(57)【要約】  例えば、多重化ＰＣＲアッセイ（例えば、多重化イムノＰＣＲアッセイ）等のアッセイを改善する為の化合物、組成物、キット、システム、デバイス及び方法が提供される。本発明の幾つかの実施形態によれば、固体支持体（例えば、ビーズ）が提供され得る。固体支持体は、コード化剤（例えば、色素）、核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド及び／又はプライマー）、及び分子認識要素（例えば、抗体）を含み得る。本発明の幾つかの実施形態によれば、検出試薬が提供され得る。検出試薬は、分子認識要素（例えば、抗体）及び核酸タグを含み得る。幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列の少なくとも一部及び検出試薬の核酸タグの少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されている。固体支持体及び検出試薬は同じ標的に結合する事ができ、それにより試薬ペアが形成される。【選択図】図６
2022501005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下：
コード化剤（例えば、色素）、
第１の核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド及び／又はプライマー）、及び
第１の分子認識要素（例えば、抗体）
を含む固体支持体（例えば、ビーズ）と、
（ｉｉ）第２の分子認識要素（例えば、抗体）及び第２の核酸配列を含む検出試薬と、
を含むキットであって、
前記第１の核酸配列の少なくとも一部及び前記第２の核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されている、キット。
【請求項２】
前記固体支持体はリンカー（例えば、特異的結合ペアの１つの成員）を更に含み、前記リンカーは、前記固体支持体の表面上にあり、任意に、前記固体支持体は、複数のリンカーで被覆及び／又は官能化されている、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の分子認識要素及び／又は前記第１の核酸配列は、前記リンカー（例えば、特異的結合ペアの１つの成員）に（例えば、共有結合及び／又は非共有結合で）取り付けられている、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記第１の分子認識要素は、ビオチン化分子認識要素であり、前記第１の分子認識要素は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記第１の核酸配列は、ビオチン化されており、前記第１の核酸配列は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
前記第１の核酸配列は、約１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド又は２５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド又は６０ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記第２の核酸配列は、約２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド又は６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド又は３００ヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記第２の核酸配列は、前記第１の核酸配列中の配列（例えば、約５個以上の連続したヌクレオチド）と実質的に同一である配列（例えば、約５個以上の連続したヌクレオチド）を含み、任意に、前記第１の核酸配列中の配列と実質的に同一である配列は、前記第２の核酸配列の５’領域中に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列は一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列は二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列はＲＮＡである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列は、１つ以上の化学修飾された塩基（例えば、天然には通常見られない１つ以上の化学修飾された塩基）を含み、任意に、前記化学修飾された塩基は、ＰＣＲ反応の特異性を向上させ、及び／又は核酸配列（例えば、オリゴ）間の非特異的結合を減少させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
前記第２の核酸配列は、前記第２の分子認識要素に共有結合で取り付けられている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記第２の分子認識要素は抗体であり、前記第２の核酸配列は、前記抗体の１つ以上のアミノ酸に取り付けられており、任意に、前記第２の核酸配列は、前記抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域に共有結合で取り付けられている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
増幅剤（例えば、リバースプライマー、ｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼ等）を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記増幅剤は、前記第２の核酸配列の一部に相補的である核酸配列を有し、任意に、前記第２の核酸配列の一部は、前記第２の核酸配列の３’領域中にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記増幅剤は、前記固体支持体に取り付けられており、任意に、前記増幅剤はビオチン化されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
前記固体支持体及び前記検出試薬は別々に保管され、及び／又は前記検出試薬及び存在する場合には前記増幅剤は別々に保管される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記固体支持体及び前記増幅剤は、前記増幅剤が存在して前記固体支持体に取り付けられていない場合に、別々に保管される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
コード化剤（例えば、色素）、
核酸配列、及び
分子認識要素（例えば、抗体）
を含む、固体支持体（例えば、ビーズ）。
【請求項２１】
リンカー（例えば、結合ペアの１つの成員）を更に含み、前記リンカーは、前記固体支持体の表面上にあり、任意に、前記固体支持体は、複数のリンカーで被覆及び／又は官能化されている、請求項２０に記載の固体支持体。
【請求項２２】
前記分子認識要素及び／又は前記核酸配列は、前記リンカーに取り付けられている、請求項２０又は２１に記載の固体支持体。
【請求項２３】
前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記分子認識要素は、ビオチン化分子認識要素であり、前記分子認識要素は、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２４】
前記リンカーは、ストレプトアビジンであり、前記核酸配列は、ビオチン化されており、ストレプトアビジン及びビオチンの結合を介して前記固体支持体に取り付けられている、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２５】
前記核酸配列は、約１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド又は２５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド又は６０ヌクレオチドを含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項２６】
第１のコード化シグナルを提供する第１のコード化剤（例えば、色素）、
第１の核酸配列、及び
第１の分子認識要素（例えば、抗体）
を各固体支持体が含む第１の複数の固体支持体と、
第２のコード化シグナルを提供する第２のコード化剤（例えば、色素）、
第２の核酸配列、及び
第２の分子認識要素（例えば、抗体）
を各固体支持体が含む第２の複数の固体支持体と
を含む複数の固体支持体であって、
前記第１のコード化シグナルは、前記第２のコード化シグナルとは異なり、前記第１の核酸配列は、前記第２の核酸配列とは異なり、且つ前記第１の分子認識要素は、前記第２の分子認識要素とは異なる、複数の固体支持体。
【請求項２７】
第１の分子認識要素（例えば、抗体）及び
第１の核酸配列
を各検出試薬が含む第１の複数の検出試薬と、
第２の分子認識要素（例えば、抗体）及び
第２の核酸配列
を各検出試薬が含む第２の複数の検出試薬と
を含む複数の検出試薬であって、
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列は、それぞれ第１の部分及び第２の部分を含み、
前記第１の核酸配列についての前記第１の部分の核酸配列は、前記第２の核酸配列についての前記第１の部分の核酸配列とは異なり、且つ前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列についての前記第２の部分の核酸配列は同じである、複数の検出試薬。
【請求項２８】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列についての第１の部分は、それぞれの配列の５’領域中にあり、前記第２の部分は、それぞれの配列の３’領域中にある、請求項２７に記載の複数の検出試薬。
【請求項２９】
試料中の標的を検出する方法であって、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキットの固体支持体、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の固体支持体、又は請求項２６に記載の複数の固体支持体の固体支持体と標的を含む試料とを混ぜ合わせて、標的に結合された固体支持体を含む第１の組成物を形成する事と、
任意に、前記標的が結合された固体支持体を（例えば、水溶液で）洗浄する事と、
検出試薬と前記標的が結合された固体支持体とを混ぜ合わせて、固体支持体、標的、及び検出試薬を含む複合体を形成する事と、ここで、前記検出試薬は、第２の分子認識要素及び第２の核酸配列を含み、前記第１の核酸配列の少なくとも一部及び前記第２の核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されており、
任意に、前記複合体を（例えば、水溶液で）洗浄する事と、
任意に、増幅剤（例えば、リバースプライマー、ｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼ等）と前記複合体とを混ぜ合わせる事と、
任意に、前記固体支持体から前記第１の核酸配列を放出させる事と、
前記第２の核酸配列の少なくとも一区画を増幅する事により、前記試料中の標的を検出する事と
を含む、方法。
【請求項３０】
前記増幅剤と前記複合体とを混ぜ合わせる事を含み、前記増幅剤と前記複合体とを混ぜ合わせる事は、前記固体支持体から前記増幅剤を放出する事を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出試薬は、前記第１の組成物中に存在する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅剤は前記第１の組成物中に存在し、任意に、前記増幅剤（例えば、リバースプライマー）は、前記固体支持体に取り付けられている、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
近接ライゲーションアッセイ又は近接伸長アッセイを使用して実施される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
アッセイシグナル（例えば、蛍光シグナル、例えば、ｄｓＤＮＡにインターカレートする色素から又はクエンチャー及び色素を含むプローブの加水分解からの蛍光シグナル等）を検出する事により前記標的を検出する事を更に含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスにおいて実施される多重化アッセイ（例えば、イムノポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）アッセイ）であり、複数のウェルの少なくとも１つのウェルにおいて前記固体支持体を１つ以上の更なる固体支持体から隔離する事を更に含む、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイに関する特異性を向上させる及び／又はバックグラウンドシグナルを低減させる方法であって、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキットの固体支持体、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の固体支持体、又は請求項２６に記載の複数の固体支持体を準備する事と、
前記固体支持体又は前記複数の固体支持体の存在下にアッセイを行う事により、前記アッセイに関する特異性を向上させる及び／又はバックグラウンドシグナルを低減させる事と
を含む、方法。
【請求項３８】
前記アッセイは、多重化イムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）アッセイである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体又は前記複数の固体支持体中の固体支持体と非標的分子（例えば、誤った抗原）との間で観察される交差反応性を減らす、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記固体支持体又は前記複数の固体支持体中の固体支持体の観察される非特異的結合を減らす、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府支援の記載）
本発明は、米国国防総省（ＤＡＲＰＡ）によって授与された助成金番号ＨＲ００１１−１２−２−０００１による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、例えば、多重化イムノＰＣＲアッセイ等のアッセイを改善する為の化合物、組成物、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質等の標的分子についてのイムノアッセイは、一般的に、最初に標的分子を捕捉した後に定量化する事ができる様に標識する分子認識要素（例えば、抗体又はアプタマー等）のペアに基づくものである。一般的には、捕捉抗体は、マイクロウェルプレートの壁部又はマイクロビーズの表面等の固体支持体に結合されている。試料を抗体で被覆された表面と共にインキュベートする事で、標的分子が捕捉される。試料マトリックスを除去する洗浄工程の後に、捕捉された標的分子は、レポーター分子（タグ）に直接コンジュゲートされているか又は後にタグにカップリングし得る連結試薬（例えば、ビオチン）にコンジュゲートされているかのいずれかであり得る検出認識要素（例えば、抗体又はアプタマー等）で標識される。或いは、検出認識要素は、タグによって更に検出される二次抗体を用いて検出する事ができる。タグには、直接的観察によって又は化学的アッセイ若しくは生化学的アッセイによって検出する事ができるナノ粒子、色素、酵素、又は核酸（ＮＡ）が含まれ得る。
【０００４】
高感度を必要としない用途では、タグは、金ナノ粒子（ラテラルフロー型のアッセイでは一般的）又は直接検出する事ができる蛍光色素であり得る。直接標識を使用する一般的なイムノアッセイの１つは、ルミネックス・コーポレーション（Luminex Corp）社によって製品化されている。このアッセイでは、コード化されたマイクロビーズセットを使用して多重化イムノアッセイが行われる。各ビーズセットは、ユニークな色素の組み合わせでビーズを染色する事によってコード化されている。更に、各ビーズセットは、異なる親和性試薬（例えば、抗体、抗原等）で官能化されている。これらのビーズを一緒に混ぜる事で、マルチプレックスビーズライブラリーを形成する事ができる。アッセイの間に、これらのビーズを試料と共にインキュベートする事で、標的が存在するならば標的分子が捕捉される。ビーズを洗浄した後に、レポーター色素で標識された検出抗体又は後にストレプトアビジン結合レポーター色素で標識する事ができる様にビオチン化された検出抗体と共にインキュベートする。フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡法を使用して、コード化色素の組み合わせ（ビーズのタイプを特定する為）と各ビーズについてのアッセイシグナル（即ち、レポーター色素からのシグナル）の両方を測定する。試料中の標的分子の濃度は、各ビーズタイプについて測定された平均アッセイシグナルを検量線と比較する事によって決定される。このアプローチでは、捕捉された標的分子は、検出抗体に取り付けられた蛍光体の数又はそのビオチン化の程度に応じて、凡そ１個〜５個の蛍光体で標識される。
【０００５】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、シグナル増幅を使用してアッセイ感度を向上させる良く知られたイムノアッセイである。ＥＬＩＳＡは、親和性試薬ペアを使用して、標的分子を捕捉し、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルクロニダーゼ又はガラクトシダーゼ等の酵素で標識する。次いで、酵素を使用する事で、基質は濃度依存的に検出可能な生成物に変換される為、標的分子の濃度を決定する事ができる（図１）。１つの酵素標識が多くの基質分子を検出可能な生成物分子に迅速に変換する事ができる為、このアプローチは一般に、直接標識アプローチよりも高感度である。
