【手続補正書】
【提出日】平成22年8月26日(2010.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
情報断片を含むポリヌクレオチドであって、マーカーMP0176及びGJ01の１cM上流の距離の所に位置し且つマーカーGJ131と同時分離するゲノムＤＮＡ領域から得られ、甜菜における抽苔遺伝子（Ｂ遺伝子）関連表現型と完全な同時分離を示し、甜菜ゲノム中の抽苔遺伝子又はＢ遺伝子に遺伝的に連鎖した甜菜ゲノムＤＮＡから得られ、次の要素：
a) 甜菜ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した時、それぞれ配列番号７と配列番号８に与えられる正プライマーPRR7-Fと逆プライマーPRR7-R、又はそれぞれ配列番号７と配列番号８に与えられる配列と少なくとも90％の配列同一性を有するプライマー対を用いたＰＣＲ反応における約0.5 kbの増幅生成物を与えるイントロン領域；
b) 配列番号１又は配列番号52に示されるヌクレオチド配列と70％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド断片；
c) 配列番号５に示されるヌクレオチド配列又は配列番号５もしくは配列番号51に与えられるヌクレオチド配列と70％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド断片；
d) スプライシング後に、配列番号６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片；及び任意に加えて
e) NH2末端の近くにPRRR（Pseudo Response Regulator Receiver）ドメインモチーフをコードし、そしてCOOH末端にＣＣＴモチーフをコードする高度に保存された部分
の１つ又は複数を含んで成る、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
情報断片を含むポリヌクレオチドであって、配列番号５、51もしくは52に示されたヌクレオチド配列、又は配列番号５、51もしくは52に与えられたヌクレオチド配列と少なくとも70％の配列同一性を有する配列を含んで成るポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項１に記載の情報断片を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
情報断片を含むポリヌクレオチドであって、中度のハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチド断片の相補鎖が配列番号５、51又は52に示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項１又は２に記載の情報断片を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
情報断片を含むポリヌクレオチドであって、中度のハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチド断片の相補鎖が配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の情報断片を含むポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号５、51又は52のいずれかに示されたヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の情報断片を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５に示されたヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドであって、前記配列は
ａ）3695位にＧを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＴを、11143位にＣを、11150位にＣを、11220位にＡを、11238位にＣを、11299位にＡを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＧを、12127位にＴを、12193位にＡを、12337位にＧを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子１を表す配列；
ｂ）3695位にＴを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＴを、11143位にＣを、11150位にＣを、11220位にＡを、11238位にＡを、11299位にＴを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＧを、12127位にＴを、12193位にＧを、12337位にＧを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子２を表す配列；
ｃ）3695位にＧを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＧを、11143位にＴを、11150位にＣを、11220位にＡを、11238位にＣを、11299位にＴを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＧを、12127位にＴを、12193位にＧを、12337位にＧを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子３を表す配列；
