(57)【要約】  本発明は、核酸を精製するための方法に関する。特に、本発明は、一体化陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖二次構造からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための方法に関する。四重鎖形成を制御し、１本鎖オリゴヌクレオチドからのインタクトな四重鎖の分離を可能にする移動相パラメーターも記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造から前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させ；
移動相を前記一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ、前記移動相が、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、緩衝液、有機溶媒及び溶出塩を含み、前記溶出塩の濃度が経時的に上昇し；
前記一体化陰イオン交換マトリクスから溶出分画を回収し、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが１セットの溶出分画中で溶出され、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖が溶出分画の別のセット中で溶出され、それにより前記四重鎖から前記オリゴヌクレオチドが分離されること
を含む、方法。
【請求項２】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出分画のセットを単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記四重鎖を含む溶出分画のセットを単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記四重鎖を含む分画を変性条件に供し、それにより、精製された１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画を約４５℃〜約９５℃の温度に加熱することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画のｐＨを約９．５〜約１３のｐＨへと上昇させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画をカオトロピック剤に曝露することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、四級アミン、ポリエチレンイミン、ジエチルアミノメチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、エチレンジアミノ又はポリアリルアミンから選択される官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、少なくとも２００ｎｍの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、約５００ｎｍ〜約２，０００ｎｍの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、約８００ｎｍ〜約１，５００ｎｍの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン又はアセトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶出塩中の陽イオンが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリメチルアンモニウム又はトリエチルアンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶出塩中の陰イオンが塩素、臭素、硝酸、亜硝酸、ヨウ素、過塩素酸、酢酸又はギ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出塩が、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶出塩が臭化ナトリウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記移動相中の前記溶出塩の濃度上昇が、０Ｍから１Ｍの勾配である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記勾配が段階的勾配である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記勾配が直線的勾配である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記移動相が、約７．５〜約８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記移動相が、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、臭化ナトリウムの濃度が経時的に０Ｍから１Ｍの勾配で上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記移動相が、約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、臭化ナトリウムの濃度が経時的に０Ｍから１Ｍの段階的勾配で上昇する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記移動相が、約８ｍＬ／分〜約６０ｍＬ／分の流速で前記一体化陰イオン交換マトリクスに適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記移動相が、約１０ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分の流速で前記一体化陰イオン交換マトリクスに適用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、少なくとも４個の連続グアニン塩基の核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であり、前記アンチセンス鎖が、少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖であり、前記センス鎖が、少なくとも４個の連続グアニン塩基を有する標的遺伝子配列の領域と同一である核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−修飾ヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）又はそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが約１２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の不純物から四重鎖構造を形成可能なグアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製するための方法であって：
前記オリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させ；
移動相を前記一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ、前記移動相が、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、緩衝液、有機溶媒及び溶出塩を含み、前記溶出塩の濃度が経時的に上昇し；
前記一体化陰イオン交換マトリクスから溶出分画を回収し、１つ以上の不純物が溶出分画の最初のセット中で溶出され、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが溶出分画の第２のセット中で溶出され、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造が溶出分画の第３のセット中で溶出され、それにより前記不純物から前記オリゴヌクレオチドを分離することを含む、方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の不純物が１つ以上の失敗配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出分画の第２のセットを単離することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記四重鎖を含む溶出分画の第３のセットを単離することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記四重鎖を含む分画を変性条件に供し、それにより、精製された１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを生成させることをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画を約４５℃〜約９５℃の温度に加熱することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画のｐＨを約９．５〜約１３のｐＨに上昇させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記変性条件が、前記四重鎖を含む分画をカオトロピック剤に曝露することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、四級アミン、ポリエチレンイミン、ジエチルアミノメチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、エチレンジアミノ又はポリアリルアミンから選択される官能基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、少なくとも２００ｎｍの孔径を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、約５００ｎｍ〜約２，０００ｎｍの孔径を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記一体化陰イオン交換マトリクスが、約８００ｎｍ〜約１，５００ｎｍの孔径を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン又はアセトンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記溶出塩中の陽イオンが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリメチルアンモニウム又はトリエチルアンモニウムである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶出塩中の陰イオンが、塩素、臭素、硝酸、亜硝酸、ヨウ素、過塩素酸、酢酸又はギ酸である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記溶出塩が、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化アンモニウムである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５３】
前記溶出塩が臭化ナトリウムである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記移動相中の前記溶出塩の濃度の上昇が０Ｍから１Ｍの勾配である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
前記勾配が段階的勾配である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記勾配が直線的勾配である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記移動相が、約７．５〜約８．５のｐＨを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５８】
前記移動相が、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、臭化ナトリウムの濃度が経時的に０Ｍから１Ｍの勾配で上昇する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５９】
前記移動相が、約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、臭化ナトリウムの濃度が経時的に０Ｍから１Ｍの段階的勾配で上昇する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記移動相が、約８ｍＬ／分〜約６０ｍＬ／分の流速で前記一体化陰イオン交換マトリクスに適用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項６１】
前記移動相が、約１０ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分の流速で前記一体化陰イオン交換マトリクスに適用される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、少なくとも４個の連続グアニン塩基の核酸塩基配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６３】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６４】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であり、前記アンチセンス鎖が、少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６５】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのセンス鎖であり、前記センス鎖が、少なくとも４個の連続グアニン塩基を有する標的遺伝子配列の領域と同一である核酸塩基配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６６】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６７】
前記修飾ヌクレオチドが２’−修飾ヌクレオチドである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）又はそれらの組み合わせである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項７０】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが約１２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長である、請求項３６に記載の方法。
【請求項７１】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長である、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月１１日出願の米国仮特許出願第６２／７２９，８７８号明細書の利益を主張する。
【０００２】
電子提出されたテキストファイルの説明
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年９月６日に作成されたコンピュータ読み取り可能フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ−２２６５−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが５２７バイトである。
【０００３】
本発明は、核酸精製の技術分野に関する。特に、本発明は、一体化陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、オリゴヌクレオチドから形成される四重鎖二次構造からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための方法に関する。本方法により、失敗配列及び他の不純物からの、インタクトな四重鎖並びに１本鎖のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製が可能になる。
【背景技術】
【０００４】
グアニンリッチ核酸は、４本鎖の四重鎖二次構造を形成するために自己会合することが長く知られてきた。例えば、（非特許文献１）及び（非特許文献２）を参照。過去数年間で、四重鎖構造がインビボで存在し、ＤＮＡ複製、テロメア維持及び遺伝子発現などの様々な生理機能に関与し得るという証拠が増えてきている。（非特許文献２）を参照。四重鎖の構造をより詳細に理解するために、それらのフォールディング／アンフォールディング動態及び生理的過程におけるそれらの役割、インタクトな四重鎖構造の単離及び精製法が必要である。
