(57)【要約】  本開示は、原薬中のＨＣＰの含有量が１０．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、原薬または医薬品中のＬＰＡの含有量が１．０ｎｇ／ｍｇ未満である、血友病を処置するための抗ＴＦＰＩ抗体を含む医薬の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物に関する。本開示によれば、ＨＣＰおよびＬＰＡの非常に少ない含有量を有する高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、抗ＴＦＰＩ抗体ポリマー生成を最小化することができる分離／精製プロセスを提供することにより提供されてもよく、抗体誘導血友病患者の処置および血液凝固疾患の予防に効果的に使用されてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原薬または医薬品中のＨＣＰの含有量が１０．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、原薬または医薬品中のＬＰＡの含有量が１．０ｎｇ／ｍｇ未満である、血友病を処置するための抗ＴＦＰＩ抗体を含む医薬の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項２】
ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量が５ｎｇ／ｍｇ以下である、請求項１に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項３】
以下：
抗ＴＦＰＩ抗体を含有する培養物を清澄化するプロセス；
アフィニティークロマトグラフィープロセス；
ウイルス不活化プロセス；
限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセス；
混合モードクロマトグラフィープロセス；
ナノ濾過プロセス；および
最終濃縮プロセス
を通して産生される、請求項１または２に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項４】
混合モードクロマトグラフィープロセスが、異なるタイプのカラム樹脂を使用して２つ以上の複数の混合モードクロマトグラフィープロセスを実施することにより抗ＴＦＰＩ抗体のポリマーの９８％以上を除去することを含む、請求項３に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項５】
アフィニティークロマトグラフィープロセスが、以下の工程：アフィニティークロマトグラフィーカラムを通過した溶出液をｐＨ４．０から６．０の範囲で中和すること；および
中和溶出液を放置して、室温（１５から２５℃）で８から１６時間静置すること
を含む、請求項３に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項６】
濃縮プロセスが、すすぎ溶液循環／回収プロセスを含む、請求項３に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項７】
原薬中の抗ＴＦＰＩ抗体ポリマーの含有量が５％未満である、請求項１に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項８】
原薬が３．２６ｎｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０値を有する、請求項１に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項９】
組成物が、精製プロセスに供される原薬中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量が、清澄化された培養物中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量より少なくとも５０，０００倍低い高純度を有する、請求項１に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【請求項１０】
原薬の相対的効力値が、１００％モノマーのものと比較して８５％以上である、請求項１に記載の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、血友病を処置するための高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ＴＦＰＩ抗体は、組織因子経路阻害剤（以下、ＴＦＰＩと呼ぶ）に対して高い親和性を有するヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である抗組織因子経路阻害剤（以下、抗ＴＦＰＩと呼ぶ）組換え抗体である。
【０００３】
抗ＴＦＰＩ抗体は、ＴＦＰＩと活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）との間の結合を阻害し、外因性血液凝固経路における下流の血液凝固因子ＦＸの活性化を誘導することにより血液を凝固させる血友病治療剤として使用される。
【０００４】
抗ＴＦＰＩ抗体はＩｇＧ４型抗体であり、一般的な抗体産生プロセスに適用される時、プロセスの間のポリマー生成が増加し、そのことが製品の治療効果の低下をもたらし、そして低ｐＨ値での抗体の高い不安定性のためにプロセスの再現性が低いという問題が発生する。
【０００５】
特に、ポリマーが最終的な抗ＴＦＰＩ抗体濃縮物中に適切なレベル以上で存在する時、ポリマーは、抗原ＴＦＰＩに対する抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性を低下させ、そのことが抗体の有効性の低下をもたらすという悪影響を有する。
【０００６】
したがって、抗ＴＦＰＩ抗体産生プロセスにおけるポリマーの生成を防ぐように処理条件が適切に維持される必要があり、そして抗体精製プロセスにおいて必然的に生成されたポリマーが選択的に除去される必要がある。
【０００７】
したがって、高純度の抗ＴＦＰＩ抗体を精製するためのプロセスを開発することは、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体治療剤の開発のために必然的に必要とされる。
【０００８】
したがって、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を産生するために、本発明者らは、タンパク質不純物を吸着するためのアフィニティークロマトグラフィープロセスにおける中和プロセス、抗ＴＦＰＩ抗体ポリマーの生成を最小化し、混合モードクロマトグラフィー精製プロセスにおいて生成されたポリマーを選択的に除去するためのプロセス、および第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセス、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスおよび最終濃縮プロセスにおいて抗ＴＦＰＩ抗体精製収率を最大化するためのプロセスについての条件に関する研究を行い、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体は産生され、それにより本開示を完了することができることを見出した。
【０００９】
［先行技術文献］
【００１０】
［特許文献］
【００１１】
（特許文献１）韓国特許第１０−１７４４８９９号公報
【００１２】
（特許文献２）韓国特許第１０−１８０４９８８号公報
【００１３】
［非特許文献］
【００１４】
（非特許文献１）1. Defining your product profile and maintaining control over it, part 2: challenges of monitoring host cell protein impurities. BioProcess Int 2005; 3:52-4, 6, 8
【００１５】
（非特許文献２）2. CHOPPI: A Web Tool for the Analysis of Immunogenicity Risk from Host Cell Proteins in CHO-Based Protein Production. Biotechnol Bioeng. 2014 Nov; 111(11): 2170-2182.
