(57)【要約】  本発明は、癌の処置に有用である新規な免疫サイトカインに関する。これらの融合タンパク質は、（ｉ）以下と融合している抗体または抗原結合フラグメント、（ｉｉ）切断可能ペプチドリンカー、および（ｉｉｉ）サイトカイン、またはその機能的フラグメントを含んでなる。これらの免疫サイトカインを用いた処置の方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下と融合している抗体または抗原結合フラグメント、
（ｉｉ）切断可能ペプチドリンカー、および
（ｉｉｉ）サイトカイン、またはその機能的フラグメント
を含んでなる、融合タンパク質。
【請求項２】
サイトカインが、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−３６、またはＩＦＮ−αである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
切断可能ペプチドリンカーが、プロテアーゼ切断部位を含んでなる、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
プロテアーゼ切断部位が、マトリックスメタロプロテイナーゼまたはｕＰＡにより切断される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
マトリックスメタロプロテイナーゼが、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
切断可能ペプチドリンカーが、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＧＰＬＧＬＷＡＱ、ＧＰＬＧＭＬＳＱ、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＶＧＬＩＧ、ＳＧＲＳ、ＳＧＲＳＡ、およびＰＳＳＲＲＲＶＮからなる群から選択される配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメ抗体およびラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
サイトカインが、マウスもしくはヒトサイトカイン、好ましくは、ヒトサイトカイン、またはその機能的フラグメントである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
（ｉ）サイトカイン、またはその機能的フラグメントが、切断可能ペプチドリンカーと融合しており、かつ
（ｉｉ）切断可能ペプチドリンカーが、抗体またはその抗原結合フラグメントに対してＮ末端またはＣ末端で使用されている、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）サイトカイン、またはその機能的フラグメントが、切断可能ペプチドリンカーと融合しており、かつ
（ｉｉ）切断可能ペプチドリンカーが、抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖に対してＮ末端またはＣ末端で融合している、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
療法における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける癌の処置における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記使用が、前記哺乳動物の免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞または単球の活性化を含んでなる、請求項１２に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質および場合により薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
サイトカインまたはその変異体を選択する方法であって、
（ｉ）試験されるサイトカインまたはその変異体を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を提供すること；
（ｉｉ）前記融合タンパク質を関連するプロテアーゼと接触させること；および
（ｉｉｉ）前記サイトカインの活性を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項１６】
切断可能ペプチドリンカーを同定する方法であって、
（ｉ）試験される切断可能ペプチドリンカーを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を提供すること；
（ｉｉ）前記融合タンパク質を関連するプロテアーゼと接触させること；および
（ｉｉｉ）前記融合タンパク質の切断を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項１７】
前記方法の工程（ｉｉｉ）が、前記融合タンパク質のサイトカインの活性を測定することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を処置するための新規な免疫サイトカインおよびその使用に関する。
【０００２】
様々な種類の血液学的悪性腫瘍およびいくつかの固形腫瘍（例えば、転移性精巣癌）に対して治療的成功が達成されているが、播種型の固形癌の大部分は不治のままである。従来の癌治療法の治療効果は、小有機分子が疾患の部位で十分な量で蓄積できないことによって、制限されることが多い（例えば、van der Veldt AA, et al. Clin Cancer Res. 19: 4163-4173, 2013参照）。
【０００３】
制御性Ｔ細胞の活性化を制限しながら、関連する免疫サブセット、例えば、Ｔエフェクター、単球およびＮＫ細胞を優先的に活性化する新規な戦略が、現在開発されている。しかしながら、実質的な副作用および好ましくない薬物動態特性が、治療上関連する用量の投与を妨害する主な欠点となっている。特に、サイトカイン免疫療法は、重度の用量制限副作用の発症をもたらすことが多い（Pachella et al., Pract Oncol 6:212-221, 2015）。ほとんどのサイトカインが共有する２つの特性が、治療に関連した有害作用の発症において重要な役割を果たすと考えられている。第１に、サイトカインは多面発現性であり、このことは、それらは単一細胞型よりも影響を及ぼすことができることを意味する。さらに、サイトカインは、短い血清中半減期を有し、このため、それらの治療効果を達成するためには高用量で投与する必要がある。高用量は、治療効果を効果的に増強する一方で、患者において有害作用として現れる多面発現活性を悪化させる。
【０００４】
有効性を増大させることを目的とした１つのアプローチでは、サイトカインを、抗体、または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体成分と遺伝的に融合させることによって、サイトカインを腫瘍部位に送達することを試みている。免疫サイトカインと名付けられたこのような融合タンパク質は、抗体の結合特異性に、例えば、ＩＬ−２などのサイトカインの効力を組み合わせている（Sondel & Gillies, Antibodies 1: 149-171, 2012; Skrombolas & Frelinger, Expert Rev Clin Immunol. 10(2): 207-217, 2014; Kiefer & Neri, Immunol Rev. 270(1): 178-192, 2016）。腫瘍部位へのサイトカインの送達は、特に、容易に到達可能な腫瘍を有する癌に対して、免疫サイトカインを使用することにより、改善される。別の例では、免疫サイトカインは、ＭＭＰ９切断部位により特異的な阻害抗ＩＬ−１２  ｓｃＦｖに連結したサイトカイン（ＩＬ−１２）を含んでなる（Skrombolas et al., J Interferon Cytokine Res. 39(4): 233-245, 2019）。しかしながら、播種性の全身性疾患の処置は、腫瘍標的および腫瘍部位での活性化に関して最適化されている免疫サイトカインから利益を得る可能性がある（Sondel & Gillies, Antibodies 1: 149-171, 2012）。特に、腫瘍の外側での抗体の結合は、望まれないサイトカイン活性および潜在的な副作用をもたらし得る。この問題は、特定のペイロードが、癌のマウスモデルにおいて親抗体の腫瘍標的能を完全に抑制することが報告されているため、一層重要である（例えば、Hess, Doctoral Thesis, ETH Zurich, 2015参照）。
【０００５】
したがって、サイトカインを腫瘍部位に安全かつ効率的に送達および活性化できる免疫サイトカインの必要性が、依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】免疫サイトカイン（ＩＣＣ）を産生するための融合部位。
【図２】脱グリコシル化、ＲＰ−ＬＣ分離後に得たｃ９Ｇ４ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図３】脱グリコシル化、ＩｄＥｓ消化およびＲＰ−ＬＣ分離後に得たＦｃ／２  ｃＧ４ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図４】ｍＡｂ重鎖のＣ末端と融合した場合のＭＭＰ−９／２リンカーの切断性の評価。ＭＭＰ−９／２により非切断可能であると報告されたＧＩＶＧＰＬリンカーを、切断特異性に関する陰性対照として使用した。
【図５】ｍＡｂ重鎖のＮ末端と融合した場合のＭＭＰ−９／２リンカーの切断性の評価。ＭＭＰ−９／２により非切断可能であると報告されたＧＩＶＧＰＬリンカーを、切断特異性に関する陰性対照として使用した。ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、Ｃｋ：サイトカイン。
【図６】ヒトおよびマウスＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２によるｃ９Ｇ４ベースの免疫サイトカインならびにＨ１６／Ｌ１６−ＩＬ１５およびＨＨＳ７６−ＩＬ１５免疫サイトカインの切断性の評価（ＨＣ  Ｃ末端融合体、リンカーＰＶＧＬＩＧ）。（Ａ）ｃ９Ｇ４−Ｉｌ１５、Ｈ１６／Ｌ１６−ＩＬ１５、およびＨＨＳ７６−ＩＬ１５；（Ｂ）ｃ９Ｇ４−ＣＣＬ４およびｃ９Ｇ４−ＩＦＮａ。ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖、Ｃｋ：サイトカイン。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合体を、切断効率に関する陽性対照として使用した。注１：ＩＬ１５およびＩＦＮａの切断後の可視化は、タンパク質の高レベルのグリコシル化によって損なわれている。切断前のサンプルの脱グリコシル化は、放出されたサイトカインの可視化を可能にし、このことは、タンパク質はＭＭＰ−９／２によってタンパク質分解されないことを示している（資料未記載）。注３：ＩＬ１５融合体に対して認められた部分的切断は、試験したサンプルの不均一性に起因している可能性が高い（サイズ排除クロマトグラフィーにより５０％モノマーにほぼ等しい。資料未記載）。
【図７】ＭＭＰ−９／２リンカー切断性の評価の要約。
【図８】５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝液中のＭＭＰ−９活性の存在下でのＰＶＧＬＩＧおよびＧＩＶＧＰＬリンカーの安定性：免疫沈降および還元および逆相分離後に得た抗ＰＤＬ１−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ａ）抗体および抗ＰＤＬ１−ＧＩＶＧＰＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｂ）抗体のＬＣ／ＭＳフラグメントプロファイル。
【図９】マウス血清におけるＩＣＣ切断の分析：ＭＭＰ−９添加なしのＴ０（Ａ）およびＴ２４（Ｂ）、ＭＭＰ−９添加ありのＴ０（Ｃ）およびＴ２４（Ｄ）における、免疫沈降、還元および逆相分離後に得た抗ＰＤＬ１−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）フラグメントのＬＣ／ＭＳプロファイル。
【図１０】ＩＬ１５は、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγ受容体サブユニットの二量体化を誘導した。３回の独立した実験からの代表的なデータ。
【図１１】血漿サンプルのウエスタンブロット解析（ＲＥＮＣＡ移植マウス）。
【図１２】血漿サンプルのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析。Ｘは、サンプルが欠測であることを示す。
【図１３】循環ＩＣＣ（血漿サンプル）に対する統計解析（ＲＥＮＣＡ移植マウス）。
【図１４】腫瘍サンプルのウエスタンブロット解析（ＲＥＮＣＡ移植マウス）。
【図１５】腫瘍サンプルのウエスタンブロットのデンシトメトリー分析。Ｘは、サンプルが欠測であることを示す。
【図１６】ＲＥＮＣＡ腫瘍に向かったＩＣＣの統計解析。
【図１７】ＲＥＮＣＡ移植マウスの血漿および腫瘍におけるＩＣＣ−ＰＶＧＬＩＧの挙動の統計解析。
【図１８】脱グリコシル化、ＲＰ−ＬＣ分離後に得たＮＨＳ６７−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図１９】脱グリコシル化、ＩｄＥｓ消化およびＲＰ−ＬＣ分離後に得たＦｃ／２  ＮＨＳ６７−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図２０】脱グリコシル化、ＲＰ−ＬＣ分離後に得たＨ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図２１】脱グリコシル化、ＩｄＥｓ消化およびＲＰ−ＬＣ分離後に得たＦｃ／２  Ｈ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５のデコンボリューション後のＭＳスペクトル。
【図２２】非還元／加熱（ＮＲＨ）条件および還元／加熱（ＲＨ）条件下での精製されたｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５およびＨ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５  ＩＣＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２３】対照と比較したＩＣＣによるマウスＴ細胞の活性化。切断および非切断ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＣＤ６９（Ａ）またはＣＤ２５（Ｂ）のＴ細胞発現、ならびに切断および非切断Ｈ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＣＤ６９（Ｃ）またはＣＤ２５（Ｄ）のＴ細胞発現により測定した活性化。
【図２４】対照と比較したＩＣＣによるヒトＴ細胞の活性化。切断および非切断ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＣＤ６９（Ａ）またはＣＤ２５（Ｂ）のＴ細胞発現、ならびに切断および非切断Ｈ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＣＤ６９（Ｃ）またはＣＤ２５（Ｄ）のＴ細胞発現により測定した活性化。
【図２５】対照と比較したＩＣＣによるヒトＴ細胞の活性化。２例の異なるドナー（ドナー１（Ａ）およびドナー２（Ｂ））に関する切断および非切断ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＩＮＦγのＴ細胞分泌により測定した活性化。上のパネル：２例の異なるドナー（ドナー１（Ｃ）およびドナー２（Ｄ））に関する切断および非切断Ｈ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５または対照の存在下でのＩＮＦγのＴ細胞分泌により測定した活性化。
【図２６】異なるサンプルで２４時間インキュベーションした後のＡ４３１条件培養培地におけるＩＬ−８産生レベルの分析。ＩＬ８相対含量は、ＤＵＯＳＥＴ  ＥＬＩＳＡを用いて決定し、４５０ｎｍでの光学単位で表している。
【図２７】ｈＩＦＮα２ａによるＩＳＲＥ依存性ルシフェラーゼ依存的産生の誘導。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）において生じた発光をモニタリングすることによって、ｈＩＦＮα２ａ活性を、ｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａ（Ａ）、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａ（Ｂ）、および１０μｇ／ｍｌのＨ１６／Ｌ１６抗体との細胞のプレインキュベーションあり（Ｃ）またはなし（Ｄ）でのＨ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａにおいてアッセイした。
【図２８】ウロキナーゼあり／なしでの６時間のインキュベーション後のＩＬ１５活性。ＩＬ１５相対含量は、ＩＬ１５  Ｂｉｏａｓｓａｙを用いて決定し、発光量で表している。
【図２９】Ｈ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳＡ  ｈＩＦＮα２ａ（Ａ）およびＨ１６／Ｌ１６−ＰＳＳＲＲＲＶＮ  ｈＩＦＮα２ａ（Ｂ）のｕＰＡ媒介切断後のｈＩＦＮα活性の評価。ｈＩＦＮα活性を、ウロキナーゼあり／なしでのＨ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳＡ  ｈＩＦＮα２ａ（Ａ）およびＨ１６／Ｌ１６−ＰＳＳＲＲＲＶＮ  ｈＩＦＮα２ａ（Ｂ）の２４時間のインキュベーション後、ならびにＩＳＲＥ−ｌｕｃ２／ＨＥＫ２９３におけるＩＧＦ１Ｒ受容体飽和後にアッセイした。相対ｈＩＦＮα活性は、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ  Ｂｉｏａｓｓａｙを用いて決定し、発光量で表している。
【図３０】ｃ９Ｇ４−ＧＳＲＳ−ＣＸＣＬ１０（Ａ）、ＮＨＳ７６−ＧＳＲＳ−ＣＸＣＬ１０（Ｂ）、およびＨ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０（Ｃ）のｕＰＡ媒介切断後のｈＣＸＣＬ１０活性の評価。相対ｈＣＸＣＬ１０活性は、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ｅＸｐｒｅｓｓ  ＣＸＣＲ３  ＣＨＯＫ１  β−アレスチンＧＰＣＲアッセイを用いて決定し、発光量で表している。
【発明の具体的説明】
【０００７】
切断可能ペプチドリンカーの切断時に選択的に放出され得るサイトカイン部分と融合した抗体の特定の組合せが、新規な治療上有効な融合タンパク質を提供することが、意外にも見出された。
【０００８】
本発明は、「免疫サイトカイン」、すなわち、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体とサイトカインとの融合体に関する。本免疫サイトカインにおける抗体部分は、サイトカインが放出されてその作用を発揮する腫瘍を標的とする。これは、融合タンパク質に対して大きな特異性を与えるものである、すなわち、それは、腫瘍に対するサイトカイン活性を標的とするために、単に限局性のタンパク質分解に頼る従来技術の免疫サイトカインよりも、少ない副作用をもたらす（Skrombolas et al., 2019）。
【０００９】
従来技術の他の免疫サイトカインは、抗体とサイトカインとの間に、いずれのリンカーも含まない、または単に構造的リンカー（すなわち、いずれの特異的な生物活性も有さないリンカー）を含むのいずれかであったが、本融合タンパク質は、２つの部分間で切断され得るペプチドリンカーを含んでなり、分子の治療活性の優れた制御を可能にする。実際に、本発明者らは、融合タンパク質は、意外にも、血液中では不活性であるが、腫瘍部位に到達すると活性化されることを見出した。切断可能ペプチドリンカーは、腫瘍微小環境中で優先的に切断され、サイトカインが放出される。このため、サイトカインの標的送達は、サイトカイン関連毒性のリスクを低減させる一方で、その抗腫瘍活性を増強する。
【００１０】
第１の側面において、本発明は、抗体、またはその抗原結合タンパク質、切断可能ペプチドリンカー、およびサイトカインまたはその機能的フラグメントを含んでなる融合タンパク質に関する。
【００１１】
「融合タンパク質」は、単一部分として組換え発現される２つ以上の別々のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。この用語は、前記抗体、またはその抗原結合タンパク質が、例えば、共有結合および／または非共有結合、例えば、イオン結合によって、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインまたはその機能的フラグメントと何とかして結合している、総てのコンジュゲートを包含するものとする。この用語は、総ての結合配置を包含する。好ましい配置としては、抗体−リンカー−サイトカインおよびサイトカイン−リンカー−抗体が挙げられる。
【００１２】
抗体
「抗体」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、すなわち「抗原」、例えば、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。本融合タンパク質の抗体またはその抗原結合タンパク質は、疾患環境および／または特異的細胞サブセットへの免疫サイトカインの標的送達を媒介する。好ましい標的抗原は、他所では低レベルでとどまりながら、罹患組織において過剰発現している抗原である。このような抗原は、長年多数の研究の対象となっているため、当業者に周知である。例えば、本免疫サイトカインの抗体部分は、悪性細胞の表面に過剰発現している抗原（例えば、上皮細胞接着分子、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＧＤ２ジシアロガングリオシド、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０およびＣＤ３０）、ならびに腫瘍および慢性炎症部位において認められる血管新生抗原（例えば、フィブロネクチン、スプライスバリアントＥＤＡ／ＥＤＢおよびテネイシンＣのＡ１ドメイン）を標的とし得る。