ｄ）3695位にＧを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＴを、11143位にＣを、11150位にＴを、11220位にＡを、11238位にＣを、11299位にＴを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＧを、12127位にＴを、12193位にＡを、12337位にＧを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子４を表す配列；
ｅ）3695位にＧを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＴを、11143位にＣを、11150位にＣを、11220位にＡを、11238位にＣを、11299位にＴを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＡを、12127位にＴを、12193位にＡを、12337位にＡを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子５を表す配列；
ｆ）3695位にＧを、3827位にＣを、3954位にＴを、5284位にＴを、5714位にＧを、10954位にＧを、11043位にＴを、11143位にＣを、11150位にＣを、11220位にＡを、11238位にＣを、11299位にＴを、11391位にＡを、12053位にＧを、12086位にＧを、12127位にＴを、12193位にＡを、12337位にＡを、そして12837位にＧを有し、一年生対立遺伝子６を表す配列；及び
ｇ）3695位にＧを、3827位にＡを、3954位にＡを、5284位にＣを、5714位にＴを、10954位にＡを、11043位にＧを、11143位にＣを、11150位にＣを、11220位にＣを、11238位にＣを、11299位にＴを、11391位にＧを、12053位にＡを、12086位にＧを、12127位にＣを、12193位にＧを、12337位にＧを、そして12837位にＡを有し、二年生対立遺伝子７を表す配列
から成る群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の情報断片を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
複数の個々のマーカーを含んで成る一組のポリヌクレオチドマーカーであって、前記マーカーは請求項８に記載の対立遺伝子変異体１〜７のいずれかを含む配列番号５に示されたポリヌクレオチドに基づいて開発され、そして表５に与えられるヌクレオチド位置の様々なＳＮＰｓを検出することができ、前記マーカー組は異なる対立遺伝子を同定することができ、よって一年生と二年生甜菜系列間を識別することができる、一組のポリヌクレオチドマーカー。
【請求項８】
ポリヌクレオチドマーカーであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号51及び配列番号52に示されたポリヌクレオチド並びに配列番号６に示されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの群から選択されたポリヌクレオチド分子又はそれの情報断片から開発することができ、ここで前記ポリヌクレオチドマーカーは１又は複数の多型を含んで成り、前記多型はＢ遺伝子座のＢ対立遺伝子について診断可能であり、一年生と二年生遺伝子型の間又は二年生もしくは一年生遺伝子型を発現する甜菜植物の植物分類内の異なるハプロタイプ間を識別できるようにする、ポリヌクレオチドマーカー。
【請求項９】
正プライマーと逆プライマーから成る一対のプライマーであって、Ｂ遺伝子に遺伝的に密接に連鎖する甜菜ゲノムのゲノム領域中のヌクレオチド配列にアニールすることができ、そして情報断片を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んで成り、ここで前記断片は多型を含んで成り、前記多型はＢ遺伝子座のＢ対立遺伝子について診断可能であり、そして一年生と二年生遺伝子型の間を又は二年生もしくは一年生遺伝子型を発現する甜菜植物の植物分類内の異なるハプロタイプ間を識別できるようにする、一対のプライマー。
【請求項１０】
正プライマーと逆プライマーから成る一対のプライマーであって、Ｂ遺伝子に遺伝的に密接に連鎖した甜菜ゲノムのゲノム領域内のヌクレオチド配列にアニールすることができ、そしてそれの情報断片を増幅せしめることができ、前記断片はＢ遺伝子座のＢ対立遺伝子について診断可能であり、そして一年生と二年生遺伝子型の間を又は二年生もしくは一年生遺伝子型を発現する甜菜植物の植物分類内の異なるハプロタイプ間を識別できるようにする、請求項９に記載の一対のプライマー。
【請求項１１】
前記多型部位がＳＮＰ、ＳＳＲ、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失又は挿入に基づいた多型により特徴づけられる、請求項９に記載の一対のプライマー。
【請求項１２】
配列番号５に示されたBvPRR7遺伝子のコード領域内のヌクレオチド配列にアニールし、そして3827位のＡ／Ｃ  ＳＮＰ及び／又は3954位のＡ／Ｔ  ＳＮＰ及び／又は5714位のＴ／Ｇ  ＳＮＰ及び／又は11220位のＣ／Ａ  ＳＮＰ及び／又は11391位のＧ／Ａ  ＳＮＰ及び／又は12053位のＡ／Ｇ  ＳＮＰ及び／又は12127位のＣ／Ｔ  ＳＮＰを含んで成る多型を含んで成る前記コード配列からの情報断片を増幅する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の一対のプライマー。
【請求項１３】
ＳＮＰ＃3827を含んで成る断片を増幅するための配列番号27に示された正プライマーＦ3806と配列番号28に示された逆プライマーＲ3807を含んで成る、請求項１２に記載の一対のプライマー。
【請求項１４】
ＳＮＰ＃160を含んで成る断片を増幅するための配列番号７に示された正プライマーPRR7-Fと配列番号８に示された逆プライマーPRR7-Rを含んで成る、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の一対のプライマー。
【請求項１５】