【０００５】
合成核酸の精製のための一般的な実施は、一般的には、シリカ又はポリマー粒子に基づく固定相を用いた、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）又はイオン交換クロマトグラフィー技術の何れかを利用する。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製法について、５’−Ｏ−トリチル保護基は一般的に、合成中に合成オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基を保護するために使用され、次いで５’−Ｏ−トリチル保護基を持たないより短い失敗配列（「トリチルオフ」配列）から全長オリゴヌクレオチド（「トリチルオン」配列）を精製するために使用される。しかし、このような方法は、精製後のトリチル保護基を除去するためのさらなる段階を必要とし、このような段階は精製全体のコスト及び時間を増大させる。大規模ＲＰ−ＨＰＬＣ精製手順はまた、有機溶媒を大量に使用すること及び高圧を必要とすることに対処するための非常に特殊な装置を必要とすることにより、コストがかかり得る。
【０００６】
イオン交換クロマトグラフィーもまた、天然及び合成オリゴヌクレオチドの精製のために頻繁に使用されてきた。イオン交換クロマトグラフィーに対するスケールアップ精製は、ＲＰ−ＨＰＬＣ法よりも顕著に低コストであり、圧力の必要条件が著しく低い。オリゴヌクレオチドは、分析及び分取スケールの両方でイオン交換クロマトグラフィーを使用して首尾よく分離されてきた。しかし、四重鎖二次構造を形成し得るグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、陰イオン交換固定相上で高い保持率を示し得、一部の例ではそれらのサイズが嵩張ること及び電荷ゆえに、陰イオン交換固定相上への不可逆的結合を示し得、それにより、陰イオン交換クロマトグラフィーによるこれらのグアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製が困難又は不可能なものとなっている。
【０００７】
一般に、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製するためのアプローチの殆どは、高温、高ｐＨ緩衝液を使用するか又はカオトロピック剤又は有機修飾因子を導入することによって、四重鎖形成などの二次相互作用を破壊することを目指す。このような強く変性させる条件により１本鎖形成が促進される。次に、１本鎖を精製し得るが、次いで精製１本鎖から四重鎖を構築する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３４：５４０２−５４１５，２００６
【非特許文献２】Ｒｈｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４３：８６２７−８６３７，２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、インタクトな四重鎖二次構造から１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための、効率的で拡張可能な方法が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一部分において、グアニンリッチオリゴヌクレオチドからの四重鎖形成が陰イオン交換一体化クロマトグラフィー中に慎重に制御され得、それにより、インタクトな四重鎖からの１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分離が可能になるという発見に基づく。本方法はまた、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及びインタクトな四重鎖の両方を失敗配列及び他の不純物から分離することも可能にする。
【００１１】
従って、本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、溶液を一体化陰イオン交換マトリクスに接触させ；本明細書中に記載の移動相を一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ；一体化陰イオン交換マトリクスから溶出分画を回収すること含み、このグアニンリッチオリゴヌクレオチドが溶出分画の１セット中で溶出され、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖が、溶出分画の別のセット中で溶出され、それにより、オリゴヌクレオチドが四重鎖から分離される。
【００１２】
ある一定の実施形態では、本発明は、１つ以上の不純物から、四重鎖構造を形成可能なグアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製するための方法も提供する。一実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させ；本明細書中に記載の移動相を一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ；一体化陰イオン交換マトリクスから溶出分画を回収することを含み、１つ以上の不純物が溶出分画の第１のセット中で溶出され、グアニンリッチオリゴヌクレオチドが溶出分画の第２のセット中で溶出され、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造が溶出分画の第３のセット中で溶出され、それによりオリゴヌクレオチドが不純物から分離される。一部の実施形態では、１つ以上の不純物は１つ以上の失敗配列を含む。
【００１３】
本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスは一般に、正荷電官能基が共有結合される架橋ポリマー骨格から構成される。一部の実施形態では、架橋ポリマー骨格は、ポリ（グリシジルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）骨格又はポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）骨格である。一体化陰イオン交換マトリクスにおいて骨格に連結される正荷電官能基は、一級アミン、二級アミン、三級アミン又は四級アミンであり得る。ある一定の実施形態では、正荷電官能基は、四級アミン、ポリエチレンイミン、ジエチルアミノメチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、エチレンジアミノ又はポリアリルアミンから選択される。好ましくは、本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスは、少なくとも２００ｎｍの孔径を有する。一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、少なくとも５００ｎｍ、例えば約５００ｎｍ〜約２，０００ｎｍの孔径を有する。一実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約８００ｎｍ〜約１，５００ｎｍの孔径を有する。別の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約１，８００ｎｍ〜約２，２００ｎｍの孔径を有する。また別の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約１，３００ｎｍ〜約２，０００ｎｍの孔径を有する。
【００１４】
本発明の方法で使用される移動相は、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、緩衝液及び有機溶媒を含む。緩衝液は、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳなど、標的範囲にｐＨを維持可能である何れかの緩衝液であり得、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で存在し得る。一実施形態では、移動相は、緩衝液約２０ｍＭ〜約１００ｍＭを含む。移動相中で使用され得る適切な有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン又はアセトンが挙げられる。一部の実施形態では、有機溶媒は、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）又は約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の濃度で移動相中に存在し得る。
【００１５】
本発明の方法で使用される移動相は溶出塩も含み、溶出塩の濃度は分離の期間にわたり上昇する。溶出塩は、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、塩化物塩、臭化物塩、硝酸塩、亜硝酸塩、ヨウ化物塩、過塩素酸塩、酢酸塩又はギ酸塩であり得る。ある一定の実施形態では、溶出塩は、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化アンモニウムから選択される。分離中、移動相中の溶出塩の濃度の上昇は、溶出塩の濃度勾配、例えば０Ｍから２Ｍ又は０Ｍから１Ｍであり得る。濃度勾配は、直線的勾配又は段階的勾配であり得る。一実施形態では、移動相は、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、リン酸ナトリウム緩衝液、アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、臭化ナトリウムの濃度は、一連の分離にわたり、段階的に０Ｍから１Ｍの勾配で上昇する（例えば段階的勾配）。
【００１６】
ある一定の実施形態では、本方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出分画又は溶出分画のセット及び／又は四重鎖を含む溶出分画又は溶出分画のセットを単離することをさらに含む。単離溶出分画は、１つ以上のさらなる精製段階（例えば脱塩）、標的リガンドをオリゴヌクレオチドに共有結合させるための共役反応、オリゴヌクレオチドを相補鎖とハイブリッド形成させて２本鎖ＲＮＡ干渉剤を形成させるためのアニーリング反応及び治療目的での患者への投与のためにオリゴヌクレオチドの医薬組成物を調製するための処方段階など、１つ以上のさらなる処理段階に供され得る。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明の方法は、四重鎖を含む溶出分画又は溶出分画のセットを単離すること及びこの分画を変性条件に供することをさらに含む。単離四重鎖は、主に１本鎖オリゴヌクレオチドから構成され、失敗配列及び他の不純物を顕著に捕捉しない。従って、四重鎖を変性させることにより、１本鎖のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの高度精製調製物を得ることができる。一実施形態では、変性条件は、水素結合の相互作用を破壊するのに十分な高温に、例えば約４５℃〜約９５℃の温度に、四重鎖を含む分画を加熱することを含む。別の実施形態では、変性条件は、強アルカリ性である条件に、例えばｐＨ約９．５〜約１３に、四重鎖を含む分画のｐＨを上昇させることを含む。また別の実施形態では、変性条件は、四重鎖を含む分画をカオトロピック剤、例えば尿素に曝露することを含む。四重鎖を変性させることから得られる溶液中でのグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８５％であり得る。一部の実施形態では、四重鎖を変性させることから得られる溶液中でのグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８８％である。他の実施形態では、四重鎖を変性させることから得られる溶液中でのグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも９０％である。
【００１８】
本発明の方法に従い精製され得るグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド、例えばゲノムＤＮＡの断片（例えばテロメア領域又はプロモーター領域）又はメッセンジャーＲＮＡの断片（例えば非翻訳領域）であり得るか、又はそれらは合成オリゴヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、疾患又は障害と関連がある遺伝子又はＲＮＡ分子を標的とするために設計される治療用オリゴヌクレオチドである。このような治療用オリゴヌクレオチドとしては、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、前駆ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えばアンタゴミル及びａｎｔｉｍｉＲ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ模倣物が挙げられる。一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であり、このアンチセンス鎖は、少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子配列の領域に相補的な核酸塩基配列を含む。本発明の方法に従い精製され得るグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’−修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム；トレースＡ）又はポリマービーズに基づく陰イオン交換樹脂（ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム；トレースＢ）を使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、臭化ナトリウムの漸増勾配による溶出で、１０ｍＬ／分の流速で陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬ）上又は８ｍＬ／分の流速でポリマービーズに基づく陰イオン交換樹脂（ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ）を充填したカラム上の何れかで、オリゴヌクレオチドを含む溶液を分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。
【図２】図２は、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）を使用した、様々な充填量での、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。１０ｍｇ（４００μＬ）、３０ｍｇ（１２００μＬ）、４０ｍｇ（１６００μＬ）又は５０ｍｇ（２０００μＬ）でカラム上にオリゴヌクレオチドを載せ、臭化ナトリウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して１０ｍＬ／分の流速で分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。
【図３】図３は、図２で示されるクロマトグラムからの１本鎖及び四重鎖についてのピーク面積に対して陰イオン交換一体化カラム上のグアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの注入充填量を比較する線グラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）及び移動相中の溶出塩の異なる陽イオンを使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。カラム上に３０ｍｇ（１２００μＬ）でオリゴヌクレオチドを載せ、臭化ナトリウム、臭化アンモニウム又は臭化カリウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、１０ｍＬ／分の流速で分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。１本鎖オリゴヌクレオチドは約１７．５分でカラムから溶出し、一方で四重鎖は約２８分でカラムから溶出する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）及び移動相中の溶出塩における異なる陰イオンを使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。カラム上に３０ｍｇ（１２００μＬ）でオリゴヌクレオチドを載せ、臭化ナトリウム又は塩化ナトリウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、１０ｍＬ／分の流速で分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。
