(57)【要約】  本発明は、生細胞を培養する基質を調製するための材料を製造する方法に関する。本発明はさらに、血小板溶解物材料及びその使用に関する。本発明の根底にある問題の解決は、ウイルス不活化手順が異なる少なくとも２つの異なる処理の組合せに基づく。ウイルス粒子及び／又はウイルス成分を不活化するための２つ以上の手順を組み合わせることで、広範囲のウイルス（例えば、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルス）が確実に不活化されて、臨床用途及び医薬用途にとって安全な生成物が提供される。さらに、血小板溶解物を含む血小板溶解物材料が提供され、材料は、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分が本質的にない液体材料又は乾燥材料である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞を培養する基質を調製するための材料を製造する方法であって：
−血小板溶解物を用意することと、
−血小板溶解物を、少なくとも２つの異なる処理にかけることと
を含み、各処理は、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分を不活化して、ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した血小板溶解物材料を用意することができる、上記方法。
【請求項２】
処理が、低温殺菌、乾熱、蒸気熱、紫外線照射、ガンマ線照射、Ｘ線照射、電子ビーム照射、ナノ濾過、及び溶媒／洗剤処理からなる群から選択される少なくとも２つの異なる処理を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血小板溶解物が液体であり、該液体血小板溶解物が処理にかけられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
血小板溶解物を処理前に乾燥させて、乾燥血小板溶解物材料が用意され、該乾燥血小板溶解物材料が処理にかけられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
血小板溶解物を、凍結乾燥によって乾燥させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
乾燥血小板溶解物材料が、粉砕されて粉末が得られる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
液体が乾燥血小板溶解物材料に加えられて、再構成された血小板溶解物材料が得られる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
血小板が、血小板濃縮物に由来し、そしてその後、凍結融解プロセスによって溶解する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
血小板溶解物を含む血小板溶解物材料であって、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分が本質的にない液体材料又は乾燥材料である血小板溶解物材料。
【請求項１０】
１〜５０％の血小板溶解物、好ましくは１〜４０％の血小板溶解物、より好ましくは１〜３０％の血小板溶解物、より好ましくは１〜２０％の血小板溶解物、より好ましくは５〜１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含む、請求項９に記載の血小板溶解物材料。
【請求項１１】
血小板が、ヒト血液に由来する、請求項９又は１０に記載の血小板溶解物材料。
【請求項１２】
材料が粉末である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の血小板溶解物材料。
【請求項１３】
臨床用途及び／又は治療用途のために生細胞を増殖させるためのウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した基質を調製するための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の血小板溶解物材料、特に、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法で製造された血小板溶解物材料の使用。
【請求項１４】
基質が、液体基質又は三次元のゲル様基質である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１３又は１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生細胞を培養する基質を調製するための材料を製造する方法に関する。本発明はさらに、血小板溶解物材料及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は通常、必須の成長因子を細胞に提供するために、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は他の血清を補充した培地中で培養される。実際には、いかなる細胞型も、成長のために血清を必要としないが、例えば幹細胞といったほとんどの敏感な細胞型は、今でも血清含有培地に依存している。しかしながら、治療用途に照らして、潜在的な異種免疫反応（例えば抗ＦＣＳ抗体）、ウシ病原体（ウイルス及びプリオン）、及び結果の再現性を妨げる高いロット間変動に起因して、ＦＣＳの使用を避けることへの関心が高まっている。化学的に定義された合成培地が現在市販されているが、多くの場合、その正確な組成は開示されておらず、そして多くの場合、組換え成長因子等の他の異種成分を含んでいる。