【００１６】
（非特許文献３）3. Reducing risk, improving outcomes: bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin Immunol. 2009 May; 131(2):189-201
【００１７】
（非特許文献４）4. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 2008 Apr 4; 4(4):e1000048
【発明の概要】
【００１８】
発明の開示
技術的問題
本開示の目的は、（ｉ）低ｐＨアフィニティークロマトグラフィー溶出プロセスの後に中和プロセスを導入することによりポリマー生成を最小化して、アフィニティークロマトグラフィープロセスにおいて抗体安定性を増加させること、（ｉｉ）効率的な精製樹脂を選択することによりポリマー分離条件を決定して、混合モードクロマトグラフィープロセスにおいて抗ＴＦＰＩ抗体中に含有されるポリマーを選択的に除去すること、および（ｉｉｉ）最終濃縮プロセスにおける抗ＴＦＰＩ抗体ポリマーの形成を最小化しながら、抗ＴＦＰＩ抗体精製収率を最大化して、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を産生することにより、ＨＣＰおよびＬＰＡの非常に低い含有量を有する高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を提供することである。
【００１９】
本開示の技術的問題は、上記の技術的問題に限定されず、言及されていない他の技術的問題は、以下の説明から当業者により明確に理解されてもよい。
【００２０】
問題の解決策
上記の目的を達成するために、本開示は、原薬中のＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量が１０ｎｇ/ｍｇ以下である、血友病を処置するための抗ＴＦＰＩ抗体を含む医薬の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を提供する。
【００２１】
ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）は、抗ＴＦＰＩ抗体産生における宿主として使用されるＣＨＯ細胞において見いだされる固有のタンパク質であり、細胞培養物中のＨＣＰの含有量は約５００，０００ｎｇ／ｍｇと非常に高い。一方、ＬＰＡ（浸出性タンパク質Ａ）は、精製プロセスにおいて樹脂から解離するタンパク質Ａ不純物であり、その含有量は精製条件により製品間で異なってもよいが、一般的には約１０ｎｇ／ｍｇである。したがって、ＨＣＰ不純物の含有量は、ＬＰＡ不純物の含有量より比較的高く、抗ＴＦＰＩ抗体組成物が有効であるためには、ＨＣＰおよびＬＰＡの含有量を下げることが不可欠かつ非常に重要である。
【００２２】
抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰの含有量が１０．０ｎｇ／ｍｇ未満に維持され、組成物中のＬＰＡの含有量が１．０ｎｇ／ｍｇ未満に維持される場合、組成物が治療薬として人体に投与される時、それは免疫原性副作用を低下させる優れた特性を有し、したがって抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示してもよい。
【００２３】
本開示の一実施形態において、ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量は、５ｎｇ/ｍｇ以下であってもよい。
【００２４】
抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量が５ｎｇ/ｍｇ以下に維持される場合、組成物が治療薬として人体に投与される時、それは免疫原性副作用を低下させる優れた特性を有し、したがって抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示してもよい。
【００２５】
本開示の別の実施形態において、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、抗ＴＦＰＩを含有する培養物を清澄化するプロセス、アフィニティークロマトグラフィープロセス、ウイルス不活化プロセス、第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセス、混合モードクロマトグラフィープロセス、ナノ濾過プロセス、および最終濃縮プロセスを通して産生されてもよい。
【００２６】
本開示のさらに別の実施形態において、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスが、混合モードクロマトグラフィープロセスの後にさらに含まれてもよい。
【００２７】
本開示のさらに別の実施形態において、混合モードクロマトグラフィープロセスは、異なるタイプのカラム樹脂を使用して２つ以上の複数の混合モードクロマトグラフィープロセスを実施することにより、抗ＴＦＰＩ抗体のポリマーの９８％以上を除去してもよい。
【００２８】
ポリマーの９８％以上が除去される場合、組成物が治療薬として人体に投与される時、それは免疫原性副作用を低下させ、抗ＴＦＰＩ抗体のＴＦＰＩへの結合親和性を増加させるという利点を有し、したがって、抗ＴＦＰＩ抗体組成物としてより良い活性を示してもよい。
【００２９】
本開示のさらに別の実施形態において、アフィニティークロマトグラフィープロセスは、以下の工程を含んでもよい：アフィニティークロマトグラフィーカラムを通過した溶出液を、ｐＨ４．０から６．０の範囲で中和すること；および中和溶出液を放置して、室温（１５から２５℃）で８から１６時間静置すること。
【００３０】
