(57)【要約】【解決手段】ＤＬＬ３結合タンパク質、および、ＣＤ３に結合するドメイン、半減期延長ドメイン、ならびにＤＬＬ３に結合するドメイン（本明細書で提供されるようなＤＬＬ３結合タンパク質）を含むＤＬＬ３標的化多特異性タンパク質（例えば、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質）が本明細書で提供される。さらに、その医薬組成物、同様に、ＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞も提供される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、ＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質であって、
前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含む、
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２】
第１のドメイン（Ａ）、第２のドメイン（Ｂ）、および第３のドメイン（Ｃ）は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で連結される、請求項１に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３】
第３のドメイン（Ｃ）は、親和性成熟結合分子を含む、請求項１または２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４】
親和性成熟結合分子は、ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する親分子に由来する、請求項３に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５】
親和性成熟結合分子は、親和性成熟のラウンド後に、ＤＬＬ３に特異的に結合する親分子に由来する、請求項３または４に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６】
親和性成熟のラウンドは、ＤＬＬ３タンパク質に対するファージディスプレイライブラリーをパニングすることを含む、請求項５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７】
ファージディスプレイライブラリーは、親分子の１つ以上の残基を変異させることにより生成される、請求項６に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項８】
ファージディスプレイライブラリーは、親分子に由来する１つ以上の分子を発現させる、請求項７に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項９】
親和性成熟結合分子は、親分子に由来する１つ以上の分子から選択される、請求項８に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１０】
親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項３−９のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１１】
親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約２倍、約５０倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項１０に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１２】
親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約３倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する、請求項１０に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１３】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１−１２のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１４】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１−１３のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１５】
第３のドメイン（Ｃ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１−１４のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１６】
ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１７】
ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１５または１６に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１８】
ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９から選択された配列に対する１つ以上の置換を含む、請求項１５、１６、および１７のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項１９】
ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２０】
ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１５または１９に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２１】
ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１５、１９、および２０のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２２】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列に少なくとも約８０％同一である配列を含む、請求項１５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２３】
ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２４】
ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を有する配列を含む、請求項２２または２３に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２５】
ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２３または２４に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２６】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２７】
ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２６に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２８】
ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２６または２７に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項２９】
ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２６、２７、または２８に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３０】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項１５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３１】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質であって、
前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列を含むか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８に由来する、
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３２】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８に由来する、請求項３１に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項３２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３４】
ＣＤＲ１は以下の配列：ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８を含む、請求項３３に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３５】
ＣＤＲ２は以下の配列：ＧＪ１ＳＪ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６Ｊ７Ｊ８Ｊ９Ｊ１０ＳＪ１１ＫＪ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９５）を含む、請求項３３または３４に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３６】
ＣＤＲ３は以下の配列：Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１を含む、請求項３３、３４、または３５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３７】
Ｘ１はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ２はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ５はＦ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｘ６はＡまたはＧであり、
Ｘ７はＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、および、
Ｘ８はＡまたはＧである、
請求項３４−３６のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３８】
Ｊ１はＩまたはＶであり、
Ｊ２はＡ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｊ３はＤまたはＮであり、
Ｊ４はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｊ５はＳまたはＴであり、
Ｊ６はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ７はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ８はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ９はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり、
Ｊ１１はＡまたはＶであり、および、
Ｊ１２はＧまたはＶである、
請求項３４−３７のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項３９】
Ｚ１はＦまたはＹであり、
Ｚ２はＧ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＴであり、
Ｚ３はＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｚ４はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、
Ｚ６はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、またはＴであり、
Ｚ７はＡ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、
Ｚ９はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ１０はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、および、
Ｚ１１はＡ、Ｆ、Ｓ、またはＹである、
請求項３４−３８のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４０】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質であって、
前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含むか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項４０に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４２】
ＣＤＲ１は以下の配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８Ａを含む、請求項４１に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４３】
ＣＤＲ２は以下の配列：ＧＪ１ＳＪ２Ｊ３ＧＪ４Ｊ５Ｊ６ＹＪ７Ｊ８ＳＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９４）を含む、請求項４１または４２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４４】
ＣＤＲ３は以下の配列：Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９を含む、請求項４１、４２、および４３のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４５】
Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ２はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４はＫ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ５はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ６はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ７はＬまたはＭであり、および、
Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＶである、
請求項４２−４４のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４６】
Ｊ１はＩまたはＶであり、
Ｊ２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ３はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり、
Ｊ４はＨ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｊ５はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、またはＶであり、
Ｊ６はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ７はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである、
請求項４２−４５のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４７】
Ｚ１はＬまたはＹであり、
Ｚ２はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ３はＱまたはＷであり、
Ｚ４はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｚ５はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｚ６はＡ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｚ７はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ８はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＴであり、および、
Ｚ９はＦ、Ｈ、またはＹである、
請求項４２−４６のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４８】
第３のドメイン（Ｃ）は、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１−４７のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項４９】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＤＬＬ３に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項１−４８のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５０】
第３のドメイン（Ｃ）は単一ドメイン抗体を含む、請求項４９に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５１】
第２のドメイン（Ｂ）はバルク血清タンパク質と結合する、請求項１−５０のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５２】
第２のドメイン（Ｂ）は、バルク血清タンパク質に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項５１に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５３】
第２のドメイン（Ｂ）は、バルク血清タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体を含む、請求項５２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５４】
バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、ＩｇＥ、五量体ＩｇＭ、またはＩｇκ遊離軽鎖を含む、請求項５３に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５５】
バルク血清タンパク質はアルブミンを含む、請求項５４に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５６】
第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項５５に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５７】
第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項５６に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５８】
第１のドメイン（Ａ）は、ＣＤ３に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項１−５７のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項５９】
第１のドメイン（Ａ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０７からなる群から選択された配列を含む、請求項５８に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６０】
第３のドメイン（Ｃ）は以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である、請求項１−５９のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６１】
第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項６０に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６２】
ドメインＣとＢはリンカーＬ１によって接続され、ドメインＢとＡはリンカーＬ２によって接続される、請求項１−６１のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６３】
リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）から選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）である、請求項６２に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６４】
リンカーＬ１およびＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１７）、（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１８）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）である、請求項６３に記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６５】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、約０．１ｎＭ〜約５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）でＤＬＬ３に結合する、請求項１−６４のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６６】
タンパク質は、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはヒトとカニクイザルの両方のＤＬＬ３に結合する、請求項１−６５のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６７】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は約８０ｋＤａ未満である、請求項１−６６のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６８】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は約５０〜約７５ｋＤａである、請求項１−６７のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項６９】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は約６０ｋＤａ未満である、請求項１−６８のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７０】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を有する、請求項１−６９のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７１】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を有する、請求項１−７０のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７２】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ヒトの被験体に投与されると、少なくとも約２５時間、少なくとも約５０時間、または少なくとも約１００時間の消失半減期を有する、請求項１−６９のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７３】
ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で連結される、請求項１−７２のいずれか１つに記載のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質。
【請求項７４】
以下の式を含むＤＬＬ３結合タンパク質であって、
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ｒ２はＣＤＲ２であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３はＣＤＲ３であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または前記１つ以上のアミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である、ＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項７４に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項７４または７５に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項７４または７５に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項７４または７５に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む、請求項７４または７５に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列を含む親のＤＬＬ３結合タンパク質に由来するか、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列を含む、ＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含む親のＤＬＬ３結合タンパク質に由来するか、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含む、ＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項８２】
（ｉ）請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、または、請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項８３】
請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を調製するための方法であって、前記方法は、
ｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片を提供する工程と、
ｉｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片に、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーを曝露する工程と、
ｉｉｉ）オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するＤＬＬ３結合タンパク質を組換えライブラリーから選択する工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で識別されたＤＬＬ３結合タンパク質を使用して、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を調製する工程とを含む、
方法。
【請求項８４】
ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーは、前記ＤＬＬ３タンパク質を用いて組換えライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロでＤＬＬ３タンパク質に曝露される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
組替えライブラリーはバクテリオファージの表面上で発現される、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
組替えライブラリーは酵母細胞の表面上で発現される、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８７】
組替えライブラリーは細菌細胞の表面上で発現される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
組替えライブラリーはＲＮＡタンパク質融合として発現される、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８９】
組替えライブラリーはｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーである、請求項８３−８８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９０】
組替え抗体ライブラリーは単一ドメインライブラリーである、請求項８３−８８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９１】
請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の産生のためのプロセスであって、前記プロセスは、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の発現を可能にする条件で請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
【請求項９２】
請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質を調製するための方法であって、前記方法は、
ｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片を提供する工程と、
ｉｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片に、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーを曝露する工程と、
ｉｉｉ）オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するＤＬＬ３結合タンパク質を組換えライブラリーから選択する工程とを含む、
方法。
【請求項９３】
ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーは、前記ＤＬＬ３タンパク質を用いて組換えライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロでＤＬＬ３タンパク質に曝露される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
組替えライブラリーはバクテリオファージの表面上で発現される、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
組替えライブラリーは酵母細胞の表面上で発現される、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９６】
組替えライブラリーは細菌細胞の表面上で発現される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
組替えライブラリーはＲＮＡタンパク質融合として発現される、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９８】
組替えライブラリーはｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーである、請求項９２−９７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９９】
組替え抗体ライブラリーは単一ドメインライブラリーである、請求項９２−９７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１００】
請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質の産生のためのプロセスであって、前記プロセスは、ＤＬＬ３結合タンパク質の発現を可能にする条件で請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む、プロセス。
【請求項１０１】
増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法であって、前記方法は、
請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質、または請求項８２の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０２】
被験体はヒトである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１−７３のいずれか１つのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、請求項７４−８１のいずれか１つのＤＬＬ３結合タンパク質、または請求項８２の医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、請求項１０１−１０３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０５】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む、請求項１０１−１０５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０７】
固形腫瘍疾患は肺癌、胃癌、卵巣癌、またはトリプルネガティブ乳癌を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
固形腫瘍疾患は転移性である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法であって、前記方法は、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列を含むＤＬＬ３結合ドメインを含むＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１１０】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を導く、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患を含む、請求項１０９−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１３】
固形腫瘍疾患は肺癌、胃癌、卵巣癌、またはトリプルネガティブ乳癌を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
固形腫瘍疾患は転移性である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法であって、前記方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８または７５で記載される配列を含むＤＬＬ３結合ドメインを含むＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８または７５で記載される配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１１６】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質を、最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する工程を含む、請求項１０１−１１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１７】
タンパク質は少なくとも週に１回投与される、請求項１０１−１１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１８】
タンパク質は１週間に２回投与される、請求項１０１−１１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１９】
タンパク質は２週間に１回投与される、請求項１０１−１１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２０】
タンパク質は３週間に１回投与される、請求項１０１−１１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９０またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９１で記載されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３結合タンパク質。
【請求項１２２】
タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９２および１８９３のいずれか１つで記載されるようなアミノ酸配列を含むＤＬＬ３配列を結合することができる、請求項１−８１および１０４のいずれか１つに記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／７３６，３６８号；２０１８年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／７３６，３５８号；および、２０１９年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，２２７号の利益を主張し、上記文献はそれぞれ全体として本明細書で参照することにより組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１９年９月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７−７３３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、９５１，５１９バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
個々の細胞または特定の細胞型の選択的な破壊は、様々な臨床設定においてしばしば望ましいことである。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健康な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残すことが癌治療の主要な目的である。そのような１つの方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞あるいは細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃および破壊させるために、腫瘍に対する免疫反応を引き起こすことによるものである。
【発明の概要】
【０００４】
神経内分泌腫瘍などのＤＬＬ３の過剰発現に関連する腫瘍性疾患の処置のための利用可能なさらなるオプションを持つことに対するニーズが依然として存在している。本開示は、特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＤＬＬ３結合ドメインを含有している三重特異性タンパク質などの腫瘍標的細胞および多特異性タンパク質の表面上でＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメインタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示は、デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）結合タンパク質、または上記のような多特異性タンパク質を提供し、これはＤＬＬ３の発現に相互に関連する兆候を診断および処置するために使用可能である。
【０００５】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、あるいは、リンカーＬ１およびＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、連結される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、親和性成熟結合分子を含む。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合分子は、ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する親分子に由来する。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約２倍、約５０倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列を含み、ここで、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列を含み、ならびに、ここで、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、請求項１のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質であって、ここで、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。
【０００８】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含み、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する。いくつかの実施形態では、第３のドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は以下の配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８Ａを含み、ＣＤＲ２は以下の配列：ＧＪ１ＳＪ２Ｊ３ＧＪ４Ｊ５Ｊ６ＹＪ７Ｊ８ＳＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９４）を含み、および、ＣＤＲ３は以下の配列：Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、
Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ２はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４はＫ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ５はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ６はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ７はＬまたはＭであり、および、
Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＶである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、
Ｊ１はＩまたはＶであり、
Ｊ２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ３はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり、
Ｊ４はＨ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｊ５はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、またはＶであり、
Ｊ６はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ７はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである；
【００１２】
いくつかの実施形態では、
Ｚ１はＬまたはＹであり、
Ｚ２はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ３はＱまたはＷであり、
Ｚ４はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｚ５はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｚ６はＡ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｚ７はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ８はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＴであり、および、
Ｚ９はＦ、Ｈ、またはＹである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）から選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）である。いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で、または、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。
【００１４】
１つの実施形態は、以下の式を含むＤＬＬ３結合タンパク質を提供し、
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ｒ２はＣＤＲ２であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３はＣＤＲ３であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。
【００１５】
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法を提供し、上記方法は、本開示にかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を被験体に投与する工程を含む。
【００１６】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、親和性成熟結合分子を含む。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合分子は、ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する親分子に由来する。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合分子は、親和性成熟のラウンド後に、ＤＬＬ３に特異的に結合する親分子に由来する。いくつかの実施形態では、親和性成熟のラウンドは、ＤＬＬ３タンパク質に対するファージディスプレイライブラリーをパニングすることを含む。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、親分子の１つ以上の残基を変異させることにより生成される。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、親分子に由来する１つ以上の分子を発現させる。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合分子は、親分子に由来する１つ以上の分子から選択される。いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約２倍、約５０倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約３倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９から選択された配列に対する１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列に少なくとも約８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。
【００１９】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列を含むか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８に由来する。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は以下の配列：ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＮＸ６Ｘ７Ｘ８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は以下の配列：ＧＪ１ＳＪ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６Ｊ７Ｊ８Ｊ９Ｊ１０ＳＪ１１ＫＪ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９５）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は以下の配列：Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９Ｚ１０Ｚ１１を含む。いくつかの実施形態では、
Ｘ１はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ２はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｘ４はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ５はＦ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｘ６はＡまたはＧであり、
Ｘ７はＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、および、
Ｘ８はＡまたはＧである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、
Ｊ１はＩまたはＶであり、
Ｊ２はＡ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｊ３はＤまたはＮであり、
Ｊ４はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｊ５はＳまたはＴであり、
Ｊ６はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ７はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ８はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ９はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり、
Ｊ１１はＡまたはＶであり、および、
Ｊ１２はＧまたはＶである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、
Ｚ１はＦまたはＹであり、
Ｚ２はＧ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＴであり、
Ｚ３はＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｚ４はＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ５はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、
Ｚ６はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、またはＴであり、
Ｚ７はＡ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであり、
Ｚ９はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ１０はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、および、
Ｚ１１はＡ、Ｆ、Ｓ、またはＹである。
【００２３】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含むか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は以下の配列：Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８Ａを含み、ＣＤＲ２は以下の配列：ＧＪ１ＳＪ２Ｊ３ＧＪ４Ｊ５Ｊ６ＹＪ７Ｊ８ＳＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９４）を含み、および、ＣＤＲ３は以下の配列：Ｚ１Ｚ２Ｚ３Ｚ４Ｚ５Ｚ６Ｚ７Ｚ８Ｚ９を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、
Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ２はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｘ３はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ４はＫ、Ｓ、またはＶであり、
Ｘ５はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ６はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、
Ｘ７はＬまたはＭであり、および、
Ｘ８はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＶである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、
Ｊ１はＩまたはＶであり、
Ｊ２はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ３はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり、
Ｊ４はＨ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｊ５はＡ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、またはＶであり、
Ｊ６はＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ７はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｊ８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、またはＶである；
【００２６】
いくつかの実施形態では、
Ｚ１はＬまたはＹであり、
Ｚ２はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ３はＱまたはＷであり、
Ｚ４はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＶであり、
Ｚ５はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、
Ｚ６はＡ、Ｐ、Ｒ、またはＳであり、
Ｚ７はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹであり、
Ｚ８はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＴであり、および、
Ｚ９はＦ、Ｈ、またはＹである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＤＬＬ３に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む。いくつかの実施形態において、第３のドメイン（Ｃ）は単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）はバルク血清タンパク質と結合する。いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、バルク血清タンパク質に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む。いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、バルク血清タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡ単量体、ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、ＩｇＥ、五量体ＩｇＭ、またはＩｇκ遊離軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、バルク血清タンパク質はアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７７４に少なくとも約７５％同一である配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、第１のドメイン（Ａ）は、ＣＤ３に特異的に結合する、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメイン（Ａ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０７からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態において、第３のドメイン（Ｃ）は以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ドメインＣとＢはリンカーＬ１によって接続され、ドメインＢとＡはリンカーＬ２によって接続される。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）から選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１７）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１８）である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約０．１ｎＭ〜約５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）でＤＬＬ３に結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ヒトＤＬＬ３、カニクイザルＤＬＬ３、またはヒトとカニクイザルの両方のＤＬＬ３に結合する。いくつかの実施形態において、タンパク質は約８０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、タンパク質は約５０〜約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は約６０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、同じＤＬＬ３へのＩｇＧと比較して、組織への浸透性を増加させた。いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。
【００２９】
１つの実施形態は、（ｉ）上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、または本開示にかかるＤＬＬ３結合タンパク質、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態は、上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を調製するための方法を提供し、上記方法は：ｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片を提供する工程と、ｉｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片に、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーを曝露する工程と、ｉｉｉ）前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するＤＬＬ３結合タンパク質をライブラリーから選択する工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で識別されたＤＬＬ３結合タンパク質を使用して、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を調製する工程とを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーは、前記ＤＬＬ３タンパク質を用いて組換えライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロでＤＬＬ３タンパク質に曝露される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはバクテリオファージの表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーは酵母細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーは細菌細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはＲＮＡタンパク質融合として発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーである。いくつかの実施形態では、組替え抗体ライブラリーは単一ドメインライブラリーである。
【００３０】
１つの実施形態は、上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の産生のプロセスを提供し、前記プロセスは、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の発現を可能にする条件で上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む
【００３１】
１つの実施形態は、以下の式を含むＤＬＬ３結合タンパク質を提供し、
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ｒ２はＣＤＲ２であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３はＣＤＲ３であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列に少なくとも約７５％同一である配列を含む。１つの実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列を含む親のＤＬＬ３結合タンパク質に由来するＤＬＬ３結合タンパク質を提供する。１つの実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含む親のＤＬＬ３結合タンパク質に由来するか、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質を提供する。
【００３２】
１つの実施形態は、本開示にかかるＤＬＬ３結合タンパク質を調製するための方法を提供し上記方法は、ｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片を提供する工程と、ｉｉ）ＤＬＬ３タンパク質またはその断片に、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーを曝露する工程と、ｉｉｉ）前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するＤＬＬ３結合タンパク質をライブラリーから選択する工程とを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質の組換えライブラリーは、前記ＤＬＬ３タンパク質を用いて組換えライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロでＤＬＬ３タンパク質に曝露される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはバクテリオファージの表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーは酵母細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーは細菌細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはＲＮＡタンパク質融合として発現される。いくつかの実施形態では、組替えライブラリーはｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーである。いくつかの実施形態では、組替え抗体ライブラリーは単一ドメインライブラリーである。
【００３３】
１つの実施形態は、本開示にかかるＤＬＬ３結合タンパク質の産生のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、ＤＬＬ３結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本開示に係るＤＬＬ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されたかトランスフェクトされた宿主を培養する工程と、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製する工程とを含む。
【００３４】
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法を提供し、上記方法は、上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、本開示にかかるＤＬＬ３結合タンパク質、または本明細書で提供されるような医薬組成物を、被験体へ投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、本開示にかかるＤＬＬ３結合タンパク質、または本明細書で提供されるような医薬組成物と組み合わせて、薬剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は肺癌、胃癌、卵巣癌、またはトリプルネガティブ乳癌を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。
【００３５】
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法を提供し、上記方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列を含むＤＬＬ３結合ドメインを含むＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を導く。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は固形腫瘍疾患である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は肺癌、胃癌、卵巣癌、またはトリプルネガティブ乳癌を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍疾患は転移性である。
【００３６】
１つの実施形態は、増殖性疾患または腫瘍性疾患の処置または改善のための方法を提供し、上記方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８または７５で記載される配列を含むＤＬＬ３結合ドメイン、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８または７５で記載される配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＤＬＬ３結合タンパク質は、最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量である。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は少なくとも週に１回投与される。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は週に２回投与される。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は２週間に１回投与される。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は３週間に１回投与される。
【００３７】
１つの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９０またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９１で記載されるアミノ酸配列を含むＤＬＬ３結合タンパク質が提供される。
【００３８】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、あるいは、リンカーＬ１およびＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、連結される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する親分子に由来する親和性成熟結合分子である。いくつかの実施形態では、親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約２倍、約５０倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−５２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列を含み、ここで、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列を含み、ならびに、ここで、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６からなる群から選択された配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ならびに、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７−３６７からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ならびに、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６８−４４２からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメイン（Ａ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０７および１８９７−１８９８からなる群から選択された配列を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）から選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で、または、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２は独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９０またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９１の配列を含む。
【００４４】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含み、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５に由来する。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８の配列またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５の配列を含む。
【００４５】
１つの実施形態は、以下の式を含むＤＬＬ３結合タンパク質を提供し、
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
ここで、ｒ１は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ｒ２はＣＤＲ２であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ならびに、ｒ３はＣＤＲ３であり、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換と同一であるか、または上記アミノ酸残基置換を含み、ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列を含む。ここで、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列を含み、ならびに、ここで、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列を含む。
【００４６】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメイン（Ｃ）はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００４７】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を提供し、前記ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する単鎖可変フラグメントである第１のドメイン（Ａ）と、
（ｂ）ヒト血清アルブミンタンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第２のドメイン（Ｂ）と、
（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体である第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５１、８６７、８７１、８７２、８７３、８７４、および１８８７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２９３、１３０９、１３１３、１３１４、１３１５、１３１６、および１８８８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７３５、１７５１、１７５５、１７５６、１７５７、１７５８、および１８８９からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０８、４２５、４３２、４３０、４３１、および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０８、４２５、４３２、４３０、４３１、および１８８６からなる群から選択された配列を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、あるいは、リンカーＬ１およびＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−Ｌ１−（Ｃ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ａ）−Ｌ２−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で、連結される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で、または、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ｃ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。いくつかの実施形態では、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、または、リンカーＬ１とＬ２によって、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で連結される。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する親分子に由来する親和性成熟結合分子である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、親和性成熟結合ＤＬＬ３分子は、ＤＬＬ３タンパク質に対する親分子の結合親和性よりも約２倍、約５０倍大きな、ＤＬＬ３タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、親分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）からなる群から選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。いくつかの実施形態では、リンカーＬ１とＬ２は独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）の配列を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、第２のドメイン（Ｂ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメイン（Ａ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０２および１８９７−１８９８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９０またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９１の配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のドメイン（Ｃ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９３の配列を含むヒトＤＬＬ３タンパク質に結合する。
【００５３】
１つの実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＤＤＬ３結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３２のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。
【００５４】
１つの実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５１、８６７、８７１、８７２、８７３、８７４、および１８８７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２９３、１３０９、１３１３、１３１４、１３１５、１３１６、および１８８８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７３５、１７５１、１７５５、１７５６、１７５７、１７５８、および１８８９からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＤＤＬ３結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０８、４２５、４３２、４３０、４３１、および１８８６からなる群から選択された配列に少なくとも８０％同一である配列を含む。
【００５５】
１つの実施形態は、有効な量の上記の実施形態のいずれか１つにかかるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を投与する工程を含む、疾患を処置または改善する方法を提供する。
【００５６】
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての公報、特許、および特許出願は、個々の公報、特許、または特許出願が、それぞれ、明確にかつ個々に引用によって組み込まれると示されるのと同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴と利点をより良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と添付図面とを参照されたい。
【図１】本開示の例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の様々なドメインを例証する。
【図２】本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、ＤＨ１８、ＤＨ１１、ＤＨ６７、およびＤＨ５６を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴ細胞依存性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイの結果を例証する。
【図３】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、ＤＨ２、ＤＨ４３、ＤＨ１０、およびＤＨ６を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図４】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、ＤＨ８２、ＤＨ２３、ＤＨ８９、およびＤＨ１７を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図５】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、ＤＨ８３、ＤＨ１２、ＤＨ６１、およびＤＨ２９を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図６】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、ＤＨ５８とＤＨ５０を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、および対照三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図７】本開示の例示的なＤＬＬ３標的ドメイン、１Ａ０１１、２Ｅ０５、１Ｈ０１２、２Ｅ０２、および１Ｃ０３を含有している例示的な親和性成熟ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図８】本開示の例示的なＤＬＬ３標的ドメイン、２Ｅ０１０、２Ｅ０１、２Ｈ０２、２Ａ０４、および２Ｆ１１を含有している例示的な親和性成熟ＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図９】本開示の例示的なＤＬＬ３標的ドメイン、２Ｅ０１１、３Ｃ０４、４Ｈ０４、４Ｈ０１１、および４Ｄ０９を含有している例示的な親和性成熟ＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１０】本開示の例示的なＤＬＬ３標的ドメイン、４Ｂ０７、４Ｅ０２、４Ｃ０６、３Ｈ０１１、および３Ｄ０７を含有している例示的な親和性成熟ＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１１】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン３Ｈ０６と４Ｂ０１１、および親ＤＬＬバインダードメインＤＨ４３、ＤＨ６を含有している例示的な親和性成熟ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ならびに対照三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１２】本開示の例示的なＤＬＬ３標的化ドメイン、２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｙ、２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｑ、４Ｄ０９−Ｍ３４Ｌ、および４Ｈ１１−Ｍ３４Ｌを含有している例示的な精製された親和性成熟ＣＨＯ発現ＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１３】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、１Ａ０１１（図１３で１Ａ１１として標識される）、１Ｈ０１２（図１３で１Ｈ１２として標識される）、２Ｅ０２、および２Ｅ０５を含有している例示的な精製された親和性成熟ＣＨＯ発現ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１４】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、２Ｈ０２、３Ｃ０４、４Ｄ０９、および４Ｈ１１−を含有している例示的な精製された親和性成熟ＣＨＯ発現ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１５】例示的なＤＬＬ３結合ドメインＤＨ４３とＤＨ６を含有している例示的な精製ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、およびＧＦＰを標的とする対照三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１６】親和性成熟の第２ラウンドからの本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメインを含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１７】１つのレーン当たり２．４マイクログラムの非還元タンパク質が充填され、かつ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色された、１０−２０％ＴＲＩＳグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像を例証する。レーン数はゲル画像の一番上の数によって示され、分子量基準の移動は、ゲル画像の右側の数によって示されている（キロダルトン）。ゲル充填：レーン１は空、レーン２は分子量基準、レーン３は空、レーン４はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ｇ２を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン５はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ｇ１０を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン６はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ｈ５を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン７はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ｘ５を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン８はＤＬＬ３結合ドメイン５２Ｂ１を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン９はＤＬＬ３結合ドメイン５２Ｃ４を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン１０はＤＬＬ３結合ドメイン５２Ｄ４を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン１１はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ａ２を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン１２はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ａ５を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン１３はＤＬＬ３結合ドメイン５１Ｆ３を含有する抗ＤＬＬ３三重特異性、レーン１４は空、および、レーン１５は空である。