【０００３】
いかなる異種成分もないことに起因して、ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）が、基礎研究においてだけでなく、臨床用途及び治療用途にとっても、幹細胞増殖に最も適した代替手段であることが実証されてきた。
【０００４】
国際公開第２０１７／２０７６８８号パンフレットは、三次元のゲル様基質を調製するための材料を製造する方法に関するものであり、そこでは、血小板濃縮物が提供され、そしてこの血小板濃縮物から血小板が獲得される。次に、血小板を溶解させて血小板溶解液を製造してから、前記血小板溶解液を凍結乾燥させて、乾燥血小板溶解物材料が提供される。凍結乾燥材料は、使用場所にて水を加えることによって容易に再構成されて、生細胞を何ら制限なく培養するのに使用することができる完全に機能的な血小板溶解物ゲルを提供することができる。したがって、この方法は、細胞培養特性に何ら影響を与えることなく、ゲル材料の輸送を容易にし、そして血小板溶解物ゲルのより長い貯蔵寿命を確実にする。
【０００５】
凍結乾燥血小板溶解物を調製する方法が、米国特許出願公開第２０１３／０１９５９５９号明細書から知られている。この文献は、治療用途に適した、又は培地として適した組成物を調製する方法を開示しており、これは、血小板源から血小板を濃縮して、血小板源の血小板リッチ部分を形成する工程と、血小板リッチ部分内の血小板を溶解させて、複数の溶解物を形成する工程とを含む。追加の工程として、溶解物を凍結乾燥させて、組成物中の凍結乾燥血小板溶解物を、利用可能な成長因子、サイトカイン、及びケモカインが放出される濃度で形成することを含む。当該凍結乾燥血小板溶解物は、乾燥形態で利用することも、利用前に再水和させることも、ゲルとして利用することもできる。
【０００６】
さらに、国際公開第２０１３／０７６５０７号パンフレットは、血小板溶解物を含む医薬組成物、及びその治療用途を開示している。当該組成物は、創傷に対して治療的に塗布することができる。血小板溶解液を凍結乾燥させて、成長因子を含有する凍結乾燥粉末であって、創傷治癒の治療用途だけでなく、天然の成長因子の送達の必要性が高い他の治療用途にも使用することができる、安定した凍結乾燥粉末を製造する。凍結乾燥した血小板溶解物を、培地又は生理食塩水中に再懸濁させて、濾過によって滅菌してから、血小板リッチ血漿ゲルを生成するのに使用することができる。
【０００７】
しかしながら、ヒト血小板溶解物は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養に一般的に使用される補助剤であり、これは、ウシ胎児血清とは対照的に、異種免疫反応又はウシ病原体の伝播のリスクはないが、臨床用途及び製薬用途に関して、ウイルス汚染が依然として問題である。とりわけ、ヒト由来補助物質に基づくあらゆる臨床用途について、ウイルスの安全性は、考慮する必要がある主要な側面の１つである。したがって、幹細胞又は他の治療的に利用可能な細胞型を増殖させるための基質を調製する場合、ウイルス汚染のあらゆるリスクを引き下げ、又は完全に排除することが何よりも重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ウイルス汚染のあらゆるリスクを完全に排除する、又は少なくとも引き下げる、生細胞を培養する基質を調製するための材料を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、生細胞を培養する基質を調製するための材料を製造する方法を提供することによって達成され、前記方法は：
−血小板溶解物を用意することと、
−前記血小板溶解物を、少なくとも２つの異なる処理にかけることと
を含み、各処理は、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分を不活化して、ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した血小板溶解物材料を用意することができる。
【００１０】
本発明の根底にある問題の解決は、ウイルス不活化手順が異なる少なくとも２つの異なる処理の組合せに基づく。ウイルス粒子及び／又はウイルス成分を不活化するための２つ以上の手順を組み合わせることで、広範囲のウイルス（例えば、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルス）が確実に不活化されて、臨床用途及び医薬用途にとって安全な生成物が提供される。各ウイルス不活化手順は通常、１種類のみ、又は多くとも数種類のウイルスしか不活化しないので、異なる不活化手順を組み合わせると、安全度が大幅に向上する。ゆえに、本発明に従う方法によって、ウイルス汚染リスクがない、又は少なくとも大幅に引き下げられた、幹細胞又は他の治療的に利用可能な細胞型を増殖させるための安全な血小板溶解物材料が提供される。
【００１１】
本発明の有利な実施形態において、処理は、低温殺菌、乾熱、蒸気熱、紫外線照射、ガンマ線照射、Ｘ線照射、電子ビーム照射、ナノ濾過、及び溶媒／洗剤処理からなる群から選択される少なくとも２つの異なる処理を含む。基本的に、処理手順の選択は、排除されるウイルスの種類（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ等）、及び処理される材料の組成（高タンパク質含量、低タンパク質含量、タンパク質フリー等）によって決まる。しかしながら、血小板溶解物の場合、先で指定された処理は、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分の効果的な不活化にとって、最も効果的かつ最も穏やかな手順であることがわかった。
【００１２】
低温殺菌：材料を穏やかな熱、すなわち１００℃未満で処理する、例えば、溶液中の生体分子を通常６０℃にて加熱するプロセス。