【００１３】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、インタクトポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合フラグメント」）またはその一本鎖、抗体を含んでなる融合タンパク質、および抗原認識部位を含んでなる免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含し、その例としては、限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメ抗体およびラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、全長抗体およびそれらの抗原結合フラグメントの両方、ならびにそれらの任意の誘導体を包含する。好ましくは、本発明に係る抗体、またはその派生化合物もしくは抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である。
【００１４】
「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、ほぼ均一な抗体集団から生じる抗体を意味する。より詳しくは、集団の個々の抗体は、最小限の割合で見出され得る数個の潜在的な自然発生変異を除き、同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一抗体をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクトした真核生物宿主細胞、均一抗体をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクトした原核生物宿主細胞など）の成長から生じる均一抗体からなり、一般に、１つおよび１つのみのクラスおよびサブクラスの重鎖、ならびに１つのみの型の軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原に対するものである。さらに、一般に種々の決定基、またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープに対するものである。これらの抗体は単一エピトープに対するものであるため、それらは高度に特異的である。
【００１５】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の部位である。それは、隣接残基、または抗原タンパク質のフォールディングによって近接される非隣接残基によって形成され得る。隣接アミノ酸により形成されるエピトープは、一般に、変性溶媒に対する曝露で保持されるが、非隣接アミノ酸により形成されるエピトープは、一般に、前記曝露下で失われる。
【００１６】
特異抗原と反応性の抗体の作製は、当業者に公知の任意の方法、例えば、免疫化マウスまたは選択された骨髄腫細胞と適合する他の種からの脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合によって、実現することができる（Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497, 1975）。免疫化動物としては、次いでヒト抗体を直接産生するヒト免疫グロブリン座位を有するトランスジェニックマウスが挙げられ得る。あるいは、抗体は、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの組換え法によって作製することができる。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製に関しては、特に手引き書「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988）に記載されている技術、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature, 256:495-497, 1975）により記載のハイブリドーマからの調製の技術を参照することが可能である。
【００１７】
抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が挙げられ、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。
【００１８】
典型的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって連結されている２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖から構成される。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープの結合を主に担う「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含む。それらは通常、Ｎ末端から順次付番されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という。可変領域のより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００１９】
３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲｓ」は、例に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつか、もしくは全部でさえも示すために、本明細書において使用される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「ＶＨ」または「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含む、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００２１】
抗体定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、異なるクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられ得、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る（W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York参照）。
【００２２】
抗体のパパイン消化により、各々が単一抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメントが生じる。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの結晶構造が、決定されている（Deisenhofer, Biochemistry, 20, 2361-2370, 1981）。本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「免疫グロブリンＦｃドメインまたはＦｃ」は、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分を意味する。本明細書で使用する場合、「天然配列Ｆｃドメイン」は、天然に認められるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含んでなる。天然配列ヒトＦｃドメインとしては、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃドメイン；および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインならびにそれらの自然発生変異体が挙げられる。
【００２３】
免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、通常、ヒンジ領域におけるＣｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むそのカルボキシル末端に及ぶと定義される。本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて、免疫グロブリン重鎖における残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
【００２４】
用語「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に及ぶと定義される（Burton, MoI Immunol, 22: 161-206, 1985）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列され得る。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインともいう）は通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点で、独特である。むしろ、２つのＮ結合型分岐糖鎖が、インタクト天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入されている。糖質は、ドメイン−ドメイン対形成の代わりとなり、ＣＨ２ドメインの安定化を助け得ると推測されている（Burton, MoI Immunol, 22: 161-206, 1985）。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ部分におけるＣＨ２ドメインまでの残基Ｃ末端の広がり（すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７まで）を含んでなる。
【００２５】
Ｆｃドメインは、免疫グロブリンの生物学的機能の決定における中心であり、これらの生物学的機能は、「エフェクター機能」と呼ばれる。これらのＦｃドメイン媒介活性は、免疫エフェクター細胞、例えば、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、および活性化マクロファージ、または種々の補体成分を介して媒介される。これらのエフェクター機能は、後述の受容体または１つもしくは複数の補体成分に対する抗体のＦｃドメインの結合を通じて、前記エフェクター細胞の表面にある受容体の活性化が関与する。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性は、エフェクター細胞のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃ受容体またはＣ１ｑなどの補体成分に対するＦｃドメインの結合が関与する。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１ｌおよびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも効果的にＡＤＣＣを媒介する。
【００２６】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体またはヒト化抗体を含んでなる。
【００２７】
キメラ抗体は、特定の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を、前記特定の種とは異種の種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域との組合せで含む抗体である。
【００２８】
抗体、またはそのキメラフラグメントは、組換え遺伝学の技術を用いて調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、特にマウスの本発明の非ヒトモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって、作製され得る。１つのそのような組換え遺伝子によりコードされる本発明に係るキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。この場合において、キメラ抗体のＦｃドメインはヒト起源であることが分かるであろう。キメラ抗体を調製する方法については、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照されたい。
【００２９】
さらに、本発明はまた、上記のマウス抗体から生じたヒト化抗体に関する。「ヒト化抗体」は、本明細書において、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体であって、抗体分子の他の部分は、１つ（またはいくつか）のヒト抗体に由来する、抗体を指す。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部は、結合親和性を保存するように改変することができる（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988）。ヒト化抗体のＦｃドメインは、キメラ抗体と同様に、ヒト起源となる。
【００３０】
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; and Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992に記載の技術）によって調製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏでの予防的および／もしくは治療的処置が関与する方法に使用することが好ましい。他のヒト化技術も当業者に公知であり、例えば、特許ＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７または米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，６９３，７６１号明細書においてＰＤＬ社によって記載された「ＣＤＲグラフティング」技術が挙げられる。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同５，８７７，２９３号明細書も引用することができる。
【００３１】
本免疫サイトカインにおける抗体フラグメントを使用することが可能であるが、全長二価抗体を使用することが好ましい。ＦａｂまたはｓｃＦｖなどの一価抗体は、（天然の「二価」抗体とは異なる）抗原に対する単一結合部位のみを有する、すなわち、単一抗原結合アームから構成される。当業者に公知なように、免疫グロブリンの結合価（抗原結合部位の数）が大きい程、それが結合できる抗原の量は大きくなる。一価結合と二価結合との間には大幅な親和性変化が存在し、Ｋｄ値において１，５００倍の変化がある。このため、二価抗体は、一価ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントと同等の治療効果を得るために、低用量で使用することができ、それにより、副次効果のリスクが制限される。
【００３２】
好ましくは、本明細書に記載の免疫サイトカインにおいて使用され得る抗体は、前記免疫サイトカインのサイトカイン部分に特異的に結合しない抗体である。例えば、サイトカインがＩＬ−１２である場合、この実施形態による抗体は、ＩＬ−１２に結合する抗体ではない。
【００３３】
別の実施形態において、本免疫サイトカインにおいて使用される抗体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に特異的に結合する抗体である。本明細書で使用する場合、「腫瘍特異抗原」は、癌細胞上に認められるタンパク質または他の分子であるが、「腫瘍特異抗原」は、癌細胞上に認められるが正常細胞上には認められないタンパク質または他の分子である。腫瘍特異抗原は、当技術分野で公知である。
【００３４】
腫瘍抗原は、種々の様式で分類され得る。腫瘍抗原としては、染色体変化を受けている遺伝子によりコードされる抗原が挙げられる。これらの抗原の多くは、リンパ腫および白血病において認められる。この分類内でさえも、抗原は、静止遺伝子の活性化が関与する抗原として特徴付けられ得る。これらには、ＢＣＬ−１およびＩｇＨ（マンテル細胞リンパ腫）、ＢＣＬ−２およびＩｇＨ（濾胞性リンパ腫）、ＢＣＬ−６（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＴＡＬ−１およびＴＣＲデルタまたはＳＩＬ（Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病）、ｃ−ＭＹＣおよびＩｇＨまたはＩｇＬ（バーキットリンパ腫）、ＭＵＮ／ＩＲＦ４およびＩｇＨ（骨髄腫）、ＰＡＸ−５（ＢＳＡＰ）（免疫細胞腫）が含まれる。
【００３５】
染色体変化が関与し、それにより新規な融合遺伝子および／またはタンパク質を作り出す他の腫瘍抗原としては、ＲＡＲｏａ、ＰＭＬ、ＰＬＺＦ、ＮＰＭもしくはＮｕＭ４（急性前骨髄球性白血病）、ＢＣＲおよびＡＢＬ（慢性骨髄性／急性リンパ芽球性白血病）、ＭＬＬ（ＨＲＸ）（急性白血病）、Ｅ２ＡおよびＰＢＸもしくはＨＬＦ（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、ＮＰＭ、ＡＬＫ（未分化大細胞白血病）、ならびにＮＰＭ、ＭＬＦ−１（骨髄異形成症候群／急性骨髄性白血病）が挙げられる。
【００３６】
他の腫瘍抗原は、組織または細胞系統に対して特異的である。これらには、細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（共通（プレＢ）急性リンパ球性白血病および悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮性およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆道腺癌および膵管腺癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原（前立腺癌）が含まれる。
【００３７】
組織または系統特異的腫瘍抗原としては、上皮成長因子受容体（高発現）、例えば、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１またはｅｒｂＢ１）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ（脳癌、肺癌、乳癌、前立腺癌および胃癌）、ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）（乳癌および胃癌）、ｅｒｂＢ３（ＨＥＲ３）（腺癌）、およびｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）（乳癌）も挙げられる。
【００３８】
組織または系統特異的腫瘍抗原としては、細胞関連タンパク質、例えば、チロシナーゼ、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）−１／ｇｐ７５（悪性黒色腫）、多形性上皮性ムチン（ＰＥＭ）（乳腺腫瘍）、およびヒト上皮性ムチン（ＭＵＣ１）（乳癌、卵巣癌、結腸癌および肺癌）も挙げられる。
【００３９】
組織または系統特異的腫瘍抗原としては、分泌タンパク質、例えば、モノクローナル免疫グロブリン（多発性骨髄腫および形質細胞腫）、免疫グロブリン軽鎖（多発性骨髄腫）、アルファ−フェトプロテイン（肝癌）、カリクレイン６および１０（卵巣癌）、ガストリン放出ペプチド／ボンベシン（肺癌）、ならびに前立腺特異抗原（前立腺癌）も挙げられる。
【００４０】
さらに他の腫瘍抗原は、精巣およびいくつかの例では胎盤などのいくつかの正常組織に発現する癌精巣（ＣＴ）抗原である。それらの発現は、多様な系統の腫瘍において共通であり、群として、抗原は免疫療法のための標的を形成する。ＣＴ抗原の腫瘍発現の例としては、ＭＡＧＥ−Ａ１、−Ａ３、−Ａ６、−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＨＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＲＡＧＥ、ＳＳＸ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５およびＰＲＡＭＥが挙げられる。ＣＴ抗原およびそれらが発現される癌のさらに他の例としては、ＳＳＸ−２、および−４（神経芽腫）、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＰＲＡＭＥ（悪性黒色腫）、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１（髄膜腫）、ＳＳＸ−４（乏突起神経膠腫）、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＭＡＧＥ−３およびＳＳＸ−４（星状細胞腫）、ＳＳＸメンバー（頭頸部癌、卵巣癌、リンパ系腫瘍、結腸直腸癌および乳癌）、ＲＡＧＥ−１、−２、−４、ＧＡＧＥ−１−２、−３、−４、−５、−６、−７および−８（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、ＨＯＭ−ＴＥＳ１４／ＳＣＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−１およびＣＴ−７（非ホジキンリンパ腫）、ならびにＰＲＡＭＥ（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））が挙げられる。
【００４１】
他の腫瘍抗原は、特定の組織または細胞系統に対して特異的ではない。これらには、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーのメンバー：ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄおよびＣＤ６６ｅが含まれる。これらの抗原は、多くの異なる悪性腫瘍において発現し得、免疫療法により標的とされ得る。
【００４２】
さらに他の腫瘍抗原は、ウイルスタンパク質であり、これらには、ヒトパピローマウイルスタンパク質（子宮頸癌）、およびＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１（頸部のリンパ腫および口腔癌）が含まれる。
【００４３】
さらに他の腫瘍抗原は、変異したまたは異常に発現した分子、例えば、限定されるものではないが、ＣＤＫ４およびβカテニン（黒色腫）である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、およびＣＤ２０からなる群から選択され得る。腫瘍抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５からなる群からも選択され得る。さらに別の実施形態において、腫瘍抗原は、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９からなる群から選択される。また、なおさらなる実施形態において、腫瘍抗原は、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１  ｒａｓ、ＲＣＡＳ  １、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ガンマ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、Ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択される。
