(57)【要約】  少なくとも２つのベクターを含む新規の治療用の免疫治療用組成物であって、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している、組成物と、がんならびにその他の疾患および状態を処置するために使用できる患者特異的免疫療法におけるその使用方法とが、本明細書中において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのベクターをコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物であって、各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、前記ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している、免疫治療用組成物。
【請求項２】
免疫治療用組成物であって、
（ａ）細胞内で機能できる核酸配列を各々含む少なくとも２つのベクターを含み、
（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、
（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、
（ｄ）前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、
（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫治療用組成物。
【請求項３】
免疫治療用組成物であって、
（ａ）細胞内で機能できる核酸配列を各々含む少なくとも２つのベクターを含み、
（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、
（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、
（ｄ）前記各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、
（ｅ）前記少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、前記ベクターの各々の間で同一でなく、
（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫治療用組成物。
【請求項４】
各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む１つを超える機能性ＣＡＲをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫治療用組成物。
【請求項５】
前記リンパ球集団は、自家Ｔ細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項６】
前記ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインは、前記抗原に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項７】
前記ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインは、前記抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項８】
前記ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン、前記ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカードメインまたはスペーサードメインによって、前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項９】
前記ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、リーダーペプチドの後ろに位置する、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１０】
前記ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせを含む抗原を標的とする、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１１】
前記ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗メソテリンｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳｏ−１  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、または、これらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、または、これらの任意の組み合わせを含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１２】
前記ＣＡＲのリンカードメインまたはスペーサードメインは、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、かつ前記膜貫通ドメインに結合している、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１３】
前記ＣＡＲはさらに、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインよりもＣ末端側に位置している、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２または３に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの任意の組み合わせの機能性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１６に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１８】
１つのウイルスベクターは、組み込みのためにＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせられて、すべてのキメラ抗原受容体をコードするために使用される（たとえば、アデノ、ＳＶ４０、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクター、またはコスミドベクター）、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫治療用組成物。
【請求項１９】
各ベクターはＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫治療用組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのベクターは、細胞内における核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫治療用組成物。
【請求項２１】
前記核酸分子は、内在性遺伝子の発現を阻害または喪失させる、請求項２０に記載の治療用組成物。
【請求項２２】
抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の細胞は、少なくとも２つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、前記ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している、医薬組成物。
【請求項２３】
抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の細胞は、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
【請求項２４】
抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の細胞は、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）前記各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）前記少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、前記ベクターの各々の間で同一でなく、（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
【請求項２５】
前記リンパ球細胞は、血液がんを有するヒトのＴ細胞である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記血液がんは白血病またはリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記血液がんは多発性骨髄腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ヒトのがんは、口腔（ｃｏｒａｌ）および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器がん（喉頭、肺、および気管支）、骨および関節がん、軟部組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）を含む成人癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫）、ならびに、乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）、脳およびその他の神経系のがん、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物の処置方法であって、前記方法は、少なくとも２つのベクターを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、前記ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、前記医薬組成物は製薬学的に許容される賦形剤をも含み、前記ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法。
【請求項３２】
腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物の処置方法であって、前記方法は、医薬組成物を対象に投与する工程を含み、（ａ）前記医薬組成物は２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）前記ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法。
【請求項３３】
腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物の処置方法であって、前記方法は、医薬組成物を対象に投与する工程を含み、（ａ）前記医薬組成物は２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、（ｂ）各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、または６２のアミノ酸配列を含む機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）前記各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）前記少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、前記ベクターの各々の間で同一でなく、（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、前記ベクターの各々において共有結合しており、前記２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法。
【請求項３４】
前記遺伝子改変されたリンパ球は自家リンパ球であり、前記自家または同種リンパ球は、悪性疾患の再発を予防するために、直接注入により患者に戻される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子改変されたリンパ球は自家Ｔ細胞であり、前記自家Ｔ細胞は、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進するため、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、緩解、またはがんもしくはがん再発の除去を患者特異的にもたらすために、直接注入により患者に戻される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞は、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーの発現に基づいて予め選択されている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞および樹状細胞は造血幹細胞ドナーに由来し、かつ、上述される手順は造血幹細胞移植のコンテクストにおいて行なわれる、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
このＰＣＴ特許出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に準拠して２０１６年９月２日付で出願された米国仮特許出願第６２／３８２，７９１号に基づく優先権の利益を主張する２０１７年９月１日付で出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／４９９２３号に基づく優先権を主張する２０１８年８月２１日付で出願された米国実用特許出願第１６／０７８，２６９号の一部継続出願である２０１８年９月１８日付で出願された米国実用出願第１６／１３４，７３５号に基づく優先権を主張するものであり、これらの各々の全記載内容を引用により本明細書に援用する。
【０００２】
開示の分野
本願はがんの分野に関し、具体的には、機能性キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物、および患者特異的免疫療法におけるその使用方法に関する。
【０００３】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ様式にて電子的に提出された配列表を含み、この配列表の全体を引用により本明細書に援用する。このＡＳＣＩＩのコピー（２０１９年９月１６日作成）のファイル名は「Sequence Listing.txt」であり、サイズは２３６キロバイトである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
がんは、人間の健康にとって非常に致死率の高い脅威の１つである。がんは、米国だけで毎年１３０万人近くが新たに発症し、死亡原因としては心血管疾患に続いて第２位であり、死亡例のおよそ４例に１例はがんによるものである。こうした死亡例のほとんどは固形腫瘍が原因である。いくつかの特定のがんの医学的処置は著しく進歩したが、すべてのがんを合わせた５年生存率は、過去２０年間で約１０％しか改善されていない。がんまたは悪性腫瘍の転移および増殖は急速かつ制御不可能であるため、処置が極めて困難である。現代のがん処置における困難の1つは、生検およびがん診断の後、患者が有効な処置を受けるまでに経過する時間である。この間に、患者の腫瘍は妨げられることなく増殖し得て、その結果、処置が行なわれるよりも前に疾患がさらに進行してしまう。このことは、がんの予後および転帰に悪い影響を及ぼす。
【０００５】
キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）は、（１）細胞外の抗原結合モチーフ、（２）結合／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内のＴ細胞シグナル伝達モチーフという３つの必須ユニットからなる混成分子である（Long AH, Haso WM, Orentas RJ. Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigen receptor. Oncoimmunology. 2013; 2 (4): e23621）。ＣＡＲの抗原結合モチーフは、一般的に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最も小さい結合ドメインである一本鎖可変断片（single chain Fragment variable; ScFv）を模して作製される。受容体リガンド（すなわち、腫瘍において発現するＩＬ−１３受容体に結合するように設計されたＩＬ−１３）などの他の抗原結合モチーフ、完全型免疫受容体、ライブラリ由来のペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（たとえば、ＮＫＧ２Ｄ）も、設計によって組み込まれている。ＣＡＲを発現させる他の細胞標的（ＮＫまたはガンマ−デルタＴ細胞など）も作製中である（Brown CE et al Clin Cancer Res. 2012;18(8):2199-209; Lehner M et al. PLoS One. 2012; 7 (2): e31210）。ＣＡＲベクターを用いて形質導入するＴ細胞集団のうち活性が最も高いものを明らかにし、最適な培養および増殖技術を見つけ、ＣＡＲタンパク質の構造自体を分子レベルで詳細に解明するには、さらに相当の労力が費やされなければならない。
【０００６】
ＣＡＲの結合モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインであってよい、または、長い可動性リンカーとして設計できる。ＩｇＧ定常ドメイン由来構造モチーフなどの構造モチーフを使用して、Ｔ細胞細胞膜表面から遠い位置までｓｃＦｖ結合ドメインを引き延ばすことができる。このことは、結合ドメインが腫瘍細胞表面膜の特に近くにあるいくつかの腫瘍標的（ジシアロガングリオシドＧＤ２など；Ｏｒｅｎｔａｓら、この観察は未公開）にとって重要である可能性がある。これまでＣＡＲにおいて使用されているシグナル伝達モチーフはいずれも、ＣＤ３−ゼータ鎖を含む。というのは、このコアモチーフはＴ細胞活性化にとって重要なシグナルであるためである。最初に報告された第２世代のＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴とするものであった。このモチーフは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達モチーフをさらに含有する第３世代のＣＡＲに使用された（Zhao Y et al J Immunol. 2009; 183 (9): 5563-74）。新技術が出現したことによって、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に結合したビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８からの古典的な「シグナル２」の存在を、ＣＡＲ自体がコードする必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を用いた第３世代ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターを超えるものではないことが分かり、さらに、白血病マウスモデルにおいて第２世代ベクターを明らかに超える利益を提供するものではなかった（Haso W, Lee DW, Shah NN, Stetler-Stevenson M, Yuan CM, Pastan IH, Dimitrov DS, Morgan RA, FitzGerald DJ, Barrett DM, Wayne AS, Mackall CL, Orentas RJ. Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2013; 121 (7):1165-74; Kochenderfer JN et al. Blood.  2012; 119 (12):2709-20）。このことは、第２世代のＣＤ２８／ＣＤ３−ゼータ（Lee DW et al. American Society of Hematology Annual Meeting. New Orleans, LA; December 7-10, 2013）およびＣＤ１３７／ＣＤ３−ゼータシグナル伝達様式（Porter DL et al. N Engl J Med. 2011; 365 (8): 725-33）におけるＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床での成功によって証明されている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの他のメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続性シグナルを提供できる（Yvon E et al. Clin Cancer Res. 2009;15(18):5852-60）。これと同様に重要なのは、ＣＡＲ  Ｔ細胞集団を培養した培養条件である。
【０００７】
現時点で、ＣＡＲ療法をがんに対してさらに幅広く効果的に適応するにあたっての課題は、有望な標的がほとんど存在しないことに関連する。細胞表面抗原に結合するバインダーの作製は現在では容易に達成できるが、腫瘍に特異的でありかつ正常組織に影響を及ぼさない細胞表面抗原の発見は、依然として非常に困難である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞に、これまでよりも強い標的細胞特異性を与え得る方法として、複数のＣＡＲアプローチを組み合わせて使用する方法がある。１つの系において、ＣＤ３−ゼータシグナルユニットおよびＣＤ２８シグナルユニットを、同一細胞中に発現させた２つの異なるＣＡＲコンストラクトのそれぞれに分割し、別の系において、２つのＤｕｏＣＡＲを同一Ｔ細胞中に発現させ、ただし、そのうち一方のほうが親和性が低いため、もう一方のＣＡＲを最初に結合させて、後者のＣＡＲの活性を最大限とする必要がある（Lanitis E et al. Cancer Immunol Res. 2013;1(1):43-53; Kloss CC et al. Nat Biotechnol. 2013;31(1):71-5）。１つのｓｃＦｖに基づくＣＡＲを免疫療法剤として作製するにあたっての２つめの課題は、腫瘍細胞が均一でないことである。少なくとも１つのグループが、ＣＡＲを用いた神経膠芽細胞腫の治療法を開発しており、この方法は、エフェクター細胞集団が同時に複数種の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を標的とするもので、標的抗原を有さない集団の増殖回避を試みたものである（Hegde M et al. Mol Ther. 2013;21(11):2087-101）。
【０００８】
Ｔ細胞に基づく免疫療法は、合成生物学における新たな最先端領域となった。この高効力の細胞を腫瘍微小環境へ誘導する目的で複数のプロモーターおよび遺伝子産物が構想されており、Ｔ細胞は、腫瘍微小環境において、負の制御シグナルを回避して効果的な腫瘍の死滅を仲介し得る。ＡＰ１９０３を使用した誘導性カスパーゼ９コンストラクトの薬剤誘発性二量化による不要Ｔ細胞の除去は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチを薬理学的に始動させ得る１つの方策を提示するものである（Di Stasi A et al. N Engl J Med. 2011;365(18):1673-83）。さらに、おとりの受容体を発現させることによって、形質転換増殖因子βの負の制御作用に反応しないエフェクターＴ細胞集団を作製したことにより、エフェクターＴ細胞を操作して最適な抗腫瘍活性を達成できる程度が示されている（Foster AE et al. J Immunother. 2008;31(5):500-5）。
【０００９】
したがって、ＣＡＲは内因性Ｔ細胞受容体と類似する様式にてＴ細胞活性化をトリガできるようではあるが、現時点では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ＋  Ｔ細胞の増殖が限られていること、この細胞が輸液後すぐに消失し臨床活性の実現を妨げていること、基礎をなす内科的な疾患または状態が再発すること、および、診断後にこのようなＣＡＲ＋  Ｔ細胞を使用して適時にがんを処置するまでに時間がかかり過ぎることが大きな障害となっていて、ＣＡＲに基づく技術の臨床応用は進んでいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、上述される問題を呈さずにがん特異的な意図される治療特性を呈し得るＣＡＲに基づく療法を使用することによってがんを処置するための組成物および方法を発見することが、当技術分野において緊急的かつ長年にわたって必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、機能性キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物と、がんならびにその他の疾患および／または状態の処置に使用できる患者特異的免疫療法におけるその使用方法とを提供することによって、上述される必要性に対処するものである。
【００１２】
特に、本明細書中に開示および記載される本発明は、少なくとも２つのベクターをコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物を提供するものであり、各ベクターは機能性ＤｕｏＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、当該免疫治療用組成物は、自家リンパ球を形質導入して活性のある患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞集団を発生させるために使用でき、これを直接注入により患者に戻すことによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる。
【００１３】
発明の概要
２つ以上のベクターで形質導入したリンパ球を含む新規の養子免疫治療用組成物と、がんならびにその他の疾患および状態を処置するために使用できる患者特異的併用免疫療法におけるその使用方法とが、本明細書中において提供される。
【００１４】
よって、一態様において、Ｄｕｏキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクターと、ＤｕｏＣＡＲを発現する当該レンチウイルスベクターをコードする核酸分子とが、本明細書中において提供される。また、たとえば対象におけるがんを処置するための、ＤｕｏＣＡＲを発現する開示されるレンチウイルスベクター、宿主細胞、および核酸分子の使用方法も提供される。
【００１５】
一態様において、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、当該ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。
【００１６】
一実施形態において、少なくとも３つのベクター（ＴｒｉｏＣＡＲ）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。
【００１７】
一実施形態において、少なくとも４つのベクター（ＱｕａｔｒｏＣＡＲ）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。
【００１８】
さらに別の一実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のベクター（たとえば、「ｎＣＡＲ」）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、当該ｎＣＡＲセットのユニークな構成要素の各々は、ＣＡＲ産物中に組み入れられて、本明細書中において「ｎＣＡＲ」（たとえば、ＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、ＱｕａｔｒｏＣＡＲ、ＰｅｎｔａＣＡＲ、ＨｅｘａＣＡＲ、ＨｅｐｔａＣＡＲ、ＯｃｔａＣＡＲ、ＮｏｎａＣＡＲ、およびＤｅｃａＣＡＲなど）と称されるユニークなＣＡＲ組成物を構成する。
【００１９】
一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、当該免疫治療用組成物は、（ａ）細胞内で機能できる核酸配列を各々含む少なくとも２つのベクターを含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）当該ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００２０】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、当該免疫治療用組成物は、（ａ）細胞内で機能できる核酸配列を各々含む少なくとも２つのベクターを含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）当該少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、当該ベクターの各々の間で同一でなく、（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００２１】
一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、各ベクターは、１つを超える機能性ＣＡＲをコードする。
【００２２】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、１つ以上のシグナル伝達モチーフの組み合わせは、１つ以上のベクター上において同一である。
【００２３】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、１つ以上の複数の結合ドメインは、１つ以上のベクター上において同一である。
【００２４】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、リンパ球集団は、自家Ｔ細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む。
【００２５】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインは、上記抗原に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む。
【００２６】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインは、上記抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【００２７】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカードメインまたはスペーサードメインによって、膜貫通ドメインに結合されている。
【００２８】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、リーダーペプチドの後ろに位置する。
【００２９】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＰＲＡＭＥペプチドとＭＨＣとの組み合わせ、またはこれらの任意の組み合わせを含む抗原を標的とする。
【００３０】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗メソテリンｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ（一本鎖ＴＣＲコンストラクトを含む）抗原結合ドメイン、抗ＭＡＧＥ−Ａ３  ＴＣＲ、または、これらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、または、これらの任意の組み合わせを含む。
【００３１】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲのリンカードメインまたはスペーサードメインは、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、かつ膜貫通ドメインに結合している。
【００３２】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、ＣＡＲはさらに、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【００３３】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含む。
【００３４】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインよりもＣ末端側に位置している。
【００３５】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３６】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ−１、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、またはこれらの任意の組み合わせの、機能性シグナル伝達ドメインを含む。
【００３７】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、１つのベクターは、組み込みのためにＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせられて、すべてのキメラ抗原受容体をコードするために使用される（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクター、ＲＮＡ、プラスミド、コスミド、または任意のウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）。
【００３８】
別の一実施形態において、各ベクターがＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターである免疫治療用組成物が、単独で、または、トランスフェクション試薬またはＲＮＡもしくはＤＮＡを細胞中に運搬する方法（エレクトロポレーションが挙げられるが、これに限定されない）との組み合わせで提供される。
【００３９】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、少なくとも１つのベクターは、細胞内における核酸の発現を調節する核酸分子を発現する。
【００４０】
別の一実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、核酸分子は、内在性遺伝子の発現を阻害または喪失させる。
【００４１】
特定の実施形態において、免疫治療用組成物が提供され、ここで、活性のある患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団は、リンパ球回収または腫瘍生検から１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、または１か月で発生し、活性のある患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団は、注入によりがん患者に戻すことによって、患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる。
【００４２】
一態様において、上述されるキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子が、本明細書中において提供される。
【００４３】
本発明に係る免疫治療用組成物の患者特異的自家リンパ球集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様において、ＤｕｏＣＡＲは、がん患者の診断、モニタリング、および／もしくは無増悪生存などの処置転帰の予測において使用するための、またはこのような処置の進捗をモニタリングするための、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態において、開示されるＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどのベクター中に含有されてよい。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはこれらの組み合わせである。
【００４４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの特定の実施形態において、２つ以上のレンチウイルスベクターは、たとえば、両栄養性マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ−Ａ］、ヒヒ内在性ウイルス（ＢａＥＶ）、ＧＰ１６４、テナガザル白血病ウイルス［ＧＡＬＶ］、ＲＤ１１４、ネコ内在性ウイルスといったレトロウイルス由来ＧＰ、ならびに水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ］、麻疹ウイルス、家禽ペストウイルス［ＦＰＶ］、エボラウイルス［Ｅｂｏ Ｖ］、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス［ＬＣＭＶ］といった非レトロウイルス由来ＧＰ、ならびにこれらのキメラバリアント（たとえば、ＧＡＬＶの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラＧＰ、またはＭＬＶ−Ａ  ＧＰの細胞質側末端（指定ＴＲ）に融合させたＲＤ１１４  ＧＰを含むが、これらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、異なるウイルス糖タンパク質（ＧＰ）でシュードタイプ化されている。
【００４５】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの特定の実施形態において、ベクターはプロモーターをさらに含み、このプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーター、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００４６】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の一実施形態において、ＣＡＲを発現するベクターは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現を制御するため、または自殺スイッチによってＣＡＲ−Ｔ細胞を除去するための、１つ以上の作動可能な要素を含むようにさらに改変されてよい。この自殺スイッチは、たとえば、アポトーシス誘発シグナル伝達カスケードまたは細胞死を誘発する薬物を含んでよい。好ましい一実施形態において、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようさらに改変されてよい。
【００４７】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の一態様において、ＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子を含む宿主細胞がさらに提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、対象から得られる初代Ｔ細胞などのＴ細胞である。一実施形態において、宿主細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。一実施形態において、宿主細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、患者産物から直接精製されたＣＤ４＋リンパ球およびＣＤ８＋リンパ球から、釣り合いを考慮せずに選択される。別の一実施形態において、産物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の数は、特定数である。別の一実施形態において、特定のＴ細胞サブセットが、Ｔナイーブ細胞（Ｔｎ）、Ｔエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）、Ｔセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、誘導性Ｔ制御性細胞（ｉＴｒｅｇ）、Ｔサプレッサー細胞（Ｔｓ）、Ｔ幹細胞メモリー細胞（Ｔｓｃｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を含む表現型マーカーによって特定されて利用される。
【００４８】
さらに別の一実施形態において、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の集団を含む免疫治療用組成物を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物が提供され、ここで、当該集団の細胞は、少なくとも２つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。
【００４９】
さらに別の一実施形態において、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の集団を含む免疫治療用組成物を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物が提供され、ここで、当該集団の細胞は、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）当該ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００５０】
さらに別の一実施形態において、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の集団を含む免疫治療用組成物を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物が提供され、ここで、当該集団の細胞は、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）当該少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、当該ベクターの各々の間で同一でなく、（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００５１】
一実施形態において、がんは、１種以上の化学療法剤に反応しない難治性がんである。がんは、造血器がん、骨髄異形成症候群、膵臓がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫、またはその他の血液がんおよび固形腫瘍、またはこれらの任意の組み合わせを含む。別の一実施形態において、がんは、白血病（たとえば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））などの血液がん、リンパ腫（たとえば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫）、または多発性骨髄腫、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５２】
さらに別の一実施形態において、がんは、口腔（ｃｏｒａｌ）および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器がん（喉頭、肺、および気管支）、骨および関節がん、軟部組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）を含む成人癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫）、ならびに、乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）、脳およびその他の神経系のがん、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５３】
別の一態様において、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物が提供され、これによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が発生する。
【００５４】
別の一態様において、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つ以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団を含む医薬組成物が提供され、これによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が発生する。
【００５５】
別の一態様において、活性のある患者特異的自家抗腫瘍Ｄｕｏ  ＣＡＲ含有リンパ球細胞の作製方法が提供される。この方法は、抗原に特異的に結合する２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターまたは核酸分子をリンパ球細胞に形質導入し、これによって、活性のある患者特異的自家抗腫瘍Ｄｕｏ  ＣＡＲ含有リンパ球細胞を作製する工程を含む。
【００５６】
さらに別の一態様において、ＲＮＡ操作リンパ球細胞の集団の発生方法が提供され、これは、２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞集団中に導入し、これによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を発生させる工程を含む。
【００５７】
別の一態様において、腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、この方法は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つ以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家リンパ球細胞集団を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物を対象に投与し、これによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を発生させる工程を含む。
【００５８】
別の一態様において、腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、この方法は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家リンパ球細胞集団を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物を対象に投与して、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を発生させる工程を含み、この細胞集団は、直接注入により患者に戻すことによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍安定化、縮小、除去、またはがんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの任意の組み合わせを患者特異的にもたらすことができる。
