(57)【要約】 【課題】穀類農作物に有用な生物性刺激剤又は生物性殺線虫剤を提供する。【解決手段】  本発明は、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されているドミニキアｓｐ．菌株、このドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物、又はこの組成物の調整方法、この組成物の生物性刺激剤又は生物性殺線虫剤使用である。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で国際寄託機関であるベルギー国立微生物の共同作業機構（International Depositary Authority Belgian Coordinated Collections of Microorganims）に寄託されているドミニキアｓｐ．菌株。
【請求項２】
寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で国際寄託機関であるベルギー国立微生物の共同作業機構に寄託されているドミニキアｓｐ．菌株を４．０−１．０重量％含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記組成物中のドミニキアｓｐ．菌株の濃度は、３．０−２．０重量％である
ことを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、個体組成物である
ことを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、粉末、乳化濃縮物、顆粒、微細顆粒の形態のいずれかである
ことを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、微細顆粒の形態である
ことを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記微細顆粒は、５００−２０００μｍの範囲内のサイズを有する
ことを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
殺菌株剤、生物性殺菌剤、殺虫剤、生物殺虫剤、殺線虫剤、生物性刺激剤の内のいずれかを更に含む
ことを特徴とする請求項２−７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で国際寄託機関であるベルギー国立微生物の共同作業機構に寄託されているドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物の調整方法において、
（Ａ）基質を提供するステップと、
（Ｂ）前記基質に、宿主植物の種子と寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株とを提供するステップと、
（Ｃ）前記基質を苗場容水量の７５％以上の湿分レベルに維持する為に、前記宿主植物を栽培し給水するステップと、
（Ｄ）少なくとも７日間、前記ステップ（Ｃ）の給水を中止するステップと、
（Ｅ）前記宿主植物の地上部と前記基質を除去するステップと、
（Ｆ）前記除去した基質を乾燥させるステップと、
（Ｇ）１００μｍ未満の粒子サイズを有する顆粒を得る為に、前記乾燥した基質を粉砕するステップと
を有する
ことを特徴とする寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されているドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物の調整方法。
【請求項１０】
前記ステップ（Ｂ）のドミニキアｓｐ．菌株は、ドミニキアｓｐ．菌株の胚芽を含む接種物である
ことを特徴とする請求項９記載の調整方法。
【請求項１１】
（Ｈ１）前記基質を微細顆粒化するステップ
を更に含む
ことを特徴とする請求項９又は１０記載の調整方法。
【請求項１２】
（Ｈ２）穀物の種子コーティングの為に、濃縮生物接種物を調整するステップ
を更に含む
ことを特徴とする請求項９又は１０記載の調整方法。
【請求項１３】
前記ステップ（Ｈ２）は、所定の値以上の粒子サイズを有する顆粒を選択する為に、前記ステップ（Ｇ）で得られた粉砕された生成物を篩いにかけることにより行われる
ことを特徴とする請求項１２記載の調整方法。
【請求項１４】
（Ｉ）種子コーティングを行うステップ
を更に有する
ことを特徴とする請求項１２記載の調整方法。
【請求項１５】
前記ステップ（Ｉ）は、ステップ（Ｉ１）−（Ｉ４）のステップを含む
（Ｉ１）前記種子を粘着性物質で覆うステップと
（Ｉ２）前記濃縮生物接種物を添加するステップと、
（Ｉ３）選択的事項として、下記のサブステップから選択された親和性のある処理を施すステップと、
（Ｉ３．１）菌根形成菌と親和性のある殺菌剤、殺虫剤、除草剤の内のいずれかで処理するサブステップ、
（Ｉ３．２）有益な微生物で処理するサブステップ、
（Ｉ３．３）マクロ栄養素又はミクロ栄養素で処理するサブステップ、
（Ｉ３．４）刺激剤で処理するサブステップ、
（Ｉ３．５）菌根菌と親和性のある着色色素で処理するサブステップ、
（１４）前記種子を乾燥させるステップ、
ことを特徴とする請求項１４記載の調整方法。
【請求項１６】
寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で国際寄託機関であるベルギー国立微生物の共同作業機構に寄託されているドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物の植物の生物性刺激剤としての使用。
【請求項１７】
寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で国際寄託機関であるベルギー国立微生物の共同作業機構に寄託されているドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物の植物の生物性殺線虫剤としての使用。
【請求項１８】
前記植物が穀物である
ことを特徴とする請求項１６又は１７記載の使用。
【請求項１９】
種子を蒔く時に、前記ドミニキアｓｐ．菌株を種子にコーティングする、又は前記ドミニキアｓｐ．菌株を種子と組み合わせる
ことを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項２０】
請求項２記載の組成物でコーティングした穀物種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業分野に関し、特にドミニキアｓｐ．菌株（Dominikia sp strain）とそれを含む組成物とその使用（例：生物性刺激剤（bio-stimulant）と生物性殺線虫剤（bio-nematicidal）としての使用）に関する。ドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物は、特に穀類農作物（cereal crop）で有用であることと判明した。
【背景技術】
【０００２】
現在、３０属（genera）の約３００種（species）がグロムス門（Glomeromycota）に記載されている。しかし核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）をベースにした生物多様性の研究は、グロムス門の遙かに幅広い多様性に向けられ、いくつかの新たな種と属が最近記載されている。
【０００３】
大部分のグロムス門はアーバスキュラー菌根菌類（arbuscular mycorrhizal fungi(AMF)：以下単に「ＡＭＦ」とも称する）である。これらは、維管束陸上植物の約８０％の相利共生菌（mutualistic symbiont）である。ＡＭＦによりコロニー化（コロニー形成）される植物の養分吸収は、根の表皮と根毛を介して直接行われるが、菌類と根の界面（fungus-root -interface）を介しても行われている。この菌類と根の界面は、アーバスキュール（arbuscule）又はラジカル内菌糸コイル（intraradical hyphal coil）の特徴的な形態を有する。ＡＭＦは、それらの宿主の養分吸収を強化する際の役割に加えて、土壌の凝縮から保護と、植物を干ばつのストレスから保護と、土壌由来の植物病原菌から保護を実行する点で重要な役割を果たす。この非常に有益な性質故に、いくつかの菌根組成物（mycorrhizal  composition）がこの技術分野で知られている。それらは、その有益な効果を穀物に及ぼす為に、開発されている。
【０００４】
特許文献１，２は、グロムシラニカムヴァー（Glomusiranicum var.）菌株とテヌイフィファラムバーノブ （tenuihypharum var nov）菌株を含む組成物とその使用例を開示している。特に特許文献１は、グロムシラニカムヴァー菌株、テヌイフィファラムバーノブ菌株を含むサブ組成物とスメクタイト粘土（smectite clay）を２：１の割合で含む組成物を開示する。特許文献１の組成物は、農作物収量に良い効果があることを即ちレタス農作物の生物性刺激剤として使用できることを開示している。
【０００５】
同様に特許文献２は、グロムシラニカムヴァー菌株とテヌイフィファラムバーノブ菌株とスメクタイト粘土を２：１の割合で含むサブ組成物と、金属イオンと、チティン（chitin）を含む組成物を開示している。特許文献２は、前記組成物をトマト農作物の生物性殺線虫剤として作用することを開示している。
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０００６１２
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０００６１３
【非特許文献１】Porter, Aust. J. Soil Res.,1979, 17, 515-19
【非特許文献２】Schwarzott D, Schussler A (2001) A simple and reliable method for SSU rRNA gene DNA extraction, amplification, and cloning from single AM fungal spores. Mycorrhiza 10: 203-207
【非特許文献３】Redecker D. (2000) Specific PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal fungi within colonized roots. Mycorrhiza 10: 73?80
【非特許文献４】Kruger M, Kruger C, Walker C, Stockinger H, Schusler A (2012) Phylogenetic reference data for systematics and phylotaxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi from phylum to species level. New Phytol 193: 970?984; downloadable at www.amf-phylogeny.com)
