【手続補正書】
【提出日】平成22年8月18日(2010.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
これらの株が、阻害濃度の酢酸塩の存在下で、グルコースおよびキシロースの濃縮混合物においてどの程度良好に作動するかを調べるために、振盪フラスコ実験を実施した。この分析には、ＺＷ６５８およびＺＷ８００も含めた。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する液体培地において３０℃で約３．０のＯＤ６００まで増殖させ、そして１５ｍｌ実験培養のために１０％播種物を使用した。後者を、５０ｍｌ試験管において、３０℃で、穏やかに撹拌（１５０ｒｐｍ）しながら増殖させた。増殖培地は、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトール、４０ｍＭのＫＨＣＯ３、９５ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、および７．７ｇ／Ｌ酢酸塩を含有した；初期ｐＨを濃リン酸で５．８に調整した。多様な時間において、実施例６において先に記載のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、培養物のアリコートを取り出した。この実験の目的の化合物は、グルコース、キシロース、エタノールおよびキシリトールであり、そして全ての値をｇ／Ｌで報告する。
表５に示すように、ＺＷ６５８は、６６．３５ｇ／Ｌのエタノールを産生し、そして後に４０．６ｇ／Ｌの残留キシロースを残した。また、ＺＷ６５８は機能性ＧＦＯＲ酵素を有したため、それは、３．１９ｇ／Ｌの所望されない副産物キシリトールを産生した。他の並行実験において先に観察されたものと同様に、ＺＷ８００は、ＺＷ６５８より１７％多いキシロースを消費し、そして６．２％多いエタノールを産生し、そしてそれは、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６では僅かに良好な結果が得られたが、これらの差異は、おそらく実験誤差の範囲内であり、そして統計的に有意ではない。この実験で観察されたＺＷ８０１−５の性能がそれほど良好ではなかったことについては、解明されていないが、それ以上調べなかった。これらの結果に基づいて、さらなる分析のために、株ＺＷ８０１−４を選択した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
【表６】
2010504758.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
ＺＷ８０１−４が少なくともＺＷ８００と同様に作動したことを示唆した振盪フラスコ実験の結果を確認するために、これらの２つの株を、ｐＨ制御条件下で比較した。種培養物を、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含有する培地において、３０℃で増殖させた。ＯＤ６００が約４．６に到達したら、種培養物の１７ｍｌアリコートを使用して、１５３ｍｌの増殖培地を含有するｐＨ制御バイオリアクターに播種した。最終的な１７０ｍｌ培養物は、１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、５ｍＭソルビトールおよび７．２ｇ／Ｌの酢酸塩を含有した。増殖は３３℃で行い、そしてｐＨを、４ＮのＫＯＨの自動化された添加によって５．５に維持した；混合速度は約１５０ｒｐｍであった。多様な時間において、上記のように、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のために、バイオリアクターから培養物のアリコートを取り出し、そしてまた、ＯＤ６００もモニターした。これらの実験条件下では、ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の増殖曲線は、ほとんど重ね合わせることができた（図２３Ａ）。グルコースおよびキシロース消費の時間経過はまた、事実上同一であり、
そして両方の株は、同様の動態で同じ量のエタノールを産生した（図２３Ｂ）。さらに加えて、これらの株のいずれも、検出可能なキシリトールを何ら産生しなかった。これらの観察に基づいて、本発明者らは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームからＳｐｅｃｒ−カセットを取り出しても、ＧＦＯＲ酵素活性が回復または部分的に回復しなかったこと、およびこの操作は発酵性能に有害な影響を及ぼさなかったことを結論付けている。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４は両方とも機能性ＧＦＯＲ酵素を有する親株（ＺＷ６５８）より良好に作動したが、ＺＷ８０１−４は抗生物質に対する耐性を付与する外来遺伝子を含有しないため、商業的アプリケーションに好適な株は、ＺＷ８０１−４である。ＺＷ８０１−４由来のゲノムＤＮＡの配列解析は、正確なＣｒｅ切り出し事象が実際に生じた明白な証拠を提供した。ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲオープンリーディングの完全なヌクレオチド配列（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）を配列番号３７に示し、そして図２４は、翻訳された変異体配列と野生型ＧＦＯＲタンパク質とのアラインメントを示し；後者は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＥ００８６９２のｎｔ６８３７５１〜６８５０５２の逆相補鎖によってコードされる。予想したとおり、Ｓｐｅｃｒ−カセットのＣｒｅ切り出しは、ＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型ｌｏｘＰ部位を残し、そしてこの挿入事象は、タンパク質を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じた；「ｌｏｘ  ｓｃａｒ」の局在を、灰色で強調された残基によって示す。自殺構築物の設計の結果として、変異体ヌクレオチド配列もまた、同じ場所で生来の野生型ＧＦＯＲヌクレオチド配列のうち約７２ｂｐを失っている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株。
２．グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、上記１に記載の組み換えザイモモナス株。
３．グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変は、相同組み換えによって、株のグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ遺伝子に導入される挿入である、上記１に記載の組み換えザイモモナス株。
４．ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６からなる群から選択された株として同定される、上記１に記載のザイモモナス株。
５．グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる遺伝子改変を伴わない株と比較して、低減した量のキシリトールを産生する、上記１に記載のザイモモナス株。
６．実質的にキシリトールを産生しない、上記５に記載のザイモモナス株。
７．ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程；および
ｂ）（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、該改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる工程
を含む、低減したＧＦＯＲ活性を有する、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス株を作製するための方法。
８．（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株は、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、Ｚ．モビリス８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＭ４（ｐ
ＺＢ５）およびＺ．モビリスＣＰ４：ｐＺＢ５からなる群から選択される、上記７に記載の方法。
９．遺伝子改変は、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択される、上記８に記載の方法。    
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株。
【請求項２】
ａ）キシロースを資化して、適切な条件下でエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程；および
ｂ）（ａ）のキシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株に少なくとも１つの遺伝子改変を導入する工程であって、該改変は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少させる工程
を含む、低減したＧＦＯＲ活性を有する、キシロースを資化してエタノールを産生することが可能なザイモモナス株を作製するための方法。