【図１８】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、５１Ｇ２、５１Ｇ１０、５１Ｈ５、５１Ｘ５、５２Ｂ１、５２Ｃ４、５２Ｄ４、５１Ａ２、および、親のＤＬＬ３バインダードメインＤＨ６を含有している例示的な精製された親和性成熟ＣＨＯ発現ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ならびに対照三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図１９】本開示の例示的なＤＬＬ３結合ドメイン、５１Ｇ２、５１Ｇ１０、５１Ｈ５、５１Ｘ５、５２Ｂ１、５２Ｃ４、５２Ｄ４、５１Ａ２、および、親のＤＬＬ３バインダードメインＤＨ６を含有している、本開示の例示的な精製された親和性成熟ＣＨＯ発現ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ならびにＧＦＰを標的とする対照結合三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−１５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図２０】本開示の例示的なＤＬＬ３結合タンパク質（ＤＬＬ３バインダー）、ＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖ）、およびアルブミン結合（抗ＡＬＢ）ドメインを、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３の配向（ＴＡＣ配向）で含有しているＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の概略図を提供する。
【図２１】本開示の例示的なＤＬＬ３結合タンパク質（ＤＬＬ３バインダー）、ＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３イプシロンｓｃＦｖ）、およびアルブミン結合（抗ＡＬＢ）ドメインを、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３の配向（ＣＡＴ配向）で含有しているＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の概略図を提供する。
【図２２】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成、または抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用する、ＮＣＩ−Ｈ２１７１細胞に対するＴ細胞依存性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイの結果を例証する。
【図２３】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または不在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成、または抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ−７９細胞に対するＴ細胞依存性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイの結果を例証する。
【図２４】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成、または抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用する、ＳＨＰ７７細胞に対するＴ細胞依存性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイの結果を例証する。
【図２５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成、または抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用する、ＷＭ２６６４細胞に対するＴ細胞依存性の細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイの結果を例証する。
【図２６】二次抗体のみ、または、任意の抗体あるいは三重特異性分子を含まない細胞を有する対照と比較した、４つの異なるドナーからのヒトＴ細胞に対する、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質の結合を描く。
【図２７】二次抗体のみ、または、任意の抗体あるいは三重特異性分子を含まない細胞を有する対照と比較した、４つの異なるドナーからのヒトＴ細胞に対する、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の結合を描く。
【図２８】ＧＦＰ結合ドメインを有する三重特異性分子と比較した、ヒトＤＬＬ３発現細胞株、ＮＣＩ−Ｈ８２（左上）、ＳＨＰ７７（右上）、ＤＭＳ５３（左下）、またはＮＣＩ−Ｈ２１７１（右下）に対する、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の結合を描く。
【図２９】ＧＦＰ結合ドメインを有する三重特異性分子と比較した、ヒトＤＬＬ３発現細胞株、ＮＣＩ−Ｈ８２（左上）、ＳＨＰ７７（右上）、ＤＭＳ５３（左下）、またはＮＣＩ−Ｈ２１７１（右下）に対する、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の結合を描く。
【図３０】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３１】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＳＨＰ７７細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３２】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３３】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＮＣＩ−Ｈ２１７１細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３４】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３５】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＳＨＰ７７細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３６】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＤＭＳ５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３７】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、ＮＣＩ−Ｈ２１７１細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【図３８】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ６９発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図３９】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４０】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡの存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＤＭＳ５３細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ６９発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＤＭＳ５３細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４２】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ６９発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４３】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４４】４つの異なるドナーからのＴ細胞を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＤＭＳ５３細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ６９発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、ＤＭＳ５３細胞で共培養されたＴ細胞でのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー測定の結果を例証する。
【図４６】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養物からの条件培地におけるＩＦＮγ測定の結果を例証する。
【図４７】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養物からの条件培地におけるＩＦＮγ測定の結果を例証する。
【図４８】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養からの条件培地におけるＩＬ−２測定の結果を例証する。
【図４９】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養からの条件培地におけるＩＬ−２測定の結果を例証する。
【図５０】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養からの条件培地におけるＴＮＦα測定の結果を例証する。
【図５１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養からの条件培地におけるＴＮＦα測定の結果を例証する。
【図５２】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養からの条件培地におけるＩＦＮγ測定の結果を例証する。
【図５３】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養からの条件培地におけるＩＦＮγ測定の結果を例証する。
【図５４】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養からの条件培地におけるＩＬ−２測定の結果を例証する。
【図５５】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養からの条件培地におけるＩＬ−２測定の結果を例証する。
【図５６】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２細胞の共培養からの条件培地におけるＴＮＦα測定の結果を例証する。
【図５７】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において試験された、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定による、培養されたＴ細胞とＳＨＰ７７細胞の共培養からの条件培地におけるＴＮＦα測定の結果を例証する。
【図５８】抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成、または、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が、２０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇの投与量でヒトＴ細胞とＮＣＩ−Ｈ８２小細胞肺癌細胞の混合物を注入されたマウス中の腫瘍成長を阻害することができたことを描いている。
【図５９】抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が、１０μｇ／ｋｇと１００μｇ／ｋｇの投与量でヒトＴ細胞を注入されたマウス中のＮＣＩ−Ｈ８２異種移植片腫瘍成長を排除することができたことを描いている。
【図６０】抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が、１０μｇ／ｋｇと１００μｇ／ｋｇの投与量でヒトＴ細胞とＳＨＰ７７小細胞肺癌細胞の混合物を注入されたマウス中の腫瘍成長を阻害することができたことを描いている。
【図６１】抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成（ＩＤ  Ｎｏ．１および２）、または、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成（ＩＤ  Ｎｏ．３および４）において本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の薬物動態プロファイルを描いている。０．３ｍｇ／ｋｇでの、カニクイザルへの注射後の様々な時点のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の血清レベルがプロットで示されている。
【図６２】１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでの、カニクイザルへの注射後の様々な時点の、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における、本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の薬物動態プロファイルを描いている。
【図６３】１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの本開示の例示的なＤＬＬ３結合ＴｒｉＴＡＣ分子またはビヒクル対照の最初の投薬後の一時的なサイトカイン増加を描いている。上のパネルはＩＦＮγの一時的な増加を示し、２番目のパネルはＩＬ−６の一時的な増加を示し、および第３のパネルはＩＬ−１０の一時的な増加を示す。
【図６４】解凍したばかりのタンパク質を使用した、または、８．４％のカニクイザル血清の存在下において測定された、１０ｍｇ／ｋｇのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を投薬の１６８時間後に採取されたカニクイザルの血清サンプル中に存在するタンパク質を使用した、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成における、本開示のＤＬＬ３結合ドメイン、５２Ｄ０４を含有している例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を用いる、ＤＭＳ５３細胞に対するＴＤＣＣアッセイの結果を例証する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
いくつかの実施形態では、デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）に特異的に結合するタンパク質、上記タンパク質を含有する多特異性（例えば、三重特異性）のタンパク質、その医薬組成物、同様に、上記のタンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書に記載される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防と処置における、開示されたＤＬＬ３結合タンパク質、または上記を含むＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の少なくとも１つを使用する方法も提供される。ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３と同様にＤＬＬ３に特異的に結合することができ、および、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）に特異的に結合することができるドメインなどの半減期延長ドメインを有する。図１は三重特異性ＤＬＬ３結合タンパク質の１つの非限定的な例を描く。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、三重特異性抗体などの抗体を含む。
【００５９】
特定の定義
「抗体」とは典型的には、共有的なジスルフィド結合と非共有的な相互作用によって一緒に保持される、２つの重（Ｈ）および２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字型の四量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）を含み、定常ドメインは、アミノ酸配列と遺伝子座位に基づいてカッパまたはラムダとして容易に分類され得る。各重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）と定常領域を含み、これは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合には、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭとＩｇＥは第４のドメイン、ＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの分類において、ＣＨ１とＣＨ２のドメインは、可変長のプロリンおよびシステイン豊富なセグメントである（通常ＩｇＧ中に約１０〜約６０のアミノ酸）柔軟なヒンジ領域によって離されている。軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに結合され、重鎖はさらに約１０のさらなるアミノ酸の「Ｄ」領域を有する。抗体の各クラスは、対になったシステイン残基によって形成された鎖間および鎖内のジスルフィド結合を含む。免疫グロブリン分子には２つのタイプの天然のジスルフィド架橋または結合：鎖間および鎖内のジスルフィド結合がある。鎖間のジスルフィド結合の位置と数は、免疫グロブリンのクラスと種によって変わる。鎖間のジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置し、溶媒に利用可能であり、通常比較的容易に還元される。ヒトＩｇＧ１アイソタイプでは、４つの鎖間のジスルフィド結合があり、各重鎖から軽鎖まで１つ、および、重鎖間に２つある。鎖間のジスルフィド結合は鎖の会合には必要ではない。周知のように、重鎖のシステイン豊富なＩｇＧ１ヒンジ領域は一般に、３つの部分：上部ヒンジ、コアヒンジ、および下部ヒンジからなるように保持されている。当業者は、ＩｇＧ１ヒンジ領域が、鎖間のジスルフィド結合（２つの重／重、２つの重／軽）を含む重鎖内にシステインを含有しており、これがＦａｂの移動を促進する構造的な柔軟性をもたらすことを理解するであろう。ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は、カッパまたはラムダの軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上部ヒンジ領域内のＣ２２０との間で形成される。重鎖間の鎖間ジスルフィド結合は、位置Ｃ２２６とＣ２２９にある（すべて、下のＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．に従ってＥＵの指標に基づき番号を付された）。
【００６０】
本明細書で使用されるように、「抗体」との用語は、その突然変異タンパク質および変異体を含む、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体、組換え生成された抗体、イントラボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、免疫特異性抗体フラグメント、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖとＳｃＦｖＦｃ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨとＣＨ１のドメインからなるＦｄ断片、線形抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、あるいはＶＨＨドメイン）と、ならびに、Ｆｃ融合と他の修飾を含むその誘導体、および、それがＤＬＬ３タンパク質との優先的な会合または結合のための結合部位を有するドメインを含む限り、任意の他の免疫反応性の分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他の方法で指定されない限り、この用語はさらに、すべてのクラスの抗体（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）とすべてのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）を含む。様々なクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは典型的には、対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ、およびμによってそれぞれ表示される。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てられ得る。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、ＶＨあるいはＶＨＨドメインなどの重鎖のみの抗体を含む。場合によっては、ＤＬＬ３結合タンパク質は、操作されたヒトＶＨドメインである重鎖のみの抗体を含む。いくつかの例において、操作されたヒトＶＨドメインは、ファージディスプレイライブラリーのパニングに生成される。いくつかの実施形態において、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、ＶＨＨを含む。「ＶＨＨ」との用語は、本明細書で使用されるように、軽鎖を欠いた単鎖抗体結合ドメインを指す。場合によっては、ＶＨＨは、軽鎖を生来欠いているラクダ科あるいは軟骨魚類で見られるタイプの抗体に由来し、あるいは、それに応じて構築することができる合成の非免疫ＶＨＨに派生する。各重鎖は、Ｖ、Ｄ、およびＪのエクソンによってコードされた可変領域を含む。ＶＨＨは、場合によっては、天然のＶＨＨ、例えば、ラクダ科由来のＶＨＨ、あるいは、重鎖可変ドメインを含む組換え型タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、グアナコ、および軟骨魚類（限定されないが、サメなど）からなる群から選択された種に由来する。別の実施形態では、ＶＨＨは、アルパカ（限定されないが、ワカヤ（Ｈｕａｃａｙａ  Ａｌｐａｃａ）とスーリ（Ｓｕｒｉ  ａｌｐａｃａ）など）に由来する。
【００６２】
本明細書で使用されるように、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合と特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。生来の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβ−シート構成を採用し、３つのＣＤＲによって結合され、ループ接合を形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。場合によっては、遺伝子操作によって得られる（可変の単鎖断片に対する）ＳｃＦｖ断片は、ペプチドリンカーによって離された抗体のＶＨとＶＬの領域と、単一のポリペプチド鎖において会合する。
【００６３】
本開示のいくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインなどのＤＬＬ３結合ドメイン、ＶＨまたはＶＨＨのドメインなどの重鎖のみの抗体などの単一ドメイン抗体を含み、および、３つのＣＤＲを含む。そのような重鎖のみの抗体は、いくつかの実施形態では、最適な結合親和性のために、ＶＬ（可変の軽鎖）領域との二量体化に依存しない単量体としてＤＬＬ３を結合する。本開示のいくつかの実施形態において、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。本開示のいくつかの実施形態において、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のアルブミン結合ドメインは、ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体などの重鎖のみの抗体を含む。
【００６４】
各ドメイン、フレームワーク領域、およびＣＤＲに対するアミノ酸の割り当ては、いくつかの実施形態では、特段の定めのない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （５ｔｈ  Ｅｄ．）、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  ＰＭＩＤ：  ３６８１９８１；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  ＰＭＩＤ：  ２６８７６９８；  ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ＰＭＩＤ：  ８８７６６５０；  あるいは、Ｄｕｂｅｌ，  Ｅｄ．  （２００７）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ  ｏｒ  ＡｂＭ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供される番号付与方法の１つに従う。本開示のＣＤＲはＫａｂａｔの番号付与の慣習に必ず対応するということを意図するものではない。本開示のいくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＶＨまたはＶＨＨのドメインなどの重鎖のみの抗体などの単一ドメイン抗体を含み、および、３つのＣＤＲを含む。そのような重鎖のみの抗体は、いくつかの実施形態では、最適な結合親和性のために、ＶＬ（可変の軽鎖）領域との二量体化に依存しない単量体としてＤＬＬ３を結合する。
【００６５】
「Ｋａｂａｔでのような可変ドメイン残基の番号付与」または「Ｋａｂａｔでのようなアミノ酸位置の番号付与」、およびその変更形態は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付与システムを参照する。この番号付与システムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの省略、またはそれらへの挿入に対応する、より少数のまたは付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ式番号付与は、「標準の」Ｋａｂａｔ式番号付与を行った配列との、抗体の配列の相同領域におけるアライメントによって、所定の抗体について決定され得る。
【００６６】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基（または領域）との用語は、本明細書で定義されるようなＣＤＲまたは超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。
【００６７】
本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」との用語は、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントして、必要に応じてギャップを導入した後に、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＥＭＢＯＳＳ  ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ  ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長での最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１−２５（Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ  ｅｄ．１９８０）に記載されるように、その通常の意味で使用される。簡潔にいえば、この用語は、薬物消失の時間経過の定量的尺度を包含することを意味している。薬物濃度が通常、消失プロセスの飽和に必要な濃度に達しないため、ほとんどの薬剤の消失は指数関数的なものである（すなわち、一次速度論に従う）。急激なプロセスの速度は、時間の単位当たりの分数変化率を表すその速度定数ｋによって、または、プロセスの５０％の完了に必要な時間であるその半減期ｔ１／２によって表され得る。これらの２つの定数の単位は、それぞれ時間−１および時間である。一次反応速度定数および反応の半減期は単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、適宜交換され得る。一次消失速度論は、薬物の一定の割合が時間単位ごとに失われることを規定するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初期分布段階後（すなわち、薬物吸収と分布が完了した後）の全ての時間で直線状である。薬物消失の半減期は、そのようなグラフから正確に判定され得る。
【００６９】
本明細書で使用されるように、「結合親和性」との用語は、結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して表現される。２つ以上のタンパク質が、その結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に相当する。いくつかの実施形態では、「Ｋｄ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を使用して放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）または表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。ある実施形態では、「ｏｎ−ｒａｔｅ」あるいは「会合速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎまたはａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」あるいは「ｋｏｎ」、および「オフ率」あるいは「解離速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」、または「ｋｏｆｆ」もＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴技術で決定される。さらなる実施形態では、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、および「ｋｏｆｆ」は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムズ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓを使用して、結合親和性を測定する例示的な方法では、リガンド、例えば、ビオチン化されたヒトまたはカニクイザルのＤＬＬ３は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ストレプトアビジンキャピラリーセンサー先端表面に固定され、その後、約２０−５０μｇ／ｍｌのヒトまたはカニクイザルのＤＬＬ３タンパク質を使用して、ストレプトアビジンの先端が、メーカーの説明書に従って活性化される。ＰＢＳ／カゼインの溶液も遮断薬として導入される。会合反応速度測定に関して、ＤＬＬ３結合タンパク質変異体は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、または約２ｎｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で導入される。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３結合単一ドメインタンパク質は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用される。完全解離は、陰性対照である、結合タンパク質を含まないアッセイ緩衝液の場合に観察される。その後、結合反応の速度論的パラメータは、適切なツール、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを使用して決定される。
【００７０】
１つの実施形態は、ＤＬＬ３結合タンパク質（本明細書では、本開示のＤＬＬ３三重特異性抗体のＤＬＬ３結合ドメインなどの、ＤＬＬ３結合ドメインとも呼ばれる）を提供し、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択された配列を含むＣＤＲ１配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択された配列を含むＣＤＲ２配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択された配列を含むＣＤＲ３配列とを含む単一ドメイン抗体を含んでいる。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質はかなり小さく、実施形態によっては、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤａ以下、または１０ｋＤａ以下であることが企図される。特定の例において、ＥＧＦＲ結合は、ペプチドまたは小分子実体である場合に、５ｋＤａ以下である。
【００７１】
１つの態様では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質（本明細書ではＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３三重特異性タンパク質、またはＤＬＬ３  ＴｒｉＴＡＣ（商標）とも呼ばれる）は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）と、（ｂ）半減期延長ドメインである第２のドメイン（Ｂ）と、（ｃ）ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含む。ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質中の３つのドメインは任意の順序で配置される。したがって、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のドメイン順序は以下のとおりであることが企図される：
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ドメイン順序がＨ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、または、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨとなるように、中央のドメインとしてＨＳＡ（本明細書ではＡＬＢとも呼ばれる）結合ドメインを有する。ＨＳＡ結合ドメインが中央のドメインであるそのような実施形態において、ＣＤ３とＤＬＬ３の結合ドメインは、それぞれの標的に結合するためのさらなる柔軟性を与えられることが企図される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第３のドメインを含み、ここで、第３のドメインは、場合によってはＤＬＬ３結合単一ドメイン抗体であり、これは、参照のＤＬＬ３結合親分子の親和性と同等またはそれ以上の親和性でＤＬＬ３に結合する。第３のドメインは、いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子（例えば、親和性成熟ＤＬＬ３結合単一ドメイン抗体）を含み、および、ＤＬＬ３結合親分子に対して１つ以上のアミノ酸突然変異（例えば、安定化突然変異、不安定化突然変異）を含んでいるＤＬＬ３結合親分子に由来する。いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、参照のＤＬＬ３結合親分子と比較して、選択された不安定化剤に対して優れた安定性を持っている。いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、ヒトＤＬＬ３タンパク質などのＤＬＬ３タンパク質に対してファージディスプレイライブラリーで発現された１つ以上のＤＬＬ３結合親分子に由来する１つ以上の事前候補ＤＬＬ３結合分子のパニングを含むプロセスで同定される。事前候補ＤＬＬ３結合分子は、いくつかの実施形態では、親分子に対する、可変領域、ＣＤＲ、またはフレームワーク残基におけるアミノ酸置換を含む。
【００７５】
本明細書で使用されるように、「ファージディスプレイ」とは、ファージ、繊維状ファージ、粒子の表面にあるコートタンパク質の少なくとも一部に対する融合タンパク質として、変異型ポリペプチドが表示される技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大規模なライブラリーが、標的分子に高い親和性で結合する配列について迅速かつ効率的に選択可能であるという事実にある。ペプチドやタンパク質のライブラリーをファージに表示することは、数百万ものポリペプチドから特定の結合特性を有するものをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに融合することにより、小さなランダムペプチドおよび小さなタンパク質を表示するために使用されている。Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ，  ３：３５５−３６２  （１９９２）およびその中で引用された文献。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドライブラリーを遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合させ、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現させることにより、ファージ粒子が融合タンパク質の１つのコピーを表示するか、またはいかなる融合タンパク質も表示しない。多価ファージに比べてアビディティ効果が小さく、選択は内因性のリガンドとの親和性に基づいており、ファージミドベクターが使用され、これによりＤＮＡ操作が容易になる。Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ３：２０５−０２１６  （１９９１）
【００７６】
いくつかの実施形態では、パニングは、事前候補のＤＬＬ３結合分子から、オンレートが増加または減少したＤＬＬ３結合分子を特定するために、変動する結合時間と濃度を使用することを含む。いくつかの実施形態では、パニングは、事前候補のＤＬＬ３結合分子から、オンレートが増加または減少したＤＬＬ３結合分子を特定するために、変動する洗浄時間を使用することを含む。いくつかの実施形態では、パニングは、変動する結合時間と変動する洗浄時間を使用することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の安定化変異は、例えば、そのような突然変異体から第２期のコンビナトリアルライブラリーを作製するためにシャッフルすること、パニングの第２ラウンド、その後、結合選択を実施することによって、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子の安定性を高めるために、組み合わされる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、ＤＬＬ３結合親分子と同等以上のＤＬＬ３タンパク質（ヒトＤＬＬ３タンパク質など）への親和性を有するが、それは、ＤＬＬ３結合親分子が特異的であるか、または特異的であるように設計されたＤＬＬ３エピトープ以外の、リガンド、タンパク質、抗原などの選択された物質との交差反応性を低減させたか、実施形態によっては、交差反応性を増大させた。後者に関して、いくつかの実施形態では、親和性成熟ＤＬＬ３結合分子を、ヒトＤＬＬ３および動物モデルの対応する標的であるマウスＤＬＬ３またはカニクイザルＤＬＬ３の両方と反応させると、動物モデルでの試験はより成功する。いくつかの実施形態では、親のＤＬＬ３結合分子は、約１０ｎＭ以下の親和性でヒトＤＬＬ３に結合し、約１５ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＤＬＬ３に結合する。いくつかの実施形態では、１ラウンドのパニング後に同定された親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、約５ｎＭ以下の親和性でヒトＤＬＬ３に結合し、約７．５ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＤＬＬ３に結合する。いくつかの実施形態では、２ラウンドのパニング後に同定された親和性成熟ＤＬＬ３結合分子は、約２．５ｎＭ以下の親和性でヒトＤＬＬ３に結合し、約３．５ｎＭ以下の親和性でカニクイザルＤＬＬ３に結合する。  
