(57)【要約】本発明は、ＧＡＢＡ受容体モジュレータとして有用な２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オールに関する。一実施形態において、前記化合物は、疼痛、神経因性疼痛および／または掻痒の処置において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
【化１】
2022500445.tif 000017
１
で示される化合物、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の治療有効量を含む医薬組成物。
【請求項３】
薬品中での使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
神経因性疼痛の処置における使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記神経因性疼痛が、アロディニアである、請求項４に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
掻痒の処置における使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記掻痒が、皮膚掻痒症である、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記掻痒が、皮膚病により引き起こされる、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
前記皮膚病が、乾癬である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記皮膚病が、湿疹である、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
必要とする個体への請求項１に記載の化合物の投与を含む、神経因性疼痛および／または掻痒の処置のための方法。
【請求項１２】
神経因性疼痛および／または掻痒の処置のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＧＡＢＡ受容体モジュレータとして有用な２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オールに関する。一実施形態において、前記化合物は、疼痛、神経因性疼痛および／または掻痒の処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＧＡＢＡは、侵害受容線維が終止する脊髄後角第ＩＩ層を含むＣＮＳ内の主な阻害性神経伝達物質である。脊髄における阻害性神経伝達は、疼痛伝達において非常に重要であり、阻害の増大は、鎮痛に導く（Ｚｅｉｌｈｏｆｅｒ  ＨＵ．  ｅｔ．  ａｌ．  （２００９），  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０００３】
ＧＡＢＡＡ受容体のモジュレータは、神経因性疼痛の動物モデルにおいて深い鎮痛を媒介することが見出されている（Ｍｕｎｒｏ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ７１６，  １−３，  １７−２３）。神経因性疼痛の管理のための現行の治療は、多くの患者には有益性が限定され、望ましくない副作用または用量制限毒性を含む。加えて現行の治療は、対症療法的であり、疾患修飾性でない。神経因性疼痛の管理および処置のための改善された治療、特にこの疾患を修飾する能力を有するそれらの治療が、依然として求められている。
【０００４】
加えて、ＧＡＢＡＡ受容体リガンドが掻痒の処置において有用になり得ることが、過去に実証されている（例えば、ＷＯ２０１７／１２９８０１号参照）。
【０００５】
ＧＡＢＡＡ受容体は、複数のアイソフォームに存在するリガンド開口型チャネルである。各受容体は、α１〜６、β１〜３、γ１〜３、δ、εおよびθサブユニットアイソフォームから引き出されたサブユニットを含む五量体の複合体である。ＣＮＳ内に存在するＧＡＢＡＡ受容体の大部分は、αサブユニット２個、βサブユニット２個およびγサブユニット１個を含有する（Ｍｃｋｅｒｎａｎ  ＲＭ．  ｅｔ．  ａｌ．  （１９９６）．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９，  １３９−４３）。ＧＡＢＡＡ受容体を活性化することの薬理学的効果は主に、受容体がサブユニットのどの型を含有するかに依存する。古典的な抗不安薬ベンゾジアゼピンは、サブタイプ選択性を示さない。古典的ベンゾジアゼピンの欠点（鎮静、依存性、および認知障害など）の手掛かりとなる要素の１つがＧＡＢＡＡ受容体のα１サブユニットに関係することが、示唆されている。異なるαサブユニットをジアゼパムに対して非感受性にする点突然変異を有するマウスを用いた近年の試験で、α２およびα３サブユニットがベンゾジアゼピンの鎮痛効果を媒介することが示唆されている（Ｋｎａｂｌ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｐａｉｎ  １４１，  ２３３−３８）。このことは、前臨床の疼痛モデルにおけるα２／３含有ＧＡＢＡＡ受容体の選択的ポジティブモジュレータの鎮痛効果を示した薬理学的研究により裏づけられる（Ｍｕｎｒｏ  Ｇ．  ｅｔ．  ａｌ  （２００８）．  ＪＰＥＴ，  ３２７，  ９６９−８１）。したがってα１サブユニットを上回るα２および／またはα３サブユニットへの選択性を有する化合物が、改善された副作用プロファイルを有すると予期される。
【０００６】
さらに、脊髄内のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンが媒介する阻害の欠如がＢｈｌｈｂ５突然変異マウスにおいて慢性掻痒を担うことが、示されており（Ｒｏｓｓ  ＳＥ．  ｅｔ．  ａｌ．  （２０１０）．  Ｎｅｕｒｏｎ  ６５，  ８８６−９８）、脊髄阻害の増大による潜在的治療活性が示唆された。
【０００７】
ＷＯ９８／３４９２３号、欧州特許第０６１６８０７号、ＷＯ２００４／０８７６９０号、ＷＯ２００７／１１０３７４号およびＷＯ２０１０／０５５１３２号には、ＧＡＢＡＡ受容体複合体のモジュレーションに応答する中枢神経系疾患および障害の処置において有用なベンゾイミダゾール誘導体が記載されている。
【０００８】
ＷＯ０３／０８６４０６号、ＷＯ０３／０８７０９９号、ＷＯ０３／０９９８１６号およびＷＯ０１／１８０００号には、ＧＡＢＡ受容体のリガンドとして有用なイミダゾピリジン誘導体が開示されている。
【０００９】
ＷＯ２０００／０４４７５２号およびＷＯ９９／６７２４５号には、ＧＡＢＡ受容体のリガンドとして有用なトリアゾロピリダジン誘導体が開示されている。
【００１０】
これらの過去に提示されたＧＡＢＡ受容体モジュレータから、微細な構造的差異が生物活性に大きな影響を有する可能性が示される。
【００１１】
しかし、過去に提示されたＧＡＢＡ受容体モジュレータの多くは、望まない副作用に関連する。したがって、最適化された薬理学的プロファイルを有し、望まない副作用を有さない化合物が、強く求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
概要
主要な態様において、本発明は、式１で表された２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（化合物１）に関係する。
【化１】
2022500445.tif 000002
１
【００１３】
その上、本発明は、医薬としての化合物１の使用に関する。本発明者らは、化合物１がポジティブアロステリックモジュレータに好適である新規なＧＡＢＡＡ  α３受容体であることを見出した。したがって一態様において、化合物１は、神経因性疼痛の処置、予防、および／または緩和において用いられる。別の態様において、化合物１は、掻痒の処置、予防、および／または緩和において用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）化合物１、（Ｂ）化合物９。卵母細胞の二電極電圧クランプの記録におけるＧＡＢＡＡ受容体への有効性プロファイル。各実験データセットで、ＧＡＢＡを一定濃度（０．５〜３μＭ）の卵母細胞リンゲル液に溶解して、所与のＧＡＢＡＡ受容体サブタイプの組み合わせでのＥＣ１０〜２０誘発電流を発生させた。ピーク電流を読み取り、ジアゼパムの最大有効濃度に正規化し、その後、データポイントを非線形回帰、ｎ＝３〜１４により経験的ヒル方程式に当てはめた。化合物１は、ＧＡＢＡＡ−α３含有受容体におけるＧＡＢＡ介在電流の優先的増強、ＧＡＢＡＡ−α２／５サブユニットのわずかな活性化（１０％未満）およびＧＡＢＡＡ−α１含有受容体の非活性化を示す。
