【手続補正書】
【提出日】平成22年5月28日(2010.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有し、全採血されていないか又は一部採血されている分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、
該ほ乳類の胎盤を、灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流し、該臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有する灌流液を作る工程と、
該灌流液を回収する工程と、
該灌流液から該臍帯血幹細胞を分離して、分離された臍帯血幹細胞を得る工程とを備えることを特徴とする臍帯血幹細胞を分離する方法。
【請求項２】
前記分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程は、全採血されていない分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程は、一部採血されている分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程は、
臍帯血幹細胞を含む臍帯血を有し、全採血されていない分離されたほ乳類の胎盤を用意する工程と、
前記分離された全採血されていないほ乳類の胎盤から一部採血することにより、一部採血されている胎盤及び多量の臍帯血幹細胞を含む臍帯血を作製する工程を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記一部採血する工程は、
前記分離されたほ乳類の胎盤から静脈穿刺によって一部採血することにより臍帯血を回収し、一部採血されている胎盤及び多量の臍帯血幹細胞を含む臍帯血を作製する工程を備えることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記一部採血する工程は、
前記分離されたほ乳類の胎盤から重力により排出することにより臍帯血を回収し、一部採血されている胎盤及び多量の臍帯血幹細胞を含む臍帯血を作製する工程を備えることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
分離する前に、前記所定量の臍帯血及び前記灌流液を貯留する工程をさらに備えることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記灌流液の圧力に依存する流れが、該灌流液の脈動流であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記灌流は、臍帯血幹細胞が実質的に存在しないほ乳類の胎盤を作製するために十分な状況下で行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記灌流は、ペリスタポンプを用いて行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記分離された臍帯血幹細胞は、造血幹細胞を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記分離されたほ乳類の胎盤を冷却し、冷却されたほ乳類の胎盤を作製する工程をさらに備え、
該分離されたほ乳類の胎盤の該冷却は、前記灌流が行われる前に行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜６℃の範囲の温度に維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に最大４０時間維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に６〜４０時間の範囲の時間維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に１０〜４０時間の範囲の時間維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記冷却されたほ乳類の胎盤を０〜１５℃の範囲の温度に２０〜４０時間の範囲の時間維持する工程をさらに備えることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記冷却は、前記分離されたほ乳類の胎盤を氷中に配置することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
前記胎盤は、前記灌流する工程の前に抗凝固剤が投与又は注入されていないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記灌流液は、抗凝固剤を含む生理学的に適合可能な溶液であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記灌流液は、ヘパリン、クレアチンリン酸ブドウ糖（ＣＰＤＡ）又はこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤の１つ以上を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記灌流する工程は、１つ以上の臍動脈及び臍静脈を介して行われることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
前記灌流する工程は、１つ以上の前記臍動脈及び前記臍静脈にカニューレを挿入し、カニューレが挿入された胎盤を作製する工程と、該カニューレが挿入された胎盤を灌流回路中に配置する工程とをさらに備えることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記灌流する工程は、脈動が１５〜６０拍／分となるように設定されて行われることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記灌流する工程は、脈動が６０拍／分となるように設定されて行われることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記灌流する工程は、収縮期圧が３０〜７０ｍｍＨｇの範囲の圧力であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記灌流する工程は、１５〜３５分の範囲の時間行われることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記分離された臍帯血幹細胞は、ＣＤ１３３＋細胞を所定の割合で備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３０】