【非特許文献５】Miller MA, Pfeiffer W, Schwartz T. (2010) Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic tres. In Proceedings of the Gateway Computing Environments Workshop (GCE), 14 Nov. 2010, New Orleans, LA pp 1 - 8; http://www.phylo.org/) with RAxML version 8.0 (Stamatakis et al. 2014
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【非特許文献７】McGonigle, T.P., Miller M.H., Evans D.G., Fairchild G.L., Swan J.A. 1990. A new method which gives an objective measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 115 (3):495-501
【非特許文献８】Phillips, J.M., Hayman D.S. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society 55:158-161
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【非特許文献１８】Instituto Nacional de Ciencias Agricolas. Manual de tecnicas Analiticas para analisis de suelo, foliar, abonos organicos y fertilizantes quimicos: La Habana. 1989
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来技術に開示された組成物は、穀類農作物に許容可能な良い効果を生物性刺激剤と生物性殺線虫剤の観点からは提供していない。
【０００７】
本発明の目的は、組成物に含めるの適した真菌類の菌株（strain of fungus）を提供することである。前記組成物とは、農作物（特に穀類農作物）に良い影響を及ぼすのに適した組成物のことである。本発明の他の目的は、穀類農作物に対する生物性刺激剤として奏効する組成物を提供することである。本発明の他の目的は、穀類農作物に対する生物性殺線虫剤として奏効する組成物を提供することである。本発明の更なる目的はこのような組成物を得るプロセスを提供することである。
【０００８】
本発明のドミニキアｓｐ．菌株は、出願人により、以下の２つの機構に２０１８年３月２１日に寄託された。
（１）国際寄託機関であるベルギー国立微生物共同作業機構（International Depositary Authority Belgian Coordinated Collections of Microorganims(BCCM)）
（２）ウニベルジテ  カソリック  デ  ルーベイン（Universite catholique de Louvain） Mycothequeque de I'Universite catholique de Louvain (MUCL).Croix du Sud 2, box L7.05.06, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgium（.住所：Campus de Espinardo 7,edificio CEEIM, 30100 Murcia Spain）
【０００９】
本発明のドミニキアｓｐ．菌株は、寄託者により参照番号ＳＭＢ０１で識別され、国際寄託機関（１）から寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２を受領した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、グロムス門の菌株即ち寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株（Dominikia sp. strain）である。本発明の菌株は、高い水性（hydromorphic ）で、高圧縮されたナトリウム塩分を含有する土壌（Solonetz Gley）から単離された。この土壌は、表面に多くの塩分堆積物を有し、Fortuna, Murcia (Spain)地方のものである。
【００１１】
本発明の菌株の胞子嚢果（sporocarps）は知られていない。本発明の菌株においては、胞子（spore）は、土壌中の遊離クラスター（loose cluster）内で発生し、末端（terminal）又は節間（intercalary）で発生することもある。胞子は根の中にも形成されうる。胞子の色は、透明から明るい黄土色であり、亜球状から球状（希に不規則）の構造であり、比較的小さく、その直径は、２４．０−４２μｍで、その平均値は３０．７±３．７μｍである。胞子は、３層構造の壁（１−４μｍ厚）を有する複合体である。特に外側層、中間層、内側層が認識可能である。
【００１２】
胞子壁の外側層は、粘液性で徐々に消えるよう（evanescent）に見える。若い胞子は粗い外観を呈し、古い胞子は幾分毛羽立った外観を示す。胞子壁の外側層は、Melzer試薬で着色すると、デキストリノイド反応（dextrinoid reaction）を示し、若い胞子は茶色がかった赤色になる。胞子壁の中間層は、実質的に永続し、０．５−２．０μｍの厚さである。
【００１３】
胞子壁の内側層は、層状であり０．５−１．５μｍの厚さを有する。胞子の中身は、淡く斑点のある外観を呈する。胞子を保持する菌糸（hphae）は、透明のガラス状から淡い黄土色であり、直線状又は波状で、直径が２．５−４．５μｍ（平均値：３．０μｍ）である。菌糸は、少なくとも成熟した胞子では、円筒状又は若干漏斗状であり、胞子壁の開放穴の層と合わさる。発芽構造（germination structure）は発芽管（germ tube）を含む。この発芽管は、成長し、胞子と菌糸の結合を介して元に戻る。それは小胞性のアーバス菌根（vesicula arbuscular mycorrhizae）を形成する。
【００１４】
ラジカル外菌糸体（extraradical myselium）は、広範囲のネットワークを形成する。
１３４  １８Ｓ  ｒＤＮＡ配列の系統派生分析（phylogenetic analysis）は、環境配列（environmental sequence ）と参照配列（referenced sequence）を含むが、本出願人により生成された。大部分のドミニキア種（Dominikia species）から、比較的短いか１８Ｓ配列が得られるかそれが無い。ドミニキア indica（Dominikia indica）配列とドミニキア iranica （Dominikia iranica）配列は、この系統派生分析に含めることができる。これら２つの種の配列は、データセットの残りの部分のそれより短かった。このデータセットをこれらの配列の長さにトリミングすると、比較的不完全な分析ツリーになった。完全な長さの配列を用いて、より高い分類レベル（higher taxonomic level）を表す枝（ブランチ）を有するツリーとなった。しかし、ドミニキアspp.（Dominikia spp.）からの配列からなる堅牢な単系統クレード（robust monohyletic clade）は、このデータセットでは、生成できなかった。ドミニキアｓｐ．は、ドミニキアiranica（Dominikia iranica）と、様々な宿主植物と様々な場所からの匿名の環境グロメラリアン配列（anonymous, enviromental glomeralean sequence）と共に、１つの十分サポートされたクレードを形成する。
【００１５】
上記したドミニキア種（Dominikia species）の大部分をからの配列を含むＳＳＵ−ＩＴＳ１データセットの系統派生分析は、Dominikia sp.はDominikia aureaの隣に枝を広げている（branches）ことを示している。
【００１６】
小さな胞子（直径が最大６５−７０μｍ）は、通常柔らかい（遊離）クラスターから堅いクラスターに渡って凝集しているが、ドミニキア属（genus Dominikia）にとって特徴的である。ドミニキア属のメンバーの胞子壁は、２層又は３層から構成される。外側層は、胞子表面を形成するが、粘液性（mucilagenous）で短命で、Melzer 試薬で染色されるか、又は単一体（小層に分割されていない）であり、永続的で、Melzer 試薬では反応しない。胞子を保持する菌糸は、円筒形から漏斗状であり、貫通穴又は中隔で塞がれている穴を有する。ドミニキア minuta(Basidionym: Glomus minutum)が、タイプ種（type-species）として指定されている。本発明の菌株即ちドミニキア sp.は、ドミニキア minuta と同じサイズのガラス状胞子を有する。しかし、G. minutum(即ちドミニキア minuta)の胞子は、中隔により閉塞されている、ドミニキアsp.とは対照的である。ドミニキアsp.は、ドミニキアminuta とも異なっている。その理由は、ドミニキアsp. は、３層の胞子壁を有し（これに対し、ドミニキア minutaは２層の胞子壁を有する）、ドミニキアmiinutaには存在しないデキストリノイド反応（dextrinoid reaction）をするからである。
【００１７】
Dominikia sp. は、上記した他のドミニキアの種とも菌株とも異なる。Dominikia achra 菌株の胞子の外側層と内側層とは、Melzer 試薬で深い赤色に染まる。 これに対しDominikia sp.では、外側層のみがデキストリノイド反応を示す。Dominikia indica がDominikia sp.と相違するのは、中の団粒（hypogeous aggregate ）内に小さなガラス性胞子を形成する点である。Dominikia indicaの胞子壁は、ガラス状の２層構造（薄い外側層と厚い内側層）からなる。薄い外側層は、粘着性で短命であり、Melzer 試薬でピンクがかっているかピンク色に染まる。厚い内側層は、層構造で平滑で永続的である。Dominikia indicaの２層構造は、Dominikia sp.の３層構造とは対照的である。１８Ｓ−ＩＴＳ１系統によると、Dominikia aureaが本発明のDominikia sp. 菌株に最も近い親戚である。しかしこの２つの種は多くの形態学的特徴の点で異なる（表１を参照）。最も明白な相違点は、Dominikia aureaがほぼ卵形の胞子である点である。この卵形胞子は不規則な胞子嚢果（sporocarp）で凝縮している。
【００１８】
本発明のドミニキアｓｐ．の配列に極めて類似する配列は、遺伝子バンクに対しブラストされた時、見いだされた（ｅ値０．００，同一性９９％）。これらの配列は、様々な国々、大陸からの幅広い範囲の様々な宿主（例：コケ類、単子葉植物）から発生し、世界的な分布を示している。これらの発見はドミニキアｓｐ．は広く分布していることを示している。
【００１９】
上記したように、Dominikia sp. は、組成物特に穀類農作物に提供される組成物が含むと、特に有益である。
本発明の他の目的は、２０１８年３月２１日に寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたDominikia sp. を含む組成物を提供することである。