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示の三特異性結合タンパク質のドメインＡ、ドメインＢ、およびドメインＣは独立して、疾患細胞上の標的などの標的、または疾患状態をサポートする他の細胞上の標的、例えば、腫瘍の成長を支持する間質細胞上の標的あるいは疾患を媒介とする免疫抑制を支持する免疫細胞上の標的などの標的に特異的に結合する抗原特異的結合ドメインポリペプチドである。いくつかの例では、抗原特異的結合ドメインは、抗体、単鎖抗体を含む重鎖のみの抗体、Ｆａｂｓ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ、または他のさまざまな抗体模倣体（アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アトリマー、ＣＴＬＡ４ベースの分子、アドネクチン、アンチカリン、クニッツドメインベースのタンパク質、アビマー、ノッティン、フィノマー、ダーピン、アフィボディ、アフィリン、モノボディ、およびアルマジロリピートタンパク質ベースのタンパク質など）を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６から選択された配列、その亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびその変異体を有するＤＬＬ結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合性のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６から選択された配列、その亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびその変異体に対して少なくとも７０％−９５％またはそれ以上の相同性を有するＤＬＬ３結合ポリペプチド（つまり、第３のドメイン（Ｃ））を含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合性のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列、その亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびその変異体に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の相同性を有するＤＬＬ３結合ポリペプチド（つまり、第３のドメイン（Ｃ））を含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合性のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６から選択された配列、その亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびその変異体に対して少なくとも７０％−９５％またはそれ以上の同一性を有するＤＬＬ３結合ポリペプチド（つまり、第３のドメイン（Ｃ））を含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合性のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６からなる群から選択された配列、その亜配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびその変異体に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するＤＬＬ３結合ポリペプチド（つまり、第３のドメイン（Ｃ））を含む。
【００８０】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞を補充することによりＤＬＬ３を発現する細胞を特異的に標的とすることができるように設計される。いくつかの実施形態では、これは、単独の抗原を対象とする完全長の抗体を使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を直接補充することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）と比較して、有効性を改善する。対照的に、これらの細胞上で特異的に発現されたＣＤ３分子を結合することにより、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、非常に特異的なやり方で細胞傷害性Ｔ細胞を、ＤＬＬ３を発現する細胞と架橋することができ、それによって、Ｔ細胞の細胞毒性の潜在能力を標的細胞へ向けることができる。本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する、表面発現されたＣＤ３タンパク質に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞に結合する。特定の細胞の表面上で発現されたＣＤ３とＤＬＬ３への複数のＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質の同時結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、特定のＤＬＬ３発現細胞のその後の溶解を媒介する。したがって、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、強力で、特異的で、かつ効率的な標的細胞死滅を表示するように企図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、病原性細胞（例えば、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞）を除去するために細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞の死滅を刺激する。そのような実施形態のいくつかでは、細胞は選択的に除去され、それによって、毒性の副作用の可能性が減少する。
【００８１】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質はさらに、従来のモノクローナル抗体と他のより小さな二重特異性の分子を上回る利点を与える。一般に、組換えタンパク質医薬品の有効性は、タンパク質自体の内因性の薬物動態学に極度に依存する。ここでの１つの利点は、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が、血清アルブミンタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンタンパク質、ＨＳＡ）に特異的に結合するドメインなどの半減期延長ドメインを有することにより、延長された薬物動態学的な消失半減期を有していたということである。この点について、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、実施形態によっては、約２、３、約５、約７、約１０、または約１４日の延長された血清消失半減期を有する。このことは、消失半減期が比較的非常に短いＢｉＴＥまたはＤＡＲＴの分子などの他の結合タンパク質にとは対照的である。例えば、ＢｉＴＥのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合分子は、消失半減期が短いため持続点滴（静脈内）による薬物送達を必要とする。ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のより長い内因性の半減期はこの問題を解決し、それによって、低用量の医薬製剤、定期的な投与の減少、および／または新規な医薬組成物などの治療可能性を増加させる。
【００８２】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質はさらに、組織への浸透と組織への分布を強化するための最適なサイズを有する。サイズが大きければ、標的組織中でのタンパク質の浸透あるいは分布が制限されるか、妨げられる。本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、組織への浸透と分布を増強する小さなサイズを有することによりこれを回避する。これに応じて、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、いくつかの実施形態では、約５０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、または、約５０ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のサイズは約６０ｋＤａよりも小さい。したがって、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のサイズは、約１５０ｋＤａであるＩｇＧ抗体よりも、および、約５５ｋＤａであるが半減期を延長されておらず、ゆえに腎臓ですぐに除去されるＢｉＴＥとＤＡＲＴ二重特異性抗体分子よりも、有利である。
【００８３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、増強された組織への浸透と分布に最適なサイズを有する。これらの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質はできるだけ小さくなるように構築され、その一方で、その標的に対する特異性を保持する。これに応じて、これらの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、約２０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、または約２５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、〜約４０ｋＤａ、〜約４５ｋＤａ、〜約５０ｋＤａ、〜約５５ｋＤａ、〜約６０ｋＤａ、〜約６５ｋＤａのサイズを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、約５０ｋＤａ、４９ｋＤａ、４８ｋＤａ、４７ｋＤａ、４６ｋＤａ、４５ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４２ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａ、約３９ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約３７ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２１ｋＤａ、または約２０ｋＤａのサイズを有する。小さなサイズに対する典型的な手法は、ドメインの各々について単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントを使用することによる。例えば、特定のＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質は、ＤＬＬ３のための抗ＣＤ３  ｓｄＡｂ、抗ＡＬＢ  ｓｄＡｂ、およびｓｄＡｂを有する。これは、典型的なＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質のサイズを６０ｋＤａ未満に減少させる。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のドメインはすべて単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質はかなり小さく、実施形態によっては、２５ｋＤａ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤａ以下、または１０ｋＤａ以下であることが企図される。特定の例において、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ペプチドまたは小分子の実体である場合に５ｋＤａ以下である。
【００８４】
他の実施形態では、本明細書に記載されたＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＡＬＢ、ＤＬＬ３、ＣＤ３、またはすべてのための小分子実体（ＳＭＥ）バインダーを含む。ＳＭＥバインダーは、平均して約５００〜２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼライゲーションまたは抱合などの既知の方法によって、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質に結合される。これらの例では、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質のドメインの１つは、ソルターゼ認識配列、ＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９６）である。ソルターゼ認識配列を有するＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質にＳＭＥバインダーを結合させるために、タンパク質はソルターゼとＳＭＥバインダーで培養され、それによってソルターゼはＳＭＥバインダーを認識配列に結合させる。さらに他の実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３に結合するドメインは、ＤＬＬ３に結合するためのノッチンペプチドを含む。ノッチンはシステインノット足場を備えたジスルフィド安定したペプチドであり、約３．５ｋＤａの平均サイズを有する。ノッチンは、ＤＬＬ３などの特定の腫瘍分子への結合について企図されてきた。さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３に結合する第３のドメインは、天然ＤＬＬ３リガンドを含む。
【００８５】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の別の特徴は、それらがドメインの柔軟な結合を有する単一のポリペプチド設計であるということである。これにより、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。なぜなら、こうしたタンパク質はベクターに容易に組み入れられる単一のｃＤＮＡ分子によってコード可能であるためである。さらに、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるため、鎖の対形成の問題がなく、二量化のための要件もない。本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、Ｆｃγ免疫グロブリンドメインを有する二重特異性のタンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低下している。
【００８６】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質では、ドメインは、実施形態によっては、内部リンカーＬ１とＬ２によって連結され、ここで、Ｌ１は、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の第１と第２のドメインに連結し、Ｌ２はＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の第２と第３のドメインに連結する。リンカーＬ１とＬ２は最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を有する。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は同じ長さとアミノ酸組成物を有する。他の実施形態では、Ｌ１とＬ２は異なる。特定の実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。特定の実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「長い」、つまり、１５、２０、あるいは２５のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態において、これらの内部リンカーは約３から約１５まで、例えば、８、９、あるいは１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１とＬ２のアミノ酸組成物に関して、ペプチドは、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質に対して柔軟性を与える特性によって選択され、結合ドメインに干渉せず、同様にプロテアーゼからの切断に抵抗しない。例えば、グリシンとセリンの残基は一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質においてドメインに連結するのに適切な内部リンカーＬ１の例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１５）、または（ＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１６）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。１つの実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１７）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１８）である。別の実施形態では、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０８）である。
【００８７】
いくつかのケースでは、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質内のドメインは、哺乳動物または細菌のトランスグルタミナーゼ酵素の使用を含む酵素部位特異的抱合方法を使用して抱合される。微生物由来のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、現代の研究やバイオテクノロジーにおいて汎用性の高いツールである。比較的純粋な酵素が大量に入手できること、使いやすいこと、カルシウムやグアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）による調節がないことなどから、ｍＴＧは食品産業やバイオテクノロジーの分野で使用される主要な架橋酵素となっている。現在、ｍＴＧは、タンパク質やペプチドを低分子、ポリマー、表面、ＤＮＡや他のタンパク質に結合させる多くの用途で使用されている。Ｐａｖｅｌ  Ｓｔｒｐ，  Ｖｅｒａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２５，  ５，  ８５５−８６２）を参照のこと。
【００８８】
いくつかの例では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が提供され、ここで、ドメインの１つは、定常領域にアクセプターグルタミンを含み、これは、リジンベースのリンカー（例えば、アルキルアミン、オキソアミンを含む、ＴＧａｓｅの基質である任意の一級アミン鎖）を介して別のドメインに結合可能であり、ここで、結合は、抗原結合部位の外側（例えば、可変領域の外側、定常領域内）の標的化部分に存在する１つ以上のアクセプターグルタミン残基上でのみ起こる。したがって、可変領域内のグルタミン、つまり、（少なくとも部分的に表面が露出したグルタミン上では、抱合は起こらない。三重特異性タンパク質は、いくつかの例では、ＴＧａｓｅの存在下でドメインの１つをリジンベースのリンカーと反応させることによって形成される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重結合タンパク質内の１つ以上のドメインが直接連結される場合、ハイブリッドベクターが作られ、直接連結されたドメインをコードするＤＮＡそれ自体が互いに直接ライゲートされる。いくつかの実施形態では、リンカーが使用される場合、ハイブリッドベクターが作られ、このとき、３つのドメインのうちの第１のドメインをコードするＤＮＡが、第１のリンカー部分の一端をコードするＤＮＡにライゲートされ、３つのドメインのうち第２のドメインをコードするＤＮＡが、第１のリンカー部分の他端にライゲートされ；さらに、３つのドメインのうち第２のドメインをコードするＤＮＡが第２のリンカー部分の一端に連結され、３つのドメインのうち第３のドメインをコードするＤＮＡが第２のリンカー部位の他端に連結され、ここで、第１のドメイン、第２のドメイン、および第３のドメインは異なり、第１のドメイン、第２のドメイン、および第３のドメインは、ドメインＡ、ドメインＢ、およびドメインＣから独立して選択される。そのようなライゲーションは、例えば、連続して、または３回方法のライゲーションとして、実施される。
【００９０】
ＣＤ３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、ＴＣＲによって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示される）の認識によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。完全なＴＣＲを含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、ＴＣＲのα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と一緒に結合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。
【００９１】
１つの態様において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。
【００９２】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＴＣＲに特異的に結合するドメインを含む。特定の例では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖を特異的に結合するドメインを含む。特定の例では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖を特異的に結合するドメインを含む。
【００９３】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、ＣＤ３に結合するあらゆるドメインであり得る。例によっては、ＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含めることが、ＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。
【００９５】
したがって、１つの態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはヒト抗体または抗体フラグメント、あるいはマウスの抗体または抗体フラグメントを含む。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／あるいは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、１つ以上、３つすべてのＬＣ  ＣＤＲと１つ以上、３つすべてのＨＣ  ＣＤＲを含む、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域にヒトあるいはヒト以外の軽鎖ＣＤＲを含む。ある例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域にヒトまたはヒト以外の重鎖ＣＤＲを含む。
【００９８】
特定の例において、重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、およびＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【００９９】
１つの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」あるいは「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、およびｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば、置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば、置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域。いくつかの例では、抗ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０７から選択された配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３−１８０７から選択された配列に少なくとも約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である配列を含む。いくつかの例において、抗ＣＤ３結合ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３）と、３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤ３結合ドメインの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣ  ＣＤＲ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８２０−１８３１から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８２０−１８３１から選択された配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含み、あるいは少なくとも約８０％から約９９％である。ＣＤ３結合ドメインの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣ  ＣＤＲ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８３２−１８４１から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８３２−１８４１から選択された配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含む。ＣＤ３結合ドメインの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣ  ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８４２−１８５３から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８４２−１８５３から選択された配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含む。ＣＤ３結合ドメインの軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣ  ＣＤＲ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８５２−１８６４から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８５２−１８６４から選択された配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含む。ＣＤ３結合ドメインの軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣ  ＣＤＲ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８６５−１８７７から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８６５−１８７７から選択され��配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含む。ＣＤ３結合ドメインの軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣ  ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８７８−１８８４から選択された配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８７８−１８８４から選択された配列中に１つ以上の修飾または置換を含む配列を含む。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域。
【０１００】
いくつかの例では、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖｓは、既知の方法に従って調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を備えるｓｃＦｖリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。これに応じて、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨまたはＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で結合することができるような長さである。ある実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態において、これらのｓｃＦｖリンカーは約３から約１５、例えば、８、９、あるいは１０の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成物に関して、柔軟性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合する鎖間フォールディングを可能にするペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するファージディスプレイ方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖにおいて可変の軽鎖ドメインと可変の重鎖ドメインを連結するのに適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１１）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１２）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１３）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１４）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１５）、または（ＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１６）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。１つの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１７）、または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１８）であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８０９〜１８１８に明記されるリンカーの任意の組み合わせからできている配列を含み、そのようなリンカーの長さは、いくつかの例では、最大で１５のアミノ酸であり、または、１５のアミノ酸よりも長い。リンカー長さの変動は活性を保持あるいは増強し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、あるいは０．５ｎＭ以下のＫＤのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、あるいは０．５ｎＭ以下のＫＤの、ＣＤ３ε、γ、あるいはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性（つまり、約１００ｎＭ以上）を有する。
【０１０２】
ＣＤ３に結合するための親和性は、例えば、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質自体あるいはそのＣＤ３結合ドメインの、アッセイプレート上でコーティングされた；微生物細胞表面上で表示された；溶液中などのＣＤ３に結合する能力によって、判定され得る。ＣＤ３に対する本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質自体あるいはそのＣＤ３結合ドメインの結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）、または、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質自体あるいはそのＣＤ３結合ドメインを固定することにより、分析され得る。薬剤は、適切な緩衝液と所定の温度で一定の期間培養された結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質は、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨ緩衝液などで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。
【０１０３】
半減期延長ドメイン
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延長するドメインが企図されている。そのようなドメインは、限定されないが、アルブミン結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、および、当該技術分野で知られている他の半減期延長ドメインを含むものと企図される。
【０１０４】
ヒトアルブミン（ＡＬＢ）（６７ｋＤａの分子質量）は、血漿中で最も大量のタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトにおいて約２０日の半減期を有している。ＡＬＢは、血漿ｐＨを維持するように役立ち、膠質の血圧に寄与し、多くの代謝物質と脂肪酸の担体として機能し、および、血漿の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。
【０１０５】
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延ばす。例えば、Ｆａｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組換え融合は、Ｆａｂフラグメントだけの投与と比較すると、マウスとウサギそれぞれへの静脈内投与時に、２５倍および５８倍のインビボの除去、ならびに２６倍および３７倍の半減期延長を結果としてもたらした。別の例において、アルブミンとの会合を促進するためにインスリンが脂肪酸でアシル化されると、ウサギまたはブタに皮下注射した時に、遅延性の効果が観察された。総じて、このような研究は、アルブミン結合と遅延性作用との連係を実証する。
【０１０６】
一態様では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＡＬＢに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質のＡＬＢ結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含む、ＡＬＢに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＬＢ結合ドメインは、ＨＳＡに特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、およびラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンド、または小分子実体である。ある実施形態では、ＡＬＢ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは小分子である。ＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインはかなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、または１０ｋＤａ以下であることが企図される。ある例では、ＡＬＢ結合は、ペプチドまたは小分子実体である場合、５ｋＤａ以下である。
【０１０７】
ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、ＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質自体の薬物動力学と薬物動態の変化をもたらす。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインは、三重特異性抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、および拡散の変化を含む、薬物動態学的特性も変化させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織分布、組織浸透、組織内での拡散、増強した有効性をもたらす。一実施形態では、治療方法は、減少量の三重特異性抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用して、その結果、非腫瘍細胞の細胞毒性の減少などの副作用が減少する。
【０１０８】
さらに、半減期延長ドメインの結合親和性は、特定の三重特異性抗原結合タンパク質の特異的な消失半減期を標的とするように選択され得る。ゆえに、いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは高度な結合親和性を有する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、半減期延長ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭと１００ｎＭの間（中）、および１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度を含む。上記のように、ＡＬＢに対する結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）など既知の方法により判定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＬＢ結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７６９−１７７８から選択される配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは１００％同一の配列である。いくつかの例では、半減期延長は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３）と、３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。いくつかの例では、半減期延長は、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３）、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣ  ＣＤＲ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７８２−１７８４から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７８２−１７８４から選択される配列中に１つ以上の修正あるいは置換を含む配列、または少なくとも約８０％〜約９９％を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣ  ＣＤＲ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７８５−１７９０から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７８５−１７９０から選択される配列中に１つ以上の修正あるいは置換を含む配列を含む。ＣＤ３結合ドメインの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣ  ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９１あるいは１７９２から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９１あるいは１７９２から選択される配列の１つ以上の修正もしくは置換を含む配列を含む。
【０１１０】
ＤＬＬ３結合ドメイン
ＤＬＬ３（δ様リガンド３またはＳＣＤＯ１としても知られる）は、Ｎｏｔｃｈ  ＤＳＬリガンドのδ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソログとしては、限定されないが、ヒト（受入番号．ＮＰ＿０５８６３７およびＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（受入番号．ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受入番号．ＮＰ＿０３１８９２）、およびラット（受入番号．ＮＰ＿４４６１１８）が挙げられる。ヒトでは、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３上にある９．５ｋｂｐに及ぶ８つのエクソンで構成される。最後のエクソン内の選択的スプライシングは、２つの処理された転写産物である、２３８９の塩基（受入番号．ＮＭ＿０１６９４１）のうちの１つと、２０５２の塩基（受入番号．ＮＭ＿２０３４８６）のうちの１つを生じさせる。前者の転写産物は、６１８のアミノ酸タンパク質（受入番号．ＮＰ＿０５８６３７）をコードするが、後者のものは、５８７のアミノ酸タンパク質（受入番号．ＮＰ＿９８２３５３）をコードする。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメインおよびそれらの膜貫通ドメインにわたって全体的に１００％の同一性を共有するが、より長いアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端で３２の追加の残基を含有する伸長した細胞質側末端を含有する点でのみ異なる。ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメイン、単一のＤＳＬドメイン、およびＮ−末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、アミノ酸残基約２１６−２４９（ドメイン１）、２７４−３１０（ドメイン２）、３１２−３５１（ドメイン３）、３５３−３８９（ドメイン４）、３９１−４２７（ドメイン５）、および４２９−４６５（ドメイン６）で生じ、ＤＳＬドメインはアミノ酸残基約１７６−２１５で生じ、およびＮ−末端ドメインはｈＤＬＬ３のアミノ酸残基約２７−１７５で生じると認められる。ＥＧＦ様ドメイン、ＤＳＬドメイン、およびＮ−末端ドメインの各々は、異なるアミノ酸配列によって定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。ＥＧＦ様ドメインは、いくつかの実施形態では、ＥＧＦ６〜ＥＧＦ１と呼ばれ、ＥＧＦ１はタンパク質のＮ末端基部分に接近している。一般に、ＤＳＬリガンドは、以下の一連の構造的なドメインからなる：固有のＮ−末端ドメイン、それに続く保存されたＤＳＬドメイン、多数のタンデム上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピート、膜貫通ドメイン、および、リガンドにわたって高度に保存されないが、固有のＥ３ユビキチンリガーゼによるユビキチン化のための可能性のある部位である複数のリシン残基を含有する、細胞質ドメイン。ＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用に必要であるが十分でない、縮重ＥＧＦドメインである。さらに、ほとんどのＤＳＬリガンドの最初の２つのＥＧＦ様リピートは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する場合に、ＤＳＬドメインと共同的に相互作用するＤＯＳドメインとして知られるより小さなタンパク質配列モチーフを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、この開示の開示されたＤＬＬ３三重特異性結合タンパク質は、ＤＬＬ３タンパク質内の選択されたドメイン、モチーフ、あるいはエピトープと反応するように生成されるか、製作されるか、操作されるか、または選択される。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質はＤＳＬドメインに結合し、いくつかの実施形態では、ＤＳＬドメイン内にＧ２０３、Ｒ２０５、Ｐ２０６を含むエピトープに結合する。