【００５９】
一実施形態において、腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、この方法は、少なくとも２つのベクターを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、医薬組成物は製薬学的に許容される賦形剤をも含み、当該ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００６０】
別の一実施形態において、腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、この方法は、医薬組成物を対象に投与する工程を含み、（ａ）医薬組成物は２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）当該ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該ベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００６１】
さらに別の一実施形態において、腫瘍抗原の高発現に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、この方法は、医薬組成物を対象に投与する工程を含み、（ａ）医薬組成物は２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、（ｂ）各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、（ｃ）各ＣＡＲは、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み、（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、（ｅ）当該少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせは、当該ベクターの各々の間で同一でなく、（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは、当該ベクターの各々において共有結合しており、当該２つ以上のベクターの組み合わせは、１つ以上のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００６２】
特定の実施形態において、遺伝子改変されたリンパ球は自家Ｔ細胞リンパ球であり、ここで、自家または同種Ｔ細胞リンパ球は、悪性疾患の再発を予防または寛解するために、直接注入により患者に戻される。
【００６３】
特定の他の実施形態において、遺伝子改変されたリンパ球は自家Ｔ細胞リンパ球であり、ここで、自家リンパ球は、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞リンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進するため、そしてその結果として、腫瘍安定化、縮小、除去、またはがんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの任意の組み合わせを患者特異的にもたらすために、直接注入により患者に戻される。
【００６４】
さらに別の一実施形態において、Ｔ細胞は、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーの発現に基づいて予め選択されている。
【００６５】
さらに別の一実施形態において、Ｔ細胞は造血幹細胞ドナーに由来し、かつ、上述される手順は造血幹細胞移植のコンテクストにおいて行なわれる。
【００６６】
特定の実施形態において、リンパ球細胞が特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーの発現に基づいて予め選択されている方法が提供される。
【００６７】
特定の実施形態において、リンパ球細胞がＴ細胞であって造血幹細胞ドナーに由来しかつ上述される手順は造血幹細胞移植のコンテクストにおいて行なわれる方法が、本明細書中において提供される。
【００６８】
さらに別の一態様において、がんと診断されたヒトにおいて遺伝子操作患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の持続性の集団を発生させるための方法が提供される。一実施形態において、この方法は、本明細書中に記載される１つ以上の患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を、それを必要とするヒト患者に投与する工程を含み、ここで、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の持続性の集団、またはこのリンパ球細胞の子孫の集団は、このヒトにおいて、投与後、少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、２年間、または３年間持続する。
【００６９】
一実施形態において、ヒトにおける子孫リンパ球細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の一実施形態において、Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞である。
【００７０】
本明細書中に記載される方法のすべての態様および実施形態において、上述される、腫瘍抗原の高発現に関連するがん、疾患、障害、または状態は、いずれも、本明細書中に開示されるＤｕｏ  Ｃａｒ免疫治療用組成物の１つ以上を含む患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を使用して処置または予防または寛解され得る。
【００７１】
さらに別の一態様において、上述されるように、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を含むＤｕｏＣａｒ免疫治療用組成物を作製するための、または、上述されるように、対象における腫瘍抗原の高発現に関連するがん、疾患、障害、もしくは状態のうち任意のものを予防、処置、もしくは寛解するための、キットが提供され、これは、上記に開示される核酸分子、ベクター、宿主細胞、もしくは組成物のうち任意の１種、またはこれらの任意の組み合わせの入った容器と、当該キットの使用説明とを含む。
【００７２】
以上、本発明に係る組成物および方法を、ＤｕｏＣＡＲの作製および利用を参照しながら例証したが、本明細書中においては、当該組成物および方法がＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの作製および利用を含むことが特に意図される。
【００７３】
さらに別の一態様において、免疫治療用組成物は、少なくとも１つのベクターをコードする１つ以上の単離された核酸分子を含み、ここで、このベクターは、ＤｕｏＣＡＲをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡをもたらす核酸配列を含有し（すなわち、多シストロン性（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の核酸、または１つを超える転写物をもたらす核酸）、その結果として、２つ以上の同一でない抗原標的に結合できる能力がもたらされ、これにより、当該ベクターを発現する１つの細胞において多重抗原特異性が生じる。
【００７４】
さらに別の一態様において、免疫治療用組成物は、上述されるように、少なくとも２つのベクターをコードする１つ以上の単離された核酸分子を含み、ここで、各ベクターはさらに、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに結合したｓｃＦｖなど）と共にインキュベートまたは同時投与されると機能性キメラ抗原受容体を再構成する機能性タグまたは抗タグ結合部位（ＡＴ−ＣＡＲ）をコードし、これにより、こうした２つのベクターが組み合わされている結果として、２つ以上の同一でない抗原結合ドメインに結合できる能力がもたらされ、これにより、これら２つのベクターを発現する細胞において多重抗原特異性が生じる。
【００７５】
さらに別の一態様において、免疫治療用組成物は、上述されるように、少なくとも２つのベクターをコードする１つ以上の単離された核酸分子を含み、ここで、各ベクターは、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに結合したｓｃＦｖなど）と共にインキュベートまたは同時投与されると機能性キメラ抗原受容体を再構成する機能性タグまたは抗タグ結合部位（ＡＴ−ＣＡＲ）をコードし、ここで、各ベクターは、可溶性タンパク質もしくはタンパク質改変構造に結合して多重抗原特異性をもたらすことのできるユニークなタグ（または抗タグ）を発現する、または、各ベクターは、可溶性結合ドメインの１つのみに結合して、ＡＴ−ＣＡＲにコードされる細胞内シグナル伝達モチーフとタグ化（または抗タグ化）バインダーの抗原結合ドメインとの特異的結合をもたらすユニークなタグ（または抗タグ）を発現する。
【００７６】
上述される実施形態および態様中に開示される、ＤｕｏＣＡＲベクターの作製、組成物および方法の各々についての実施形態（限定を加えるものではない）において、２つのベクターは別個に作製でき、次いで逐次的にまたは同時にＴ細胞に添加できる。別の一実施形態（限定を加えるものではない）において、２つ以上のベクターのプラスミドＤＮＡは、産生用細胞のトランスフェクションよりも前もしくはその間に結合させることにより、または、産生用細胞のゲノム中に一体化させることにより、複数のＤｕｏＣＡＲベクター粒子を含有するウイルスベクターの混合物を生成でき、これに続いて、患者のＴ細胞の形質導入および遺伝子改変に使用することができる。
【００７７】
本明細書中において具体的に意図されるＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、およびＱｕａｔｒｏＣＡＲの様々な態様および実施形態の各々について、機能性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、９、２１、２５、２９、３１、３５、３９、４３、４７、４９、５１、５３、５５、５９、もしくは６１のヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００７８】
本明細書中において具体的に意図されるＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、およびＱｕａｔｒｏＣＡＲの様々な態様および実施形態の各々について、各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、もしくは６２のアミノ酸配列またはこれらの任意の組み合わせを含む機能性ＣＡＲをコードする。
【００７９】
上述されるような、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現する２つ以上のレンチウイルスベクター、宿主細胞、および方法は、本明細書中において詳細に記載される具体的な態様および実施形態の範囲を超えて有用であることが理解される。上述される本開示の特徴および利点は、付属の図面を参照して記載される以下の詳細な説明によって、さらに明らかになるであろう。
【００８０】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい実施形態についての以下の詳細な説明は、付属の図面と併せて読むことによって、理解がより深まる。本発明を例証する目的で、図面中には、現時点で好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は図面中に示される実施形態の厳密な配置および手段に限定されないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】別個の市販品として作製できる４つの産物（実施例１〜４）を示す。これらのＤｕｏＣＡＲセットは、３つの白血病関連抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を発現しているヒトＢ細胞性悪性腫瘍を標的とするように作製できる。産物１においては、活性化されたＴ細胞集団を同時形質導入するために２つの遺伝子ベクターが使用される。第１のベクターは、ＣＤ８膜貫通領域（８）により接続された１つの細胞内ドメイン（ｚ、ＣＤ３ゼータ鎖）に結合した２つの抗原結合ドメイン（ＣＤ１９、ＣＤ２０）をコードしている。第２のベクターは、ＣＤ２２結合ドメインおよび２つのシグナル伝達ドメイン（ＢＢ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢに由来；およびｚ）をコードしている。第２の産物（実施例２）は、第１のベクターと、ＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに結合したＣＤ１９およびＣＤ２０結合ドメインとを有する。第２のベクターは、ＣＤ２２結合ドメインとＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインとをコードしており、第３世代ＣＡＲベクターのシグナル伝達パッケージ（３つの異なるシグナル伝達ドメイン）を本質的に再現したものである。第３の産物（実施例３）においては、第１のベクターが、ＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインに結合したＣＤ２０およびＣＤ２２結合ドメインをコードしており、第２のベクターが、ＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに結合したＣＤ１９結合ドメインをコードしている。第４の産物（実施例４）においては、第１のベクターが、ＣＤ２０およびＣＤ２２結合ドメインとＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインとをコードしている。第２のベクターは、ＣＤ１９結合ドメインおよびｚシグナル伝達ドメインをコードしている。
【図２】Ｂ細胞性悪性腫瘍を標的とする治療用製品のためのＤｕｏＣＡＲに組み込むことができるすべての単独要素を示す。学術用語は図１中と同様である。
【図３】炎症性疾患または自己免疫疾患および感染症を含む複数の治療上の要求に適用できるＤｕｏＣＡＲのための一般的なスキームを示す。図中、ａ−ＣＤＸ、ａ−ＣＤＹ、ａ−ＣＤＺは、３つの異なる標的抗原ＣＤＸ、ＣＤＹ、およびＣＤＺのそれぞれに対して特異的な抗原結合ドメインを指す。ＣＡＲの細胞内部分は、すべて、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインのいずれかに結合したＣＤ８リンカー・膜貫通ドメインを含む（図１に示されるように）。これらの２つのベクターのうち任意のものの具体的な組み合わせ（たとえばＡとＦで、抗原Ｘ、Ｙ、およびＺが標的とされ、ＣＤ３−ゼータおよび４−１ＢＢによって細胞内シグナルを提供する）を１つのベクター中に含めたものが、具体的な治療上の要求に応じて規定され得る。
【図４】各ベクターが２つの抗原を標的としているＤｕｏＣＡＲセットのための一般的なスキームを示す。図３中と同じベクターは、個々の文字名称も同じである（図３中と図４中とで、Ａは同じである）。新しい第４の抗原結合ドメインがａ−ＣＤＷで示される。４つの抗原を標的とし得る１つの産物はＡ＋Ｔ  Ｄｕｏ  ＣＡＲセットである。この場合、細胞外抗原ＣＤＸ、ＣＤＹ、ＣＤＺ、およびＣＤＷが標的とされ、ＣＤ３−ゼータおよびＣＤ２８細胞内シグナルの両方が提供される。
【図５】文献中に示される現行のＣＡＲ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を、本発明に係るＤｕｏＣＡＲ（Ｅ、Ｆ、Ｇ）と比較して示す。リンカー・膜貫通ドメイン（個々の白抜き四角）に結合した１つの結合ドメイン（対になった黒色、白抜き、または縞つきの丸、それぞれに特異性が異なる）の発現を誘発するＣＡＲ発現ベクターを作製できる。図ａ中の太い灰色の線は、形質細胞膜を表す。この図において、一対の黒丸は抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを表し得て、一対の白抜き丸は抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを表し得て、一対の縞つきの丸は抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを表し得て、これらのすべては、たとえばＧＧＧＧＳの多量体（１、２、３、４、５、または６回リピート）などの連結アミノ酸配列によって結合されている。細胞内において、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、およびＣＤ３−ゼータ鎖に由来するリンパ球シグナル伝達ドメインを、図示される通りに結合させ得る。（Ａ）単独ＣＡＲにおいては、１つの結合ドメインが膜貫通および２つのシグナル伝達ドメインに結合していて、第２世代ＣＡＲが作製される。（Ｂ）分割ＣＡＲにおいては、２つの異なるバインダーが、２つの別個の抗原を認識した際に有効なＴ細胞シグナル伝達をもたらすために結合していなければならない１つのシグナル伝達ドメインと共に表されている。（Ｃ）タンデムＣＡＲにおいては、２つの結合ドメインが１つのシグナル伝達ドメインに結合している。この場合、いずれかのドメインの結合によって十分なＴ細胞活性化が誘発される。（Ｄ）１つのベクターからの複数のＣＡＲにおいては、１つのベクターから２つの十分な機能性を有するＣＡＲが発現していて、各々は１つのみの抗原に結合できる。（Ｅ）一方、ＤｕｏＣＡＲは、２つのベクターからなり、少なくとも３つの結合ドメインを発現し、シグナル伝達ドメインの組み合わせは複数あり得る。ＤｕｏＣＡＲを区別する本質的な特徴は、２つ以上の転写物が発現していること、結合ドメインが複数あること（少なくとも１つは複数を標的とする）、および発現された２つの細胞表面タンパク質のうち少なくとも１つが十分に機能的なシグナル伝達特性を有することである。（Ｆ）ＤｕｏＣＡＲ単一特異性可溶性バインダー様式においては、ベクターによりコードされるＣＡＲ部分が、膜貫通および細胞内シグナル伝達モチーフをもコードするタグまたは抗タグモチーフを発現する（ＣＡＲベースベクター、細胞内モチーフが同一でない）。ベースベクターは、抗原と相互作用するｓｃＦｖドメインとタグまたは抗タグモチーフとの両方を含有する可溶性タンパク質と結合して、自身とＣＡＲベースタンパク質との結合に介在する。可溶性タンパク質がＣＡＲベースタンパク質に結合すると、ＤｕｏＣＡＲが介在する抗腫瘍活性に介在する同じ構造特徴［（Ｅ）におけるものと同じ］が再構成される。（Ｇ）二重特異性可溶性バインダー様式のＤｕｏＣＡＲにおいては、二重特異性「タグ」−「抗タグ」相互作用がユニークであるために、可溶性バインダーのうちの１つのみがベースベクターのうちの１つのみに結合できる。この場合、ベースベクター上の黒菱形と可溶性デュアルｓｃＦｖタンパク質上の山形のバインダーとが「ビオチン」−「抗ビオチン」相互作用を示し得て、第２のＣＡＲベースベクター上の黒の三日月型が単一特異性ｓｃＦｖ構造上の黒長円と相互に作用して、「ＦＩＴＣ」−「抗ＦＩＴＣ」相互作用を示し得る。
【図６】第２世代（２つの共刺激ドメイン）様式と第３世代（３つの共刺激ドメイン）様式とで異なるＣＡＲ発現ベクターが形質導入された初代ヒトＴ細胞上におけるＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現レベルを示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：ＣＡＲなし（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ＢＢｚ）、およびその他の第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−ＢＢｚ）。ＣＡＲの表面発現レベルをフローサイトメトリーによって検出し、ｙ軸上に平均蛍光強度（ＭＦ）として示す。すべてのコンストラクトが全く同一のＣＡＲ結合ドメインを発現していたが、２つの第２世代ＣＡＲのＭＦＩは大幅に明るかった。
【図７】ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲの細胞表面発現を示す。ヒトＴ細胞を、ＩＬ−２の存在下においてＣＤ３−ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化し、２つのベクター（１つはタンデムＣＤ２０−ＣＤ１９  ＣＡＲをコードし、もう１つは単独ＣＤ２２  ＣＡＲをコードしており、したがって２＋１  Ｄｕｏセット様式）で形質導入し、次いで、フローサイトメトリーにより、染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、またはＣＤ２２−ｓｃＦｖドメインの発現について分析した。対になった列について、左列はＣＤ２０  ｓｃＦｖおよびＣＤ１９  ｓｃＦｖの、右列はＣＤ２２  ｓｃＦｖおよびＣＤ１９  ｓｃＦｖの二重染色を示す。１段目は形質導入していないＴ細胞（ＵＴＤ）を示し、かくして、結合がないことを示す。２段目は、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび細胞内ＣＤ２８およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲベクター（２０−１９−２８ｚ）をコードするＬＶで形質導入したＴ細胞を示す。ＣＤ２０およびＣＤ１９の結合についての二重染色がみられるが（左パネル）、右パネルではＣＤ１９の結合のみがみられる。３段目は、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２２  ＣＡＲベクター（２２−ＢＢｚ）で形質導入したＴ細胞を示す。ＣＤ１９またはＣＤ２０についての二重染色がみられず（左パネル）、１つの細胞集団のみがＣＤ２２と結合できたことがわかる（右パネル）。４段目では、２段目および３段目の両ベクターを含むＤｕｏセットでＴ細胞を形質導入している。このＤｕｏセットのみが全３つのＣＡＲコード結合ドメインを発現している（４２％の細胞がＣＤ２０＿１９を発現し（左パネル）、３８％がＣＤ２２およびＣＤ１９結合ドメインを発現している（右パネル））。ＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖは、Ｄｕｏセットを含む２つの別個の膜貫通型タンパク質の各々にあるため、３８％は、この実施例において真にＤｕｏセットを発現している集団を表している。
【図８】ＤｕｏＣＡＲを発現しているＴ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示す。図７中に記載されるように、単独ＣＡＲ要素（２０＿１９−２８ｚまたは２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（２０＿１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚ）で形質導入したヒトＴ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、４つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり、２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）にて使用した。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した白血病細胞株は以下である：Ｒａｊｉ（全３つの標的抗原を発現）、ＲＥＨ（全３つの標的抗原を発現）、Ｋ５６２（コントロール、標的を発現しない）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現）、Ｋ５６２−ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現）、およびＫ５６２−ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現）。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０−１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚ、２＋１  Ｄｕｏセット）のみが、両白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）と３つの単独発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２０、Ｋ５６２−ＣＤ２２）のすべてとに対して、高い細胞溶解活性を呈した。
【図９】２つの異なるＬＶ調製方法によって達成された、初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ細胞表面発現を示す。図７中と同じ方法およびデータ分析を用い、その結果、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２に対して特異的なＤｕｏＣＡＲ（１つのＣＡＲがタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーで、第２のＣＡＲがＣＤ２２バインダーからなる、２＋１  Ｄｕｏセット）で形質導入した細胞を作製した。データの１列目は、ＣＤ１９およびＣＤ２０バインダーの発現をフローサイトメトリーで分析したものを示し、２列目は、ＤｕｏＣＡＲ発現細胞においてＣＡＲとして存在するＣＤ２２およびＣＤ１９バインダーをフローサイトメトリーで分析したものを示し、形質導入していない集団、単独ＣＤ２２−ＣＡＲ形質導入の集団、ＣＤ２２およびＣＤ２０＿１９  ＣＡＲの二重形質導入集団、ならびにタンデムＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲで単独形質導入した集団という４つの別個の集団が、それぞれ左下、左上、右上、および右下の象限に対応する。２つのＬＶの形質導入法（同時形質導入）および１つのＬＶの形質導入法（同時トランスフェクション）のいずれもＤｕｏＣＡＲ染色パターンが同様であり、Ｔ細胞集団の３０％超が、ＣＡＲ細胞表面タンパク質の両方を発現しているために、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２に対して特異的であった。
【図１０】ＤｕｏＣＡＲバイシストロニックコンストラクトの概略図を示す。１つのバイシストロニックなオープンリーディングフレームから、２Ａペプチドで隔てられた２つのＣＡＲ鎖の配列を含有するＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトを発現させる。一方のＣＡＲは、ＣＤ２２  ｓｃＦｖがインフレームでＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインに結合したものからなる。もう一方のＣＡＲは、タンデムＣＤ２０  ＣＤ１９  ｓｃＦｖに基づく標的化ドメインと、これに続くＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなる。
【図１１】ＤｕｏＣＡＲ発現ベクターおよびコントロールで形質導入した初代ヒトＴ細胞上における、セット１のバイシストロニックＤｕｏＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーで測定したものを示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２２８（２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００、２２０９、２２１８、２２２５、２２２７（ＣＤ２２  ＣＡＲバリアント）、コンストラクト番号（２５１５、２５２０、２５２１、ＣＤ２２を標的とする１つのＣＡＲ鎖と腫瘍抗原ＣＤ２０およびＣＤ１９を標的とする別のタンデムＣＡＲ鎖とを含有するバイシストロニックＣＡＲ）。示されている２部プロットにおいて、ＣＡＲ  ２２の発現がＹ軸上に示され、タンデム２０１９  ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ  １９の発現がＸ軸上に示される。陽性細胞の割合が各象限に示される。データは、別々の健康なドナーからのＴ細胞における３回の形質導入実験を表す。
【図１２】Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共にインキュベートしたバイシストロニックＤｕｏＣＡＲセット１のサイトカイン反応を示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２２８（−  ２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（−  ＣＤ２２  ＣＡＲ）、コンストラクト番号２５１５、２５２０、２５２１。ＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞およびコントロールを三重陽性Ｒａｊｉ細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を回収して、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ−２についてＥＬＩＳＡで分析した。Ｎ＝３、±ＳＤ。１つの実験は、別個のドナー由来のＴ細胞における３回の別個の実験を表す。
【図１３】ＤｕｏＣＡＲ発現ベクターおよびコントロールで形質導入した初代ヒトＴ細胞上における、セット２のバイシストロニックＤｕｏＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーで測定したものを示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号１４９７（−  ２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（−  ＣＤ２２  ＣＡＲ）、コンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７（ＣＤ２２を標的とする１つのＣＡＲ鎖と腫瘍抗原ＣＤ２０およびＣＤ１９を標的とする別のタンデムＣＡＲ鎖とを含有するバイシストロニックＣＡＲ）。示されている２部プロットにおいて、ＣＡＲ  ２２の発現がＹ軸上に示され、タンデム２０１９  ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ  １９の発現がＸ軸上に示される。陽性細胞の割合が各象限に示される。データは、３人の別々の健康なドナーからのＴ細胞における３回の形質導入実験を表す。
【図１４】セット２のバイシストロニックＤｕｏＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示す。単独ＣＡＲ要素（ＬＴＧ１４９７、２０＿１９−２８ｚ、またはＬＴＧ２２００、２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７、２０＿１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚをコード）で形質導入したヒトＴ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、４つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり１０：１、５：１、２．５：１、コンストラクト名中の「Ｄ」と数値名称との間のゼロは簡単にするために省いている）にて使用した。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した白血病細胞株は以下である：Ｒａｊｉ（全３つの標的抗原を発現）、Ｒｅｈ（全３つの標的抗原を発現）、３９２Ｔ（３つの標的抗原のいずれも含まない）。ＤｕｏＣＡＲはＥ：Ｔ依存的に三重陽性細胞株を溶解し、標的陰性２９３Ｔ細胞株では溶解が生じなかった。
【図１５】バイシストロニックＤｕｏＣＡＲセット２発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示す。単独ＣＡＲ要素（ＬＴＧ１４９７、２０＿１９−２８ｚ、またはＬＴＧ  ２２００、２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７、２０＿１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚをコード）で形質導入したヒトＴ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、４つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり１０：１、５：１、２．５：１、コンストラクト名中の「Ｄ」と数値名称との間のゼロは簡単にするために省いている）にて使用した。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した一重陽性腫瘍細胞株は以下である：Ｋ１９（ＣＤ１９を発現）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現）。もともとＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を発現していない親のＫ５６２赤白血病株を背景にして、所望の１つの抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２）およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定的形質導入によって、３つの一重陽性腫瘍細胞株を生じさせた。ＤｕｏＣＡＲは一重陽性細胞株をＥ：Ｔ依存的に溶解し、抗原標的化ドメインが適合しないＣＡＲコントロール（ＣＡＲ  ２２、ＬＴＧ  ２２００ｖｓＫ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ  ２０１９、ＬＴＧ  １４７９ｖｓＫ２２）により介在される溶解は、バックグランドレベルを超えるものではなかった。
【図１６】Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共にインキュベートしたまたは腫瘍非存在下でインキュベートした（ＣＡＲ単独で）バイシストロニックＤｕｏＣＡＲバージョン２のサイトカイン反応を示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２７３（−  ２０１９タンデム  一本鎖ＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（ＣＤ２２  一本鎖ＣＡＲ）、コンストラクト番号Ｄ４４、Ｄ４７（Ｄ００４４およびＤ００４７  ＣＡＲコンストラクトのそれぞれについて、コンストラクト名中の「Ｄ」と数値名称との間のゼロは簡単にするために省いている）。ＤｕｏＣＡＲおよびＴ細胞およびコントロールを三重陽性Ｒａｊｉ細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を回収して、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ−２についてＥＬＩＳＡで分析した。Ｎ＝３、±ＳＤ。１つの実験は、別個のドナー由来のＴ細胞における３回の別個の実験を表す。
【図１７】同時トランスフェクションまたは同時形質導入によるＤｕｏＣＡＲ作製の目的で同一細胞または細胞集団中で共発現させるために組み合わせできる２つのＣＡＲ鎖の概略図を示す。一方のＣＡＲ鎖は、ＣＤ２２  ｓｃＦｖがインフレームでＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインに結合したものからなる。もう一方のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０  ＣＤ１９  ｓｃＦｖに基づく標的化ドメインと、これに続くＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなる。
【図１８】ＬＶ作製のために２つのトランスファープラスミドの同時トランスフェクションにより作製したＤｕｏＣＡＲ発現ベクター調製物で形質導入した、または単独ベクターコントロールで個別に形質導入（上パネル）した初代ヒトＴ細胞上における、ＤｕｏＣＡＲおよびコントロールの細胞表面発現を、フローサイトメトリーで測定したものを示す。Ｔ細胞を形質導入して、以下のＣＡＲを発現するようにした：コンストラクト番号２２７３、２２２８（−  ２０１９タンデムＣＡＲ）、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、ＣＤ２２  ＣＡＲ、およびＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３）。散布図中、ＣＡＲ  ２２の発現がＹ軸上に示され、タンデム２０１９  ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ  １９の発現がＸ軸上に示される。陽性細胞の割合が各象限に示される。３人のドナーからのＴ細胞を使用した３回の実験についての代表的なデータである。
【図１９Ａ】ＤｕｏＣＡＲ細胞または一本鎖ＣＡＲコントロールの抗腫瘍細胞溶解活性を示す。このＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞は、２つのトランスファープラスミドを同時トランスフェクションしてレンチウイルスベクターを作製することによって発生させた。得られたＤｕｏＣＡＲベクターまたは一本鎖ＣＡＲコントロールでＴ細胞の形質導入を行ない、以下のＣＡＲを発現させた：コンストラクト番号２２７３（−  ２０１９一本鎖タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（−  ＣＤ２２一本鎖ＣＡＲ）；および、同じＣＡＲ  Ｔ産物中において２つの単独ＣＡＲ鎖の組み合わせにより発生させたＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、名称中の「Ｄ」は簡略にするために省いている）。得られたＣＡＲ  Ｔ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、２つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり、１０：１、５：１）にて、天然白血病株（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ、Ｒｅｈ）またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重ネガティブコントロール株２９３Ｔ）に対して分析した（図１９Ａ）。天然標的株ＲａｊｉおよびＲｅｈは、一本鎖ＣＡＲコンストラクトによって、およびすべてのＤｕｏＣＡＲ群（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、名称中の「Ｄ」は簡略にするために省いている）によって、および一本鎖ＣＡＲコントロールによって溶解された。これとは対照的に、ＤｕｏＣＡＲおよび単独ＣＡＲコントロールはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性株２９３Ｔに対しては細胞溶解性を示さず、このことから、ＣＡＲコンストラクトの標的特異性が示された。ＤｕｏＣＡＲは３つの標的抗原を同時に標的とするため、そして標的特異性についての課題にさらに対処するために、もともとＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を発現していないＫ５６２赤白血病細胞を背景にして発生させた遺伝子組換え一重陽性腫瘍株に対して、ＤｕｏＣＡＲの試験を行なった。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した一重陽性腫瘍細胞株は以下であった：Ｋ１９（ＣＤ１９を発現）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現）、図１９Ｂ。ＤｕｏＣＡＲは一重陽性細胞株をＥ：Ｔ依存的に溶解したが、このことから、ＤｕｏＣＡＲのすべての標的化ドメインが機能性を有し、同族の標的分子に対して特異的であることが示された（図１９Ｂ）。また、抗原標的化ドメインが適合しないＣＡＲ一本鎖コントロール（ＣＡＲ  ２２、ＬＴＧ  ２２００ｖｓＫ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ  ２０１９、ＬＴＧ  １４７９ｖｓＫ２２）は特異的な溶解活性を有さなかった（図１９Ｂ）。
【図１９Ｂ】ＤｕｏＣＡＲ細胞または一本鎖ＣＡＲコントロールの抗腫瘍細胞溶解活性を示す。このＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞は、２つのトランスファープラスミドを同時トランスフェクションしてレンチウイルスベクターを作製することによって発生させた。得られたＤｕｏＣＡＲベクターまたは一本鎖ＣＡＲコントロールでＴ細胞の形質導入を行ない、以下のＣＡＲを発現させた：コンストラクト番号２２７３（−  ２０１９一本鎖タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（−  ＣＤ２２一本鎖ＣＡＲ）；および、同じＣＡＲ  Ｔ産物中において２つの単独ＣＡＲ鎖の組み合わせにより発生させたＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、名称中の「Ｄ」は簡略にするために省いている）。得られたＣＡＲ  Ｔ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、２つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり、１０：１、５：１）にて、天然白血病株（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ、Ｒｅｈ）またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重ネガティブコントロール株２９３Ｔ）に対して分析した（図１９Ａ）。天然標的株ＲａｊｉおよびＲｅｈは、一本鎖ＣＡＲコンストラクトによって、およびすべてのＤｕｏＣＡＲ群（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、名称中の「Ｄ」は簡略にするために省いている）によって、および一本鎖ＣＡＲコントロールによって溶解された。これとは対照的に、ＤｕｏＣＡＲおよび単独ＣＡＲコントロールはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性株２９３Ｔに対しては細胞溶解性を示さず、このことから、ＣＡＲコンストラクトの標的特異性が示された。ＤｕｏＣＡＲは３つの標的抗原を同時に標的とするため、そして標的特異性についての課題にさらに対処するために、もともとＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を発現していないＫ５６２赤白血病細胞を背景にして発生させた遺伝子組換え一重陽性腫瘍株に対して、ＤｕｏＣＡＲの試験を行なった。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した一重陽性腫瘍細胞株は以下であった：Ｋ１９（ＣＤ１９を発現）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現）、図１９Ｂ。ＤｕｏＣＡＲは一重陽性細胞株をＥ：Ｔ依存的に溶解したが、このことから、ＤｕｏＣＡＲのすべての標的化ドメインが機能性を有し、同族の標的分子に対して特異的であることが示された（図１９Ｂ）。また、抗原標的化ドメインが適合しないＣＡＲ一本鎖コントロール（ＣＡＲ  ２２、ＬＴＧ  ２２００ｖｓＫ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ  ２０１９、ＬＴＧ  １４７９ｖｓＫ２２）は特異的な溶解活性を有さなかった（図１９Ｂ）。
【図２０】Ｒａｊｉ１３Ｇ１１、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋クローンに反応してのＤｕｏＣＡＲ細胞または一本鎖ＣＡＲコントロールのサイトカイン放出活性を示す。このＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞は、２つのトランスファープラスミドを同時トランスフェクションしてレンチウイルスベクターを作製することによって発生させた。一本鎖ＣＡＲコントロールベクターの得られたＤｕｏＣＡＲベクターでＴ細胞の形質導入を行ない、以下のＣＡＲを発現させた：コンストラクト番号２２７３（−  ２０１９タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（−  ＣＤ２２  ＣＡＲ）；および３つのＤｕｏＣＡＲ（Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、図２０、群の名称にある「Ｄ」は簡略にするために省いている）。得られたＣＡＲ  Ｔ細胞を、三重陽性Ｒａｊｉ腫瘍株とＥ：Ｔ比１０にて一緒にして一晩おき、培養上清を分析してＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ−２について調べた。すべてのＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトが、Ｒａｊｉ細胞に応答して３つのサイトカインを高レベルで示した。Ｒａｊｉ標的の非存在下でインキュベートしたＣＡＲ  Ｔ細胞からなるＤｕｏＣＡＲ単独コントロールについては、Ｒａｊｉ  １３Ｇ１１細胞に応答したはっきりとしたサイトカイン生成は確認されず、このことから、サイトカイン反応が標的特異的であることが示された（図２０）。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
詳細な説明
定義
本明細書中において使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上明らかな矛盾がない限り、単数形と複数形の両方を指す。たとえば、用語「an antigen（抗原）」は、１つまたは複数の抗原を含み、「少なくとも１つの抗原」という言葉と同等であるとみなし得る。本明細書中において使用される場合、用語「comprises」は「includes」を意味する。したがって、「comprising an antigen」は、他の要素を除外しない「includingan antigen」を意味する。「および／または」という言葉は、「および」または「または」を意味する。さらに、特に記載がない限り、核酸またはポリペプチドに与えられる任意のおよびすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさならびにすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明目的で提供されることが理解される。本明細書中に記載されるものと類似するまたはこれと同等である多くの方法および材料を使用できるが、特に好適な方法および材料が以下に記載される。万一矛盾がある場合には、本明細書（用語の説明を含む）が支配する。これに加えて、材料、方法、および例示は、例証することのみを目的とし、限定を意図しない。多様な実施形態を参照することを容易とするために、以下に用語の説明が提供される。
