(57)【要約】本発明は、化合物の毒性を測定するために使用される代謝産物を生成するためのデバイス及び方法を提供する。それらは、酵素のミクロソーム及び酵素を磁気的に封入する磁気ナノ粒子を組み込む。これらの酵素系は、化学物質が測定可能な代謝産物を生成することを触媒する。酵素を含有するミクロソーム及び磁気ナノ粒子は、酵素反応を促進するマクロ多孔性骨格及び非反応性成分と会合される。
2022500016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロソーム及び磁気ナノ粒子の自己集合メソ多孔性凝集体を含み、ここで第１酵素活性を有する拡散性補因子を必要とする第１酵素は前記ミクロソーム内に含有され、補因子再生活性を含む第２酵素は前記メソ細孔内に磁気的に封入され、
前記補因子は前記第１酵素活性において利用される、
デバイスであって、
前記第１及び第２酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能し；
前記磁気ナノ粒子は、マクロ多孔性骨格と磁気的に会合され；
前記ミクロソームは、前記マクロ多孔性骨格と会合され；且つ
前記磁気ナノ粒子を含む前記マクロ多孔性骨格は、前記マクロ多孔性骨格を反応溶液に入れるか又はそれから除去するように機能し得る非反応性部分と会合される、
デバイス。
【請求項２】
前記ミクロソーム、前記磁気ナノ粒子、前記第１酵素、前記第２酵素、及び前記マクロ多孔性骨格を安定に維持するための機能部分をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記機能部分は、緩衝液を含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記機能部分は、前記第２酵素用の基質を含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記機能部分は、前記補因子を含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項６】
前記機能部分は、磁性がある、請求項２に記載のデバイス。
【請求項７】
前記補因子は、前記第１及び第２酵素とともに磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体内に封入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記マクロ多孔性骨格は、円筒ピン、球体、ビーズ、カプセル、立方体、角棒体、錐体、菱形の形状であるか、又は非晶質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記マクロ多孔性骨格は、円筒ピンの形状である、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記非反応性部分は、金属、プラスチック、セラミック、コンポジット材、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記非反応性部分は、前記デバイスを操作するためのハンドルを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記非反応性部分は、ハイスループットスクリーニングのためのロボットアームによるハンドリングとして機能し得る、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記非反応性部分は、ガスの拡散を可能にする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、酸化鉄組成物を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、前記磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が少なくとも３ｎｍ〜３０ｎｍまでのサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、及び磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が少なくとも１０ｎｍ〜５００ｎｍまでのサイズを有する凝集粒径分布を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、５ｅｍｕ／ｇまでの残留磁化を有する、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記第１及び第２酵素は、磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体中に１００％までの飽和容量で含有される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記第１及び第２酵素は、微生物に物理的に接近できない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記第１酵素は、酸化酵素である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記酸化酵素は、フラビン含有オキシゲナーゼであり；ここで、前記組成物は、前記第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼを有する第３酵素をさらに含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記酸化酵素は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり；ここで、前記組成物は、前記第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２３】
単一タンパク質は、前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び前記第３酵素を含む、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、脂質膜内で前記第３酵素と共局在化される、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記第３酵素は、シトクロムＰ４５０レダクターゼである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、哺乳動物であるＰ４５０配列を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ヒトであるＰ４５０配列を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＰ２Ｗ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ２０Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１、ＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１又はＣＹＰ５１Ａ１を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物及び植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記第２酵素は、カルボニルレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アリール−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−１キシロースデヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸＋水素（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド＋水素（ＦＡＤＨ）又はグルタチオンである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記第１酵素は、第Ｉ相代謝に関与する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３４】
第ＩＩ相代謝に関与する第３酵素をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３５】
反応性酸素種（ＲＯＳ）を低減する第４酵素をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記第４酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、又はグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼ又はそれらの組み合わせである、請求項３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
ＵＤＰ−グルコロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、及びカルボキシルエステラーゼからなる群から選択される第５酵素をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記マクロ多孔性骨格は、磁気マクロ多孔性骨格である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記マクロ多孔性磁気骨格は、架橋結合水不溶性ポリマー及び埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含むポリマーハイブリッド骨格である、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡと、ＣＭＣ、アルギン酸塩、ＨＥＣ、ＥＨＥＣからなる群から選択されるポリマーとを含む、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、親水性ポリマーを含む、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記親水性ポリマーは、キサンタンガムである、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
１以上の前記酵素は、組み換えＤＮＡテクノロジーによって生成される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４４】
１以上の前記酵素は、合成される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記磁気ナノ粒子は、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）、ヒト肝サイトゾル画分（ＨＬＣＦ）からの酵素、又はＵＧＴ１Ａ６を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のデバイスを用いて化合物の代謝産物の毒性を測定する方法であって、前記化合物を反応溶液中で前記拡散性基質と混合する工程と、前記磁気ナノ粒子を含む前記マクロ多孔性骨格を前記拡散性基質と接触させる工程と、前記溶液中の酵素反応から得られる生成物を測定する工程と、を含む方法。
【請求項４７】
前記ミクロソーム及び前記磁気ナノ粒子を含む前記マクロ多孔性骨格を前記溶液から除去する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法は、複数の化合物の毒性をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニング法に組み込まれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法は、代謝酵素の混合物からの代謝産物をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニング法に組み込まれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のデバイスを製造する方法であって、前記第２酵素を磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体内に磁気的に封入する工程と、前記第２酵素を有する前記凝集体を前記第１酵素を含む前記ミクロソームと組み合わせる工程と、前記凝集体及びミクロソームを前記マクロ多孔性骨格上でテンプレート化する工程と、前記骨格を前記非反応性部分上でテンプレート化する工程と、を含む方法。
【請求項５１】
前記凝集体は、補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記凝集体は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、又はグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼである第４酵素をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記凝集体は、第ＩＩ相代謝に関与する第５酵素をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、２０１８年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，５１９号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、化合物の毒性を測定する場合に使用される代謝産物を生成するためのデバイス及び方法を提供する。それらは、酵素のミクロソーム及び酵素を磁気的に封入する磁気ナノ粒子を組み込む。これらの酵素系は、化学物質が測定可能な代謝産物を生成することを触媒する。酵素を含有するミクロソーム及び磁気ナノ粒子は、酵素反応を促進するマクロ多孔性骨格及び非反応性成分と会合される。
【背景技術】
【０００３】
開発される多数の薬剤及び化学物質は、本質的に安全であるかもしれないが、毒素に代謝されることがある。したがって、薬剤及び化学物質の開発における重要な局面は、危険な化合物が、ヒト試験段階又は消費市場にいずれ移行する前に化合物の安全性を十分に確立することにより、「早く失敗する（ｆａｉｌ  ｆａｓｔ）」ことを保証することである。約２，０００の新規の化学物質が毎年市場化されているが、化学物質の安全性を迅速に判定する上での重要な部分が、身体が通常は安全な親化学物質から生成する潜在的に有毒な代謝産物の寄与を評価することである。したがって、かかる化学的代謝産物（又は分解生成物）を捕捉し、それらを毒性についてスクリーニングすることは、医薬品を含む市販の化学物質の安全性を保証するために重要である。現在、インビトロ代謝を迅速に評価するためのツールは限られる。したがって、複数のヒト生体異物代謝酵素による既存の毒性スクリーニングアッセイプラットフォームを改良するというのが長年の目標となっている。
【０００４】
磁気酵素固定化は、酵素の周りで自己集合するメソ多孔性磁気クラスター内への酵素の封入を含む。固定化効率は、酵素及びナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面並びに接触時間を含む多数の因子に依存する。バイオ触媒プロセスにおいて工業的又は医学的製造のために使用される酵素は、高度に効率的、プロセス前及びプロセス中に安定性、数回にわたるバイオ触媒サイクルにおいて再使用可能、さらに経済的でなければならない。スクリーニング用及び試験用の薬物及び化学物質のために使用される酵素は、安定性であり、信頼性があり、感受性があり、経済的である上に高スループット自動化と適合しなければならない。
【０００５】
検定化合物の毒性を判定するため、Ｐ４５０触媒反応が使用されてもよい。シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０又はＣＹＰと呼ばれる）は、Ｅ．Ｃ．１．１４クラスの酵素である（参照により全体として本明細書に組み込まれるＢｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ２１５−Ｓ２１７（２００９）を参照されたい）。それらは、薬物、生体異物、アルカン、テルペン及び芳香族化合物の生体内変化に関係するモノオキシゲナーゼの１ファミリーを構成する。それらはさらに、化学的発癌物質の代謝並びに例えばステロイド、脂肪酸、エイコサノイド、脂溶性ビタミン類及び胆汁酸などの生理学的に重要な化合物の生合成にも関与する。さらに、それらは例えば殺虫剤などの環境内の生体異物及び他の工業的有機汚染物質の分解にも関係している。それらは多数の代謝経路において見いだされる基質中に１つのヒドロキシル基を組み込むことによって機能する。この反応では、二酸素が、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補因子の同時酸化によって、１つのヒドロキシル基及び１つのＨ２Ｏ分子に還元させられる。
【０００６】
モノオキシゲナーゼは、全ての生物系において解毒性バイオ触媒として作用し、内因性又は外因性毒性分子の分解を開始する鍵酵素である。生体異物の第Ｉ相代謝は、例えば、酸化、還元、加水分解、水化及び脱ハロゲン化などの官能化反応を含む。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、代謝の７５〜８０％に関係する最も重要なクラスの酵素を表す。その他の第Ｉ相酵素としては、モノアミンオキシダーゼ、フラビン含有オキシゲナーゼ、アミダーゼ及びエステラーゼが挙げられる。
【０００７】
第ＩＩ相代謝は、第Ｉ相代謝産物上での極性基（例えば、グルクロン酸、硫酸及びアミノ酸）の共役結合反応（グルクロン酸化、硫酸化、ＧＳＨ共役結合、アセチル化、アミノ酸共役結合及びメチル化）を含んでいる。
【０００８】
近年では、特に高度の立体選択性及び位置選択性が必要とされる場合に、バルク化学物質、医薬品、農薬及び食品添加物を工業的合成するために、Ｐ４５０バイオ触媒を適用することへの関心が高まっている。
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ酵素は、不安定でバイオ触媒反応に使用するのが困難であることは有名である。しかしそれらは、薬物及び生体異物変換の代謝経路にとって重要な成分であるため、薬物代謝産物の生成及び化学物質の解毒において重要な役割を果たす。Ｐ４５０を含む代謝酵素によって化学的代謝産物の多様性を生じさせるための新規な方法に対するニーズが高まっている。それらは、新薬開発において化学物質の薬物動態研究及び生分解研究のために使用されている。組み換えシトクロムＰ４５０  ＢＭ３（ＢＭ３）は、その活性が高いため、及び例えば、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一般的宿主内での組み換えベクターから発現させるのが容易であるために、生体工学的及び化学的用途のための最も前途有望なモノオキシゲナーゼの１つであると考えられている。ＢＭ３は、それらが酸化活性及び補因子還元活性を有するので、一体型触媒である。構造的に、Ｐ４５０ドメインは、レダクターゼドメインと融合しているので電子の直接移動を容易にする。さらに、分子は可溶性であり、膜結合される必要はない。これは、バイオ触媒反応における製造及び使用のための利点を提供する。そこで、バイオ触媒反応においてＰ４５０を使用するための新規な方法を開発することには、商業的関心が有意に高い。
Ｐ４５０及び一般に大多数の代謝性酸化酵素は、それらの標的化合物を変換させるためには補因子を必要とする。陽子（Ｈ＋）は、通常はＣＹＰ酵素内の特異アミノ酸を通して補因子ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから送達される。それらは陽子を活性部位に中継し、そこでそれらは単一原子を基質に添加できるように酸素分子を還元的に分割する。ＣＹＰ酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を含むがそれらに限定されないある範囲の様々な酸化還元パートナー酵素からの電子を受け入れる。
【０００９】
ＧＤＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）は、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ又はＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの同時の還元を伴ってβ−Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−１，５−ラクトンへの酸化を触媒する。ＦＤＨ（ＥＣ１．２．１．２）は、ギ酸から二酸化炭素への酸化を触媒する１組の酵素を意味する。それらは、例えばＮＡＤ＋などの第２基質へ電子を供与する。特に真核生物起源由来のこれらの酵素は、あらゆる酵素の中で最少の総代謝回転数を有している。シトクロムＰ４５０を用いたバイオ触媒反応は、基質酸化には副生成物として、例えば過酸化水素及び過酸化物の反応性酸素種（ＲＯＳ）産生が結び付いているために、高度に非効率である。酵素からの活性化酸素の大きな分画である真核生物モノオキシゲナーゼは、ペルオキシシトクロムＰ４５０のプロトン化及び酸素の４電子還元がＨ２Ｏ２を生成する間に、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ−２）を生成する一電子還元三元複合系のいずれかの崩壊によって、標的の酸化から流用されてＲＯＳへ変換させられる。そこで、真核生物Ｐ４５０酵素は、極めて実質的部分（＞３０％）のＲＯＳ生成のための消費還元当量を消失する。