特定の説明に縛られることなく、驚くべきことに、本発明のドミニキアｓｐ．とそれを含む組成物は農作物特に穀類農作物に有益な効果を奏することが観測された。
【００２０】
特に、ドミニキアｓｐ．を含む組成物を、農作物特にシリアル（穀物）農作物（例：トウモロコシ、小麦、大麦、稲）に与えることにより、それを与えなかった場合に比較して、栄養素の取り込み量の増加と穀物の収量の改善が観測された。好ましくは、組成物中のドミニキアｓｐ．の濃度は、４．０−１０重量％、より好ましくは３．０−２．０重量％、更に好ましくは２．５−２．３重量％である。
【００２１】
一実施例によれば、本発明の組成物は、液体、固体、ジェルのいずれかの形態の組成物である。好ましくは、本発明の組成物は、個体の形態の組成物である。一実施例によれば、本発明の組成物は、粉末、乳化性濃縮物、顆粒、微細顆粒のいずれかの形態である。
【００２２】
本発明の組成物は個体組成物である。その組成物中のドミニキアｓｐ．の胎芽（propagules）の濃度は、"Most Propable Number Method"（非特許文献１）で測定すると、組成物１グラム（ｇ）当たり１８０−１２０個の胎芽であり、好ましくは組成物１ｇ当たり１５０−１２０個の胎芽であり、更に好ましくは組成物１ｇ当たり１２５−１２０個の胎芽である。胎芽の濃度は、最終品中の胎芽の濃度である。
【００２３】
一実施例によれば、本発明の組成物は、微細顆粒の形態である。
一実施例によれば、前記微細顆粒のサイズは、５００−２０００μｍの範囲、好ましくは８００−１５００μｍの範囲、より好ましくは９００−１２００μｍの範囲である。
【００２４】
好ましくは、ドミニキアｓｐ．の濃度は、本発明の組成物において、更に組成物の存在の形態（例：微細顆粒）においては、所定の最終用途に従って、選択される。
【００２５】
一実施例によれば、本発明の組成物は、殺菌株剤、生物性殺菌剤、殺虫剤、生物殺虫剤、殺線虫剤、生物性刺激剤の内のいずれかを更に含む。
【００２６】
一実施例によれば、本発明の組成物は、種子をコーティング（以下「種子コーティング」と称する）する形態である。
例えば、殺菌剤は、以下の群から選択される。マネブ（Maneb）,マコゼブ（Mancozeb）, メタラキシ−リドミル（Metalaxyl-Ridomil）, ミクロブタニル（Myclobutanil）, オルピサン（Olpisan）, プロパモカルブ（Propamocarb）, キントゼン（Quintozene）, ストレプトマイシン（Streptomycin）, 硫黄（Sulfur）,チオファネート−メチル （Thiophanate-methyl）, チラム（Thiram）, トリフォリン（triforine）,ビンクロゾリン（vinclozolin）,亜鉛白（Zinc white）, ジネブ（Zineb）, ジラム（Ziram）, バンロット（Banrot）, 固定銅（Fixed copper）, クロロタロニル（Chlorothalonil）, キャプタン（Captan）, クロロネブ（Chloroneb）, シプロクロナゾール（Cyproconazole）, 亜鉛エテレン（Zinc ethelene）, ビスジチオカルバメート（bisdithiocarbamate）, エトリジアソール（Etridiazole）, フェナミノスルフ（Fenaminosulf）, フェナリモール（Fenarimol）, フルトラニル（Flutolanil）, フォルペット（Folpet）, フォセチル−ＡＬ（Fosetyl-AL）、イプロジオン （Iprodione）。
代表的な生物性殺菌剤は、以下の群から選択される。トリコデルマ属（Trichodermas sp）, 枯草菌（Bacillus subtilis）, バシラスリチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）, バシラスプルミス（Bacillus pumilus）,バシラス アミロリケファエンス（Bacillus amyloliquefaciens）, ストレスミセス属（Streptomyces sp）, コニオシリウムミニタン（Coniothyrium minitans），ピシリウムオリガンドラム（Pythium oligandrum）。
【００２７】
一実施例によれば、殺虫剤は、以下の群から選択される。
有機リン酸塩（organophosphate）, カルバメート（carbamate），ネオニコチノイド（neonicotinoid）。
一実施例によれば、生物性殺虫剤は、以下の群から選択される。
バシラス種（Bacillus sp.）, クロモバクテリウム種（Chromobacterium sp.）, ボーベリア種（Beauveria sp.）、マタリズム種（Metarhizium sp.）
一実施例によれば、線虫剤は、以下の群から選択される。
有機リン酸塩（organophosphate），カルバメート（carbamate.）
一実施例によれば、生物線虫剤は、パスツリア種（Pasteuria sp）である。
本発明の別の目的は、ドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物の調整方法である。
【００２８】
本発明の方法は、以下のステップを含む。
（Ａ）基質を提供するステップと、
（Ｂ）前記基質に、宿主植物の種子と寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株とを提供するステップと、
（Ｃ）前記宿主植物を栽培し給水し、前記基質を苗場容水量の７５％以上の湿分レベルに維持するステップと、
（Ｄ）少なくとも７日間前記給水ステップ（Ｃ）を中止するステップと、
（Ｅ）前記宿主植物の地上部と前記基質を除去するステップと、
（Ｆ）前記除去された基質を乾燥させるステップと、
（Ｇ）前記乾燥した基質を粉砕するステップ。
これにより、１００μｍ未満の粒子サイズを有する顆粒を得る。
【００２９】
好ましくは、基質はクレイ（粘土）を含む。
一実施例によれば、前記ステップ（Ｂ）のドミニキアｓｐ．は、ドミニキアｓｐ．の胎芽を含む接種物である。好ましくは、この接種物は、以下の手順により得られる。
（Ｂ１）宿主植物の根系に高純度のドミニキアｓｐ．を提供し、（Ｂ２）この宿主植物を粘土（好ましくは滅菌スメタイト粘土、以下単に「粘土」とも称する）を含む基質上でそのライフサイクルの間育て、（Ｂ３）その後根系を抽出して、接種物を得る。
この場合、接種物は、ある量の基質と、細根又は小根（rootlet）と、ドミニキアｓｐ．の胚芽（胎芽）を含む。
【００３０】
一実施例によれば、本発明の方法は、微細顆粒化するステップ（Ｈ１）を含む。
好ましくは、このステップ（Ｈ１）により、本発明のドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物は、微細顆粒の形態で得られる。上記したように、前記微細顆粒のサイズは、５００−２０００μｍの範囲、好ましくは８００−１５００μｍの範囲、より好ましくは９００−１２００μｍの範囲である。
【００３１】
一実施例によれば、本発明の方法は、濃縮生物接種物を準備するステップ（Ｈ２）を含む。これにより穀物の種子をコーティングする。即ちステップ（Ｇ）で得られた粉砕製品の穀物の種子をコーティングをする濃縮生物接種物を得る。本明細書において、前記ステップ（Ｈ２）は、組成物内のドミニキアｓｐ．（例：ドミニキアｓｐ．胎芽）の濃度を上げることを意味する。
【００３２】
前記ステップ（Ｈ２）は、前記ステップ（Ｇ）で得られた粉砕された生成物を篩いにかけることにより行われ、所定の値（例：３５μｍ）以上の粒子サイズを有する顆粒を選択する。
【００３３】
好ましくは、ステップ（Ｈ２）により、ドミニキアｓｐ．（例：ドミニキアｓｐ．胎芽）の濃度を最初の濃度（ステップ（Ｈ２）前の生成物内のドミニキアｓｐ．の濃度）に比較して、１０倍に、好ましくは５０倍に、更に好ましくは１００倍に上げる。
【００３４】
一実施例によれば、ステップ（Ｈ２）前の生成物内のドミニキアｓｐ．（例：ドミニキアｓｐ．胎芽）の最初の濃度に比較して、濃度を１００倍に上げることも可能である。
【００３５】
一実施例によれば、本発明の方法は、（Ｉ）種子コーティングを行うステップを含む。即ち、ステップ（Ｈ２）により得られた濃縮生成物に種子コーティングを行う。
【００３６】
前記種子コーティングを行うステップ（Ｉ）は、以下のステップを含む。
（Ｉ１）前記種子を粘着性物質で覆うステップと
（Ｉ２）前記濃縮生物接種物を添加するステップと、
（Ｉ３）選択的事項として、下記のサブステップから選択された親和性のある処理を施すステップと、
（Ｉ３．１）菌根形成菌（mycorrhizal froming fungi）と親和性のある殺菌剤、殺虫剤、除草剤の内のいずれかで処理するサブステップ、
（Ｉ３．２）有益な微生物で処理するサブステップ、
（Ｉ３．３）マクロ又はミクロ栄養素で処理するサブステップ、
（Ｉ３．４）刺激剤で処理するサブステップ、
（Ｉ３．５）菌根菌と親和性のある着色色素で処理するサブステップ、
（１４）前記種子を乾燥させるステップ。
【００３７】
本発明の他の目的は、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物を植物の生物性刺激剤として使用することである。本明細書において、「生物性刺激剤」とは、植物に本発明の組成物が及ぼす刺激を意味する。
【００３８】
特定の科学的説明に縛られることなく、以下が仮説として説明できる。即ち、本発明のドミニキアｓｐ．菌株は、栄養素の転流の機能を発揮し、これらの栄養素を土壌又は基質から取りだし、この栄養素を代謝系で使用し、この栄養素を菌糸ネットワークから転流させ、続いて、それらを根細胞内で交換する。
【００３９】
一実施例によれば、本発明の組成物は、穀物に対する生物性刺激剤として使用される。本発明の他の目的は、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株を含む組成物を植物の生物性殺線虫剤として使用することである。言い換えると、本発明の組成物は植物を線虫から保護する。
【００４０】
一実施例によれば、本発明の組成物は、穀物に対する生物性殺線虫剤として使用される。好ましくは、本発明の組成物は、植物即ち穀物例えば穀類農作物に、いくつかの方法で与えられる。一実施例によれば、本発明の組成物は、植物に以下の方法で与えることができる。即ち、種子処理（即ち、種子コーティング）、根処理、乳濁液に沈めた根、潅漑水への添加、灌漑、粉末状での根系への添加、乳濁液の根系への注入適用である。
【００４１】
好ましくは、特に本発明の組成物が穀類に提供される時は、本発明の組成物は、種子コーティングにより、種まき時に種子と共に、微細顆粒の形態のいずれかで提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ドミニキアｓｐ．で処理した植物の視覚密度（％）で表した胞子生成（spore production）と菌類占有（fungal occupation）のグラフ。横軸：ＤＰＴ（移植後の日数）、縦軸：１ｇ土壌当たりの胞子数／視覚密度（％）黒四角；視覚密度（％）、白四角：１ｇ土壌当たりの胞子数
【図２】ドミニキアｓｐ．で処理したアーバスキュラー外菌糸体（arbuscular external mycelium）とアーバスキュラー内部増殖菌（arbuscular endophyte）の挙動を示すグラフ。横軸：ＤＰＴ（移植後の日数）、縦軸：土壌５０ｇ当たりＭｇ黒四角；アーバスキュラー外菌糸体、白四角：アーバスキュラー内部増殖菌