本開示のさらに別の実施形態において、濃縮プロセスは、すすぎ溶液循環／回収プロセスを含んでもよい。
【００３１】
本開示のさらに別の実施形態において、原薬中の抗ＴＦＰＩ抗体ポリマーの含有量は、１％未満であってもよい。
【００３２】
本開示のさらに別の実施形態において、原薬は、３．２６ｎｇ/ｍＬ以下のＥＣ５０値を有してもよい。
【００３３】
原薬のＥＣ５０値が３．２６ｎｇ/ｍＬ以下である場合、組成物は、ＴＦＰＩに対する抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性を増加させ、ＴＦＰＩの機能を中和する抗ＴＦＰＩ抗体の能力を改善するという利点を有し、したがって抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示してもよい。
【００３４】
本開示のさらに別の実施形態において、原薬中のＨＣＰの含有量が１０．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、原薬中のＬＰＡの含有量が１．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、同時に、最終製品である原薬中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量が出発物質である清澄化された培養物中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量より少なくとも１０，０００倍低い高純度の抗ＴＦＰＩ抗体組成物が、産生されてもよい。
【００３５】
抗ＴＦＰＩ抗体組成物が、原薬中のＨＣＰの含有量が１０．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、原薬中のＬＰＡの含有量が１．０ｎｇ／ｍｇ未満であり、同時に、精製プロセスに供される原薬中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量が、清澄化された培養物中の抗ＴＦＰＩ抗体の単位含有量あたりのＨＣＰの含有量より少なくとも５０，０００倍低い高純度抗ＴＦＰＩ抗体組成物として維持される場合、抗ＴＦＰＩ抗体組成物が治療薬として人体に投与される時、それは、免疫原性副作用を低下させるという利点を有し、したがって抗ＴＦＰＩ抗体組成物としてより良い活性を示してもよい。
【００３６】
本開示のさらに別の実施形態において、原薬中のＨＣＰの含有量は、１０．０ｎｇ／ｍｇ未満であってもよく、原薬中のＬＰＡの含有量は、１．０ｎｇ／ｍｇ未満であってもよく、同時に、原薬の結合活性ＥＣ５０値は３．２６ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
【００３７】
ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量が５．０ｎｇ／ｍｇ以下であり、一方で結合活性ＥＣ５０値が３．２６ｎｇ／ｍＬ以下である場合、抗体組成物が治療薬として人体に投与される時、それは、免疫原性副作用を低下させ、ＴＦＰＩに対する抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性を増加させるという利点を有し、したがって抗ＴＦＰＩ抗体組成物としてより良い活性を示してもよい。
【００３８】
発明の有利な効果
本開示によれば、ＨＣＰおよびＬＰＡの非常に低い含有量を有する高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、ポリマー生成を最小化し、生成されたポリマーを効果的に除去し、濃縮プロセスにおいてすすぎ溶液を再循環させ、したがって精製収率を最大化することにより、提供される。したがって、高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、抗体誘導血友病患者の処置および血液凝固疾患の予防に効果的に使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
図１は、本開示の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を産生するための全体的なプロセスのフローチャートを概略的に示す。
【００４０】
図２Ａは、培養物の採取および清澄化プロセスからウイルス不活化プロセスまでのプロセスにおける物質（substance）中の抗体を確認し、不純物除去パターンを確認するために、非還元条件下で（抗ＴＦＰＩ抗体組成物の固有のサイズである）１５０ｋＤａ（左）および還元条件下で５０ｋＤａの重鎖および２５ｋＤａの軽鎖（右）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した結果を示す。示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料レーンは次のとおりである：レーン１および９−マーカー；レーン２-清澄化された培養物；レーン３-アフィニティークロマトグラフィー非結合溶液（ＡＣＵ）；レーン４-アフィニティークロマトグラフィー洗浄（ＡＣＷ）；レーン５-アフィニティークロマトグラフィーカラム洗浄（ＡＣＣＷ）；レーン６-アフィニティークロマトグラフィー溶出液（ＡＣＥ）；レーン７-アフィニティークロマトグラフィー中和溶出液（ＡＣＥＮ）；レーン８-ウイルス不活化溶液（ＶＩ）。
【００４１】