【００１０】
真核生物Ｐ４５０と比較して、細菌性Ｐ４５０は、ＲＯＳへ流用される全電子取り込みが１０％未満であり、酸化経路におけるＯ２のより優れた効率及び電子転換効率を生じさせるので、より効率的である。反応速度を緩徐化させることなくＲＯＳの集積を防止するレベルで溶存酸素濃度を制御するためには、バイオリアクターの特別設計が不可欠である。
【００１１】
反応性酸化種（ＲＯＳ）の生成に起因する酸化阻害は、Ｐ４５０バイオ触媒の主要な制限の１つである。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、Ｐ４５０並びにＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を含む他のオキシダーゼの代謝反応の主要な副生成物である。反応性酸素種（ＲＯＳ）には、高度に反応性の酸素ラジカル［スーパーオキシド（Ｏ２・−）、ヒドロキシル（・ＯＨ）、ペルオキシル（ＲＯ２・）、アルコキシル（ＲＯ・）］並びに酸化剤である、及び／又はラジカルに容易に転換されるいずれかであるノンラジカルが含まれる。例としては、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、オゾン（Ｏ３）、一重項酸素（１Ｏ２）並びに反応が酸素過剰で発生する場合の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びスーパーオキシドイオン（Ｏ２−）としての過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が挙げられる。高レベルのＲＯＳは変換反応の効率を減少させるだけではなく、さらに酸化変性に起因する反応を阻害もする。酸化反応中のＲＯＳ集積を防止する１つの方法は、例えばカタラーゼ又はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などのＲＯＳ分解酵素を使用して重要な中間物を捕捉することである。それらは、二酸素を生成しながらＲＯＳから汚染除去し、Ｐ４５０酸化サイクルのために使用できるように酸素ラジカルをリサイクルする。
【００１２】
第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相代謝において代謝産物を生成する、当技術分野において公知である他の代謝酵素には、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ及びカルボキシエステラーゼが含まれる。代謝酵素は低活性を有しており、特にｅｘ−ｖｉｖｏで不安定である。スクリーニング用又は生化学物質生成における化学的代謝産物の高度で迅速な生成を得るために、Ｐ４５０の濃度は歴史的に高かった（５０〜２００％の基質負荷）。標的化合物の酸化速度を増加させるために、酸素レベルは、化学量論を超える濃度でさらに高いことが必要である。これは、酵素を変性させ、反応の効率を制限するスーパーオキシドアニオンの生成をもたらす。
【００１３】
ライフサイエンス及び医薬品市場において使用される大部分の代謝経路系は、インビトロで培養された肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ、ＨｅｐａＲＧ）に基づく。細胞に基づくプラットフォームの利点は、単一の組み込みプラットフォーム内の代謝酵素（ＣＹＰ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、カルボキシエステラーゼなど）の系からなる複数の生化学ネットワークを共活性化する能力である。かかる高い生物学的複雑性を伴う代謝過程は、肝生理学を再現する機会を増やす。残念ながら、インビトロでの細胞に基づく系は、代謝産物の集積によってもたらされる細胞傷害性効果及び長期にわたる酸化処理による細胞ストレスに対して脆弱である。これは、短いインキュベーション時間（１〜２時間）及び対応する無細胞酵素系よりも有意に低い酵素速度（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒａｔｅｓ）（約１００倍）をもたらす。さらに、細胞系は、ＬＣ−ＭＳ分析による基質由来の代謝産物の同定を複雑にする、有意なバックグラウンドのメタボロームをもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
当該技術では、数千の化学物質を酵素的にスクリーニングするため、化合物の毒性を測定するための効率的方法が求められる。代謝酵素は、ハイスループットな毒性選別を容易にするためのデバイス及び方法において設計される必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、化合物の毒性を測定する場合に使用される代謝産物を生成するためのデバイス及び方法を提供する。それらは、酵素のミクロソーム及び酵素を磁気的に封入する磁気ナノ粒子を組み込む。これらの酵素系は、化学物質が測定可能な代謝産物を生成することを触媒する。酵素を含有するミクロソーム及び磁気ナノ粒子は、酵素反応を促進するマクロ多孔性骨格及び非反応性成分と会合される。
【００１６】
したがって、本発明は、ミクロソーム及び磁気ナノ粒子の自己集合メソ多孔性凝集体を含むデバイスであって、ここで第１酵素活性を有する拡散性補因子を必要とする第１酵素はミクロソーム内に含有され、補因子再生活性を含む第２酵素はメソ細孔内に磁気的に封入され、補因子は第１酵素活性において利用され；第１及び第２酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換することにより機能し；磁気ナノ粒子は、マクロ多孔性骨格と磁気的に会合され；ミクロソームは、マクロ多孔性骨格と会合され；且つ磁気ナノ粒子を含むマクロ多孔性骨格は、マクロ多孔性骨格を反応溶液に入れるか又はそれから除去するように機能し得る非反応性部分と会合される、デバイスを提供する。
【００１７】
本発明の一部の実施形態では、デバイスは、ミクロソーム、磁気ナノ粒子、第１酵素、第２酵素、及びマクロ多孔性骨格を安定に維持するための機能部分をさらに含む。好ましい実施形態では、機能部分は、緩衝液を含む。他の好ましい実施形態では、機能部分は、第２酵素用の基質を含む。他の好ましい実施形態では、機能部分は、補因子を含む。他の好ましい実施形態では、機能部分は、磁性がある。
【００１８】
本発明の一部の実施形態では、補因子は、第１及び第２酵素とともに磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体内に封入される。
【００１９】
本発明の一部の実施形態では、マクロ多孔性骨格は、円筒ピン、球体、ビーズ、カプセル、立方体、角棒体、錐体、菱形の形状であるか、又は非晶質である。好ましい実施形態では、マクロ多孔性骨格は、円筒ピンの形状である。
【００２０】
本発明の一部の実施形態では、非反応性部分は、金属、プラスチック、セラミック、コンポジット材、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、非反応性部分は、デバイスを操作するためのハンドルを含む。他の実施形態では、非反応性部分は、ハイスループットスクリーニングのためのロボットアームによるハンドリングとして機能し得る。他の実施形態では、非反応性部分は、ガスの拡散を可能にする。
【００２１】
本発明の他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、酸化鉄組成物を有する。他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が少なくとも３ｎｍ〜３０ｎｍまでのサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、及び磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が少なくとも１０ｎｍ〜５００ｎｍまでのサイズを有する凝集粒径分布を有する。
【００２２】
本発明の一部の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する。他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、５ｅｍｕ／ｇまでの残留磁化を有する。
【００２３】
本発明の一部の実施形態では、第１及び第２酵素は、磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体中に１００％までの飽和容量で含有される。
【００２４】
本発明の一部の実施形態では、第１及び第２酵素は、微生物に物理的に接近できない。
【００２５】
本発明の一部の実施形態では、第１酵素は、酸化酵素である。好ましい実施形態では、酸化酵素は、フラビン含有オキシゲナーゼであり；ここで、組成物は、第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む。他の好ましい実施形態では、酸化酵素は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり；ここで、組成物は、第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む。
【００２６】
本発明の一部の実施形態では、単一タンパク質は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び第３酵素を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、脂質膜内で第３酵素と共局在化される。
【００２７】
本発明の一部の実施形態では、第３酵素は、シトクロムＰ４５０レダクターゼである。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、哺乳動物であるＰ４５０配列を含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ヒトであるＰ４５０配列を含む。別の好ましい実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＰ２Ｗ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ２０Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１、ＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１又はＣＹＰ５１Ａ１を含む。
【００２９】
本発明の一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物及び植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。
【００３０】
請求項１〜３０に記載のデバイスであって、第２酵素は、カルボニルレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アリール−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−１キシロースデヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される。
【００３１】
本発明の一部の実施形態では、補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸＋水素（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド＋水素（ＦＡＤＨ）又はグルタチオンである。
【００３２】
本発明の一部の実施形態では、第１酵素は、第Ｉ相代謝に関与する。
【００３３】
本発明の一部の実施形態は、第ＩＩ相代謝に関与する第３酵素を提供する。
【００３４】
本発明の一部の実施形態は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を低減する第４酵素を提供する。他の実施形態では、第４酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、又はグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼ、又はそれらの組み合わせである。
【００３５】
本発明の一部の実施形態は、ＵＤＰ−グルコロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、モノアミンオキシダーゼ、及びカルボキシルエステラーゼからなる群から選択される第５酵素を提供する。
【００３６】
本発明の一部の実施形態では、マクロ多孔性骨格は、磁気マクロ多孔性骨格である。他の実施形態では、マクロ多孔性磁気骨格は、架橋結合水不溶性ポリマー及び埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含むポリマーハイブリッド骨格である。他の実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡと、ＣＭＣ、アルギン酸塩、ＨＥＣ、ＥＨＥＣからなる群から選択されるポリマーとを含む。他の実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、親水性ポリマーを含む。他の実施形態では、親水性ポリマーは、キサンタンガムである。
【００３７】
本発明の一部の実施形態では、１種以上の酵素が、組み換えＤＮＡテクノロジーによって生成される。他の実施形態では、１種以上の酵素は、合成される。
【００３８】
本発明の一部の実施形態では、磁気ナノ粒子は、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）又はヒト肝サイトゾル画分（ＨＬＣＦ）からの酵素を含む。
【００３９】
本発明は、化合物の代謝産物の毒性を本明細書で開示されるデバイスを用いて測定する方法であって、化合物を反応溶液中で拡散性基質と混合する工程と、磁気ナノ粒子を含むマクロ多孔性骨格を拡散性基質と接触させる工程と、溶液中の酵素反応から得られる生成物を測定する工程と、を含む方法を提供する。
【００４０】
一部の実施形態では、方法は、ミクロソーム及び磁気ナノ粒子を含むマクロ多孔性骨格を溶液から除去する工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、複数の化合物の毒性をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニング法に組み込まれる。他の実施形態では、方法は、代謝酵素の混合物からの代謝産物をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニング法に組み込まれる。
【００４１】
本発明は、本明細書で開示されるデバイスを製造する方法であって、第２酵素を磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体内に磁気的に封入する工程と、第２酵素を有する凝集体を第１酵素を含むミクロソームと組み合わせる工程と、凝集体及びミクロソームをマクロ多孔性骨格上でテンプレート化する工程と、骨格を非反応性部分上でテンプレート化する工程と、を含む方法を提供する。
【００４２】
本明細書で開示される方法の一部の実施形態では、凝集体は、補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む。他の実施形態では、凝集体は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、又はグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼである第４酵素をさらに含む。他の実施形態では、凝集体は、第ＩＩ相代謝に関与する第５酵素をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａは、マクロ多孔性の機能的チップによる機能化前の２ｍｌのチューブでの使用を意図したピンを示す。図１Ｂは、マクロ多孔性骨格によって機能化されたピンの図面を示す。
【図２】図２Ａは、９６ピンマイクロプレートアレイの側面図である。図２Ｂは、９６ピンマイクロプレートアレイの底面図である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、異なる視点からの機能化されたピンの図面を示す。図３Ｃは、２ｍｌのチューブ内の機能化されたピンを示す。
【図４】図４Ａは、菱形形状を有するコーティング材料の側面図の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。図４Ｂは、側表面のＳＥＭを示す。図４Ｃは、上面のＳＥＭを示す。図４Ｄは、脆弱な壁のＳＥＭを示す。
【図５】７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定する蛍光定量アッセイを用いての固定化ＣＹＰ３Ａ４の貯蔵及び安定性分析である。バーの第１セット（Ａ）は、４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４を表す。バーの第２セット（Ｂ）は、−２０℃での貯蔵を示す。バーの第３セット（Ｃ）は、−８０℃での貯蔵を示す。
【図６】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＤＨ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、及び固定化ＮＡＤＰを含む自己充足的な酵素系を用いての３７℃で１時間及び１８時間のインキュベーション時間後のＣＹＰ３Ａ４活性を示す。固定化条件：（１）ｐＨ１１で２５０μｇ／ｍｌのナノ粒子、及び（２）ｐＨ１１で１０００μｇ／ｍｌのナノ粒子。安定性は、７日間にわたり示された。
【図７】３７℃での１時間の反応における遊離及び固定化ヒト肝ミクロソームのＣＹＰ３Ａ４活性を示す。
【図８】図８Ａは、＜１０μｍのマグネタイト粉末に対するＣＹＰ２Ｂ６の固定化収率及び同じタンパク質濃度で遊離ＣＹＰ２Ｂ６と比べての固定化ＣＹＰ２Ｂ６の相対活性を示す。図８Ｂは、発光単位で測定された固定化ＣＹＰ２Ｂ６及び遊離ＣＹＰ２Ｂ６の活性を示す。
【図９】固定化ＣＹＰ２Ｂ６は、新規の遊離ＣＹＰ２Ｂ６の活性の５０％以上を保持した。
【図１０】図１０Ａは、＜１０μｍのマグネタイト粉末に対するＵＧＴ１Ａ６の固定化収率及び同じタンパク質濃度で遊離ＵＧＴ１Ａ６と比べての固定化ＵＧＴ１Ａ６の相対活性を示す。図１０Ｂは、発光単位で測定された固定化ＵＧＴ１Ａ６及び遊離ＵＧＴ１Ａ６の活性を示す。
【図１１】固定化ＵＧＴ１Ａ６が新規の遊離ＵＧＴ１Ａ６の活性の５０％以上を保持したことを示す。
【図１２】図１２Ａは、ＣＹＰ３Ａ４の固定化収率が、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、及  図１２Ｂは、遊離ＣＹＰ３Ａ４酵素に対する固定化ＣＹＰ３Ａ４の活性が、同じタンパク質濃度で、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、及びｐＨ８．０の固定化緩衝液に対して各々、３５％±３％、３０％±３％、及び３６％±５％であることが判定されたことを示す。
【図１３】図１３Ａは、−２０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４が、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１、３、７、及び１４日間にわたって各々、４６％±４％、３９％±３％、４６％±１％、及び５３％±３％の活性を保持したことを示す。−２０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１、３、７、及び１４日間にわたって各々、６３％±６％、５３％±４％、６２％±１％、及び７２％±４％を保持した。図１３Ｂは、凍結乾燥され、次に４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４が、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１、３、７、及び１４日間にわたって各々、１８％±１２％、２３％±１％、２３％±０％、及び１９％±４％の活性を保持したことを示す。凍結乾燥され、次に４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１、３、７、及び１４日間にわたって各々、２５％±１６％、３１％±２％、３１％±０．３％、及び２５％±６％を保持した（図１３Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、代謝産物を生成し、続いて化合物の毒性を測定するためのデバイス及び方法を提供する。酵素を含有するミクロソーム及び磁気ナノ粒子は、酵素反応を促進するマクロ多孔性骨格及び非反応性成分と会合される。