【０００６】
ＥＬＩＳＡでは、捕捉抗体はマイクロウェルプレートの表面等の固相に結合されており、蛍光プレートリーダー等のリーダーを使用してアナログシグナルが測定される。多重化は、異なる捕捉抗体を含み、異なる検出抗体が添加されるマイクロウェルプレートの異なるウェル間に試料が分けられている空間内で実施され得る。単一容器多重化を行う事もできるが、標的毎に異なる酵素と基質のペアが必要となり、更なる複雑さが増す事から、一般的に実用的ではない。或いは、捕捉抗体をマイクロビーズ又は磁性マイクロビーズに連結させて、より取り扱い易くする事ができる、又はワークフローを改善する事もできる（図１）。
【０００７】
ＥＬＩＳＡに加えて、タンパク質及びその他の分子は、イムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を使用して定量化する事ができる。このアプローチは、ＥＬＩＳＡと同様の親和性試薬を使用するが、ＥＬＩＳＡとは異なり、検出試薬（例えば、抗体）は、酵素ではなく核酸（ＮＡ）タグで標識されている。ＮＡタグは、抗体に共有結合で連結させる事ができ（コンジュゲートを形成する）、又はビオチン−ストレプトアビジン結合等の相互作用によって連結させる事もできる。タグは通常、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって増幅されて、標的分子の濃度が決定される。ＥＬＩＳＡと同様に、ｉＰＣＲは、捕捉抗体で被覆されたマイクロウェルプレートを使用してアナログシグナル形式で行われ得る。免疫複合体はそのままの状態にしておく事も、又は分離してＮＡタグを放出させた後にＰＣＲを行う事もできる。放出されたタグは、液滴又はマイクロウェルアレイ形式でデジタルＰＣＲを使用して検出する事ができる為、より高精度の定量化がもたらされる。多重化は、試料をシングルプレックス反応間で分ける事によって、又は単一反応で複数のユニークなタグ配列と共に異なる色のプローブセットを使用する事によって実現する事ができる。
【０００８】
ＥＬＩＳＡと同様に、ビーズに結合された捕捉抗体を使用してｉＰＣＲを行う事もできる（図２）。異なるコード化がなされたビーズセットは、別々の捕捉抗体で官能化されている為、各ビーズに結合された捕捉抗体の個性を光シグナル（例えば、ビーズに取り付けられた又は埋め込まれた異なる濃度の複数の色素からの蛍光）からデコード化する事ができる。異なるビーズセットを一緒に混ぜる事で、単一試料において複数の分析物を定量化する事ができるビーズライブラリー又はアッセイパネルを形成する事ができる（図３）。
【０００９】
典型的なビーズベースのｉＰＣＲアッセイでは、ビーズを試料と共にインキュベートして、標的分子を捕捉し、洗浄して試料マトリックスを除去した後に、検出抗体により標識する（図４）。検出抗体が核酸タグに共有結合で連結されている場合に（即ち、検出抗体−ＮＡコンジュゲート又は「検出コンジュゲート」）、免疫複合体は完成している。しかしながら、検出抗体がビオチン化されている場合に、これらのビーズはストレプトアビジン及びビオチン化ＮＡタグと共に続けてインキュベートされる。定量的ＰＣＲを使用して、ＮＡタグの数、従って当初の試料の濃度が決定される。多重化アッセイは、各標的分子が異なるペアの捕捉抗体と検出抗体を必要とする為、シングルプレックスアッセイよりも複雑である。
【００１０】
上記のデジタルＥＬＩＳＡと同様に、デジタルｉＰＣＲアッセイでは、ビーズを個々の反応ウェルにロードする事で、ＰＣＲ反応は互いに分離される。殆どのウェルには、１つだけのビーズと、タグ配列を増幅するプライマーを含む少量のＰＣＲマスターミックスが収容されている。ＰＣＲ増幅は、例えば非混和性オイルでウェルをシールした後に行われる。ビーズの個性は、光学的特性（例えば、１つ以上の波長での蛍光強度等）を調べる事によって決定される。ＰＣＲ陽性ビーズは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）にインターカレートする色素又は加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の蛍光シグナルを測定する事等の幾つかの方法により特定する事ができる。
【００１１】
低い標的分子濃度では、殆どのビーズは検出コンジュゲートを有しないか又は１つの検出コンジュゲートを有し、ＰＣＲ陽性ビーズ（即ち、デジタルシグナル）のパーセンテージをポアソン統計と共に使用して、ビーズ当たりの検出コンジュゲートの平均数、従って試料中の標的分子の濃度を決定する事ができる。高い標的濃度では、殆どのビーズは２つ以上の検出コンジュゲートを有し得る為、アナログシグナル（例えば、標的分子の集合のリアルタイムＰＣＲ又は別の定量的測定）を使用して、各ビーズ上の検出コンジュゲートの数を決定する事ができる。デジタルＰＣＲシグナル及びアナログＰＣＲシグナルを組み合わせると、非常に大きなダイナミックレンジ（一定の条件下で最大約１０１０）がもたらされる一方で、低い標的濃度でのデジタルＰＣＲの正確な定量能力は維持される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先に詳説された全てのイムノアッセイでは、検出親和性試薬（例えば、抗体）の濃度を各標的分子につき最適化せねばならない。例えば、検出抗体濃度が低すぎると、捕捉された標的分子が効率的に標識されない為、アッセイは不十分な感度を有する事となる。検出抗体濃度が高まると、より多くの捕捉された標的分子が標識される為、感度は向上するが、これはアッセイのバックグラウンドシグナルを増加させる可能性もある。バックグラウンドシグナルの増加は、マイクロウェル若しくはマイクロビーズ表面への検出試薬の非特異的結合（ＮＳＢ）、捕捉抗体との相互作用、又はビーズベースのイムノアッセイにおけるビーズのコード化色素との相互作用によって屡々引き起こされる。残念な事に、適切に形成された免疫複合体（図５、複合体Ａ）に由来する陽性シグナルを、捕捉抗体と検出抗体との間の相互作用（図５、複合体Ｂ）、捕捉抗体とＮＡタグとの相互作用（図５、複合体Ｃ）、又はＮＡタグとビーズ表面との相互作用（図５、複合体Ｄ）等の非特異的相互作用から区別する事は不可能である。検出抗体コンジュゲートの抗体部分がビーズ表面と相互作用する場合もあり（図５、複合体Ｅ）、検出抗体と、ビーズ又は捕捉抗体に特異的又は非特異的に結合した可能性のある試料マトリックス中の他のタンパク質との間でＮＳＢが起こる場合がある事に留意すべきである。
【００１３】
上記のＮＳＢ相互作用は、シングルプレックスアッセイをマルチプレックスパネルへと組み合わせる場合に一層深刻になり、検出抗体濃度及びその他のアッセイパラメーターを再び最適化させる事が屡々必要となる。マルチプレックスアッセイにおいてＮＳＢが増加する主な理由は、より多くの標的分子がアッセイに加えられると、総検出抗体濃度が増加し、一般的にＮＳＢから観察されるシグナルが増加する為である。更に、抗体とオフターゲット分子との間の交差反応性は、マルチプレックスアッセイ形式ではより大きな問題になり得る。アッセイシグナルに影響を与え得る交差反応性には多くの形がある。例えば、抗原が誤った（オフターゲット）捕捉抗体に結合し、その後にそれ自体の検出抗体によって検出される場合がある為、偽陽性シグナルが生ずる事となる。同様の例では、抗原は誤った（オフターゲット）捕捉抗体に結合する場合があるが、検出抗体によって検出されない。この場合に、誤って捕捉された抗原は、実際の標的の結合に続いてその検出を遮断（即ち、競合的に阻害）する場合があり、その結果、偽陰性シグナルが生ずる。
【００１４】
交差反応性及びＮＳＢによるシグナルは、より感度の低い直接標識アッセイ又はバルクのアナログアッセイでは時々軽減される場合があるが、デジタルアッセイ性能にはビーズ毎の単一のＮＳＢイベントでさえも有害となり得るので、このシグナルは単一分子アッセイにとってはかなり重大な問題である。検出化学物質間のＮＳＢ及び交差反応性は信号対雑音比を大幅に減少させ、検出限界を引き上げる為、高感度のマルチプレックスアッセイは、通常、約５個〜１０個の異なる標的に制限される。
【００１５】
先で強調した問題に加えて、多重化ＰＣＲは屡々、オフシーケンス増幅（off-sequence amplification）及びプライマーセットとプローブセットとの間の競合に見舞われる。より高レベルの多重化で高感度のｉＰＣＲアッセイを実現するには、別のアプローチが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の態様は、例えば、多重化ＰＣＲアッセイ（例えば、多重化イムノＰＣＲアッセイ）等のアッセイを改善する為の化合物、組成物、キット、システム、デバイス及び方法に関する。
【００１７】
本発明の一態様は、（ｉ）コード化剤（例えば、色素）、第１の核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド及び／又はプライマー）及び第１の分子認識要素（例えば、抗体）を含む固体支持体（例えば、ビーズ）と、（ｉｉ）第２の分子認識要素（例えば、抗体）及び第２の核酸配列を含む検出試薬とを含み、且つ上記第１の核酸配列の少なくとも一部及び上記第２の核酸配列の少なくとも一部が、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されているキットに関する。幾つかの実施形態では、固体支持体及び検出試薬は別々に保管される。幾つかの実施形態では、固体支持体及び検出試薬は、同じ組成物中に存在し、並びに／又は一緒に保管される及び／若しくは提供される。
【００１８】
本発明の別の態様は、コード化剤（例えば、色素）、核酸配列、及び分子認識要素（例えば、抗体）を含む固体支持体（例えば、ビーズ）に関する。
【００１９】
本発明の更なる態様は、（ｉ）第１のコード化シグナルを提供する第１のコード化剤（例えば、色素）、第１の核酸配列、及び第１の分子認識要素（例えば、抗体）を各固体支持体が含む第１の複数の固体支持体と、（ｉｉ）第２のコード化シグナルを提供する第２のコード化剤（例えば、色素）、第２の核酸配列、及び第２の分子認識要素（例えば、抗体）を各固体支持体が含む第２の複数の固体支持体とを含む複数の固体支持体であって、上記第１のコード化シグナルは、上記第２のコード化シグナルとは異なり、上記第１の核酸配列は、上記第２の核酸配列とは異なり、且つ上記第１の分子認識要素は、上記第２の分子認識要素とは異なる、複数の固体支持体に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、（ｉ）第１の分子認識要素（例えば、抗体）及び第１の核酸配列を各検出試薬が含む第１の複数の検出試薬と、（ｉｉ）第２の分子認識要素（例えば、抗体）及び第２の核酸配列を各検出試薬が含む第２の複数の検出試薬とを含む複数の検出試薬であって、上記第１の核酸配列及び上記第２の核酸配列は、それぞれ第１の部分及び第２の部分を含み、且つ上記第１の核酸配列についての上記第１の部分の核酸配列は、上記第２の核酸配列についての上記第１の部分の核酸配列とは異なる、複数の検出試薬に関する。幾つかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列についての第２の部分の核酸配列は同じである。
【００２１】
本発明の更なる態様は、試料中の標的を検出する方法であって、本明細書に記載される固体支持体と標的を含む試料とを混ぜ合わせて、標的に結合された固体支持体を含む第１の組成物を形成する事と、任意に上記標的が結合された固体支持体を（例えば、水溶液で）洗浄する事と、検出試薬と上記標的が結合された固体支持体とを混ぜ合わせて、固体支持体、標的、及び検出試薬を含む複合体を形成する事と、ここで、上記検出試薬は、第２の分子認識要素及び第２の核酸配列を含み、且つ上記第１の核酸配列の少なくとも一部及び上記第２の核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されており、任意に、上記複合体を（例えば、水溶液で）洗浄する事と、任意に、増幅剤（例えば、リバースプライマー、ｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼ等）と上記複合体とを混ぜ合わせる事と、任意に、上記固体支持体から核酸配列を放出させる事と、上記第２の核酸配列の少なくとも一区画を増幅する事により、試料中の標的を検出する事とを含む、方法に関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、アッセイに関する特異性を向上させる及び／又はバックグラウンドシグナルを低減させる方法であって、本明細書に記載される固体支持体又は本明細書に記載される複数の固体支持体を準備する事と、上記固体支持体又は上記複数の固体支持体の存在下でアッセイを行う事により、アッセイに関する特異性を向上させる事及び／又はバックグラウンドシグナルを低減させる事とを含む、方法に関する。
【００２３】
一実施形態に関して記載された本発明の態様は、それに関連して具体的に記載されていなくても、異なる実施形態に組み込まれ得る事に留意されたい。即ち、全ての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、如何様にも及び／又はあらゆる組み合わせで組み合わされる事ができる。出願人は、当初提出された任意のクレームを補正して、当初はその様にクレームされていないとしても任意のその他の１つ以上のクレームの任意の特徴に従属させる及び／又は組み込む事ができる権利を含む、当初提出された任意のクレームを変更する及び／又は任意の新たなクレームを提出する権利を保有している。本発明のこれらの及びその他の目的及び／又は態様は、以下に示される明細書で詳細に説明されている。本発明の更なる特徴、利点及び詳細は、図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読む事で当業者によって理解され、その様な説明は本発明の単なる例示にすぎない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＬＩＳＡで使用する為の例示的な親和性試薬ペアから形成された複合体の概略図である。
【図２】ｉＰＣＲで使用する為の例示的な親和性試薬ペアから形成された複合体の概略図である。
【図３】別々の捕捉抗体で官能化された、各ビーズセットが異なる検出抗体に対応する３つの異なるコード化されたビーズセットの概略図である。
【図４】ビーズベースのｉＰＣＲアッセイにおける例示的な方法工程の概略図である。
【図５】イムノアッセイで真陽性又は偽陽性をもたらし得る相互作用の概略図である。
【図６】本発明の幾つかの実施形態に従って形成された例示的な複合体の概略図である。
【図７】ユニークな色素又は色素の組み合わせにより各セットをコード化する事によって調製されたビーズセットの概略図であり、各セットについての対応する検出試薬は、本発明の幾つかの実施形態による異なる核酸タグを含む。
【図８】本発明の幾つかの実施形態による、正しく形成され（即ち、ビーズ上の捕捉抗体が適切な標的に結合し、対応する検出試薬も標的に結合され）た結果、蛍光シグナルを生ずる例示的な複合体と、誤って形成され（即ち、ビーズ上の捕捉抗体がビーズの対応する検出試薬ではない検出試薬に結合し）て、蛍光シグナルを生じない複合体の概略図である。
【図９Ａ】種々の標的についてのシングルプレックスアッセイで得られた陽性ビーズのパーセンテージを示すグラフである。
【図９Ｂ】種々の標的についてのマルチプレックスアッセイで得られた陽性ビーズのパーセンテージを示すグラフである。
【図９Ｃ】それぞれ図９Ａ及び図９Ｂで参照されるシングルプレックスアッセイ及びマルチプレックスアッセイについてのバックグラウンドシグナルを示すグラフである。
【図１０】本発明の幾つかの実施形態による固体支持体の調製方法の概略図である。
【図１１】種々のビーズセットからの代表的なビーズに結合したコード化色素の蛍光強度のプロットである。
【図１２】従来のｉＰＣＲビーズの陽性ビーズのパーセンテージと、本発明の幾つかの実施形態に従って調製された陽性ビーズのパーセンテージとを比較したグラフを示す。全てのアッセイについて、ｉＰＣＲ  ｄＡｂコンジュゲートを、ＰＣＲマスターミックス中に含まれる１セットのプライマーと共に使用した。
【図１３】従来のｉＰＣＲ検出試薬コンジュゲートの活性と、本発明の幾つかの実施形態に従って調製された検出試薬の活性とを比較したグラフを示す。全てのアッセイについて、ｉＰＣＲビーズを、ＰＣＲマスターミックス中に含まれる１セットのプライマーと共に使用した。
【図１４】従来のｉＰＣＲシステムを使用するベースラインのシングルプレックスアッセイにおける様々な標的についての陽性ビーズのパーセンテージと、本発明の幾つかの実施形態によるシステムを使用する同じ標的についての陽性ビーズのパーセンテージとを比較したグラフを示す。
【図１５】３プレックスｉＰＣＲアッセイで各ビーズタイプについて得られたシグナルを示すグラフと、種々のアッセイ条件を比較したグラフを示す。
【図１６】本発明の幾つかの実施形態による３プレックスアッセイで各ビーズタイプについて得られたシグナルを示すグラフと、種々のアッセイ条件を比較したグラフを示す。
【図１７】図１５の３プレックスｉＰＣＲアッセイについての比較グラフと、図１６の本発明の幾つかの実施形態による３プレックスアッセイについての比較グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の実施形態が示されている添付の図面を参照して、本発明を以下により完全に説明する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形で具体化する事ができ、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的かつ完全なものにし、本発明の範囲を当業者に十分に伝える為に提示されるものである。
【００２６】
本明細書の発明の説明に使用される用語は、特定の実施形態を説明する事のみを目的とし、本発明を限定する事を意図するものではない。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される場合に、単数形（"a"、"an"、及び"the"）は、文脈上特に明記されていない限り、複数形も同様に含む事が意図される。