【図２】雄ＣＤ−１マウスにおける引っ掻き行動に及ぼす急性投与後の化合物１の影響。化合物１での急性処置は、ＣＣＩ病変に見舞われたラットにおける機械的アロディニアを回復させ、最小有効用量は経口投与後に１ｍｇ／ｋｇ以下であった。慢性処置の７日後に、３用量全ての有意な鎮痛効果が保持されたが、モルホリン（６ｍｇ／ｋｇ）の効果は、完全に喪失された。モルホリンは、皮下投与された。雄スプラグドゥーリーラットにおける慢性絞扼神経損傷（ＣＣＩ）は、ＢｅｎｎｅｔｔｅおよびＸｉｅ（１９９８）により記載された通り実施された。動物は、手術の１４日後に検査された。ビヒクルに対して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、フィッシャーのＬＳＤポストテスト（ｐｏｓｔｔｅｓｔ）、ｎ＝７〜９。
【図３】ＣＣＩ病変のあるラットにおける足逃避閾値に及ぼす急性および慢性投与後の化合物１の影響。化合物１は、ＣＤ−１雄マウスにおけるコンパウンド４８／８０誘導性引っ掻き行動を用量依存的に低減した。首筋に５０μＬ皮下注射されたコンパウンド４８／８０は、ビヒクルを注射されたマウスに比較して、引っ掻き回数の顕著で有意な増加を誘導した。ヒスタミン作動性Ｈ１アンタゴニストのジペンヒドラミン（ｄｉｐｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ）塩酸塩が、参照として用いられ、コンパウンド４８／８０の６０分前に経口投与されたが、化合物１は、コンパウンド４８／８０投与の３０分前に経口投与された。＃＃＃＃生理食塩水に対してｐ＜０．０００１、ビヒクル＋コンパウンド４８／８０に対して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、フィッシャーＬＳＤ事後検定、ｎ＝７〜９。
【図４】雄ＳＤラットにおける探索的自発運動に及ぼす化合物１の影響。４９４の遊離脳内濃度に対応する３０ｍｇ／ｋｇまでで投与された化合物１は、雄スプラグドゥーリーラットにおける探索的自発運動に影響を及ぼさなかった（時間および用量を因子とする二元配置反復測定分散分析でｐ＞０．０５）。化合物１を、薄明条件下で新規なホームケージにラットを導入する１２０分前に３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇで経口投与した。ラットの活性は、自動的に３０分間登録された（ＴＳＥ  ＭｏＴｉｌ、ドイツ所在）。
【図５】雄ＳＤラットにおけるロータロッドパフォーマンスに及ぼす化合物１の影響。３０ｍｇ／ｋｇまでで投与された化合物１は、ロッドを落下するまでの潜時として測定された、加速しながら回転するロッド上でバランスを維持するラットの能力を損傷しなかった。これに反して非選択的ＧＡＢＡＡ受容体ポジティブモジュレータのジアゼパムは、落下までの潜時を有意に短縮させた（ｐ＜０．０５）。化合物１およびジアゼパムは、それぞれ検査開始の２時間および１時間前に経口投与された。ラットは、３日目に薬物効果を評価する前に２日間にわたり、４〜４０ｒｐｍで５分間、ロータロッドで訓練された。訓練後に９０秒より長く走ることができなかったラットは、実験に含めなかった。ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、フィッシャーのＬＳＤポストテスト、ｎ＝６〜７。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な記載
一態様において、本発明は、式１で表された２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オールに関係する。
【化２】
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１
【００１６】
一実施形態において、化合物１は、医薬的に許容できる塩である。
【００１７】
本発明の化合物は、互変異性体形態で存在してもよい。
【００１８】
医薬的に許容できる塩
本発明の化学化合物は、医薬的に（即ち、生理学的に）許容できる塩をはじめとする意図する投与に適した任意の形態で提供されてもよい。医薬的に許容できる付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、アコナート（ａｃｏｎａｔｅ）、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸塩、クエン酸塩、エンボン酸塩、エナント酸塩、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、フタル酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トルエン−ｐ−スルホン酸塩および同様のものなどの非毒性の無機および有機酸付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。そのような塩は、当該技術分野で周知の記載された手順により形成されてもよい。医薬的に許容できると見なされ得ないシュウ酸などの他の酸が、本発明の化学化合物およびその医薬的に許容できる酸付加塩を得る際に中間体として有用な塩の調製において有用になる場合がある。
【００１９】
本発明の化合物１の医薬的に許容できる陽イオン性塩の例としては、陰イオン性基を含有する本発明の化合物１の、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、リチウム塩、コリン塩、リジニウム塩およびアンモニウム塩、並びに同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。そのような陽イオン性塩は、当該技術分野で周知の記載された手順により形成されてもよい。本発明の文脈において、Ｎ含有化合物の「オニウム塩」もまた、医薬的に許容できる塩として企図される。好ましい「オニウム塩」としては、アルキル−オニウム塩、シクロアルキル−オニウム塩、およびシクロアルキルアルキル−オニウム塩が挙げられる。
【００２０】
標識された化合物
本発明の化学化合物は、標識または非標識形態で用いられてもよい。本発明の文脈において、標識された化合物は、通常は天然に見出される原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられた原子を１種または複数有する。この標識は、前記化合物の容易な定量的検出を可能にするであろう。
【００２１】
本発明の標識された化合物は、様々な診断法において、そしてインビボ受容体撮像のために、診断ツール、放射線トレーサ、またはモニタリング剤として有用になり得る。本発明の標識された異性体は、好ましくは標識として少なくとも１種の放射性核種を含有する。ポジトロン放出放射性核種は全て、使用候補である。本発明の文脈において、放射性核種は、好ましくは２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１３Ｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１８Ｆから選択される。
【００２２】
本発明の標識された異性体を検出するための物理的方法は、ポジトロン断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、およびコンピュータＸ線体軸断層撮影法（ＣＡＴ）、またはそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【００２３】
調製方法
本発明の化学化合物は、化学合成のための従来法、例えば実用例に記載されたものにより調製されてもよい。本出願に記載された工程の出発原料は公知であるか、または市販の化学薬品から従来法により即座に調製されてもよい。
【００２４】
本明細書に記載された反応の目的生成物は、従来の技術により、例えば抽出、結晶化、蒸留、クロマトグラフィー他により単離されてもよい。
【００２５】
本発明の化合物は、非溶媒和形態に加え、水、エタノールおよび同様のものなどの医薬的に許容できる溶媒での溶媒和形態で存在してもよい。一般に溶媒和形態は、本発明の目的では非溶媒和形態と等しいと見なされる。
【００２６】
医薬組成物
本発明はまた、化合物１またはその医薬的に許容できる塩の治療有効量を、少なくとも１種の医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
治療における使用のための本発明の化合物１は、原料のままの化学化合物の形態で投与されてもよいが、有効成分を場合により生理学的に許容できる塩の形態で、１種または複数のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤、および／または他の慣用的医薬助剤と共に医薬組成物に導入することが、好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の化学化合物またはその医薬的に許容できる塩を、１種または複数の医薬的に許容できる担体と、そして場合により当該技術分野で公知であり使用される他の治療および／または防御成分と共に含む医薬組成物を提供する。担体（複数可）は、配合剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害でない、という意味で「許容でき」なければならない。本発明の医薬組成物は、経口、直腸内、気管支内、鼻内、肺、局所（口腔および舌下を含む）、経皮、膣内または非経口（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、脳内、眼内注射または輸液を含む）投与に適したもの、あるいは粉末および液体エアロゾル投与をはじめとする吸入もしくは吹送法による投与、または持続放出システムによる投与に適した形態のものであってもよい。持続放出システムの適切な例としては、本発明の化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形品、例えば薄膜またはマイクロカプセルの形態であってもよい。
