番号２０８２）。数字２５、４５、５０、５６、６４、６７及び８３は、例えばｘは随意に２０である、（Ｎ）ｘとして示すガイド領域をもつｓｇＲＮＡ内のＹＡ部位１、５、６、７、８、９及び１０のピリミジンの位置を示す。
【図１１】図１１は、下方ステム領域、バルジ領域、上方ステム領域、ネクサス（そのヌクレオチドは、５’から３’に向けてそれぞれＮ１〜Ｎ１８と呼ぶことができる）領域、ヘアピン１領域及びヘアピン２領域を含む、ｓｇＲＮＡの保存領域の個々のヌクレオチドを示す標識を伴う可能性のある二次構造における例示的なｓｇＲＮＡ（配列番号４０１；全ての修飾を示しているわけではない）を示す。ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドは、ｎと名付けている。ガイド領域は、ｓｇＲＮＡ上に存在してもよく、またこの図においてｓｇＲＮＡの保存領域より前を「（Ｎ）ｘ」として示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、初代カニクイザル肝細胞における、ＬＤＨＡを標的とするあるｓｇＲＮＡの編集率の用量反応曲線を示す。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞における、あるｓｇＲＮＡを含むリポフェクション処置後のＬＤＨＡ発現の相対的減少についての用量反応曲線を示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＡＧＴ欠損マウスのあるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の、用量依存的な尿中シュウ酸塩レベル、編集率、及び尿中シュウ酸塩レベルと編集率との間の相関をそれぞれ示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂは、実施例４に記載する、１５週間の耐久試験でのＡＧＴ欠損マウスのあるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の、肝臓試料及び筋肉試料中のＬＤＨＡ活性を示す。
【図１５Ｂ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｂは、実施例４に記載する、１５週間の耐久試験でのＡＧＴ欠損マウスのあるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の、肝臓試料及び血漿試料中のピルビン酸レベルを示す。
【図１６Ｂ】同上。
【図１７】図１７は、あるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰによる処置後の、５／６腎切除術又はシャム手術のいずれかを受けたマウスにおける平均血漿中乳酸クリアランス機能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ここで本発明のある実施形態に対する言及を詳細に行うこととし、それらの例は、添付の図面に示す。本発明は、説明した実施形態に関連して説明するが、本発明はそれら実施形態に限定することを意図するものではないということが理解されるであろう。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲及び含まれる実施形態によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る、全ての代替物、変形物及び均等物をカバーすることが意図される。
【００１５】
本教示を詳細に説明する前に、本開示は特定の組成物又は方法のステップに限定されるものではなく、それ自体は変化し得るものであるということを理解されたい。この明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、別段に文脈が明示していない限り複数形の言及を含めることに留意されたい。すなわち、例えば「複合体」への言及は、複数の複合体を含み、また「細胞」への言及は複数の細胞を含む等である。
【００１６】
数値範囲は、その範囲を規定している数字も含める。測定された値及び測定できる値は、測定値に関連する有効数字及び誤差を考慮に入れた、概算であるものと理解される。また「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定であることを意図していない。前述の概略的な記載も発明の詳細な説明もいずれも、単に典型的かつ説明的なものであり、また教示の限定ではないということを理解されたい。
【００１７】
本明細書において特に言及しない限り、様々な構成要素を「含むこと」と記載された本明細書の実施形態はまた、当該記載の構成要素「からなる」又は「実質的に」当該記載の構成要素「からなる」も意図し、様々な構成要素「からなる」と記載された本明細書の実施形態はまた、当該記載の構成要素「を含む」又は「実質的に」当該記載の構成要素「からなる」も意図し、そして「実質的に」様々な構成要素「からなる」と記載された本明細書の実施形態はまた、当該記載の構成要素「からなる」又は当該記載の構成要素「を含む」も意図する（この交換可能性は、特許請求の範囲におけるこれら語の使用には適用されない）。「又は」の語は、文脈が別を明示していない限り包括的な意味で用い、すなわち「及び／又は」と同等である。
【００１８】
本明細書で用いる各節の見出しは、構造化する目的のためのみであり、決して所望の主題を限定することを意図しているものではない。参照により援用する任意の事柄が本明細書に規定する任意の語と矛盾する又はその他のことが本明細書の内容を表現する事象においては、本明細書が支配する。本教示は種々の実施形態と関連して説明されるが、本教示がそうした実施形態に限定されることは意図していない。対照的に、本教示は、種々の代替物、変形物、及び均等物を包含するものであり、これらは当業者によって理解されることとなるであろう。
Ｉ．定義
【００１９】
別段に述べない限り、本明細書で用いる場合、以下の語及び句は以下の意味を有することを意図する。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ及びその類似体である高分子を含める、骨格として一緒に結合している窒素複素環の塩基又は塩基類似体を有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指すために用いる。核酸「骨格」は、糖−リン酸ジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」又はＰＮＡ；ＰＣＴ出願である国際公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合又はこれらの組み合わせのうちの１又は複数を含める、種々の結合で構成され得る。核酸の糖部分は、例えば２’メトキシ又は２’ハライドの置換基である置換基を伴うリボース、デオキシリボース又は同様の化合物であり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、５−メトキシウリジン、プソイドウリジンもしくはＮ１−メチルプソイドウリジン等の修飾ウリジン類、又はその他）；イノシン；プリン又はピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン、デアザ−又はアザ−ピリミジン、５又は６位に置換基を伴うピリミジン塩基（例えば、５−メチルシトシン）、２、６又は８位に置換基を伴うプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、及びＯ４−アルキル−ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ出願である国際公開第９３／１３１２１号）であり得る。全般的な議論に関しては、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈｅｄ．，１９９２）を参照されたい。核酸は、１又は複数の「脱塩基」残基であって、骨格が高分子のうちの位置に窒素塩基を含んでいない１又は複数の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡの糖、塩基及び結合のみを含み得、又は従来の成分及び置換の両方を含み得る（例えば、２’メトキシ結合を伴う従来の塩基、又は従来の塩基及び１もしくは複数の塩基類似体の両方を含有する高分子）。核酸は、「ロック核酸」（ＬＮＡ）、相補性ＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強するＬＮＡヌクレオチドモノマーであってＲＮＡ模倣性糖コンホメーション内に固定された二環式フラノース単位を伴う当該１又は複数のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体を含む（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは、異なる糖部分を有して、ＲＮＡ内のウラシル又はその類似体及びＤＮＡ内のチミン又はその類似体の存在が異なり得る。
【００２１】
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」及び「ガイド」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとしても知られる）又はｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）の組み合わせのいずれかを指すために本明細書において区別なく用いる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として結合し得るか、又は２つの別個のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）であり得る。「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、それぞれのタイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然の配列、又は天然の配列と比べて修飾もしくは変形を伴うｔｒＲＮＡ配列、であり得る。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、そしてＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤による結合又は修飾（例えば、切断）のためにガイドＲＮＡを標的配列へと方向付けるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「ターゲティング配列」又は「スペーサー配列」と呼ぶこともあり得る。ガイド配列は、例えば化膿性レンサ球菌の場合（すなわちＳｐｙ  Ｃａｓ９）、及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合において、長さが２０塩基対であり得る。例えば長さが１５−ヌクレオチド、１６−ヌクレオチド、１７−ヌクレオチド、１８−ヌクレオチド、１９−ヌクレオチド、２１−ヌクレオチド、２２−ヌクレオチド、２３−ヌクレオチド、２４−ヌクレオチド、又は２５−ヌクレオチドである、より短い配列又はより長い配列もまた、ガイドとして用いることが可能である。例えば、一部の実施形態においては、ガイド配列は、配列番号１〜８４から選択された配列の少なくとも１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、標的配列は、例えば遺伝子内又は染色体上にあり、またガイド配列に対して相補的である。一部の実施形態においては、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性又は同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。例えば、一部の実施形態においては、ガイド配列は、配列番号１〜８４から選択された配列の少なくとも１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドに対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を含む。一部の実施形態においては、ガイド配列と標的領域とは、１００％相補的又は同一であり得る。他の実施形態においては、ガイド配列と標的領域とは、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、ガイド配列と標的配列とは、１、２、３又は４つのミスマッチを含有し得るものであって、当該標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個又はそれ以上の塩基対である。一部の実施形態においては、ガイド配列と標的領域とは、１〜４つのミスマッチを含有し得るものであって、当該ガイド配列が少なくとも１７、１８、１９、２０個又はそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、ガイド配列と標的領域とは、１、２、３又は４つのミスマッチを含有し得るものであって、当該ガイド配列が２０個のヌクレオチドを含む。
【００２３】
ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤に対する標的配列は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤に対する核酸の基質が二本鎖核酸である場合、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖との両方（すなわち、所与の配列と配列の逆相補配列）を含む。したがって、ガイド配列が「標的配列に対して相補的」であるというときは、ガイド配列が、ガイドＲＮＡを標的配列の逆相補配列に結合させるようにすることができるということが理解される。そのため、一部の実施形態においては、ガイド配列が標的配列の逆相補配列に結合するとき、ガイド配列内のＵがＴを置換していることを除いて、ガイド配列は、標的配列（例えば、ＰＡＭを含んでいない標的配列）の特定のヌクレオチドと同一である。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「ＹＡ部位」は、５’−ピリミジン−アデニン−３’ジヌクレオチドを指す。「保存領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡの保存領域内に存在する。「ガイド領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡのガイド領域内に存在する。ｓｇＲＮＡ内の無修飾ＹＡ部位は、例えばＲＮアーゼＡである、ＲＮアーゼ−Ａ様エンドヌクレアーゼによる切断を受けやすいものであり得る。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、その保存領域内に約１０個のＹＡ部位を含む。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、その保存領域内に１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＹＡ部位を含む。例示的な保存領域ＹＡ部位は、図１０に示している。ガイド領域が任意の数のＹＡ部位を含めた任意の配列であり得るため、例示的なガイド領域ＹＡ部位は、図１０に示していない。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、図１０に示したＹＡ部位のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、以下の位置又はそのサブセットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＹＡ部位を含む：ＬＳ５−ＬＳ６；ＵＳ３−ＵＳ４；ＵＳ９−ＵＳ１０；ＵＳ１２−Ｂ３；ＬＳ７−ＬＳ８；ＬＳ１２−Ｎ１；Ｎ６−Ｎ７；Ｎ１４−Ｎ１５；Ｎ１７−Ｎ１８；及びＨ２−２からＨ２−３。一部の実施形態においては、ＹＡ部位は修飾を含み、これはＹＡ部位の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されていることを意味する。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジン（ピリミジン位とも呼ぶ）は、修飾（ピリミジンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のアデニン（アデニン位とも呼ぶ）は、修飾（アデニンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジン位とアデニン位とが、修飾を含む。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、ＲＮＡ及びＤＮＡの結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、又は当該複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的でありＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤としては、Ｃａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ／ニッカーゼ及びその不活性化形態（「ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤」）を含む。本明細書で用いる場合“Ｃａｓタンパク質”とも呼ぶ“Ｃａｓヌクレアーゼ”は、Ｃａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ、Ｃａｓニッカーゼ及びｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤を包含する。Ｃａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ／ニッカーゼ及びｄＣａｓ  ＤＮＡの結合剤は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ又はＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１又はＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２  Ｃａｓヌクレアーゼを含む。本明細書で用いる場合、「クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合活性を伴う一本鎖ポリペプチドであり、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼ等である。クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡのｃｌｅａｖａｓｅ又はニッカーゼの活性をさらに有するクラス２  Ｃａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ及びクラス２  Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ又はＮ８６３Ａのバリアント）と、ｃｌｅａｖａｓｅ／ニッカーゼの活性が不活性化されているクラス２  ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤とを含む。クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ  Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａのバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａのバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａのバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａのバリアント）であるタンパク質及びその修飾を含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１−１３（２０１５）のＣｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９に対して相同であり、またＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、その全体が参照により援用される。例えばＺｅｔｓｃｈｅの、表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。「Ｃａｓ９」は、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９、本明細書で列記するＣａｓ９のバリアント、及びその同等物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２−３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６０：３８５−３９７（２０１５）を参照されたい。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）又は「ＲＮＰ複合体」は、例えばＣａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ、Ｃａｓニッカーゼ、又はｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤である、Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）を伴うガイドＲＮＡを指す。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９等のＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を標的配列へと導き、またガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし当該結合剤は標的配列と結合するものであり、当該結合剤がｃｌｅａｖａｓｅ又はニッカーゼである場合には、結合の後に切断又はニッキングが続き得る。
【００２７】
本明細書で用いる場合、第１の配列の第２の配列に対するアラインメントが、その全体における第２の配列の位置のうちのＸ％以上が第１の配列とマッチするということを示していれば、第１の配列は、第２の配列に対して「少なくともＸ％の同一性をもつ配列を含む」と考える。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対して１００％の同一性をもつ配列を含むが、これは当該第２の配列の３つの位置全てに対してマッチしているという点で、アラインメントは１００％の同一性を与えることとなるからである。ＲＮＡ及びＤＮＡの間の相違（概してウリジンをチミジンと入れ替える、又はその逆）ならびに修飾ウリジン等のヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド（例えば、チミジン、ウリジン又は修飾されたウリジン等）が同一の相補配列（例えば、チミジン、ウリジン又は修飾ウリジンの全てに対するアデノシン；別の例は、シトシン及び５−メチルシトシンであり、その両方が、相補配列としてグアノシン又は修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチドの間における同一性又は相補性での相違に寄与しない。したがって、例えば、式中Ｘが例えばプソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン又は５−メトキシウリジン等の任意の修飾ウリジンである、配列５’−ＡＸＧは、両方が同一の配列（５’−ＣＡＵ）に対して完全に相補的であるという点で、ＡＵＧに対して１００％同一と考える。例示的なアラインメントのアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが挙げられ、これらは当技術で周知である。当業者は、アラインしようとする配列の所与の対に対して適しているアルゴリズムの選択とパラメータ設定とが何であるか理解することとなるものであり；アミノ酸に対して概ね類似の長さ及び５０％を超える予測の同一性又はヌクレオチドに対して７５％を超える予測の同一性である配列に関しては、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインタフェースのデフォルトの設定でのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが、概して適している。
【００２８】
「ｍＲＮＡ」は、本明細書において、ＲＮＡ又は修飾ＲＮＡであり、またポリペプチドに翻訳され得るオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチドを指すために用いる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能し得る）。ｍＲＮＡは、例えば２’−メトキシリボース残基であるリボソーム残基又はその類似体を含むリン酸塩−糖骨格を含み得る。一部の実施形態においては、ｍＲＮＡのリン酸−糖骨格の糖は、実質的に、リボース残基、２’−メトキシリボース残基又はこれらの組み合わせからなる。
【００２９】
本明細書に記載するガイドＲＮＡの組成物及び方法において有用なガイド配列は、表１及び本願の全体にわたって示している。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「インデル（ｉｎｄｅｌ）」は、標的核酸における二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入又は欠失のいずれかがされているいくつかのヌクレオチドからなる、挿入／欠失である変異を指す。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ又は両方）の発現の低下を指す。タンパク質のノックダウンは、関心の組織又は細胞の集団よりのタンパク質の合計細胞量を検出することによって測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は公知であり、また関心の組織又は細胞の集団より単離されたｍＲＮＡの配列決定を含む。一部の実施形態においては、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現を一部喪失することであって、例えば転写されたｍＲＮＡの量の減少又は細胞の集団（例えば組織において存在するもの等であるｉｎ  ｖｉｖｏの集団を含む）により発現されたタンパク質の量の減少を指し得る。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「ノックアウト」は、細胞における特定のタンパク質の発現が喪失することを指す。ノックアウトは、細胞、組織又は細胞の集団のいずれかにおいてタンパク質の合計細胞量を検出することによって測定することができる。一部の実施形態においては、本開示の方法で、１又は複数の細胞において（例えば、組織において存在するもの等であるｉｎ  ｖｉｖｏの集団を含めた細胞集団において）、ＬＤＨＡをノックアウトする。一部の実施形態においては、ノックアウトは、例えばインデルによって作製される、変異ＬＤＨＡタンパク質の形成ではなく、むしろ細胞におけるＬＤＨタンパク質の発現の完全な喪失である。本明細書で用いる場合、“ＬＤＨ”は、ＬＤＨＡ遺伝子の遺伝子産物である、乳酸デヒドロゲナーゼを指す。ヒト野生型ＬＤＨＡ配列は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３９３９；Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＧ０００００１３４３３３で利用可能である。
