(57)【要約】  ニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）を特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントが記載される。これらの抗ＮＴＳＲ１抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、正常細胞および腫瘍細胞におけるＮＴＳＲ１のニューロテンシン媒介性活性化を阻害することが可能である。ＮＴＳＲ１陽性癌または特定の代謝疾患などのＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態の治療のための方法ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントの使用もまた記載される。また、ＮＴＳＲ１の第２の細胞外ループの立体構造を模倣し、ニワトリなどの動物における抗ＮＴＳＲ１抗体の産生を誘導することが可能な環状ペプチドも記載される。
2022500072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）の細胞外ループに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記細胞外ループがヒトＮＴＳＲ１（配列番号８０）の残基２０６〜２３４に対応する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧ（配列番号８３）および／またはラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧ（配列番号８４）に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ポリクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の以下の組み合わせ：配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列ＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（ｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）もしくはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）もしくはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）もしくはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）もしくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）もしくはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）もしくはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせである、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
（ｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、もしくはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）を含み、（ｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）もしくはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含み、（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）もしくはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含み、（ｉｖ）前記ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、もしくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）を含み、（ｖ）前記ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、もしくはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）を含み、（ｖｉ）前記ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）もしくはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含み、または（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせである、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
（ｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）を含み、（ｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含み、（ｉｉｉ）前記ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含み、（ｉｖ）前記ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）を含み、（ｖ）前記ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）を含み、（ｖｉ）前記ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ＩｇＹ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、（ｉｉ）配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
（ｉ）前記軽鎖ＦＲ１が、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）を含み、（ｉｉ）前記軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）を含み、（ｉｉｉ）前記軽鎖ＦＲ３が、配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）を含み、（ｉｖ）前記軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）を含み、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
（ｉ）前記軽鎖ＦＲ１が、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）またはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）を含み、（ｉｉ）前記軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）またはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）を含み、（ｉｉｉ）前記軽鎖ＦＲ３が、配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）またはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）を含み、（ｉｖ）前記軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）またはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）を含む、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）もしくはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１３５）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）もしくはＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１３６）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）もしくはＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号１３７）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）もしくはＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１３８）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
（ｉ）前記重鎖ＦＲ１が、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）もしくはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１３５）を含み、（ｉｉ）前記重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）もしくはＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１３６）を含み、（ｉｉｉ）前記重鎖ＦＲ３が、配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）を含み、（ｉｖ）前記重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）を含み、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
（ｉ）前記重鎖ＦＲ１が、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）を含み、（ｉｉ）前記重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）を含み、（ｉｉｉ）前記重鎖ＦＲ３が、配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）またはＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号１３７）を含み、（ｉｖ）前記重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）またはＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１３８）を含む、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＦＮＤＫＲＰＳＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣＧＳＡＤＳＴＧＧＩＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０８）またはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＤＮＴＮＲＰＳＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３９）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記ＶＬが、配列番号１０８または配列番号１３９に記載される配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０９）またはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１４０）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記ＶＨが、配列番号１０９または配列番号１４０に記載される配列を含む、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
ＩｇＹ抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣ（配列番号１１０）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、（ｉｉ）配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１１１）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１１２）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１３）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
（ｉ）前記軽鎖ＦＲ１が、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣ（配列番号１１０）を含み、（ｉｉ）前記軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１１１）を含み、（ｉｉｉ）前記軽鎖ＦＲ３が、配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１１２）を含み、（ｉｖ）前記軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１３）を含み、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項２１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
（ｉ）前記軽鎖ＦＲ１が、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣ（配列番号１１０）を含み、（ｉｉ）前記軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１１１）を含み、（ｉｉｉ）前記軽鎖ＦＲ３が、配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１１２）を含み、（ｉｖ）前記軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１３）を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１４）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１１５）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号１１６）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
（ｉ）前記重鎖ＦＲ１が、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１４）を含み、（ｉｉ）前記重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１１５）を含み、（ｉｉｉ）前記重鎖ＦＲ３が、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号１１６）を含み、（ｉｖ）前記重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７）を含み、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
（ｉ）前記重鎖ＦＲ１が、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１４）を含み、（ｉｉ）前記重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１１５）を含み、（ｉｉｉ）前記重鎖ＦＲ３が、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号１１６）を含み、（ｉｖ）前記重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７）を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹＦＮＤＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＧＳＡＤＳＴＧＧＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１８）またはＳＳＥＬＴＱＰＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹＤＮＴＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１４１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記ＶＬが、配列番号１１８または配列番号１４１の配列を含む、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１９）またはＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４２）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記ＶＨが、配列番号１１９または配列番号１４２の配列を含む、請求項２９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
抗体の抗原結合フラグメントである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
前記抗原結合フラグメントが、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、および前記ＶＬと前記ＶＨとを接続するリンカーを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
前記リンカーが、約５〜約５０個のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーである、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
前記ポリペプチドリンカーが、約１５〜約２０個のアミノ酸を含む、請求項３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
前記ポリペプチドリンカーが、約１８個のアミノ酸を含む、請求項３４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
前記ポリペプチドリンカー中の残基の少なくとも２５％がグリシン残基である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
前記リンカーが、ペンタペプチド配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１２０）を含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
前記ポリペプチドリンカーが、配列ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２１）を含む、請求項３７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
前記リンカーが、前記ＶＨのＮ末端を前記ＶＬのＣ末端と接続する、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくとも１つの定常ドメインまたはそのフラグメントをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性（Ｆｃ）フラグメントを含む、請求項４０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
前記Ｆｃフラグメントが配列番号７９の残基１４〜２３３の配列を含む、請求項４１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖを前記Ｆｃフラグメントに接続するヒンジをさらに含む、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４４】
前記ヒンジが配列番号７９の残基１〜１３の配列を含む、請求項４３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４５】
検出可能な標識または親和性タグにコンジュゲートされる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸または核酸の組み合わせ。
【請求項４７】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞。
【請求項４８】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、組成物。
【請求項４９】
試料中または細胞上のＮＴＳＲ１を検出する方法であって、前記細胞を、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５０】
細胞内のＮＴＳＲ１活性を阻害するための方法であって、前記細胞を、有効量の請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５１】
細胞内のニューロテンシンによるＮＴＳＲ１の活性化を阻害する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
対象におけるＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項もしくは４８に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５３】
前記疾患または状態が炎症性腸疾患である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療が、大腸炎関連腫瘍形成を発症するリスクを低減する、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患または状態が代謝性疾患または状態である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患または状態が癌、好ましくは膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮癌、皮膚癌、胃癌、または結腸直腸癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記癌が原発性癌である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記癌が転移性または続発性癌である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が難治性癌である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記治療が、前記癌の悪性度および／または転移能を低減するためのものである、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、上皮成長因子受容体を発現または過剰発現する、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記上皮成長因子受容体が、構成的に活性化された上皮成長因子受容体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆｃフラグメントを含むｓｃＦｖ（ｓｃＦＶ−Ｆｃ）である、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象に、有効量の追加の化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象がヒト対象である、請求項５２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ａ−Ｄ−Ｇ１−Ｘ４−Ｈ−Ｘ５−Ｇ２−Ｇ３
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド（アミド）結合であり、
Ｘ１はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ２はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ３はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３またはＮのうちの１つは、Ｇ３への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩。
【請求項６７】
Ｘ１が存在する場合、システインである、請求項６６に記載の環状ペプチド。
【請求項６８】
Ｘ２が存在する場合、正荷電残基、好ましくはリジン（Ｋ）残基である、請求項６６または６７に記載の環状ペプチド。
【請求項６９】
Ｘ３が存在する場合、正荷電残基である、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項７０】
前記正荷電残基が、リジン（Ｋ）またはオルニチンである、請求項６９に記載の環状ペプチド。
【請求項７１】
前記リジンまたはオルニチンのアミン基が、Ｇ３のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する、請求項７０に記載の環状ペプチド。
【請求項７２】
Ｘ５がＱまたはＴである、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項７３】
Ｘ５がＱである、請求項７２に記載の環状ペプチド。
【請求項７４】
Ｘ５がＴである、請求項７２に記載の環状ペプチド。
【請求項７５】
Ｘ６がＡまたはＰである、請求項６６〜７４のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項７６】
Ｘ６がＡである、請求項７５に記載の環状ペプチド。
【請求項７７】
Ｘ６がＰである、請求項７５に記載の環状ペプチド。
【請求項７８】
担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項６６〜７７のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項７９】
前記担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、請求項７８に記載の環状ペプチド。
【請求項８０】
請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の環状ペプチドを含む組成物。
【請求項８１】
担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
ワクチンまたは免疫原性組成物である、請求項８０または８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ワクチン組成物が、請求項７８または７９に記載の環状ペプチドを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項８２または８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ワクチンアジュバントがフロイントアジュバントである、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
動物におけるＮＴＳＲ１に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法であって、前記動物に、有効量の請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の環状ペプチドまたは請求項８０〜８５のいずれか一項に記載の組成物を前記動物に投与することを含む、方法。
【請求項８７】
前記動物において産生された前記抗体を採取することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
採取された前記抗体を精製することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記精製が、前記動物に投与される前記ペプチドを使用して、前記抗体を含む試料を親和性精製ステップに供することを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記動物が、ニワトリ（雌鶏）である、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
請求項８７に記載の前記採取が前記動物によって産生される卵からである、請求項９０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７２５，４５１号の利益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して、特定の形態の癌などのＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態の治療を含む、様々な用途のための、例えば組換え抗体を使用したニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１またはＮＴＳ１）の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＮＴＳＲ１は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の大スーパーファミリーに属し、低血圧症、高血糖症、低体温症、痛覚抑制、ならびに腸運動性および分泌の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）などのニューロテンシン（ＮＴＳまたはＮＴ）の複数の機能を媒介することが示されている。ＮＴＳＲ１発現／過剰発現は、炎症性腸疾患と関連することが示されている（例えば、Ｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ  ２８；１９（２８）：４５０４−４５１０を参照。文献中には、ＮＴＳＲ１活性が統合失調症などの神経障害に関連するという証拠も存在する。
【０００４】
中枢神経系（ＣＮＳ）および胃腸管におけるＮＴによるＮＴＳＲ１関与の生理学的作用に加えて、ＮＴ媒介性ＮＴＳＲ１刺激が発癌において重要な役割を果たすという証拠が増えている。ＮＴＳＲ１の異常発現（例えば、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、および結腸癌）、増殖および生存効果を伴う腫瘍成長から、足場非依存性成長ならびに前移動性および前侵襲性効果を有する転移拡散までの癌進行の各段階における効果を伴う、多数のタイプの癌細胞および腫瘍におけるＮＴ発癌作用が記載されている（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．２０１２；３：１８４を参照）。これらの効果は全て、細胞形質転換の初期段階中のＮＴＳＲ１の異常または調節不全発現と関連し、いくつかのキナーゼおよびエフェクター、例えばＰＫＣ、ＭＡＰＫ、ＦＡＫ、ＲＨＯ−ＧＴＰａｓｅ、ＲＡＳ、およびＳｃｒの活性化の結果である（Ｙｏｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；５（１８）：８２５２−８２６９）。ＮＴＳＲ１発現は、乳癌、肺癌、および頭頸部扁平上皮細胞癌を含むいくつかの癌における予後不良の独立したマーカーであることが示されている（Ｙｏｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、上記参照、Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１４：２１、Ａｌｉｆａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；１６（１７）；４４０１−１０）。
【０００５】
細胞内シグナル伝達におけるそれらの重要な役割、ならびに癌、感染、および炎症を含む様々な疾患に対するそれらの臨床的関連性のため、ＮＴＳＲ１などのＧＰＣＲは、最も魅力的な治療標的クラスの１つである。しかしながら、高い立体構造変動性、細胞外エピトープの小さい露出面積（抗体結合のためにアクセスできない場合がある）、ならびに好適なＧＰＣＲ抗原および効率的な抗体スクリーニングツールの調製が困難なことは、有効な抗ＧＰＣＲ抗体の開発を妨げており、これは依然として課題である。実際、ＧＰＣＲ標的抗体は、これまで米国食品医薬品局および欧州医薬品庁によって承認されていない（Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６  Ｆｅｂ；４８（２）：ｅ２０７）。
【０００６】
したがって、抗ＮＴＲＳ１抗体などのＮＴＳＲ１を特異的に標的とする薬剤の開発、ならびに予後不良のある特定の形態の癌を含むＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態の治療のための新規戦略の必要性がある。
【０００７】
本説明は、多くの文書を参照し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、以下の項目１〜９１を提供する。
１．ニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）の細胞外ループに位置する立体構造エピトープ（該細胞外ループがヒトＮＴＳＲ１（配列番号８０）の残基２０６〜２３４に対応する）に、好ましくは、ヒトニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）からのアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧおよび／またはラットＮＴＳＲ１からのアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
２．ヒトＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧおよびラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧに位置する立体構造エピトープに特異的に結合する、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３．ポリクローナル抗体である、項目１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４．モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
