(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する特性を有し、また、前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの結合親和性は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの結合親和性の少なくとも２倍である。本発明は、このようなＴＣＲと治療剤の融合分子をさらに提供する。このようなＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体を提示する腫瘍細胞を標的とするために、単独で、または治療剤と組み合わせて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する活性を有し、また、前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
【表１】
2022502078.tif 000028
および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ
ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ
ＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含むことを特徴とする、前記ＴＣＲ。
【表２】
2022502078.tif 000029
【請求項２】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域における突然変異の数は、３から８個であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域における突然変異の数は、４から８個であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの突然変異部位は、ＣＤＲ３αの７番目および／または８番目を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲの突然変異は、次の群を含み、
【表３】
2022502078.tif 000030
および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲの突然変異は、次の群を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【表４】
2022502078.tif 000031
【請求項７】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＴＳＩＮＮ、ＴＰＩＳＳ、ＴＤＩＹＫ、ＴＡＶＤＳ、ＴＥＩＳＳおよびＴＤＶＳＳからなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＲＳＮＥＲＥであることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、また、ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰ［３αＸ１］［３αＸ２］［３αＸ３］［３αＸ４］ＮＳＫＬＴの配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］および［３αＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記［３αＸ１］は、ＲまたはＡまたはＳまたはＤまたはＥまたはＱまたはＶまたはＴであることを特徴とする
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記［３αＸ２］は、ＴまたはＭまたはＲまたはＬまたはＡまたはＮまたはＳであることを特徴とする
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記［３αＸ３］は、ＧまたはＡまたはＱまたはＳまたはＥまたはＮであることを特徴とする
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記［３αＸ４］は、ＡまたはＳまたはＧまたはＰまたはＷであることを特徴とする
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
前記ＣＤＲ３αのアミノ酸配は、ＡＴＤＰＳＭＳＰＮＳＫＬＴ、ＡＴＤＰＳＬＳＰＮＳＫＬＴおよびＡＴＤＰＳＬＱＳＮＳＫＬＴからなる群から選択されることを特徴とする
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＦＱＧＤＭＥ、ＦＱＧＤＬＥおよびＦＨＧＤＬＥからなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は、ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹであることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
前記ＴＣＲは、次の群から選択されるＣＤＲを有することを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【表５】
2022502078.tif 000032
2022502078.tif 000033
2022502078.tif 000034
2022502078.tif 000035
【請求項１８】
前記ＴＣＲは、可溶性であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１９】
前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖定常領域配列ＴＲＡＣ＊０１およびβ鎖定常領域配列ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を有することを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２０】
前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする
請求項１９に記載のＴＣＲ。
【請求項２１】
前記ＴＣＲのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工鎖間ジスルフィド結合が含まれることを特徴とする
請求項２０に記載のＴＣＲ。
【請求項２２】
前記ＴＣＲα鎖とβ鎖との定常領域の間に、人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される一つまたは複数の部位を置換することを特徴とする
請求項２１に記載のＴＣＲ。
【請求項２３】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−７７および９１−９２から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８−８８および９３−１０１から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２４】
前記ＴＣＲは、次の群からなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【表６】
2022502078.tif 000036
2022502078.tif 000037
2022502078.tif 000038
【請求項２５】
前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２６】
前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインからなる単鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、柔軟な短いペプチド配列（リンカー（ｌｉｎｋｅｒ））によって結合される
ことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２７】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−３５から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６−４６から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２８】
前記ＴＣＲは、次の群からなる群から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【表７】
2022502078.tif 000039
2022502078.tif 000040
【請求項２９】
前記ＴＣＲの鎖および／またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端には、コンジュゲートが結合されることを特徴とする
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項３０】
前記ＴＣＲに結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質の任意の組み合わせであることを特徴とする
請求項２９に記載のＴＣＲ。
【請求項３１】
前記ＴＣＲに結合する治療剤は、前記ＴＣＲα鎖またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端に結合された抗−ＣＤ３抗体であることを特徴とする
請求項３０に記載のＴＣＲ。
【請求項３２】
多価ＴＣＲ複合体であって、
少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、また、ここで、ＴＣＲ分子の少なくとも一つは、前記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲであることを特徴とする、前記多価ＴＣＲ複合体。
【請求項３３】
核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列またはその相補的配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項３４】
ベクターであって、
前記ベクターは、請求項３３に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、前記ベクター。
【請求項３５】
宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、請求項３４に記載のベクターを含むか、または染色体に外因性の請求項３３に記載の核酸分子が組み込まれることを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項３６】
単離された細胞であって、
前記細胞は、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴＣＲを発現することを特徴とする、前記単離された細胞。
【請求項３７】
医薬組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項３２に記載のＴＣＲ複合体、または請求項３６に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項３８】
疾患を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項３２に記載のＴＣＲ複合体、または請求項３６に記載の細胞、または請求項３７に記載の医薬組成物を投与する段階を含むことを特徴とする、前記疾患を治療する方法。
【請求項３９】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項３２に記載のＴＣＲ複合体または請求項３６に記載の細胞の用途であって、
腫瘍を治療する薬物の調製に使用され、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓癌であることを特徴とする、前記用途。
【請求項４０】
腫瘍を治療する薬物として使用され、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓癌である
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項３２に記載のＴＣＲ複合体または請求項３６に記載の細胞。
【請求項４１】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を調製する方法であって、
（ｉ）請求項３５に記載の宿主細胞を培養することにより、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を発現する段階と、および
（ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製する段階とを含むことを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、ＡＦＰタンパク質由来のポリペプチドを識別することができるＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）に関する。本発明は、前記受容体の調製および用途にさらに関する。
【０００２】
［背景技術］
２種類の分子だけが、特定の方法で抗原を識別することができる。ここで、一つは、免疫グロブリンまたは抗体であり、もう一つは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、これは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖がヘテロ二量体の形式で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。免疫系のＴＣＲスペクトルの構成は、胸腺でＶ（Ｄ）Ｊ組換え、それに陽性および陰性の選択によって生成される。末梢環境において、ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体−ペプチド複合体（ｐＭＨＣ）に対するＴ細胞の特異的識別を仲介するため、免疫系に対する細胞免疫機能は不可欠である。
【０００３】
ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示される特異的抗原ペプチドの唯一の受容体であり、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは、細胞に異常が発生する唯一の兆候である可能性がある。免疫系において、抗原特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合を介して、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との直接な物理的接触を引き起こした後、Ｔ細胞とＡＰＣとの両者の他の細胞膜表面分子が相互作用して、一連の後続的の細胞シグナル伝達および他の生理学的反応を引き起こすことにより、異なる抗原特異的Ｔ細胞がその標的細胞に対して免疫効果を発揮する。
【０００４】
ＴＣＲに対応するＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子リガンドも、免疫グロブリンのスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる固体は、異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原に異なる短いペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示することができる。ヒトＭＨＣは、一般にＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
【０００５】
αフェトプロテインとも呼ばれるＡＦＰ（αＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、胚発育時に発現するタンパク質であり、胚血清の主成分である。発育において、ＡＦＰは、卵黄嚢および肝臓で比較的に高レベルの発現水準を有し、その後阻害される。肝細胞癌では、ＡＦＰの発現が活性化される（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、Ａｐｒ  １５；１６６（８）：５３００−８）。ＡＦＰは、細細胞内で生成された後、小分子ポリペプチドに分解され、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子と結合して複合体を形成し、細胞表面に提示される。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩは、ＡＦＰ抗原由来の短いペプチドであり、ＡＦＰ関連疾患治療の標的である。
【０００６】
従って、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体は、腫瘍細胞を標的とするＴＣＲのマーカーを提供する。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合されることができるＴＣＲは、腫瘍治療に非常に高い応用価値を有する。例えば、当該腫瘍細胞マーカーを標的とすることができるＴＣＲは、細胞毒性剤または免疫刺激剤を標的細胞に送達するか、またはＴ細胞に形質転換されて、当該ＴＣＲを発現するＴ細胞が腫瘍細胞を破壊することができるようにして、養子免疫治療と呼ばれる治療過程で患者に投与することができるようにするためである。前者の目的について、理想的なＴＣＲは、比較的に高い親和性を有するため、当該ＴＣＲが標的細胞に長期間存在することができる。後者の目的について、中間程度の親和性のＴＣＲを使用することが好ましい。従って、当業者は、腫瘍細胞マーカーを標的とするために異なる目的を満足することができるＴＣＲの開発に専念している。
【０００７】
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対してより高い親和性を有するＴＣＲを提供するすることを目的とする。
【０００８】
本発明は、前記タイプのＴＣＲの調製方法および前記タイプのＴＣＲの用途を提供することを別の目的とする。
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する活性を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【０００９】
別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する活性を有し、また、前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
【００１０】
【表１】
2022502078.tif 000002
【００１１】
および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ
ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ
ＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
【００１２】
【表２】
2022502078.tif 000003
【００１３】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の突然変異の数は、１から８個であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の突然変異の数は、１から８個である。
【００１４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、３個、４個、５個、６個、７個または８個であり得る。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、４個、５個、６個、７個または８個であり得る。
【００１５】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲはまた、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０７複合体に結合されることができる。
【００１６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの突然変異部位は、ＣＤＲ３αの７番目および／または８番目を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲの突然変異は、次の群を含み、
【００１８】
【表３】
2022502078.tif 000004
【００１９】
および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲの突然変異は、次の群を含む。
【００２０】
【表４】
2022502078.tif 000005
【００２１】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含む。
【００２２】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は、ＴＳＩＮＮ、ＴＰＩＳＳ、ＴＤＩＹＫ、ＴＡＶＤＳ、ＴＥＩＳＳおよびＴＤＶＳＳからなる群から選択される。
【００２３】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＲＳＮＥＲＥである。
【００２４】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、Ｔ［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］［１αＸ４］の配列を含み、ここで、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］、［１αＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００２５】