【００４５】
本発明は、生体触媒プロセス用の酵素を固定化及び安定化するためのユニバーサルなプラットフォームを提供する。無細胞技術は、タンパク質修飾又は共有結合の必要性がなく、磁気担体上でテンプレート化された自己集合ナノ粒子（ＮＰ）クラスター内での酵素又は酵素混合物の分子封入により機能する。イオン強度、緩衝液ｐＨ、及びＮＰ濃度は、クラスターサイズ及び固定化収率を制御する場合の主要パラメータである。磁気材料は、酵素負荷、安定性、及び活性の正確な制御のため、様々な規模（ナノからマクロ）での自己集合を可能にする。Ｃｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ３４（５）：１５−２０（２０１６）は、参照により本明細書中にその全体が組み込まれる。この技術は、現在では、固定化ＣＹＰ及び自己充足的な代謝酵素系による下流のハイスループットな毒性学的スクリーニングにおける無細胞代謝プロファイリングに拡張される。
【００４６】
無細胞代謝プロファイリングは、細胞に基づく手法にまさるいくつかの利点を有する。無細胞酵素が、競合するバックグラウンド細胞維持及び増殖プロセスにより制限されないことから、無細胞系における酵素変換率（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｄｍｅ−ｔｏｘ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｅｔａｂｏｌｉｃ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｈｔｍｌ）では、典型的には、代謝、クリアランス、及び肝毒性における「ゴールドスタンダード」であるヒト初代肝細胞（ｈＰＨ）の場合よりも１０倍多い量の代謝産物が生成される。これは、１〜２時間のインキュベーション時間にわたり測定される。さらに、基質、代謝産物及び反応性酸素種（ＲＯＳ）の細胞傷害性負荷は、代謝寿命延長を制限する。
【００４７】
別の利点は、代謝多型である。制御された酵素成分比で加え、維持する能力は、組織／臓器特異的代謝特性の定式化を可能にし、ヒト代謝の遺伝的多様性に対処する。さらに、低い、中程度の、及び高い代謝活性レベルは、酵素濃度を調節することにより容易に得ることが可能である。肝代謝に加えて、他の臓器又は身体区画の代謝酵素構築物もまた、容易に得ることが可能である。これは、胃腸管、又はさらに細菌代謝酵素を加えることによる、マイクロバイオームを含む。
【００４８】
別の利点は、アッセイの設計及びハンドリングである。無細胞酵素反応系は、複雑な細胞成長培地（例えばＤＭＥＭ）と比較して、単純な制御された組成物（緩衝液、塩、糖、補因子）を有する。よりクリーンな化学特性は、より強固な統計学におけるデータ及びパターン分析を簡素化する。細胞プロセスの不在は、親基質及び選択された酵素に特異的な低いバックグラウンドのメタボロームをもたらし、結果的により強固な用量−応答特性、特により長いインキュベーション時間をもたらす。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるデバイス及び方法は、無細胞毒性学的選別において使用される。他の実施形態では、それらは細胞に基づく溶液と併用される。一部の実施形態では、細胞に基づくアッセイは、有毒な代謝産物についての広範な第１選別として使用される。次に、無細胞代謝産物スクリーニングが、規範事例の範囲から代謝産物を同定するための洗練された機構的手法として使用されてもよい。ＨＴスクリーニングと組み合わせて、代謝酵素の組み合わせを用いた無細胞プロファイリングでは、（１）ヒトメタボロームの多型を迅速に捕捉し、且つ（２）複雑な代謝経路の代謝産物の解明を可能にする、各化学的基質からの一連のメタボロームを得ることができる。本発明は、毒性試験における動物の数削減、苦痛軽減、又は代替、及び規定外の（ｏｕｔ−ｏｆ−ｎｏｒｍａｌｉｔｙ）代謝特性における潜在的な毒性代謝産物についての初期理解を支持する。
【００５０】
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）、ヒト組み換えミクロソーム、及び精製ヒト組み換えＣＹＰモノオキシゲナーゼを含む、市販の無細胞代謝酵素（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ）は、不評にも不安定であり、それらの活性をインキュベーション期間として１〜２時間しか保持しない。ヒト肝ミクロソームはまた、集団を意味する屍体に由来するプールされた肝ミクロソーム画分から生成されることから、希少且つ高価である。ヒトＣＹＰは、特に、副生成物としての阻害反応性酸素種（ＲＯＳ）−過酸化水素及びスーパーオキシド−の生成に起因して、非常に低い総代謝回転数を有する。ＣＹＰの代謝活性を拡張することは、特に低クリアランスの代謝産物の場合、十分な分析的検出を保証するため、十分な代謝産物量を生成することに対して主要な障壁である。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明は、化学的代謝産物とともに、ロボットハイスループット（ＨＴ）毒性アッセイ又は化学的分析に適合するように設計された、マクロ多孔性骨格上に固定化された安定化された合成酵素系を生成する。他の実施形態では、マクロ多孔性骨格は、ロボットＨＴアッセイ向けでないどころか、より小規模なベンチトップ分析向けに設計される。
【００５２】
磁気固定化された酵素を含む自己集合メソ多孔性ナノクラスターは、使用前及び使用中に高度に活性及び安定性である。磁気固定化された酵素は、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ又はＮＰ）によって形成された自己集合メソ細孔内に組み込むために結合剤を必要としない。ＭＮＰへの酵素の永久的化学修飾又は架橋結合は必要とされない。このテクノロジーは、組織化の３つの統合レベルでの生化学、ナノテクノロジー及び生体工学のブレンドである：レベル１は、磁気メソ多孔性ナノクラスターの合成のためのＭＮＰを備える酵素の自己集合であり、場合によっては補因子である。このレベルは、酵素及び補因子を固定化するための分子自己封入の機構を使用する。自己集合磁気ナノ粒子中に固定化された酵素は、本明細書では「バイオナノ触媒」（ＢＮＣ）と呼ばれる。レベル２は、磁気マトリックス又はポリマーマトリックスなどの他の集合体中へのＭＮＰ又はミクロソームの安定化である。特定の実施形態では、ＢＮＣ又はミクロソームは、商業用途又は他の用途のためにマイクロ又はマクロ構造上又は構造中に「テンプレート化」される。１つの実施形態では、レベル２テンプレートは磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。レベル３は、レベル１＋２の固定化酵素を使用するための製品状態調節である。
【００５３】
一実施形態では、第１工程は、ＣＹＰミクロソームとレベル１のＧ６ＤＨ−ＲＯＳ再利用酵素系とを組み合わせることである。効率的ＮＡＤＰＨ再利用系におけるクラスター内での共局在を保証するため、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＤＨ）が共固定化される。Ｇ６ＤＨは、より長いインキュベーション時間（例えば１８時間）にわたるＮＡＤＰＨの利用可能性を保証する。反応性酸素種（ＲＯＳ）の除去を保証するため、ナノモル濃度のカタラーゼ（ＣＡＴ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が共固定化される。この組み合わせは、自己充足的反応に要求される全ての酵素の共局在化を保証する。
【００５４】
この実施形態では、第２工程は、レベル１及びレベル２の磁気材料上のミクロソームを安定化させる。過剰凝集を阻止し、クラスター及び酵素を安定化し、且つ固定化酸素のハンドリングを容易にするため、ＮＰクラスター（レベル１）は、より大きい多孔性磁気骨格上の磁気自己集合（レベル２）を介してテンプレート化される。レベル２の磁気材料は、リン脂質膜の完全性を維持することにより、ミクロソーム吸着に適する必要がある。ミクロソームは、静電性及び／又は疎水性相互作用によって、レベル２に効率的に吸着される。
【００５５】
一部の実施形態では、組み換えヒトＣＹＰ酵素系は、少量での代謝過程において３Ｄ印刷された磁気ピン上に固定化される。ピンは、支持又はハンドリングのため、非反応性部分を有する。他の実施形態では、ピンは、ロボットハンドリング及び下流アッセイに適合する９６ウェルマイクロプレート内での代謝プロファイリング用の９６ピンアレイである。３Ｄプリンティングとしても知られる付加製造は、他の製造方法では到達できない設計及び組成物を可能にすることによる、大規模なバイオテクノロジー用途に適する工業的生産方法である。固定化は、酵素を安定化し、使用（「プラグ、インキュベート、分析」）を容易にし、且つそれらが製品流に入ることを阻止する。
【００５６】
他の実施形態では、対象化学物質の無細胞代謝は、ピン固定化されたミクロソームの組み合わせを用いて行われる。好ましい例では、ミクロソームの組み合わせは、レベル１のＣＡＴ、ＳＯＤ及びＧＤＨと組み合わせて、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＵＧＴ１Ａ６を含んでもよい。ＣＹＰ３Ａ４は、酵素のチトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーである。このファミリー内の酵素は、薬剤代謝に関与するモノオキシゲナーゼである。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明は、マイクロプレート適用のため、プリント可能な３Ｄピンを提供する。好ましい実施形態では、マグネタイトからなる大孔げきに富んだレベル２の骨格粉材（粒径１００ｎｍ、５０％ｗ／ｗ）が、（モノリス骨格と称される）凍結乾燥ポリビニルアルコール−セルロース架橋複合体に埋め込まれる。一部の実施形態では、その粉末は、外部自動化磁気ミキサーを必要とした。他の実施形態では、ＣＹＰは、メタクリル酸樹脂製の光造形法（ＳＬＡ）によってプリントされた円筒ピン（例えば、３．６ｍｍのφ、１０ｍｍの高さ）に固定化される（Ｆｏｒｍｌａｂｓ  ｈｔｔｐｓ：／／ｆｏｒｍｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｕｓ／ｆｏｒｍ−２／ｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｃｌｅａｒ−ｒｅｓｉｎ／）。好ましい実施形態では、それらは２．０ｍｌのミクロチューブ内の０．５ｍｌの代謝反応体積として設計される。他の実施形態では、ピンの先端に永久磁石（１／１６インチのφ、１／８インチの高さ）を設けることで、代謝酵素系を含有するレベル２のモノリス担体（最大４５ｍｇ）の捕捉が可能になる。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明のＢＮＣは、架橋結合水不溶性ポリマー及び埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格中で提供される。ポリマーは、少なくともポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み、サイズが約５０〜５００ｎｍのＭＭＰ、サイズが約１〜約５０μｍの細孔、約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを有するが、ここで骨格は総計約１〜１５ｍ２／ｇであるバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための有効表面積を含み；酵素を組み込むための総有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；骨格は約０．０１〜約１０ｇ／ｍＬのバルク密度を有し；及び骨格は約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３／ｋｇの質量磁化率を有する。好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、骨格と水との約０〜９０度の接触角を含む。
【００５９】
好ましい実施形態では、架橋結合水不溶性ポリマーは、本質的にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。より好ましい実施形態では、骨格は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリレート塩、ポリメチルメタクリレート、酢酸ポリビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レゾルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン及びポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーをさらに含む。
【００６０】
他のより好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡ及びＣＭＣ、ＰＶＡ及びアルギン酸塩、ＰＶＡ及びＨＥＣ又はＰＶＡ及びＥＨＥＣを含む。マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書に教示されている。
【００６１】
ＭＮＰは、例えば、温度、イオン強度、ｐＨ及び溶媒などのバイオ触媒プロセスにおいて酵素を使用するためのより幅広い範囲の作動条件を許容する。ＭＮＰのサイズ及び磁化は、ＢＮＣの形成及び構造に影響を及ぼす。これは、封入された酵素の活性に有意な強い影響を及ぼす。様々な反応条件下でのそれらの驚くべき回復力によって、自己集合ＭＮＰクラスターは、ポリマー樹脂、架橋結合ゲル、架橋結合酵素凝集体（ＣＬＥＡ）、架橋結合磁気ビーズなどに置換する酵素のための優れた固定化材料として使用できる。さらに、それらは拡散性基質上の酵素の任意の用途において使用できる。
【００６２】
ＢＮＣは、クラスター化磁気ナノ粒子間の格子間隙であるメソ細孔を含有している。酵素は、磁気ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部分内に固定化される。本明細書で使用する用語「磁気」には、永久磁性、超常磁性、常磁性及び強磁性挙動を含む、全てのタイプの有用な磁気特性が含まれている。
【００６３】
本発明のＢＮＣサイズは、ナノスケールにある、つまり一般に５００ｎｍ以下である。本明細書で使用する用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子がほぼ又は実質的に球形である場合に磁気ナノ粒子の直径を意味することができる。磁気ナノ粒子がほぼ又は実質的に球形ではない（例えば、実質的に卵形又は不規則形）場合には、用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子の３つの寸法の最長寸法又は平均値のいずれかを意味することができる。用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子の集団内の計算平均サイズを意味することができる。
【００６４】
様々な実施形態では、磁気ナノ粒子は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、又は未満として表したとき、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ若しくは１ｎｍのサイズ、又は上記の例示的なサイズのいずれか２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００６５】
ＢＮＣ内では、個々の磁気ナノ粒子は、上記に提供したサイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、初晶）であってよい。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体は、ナノ粒子よりサイズが大きく、一般に少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。様々な実施形態では、凝集体は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、又は未満として表したとき、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ若しくは８００ｎｍのサイズ、又は上記の例示的なサイズのいずれか２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００６６】
典型的には、一次及び／又は凝集磁気ナノ粒子若しくはそれらのＢＮＣは、ある分布のサイズを有する、すなわち、それらのサイズは一般に狭いサイズ又は広いサイズのいずれかで分散している。様々な実施形態では、任意の範囲の一次若しくは凝集体サイズは、一次若しくは凝集体サイズの全範囲の大きい、若しくは小さい割合を構成することができる。例えば、一部の実施形態では、一次粒径の特定範囲（例えば、少なくとも約１、２、３、５若しくは１０ｎｍ及び約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍまで）又は凝集体粒径の特定範囲（例えば、少なくとも約５、１０、１５若しくは２０ｎｍ及び約５０、１００、１５０、２００、２５０若しくは３００ｎｍまで）は一次粒径の全範囲の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％又はそれ以上を構成する。他の実施形態では、一次粒径の特定範囲（例えば、約１、２、３、５若しくは１０ｎｍ未満又は約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍ超）又は凝集体粒径の特定範囲（例えば、約２０、１０若しくは５ｎｍ未満又は約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０若しくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％若しくは０．１％以下若しくは未満を構成する。
【００６７】
磁気ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）若しくはそれらのＢＮＣは、それらがそれから製造されている個々の初晶の量に依存して、多孔性の実質的な欠如を含む任意の程度の多孔性を有し得る。特定の実施形態では、凝集体は、格子間のメソ細孔（すなわち、充填配置によって形成された、一次磁気ナノ粒子間に位置するメソ細孔）を含有することによってメソ多孔性である。メソ細孔のサイズは、一般に、少なくとも２ｎｍ〜５０ｎｍまでである。様々な実施形態において、メソ細孔は、正確に又は約、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ｎｍの孔径、又は上記の例示的な孔径のいずれか２つに挟まれる範囲内の孔径を有し得る。粒径の場合と同様に、メソ細孔は、典型的には、ある分布のサイズを有する、すなわち、それらのサイズは一般に狭いサイズ又は広いサイズのいずれかで分散している。様々な実施形態では、メソ細孔径の任意の範囲は、メソ細孔径若しくは全孔容積の全範囲の大きい、若しくは小さい割合を構成することができる。例えば、一部の実施形態では、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、少なくとも約２、３若しくは５、及び８、１０、１５、２０、２５若しくは３０ｎｍまで）は、メソ細孔径の全範囲又は全細孔容積の少なくとも、又は約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％超を占める。他の実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４若しくは５ｎｍ未満、又は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０ｎｍ超）は、メソ細孔径の全範囲又は全細孔容積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％若しくは０．１％以下若しくは未満を占める。
【００６８】