【図５Ａ】図５Ａは、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）を使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。カラム上に３０ｍｇ（１２００μＬ）でオリゴヌクレオチドを載せ、臭化アンモニウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、１０ｍＬ／分の流速で分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。分画回収のための閾値を５００ｍＡＵに設定した。１本鎖オリゴヌクレオチドに対応するピークを含有する分画２５（Ｆ２５）及び四重鎖に対応するピークを含有する分画５０（Ｆ５０）をネイティブ質量分析により分析した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａで示される分取クロマトグラフィー精製からの分画２５のネイティブ質量分析である。分画２５中の主要な種は、１本鎖オリゴヌクレオチドに対する予想分子量である約７ｋＤａの分子量に対応するピークである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａで示される分取クロマトグラフィー精製からの分画５０のネイティブ質量分析である。約２８ｋＤａの分子量に対応する２個の主要なピークが観察されるが、これはグアニンリッチオリゴヌクレオチドの４本鎖から構成されるインタクトな四重鎖に対する予想分子量である。
【図６】図６は、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）を使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの２４回の分離からの分取クロマトグラムを重ねたものを示す。カラム上に３０ｍｇ（１２００μＬ）でオリゴヌクレオチドを載せ、臭化ナトリウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、１０ｍＬ／分の流速で分離した。検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。１本鎖オリゴヌクレオチドは約１７．５分でカラムから溶出し、一方で四重鎖は約２８分でカラムから溶出した。保持時間の相対標準偏差（ＲＳＤ）は１％未満である。
【図７Ａ】図７Ａは、陰イオン交換一体化カラム（ＣＩＭ−ＱＡ−８ｍＬカラム）を使用した、グアニンリッチ２１−マーオリゴヌクレオチドの分離の分取クロマトグラムを示す。カラム上に３０ｍｇ（１２００μＬ）でオリゴヌクレオチドを載せ、臭化ナトリウムの漸増勾配による溶出で、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）移動相、ｐＨ８．５を使用して、１０ｍＬ／分の流速で分離した。純度を調べるために、ネイティブ質量分析によって、四重鎖に対応するピーク（ボックスにより示される）を含有する分画を分析した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａで示される分取クロマトグラフィー精製からの四重鎖分画のネイティブ質量分析である。約２８ｋＤａの分子量に対応する２個の主要ピークが観察され、これは、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの４本鎖から構成されるインタクトな四重鎖に対する予想分子量である。他のピークがないことは、四重鎖分画が純粋であることを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、分取陰イオン交換一体化クロマトグラフィーからの回収分画のイオン対形成逆相液体クロマトグラムである。四重鎖ピークを含む回収分画を合わせ、脱塩し、アセトニトリル勾配による溶出で、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、５０ｍＭヘキサフルオロ−２−プロパノール移動相を使用して、イオン対形成逆相液体クロマトグラフィーにより分析した。２６０ｎｍ吸収での検出。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａで示されるイオン対形成逆相液体クロマトグラムからの単一主要ピークの質量分析である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドのトリチル−オン精製からの試料のイオン対形成逆相液体クロマトグラムであり、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製調製物の代表である。アセトニトリル勾配による溶出で、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、５０ｍＭヘキサフルオロ−２−プロパノール移動相を使用して、イオン対形成逆相液体クロマトグラフィーによって試料を分析した。２６０ｎｍ吸収での検出。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ｃで示されるイオン対形成逆相液体クロマトグラムからの単一ピークの質量分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、四重鎖二次構造を形成する傾向を有するグアニンリッチオリゴヌクレオチドに対する分取精製法に関する。本発明は、部分的には、クロマトグラフィー操作条件を調整することにより、陰イオン交換一体化クロマトグラフィー中にグアニンリッチオリゴヌクレオチドからの四重鎖二次構造の形成が慎重に制御され得、それにより１本鎖オリゴヌクレオチドとインタクトな四重鎖二次構造との間の分割が可能になるという発見に基づく。
【００２１】
発明者らは、驚くべきことに、クロマトグラフィー分離中に四重鎖の形成をよりゆっくりと誘導することにより、１本鎖オリゴヌクレオチド並びに失敗配列及び他の不純物から四重鎖が分離され得ることを発見した。閉じ込め効果（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ）は四重鎖構造の急速な形成及び安定化に寄与し得ることが文献で報告されている（Ｓｈｒｅｓｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．１２：５８２−５８８，２０１７）。理論により縛られるものではないが、発明者らは、一体化固定相の大きな孔径により閉じ込め効果が低下し、それにより四重鎖の形成を遅らせると考える。一体化固定相での分離中の移動相の組成を調整することによって、得られる四重鎖構造が主にグアニンリッチオリゴヌクレオチドから構成され、失敗配列又は他の不純物を捕捉しないように、四重鎖形成が慎重に制御され得る。インタクトな四重鎖は、単離され得、任意選択により、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの高度に純粋な調製物を得るために変性され得る。従って、本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造及び１つ以上の不純物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための方法を提供し、この方法は、次のことを含む：オリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させ；移動相を一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ、移動相が約７．０〜約９．０のｐＨを有し、緩衝液、有機溶媒及び溶出塩を含み、移動相中の溶出塩の濃度が経時的に上昇し；一体化陰イオン交換マトリクスから溶出分画を回収し、１つ以上の不純物が溶出分画の第１のセット中で溶出され、グアニンリッチオリゴヌクレオチドが溶出分画の第２のセット中で溶出され、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造が溶出分画の第３セットの中で溶出される。本発明の方法は、分取スケール上のインタクトな四重鎖構造及び１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製を提供し、本方法は、高度精製１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び四重鎖の市販スケールの量を作製するために容易に大規模化し得る。
【００２２】
本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個以上の連続グアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを含むオリゴヌクレオチドである。他の塩基により分離されるこのような配列モチーフを含有するオリゴヌクレオチド（Ｇ−トラクトとも呼ばれる）は、自然にフォールディングして四重鎖（Ｇ−四重鎖又は四重体とも呼ばれる）二次構造になることが観察されている。例えば、Ｂｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３４：５４０２−５４１５，２００６及びＲｈｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４３：８６２７−８６３７，２０１５を参照。四重鎖は、フーグスティーン水素結合により安定化される環状配置への４個のグアニン塩基の会合から形成される平面状Ｇ−カルテットから組み立てられる４本鎖のヘリックス構造である。Ｇ−カルテットは、４本鎖のヘリックス四重鎖構造を形成させるために互いの上に重なり得る。Ｂｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６及びＲｈｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｓ，２０１５を参照。オリゴヌクレオチド中に存在するＧ−トラクト（即ち３個以上の連続グアニン塩基の配列モチーフ）の数に依存して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子内又は分子間フォールディングから四重鎖が形成され得る。例えば、４個以上のＧ−トラクトを含む単一のオリゴヌクレオチドの分子内フォールディングから四重鎖が形成され得る。或いは、少なくとも２個のＧ−トラクトを含む２個のオリゴヌクレオチド又は少なくとも１個のＧ−トラクトを含む４個のオリゴヌクレオチドの分子間フォールディングから四重鎖が形成され得る。Ｂｕｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６及びＲｈｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｓ，２０１５を参照。
【００２３】
ある一定の実施形態では、本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個の連続グアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを有する。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、４個の連続グアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを有する。また他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個の連続グアニン塩基の単一の配列モチーフを有する。さらに他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、４個の連続グアニン塩基の単一配列モチーフを有する。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、少なくとも４個の連続グアニン塩基の配列を有する。本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖を形成するコンセンサス配列、例えばテロメアで見出されるもの又はある一定のプロモーター領域で見られるものなどを含有し得る。例えば、一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドはＴＴＡＧＧＧの配列モチーフを含み得る。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧＣＣの配列モチーフを含み得る。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、（ＧｐＮｑ）ｎの配列モチーフを含み得、ここでＧはグアニン塩基であり、Ｎは何れかの核酸塩基であり、ｐは少なくとも３であり、ｑは１〜７であり、ｎは１〜４である。ある一定の実施形態では、ｐは３又は４である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、数ヌクレオチド長〜数百ヌクレオチド長、例えば約１０ヌクレオチド長〜約３００ヌクレオチド長、約１２ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長〜約２５０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長〜約８０ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長又は約１８ヌクレオチド長〜約２６ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６ヌクレオチド長である。一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約１９ヌクレオチド長である。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２１ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２３ヌクレオチド長である。
【００２５】
グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、細胞又は生物から単離される天然のオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ由来又はゲノムＤＮＡの断片、特にテロメア又はプロモーター領域、であり得るか、又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来又はｍＲＮＡの断片、特に５’若しくは３’非翻訳領域であり得る。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、化学合成法又はインビトロ酵素法により作製される合成オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、前駆ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えばアンタゴミル及びａｎｔｉｍｉＲ）又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＲＮＡ分子又はＲＮＡ干渉剤、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ模倣物の構成成分鎖の１つであり得る
【００２６】
ある一定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、疾患又は障害に関連する遺伝子又はＲＮＡ分子を標的とするように設計された治療用オリゴヌクレオチドである。例えば、一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、少なくとも３又は少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、ある一定の条件下で第２の配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して２本鎖領域を形成し得る場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。「ハイブリッド形成する」又は「ハイブリッド形成」は、典型的には２個のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基間の水素結合（例えばワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した、相補的ポリヌクレオチドの対形成を指す。第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、第２の配列を含むオリゴヌクレオチドと、ミスマッチなく、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。
【００２７】