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＤまたはＰまたはＡまたはＥである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ２］は、ＩまたはＶである。
【００２６】
別の好ましい例において、前記［１αＸ３］は、ＮまたはＳまたはＹまたはＤである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ４］は、ＮまたはＳまたはＫである。
【００２７】
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＤまたはＰまたはＡまたはＥであり、［１αＸ２］は、ＩまたはＶであり、［１αＸ３］は、ＮまたはＳまたはＹまたはＤであり、および［１αＸ４］は、ＮまたはＳまたはＫである。
【００２８】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、ＴＳＩＮＮ、ＴＰＩＳＳ、ＴＤＩＹＫ、ＴＡＶＤＳ、ＴＥＩＳＳおよびＴＤＶＳＳからなる群から選択される配列を含む。
【００２９】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰ［３αＸ１］［３αＸ２］［３αＸ３］［３αＸ４］［３αＸ５］［３αＸ６］ＫＬＴの配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］、［３αＸ４］、［３αＸ５］、［３αＸ６］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００３０】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、また、ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰ［３αＸ１］［３αＸ２］［３αＸ３］［３αＸ４］［３αＸ５］［３αＸ６］ＫＬＴの配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］、［３αＸ４］、［３αＸ５］および［３αＸ６］それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００３１】
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＲまたはＡまたはＳまたはＤまたはＥまたはＱまたはＶまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ２］は、ＴまたはＭまたはＲまたはＬまたはＡまたはＮまたはＳである。
【００３２】
別の好ましい例において、前記［３αＸ３］は、ＧまたはＡまたはＱまたはＳまたはＥまたはＮである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ４］は、ＡまたはＳまたはＧまたはＰまたはＷである。
【００３３】
別の好ましい例において、前記［３αＸ５］は、ＮまたはＳまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ６］は、ＳまたはＡまたはＮまたはＴまたはＰである。
【００３４】
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＲまたはＡまたはＳまたはＤまたはＥまたはＱまたはＶまたはＴであり、［３αＸ２］は、ＴまたはＭまたはＲまたはＬまたはＡまたはＮまたはＳであり、［３αＸ３］は、ＧまたはＡまたはＱまたはＳまたはＥまたはＮであり、［３αＸ４］は、ＡまたはＳまたはＧまたはＰまたはＷであり、［３αＸ５］は、ＮまたはＳまたはＴであり、および［３αＸ６］は、ＳまたはＡまたはＮまたはＴまたはＰである。
【００３５】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰＳＭＳＰＮＳＫＬＴ、ＡＴＤＰＳＬＳＰＮＳＫＬＴおよびＡＴＤＰＳＬＱＳＮＳＫＬＴからなる群から選択される配列を含む。
【００３６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹの配列を含む。
【００３７】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１βは、［１βＸ１］［１βＸ２］［１βＸ３］［１βＸ４］Ｒの配列を含み、ここで、［１βＸ１］、［１βＸ２］、［１βＸ３］、［１βＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００３８】
別の好ましい例において、前記［１βＸ１］は、ＳまたはＡまたはＱまたはＧである。
別の好ましい例において、前記［１βＸ２］は、ＥまたはＧまたはＴまたはＲまたはＬである。
【００３９】
別の好ましい例において、前記［１βＸ３］は、ＨまたはＷまたはＲである。
別の好ましい例において、前記［１βＸ４］は、ＮまたはＡまたはＰである。
【００４０】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、Ｆ［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］［２βＸ５］の配列を含み、ここで、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］、［２βＸ４］および［２βＸ５］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００４１】
別の好ましい例において、前記［２βＸ１］は、ＱまたはＨである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ２］は、ＮまたはＧである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ３］は、ＥまたはＤである。
【００４２】
別の好ましい例において、前記［２βＸ４］は、ＡまたはＭまたはＬである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ５］は、ＱまたはＥである。
【００４３】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＱＧＤＭＥ、ＦＱＧＤＬＥおよびＦＨＧＤＬＥからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＦＱＧＤＭＥ、ＦＱＧＤＬＥおよびＦＨＧＤＬＥからなる群から選択される。
【００４４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲα鎖可変ドメインが異なる場合、ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥおよびＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴのＣＤＲを含む。
【００４５】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲβ鎖可変ドメインが異なる場合、ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ、ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱおよびＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹのＣＤＲを含む。
【００４６】
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および／またはβ鎖可変ドメインの一つまたは複数のＣＤＲ領域で発生する。
別の好ましい例において、前記突然変異は、α鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３で発生し、および／または前記突然変異は、β鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２で発生する。
【００４７】
本発明の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であり、好ましくは、少なくとも５倍であり、より好ましくは、少なくとも１０倍である。
【００４８】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍であり、好ましくは、少なくとも１００倍であり、より好ましくは、少なくとも５００倍であり、最も好ましくは、少なくとも１０００倍である。
【００４９】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０４倍であり、好ましくは、少なくとも１０５倍であり、より好ましくは、少なくとも１０６倍である。
【００５０】
具体的には、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤは、≦２０μＭである。
別の好ましい例において、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦ＫＤ≦１０μＭであり、好ましくは、０．１μＭ≦ＫＤ≦１μＭであり、より好ましくは、１ｎＭ≦ＫＤ≦１００ｎＭである。
【００５１】
別の好ましい例において、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、１００ｐＭ≦ＫＤ≦１０００ｐＭであり、好ましくは、１０ｐＭ≦ＫＤ≦１００ｐＭである。
【００５２】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、以下の群から選択されるＣＤＲを有する。
【００５３】
【表５】
2022502078.tif 000006
2022502078.tif 000007
2022502078.tif 000008
【００５４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲである。
【００５５】
別の好ましい例において、本発明の前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖定常領域配列ＴＲＡＣ＊０１およびβ鎖定常領域配列ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を有する。前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
【００５７】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域とのあいだには、人工鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
【００５８】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に、人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される一つまたは複数の部位を置換する。
【００５９】
別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が含まれるＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメイン、ならびに膜貫通ドメインを除く全部または一部のβ鎖定常ドメインを含むが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロ二量体を形成する。
【００６０】
別の好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が含まれるＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
【００６１】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
【００６２】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には、人工鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲαとβ鎖の定常領域の間に、人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９和ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される一つまたは複数の部位を置換する。
【００６３】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲである。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとで構成される単鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、柔軟な短いペプチド配列（リンカー（ｌｉｎｋｅｒ））によって結合される。
【００６４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよび／またはβ鎖可変ドメインの疎水性コアで突然変異する。
別の好ましい例において、前記疎水性コアで突然変異するＴＣＲは、α可変ドメインとβ可変ドメインとで構成される単鎖ＴＣＲであり、前記α可変ドメインとβ可変ドメインとは、柔軟な短いペプチド配列（リンカー）によって結合される。
【００６５】
別の好ましい例において、本発明の前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−３５、５１−７７および９１−９２から選択され、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６−４６、７８−８８および９３−１０１から選択される。
【００６７】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、次の群からなる群から選択される。
【００６８】
【表６】
2022502078.tif 000009
2022502078.tif 000010
【００６９】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、次の群からなる群から選択される。
【００７０】
【表７】
2022502078.tif 000011
2022502078.tif 000012
2022502078.tif 000013
【００７１】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲの鎖および／またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端には、コンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲに結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質の任意の組み合わせである。
【００７２】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲに結合する治療剤は、前記ＴＣＲα鎖またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端に結合された抗−ＣＤ３抗体である。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有し、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるα鎖可変ドメインで突然変異し、前記突然変異のアミノ酸残基部位は、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、３１Ｎ、９４Ｒ、９５Ｔ、９６Ｇ、９７Ａ、９８Ｎおよび９９Ｓの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または前記ＴＣＲ在ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるβ鎖可変ドメインで突然変異し、前記突然変異のアミノ酸残基部位は、２７Ｓ、２８Ｅ、２９Ｈ、３０Ｎ、５０Ｑ、５１Ｎ、５２Ｅ、５３Ａおよび５４Ｑの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を採用し、
好ましくは、突然変異後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２８Ｄまたは２８Ｐまたは２８Ａまたは２８Ｅ、２９Ｖ、３０Ｓまたは３０Ｙまたは３０Ｄ、３１Ｓまたは３１Ｋ、９４Ａまたは９４Ｓまたは９４Ｖまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｑまたは９４Ｔ、９５Ｍまたは９５Ｒまたは９５Ｌまたは９５Ａまたは９５Ｎまたは９５Ｓ、９６Ａまたは９６Ｑまたは９６Ｓまたは９６Ｅまたは９６Ｎ、９７Ｓまたは９７Ｇまたは９７Ｐまたは９７Ｗ、９８Ｓまたは９８Ｔ、および９９Ａまたは９９Ｎまたは９９Ｔまたは９９Ｐからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または突然変異後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、２７Ａまたは２７Ｑまたは２７Ｇ、２８Ｇまたは２８Ｔまたは２８Ｒまたは２８Ｌ、２９Ｗまたは２９Ｒ、３０Ａまたは３０Ｐ、５０Ｈ、５１Ｇ、５２Ｄ、５３Ｍまたは５３Ｌ、および５４Ｅからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を採用する。
【００７４】
本発明の第２の態様は、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含む多価ＴＣＲ複合体を提供し、また、ここで、ＴＣＲ分子の少なくとも一つは、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲである。  
【００７５】
本発明の第３の態様は、核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第１の態様にＴＣＲ分子または本発明の第２の態様に記載の多価ＴＣＲ複合体をコードする核酸配列またはその相補的配列を含む。  
【００７６】
本発明の第４の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含む。  
本発明の第５の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第４の態様に記載のベクターを含むか、または染色体に外因性の本発明の第３の態様に記載の核酸分子が組み込まれる。  
【００７７】
本発明の第６の態様は、単離された細胞を提供し、前記細胞は、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲを発現する。  
本発明の第７の態様は、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞を含む。  
【００７８】
本発明の第８の態様は、治療を必要とする対象に適切の量の本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞、または本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む疾患を治療する方法を提供する。  
【００７９】
本発明の第９の態様は、腫瘍を治療する薬物の調製に使用され、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓癌である本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞の用途を提供する。  
【００８０】
本発明の第１０の態様は、腫瘍を治療する薬物として使用され、好ましくは、前記腫瘍は、肝臓癌である本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様に記載の細胞を提供する。  
【００８１】
本発明の第１１の態様は、
（ｉ）本発明の第５の態様に記載の宿主細胞培養することにより、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体を発現する段階と、および
（ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製する段階とを含む本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体を調製する方法を提供する。
【００８２】
［発明の効果］
本発明の範囲内で、本発明の前記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１ａ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１ｂ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２ａ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２ｂ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３ａ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのＤＮＡ配列を示す。
【図３ｂ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲβ鎖可変ドメインのＤＮＡ配列を示す。
【図４ａ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲの結合する短いペプチド（リンカー）のアミノ酸配列を示す。
【図４ｂ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲの結合する短いペプチド（リンカー）のヌクレオチド配列を示す。