前記分離された臍帯血幹細胞は、ＣＤ１３３＋細胞以外の細胞をさらに備えており、該ＣＤ１３３＋細胞以外の細胞は、胚幹細胞（ＥＳ細胞）様幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞又はこれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ１３３＋細胞の所定の割合は、比較サンプルから分離された幹細胞中のＣＤ１３３＋細胞の比較割合より大きく、
該比較サンプルは、比較用の全採血されていないほ乳類の胎盤に灌流を行わずに、一部採血することによって分離されたものであることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記分離された臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、Ｌｉｎ−細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ−３＋細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞、ＴＲＡ−１−８１細胞又はこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞をさらに備えることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記分離された臍帯血幹細胞は、さらにＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞若しくはＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、Ｌｉｎ−細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ−３＋細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞又はＴＲＡ−１−８１細胞以外に分化することができる幹細胞からなることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
造血再構成を必要とするほ乳類の治療のために用いる、増殖された造血幹細胞を医療的に有効な量備える組成物の製造における増殖された造血幹細胞の使用であって、
該増殖された造血幹細胞は、請求項１１記載の方法により分離された造血幹細胞を培養することにより得たものであることを特徴とする造血幹細胞の使用。
【請求項３５】
造血再構成を必要とするほ乳類の治療のために用いる、前記造血幹細胞を医療的に有効な量備える静脈内投与組成物又は骨内投与組成物の製造における請求項１１記載の分離された造血幹細胞の使用。
【請求項３６】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、再生不良性貧血、造血器悪性腫瘍、自己免疫疾患、遺伝性疾患、免疫不全、悪性固形癌又はこれらの組合せを保有することを特徴とする請求項３４記載の使用。
【請求項３７】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群から選択される造血器悪性腫瘍を保有することを特徴とする請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
前記造血再構成を必要とするほ乳類は、放射線治療、化学療法、病原微生物による感染、又は、これらの組み合わせの結果生じる免疫不全を保有することを特徴とする請求項３６記載の使用。
【請求項３９】
請求項１記載の分離された前記臍帯血幹細胞をインビトロで培養することにより生成された前記分化された細胞又は増殖された細胞を備え、組織再生を必要とするほ乳類の損傷した組織の再生に用いる組成物において、
ほ乳類の静脈への注射、又は標的器官に直接注射することにより導入されることを特徴とする組成物。
【請求項４０】
前記臍帯血幹細胞を医療的に有効な量備え、組織再生を必要とするほ乳類の損傷した組織の再生に用いる注射可能な組成物の製造における、請求項１記載の分離された臍帯血幹細胞の使用。
【請求項４１】
前記損傷した組織は、心臓組織、筋組織、肝臓、皮膚、神経組織、骨組織、上皮、間質、又は内皮の内、一つ以上からなることを特徴とする請求項３９記載の使用。
【請求項４２】
前記損傷した組織は、心臓組織、筋組織、肝臓、皮膚、神経組織、骨組織、上皮、間質、又は内皮の内、一つ以上からなることを特徴とする請求項４０記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
１．技術分野
本発明は、胎盤から幹細胞を回収する、臨床に適した便利で効率のよい新しい方法に関するものである。また、胎盤由来のすべての組織を、容易に、効率的に、固定され、操作されておらず、冷却された、無菌の分娩後にまとめられた胎盤を、地方、州、国、地域又は世界中の顧客若しくは患者基盤に提供することができる可能性を有する中央施設に、摘出して預けることを含む。特に、本発明は、機械による脈動灌流によって回収された残余の胎盤臍帯血細胞が、従来の針／シリンジを用いた回収方法または重力により排出して回収する方法を用いた場合に比較して、初期造血幹細胞表現型（ＣＤ１３３＋）をより多く含んでおり、一生を通じて再生医療において１つの胎盤からの臍帯血細胞を用いることができる。本発明の方法を用いることで、１つの胎盤からより多くの数の幹細胞を得ることができるため、同種の造血幹細胞の移植結果を向上させることができ、単一提供者からの移植片では幹細胞の数が不十分な場合を補うため、異なる提供者からの２種又は３種の臍帯血移植片を用いることを避けることができる。本発明のもう一つの特徴としては、固定された臍帯を有する分娩直後の操作されていない胎盤全体を、氷冷された適切な滅菌容器内に収納し、生存能力の顕著な損失なしに利用可能な組織型すべてを摘出しかつ預けるために４０時間以内に中央施設に輸送することができることを新たに発見したことである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
造血細胞系統由来の内胚葉細胞分化転換の証拠