別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの２本鎖ＲＮＡ干渉剤のアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖は、少なくとも３又は少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域に相補的な配列を含む。また別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの２本鎖ＲＮＡ干渉剤のセンス鎖であり、このセンス鎖は、少なくとも３又は少なくとも４個の連続グアニン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域と同一である配列を含む。標的配列（例えば標的ｍＲＮＡ）に相補的な配列を有する領域を含む、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの２本鎖ＲＮＡ干渉剤の鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれる。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と相補的な領域を含む鎖を指す。
【００２８】
本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はリン酸基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。このような修飾ヌクレオチドとしては、２’糖修飾があるヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエチル、２’−フルオロなど）、脱塩基ヌクレオチド、逆ヌクレオチド（３’−３’連結ヌクレオチド）、ホスホロチオエート連結ヌクレオチド、二環式糖修飾があるヌクレオチド（例えばＬＮＡ、ＥＮＡ）及び塩基類似体（例えばユニバーサル塩基、５−メチルシトシン、シュードウラシルなど）を含むヌクレオチドが挙げられ得るが限定されない。
【００２９】
ある一定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾は、ペントース環の２’及び／又は５’位における修飾並びに二環式糖修飾を含み得る。２’−修飾ヌクレオチドは、Ｈ又はＯＨ以外の置換基が２’位にあるペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’−修飾としては、２’−Ｏ−アルキル（例えばＯ−Ｃ１−Ｃ１０又はＯ−Ｃ１−Ｃ１０置換アルキル）、２’−Ｏ−アリル（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル（ＯＣＨ３）、２’−Ｏ−メトキシエチル（Ｏ−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’−ＯＣＦ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−アミノ（例えばＮＨ２）、２’−Ｏ−エチルアミン及び２’−アジドが挙げられるが限定されない。ペントース環の５’位における修飾としては、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、５’−ビニル及び５’−メトキシが挙げられるが限定されない。「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２個の原子を接続して、二環性糖構造をもたらす第２の環を形成する。一部の実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’と２’炭素との間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書中で二環式核酸又はＢＮＡと呼ぶ。代表的な二環式糖修飾としては、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも呼ばれる）；エチレンエオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（コンストレインド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル又はｃＥｔとも呼ぶ）；メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ；メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；メチル炭素環（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンエオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（コンストレインドＭＯＥ又はｃＭＯＥとも呼ばれる）が挙げられるが限定されない。グアニンリッチオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、全てそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７−９５４，２０１２に記載されている。
【００３０】
一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）又はそれらの組み合わせを含む。ある一定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含む。
【００３１】
本発明の方法に従い精製され得るグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書中で使用する場合、「修飾されたヌクレオチド間結合」という用語は、天然の３’〜５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’−アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’〜５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、従って、修飾されたヌクレオシド間結合と呼ばれ得る。このようなリン非含有結合としては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホン酸及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成させるためのペプチドに基づく結合（例えばアミノエチルグリシン）である。グアニンリッチオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る他の適切な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、全てそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７−９５４，２０１２に記載されている。
【００３２】
ある一定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合の全てがホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３’末端、５’末端又は３’及び５’末端の両方で１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、ある一定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３’末端で約１〜約６個又はそれを超える（例えば約１、２、３、４、５、６個又はそれを超える）連続ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、５’末端で約１〜約６個又はそれを超える（例えば約１、２、３、４、５、６個又はそれを超える）連続ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【００３３】
本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の技術を使用して、例えば従来からの核酸固相合成を使用して容易に作製され得る。オリゴヌクレオチドは、標準ヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えばホスホラミダイト）を利用する適切な核酸合成装置上で構築され得る。自動核酸合成装置は、いくつかの業者により市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）からのＭｅｒＭａｄｅ合成装置及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からのＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。２’シリル保護基をリボヌクレオシドの５’位で酸不安定性のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と一緒に使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成し得る。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。合成は全て、大規模、中規模又は小規模で何らかの自動又は手動合成装置において行われ得る。合成は、複数のウェルプレート、カラム又はスライドガラスにおいても実行され得る。２’−Ｏ−シリル基は、フッ素イオンへの曝露を介して除去され得、フッ素イオンは、フッ素イオンの何らかの供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ素イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム、又は有機対イオンと対になるフッ素イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウム、を含み得る。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用され得る。好ましいフッ素イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミノヒドロフルオリド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミドにおいてトリエチルアミンと水性ＨＦを組み合わせる）である。所望の化合物を与えるために、様々な合成段階を代替的な順番又は順序で実施し得る。オリゴヌクレオチドの合成において有用な他の合成化学変換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのため）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で公知であり、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。
【００３４】
当業者によって理解され得るように、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを合成するさらなる方法は、当業者にとって明らかであろう。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５７：１８２１−１８３２，２０１８に記載の方法などで、インビトロ系で酵素を使用して合成され得る。天然のオリゴヌクレオチドは、従来の方法を使用して細胞又は生物から単離され得る。オリゴヌクレオチドのカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ  ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むいくつかの供給業者から利用可能である。
【００３５】
本発明の方法は、溶液中で１つ以上の不純物からグアニンリッチオリゴヌクレオチド又は四重鎖構造を精製又は分離するために使用され得る。「精製する」又は「精製」は、標的分子（例えばグアニンリッチオリゴヌクレオチド又は四重鎖）とは異なり、最終組成物又は調製物から望ましくは排除される物質の量を減少させる工程を指す。「不純物」という用語は、標的分子とは異なる構造を有する物質を指し、この用語は、単一の不要な物質又はいくつかの不要な物質の組み合わせを含み得る。不純物は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するための方法で使用される材料又は試薬並びこのオリゴヌクレオチドの断片又は他の不要な誘導体若しくは形態を含み得る。ある一定の実施形態では、不純物は、標的のグアニンリッチオリゴヌクレオチドより長さが短い１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。これら及び他の実施形態では、不純物は１つ以上の失敗配列を含む。失敗配列は、標的オリゴヌクレオチドの合成中に生じ得、オリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単量体の段階的付加中のカップリング反応の失敗から生じ得る。オリゴヌクレオチド合成反応の生成物は、標的オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドよりも長さが短い様々な失敗配列（即ち標的オリゴヌクレオチドの短縮型）を含む様々な長さのオリゴヌクレオチドの不均一な混合物であることが多い。一部の実施形態では、不純物は、１つ以上の工程に関連する不純物を含む。グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するための合成方法に依存して、このような工程関連不純物としては、ヌクレオチド単量体、保護基、塩、酵素及び内毒素が挙げられ得るが限定されない。
【００３６】
グアニンリッチオリゴヌクレオチドが精製され得る溶液は、オリゴヌクレオチド及び、存在することが望ましくない１つ以上の不純物又は混入物を含有する何らかの溶液であり得る。グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液は、オリゴヌクレオチドを作製するための合成方法の結果生じる混合物を含み得る。例えば、一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液は、自動化合成装置から得られる合成反応混合物などのオリゴヌクレオチドを作製するための化学合成法由来の反応混合物である。このような実施形態では、溶液は失敗配列も含み得る。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液は、インビトロでの酵素による合成反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））からの混合物である。また別の実施形態では、例えばグアニンリッチオリゴヌクレオチドが細胞又は生物から単離される天然のオリゴヌクレオチドである場合、グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液は、細胞溶解液又は生体試料である。さらに別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液は、クロマトグラフィー分離からの溶出液など、別の精製操作からの溶液又は混合物である。
【００３７】
一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製しようとする溶液は、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇのグアニンリッチオリゴヌクレオチド、約１０ｍｇ〜約３０ｍｇのグアニンリッチオリゴヌクレオチド又は約３０ｍｇのグアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む。これらの充填量は、８ｍＬのベッド体積の一体化カラムに適切である。当業者により公知のように、ベッド体積がより大きい一体化カラムに対して比例的に充填量をスケールアップし得る。例えば、ベッド体積が１０倍大きい一体化カラムに対するグアニンリッチオリゴヌクレオチドの充填量は、本明細書中に記載の範囲よりも１０倍大きいものであり得る。単なる例として、ベッド体積が８０ｍＬの一体化カラムに対するグアニンリッチオリゴヌクレオチドの適切な充填量は約１００ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。
【００３８】