【００８３】
用語「約」は、量および持続期間などの測定可能な値を指す場合、明示される値から±２０％、±１０％、またはより好ましくは±５％、または±１％、またはさらにより好ましくは±０．１％の変量を含むことを意味する。というのは、こうした変量が、開示される方法の実施に適切であるためである。
【００８４】
特に記載がない限り、本明細書中の科学用語は、従来の用法で使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994; and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995；および他の類似する参考資料において見つけ得る。
【００８５】
本発明は、疾患および／または状態、ならびに血液悪性腫瘍および固形腫瘍を含むがこれらに限定されないがんを処置するための組成物ならびに方法に関する。本発明は、２つ以上のベクターが形質導入されたＴ細胞を養子細胞移入して１つ以上のＤｕｏＣＡＲを発現させるための、患者特異的かつ腫瘍特異的な方法に関する。
【００８６】
より具体的には、本発明は、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクターに関し、また、たとえば対象におけるがんを処置するための、当該ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターが形質導入された宿主細胞（たとえば、リンパ球、Ｔ細胞）、当該レンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、ならびにそれらの使用方法も提供される。
【００８７】
驚くべきことに、そして予期しないことには、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を含む免疫治療用組成物は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターを自家リンパ球細胞集団に形質導入した場合に、抗腫瘍免疫療法としての有効性が大幅に高くなることを本発明者らは見い出した。１つまたは複数のＣＡＲを発現する少なくとも２つ以上のレンチウイルスベクターを使用することは、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進し、そしてその結果として、腫瘍安定化、縮小、除去、またはがんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの任意の組み合わせを患者特異的にもたらすようである。
【００８８】
本明細書中に記載される、このような活性のある患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞集団は、直接注入により患者に戻すことによって、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍の安定化、縮小、除去、がんの緩解、またはがん再発の予防もしくは寛解、またはこれらの組み合わせを患者特異的にもたらすことができる。また、治療用細胞集団の効果的な増殖および迅速な収縮も含まれる。
【００８９】
よって、最も広い態様において、この養子免疫療法の新規性は、ＣＡＲ発現ベクターの組み合わせの使用にある。特徴の違いとして、従来の１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する１つのベクターの使用とは異なり、当該Ｄｕｏ  ＣＡＲアプローチは、多重抗原特異性と、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍Ｔ細胞活性に最適なシグナル伝達との両方をもたらす。３つ以上の抗原が効率よく標的とされるシステムを作製することは、腫瘍がん細胞によるエスケープ変異体の発生が可能であるために腫瘍転移および／または腫瘍再発が生じ得る単独型またはタンデム型のアプローチよりも、大幅に優れている。１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターの使用においては、各ベクターにおいて少なくとも１つの結合ドメインの特定の組み合わせが同一でなく、さらに、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組み合わせがベクターの各々の間で同一でないことも必要とされ、こうしたことによって、このようなｄｕｏレンチウイルスベクター由来ＣＡＲが形質導入された１つ以上の遺伝子改変リンパ球集団が、患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続を促進でき、そしてその結果として、腫瘍もしくはがんの安定化、縮小、除去、もしくは緩解、および／または腫瘍もしくはがんの再発の予防もしくは寛解、またはこれらの任意の組み合わせを患者特異的にもたらすことができる、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を発生させる。
【００９０】
一態様において、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、当該ベクターの１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。
【００９１】
別の一態様において、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つ以上の単離された核酸分子を含む免疫治療用組成物が提供され、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、ただし、免疫治療用組成物は、特に、図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）にそれぞれ示される単独ＣＡＲ、分割ＣＡＲ、タンデムＣＡＲ、または複数のＣＡＲを除く。
【００９２】
本発明に係るＤｕｏＣＡＲレンチウイルスベクター改変Ｔ細胞を用いて達成される免疫療法効力および腫瘍またはがんの再発の予防または寛解は、従来の単独ＣＡＲ設計による成果を大幅に上回り、かつこれを相乗的に超えるものである。この生物学的治療利益のユニークな組み合わせと相互に関連し合って、従来のＣＡＲに基づくＴ細胞免疫療法よりも患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖、持続が増大し、そしてその結果として、腫瘍またはがんの安定化、縮小、除去、または緩解がもたらされるのである。
【００９３】
リンカードメインおよび膜貫通ドメイン（個々の白抜き四角）に結合した１つの結合ドメイン（黒色、白抜きまたは縞つきの丸、特異性がそれぞれ異なる、図５）の発現を誘発するように、ＣＡＲ発現ベクターを作製できる。下記の図５は、従来のＣＡＲと本発明に係るＤｕｏＣＡＲとの比較を示す。図５中、太い灰色の線は、形質細胞膜を表す。細胞内において、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、およびＣＤ３−ゼータ鎖に由来するリンパ球シグナル伝達ドメインを、図示される通りに結合させ得る。本出願中におけるＣＤ３シグナル伝達ドメインのすべての例および使用において、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）の１つ、２つ、または３つを、その中のチロシン残基の選択的変異誘発（または、ＩＴＡＭモチーフがリン酸化の標的とならないようにできるその他のこのような変異）を行なって変化させることにより、ＣＤ３ゼータ鎖を改変することが含まれる。単独ＣＡＲ（図５Ａ）においては、１つの結合ドメインが、膜貫通ドメインと２つのシグナル伝達ドメインとに結合している。分割ＣＡＲ（図５Ｂ）においては、２つの異なるバインダーが、有効なシグナル伝達をもたらすために結合していなければならない１つのシグナル伝達ドメインと共に表されている。タンデムＣＡＲ（図５Ｃ）においては、２つの結合ドメインが１つのシグナル伝達ドメインに結合している。１つのベクターからの複数のＣＡＲ（図５Ｄ）においては、１つのベクターから２つの十分な機能性を有するＣＡＲが発現している。本発明に係るＤｕｏ−ＣＡＲ（たとえば、図５Ｅ）は少なくとも２つのベクターをコードし、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合している。本発明に係るＤｕｏＣＡＲを区別している必須の特徴は、２つ以上のベクターを使用すること、結合ドメインが複数あること、および、発現された２つの細胞表面タンパク質のうち少なくとも１つが十分に機能的なシグナル伝達特性（ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖に関する）を有することである。
【００９４】
別の一態様において、ＤｕｏＣＡＲは、治療用Ｔ細胞集団が介在する腫瘍に対する免疫応答を亢進させるために使用される。免疫応答は、少なくとも３つの様式で亢進する。
【００９５】
第１に、体内で増殖および生存するためのさらなるシグナルをＴ細胞に与えることによって、本発明に係るＤｕｏＣＡＲは、自己抗原（たとえばＣＤ１９）（これがなくなっても患者は許容できる）（腫瘍組織自体には存在しない治療用細胞集団に対して刺激シグナルを与える役目を果たす）に遭遇した際にＴ細胞集団を刺激することによって、治療用Ｔ細胞集団を持続させることができる。第３世代ＤｕｏＣＡＲ（細胞内において３つの共刺激ドメインを発現しており、１つの細胞外Ｉｇ様バインダーに結合している）は、２つの細胞内共刺激ドメインを発現するＤｕｏＣＡＲと同様に、治療用Ｔ細胞上に発現していないことがよく知られており、かつ明らかになっている。たとえば、下記の図６中、初代ヒトＴ細胞上におけるＣＡＲコンストラクトの発現レベルが、第２世代（２つの共刺激ドメイン）のコンストラクトと第３世代（３つの共刺激ドメイン）のコンストラクトとの間で異なっている。Ｔ細胞は、以下のＣＡＲを発現するように形質導入されている：ＣＡＲなし（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ＢＢｚ）、およびその他の第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−ＢＢｚ）。ＣＡＲの表面発現レベルをフローサイトメトリーによって検出し、ｙ軸上に平均蛍光強度（ＭＦ）として示す。すべてのコンストラクトが全く同一のＣＡＲ結合ドメインを発現していたが、２つの第２世代ＣＡＲのＭＦＩは大幅に明るかった。
【００９６】
別のベクターＣＡＲコンストラクトに第３のＴ細胞活性化配列を与えることによって、本発明者らは、Ｔ細胞表面におけるＣＡＲ発現の低下というデメリットを生じることなく、３つの共刺激ドメインを発現させる利点を達成できる。
【００９７】
第２の態様において、本発明に係るＤｕｏＣＡＲは、免疫抑制効果に介在する腫瘍以外の細胞型を標的とし得る。たとえば、ＣＤ１９発現Ｂ細胞が腫瘍病変中に存在していて、ＩＬ−４またはその他のメディエーターを産生することによって抗腫瘍免疫を阻害している場合に、ＤｕｏＣＡＲを発現する腫瘍特異的Ｔ細胞集団を使用することの第２の利益として、この免疫抑制細胞集団も除去されるということがある。
【００９８】
たとえば、免疫抑制性のＢ細胞が固形腫瘍病変中に存在する場合、Ｂ細胞に特異的なＤｕｏＣＡＲ（ＣＤ１９特異的ＤｕｏＣＡＲなど）を用いることによって、これらを除去できる。免疫抑制性の線維芽細胞様細胞が存在する場合には、間質特異的ＤｕｏＣＡＲによって（たとえば、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）を標的とすることによって）、これらを除去できる。脈管構造の形成異常が原因となって効果的な免疫応答が損なわれている場合には、そうした型の血管またはリンパ管特異的標的（ＶＥＧＦＲ抗体など）に対して特異的なＤｕｏＣＡＲによって治療転帰を改善することもできる。
【００９９】
第３の態様において、本発明に係るＤｕｏＣＡＲは、腫瘍から遠位にある（すなわち体内の別の区画に存在する）免疫抑制性集団を標的とする。たとえば、腫瘍病変自体または局所のリンパ節もしくは骨髄に存在し得る骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的とするＤｕｏＣＡＲを使用する。腫瘍流入リンパ節（ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）は免疫活性化の場にも免疫抑制の場にもなり得るということが明らかになっている。このことは、そのリンパ節の全般的炎症程度と、リンパ節への移行よりも前に生じた遠位の樹状細胞分化とに依存している。骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）または間違って分化した樹状細胞などの抗原提示細胞が腫瘍流入リンパ節内に存在している場合、これらの細胞型を標的とするＤｕｏＣＡＲを用いて（腫瘍自体からは遠位であっても）、治療転帰を改善できる。がん特異的ＤｕｏＣＡＲ免疫療法用途以外に、ＤｕｏＣＡＲの２つめの用途として、自己免疫性および／または炎症性の疾患の予防または処置が考えられる。腫瘍関連用途との違いは、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、または誘導性Ｔ制御性細胞（ｉＴｒｅｇ）、またはＴｈ−２様免疫応答を促進する条件下において培養したその他の細胞が、細胞性基質になり得るという点である。腫瘍用途においては、Ｔｈ−１様細胞が細胞性基質である。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、アレルギー性の気道、腸、もしくはその他の粘膜の炎症、または皮膚アレルギーといった広い治療用途において、形質転換増殖因子ベータ（ＴＦＧ−ベータ）などの免疫阻害性サイトカインを産生するＣＡＲ改変リンパ球が存在することにより、自己免疫または炎症により引き起こされる疾患を寛解する幅広い免疫寛容原性シグナルが生じると考えられる。このアプローチは、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷性脳損傷、パーキンソン病、およびＣＴＥ（振盪または微小振盪の繰り返しによって生じる慢性外傷性脳症）などの抹消または中枢神経系（ＣＮＳ）の神経性炎症状態を含む。また、このアプローチは、ＣＯＰＤ（慢性阻塞性肺疾病）などの進行性瘢痕疾患も含む。
【０１００】
炎症性疾患の処置において、組織抗原、または炎症を起こしている細胞の表面上のストレス（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）マーカー、またはミスフォールドされたタンパク質（タウタンパク質またはベータ−アミロイドなど）に対して特異的なリンパ球を、これらの標的に対して特異的なＤｕｏＣＡＲ発現ベクターを発生させることによって産生できると考えられる。単一の抗体に基づくアルツハイマー病療法が既に臨床展開されている（すなわち、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社によるソラネズマブおよびＢｉｏｇｅｎ社によるアデュカヌマブ）。アルツハイマー病においては、モノマー型または凝集型ベータアミロイドに対する抗体を、細胞表面タンパク質に結合するバインダーの代わりに、ＣＡＲ様式にて使用することができる。また、ＭＨＣ分子が結合したタウタンパク質またはタウペプチドに結合するバインダーも、ＣＡＲの結合モチーフとして使用できる。また、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ集団に対する局所特異性を与える目的で、特定末梢組織へのリンパ球のホーミングに介在する受容体をＣＡＲ様式に含めることもできる。リンパ球を特定組織中へと浸潤させることが知られる接着受容体ドメインおよびサイトカイン配列またはサイトカインまたはケモカイン受容体またはバインダーを、ＣＡＲドメインの一部として使用できる。ＣＤ４４およびインテグリンアルファ−４などの接着分子はリンパ球をＣＮＳへと指向させることが知られており、よって、リンパ球集団のＣＮＳ遊走性挙動に介在することが知られる接着分子由来のドメインを使用してＣＡＲ発現リンパ球を疾患部位に指向させることもできると考えられる。同じことが、腸（すなわち、ＭＡｄＣＡｍ−１に結合するバインダー、ＣＣＲ９、または抗ＣＣＬ２５抗体の発現など）、肺（すなわち、Ｐ−セレクチンまたはメソテリン）、皮膚（すなわち、Ｅ−セレクチンに結合するバインダー）、またはその他の粘膜表面についてもいえると考えられる。
【０１０１】
このアプローチを用いるために、炎症状態を有する、または炎症病態の軽減によって処置できる疾患（アルツハイマー病など）を有する患者を診療所に入院させて、末梢血を回収することができる。Ｔｒｅｇを、免疫磁気ビーズ（制御性Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて直接選択できる、または、適切なサイトカイン環境下での培養により誘発できる。次いで、このＴｒｅｇまたはｉＴｒｅｇをＤｕｏＣＡＲベクターを用いて形質導入し、必要であればｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖させることができる（Ｔｒｅｇ増殖キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。ＤｕｏＣＡＲ結合ドメインは、抗体、または組織特異的ホーミングに介在する受容体、および抗ベータアミロイドなどの疾患関連バインダーに由来するものであってよい。こうして作製された操作免疫エフェクター細胞を適切な部位へと指向させて、そのＴｈ２またはＴｒｅｇ分化パターンに応じたサイトカインを産生させることができる。ＣＡＲ受容体が活性化時に特異的遺伝子ペイロード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｙｌｏａｄｓ）を分泌するようにＣＡＲ−Ｔ細胞を操作できることも知られている。ベクターから発現されるＤｕｏＣＡＲペイロード以外にも、Ｔ細胞集団の操作により、ａ）Ａ−ベータＤＰ（アミロイドベータ分解プロテアーゼ）、ｂ）マトリックスプロテアーゼ（たとえば、ＣＯＰＤにおけるＭＭＰ−９およびＭＭＰ９阻害剤）、ｃ）プラーク形成を妨げるペプチドまたは可溶性抗体様バインダー、およびｄ）サイトカイン（たとえば、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）などのさらなる治療用タンパク質またはペプチドを発現または分泌させることができる。
【０１０２】
また、細胞内でＴ細胞の機能を調節するｍｉＲＮＡを発現させることもできる。ｍｉＲＮＡの例には、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−３１６２、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１２４６、およびｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１７−９２が挙げられる。また、ｍｉＲＮＡに対するｓｈＲＮＡも作製できる。例として、一般にＰＤ１に結合してその発現を増大させるｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−１５０、およびｍｉＲ−１０７を標的とするｓｈＲＮＡが挙げられる。
【０１０３】
腫瘍学に関連する用途、ならびに炎症性および自己免疫性の疾患に関連する用途以外に、Ｄｕｏ  ＣＡＲ技術の３つめの用途として、ウイルス性、細菌性、または真菌性の抗原に対して特異的な治療用リンパ球集団を発生させることが考えられる。かくして、Ｂ細胞性悪性腫瘍について説明した腫瘍学用途においては、感染症を標的とし、微生物抗原を認識させることによって、Ｄｕｏ  ＣＡＲ産物を、感染病原体または疾患組織に対する免疫防御活性または免疫治療活性において介在させることができる。病原体がコードするペプチドの認識に細胞受容体自体が介在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づくアプローチとは異なり、Ｄｕｏ  ＣＡＲアプローチは、ＣＡＲベクター様式にて発現した結合タンパク質を利用できるため、形質導入Ｔ細胞集団が抗体のように認識できる（すなわち、抗原プロセシングを必要としない）。治療用Ｔ細胞集団が活性化されると、その結果として、免疫活性化座位が感染細胞を除去できるようになり、また、微生物抗原が細胞に結合していない場合にはインターフェロン−ガンマのような可溶性メディエーターを放出できるようになるために、感染病原体に対する有効な免疫応答をもたらすことができる。
【０１０４】
たとえば、ＨＩＶは非常に変異しやすいことが知られているが、しかしながら、特定のクレードまたはファミリーを類別でき、かつ、クレード特異的ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ、ｇｐ１２０）に対する抗体を作製できる。ＤｕｏＣＡＲアプローチを用いれば、３つ以上のクレード特異的抗体様バインダーをＣＡＲコンストラクト中に含めることにより、広い抗ＨＩＶ免疫活性が得られる。ウイルスタンパク質に加えて、細菌タンパク質を標的とすることもできる。現時点での医学上の課題は、医療現場で生じることの多い抗生物質耐性細菌株の処置である。これには、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、およびＫＰＣ（クレブシエラ・ニューモニエカルバペネマーゼ産生グラム陰性細菌、ＣＲＫＰ）などが含まれる。クレブシエラ細胞表面抗原は、Ｏ抗原（９個のバリアント）およびＫ抗原（およそ８０個のバリアント）を含む。Ｏ抗原スペクトルは小さなＤｕｏＣＡＲライブラリで容易に対応でき、複数のＫ抗原についても同様である。使用にあたり、異なるＫ血清型またはＯ血清型に結合する抗体を特徴とするＣＡＲコンストラクトを作製することができ、腫瘍学用途での場合と同様に、こうしたＣＡＲベクターを使用してＴｈ１様エフェクター細胞集団を形質導入、単離、活性化できる。真菌性疾患においては、Ｌ．Ｃｏｏｐｅｒらの研究（Kumasesan, P.R., 2014, PNAS USA, 111:10660）から、通常ヒト細胞上に発現している真菌結合タンパク質デクチン−１をＣＡＲとして再構成でき、これを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける真菌の増殖を制御できることが示されている。アスペルギルス症というヒト疾患は、重症の免疫抑制患者において生じ、真菌Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）によって引き起こされる。複数のグループが、アスペルギルス細胞表面の抗原成分に対して特異的なモノクローナル抗体を作製し、真菌表面の３つ以上のアスペルギルス抗原を標的とするＤｕｏＣＡＲを用いた養子免疫療法への扉を開いた。これにより、これらの感染症用途のすべてにおいて、微生物抗原に結合する免疫グロブリン様バインダーを作製できるようになったため、ＣＡＲ発現エフェクターリンパ球集団により複数の抗原を標的化することが可能となった。
【０１０５】
次に、本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用され得るＤｕｏＣＡＲについて詳細に説明する。この説明には、その細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインについての説明と、ＤｕｏＣＡＲ、抗体、およびその抗原結合断片、結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ヌクレオチド、発現、ベクター、および宿主細胞、開示されるＤｕｏＣＡＲを使用する処置方法、組成物、およびキットについてのさらなる説明が含まれる。ここまで、本発明に係る組成物および方法を、ＤｕｏＣＡＲの作製および利用を参照しながら例証したが、本明細書中においては、当該組成物および方法がＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの作製および利用を含むことが特に意図される。
【０１０６】
Ａ．キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ中に存在）
本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲは少なくとも２つのベクターを含み、各ベクターは機能性ＣＡＲをコードし、これにより、ベクターが組み合わされている結果として２つ以上の同一でない結合ドメインの発現が生じることになり、当該ベクターにコードされる結合ドメインは各々が膜貫通ドメインおよび１つ以上の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合しており、少なくとも１つの細胞外ドメインは、抗原、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインに結合できる。
【０１０７】
ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに結合した抗体の抗原結合ドメイン（たとえば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＤｕｏＣＡＲの特徴には、ＭＨＣに制限されない様式で、Ｔ細胞の特異性および反応性を、選択された標的に再指向させ、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用する能力が含まれる。ＭＨＣに制限されずに抗原を認識できるため、ＤｕｏＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングから独立して抗原を認識でき、その結果として腫瘍エスケープの主要な機序を回避できる能力を有する。また、ＤｕｏＣＡＲは、Ｔ細胞において発現すると、有利にも、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
【０１０８】
本明細書中に開示されるとおり、ＤｕｏＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、たとえば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方を含んでよい。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、たとえばＣＤ３ゼータ  タンパク質の細胞内部分など（これに限定されない）のＴ細胞受容体の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指し、これは、リンパ球が抗原に対して効率よく反応するために必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。いくつかの例において、活性化ドメインは、リン酸化の特定部位（すなわちＣＤ３ゼータ鎖におけるＩＴＡＭモチーフ）の変異によって減弱され得て、これにより、このドメインが介在するシグナル伝達の程度を慎重に調節することができる。
【０１０９】
１．細胞外ドメイン
一実施形態において、本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲは、抗原結合ドメインまたは部位とも称される標的特異的結合要素を含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を定めるリガンドの種類および数に依存する。たとえば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上において細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するように選択されてよい。したがって、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして働き得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス感染、細菌感染、および寄生虫感染、自己免疫疾患、およびがん細胞に関連するものを含む。
【０１１０】
一実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを設計することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように設計できる。腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって産生され、免疫応答、特にＴ細胞介在性の免疫応答を顕在化させるタンパク質である。抗原結合ドメインの選択は、処置するがんの具体的な種類に依存し得る。腫瘍抗原は当技術分野において周知されており、たとえば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体、およびメソテリンを含む。本明細書中に開示される腫瘍抗原は、単に例示として含まれる。その列記は限定を意図するものではなく、これら以外の例が当業者には容易に認識されるであろう。
【０１１１】
一実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として働き得る複数のタンパク質を発現する。こうした分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、およびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異抗原を含むが、これらに限定されない。これら以外の標的分子として、がん遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属するものがある。さらに別の標的抗原の群として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性の抗原がある。Ｂ細胞リンパ腫においては、腫瘍特異的なイディオタイプの免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有である真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原に該当する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原もまた、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の候補である。こうした抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、イディオタイプ）のうちいくつかは、モノクローナル抗体を使用する受動免疫療法の標的として使用されているが、十分な成功は収めていない。
【０１１２】
腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。ＴＳＡは腫瘍細胞に固有であり、身体の他の細胞上には生じない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有ではなく、その代わり、この抗原に対する免疫寛容状態が誘発されない条件下において、正常細胞上にも発現する。腫瘍におけるこの抗原の発現は、この抗原に対する免疫系の応答を可能とする条件下において生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が成熟しておらず抗原に応答できない胎児発生の間に正常細胞上に発現する抗原であり得る、または、ＴＡＡは、通常から正常細胞上に極めて低レベルで存在しているが腫瘍細胞上ではこれより大幅に高いレベルで発現する抗原であり得る。
【０１１３】
ＴＳＡまたはＴＡＡの例は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５などの腫瘍特異的多系譜抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの過剰発現がん遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；ならびに、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原を含むが、これらに限定されない。これら以外の、タンパク質に基づく大きな抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳを含む。
【０１１４】
好ましい一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、およびＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的とする。さらに別の一実施形態において、タグまたは抗タグ結合ドメインを含むＤｕｏＣＡＲが、本明細書中において提供される。
【０１１５】
標的とする所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、当該所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合ドメインを含むように設計されてもよい。たとえば、ＣＤ１９が、標的とする所望の抗原である場合には、ＣＤ１９に対する抗体またはそのＣＤ１９特異的ｓｃＦｖサブ断片を、ＣＡＲに組み込む抗原結合ドメインとして使用してよい。
【０１１６】
例示的な一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、ＣＤ１９を標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶであり、ここで、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号２７の配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ部分は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。第２の例示的な実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２０を標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖであり、ここで、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖの核酸配列は、配列番号１の配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。第３の例示的な実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２を標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖであり、ここで、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの核酸配列は、配列番号７の配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
本発明の一態様において、たとえば、レトロウイルス科（たとえば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ＬＰなどのヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナウイルス科（たとえば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、およびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科（たとえば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（たとえば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス）、またはＣ型肝炎ウイルス、またはこれらの任意の組み合わせに由来する抗原（これらに限定されない）を含む、ＴＳＡ以外またはＴＡＡ以外に結合できるＣＡＲが提供される。
【０１１８】
本発明の別の一態様において、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、シュードモナス、またはサルモネラ菌といった菌種に由来する抗原に結合できるＣＡＲが提供される。特に、たとえば、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリア種（たとえば、結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ（M.kansaii）、またはＭ．ゴルドナエ（M.gordonea））、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、リステリア菌、化膿連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクチア）、肺炎連鎖球菌、もしくは破傷風菌といった菌種またはこれらの組み合わせなどの感染性細菌に由来する抗原に結合できるＣＡＲが提供される。
【０１１９】
２．膜貫通ドメイン
本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲにおいて、ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ドメインに融合した１つ以上の膜貫通ドメインを含む。
【０１２０】
一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリンカードメインは、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、かつ膜貫通ドメインに結合している。
【０１２１】
一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリンカードメインは、膜貫通ドメインの細胞外ドメインに由来し、かつ膜貫通ドメインに結合している。
【０１２２】
いくつかの例において、受容体複合体のその他の構成要素との相互作用を最小限とするために、膜貫通ドメインは、当該ドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように選択またはアミノ酸置換されてよい。
【０１２３】
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来するものであってよい。供給源が天然のものである場合、このドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来するものであってよい。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはこれらの任意の組み合わせに由来する（すなわち、これらの膜貫通領域を少なくとも含む）ものであってよい。代替的には、膜貫通ドメインは、合成されたものであってよく、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主として含んでよい。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端にみられてよい。任意に、好ましくはアミノ酸２〜１０個の長さの、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成していてよい。グリシンとセリンとのダブレットまたはトリプルアラニンモチーフは、特に好適なリンカーである。
【０１２４】
一実施形態において、本発明に係るＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１１の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
いくつかの例において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１３の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
いかなる特定の作用機序に限定されることも意図しないが、本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用される本発明に係る例示的なＤｕｏＣＡＲに関連して治療的機能が向上した理由には、たとえば以下が含まれると考えられるが、これらに限定されない：ａ）細胞膜中における横方向の動きが改善されたためにシグナル伝達の効率が上がった、ｂ）細胞膜マイクロドメイン中における位置が優れていたために（脂質ラフトなど）、Ｔ細胞活性化に関連する膜貫通型シグナル伝達カスケードとの相互作用能力が向上した、ｃ）低減性もしくは下方調節性の相互作用から離れる動きが優先的であったために、細胞膜中における位置が優れていた、たとえば、ＣＤ４５などのホスファターゼからの距離が比較的遠かったもしくは当該ホスファターゼとの相互作用が比較的少なかった、ならびに、ｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（すなわち、免疫シナプス）への結合が優れていた、またはこれらの任意の組み合わせ。
【０１２７】
本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団の一実施形態において、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲにおいて使用される非限定的かつ例示的な膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ１６を含む。同出願人による同時係属中の仮特許出願第６２／２３９，５０９号（発明の名称「キメラ抗原受容体および使用方法」、２０１５年１０月９日付で出願、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の事件番号第ＬＥＮ＿０１５ＰＲＯ号）中に開示されるとおり、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインおよび／またはリンカードメインもしくはスペーサードメインを誘導するために使用され得る（特に、その表Ｉ中に列記される腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに列記されるその他のＴＮＦＲＳＦ構成要素を含む）。
【０１２８】
３．スペーサードメイン
本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲにおいて、細胞外ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間に、スペーサドメインが配置されていてよい。スペーサドメインとは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞外ドメインと、および／またはＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞内ドメインと結合させるように働く、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサドメインは、アミノ酸を上限３００個まで、好ましくはアミノ酸を１０〜１００個、最も好ましくはアミノ酸を２５〜５０個を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサー要素を含んでよく、スペーサー要素が存在する場合、スペーサー要素によってリンカーが大きくなり、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合断片との間の距離が長くなる。スペーサーの具体例は当業者に周知されており、米国特許第７，９６４，５６６号、第７，４９８，２９８号、第６，８８４，８６９号、第６，３２３，３１５号、第６，２３９，１０４号、第６，０３４，０６５号、第５，７８０，５８８号、第５，６６５，８６０号、第５，６６３，１４９号、第５，６３５，４８３号、第５，５９９，９０２号、第５，５５４，７２５号、第５，５３０，０９７号、第５，５２１，２８４号、第５，５０４，１９１号、第５，４１０，０２４号、第５，１３８，０３６号、第５，０７６，９７３号、第４，９８６，９８８号、第４，９７８，７４４号、第４，８７９，２７８号、第４，８１６，４４４号、および第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許公開第２０１１０２１２０８８号および第２０１１００７０２４８号中に列記されるものを含む（これらの全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１３０】
スペーサードメインは、好ましくは、ＣＡＲと抗原との結合を促進し細胞中へのシグナル伝達を増大させる配列を有する。結合を促進すると予期されるアミノ酸の例は、システイン、荷電アミノ酸、ならびにグリコシル化の可能性のある部位におけるセリンおよびトレオニンを含み、これらのアミノ酸を、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用できる。
【０１３１】
このスペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５９．３）のヒンジ領域を含むアミノ酸番号１３７〜２０６（配列番号１５）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５〜１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５〜３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７〜１５２の、全体または一部を使用できる。また、このスペーサードメインとして、抗体のＨ鎖またはＬ鎖（ＣＨ１領域またはＣＬ領域、たとえば、配列番号１６のアミノ酸配列を有するペプチド）の定常領域の一部も使用できる。さらに、このスペーサードメインは、人工的に合成された配列であってもよい。
【０１３２】
さらに、ＣＡＲにおいて、Ｎ末端にシグナルペプチド配列が結合していてよい。このシグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、アミノ酸１５〜３０個の長さを有する。細胞内ドメインとして上述されるタンパク質分子の多くがシグナルペプチド配列を有するため、このシグナルペプチドを、ＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用できる。一実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号５のリーダー（シグナルペプチド）配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊機能を指す。たとえば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。よって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し細胞が特殊機能を果たすように仕向ける、タンパク質部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用できるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインを切断した一部が使用される場合、この切断部分がエフェクター機能シグナルを伝達できる限りは、これを完全な鎖の代わりに使用してよい。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」の意味には、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれる。