図２Ｂは、第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスから第２の混合モードクロマトグラフィープロセスまでのプロセスにおける物質中の抗体を確認し、不純物除去パターンを確認するために、非還元条件下で（抗ＴＦＰＩ抗体組成物の固有のサイズである）１５０ｋＤａ（左）および還元条件下で５０ｋＤａの重鎖および２５ｋＤａの軽鎖（右）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した結果を示す。示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料レーンは次のとおりである：レーン１および１０−マーカー；レーン２-第１のＵＦ保持液；レーン３-第１のＵＦ透過液；レーン４-第１の混合モードフロースルー溶液（１ｓｔ  ＭＭ  ＦＴ）；レーン５-第１の混合モードカラム洗浄（１ｓｔ  ＭＭ  ＣＷ）；レーン６-第２の混合モードロード溶液（２ｎｄ  ＭＭ  Ｌｏａｄ）；レーン７-第２の混合モード非結合溶液（２ｎｄ  ＭＭ非結合）；レーン８-第２の混合モード溶出液（２ｎｄ  ＭＭ溶出）；レーン９-第２の混合モードカラム洗浄（２ｎｄ  ＭＭ  ＣＷ）。
【００４２】
図２Ｃは、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスから原薬製剤（formulation）プロセスまでのプロセスにおける物質中の抗体を確認し、不純物除去パターンを確認するために、非還元条件下で（抗ＴＦＰＩ抗体組成物の固有のサイズである）１５０ｋＤａ（左）および還元条件下で５０ｋＤａの重鎖および２５ｋＤａの軽鎖（右）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した結果を示す。示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料レーンは次のとおりである：レーン１および８−マーカー；レーン２-第２のＵＦ保持液（２ｎｄ  ＵＦ保持液）；レーン３-第２のＵＦ透過液（２ｎｄ  ＵＦ透過液）；レーン４−ナノ濾液；レーン５-最終保持液；レーン６-最終濃度透過液；レーン７-原薬。
【００４３】
発明のモード
本開示の高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、以下に記載されるような最適化された方法により産生されてもよい。しかしながら、本開示は、本開示の実施形態に限定されるとは解釈されず、最適条件は、処理条件の変化と共に変化してもよい。
【００４４】
１．培養物の採取および清澄化
【００４５】
培養物の採取および清澄化プロセスは、培養物中に含有される細胞および細胞破片を除去することを目的としている。このプロセスは、１５から２５℃で実施された。
【００４６】
まず、ＰＯＤホルダーはＰＯＤフィルターを順番に取り付けられ、次いで入口および出口以外の部分への液漏れを防ぐためにホルダーのハンドルが回され、フィルターは２００から３００Ｌの注入用の水で洗い流された。
【００４７】
その後、培養物清澄化バッファーは通されて、ホルダー中に取り付けられたＰＯＤフィルターおよび出口に接続された滅菌カプセルフィルターが洗浄された。培養物の採取弁が開かれて培養物の清澄化が開始され、培養物の清澄化中にＰＯＤフィルターシステムの圧力は２９ｐｓｉ（２バール）を超えないように調整された。
【００４８】
上記のように培養物の清澄化が完了した後、後洗浄が培養物清澄化バッファーで実施された。後洗浄が完了した後、そこに回収された清澄化された培養物を含有する容器は、秤量され、次のプロセスにおいて使用された。培養物の採取および清澄化プロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡ（品質／パフォーマンス属性）が、以下の表１に示される。
【００４９】
【表１】
2022501379.tif 000003
【００５０】
２．アフィニティークロマトグラフィー
【００５１】
アフィニティークロマトグラフィープロセスは、培養物から抗ＴＦＰＩ抗体組成物を吸着および回収することを目的としている。このプロセスは、１５から２５℃でＭａｂｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅ樹脂を使用して実施されたが、これに限定されるものではなく、従来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂が使用されてもよい。
【００５２】
まず、ＡＫＴＡ精製システムを使用してパッキング評価が実施され、適合性が確認された。さらに、ＣＩＰ溶液は１５分間洗い流され、次いで消毒がカラム洗浄バッファーで実施された。
【００５３】
平衡化バッファーで平衡化が実施された後、清澄化された培養物は接続して吸着され、カラムを通過した試料は非結合溶液として回収された。吸着が完了した後、再平衡化が平衡化バッファーで洗い流すことにより実施された。このとき、カラムを通過した再平衡化溶液は、未結合溶液と一緒に回収された。再平衡化プロセスが完了した後、カラムは洗浄バッファーで洗浄され、カラムを通過した洗浄溶液は回収された。
【００５４】
溶出プロセスにおいて、カラムはアフィニティークロマトグラフィー溶出バッファーで洗い流され、溶出液はゲル体積の０．８倍に達した時点から回収された。上記のように回収された溶出液は、ｐＨ調整溶液でｐＨを４．０から６．０に調整することにより中和され、中和溶出液は次のプロセスまで１５から２５℃で保存された。プロセスが完了した後、カラム洗浄が実施され、一方で樹脂がカラム洗浄バッファーで洗い流された。カラムＣＩＰはＣＩＰバッファーで１５分間実施され、カラムのｐＨは平衡化バッファーで安定された。その後、カラムはゲル保存液でフラッシングすることにより充填され、次いでシステムから分離して保存された。
【００５５】
アフィニティークロマトグラフィープロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表２に示される。
【００５６】
【表２】
2022501379.tif 000004
【００５７】
３．ウイルス不活化
【００５８】