【００４５】
癌または腫瘍抗原は、それらが関連する（すなわち、それによって発現される）癌または腫瘍に従っても分類され得る。腫瘍抗原に関連する癌または腫瘍としては、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６；ａｍ１１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）；バーキット（非ホジキン）リンパ腫（ＣＤ２０）；神経膠腫（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；ガンマ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ系細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、癌胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１  ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸部および食道の扁平上皮細胞癌（ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質および非感染性粒子）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、ならびに黒色腫（メランＡ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ｒａｓ；ｇｐ１００Ｐｍｅ１１７）が挙げられる。より好ましくは、本免疫サイトカインの抗体は、前記免疫サイトカインのサイトカイン部分に特異的に結合しないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に特異的に結合する抗体である。
【００４６】
本発明において使用され得る抗体の例としては、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、アリロクマブ（ＰＣＳＫ９）、アルシツモマブ（ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原））、アテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ−Ｌ１）、バシリキシマブ（ＣＤ２５（ＩＬ２受容体の鎖））、ベリムマブ（ＢＬｙＳ）、ベバシズマブ（ＣＤ１９）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ）、ブロダルマブ（ＩＬ−１７ＲＡ）、カプロマブ（腫瘍表面抗原ＰＳＭＡ）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ）、セルトリズマブペゴール（ＴＮＦａ）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、ダラツムマブ（ＣＤ３８）、ジヌツキシマブ（ＧＤ２）、デュピルマブ（ＩＬ−４Ｒα）、デュルバルマブ（ＰＤ−Ｌ１）、エファリズマブ（ＣＤ１１ａ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エボロクマブ（ＬＤＬ−Ｃ／ＰＣＳＫ９）、ファノレソマブ（ＣＤ１５）、ゴリムマブ（ＴＮＦａ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、インフリキシマブ（ＴＮＦα）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ネシツムマブ（ＣＤ２５（ＩＬ２受容体の鎖））、ニボルマブ（ＰＤ−１）、ノフェツモマブ（癌関連抗原）、オビヌツズマブ（ＣＤ２０）、オクレリズマブ（ＣＤ２０）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦＲ−α）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、ペムブロリズマブ（ＰＤ−１）、ペルツズマブ（ＨＥＲ２）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦ）、ラニビズマブ（ＶＥＧＦ−Ａ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、シルツキシマブ（ｃＣＬＢ８）、トシリズマブ（ＩＬ−６受容体）、トラスツズマブ（ＨＥＲ−２）、ベドリズマブ（インテグリン−α４β７）、ボツムマブ（サイトケラチン腫瘍関連抗原）が挙げられる。
【００４７】
切断可能ペプチドリンカー
「切断可能ペプチドリンカー」は、本明細書で使用する場合、酵素的に切断可能な（例えば、切断部位において）、抗体、またはその抗原結合フラグメントに共有結合的に結合した、およびサイトカイン、またはそのフラグメントに共有結合的に結合した多価リンカーを指す。本発明によれば、切断可能ペプチドリンカーの加水分解（タンパク質分解切断）時、サイトカイン部分、好ましくはＩＬ−１５が放出され、その治療活性を発揮することが可能となる。好ましい実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、免疫サイトカインの一部として組換え発現する。他の複数の実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、例えば、コンジュゲート化学を用いて、リンカーに結合した官能（反応）基を抗体、またはその抗原結合フラグメントと反応させることによって形成されるリンカーである。さらに他の複数の実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、例えば、コンジュゲート化学を用いて、リンカーに結合した官能（反応）基をサイトカイン、またはそのフラグメントと反応させることによって形成されるリンカーである。好ましい実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、サイトカイン、またはそのフラグメントを、抗体、またはその抗原結合フラグメントの重鎖と連結させる。別の実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、サイトカイン、またはそのフラグメントを、抗体、またはその抗原結合フラグメントの軽鎖と連結させる。切断可能ペプチドリンカーは、サイトカイン、またはそのフラグメントを、抗体、またはその抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖のうちの１つのＮ末端と連結させ得る。切断可能ペプチドリンカーは、サイトカイン、またはそのフラグメントを、抗体、またはその抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖のＣ末端と連結させることもあり得る。最も好ましくは、切断可能ペプチドリンカーは、サイトカイン、またはそのフラグメントを、抗体、またはその抗原結合フラグメントの重鎖のＮ末端またはＣ末端と連結させる。
【００４８】
本明細書において提供される切断可能ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含み得る。
【００４９】
「切断部位」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載の免疫サイトカインにおいて存在するリンカー（例えば、本明細書において上記の切断可能ペプチドリンカー）の部分の切断に関する認識可能部位を指す。このため、切断部位は、その実施形態を含め、本明細書に記載の切断可能ペプチドリンカーの配列において認められ得る。複数の実施形態において、切断部位は、切断剤により認識および切断されるアミノ酸配列（例えば、ペプチジル配列）である。例示的な切断剤としては、タンパク質、酵素、ＤＮＡザイム、ＲＮＡザイム、金属、酸、および塩基が挙げられる。例示的な切断部位は、本明細書において定義される（図７参照）。
【００５０】
「プロテアーゼ切断部位」は、本明細書で使用する場合、プロテアーゼにより認識および特異的に切断される切断部位である。好ましい実施形態によれば、プロテアーゼ切断部位は、腫瘍関連プロテアーゼ切断部位である。「腫瘍関連プロテアーゼ切断部位」は、本明細書で使用する場合、その発現が腫瘍細胞もしくはその腫瘍細胞環境に対して特異的であるか、または健常組織と比較して腫瘍細胞もしくは腫瘍環境において主に発現するか、または腫瘍細胞もしくは腫瘍環境においてのみ／主に活性である、プロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列を指す。複数の実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロテアーゼ切断部位、膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１）プロテアーゼ切断部位、ｕＰＡウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター切断部位、またはレグマインプロテアーゼ切断部位である。いくつかの実施形態において、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位は、ＭＭＰ９切断部位、ＭＭＰ１３切断部位、またはＭＭＰ２切断部位である。プロテアーゼ切断部位は、特異的なアミノ酸配列により指定され得るが、目的のプロテアーゼにより依然として認識および切断されるこの基準となるアミノ酸配列の任意のバリエーションも包含し得る。
【００５１】
好ましくは、切断可能ペプチドリンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位である。より好ましくは、切断可能ペプチドリンカーは、ＭＭＰ９切断部位またはＭＭＰ２切断部位を含んでなる。ＭＭＰ切断部位の例としては、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＧＰＬＧＬＷＡＱ、ＧＰＬＧＭＬＳＱ、ＰＬＧＬＡＧ、およびＰＶＧＬＩＧが挙げられる。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）切断部位である。ｕＰＡ切断部位の例としては、ＳＧＲＳ、ＳＧＲＳＡ、およびＰＳＳＳＲＲＲＶＮが挙げられる。
【００５３】
用語「ＭＭＰ２」または「ＭＭＰ２プロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）を指す。ＭＭＰ−２は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＩ：１８９２１７８５３によって同定されるタンパク質である。用語「ＭＭＰ−９」または「ＭＭＰ９プロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を指す。ＭＭＰ９は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＩ：７４２７２２８７によって同定されるタンパク質である。用語「ＭＭＰ１３」または「ＭＭＰ１３プロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）を指す。ＭＭＰ１３は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＬ４５０５２０９によって同定されるタンパク質である。用語「ＰＳＡ」または「ＰＳＡプロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、ガンマセミノプロテインまたはカリクレイン−３としても知られる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を指す。ＰＳＡは、ＮＣＢＩ配列参照ＧＬ７１８３４８５３によって同定されるタンパク質である。用語「ＰＳＭＡ」または「ＰＳＭＡプロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  Ｉ）またはＮＡＡＧペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を指す。ＰＳＭＡは、ＮＣＢＩ配列参照ＧＬ６２５４８８５８によって同定されるタンパク質である。用語「線維芽細胞関連タンパク質」は、本明細書で使用する場合、線維芽細胞関連タンパク質を指す。線維芽細胞関連タンパク質は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＬ１８８８３１６によって同定されるタンパク質である。用語「ＭＴ−ＳＰｌ」または「ＭＴ−ＳＰｌプロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰｌ）を指す。ＭＴ−ＳＰｌは、ＮＣＢＩ配列参照ＧＩ：１１４１５０４０によって同定されるタンパク質である。用語「レグマイン」または「レグマインプロテアーゼ」は、本明細書で使用する場合、レグマインタンパク質を指す。レグマインは、ＮＣＢＩ配列参照ＧＬ２８４２７５９によって同定されるタンパク質である。用語ｕＰＡは、本明細書で使用する場合、ＮＣＢＩ配列参照遺伝子ＩＤ：５３２８によって同定されるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターを指す。
【００５４】
いくつかの実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個のアミノ酸を含んでなる。他の複数の実施形態において、切断可能ペプチドリンカーは、５−ｍｅｒ（すなわち、５アミノ酸長のペプチド）、６−ｍｅｒ（すなわち、６アミノ酸長のペプチド）、７−ｍｅｒ（すなわち、７アミノ酸長のペプチド）、８−ｍｅｒ（すなわち、８アミノ酸長のペプチド）、９−ｍｅｒ（すなわち、９アミノ酸長のペプチド）、１０−ｍｅｒ（すなわち、１０アミノ酸長のペプチド）、１１−ｍｅｒ（すなわち、１１アミノ酸長のペプチド）、１２−ｍｅｒ（すなわち、１２アミノ酸長のペプチド）、または１３−ｍｅｒ（すなわち、１３アミノ酸長のペプチド）である。
【００５５】
最も好ましくは、前記切断ペプチドリンカーの前記配列は、ＧＰＬＧＩＡＧＱ、ＧＰＬＧＬＷＡＱ、ＧＰＬＧＭＬＳＱ、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＶＧＬＩＧ、ＳＧＲＳ、ＳＧＲＳＡ、およびＰＳＳＳＲＲＲＶＮからなる群から選択される。
【００５６】
サイトカイン
用語「サイトカイン」は、本明細書で使用する場合、免疫系に対する効果を有する小さな分泌調節タンパク質のファミリーのメンバーを指す。サイトカインは、細胞間情報交換に関与し、多くの細胞機能、例えば、細胞の生存および成長、ならびに多くの遺伝子の発現の誘導を調節する。このため、サイトカインの分泌は、多面的および効率的な様式での免疫シグナル伝達の急速な伝播を可能にする。サイトカインは、リンパ球および／または他の細胞に対する種々の効果を発揮することによって、免疫応答の性質、強度および持続時間を調節する。実際に、サイトカインは通常、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインに分類される。いくつかのサイトカインは、癌と戦うために免疫系を動員することもできる（例えば、Floros & Tarhini, Semin Oncol. 42(4): 539-548, 2015参照）。サイトカインは、免疫細胞および非免疫細胞を含む多くの細胞型によって産生され得る。サイトカインの例としては、とりわけ、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびケモカインが挙げられる。「サイトカイン」は、本明細書で使用する場合、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６、ＩＬ３７、ＩＬ−３８、ＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α１／１３、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７、およびＩＦＮ−α２１を含む）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β１、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＣＸＬ１０のいずれか１つであり得る。本発明によれば、サイトカインは、好ましくは、ＩＣＣに連結すると不活性化または減弱され、プロテアーゼによるＩＣＣの切断後にのみ活性化した。
【００５７】
前記サイトカインに関する用語「機能的フラグメント」は、抗体に対する同じ用語と本質的に同様であると解釈されるべきである（下記参照）。サイトカインの機能的フラグメントおよび誘導体は、天然に存在するサイトカインと同じ生理学的機能／活性を本質的に有するものである。
【００５８】
好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−１５である。「ＩＬ−１５」または「インターロイキン−１５」とは、本明細書において、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化および増殖を調節するサイトカインを指す。インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、配列がアクセッション番号ＮＰ＿０００５７６．１の下で入手可能な１１４個のアミノ酸から構成されるサイトカインの４α−ヘリックス束ファミリーの１４〜１５ｋＤａのメンバーである。ヒトＩＬ−１５とサルＩＬ−１５との間の配列同一性は９７％であり、ヒトとマウスとの間では７３％である。これは、ｈｕｌＬ−１５にとって、サルおよびマウス細胞に対して生物学的に活性とするのに十分であると思われる。
【００５９】
ＩＬ−１５は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と高い構造類似性を示す。ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ガンマ−Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、それを介してシグナルを伝達する。シグナル伝達の特異性は、その受容体（ＩＬ１５ＲＡ）のアルファユニットにより認識されるＩＬ１５によって確認されるが、一方、ＩＬ−２はＩＬ２ＲＡに結合する。ＩＬ−１５は、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＦＮγ）の産生、活性化Ｂ細胞の増殖およびｌｇ合成、ＴＨ１、単球およびリンホカイン活性化キラー細胞の活性化、肥満細胞およびＴ細胞の増殖を刺激し、Ｔ細胞およびＢ細胞のアポトーシスを阻害する。上記の機能活性に加えて、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生、生存および機能において中心的役割を果たす[Joost J. Oppenheim et al., Cytokine Reference; 213-221, (2002)]。ＩＬ−１５は、ＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖および細胞傷害機能を主に刺激し、抗腫瘍応答の増大をもたらすサイトカインである（Waldmann, J Investig Dermatol Symp Proc. 16(1): S28-30, 2013）。癌治療法としての見込みを最初に示したが、ＩＬ−１５の有効性は、その短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期によって制限された。しかしながら、新規なＩＬ−１５ベースの療法が開発されており、現在臨床試験中である（Robinson & Schluns, Immunol Lett. 190: 159-168, 2017）。本発明者らは今回、ＩＬ−１５は、抗体部分と融合した際には活性ではなく、リンカーの切断によって放出されて初めて活性化することを示した。ＩＬ−１５を含んでなる免疫サイトカインは、それらが切断される腫瘍にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて局在する。このことにより、短い半減期の問題を回避することが可能となる。さらに、活性サイトカインは、それが必要とされる部位に送達され、副作用のリスクが低減する。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、サイトカインはＣＸＣＬ１０である。「ＣＸＣＬ１０」または「Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０」または「インターフェロンガンマ−誘導タンパク質１０」または「ＩＰ１０」とは、本明細書において、活性化リンパ球およびメモリーリンパ球を炎症の部位に動員するように機能する８．７ｋＤａのＣＸＣケモカインを指す。分泌生物活性型（シグナルペプチドの切断後）は、ＣＸＣＲ３受容体に結合する、本明細書において「ロングＣＸＣＬ１０」と名付けられた、７７残基（ＮＰ＿００１５５６の２２〜９８位に相当）のポリペプチドである。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３を介したＣＸＣＬ１０シグナル伝達は、リンパ球の遊走および機能において重要な役割を果たす。注目すべきことに、ＣＸＣＬ１０は、Ｔ細胞依存性抗癌免疫を増強させるようである（Karin et Razon, Cytokine, 109:24-28, 2018）。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、サイトカインはＩＬ−３６である。本明細書で使用する場合、表現「ＩＬ−３６」または「ｈＩＬ−３６」または「インターロイキン−３６」は、炎症促進特性を有するＩＬ−１ファミリーのサブグループを指す（例えば、Murrieta-Coxca, Int J Mol Sci., 20(7). pii: E1649, 2019参照）。「ＩＬ−３６」とは、特に、ＩＬ−３６α（ＩＬ−１Ｆ６）、ＩＬ−３６β（ＩＬ−１Ｆ８）、およびＩＬ−３６γ（ＩＬ−１Ｆ９）を指す。本明細書で使用する場合、「ＩＬ−３６α」は、配列がアクセッション番号ＮＰ＿０５５２５５の下で入手可能な１５８アミノ酸タンパク質を指し、「ＩＬ−３６β」は、２つのアイソフォーム（アクセッション番号：ＮＰ＿０５５２５３およびＮＰ＿７７５２７０）を有する１５７アミノ酸タンパク質を指し、「ＩＬ−３６γ」は、２つのアイソフォーム（アクセッション番号：ＮＰ＿００１２６５４９７およびＮＰ＿０６２５６４）を有する１６９アミノ酸タンパク質を指す。ＩＬ−３６α、ＩＬ−３６β、およびＩＬ−３６γは、炎症促進活性を有するアゴニストリガンドである。それらは、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、および抗菌ペプチドを含む種々の炎症性メディエーターの誘導を促進する。それらの総てが同じ受容体、ＩＬ−３６Ｒを使用するが、この受容体は、ＩＬ−１ＲＡｃＰと二量体化し、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。この経路は、ＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）およびＮＦ−ｋＢ転写因子により駆動される炎症性サイトカインの発現とともに最高に達する。