磁気ナノ粒子は、当技術分野において公知の組成物のいずれかを有することができる。一部の実施形態では、磁気ナノ粒子は、磁性であるゼロ価金属部分であるか、又はそれを含む。そのようなゼロ価の金属の一部の例としては、コバルト、ニッケル及び鉄並びにそれらの混合物及び合金が挙げられる。他の実施形態では、磁気ナノ粒子は、例えばコバルト、ニッケル、若しくは鉄又はそれらの混合物の酸化物などの、磁性金属の酸化物であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、磁気ナノ粒子は、特徴的なコア及び表面部分を有する。例えば、磁気ナノ粒子は、元素の鉄、コバルト若しくはニッケルで構成されるコア部分、及び金属酸化物又は例えば金、白金、パラジウム若しくは銀の層などの貴金属コーティングなどの不動態化層で構成される表面部分を有し得る。他の実施形態では、金属酸化物磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁気ナノ粒子表面上の電荷数を減少させることができ、それにより、溶液中の分散性を有益に高め、ＢＮＣのサイズをより良好に制御することができる。貴金属コーティングは、酸化、浸出又は例えばクエン酸塩、マロン酸塩若しくは酒石酸塩などの有機酸をキレート化する工程が生化学反応若しくはプロセスにおいて使用される場合はキレート化による可溶化に対して磁気ナノ粒子を保護する。不動態化層は、任意の好適な厚さ、例えば、特に少なくとも、約、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ若しくは１０ｎｍまで若しくは未満、又はこれらの値のいずれか２つに挟まれる範囲内の厚さを有し得る。
【００６９】
本発明のために有用である磁性材料は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイト若しくは磁鉄鉱）、コバルト及びニッケルなどの鉱石を含む強磁性体及び強磁性材料を含む。他の実施形態では、希土類磁石が使用される。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素などが挙げられる。さらに他の実施形態において、磁石は、複合材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト、及びアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態では、磁気ナノ粒子は、酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当該技術分野において公知の磁性若しくは超常磁性酸化鉄組成物、例えば、マグネタイト（ＦｅｓＯ／Ｏ、赤鉄鉱（α−Ｆｅ２θ  ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｃ＞３）又は式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａは二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋若しくはそれらの組み合わせ）であり、Ｂは三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋若しくはそれらの組み合わせ）である）によるスピネルフェライトのいずれかであり得る。
【００７０】
一部の実施形態では、ＢＮＣは、超常磁性ＮＰの不安定性を利用することによって形成される。マグネタイトのゼロ電荷電位（ＰＺＣ）は、その周囲では磁性ＮＰが互いに反発し合うことができずに容易にクラスター化するｐＨ７．９である。ＮＰは、ＰＺＣより下では正帯電しており、それより上では負帯電している。クラスター形成は、静電相互作用によって駆動され得る。荷電アミノ酸からの酵素の表面での反対静電電荷は、ＮＰの表面電荷を相殺することができる。酵素は、複数のＮＰの電荷を中和するポリアニオン若しくはポリカチオンに同化させることができる。各酵素は、その固有の等電点（ｐＩ）及びナノ粒子の凝集を誘発するであろう荷電アミノ酸の表面組成を有する。酵素は次に、メソ多孔性クラスター内に封入及び安定化され得る。初期ＮＰ及び酵素濃度、ｐＨ及びイオン強度は、凝集速度及び最終クラスターサイズを制御する主要なパラメータである。クラスターのサイズは、クラスターから出入りする基質及び生成物の物質移行に制限があるために、反応の有効性に大きく影響を及ぼす。クラスターのサイズは、酵素負荷及び基質拡散速度を制御するために、１００ｎｍ〜１０μｍのクラスターに調整することができる。
【００７１】
封入された酵素は、レベル１と呼ばれる。剛性骨格内の「ロックされた」クラスターは、より大きい、若しくはより安定性の磁気骨格若しくはポリマー骨格上若しくはその中でそれらをテンプレート化することの結果として生じる可能性があり、レベル２と呼ばれる。これは、過剰凝集を防止し、外部磁石による捕捉が容易になるように質量磁化率を加える。
【００７２】
特定の実施形態では、磁気ナノ粒子（ＢＮＣ）の上記のメソ多孔性凝集体は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１及び第２レベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１レベルの集合体は、ＢＮＣ中で見いだされる。第２レベルの集合体は、連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの組み込み中に見いだされる。一部の実施形態では、レベル２集合体には磁気がある。
【００７３】
本明細書でマクロ多孔性磁気骨格に対して使用される用語「連続」は、微粒子集合体でない材料、すなわち、互いに集合して巨視的構造を形成する粒子や離散物体で構築されてない材料を意味する。微粒子集合体とは対照的に、連続構造は、シームレス及び均一な構造を周期的に中断する、マクロ細孔の周りで実質的にシームレス及び均一である。したがって、連続骨格中のマクロ細孔は、凝集粒子間の格子間隙ではない。それにもかかわらず、一次連続骨格の集合又は凝集が一次連続骨格間の格子間隙により形成されたマクロ細孔（例えば、約５０ｎｍ超〜約１００まで）を含んでいない限り、より小さい一次連続骨格の集合又は凝集から連続骨格を構築することができる。特にセラミック材料や元素材料などの無機材料の場合、連続骨格は結晶ドメイン若しくは相界を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００７４】
特定の実施形態では、磁気ナノ粒子（ＢＮＣ）の上記のメソ多孔性凝集体は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１及び第２レベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１レベルの集合体は、ＢＮＣ中に見いだされる。第２レベルの集合体は、連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの組み込み中に見いだされる。全階層的触媒集合体には、少なくともＢＮＣの存在によって磁気がある。
【００７５】
マクロ多孔性骨格は、５０ｎｍ超のサイズを有するマクロ細孔（すなわち、マクロスケールサイズの細孔）を含有する。様々な実施形態では、マクロ細孔は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、又は未満として表したとき、例えば、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１ミクロン（１μｍ）、１．２μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、若しくは１００μｍのサイズ、又は上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００７６】
マクロ多孔性骨格は、マクロ細孔を収容可能である限り、任意の好適なサイズを有し得る。典型的な実施形態では、マクロ多孔性骨格は、少なくとも１つのマクロスケールのサイズ寸法を有する。少なくとも１つのマクロスケールの寸法は５０ｎｍ超であり、上記に提供したマクロ細孔の値のいずれかであり得るとともに特に、その寸法を正確に、約、少なくとも、超、まで、又は未満として表したとき、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ若しくは１ｃｍの寸法、又は上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズであり得る。サイズ寸法の１つのみ又は２つがマクロスケールである場合、残りの１つ又は２つの寸法は、ナノスケール、例えば、上記に提供した磁気ナノ粒子の値のいずれか（例えば、独立して、その値を正確に、約、少なくとも、超、まで、又は未満として表したとき、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｎｍの値、又は上記の値の任意の２つに挟まれる範囲内の値）であり得る。一部の実施形態では、マクロ多孔性骨格のサイズ寸法の少なくとも２つ若しくは全てがマクロスケールである。
【００７７】
第１セットの実施形態では、ＢＮＣが取り込まれる連続マクロ多孔性骨格には磁気がある、すなわち、ＢＮＣの不在下でさえも磁気がある。例えば、連続マクロ多孔性骨格には、磁気ポリマー組成物で構成されることにより磁気がある場合もある。磁気ポリマーの例は、当技術分野で周知のように、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）とエメラルジン塩基形式のポリアニリン（ＰＡＮｉ）との組み合わせでのＰＡＮｉＣＮＱである。あるいは、追加して、連続マクロ多孔性骨格には、ＢＮＣに属さない磁気粒子が埋め込まれたことによって磁気がある場合もある。ＢＮＣに属さない磁気粒子は、例えば、ＦＲＰ酵素やいずれの酵素にも一体化されていない磁気ナノ粒子若しくはマイクロ粒子であり得る。磁気マイクロ粒子は、マクロ細孔サイズと無関係ではあるが、マクロ細孔について上記に提供したサイズ若しくはサイズ分布を有し得る。特定の実施形態では、磁気マイクロ粒子は、約、正確に若しくは少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍのサイズ、又は上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。一部の実施形態では、連続マクロ多孔性骨格は、ＢＮＣの少なくとも一部分に吸着された磁気マイクロ粒子がその中に埋め込まれているか、又は磁気マイクロ粒子がＢＮＣに一体化されても吸着もされていない。
【００７８】
第２セットの実施形態では、ＢＮＣが組み込まれている連続骨格には磁気がない。それにもかかわらず、非磁気骨格を含有する全階層的触媒集合体には、少なくともその中に組み込まれたＢＮＣの存在によって磁気が残留する。
【００７９】
１つの実施形態では、連続マクロ多孔性骨格（若しくはその前駆体）はポリマー組成物を有する。ポリマー組成物は、当技術分野で公知の固体の有機、無機、又はハイブリッド有機−無機のポリマー組成物のいずれかである可能性があり、バインダーとして作用する合成ポリマー若しくはバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロ多孔性骨格は、水中又はその中で階層的触媒の使用が意図される他の媒体中で溶解も分解もしない。合成有機ポリマーの一部の例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸若しくはポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸若しくはポリメタクリレート塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコールなど）、フルオロポリマー（例えば、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレンなど）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール及びそれらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーの一部の例としては、多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース及びアルギン酸）、ポリ乳酸並びにポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定の例では、セルロースは、微生物又は藻類に由来するセルロースであり得る。無機若しくはハイブリッド有機−無機ポリマーの一部の例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成により調製されるもの）及びポリホスファゼンが挙げられる。一部の実施形態では、上記に提供したいずれか１つ以上のクラス又は特定のタイプのポリマー組成物は、マクロ多孔性骨格として除外される。
【００８０】
また別の実施形態では、連続マクロ多孔性骨格（若しくはその前駆体）は、非ポリマー組成物を有する。非ポリマー組成物は、例えば、セラミック組成物又は元素組成物を有し得る。セラミック組成物は、結晶、多結晶若しくは非晶質であってよく、並びに酸化物組成物（例えば、アルミナ、ベリリア、セリア、イットリア若しくはジルコニア）及び非酸化物組成物（例えば、炭化物、ケイ化物、窒化物、ホウ化物若しくは硫化物の組成物）を含む当技術分野で公知の組成物のいずれかを有し得る。元素組成物もまた、結晶、多結晶若しくは非晶質であってよく、及び炭素、アルミニウム又はケイ素などの任意の好適な元素組成物を有し得る。
【００８１】
他の実施形態では、ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子間の格子間隙としてマクロ細孔を含む磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）の集合体（すなわち凝集体）を含む（若しくはそれにより構築される）非連続マクロ多孔性支持体中に存在する。磁気マイクロ粒子は典型的には強磁性であり、マグネタイト若しくは他の強磁性材料で作製可能である。ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子の凝集のマクロ細孔の少なくとも一部分に埋め込まれているが、さらに磁気マイクロ粒子の表面上にも存在し得る。ＢＮＣは、磁気相互作用によって磁気マイクロ粒子の表面に一体化可能である。磁気マイクロ粒子は、金属酸化物又は貴金属のコーティング層で被覆されてもされなくてもよい。一部の実施形態では、ＢＮＣ−ＭＭＰ集合体は、階層的触媒集合体を提供するために、上記に記載した連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれる（すなわち、埋め込まれる）。
【００８２】
一部の実施形態では、骨格は、架橋結合水不溶性ポリマー及び埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む。架橋結合ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び任意選択的に追加のポリマー材料を含む。骨格は、骨格の調製中に注型を使用することによって任意の形状を取ることができる。又は、骨格は、バイオ触媒反応において使用するためにマイクロ粒子に粉砕されてよい。又は、骨格は、バイオ触媒反応において使用するためにビーズとして成形されてよい。又は、骨格は、モノリスであってよい。骨格を調製及び使用するための方法もまた提供される。
【００８３】
他の実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、架橋結合水不溶性ポリマー及び埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む。ポリマーは、少なくともポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み、サイズが約５０〜５００ｎｍのＭＭＰ、サイズが約１〜約５０μｍの細孔、約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを有するが、ここで骨格はバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための総計約１〜１５ｍ２／ｇである有効表面積を含み；酵素を組み込むための総有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；骨格は約０．０１〜約１０ｇ／ｍＬのバルク密度を有し；及び骨格は約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３ｋｇ−１の質量磁化率を有する。好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、骨格と水との約０〜９０度の接触角を含む。マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格の実施形態の詳細は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書に教示されている。
【００８４】
個別の磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体又はそれらのＢＮＣは、任意の好適な磁性度を有する。例えば、磁気ナノ粒子、ＢＮＣ若しくはＢＮＣ骨格集合体は、少なくとも、若しくは約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｅｍｕ／ｇまでの飽和磁化（Ｍｓ）を有し得る。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ若しくはＢＮＣ−骨格集合体は、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（すなわち、〜まで）若しくは未満、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇ若しくは０．１ｅｍｕ／ｇまで若しくは未満の残留磁化（Ｍｒ）を有する。磁気ナノ粒子、ＢＮＣ若しくはＢＮＣ−骨格集合体の表面磁場は、約若しくは少なくとも、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００ガウス（Ｇ）、又は上記の値のいずれか２つに挟まれる範囲内の磁場であり得る。マイクロ粒子が含まれる場合、マイクロ粒子はまた、上記の磁気強度のいずれかを有し得る。
【００８５】
磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、結果として生じるＢＮＣを生成するために、用途に応じて、飽和レベルまで若しくは未満の好適な量の酵素を吸着するように作製することができる。様々な実施形態では、磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜まで若しくは〜未満で表したときに、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５若しくは３０ｐｍｏｌ／ｍ２の酵素を吸着し得る。又は、磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、飽和レベルの約〜、少なくとも〜、〜まで若しくは〜未満で表したときに、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％である量の酵素を吸着し得る。
【００８６】
磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体又はそれらのＢＮＣは、任意の好適な細孔容積を有する。例えば、磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜まで若しくは〜未満で表したときに、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５若しくは１ｃｍ３／ｇの細孔容積、又は上記の値のいずれか２つに挟まれる範囲内の細孔容積を有し得る。
【００８７】
磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体又はそれらのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁気ナノ粒子若しくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜まで若しくは〜未満で表したときに、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ｍ２／ｇの比表面積を有し得る。
【００８８】
ＭＮＰ、それらの構造、組織、好適な酵素、及び使用は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／３１４１９号明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／２６０８６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８０２００７０１号明細書に記載されている。ＢＮＣの自動化連続生産は、米国特許出願公開第２０１８０２００７０１号明細書に開示されている。磁気固定化酸素及び補因子系は、国際公開第２０１８１０２３１９号パンフレットに記載されている。上記は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【００８９】