【００３３】
「高シュウ酸尿症」は、過剰な尿中シュウ酸塩を特徴とする症状である。例示的な高シュウ酸尿症の種類としては、原発性高シュウ酸尿症（１型（ＰＨ１）、２型（ＰＨ２）及び３型（ＰＨ３）を含む）、シュウ酸症、腸内高シュウ酸尿症、及びシュウ酸塩を多く含む食品を摂取することに関連した高シュウ酸尿症が挙げられる。高シュウ酸尿症は原因不明であり得る。高いシュウ酸塩レベルは、シュウ酸カルシウム結石ならびに結果的に腎機能の進行性の劣化及び最終的に末期腎疾患をもたらす腎実質損傷につながる。すなわち、高シュウ酸尿症は、結果的に、腎臓及び尿路における過剰なシュウ酸塩の産生とシュウ酸カルシウム結晶の沈着とをもたらし得る。シュウ酸塩による腎障害は、尿細管毒性、腎臓におけるシュウ酸カルシウムの沈着、及びシュウ酸カルシウム結石による尿路閉塞の組み合わせにより引き起こされる。損傷した腎臓の機能は、過剰なシュウ酸塩をもはや有効に排出することができないために疾患を悪化させて、次いで骨、目、皮膚及び心臓におけるシュウ酸塩の蓄積及び結晶化を結果的にもたらし、また他の臓器の深刻な疾患及び死につながる。腎不全及び末期の腎疾患が生じ得る。高シュウ酸尿症に関して認可された薬物療法は存在しない。
【００３４】
「原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）」は、肝臓のペルオキシソームアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）酵素をコードするＡＧＸＴ遺伝子の変異に起因した常染色体劣性遺伝疾患である。ＡＧＴはグリオキシル酸塩をグリシンへと代謝する。ＡＧＴ活性の欠如又はそのミトコンドリアへのミスターゲティングにより、グリオキシル酸塩がシュウ酸塩へと酸化するのを許容し、当該シュウ酸塩が尿中に単に排出され得る。
【００３５】
腎臓による排出の前にグリオキシル酸塩をオキシレート（ｏｘｙｌａｔｅ）に変換する肝臓のペルオキシソーム酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を破壊することは、罹患肝臓におけるシュウ酸塩合成を防止して高シュウ酸尿症で発達する病理を潜在的に予防するための１つの可能性のある機序である。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨＡ）の遺伝子がコードするＬＤＨは、グリオキシル酸塩のシュウ酸塩への変換を触媒する。ＬＤＨ活性を抑制することで、シュウ酸塩の産生を阻害して、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）によってグリコール酸塩へと変換され得るグリオキシル酸塩の蓄積を引き起こしつつ、結果的に尿中シュウ酸塩レベルの低下をもたらすはずである。シュウ酸塩と異なり、グリコール酸塩は、可溶性で尿中に容易に排出される。現在のところ、グリコール酸塩レベルが上昇することによるネガティブな副作用は知られていない。そのため、一部の実施形態においては、ＬＤＨ活性を阻害する方法が提供されているものであって、当該方法では、阻害されると、シュウ酸塩産生が阻害され、グリコール酸塩産生が増加する。
【００３６】
グリオキシル酸塩の酸化産物であるシュウ酸塩は、単に尿中に排出され得る。尿中のシュウ酸塩が高レベルであること（高シュウ酸尿症）は、高シュウ酸尿症の症状である。したがって、尿中でシュウ酸塩が増加することは、高シュウ酸尿症の症状である。シュウ酸塩は、カルシウムと結合して、腎臓及び膀胱結石の主要成分である、シュウ酸カルシウムを形成できる。腎臓及び他の組織におけるシュウ酸カルシウムの沈着は、尿中の血液（血尿）、尿路感染症、腎障害、末期腎疾患及びその他のものを招き得る。時間の経過と共に、血中のシュウ酸塩レベルが上昇し得、そして全身にわたって他の器官でシュウ酸カルシウムが沈着し得る（シュウ酸症又は全身性シュウ酸症）。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する、標的遺伝子における核酸の配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用が、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を結合させるようにして、標的配列内で潜在的にニッキング又は切断（当該結合剤の活性に依存する）させるようにする。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「治療」は、対象における疾患又は障害に対する治療の任意の施与又は適用を指し、疾患を阻害すること、その発症を抑止すること、疾患の１もしくは複数の症状を軽減すること、疾患を治癒すること、又は疾患の１もしくは複数の症状の再発を予防することを含む。例えば高シュウ酸尿症の治療は、高シュウ酸尿症の症状を緩和することを含み得る。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「シュウ酸塩の治療上関連のある低下」又は「治療域内のシュウ酸塩レベル」の語は、ベースラインと比較して尿中シュウ酸塩の排出の３０％を超える減少を意味する。Ｌｅｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｏｐｐｅ（１９９９）  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １４：２５５６−２５５８の、２５５７ページ第２欄を参照されたい。例えば、治療域内のシュウ酸塩レベルを達成することは、ベースラインから３０％を超えて尿中シュウ酸塩が減少することを意味する。一部の実施形態においては、「正常なシュウ酸塩レベル」又は「正常なシュウ酸塩の範囲」は、約８０から約１２２μｇシュウ酸塩／ｍｇクレアチニンまでである。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８６２（２）：２３３−２３９を参照されたい。一部の実施形態においては、シュウ酸塩の治療上関連のある減少は、正常の２００％、１５０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％又は１００％未満又は以内のレベルを達成する。
【００４０】
「約」又は「およそ」の語は、当業者によって決定される特定の値に関する許容可能な誤差を意味し、それはその値がどのように測定又は決定されたかに一部依存する。
ＩＩ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
【００４１】
本明細書においては、例えばＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を伴うガイドＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いることによって、ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発するのに有用な組成物を提供する。組成物は、高シュウ酸尿症を患う対象又は疑いがある対象に投与され得る。組成物は、尿中シュウ酸塩排出量が増えた又は血清グリコール酸塩排出量が減少した対象に投与され得る。ＬＤＨＡ遺伝子を標的とするガイド配列を、配列番号１〜８４で表１に示している。
【００４２】
配列番号１〜８４及び１００〜１９２で表１に示すガイド配列のそれぞれは、例えばガイド配列の３’末端においてガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を伴う、ｃｒＲＮＡを形成するさらなるヌクレオチドをさらに含み得る：５’から３’に向けてＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２００）。ｓｇＲＮＡの場合には、上記したガイド配列は、例えばガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を伴う、ｓｇＲＮＡを形成する追加のヌクレオチドをさらに含み得る：５’から３’に向けて、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０１）、又はＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０３、これは４つの終端のＵがない配列番号２０１である）。一部の実施形態においては、配列番号２０１の４つの終端のＵが存在しない。一部の実施形態においては、配列番号２０１の４つの終端のＵのうち１、２又は３つのみが存在する。
【００４３】
一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ短鎖シングルガイドＲＮＡ（ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡ）を提供するものであって、これは本明細書に記載のガイド配列と、少なくとも５〜１０個のヌクレオチド又は６〜１０個のヌクレオチドが欠如したヘアピン領域を含む「ｓｇＲＮＡの保存部分」とを含む。ある実施形態においては、例えば表２ＢのヌクレオチドＨ１−１からＨ２−１５である、ＬＤＨＡ短鎖シングルガイドＲＮＡのヘアピン領域は、ｓｇＲＮＡの保存部分と比べて、５〜１０個のヌクレオチドが欠如している。ある実施形態においては、例えば表２ＢのヌクレオチドＨ１−１からＨ１−１２である、ＬＤＨＡ短鎖シングルガイドＲＮＡのヘアピン１領域は、ｓｇＲＮＡの保存部分と比べて、５〜１０個のヌクレオチドが欠如している。
【００４４】
例示的な「ｓｇＲＮＡの保存部分」を表２Ａに示しており、これは化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」（「ｓｐＣａｓ９」とも呼ぶ））  ｓｇＲＮＡの「保存領域」を示す。第１行目はヌクレオチドの番号を示し、第２行目は配列を示し（配列番号７００）、また第３行目は「ドメイン」を示す。Ｂｒｉｎｅｒ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５６：３３３−３３９（２０１４）は、ターゲティングに関与する「スペーサー」ドメインと、「下方ステム」ドメインと、「バルジ」ドメインと、「上方ステム」ドメイン（テトラループを含み得る）と、「ネクサス」ドメインと、「ヘアピン１」ドメイン及び「ヘアピン２」ドメインとを含む本明細書で「ドメイン」と呼ぶｓｇＲＮＡの機能ドメインを記述している。Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の３３４ページ、図１Ａを参照されたい。
【００４５】
表２Ｂでは、本明細書で用いるように、ｓｇＲＮＡのドメインの概要を提供している。表２Ｂにおいて、領域の間における「ｎ」は、ヌクレオチドの様々な数を表し、例えば、０から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上を表す。一部の実施形態においては、ｎは０に等しい。一部の実施形態においては、ｎは１に等しい。
【００４６】
一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｇＲＮＡは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）又はｓｐｙＣａｓ９同等物に由来する。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来でない（「ｎｏｎ−ｓｐｙＣａｓ９」）。一部の実施形態においては、５〜１０個のヌクレオチド又は６〜１０個のヌクレオチドは、連続している。
【００４７】
一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡは、表２Ａで示すように、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）  ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）が欠如している。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡは、例えばペアの又は構造のアラインメントによって決定される、ｓｐｙＣａｓ９の保存部分のヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）に相当するヌクレオチドが少なくとも欠如しているｎｏｎ−ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡである。一部の実施形態においては、ｎｏｎ−ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡは、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９（「ｓａＣａｓ９」）  ｓｇＲＮＡである。
【００４８】
一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）が欠如している。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）が欠如している。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ  ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡは、例えばペアの又は構造のアラインメントによって決定される、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の、又はｎｏｎ−ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の対応するヌクレオチドの、ヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）又はヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）の４、５、６、７、又は８個のヌクレオチドが欠如している。
【００４９】
一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれかひとつと、例えばガイド配列の３’末端においてガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を伴う、ｃｒＲＮＡを形成するさらなるヌクレオチドとを含む：５’から３’に向けてＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０２）。配列番号２０２は、以下の野生型ガイドＲＮＡ保存配列と比べて８個のヌクレオチドが欠如している：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０３）。
【００５０】
【表１】
2022502055.tif 000003
2022502055.tif 000004
2022502055.tif 000005
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2022502055.tif 000011
【００５１】
【表２】
2022502055.tif 000012
2022502055.tif 000013
2022502055.tif 000014
【００５２】
【表３−１】
2022502055.tif 000015
【００５３】
【表３−２】
2022502055.tif 000016
【００５４】
【表３−３】
2022502055.tif 000017
【００５５】
【表３−４】
2022502055.tif 000018
【００５６】
【表３−５】
2022502055.tif 000019
【００５７】
一部の実施形態においては、本発明は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９等のＣａｓヌクレアーゼ）であり得るＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をＬＤＨＡにおける標的ＤＮＡ配列へと方向付けるガイド配列を含む１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供する。ｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列の１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含み得る。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列の少なくとも１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドに対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を含むｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ配列を含むｃｒＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載する各組成物及び方法の実施形態においては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として結合し得るか、又は別個のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上に存在し得る。ｓｇＲＮＡの文脈においては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの成分は、例えばホスホジエステル結合又は他の共有結合を介して、共有結合することができる。
【００５８】
本明細書に記載する組成物、使用及び方法の実施形態のそれぞれにおいては、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば表１に示すガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子とは、共有結合できないが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間における塩基対形成を介してＲＮＡ二本鎖を形成できる。
【００５９】
本明細書に記載する組成物、使用及び方法の実施形態のそれぞれにおいては、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）」又は「ｓｇＲＮＡ」として単一のＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表１に示すガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（又はその部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列の１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態においては、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡとは、リンカーを介して共有結合する。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間における塩基対形成を介してステムループ構造を形成する。一部の実施形態においては、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡとは、ホスホジエステル結合ではない１又は複数の結合を介して共有結合する。
【００６０】
一部の実施形態においては、ｔｒＲＮＡは、天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するｔｒＲＮＡ配列の全て又は部分を含み得る。一部の実施形態においては、ｔｒＲＮＡは、切断型又は修飾された野生型のｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに依存する。一部の実施形態においては、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１００以上のヌクレオチドを含むか、又は５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１００以上のヌクレオチドからなる。一部の実施形態においては、ｔｒＲＮＡは、例えば１もしくは複数のヘアピンもしくはステムループ構造、又は１もしくは複数のバルジ構造等である、一定の二次構造を含み得る。
【００６１】
一部の実施形態においては、本発明は、配列番号１〜８４のいずれか１つのガイド配列を含む１又は複数のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００６２】
一部の実施形態においては、本発明は、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、及び１０８１、又は例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９、及び２０８１で示されるその修飾バージョン、のうちのいずれか１つを含む１又は複数のｓｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００６３】
一態様においては、この発明は、配列番号１〜８４の核酸のいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、又は９０％同一であるガイド配列を含むｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００６４】
他の実施形態においては、組成物は、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか２以上から選択されたガイド配列を含む、例えば少なくとも２つである少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、この組成物は、配列番号１〜８４の核酸のいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、又は９０％同一であるガイド配列をそれぞれ含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
【００６５】
本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子において標的配列を認識する（例えば、当該標的配列に対してハイブリダイズする）ように設計される。例えば、ＬＤＨＡ標的配列は、ガイドＲＮＡを含む提供されたＣａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅによって認識及び切断され得る。一部の実施形態においては、例えばＣａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、ガイドＲＮＡによってＬＤＨＡ遺伝子の標的配列へと方向付けられ得るものであって、当該ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、また例えばＣａｓ  ｃｌｅａｖａｓｅ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤が、標的配列を切断する。
【００６６】
一部の実施形態においては、１又は複数のガイドＲＮＡの選択が、ＬＤＨＡ遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
【００６７】
任意の特定の理論に拘束されることなく、遺伝子のある領域における変異（例えば、ヌクレアーゼが介在するＤＳＢの結果として生じるインデルより得られるフレームシフト変異）は、遺伝子の他の領域における変異よりも耐性が少ないものであり得、したがってＤＳＢの位置は、結果として得られ得るタンパク質のノックダウンの量又はタイプにおいて重要な因子である。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ内の標的配列に対して相補的である又は相補性を有するｇＲＮＡを用いて、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をＬＤＨＡ遺伝子内の特定の位置に方向付ける。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、ＬＤＨＡのエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エキソン７、又はエキソン８における標的配列に対して相補的であるか又は相補性を有するガイド配列を有するように設計される。
【００６８】
一部の実施形態においては、ガイド配列は、ヒトＬＤＨＡ遺伝子に存在する標的配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、又は９０％同一である。一部の実施形態においては、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性又は同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。一部の実施形態においては、当該標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１００％相補的又は同一であり得る。他の実施形態においては、当該標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、当該標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１、２、３又は４つのミスマッチを含有し得るものであって、当該ガイド配列の全長は２０である。一部の実施形態においては、当該標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１〜４つのミスマッチを含有し得るものであって、当該ガイド配列は２０個のヌクレオチドである。