【図５（１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（１９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図５（２７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（１０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図６（１１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図７ａ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲのアミノ酸配列を示す。
【図７ｂ】本発明で構成された単鎖テンプレートＴＣＲのＤＮＡ配列を示す。
【図８ａ】本発明の可溶性参照ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を示し、突然変異後のシステイン残基は、太字で示される。
【図８ｂ】本発明の可溶性参照ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を示し、突然変異後のシステイン残基は、太字で示される。
【図９（１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（１９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図９（２９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して、高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１））】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１１）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１２）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１３）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１４）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１５）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１６）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１７）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１８）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（１９）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１０（２０）】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で示される。
【図１１ａ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列を示す。
【図１１ｂ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図１２】可溶性参照ＴＣＲ、即ち、野生型ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との結合曲線を示す。
【図１３ａ】本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の活性化機能の実験結果を示す。
【図１３ｂ】本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の活性化機能の実験結果を示す。
【図１４ａ】本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の殺傷機能の実験結果を示す。
【図１４ｂ】本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の殺傷機能の実験結果を示す。
【図１５ａ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｂ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｃ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｄ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｅ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｆ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１５ｇ】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−活性化の実験結果を示す。
【図１６】本発明の高親和性ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体との融合タンパク質の機能検証−殺傷の実験結果を示す。
【図１７ａ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲα鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
【図１７ｂ】ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
広範囲にわたる詳細な研究を通じて、本発明者らは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ短いペプチド（ＡＦＰタンパク質に由来する）を識別する高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を得、前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ短いペプチドは、ペプチド−ＨＬＡ  Ａ２複合体の形式で提示される。前記高親和性ＴＣＲは、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴのα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域から突然変異が発生され、および／または
ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ
ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ
ＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹのβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域から突然変異が発生され、また、突然変異後、前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である。  
【００８５】
本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的方法方法および実験条件に限定されなくいことを理解されたく、このような方法および条件は、変化することができるためである。本明細書で使用される用語の目的は、具体的実施形態を説明することのみであり、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００８６】
特に明記されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００８７】
本発明の実施または試験において、本発明に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書は、好ましい方法および材料を例示する。  
【００８８】
用語
Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）ＩＭＧＴ
国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）を使用して、ＴＣＲを説明する。天然αβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。大まかにいえば、各鎖は、可変領域、結合領域および定常領域を含み、β鎖は、一般に可変領域と結合領域との間に短い多変領域をさらに含むが、当該多変領域は、通常結合領域の一部として見なされる。固有のＩＭＧＴのＴＲＡＪおよびＴＲＢＪは、ＴＣＲの結合領域を決定し、ＩＭＧＴのＴＲＡＣおよびＴＲＢＣは、ＴＣＲの定常領域を決定する。
【００８９】
各可変領域は、フレームワーク配列に埋め込まれた三つのＣＤＲ（相補性決定領域）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ＩＭＧＴの命名法において、ＴＲＡＶとＴＲＢＶとの異なる番号は、それぞれ異なるＶαタイプおよびＶβタイプを指す。ＩＭＧＴシステムにおいて、α鎖定常ドメインは、ＴＲＡＣ＊０１の記号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ａ」は、α鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。β鎖定常ドメインは、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１の記号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ｂ」は、β鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。α鎖の定常領域は、唯一に決定され、β鎖の形式において、二つの可能な定常領域遺伝子「Ｃ１」および「Ｃ２」が存在する。当業者は、公開されたＩＭＧＴデータベースを通じて、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域遺伝子配列を得ることができる。
【００９０】
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般にそれぞれ二つの「ドメイン」、つまり、可変ドメインおよび定常ドメインを有すると見なされる。可変ドメインは、結合された可変領域と結合領域とで構成される。従って、本出願の明細書および特許請求の範囲において、「ＴＣＲα鎖可変ドメイン」は、結合されたＴＲＡＶ領域およびＴＲＡＪ領域を指し、同様に、「ＴＣＲβ鎖可変ドメイン」は、結合されたＴＲＢＶ領域およびＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域を指す。ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αであり、ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βである。本発明のＴＣＲ可変ドメインのフレームワーク配列は、マウスまたはヒトの起源のものであり得、好ましくは、ヒト起源のものである。ＴＣＲの定常ドメインは、細胞内部分、膜貫通領域、および細胞外部分を含む。ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の間の親和性を決定するための可溶性ＴＣＲを得るために、本発明のＴＣＲは、好ましくは膜貫通領域を含まない。より好ましくは、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列は、ＴＣＲの細胞外アミノ酸配列を指す。
【００９１】
図１１ａおよび１１ｂに示されるように、本発明に記載される「野生型ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０である。図１７ａおよび１７ｂに示されるように、本発明に記載される「野生型ＴＣＲ」のα鎖およびβ鎖の細胞外アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３である。図８ａおよび８ｂに示されるように、本発明に記載される「参照ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列およびβ鎖アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０である。本発明において、図１ａおよび１ｂに示されるように、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合することができる野生型ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である。本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」および「本発明のＴ細胞受容体」は、交換可能に使用される。  
【００９２】
天然鎖間ジスルフィド結合および人工鎖間ジスルフィド結合
天然ＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖との間には、一つの群のジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
【００９３】
容易に説明するために、本発明におけるＴＲＡＣ＊０１およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号は、Ｎ端からＣ端まで順番に位置番号を付け、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順番の順序の６０番目のアミノ酸は、Ｐ（プロリン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸と表現することもでき、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順次的順序の６１番目のアミノ酸は、Ｑ（グルタミン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸と表現することもでき、他は、類推によって推測することができる。本発明において、可変領域のＴＲＡＶとＴＲＢＶとのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに記載の位置番号に従って番号が付けられる。例えば、ＴＲＡＶの特定のアミノ酸について、ＩＭＧＴに記載された位置番号が４６であると、本発明においてＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸と表現され、他は、類推によって推測することができる。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な指示がある場合、特別な指示に従う。
【００９４】
腫瘍
「腫瘍」という用語は、病理学的タイプまたは感染の段階に関係なく、すべてのタイプの癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織または器官を含むことを意味する。腫瘍の実施例は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は、例えば、肉腫、肺扁平上皮癌および癌等の様々な臓器系の悪性腫瘍を含む。例えば、感染された前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎臓、上皮細胞）、咽頭である。肺扁平上皮癌は、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む。前記癌の転移性病変は、本発明の方法および組成物を使用し手治療および予防することができる。
【００９５】
発明の詳細な説明
周知されたように、ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとは、それぞれ三つのＣＤＲを含み、抗体の相補性決定領域に類似している。ＣＤＲ３は、抗原の短いペプチドと相互作用し、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とは、ＨＬＡと相互作用する。従って、ＴＣＲ分子のＣＤＲは、抗原の短いペプチド−ＨＬＡ複合体との相互作用を決定する。抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩおよびＨＬＡ  Ａ０２０１複合体（即ち、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体）に結合することができる野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、当該配列は、本発明者らによってはじめて発見された。
【００９６】
α鎖可変ドメインＣＤＲ  ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴ
およびβ鎖可変ドメインＣＤＲ  ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ
ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ
ＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹのようなＣＤＲ領域を有する。
【００９７】
本発明は、前記ＣＤＲ領域に対して突然変異のスクリーニングすることにより、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性が野生型ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性の少なくとも２倍である高親和性ＴＣＲを得た。
【００９８】
本発明は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン和ＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含み、
【００９９】
【表８】
2022502078.tif 000014
【０１００】
および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つのＣＤＲ領域の参照配列は、次のとおりであり、
ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ
ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ
ＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹ
また、少なくとも一つの次のような突然変異を含む。
【０１０１】
【表９】
2022502078.tif 000015
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含む。
【０１０３】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、Ｔ［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］［１αＸ４］の配列を含み、ここで、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］、［１αＸ４］  は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１０４】
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＤまたはＰまたはＡまたはＥである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ２］は、ＩまたはＶである。
【０１０５】
別の好ましい例において、前記［１αＸ３］は、ＮまたはＳまたはＹまたはＤである。
別の好ましい例において、前記［１αＸ４］は、ＮまたはＳまたはＫである。
【０１０６】
別の好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＳまたはＤまたはＰまたはＡまたはＥであり、［１αＸ２］は、ＩまたはＶであり、［１αＸ３］は、ＮまたはＳまたはＹまたはＤであり、また、［１αＸ４］は、ＮまたはＳまたはＫである。
【０１０７】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、ＴＳＩＮＮ、ＴＰＩＳＳ、ＴＤＩＹＫ、ＴＡＶＤＳ、ＴＥＩＳＳおよびＴＤＶＳＳからなる群から選択される配列を含む。
【０１０８】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、ここで、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は、ＩＲＳＮＥＲＥである。
【０１０９】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３αを含み、また、ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰ［３αＸ１］［３αＸ２］［３αＸ３］［３αＸ４］［３αＸ５］［３αＸ６］ＫＬＴの配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］、［３αＸ４］、［３αＸ５］および［３αＸ６］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１１０】
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＲまたはＡまたはＳまたはＤまたはＥまたはＱまたはＶまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ２］は、ＴまたはＭまたはＲまたはＬまたはＡまたはＮまたはＳである。
【０１１１】