【０１３４】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原と受容体との結合後にシグナル伝達を開始するよう協同作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の派生物またはバリアント、ならびに同じ機能性能力を有する任意の合成配列を含む。
【０１３５】
ＴＣＲのみを通って発されたシグナルはＴ細胞を十分に活性化するには不十分であること、および第２のまたは共刺激シグナルがさらに必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化には、抗原依存性の第１の活性化をＴＣＲを経て開始するもの（第１の細胞質シグナル伝達配列）と、抗原とは独立した様式で働いて第２のまたは共刺激シグナルを提供するもの（第２の細胞質シグナル伝達配列）との、２つの別個の種類の細胞質シグナル伝達配列が介在するといえる。
【０１３６】
第１の細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の第１の活性化を、刺激的様式または阻害的様式のいずれかで調節する。刺激的様式で働く第１の細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【０１３７】
本明細書中に開示されるＣＡＲにおいて特に有用な第１の細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを含む。ＩＴＡＭの具体例は、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１〜１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５〜８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１〜２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９〜１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８〜１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３〜２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、００２２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７〜８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６〜２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２〜２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７〜２５２の配列を有するペプチド、ならびに、これらのペプチドと同じ機能を有するバリアントを含むが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされたものである。一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ３ゼータにおけるＩＴＡＭモチーフの１つ、２つ、または３つが、チロシン残基の変異または別のアミノ酸での置換によって減弱される。
【０１３８】
好ましい一実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体がＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計されてよい、または、ＣＡＲとの関連で有用である任意のその他の望ましい細胞質ドメインと組み合わせてよい。たとえば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含んでよい。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、リンパ球が抗原に対して効率よく反応するために必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、および特異的にＣＤ８３と結合するリガンドなどを含む。このような共刺激分子の具体例は、ＣＤ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６〜３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１〜４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７〜２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６〜２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１〜２２０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４〜２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１〜２７７、およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６〜１９９の配列を有するペプチド、ならびに、これらのペプチドと同じ機能を有するバリアントを含むが、これらに限定されない。このように、本開示は、ここまで、共刺激シグナル伝達要素として主に４−１ＢＢを用いて例示されてきたが、その他の共刺激要素も本開示の範囲内である。
【０１３９】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分における細胞質シグナル伝達配列は、無作為のまたは特定の順序で、互いに結合していてよい。任意に、好ましくはアミノ酸２〜１０個の長さの、短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、この結合を形成していてよい。グリシンとセリンとのダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１４０】
一実施形態において、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータおよびシグナル伝達ドメインＣＤ２８を含むように設計される。別の一実施形態において、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータおよびシグナル伝達ドメイン４−１ＢＢを含むように設計される。さらに別の一実施形態において、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータ、ならびにシグナル伝達ドメインＣＤ２８および４−１ＢＢを含むように設計される。
【０１４１】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢおよびシグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータを含むように設計され、ここで、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢは配列番号１７の核酸配列を含み、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータは配列番号１９の核酸配列を含む。
【０１４２】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢおよびシグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータを含むように設計され、ここで、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢは配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータは配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０１４３】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢおよびシグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータを含むように設計され、ここで、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、シグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータは配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
５．ＤｕｏＣＡＲについてのさらなる説明
本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの機能性部分もまた、本発明の範囲内に明白に含まれる。用語「機能性部分」は、ＣＡＲに言及して使用される場合、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲの１種以上の任意の部分または断片を指し、この部分または断片は、当該ＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能性部分は、たとえば、親ＣＡＲと類似する程度に、親ＣＡＲと同程度に、または親ＣＡＲよりも高程度に、標的細胞の認識、または疾患の検出、処置、もしくは予防を行なう能力を保持する、ＣＡＲ部分を包含する。親ＣＡＲに関して、機能性部分は、たとえば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含み得る。
【０１４５】
機能性部分は、当該部分のアミノ末端またはカルボキシ末端または両末端に、親ＣＡＲのアミノ酸配列にはみられないさらなるアミノ酸を含んでよい。望ましくは、これらのさらなるアミノ酸は、たとえば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防などの、機能性部分の生物学的機能を妨げない。より望ましくは、これらのさらなるアミノ酸は、こうした生物学的活性を、親ＣＡＲの生物学的活性よりも向上させる。
【０１４６】
本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲの機能性バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能性バリアント」は、本明細書中において使用される場合、親ＣＡＲとの配列同一性または類似性が相当程度または顕著であるＣＡＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、この機能性バリアントは、当該バリアントの派生元であるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能性バリアントは、たとえば、本明細書中に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントであって、親ＣＡＲと類似する程度に、親ＣＡＲと同程度に、または親ＣＡＲよりも高程度に、標的細胞を認識する能力を保持するものを包含する。親ＣＡＲに関して、機能性バリアントは、たとえば、親ＣＡＲとのアミノ酸配列同一性が、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％、またはそれ以上であってよい。
【０１４７】
機能性バリアントは、たとえば、親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を加えたものを含んでよい。代替的には、または追加的には、機能性バリアントは、親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を加えたものを含んでよい。この場合、この非保存的アミノ酸置換は、機能性バリアントの生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。この非保存的アミノ酸置換は、機能性バリアントの生物学的活性を向上させて、その結果、機能性バリアントの生物学的活性が親ＣＡＲよりも優れるようにするものであってよい。
【０１４８】
ＤｕｏＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当技術分野において周知されており、特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似する化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるようなアミノ酸置換を含む。たとえば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負荷電極性アミノ酸（たとえば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を別の酸性／負荷電極性アミノ酸で置換すること、非極性側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を別の非極性側鎖含有アミノ酸で置換すること、塩基性／正荷電極性アミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を別の塩基性／正荷電極性アミノ酸で置換すること、極性側鎖含有非荷電アミノ酸（たとえば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を別の極性側鎖含有非荷電アミノ酸で置換すること、ベータ分枝側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ｈｅ、Ｔｈｒ、およびＶａｌ）を別のベータ分枝側鎖含有アミノ酸で置換すること、芳香族側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を別の芳香族側鎖含有アミノ酸で置換することなどであってよい。
【０１４９】
ＣＡＲは、本質的に、本明細書中に記載される１つまたは複数の指定のアミノ酸配列からなるものであってよく、その結果、他の構成要素（たとえば、他のアミノ酸）によって機能性バリアントの生物学的活性が実質的に変化しない。
【０１５０】
ＤｕｏＣＡＲ（機能性部分および機能性バリアントを含む）は、ＤｕｏＣＡＲ（またはその機能性部分または機能性バリアント）が、たとえば、抗原への特異的結合能力、哺乳動物における疾患細胞検出能力、または哺乳動物における疾患の処置もしくは予防能力などの、生物学的活性を保持する限り、任意の長さであってよい、すなわち任意の数のアミノ酸を含むものであってよい。たとえば、ＣＡＲは、アミノ酸約５０〜約５０００個の長さ、たとえば、アミノ酸５０個、７０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、またはそれ以上の長さであってよい。
【０１５１】
ＤｕｏＣＡＲ（本発明に係る機能性部分および機能性バリアントを含む）は、１つ以上の天然アミノ酸に替えて、合成アミノ酸を含んでよい。このような合成アミノ酸は当技術分野において周知であり、たとえば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、−アミノ  ｎ−デカン酸（−ａｍｉｎｏ  ｎ−ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、ｔｒａｎｓ−３−およびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ν’，Ν’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、−アミノシクロペンタンカルボン酸（−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ａ−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ−アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、γ−ジアミノ酪酸、β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびａ−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【０１５２】
ＤｕｏＣＡＲ（機能性部分および機能性バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化（たとえば、ジスルフィド架橋により）、または酸付加塩に変換、および／または任意に二量体化もしくは重合もしくは共役されていてよい。
【０１５３】
ＤｕｏＣＡＲ（その機能性部分および機能性バリアントを含む）は、当技術分野において周知の方法によって得ることができる。ＤｕｏＣＡＲは、任意の好適なポリペプチドまたはタンパク質作製方法によって作製されてよい。ポリペプチドおよびタンパク質を新たに合成する好適な方法が、Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001；および米国特許第５，４４９，７５２号などの先行技術文献中に記載される。キメラ抗原受容体の発生方法、このような受容体を含むＴ細胞、およびこれらの使用（たとえば、がんの処置を目的として）が、当技術分野において周知されており、さらに、本明細書中に記載される（たとえば、Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, published online February 23, 2010, pages 1 -9; Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 -2271; Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; Tumaini et al., Cytotherapy, 15, 1406-1417, 2013; Haso et al., (2013) Blood, 121, 1165-1174；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１２／０７９０００号、第ＷＯ２０１３／１２６７２６号；および米国公報第２０１２／０２１３７８３号を参照（これらの各々の全体を引用により本明細書に援用する））。たとえば、開示されるキメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子を、Ｔ細胞などの宿主細胞への形質導入に使用される発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）に含めることにより、開示されるＣＡＲを作製することもできる。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体の使用方法は、対象からＴ細胞を単離し、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）でこのＴ細胞を形質導入して、たとえば当該対象における腫瘍の処置などの処置を目的として、当該対象にＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与することを含む。
【０１５４】
Ｂ．抗体および抗原結合断片
一実施形態は、本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合ドメインもしくは一部分（いずれも、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に特異的に結合する）をさらに提供する。本明細書中において使用される場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ  Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、たとえばＣＡＲの抗体由来標的化ドメインによって決定される、抗原特異性を有する。
【０１５５】
本明細書中において使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、抗体およびその抗原結合断片を含んでよい。用語「抗体」は、本明細書中において、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を呈するものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、およびその抗原結合断片を含む（がこれらに限定されない）多様な抗体構造を包含する。抗体の例は、たとえば、抗原に対する結合親和性を保持する当技術分野において周知の完全型免疫グロブリンならびにそのバリアントおよび断片を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体である。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、ごく微量で存在し得る天然の変異を有し得ることを除いて、同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原エピトープに対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から当該抗体が得られるという特性を示すものであって、当該抗体が何らかの特定の方法によって作製される必要があると解釈されるべきではない。いくつかの例において、モノクローナル抗体は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または、単一の抗体（またはその抗原結合断片）についてその抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクションされた細胞もしくはその子孫によって、産生された抗体である。いくつかの例において、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合またはその他の免疫グロブリン機能に実質的に影響しない保存的アミノ酸置換を有してよい。例示的なモノクローナル抗体作製方法は周知されており、たとえば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)を参照。
【０１５７】
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により互いに結合した重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類がある。主要な重鎖には５つのクラス（またはアイソタイプ）があり、これらが抗体分子の機能活性を決定する（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）。
【０１５８】
重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメイン）を含有する（たとえば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照）。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖可変領域が組み合わさって、抗原に特異的に結合する。追加的な実施形態において、重鎖可変領域のみが必要とされる。たとえば、重鎖のみからなる天然のラクダ類抗体は、軽鎖がなくても機能性かつ安定である（たとえば、Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996を参照）。「ＶＨ」への言及、または「ＶＨ」は、抗原結合断片の可変領域を含む、抗体重鎖の可変領域、たとえばＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂなどを指す。「ＶＬ」への言及、または「ＶＬ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂのものを含む抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
【０１５９】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「フレームワーク」領域と、これを中断する３つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともよばれる）とを含有する（たとえば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest，米国保健福祉省(U.S. Department of Health and Human Services),1991を参照）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、同種間で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および構成重鎖のフレームワーク領域が結合して、三次元空間においてＣＤＲを位置決めおよび整列させている。
【０１６０】
ＣＤＲは、主に、抗原エピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Kabatら（“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）, Bethesda, MD, 1991; “Kabat” numbering scheme)、Al-Lazikaniら（JMB 273,927-948, 1997; “Chothia” numbering scheme）、およびLefrancら（“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; “IMGT” numbering scheme）により記載されるスキームを含む複数の周知のスキームのうち任意のものを使用して容易に判断できる。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端に向かって）と称され、さらに、典型的には、そのＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、これを含む抗体の重鎖の可変ドメインからのＣＤＲ３であり、ＶＬ  ＣＤＲ１は、これを含む抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される場合がある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される場合がある。
【０１６１】
「抗原結合断片」は、同族の抗原を特異的に認識する能力を保持する、全長抗体の一部分、およびこのような部分の多様な組み合わせである。抗原結合断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；一本鎖抗体分子（たとえば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、抗体全体の改変によって作製された、または、組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成された、抗原結合断片を含む（たとえば、Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010を参照）。
【０１６２】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、１つ以上の抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを好適なポリペプチドリンカーによって結合して遺伝子融合一本鎖分子としたものを含有する、遺伝子操作された分子である（たとえば、Bird et al., Science, 242:423 426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:5879 5883, 1988; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010を参照）。ｓｃＦｖ内におけるＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ｓｃＦｖを決定づけるものではない。したがって、起こり得る編成（ＶＨドメイン−リンカードメイン−ＶＬドメイン；ＶＬドメイン−リンカードメイン−ＶＨドメイン）の両方を有するｓｃＦｖを使用してよい。
【０１６３】
ｄｓＦｖにおいて、重鎖および軽鎖の可変鎖は、変異によりジスルフィド結合を導入して、両鎖の結合を安定化させたものである。また、ダイアボディも含まれ、これは２価の二重特異性抗体であって、ＶＨドメインとＶＬドメインとが１本のポリペプチド鎖上に発現しているが、２つのドメインを繋いで１本の鎖にするには短すぎるリンカーを使用しているため、２つのドメインを別の鎖の相補的ドメインと繋いでおり、２つの抗原結合部位が形成されている（たとえば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444 6448, 1993; Poljak et al., Structure, 2:1121 1123, 1994を参照）。
【０１６４】
抗体は、さらに、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体など）およびヘテロ結合抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（二重特異性抗体など）などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照。
【０１６５】
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築できる、または、組換えによって作製できる、または、たとえば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)（引用により本明細書に援用する）により記載される可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリのスクリーニングによって得ることができる。これらの方法、ならびに、たとえばキメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、一本鎖、および二機能性抗体を作製するための、その他の方法は、当業者に周知されている（Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Harlow and Lane, supra, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995）；これらの各々を引用により本明細書に援用する）。
【０１６６】
参照抗体としての「同じエピトープに結合する抗体」は、拮抗アッセイにおいて参照抗体とその抗原との結合を５０％以上妨げる抗体を指し、逆に、参照抗体は、拮抗アッセイにおいてこの抗体とその抗原との結合を５０％以上妨げる。抗体拮抗アッセイは周知されており、例示的な拮抗アッセイが本明細書中において提供される。
【０１６７】
「ヒト化」抗体または抗原結合断片は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（マウス、ラット、または合成など）抗体または抗原結合断片からの１つ以上のＣＤＲとを含む。このＣＤＲを与える非ヒト抗体または抗原結合断片は「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを与えるヒト抗体または抗原結合断片は「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、すべてのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンからのものである。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であってよく、たとえば少なくとも約８５〜９０％（約９５％以上など）同一であってよい。よって、ヒト化抗体または抗原結合断片のすべての部分（恐らくはＣＤＲを除く）が、天然ヒト抗体配列の対応部分と実質的に同一である。
【０１６８】
「キメラ抗体」は、２つの異なる抗体（典型的には種が異なる）に由来する配列を含む抗体である。いくつかの例において、キメラ抗体は、１つのヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域と、別のヒト抗体からのＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域とを含む。
【０１６９】
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノムからの（または、これに由来する）配列を含み、別の種からの配列を含まない抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒトゲノムからの（または、これに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域、および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、たとえばファージディスプレイまたは遺伝子組換え動物の使用により、ヒトゲノム由来配列に基づく抗体作製技術を使用することによって、同定および単離できる（たとえば、Barbas et al.  Phage display:  A Laboratory Manuel.  1st Ed. New York:  Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004.  Print.; Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008を参照）。
【０１７０】
抗体は、１つ以上の結合部位を有してよい。結合部位が１を超える場合には、これらの結合部位は、互いに同じであってよい、または異なってもよい。たとえば、天然の免疫グロブリンは２つの同じ結合部位を有し、一本鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合部位を有し、二重特異性または二機能性抗体は２つの異なる結合部位を有する。
【０１７１】
ＣＡＲの任意の機能性部分に結合できる抗体能力を試験する方法は当技術分野において周知であり、たとえば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、および競合阻害アッセイなどの、任意の抗体抗原結合アッセイを含む（たとえば、下記のＪａｎｅｗａｙら、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６  Ａｌ号、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照）。
【０１７２】
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分は、たとえば、放射性同位体、フルオロフォア（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（たとえば、金粒子）などの、検出可能な標識を含むようにされていてよい。
【０１７３】
Ｃ．結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
本明細書中に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、またはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片（いずれも、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的）は、当業者に周知の多くの手段のうち任意の手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの剤に結合されていてよい。共有結合による手段および非共有結合による手段のいずれを使用してもよい。結合体は、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的に結合する抗体または抗原結合断片と、エフェクター分子または検出可能なマーカーとが共有結合している分子を含むが、これらに限定されない。当技術分野における当業者には、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、および３５Ｓなどの放射性剤、ならびに、その他の標識、標的部位、およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）多様なエフェクター分子および検出可能なマーカーを使用できるということが理解される。
【０１７４】
具体的なエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、具体的な標的分子または細胞、および所望される生物学的作用に依存する。したがって、たとえば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（腫瘍細胞など）の死を引き起こすために使用される細胞毒であってもよい。
【０１７５】
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合断片に付着させる手順は、エフェクターの化学構造によって異なる。ポリペプチドは、典型的には、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）、またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基などの多様な官能基を含有しており、これらを抗体上の好適な官能基との反応に利用でき、その結果として、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合が得られる。代替的には、抗体または抗原結合断片を誘導体化して、さらなる反応性官能基を露出または付着させる。誘導体化は、Pierce Chemical Company (Rockford, IL)から入手できるものなどの複数の周知のリンカー分子のうち任意のものの付着に関連してよい。リンカーは、抗体または抗原結合断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーと結合させるために使用される任意の分子であってよい。リンカーは、抗体または抗原結合断片とエフェクター分子または検出可能なマーカーとの両方に共有結合を形成できる。好適なリンカーは当業者に周知されており、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。抗体または抗原結合断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、その側鎖を介して構成アミノ酸に（たとえば、ジスルフィド結合を介してシステインに）、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノ基およびカルボキシ基に結合していてよい。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサー要素を含んでよく、スペーサー要素が存在する場合、スペーサー要素によってリンカーが大きくなり、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合断片との間の距離が増大する。スペーサーの具体例は当業者に周知されており、米国特許第号７，９６４，５６６号、第７，４９８，２９８号、第６，８８４，８６９号、第６，３２３，３１５号、第６，２３９，１０４号、第６，０３４，０６５号、第５，７８０，５８８号、第５，６６５，８６０号、第５，６６３，１４９号、第５，６３５，４８３号、第５，５９９，９０２号、第５，５５４，７２５号、第５，５３０，０９７号、第５，５２１，２８４号、第５，５０４，１９１号、第５，４１０，０２４号、第５，１３８，０３６号、第５，０７６，９７３号、第４，９８６，９８８号、第４，９７８，７４４号、第４，８７９，２７８号、第４，８１６，４４４号、および第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許公開第２０１１０２１２０８８号および第２０１１００７０２４８号中に列記されるものを含む（これらの各々の全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内という条件下において開裂可能であり、リンカーの開裂によって、細胞内環境において、抗体または抗原結合断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーが解放される。さらに別の実施形態において、リンカーは開裂可能ではなく、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、たとえば抗体の分解によって、解放される。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境内（たとえば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する開裂剤によって開裂可能である。リンカーは、たとえば、細胞内のペプチダーゼ、またはリソソームプロテアーゼもしくはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼ酵素によって開裂したペプチドリンカーであってよい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくともアミノ酸２個の長さ、または少なくともアミノ酸３個の長さである。しかしながら、リンカーは、アミノ酸４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の長さ、たとえばアミノ酸１〜２個、１〜３個、２〜５個、３〜１０個、３〜１５個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個の長さであってよい。プロテアーゼは、カテプシンＢおよびＤ、ならびにプラスミンを含んでよく、これらはすべて、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞中において活性薬物を放出することが知られている（たとえば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照）。たとえば、チオール依存性プロテアーゼ  カテプシン−Ｂによって開裂可能なペプチドリンカーを使用できる（たとえば、フェニルアラニン−ロイシンまたはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシンリンカー）。このようなリンカーのその他の例が、たとえば米国特許第６，２１４，３４５号中に記載され、これを引用により本明細書に援用する。具体的な一実施形態において、細胞内プロテアーゼによって開裂可能なペプチドリンカーは、バリン−シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン−リシンリンカーである（たとえば、米国特許第６，２１４，３４５号を参照。この文献はドキソルビシンとバリン−シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーとの合成を記載している）。
【０１７８】
別の実施形態において、開裂可能なリンカーは、ｐＨ感受性である、すなわち、特定のｐＨ値において加水分解に感受性を有する。典型的には、こうしたｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下において加水分解する。たとえば、リソソーム内で加水分解し得る酸不安定リンカー（たとえば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）を使用できる。（たとえば、米国特許第５，１２２，３６８号、第５，８２４，８０５号、第５，６２２，９２９号；Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661を参照）。こうしたリンカーは、中性ｐＨ条件下（血液中など）においては比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカーである（たとえば、アシルヒドラゾン結合を介して当該治療剤に結合したチオエーテルなど（たとえば、米国特許第５，６２２，９２９号などを参照））。
【０１７９】
別の実施形態において、リンカーは、還元条件下において開裂可能である（たとえば、ジスルフィドリンカー）。多様なジスルフィドリンカーが当技術分野において周知されており、たとえば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成できるものを含む。（たとえば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68:92809290, 2008を参照）。また、米国特許第４，８８０，９３５号も参照される。
【０１８０】
さらに別の具体的な実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12）である。
【０１８１】
さらに別の実施形態において、リンカーは開裂可能ではなく、エフェクター分子または検出可能なマーカーは抗体の分解によって解放される（米国公報第２００５／０２３８６４９号を参照、この全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞外環境において、開裂に対して抵抗性を有する。たとえば、結合体が細胞外環境内（たとえば、血漿中）に存在する際には、結合体の試料中において、リンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が開裂している。細胞外環境内においてリンカーが開裂に対して抵抗性を有するか否かは、たとえば、目的とするリンカーを含有する結合体を血漿と共に、あらかじめ定められた時間（たとえば、２、４、８、１６、または２４時間）かけてインキュベートし、次いで、血漿中に遊離しているエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって、判断できる。結合体中において使用できる多様な例示的なリンカーが、ＷＯ２００４−０１０９５７号、米国公報第２００６／００７４００８号、米国公報第２００５０２３８６４９号、および米国公報第２００６／００２４３１７号中に記載され、これらの各々の全体を引用により本明細書に援用する。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分と、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの１つ以上の小分子毒素、ならびにこれらの毒素の誘導体で毒素活性を有するものとの結合体が提供される。
【０１８４】