【００２９】
したがって本発明の化合物１は、従来のアジュバント、担体、または希釈剤と共に、医薬組成物およびその単位投与物の形態にされてもよい。そのような形態としては、固体、詳細には錠剤、充填カプセル、粉末およびペレット形態、ならびに液体、詳細には水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル、およびそれらを充填されたカプセルが挙げられ、その全てが経口使用のためのもの、直腸内投与のための坐剤、および非経口使用のための滅菌注射可能溶液である。そのような医薬組成物およびその単位投与剤形は、追加の活性化合物または活性原材料を有し、または有さず、従来の成分を従来の割合で含んでいてもよく、そのような単位投与剤形は、用いられることになる意図する日用量範囲に相応しい任意の適切な有効量の有効成分を含有してもよい。本発明の化合物１は、非常に種々の経口および非経口投与剤形で投与され得る。以下の投与剤形が、本発明の化学化合物、または本発明の化学化合物の医薬的に許容できる塩のいずれかを活性成分として含み得ることは、当業者に自明であろう。
【００３０】
本発明の化合物１から医薬組成物を調製するために、医薬的に許容できる担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固体形態調製物としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用し得る１種または複数の物質であり得る。
【００３１】
医薬調製物は、好ましくは単位投与剤形である。そのような形態において、該調製物は、適当な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。該単位投与剤形は、包装された錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル中の粉末など、包装された調製物であり得、その包装物は、異なる量の調製物を含有し得る。同じく単位投与剤形は、それ自体がカプセル、錠剤、カシェ剤もしくはロゼンジであり得、またはそれは、包装形態中のこれらのいずれかの適当な数であり得る。
【００３２】
治療有効用量は、症状または病気を好転させる有効成分の量を指す。治療有効性および毒性、例えばＥＤ５０は、細胞培養物または実験動物において標準の薬理学的手順により決定されてもよい。治療効果と毒性効果の用量比が、治療指数であり、治療効果をもたらす血漿レベルと、毒性効果をもたらす血漿比の間の比率により表されてもよい。大きな治療指数を呈する医薬組成物が、好ましい。
【００３３】
投与された用量は、もちろん、処置される個体の年齢、体重および病気に加え、投与経路、投与剤形およびレジメン、ならびに所望の結果に注意深く適合されなければならず、厳密な投与量は、もちろん、実施担当者により決定されなければならない。
【００３４】
実際の投与量は、処置される疾患の性質および重症度に依存し、医師の裁量の範囲内であり、所望の治療効果を生じるように本発明の固有の状況に投与量を用量設定することにより変動されてもよい。しかし、個々の用量あたり約０．１〜約１０．０００ｍｇ、好ましくは約１〜約１０００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜約５００ｍｇの有効成分を含有する医薬組成物が、治療的処置に適することが目下、企図される。有効成分は、１日あたり１回または複数回投与されてもよい。充分な結果が、特定の例において、０．１μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．および１μｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．という低い投与量で得ることができる。投与量範囲の上限は、約１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．および１００ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．であると目下、見なされる。好ましい範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日  ｉ．ｖ．、そして約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日  ｐ．ｏ．である。
【００３５】
生物活性
本発明の化合物１は、ＧＡＢＡＡ受容体複合体のモジュレーションが可能であり、α３サブユニットと、わずかな程度にα２およびα５サブユニットを含有するＧＡＢＡＡ受容体のポジティブアロステリックモジュレータ（ＰＡＭ）であることが実証される。化合物１は、急性および慢性処置後に神経因性疼痛のラットモデルにおいて機械的アロディニアを回復させ、それは、掻痒を誘導する化合物で処置されたマウスの引っ掻きを好転させており、鎮痛に加え鎮痒効果が示唆される。化合物１は、ラットの探索的自発運動およびロータロッドパフォーマンスでの測定で、鎮静の易罹病性および運動障害的影響を示さない。
【００３６】
治療法
化合物１は、ＧＡＢＡＡ受容体のリガンドであるため、ヒトをはじめとする生存する身体の障害の処置、予防および／または緩和に有用である。好ましくは化合物１は、神経因性疼痛などの疼痛および／または掻痒の処置、予防、および／または緩和において使用される。
【００３７】
神経因性疼痛の処置
一態様において、本発明は、神経因性疼痛の処置、予防、および／または緩和における式１で表される２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オールの使用に関係する。
【００３８】
神経因性疼痛は、慢性疼痛の複数の形態をはじめとする疼痛の分類であり、体細胞組織というよりむしろ神経の機能不全から生じる。神経因性疼痛、即ち中枢神経系または末梢神経系の機能不全に由来する疼痛はまた、末梢神経もしくは中枢神経系の領域への損傷の結果の場合があり、疾患から生じる場合があり、または特発性の場合がある。神経因性疼痛の症状としては、熱傷、刺痛、電気、ピンおよび針の感覚、知覚異常、異常錯覚感、凝り、四肢のしびれ、体の歪みの感じ、アロディニア（通常は無害である刺激により誘発された疼痛）、痛覚過敏（疼痛への異常な感受性）、ヒペルパチー（悪化した疼痛応答が疼痛刺激の停止後に長時間持続すること）、幻肢痛、および自発痛が挙げられる。
【００３９】
掻痒の処置
一態様において、本発明は、掻痒の処置、予防、および／または緩和における、式１で表された２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オールの使用に関係する。
【００４０】
掻痒（皮膚掻痒症としても知られる）は、引っ掻きの欲求または反射を引き起こす感覚である。掻痒は、疼痛に対して多くの類似性を有することが示されている。掻痒のほとんどの例が、ヒスタミン関連であり、抗ヒスタミン薬で処置される。しかし掻痒の一部の例は、抗ヒスタミン薬で処置できない。掻痒の考えられる原因としては、乾燥肌、皮膚病および発疹、内在性の疾患、神経障害、かぶれおよびアレルギー反応、薬物、ならびに妊娠が挙げられる。
【００４１】
皮膚病、ふけ、点状掌蹠角化症、疥癬、瘢痕の増殖、乾皮症、シラミ、水痘および蕁麻疹などの多くの皮膚障害が、掻痒を引き起こす。前記皮膚病としては、乾癬、湿疹（皮膚炎）、日焼け、足部の水虫、および化膿性汗腺炎が挙げられる。
【００４２】
皮膚の痒みは、根底にある疾病の症状の可能性がある。これらには、肝臓疾患、腎不全、糖尿病、副甲状腺機能亢進、鉄欠乏性貧血、黄疸、胆汁うっ血、尿毒症、赤血球増多症、甲状腺の問題、ならびに白血病およびリンパ腫をはじめとする癌がある。神経系に影響を及ぼす病気  −  多発性硬化症、糖尿病、ピンチナーブおよび帯状ヘルペス（帯状疱疹）など  −  が、掻痒を引き起こす可能性がある。
【００４３】
掻痒は、羊毛、化粧品、石鹸、ヒスタミン、オピオイド、プロスタグランジン、プロテアーゼ、サイトカイン、ニューロペプチド、詳細にはサブスタンスＰ、セロトニン、クロロキン、コンパウンド４８／８０（ＣＡＳ  ＮＯ．９４７２４−１２−６）および胆汁酸塩などの複数の材料および化学物質により誘起または増大され得る。食物アレルギーもまた、皮膚に掻痒を引き起こす場合がある。
【００４４】
掻痒の感覚を増大すると考えられる因子としては、表皮および真皮の乾燥、組織の酸欠、毛細血管の拡張、刺激を与えること、原発性皮膚疾患および精神障害が挙げられる。