別の好ましい例において、前記［３αＸ３］は、ＧまたはＡまたはＱまたはＳまたはＥまたはＮである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ４］は、ＡまたはＳまたはＧまたはＰまたはＷである。
【０１１２】
別の好ましい例において、前記［３αＸ５］は、ＮまたはＳまたはＴである。
別の好ましい例において、前記［３αＸ６］は、ＳまたはＡまたはＮまたはＴまたはＰである。
【０１１３】
別の好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＲまたはＡまたはＳまたはＤまたはＥまたはＱまたはＶまたはＴである、［３αＸ２］は、ＴまたはＭまたはＲまたはＬまたはＡまたはＮまたはＳであり、［３αＸ３］は、ＧまたはＡまたはＱまたはＳまたはＥまたはＮであり、［３αＸ４］は、ＡまたはＳまたはＧまたはＰまたはＷであり、［３αＸ５］は、ＮまたはＳまたはＴであり、また、［３αＸ６］は、ＳまたはＡまたはＮまたはＴまたはＰである。
【０１１４】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＰＳＭＳＰＮＳＫＬＴ、ＡＴＤＰＳＬＳＰＮＳＫＬＴおよびＡＴＤＰＳＬＱＳＮＳＫＬＴからなる群から選択される配列を含む。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹの配列を含む。
【０１１６】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１βは、［１βＸ１］［１βＸ２］［１βＸ３］［１βＸ４］Ｒの配列を含み、
ここで、［１βＸ１］、［１βＸ２］、［１βＸ３］、［１βＸ４］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１１７】
別の好ましい例において、前記［１βＸ１］は、ＳまたはＡまたはＱまたはＧである。
別の好ましい例において、前記［１βＸ２］は、ＥまたはＧまたはＴまたはＲまたはＬである。
【０１１８】
別の好ましい例において、前記［１βＸ３］は、ＨまたはＷまたはＲである。
別の好ましい例において、前記［１βＸ４］は、ＮまたはＡまたはＰである。
【０１１９】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、Ｆ［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］［２βＸ５］の配列を含み、ここで、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］、［２βＸ４］および［２βＸ５］は、それぞれ独立して、任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１２０】
別の好ましい例において、前記［２βＸ１］は、ＱまたはＨである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ２］は、ＮまたはＧである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ３］は、ＥまたはＤである。
【０１２１】
別の好ましい例において、前記［２βＸ４］は、ＡまたはＭまたはＬである。
別の好ましい例において、前記［２βＸ５］は、ＱまたはＥである。
【０１２２】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＱＧＤＭＥ、ＦＱＧＤＬＥおよびＦＨＧＤＬＥからなる群から選択される配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βおよびＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は、ＦＱＧＤＭＥ、ＦＱＧＤＬＥおよびＦＨＧＤＬＥからなる群から選択される。
【０１２３】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ、およびＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴのＣＤＲを同時に含まない。
【０１２４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ、ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱ、およびＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹのＣＤＲを同時に含まない。
【０１２５】
より具体的には、前記ＴＣＲα鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、３個、４個、５個、６個、７個または８個であり得、および／または前記ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ領域における突然変異の数は、４個、５個、６個、７個または８個であり得る。
【０１２６】
さらに、本発明の前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
さらに、本発明の前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％；（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であり得る配列相同性）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
好ましくは、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
【０１２９】
本発明において、野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の２７〜３１番目、４９−５５番目および９０−１０２番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を採用し、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目Ｓであり、２９Ｉは、ＣＤＲ１αの３番目Ｉであり、３０Ｎは、ＣＤＲ１αの４番目Ｎであり、３１Ｎは、ＣＤＲ１αの５番目Ｎであり、９４Ｒは、ＣＤＲ３αの５番目Ｒであり、９５Ｔは、ＣＤＲ３αの６番目Ｔであり、９６Ｇは、ＣＤＲ３αの７番目Ｇであり、９７Ａは、ＣＤＲ３αの８番目Ａであり、９８Ｎは、ＣＤＲ３αの９番目Ｎであり、および９９Ｓは、ＣＤＲ３αの１０番目Ｓである。
【０１３０】
同様に、本発明において、野生型ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２７〜３１番目、４９〜５４番目および９３〜１０２番に位置する。従って、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を採用し、２７Ｓは、ＣＤＲ１βの１番目Ｓであり、２８Ｅは、ＣＤＲ１βの２番目Ｅであり、２９Ｈは、ＣＤＲ１βの３番目Ｈであり、３０Ｎ、ＣＤＲ１βの４番目Ｎであろ。５０Ｑは、ＣＤＲ２βの２番目Ｑであり、５１Ｎは、ＣＤＲ２βの３番目Ｎであり、５２Ｅは、ＣＤＲ２βの４番目Ｅであり、５３Ａは、ＣＤＲ２βの５番目Ａであり、５４Ｑは、ＣＤＲ２βの６番目Ｑである。
【０１３１】
本発明は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合する特性を有するＴＣＲを提供し、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるα鎖可変ドメインで突然変異が発生され、前記突然変異のアミノ酸残基部位は、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、３１Ｎ、９４Ｒ、９５Ｔ、９６Ｇ、９７Ａ、９８Ｎおよび９９Ｓの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるβ鎖可変ドメインで突然変異が発生され、前記突然変異のアミノ酸残基部位は、２７Ｓ、２８Ｅ、２９Ｈ、３０Ｎ、５０Ｑ、５１Ｎ、５２Ｅ、５３Ａおよび５４Ｑの一つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を採用し、
好ましくは、突然変異後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２８Ｄまたは２８Ｐまたは２８Ａまたは２８Ｅ、２９Ｖ、３０Ｓまたは３０Ｙまたは３０Ｄ、３１Ｓまたは３１Ｋ、９４Ａまたは９４Ｓまたは９４Ｖまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｑまたは９４Ｔ、９５Ｍまたは９５Ｒまたは９５Ｌまたは９５Ａまたは９５Ｎまたは９５Ｓ、９６Ａまたは９６Ｑまたは９６Ｓまたは９６Ｅまたは９６Ｎ、９７Ｓまたは９７Ｇまたは９７Ｐまたは９７Ｗ、９８Ｓまたは９８Ｔ、９９Ａまたは９９Ｎまたは９９Ｔまたは９９Ｐからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を採用し、および／または突然変異後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、２７Ａまたは２７Ｑまたは２７Ｇ、２８Ｇまたは２８Ｔまたは２８Ｒまたは２８Ｌ、２９Ｗまたは２９Ｒ、３０Ａまたは３０Ｐ、５０Ｈ、５１Ｇ、５２Ｄ、５３Ｍまたは５３Ｌ、５４Ｅからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を採用する。
【０１３２】
より具体的には、α鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的形式は、Ｓ２８Ｄ／Ｐ／Ａ／Ｅ、Ｉ２９Ｖ、Ｎ３０Ｓ／Ｙ／Ｄ、Ｎ３１Ｓ／Ｋ、Ｒ９４Ａ／Ｓ／Ｖ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ、Ｔ９５Ｍ／Ｒ／Ｌ／Ａ／Ｎ／Ｓ、Ｇ９６Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｅ／Ｎ、Ａ９７Ｓ／Ｇ／Ｐ／Ｗ、Ｎ９８Ｓ／Ｔ、Ｓ９９Ａ／Ｎ／Ｔ／Ｐの一つまたは複数の群を含み、β鎖可変ドメインにおける前記突然変異の具体的形式は、Ｓ２７Ａ／Ｑ／Ｇ、Ｅ２８Ｇ／Ｔ／Ｒ／Ｌ、Ｈ２９Ｗ／Ｒ、Ｎ３０Ａ／Ｐ、Ｑ５０Ｈ、Ｎ５１Ｇ、Ｅ５２Ｄ、Ａ５３Ｍ／Ｌ、Ｑ５４Ｅの一つまたは複数の群を含む。
【０１３３】
当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法によれば、野生型ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８をシステインに突然変異し、β鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７をシステインに突然変異して、可溶性参照ＴＣＲを得ることができ、そのアミノ酸配列は、それぞれ図８ａおよび８ｂに示され、突然変異後のシステイン残基は、太字で示される。前記システイン置換は、参照ＴＣＲのα鎖とβ鎖との定常領域の間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成して、より安定した可溶性ＴＣＲを形成することにより、ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をより容易に評価することができる。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域は、ｐＭＨＣ複合体との間の親和性を決定し、従って、前記ＴＣＲ定常領域のシステイン置換は、ＴＣＲの結合親和性および／または結合半減期に影響を与えないことを理解されたい。従って、本発明において、測定された参照ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性は、野生型ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−  ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性であると見なされる。同様に、本発明のＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性が参照ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性の少なくとも１０倍であると測定した場合、本発明のＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性が野生型ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性の少なくとも１０倍と同等である。
【０１３４】
任意の適合した方法によって結合親和性（解離平衡定数ＫＤに反比例）および結合半減期（Ｔ１／２として表される）を測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴技術で＜検出する。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、ＫＤが半分になることを理解されたい。Ｔ１／２は、Ｉｎ２を解離速率（Ｋｏｆｆ）で割ったものと計算される。従って、Ｔ１／２を２倍にすると、Ｋｏｆｆが半分になる。好ましくは、同じ試験計画を使用して、所与ＴＣＲの結合親和性または結合半減期の回数、例えば、３回またはその以上検出し、結果の平均値をとる。好ましい実施形態において、本明細書の実施例における表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）の方法で可溶性ＴＣＲの親和性を検出する。条件は、温度が２５℃、ＰＨ値が７．１〜７．５である。当該方法は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する参照ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤが４３μＭである４．３Ｅ〜０５Ｍであることを検出し、本発明において、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する野生型ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤも４３μＭであると見なされる。ＴＣＲの親和性を２倍にすると、ＫＤが半分になるため、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する高親和性ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤが４．３μＭである４．３Ｅ〜０６Ｍであると検出された場合、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する当該高親和性ＴＣＲの親和性は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する野生型ＴＣＲの親和性の１０倍であると説明される。当業者は、ＫＤ値の単位間の変換関係、即ち、１Ｍ＝１０６μＭ、１μＭ＝１０００ｎＭおよび１ｎＭ＝１０００ｐＭに精通している。
【０１３５】
本発明の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であり、好ましくは、少なくとも５倍であり、より好ましくは、少なくとも１０倍である。
【０１３６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍であり、好ましくは、少なくとも１００倍であり、より好ましくは、少なくとも５００倍であり、最も好ましくは、少なくとも１０００倍である。
【０１３７】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との親和性は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０４倍であり、好ましくは、少なくとも１０５倍であり、より好ましくは、少なくとも１０６倍であり、
具体的には、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤは、≦２０μＭである。
【０１３８】
別の好ましい例において、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦ＫＤ≦１０μＭであり、好ましくは、０．１μＭ≦ＫＤ≦１μＭであり、より好ましくは、１ｎＭ≦ＫＤ≦１００ｎＭである。
【０１３９】
別の好ましい例において、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、１００ｐＭ≦ＫＤ≦１０００ｐＭであり、好ましくは、１０ｐＭ≦ＫＤ≦１００ｐＭである。  
【０１４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくもの、制限酵素に基づくグローニングまたはライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）方法を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法を使用して突然変異することができる。多くの標準的分子生物学の教科書は、これらの方法を詳述している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の突然変異誘発および制限酵素に基づくグローニングの多くの詳細は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、（２００１）分子グローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）ＣＳＨＬ出版社を参照してください。ＬＩＣ方法のより多くの詳細は、（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ、（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６（１）：３０−６）を参照することができる。
【０１４１】
本発明のＴＣＲを生成する方法は、例えば、文献（Ｌｉ、ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（３）：３４９−３５４）に記載されるように、そのようなＴＣＲを表すファージ粒子を多様なライブラリーからＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対して高親和性を有するＴＣＲを選択することができるが、これらに限定されない。
【０１４２】
野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子またはわずかに修飾した野生型ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸を発現する遺伝子は、両方ともテンプレートＴＣＲを調製されることができることを理解されたい。次に、当該テンプレートＴＣＲの可変ドメインをコードするＤＮＡは、本発明の高親和性ＴＣＲを生成するために必要な変化を導入する。
【０１４３】
本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９１、９２のいずれかおよび／またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１のいずれかを含む。従って、野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１のいずれかを含むＴＣＲβ鎖と組み合わせてヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、野生型ＴＣＲのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含むＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９１、９２のいずれかを含むＴＣＲα鎖と組み合わせてヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９１、９２のいずれかを含むＴＣＲα鎖は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１のいずれかを含むＴＣＲβ鎖と組み合わせてヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。本発明において、ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を形成するα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表１から選択される。
【０１４４】
【表１０】
2022502078.tif 000016
2022502078.tif 000017
2022502078.tif 000018
【０１４５】
本発明の目的に基づいて、本発明のＴＣＲは、少なくとも一つのＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ鎖可変ドメインを有する一部である。通常、それらは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを同時に含む。それらは、αβヘテロ二量体または単鎖形式または安定して存在することができる他の形態であり得る。養子免疫治療において、αβヘテロ二量体ＴＣＲの全長鎖（細胞質および膜貫通ドメインを含む）をトランスフェクションすることができる。本発明のＴＣＲは、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的剤として使用するか、または他の分子と組み合わせて、エフェクター細胞を標的とする二機能性ポリペプチドを調製することができ、この場合、ＴＣＲは、好ましくは、可溶性形態である。
【０１４６】