以前、マウスモデルにおいて、幹細胞は注入されたＢＭ細胞が変換されているものだと思われていた（例えば、非特許文献５５参照）が、特定の肝再生モデルにおける細胞融合の結果生じていることが発見された（例えば、非特許文献５６参照）。他の人もまた、ＢＭ  ＨＳＣ源由来の骨髄単核細胞が、幹細胞融合パートナーの主要源であることを発見した（例えば、非特許文献５７参照）。リナージ陽性細胞から分離されたＣＢ細胞は、減少手順に続く１週間の懸濁培養により、接着細胞群を形成し、これは肝細胞増殖培養液によるさらなる培養の後、肝細胞に対するマーカーを発現することが発見された（例えば、非特許文献５８参照）。ＣＢ  ＣＤ３４＋．ＣＤ３８−  ＣＤ７−移植後の免疫不全マウスによる生体内実験において、ＣＣｌ４で処理した肝臓中に肝細胞様細胞発生の証拠が報告され（例えば、非特許文献５９参照）、また、ごく最近、ヒツジ胎児を用いた非損傷モデルにおいて、ヒツジ胎児のＢＭ再構成を通じて、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−，ＣＤ３４−／Ｌｉｎ−，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−／ＣＤ３８−，ＣＤ３４−／Ｌｉｎ−／ＣＤ３８−，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−／ＣＤ１３３＋，ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−・ＣＤ１３３−を含むヒトＨＳＣからヒト肝細胞が生成された（例えば、非特許文献６０参照）。
胎盤由来の他の組織型の摘出及び預け入れ
摘出され、預けられ及び移植され得る、幅広い種類の組織（臍帯以外）の貴重な資源としての胎盤は、医療団体に徐々に受け入れられるようになってきている（例えば、非特許文献７５参照）。例えば、羊膜といわれる胎盤の一部、又は羊膜嚢の外膜は、胚幹細胞にその固有の能力を与え、あらゆる種類の特殊化した細胞にする２つの鍵遺伝子を発現する能力を含む胚幹細胞に非常によく似た特徴を有する細胞からなる。羊膜上皮細胞は、実際、適切な実験室条件下で、肝細胞、膵臓細胞、心臓細胞及び神経細胞を形成するように誘導され得る。他の例として、臍帯の初期の結合組織からなるワルトンゼリーがある。ワルトンゼリー幹細胞（ＷＪＳＣ）は、多数の細胞が容易に分離され、低い免疫原性及び免疫抑制のため移植により寛容であろうことを理由として、顕著な治療可能性を有している。前記細胞は、ＷＪＳＣが脂肪組織、骨、軟骨、骨格筋、心臓ミオサイト様細胞及び神経細胞を形成するように誘導され得るため、様々な遺伝的疾患及び後天的な疾患に対する細胞治療及び遺伝子治療を行う再生医療のために将来性のある重要な手段である。ＷＪＳＣは、タンパク質欠乏症、骨及び軟骨の疾患、心臓病、骨髄間質疾患、パーキンソン病のような神経疾患、多発性硬化症、脳血管障害（脳卒中）及び脳性麻痺さえも治療するために用いることができる。最後に、胎盤組織は、熱傷した皮膚、潰瘍性皮膚及び結膜異常の治療に直接用いられている。羊膜が抗炎症、静菌、鎮痛、創傷治療等の多くの有益な特性を有することが知られている。
【非特許文献１】KURTZBERG, J., LAUGHLIN, M., GRAHAM, M.L., SMITH, C., OLSON, J.F., HALPERIN, E.C., CIOCCI, G., CARRIER, C., STEVENS, C.E., and RUBINSTEIN, P. (1996). Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N Engl J Med 335, 157-166.
【非特許文献２】WAGNER, J.E., ROSENTHAL, J., SWEETMAN, R., SHU, X.O., DAVIES, S.M., RAMSAY, N.K., MCGLAVE, P.B., SENDER, L., and CAIRO, M.S. (1996). Successful transplantation of HLA-matched and HLA-mismatched umbilical cord blood from unrelated donors: analysis of engraftment and acute graft-versus-host disease. Blood 88, 795-802.
【非特許文献３】GLUCKMAN, E., ROCHA, V., BOYER-CHAMMARD, A., LOCATELLI, F., ARCESE, W., PASQUINI, R., ORTEGA, J., SOUILLET, G., FERREIRA, E., LAPORTE, J.P., FERNANDEZ, M., and CHASTANG, C. (1997). Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group. N Engl J Med 337, 373-381.
【非特許文献４】RUBINSTEIN, P., CARRIER, C., SCARADAVOU, A., KURTZBERG, J., ADAMSON, J., MIGLIACCIO, A.R., BERKOWITZ, R.L., CABBAD, M., DOBRILA, N.L., TAYLOR, P.E., ROSENFIELD, R.E., and STEVENS, C.E. (1998). Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med 339, 1565-1577.
【非特許文献５】BARKER, J.N., KREPSKI, T.P., DEFOR, T.E., DAVIES, S.M., WAGNER, J.E., and WEISDORF, D.J. (2002). Searching for unrelated donor hematopoietic stem cells: availability and speed of umbilical cord blood versus bone marrow. Biol Blood Marrow Transplant 8, 257-260.
【非特許文献６】WAGNER, J.E., BARKER, J.N., DEFOR, T.E., BAKER, K.S., BLAZAR, B.R., EIDE, C., GOLDMAN, A., KERSEY, J., KRIVIT, W., MACMILLAN, M.L., ORCHARD, P.J., PETERS, C., WEISDORF, D.J., RAMSAY, N.K., and DAVIES, S.M. (2002). Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 100, 1611-1618.
【非特許文献７】LAUGHLIN, M.J., EAPEN, M., RUBINSTEIN, P., WAGNER, J.E., ZHANG, M.J., CHAMPLIN, R.E., STEVENS, C., BARKER, J.N., GALE, R.P., LAZARUS, H.M., MARKS, D.I., VAN ROOD, J.J., SCARADAVOU, A., and HOROWITZ, M.M. (2004). Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N Engl J Med 351, 2265-2275.