メイタンシノイド毒素部位としての使用に好適なメイタンシン化合物が当技術分野において周知されており、周知の方法にしたがって天然の供給源から単離でき、遺伝子操作技術を使用して作製できる（Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973を参照）、または、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を周知の方法にしたがって合成により調製できる。メイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害によって作用する有糸分裂阻害剤（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）である。メイタンシンは、東アフリカ産の灌木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、さらに、特定の微生物が、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体および類似体が、たとえば、米国特許第４，１３７，２３０号、第４，２４８，８７０号、第４，２５６，７４６号、第４，２６０，６０８号、第４，２６５，８１４号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３１７，８２１号、第４，３２２，３４８号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６４，８６６号、第４，４２４，２１９号、第４，４５０，２５４号、第４，３６２，６６３号、および第４，３７１，５３３中に開示され、これらの各々を引用により本明細書に援用する。メイタンシノイドを含有する結合体、その作製方法、およびその治療的使用が、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，４４１，１６３号、および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５  Ｂ１号中に開示され、その開示内容を引用により本明細書に明白に援用する。
【０１８５】
さらなる毒素を、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分と共に使用できる。毒素の例は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリン、およびカリケアマイシン、ならびにボツリヌストキシンＡ〜Ｆを含む。こうした毒素は当技術分野において周知されており、その多くを商業的供給元（たとえば、Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）から容易に入手できる。意図される毒素は、こうした毒素のバリアントをも含む（たとえば、米国特許第５，０７９，１６３号および第４，６８９，４０１号を参照）。
【０１８６】
サポリンは、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素であり、リボソーム複合体の６０Ｓ部分の不活性化によってタンパク質合成を妨げる（Stirpe et al., Bio/Technology, 10:405-412, 1992）。しかしながら、この毒素は、細胞内に特異的に侵入するための機構を有さず、そのため、細胞内に効率よく入るには、内在している細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合断片に結合する必要がある。
【０１８７】
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素中において使用するためのジフテリア毒素は、変異により、非特異的毒性が低減または除去されている。ＣＲＭ１０７として知られる変異体は、十分な酵素活性を有するが非特異的毒性が著しく低減されたものであり、１９７０年代から周知され（Laird and Groman, J. Virol. 19:220, 1976）、ヒト臨床試験において使用されている。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照。
【０１８８】
リシンは、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ（Ｃａｓｔｏｒ  ｂｅａｎ））から得られるレクチンＲＣＡ６０である。リシンの例は、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ）には２つの形態があり、これらの分子量がそれぞれ約６５ｋＤおよび約１２０ｋＤであることからＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される（Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543, 1972）。Ａ鎖はタンパク質合成の不活性化と細胞の死滅とを担う。Ｂ鎖は、細胞表面ガラクトース残基にリシンを結合させて、サイトゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Olsnes et al., Nature 249:627-631, 1974および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１８９】
リボヌクレアーゼもまた、標的化分子に結合させることによって免疫毒素として使用されている（Suzuki et al., Nat. Biotech. 17:265-70, 1999を参照）。α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）などの例示的なリボトキシンが、たとえば、Rathore et al., Gene 190:31-5, 1997; and Goyal and Batra, Biochem. 345 Pt 2:247-54, 2000中に記載されている。カリケアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ二本鎖の切断を引き起こしてアポトーシスを導くエンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（たとえば、Lee et al., J. Antibiot. 42:1070-87,1989を参照）。この薬物は、臨床試験において、免疫毒素の毒性部位である（たとえば、Gillespie et al., Ann. Oncol. 11:735-41, 2000を参照）。
【０１９０】
アブリンは、Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓから得られる毒性レクチンを含む。その毒性成分であるアブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄは、分子量が約６３〜６７ｋＤであり、２つのポリペプチド鎖ＡおよびＢがジスルフィド結合したものから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害し、Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基に結合する（Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095, 1988; and Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335, 1978を参照）。
【０１９１】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、モノクローナル抗体、その抗原結合断片（いずれも、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的）は、検出可能なマーカー、たとえば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法、または画像診断技術（コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波診断、光ファイバー検査、および腹腔鏡下検査など）によって検出できる検出可能なマーカーとも結合していてよい。検出可能なマーカーの具体例は、フルオロフォア、化学発光剤、酵素による結合、放射性アイソタイプ、および重金属または化合物（たとえば、ＭＲＩによる検出を目的とした超常磁性酸化鉄ナノ結晶）を含むが、これらに限定されない。たとえば、有用である検出可能なマーカーは、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−１−ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フィコエリトリン、およびランタニド発光体などを含む蛍光性化合物を含む。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーも有用である。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼなどの、検出にとって有用な酵素と結合していてもよい。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分が、検出可能な酵素と結合している場合、当該酵素に使用されると識別可能な反応生成物を生成するようなさらなる試薬を添加することによって検出できる。たとえば、剤である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって着色反応生成物が得られ、これを目視によって検出できる。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、ビオチンと結合していてもよく、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することによって検出されてもよい。注目すべきことに、アビジン自体が酵素または蛍光標識と結合していてもよい。
【０１９２】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分は、ガドリニウムなどの常磁性剤と結合していてもよい。超常磁性酸化鉄などの常磁性剤も、標識として有用である。抗体はまた、ランタニド（ユーロピウムおよびジスプロシウムなど）およびマンガンと結合していてもよい。抗体または抗原結合断片はまた、第２のレポーター（ロイシンジッパーの配列対、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）によって認識されるあらかじめ定められたポリペプチドエピトープで標識されていてもよい。
【０１９３】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、放射性標識アミノ酸と結合していてもよい。放射性標識は、診断目的および治療目的の両方に使用してよい。たとえば、放射性標識は、本明細書中に開示される抗原の１つ以上および抗原発現細胞をＸ線、発光スペクトル、またはその他の診断技術によって検出するために使用してよい。さらに、放射性標識は、治療において、対象における腫瘍を処置するための、たとえば神経芽細胞腫を処置するための、毒素として使用してよい。ポリペプチドのための標識の例は、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位体または放射性ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
このような検出可能なマーカーの検出手段は、当業者に周知されている。したがって、たとえば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンタを使用して検出されてよく、蛍光性マーカーは、光検出器を使用して放射光を検出することによって検出されてよい。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与えて、基質に対する酵素の作用により生成した反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することによって検出される。
【０１９５】
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクター、および宿主細胞
本発明の一実施形態によって、本明細書中に記載されるＤｕｏＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合部分（その機能性部分および機能性バリアントを含む）のうち任意のものをコードするヌクレオチド配列を含む核酸がさらに提供される。本発明に係る核酸は、本明細書中に記載されるリーダー配列、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのうち任意のものをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１９６】
一実施形態において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９７】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲの一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む。
【０１９８】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲの別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【０１９９】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲのさらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるＣＡＲ細胞外抗原結合ドメインは、抗原に結合する、少なくとも１つのリポカリンに基づく抗原結合抗原（アンチカリン）を含む。
【０２００】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＣＡＲの一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、リンカードメインによって、膜貫通ドメインに結合している。
【０２０１】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、リーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列の後ろに位置する。
【０２０２】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない抗原を標的とする。
【０２０３】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの特定の実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗メソテリンｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３／ＩＬ３ＲａｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳｏ−１  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合ドメイン、または、これらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、または、これらの任意の組み合わせを含む。
【０２０４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様において、本明細書中において提供されるＤｕｏＣＡＲはさらに、リンカードメインを含む。
【０２０５】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、細胞外抗原結合ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカードメインによって、膜貫通ドメインに結合されている。
【０２０６】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリンカードメインは、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、かつ膜貫通ドメインに結合している。
【０２０７】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、これらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０８】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる膜貫通ドメインは、少なくとも１個でありかつ１０個を超えない改変を含むアミノ酸配列、またはこれらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含む。
【０２０９】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるＣＡＲはさらに、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【０２１０】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含む。
【０２１１】
本明細書中に開示されるＣＡＲの一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインよりもＣ末端側に位置している。
【０２１２】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはこれらの組み合わせを含む。
【０２１３】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらなる実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの組み合わせの機能性シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態において、リーダー配列またはシグナルペプチド配列をさらに含有する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、コドンが改変されたものであってよい。いかなる理論にも拘束されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化によってｍＲＮＡ転写物の翻訳効率が増大すると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然コドンを、同じアミノ酸をコードするが細胞内での利用がより容易なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換することを伴ってよく、したがって、翻訳効率が増大し得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害し得る二次ｍＲＮＡ構造を低減し得るものであってよく、したがって、翻訳効率が増大し得る。
【０２１６】
本発明の一実施形態において、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含んでよい。本発明の別の一実施形態において、核酸は、本明細書中に記載されるＤｕｏＣＡＲ（その機能性部分および機能性バリアントを含む）のうち任意のものをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含んでよい。
【０２１７】
本明細書中において使用される「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含むものであり、一般的には、一本鎖または二本鎖であってよく、合成または天然の供給源から（たとえば、単離および／または精製により）得られてよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチドを含有してよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチド間結合（無改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルに代えて、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合など）を含有してよい、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。いくつかの実施形態において、核酸は、挿入、欠失、反転、および／または置換を全く含まない。しかしながら、本明細書中において記載されるとおり、いくつかの例においては、核酸が１つ以上の挿入、欠失、反転、および／または置換を含むことが好適であってよい。
【０２１８】
組換え核酸は、天然には存在しない配列を有するもの、または、配列中では離れた２つの領域を人工的に組み合わせた配列を有するものであってよい。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または、より一般的には、離れた核酸領域を、たとえば、上述されるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献中に記載されるものなどの、遺伝子操作技術により、人工的に操作して、実現されることが多い。核酸は、当技術分野において周知される手順を使用した化学合成および／または酵素による結合反応に基づいて構築されてもよい。たとえば、上述されるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献および上述されるＡｕｓｕｂｅｌらの文献を参照。たとえば、核酸は、天然のヌクレオチドを使用して、または、当該分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、多様な様式で改変されたヌクレオチド（たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成されてもよい。核酸生成に使用できる改変ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない。代替的には、本発明に係る核酸の１つ以上を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、米国）などの企業から購入してもよい。
【０２１９】
核酸は、上述されるＤｕｏＣＡＲのうち任意のものまたはその機能性部分もしくは機能性バリアントをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含んでよい。代替的には、ヌクレオチド配列は、上述される配列のうち任意のものに縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）されたヌクレオチド配列または縮重配列の組み合わせを含んでよい。
【０２２０】
一実施形態は、本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、または本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸をさらに提供する。
【０２２１】
ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしてよい。「高度にストリンジェントな条件」とは、ヌクレオチド配列が標的配列（本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズし、その量が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に多いことを意味する。高度にストリンジェントな条件は、厳密に相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはミスマッチが２〜３個散在するのみであるものを、当該ヌクレオチド配列に一致する小領域（たとえば、３〜１０塩基）を偶然にも２〜３個有する無作為の配列から区別できるような条件を含む。こうした小さな相補性領域は、塩基１４〜１７個またはそれ以上の長さの全長相補性領域よりも容易に融解され、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションによってこれらを容易に区別できる。比較的高度にストリンジェントな条件は、たとえば、約０．０２〜０．１Ｍ  ＮａＣｌまたはこれと同等で温度約５０〜７０℃などのような低塩および／または高温条件を含み得る。このように高度にストリンジェントな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、万一許容するとしても、その程度は非常に低く、本発明のＤｕｏＣＡＲのうち任意のものの発現を検出するために特に好適である。一般的に、ホルムアミドの添加量を増加することによって条件をさらにストリンジェントにすることができると理解される。
【０２２２】
また、本明細書中に記載される核酸のうち任意のものとの同一性が少なくとも約７０％またはそれ以上、たとえば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。
【０２２３】
一実施形態において、核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれてよい。この点において、一実施形態は、上述される核酸のうち任意のものを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書中に記載される目的において、用語「組換え発現ベクター」は、遺伝子改変オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、このコンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、当該ベクターと宿主細胞とを、宿主細胞中において当該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが発現するのに十分な条件下において接触させた場合に、宿主細胞が当該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現できるものである。こうしたベクターは、総じて、天然には存在しない。
【０２２４】
しかしながら、こうしたベクターの一部は天然に存在し得る。この組換え発現ベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の種類のヌクレオチドを含んでよく、これらは、一本鎖または二本鎖であってよく、合成または一部は天然の供給源から得られてよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチドを含有してよい。組換え発現ベクターは、天然または非天然のヌクレオチド間結合、または両方の型の結合を含んでよい。好ましくは、非天然または変化したヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、当該ベクターの転写または複製を妨げない。
【０２２５】
一実施形態において、組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするために使用できる。好適なベクターは、繁殖および増殖を目的として、または発現を目的として、またはその両方の目的で設計されたもの（プラスミドおよびウイルスなど）を含む。ベクターは、ｐＵＣ系（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、およびｐＥＸ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群より選択されてよい。
【０２２６】
λυΤΙΟ、λυΤΙ  １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４、およびλΝΜΙ  １４９などのバクテリオファージベクターも使用できる。植物発現ベクターの例は、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１、およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。動物発現ベクターの例は、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってよい。レンチウイルスベクターは、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中において提供されるような自己不活型レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。診療所において使用され得るレンチウイルスベクターのその他の例は、たとえば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  ｐｌｃからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子導入技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎなどからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系を含むが、これらに限定されない。臨床用の型ではないレンチウイルスベクターも入手可能であり、当業者に周知され得る。
【０２２７】
複数のトランスフェクション技術が当技術分野において一般的に周知されている（たとえば、Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., supra; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); and Chu et al, Gene, 13: 97 (1981)を参照）。
【０２２８】
トランスフェクション方法は、リン酸カルシウム共沈（たとえば、上述されるGrahamらを参照）、培養細胞中への直接マイクロインジェクション（たとえば、Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)を参照）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)を参照）、リポソーム介在性遺伝子導入（たとえば、Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)を参照）、脂質介在性形質導入（たとえば、Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)を参照）、および高速微粒子銃を使用した核酸導入（たとえば、Klein et al, Nature, 327: 70-73 (1987)を参照）を含む。
【０２２９】
一実施形態において、組換え発現ベクターは、たとえば上述されるＳａｍｂｒｏｏｋら、および上述されるＡｕｓｕｂｅｌら中に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製されてよい。発現ベクターの環状または線状コンストラクトは、原核または真核生物の宿主細胞において機能する複製機構を含有するように調製されてよい。複製機構は、たとえば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、およびウシパピローマウイルスなどに由来するものであってよい。
【０２３０】
組換え発現ベクターは、ベクター導入先の宿主細胞（たとえば、細菌、真菌、植物、または動物）の種類に対して適宜特異的であり、かつ、ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡのいずれに基づくかが考慮された、転写コドンおよび翻訳開始コドンおよび停止コドンなどの調節配列を含んでよい。組換え発現ベクターは、クローニングを促進するための制限部位を含んでよい。
【０２３１】
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能とする１つ以上のマーカー遺伝子を含んでよい。マーカー遺伝子は、たとえば抗生物質、重金属などに対する耐性といった、殺生物剤耐性、および、原栄養性とするための栄養要求性宿主における補完などを含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子は、たとえば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０２３２】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能性部分および機能性バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に相補的なもしくはこれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合した、天然または非天然のプロモーターを含んでよい。プロモーターの選択（たとえば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、および発生特異的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）など）は、当業者の通常の知識の範囲内である。同様にヌクレオチド配列とプロモーターとの結合も、当業者の通常の知識の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列中にみられるプロモーターであってよい。
【０２３３】
組換え発現ベクターは、一過性の発現、または安定的な発現、またはその両方のうちのいずれかを目的として設計されてよい。また、組換え発現ベクターは、恒常的発現または誘導性発現を目的として作製されてよい。
【０２３４】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製されてよい。本明細書中において使用される場合、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現している細胞の死を引き起こす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、当該遺伝子が発現している細胞に、たとえば薬物などの剤に対する感受性を与えて、当該細胞がこの剤に接触または曝露されると当該細胞の死を引き起こす遺伝子であってよい。自殺遺伝子は当技術分野において周知されており（たとえば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004を参照）、かつ、たとえば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼを含む。
【０２３５】
一実施形態は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターのうち任意のものを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中において使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明に係る組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、たとえば植物、動物、真菌、もしくは藻類などの、真核細胞であってもよいし、または、たとえば細菌もしくは原生動物などの、原核細胞であってもよい。宿主細胞は、培養細胞、または、初代細胞（すなわち、たとえばヒトなどの、生物から直接単離されたもの）であってよい。宿主細胞は、接着細胞、または、懸濁細胞（すなわち、懸濁液中で増殖する細胞）であってよい。好適な宿主細胞は当技術分野において周知されており、たとえば、ＤＨ５ａ大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＨＥＫ２９３細胞などを含む。組換え発現ベクターの増幅または複製が目的である場合には、宿主細胞は、原核細胞、たとえばＤＨ５ａ細胞であってよい。組換えＣＡＲの作製が目的である場合には、宿主細胞は哺乳動物細胞であってよい。宿主細胞はヒト細胞であってよい。宿主細胞は任意の細胞型であってよく、任意の種類の組織に由来してよく、任意の発生段階であってよいが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってよい。宿主細胞はＴ細胞であってよい。
【０２３６】
本明細書中に記載される目的において、Ｔ細胞は任意のＴ細胞であってよく、培養Ｔ細胞（たとえば初代Ｔ細胞など）、または培養Ｔ細胞株（たとえば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど）からのＴ細胞、または哺乳動物から得られるＴ細胞であってよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない、非常に多様な供給源から得られてよい。Ｔ細胞は、強化または精製されていてもよい。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、たとえばＴｈｉおよびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（たとえば、細胞毒性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、およびナイーブ型Ｔ細胞などを含むがこれらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞であってよい。
【０２３７】
一実施形態において、本明細書中に記載されるＤｕｏＣＡＲは、Ｔ細胞ではない好適な細胞において使用できる。このような細胞は、たとえば、ＮＫ細胞および多能性幹細胞から発生させたＴ様細胞などの、免疫エフェクター機能を有するものである。
【０２３８】
また、一実施形態は、本明細書中に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団も提供する。この細胞の集団は、記載される組換え発現ベクターのうち任意のものを含む宿主細胞に加えて、少なくとも１種のその他の細胞、たとえば、組換え発現ベクターのうち任意のものを含まない宿主細胞（たとえば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、たとえば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などを含む、不均質な集団であってよい。代替的には、細胞の集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（たとえば、本質的にこれからなる）、実質的に均質な集団であってよい。また、集団は、当該集団の全細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、したがって当該集団の全細胞がこの組換え発現ベクターを含むような、クローン細胞集団であってもよい。本発明の一実施形態において、細胞の集団は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【０２３９】
ＤｕｏＣＡＲ（その機能性部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離および／または精製されてよい。たとえば、精製された（または単離された）宿主細胞の調製物中では、宿主細胞の純度が、体内の自然環境中における純度よりも高い。このような宿主細胞は、たとえば標準的な精製技術によって作製されてよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞の調製物は、この調製物の総細胞含有量の少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約７０％を宿主細胞が占めるように精製される。たとえば、この純度は、少なくとも約５０％であってよい、または約６０％、約７０％、もしくは約８０％を超えてよい、または約１００％であってよい。
【０２４０】
Ｅ．処置方法
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団において使用されるＤｕｏＣＡＲを哺乳動物における疾患の処置または予防方法において使用してよいことが意図される。この点において、一実施形態は、哺乳動物におけるがんの処置または予防方法を提供し、これは、哺乳動物に、ＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／またはその抗原結合部分、および／または医薬組成物を、哺乳動物におけるがんの処置または予防に有効な量にて投与する工程を含む。上述されるＤｕｏＣＡＲのさらなる使用方法が上記に開示されている。
【０２４１】
一実施形態は、さらに、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲを投与するより前に、哺乳動物をリンパ球枯渇させる工程を含む。リンパ球枯渇の例は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身照射などを含むが、これらに限定されなくてよい。
【０２４２】
宿主細胞または細胞の集団が投与される本方法の目的において、この細胞は、当該哺乳動物の同種細胞、またはこれの自家細胞であってよい。好ましくは、この細胞は、当該哺乳動物の自家細胞であってよい。本明細書中において使用される場合、同種とは、任意の材料であって、当該材料を導入した個体と同種であるが別個体である動物に由来することを意味する。２つ以上の個体について、１つ以上の座における遺伝子が同一でない場合に、これらの個体は互いに同種であるといわれる。いくつかの態様において、同種の個体からの同種の材料は、抗原性的に相互に作用できるほど十分に遺伝学的に異なっていてよい。本明細書中において使用される場合、「自家」は、任意の材料であって、この材料を後に再び導入することになる個体と同じ個体に由来する材料を意味する。
【０２４３】
本明細書中において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であってよい。本明細書中において使用される場合、用語「哺乳動物」は、マウスおよびハムスターなどの齧歯目哺乳動物およびウサギなどのウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目のものであってよい。哺乳動物は、ウシ亜科（ウシ）およびブタ類（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであってよい。哺乳動物は、霊長目、セボイド類（Ｃｅｂｏｉｄｓ）、もしくはシモイド類（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル（ｍｏｎｋｅｙｓ））、または類人猿類（ヒトおよびサル（ａｐｅｓ））であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２４４】
上述される方法に関して、がんは、急性ンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣型横紋筋肉腫、膀胱がん（たとえば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（たとえば、髄芽細胞腫）、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頚部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頚がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（たとえば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（たとえば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ−慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、ならびに尿管がんのうち任意のものを含む、任意のがんであってよい。
【０２４５】
用語「処置」および「予防」ならびにこれらの派生語は、本明細書中において使用される場合、必ずしも１００％のまたは完全な処置または予防を示唆するものではない。そうではなく、むしろ、当技術分野において通常の知識を有する者が利益または治療効果の可能性を認識する処置または予防には、多様な程度のものがある。この点に関し、本方法は、哺乳動物における任意の量または任意のレベルのがん処置または予防を提供できる。
【０２４６】
さらに、本方法によって提供される処置または予防は、処置または予防されている疾患（たとえば、がん）の１つ以上の状態または症状の処置または予防を含んでよい。また、本明細書中に記載される目的において、「予防」は、疾患またはその症状もしくは状態の発症の遅延を包含してもよい。
【０２４７】
別の一実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在の検出方法を提供し、これは、（ａ）哺乳動物からの１つ以上の細胞を含む試料をＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、および／またはその抗原結合部分、または医薬組成物に接触させることによって、複合体を形成する工程と、（ｂ）この複合体を検出する工程とを含み、複合体が検出された場合、哺乳動物においてがんが存在することが示唆される。
【０２４８】
この試料は、たとえば生検または剖検などの、任意の好適な方法によって得られてよい。生検は、個体から組織および／または細胞を除去することである。こうした除去は、除去された組織および／または細胞を実験法に供するために、個体から組織および／または細胞を採取するものであってよい。この実験法は、この個体が特定の状態もしくは疾患状態を有するか否かおよび／またはこれに罹患しているか否かを判断するための実験を含んでよい。この状態または疾患は、たとえば、がんであってよい。
【０２４９】
哺乳動物における増殖性障害、たとえばがん、の存在の検出方法の一実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、全細胞、その溶解物、または全細胞溶解物画分、たとえば、核もしくは細胞質画分、総タンパク質画分、または核酸画分、を含む試料であってよい。試料が全細胞を含む場合、この細胞は、哺乳動物の任意の細胞、たとえば、任意の臓器または組織の細胞（血液細胞または内皮細胞を含む）であってよい。
【０２５０】
上述される接触は、哺乳動物について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じてよい。好ましくは、当該接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる。
【０２５１】
また、複合体の検出は、当技術分野において周知される複数の方法のうち任意のものによって行なってよい。たとえば、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲ、本明細書中に記載されるポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体、またはその抗原結合部分は、たとえば、上記に開示されるとおり、放射性同位体、フルオロフォア（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（たとえば、金粒子）などの、検出可能な標識で標識されてよい。
【０２５２】
ＣＡＲの標的細胞認識能力および抗原特異性を試験する方法は、当技術分野において周知されている。たとえば、Clay et al., J. Immunol, 163: 507-513 (1999)は、サイトカイン（たとえば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出の測定方法を教示する。それに加えて、ＣＡＲの機能を、Zhao et al, J. Immunol. 174: 4415-4423 (2005)中に記載されるとおり、細胞の細胞毒性の測定によって評価してよい。