５．相補性決定領域（ＣＤＲ）の以下の組み合わせ：配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列ＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
６．（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）もしくはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）もしくはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）もしくはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）もしくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）もしくはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）もしくはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせである、項目５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
７．（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、もしくはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）を含む、（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）もしくはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含む、（ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）もしくはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含む、（ｉｖ）ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、もしくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）を含む、（ｖ）ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、もしくはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）を含む、（ｖｉ）ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）もしくはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含む、または（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせである、項目６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
８．（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１が、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ２が、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含み、（ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ３が、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含み、（ｉｖ）ＣＤＲ−Ｈ１が、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）を含み、（ｖ）ＣＤＲ−Ｈ２が、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）を含み、（ｖｉ）ＣＤＲ−Ｈ３が、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
９．ＩｇＹ抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１０．抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、（ｉｉ）配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、項目９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１１．（ｉ）軽鎖ＦＲ１が、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）を含む、（ｉｉ）軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）を含む、（ｉｉｉ）軽鎖ＦＲ３が、配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）を含む、（ｉｖ）軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）を含む、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、項目１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１２．（ｉ）軽鎖ＦＲ１が、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）またはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）を含み、（ｉｉ）軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）またはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）を含み、（ｉｉｉ）軽鎖ＦＲ３が、配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）またはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）を含み、（ｉｖ）軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）またはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）を含む、項目１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１３．抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）もしくはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１３５）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）もしくはＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１３６）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）もしくはＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号１３７）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）もしくはＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１３８）と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、項目９〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１４．（ｉ）重鎖ＦＲ１が、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）もしくはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１３５）を含む、（ｉｉ）重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）もしくはＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１３６）を含む、（ｉｉｉ）重鎖ＦＲ３が、配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）を含む、（ｉｖ）重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）を含む、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、項目１３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１５．（ｉ）重鎖ＦＲ１が、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）を含み、（ｉｉ）重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）を含み、（ｉｉｉ）重鎖ＦＲ３が、配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）またはＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号１３７）を含み、（ｉｖ）重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）またはＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１３８）を含む、項目１４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１６．抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＦＮＤＫＲＰＳＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣＧＳＡＤＳＴＧＧＩＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０８）またはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹＤＮＴＮＲＰＳＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３９）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、項目９〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１７．ＶＬが、配列番号１０８または１３９の配列を含む、項目１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１８．抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０９）またはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１４０）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、項目９〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
１９．ＶＨが、配列番号１０９または１４０の配列を含む、項目１８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２０．ＩｇＹ抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である、項目１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２１．抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、（ｉｉ）配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、項目２０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２２．（ｉ）軽鎖ＦＲ１が、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣを含む、（ｉｉ）軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹを含む、（ｉｉｉ）軽鎖ＦＲ３が、配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣを含む、（ｉｖ）軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬを含む、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、項目２１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２３．（ｉ）軽鎖ＦＲ１が、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣを含み、（ｉｉ）軽鎖ＦＲ２が、配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹを含み、（ｉｉｉ）軽鎖ＦＲ３が、配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣを含み、（ｉｖ）軽鎖ＦＲ４が、配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬを含む、項目２２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２４．抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせを含む、項目２０〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２５．（ｉ）重鎖ＦＲ１が、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳを含む、（ｉｉ）重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶを含む、（ｉｉｉ）重鎖ＦＲ３が、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫを含む、（ｉｖ）重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含む、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２６．（ｉ）重鎖ＦＲ１が、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳを含み、（ｉｉ）重鎖ＦＲ２が、配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶを含み、（ｉｉｉ）重鎖ＦＲ３が、配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫを含み、（ｉｖ）重鎖ＦＲ４が、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳを含む、項目２５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２７．抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹＦＮＤＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＧＳＡＤＳＴＧＧＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１８）またはＳＳＥＬＴＱＰＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹＤＮＴＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１４１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む、項目２０〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２８．ＶＬが、配列番号１１８または１４１の配列を含む、項目２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
２９．抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１９）またはＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４２）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、項目２０〜２８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３０．ＶＨが、配列番号１１９または１４１の配列を含む、項目２９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３１．抗体の抗原結合フラグメントである、項目１〜３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３２．該抗原結合フラグメントが、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびＶＬとＶＨとを接続するリンカーを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、項目３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３３．該リンカーが、約５〜約５０個のアミノ酸を含むポリペプチドリンカーである、項目３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３４．該ポリペプチドリンカーが、約１５〜約２０個のアミノ酸を含む、項目３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３５．該ポリペプチドリンカーが、約１８個のアミノ酸を含む、項目３４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３６．ポリペプチドリンカー中の残基の少なくとも２５％がグリシン残基である、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３７．該リンカーが、ペンタペプチド配列ＧＧＧＧＳを含む、項目３３〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３８．ポリペプチドリンカーが、配列ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳを含む、項目３７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
３９．該リンカーが、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続する、項目３２〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４０．抗体またはその抗原結合フラグメントが、少なくとも１つの定常ドメインまたはそのフラグメントを含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４１．抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性（Ｆｃ）フラグメントを含む、項目４０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４２．Ｆｃフラグメントが、図８Ｇの太字の配列を含む、項目４１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４３．検出可能な標識または親和性タグにコンジュゲートされる、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
４４．項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸または核酸の組み合わせ。
４５．項目４４に記載の核酸または核酸の組み合わせを含むプラスミドまたはベクター。
４６．項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する宿主細胞。
４７．項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物。
４８．担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目４７に記載の組成物。
４９．試料中または細胞上のＮＴＳＲ１を検出する方法であって、細胞を、項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目４７もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
５０．細胞内のＮＴＳＲ１活性を阻害するための方法であって、細胞を、有効量の項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目４７もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
５１．細胞内のニューロテンシンによるＮＴＳＲ１の活性化を阻害する方法であって、細胞を、有効量の項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目４７もしくは４８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
５２．対象におけるＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態を治療するための方法であって、対象に、有効量の項目１〜４３のいずれか一項に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または項目４７もしくは４８に記載の組成物を投与することを含む、方法。
５３．該疾患または状態が炎症性腸疾患である、項目５２に記載の方法。
５４．該治療が、大腸炎関連腫瘍形成を発症するリスクを低減する、項目５２または５３に記載の方法。
５５．該疾患または状態が代謝性疾患または状態である、項目５２に記載の方法。
５６．該疾患または状態が癌、好ましくは膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、肝臓癌、脳癌、子宮癌、皮膚癌、胃癌、または結腸直腸癌である、項目５２に記載の方法。
５７．該癌が原発性癌である、項目５６に記載の方法。
５８．該癌が転移性または続発性癌である、項目５６に記載の方法。
５９．該癌が難治性癌である、項目５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
６０．該治療が、癌の悪性度および／または転移能を低減するためのものである、項目５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
６１．該癌が、上皮成長因子受容体を発現または過剰発現する、項目５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
６２．該上皮成長因子受容体が、構成的に活性化された上皮成長因子受容体である、項目６１に記載の方法。
６３．該抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆｃフラグメントを含むｓｃＦｖ（ｓｃＦＶ−Ｆｃ）である、項目５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
６４．対象に、有効量の追加の化学療法薬を投与することをさらに含む、項目５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
６５．対象がヒト対象である、項目５２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
６６．以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ａ−Ｄ−Ｇ１−Ｘ４−Ｈ−Ｘ５−Ｇ２−Ｇ３
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド（アミド）結合であり、
Ｘ１はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ２はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ３はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体であるか、または存在せず、
Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３またはＮのうちの１つは、Ｇ３への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩。
６７．Ｘ１が存在する場合、システインである、項目６６に記載の環状ペプチド。
６８．Ｘ２が存在する場合、正荷電残基、好ましくはリジン（Ｋ）残基である、項目６６または６７に記載の環状ペプチド。
６９．Ｘ３が存在する場合、正荷電残基である、項目６６〜６８のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
７０．該正荷電残基が、リジン（Ｋ）またはオルニチンである、項目６９に記載の環状ペプチド。
７１．リジンまたはオルニチンのアミン基が、Ｇ３のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する、項目７０に記載の環状ペプチド。
７２．Ｘ５がＱまたはＴである、項目６６〜７１のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
７３．Ｘ５がＱである、項目７２に記載の環状ペプチド。
７４．Ｘ５がＴである、項目７２に記載の環状ペプチド。
７５．Ｘ６がＡまたはＰである、項目６６〜７４のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
７６．Ｘ６がＡである、項目７５に記載の環状ペプチド。
７７．Ｘ６がＰである、項目７５に記載の環状ペプチド。
７８．担体タンパク質にコンジュゲートされる、項目６６〜７７のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
７９．該担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、項目７８に記載の環状ペプチド。
８０．項目６６〜７９のいずれか一項に記載の環状ペプチドを含む組成物。
８１．担体または賦形剤、好ましくは薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、項目８０に記載の組成物。
８２．ワクチンまたは免疫原性組成物である、項目８０または８１に記載の組成物。
８３．該ワクチン組成物が、項目７８または７９に記載の環状ペプチドを含む、項目８２に記載の組成物。
８４．ワクチンアジュバントをさらに含む、項目８２または８３に記載の組成物。
８５．ワクチンアジュバントがフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）である、項目８４に記載の組成物。
８６．動物におけるＮＴＳＲ１に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法であって、該動物に、有効量の項目６６〜７９のいずれか一項に記載の環状ペプチドまたは項目８０〜８５のいずれか一項に記載の組成物を該動物に投与することを含む、方法。
８７．動物において産生された抗体を採取することをさらに含む、項目８６に記載の方法。
８８．採取された抗体を精製することをさらに含む、項目８７に記載の方法。
８９．該精製が、該動物に投与されるペプチドを使用して、抗体を含む試料を親和性精製ステップに供することを含む、項目８８に記載の方法。
９０．該動物が、ニワトリ（雌鶏）である、項目８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
９１．項目８７に記載の該採取が該動物によって産生される卵からである、項目９０に記載の方法。
【０００９】
添付の図面を参照してほんの一例として与えられる本発明の特定の実施形態の以下の非限定的な説明を読むと、本発明の他の目的、利点、および特徴がより明らかになる。添付図面では、以下の事項が示される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｄは、本明細書に記載の研究で使用される４つの免疫ペプチド（それぞれＬｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）の化学構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｄは、本明細書に記載の研究で使用される４つの免疫ペプチド（それぞれＬｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）の化学構造を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｄは、本明細書に記載の研究で使用される４つの免疫ペプチド（それぞれＬｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）の化学構造を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄは、本明細書に記載の研究で使用される４つの免疫ペプチド（それぞれＬｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）の化学構造を示す。
【図２Ａ】ＥＬＩＳＡベースの手順を使用して、遊離ペプチドの量を増加させることによってその対応する結合ペプチドに結合する各ＩｇＹ（−Ｌｉｎ、−３Ｄ−１、−３Ｄ−２、および−３Ｄ−３）の４つの阻害曲線を示すグラフである。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、グラフの下の表に示されるＩＣ５０をもたらした。
【図２Ｂ】示される遊離ペプチドとの競合の文脈において、その対応する結合ペプチドへの各ＩｇＹ結合の阻害を示すグラフである。陽性対照（黒い棒）は、その対応するＩｇＹによる特定の結合ペプチドの完全検出に対応する。４５０ｎｍの吸光度で測定された全ての生データを、１００％の検出に対応するペプチドなしの対照に対して正規化した。データは、少なくとも３つの実験複製の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、少なくとも２つの独立した実験を表す。
【図３Ａ】複製とみなされる５つのランダムに選択された免疫蛍光顕微鏡視野の１０個のｚスタックスライスのオーバーラップ係数を定量化した、共局在化分析（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０−ＡＳＷソフトウェア）を示すグラフである。免疫蛍光顕微鏡法を、示される抗体および抗ＨＡ抗体で血球凝集素（ＨＡ−ｒＮＴＳＲ１）に融合したラットＮＴＳ１受容体を安定して発現する固定ＨＥＫ２３９Ａ細胞に対して実施して、共局在化分析を可能にした（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０−ＡＳＷソフトウェア）。抗体とそれらの対応するペプチドとの１：１０の比率でのプレインキュベーションを、陰性対照として使用した。
【図３Ｂ】示される抗体を有する固定ラット脳スライスに対して実施した免疫組織化学アッセイの画像を表す。ＩｇＹ  ３Ｄ−２およびＩｇＹ  ３Ｄ−３も試験し、ＩｇＹ−３Ｄ−３についてのみ特異的検出をもたらした（図示せず）。ラットＮＴＳ１受容体の発現についてすでに特徴付けられた領域の写真（Ｂｏｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９６）が示され、矢印はｒＮＴＳ１受容体シグナルを示している。実験は、少なくとも２つの独立した実験を表す。陰性対照は、二次抗体のみとのインキュベーションに対応する。
【図４Ａ】その後の質量分析識別のために、示されるニワトリ抗体を磁気ビーズにコンジュゲートした状態の、ラットＮＴＳ１受容体を単離するために使用される免疫沈降の免疫ブロット（抗ＨＡ  ＨＲＰ）を示す。陰性対照は、ＩｇＹとその対応するペプチドとの１：１０の比率でのプレインキュベーションからなる。
【図４Ｂ】ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３を使用した質量分析による、識別されたｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓペプチド配列の各アミノ酸のイオンデータを示す。
【図４Ｃ】各示される条件について得られたスペクトルの曲線下面積から計算される、識別されたラットペプチドの相対シグナル強度を示すグラフである（Ｐｅａｋｖｉｅｗ  ２．２ソフトウェア）。全ての実験は、少なくとも２つの独立した実験を表す。２つの異なる施設によって質量分析を実施および分析した。
【図５Ａ】様々な種由来のＮＴＳＲ１の第２の細胞外ループのアミノ酸配列、ならびに本明細書に記載の研究においてニワトリを免疫化するために使用されるペプチド（エピトープ）の配列のアライメントを示す。アライメントされた配列の下の棒は、保存パーセンテージを示す（ＣＬＣ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｉｏ  Ｖ５）。
【図５Ｂ】図５Ｂおよび図５Ｃは、ＮＴＳ１タンパク質変異体へのポリクローナルＩｇＹ−３Ｄ−３抗体の結合を示すグラフである。最も露出されると予測される設計されたエピトープ（Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｐ）の５個のアミノ酸の各々をアラニン（Ａ）に置換することによって、５つのＮＴＳ１タンパク質変異体を生成した。全ての変異体はＨＥＫ細胞内で安定して発現した。図５Ｂ：フローサイトメトリーを、ＷＴ  ＮＴＳ１、またはＩｇＹ−３Ｄ−３抗体を有する５つの変異体のうちの１つのいずれかを発現する全ての生細胞に対して実施した。蛍光（ＦＩＴＣ）を、条件当たり少なくとも２５，０００個の細胞について評価した。対照（ＣＴＬ）は、二次抗体のみとインキュベートしたＷＴ細胞に対応する。図５Ｃ：ＩｇＹ−３Ｄ−３抗体の結合を、ＷＴまたはＮＴＳ１の変異型を発現する細胞からの６つの異なる膜調製物上の放射性標識ニューロテンシン（ＮＴ）の置き換えによって測定した。対照は、抗体なしの緩衝液のみとの全結合に対応する。