【００６９】
一部の実施形態においては、本明細書に開示する組成物又は製剤が、本明細書に記載するようなＣａｓヌクレアーゼ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを提供し、使用し、又は投与する。
Ｂ．修飾されたｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ
【００７０】
一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは化学的に修飾されている。１又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準のＡ、Ｇ、Ｃ及びＵの残基の代わりに又は当該残基に加えて用いられる１又は複数の非天然及び／又は天然の成分又は構成の存在を記述するために、「修飾された」ｇＲＮＡ又は「化学的に修飾された」ｇＲＮＡと呼ぶ。一部の実施形態においては、修飾ｇＲＮＡは、非標準のヌクレオシド又はヌクレオチドを用いて合成され、それをここでは「修飾された」と呼ぶ。修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における、非結合リン酸酸素のうちの１もしくは両方の、及び／又は結合リン酸酸素のうちの１もしくは複数の変更、例えば置換（例示的な骨格修飾）；（ｉｉ）リボース糖の構成の、例えばリボース糖における２’ヒドロキシルの変更、例えば置換（例示的な糖修飾）；（ｉｉｉ）「脱リン酸化」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換（例示的な骨格修飾）；（ｉｖ）非標準核酸塩基によることを含む、天然の核酸塩基の修飾又は置換（例示的な塩基修飾）；（ｖ）リボースリン酸骨格の置換又は修飾（例示的な骨格修飾）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾、例えば部分、キャップ、又はリンカーの末端のリン酸基又は結合の除去、修飾又は置換（こうした３’又は５’キャップ修飾は、糖及び／又は骨格の修飾を含み得る）；ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾又は置換（例示的な糖修飾）、のうちの１又は複数を含み得る。
【００７１】
上記に列記したもの等である化学修飾は組み合わせて、２、３、４又はそれ以上の修飾を有することができるヌクレオシド及びヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む、修飾されたｇＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡを提供することが可能である。例えば、修飾残基は、修飾された糖及び修飾された核酸塩基を有することが可能である。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡの全ての塩基が修飾され、例えば全ての塩基が、ホスホロチオエート基等の修飾リン酸基を有する。ある実施形態においては、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て又は実質的に全てが、ホスホロチオエート基で置換される。一部の実施形態においては、修飾されたｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において又はＲＮＡの５’末端近傍に、少なくとも１つの修飾残基を含む。一部の実施形態においては、修飾されたｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において又はＲＮＡの３’末端近傍に、少なくとも１つの修飾残基を含む。
【００７２】
一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、１、２、３又はそれ以上の修飾残基を含む。一部の実施形態においては、修飾ｇＲＮＡ内の位置のうちの少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）が、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドである。
【００７３】
無修飾核酸は、例えば細胞内ヌクレアーゼ又は血清中に存在するものによって、分解する傾向があり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様においては、本明細書に記載するｇＲＮＡは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含有して、例えば細胞内の又は血清由来のヌクレアーゼに対する安定性を誘発することが可能である。一部の実施形態においては、本明細書に記載する修飾ｇＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方において、細胞集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し得る。「自然免疫応答」の語は、一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答を含み、サイトカイン発現、特にインターフェロンの放出、及び細胞死の誘発に関与する。
【００７４】
骨格修飾の一部の実施形態においては、修飾された残基のリン酸基は、酸素の１又は複数を異なる置換基と置換することによって修飾することができる。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸に存在する修飾残基は、本明細書に記載する修飾リン酸基により無修飾リン酸部分を大規模に置換することを含み得る。一部の実施形態においては、リン酸骨格の骨格修飾は、無電荷のリンカー又は非対称の電荷分布をもつ荷電リンカーのいずれかを結果的にもたらす変更を含み得る。
【００７５】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎａｔｅ）、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキル又はホスホン酸アリール、及びリン酸トリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）が挙げられる。無修飾リン酸基内のリン原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを、上記の原子又は原子の群のうちの１つと置換することで、リン酸原子をキラルにさせることが可能である。不斉中心のリン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてはＲｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書においてはＳｐ）のいずれかを所有することが可能である。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸塩をヌクレオシドに連結させる酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。置換は、いずれかの連結酸素において又は連結酸素の両方において生じ得る。
【００７６】
リン酸基は、ある骨格修飾内にコネクターを含有するリンでない基によって置換することができる。一部の実施形態においては、荷電リン酸基は、中性の成分で置換することができる。リン酸基を置換することができる成分の例としては、例えばメチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバミン酸塩、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、オキシム、メチレンイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｏ）、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができるが、これに限定されない。
【００７７】
核酸を模倣することが可能である足場を構築することも可能であり、当該足場は、リン酸リンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオシド又はヌクレオチド代替物で置換されている。こうした修飾は、骨格及び糖の修飾を含み得る。一部の実施形態においては、核酸塩基を代替的な骨格で連結することが可能である。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物を挙げることができるが、これに限定されない。
【００７８】
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖類に対する１又は複数の修飾、すなわち糖修飾、を含むことが可能である。例えば、２’ヒドロキシ基（ＯＨ）は、修飾することができ、例えばいくつかの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で置換できる。一部の実施形態においては、ヒドロキシル基はもはや脱プロトン化して２’−アルコキシドイオンを形成することができないため、２’ヒドロキシル基に対する修飾が核酸の安定性を高めることが可能である。
【００７９】
２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、式中「Ｒ」は例えばアルキル、シクロアルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロアリール又は糖とすることが可能である）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって、式中Ｒは例えばＨ又は置換されていてもよいアルキルとすることが可能であり、またｎは０から２０（例えば、０から４、０から８、０から１０、０から１６、１から４、１から８、１から１０、１から１６、１から２０、２から４、２から８、２から１０、２から１６、２から２０、４から８、４から１０、４から１６、及び４から２０）の整数とすることが可能であるＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、を挙げることが可能である。一部の実施形態においては、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅとすることが可能である。一部の実施形態においては、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシル基をフッ化物で置換した、２’−フルオロ修飾とすることが可能である。一部の実施形態においては、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが例えばＣ１−６アルキレン又はＣ１−６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に連結することが可能である「ロック」核酸（ＬＮＡ）であって、ここで例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、又はアミノの架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノとすることが可能である）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノとすることが可能である）を含み得る、「ロック」核酸（ＬＮＡ）を含むことが可能である。一部の実施形態においては、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’−Ｃ３’結合を欠如している「アンロック」核酸（ＵＮＡ）を含むことが可能である。一部の実施形態においては、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含むことが可能である。
【００８０】
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、例えば一部ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分における、デオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、又はヨード）；アミノ（アミノは、例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸とすることが可能である）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（アミノは例えば本明細書に記載のとおりとすることが可能である）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中Ｒは、例えばアルキル、シクロアルキル、アリール、アルアルキル、ヘテロアリール又は糖とすることが可能である）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびに、例えば本明細書に記載するアミノで置換されていてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニル、を含むことが可能である。
【００８１】
糖修飾は、リボースにおける対応する炭素のものとは逆の立体化学的配置をもつ、１又は複数の炭素を含有し得る糖類を含むことが可能である。したがって、修飾核酸は、糖として、例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことが可能である。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含むことも可能である。これら脱塩基糖はまた、構成糖原子のうちの１又は複数においてさらに修飾可能である。修飾核酸はまた、Ｌ体である１又は複数の糖、例えばＬ−ヌクレオシド、を含むことが可能である。
【００８２】
本明細書に記載する、修飾核酸に組み込むことが可能である修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含むことが可能である。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されない。これら核酸塩基は、修飾されて、又は完全に置換されて、修飾核酸に組み込むことが可能である修飾残基を提供することが可能である。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン類似体、又はピリミジン類似体から独立に選択することが可能である。一部の実施形態においては、核酸塩基は、例えば、天然の及び合成の塩基誘導体を含むことが可能である。
【００８３】
デュアルガイドＲＮＡを採用する実施形態においては、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのそれぞれが、修飾を含有することが可能である。こうした修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの一方又は両方の末端において存在し得る。ｓｇＲＮＡを含む実施形態においては、ｓｇＲＮＡの一方もしくは両方の末端における１もしくは複数の残基が、化学的に修飾され得、及び／又は内部ヌクレオシドが修飾され得、及び／又はｓｇＲＮＡ全体が化学的に修飾され得る。ある実施形態は、５’末端修飾を含む。ある実施形態は、３’末端修飾を含む。
【００８４】
一部の実施形態においては、本明細書に開示するガイドＲＮＡは、２０１７年１２月８日出願の国際公開第２０１８／１０７０２８Ａ１号、発明の名称「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ（化学的に修飾されたガイドＲＮＡ）」に開示された修飾パターンのうちの１つを含むものであり、当該公報の内容は、その全体として参照により本明細書で援用する。一部の実施形態においては、本明細書に開示するガイドＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１７０１１４３３４号に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含むものであり、当該公報の内容は、その全体として参照により本明細書で援用する。一部の実施形態においては、本明細書に開示するガイドＲＮＡは、国際公開第２０１７／１３６７９４号に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含むものであり、当該公報の内容は、その全体として参照により本明細書で援用する。
Ｃ．ＹＡ修飾
【００８５】
ＹＡ部位における修飾（本明細書においては「ＹＡ修飾」とも呼ぶ）は、ヌクレオシド間結合の修飾、例えば化学修飾、置換もしくはその他による塩基（ピリミジン又はアデニン）の修飾、及び／又は糖の修飾（例えば２’位置における、例えば２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、２’−Ｈ（デオキシリボース）等）とすることが可能である。一部の実施形態においては、「ＹＡ修飾」は、例えばＲＮアーゼによるＹＡ部位の認識もしくは切断との干渉によって、ならびに／又はＲＮアーゼに対する切断部位の到達性を低下させるＲＮＡ構造（例えば二次構造）を安定化させることによって、ジヌクレオチドモチーフの構造を変更してＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低下させる任意の修飾である。Ｐｅａｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．７６：７２９５−７３００（２０１１）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３０５−３２０（２００８）；Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０４：１６−２８（２０１６）；Ｇｈｉｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３，４９，９０３６を参照されたい。Ｐｅａｃｏｃｋら、Ｂｅｌｈｋｅ、Ｋｕ、及びＧｈｉｄｉｎｉは、ＹＡ修飾として好適な例示的な修飾を提供する。ヌクレオチド鎖切断による分解（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を減少させる、当業者にとって公知の修飾を包含する。ＲＮアーゼ切断に関与する２’ヒドロキシル基に影響を及ぼす例示的な２’リボース修飾は、２’−Ｈ、及び２’−Ｏ−Ｍｅを含む２’−Ｏ−アルキルである。ＹＡ部位における残基の、二環式リボース類似体、ＵＮＡ、及び修飾されたヌクレオシド間結合等である修飾は、ＹＡ修飾とすることが可能である。ＲＮＡ構造を安定化することが可能である例示的な塩基修飾は、プソイドウリジン及び５−メチルシトシンである。一部の実施形態においては、ＹＡ部位の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジン（「ピリミジン位」とも呼ぶ）は、修飾（ピリミジンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾、ピリミジン塩基の修飾、及び例えばその２’位におけるリボースの修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のアデニン（「アデニン位」とも呼ぶ）は、修飾（ピリミジンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾、ピリミジン塩基の修飾、及び例えばその２’位におけるリボースの修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジンとアデニンとが、修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾が、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低下させる。
【００８６】
一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個又はそれ以上のＹＡ部位において修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジンは、修飾（ピリミジンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のアデニンは、修飾（アデニンの糖の３’直近のヌクレオシド間結合を変える修飾を含む）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位のピリミジンとアデニンとが、例えば糖、塩基又はヌクレオシド間結合の修飾等である、修飾を含む。ＹＡ修飾は、本明細書に記載する修飾のタイプのうちのいずれかであり得る。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、又は２’−フルオロのうちの１又は複数を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、又は２’−フルオロのうちの１又は複数を含むピリミジン修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、１又は複数のＹＡ部位を含有するＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボソーム類似体（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ又はＥＮＡ）を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位を含有するＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボソーム類似体（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ又はＥＮＡ）を含むものであって、ＹＡ修飾がＹＡ部位に対して遠位である。
【００８７】
一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、ガイド領域ＹＡ部位の修飾を含む。一部の実施形態においては、ガイド領域は、ＹＡ修飾を含み得る１、２、３、４、５個又はそれ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。一部の実施形態においては、５’終端の５’末端からの、５から末端、６から末端、７から末端、８から末端、９から末端又は１０から末端（「５から末端（５−ｅｎｄ）」等は、ガイド領域の５位から３’末端、すなわちガイド領域内の最も３’のヌクレオチドまでを指す）に位置する１又は複数のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、５’終端の５’末端からの、５から末端、６から末端、７から末端、８から末端、９から末端又は１０から末端に位置する２以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、５’終端の５’末端からの、５から末端、６から末端、７から末端、８から末端、９から末端又は１０から末端に位置する３以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、５’終端の５’末端からの、５から末端、６から末端、７から末端、８から末端、９から末端又は１０から末端に位置する４以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、５’終端の５’末端からの、５から末端、６から末端、７から末端、８から末端、９から末端又は１０から末端に位置する５以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。修飾されたガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
【００８８】
一部の実施形態においては、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、又は９個のヌクレオチドの範囲内にある。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドの１０個のヌクレオチドの範囲内にあり、かつ、ガイド領域が、２０ヌクレオチドの長さである場合には、修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１〜２０位のいずれかに位置する。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドからＹＡ部位２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のヌクレオチドの範囲内に位置する。一部の実施形態においては、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個のヌクレオチドに位置する。
【００８９】
一部の実施形態においては、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、５’終端の５’末端からのヌクレオチド４、５、６、７、８、９、１０又は１１にある又はその後にある。
【００９０】
一部の実施形態においては、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端修飾以外である。例えば、ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載するような５’末端修飾を含むことが可能であり、また修飾ガイド領域ＹＡ部位をさらに含むことが可能である。あるいは、ｓｇＲＮＡは、無修飾５’末端と、修飾ガイド領域ＹＡ部位とを含むことが可能である。あるいは、ｓｇＲＮＡは、修飾５’末端と、無修飾ガイド領域ＹＡ部位とを含むことが可能である。
【００９１】
一部の実施形態においては、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが含んでいない修飾を含む。例えば、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４が２’−ＯＭｅ修飾のみを含み、かつ、ヌクレオチド５がＹＡ部位のピリミジンであり、ホスホロチオエートを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチド（ヌクレオチド４）が含んでいない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例においては、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、かつ、ヌクレオチド４がＹＡ部位のピリミジンであり、２’−ＯＭｅを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１つのヌクレオチド（ヌクレオチド１〜３のいずれか）が含んでいない修飾（２’−ＯＭｅ）を含む。この条件はまた、無修飾ヌクレオチドが修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置するならば、常に満たされる。