【００６２】
さらに別の好ましい実施形態において、サイトカインはＩＦＮαである。本明細書で使用する場合、表現「ＩＦＮα」または「ＩＦＮ−α」または「インターフェロンα」は、免疫系の活性の調節を助けるインターフェロンタンパク質の大きなサブグループである、ヒトＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）のサブタイプを指す。ＩＦＮ−αを含む総てのＩＦＮ−Ｉは、ＩＦＮＡＲ１鎖およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的な細胞表面受容体複合体に結合する（例えば、Lopez de Padilla & Niewold, Gene, 576(1 Pt 1): 14-21, 2016参照）。１２種類の機能性ヒトＩＦＮ−αタンパク質（ＩＦＮ−α１／１３、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α７、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α１６、ＩＦＮ−α１７、およびＩＦＮ−α２１）が存在し、その総てが、それらの一次、二次、および三次構造において高い相同性を示す。ＩＦＮＡ遺伝子（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ３、ＩＦＮ４、ＩＦＮ５、ＩＦＮ６、ＩＦＮ７、ＩＦＮ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１）のそれぞれが、２３アミノ酸シグナルペプチドを含んでなるプレタンパク質をコードしており、このプレタンパク質は、分泌時に切断され、その結果、成熟１６６残基タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＱＮＢ６）を生じるが、１６５アミノ酸のみ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０１５６３）から構成されるＩＦＮ−２は除かれる。実際に、ＩＦＮ−αの他のサブタイプの４４位に存在するアスパラギン酸残基は、ＩＦＮ−α２では欠いている。
【００６３】
この実施形態によれば、本発明は、
（ｉ）以下と融合している抗体または抗原結合フラグメント、
（ｉｉ）切断可能ペプチドリンカー、および
（ｉｉｉ）サイトカイン、好ましくは、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−３６、もしくはＩＦＮ−α、またはその機能的フラグメント
を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００６４】
ペプチド切断リンカーおよびサイトカインを同定する方法
本発明者らは、本融合タンパク質における使用に好適なリンカーを同定することが可能であることを示した。実験データは、いくつかのリンカーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて切断されるか否かに従って識別できることを示している。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果の妥当性は、このように同定されたリンカー総てがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて切断され、それにより、腫瘍の部位で活性サイトカインが遊離されるという事実によって、強調されている。
【００６５】
このため、別の側面において、切断可能ペプチドリンカーを選択する方法が、本明細書において提供される。この方法は、以下の工程：
（ｉ）試験される切断可能ペプチドリンカーを含んでなる、本明細書に記載の融合タンパク質を提供すること；
（ｉｉ）前記融合タンパク質を関連するプロテアーゼと接触させること；および
（ｉｉｉ）前記融合タンパク質の切断を検出すること
を含んでなる。
【００６６】
ある実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施される。別の実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施される。この特定の実施形態によれば、方法の工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の融合タンパク質を哺乳動物、好ましくは、齧歯類、最も好ましくは、マウスに投与することを含んでなる。
【００６７】
リンカーの切断の検出は、当業者に利用可能な任意の手段によって行うことができる。これは特に、特異抗体を用いて、特に、周知の技術、例えば、特異抗体を用いた免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、抗体マイクロアレイ、または免疫組織化学と組み合わせた組織マイクロアレイを用いて、実施され得る。他の好適な技術としては、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ、単一または複数の励起波長を用いた、ならびに適合した光学的方法、例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリー法およびアンペロメトリー法）、原子間力顕微鏡法、および高周波法、例えば、多極共鳴分光法、共焦点および非共焦点の、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折率または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、格子カプラー導波管法または干渉法）、細胞ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、放射性同位体画像法、磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析；ＨＰＬＣ−質量分析；液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のいずれかを適用した、単一細胞顕微鏡法または組織化学法が挙げられる。
【００６８】
あるいは、リンカーの切断は、機能試験で検出することもできる。注目すべきことに、リンカーの加水分解は、活性サイトカイン部分を放出するが、前記サイトカイン部分は、融合タンパク質の一部である場合、減弱した。この実施形態において、方法の工程（ｉｉｉ）は、サイトカイン部分の活性を測定することを含んでなる。好ましくは、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）における関連するプロテアーゼと接触している前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性を、プロテアーゼと接触していない前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性と比較することをさらに含んでなる。好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）における関連するプロテアーゼと接触している前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性が、無処置融合タンパク質のサイトカイン部分の活性と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも３倍、好ましくは、少なくとも４倍、好ましくは、少なくとも５倍、好ましくは、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも２０倍、好ましくは、少なくとも５０倍、好ましくは、少なくとも１００倍増加している場合、リンカーは切断される。より好ましくは、サイトカイン部分の活性が少なくとも１０倍増加している場合、リンカーは切断される。
【００６９】
さらに、サイトカインおよびその変異体は、本免疫サイトカインにおけるそれらの適合性に関して容易に試験できることが、直ちに明らかである。「サイトカイン変異体」は、本明細書で使用する場合、主要種のサイトカインと異なるサイトカインを指す。例えば、サイトカイン変異体は、主要種のサイトカインと異なるアミノ酸配列を有し得る。通常、変異体は、主要種のサイトカインと少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは、主要種のサイトカインと少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％相同となる。サイトカイン変異体は、主要種のサイトカインのアミノ酸配列内またはそれに隣接した特定の位置で、置換、欠失、および／または付加を有する。あるいは、サイトカイン変異体は、少なくとも１つの翻訳後修飾において、主要種のサイトカインと異なり得る。例えば、サイトカイン変異体は、主要種の抗体に結合した１つ以上の糖質部分と異なる、サイトカイン変異体に結合した１つ以上の糖質部分を保有し得る。
【００７０】
このため、別の側面において、サイトカインまたはその変異体を選択する方法が、本明細書において提供される。この方法は、以下の工程：
（ｉ）試験されるサイトカインまたはその変異体を含んでなる、本明細書に記載の融合タンパク質を提供すること；
（ｉｉ）前記融合タンパク質を関連するプロテアーゼと接触させること；および
（ｉｉｉ）前記サイトカインの活性を検出すること
を含んでなる。
【００７１】
ある実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施される。別の実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施される。この特定の実施形態によれば、方法の工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の融合タンパク質を哺乳動物、好ましくは、齧歯類、最も好ましくは、マウスに投与することを含んでなる。
【００７２】
サイトカインまたは変異体が、本明細書に記載の免疫サイトカインにおける使用に好適である場合、リンカーの加水分解は、活性サイトカイン部分を放出するが、前記サイトカイン部分は、融合タンパク質の一部である場合、減弱する。この実施形態において、方法の工程（ｉｉｉ）は、サイトカイン部分の活性を測定することを含んでなる。好ましくは、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）における関連するプロテアーゼと接触している前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性を、プロテアーゼと接触していない前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性と比較することをさらに含んでなる。好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）における関連するプロテアーゼと接触している前記融合タンパク質のサイトカイン部分の活性が、無処置融合タンパク質のサイトカイン部分の活性と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも３倍、好ましくは、少なくとも４倍、好ましくは、少なくとも５倍、好ましくは、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも２０倍、好ましくは、少なくとも５０倍、好ましくは、少なくとも１００倍増加している場合、サイトカインまたはサイトカイン変異体は活性である。より好ましくは、前記活性が少なくとも１０倍増加している場合、サイトカインまたはサイトカイン変異体は活性である。
【００７３】
当業者は、前記サイトカインの性質に応じて、サイトカイン部分の活性を測定する方法を分かるであろう。サイトカイン活性は、限定されるものではないが、酵素フラグメント補完（Eglen J Biomol Screen. 2004 Aug;9(5):398-408）、近接ライゲーションアッセイ（Andersen et al. Cytokine. 2013 Oct;64(1):54-7）、ＮＦ−κＢトランスロケーション（Trask 2012, Assay Guidance Manual [インターネット]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-2012 Oct 1.）ベータ−アレスチン動員（Wang Assay Guidance Manual [インターネット]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-2017 Nov 20.）、生物発光共鳴エネルギー移動（Compan Methods Mol Biol. 2016; 1417:89-95）の技術を含む種々の方法によって決定することができる。これらの方法は、広範囲のサイトカインに対して使用されており、必要に応じて、目的の特定のサイトカインの必要性に対して容易に適合され得る。
【００７４】
当業者は、特に、このようなアッセイの例が記載されている本出願の実験の項を参照するであろう。
【００７５】
免疫サイトカインをコードするポリヌクレオチド
上記の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドも、本明細書において提供される。例えば、上記で定義されるように、本明細書において提供される融合タンパク質または改変融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば、上記で定義したように、高いストリンジェンシー、中程度または低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも、本明細書において提供される。
【００７６】
特定の複数の実施形態において、本明細書において提供される核酸分子は、本明細書において提供される切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合しているＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる、またはそれからなる。他の複数の実施形態において、本明細書において提供される核酸分子は、さらなる配列と融合していないＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる、またはそれからなる。さらに他の実施形態において、本明細書において提供される核酸分子は、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合しているＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列と、さらなる配列と融合していないＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列との組合せを含んでなる、またはそれからなる。好ましくは、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合しているＶＨアミノ酸配列をコードする核酸配列は、さらなる配列と融合していないＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列と組み合わされる。あるいは、前記組合せは、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合しているＶＬアミノ酸配列をコードする核酸配列と、さらなる配列と融合していないＶＨアミノ酸配列をコードする核酸配列とを含んでなる。
【００７７】
抗体の組換え発現
本明細書に記載の本免疫サイトカインを発現させるために、種々の発現系が使用され得る。一つの側面において、このような発現系は、目的のコード配列が産生され、その後に精製され得るビヒクルを表すが、適当なヌクレオチドコード配列で一過性にトランスフェクトされた場合、ｉｎ  ｓｉｔｕで本発明の抗体を発現し得る細胞も表す。
【００７８】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。一つの実施形態において、ベクターは、本発明の免疫サイトカインの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、前記重鎖は、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合している、またはしていない。別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本発明の免疫サイトカインの軽鎖をコードし、前記軽鎖は、切断可能ペプチドリンカーおよびサイトカインと融合している、またはしていない。本発明はまた、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、改変抗体、抗体フラグメント、およびそれらのプローブを含んでなるベクターを提供する。
【００７９】
本明細書に開示される免疫サイトカインの重鎖および／または軽鎖を発現させるために、前記重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、遺伝子が転写配列および翻訳配列と動作可能に連結されるように、発現ベクターに挿入する。
【００８０】
「動作可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現調節配列、および目的の遺伝子を調節するようにトランスでまたは離れて作用する発現調節配列の両方を含む。用語「発現調節配列」は、本明細書で使用する場合、ライゲート対象のコード配列の発現およびプロセシングを引き起こすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列は、適当な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増大させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増大させる配列；ならびに望ましい場合、タンパク質の分泌を増大させる配列を含む。このような調節配列の性質は、宿主生物体に応じて異なり、原核生物においては、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物においては、一般に、このような調節配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「調節配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である総ての成分を含むものとし、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【００８１】
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターのうちの１種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムの中にライゲートされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。
【００８２】
特定のベクターは、それらが動作可能に連結される遺伝子の発現を方向付けることができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、このような形態の発現ベクター、例えば、細菌プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、ならびに本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を保証するのに好都合であると当業者が分かるその他の総てのベクターを含むものとする。当業者は、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、異なるベクターに、または同じベクターにおいてクローン化され得ることを理解するであろう。好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、２つのベクターにクローン化される。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドおよびこれらの分子を含んでなるベクターは、好適な宿主細胞のトランスフォーメーションのために使用することができる。用語「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、本免疫サイトカインを発現するために組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すものとする。係る用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すものとすることが理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかが原因で特定の修飾が後世に生じ得るため、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでも、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００８４】
トランスフォーメーションは、ポリヌクレオチドを細胞宿主に導入する任意の公知の方法によって行うことができる。このような方法は、当業者に周知であり、デキストラン媒介トランスフォーメーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、バイオリスティックインジェクションおよび核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【００８５】
宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現するベクターを含む、２つ以上の発現ベクターでコトランスフェクトしてもよい。特に、他の発現ベクターは、グリコシル化などの翻訳後修飾に関与する酵素をコードし得る。例えば、宿主細胞は、上記の免疫サイトカインをコードする第１のベクター、およびグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第２のベクターでトランスフェクトすることができる。あるいは、宿主細胞は、上記の、免疫サイトカインをコードする第１のベクター、グリコシルトランスフェラーゼをコードする第２のベクター、および別のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第３のベクターで形質転換することができる。哺乳動物細胞は、組換え治療用免疫グロブリンの発現、特に全組換え抗体の発現のために一般的に使用される。例えば、ベクターとともに、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーターエレメントを保有するものなどの発現シグナルを含む、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、本免疫サイトカインを発現するための効果的な系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。
【００８６】
挿入配列の発現を調節し、所望の特異的な様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞を選択することもできる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシングは、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特徴および特異的な機序を有する。目的の発現抗体の正確な修飾およびプロセシングを保証するために、適当な細胞株または宿主系が選択される。したがって、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ／０、ＢＨＫ、Ｙ２／０、３Ｔ３または骨髄腫細胞が挙げられる（これらの細胞株は総て、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、パリ、フランスなどの公共の寄託機関から、またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナサス、バージニア州、米国にて入手可能である）。
【００８７】
組換えタンパク質の長期の高収率の製造のためには、安定した発現が好ましい。本発明の一つの実施形態において、免疫サイトカインを安定して発現する細胞株が設計され得る。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および当業者に公知の他の適当な配列、および選択可能マーカーを含む適当な発現調節エレメントの制御下のＤＮＡで形質転換される。外来ＤＮＡの導入後、設計された細胞を、栄養強化培地中で１〜２日間成長させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド上の選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドを染色体内に安定して組み込み、細胞株へと増やされることを可能にする。安定した細胞株を構築する他の方法は、当技術分野で公知である。特に、部位特異的組込みの方法が開発されている。これらの方法によれば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、および他の適当な配列を含む適当な発現調節エレメントの制御下の形質転換ＤＮＡが、以前に切断されている特異的標的部位において宿主細胞ゲノムに組み込まれる（Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; US 5,792,632; US 5,830,729; US 6,238,924; WO 2009/054985; WO 03/025183; WO 2004/067753、これら総ては、引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００８８】
多数の選択系を使用することができ、その例としては、限定されるものではないが、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞それぞれにおける、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223, 1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202, 1992）、メチオニンスルホキシミドの存在下でのグルタミン酸シンターゼ選択（Adv Drug Del Rev, 58:671, 2006, およびＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．のウェブサイトまたは文献）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:817, 1980）遺伝子が挙げられる。また、代謝拮抗剤抵抗性を、以下の遺伝子に対する選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ（メトトレキサートに対する抵抗性を与える）（Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980）；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する抵抗性を与える）（Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981）；ｎｅｏ（アミノグリコシド、Ｇ−４１８に対する抵抗性を与える）（Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える）（Santerre et al., Gene 30: 147, 1984）。組換えＤＮＡ技術の当技術分野で公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために慣例的に適用され得、そのような方法は、例えば、Ausubel et al.編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)において記載されている。免疫サイトカインの発現レベルは、ベクターの増幅によって増加され得る。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加すれば、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域は、目的の免疫サイトカインをコードする遺伝子と関連するため、前記免疫サイトカインの産生も増加する（Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983）。本発明の遺伝子を発現させる代替法が存在し、それは当業者に公知である。例えば、本発明の遺伝子の上流にある発現調節エレメントと結合することができる改変ジンクフィンガータンパク質を設計することができ、本発明の宿主細胞における前記設計されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＮ）の発現は、タンパク質産生の増加をもたらす（例えば、Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5), 1180-1189, 2006参照）。さらに、ＺＦＮは、所定のゲノム位置へのＤＮＡの組込みを刺激することができ、その結果、高効率の部位特異的遺伝子付加をもたらす（Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA 104:3055, 2007）。
【００８９】
本発明の免疫サイトカインは、所望の抗体を発現させるのに必要な培養条件下で形質転換宿主細胞の培養物を成長させることにより、調製してもよい。次いで、得られた発現免疫サイトカインは、培養培地または細胞抽出物から精製され得る。可溶型の免疫サイトカインは、培養上清から回収することができる。次いで、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、Ｆｃに対するプロテインＡアフィニティーによる、など）、遠心分離、溶解度差またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製してもよい。好適な精製方法は、当業者に明らかであろう。
【００９０】
本明細書において提供される免疫サイトカインは、腫瘍部位に向かうと、切断され、その結果、抗腫瘍活性を有するＩＬ−１５などのサイトカインを放出する。さらに、抗体部分のいくつかは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答を誘導することができ、および／または内因性抗腫瘍活性を有する。このため、本明細書において提供される免疫サイトカインは、転移性腫瘍および癌などの疾患の処置において有用であることが、当業者により認識されるであろう。
【００９１】
用語「処置すること」または「処置」は、統計学的に有意な程度または当業者に検出可能な程度のいずれかまで、病態、症状、もしくは障害に関連するパラメーターを改善する、または障害（障害により引き起こされる二次損傷を含む）の進行もしくは悪化を予防するのに有効な量、様式、および／またはモードで、本明細書に記載の組成物を投与することまたはそれの投与を指す。
【００９２】
本発明の別の側面は、本明細書に記載の免疫サイトカインの医薬組成物に関する。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、本発明の免疫サイトカインに加えて、種々の希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当技術分野で周知の他の材料を含み得る。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、緩衝剤、塩溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体の種類は、意図する投与経路に基づき選択され得る。種々の実施形態において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮または経口投与に好適である。薬学上許容可能な担体は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射用液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学上有効な物質のための培地および剤の使用は、当技術分野で周知である。以下に記載するように、さらなる有効化合物も、組成物に組み込むことができ、例えば、抗癌剤および／または抗血管新生剤が挙げられ、特に、さらなる有効化合物は、抗血管新生剤、化学療法剤、または低分子量剤であり得る。静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および１００ｍｇの組合せを含むように調製され得る。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第１７版， Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)、ならびにその第１８版および第１９版においてより詳細に記載されており、それらは、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００９５】
組成物中に存在する免疫サイトカインは、好ましくは、有効量で処方される。「有効量」は、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導など、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間で有効な量を指す。「治療上有効な量」は、特定の病態の治療経過に影響を及ぼすのに十分な量を意味する。治療上有効な量はまた、剤のいずれかの毒性作用または有害作用を、治療上有益な効果が上回る量でもある。
【００９６】
治療適用では、免疫サイトカインは、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によって、一定期間ボーラスとしてまたは持続注入によってヒトに静脈内投与され得るものを含む、上記で考察したものなどの薬学上許容可能な投与形で、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与される。免疫サイトカインはまた、局所的および全身的治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲経路によっても好適に投与される。腹腔内経路は、例えば、卵巣腫瘍の処置において特に有用であることが予想される。投与計画は、最適な応答をもたらすように調整してもよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割量を経時的に投与してもよいし、または用量を比例的に減量もしくは増量してもよい。製剤を調製する分野の当業者ならば、選択された製品の特定の特徴、処置される疾患または病態、疾患または病態の病期および他の関連する状況に応じて、投与の適切な形態およびモードを容易に選択することができる。
【００９７】
本発明の組成物は、対象において細胞成長活性をもたらすために、対象に投与され得る。本明細書で使用する場合、用語「対象」は、アポトーシスが誘導され得る生物体を含むものとし、具体的には、哺乳動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サルのトランスジェニック種、好ましくは、ヒトを含む。
【００９８】
癌の予防または処置における免疫サイトカインの有効性は、前記免疫サイトカインを連続的に投与することによって、またはそれらの目的に有効な別の剤、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、酸性もしくは塩基性の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の血管新生活性を阻害もしくは中和することができるアンタゴニスト、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、もしくは肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、組織因子、タンパク質Ｃ、もしくはタンパク質Ｓの凝集活性を阻害もしくは中和することができるアンタゴニスト（ＷＯ９１／０１７５３参照）、ＨＥＲ２受容体に結合することができる抗体などのアンタゴニスト（ＵＳ５，７７２，９９７参照）、または１つ以上の従来の治療剤、例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質、ピリミジン類似体、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、もしくはコルチコステロイドと組み合わせて投与することによって、改善され得る。
【００９９】
さらに、本発明の医薬組成物はまた、免疫細胞、特にＴ細胞または単球の活性化および／または機能を調節することができる別の剤を含んでなってもよい。特に、本発明の医薬組成物は、共抑制分子に対する治療上有効な量のアンタゴニストをさらに含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、共抑制分子は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ブチロフィリン、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、ＴＩＭ−３、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ガレクチン９、ＴＩＭ３、ＣＤ４８、２Ｂ４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３およびＴＩＧＩＴからなる群から選択される。共抑制分子に対するアンタゴニストは、共抑制分子に対する抗体を含む。他の共抑制分子に対するアンタゴニストは、例えば、Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015)、Kyi et al., FEBS Letters, 588:368-376 (2014)およびPardoll, Nature Reviews, 12:252-264 (2012)に記載のものなど、当技術分野で周知であることが認識される。いくつかの他の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、共刺激分子に対する治療上有効な量のアゴニストをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、共刺激分子は、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳＬ、サイトカイン、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、Ｂ７−Ｈ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ４、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、およびＣＤ２２６からなる群から選択される。共刺激分子に対するアゴニストは、共刺激分子に対するアゴニスト抗体を含む。他の共刺激分子に対するアゴニストは、例えば、Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015)、Kyi et al., FEBS Letters, 588:368-376 (2014)およびCapece et al., J. Biomed. Biotechnol. 2012:926321, 17頁(2012)に記載のものなど、当技術分野で周知であることが認識される。
【０１００】
本発明の別の側面において、投与は、治療上有効な量の化学療法剤、例えば、タキソール（パクリタキセル）またはタキソテール（ドセタキセル）の投与と組み合わされる。
【０１０１】
化学療法剤としては、何ら限定されるものではないが、抗微小管剤、例えば、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイド；白金配位錯体；アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホン酸塩、ニトロソウレア、およびトリアゼン；抗生物質剤、例えば、アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン；代謝拮抗剤、例えば、プリンおよびピリミジン類似体および抗葉酸化合物；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管新生阻害剤；免疫治療剤；アポトーシス促進剤；ならびに細胞周期シグナル伝達阻害剤が挙げられる。さらに、本発明の方法は、別の抗癌治療法、抗血管新生剤、または化学療法剤または放射線療法と組み合わせることができる。好ましい例は、ドセタキセルまたはタキソテールである。他の例としては、ゲムシタビン、シスプラチン、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ダカルバジン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ダカルバジン、限定されるものではないが、アクチノマイシン、例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン、ブレオマイシン、エピポドフィロトキシン、エトポシドおよびテニポシドを含む抗新生物剤；代謝拮抗新生物剤、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、カンプトテシン、イリノテカンＨＣＩ、ならびにトポテカンＨＣＩが挙げられる。
【０１０２】
種々の異なる化学療法剤または抗癌ポリペプチドも、選択することができる。www.clinicaltrials.gov、www.ncbi.nlm.nihおよびwww.drugs.comなどの情報源は、選択することができるポリペプチドおよび剤に対する参照を含む。
【０１０３】
本発明の免疫サイトカインおよび医薬組成物は、いくつかの種類の癌の処置または予防において特に有用である。
【０１０４】
このため、本発明の別の側面は、癌の処置における使用のための本明細書に記載の免疫サイトカインに関する。
【０１０５】
本発明はまた、癌の処置における使用のための本明細書に記載の免疫サイトカインを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１０６】
本免疫サイトカインにより処置され得る癌は、前記免疫サイトカインの抗体部分によって認識される抗原が発現される癌である。これらの癌は、（限定されるものではないが）以下を含む：膀胱、乳、結腸、頭頸部、前立腺、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚のものを含む、ならびに扁平上皮癌を含む、癌腫および腺癌；多発性骨髄腫、白血病、急性および慢性リンパ球性（またはリンパ性）白血病、急性および慢性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）を含む、リンパ系の造血腫瘍；急性および慢性骨髄性（骨髄性または骨髄球性）白血病、および前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血腫瘍；線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉系起源の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍；ならびに黒色腫、奇形癌腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、および精上皮腫を含む、他の腫瘍、ならびに前記抗原が発現されるまだ決定されていない他の癌。前記免疫サイトカインの抗体部分によって認識される抗原が発現される癌とは、本明細書において、正常成熟細胞上の前記抗原の発現レベルと比較して、前記抗原の高い発現を示す癌を指す。
【０１０７】
