【手続補正書】
【提出日】平成22年7月22日(2010.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を特異的に調節する化合物を同定するための方法であって、
ａ）単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、および単離したＧαタンパク質を提供するステップと、
ｂ）試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片と単離したＧαタンパク質を組み合わせ培養するステップと、
ｃ）試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＧαタンパク質に対する、ＲＧＳ２１のＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）活性のレベルを決定するステップと、
ｄ）ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性のレベルを調節する試験化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
単離したＧαタンパク質が、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏ１ｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４およびＧα１６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離したＧαタンパク質が、α−ガストデューシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＧＳ２１タンパク質、Ｇαタンパク質または両方のタンパク質が、味覚細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＧＳ２１タンパク質、Ｇαタンパク質または両方のタンパク質が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、ＧＴＰの加水分解の量を測定することによって決定され、ＧＴＰが、放射標識または蛍光標識を用いて標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、上清中に放出された放射標識無機リン酸（３２Ｐｉ）の量を測定することによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、蛍光分光法によって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を特異的に調節する化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、およびＧαタンパク質を発現する宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）宿主細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）宿主細胞中のＲＧＳ２１の活性のレベルを決定するステップと、
ｄ）細胞中のＲＧＳ２１の活性を調節する化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
Ｇαタンパク質が、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏ１ｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４およびＧα１６からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇαタンパク質が、α−ガストデューシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、味覚細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記味覚細胞が、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞およびＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞からなる群から選択されるモデル味覚細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記味覚細胞が、ヒト味蕾細胞に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、機能性味覚受容体、Ｇタンパク質、ＲＧＳ２１タンパク質およびエフェクターを天然に発現する真核細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能性味覚受容体が、甘味物質受容体、苦味受容体およびうま味受容体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エフェクターが、ホスホリパーゼＣβ２（ＰＬＣβ２）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中の細胞内セカンドメッセンジャーのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内セカンドメッセンジャーが、ｃＡＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃＡＭＰのレベルが、ｃＡＭＰの量を直接測定することによって検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｃＡＭＰのレベルが、ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーター配列のコントロール下にあるレポーター遺伝子の発現量を測定することによって検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、放射標識ホスホイノシチドの加水分解のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
細胞内セカンドメッセンジャーが、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）またはジアシルグリセロール（ＤＡＧ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中のリン酸化されたキナーゼのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
リン酸化されたキナーゼが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔ、ＭＥＫおよび上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中の甘味受容体の内在化のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３０】
甘味受容体の内在化のレベルが、蛍光顕微鏡法、細胞下分画、甘味受容体の特異的化学的修飾、またはβ−アレスチンの移行のレベルの測定によって測定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、神経伝達物質、神経ペプチドまたは消化管ペプチドのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３２】
神経伝達物質がＡＴＰである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
消化管ペプチドが、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および胃インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、ＧαサブユニットとＲＧＳ２１との相互作用のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３５】
相互作用のレベルが、蛍光共鳴エネルギー転移または酵母の２ハイブリッドアッセイを使用して測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
甘味を増強する化合物を同定するための方法であって、
ａ）Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を阻害する化合物を同定するステップと、
ｂ）甘味物質単独でおよび化合物と組み合わせて、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを決定するステップと、
ｃ）前記甘味物質によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを、甘味物質単独で検出されたレベルを上回って増加させる化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記甘味物質が、炭水化物の甘味物質、合成の強力な甘味物質、天然の強力な甘味物質、ポリオールおよびアミノ酸からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。
【請求項３９】
請求項１０に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。