【０２５３】
別の一実施形態は、哺乳動物における増殖性障害、たとえばがん、を処置または予防するための、本発明に係るＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、またはその抗原結合部分、および／または医薬組成物の使用を提供する。このがんは、本明細書中に記載されるがんのうち任意のものであってよい。
【０２５４】
局所および全身投与を含む任意の投与方法を、開示される治療剤に対して使用してよい。たとえば、外用的、経口、静脈内などの血管内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内、および皮下への投与を使用してよい。具体的な投与様式および投薬レジメンは、担当臨床医によって、当該症例の詳細（たとえば、対象、疾患、関連する疾患状態、および処置が予防的であるか否か）を考慮の上で選択されてよい。１種を超える剤または組成物が投与される場合、１種以上の投与経路が使用されてよく、たとえば、化学療法剤は経口的に投与されてよいし、抗体または抗原結合断片または結合体または組成物は静脈内に投与されてよい。投与方法は注射を含み、この注射において、ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、結合体、抗体、抗原結合断片、または組成物は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソームなどの、非毒性でありかつ製薬学的に許容される担体中に提供される。いくつかの実施形態において、開示される化合物の局所投与は、たとえば、抗体または抗原結合断片を、腫瘍除去後の組織領域、または腫瘍発生傾向が疑われる領域に適用することによって使用されてよい。いくつかの実施形態において、治療的有効量の抗体または抗原結合断片を含む医薬調製物の持続的な腫瘍内（または腫瘍近傍）への放出が有益である可能性がある。その他の例において、結合体は、点眼剤として、外用的に角膜に、または眼の硝子体内に適用される。
【０２５５】
開示される治療剤は、正確な投薬量を１回１回投与するのに好適な単位投薬形態で製剤化されてよい。それに加えて、開示される治療剤は、単回投与または複数回投与のスケジュールで投与されてよい。複数回投与のスケジュールは、最初の一連の処置では１回を超える投与（たとえば１〜１０回の投与）が１回１回別個に行なわれてよく、続いてその後、必要に応じて、組成物の作用を維持または増大させるために、残りの投与が時間間隔をあけて行なわれてよいというものである。処置は、化合物を１日１回または１日複数回（ｍｕｌｔｉ−ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｅｓ）、２〜３日間から数か月間、またはさらには数年間の期間にわたって投与することを伴ってよい。したがって、投薬レジメンは、処置する対象の具体的な要求事項にも少なくとも一部基づいて決定されてよく、投与担当医の判断に依存してよい。
【０２５６】
抗体または結合体の典型的な投薬量は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、たとえば約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０２５７】
具体的な例において、対象は、結合体、抗体、組成物、ＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはさらなる剤のうち１種以上を含む治療用組成物を、少なくとも連続２日間および連続１０日間などの複数日投与スケジュール（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｉｎｇ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）にて、たとえば数週間、数か月間、または数年間の期間にわたって投与される。一例において、対象は、結合体、抗体、組成物、またはさらなる剤を、少なくとも３０日間の期間にわたって、たとえば少なくとも２か月間、少なくとも４か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも２４か月間、または少なくとも３６か月間の期間にわたって投与される。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、開示される方法は、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて（たとえば、逐次的に、実質的に同時に、または同時に）、手術、放射線療法、および／または化学療法を、対象に提供することを含む。このような剤および処置についての方法および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって判断されてよい。さらなる剤についての調製物および投与スケジュールは、製造元の説明書にしたがって、または熟練した医師の経験に基づく判断にしたがって使用されてよい。また、このような化学療法の調製物および投与スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md中に記載される。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、併用療法は、さらなるがん阻害剤の治療的有効量を対象に投与することを含んでよい。併用療法と共に使用できるさらなる治療剤の例は、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、ならびに血管新生阻害剤を含むが、これらに限定されない。これらの剤（治療的有効量にて投与される）および処置は、単独で、または組み合わせで使用されてよい。たとえば、任意の好適な抗がんまたは抗血管新生剤が、本明細書中に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗体、抗原結合断片、または結合体との組み合わせで投与されてよい。このような剤についての方法および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０２６０】
併用免疫療法のためのさらなる化学療法剤は、ナイトロジェンマスタード（たとえば、クロラムブチル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（たとえば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（たとえば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチンなどのアルキル化剤；葉酸（たとえば、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（たとえば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（たとえば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビンなどの代謝拮抗剤；ポドフィルム（たとえば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（たとえば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）などの植物アルカロイド；アントラサイクリンファミリーのメンバー（たとえば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、およびマイトマイシンなどの細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質；トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、およびトラスツズマブなどのモノクローナル抗体；アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィンなどの光増感剤；ならびに、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペガスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブ、およびトレチノインなどのその他の剤を含むが、これらに限定されない。このような剤の選択および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０２６１】
本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法を使用して、または、当技術分野において周知されている、Ｔ細胞を治療用レベルまで増殖させるその他の方法を使用して活性化および増殖させた細胞は、任意の数の妥当な処置モダリティ（抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）、またはＭＳ患者に対するナタリズマブ処置、または乾癬患者に対するエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者に対するその他の処置など、剤を用いた処置を含むが、これらに限定されない）と併せて（たとえば、その前、それと同時、またはその後に）、患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明に係るＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭ  ＰＡＴＨなどのその他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体またはその他の抗体療法、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射との組み合わせで使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性のホスファターゼであるカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害する、または、増殖因子誘発性シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993）。さらなる一実施形態において、本発明に係る細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体と併せて（たとえば、その前、それと同時、またはその後に）、患者に投与される。別の一実施形態において、本発明に係る細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する剤（たとえばリツキサン）などのＢ細胞除去療法の後に投与される。たとえば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置と、その後に末梢血幹細胞移植とを受けてよい。特定の実施形態において、移植後に、対象は、本発明に係る増殖させた免疫細胞の注入を受ける。追加的な一実施形態において、増殖させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【０２６２】
患者に投与される上記処置の用量は、処置されている状態および処置を受ける患者の厳密な性質に応じて異なってよい。ヒトへの投与における用量の決定は、従来許容されている通りに実施される。たとえば、ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、一般的に成人患者について１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常１日１回、１〜３０日間にわたって投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、いくつかの例においては、これより多い１日４０ｍｇといった用量でも使用され得る。
【０２６３】
併用療法は、相乗作用を生じ得るものであり、かつ、相乗的であることが立証され得る、すなわち、複数の活性成分を一緒に使用した際に達成される作用が、同じ化合物を別個に使用した際に得られる作用を合わせたものより大きい。相乗効果は、複数の活性成分が、（１）一緒に製剤化されて、これらを合わせた単位投薬用調製物として同時に投与もしくは送達された場合、（２）別個の調製物として、交互にもしくは平行して送達された場合、または（３）何らかのその他のレジメンが使用された場合に生じ得る。交互に送達された場合には、たとえば別個のシリンジで別々に注射されることによって、当該化合物が逐次的に投与または送達された際に、相乗効果が生じ得る。一般的に、交互の場合には、各活性成分の有効投薬量が逐次的に、すなわち連続的に投与され、一方、併用療法では、２種以上の活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
【０２６４】
一実施形態において、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片またはその結合体の有効量が、腫瘍を有する対象に、抗がん処置後に投与される。十分な時間が経過して、投与された抗体または抗原結合断片または結合体が、それぞれのがん細胞上に発現した抗原と免疫複合体を形成した後、この免疫複合体が検出される。免疫複合体が存在すること（または存在しないこと）が、上記処置の有効性を示す。たとえば、上記処置よりも前に得たコントロールと比較して免疫複合体が増加していれば、上記処置が有効でないことが示され、上記処置よりも前に得たコントロールと比較して免疫複合体が減少していれば、上記処置が有効であることが示される。
【０２６５】
Ｆ．バイオ医薬組成物
本明細書中に開示される１つ以上の抗原に特異的に結合する、開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、結合体、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種以上を、担体（製薬学的に許容される担体など）中に含む、バイオ医薬組成物または生物組成物（以下、「組成物」）が、本明細書中において、遺伝子療法、免疫療法、養子免疫療法、および／または細胞療法における使用を目的として提供される。この組成物は、対象への投与のために単位投薬形態にて調製されてよい。投与の量およびタイミングは、所望される転帰を達成するために、処置担当臨床医によって判断される。この組成物は、全身（静脈内など）または局所（腫瘍内など）への投与を目的として配合されてよい。一例において、開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、結合体は、静脈内投与などの非経口投与を目的として配合される。本明細書中に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、たとえば、腫瘍（たとえば、神経芽細胞腫であるが、これに限定されない）の処置および検出に有用である。いくつかの例において、この組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書中に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、たとえば病理学的血管新生の検出にも有用である。
【０２６６】
この投与用組成物は、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を、水性担体などの製薬学的に許容される担体中に溶解した、溶液を含んでよい。たとえば緩衝生理食塩水などの、多様な水性担体が使用されてよい。こうした溶液は、滅菌されており、一般的に、望ましくない物質を含まない。この組成物は、従来から周知される滅菌技術によって滅菌されていてよい。この組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなどの、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤、および補助剤といった製薬学的に許容される補助的な物質を含有してよい。当該調製物中におけるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の濃度は、広範囲で変動してよく、主に流体の体積、粘度、および体重などに基づいて、選択された特定の投与様式および対象の要求事項に応じて選択されてよい。遺伝子療法、免疫療法、および／または細胞療法において使用するためのこのような投薬形態の実際の調製方法は、周知されている、または当業者には明らかであろう。
【０２６７】
静脈内投与用の典型的な組成物は、対象１人につき１日当たり約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇの、抗体または抗原結合断片または結合体（または、対応する投与量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合断片を含む結合体）を含む。投与用組成物の実際の調製方法は、当業者に周知または明白であってよく、Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)などの出版物中に、より詳細に記載される。
【０２６８】
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、または結合体は、凍結乾燥形態で提供されてよく、滅菌水で戻して投与されてよいが、周知の濃度の滅菌溶液中に溶解した形態でも提供される。ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の溶液は、次いで、０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を入れた注入バッグに充填され、場合によっては、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。抗体または抗原結合断片および結合体の薬物の投与にあたっては、当技術分野において相当量の経験を見いだすことができ、たとえば、抗体薬が、１９９７年のリツキサン（登録商標）の承認以来、米国市場に出回っている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、その抗原結合断片および結合体は、静脈内プッシュ（ｐｕｓｈ）またはボーラスではなく、低速の注入によって投与されてよい。一例において、より高負荷の投与量が投与され、続いて、これより低い程度にて維持投与量が投与される。たとえば、抗体または抗原結合断片が初期負荷投与量４ｍｇ／ｋｇ（または、抗体もしくは抗原結合断片を含む結合体の、これに対応する投与量）が約９０分間にわたって注入され、この初期投与量が良好に許容されれば、続いて、週１回の維持投与量２ｍｇ／ｋｇが、一回につき３０分間、４〜８週間にわたって注入されてよい。
【０２６９】
制御放出非経口調製物は、移植片、油性注射、または粒子系として調製されてよい。タンパク質送達系の広範囲の全体像は、Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995)を参照。粒子系は、微小球体、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ球体、およびナノ粒子を含む。マイクロカプセルは、細胞毒または薬物などの治療用タンパク質を中心核として含有する。微小球体中、粒子の全体に治療薬が分散している。約１μｍ未満の粒子、微小球体、およびマイクロカプセルは、一般的に、それぞれ、ナノ粒子、ナノ球体、およびナノカプセルと称される。毛細血管は直径約５μｍであるため、ナノ粒子のみが静脈内に投与される。微粒子は、典型的には直径約１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。たとえば、Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994);およびTice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A.  Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339, (1992)を参照。
【０２７０】
ポリマーを、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の組成物のイオン制御（ｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）放出に使用してよい。制御薬物送達において使用するための多様な分解性および非分解性ポリマーマトリックスが当技術分野において周知されている（Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993）。たとえば、ブロックコポリマーであるポロキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では粘性を有する可動性の液体として存在するが、体温においては半固体のゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの調製物および持続送達にとって有効なビヒクルであることが示されている（Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; and Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990）。代替的には、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御放出用のマイクロ担体として使用されている（Ijntema et al., Int. J. Pharm.112:215-224, 1994）。さらに別の一態様において、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御放出および薬物標的のために使用される（Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)）。これら以外にも、治療用タンパク質の制御送達のための非常に多くの系が周知されている（米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，１８８，８３７号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，９５７，７３５号、米国特許第５，０１９，３６９号、米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，５１４，６７０号、米国特許第５，４１３，７９７号、米国特許第５，２６８，１６４号、米国特許第５，００４，６９７号、米国特許第４，９０２，５０５号、米国特許第５，５０６，２０６号、米国特許第５，２７１，９６１号、米国特許第５，２５４，３４２号、および米国特許第５，５３４，４９６号）。
【０２７１】
Ｇ．キット
一態様において、本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲを使用するキットがさらに提供される。たとえば、対象における腫瘍を処置するための、または本明細書中に開示されるＤｕｏＣＡＲの１種以上を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を作製するためのキットである。こうしたキットは、典型的には、本明細書中に開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞を含んでよい。開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種を超えるものが、キット中に含まれてよい。
【０２７２】
キットは、容器と、容器に付けられたまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含んでよい。好適な容器は、たとえば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。容器には、典型的には、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種以上を含む組成物が入っている。いくつかの実施形態において、容器は、滅菌アクセス口を有してよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内投与用液剤バッグまたはバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物を特定の状態の処置に使用するということを示すものである。
【０２７３】
ラベルまたは添付文書は、典型的には、たとえば、腫瘍の処置もしくは予防方法、またはＣＡＲ  Ｔ細胞の作製方法における、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用についての説明をさらに含んでよい。添付文書は、典型的には、治療用製品の市販パッケージ中に慣習的に入っている説明書を含んでおり、この説明書は、当該治療用製品の使用に関連する適応、用法、投薬量、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含む。説明書の内容は、電子形式（フロッピーディスクまたはコンパクトディスクなど）または視覚形式（ビデオファイルなど）で記述されていてよい。キットは、さらに、キット設計目的である特定の用途を推進するためのさらなる構成要素を含んでよい。したがって、たとえば、キットには、さらに、標識検出手段（たとえば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識検出のためのフィルターセット、または、二次抗体などの適切な二次標識など）が入っていてよい。キットには、さらに、特定の方法の実施において慣例的に使用されるバッファーおよびその他の試薬が入っていてよい。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知されている。
【実施例】
【０２７４】
実施例
本発明が、下記の添付図面および本開示の１７〜２７ページ（上述されるものを含む）に示されるＤｕｏＣＡＲの実施例によってさらに例証されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。逆に、様々な他の実施形態、改変、および等価物に頼らなければならず、こうした他の実施形態、改変、および等価物は、本発明の精神および／または付属の請求項の範囲から逸脱することなく、本明細書の記載を読んだ後、当業者の念頭に浮かび得るということが明瞭に理解される。
【０２７５】
様々な詳細が、以上に概説される例示的な実現例と併せて記載されるが、様々な代案、改変、変形、改善、および／または実質的等価物が（周知されているか否かにかかわらず、または、現時点で予見されているもしくは予見され得るか否かにかかわらず）、前述される開示内容を参照することによって明白となると考える。
【０２７６】
本文中に引用された各出願および特許、ならびに各出願および特許中に引用された各文献または先行技術文献（訴訟中の各発行済特許「出願引用文献」を含む）、ならびに当該出願および特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張する各ＰＣＴ出願または特許および外国出願または特許、ならびに各出願引用文献中に引用または参照された各文献を、引用により明白に本明細書に援用し、これらは本発明の実施において使用されてよい。より一般的には、文献または先行技術文献は本文中、請求項の前の先行技術文献一覧、または本文自体のいずれかにおいて引用され、当該文献または先行技術文献の各々（「本明細書中引用先行技術文献」）、および各本明細書中引用先行技術文献中に引用された各文献または先行技術文献（製造元の規格、説明書などを含む）を、引用により明白に本明細書に援用する。
【０２７７】
いくつかの具体的な実施形態についての上述される記載は、他者が最新の知識の適用により、一般的概念から逸脱することなく、多様な用途のために当該具体的な実施形態を容易に変更または適合させるのに十分な情報を提供するものであり、したがって、このような適合および変更は、当該開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であると理解されるべきである。本明細書中において使用される語句または専門用語は説明目的であって限定目的でないことが理解される。図面および記載中、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されている可能性があるが、これらは、特記しない限り、一般的かつ説明目的のみで使用されており、限定を目的するものではないため、これによって請求項の範囲が限定されるものではない。また、当業者には、本明細書中に開示される方法の特定の工程を別の順序で実施してよいこと、または工程を組み合わせてよいことが理解される。したがって、本明細書中に開示される具体的な実施形態に付属の請求項が限定されないことが意図される。当業者には、本明細書中に記載される本発明に係る実施形態の多くの等価物が認識され得る、または常套的な実験法のみを使用して把握できる。かかる等価物は、下記請求項に包含される。
【０２７８】
実施例の記載
４つの実施例が示されており、ここでは、ＬＶ形質導入ヒトＴ細胞集団表面において３つの機能性結合ドメインおよび異なる共刺激細胞内ドメインの組み合わせが発現することからＤｕｏセット技術の実現可能性が立証され（実施例１）、かつ、当該集団が３つの異なる白血病抗原に対する機能活性を有することからその有効性が立証される（実施例２）。同時トランスフェクション、すなわち両ＤｕｏＣＡＲ鎖をコードする１つのＬＶ産物（ＣＡＲをコードする２つのプラスミドでパッケージング株を同時トランスフェクションすることにより作製）での形質導入により作製したＤｕｏＣＡＲの発現および機能の比較が、実施例３中に記載される。実施例４において、同時トランスフェクション法で作製したＬＶで形質導入したＤｕｏＣＡＲと、１つのコンストラクトによりコードされるバイシストロニックＤｕｏＣＡＲ（２つのＤｕｏＣＡＲ鎖の間にリボソームスキップ部位が入っている）とが、形質導入効率および機能について比較される。
【０２７９】
単一特異性ＣＡＲ（本技術の基盤をなすものであり、かつ、ＤｕｏＣＡＲにおいてＤｕｏセット要素として含まれ得る）の例は、単独ＣＤ２０標的化ベクターＬＴＧ１４９５（ヌクレオチド配列は配列番号３、アミノ酸配列は配列番号４）を含む。第２の例は、ＣＤ２２に対して特異的な単一特異性ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００（ヌクレオチド配列は配列番号９、アミノ酸配列は配列番号１０）である。ＤｕｏＣＡＲ作製において重要な分子の態様として、重複のない適合配列を含めることと、不適当な組換えまたは細胞内結合が生じることのないように形質導入Ｔ細胞中の当該配列を評価することとがある。こうしたことは、ベクターの産生細胞株と標的細胞集団との両方において生じ得る。この理由から、ＤｕｏＣＡＲという場に適合することが知られているバリアントＣＡＲ構造を含めている。これらには、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９４（ヌクレオチド配列は配列番号２９、アミノ酸配列は配列番号３０）が含まれる。この配列は、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖を結合することが明らかに記載されている、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０７）、Whitlow M., et al., 1993, Protein Eng. 6:989-995を参照）と称されるリンカーを含む。いくつかの場合には、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーを（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーで置換した（たとえば、ＬＴＧ１５３８（ヌクレオチド配列は配列番号３１、アミノ酸配列は配列番号３２）におけるＣＤ１９  ＣＡＲ様式）。別の例においては、他の膜貫通ドメインを有するＣＡＲを作製した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２（ヌクレオチド配列は配列番号２１、アミノ酸配列は配列番号２２）は、ＣＤ４（ＣＤ８ではない）膜貫通ドメインを利用する。同様に、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３は、ＴＮＦＲＳＦ１９に由来する他の膜貫通型（ヌクレオチド配列は配列番号４９、アミノ酸配列は配列番号５０）を有する。また、ＤｕｏＣＡＲは、固形腫瘍（たとえばメソテリン腫瘍抗原を発現するもの）も標的とし得る。たとえば、メソテリンに対するｓｃＦＶバインダーが作製されており（同出願人による同時係属中の仮特許出願第６２／４４４，２０１号（発明の名称「抗メソセリン免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法」、２０１７年１月９日付で出願、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の事件番号第ＬＥＮ＿０１７号）中に開示される；ヌクレオチド配列は配列番号３７、アミノ酸配列は配列番号３８）、これを、機能性ＣＡＲ（ヌクレオチド配列は配列番号３９、アミノ酸配列は配列番号４０）に組み込むことができ、よってＤｕｏＣＡＲ療法に組み込むことができる。ｓｃＦｖ配列に加えて、一本鎖抗原バインダー（ｓｃＦｖではなく）も、ＤｕｏＣＡＲ用途に組み込むことができる。たとえば、ＣＤ３３特異的重鎖単独バインダー（同出願人による同時係属中の仮特許出願第６２／４７６，４３８号（発明の名称「抗ＣＤ３３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法」、２０１７年３月２４日付で出願、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の事件番号第ＬＥＮ＿０１８号）中に開示される；ヌクレオチド配列は配列番号４１、アミノ酸配列は配列番号４２）を、機能性ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０６（ヌクレオチド配列は配列番号４３、アミノ酸配列は配列番号４４）に組み込んで、ＣＤ３３発現悪性病変を標的とすることができる。ＤｕｏＣＡＲ治療用途の一例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＴＳＬＰＲ抗原を発現する白血病の処置が考えられる。この場合、ＬＴＧ１４９６またはＬＴＧ  １４９７（それぞれ配列番号３５、２６）を、ＴＳＬＰＲ特異的ｓｃＦＶドメイン（ヌクレオチド配列は配列番号４５、アミノ酸配列は配列番号４６）から作製されたＴＳＬＰＲ特異的ＣＡＲ（ＬＴＧ１７８９）（配列番号４７、およびアミノ酸配列は配列番号４８）と組み合わせることができた。
【０２８０】
本技術の基盤をなすタンデムＣＡＲ（２つのｓｃＦｖドメインを含む、ヌクレオチド配列は配列番号２３、アミノ酸配列は配列番号２４）の例には、ＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７（ヌクレオチド配列は配列番号２５、アミノ酸配列は配列番号２６）が含まれる。いくつかの場合において、これら２つのバインダーの順を逆にすることにより、標的細胞におけるＤｕｏＣＡＲの発現がより良好になり得る。よって、ＣＤ１９  ｓｃＦｖが膜から比較的近いＬＴＧ１４９７（ヌクレオチド配列は配列番号２５、アミノ酸配列は配列番号２６）と、ＣＤ１９  ｓｃＦＶが比較的遠いＬＴＧ１４９６（ヌクレオチド配列は配列番号３３、アミノ酸配列は配列番号３４）とを、いずれも、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏセットの一構成要素として使用できる。
【０２８１】
実施例１および２において利用される方法：
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）
すべての細胞株および試薬は、特記しない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入したものである。Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、急性リンパ球性白血病細胞株ＲＥＨ、および慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔを、１０％熱失活ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。
【０２８２】
ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で野生型腫瘍株を安定的に形質導入し、続いてルシフェラーゼ陽性クローンをクローニングおよび選択することによって、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを作製した。ホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉクローンをＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）に移植することによってマウス適合Ｒａｊｉ−ｌｕｃ株を作製し、正の選択（ＣＤ１９マイクロビーズ、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）または負の選択（マウス細胞除去キット（ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかによってマウス脾臓から移植Ｒａｊｉ−ｌｕｃ腫瘍細胞を単離し、培養により増殖させ、再度クローニングを行なうことにより、ホタルルシフェラーゼ高発現クローンの選択を促進した。Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ、ＯＫ）において、健康な志願者から、当該ドナーの同意を書面で得て、全血を採取した。処理済バフィーコートをＯＢＩから購入した。バフィーコートから、ＣＤ４マイクロビーズおよびＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を使用した正の選択によって、製造元のプロトコールのとおりに、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のヒトＴ細胞を精製した。
【０２８３】
ＤｕｏＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの作製
ＣＡＲ抗原結合ドメインｓｃＦｖの配列は、ＣＤ１９についてはマウスハイブリドーマＦＭＣ−６３（ＦＭＣ−６３：ＡＡ  １−２６７、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）、ＣＤ２０についてはＬｅｕ−１６に由来するものであった［１］（ＶＬおよびＶＨの配列全体）。ＣＤ２２  ｓｃＦｖ結合は、一般に利用可能な配列から作製した。タンデム型のＣＡＲ１９＿２０またはＣＡＲ２０＿１９は、各抗体のｓｃＦｖを、インフレームで、ＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン（ＡＡ  １２３−１９１、参照配列番号ＮＰ＿００１７５９．３）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ  ２１４−２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ  ５２−１６３、参照配列番号ＮＰ＿０００７２５．１．）に結合することによって作製した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を可動性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１０８）によって順に結合し、続いてＣＤ８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータドメインを結合した。［２］中に記載されるとおりに、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列をすべてのコンストラクトに含めた。ＣＡＲコンストラクトの配列は、コドン最適化して（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ヒトＥＦ−１αプロモーターの制御下において、第３世代レンチウイルスプラスミドバックボーン中にクローニングした（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。以前に［３］に記載されるとおりに、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることによって、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含有する上清を得た。ペレット状のレンチウイルスの上清を回収して、−８０℃において保存した。
【０２８４】
初代Ｔ細胞形質導入：
正常ドナーからの選択したＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を、４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地（無血清）中において、細胞密度０．３〜２×１０６個／ｍｌにて培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化して、３日目に、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを用いて、１０μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下において一晩かけて形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に、培養物を、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地に移して増殖させ、１０〜１３日目に回収した。
【０２８５】
免疫性エフェクターアッセイ：細胞介在性の細胞毒性を調べるために（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入した標的細胞５，０００個を、多様なエフェクター標的比にてＣＡＲ  Ｔ細胞と一緒にして、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を各ウェルに添加し、得られた発光を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析し、１秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）と、標的のみのウェルに１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したもの（最小ＣＰＳ）とを使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的溶解の割合を、（１−（試料ＣＰＳ−最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ−最小ＣＰＳ））として計算した。
【０２８６】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーに用いたすべての細胞染色試薬は、特記しない限り、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手した。ＣＡＲ  Ｔを形質導入した細胞１００万個を培養物から回収して、冷やした染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン添加ＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）中において２回洗浄し、４℃において３５０×ｇで５分間かけてペレット状にした。まず、形質導入したＴ細胞のＣＡＲ表面発現を、タンパク質Ｌ−ビオチンコンジュゲート（保存液１ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で４℃において３０分間染色することによって検出し、続いて２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（保存液：１．０ｍｌ、１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて４℃において３０分間染色した。形質導入していない細胞および形質導入した細胞（ストレプトアビジン−ＰＥのみで染色）を、ネガティブコントロールとして使用した。抗ＣＤ４抗体を、ＣＡＲ  Ｔ陽性集団のＣＤ４とＣＤ８との比率を決定するために使用し、第２のインキュベーション工程において添加した。死細胞を、７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって除去した。細胞を２回洗浄して、２００μｌの染色バッファー中に再懸濁した後、フローサイトメトリーによって定量分析を行なった。ＣＤ３−ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、ＩＬ−２の存在下においてＤｕｏセットベクターで形質導入したヒトＴ細胞に対して、特異的ＤｕｏセットＣＡＲ  Ｔ染色を行ない、フローサイトメトリーにより、染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、抗体のＣＤ１９−、ＣＤ２０−、またはＣＤ２２−ｓｃＦｖドメインの発現を分析した。
【０２８７】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ活性を、ＣＤ１９−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／試料で使用して検出し、ヤギ抗ヒトＦｃ−ガンマ−Ｒ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を０．７５μｇ／試料で使用して染色した。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ活性を、ＣＤ２０−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．１μｇ／試料で使用して検出し、ストレプトアビジンｐＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を０．２μｇ／試料で使用して検出した。抗ＣＤ２２  ｓｃＦｃ活性を、Ｄ２２−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を０．１μｇ／試料で使用して検出し、抗Ｈｉｓ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して検出した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて行なった。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴づけを、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０  ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ２２−ＡＰＣ抗体を用いて行なった。７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって死細胞を分析から除去した。