上記の他の剤、例えば、抗血管新生剤または化学療法剤は、投与される組成物中に存在してもよいし、または別々に投与してもよい。本発明の一つの側面において、投与は、同時に、別々にまたは時間をかけて逐次的にのいずれかで、他の有効成分とともに行われる。投与が同時に行われる場合、２つの有効成分を、錠剤またはゲルカプセル剤などの２つの組成物を含んでなる単一の医薬組成物中で組み合わせてもよい。他方、２つの有効成分は、それらが同時に投与されるか否かを問わず、別々の医薬組成物中に存在してもよい。この目的を達成するため、組合せは、一方で本明細書に記載の免疫サイトカインを、他方で第２の有効成分を含んでなるキットの形態であってもよく、本明細書に記載の免疫サイトカインおよび第２の有効成分は、別々の区画に入れられ、同時に、別々に、または時間をかけて逐次的に投与されるものとする。
【０１０８】
本組合せは、特に、化学療法、タンパク質療法（すなわち、抗体または組換えタンパク質などの治療剤を用いた）、遺伝子療法、放射線療法、免疫療法、外科的介入、またはこれらの組合せと組み合わせて、癌を処置するために投与することができる。上記のように、他の処置戦略の文脈において、長期療法が、アジュバント療法と等しく可能である。
【０１０９】
ＩＬ−１５などのサイトカインは、高度に特異的な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することができる。例えば、ＩＬ−１５の投与は、抗腫瘍応答を媒介するのに最も適したまさに細胞型である、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞における選択的活性化および増殖を誘導する（Waldmann, J Investig Dermatol Symp Proc. 16(1): S28-30, 2013）。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、免疫サイトカインは、前記免疫サイトカインのサイトカイン部分、好ましくは、ＩＬ−１５の結合によって媒介される、免疫細胞機能を調節する方法において使用することができる。好ましくは、前記免疫細胞は、Ｔ細胞または単球である。このような方法は、免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞または単球を、本明細書に記載の免疫サイトカインと接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞（特にＴ細胞または単球）機能を調節する方法は、本明細書において提供される免疫サイトカインを含んでなる有効量の組成物を、対象に投与することを含む。いくつかの側面において、調節されるＴ細胞機能は、Ｔ細胞活性化を増大させることを含む。このようなＴ細胞活性化は、Ｔ細胞増殖を増大させることをさらに含み得る。いくつかの側面において、調節される単球機能は、抗癌サイトカインの分泌を増大させることを含む。免疫応答の調節をアッセイする方法は、当業者に周知であり、当業者はこのようなアッセイを容易に実施できるであろうことが理解される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のものを含む、免疫サイトカインまたは免疫サイトカインを含んでなる組成物は、単独で、または別の化合物または処置と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、他の化合物は、共抑制分子に対するアンタゴニストまたは共刺激分子に対するアゴニストである。このような実施形態において、組合せ療法は、化合物または処置のいずれかの個別の投与よりも大きな活性化Ｔ細胞を介した免疫系の再活性化または新規活性化をもたらす。免疫系のこの活性化は、癌の処置における非常に有益な生理学的応答をもたらすであろう。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、治療上有効な量の免疫サイトカインを、共抑制分子に対する治療上有効な量のアンタゴニストと組み合わせて投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、共抑制分子は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ブチロフィリン、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、ＴＩＭ−３、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ガレクチン９、ＴＩＭ３、ＣＤ４８、２Ｂ４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３およびＴＩＧＩＴからなる群から選択される。共抑制分子に対するアンタゴニストは、共抑制分子に対する抗体を含む。他の共抑制分子に対するアンタゴニストは、例えば、Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015)、Kyi et al., FEBS Letters, 588:368-376 (2014)およびPardoll, Nature Reviews, 12:252-264 (2012)に記載のものなど、当技術分野で周知であることが認識される。この実施形態によれば、本発明は、上記の癌の処置における使用のための免疫サイトカインに関し、前記使用は、共抑制分子に対するアンタゴニストの投与をさらに含んでなり、ここで、前記共抑制分子は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＰＤＬ−１、ＰＤＬ−２、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ブチロフィリン、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、ＴＩＭ−３、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ１、ガレクチン９、ＴＩＭ３、ＣＤ４８、２Ｂ４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３およびＴＩＧＩＴからなる群から選択される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、治療上有効な量の免疫サイトカインを、共刺激分子に対する治療上有効な量のアゴニストと組み合わせて投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、共刺激分子は、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳＬ、サイトカイン、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、Ｂ７−Ｈ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ４、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、およびＣＤ２２６からなる群から選択される。共刺激分子に対するアゴニストは、共刺激分子に対するアゴニスト抗体を含む。共刺激分子に対するアゴニストは、例えば、Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015)、Kyi et al., FEBS Letters, 588:368-376 (2014)およびCapece et al., J. Biomed. Biotechnol. 2012:926321, 17頁(2012)に記載のものなど、当技術分野で周知であることが認識される。この実施形態によれば、本発明は、上記の癌の処置における使用のための免疫サイトカインに関し、前記使用は、共刺激分子に対するアゴニストの投与をさらに含んでなり、ここで、前記共刺激分子は、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳＬ、サイトカイン、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、Ｂ７−Ｈ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ４、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、およびＣＤ２２６からなる群から選択される。
【０１１４】
以下の実施例は、本発明の範囲および本開示の内容の単なる例示である。当業者ならば、本発明の範囲から逸脱することなく、以下に記載の実施例に対する多数の改変を考案および構築することができる。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：構築物の配列：
１．配列
【０１１６】
【表１】
2022502443.tif 000002
【０１１７】
【表２】
2022502443.tif 000003
【０１１８】
【表３】
2022502443.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2022502443.tif 000005
【０１２０】
【表５】
2022502443.tif 000006
【０１２１】
【表６】
2022502443.tif 000007
【０１２２】
【表７】
2022502443.tif 000008
2022502443.tif 000009
2022502443.tif 000010
【０１２３】
１．２．免疫サイトカイン（ＩＣＣ）の取得
全ＩＣＣ（項目１．配列参照）をコードする配列を、シグナルペプチド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を用いることにより、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターにクローン化した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＤＮＡ配列を、Ｐｒｏｍｅｇａ社から得た。リンカー修飾を、Ｑ５変異誘発（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）により達成した。Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で密度２．５×１０６／ｍｌまで成長させ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、ＤＮＡ／ＰＥＩ比：１／４）を用いて１．２５μｇ／ｍｌのＤＮＡ（ＨＣ／ＬＣ：１／１ｗ／ｗ）でコトランスフェクトしたＥｘｐｉ  ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）における一過性タンパク質発現により、融合タンパク質を得た。次いで、２ｍＭのバルプロ酸（ＶＰＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、トランスフェクションの３時間後に加えた。産生された融合タンパク質を含有する上清を、トランスフェクションの６日後に回収した。タンパク質を、プロテインＡ−セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％サッカロースｐＨ５．５に対する一晩の透析により処方した。実現した構築物のいくつかを、図１に要約する。
【０１２４】
Ａｂ上のリンカー−サイトカインの位置（すなわち、融合部位）を、図２で説明する。
【０１２５】
実施例２：ＬＣ−ＭＳ分析による免疫サイトカインの形成および完全性の証明
２．１．材料と方法：
総ての精製ＩＣＣを、非還元加熱条件下および還元加熱条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けた。ｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５およびＨ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動を、図２２に示す。ＳＤＳ  ＰＡＧＥから推定された見かけのＩＣＣ分子量は、理論計算で予想されたものと一致していた。各ＩＣＣに対して少なくとも８０％が、完全ＩＣＣ（Ｈ２Ｌ２）であった。ＩＣＣの単量体含量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した。
【０１２６】
ＩＣＣの完全性も、グリコシル化ＩＣＣおよびＩｄｅＳ消化後の脱グリコシル化ＩＣＣに対するＬＣ−ＭＳによって検証した。逆相分離を、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２ｓｉ質量分析計と連結された超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システム（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏシステム、Ｗａｔｅｒｓ社）で行い、機器制御を、ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて行った。
【０１２７】
ｃ９Ｇ４ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５、ｃ９Ｇ４ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＮＦａ、ｃ９Ｇ４ＰＶＧＬＩＧ−ｈＣＣＬ４に対して、製造業者の説明書に従って、ＩＣＣのμｇあたり酵素１単位の濃度で、ＩｇＧＺＥＲＯ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｅｎｏｖｉｓ社）でＩＣＣ溶液を３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、Ｆｃ領域の脱グリコシル化を行った。ＩＬ１５部分でのＮ−グリコシル化を行うＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５およびＨ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５に対して、２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、５０００００Ｕ／ｍＬ）および２μＬのノイラミニダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、５００００Ｕ／ｍＬ）を２５μｇのサンプル溶液に加え、次いで、３７℃で一晩インキュベーションすることにより、脱グリコシル化を行った。脱グリコシル化ＩＣＣを、８０℃で加熱したｚｏｒｂａｘジフェニルカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に注入した。水を溶離液Ａ、アセトニトリルを溶離液Ｂとして（両方とも０．１％ＦＡおよび０．０２ＴＦＡを含有する）、溶出を行った。勾配条件を３０％Ｂに０．５分間維持し、６．５分で４６．９％に増やし、０．１分で９５％に増加させた。
【０１２８】
製造業者の説明書に従って、ＩＣＣのμｇあたり酵素１単位の濃度で、ＩｄｅＳ酵素（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）、Ｇｅｎｏｖｉｓ社）でＩＣＣ溶液を３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、サブユニットＦｃ／２フラグメントを得た。脱グリコシル化および消化ＩＣＣを、８０℃で加熱したＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に注入した。水を溶離液Ａ、アセトニトリルを溶離液Ｂとして（両方とも０．０５％ＴＦＡを含有する）、溶出を行った。勾配条件を５％Ｂに５分間維持し、４５分で５０％に増やし、２分で９５％に増加させた。
【０１２９】
２．２．結果
ＭＳクロマトグラムピークに関して、ｍ／ｚスペクトルを抽出し、ｍ／ｚスペクトルデコンボリューション後に質量を決定し、脱グリコシル化ＩＣＣおよび脱グリコシル化ｆｃ／２の計算質量を、実験質量と比較した。
【０１３０】
脱グリコシル化ｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５およびＨ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５免疫サイトカインのＬＳ−ＭＳ分析を、（図２および図３）に示す。表８に示されるように、パターンは、完全に形成されたＩＣＣに関して予想されたものと一致する。
【０１３１】
【表８】
2022502443.tif 000011
【０１３２】
全実験質量は、ＩＣＣ構造（２つのサイトカイン／抗体）を確認するものであり、Ｆｃ／２＋サイトカイン質量は、サイトカインの位置の確認するものであった。
【０１３３】
同様の実験を行い、他のＩＣＣに関して同様の結論が得られた。
【０１３４】
実施例３：リンカーの配列およびＭＭＰ−９／２による切断性
文献からの５つのリンカーを、ＰＤＬ１  Ａｂ配列上の４つの異なる部位：Ｎ末端ＨＣ、Ｎ末端ＬＣ、Ｃ末端ＨＣおよびＣ末端ＬＣと融合した場合のＭＭＰ−９に対する基質として評価した。非切断可能と記載された「ＧＩＶＧＰＬ」リンカー（Chau et al. Bioconjug Chem (2004) 15(4):931-41）を、陰性対照として使用した。構築物および結果の要約を、図７に示す。
【０１３５】
３．１．材料と方法
総容量２０μｌでの２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するアッセイ緩衝液中の４０ｎｇの組換えＭＭＰ−９またはＭＭＰ−２（モル比２５：１）の存在下で、２μｇの精製ＩＣＣをインキュベートした。サンプルを、穏やかな撹拌下（３００ｒｐｍ）で、３０℃で２．５時間インキュベートした。ローディング緩衝液＋還元剤（４倍ＸＴサンプル緩衝液および２０倍還元剤、ＢｉｏＲａｄ社）を加え、サンプルを９０℃で５分間加熱することにより、切断反応を停止させた。
【０１３６】
次いで、切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。タンパク質標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ、ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、２０μｌのサンプルを、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ社）中のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ４−１５％  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅゲル（ＢｉｏＲａｄ社）上で、３００Ｖで２０分間ランした。次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、タンパク質バンドを明らかにした。
【０１３７】
３．２．結果
３．２．１．抗ＰＤＬ１抗体および２つの異なる分子：ＩＬ２およびＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のＨＣまたはＬＣ  Ｃ末端融合体における異なるリンカーによる切断性：
結果は図４に示す。
【０１３８】
３．２．２．抗ＰＤＬ１抗体および２つの異なる分子：ＩＬ２およびＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）のＨＣまたはＬＣ  Ｎ末端融合体における異なるリンカーによる切断性：
結果は図５に示す。
【０１３９】
３．２．３．ヒトおよびマウスＭＭＰ−９／２による異なるｃ９Ｇ４ベースのＩＣＣならびにＨ１６／Ｌ１６−ＩＬ１５およびＨＨＳ７６−ＩＬ１５  ＩＣＣの切断性（ＨＣ  Ｃ末端融合体およびＰＶＧＬＩＧリンカー）。結果は図６に示す。
【０１４０】
注１：ＩＬ１５およびＩＦＮａの切断後の可視化は、タンパク質の高レベルのグリコシル化によって損なわれている。切断前のサンプルの脱グリコシル化は、放出されたサイトカインの可視化を可能にし、このことは、タンパク質はＭＭＰ−９／２によってタンパク質分解されないことを示している（資料未記載）。
【０１４１】
３．３．結論
図４、５および６の結果を、図７に要約する。プロテアーゼによる正確な切断を可能にした、２つの融合部位：Ａｂ重鎖のＮ末端およびＣ末端が同定された。
【０１４２】
他方、ＭＭＰ−９リンカーは、Ａｂ軽鎖のＮ末端またはＣ末端で融合した場合、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９のいずれかにより弱く切断されただけであった。
【０１４３】
５つのｃ９Ｇ４融合タンパク質総てが、マウスおよびヒトＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２により切断される（図６）。
【０１４４】
実施例４：ＬＣ−ＭＳによるＭＭＰ−９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性の分析
４．１．材料と方法
１２ｎＭ  ＭＭＰ−９を含有するおよび含有しない濃度１００μｇ／ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２）、血清、血漿、および新鮮血に、ＩＣＣを添加した。１００μｌのアリコートを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ  Ｔｕｂｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）中にて＋３７℃でインキュベートした。２４時間後、サンプルをオーブンから取り出し、サンプルの処理および分析まで、−８０℃で保存した。
【０１４５】
４μｇのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ヒトＩｇＧ−Ｆｃ  ＢｉｏｔｉｎでコーティングしたＭ２８０ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた免疫沈降により、ＩＣＣを生体液から免疫沈降させた。洗浄後、ＩＣＣを水中０．４％ＴＦＡで溶出し、凍結乾燥した。サンプルを、変性緩衝液（６Ｍグアニジン、０．１Ｍトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）中で再構成し、ＤＴＴの存在下で、５６℃で４５分間還元した。次いで、酢酸を加えて反応をクエンチし、サンプルをＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０１４６】
逆相分離を、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２ｓｉ質量分析計と連結された超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システム（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏシステム、Ｗａｔｅｒｓ社）で行い、機器制御を、ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて行った。