【非特許文献８】LASKY, L.C., LANE, T.A., MILLER, J.P., LINDGREN, B., PATTERSON, H.A., HALEY, N.R., and BALLEN, K. (2002). In utero or ex utero cord blood collection: which is better? Transfusion 42, 1261-1267.
【非特許文献９】GEORGE, T.J., SUGRUE, M.W., GEORGE, S.N., and WINGARD, J.R. (2006). Factors associated with parameters of engraftment potential of umbilical cord blood. Transfusion 46, 1803-1812.
【非特許文献１０】HARRIS, D.T., SCHUMACHER, M.J., RYCHLIK, S., BOOTH, A., ACEVEDO, A., RUBINSTEIN, P., BARD, J., and BOYSE, E.A. (1994). Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation. Bone marrow transplantation 13, 135-143.
【非特許文献１１】COGLE, C.R., YACHNIS, A.T., LAYWELL, E.D., ZANDER, D.S., WINGARD, J.R., STEINDLER, D.A., and SCOTT, E.W. (2004). Bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation: a retrospective study. Lancet 363, 1432-1437.
【非特許文献１２】HRUBAN, R.H., LONG, P.P., PERLMAN, E.J., HUTCHINS, G.M., BAUMGARTNER, W.A., BAUGHMAN, K.L., and GRIFFIN, C.A. (1993). Fluorescence in situ hybridization for the Y-chromosome can be used to detect cells of recipient origin in allografted hearts following cardiac transplantation. Am J Pathol 142, 975-980.
【非特許文献１３】THEISE, N.D., NIMMAKAYALU, M., GARDNER, R., ILLEI, P.B., MORGAN, G., TEPERMAN, L., HENEGARIU, O., and KRAUSE, D.S. (2000). Liver from bone marrow in humans. Hepatology 32, 11-16.
【非特許文献１４】KORBLING, M., KATZ, R.L., KHANNA, A., RUIFROK, A.C., RONDON, G., ALBITAR, M., CHAMPLIN, R.E., and ESTROV, Z. (2002). Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells. N Engl J Med 346, 738-746.
【非特許文献１５】MULLER, P., PFEIFFER, P., KOGLIN, J., SCHAFERS, H.J., SEELAND, U., JANZEN, I., URBSCHAT, S., and BOHM, M. (2002). Cardiomyocytes of noncardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts. Circulation 106, 31-35.
【非特許文献１６】OKAMOTO, R., YAJIMA, T., YAMAZAKI, M., KANAI, T., MUKAI, M., OKAMOTO, S., IKEDA, Y., HIBI, T., INAZAWA, J., and WATANABE, M. (2002). Damaged epithelia regenerated by bone marrow-derived cells in the human gastrointestinal tract. Nat Med 8, 1011-1017.
【非特許文献１７】QUAINI, F., URBANEK, K., BELTRAMI, A.P., FINATO, N., BELTRAMI, C.A., NADAL-GINARD, B., KAJSTURA, J., LERI, A., and ANVERSA, P. (2002). Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med 346, 5-15.
【非特許文献１８】EGLITIS, M.A., and MEZEY, E. (1997). Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 4080-4085.
【非特許文献１９】BRAZELTON, T.R., ROSSI, F.M., KESHET, G.I., and BLAU, H.M. (2000). From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 290, 1775-1779.
【非特許文献２０】MEZEY, E., CHANDROSS, K.J., HARTA, G., MAKI, R.A., and MCKERCHER, S.R. (2000). Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 290, 1779-1782.
【非特許文献２１】SANCHEZ-RAMOS, J.R., SONG, S., KAMATH, S.G., ZIGOVA, T., WILLING, A., CARDOZO-PELAEZ, F., STEDEFORD, T., CHOPP, M., and SANBERG, P.R. (2001). Expression of neural markers in human umbilical cord blood. Exp Neurol 171, 109-115.
【非特許文献２２】CHEN, N., HUDSON, J.E., WALCZAK, P., MISIUTA, I., GARBUZOVA-DAVIS, S., JIANG, L., SANCHEZ-RAMOS, J., SANBERG, P.R., ZIGOVA, T., and WILLING, A.E. (2005). Human Umbilical Cord Blood Progenitors: The Potential of These Hematopoietic Cells to Become Neural. Stem cells (Dayton, Ohio).
【非特許文献２３】GOODWIN, H.S., BICKNESE, A.R., CHIEN, S.N., BOGUCKI, B.D., QUINN, C.O., and WALL, D.A. (2001). Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. Biol Blood Marrow Transplant 7, 581-588.
