【手続補正書】
【提出日】平成22年10月29日(2010.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）蛍光ポリペプチド；
ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
ｉｉｉ）標識
を含む、融合タンパク質であって、
蛍光ポリペプチドおよび標識が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）ペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する融合タンパク質。
【請求項２】
前記標識がルミネッセンス金属錯体である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質がＮＥＤＤ８、ＳＵＭＯ−１、ＵＣＨＬ３、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、ＳＵＭＯ−４、ＩＳＧ１５ａ、ＩＳＧ１５ｂ、ＦＡＴ１０ａ、ＦＡＴ１０ｂ、ＦＵＢ１、ＵＢＬ５、ＵＲＭ１、ＡＴＧ８、Ｒｕｂ１、Ｓｍｔ３、Ｈｕｂ１、Ｕｒｍ１、およびＡＴＧ１２からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記蛍光ポリペプチドがＧＦＰまたはＹＦＰである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
以下の段階を含む、脱ユビキネーション活性のモジュレータを同定する方法であって：
ａ）少なくとも１つの脱ユビキネーション酵素と融合タンパク質とを、脱ユビキネーション活性の少なくとも１つの被験モジュレータの存在下で接触させて被験試料を生成させる段階であって、
少なくとも１つの融合タンパク質が、蛍光ポリペプチド、ユビキネーション酵素ポリペプチド基質、および標識を含む、段階；
ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階；
ここで、該蛍光ポリペプチドおよび該標識がＲＥＴペアであり、かつ脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断によりＲＥＴペアのアクセプター部分およびドナー部分の間の共鳴エネルギー移動が減少する、方法。
【請求項６】
以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物の脱ユビキネーション活性を測定する方法：
ａ）化合物と少なくとも１つの融合タンパク質とを接触させて被験試料を生成させる段階であって、
少なくとも１つの融合タンパク質が以下を含み：
ｉ）蛍光ポリペプチド；
ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
ｉｉｉ）標識、
蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する段階；
ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項７】
少なくとも１つの化合物および少なくとも１つの融合タンパク質を、少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素と接触させて被験試料を生成させる段階を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記標識がルミネッセンス金属錯体である、請求項５または請求項６記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、化合物が脱ユビキネーション活性のモジュレータであるかどうかを決定する方法：
ａ）該化合物を少なくとも１つの融合タンパク質を発現する細胞と接触させて被験試料を生成させる段階であって、該融合タンパク質が第１の標識および脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質を含む、段階；
ｂ）脱ユビキネーション活性に適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
ｃ）（ｂ）の前、間、または後に、被験試料を、脱ユビキネーションの有無に基づいて少なくとも１つの融合タンパク質への弁別結合を示す結合パートナーと接触させる段階であって、該結合パートナーは第２の標識を含み、かつ該第１および第２の標識はＲＥＴペアである、段階；
ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項１０】
前記第１の標識が蛍光ポリペプチドでありかつ前記第２の標識がルミネッセンス金属錯体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記結合パートナーが抗体または抗体フラグメントである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質が、ユビキチンポリペプチド、ユビキチンポリペプチドフラグメント、ユビキチン様ポリペプチド、またはユビキチン様ポリペプチドフラグメントである、請求項５、６、または９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
蛍光発光が２つの波長で測定される、請求項５、６、または９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
２つの波長での蛍光発光の比率が計算される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む、試料の脱ユビキチン化活性を同定する方法：
ａ）ｉ）試料を、ｉｉ）基体上に固定された少なくとも１つまたは複数のポリペプチドと接触させる段階であって、少なくとも１つまたは複数のポリペプチドが検出可能部分に結合したユビキチンまたはユビキチン様のタンパク質を含み、脱ユビキチン化活性が基体からの検出可能部分の解離を生じさせる、段階；
ｂ）脱ユビキチン化活性に適切な条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
ｃ）基体上の任意のポリペプチドに結合した検出可能部分を検出する段階。
【請求項１６】
ａ）パッケージ材料；ならびに
ｂ）請求項１記載の融合タンパク質
を含む、製品。
【請求項１７】
以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定する方法：
ａ）少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも２集団のユビキトンと接触させて被験試料を生成させる段階であって、１集団のユビキトンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている段階；
ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項１８】
以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物がユビキチン化活性を調節するか否かを判定する方法：
ａ）少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも２集団のユビキトンと接触させて被験試料を生成させる段階であって、１集団のユビキトンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている段階；
ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項１９】
以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定する方法：
ａ）ｉ）少なくとも１つの化合物を、
ｉｉ）ユビキチン、および
ｉｉｉ）タンパク質
と接触させて被験試料を生成させる段階であって、タンパク質がユビキネーション基質とＲＥＴペアの第１の部分とを含む段階；
ｂ）ユビキチン化のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料をユビキチンと結合する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＲＥＴペアの第２の部分で標識されている段階；
ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項２０】
以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物がユビキチン化活性のモジュレータであるか否かを判定する方法：
ａ）ｉ）少なくとも１つの化合物を、
ｉｉ）ユビキチン、
ｉｉｉ）タンパク質、および
ｉｖ）ユビキチン化酵素
と接触させて被験試料を生成させる段階であって、タンパク質がユビキネーション基質とＲＥＴペアの第１の部分とを含む段階；
ｂ）ユビキチン化のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料をユビキチンと結合する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＲＥＴペアの第２の部分で標識されている段階；
ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；
ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、ならびに
ｆ）蛍光発光を対照試料と比較する段階。
【請求項２１】
以下の段階を含む、少なくとも１つのユビキチン化酵素またはユビキチン化様の酵素のための少なくとも１つの基質を検出する方法：
ａ）ｉ）少なくとも１つのユビキチン化酵素またはユビキチン化様の酵素の少なくとも１つの基質を、
ｉｉ）基体上に固定されたポリペプチド、および
ｉｉｉ）検出可能部分を含む、少なくとも１つのユビキチンまたはユビキチン様のタンパク質
と接触させる段階；
ｂ）ユビキチン活性またはユビキチン化様の活性を可能にする条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
ｃ）基体上の任意のポリペプチドに結合した検出可能部分を検出する段階。
【請求項２２】
ａ）パッケージ材料；および
ｂ）少なくとも２集団のユビキチン
を含む、製品であって、
１集団のユビキチンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている、製品。
【請求項２３】
以下の段階を含む、化合物が翻訳後修飾のモジュレータであるか否かを判定する方法：
ａ）化合物と少なくとも１つの融合タンパク質を発現している細胞とを接触させて被験試料を生成させる段階であって、融合タンパク質が第１の標識および翻訳後修飾のための基質を含む段階；
ｂ）翻訳後修飾のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
ｃ）（ｂ）の前、間、または後に、翻訳後修飾の有無に基づいて、被験試料を少なくとも１つの融合タンパク質への弁別結合を示す結合パートナーと接触させる段階であって、結合パートナーが第２の標識を含み、第１および第２の標識が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）ペアである段階；および
ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
【請求項２４】
以下の段階を含む、ホスホジエステラーゼ活性を検出する方法：
ａ）ｉ）試料を、
ｉｉ）ホスホジエステラーゼの基質
と接触させて被験試料を生成させる段階であって、基質がＲＥＴペアの第１のメンバーを含む段階；
ｂ）ホスホジエステラーゼ活性に適切な条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料を、ホスホジエステラーゼの切断生成物の特異性を有する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＲＥＴペアの第２のメンバーを含み、切断生成物がＲＥＴペアの第１のメンバーを含む段階；
ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。