本発明は、磁気的に封入されたモノオキシゲナーゼを有するＢＮＣ（Ｅ．Ｃ．１．１３）を提供する。１つの実施形態では、モノオキシゲナーゼは、Ｐ４５０（ＥＣ＿１．１４．−．−））である。１つの好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、ヒト起源である。（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２８８４６２５／を参照されたい。）また別の好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、細菌起源である。他の好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、藻類、真菌、植物若しくは動物起源である。
【００９０】
一部の実施形態では、Ｐ４５０は、ヒトである。他の実施形態では、ヒトＰ４５０は不溶形にあり、小胞オルガネラの膜内に埋め込まれている。オルガネラは、モノオキシゲナーゼの活性とともに作用する、又はモノオキシゲナーゼの活性を増強する他の酵素を含有し得る。他の実施形態では、Ｐ４５０は、ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ内に含まれている。（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｄｍｅ−ｔｏｘ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｅｔａｂｏｌｉｃ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｈｔｍｌ．を参照されたい）。他の実施形態では、Ｐ４５０は、バクトソーム（ｂａｃｔｏｓｏｍｅ）内にある。（例えば、Ｃｙｐｅｘ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｐｅｘ．ｃｏ．ｕｋ／ｅｚｃｙｐｂｕｆ．ｈｔｍ．を参照されたい）。
【００９１】
一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列又はそれらの誘導体を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物及び植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。
【００９２】
シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）（ＥＣ１．１４．１３．−）は、全生物中に存在するＮＡＰＤＨ依存性酸化ヘムタンパク質の多様なファミリーである。組織間で異なる発現プロファイルを備えるこれらの酵素は、生体異物又は非内因性化学物質の代謝を実施する。（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＤｅｎｉｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５（６）：２２５３−７８（２００５）を参照されたい）。ＣＹＰは、身体からの排泄を促進するためにそれらの親化合物より高い溶解度を備える代謝産物を生成する。ＣＹＰの基質範囲は広く、特に、ヒドロキシル化、エポキシ化、脱アミノ化、脱アルキル化及び脱アリール化反応を実施できるアイソフォーム間で異なる。
【００９３】
薬物、消費者製品及び食品添加物の開発に関する安全注意義務（ｓａｆｅｔｙ  ｄｕｅ  ｄｉｌｉｇｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ，ｃｏｎｓｕｍｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の一部として、組織ミクロソーム及び組み換えＣＹＰは、それらの毒性を評価するための代謝産物を生成するために使用されている。しかし、ＣＹＰは、反応性酸素種（ＲＯＳ）がＣＹＰ媒介性酸化の副生成物として形成されるために低いプロセス安定性を有することが多く、酸化的変性に屈するので、工業において使用するためには困難であることが有名である。ヒトＣＹＰは、膜結合性であり、小胞体近シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）及びシトクロムｂ５内に局在化しているが、後者は時々ＣＹＰ活性を改善し、前者は活性のために必要とされる。（図２）。
【００９４】
本発明のＰ４５０は、エステルの脂肪族ヒドロキシル化、芳香族ヒドロキシル化、エポキシ化、ヘテロ原子脱アルキル化、アルキン酸化、ヘテロ原子酸化、芳香族エポキシ化及びＮＩＨシフト、脱ハロゲン化、脱水素化、還元及び開裂を実施することができる。
【００９５】
本発明は、第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相代謝において代謝産物を生成する、ＢＮＣ中の他の代謝酵素を使用する工程を提供する。例としては、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ及びカルボキシエステラーゼが挙げられる。
【００９６】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ、ＥＣ．２．４．１．１７）酵素は、生体異物へのグルクロン酸部分の添加を触媒する。ＵＧＴの経路は、頻回に処方される薬物、生体異物、食物中の物質、毒素及び内因性毒素のヒト身体からの排出の主要経路である。
【００９７】
スルホトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．８．２．）のスーパーファミリーは、ドナー分子からアクセプターのアルコール若しくはアミンへのスルホ基の移動を触媒するトランスフェラーゼ酵素である。最も一般的なスルホ基ドナーは、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）である。大多数の生体異物及び小さな内因性基質の例では、スルホン化は、一般により水溶性生成物を生じさせ、それによって腎臓若しくは胆汁を介してそれらの排泄に役立つ解毒経路であると見なされている。
【００９８】
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ、Ｅ．Ｃ．１．１４．１３．８）酵素は、それらの排泄を促進するために生体異物の酸化を実施する。これらの酵素は、多種多様なヘテロ原子、特に軟質求核基、例えばアミン、硫化物及び亜リン酸塩を酸化することができる。この反応は、二酸素、ＮＡＤＰＨ補因子及びＦＡＤ補欠分子族を必要とする。
【００９９】
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ、Ｅ．Ｃ．１．４．３．４）は、モノアミンの酸化的脱アミノ化を触媒する。酸素は、１つの分子から１つのアミン基を除去するために使用され、結果として対応するアルデヒド及びアンモニアを生じさせる。ＭＡＯは、それらが数多くのモノアミンオキシダーゼ阻害剤薬の作用にとっての基質であるため、薬理学における周知の酵素である。
【０１００】
カルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１）は、カルボン酸エステル及びＨ２Ｏをアルコール及びカルボキシレートに変換する。それらは哺乳動物肝臓内で一般的であり、例えば毒素若しくは薬物などの生体異物の代謝に関与する；結果として生じるカルボキシレートは、次に他の酵素によって共役結合されて溶解度を増加させ、最終的には排出される。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明のオキシドレダクターゼは、カタラーゼである。カタラーゼ（ＥＣ．１．１１．１．６）は、ほぼ全ての生物中で酸素に曝露されると見いだされる酵素である。それらは水及び酸素（Ｏ２）への過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の分解を触媒する。それらは、細胞を反応性酸素種（ＲＯＳ）による酸化損傷から保護する。カタラーゼは、全酵素の最高代謝回転数の一部を有している；典型的には、カタラーゼ分子１個は毎秒何百万個の過酸化水素分子を水及び酸素に転換させることができる。カタラーゼは、各々が５００アミノ酸長を超える４本のポリペプチド鎖の四量体である。それらは過酸化水素と反応することを許容する４つのポルフィリンヘム（鉄）基を含有する。カタラーゼは、食品工業において、例えばチーズ製造の前に牛乳から過酸化水素を除去するため、及び例えばグルコン酸などの酸性度調節剤を製造するために使用される。カタラーゼは、繊維工業において、織物から過酸化水素を除去するためにも使用される。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明のオキシドレダクターゼは、スーパーオキシドジスムターゼ（例えば、ＥＣ１．１５．１．１）である。これらは、通常の分子酸素（Ｏ２）若しくは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）いずれかへのスーパーオキシド（Ｏ２−）ラジカルの不均化を交互に触媒する酵素である。スーパーオキシドは、酸素代謝の副生成物として生成され、及び調節されない場合は、酸化損傷を誘発する。過酸化水素もまた損傷性であるが、例えばカタラーゼなどの他の酵素によって分解され得る。
【０１０３】
他の実施形態では、オキシドレダクターゼは、グルコースオキシダーゼ（例えば、ＥＣ１．１．３．４）である。オキシドレダクターゼは、グルコースから過酸化水素及びＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。オキシドレダクターゼは、例えば、ペルオキシダーゼなどの過酸化水素消費酵素のための酸化剤として過酸化水素を生成するために使用される。
【０１０４】
他の実施形態では、代謝酵素は、カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）である。カルボキシルエステラーゼは、自然に広く分布しており、哺乳動物肝臓内で一般的である。多くは、例えば毒素若しくは薬物などの生体異物の第Ｉ相代謝に関与する；結果として生じるカルボキシレートは、次に他の酵素によって共役結合されて溶解度を増加させ、最終的には排出される。進化的に関連するタンパク質（相互に対して明白な配列相同性を備えるタンパク質）のカルボキシルエステラーゼファミリーには、例えばアセチルコリンエステラーゼなどの様々な基質特異性を備える多数のタンパク質が含まれる。
【０１０５】
本発明は、Ｐ４５０の化学的代謝産物を製造するための磁気固定化されたＰ４５０触媒系を提供する。一部の実施形態では、酵素の安定性若しくは活性は、補因子要件を低下させながら最大化される。他の実施形態では、酵素は、代謝産物製造のための再使用可能な磁性キャリア上に固定化される。他の実施形態では、磁気固定化されたＰ４５０は、化学物質製造能力を増加させる、酵素回収を強化する、又はコスト及び環境汚染を減少させる。本発明の他の実施形態では、酵素活性における損失が最小からゼロまでである。好ましい実施形態では、酵素活性の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６〜２０若しくは２０〜３０％しか消失しない。本発明の他の実施形態では、酵素活性及び生産性の増加が見られる。他の実施形態では、Ｐ４５０に加えて１種以上の酵素が磁気固定化される。これは、現行の製造基盤中への磁気プロセスと結合された磁性材料の採用を促進できる、又は環境に優しい化学方法を可能にする可能性がある。
【０１０６】
本発明は、さもなければ伝統的化学によっては合成するのが困難である生物学的に重要な代謝産物を生成するＰ４５０代謝酵素／ＢＮＣ系のバイオ触媒合成を提供する。一部の実施形態では、本発明は、生体異物に曝露させられると生物によって生成される代謝産物の多様性を模倣する。これは、酸化代謝産物が有害な作用を有し得る、又はその反対に、それがそれに由来する親分子より高い薬理効果を有する薬物の評価において特に重要である。ここで、メタボリックプロファイリングは、新薬の安全性を増加させる可能性がある。（例えば、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による代謝産物安全性試験ガイドライン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／．．．／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ０７９２６６．ｐｄｆを参照されたい）。薬物及び化学物質のメタボリックプロファイリングは、一般に、十分な量の生物学的に重要な代謝産物を製造するのが困難であること、又は高スループット法で多様な代謝産物を製造するのが困難であることによって制限される。
【０１０７】
Ｐ４５０シトクロムは、薬物を含む広範囲の生体異物の酸化代謝に責任を負う酵素の遺伝子スーパーファミリーを表す。Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘ．２２（１）：１−２１（１９９２）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ２７（７）：６５７−６６５（１９９７）：Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２９３（２）：４５３−４５９（２０００）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３３（４）：５００−５０７（２００５）；Ｔｒｅｆｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（１３）：４３１７−４３２５（２００７）；Ｄｒｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ３８（１）：４１−５７（２０１２）。新薬開発において薬物代謝産物を生成するために、ヒト肝臓ミクロソーム、ヒト組み換えミクロソーム若しくは精製ヒト組み換えＰ４５０モノオキシゲナーゼは、市販で入手できるが、典型的にはプロセス不安定性及び不良な活性レベルに悩まされる。Ｉｒｉｂａｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．９（２）：ｐ．３６５−３７３（１９９６）；Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．１１（６）：ｐ．６５９−６６５（１９９８）；Ｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９（６７３７）：６７０−６７３（１９９９）。上記の文献は、参照によりそれらの全体として組み込まれる。
【０１０８】
本発明のＰ４５０  ＢＮＣは、例えば薬物若しくは特殊化学物質製造において使用することができる。一部の実施形態では、製造される化合物は、小分子である。他の実施形態では、製造される化合物は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。他の実施形態では、製造される化合物は、殺虫剤などの農薬有効成分である。他の実施形態では、製造される化合物は、ホルモン及びフェロモンなどの有効成分である。他の実施形態では、製造される化合物は、香味料、香料及び食用着色料である。
【０１０９】
Ｐ４５０酵素は、不安定であり、バイオ触媒反応に使用するのが困難であることは有名である。しかしそれらは、薬物及び生体異物変換の代謝経路にとって重要な成分であるため、薬物代謝産物の生成において重要な役割を果たす。ヒトＰ４５０は、広範囲の基質を有する。例えば、ヒトＣＹＰ１Ａ１は、ＥＲＯＤをレゾフリン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）に変換する；ヒトＣＹＰ１Ａ２は、フェナセチンをアセトアミノフェンに変換し、さらにクロザピン、オランゼピン、イミプラミン、プロプラノール及びテオフィリン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ａ６は、クマリンを７−ヒドロキシクマリンに変換する；ヒトＣＹＰ２Ｂ６はブプロピオンをヒドロキシブプロピオンに変換し、さらにシクロホスファミド、エファビレンツ、ネビラピン、アルテミシシン、メタドン及びプロフォフォール上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｃ８は、パクリタキセルを６α−ヒドロキシパクリタキセルに変換する；ヒトＣＹＰ２Ｃ９は、ジクロフェナクを４’−ヒドロキシジクロフェナクに変換し、さらにフルルビプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、フェニトイン、ピロキシカム、トルブタミド及びワルファリン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｃ１９は、メフェニトインを４’−ヒドロキシフェニトインに変換し、さらにアミトリプチリン、シクロホスファミド、ジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾール及びフェニトイン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｄ６は、デキストロメトルファンをデキストロファンに変換し、さらにアミトリプチリン、イミプラミン、プロパノール、コデイン、デキストロメトルファン、デシプラミン及びブファラロール上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｅ１は、クロルゾキサノンから６−ヒドロキシクロロゾキサノン上で活性であり、さらにアセトアミノフェンを変換する；ヒトＣＹＰ２Ａ４は、ミダゾラムを１−ヒドロキシミダゾラムに変換し、さらにアルプラゾラム、カルバマゼピン、テステロン、シクロスポリン、ミダゾラム、シンバスタチン、トリアゾラム及びジアゼパム上で活性である。
【０１１０】
例えばヒトＵＧＴなどの他の代謝酵素は、例えば、７−ヒドロキシクマリンを７−ヒドロキシクマリングルクロニドに変換し、ヒトＳＵＬＴは、７−ヒドロキシクマリンを７−ヒドロキシクマリン硫酸塩に変換する。
【０１１１】
工業プロセスにおいてモノオキシゲナーゼを使用することにおける１つの困難は、補因子再生、及び特にβ−１，４−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）である。ＮＡＤＰＨは、化学量論的に使用するには高価すぎる。したがって、一部の実施形態では、本発明は、Ｐ４５０  ＢＮＣとともに使用される補因子再生組成物及び方法を提供する。好ましい実施形態では、ＢＮＣは、再生酵素と一緒に使用される。より好ましい実施形態では、再生酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である。他の好ましい実施形態では、例えばＧＤＨなどの再生酵素は、Ｐ４５０とともに共固定化される。
【０１１２】
本発明は、ＢＮＣ内に磁気固定化されたＰ４５０代謝酵素を使用するためのプロセスを提供する。一部の実施形態では、機械は磁気混合を提供し、Ｐ４５０を捕捉する。
【０１１３】
本発明は、酵素ポリペプチドをコードする核酸から発現させられる酵素を提供する。所定の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードする組み換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に機能的に連結させられてよい。調節ヌクレオチド配列は、発現のために使用される宿主細胞にとって一般に適切であろう。数多くのタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列は、様々な宿主細胞について当技術分野において公知である。
【０１１４】