【非特許文献２４】SANCHEZ-RAMOS, J.R., SONG, S., KAMATH, S.G., ZIGOVA, T., WILLING, A., CARDOZO-PELAEZ, F., STEDEFORD, T., CHOPP, M., and SANBERG, P.R. (2001). Expression of neural markers in human umbilical cord blood. Exp Neurol 171, 109-115.
【非特許文献２５】BICKNESE, A.R., GOODWIN, H.S., QUINN, C.O., HENDERSON, V.C., CHIEN, S.N., and WALL, D.A. (2002). Human umbilical cord blood cells can be induced to express markers for neurons and glia. Cell Transplant 11, 261-264.
【非特許文献２６】SANCHEZ-RAMOS, J.R. (2002). Neural cells derived from adult bone marrow and umbilical cord blood. J Neurosci Res 69, 880-893.
【非特許文献２７】ZIGOVA, T., SONG, S., WILLING, A.E., HUDSON, J.E., NEWMAN, M.B., SAPORTA, S., SANCHEZ-RAMOS, J., and SANBERG, P.R. (2002). Human umbilical cord blood cells express neural antigens after transplantation into the developing rat brain. Cell Transplant 11, 265-274.
【非特許文献２８】MCGUCKIN, C.P., FORRAZ, N., ALLOUARD, Q., and PETTENGELL, R. (2004). Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and neuroglial progenitors in vitro. Exp Cell Res 295, 350-359.
【非特許文献２９】ESCOLAR, M.L., POE, M.D., PROVENZALE, J.M., RICHARDS, K.C., ALLISON, J., WOOD, S., WENGER, D.A., PIETRYGA, D., WALL, D., CHAMPAGNE, M., MORSE, R., KRIVIT, W., and KURTZBERG, J. (2005). Transplantation of umbilical-cord blood in babies with infantile Krabbe's disease. N Engl J Med 352, 2069-2081.
【非特許文献３０】GEKAS, C., DIETERLEN-LIEVRE, F., ORKIN, S.H., and MIKKOLA, H.K. (2005). The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell 8, 365-375
【非特許文献３１】OTTERSBACH, K., and DZIERZAK, E. (2005). The murine placenta contains hematopoietic stem cells within the vascular labyrinth region. Dev Cell 8, 377-387.
【非特許文献３２】FORTUNEL, N.O., OTU, H.H., NG, H.H., CHEN, J., MU, X., CHEVASSUT, T., LI, X., JOSEPH, M., BAILEY, C., HATZFELD, J.A., HATZFELD, A., USTA, F., VEGA, V.B., LONG, P.M., LIBERMANN, T.A., and LIM, B. (2003). Comment on " 'Stemness': transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells" and "a stem cell molecular signature". Science 302, 393; author reply 393.
【非特許文献３３】CAI, J., WEISS, M.L., and RAO, M.S. (2004b). In search of "stemness". Exp Hematol 32, 585-598.
【非特許文献３４】FORRAZ, N., PETTENGELL, R., and MCGUCKIN, C.P. (2004). Characterization of a lineage-negative stem-progenitor cell population optimized for ex vivo expansion and enriched for LTC-IC. Stem cells (Dayton, Ohio) 22, 100-108.
【非特許文献３５】KUCI, S., WESSELS, J.T., BUHRING, H.J., SCHILBACH, K., SCHUMM, M., SEITZ, G., LOFFLER, J., BADER, P., SCHLEGEL, P.G., NIETHAMMER, D., and HANDGRETINGER, R. (2003). Identification of a novel class of human adherent CD34- stem cells that give rise to SCID-repopulating cells. Blood 101, 869-876.
【非特許文献３６】KUCIA, M., HALASA, M., WYSOCZYNSKI, M., BASKIEWICZ-MASIUK, M., MOLDENHAWER, S., ZUBA-SURMA, E., CZAJKA, R., WOJAKOWSKI, W., MACHALINSKI, B., and RATAJCZAK, M.Z. (2006). Morphological and molecular characterization of novel population of CXCR4(+) SSEA-4(+) Oct-4(+) very small embryonic-like cells purified from human cord blood - preliminary report. Leukemia.
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【非特許文献４４】MIGISHIMA, F., OIKAWA, A., KONDO, S., EMA, H., MORITA, Y., NAKAUCHI, H., YOKOYAMA, M., SONG, S.Y., NISHIJIMA, M., OKABE, M., and SHINOHARA, N. (2003). Full reconstitution of hematopoietic system by murine umbilical cord blood. Transplantation 75, 1820-1826.
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【非特許文献４６】ZHOU, S., SCHUETZ, J.D., BUNTING, K.D., COLAPIETRO, A.M., SAMPATH, J., MORRIS, J.J., LAGUTINA, I., GROSVELD, G.C., OSAWA, M., NAKAUCHI, H., and SORRENTINO, B.P. (2001). The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med 7, 1028-1034.