【図３】ドミニキアｓｐ．で処理したアーバスキュラー外菌糸体とアーバスキュラー内部増殖菌の間の関係を示すグラフ。横軸：ＤＰＴ（移植後の日数）、縦軸：ＭＥＡ：ＥＡ黒四角；ＭＥＡ：ＥＡ
【図４】表１を示す。
【図５】表２を示す。
【図６】表３を示す。
【図７】表４を示す。
【図８】表５を示す。
【図９】表６を示す。
【図１０】表７を示す。
【図１１】表８を示す。
【図１２】表９示す。
【図１３】表１０を示す。
【図１４】表１１を示す。
【図１５】表１２を示す。
【図１６】表１３を示す。
【図１７】表１４を示す。
【図１８】表１５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
実験編
実験例１：分子分析
ＤＮＡ−抽出
分離された菌糸と胞子を、１．５ｍＬのEppendorf試験管に、０．２ｇのガラス・ビーズ（直径２ｍｍ）と１００μＬのＣＴＡＢバッファー液（２％ＣＴＡＢ＝臭化セチルトリメチルアンモニウム（cetyltrimethylammoniumbromide),１．４Ｍ  Ｎａｃｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨｃｌｐＨ７．５  ０．２Ｍ  Ｎａ−ＥＤＴＡ）と共に入れられた。この混合物を、RetschＭＭ３０１ボールミルで、５０Ｈｚで３０秒間均質化した。４００μＬのＣＴＡＢバッファー液を更に添加し、この混合物を６５℃で１時間培養した。４００μＬのクロロフォルム−イソアミルアルコール（Cholroform-Isoamylalkohol）（２４：１）を懸濁液に添加し、反応チューブを反転して混合した。その後、５分間１５０００ｇで遠心分離し、最上層をきれいなEppendorf試験管に回収した。このステップを２回繰り返した。この懸濁液に２００μＬ５Ｍ酢酸アンモニウムを添加した。この混合物を４℃で少なくとも３０分間培養した。その後、２０分間４℃で１５０００ｇで回転させた。ＤＮＡを７００μＬのイソプロパノール（Isopropanol）で−２０℃で一晩沈殿させた。イソプロパノールによる沈殿後得られたＤＮＡペレットを氷冷した７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥させ、５０μＬのＴＥバッファー液（10mM Tris, 10mM EDTA, pH8）＋４．５ＵＲＮａｓｅ／ｍＬに再溶解させた。
【００４４】
ＰＣＲ条件
１８ＳｒＤＮＡは、プライマーＧＥＯＡ２，ＧＥＯ１１（非特許文献２）で増幅された。ＰＣＲ増幅用と１８ＳｒＤＮＡ内部転写スペーサー領域の配列決定用に使用されるプライマーは、Ｇｌｏｍ１３１０とＩＴＳ４ｉ（非特許文献３）であった。増幅は、０．２ｍＭｄＮＴＰ−ｍｉｘ，１ｍＭの各プライマー、１０％のＰＣＲ反応バッファー、無菌の分子グレードの水で行われた。ＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ドイツ国、マンハイム市  プロメガ社製（Promega Mannheim Germany））が、４ｕ／１００μＬの反応混合物で添加された。２μＬのゲノムＤＮＡテンプレートが、各２０μＬの反応混合物で使用された。増幅は、２００μＬ反応管内のPrimus 96最新式の熱サイクラー(peqLab Biotechnology社製)内で、次のＰＣＲ条件で行われた。９６℃で１８０秒間の初期変性：続いて１サイクル（９６℃を３０秒間、５８℃を３０秒間、７２℃を３０秒間）を３５回繰り返し、そして７２℃で１０分間の最終延長である。
【００４５】
配列データとグロムス門分類
Krueger et al.（非特許文献４）によって発行された参照／基準アラインメント（reference arignment）が、１８Ｓ系統発生の基礎として使用された。類似の環境配列を同定するために、Dominikia sp. は、遺伝子バンク（GenBank）にブラストされた。高度に類似する配列が、１８Ｓツリーの基礎を構成するアラインメントに含まれる。発行された部分的１８Ｓ−ＩＴＳ１−部分的５．８Ｓ配列が、ドミニキア系統発生に用いられた。
【００４６】
アラインメントは、最初はClustal Wによって実行された。最尤系統分析（maximum likelihood phylogenetic analysis）は、CIPRES web-portal （非特許文献５）を介して、１００ブーツトラップ（bootstrap replicas）複製とGTRGAMMAモデルを用いて、計算された。バイジアン・コンセンサス・ツリー（Bayesian consensus tree）が、MrBayes version 2.0.5を用いて構築された。ランダムに生成されたスターティング・ツリーでの２つの枝分かれたＭＣ３ランを、ＧＴＲ＋１モデルを利用してで実行し、１つのコールド・チェーンと３つのヒート・チェーンを有する２Ｍ世代（generation）を得た。全てのパラメータはデータから推定される。ツリーは、１０００世代毎にサンプリングされる。２０００００世代は、バーン・イン（burn-in）として廃棄され、コンセンサス・ツリーは、戻されたサンプルから構築された。
【００４７】
実験例２：本発明の組成物の実施例の調製手順−種子コーティング用の濃縮された組成物
第１フェーズ−温室条件
基質：スメクタイト粘土を、ｐＨが７．８−８の間で選択し、基質として使用する前に、３日間の交互のサイクルで滅菌する。
ＡＭＦ菌株：純粋な状態のドミニキアｓｐ．胎芽（Dominikia sp. propagules）を開始接種物として使用する。この種の接種物は、９０−１８０日のサイクルで、宿主植物が制御された状態にある成長室内または温室内で、常に連続的に再生される。様々な植物を用いて、接種物を連続したサイクルで複製して、同一宿主での病気の伝染を避ける。
夏−秋：トウモロコシブルゲア（Sorghum vulgare）と メボウシ属ｓｐ．（Ocimum sp.）
冬ー春：ホソムギ(Lolium perenne)
培養ポット：１５リットルの容量のポットが使用される。
【００４８】
宿主植物の成長条件
成長室又は温室において、培養は、宿主植物の根系に直接接種することで始まる。この接種は、無菌のスメクタイト粘土製基質中でＡＭＦ（ドミニキアｓｐ．）の選択された菌株の純粋な接種物で行われた。この宿主植物は、完全なライフ・サイクルで成長する。そのサイクルは、宿主植物の種類によっては９０−１９０日間かかる。これらの植物は、常に十分に水分補給されており、２５−２８℃の温度範囲で相対湿度６５％で、毎日灌漑給水（無菌水で）されている。これが完了すると、根系が抽出される。この根系は、スメクタイト粘土製基質、小根、純粋なＡＭＦ胎芽を含む。その後これは、第２フェーズで規模拡大（scale up）する為に使用される。
【００４９】
接種物の品質を決定する為に、次の最小仕様が用いられた。
全胞子数：５０−２２５個の胞子／ｇ
マトリックス外菌糸体：７０ｍｇ／ｋｇ基質
小根でのコロニー化割合（％）：ソルガム＞５０％、ドクムギ属＞４５％、メボウシ属＞４０％
ＭＰＮ濃度：基質１００ｍｌ当たり１００００胎芽
【００５０】
第２フェーズ−規模拡大（スケールアップ）
ステップ１：ベッド即ち苗床の準備
苗床は、プラスチック・ライナー材料で形成されている。その為苗床は周りの土壌から離れている。苗床の構造は、排水が行われ、望ましくない植物の成長が阻止される。好ましくはプラスチック製のカバーで覆われている。
【００５１】
苗床は選択されたスメクタイト粘土（Arcilla Roja Galve）で満たされている。この粘土の湿度は約１５％であり、苗床を粘土で満たす間その取り扱いが容易になる。粘土充填後、灌漑が飽和するまで行われ、粘土の生体構造を改善する。
−苗床は水はけの良い場所に置かれる。
−苗床は任意の大きさである。ただし、苗床を世話するのに必要な作業員と道具の移動が容易になるようアクセスを考慮に入れて決められる。
−苗床は、場所のニーズに応じて示された灌漑系を有する。好ましい灌漑系の設定は、点滴灌漑又はスプリンクラーのいずれかであり、自動化されており、苗床の所定の領域毎に独立して水やりができる。
【００５２】
ステップ２：宿主植物の種
このシステムで設定される宿主植物の種と菌根菌の決定：
宿主植物の種と菌根菌の種子の選択と同定は、特定の場所の条件と生産の目的に対応する。ライ麦（Rye grass）（多年生のドクムギ属（Lolium perenne））と第１フェーズで予め調製されたＡＭＦが使用される。
【００５３】
ステップ３：宿主植物への種植えと接種
宿主植物を植える前に、種子の発芽（seed germination）が試験される。この試験結果に基づいて、適切な種子植え率（seeding rate）が決定される。多年生のライ麦（perennial ryegrass）の場合、事前に認証された種子を８０ｋｇ／ｈａの割合で、ペレット状で万遍なく蒔く。この種子と組み合わせて、２０ｇのＡＭＦ接種物のｍ２苗床がスメクタイト粘土に直接適用される。種まき直後に、灌漑／注水を細かいスプレーで行い、種子と接種物の再分散／拡散を防ぐ。
灌漑に使用される水は、以下の特性を有する。
−ｐＨ値：６以上７．５以下
−電気伝導率：１．６ｍＳ／ｍ以下
−可溶な総塩量：１０００ｐｐｍ以下
−ナトリウム吸収率（Sodium Absorption Ratio）(SAR)＜１０
−重元素と病原菌を含まない。灌漑用水は飲料水が好ましい。
【００５４】
ステップ４：培養活動と灌漑
適用される灌漑は、苗場容量(field capacity)を１００％達成できるほど十分でなければならない。しかし水を過剰にやったり、水溜まりが出来たり、水が溜まった状態になるのを避けねばならない。苗床は、粘土の水分が苗場容量の７５−８０％に低下した時に、再度灌漑する。
【００５５】
ステップ５：菌根共生の確立の管理と菌根菌のコロニー化（colonization）の発達の動きの知識
宿主植物の成長と発達の間、ＡＭＦ根でのコロニー化が起き、宿主植物と菌株との間の共生が確立される。この関係の発達を評価するために、根系（root system）の周期的なサンプリングが行われ、菌根発達が評価される。コロニー化を評価するのに使用される方法は、Gerdeman & Nicolson (1963)（非特許文献６）とMcGonigle (1990)（非特許文献７）とPhillip s & Hayman(1970)（非特許文献８）である。
【００５６】
サンプリングは、植え付けから２月後に始まり成長期の終わりまで毎月続ける。これらのサンプルから得られた情報で、接種物内の菌根共生の発達の動きを決定することができる。
【００５７】
生成過程の評価は、菌根根（mycorrhizal root）のコロニー化、菌糸体のマトリックス外濃度、周期的に採取された胞子含有粘土サンプルに基づく。
菌根生成の発達の動きを知ることにより、最適な収穫時期を決定でき、宿主植物と菌根菌株に対する共生の過程の大部分を作り出すことができるようになる。
【００５８】
ステップ６：収穫
使用される宿主植物が多年生のドクムギ属（perennial Lolium）であると、最適な収穫時期は、種まきから６−７月の間である。理由は、その期間で宿主植物が成熟し、その寿命サイクルを完了させ、活力を失わせ、黄色に変色する傾向を示すからである。
【００５９】
収穫予定日の１５日前に、灌漑給水を止め、葉を保持し、粘土が徐々に湿分を失うようにして、接種プロセスを完了する。この作業／活動が雨期に一致した場合、苗床を防水性のプラチックでカバーして、苗床を雨から守り、苗床を乾燥状態に適時維持する必要がある。土の上の方で、宿主植物からの葉をまず手で取り除く。収穫は、苗床から粘土を取り除くことで行われる。基質の除去は、粘土を出来る限り薄い部分に分割することにより、行われ、苗床容器の深さ方向でその内容物を混合して、それを輸送用のバッグに入れる。