【００１３】
乾熱：例えば凍結乾燥後に、乾物を、通常８０℃以上にて加熱するプロセス。
【００１４】
蒸気熱：例えば凍結乾燥後に、乾物を、好ましくは６０℃又は８０℃にて、加熱してから水分を再導入するプロセス。
【００１５】
ＵＶ照射：好ましくは１００〜２８０ｎｍ（ＵＶＣ）又は３１５〜４００ｎｍ（ＵＶＡ）の波長にて、材料に紫外線（ＵＶ）を当てるプロセス。
【００１６】
ガンマ線照射：ウイルスの不活化又は細菌の滅菌のためにガンマ線の照射を使用して、液体材料、凍結材料、又は凍結乾燥材料を処理するプロセス。ガンマ線は、原子核の放射性崩壊から生じる透過性の電磁放射線であり、通常、波長がＸ線の波長よりも短い。
【００１７】
Ｘ線：Ｘ線（レントゲン線）の照射は、主に０．０１〜１０ナノメートルに及ぶ波長での電磁放射の別の形態であり、３０ペタヘルツ〜３０エクサヘルツ（３×１０１６Ｈｚ〜３×１０１９Ｈｚ）の範囲の周波数、及び１００ｅＶ〜１００ｋｅＶの範囲のエネルギーに相当する。
【００１８】
電子ビーム照射：真空管内で負極（陰極）によって放出される電子の流（陰極線）で材料を処理するプロセス。
【００１９】
ナノ濾過：流体（液体又は気体）から固体を分離するための、通常、５０ｎｍ以下の有効孔径、好ましくは１〜１０ナノメートルの孔径を有する膜を通過させる、ナノメートルサイズの貫通孔を使用する膜濾過ベースのプロセス。
【００２０】
Ｓ／Ｄ処理：溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理とは、通常、有機溶媒（例えば、リン酸トリ（ｎブチル））、及びＴｗｅｅｎ８０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の洗剤で、溶液中の材料を処理するプロセスを指す。
【００２１】
血小板溶解物は液体であってもよく、液体血小板溶解物が処理にかけられる。これ以外にも、血小板溶解物を処理前に乾燥させて、乾燥血小板溶解物材料が提供されてもよく、その後、乾燥血小板溶解物材料が処理にかけられる。
【００２２】
本発明の有利な実施形態において、血小板溶解物を、凍結乾燥によって乾燥させる。処理前のこの有利な工程は、血小板溶解物を凍結乾燥させて、乾燥した粉末状の血小板溶解物材料を形成することを含む。驚くべきことに、凍結乾燥工程は、生じた基質の特性に影響を与えない。そして、品質管理された条件下での貯蔵寿命を長期間延ばすことにより、より安定した補助剤を提供する。すなわち、凍結乾燥血小板溶解物材料は、安定しており、長期間保存することができる。さらに、凍結乾燥材料は、容易に輸送することができるので、基質の完全な組成物を使用場所に送達することができる。ユーザーは、使用場所で血小板溶解物基質を製造するプロセス全体を完遂する必要はない。代わりに、血小板溶解物材料は、製造施設において標準化かつ管理された条件下で製造され、そしてその後、ウイルスフリーの乾燥血小板溶解物材料が、直ぐに使用できる一種の材料としてユーザーに送達されて、ユーザーはこれを容易に再構成することができる。
【００２３】
この実施形態の利点は、（凍結乾燥によって）凍結乾燥すること、そしてウイルス不活化することを組み合わせた血小板溶解物に基づく。凍結乾燥した溶解物は、凍結状態下（摂氏−２０度以下）での可溶形態の保存の代わりに、周囲温度条件にて保存することができ、ここでは、凍結乾燥が、液体状態と比較して、材料の安定性を高めている。凍結乾燥したヒト血小板溶解物は、水和形態と比較して、より低い線量でウイルス不活化され得ることが、本発明に従う方法の利点である。例えば、本発明に従えば、照射がウイルス不活化に使用されてもよい。照射線量が低いほど、ヒト血小板溶解物の必須の成長因子及び他のタンパク質が照射によって損傷を受けない結果となる。それにもかかわらず、ヒト血小板溶解物の性能は、例えば細胞成長の観点から、影響を受けるが、水和形態を処理するのに必要なより高線量の照射と比較して、影響は大幅に小さくなる。したがって、従来通りウイルス不活化されるものと比較して、より性能が高い、より安全なヒト血小板溶解物生成物が提供される。一般に、凍結乾燥が、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、及び他の内容物を保存するという利点を追加するだけでなく、貯蔵、輸送、及びロジスティクスに関する追加の利点も示す一方、照射が、血小板溶解物の成分の損傷を少なくして、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分、例えばウイルスＲＮＡ及びＤＮＡを効果的に不活化するという利点を追加する。
【００２４】
全体として、治療用途に適した生細胞を培養し、かつ増殖させるための基質、ならびに臨床用途及び治療用途のためのウイルスフリーの、又はウイルスが低減したヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を調製する方法が提供される。本発明に従う方法は、細胞培養特性に何ら影響を与えることなく、治療用途にとって安全な生成物を提供し、かつ性能特性に何ら影響を与えることなく、貯蔵寿命及び安定性がより高い保存条件及び輸送条件を容易にする。
【００２５】
便宜上、乾燥血小板溶解物材料は、好ましくは処理の前に、粉砕されて粉末が得られてもよい。
【００２６】