ウイルス不活化プロセスは、エンベロープウイルスを低ｐＨで不活化することを目的としている。
【００５９】
この実験において、ウイルス不活化プロセスは１５から２５℃で実施された。クリーンブースにおいて、アフィニティークロマトグラフィーからの中和溶出液のｐＨは、溶出液を攪拌しながらｐＨ調整溶液（０．１Ｍ  ＨＣｌ）を加えることにより、基準ｐＨである３．０から３．８（対照ｐＨ１）に調整され、ウイルス不活化は、１８から２４℃で４５分から１０５分間実施された。
【００６０】
ウイルス不活化が完了した後、得られた溶液は、ｐＨ調整溶液で再びｐＨ４．５から５．５（対照ｐＨ２）に調整された。その後、ｐＨ調整された処理溶液は、滅菌カプセルフィルターを使用して濾液回収バッグ中に濾過された。濾過が完了した後、ウイルス不活化溶液は、次のプロセスである第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスに供された。ウイルス不活化プロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表３に示される。
【００６１】
【表３】
2022501379.tif 000005
【００６２】
４．第１の限外濾過およびダイアフィルトレーション
【００６３】
第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスは、ウイルス不活化溶液を第１の混合モードクロマトグラフィープロセスのロード条件下で限外濾過およびダイアフィルトレーションに供することを目的としている。
【００６４】
実際のプロセスは、以下のように実施された。
【００６５】
ＵＦホルダーはメンブレンを取り付けられ、固定板が押し付けられるように、トルクレンチで所定の圧力まで締め付けられた。組み立てられたＵＦホルダーは、「ＵＦシステム」と名付けられた。ＵＦシステムは、第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションＣＩＰ溶液での循環によりＣＩＰに供され、注入用の水ならびに第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファーで洗い流されてｐＨが安定した。
【００６６】
その後、ＴＭＰ圧力は、透過弁および保持弁を調整することにより１．０±０．５バールに調整された。ウイルス不活化溶液が、１０±５ｍｇ／ｍＬに濃縮され、濃縮体積の５から１５倍に相当する平衡化バッファー（第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファー）でダイアフィルトレーションされ、次いでｐＨおよび導電率が基準を満たすかどうかがチェックされ、ダイアフィルトレーションは終了された。
【００６７】
その後、０．２２μｍフィルターが保持液ラインに接続され、後洗浄が濾過と同時に実施された。次いで、透過弁が閉められ、最終保持液量の約１０から３０ｖｏｌ％に相当するダイアフィルトレーションバッファーが供給ライン中に注入されて濃縮器および供給ライン中に停滞した液体が加圧され、第１の後洗浄が排水なしで実施された。
【００６８】
最終保持液量の２０から４０ｖｏｌ％に相当するダイアフィルトレーションバッファーが供給ライン中に注入されて１分間循環され、次いで第２の後洗浄が実施され、一方ですすぎ溶液が完全に排出され、それにより保持液濃度が最終標的濃度（３から７ｍｇ／ｍＬ）に調整された。その後、濾過された第１のＵＦ保持液が秤量され、記録紙が取り付けられた。上記のように実施された第１の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表４に示される。
【００６９】
【表４】
2022501379.tif 000006
【００７０】
５．第１の混合モードクロマトグラフィー
【００７１】
第１の混合モードクロマトグラフィープロセスは、ＨＣＰおよびＬＰＡなどの不純物を除去し、純度を増加させることを目的としている。
【００７２】
第１の混合モードクロマトグラフィー精製プロセスは、ＰＰＡ混合モード樹脂を使用して１５から２５℃で実施された。まず、パッキング評価がＡＫＴＡ精製システムを使用して実施され、適合性が確認された。その後、滅菌プロセスは、ＣＩＰ溶液で洗い流し、カラム洗浄バッファーをカラムに通すことにより実施され、次いで、平衡化プロセスは、平衡化バッファーで洗い流すことにより実施された。
【００７３】
上記のプロセスを通して平衡化が完了した後、第１のＵＦ保持液が接続され、次いでフロースループロセスが実施された。第１の混合モードクロマトグラフィー精製について、試料はフロースルーモードプロセスにおいてロードされ、フロースルー溶液の回収はロードの時点から開始された。試料のロードが完了した後、平衡化バッファーが注入され、再平衡化プロセスが実施されてカラム中に残っているフロースルー溶液は完全に回収された。
【００７４】
その後、カラム洗浄がカラム洗浄バッファーで洗い流すことにより実施され、カラムＣＩＰがＣＩＰバッファーで実施された。ＣＩＰが完了した後、カラムのｐＨは、平衡化バッファーで洗い流すことにより安定された。その一方、カラムはゲル保存溶液で充填され、次いでシステムから分離して別々に保存された。
【００７５】
上記のように実施された第１の混合モードクロマトグラフィープロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表５に示される。
【００７６】
【表５】
2022501379.tif 000007
【００７７】
６．第２の混合モードクロマトグラフィー
【００７８】
このプロセスは、高分子抗体およびＨＣＰなどの残りの不純物を除去することを目的としている。
【００７９】