本発明の方法は、精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させることを必要とする。一体化陰イオン交換マトリクスは、正荷電官能基を含む融合した小球の単一の連続構造から構成される多孔性材料を指す。一体化材料は一般に、様々な化学官能基が共有結合され得る骨格を構成する架橋無機又は有機ポリマーから構成される。ある一定の実施形態では、本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスは、正荷電官能基が共有結合される架橋有機ポリマー、例えばポリ（グリシジルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）を含む。一体化陰イオン交換マトリクスの骨格を生成させるための適切な有機ポリマーとしては、ポリ（グリシジルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）、ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）、ポリ（グリシジルメタクリラート−コ−トリメチロールプロパントリメタクリラート）、ポリ（クロロメチルスチレン−コ−ジビニルベンゼン）、ポリ（ブチルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）、ポリ（ｐ−メチルスチレン−コ−１，２−（４−ビニルフェニル）エタン）及びポリ（ラウリルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）が挙げられるが限定されない。一体化陰イオン交換マトリクスの架橋ポリマー骨格を生成させるために使用され得る代表的な単量体及び架橋剤並びに重合方法は、例えばＳｖｅｃ，Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２７：７４７−７６６，２００４及びＳｖｅｃ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，Ｖｏｌ．１２１７：９０２−９２４，２０１０に記載のものなど、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスは、ポリ（グリシジルメタクリラート−コ−エチレンジメタクリラート）骨格を含む。別の実施形態では、本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスはポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）骨格を含む。
【００３９】
好ましくは、一体化陰イオン交換マトリクスの孔径は少なくとも約２００ｎｍである。例えば、一体化陰イオン交換マトリクスの孔径は、約２００ｎｍ〜約１０，０００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約８，０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約５，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ〜約６，０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約２，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ〜約３，０００ｎｍ、約１，５００ｎｍ〜約４，０００ｎｍ、約８００ｎｍ〜約１，５００ｎｍ、約１，８００ｎｍ〜約２，２００ｎｍ、約１，３００ｎｍ〜約２，０００ｎｍ又は約６００ｎｍ〜約１，０００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスの孔径は少なくとも５００ｎｍである。ある一定の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは約５００ｎｍ〜約２，０００ｎｍの孔径を有する。他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約８００ｎｍ〜約１，５００ｎｍの孔径を有する。また他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約１，８００ｎｍ〜約２，２００ｎｍの孔径を有する。特定の一実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約１，３００ｎｍの孔径を有する。別の特定の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは、約２，０００ｎｍの孔径を有する。一体化支持体の孔径は、ポロジェニック（ｐｏｒｏｇｅｎｉｃ）溶媒の選択及び濃度並びに重合条件によって重合工程中に制御され得る。例えばＳｖｅｃ，Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２７：７４７−７６６，２００４及びＳｖｅｃ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，Ｖｏｌ．１２１７：９０２−９２４，２０１０及びそこで引用される参考文献を参照。
【００４０】
本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスは一般に、一体化マトリクスへの、オリゴヌクレオチドなどの負荷電分子の結合を可能にするために、正荷電官能基を含む。正荷電官能基は一級アミン、二級アミン、三級アミン又は四級アミンであり得る。一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス中の正荷電官能基は、四級アミンなど、強陰イオン交換基である。強陰イオン交換基は、ｐＨの変化でイオン交換能の変動を示さず、２〜１３のｐＨ値で完全に荷電する。他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス中の正荷電官能基は、弱陰イオン交換基、例えばジエチルアミノエチル及びジメチルアミノプロピルなどである。弱陰イオン交換基は、限られたｐＨ範囲（例えばｐＨ３〜９）でのみイオン化される。一体化陰イオン交換マトリクスは、四級アミン、ポリエチレンイミン、ジエチルアミノメチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、エチレンジアミノ又はポリアリルアミンから選択される正荷電官能基を含み得る。一実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスは四級アミン基を含む。別の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスはジエチルアミノエチル基を含む。一体化のポリマー骨格に正荷電官能基を共有結合させる方法は当技術分野で公知であり、ポリマー骨格を生成させるための単量体単位との反応又はその官能化を含み得る。例えば、Ｓｖｅｃ，Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２７：７４７−７６６，２００４及びＳｖｅｃ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，Ｖｏｌ．１２１７：９０２−９２４，２０１０を参照。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ及びＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥカラムを含め、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから入手可能なカラムのＣｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ）ラインなど、本発明の方法での使用に適切な一体化陰イオン交換マトリクスは市販もされている。
【００４１】
グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不純物を含む溶液を一体化陰イオン交換マトリクスと接触させたら、マトリクスを通じて溶液の構成成分を運ぶために移動相を一体化陰イオン交換マトリクスに通過させ、それにより構成成分が、マトリクス中に存在する正荷電官能基と様々な度合いで相互作用することが可能になる。本明細書中の実施例２に記載のように、四重鎖構造の形成を慎重に制御し、失敗配列など、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び不純物からのその分離を可能にするために分離中の移動相の組成を最適化した。
【００４２】
本発明の方法で使用される移動相は一般に約７．０〜約９．０のｐＨの緩衝溶液である。一部の実施形態では、移動相のｐＨは約７．５〜約８．５である。他の実施形態では、移動相のｐＨは約８．０〜約８．５である。ある一定の他の実施形態では、移動相のｐＨは約８．３〜約８．７である。特定の一実施形態では、移動相のｐＨは約８．５である。あらゆる緩衝液を使用し得るが、ただし、緩衝液は、標的ｐＨ範囲で溶液のｐＨを維持可能であるものとする。本発明の方法における移動相の構成成分として使用し得る、このｐＨ範囲で緩衝する適切な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、Ｔｒｉｓ塩酸、リン酸塩、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、トリシン（Ｎ−Ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］メチルグリシン）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ビス−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メタン）及びＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）が挙げられるが限定されない。ある一定の実施形態では、移動相は、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳから選択される緩衝液を含む。緩衝液は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、移動相は、リン酸ナトリウム緩衝液を例えば約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で含む。他の実施形態では、移動相は、ＨＥＰＥＳ緩衝液を例えば約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で含む。ある一定の他の実施形態では、移動相は、Ｔｒｉｓ緩衝液を例えば約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で含む。さらに他の実施形態では、移動相は、ＭＯＰＳ緩衝液を例えば約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で含む。
【００４３】
ある一定の実施形態では、移動相は有機溶媒を含む。移動相中に含まれ得る代表的な有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン及びアセトンが挙げられるが限定されない。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、アセトニトリル又はテトラヒドロフランである。一実施形態では、有機溶媒はアセトニトリルである。別の実施形態では、有機溶媒はメタノールである。分離しようとする分子の性質に依存して、約０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で移動相中に有機溶媒が存在し得る。例えば、より疎水性であるオリゴヌクレオチドを精製するために、及び一体化陰イオン交換マトリクスからそれらが放出されることを確実にするために、有機溶媒のより高濃度が使用され得る。移動相中の有機溶媒の濃度は、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）〜約３５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５５％（ｖ／ｖ）〜約７５％（ｖ／ｖ）、約７０％（ｖ／ｖ）〜約１００％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）〜約２５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）又は約８％（ｖ／ｖ）〜約１２％（ｖ／ｖ）であり得る。一実施形態では、有機溶媒が約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で移動相中に存在する。別の実施形態では、有機溶媒が約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で移動相中に存在する。また別の実施形態では、有機溶媒が約２０％（ｖ／ｖ）の濃度で移動相中に存在する。ある一定の実施形態では、移動相中の有機溶媒の濃度は、分離全体を通じて一定のままである。
【００４４】
一部の実施形態では、移動相は溶出塩を含み、その濃度は分離の時間にわたり上昇する。溶出塩は、酸及び塩基の中和反応から生じるイオン性化合物を指す。塩は、通常、塩の全体的な正味電荷がゼロであるように同数の陽イオン及び陰イオンから構成される。本明細書中の実施例２の実験結果により示されるように、溶出塩の選択は、四重鎖構造の形成及び１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び不純物から四重鎖を効率的に分離する能力を調整し得る。溶出塩中の適切な陽イオンとしては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リチウム、カルシウム及びマグネシウムが挙げられるが限定されない。ある一定の実施形態では、溶出塩中の陽イオンは、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリメチルアンモニウム及びトリエチルアンモニウムから選択され得る。一部の実施形態では、溶出塩中の陽イオンはナトリウム、カリウム又はアンモニウムである。一実施形態では、溶出塩中の陽イオンはナトリウムである。別の実施形態では、溶出塩中の陽イオンはカリウムである。溶出塩中の適切な陰イオンとしては、塩素、臭素、硝酸、亜硝酸、ヨウ素、過塩素酸、酢酸、ギ酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸及び炭酸が挙げられるが限定されない。溶出塩中の陰イオンは、一部の実施形態では、塩素、臭素、硝酸、亜硝酸、ヨウ素、過塩素酸、酢酸及びギ酸から選択され得る。特定の一実施形態では、溶出塩中の陰イオンは塩素である。別の特定の実施形態では、溶出塩中の陰イオンは臭素である。移動相中に含まれ得る代表的な溶出塩としては、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、酢酸カリウム、過塩素酸カリウム、ヨウ化カリウム、ギ酸カリウム、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化トリメチルアンモニウム、臭化トリメチルアンモニウム、酢酸トリメチルアンモニウム、塩化トリエチルアンモニウム、臭化トリエチルアンモニウム及び酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが限定されない。ある一定の実施形態では、移動相は、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化アンモニウムから選択される溶出塩を含む。一実施形態では、移動相中の溶出塩は臭化ナトリウムである。別の実施形態では、移動相中の溶出塩は臭化カリウムである。別の実施形態では、移動相中の溶出塩は臭化アンモニウムである。
【００４５】
分離中、オリゴヌクレオチド／四重鎖と一体化陰イオン交換マトリクスとの間の静電相互作用を破壊するために、移動相中の溶出塩の濃度を上昇させる。移動相中の溶出塩の濃度の上昇は、溶出塩の濃度勾配、例えば０Ｍ〜約２Ｍ、０Ｍ〜約１Ｍ、０Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約１Ｍ又は約０．５Ｍ〜約２Ｍであり得る。一部の実施形態では、勾配は、移動相中の溶出塩の濃度が経時的に直線的に変化する直線的勾配である。他の実施形態では、勾配は、経時的に別々の段階で移動相中の溶出塩の濃度が変化する段階的勾配であり、溶出塩濃度は各段階で一定である。異なる時間に異なる溶出塩濃度で異なるパーセンテージの２つの緩衝液を混合することによって、溶出塩の直線的及び段階的勾配の両方が作製され得る。例として、勾配を生成させるために、溶出塩を含有しない緩衝液Ａが溶出塩１Ｍを含む緩衝液Ｂと混合され得る。時間の関数として緩衝液Ａとの混合物中の緩衝液Ｂのパーセンテージを上昇させることにより、０Ｍから１Ｍの溶出塩の直線的濃度勾配の生成が可能になる。同様に、分離中の特定の時点での特定のパーセンテージの緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂの混合によって、段階的勾配を生成させ得る。一実施形態では、移動相中の溶出塩の濃度の上昇は、０Ｍから１Ｍの直線的勾配である。別の実施形態では、移動相中の溶出塩の濃度の上昇は、０Ｍから１Ｍの段階的勾配である。一連の分離にわたり移動相中の溶出塩の濃度を変化させるための代表的な段階的勾配は、次の表に記載するが、緩衝液Ａは溶出塩を全く含有せず（即ち０Ｍ）、緩衝液Ｂは１Ｍ溶出塩を含有する：