本発明の別の有利な実施形態において、液体が乾燥血小板溶解物材料に加えられて、再構成された血小板溶解物材料が得られる。ウイルスフリーの乾燥血小板溶解物材料は、水、生理食塩水、又は液体培地を加えることによって再水和させることができる。例えば、少なくとも１つの培地成分を、再水和した血小板溶解物材料に加えて、生じた基質を、増殖させることとなる細胞の特定の必要性に適合させることができる。培地成分は、例えば、細胞培養用の標準化された培地組成物、好ましくはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、特にＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）を含んでもよい。ゆえに、細胞培養に必須の成長因子及び必要な全ての栄養素を含有し、不所望の血清成分を含まない、ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した基質を提供することができる。
【００２７】
本発明のさらに有利な実施形態において、血小板は、血小板濃縮物に由来し、そしてその後、凍結融解プロセスによって溶解する。例えば、獲得された血小板ユニットは、２回、−８０℃にて凍結されて、それぞれ３７℃にて再解凍されてもよい。
【００２８】
この目的はまた、血小板溶解物を含む血小板溶解物材料を提供することによって達成され、前記材料は、ウイルス粒子及び／又はウイルス成分が本質的にない液体材料又は乾燥材料である。ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した液体材料は、使用場所にて直接使用することができる、直ぐに使用できる一種の材料として製造され得る。ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した乾燥材料は、安定しており、そして長期間保存することができる。さらに、乾燥材料は、容易に輸送することができるので、完全な基質を使用場所に送達することができる。ユーザーは、使用場所で血小板溶解物基質を製造するプロセス全体を完遂する必要はない。代わりに、ウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した乾燥血小板溶解物材料は、製造施設において標準化かつ管理された条件下で製造され、そしてその後、直ぐに使用できる一種の材料としてユーザーに送達されて、ユーザーはこれを容易に再構成することができる。
【００２９】
例えば、血小板溶解物材料は、１〜５０％の血小板溶解物、好ましくは１〜４０％の血小板溶解物、より好ましくは１〜３０％の血小板溶解物、より好ましくは１〜２０％の血小板溶解物、より好ましくは５〜１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含み得る。
【００３０】
本発明の有利な実施形態において、血小板は、ヒト血液に由来する。ヒト血小板溶解物の使用は、とりわけ、異種免疫反応のリスクも（非ヒト）病原体の伝播のリスクもなしに、ヒト細胞（例えばヒト間葉系幹細胞）を培養するのに有益である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、血小板溶解物材料は粉末である。
【００３２】
本発明の別の態様は、臨床用途及び／又は治療用途のために生細胞を増殖させるためのウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した基質を調製するための、本発明に従う血小板溶解物材料、特に、本発明に従う方法で製造された血小板溶解物材料の使用である。特に、本発明は、治療用途のためのより安全なタイプの（ヒト）血小板溶解物、及び臨床用途又は治療用途のために生細胞を増殖させるための、治療用途に適した、又は細胞培地として適したウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した基質を調製する方法の開発に関する。
【００３３】
製造されたウイルスフリーの、又は少なくともウイルスが低減した基質は、液体基質であっても、三次元のゲル様基質であってもよい。本発明に従う液体基質又はゲル様基質は、細胞療法において医薬組成物として有利に使用することができる。特に、本発明に従って液体中で培養された、又はゲル中に植え込まれた細胞、好ましくは幹細胞、特に間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、細胞置換又は組織修復等のために、生きている動物又はヒトの体内に移植することができる。これ以外にも、本発明に従う基質は、動物又はヒトの体に移植かつ／又は注射されて、周囲組織又は血液の細胞に適した基質を提供することができる。本発明に従う材料は、例えば、関節症、壊死、又は組織の損傷と関連する他の疾患を処置するのに使用することができる。
【００３４】
培養又は増殖されることとなる生細胞は、例えば、間葉系幹細胞であってもよい。例えば、培養又は増殖されることとなる細胞は、幹細胞又は前駆細胞、特に好ましくは間葉系幹細胞、特に間葉系間質細胞である。本発明の別の例示的な実施形態において、細胞は、中胚葉細胞、好ましくは線維芽細胞又は間葉系間質細胞である。しかし、明らかに、他のタイプの細胞、例えば、外胚葉系統又は内胚葉系統に由来する細胞、又は初代細胞さえも培養することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「凍結乾燥」は、水を、凍結状態から、液体状態を経ることなく気体状態に変換することを含む「凍結乾燥」プロセスを指す。凍結乾燥プロセスは、含水材料を凍結させたまま、当該材料から水分を除去する。凍結乾燥の基本的なプロセスは、以下の工程：凍結、一次乾燥（昇華）、及び二次乾燥（脱着）を含む。最初に、溶解及び／又は懸濁させた物質を、低温（例えば−６０℃）にて凍結させる。ゆっくりと凍結させると、より大きな結晶が生じ、昇華する物質は逃げることができる。一部の生成物は、ガラス状の物質を形成し、凍結プロセス中にアニーリングが必要とされる場合がある。アニーリングは、最初に温度を下げ、次に温度を上げ、その後再び下げることで、構成要素を適所に固定してから結晶を成長させることができる。凍結は、用途に応じて、１時間から２４時間に及んでよい。次に、工程２（一次乾燥）において、水又は希釈剤が、真空によって抽出されて、多孔質の乾燥した「ケーキ」が生じる。昇華は、生成物の温度が、その臨界温度を下回る真空下で起こる。これは通常、最も長いプロセスである。一次乾燥サイクルの終わりに、生成物は、含水量が３〜５％となる。残留する未凍結の水分子を除去するために、最終乾燥工程（二次乾燥）がある。これは、生成物を加熱することによって行われる。二次乾燥により、水分レベルが約０．５％となり得る。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「照射」は、ウイルス粒子又はウイルス成分の不活化に適したあらゆる種類の放射線（光線）を前記材料に当てることによる材料の処理を指す。放射線は、例えば、ガンマ線、熱線、紫外線、Ｘ線、及び電子線を含み得る。