【０２８８】
実施例１
初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ（２＋１  Ｄｕｏセット）の発現
原理の証明として、２つのＣＡＲ−Ｔベクターを含むＤｕｏセットを作製した。このセットの構成要素の１つは、ＣＤ８膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインに結合したタンデムＣＤ２０＿ＣＤ１９結合ドメイン（ＬＴＧ２２２８）（配列番号５１および配列番号５２）を発現した。当該Ｄｕｏセットの２つめの構成要素は、１つのＣＤ２２バインダーがＣＤ８膜貫通ドメインならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインに結合したＣＡＲコンストラクト（ＬＴＧ２２００）（配列番号９および配列番号１０）であった。図７中、対になった列について、左列はＣＤ２０  ｓｃＦｖおよびＣＤ１９  ｓｃＦｖの、右列はＣＤ２２  ｓｃＦｖおよびＣＤ１９  ｓｃＦｖの二重染色を示す。１段目は形質導入していないＴ細胞（ＵＴＤ）を示し、かくして、結合がないことを示す。２段目は、ＣＤ８膜貫通ドメインならびに細胞内ＣＤ２８およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲベクター（２０−１９−２８ｚ）をコードするＬＶで形質導入したＴ細胞を示す。ＣＤ２０およびＣＤ１９の結合についての二重染色がみられるが（左パネル）、右パネルではＣＤ１９の結合のみがみられる。３段目は、ＣＤ８膜貫通ドメインならびに細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２２  ＣＡＲベクター（２２−ＢＢｚ）で形質導入したＴ細胞を示す。ＣＤ１９またはＣＤ２０についての二重染色がみられず（左パネル）、１つの細胞集団のみがＣＤ２２と結合できたことがわかる（右パネル）。４段目では、２段目および３段目の両ベクターを含むＤｕｏセットでＴ細胞を形質導入している。このＤｕｏセットのみが全３つのＣＡＲコード結合ドメインを発現している（４２％の細胞がＣＤ２０＿１９を発現し（左パネル）、３８％がＣＤ２２およびＣＤ１９結合ドメインを発現している（右パネル））。ＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖは、Ｄｕｏセットを含む２つの別個の膜貫通型タンパク質の各々にあるため、３８％は、この実施例において真にＤｕｏセットを発現している集団を表している。
【０２８９】
実施例２
同時形質導入法で作製したＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性
ＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性（３つの白血病抗原を同時に標的とする）（ＤｕｏＣＡＲ発現の特徴については図７を参照）。ＣＤ２０＿１９タンデムＣＡＲおよびＣＤ２２特異的単独ＣＡＲ（実施例１と同様に調製）を含むＤｕｏセットを、細胞毒性Ｔ細胞アッセイ（標的として白血病細胞株およびモデル細胞株を使用）において、エフェクターＴ細胞集団に使用した。単独ＣＡＲ要素（２０＿１９−２８ｚまたは２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（２０＿１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚ）で形質導入したヒトＴ細胞を、細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて、４つの異なるエフェクター標的比（示されるとおり、２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）にて使用した（図８を参照）。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用した白血病細胞株は以下である：Ｒａｊｉ（全３つの標的抗原を発現）、ＲＥＨ（全３つの標的抗原を発現）、Ｋ５６２（コントロール、標的を発現しない）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現）、Ｋ５６２−ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現）、およびＫ５６２−ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現）。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０−１９−２８ｚ  ＋  ２２−ＢＢｚ）のみが、両白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）と、３つの単独発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２０、Ｋ５６２−ＣＤ２２）のすべてとに対して、高い細胞溶解活性を呈した。このことは、同じエフェクターＴ細胞集団においてＤｕｏＣＡＲ技術が３つの白血病抗原を一義的かつ同時に標的化できることを示すものであり、したがって、１つまたは２つを超える標的抗原を一度に標的化できるのでエスケープ変異体（悪性病変を引き起こす）（１つまたは２つの抗原が喪失または下方調節されているために免疫除去を逃れた細胞クローン）の発生を抑制できるため、優れた抗新生物活性を有している、ということを示す。最終的には、抗原欠失バリアントがエスケープおよび増殖（最終的には再発）するために、患者の治癒率が上がると考えられる。
【０２９０】
実施例３
同時トランスフェクション法で作製したＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性
本願中に記載されるＤｕｏＣＡＲ技術は、遺伝子ベクターによりコードされる１つを超える膜貫通型タンパク質から２つを超える抗原特異性を発現する治療用リンパ球（この実施例ではヒトＴ細胞）の集団を発生させる。この実施例では、２つの異なる手段によって行なう。図９は、「形質導入なし」、「同時形質導入」、および「同時トランスフェクション」と示される３段のデータを含む。図９は、図７で作製された２列のデータを含み、１列目は、ＣＤ２０およびＣＤ１９に特異的な特異的結合の発現をフローサイトメトリーで分析したものであり、２列目は、ＣＤ２２およびＣＤ１９結合活性の発現をフローサイトメトリーで分析したものである。１段目のデータには、形質導入していないヒトＴ細胞が示される。ＣＡＲ由来の結合活性の指標であるＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２組換えタンパク質について結合活性が見られず、ＤｕｏＣＡＲが発現していないことが示される。２段目では、「同時形質導入」を用いてＤｕｏＣＡＲを作製した。このデータセットにおいては、２つのＬＶを使用して、活性化されたＴ細胞を同時に形質導入した。図７中に示されるように、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏセットにおける一方のＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達モチーフおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達モチーフに結合したタンデム型のＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーであり、もう一方のＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達モチーフに結合したＣＤ２２バインダーであった。１列目の右上象限は、ＣＤ２０およびＣＤ１９−ｓｃＦｖ活性が単一染色された非常に特有のパターンを示す。これは、両バインダーが同じ表面糖タンパク質上にあり、そのために等しい強度で共発現していることによるもので、このように非常に特殊な線状パターンを生じている。同時形質導入データの２列目は、各細胞上での２つの糖タンパク質の発現パターンが等しくなく、比較的慣習的なパターンを示す。このように、４つの異なる集団のパターンがみられる。左下象限は、いずれのバインダーも発現していない細胞を示す。左上は、ＣＤ２２  ＣＡＲのみを発現している細胞を示す。右下象限は、ＣＤ２０＿ＣＤ１９タンデムＣＡＲのみを発現している細胞を示す。最後に、右上象限は、ＤｕｏＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｄｕｏセットの両構成要素を発現している細胞を示す。
【０２９１】
一番下の段では、ＤｕｏＣＡＲを発現している細胞集団を、別の手法で発生させている。同時形質導入法では、独立して作製した２つのＬＶ調製物をＴ細胞形質導入に用いるが、「同時トランスフェクション」は、２つのバックボーンプラスミド（ＤｕｏＣＡＲを含む２つのＣＡＲをコードする）を２９３Ｔパッケージング細胞株中に同時にトランスフェクションしてＬＶを作製する方法を指す。この第３世代ＬＶシステムを含むヘルパープラスミドは、両方法において同じものである。同時トランスフェクション法の利点は、両ＣＡＲをコードするベクターを含有する１つのＬＶ調製物が作製されるという点である。データからわかるように、同時トランスフェクション法を用いた場合、２段目の同時形質導入法とほぼ同じＣＤ２０−ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＣＤ２２  ＣＡＲの発現パターンがみられる。２列目のデータの右上象限の、同時トランスフェクションで作製したＬＶにより誘発された両糖タンパク質の染色パターンから（ＣＤ２２−ＣＡＲについてはＣＤ２２、ＣＤ２０＿１９  ＣＡＲについてはＣＤ１９共染色）、いずれの方法でもＤｕｏＣＡＲが効率よく作製されることが示される。
【０２９２】
参照文献：
１）Wu, A.M., et al., Multimerization of a chimeric anti-CD20 single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange. Protein engineering, 2001. 14(12): p. 1025-1033.
２）Haso, W., et al., Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2013. 121(7): p. 1165-1174.
３）Kuroda, H., et al., Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection. Journal of virological methods, 2009. 157(2): p. 113-121.
実施例４
同時トランスフェクション法により作製したＤｕｏＣＡＲとバイシストロニックＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトとの比較
実施例４において用いた方法：
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）：すべての細胞株および試薬は、特記しない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、急性リンパ球性白血病細胞株ＲＥＨ、および慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔを、１０％熱失活ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。
【０２９３】
ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で野生型腫瘍株を安定的に形質導入し、続いてルシフェラーゼ陽性クローンをクローニングおよび選択することによって、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを作製した。ホタルルシフェラーゼを安定して発現するＲａｊｉクローンをＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）に移植することによってマウス適合Ｒａｊｉ−ｌｕｃ株を作製し、正の選択（ＣＤ１９マイクロビーズ、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）または負の選択（マウス細胞除去キット（ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかによってマウス脾臓から移植Ｒａｊｉ−ｌｕｃ腫瘍細胞を単離し、培養により増殖させ、再度クローニングを行なうことにより、ホタルルシフェラーゼ高発現クローンの選択を促進した。Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ、ＯＫ）において、健康な志願者から、当該ドナーの同意を書面で得て、全血を採取した。処理済バフィーコートをＯＢＩから購入した。バフィーコートから、ＣＤ４マイクロビーズおよびＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を使用した正の選択によって、製造元のプロトコールのとおりに、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性のヒトＴ細胞を精製した。
【０２９４】
ＤｕｏＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの作製：
ＣＡＲ抗原結合ドメインｓｃＦｖの配列は、ＣＤ１９についてはマウスハイブリドーマＦＭＣ−６３（ＦＭＣ−６３：ＡＡ  １−２６７、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）、ＣＤ２０についてはＬｅｕ−１６に由来するものであった［１］（ＶＬおよびＶＨの配列全体）。いくつかの抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ結合配列を使用した。タンデム型のＣＡＲ１９＿２０またはＣＡＲ２０＿１９は、各抗体のｓｃＦｖを、インフレームで、ＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン（ＡＡ  １２３−１９１、参照配列番号ＮＰ＿００１７５９．３）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ  ２１４−２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ  ５２−１６３、参照配列番号ＮＰ＿０００７２５．１．）に結合することによって作製した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を可動性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１０８）によって順に結合し、続いてＣＤ８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータドメインを結合した。［２］中に記載されるとおりに、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列をすべてのコンストラクトに含めた。バイシストロニックなＣＡＲの設計においては、２つのＣＡＲ鎖が同じ発現カセット内にコードされており、リボソームのスキップ要素２Ａで隔てられている。ＣＡＲコンストラクトの配列は、コドン最適化して（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ＭＳＣＶプロモーターのヒトＥＦ−１αの制御下において、第３世代レンチウイルスプラスミドバックボーン（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中にクローニングした。以前に［３］に記載されるとおりに、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることによって、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含有する上清を得た。同時トランスフェクション実験のために、トランスフェクション工程において、各ＤｕｏＣＡＲ鎖をコードする２つのトランスファープラスミドを等量ずつ合わせて、ヘルパープラスミドと共に、ＨＥＫ  ２９３Ｔパッケージング細胞株に与え、得られたウイルスベクター調製物を初代ヒトＴ細胞の形質導入に使用した。ペレット状にしたレンチウイルスの上清を回収して、−８０℃において保存した。
【０２９５】
初代Ｔ細胞形質導入：正常ドナーからの選択したＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を、４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地（無血清）中において、細胞密度０．３〜２×１０６個／ｍｌにて培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化して、３日目に、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを用いて、１０μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下において一晩かけて形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に、培養物を、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地に移して増殖させ、１０〜１３日目に回収した。
【０２９６】
免疫性エフェクターアッセイ：細胞介在性の細胞毒性を調べるために（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入した標的細胞５，０００個を、多様なエフェクター標的比にてＣＡＲ  Ｔ細胞と一緒にして、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を各ウェルに添加し、得られた発光を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析し、１秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）と、標的のみのウェルに１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したもの（最小ＣＰＳ）とを使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的溶解の割合を、（１−（試料ＣＰＳ−最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ−最小ＣＰＳ））として計算した。
【０２９７】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーに用いたすべての細胞染色試薬は、特記しない限り、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手した。ＣＡＲ  Ｔを形質導入した細胞１００万個を培養物から回収して、冷やした染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン添加ＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）中において２回洗浄し、４℃において３５０×ｇで５分間かけてペレット状にした。まず、形質導入したＴ細胞のＣＡＲ表面発現を、タンパク質Ｌ−ビオチンコンジュゲート（保存液１ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で４℃において３０分間染色することによって検出し、続いて２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（保存液：１．０ｍｌ、１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて４℃において３０分間染色した。形質導入していない細胞および形質導入した細胞（ストレプトアビジン−ＰＥのみで染色）を、ネガティブコントロールとして使用した。抗ＣＤ４抗体を、ＣＡＲ  Ｔ陽性集団のＣＤ４とＣＤ８との比率を決定するために使用し、第２のインキュベーション工程において添加した。死細胞を、７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって除去した。細胞を２回洗浄して、２００μｌの染色バッファー中に再懸濁した後、フローサイトメトリーによって定量分析を行なった。ＣＤ３−ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、ＩＬ−２の存在下においてＤｕｏセットベクターで形質導入したヒトＴ細胞に対して、特異的ＤｕｏセットＣＡＲ  Ｔ染色を行ない、フローサイトメトリーにより、染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、抗体のＣＤ１９−、ＣＤ２０−、またはＣＤ２２−ｓｃＦｖドメインの発現を分析した。
【０２９８】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ活性を、ＣＤ１９−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／試料で使用して検出し、ヤギ抗ヒトＦｃ−ガンマ−Ｒ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を０．７５μｇ／試料で使用して染色した。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ活性を、ＣＤ２０−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．１μｇ／試料で使用して検出し、ストレプトアビジンＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を０．２μｇ／試料で使用して検出した。抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ活性を、Ｄ２２−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を０．１μｇ／試料で使用して検出し、抗Ｈｉｓ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して検出した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて行なった。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴づけを、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０  ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ２２−ＡＰＣ抗体を用いて行なった。７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって死細胞を分析から除去した。
【０２９９】
２Ａリボソームスキップ配列を使用するバイシストロニックＤｕｏＣＡＲの作製
上述される実施例２および実施例３中に記載される同時形質導入および同時トランスフェクションというアプローチ（３つの血液腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２を同時に標的とし異なる共刺激ドメインを有するＤｕｏＣＡＲ）に加えて、自己切断要素２Ａを用いることにより、１つのｍＲＮＡ転写物からの２つのＣＡＲ鎖の同時発現を促進できる。２Ａ要素は、ｍＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される際のリボソームのスキップに介在し、よって、２つの別個のＣＡＲタンパク質鎖を等モル比で作製することを可能とする。この実施例において、１つめのＣＡＲ鎖は、ＣＤ２２  ｓｃＦｖがインフレームでＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインに結合したものからなる。第２のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０  ＣＤ１９  ｓｃＦｖに基づく標的化ドメインと、これに続くＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなる。これら２つの設計はＣＡＲ鎖の順が異なっており、一方の設計では先にＣＤ２２  ＣＡＲがきて、続いて２Ａ要素およびタンデム２０１９  ＣＡＲがきており、もう一方はその逆である。（図１０）。
【０３００】
まず、ＥＦ１ａプロモーターの制御下においてＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２抗原を同時に標的とする４つのバイシストロニックＤｕｏＣＡＲ設計のセットを、上述されるとおりに構築した（セット１、下記表１）。
【０３０１】
【表１】
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【０３０２】
ＤｕｏＣＡＲ様式においてＣＤ２２標的化ＣＡＲ部位の最適な発現を促進するために、ＣＤ２２標的化ＣＡＲ鎖に、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ配列１６Ｐ８または１６Ｐ１７の１つを組み込んだ。ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ｍ９７１を比較相手として使用し、形質導入していない細胞（ＵＴＤ）をＣＡＲネガティブコントロールとした。ＣＤ２０−ＣＤ１９標的化ＣＡＲ鎖とＣＤ２２標的化ＣＡＲ鎖との共発現が、上述されるように２Ａリボソームスキップ配列によって促進された。個々にコードされるＣＡＲ鎖を発現コントロールとして含めた。健康なドナーからのヒト初代Ｔ細胞を、各ＤｕｏＣＡＲまたは単独ＣＡＲコントロールをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。Ｔ細胞培養増殖が完了した際に、フローサイトメトリーによってＣＡＲ発現を調べた。ＤｕｏＣＡＲ群におけるＣＡＲ２０＋ＣＡＲ２２＋二重陽性細胞（同一細胞内におけるタンデムＣＤ２０−ＣＤ１９  ＣＡＲ鎖とＣＤ２２−ＣＡＲ鎖との共発現を表す）（ＬＴＧ２５１５、ＬＴＧ２５２０、ＬＴＧ２５２１）の割合は比較的低く、２８％（ＬＴＧ２５１５、ＬＴＧ２５２０）〜９％（ＬＴＧ２５２１）の範囲であった（図１１）。これとは対照的に、個々のＣＡＲコントロールの発現はこれよりも大幅に高く、ＣＤ２２標的化コンストラクト（ＬＴＧ２２００）で最高７２％、タンデムＣＤ２０−ＣＤ１９標的化ＣＡＲ（ＬＴＧ２２２８）で最高３８％であった（図１１）。次いで、ＤｕｏＣＡＲの機能性をサイトカイン放出アッセイで試験した。コントロールのＤｕｏＣＡＲエフェクター細胞とＲａｊｉ標的細胞とをエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）１０で一緒にして一晩おいた。インキュベーション期間の終わりに、細胞培養上清を回収して、Ｔ細胞サイトカインＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ−２の分泌についてアッセイした（図１２）。腫瘍標的細胞を存在させないこと以外は同様の条件下でインキュベートしたエフェクターを、自発性サイトカイン放出についてのさらなるコントロールとして使用した。Ｒａｊｉ腫瘍細胞とＣＡＲエフェクターとを共にインキュベートすると、すべてのコンストラクトについてＩＦＮガンマ、ＩＬ−２、およびＴＮＦａが強く上方調節された。注目すべきことに、いずれのＣＡＲについても自発的なサイトカイン産生は生じなかった。しかしながら、サイトカイン分泌の程度は、すべてのＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトについて、ポジティブコントロールＣＡＲ２２  ＬＴＧ２２００およびタンデム２０１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ２２２８よりも低い傾向にあり、これは図１１中に示すようにＤｕｏＣＡＲの発現が比較的低いためであると考えられる。
【０３０３】
単独ＣＡＲコントロールと比較してＤｕｏＣＡＲ発現およびサイトカイン反応が低いことから（図１１、図１２）、大きなペイロードサイズがこの構成においてはＤｕｏＣＡＲ発現効率に好ましくない影響を及ぼしていることが示唆される。ＤｕｏＣＡＲ形質導入効率を改善する目的で、選択したＤｕｏＣＡＲ配列について必要に応じて再度コドン最適化を行ない、バイシストロニックな発現を改善するためにＭＳＣＶ内部プロモーターの制御下において新しい発現バックボーン中に発現カセットを再クローニングした（セット２、表１）。
【０３０４】
新しいＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトのそれぞれについてレンチウイルスベクターを作製し、ＣＡＲ  Ｔ細胞に形質導入して増殖させた（材料および方法中に記載されるとおり）。フローサイトメトリーによって、ＤｕｏＣＡＲの発現を調べた。ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋  Ｔ細胞の割合は、ＤｕｏＣＡＲの２つの鎖を共発現している細胞を表す（図１３）。ここで、Ｄｕｏ  ＣＡＲコンストラクトＤ００４４（ＭＳＣＶ＿２０−１９−２８ｚ−２Ａ−１６ｐ８−ＢＢｚ）およびＤ００４７（ＭＳＣＶ＿１６ｐ８−ＢＢｚ−２Ａ−２０−１９−２８ｚ）について高い形質導入効率が達成された（いずれも抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  １６Ｐ８（図１３、それぞれ５１％および４５％）を含有）。予期しないことには、比較相手であるｍ９７１  ＣＤ２２  ｓｃＦｖを遠い方の向きで含有するＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４３は良好に発現したが（ＭＳＣＶ＿２０−１９−２８ｚ−２Ａ−ｍ９７１−ＢＢｚ、４６％陽性）、逆の向きでは発現を示さなかった（Ｄ００４６、ＭＳＣＶ＿ｍ９７１−ＢＢｚ−２Ａ−２０−１９−２８ｚ）。したがって、ＤｕｏＣＡＲ設計に含まれるｓｃＦｖ配列の選択と、配列コドン最適化と、発現バックボーンの選択とのすべてが、最適なＤｕｏＣＡＲ発現にとって重要である。
【０３０５】
ＤｕｏＣＡＲセット２を形質導入したＴ細胞の細胞毒性機能を、パネル腫瘍株に対してオーバーナイト死滅アッセイで、腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２の発現を変化させてアッセイした。すべての株を、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定的に形質導入して、死滅アッセイを行なった（材料および方法中に記載されるとおり）。まず、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋のＤｕｏＣＡＲと、非ホジキンリンパ腫Ｒａｊｉ、または急性リンパ芽球性白血病Ｒｅｈ細胞、またはＣＤ１９−ＣＤ２０−ＣＤ２２−ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞株とを組み合わせた（図１５）。ＣＡＲ  ２０−１９−２８ｚおよびＣＤ２２  ＣＡＲ  １６ｐ８−ＢＢｚ  ＣＡＲをバイシストロニックにコードするＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４４およびＤ００４７と、単独ＣＡＲ  ２２コントロールＬＴＧ２２００と、タンデムＣＡＲコントロール２０−１９  ＬＴＧ１４９７と、形質導入していないＴ細胞コントロール（ＵＴＤ）とが含まれていた（図１４）。図面の凡例において、コンストラクトＤ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、およびＤ００４７は、略してそれぞれＤ４３、Ｄ４４、Ｄ４６、およびＤ４７と示されている（図１４）。エフェクターおよび標的細胞を比率２．５、５、または１０で各３つずつ一晩インキュベートし、次いでプレートから回収してＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬を用いて行ない、発光測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）によって生存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を調べた。全般的に、ＣＡＲ細胞溶解機能とＤｕｏＣＡＲ発現とは相関していた（図１３）。ＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４７およびＤ００４４は、ポジティブコントロールＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４３と同様に、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２三重陽性腫瘍株ＲａｊｉおよびＲｅｈを非常によく溶解したのに対し、準最適に発現させたコンストラクトＤ００４６は溶解機能が比較的低かった（図１４）。いずれのＣＡＲコンストラクトによっても、ＣＤ１９−ＣＤ２０−ＣＤ２２三重陰性株は溶解されず、ＣＡＲ介在性溶解が同族の抗原に対して特異的であることが強調された。
【０３０６】
Ｄｕｏ  ＣＡＲコンストラクトの特異性をさらに詳細に示すために、抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２のいずれかを発現している遺伝子組換えＫ５６２株を発生させた（それぞれＫ１９、Ｋ２０、Ｋ２２と呼ぶ）（図１５）。一重陽性腫瘍株と共にインキュベートしてアッセイしたところ、ＤｕｏＣＡＲ  Ｄ４４およびＤ４７（ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を標的とするＣＡＲ鎖を有する）がエフェクター標的比依存的に各標的株を強力に溶解し、その機能は比較相手ＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４３に類似していた（図面の凡例におけるコンストラクトの名称はＤ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７をＤ４３、Ｄ４４、Ｄ４６、およびＤ４７にそれぞれ短縮したもの、図１５）。タンデム２０１９  ＣＡＲ（１４９７）を発現しているコントロールＴ細胞は腫瘍株Ｋ１９およびＫ２０を溶解したが、Ｋ２２に対する溶解作用はバックグラウンド程度で非常に弱かった（最高のＥ：Ｔ比１０で溶解は１０％未満）。単独ＣＤ２２コントロールＣＡＲはＫ２２腫瘍細胞を強力に溶解したが、Ｋ２０細胞に対しては機能を有さず、Ｋ１９細胞に対してはバックグラウンド程度の溶解しか示さなかった（最高のＥ：Ｔ  １０：１で溶解は１０％）。したがって、この実験系により、各腫瘍抗原に対するＣＡＲ反応性を高精度で試験できる。要するに、ＤｕｏＣＡＲ  Ｄ００４４およびＤ００４７の両方について、当該単独抗原発現試験系におけるこれらの腫瘍標的化ドメインの各々の機能性が示された（図１５）。
【０３０７】
Ｄｕｏ  ＣＡＲコンストラクトのサイトカイン放出反応を特徴づけるために、ＣＤ１９＋  ＣＤ２０＋  ＣＤ２２＋であるＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞調製物Ｄ００４４、Ｄ００４７（図面の凡例ではそれぞれＤ４４、Ｄ４７）の各々をＲａｊｉ腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１０で一緒にして一晩おき、培養上清をＥＬＩＳＡで分析してＴ細胞サイトカインＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ−２について調べた（図１６）。単独ＣＡＲ２２コンストラクトＬＴＧ２２００およびタンデム２０１９  ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ２２７３を比較のために含め、形質導入していないＴ細胞（ＵＴＤ）をネガティブコントロールとして使用した。平行して、各群のＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍細胞を存在させない以外は同様の条件下においてインキュベートして、自発性サイトカイン放出について調べた（図１６）。いずれのコンストラクトについてもサイトカインの自発放出は生じなかったが、ＤｕｏＣＡＲ  Ｄ４４およびＤ４７はいずれも、Ｒａｊｉ標的と共にインキュベートした後でＩＬ−２、ＩＦＮｇ、およびＴＮＦａを強く誘発したことがわかり、このことから、これらのＤｕｏ  ＣＡＲコンストラクトが効力を有することが強調された。注目すべきことには、同一細胞内において２つの鎖を同時に共発現しているにもかかわらず、緊張性シグナル伝達の証拠は検出されず、このことは、自発性サイトカイン放出が全くみられないことによって確かめられた（図１６）。
【０３０８】
３つの異なる腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２を標的とし別個かつ相補的な機能をもつ共刺激ドメインを有する２つのＣＡＲ鎖からなるバイシストロニックＤｕｏＣＡＲを開発できたが、同様のコンストラクトを他のアプローチを用いて作製できるかどうかという疑問があった。同一ＯＲＦ内において別個のＣＡＲ鎖をバイシストロニックに発現させるためには複数の最適化および精製工程が必要であり、新たな配列セットの１つ１つに対してユニークとする必要があると考えられる。これに対し、レンチウイルスベクターの作製中またはＣＡＲ  Ｔの形質導入中に２つのＣＡＲ配列を組み合わせれば、同一細胞または同一Ｔ細胞集団中で発現できるＣＡＲの組み合わせを１つのレンチウイルス調製物でＴ細胞形質導入を行なって作製できる、より普遍的なアプローチおよび迅速な方法とし得る。この実施例では、ＤｕｏＣＡＲアプローチと同様に、１つめのＣＡＲ鎖は、ＣＤ２２  ｓｃＦｖがインフレームでＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインに結合したものからなる。第２のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０  ＣＤ１９  ｓｃＦｖに基づく標的化ドメインと、これに続くＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなる（図１７）。同時トランスフェクションアプローチでは、ベクター作製工程において、標準的なプロトコール（材料および方法を参照）に則って、それぞれ１つのＣＡＲ鎖をコードする２つのトランスファープラスミドを混合してヘルパープラスミドと結合させる。よって、得られるレンチウイルス調製物は上記２つのＣＡＲ鎖の混合物をコードするものとなる。このアプローチを用いて、２つのＣＡＲ鎖を同時にコードするレンチウイルス調製物のセットを作製した（下記表２）。
【０３０９】
【表２】
2022500467.tif 000003
【０３１０】
ＭＳＣＶプロモーターに制御されるｓｃＦｖ  １６Ｐ１７、１６Ｐ８、１６Ｐ１３  ＣＡＲ２２−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを利用するＣＡＲ２２のためのトランスファープラスミド（それぞれＤ１、Ｄ２、Ｄ３）と、ＭＳＣＶに制御されるタンデムＣＡＲ  ２０１９−２８−ＣＤ３ゼータ（ＬＴＧ２２７３）とを構築した。平行して、各ＣＡＲ鎖のみをコードするレンチウイルスベクターを作製した。すべてのＤｕｏＣＡＲ同時トランスフェクション調製物について一様に高力価が達成され（１０１０ＴＵ／ｍｌ、記載なし）、これは、当該アプローチの効率を強調するものであった。
【０３１１】
ＤｕｏＣＡＲの機能を最適化するために、ＭＳＣＶプロモーターに制御されるｓｃＦｖｓ  １６Ｐ１７、１６Ｐ８、および１６Ｐ１３からなる一連のＣＡＲ２２コンストラクトを設計し（それぞれコンストラクトＤ１、Ｄ２、Ｄ３）、ＤｕｏＣＡＲ同時トランスフェクションにおいてのコンビネーションとするために、同じくＭＳＣＶプロモーターに制御されるタンデムＣＡＲ  ２０１９（ＬＴＧ２２７３）を使用した（表２および図１８）。ＬＴＧ２２７３とＣＤ２２  ＣＡＲプラスミドのうちの１つとの同時トランスフェクションによってレンチウイルスベクターを調製し、高い感染力価を得た（記載なし）。各ＬＶを感染多重度（ＭＯＩ）２０にて使用して健康なドナーのＴ細胞に形質導入し、フローサイトメトリーによってＣＡＲ発現を調べた（図１８）。単独ＣＡＲコントロールをコードするＬＶで形質導入したコントロール群のすべてが、高いＣＡＲ発現を示した（Ｄ１は４５％、Ｄ２は８２％、Ｄ３は８２％、２２７３は８７％（記載なし））。驚くべきことに、かつ予期しないことには、コンビネーション同時トランスフェクションにおいて、Ｄ２＋７３群およびＤ３＋７３群が高い効率を示し、２つのＣＡＲ鎖の共発現の場合（５１％）とほぼ同じであったが、Ｄ１＋７３の組み合わせは共発現しなかった（２．８％  ＣＡＲ＋）（図１８）。これらのＤｕｏＣＡＲが溶解機能をもつかどうかを調べるために、各群のＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍株パネルに対して試験した（図１９、Ｄ１＋２２７３群、Ｄ２＋２２７３群、Ｄ３＋２２７３群の名称にある「Ｄ」は簡略にするために省いている）。すべてのＤｕｏＣＡＲ調製物が三重陽性腫瘍株ＲａｊｉおよびＲｅｈを効率よく溶解したが、三重陰性株２９３Ｔは溶解せず、このことによりＤｕｏＣＡＲの特異性が証明された（図１９Ａ）。加えて、すべてのＤｕｏＣＡＲが、単独抗原腫瘍株Ｋ１９、Ｋ２０、およびＫ２２に対してバックグラウンドよりも強い溶解機能を示したが、標的化ドメインが適合しない単独コントロールＣＡＲは特異的溶解を示さなかった（Ｋ１９におけるＤ１〜Ｄ３、Ｋ２０におけるＤ１〜Ｄ３、Ｋ２２における２２７３を参照）（図１９Ｂ）。次いで、特定の腫瘍標的と共にインキュベートされるとサイトカインを誘発できるというＤｕｏＣＡＲの能力をアッセイした（図２０、Ｄ１＋２２７３群、Ｄ２＋２２７３群、Ｄ３＋２２７３群の名称にある「Ｄ」は簡略にするために省いている）。ＤｕｏＣＡＲ  Ｔ細胞、単独ＣＡＲコントロール、および形質導入していないＴ細胞（ＵＴＤ）を、三重ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞と一緒にして、一晩インキュベートした。平行して、自発性サイトカイン放出を除外する目的で、同様の条件のもと、腫瘍の非存在下においてＣＡＲ  Ｔ細胞をインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培養上清をＥＬＩＳＡでアッセイしてサイトカインＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ−２について調べた（図２０）。すべてのＣＡＲ群が、Ｒａｊｉと共にインキュベートしたことにより、高いＩＦＮｇレベルを示した。一方、いくつかの単独ＣＤ２２  ＣＡＲコントロールは、中程度の自発性ＩＦＮｇ放出を示し（Ｄ２、Ｄ３）、ＤｕｏＣＡＲはいずれも自発的にＩＦＮｇを産生しておらず、このことは、ＤｕｏＣＡＲの安全域がさらに広い可能性があることを示唆している。また、ＣＡＲ  ２２７２を除くすべてのＣＡＲ群において、Ｒａｊｉと共にインキュベートしたことによりＩＬ−２およびＴＮＦａの発現も大いに誘発された（図２０）。
【０３１２】
要するに、本明細書には、ＬＶを調製する際に個々のＣＡＲ鎖を同時トランスフェクションし、得られるＬＶ調製物をＴ細胞形質導入に適用することによる、機能性および高度な特異性を有するＤｕｏＣＡＲの作製が記載される。また、１つの標的抗原のみを発現する遺伝子組換え細胞株（Ｋ１９、Ｋ２０、Ｋ２２）を使用することによって、本発明者らは、ＣＡＲ標的化ドメインの各々が機能性を有しており、かつ、標的発現腫瘍細胞に対するＤｕｏＣＡＲ機能を誘発できることを示した。驚くべきことに、かつ予期しないことに、強いＣＡＲ発現と高効力の細胞毒性機能との両方を示すことのできた組み合わせは２〜３通りのみであり、したがって、ＤｕｏＣＡＲ設計は些末なことではない。
【０３１３】
配列表
配列番号１は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９５）のヌクレオチド配列である：
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAA
配列番号２は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９５）のアミノ酸配列である：
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK
配列番号３  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９５（ＬＰ−１４９５−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列：
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９５（ＬＰ−１４９５−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５は、リーダー／シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列である：
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCG
配列番号６は、リーダー／シグナルペプチド配列のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号７は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合ドメインＬＴＧ２２００）のヌクレオチド配列である：
CAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCA
配列番号８は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ２２００）のアミノ酸配列である：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAA
配列番号９  ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００（ＬＰ−２２００−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列：
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１０  ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００（ＬＰ−２２００−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１は、ＤＮＡ  ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である：
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