【図５Ｃ】図５Ｂおよび図５Ｃは、ＮＴＳ１タンパク質変異体へのポリクローナルＩｇＹ−３Ｄ−３抗体の結合を示すグラフである。最も露出されると予測される設計されたエピトープ（Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ｐ）の５個のアミノ酸の各々をアラニン（Ａ）に置換することによって、５つのＮＴＳ１タンパク質変異体を生成した。全ての変異体はＨＥＫ細胞内で安定して発現した。図５Ｂ：フローサイトメトリーを、ＷＴ  ＮＴＳ１、またはＩｇＹ−３Ｄ−３抗体を有する５つの変異体のうちの１つのいずれかを発現する全ての生細胞に対して実施した。蛍光（ＦＩＴＣ）を、条件当たり少なくとも２５，０００個の細胞について評価した。対照（ＣＴＬ）は、二次抗体のみとインキュベートしたＷＴ細胞に対応する。図５Ｃ：ＩｇＹ−３Ｄ−３抗体の結合を、ＷＴまたはＮＴＳ１の変異型を発現する細胞からの６つの異なる膜調製物上の放射性標識ニューロテンシン（ＮＴ）の置き換えによって測定した。対照は、抗体なしの緩衝液のみとの全結合に対応する。
【図５Ｄ】図５Ｄおよび図５Ｅは、ラットＮＴＳＲ１対ラットＮＴＳＲ２に対するＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３ニワトリ抗体の選択性を示す免疫ブロットである。ＨＡタグ付きラットＮＴＳ１、ラットＮＴＳ２、またはラットアペリン（ＡＰＪ）受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、ＩｇＹ−３Ｄ−１またはＩｇＹ−３Ｄ−３のいずれかを使用して、ネイティブ条件下でウエスタンブロット（図５Ｄ）および免疫沈降（図５Ｅ）のために処理した。
【図５Ｅ】図５Ｄおよび図５Ｅは、ラットＮＴＳＲ１対ラットＮＴＳＲ２に対するＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３ニワトリ抗体の選択性を示す免疫ブロットである。ＨＡタグ付きラットＮＴＳ１、ラットＮＴＳ２、またはラットアペリン（ＡＰＪ）受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、ＩｇＹ−３Ｄ−１またはＩｇＹ−３Ｄ−３のいずれかを使用して、ネイティブ条件下でウエスタンブロット（図５Ｄ）および免疫沈降（図５Ｅ）のために処理した。
【図６Ａ】ニワトリ抗体による放射性標識ニューロテンシンの置換曲線を示すグラフである。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。データは、少なくとも３つの実験複製の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、少なくとも２つの独立した実験を表す。
【図６Ｂ】抗体によるニューロテンシン（ＮＴ）依存性環状ＡＭＰ産生遮断を示すグラフである。陰性対照は、非刺激細胞に対応し、全ての抗体をＮＴ（ＥＣ５０）の存在下で試験した。一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｒｋｅｙの多重比較試験を実施し（Ｇｒａｐｈｐａｄ）、＊＊＊＊はＰ値＜０．０００１に対応する。
【図６Ｃ】ラットＮＴＳ１受容体を、天然リガンドＮＴの結合（ＥＣ５０に対応する用量で）に応答したその活性について試験したシグナル伝達経路を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄおよび図６Ｅは、ＢＲＥＴベースのアッセイを使用して評価した、示される抗体がラットＮＴＳ１受容体（アゴニストモード）に依存するＧαｑ（図６Ｄ）およびβ−アレスチン−２（図６Ｅ）シグナル伝達経路を活性化する能力を示すグラフである。
【図６Ｅ】図６Ｄおよび図６Ｅは、ＢＲＥＴベースのアッセイを使用して評価した、示される抗体がラットＮＴＳ１受容体（アゴニストモード）に依存するＧαｑ（図６Ｄ）およびβ−アレスチン−２（図６Ｅ）シグナル伝達経路を活性化する能力を示すグラフである。
【図６Ｆ】図６Ｆおよび図６Ｇは、ＢＲＥＴベースのアッセイを使用して評価した、示される抗体がＮＴ媒介性Ｇαｑ（図６Ｆ）およびβ−アレスチン−２（図６Ｇ）シグナル伝達経路（アンタゴニストモード、ＥＣ５０に対応するＮＴ用量）を遮断する能力を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（Ｍｅｃｌｉｎｅｒｔａｎｔ）は、文書で十分に裏付けられたＮＴＳ１受容体のアンタゴニストであり、陽性対照として使用した。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。データは、少なくとも２つの独立した実験を示す。
【図６Ｇ】図６Ｆおよび図６Ｇは、ＢＲＥＴベースのアッセイを使用して評価した、示される抗体がＮＴ媒介性Ｇαｑ（図６Ｆ）およびβ−アレスチン−２（図６Ｇ）シグナル伝達経路（アンタゴニストモード、ＥＣ５０に対応するＮＴ用量）を遮断する能力を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（Ｍｅｃｌｉｎｅｒｔａｎｔ）は、文書で十分に裏付けられたＮＴＳ１受容体のアンタゴニストであり、陽性対照として使用した。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。データは、少なくとも２つの独立した実験を示す。
【図７Ａ】ＨＲＰに結合した抗ｓｃＦｖ抗体または抗Ｈｉｓ抗体を使用したｓｃＦｖ（Ｈｉｓ付き）のウエスタンブロットを示す。
【図７Ｂ】ＨＡ−ヒトＮＴＳ１を安定して発現する固定ＨＥＫ細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。ＮＴＳ１を、２つの異なる濃度（１：２００および１：５０、中央パネル）で抗ＨＡ（左パネル）およびｓｃＦｖ  ２３８を使用して検出した。右のパネルは、二次抗体のみを用いた対照（第２のＣＴＬ）に対応する。
【図７Ｃ】図７Ｃおよび図７Ｄは、ＨＣＴ１１６（図７Ｃ）およびＰＡＮＣ−１（図７Ｄ）膜調製物上の増加する量のｓｃＦｖ  ２３８による、放射性標識ニューロテンシン（１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］ＮＴ）の置換曲線を示す。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図７Ｄ】図７Ｃおよび図７Ｄは、ＨＣＴ１１６（図７Ｃ）およびＰＡＮＣ−１（図７Ｄ）膜調製物上の増加する量のｓｃＦｖ  ２３８による、放射性標識ニューロテンシン（１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］ＮＴ）の置換曲線を示す。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図７Ｅ】図７Ｅおよび図７Ｆは、ＨＣＴ１１６（図７Ｅ）およびＰＡＮＣ−１（図７Ｆ）生細胞内のホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって測定した、増加する量のｓｃＦｖ  ２３８を用いたＮＴ  １−１３によるＧαｑ活性化後のＩＰ−１産生（％）（Ｇαｑ媒介性イノシトールモノホスフェート（ＩＰ１）産生の尺度）の遮断を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（１０μＭ）をアンタゴニスト対照として使用した。曲線を、４つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図７Ｆ】図７Ｅおよび図７Ｆは、ＨＣＴ１１６（図７Ｅ）およびＰＡＮＣ−１（図７Ｆ）生細胞内のホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって測定した、増加する量のｓｃＦｖ  ２３８を用いたＮＴ  １−１３によるＧαｑ活性化後のＩＰ−１産生（％）（Ｇαｑ媒介性イノシトールモノホスフェート（ＩＰ１）産生の尺度）の遮断を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（１０μＭ）をアンタゴニスト対照として使用した。曲線を、４つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図７Ｇ】ｓｃＦｖ  ２３８によるＨＣＴ１１６生細胞における選択的ＮＴＳ１受容体遮断を示すグラフである。Ｇαｑ経路をＮＴ  １−１３（１０ｎＭ）およびＵＤＰ（４００μＭ）で活性化し、ｓｃＦｖ  ２３８（２．８μＭ）を付加することによってＩＰ−１産生を遮断した。一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙの多重比較試験を実施した。データは、少なくとも３つの実験複製の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、少なくとも２つの独立した実験を表す。
【図８Ａ】３Ｄペプチド−３によるニワトリの免疫化後に得られた１９個のＩｇＹ抗体由来のＣＤＲのアミノ酸配列のアライメントを示す。「＃」と題する列は、配列決定した示されるＣＤＲ配列を有する抗体の数に対応する。
【図８Ｂ】３Ｄペプチド−３によるニワトリの免疫化後に得られた２０個のＩｇＹ抗体の軽鎖可変領域のアライメントを示し、ＣＤＲ領域は太字であり、フレームワーク領域のアミノ酸変異は下線付きである。
【図８Ｃ】３Ｄペプチド−３によるニワトリの免疫化後に得られた２０個のＩｇＹ抗体の重鎖可変領域のアライメントを示し、ＣＤＲ領域は太字であり、フレームワーク領域のアミノ酸変異は下線付きである。
【図８Ｄ】本明細書に記載の研究で産生した最も豊富なＩｇＹ抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示し、異なる領域が識別される。
【図８Ｅ】図８Ｄのニワトリ抗体のヒト化形態の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を示し、異なる領域が識別される。
【図８Ｆ】図８Ｆおよび図８Ｇは、長い１８アミノ酸リンカー（図８Ｆ、以下、ｓｃＦｖ  ２３８と称される））または短い７アミノ酸リンカー（図８Ｇ）によって接続された、図８Ｅのヒト化抗体の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖフラグメントのアミノ酸配列を示し、異なる領域が識別される。
【図８Ｇ】図８Ｆおよび図８Ｇは、長い１８アミノ酸リンカー（図８Ｆ、以下、ｓｃＦｖ  ２３８と称される））または短い７アミノ酸リンカー（図８Ｇ）によって接続された、図８Ｅのヒト化抗体の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖフラグメントのアミノ酸配列を示し、異なる領域が識別される。
【図８Ｈ】本明細書に記載の研究で調製および使用した別のｓｃＦｖフラグメント（ニワトリ、以下、ｓｃＦｖ  ００９と称される）のアミノ酸配列を示す。
【図８Ｉ】本明細書に記載のｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体フラグメントのヒンジ領域（下線付き）およびＦｃドメイン（太字）のアミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、ヒト、ラット、およびマウスＮＴＳＲ１のアミノ酸配列をそれぞれ示し、本明細書に記載の抗体によって標的化される細胞外ループは灰色で強調され、本明細書に記載の抗体を産生するために使用されるペプチドに対応する領域は太字および下線付きである。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｃは、ヒト、ラット、およびマウスＮＴＳＲ１のアミノ酸配列をそれぞれ示し、本明細書に記載の抗体によって標的化される細胞外ループは灰色で強調され、本明細書に記載の抗体を産生するために使用されるペプチドに対応する領域は太字および下線付きである。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、ヒト、ラット、およびマウスＮＴＳＲ１のアミノ酸配列をそれぞれ示し、本明細書に記載の抗体によって標的化される細胞外ループは灰色で強調され、本明細書に記載の抗体を産生するために使用されるペプチドに対応する領域は太字および下線付きである。
【図１０】本明細書に記載の研究で使用した４つの免疫ペプチド（ｌｉｎ、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）の特徴を示す。各ペプチドの一次配列、リンカーのタイプ、および大環を産生するために使用される鎖が示される。ヒトＮＴＳＲ１との交差反応性、および対応する示されたペプチドで産生された４つのＩｇＹ抗体の機能特性が、表の最後の２つの列に示される（＋および＋＋＋はそれぞれ、低活性および高活性に対応する）。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＨＣＴ１１６（図１１Ａ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｂ）膜調製物上の増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９による、放射性標識ニューロテンシン（１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］ＮＴ）の置換曲線を示す。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＨＣＴ１１６（図１１Ａ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｂ）膜調製物上の増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９による、放射性標識ニューロテンシン（１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］ＮＴ）の置換曲線を示す。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。
【図１１Ｃ】図１１Ｃおよび図１１Ｄは、ＨＣＴ１１６（図１１Ｃ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｄ）生細胞内のＨＴＲＦによって測定した、増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９を用いたＮＴ  １−１３によるＧαｑ活性化後のＩＰ−１産生（％）の遮断を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（１０μＭ）をアンタゴニスト対照として使用した。曲線を、４つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。データは、少なくとも３つの実験複製の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、少なくとも２つの独立した実験を表す。
【図１１Ｄ】図１１Ｃおよび図１１Ｄは、ＨＣＴ１１６（図１１Ｃ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｄ）生細胞内のＨＴＲＦによって測定した、増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９を用いたＮＴ  １−１３によるＧαｑ活性化後のＩＰ−１産生（％）の遮断を示すグラフである。ＳＲ４８６９２（１０μＭ）をアンタゴニスト対照として使用した。曲線を、４つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。曲線適合は、キャプションに示されるＩＣ５０をもたらした。データは、少なくとも３つの実験複製の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、少なくとも２つの独立した実験を表す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅおよび図１１Ｆは、生標的ＨＣＴ１１６（図１１Ｅ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｆ）細胞上のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を示すグラフである。ＡＤＣＣ応答を、生標的ＨＣＴ１１６およびＰＡＮＣ−１細胞上で増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８を使用して、レポーターバイオアッセイ（Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞内のＮＦＡＴ遺伝子活性化）で測定した。全発光を陰性対照（抗体を含まない試料）に対して正規化し、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲキメラモノクローナル抗体）をＡＤＣＣの陽性対照として使用した。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。結果として生じるＥＣ５０は、キャプションに示される。データは、少なくとも２つの独立した実験を示す。
【図１１Ｆ】図１１Ｅおよび図１１Ｆは、生標的ＨＣＴ１１６（図１１Ｅ）およびＰＡＮＣ−１（図１１Ｆ）細胞上のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を示すグラフである。ＡＤＣＣ応答を、生標的ＨＣＴ１１６およびＰＡＮＣ−１細胞上で増加する量のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８を使用して、レポーターバイオアッセイ（Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞内のＮＦＡＴ遺伝子活性化）で測定した。全発光を陰性対照（抗体を含まない試料）に対して正規化し、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲキメラモノクローナル抗体）をＡＤＣＣの陽性対照として使用した。曲線を、３つのパラメータを使用して非線形回帰によって評価した。結果として生じるＥＣ５０は、キャプションに示される。データは、少なくとも２つの独立した実験を示す。
【図１２Ａ】プロテインＡ／Ｇアガロースビーズを用いた免疫沈降実験のウエスタンブロットを示す。ＨＡ−ヒトＮＴＳ１またはＨＥＫ  ＣＴＬ（ＮＴＳ１を発現しない、右パネル）を安定して発現するＨＥＫ由来の全細胞溶解物を、ビーズおよび試験抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８および００９ならびにマウス抗ＨＡ  ＩｇＧ）と共に一晩インキュベートした。ウエスタンブロットを、抗ＨＡ  ＨＲＰ抗体を用いて明らかにした。
【図１２Ｂ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８および００９を使用して免疫組織化学（ＩＨＣ）について試験した異なる患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を示す表である。関連するタイプの癌が示される。陽性染色を、染色なし（−）から強い染色（＋＋＋）の範囲の全てのスライドについて評価した。（＋／−）は、アイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ）で得られたＩＨＣよりもわずかに強い染色を表す。
【図１２Ｃ】８つのＰＤＸ上の示される抗体（アイソタイプ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８および００９）で得られたＩＨＣの画像を示す。ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを染色に使用し、写真を２０倍拡大レンズ（Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｍ２）でスキャンした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載の研究において、本発明者らは、様々な種（ヒトを含む）由来のＮＴＳ１受容体の第２の細胞外ループの立体構造を模倣する環状ペプチドを操作し、これを使用してニワトリを免疫化し、ＮＴＳ１受容体を特異的に識別するＩｇＹ抗体を作った。これらの抗体は、ＮＴＳ１受容体への結合についてＮＴと競合し、ＮＴ依存性環状ＡＭＰ産生ならびにＮＴ媒介性Ｇαｑおよびβ−アレスチン−２シグナル伝達経路活性化を阻害することが示された。これらの抗体の組換え形態（ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ）も産生され、ヒトＮＴＳ１受容体を内因的に発現する癌細胞株におけるニューロテンシン媒介性Ｇαｑ活性化を阻害し、ＡＤＣＣを誘発し、異なる起源からの癌患者由来の異種移植片に結合することが示された。
【００１２】
抗ＮＴＳＲ１抗体およびその抗原結合フラグメント
したがって、第１の態様において、本開示は、ＮＴＳ１受容体（ＮＴＳＲ１）の細胞外ループ、好ましくはヒトＮＴＳＲ１（図９Ａ、配列番号８０）の残基２０６〜２３４に対応するＮＴＳＲ１の細胞外ループに位置するエピトープ（例えば、立体構造エピトープ）に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この細胞外ループは、ラットＮＴＳＲ１（図９Ｂ、配列番号８１）における残基２０７〜２３５、およびマウスＮＴＳＲ１（図９Ｃ、配列番号８２）の残基２０６〜２３４によって定義される。別の態様において、本開示は、ニューロテンシンとＮＴＳＲ１との間の相互作用を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＮＴＳ２に結合しない。
【００１３】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＮＴＳ１受容体（ＮＴＳＲ１）由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧ（配列番号８３）および／またはラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧ（配列番号８４）に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧ（配列番号８３）およびラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧ（配列番号８４）に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＰＧＧ（配列番号８５）に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＴＨＰＧＧ（配列番号８６）に位置する立体構造エピトープに特異的に結合する。
【００１４】
本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、タンパク質のネイティブな三次元構造に見られ、抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合することが可能な抗原決定基を指す。
【００１５】
本明細書で使用される「抗体またはその抗原結合フラグメント」という用語は、所望の抗原特異性／結合活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメントを含む任意のタイプの抗体／抗体フラグメントを指す。抗体フラグメントは、完全長抗体の一部分、概してその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖ＦＶ、ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ由来）、サメＮＡＲ単一ドメイン抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体フラグメントはまた、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ−ＶＨ）、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ＰｅｐＢｏｄｙ、抗体Ｔ細胞エピトープ融合体（Ｔｒｏｙｂｏｄｙ）、またはＰｅｐｔｉｂｏｄｙを含むがこれらに限定されない、ＣＤＲまたは抗原結合ドメインを含む結合部分を指すことができる。
【００１６】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団からの抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は実質的に類似しており、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る考えられるバリアントを除いて、同じエピトープ（複数可）に結合し、そのようなバリアントは概して微量で存在している。そのようなモノクローナル抗体は典型的には、標的に結合する可変領域を含む抗体を含み、抗体は、複数の抗体からの抗体の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールからの特有のクローンの選択であり得る。選択された抗体は、例えば、標的に対する親和性を改善する、抗体をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作るなどのために、さらに改変され得、改変された可変領域配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。修飾語「モノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照）、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物からヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，��０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ，７：３３（１９９３）、米国特許第．５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）、同第５，５４５，８０７号、ＷＯ９７／１７８５２、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、および同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３（１９９５）を参照）を含む、様々な技法によって作製され得る。本明細書に定義されるＮＴＳＲ１からの立体構造エピトープに特異的に結合することが可能な抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して産生され得る。次いで、本明細書に定義されるＮＴＳＲ１からの立体構造エピトープに選択的に結合する抗体フラグメントが単離され得る。ファージディスプレイを介してそのような抗体を産生するための例示的な方法は、例えば、米国特許第６，２２５，４４７号に開示されている。
【００１７】
本明細書におけるモノクローナル抗体は具体的には、所望の生物活性を示す限り、軽鎖および／または重鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」または「組換え」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体としては、「ヒト化」抗体が挙げられる。
【００１８】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列において大きく異なるという事実を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布していない。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲによって接続される、主にβシート構造を採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、交互のＦＲおよびＣＤＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各領域へのアミノ酸の割り当ては、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；２７３（４）：９２７−４８）、またはＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１８，５０９（１９９７））に従って行われ得る。
【００１９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、密接な非共有会合における１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造で会合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。この構造では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定する。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与することに関与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【００２０】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は概して、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）を含む。
【００２１】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のリガンドと接触し、その特異性を決定する免疫学的受容体の一部を指す。免疫学的受容体のＣＤＲは、受容体タンパク質の最も可変な部分であり、受容体にその多様性を与え、受容体の可変ドメインの遠位端の６つのループ上に担持され、３つのループは、受容体の２つの可変ドメインの各々に由来する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、Ｋａｂａｔら（上記参照）またはＣｈｏｔｈｉａ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）によって定義されるように、単一種中の異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分（すなわち、ＣＤＲ以外）を指す。本明細書で使用される場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一であるフレームワーク領域である。
【００２３】
一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体である。
【００２４】
別の実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である。
【００２５】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）の以下の組み合わせ：配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｌ２、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｌ３、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【００２６】
一実施形態において、上述のＣＤＲ配列内の１つまたは２つの残基が置換される。さらなる実施形態において、上述のＣＤＲ配列内の１つの残基が置換される。
【００２７】
一実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ１は以下の配列：ＳＧＧＧＳＴＤＡＸＳＹＹＹＧ（配列番号８６）を含み、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくはグリシンまたはセリンである。
【００２８】
一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＸ１ＴＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＮＸ６Ｘ７（配列番号８７）を含み、Ｘ１〜Ｘ７は独立して、任意のアミノ酸である。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＸ１ＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号８８）を含み、Ｘ１は任意のアミノ酸、好ましくはバリンまたはフェニルアラニンである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＸ２ＳＳＦＮＭＦ（配列番号８９）を含み、Ｘ２は任意のアミノ酸、好ましくはバリンまたはフェニルアラニンである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＦＸ３ＳＦＮＭＦ（配列番号９０）を含み、Ｘ３は任意のアミノ酸、好ましくはセリン、アルギニン、またはグリシンである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＦＳＸ４ＦＮＭＦ（配列番号９１）を含み、Ｘ４は任意のアミノ酸、好ましくはセリン、アルギニン、またはグリシンである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＦＳＳＸ５ＮＭＦ（配列番号９２）を含み、Ｘ５は任意のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、バリン、ロイシン、またはシステインである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＦＳＳＦＮＸ６Ｆ（配列番号９３）を含み、Ｘ６は任意のアミノ酸、好ましくはメチオニンまたはアルギニンである。一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は以下の配列：ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＸ７（配列番号９４）を含み、Ｘ７は任意のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、バリン、またはシステインである。
【００２９】