【００３７】
例えば、以下のウイルスを、本発明に従う方法を使用して不活化することができる：
ＢＥＶ（ウシエンテロウイルス）：Ａ型肝炎ウイルスのモデルとして使用される、非エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＢＶＤＶ（牛ウイルス性下痢ウイルス）：Ｃ型肝炎ウイルスのモデルとして使用される、エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスで、通常は細胞に付随する。
コクサッキーウイルス：非エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＣＰＶ（イヌパルボウイルス）：非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルス。
ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスで、通常は細胞に付随する。
ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）：非エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）：非エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルス。
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＨＤＶ（デルタ肝炎ウイルス）：Ｂ型肝炎ウイルスによる重感染を必要とする欠損ウイルス。
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスで、通常は細胞に付随する。
ＨＴＬＶ  １及び２（ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、１型及び２型）：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス、通常は細胞に付随する。
ポリオウイルス：非エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＰＰＲＶ（ブタ仮性狂犬病ウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルス。
ＰＰＶ（ブタパルボウイルス）：非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルス。
ＰＲＶ（仮性狂犬病ウイルス）：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルス。
シンドビスウイルス：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ＳＬＦＶ（セムリキ森林熱ウイルス）：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ワクシニアウイルス：エンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルス。
水疱性口内炎ウイルス：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
ウエストナイルウイルス：エンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルス。
【００３８】
しかしながら、他のいかなるウイルスも、本発明に従う方法によって不活化され得る。
【００３９】
本発明は、例を参照してさらに詳細に説明される。
【００４０】
本発明の例示的かつ好ましい実施形態の説明
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、造血を補助することができ、間葉系に沿って、そして非間葉系に沿ってインビトロで分化することができ、アロ応答を抑制することができ、かつ非免疫原性であると思われる、生物学的に重要な細胞集団である。これらの特性は、細胞療法における間葉系間質細胞の新たな役割を示唆している。