安定性に関して、先行技術は、例えば、特許文献ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０９３８０６に記載されたように、ＴＣＲα鎖とβ鎖定常ドメインとの間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、可溶性で安定したＴＣＲ分子を得ることができることを開示している。従って、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入されるＴＣＲであり得る。システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然ＴＣＲの適切な部位にある他のアミノ酸残基を置換して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８を置換して、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７を置換することにより、ジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入して、ジスルフィド結合を形成する部位は、さらにＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ａｒｇ５３和ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ｐｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であり得る。即ち、システイン残基は、前記α鎖およびβ鎖定常ドメインの任意の群の部位を置換する。最大１５個、または最大１０個、または最大８個またはその以下のアミノ酸を、本発明のＴＣＲ定常ドメインの一つまたは複数のＣ末端で切断して、システイン残基を含まないようにして、天然鎖間ジスルフィド結合を欠如する目的を達成し、天然鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸に突然変異することによって前記目的を達成することができる。
【０１４７】
前記のように、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に導入された人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に前記に記載の導入された人工鎖間ジスルフィド結合の有無に関係なく、本発明のＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含むことができることに留意されたい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列は、ＴＣＲに存在する天然鎖間ジスルフィド結合によって結合されることができる。
【０１４８】
さらに、安定性に関して、特許文献ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７７６８０は、ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ＴＣＲの安定性を大幅に向上させることができることも開示された。従って、本発明の高親和性ＴＣＲの鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。具体的には、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸を置換した。好ましくは、そのようなＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含むことができ、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、両方ともＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。より好ましくは、そのようなＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメイン、ならびに膜貫通ドメインを除く全部または一部のβ鎖定常ドメインを含むことができるが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。
【０１４９】
安定性に関して、一方、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲを含み、これらの疎水性コア領域における突然変異は、好ましくは、例えば、ＷＯ２０１４／２０６３０４の公開番号を有する特許文献に記載されるように、本発明のＴＣＲの安定性を向上させることができる。そのようなＴＣＲは、（α鎖および／またはβ鎖）可変領域アミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番目、および／またはα鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＡＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後の最後から３番目、最後の最後から５番目、最後の最後から７番目、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＢＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後の最後から２番目、４番目、６番目の可変ドメイン疎水性コア位置で突然変異させることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に記載された位置番号による。当業者は、前記国際免疫遺伝学情報システムを知り、当該データベースに従って、ＩＭＧＴにおける異なるＴＣＲのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。
【０１５０】
より具体的には、本発明において、疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合する柔軟なペプチド鎖から構成される安定的な可溶性一本鎖ＴＣＲであり得る。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域は、短いペプチド−ＨＬＡ複合体との間の親和性を決定し、疎水性コアの突然変異により、ＴＣＲがより安定することができるが、短いペプチド−ＨＬＡ複合体との間の親和性に影響を与えない。本発明における柔軟なペプチド鎖は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合するのに適した任意のペプチド鎖であり得ることに留意されたい。本発明の実施例１で構築された高親和性ＴＣＲをスクリーニングするためのテンプレート鎖は、前記疎水性コア突然変異を含む高安定性単鎖ＴＣＲである。より安定性の高いＴＣＲを使用して、ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との間の親和性をより容易に評価することができる。
【０１５１】
当該単鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域は、野生型ＴＣＲのＣＤＲ領域と全く同じである。即ち、α鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥおよびＣＤＲ３α：ＡＴＤＰＲＴＧＡＮＳＫＬＴであり、β鎖可変ドメインの三つのＣＤＲは、それぞれ  ＣＤＲ１β：ＳＥＨＮＲ、ＣＤＲ２β：ＦＱＮＥＡＱおよびＣＤＲ３β：ＡＳＥＧＬＡＹＥＱＹである。当該単鎖テンプレートＴＣＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）およびヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）は、それぞれ図７ａおよび７ｂに示される。これに基づいて、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有するα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとで構成される単鎖ＴＣＲをスクリーニングする。
【０１５２】
本発明において、単鎖テンプレートＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の２７〜３１番目、４９〜５５番目および９０−１０２番目に位置する。これに従って、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される番号を採用し、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目Ｓであり、２９Ｉは、ＣＤＲ１αの３番目Ｉであり、３０Ｎは、ＣＤＲ１αの４番目Ｎであり、３１Ｎは、ＣＤＲ１αの５番目Ｎであり、９４Ｒは、ＣＤＲ３αの５番目Ｒであり、９５Ｔは、ＣＤＲ３αの６番目Ｔであり、９６Ｇは、ＣＤＲ３αの７番目Ｇであり、９７Ａは、ＣＤＲ３αの８番目Ａであり、９８Ｎは、ＣＤＲ３αの９番目Ｎであり、および９９Ｓは、ＣＤＲ３αの１０番目Ｓである。
【０１５３】
同様に、本発明において、単鎖テンプレートＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の三つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２７〜３１番目、４９〜５４番目および９３−１０２番目に位置する。従って、アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される番号を採用し、２７Ｓは、ＣＤＲ１βの１番目Ｓであり、２８Ｅは、ＣＤＲ１βの２番目Ｅであり、２９Ｈは、ＣＤＲ１βの３番目Ｈであり、３０Ｎは、ＣＤＲ１βの４番目Ｎであり、５０Ｑは、ＣＤＲ２βの２番目Ｑであり、５１Ｎは、ＣＤＲ２βの３番目Ｎであり、５２Ｅは、ＣＤＲ２βの４番目Ｅであり、５３Ａは、ＣＤＲ２βの５番目Ａであり、および５４Ｑは、ＣＤＲ２βの６番目Ｑである。
【０１５４】
ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に対して高親和性を有する本発明のαβヘテロ二量体は、スクリーニングされた高親和性単鎖ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域を野生型ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の対応する位置に移すことによって得られる。別の一部は、スクリーニングして得られたＣＤＲ領域の突然変異部位に基づいて人工的に組み合わせて得られる。
【０１５５】
本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５のいずれか、および／またはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６のいずれかを含む。従って、テンプレート鎖としての前記高安定性単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６のＴＣＲβ鎖可変ドメインと組み合わせて前記単鎖ＴＣＲ分子を形成する。または、テンプレート鎖としての前記高安定性単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のＴＣＲα鎖可変ドメインと組み合わせて前記単鎖ＴＣＲ分子を形成する。または、ＴＣＲα鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５のいずれかは、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６のいずれかと組み合わせて前記単鎖ＴＣＲ分子を形成する。本発明において、高親和性単鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、以下の表２から選択される。
【０１５６】
【表１１】
2022502078.tif 000019
2022502078.tif 000020
【０１５７】
本発明のＴＣＲは、多価複合体の形態で提供することもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、２個、３個、４個またはより多くの本発明のＴＣＲを結合して形成されるポリマーを含み、例えば、ｐ５３の四量体化ドメインを使用して、四量体、または複数の本発明のＴＣＲを別の分子と結合して形成する複合体を生成する。本発明のＴＣＲ複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために使用されることができ、そのような用途で他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を生成するために使用することもできる。
【０１５８】
本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、共有結合または他の方法で、好ましくは、共有結合でコンジュゲートと結合することができる。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー（診断目的とし、ここで、前記ＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示する細胞の存在を検出する）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分あるいは、これらの物質の任意の組み合わせ結合またはカップリングを含む。
【０１５９】
診断目的で使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（電子コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
本発明のＴＣＲと結合またはカップリングすることができる治療薬は、（１）放射性核種（Ｋｏｐｐｅら、２００５、癌転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ）２４、５３９）、（２）生物学的毒性（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９、自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９、３９４、Ｅｐｅｌら、２００２、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１、５６５）、（３）ＩＬ−２等のサイトカイン（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２、米国国立科学アカデミーの学術誌（ＰＮＡＳ）８９、１４２８、Ｃａｒｄら、２００４、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３、３４５、Ｈａｌｉｎら、２００３、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３、３２０２）、（４）抗体Ｆｃフラグメント（Ｍｏｓｑｕｅｒａら、２００５、免疫学ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７４、４３８１）、（５）抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｚｈｕら、１９９５、癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）６２、  ３１９）、（６）金ナノ粒子／名のロッド（Ｌａｐｏｔｋｏら、２００５、癌コミュニケーション（Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ）２３９、３６、Ｈｕａｎｇら、２００６、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８、２１１５）、（７）ウイルス粒子（Ｐｅｎｇら、２００４、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）１１、１２３４）、（８）リポソーム（Ｍａｍｏｔら、２００５、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５、１１６３１）、（９）ナノ磁性粒子、（１０）プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、（１１）化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
本発明のＴＣＲに結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ２８または抗−ＣＤ１６抗体等の抗−Ｔ細胞またはＮＫ−細胞決定抗体を含み、前記抗体またはそのフラグメントとＴＣＲとの結合は、エフェクター細胞に対して、より適切に標的細胞を標的にすることができる。好ましい実施形態は、本発明のＴＣＲが、抗−ＣＤ３抗体または前記抗−ＣＤ３抗体の機能的フラグメントまたは変異体と結合することである。具体的には、本発明のＴＣＲと抗ＣＤ３単鎖抗体との融合分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９１および９２からなる群から選択されるＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００および１０１およびからなる群から選択されるＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
本発明は、本発明のＴＣＲをコードする核酸分子にさらに関する。本発明の核酸分子は、ＤＮＡの形態またはＲＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。例えば、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、本発明の図面に示される核酸配列と同じであるか、または縮重変異体であり得る。「縮重変異体」の意味を説明すると、本明細書に使用されるように、本発明における「縮重変異体」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４７を有するタンパク質配列をコードするが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列とは異なる核酸配列を指す。
【０１６３】
本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工的合成法によって得ることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入されることができる。
【０１６４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって作製された宿主細胞にも関する。
【０１６５】
本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離された細胞、特にＴ細胞をさらに含む。本発明の高親和性ＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡによるＴ細胞トランスフェクション（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６−６１３１）に適した多くの方法がある。本発明の高親和性ＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫治療に使用することができる。当業者は、養子治療に適した多くの方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９−３０８）。
【０１６６】
本発明は、医薬組成物をさらに提供し、前記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞を含む。
【０１６７】
本発明は、治療を必要とする対象に適切の量の本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞、または本発明の医薬組成物を投与する段階を含む疾患を治療する方法をさらに提供する。
【０１６８】
本明細書におけるアミノ酸の名称は、国際的に使用される単一の英字で表示され、それに対応するアミノ酸の名称の三つの英字の略語は、それぞれＡｌａ  （Ａ）、Ａｒｇ  （Ｒ）、Ａｓｎ  （Ｎ）、Ａｓｐ  （Ｄ）、Ｃｙｓ  （Ｃ）、Ｇｌｎ  （Ｑ）、Ｇｌｕ  （Ｅ）、Ｇｌｙ  （Ｇ）、Ｈｉｓ  （Ｈ）、Ｉｌｅ  （Ｉ）、Ｌｅｕ  （Ｌ）、Ｌｙｓ  （Ｋ）、Ｍｅｔ  （Ｍ）、Ｐｈｅ  （Ｆ）、Ｐｒｏ  （Ｐ）、Ｓｅｒ  （Ｓ）、Ｔｈｒ  （Ｔ）、Ｔｒｐ  （Ｗ）、Ｔｙｒ  （Ｙ）およびＶａｌ  （Ｖ）である。
【０１６９】
本発明において、Ｐｒｏ６０または６０Ｐのいずれかは、６０番目のプロリンを表す。また、本発明における前記突然変異の具体的形態、例えば、「Ｔ２７Ｇ」は、２７番目のＴがＧによって置換されることを表し、同様に、「Ｉ２９Ａ／Ｖ」は、２９番目のＩがＡによって置換されるか、またはＶによって置換されることを表す。他は、類推によって推測することができる。
【０１７０】
当技術分野において、同様または類似の性能を有するアミノ酸を使用して置換される場合、通常、タンパク質の機能は変化しない。Ｃ末端および／またはＮ末端に一つまたは複数のアミノ酸を追加しても、通常、タンパク質の構造および機能は変化しない。従って、本発明のＴＣＲは、本発明のＴＣＲのうち最大５個、好ましくは、最大３個、より好ましくは、最大２個、最も好ましくは、１個のアミノ酸（特に、ＣＤＲ領域の以外に位置するアミノ酸）が、類似または同様の性質を有するアミノ酸によって置換されても、依然とその機能性を維持するＴＣＲを含む。
本発明は、本発明のＴＣＲに対してわずかに修飾したＴＣＲをさらに含む。修飾（通常、一時構造を変更しない）形態は、例えば、アセチル化またはカルボキシル化等の本発明のＴＣＲの化学的誘導形態を含む。修飾は、例えば、本発明のＴＣＲの合成および加工中またはさらなる加工段階において、グリコシル化修飾によって生成されたＴＣＲ等のグリコシル化をさらに含む。このような修飾は、ＴＣＲをグリコシル化した酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼ）に曝露することによって達成することができる。修飾形態は、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンおよびホスホスレオニン）を有する配列をさらに含む。修飾されることによってその抗タンパク質加水分解性能を向上させたり、溶解性能を最適化したＴＣＲをさらに含む。