【００４５】
一実施形態において、掻痒は、皮膚掻痒症である。一実施形態において、皮膚掻痒症は、肛門掻痒症である。一実施形態において、皮膚掻痒症は、陰嚢掻痒症である。一実施形態において、皮膚掻痒症は、外陰掻痒症である。一実施形態において、皮膚掻痒症は、肛門陰部掻痒症である。
【００４６】
実施例
実施例１：２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（１）の調製
【００４７】
ステップ１：メチル６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）−５−ニトロニコチナート（４）の調製
【化３】
2022500445.tif 000004
０℃の無水テトラヒドロフラン（７５０ｍＬ）中の６−クロロ−５−ニトロ−ニコチン酸  ２（１００ｇ、４６１．７２ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２０．６ｍＬ、６９２．５８ｍｍｏｌ）を、続いて３−ブロモアニリン  ３（５５ｍｌ、４９４．１ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物を窒素雰囲気下、周囲温度で２４時間撹拌した。反応物をＴＬＣおよびＵＰＬＣによりモニタリングした。反応混合物を減圧下で初期容量の半量まで濃縮した。石油エーテル（８００ｍＬ）を反応混合物に添加し、この懸濁液を１時間撹拌した。出現した橙色固体を吸引濾過し、石油エーテル（３００ｍＬで８回）で徹底して洗浄し、メチル６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）−５−ニトロニコチナート  ４（１３２ｇ、８１％）を橙色固体として供給した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.31 (s, 1H, 交換可能なプロトン), 8.94 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.63 (d, J = 7.60 Hz, 1H), 7.41-7.36 (m, 2H), 3.88 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 352.9 (M+H)+。
【００４８】
ステップ２：メチル５−アミノ−６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）ニコチナート（５）の調製
【化４】
2022500445.tif 000005
エタノール：ＴＨＦ［１：１；（２６００ｍＬ）］の混合物中のメチル６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）−５−ニトロニコチナート  ４（４８５ｇ；１３７７．２８ｍｍｏｌ）の冷却された（０℃）懸濁液に、塩化スズ二水和物（９３２．３ｇ；４１３１．８ｍｍｏｌ）を０℃で少量ずつ添加し、放置して反応混合物の温度を周囲温度にしながら、反応混合物を窒素雰囲気下で２０時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＵＰＬＣによりモニタリングした。２０時間後に、反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を水（１０００ｍＬ）で希釈した。水性混合物を５℃で固体重炭酸ナトリウムにより塩基性にした（ｐＨがおよそ９〜１０になるまで）。その後、クロロホルム（１５００ｍＬ）を水性部分に添加し、１５分間撹拌し、出現した不溶性無機物をＣｅｌｉｔｅのベッドで濾過した。ベッドをクロロホルム（５００ｍＬで５回）で徹底して洗浄した。有機層を分離し、飽和ブライン溶液（８００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過して濃縮し、メチル５−アミノ−６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）ニコチナート  ５（３５０ｇ、７８．８８％）を灰色がかった固体として産出した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.38 (s, 1H, 交換可能なプロトン), 8.13 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.70 (d, J = 10.00 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.27-7.22 (m, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 5.31 (s, , 2H, 交換可能なプロトン), 3.80 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 324.0 (M+H)+。
【００４９】
ステップ３：メチル３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−カルボキシラート（６）の調製
【化５】
2022500445.tif 000006
無水ＴＨＦ（３０００ｍＬ）中のメチル５−アミノ−６−（（３−ブロモフェニル）アミノ）ニコチナート  ５（３５０ｇ、１０８６．４１ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に、オルトギ酸トリメチル（１７２．９４ｇ、１６２９．６ｍｍｏｌ）を、続いてｐ−トルエンスルホン酸（ｐＴＳＡ）（６１．９９ｇ、３２５．９２ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応塊を窒素雰囲気下で８０℃まで加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＵＰＬＣによりモニタリングした。３時間後に、反応混合物を放置して周囲温度に到達させ、溶媒を減圧除去した。得られた粗製物を水（１０００ｍＬ）で希釈し、室温で撹拌しながら、水性部分を重炭酸ナトリウムでｐＨがおよそ９〜１０になるまで塩基性にした。撹拌をさらに１時間継続した。出現した固体を吸引濾過し、真空下で完全に乾燥させて、粗製の塊状物（３８０ｇ、１０５．３％物質収支）をオフホワイト色の固体として供給した。粗製物をクロロホルム（５０００ｍＬ）に溶解し、ブラインで洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過して減圧濃縮し、メチル３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−カルボキシラート  ６（３３５ｇ、９２．８３％）をオフホワイト色の固体として供給した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ =  9.12 (s, 1H), 9.03 (d, J = 2.00 Hz, 1H), 8.67 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.27-8.26 (m, 1H), 8.04-8.01 (m, 1H), 7.73-7.71 (m, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 3.94 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 334.0 (M+H)+。
【００５０】
ステップ４：２−（３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（７）の調製
【化６】
2022500445.tif 000007
−２０℃の無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）中のメチル３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−カルボキシラート  ６（５０ｇ、１５０．５３ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に、ＭｅＭｇＣｌ溶液［（７２ｍＬ、１４３．９２ｍｍｏｌ）；ＴＨＦ中の２Ｍ］を窒素雰囲気下で３０分の期間に滴加した。反応混合物を−２０℃〜０℃の反応温度に保持しながら、窒素雰囲気下で３．５時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣおよびＵＰＬＣによりモニタリングした。３．５時間後に、反応塊を飽和塩化アンモニウム溶液（１５００ｍＬ）でクエンチし、水層を酢酸エチル（１０００ｍＬで３回）で抽出して、ひとまとめにした有機層を飽和ブライン溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過して濃縮し、粗製の塊状物（５１ｇ、１０２％物質収支）を褐色ガム状物として供給した。粗製物を、ヘキサン中の２０％酢酸エチルを溶離液として用いた中性アルミナのベッドのフラッシュカラムにより精製して、所望の生成物２−（３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール  ７（２２ｇ、４４％）を褐色ガム状物として供給した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ =  8.95 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.06 (d, J = 8.00 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.00 Hz, 1H), 7.59-7.55 (m, 1H), 5.32 (s, 1H, 交換可能なプロトン), 1.55 (s, 6H); LCMS (ESI): m/z: 334.0 (M+H)。