一実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は以下の配列：ＱＸ８Ｘ９Ｘ１０ＧＡＧＳＲＴＡＸ１１ＧＡＡＶＫＧ（配列番号９５）を含み、Ｘ８〜Ｘ１１は独立して、任意のアミノ酸である。別の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下の配列：ＱＸ８ＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号９６）を含み、Ｘ８は任意のアミノ酸、好ましくはイソロイシン、セリン、またはメチオニンである。別の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下の配列：ＱＩＸ９ＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号９７）を含み、Ｘ９は任意のアミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはセリンである。別の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下の配列：ＱＩＩＸ１０ＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号９８）を含み、Ｘ１０は任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。別の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下の配列：ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＸ１１ＧＡＡＶＫＧ（配列番号９９）を含み、Ｘ１１は任意のアミノ酸、好ましくはチロシンまたはアスパラギン酸である。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、図８Ａに示されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、（ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１は、配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、もしくはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）を含むもしくはそれからなる、（ｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ２は、配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）もしくはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含むもしくはそれからなる、（ｉｉｉ）ＣＤＲ−Ｌ３は、配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）もしくはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含むもしくはそれからなる、（ｉｖ）ＣＤＲ−Ｈ１は、配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、もしくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）を含むもしくはそれからなる、（ｖ）ＣＤＲ−Ｈ２は、配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、もしくはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）を含むもしくはそれからなる、（ｖｉ）ＣＤＲ−Ｈ３は、配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）もしくはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含むもしくはそれからなる、または（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせである。
【００３１】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＣＤＲの組み合わせを含む：（ｉ）配列ＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）、ＳＧＧＧＳＴＤＡＳＳＹＹＹＧ（配列番号１９）、またはＳＧＳＧＳＳＷＨＧＹＧ（配列番号１２５）、好ましくはＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧ（配列番号９）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列ＦＮＤＫＲＰＳ（配列番号１０）またはＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号１２６）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列ＧＳＡＤＳＴＧＧＩ（配列番号１１）またはＧＧＹＤＳＳＴＹＡＧＩ（配列番号１２７）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＲＦ（配列番号１５）、ＧＦＴＶＳＳＦＮＭＦ（配列番号１６）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＣ（配列番号１７）、ＧＦＴＦＳＳＦＮＭＶ（配列番号１８）、ＧＦＴＦＳＧＦＮＭＦ（配列番号２０）、ＧＦＴＦＲＳＦＮＭＦ（配列番号２１）、ＧＦＴＦＳＲＦＮＭＦ（配列番号２３）、ＧＶＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号２４）、ＧＦＴＦＳＳＶＮＭＦ（配列番号２５）、ＧＦＴＦＳＳＬＮＭＦ（配列番号２６）、ＧＦＴＦＧＳＦＮＭＦ（配列番号２７）、ＧＦＴＦＳＳＣＮＭＦ（配列番号２８）、またはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＩ（配列番号１２８）、好ましくはＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦ（配列番号１２）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｈ１、（ｖ）配列ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）、ＱＩＳＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２２）、ＱＳＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号２９）、ＱＭＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３０）、ＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＤＧＡＡＶＫＧ（配列番号３１）、ＱＩＩＥＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号３２）、またはＡＳＩＣＴＧＧＳＹＴＹＹＡＰＡＶＫＧ（配列番号１２９）、好ましくはＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号１３）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｈ２、および（ｖｉ）配列ＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡ（配列番号１４）またはＳＶＤＧＶＧＷＨＡＧＱＩＤＡ（配列番号１３０）を含むまたはそれからなるＣＤＲ−Ｈ３。
【００３２】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。一実施形態において、軽鎖ＦＲ１は、図８Ｂに示されるＦＲ１アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖ＦＲ２は、図８Ｂに示されるＦＲ２アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖ＦＲ３は、図８Ｂに示されるＦＲ３アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、軽鎖ＦＲ４は、図８Ｂに示されるＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。
【００３３】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＡＬＴＱＰＴＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＥＩＴＣ（配列番号１００）もしくはＡＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ（配列番号１３１）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＦＱＱＫＳＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１０１）もしくはＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１３２）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＴＳＧＳＴＮＴＬＴＩＴＧＶＱＡＤＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１０２）もしくはＮＩＰＳＲＦＳＧＳＡＳＧＳＴＡＴＬＴＩＴＧＶＲＡＥＤＥＡＶＹＦＣ（配列番号１３３）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１０３）もしくはＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号１３４）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。
【００３４】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１０４）もしくはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＲＡＬＳＬＶＣＫＡＳ（配列番号１３５）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶ（配列番号１０５）もしくはＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１３６）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＲ（配列番号１０６）もしくはＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号１３７）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１０７）もしくはＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳ（配列番号１３８）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。一実施形態において、重鎖ＦＲ１は、図８Ｃに示されるＦＲ１アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖ＦＲ２は、図８Ｃに示されるＦＲ２アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖ＦＲ３は、図８Ｃに示されるＦＲ３アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。一実施形態において、重鎖ＦＲ４は、図８Ｃに示されるＦＲ４アミノ酸配列のうちの１つを含むまたはそれからなる。
【００３５】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列番号１０４もしくは１３５を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列番号１０５もしくは１３６を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列番号１０６もしくは１３７を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列番号１０７もしくは１３８を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。
【００３６】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列 
【化１】
2022500072.tif 000003
（配列番号１０８）または
【化２】
2022500072.tif 000004
（配列番号１３９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。一実施形態において、参照可変軽鎖配列に対する差は、上記の下線付きのＦＲのうちの１つ以上内にある。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０８または１３９の配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
【００３７】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列 
【化３】
2022500072.tif 000005
（配列番号１０９）または
【化４】
2022500072.tif 000006
（配列番号１４０）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。一実施形態において、参照可変重鎖配列に対する差は、上記の下線付きのＦＲのうちの１つ以上内にある。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０９または１４０の配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
【００３８】
本明細書に記載のＣＤＲおよびＦＲの配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けに基づいている（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｎｏｖ  ７；２７３（４）：９２７−４８）。
【００３９】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化形態である。
【００４０】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるＣＤＲの組み合わせのいずれかを含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくはキメラまたはヒト化抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【００４１】
非ヒト（例えば、ニワトリ、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（例えば、ＣＤＲ）由来の残基が、本明細書に定義されるＣＤＲなどの所望の特異性、親和性、および能力を有するニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、ＦＲのうちの１つ以上からの残基がヒト免疫グロブリンの１つ以上のＦＲからの残基によって置き換えられる、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト（例えば、ニワトリ）免疫グロブリンに対応し得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト（例えば、ニワトリ）免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照。
【００４２】
ヒトキメラ抗体およびヒトＣＤＲ移植抗体は、当該技術分野において既知の方法を使用して調製され得る。代表的な方法が以下に記載される。
【００４３】
（１）組換え抗体発現のためのベクターの構築。組換え抗体発現のためのベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが挿入された動物細胞の発現ベクターであり、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの各々を動物細胞の発現ベクターにクローニングすることによって構築される。ヒト抗体の定常領域（以下、Ｃ領域と称される）は、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであり得る。例としては、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどが挙げられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとして、ｃＤＮＡが一般的に使用され得、エクソンおよびイントロンからなる染色体ＤＮＡもまた使用され得る。動物細胞の発現ベクターとして、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子がその中に挿入され、その中で発現され得る限り、任意の発現ベクターが使用され得る。その例としては、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）］などが挙げられる。動物細胞の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖プロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］、エンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などが挙げられる。組換え抗体発現のためのベクターとして、抗体ＨおよびＬ鎖の両方が同一ベクター上に存在する組換え抗体発現のためのベクターのタイプ（タンデムタイプ）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））が、組換え抗体発現のためのベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、ならびに動物細胞における抗体ＨおよびＬ鎖の発現レベルのバランスの観点から使用されてもよく、抗体ＨおよびＬ鎖が別個のベクター上に存在するタイプも使用され得る。組換え抗体発現のためのベクターのタンデムタイプの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８））などが挙げられる。
【００４４】
（２）非ヒト動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の分析。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを合成するために非ヒト抗体（例えば、ニワトリ抗体）を産生するハイブリドーマ細胞から抽出される。合成されたｃＤＮＡは、ファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングされて、ｃＤＮＡライブラリを調製する。ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを含有する組換えファージまたは組換えプラスミドの各々は、プローブとして非ヒト抗体のＣ領域またはＶ領域をコードするＤＮＡを使用してライブラリから単離される。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの塩基配列の完全長が決定され、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の完全長がそれぞれ塩基配列から推定される。非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製するための非ヒト動物の例としては、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。ハイブリドーマ細胞が産生され得る限り、任意の動物が使用され得る。全ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７））、またはＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）製）などのキットなどを使用して、ハイブリドーマ細胞から調製され得る。ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（商標）−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ製）などのキットを使用する方法などを使用して、全ＲＮＡから調製され得る。加えて、ｍＲＮＡは、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（登録商標）ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製）、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標）ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）製）などのキットを使用して、ハイブリドーマ細胞から調製され得る。ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを調製するための方法の例としては、既知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）製）などのキットを使用する方法が挙げられる。テンプレートとしてハイブリドーマ細胞から抽出されたｍＲＮＡを使用して合成されたｃＤＮＡが挿入される、ｃＤＮＡライブラリを調製するためのベクターは、ｃＤＮＡがそこに挿入され得る限り、任��のベクターであってもよい。その例としては、ＺＡＰ  ＥｘＰｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）製）、λｇｔ１０およびλｇｔ１１（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５））、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）製）、λＥｘＣｅｌｌ，ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３））、ｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５））などが挙げられる。ｃＤＮＡライブラリが導入、発現、および維持され得る限り、ファージまたはプラスミドベクターによって構築されたｃＤＮＡライブラリを導入するための任意のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが使用され得る。その例としては、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４））、Ｙ１０８８およびＹ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：７７８（１９８３））、ＮＭ５２２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３））、Ｋ８０２（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６））、ＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５））などが挙げられる。同位体または蛍光標識プローブを使用するコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））は、ｃＤＮＡライブラリから非ヒト抗体などのＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンを選択するために使用され得る。また、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、プライマーを調製し、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリから調製したｃＤＮＡをテンプレートとして使用することによって、ポリメラーゼ連鎖反応を通して調製され得る。ｃＤＮＡの塩基配列は、適切な制限酵素などで選択されたｃＤＮＡを消化し、フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）などのプラスミドにクローニングし、通常使用される配列分析法を行うことによって決定され得る。例えば、配列分析法は、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））などの反応後に、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（登録商標）（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）製）などの自動ヌクレオチド配列決定分析装置を使用することによって実施される。得られたｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含有する抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードするかどうかは、決定されたヌクレオチド配列からＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の完全長を推定し、それらを既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の完全長と比較することによって確認され得（Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））、さらに、それらが属するサブグループが決定され得る。加えて、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列は、それらを既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列と比較することによって決定され得る。
【００４５】
（３）ヒトキメラ抗体発現のためのベクターの構築。非ヒト動物（例えば、ニワトリ）の抗体のＶＨおよびＶＬの各々をコードするｃＤＮＡは、上述の組換え抗体の発現のためのベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の上流でクローニングされ、それによってヒトキメラ抗体発現のためのベクターを構築する。非ヒト動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端とをライゲーションするために、ＶＨおよびＶＬをコードする各ｃＤＮＡは、連結部分の塩基配列によってコードされる適切なアミノ酸をコードするように調製され、制限酵素の適切な認識配列を有するように設計される。ＶＨおよびＶＬの調製されたｃＤＮＡは、それらの各々が上記（１）で言及されたヒトＣＤＲ移植抗体発現のためのベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の上流で適切な形態で発現されるようにそれぞれクローニングされて、ヒトキメラ抗体発現のためのベクターを構築する。加えて、非ヒト動物抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、両端に適切な制限酵素の認識配列を有する合成ＤＮＡを使用してＰＣＲによって増幅され、それらの各々は、組換え抗体発現のために上記（１）で得られたベクターにクローニングされる。
【００４６】
（４）ヒトＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築。非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬ中のＣＤＲ（例えば、本明細書に記載の抗体のＣＤＲ）のアミノ酸配列が移植される、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬ中のＦＲのアミノ酸配列がそれぞれ選択される。ＦＲの任意のアミノ酸配列は、それらがヒト由来である限り使用され得る。その例としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲのサブグループに共通のアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などが挙げられる。抗体の結合活性の減少を阻害するために、元の抗体のＶＨまたはＶＬ中のＦＲのアミノ酸配列と高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するＦＲのアミノ酸配列が選択される。次いで、元の抗体のＣＤＲのアミノ酸配列が、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬ中のＦＲの選択されたアミノ酸配列にそれぞれ移植されて、ヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬの各アミノ酸配列を設計する。設計されたアミノ酸配列は、抗体の遺伝子のヌクレオチド配列に見られるコドン使用の頻度を考慮することによってＤＮＡ配列に変換され、ヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が設計される。設計されたＤＮＡ配列に基づいて、約１００ヌクレオチドの長さを有するいくつかの合成ＤＮＡが合成され、それらを使用してＰＣＲが行われる。この場合、ＰＣＲの反応効率および合成され得るＤＮＡの長さを考慮して、Ｈ鎖およびＬ鎖の各々当たり６個の合成ＤＮＡが設計されることが好ましい。さらに、ヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、両端上に存在する合成ＤＮＡの５’末端に適切な制限酵素の認識配列を導入することによって、（１）で構築されたヒトＣＤＲ移植抗体を発現するためのベクターに容易にクローニングされ得る。そうでなければ、設計されたＤＮＡ配列に基づいて、完全長Ｈ鎖および完全長Ｌ鎖の各々をコードする単一ＤＮＡとして合成ＤＮＡを使用して行われ得る。ＰＣＲ後、増幅産物がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）などのプラスミドにクローニングされ、塩基配列は、（２）に記載の方法と同様の方法に従って決定されて、所望のヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを得る。
【００４７】
（５）ヒトＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の修飾。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬ中のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植することによってヒトＣＤＲ移植抗体が産生される場合、その抗原結合活性が元の非ヒト抗体よりも低い場合があることが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。ヒトＣＤＲ移植抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬ中のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗原への結合に直接関与するアミノ酸残基、ＣＤＲ中のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合に間接的に関与するアミノ酸残基が識別され、元の非ヒト抗体中に見られるアミノ酸残基と置き換えられ、それによって減少した抗原結合活性を増加させ得る。ＦＲにおける抗原結合活性に関与するアミノ酸残基を識別するために、抗体の三次元構造が構築され、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリングなどによって分析され得る。加えて、抗原に対する十分な結合活性を有する修飾ヒトＣＤＲ移植抗体は、各抗体のいくつかの修飾抗体を産生し、それらの抗原結合活性を検査して改善された親和性を有するものを識別することによって得られ得る。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬ中のＦＲのアミノ酸配列の修飾は、（４）に記載のＰＣＲに従って修飾のための様々な合成ＤＮＡを使用して達成され得る。ＰＣＲにより得られた増幅産物に関しては、所望の修飾が行われたかどうかを検査するために、（２）に記載の方法に従って塩基配列が決定される。
【００４８】
（６）ヒトＣＤＲ移植抗体発現のためにベクターの構築。ヒトＣＤＲ移植抗体発現のためのベクターは、構築された組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードする各ｃＤＮＡを、（１）に記載の組換え抗体発現のためのベクター中のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流にクローニングすることによって構築され得る。例えば、（４）および（５）のヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬの構築に使用される合成ＤＮＡのうち両端に位置付けられた合成ＤＮＡの５’末端に、適切な制限酵素の認識配列が導入され、（１）に記載のヒトＣＤＲ移植抗体発現のためのベクターにおけるヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流で適切な形態でそれらが発現されるようにクローニングが行われ得る。
【００４９】
（７）組換え抗体の一過性発現。組換え抗体は、様々なヒトＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、（３）および（６）で得られた組換え抗体発現のためのベクターまたはその修飾発現ベクターを使用して一過性に発現され得る。宿主細胞が組換え抗体を発現することが可能である限り、任意の細胞が宿主細胞として使用され得る（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）。例えば、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が使用される。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入は、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法などを使用することによって実施される。発現ベクターの導入後、培養上清中の組換え抗体の発現レベルおよび抗原結合活性は、酵素免疫測定法などによって決定され得る。
【００５０】