典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー若しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び転写終結配列、翻訳開始及び翻訳終結配列並びにエンハンサー若しくはアクチベーター配列が含まれ得るがそれらに限定されない。当技術分野において公知である構成的若しくは誘導性プロモーターもまた企図されている。プロモーターは、天然型プロモーター又は２つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。発現構築物は、細胞内で例えばプラスミドなどのエピソーム上に存在してよい、又は発現構築物は染色体中に挿入されてよい。特定の実施形態では、発現ベクターには、形質転換宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。所定の実施形態には、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結した酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが含まれる。本明細書で使用するための調節配列には、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素が含まれる。所定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、発現するのが望ましい特定酵素ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力又は例えば抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質の発現を考慮に入れて設計される。
【０１１５】
また別の態様には、本明細書に記載した核酸のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする工程が含まれる。そのようなスクリーニング法には、例えば、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローニングする工程、結果として生じたベクターのライブラリーを用いて適切な細胞を形質転換させる工程及びそのようなライブラリーを形成するための条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させる工程が含まれる。スクリーニング法は、任意選択的にさらに所望の活性を検出する工程及び検出された産物を単離する工程をさらに含む。下記に記載する例示的なアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された極めて多数の縮退配列をスクリーニングするために必要であるような高スループット分析に適用できる。
【０１１６】
所定の実施形態には、微生物中で核酸を発現させる工程が含まれる。１つの実施形態には、核酸を細菌系中、例えばバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びそれらの誘導体中で発現させる工程が含まれる。典型的なプロモーターには、ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰＢＡＤ）、ｌａｃプロモーター、ｌ−ラムノース誘導性ｒｈａＰ  ＢＡＤプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃ及びｔａｃプロモーター、λファージプロモーターＰｌ及びアンヒドロテトラサイクリン誘導性ｔｅｔＡプロモーター／オペレーターが含まれる。
【０１１７】
他の実施形態には、酵母発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。酵母ベクター中で使用される典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））；他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））のためのプロモーターが含まれる。その他のプロモーターは、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素及び上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用について責任を担う酵素である。複製起源を含む、若しくは含まない酵母適合性プロモーター及び終結配列を含有する任意のプラスミドベクターは適切である。所定の酵母発現系は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためのベクターのＰｙｅｘ  ４Ｔファミリー）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＰｐｉｃｚシリーズＥａｓｙ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ発現キット）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）のためのＥＳＰ（商標）酵母タンパク質発現及び精製システム並びにＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためのＰｅｓｃベクター）から市販で入手できる。
【０１１８】
他の実施形態には、哺乳動物発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。好適な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、下記の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列領域、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列領域及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。その他の非相同哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン若しくは熱ショックプロモーターである。特定の実施形態では、酵母アルコールオキシダーゼプロモーターが使用される。
【０１１９】
追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞中で使用するためのプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公表された英国特許第２，２１１，５０４号明細書）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらに別の実施形態では、非相同哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、便宜的にもＳＶ４０ウイルス複製起源をさらに含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、便宜的にもＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として入手される。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２）。上記の文献は、参照によりそれらの全体として組み込まれる。
【０１２０】
他の実施形態には、昆虫細胞発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。昆虫細胞宿主を使用する真核生物発現系は、プラスミド若しくはバキュロウイルス発現系のいずれかに依存することができる。典型的な昆虫宿主細胞は、ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に由来する。異種タンパク質を発現させるためには、これらの細胞はウイルスポリヘドロンプロモーターの制御下で発現させられた関心対象の遺伝子を有するバキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルスの組換形により感染させる。このウイルスによって感染した他の昆虫には、キャベツルーパー（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ））に由来する「Ｈｉｇｈ  ５」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）として商業的に公知の細胞系が含まれる。時々使用されるまた別のバキュロウイルスは、カイコ（カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））に感染するカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病（ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｓｉｓ）ウイルスである。数多くのバキュロウイルス発現系は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（商標）ｋ若しくはＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（商標）系）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現系）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｂａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標））から市販で入手できる、又はその他はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ若しくはＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる。また別の昆虫細胞宿主は、一般的ミバエ、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）であり、それに対しては一過性若しくは安定性プラスミドに基づくトランスフェクションキットがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ＤＥＳ（商標）系）によって市販で提供されている。
【０１２１】
一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載した核酸を発現するベクターを用いて形質転換させられる。新規な遺伝物質を動物細胞及び植物細胞を含む真核細胞内に挿入するための形質転換技術は、周知である。発現カセットを宿主細胞ゲノム内に挿入するためにはウイルスベクターを使用できる。又は、ベクターは、宿主細胞内にトランスフェクトさせることができる。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、光学的トランスフェクション法、プロトプラスト融合法、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）法及び流体力学的送達によって遂行されてよい。
【０１２２】
所定の実施形態には、哺乳動物細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及びベロ細胞内で酵素ポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程が含まれる。この方法は、任意選択的に酵素ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、本発明の酵素は、天然型酵素と相同である。「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能的若しくは構造的レベルで参照分子に類似する生物活性分子である。相同体は、参照配列と所定の同一性パーセントを共有する配列誘導体を含み得る。したがって、１つの実施形態では、相同若しくは誘導体配列は、少なくとも７０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同若しくは誘導体配列は、少なくとも８０若しくは８５％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同若しくは誘導体配列は、少なくとも９０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同若しくは誘導体配列は、少なくとも９５％の配列同一性を共有する。より特定の実施形態では、相同若しくは誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の配列同一性を共有する。相同若しくは誘導体核酸配列は、さらに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でそれらが参照核酸配列に結合したままで留まる能力によって定義することもできる。参照分子との構造的若しくは機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学的誘導体であってよい。構造的及び機能的相同体並びに誘導体を検出、生成及びスクリーニングする方法は、当技術分野において周知である。
【０１２４】
２つ以上の核酸配列若しくはポリペプチド配列の状況下での用語「同一性」パーセントは、下記で記載する配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ若しくは当業者であれば利用できる他のアルゴリズム）又は視覚的検査を使用して測定した、最大一致について比較及びアラインメントした場合に同一である規定パーセンテージのヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列若しくは部分配列に関する。用途に依存して、「同一性」パーセントは、比較対象の配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在し得る、又は比較対象の２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のためには、典型的には１つの配列は、それと試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば配列座標が指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは、次に指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比較して試験配列について配列同一性パーセントを計算する。
【０１２５】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．に記載のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は視覚的検査（一般に、下記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）によって実施することができる。
【０１２６】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。
【０１２７】
本発明のまた別の態様には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成反応において合成される酵素ポリペプチドが含まれる。１つの例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成反応は、当技術分野において周知である無細胞タンパク質合成、液相タンパク質合成及び固相タンパク質合成からなる群から選択される。
【０１２８】
本明細書に記載した本発明をより十分に理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示することだけを目的としており、決して本発明を限定すると見なすべきではないと理解すべきである。
【実施例】
【０１２９】
実施例１：ピン製造
ピンの製造に使用する材料は、Ｆｏｒｍｌａｂｓから購入した高温樹脂であった（０．４５ＭＰａで２８９℃、ｈｔｔｐｓ：／／ｆｏｒｍｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｕｓ／ｆｏｒｍ−２／ｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐ−ｒｅｓｉｎ／）。ピンはコンピュータ支援設計を用いてモデル化し、そのモデルの方向付け及びサポートを行うＰｒｅＦｏｒｍ（Ｆｏｒｍｌａｂｓ  ｈｔｔｐｓ：／／ｆｏｒｍｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｅｆｏｒｍ／）に送った。ピンは、Ｆｏｒｍ  ２（Ｆｏｒｍｌａｂｓ  ｈｔｔｐｓ：／／ｆｏｒｍｌａｂｓ．ｃｏｍ／３ｄ−ｐｒｉｎｔｅｒｓ／ｆｏｒｍ−２／）プリンター及び高温樹脂を使用し、３Ｄ印刷した。印刷後、ピンを２つのイソプロピルアルコール槽で各々５分間洗浄した。ピンを槽から取り出し、室温で風乾した。次に、ピンをポスト硬化室内に配置し、６０℃で４０５ｎｍの光に６０分間曝露した。最後に、支持体を除去し、ピンを水と８００及び１２００グリットの紙やすりで滑らかになるまでウェットサンドした。印刷されたピンを図１に示す。マイクロプレートピンアレイの図面を図２に示す。
【０１３０】
実施例２：機能化されたピンコーティング材料及び方法
機能化されたピンコーティングの製作に使用する材料は、鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）酸化物（マグネタイト、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＜５μｍの粒子、カタログ番号３１００６９−５００Ｇ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、Ａｑｕａｌｏｎ  ＴＭ、ＣＭＣ  ７Ｈ３ＳＸＦ  ＰＨ、Ａｓｈｌａｎｄ、カタログ番号４２６３５２）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、８９−９８Ｋ  ９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３４１５８４−５００Ｇ）、ナノフィブリル化セルロース（ＮＦＣ、３％ｗ／ｗの水分散液、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｉｎｅ）、無水クエン酸（ＶＷＲ）、キサンタンガム（Ｊｕｄｅｅのグルテンフリー、１００％純粋）、及びミリＱ水であった。
【０１３１】
ピンコーティング調製においては、ナノフィブリル化セルロース（ＮＦＣ）を水に分散させ、氷槽内で数秒間、４０％振幅で超音波処理した。その後、クエン酸をＮＦＣ分散液に添加し、連続撹拌下で数分間溶解させておいた。混合物を撹拌しながら、数ｍＬのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を添加した。分散が均一に見えたら、鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）酸化物粒子を添加し、混合物を勢いよく撹拌した。最後に、混合物を氷槽内で数秒間、３５％振幅で超音波処理した。生成された材料をピンとともにシリコーンモールドに注ぎ、−２０℃〜−１９６℃の温度範囲で凍結させ、次に−１２℃及び１００ｍＴｏｒｒ未満で材料が乾燥するまで凍結乾燥させた。凍結乾燥後、コーティングピンを乾燥器内、１３０℃で数分間架橋させ、材料を水で数回すすぐことにより、未反応のクエン酸を除去した。
【０１３２】
実施例３：ピンコーティング製剤
４０％振幅で１分間、パルスの３０秒オン及び１０秒オフでの超音波処理を通じて、１ｇの３％ｗ／ｗ  ＮＦＣ分散液を６．３ｍＬの水に添加することにより、ＮＦＣの分散液を生成した。次に、８０ｍｇのクエン酸を、５００ＲＰＭで溶解するまで分散液に添加した。これに続いて、７００ＲＰＭで撹拌中、２．７ｍＬのＣＭＣ  ２％ｗ／ｗ及び１．３７ｍＬのＰＶＡ  １０％ｗ／ｗ水溶液を添加した。次に、８２３ｍｇのマグネタイトを先の分散液に添加し、８００ＲＰＭで２分間撹拌し、次に氷槽内、３５％で１分間、パルスの６秒オン及び２秒オフで超音波処理した。
【０１３３】
別の配合では、１ｇのＮＦＣを１７．４１ｍＬのキサンタンガム０．５％ｗ／ｗ水溶液及び７００μＬの水に分散させ、次に上のように超音波処理した。これに続いて、８０ｍｇのクエン酸を添加した。その後、７００ＲＰＭで撹拌中、２．７ｍＬのＣＭＣ２％ｗ／ｗ及び７００μＬのＰＶＡ１５％ｖ／ｖを添加した。分散が均一に見えたら、８２３ｍｇのマグネタイトを添加し、８００ＲＰＭで撹拌し、続いて上のように超音波処理した。図３は、機能化されたコーティングピンのいくつかの例を示す。
【０１３４】
コーティング材料の微細構造的特徴が、金パラジウム標的を用いるスパッターコーティング（７ｎｍ厚）後、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ、Ｔｅｓｃａｎ  Ｍｉｒａ３）下で認められた。架橋コーティング材料のＳＥＭ画像を図４に示す。図４Ａでは、菱形形状材料の全体構造が認められる。図４Ｂは、該材料における最も支配的な構造である、側表面のより高い解像度画像を示す。
【０１３５】
実施例４：固定化ＣＹＰ３Ａ４の貯蔵及び安定性