【００５１】
ステップ５：２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（１）の調製
【化７】
2022500445.tif 000008
１，２−ジメトキシエハン（ｅｈａｎｅ）：水［２：１；（４５ｍＬ）］の混合物中の２−（３−（３−ブロモフェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール  ７（０．７５ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に、２，４−ジメトキシピリミジン−５−ボロン酸  ８（０．４５６ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を、続いてＮａ２ＣＯ３（０．４７８ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素ガスで２５分間脱気した。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）二塩酸塩（０．０７９ｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）を上記反応混合物に添加して、窒素雰囲気下で９０℃まで加熱した。反応の進行をＴＬＣおよびＵＰＬＣによりモニタリングした。１５時間後に、反応混合物を放置して周囲温度に到達させ、冷水（７５ｍＬ）でクエンチした。水性部分を酢酸エチル（２００ｍＬで３回）で抽出し、ひとまとめにした有機層をブライン（５０ｍＬで２回）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過して濃縮し、粗製物（０．８６５ｇ；物質収支９７．８％）を褐色ガム状物として供給した。粗製物を、ヘキサン中の５０％酢酸エチルを溶離液として用いたフラッシュカラムにより精製して、所望の生成物（０．５７５ｇ）をオフホワイト色の固体として供給し、さらに研和して、吸引により濾過および乾燥させ、２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（１）（０．５ｇ、５６．６２％）をオフホワイト色の固体として供給した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.94 (s, 1H), 8.60 (d, J = 2.00 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.24 (d, J = 2.00 Hz, 1H), 8.13-8.12 (m, 1H), 8.01-7.98 (m, 1H), 7.70-7.63 (m, 2H), 5.3 (s, 1H, 交換可能なプロトン), 3.98 (d, J = 4.00 Hz, 6H), 1.55 (s, 6H); LCMS (ESI): m/z: 392.3 (M+H)+、ＭＲ：８６．０℃〜９３．４℃。
【００５２】
実施例２：３Ｈ−フルマゼニルへの結合のインビトロ阻害
【００５３】
組織調製
組換えＧＡＢＡ  α３β３γ２受容体の安定した発現を有するＨＥＫ−２９３細胞株を、Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ  １、４５００ｍｇ／ｌ  Ｄ−グルコース、１０％ウシ胎仔血清を有し、以下の抗生物質：ｚｅｏｃｉｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシンＢ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）およびＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。
【００５４】
培養物が、大型培養フラスコ（１７５ｃｍ２）でコンフルエントに達したら、ＤＭＥＭを除去し、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；ＫＣｌ：０．２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇ／ｌ、ＮａＣｌ：８ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４：１．１５ｇ／ｌ）で１回洗浄した。培養物にＤＰＢＳ  ２ｍｌをおよそ５分間添加し、続いて培養フラスコの底部の細胞を穏やかに剥離させた後、細胞を回収した。さらなるＤＰＢＳ  １５ｍｌの添加の後、細胞懸濁液をＦａｌｃｏｎチューブに移して、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）１５ｍｌ中でＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて１回洗浄し、２℃および２７，０００×ｇで１０分間遠心分離した。洗浄されたペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）１５ｍｌに再懸濁させて、結合実験の当日まで−８０℃で凍結させた。
【００５５】
アッセイ
実験の当日、膜調製物を室温で解凍して、２℃および２７，０００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＴｒｉｓクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）中でＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを利用して３０〜１５０μｇタンパク質／アッセイに再懸濁させ、その後、結合アッセイに用いた。細胞懸濁液のアリコット０．５ｍｌを検査溶液２５μｌおよび３Ｈ−フルマゼニル（１ｎＭ最終濃度）２５μｌに添加して混合し、二重測定として２℃で４０分間インキュベートした。非特異的結合を、クロナゼパム（１μＭ最終濃度）を使用して決定した。
【００５６】
検査化合物の希釈およびアッセイのインキュベーションは全て、ガラスバイアル／プレートの中で実施した。検査化合物および３Ｈ−フルニトラゼパムの溶液を、所望の最終濃度の２２倍に調製した。化合物を１００％ＤＭＳＯ（１０ｍＭ原液）に溶解し、４８％エタノール−水で希釈して、三重測定として系列希釈物で検査した。Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いたＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルター上への急速な濾過により結合を停止させ、続いて氷冷Ｔｒｉｓクエン酸塩緩衝液１ｍｌで１０回洗浄した。Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ（商標）カウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた従来の液体シンチレーションカウンティングにより、フィルター上の放射線の量を決定した。特異的結合は、全結合から非特異的結合を減算したものである。
【００５７】
結果
【表１】
2022500445.tif 000009
【００５８】
ＩＣ５０値は、３Ｈ−フルマゼニルの特異的結合を５０％阻害する検査物質の濃度である、
【数１】
2022500445.tif 000010
（ここで、Ｃ０は、対照アッセイにおける特異的結合であり、Ｃｘは、検査アッセイの特異的結合である）。
【００５９】
結論
２−（３−（３−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）フェニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イル）プロパン−２−オール（１）は、０．０１５μＭのＫｉ値および０．０３８μＭのＩＣ５０値を有することが見出された。
【００６０】
実施例３：卵母細胞の電気生理学的検査
ここで報告されるアッセイは、主な脳ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプでのＰＡＭのインビトロ機能的能力および有効性を決定するために実施される。これを確定するために、全濃度応答プロファイルを、アフリカツメガエル卵母細胞内で発現されるα１β２γ２、α２β２γ２、α３β２γ２およびα５β２γ２受容体からの最大ＧＡＢＡ誘導性応答の５〜２０％を発生するＧＡＢＡ濃度で決定した。