【０１１２】
本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３の両方のアイソフォームあるいはタンパク質の単一のアイソフォームと反応するように操作されるか、製作されるか、および／または選択されるか、または反対に、ＤＬＬ３に加えて、少なくとも１つの追加のＤＬＬファミリーメンバーと反応するか、もしくは会合する汎ＤＬＬ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインなどのＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＬＬ３のみによって示されるドメイン（あるいは、その中のエピトープ）と反応するか、あるいは複数のもしくはすべてのＤＬＬファミリーメンバーにわたって少なくともいくらか保存されるドメインと反応するように、操作されるか、製作されるか、および／または選択される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＬＬ３の特定のエピトープ、部分、モチーフ、あるいはドメインと会合または結合する。両方のＤＬＬ３アイソフォームは、少なくともＮ−末端ドメイン、ＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ｌａｇ−２）ドメイン、および６つのＥＧＦ様ドメイン（つまり、ＥＧＦ１−ＥＧＦ６）を含む、同一の細胞外領域を取り込む。したがって、ある実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＬＬ３のＮ−末端ドメイン（成熟したタンパク質中のアミノ酸２７−１７５）に結合または会合するが、他の実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＳＬドメイン（アミノ酸１７６−２１５）またはその中のエピトープに結合または会合する。本開示の他の態様では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＬＬ３の特別のＥＧＦ様ドメインにある特定のエピトープに会合または結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＥＧＦ１（アミノ酸２１６−２４９）、ＥＧＦ２（アミノ酸２７４−３１０）、ＥＧＦ３（アミノ酸３１２−３５１）、ＥＧＦ４（アミノ酸３５３−３８９）、ＥＧＦ５（アミノ酸３９１．４２７）、あるいはＥＧＦ６（アミノ酸４２９−４６５）にあるエピトープに会合または結合する。いくつかの実施形態では、前述のドメインの各々は、１つ以上のエピトープおよび／または１つ以上のビンを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＳＬドメインあるいはその中のエピトープと結合するか、反応するか、または会合する。他の実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、特定のＥＧＦ様ドメインあるいはその中のエピトープと結合するか、反応するか、または会合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、Ｎ−末端ドメインまたはその中のエピトープと結合するか、反応するか、または会合する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本開示の三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインなどの、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質は、上述されるように、完全長のＤＬＬ３タンパク質あるいはそのフラグメント、例えば、完全長のＤＬＬ３タンパク質内のエピトープ含有フラグメントに結合する。場合によっては、エピトープ含有フラグメントは、ＤＬＬ３タンパク質の抗原性または免疫原性のフラグメントおよびその誘導体を含む。抗原性または免疫原性のフラグメントを含む、エピトープ含有フラグメントは、いくつかの実施形態では、１２以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、５０以上または１００のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３フラグメントは、完全なタンパク質の長さの９５％以上、９０％または、完全なタンパク質の長さの７５％あるいは５０％あるいは２５％あるいは１０％以上を含む。いくつかの実施形態では、抗原性または免疫原性のフラグメントを含むＤＬＬ３のエピトープ含有フラグメントは、患者の関連免疫応答を誘発することができる。ＤＬＬ３の誘導体は、いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８８５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｑ９ＮＹＪ７）で提供されるＤＬＬ３配列に対して、１以上（例えば、１−２０、例えば、１５のアミノ酸、または最大２０％、例えば、タンパク質の全長に基づいたアミノ酸の数によって最大１０％あるいは５％あるいは１％）の欠失、挿入、または置換がなされている配列上の変異体を含む。いくつかの実施形態では、置換は保存的置換を含む。ＤＬＬ３の誘導体および変異体は、いくつかの例では、それらが由来するＤＬＬ３タンパク質と本質的に同じ生体機能を有している。例えば、ＤＬＬ３の誘導体および変異体は、場合によっては、それらが由来するタンパク質に対して比較的に抗原性または免疫原性であり、それらが由来するタンパク質のリガンド結合活性、あるいは活性な受容体複合体成形能力のいずれか、あるいは好ましくは両方を有しており、およびＤＬＬ３と同じ組織分布を有する。
【０１１５】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の設計により、ＤＬＬ３に対する結合ドメインが、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含む任意のタイプの結合ドメインであってもよいという点で、ＤＬＬ３に対する結合ドメインを柔軟なものとすることができる。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３に対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、およびラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、ＤＬＬ３に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチド、およびモノボディなどの抗体模倣物である。さらなる実施形態では、ＤＬＬ３に対する結合ドメインは、ＤＬＬ３に結合または会合するリガンドまたはペプチドである。さらなる実施形態では、ＤＬＬ３に対する結合ドメインはノッチンである。さらなる実施形態では、ＤＬＬ３に対する結合ドメインは小分子実体である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｑ９ＮＹＪ７）の配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｑ９ＮＹＪ７）と比較して、切断した配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９２またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９３（ＤＬＬ３タンパク質の成熟した細胞外ドメインである）の配列を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９２のアミノ酸４７−４９２を含むタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９２のアミノ酸４７−４４９２内のエピトープを認識する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、抗ＤＬＬ３の抗体あるいは抗体変異体である。本明細書で使用されるように、「抗体変異体」との用語は、本明細書に記載される抗体の変異体および誘導体を指す。ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の結合親和性および／または他の生体特性を改善するように企図される。アミノ酸変異体を調製するための例示的な方法としては、限定されないが、抗体をコードするヌクレオチド配列へ適切な修飾を導入すること、あるいはペプチド合成が挙げられる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはその残基への挿入および／または置換を含む。
【０１１８】
最終構築物を得るために、あらゆる欠失、挿入、および置換の組み合わせを行うことができる。ただし、最終構築物は所望の特徴である抗原結合を有するものとする。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象部位には、ＣＤＲとフレームワーク領域が含まれる。そのような置換の例が以下に記載される。アミノ酸置換は対象の抗体に導入されてもよく、生成物は、所望の活性、保持された／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＴ細胞媒介性細胞毒性（ＴＤＣＣ）についてスクリーニングされてもよい。保守的および非保存的なアミノ酸置換の両方は、抗体変異体の調製のために企図される。
【０１１９】
変異体抗ＤＬＬ３抗体を作製する置換の別の例では、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換される。一般に、変異体は、親抗体と比較して改善された所望の特性、例えば、親和性の増加、親和性の減少、免疫原性の減少、結合のｐＨ依存性の増加に基づいて、選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、ＤＬＬ３に特異的な単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ラマ由来のｓｄＡｂの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンド、または小分子実体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、ＤＬＬ３に結合する任意のドメインである。ある実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは小分子である。
【０１２１】
一般に、単一ドメイン抗体との用語は、その最も広い意味で本明細書で使用されるように、特定の生体源あるいは特定の調製方法に限定されないことに留意されたい。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例として、限定されないが、重鎖抗体、軽鎖を生来欠いている抗体、従来の４鎖状抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャホールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当該技術分野の任意の抗体、または、任意の将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含む、任意の種に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、（１）自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインの隔離によって；（２）自然発生のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって；（３）自然発生のＶＨＨドメインの「ヒト化」によって、あるいはそのようなヒト化されたＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）任意の動物種に由来する、および、とりわけヒトなどの哺乳動物の種に由来する自然発生のＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」によって、あるいは、そのようなラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（５）「ドメイン抗体」もしくは「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によって、あるいはそのようなラクダ化されたＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（６）タンパク質、ポリペプチド、あるいは他のアミノ酸配列を調製するための合成技術または半合成技術の使用によって；（７）当該技術分野で既知の核酸合成の技術を使用した単一ドメイン抗体をコードする核酸の調製と、それに続く、このようにして得られた核酸の発現によって；および／または、（８）前述の１つ以上の任意の組み合わせによって得られる。
【０１２２】
一実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＤＬＬ３に対して向けられた自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は一般に、ＤＬＬ３を有するラマの種を適切に免疫化することによって（つまり、ＤＬＬ３に対して向けられる免疫応答および／または重鎖抗体を産生するために）、上記ラマから適切な生体試料（血液試料、血清試料、またはＢ細胞の試料など）を得ることによって、および、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を用いて、上記試料から始まるＤＬＬ３に対して向けられたＶＨＨ配列を生成することによって生成するか、または得ることができる。
【０１２３】
別の実施形態では、ＤＬＬ３に対するそのような自然発生のＶＨＨドメインは、例えば、当該技術分野で知られている少なくとも１つのスクリーニング技術を用いて、ＤＬＬ３、あるいはその少なくとも１つの部分、フラグメント、抗原決定基、もしくはエピトープを使用して、そのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ラクダ科動物のＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得られる。そのようなライブラリーおよび技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、およびＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、ナイーブＶＨＨライブラリーに由来する改善された合成または半合成のライブラリー、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるような、無作為の突然変異誘発および／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によって、ナイーブＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーが使用される。
【０１２４】
さらなる実施形態では、ＤＬＬ３に対して向けられたＶＨＨ配列を得るためのさらに他の技術には、重鎖抗体を発現することができる（つまり、ＤＬＬ３に対して向けられた免疫応答および／または重鎖抗体を産生するために）トランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化すること、上記トランスジェニック哺乳動物から適切な生体試料（血液試料、血清試料、またはＢ細胞の試料）を得ること、当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して、上記試料から開始するＤＬＬ３に対して向けられたＶＨＨ配列を生成することが含まれる。例えば、この目的のために、重鎖抗体発現ラットまたはマウス、およびＷＯ０２／０８５９４５およびＷＯ０４／０４９７９４に記載されるさらなる方法と技術を使用することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体は、自然発生のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化されている」、つまり、自然発生のＶＨＨ配列のアミノ酸配列中（および、とりわけ、フレームワーク配列内）の１つ以上のアミノ酸残基を、（例えば、上に示すような）ヒト由来の従来の４−鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上によって置き換えることにより「ヒト化しされている」、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。これは、例えば、本明細書のさらなる説明に基づいて、当業者に明らかな当該技術分野で知られている様式で実施可能である。さらに、本開示のそのようなヒト化された抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体がそれ自体で知られている任意の適切な様式（つまり、上記項目（１）〜（８）で示されるような）で得られ、したがって、出発物質として自然発生のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されない。いくつかのさらなる実施形態では、単一ドメイン抗ＤＬＬ３抗体は、本明細書に記載されるように、自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化されている」、つまり、従来の４−鎖抗体からの自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上によって置き換えることにより「ラクダ化されている」、アミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体を含む。そのような「ラクダ化」置換は、ＶＨ−ＶＬ界面、および／またはいわゆるラクダ科に顕著な残基を形成するか、ならびに／あるいは、そのＶＨ−ＶＬ界面、および／またはいわゆるラクダ科に顕著な残基に存在するアミノ酸位置に挿入されるのが好ましい（例えば、ＷＯ９４／０４６７８とＤａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４と１９９６）を参照）。好ましくは、ラクダ化された単一ドメインを生成または設計するための出発物質あるいは出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかし、ある実施形態では、本開示のそのようなラクダ化された抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体は、当該技術分野で知られている様式（つまり、上記項目（１）〜（８）で示されるような）で得られ、したがって、出発物質としての自然発生のＶＨドメインを含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに厳密に限定されないということに留意されたい。例えば、本明細書にさらに記載されるように、「ヒト化」および「ラクダ化」の両方は、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供し、その後、新しいヌクレオチド配列が「ヒト化された」または「ラクダ化された」単一ドメイン抗体をそれぞれコードするように、上記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変えることによって、実行される。その後、この核酸は発現され、その結果、本開示の所望の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体がもたらされ得る。あるいは、他の実施形態では、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列にそれぞれ基づいて、本開示の��望のヒト化またはラクダ化された抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体のアミノ酸配列がそれぞれ設計され、その後、ペプチド合成の既知の技術を用いてデノボ合成される。いくつかの実施形態では、自然発生のＶＨＨドメインあるいはＶＨドメインのアミノ酸配列あるいはヌクレオチド配列にそれぞれ基づいて、本開示の所望のヒト化またはラクダ化された抗ＤＬＬ３単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列がそれぞれ設計され、次に、核酸合成の既知の技術を用いてデノボ合成され、その後、このように得られた核酸を既知の発現技術を用いて発現させ、その結果、本開示の所望の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体が得られる。
【０１２６】
自然発生のＶＨ配列またはＶＨＨ配列から始まる、本開示の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体および／またはそれをコードする核酸を得るための他の適切な方法および技術には、例えば、本開示の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体あるいはそれをコードするヌクレオチド配列または核酸を提供するために、適切な様式で、１つ以上の自然発生のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）配列および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、１つ以上の自然発生のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列あるいはＣＤＲ配列など）、および／または、１つ以上の合成または半合成の配列を組み合わせることが含まれる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、重鎖可変相補性決定領域ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、重鎖可変ＣＤＲ３、軽鎖可変ＣＤＲ１、軽鎖可変ＣＤＲ２、および軽鎖可変ＣＤＲ３を含む、抗ＤＬＬ３特異的抗体である。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、あるいは抗原結合フラグメント、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または重鎖二量体、軽鎖単量体または軽鎖二量体、ならびに１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体からのドメインを含む、ＤＬＬ３に結合する任意のドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体は、重鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、以下の式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４によって表されるように、３つの相補性決定領域／配列によって中断された４つのフレームワーク領域／配列（ｆ１−ｆ４）で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、式中、ｒ１、ｒ２、およびｒ３はそれぞれ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、およびｆ４はフレームワーク残基である。本開示のＤＬＬ３結合タンパク質のフレームワーク残基は、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４のアミノ酸残基を含み、および、相補性決定領域は、例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４４２および１８８６から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインのＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７から選択される配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７からなる群から選択される配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８からなる群から選択される配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９から選択される配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９からなる群から選択される配列に対する１つ以上の置換を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４３−８８４および１８８７から選択されるアミノ酸中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８５−１３２６および１８８８から選択されるアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３２７−１７６８および１８８９から選択される配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９５−５２８から選択されるアミノ酸中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９３７−９７０から選択されるアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ，１３７９−１４１２から選択される配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２９−８０９から選択されるアミノ酸中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９７１−１２５１から選択されるアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３７９−１４１２から選択される配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１０−８８４から選択されるアミノ酸中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２５２−１３２６から選択されるアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８から選択されるアミノ酸配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６９２−１７６８から選択される配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【０１３３】
様々な実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。様々な実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３−８６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
【０１３４】
様々な実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８７−３６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
【０１３５】
様々な実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６８に由来する配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
【０１３６】
様々な実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５に由来する配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性結合タンパク質のＤＬＬ３結合ドメインは、ヒトとカニクイザルのＤＬＬ３と交差反応性である。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインはヒトＤＬＬ３に特異的である。ある実施形態では、本明細書で開示されるＤＬＬ３結合ドメインは、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＤＬＬ３に結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＤＬＬ３結合ドメインは、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＤＬＬ３に結合する。ある実施形態では、本明細書で開示されるＤＬＬ３結合ドメインは、それぞれカニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）およびヒトＫｄを有する、カニクイザルＤＬＬ３およびヒトＤＬＬ３（ｈＫｄ）の両方に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、同等の結合親和性でヒトとカニクイザルＤＬＬ３に結合する（つまり、ｈＫｄとｃＫｄの値は、±１０％を超えて異ならない）。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約４５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約４００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約３５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約３００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約１５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．００１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約９０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．２ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．３ｎＭ〜約７０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．４ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．５ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．６ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．７ｎＭ〜約８ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．８ｎＭ〜約６ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約０．９ｎＭ〜約４ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ｈＫｄとｃＫｄは、約１ｎＭ〜約２ｎＭの範囲である。
【０１３８】
ある実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合ドメインは、可溶性ＤＬＬ３よりも膜結合型ＤＬＬ３に優先的に結合する。膜結合型ＤＬＬ３は、ＤＬＬ３を発現する細胞の細胞膜表面中あるいはその表面上のＤＬＬ３の存在を指す。可溶性ＤＬＬ３は、ＤＬＬ３を発現するか、またはＤＬＬ３を発現した細胞の細胞膜表面中またはその表面上にはもはや存在しないＤＬＬ３を指す。ある例では、可溶性ＤＬＬ３は、被験体の血液および／またはリンパ循環中に存在する。一実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、可溶性ＤＬＬ３と比べて、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多く膜結合型ＤＬＬ３に結合する。一実施形態では、本開示の三重特異性抗原結合タンパク質は、可溶性ＤＬＬ３と比べて３０倍多く、膜結合型ＤＬＬ３に優先的に結合する。可溶性ＤＬＬ３に対して膜結合型ＤＬＬ３への抗原結合タンパク質の優先的な結合の判定は、当該技術分野で周知のアッセイを使用して容易に判定され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前述のＤＬＬ３結合ドメイン（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１−４４２および１８８６の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体）のいずれかは、精製しやすくするためにタグをつけられた親和性ペプチドである。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドタグは、６Ｘ−ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１９）と呼ばれる、６つの連続するヒスチジン残基である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前述のＤＬＬ３結合ドメイン（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４４２および１８８６の抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体）のいずれかは、精製しやすくするためにタグをつけられた親和性ペプチドである。いくつかの実施形態では、親和性ペプチドタグは、６Ｘ−ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１９）と呼ばれる、６つの連続するヒスチジン残基である。
【０１４１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）への組込み
本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性抗原結合タンパク質は、ある実施例では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）へと組み込むことができる。操作された免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体を含有する抗ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を含むＣＡＲを発現するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を含むＣＡＲは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに、さらには共刺激ドメイン、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、あるいは４−１ＢＢから得られる機能的シグナル伝達ドメインに結合される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。
【０１４２】
腫瘍増殖抑制特性
ある実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞を有する被験体に投与されると、インビボでの腫瘍細胞の増殖を減少させる。腫瘍細胞の増殖の減少の測定は、当該技術分野で周知の複数の様々な方法によって判定することができる。非限定的な例には、腫瘍寸法の直接測定、切除された腫瘍量の測定と対照被験体との比較、解析を強化するために同位体あるいは発光分子（例えば、ルシフェラーゼ）を使用することもあれば使用しないこともある画像処理技術（例えば、ＣＴまたはＭＲＩ）による測定などが含まれる。
【０１４３】
特定の実施形態では、本開示の三重特異性タンパク質の投与は、結果として、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のインビボでの増殖を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは１００％減少させ、腫瘍増殖の約１００％の減少は腫瘍の完全寛解と消失を示す。さらなる実施形態では、本開示の三重特異性タンパク質の投与は、結果として、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のインビボでの増殖を約５０〜１００％、約７５〜１００％、または約９０〜１００％減少させる。さらなる実施形態では、本開示の三重特異性タンパク質の投与は、結果として、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍細胞のインビボでの増殖を約５０〜６０％、約６０〜７０％、約７０〜８０％、約８０〜９０％、または約９０〜１００％減少させる。
【０１４４】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の修飾
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が、遺伝子コードによりコードされたものでないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、または（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、リーダー配列または分泌配列、あるいはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合される、誘導体またはアナログを包含する。
【０１４５】
典型的な修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドあるいはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質あるいは質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性の加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の付加、例えば、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、およびユビキチン化が挙げられる。
【０１４６】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の修飾に有用な特定の一般的なペプチド修飾は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合性修飾によるポリペプチド中のアミノ基またはカルボキシル基、あるいはその両方の遮断、およびＡＤＰ−リボシル化を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の誘導体は、免疫反応性モジュレーターの誘導体、および１つ以上の修飾を含む抗原結合性分子を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示の三重特異性ＤＬＬ３結合分子は、一価または多価、二価、三価などである。本明細書で使用されるように、「原子価」との用語は、抗体と会合する潜在的な標的結合部位の数を指す。それぞれの標的結合部位は、１つの標的分子または標的分子上の特定位置あるいは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価の場合、分子のそれぞれの結合部位は、単一の抗原位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が１つより多い標的結合部位を含む（多価である）場合、それぞれの標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンドあるいは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に結合し得る）。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、とりわけ、１つ以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異、および／または修飾を含み、これにより、限定されないが、以下の好ましい特性を有する化合物を結果としてもたらす：薬物動態学の変更、血清半減期の増大、結合親和性の増大、免疫原性の減少、産生の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合するＦｃリガンドの変化、「ＡＤＣＣ」（抗体依存性細胞性細胞傷害）あるいは「ＣＤＣ」（補体依存性細胞傷害）の活性の増強または低減、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変化、ならびに結合特異性の修飾。場合によっては、これらのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質変異体は、開示されたＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の有効な抗腫瘍性の特性を増強するために有利に使用される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ヒトなどの哺乳動物またはカニクイザルにおいて、約５日未満、約５日、約５日より長い、１０日より長い、約１５日より長い、約２０日より長い、約２５日より長い、約３０日より長い、約３５日より長い、約４０日より長い、約４５日より長い、約２ヶ月より長い、約３ヶ月より長い、約４ヶ月より長い、または約５ヶ月より長い半減期を有する。半減期の増加は、場合によっては、より高い血清力価を結果としてもたらし、したがって、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の投与の頻度が減少させるか、投与される抗体の濃度を減少させるか、またはその両方を行う。
【０１５１】