【００９２】
一部の実施形態においては、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、上記したＹＡ部位に関して記載したような修飾を含む。
【００９３】
ガイド領域ＹＡ部位修飾のさらなる実施形態は、上記した発明の概要に記載している。本開示の他の箇所で記載した任意の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと、実行可能な範囲で組み合わせてもよい。
【００９４】
一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、保存領域ＹＡ部位の修飾を含む。保存領域ＹＡ部位１〜１０は、図１０に示す。一部の実施形態においては、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の保存領域ＹＡ部位が修飾を含む。
【００９５】
一部の実施形態においては、保存領域ＹＡ部位１、８、又は１及び８が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、保存領域ＹＡ部位１、２、３、４、及び１０が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位２、３、４、８及び１０が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、保存領域ＹＡ部位１、２、３、及び１０が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位２、３、８及び１０が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、ＹＡ部位１、２、３、４、８及び１０が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のさらなるの保存領域ＹＡ部位がＹＡ修飾を含む。
【００９６】
一部の実施形態においては、保存領域ＹＡ部位２、３、４、及び１０のうちの１、２、３又は４個が、ＹＡ修飾を含む。一部の実施形態においては、１、２、３、４、５、６、７、又は８個のさらなる保存領域ＹＡ部位がＹＡ修飾を含む。
【００９７】
一部の実施形態においては、修飾された保存領域ＹＡ部位は、上記したＹＡ部位に関して記載したような修飾を含む。
【００９８】
保存領域ＹＡ部位修飾のさらなる実施形態は、上記した発明の概要に記載している。本開示の他の箇所で記載した任意の実施形態は、前述の実施形態のいずれかと、実行可能な範囲で組み合わせてもよい。
【００９９】
一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、上記の表２又は以下の表３に示した修飾パターンのいずれかを含むものであり、ここでＮは、存在する場合には、任意の天然の又は非天然のヌクレオチドであり、また全体としてＮは本明細書において表１に記載したＬＤＨＡガイド配列を含む。表３は、ｓｇＲＮＡのガイド配列部分は表していない。修飾は、ガイドのヌクレオチドに対するＮの置換にかかわらず、表３に示したとおりのままである。すなわち、ガイドのヌクレオチドはＮを置換しているが、ヌクレオチドは表３に示すとおり修飾されている。ガイド配列が５’末端に結合している場合には、ガイド配列の５’末端（又は５’終端）が修飾されていてもよい。一部の実施形態においては、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ及び／又はＰＳ結合を含む。一部の実施形態においては、２’−Ｏ−Ｍｅ及び／又はＰＳ結合は、ガイド配列の５’末端において、ガイド配列の最初の１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、又は１〜３個のヌクレオチドに存在する。
【０１００】
【表４】
2022502055.tif 000020
2022502055.tif 000021
2022502055.tif 000022
2022502055.tif 000023
【０１０１】
一部の実施形態においては、修飾ｓｇＲＮＡは、以下の：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）、の配列を含み、「Ｎ」は任意の天然の又は非天然のヌクレオチドであり得、また全体としてＮは、表１に記載するＬＤＨＡガイド配列を含む。例えば、本明細書には、配列番号３００であって、Ｎが本明細書において表１に開示されるガイド配列（配列番号１〜８４）のうちのいずれかで置換されている、配列番号３００を包含する。
【０１０２】
以下に記載する修飾のいずれかが、本明細書に記載するｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ内に存在し得る。
【０１０３】
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」又は「ｍＧ」の語は、２’−Ｏ−Ｍｅで修飾されているヌクレオチドを示すために用い得る。
【０１０４】
２’−Ｏ−メチルの修飾は、以下のように表すことができる：
【０１０５】
【化１】
2022502055.tif 000024
【０１０６】
ヌクレオチドの糖環に影響することがわかっている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環における２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を増加させることが可能である。
【０１０７】
本願においては、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、又は「ｆＧ」の語は、２’−Ｆで置換されているヌクレオチドを示すために用い得る。
【０１０８】
２’−Ｆの置換は以下のとおり表すことが可能である：
【０１０９】
【化２】
2022502055.tif 000025
【０１１０】
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結又は結合は、リン酸ジエステル連結内の、例えばヌクレオチド塩基間の結合内の、１つの非架橋のリン酸酸素を硫黄で置換した結合を指す。ホスホロチオエートを用いてオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾したオリゴヌクレオチドは、Ｓ−ｏｌｉｇｏとも呼び得る。
【０１１１】
「＊」は、ＰＳ修飾を表すために用い得る。本願においては、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊又はＧ＊の語は、ＰＳ結合でその次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結するヌクレオチドを表すために用い得る。
【０１１２】
本願においては、「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」又は「ｍＧ＊」の語は、２’−Ｏ−Ｍｅと置換されており、かつＰＳ結合でその次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結する、ヌクレオチドを表すために用い得る。
【０１１３】
以下の式は、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生成する、非架橋のリン酸酸素に対するＳ−の置換を示す：
【０１１４】
【化３】
2022502055.tif 000026
【０１１５】
脱塩基ヌクレオチドは、窒素性塩基が欠如したヌクレオチドを指す。以下の式は、塩基が欠如した脱塩基（脱プリン塩基としても知られる）部位を伴うオリゴヌクレオチドを表す：
【０１１６】
【化４】
2022502055.tif 000027
【０１１７】
逆位塩基は、正常の５’から３’の結合とは逆転した結合（すなわち、５’から５’の結合又は３’から３’の結合のいずれか）を伴う塩基を指す。例えば：
【０１１８】
【化５】
2022502055.tif 000028
【０１１９】
脱塩基ヌクレオチドは、逆位結合と結合することが可能である。例えば、脱塩基ヌクレオチドが、５’から５’の結合を介して終端５’ヌクレオチドに結合し得るか、又は脱塩基ヌクレオチドが、３’から３’の結合を介して終端３’ヌクレオチドに結合し得る。終端５’又は３’のヌクレオチドのいずれかにおいて挿入された脱塩基ヌクレオチドはまた、逆位脱塩基エンドキャップと呼ばれ得る。
【０１２０】
一部の実施形態においては、５’終端における最初の３、４、又は５個のヌクレオチドの１又は複数と、３’終端における最後の３、４、又は５個のヌクレオチドの１又は複数とが修飾される。一部の実施形態においては、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、逆位脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、又は安定性及び／もしくは性能を向上させる当業者に周知である他のヌクレオチド修飾である。
【０１２１】
一部の実施形態においては、５’終端における最初の４個のヌクレオチドと、３’終端における最後の４個のヌクレオチドとが、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で連結している。
【０１２２】
一部の実施形態においては、５’終端における最初の３個のヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドとが、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、５’終端における最初の３個のヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドとが、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、５’終端における最初の３個のヌクレオチドと、３’終端における最後の３個のヌクレオチドとが、逆位脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１２３】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１、２０２、又は２０３に示す修飾パターンであって、ここでＮが任意の天然又は非天然ヌクレオチドであり、また全体としてＮが、例えば表１に示すような、ヌクレアーゼをＬＤＨＡ内の標的配列へと方向付けるガイド配列を含むものである、配列番号２０１、２０２、又は２０３に示す修飾パターンを含む。
【０１２４】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、及び１０８１、又は例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９、及び２０８１で示されるその修飾バージョン、のいずれか１つに示すｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１つならびに配列番号２０１、２０２又は２０３のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡを含むものであり、当該配列番号２０１、２０２又は２０３のヌクレオチドがガイド配列の３’末端上にあり、またｓｇＲＮＡが表３又は配列番号３００に示すように修飾されていてもよい。
【０１２５】
上記に記載するように、一部の実施形態においては、本明細書に開示する組成物又は製剤が、本明細書に記載するようなＣａｓヌクレアーゼ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼ等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを提供し、使用し、又は投与する。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」又は単に「修飾ＯＲＦ」であり、これはＯＲＦが修飾されているということを示す略語として用いる。
【０１２６】
一部の実施形態においては、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つの、複数の、又は全てのウリジン位置において、修飾ウリジンを含み得る。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、５位が、例えばハロゲン、メチル又はエチルで修飾されたウリジンである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、１位が、例えばハロゲン、メチル又はエチルで修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、又はこれらの組み合わせとすることが可能である。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、５−メトキシウリジンである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、プソイドウリジンである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジンである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、プソイドウリジン及びＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、プソイドウリジン及び５−メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチルプソイドウリジン及び５−メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジン及びＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、プソイドウリジン及び５−ヨードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態においては、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジン及び５−メトキシウリジンの組み合わせである。
【０１２７】
一部の実施形態においては、本明細書に開示するｍＲＮＡは、例えばＣａｐ０、Ｃａｐ１、又はＣａｐ２等の５’キャップを含む。５’キャップは概して、ｍＲＮＡの５’から３’鎖のはじめのヌクレオチドの、すなわち第１のキャップ近位ヌクレオチドの５’位に、５’−三リン酸塩を介して連結した７−メチルグアニンリボヌクレオチド（例えばＡＲＣＡに関して以下に述べるように、さらに修飾されていてもよい）である。Ｃａｐ０においては、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも、２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１においては、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースが、それぞれ２’−メトキシ及び２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２においては、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも、２’−メトキシを含む。例えばＫａｔｉｂａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１（３３）：１２０２５−３０；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（１１）：Ｅ２１０６−Ｅ２１１５を参照されたい。例えばヒトｍＲＮＡ等の哺乳類ｍＲＮＡを含めた、内在性レベルがより高い真核生物ｍＲＮＡの大部分が、Ｃａｐ１又はＣａｐ２を含む。Ｃａｐ１及びＣａｐ２とは異なる、Ｃａｐ０及び他のキャップ構造は、例えばＩＦＩＴ−１及びＩＦＩＴ−５等の自然免疫系の成分によって「非自己」として認識されることに起因して、ヒト等の哺乳類において免疫原性であり得、これはＩ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を結果的にもたらすことが可能である。ＩＦＩＴ−１及びＩＦＩＴ−５等の自然免疫系の成分はまた、Ｃａｐ１又はＣａｐ２以外のキャップをもつｍＲＮＡの結合をｅＩＦ４Ｅと競合し得、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。
【０１２８】
キャップは、同時転写的に含まれ得る。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  カタログ番号ＡＭ８０４５）は、開始時の転写物にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み込まれ得るグアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７−メチルグアニン  ３’−メトキシ−５’−三リン酸塩を含むキャップアナログである。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップを結果的にもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ  ａｎｄ  ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”  ＲＮＡ  ７：１４８６−１４９５を参照されたい。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
【０１２９】
【化６】
2022502055.tif 000029
【０１３０】
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）  ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  カタログ番号Ｎ−７１１３）又はＣｌｅａｎＣａｐ（商標）  ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  カタログ番号Ｎ−７１３３）を用いて、同時転写的にＣａｐ１構造を提供することが可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）  ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）  ＧＧの３’−Ｏ−メチル化バージョンもまた、それぞれＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  カタログ番号Ｎ−７４１３及びＮ−７４３３から利用可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）  ＡＧの構造を以下に示す。
【０１３１】
【化７】
2022502055.tif 000030
【０１３２】
あるいは、キャップは、転写後にＲＮＡに付加させることが可能である。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｃａｐｐｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅは、市販されており（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社  カタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、またそのＤ１サブユニットにより提供される、ＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼの活性と、そのＤ１２サブユニットにより提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼとを有する。このように、Ｓ−アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるようにＲＮＡに７−メチルグアニンを付加させることが可能である。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，４０２３−４０２７；Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２−２４４７９を参照されたい。
【０１３３】
一部の実施形態においては、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部をさらに含む。一部の実施形態においては、ポリＡ尾部は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個のアデニン、随意に最大３００個のアデニン、を含む。一部の実施形態においては、ポリＡ尾部は、９５、９６、９７、９８、９９又は１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
Ｄ．リボ核タンパク質複合体
【０１３４】
一部の実施形態においては、表１からの１もしくは複数のガイド配列又は表２からの１もしくは複数のｓｇＲＮＡを含む１又は複数のｇＲＮＡと、Ｃａｓ９等であるＣａｓヌクレアーゼ等である例えばヌクレアーゼであるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤とを含む組成物を包含する。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼ばれ得る切断活性を有する。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのもの、及び他の原核生物のもの（例えば、次の段落の列記を参照）、及びその修飾（例えば、遺伝子操作又は変異）されたバージョンのものを含む。例えば、米国出願公開第２０１６／０３１２１９８Ａ１号；米国出願公開第２０１６／０３１２１９９Ａ１号を参照されたい。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ又はＣｍｒ複合体、又はそのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１又はＣｍｒ２サブユニット、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのカスケード複合体、又はそのＣａｓ３サブユニットを含む。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、又はＩＩＣ型のシステムよりのものであってもよい。種々のＣＲＩＳＰＲシステム及びＣａｓヌクレアーゼの議論については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７−４７７（２０１１）；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２−３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６０：３８５−３９７（２０１５）を参照されたい。
【０１３５】
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る種の非限定的な例としては、化膿性レンサ球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、レンサ球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、黄色ブドウ球菌、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、髄膜炎菌、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、ブーフナー乳酸杆菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、バークホルデリア目バクテリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ菌種（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ菌種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ菌種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、ボツリヌス菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ菌種（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕ��ａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ菌種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属菌種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、Ｌｙｎｇｂｙａ属菌種（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ属菌種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．）、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、ジフテリア菌、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科バクテリアＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａが挙げられる。
【０１３６】