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【非特許文献５２】SANCHEZ-RAMOS, J., SONG, S., CARDOZO-PELAEZ, F., HAZZI, C., STEDEFORD, T., WILLING, A., FREEMAN, T.B., SAPORTA, S., JANSSEN, W., PATEL, N., COOPER, D.R., and SANBERG, P.R. (2000). Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol 164, 247-256.
【非特許文献５３】SANCHEZ-RAMOS, J.R., SONG, S., KAMATH, S.G., ZIGOVA, T., WILLING, A., CARDOZO-PELAEZ, F., STEDEFORD, T., CHOPP, M., and SANBERG, P.R. (2001). Expression of neural markers in human umbilical cord blood. Exp Neurol 171, 109-115.
【非特許文献５４】BICKNESE, A.R., GOODWIN, H.S., QUINN, C.O., HENDERSON, V.C., CHIEN, S.N., and WALL, D.A. (2002). Human umbilical cord blood cells can be induced to express markers for neurons and glia. Cell Transplant 11, 261-264.
【非特許文献５５】LAGASSE, E., CONNORS, H., AL-DHALIMY, M., REITSMA, M., DOHSE, M., OSBORNE, L., WANG, X., FINEGOLD, M., WEISSMAN, I.L., and GROMPE, M. (2000). Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med 6, 1229-1234.
【非特許文献５６】WANG, X., WILLENBRING, H., AKKARI, Y., TORIMARU, Y., FOSTER, M., AL-DHALIMY, M., LAGASSE, E., FINEGOLD, M., OLSON, S., and GROMPE, M. (2003b). Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 422, 897-901.
【非特許文献５７】CAMARGO, F.D., FINEGOLD, M., and GOODELL, M.A. (2004). Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners. J Clin Invest 113, 1266-1270.
【非特許文献５８】MCGUCKIN, C.P., FORRAZ, N., BARADEZ, M.O., NAVRAN, S., ZHAO, J., URBAN, R., TILTON, R., and DENNER, L. (2005). Production of stem cells with embryonic characteristics from human umbilical cord blood. Cell Prolif 38, 245-255.
【非特許文献５９】WANG, X., GE, S., MCNAMARA, G., HAO, Q.L., CROOKS, G.M., and NOLTA, J.A. (2003a). Albumin-expressing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of highly purified human hematopoietic stem cells. Blood 101, 4201-4208.
【非特許文献６０】ALMEIDA-PORADA, G., PORADA, C.D., CHAMBERLAIN, J., TORABI, A., and ZANJANI, E.D. (2004). Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood 104, 2582-2590.
【非特許文献６１】Daley, J. P. ら., Focus 18:62-67 (1996)
【非特許文献６２】Pimentel, E., Ed., Handbook of Growth Factors Vol. III: Hematopoietic Growth Factors and Cytokines, pp. 1-2, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1994
【非特許文献６３】TAKEBE, N., XU, L.C., MACKENZIE, K.L., BERTINO, J.R., and MOORE, M.A. (2002). Methotrexate selection of long-term culture initiating cells following transduction of CD34(+) cells with a retrovirus containing a mutated human dihydrofolate reductase gene. Cancer Gene Ther 9, 308-320.
【非特許文献６４】TAKEBE, N., XU, L.C., MACKENZIE, K.L., BERTINO, J.R., and MOORE, M.A. (2002). Methotrexate selection of long-term culture initiating cells following transduction of CD34(+) cells with a retrovirus containing a mutated human dihydrofolate reductase gene. Cancer Gene Ther 9, 308-320.
【非特許文献６５】BELVEDERE, O., FERUGLIO, C., MALANGONE, W., BONORA, M.L., MINISINI, A.M., SPIZZO, R., DONINI, A., SALA, P., DE ANNA, D., HILBERT, D.M., and DEGRASSI, A. (2000). Increased blood volume and CD34(+)CD38(-) progenitor cell recovery using a novel umbilical cord blood collection system. Stem Cells 18, 245-251.
【非特許文献６６】BERTOLINI, F., LAZZARI, L., LAURI, E., CORSINI, C., CASTELLI, C., GORINI, F., and SIRCHIA, G. (1995). Comparative study of different procedures for the collection and banking of umbilical cord blood. J Hematother 4, 29-36.
【非特許文献６７】BRAZELTON, T.R., ROSSI, F.M., KESHET, G.I., and BLAU, H.M. (2000). From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 290, 1775-1779.