【００４６】
【表１】
2022500025.tif 000003
【００４７】
一連の分離にわたる移動相中の溶出塩の濃度を上昇させるための、他の可能な勾配及び勾配を生成させるための方法は、当業者にとって公知である。
【００４８】
本発明の方法の一部の実施形態では、移動相は約７．０〜約９．０のｐＨを有し、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）有機溶媒及び溶出塩を含み、溶出塩の濃度は経時的に０Ｍから約２Ｍの勾配で上昇する。他の実施形態では、移動相は約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）有機溶媒及び溶出塩を含み、溶出塩の濃度は経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。これらの移動相組成の何れかに対して、緩衝液はリン酸ナトリウム又はＴｒｉｓ塩酸であり得、有機溶媒はアセトニトリル又はメタノールであり得、溶出塩は臭化ナトリウム、臭化カリウム又は臭化アンモニウムであり得る。例えば、ある一定の実施形態では、移動相は約７．０〜約９．０のｐＨを有し、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は経時的に０Ｍから約２Ｍの勾配で上昇する。一部の実施形態では、移動相は約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。他の実施形態では、移動相は、約８．０〜約８．５のｐＨを有し、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約８％（ｖ／ｖ）〜約１２％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。一実施形態では、移動相は、約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で段階的に上昇する（即ち段階的勾配）。
【００４９】
本方法のある一定の実施形態では、移動相は、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約２Ｍの勾配で上昇する。一部の実施形態では、移動相は、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）メタノール及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。他の実施形態では、移動相は、約８．０〜約８．５のｐＨを有し、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、約８％（ｖ／ｖ）〜約１２％（ｖ／ｖ）メタノール及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。また他の実施形態では、移動相は、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約２Ｍの勾配で上昇する。さらに他の実施形態では、移動相は、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）メタノール及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。ある一定の他の実施形態では、移動相は、約７．０〜約９．０のｐＨを有し、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約２Ｍの勾配で上昇する。さらに他の実施形態では、移動相は、約７．５〜約８．５のｐＨを有し、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル及び臭化ナトリウムを含み、移動相中の臭化ナトリウムの濃度は、経時的に０Ｍから約１Ｍの勾配で上昇する。上記の移動相緩衝液の何れかにおいて、臭化ナトリウムの代わりに溶出塩として臭化カリウム又は臭化アンモニウムを使用し得る。
【００５０】
粒子に基づく固定相に対して、一体化固定相は、分離効率を損ねることなく高い流速に適応し得、それにより分離時間がより速くなる。従って、カラムの孔径及びサイズに依存して、５０ｍＬ／分以上の流速で一体化陰イオン交換マトリクスに移動相が適用され得る。一般的には、一体化マトリクスを通じて移動相を駆動させるために必要とされる圧力を最小化することが所望される。孔径が小さいほど、一体化マトリクスを通じて移動相を駆動するために必要とされる圧力が大きくなり、それによって流速がより遅くなる。逆に、より大きい孔径は、許容可能なレベルで圧力を維持しながら、より速い流速の使用を可能にする。一部の実施形態では、本発明の方法で使用される一体化陰イオン交換マトリクスの孔径は少なくとも５００ｎｍであり、それにより少なくとも５０ｍＬ／分以上の流速が可能になる。より大きい孔径（例えば１，０００超）を有する一体化陰イオン交換マトリクスに対して、移動相は、さらにより高い流速で、例えば少なくとも３００ｍＬ／分以上の流速で適用され得る。従って、移動相が一体化陰イオン交換マトリクスに適用され得る適切な流速としては、約５ｍＬ／分〜約５００ｍＬ／分、約８ｍＬ／分〜約１００ｍＬ／分、約４０ｍＬ／分〜約４００ｍＬ／分、約１００ｍＬ／分〜約３００ｍＬ／分、約８ｍＬ／分〜約６０ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分又は約８ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分が挙げられるが限定されない。ある一定の実施形態では、移動相は、約８ｍＬ／分〜約６０ｍＬ／分の流速で一体化陰イオン交換マトリクスに適用される。他の実施形態では、移動相は、約１０ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分の流速で一体化陰イオン交換マトリクスに適用される。さらに他の実施形態では、移動相は、約８ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分の流速で一体化陰イオン交換マトリクスに適用される。一実施形態では、移動相は、約１０ｍＬ／分の流速で一体化陰イオン交換マトリクスに適用される。当業者は、許容可能な圧力レベルを維持するために、一体化陰イオン交換マトリクスの孔径及びカラムのベッド体積に依存して、移動相に対して他の適切な流速を決定し得る。
【００５１】
グアニンリッチオリゴヌクレオチド、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造及び１つ以上の不純物を含む溶液が、本明細書中に記載の移動相とともに一体化陰イオン交換マトリクスを移動するので、溶出分画が回収される。ＵＶ吸収、例えば２６０ｎｍを使用して、分画中のオリゴヌクレオチド内容物を監視し得る。図面（例えば図１Ａ、５Ａ〜Ｃ及び６）におけるクロマトグラムにより示されるように、一体化陰イオン交換クロマトグラフィーが本発明の方法に従い操作される場合、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖の前に一体化陰イオン交換マトリクスから溶出し、従って、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドに対する及び四重鎖に対する分画の個別のセットの回収が可能になる。実施例２に記載のように、及び図５Ａ〜Ｃ及び図８Ａ〜Ｂで示されるように、１本鎖オリゴヌクレオチドを含有する分画のセット及び四重鎖を含有する分画のセットは、それぞれ１本鎖オリゴヌクレオチド及び四重鎖について濃縮され、失敗配列などの不純物の顕著な量を含有しない。１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び四重鎖に対する分画の濃縮を検証するために、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、イオン対形成逆相液体クロマトグラフィー−質量分析、分析的イオン交換クロマトグラフィー及び／又はネイティブ質量分析によって溶出分画からの試料を分析し得る。
【００５２】
一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は周囲温度で行われ得る。例えば、一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、約１５℃〜約２５℃の温度で行われる。他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、約１８℃〜約２２℃の温度で行われる。また他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、約２０℃〜約２５℃の温度で行われる。ある一定の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、３５℃を上回る温度で行われない。本発明の方法中に四重鎖二次構造の形成が誘導され、慎重に制御されるので、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、二次構造の形成を変性させないか又はそれと不適合ではない温度で行われるべきである。従って、一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクス上での分離は、３５℃未満の温度で行われる。
【００５３】
本発明の方法のある一定の実施形態では、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出分画又は溶出分画のセットが単離され、任意選択によりさらなる処理のためにプールされ得る。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含有する溶出分画は、１つ以上のさらなる精製段階、例えばアフィニティー分離（例えば配列特異的な試薬を用いた核酸ハイブリッド形成）、さらなるイオン交換クロマトグラフィー段階（例えば異なる固定相を使用）、逆相クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えば脱塩カラムによる）に対する対象であり得る。これら及び他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含有する溶出分画は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの構造を修飾するための他の反応に対する対象であり得る。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドが治療用分子（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）又は治療用分子の構成成分（例えば２本鎖ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ）である実施形態では、溶出分画中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、標的リガンド、例えば炭水化物含有リガンド、コレステロール、抗体などをオリゴヌクレオチドに共有結合させるための共役反応に対する対象であり得る。他の実施形態では、溶出分画中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、エキソソーム、リポソーム又は他のタイプの脂質ナノ粒子中にカプセル封入し得るか、又は治療目的での患者への投与のための薬学的に許容可能な賦形剤とともに医薬組成物中で処方し得る。グアニンリッチオリゴヌクレオチドが２本鎖ＲＮＡ干渉剤（例えばｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れか）の構成成分である実施形態では、溶出分画中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、グアニンリッチオリゴヌクレオチドをその相補鎖とハイブリッド形成させて、２本鎖ＲＮＡ干渉剤を形成させるためのアニーリング反応に対する対象であり得る。
【００５４】
本発明の方法の一部の実施形態では、四重鎖を含む溶出分画又は溶出分画のセットが単離され得、任意選択によりさらなる処理のためにプールされ得る。四重鎖は、様々な系で四重鎖構造の機能を試験及び評価するための続くアッセイ又は分析においてインタクトな構造として使用され得る。或いは、四重鎖を含有する溶出分画は、四重鎖をその構成成分の１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドに分解するための変性条件に対する対象であり得る。図８Ａ〜８Ｂで示されるように、四重鎖は、主に１本鎖オリゴヌクレオチドから構成され、失敗配列及び他の不純物を顕著には捕捉しない。従って、四重鎖を変性させることにより、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの高度精製調製物を得ることができる。従って、ある一定の実施形態では、四重鎖を含む溶出分画又は溶出分画のセットは変性条件に対する対象である。変性条件は、温度上昇、ｐＨ上昇、カオトロピック剤への曝露、有機剤への曝露又はこれらの条件の何れかの組み合わせによる四重鎖二次構造の変性を含み得る。
【００５５】
一部の実施形態では、Ｇ−カルテットを形成させるグアニン塩基間の水素結合相互作用を破壊するのに十分な高温に四重鎖を含有する溶出分画を加熱することによって、四重鎖を変性させる。例えば、約４５℃〜約９５℃、約５５℃〜約８５℃又は約６５℃〜約７５℃の温度に溶出分画を加熱し得る。四重鎖が変性され得る温度は、構成成分オリゴヌクレオチドの配列及び化学修飾に基づいて調整され得る。より高いＧＣ含量又はある特定の修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドは、より高い融解温度を有し、従って、このようなオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖構造は、四重鎖を変性させるためのより高い温度を必要とし得る。他の実施形態では、四重鎖は、四重鎖を含む溶出分画のｐＨを強アルカリ条件に上昇させることにより変性させる。例えば溶出分画のｐＨは、約９．５〜約１３、約１０〜約１２又は約９．５〜約１１．５のｐＨに上昇させ得る。ある一定の実施形態では、四重鎖は、四重鎖を含有する溶出分画をカオトロピック剤に曝露することによって変性される。「カオトロピック剤」は、水素結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用などの非共有結合力が介在する分子内相互作用に影響を及ぼすことにより、水分子間の水素結合ネットワークを破壊し、高分子の構造において秩序を低下させ得る物質である。四重鎖を変性させるために使用され得る適切なカオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム及び他のグアニジニウム塩、酢酸リチウム又は過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、チオ尿素及びチオシアン酸塩（例えばチオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム又はチオシアン酸カリウム）が挙げられるが限定されない。一実施形態では、四重鎖を変性させるために、例えば約１Ｍ〜約８Ｍの濃度の尿素に四重鎖を含む溶出分画を曝露する。当技術分野で公知である水素結合相互作用を破壊する何らかの他の物質及び方法は、四重鎖を変性させて精製１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するために使用され得る。
【００５６】