【００６１】
アフリカツメガエル卵母細胞の調製
コラゲナーゼで濾胞除去されたアフリカツメガエル卵母細胞を、Ｅｃｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。注射のために、卵母細胞を改変バース溶液（９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、０．６６ｍＭ  ＮａＮＯ３、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．７４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよびｐＨ７．５５に調整された１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で注文設計されたチャンバー内に配置し、Ｐｉｃｏ  Ｐｕｍｐ（ＷＰＩ）を用いてｃＲＮＡ混合物２５〜５０ｎｌと共に注射した。ｃＲＮＡ混合物は、３：１：３比および総濃度０．５μｇ／μｌのＧＡＢＡＡＲサブユニットαｘ、β２およびγ２ｓを含有している。注射に続いて、卵母細胞を改変バース溶液中、１８℃で１〜５日間保持した。
【００６２】
二電極電圧クランプの実験
アフリカツメガエル卵母細胞の電気生理学的応答を、二電極電圧クランプ法を利用して測定した。単一の卵母細胞を、２ｍｌ／分より多量のＯＲ２（９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）で継続的に灌流される注文設計の記録チャンバーに配置した。実験アッセイ溶液は、およそ１８０ｍＯｓｍの測定モル浸透圧濃度を有する標準のＯＲ２緩衝溶液であった。記録電極は、ＤＭＺ−Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプラー（Ｚｅｉｔｚ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いてフィラメント（Ｓｕｔｔｅｒ  ＢＦ１５０−１１０−１０）付きのホウケイ酸ガラス管から組み立て、２Ｍ  ＫＣｌを埋め戻し、ＯＲ２溶液に沈積されると、電極抵抗が０．５〜１ＭΩの範囲内であった。手動のマイクロマニピュレータを用いて卵母細胞を突き刺し、少なくとも１分間−５０ｍＶ〜−８０ｍＶの保持電位で平衡にさせて、実験が開始する前に最大漏洩電流が確実に１００ｎＡになるようにした。保持電位は通常、典型的な静止電位−２５ｍＶよりも有意に低い−６０ｍＶに設定した。電流振幅が卵母細胞のバッチで低くなった場合、漏洩電流が１００ｎＡを超えないことを条件に、−８０ｍＶの保持電位を利用した。電流をＧｅｎｅｃｌａｍｐ  ５００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ）により増幅し、２０Ｈｚでローパスフィルターにかけて、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ（Ａｘｏｎ）により２００Ｈｚでデジタル化し、その後、ｐＣｌａｍｐ９スイート（Ａｘｏｎ）を用いてＰＣ（Ｃｏｍｐａｑ  Ｅｖｏ）により記録および解析した。
【００６３】
卵母細胞からおよそ２ｍｍのところに配置され、Ｔｅｆｌｏｎチューブを通してＧｉｌｓｏｎ  ２３３ＸＬオートサンプラーに接続された、内径１．５ｍｍのキャピラリーチューブ（Ｍｏｄｕｌｏｈｍ  ２１４８１３）を通して、化合物溶液を適用した。Ｇｉｌｓｏｎ  ７３５ソフトウエアスイートを用いて、Ｇｉｌｓｏｎ装置（２３３ＸＬオートサンプラー、４０２ダイリュータおよびＭｉｎｉｐｕｌｓ  ３ポンプ）の全てを制御し、ｐＣＬＡＭＰ９により記録を開始した。適用の間にキャピラリーチューブを通る流速２．５ｍｌ／分が、卵母細胞周辺の液体の急速な交換を確実にした。適用の長さを、ピーク電流を得るのに充分となる６０秒間継続するように設定した。記録間の時間間隔は５分とし、その間はまた、キャピラリーチューブを通して卵母細胞をＯＲ２で灌流した。
【００６４】
実験データ
各実験データセットで、所与のＧＡＢＡＡ受容体サブタイプの組み合わせのためのＥＣ５−ＥＣ２０誘発電流を発生することが知られる濃度（０．５〜５μＭ）のＯＲ２に、ＧＡＢＡを溶解し、その後、この溶液を対照に、そして該化合物を溶解して実験で検査するための原液に用いた。完全な実験セットは、ＧＡＢＡの４種の対照トレースと、参照の０．５μＭジアゼパムトレースと、１０種のＧＡＢＡ対照トレースと、最後に上昇濃度の検査化合物のトレースと、を含有した。個々の卵母細胞は、１つの実験セットの後に廃棄された。
【００６５】
ジアゼパムのモジュレーション効果は、直前にジアゼパムトレースを対照トレースと比較することにより計算された。同様に、検査トレース中の化合物のモジュレーション効果は、検査トレースを直前に対照に比較することにより得られた。個々の卵母細胞間で化合物の効果の比較を可能にするために、全ての化合物の増強を、同じ卵母細胞での対照ジアゼパムの増強に正規化した。
【００６６】
結果
アッセイを化合物１および９について実施し、以下を参照されたく、結果を図１に表す。
【化８】
2022500445.tif 000011
【００６７】
結論
濃度応答プロファイルから理解され得る通り、化合物１および９によるモジュレーションは、特にα１β２γ２受容体のモジュレーションに関係して、変動する。重要なこととして、α１β２γ２受容体のモジュレーションは、化合物１の場合には０に近似しているが、それは、化合物９では明確に負である。この実施例はまた、２分子間の相対的に小さな構造的差異が生物活性に大きな影響を有することを実証している。
【００６８】
実施例４：ラットにおける慢性絞扼神経損傷（ＣＣＩ）の機械的アロディニアに及ぼす化合物１の急性および慢性効果
【００６９】
方法
動物：
雄ＳＰＲＤラット（Ｔａｃｏｎｉｃ）、手術時に１４０〜１６０グラム
【００７０】
手術：
麻酔を誘導して、酸素（３０％）および酸化窒素（６８％）と組み合わせた２．５％イソフルランにより保持した。坐骨神経を、坐骨神経三枝分岐の近位の大腿中部で露出させた。血管供給が明らかに損なわれないように、４本のクロムガット結紮糸（４／０）（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ニュージャージー州ニューブランズウィック所在）で、神経の周囲を１〜２ｍｍ離して緩く結紮した。上に横たわる筋肉は、４／０合成吸収性縫合糸で筋層を閉創した。皮膚は、１〜２個のクリップで閉創した。
【００７１】
神経を損傷されたラットの行動検査：
手術の３〜１４日後に、動物を機械的アロディニアの存在についてモニタリングした。評定の前に、個々のラットをホームケージから取り出し、損傷された後足の足底表面に接近できるように高架された金属格子の上に配置された開口部で通気される１５×２０ｃｍ白色Ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ検査ケージの中で、ラットを６０分間放置して順化させた。機械的アロディニアの存在を、一連の目盛り付きｖｏｎ  Ｆｒｅｙヘア（下限＝０．１および上限＝２６ｇ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ、イリノイ州ウッドデール所在）を用いて評定し、その際、ヘアを足底表面に適用して、用いられた個々のフィラメントがちょうど曲がり始めるまで力を加えていった。フィラメントを１〜２秒の期間適用し、１〜２秒間隔で５回繰り返した。５回の適用のうち３回で足逃避を誘導したフィラメントを、機械的アロディニアの応答が起こる足の閾値（ｐａｗ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＰＷＴ）を表すと見なした。明らかな神経因性疼痛の行動（アロディニア）を示したそれらの動物のみを、薬物検査の実験に含めた。両側の足で４ｇ以下のＰＷＴを示した動物および対側の足で８ｇ以上のＰＷＴを示した動物を、アロディニアであると見なした。薬物検査の当日、実験担当者には処置について伏せた。薬物処置は、手術後１５日目に実施された。
【００７２】
薬物処置：
急性薬物効果：
化合物１：経口投与あたり１、３、１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ。
前処置：２時間
モルヒネ塩酸塩：６ｍｇ／ｋｇ遊離塩基重量、１ｍｌ／ｋｇの皮下投与。
前処置：３０分
化合物１およびモルヒネのビヒクル：水中の５％ＤＭＳＯ＋３０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）。
統計学的評価：一元配置分散分析、続いて多重比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定。
【００７３】
慢性薬物効果：
化合物１：経口投与あたり１、３、１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇを１日１回７日間。