【００２７】
別段の規定が無い限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。更に、通常使用される辞書で定義されている様な用語は、本出願及び関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されない限り、理想化された意味又は過度に形式的な意味で解釈されるべきではないと解される。本明細書の発明の記載で使用される用語は、特定の実施形態を説明する事のみを目的とし、本発明を限定する事を意図するものではない。本明細書で挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献の内容全体を、引用する事により本明細書に援用する。用語が矛盾する場合は本明細書が優先する。
【００２８】
又、本明細書で使用される場合に、「及び／又は」は、関連する列挙された事項の１つ以上のあらゆる全ての可能な組み合わせだけでなく、選択肢（「又は」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、それらを包含する。
【００２９】
文脈上特に明記されていない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用できる事が特に意図される。更に、本発明は、本発明の幾つかの実施形態では、本明細書に示される任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略する事ができる事も企図する。例として説明すると、複合体が構成要素Ａ、Ｂ及びＣを含む事が本明細書に示される場合に、Ａ、Ｂ若しくはＣのいずれか、又はそれらの組み合わせを省略し、放棄できる事が特に意図される。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」（及び文法的別形）という移行句は、特許請求の範囲に記載の発明の列挙された材料又は工程「並びに１つ以上の基本的な特性及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（強調は原文通り）を参照の事；ＭＰＥＰのセクション２１１１．０３も参照の事。従って、本明細書で使用される「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、「含む（comprising）」と同等であると解釈されるべきではない。
【００３１】
本明細書で使用される場合に、「例」、「例示的」という用語及びそれらの文法的別形は、本明細書で論じられる非限定的な例及び／又は変形実施形態を指す事が意図され、本明細書で論じられる１つ以上の実施形態が１つ以上の他の実施形態と比べて好ましい事を示すとは意図されないとも理解される。
【００３２】
量又は濃度等の様な測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更に±０．１％の変動だけでなく指定された値も包含する事を意味する。例えば、Ｘが測定可能な値である場合の「約Ｘ」は、ＸだけでなくＸの±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更に±０．１％の変動を含む事を意味する。測定可能な値について本明細書で示される範囲は、任意の他の範囲及び／又はその中の個々の値を含み得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合に、「増加する（increase）」、「増加する（increases）」、「増加した（increased）」、「増加している（increasing）」、「増強する（enhance）」という用語及び同様の用語は、指定されたパラメーターにおける少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の上昇を示す。
【００３４】
本明細書で使用される場合に、「低下する（reduce）」、「低下する（reduces）」、「低下した（reduced）」、「低下（reduction）」、「阻害する（inhibit）」という用語及び同様の用語は、指定されたパラメーターにおける少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の減少を指す。
【００３５】
或る要素が、別の要素「上にある（on）」、別の要素に「取り付けられる（attached）」、別の要素に「接続される（connected）」、別の要素と「カップリングされる（coupled）」、別の要素と「接触している（contacting）」等と言及される場合に、その要素は、他の要素の直上にあり、他の要素に取り付けられ、他の要素に接続され、他の要素とカップリングされ、若しくは他の要素と接触していても良く、又は介在する要素が存在しても良い。それに対して、或る要素が、例えば、別の要素の「直上にある（directly on）」、別の要素に「直接的に取り付けられる（directly attached）」、別の要素に「直接的に接続される（directly connected）」、別の要素と「直接的にカップリングされる（directly coupled）」、又は別の要素と「直接的に接触している（directly contacting）」と言及される場合には、介在する要素は存在しない。別の特徴に「隣接して（adjacent）」配置されている構造又は特徴についての言及は、隣接する特徴と重複する部分又は隣接する特徴の下にある部分を有し得る事も当業者には理解されるであろう。
【００３６】
「〜の下方（under）」、「〜の下（below）」、「〜より低い（lower）」、「〜の上方（over）」、「〜より上（upper）」等の様な空間的に相対的な用語は、本明細書では説明を容易にする為に、図面に示されている或る要素又は特徴と１つ以上の別の要素又は特徴との関係を説明する為に使用され得る。空間的に相対的な用語は、図面に示される方向に加えて、使用中又は動作中のデバイスの異なる方向を包含する事が意図されると理解される。例えば、図中のデバイスが反転している場合に、他の要素又は特徴の「下方（under）」又は「下（beneath）」と記載される要素は、他の要素又は特徴の「上方（over）」に向きが合わせられる事となる。従って、「下方（under）」という例示的な用語は、「〜の上方（over）」及び「〜の下方（under）」の両方の方向を包含し得る。該デバイスは、それ以外に方向付けられ（９０度又は他の方向に回転され）る場合もあり、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子がそれに応じて解釈され得る。同様に、「上向き（upwardly）」、「下向き（downwardly）」、「垂直（vertical）」、「水平（horizontal）」等の用語は、本明細書では、特段の具体的な指示が無い限り、説明の目的でのみ使用される。
【００３７】
本明細書では、「第１」、「第２」等の用語を使用して様々な要素が説明され得るが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではない事が理解されよう。これらの用語は、或る要素を別の要素と区別する為だけに使用される。従って、以下で論じる「第１の」要素は、本発明の教示から逸脱する事なく、「第２の」要素と呼ぶ事もできる。操作（又は工程）の順序は、特段の具体的な指示が無い限り、特許請求の範囲又は図面に示される順序に限定されない。
【００３８】
本明細書で使用される場合に、「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、線状又は分岐状の一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらのハイブリッドを指す。これらの用語はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、例えば、天然には通常見られない様な化学修飾された塩基を含む事ができ、化学修飾された塩基は、アッセイ（例えば、ＰＣＲ反応）の特異性を向上させ、並びに／又はその他のＲＮＡ及び／若しくはＤＮＡ間の非特異的結合を低下させる。ｄｓＲＮＡが合成により作製される場合に、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、及びリボザイムのペアリングの為に、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン等の様なあまり一般的ではない塩基を使用する事ができる。例えば、ウリジン及びシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡに高い親和性で結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤である事が分かっている。ホスホジエステル骨格への、又はＲＮＡのリボース糖基の２’−ヒドロキシへの修飾等のその他の修飾を行う事もできる。
【００３９】
本明細書で使用される場合に、「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、区別なく使用され、ヌクレオチドのヘテロポリマー又は核酸分子の５’末端から３’末端迄のこれらのヌクレオチドの配列を指し、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片又は部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成された）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含み、これらのいずれも一本鎖及び／又は二本鎖であり得る。「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、又、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指す為に本明細書で区別なく使用される。本明細書に示される核酸分子及び／又はヌクレオチド配列は、左から右へと５’から３’の方向で表され、米国配列規則、連邦規則集第３７巻第１．８２１条〜第１．８２５条及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチド記号を表す為の標準符号を使用して表される。本明細書で使用される「５’領域」は、５’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を指す。従って、例えば、ポリヌクレオチドの５’領域中の要素は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する第１のヌクレオチドからポリヌクレオチドの途中に位置するヌクレオチド迄のどこに位置しても良い。本明細書で使用される「３’領域」は、３’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を指す。従って、例えば、ポリヌクレオチドの３’領域中の要素は、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する第１のヌクレオチドからポリヌクレオチドの途中に位置するヌクレオチド迄のどこに位置しても良い。
【００４０】
本明細書で使用される「相補的」又は「相補性」という用語は、許容可能な塩条件及び温度条件下での塩基対形成によるポリヌクレオチドの天然の結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」（５’から３’）は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」（３’から５’）に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部しか結合しない「部分的」であり得るか、又は一本鎖分子間に全体的な相補性が存在する場合の完全であり得る。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を及ぼす。
【００４１】
本明細書で使用される「相補性」は、比較ヌクレオチド配列との１００％の相補性を意味し得るか、又は１００％未満の相補性（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％等の相補性）を意味し得る。
【００４２】
本発明の核酸配列の「部分」又は「区間」は、参照核酸配列に対して短縮された（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個以上のヌクレオチドだけ短縮された）長さの核酸配列であって、参照核酸配列に対して同一又はほぼ同一（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）の連続するヌクレオチドの核酸配列を含む、核酸配列を意味すると理解される。本発明によるその様な核酸部分は、構成素であるより大きなポリヌクレオチドの任意の部分に適宜含まれ得る。
【００４３】
本発明のアミノ酸配列の「断片」は、参照アミノ酸配列に対して短縮された（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個以上のアミノ酸だけ短縮された）長さのアミノ酸配列であって、参照アミノ酸配列に対して同一又はほぼ同一（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を意味すると理解される。本発明によるその様なアミノ酸断片は、構成素であるより大きなタンパク質又はペプチドに適宜含まれ得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合に、「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチド又はペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。「同一性」は、限定されるものではないが、分子計算生物学（Computational Molecular Biology）（レスク，Ａ．Ｍ．（Lesk, A. M.）編）オックスフォード大学出版局，ニューヨーク（１９８８）、バイオコンピューティング：情報科学及びゲノムプロジェクト（Biocomputing: Informatics and Genome Projects）（スミス，Ｄ．Ｗ．（Smith, D. W.）編）アカデミックプレス社（Academic Press），ニューヨーク（１９９３）、配列データのコンピュータ分析，第Ｉ部（Computer Analysis of Sequence Data, Part I）（グリフィン，Ａ．Ｍ．（Griffin, A. M.及びグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Griffin, H. G.）編）ヒューマナ・プレス社（Humana Press），ニュージャージー（１９９４）、分子生物学における配列分析（Sequence Analysis in Molecular Biology）（フォン・ハイニェ，Ｇ．（von Heinje, G.）編）アカデミックプレス社（Academic Press）（１９８７）、及び配列分析入門（Sequence Analysis Primer）（グリブスコフ，Ｍ．（Gribskov, M.）及びデヴェル，Ｊ（Devereux, J.）編）ストックトン・プレス社（Stockton Press），ニューヨーク（１９９１）に記載される方法を含む既知の方法によって容易に計算する事ができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合に、「パーセントの配列同一性」又は「パーセントの同一性」という用語は、２つの配列が最適にアラインメントされている場合の、試験（「サブジェクト」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の線形ポリヌクレオチド配列における同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。幾つかの実施形態では、「パーセントの同一性」は、アミノ酸配列中の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合に、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列の文脈における「実質的に同一」又は「実質的な同一性」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定された、最大一致に関して比較及びアラインメントされた場合に、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び／又は１００％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。本発明の幾つかの実施形態では、実質的な同一性は、約４ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチド長である本発明のヌクレオチド配列の連続するヌクレオチドの領域及び該配列の全長迄のその中の任意の範囲にわたって存在する。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個又は２５個の連続するヌクレオチドにわたって実質的に同一であり得る。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約５個の連続するヌクレオチドにわたって実質的に同一であり得る。幾つかの実施形態では、実質的に同一のヌクレオチド又はタンパク質配列は、実質的に同一であるヌクレオチド又はタンパク質配列と実質的に同じ機能を発揮する。
【００４７】
配列比較では、一般的に、１つの配列が参照配列として機能し、その配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合に、試験配列と参照配列とをコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する１つ以上の試験配列についてのパーセントの配列同一性を計算する。