【００６０】
ステップ７：接種物の乾燥と粉砕
乾燥：収穫された基質と菌根胎芽は、５０℃で３０日間日光にさらし熱消毒をする。乾燥期間は、湿度が５％以下になるまで行われ、粉砕プロセスを容易にする。
粉砕：製品は工業用製粉所で粉砕され２℃に冷却し、菌根胎芽の過熱を回避する。粉砕は、粒子サイズが１００μｍになるまで、継続する。
【００６１】
第３フェーズ−濃縮
ステップ７の後、粉砕されたバイオマスは、３５μｍの篩いを用いて、濃縮物になる。この値以下の粒子（最初の物の６０−７０％）は、廃棄されて残り、超濃縮された物の２５−３０％は、このサイズを通過せず、最終的に濃縮した組成物になる。この技術を用いて、１００ｍｌ当たり１．２ｘ１０４個の胎芽から１．２ｘ１０６個の胎芽を通過させた。最終品の出口相対湿度は、５％未満である。
【００６２】
品質制御：最終品の純度と濃度は、Porter (1979)の最も可能性の高い数値法（非特許文献９）に従って決定された。
【００６３】
梱包：最終品は、梱包され、出荷用のラベルが付された。
濃縮組成物（concentrated composition）の最終濃度は、ＭＰＮ濃度＞生成物１００ｍｌ当たり１．２ｘ１０６の胎芽である。
【００６４】
第４フェーズ−種子コーティング
菌糸体接種物による種子のコーティングは種子コーティング用の特別な機械で行われる。例えば、従来のコンクリート・ミキサー又は混合容器内で手動で行われる。種子コーティングは、下記の様々なステップを必要とする。
【００６５】
（１）最初のステップとして、種子を接着性基質（adhesive substance）でコーティングする。水に加えて使用される接着性物質は、有機接着剤（ゼラチン、エチルセルロース、プロピレングリコール等）と無機接着剤（鉱油、ポリビニル、プラスチックレジン等）を含む。好ましい接着剤は、ポリビニル基のポリマー又はコポリマーである。その一例は、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリビニルアセテート（polyvinyl acetate）である。接着剤は、水溶液又はアルコール溶液にその最適な溶解度まで添加される。接着剤の量は、コーティングされるべき種子の総重量の、０．１−１５％の間、好ましくは０．５−１０％の間、より好ましくは１．０−５％の間で変えられる。使用される接着剤の量は、接着剤の化学特性と処理すべき種子の種類に依存する。接着剤で種子を処理する時間は、種子１００ｋｇ当たり、１−６０秒の間、好ましくは５−５０秒の間、より好ましくは１０−４０秒の間である。
【００６６】
（２）接着剤でコーティングした後、菌根接種物を添加する。種子に添加される接種物の比率は、種子の重量の、０．１−１５％の間、好ましくは０．１−１５％の間、より好ましくは０．５−１０％の間、更に好ましくは１−５％の間で選択される。これは種子の種類と多様性に依存する。菌糸体接種物による種子の処理時間は、種子１００ｋｇ当たり、１−５０秒の間、好ましくは５−４０秒の間、より好ましくは１０−３０秒の間である。
【００６７】
菌糸体処理は、以下の（２ａ）−（２ｅ）に記載した他の処理と組み合わせることもできる。これらの処理は、菌根接種物処理から切り離して実行して、多層のコーティングを得てもよい。各層のコーティングで行われるステップは、菌根接種物の場合のそれらと同じである。これらの層は、無害の、石灰質物質（炭酸カルシウム等）、粘土、ポリマー由来物（polymeric origin）のいずれかで、種子をコーティングすることにより、分離される。ペレット化物質又は外皮形成物質は、種子の重量の、５０％、好ましくは４０％、更に好ましくは３０％を超えてならず、上記（１）で述べた接着性物質の付いた種子に添加される。
【００６８】
（２ａ）菌糸体を形成する菌と親和性のある殺菌剤、殺虫剤、除草剤による処理。
一般的に、市販されている除草剤と殺虫剤の全ては、菌糸体を形成する菌（mycorrhizal forming fungi）と親和性がある。しかし殺菌剤の全てが、菌糸体菌の生存に適合するわけではない。使用される主な殺菌剤は、以下を含む。
アゾキシトロビン（azoxystrobin）、カルボキシン（carboxin）、シプロコナゾール（cyproconazole）、クロロタロニル（chlorothalonil）、メタラキシル（metalaxyl）、ミクロブタニール（myclobutanil）、プロチオコナゾール（ prothioconazole）。
使用する農薬（pesticide）の量は、製造業者の推奨事項に依存し、様々な農薬がニーズに応じて使用される。
【００６９】
（２ｂ）以下を含む有益な微生物による処理。
トリコデルマｓｐｐ．（Trichoderma spp.），リゾビウム（Rhizobium ）菌、担根体（rhizosphere）に有益な微生物の組み合わせ。
担根体の一例は、アスペルギラス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、窒素固定菌（nitrogen fixing bacteria）等である。
【００７０】
（２ｃ）マクロ栄養素又はミクロ栄養素による処理：
窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、硫黄（Ｓ）は、必須のマクロ栄養素である。これに対し、鉄（Ｆ）、亜鉛（Ｚｎ）、マンガン（Ｍｎ）、ボロン（Ｂ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、塩素（Ｃｌ）は、必須のミクロ栄養素である。コーティング用の栄養素のドーズ量は、コーティングされるべき種子の総重量の０．０１−１５％の間で、好ましくは０．０５−１０％の間で、更に好ましくは０．１−５％の間で変わる。
【００７１】
（２ｄ）刺激剤による処理：
種子を刺激剤でコーティングする。これの刺激剤は、種子の発芽と成長、植物の防御と胞子形成、菌根菌の成長を誘発する。これの刺激剤は、植物ホルモン（phytohormone）（アブシジス酸（abscisic acid）、ストリゴラクトン（strigolactones）、ブラシノステロイド（brassinosteroids）等）とそれらの誘発体と誘導体、二次代謝産物（フラボノイド（flavonoids）、テルペノイド（terpenoids））、補因子（cofactors）（金属イオン等）のいずれかである。
【００７２】
（２ｅ）着色色素による処理：
これらの色素は、菌糸体菌の生存に適合しなければならず、処理済みの種子と未処理の種子とを明確に個別できるものでなければならない。
【００７３】
（３）ステップ１，２は、接着性物質を利用した菌根接種物の完全なコーティングが、１−４０秒の間、好ましくは５−３０秒の間、より好ましくは１０−２０秒の間で行われることを、意味する。
【００７４】
（４）菌糸体の処理の後、種子の乾燥は、１−５０秒の間、好ましくは５−４０秒の間、より好ましくは１０−３０秒の間で行われる。このステップ（４）はステップ（５）の後に実行してもよい。
【００７５】
（５）最後に、コーティングされた種子は、コーティング室から容器に放出される。この放出の持続時間は、５−３０秒の間、好ましくは１０−２５秒の間、より好ましくは１５−２０秒の間で変わる。
【００７６】
実験例３：本発明の組成物の実施例の調製手順−微細顆粒化された組成物
第１フェーズ−温室条件
基質：ｐＨが７．８−８の間のスメクタイト粘土を選択し、基質として使用する前に、３日間の交互のサイクルで滅菌する。
ＡＭＦ菌株：純粋な状態のドミニキアｓｐ．胎芽（Domiikia sp. propagules）を開始接種物として使用する。この種の接種物は、９０−１８０日のサイクルで、宿主植物が制御された状態にある成長室内または温室内で、常に連続的に再生される。様々な植物を用いて、連続したサイクルで接種物を複製して、同じ宿主での病気の伝染を避ける。
夏−秋：モロコシブルゲア（Sorghum vulgare）と メボウシ属ｓｐ．（Ocimum sp.）
冬ー春：ホソムギ(Lolium perenne)
培養ポット：１５リットルの容量のポットが使用される。
【００７７】
宿主植物の成長条件
成長室又は温室において、培養は、無菌のスメクタイト粘土製基質中でＡＭＦ（ドミニキアｓｐ．）の選択された菌株の純粋な接種物で宿主植物の根系に直接接種することで始まる。これらの植物は、完全なライフ・サイクルで成長する。そのサイクルは、宿主植物の種類によっては９０−１９０日間かかる。これらの植物は、常に十分に水分補給されており、２５−２８℃の温度範囲で相対湿度６５％で、毎日灌漑給水（無菌水で）されている。これが完了すると、根系が抽出される。この根系は、スメクタイト粘土製基質、小根、純粋なＡＭＦ胎芽を含む。その後これは、第２フェーズで規模拡大する為に使用される。
【００７８】
接種物の品質を決定する為に、次の最小仕様が用いられた。
全胞子数：５０−２２５個の胞子／ｇ
マトリックス外菌糸体：＞７０ｍｇ／ｋｇ基質
小根でのコロニー化割合（％）：ソルガム＞５０％、ドクムギ属＞４５％、メボウシ属＞４０％
ＭＰＮ濃度：基質１００ｍｌ当たり１００００胎芽
【００７９】
第２フェーズ−規模拡大
ステップ１：苗床の準備
苗床は、プラスチック・ライナー材料で形成されている。その為苗床は、周りの土壌から離れている。苗床の構造は、排水が起こり、望ましくない植物の成長が阻止され、プラスチック製のカバーで覆うのが好ましい。
【００８０】
苗床は、選択されたスメクタイト粘土（Arcilla Roja Galve）で満たされている。この粘土の湿度は約１５％であり、苗床を粘土で満たす間その取り扱いが容易になる。粘土充填後、灌漑が飽和するまで行われ、粘土の生体構造を改善する。
−苗床は水はけの良い場所に置かれる。
−苗床は任意の大きさである。ただし、苗床を世話するのに必要な作業員と道具の移動が容易になるようなアクセスを考慮に入れて決められる。
−苗床は、場所の必要に応じて示された灌漑系を有する。好ましい灌漑系の設定は、点滴灌漑又はスプリンクラーのいずれかであり、自動化されており、苗床の所定の領域に独立して水やりができる。
【００８１】
ステップ２：宿主植物の種
このシステムで設定される宿主植物の種と菌根菌の決定：
宿主植物の種と菌根菌の種子の選択と同定は、特定の場所の条件と生産の目的に対応する。ライ麦（Rye grass）（多年生のドクムギ属（Lolium perenne））と第１フェーズで予め調製されたＡＭＦが使用される。
【００８２】
ステップ３：宿主植物の種植えと接種
宿主植物を植える前に、種子の発芽（seed germination）が試験される。この試験結果に基づいて、適切な種子植え率（seeding rate）が決定される。多年生のライ麦（perennial ryegrass）の場合、事前に認証された種子を８０ｋｇ／ｈａの割合で、ペレット状で万遍なく蒔く。又、この種子と組み合わせて、２０ｇのＡＭＦ接種物のｍ２苗床がスメクタイト粘土に直接適用される。種まき直後に、灌漑を細かいスプレーで行い、種子と接種物の再分散を防ぐ。
灌漑に使用される水は、以下の特性を有する。
−ｐＨ値：６以上７．５以下
−電気伝導率：１．６ｍＳ／ｍ以下
−可溶な総塩量：１０００ｐｐｍ以下
−ナトリウム吸収率（Sodium Absorption Ratio）(SAR)＜１０
−重元素と病原菌を含まない。灌漑用水は飲料水が好ましい。