四重鎖を含む溶出分画又は溶出分画のセットが、精製又は濃縮１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するための変性条件に対する対象である実施形態では、濃縮された１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む得られた溶液は、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む一体化陰イオン交換マトリクスからの溶出分画に対する上記のさらなる処理段階の何れかなど、さらなる処理段階に対する対象であり得る。例えば、四重鎖の変性から得られた濃縮された１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶液は、例えば変性段階で使用される物質（例えばカオトロピック剤）又は他の工程関連不純物（例えば塩）を除去するための１つ以上の精製段階に対する対象となり得る。これら及び他の実施形態では、四重鎖の変性から得られた濃縮１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶液は、他の反応、例えば標的リガンドをグアニンリッチオリゴヌクレオチドに共有結合させるための共役反応又はグアニンリッチオリゴヌクレオチドをその相補鎖に対してハイブリッド形成させて２本鎖ＲＮＡ干渉剤（例えばｓｉＲＮＡ分子）を生成させるためのアニーリング反応など、に対する対象となり得る。一部の実施形態では、四重鎖の変性から得られる濃縮された１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、エキソソーム、リポソーム又は他のタイプの脂質ナノ粒子中にカプセル封入され得るか、又は治療目的での患者への投与のための薬学的に許容可能な賦形剤とともに医薬組成物中で処方され得る。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明の方法は、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドに対して漸進的に濃縮することを繰り返し行い得る。例えば、本発明の方法の第１回目からの１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出分画を一体化陰イオン交換マトリクスに再適用し、本発明の方法に従い再び分離し得る。本方法の第２回目及び続く回の間、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは再び四重鎖構造を形成するが、これは精製１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを得るために単離され、変性され得る。所望のレベルの純度の調製物が得られるまで、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶液を本発明の方法において繰り返し処理し得る。
【００５８】
本発明の方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの実質的に純粋な調製物を提供する。例えば、一部の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスからの溶出分画中又は、単離され、続いて変性された四重鎖構造を含む溶液中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。ある一定の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスからの溶出分画中又は四重鎖の変性から得られた溶液中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８５％である。他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスからの溶出分画中又は四重鎖の変性から得られた溶液中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８８％である。さらに他の実施形態では、一体化陰イオン交換マトリクスからの溶出分画中又は四重鎖の変性から得られた溶液中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも９０％である。オリゴヌクレオチドを検出し、定量する方法は、当業者にとって公知であり、イオン対形成逆相液体クロマトグラフィー質量分析法及び分析的イオン交換法、例えば実施例に記載のものなど、を含み得る。
【００５９】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１．イオン交換一体化クロマトグラフィーを使用したグアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製
イオン交換クロマトグラフィーは、天然及び合成オリゴヌクレオチドを精製するための一般的技術である。陰イオン交換カラム、例えばＳｏｕｒｃｅ  Ｑ１５又はＱ３０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００ＲＳ及びＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  １００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などは、分析的及び分取スケールの両方でオリゴヌクレオチドを効率的に分離するために使用されてきた。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｔｅ，１−１０；ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ，Ｖｏｌ．８８３−８８４：７６−９４，２０１２；Ｎｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．２１：３８３−３９３，２０１１；及びＴｈａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ，Ｖｏｌ．８７８：９３３−９４１，２０１０を参照。しかし、四重鎖二次構造を形成可能であるグアニンリッチモチーフを含有するオリゴヌクレオチドの精製はこのようなカラムでは困難であるか又は達成不能であり得る。この実施例は、四重鎖構造及び不純物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離するための、陰イオン交換一体化クロマトグラフィーの評価を記載する。
【００６１】
最初に、従来のポリマービーズに基づく陰イオン交換樹脂を使用した２１−マーのグアニンリッチオリゴヌクレオチドの精製を、陰イオン交換一体化カラムを使用する同じオリゴヌクレオチドの精製と比較した。オリゴヌクレオチド（５’−ＵＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧＣＵＧ−３’（配列番号１））は２’−Ｏ−メチル−及び２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含有し、ホスホラミダイト化学を使用して固体支持体上で合成された。オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端の２個のヌクレオチド間結合はホスホロチオエートヌクレオチド間結合であり、一方で全ての他のヌクレオチド間結合はホスホジエステルヌクレオチド間結合であった。
【００６２】
ポリマービーズに基づく強陰イオン交換樹脂（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を充填したカラム又は強陰イオン交換基を含む一体化カラム（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ）−ＱＡ  ８ｍＬ，ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）の何れかにおいて、オリゴヌクレオチドを含む溶液を分離した。２つのタイプのカラムの仕様を以下の表１で挙げる。
【００６３】
【表２】
2022500025.tif 000004
【００６４】
オリゴヌクレオチドを含有する１．２ｍＬの溶液を各カラム載せ、塩勾配を使用して分離し、この塩勾配は、次のように緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５）及び緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５）を混合することにより生成させた。ＴＳＫｇｅｌ−ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムの場合、８ｍＬ／分の流速でカラムに緩衝液を適用し、勾配条件は次のとおりであった：０〜３分に０〜２０％緩衝液Ｂ、３〜４３分に２０〜６５％緩衝液Ｂ、４３〜４５分に６５〜８０％緩衝液Ｂ、８０％Ｂで２分保持及び４８分に０％緩衝液Ｂ。ＣＩＭ−ＱＡカラムの場合、１０ｍＬ／分の流速でカラムに緩衝液を適用し、勾配条件は次のとおりであった：０〜１５分に０〜５５％緩衝液Ｂ、１５〜２５分に５５％緩衝液Ｂ、２５〜３０分に５５〜１００％緩衝液Ｂ；３０〜３２分に１００％緩衝液Ｂ；及び３２．１〜３７分に０％緩衝液Ｂ。両カラムとも、分離は周囲温度で行った。分画を回収し、分析的イオン交換（ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００  ＲＳカラム、４．６×５０ｍｍ、４μｍ粒径）又はイオン対形成逆相（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム、２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒径）高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）法を使用して、２１−マーのオリゴヌクレオチド又は四重鎖構造についてアッセイした。２つのカラムそれぞれに対する分離の結果を図１で示す。
【００６５】
ポリマービーズに基づくクロマトグラフィー材料（ＴＳＫｇｅｌ−ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム）は、一体化クロマトグラフィー材料（ＣＩＭ−ＱＡカラム）と比較した場合、孔径が１０分の１である結果として、１０倍高い動的結合容量を有する（表１）。従って、ＴＳＫｇｅｌカラムは、２１−マーの１本鎖オリゴヌクレオチド並びに四重鎖に対して全体的なより高い保持率を示すと予測された。ＴＳＫｇｅｌカラムを用いて、主要ピークが約３８分に観察され、１本鎖オリゴヌクレオチドと四重鎖との間で別個の分離は観察されなかった（図１で点線のボックス、Ｂトレース）。さらに、回収した分画全てが、１本鎖オリゴヌクレオチド及び四重鎖に対して６１〜７４％の範囲の純度を有した。対照的に、ＣＩＭ−ＱＡカラムによって、四重鎖からの１本鎖オリゴヌクレオチドの分離が可能になった（図１、Ａトレース）。より速い流速、一体化のより小さな全体的表面積及び１３００ｎｍの実質的により大きい孔径の結果として、四重鎖の完全な溶出はＣＩＭ−ＱＡカラム上で３０分で起こった（図１、Ａトレース）。
【００６６】
ＴＳＫｇｅｌカラム上で１本鎖と四重鎖との間の分離がないことは、カラムの表面積が大きく、孔径が比較的小さいことに起因し得る。２１−マーの１本鎖オリゴリボヌクレオチドのサイズは７ｎｍの範囲であり（Ｖａｌｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，Ｖｏｌ．５６８：４５９−４６８，２００５）、一方でＴＳＫｇｅｌカラムの孔径は１００ｎｍである。結果として、１本鎖及び四重鎖は両方とも、ＴＳＫｇｅｌカラムの固定相のポリメタクリラート粒子の孔に浸透可能である。
【００６７】
最近、Ｓｈｒｅｓｔｈａ及び共同研究者らは、閉じ込め効果が、グアニンに基づく四重鎖の迅速な安定化に寄与し、その形成を促進し得ることを報告した（Ｓｈｒｅｓｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．１２：５８２−５８８，２０１７）。著者らは、ＤＮＡオリガミナノケージ内部の四重鎖形成が、希釈溶液中よりも実質的に安定であり、フォールディングが２桁、より速いことを明らかにし、ケージのサイズが小さくなるほど、Ｇ−四重鎖の機械的及び熱力学的安定性が上昇した（Ｓｈｒｅｓｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。類似して、理論により縛られるものではないが、発明者らは、クロマトグラフィー固定相の孔が、ナノケージとして機能し、同様の閉じ込め効果を誘導して、Ｇ−四重鎖のフォールディング及び安定化を促進すると考える。従って、四重鎖フォールディングは、何らかの分離が達成され得る前に不純物及び失敗配列を捕捉する閉鎖された１００ｎｍ孔内でＴＳＫ−ｇｅｌカラム上で顕著に速く起こるはずであり、これは実際には図１のＢトレースで示されるようなケースであると思われる。対照的に、一体化カラムのより大きい孔径は、閉じ込め効果を低下させ、四重鎖組み立てを遅延させ、不純物／失敗配列及び１本鎖からのその分離を促進する。図１のＡトレースで示される結果は、一体化カラム上で１本鎖から四重鎖が効率的に分離されることが可能であるので、この仮説を裏付ける。
【００６８】
次に、一体化カラムが１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを四重鎖から分離する能力及び処理量を決定するために、様々な量のオリゴヌクレオチドをカラム上に載せた。具体的に、１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲の量で一体化カラム上にオリゴヌクレオチドを載せ、ＣＩＭ−ＱＡカラムに対する上記の条件を使用して分離を遂行した。分画を回収し、１本鎖オリゴヌクレオチド及び四重鎖に対する分画の純度を確認するために、分析的イオン交換（ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ２００  ＲＳカラム、４．６×５０ｍｍ、４μｍ粒径；２ｍＬ／分の流速；温度７０℃）及びイオン対形成逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム、２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒径；０．４ｍＬ／分の流速；温度６０℃）法を使用して分析した。
【００６９】
分離の分取クロマトグラムを図２で示す。この結果は、最大充填量が最良の収率及び純度をもたらさないことを示す。実際に、４０ｍｇ及び５０ｍｇのより大きい充填量で、四重鎖の純度が低下した。１０ｍｇ及び３０ｍｇの充填量で四重鎖の同等な純度を生じさせたが、後者の充填量により処理が促進された。従って、四重鎖の最良純度及び本方法の処理を達成するための最適充填量は３０ｍｇであった。注入量の増加は、四重鎖のピーク面積に与える影響が最小限であったが、代わりに１本鎖形成に顕著な影響があった（図３）。この結果は、一体化面が約４０〜５０ｍｇの充填量の四重鎖に対して飽和することを示し、５０ｍｇ充填量で、１本鎖が主要な種になり、過剰な投入の明らかな指標を示す。
【００７０】
この実施例に記載される実験の結果は、孔径が大きい陰イオン交換一体化カラムを使用して、短いグアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される４本鎖の四重鎖構造が１本鎖オリゴヌクレオチド並びに不純物から効率的に分離され得ることを示す。一体化カラムの大きい孔径（約１．３μｍ）及び一体化カラムのユニークな面は、四重鎖が相互作用し得る適切な接近可能な面を提供し、それにより１本鎖オリゴヌクレオチドからの分離が可能になり、一方で全体の分析時間が短くなる。一体化支持体は、従来のポリマービーズに基づく樹脂よりも、１本鎖オリゴヌクレオチドと四重鎖との間で良好な分割をもたらし、その結果、四重鎖の全体的純度がより高くなる。一体化支持体上での閉じ込め効果の低下は、１本鎖と四重鎖との間のより良好な分離を促進する、よりゆっくりとした四重鎖形成を誘導した。次に、四重鎖構造は、さらなる実験のために単離され得るか、又は精製１本鎖オリゴヌクレオチドを得るためにさらに変性され得る。
【００７１】
実施例２．四重鎖形成を調整するための移動相パラメーターの最適化
四重鎖の保持、分割及び選択性に影響を与える因子を試験するために、様々な移動相パラメーターを調べた。最初に、移動相中で使用される陽イオンのタイプの効果を評価した。以前の研究で、様々な陽イオンが四重鎖安定化及びフォールディングに影響を与えることが報告された。例えばＭｅｒｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３３：８１−９４，２００５；Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５３（６３０６）：ａａｆ５３７１，２０１６；Ｋｌｅｊｅｖｓｋａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），Ｖｏｌ．５２：１２４５４−１２４５７，２０１６；Ｏｌｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３４：２７８−２８４，１９９５；及びＹｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ，Ｖｏｌ．３０：１１２１−１１４２，２０１１を参照。緩衝液Ｂ中の溶出塩中で対陽イオンとしてアンモニウム、ナトリウム及びカリウムを評価した。具体的には、移動相緩衝液は次のとおりであった：
・緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５
・緩衝液Ｂ１：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５
・緩衝液Ｂ２：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮＨ４Ｂｒ、ｐＨ８．５
・緩衝液Ｂ３：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＫＢｒ、ｐＨ８．５
【００７２】