固定化ＣＹＰ３Ａ４は、７日にわたり貯蔵したとき、安定であった。遊離及び固定化ＣＹＰ３Ａ４の活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。ＣＹＰ３Ａ４ミクロソームは、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した（カタログ４５６２０２：ヒトＣＹＰ３Ａ４＋Ｐ４５０レダクターゼ＋チトクロムｂ５  ＳＵＰＥＲＳＯＭＥＳ（商標））。トリス緩衝液は、１Ｍトリス、ｐＨ７．５（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。トレハロース（Ｄ−（＋）−トレハロース、二水和物）及びスクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜５μｍ、９５％）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１３６】
アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）。３７℃で５００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、ローテータ上で１〜１８時間混合した。ＣＹＰ３Ａ４反応物は、６．２５ｎＭ（３．１２５ｐｍｏｌ）のＣＹＰ３Ａ４、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、並びに１．３ｍＭのＮＡＤＰ、５Ｕ／ｍＬのＧ６ＰＤＨ、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐからなる補因子再生系を含有した。生成物のレゾルフィン（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、ＲＦＮの検量線の蛍光を比較することにより定量化した。
【０１３７】
固定化ＣＹＰ粉末を５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、２００μｌの５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのトレハロースに懸濁した。サンプルは、（Ａ）４℃で貯蔵し、（Ｂ）凍結させ、−２０℃で貯蔵し、そして（Ｃ）凍結させ、−８０℃で貯蔵した。１日後、３日後、及び７日後、サンプルを急速に解凍し、且つ／又は室温まで温め、そして凍結保護剤／凍結乾燥保護剤の緩衝液を除去し、サンプルを１００ｍＭのＫＨＰＯ４で洗浄した。その後、ＣＹＰ３Ａ４活性を上記のように実施した。
【０１３８】
ＣＹＰ３Ａ４活性は、７日間にわたり低下しなかった。凍結サンプル（Ｂ、Ｃ）の活性は、４℃で貯蔵されたもの（Ａ）よりもやや低かった。
【０１３９】
実施例５：拡張されたＣＹＰ３Ａ４活性
固定化ＣＹＰ３Ａ４活性は、無細胞アッセイにおいて、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比較すると、有意に拡張された。ＣＹＰ３Ａ４ミクロソーム（カタログ４５６２０２：ヒトＣＹＰ３Ａ４＋Ｐ４５０レダクターゼ＋チトクロムｂ５  ＳＵＰＥＲＳＯＭＥＳ（商標））は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。ヘペス緩衝液は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した（ヘペスナトリウム塩、９９％）。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。スクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜５μｍ、９５％）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。スーパーオキシドジスムターゼ（ウシ赤血球由来；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）；カタラーゼ（ウシ肝臓由来；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＲＥ００４１）、Ｇ６ＤＨ（ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒカタログ番号Ｊ６０１１７−４Ｉ）、ＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’−リン酸還元テトラナトリウム塩水和物、＞９７％；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びヘペス（ヘペスナトリウム塩、９９％、ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を配合し、−２０℃で貯蔵した。各固定化に対して、カタラーゼを新規に調製した。スーパーオキシドジスムターゼの保存液（水中、５００Ｕ／ｍｌ）、Ｇ６ＤＨの保存液（ｐＨ８の水中、５００Ｕ／ｍｌ）を調製し、−２０℃で貯蔵した。ＮＡＤＰの保存液（ｐＨ８の水中、２６ｍＭ）を調製し、−８０℃で貯蔵した。２６ｍＭのＭｇＣｌ２の保存液を塩化マグネシウム六水和物（Ｍａｃｒｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から調製した。
【０１４０】
酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）は、先にＣｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ３４（５）：１５−２０（２０１６）（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に記載のように調製した。それらを４℃、ｐＨ１１、Ｎ２パージ雰囲気下で貯蔵した。ＮＰは、固定化の日に４０％振幅で１分間超音波処理した（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。５００μｇ／ｍｌ及び２０００μｇ／ｍｌのナノ粒子溶液（２倍）を、ｐＨ１１の水を用いて２２ｍｇ／ｍｌの保存液から調製した。２６０μｌの冷却ＮＰ溶液を、ｐＨ４の水中、スーパーオキシドジスムターゼ（１０Ｕ／ｍｌ）、カタラーゼ（２０ｕｇ／ｍｌ；４０〜１００Ｕ／ｍｌ）、Ｇ６ＤＨ（２０Ｕ／ｍｌ）、及びＮＡＤＰ（２６ｍＭ）を含有する２６０μｌの冷却酵素溶液に急速に添加した。添加の１〜２分以内に、５０ｍＭの冷却ヘペス（ｐＨ７．５）中のＣＹＰ３Ａ４の溶液（１２．５ｐｍｏｌ／ｍｌ）をＮＰ−酵素混合物に添加し、４℃で１時間インキュベートした。固定化収率は、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ３Ａ４酵素標準に対して比較することにより定量化した。
【０１４１】
遊離及び固定化ＣＹＰ３Ａ４の活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）から購入した。３７℃で５００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、ローテータ上で１〜１８時間混合した。ＣＹＰ３Ａ４反応物は、６．２５ｎＭ（３．１２５ｐｍｏｌ）のＣＹＰ３Ａ４、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐを含有したが、補因子再生系（ＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ）が欠如した。生成物（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、ＲＦＮの検量線の蛍光を比較することにより定量化した。
【０１４２】
反応時間の１時間と１８時間との間で、７−ＥＲからレゾルフィンへの変換における２８０％の増加及び３７０％の増加が認められた（図２）。
【０１４３】
これらは、１時間後、固定化ＣＹＰ３Ａ４が活性を示し、２．７倍〜３．７倍の範囲の変換における著しい増加が認められたことを示す。比較によると、遊離ＣＹＰ３Ａ４は、１時間経過するまでにほぼ完全に不活性化される。これは、固定化ＣＹＰ３Ａ４が基質を長期間にわたり代謝し、低クリアランスの代謝産物を生成し得ることを示す。加えて、補因子ＮＡＤＰ及び補因子再生酵素Ｇ６ＤＨは、自由溶液中に添加されたＮＡＤＰ又はＧ６ＤＨの不在下での活性によって示された通り、巧みに固定化され、機能的であった。
【０１４４】
実施例６：ヒト肝ミクロソームの固定化
ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ（著作権）ＵｌｔｒａＰｏｏｌ（商標）ＨＬＭ１５０カタログ番号４５２１１７）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液を１Ｍトリス（ｐＨ７．５）（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。スクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜５μｍ、９５％）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【０１４５】
ＨＬＭストック（２０ｍｇ／ｍｌ）を３７℃の槽内で急速に解凍させ、１２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで２５ｍＭスクロースを添加した５０ｍＭの冷却トリス（ｐＨ７．５）で希釈した。５００μｌのＨＬＭ溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により定量化した。
【０１４６】
遊離及び固定化ＨＬＭの活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）。３７℃で５００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、ローテータ上で１時間混合した。ＨＬＭ反応物は、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、並びに１．３ｍＭのＮＡＤＰ、５Ｕ／ｍＬのＧ６ＰＤＨ、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐからなる補因子再生系を含有した。生成物（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、蛍光をＲＦＮの検量線と比較することにより定量化した。
【０１４７】
ＨＬＭの固定化収率は、９６＋／−２．９％であることが３通りに判定された。同じ濃度での遊離ＨＬＭに対する活性は、５５＋／−４％であることが判定された（図３）。
【０１４８】
プールしたヒト肝ミクロソームは、ほぼ完全に固定化され、そのＣＹＰ３Ａ４活性は、それを遊離ＨＬＭ反応と比較することにより示された。これは、ＣＹＰミクロソーム、他のミクロソーム（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＵＧＴ１Ａ１）など、又はそれらの組み合わせを固定化する広範な適用性を示す。
【０１４９】
実施例７：ピンデバイス上のミクロソーム固定化
実施例３に記載の通り、ＰＶＡ、ＣＭＣ及びクエン酸の懸濁液（７％ｗ／ｖ）を円形ピンの形状で薄壁鋳型内に投じ、それを−８０℃で凍結させることにより、酵素ピンデバイスを構築した。ピンを−１２℃及び＜１００ｍＴｏｒｒで３日間凍結乾燥させ、１６０℃の乾燥器内で１時間硬化させることにより直ぐに架橋させた。
【０１５０】
ＣＹＰ３Ａ４ミクロソーム（カタログ４５６２０２：ヒトＣＹＰ３Ａ４＋Ｐ４５０レダクターゼ＋チトクロムｂ５  ＳＵＰＥＲＳＯＭＥＳ（商標））は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液（ｐＨ７．５、１Ｍストック）は、ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから購入した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。スクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜５μｍ、９５％）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。スーパーオキシドジスムターゼ（ウシ赤血球由来；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）；カタラーゼ（ウシ肝臓由来；  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｇ６ＤＨ（ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、ＮＡＤＰ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’−リン酸還元テトラナトリウム塩水和物、＞９７％；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヘペス（ヘペスナトリウム塩、９９％、ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を配合し、−２０℃で貯蔵した。各固定化に対して、カタラーゼを新規に調製した。スーパーオキシドジスムターゼの保存液（水中、５００Ｕ／ｍｌ）、Ｇ６ＤＨの保存液（ｐＨ８の水中、５００Ｕ／ｍｌ）を調製し、−２０℃で貯蔵した。ＮＡＤＰの保存液（ｐＨ８の水中、２６ｍＭ）を調製し、−８０℃で貯蔵した。２６ｍＭのＭｇＣｌ２の保存液を塩化マグネシウム六水和物（Ｍａｃｒｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から調製した。
【０１５１】
酸化鉄ナノ粒子（ＮＰ）は、上記のように調製し、４℃、ｐＨ１１、Ｎ２パージ雰囲気下で貯蔵した。ＮＰは、固定化の日に４０％振幅で１分間超音波処理した（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０１５２】
ピン固定化：２５００μｇ／ｍｌのナノ粒子溶液を、ｐＨ１１の水を用いて２２ｍｇ／ｍｌの保存液から調製した。１００μｌの冷却ＮＰ溶液（２５００μｇ／ｍｌ）を、ｐＨ４の水中、スーパーオキシドジスムターゼ（５０Ｕ／ｍｌ）、カタラーゼ（１００μｇ／ｍｌ；２００〜５００Ｕ／ｍｌ）、Ｇ６ＤＨ（１００Ｕ／ｍｌ）、及びＮＡＤＰ（１０ｍＭ）を含有する１００μｌの酵素溶液に急速に添加した。添加の１〜２分以内に、２５μｌの溶液をピンに添加し、溶液の急速な吸収を引き起こした。ピンを２５℃で１時間インキュベートしてから、２５μｌのＣＹＰ３Ａ４（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２５ｍＭスクロース中、１２５ｐｍｏｌ／ｍｌ）を添加した。４℃で１時間のインキュベーション後、ピンを２５０μｌの水に浸漬し、固定化収率を、ブラッドフォード法（ＢｉｏＲａｄ製のブラッドフォード試薬：ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ３Ａ４酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１５３】
ＣＹＰ３Ａ４活性：遊離及び固定化ＨＬＭの活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎから購入した（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）。３７℃で２００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、オービタルシェーカー上で５００ｒｐｍで１時間回転させた。ＣＹＰ３Ａ４反応物は、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、並びに１．３ｍＭのＮＡＤＰ、５Ｕ／ｍＬのＧ６ＰＤＨ、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐからなる補因子再生系を含有した。生成物（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、蛍光をＲＦＮの検量線と比較することにより定量化した。
【０１５４】
ピンは、高度に多孔性で海綿状の挙動を呈し、２つの２５μｌの体積の液体を容易に吸収した。ブラッドフォード法によって測定した、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＡＴ／Ｇ６ＤＨ／ＳＯＤの固定化収率は、９１．８＋／−１．５％であり、遊離ＣＹＰ３Ａ４に対する活性は、２９．５％＋／−３．８％であった。したがって、補因子及びＲＯＳ再利用酵素系とＣＹＰ３Ａ４の双方を、キャピラリー力により溶液中に順次導くことにより、濃縮保存液として巧みに固定化した。
【０１５５】
実施例８：マグネタイト粉末に対するＣＹＰ２Ｂ６の固定化及び活性
ＣＹＰ２Ｂ６は、酵素のチトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーである。このファミリー内の酵素は、薬剤代謝に関与するモノオキシゲナーゼである。固定化ＣＹＰ２Ｂ６の活性は、同じ濃度のタンパク質において遊離酵素の活性以上であった。
【０１５６】
ＣＹＰ２Ｂ６酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＣＹＰ２Ｂ６＋オキシドレダクターゼ、カタログ番号４５６２１０）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液は、１Ｍトリス、ｐＨ７．５（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１５７】
ＣＹＰ２Ｂ６ストック（１ｎｍｏｌ／ｍｌ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、４ｐｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０で希釈した。５００μｌのＣＹＰ２Ｂ６溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ２Ｂ６酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１５８】
発光基質アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｂ６アッセイ及びスクリーニングシステム）を使用し、遊離及び固定化ＣＹＰ２Ｂ６の活性を測定した。アッセイでは、カブトムシルシフェリンから誘導された発光基質を利用する。誘導された基質は、ルシフェラーゼ用の基質でないが、ＣＹＰ２Ｂ６によりルシフェリンに変換され、それは次にルシフェラーゼと反応し、アッセイにおいてＣＹＰ２Ｂ６の活性に正比例する光を生成する。２通りの反応を、室温で５００μｌの反応体積を有する０．５ドラムのガラスバイアル（ＶＷＲ（登録商標）バイアル、ホウケイ酸塩ガラス、フェノールスクリューキャップ装備）内で振盪しながら２時間実施した。ＣＹＰ２Ｂ６反応物は、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、３μＭのＣＹＰ２Ｂ６発光基質、並びに１．３ｍＭのＮＡＤＰ、５Ｕ／ｍＬのＧ６ＰＤＨ、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐからなる補因子再生系を含有した。生成物は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１ハイブリッドマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）での発光検出により検出した。
【０１５９】
ＣＹＰ２Ｂ６の固定化収率は、８５％＋／−１％であることが３通りに判定された。遊離ＣＹＰ２Ｂ６酵素に対する活性は、１１４％＋／−３％であることが判定された。固定化ＣＹＰ２Ｂ６は、同じ濃度のタンパク質について遊離酵素の活性以上を有した。固定化ＣＹＰ２Ｂ６は、反応バイアルから容易に回収され、分析対象の反応混合物のみが残存した。
【０１６０】
実施例９：固定化ＣＹＰ２Ｂ６の貯蔵及び安定性
固定化ＣＹＰ２Ｂ６は、１４日間にわたり貯蔵したとき、安定であった。ＣＹＰ２Ｂ６酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＣＹＰ２Ｂ６＋オキシドレダクターゼ、カタログ番号４５６２１０）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液を１Ｍトリス（ｐＨ７．５）（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。スクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１６１】
ＣＹＰ２Ｂ６ストック（１ｎｍｏｌ／ｍｌ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、４ｐｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０で希釈した。５００μｌのＣＹＰ２Ｂ６溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ２Ｂ６酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１６２】