情報ポリヌクレオチド断片中の部分領域に相補的である少なくとも２つの別々のプローブ分子を含んで成る一組のプローブポリヌクレオチドであって、前記情報ポリヌクレオチド断片は多型を含んで成り、前記多型は、配列番号５に示されたPRR7遺伝子の疑似受容体領域の中のＳＮＰ ＃3827に基づいており、そして第一の蛍光色素で標識された第一のプローブ分子は配列番号47に示されたヌクレオチド配列を有し、そして第二の蛍光色素で標識された第二のプローブ分子は配列番号48に示されたヌクレオチド配列を有する、一組のプローブポリヌクレオチド。
【請求項１６】
甜菜ゲノム中の多型を検出するための対立遺伝子識別アッセイにおけるマーカーとしての、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はそれの情報断片、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の一対のプライマー又は請求項１５に記載の一組のプローブポリヌクレオチドの使用。
【請求項１７】
甜菜植物における一年生に関連する対立遺伝子の不在又は存在を同定する方法であって、
a) 分析しようとする甜菜植物からゲノム試料を獲得し；
b) 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの配列に相補的である前記試料からのゲノム領域のヌクレオチド配列を分析し；そして
c) 前記配列を、二年生表現型及び一年生表現型と関連することが知られている対立遺伝子配列とそれぞれ比較する
ことを含んで成る方法。
【請求項１８】
前記ゲノム領域が配列番号５に表される配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記配列分析が、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドもしくはそれの情報断片又は請求項９〜１４のいずれか1項に記載の一対のプライマーに基づいた分子マーカーを使って実施される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
多型部位を含んで成る請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの部分領域と隣接する正及び逆プライマーを使ったＰＣＲ反応において、イントロン領域を分析し、前記部分領域を増幅せしめ、そして増幅された断片を、それぞれ二年生表現型及び一年生表現型と関連することが知られている対立遺伝子配列と比較する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記多型がＳＮＰに基づく、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
甜菜植物の一年生に関連する対立遺伝子の不在又は存在を同定する方法であって、
a) 分析しようとする甜菜植物からゲノム試料を獲得し；
b) 配列番号７に示された正プライマーPRR7-F及び配列番号８に示された逆プライマーPRR7-Rに基づいたＰＣＲ増幅により甜菜ゲノムから得られるイントロン領域のヌクレオチド配列を分析し；そして
c) 前記配列を、二年生表現型及び一年生表現型とそれぞれ関連することが知られている対立遺伝子配列と比較する
ことを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記イントロン領域が配列番号２に示されたヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
一年生表現型と同時分離する甜菜ゲノムのゲノム領域中の多型を検出するための対立遺伝子識別アッセイであって、前記多型がＢ遺伝子座のＢ対立遺伝子について診断可能であり、そして上記請求項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はそれの任意情報断片に基づいて開発された分子マーカーを含んで成る一年生遺伝子型と二年生遺伝子型の間を識別できるようにするという対立遺伝子識別アッセイ。
【請求項２５】
前記分子マーカーが請求項９〜１４のいずれか１項に記載の一対のプライマーを含んで成る、請求項２４に記載の対立遺伝子識別アッセイ。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載のマーカー補助対立遺伝子識別アッセイにおける市販の種子中の一年生混入を同定する方法。
【請求項２７】
甜菜ゲノムにおける一年生に関連する対立遺伝子の不在又は存在を同定するために使用することができる分子マーカーの開発のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用であって、
a) 前記ポリヌクレオチドの多型部位を同定し、
b) 前記多型を甜菜の一年生に関連する対立遺伝子の存在又は不在と関連付け、
c) 対立遺伝子識別アッセイにおいて使用することができる前記多型部位を含んで成るポリヌクレオチドの増幅のための、この多型部位に隣接するヌクレオチド配列を認識する正及び逆プライマーをデザインする
ことを含んで成る使用。
【請求項２８】
甜菜植物における一年生に関連する対立遺伝子の不在又は存在を同定する方法であって、
a) 分析しようとする甜菜植物からゲノム試料を獲得し；
b) BvPRR7遺伝子のプロモーター領域中に存在するヌクレオチド配列に相補的であり且つ結合するプライマー又はプライマー対を使って、前記試料ＤＮＡから断片を増幅せしめ；そして
c) 前記配列を、二年生表現型に関連するが一年生表現型には関連しないことが知られている対立遺伝子配列と比較する
ことを含んで成る方法。
【請求項２９】
a) 分析しようとする甜菜植物からゲノム試料を獲得し、
b) 前記試料ＤＮＡを、特に二年生対立遺伝子中に存在するが一年生対立遺伝子中には存在しないことが知られている対立遺伝子特異的配列を含んで成るプローブ分子で探査する
段階を含んで成る、請求項２８に記載の方法。