【０１４７】
還元サンプルを、溶離液Ａを用いて容量対容量で希釈し、流速０．５ｍＬ／分で、８０℃で加熱したＰＬＲＰ−Ｓカラムに注入した。水を溶離液Ａ、アセトニトリルを溶離液Ｂとして（両方とも０．０５％ＴＦＡを含有する）、溶出を行った。勾配条件を５％Ｂに５分間維持し、４５分で７０％に増やし、２分で９５％に増加させた。
【０１４８】
ＭＳクロマトグラムの各ピークに関して、ｍ／ｚスペクトルを抽出し、ｍ／ｚスペクトルデコンボリューション後に質量を決定した。
【０１４９】
４．２．結果
４．２．１  ＩＣＣにおけるＭＭＰ−９切断部位の検証
ＭＭＰ−９の非存在下では、抗ＰＤＬ１−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）および抗ＰＤＬ１−ＧＩＶＧＰＬ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の両方に関して、切断されたフラグメントは認められず、このため、両リンカーとも、濃度１２ｎＭの緩衝液中で安定であった。
【０１５０】
ＭＭＰ−９の存在下での切断は、実施例２に記載の通り、ＬＣ／ＭＳによって確認した。結果を図８ＡおよびＢに示す。
【０１５１】
ＭＭＰ−９の存在下では、抗体抗ＰＤＬ１−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の１００％が、３７℃で２４時間後に緩衝液中で切断された（図８Ａ）。実際に、図８Ａにおいて、ピークが２９．４７分に認められ、これは、ＰＶＧＬＩＧリンカー（ＰＶＧ）のフラグメントに連結された抗ＰＤＬ１抗体の重鎖に相当する。比較して、図８Ｂにおいてはそのようなフラグメントは認められず、主要シグナルは、ＧＩＶＧＰＬリンカーおよびＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）に連結された抗ＰＤＬ１抗体の完全重鎖に相当する。したがって、ＭＭＰ−９は、ＰＶＧＬＩＧペプチドとは対照的に、ＧＩＶＧＰＬペプチドを切断することができない。
【０１５２】
４．２．２．血清、血漿および新鮮血中でのＭＭＰ−９切断
結果を図９に示す。ＭＭＰ−９の添加ありまたはなしで、マウスヘパリン血漿、マウス、カニクイザル、ヒト血清およびマウスヘパリン全血において、類似のプロファイルがＴ０およびＴ２４にて得られた。ＭＭＰ−９は、試験した総ての生体液中で阻害され、ＬＣ−ＭＳプロファイルの例を図９に示した。
【０１５３】
結論として、おそらくＭＭＰ−９が阻害されたことが原因で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体抗ＰＤＬ１  ｈカッパ／ｈＩｇＧ４−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の切断のモニタリングは、血漿ヘパリン、血清およびヘパリン全血中では不可能であった（資料未記載）。実際に、ＭＭＰ−９は、Ａ２Ｍのようなプロテアーゼ阻害剤の存在が特に原因で、血清、血漿および血液中で自然に減弱することが知られている。
【０１５４】
実施例５：抗体と融合した場合のｈＩＬ１５の減弱
ＩＣＣと連結した場合またはＭＭＰ９による切断後のｈＩＬ１５の生物活性を評価および比較するために、ＩＬ−１５受容体二量体化の試験を行った。ＩＬ１５は、その活性型において、その２つの受容体サブユニットＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγの二量体化を介してシグナルを伝達する。
【０１５５】
５．１．材料と方法
５．１．１．材料および試薬
組換えヒト組換えプロＭＭＰ−９を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中の１ｍＭ酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）により活性化させた。次いで、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＡＰＭＡを除去し、ＡＰＭＡ不含ＭＭＰ−９を、必要になるまで−８０℃で直ちに保存した。組換えヒトＩＬ１５を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｕ２ＯＳ  ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγ／（ＩＬ２Ｒα）Ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  Ｂｉｏａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）を用いて、ＩＬ１５活性をモニタリングした。このアッセイは、２つの受容体サブユニットＩＬ２ＲβおよびＩＬ２ＲγのＩＬ１５誘導二量体化の検出を可能にする。
【０１５６】
５．１．２．方法
３つのＩＬ１５ベースの免疫サイトカイン：ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５、Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５およびｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ１５の活性を評価した。組換えｈＩＬ１５およびｈＭＭＰ−９の効果も、同じ手順を用いて評価した。５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．５を含有するアッセイ緩衝液中で、組換えｈＭＭＰ−９の存在下（＋ＭＭＰ−９）または非存在下（−ＭＭＰ−９）で、全サンプルを２時間インキュベートした。切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御し、サンプルを、処理するまで−２０℃で直ちに保存した。Ｕ２ＯＳ  ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγ／ＩＬ２Ｒα細胞を、切断ＩＣＣまたは非切断ＩＣＣのいずれかおよび対照により、６時間処置した。次いで、検出試薬を加え、化学発光強度を、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社）で記録した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０１５７】
５．２．結果
３つの試験したＩＣＣに関するｈＩＬ１５誘導受容体二量体化の結果を、ｈＩＬ１５濃度の関数として図１０に示す。
【０１５８】
各化合物またはＩＣＣのＥＣ５０を、表９に示す。
【０１５９】
図１０および表９から分かるように、ｈＩＬ１５およびｈＩＬ１５＋ＭＭＰ−９は、受容体二量体化を高度に誘導し、このため、実験を検証するものであった。これに対して、ＭＭＰ−９単独は、予想されたように、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγ二量体化に対して効果を示さない。
【０１６０】
ＭＭＰ−９の非存在下では、３つの評価したＩＣＣは、受容体二量体化に対する有意な活性を示さなかった。他方、ＭＭＰ−９による同じ分子の前処置は、用量依存的な様式で、ＩＬ１５誘導受容体二量体化を介した活性の回復をもたらす。
【０１６１】
したがって、これらの実験から、ＩＬ−１５は、３つの抗体に連結された場合、高度に減弱した活性を示すことが明らかであるようである。ＭＭＰ−９によるＩＣＣの切断後、ＩＬ１５は、その活性型で遊離し、再びその生物活性を果たすことができる。
【０１６２】
【表９】
2022502443.tif 000012
【０１６３】
実施例６：ＩＣＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
６．１．材料と方法：
６．１．１．マウスの移植およびＩＣＣの注入
６週齢の免疫適格ＢＡＬＢ／ｃマウスを、総てのｉｎ  ｖｉｖｏ評価に使用した。それらを滅菌フィルタートップケージに収容し、無菌条件下で飼育し、フランスおよび欧州のガイドラインに従って操作した。
【０１６４】
ＲＥＮＣＡ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２９４７）、すなわちＰＤＬ１を発現するマウス腎癌細胞株を、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択した。マウスに対し、Ｄ０において０．５×１０６個の細胞を皮下注入した。腫瘍が１００ｍｍ３（腫瘍細胞注入後１１〜１２日）に達したとき、動物を、同等の腫瘍サイズを有するマウス６匹の９群に分け、ＰＤＬ１−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）または対照アイソタイプｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、２００μｇ／マウスＱ１ｄ１を腹膜内投与した。
【０１６５】
６．１．２．血清サンプル
投与後０、３、６、２４および４８時間に動物を屠殺し、血液サンプルを、心臓穿刺によりＮａ−ヘパリン加チューブに回収した。血液サンプルを４℃にて１５００ｇで１５分間遠心分離し、血漿を９６ウェルＵ底プレートに回収した。血漿サンプルを、分析の前に凍結した（−８０℃）。
【０１６６】
６．１．３．腫瘍サンプル
腫瘍を採取し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０１６７】
評価の前に、緩衝液のｍｌあたり腫瘍２００ｍｇで、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＤＯＣ、１％Ｉｇｅｐａｌ、阻害剤カクテル（溶解緩衝液）を含有する１％トリトンＸ１００に腫瘍を「再懸濁」させる。
【０１６８】
鋼球の存在下で１５秒間の５０００ｒｐｍでの撹拌を３サイクル行うことにより、腫瘍をＭｉｎｉｌｙｓで破壊する。２サイクル間で、チューブを氷上で２分間維持する。溶液を２ｍｌエッペンドルフコニカルチューブに入れ、４℃にて１１５００ｇで１０分間遠心分離する。上清、すなわち細胞ライセートを回収する。そのタンパク質含量を、製造業者の説明書に従って、ビシンコニン酸アッセイにより測定する。
【０１６９】
６．１．４．ウエスタンブロット解析
血清サンプルおよび腫瘍サンプルを、ウエスタンブロットにより分析した。各ｉｎ  ｖｉｖｏ実験につき、ウエスタンブロットを３回行った。
【０１７０】
簡単に述べれば、分析するサンプルを、血漿サンプルでは０．１μｌ、腫瘍ライセートでは２μｌの速度で、プレキャスト４〜１５％ポリアクリルアミドゲルにロードする。サンプルを、加熱、非還元条件下で遊走させる。次いで、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｍｉｄｉ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋｓ（２．５Ａ、２５Ｖ、７分）を用いて、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写する。トリス緩衝生理食塩水、０．０５％ツイーン２０、１％ミルク（ＴＢＳ−Ｔ１％ミルク）中での１時間の室温飽和工程後、ヤギ抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｆｃγフラグメント特異的（１／５００００）でメンブレンを室温にて１時間インキュベートする。３回の洗浄後、メンブレンの標識化をＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）Ｔｏｕｃｈ  Ｇｅｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで分析する。
【０１７１】
６．１．５．ソフトウェア
ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて行う。
【０１７２】
統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて行う。
【０１７３】
６．２．結果：
６．２．１  マウス血清におけるＩＣＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
ＩＣＣの安定性を、時間の関数としてマウス血清において評価した。図１１は、ＩＣＣ注入後３時間、６時間および２４時間に、ウエスタンブロットにより得た結果を示す。循環ＩＣＣの量は、試験した各ＩＣＣ構築物に関して、時間の関数として劇的に減少する。理論に拘束されるものではないが、この結果は、腫瘍におけるＩＣＣの分離および／または自然のｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｂ分解により、最も容易に説明される。
【０１７４】
ウエスタンブロットを、デンシトメトリー分析に送った。グラフ表現（図１２）では、以下のように計算された非切断ＩＣＣのパーセンテージを示している：［非切断ＩＣＣの強度／（切断＋非切断）ＩＣＣ］×１００。両モデルＩＣＣは、血液循環において同様の挙動を示した、すなわち、それらは、それらのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）対応物を進行性に失う前に、６時間の期間にわたって安定であるように見えた。
【０１７５】
全体的に、循環ｃ９Ｇ４  ＩＣＣとＰＤＬ１  ＩＣＣとの間に有意差はみられなかった。
【０１７６】
６．２．２．マウス腫瘍サンプルにおけるＩＣＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
ＩＣＣの安定性を、時間の関数としてマウス腫瘍サンプルにおいて評価した。図１４は、ＩＣＣ注入後３時間、６時間および２４時間に、ウエスタンブロットにより得た結果を示す。
【０１７７】
ウエスタンブロットをデンシトメトリー分析に送り、グラフ表現（図１５）では、上記のように計算された非切断ＩＣＣパーセンテージを示している。
【０１７８】
両モデルＩＣＣは、同様の挙動を示した、すなわち、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）対応物は、４８時間の期間にわたってＲＥＮＣＡ腫瘍において切断された。ＰＤＬ１  ＩＣＣの切断は、非常に迅速に検出された（注入後３時間という早さで、腫瘍中の非切断型は６０％未満）。注入後２４時間において、腫瘍中に存在する総ＩＣＣの８０％超が切断された。
【０１７９】
ｃ９Ｇ４  ＩＣＣの切断は緩徐であり、ＩＣＣの約２０％が、注入後６時間において腫瘍中で切断された。しかしながら、注入後２４時間において、腫瘍中に存在する総ＩＣＣの８０％超が切断される。統計解析を、腫瘍分離ＩＣＣに対して行った。各時点で非切断ＩＣＣおよび切断ＩＣＣに関して得られたシグナルを加えることにより、総腫瘍分離ＩＣＣの量を決定した。
【０１８０】
図１６は、時間の関数としての、腫瘍中に存在する総ＩＣＣ（切断および非切断）の定量分析を示す。
【０１８１】
全体的に、ＰＤＬ１−ＩＣＣは、対照ｃ９Ｇ４  ＩＣＣよりも、ＲＥＮＣＡ腫瘍において多く分離されていた。
【０１８２】
これらの結果は、腫瘍特異的ＩＣＣは腫瘍環境において迅速に蓄積できることを示している。蓄積後、ＩＣＣは、腫瘍環境においてサイトカインを特異的に放出する腫瘍特異的プロテアーゼによって切断される。
【０１８３】
６．２．３．腫瘍サンプルと比較したマウス血清におけるＩＣＣのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
２つのＩＣＣの挙動を、時間の関数として、ＲＥＮＣＡ移植マウスにおける血漿サンプルと腫瘍サンプルにおいて比較した。
【０１８４】
図１７は、抗体部分の性質を問わず、ＩＣＣは、マウス血漿よりもＲＥＮＣＡ腫瘍において有意に多く切断されることを示している。
【０１８５】
実施例７：ＩＣＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化
７．１．材料と方法：
７．１．１  材料と方法
組換えヒトＩＬ１５を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した。
【０１８６】
以下のＩＣＣ構築物を試験した：
・ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５；
・Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５；および
・ｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５
【０１８７】
以下の対照を加えた：ｈＩＬ１５、ＭＭＰ９、ｈＩＬ１５＋ＭＭＰ９および個々の抗体。
【０１８８】
７．１．２．方法
３つのＩＬ１５ベースの免疫サイトカイン、すなわち、ＮＨＳ７６−ＩＬ１５、Ｈ１６／Ｌ１６−ＩＬ１５、およびｃ９Ｇ４−ＩＬ１５の活性を、マウスおよびヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化するそれらの能力に関して評価した。ｈＩＬ１５＋／−ＭＭＰ９、ＭＭＰ９および個々の抗体の効果も、同じ手順を用いて評価した。
【０１８９】
マウスＣＤ３＋Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、マウス汎Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、１３０−０９５−１３０）を用いて、ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）の脾臓からネガティブセレクションにより単離した。実験あたり２つの脾臓を、Ｔ細胞の単離に使用した。
【０１９０】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離により、健常ドナーのサイタフェレーシスリングからの新鮮血から単離した。次いで、ＣＤ３Ｔ細胞を、ヒト汎Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、１３０−０９６−５３５）を用いて、ＰＢＭＣからネガティブセレクションにより精製した。
【０１９１】
マウスおよびヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、それぞれ培養培地、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋０．１ｍＭ  ベータ−２−メルカプトエタノールまたはＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｌ−グルタミン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンに、２０００００個／ウェルで播種した。
【０１９２】
次いで、それらを、ＭＭＰ９の存在下または非存在下で、１００および２００ｎｇ／ｍｌの陽性対照としてのヒトＩＬ−１５、またはＩＬ−１５に対する２００ｎｇ／ｍｌと同等の６μｇ／ｍｌの異なるＩＣＣ構築物で処置した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートし、培養培地を３日後に新しくした。
【０１９３】
ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ２５およびＣＤ６９表面マーカーの発現を介して、処置の６日後にモニタリングした。これらのマーカーの発現は、フローサイトメトリー（Ｎｏｖｏｃｙｔｅ、ＡＣＥＡ社）により評価した。細胞培養上清を、フローサイトメトリー（ＢＤ社、ＣＢＡ  ＩＦＮ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ）によるインターフェロン−γ分泌の分析のために、９６ウェルプレートに移した。
【０１９４】
各マウスおよびヒトＴ細胞活性化実験につき、分析は３回行い、３例のヒト健常ドナーを試験した。
【０１９５】
データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０１９６】
７．２．結果
マウスＴ細胞を活性化するＩＣＣの能力を、対照と比較した。Ｔ細胞活性化を、ＣＤ６９またはＣＤ２５のＴ細胞発現により測定した。図２３ＡおよびＢは、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５およびｃ９Ｇ４−ＰＶＬＧＩＧ−ＩＬ１５は、ＭＭＰ−９の存在下でＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を誘導するが、ＭＭＰ−９の非存在下では誘導しないことを示している。このため、ＩＣＣが非切断である場合、マウスＴ細胞の活性化は観察されない。実験の妥当性を確認するために、陰性対照（抗体単独、ＭＭＰ−９単独、緩衝液単独）または陽性対照（ＩＬ１５およびＩＬ１５＋ＭＭＰ−９単独）も試験した。
【０１９７】
図２３ＢおよびＣに示されるように、切断Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５（しかし、ＩＣＣ非切断型はそうではない）も、同様の様式でマウスＴ細胞活性化を活性化することができる。
【０１９８】
健常ドナー由来のヒトＴ細胞を用いて、同じ実験を行った。Ｔ細胞活性化を、ＣＤ６９またはＣＤ２５のＴ細胞発現により測定した。ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５、ｃ９Ｇ４−ＰＶＬＧＩＧ−ＩＬ１５およびＨ１６Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ１５は、ＭＭＰ−９の存在下でＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を誘導するが、ＭＭＰ−９の非存在下では誘導しない（図２４Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）。このため、ＩＣＣが非切断である場合、ヒトＴ細胞の活性化は観察されなかった。実験の妥当性を確認するために、陰性対照（抗体単独、ＭＭＰ−９単独、緩衝液単独）または陽性対照（ＩＬ１５およびＩＬ１５＋ＭＭＰ−９単独）も試験した。
【０１９９】
切断（非切断ＩＣＣではない）の存在下でのＴ細胞のこの活性化は、２例の異なるドナー由来のヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの分泌によっても測定した。
【０２００】
実施例８：抗体と融合した場合のｈＩＬ３６γの減弱