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、つまり、変更されたグリコシル化パターンあるいはタンパク質に共有結合される変更された炭水化物組成物を含む、ＤＬＬ３標的化三重特異性結合タンパク質を含む。操作されたグリコフォームは、場合によっては、限定されないが、エフェクター機能を増強あるいは低減すること、標的に対する三重特異性タンパク質の親和性を増大させること、または三重特異性タンパク質の産生を促進することを含む、様々な目的に有用である。エフェクター機能の低減が所望されるある実施形態では、分子はアグリコシル化形態を発現するように操作される。１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去を結果としてもたらし、それにより、その部位のグリコシル化を除去する置換が、いくつかの実施形態に含まれる。反対に、場合によっては、１つ以上の追加のグリコシル化部位において操作することにより、エフェクター機能の増強または結合の改善が、この開示の三重特異性タンパク質を含有するＦｃに与えられる。
【０１５２】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、場合によっては、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子または他の細胞のリガンドへの結合などによって、産生中または産生後に異なって修飾される。多数の化学修飾のうちのいずれかが、限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル基置換、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下における代謝合成などによる、特定の化学的切断を含む技術によって行なわれる。
【０１５３】
本開示にも含まれる様々な翻訳後修飾には、例えば、Ｎ連結糖鎖あるいはＯ連結糖鎖、Ｎ端末側終端あるいはＣ端末側終端の処理、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ連結糖鎖あるいはＯ連結糖鎖の化学修飾、および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのＮ末端のメチオニン残基の付加もしくは欠失が含まれる。さらに、ＤＬＬ３標的化三重特異性結合タンパク質は、場合によっては、モジュレーターの検出および単離を可能にするために、酵素学的、蛍光性、放射性同位体の、または親和性のラベルなどの、検出可能なラベルを用いて修飾される。
【０１５４】
ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３三重特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
【０１５５】
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーにより分離されるか、あるいは他の実施形態ではペプチド結合により直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を、適切なプロモーター、および随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に結合された１つの遺伝子構築物に組み合わせることによって、ならびに、細菌または他の適切な発現系、例えば、ＣＨＯ細胞などにおいてそれを発現させることによってなど、既知の方法によって構築される。ＤＬＬ３結合ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３結合ドメインおよび半減期延長ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３およびＤＬＬ３に結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性のプロモーターを含む、任意数の適切な転写および翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターは、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を促進するように選択される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入され、これはさらなる実施形態を表す。この組み換えベクターは、既知の方法に従って構築され得る。特定の対象のベクターには、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ｖｉｒｉｉ（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドが含まれる。
【０１５７】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載される三重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、およびこのポリオヌクレオチドを発現させるために利用され得る。大腸菌における発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１−２７）、または哺乳動物細胞における発現のためのｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１５８】
したがって、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、いくつかの実施形態では、上述されるタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入し、タンパク質ドメインを発現させる条件下で上記宿主細胞を培養することによって生成され、単離され得、随意にさらに精製され得る。
【０１５９】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３三重特異性結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはこのベクターにより形質転換される宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物も提供される。「薬学的に許容可能な担体」との用語は、限定されないが、成分の生物活性の有効性に干渉せず、および投与される患者に対して毒性ではない担体を含む。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。そのような担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被験体に投与することができる。好ましくは、組成物は滅菌される。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって確かなものとなり得る。さらなる実施形態は、凍結乾燥された形態でパッケージ化されるか、または水性媒体中でパッケージ化される、上記のＤＬＬ３三重特異性タンパク質の１つ以上を提供する。
【０１６０】
医薬組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３三重特異性標的タンパク質は、ナノ粒子に封入される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性微粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質はリポソームに結合される。いくつかの例では、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、リポソームの表面に結合される。いくつかの例では、ＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
【０１６１】
本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、薬剤としての使用のために企図される。投与は、異なる方法、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内の投与により達成される。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類、および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医および他の臨床学的要因により決定される。任意の１人の患者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。「有効な量」は、疾患の経過と重症度に影響を及ぼし、それにより、そのような病状の軽減または寛解を引き起こすのに十分な活性成分の量を指し、および、既知の方法を用いて決定され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、週に一回の頻度で、最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。場合によっては、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ〜約３０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｎｇ／ｋｇ、約３５ｎｇ／ｋｇ〜約６０ｎｇ／ｋｇ、約４５ｎｇ／ｋｇ〜約７０ｎｇ／ｋｇ、約６５ｎｇ／ｋｇ〜約８５ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約３５μｇ／ｋｇ〜約７０μｇ／ｋｇ、約４５μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇ、約６５μｇ／ｋｇ〜約９０μｇ／ｋｇ、約８５μｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０９５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ；約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ、または約８．５ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与の頻度は、いくつかの実施形態では、およそ毎日の投与より少ない、隔日、１日１回より少ない、週に２回、毎週、７日に１回、２週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、または月に１回である。場合によっては、投与の頻度は毎週である。場合によっては、投与の頻度は毎週であり、投与量は最大１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、投与の持続時間は約１日〜約４週間以上である。
【０１６３】
治療法
いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患を処置するために、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、良性または悪性；固形腫瘍または他の血液腫瘍（ｂｌｏｏｄ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）であり、および、いくつかの実施形態では、限定されないが  以下を含む群から選択される：副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連癌、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｇａｎｇｌｉａ  ｔｕｍｏｒｓ）、膀胱癌（扁平上皮癌および移行上皮癌）、胞胚腔障害（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、骨癌（エナメル上皮腫、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳脊髄癌、転移性脳腫瘍、トリプルネガティブ乳癌を含む乳癌、頸動脈球腫瘍、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、明細胞癌、結腸癌、大腸癌、皮膚の良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、線維形成性骨形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、硬骨、胆嚢、ならびに胆管癌の線維性形成異常、胃癌、胃腸、妊娠性絨毛疾患、胚細胞性腫瘍、腺機能異常、頭頚部癌、視床下部、腸癌、島細胞腫、カポジ肉腫、腎癌（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性の脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、上皮小体腫瘍、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後部ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、希少な血液障害、腎転移性癌、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部肉腫、扁平上皮癌、胃癌、間質性障害、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、および子宮癌（頚部癌、子宮内膜癌、ならびに平滑筋腫）。
【０１６４】
ある実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、フロントライン治療として使用され、以前に癌性状態の処置を受けたことがない被験体に投与される。他の実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、（本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、あるいは他の抗癌剤を用いた）処置を以前に受けたことがないか、再発したか、または以前の処置では効果がないと決定された被験体を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、再発性腫瘍を有する被験体を処置するために使用される。
【０１６５】
いくつかの態様では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、固形腫瘍を含む増殖性疾患を処置するために投与され、固形腫瘍としては、限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、頚部、子宮、食道、大腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺、細胞腫、肉腫、膠芽腫、および様々な頭頸部腫瘍が挙げられる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、黒色腫に罹患している被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、黒色腫を診断するか、モニタリングするか、処置するか、または予防するために使用される。「黒色腫」との用語には、本明細書で使用されるように、限定されないが、原発性黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、皮膚外黒色腫（ｅｘｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、表在拡大型黒色腫、ポリープ状黒色腫、黒色癌、黒色表皮腫、黒色肉腫、表皮内黒色腫、結節型悪性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、黒子型黒色腫、黒子型悪性黒色腫、粘膜黒子型黒色腫（ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、粘膜悪性黒色腫（ｍｕｃｏｓａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、肢端黒子型黒色腫、軟部組織黒色腫、眼内黒色腫、浸潤性黒色腫、家族性異型母斑黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群、線維形成性悪性黒色腫、またはブドウ膜黒色腫を含む、すべてのタイプの黒色腫が含まれる。
【０１６７】
ＤＬＬ３は、多くの様々な癌上で発現され、かつ癌幹細胞と会合することが分かっている有効な腫瘍マーカーである。したがって、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質がリンパ球上で発現されたキメラ抗原受容体内に取り込まれているいくつかの実施形態では、結果として生じる「ＤＬＬ３感作リンパ球」（例えば、ＤＬＬ３決定因子を疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）認識するナチュラルキラー細胞あるいはＴ細胞）は、癌幹細胞を含む異常なＤＬＬ３陽性細胞に向けられた免疫応答を有効に開始することができる。腫瘍原性「種子」細胞を有効に除去するこの能力は、腫瘍の再発または転移の可能性を減らす上でしばしば重要である。いくつかの実施形態では、そのようなＤＬＬ３感作リンパ球は、他の治療剤と組み合わせて、または、標準治療に続く維持レジメンの一部として使用される。
【０１６８】
より一般には、キメラ抗原受容体は、シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、Ｔ細胞シグナル伝達あるいはＴ細胞活性化ドメイン）を含有するか、または含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質あるいはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性結合タンパク質を含むＣＡＲは、抗体またはその抗原結合性フラグメントの抗原結合特性を利用することによって、非ＭＨＣ制限様式で、感作リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の特異性および反応性を、ＤＬＬ３陽性標的細胞の方に向け直す能力を有する。非ＭＨＣ制限の抗原認識は、ＤＬＬ３  ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原処理と無関係の腫瘍原性ＤＬＬ３を認識する能力を与え、したがって、腫瘍エスケープの主要なメカニズムを回避する。さらに、Ｔ細胞が発現される場合、ＣＡＲは、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖およびβ鎖と二量化しないのが有利である。
【０１６９】
選択された態様では、ＤＬＬ３結合タンパク質、または本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）へと取り込まれ、および、ＤＬＬ３  ＣＡＲは、以下のサブタイプを含む肺癌の処置に有効なＣＡＲベースの治療において投与される：小細胞肺癌、非小細胞肺癌（例えば、扁平細胞非小細胞肺癌あるいは扁平細胞小細胞肺癌）、および大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３感受性リンパ球は、限局期疾患あるいは進行期疾患を示す患者に投与される。他の実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性抗体は、難治性患者（つまり、一連の初期治療中、あるいはその初期治療の完了直後に、疾患が再発する患者）；感受性患者（つまり、その再発が一次治療の２〜３ヶ月以上後である患者）；または、プラチナベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、および／またはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、あるいはカバジタキセル）に耐性を示す患者に投与される。別の実施形態では、開示されたＤＬＬ３  ＣＡＲによる処置は、卵巣−漿液性癌および卵巣−漿液性乳頭状癌を含む、卵巣癌の処置に有効である。
【０１７１】
本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、またはＤＬＬ３標的化三重特異性結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌の特徴あるいは表現型を有する腫瘍を予防するか、処置するか、または診断するために使用される。分散した内分泌系から発生する真のまたは基準の神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的まれで、１００，０００人当たり２〜５人の発生率であるが、高悪性度である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、頚部、および子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）において生じる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として知られる衰弱性症状を引き起こす可能性があるセロトニンおよび／またはクロモグラニンＡを含む、いくつかのホルモンを分泌することがある。そのような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、γエノラーゼ（遺伝子記号＝ＥＮＯ２）としても知られる））、ＣＤ５６（あるいは、ＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、およびシナプトフィジン（ＳＹＰ）などの陽性の免疫組織化学的マーカーによって、またはＡＳＣＬ１などの発現上昇を示すことが知られている遺伝子によって示される。従来の化学療法は、神経内分泌腫瘍の処置に特に効果的ではなく、肝転移は一般的な結果である。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性抗体は、神経内分泌腫瘍の処置に有利に使用され、いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性抗体は、カノニカルな神経内分泌腫瘍に共通の形質を遺伝子型的あるいは表現型的に模倣するか、似ているか、あるいは示す偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）を処置するか、予防するか、または診断するために使用される。偽性神経内分泌腫瘍または神経内分泌の特徴を有する腫瘍は、散在する神経内分泌細胞から、あるいは、神経内分泌分化カスケードが発癌プロセス中に再活性化された細胞から異常に発生する腫瘍である。そのようなｐＮＥＴは、一般に、生物学的に活性なアミン、神経伝達物質、およびペプチドホルモンのサブセットを産生する能力など、従来定義されている神経内分泌腫瘍と特定の表現型または生物学的特性を共有する。組織学的に、そのような腫瘍（ＮＥＴおよびｐＮＥＴ）は、共通の外観を有しており、その外観には、穏やかな（ｂｌａｎｄ）細胞病理学の最小限の細胞質と、丸形から楕円形の点状の核とを有する、密に結合する小さな細胞が見られる。本開示のいくつかの実施形態では、神経内分泌および偽性神経内分泌腫瘍を定義するために使用される、一般的に発現した組織学的マーカーあるいは遺伝子マーカーとしては、限定されないが、クロモグラニン  Ａ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、ＰＧＰ９．５、ＡＳＣＬ１、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、本開示のＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、頚部、ならびに子宮内膜、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様癌）、および肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）中で発生する神経内分泌腫瘍（ＮＥＴとｐＮＥＴの両方）などの、偽性神経内分泌腫瘍およびカノニカルな神経内分泌腫瘍の両方を処置するために有益に使用される。さらに、いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、ＮＳＥ、ＣＤ５６、シナプトフィジン、クロモグラニンＡ、ＡＳＣＬ１、もしくはＰＧＰ９．５（ＵＣＨＬ１）などの１つ以上のマーカーを発現する腫瘍を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、ＮＳＥ＋あるいはＣＤ５６＋あるいはＰＧＰ９．５＋あるいはＡＳＣＬ１＋あるいはＳＹＰ＋あるいはＣＨＧＡ＋もしくはそれらの任意の組み合わせである腫瘍を抱える被験体を処置するために使用される。
【０１７２】
別の実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、その疾病の最初の発現に続く腫瘍再発の可能性を下げるか、または排除するために、維持療法で使用される。場合によっては、上記疾患が処置されており、および、初期の腫瘍量が除去されるか、減少するか、あるいは他の方法で改善され、そのため、患者は無症状であるか、または寛解期にある。そのような時に、被験体は、標準診断法を使用して、疾患の兆候がほとんどないか、またはまったくないかどうかに関わらず、薬学的に有効な量の本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせを１回以上投与される。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、例えば、疾患再発の可能性を下げるために、一定の期間にわたって、規則的なスケジュールで、例えば、毎週、２週間ごと、毎月、６週間ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、あるいは毎年投与される。さらに、そのような処置は、いくつかの実施形態では、患者の応答および臨床的と診断的なパラメータに応じて、数週間、数か月、数年、さらには無期限の期間にわたって継続される。
【０１７３】
さらに別の実施形態では、本開示のＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、減量手術後の腫瘍転移の可能性を防ぐか、または減少させるために、予防的に使用されるか、もしくはアジュバント療法として使用される。本開示で使用されるように、「減量手術」は広く定義され、腫瘍または腫瘍増殖を排除するか、減少させるか、処置するか、または改善するあらゆる手術、技術、あるいは方法を意味する。例示的な減量手術としては、限定されないが、外科手術、放射線処理（つまり、ビーム放射線）、化学療法、免疫療法、またはアブレーションが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、腫瘍転移を減少させるための臨床的、診断的、もしくはセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）手順によって示唆されるように、適切な時間に投与される。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、投与レジメンの変更を可能にする適切な診断的技術またはモニタリング技術を伴う。
【０１７４】
本開示のさらに他の実施形態は、ＤＬＬ３結合タンパク質、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせを、無症状だが増殖性障害を発症するリスクがある被験体に投与する工程を含む。すなわち、いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、ＤＬＬ３  ＣＡＲ、またはＤＬＬ３感作リンパ球、あるいはそれらの任意の組み合わせは、予防的な意味で使用され、および、診察または試験されたことがあり、かつ１つ以上の注目される危険因子（例えば、ゲノムの兆候、家族歴、インビボあるいはインビトロの試験結果など）を有するが、新生物を発症していない患者に投与された。そのような場合、当業者ならば、経験的観察によって、または容認された臨床実践によって、有効な投与レジメンを決定することができるだろう。
【０１７５】
本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態では、「処置」または「処置すること」または「処置された」とは、望ましくない生理的な疾患、障害、あるいは疾患を遅らせること、あるいは、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、あるいは疾患の程度の減少；疾病、障害、あるいは疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせること、または進行を遅らせること；疾病、障害、あるいは疾患状態の改善；および、検出可能であれ検出不可能であれ、または疾病、障害、あるいは疾患の亢進であれ改善であれ、緩解（部分的でも全体でも）が挙げられる。処置は、過剰なレベルの副作用がない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態では、「処置」または「処置すること」または「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患の遺伝子マーカーを有する個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせるか、あるいはその重症度を低減させることである。
【０１７６】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質、または組成物は、特定の疾患、疾病、あるいは障害の処置のために、薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体を含む治療薬、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線治療薬（γ線、Ｘ線、および／または、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの配向された送達）、遺伝子治療薬（例えば、アンチセンス、レトロウイルスの治療など）、および他の免疫療法薬が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３の結合タンパク質、または抗ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、抗下痢性剤、抗催吐剤、鎮痛剤、オピオイド、および／または非ステロイド性の抗炎症剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３結合タンパク質、または抗ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、抗癌剤と組み合わせて投与される。本開示の医薬組成物および剤形ならびにキットを含む、本開示の様々な実施形態で使用することができる抗癌剤の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；アメタントロンアセタート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテーパ；アズトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ビスナフィドジメシレート（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナーナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベティマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンガル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デクソロマプラティン；デザグアミン；デザグアミンメシレート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラティン；エンプロメイト；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロオシタビン；フォスクィダン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えのインターロイキンＩＩ、あるいはｒＩＬ２を含む）、イ��ターフェロンα−２ａ）；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１  インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラティン；塩酸イリノテカン；ランレオチドアセタート；レトロゾール；レウプロリドアセタート；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；メゲストロールアセテート；メレンゲスロロールアセテート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトザントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オクシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタマスティン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロクサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニマスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンガル；塩酸サフィンガル；セムスチン；シムトラゼーネ；スパルフォスエートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロマスティン；スピロプラティン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェナール；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸トレクサトロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシビリン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロジン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンゾキジン；硫酸ビンゾキジン；ボロゾール；ゼニプラティン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。抗癌剤の他の例としては、限定されないが、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アキルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アムバマスティン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背方化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；細胞死レギュレー���ー；アプリン酸；コンゴウインコＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリマスティン；アクシナスタティン１；アクシナスタティン２；アクシナスタティン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾチロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジンイルスペルミン；ビアンサフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来の阻害剤；カルゼルシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ‐ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトール；クリプトファイシン８；クリプトファイシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタンチラキノーズ；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞傷害性因子；シトスタティン；ダクリズマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキフォスダミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオクサマイシン；ジフェニルスピロマスティン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；ズオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスティン；エデルフォスティン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレツッエラスティン；フラステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテクサピリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ハプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロニック酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントーネ；イルモフォシン；イルモスタット；イミダゾアクリドーネ；イミキモド；免疫賦活剤ペプチド；インスリン様成長因子Ｉ受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラライドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖のポリアミンアナログ；親油性二糖類ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメテレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤；（限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シンバスタチン、およびアトルバスタチンなど）ロクソリビン；ラルトテカン；ルテチウムテクサピリン；リソフィリン；細胞溶解ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メタレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二重鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナファイド；マイトトキシン繊維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体（ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン）；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１ベースの療法；マスタード抗癌剤；ミカペロキサイドＢ；ミコバクテリウムの細胞壁抽出物；ミラポロン；ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスティップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフターピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ニーリドロニック酸；中性エンドペプチターゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアミン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オ
ンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイニンインデューサ；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オグサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロニック酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプティン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリサルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；ウィザフェリンＡ；プラセティンＢ；プラスミノゲンアクチベータインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；チロシンホスファターゼタンパク質阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化したヘモグロビン・ポリオキシエチレン抱合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レティプティン；レニウムＲｅ  １８６  エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ラビジノンＢ１；ラボキシル；サフィンガル；セイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ  １ミメティック；セムスチン；セネスセンス由来の阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；フェニル酢酸ナトリウム；サルバロル；ソマトメジン結合タンパク質；ソナーミン；スパルフォシック酸；スピカマイシンＤ；スピロマスティン；スプレノペンティン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分割阻害剤；スティピアミド；ストロメリシン阻害剤；サルフィノジン；超活性な血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；サラディスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスティン；タモキシフェンメチオジド；タウロマスティン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスティン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチンミメティック；チマルファジン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプロプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンティン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシビリン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；テュロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレゾール；ベラミン；アメリカツリスガラ；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンザルティン；Ｖｉｔａｘｉｎ（登録商標）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラティン；ジラスコルブ；および、ジノスタチンスチマラマー。追加の抗癌剤は、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンである。これらの２つの薬剤は、サリドマイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤を使用する方法で使用される場合、特に有用である。いくつかの実施形態では、本開示のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、ゲムシタビンと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質は、手術前、手術中、または手術後に投与される。