配列番号１２は、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である：
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１３は、ＤＮＡ  ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列である：
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTAC
配列番号１４は、ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列である：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
配列番号１５は、ＣＤ８アルファのヒンジ・膜貫通領域のアミノ酸番号１３７〜２０６のアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．−−００１７５９．３）：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１６は、ヒトＩｇＧ  ＣＬ配列のアミノ酸配列である：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号１７は、ＤＮＡシグナル伝達ドメイン４−１ＢＢのヌクレオチド配列である：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
配列番号１８は、シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢのアミノ酸配列である：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号１９は、ＤＮＡシグナル伝達ドメインＣＤ３−ゼータのヌクレオチド配列である：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
配列番号２０は、ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列である：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンカー−ＣＤ４ｔｍ−４−１ＢＢ−ＣＤ３−ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGATATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGATCGCGTGACCATTAGCTGCCGCGCGAGCCAGGATATTAGCAAATATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGCACCGTGAAACTGCTGATTTATCATACCAGCCGCCTGCATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAACCTGGAACAGGAAGATATTGCGACCTATTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTACCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCGGATTATGGCGTGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGCGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCAGCGAAACCACCTATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGACCATTATTAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGACCGATGATACCGCGATTTATTATTGCGCGAAACATTATTATTATGGCGGCAGCTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGTGCAGCCGATGGCGCTGATTGTGCTGGGCGGCGTGGCGGGCCTGCTGCTGTTTATTGGCCTGGGCATTTTTTTTTGCGTGCGCTGCCGCCCGCGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCG CTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC
配列番号２２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８結合−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２３は、ＣＤ２０＿１９反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のヌクレオチド配列である：
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCA
配列番号２４は、ＣＤ２０＿１９反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のアミノ酸配列である：
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA
配列番号２５は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７（ＬＰ−ＬＴＧ１４９７−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ、または、ＬＰ−ＣＤ２０  ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ）５−ＣＤ１９ＶＬ−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２６は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７（ＬＰ−ＬＴＧ１４９７−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ、または、ＬＰ−ＣＤ２０  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ）５−ＣＤ１９  ＶＬ−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２７は、ＣＤ１９に対するｓｃＦＶのヌクレオチド配列である：
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２８は、ＣＤ１９に対するｓｃＦＶのアミノ酸配列である：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号２９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ  １４９４（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８結合−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACACTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCTCCACGAGCGGCTCCGGGAAGCCTGGTTCCGGGGAAGGCTCCACTAAGGGTGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACATCCGTGACAGTCAGCTCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９４（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８結合−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDTDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５３８（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８結合−ＣＤ８ｔｍ−シグナル（ＬＴＩ再設計ＣＤ１９  ＣＡＲ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGCACTTCGGTGACTGTGTCAAGCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５３８（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８結合−ＣＤ８ｔｍ−シグナル（ＬＴＩ再設計ＣＤ１９  ＣＡＲ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３３は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のヌクレオチド配列である：
GACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCA
配列番号３４は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のアミノ酸配列である：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAA
配列番号３５は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９６（ＬＰ−ＬＴＧ１４９６−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ、または、ＬＰ−ＣＤ１９  ＶＬ−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）５  ＣＤ２０  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ  ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３６  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９６（ＬＰ−ＬＴＧ１４９６−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ、
または、ＬＰ−ＣＤ１９  ＶＬ−Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）５−ＣＤ２０  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３７は、メソテリン反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のヌクレオチド配列である：
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGT
配列番号３８は、メソテリン反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のアミノ酸配列である：
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLG
配列番号３９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０４（ＬＰ−ＬＴＧ１９０４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列：
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４０  ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０４（ＬＰ−ＬＴＧ１９０４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４１は、ＣＤ３３反応性一本鎖結合ドメインＶＨ−４（ＬＴＧ１９０６）のヌクレオチド配列である：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号４２は、ＣＤ３３反応性一本鎖結合ドメインＶＨ−４（ＬＴＧ１９０６）のアミノ酸配列である：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSS
配列番号４３は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０６（ＬＰ−ＶＨ４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４４は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０６（ＬＰ−ＶＨ４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４５は、ＴＳＬＰＲ反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のヌクレオチド配列である：
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGATCTGGGTCCGGTACTGACTACAGCCTCACCATTAGAAACCTTGAACAGGAGGACATCGCAACTTATTTCTGCCAACAGGTCTATACTCTGCCGTGGACCTTCGGCGGAGGTACCAAACTGGAGATTAAGTCCGG
配列番号４６は、ＴＳＬＰＲ反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のアミノ酸配列である：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKS
配列番号４７は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１７８９（ＬＰ−３Ｇ１１−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４８は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１７８９（ＬＰ−３Ｇ１１−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３（ＬＰ−ＣＤ１９−ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である：
ATGCTGCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTCCCTCACCCCGCCTTTCTGCTTATCCCGGACATTCAGATGACACAGACCACCTCGAGCTTGTCCGCGTCGCTGGGCGATCGCGTGACCATCTCCTGCCGGGCCTCCCAAGACATTTCAAAGTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGACGGAACCGTGAAACTGCTGATCTACCATACCAGCCGCCTGCACTCCGGCGTGCCGTCCCGCTTCTCCGGATCGGGTTCCGGAACTGACTACTCACTGACTATCTCCAACTTGGAACAAGAGGACATCGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAATACCCTTCCCTACACCTTCGGGGGGGGTACCAAGCTGGAGATCACTGGGGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGGAGCGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCAGGACTCGTGGCGCCATCCCAGTCCCTGTCGGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTCCCCGATTACGGAGTGTCATGGATTAGGCAACCCCCAAGAAAAGGGCTGGAATGGCTCGGAGTGATCTGGGGCTCCGAAACCACCTACTACAACTCGGCGCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTGTTCTTGAAGATGAACAGCTTGCAGACCGACGATACCGCAATCTACTACTGTGCCAAGCACTATTACTACGGGGGGTCTTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACCTCCGTGACTGTGTCGTCCGCGGCCGCGCCCGCCCCTCGGCCCCCGACTCCTGCCCCGACGATCGCTTCCCAACCTCTCTCGCTGCGCCCGGAAGCATGCCGGCCCGCCGCCGGTGGCGCTGTCCACACTCGCGGACTGGACTTTGATACCGCACTGGCGGCCGTGATCTGTAGCGCCCTGGCCACCGTGCTGCTGGCGCTGCTCATCCTTTGCGTGATCTACTGCAAGCGGCAGCCTAGGCGAAAGAAGCTCCTCTACATTTTCAAGCAACCCTTCATGCGCCCCGTGCAAACCACCCAGGAGGAGGATGGATGCTCATGCCGGTTCCCTGAGGAAGAAGAGGGCGGTTGCGAGCTCAGAGTGAAATTCAGCCGGTCGGCTGACGCCCCGGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGATCCGGAAATGGGCGGAAAGCCAAGGCGGAAGAACCCGCAGGAAGGTCTTTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATTGGGATGAAGGGAGAAAGACGGAGGGGAAAGGGACATGACGGACTTTACCAGGGCCTGAGCACTGCCACGAAGGACACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCGCTGCCGCCTCGG
配列番号５０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３（ＬＰ−ＣＤ１９−ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFDTALAAVICSALATVLLALLILCVIYCKRQPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２２８（ＬＰ−ＣＤ２０＿ＣＤ１９−ＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド酸配列である：
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号５２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２２８（ＬＰ−ＣＤ２０＿ＣＤ１９−ＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５３  Ｄ００４３  ヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTG ATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTG AAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAA CAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACT TCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACC GCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGG TCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTG ACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGAC ATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATG ACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCG TCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTC AGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGAC GCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACT AAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCT GGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCC CTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCG AAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCAC ACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGAC TACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAA GGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACA TCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAG GAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCC GGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTG GAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCC AGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTG CAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTAC GCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACC ACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTG CGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTC GCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCT CTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATG AACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCT CGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCC TACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATAT GACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAG AACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCC GAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGC CTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG CGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTG GAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGCTTCTATTAGTGACTTCCCTT TTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAG AGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGG GATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGG TTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCA GTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTT AACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGAC CTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGC GGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCC CCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAA ACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTG ATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCC GGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTAC TGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAG GCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGT CAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACT CGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGG GTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTT TACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGC TCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGG TCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTG GGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGA GGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAG ATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCAT GATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATG CAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号５４  Ｄ００４３  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５５  Ｄ００４４  ヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号５６  Ｄ００４４  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５９  Ｄ００４６  ヌクレオチド配列
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号６０  Ｄ００４６  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６１  Ｄ００４７  ヌクレオチド配列
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号６２  Ｄ００４７  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６５  Ｄ０００１  ヌクレオチド配列
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTGACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGACAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTATAACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCTCAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTCAGCAGTGGCGGCGGCGGATCTGGGGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGAGGATCAGACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACTATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGTAGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCAGAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAAGGTACCAAGTTGGAGATAAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号６６  Ｄ０００１  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６７  Ｄ０００２  ヌクレオチド配列
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号６８  Ｄ０００２  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６９  Ｄ０００３  ヌクレオチド配列
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCACGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号７０  Ｄ０００３  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７３  ＬＴＧ２２７３  ヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号７４  ２２７３  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７５  ＬＴＧ２２００  ヌクレオチド配列
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号７６  ＬＴＧ２２００  アミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７７  ＧＭＣＳＦリーダーペプチドヌクレオチド配列
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCC
配列番号７８  ＧＭＣＳＦリーダーペプチドアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号７９  ＣＤ８ａリーダーペプチドヌクレオチド配列
ATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCG
配列番号８０  ＣＤ８ａリーダーペプチドアミノ酸配列
MALPVTALLLPLALLLHAARP
配列番号８１  ＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメインヌクレオチド配列
GCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTC
AACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACAC
GGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAG
TTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGC
配列番号８２  ＣＤ８ヒンジ・膜貫通ドメインアミノ酸配列
AAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYC
配列番号８３  ４−１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインヌクレオチド配列
AAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAG
ACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGC
GAGTTG
配列番号８４  ４−１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインアミノ酸配列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号８５  ＣＤ２８共刺激ドメインヌクレオチド配列
CGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCG
GGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGC
TCC
配列番号８６  ＣＤ２８共刺激ドメインアミノ酸配列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号８７  ＣＤ３ゼータヌクレオチド配列
AGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTC
TACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGT
CGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAAC
GAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGA
AGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACC
TACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGA
配列番号８８  ＣＤ３ゼータアミノ酸配列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN
ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８９  フューリンＰ２Ａフューリンヌクレオチド配列
CGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTG
GAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAG
配列番号９０  フューリンＰ２Ａフューリンアミノ酸配列
RAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKR
配列番号９５  １６Ｐ１７  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨヌクレオチド配列
CAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTG
ACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGA
CAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTAT
AACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAAC
CAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCT
CAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTC
AGCAGT
配列番号９６  １６Ｐ１７  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨアミノ酸配列
QVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWY
NDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTV
SS
配列番号９７  １６Ｐ１７  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬヌクレオチド配列
GACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACT
ATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCA
GGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGT
AGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCA
GAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAA
GGTACCAAGTTGGAGATAAAG
配列番号９８  １６Ｐ１７  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬアミノ酸配列
DIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号９９  １６Ｐ８  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨヌクレオチド配列
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTG
ACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGG
CAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTAT
ACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAAC
CAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCA
CAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTG
TCGTCC
配列番号１００  １６Ｐ８  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨアミノ酸配列
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWY
TDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTV
SS
配列番号１０１  １６Ｐ８  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬヌクレオチド配列
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACC
ATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCA
GGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCA
CGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCT
GAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGA
GGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号１０２  １６Ｐ８  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬアミノ酸配列
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIK
配列番号１０３  １６Ｐ１３  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨヌクレオチド配列
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTG
ACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGG
CAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTAT
AACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAAC
CAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCA
CAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTG
TCGTCC
配列番号１０４  １６Ｐ１３  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＨアミノ酸配列
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWY
NDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTV
SS
配列番号１０５  １６Ｐ１３  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬヌクレオチド配列
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACC
ATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCA
GGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCA
CGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCT
GAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAA
GGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号１０６  １６Ｐ１３  ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＶＬアミノ酸配列
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPS
RFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号１０７  Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーアミノ酸配列
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
配列番号１０８  可動性鎖間リンカーアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【図１】
2022500467.tif 000004
【図２】
2022500467.tif 000005
【図３】
2022500467.tif 000006
【図４】
2022500467.tif 000007
【図５】
2022500467.tif 000008
【図６】
2022500467.tif 000009
【図７】
2022500467.tif 000010
【図８】
2022500467.tif 000011
【図９】
2022500467.tif 000012
【図１０Ａ】
2022500467.tif 000013
【図１０Ｂ】
2022500467.tif 000014
【図１１】
2022500467.tif 000015
【図１２】
2022500467.tif 000016
【図１３】
2022500467.tif 000017
【図１４】
2022500467.tif 000018
【図１５】
2022500467.tif 000019
【図１６】
2022500467.tif 000020
【図１７】
2022500467.tif 000021
【図１８】
2022500467.tif 000022
【図１９Ａ】
2022500467.tif 000023
【図１９Ｂ】
2022500467.tif 000024
【図２０】
2022500467.tif 000025
【配列表】
2022500467000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月19日(2021.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2022500467.tif 000026
【図２】
2022500467.tif 000027
【図３】
2022500467.tif 000028
【図４】
2022500467.tif 000029
【図５】
2022500467.tif 000030
【図６】
2022500467.tif 000031
【図７】
2022500467.tif 000032
【図８】
2022500467.tif 000033
【図９】
2022500467.tif 000034
【図１０】
2022500467.tif 000035
【図１１】
2022500467.tif 000036
【図１２】
2022500467.tif 000037
【図１３】
2022500467.tif 000038
【図１４】
2022500467.tif 000039
【図１５】
2022500467.tif 000040
【図１６】
2022500467.tif 000041
【図１７】
2022500467.tif 000042
【図１８】
2022500467.tif 000043
【図１９Ａ】
2022500467.tif 000044
【図１９Ｂ】
2022500467.tif 000045
【図２０】
2022500467.tif 000046
【国際調査報告】
2022500467.tif 000047
2022500467.tif 000048
2022500467.tif 000049
2022500467.tif 000050
2022500467.tif 000051