一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来であるＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科バクテリアＮＤ２００６（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６）由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科バクテリア（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａバクテリア、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａバクテリア、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、又はＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ、よりのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ又はＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、よりのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
【０１３７】
一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を伴うｇＲＮＡを、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ぶ。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼを伴うｇＲＮＡを、Ｃａｓ  ＲＮＰと呼ぶ。一部の実施形態においては、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型の成分を含む。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９を伴うｇＲＮＡを、Ｃａｓ９  ＲＮＰと呼ぶ。
【０１３８】
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、またＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９タンパク質は、１以上のＲｕｖＣドメイン及び／又は１以上のＨＮＨドメインを含む。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用及び方法の実施形態のそれぞれにおいては、Ｃａｓが標的ＤＮＡ内の二本鎖切断を誘発する。
【０１３９】
一部の実施形態においては、キメラＣａｓヌクレアーゼを用いるものであって、タンパク質の１つのドメイン又は領域が、異なるタンパク質の部分で置換されている。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置換されていてもよい。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであり得る。
【０１４０】
他の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素であり得る。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
【０１４１】
一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断を生じることが可能であり、これは「ニック」としても知られる。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにおいてニックを生じる酵素、すなわちＤＮＡ二重螺旋の一方の鎖を切断するが他方は切断しない酵素である。一部の実施形態においては、Ｃａｓニッカーゼは、あるバージョンのＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上記に述べたＣａｓヌクレアーゼ）であって、ヌクレオチド鎖切断活性部位（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）が例えば触媒ドメインにおける１又は複数の変化（例えば、点変異）によって不活性化されているバージョンのＣａｓヌクレアーゼである。Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメインの変化の議論に関しては、例えば米国特許第 ８，８８９，３５６号を参照されたい。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼは、不活化されたＲｕｖＣ又はＨＮＨのドメインを有する。
【０１４２】
一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１つのみの機能性ヌクレアーゼドメインを含有するように修飾される。例えば、当該結合剤のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが、変異又は完全にもしくは部分的に欠失して、その核酸切断活性が低下するように修飾され得る。一部の実施形態においては、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを用いる。一部の実施形態においては、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを用いる。一部の実施形態においては、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼを用いる。一部の実施形態においては、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼを用いる。
【０１４３】
一部の実施形態においては、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸を、ヌクレアーゼ活性が低下又は変化するように置換する。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおいてアミノ酸置換を含んでもよい。ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミン酸置換は、Ｄ１０Ａ（化膿性レンサ球菌Ｃａｓ９タンパク質に基づく）を含む。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｃｅｌｌ  Ｏｃｔ  ２２：１６３（３）：７５９−７７１を参照されたい。一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨ又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおいてアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミン酸置換は、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ及びＤ９８６Ａ（化膿性レンサ球菌Ｃａｓ９タンパク質に基づく）を含む。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）を参照されたい。さらなる例示的なアミノ酸置換は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａのＵ１１２  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）を含む。
【０１４４】
一部の実施形態においては、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対してそれぞれ相補的であるガイドＲＮＡの対との組み合わせで提供する。この実施形態においては、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列へと方向付けて、そして標的配列の両鎖においてニックを生じることによって（すなわちダブルニッキング）、ＤＳＢを導入する。一部の実施形態においては、ダブルニッキングの使用により、特異性が改善されて、オフターゲット効果が低下し得る。一部の実施形態においては、ニッカーゼを、ＤＮＡの両鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に用いて、標的ＤＮＡにおいてダブルニッキングを生じさせる。一部の実施形態においては、ニッカーゼを、近接近にある選択すべき２つの別個のガイドＲＮＡと共に用いて、標的ＤＮＡにおいてダブルニッキングを生じさせる。
【０１４５】
一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、ｃｌｅａｖａｓｅ及びニッカーゼ活性が欠如している。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、触媒（ｃｌｅａｖａｓｅ／ニッカーゼ）活性が本質的に欠如している一方でＤＮＡ結合活性を有する。一部の実施形態においては、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。一部の実施形態においては、ｃｌｅａｖａｓｅ及びニッカーゼ活性が欠如しているＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤又はｄＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、あるバージョンのＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上記に述べたＣａｓヌクレアーゼ）であって、そのヌクレオチド鎖切断活性部位（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）が例えばその触媒ドメインにおける１又は複数の変化（例えば、点変異）によって不活性化されているバージョンのＣａｓヌクレアーゼである。例えば、米国出願公開第２０１４／０１８６９５８Ａ１号；米国出願公開第２０１５／０１６６９８０Ａ１号を参照されたい。
【０１４６】
一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１又は複数の異種機能性ドメイン（例えば、融合ポリペプチドであるか又は融合ポリペプチドを含む）を含む。
【０１４７】
一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の、細胞の核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能性ドメインは、核移行シグナル（ＮＬＳ）であり得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１〜１０個のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１〜５個のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合し得る。１個のＮＬＳを用いる場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤配列のＮ末端又はＣ末端において連結することができる。また、それはＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤配列内に挿入することもできる。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１以上のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、２、３、４又は５個のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合し得る。一定の状況においては、２個のＮＬＳは、同一であってもよく（例えば、２個のＳＶ４０  ＮＬＳ）、又は異なっていてもよい。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端に連結した２個のＳＶ４０  ＮＬＳ配列と融合する。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、１個がＮ末端に連結して１個がＣ末端に連結する２個のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合し得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳと融合していなくてもよい。一部の実施形態においては、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）又はＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）等である、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）の配列であり得る。一部の実施形態においては、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）等である、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）の配列であり得る。ある実施形態においては、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）のＮＬＳは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤のＣ末端において連結することができる。１又は複数のリンカーが、融合部位において含まれていてもよい。
【０１４８】
一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の、細胞内半減期を改変することが可能であり得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の半減期を、長くすることができる。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の半減期を、短くすることができる。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の安定性を増加させることが可能であり得る。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤の安定性を低下させることが可能であり得る。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用し得る。一部の実施形態においては、タンパク質分解は、例えばプロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、又はカルパインプロテアーゼ等であるタンパク質分解性酵素が介在し得る。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインが、ＰＥＳＴ配列を含み得る。一部の実施形態においては、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、ユビキチン又はポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。一部の実施形態においては、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であり得る。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン活性化遺伝子−１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子−１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞により発現される発達的に下方制御されたタンパク質８（ＮＥＤＤ８（ｎｅｕｒｏｎａｌ−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｃｅｌｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−８）、Ｓ．セレビシエにおけるＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（ＦＡＴ１０）、オートファジー−８（ＡＴＧ８）及び−１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子−１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質−５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
【０１４９】
一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、マーカードメインであり得る。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。一部の実施形態においては、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ）、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシシアン）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、クサビラオレンジ、単量体クサビラオレンジ（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）又はその他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態においては、マーカードメインは、精製タグ及び／又はエピトープタグであり得る。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、又は蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１５０】
さらなる実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を、特定のオルガネラ、細胞型、又は器官へと方向付けるようにできる。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤を、ミトコンドリアへと方向付けるようにできる。
【０１５１】
さらなる実施形態においては、異種機能性ドメインは、エフェクタードメインであり得る。ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤がその標的配列へと方向付けられると、例えばＣａｓヌクレアーゼがｇＲＮＡによって標的配列へと方向付けられると、エフェクタードメインは、標的配列を修飾又は標的配列に影響を及ぼすことができる。一部の実施形態においては、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、後成的修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、又は転写抑制因子ドメインから選択され得る。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼ等のヌクレアーゼである。例えば米国特許第９，０２３，６４９号を参照されたい。一部の実施形態においては、異種機能性ドメインは、転写活性因子又は転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−８３（２０１３）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ，”  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：９７３−６（２０１３）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３−８（２０１３）；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”  Ｃｅｌｌ  １５４：４４２−５１（２０１３）を参照されたい。このように、ＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤は、実質的に、ガイドＲＮＡを用いて所望の標的配列に結合するように方向付けることが可能である転写因子になる。
Ｅ．ｇＲＮＡの効力の決定
【０１５２】
一部の実施形態においては、ＲＮＰを形成する他の成分と共に送達される又は発現されるときの、ｇＲＮＡの効力が決定される。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ９であるＣａｓタンパク質等であるＲＮＡガイド型のＤＮＡ結合剤と共に発現する。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼであるＣａｓヌクレアーゼ又はニッカーゼ等のＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼを既に安定に発現している細胞株に送達される又は当該細胞株において発現される。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼであるＣａｓヌクレアーゼ又はニッカーゼ等のＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡに加えて細胞に送達される。
【０１５３】
本明細書に記載するように、本明細書に開示するＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを使用することにより、細胞機構による修復に対する挿入／欠失（インデル）変異の形態で、エラーを生じる可能性があるＤＮＡにおいて二本鎖切断を招くことが可能である。インデルに起因する多数の変異が、リーディングフレームを変更する又は未熟な停止コドンを導入するので、非機能性タンパク質が産生される。
【０１５４】
一部の実施形態においては、特定のｇＲＮＡの効力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに基づいて決定する。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞である（ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９）。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ＨＵＨ７ヒト肝細胞がん細胞である。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ＨｅｐＧ２細胞である。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、初代ヒト肝細胞である。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、初代カニクイザル肝細胞である。初代ヒト肝細胞を用いることに関して、市販の初代ヒト肝細胞を用いて、実験間でより高い一貫性を提供することが可能である。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて（例えば、初代ヒト肝細胞において）欠失又は挿入が生じるオフターゲット部位の数を、例えばＣａｓ９  ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質移入した初代ヒト肝細胞からのゲノムＤＮＡを解析することによって、決定する。一部の実施形態においては、当該決定は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びドナーオリゴヌクレオチドによりインビトロで形質移入した初代ヒト肝細胞からのゲノムＤＮＡを解析することを含む。当該決定のための例示的な手順は、以下の実施例において提供する。
【０１５５】
一部の実施形態においては、特定のｇＲＮＡの効力は、ｇＲＮＡ選択工程のための複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞モデルの全体にわたって決定する。一部の実施形態においては、選択されたｇＲＮＡと細胞株をデータ比較する。一部の実施形態においては、複数の細胞モデルのデータスクリーニングを行う。
【０１５６】
一部の実施形態においては、特定のｇＲＮＡの効力は、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルに基づいて決定する。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルはげっ歯類モデルである。一部の実施形態においては、げっ歯類モデルは、ＬＤＨＡ遺伝子を発現するマウスである。一部の実施形態においては、げっ歯類モデルは、ヒトＬＤＨＡ遺伝子を発現するマウスである。一部の実施形態においては、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、例えばカニクイザルである、非ヒト霊長類である。
【０１５７】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡの効力は、ＬＤＨＡの編集率によって測定する。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡの編集率を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの場合には全細胞可溶化物からの又はｉｎ  ｖｉｖｏモデルの場合には細胞中の、ＬＤＨＡタンパク質のノックダウンを達成するのに必要な編集率と比較する。
【０１５８】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡの効力は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルの数及び／又は頻度によって測定する。一部の実施形態においては、細胞集団において及び／又は標的部位におけるインデル生成の頻度と比較して、非常に低い頻度（例えば、＜５％）でオフターゲット部位においてインデルを産生する、有効なガイドＲＮＡを提供する。したがって、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）におけるオフターゲットインデルの形成を呈しない、又は細胞集団及び／もしくは標的部位におけるインデル生成の頻度と比較して、＜５％のオフターゲットインデル形成の頻度を生じる、ガイドＲＮＡを提供する。一部の実施形態においては、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）における任意のオフターゲットインデル形成を呈しないガイドＲＮＡを提供する。一部の実施形態においては、例えば本明細書において記載する１又は複数の方法によって評価される場合に、５未満のオフターゲット部位においてインデルを産生するガイドＲＮＡを提供する。一部の実施形態においては、例えば本明細書において記載する１又は複数の方法によって評価される場合に、４、３、２又は１以下のオフターゲット部位においてインデルを産生するガイドＲＮＡを提供する。一部の実施形態においては、オフターゲット部位は、標的細胞（例えば、肝細胞）ゲノムにおけるタンパク質コード領域で発生しない。