モルヒネ塩酸塩：６ｍｇ／ｋｇ遊離塩基重量、１ｍｌ／ｋｇの皮下投与を１日１回７日間。８日目に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを適用することにより機械的アロディニアをモニタリングし（「基礎レベル」）、その後、ラットに化合物１またはモルヒネ塩酸塩を投与して、投与２時間後および３時間後（化合物１）、または投与３０分後（モルヒネ塩酸塩）に再度、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントにより機械的アロディニアをモニタリングした。
ビヒクル：５％ＤＭＳＯ＋３０％ＨＰＢＣＤ（水中）
統計学的評価：一元配置分散分析、続いて多重比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定。
【００７４】
結果
化合物１の急性投与は、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙヘアを用いて機械的アロディニアをモニタリングすることによる評定では、神経因性疼痛行動の有意な好転をもたらした。最低検査用量の１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇは、処置２時間後および３時間後のモニタリングで、ビヒクル処置に比較して足逃避閾値を有意に増大しており、図２を参照されたい（２時間後：ｐ＜０．０１、３時間後：ｐ＜０．０５、一元配置分散分析、続いてフィッシャーＬＳＤ事後検定）。ただ１０ｍｇ／ｋｇでは、統計学的有意性に達することができなかった。モルヒネ塩酸塩６ｍｇ／ｋｇもまた、処置２時間後および３時間後にビヒクル処置に比較して足逃避閾値が有意に増大した（それぞれビヒクルに対してｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。化合物１の７日の連日投与後、検査の３時間前に１〜３、および１０ｍｇ／ｋｇを前処置された後（それぞれビヒクルに対してｐ＜０．０５、０．０１および０．０１）、そして検査の２時間前に１０ｍｇ／ｋｇ投与された後（ビヒクルに対してｐ＜０．００１）に、足逃避閾値の有意な増大が保持された（一元配置分散分析、続いてフィッシャーＬＳＤ事後検定）。これに反して、急性薬物投与前のモルヒネでの慢性処置は、アロディニアへの効果を完全に消滅させており、耐性発現が示された（図２）。
【００７５】
結論
この実施例は、化合物１が急性薬物投与後に神経因性疼痛行動を好転させること、およびその効果が慢性薬物投与後に保持されることを実証し、耐性発現がないことを示している。これに反して、オピオイドであるモルヒネ塩酸塩の効果は、耐性発現により慢性投与後に完全に消失する。
【００７６】
実施例５：雄ＣＤ−１マウスにおけるコンパウンド４８／８０に誘導された引っ掻きに及ぼす化合物１の急性効果
【００７７】
方法
動物：
雄ＣＤ−１マウス（２２〜３０ｇ）（ＩｎｔｅｒＶｉｖｏ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カナダ所在）
【００７８】
薬物処置：
動物に以下の処置の１つを施した：化合物１、ビヒクル（陰性対照）またはジフェンヒドラミン塩酸塩（陽性対照）；Ｎ＝マウス８匹／群。検査の３０分前に、化合物１をビヒクル（水中の５％ＤＭＳＯ＋３０％ＨＰＢＣＤ）中の３、１０および３０ｍｇ／ｋｇの濃度で強制経口投与により投与した。ジフェンヒドラミン塩酸塩は、検査の６０分前に蒸留水（ＢＥＷ＝１．１４）中の５％Ｔｗｅｅｎ  ８０の中の６０ｍｇ／ｋｇの用量で強制経口投与により投与した。処置は全て、１０ｍｌ／ｋｇの投与容量で施された。コンパウンド４８／８０は、生理食塩水中の５０μｇ／０．０２ｍｌで頸部に皮内投与された。
【００７９】
行動のモニタリング：
３０分にわたる引っ掻き回数の視覚的観察。視覚的評定は、処置について伏せられて実施された。
【００８０】
統計学的評価：
一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定。
【００８１】
結果
化合物１は、ビヒクル処置に比較した引っ掻き回数で評定すると、最小有効用量を１０ｍｇ／ｋｇで掻痒を有意に軽減し（それぞれ１０および３０ｍｇ／ｋｇでビヒクル処置に対してｐ＜０．０１／０．００１、一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定）、図３を参照されたい。
【００８２】
結論
この実施例は、化合物１がマウスにおける引っ掻き行動を有意に好転させることを実証し、掻痒に及ぼすプラスの効果を示している。
【００８３】
実施例６：雄スプラグドゥーリー（ＳＤ）ラットにおける探索的自発運動に及ぼす化合物１の急性効果
【００８４】
方法
動物：
雄ＳＤラット（１８０〜２５０グラム、ＮＴａｃ：ＳＤ、Ｔａｃｏｎｉｃ、デンマーク所在）
【００８５】
薬物処置：
動物に以下の処置の１つを施した：検査の１２０分前に、ビヒクル（水中の５％ＤＭＳＯ＋３０％ＨＰＢＣＤ）または化合物１（経口投与あたり３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）。ｎ＝６〜７匹／用量群。
【００８６】
行動のモニタリング：
投与の２時間後に、おがくずの床敷を減らした新規な標準ホームケージにラットを個別に配置した。フォトセルおよびビームを具備したフレームの中にケージを配置して、自発行動の自動記録を可能にした（ＴＳＥ  ＭｏＴｉｌ、ドイツ所在）。探索的自発運動を、３０分間記録した。
【００８７】
統計学的評価：
一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定。
【００８８】
結果
化合物１は、検査された最高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）では雄ＳＤラットにおける探索的自発運動へのいずれの影響も発揮しておらず（一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定）、図４を参照されたい。
【００８９】
結論
この実施例では、化合物１が検査された用量でラットにおける探索的自発運動に影響を及ぼさなかったことが実証され、鎮静を引き起こす傾向がないことが示される。
【００９０】
実施例７：雄スプラグドゥーリー（ＳＤ）ラットにおけるロータロッドパフォーマンスに及ぼす化合物１に急性効果
【００９１】
方法
動物：
雄ＳＤラット（１５０〜１８０グラム、ＮＴａｃ：ＳＤ、Ｔａｃｏｎｉｃ、デンマーク所在）
【００９２】
薬物処置：
動物に以下の処置の１つを施した：それぞれ検査の１２０分前または６０分前に、ビヒクル（水中の５％ＤＭＳＯ＋３０％ＨＰＢＣＤ）、化合物１（経口投与あたり３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）またはジアゼパム１０ｍｇ／ｋｇ（経口投与あたり１０ｍｌ／ｋｇ）。ｎ＝６〜７匹／用量群。
【００９３】
行動のモニタリング：
ラットを、加速するロータロッド（４〜４０ｒｐｍ、ＰａｎＬａｂ）で、薬物検査前の２日間、１日あたり５分間の１トライアルにより訓練した。訓練の２日後に、９０秒より長く回転ロッド上に留まることができたラットのみを、この試験に含めた。検査当日に、ラットを回転ロッド上に配置し、４〜４０ｒｐｍ／５分の速度で加速し、ロッド上で過ごすことが可能な最小時間を０秒とし、ロッド上で過ごす最大時間を３００秒に設定した。化合物１は検査の２時間前に投与したが、陽性対照であるジアゼパムは検査の６０分前に投与した。
【００９４】
統計学的評価：
一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定。
【００９５】
結果
落下までの潜時としての測定で、ビヒクル処置ラットに比較して検査された最高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）では、化合物１は加速するロッド上でバランスをとるラットの能力に影響を及ぼさなかった。これに反して、ジアゼパムは、ロッドから落下するまでの時間を有意に短縮させており（ビヒクル処置に対してｐ＜０．０５）（一元配置分散分析、続いて事後比較のためのフィッシャーＬＳＤ検定）、図５を参照されたい。
【００９６】
結論
この実施例では、化合物１が検査された用量では加速するロッド上でバランスを維持するラットの能力を損なわないことが実証され、運動障害を引き起こす傾向がないことが示される。
【００９７】
実施例８：迅速平衡透析法により推定された血漿タンパク質結合
このアッセイの目的は、検査化合物が血漿タンパク質に結合する度合いを決定することである。
【００９８】
方法
迅速平衡透析法（ＲＥＤ）のデバイス：
透析膜（ＭＷＣＯ約８０００）の垂直円筒により分離された２つの並列チャンバー（血漿および緩衝液）で構成されたディスポーザブルインサートを用いた。ＲＥＤデバイスをＴｅｆｌｏｎ製ベースプレート内に配置して、１００ｒｐｍに設定されたＨｅｉｄｏｌｐｈインキュベータにおいて３７℃で４時間インキュベートした。
【００９９】
アッセイ