【０１７１】
本発明のＴＣＲ、ＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲをトランスフェクションしたＴ細胞は、薬学的に許容されるベクターとともに医薬組成物に提供されることができる。本発明のＴＣＲ、多価ＴＣＲ複合体または細胞は、通常、無菌医薬組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容されるベクターを含む。当該医薬組成物は、任意の適した形態（患者の所望の投与方法に依存する）であり得る。通常、密封された容器で、単位剤形で提供されることができ、キットの一部として提供されることができる。そのようなキット（必須でなない）は、マニュアルを含む。それは、複数の前記単位剤形を含むことができる。
【０１７２】
さらに、本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、他の治療剤と結合またはカップリングして一緒に使用することができる（例えば、同じ医薬組成物に調整される）。
【０１７３】
医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターを含むことができる。「薬学的に許容されるベクター」という用語は、治療剤の投与に使用されるベクターを指す。当該用語は、それ自体が当該組成部を受け取る個体に有害な抗体の生成を誘発せず、投与後に過度の毒性を有さない等のような医薬ベクターを指す。これらのベクターは、当業者によってよく知られている。レミントンの薬物科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．  １９９１））で、薬学的に許容される賦形剤の十分な議論を見つかることができる。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、アジュバント、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１７４】
治療性組成物の薬学的に許容されるベクターは、例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール等の液体を含むことができる。また、これらのベクターには、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が存在することができる。
【０１７５】
通常、治療性組成物を、例えば、液体溶液または懸濁液等の注射可能な剤形に調製することができ、注射前に液体または懸濁液または液体ベクターに処方されるのに適した固体形態に調製することができる。
【０１７６】
本発明の組成物が処方されると、従来の経路によって投与することができ、ここで、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、または局所投与を含むが、これらに限定されなく、好ましくは、皮下、肌肉内または静脈内を含む胃腸外である。予防または治療される対象は、動物であり得、特に、ヒトであり得る。
【０１７７】
本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、使用状況に応じて様々な剤形の医薬組成物を使用することができる。好ましくは、注射および経口剤などが例示されることができる。
【０１７８】
これらの医薬組成物は、従来の方法に基づいて混合、希釈または溶解することによって処方することができ、また、場合によって、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｉｅｓ）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤および共溶媒等の適切な薬物添加剤を加え、当該調製プロセスは、剤形に従って通常の方法で実施することができる。
【０１７９】
本発明の医薬組成物は、徐放剤形の形態で投与することができる。例えば、本発明のＴＣＲは、ベクターとして徐放性ポリマーを有するピルまたはマイクロカプセルに組み込むことができ、次に、当該ピルまたはマイクロカプセルを、手術を通じて、治療される組織に移植する。徐放性ポリマーの例として、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、ポリヒドロメタアクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｍｅｔａａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、乳酸ポリマー、乳酸−グリコール酸ポリマー等を含み、好ましくは、例えば、乳酸ポリマーおよび乳酸−グリコール酸ポリマー等の生分解性ポリマーを含む。
【０１８０】
本発明の医薬組成物が実際の治療に使用される場合、有効成分としての本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲを提示する細胞は、治療される各患者の体重、年齢、性別および症状程度等に基づいて合理的に決定することができ、最終に、医師によって合理的な投与量を決定される。
【０１８１】
本発明の主な利点は次のとおりである。
（１）前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍である。
【０１８２】
（２）前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する本発明のＴＣＲの親和性および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも１０００倍であり、より好ましくは、１０４−１０７倍に達成することができる。
【０１８３】
（３）本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞は、標的細胞に対して強い殺傷効果を有する。
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。
【０１８４】
材料および方法
本発明の実施例で使用される実験材料は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができ、ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは、Ｔｉａｎｇｅｎから購入し、  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔｉａｎｇｅｎから購入し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ  （ＤＥ３）は、Ｎｏｖａｇｅｎから購入し、プラスミドｐＥＴ２８ａは、Ｎｏｖａｇｅｎから購入する。
【０１８５】
実施例１．疎水性コアの突然変異の安定性単鎖ＴＣＲテンプレート鎖の生成
本発明は、特許文献ＷＯ２０１４／２０６３０４による部位特異的突然変異誘発の方法を使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインを結合する柔軟な短いペプチド（リンカー）から構成される安定性単鎖ＴＣＲ分子を構築し、図７ａおよび図７ｂに示されるように、そのアミノ酸およびＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８である。当該単鎖ＴＣＲ分子をテンプレートとして使用して、高親和性ＴＣＲ分子をスクリーニングする。当該テンプレート鎖のα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のアミノ酸配列は、図２ａおよび２ｂに示され、図３ａおよび３ｂに示されるように、その対応するＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６であり、図４ａおよび４ｂに示されるように、柔軟な短いペプチド（リンカー）のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８である。
【０１８６】
テンプレート鎖を持つ標的遺伝子をＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化した後、ＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性グローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、発現に使用する。
【０１８７】
実施例２．実施例１で構築された安定性単鎖ＴＣＲの発現、再生および精製
実施例１で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ−テンプレート鎖を含むＢＬ２１（ＤＥ  ３）コロニーの全部を、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６−０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、３７℃で引き続き４時間培養する。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞ペレットを採集し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを熱分解し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して封入体を回収し、再びＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して封入体を収集する。封入体を緩衝液（２０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、８Ｍ尿素）に溶解し、高速遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量した後、分注して、−８０℃で保存する。
【０１８８】
５ｍｇの溶解した単鎖ＴＣＲ封入体タンパク質に、２．５ｍＬの緩衝液（６Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、最終濃度が１０ｍＭになるまでＤＴＴを加え、３７℃で３０分間処理する。注射器を使用して、１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．１、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、５Ｍ  尿素、  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ、６．５ｍＭ  β−メルカプトエチルアミン（ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、１．８７ｍＭ  シスタミン（Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ））に前記処理後の単鎖ＴＣＲを滴下し、４℃で１０分間撹拌した後、再生液をカットオフが４ＫＤａであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを１Ｌの予冷した水に入れ、４℃で一晩ゆっくりと撹拌する。１７時間後、透析液を１Ｌの予冷した緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）に変更し、４℃で引き続き８時間透析し、次に、透析液を同じ新しい緩衝液に変更し、引き続き一晩透析する。１７時間後、サンプルを０．４５μｍフィルターメンブレンでろ過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過し、タンパク質を２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０で調製した０−１Ｍ  ＮａＣｌ線形勾配溶出液で精製し、収集した溶出成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、単鎖ＴＣＲを含む成分を濃縮した後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製し、標的成分もＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０１８９】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用された溶出成分は、ゲルろ過法でその純度をさらに試験する。条件は、次のとおりである。クロマトグラフィーカラムＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−３（３００  Ａ、φ７．８×３００ｍｍ）、移動相が１５０ｍＭであるリン酸塩緩衝液、流速が０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度が２５℃、ＵＶ検出波長が２１４ｎｍである。
【０１９０】
実施例３．結合の特性化
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００リアルタイム分析システムを使用して、ＴＣＲ分子とＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体の結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をカップリング緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ４．７７）に加えた後、事前にＥＤＣおよびＮＨＳで活性化されたＣＭ５チップに抗体を流して、抗体がチップ表面に固定させ、最後に、エタノールアミンの塩酸溶液で未反応の活性化表面を密封して、カップリング過程を完了し、カップリング水準は、約１５０００ＲＵである。条件は、次のとおりである。温度が２５℃、ＰＨ値が７．１−７．５である。
【０１９１】
低濃度のストレプトアビジンを抗体でコーティングされたチップの表面に流した後、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体を検出チャネルに流し、別のチャネルを参照チャネルとして、０．０５ｍＭのビオチンを１０μＬ／ｍｉｎの流速で２分間チップに流して、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密閉する。単一サイクルの動力学解析方法を使用して、その親和性を測定し、ＴＣＲをＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｐ２０、ｐＨ  ７．４）でいくつかの異なる濃度に希釈し、３０μＬ／ｍｉｎの流速で、チップ表面を順番に流し、毎回注入の結合時間は、１２０秒であり、最後の注入が完了後、６００秒間解離させる。各ラウンドを測定した後、チップをｐＨ  １．７５である１０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌで再生する。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して動力学パラメーターを計算する。
【０１９２】
前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体の調製プロセスは、次のとおりである。
ａ．精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ．  ｃｏｌｉ菌溶液を１００ｍｌ収集し、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、１０ｍｌ  ＰＢＳで最近を１回洗浄した後、５ｍｌ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして細菌を再懸濁し、室温で回転させながら２０分間インキュベートした後、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨てて封入体を収集する。
【０１９３】
前記封入体を５ｍｌ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに再懸濁し、室温で回転させながら５分間インキュベートし、１０倍希釈した３０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加え、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、１０倍希釈した３０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加えて封入体を再懸濁し、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、２回繰り返し、３０ｍｌの２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０を加えて封入体を再懸濁し、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、最後に、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ８Ｍ尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで封入体の純度を検出し、ＢＣＡキットで濃度を測定する。
【０１９４】
ｂ．再生
合成された短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（北京サイバイシェン遺伝子技術会社）をＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで溶解した。軽鎖と重鎖との封入体を、８Ｍ尿素、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ  ＤＴＴで溶解し、再生前に、３Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えてさらに変性する。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１００ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．３、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、４℃まで冷却し）に加えた後、順序に２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖（最終濃度、重鎖は、８時間／回で３回に分けて加え）、再生は、４℃で少なくとも三日で完了し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで再生が成功したかどうかを検出する。
【０１９５】
ｃ．再生後の精製
透析用として１０倍量の２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、タンパク質溶液を０．４５μｍの  醋酸セルロースフィルターメンブレンでろ過した後、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ））陰イオン交換カラム（５ｍｌベッドボリューム）にロードする。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０で調製した０〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣは、約２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出され、ピーク成分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を検出する。
【０１９６】
ｄ．ビオチン化
精製したｐＭＨＣ分子をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、同時に、緩衝液を２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０に交換した後、ビオチン化試薬０．０５Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ  ｐＨ  ８．３、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、５０μＭ  Ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ−ＢｉｒＡ）を加え、室温で混合物を一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
【０１９７】
ｅ．ビオチン化後の複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を１ｍｌに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化ｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、ろ過したＰＢＳを使用してＨｉＰｒｅｐＴＭ  １６／６０  Ｓ２００  ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）で事前平衡化し、１ｍｌの濃縮後のビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードした後、ＰＢＳで１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出する。ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、約５５ｍｌで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合わせ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、タンパク質酵素阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ビオチン化ｐＭＨＣ分子を分注して、−８０℃で保存する。