第２の混合モードクロマトグラフィー精製プロセスは、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト樹脂を使用して１５から２５℃で実施された。まず、パッキング評価がＡＫＴＡ精製システムを使用して実施され、適合性が確認された。
【００８０】
その後、第１の混合モードクロマトグラフィーフロースルー溶液は希釈バッファーで１：１の比率で希釈され、ｐＨおよび導電率の基準を満たすかどうかについて確認された。それは、滅菌および濾過後のローディング溶液として使用された。次いで、滅菌は、ＣＩＰ  １溶液で洗い流し、カラム洗浄バッファーをカラムに通すことにより実施され、平衡化は、平衡化バッファーで洗い流すことにより実施された。上記のように平衡化が完了した後、第２の混合モードクロマトグラフィーローディング溶液は接続され、吸着プロセスは実施された。吸着が完了した後、再平衡化プロセスは、平衡化バッファーで洗い流すことにより実施された。
【００８１】
再平衡化が完了した後、カラムは溶出バッファーで洗い流され、溶出液はＵＶピークが０．１ＡＵを下回るまで回収された。このとき、ＵＶピークが基準を満たしていない時、ＵＶ値が基準を満たすように、ゲル体積の２倍に相当する溶出バッファーが追加でロードされた。
【００８２】
その後、カラム洗浄は、カラム洗浄バッファーで洗い流すことにより実施された。カラム洗浄プロセスが完了した後、カラムＣＩＰは、ＣＩＰ２−＞ＣＩＰ３−＞ＣＩＰ２−＞ＣＩＰ１の順で溶液をロードすることにより実施された。さらに、カラムは、ゲル保存液で洗い流すことにより充填され、次いでシステムから分離して保存された。回収された溶出液は、秤量され、次いで濾過され、次のプロセスにおいて使用するまで１５から２５℃で保存された。第２の混合モードクロマトグラフィープロセスのプロセスパラメーターおよび操作条件は、以下の表６に示される。
【００８３】
【表６】
2022501379.tif 000008
【００８４】
７．第２の限外濾過およびダイアフィルトレーション
【００８５】
第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスは、第２のＭＭ溶出液を標的濃度に濃縮し、次いで溶出液を製剤バッファーでダイアフィルトレーションすることを目的としている。
【００８６】
ＵＦシステムは、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションＣＩＰ溶液での循環によりＣＩＰに供され、注入用の水ならびに第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファーで洗い流されてｐＨが安定した。さらに、ＴＭＰ圧力は、透過弁および保持弁を調整することにより１．０±０．５バールに調整された。
【００８７】
その後、第２の混合モードクロマトグラフィー溶出液は２０±５ｍｇ／ｍＬに濃縮され、濃縮体積の５から１５倍に相当する平衡化バッファー（第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファー）でダイアフィルトレーションされた。ｐＨおよびその導電率は測定され、それらが基準を満たした時に、ダイアフィルトレーションは終了された。
【００８８】
さらに、透過弁は閉じられ、最終保持液質量の１０から３０ｖｏｌ％に相当する第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファーは供給ライン中に注入され、第１の後洗浄は、濃縮器および供給ライン中に停滞した液体を該液体を排出せずに移しながら実施された。
【００８９】
その一方、最終保持液量の１０から３０ｖｏｌ％に相当する第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションバッファーは、供給ライン中に注入されて１分間循環され、次いで第２の後洗浄はすすぎ溶液を完全に排出しながら実施され、それにより保持液濃度は標的濃度（１０から２０ｍｇ／ｍＬ）に調整された。
【００９０】
その後、Ａ１ＨＣ（Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ、Ｐｒｅ−ｆｉｌｔｅｒ）およびＤｕｒａｐｏｒｅ  ０．１μｍフィルターのフィルターセットは、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーション保持液回収容器に接続され、保持液の濾過は実施された。濾過が完了した後、３から７Ｌのダイアフィルトレーションバッファーでの後洗浄が実施され、それにより第２の限外濾過およびダイアフィルトレーション保持液の最終濃度は５から１５ｍｇ／ｍＬに調整された。
【００９１】
上記のように濾過された第２の限外濾過およびダイアフィルトレーション保持液は、秤量され、次のプロセスにおいて使用するまで１５から２５℃で保存された。第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表７に示される。
【００９２】
【表７】
2022501379.tif 000009
【００９３】
上記の分析結果から分かるように、第２の限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスを通して得られた抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰの含有量は５．３ｎｇ／ｍｇであり、抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＬＰＡの含有量は０．４ｎｇ／ｍｇであり、ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量は５．７ｎｇ／ｍｇであった。抗体組成物中のＨＣＰおよびＬＰＡの含有量は上記のように非常に低く、したがって、抗体組成物は抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示すことができることが分かった。