発光基質アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐ４５０−Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｂ６アッセイ及びスクリーニングシステム）を使用し、遊離及び固定化ＣＹＰ２Ｂ６の活性を測定した。アッセイでは、カブトムシルシフェリンから誘導された発光基質を利用する。誘導された基質は、ルシフェラーゼ用の基質でないが、ＣＹＰ２Ｂ６によりルシフェリンに変換され、それは次にルシフェラーゼと反応し、アッセイにおいてＣＹＰ２Ｂ６の活性に正比例する光を生成する。２通りの反応を、室温で５００μｌの反応体積を有する０．５ドラムのガラスバイアル（ＶＷＲ（登録商標）バイアル、ホウケイ酸塩ガラス、フェノールスクリューキャップ装備）内で振盪しながら２時間実施した。ＣＹＰ２Ｂ６反応物は、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、３μＭのＣＹＰ２Ｂ６発光基質、並びに１．３ｍＭのＮＡＤＰ、５Ｕ／ｍＬのＧ６ＰＤＨ、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐからなる補因子再生系を含有した。生成物は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１ハイブリッドマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）での発光検出により検出した（図８Ａ）。
【０１６３】
固定化ＣＹＰ２Ｂ６粉末を５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、１００μｌの５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのスクロースに懸濁した。サンプルを−２０℃で貯蔵した。２日後、７日後、及び１４日後、サンプルを３７℃の槽内で急速に解凍し、抗凍結剤緩衝液を除去し、サンプルを１００ｍＭのＫＨＰＯ４で洗浄した。その後、ＣＹＰ２Ｂ６活性測定を上記のように実施した（図８Ｂ）。
【０１６４】
固定化ＣＹＰ２Ｂ６は、新鮮な遊離ＣＹＰ２Ｂ６の活性の５０％以上を保持した（図９）。
【０１６５】
実施例１０：マグネタイト粉末上に固定化されたＵＧＴ１Ａ６
ＵＧＴ１Ａ６は、小さい親油性分子を水溶性の排泄可能な代謝産物に変換するグルクロン酸抱合経路の酵素のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼである。固定化ＵＧＴ１Ａ６活性は、同じタンパク質濃度で遊離ＵＧＴ１Ａ６の活性以上であった。
【０１６６】
ＵＧＴ１Ａ６酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＵＧＴ１Ａ６、カタログ番号４５６４１６）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液は、１Ｍトリス、ｐＨ７．５（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。スクロースは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１６７】
ＵＧＴ１Ａ６ストック（５ｍｇ／ｍＬ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０で希釈した。５００μｌのＵＧＴ１Ａ６溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＵＧＴ１Ａ６酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１６８】
蛍光定量アッセイ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴ活性アッセイ／リガンドスクリーニングキット、カタログ番号Ｋ６９２）を使用し、遊離及び固定化ＵＧＴ１Ａ６の活性を測定した。アッセイでは、高度蛍光性ＵＧＴ基質を利用し、基質が非蛍光性グルクロニドに変換されるとき、蛍光発光における低下を追跡することにより、ＵＧＴ活性を測定する。ＵＧＴの比活性は、蛍光減少を要求される補因子ＵＤＰＧＡの不在下で実施される対照反応と比較することによって計算する。２通りの反応を、３７℃で５００μｌの反応体積を有する０．５ドラムのガラスバイアル（ＶＷＲ（登録商標）バイアル、ホウケイ酸塩ガラス、フェノールスクリューキャップ装備）内で振盪しながら２時間実施した。ＵＧＴ１Ａ６反応物は、アラメチシン、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴ基質及びＵＤＰＧＡ補因子を有するＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴアッセイ緩衝液を含有した。対照反応物は、アラメチシン、ＵＧＴ基質、及びＵＤＰＧＡ補因子に代わる一定量のアッセイ緩衝液を有するＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴアッセイ緩衝液を含有した。生成物は、Ｅｘ／Ｅｍ＝４１５／５０２ｎｍでの蛍光により検出し、蛍光における減少をＵＧＴ基質蛍光の検量線と比較することにより定量化した。
【０１６９】
ＵＧＴ１Ａ６の固定化収率は、９２％＋／−１％であることが３通りに判定された（図１０Ａ）。同じ濃度での遊離ＵＧＴ１Ａ６酵素に対する活性は、１０９％＋／−２７％であることが判定された（図１０Ａ）。固定化ＵＧＴ１Ａ６は、平均で０．６３±０．１６ｎｍｏｌのＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴ活性アッセイ基質を消費し、遊離ＵＧＴは、平均で０．５８±０．３９ｎｍｏｌの基質を消費した（図１０Ｂ）。固定化ＵＧＴ１Ａ６は、反応バイアルから容易に回収され、分析対象の反応混合物のみが残存した。
【０１７０】
実施例１１：固定化ＵＧＴ１Ａ６の貯蔵及び安定性
ＵＧＴ１Ａ６酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＵＧＴ１Ａ６、カタログ番号４５６４１６）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液を１Ｍトリス（ｐＨ７．５）（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１７１】
ＵＧＴ１Ａ６ストック（５ｍｇ／ｍＬ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０で希釈した。５００μｌのＵＧＴ１Ａ６溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＵＧＴ１Ａ６酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１７２】
蛍光定量アッセイ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴ活性アッセイ／リガンドスクリーニングキット、カタログ番号Ｋ６９２）を使用し、遊離及び固定化ＵＧＴ１Ａ６の活性を測定した。アッセイでは、高度蛍光性ＵＧＴ基質を利用し、基質が非蛍光性グルクロニドに変換されるとき、蛍光発光における低下を追跡することにより、ＵＧＴ活性を測定する。ＵＧＴの比活性は、蛍光減少を要求される補因子ＵＤＰＧＡの不在下で実施される対照反応と比較することによって計算する。２通りの反応を、３７℃で５００μｌの反応体積を有する０．５ドラムのガラスバイアル（ＶＷＲ（登録商標）バイアル、ホウケイ酸塩ガラス、フェノールスクリューキャップ装備）内で振盪しながら２時間実施した。ＵＧＴ１Ａ６反応物は、アラメチシン、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴ基質及びＵＤＰＧＡ補因子を有するＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴアッセイ緩衝液を含有した。対照反応物は、アラメチシン、ＵＧＴ基質、及びＵＤＰＧＡ補因子に代わる一定量のアッセイ緩衝液を有するＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＵＧＴアッセイ緩衝液を含有した。生成物は、Ｅｘ／Ｅｍ＝４１５／５０２ｎｍでの蛍光により検出し、蛍光における減少をＵＧＴ基質蛍光の検量線と比較することにより定量化した。
【０１７３】
固定化ＵＧＴ１Ａ６粉末を５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、１００μｌの５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのスクロースに懸濁した。サンプルを−２０℃で貯蔵した。１日後及び１４日後、サンプルを３７℃の槽内で急速に解凍し、抗凍結剤緩衝液を除去し、サンプルを１００ｍＭのＫＨＰＯ４で洗浄した。その後、ＵＧＴ１Ａ６活性測定を上記のように実施した。固定化ＵＧＴ１Ａ６は、新規の遊離ＵＧＴ１Ａ６の活性の５０％以上を保持した（図１１）。
【０１７４】
実施例１２：マグネタイト粉末上に固定化されたＣＹＰ３Ａ４
マグネタイト粉末上でのＣＹＰ３Ａ４の固定化及び活性。固定化反応緩衝液ｐＨは、固定化反応における重要なパラメータであった。
【０１７５】
ＣＹＰ３Ａ４酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＣＹＰ３Ａ４＋オキシドレダクターゼ、カタログ番号４５６２０７）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液を１Ｍトリス（ｐＨ７．５）（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１７６】
ＣＹＰ３Ａ４ストック（２ｎｍｏｌ／ｍｌ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、６．２５ｐｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０、ｐＨ７．５、又はｐＨ８．０で希釈した。５００μｌのＣＹＰ３Ａ４溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ３Ａ４酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１７７】
遊離及び固定化ＣＹＰ３Ａ４の活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）から購入した。３７℃で５００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、ローテータ上で１〜１８時間混合した。ＣＹＰ３Ａ４反応物は、６．２５ｎＭ（３．１２５ｐｍｏｌ）のＣＹＰ３Ａ４、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐを含有したが、補因子再生系（ＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ）が欠如した。生成物（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、ＲＦＮの検量線の蛍光を比較することにより定量化した。
【０１７８】
ＣＹＰ３Ａ４の固定化収率は、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、及びｐＨ８．０の固定化緩衝液に対して各々、９７％±０．４％、９１％±５％、及び９２％±０．５％であることが２通りに判定された（図１２Ａ）。遊離ＣＹＰ３Ａ４酵素に対する活性は、同じタンパク質濃度で、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、及びｐＨ８．０の固定化緩衝液に対して各々、３５％±３％、３０％±３％、及び３６％±５％であることが判定された（図１２Ｂ）。固定化ＣＹＰ３Ａ４は、反応バイアルから容易に回収され、分析対象の反応混合物のみが残存した。
【０１７９】
実施例１３：固定化ＣＹＰ３Ａ４の貯蔵及び安定性
固定化ＣＹＰ３Ａ４は、１４日間にわたり貯蔵したとき、安定であった。ＣＹＰ３Ａ４酵素（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＣＹＰ３Ａ４＋オキシドレダクターゼ、カタログ番号４５６２０７）は、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。トリス緩衝液を１Ｍトリス（ｐＨ７．５）（ＫＰ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ）から調製した。全ての水は、ＢａｒｎＳｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ浄水器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１８．５Ｍオーム−ｃｍ）から入手した。マグネタイト粉末（鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化物粉末＜１０μｍ）は、Ｒｅａｄｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。
【０１８０】
ＣＹＰ３Ａ４ストック（２ｎｍｏｌ／ｍｌ）を３７℃の槽内で急速に解凍し、６．２５ｐｍｏｌ／ｍｌの最終濃度まで５０ｍＭの冷却トリスｐＨ７．０で希釈した。５００μｌのＣＹＰ３Ａ４溶液を５ｍｇのマグネタイト粉末に添加し、振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。固定化収率を、ブラッドフォード法（ブラッドフォード試薬：ＢｉｏＲａｄ製のＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×色素試薬＃５０００２０５）により、ＣＹＰ３Ａ４酵素標準と比較することにより定量化した。
【０１８１】
遊離及び固定化ＣＹＰ３Ａ４の活性を評価するため、蛍光定量代替基質アッセイを開発した。アッセイでは、７−エトキシレゾルフィン（７−ＥＲ）のレゾルフィン（ＲＦＮ）への脱アルキル化を測定した。７−ＥＲは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（チトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）活性アッセイキット；Ｋ７０１２００）から購入した。３７℃で５００μＬの反応体積を有する２ｍＬのチューブ内で２通りの反応を実施し、ローテータ上で１〜１８時間混合した。ＣＹＰ３Ａ４反応物は、６．２５ｎＭ（３．１２５ｐｍｏｌ）のＣＹＰ３Ａ４、１００ｍＭのＫＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、２μＭの７−ＥＲ、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２．３ｍＭのＧ６Ｐを含有したが、補因子再生系（ＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ）が欠如した。生成物（ＲＦＮ）は、５３５／５８７ｎｍの励起／放射での蛍光により検出し、ＲＦＮの検量線の蛍光を比較することにより定量化した。
【０１８２】
固定化ＣＹＰ３Ａ４粉末を５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、１００μｌの５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのスクロースに懸濁した。サンプルを１）−４℃、２）−８０℃、３）−２０℃で貯蔵し、４）凍結乾燥を行い、次に４℃で貯蔵した。１日後、３日後、７日後、及び１４日後、サンプルを３７℃の槽内で急速に解凍し、抗凍結剤緩衝液を除去し、サンプルを１００ｍＭのＫＨＰＯ４で洗浄した。その後、ＣＹＰ３Ａ４活性を上記のように測定した。
【０１８３】
４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、５５％±６％、５４％±２％、５５％±３％、及び４４％±０．１％の活性を保持した。４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、７５％±８％、７４％±３％、７５％±４％、及び６０％±０．１％を保持した。−８０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、４６％±３％、４８％±１０％、５３％±６％、及び５１％±３％の活性を保持した。−８０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、６３％±３％、６５％±１３％、７２％±８％、及び６９％±４％を保持した。−２０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、４６％±４％、３９％±３％、４６％±１％、及び５３％±３％の活性を保持した。−２０℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、６３％±６％、５３％±４％、６２％±１％、及び７２％±４％を保持した（図１３Ａ）。凍結乾燥され、次に４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、遊離ＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、１８％±１２％、２３％±１％、２３％±０％、及び１９％±４％の活性を保持した。凍結乾燥され、次に４℃で貯蔵された固定化ＣＹＰ３Ａ４は、新規に固定化されたＣＹＰ３Ａ４と比べて、１日、３日、７日、及び１４日にわたって各々、２５％±１６％、３１％±２％、３１％±０．３％、及び２５％±６％を保持した（図１３Ｂ）。
【０１８４】
例示的な配列
配列番号１
シトクロムＰ４５０  ３Ａ４アイソフォーム１［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化１】
2022500016.tif 000003
配列番号２
シトクロムＰ４５０  １Ａ２［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化２】
2022500016.tif 000004
配列番号３
ＣＹＰ２Ｄ６［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化３】
2022500016.tif 000005
配列番号４
チトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化４】
2022500016.tif 000006
配列番号５
シトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化５】
2022500016.tif 000007
配列番号６
シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化６】
2022500016.tif 000008
【０１８５】
本明細書で開示及び言及した全ての刊行物及び特許文献は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。上記の説明は、例示及び説明のためだけに提示されている。この説明は、本発明を本明細書に開示した正確な形態に限定することは意図されていない。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求項によって規定されることが意図されている。
【図１】
2022500016.tif 000009
【図２Ａ】
2022500016.tif 000010
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2022500016.tif 000012
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
2022500016.tif 000015
【図５】
2022500016.tif 000016
【図６】
2022500016.tif 000017
【図７】
2022500016.tif 000018
【図８】
2022500016.tif 000019
【図９】
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【図１０】
2022500016.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
2022500016.tif 000025
2022500016.tif 000026