（８）組換え抗体を安定して発現する形質転換体の取得および組換え抗体の調製。組換え抗体を安定して発現する形質転換体は、（３）および（６）で得られた組換え抗体発現のためのベクターを適切な宿主細胞に導入することによって得られ得る。宿主細胞への発現ベクターの導入は、エレクトロポレーションなどによって実施される。組換え抗体発現のためのベクターが導入される宿主細胞として、組換え抗体を産生することが可能である宿主細胞である限り、任意の細胞が使用され得る。その例としては、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カタログ番号１１６１９）、ラット骨髄腫細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＹＢ２／０とも呼ばれる）、マウス骨髄腫細胞ＮＳＯ、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞、レクチン抵抗性獲得Ｌｅｃ１３、α１，６−フコシルトランスアファーゼ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６６２）、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞（ＥＢＮＡ１の、切断されているが機能的な形態を発現する、米国特許第８，６３７，３１５号）などが挙げられる。発現ベクターの導入後、組換え抗体を安定して発現する形質転換体は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含有する動物細胞培養用培地中でそれらを培養することによって選択される。動物細胞培養用培地の例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製）、ＧＩＴ培地（Ｎｉｈｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（登録商標）製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１（登録商標）培地（ＪＲＨ（登録商標）製）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製）、ハイブリドーマ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）製）、これらの培地にＦＢＳなどの様々な添加剤を添加することによって得られた培地などが挙げられる。組換え抗体は、得られた形質転換体を培地中で培養することによって、培養上清中で産生および蓄積され得る。培養上清中の組換え抗体の発現レベルおよび抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡなどによって測定され得る。また、形質転換体において、組換え抗体の発現レベルは、ＤＨＦＲ増幅系などを使用することによって高められ得る。組換え抗体は、プロテインＡカラムを使用することによって形質転換体の培養上清から精製され得る。加えて、組換え抗体は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過などのタンパク質精製方法を組み合わせることによって精製され得る。精製された組換え抗体または抗体分子のＨ鎖またはＬ鎖の全体としての分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングなどによって決定される。
【００５１】
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣ（配列番号１１０）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１１１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１１２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１３）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。
【００５２】
さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣ（配列番号１１０）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹ（配列番号１１１）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１１２）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１３）を含むもしくはそれからなる軽鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。
【００５３】
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１１５）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号１１６）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。
【００５４】
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む：（ｉ）配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号１１４）を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ１、（ｉｉ）配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号１１５）を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ２、（ｉｉｉ）配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号１１６）を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ３、（ｉｖ）配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１７）を含むもしくはそれからなる重鎖ＦＲ４、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせ。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、特徴（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。
【００５５】
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
【化５】
2022500072.tif 000007
（配列番号１１８）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
【００５６】
別の態様において、本開示は、配列
【化６】
2022500072.tif 000008
（配列番号１１８）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００５７】
一実施形態において、参照可変軽鎖配列に対する差は、上記の下線付きのＦＲのうちの１つ以上内にある。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＳＧＧＧＳＴＤＡＧＳＹＹＹＧＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＴＶＩＹＦＮＤＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＧＳＡＤＳＴＧＧＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１１８）の配列を含むまたはそれからなる可変軽鎖を含む。
【００５８】
一実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列
【化７】
2022500072.tif 000009
（配列番号１１９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
【００５９】
別の態様において、本開示は、配列
【化８】
2022500072.tif 000010
（配列番号１１９）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００６０】
一実施形態において、参照可変重鎖配列に対する差は、上記の下線付きのＦＲのうちの１つ以上内にある。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＮＭＦＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＩＤＧＡＧＳＲＴＡＹＧＡＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧＨＹＷＧＧＡＳＩＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１９）を含むまたはそれからなる可変重鎖を含む。
【００６１】
別の実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、一本鎖抗体、好ましくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ｓｃＦｖは、上述のＣＤＲ、ＦＲ、および／または可変領域を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、リンカーを通して一緒に連結または接続される。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続し得るか、またはＶＬのＮ末端をＶＨのＣ末端と接続し得る。一実施形態において、リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続する。
【００６２】
リンカーは、軽鎖および重鎖が抗原認識のための適切な立体構造を採用すること（すなわち、ＮＴＳＲ１からの上述の立体構造エピトープに結合する能力を維持すること）を可能にするために、好適な可撓性および安定性を有する、１つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドリンカー、または別のタイプの化学リンカー（例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、ＰＥＧなど）であってもよい。一実施形態において、リンカーは、ポリペプチドリンカーである。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、約１００、９０、８０、７０、６０、もしくは５０個のアミノ酸またはそれ以下を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、約５〜約５０個のアミノ酸、例えば、約５〜約４０個のアミノ酸または約７〜約３０個のアミノ酸、例えば、約７〜約２０または２５個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、リンカーは、約１５〜約２０個のアミノ酸または約１８〜２０個のアミノ酸、好ましくは１８個のアミノ酸を含む。ポリペプチドリンカーは、軽鎖および重鎖が抗原認識のための適切な立体構造を採用すること（すなわち、上述のＮＴＳＲ１からの立体構造エピトープに結合する能力を維持すること）を可能にするために、好適な可撓性および安定性を有するように設計されている。ｓｃＦｖフラグメントに好適な可撓性ポリペプチドリンカー、より具体的には最小の球状性および最大の障害を有するリンカーを設計するための方法は、当該技術分野において既知である。これは、例えば、Ｇｌｏｂｐｌｏｔ  ２．３プログラムまたは任意の他の好適なツールを使用して達成され得る。配列は、推定凝集ホットスポット、局在化ドメイン、ならびに／または相互作用およびリン酸化モチーフを排除するためにさらに最適化され得る。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、グリシン残基が豊富であり、すなわち、リンカーの残基の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％がグリシン残基である（リンカー可撓性に有利に働くことが知られている）。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、１つ以上のセリン（ＳｅｒもしくはＳ）および／またはトレオニン残基（リンカー溶解性に有利に働くことが知られている）、好ましくはセリン残基を含む。別の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、ペンタペプチド配列ＧＧＧＧＳ（またはＧ４ＳまたはＧｌｙ４Ｓｅｒ）を含む。一実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのアルギニン残基を含む。別の実施形態において、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのグルタミン残基を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列ＧＱＳＳＲＳＳ（配列番号１２０）を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドリンカーは、配列ＧＱＳＳＲＳＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２１）を含むまたはそれからなる。
【００６３】
一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメイン、例えば、軽鎖および／または重鎖の定常ドメイン、またはそのフラグメントを含む。さらなる実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体の定常重鎖のフラグメント結晶性（Ｆｃ）フラグメントを含む。Ｆｃフラグメントは、２つまたは３つの定常ドメイン、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい。Ｆｃ領域は、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、または最大１０個のアミノ酸修飾を有するヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のバリアントから得てもよい。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ヒト抗体、好ましくはＩｇＧ１などのヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むまたはそれからなる。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、図８Ｇの太字の配列（配列番号７９の残基１４〜２３３）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、図８Ｇの太字の配列を含むまたはそれからなる。
【００６４】
一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントは、上で定義したＦｃフラグメントなどのＦｃフラグメントを含むｓｃＦｖ（ｓｃＦＶ−Ｆｃ）である。一実施形態において、ｓｃＦｖ成分は、リンカー、例えば、ヒンジによってＦｃフラグメントに接続される。ヒンジは、抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列ＰＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号７９の残基１〜１３）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列ＰＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰを含むまたはそれからなる。
【００６５】
ｓｃＦｖ−Ｆｃの様々な特性を改善するために、ヒンジ領域およびＦｃ領域に修飾が行われ得る。一実施形態において、天然に存在するヒトＦｃ領域の１、２、３、４、５、または最大１０個のアミノ酸が、ヒンジ領域の修飾に加えて修飾され得る。例えば、Ｆｃ領域は、ｓｃＦｖ−Ｆｃの血清半減期を延長させるように修飾され得る。ＩｇＧの半減期は、受容体ＦｃＲｎへのそのｐＨ依存的結合に依存する。内皮細胞の表面上で発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存的にＩｇＧに結合し、それを分解から保護する。例えば、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の界面に位置する変異は、インビボでＦｃＲｎへの結合親和性を増加させ、ＩｇＧ１の半減期を延長させることが示されている。そのような修飾は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ  ＷＲ．，２００９．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（６）：６８５−９１、およびＶａｃｃａｒｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３−８で概説されている。
【００６６】
ヒンジおよび／またはＦｃフラグメントに対する他の修飾は、エフェクター機能を増加または低減させることができる。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃ−ガンマ（Ｆｃγ）受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、抑制性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、および補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、異なるエフェクター機能をもたらす。ＩｇＧのＦｃγＲまたはＣ１ｑへの結合は、例えば、ＩｇＧヒンジ領域およびＣＨ２ドメイン内に位置する残基に依存する。これらの残基の単一または複数のアミノ酸置換は、ＦｃγＲまたはＣ１ｑとのＩｇＧ相互作用を調節することによってエフェクター機能に影響を及ぼし得る。他の置換がエフェクター機能に影響を与えることが知られている。これらの修飾は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ  ２００９（上記参照）で概説されている。アミノ酸修飾を使用して、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントの薬理学的機能を改善することもできる。例えば、アミノ酸修飾を使用して、補体活性化を増加させ、ＦｃｙＲＩＩＩＡ結合を増加させるもしくはＦｃｙＲＩＩＩＢ結合を減少させることによって抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強し、かつ／またはＦｃＲｎ結合を増加させることによって血清半減期を延長させることができる。そのようなアミノ酸修飾は、例えば、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  １０：３４５−５２で概説されている。
【００６７】
ヒトＩｇＧ１のヒンジおよび／またはＦｃフラグメントの代表的な修飾が表１に要約される（ＷＯ２０１６／１４１２４４から）。
【表１】
2022500072.tif 000011
１．Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−１６。２．Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３−８８。３．Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４。４．Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４。５．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４。６．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（４）：２５７１−７５。７．Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（１１）：４００５−１０。８．Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：３００９−１８。９．Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５：８６−９４。１０．Ｓｔｅｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４。１１．Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２７。
【００６８】
したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆｃフラグメント」という用語は、ＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑに結合する能力を維持する抗体またはそのバリアント由来のネイティブＦｃフラグメント（例えば、ネイティブＦｃフラグメントと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の配列同一性を有する）を指す。
【００６９】
抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントに対する考えられる修飾
本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載される保存的および非保存的変異のための技法およびガイドラインのいずれかを使用して行われ得る。変異は、ネイティブ配列抗体と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす抗体をコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であってもよい。任意に、この変異は、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントのドメインのうちの１つ以上において、少なくとも１個のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することによる。どのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際のガイダンスは、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの配列を相同性の既知のタンパク質分子の配列と比較し、高相同性の領域で行われるアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換える結果であり得、例えば、ロイシンのセリンでの置き換え、すなわち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。挿入または欠失は任意に、約１〜５個のアミノ酸の範囲内であり得る。許容される変異は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に行い、得られるバリアントを、完全長または成熟天然配列によって示される活性について試験することによって決定され得る。実施形態において、バリアントは、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの配列と少なくとも５０％、５５％または６０％、好ましくは少なくとも６５、７０、７５、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を示し、本明細書に記載のＮＴＳＲ１から立体構造エピトープに特異的に結合する能力を維持する。
【００７０】
「同一性」は、２つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、アライメントされた配列内の各位置を比較することによって決定され得る。同一性パーセントを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＳＩＭ、ＤＩＡＬＩＧＮなどを含むいくつかのツールおよびプログラムが、アミノ酸配列をアライメントし、同一性パーセンテージを決定するために利用可能である。本明細書で使用される場合、特定の対象配列またはその指定された部分に対する所与の同一性パーセンテージは、ＢＬＯＳＵＭ置換マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−９（１９９２））を類似性尺度として使用して、スミスウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７（１９８１））によって生成される最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、対象配列（またはその指定された部分）内のアミノ酸と同一の候補誘導体配列内のアミノ酸のパーセンテージとして定義され得る。
「同一性％値」は、同一性パーセントが報告されている配列長で割った一致する同一アミノ酸の数によって決定される。
【００７１】
抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾としては、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの標的アミノ酸残基を、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させることが挙げられる。他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパルチル残基のそれぞれへの脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００７２】
本開示の範囲内に含まれる抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの他のタイプの共有結合修飾としては、抗体またはその抗原結合フラグメントのネイティブグリコシル化パターンを変更すること（Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８２−５０１，２００８、Ｗａｌｓｈ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  １５：７７３−７８０，２０１０）、および米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載される方法で、抗体またはその抗原結合フラグメントを様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つに連結することが挙げられる。グリコシル化はまた、結果として生じる抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ−ＦｃのＡＤＣＣ活性を増加させるために、例えば、フコシル化を阻害することによって意図的に変更され得る。
【００７３】
一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の部分で標識されるか、またはそれとコンジュゲートされる。抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、コエンザイム標識、化学発光標識、または放射性同位体標識などの１つ以上の標識で標識され得る。一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識、例えば、蛍光部分（フルオロフォア）で標識される。有用な検出可能な標識としては、蛍光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料など）、放射性標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびタンパク質検出アッセイで一般的に使用される他のもの）、ストレプトアビジン／ビオチン、ならびにコロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色標識が挙げられる。化学発光化合物も使用され得る。そのような標識抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織染色などによって、例えば、インビボまたはインビトロでＮＴＳＲ１および／またはＮＴＳＲ１発現細胞を検出するのに有用であり得る。抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの検出および／または精製を容易にする検出可能または親和性タグにコンジュゲートされ得る。そのようなタグは、当該技術分野において周知である。検出可能または親和性タグの例としては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ポリアルギニンタグ、ポリアスパラギン酸タグ、ポリシステインタグ、ポリフェニルアラニンタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ（登録商標）タグ、エピトープタグ（ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ＨＳＶ、Ｓ／Ｓ１、ｃ−ｍｙｃ、ＫＴ３、Ｔ７、Ｖ５、Ｅ２、およびＧｌｕ−Ｇｌｕエピトープタグなど）、レポータータグ、例えば、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）タグが挙げられる（例えば、Ｋｉｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１３；７３：Ｕｎｉｔ−９．９を参照）。
【００７４】
抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、１つ以上の治療薬または活性剤（例えば、薬物）にコンジュゲートされ得、したがって、治療薬（複数可）（例えば、抗腫瘍薬、あるいは疾患もしくは状態の治療または１つ以上の症状の緩和に有用な任意の他の薬剤）を腫瘍などの細胞または組織に送達するために治療的に使用され得る。抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントを別の部分（例えば、検出可能な部分、活性剤）にコンジュゲートするための当該技術分野において既知の任意の方法が用いられ得、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４、Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９、Ｎｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）、およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載される方法を含む。
【００７５】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の特徴のうちの１つ以上、すなわち、本明細書に記載の特徴の任意の組み合わせ／部分的組み合わせを有する、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００７６】
抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸、細胞、および作製方法
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。単離された核酸は、例えば、合成ＤＮＡ、非自然発生的ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。例としては、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬドメインをコードする核酸、ならびに／またはｓｃＦｖもしくはｓｃＦｖ−Ｆｃをコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミド、ベクター、または転写もしくは発現カセット内に挿入され得る。当該技術分野において周知の従来の技法を使用して、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸が作製され得、記載の発現された抗体または抗原結合フラグメントが試験され得る。
【００７７】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントを発現する細胞、例えば、組換え宿主細胞を提供する。抗体または抗原結合フラグメントを調製する方法は、抗体または抗原結合フラグメントを産生する条件下で宿主細胞においてコード核酸（複数可）を発現することと、抗体または抗原結合フラグメントを回収することとを含む。抗体または抗原結合フラグメントを回収するプロセスは、抗体または抗原結合フラグメントの単離および／または精製を含み得る。産生方法は、抗体または抗原結合フラグメントを、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの追加の成分を含む組成物に製剤化することを含んでもよい。
【００７８】
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡが導入された細胞を指すように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すように意図されることが理解されるべきである。ある特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかにより後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなくてもよいが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。好ましくは、宿主細胞は、生命界のいずれかから選択される原核細胞および真核細胞を含む。好ましい真核細胞としては、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられる。最も好ましくは、宿主細胞としては、原核細胞株Ｅ．Ｃｏｌｉ、哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ  ２９３、およびＣＯＳ、昆虫細胞株Ｓｆ９、真菌細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、植物細胞、または藻類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