【００８３】
ステップ４：培養活動と灌漑
適用される灌漑は、苗場容量(field capacity)を１００％達成できるほど十分でなければならない。しかし水を過剰にやったり、池となったり水が溜まった状態になるのを避けねばならない。苗床は、粘土の水分が苗場容量の７５−８０％に低下した時に、再度灌漑する。
【００８４】
ステップ５：菌根共生の確立の管理と菌根菌のコロニー化の発達の動きの知識
宿主植物の成長と発達の間、ＡＭＦの根でのコロニー化が起き、宿主植物と菌株との間の共生を確立する。この関係の発達を評価するために、根系（root system）の周期的なサンプリングが行われ、菌根発達が評価される。コロニー化を評価するのに使用される方法は、Gerdeman & Nicolson (1963)（非特許文献６）とMcGonigle (1990)（非特許文献７）とPhillip s & Hayman(1970)（非特許文献８）である。
【００８５】
サンプリングは、植え付けから２月後に始まり成長期の終わりまで毎月続ける。これらのサンプルから得られた情報で、接種物内の菌根共生の発達の動きを決定することができる。
【００８６】
生成過程の評価は、菌根根でのコロニー化、菌糸体のマトリックス外濃度、周期的に採取された胞子含有粘土サンプルに基づく。
菌根生成の発達の動きを知ることにより、最適な収穫時期を決定でき、宿主植物と菌根菌株に対する共生の過程の大部分を作り出すことができるようになる。
【００８７】
ステップ６：収穫
収穫が、製造プロセスの中で最も重要なステップである。使用される宿主植物が多年生のドクムギ属（perennial Lolium）であると、最適な収穫時期は、種まきから６−７月の間にである。理由は、この期間で、宿主植物が成熟し、そのライフサイクルを完了させ、活力を失わせ、黄色に変色する傾向を示すからである。
【００８８】
収穫予定日の１５日前に、灌漑給水を止め、葉を保持し、粘土が徐々に湿分を失うようにして、接種プロセスを完了する。この作業／活動が雨期に一致した場合、苗床を防水性のプラチックでカバーして、苗床を雨から守り、苗床を乾燥状態に適時維持する必要がある。土の上の方で、宿主植物からの葉をまず手で取り除く。収穫は、苗床から粘土を取り除くことで行われる。基質の除去は、粘土を出来る限り薄い部分に分割することにより、行われ、苗床容器の深さ方向でその内容物を混合して、それを輸送用のバッグに入れる。
【００８９】
ステップ７：接種物の乾燥と粉砕
乾燥：収穫された基質と菌根胎芽は、５０℃で３０日間、日光にさらし熱消毒をする。乾燥期間は、湿度が５％以下になるまで行われる。粉砕プロセスを容易にする為である。
粉砕：製品は工業用製粉所で粉砕され２℃に冷却し、菌根胎芽の過熱を回避する。粉砕は、粒子サイズが１００μｍになるまで、継続する。
【００９０】
第３フェーズ−微細顆粒化
微細顆粒化プロセスは、以下の３ステップに分けられる。
（１）顆粒化された支持体を回転するバイコニカル・ミキサーへ添加する：
この支持体を作る為、雲母、アタパルガイト（attapulgite）、石灰石の混合物が用いられた。この濃度は、４０−９０重量％の間、好ましくは５０−８０重量％の間、より好ましくは６０−７０重量％の間である。
【００９１】
（２）菌糸体（mycorrhizae）（ＡＭＦ）の添加：
ＡＭＦは、バインダーと共に、スクリューで回転するバイコニカルなミキサー内に投与された。ＡＭＦの濃度は、ステップ７で生成されたドミニキアｓｐ．の、１０−６０重量％の間、好ましくは２０−５０重量％の間、より好ましくは３０−４０重量％の間である。バインダーの一例は、ワックス（wax）、亜麻仁油（linseed oil）、アラビアゴム（gum arabic）、トラガカントガム（gum tragacanth）、メチルセルロース（methyl cellulose）ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol）、タピオカ粉末（tapioca flour）、ラクトース（lactose）、スクロース（sucrose）粉末、微細結晶セルロース（microcrystalline cellulose）、ポリビニルピロリドン（poly vinyl pyrrolidone ）、ラクトース粉末（lactose powder）、スクロース粉末（sucrose powder）、タピオカデンプン（tapioca starch ）（カッサバ粉末（cassava flour））、ガム、タンパク質（卵白、カセイン（casein））等である。バインダーの濃度は、１−２５重量％の間、好ましくは５−２０重量％の間、より好ましくは１０−１５重量％の間である。この作業の間、ミキサーは、顆粒が完全に均質化するまで動き続けている。
【００９２】
（３）梱包：
配合された製品は、完全に均質化されると、篩いの上に出され、塊やほこりを取り除く。最後に、製品は梱包ホッパーに集められ、そこから、自動的に対応する充填容器に入れられる。
【００９３】
品質制御と梱包
品質制御：
最終品の純度と濃度は、Porter (1979)の最も可能性のある数値法（非特許文献９）に従って決定された。
【００９４】
梱包：
最終品は、梱包され出荷用のラベルが付された。微細顆粒化された組成物の最終濃度は、ＭＰＮ濃度＞生成物１００ｍｌ当たり１ｘ１０４個の胎芽である。
【００９５】
実験例４：本発明の組成物が小麦（Triticum durum）の成長／発育に及ぼす影響：
本発明の組成物が小麦に及ぼす影響を調べるために、実験を、ＭｕｒｃｉａのＣＥＢＡＳ−ＣＳＩＣ社が所有する実験農場”Tres caminos"で行った。本発明の組成物は、ＡＭＦ、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株を含む。
【００９６】
実験計画は、４回の複製をしたランダムにされたブロック（塊）である。実験場所は、長さ３ｍで幅４．２ｍである。
【００９７】
以下の処理が適用された。
（１）対照（コントロール）：化学肥料や菌類は加えていない。
（２）本発明の組成物：微細顆粒の状態で、化学肥料（非特許文献１０）と組み合わせて、１０ｋｇ／ｈａの割合で、提供された。
（３）標準製品：化学肥料投与（非特許文献１０）：１５０ｋｇ／ｈａの窒素、５４ｋｇ／ｈａのリン、１００ｋｇ／ｈａのカリウム、１５ｋｇ／ｈａのカルシウム、１５ｋｇ／ｈａのマグネシウム、２３ｋｇ／ｈａの硫黄、及びその他の微細栄養素。
【００９８】
植え付けは２０１３年１１月１日に行われ、収穫は２０１４年６月１日に行われ、全部で２４０日かかった。種まきと接種は機械で行われ、穀物ドリル・ストロークが適用され、本発明の組成物は、微細顆粒の形態で１０ｋｇ／ｈａの割合で、種子と共に適用された。
【００９９】
使用した土壌は、Nitisol（非特許文献１１）と分類された。この土壌の化学的特性を得る為に、以下の分析方法が用いられた。
−ｐＨ：土壌−溶液比率  １：２．５
−有機物（organic matterＭＯ）：ウォークリーとブラック（Walkely and Black）
−Ｐ２Ｏ５：オニアニ（Oniani）
−交換可能な陽イオン：ｐＨ７でＮＨ４ＡＣを１ｍｌ／Ｌで抽出。錯滴定（complexometric titration）（Ｃａ，Ｍｇ）とフレーム測光（flame photometry）（Ｎａ，Ｋ）を実行。
【０１００】
これらの方法は、土壌、葉、有機肥料、化学肥料の分析用の分析技術のマニュアル（非特許文献１２）に記載されている。化学土壌の特性の結果（表２）は、中程度から高程度の肥沃土を示し、有機物の平均量を記述する。これは、土壌のこの種類の記載事項（非特許文献１３）に対応する。
表２：土壌の化学的特性
本発明のドミニキアｓｐ．の菌類（fungal strain）は、塩性土壌から分離され、この菌類は高塩濃度に対し耐性がある。
【０１０１】
分析された変数は、以下であった。
根菌土壌（rhizospheric soil）１ｇ当たりのＡＭＦの胞子数（非特許文献１４)、
根の染色技術による菌根コロニー化の割合（％）（非特許文献１５)、
インターセプト法による視覚密度の割合（％）（非特許文献１６)、
圧力鍋方式で得られた全グロマリン（glomalin）（糖タンパク（glycoprotein））量（非特許文献１７)。
【０１０２】
葉の栄養素含有量（％  Ｎ，Ｐ，Ｋ）と全タンパク量とは、ＩＮＣＡ（非特許文献１８)分析技術の研究所マニュアルに記載された方法で決定された。
収量は次のようにして評価された。スパイク当たりの粒（grain）の量、１ｍ２当たりスパイクの数、１０００粒当たりの質量、農業収量（Ｔ／ｈａ）で、決定された。
【０１０３】
実験結果の統計的処理は、一方向ＡＮＯＶＡ解析で行われ、ダンカンのテスト（非特許文献１９)が用いられた。平均値の間に差がある時は、統計プロセッサーＳＰＳＳ１１．５が、全ての場合に用いられた。
【０１０４】
結果と考察
表３は、菌根変数（mycorrhizal variable）に対する様々な処理の結果を示す。これらの値は、胞子数の増加を明確に示す。ここで、本発明の組成物は、対照（化学肥料なし）と標準製品に関連して適用された。
表３：研究された菌根変数に対する処理の効果
同じ列内の異なる文字は、ｐ＜０．０５で大幅に異なる。
【０１０５】
上記のことは、強いコロニー化活性に起因し、ＡＭＦの他の種類による根コロニー化を困難にすることもある。他方で、菌根コロニー化は、本発明の組成物でより効果的であるこを示している。本発明の組成物は、他の処理に比べてより高い値を示す。
【０１０６】
注目すべき点は、土壌中の在来菌株（native strain）はコロニー化の値が低いことを示していることである。視覚密度の値（菌根コロニー化の強度を測る変数）を見ると、最高の割合（％）が、本発明の組成物で得られていることが解る。
【０１０７】
別の注目すべき変数は、全糖タンパク量であった。この全糖タンパク量は、本発明の組成物で高かった。この現象は、本発明の組成物が適用された時に菌根共生がより高くなることと、土壌中の凝集体の形成を増加させる接種物の可能な影響を、再確認させる。更に、菌根接種物が適用されない処理では、この変数の値は低く、これは在来菌根の有効性が低いことに起因している。
【０１０８】
表４は、各処理における葉のミネラル含有量（foliar mineral content）を示す。窒素、リンに関しては、その含有量は、本発明の組成物が適用された場合がより高く、カリウム含有量は、化学肥料が投与された場合がより高かった。
表４：葉の窒素、リン、カリウム、総タンパク量
同じ列の異なる文字は、ｐ＜０．０５で、大幅に異なる。
【０１０９】
この変数（％Ｎ葉）に対し報告された値（非特許文献２０）は、４−５Ｔ／ｈａの小麦収量の臨界指数より上である。
同様な結果（非特許文献２１，２２）は、葉の組織内に栄養素が存在することを示している。これは菌根共生プロセス（mycorrhizal symbiosis process）に起因する。このプロセスにより、窒素の吸収と移送が菌糸体を介して可能となっている。葉中のリンの含有量はどの処理に対しても有意差を示さない（表４）。これは、土壌中のこの元素（リン）の含有量に起因するのかも知れない。この元素は、この土壌溶液からそのラディカル系を介して植物により取り込まれる。特殊なケースにおいては、植物−アーバスキュラー菌根（菌根共生）と土壌の三者相互作用（tripartite interaction）により、デュラム小麦（durum wheat）中のこの栄養素の葉臨界指数よりも高い値を示し（非特許文献２０）、良好な穀物の発育を示す。これと同様に、この値は、本発明の組成物を適用すると、高い傾向にあった。