【０１９８】
実施例４．高親和性単鎖ＴＣＲの生成
ファージディスプレイ技術は、ＴＣＲ高親和性変異体のライブラリーを生成して、高親和性変異体をスクリーニングする手段である。Ｌｉら（（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（３）：３４９−３５４）によって記載されたＴＣＲファージディスプレイおよびスクリーニング方法を、実施例１の単鎖ＴＣＲテンプレートに適応した。当該テンプレート鎖のＣＤＲ領域を突然変異させることにより、高親和性ＴＣＲのライブラリーを構築して、パンニングした。数回のパンニング後、ファージライブラリーは、対応する抗原に特異的に結合し、その中から単一のグローニングを選択し、配列分析を行う。
【０１９９】
実施例３のＢＩＡｃｏｒｅ方法を使用して、ＴＣＲ分子とＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との相互作用を分析し、親和性および／または結合半減期が野生型ＴＣＲの少なくとも２倍の高親和性ＴＣＲをスクリーニングし、即ち、スクリーニングした高親和性ＴＣＲ結合ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体の解離平衡定数ＫＤは、野生型ＴＣＲ結合ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体の解離平衡定数ＫＤの半分以下であり、結果は、以下の表３に示される。前記方法を使用して検出された可溶性参照ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との相互作用のＫＤ値は、４３μＭであり、その相互作用の曲線は、図１２に示され、即ち、野生型ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との相互作用のＫＤ値も４３μＭであり、即ち、４．３Ｅ−０５Ｍである。
【０２００】
具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲ突然変異体のα鎖可変ドメインは、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、３１Ｎ、９４Ｒ、９５Ｔ、９６Ｇ、９７Ａ、９８Ｎおよび９９Ｓの一つまたは複数の部位のアミノ酸で突然変異が発生し、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲ突然変異体のβ鎖可変ドメインは、２７Ｓ、２８Ｅ、２９Ｈ、３０Ｎ、５０Ｑ、５１Ｎ、５２Ｅ、５３Ａおよび５４Ｑの一つまたは複数の部位で突然変異が発生する。
【０２０１】
より具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２８Ｄまたは２８Ｐまたは２８Ａまたは２８Ｅ、２９Ｖ、３０Ｓまたは３０Ｙまたは３０Ｄ、３１Ｓまたは３１Ｋ、９４Ａまたは９４Ｓまたは９４Ｖまたは９４Ｄまたは９４Ｅまたは９４Ｑまたは９４Ｔ、９５Ｍまたは９５Ｒまたは９５Ｌまたは９５Ａまたは９５Ｎまたは９５Ｓ、９６Ａまたは９６Ｑまたは９６Ｓまたは９６Ｅまたは９６Ｎ、９７Ｓまたは９７Ｇまたは９７Ｐまたは９７Ｗ、９８Ｓまたは９８Ｔ、９９Ａまたは９９Ｎまたは９９Ｔまたは９９Ｐからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含み、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される番号を使用すると、これらの高親和性ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、２７Ａまたは２７Ｑまたは２７Ｇ、２８Ｇまたは２８Ｔまたは２８Ｒまたは２８Ｌ、２９Ｗまたは２９Ｒ、３０Ａまたは３０Ｐ、５０Ｈ、５１Ｇ、５２Ｄ、５３Ｍまたは５３Ｌ、５４Ｅからなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
【０２０２】
高親和性単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５）およびβ鎖可変ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６）の具体的アミノ酸配列は、それぞれ図５（１）−（２７）および図６（１）−（１１）に示される。
【０２０３】
【表１２】
2022502078.tif 000021
2022502078.tif 000022
2022502078.tif 000023
【０２０４】
実施例５．高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲの生成
実施例４でスクリーニングされた高親和性単鎖ＴＣＲのＣＤＲ領域の突然変異は、αβヘテロ二量体ＴＣＲの可変ドメインに対応する部位に導入され、ＢＩＡｃｏｒｅを通じて、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との親和性を検出する。前記ＣＤＲ領域における高親和性突然変異点の導入は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発の方法を採用する。前記野生型ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図１ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および１ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に示される。
【０２０５】
より安定した可溶性ＴＣＲを得て、ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をより容易に評価するために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の定常領域にそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成するＴＣＲであり得ることに留意しなければなり、本実施例でシステイン残基を導入した後、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図８ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）および８ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）  に示され、導入されたシステイン残基は、太字で示される。
【０２０６】
「分子グローニング−実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）で記載された標準方法を通じて、発現されるＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外配列遺伝子を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入し、アップストリームおよびダウンストリームのグローニング部位は、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。ＣＤＲ領域の突然変異は、当業者に周知のオーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ）によって導入される。挿入フラグメントは、シーケンシングによって確認される。
【０２０７】
実施例６．αβヘテロ二量体ＴＣＲの発現、再生および精製
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現ベクターを化学的形質転換法によって発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、細菌をＬＢ培地で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６である場合、最終濃度０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現した後に形成された封入体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ｎｏｖａｇｅｎｅ）を通じて抽出し、また、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液で複数回繰り返して洗浄し、最後に封入体を６Ｍ  塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ８．１）にに溶解する。
【０２０８】
溶解後のＴＣＲα鎖およびβ鎖は、５Ｍ  尿素、０．４Ｍ  アルギニン、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ８．１）、３．７ｍＭ  シスタミン、６．６ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  （４℃）を１：１の質量比ですばやく混合され、最終濃度は、６０ｍｇ／ｍｌである。混合後、溶液を透析用の脱イオン水（４℃）の１０倍量に入れ、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０）に交換して、引き続き４℃で１２時間透析する。透析完了後、溶液を０．４５μＭのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出ピークは、再生に成功したαおよびβ二量体のＴＣＲを含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって確認される。次に、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じてＴＣＲさらに生成する。精製されたＴＣＲの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％を超えると測定され、濃度は、ＢＣＡ法によって決定される。
【０２０９】
実施例７．ＢＩＡｃｏｒｅ分析結果
実施例３に記載の方法を使用して、高親和性ＣＤＲ領域に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との親和性を検出する。
【０２１０】
高親和性単鎖ＴＣＲα鎖およびβ鎖からスクリーニングされたＣＤＲ領域を、それぞれ野生型ＴＣＲα鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対応する位置に移して、αβヘテロ二量体ＴＣＲを形成し、また、スクリーニングによって得られたＣＤＲ領域の突然変異部位を人工的に組み合わせて、αβヘテロ二量体ＴＣＲを形成し、得られた新しいＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図９（１）−（２９）および図１０（１）−（２０）に示される。ＴＣＲ分子のＣＤＲ領域が対応するｐＭＨＣ複合体との親和性を決定するため、当業者は、高親和性突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲもＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に対する高親和性を有することを予期することができる。以下の表４に示されるように、実施例５に記載の方法を使用して発現ベクターを構築し、実施例６に記載の方法を使用して前記高親和性突然変異を導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲに対して発現、再生および精製した後、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用してＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体との親和性を測定する。
【０２１１】
【表１３】
2022502078.tif 000024
2022502078.tif 000025
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【０２１２】
表４から、ＣＤＲ領域の突然変異点に導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に対する高親和性を維持していることが分かる。前記ヘテロ二量体ＴＣＲの親和性は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に対する野生型ＴＣＲの親和性の少なくとも２倍である。
【０２１３】
実施例８．抗−ＣＤ３抗体と高親和性単鎖ＴＣＲとの融合物の発現、再生および精製
本発明の高親和性単鎖ＴＣＲ分子を抗ＣＤ−３抗体の単鎖分子（ｓｃＦｖ）と融合させて、融合分子を構築する。オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法により、プライマーをデザインして、抗−ＣＤ３抗体と高親和性単鎖ＴＣＲ分子の遺伝子とを結合し、中央の結合短いペプチド（リンカー）をＧＧＧＧＳにデザインし、また、融合分子の遺伝子フラグメントに制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏIおよびＮｏｔIを持たせる。ＰＣＲ増幅生成物をＮｃｏIおよびＮｏｔIで二重酵素消化し、ＮｃｏIおよびＮｏｔIで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性グローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用する。
【０２１４】
融合タンパク質の発現
標的遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）にコーティングして、３７℃で一晩インキュベートしする。翌日、グローニングを選択して１０ｍｌ  ＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種して、２〜３時間培養し、倍量比１：１００で１Ｌ  ＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種し、引き続きＯＤ６００が０．５〜０．８になるまで培養し、次に、最終濃度が０．５ｍＭであるＩＰＴＧを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。４時間誘導した後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を得る。菌体をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、また、菌体を分注し、細菌を２００ｍｌの細菌培養物に相当する菌体用５ｍｌ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で熱分解し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で４回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を８Ｍ尿素を含むトリス緩衝溶液に溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、−８０℃で冷凍保存する。
【０２１５】
融合タンパク質のリフォールディング
−８０℃の超低温冷蔵庫から約１０ｍｇの封入体を取り出して解凍し、最終濃度が１０ｍＭになるまでジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、３７  ℃で３０分間〜１時間インキュベートして、ジスルフィド結合が完全に開くように確保する。次に、封入体サンプル溶液をそれぞれ２００ｍｌの４℃で予冷リフォールディング緩衝液（１００ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素、６．５ｍＭ  β−メルカプトエチルアミン、１．８７ｍＭ  シスタミン）に滴下し、４℃で約３０分間ゆっくりと撹拌する。再生溶液を８倍量の予冷したＨ２Ｏで１６〜２０時間透析する。再び８倍量の１０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０で２回透析し、４℃で引き続き約８時間透析し、透析後、サンプルをろ過して、以下の生成を行う。
【０２１６】
融合タンパク質の第１の段階の精製
透析されたリフォールディング物（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０中）は、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ／２０陰イオン交換クロマトグラフィープレパックカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＫＴＡ精製器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で０〜６００ｍＭ  ＮａＣｌでグラジエント溶出する。クマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで各成分を分析して、合併する。
【０２１７】
融合タンパク質の第２の段階の精製
この段階の精製のために、第１の段階で精製して合併されたサンプル溶液を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液で事前に平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬゲルろ過クロマトグラフィープレパックカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）使用して、融合タンパク質を精製し、クマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥでピークの成分を分析して、合併する。
【０２１８】
実施例９．抗−ＣＤ３抗体と高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲとの融合物の発現、再生および精製
抗−ＣＤ３の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をαβヘテロ二量体ＴＣＲと融合させて、融合分子を調製する。抗−ＣＤ３のｓｃＦｖは、ＴＣＲβ鎖と融合し、当該ＴＣＲβ鎖は、前記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖可変ドメインのいずれかを含むことができ、融合分子のＴＣＲα鎖は、前記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲα鎖可変ドメインのいずれかを含むことができる。
【０２１９】
融合分子発現ベクターの構築
１．α鎖発現ベクターの構築
αβヘテロ二量体ＴＣＲα鎖を持つ標的遺伝子をＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化し、ＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性グローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）に形質転換して、発現に使用する。
【０２２０】
２．抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖発現ベクターの構築
オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法により、プライマーをデザインして、抗−ＣＤ３ｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖遺伝子とを結合し、中央の結合短いペプチド（リンカー）は、ＧＧＧＧＳであり、また、抗−ＣＤ３のｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖の融合タンパク質の遺伝子フラグメントは、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏI（ＣＣＡＴＧＧ）とＮｏｔI（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）とを備える。ＰＣＲ増幅生成物をＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化し、ＮｃｏIとＮｏｔIとで二重酵素消化したｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で転倒して一晩インキュベートし、陽性グローニングを選択してＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンシングし、正しい配列を確認した後、組換えプラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換して、発現に使用する。
【０２２１】
融合タンパク質の発現、再生および精製