別の実施形態において、宿主細胞は免疫細胞である。本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞などを産生するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として使用され得る。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、ＮＴＳＲ１）に対する特異性を提供するリガンド結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）を、Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン（またはシグナル伝達ドメイン（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ））部分と組み合わせ、一次活性化シグナルを提供する。腫瘍細胞によって発現される分子に結合することが可能な抗体の抗原結合フラグメント、より具体的にはｓｃＦｖは、一般にＣＡＲとして使用される。したがって、別の態様において、本開示は、本明細書に記載のｓｃＦｖを発現する宿主細胞、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞を提供する。
【００８０】
本開示のＣＡＲはまた、膜に広がる膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、天然ポリペプチド由来であり得るか、または人工的に設計され得る。天然ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質から得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体ａもしくはβ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３−エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲの膜貫通ドメインが使用され得る。人工的に設計された膜貫通ドメインは、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むポリペプチドである。合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見られることが好ましい。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性を与えるＣＤ２８またはＣＤ８由来である。
【００８１】
ＣＡＲで使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体関与後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、抗原依存性一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するものを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能する様々な受容体の細胞質内尾部に見られる、十分に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明で使用されるＩＴＡＭの例には、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲエプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものが含まれ得る。
【００８２】
本開示のＣＡＲはまた、ヒトＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ−１、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、およびＧＩＴＲ（ＡＩＴＲ）などの１つ以上の共刺激ドメインを含んでもよい。実施形態において、ＣＡＲは第３世代であり、ＣＤ２８および４−１ＢＢなどの２つの共刺激ドメインを含む。
【００８３】
本開示のＣＡＲはまた、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のシグナルペプチドＮ末端を含んでもよく、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞内で発現されると、新生タンパク質が小胞体に、その後それが発現される細胞表面に向けられる。シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−ヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長い伸長を含有し得る。シグナルペプチドは転座中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ、短い正荷電アミノ酸伸長から始まってもよい。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸の伸長が存在する。シグナルペプチダーゼは、転座中または完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによって消化される。一例として、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８もしくはＧＭ−ＣＳＦ、または１もしくは２個のアミノ酸変異を有するそのバリアントに由来し得るが、ただし、シグナルペプチドが依然として、ＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能することを条件とする。
【００８４】
本開示のＣＡＲは、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのヒンジとして、スペーサー配列を含み得る。可撓性スペーサーにより、結合ドメインが異なる方向に配向して、所望の抗原（例えば、ＮＴＳＲ１）へのその結合を可能にすることができる。スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００８５】
本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸（複数可）を含む好適なベクターが選択または構築され得、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスであってもよい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現における核酸の操作のための技法およびプロトコルは、当該技術分野において周知である。
【００８６】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すように意図される。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。
【００８７】
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律複製が可能である（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用である発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのそのような他の形態を含むように意図される。
【００８８】
そのような核酸を宿主細胞に導入することは、当該技術分野において周知の技法を使用して達成され得る。真核細胞については、好適な技法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルスを使用した形質導入が挙げられる。細菌細胞については、好適な技法としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションが挙げられ得る。導入の後に、核酸からの発現を引き起こすこと、またはそれを可能にすること、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することが続いてもよい。一実施形態において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム、例えば、染色体に組み込まれる。組み込みは、標準的な技法に従ってゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進され得る。
【００８９】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌、酵母、ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウス黒色腫細胞、ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児網膜細胞、および多くの他のものが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は、当該技術分野において十分に確立されている。概説については、例えば、Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照。例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１７−２３で概説されるように、真核細胞における発現もまた当業者に利用可能である。
【００９０】
抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび担体または賦形剤、さらなる実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、好適な純度を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって、薬学分野において周知の方法で調製されてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｏｙｄ  Ｖ  Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ，２０１２，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照）。担体／賦形剤は、任意の従来の投与経路、例えば、経口、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、脳室内、嚢内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、大槽内、腹腔内、鼻腔内、または肺（例えば、エアロゾル）投与による、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に好適であり得る。一実施形態において、担体／賦形剤は、静脈内または皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。一実施形態において、担体／賦形剤は、静脈内経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。別の実施形態において、担体／賦形剤は、皮下経路による抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に適合される。
【００９１】
「賦形剤」は、本明細書で使用される場合、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、活性成分（薬物）自体ではない任意の成分である。賦形剤としては、例えば、結合剤、潤滑剤、希釈剤、充填剤、増粘剤、崩壊剤、可塑剤、コーティング剤、バリア層製剤、潤滑剤、安定剤、放出遅延剤、および他の成分が挙げられる。「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、活性成分の生物活性の有効性を妨げず、対象に対して毒性がない、すなわち、対象に対して毒性がないタイプ賦形剤であり、かつ／または対象に対して毒性がない量で使用するためのものである、任意の賦形剤を指す。賦形剤は当該技術分野において周知であり、本系はこれらの点で限定されない。ある特定の実施形態において、剤形の１つ以上の製剤としては、例えば、限定するものではないが、１つ以上の結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）（結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））、増粘剤、界面活性剤、希釈剤、放出遅延剤、着色剤、香味剤、充填剤、崩壊剤／溶解促進剤、潤滑剤、可塑剤、シリカフローコンディショナー、流動促進剤、固化防止剤、抗粘着剤、安定剤、帯電防止剤、腫脹剤、およびそれらの任意の組み合わせを含む賦形剤が挙げられる。当業者が認識するように、単一の賦形剤は、一度に３つ以上の機能を果たすことができ、例えば、結合剤および増粘剤の両方として機能することができる。また、当業者が認識するように、これらの用語は必ずしも相互排他的ではない。一般的に使用される賦形剤の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。薬学的に許容される物質の追加の例は、貯蔵寿命を延長させるまたは有効性を高める、湿潤剤または補助物質、例えば乳化剤、防腐剤、または緩衝液である。
【００９２】
組成物はまた、以下にさらに詳述されるように、標的疾患／状態の治療、または標的疾患／状態の症状（複数可）の管理のための１つ以上の追加の活性剤（例えば、鎮痛剤、制吐剤など）を含んでもよい。
【００９３】
抗ＮＴＳＲ１抗体およびその抗原結合フラグメント、またはそれらを含む組成物の使用
別の態様において、本開示は、細胞におけるＮＴＳＲ１活性を阻害するための方法を提供し、方法は、細胞を有効量の本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物と接触させることを含む。本開示はまた、細胞におけるＮＴＳＲ１活性を阻害するための、または細胞におけるＮＴＳＲ１活性を阻害するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、ＮＴＳＲ１活性は、ＮＴＳＲ１へのニューロテンシン（ＮＴ）の結合によって媒介される。一実施形態において、ＮＴＳＲ１活性は、ＮＴ媒介性Ｇαｑ活性化、すなわち、ＮＴのＮＴＳＲ１への結合によって誘導されるＧαｑ経路の活性化を含む。
【００９４】
別の態様において、本開示は、細胞上のＮＴＳＲ１へのニューロテンシン（ＮＴ）の結合を阻害するための方法を提供し、方法は、細胞（ＮＴＳＲ１発現細胞）を、有効量の本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物と接触させることを含む。本開示はまた、細胞上のＮＴＳＲ１へのＮＴの結合を阻害するための、または細胞上のＮＴＳＲ１へのＮＴの結合を阻害するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。一実施形態において、細胞は腫瘍または癌細胞である。一実施形態において、細胞は膵臓、前立腺、肺、乳房、肝臓、または結腸細胞である。別の実施形態において、細胞は膵臓または肝臓細胞である。
【００９５】
別の態様において、本開示は、対象におけるＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態（例えば、ＮＴＳＲ１活性の調節不全または異常）を治療するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象におけるＮＴＳＲ１活性に関連する疾患もしくは状態を治療するための、または対象におけるＮＴＳＲ１活性に関連する疾患もしくは状態を治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。
【００９６】
ＮＴＳＲ１は、ＧＰＣＲの大スーパーファミリーに属し、低血圧症、高血糖症、低体温症、痛覚抑制、ならびに腸運動性および分泌の調節などのＮＴの複数の機能を媒介することが示されている。
【００９７】
ＮＴＳＲ１発現／過剰発現は、炎症性腸疾患と関連することが示されている（例えば、Ｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ  ２８；１９（２８）：４５０４−４５１０を参照。したがって、一実施形態において、ＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。一実施形態において、治療は、腸粘膜炎症および／または急性結腸炎症を低減する。一実施形態において、治療は、大腸炎関連腫瘍形成を発生するリスクを予防または低減する。
【００９８】
疾患の重症度とも相関したより高い血漿ｐｒｏ−ＮＴレベルがＮＡＦＬＤを有する対象において検出されたため、ＮＴ／ＮＴＳＲ１系が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの特定の代謝障害に関与するという証拠も存在する（Ｂａｒｃｈｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１０３（６）：２２５３−２２６０）。より高い血漿ｐｒｏ−ＮＴレベルはまた、インスリン抵抗性の特徴と関連付けられ、非肥満個体において後期に肥満を発症するリスクを倍増させた（Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６；５３３（７６０３）：４１１−４１５）。全身投与されるＮＴは、高血糖および高グルカゴン血症効果を有することが知られている。これらの効果は、ヒスタミンＨ−１およびＨ−２受容体によって遮断されることがわかっており（Ｎａｇａｉ  Ｋ，Ｆｒｏｈｍａｎ  ＬＡ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９７８  ２７（５）：５７７−８２）、ヒスタミン放出がシグナル伝達経路に関与することを示唆する。ソマトスタチンの変化も報告された。ＮＴ欠損マウスは、高脂肪食誘発性肥満、インスリン抵抗性、および肝臓組織における脂質の蓄積に対してより耐性があることが示された（Ｊｉｎｇ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３，４１１−４１５）。
【００９９】
したがって、一実施形態において、ＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態は、肥満、インスリン抵抗性、グルコース抵抗性、２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ、またはＮＡＳＨなどの心血管疾患または代謝疾患である。一実施形態において、ＮＴＳＲ１活性に関連する疾患または状態は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨである。
【０１００】
中枢神経系（ＣＮＳ）および胃腸管におけるＮＴによるＮＴＳＲ１関与の生理学的作用に加えて、ＮＴ媒介性ＮＴＳＲ１刺激が発癌において重要な役割を果たすという証拠が増えている。ＮＴＳＲ１の異常発現（例えば、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、および結腸癌）、増殖および生存効果を伴う腫瘍成長から、足場非依存性成長ならびに前移動性および前侵襲性効果を有する転移拡散までの癌進行の各段階における効果を伴う、多数のタイプの癌細胞および腫瘍におけるＮＴ発癌作用が記載されている（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．２０１２；３：１８４、Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１４；１００（１）：２５−３４、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０１３；３：１−９、Ａｌｆａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０；１６：４４０１−４４１０、Ｄｕｐｏｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２００９；４：ｅ４２２３、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８；１２３：１８１６−１８２３、Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００１；２２：１０９−１１５、Ｍａｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８０：４４８−４５４を参照）。これらの効果は全て、細胞形質転換の初期段階中のＮＴＳＲ１の異常または調節不全発現と関連し、いくつかのキナーゼおよびエフェクター、例えばＰＫＣ、ＭＡＰＫ、ＦＡＫ、ＲＨＯ−ＧＴＰａｓｅ、ＲＡＳ、およびＳｃｒの活性化の結果である。ＮＴＳＲ１発現は、乳癌、肺癌、および頭頸部扁平上皮細胞癌を含むいくつかの癌における予後不良の独立したマーカーであることが示されている。
【０１０１】
別の態様において、本開示は、対象における癌（ＮＴＳＲ１陽性癌）を治療するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象における癌（ＮＴＳＲ１陽性癌）を治療するための、または対象における癌（ＮＴＳＲ１陽性癌）を治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物の使用を提供する。
【０１０２】
一実施形態において、上述の細胞は、ＮＴＳＲ１を発現する腫瘍または癌細胞である。一実施形態において、腫瘍または癌細胞はまた、ＮＴを発現／分泌する。
【０１０３】
一実施形態において、ＮＴＳＲ１発現腫瘍／癌は、心臓肉腫、肺癌、肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）、非肺小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平上皮、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞腺癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、カポジ肉腫）、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸系の癌、例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、腹部（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖器管の癌、例えば、腎臓癌（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺癌（腺癌、肉腫）、精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫、線維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌、例えば、肝癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍（褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ポリペプチド産生腫瘍、膵島細胞腫瘍、およびグルカゴノーマなど）；骨癌、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫；神経系の癌、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋癌（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜炎（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳癌（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽細胞腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖器系の癌、例えば、婦人科癌、子宮癌（子宮内膜癌）、子宮頸癌（子宮頸癌腫、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣癌（卵巣悪性腫瘍［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌］、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰癌（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣癌（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管癌（癌腫）；胎盤癌、陰茎癌、前立腺癌、精巣癌；血液系の癌、例えば、血液癌（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔癌、例えば、口唇癌、舌癌、歯肉癌、口蓋癌、中咽頭癌、鼻咽頭癌、副鼻腔癌；皮膚癌、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、およびケロイド；副腎癌：神経芽細胞腫；ならびに結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜を含む他の組織の癌、眼癌、眼内黒色腫、および付属器、乳癌（例えば、乳管癌）、頭部および／または頸部の癌（頭頸部扁平上皮癌）、肛門癌、甲状腺癌、副甲状腺癌；リンパ節の続発性および部位不明の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の続発性新生物、ならびに他の部位の続発性悪性新生物である。
【０１０４】
さらなる実施形態において、ＮＴＳＲ１発現腫瘍／癌は、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、前立腺癌（例えば、前立腺腺癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胸膜中皮腫）、乳癌、甲状腺癌（甲状腺髄様癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌、ＨＣＣ）、脳癌（例えば、神経膠腫、膠芽細胞腫）、子宮癌（例えば、子宮内膜腺癌）、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌（例えば、皮膚黒色腫）、胃癌、または結腸直腸癌（例えば、結腸腺癌）である。一実施形態において、腫瘍または癌は、原発性腫瘍または癌である。別の実施形態において、腫瘍または癌は、転移性または続発性腫瘍または癌である。別の実施形態において、腫瘍または癌は、難治性腫瘍または癌である。一実施形態において、治療は、癌の悪性度および／または転移能を低減するためのものである。
【０１０５】
一実施形態において、癌または腫瘍は、上皮成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４）、例えば、上皮成長因子受容体の構成的に活性化された形態を発現または過剰発現する。
【０１０６】
一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、標的細胞上のＮＴＳＲ１へのＮＴの結合を妨げ、かつ／または標的細胞内のＮＴＳＲ１関連シグナル伝達経路のうちの１つ以上のＮＴ媒介活性化を阻害する。
【０１０７】
別の実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性（または細胞性）細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を通して、ＮＴＳＲ１発現細胞（例えば、ＮＴＳＲ１発現腫瘍／癌細胞）の死滅を誘導する。さらなる実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＮＴＳＲ１へのＮＴの結合に干渉し、かつ／または標的細胞内のＮＴＳＲ１関連シグナル伝達経路のうちの１つ以上のＮＴ媒介活性化を阻害し、ＣＤＣまたはＡＤＣＣを通してＮＴＳＲ１発現細胞の殺傷を誘導する。一実施形態において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、古典的補体経路の成分によって、および／または細胞傷害性免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞マクロファージ、単球、または好酸球）によって認識されるドメイン、例えば、古典的補体経路の開始成分Ｃ１ｑによって、および／または細胞傷害性免疫細胞上に存在するＦｃガンマ受容体（例えば、フラグメント結晶性（Ｆｃ）部分）によって認識されるドメインを含み、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを通してＮＴＳＲ１発現細胞（例えば、ＮＴＳＲ１発現腫瘍／癌細胞）の殺傷を誘導する。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的効果を達成するのに十分な量の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、細胞内のＮＴＳＲ１活性の阻害／低減、または癌に関連する症状の予防もしくは減少をもたらす量を指す。対象に使用または投与される抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、例えば、疾患のタイプおよび重症度、ならびに個体の特徴、例えば、全般的な健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性に依存する。また、疾患の程度、重症度、およびタイプにも依存する。当業者は、これらおよび他の因子に応じて適切な投与量を決定することができるであろう。抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、１つ以上の追加の治療用化合物と組み合わせて投与されてもよい。本明細書に記載の方法において、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の１つ以上の兆候または症状を有する対象に投与され得る。例えば、「治療有効量」の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の生理学的効果が少なくとも改善されるレベルを意味する。
【０１０９】
本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、標的疾患／状態の治療（放射線療法、手術、ワクチンなど）のために、または標的疾患／状態の１つ以上の症状の管理（例えば、鎮痛剤、制吐剤など）のために、１つ以上の追加の活性剤または療法と組み合わせて使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上の化学療法薬、免疫療法、チェックポイント阻害剤、細胞ベースの療法等と組み合わせて使用される。本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用するのに好適な化学療法薬の例としては、ビンカアルカロイド、微小管形成を妨げる薬剤（コルヒチンおよびその誘導体など）、抗血管新生薬、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化剤、チロシンキナーゼ標的化剤（チロシンキナーゼ阻害剤など）、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗薬（ヌクレオシド類似体など）、アルキル化剤、白金ベースの薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド（オールトランスレチノイン酸またはそれらの誘導体など）；ゲルダナマイシンまたはその誘導体（１７−ＡＡＧなど）、ならびに当該技術分野において認識される他の癌治療薬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用するための化学療法薬は、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびそれらの誘導体、フェネステリン、タキサンおよびそれらの誘導体（例えば、タキソール、パクリタキセルおよびその誘導体、タキソテールおよびその誘導体など）、トポテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ビノレルビン、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）、カペシタビン、Ａｌｉｍｔａ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、エルビタックス、それらの誘導体などのうちの１つ以上を含む。一実施形態において、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、ＥＧＦＲまたはチロシンキナーゼ標的化剤、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤（ＲＴＫ阻害剤）と組み合わせて使用される。本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物もまた、１つ以上の追加の治療用抗体または抗体フラグメント、例えば、腫瘍の治療に使用される治療用抗体または抗体フラグメントと組み合わせて使用され得る。
【０１１０】
活性剤および／またはそれらを含む組成物の組み合わせは、任意の従来の剤形で（例えば、連続的に、同時に、異なる時間に）投与または同時投与され得る。本発明との関連における同時投与とは、改善された臨床転帰を達成するための協調的な治療の過程における２つ以上の治療薬の投与を指す。そのような同時投与はまた、同一の広がりを持ってもよく、すなわち、重複した期間中に行われ得る。例えば、第１の薬剤（例えば、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメント）は、第２の活性薬剤（例えば、化学療法薬）が投与される前、それと同時、前および後、または後に患者に投与され得る。一実施形態において、薬剤は、単一組成物中で組み合わされ／製剤化され、したがって、同時に投与され得る。
【０１１１】
一実施形態において、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む組成物は、目的の薬剤（例えば、化学療法薬、放射性核種、造影剤などの薬剤）をＮＴＳＲ１発現細胞または組織に送達するための標的化剤または送達ビヒクルとして使用される。一実施形態において、目的の薬剤は、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートされる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびヒトなどの温血動物を意味するとみなされる。一実施形態において、対象は哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
【０１１３】