【００４８】
比較ウィンドウをアラインメントする為の配列の最適なアラインメントは、当業者に良く知られており、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）の局所相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、ニードルマン（Needleman）及びヴンシュ（Wunsch）の相同性アラインメントアルゴリズム（homology alignment algorithm）、ピアソン（Pearson）及びリップマン（Lipman）の類似性検索法（search for similarity method）等のツールによって、任意にＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（アセルリス・インコーポレーテッド（Accelrys Inc.）社、カリフォルニア州サンディエゴ）の部分として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実装によって実行され得る。試験配列と参照配列とのアラインメントされた区間の「同一性の割合」は、２つのアラインメントされた配列が共有する同一の成分の数を、参照配列区間内の成分の総数、即ち、参照配列全体又は参照配列のより小さな規定部分で割ったものである。パーセントの配列同一性は、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長のポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的の為に、「パーセントの同一性」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用して、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定することもできる。
【００４９】
２つのヌクレオチド配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、これらの２つの配列も、実質的に相補的であると見做され得る。幾つかの代表的な実施形態では、実質的に相補的であると見做される２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。
【００５０】
サザンハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、異なる環境パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、分子化学及び分子生物学におけるティヒセン研究室の技術（Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）−核酸プローブとのハイブリダイゼーション（Hybridization with Nucleic Acid Probes）第Ｉ部第２章（part I chapter 2）「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブアッセイの戦略の概要（Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays）」エルゼビア社（Elsevier），ニューヨーク（１９９３）に見られる。一般的に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低い様に選択される。
【００５１】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致したプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しくなる様に選択される。サザンブロット又はノーザンブロットにおいてフィルター上に１００個を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの為のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、ここで、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。非常にストリンジェントな洗浄条件の一例は、７２℃で約１５分間の０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で１５分間の０．２×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）洗浄である（ＳＳＣバッファーの説明については、以下のサンブルック（Sambrook）を参照の事）。屡々、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する為に、高ストリンジェンシー洗浄に先行して低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖の為の中ストリンジェンシー洗浄の一例は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖の為の低ストリンジェンシー洗浄の一例は、４０℃で１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合に、ストリンジェントな条件は、一般的に、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、一般的に、約０．０１Ｍ〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は、一般的には少なくとも約３０℃である。ホルムアミド等の不安定化剤を添加して、ストリンジェントな条件を実現する事もできる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイで無関係のプローブで観察されたものの２倍（又はそれ以上）の信号対雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００５２】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングする為に使用され得るハイブリダイゼーション条件／洗浄条件のセットの例である。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中と共に５０℃で２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄で、「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中と共に５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄で、「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、又は５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中と共に５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄で、「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。又、更なる実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中と共に５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄で、「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、又は５０℃で７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中と共に６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄で、「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
【００５３】
本明細書で使用される「標的」という用語は、試料中に存在し得る任意の対象となる分析物を指す。標的の例には、限定されるものではないが、合成又は天然の化学的巨大分子及び／又は生物学的巨大分子、ナノ粒子、小分子化合物、ＤＮＡ、核酸／ポリ核酸、ペプチド、タンパク質及び／又は同等物が含まれる。標的は１つ以上の分析物分子であり得る。幾つかの実施形態では、標的は試料中に存在する事ができ、任意に、試料は供給源（例えば、被験体、水供給物、食品供給物等）に由来する。標的及び／又は試料は、例えば、アミノ酸及び／若しくは荷電分子、ペプチド、並びに／又はタンパク質等の１つ以上の極性代謝物を含み得る。標的及び／又は試料は、生体液、組織、血液、血清、尿、細胞成長培地、溶解された細胞、飲料、及び／又は食品等から抽出された１つ以上の化学的化合物及び／又は生物学的化合物を含み得る。幾つかの実施形態では、標的は、例えば、水、空気、及び／又は土壌試料等の環境試料に由来する、及び／又はその中に存在し得る。幾つかの実施形態では、標的は、法医学的試料に由来し、及び／又はその中に存在し得る。幾つかの実施形態では、標的及び／又は試料は、２つ以上の試料の混合物を含むプールされた試料を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合に、「接触（contact）」、「接触する（contacting）」、「接触した（contacted）」及びそれらの文法的別形は、適切な条件下で所望の反応が行われ得る様に（例えば、核酸の結合、転写制御、ゲノム編集、ニッキング、切断、及び／又は増幅）、２つ以上の成分を一緒に又は十分に近接して配置する事を指す。
【００５５】
本発明の実施形態は、例えば、非特異的結合（ＮＳＢ）によって引き起こされる問題、及び／又は抗体の交差反応性の問題等の、例えばバックグラウンドシグナルの問題の様なアッセイ（例えば、多重化ｉＰＣＲアッセイ）における１つ以上の問題に対処する事ができ、及び／又はそれらの問題を減らす事ができる。本発明の実施形態は、ユニークな核酸タグの組み合わせを含む及び／又は利用し、空間的に多重化されたＰＣＲ反応の形成の為に固体支持体（例えば、ビーズ）ベースの送達を提供し、それにより単一反応の多重化ＰＣＲに関連する通常の厄介な問題が回避され得る。
【００５６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、固体支持体が提供される。本明細書で使用される「固体支持体」という用語は、例えば、マイクロビーズ、チップ、プレート、スライド、ピン、プレートウェル、ビーズ、ミクロスフェア、ナノ粒子、マイクロウェル、又は核酸配列を得る為に使用する事ができ、コード化剤（例えば、蛍光性化合物、化学発光性化合物、放射性要素、及び／又は酵素等）及び／又は動的要素にカップリングさせる事ができる又はコード化剤で標識する事ができる他の部材等の１つ以上の物体を含む。核酸配列、分子認識要素、コード化剤、及び／又は動的要素は、例えば、共有結合による取り付け、非共有結合による取り付け、及び／又は物理的組み込み等によって、固体支持体内に直接的に又は間接的に取り付け又は埋設（部分的に又は完全に）する事ができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、固体表面上に印刷されたアレイであり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェアであり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は、例えば、化学的成分及び／又は生物学的成分（例えば、組織試料）等の試料が接触する固体表面であり得ると共に、固体支持体上の分子認識要素（任意に、１つ以上のコード化剤を含む）は、試料及び／又はその中の標的の一部に取り付けられ得る。分子認識要素は、抗体又はそのフラグメント、アプタマー、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及び／若しくはそれらの組み合わせを含み得るか、又はそれらであり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は、それぞれ固体支持体からの成分（例えば、核酸配列）の切断を可能にし得る不安定な試薬及び／又は支持結合を含み得る。
【００５７】
幾つかの実施形態では、１つ以上のコード化剤を固体支持体（例えば、ビーズ又はミクロスフェア）に取り付ける事で、コード化された固体支持体（例えば、コード化されたビーズ又はコード化されたミクロスフェア）を得る事ができる。幾つかの実施形態では、１つ以上のコード化剤を分子認識要素（例えば、抗体）に取り付けて、コード化された分子認識要素（例えば、コード化された抗体）を得る事ができ、これを固体支持体に取り付ける事により、コードされた固体支持体を得る事ができる。幾つかの実施形態では、コード化された分子認識要素は、例えば、ナノ粒子等の粒子に取り付けられ得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のコード化剤及び／又はコード化された分子認識要素を固体支持体上に設ける事又は結合させる事を含み得る。幾つかの実施形態では、固体支持体及び／又はコード化された固体支持体は、国際公開第２００７／１１２０２５号パンフレットに記載されるものであり、その内容全体を、引用する事により本明細書に援用する。
【００５８】
本明細書で使用される「ビーズ（"bead"又は"beads"）」という用語は、例えば、多孔質、表面多孔質、又は多孔質の、例えば、反応ウェル中で使用する為に適切であり得るポリマー、プラスチック、ガラス、二酸化ケイ素、金属酸化物若しくは半金属酸化物（限定されるものではないが、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム又はその他の酸化物）、量子ドット、金属粒子及び／又は同等物の様な１つ以上の材料であり得る、例えば、粒子、顆粒又はミクロスフェア、一般的には、磁性ミクロスフェア等の固相部材を指す。幾つかの実施形態では、或る集団のビーズを別の集団から区別する為にユニークにコード化された複数のビーズ（例えば、ミクロスフェア）を含む多重化ビーズセットが提供され得る。
【００５９】
幾つかの実施形態では、固体支持体は、例えば、磁性ビーズ又は超常磁性ビーズ等のビーズである。幾つかの実施形態では、固体支持体は、磁性ビーズ又は超常磁性ビーズではない。幾つかの実施形態では、固体支持体は、多孔質である及び／又は表面積を増加させるコーティングを有するビーズである。幾つかの実施形態では、固体支持体は、任意に、例えば、捕捉親和性試薬、プライマー、プローブ、ブロッキング剤、ポリメラーゼ、逆転写酵素、及び／又は他の酵素等の試薬を保持する為に使用する事ができる様に官能化されたマイクロ粒子及び／又はナノ粒子の幾つか又は全てと一緒に、マイクロ粒子及び／又はナノ粒子の凝集体を生成させる事によって作製されるビーズである。
【００６０】
幾つかの実施形態では、固体支持体（例えば、ビーズ）は、コード化剤（例えば、色素）、核酸配列、及び分子認識要素（例えば、抗体）を含む。幾つかの実施形態では、コード化剤は、直接的に又は間接的に固体支持体に取り付けられるか、又は少なくとも部分的に埋設される。幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列及び／又は分子認識要素は、コード化剤を含む。分子認識要素は、抗体又はそのフラグメント、アプタマー、修飾アプタマー、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、及び／又はそれらの組み合わせを含み得るか、又はそれらであり得る。
【００６１】
本明細書で使用される「コード化剤」という用語は、固体支持体及び／又は固体支持体の材料及び／又は固体支持体と接触している材料に随伴する（例えば、それらに適用される、取り付けられる、結合される、配合される、製造又は作製の為に使用される）それぞれの固体支持体（その全て又は一部であり得る）にコード化シグナルを提供及び／又は発生する１つ以上の薬剤（例えば、化学物質、タンパク質等）を指す。幾つかの実施形態では、１つ以上のコード化剤は、固体支持体（例えば、ビーズ）の集団又は部分集団の識別を可能にする検出可能なコード化シグナルを提供及び／又は発生する。例えば、幾つかの実施形態では、１つ以上のコード化剤は、１つ以上のコード化剤が随伴する（例えば、取り付けられる）個々の固体支持体（例えば、ビーズ）に検出可能なコード化シグナルを提供及び／若しくは発生させ得る、並びに／又は１つ以上のコード化剤は、１つ以上のコード化剤が取り付けられる固体支持体の特定の部分（例えば、１つ以上のコード化剤を含む分子認識要素が結合する固体支持体の部分）に検出可能なコード化シグナルを提供及び／若しくは発生させ得る。
【００６２】
コード化シグナルは、固体支持体に随伴する１つ以上のコード化剤によって、並びに／又は固体支持体自体及び／若しくは固体支持体に随伴する材料（例えば、化合物）によって提供及び／又は発生され得る。幾つかの実施形態では、コード化シグナルは、固体支持体のサイズ及び／又は形状であり得る。幾つかの実施形態では、コード化シグナルは、固体支持体に随伴する（例えば、それに適用される、それに取り付けられる、それに結合される、それと配合される、製造又は作製の為に使用される等）１つ以上のコード化剤（例えば、化学物質、タンパク質等）によって、及び／又は固体支持体によって発生されるシグナル（例えば、光学的シグナル及び／又は電気的シグナル）である。検出可能なコード化シグナルは、光学的に及び／又は電子的に検出可能であり得る。この検出可能なコード化シグナルは、人間の目で視覚的に知覚する事ができ、並びに／又は電子的に読み取り、検出し、及び／若しくは取得する事ができる。検出可能なコード化シグナルは、典型的には規定された閾値以上の強度、色（例えば、色相、色強度、及び／又は色値）、色及び強度、並びに／又はサイズ、形状及び／若しくは放射性の変化を含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能なコード化シグナルは、蛍光、リン光、及び／又は化学発光の強度を含み得る発光強度を含む。