【非特許文献６８】DONALDSON, C., ARMITAGE, W.J., LAUNDY, V., BARRON, C., BUCHANAN, R., WEBSTER, J., BRADLEY, B., and HOWS, J. (1999). Impact of obstetric factors on cord blood donation for transplantation. British journal of haematology 106, 128-132.
【非特許文献６９】GAGE, F., BARHYTE, D.Y., KOWALSKI, A.E., LIGHT, J.A., WILMER, R., and CALLENDER, C.O. (1997). A comparison study of the Belzer machine preservation solution with and without penicillin. Transplant Proc 29, 3643.
【非特許文献７０】LEESER, D.B., BINGAMAN, A.W., POLIAKOVA, L., SHI, Q., GAGE, F., BARTLETT, S.T., and FARNEY, A.C. (2004). Pulsatile pump perfusion of pancreata before human islet cell isolation. Transplant Proc 36, 1050-1051.
【非特許文献７１】RUBINSTEIN, P., ROSENFIELD, R.E., ADAMSON, J.W., and STEVENS, C.E. (1993). Stored placental blood for unrelated bone marrow reconstitution. Blood 81, 1679-1690.
【非特許文献７２】SHLEBAK, A.A., ROBERTS, I.A., STEVENS, T.A., SYZDLO, R.M., GOLDMAN, J.M., and GORDON, M.Y. (1998). The impact of antenatal and perinatal variables on cord blood haemopoietic stem/progenitor cell yield available for transplantation. Br J Haematol 103, 1167-1171.
【非特許文献７３】TURNER, C.W., LUZINS, J., and HUTCHESON, C. (1992). A modified harvest technique for cord blood hematopoietic stem cells. Bone marrow transplantation 10, 89-91.
【非特許文献７４】WAGNER, J.E., BROXMEYER, H.E., and COOPER, S. (1992). Umbilical cord and placental blood hematopoietic stem cells: collection, cryopreservation, and storage. J Hematother 1, 167-173.
【非特許文献７５】PAROLINI, O., ALVIANO, F., et al. (2008). Concise Review: Isolation and Characterization of Cells from Human Term Placenta: Outcome of the First International Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells 26, 300-311.
【非特許文献７６】JAATINEN, T., HEMMORANTA, H., HAUTANIEMI, S., NIEMI, J., NICORICI, D., LAINE, J., YLI-HARJA, O., AND PARTANEN, J. (2006). Global Gene Expression Profile of Human Cord Blood-Derived CD133+ Cells. Stem Cells 24, 631-641.
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、胎盤から臍帯血（ＣＢ）由来の肝細胞を回収する革新的な方法、組織全体を摘出し、分娩後４０時間以内の運搬により中央施設に預けるために胎盤を安全に長時間維持して冷却輸送する容易な方法、及び回収した幹細胞を用いる方法を提供することを目的とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の第１の態様は、胎盤灌流を胎盤灌流機械灌流（ＰＭＰＰ）によって行うことができる。ＰＭＰＰは、通常、静脈穿刺（針とシリンジとを用い臍帯血管から吸引する方法）若しくは重力による排出などの従来の方法のいずれかと組み合わせて、又は事前の回収を行わずに行うことができる。ＰＭＰＰは、抗凝固剤を含む組織灌流液を用い、臍帯細胞を洗浄し、次に、生じた幹細胞を含む灌流液を回収するようにして行うことができる。このような方法は、凝固を防ぐために分娩後の胎盤中に抗凝固剤を調整又は投与する必要がない。分離された前記胎盤を、灌流の前に、例えば、氷上に配置されて冷却することができる。もし、胎盤の分離後１時間以内に灌流が行われるのであれば、該胎盤は灌流前に冷却する必要がない。本発明の方法は、前記胎盤が灌流の開始前に抗凝固剤が調整又は投与されているとしても、まだ行うことができる。もし、臍帯血細胞が先ず従来の方法を用いて回収されている場合、ＰＭＰＰで得られる残余の臍帯血細胞を、始めに回収した細胞に加えることができる。前記ＰＭＰＰで得た臍帯血細胞は、予備の細胞として保存することもでき、また、将来の細胞移植片工学及び再生医療のために保存するようにしてもよい。