２１−マーのグアニンリッチオリゴヌクレオチド（配列番号１）を含有する溶液１．２ｍＬをＣＩＭ−ＱＡ  ８ｍＬ陰イオン交換一体化カラム上に載せ、次のように緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ１、Ｂ２又はＢ３を混合することにより生成させた塩勾配を使用して１０ｍＬ／分の流速で周囲温度にて分離した：
【００７３】
【表３】
2022500025.tif 000005
【００７４】
図４Ａは、異なる対陽イオンとともに異なるＢ緩衝液を使用した、分離のための分取クロマトグラムを示す。対陽イオンとしてのカリウムの使用は四重鎖安定化に都合がよいものの、対陽イオンとしてカリウムを使用して精製した場合、四重鎖が失敗配列を捕捉する傾向があるので、これにより四重鎖の最大純度はもたらされない。対陽イオンとしてアンモニウムを使用すると、四重鎖形成量は最低となり、一方で対陽イオンとしてナトリウムを使用すると、四重鎖の回収率並びに純度が最大となる。従って、最適な対陽イオンとしてナトリウムを選択した。
【００７５】
これらの陰イオンはイオン交換条件下で負荷電オリゴヌクレオチドの保持及び選択性を支配するので、溶出塩中の異なる対陰イオンも評価した。緩衝液Ｂ中の溶出塩中で対陰イオンとして臭素及び塩素を評価した。この実験のための移動相緩衝液は次のとおりであった：
・緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５
・緩衝液Ｂ１：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５
・緩衝液Ｂ２：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５
【００７６】
２１−マーのグアニンリッチオリゴヌクレオチド（配列番号１）を含有する溶液１．２ｍＬをＣＩＭ−ＱＡ  ８ｍＬ陰イオン交換一体化カラム上に載せ、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ１又はＢ２を混合することにより生成される塩勾配を使用して、対陽イオンに対してすぐ上の表で記載される同じ勾配パラメーターに従い、１０ｍＬ／分の流速で周囲温度にて分離した。図４Ｂは、この実験からの、結果として得られる分取クロマトグラムを示す。移動相中に塩素が存在すると、四重鎖に対する保持時間がより長くなり、１本鎖オリゴヌクレオチドと四重鎖との分離がより乏しくなった。対照的に、移動相中に臭素が存在すると、より短い全体的分析時間で、１本鎖オリゴヌクレオチド及び四重鎖のほぼベースラインの分離が起こった。
【００７７】
高ｐＨ値は、二次的相互作用を破壊し、従って結果として四重鎖形成を減少させる可能性があることが知られている。従って、緩衝液ｐＨも調べた。移動相緩衝液のｐＨ（緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ）をｐＨ７．５又はｐＨ８．５の何れかに調整した。この２つの異なる移動相条件の結果、ｐＨの相違にもかかわらず、ほぼ同一であるクロマトグラムが得られた（データを示さない）。
【００７８】
異なる移動相パラメーターを評価する一連の実験に基づき、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを四重鎖から分離するための最適条件が次のとおりであることが決定された：
・カラム：ＣＩＭ−ＱＡ  ８ｍＬ陰イオン交換一体化カラム
・流速：１０ｍＬ／分
・温度：周囲温度
・注入体積：１２００μＬ
・移動相：
〇緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５
〇緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５
・段階的勾配条件：
【００７９】
【表４】
2022500025.tif 000006
【００８０】
分画の回収のための閾値を３００ｍＡＵに設定した。イオン対形成逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ法（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム、２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒径；０．４ｍＬ／分の流速；温度６０℃）を使用して、分画の純度を確認した。四重鎖について回収した分画は、８８〜９３％の範囲の純度を示した。
【００８１】
異なる分画中での１本鎖オリゴヌクレオチド及び四重鎖の存在を確認するために、陰イオン交換一体化カラムでの分取精製後、関連のある分画上でネイティブ質量分析（ＭＳ）実験を行った。２１−マーのグアニンリッチオリゴヌクレオチド（配列番号１）を含有する溶液１．２ｍＬをＣＩＭ−ＱＡ  ８ｍＬ陰イオン交換一体化カラム上に載せ、周囲温度にて１０ｍＬ／分の流速で塩勾配を使用して分離し、この塩勾配は、次のように緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５）及び緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮＨ４Ｂｒ、ｐＨ８．５）の混合によって生成させた：０〜１５分に０〜５５％緩衝液Ｂ、１５〜２５分に５５％緩衝液Ｂ；２５〜３０分に５５〜１００％緩衝液Ｂ；３０〜３２分に１００％緩衝液Ｂ；及び３２．１〜３７分に０％緩衝液Ｂ。分画回収に対する閾値を５００ｍＡＵに設定した。分画をサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム；２６×１００ｍｍ、９０μｍ粒径）によって脱塩し、ネイティブＭＳ分析に供した。ネイティブＭＳ分析のために、試料に対して、Ｐ６スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ，７３２−６２２１）を用いて２００ｍＭ酢酸アンモニウムへと緩衝液交換を行い、ｎＥＳＩ金コーティングガラス針（長尺薄壁、Ｍ９５６２３２ＡＤ１−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて試料を質量分析計内に導入した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ１  Ｑ−ＴｏＦ機器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、正及び負イオン化モードの両方でネイティブＭＳ実験を実施した。基本的な機器電圧及び圧力は以下のとおりであった：試料コーン５０Ｖ、Ｔｒａｐ  ＣＥ  ２０Ｖ、Ｔｒａｐ  Ｇａｓ  Ｘｅ、１．０ｅ−２ｍＢａｒ。
【００８２】
図５Ａは、分取精製からの得られたクロマトグラムを示し、図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ分画２５及び分画５０に対するネイティブ質量分析を示す（分取クロマトグラムにおいてボックスにより示される）。図５Ｂの質量分析から明らかなように、より早い分画２５は７，０２１Ｄａ（＋／−１Ｄａ）の分子量の１本鎖オリゴヌクレオチドを主に含有する。低レベルの付加物が多い四重鎖シグナルも分画２５で検出された。分画５０は、２８，１１８Ｄａ（＋／−８Ｄａ）の分子量を有する四重鎖を含有する（図５Ｃ）。インタクトな四重鎖は、この分画で検出された主要な種であった。これらの結果から、一体化マトリクスを使用した陰イオン交換クロマトグラフィー法によって、１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び四重鎖構造を効率的に精製し得ることが明らかになる。
【００８３】
精製方法の可変性を評価するために、最適な移動相条件下でグアニンリッチオリゴヌクレオチドを用いて、本方法を個別に２４回行った。具体的には、２１−マーのグアニンリッチオリゴヌクレオチド（配列番号１）を含有する溶液１．２ｍＬをＣＩＭ−ＱＡ８ｍＬ陰イオン交換一体化カラムに載せ、周囲温度にて１０ｍＬ／分の流速で塩勾配を使用して分離し、この塩勾配は次のように緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．５）及び緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５）を混合することにより作製した：０〜１５分に０〜５５％緩衝液Ｂ、１５〜２５分に５５％緩衝液Ｂ；２５〜３０分に５５〜１００％緩衝液Ｂ；３０〜３２分に１００％緩衝液Ｂ；及び３２．１〜３７分に０％緩衝液Ｂ。図６で示されるように、本方法は、１％未満の保持時間の相対標準偏差（ＲＳＤ）で、優れた実行間の再現性を生じさせる。これらの移動相条件下で、四重鎖が１本鎖オリゴヌクレオチドから効率的に分離される（図７Ａ）。２８，１４６Ｄａ（＋／−１７Ｄａ）の分子量に対応する特性で、ネイティブＭＳによって四重鎖の同一性を確認した（図７Ｂ）。四重鎖は検出された主要な種であり、このことから、本方法が精製インタクト四重鎖を生成させ得ることが示される（図７Ｂ）。ネイティブＭＳに対する条件は、ＳＦ６がＸｅの代わりに衝突ガスとして使用されたことを除き、上記のものと同じであった。
【００８４】
単回の分取精製からの四重鎖ピークを含有する３つの分画を合わせ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム；２６×１００ｍｍ、９０μｍ粒径）により脱塩した。分画中の１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度を決定するために、分析的イオン対形成逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ法（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８カラム、２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ粒径；０．４ｍＬ／分の流速；温度６０℃）によって、合わせた分画を分析し、その結果、四重鎖の変性が起こっていた。図８Ａで示されるように、合わせた分画中の１本鎖オリゴヌクレオチドの純度は９２％であった。小さな先頭ピークは不純物であった。質量分析が図８Ｂで示され、これは１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドに対して予想されるイオン化パターンを示し、このことから、四重鎖が主に１本鎖オリゴヌクレオチドから構成され、失敗配列及び他の不純物を顕著には捕捉しないことが示唆される。
【００８５】
比較目的のために、トリチル−オン精製法を使用して１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製し、上記の分析的イオン対形成逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ法によって分析した。水中０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐＨ９．０移動相を使用してＫｉｎｅｔｅｘ  ＥＶＯ  Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、５μｍ）でトリチル−オン精製を行い、アセトニトリル勾配で溶出した。トリチル−オン精製は、９３％を超える純度で１本鎖オリゴヌクレオチドをもたらす。トリチル−オン精製した１本鎖オリゴヌクレオチドに対するイオン対形成逆相液体クロマトグラムを図８Ｃで示し、質量分析を図８Ｄで示す。図８Ａで示される四重鎖に対するクロマトグラムは、図８Ｃで示される１本鎖オリゴヌクレオチドに対するクロマトグラムとほぼ同一であり、これにより、分析的イオン対形成逆相ＨＰＬＣの変性条件下で、四重鎖がその構成成分の１本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドに分解され、不純物が殆どないか又は全く存在しないことが明らかになる。図８Ｂで示される変性四重鎖試料に対する質量分析は、四重鎖が主に１本鎖オリゴヌクレオチドから構成され、不純物を捕捉しないことを示す図８Ｄで示される１本鎖オリゴヌクレオチドに対する質量分析と同様である。
【００８６】
一体化陰イオン交換分取法の結果、２００ｍｇを超える精製四重鎖が得られた。この方法は、より大きい体積の一体化カラム、例えばＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから利用可能なＣＩＭ−ＱＡ−８０ｍＬ及びＣＩＭ−ＱＡ−８００ｍＬカラムを使用することにより、容易にスケールアップし得る。
【００８７】
この実施例及び実施例１に記載の分析的クロマトグラフィー法及び脱塩方法に対するパラメーターのまとめを以下に挙げる：
【００８８】
分析的イオン交換法
・カラム：ＤＮＡ  Ｐａｃ  ＰＡ  ２００  ＲＳ（４．６×５０ｍｍ、４μｍ）
・流速：２ｍＬ／分
・温度：７０℃
・移動相：
〇緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
〇緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０％アセトニトリル、１Ｍ  ＮａＢｒ、ｐＨ８．５
・勾配精製条件：
【００８９】
【表５】
2022500025.tif 000007
【００９０】
・検出：２６０ｎｍでダイオードアレイ検出器
【００９１】
分析的イオン対形成逆相液体クロマトグラフィー−質量分析方法
・カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＯＳＴ  Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、２．５μｍ）
・流速：０．４ｍＬ／分
・温度：６０℃
・移動相：
〇緩衝液Ａ：水中、１５．７ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、５０ｍＭヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）
〇緩衝液Ｂ：水：アセトニトリル（５０：５０）中、１５．７ｍＭ  ＤＩＥＡ、５０ｍＭ  ＨＦＩＰ
・勾配精製条件：
【００９２】
【表６】
2022500025.tif 000008
【００９３】
・検出：２６０ｎｍでダイオードアレイ検出器、続いて質量分析
【００９４】
脱塩（サイズ排除クロマトグラフィー）
・カラム：ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（２６×１００ｍｍ、９０μｍ）
・移動相：８０：２０  水：エタノール
・流速＝１０ｍＬ／分
【００９５】
本明細書において論じ、引用してきた全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコール及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【００９６】
当業者は、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか、又は確認可能であろう。このような同等物は、続く特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2022500025.tif 000009
【図２】
2022500025.tif 000010
【図３】
2022500025.tif 000011
【図４Ａ】
2022500025.tif 000012
【図４Ｂ】
2022500025.tif 000013
【図５Ａ】
2022500025.tif 000014
【図５Ｂ】
2022500025.tif 000015
【図５Ｃ】
2022500025.tif 000016
【図６】
2022500025.tif 000017
【図７Ａ】
2022500025.tif 000018
【図７Ｂ】
2022500025.tif 000019
【図８Ａ】
2022500025.tif 000020
【図８Ｂ】
2022500025.tif 000021
【図８Ｃ】
2022500025.tif 000022
【図８Ｄ】
2022500025.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月11日(2021.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2022500025.tif 000024
【図２】
2022500025.tif 000025
【図３】
2022500025.tif 000026
【図４Ａ】
2022500025.tif 000027
【図４Ｂ】
2022500025.tif 000028
【図５Ａ】
2022500025.tif 000029
【図５Ｂ】
2022500025.tif 000030
【図５Ｃ】
2022500025.tif 000031
【図６】
2022500025.tif 000032
【図７Ａ】
2022500025.tif 000033
【図７Ｂ】
2022500025.tif 000034
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【国際調査報告】
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