【００６３】
それぞれの固体支持体のコード化シグナル（その全て又は一部であり得る）は、検出可能（例えば、光学的、電子的、電気化学的、静電的、磁気的等で検出可能）であり得るか、又は検出可能でない場合もある。幾つかの実施形態では、それぞれの固体支持体のコード化シグナル（その全て又は一部であり得る）は変化し得る。例えば、それぞれの固体支持体についてのコード化シグナルは、検出可能から検出不可能に、検出不可能から検出可能に、より大きな値からより低い値に（例えば、より大きなシグナル振幅、蛍光強度値、直径等から）、及び／又はより低い値からより大きな値に変化し得る。それぞれの固体支持体についてのコード化シグナルの変化は、時間の経過と共に起こり得る、並びに／又は固体支持体に随伴する少なくとも１つの化学的変化及び／若しくは物理的変化の為に起こり得る。幾つかの実施形態では、固体基材についてのコード化シグナルは、変化し得る、並びに／又は固体支持体が存在する環境の変化（例えば、固体支持体及び／又はコード化剤が接触する溶液中の変化）によって提供及び／若しくは発生され得る。例えば、固体支持体についてのコード化シグナルは変化し得る、並びに／又は磁気的挙動、ｐＨ、光散乱、物理的サイズ（増加又は減少）、形状、屈折率、溶解性、吸光度及び／若しくは発光強度若しくは最大波長シフト、導電率、誘電率、粘度、及び同位体崩壊からの電波放射、及び上記の組み合わせの変化によって提供及び／若しくは発生され得る。
【００６４】
「デコード化」という用語は、少なくとも部分的に１つ以上のコード化された固体支持体及び／又はコード化された分子認識要素からのコード化シグナルに基づく、それぞれの試料（例えば、固体支持体の試料及び／又は複数のコード化された分子認識要素を含む試料を含む）の異なる集団の（典型的には、電子的／プログラムに従う）識別を指す。１つ以上のコード化シグナルの検出及び／又は識別は試料のデコード化を可能にして、特定の固体支持体の集団の個性を決定し、及び／又は標的を検出する事ができる。
【００６５】
本明細書で使用される「動的要素」は、規定の事象に応答して物理的変化及び／又は化学的変化を提供する又は示す化学的化合物及び／又は生物学的化合物を指す。物理的変化及び／又は化学的変化は、異なる（例えば、より早い）時点でのコード化シグナルと比較して、或る時点でのそれぞれの固体支持体についてのコード化シグナル（その全て又は一部であり得る）を変更する事ができ、検出可能であり得る（例えば、光学的に及び／又は電気的に検出可能）。「動的要素」は、コード化剤（例えば、色素、タンパク質等）及び／又は固体支持体（例えば、ミクロスフェア）を含み得る。物理的変化及び／又は化学的変化は、固体支持体に影響を与える物理的変化及び／又は化学的変化であり得る（例えば、この変化は、固体支持体の電荷及び／若しくは色の変化であり得る、並びに／又は固体支持体のサイズ及び／若しくは形状の変化であり得る）。従って、動的要素は、固体支持体並びに／又は固体支持体に取り付けられる及び／若しくは随伴する化合物であり得る。幾つかの実施形態では、物理的変化及び／又は化学的変化は、固体支持体に随伴するコード化剤に影響を及ぼす物理的変化及び／又は化学的変化である（例えば、この変化は、コード化剤を固体支持体に結合するリンカーの安定性の変化、コード化剤の溶剤アクセシビリティーの変化、並びに／又はクエンチャーの存在及び／若しくは不存在であり得る）。従って、動的要素は、コード化剤並びに／又はコード化剤に取り付けられる及び／若しくは随伴する化合物（例えば、クエンチャー）であり得る。物理的変化及び／又は化学的変化は、可逆的又は不可逆的であり得る。幾つかの実施形態では、動的要素はコード化剤であり得る。幾つかの実施形態では、動的要素及び／又はコード化剤は、国際公開第２００７／１１２０２５号パンフレットに記載されるものであり、その内容全体を、引用する事により本明細書に援用する。
【００６６】
固体支持体のコード化は、当業者に知られる任意の方法によって（例えば、色、蛍光色、サイズ、形状、熱不安定若しくは光不安定性の色素等の変化する特性、及び／又はそれらの任意の組み合わせを使用して）達成する事ができる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、固体支持体に共有結合又は非共有結合により取り付けられているコード化剤を含み得る。幾つかの実施形態では、色素は、例えば、溶剤膨潤及び捕捉等を介して、固体支持体（例えば、ビーズ）に埋設される。
【００６７】
幾つかの実施形態では、固体支持体は、同じ又は異なり得る１つ以上のリンカーを含む。１つ以上のリンカーは、分子認識要素及び／又は核酸配列を固体支持体に取り付ける事ができる及び／又は結合（例えば、共有結合又は非共有結合）する事ができる。例えば、リンカーを使用して、１つ以上の分子認識要素を固体支持体に取り付ける若しくは結合する事ができる、及び／又は同じ若しくは異なるリンカーを使用して、１つ以上の核酸配列を固体支持体に取り付ける若しくは結合する事ができる。本明細書で使用される「リンカー」は、或る成分（例えば、固体支持体）を別の成分（例えば、分子認識要素）に取り付ける又は結合する為に使用され得る任意の分子、部分及び／又は官能基を指す。リンカーの例には、限定されるものではないが、例えば、アミン（例えば、アミン誘導体、イソシアネート、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、アジド等）、酸（例えば、酸誘導体、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酸ヒドラジド等）、アルデヒド、塩化スルホニル、スルホニルヒドラジド、エポキシド、ヒドロキシル基、チオール基、及び／若しくはマレイミド等の化学部分及び／若しくは化合物、並びに／又は、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡ等の生体分子が含まれる。幾つかの実施形態では、リンカーは、特異的結合ペアの成員である生体分子である。「特異的結合ペア」及び「リガンド−受容体結合ペア」は、本明細書において区別なく使用され、分子の一方が、該分子の表面上又は空洞内に他方の分子の特定の空間的組織又は極性組織に特異的に引き寄せる又は結合する領域を有する為、両方の分子が互いに親和性を有する２つの異なる分子を指す。特異的結合ペアの成員は、リガンド及び受容体（抗リガンド）と呼称され得る。リガンド及び受容体という用語は、リガンド若しくは受容体全体又はリガンドと受容体との間で結合が起こるのに十分なその一部を包含する事が意図される。リガンド−受容体結合ペアの例には、限定されるものではないが、ホルモンとホルモン受容体、例えば、上皮成長因子と上皮成長因子受容体、腫瘍壊死因子αと腫瘍壊死因子受容体、及びインターフェロンとインターフェロン受容体、アビジンとビオチン又は抗ビオチン、抗体と抗原のペア、酵素と基質、薬物と薬物受容体、細胞表面抗原とレクチン、２つの相補的な核酸鎖、核酸鎖と相補的オリゴヌクレオチド、インターロイキンとインターロイキン受容体、並びに顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）とＧＭＣＳＦ受容体、並びにマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）とＭＣＳＦ受容体等の刺激因子とそれらの受容体が含まれる。２つの成分を取り付ける為に使用され得る更なる例示的なリンカー及び／又は化学物質には、限定されるものではないが、光切断可能なビオチン、固体支持体と認識要素との間に共有結合を与えるリンカー、アビジン、インテグレイテッド・ディーエヌエー・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Integrated DNA Technologies, Inc.）社から市販されているＡｃｒｙｄｉｔｅ（商標）、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール−ＴＥＧ、インテグレイテッド・ディーエヌエー・���クノロジーズ・インコーポレーテッド（Integrated DNA Technologies, Inc.）社から市販されているＩ−Ｌｉｎｋｅｒ（商標）、インテグレイテッド・ディーエヌエー・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Integrated DNA Technologies, Inc.）社から市販されているＵｎｉ−Ｌｉｎｋ（商標）Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ、５’ヘキシニル、５−オクタジイニルｄＵ、ビオチンｄＴ、ビオチン−ＴＥＧ、デュアルビオチン、デスチオビオチン−ＴＥＧ、チオール修飾剤Ｃ３  Ｓ−Ｓ、ジチオール、及び／又はチオール修飾剤Ｃ６  Ｓ−Ｓが含まれる。
【００６８】
任意の適切なカップリング化学物質を使用して、分子認識要素及び／又は核酸配列を固体支持体に結合する事ができる。幾つかの実施形態では、リンカー、分子認識要素及び／又は核酸配列は、分子認識要素若しくはその一部を固体支持体から分離する為に、及び／又は核酸配列若しくはその一部を固体支持体から分離する為に使用され得る不安定な化学結合を含む。不安定な化学結合は、限定されるものではないが、不安定な化学結合を切断する為の熱、光、及び／又は化学物質の使用を含む様々な技術を使用して切断する事ができる。例えば、熱エネルギーを適用して不安定な化学結合を破断若しくは切断する事ができる、又は光を適用して不安定な化学結合（例えば、光切断可能な結合）を破断する事ができる。熱的加熱は、高温表面との導電的接触、溶液のジュール加熱、固体支持体に隣接する基材の抵抗加熱、電磁放射及び／又は電磁誘導への曝露によって達成され得る。幾つかの実施形態では、不安定な化学結合は、電離放射線、化学薬品、酵素、電気化学的プロセス、ｐＨの変化、及び／又は他の適切な切断操作を使用して切断され得る。例えば、ｐＨの変化は、固体支持体を含む領域の表面で起こる電気化学反応によって引き起こされ得る、又は条件の変化は、熱、光、電気化学的プロセス、ｐＨの変化等の物理的変化によりそれ自体が活性化され得る開始剤試薬の活性化によって直接的若しくは間接的に引き起こされ得る。幾つかの実施形態では、不安定な化学結合の切断は、ＰＣＲアッセイ及び／又は反応の前及び／又はその間に実施され得る。幾つかの実施形態では、不安定な化学結合が切断されると、核酸配列が固体支持体から分離される為、ＰＣＲが起こり得る及び／又は開始され得る。幾つかの実施形態では、ＰＣＲ反応は、核酸配列（例えば、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマー）が、それが取り付けられている固体支持体から放出される迄は起こらない。幾つかの実施形態では、核酸配列が固体支持体に取り付けられる間に、ＰＣＲ反応が起こり得る。幾つかの実施形態では、成分（例えば、分子認識要素及び／又は核酸配列）は、米国特許第９，６１７，５８９号明細書（この内容全体を、引用する事により本明細書に援用する）に記載される化合物、組成物、及び／又は方法を使用して固体支持体に取り付けられ得る。
【００６９】
幾つかの実施形態では、分子認識要素（例えば、抗体）及び／又は核酸配列（例えば、プライマー又はオリゴヌクレオチド）は、光開裂可能な又は熱に不安定な結合を介して固体支持体に取り付けられる。例えば、幾つかの実施形態では、光切断可能なビオチンを使用して、分子認識要素及び／又は核酸配列を固体支持体に取り付ける。幾つかの実施形態では、限定されるものではないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ等の様な抗体に親和性を有する分子を利用する様な１つ以上の取り付け化学を使用して、分子認識要素及び／又は核酸配列を固体支持体に取り付ける。
【００７０】
幾つかの実施形態では、核酸配列（例えば、フォワードプライマー）は、特に加水分解プローブ又はＴａｑＭａｎプローブが検出化学に使用される場合に共有結合によって固体支持体に取り付けられ得る。それというのも、加水分解プローブからの色素は、ｄｓＤＮＡアンプリコンがビーズに取り付けられていても、依然として検出され得るからである。
【００７１】
幾つかの実施形態では、固体支持体は、複数のリンカーを含む、及び／又は１つ以上のリンカーで被覆されている。例えば、固体支持体は、固体支持体の表面の少なくとも一部に結合された及び／若しくは被覆されたストレプトアビジンと、１つ以上のビオチン化分子認識要素とを含み得る、並びに／又は１つ以上のビオチン化核酸配列は、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を介して固体支持体に結合され得る。幾つかの実施形態では、固体支持体（例えば、ビーズ）は、固体支持体当たり約３．５ａｍｏｌのストレプトアビジンを含み、各ストレプトアビジンは、約１個、２個、３個又は４個のビオチン化分子を結合する。幾つかの実施形態では、固体支持体上に存在する分子認識要素の分子対核酸配列の分子の比は、約４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、又は１：４（分子認識要素：核酸配列）である。
【００７２】
固体支持体は、約１分子、１０分子、５０分子、１００分子、２００分子、３００分子、４００分子、５００分子又は６００分子〜約１０００分子、５０００分子、１００００分子、５００００分子、１０００００分子、２５００００分子、５０００００分子、１００００００分子、１０００００００分子、２５００００００分子、５０００００００分子、６０００００００分子以上の量で分子認識要素及び／又は核酸配列（即ち、１つ以上の分子認識要素及び／又は１つ以上の核酸配列）を含み得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は、約１０ｙｍｏｌ、３０ｙｍｏｌ、５０ｙｍｏｌ、７５ｙｍｏｌ又は１００ｙｍｏｌ〜約１ｆｍｏｌ、２ｆｍｏｌ、３ｆｍｏｌ、４ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、６ｆｍｏｌ、７ｆｍｏｌ、８ｆｍｏｌ、９ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１１ｆｍｏｌ、１２ｆｍｏｌ、１３ｆｍｏｌ、１４ｆｍｏｌ又は１５ｆｍｏｌの量で分子認識要素及び／又は核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、固体支持体は、約０．１ｚｍｏｌ、０．３ｚｍｏｌ、０．５ｚｍｏｌ、０．７５ｚｍｏｌ、１ｚｍｏｌ、２ｚｍｏｌ、３ｚｍｏｌ、４ｚｍｏｌ又は５ｚｍｏｌ〜約１ａｍｏｌ、５ａｍｏｌ、１０ａｍｏｌ、１５ａｍｏｌ、２０ａｍｏｌ、２５ａｍｏｌ、３０ａｍｏｌ、３５ａｍｏｌ又は４０ａｍｏｌの量で分子認識要素及び／又は核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、固体支持体は、約１ａｍｏｌの量、約１ｚｍｏｌ〜約１００ａｍｏｌの範囲の量、又は約１００ｙｍｏｌ〜約１０ｆｍｏｌの範囲の量で分子認識要素を含む及び／又は結合する。幾つかの実施形態では、固体支持体は、約３ａｍｏｌの量、約０．３ｚｍｏｌ〜約３０ａｍｏｌの範囲の量、又は約３０ｙｍｏｌ〜約３ｆｍｏｌの範囲の量で核酸配列（例えば、プライマー及び／又は一本鎖オリゴヌクレオチド）を含む及び／又は結合する。
【００７３】
固体支持体は、分子認識要素が約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の量で存在する及び／又は核酸配列が約３００ｐＭ又は１ｎＭ若しくは３ｎＭ〜約３００μＭ又は３ｍＭの範囲の量で存在するアッセイ及び／又は反応ウェルを提供し得る。幾つかの実施形態では、固体支持体は、核酸配列（例えば、プライマー）が約１μＭ〜約１００ｎＭの範囲の量で存在するアッセイ及び／又は反応ウェルを提供し得る。分子認識要素及び／又は核酸配列の濃度は、固体支持体上に存在する量及び／又は固体支持体から放出される量であり得る。幾つかの実施形態では、固体支持体によってアッセイ及び／又は反応ウェル中に提供される分子認識要素及び／又は核酸配列の濃度は、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ）を実行若しくは実施する為に及び／又は標的を検出する為に十分であり得る。
【００７４】
幾つかの実施形態では、核酸配列は、任意にリンカーを介して、固体支持体に取り付けられ及び／又は結合され得て、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド又は２５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド又は５００ヌクレオチドの長さを有し得る。幾つかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド（例えば、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３５０ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド又は５００ヌクレオチド）を含む。幾つかの実施形態では、核酸配列はオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、核酸配列は、例えば、ＰＣＲアッセイにおけるプライマーとして、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、及び／又はマイクロアレイにおいて使用され得るプライマー（例えば、フォワードプライマー又はリバースプライマー）である。本発明において有用なプライマーには、限定されるものではないが、増幅用及び／又は検出用のプライマーが含まれる。幾つかの実施形態では、核酸配列は、約１５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド又は約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、少なくとも１つのフォワードプライマー及び／又は少なくとも１つのリバースプライマーを含む。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、フォワードプライマーを含み、リバースプライマーを含まない。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