前記胎盤から臍帯血幹細胞を直ちに取り除く必要がないという便益、及び、中央施設までにさらなる準備をする必要なく、氷上に直接送るだけでよいという能力により、本発明の方法は、組織全体を摘出し、預けるため、中央施設に胎盤を輸送することにより、現在確立している臍帯血細胞バンクシステムに組み込むために魅力的な可能性を有している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の方法は、いくつかの態様において、前記全採血されていないか又は一部採血されているほ乳類の胎盤を、臍帯血幹細胞が実質的に存在しないほ乳類の胎盤を作製するのに十分な条件下で、例えば、脈動灌流となるように、前記灌流液の圧力に依存する流れを形成させて灌流する工程を備えている。また、すべての血管内血液を実質的になしにするか、又は完全になしにすることにより、血液による他の摘出した胎盤組織との相互汚染を最小限に確保する。さらなる態様として、前記胎盤灌流は、ペリスタポンプを用いて行われる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の方法におけるいくつかの態様として、前記分離された胎盤は、該胎盤の分離から灌流の開始までの間、冷却又は氷上に維持される。いくつかの態様において、前記冷却され分離された胎盤は、前記灌流が行われる前、冷凍しないよう、０〜６℃の範囲の温度、又は１〜４℃の範囲の温度に維持される。他の態様では、前記灌流を行う前に、前記胎盤は、４〜１０℃の範囲の温度に４時間の間維持される。１態様として、前記胎盤は、前記灌流が行われる前、４℃に維持される。ある種の態様では、前記分離され冷却された胎盤は、該胎盤の分離から灌流の開始までの間、４０時間以上の範囲の時間維持され、組織型に誘導された他の胎盤の全体的な摘出を促進し、４０時間以内の運搬により中央施設に預ける。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の方法の１態様において、前記胎盤は、臍動脈又は臍静脈を用いる閉鎖系を介して灌流が行われる。いくつかの態様では、前記胎盤を灌流し、分娩後４０時間までに生存可能な幹細胞を含む臍帯血を取り除き、施設に集中的に摘出して預け、世界中の広範な地理的地域に提供することができる。ある態様では、前記胎盤を灌流し、生存可能な分娩後最高６〜４０時間の範囲内である幹細胞を含む臍帯血を取り除いた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の方法において、ある態様では、前記分離された初期造血幹細胞表現型は、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、Ｔｈｙ１＋細胞、Ｌｉｎ−細胞、ＣＸＣＲ４細胞、ＡＬＤＨｈｉｇｈ細胞、ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞、ＳＳＥＡ−３＋細胞、ＳＳＥＡ−４＋細胞、ＴＲＡ−１−６０細胞、ＴＲＡ−１−８１細胞又はこれらの組合せの一つ以上を含んでいる。さらなる態様として、前記分離された幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞、又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞以外に分化することができる初期造血幹細胞表現型を備える。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明の方法では、いくつかの態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、１つの胎盤から得られる総単核細胞数を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約１．５倍に増加させることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
本発明の方法のさらなる態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られる濃縮ＣＤ１３３＋細胞の割合を、針とシリンジとのみを用いて臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約５倍にすることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
本発明の方法のさらなる態様として、前記ＰＭＰＰにより得た灌流液に、例えば、針とシリンジのような従来の採血方法により臍血管から吸引した臍帯血を加えることで、得られるＣＤ１３３＋細胞群の数を、針とシリンジとだけで臍血管から臍帯血を吸引した場合に比較して、約７倍に高くすることができる。もし本発明の灌流方法を行う前に採血を行わなかった場合でも、それに相当する全ての細胞を回収することが可能である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５、００３６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
臍帯血幹細胞を回収する方法は、全採血されていないか又は一部採血されている分離されたほ乳類（ウマを含むあらゆる種）の胎盤を、灌流液で灌流（例えば、脈動灌流）し、臍帯血幹細胞を含む灌流液を得る工程と、該臍帯血を含む灌流液を回収する工程と、該灌流液から臍帯血幹細胞を分離し、臍帯血幹細胞を得る工程とを備える。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
造血幹細胞は、新生細胞の連続的な供給源を維持するため、自己複製能を有する希少な初期血球細胞前駆体であり、血球細胞系統の様々な形態学的に認識される前駆細胞に分化する。このような前駆細胞は、未成熟な血球細胞であり、自己複製能が無く、赤血球、リンパ球及び骨髄性細胞を含む成熟血球細胞に分化することになる。骨髄微小環境の中で、前記幹細胞は、一生を通じて、自己複製すると共に、全ての成熟した血球細胞系統の継続的な産生を活発に維持する。
ＣＤ１３３＋細胞から誘導されたヒト臍帯血は、造血幹細胞移植においてＣＤ３４＋に置換されるように提供する初期の造血細胞の特性を有する（非特許文献７６参照）。ＣＤ３４＋細胞とは異なり、ＣＤ１３３＋細胞は、自己複製能及び分化能を有する高度に関係性のないものと考えられている。ＣＤ３４＋細胞に比較して、より同質な細胞集団である。さらに、ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３−細胞より、高度なコロニー形成能を有することが示されている。ＣＤ１３３発現は、ＣＤ３４発現と必ずしも関連しない（非特許文献７６参照）。