【００９４】
８．ナノ濾過
【００９５】
ナノ濾過プロセスは、ナノフィルターを使用してウイルスを除去することを目的としている。
【００９６】
ナノ濾過プロセスは、１５から２５℃でナノフィルター（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ）を使用して実施された。まず、ナノフィルターは、注入用の水で洗い流され、次いでナノ濾過バッファーで洗浄された。その後、圧力調整器の圧力は２．０±０．５バールに調整され、圧力弁が開かれてナノ濾過が開始された。
【００９７】
ナノ濾過が完了した後、後洗浄が１から３Ｌのナノ濾過バッファーで実施され、次いでナノ濾液が秤量された。ナノ濾過プロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表８に示される。
【００９８】
【表８】
2022501379.tif 000010
【００９９】
上記の分析結果から分かるように、ナノ濾過プロセスを通して得られた抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰの含有量は４．５ｎｇ／ｍｇであり、抗体組成物中のＬＰＡの含有量は０．４ｎｇ／ｍｇであり、ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量は４．９ｎｇ／ｍｇであった。上記のようにＨＣＰおよびＬＰＡの含有量は非常に低く、したがって、抗体組成物は抗ＴＦＰＩ抗体組成物として非常に優れた効果を示すことができることが分かった。
【０１００】
９．最終濃縮
【０１０１】
最終濃縮プロセスは、ナノ濾液を最終目標濃度に濃縮することを目的としている。まず、透過弁は開かれ、ＣＩＰは最終濃度ＣＩＰ溶液での循環により実施され、ｐＨは注入用の水および最終濃度バッファーで洗い流すことにより安定された。
【０１０２】
その後、透過弁および保持弁を調整することにより、ＴＭＰ圧力は１．０±０．５バールに調整され、ナノ濾液は３６±１０ｍｇ／ｍＬに濃縮された。濃縮が終了した後、追加濃縮が最終質量の７０％まで実施され、次いで、低下した（reduced）３０％の１０ｖｏｌ％に相当する最終濃度バッファーが注入され、第１の後洗浄が濃縮保存ラインにおいて充填された液体を液漏れなく移しながら実施された。さらに、残りの２０ｖｏｌ％に相当する最終濃度バッファーは注入されて１分間循環され、第２の後洗浄はすすぎ溶液を完全に排出しながら実施された。最終濃縮物が得られ、その質量が測定された。最終濃縮プロセスのプロセスパラメーターおよびＱＡ／ＰＡが、以下の表９に示される。
【０１０３】
【表９】
2022501379.tif 000011
【０１０４】
上記の分析結果から分かるように、最終濃縮プロセスを通して得られた抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰの含有量は３．９ｎｇ／ｍｇであり、抗体組成物中のＬＰＡの含有量は０．５ｎｇ／ｍｇであり、ＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量は４．４ｎｇ／ｍｇであった。抗体組成物中のＨＣＰおよびＬＰＡの含有量は上記のように非常に低く、したがって、抗体組成物は抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示すことができることが分かった。
【０１０５】
１０．原薬製剤
【０１０６】
原薬製剤プロセスは、賦形剤のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０を加えることにより原薬の安定性を増加させ、標的濃度で原薬を製剤することを目的としている。
【０１０７】
まず、賦形剤のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０は最終保持液に加えられ、十分な混合のために撹拌され、撹拌された溶液は０．２μｍフィルターを通して濾過され、それにより原薬が製剤された。
【０１０８】
【表１０】
2022501379.tif 000012
【０１０９】
上記の分析結果から分かるように、原薬製剤プロセスを通して得られた抗ＴＦＰＩ抗体組成物中のＨＣＰ含有量は４．１ｎｇ／ｍｇであり、抗体組成物中のＬＰＡ含有量は０．４ｎｇ／ｍｇであり、抗体組成物中のＨＣＰおよびＬＰＡの総含有量は４．５ｎｇ／ｍｇであった。抗体組成物中のＨＣＰおよびＬＰＡの含有量は上記のように非常に低く、したがって、抗体組成物は抗ＴＦＰＩ抗体組成物として優れた効果を示すことができることが分かった。
【０１１０】
１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【０１１１】
産生された原薬中の抗体を確認し、不純物除去パターンを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が、還元および非還元条件下で実施された。
【０１１２】
抗ＴＦＰＩ抗体組成物がプロセスの間に精製された主要な試料において、非還元条件下で（抗体の固有のサイズである）１５０ｋＤａのバンド、および還元条件下で５０ｋＤａの重鎖および２５ｋＤａの軽鎖（図２、３および４）は、メインバンドと見なされた。その結果、非特異的なバンドの発生も不純物の汚染もなかった。さらに、不純物はプロセスの間に除去されたか、または抗体バンドは非結合溶液中のメインバンドとして検出されなかった。
【０１１３】
ゆえに、本開示の精製プロセスは、不純物、微生物およびウイルスに汚染されていない高効率の抗ＴＦＰＩ抗体組成物を原材料培養物から効果的に産生するための最適なプロセスであることが確認できた。
【０１１４】