発現プラスミドをそれぞれＥ．  ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）にコーティングして、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、グローニングを選択して１０ｍＬ  ＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種して、２〜３時間培養し、倍量比１：１００で１Ｌ  ＬＢ培地に接種し、引き続きＯＤ６００が０．５〜０．８になるまで培養し、最終濃度が１ｍＭであるＩＰＴＧを使用して標的タンパク質の発現を誘導する。４時間誘導した後、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を得る。菌体をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、また、菌体を分注し、細菌を２００ｍＬの細菌培養物に相当する菌体用５ｍＬ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で熱分解し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集する。次に、洗浄剤で４回洗浄して、細胞破片および膜成分を除去する。次に、例えばＰＢＳ等の緩衝液で封入体を洗浄して、洗浄剤および塩を除去する。最終的に、封入体を６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．１を含む緩衝溶液で溶解し、封入体の濃度を測定し、それを分注して、−８０℃で冷凍保存する。
【０２２２】
溶解後のＴＣＲα鎖および抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖は、２：５の質量比で５Ｍ  尿素（ｕｒｅａ）、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．１、３．７ｍＭ  シスタミン、６．６ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）にすばやく混合し、α鎖および抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖の最終濃度は、それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．２５ｍｇ／ｍｌである。
【０２２３】
混合後、溶液を透析用１０倍量の脱イオン水（４  ℃）に入れ、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０）に交換して、引き続き４℃で１２時間透析する。透析完了後の溶液は、０．４５μＭのフィルターメンブレンでろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  ５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出ピークは、再生に成功したＴＣＲα鎖および抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖二量体のＴＣＲが含まれることをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて確認される。次に、ＴＣＲ融合分子を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ−１００  １６／６０、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じてさらに精製し、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  ５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じて再び精製する。精製後のＴＣＲ融合分子の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％を超えることを測定され、濃度は、ＢＣＡ法によって測定される。
【０２２４】
実施例１０．本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の活性化機能実験
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性化効果を有することを検証する。
【０２２５】
細胞における本発明の高親和性ＴＣＲの機能および特異性は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験によって試験される。当業者は、細胞個濃を検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用する方法に精通している。本実施例のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ実験は、健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に、エフェクター細胞として、レンチウイルスによって本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションした。
【０２２６】
ランダムに本発明のＴＣＲを選択し、二つの群に分けて実験を行い、前記ＴＣＲおよびその番号は、表４からわかる。
第１の群は、ＴＣＲ３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＣＲ２（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＣＲ４（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびＴＣＲ１（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、対照群のエフェクター細胞は、ＷＴ−ＴＣＲ（野生型ＴＣＲをトランスフェクションする）およびＡ６（本発明以外の他のＴＣＲをトランスフェクションする）に標識される。標的細胞系は、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、Ｈｕｈ−１、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＫ−ＨＥＰ−１細胞である。ここで、標的細胞系ＨｅｐＧ２は、関連する抗原を発現し、遺伝子型も陽性細胞系に適合し、Ｈｕｈ−７、Ｈｕｈ−１、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＫ−ＨＥＰ−１は、対照として陰性細胞系である。
【０２２７】
第２の群は、ＴＣＲ７（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＣＲ１１（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびＴＣＲ１３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。対照群のエフェクター細胞は、ＷＴ−ＴＣＲ（野生型ＴＣＲをトランスフェクションする）およびＡ６（本発明以外の他のＴＣＲをトランスフェクションする）に標識される。標的細胞系は、ＨＣＣＣ９８１０−ＡＦＰ、ＰＬＣＰＲＦ５−Ａ２、ＳＮＵ３９８およびＨＣＣＣ９８１０であり、ここで、標的細胞系ＨＣＣＣ９８１０−ＡＦＰおよびＰＬＣＰＲＦ５−Ａ２は、関連する抗原を発現し、遺伝子型も陽性細胞系に適合し、ＳＮＵ３９８およびＨＣＣＣ９８１０は、対照として陰性細胞系である。
【０２２８】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化して、４℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、次の順序で試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、培地は、エフェクター細胞を１×１０４個細胞／ｍｌに調整し、培地は、各標的細胞を２×１０５個細胞／ｍｌに調整する。均等に混合した後、１００μＬの標的細胞（即ち、２００００個細胞／ウェル）、１００μＬのエフェクター細胞（即ち１０００個細胞／ウェル）を対応するウェルに加え、二つの重複ウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％  ＣＯ２）。実験の二日目に、プレートを洗浄して二次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＲＥＡＤＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。
【０２２９】
第１の群および第２の群の実験結果は、それぞれ図１３ａおよび１３ｂに示され、本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞は、陰性標的細胞に対して、基本的に活性化効果を有さず、陽性標的細胞に対して、良好な特異的活性化効果を有し、その效果は、野生型ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞よりはるかに優れている。
【０２３０】
実施例１１．本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションしたエフェクター細胞の殺傷機能実験
本実施例は、非放射性細胞毒性実験を使用して、ＬＤＨの放出を測定することにより、本発明のＴＣＲをトランスフェクションした細胞の殺傷機能を検証する。当該試験は、５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞熱分解後に放出した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量測定する。３０分間のカップリング酵素反応を使用して、培地中に放出されたＬＤＨを検出し、酵素反応で、ＬＤＨは、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を赤いホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に形質転換することができる。生成された赤い生成物の量は、熱分解した細胞の数に正比例する。標準の９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの可視光吸光度データを収集することができる。
【０２３１】
当業者は、細胞機能を検出するためにＬＤＨ放出実験を使用する方法に精通している。本実施例のＬＤＨ実験は、健康なボランティアの血液から単離されたＰＢＬ細胞に、エフェクター細胞として、レンチウイルスによってＴＣＲをトランスフェクションした。標的細胞系は、ＨｅｐＧ２、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８であり、ここで、ＨｅｐＧ２は、陽性標的細胞系であり、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８は、参照としての陰性標的細胞系である。
【０２３２】
本発明のＴＣＲをランダムに選択し、二つの群に分けて実験し、前記ＴＣＲおよびその番号は、表４からわかり、第１の群は、ＴＣＲ３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴＣＲ２（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびＴＣＲ１（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、第２の群は、ＴＣＲ７（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびＴＣＲ１３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。対照群のエフェクター細胞は、ＷＴ−ＴＣＲ（野生型ＴＣＲをトランスフェクションする）およびＡ６（本発明以外の他のＴＣＲをトランスフェクションする）に標識される。
【０２３３】
まず、ＬＤＨプレートを準備する。実験の初日に、次の順序で試験の各成分をプレートに加える。培地は、エフェクター細胞を３×１０５個細胞／ｍｌになるまで調整し、培地は、各標的細胞系を３×１０５個細胞／ｍｌになるまで調整する。均等に混合した後、１００μＬの標的細胞（即ち、３００００個細胞／ウェル）、１００μＬのエフェクター細胞（即ち、３００００個細胞／ウェル）を対応するウェルに加え、三つの重複ウェルを設置する。同時に、エフェクター細胞用自発的ウェル、標的細胞用自発的ウェル、標的細胞用最大ウェル、体積補正対照ウェルおよび培地背景対照ウェルをすべて２００μＬに設定する。一晩インキュベートする（３７℃、５％  ＣＯ２）。実験の二日目に、発色を検出し、反応終了後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｋ）を使用して４９０ｎｍの吸光度を記録する。
【０２３４】
第１の群および第２の二群の実験結果は、それぞれ図１４ａおよび１４ｂに示されたように、本発明のＴＣＲをトランスフェクションした細胞は、関連する抗原を発現する標的細胞に対して強い殺傷効果を有するが、関連する抗原を発現する標的細胞に対して、基本的に殺傷効果を有さず、他のＴＣＲをトランスフェクション下細胞は、関連する抗原を発現する標的細胞に対して殺傷効果はない。
【０２３５】
実施例１２．本発明の高親和性ＴＣＲおよび抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質の機能検証−活性化実験
本実施例は、本発明の高親和性ＴＣＲおよび抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質がエフェクター細胞をリダイレクトし、それを良好な活性化効果を有するようにすることができることを検証する。
【０２３６】
当業者は、細胞機能を検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用する方法に精通している。本実施例のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であり、標的細胞系は、ＨＥＰＧ２、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８であり、ここで、ＨＥＰＧ２は、陽性標的細胞系であり、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８は、陰性標的細胞系である。本発明の高親和性ＴＣＲをランダムに選択し、実施例９に記載されるように融合タンパク質を調製し、具体的には、選択された高親和性ＴＣＲおよびその番号は、表４からわかり、それぞれ、ＴＣＲ２１（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＴＣＲ２４（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、ＴＣＲ２５（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）、ＴＣＲ１７（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）、ＴＣＲ２３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、ＴＣＲ３３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）およびＴＣＲ３４（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）である。
【０２３７】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化して、４℃で一晩コーティングする。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加える。標的細胞は、２００００個細胞／ウェルであり、エフェクター細胞は、４０００個細胞／ウェルであり、融合タンパク質の濃度は、０．０４μＭであり、一つずつ１０倍に勾配希釈して、合計六つの濃度勾配を希釈する。二つの重複ウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％  ＣＯ２）。実験の二日目に、プレートを洗浄して二次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＲＥＡＤＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０公司）でメンブレンに形成されたスポットをカウントする。
【０２３８】
実験結果は、図１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆおよび１５ｇに示されたように、本発明の高親和性ＴＣＲおよび抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質は、エフェクター細胞をリダイレクトすることができ、陽性標的細胞に対して、エフェクター細胞は、強い活性化効果を示すが、陰性標的細胞に対して、エフェクター細胞は、基本的に活性化されず、良好な特異性を示すことを示す。
【０２３９】
実施例１３．本発明の高親和性ＴＣＲおよび抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質の機能検証−殺傷実験
本実施例は、非放射性細胞毒性試験を使用して、殺傷効果を検証する。当該試験は、５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞熱分解後に放出した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量測定する。３０分間のカップリング酵素試験を使用して、培養上清液に放出されたＬＤＨを検出し、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を赤いホルマザン生成物に形質転換する。形成された色の量は、細胞を熱分解した数に比例する。標準９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの吸光度データを収集する。
【０２４０】
本実験で使用された標的細胞系は、ＨＥＰＧ２、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８であり、ここで、ＨＥＰＧ２は、陽性標的細胞系であり、ＨＣＣＣ９８１０およびＳＮＵ−３９８は、陰性標的細胞系である。エフェクター細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。本発明の高親和性ＴＣＲをランダムに選択し、前記ＴＣＲおよびその番号は、表４からＴＣＲ２３（α鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１およびβ鎖可変ドメインＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）が実施例９に記載されるように調製された融合タンパク質であることが分かり、実験培地を通じて異なる濃度（１０−１３−１０−８Ｍ）に希釈する。５０μｌの標的細胞および５ｘ１０４個細胞／ウェル、１００μｌのエフェクター細胞および５ｘ１０４個細胞／ウェルおよび５０μｌ融合タンパク質の順序で実験の各成分をプレートに加えた。
【０２４１】
標的細胞の自発的放出：わずか２００μｌの標的細胞および標的細胞の最大放出：わずか２００μｌの標的細胞が存在するいくつかの対照を調整した。培地対象群：わずか２００μｌの培地、体積補正対照群：２００μｌの培地および２０μｌの細胞熱分解溶液。すべてのウェルは、３回調製し、最終体積が２００μｌである。プレートを２５０ｘｇで４分間遠心分離した後、３７℃で２０時間インキュベートする。２０μｌの熱分解溶液を標的細胞の最大放出対照ウェルおよび体積補正対照ウェルに加え、４５分後に上清液を収集する。プレートを２５０ｘｇで４分間遠心分離する。試験プレートの各ウェルの５０μｌ上清液を平底９６ウェルＮｕｎｃ  Ｖｌｎｘｉｓｏｒｂプレートの対応するウェルに移す。試験緩衝液（１２ｍ１）で基質混合物を再構成する。次に、再構成された５０μｌの基質混合物をプレートの各ウェルに加える。プレートをアルミホイルで覆い、室温下で３０分間インキュベートする。５０μｌの停止溶液をプレートの各ウェルに加えて反応を停止する。停止溶液を加えた後、１時間内にＥｌｉｓａプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの吸光度を記録する。
【０２４２】
実験結果は、図１６に示されるように、本発明の高親和性ＴＣＲおよび抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質は、エフェクター細胞をリダイレクトすることができ、陽性標的細胞を殺傷し、陰性標的細胞には殺傷効果を有さず、良好な特異性を示す。
【０２４３】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって限られる範囲に含まれる。
【図１ａ−５（５）】
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【図５（６）−５（２０）】
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【図５（２１）−６（８）】
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【図６（９）−９（３）】
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【図９（４）−９（１８）】
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【図９（１９）−１０（４）】
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【図１０（５）−１０（１９）】
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【図１０（２０）−１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１５ｇ】
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【図１６】
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【図１７ａ−１７ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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