【０１５９】
一部の実施形態においては、標的ＤＮＡにおける挿入／欠失（「インデル」）変異の形成及び相同組換え修復（ＨＤＲ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ））事象等である、遺伝子編集事象の検出は、タグをつけたプライマーによる線形増幅（ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と、タグをつけた増幅産物を単離すること（本明細書においては、以下「ＬＡＭ−ＰＣＲ」又は「線形増幅（ＬＡ（Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））」法と呼ぶ）とを利用する。
【０１６０】
一部の実施形態においては、例えば血清、血漿、血液又は尿である体液等の試料中のグリコール酸塩のレベル及び／又はシュウ酸塩のレベルを測定することによって、ガイドＲＮＡの効力を測定する。一部の実施形態においては、血清もしくは血漿中のグリコール酸塩のレベル、及び／又は尿中のシュウ酸塩のレベルを測定することによって、ガイドＲＮＡの効力を測定する。血清もしくは血漿中のグリコール酸塩のレベルの増加及び／又は尿中のシュウ酸塩のレベル低下が、有効なガイドＲＮＡの指標である。一部の実施形態においては、尿中シュウ酸塩が、０．７ｍｍｏｌ／２４時間／１．７３ｍ２より下に減少する。一部の実施形態においては、細胞培地又は血清もしくは血漿を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のアッセイで、グリコール酸塩及びシュウ酸塩のレベルを測定する。一部の実施形態においては、グリコール酸塩及びシュウ酸塩のレベルを、編集を測定するために用いる同一のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの系又はモデルで測定する。一部の実施形態においては、グリコール酸塩及びシュウ酸塩のレベルは、例えば初代ヒト肝細胞である細胞中で測定する。一部の実施形態においては、グリコール酸塩及びシュウ酸塩のレベルは、ＨＵＨ７細胞中で測定する。一部の実施形態においては、グリコール酸塩及びシュウ酸塩のレベルは、ＨｅｐＧ２細胞中で測定する。
ＩＩＩ．治療法
【０１６１】
本明細書に開示するｇＲＮＡ及び関連の方法及び組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発してＬＤＨＡ遺伝子の発現を低下させるのに有用である。本明細書に開示するｇＲＮＡ及び関連の方法及び組成物は、高シュウ酸尿症を治療及び予防して、高シュウ酸尿症の症状を予防するのに有用である。一部の実施形態においては、本明細書に開示するｇＲＮＡは、シュウ酸カルシウム産生、器官におけるシュウ酸カルシウム沈着、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２及びＰＨ３）、全身性シュウ酸症を含めたシュウ酸症及び血尿を治療及び予防するのに有用である。一部の実施形態においては、本明細書に開示するｇＲＮＡは、腎臓又は肝臓の移植の必要性を遅延又は改善するのに有用である。一部の実施形態においては、本明細書に開示するｇＲＮＡは、末期の腎疾患（ＥＳＲＤ）を予防するのに有用である。本明細書に開示するｇＲＮＡの投与により、尿中に排出されるシュウ酸塩がより少なくなるように血清又は血漿のグリコール酸塩が増加してシュウ酸塩の産生又は蓄積が減少することとなる。したがって、一態様においては、治療／予防の有効性は、血清又は血漿のグリコール酸塩を測定することによって評価することができ、グリコール酸塩レベルの増加が有効性を示唆するものである。一部の実施形態においては、治療／予防の有効性は、尿中シュウ酸塩等の試料中のシュウ酸塩を測定することによって評価することができ、尿中シュウ酸塩の減少が、有効性を示唆するものである。
【０１６２】
健常な対象の尿中の正常な１日当たりのシュウ酸塩排出量は、約４５ｍｇ未満であるが、２４時間当たり約４５ｍｇを超える濃度は、臨床的高シュウ酸尿症であるとみなされる（例えば、Ｂｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０１５  Ｍａｙ  ６；４（２）：２３５−２４４；及びＣｏｃｈａｔ  Ｐ．，Ｒｕｍｓｂｙ  Ｇ．（２０１３）．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：６４９−６５８を参照のこと）。したがって、一部の実施形態においては、本明細書において開示するｇＲＮＡ及び組成物の投与は、もはや対象が臨床的高シュウ酸尿症と関連した尿中シュウ酸塩レベルを呈しないように、シュウ酸塩レベルを低下させるのに有用である。一部の実施形態においては、本明細書に開示するｇＲＮＡ及び組成物の投与により、２４時間当たり約４５又は４０ｍｇ未満まで対象の尿中シュウ酸塩が減少する。一部の実施形態においては、本明細書に開示するｇＲＮＡ及び組成物の投与により、２４時間当たり約３５ｍｇ未満、約３０ｍｇ未満、約２５ｍｇ未満、約２０ｍｇ未満、約１５ｍｇ未満、又は約１０ｍｇ未満まで対象の尿中シュウ酸塩が減少する。
【０１６３】
一部の実施形態においては、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤のうちのいずれか１又は複数は、対象における疾患又は障害を治療又は予防するための医薬を調製する際に用いるためのものである。一部の実施形態においては、治療及び／又は予防は、医薬／組成物の、例えば一回での投与である単回用量で達成される。一部の実施形態においては、疾患又は障害は、高シュウ酸尿症である。
【０１６４】
一部の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤のうちのいずれか１又は複数を投与することを含む、対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法を含む。一部の実施形態においては、疾患又は障害は、高シュウ酸尿症である。一部の実施形態においては、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤は、例えば１回での、単回用量として投与される。一部の実施形態においては、単回用量により、永続的な治療及び／又は予防を達成する。一部の実施形態においては、当該方法は、永続的な治療及び／又は予防を達成する。本明細書において用いる場合、永続的な治療及び／または予防は、少なくともｉ）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５週；ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０又は３６ヶ月；又はｉｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年に及ぶ治療及び／又は予防を含む。一部の実施形態においては、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤の単回用量は、対象の寿命の持続に関して本明細書に記載する兆候のいずれかを治療又は予防するのに十分である。
【０１６５】
一部の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤のうちのいずれか１又は複数を投与又は送達することを含む、標的ＤＮＡを修飾する（例えば、二本鎖切断を生じる）方法又はその使用を含む。一部の実施形態においては、標的ＤＮＡはＬＤＨＡ遺伝子である。一部の実施形態においては、標的ＤＮＡはＬＤＨＡ遺伝子のエキソン内にある。一部の実施形態においては、標的ＤＮＡはＬＤＨＡ遺伝子のエキソン１、２、３、４、５、６、７、又は８内にある。
【０１６６】
一部の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載するｇＲＮＡ、組成物又は医薬製剤のうちのいずれか１又は複数を投与又は送達することを含む、標的遺伝子を修飾する方法又はその使用を含む。一部の実施形態においては、修飾はＬＤＨＡ標的遺伝子を編集することである。一部の実施形態においては、修飾はＬＤＨＡ標的遺伝子でコードしたタンパク質の発現が変化することである。
【０１６７】
一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果として遺伝子編集をもたらす。一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果として標的ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断をもたらす。一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果として、ＤＳＢの非相同性末端結合の間にインデル変異の形成をもたらす。一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果として、標的ＬＤＨＡ遺伝子におけるヌクレオチドの挿入又は欠失をもたらす。一部の実施形態においては、標的ＬＤＨＡ遺伝子におけるヌクレオチドの挿入又は欠失が、結果として非機能性タンパク質をもたらすフレームシフト変異又は未熟な停止コドンを導く。一部の実施形態においては、標的ＬＤＨＡ遺伝子におけるヌクレオチドの挿入又は欠失が、標的遺伝子発現のノックダウン又は除去を導く。一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、ＤＳＢの相同組換え修復を含む。
【０１６８】
一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果としてＬＤＨＡ遺伝子修飾をもたらす。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ遺伝子修飾は、遺伝子発現の低下である。一部の実施形態においては、当該方法又は使用は、結果として、標的遺伝子によってコードしたタンパク質の発現の低下をもたらす。
【０１６９】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のいずれか１もしくは複数のガイド配列、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、ＬＤＨＡ遺伝子内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する方法を提供する。一部の実施形態においては、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡを投与して、ＬＤＨＡ遺伝子においてＤＳＢを誘発する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、又はＣａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７０】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、ＬＤＨＡ遺伝子を修飾する方法を提供する。一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むｇＲＮＡを投与して、ＬＤＨＡ遺伝子を修飾する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７１】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、高シュウ酸尿症を治療又は予防する方法を提供する。一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むｇＲＮＡを投与して、高シュウ酸尿症を治療又は予防する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。一部の実施形態においては、高シュウ酸尿症は、原発性高シュウ酸尿症である。一部の実施形態においては、原発性高シュウ酸尿症は、１型（ＰＨ１）、２型（ＰＨ２）又は３型（ＰＨ３）である。一部の実施形態においては、高シュウ酸尿症は、突発性のものである。
【０１７２】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、シュウ酸カルシウムの産生及び／又は沈着を減少させる又は除去する方法を提供する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７３】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、ＰＨ１、ＰＨ２又はＰＨ３を含む原発性高シュウ酸尿症を治療又は予防する方法を提供する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７４】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症を治療又は予防する方法を提供する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７５】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、血尿を治療又は予防する方法を提供する。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７６】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むｇＲＮＡを投与して、尿中のシュウ酸塩レベルを減少させる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７７】
一部の実施形態においては、配列番号１〜８４及び１００〜１９２のガイド配列のいずれか１もしくは複数、又は配列番号１００１、１００５、１００７、１００８、１０１４、１０２３、１０２７、１０３２、１０４５、１０４８、１０６３、１０６７、１０６９、１０７１、１０７４、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９及び１０８１のｓｇＲＮＡもしくは例えば配列番号２００１、２００５、２００７、２００８、２０１４、２０２３、２０２７、２０３２、２０４５、２０４８、２０６３、２０６７、２０６９、２０７１、２０７４、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９及び２０８１において示すようなその修飾バージョンのいずれか１もしくは複数、を含むｇＲＮＡを投与して、血清又は血漿中の血清グリコール酸塩レベルを増加させる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼ等（例えば、Ｃａｓ９）であるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与してもよい。
【０１７８】
一部の実施形態においては、Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼと共に表１のガイド配列を含むｇＲＮＡがＤＳＢを誘発し、また修復中の非相同性末端連結（ＮＨＥＪ）が、ＬＤＨＡ遺伝子において変異を導く。一部の実施形態においては、ＮＨＥＪは、ＬＤＨＡ遺伝子におけるフレームシフト又はナンセンス変異を誘発する、ヌクレオチドの挿入又は欠失を導く。
【０１７９】
一部の実施形態においては、本発明のガイドＲＮＡ（例えば本明細書で提供する組成物中の）を投与することにより、対象におけるグリコール酸塩のレベル（例えば、血清レベル又は血漿レベル）が増加するので、シュウ酸塩の蓄積を予防する。
【０１８０】
一部の実施形態においては、血清グリコール酸塩が増加することで、結果的に尿中シュウ酸塩の減少がもたらされる。一部の実施形態においては、尿中シュウ酸塩の減少が、シュウ酸カルシウムの形成及び器官における沈着を減少させる又は除去する。
【０１８１】
一部の実施形態においては、対象は哺乳類である。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚又は家禽である。
【０１８２】
一部の実施形態においては、表１のガイド配列のいずれか１もしくは複数又は表２の１もしくは複数のｓｇＲＮＡを含むガイドＲＮＡの使用（例えば、本明細書で提供する組成物中の）は、高シュウ酸尿症を患うヒト対象を治療する医薬の調製のために提供する。
【０１８３】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡ、組成物及び製剤は、静脈内に投与する。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡ、組成物及び製剤は、肝循環内に投与する。
【０１８４】
一部の実施形態においては、本明細書で提供するガイドＲＮＡを含む組成物の単回投与は、変異タンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。他の実施形態においては、本明細書で提供するガイドＲＮＡを含む組成物の複数回の投与は、治療効果を最大化するのに有利であり得る。
【０１８５】
一部の実施形態においては、治療により、高シュウ酸尿症の進行が遅くなるか又は停止する。
【０１８６】
一部の実施形態においては、治療により、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の進行が遅くなるか又は停止する。一部の実施形態においては、治療により、腎臓及び／又は肝臓の移植の必要性を遅くさせるか又は停止させる。一部の実施形態においては、治療により、高シュウ酸尿症の症状の改善、安定化、又は変化の遅延を結果としてもたらす。
Ａ．併用療法
【０１８７】
一部の実施形態においては、本発明は、上記に記載するような高シュウ酸尿症及びその症状を緩和するのに好適なさらなる療法と共に、表１に開示するガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供する組成物中に）を含む併用療法を含む。
【０１８８】
一部の実施形態においては、高シュウ酸尿症のさらなる療法は、ビタミンＢ６、水分補給、腎透析又は肝臓もしくは腎臓の移植である。一部の実施形態においては、さらなる療法は、例えばＬＤＨＡ遺伝子へと方向付けられたｓｉＲＮＡ等である、ＬＤＨＡ遺伝子を破壊する別の薬剤である。一部の実施形態においては、ＬＤＨＡ遺伝子へと方向付けられたｓｉＲＮＡは、ＤＣＲ−ＰＨＸＣである。一部の実施形態においては、高シュウ酸尿症がＰＨ１を原因とする場合等に、さらなる療法は、例えばＨＡＯ１遺伝子へと方向付けられたｓｉＲＮＡ等である、ＨＡＯ１遺伝子を破壊する薬剤である。一部の実施形態においては、ＨＡＯ１  ｓｉＲＮＡは、ｌｕｍａｓｉｒａｎ（ＡＬＮ−ＧＯ１；アルナイラム社（Ａｌｎｙｌａｍ））である。
【０１８９】
一部の実施形態においては、併用療法は、ＨＡＯ１又はＬＤＨＡを標的とするｓｉＲＮＡと共に、表１に開示するガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡのいずれか１つを含む。一部の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、ＬＤＨＡの発現をさらに低下又は除去することが可能である任意のｓｉＲＮＡである。一部の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、表１に開示するガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡ（例えば、本明細書で提供する組成物中）のいずれか１つの後に投与される。一部の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、本明細書で提供するｇＲＮＡ組成物のいずれかによる治療の後で、定期的に投与する。
【０１９０】
一部の実施形態においては、併用療法は、ＬＤＨＡを標的とするアンチセンスヌクレオチドと共に、表１に開示するガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡ（例えば、本明細書で提供する組成物中）のいずれか１つを含む。一部の実施形態においては、アンチセンスヌクレオチドは、ＬＤＨＡの発現をさらに低下又は除去することが可能である任意のアンチセンスヌクレオチドである。一部の実施形態においては、アンチセンスヌクレオチドは、表１に開示するガイド配列のいずれか１又は複数を含むｇＲＮＡ（例えば、本明細書で提供する組成物中）のいずれか１つの後に投与される。一部の実施形態においては、アンチセンスヌクレオチドは、本明細書で提供するｇＲＮＡ組成物のいずれかによる治療の後で、定期的に投与する。
Ｂ．ｇＲＮＡ組成物の送達
【０１９１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｒｇｏ）の送達のための周知の手段であり、また本明細書に開示するガイドＲＮＡ、組成物又は医薬製剤の送達に用いられ得る。一部の実施形態においては、ＬＮＰは、核酸を、タンパク質を、又はタンパク質と共に核酸を送達する。
【０１９２】
一部の実施形態においては、本発明は、対象に対して本明細書に開示するｇＲＮＡのいずれか１つを送達する方法を含むものであり、当該ｇＲＮＡは、ＬＮＰと結合する。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９と、又はＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと結合する。
【０１９３】
一部の実施形態においては、本発明は、開示のｇＲＮＡのいずれか１つとＬＮＰとを含む組成物を含む。一部の実施形態においては、組成物は、Ｃａｓ９又はＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
【０１９４】
一部の実施形態においては、ＬＮＰは陽イオン性脂質を含む。一部の実施形態においては、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル  オクタデカ−９，１２−ジエノアートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアート）とも呼ばれるもの、又は別のイオン性脂質を含む。例えば、国際公開第２０１７／１７３０５４号及びそれに記載の参考文献の脂質を参照されたい。一部の実施形態においては、ＬＮＰは、陽イオン性脂質アミンのＲＮＡリン酸塩に対するモル比（Ｎ：Ｐ）が、約４．５、５．０、５．５、６．０又は６．５である。一部の実施形態においては、ＬＮＰ脂質の文脈における陽イオン性及びイオン性の語は、交換可能であり、例えば、イオン性脂質はｐＨにより陽イオン性である。
【０１９５】
一部の実施形態においては、本明細書で開示するｇＲＮＡと結合するＬＮＰは、疾患又は障害を治療するための医薬を調製する際に用いる。
【０１９６】
電気穿孔法は、カーゴの送達のための周知の手段であり、また任意の電気穿孔法は、本明細書に開示するｇＲＮＡのいずれか１つの送達に用いられ得る。一部の実施形態においては、電気穿孔法は、本明細書に開示するｇＲＮＡのいずれか１つと、Ｃａｓ９又はＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとを送達するために用いられ得る。
【０１９７】
一部の実施形態においては、本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞に対して本明細書に開示するｇＲＮＡのいずれか１つを送達する方法を含むものであり、当該ｇＲＮＡは、ＬＮＰと結合するか、又はＬＮＰと結合しない。一部の実施形態においては、ｇＲＮＡ／ＬＮＰ又はｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９と、又はＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと結合する。
【０１９８】
一部の実施形態においては、本明細書に記載するガイドＲＮＡ組成物は、単独で又は１もしくは複数のベクター上にコードされて、脂質ナノ粒子中で製剤化されるか又は脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、２０１７年３月３０日出願で２０１７年５月１０日に公開された、発明の名称が「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分のための脂質ナノ粒子製剤（ＬＩＰＩＤ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）」である国際公開第２０１７／１７３０５４号であって、その内容がその全体として参照により本明細書に援用される、当該公報を参照されたい。
【０１９９】
ある実施形態においては、本発明は、本明細書に記載するガイド配列のいずれか１又は複数を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのベクターを含む。一部の実施形態においては、ベクターは、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸は、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼとすることが可能である、ＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードする、プロモーター、エンハンサー、制御配列、及び核酸を含むがこれに限定されない。一部の実施形態においては、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１又は複数のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、ベクターは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１等であるＣａｓヌクレアーゼとすることが可能である、ＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡをコードする１又は複数のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、ベクターは、Ｃａｓ９等であるＣａｓタンパク質とすることが可能である、ＲＮＡガイド型のＤＮＡヌクレアーゼをコードするｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ及びｍＲＮＡをコードする１又は複数のヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、Ｃａｓ９は、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（すなわち、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９）由来である。一部の実施形態においては、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の反復配列のうちの全て又は一部が隣接するガイド配列を含む又は当該ガイド配列からなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含む又はｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡからなる核酸は、ベクター配列であってｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に天然に存在しない核酸を含む又は当該核酸からなるベクター配列をさらに含み得る。