【００７５】
幾つかの実施形態では、プライマーは、プライマーが固体支持体（例えば、ヒドロゲルビーズ）の殆ど内側にあり、固体支持体の外側に露出されない様に固体支持体（そこには、分子認識要素（例えば、捕捉抗体）が結合されている場合もある）へと吸収され得る。例示的なヒドロゲルビーズには、限定されるものではないが、アガロースビーズ（例えば、セファロースビーズ）が含まれる。
【００７６】
固体支持体上に存在するプライマーは、例えば、検出試薬がインキュベートされる温度よりも高いが、ＰＣＲが行われるアニーリング温度より低い融点を有する特定の核酸配列（任意に修飾塩基を有する）等のハイブリダイゼーションを妨げる化学種に随伴し得る。その代わりに又はそれに加えて、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ配列、ポリマー及び／又は他の試薬を使用して、固体支持体上のプライマーへの非特異的結合及び／又は不所望なハイブリダイゼーションを減らす事ができる。
【００７７】
幾つかの実施形態では、固体支持体は、例えば、ファイヤーバード（Firebird）社及び他の供給源から入手可能な自己回避（self-avoiding）プライマー等の１つ以上の修飾された塩基から得られる自己回避プライマーを含む。幾つかの実施形態では、自己回避分子認識システム（ＳＡＭＲＳ）はフォワードプライマー及び検出試薬の核酸タグであり、リバースプライマーは通常のＤＮＡである。
【００７８】
本発明の固体支持体上のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマー及び／又は本発明の検出試薬は、適切な時点で特定の成分に結合する様に構成され得る。例えば、幾つかの実施形態では、プライマー（例えば、フォワードプライマー）は、最初のＰＣＲサイクルが終わる迄、検出試薬の核酸タグと結合する事が妨げられる。それというのも、最初のＰＣＲサイクル後迄は、ＮＡタグは一本鎖であり、プライマー結合部位は存在しないからである。幾つかの実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それらがより低い温度（例えば、検出試薬と共にインキュベートする間）では塩基対に利用する事ができないが、より高い温度（例えば、余分の検出試薬を洗い流した後の時点）で利用可能になる様に設計され得る。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体上のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、（例えば、二重鎖又はヘアピン構造を介して）二本鎖であり得て、ＰＣＲの変性工程に際して、１つ以上のプライマーは一本鎖になる。１つ以上のプライマーは、二本鎖構造（例えば、二重鎖又はヘアピン）がＰＣＲを阻害する可能性がある為、その構造がＰＣＲアニーリング温度ではあまり高度に形成されない様に設計され得る。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体上のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、酵素的切断後に利用可能になり得る。例えば、プライマーは二重鎖の部分であり得て、競合鎖（プライマーに対して逆相補）は切断可能な結合を含む。競合鎖がより小さな部分に分解されると、融解温度が大幅に低下し得る為、ＰＣＲの間に競合する事はない。切断可能な結合については、以下の非排他的な例、即ち光切断可能な結合、エンドヌクレアーゼ若しくは他の酵素によって作用され得る特別に組み込まれたヌクレオチド、又はＲＮＡｓｅによって作用され得るＲＮＡを使用する事ができる。幾つかの実施形態では、切断により、伸長可能な３’末端を有するプライマーが提供される。
【００７９】
幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬は、固体支持体上のプライマーへのハイブリダイゼーションを最小化する様に保護及び／又は設計され得る。例えば、上記で論じられたのと同様の技術（例えば、ｄｓＤＮＡ二重鎖、ヘアピン構造）を使用して、リバースプライマーの結合部位が既に塩基対を形成している様にする事ができる。
【００８０】
幾つかの実施形態によれば、第１の複数の固体支持体及び第２の複数の固体支持体を含む複数の固体支持体が提供される。第１の複数の固体支持体中の各固体支持体は、第１のコード化シグナルを提供する第１のコード化剤（例えば、色素）、第１の核酸配列、及び第１の分子認識要素（例えば、抗体）を含み、第２の複数の固体支持体中の各固体支持体は、第２のコード化シグナルを提供する第２のコード化剤（例えば、色素）、第２の核酸配列、及び第２の分子認識要素（例えば、抗体）を含む。第１の複数の固体支持体中の固体支持体と第２の複数の固体支持体中の固体支持体とは、第１のコード化シグナルが第２のコード化シグナルと異なり、第１の核酸配列が第２の核酸配列と異なり、及び／又は第１の分子認識要素が第２の分子認識要素と異なる為、区別及び／又は識別される。
【００８１】
幾つかの実施形態によれば、分子認識要素（例えば、抗体）及び核酸配列を含む検出試薬が提供される。検出試薬の核酸配列は、本明細書では「核酸タグ」又は「タグ」とも呼ばれる。検出試薬は、標的の第１の部分に結合する事ができ、本発明の固体支持体は、標的の第２の部分に結合する事ができる。この様に、検出試薬は、それが標的を介して固体支持体と対を成す事で、対応する固体支持体を有する。本発明の検出試薬についての核酸タグは、検出試薬についての対応する固体支持体に取り付けられた（例えば、結合された）核酸配列の一部と共に核酸増幅プロセスに参加する様に構成される部分を有する。幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬は、核酸タグを含む検出抗体である。
【００８２】
検出試薬の核酸タグは、約２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド又は６０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１１０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３０ヌクレオチド、１４０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド、１７０ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２２０ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２６０ヌクレオチド、２８０ヌクレオチド又は３００ヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施形態では、核酸タグはヘアピンループを含む。
【００８３】
幾つかの実施形態では、核酸タグの少なくとも一部は、検出試薬についての対応する固体支持体の核酸配列の少なくとも一部と実質的に同一である。幾つかの実施形態では、核酸タグ中の少なくとも約５個以上（例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上）の連続的なヌクレオチドは、検出試薬についての対応する固体支持体の核酸配列中の少なくとも約５個以上（例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上）の連続的なヌクレオチドと実質的に同一である。幾つかの実施形態では、核酸タグの５’領域における配列は、固体支持体の核酸分子中の配列と実質的に同一である。幾つかの実施形態では、核酸タグの５’領域中の配列は、検出試薬についての対応する固体支持体の核酸配列と実質的に同一であり、及び／又は核酸タグの３’領域中の配列は、ＰＣＲマスターミックス中に任意に存在し得るリバースプライマーと相補的である。幾つかの実施形態では、２つ以上の異なる固体支持体のセットに対応する２つ以上の検出試薬は、核酸タグの３’領域において実質的に同一の配列を含み、この配列はリバースプライマーに相補的であり得る。
【００８４】
ここで図６を参照すると、本発明の実施形態による例示的な複合体が示されており、該複合体は、コード化された固体支持体、標的及び検出試薬を含んでいる。コード化された固体支持体は、フォワードプライマー及び標的に結合する抗体（例えば、捕捉抗体）の両方で官能化されたコード化されたビーズである。図６に示される検出試薬は、核酸配列を含む抗体であり、該抗体は標的に結合する事により本発明の複合体を形成する。従って、捕捉された標的は、ユニークな核酸配列を含む検出抗体で標識され、核酸配列（即ち、核酸タグ）の少なくとも一部は、任意にフォワードプライマーがビーズから放出され、リバースプライマーがＰＣＲマスターミックス中で提供されると、対応するコード化されたビーズのフォワードプライマーによって増幅される。次いで、ＰＣＲ産物を（例えば、ｄｓＤＮＡにインターカレートする色素からの）蛍光シグナルによって検出する事ができる。
【００８５】
１つ又は複数の固体支持体セット中の固体支持体に対応する検出試薬は、それぞれ同じ核酸タグを含む。核酸タグは、異なる固体支持体に対応する検出試薬の場合に相違する。再び図６を参照すると、検出試薬の核酸タグは、フォワードプライマーの少なくとも一部と共に核酸増幅プロセスに参加する様に構成された５’領域における配列を含む。更に、図７に示される様に、核酸タグは、リバースプライマーに相補的な３’領域における配列を含み、この核酸配列は、異なる固体支持体に対応する異なる検出試薬にも存在する（従って、共通している）。従って、核酸タグは、２つのプライマー、即ち、ユニークなフォワードプライマー及び共通のリバースプライマーによって増幅され得る。ユニークなフォワードプライマーは、核酸タグの５’領域における配列と実質的に同一であり得る。リバースプライマーは、全ての核酸タグの３’領域における配列と相補的であり得て、ＰＣＲマスターミックスに添加され得る。
【００８６】
幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列及び／又は検出試薬の核酸タグは、一本鎖ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列及び／又は検出試薬の核酸タグは、二本鎖ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列及び／又は検出試薬の核酸タグは、ＲＮＡ又はハイブリダイズしたＤＮＡ−ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体の核酸配列及び／又は検出試薬の核酸タグは、例えば、天然には通常見られない１つ以上の化学修飾された塩基等の１つ以上の化学修飾された塩基を含む。１つ以上の化学修飾された塩基は、ＰＣＲ反応の特異性を向上させ、及び／又は核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド）間の非特異的結合を減らし得る。
【００８７】
核酸タグは、任意の様式で分子認識要素に、及び／又は分子認識要素の任意の部分に取り付けられ又は結合され得る。幾つかの実施形態では、核酸タグは、分子認識要素に共有結合又は非共有結合で取り付けられている。幾つかの実施形態では、リンカーを使用して、核酸タグが分子認識要素に取り付けられる。核酸タグは、分子認識要素（例えば、抗体）の１つ以上のアミノ酸に取り付けられ得る。幾つかの実施形態では、分子認識要素は、抗体又はそのフラグメントであり、核酸タグは、抗体又はそのフラグメントのフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域に取り付けられ（例えば、共有結合で取り付けられ）得る。
【００８８】
幾つかの実施形態では、核酸タグは、化学合成された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。幾つかの実施形態では、分子認識要素に取り付けられた二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）タグは、非特異的結合の低減をもたらし得る検出試薬を提供する。幾つかの実施形態では、固体支持体に結合されたプライマーへのｄｓＤＮＡのハイブリダイゼーションは、（例えば、プライマー又は核酸タグに対する）相補鎖を、アッセイの間に、任意にその所望の放出迄はアニーリングされた状態が保証される様に設計する事によって低減される。当業者に認識される様に、ＤＮＡ鎖は、配列、温度及び化学的環境によって決定される速度で融解及びアニーリング（ほつれ）を受け得る。この末端のほつれは、他の核酸分子（例えば、固体支持体に結合されたプライマー又はプローブ等）への非特異的結合又は不所望なハイブリダイゼーションを増加させ得る。固体支持体に結合されたフォワードプライマーへのｄｓＤＮＡタグの相補鎖のハイブリダイゼーションを防ぐ為に、相補鎖はより短い場合があり、即ち、フォワードプライマーに相補的な配列を欠いている場合がある。この場合に、タグは部分的にｄｓＤＮＡであり、部分的にｓｓＤＮＡであり得る。
【００８９】
幾つかの実施形態では、核酸タグは、ヘアピンタグ配列及び／又はＧＣクランプを有する配列であり得る。ヘアピン配列及び／又はＧＣクランプを有する配列は、検出試薬と共にインキュベートしている間の末端のほつれ及び／又は不所望なハイブリダイゼーションを低減し得る。幾つかの実施形態では、核酸タグはＲＮＡ配列であり得て、逆転写酵素が使用され得る。ＲＮＡ配列は、試料捕捉の間のハイブリダイゼーションを妨げ得る内部構造を有するＲＮＡヘアピンを含み得る。
【００９０】
幾つかの実施形態では、核酸タグは、所望される迄（例えば、反応ウェル中にシールされた後迄）固体支持体に結合された核酸配列（例えば、プライマー）にハイブリダイズする事ができない様にタンパク質、膜、ミセル、ペプチド、バクテリオファージ等によってカプセル化され得る。
【００９１】
幾つかの実施形態では、核酸タグは制限酵素部位を含む。制限酵素部位を含む核酸タグは、酵素がヘアピン又はＧＣクランプを切断し、これを使用する事で、効率的なＰＣＲ分析の為に核酸配列が放出され得る様に設計する事ができる。幾つかの実施形態では、核酸タグは、光切断可能な結合又は化学的に切断可能なジスルフィドリンカーを含み、これを使用する事で、検出試薬から核酸タグの全て又は一部が放出され得る。
【００９２】
本発明の核酸タグは、例えば図７に示される様にユニークな領域及び共通の領域を含む必要はない。幾つかの実施形態では、検出試薬の核酸タグは、全体的に又は部分的にユニークである配列を含み、フォワードプライマー又はリバースプライマーの混合物を、その様な配列のマスターミックスに加える事ができる。
【００９３】
幾つかの実施形態では、核酸タグは、異なる検出試薬の核酸タグにおける保存された核酸配列であり、配列の一部又は全てが１つ以上のプライマーペアでの増幅によって検出され得る様に十分に大きい少なくとも１つの共通領域を含む。保存された核酸配列は、ユニークな領域の外側に位置する５’領域及び／又は３’領域中に存在し得る。保存された領域は、２つ以上の異なる検出試薬の全てについての核酸タグの全てに存在し得る。従って、異なる検出試薬についての核酸タグは、それらがユニークなプライマーペアによって、そして全ての検出試薬の核酸タグに共通であるユニバーサルなプライマーペアによって増幅され得る様に設計され得る。この実施形態は、非特異的結合及び／又は交差反応性を容易に視覚化する事ができる様に、アッセイ開発の間のトラブルシューティングに有用であり得る。幾つかの実施形態では、本発明の核酸タグは、少なくとも２つの核酸配列を含み、１つはユニークなリバースプライマーによって増幅され、もう１つはユニバーサルなリバースプライマーによって増幅される。
【００９４】
当業者に知られる任意の方法を使用して、核酸タグを分子認識要素に取り付ける事で、検出試薬が提供される。幾つかの実施形態では、従来の化学的方法、クリックケミストリー、遺伝子工学、及び／又は分子工学的方法を使用して、核酸タグが分子認識要素に取り付けられる。
【００９５】
幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬の分子認識要素を官能化する事で、核酸タグと、任意に固体支持体に結合された核酸配列を増幅するプライマー及び／又はプローブとで官能化されたナノ粒子となり得る。しかしながら、幾つかの実施形態では、可変濃度の多重化プライマーセットは、アッセイの変動を減らす為に避けられる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、検出試薬が核酸を含む分子認識要素を含む場合に、核酸タグは、分子認識要素の全て又は一部によって提供され得る。即ち、分子認識要素自体が核酸タグとして機能し得る。
【００９７】
幾つかの実施形態によれば、各検出試薬が第１の分子認識要素（例えば、抗体）及び第１の核酸タグを含む第１の複数の検出試薬と、各検出試薬が第２の分子認識要素（例えば、抗体）及び第２の核酸タグを含む第２の複数の検出試薬とを含む複数の検出試薬であって、上記第１の核酸タグ及び上記第２の核酸タグは、それぞれ第１の部分及び第２の部分を含み、且つ上記第１の核酸タグについての上記第１の部分の核酸配列は、上記第２の核酸タグについての上記第１の部分の核酸配列とは異なる、複数の検出試薬が提供される。幾つかの実施形態では、第１の核酸タグ及び第２の核酸タグについての第２の部分の核酸配列は同じ又は実質的に同一である。幾つかの実施形態では、第１の核酸タグ及び第２の核酸タグの第１の部分は、それぞれのタグの５’領域中にあり、第２の部分は、それぞれのタグの３’領域中にある。第１の核酸タグは、第１の分子認識要素に取り付けられ（例えば、連結され、結合され、及び／又は融合され）得て、第２の核酸タグは、第２の分子認識要素に取り付けられ（例えば、連結され、結合され、及び／又は融合され）得る。
【００９８】
幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載される固体支持体及び／又は本明細書に記載される検出試薬を含む組成物、キット、デバイス、及び／又はシステムが提供される。固体支持体及び検出試薬は、固体支持体及び検出試薬に対応する標的が存在する場合に、複合体を形成し得る。組成物、キット、デバイス、及び／又はシステムは、任意に２つ以上の異なるコード化された固体支持体を含む複数の固体支持体と、任意に２つ以上の異なる検出試薬を含む複数の検出試薬とを含み得る。
【００９９】
幾つかの実施形態では、ビーズセットは、図７におけるビーズ「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」によって示される様に、各セットをユニークな色素又は蛍光色素のユニークな組み合わせでコード化する事によって調製され得る。例えば、ビーズセット「Ａ」は赤色蛍光色素で染色される一方で、ビーズセット「Ｂ」は青色蛍光色素で染色される。幾つかの実施形態では、全てのセットは、各セットが特定の標的分子に対する異なるビオチン化された捕捉抗体と共にインキュベートされる前に、ストレプトアビジンで官能化される。最終的に、各セットはユニークなビオチン化されたプライマー（フォワードプライマーなど）と共にインキュベートされる。幾つかの実施形態では、検出試薬は、各標的に対する検出抗体にユニークな核酸タグを共有結合で取り付ける事によって調製される。幾つかの実施形態では、タグは、５’末端又は領域のユニークな配列及び全てのタグ間で保存されている３’末端又は領域に共通配列を有する６０ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。各タグは、フォワードプライマー（タグ毎に異なる）及び共通のリバースプライマーの２つのプライマーによって増幅される。幾つかの実施形態では、フォワードプライマーは、検出抗体に取り付けられたタグの５’領域又は５’末端の配列と同一又は実質的に同一である配列を含み得る。或いは、タグの３’末端を検出抗体に取り付ける事ができる。幾つかの実施形態では、全てのタグの保存された３’末端又は領域に相補的であるリバースプライマーが、ＰＣＲマスターミックスに添加され得る。この様に、ビーズセットＡは、捕捉抗体Ａと、検出抗体Ａに連結された核酸タグＡのみを増幅し得るフォワードプライマーＡの両方を有する。ビーズセットＢは、捕捉抗体Ｂと、検出抗体Ｂに連結された核酸タグＢのみを増幅し得るフォワードプライマーＢの両方を有する。マスターミックスに添加されたプライマーは、核酸タグＡと核酸タグＢの両方についてのリバースプライマーとして機能する。それというのも、タグの３’末端又は領域には保存された配列が含まれるからである。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、核酸タグにハイブリダイズする事ができる相補的配列を含まない。その様なハイブリダイゼーションは、標的の不存在下でインキュベーション混合物からの検出試薬の大幅なプルダウンをもたらす為、非常に高いバックグラウンドシグナルを生じ得る。この理由の為、幾つかの実施形態では、フォワードプライマーのみが固体支持体に取り付けられている。それというのも、フォワードプライマーは、タグの５’末端又は領域と配列が同一又は実質的に同一（相補的ではない）であるからである。タグに相補的なリバースプライマーはＰＣＲマスターミックスに添加され得る為、ＰＣＲが行われ得る。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、アッセイは異なる標的について固体支持体の混合物の存在下で実施され、固体支持体は、試料と共にインキュベートされる。固体支持体は標的を捕捉する事ができ、試料マトリックスを洗い流すことができる。次いで、固体支持体を、該固体支持体に対応する複数の検出抗体試薬の混合物と共にインキュベートする事で、捕捉された標的は標識されて、複合体を形成し得る。該複合体は、洗浄され得る及び／又はアレイ（例えば、殆どの反応ウェルが単一のビーズのみを収容する様なサイズのマイクロウェルアレイ）にロードされ得る。全てのタグの３’末端又は領域に相補的である共通のリバースプライマーを含むＰＣＲマスターミックスを添加した後に、任意に、例えば非混和性オイルでシールする事により、各反応を流体的に隔離する事ができる。ＰＣＲの変性工程の間に、固体支持体に取り付けられたフォワードプライマーが隔離された反応ウェルに放出され得る為、ここで各ウェルに完全なＰＣＲプライマーセットが収容される。例えば、検出抗体コンジュゲートＡが存在する場合にはビーズタイプＡを含むウェルがＰＣＲ陽性になり、検出抗体コンジュゲートＢが存在する場合にはビーズタイプＢを含むウェルがＰＣＲ陽性になる。しかしながら、ビーズタイプＡ及び非特異的に結合した検出抗体コンジュゲートＢを含む反応は、ビーズタイプＡにより運ばれるプライマーが検出抗体コンジュゲートＢ上の核酸タグを増幅する事ができない為、ＰＣＲ陽性にはならない（図８）。この様に、シングルプレックス反応として最適化されたｉＰＣＲアッセイは多重化に際して殆ど再最適化を必要としない。それというのも、各ビーズセットにより増幅及び／又は検出され得る総検出抗体濃度は、追加の標識をアッセイに加えても変化しないからである。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、それらの対応する固体支持体との複合体として、約０個〜約１０００００００個の検出試薬の結合を捕らえる及び／又はそれをもたらす。例えば、本発明の方法は、それらの対応する固体支持体との複合体として、約０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１２００個、１４００個、１６００個、２０００個、２２００個、２５００個、２７５０個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個又は５０００個〜約１００００個、２５０００個、５００００個、７５０００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、５００００００個又は１０００００００個の検出試薬の結合を捕らえ得る及び／又はそれをもたらし得る。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物、キット、デバイス、及び／又はシステムは、増幅剤を更に含む。例示的な増幅剤には、限定されるものではないが、リバースプライマー、ｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼ等が含まれる。幾つかの実施形態では、増幅剤は、検出試薬及び固体支持体の核酸配列の少なくとも一部に相補的である核酸配列を有し、任意に、核酸配列の一部は、核酸タグの３’領域内にある。増幅剤は、固体支持体及び／又は検出試薬から分離され得る。幾つかの実施形態では、増幅剤は固体支持体に取り付けられており、任意に、増幅剤はビオチン化されている。
【０１０４】
本発明の固体支持体及びその対応する検出試薬は、本発明の組成物、キット、デバイス、及び／又はシステムにおいて別々に保管され得る。幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬及び増幅剤は、本発明の組成物、キット、デバイス、及び／又はシステムにおいて別々に保管される。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体及び増幅剤は、増幅剤が存在して固体支持体に取り付けられていない場合に別々に保管される。
【０１０５】
幾つかの実施形態によれば、試料中の標的を検出する方法が提供される。該方法は、本発明の固体支持体と標的を含む試料とを混ぜ合わせて、標的に結合された固体支持体を含む第１の組成物を形成する事を含み得る。
【０１０６】
本明細書で使用される「混ぜ合わせている（combining）」及び「混ぜ合わせる（combine）」は、任意に適切な条件下で、２つ以上の成分を、結合及び／又は反応するのに十分な近接及び／又は接触にもたらす事を指す。本発明の検出試薬を、標的に結合された固体支持体と混ぜ合わせる事で、固体支持体、標的及び検出試薬を含む複合体を形成する事ができ、ここで、検出試薬は、標的に結合する分子認識要素及び核酸タグを含む。核酸タグの少なくとも一部及び固体支持体に結合された核酸配列の少なくとも一部は、核酸増幅プロセスに参加する様に構成されている。核酸タグの少なくとも一部が増幅され、それにより試料中の標的の検出が可能となる。限定されるものではないが、ＰＣＲ及び／又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）等の任意の適切な増幅方法を使用及び／又は実施する事ができる。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、上記方法は、任意に水溶液を使用する１回以上洗浄工程を含み得る。１回以上の洗浄工程を実施して、標的に結合された固体支持体を洗浄する、及び／又は複合体を洗浄する事ができる。１回以上の洗浄工程は、未反応成分及び／若しくは非結合成分、並びに／又は複合体に非特異的に結合された成分を除去する事ができる。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、本発明の方法において増幅剤が使用される。この方法は、増幅剤と、固体支持体、標的及び検出試薬を含む複合体とを混ぜ合わせる及び／又は反応させる事を含み得る。増幅剤と複合体とを混ぜ合わせる工程の前に、その間に、及び／又はその後に、増幅剤が固体支持体に取り付けられている場合に、増幅剤は固体支持体から放出され得る。幾つかの実施形態では、増幅剤は固体支持体上に留まる。幾つかの実施形態では、増幅剤は固体支持体に取り付けられておらず、複合体を含む組成物に添加される。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、増幅剤は、任意に増幅工程の前に固体支持体から放出され得る核酸配列（例えば、プライマー）である。幾つかの実施形態では、固体支持体に結合された及び／又は固体支持体から放出された核酸配列の少なくとも一部が増幅される。幾つかの実施形態では、増幅剤は、適切な条件下で反応して２つのオリゴヌクレオチドを一緒にライゲーションするｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼを含む。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡオリゴ）を含み、本発明の検出試薬は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡオリゴ）を含み、ｓｓＤＮＡスプリント及びリガーゼの存在下に適切な条件下で（例えば、オリゴが互いに近接している場合、例えば、それぞれが同じ標的に結合している場合）、２つのオリゴヌクレオチドはライゲーション及び／又は伸長され、その後に、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が増幅され得る。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡオリゴ）を含み、本発明の検出試薬は、オリゴヌクレオチド（例えば、固体支持体のｓｓＤＮＡオリゴにハイブリダイズし得る３’オーバーハングを有するオリゴ）を含み、互いに近接している場合、例えば、それぞれが同じ標的に結合している場合に、２つのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズして伸長され、その後に、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が増幅され得る。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬は、標的及び固体支持体が混ぜ合わされると、本発明の対応する固体支持体を含む組成物中に存在する。幾つかの実施形態では、本発明の検出試薬、本発明のその対応する固体支持体、及び標的は同時に混ぜ合わされる。
【０１１１】
本発明の方法は、同じ及び／又は異なる１つ以上の核酸配列を増幅する事を含み得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、検出試薬の核酸タグの少なくとも一部を増幅する事を含む。幾つかの実施形態では、検出試薬の核酸タグの少なくとも一部を増幅する事は、ＰＣＲを使用して行われる。幾つかの実施形態では、検出試薬の核酸タグの少なくとも一部を増幅する事はＰＣＲを伴わず、限定されるものではないが、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅、鎖置換増幅、転写媒介増幅及び／又は核酸回路等の別の核酸増幅技術が使用され、ここで、酵素分解されたタグは、ハイブリダイゼーションによって駆動される連鎖反応を開始し得る。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を使用して行われる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、結合誘導ＤＮＡ増幅（Binding Induced DNA Amplification）（ＢＩＮＤＡ）、近接伸長アッセイ（ＰＥＡ）及び／又はトリプルＰＬＡを使用して行われる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、複数のウェルを含むマイクロ流体デバイスにおいて実施される多重化アッセイ（例えば、イムノポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）アッセイ）であり、この方法は、複数のウェルの少なくとも１つのウェルにおいて固体支持体を１つ以上の更なる固体支持体から隔離する事を更に含む。
【０１１３】
マイクロ流体デバイスは、硬質又は固体のマイクロウェルアレイを含む場合も又は含まない場合もある。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体は、非混和性オイル中の水性ＰＣＲマスターミックスの液滴（例えば、エマルジョンＰＣＲ、ＢｉｏＲａｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲシステム、ＲａｉｎＤａｎｃｅ  ＰＣＲシステム又はＢＥａＭｉｎｇとして知られる技術で使用される液滴）において隔離され得る。幾つかの実施形態では、フォワードプライマーは、共有結合による連結又は複数のビオチン基を介して本発明の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合され（例えば、つながれ）ている為、エマルジョンの破壊後に、フローサイトメーターによってシグナルを読み取る事ができる。特定の等温増幅技術を、エマルジョン／液滴の形式で、又はアンプリコンが固体支持体に取り付けられたままの場合にはバルク溶液で使用する事ができる。幾つかの実施形態では、本発明の基板、デバイス、及び／又は方法は、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１５／０２１１０４８号明細書、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２９１３号、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３４６３号、及び国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５５４７０号に記載されるもの（例えば、基板、デバイス、及び／又は方法）を含み得る（これらのそれぞれの内容全体を、引用する事により本明細書に援用する）。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２１１０４８号明細書及び国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２９１３号に記載される様なビーズ（例えば、超常磁性ビーズ）を使用して試薬及び／又は標的を反応ウェルに送達する方法を含む（これらのそれぞれの内容全体を、引用する事により本明細書に援用する）。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物、組成物、キット、システム、デバイス、及び／又は方法は、例えば、ＰＣＲ反応等の生体分子を含むアッセイ、空間アレイベースのアッセイ、例えば、再構成可能な多要素診断（ＲｅＭｅＤｘ）アッセイ、コンパクトアレイでのシングルプレックス反応（ＳｉＲＣＡ）、水性反応組成物を含むアッセイ、プラスチック基材上で実施されるアッセイ、及び／又は国際公開第２０１３／１７６７６７号パンフレット（この内容を引用する事により本明細書に援用する）に記載されるアッセイ等の任意の適切な反応を実施する為に使用され得る。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、本発明の固体支持体を調製する事を含む。本発明の固体支持体は、固体支持体（任意に１つ以上のリンカーを含む）を分子認識要素及び核酸配列と同時に及び／又は異なる時点で接触させる事によって形成され得る。幾つかの実施形態では、分子認識要素及び核酸配列は、複数のビーズ中のそれぞれのビーズに実質的に同じ数（即ち、±２０％以内）の分子認識要素及び核酸配列を有する複数のビーズを提供するのを助ける為に複数回に分けて添加され得る。幾つかの実施形態では、本発明の固体支持体を調製する方法は、固体支持体を、限定されるものではないが、ビオチン、ビオチン化ポリマー、ビオチン化核酸ポリマー、ビオチン化炭水化物、ビオチン化量子ドット若しくは他のナノ粒子、ビオチン化ペプチド、及び／又はビオチン化タンパク質等の１つ以上のフィラーと接触させる事を含む。フィラーは、固体支持体に添加される分子認識要素及び／又は核酸配列の量を制御するのを助ける事ができ、及び／又はアッセイの間の非特異的結合を減らすのを助ける事ができる。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、固体支持体に取り付けられた核酸配列（例えば、プライマー）への検出試薬の望ましくないハイブリダイゼーションは、トーホールド置換プライマー、ヘアピンプライマー、部分的に消化可能なヘアピンプライマー、及び／又はブロッキングＮＡ配列を使用する事によって低減され得る。プライマーは、５’末端及び／若しくは３’末端又は５’末端及び３’末端の両方で固体支持体につながれていても良い。幾つかの実施形態では、適切な条件がもたらされる場合に、二本鎖プライマーを使用する事ができる。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、インキュベート条件及び／又は増幅条件は、本発明の方法では、固体支持体に取り付けられた核酸配列への検出試薬のハイブリダイゼーションが有利に働かずに、ＰＣＲ増幅が依然として該方法の検出段階の間に起こり得る様に制御され得る。例えば、低融点プライマーは、プライマーが検出試薬にハイブリダイズしない様に、融解状態（例えば、低い塩又はベタインの添加）を支持するインキュベート条件下で使用され得る。しかしながら、より高い融点を支持する条件はＰＣＲの間に使用する事ができる為（例えば、より高い塩又はベタインの除去）、プライマーは検出試薬の核酸配列を効率的に増幅する事ができる。