別の態様において、本開示は、試料中または細胞上のＮＴＳＲ１の検出するための方法に関し、細胞を本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。一実施形態において、方法は、抗体−ＮＴＳＲ１複合体を検出または定量化することをさらに含む。そのような方法は、試料中のＮＴＳＲ１発現細胞を検出、定量化、および／または精製するために、例えば、上記の疾患または状態（例えば、ＮＴＳＲ１発現癌）などのＮＴＳＲ１発現／活性の調節不全に関連する疾患または状態を診断するために有用であり得る。一実施形態において、本明細書に記載の抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記のように検出可能な標識（例えば、造影剤）にコンジュゲートされる。
【０１１４】
環状ペプチド
上述のように、本発明者らは、ＮＴＳＲ１の第２の細胞外ループの立体構造を模倣する環状ペプチドを操作し、これを使用してニワトリを免疫化し、ＮＴＳＲ１を特異的に識別する抗体を作った。
【０１１５】
したがって、別の態様において、本開示は、以下の配列のドメインを含む環状ペプチドであって、 
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ａ−Ｄ−Ｇ１−Ｘ４−Ｈ−Ｘ５−Ｇ２−Ｇ３
式中、
「−」は結合、好ましくはペプチド（アミド）結合であり、
Ｘ１はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはシステイン（Ｃ）であるか、または存在せず、
Ｘ２はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはリジンもしくはリジン類似体であるか、または存在せず、
Ｘ３はアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、好ましくはアミンもしくはその類似体を含む側鎖を含むアミノ酸、より好ましくはリジン（Ｋ）であるか、または存在せず、
Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３またはＮのうちの１つは、Ｇ３への結合、好ましくはペプチド結合を介して付着し、それによって環状ペプチドを形成する、環状ペプチド、
あるいはその塩を提供する。
【０１１６】
一実施形態において、Ｘ１およびＸ２は存在しない。別の実施形態において、Ｘ１およびＸ２は存在する。さらなる実施形態において、Ｘ１はシステイン（Ｃ）残基である。別のさらなる実施形態において、Ｘ２はリジン（Ｋ）残基である。
【０１１７】
一実施形態において、Ｘ３は存在しない。別の実施形態において、Ｘ３は存在する。存在する場合、Ｘ３は、好ましくはリジンまたはオルニチン、好ましくはリジンである。さらなる実施形態において、Ｘ３のアミン基（例えば、リジンまたはオルニチン）は、Ｇ３のカルボキシ末端とペプチド結合を形成する。
【０１１８】
一実施形態において、Ｘ５はＱまたはＴである。別の実施形態において、Ｘ５はＱである。別の実施形態において、Ｘ５はＴである。
【０１１９】
一実施形態において、Ｘ６はＡまたはＰである。一実施形態において、Ｘ６はＡである。別の実施形態において、Ｘ６はＰである。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、式Ｉの環状ペプチドを提供し、
【化９】
2022500072.tif 000012
式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖であり、
Ｒ３は、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキルである。
一実施形態において、Ｒ１は、アラニン（Ａ）またはプロリン（Ｐ）の側鎖である。一実施形態において、Ｒ１はＡの側鎖である。別の実施形態において、Ｒ１はＰの側鎖である。
【０１２１】
一実施形態において、Ｒ２は、グルタミン（Ｑ）またはトレオニン（Ｔ）の側鎖である。一実施形態において、Ｒ２はＱの側鎖である。別の実施形態において、Ｒ２はＴの側鎖である。
【０１２２】
一実施形態において、環状ペプチドは式Ｉａであり、
【化１０】
2022500072.tif 000013
式中、Ｒ３は上で定義した通りである。
【０１２３】
一実施形態において、Ｒ３は、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、好ましくは置換または非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。
【０１２４】
一実施形態において、Ｒ３はＲ４置換基で置換され、Ｒ４は、環状ペプチドを部分／分子にコンジュゲートするためのリンカーである。
【０１２５】
したがって、一実施形態において、本開示は、式ＩＩのコンジュゲートまたは融合分子を提供する。
【化１１】
2022500072.tif 000014
一実施形態において、Ｒ４はチオール（ＳＨ）基を含む。
【０１２６】
さらなる実施形態において、Ｒ４は、（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ（ＣＯ）−Ｃ（ＮＲ５Ｒ６）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨまたはＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ（ＣＯ）−Ｃ（ＮＲ５Ｒ６）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨであり、式中、ｍおよびｎは独立して、１〜６の整数であり、Ｒ５およびＲ６は独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。一実施形態において、ｍは、３〜５、好ましくは４の整数である。一実施形態において、ｎは、１〜３、好ましくは１の整数である。一実施形態において、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも１つはＨであり、好ましくは、Ｒ５およびＲ６はＨである。
【０１２７】
一実施形態において、Ｒ３は
【化１２】
2022500072.tif 000015
である。別の実施形態において、Ｒ３は
【化１３】
2022500072.tif 000016
である。
【０１２８】
「塩（複数可）」という用語は、本明細書で使用される場合、無機酸および／または有機酸で形成される酸性塩、ならびに無機塩基および／または有機塩基で形成される塩基性塩を示す。医薬組成物で使用される塩は、薬学的に許容される塩であるが、他の塩が本明細書に記載の環状ペプチドの産生に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、親ペプチドの生物活性を保持し、かつ生物学的または別様に不適切ではないペプチドの塩を指す。
【０１２９】
「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチドの合成類似体を調製するためにペプチド化学において使用される、天然に存在するアミノ酸ならびに他のアミノ酸（例えば、天然に存在するアミノ酸、非自然発生的アミノ酸、核酸配列によってコードされていないアミノ酸など）のＬ異性体およびＤ異性体の両方を含む。天然に存在するアミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンなどである。
【０１３０】
他のアミノ酸としては、例えば、アミノ酸の非遺伝子的にコードされた形態、ならびにＬ−アミノ酸の保存的置換が挙げられる。天然に存在する非遺伝的にコードされたアミノ酸としては、例えば、ベータ−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン（例えば、Ｌ−オルニチン）、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、ベータ−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−ホモアルギニン（Ｈｏａｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄ−もしくはＬ−）、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン（ＨｏＳｅｒ）、システイン酸、エプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、または２，３−ジアミノ酪酸（Ｄ−もしくはＬ−）などが挙げられる。これらのアミノ酸は、生化学／ペプチド化学の分野において周知である。
【０１３１】
上述の環状ペプチドは、全てのＬ−アミノ酸、全てのＤ−アミノ酸、またはＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。したがって、上述の式におけるアミノ酸を設計するための単一文字コードは、列挙したアミノ酸のＬ異性体およびＤ異性体の両方を包含する（キラル中心を有するものについて）。例えば、「Ｎ」という文字は、Ｌ−アスパラギンおよびＤ−アスパラギンを指す。
【０１３２】
環状ペプチドを形成するために、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、またはＲのうちの１つは、Ｇ３、Ｘ７、またはＸ８のうちの１つへの結合を介して付着する。結合／接続は、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端との間、アミノ末端とアミノ酸の側鎖との間、カルボキシ末端とアミノ酸の側鎖との間、またはアミノ酸の２つの側鎖間であり得る。２個のアミノ酸は、通常のペプチド結合（すなわち、１つの残基のアルファカルボキシルと別の非連続残基のアルファアミンとの間）、非アルファアミド結合、例えば、１つの残基の側鎖と別の残基のアルファカルボキシル基との間の結合、またはラクトン、エーテル、チオエーテル、もしくはジスルフィドなどの任意の他の化学的に安定した結合を含む、任意の好適な結合を通して結合または接続され得る。
【０１３３】
実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインに加えて、該ドメインのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に共有結合した１つ以上のアミノ酸（天然または合成）を含んでもよい。一実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインのＮ末端および／またはＣ末端に最大５個の追加のアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、上述のＧＲＦ類似体は、上で定義したドメインのＮ末端および／またはＣ末端に最大５、４、３、２、または１個の追加のアミノ酸を含む。一実施形態において、上述のドメインまたは環状ペプチドは、約５０個の残基またはそれ以下、好ましくは４０、３０、２０、１５、１４、もしくは１３個のアミノ酸またはそれ以下を含む。一実施形態において、上述のドメインまたは環状ペプチドは、約９または１０〜約１５個の残基、好ましくは約１１〜約１５個の残基、例えば１２、１３、または１４個のアミノ酸を含む。一実施形態において、上述の環状ペプチドは、上で定義したドメインからなる。
【０１３４】
一実施形態において、ペプチドのネイティブアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾基を使用して修飾され得る。
【０１３５】
「アミノ末端修飾基」という用語は、例えば、プロテアーゼ消化に対するその安定性および／または感受性を高めるために、環状ペプチドのネイティブＮＨ２末端基を置き換えるかまたは修飾するために、ペプチド化学分野において一般的に使用される部分を指す。アミノ末端修飾基は、１〜８個の炭素の直鎖もしくは分枝鎖アルキル基、またはアシル基（ＲＡ−ＣＯ−）（式中、ＲＡは疎水性部分（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブタニル、イソ−プロピル、もしくはイソ−ブタニルなどのアルキル）である）、またはアロイル基（Ａｒ−ＣＯ−）（式中、Ａｒはアリール基である）であってもよい。アシル基は、Ｃ１〜Ｃ１６またはＣ３〜Ｃ１６アシル基（直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和）、例えば、飽和Ｃ１〜Ｃ６アシル基（直鎖または分枝鎖）または不飽和Ｃ３〜Ｃ６アシル基（直鎖または分枝鎖）、例えば、アセチル基（ＣＨ３−ＣＯ−、Ａｃ）であってもよい。一実施形態において、ペプチドのアミノ末端がペプチドを環状にする結合を形成しない場合、環状ペプチドはネイティブＮＨ２末端基を有する。
【０１３６】
「カルボキシ末端修飾基」という用語は、例えば、プロテアーゼ消化に対するその安定性および／または感受性を高めるために、ペプチドのネイティブＣＯ２Ｈ末端基を置き換えるかまたは修飾するために、ペプチド化学分野において一般的に使用される部分を指す。カルボキシ末端修飾基は、以下であってもよい。
・カルボキシル基に付着したヒドロキシルアミン基（ＮＨＯＨ）（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＯＨ）、
・カルボキシル基に結合したアミン（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲＢＲＣ）であって、アミンは一級、二級、もしくは三級アミンであり、好ましくはアミンは、好ましくは１〜１０個の炭素の脂肪族アミンであり、例えばメチルアミン、イソ−ブチルアミン、イソ−バレリルアミンもしくはシクロヘキシルアミン、芳香族アミンもしくはアリールアルキルアミン、例えば、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シナミルアミン、もしくはフェニルエチルアミンであり、好ましくはアミンは−ＮＨ２である、
・ニトリル基（Ｃ≡Ｎ）、または
・ヒドロキシアルキル（すなわち、アルコール）、好ましくはＣＨ２ＯＨ。
【０１３７】
一実施形態において、ペプチドのカルボキシル末端がペプチドを環状にする結合を形成しない場合、環状ペプチドはネイティブＣＯ２Ｈ末端基を有する。
【０１３８】
環状ペプチドは、ペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は典型的には、そのペプチド等価物の極性、三次元サイズ、および官能性（生物活性）を保持することによって特徴付けられるが、ペプチド結合／連結のうちの１つ以上は、しばしばより安定した連結によって置き換えられている。一般に、アミド結合を置き換える結合（アミド結合代替物）は、アミド結合の特性の多くまたは全て、例えば、立体構造、立体的かさ高さ、静電特性、水素結合能などを保存する。典型的なペプチド結合の置き換えとしては、エステル、ポリアミンおよびその誘導体、ならびにアミノメチルおよびケトメチレンなどの置換アルカンおよびアルケンが挙げられる。例えば、上述のドメインまたは環状は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスもしくはトランス）、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、または−ＣＯＣＨ２−などの連結によって置き換えられた１つ以上のペプチド連結を有し得る。そのようなペプチド模倣体は、そのペプチド等価物と比較してより大きい化学安定性、強化された生物学的／薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率など）、および／または低減された抗原性を有し得る。一実施形態において、環状ペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＲのうちの１つと、環を形成するＧ３、Ｘ７、またはＸ８のうちの１つとの間の結合を除いて、ネイティブペプチド結合のみを含み、すなわち、上記の式中の「−」で表される結合は、全てのペプチド結合である。
【０１３９】
一実施形態において、環状ペプチドは、図１Ｂ〜図１Ｄのいずれか１つに示される構造を有する。さらなる実施形態において、環状ペプチドは、図１Ｄに示される構造を有する。
【０１４０】
本明細書に記載の環状ペプチドは、プロテアーゼ抵抗性、血漿タンパク質結合、血漿半減期の延長、細胞内浸透などの追加の生物学的特性を環状ペプチドに付与する１つ以上の修飾をさらに含んでもよい。そのような修飾としては、例えば、脂肪酸（例えば、Ｃ６〜Ｃ１８）などの環状ペプチド（例えば、上記の式ＩＩの分子）への分子／部分の共有結合、アルブミンなどのタンパク質の付着（例えば、米国特許第７，２６８，１１３号を参照）；糖／多糖（グリコシル化）、ビオチン化またはＰＥＧ化（例えば、米国特許第７，２５６，２５８号および同第６，５２８，４８５号を参照）が挙げられる。環状ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）などの担体タンパク質、ならびに／または多糖を含む、その免疫原性を高める分子にコンジュゲートされてもよい。一実施形態において、環状ペプチドは、担体タンパク質、好ましくはＫＬＨにコンジュゲートされる。一実施形態において、担体タンパク質は、環状ペプチドへのジスルフィド結合を介して、すなわち、ペプチドのシステイン残基の硫黄を通してコンジュゲートされる。環状ペプチドの修飾の上記の説明は、アプローチの範囲も操作され得る考えられる修飾も限定するものではない。
【０１４１】
環状ペプチドは、当該技術分野において周知の方法を使用して、例えば、固相合成ならびに従来の有機合成によって合成され得る。
【０１４２】
環状ペプチドを含む組成物
別の態様において、本開示は、本明細書に定義される環状ペプチドを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、上述の環状ペプチド、および担体または賦形剤、さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるものなどの薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。そのような組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントについて上述されるように、薬学分野において周知の方法で調製され得る。
【０１４３】
一実施形態において、組成物は、免疫原性組成物またはワクチン組成物である。そのような組成物は、ワクチン分野において既知の任意の従来の経路によって、例えば、粘膜（例えば、眼内、鼻腔内、肺、経口、胃、腸管、直腸、膣、もしくは尿路）表面を介して、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内）経路を介して、または（例えば、パッチなどの経皮送達系を介した）局所投与を介して投与され得る。
【０１４４】
一実施形態において、本明細書に定義される環状ペプチドを含む組成物は、ワクチンアジュバントをさらに含む。「ワクチンアジュバント」という用語は、抗原（例えば、本明細書で定義される環状ペプチド）などの免疫原に添加されると、混合物への曝露時に宿主における薬剤に対する免疫応答を非特異的に強化または増強する物質を指す。好適なワクチンアジュバントは当該技術分野において周知であり、例えば、（１）無機塩（アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム、リン酸カルシウムゲル）、スクワレン、（２）油系アジュバント、例えば、油エマルションおよび界面活性剤系製剤、例えば、不完全もしくは完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）ＭＦ５９（マイクロ流動化洗剤で安定化した水中油エマルション）、ＱＳ２１（精製サポニン）、ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］（水中油エマルション＋ＭＰＬ＋ＱＳ−２１）、（３）微粒子アジュバント、例えば、ビロソーム（インフルエンザ血球凝集素を組み込んだ単層リポソームビヒクル）、ＡＳ０４（ＭＰＬを含む［ＳＢＡＳ４］アルミニウム塩）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニンおよび脂質の構造化複合体）、ポリラクチドコ−グリコリド（ＰＬＧ）、（４）微生物誘導体（天然および合成）、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋Ｍ．Ｐｈｌｅｉ細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化単糖）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（リポソームに自己組織化することが可能なリポイド免疫刺激剤）、ＯＭ−１７４（リピドＡ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、修飾ＬＴおよびＣＴ（非毒性アジュバント効果を与える遺伝子操作された細菌毒素）、完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（不活性化および乾燥マイコバクテリウムを含む）（５）内因性ヒト免疫調節剤、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦもしくはｈＩＬ−１２（コードされたタンパク質もしくはプラスミドとして投与され得るサイトカイン）、Ｉｍｍｕｄａｐｔｉｎ（Ｃ３ｄタンデムアレイ）、ならびに／または（６）不活性ビヒクル、例えば、金粒子が挙げられる。
【０１４５】
環状ペプチドまたはそれを含む組成物の使用
別の態様において、本開示は、動物におけるＮＴＳＲ１（例えば、ヒトＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧ（配列番号８３）および／またはラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧ（配列番号８４）に位置する立体構造エピトープ）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための方法を提供し、方法は、該動物に、有効量の本明細書に定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物を該動物に投与することを含む。別の態様において、本開示はまた、動物におけるＮＴＳＲ１（例えば、ヒトＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧおよび／またはラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧに位置する立体構造エピトープ）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物の使用も提供する。本開示はまた、動物におけるＮＴＳＲ１（例えば、ヒトＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＡＤＧＱＨＡＧＧおよび／またはラットＮＴＳＲ１由来のアミノ酸配列ＮＲＳＧＤＧＴＨＰＧＧに位置する立体構造エピトープ）に特異的に結合する抗体の産生を誘導するための、本明細書で定義される環状ペプチドまたはそれを含む組成物も提供する。
【０１４６】
一実施形態において、上述の方法または使用は、動物において産生された抗体を採取することをさらに含む。さらなる実施形態において、上述の方法または使用は、採取された抗体を精製することをさらに含む。
【０１４７】
環状ペプチドまたはそれを含む組成物が投与される動物は、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ、またはニワトリなど、抗体の産生に従来使用されている任意の動物であってもよい。
【０１４８】
一実施形態において、動物はニワトリ（雌鶏）である。ニワトリ（雌鶏）を動物宿主として使用する場合、動物において産生される抗体はＩｇＹ型であり、動物の卵から採取（および精製）される。卵から抗体を採取および精製するための方法は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｍ．ＮＡＲＡＴ，Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４１（３）２５９−２６７（２００３）およびその中で引用される参考文献を参照）、代表的な方法が以下に記載される。
【０１４９】
用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）同様の指示対象の使用は、本明細書で別途記載のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。
【０１５０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。
【０１５１】
本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書に別途記載のない限り、範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡単な方法として機能することのみを意図し、各別個の値は、それがあたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。範囲内の値の全てのサブセットもまた、それらがあたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
本明細書に提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図するものであり、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。
【０１５３】
本明細書のいかなる言語も、いかなる特許請求されていない要素も本発明の実施に必須なものとして示していると解釈されるべきではない。
【０１５４】
本明細書において、「約」という用語は、その通常の意味を有する。「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられるデバイスもしくは方法についての固有の誤差変動を含むことを示すためか、または列挙される値に近い値、例えば、列挙される値（または値の範囲）の１０％もしくは５％以内の値を包含するために使用される。
【０１５５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１５６】
本発明を実施するためのモード（複数可）
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
【０１５７】
実施例１：材料および方法
ペプチド合成。２−クロロトリチルクロリド樹脂を、直鎖ペプチド（カルボン酸機能および遊離アミン機能を有し、他方の側鎖は保護されている）で回収した。樹脂を５ｍＬのＤＭＦに添加した。５当量のＤＥＰＢＴおよび６当量のＤＩＰＥＡを溶液に添加した。樹脂を１６時間インキュベートし、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。次いで、樹脂を真空下で乾燥させた。反応収率についての品質管理の後、ペプチド切断を行い、分取ＨＰＬＣによって大環状ペプチドの精製を実施した。
【０１５８】
ニワトリ免疫化およびＩｇＹ抽出。ＫＬＨコンジュゲートペプチド（Ｌｉｎ−ペプチド、３Ｄ−ペプチド−１、−２、および−３）の一次免疫化を完全フロイントアジュバント中で適用した一方で、以下のブースターを不完全フロイントアジュバント中に与えた。ＫＬＨコンジュゲートペプチドを筋肉内注射した。毎月の抗原ブーストによる３ヶ月の免疫化の後、全ての卵を抗原および採取時間に従ってプールした。卵黄を卵白から分離し、タンパク質を、いくつかの修飾を加えてすでに記載されているように抽出した（”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｒ．Ｓｃｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌｓ，ＩＳＢＮ  ３−５４０−６６６７９−６．”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ”）。抽出した全てのＩｇＹ（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、ＩｇＹ−３Ｄ−２、およびＩｇＹ−３Ｄ−３）を、アガロースビーズにコンジュゲートされた対応するペプチドを使用する免疫親和性精製の第２のステップのために処理した。
【０１５９】
抗体配列決定。抗体の配列を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定し、サンガーシーケンシングによって確認した。
【０１６０】
細胞および試薬。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ａおよび２９３Ｔ細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、３７℃、５％  ＣＯ２で、ＦＢＳ  １０％、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、および抗生物質を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。全ての細胞培養試薬は、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）からのものであった。
【０１６１】
ＨＥＫ２９３ＡおよびＣＨＯ−Ｋ１細胞をレンチウイルス系で形質転換して、ラットＮＴＳ１受容体を安定して発現した。ＨＡタグ付きラットＮＴＳ１を発現するレンチウイルスベクターを生成するために、２ＨＡ−ｒＮＴＳ１コード配列を、カスタムプラスミド（ｐ２ＨＡ−ｒＮＴＳ１）から以下のプライマー（順方向：５’−ＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡ−３’（配列番号１２２）および逆方向：５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号１２３））で増幅し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、ｐＣＤＨ−ＭＣＳ−Ｅｆ１−ｐｕｒｏ  ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングした。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンアミン（ＭＷ  ２５，０００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して、ｐＣＤＨレンチベクター、ｐＭＤ２．Ｇ（Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏからの贈答品、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２５９）およびｐｓＰＡＸ２（Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏからの贈答品、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２６０）で一過性に共トランスフェクトした。次いで、ウイルス粒子をトランスフェクションの４８時間後に採取し、濾過し（０．４５μＭ  ＰＶＤＦシリンジフィルタ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、ＨＡ−ｒａｔＮＴＳ１を安定して発現する細胞を生成するために使用した。ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−２ＨＡ−ｒＮＴＳ１−Ｅｆ１−ｐｕｒｏを発現するＨＥＫおよびＣＨＯ−Ｋ１細胞を、それぞれ０．５μｇ／ｍＬおよび８μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシンを使用して選択した。
【０１６２】
ペプチドに対する酵素結合免疫吸着測定法。試験した全てのペプチド（Ｌｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、３Ｄペプチド−２、および３Ｄペプチド−３）を、４℃で一晩、結合緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２）で、Ｗｅｌｌ−Ｃｏａｔｅｄ（商標）スルフヒドリル結合、８ウェルストリッププレート、クリア（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＯ  ６３１３２−１４２９，ＵＳＡ）内で、ウェル当たり３．５μｍｏｌｅの濃度でプレートコーティングした。遮断するために、Ｌ−システイン（結合緩衝液中１μＭ）を各ウェルに、室温（ＲＴ）で１時間添加した。試験した抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、ＩｇＹ−３Ｄ−２、およびＩｇＹ−３Ｄ−３）を、１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度（ＰＢＳ  ０．２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．３％ミルク）で希釈し、その対応する遊離ペプチドの増加する量（０．３ｎＭ〜１００００ｎＭ）、または遊離Ｌｉｎ−ペプチド、３Ｄ−ペプチド−１、−２、もしくは−３のいずれかの固定濃度（１０μＭ）と予めインキュベートした。全てのＩｇＹ−ペプチド混合物および対照（陽性対照としてＩｇＹのみ、および陰性対照として二次抗体のみ）を各ペプチドコーティングウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ  ０．２５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）での４回の洗浄を実施し、二次抗体（アルパカ抗ニワトリＨＲＰ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ，ＱＣ，ＣＡ）を室温で４５分間添加した。ＰＢＳＴでの４回の追加の洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を添加し、反応をＨＣｌ  ２Ｎで停止させる前に室温で１５分間インキュベートした。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ（登録商標）プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）で読み取った。
【０１６３】