【０１７７】
ＤＬＬ３発現の検出およびＤＬＬ３関連癌の診断の方法
本開示の別の実施形態によると、インビトロまたはインビボでのＤＬＬ３の発現を検出するためのキットが提供される。キットは、前述のＤＬＬ３結合タンパク質、ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質（例えば、標識された抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体あるいはその抗原結合性フラグメントを含む、三重特異性タンパク質）、および標識を検出するための１つ以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、ラベルは、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、および発色団標識からなる群から選択される。
【０１７８】
場合によっては、ＤＬＬ３発現は生体試料中で検出される。試料は、限定されないが、生検、剖検、および病理標本からの組織を含む、任意の試料であってもよい。生体試料には、組織の切片、例えば、組織学的な目的のために得られた凍結切片も含まれる。生体試料は、血液、血清、血漿、唾液、髄液、または尿などの体液をさらに含む。生体試料は、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物から典型的に得られる。
【０１７９】
一実施形態では、被験体の試料を、本明細書で開示される抗ＤＬＬ３の単一ドメイン抗体または抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質と接触させることによって、被験体が癌を抱えているかどうかを決定し；および、上記試料への単一ドメイン抗体の結合を検出する方法が提供される。対照試料への抗体の結合と比較して、試料への抗体の結合が増大することで、被験体が癌を抱えていると同定される。
【０１８０】
別の実施形態では、癌と診断された被験体の試料を、本明細書で開示される抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体または抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質と接触させることによって、被験体における癌の診断を確認し；および、上記試料への抗体の結合を検出する方法が提供される。対照試料への抗体の結合と比較して、試料への抗体の結合が増大することで、被験体における癌の診断が確認される。
【０１８１】
本開示の方法のいくつかの例では、ＤＬＬ３結合タンパク質、または三重特異性タンパク質のＤＬＬ３結合単一ドメイン抗体は、直接標識される。いくつかの例では、上記方法は、抗ＤＬＬ３単一ドメイン抗体あるいは抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質に特異的に結合する第２の抗体を、試料と接触させること；および、上記第２の抗体の結合を検出することをさらに含む。対照試料への第２の抗体の結合と比較して、試料への第２の抗体の結合が増大すると、被験体において癌が発見されるか、または被験体における癌の診断が確認される。場合によっては、癌は、神経内分泌癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、扁平上皮癌、膵臓癌、胆管細胞癌、トリプルネガティブ乳癌、または卵巣癌、あるいはＤＬＬ３を発現する他の型の癌である。いくつかの例では、対照試料は、癌を抱えていない被験体からの試料である。特定の例では、試料は、血液試料または組織試料である。
【０１８２】
場合によっては、ＤＬＬ３に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は、検出可能なラベルを用いて直接標識される。別の実施形態では、ＤＬＬ３（第１の抗体）に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体が標識されず、および、第２の抗体またはＤＬＬ３を特異的に結合する抗体に結合することができる他の分子が標識される。第２の抗体は、第１の抗体の特定の種およびクラスを特異的に結合することができるように選択される。例えば、第１の抗体がラマＩｇＧである場合、二次抗体は抗ラマＩｇＧであり得る。抗体に結合することができる他の分子としては、限定されることなく、プロテインＡとＧタンパク質が挙げられ、その両方は市販されている。抗体または二次抗体に適切な標識は上に記載されるものであり、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、および放射性物質を含む。適切な酵素の非限定的な例としては、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼを含む、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的な発光材料はルミノールであり、非限定的な例示的な磁性剤はガドリニウムであり、非限定的な例示的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【０１８３】
代替的な一実施形態では、ＤＬＬ３は、検出可能な物質で標識されたＤＬＬ３基準物質と、ＤＬＬ３に特異的に結合する標識されていない抗体とを利用する競合免疫測定法によって、生体試料中で分析することができる。このアッセイでは、生体試料、標識されたＤＬＬ３基準物質、およびＤＬＬ３に特異的に結合する抗体は組み合わせられ、標識されていない抗体に結合する標識されたＤＬＬ３標準物質の量が決定される。生体試料中のＤＬＬ３の量は、ＤＬＬ３に特異的に結合する抗体に結合される、標識されたＤＬＬ３標準物質の量に反比例する。
【０１８４】
本明細書で開示される免疫測定法および方法は、多くの目的に使用することができる。一実施形態では、ＤＬＬ３に特異的に結合する抗体は、細胞培養中の細胞においてＤＬＬ３の産生を検出するために使用されてもよい。別の実施形態では、抗体は、組織試料などの生体試料、または血液試料あるいは血清試料中のＤＬＬ３の量を検出するために使用することができる。いくつかの例では、ＤＬＬ３は細胞表面ＤＬＬ３である。他の例では、ＤＬＬ３は、可溶性ＤＬＬ３（例えば、血液試料または血清試料などの体液試料中の細胞培養上清中のＤＬＬ３または可溶性ＤＬＬ３）である。
【０１８５】
一実施形態では、血液試料または組織試料などの生体試料中のＤＬＬ３を検出するためのキットが提供される。例えば、被験体における癌診断を確認するために、生検を実施して、組織学的検査のための組織試料を得ることができる。あるいは、血液試料を得て、可溶性ＤＬＬ３タンパク質またはフラグメントの存在を検出することができる。ポリペプチドを検出するためのキットは、典型的には、ＤＬＬ３に特異的に結合する、本開示による単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメント、ＶＨドメイン、またはＦａｂがキットに含まれている。さらなる実施形態では、抗体は標識される（例えば、蛍光性標識、放射性標識、または酵素標識を用いて）。
【０１８６】
一実施形態では、キットは、ＤＬＬ３に結合する抗体の使用方法を開示する教材を含む。例えば、上記教材は、電子形態（コンピューター・ディスケットまたはコンパクトディスクなど）で書かれているか、または視覚的なもの（動画ファイルなど）であり得るか、または電子ネットワークを介して、例えば、インターネット、ワールド・ワイド・ウェブ、イントラネットあるいは他のネットワーク上で提供され得る。キットはさらに、キットが設計されている特定の用途を容易にするために、さらなる構成要素を含む場合がある。したがって、例えば、キットは、標識（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するフィルターセット、または二次抗体などの適切な二次標識など）を検出する手段をさらに含む場合がある。キットは、緩衝剤、および特定の方法を実施するために慣例的に使用される他の試薬をさらに含んでもよい。そのようなキットおよび適切な内容物は当業者に周知である。
【０１８７】
一実施形態では、診断キットは免疫測定法を含む。免疫測定法の詳細は使用される特定のフォーマットにより変化する可能性があるが、生体試料中のＤＬＬ３を検出する方法は、一般に、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下でＤＬＬ３ポリペプチドに特異的に反応する抗体と接触させる工程を含む。抗体は、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合して免疫複合体を形成し、免疫複合体（結合した抗体）の存在は、直接または間接的に検出される。
【０１８８】
細胞表面マーカーの有無を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、抗体は、限定されないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド状の磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、または薬物を含む、他の化合物に結合することができる。抗体は、限定されないが、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学的アッセイなどの免疫測定法で利用することもできる。抗体は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に使用することもできる。ＦＡＣＳは、細胞を分離または選別するために、より高度なレベルの検出の中でも、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャンネル、およびインピーダンスチャネルを使用する（米国特許５，０６１，６２０号を参照）。本明細書で開示されるＤＬＬ３に結合する単一ドメイン抗体のいずれも、これらのアッセイで使用することができる。したがって、抗体は、限定されることなく、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学的検査、ウェスタンブロット、または免疫沈降を含む、従来の免疫測定法で使用することができる。
【実施例】
【０１８９】
実施例１：ＤＬＬ３結合ドメインの特定のためのファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞で発現した、精製されたＤＬＬ３タンパク質を用いて、ラマを免疫化した。重鎖可変抗体ドメインの発現のためのファージディスプレイライブラリーを、循環Ｂ細胞から構築した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，ｄｅ  Ｇｅｕｓ，Ｓｔｏｋ，Ｂｏｓ，ｖａｎ  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ｖｅｒｒｉｐｓ，ａｎｄ  Ｆｒｅｎｋｅｎ．２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４０：１８５−１９５を参照）。大腸菌においてクローンを発現させ、ペリプラズム抽出物を調製し、およびＥＬＩＳＡによってＤＬＬ３結合活性について上記クローンをスクリーニングすることによって、ＤＬＬ３への結合についてファージクローンをスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニング（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜５２）において、シグナルを生成した５２の固有の重鎖のみの単一ドメイン抗体を同定した。これらの重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４４３〜４９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８８５〜９３６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３２７〜１３７８であった。
【０１９０】
実施例２：ＤＬＬ３結合単一ドメイン抗体のヒト化およびＴ細胞依存性細胞傷害アッセイ
実施例１から３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５３〜８６）の例示的なラマ抗ＤＬＬ３重鎖のみの単一ドメイン抗体をヒト化した。３４の重鎖単一ドメイン抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４９５〜５２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９３７〜９７０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３７９〜１４１２であった。
【０１９１】
シグナルドメインと、それに続く抗ＤＬＬ３重鎖のみの可変ドメインと、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０８）と、それに続く抗ヒトアルブミン単一ドメイン抗体１０Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７７４）と、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０８）と、それに続く抗ヒトＣＤ３抗体２Ｂ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７９３）と、それに続くＨＨＨＨＨＨタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８１９）を含む、発現構築物において、ヒト化された抗ＤＬＬ３配列を発現ベクターへとクローン化し、抗ＤＬＬ３三重特異性構築物を生成した。
【０１９２】
次いで、ヒト化された抗ＤＬＬ３結合配列を含む抗ＤＬＬ３三重特異性構築物を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞へとトランスフェクトした。これらの抗ＤＬＬ３三重特異性構築物をプロテインＡ結合部位を用いて操作し、および、トランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３（商標）細胞からの馴化培地中の抗ＤＬＬ３三重特異性構築物の量を、プロテインＡチップを備えたオクテット機器を使用して定量化した。抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質と同様の分子量の三重特異性タンパク質を、基準として使用した。
【０１９３】
既知の濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を含む馴化培地を使用して、ヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３タンパク質に対する抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の結合親和性を測定し、および、ＤＬＬ３タンパク質をヒトＩｇＧ１−Ｆｃ融合として発現させる方法を使用して、抗ヒトＦｃチップを備えたオクテット機器を用いて測定を実施した。単一の５０ｎＭの濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用して、ＫＤ測定を行い、これにより、効力に基づいたランク付け（ｒａｎｋ  ｏｒｄｅｒｉｎｇ）が可能になった。上記のように測定された相対親和度を表１に表記する。配列はすべて、０．５〜４２ｎＭの範囲の相対親和度（ＫＤ）でヒトＤＬＬ３に結合することが分かった。配列の一部は、ヒトＤＬＬ３と同様の親和性でカニクイザルＤＬＬ３に結合することがわかり、カニクイザルＤＬＬ３へのそれらの配列の結合の相対親和度を表１に示す。
【０１９４】
馴化培地を、Ｔ細胞依存性細胞傷害アッセイでも試験した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ＡＡ，  Ａｒｃｈｉｂｅｑｕｅ  ＩＬ，Ｎｇｕｙｅｎ  ＹＨ，Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＡＭ，Ｐｏｗｅｒｓ  ＤＡ．２０１５．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９−２７を参照）。このアッセイでは、ルシフェラーゼ標識ＤＭＳ−１５３細胞（小細胞肺癌細胞株；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２０６４（商標））を、ドナーからの精製されたヒトＴ細胞と組み合わせ、および抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の滴定を試験した。
【０１９５】
抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質が、ＤＬＬ３を発現するＤＭＳ−１５３細胞を死滅させるようにＴ細胞を導いた場合、実験の開始から４８時間後にルシフェラーゼアッセイを実行することにより決定されるＤＭＳ−１５３細胞の生存率は減少するはずであるという仮定を立てた。
【０１９６】
代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す図２−６で示されるように、いくつかの例示的な抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質は、ＤＭＳ−１５３細胞の生存率を減少させることができた。図２は、ＤＬＬ３結合ドメインＤＨ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５９）、ＤＨ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５５）、ＤＨ６７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４２）、およびＤＨ５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７３）を含む、抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質についてのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。図３は、ＤＬＬ３結合ドメインＤＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６０）、ＤＨ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６８）、ＤＨ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５４）、およびＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５）を含む、抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質についてのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。図４は、ＤＬＬ３結合ドメインＤＨ８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８１）、ＤＨ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６２）、ＤＨ８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８４）、およびＤＨ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５８）を含む、ＤＬＬ３三重特異性タンパク質についてのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。図５は、ＤＬＬ３結合ドメインＤＨ８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８２）、ＤＨ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５６）、ＤＨ６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７６）、およびＤＨ２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６４）を含む、ＤＬＬ３三重特異性タンパク質についてのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。図６は、ＤＬＬ３結合ドメインＤＨ５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７４）およびＤＨ７０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７９）を含む、ＤＬＬ３三重特異性タンパク質についてのＴＤＣＣアッセイの結果を示す。ＴＤＣＣアッセイの陰性対照は、ＤＭＳ−１５３細胞を死滅するようにＴ細胞を導かなかった、ＤＬＬ３の代わりにＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質（図６に示されるような）であった。ＴＤＣＣアッセイのＥＣ５０値も表１に表記する。これらの値は６９ｐＭ〜１１ｎＭの範囲であった。
【０１９７】
【表１】
2022502371.tif 000003
【０１９８】
実施例３：前述の実施例からの２つのヒト化ＤＬＬ３単一ドメイン抗体を使用した、より高い結合親和性を有するＤＬＬ３結合ドメインの同定のためのファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
ヒト化抗体配列のうちの２つ、ＤＨ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６８）およびＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５）を、ファージディスプレイライブラリーを作成するための出発点として使用した（ＷＯ２０１６１８７１０１Ａ２に記載される方法に従って）。その後、抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を生成するために、このパニングからの抗ＤＬＬ３の配列を、シグナルドメインと、それに続く抗ＤＬＬ３重鎖のみの可変ドメインと、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０８）と、それに続く抗ヒトアルブミン単一ドメイン抗体ドメインと、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０８）と、それに続く抗ヒトＣＤ３抗体フラグメントと、それに続くＨＨＨＨＨＨタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８１９）を含む発現構築物において、発現ベクターへとクローン化した。これらの構築物を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞へとトランスフェクトし、発現された抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を、実施例２で記載されるように定量化した。パニングから同定されたクローンの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８７〜３６７である。表２は、ファージディスプレイの選択後に、ＤＨ４３  ＤＬＬ３バインダー配列（ｂｉｎｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）において得られたＣＤＲ変異を提供する。パニングから同定されたクローンのうちの３つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９９（２Ｅ０５）、３３０（４Ｄ０９）、および３６５（４Ｈ０１１）を、変異体を生成するように操作し、ここで、例えば、親配列の可能性のある代謝の傾向性を取り除くために、各変異体は親配列からの単一のアミノ酸変化を有していた。特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２７（２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｙ）、２２８（２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｑ）を含むＤＬＬ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９９（２Ｅ０５）の操作された変異体であった；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６６（４Ｄ０９−Ｍ３４Ｌ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３３０（４Ｄ０９）の操作された変異体であった；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６７（４Ｈ１１−Ｍ３４Ｌ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６５（４Ｈ０１１）の操作された変異体であった。パニングによって同定されたこれらのＤＬＬ３結合クローンのＣＤＲ１配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５２９〜８０９であり、パニングによって同定されたＤＬＬ３結合クローンのＣＤＲ２配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９７１〜１２５１であり、パニングによって同定されたＤＬＬ３結合クローンのＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４１３〜１６９１である。
【０１９９】
【表２】
2022502371.tif 000004
【０２００】
既知の濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を有する馴化培地を使用して、ヒトＤＬＬ３タンパク質のビオチン化されたバージョンをヒトＩｇＧ１融合タンパク質として発現させる方法を用いて、ヒトＤＬＬ３タンパク質に対する抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の結合親和性を測定し、その結合親和性測定は、ストレプトアビジンチップを備えたオクテット機器で行った。単一の５０ｎＭの濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用してＫＤ測定を行い、これにより、効力のランク付けが可能になった。この実験では、親和性成熟クローンの相対的なＫＤ値は、表３に表記されるように、２．３ｎＭ〜６４ｎＭの範囲であった。親のバインダーであるＤＨ４３およびＤＨ６はそれぞれ、４回のトランスフェクションからの馴化培地の４つの試料に基づいて、７．７±０．６ｎＭ、および９．９±０．３ｎＭのＫＤ値を有していた。
【０２０１】
このラウンドのパニングで同定されたＤＬＬ３バインダー分子、ならびに、親ＤＬＬ３バインダーであるＤＨ４３およびＤＨ６を選択するために、ヒトＤＬＬ３のより正確な親和性測定を、６０ｎＭ、２０ｎＭ、６．６７ｎＭ、および２．２２ｎＭの濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用して行った。加えて、相対親和度測定を、６０ｎＭの抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質のみを使用して行った。特定の抗ＤＬＬ３結合分子のより正確な測定から決定された結合親和性を、表４に表記する［１Ｈ０１２  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２）；１Ａ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９５）；２Ｅ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９９）；４Ｈ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６５）；３Ｃ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５１）；２Ｅ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９８）；２Ｈ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２１）；３Ａ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３８）；３Ａ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３０）；４Ｄ０９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３０）；ＤＨ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８）；および、ＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５）］。この試験では、親バインダー（ＤＨ４３）は８．９ｎＭのＫＤ値を有していたが、最も高い親和性の娘分子（１Ｈ０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６２））は２．９ｎＭの親和性を有していた。さらに、１Ｈ０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６２）は、カニクイザルＤＬＬ３にも結合する能力を保持していた。さらに、この試験では、親バインダー（ＤＨ６）は９．０ｎＭのＫＤ値を有していたが、最も高い親和性の娘分子（４Ｈ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６５））は３．９ｎＭの親和性を有していた。さらに、４Ｈ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６５）は、カニクイザルＤＬＬ３にも結合する能力を保持していた。
【０２０２】
このラウンドのパニングで同定された２２のＤＬＬ３バインダー分子を選択し、実施例２に記載されるプロトコルと同じプロトコルを使用して、ＤＭＳ−１５３細胞を用いたＴＤＣＣアッセイで試験を行った。例示的なＴＤＣＣデータは、図７〜１１中のグラフとしてのプロットであり、ＥＣ５０値の要約を表５に表記する。この実験では、親のＤＬＬ３分子（ＤＨ４３とＤＨ６）は、２００ｎＭおよび３４０ｎＭのＥＣ５０値をそれぞれ有していた。ＤＨ４３の最も強力な娘分子は１Ｈ０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６２）であり、ＥＣ５０値は２８ｎＭであり、親のＤＬＬ３バインダーであるＤＨ４３と比較して、ＴＤＣＣ効力の７倍を超える増大を示した。ＤＨ６の最も強力な娘分子は４Ｈ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６５）であり、ＥＣ５０値が３６ｎＭであり、それにより、親のＤＬＬ３バインダー分子と比較して、ＴＤＣＣ効力の８倍を超える増大を示した。対照として使用される、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性タンパク質は、このアッセイでは活性を有していなかった（図１１に示されるように）。
【０２０３】
【表３−１】
2022502371.tif 000005
【０２０４】
【表３−２】
2022502371.tif 000006
【０２０５】
【表４】
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【０２０６】
【表５】
2022502371.tif 000008
【０２０７】
実施例４：実施例３から選択されたＤＬＬ３結合分子の哺乳動物細胞へのクローニング
実施例３に記載される抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質、ならびに、親のＤＬＬ３バインダー分子を、ＣＨＯ細胞発現ベクターへとサブクローン化し、ＣＨＯ細胞中で安定してトランスフェクトした（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ  ２００４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０−８８９を参照）。ＤＬＬ３バインダー分子は以下のとおりであった：２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｑ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２８）；２Ｃ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８１）；４Ｄ０９−Ｍ３４Ｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６６）；４Ｄ０９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３０）；２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２２７）；１Ｈ０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２）（本明細書において１Ｈ１２とも呼ばれる）；２Ｅ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９９）；２Ｈ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２１）；４Ｄ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３２）（本明細書において４Ｄ１１とも呼ばれる）；２Ｅ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９８）；４Ｈ１１−Ｍ３４Ｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６７）；１Ａ０１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９５）（本明細書において１Ａ１１とも呼ばれる）；ＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５）；および、ＤＨ４３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８）。抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を、プロテインＡおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、安定したクローンのプールからの馴化培地におけるＣＨＯ細胞での発現後に精製した。精製したタンパク質を、実施例２に記載される方法と同じ方法を使用して、ＴＤＣＣアッセイを試験した。本実施例のＴＤＣＣアッセイからのＥＣ５０値を表６に表記し、データのグラフを図１２−１５に示す。最も強力な分子（２Ｅ０５−Ｍ１０６Ｑ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２８））は、４１ｎＭのＥＣ５０価を有しており、親の分子（ＤＨ４３）よりも６．６倍強力である。ＤＨ６に由来する最も強力な分子は４Ｄ０９−Ｍ３４Ｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６６）であり、これは５４ｎＭのＥＣ５０価を有しており、親の分子（ＤＨ６）よりも４．４倍強力である。
【０２０８】
【表６】
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【０２０９】
実施例５：親和性が改善された抗ＤＬＬ３バインダーを得るための親和性成熟
より強力な抗ＤＬＬ３バインダーを得るために、２ラウンド目の親和性成熟を実施した。ファージディスプレイライブラリーを、ＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５）およびＤＨ５８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７４）の親配列に基づいて作成した。このラウンドの親和性成熟からのバインダーの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３６８〜４４２で提供される。このラウンドの親和性成熟から同定されたＤＬＬ３バインダーのＣＤＲ１配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８１０〜８８４であり、このラウンドの親和性成熟から同定されたＤＬＬ３バインダーのＣＤＲ２配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２５２〜１３２６であり、このラウンドの親和性成熟から同定されたＤＬＬ３バインダーのＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６９２〜１７６８である。表７は、ファージディスプレイ選択後にＤＨ６  ＤＬＬ３バインダー配列で得られたＣＤＲ変異を提供する。
【０２１０】
シグナルドメインと、それに続く抗ＤＬＬ３配列と、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １８０８）と、それに続く抗ヒトアルブミン単一ドメイン抗体１０Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７７４）と、それに続くＧＧＧＧＳＧＧＧＳリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０８）と、それに続く、抗ヒトＣＤ３抗体２Ｂ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７９３）と、それに続くＨＨＨＨＨＨタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８１９）を含む発現構築物において、上記ように同定された親和性成熟抗ＤＬＬ３配列を発現ベクターへとクローン化して、抗ＤＬＬ３三重特異性構築物を生成した。
【０２１１】
次いで、親和性成熟抗ＤＬＬ３結合配列を含む抗ＤＬＬ３三重特異性構築物を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞へとトランスフェクトした。その後、これらの抗ＤＬＬ３三重特異性構築物を、プロテインＡ結合部位を用いて操作し、および、トランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３（商標）細胞からの馴化培地中の抗ＤＬＬ３三重特異性構築物の量を、プロテインＡチップを備えたオクテット機器を使用して定量化した。抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質と同様の分子量の対照三重特異性タンパク質を、基準として使用した。
【０２１２】
既知の濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を有する馴化培地を使用して、ヒトＤＬＬ３タンパク質のビオチン化されたバージョンをヒトＩｇＧ１融合タンパク質として発現させる方法を用いて、ヒトＤＬＬ３タンパク質への抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の相対的結合親和性を測定し、その結合親和性測定は、ストレプトアビジンチップを備えたオクテット機器で行った。単一の５０ｎＭの濃度の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質を使用してＫＤ測定を行い、これにより、効力のランク付けが可能になった。測定した親和性を、表８に表記する。試験した配列はすべて、０．３ｎＭ〜３４ｎＭの範囲のＫＤ値でヒトＤＬＬ３に結合することがわかった。
【０２１３】
馴化培地をＴ細胞依存性細胞傷害アッセイでも試験した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ＡＡ，Ａｒｃｈｉｂｅｑｕｅ  ＩＬ，Ｎｇｕｙｅｎ  ＹＨ，Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＡＭ，  Ｐｏｗｅｒｓ  ＤＡ．２０１５．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９−２７）。このアッセイでは、ルシフェラーゼ標識ＤＭＳ−１５３細胞を、精製したヒトＴ細胞と組み合わせ、および、抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の滴定を行った。抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質が、ＤＬＬ３を発現するＤＭＳ−１５３細胞を死滅させるようにＴ細胞を導く場合、実験の開始から４８時間後にルシフェラーゼアッセイを実行することにより決定されるＤＭＳ−１５３細胞の生存率は減少するはずであるという仮定を立てた。図１６は、以下のＤＬＬ３結合ドメイン：５１Ａ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０９）、５１Ｇ０２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２５）、５２Ｂ０１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３０）、５２Ｃ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３１）、５１Ａ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１１）、５２Ｄ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３２）、５１Ｅ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２０）、５１Ｈ０５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２９）を含む抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質、および精製したＤＨ４３タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８）、ならびに精製したＤＨ６タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５）の代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す。ＴＤＣＣアッセイからのＥＣ５０値を表９に表記する。上記値は、４．２ｐＭ〜１．５ｎＭの範囲であった。ＴＤＣＣアッセイの陰性対照は、ＤＭＳ−１５３細胞を死滅させるようにＴ細胞を導かなかった、ＤＬＬ３の代わりにＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質（図１６に示されるような）であった。
【０２１４】
【表７】
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【０２１５】
【表８−１】
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【０２１６】
【表８−２】
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【０２１７】
【表８−３】
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【０２１８】