以下、本開示の効果について対照実験を実施することにより得られた結果をまとめた結果が、説明される。
【０１１５】
Ａ．ポリマー生成の最小化のためのプロセス最適化実験
【０１１６】
本開示は、アフィニティークロマトグラフィー溶出液を中和するプロセスの導入を通してポリマー生成を最小化することを特徴とする。
【０１１７】
ポリマー生成を最小化するために、抗ＴＦＰＩ抗体組成物は、アフィニティークロマトグラフィー溶出プロセスのｐＨを３．２から３．６に維持することにより最初に溶出された。次に、ウイルス不活化は、ウイルスの安定性を確保するために低ｐＨで１時間から１時間３０分実施され、次いで次のプロセスはｐＨを上げて実施された。以下の３つの対照実験は、ポリマー生成が中和プロセスの導入を通して最小化できるかどうかを確認するために実施された。
【０１１８】
＜実験例１＞
【０１１９】
一般的な抗体について、ウイルス不活化を、低ｐＨアフィニティークロマトグラフィー溶出プロセスの直後に実施し、この場合、溶出プロセスからの溶出液の純度は、ウイルス不活化後に９６．０％から８５％に低下し、そのポリマー含有量は１１％増加した。
【０１２０】
＜実験例２＞
【０１２１】
溶出液を、低ｐＨアフィニティークロマトグラフィー溶出プロセス後に、放置してｐＨ調整せずに室温で８から１６時間静置し、次いでウイルス不活化プロセスに供した。この場合、溶出直後の９６％の純度は、８から１６時間の静置に続くウイルス不活化後に８３％に低下し、ポリマー含有量は１３％増加した。
【０１２２】
＜実験例３＞
【０１２３】
溶出液を、低ｐＨアフィニティークロマトグラフィー溶出プロセス後に、ｐＨ４．８から５．２に中和し、放置して室温で８から１６時間静置し、次いで再び低ｐＨに滴定し、ウイルス不活化プロセスに供した。この場合、溶出直後の９６％の純度はウイルス不活化後に９１％に低下し、ポリマー含有量は５％増加した。
【０１２４】
これらの実験例を考慮すると、アフィニティークロマトグラフィー溶出プロセス直後のｐＨ中和プロセスを通して物質を安定化させ、次いでウイルス不活化プロセスを実施することにより、ポリマーの形成が約２倍阻害されることが確認できた。
【０１２５】
上記の実験例１から３の結果は、以下の表１１に要約される。
【０１２６】
【表１１】
2022501379.tif 000013
【０１２７】
１３．ポリマー形成と抗ＴＦＰＩ抗体の効果との相関関係の検討
【０１２８】
ポリマー形成と抗ＴＦＰＩ抗体の効果との相関関係を検討するために、それぞれ１００％、９０％、および６０％のモノマー含有量を有する抗ＴＦＰＩ抗体は、ポリマー形成を増加させることにより構築され、それらの結合活性効力について試験された。
【０１２９】
１００％モノマーで構成される抗ＴＦＰＩ抗体についての結合活性効力試験におけるＥＣ５０値は、１．９１ｎｇ／ｍＬであると決定された。１０％の増加したポリマー含有量による９０％のモノマー純度を有する抗ＴＦＰＩ抗体についての結合活性効力試験におけるＥＣ５０値は、２．５３ｎｇ／ｍＬであると決定された。４０％の増加したポリマー含有量による６０％のモノマー純度を有する抗ＴＦＰＩ抗体についての結合活性効力試験におけるＥＣ５０値は、３．２６ｎｇ／ｍＬであると決定された。ポリマー含有量が増加するにつれて、抗体の結合活性は低下すること、および６０％のモノマー純度を有する抗ＴＦＰＩ抗体の結合活性効力値は１００％のモノマー純度を有する対照と比較して４０％以上低下することが、確認された。結果は、以下の表１２に要約される。
【０１３０】
【表１２】
2022501379.tif 000014
【０１３１】
Ｂ．ＣＨＴ樹脂を通したポリマー除去
【０１３２】
抗ＴＦＰＩ抗体は、ＩｇＧ４型抗体であり、ＩｇＧ１型抗体より高いポリマー生成率を有する。ポリマーが生成されると、ＴＦＰＩに対する抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性が低下し、したがって該抗体の効果が低下する。したがって、処理条件は、産生プロセスにおいてポリマーが生成されるのを防ぐために、適切に維持される必要がある。それにもかかわらず、高効率の抗体治療剤は、中間プロセスにおいて産生されたポリマーを選択的に除去することにより高純度の抗体試料を産生できる時にのみ、開発されることができる。
【０１３３】
本発明者らは、抗体中に含有されるポリマーをプロセスの間に選択的に除去するために、スクリーニング後に（最も効率的な精製樹脂ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトである）混合モード樹脂を選択し、最適なポリマー分離条件を確立した。その結果、ＣＨＴ樹脂を使用した精製プロセスを通して１２−２３％のポリマーが除去され、したがって１００％に近い純度が得られることが確認された。
【０１３４】
【表１３】
2022501379.tif 000015
【０１３５】
Ｃ．濃縮およびバッファー循環／回収プロセス
【０１３６】
限外濾過およびダイアフィルトレーションプロセスの回収率は、圧力条件、タンパク質特性およびタンパク質濃度に影響される。
【０１３７】
ゆえに、回収率は同じ条件下でタンパク質回収法により増加できることが、確認された。つまり、収率はすすぎ溶液を循環させながら膜上に吸着したタンパク質も回収することにより増加できることが、確認された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【国際調査報告】
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2022501379.tif 000021
2022501379.tif 000022
2022501379.tif 000023
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