【０２００】
この明細書及び例示的な実施形態は、限定として捉えるべきでない。本明細書及び添付の特許請求の範囲のために、別段に示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いる量、割合又は比率を表す全ての数字及び他の数値は、それらが「約」の語でそのように修飾されていない範囲に対して、「約」の語で全ての例を修飾しているものとして理解されるべきである。したがって、反対のことが示されていない限り、以下の記載及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、獲得しようと模索する所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告した有効数字の数に照らして、そして通常の切り上げ技術を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【０２０１】
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び任意の文言の任意の単数形の使用は、単数であることに明示的且つ明瞭に限定されていない限り、複数形を含む。本明細書で用いる場合「含む」及びその文法上の変形である語は、非限定的であることを意図しているものであるため、列記の中の項目の記載は、列記した項目に代える又は追加することが可能である他の同様の項目を除外しない。
【実施例】
【０２０２】
以下の実施例は、一定の開示された実施形態を説明するために提供するものであり、決してこの開示の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【０２０３】
実施例１−材料及び方法
【０２０４】
ヌクレアーゼｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
【０２０５】
Ｎ１−メチルプソイド−Ｕを含有するキャッピング及びポリアデニル化した化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（「Ｓｐｙ」）のＣａｓ９  ｍＲＮＡを、直線化プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成した。Ｔ７プロモーターと転写のための配列（本明細書に記載するｍＲＮＡを含むｍＲＮＡを産生するため（例示的なＯＲＦに関する以下の表２４の配列番号５０１〜５１５を参照）とを含有するプラスミドＤＮＡを、３７℃でインキュベートして直線化し、以下の条件でのＸｂａＩによる消化を完了した：２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ社）及び１倍反応緩衝液。ＸｂａＩは、６５℃で２０分間反応を加熱することによって失活させた。直線化したプラスミドは、シリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて酵素及び緩衝塩から精製し、アガロースゲルで分析して直線化を確認した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件下で４時間３７℃でインキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直線化プラスミド；各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＮ１−メチルプソイド−ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）；１０ｍＭのＡＲＣＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）；５Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ社）；０．００４Ｕ／μＬの無機大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ピロホスファターゼ（ＮＥＢ社）；及び、１倍反応緩衝液。４時間のインキュベーション後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を最終濃度０．０１Ｕ／μＬまで加えて、反応液をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡ鋳型を除去した。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを、ＭｅｇａＣｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを用いて、メーカーのプロトコールに従って（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、酵素及びヌクレオチドから精製した。あるいは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿法によって精製したが、これは一部の場合においては、その後に接線流ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によるさらなる精製を続けた。２６０ｎｍにおける吸光度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を測定することによって転写濃度を決定し、転写をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）によるキャピラリー電気泳動法によって解析した。
【０２０６】
この実施例において用いるＣａｓ９  ｍＲＮＡの転写のための配列は、表２４に示す配列番号５０１〜５１５より選択される配列を含んだ。
【０２０７】
【表５】
2022502055.tif 000031
2022502055.tif 000032
2022502055.tif 000033
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【０２０８】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤
【０２０９】
概して、脂質ナノ粒子成分を、種々のモル比で１００％エタノール中に溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を、２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０中に溶解して、結果的におよそ０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度にした。実施例２〜４で用いるＬＮＰは、イオン性脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル  オクタデカ−９，１２−ジエノアートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアート）とも呼ばれる）、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含有した。ＬＮＰは、脂質アミンのＲＮＡリン酸塩に対する（Ｎ：Ｐ）モル比を約６、かつｇＲＮＡのｍＲＮＡに対する重量比を１：１として製剤化した。
【０２１０】
ＬＮＰは、ＲＮＡ溶液２容及び水１容と共にエタノール中の当該脂質の衝突ジェット混合を利用したクロスフロー技術を用いて調製した。エタノール中の脂質を、ＲＮＡ溶液２容との混合用クロス（ｍｉｘｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ）を通して混合した。水の第４の流れを、ライン内Ｔ字管を通るクロスの出力流れと混合させた（国際公開第２０１６０１０８４０号、図２を参照）。ＬＮＰを、室温で１時間そのまま保持し、水でさらに希釈した（およそ１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ）でタンジェンシャルフロー・フィルトレーションを用いて濃縮し、次いで緩衝液を、ＰＤ−１０脱塩用カラム（ＧＥ社）を用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。次いで、得られた混合物を、０．２μｍの細菌ろ過器を用いてろ過した。最終的なＬＮＰは、４℃で又はさらに使用するまで−８０℃で保存した。
【０２１１】
ヒトＬＤＨＡガイド設計、及びカニクイザル相同ガイド設計を伴うヒトＬＤＨＡ
【０２１２】
ヒトリファレンスゲノム（例えば、ｈｇ３８）と、関心の領域内のＰＡＭを同定するためにユーザが定めた関心のゲノム領域（例えば、ＬＤＨＡタンパク質コードエキソン）とを用いて、インシリコで、最初のガイド選択を実施した。同定されたＰＡＭごとに、解析を行って、統計が報告された。ｇＲＮＡ分子を、当技術で公知のいくつかの基準（例えば、ＧＣ含量、予測されたオンターゲット活性、及び潜在的なオフターゲット活性）に基づいてさらに選択して、順位付けて並べた。
【０２１３】
タンパク質エキソンコード領域を標的とする、ヒトＬＤＨＡ（ＥＮＳＧ０００００１３４３３３）に対する、合計８４個のガイドＲＮＡを設計した。ガイド及び相当するゲノムの組み合わせを、上記に提供している（表１）。ガイドＲＮＡのうち４０個が、カニクイザルＬＤＨＡと１００％相同性を有する。
【０２１４】
デノボのカニクイザルマカクＬＤＨＡ転写物に対して、さらなるガイドを設計した。メスのモーリシャス産カニクイザルマカクの肝臓試料についての公開されているトランスクリプトーム配列決定から生データを取得した（ＮＣＢＩ  ＳＲＡ  ＩＤ：ＳＲＲ１７５８９５６；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４３，Ｉｓｓｕｅ  Ｄ１，Ｐａｇｅｓ  Ｄ７３７−Ｄ７４２）。Ｔｒｉｎｉｔｙ（ｖ２．８．４；Ｇｒａｂｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９：６４４−６５２）とＳＰＡｄｅｓ（ｖ３．１３．０；Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９：５）を用いて、デノボのトランスクリプトームアセンブリを実行した。いずれの方法も、ＬＤＨＡ転写物を構築することができるが、当該転写物は、それらの配列をＢＬＡＳＴを用いてＬＤＨＡタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ９ＢＥ２４）と比較することによって同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５：３，４０３−４１０）。Ｃａｓ９（ｍＲＮＡ／タンパク質）及びガイドＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの送達
【０２１５】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｇｉｂｃｏ社、ロット番号Ｈｕ８２９８又はＨｕ８２９６）と初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）（Ｇｉｂｃｏ社、ロット番号Ｃｙ３６７又はＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＡＤＭＥＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社  ロット番号１０２８１０１１）とを解凍して、補助剤を含む肝細胞解凍培地（ｔｈａｗｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号ＣＭ７５００）中で再懸濁させて、その後に遠心分離を続けた。上清を除いて、そしてペレット状の細胞を、補助剤パックを合わせた肝細胞プレート培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ａ１２１７６０１及びＣＭ３０００）中で再懸濁させた。細胞を計数して、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、及びＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ−ｃｏａｔコラーゲンＩを被覆した９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、カタログ番号８７７２７２）上に蒔いた。蒔いた細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気下で、細胞培養インキュベーター内で５時間、定着及び付着させるようにした。インキュベート後、細胞は、単層形成を確認して、肝細胞培地（Ｔａｋａｒａ社、カタログ番号Ｙ２００２０ならびに／又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ａ１２１７６０１及びＣＭ４０００）で一度洗浄した。
【０２１６】
ｄｇＲＮＡを利用する試験のために、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをそれぞれ、等量の薬剤を混合すること及び９５℃で２分間インキュベートして室温まで冷却することによって、予めアニーリングした。予めアニーリングしたｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡからなるデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）を、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質とともにインキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。細胞を、メーカーのプロトコールに従って、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、カタログ番号１３７７８１５０）で形質移入した。細胞を、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９（１０ｎＭ）、各ガイド（１０ｎＭ）、トレーサーＲＮＡ（１０ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（１．０μＬ／ウェル）及びＯｐｔｉＭｅｍを含有するＲＮＰで形質移入した。
【０２１７】
ｓｇＲＮＡを利用する試験のために、ガイドを、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質と共にインキュベートし、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。ＲＮＰ形質移入を利用する試験においては、細胞を、メーカーのプロトコールに従って、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、カタログ番号１３７７８１５０）で形質移入した。細胞を、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９（１０ｎＭ）、ｓｇＲＮＡ（１０ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（１．０μＬ／ウェル）及びＯｐｔｉＭｅｍを含有するＲＮＰで形質移入した。電気穿孔法を利用する試験においては、細胞に対して、Ｌｏｎｚａ社の４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅユニット（カタログ番号ＡＡＦ−１００２Ｘ）、９６ウェルシャトルデバイス（カタログ番号ＡＡＭ  １００１５）及びＰ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌキット（カタログ番号Ｖ４ＸＰ−３９６０）を利用して、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９（２ｕＭ）及びｓｇＲＮＡ（４ｕＭ）を含有するＲＮＰを用いて電気穿孔を行った。
【０２１８】
初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル（ｃｙｎｏ）肝細胞をまた、以下にさらに記載するようにＬＮＰで処置した。細胞を、ＬＮＰによる処置の前に、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰを、３％カニクイザル血清を含有する培地中で３７℃、１０分間インキュベートして、そして本明細書でさらに提供する量で細胞に施与した。
【０２１９】
脂質成分を、５０％のリピドＡ、９％のＤＳＰＣ、３８％のコレステロール及び３％のＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧのモル比で１００％エタノール中で再構成したものである予め混合した脂質製剤を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのリポフェクションで用いた。次いで脂質混合物を、脂質アミンのＲＮＡリン酸塩に対する（Ｎ：Ｐ）モル比を約６．０として、ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）と混合した。６％カニクイザル血清で、及びｇＲＮＡのｍＲＮＡに対する重量比１：１で、リポフェクションを行った。
【０２２０】
ゲノムＤＮＡの単離
【０２２１】
ＰＨＨ及びＰＣＨのトランスフェクト細胞を、形質移入後７２時間又は９６時間で集めた。メーカーのプロトコールに従って、５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃａｌＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を用いて、９６ウェルプレートの各ウェルからｇＤＮＡを抽出した。本明細書に記載するように、全てのＤＮＡサンプルをＰＣＲにかけて、次いでＮＧＳ解析をした。
【０２２２】
次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の解析
【０２２３】
ゲノムにおける標的位置での編集効率を定量的に決定するために、ディープシーケンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失の存在を特定した。関心の遺伝子（例えば、ＬＤＨＡ）内の標的部位周囲でＰＣＲプライマーを設計して、関心のゲノム領域を増幅した。プライマー配列設計は、当該分野の標準であるようになされた。
【０２２４】
メーカーのプロトコール（イルミナ社）に従ってさらなるＰＣＲを行い、配列決定のために化学的性質を加えた。イルミナ社ＭｉＳｅｑ機器で、単位複製配列を配列決定した。品質スコアが低いものを除外してから、参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対してリードをアラインした。リードを含有する得られたファイルを、参照ゲノムに対してマッピングしたが（ＢＡＭファイル）、当該ファイルでは、関心の標的領域と重複したリードを選択して、挿入又は欠失（「インデル」）を含有するリード数に対する野生型のリード数を算出した。
【０２２５】
編集率（例えば、「編集効率」又は「編集率」）を、野生型を含めた配列のリードの総数に対する、挿入又は欠失（「インデル」）を含む配列のリードの総数として規定する。
【０２２６】
ウエスタンブロットによる乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）タンパク質解析
【０２２７】
初代ヒト肝細胞を、実施例３にさらに記載するように、表１からの選択ガイドと共に製剤化されたＬＮＰで処置した。ＬＮＰは、３％カニクイザル血清を含有する培地（Ｔａｋａｒａ社、カタログ番号Ｙ２００２０）中で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＬＮＰをヒト肝細胞に加えた。形質移入２１日後、培地を除去して、細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号１１６９７４９８００１）、１ｍＭのＤＴＴ及び２５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号７１２０６−３）からなる新たに加えたプロテアーゼ阻害剤混合物を合わせた、５０μＬ／ウェルのＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カタログ番号ＢＰ−１１５）で溶解した。細胞を氷上で３０分間維持し、その時にＮａＣｌ（最終濃度１Ｍ）を加えた。細胞可溶化物を完全に混合して、氷上で３０分間保持した。全細胞抽出物（「ＷＣＥ」）をＰＣＲプレートに移して、そして遠心分離によりデブリをペレットにした。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０００１）を用いて、可溶化物のタンパク質含量を評価した。ブラッドフォードアッセイ手順は、メーカーのプロトコールに従って完了させた。抽出物を使用まで−２０℃で保存した。
【０２２８】
ＡＧＴ欠損マウスを、実施例４にさらに記載するような選択ガイドと共に製剤化したＬＮＰで処置した。処置後のマウスから肝臓を採取して、６０ｍｇ分をタンパク質抽出のために用いた。試料をＢｅａｄ  Ｔｕｂｅ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、カタログ番号６９２５−５００）に移し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号１１６９７４５００）からなる新たに加えたプロテアーゼ阻害剤混合物を合わせた、６００μＬ／試料のＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カタログ番号ＢＰ−１１５）で溶解して、５．０ｍ／秒で均質化した。次いで試料を１０分間、４℃、１４，０００ＲＰＭで遠心分離して、液体を新しいチューブに移した。最終遠心分離は１０分間、１４，０００ＲＰＭで行い、そして試料は、上記に記載したようにブラッドフォードアッセイを用いて定量した。
【０２２９】
ウエスタンブロットを実施して、ＬＤＨＡタンパク質レベルを評価した。可溶化物を、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液と混合して、９５℃で１０分間、変性させた。メーカーのプロトコールに従って、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＮＰ０３０２ＢＯＸ）上でＮｕＰａｇｅシステムを用いてブロットを行った後で、０．４５μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カタログ番号１６２０１１５）上でウェットトランスファーを続けた。当該転写膜を水で全体的にすすいで、ポンソーＳ溶液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カタログ番号ＳＴ−１８０）で染色した後で、完了を確認してさらに転写した。５％粉ミルクのＴＢＳ溶液を用いて、室温で、ラボロッカーにより３０分間、ブロットをブロックした。ブロットを、ＴＢＳＴですすぎ、そしてＴＢＳＴ中、１：１０００で、ウサギα−ＬＤＨＡポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号ＳＡＢ２１０８６３８、細胞可溶化物用、又はＧｅｎｅｔｅｘ社、カタログ番号ＧＴＸ１０１４１６、マウス肝臓可溶化物用）でプローブした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞可溶化物でのブロットに関しては、ベータアクチンをＴＢＳＴ中、１：１０００でローディングコントロールとして用いて（Ｎｏｖｕｓ社、カタログ番号ＮＢ６００−５０１）、ＬＤＨＡ一次抗体と同時にインキュベートした。ｉｎ  ｖｉｖｏマウス肝臓抽出物によるブロットに関しては、ＧＡＰＤＨをＴＢＳＴ中、１：１０００でローディングコントロールとして用いて（Ａｂｃａｍ社、ａｂ８２４５）、ＬＤＨＡ一次抗体と同時にインキュベートした。ブロットをバッグ中に封止して、４℃でラボロッカー上で一晩維持した。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴ中でそれぞれ５分間、３回すすぎ、そして室温で３０分間、ＴＢＳＴ中でそれぞれ１：１２，５００で、マウス及びウサギに対する二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＰＩ３５５１８及びＰＩＳＡ５３５５７１）でプローブした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴ中でそれぞれ５分間３回すすぎ、ＰＢＳで２回すすいだ。Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いて、ブロットを可視化及び解析した。
【０２３０】
免疫組織化学的染色による、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）タンパク質解析
【０２３１】
マウス肝臓のＬＤＨＡタンパク質視覚解析に関して、Ｌｅｃｉａ社Ｂｏｎｄ  Ｒｘｍで標準の免疫組織化学的染色を行った。抗原賦活化（ＨＩＥＲ）のため、ｐＨ９のＥＤＴＡ系緩衝液中、９４℃で２５分間スライドを加熱し、次いで１：５００で３０分の抗体インキュベーション（３０ｍｉｎｕｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）（Ａｂｃａｍ社、カタログ番号Ａｂ５２４８８）を続けた。抗体の結合は、ＨＲＰ結合二次高分子と、その後に続くジアミノベンジジンでの色素による可視化とを用いて、検出した。
【０２３２】
マウスの筋肉及び肝臓よりのＬＤＨ活性の測定
【０２３３】