【表９−１】
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【０２１９】
【表９−２】
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【０２２０】
【表９−３】
2022502371.tif 000016
【０２２１】
実施例６：親和性が改善された抗ＤＬＬ３バインダーを得るための親和性成熟
実施例５に記載されるアッセイで最も強力なＴＤＣＣ活性を有していたＤＬＬ３結合配列を含む特定の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質と、親のＤＬＬ３バインダーＤＨ６を含む抗ＤＬＬ３の三重特異性タンパク質とを、ＣＨＯ細胞発現ベクターへとサブクローン化し、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトした（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ  ２００４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：８８０−８８９を参照）。ＤＬＬ３結合配列は以下のとおりであった：ＤＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５）；５１Ａ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０８）；５１Ａ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１１）；５１Ｆ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２３）；５１Ｇ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２５）；５１Ｇ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２７）；５１Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２９）；５１Ｘ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８８６）；５２Ｂ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３０）；５２Ｃ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３１）；および、５２Ｄ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３２）。三重特異性タンパク質を、プロテインＡおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、安定したクローンのプールから馴化培地へと精製した。精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像が図１７で提供される。
【０２２２】
オクテットストレプトアビジンチップ上で固定された、６０ｎＭ、２０ｎＭ、６．６７ｎＭ、および２．２２ｎＭの濃度のビオチン化ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用して、ヒトとカニクイザルのＤＬＬ３の親和性測定を行った。上記測定から決定された親和性を、表１０に表記する。この実験では、親和性成熟ＤＬＬ３バインダー配列に対する親のＤＬＬ３バインダー配列である、ＤＨ６を含む抗ＤＬＬ３三重特異性は、ヒトＤＬＬ３で１３．５ｎＭ、およびカニクイザルＤＬＬ３で１１ｎＭのＫＤ値であった。それに対し、この実験で試験された親和性成熟ＤＬＬ３バインダー分子を含む１０の抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質は、ヒトＤＬＬ３で０．９〜２．２ｎＭの範囲のＫＤ値、およびカニクイザルＤＬＬ３で１．４〜３．４ｎＭの範囲のＫＤ値を有していた。したがって、親和性の改善は、ヒトＤＬＬ３で６．１〜１５倍の範囲、およびカニクイザルＤＬＬ３で３．２〜７．９倍の範囲であった。
【０２２３】
ＤＬＬ３を発現する２つの追加の細胞株（ＤＭＳ−５３およびＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ）がアッセイに含まれていることを除いて、実施例２に記載される方法と同じ方法を使用して、精製されたタンパク質をＴＤＣＣアッセイで試験した。これらのＴＤＣＣアッセイからのＥＣ５０値が表１１に表記され、ＤＭＳ−５３およびＤＭＳ−１５３のＴＤＣＣデータのグラフが図１８−１９にそれぞれ提供される。ＧＦＰを標的とする三重特異性分子は、これらのアッセイでは活性を有していなかった（図１８−１９に示されるように）。親の分子ＤＨ６と比較して、ＥＣ５０値が、ＤＭＳ−１５３細胞で２．３〜１２．１倍、ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞で４．５〜３１．５倍、ＤＭＳ−１５３細胞で８．１〜２６．１倍改善された。
【０２２４】
【表１０】
2022502371.tif 000017
【０２２５】
【表１１】
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【０２２６】
実施例７：本開示のＤＬＬ３結合タンパク質を含む例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を使用する、Ｔ細胞依存性細胞傷害アッセイ
本開示のＤＬＬ３結合ドメイン（５２Ｄ０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４３２））を含むいくつかの例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質を、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイで試験し（Ｎａｚａｒｉａｎ  ＡＡ，Ａｒｃｈｉｂｅｑｕｅ  ＩＬ，Ｎｇｕｙｅｎ  ＹＨ，Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＡＭ，Ｐｏｗｅｒｓ  ＤＡ．２０１５．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９−２７を参照）、その結果を図２２−２４に示す。三重特異性タンパク質は、図２０に示されるように、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３構成（ＴＡＣ）において、あるいは、図２１に示されるように、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成において、ＤＬＬ３結合ドメイン、アルブミン結合ドメイン（抗ＡＬＢ）、およびＣＤ３結合ドメイン（抗ＣＤ３）を含んでいた。ＴＤＣＣアッセイを、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下で実行した。このアッセイでは、ルシフェラーゼ標識ＮＣＩ−Ｈ２１７１（図２２）、ＤＭＳ−７９（図２３）、ＳＨＰ７７（図２４）、またはＷＭ２６６４（図２５）の細胞を、精製されたヒトＴ細胞と組み合わせ、および、アルブミンの存在下または非存在下で、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の滴定を行った。抗ＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質が、ＤＬＬ３を発現するＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＤＭＳ−７９、ＳＨＰ７７、またはＷＭ２６６４の細胞を死滅させるようにＴ細胞を導く場合、実験の開始から４８時間後にルシフェラーゼアッセイを実行することにより決定される、ＤＭＳ−１５３細胞の生存率が減少するはずであるという仮定を立てた。図２２は、ＮＣＩ−Ｈ２１７１細胞を使用した、以下のＤＬＬ３結合ドメインを含む、ＴＡＣまたはＣＡＴ構成のＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質の代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す。図２３は、ＤＭＳ−７９細胞を使用した、以下のＤＬＬ３結合ドメインを含む、ＴＡＣまたはＣＡＴの構成のＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質の代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す。図２４は、ＳＨＰ７７細胞を使用した、以下のＤＬＬ３結合ドメインを含む、ＴＡＣまたはＣＡＴの構成のＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質の代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す。図２５は、ＷＭ２６６４細胞を使用した、以下のＤＬＬ３結合ドメインを含む、ＴＡＣまたはＣＡＴの構成のＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質の代表的なＴＤＣＣデータのグラフを示す。ＴＤＣＣアッセイのＥＣ５０値が表１２に表記される。グラフ中に示され、かつＥＣ５０値によって示されるように、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下において、ＣＡＴ配向を有するＤＬＬ３結合三重特異性タンパク質（図２１）は、ＴＤＣＣアッセイにおいて、ＴＡＣ構成を有するＤＬＬ３三重特異性タンパク質よりも強力であった。
【０２２７】
【表１２】
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【０２２８】
実施例８：ヒトＴ細胞への例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の結合
細胞結合試験では、ヒトＴ細胞を、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の存在下または非存在下で培養した（抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１；あるいは、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０）のいずれかで）。ヒトＴ細胞を、二次抗体（抗三重特異性抗体）を用いてさらに培養し、その二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に結合された、例示的な三重特異性分子中の抗アルブミンドメインを認識することができる。抗三重特異性抗体の結合をフローサイトメトリーによって測定した。二次抗体単独を用いて培養された細胞、または例示的な三重特異性タンパク質あるいは二次抗体なしで培養された細胞（図２６におけるプロット中の左ピーク）と比較して、抗三重特異性抗体の頑強な結合が、抗ＤＬＬ３：抗ＡＬＢ：抗ＣＤ３（ＴＡＣ）構成の例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質の存在下で見られた（図２６におけるプロット中の右ピーク）。二次抗体単独を用いて培養された細胞、または例示的な三重特異性タンパク質あるいは二次抗体を用いずに培養された細胞（図２７におけるプロット中の左ピーク）と比較して、抗三重特異性抗体の頑強な結合が、抗ＣＤ３：抗ＡＬＢ：抗ＤＬＬ３（ＣＡＴ）構成の例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質の存在下で見られた（図２７におけるプロット中の右ピーク）。
【０２２９】
実施例９：癌細胞株を発現するＤＬＬ３への例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の結合
別の結合試験では、癌細胞［ＮＣＩ−Ｈ８２（肺癌細胞株）、ＳＨＰ７７（肺癌細胞株）、ＤＭＳ５３（肺癌）、またはＮＣＩ−Ｈ２１７１（肺癌細胞株）］を発現するＤＬＬ３を、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴまたはＴＡＣの構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１）またはＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子を用いて培養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、結合されていない三重特異性分子を取り除き、および、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７あるいはＦＩＴＣに結合した三重特異性分子中の抗アルブミンのドメインを認識することができる二次抗体でさらに培養した。細胞への例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子の結合、または、細胞への対照の三重特異性分子の結合を、フローサイトメトリーによって測定した。ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子で培養された細胞（図２８におけるプロット中の左ピーク）と比較して、各細胞株へのＤＬＬ３標的化三重特異性（ＴＡＣ構成）の頑強な結合が観察された（図２８におけるプロット中の右ピーク）。ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子で培養された細胞（図２９におけるプロット中の左ピーク）と比較して、各細胞株へのＤＬＬ３標的化三重特異性（ＣＡＴ構成）の頑強な結合も観察された（図２９におけるプロット中の右ピーク）。ＤＬＬ３発現を欠く細胞株であるＨＣＴＩ１６（結腸癌細胞株）とＮＣＩ−Ｈ２９２（肺癌細胞株）を用いた対照実験では、同様の量の抗三重特異性抗体が、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質またはＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子（図示せず）で培養された細胞に結合し、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子がＤＬＬ３発現を欠く細胞には結合しなかったことを示す。
【０２３０】
実施例１０：ＤＬＬ３を発現する癌細胞株のＴ細胞媒介性死滅を導く例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の能力
この試験の目標は、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子がＴ細胞に、ＤＬＬ３を表現する細胞株、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＳＨＰ７７、ＤＭＳ５３、およびＮＣＩ−Ｈ２１７１を殺させるように導くことができるか否かを評価することであった。この試験で使用されるＤＬＬ３を表現する細胞を、ルシフェラーゼを発現するように操作した。
【０２３１】
ＴＤＣＣアッセイ（Ｔ細胞依存性細胞傷害アッセイ）では、４人の健康なドナー（ドナー２；ドナー４７；ドナー８１；ドナー８６）のＴ細胞、およびＤＬＬ３を表現する細胞を混合し、その混合物に、様々な量の例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質（ＣＡＴまたはＴＡＣの構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１）を添加した。上記混合物を３７℃で４８時間培養した。対照として、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子を使用して並列実験を実施した。４８時間後、残っている生存可能なＤＬＬ３を表現する細胞の量を、発光アッセイを使用して定量化した。ＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＴＡＣおよびＣＡＴの構成の両方）が、４人の健康なドナー全員からのＴ細胞（ＴＡＣ構成を使用した結果の場合、図３０、３１、３２、および３３を参照；ＣＡＴ構成を使用した結果の場合、図３４、３５、３６、および３７を参照）に、４つのＤＬＬ３を発現する細胞株をすべて死滅させるように効率的に導くことができたが、対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子がそのように効率的に導くことができなかったことが観察された（図３０−３７にも示される）。ＥＣ５０値を表１３および表１４に提示する。さらに、ＤＬＬ３標的ＴｒｉＴＡＣ、およびＤＬＬ３発現、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ならびにＨＣＴ１１６を欠く細胞株を用いて、ＴＤＣＣアッセイを実行した。ＤＬＬ３標的ＴｒｉＴＡＣが、ＤＬＬ３発現を欠くこれらの２つの細胞株を死滅させるようにＴ細胞を導くことができなかったことが観察された（図示せず）。
【０２３２】
【表１３】
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【０２３３】
【表１４】
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【０２３４】
実施例１１：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による、Ｔ細胞のＤＬＬ３依存性活性化
このアッセイでは、異なる４人の健康なドナー（ドナー２；ドナー３５；ドナー４７；およびドナー８６）のＴ細胞およびＮＣＩ−Ｈ８２細胞またはＤＭＳ５３細胞を、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質（ＣＡＴまたはＴＡＣの構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１）で、３７℃で４８時間培養した。同じドナーのＴ細胞を、ＧＦＰおよびＮＣＩ−Ｈ８２またはＤＭＳ５３細胞を標的とする対照三重特異性分子（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）でも、３７℃で４８時間培養した。４８時間後、Ｔ細胞を採取し、Ｔ細胞上でのＣＤ６９およびＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーによって測定した。図３８−４５で見られるように、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞またはＳＨＰ７７細胞、およびＤＬＬ３標的化三重特異性分子の存在下で、ＣＤ６９あるいはＣＤ２５の発現の増加が４人の健康なドナー全員のＴ細胞上で検出されたが、陰性対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣの存在下では検出されなかった。ＤＬＬ３発現を欠くＨＣＴ１１６細胞を用いて並列実験を実施した。ＨＣＴ１１６細胞を用いて試験されたＤＬＬ３三重特異性分子では、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現の増加が観察されなかった（図示せず）。
【０２３５】
実施例１２：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質によって誘導される、Ｔ細胞によるＤＬＬ３依存性サイトカイン産生
このアッセイでは、健康なドナーのＴ細胞およびＮＣＩ−Ｈ８２あるいはＳＨＰ７７細胞を、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴまたはＴＡＣ構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１）で、３７℃で４８時間培養した。同じ被験者のＴ細胞を、ＧＦＰおよびＮＣＩ−Ｈ８２またはＤＭＳ５３細胞を標的とする対照三重特異性分子（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）でも、３７℃で４８時間培養した。４８時間後、馴化培地を採取し、および、馴化培地中に存在する様々なサイトカインの量を、電気化学発光アッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して測定した。ＮＣＩ−Ｈ８２またはＳＨＰ７７細胞およびＤＬＬ３標的化三重特異性分子の存在下で、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαが上記培地中に分泌されたが、対照ＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下では分泌されなかったことが観察された。ＴＡＣ構成のＤＬＬ３標的化三重特異性分子について：ＩＦＮγの産生が図４６および図４７で示される；ＩＬ−２の産生が図４８および４９で示される；ＴＮＦαの産生が図５０および５１で示される。ＣＡＴ構成のＤＬＬ３標的化三重特異性分子について：ＩＦＮγの産生が図５２および５３で示される；ＩＬ−２の産生が図５４および５５で示される；ＴＮＦαの産生が図５６および図５７で示される。
【０２３６】
実施例１３：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による、ＮＣＩ−Ｈ８２異種移植片の成長の阻害
この試験では、０日目に、５×１０６のヒトＴ細胞および５×１０６のＮＣＩ−Ｈ８２小細胞肺癌細胞をマウスに注射した。１〜１０日目に、２０、１００、あるいは５００μｇ／ｋｇの用量の例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴまたはＴＡＣの構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９１）、あるいは５００μｇ／ｋｇの用量の陰性対照ＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣを、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に毎日注射した。７日目から２４日目まで、数日ごとに腫瘍量を測定した。図５８に示されるように、すべての用量のＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質が注射されたマウスにおいて、５００μｇ／ｋｇの用量のＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣが投与されたマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害が観察された。
【０２３７】
実施例１４：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による、ＮＣＩ−Ｈ８２異種移植片の除去
この試験では、０日目に、５×１０６のＮＣＩ−Ｈ８２小細胞肺癌細胞を皮下注射した。８日目にマウスを無作為化し、１匹のマウス当たり２×１０７のヒトＴ細胞を注射した。９〜１８日目に、１、１０、あるいは１００μｇ／ｋｇの用量の例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴ構成；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０）、または１００μｇ／ｋｇの用量の陰性対照ＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣを、マウスの腹腔内に毎日注射した。８日目から２９日目まで、数日ごとに腫瘍量を測定した。図５９に示されるように、１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇの用量のＤＬＬ３標的化三重特異性分子が注射されたマウスにおいて、１００μｇ／ｋｇの用量のＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣが投与されたマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害が観察された。
【０２３８】
実施例１５：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による、ＳＨＰ７７異種移植片の成長の阻害
この試験では、０日目に、５×１０６のヒトＴ細胞および１×１０７のＳＨＰ７７小細胞肺癌細胞をマウスに注入した。１〜１０日目に、１、１０、あるいは１００μｇ／ｋｇの用量のＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴ構造；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９０）、または１００μｇ／ｋｇの用量の陰性対照ＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣを、マウスの腹腔内に毎日注射した。６日目から２８日目まで、数日ごとに腫瘍量を測定した。図６０に示されるように、１０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇの用量のＤＬＬ３標的化三重特異性分子が注入されたマウスにおいて、１００μｇ／ｋｇの用量のＧＦＰ標的ＴｒｉＴＡＣが投与されたマウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害が観察された。
【０２３９】
実施例１６：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の薬物動態プロファイル
０．３ｍｇ／ｋｇで投与したときのＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の半減期は、カニクイザルでは最大３日〜最大３．９日である。
【０２４０】
本試験では、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子（ＣＡＴ構成またはＴＡＣの構成にある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９０とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８９１）０．３ｍｇ／ｋｇの投与量をカニクイザルに静脈内注入してから、注入後様々な時点で血清試料を採取した。２匹のカニクイザルに各投与量を注入した。電気化学発光アッセイにおいてＤＬＬ３標的化三重特異性分子を認識する抗イディオタイプ抗体を使用して、血清中のＤＬＬ３標的化三重特異性分子の量を測定した。図６１は、様々な時点での血清中なＤＬＬ３標的化三重特異性分子の量に関するプロットを示す。その後、このデータを使用して、表１５で提供されるようにＤＬＬ３標的化三重特異性分子の薬物動態特性を算出した。この薬物動態データに基づき、ヒトを対象とする週に１回または２回の投与スケジュールを企図した。
【０２４１】
【表１５】
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【０２４２】
１または１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＤＬＬ３標的化三重特異性分子の半減期は、カニクイザルでは最大２．８日〜最大３．３日である。
【０２４３】
本試験では、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性分子１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの投与量をカニクイザルに静脈内注入してから、注射後の様々な時点で血清試料を採取した。２匹のカニクイザルに各投与量を注入した。電気化学発光アッセイにおいてＤＬＬ３標的化ＴｒｉＴＡＣを認識する抗イディオタイプ抗体を使用して、血清中のＤＬＬ３標的化ＴｒｉＴＡＣの量を測定した。図６２は、様々な時点での血清中なＤＬＬ３標的化三重特異性分子の量に関するプロットを示す。その後、このデータを使用して、表１６で提供されるようにＴｒｉＴＡＣ分子の薬物動態特性を算出した。この薬物動態データは、ヒトを対象に週に１回または２回投与することを示唆している。
【０２４４】
【表１６】
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【０２４５】
最大１０ｍｇ／ｋｇの単回投与量を投与したとき、例示的なＤＬＬ３三重特異性タンパク質はカニクイザルに対して忍容性を示した。
【０２４６】
主に例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質（ＣＡＴ構成にある）を１０ｍｇ／ｋｇ用量で投与したときに、血清中サイトカイン値の一時的な上昇を認めた（図６３を参照。ＩＦＮγは１番目のパネルに、ＩＬ−６は２番目のパネルに、ＩＬ−１０は３番目のパネルに示す）。一時的なＴ細胞辺縁趨向とＴ細胞活性化も認めた（図示せず）。終末期と回復安楽死（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）ではＤＬＬ３三重特異性タンパク質に関連する肉眼的な所見も器官重量の差異も認められず、回復安楽死ではＤＬＬ３三重特異性タンパク質に関連する微視的な所見は認められなかった。
【０２４７】
ＤＬＬ３標的化ＴｒｉＴＡＣを保持した細胞がカニクイザルへの投与後に致死活性を導いたことを実証するために、投与の１６８時間後に１０ｍｇ／ｋｇ投与群から採取した血清試料をＤＭＳ５３  ＴＤＣＣアッセイで検査し、解凍したばかりのＤＬＬ３標的化ＴｒｉＴＡＣを比較した。同一の細胞ＤＭＳ５３の細胞致死を血清試料と解凍したばかりのタンパク質に認める（図６４）。これより、ＤＬＬ３標的化ＴｒｉＴＡＣはカニクイザルへの投与後１週間でＴ細胞に標的細胞を死滅させる能力を保持することが示される。
【０２４８】
実施例１７：異種移植片腫瘍モデル
本開示の例示的な抗ＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を異種移植片モデルに対して評価する。
【０２４９】
メスの免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを致死量以下で照射し（２Ｇｙ）、１×１０６のＮＣＩ−Ｈ２８細胞を右背側側腹部の皮下に接種させる。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達すると、動物を３つの処置群へと割り当てる。群２と３（各々８匹の動物）に、１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注入する。３日後、群３の動物に、引き続き例示的なＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質（１、１０、５０、または１００μｇ／ｋｇなど）（ｑｄｘ９ｄ）を計９回、静脈内投与した。群１と２をビヒクルのみで処置する。体重と腫瘍体積を３０日間測定する。
【０２５０】
先の実施例の例示的なＤＬＬ３標的三重特異性タンパク質で処置した動物の腫瘍成長は、ビヒクルで処置した対照群それぞれと比較して統計的に著しく遅れていることが予想される。
【０２５１】
実施例１８：神経内分泌癌患者への例示的なＤＬＬ３三重特異性抗原結合タンパク質（抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質）の投与に対する概念実証臨床試験プロトコル
本試験は、神経内分泌癌に対する処置としての例示的なＤＬＬ３標的抗原結合タンパク質を試験する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
【０２５２】
試験アウトカム
【０２５３】
主要アウトカム：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質の最大耐容量
【０２５４】
副次的アウトカム：例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質のインビトロ応答が臨床応答に関連するかどうかの判定。
【０２５５】
第Ｉ相
【０２５６】
本試験の第Ｉ相セクションで最大耐用量（ＭＴＤ）を求めることとなる。
１．１  本試験の第Ｉ相セクションで最大耐用量（ＭＴＤ）を求める。
１．２  例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質を評価するために、適格基準を満たす患者を本試験に登録する。
１．３  目標は、参加者に重度または対処不可能な副作用を生じさせることなく安全に投与可能である例示的な抗ＤＬＬ３三重特異性タンパク質の最大用量の特定である。投与量は、先の試験に登録された参加者の数、および前記投与量に対する忍容性がどれほど十分なものかに左右される。全参加者が同じ投与量を受けるとは限らない。
【０２５７】
第ＩＩ相
２．１  続く第ＩＩ相セクションではＭＴＤによる処置を行い、その目標を、例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による治療の結果、応答率が少なくとも２０％になるかどうかの判定とする。
第ＩＩ相に対する主要アウトカム−−−例示的なＤＬＬ３標的化三重特異性タンパク質による治療の結果、患者の少なくとも２０％が臨床応答（急激な（ｂｌａｓｔ）応答、軽微な応答、部分的応答、または完全応答）を達成するかどうかの判定。
【０２５８】
適格性：生検により神経内分泌腫瘍と証明されている患者。この患者はソマトスタチン受容体ＰＥＴに対して実証されるようにソマトスタチン受容体が陽性である。
【０２５９】
すべての部位または起源を適格とする。
【０２６０】
機能性腫瘍と非機能性腫瘍を許容する。
【０２６１】
外科的減量の候補とならない患者。
【０２６２】
ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０、１、または２の患者。
【０２６３】
年齢１８歳以上の患者。
【０２６４】
書面のインフォームドコンセント文書を理解でき、これに署名する意思のある患者。
【０２６５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、かつ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施に利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法と構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【０２６６】
【表１７−１】
2022502371.tif 000024
【０２６７】
【表１７−２】
2022502371.tif 000025
【０２６８】
【表１７−３】
2022502371.tif 000026
【０２６９】
【表１７−４】
2022502371.tif 000027
【０２７０】
【表１７−５】
2022502371.tif 000028
【０２７１】
【表１７−６】
2022502371.tif 000029
【０２７２】
【表１７−７】
2022502371.tif 000030
【０２７３】
【表１７−８】
2022502371.tif 000031
【０２７４】
【表１７−９】
2022502371.tif 000032
【０２７５】
【表１７−１０】
2022502371.tif 000033
【０２７６】
【表１７−１１】
2022502371.tif 000034
【０２７７】
【表１７−１２】
2022502371.tif 000035
【０２７８】
【表１７−１３】
2022502371.tif 000036
【０２７９】
【表１７−１４】
2022502371.tif 000037
【０２８０】
【表１７−１５】
2022502371.tif 000038
【０２８１】
【表１８−１】
2022502371.tif 000039
【０２８２】
【表１８−２】
2022502371.tif 000040
【０２８３】
【表１８−３】
2022502371.tif 000041
【０２８４】
【表１８−４】
2022502371.tif 000042
【０２８５】
【表１８−５】
2022502371.tif 000043
【０２８６】
【表１８−６】
2022502371.tif 000044
【０２８７】
【表１８−７】
2022502371.tif 000045
【０２８８】
【表１８−８】
2022502371.tif 000046
【０２８９】
【表１８−９】
2022502371.tif 000047
【０２９０】
【表１８−１０】
2022502371.tif 000048
【０２９１】
【表１９−１】
2022502371.tif 000049
【０２９２】
【表１９−２】
2022502371.tif 000050
【０２９３】
【表１９−３】
2022502371.tif 000051
【０２９４】
【表１９−４】
2022502371.tif 000052
【０２９５】
【表１９−５】
2022502371.tif 000053
【０２９６】
【表１９−６】
2022502371.tif 000054
【０２９７】
【表１９−７】
2022502371.tif 000055
【０２９８】
【表１９−８】
2022502371.tif 000056
【０２９９】
【表１９−９】
2022502371.tif 000057
【０３００】
【表１９−１０】
2022502371.tif 000058
【０３０１】
【表２０−１】
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【０３０２】
【表２０−２】
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【０３０３】
【表２０−３】
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【０３０４】
【表２０−４】
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【０３０５】
【表２０−５】
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【０３０６】
【表２０−６】
2022502371.tif 000064
【０３０７】
【表２０−７】
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【０３０８】
【表２０−８】
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【０３０９】
【表２０−９】
2022502371.tif 000067
【０３１０】
【表２０−１０】
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【０３１１】
【表２１−１】
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【０３１２】
【表２１−２】
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【０３１３】
【表２２−１】
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【０３１４】
【表２２−２】
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【０３１５】
【表２２−３】
2022502371.tif 000073
【０３１６】
【表２３】
2022502371.tif 000074
【０３１７】
【表２４−１】
2022502371.tif 000075
【０３１８】
【表２４−２】
2022502371.tif 000076
【０３１９】
【表２４−３】
2022502371.tif 000077
【０３２０】
【表２５】
2022502371.tif 000078
【図１】
2022502371.tif 000079
【図２】
2022502371.tif 000080
【図３】
2022502371.tif 000081
【図４】
2022502371.tif 000082
【図５】
2022502371.tif 000083
【図６】
2022502371.tif 000084
【図７】
2022502371.tif 000085
【図８】
2022502371.tif 000086
【図９】
2022502371.tif 000087
【図１０】
2022502371.tif 000088
【図１１】
2022502371.tif 000089
【図１２】
2022502371.tif 000090
【図１３】
2022502371.tif 000091
【図１４】
2022502371.tif 000092
【図１５】
2022502371.tif 000093
【図１６】
2022502371.tif 000094
【図１７】
2022502371.tif 000095
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2022502371.tif 000098
【図２１】
2022502371.tif 000099
【図２２】
2022502371.tif 000100
【図２３】
2022502371.tif 000101
【図２４】
2022502371.tif 000102
【図２５】
2022502371.tif 000103
【図２６】
2022502371.tif 000104
【図２７】
2022502371.tif 000105
【図２８】
2022502371.tif 000106
【図２９】
2022502371.tif 000107
【図３０】
2022502371.tif 000108
【図３１】
2022502371.tif 000109
【図３２】
2022502371.tif 000110
【図３３】
2022502371.tif 000111
【図３４】
2022502371.tif 000112
【図３５】
2022502371.tif 000113
【図３６】
2022502371.tif 000114
【図３７】
2022502371.tif 000115
【図３８】
2022502371.tif 000116
【図３９】
2022502371.tif 000117
【図４０】
2022502371.tif 000118
【図４１】
2022502371.tif 000119
【図４２】
2022502371.tif 000120
【図４３】
2022502371.tif 000121
【図４４】
2022502371.tif 000122
【図４５】
2022502371.tif 000123
【図４６】
2022502371.tif 000124
【図４７】
2022502371.tif 000125
【図４８】
2022502371.tif 000126
【図４９】
2022502371.tif 000127
【図５０】
2022502371.tif 000128
【図５１】
2022502371.tif 000129
【図５２】
2022502371.tif 000130
【図５３】
2022502371.tif 000131
【図５４】
2022502371.tif 000132
【図５５】
2022502371.tif 000133
【図５６】
2022502371.tif 000134
【図５７】
2022502371.tif 000135
【図５８】
2022502371.tif 000136
【図５９】
2022502371.tif 000137
【図６０】
2022502371.tif 000138
【図６１】
2022502371.tif 000139
【図６２】
2022502371.tif 000140
【図６３】
2022502371.tif 000141
【図６４】
2022502371.tif 000142
【配列表】
2022502371000001.app
【国際調査報告】
2022502371.tif 000143
2022502371.tif 000144
2022502371.tif 000145
2022502371.tif 000146
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