【００４１】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａａｃｈｅｎの倫理委員会によって承認されたガイドラインを用いて書面による同意を得た後に、ＭＳＣを、股関節部骨折直後に大腿骨頭から単離した。骨片をＰＢＳでフラッシュしてから、単核細胞（ＭＮＣ）を、密度勾配によって、Ｂｉｏｃｏｌｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で単離した。細胞を、フィブロネクチン被覆細胞培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）内で、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ；Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）入りダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ；ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）中で培養した。示すように、培地にＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＨＰＬを補充した。培地を、週に２回、常に交換した。８０％のコンフルエンスに達したら、細胞をトリプシン処理して、Ｎｅｕｂａｕｅｒカウントチャンバ（Ｂｒａｎｄ，Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でカウントして、１０４細胞／ｃｍ２にて再プレーティングした。累積集団倍増を、第１の継代から算出した。
【００４２】
ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）を、Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）によって記載されるように、健康なドナーの血小板ユニットから生成した。特に、ＨＰＬを、Ｔｒｉｍａ  Ａｃｃｅｌ収集系（ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｇａｒｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したアフェレーシスによって生成した。そのような血小板濃縮物は、血小板含量が、クエン酸−デキストロース（ＡＣＤ）（１：１１ｖ／ｖ）を補充した２００ｍＬ血漿中で２．０〜４．２×１０１１血小板であった。血小板ユニットを等分して、２回、−８０℃にて凍結させて、３７℃にて再解凍して、２６００ｇで４℃にて３０分間遠心分離して細胞片を除去して、等量でプールした。上清を０．２２μｍ  ＧＤ／Ｘ  ＰＶＤＦフィルタデバイス（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過して、場合によってはゼラチン化を回避するために２Ｕ／ｍＬヘパリンを補充して、−８０℃にて保存した。
【００４３】
細胞を、細胞培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）内で、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ；Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）入りダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ；ＰＡＡ）中で培養した。培地／基質に、本明細書中に示されるように、ＨＰＬを補充した。細胞を、５％二酸化炭素を含有する加湿雰囲気内で３７℃にて培養した。培地は週に２回交換した。
【００４４】
細胞増殖を、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを介して評価した。ＭＳＣを、本明細書中に示すように、９６ウェルプレート（３，０００細胞／ウェル）上で、０、１、５、１０、又は２０％のＨＰＬを補充した培地／基質中に播種した。培養７日後に、細胞をＰＢＳ（ＰＡＡ）で洗浄して、ＰＢＳ中１ｍＭ  ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３．５時間インキュベートした。過剰な溶液を廃棄して、結晶を、イソプロパノール中４ｍＭ  ＨＣｌ（双方ともＲｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で分解（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）させた。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２０００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、波長５９０ｎｍにて光学密度（ＯＤ）を測定した。
【実施例】
【００４５】
ヒト血小板溶解物の生成：
血小板ユニットを、有効期限後（収穫５日後）に、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＲＷＴＨ  Ａａｃｈｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌから好意でいただいた。血小板ユニットを、Ｔｒｉｍａ  Ａｃｃｅｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ，Ｇａｒｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したアフェレーシスによって生成した。これは、クエン酸−デキストロース（ＡＣＤ）（１：１１ｖ／ｖ）を補充した２００ｍＬ血漿中で、２．０〜４．２×１０１１個の血小板を含む。４５ｍＬのアリコートを、２回、−８０℃にて凍結させて、３７℃にて再解凍してから、２，６００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を０．２μｍ  ＧＤ／Ｘ  ＰＶＤＦフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過して、使用するまで−８０℃にて保存した。本研究の実験は、それぞれが４人のドナーの溶解物からなる３つのＨＰＬプールで実行したが、個々のドナー由来のＨＰＬを使用しても同様の結果が観察された。ＨＰＬは主に血液型Ａ型からなったが、システマティック分析では血液群の影響は何ら明らかにならなかった。