【０１１０】
関連する別の変数は、葉のタンパク質含有量であり、これは、本発明の組成物での処理ではより高くなり、化学肥料での処理より更に高くなる。最後に、対照処理では大幅に低い割合（％）であった。
【０１１１】
収量とその成分の結果（表４）は、本発明の組成物と標準製品に対するデュラム小麦の反応を明確に反映している。ただし両者は高含有量のＮで行われた。
表５：収量とその変数に対する処理の効果。
同じ列の異なる文字は、ｐ＜０．０５で、大幅に異なる。
本発明の組成物と標準製品での処理は、対照と比較すると、各変数に対する最高の影響を与えた。これは、個体接種物のより大きな有効性と高濃度の窒素の適用により、説明できる。
【０１１２】
本発明の組成物に関連する小麦の栽培により、十分な生産性応答を、菌根操作の許容可能な指標で達成可能であり、土壌生物活性を改善し、更に対照と標準製品に比較して、８．８％の生産性の大幅な増加を達成できる。
【０１１３】
実験例５：本発明の組成物がトウモロコシ（Zea mays）の発育に及ぼす影響：
本発明の組成物がトウモロコシ（maize）に及ぼす影響を調べるために、"Egea de los Caballeros"町に近い現場の農場畑で実験を行った。本発明の組成物は、ＡＭＦ、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌株を含む。本発明の組成物の微細粒子の形態がテストされた。標準製品を用いてCambisol土壌でのトウモロコシの栽培に対する、両方の製品(var DKC 6717、Monsanto社)の効果を比較した。
【０１１４】
植え付けは２０１４年４月１２日に行われ、収穫は２０１４年１２月１４日に行われ、全部で２３０日かかった。種まきと接種は機械で行われ、穀物ドリル・ストロークが適用され、本発明の組成物は、微細顆粒の形態で１０ｋｇ／ｈａの割合で種子と共に適用された。
【０１１５】
使用された植え付けは、０．７ｍｘ０．１６ｍで、１平方ｍ当たり全部で８０本の植え付けだった。使用されたスプレイ・システムは１８ｘ１８ｍであった。
実験計画は、３回の複製でランダムにされたブロック（塊）であった。実験場所は、長さ２０ｍｘ幅２０ｍであった。
以下の処理が適用された。
（１）本発明の組成物：１０ｋｇ／ｈａの割合で提供され、化学肥料投与（非特許文献１０）。
（２）標準製品：化学肥料投与（非特許文献１０）：３２５ｋｇ／ｈａの窒素、８０ｋｇ／ｈａのリン、２００ｋｇ／ｈａのカリウム、有機物をスラリーの形態で１０Ｔ／ｈａを最初に加えた。
【０１１６】
使用した土壌は、Cambisol（非特許文献１１）と分類された。土壌の化学的特性を得る為に、以下の分析方法が用いられた。
−ｐＨ：土壌−溶液の比率  １：２．５
−有機物（ＭＯ）：ウォークリーとブラック（Walkely and Black）
−Ｐ２Ｏ５：オニアニ（Oniani）
−交換可能な陽イオン：ｐＨ７でＮＨ４ＡＣを１ｍｌ／Ｌで抽出。錯滴定（complexometric titration）（Ｃａ，Ｍｇ）とフレーム測光（flame photoetry）（Ｎａ，Ｋ）を実行した。
【０１１７】
これらの方法は、土壌、葉、有機肥料、化学肥料の分析用の分析技術のマニュアル（非特許文献１２）に記載されている。化学土壌特性の結果（表６）は、中程度から高程度の肥沃土を示し、有機物の平均量を記述し、これは土壌のこの種類の記載事項（非特許文献１３）に対応する。
表６：土壌の化学的特性
本発明のドミニキアｓｐ．の菌類（fungal strain）は塩性土壌から分離される。この菌類は高塩濃度に対し耐性がある。
【０１１８】
分析された変数は、以下である。
根の染色技術による菌根コロニー化の割合（非特許文献１５)、
インターセプト法による視覚密度（ＶＤ）割合（％）（非特許文献１６)。
【０１１９】
葉の栄養素含有量（％Ｎ，Ｐ，Ｋ）は、ＩＮＣＡ（非特許文献１８)分析技術の研究所マニュアルに記載された方法で決定された。
収量は次のようにして評価された。スパイク当たりの穀物の粒量は、１ｍ２当たりスパイク数と、１０００粒当たりの質量と、農業収量（Ｔ／ｈａ）とで、決定された。
【０１２０】
実験結果の統計的処理は、一方向ＡＮＯＶＡ解析で行われ、ダンカンのテスト（非特許文献１９)が用いられた。平均値の間に差がある時は、統計プロセッサーＳＰＳＳ１１．５が、全ての場合で使用された。
【０１２１】
結果と考察
表７は、植え付け後４５日と１２０日後の菌根活性の展開を結果を示す。これらの値は、本発明の組成物が適用された場合に増加した活性を示す。菌根でのコロニー化割合（％）の増加を示すだけでなく、コロニー化の強度が大きくなったことを示し、これは、高い視覚密度に反映されている。
表７：研究された菌根変数の処理の効果
同じ列内の異なる文字は、ｐ＜０．０５で大幅に異なる。
【０１２２】
このアッセイは、最も効果的な接種物は本発明の組成物であることを示している。本発明の組成物は、他の処理に比較してより高い値を示す。視覚密度の値（菌根コロニー化の強度を測る変数）は、最大の割合は本発明の組成物に関係しており、有効性に直接関連していることを、示している。
【０１２３】
葉のミネラル含有量を測定した（表８）。その結果は、両方の処理（本発明の組成物と標準製品）の間に有意差がないことを示した。しかしより大きな栄養供給に向かう傾向がある。特に、ドミニキアｓｐ．（本発明の組成物）の存在下での窒素を含有している場合である。表８は、トウモロコシに対し、１２０日目の葉の窒素、リン，カリウム：
同じ列内の異なる文字は、ｐ＜０．０５で大幅に異なる。
本発明の組成物での処理で得られた窒素含有量は、４−５Ｔ／ｈａの間の収穫の小麦の臨界指標より大きい（非特許文献２０）。
【０１２４】
葉中のリンの含有量は、どの処理に対しても有意差を示さない（表８）。これは、使用された土壌中のこの元素（リン）の含有量に起因するかも知れない。リンは、この土壌溶液からそのラディカル系を介して植物により取り込まれる。特殊なケースにおいては、植物−アーバスキュラー菌根（菌根共生）と土壌の三者相互作用により、デュラム小麦（durum wheat）中のこの栄養素の臨界指数よりも高い値を示し（非特許文献２０）、良好な穀物の発育を示す。この値は、本発明の組成物を適用すると、より高い傾向にあった。
【０１２５】
小麦とトウモロコシにおける同様な結果は、無機肥料の投与が、低用量のリンが適用された場合、コロニー化された根の長さの割合に対し及ぼす影響を示す。このことは、トウモロコシと小麦に対する本発明の組成物の重要性と有効性（即ち、本発明の組成物が窒素とリンの有無にかかわらず、土壌からのリンの吸収を増加させ、肥料の投与量を最小にする）を支持している。葉のカリウムの含有量は、研究中の様々な処理に対し同様であり、この穀物に対し満足するレベルを示し、このことはマクロ元素に関する穀物の記述（非特許文献２０)と一致している。更に、この元素の高濃度イオンは、菌根植物とそれ以外の植物の両方に見いだされる（非特許文献２３，２４)。この理由は、この元素が土壌溶液中でより容易に移動できるという事実によると思われる。
【０１２６】
表９は、得られた結果をまとめたものである。表９は、本発明の組成物と標準製品の適用に対するトウモロコシの応答を明示している。
表９：培養中のその成分と収量に対する処理の効果；
同じ列内の異なる文字は、ｐ＜０．０５で大幅に異なる。
【０１２７】
本発明の組成物で処理された植物は、標準製品によるものと比較すると、最高値を示す。このことは、植物との共生を確立する固体接種物のより大きな有効性、結果的に高用量の窒素のより良い同化により説明できる。
【０１２８】
最終結論として次のことが指摘できる。本発明の組成物を利用したトウモロコシの栽培により、生産性の観点から肯定的な生産応答を達成でき、無機肥料の投与に比較して９．１８％の生成物の増量を達成できた。同様に栄養の指標は高い傾向を示し、本発明のＡＭＦの使用は、土壌生物活性を改善し、より持続可能な管理に基づく生産性の大幅な増加を促進した。
【０１２９】
実験例６：ドミニキアｓｐ．と接着性基質によるトウモロコシ種子のコーティングが菌根活性に及ぼす有効性：
目的：ドミニキアｓｐ．と接着性基質によるトウモロコシ種子のコーティングが菌根活性に及ぼす有効性を知ること。
この目的を達成する為に、３個のプランター（それぞれが繰り返しとみなされる）に、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．と接着性基質でコーティングしたトウモロコシの種子を植えた。
【０１３０】
種子が２０１６年３月８日に植えられ、菌根コロニー形成アッセイが、Phillips and Hayman (1970)の染色技術（非特許文献１５）を用いた根に対し、植え付け後２１日目と３５日目に、実行された。
表１０：ドミニキアｓｐ．と接着性基質の混合物でコーティングしたトウモロコシ種子からの小根の菌根コロニー形成の、植え付け後２１日目（２１ｄｐｐ）と３５日目（３５ｄｐｐ）における、割合（％ＭＣ）：
表１０は、分析された各サンプルにおいて、植物が成長するに連れて、菌根コロニー形成（化）割合が正の方向に増加していることを示している。この段階において、トウモロコシ上の初期コロニー形成点（incipient colonization point）のみが検出された。この初期コロニー形成点は、形成開始したばかりのマトリックス外菌糸体網（network of extramatical mycelium）により形成されたものである。
結論：
ドミニキアｓｐ．と接着性基質を含む接種物の濃度状態（concentration）で行ったトウモロコシ種子のコーティングは有効である。その理由は、ドミニキアｓｐ．が、植物の第１段階において、マトリックス外菌糸体として根内の菌根構成（mycorrhizal structure）を生成するからである。発芽した種子の胞子が見られ、内部発芽とコロニー形成網を形成する。コロニー形成の値がトウモロコシ成長の時間に依存することを示す。
【０１３１】
実験例７：小麦と大麦に対し本発明の組成物を微細顆粒形態で（in microgranulated form ）適用した畑で得られた結果：
表１１に、小麦と大麦に対し寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．を含む本発明の組成物を微細顆粒形態で適用した畑で得られた結果を示す。
【０１３２】
実験例８：トウモロコシに対し本発明の組成物を微細顆粒形態で適用した畑で得られた結果：
表１２に、トウモロコシに対し寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．を含む本発明の組成物を微細顆粒形態で適用した畑で得られた結果を示す。
【０１３３】
実験例９：水田（flooded soil）での稲（Oriza sativa）の栽培におけるドミニキアｓｐ．の菌根活性：
実験を行って、灌漑した塩水土壌状態中に、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．を含む濃縮形態（in concentrated form）での本発明の組成物の菌根活性を決定した。使用された本発明の組成物の濃度は、基質１ｇ当たり１−４ｘ１０６個の胎芽である。実施例によれば、本発明の組成物の濃度は、基質１ｇ当たり１−２ｘ１０４個、好ましくは１．２−１．８ｘ１０４個である。
【０１３４】
材料と方法