ＩＣＣの一部である場合またはＭＭＰ９による切断後のｈＩＬ３６γの生物活性を評価および比較するために、ＩＬ３６γ活性を、ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞培養物におけるＣＸＣＬ８産生を測定することにより、アッセイした。このアッセイは、ＩＬ３６γシグナル伝達経路はＣＸＣＬ８分泌を引き起こし得るという所見に基づいている。
【０２０１】
８．１．材料と方法
８．１．１．材料および試薬
組換えヒト組換えプロＭＭＰ−９を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中の１ｍＭ酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）により活性化させた。次いで、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＡＰＭＡを除去し、ＡＰＭＡ不含ＭＭＰ−９を、必要になるまで−８０℃で直ちに保存した。組換えヒトＩＬ３６γを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ＩＬ８を、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ８  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて投与した。
【０２０２】
８．１．２．方法
ＩＬ３６ γベースの免疫サイトカイン（Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ＩＬ−３６）の活性を評価するために、扁平上皮癌Ａ４３１細胞を、ＩＣＣまたは異なる対照分子で２４時間インキュベートした。５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．５を含有するアッセイ緩衝液中で、組換えｈＭＭＰ−９の存在下（＋ＭＭＰ−９）または非存在下（−ＭＭＰ−９）で、全サンプルを試験した。次いで、細胞培養培地を回収し、ｈＩＬ８をＥＬＩＳＡにより投与した。組換えｈＩＬ３６γおよびＨ１６／Ｌ１６抗体（＋／−ｈＭＭＰ−９）の効果も、同じ手順を用いて評価した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０２０３】
８．２．結果
ＩＣＣおよび対照に関するＡ４３１培養物におけるｈＩＬ８産生の結果を、図２６に示す。データは、ｈＩＬ３６γ濃度の関数としてのｈＩＬ８発現レベルに対応するＯ．Ｄ（４５０ｎｍ）で表している。
【０２０４】
図２６から分かるように、ｒｈＩＬ３６γおよびｒｈＩＬ３６γ＋ＭＭＰ−９は、Ａ４３１細胞によるｈＩＬ８産生を高度に誘導し、このため、実験形式が検証された。他方、予想されたように、ＭＭＰ−９単独および抗体Ｈ１６／Ｌ１６（＋／−ＭＭＰ９）のいずれも、ｈＩＬ８産生に対する効果を示さなかった。
【０２０５】
ＭＭＰ−９の非存在下では、Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＬ３６γ  ＩＣＣは、ｈＩＬ８産生に対する有意な活性を示さなかった。他方、ＭＭＰ−９による同じ分子の前処置は、用量依存的な様式で、ＩＬ−８産生を介して認められた活性の回復をもたらした。
【０２０６】
要約すると、Ｈ１６／Ｌ１６抗体に対するＰＶＧＬＩＧを用いたｈＩＬ３６γのＣ末端結合は、サイトカイン活性を完全に減弱させる。ＰＶＧＬＩＧペプチド内のＭＭＰ９切断は、同等の用量の遊離ｈＩＬ３６γサイトカインと同等なレベルでそれを回復させる。
【０２０７】
実施例９：抗体と融合した場合のｈＩＦＮα２αの減弱
ＩＣＣと連結した場合またはＭＭＰ９による切断後のｈＩＦＮα２ａ生物活性を評価および比較するために、ＩＦＮα２ａ活性を、細胞ベースのルシフェラーゼレポーターバイオアッセイを用いてアッセイした。
【０２０８】
９．１．材料と方法
９．１．１．材料および試薬
組換えヒト組換えプロＭＭＰ−９を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中の１ｍＭ酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）により活性化させた。次いで、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＡＰＭＡを除去し、ＡＰＭＡ不含ＭＭＰ−９を、必要になるまで−８０℃で直ちに保存した。組換えヒトＩＦＮα２ａを、Ｐｂｌ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ｒｈＩＦＮα２ａ）から購入した。
【０２０９】
９．１．２．方法
ＩＦＮα２ａ活性を、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてモニタリングした。ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞内に安定して組み込まれたＩＳＲＥの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する。ＩＦＮα２ａのその受容体への結合は、ＪＡＫ経路の活性化をもたらし、それにより、ルシフェラーゼ遺伝子のＩＳＲＥ依存的転写を促進する。次いで、発光を、基質の添加時に検出し、ルミノメーターで定量化することができる。
【０２１０】
３つのｈＩＦＮα２ａベースの免疫サイトカイン：ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈ  ＩＦＮα２ａ、Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａおよびｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａの活性を評価した。組換えｈＩＦＮα２ａの効果も、同じ手順を用いて評価した。５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．５を含有するアッセイ緩衝液中で、組換えｈＭＭＰ−９の存在下（＋ＭＭＰ−９）または非存在下（−ＭＭＰ−９）で、全サンプルを１時間インキュベートした。
【０２１１】
切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御し、サンプルを、処理するまで−２０℃で直ちに保存した。ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞を、切断ＩＣＣもしくは非切断ＩＣＣのいずれかまたは対照で、一晩処置した。次いで、検出試薬（Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬）を加え、化学発光強度を、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社）で記録した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０２１２】
Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａに関して、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞表面上のＩＧＦ１−Ｒ結合部位を飽和させるために、細胞を、サイトカイン融合体を欠くＨ１６／Ｌ１６抗体１０μｇで前処置したか、またはしなかった。
【０２１３】
９．２．結果
３つの試験したＩＣＣに関するｈＩＦＮα２ａ活性アッセイの結果を、ｈＩＦＮα２ａ濃度の関数として図２７に示す。各化合物またはＩＣＣのＥＣ５０を、表１０に示す。
【０２１４】
ｈＩＦＮα２ａおよびｈＩＦＮα２ａ＋ＭＭＰ−９の両方とも、ルシフェラーゼ発現により示されるように、シグナル伝達応答を強力に誘導し、このため、実験が検証された（図２７および表１０）。
【０２１５】
ＭＭＰ−９の非存在下では、１０μｇ／ｍｌのＨ１６／Ｌ１６抗体での細胞のプレインキュベーションあり（図２７Ｃ）またはなし（図２７Ｄ）で、３つの評価したＩＣＣ：ｃ９Ｇ４−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａ（図２７Ａ）、ＮＨＳ７６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａ（図２７Ｂ）、およびＨ１６／Ｌ１６−ＰＶＧＬＩＧ−ｈＩＦＮα２ａのそれぞれが、等モル濃度のｈＩＦＮα２ａ活性と比較して、高度に減弱した活性を示した。他方、ＭＭＰ−９による同じ分子の前処置は、用量依存的な様式で活性の回復をもたらす。
【０２１６】
したがって、これらの実験から、ｈＩＦＮα２ａは、３つの抗体のいずれかに連結された場合、減弱した活性を示すことが明らかであるようである。ＭＭＰ−９によるＩＣＣの切断後、ｈＩＦＮα２ａは、その活性型で遊離し、再びその生物活性を果たすことができる。
【０２１７】
【表１０】
2022502443.tif 000013
【０２１８】
実施例１０：抗体と融合した場合のｈＩＬ１５の減弱
ＩＣＣと連結した場合またはｕＰＡによる切断後のｈＩＬ１５の生物活性を評価および比較するために、ＩＬ１５活性の生物学的試験を用いた（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩＬ１５  Ｂｉｏａｓｓａｙ）。
【０２１９】
１０．１．材料と方法
１０．１．１．材料および試薬
以下の組換えウロキナーゼ（＝ｕＰＡ）を、Ａｂｃａｍ社から購入した：ヒト用ａｂ９２７６７。組換えヒトＩＬ１５を、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から購入した（２００−１５）。
【０２２０】
ＩＬ１５活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのＩＬ−１５  Ｂｉｏａｓｓａｙ（カタログ番号ＪＡ２０１５）を用いてモニタリングした。これは、読み出し情報としてＳＴＡＴ−５応答エレメントを用いてＩＬ−１５刺激または阻害を測定するように設計された、生物発光細胞ベースアッセイである。ＩＬ−１５がその受容体に結合すると、受容体媒介経路シグナル伝達が、基質の添加時に検出でき、かつルミノメーターで定量化することができる発光を誘導する。
【０２２１】
１０．１．２．切断
評価する構築物を、ｕＰＡでＰＢＳ中にて、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０２２２】
切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御し、サンプルを、処理するまで−２０℃で直ちに保存した。
【０２２３】
１０．１．２．方法
ＩＬ１５細胞を、切断ＩＣＣもしくは非切断ＩＣＣのいずれかまたは対照で、６時間処置した。次いで、検出試薬（Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬）を加え、化学発光強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）で記録した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０２２４】
１０．２．結果
ＩＣＣおよび対照に関するｈＩＬ１５活性の結果を、図２８に示す。データは、ＳＴＡＴ−５活性化の関数としてのｈＩＬ１５活性レベルに対応する相対発光量（ＲＬＵ）で表している。
【０２２５】
ｒｈＩＬ１５およびｒｈＩＬ１５＋ｕＰＡの両方とも、発光を高度に活性化し、これにより、実験形式が検証された。ｕＰＡの非存在下では、Ｈ１６Ｌ１６−ＳＧＲＳＡ−ｈＩＬ１５  ＩＣＣは、有意なＩＬ１５活性を示さなかった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＳＴＡＴ−５活性化を介して認められた活性の有意な回復をもたらした（図２８）。
【０２２６】
要約すると、Ｈ１６／Ｌ１６抗体に対するＳＧＲＳＡを用いたｈＩＬ１５のＣ末端結合は、その活性を完全に減弱させる。ＳＧＲＳＡペプチド内のｕＰＡによる切断は、ＩＬ１５活性を有意に回復させる。
【０２２７】
実施例１１：抗体と融合した場合のｈＩＦＮαの減弱
ＩＣＣと連結した場合またはｕＰＡによる切断後のｈＩＦＮαの生物活性を評価および比較するために、ＩＦＮα活性の生物学的試験を用いた（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ）。
【０２２８】
１１．１．材料と方法
１１．１．１．材料および試薬
組換えヒトウロキナーゼ（＝ｕＰＡ）を、Ａｂｃａｍ社から購入した（ａｂ９２７６７）。組換えヒトＩＦＮαを、ＰＢＬ社から購入した（１１１０１−０２）。ＩＦＮα活性を、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣＳ１９０７０１）を用いてモニタリングした。これは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）の転写を駆動するインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を用いてＩＦＮα刺激または阻害を測定するように設計された、生物発光ＨＥＫ２９３細胞ベースアッセイである。ＩＦＮαがその受容体に結合すると、受容体媒介経路シグナル伝達が、基質の添加時に検出でき、かつルミノメーターで定量化することができる発光を誘導する。
【０２２９】
１１．１．２．切断
評価する構築物を、ｕＰＡでＰＢＳ中にて、３７℃で２４時間インキュベートする。切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御し、サンプルを、処理するまで−２０℃で直ちに保存した。
【０２３０】
１１．１．２．方法
細胞表面上のＩＧＦ１Ｒ結合部位を飽和させるために、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞を、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体１０μｇで１時間前処置した。
【０２３１】
ＩＳＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ／ＨＥＫ２９３細胞を、切断ＩＣＣもしくは非切断ＩＣＣのいずれかまたは対照で、一晩処置した。次いで、検出試薬（Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬）を加え、化学発光強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）で記録した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０２３２】
１１．２．結果
ＩＣＣおよび対照に関するｈＩＦＮα活性の結果を、図２９Ａおよび２９Ｂに示す。データは、ＩＳＲＥ活性化の関数としてのｈＩＦＮα活性レベルに対応する相対発光量（ＲＬＵ）で表している。
【０２３３】
１１．２．１  Ｈ１６Ｌ１６−ＳＧＲＳＡ−ｈＩＦＮα
図２９Ａから分かるように、ｒｈＩＦＮαおよびｒｈＩＦＮα＋ｕＰＡは、発光を高度に活性化し、このため、実験形式が検証された。
【０２３４】
ｕＰＡの非存在下では、Ｈ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳＡ−ｈＩＦＮα  ＩＣＣのＩＦＮα  ＥＣ５０は、２対数減少を示し、わずか７５％の最大活性であった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＩＳＲＥ活性化により決定されたｒｈＩＦＮαと同等の活性をもたらした。
【０２３５】
要約すると、Ｈ１６／Ｌ１６抗体に対するＳＧＲＳＡを用いたｈＩＦＮαのＣ末端結合は、その活性を減弱させる。ＳＧＲＳＡペプチド内のｕＰＡによる切断は、遊離ｈＩＦＮαサイトカインと同等なレベルでそれを回復させる。
【０２３６】
１１．２．２  Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＳＳＲＲＲＶＮ−ｈＩＦＮα
図２９Ｂから分かるように、ｒｈＩＦＮαおよびｒｈＩＦＮα＋ｕＰＡは、発光を高度に活性化し、このため、実験形式が検証された。
【０２３７】
ｕＰＡの非存在下では、Ｈ１６／Ｌ１６−ＰＳＳＲＲＲＶＮ−ｈＩＦＮα  ＩＣＣのＩＦＮα  ＥＣ５０は、２対数減少を示し、わずか７５％の最大活性であった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＩＳＲＥ活性化を介して認められた活性の回復をもたらした。
【０２３８】
要約すると、Ｈ１６／Ｌ１６抗体に対するＰＳＳＲＲＲＶＮを用いたｈＩＦＮαのＣ末端結合は、その活性を減弱させる。ＰＳＳＲＲＲＶＮペプチド内のｕＰＡによる切断は、遊離ｈＩＦＮαサイトカインと同等なレベルで活性を回復させる。
【０２３９】
実施例１２：抗体と融合した場合のｈＣＸＣＬ１０の減弱
ＩＣＣと連結した場合またはｕＰＡによる切断後のｈＣＸＣＬ１０の生物活性を評価および比較するために、ＣＸＣＲ３受容体に対するＣＸＣＬ１０の結合により誘導されたβ−アレスチン動員の生物学的試験を行った（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ｅＸｐｒｅｓｓ  ＣＸＣＲ３  ＣＨＯＫ１  β−アレスチンＧＰＣＲアッセイ）。
【０２４０】
１２．１．材料と方法
１２．１．１．材料および試薬
組換えヒトウロキナーゼ（＝ｕＰＡ）を、Ａｂｃａｍ社から購入した（ａｂ９２７６７）。組換えヒトＣＸＣＬ１０を、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社から購入した（３００−１２）。ＣＸＣＬ１０活性を、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ｅＸｐｒｅｓｓ  ＣＸＣＲ３  ＣＨＯＫ１  β−アレスチンＧＰＣＲアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ９３−０２７１Ｅ２）を用いてモニタリングした。これは、ＣＸＣＲ３受容体に対するＣＸＣＬ１０の結合により誘導されたβ−アレスチン動員を測定するように設計された、生物発光ＣＨＯ細胞ベースアッセイである。
【０２４１】
ＧＰＣＲ−ＰＫの活性化は、β−アレスチン−ＥＡの動員を誘導し、２つのβ−ガラクトシダーゼ酵素フラグメント（ＥＡおよびＰＫ）を補完させる。得られた機能酵素は、基質を加水分解して、基質の添加時に検出でき、かつルミノメーターで定量化することができる化学発光シグナルを生成する。
【０２４２】
１２．１．２．切断
評価する構築物を、ｕＰＡでＰＢＳ中にて、３７℃で１時間インキュベートする。切断効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により制御し、サンプルを、処理するまで−２０℃で直ちに保存した。
【０２４３】
１２．１．２．方法
ＣＨＯ−Ｋ１  ＣＸＣＲ３細胞を、切断ＩＣＣもしくは非切断ＩＣＣのいずれかまたは対照で、１時間３０分処置した。次いで、検出試薬を加え、化学発光強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）で１時間後に記録した。データ解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。
【０２４４】
１２．２．結果
ＩＣＣおよび対照に関するｈＣＸＣＬ１０活性の結果を、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃに示す。データは、ＣＸＣＲ３  β−アレスチン動員の関数としてのｈＣＸＣＬ１０活性レベルに対応する相対発光量（ＲＬＵ）で表している。
【０２４５】
１２．２．１  ９Ｇ４−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０
組換えｈＣＸＣＬ１０および組換えｈＣＸＣＬ１０＋ｕＰＡの両方とも、発光シグナルの強力な活性化をもたらし、これにより、実験形式が検証された。ｕＰＡの非存在下では、９Ｇ４−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０  ＩＣＣは、有意な活性を示さなかった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＣＸＣＲ３  β−アレスチン動員を介して認められた活性の回復をもたらした（図３０Ａ）。
【０２４６】
要約すると、９Ｇ４抗体に対するＳＧＲＳリンカーを用いたｈＣＸＣＬ１０のＣ末端結合は、その活性を減弱させる。ＳＧＲＳペプチド内のｕＰＡによる切断は、遊離ｈＣＸＣＬ１０サイトカインとほぼ同等にＣＸＣＬ１０活性を回復させる。
【０２４７】
１２．２．２  ＮＨＳ７６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０
組換えｈＣＸＣＬ１０および組換えｈＣＸＣＬ１０＋ｕＰＡの両方とも、発光シグナルの強力な活性化をもたらし、これにより、実験形式が検証された。ｕＰＡの非存在下では、ＮＨＳ７６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０  ＩＣＣは、有意な活性を示さなかった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＣＸＣＲ３  β−アレスチン動員を介して認められた活性の部分的回復をもたらした（図３０Ｂ）。親ＮＨＳ７６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０の部分的タンパク質分解がおそらく原因で、完全な活性は認められなかった。
【０２４８】
要約すると、ＮＨＳ７６抗体に対するＳＧＲＳを用いたｈＣＸＣＬ１０のＣ末端結合は、その活性を減弱させる。ＳＧＲＳペプチド内のｕＰＡによる切断は、ＣＸＣＬ１０活性を回復させる。
【０２４９】
１２．２．３  Ｈ１６Ｌ１６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０
組換えｈＣＸＣＬ１０および組換えｈＣＸＣＬ１０＋ｕＰＡの両方とも、発光シグナルの強力な活性化をもたらし、これにより、実験形式が検証された。ｕＰＡの非存在下では、Ｈ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０  ＩＣＣは、有意な活性を示さなかった。ｕＰＡによる同じ分子の前処置は、ＣＸＣＲ３  β−アレスチン動員を介して認められた活性の部分的回復をもたらした（図３０Ｃ）。親Ｈ１６／Ｌ１６−ＳＧＲＳ−ＣＸＣＬ１０の部分的タンパク質分解がおそらく原因で、完全な活性は認められなかった。
【０２５０】
要約すると、Ｈ１６／Ｌ１６抗体に対するＳＧＲＳを用いたｈＣＸＣＬ１０のＣ末端結合は、その活性を減弱させる。ＳＧＲＳペプチド内のｕＰＡによる切断は、ＣＸＣＬ１０活性を回復させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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