【００４６】
培地及びＨＰＬゲル：
培地は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ；Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びＨＰＬ（特に明記されていなければ１０％）入りダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ；ＰＡＡ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）からなった。細胞を、組織培養プラスチック（ＴＣＰ；Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）上で培養した。ゲル調製のために、ヘパリンを含まないＨＰＬ含有細胞培地を細胞培養プレート内に充填した。培地中に含まれるカルシウムにより、凝固カスケードが開始されて、ＨＰＬ培地は３７℃にて１時間以内にゼラチン化した。すなわち、純粋な、又は希釈された血小板溶解物は、トロンビン及び／又はグルコン酸カルシウム等のいかなる凝固誘導剤も加える必要なく、約３７℃にて自発的にゼラチン化する。生じたＨＰＬ−ゲルを、同量のＭＮＣを播種した細胞培養基質として使用した。比較のために、８０％コラーゲンＧ（１２ｍＭ  ＨＣｌ中３ｍｇ／ｍＬコラーゲンＩ／ＩＩＩ型；Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるゲルを、前述のように使用した。細胞を、６ウェルプレート又はＴ７５組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で３７℃にて培養した。
【００４７】
骨髄由来ヒト間葉系間質細胞の単離：
ＭＳＣを、プラスチック接着（ｐｌａｓｔｉｃ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）によって単核細胞（ＭＮＣ）から単離した。手短に言えば、大腿骨頭プロテーゼを経験している患者の大腿骨頭由来の骨片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でフラッシュした。続いて、ＭＮＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｂｉｏｃｏｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、密度１．０７７ｇ／ｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって単離して、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、少なくとも５×１０５個のＭＮＣを、６ウェルプレート内のＴＣＰ、ＨＰＬゲル、又はコラーゲンゲルのいずれかの培地中に再懸濁させた。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気内で３７℃にて培養した。４８時間後に第１の培地交換を実行して、非接着細胞を除去した。その後、半培地交換を週に２回実行して、ＭＳＣを、以下に説明するようにさらに継代した。
【００４８】
凍結乾燥：
ゲルを凍結乾燥フラスコ内に入れて、機械的冷蔵、ドライアイス、及びメタノール、又は液体窒素によって冷却したシェルフリーザ内でフラスコを回転させることによって、凍結を行う。より大規模な場合、凍結は、凍結乾燥機を使用して達成することができる。この工程では、材料の固相と液相が共存し得る最低温度である三重点未満に材料を冷却することが重要である。これにより、次の工程において溶融ではなく昇華が確実に起こることとなる。結晶が大きいほど、凍結乾燥は容易となる。より大きな結晶を生成するために、生成物をゆっくりと凍結させるべきであり、又は温度を上下に循環させてもよい（アニーリング）。凍結温度は−５０℃〜−８０℃である。
【００４９】
一次乾燥フェーズの間に、圧力が（数ミリバールの範囲にまで）低下して、氷が昇華するのに十分な熱が凍結ゲルに供給される。この最初の乾燥フェーズでは、材料中の約９５％の水が昇華する。熱を加えすぎると、材料の構造が変化する虞があるので、このフェーズはゆっくりであってよい。このフェーズでは、部分真空を利用して圧力を制御する。真空は昇華を加速し、周到な（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ）乾燥プロセスとして有用である。さらに、コールドコンデンサチャンバ及び／又はコンデンサプレートが、水蒸気が再凝固する表面を提供する。コンデンサの温度は通常、−５０℃（−６０°Ｆ）未満である。
【００５０】
二次乾燥フェーズは、氷を一次乾燥フェーズにおいて既に除去したため、凍結していない水分子を除去することを目的としている。このフェーズでは、水分子と凍結材料との間に形成されたあらゆる物理−化学的相互作用を破壊するために、温度が一次乾燥フェーズよりも高くなり、０℃を超えることすらあり得る。この段階で圧力を下げて、脱着を促進することもできる（例えば、マイクロバー、又はパスカルの小数部（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｐａｓｃａｌ）の範囲内）。
【００５１】
凍結乾燥プロセスが完了した後に、窒素等の不活性ガスで真空を破壊してから、材料をシールする。操作の終了時に、生成物中の最終の残留含水量は非常に低く、約１％〜４％である。
【００５２】
非特許文献
2022501058.tif 000002
【国際調査報告】
2022501058.tif 000003
2022501058.tif 000004
2022501058.tif 000005