このアッセイは、以下のアッセイ記述に従ってリキッドハンドリングシステムで実施した：
・スパイクされた血漿の調製
・Ｔｅｆｌｏｎ製ベースプレート内に関連の数のＲＥＤデバイスを配置して、プレートをインキュベータ上で予備加熱する。
・血漿４００μｌを血漿チャンバーに添加し、ＰＢＳ緩衝液６００μｌを緩衝液チャンバーに添加する。
・１４０ｒｐｍに設定されたＨｅｉｄｏｌｐｈインキュベータ上で３７℃で４時間インキュベートする。
・インキュベーション後に、血漿チャンバーの５０μｌをエッペンドルフ管に移して、ＰＢＳ緩衝液５０μｌを添加する。
・相応に、緩衝液チャンバーの５０μｌをエッペンドルフ管に移して、血漿５０μｌを添加する。
・試料の全てをＭｅＣＮ  ３００μｌで沈殿させる。
・５℃および１４０００ｒｐｍ（１６０００ｇ）で２５分間遠心分離する。
・上清を同容量のＭｉｌｌｉＱ水と共にＨＰＬＣバイアルに移す。
・ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＳＲＭ検出により分析する。
【０１００】
結果
蛋白質結合を、以下の式を利用して計算した。
【数２】
2022500445.tif 000012
遊離画分：ｆｕ＝１００−％タンパク質結合
（式中、
Ａｂｕｆｆｅｒは、緩衝液チャンバーからの試料についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された面積である。
Ａｐｌａｓｍａは、血漿チャンバーからの試料についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された面積である。）
【０１０１】
化合物１の血漿遊離画分は、マウスでは１６％、ラットでは１９％であった。
【０１０２】
結論
化合物１は、薬理学的効果を発揮するほど豊富に血漿中で遊離している。
【０１０３】
実施例９：脳組織結合
この実施例の目的は、迅速平衡透析（ＲＥＤ）法を利用したラット脳ホモジネートへの化合物１のタンパク質結合を評価することである。
【０１０４】
材料と器具
ラット脳ホモジネート
ラット脳タンパク質画分を、成体ウィスターラットから単離された新鮮な脳組織から調製した。雄ウィスターラット（Ｈａｒｌａｎ、オランダ所在）を安楽死させて（認可された方法により）、直ちに脳組織を回収した。白質を解離して、組織ホモジネート（１０％ｗ／ｖ）をリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で調製した。この画分を脳ホモジネートと呼び、この実験で使用した。
【０１０５】
平衡透析のための手順
Ｔｅｆｌｏｎ製ベースプレートの調製
Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）製ベースプレートのウェルを２０％エタノールで１０分間すすいだ。エタノールを除去し、ウェルを蒸留水で２回すすぎ、その後、プレートを使用前に放置して乾燥させた。
【０１０６】
平衡透析
化合物１（１００％ＤＭＳＯ中の２ｍＭ  保存液）１μｌを脳抽出液２００μｌに添加した（最終濃度１０μＭ）。試料２００μｌを試料チャンバー内に入れた。１０ｍＭ  ＰＢＳ  ３５０μｌを緩衝液チャンバー内に添加した。この装置をシーリングテープで覆い、およそ３５０ｒｐｍのオービタルシェーカにおいて３７℃で４時間インキュベートして、平衡にした。その後、緩衝液チャンバーと抽出液チャンバーの両方から同容量を取り出し、別のマイクロ遠沈管に入れた。
【０１０７】
試料分析のための手順
各透析後試料５０μｌを、緩衝液チャンバーおよび抽出液チャンバーから別のマイクロ遠沈管へピペットで移した。抽出液５０μｌを緩衝液試料に添加し、同様に同容量のＰＢＳを回収された抽出試料に添加した。沈殿緩衝液（９０／１０  アセトニトリル：０．１％ギ酸含有水＋内部標準、つまりトルブタミドまたはイブプロフェン、５μｇ／ｍｌ）３００μｌを添加してタンパク質を沈殿させ、化合物を放出させて、ボルテックス処理し、１３，０００〜１５，０００ｇでの１０分の遠心分離の前に氷上で３０分間インキュベートした。その後、上清をバイアルまたは９６ウェルプレートに移して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量測定を実施した。緩衝液チャンバーおよび抽出液チャンバー中の化合物１の濃度を、内部標準に相対的なピーク面積から決定した。
【０１０８】
結果
非結合画分（ｆｕ）を、以下の式を利用して計算した：
【数３】
2022500445.tif 000013
（式中、
Ａｂｕｆｆｅｒは、緩衝液チャンバーからの試料についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された面積である。
Ａｂｒａｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅは、脳ホモジネートチャンバーからの試料についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより決定された面積である。）
【０１０９】
参照化合物：ハロペリドール（高結合）およびカフェイン（低結合）。
【０１１０】
脳組織中の化合物１の遊離画分は、ラットにおいて７％であった。
【０１１１】
結論
化合物１は、薬理学的効果を発揮するほど豊富に脳内で遊離している。
【０１１２】
実施例１０：薬物動態プロファイル
この実施例の目的は、薬物動態データを得ることである。血漿試料は、典型的には６〜８のタイムポイントで採取した（Ｎ＝３〜４）。試料を、１０の標準を用い、長い標準曲線を利用して分析した。血漿試料をタンパク質沈殿させて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた分析後にリキッドハンドリングシステムを利用して希釈した。
【０１１３】
アッセイ
標準の調製
２つの各標準セットを、典型的には以下の濃度レベルで調製した：１、３、１０、１００、３００、１，０００、３，０００、５，０００および１０，０００ｎｇ／ｍｌ。第一の標準セットを、実行の開始時に分析し、較正に使用した。第二の標準セットは、実行の終了時に分析し、ＱＣとして使用した。
【０１１４】
血漿試料の調製
・血漿５０μｌをアセトニトリル中の内部標準１５０μｌで沈殿させた。
・次に、５℃および１６，０００ｇ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管）または３，０００ｇマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で２５分間遠心分離。
・上清５０μｌおよび１５０Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水をＨＰＬＣバイアル／ＭＴＰに移した。
【０１１５】
結果
承認基準
検量線上の各ポイントは、公称値から１５％変動することが許容される（ＬＬＯＱは、２０％変動し得る）。ポイントがより大きく変動する場合、それは除外され得る。標準曲線は、最低でも５ポイント含まなければならず、２つの連続するポイントを除外してはならない。ＱＣは、検量線の中では標準と同じ承認基準を有する。
【０１１６】
薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで計算した。
【表２】
2022500445.tif 000014
【表３】
2022500445.tif 000015
＊  ＡＵＣを０〜８時間で計算し、８時間後の濃度は１４９ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１７】
結論
化合物１は、ラットにおいて長い半減期および低いクリアランスを示す。化合物１はまた、用量直線性（Ｃｍａｘ）、高い血漿暴露および高い暴露を示す。
【０１１８】
実施例１１：ヒトおよびラット肝細胞を用いた内因性クリアランス試験
このアッセイでは、化合物１を凍結保存された肝細胞と共に異なるタイムポイントでインキュベートして、化合物１の消失をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりモニタリングした。このアッセイで用いられた条件を、以下に要約する。
・アッセイでの化合物濃度：１μＭ
・肝細胞とのインキュベーションの時間：３７℃および５％ＣＯ２で０、１５、３０、６０、９０および１２０分
・肝細胞の細胞密度：１０６細胞／ｍｌ
・アッセイ容量：５００μｌ
・測定の重複数：２
・参照化合物：テストステロン（高クリアランス）
【０１１９】
結果
【表４】
2022500445.tif 000016
【０１２０】
結論
化合物１は、ヒトおよびラット肝細胞において低クリアランスを有する。
【図１】
2022500445.tif 000018
【図２】
2022500445.tif 000019
【図３】
2022500445.tif 000020
【図４】
2022500445.tif 000021
【図５】
2022500445.tif 000022
【国際調査報告】
2022500445.tif 000023
2022500445.tif 000024