実験は"Tres Caminos"実験農場で行われた。この農場は、ＣＥＢＡＳ−ＣＳＩＣ社が所有し、Santomera 市（Murcia）のMatanza 地区にある。植物は、単層のトンネル型の温室で成長した。この温室は、約６０ｍ２の面積を有し、ポリカーボネイト製のカバーで覆われ、天井窓はトリップ防止のメッシュで保護されている。更に冷却システムとアルミ製スクリーン・シェード・システムを備える。実験は、稲植物（Oriza sativa）品番Ｊ１０４で実施した。この稲は菌根接種処理を２回行ったが、対照はこの処理をしなかった。菌根処理は、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．を含む濃縮形態の本発明の組成物で行い、その濃度は、稲の種子を１ｋｇ／ｈａでコーティングする程度のドーズ量であった。
【０１３５】
接種が個々のシュートで確認されると、発芽後１５日目に、この稲植物は、２ｍ２の表面積のコンクリート製チャネル当たり１０個の植物の割合で移植された、これは、ＵＮＥＳＣＯの土壌分類（非特許文献３０)に従って、Hidromorfico Gley Nodular Salinizado 土壌を両方の容器内の基質として、用いて行った。主な特徴を表１３に示す。培養作業が行われ、水の層が、全ての処理において、種子を蒔いてから１８日後に、追加された。
表１３：この実験で使用された前記Hidromorfico Gley Nodular Salinizado 土壌５０ｇ当たりの胞子数と化学的特性：
【０１３６】
濃縮形態の本発明の組成物の特性
この実施例においては、菌根接種物、濃縮形態での本発明の組成物は、寄託番号ＭＵＣＬ５７０７２で寄託されたドミニキアｓｐ．菌（fungus Dominikia sp.）を形成するアーバスキュラー菌根菌（ＡＭＦ）を含む。本発明の組成物の濃度は、基質１ｇ当たり１−４ｘ１０６個の胎芽である。
【０１３７】
行われた決定
移植後９０日間（単位：ｄｐｔ）の動きが決定された。植物の高さと根系の深さが測定され、収穫量とその成分の一部も測定された。
【０１３８】
菌根菌の作用は、穀物の成長の間、以下の測定を実行することにより決定された。
アーバスキュラー・マトリックス外菌糸体（arbuscular extramatricla mycelium）とアーバスキュラー・内生菌（arbuscular endophtes）のコロニー形成割合（％）、視覚密度（％）を、ステレオ顕微鏡（streo micorscope）（ドイツ、ツァイス社製）とAxiostar 複合顕微鏡（compound microscope）（ドイツ、ツァイス社製）を用いて測定した。アーバスキュラー・マトリックス外菌糸体とアーバスキュラー内生菌の比率（ＭＥＡ：ＥＡ）も計算された。
【０１３９】
サンプルの菌根評価（mycorrhizal evaluation）は、根の染色技術（非特許文献１５)を用いて行われた。コロニー形成の割合は、インターセプト法（非特許文献１６)を用いて決定された。視覚密度、アーバスキュラー内生菌、菌根活性の数学的計算は、提案されたプロトコル（非特許文献２５，２６)に従って決定された。土壌１ｇ当たりの胞子の全数も決定された。
【０１４０】
統計による分析
結果の統計的処理は、分類の分散の単純解析により行われた。Tukeyのテストが用いられたのは、平均値の間に有意差がある時である。これは、プログラムStatgraphics（登録商標） Plus 4.1を用いて行われた。図１，２，３のグラフについては、SigmaPlot 4 プログラムが用いられた。
【０１４１】
菌根コロニー形成の割合（％）は、計算式2arcsen √x を用いて変換された。
【０１４２】
結果と議論
表１３は、実験で使用された土壌の化学的性質の一部を示す。この土壌は、わずかなアルカリ性のｐＨを有し、有機物Ｐの平均レベルとＣａ２＋の値は、１０ｃｍｏｌ．ｋｇ−１のオーダーである。塩分特性については、Ｎａの含有量が大きく、導電率が高く、これは塩分特性が強いことを示すが、肥沃の程度は稲の成長に許容できる程度である。
【０１４３】
この基質で見つかった胞子の量は非常に少なく、ＡＭＦの多様性と強度が低下している頻繁に使用されている農業用土壌の特徴である。この種の農業用土壌は、集中的な耕作、乱開発、典型的な化学化プロセス、塩化プロセス等が行われた土壌である（非特許文献２７)。
【０１４４】
これらの条件下での稲植物の成長ダイナミクスの分析は、処理に際し明確な変数の挙動を、示した。植物の高さは順調に増加し、２７日目以降の成長を加速させた（表１４）。
表１４：塩性土壌条件下でドミニキアｓｐ．で処理した植物（Ｄ．ｔ）と対照植物（Ｃ）の、処理後９０日間の植物の高さ（ｃｍ）、根系の深さ（ｃｍ）、菌根コロニー形成（％ＭＣ）：
ＤＲＳ：根系の深さ、ＤＰＴ：処理後の経過日、Ｓｔ．Ｓｉｇ：標準偏差
同じ列内の同じ文字は、ｐ＜＝０．０５で大幅には違わない。
【０１４５】
両方の処理は、高さが伸びる間は有意差がある。最高値は、対照処理で１８日目までに得られた。その後は挙動に変化が見られ、植物高さの最高値は、効率的なＡＭＦによる接種処理で得られた。
【０１４６】
これらの条件下での植物の成長ダイナミクスの分析は、処理したことによる変数の明確な挙動を明らかにした。植物の高さは順調に増加し、２７日目以降の成長を加速させた。
【０１４７】
高さ変数の類似の挙動は、根系の深さでも観測された。これは、本発明の組成物で処理された植物のほうが３２日経過後、対照植物より大きかった。
【０１４８】
この場合、挙動が加速される理由は、これは、菌類（fungus）が確立される植物の一部だからである。
【０１４９】
菌根コロニー形成の研究は、以前に分析された変数で見られるものに対し、異なる挙動を示した。この場合、両方の処理において、コロニー形成は累進的／進行性（progressive）であり、対照処理に比較してこの接種処理において常に最高値に達する。しかし、未接種の対照処理は、菌根コロニー形成の自然レベル自然条件で行われた実験の典型的な結果を示す。
【０１５０】
発達／生育は、ＡＭＦを接種した処理の場合、十分顕著であり、実験が灌漑条件（fluided condition）又は２０日間水層を用いて行われたことを考慮すると、高い値に達する。
【０１５１】
栽培の最終時点において、根でのコロニー形成は４４％の値に達する。この値は、稲の菌根の他の研究（非特許文献２８)に比較しても高いと思われる。ここで、コロニー形成の最大値は、固形ベースの接種では、２５％を超えることはない。
【０１５２】
図１は、本発明の組成物を濃縮形態で接種する処理による菌根活性の２つの非常に重要な菌類変数（fungal variables）の展開を示す。２つの菌類変数である胞子の集団／密度（population of spores）と菌類の占有（fungal occupation）は、視覚密度割合（％）で表されるが、これは菌糸体が内部の根をコロニー化する強さ以外の何ものでもない。
【０１５３】
視覚密度は、明確に定義された潜伏期間（latency phase）を有する通常の微生物の挙動を示した。この潜伏期間においては、菌類は、根内部を、０−２０日をかけてゆっくりとコロニー化し、その後４０日目（安定状態に達し栽培の終了時までの時間）まで指数関数的な成長を示す。
【０１５４】
胞子集団の場合、土壌内の値は、初日に検出され、接種（茎で最大１５日）に由来し、その後、胞子は、徐々に時間をかけて消失し、発芽の生成物は、高温で湿度が良好な条件で、土壌中の個体数が減少するまで、置かれた。
【０１５５】
３０日後、新たな胞子の生成が開始した。この胞子は、外部菌類バイオマスの発達と植物との共生の発達に由来する。この場合、胞子の数は、土壌１ｇ当たり胞子数１２個に迫る値まで成長し続けた。
【０１５６】
アーバスキュラー外菌糸体とアーバスキュラー内菌根の変数の分析（図２）は、非常に興味深い。その理由は、菌根共生菌（mycorrhizal symbiont）の内部挙動と外部挙動が、共生が毎年の成長サイクルを発展させるに連れて、どのように起こるかを示しているからである。
【０１５７】
この場合、外部菌糸体の高い値が、共生展開の第１段階の間、観測された。共生展開は、植物の成長を犠牲にした菌類の成長により引き起こされ、数年後に寄生付着プロセス（frank parasitic process）として発現した（非特許文献２９)。この寄生プロセスは、植物内の菌根でのコロニー形成（低い光合成段階と高い代謝コストを伴う）の初期段階における菌糸体の豊かな成長（時間）に由来する。アーバスキュラー内菌根の発達は、逆の傾向に従う。非常に低い値が、最初の数日間表れる。成長の２５日目以後、アーバスキュラー菌根共生における遷移と見なされる段階、まで有意な成長を達成しない。
【０１５８】
３０日後、外部菌糸体の減少と安定化があり、植物の成長と共生に発展に関連する内生菌のゆっくりとした増加があった。
【０１５９】
図３は、稲穀物の菌根成分の間の関係（アーバスキュラー外菌糸体と内生菌糸体の間の比率（ＭＥＡ：ＥＡ））を示す。共生の２つの主要な成分である外部菌糸体と内生菌の間のこの対応は、成長の様々な段階を経験するこの生物群衆（association）の活性度を表している（非特許文献３０)。
【０１６０】
初期段階は、これらの変数だけでなく、未接種の対照又は非効率的な菌根化対照と比較した植物の成長の低下でも、表現される。これは、植物の成長に実質的な変化を引き起こすものではない（表２）。ここで初期段階とは、非常に低い値の内生菌に対応して高い値の外部菌糸が存在し、率直な寄生化を抑制する状態のことである、
【０１６１】
両方の部分がバランスを取り始める中間フェーズ即ち遷移フェースと、両成分が値１以下で平衡状態になる時である交換の双利共生フェーズ（mutualist phase of exchange）が発生すると、根の内部で顕著な増加が見られ、細胞内のアーバスキュール（arbuscule）のレベルでの栄養素の適切な交換を保証する。
【０１６２】
特に、この穀物では、２つのフェーズは明確に定義できる。即ち２０−２５日目までの初期遷移フェーズと、それ以降の双利共生フェーズである。これと並行して、植物の高さの分析は、植え付け後２７日目以降の未接種の対照に関連して、植物の成長のテイクオフを示す。この効果は、収量とその成分の分析に示されている（表１５）。
表１５：塩性土壌中で、ドミニキアｓｐ．で処理された稲植物（Ｄ．ｔ）と未処置の対照植物（Ｃ）の、植物当たりの稲穂の数（ｎ）、稲穂の重量（ｇ）、１００粒の重量（ｇ）、収量（ｇ．植物−１）：
ＮＰＰ：植物当たりの稲穂の数（ｎ）、ＰＰ：稲穂の重量（ｇ）、Ｐ１００ｇ：１００粒の重量（ｇ）、Ｒ：収量（ｇ．植物−１）、Ｓｔ．Ｓｉｇ：標準偏差、同じ列内の同じ文字は、ｐ＜＝０．０５で大幅には違わない。
【０１６３】
未処置の対照植物に比較して、ドミニキアｓｐ．で処理された植物で測定された収量の全ての要素で増加が見られた。この実験の塩分条件は特に興味を引く。
【０１６４】
結論として、菌根菌（mycorrhizal fungus）のこの菌株の使用は、これらの土壌条件には有効であった。これは、塩分によるストレスの悪条件に対し、実行可能かつ持続可能は代替手段として非常に興味深い。
【０１６５】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するためではない。同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。％表示は特に断りのない限り重量％である。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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