【０１１８】
本発明の方法では、例えば、目視観察及び／又は化学的アッセイ若しくは生化学的アッセイ等の当業者に知られる任意の方法を使用して、標的が検出され得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、アッセイシグナルを検出する事によって標的を検出する事を含む。例えば、アッセイシグナルは、例えばｄｓＤＮＡにインターカレートする色素から、並びに／又はクエンチャー及び色素を含むプローブの加水分解からの様な蛍光シグナルであり得る。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、検出の為に蛍光が使用される。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、蛍光の読み取りを含み、及び／又は提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、アンプリコンの固体センサーへのハイブリダイゼーション、パイロシーケンシング等の方法によるアンプリコンのシーケンシング、及び／又はＬＡＭＰ増幅の間に見られる様な沈殿物の形成による電子的読み取りを含み、及び／又は提供する。
【０１２０】
本発明の方法は、アッセイの特異性を向上させる事ができ、及び／又はアッセイについてのバックグラウンドシグナルを低下させる事ができる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、固体支持体と非標的分子（例えば、誤った抗原）との間で観察される交差反応性を低下させる。本明細書で使用される「観察される交差反応性」は、固体支持体と非標的分子（例えば、誤った抗原）との間の相互作用と関連する検出されたシグナルを指す。幾つかの実施形態では、検出されたシグナルは視覚的に観察され得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、図５に示される様に偽陽性で観察される蛍光シグナル等の、固体支持体の観察される非特異的結合を低下させる。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、アッセイについての信号対雑音比を改善し、アッセイについての感度を改善し、及び／又はアッセイについての観察される交差反応性を低下させる。幾つかの実施形態では、本発明の化合物、組成物、デバイス、キット、システム、及び／又は方法は、多重化イムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）アッセイを改善する。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、標的について観察される交差反応性及び／又はバックグラウンドシグナルは、標的毎に異なる核酸配列を使用する事によって、及び／又は各プローブがスペクトルの異なる蛍光色素で標識される多重化されたプローブベースのｑＰＣＲを実施する事によって低減され得る。この場合に、プローブの加水分解から観察される蛍光の増加は、正しい複合体が形成されたか否かを決定する為にビーズのコード化を参照する事ができる。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、検出試薬で使用されるＮＡタグの配列は、正しいＰＣＲ増幅から生じるアンプリコンが別個の融点、任意に異なる融点を有する様に慎重に選択される事から、これらの配列を非特異的増幅産物と区別する事ができ、任意に互いに区別する事ができる。異なる融点のアンプリコンの使用は、或るビーズ集団を別のビーズ集団から区別する為のコード化の手段として、及び／又はコード化シグナルを裏付ける手段として使用する事ができる。本発明の方法は、アッセイについてのバックグラウンドシグナルを、対照法（例えば、既知の固体支持体及び検出試薬を使用したｉＰＣＲ）と比べて約０．５桁、１桁、１．５桁、２桁、２．５桁、又は３桁減少させる事ができる。
【０１２３】
本発明の化合物、組成物、キット、デバイス、システム及び／又は方法は、多重化イムノアッセイパネルで使用する事ができる。本発明の幾つかの実施形態は、定性的及び／若しくは定量的な医学的及び／若しくは獣医学的な診断検査、法医学的検査、生物学的危険物質の同定、環境モニタリング、研究開発、並びに／又は同等の事において有用であり得る。幾つかの実施形態では、そうでなければ高レベルの交差反応性を示すであろう分子認識要素（例えば、抗体）ペアを多重化する能力は、現在実現されていない新しい診断試験を可能にし得る。
【０１２４】
本発明を、以下の非限定的な実施例でより詳細に説明する。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
単一分子のビーズベースのイムノアッセイを、本明細書に記載される様に、固体支持体及び検出試薬を使用して開発した（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡ技術」と呼ばれる）。これらのアッセイを類似のｉＰＣＲアッセイと比較して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡ技術が非特異的結合及び抗体交差反応性からのバックグラウンドをどの様に減らす事ができるかを示した。
【０１２６】
まず、ｉＰＣＲアッセイ試薬を調製した。サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αについてのビーズセットを、３μｍのＰｒｏＭａｇ  ＣＯＯＨ修飾超常磁性ビーズをコード化色素及び捕捉抗体で官能化する事により調製した。トライリンク・バイオテクノロジーズ（TriLink Biotechnologies）社製のＰｒｏｔｅｉｎ−Ｏｌｉｇｏ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、同じ６０ヌクレオチドのｓｓＤＮＡタグを関連する検出抗体（図３）に取り付ける事によって、検出抗体コンジュゲートを作製した。図４に示される様にｉＰＣＲアッセイを行った。シングルプレックスアッセイにより、優れた感度が示された（図９Ａ）。５プレックスアッセイでは、検出限界（ＬＯＤ）付近で、一般的に約１ｐｇ／ｍＬ以下で行われた測定により、殆どのビーズセットで優れた感度が示される（図９Ｂ）。しかしながら、多重化すると、バックグラウンドシグナルは全てのビーズセットで、特にＩＬ−８について大幅に増加した（図９Ｂ及び図９Ｃ）。
【０１２７】
ストレプトアビジン被覆されたＤｙｎａｂｅａｄｓをビオチン化捕捉抗体と共にインキュベートする事により、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズを調製した（図１０）。トライリンク・バイオテクノロジーズ（TriLink Biotechnologies）社製のＣｈｒｏｍａｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、抗体を内製でビオチン化した。次いで、抗体標識されたビーズを、蛍光色素で共有結合的に標識されたビオチン化フォワードプライマー（図１０）と共にインキュベートすることで、ビーズをコード化した。サイトカインＩＬ−７、ＩＬ−８及びＩＬ−１０について、３セットのビーズを調製した。各セットからの代表的なビーズについての２つのコード化波長における蛍光強度のプロットを図１１に示す。色素が共有結合により取り付けられた３つのｉＰＣＲビーズについてのコード化クラスターも図１１に示す。各ビーズセットの緊密なクラスター化により、多重化実験で各ビーズタイプを正確に特定する事ができた。
【０１２８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズの陽性のパーセントを、シングルプレックスアッセイにおいて従来のｉＰＣＲビーズと比較した。ｉＰＣＲビーズとＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズとは、ｉＰＣＲビーズがストレプトアビジンで官能化されていない点で、又はｉＰＣＲビーズがプライマーで被覆されており、それらがコード化色素及び捕捉抗体に共有結合により連結されている点で異なっている。各標的についてのｉＰＣＲ及びＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズを、血清（ブランク）又は血清中の９０ｆＭの標的サイトカイン（ポジティブコントロール）のいずれかと共にインキュベートした。この初期試験の目標は、種々のアッセイビーズ上の捕捉抗体の感度又は活性を測定する事であった為、各ビーズセットをｉＰＣＲ用に開発された適切な抗体コンジュゲートと共にインキュベートした（即ち、全ての検出コンジュゲートは同じＮＡタグを有していた）。両方のプライマーをＰＣＲマスターミックスに添加した。図１２は、血清ブランク及び９０ｆＭの各サイトカインについて得られたシグナルを示している。一般に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズは、バックグラウンドへのシグナルに関してｉＰＣＲビーズと非常に類似した挙動を示し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズは、これらのアッセイについて僅かに高いシグナル及び僅かに高いバックグラウンドを示した。
【０１２９】
次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡについて検出抗体コンジュゲートを調製した。ｉＰＣＲでは、各抗体コンジュゲートに同じＮＡタグが使用される。Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡでは、図７に示される様に、コンジュゲート毎に異なるＮＡタグが使用される。フォワードプライマーを欠いたｉＰＣＲビーズをシングルプレックスアッセイで使用して、ｉＰＣＲ及びＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡコンジュゲートの活性を比較した。その為、各タグについてのプライマーを、各シングルプレックスアッセイのマスターミックスに添加した。他の点では同一の実験における検出抗体コンジュゲートの活性の比較により、全てのＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡコンジュゲートの感度がｉＰＣＲコンジュゲートよりも低い事が示された（図１３）。コンジュゲートの特性評価により、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡ抗体は全てが標識不足である為、抗体のかなりの割合がＮＡタグを欠いている事が明らかになった。これらのタグの無い抗体は、捕捉された標的分子を結合する事ができるが、検出可能な（変換可能な）ＰＣＲシグナルを生じない。ｉＰＣＲコンジュゲートとＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡコンジュゲートとの間の標識効率の違いは、ｉＰＣＲコンジュゲート及びＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡコンジュゲートが異なる時期に調製された為、購入した抗体ストックのバッチ変動又はコンジュゲーションキット（トライリンク・バイオテクノロジーズ（TriLink Biotechnologies）社製のＰｒｏｔｅｉｎ−Ｏｌｉｇｏ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）中の試薬の劣化が原因である可能性がある。コンジュゲート間で観察された違いは、抗体コンジュゲートの調製におけるばらつきが原因である可能性があり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡコンジュゲートの固有の特性ではない。
【０１３０】
ビーズタイプ、コード化スキーム、ビーズへの抗体の取り付け、プライマー送達、抗体コンジュゲート標識効率、及び異なるＮＡタグ配列のＰＣＲ増幅効率における違いを説明する為に、ベースラインのシングルプレックスアッセイをｉＰＣＲ及びＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡについて実施した（図１４）。シングルプレックスアッセイでのＩＬ−７及びＩＬ−８についてのバックグラウンドシグナルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡで僅かにより高いが、ＩＬ−１０  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡは、より低いバックグラウンドシグナルを有する。
【０１３１】
次に、ＩＬ−７、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のｉＰＣＲビーズを含む３プレックスｉＰＣＲアッセイを、３つのｉＰＣＲ抗体コンジュゲートを使用して実施した。３つの全てのサイトカインについてのビーズを一緒に混ぜた後に、バッファー（ブランク）又は９０ｆＭの各サイトカインと共にインキュベートした。共通のｉＰＣＲ  ＮＡタグ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーの単一のセットをＰＣＲマスターミックス中に供給した。以前の研究から予想される様に、ＩＬ−８は非常に高いバックグラウンドシグナルを示した。この様に高いパーセンテージの陽性ウェルは、ビーズ毎に幾つかの非特異的結合した検出抗体複合体が存在する可能性が高い事を示している。９０ｆＭのＩＬ−７又はＩＬ−１０のいずれかをサンプルバッファー中にスパイクすると、適切なビーズセットにおいてアッセイシグナルの大幅な増加が観察された。しかしながら、サンプルバッファーに９０ｆＭのＩＬ−８を添加しても、ＩＬ−８ビーズではバックグラウンドを超える大幅なシグナルの増加は生じなかった事から、この濃度が３プレックスｉＰＣＲアッセイでの検出限界を下回っている事を示している（図１５）。各ビーズタイプについての４つの異なるアッセイ条件（ブランク及び９０ｆＭの各サイトカイン）の比較チャートを図１５ｅに示す。ＩＬ−８ビーズからの高いシグナルは、他の検出抗体コンジュゲートの非特異的結合が原因である可能性がある。
【０１３２】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡビーズ並びにＩＬ−７、ＩＬ−８及びＩＬ−１０についての検出抗体コンジュゲートを使用して、同じ３プレックスアッセイを繰り返した。３つの全てのサイトカインについてのビーズを一緒に混ぜた後に、バッファー（ブランク）又は９０ｆＭの各サイトカインと共にインキュベートした（図１６）。各コンジュゲートタグについてのユニークなフォワードプライマーがビーズ自体によってウェルに送達された為、共通のリバースプライマーのみをＰＣＲマスターミックス中に供給した。４つの実験（ブランク及び９０ｆＭの各サイトカイン）についての各ビーズセットからのシグナルを示す比較チャートを図１６に示す。それぞれの分析物が存在する場合に、全てのビーズについてバックグラウンドを超えるシグナルの識別可能な増加が認められる。
【０１３３】
ｉＰＣＲ及びＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡアッセイの直接的な比較を図１７に示す。シングルプレックスアッセイデータでは、ＩＬ−７は、ｉＰＣＲと比較してＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡにおいてバックグラウンドに対するより低いシグナルを示すが、これはＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡ抗体コンジュゲートでの問題が原因である可能性がある。ＩＬ−１０は、ｉＰＣＲと比較してＰｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡにおいてバックグラウンドに対するシグナルの大幅な改善を示している。しかしながら、最も顕著な改善はＩＬ−８ビーズで認められる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｉＲＣＡ  ＩＬ−８ビーズのバックグラウンドシグナルは、ｉＰＣＲで見られるものよりも一桁以上低い事から、９０ｆＭのＩＬ−８とブランクとの間の違いを簡単に識別するのに十分なバックグラウンドに対するシグナルを可能にする。
【０１３４】
前述のものは本発明を例示するものであって、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定され、そこには特許請求の範囲の均等物も含まれるべきである。参考文献が示される文及び／又は段落に関連する教示について、本明細書で引用される全ての出版物、特許出願、特許、特許公報、及び他の参考文献の内容全体を、引用する事により援用する。
【図１】
2022501005.tif 000003
【図２】
2022501005.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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