乳酸デヒドロゲナーゼ活性に関しては、生化学的方法（例えば、Ｗｏｏｄ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  Ｍｏｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｄｉｓ．  ２０１９  Ｓｅｐ  １；１８６５（９）：２２０３−２２０９；ＰＭＣ６６１３９９２）を用いた。乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定に関しては、氷冷した溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中で、プローブ型超音波処理により、組織を均質化して、１０％ｗｔ／ｖｏｌの可溶化物を得た。乳酸塩の存在下でのＮＡＤのＮＡＤＨへの還元に伴う３４０ｎｍでの吸光度の増加により、ＬＤＨ活性が測定された。ＬＤＧの乳酸塩からピルビン酸塩への活性を、２０ｍＭ乳酸塩、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ９．０、２ｍＭのＮＡＤ＋、０．０１％の肝臓可溶化物を用いて測定した。標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた、Ｃｏｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）を用いて、組織可溶化物中でのタンパク質濃度を決定した。
【０２３４】
マウス試料よりのシュウ酸塩、クレアチニン、ピルビン酸塩及び乳酸塩の測定
【０２３５】
シュウ酸塩の測定に関しては、冷蔵で生じ得る及び／又はアルカリ化に関連したシュウ酸塩起源（ｏｘａｌｏｇｅｎｓｉｓ）により生じ得る何らかのシュウ酸塩結晶化を防止するように、採尿の一部をＨＣｌでｐＨ１〜２に酸性化した後で−８０℃で保存した。残りの酸性化していない尿は、クレアチニン測定のために−８０℃で凍結した。血漿試料を、名目上分子量１０，０００限界でのナノセップ遠心ろ過機（ＶＷＲインターナショナル社、イリノイ州バタヴィア）でろ過して巨大分子を除去した後で、質量分析又はＩＣＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）と連結したイオンクロマトグラフィーを行った。試料のろ過の前に遠心ろ過機を１０ｍＭのＨＣｌで洗浄して、ろ過装置中に閉じ込められた汚染となるあらゆる追跡有機酸を除去した。有機酸解析のために、肝臓組織を、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で抽出した。これら有機酸は、同量の１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ（フレオン））−トリオクチルアミン（３：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ；アルドリッチ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で激しく攪拌して、４℃で遠心分離して相分離を促進して、そして解析のために上方の水層を回収することによって、ＴＣＡを除去してから、ＩＣＭＳで測定した。化学分析機によって尿中クレアチニンを測定して、先に記載したとおりＩＣＭＳで尿中シュウ酸塩を測定した。
【０２３６】
下記の質量／電荷比での選択イオン検出（ＳＩＭ）及びコーン電圧を用いて、乳酸塩（ＳＩＭ８９．０、３５Ｖ）及び１３Ｃ３−乳酸塩（ＳＩＭ９２．０、３５Ｖ）を定量した。ピルビン酸は、制御温度３０℃でのＡＳ１１−ＨＣ  ４μｍ、２×１５０ｍｍのアニオン交換カラム、及びＤｉｏｎｅｘ（商標）  ＥＲＳ（商標）５００  ａｎｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いたＩＣ／ＭＳで測定した。流速０．３８ｍｌ／分で、６０分かけて０．５から８０ｍＭまでのＫＯＨグラジエントにより、試料のアニオンを分離した。質量分析計（ＭＳＱ−ＰＬＵＳ）を、ＥＳＩネガティブモードで、ニードル電圧１．５Ｖ、ソース温度５００℃で運転して、そしてカラム溶離液は、ゼロデッドボリュームの混合Ｔ字管で０．３８ｍｌ／分で５０％アセトニトリルと混合してから、ＭＳＱに導入した。ピルビン酸塩のために、以下の質量／電荷比での選択イオン検出（ＳＩＭ）及びコーン電圧を用いた（ＳＩＭ８７．０、３０Ｖ）。
【０２３７】
実施例２−スクリーニング及びガイドの条件
【０２３８】
初代肝細胞におけるＬＤＨＡガイドのクロススクリーニング
【０２３９】
ヒトＬＤＨＡ及びカニクイザルにおいて相同であるものを標的とするガイドは、実施例１に記載したように、初代のヒト肝細胞（ＲＮＰ形質移入を介して）及びカニクイザルの肝細胞（ＲＮＰ電気穿孔法を介して）の中に形質移入した。それぞれの細胞型の全域にわたって、各ガイド配列を含むｓｇＲＮＡに関して、編集率を求めた。両細胞株における表１のガイド配列に関するスクリーニングデータを、以下に列記する（表４〜５）。
【０２４０】
表４は、ＲＮＰとして初代ヒト肝細胞に形質移入されたＬＤＨＡに対する編集率％、挿入率％（Ｉｎｓ）及び欠失率％（Ｄｅｌ）についての、デュプリケートでのサンプルの平均値及び標準偏差を示している。Ｎ＝２。
【０２４１】
【表６】
2022502055.tif 000050
2022502055.tif 000051
【０２４２】
表５は、初代カニクイザル肝細胞におけるＲＮＰで電気穿孔された試験したＬＤＨＡ  ｓｇＲＮＡ対する編集率％、挿入率％（Ｉｎｓ）、及び欠失率％（Ｄｅｌ）の平均値及び標準偏差を示している。Ｎ＝２。
【０２４３】
【表７】
2022502055.tif 000052
【０２４４】
表６は、濃度３０ｎＭのｓｇＲＮＡでのリポフェクションによる、初代カニクイザル肝細胞における試験したＬＤＨＡ  ｓｇＲＮＡに対する、複数の染色体位置にわたる編集率％の平均値及び標準偏差を示している。Ｎ＝２。
【０２４５】
【表８】
2022502055.tif 000053
2022502055.tif 000054
2022502055.tif 000055
【０２４６】
初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞の編集データに基づいて、ガイド配列のサブセットをさらに評価した。このサブセットは表７及び８に提供するが、初代肝細胞スクリーニングからの対応する編集データで再現されている。
【０２４７】
【表９】
2022502055.tif 000056
【０２４８】
【表１０】
2022502055.tif 000057
【０２４９】
ＬＤＨＡガイドのオフターゲット解析
【０２５０】
ＬＤＨＡを標的とするＣａｓ９により切断された潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定するために、生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００−６０６；２０１７を参照）を用いた。この実験において、単離したＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡを用いて、ヒトＬＤＨＡを標的とする１０個の修飾ｓｇＲＮＡ（及び公知のオフターゲットプロファイルをもつ２個の対照ガイド）をスクリーニングして、潜在的なオフターゲットの結果を図１にプロットした。このアッセイにより、試験したｓｇＲＮＡについて潜在的なオフターゲット部位が特定された。
【０２５１】
潜在的なオフターゲット部位を確認するための標的化配列決定
【０２５２】
上記で用いた生化学的方法等の公知のオフターゲット検出アッセイにおいては、典型的には、他の背景で、例えば関心の初代細胞において確認することが可能である潜在的な部位に関して「広い範囲を探索する」ために、設計によって、大量の潜在的なオフターゲット部位を得る。例えば、生化学的方法は、当該アッセイは、典型的に、細胞環境から自由である精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し且つ使用するＣａｓ９  ＲＮＰの用量に左右されるために潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に多く表す。したがって、これら方法で特定した潜在的なオフターゲット部位は、特定した潜在的なオフターゲット部位の標的化配列決定（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて確認してもよい。
【０２５３】
１つのアプローチにおいては、初代肝細胞を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及び関心のｓｇＲＮＡ（例えば、評価のために潜在的なオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡ）を含むＬＮＰで処置する。次いで初代肝細胞を溶解して、初代オフターゲット部位に隣接するプライマーを用いて、ＮＧＳ解析のための単位複製配列を生成する。一定のレベルでのインデルの特定により、潜在的なオフターゲット部位を確認することができるが、一方で、潜在的なオフターゲット部位に存在するインデルの欠如が、利用したオフターゲットアッセイにおける偽陽性を示唆する可能性もある。
【０２５４】
初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞における、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のクロススクリーニング
【０２５５】
ヒトＬＤＨＡを標的とする修飾ｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤と、カニクイザルにおけるそれらの相同体とを、用量反応アッセイで、初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞に対して試験した。ＬＮＰは、実施例１に記載したとおりに製剤化した。初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞は、実施例１に記載したとおりに蒔いた。両細胞株は、ＬＮＰによる処置の前に、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰは、６％カニクイザル血清を含有する培地中で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、３００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡで開始した８点での倍率３の用量反応曲線において、ＬＮＰをヒト肝細胞又はカニクイザル肝細胞に添加した。実施例１に記載したように、ＮＧＳ解析のために処置後９６時間に、細胞を溶解させた。両細胞株中のガイド配列に関する用量反応曲線のデータを、図２及び３に示している。２２ｎＭ濃度における編集率を、以下の表９及び１０に列記する。
【０２５６】
表９は、初代ヒト肝細胞中のＬＮＰを介してＳｐｙ  Ｃａｓ９で送達された、２２ｎＭでの試験ＬＤＨＡ  ｓｇＲＮＡに対する編集率％、挿入率％（Ｉｎｓ）、及び欠失率％（Ｄｅｌ）の平均値及び標準偏差を示している。これらサンプルは、デュプリケートで生成した。
【０２５７】
【表１１】
2022502055.tif 000058
【０２５８】
表１０は、初代カニクイザル肝細胞中のＬＮＰを介してＳｐｙ  Ｃａｓ９で送達された、２２ｎＭでの試験ＬＤＨＡ  ｓｇＲＮＡに対する編集率％、挿入率％（Ｉｎｓ）、及び欠失率％（Ｄｅｌ）の平均値及び標準偏差を示している。これらサンプルは、デュプリケートで生成した。
【０２５９】
【表１２】
2022502055.tif 000059
【０２６０】
リポフェクションを用いた、初代カニクイザル肝細胞中のＳｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡのクロススクリーニング。ＬＤＨＡを標的とする修飾ｓｇＲＮＡを、用量反応アッセイにおいて初代カニクイザル肝細胞に対して試験した。実施例１に記載するとおりにリポフェクションサンプルを調製した。初代カニクイザル肝細胞は、実施例１に記載したとおりに蒔いた。細胞を、リポフェクションの前に、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。リポフェクションサンプルは、６％カニクイザル血清を含有する培地中で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、５３ｎＭのｓｇＲＮＡで開始した８点での倍率３の用量反応曲線において、リポフェクションサンプルをカニクイザル肝細胞に添加した（ｎ＝２）。実施例１に記載したように、ＮＧＳ解析のために処置後９６時間に、細胞を溶解させた。ガイド配列に関する用量反応曲線のデータを、図１２Ａ〜１２Ｃに示している。５３ｎＭ濃度における編集率％を、以下の表１１に列記する。
【０２６１】
【表１３】
2022502055.tif 000060
【０２６２】
実施例３．表現型分析
【０２６３】
細胞内乳酸デヒドロゲナーゼＡのウエスタンブロット解析
【０２６４】
ヒトＬＤＨＡを標的とする修飾ｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、ウエスタンブロット用のサンプルを生成するために初代ヒト肝細胞に施与した。ＬＮＰは、実施例１に記載したとおりに製剤化した。初代ヒト肝細胞は、実施例１に記載したとおりに蒔いた。細胞を、ＬＮＰによる処置の前に、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰは、６％カニクイザル血清を含有する培地中で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＬＮＰを、サンプル当たり２５ｎＭのｓｇＲＮＡの濃度でヒト肝細胞に加えた。形質移入後９６時間に、細胞の一部を回収して、実施例１に記載のとおりにＮＧＳ配列決定を行った。残りの細胞は、形質移入後２１日目に集め、そして全細胞抽出物（ＷＣＥ）を調製して、実施例１に記載したとおりにウエスタンブロットでの解析にかけた。
【０２６５】
これら細胞についての編集データを表１２に提供する。
【０２６６】
【表１４】
2022502055.tif 000061
【０２６７】
ＬＤＨＡタンパク質の還元に関して、ＷＣＥをウエスタンブロットで解析した。完全長ＬＤＨＡタンパク質は、３３２個のアミノ酸を有し、予測分子量は３６．６ｋＤである。この分子量のバンドは、対照レーン（未処置細胞）で観察されたが、処置したもののレーンではいずれのレーンにおいても観察されなかった（図４）。
【０２６８】
乳酸デヒドロゲナーゼＡの転写解析
【０２６９】
ＬＤＨＡを標的とする選択された修飾ｓｇＲＮＡを、リポフェクションにより、初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞に施与し、ｑＰＣＲのためのサンプルを生成した。実施例１に記載するとおりにリポフェクションサンプルを調製した。初代肝細胞は、実施例１に記載したとおりに蒔いた。細胞を、脂質パケットによる処置の前に、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。リポフェクションサンプルは、６％カニクイザル血清を含有する培地中で、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、脂質パケットを、複数の濃度で肝細胞に加えた。リポフェクション後９６時間に、細胞を回収して、実施例１に記載のとおりにＲＮＡに関して処理を行った。１５ｎＭのガイドでの初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞中のＬＤＨＡ転写の減少の平均値を、以下の表１３に示し、また図１３Ａ〜１３Ｂに示した完全な用量反応データも含む。
【０２７０】
【表１５】
2022502055.tif 000062
【０２７１】
実施例４．ＰＨ１のマウスモデルにおけるＬｄｈａのｉｎ  ｖｉｖｏでの編集
【０２７２】
この試験では、野生型マウスと、ＡＧＴ欠損マウス（Ａｇｘｔ１−／−）、例えば肝臓ＡＧＸＴ  ｍＲＮＡ及びタンパク質が欠如したヌル変異マウスとの両方を用いた。ＡＧＴ欠損マウスは高シュウ酸尿症及び結晶尿を呈し、すなわちＳａｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６  Ｎｏｖ  ２８；１０３（４８）：１８２４９−５４に先立って記載されているように、ＰＨ１の表現型モデルに相当する。野生型マウスを用いて、ＡＧＴ欠損マウスにおいて試験する製剤を決定した。
【０２７３】
ＬＮＰを製剤化する前に、マウスＬｄｈａを標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰを、ヒト及びカニクイザルのＬＤＨＡ標的ｇＲＮＡに関する実施例２の記載と同様に、編集効率に関してスクリーニングした。ｄｇＲＮＡスクリーニングから活性なｇＲＮＡを同定したことから、ｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる評価のために、これらｇＲＮＡに基づく修飾ｓｇＲＮＡのより小さいセットを合成した。
【０２７４】
グループの平均体重に基づいて投薬溶液を調製するために、動物の体重を測定し、体重をもとにグループに分けた。マウスＬｄｈａを標的とする修飾ｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰ（以下の表１４を参照）を、動物当たり体積０．２ｍＬ（体重１キログラム当たりおよそ１０ｍＬ）で、外側尾静脈より投与した。ＬＮＰは、実施例１に記載したとおりに製剤化した。ＤＮＡ抽出及びマウスＬｄｈａの編集の解析のために、処置後１週間で、野生型マウスを安楽死させて、肝臓組織を採取した。以下の表１４に示すように、編集の用量依存レベルを、処置したマウスで観察した。
【０２７５】
【表１６】
2022502055.tif 000063
【０２７６】
ＬＮＰがｉｎ  ｖｉｖｏでマウスＬｄｈａ遺伝子を編集することができるということを確立したことから、Ｇ００９４３９を含有するＬＮＰを、ｍＲＮＡカーゴ全体に対する用量反応（０、０．２５、０．５、１及び２ｍｐｋ）でＡＧＴ欠損マウスに投与した。これらマウスは代謝ケージに入れて、尿は、例えばＬｉｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１７  Ｆｅｂ；２８（２）：４９４−５０３に記載されるとおり、シュウ酸塩レベルに関する種々の時点で採取した。Ｌｄｈａ遺伝子の編集及びシュウ酸塩の分泌は、ＬＮＰの用量を増加させていくと、それぞれ増加及び低下することが示された。編集率％及び排出されたｕｇ尿中シュウ酸塩／ｍｇクレアチニンを、以下の表１５に示し、また図１４Ａ〜１４Ｃに示す。
【０２７７】
【表１７】
2022502055.tif 000064
【０２７８】
ＬＮＰがｉｎ  ｖｉｖｏでシュウ酸塩分泌を低下させることができるということが確立された後で、Ｇ００９４３９を含有するＬＮＰを、ｍＲＮＡカーゴ全体に対して、用量２ｍｐｋでＡＧＴ欠損マウスに投与した（ｎ＝４）。図５に示すように、尿中のシュウ酸塩レベルが、処置１週後に低下し、そしてこの低下のレベルは、試験を終了した時点である、投与後の少なくとも５週まで持続した。対照（ＰＢＳを注射した）動物（ｎ＝４）では、低下は観察されなかった。処置した動物それぞれの編集率を表１６に報告しており、また尿中シュウ酸塩の減少率％は、表１８に処置後の週毎に示している。
【０２７９】
同一の試験において、ＡＧＴ欠損マウスには、マウスＨａｏ１を標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０００７２３）を含有するＬＮＰ（用量２ｍｐｋで（ｎ＝４））も投与した。図５及び表１７にも示すように、シュウ酸塩レベルが、このｇＲＮＡを含むＬＮＰでの処置１週後に低下し、そしてこの低下のレベルは、投与後の少なくとも５週まで持続した。
【０２８０】
Ｇ０００７２３：ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＧＵＧＡＧＣＣＡＵＧＣＡＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号８５）  ＊＝ＰＳ結合；’ｍ’＝２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチド
【０２８１】
【表１８】
2022502055.tif 000065
【０２８２】
【表１９】
2022502055.tif 000066
【０２８３】
【表２０】
2022502055.tif 000067
【０２８４】
ＡＧＴ欠損マウスにおける尿中シュウ酸塩の減少がＬＮＰ処置後５週まで持続することが実証されたことから、投与後１５週までの尿中シュウ酸塩を追跡するための追加試験を行った。Ｇ００９４３９を含有するＬＮＰを、０．３ｍｐｋの用量（ｎ＝４）及び１ｍｐｋの用量（ｎ＝４）でＡＧＴ欠損マウスに投与した。これらマウスは代謝ケージに入れて、尿は、上記に記載されるとおり、シュウ酸塩レベルに関する種々の時点で採取した。表１９が、ＡＧＴ欠損マウスに関する編集の結果を示している。０．３ｍｐｋ用量において達成した編集率％の平均は３３．４２であり、標準偏差は１１．９５であった。１ｍｐｋ用量において達成した編集率％の平均は７５．６８であり、標準偏差は７．３５であった。図６に示すように、尿中のシュウ酸塩レベルが、処置後に低下し、そしてこの低下のレベルは、試験を終了した時点である、投与後の１５週まで持続した。図６に示すデータを表２０に示している。対照（ＰＢＳを注射した）動物（ｎ＝３）では、低下は観察されなかった（データは示さず）。
【０２８５】
処置したマウスからの肝臓試料を処理して、実施例１に記載のようにウエスタンブロットにかけた。ＬＤＨＡタンパク質の減少率を、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏバージョン５．２ソフトウェアを用いて算出した。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして用い、同時にＬＤＨＡでプローブした。ＬＤＨＡのバンドを包含する全体的な領域と比較した、各試料の範囲内のＧＡＰＤＨのデンシトメトリー値に関する比を算出した。当該比を陰性対照レーンに対して正規化した後で、ＬＤＨＡタンパク質の減少率を決定した。結果を表１９に示し、図７に表している。
【０２８６】
処置したマウス又は未処置マウスにおけるＬＤＨＡタンパク質を、実施例１に記載するように、また図８に表すように、免疫組織化学的染色を介して、さらに特性決定した。ＬＤＨＡ染色の漸減が、対照マウスと比較して、０．３ｍｐｋ用量マウスと１ｍｐｋ用量マウスとにおいて観察された。図９は、表１９における編集レベルとタンパク質レベルとの間の、Ｒ２が０．９５である相関を示す。
【０２８７】
【表２１】
2022502055.tif 000068
【０２８８】
【表２２】
2022502055.tif 000069
【０２８９】
処置したマウスからの肝臓試料及び筋肉試料を、実施例１に記載のようにＬＤＨ活性のために処理した。１ｍｐｋのＬｄｈａ  ＬＮＰで処置したマウスの肝臓試料で、ＬＤＨ活性の低下が観察された。処置したマウス及び対照マウスよりの比活性（μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）を、以下の表２１に示し、またデータを図１５Ａ〜１５Ｂに図示する。
【０２９０】
【表２３】
2022502055.tif 000070
【０２９１】
処置したマウスよりの肝臓及び血漿の試料はまた、実施例１に記載するようにピルビン酸塩について解析した。ピルビン酸塩は、乳酸デヒドロゲナーゼで乳酸塩に変換される代謝産物である（Ｕｒｂａｎｓｋａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１９  Ａｐｒ  ２７；２０（９））。ピルビン酸塩濃度は、１ｍｐｋ処置マウスよりの肝臓試料で高くなることが証明されたが、血漿中のピルビン酸塩濃度は、処置したマウスと対照マウスとでの相違はほとんど観察されなかった。これらデータを、表２２に示し、また図１６Ａ〜１６Ｂに示す。
【０２９２】
【表２４】
2022502055.tif 000071
【０２９３】
ＡＧＴ欠損マウスにおける尿中シュウ酸塩の減少が、ＬＮＰ処置後１５週まで持続することが実証されたことから、易感染性腎臓機能をもつマウスについてのＬＤＨＡノックダウン後に乳酸塩を除去する能力を決定するために、追加試験を行った。５／６腎切除術又はシャム手術のいずれかを受けたＣ５１Ｂｌ６雄マウスを、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（メイン州バー・ハーバー）より取得した。手術後１週で、実施例１に記載するような乳酸塩レベルのベースラインのために、動物を出血させた。次いで動物に、Ｇ００９４３９を含有するＬＮＰを、用量２ｍｐｋで投与した（ｎ＝６）。投与後２週で、動物を、リン酸緩衝食塩水（濃度２００ｍｇ／ｍＬ、約１８ｍＭ）、ｐＨ７．４中に溶解させた乳酸ナトリウム２ｇ／ｋｇからなる乳酸塩接種を腹腔内投与で行った。動物は、接種前に尾部出血させ、次いで接種後１５、３０、６０及び１８０分に尾部出血させた。血液試料について、実施例１に記載するように乳酸塩レベルを解析した。シャム手術マウス及びビヒクル処置マウスと比較して、腎切除術及びＬＤＨＡ  ＬＮＰを受けたマウスでは、乳酸塩クリアランスでの有意な相違は観察されなかった。以下の表２３は、動物群の全域にわたる血漿ピルビン酸塩の平均を詳細に示し、また図１７にも示す。
【０２９４】
【表２５】
2022502055.tif 000072
【図１】
2022502055.tif 000073
【図２】
2022502055.tif 000074
【図３】
2022502055.tif 000075
【図４】
2022502055.tif 000076
【図５】
2022502055.tif 000077
【図６】
2022502055.tif 000078
【図７】
2022502055.tif 000079
【図８】
2022502055.tif 000080
【図９】
2022502055.tif 000081
【図１０】
2022502055.tif 000082
【図１１】
2022502055.tif 000083
【図１２Ａ】
2022502055.tif 000084
【図１２Ｂ】
2022502055.tif 000085
【図１２Ｃ】
2022502055.tif 000086
【図１３Ａ】
2022502055.tif 000087
【図１３Ｂ】
2022502055.tif 000088
【図１４Ａ】
2022502055.tif 000089
【図１４Ｂ】
2022502055.tif 000090
【図１４Ｃ】
2022502055.tif 000091
【図１５Ａ】
2022502055.tif 000092
【図１５Ｂ】
2022502055.tif 000093
【図１６Ａ】
2022502055.tif 000094
【図１６Ｂ】
2022502055.tif 000095
【図１７】
2022502055.tif 000096
【配列表】
2022502055000001.app
【国際調査報告】
2022502055.tif 000097
2022502055.tif 000098
2022502055.tif 000099