免疫蛍光顕微鏡検査法。ＨＡ−ｒＮＴＳ１を安定して発現するか、またはＨＡタグ付きのｒＮＴＳ１、ｒＮＴＳ２、またはｒＡＰＪのいずれかを一過性に発現する１２０，０００個のＨＥＫ２９３Ａ細胞を、６ウェルプレート内の顕微鏡ガラスカバースリップ上に播種した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃の３．７％ホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で１０分間固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、氷上で２分間、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、室温で１時間ＰＢＳ中の１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で処理した。この飽和ステップに続いて、マウスモノクローナルＨＡ−プローブ抗体（１：２００、（Ｆ−７）ｓｃ７３９２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および５μｇ／ｍＬの各ニワトリポリクローナル抗ＮＴＳ１（Ｌｉｎ、３Ｄ−１、３Ｄ−２、および３Ｄ−３）、またはＰＢＳ  ＮＧＳ  １０％中１：１０（ＩｇＹ：ペプチド）の比率で抗体および対応するペプチドを含有する混合物と共に一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートヤギ抗ニワトリ抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（各々を１：２００希釈で使用）とインキュベートすることによって、蛍光染色を行った。細胞を、ＰＢＳ中で４回洗浄した後、ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）ｇｏｌｄ褪色防止用封入剤中でマウントした。共焦点Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１  ＦＶ１０００  ＬＳＭ顕微鏡およびＦｌｕｏｖｉｅｗ（登録商標）ＦＶ１０−ＡＳＷ  ３．１ビューアソフトウェアを使用して写真を生成した。撮像パラメータを、試料間で同一の値に設定した。条件毎にランダムに選択された５つの視野（ＦＶ１０−ＡＳＷ  ３．１ビューアソフトウェア）のｚスタック画像（視野毎に１０スライス）に対して、共局在化および係数計算（ピアソンおよびオーバーラップ４８８／６４７）を実施した。
【０１６４】
組織固定および免疫組織染色。成体雄ラットを５％イソフルランで麻酔し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流した。脳を４℃で一晩凍結防止し（リン酸緩衝液０．１Ｍ、３０％スクロース）、イソペンタン中で−４０℃において１分間凍結させた。凍結ミクロトーム上で冠状切片を切断し、ＰＢＳ中で採取して免疫染色を進めた。遊離浮遊脳切片をＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳ−Ｈ２Ｏ２  ３％で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳでさらに４回洗浄し、透過処理し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、ＮＧＳ  ３％、およびｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  ０．３％）で１時間遮断した。希釈溶液（ＰＢＳ、ＮＧＳ  １％、およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ０．３％）中５μｇ／ｍＬの濃度のニワトリ抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１／２および３）で２時間のインキュベーションを行った。洗浄後、ヤギ抗ニワトリＨＲＰコンジュゲート抗体を希釈溶液中に添加し（１：２００）、１時間インキュベートし、再度洗浄した。溶液Ａ（１：１００）およびＢ（１：１００）を希釈溶液中で希釈し、スライドに添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、ＤＡＢ溶液（ＰＢＳ、ジアミノベンジジン０．０５％、Ｈ２Ｏ２  ０．０１５％）を３分間添加し、反応をＰＢＳで停止させた。全てのステップを、撹拌下で室温において実施した。脳切片を乾燥させ、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ（ＳＰ１５−５００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＹ，ＵＳＡ）でカバースリップした。１０倍の倍率のＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００顕微鏡で画像を取得した。
【０１６５】
ウエスタンブロット。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、等量（６μｇ）のＨＡタグ付きのｒＮＴＳ１、ｒＮＴＳ２、ｒＡＰＪ、または陰性対照としての空ベクターのいずれかで一過性にトランスフェクトした。全細胞を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した還元溶解緩衝液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１５ｇ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）、またはネイティブ溶解緩衝液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）、１％  ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ））中で溶解し、トランスフェクションの４８時間後に３０秒間超音波処理した。全細胞溶解物を、免疫沈降および／またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のためにさらに処理した。後者に関して、溶解物を、変性／還元タンパク質試料緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％グリセロール、０．００２％ブロモフェノールブルー、２％  ＳＤＳ、２％  ２−メルカプトエタノール）、またはネイティブタンパク質試料緩衝液（３１．２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）中で３７℃において加熱した。タンパク質試料（ウェル当たり２０μｇの総タンパク質）を装填し、ＳＤＳまたはネイティブＰＡＧＥによって分解した。ニトロセルロース膜に移した後、ブロットを、１μｇ／ｍＬの濃度の異なるニワトリ抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、ＩｇＹ−３Ｄ−２、およびＩｇＹ−３Ｄ−３）、またはニワトリ抗ＨＡ抗体（１：１０００、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ，ＱＣ，ＣＡ）、続いて二次抗体であるヤギ抗ニワトリＨＲＰ（１：５０００、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ，ＱＣ，ＣＡ）でプローブした。ラットモノクローナル抗ＨＡ高親和性ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：１０００、Ｒｏｃｈｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を使用して、選択性アッセイにおける全細胞溶解物のタンパク質発現レベルを検出した。全てのブロットを、化学発光検出系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｌａｒｉｔｙ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して明らかにした。画像を、ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｌａｂバージョン５．０を使用してＣｈｅｍｉｄｏｃ（登録商標）ＭＰに記録した。
【０１６６】
免疫沈降。試験した全てのニワトリ抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、ＩｇＹ−３Ｄ−２、ＩｇＹ−３Ｄ−３、およびＩｇＹ抗ＨＡ）を、等価モル比でマレイミド磁気ビーズ（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）にコンジュゲートした。抗体結合磁気ビーズ（１０μＬ）を各試料（１ｍｇ／ｍＬの全タンパク質において２００μＬの全細胞溶解物）、および空ベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物、または質量分析の前のアッセイにおいて１：１０の比率で予めインキュベートしたＩｇＹ−ペプチドの混合物を有する標的受容体を含有する試料からなる陰性対照に添加した。全ての試料をローテーター上で４℃において一晩インキュベートした。翌日、タンパク質−抗体−磁気ビーズ複合体をＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）０．０１％で４回洗浄した後、質量分析で試験した試料の場合は、ＴｗｅｅｎなしのＰＢＳで４回洗浄した。免疫沈降タンパク質を溶出緩衝液（水酸化アンモニウム０．５Ｍ）で溶出し、上記のウエスタンブロットのために処理するか、または瞬間凍結させて、ストッパリングトレイ乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用してさらに凍結乾燥させた（プログラム：−４０℃（６時間）、−２１℃（１０時間）、２０℃（４時間））。試料を２つのプラットフォームに送り、質量分析を評価した：ＰｈｅｎｏＳｗｉｔｃｈ（Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ，ＱＣ，ＣＡ）およびＣＨＵＬの研究センターのプロテオミクスプラットフォーム（Ｌａｖａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＱＣ，ＣＡ）。
【０１６７】
質量分析およびタンパク質識別。タンパク質を、１００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８＋０．７５Ｍ尿素中で再構成し、１０ｍＭのＤＴＴで６５℃において１５分間還元し、暗所で室温において１時間、１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。トリプシン／ＬｙｓＣ（１μｇ）を各試料に添加し、タンパク質を撹拌しながら３７℃で一晩消化した。２％ギ酸の添加によって消化を停止させ、ペプチドを逆相ＳＰＥによって精製した。Ｐｈｅｎｏｓｗｉｔｃｈおよびプロテオミクスプラットフォームのそれぞれによって、ＡＢＳｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００（ＡＢＳｃｉｅｘ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｒｉｂｒｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）で、取得を実施した。Ｐｈｅｎｏｓｗｉｔｃｈからのタンパク質識別を、ＴｒｉｐｌｅＴｏｆ５６００について予め設定された機器、特殊因子としてのシステインアルキル化としてのヨードアセトアミドを用いた、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  Ｖ４．５ベータ（ＡＢＳｃｉｅｘ）で実施した。（カスタムタンパク質配列を付加した）ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）プロテオームに対する生物学的修飾に重点を置いて、偽発見率分析を用いた徹底した検索を実施した。タンパク質識別およびデータ分析については、全体的な偽発見率（ＦＤＲ）を１％に設定し、局所的な偽発見率を５％に設定した。ニューロテンシン受容体１のペプチドが基本的な品質基準を満たしていることを確認するために、手動でレビューした。プロテオミクスプラットフォームは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；バージョン２．５．１）を使用して全てのＭＳ／ＭＳ試料を分析した。Ｍａｓｃｏｔは、消化酵素トリプシンを仮定して、ＣＰ＿ＲａｔｔｕｓＮｏｒｖｅｇｉｃｕｓ＿１０１１６＿ＣＯ＿２０１６１０１９データベース（バージョン不明、３１６０２エントリ）を検索するように設定した。Ｍａｓｃｏｔを、０，６Ｄａのフラグメントイオン質量許容差および１０ＰＰＭの親イオン許容差で検索した。システインのカルバミドメチルを、Ｍａｓｃｏｔで固定修飾として指定した。アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化ならびにメチオニンの酸化は、Ｍａｓｃｏｔで可変修飾として指定した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（バージョンＳｃａｆｆｏｌｄ＿４．７．５、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、ＭＳ／ＭＳベースのペプチドおよびタンパク質識別を検証した。ペプチド識別を、それらが、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｌｏｃａｌ  ＦＤＲアルゴリズムによって１％未満のＦＤＲを達成する確率が９９％を超えて確立され得る場合に認めた。タンパク質識別を、それらが、１％未満のＦＤＲを達成する確率が９９％を超えて確立され得、少なくとも１つの識別されたペプチドを含有した場合に認めた。
【０１６８】
環状ＡＭＰ産生測定。ＨＡ−ｒＮＴＳ１を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用して、ＨＴＲＦ技術（ｃＡＭＰ−Ｇｓ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｋｉｔ，Ｃｉｓｂｉｏ  ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に基づいて、この競合免疫アッセイを実施した。細胞（２０００／ウェル）を、アルファ−プレート３８４  ＳＷ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で、ＮＴ８−１３（６ｎＭ（ＥＣ５０）および１０μＭ（ＥＣｍａｘ）のみ、またはＮＴ８−１３（６ｎＭ）と各ＩｇＹ（−Ｌｉｎ、−３Ｄ−１、−３Ｄ−２、および−３Ｄ−３）との混合物で３０分間、３７℃で刺激した。刺激を受けなかった細胞を陰性対照として使用した。試薬を製造業者のプロトコルに記載されるように添加した。蛍光を、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで測定した。
【０１６９】
結合アッセイ。ＨＡタグ付きラットＮＴＳ１（ＨＡ−ｒＮＴＳ１）を発現するＨＥＫ２９３細胞を、８０％のコンフルエンシーに達したときに凍結させた。細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．５で皿から剥離し、４℃において５分間１５，０００ｇで遠心分離した。次いで、ペレットを結合緩衝液中に再懸濁した。ＨＡ−ｒＮＴＳ１受容体を発現する１５μｇの細胞膜を、濃度が増加するニワトリ抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、ＩｇＹ−３Ｄ−２、およびＩｇＹ−３Ｄ−３）の存在下で、結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％  ＢＳＡ）中で４５ｐＭの１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］−ＮＴ（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と６０分間２５℃においてインキュベートすることによって、競合放射性リガンド結合実験を実施した。インキュベーション後、結合反応混合物をポリエチレンアミンコーティング９６ウェルフィルタプレート（ガラス繊維フィルタＧＦ／Ｂ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中に移した。反応を濾過によって終了し、プレートを２００μＬの氷冷結合緩衝液で３回洗浄した。次いで、ガラスフィルタをγカウンタ（２４７０  Ｗｉｚａｒｄ２，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でカウントした。非特異的結合を、１０−５Ｍの非標識ＮＴ［８−１３］の存在下で測定し、総結合の５％未満を表した。１２５Ｉ−［Ｔｙｒ３］−ＮＴ特異的結合の半分を阻害する非標識リガンド濃度として、ＩＣ５０値を競合曲線から決定した。
【０１７０】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）ベースのバイオセンサアッセイ。全てのＢＲＥＴアッセイをＤｏｍａｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＮＡ  Ｉｎｃ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）で実施した。実験を全て、ＨＡ−ラットＮＴＳ１受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施し、上記のようにわずかな修正を伴い処理した（Ｒｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１８）。細胞を３８４ウェルプレートにプレートした。最初に、増加する量のＮＴ  １−１３（０．１ｐＭ〜０．１ｍＭ）、ＳＲ４８６９２（０．１ｐＭ〜０．１ｍＭ）、およびニワトリ抗体：ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３（０．０２μＭ〜２μＭ）を用いて、トランスフェクションの４８時間後に細胞を処理することによって、アゴニストモードを試験した。細胞をＴｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２１４５−Ｈ９１３６）で洗浄し、室温で６０分間の平衡期間にわたって続行した。次いで、ｅ−Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ  Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ（１．８μＭ、Ｍｅｔｈｏｘｙ  ｅ−ＣＴＺ；Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ，カタログ番号３６９）を各ウェルに添加し、第１の読み取り値をＳｙｎｅｒｇｙ  ＮＥＯプレートリーダー上で取得した。アンタゴニストモードについて、ＥＣ５０のＮＴ  １−１３を以前のウェルに添加し、これをＳＲ４８６９２および抗体で処理し、１０分のインキュベーション後に第２の読み取りを実施した。ＢＲＥＴシグナルを、ドナー放出に対するアクセプター放出の比率として計算した。
【０１７１】
ヒト化および組換え抗体の調製。ヒト化フレームワークｓｃＦｖ配列を含有するｇＢｌｏｃｋｓを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって合成した。受け取り時に、ｇＢｌｏｃｋｓを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に再懸濁し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によってｐＴＴ５−Ｆｃプラスミド中に導入した。組み立てられた生成物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、選択プレート上で一晩増殖した。コロニーをカウントし、コロニーＰＣＲによって検証した。プラスミドを陽性クローンのためにＭｉｎｉｐｒｅｐによって単離し、さらなる分析のためのサンガーシーケンシングのために送った。確認された陽性クローンを含有するプラスミドを増幅し、Ｍａｘｉｐｒｅｐによって単離した。プラスミドをＣＨＯ−３Ｅ７中でトランスフェクトし、細胞を７日間維持した。培養培地を採取し、抗体を、プロテインＡカラムを使用した親和性クロマトグラフィーによって単離した。
【０１７２】
実施例２：ペプチドの説明ならびにペプチドに対する抗体選択性および親和性の評価
抗原決定基として機能した本研究のために選択されたペプチドは、アゴニスト結合結晶化ラットＮＴＳ１受容体の第２の細胞外ループの１１アミノ酸配列に基づいている。４つの設計されたペプチド（Ｌｉｎ−ペプチド、３Ｄペプチド−１、−２、および−３）ならびにリンカーの構造および説明が図１Ａ〜図１Ｄおよび図１０に示される。４つのペプチドでの免疫化の後、ニワトリポリクローナル抗体（ＩｇＹ）を抽出し、免疫精製して、４つの異なる抗体：ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、−２、および−３を生成した。以下に記載される全ての検証結果に基づいた、結果として生じる抗体交差反応性および機能特性は、図１０に示される。
【０１７３】
エピトープ結合有効性を検証するために、全ての抗体を、固定ペプチド上の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において試験した（図２Ａ）。抗体を増加する量のその適合する遊離ペプチドと（例えば、ＩｇＹ−ＬｉｎをＬｉｎ−ペプチドと）予めインキュベートして、固定ペプチド検出を遮断することによって、阻害曲線を生成した。遊離ペプチドを含まない抗体のみを含有する対照の４５０ｎｍにおける吸光度測定を、１００％の全検出に対して正規化し、全ての試料を、それらの対応する対照に対してパーセンテージで正規化した。固定ペプチドへの結合の５０％を阻害するために、計算された濃度（ＩＣ５０）は、約２．２５ｎＭ（Ｌｉｎ）〜約７．８１ｎＭ（３Ｄ−３）の範囲の４つの抗体について同等であった。
【０１７４】
設計したペプチドに対する抗体の選択性を分析するために、示された抗体（図２Ｂ）を固定濃度（１０μＭ）の各ペプチドと混合することによって競合アッセイを行った。対照は、遊離ペプチドを含まない抗体のみに対応した。全ての吸光度測定をパーセンテージに変換し、それぞれの対照に対して正規化した。得られた結果は、全ての抗体がそれらの適合するペプチドによって遮断されたことを示す。ＩｇＹ−Ｌｉｎは、３つの３Ｄ−ペプチドによって部分的に遮断された（最大６７％の遮断）。興味深いことに、ＩｇＹ−３Ｄ−１は、その対応するペプチド（３Ｄペプチド−１）によってのみ効率的に遮断された。ＩｇＹ−３Ｄ−２および−３は、類似の表現型を有し、全ての３Ｄ−ペプチドによって（３Ｄペプチド−１によってはより低い程度まで）遮断され、Ｌｉｎ−ペプチドによっては部分的にのみ遮断された（最大４５％の遮断）。
【０１７５】
実施例３：抗体の検証−ラットＮＴＳ１受容体の検出
抗体を、それらが産生されたエピトープを検出する能力について検証した。次のステップは、それらが完全タンパク質を検出することができたかどうかを決定することであった。ＨＡタグ付きラットＮＴＳ１受容体を安定して発現する固定ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対して免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡法を実施し、共局在化分析を実施し、ＨＡ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７）によって生成されたシグナル上の、ニワトリ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８）によって生成されたシグナルに基づいて、オーバーラップ係数を計算した。図３Ａのグラフは、条件毎にランダムに選択された５つの視野からの、複製とみなされる１０個のｚスタックスライス（０．５μｍ）の計算されたオーバーラップ係数（４８８／６４７）を示す。文献によると、０．５未満のオーバーラップ係数は、ＩｇＹ−３Ｄ−２の場合のように有意な共局在化としてみなされない。
【０１７６】
内因性ラットＮＴＳ１受容体の検出を検証するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）をニワトリ抗体を用いてラット脳切片上で実施した。ＩｇＹ−ＬｉｎおよびＩｇＹ−３Ｄ−１で得られた結果が図３Ｂに示される。ｒＮＴＳ１受容体を高度に発現すると以前に記載された領域が示され、矢印はＮＴＳ１特異的シグナルを示している。ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３は、ＩｇＹ−Ｌｉｎで得られた非特異的シグナルを生成することなく、ラットＮＴＳ１受容体を効率的に検出していた。ＩｇＹ−３Ｄ−２は、ラット脳内の受容体を検出することができなかった。
【０１７７】
抗体とラットＮＴＳ１受容体との特異的相互作用の実証は、質量分析による識別によって確立された。最初に、ラットＮＴＳ１受容体を、ＨＡ−ｒＮＴＳ１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞から、磁気ビーズにコンジュゲートされたニワトリ抗体（ＩｇＹ−３Ｄ−１および−３）との免疫沈降（ＩＰ）によって単離した。使用した陰性対照は、ＩｇＹコンジュゲートビーズと、それらの適合するペプチドとの１：１０の比率でのプレインキュベーションに対応した。免疫ブロットを抗ＨＡ−ＨＲＰ抗体で明らかにした（図４Ａ）。全ての試料を分析のために送り、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のペプチドが明確に識別され、ラットＮＴＳ１受容体のＣ末端ドメインに対応した。識別されたペプチド配列およびそのイオンプロファイルが図４Ｂに示される。ＮＴＳ１特異的抗体とＮＴＳ１受容体との間の相互作用は、図４Ｃのグラフによって示されるように、対応するペプチドとのプレインキュベーションによって有意に遮断された。
【０１７８】
実施例４：種間のＮＴＳＲ１保存および抗体選択性
免疫原が使用された第２の細胞外ループラットＮＴＳ１受容体のＸ線ベースのペプチド配列は、１個および２個のアミノ酸がマウスおよびヒトＮＴＳ１タンパク質配列のそれぞれと異なるため、種間で大部分は保存される（図５Ａ）。このエピトープに対して作られたＮＴＳ１受容体抗体（ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３）は、ヒトＮＴＳ１受容体を認識することが示され、マウス受容体を認識すると予想される。図５Ｂに示される結果は、ポリクローナルＩｇＹ−３Ｄ−３抗体が、変異体のいくつかに対して（ネイティブＮＴと比較して）より強い結合を有して、最も曝露されたものであると予測される、設計されたエピトープの５個のアミノ酸（Ｄ２１６、Ｇ２１７、Ｔ２１８、Ｈ２１９、およびＰ２２０）において変異（アラニン置換）したＮＴＳ１タンパク質に結合することを示す。ＩｇＹ−３Ｄ−３抗体はまた、ネイティブＮＴと比較してより低いレベルではあるが、変異体上の放射性標識ニューロテンシン（ＮＴ）の置き換えを誘導することができた（図５Ｃ）。
【０１７９】
標的選択性は、抗体の産生における決定因子であり、評価する必要があった。この問題に対処するために、全ての抗体を、他のクラスＡ  ＧＰＣＲ：ニューロテンシン低親和性受容体２（ｒＮＴＳ２）およびアペリン受容体（ｒＡＰＪ）（両方ともラット由来）を検出する能力について試験した。ＨＡタグ付きｒＮＴＳ１、ｒＮＴＳ２、ｒＡＰＪ、または空ベクター対照のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を、ウエスタンブロット（図５Ｄ）およびネイティブ免疫沈降（図５Ｅ）のために処理した。これらの図に示される結果は、ＮＴＳ１抗体ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−３Ｄ−３がラットＮＴＳ１受容体のみを検出したことを示す。
【０１８０】
実施例５：抗体の機能特性
ＮＴＳ１受容体に対する化合物または抗体の機能特性を検証するためのロバストな技法は、抗体を用量反応的に添加することによって、その受容体に結合する放射性標識ニューロテンシン（１２５Ｉ−Ｔｙｒ３−ニューロテンシン）の置き換えを測定することである（図６Ａ）。ＩｇＹ−３Ｄ−３は最も強力な抗体であり、低濃度（ＩＣ５０＝３．２μｇ／ｍＬ）でＮＴを効率的に置き換えることができた。ＩｇＹ−３Ｄ−１およびＩｇＹ−Ｌｉｎは、ＩｇＹ−３Ｄ−３と比較してより高い濃度（それぞれ３６．５μｇ／ｍＬおよび１８７μｇ／ｍＬ）で、ニューロテンシンの５０％を置き換えることが示された。ＩｇＹ−３Ｄ−２は、結合ＮＴのレベルを有意に変化させなかった。
【０１８１】
ニューロテンシン結合後のＮＴＳ１受容体活性化は、複数のシグナル伝達経路を誘発し、最初に試験したものは、Ｇｓ結合ＮＴＳ１活性化に応答する環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の蓄積であった。産生されたｃＡＭＰの量を、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術に基づくアッセイを用いて、ラットＮＴＳ１受容体を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞内で計算した。細胞をＮＴで刺激し（ＥＣ５０に対応する濃度で）、抗体とインキュベートして、ｃＡＭＰの産生を遮断する能力を評価した（図６Ｂ）。ＩｇＹ−３Ｄ−３抗体は、これらの条件下でＮＴによって誘導されるｃＡＭＰの産生を有意に阻害する唯一の抗体であった。
【０１８２】
次いで、ＢＲＥＴベースのアッセイを使用して、ＨＡ−ｒＮＴＳ１を一過性に発現するＨＥＫ２９３細胞内で、ＮＴ刺激後のラットＮＴＳ１シグナル伝達活性プロファイルを決定し、試験した全てのシグナル伝達経路がグラフに示される（図６Ｃ）。Ｇαｑおよびβアレスチン２は、ＮＴ刺激に対する良好な応答を引き起こし、その後、アゴニストモード（図６Ｄ、６Ｅ）およびアンタゴニストモード（図６Ｆ、６Ｇ）でニワトリ抗体（ＩｇＹ−Ｌｉｎ、ＩｇＹ−３Ｄ−１、およびＩｇＹ−３Ｄ−３）を用いた濃度応答アッセイにおいて試験した。いずれの抗体も、全ての試験されたシグナル伝達経路の活性化に有効であることが示されていない（アゴニストモード）。アンタゴニストモードでは、細胞をＮＴ（ＥＣ５０）で刺激し、抗体とインキュベートして、Ｇαｑおよびβアレスチン２依存性シグナル伝達を遮断するそれらの能力を評価した。ＩｇＹ−３Ｄ−３は、これらのシグナル伝達経路を遮断することができる唯一の抗体であった。既知のＮＴＳ１アンタゴニストＳＲ４８６９２を、陽性対照として使用した。
【０１８３】
実施例６：ＮＴＳＲ１特異的組換え抗体および機能特性
３Ｄペプチド−３で免疫化したニワトリの遺伝物質を使用してファージディスプレイを実施し、ｓｃＦｖライブラリを生成し、関連配列を選択して、ニワトリＨｉｓタグ付きｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ  ２３８）およびヒトＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを有するニワトリｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８）を構築した。ｓｃＦｖのサイズ（約２５ｋＤａ）を確認するウエスタンブロットを図７Ａに示し、ニワトリ抗Ｈｉｓおよび抗ｓｃＦｖの２つのＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて行った。ヒトＩｇＧ由来のＦｃフラグメントを有する第２のニワトリｓｃＦｖも調製した（ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９、ｓｃＦｖ  ００９の配列については図８Ｈを参照）。ｓｃＦｖ  ２３８はまた、ＨＡ−ヒトＮＴＳ１を安定して発現するＨＥＫ細胞を検出すること（図７Ｂ）、およびＨＣＴ１１６およびＰＡＮＣ−１膜調製物上で放射性標識ニューロテンシンを置き換えること（図７Ｃおよび図７Ｄ）ができた。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９で同様の結果が得られた。
【０１８４】
組換え抗体の機能特性を試験するために、増加する量のｓｃＦｖ  ２３８（図７Ｅ）およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８を使用して、Ｇｑ結合ＮＴＳ１活性化に応答するイノシトールモノホスフェート（ＩＰ−Ｏｎｅ）の蓄積を、濃度応答アッセイにおいて測定した。ヒトＮＴＳ１受容体を内因的に発現する結腸直腸癌細胞であるＨＣＴ１１６細胞を、ＮＴ（１０ｎＭ）で刺激し、組換え抗体とインキュベートした。ｓｃＦｖ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８の両方は、ｓｃＦｖ  ２３８およびｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８のそれぞれについて１００ｎｇ／ｍＬの濃度でのＩＰ−Ｏｎｅ産生の完全（約％１００）または約５０％の阻害で、ＨＣＴ１１６細胞内のＮＴ誘導性ＩＰ−Ｏｎｅ産生を阻害することができた。ヒトＮＴＳ１受容体を発現するヒト膵臓癌細胞であるＰＡＮＣ−１細胞上のｓｃＦｖ  ２３８（図７Ｆ）、ならびにｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８および別のｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９）（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）で、同様の結果が得られた。ｓｃＦｖ  ２３８は、ＨＣＴ１１６生細胞においてＵＤＰではなくＮＴ  １−１３で、Ｇαｑ経路を活性化した後のＩＰ−ｏｎｅ産生を阻害することが示され、ＮＴＳ１に対する抗体の特異性を確認した。
【０１８５】
図１１Ｅおよび図１１Ｆに示される結果は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８が、ＨＣＴ１１６およびＰＡＮＣ−１細胞に対するＡＤＣＣ応答を誘発する能力を有することを示す。したがって、腫瘍細胞内のＮＴ媒介性シグナル伝達を遮断することに加えて、組換え抗体は、腫瘍細胞の死滅を誘導することができる。
【０１８６】
図１２Ａ〜図１２Ｃに示される結果は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ２３８および／またはｓｃＦｖ−Ｆｃ  ００９が、安定してトランスフェクトされたＨＥＫ細胞（図１２Ａ）、ならびに膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌異種移植片を含む異なる起源由来のいくつかの癌患者由来の異種移植片（図１２Ｂ、図１２Ｃ）上でのＩＨＣによって、ヒトＮＴＳ１を検出することができることを示し、組換え抗体が任意の起源のＮＴＳ１発現腫瘍を標的にするのに有用であり得るという証拠を提供する。
【０１８７】
本発明は、その特定の実施形態によって上で説明されているが、添付の特許請求の範囲に定義される主題の発明の精神および本質から逸脱することなく修正され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含むがこれらに限定されない」という語句に実質的に等しいオープンエンドの用語として使用される。単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、対応する複数の参照を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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