【事件の表示】
　特許第３１８７４３２号「Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のイン・ビトロでの再生法」の請求項１ないし６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１８７４３２号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
〔１〕手続きの経緯：
　本件特許3187432号は、平成8年5月24日に国際出願された（PCT/IT96/00106、優先権主張1995.5.25,イタリア）特願平8-535546号の特許出願であって、平成13年5月11日に特許権の設定登録がなされ、その後柴田明博から特許異議の申立てがなされたところ、当審において平成14年7月19日付で取消理由の通知がなされ指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされたものである。
　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、請求項１乃至６を訂正明細書に記載された請求項１乃至４の通りに訂正しようとするものであり、具体的には、
ａ．特許請求の範囲の請求項１の「プライマー又はペプチド補因子を添加せずに行うことができる」を「プライマーを添加しない」に訂正し、
ｂ．同請求項１の「ＮＳ５Ｂ（配列番号１）を含む配列」を「ＮＳ５Ｂ（配列番号１）を含む精製された配列」に訂正し、
ｃ．同請求項２及び３を削除し、
ｄ．同請求項４乃至６の番号及び引用する請求項の番号をｃ．の訂正に伴い繰り上げる、
という訂正をしようとするものである。
　上記訂正事項ａ．のうち、「ペプチド補因子」に関する記載を削除することは、択一的記載の要素の削除に相当するので特許請求の範囲の減縮に該当し、「添加せずに行うことができる」を「添加しない」に訂正することは、「添加して行う」態様を明確に除外することになるから、特許請求の範囲の減縮であり、かつ明りょうでない記載の釈明に該当する。
　また、同訂正事項ｂ．は、「ＮＳ５Ｂ（配列番号１）を含む配列」を用いるにあたり、その精製されたものを用いる場合に限定するものであり、特許請求の範囲の減縮に該当し、この点は特許明細書中（例えば特許公報第2頁第4欄最下行〜第3頁第5欄5行など）に記載されており、国際出願日における国際出願当初の明細書中にも記載されている事項である。
  そして、訂正事項ｃ．における請求項２及び３の削除は特許請求の範囲の減縮に該当し、訂正事項ｄ．は訂正事項ｃ．に伴い請求項を繰り上げたことによるものであるから、明りょうでない記載の釈明に該当する。
　そうなので、上記訂正事項はいずれも明細書に記載された事項の範囲内における特許請求の範囲の減縮もしくは明りょうでない記載の釈明にあたるものであり、またいずれも特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
　したがって、上記訂正は、いずれも特許法120条の4第第2項及び同条第3項において準用する特許法第126条第2項乃至第4項の規定に適合するので、当該訂正は認められるものである。
　
〔３〕特許異議申立について：
１．本件発明について：
　本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１乃至４の記載により以下のように特定されている（以下、請求項１に係る発明を「本件発明」ともいう。）。
　
「【請求項１】　プライマーを添加しない、Ｃ型肝炎ウイルスによってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性および末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のイン・ビトロでの再生法であって、酵素的に活性なＮＳ５Ｂ（配列番号１）を含む精製された配列をそのＲＮＡ基質と合わせる反応混合物に用いることを特徴とする、方法。
【請求項２】　請求項１に記載の方法によって得ることができるＮＳ５Ｂ配列を含む、組成物。
【請求項３】　配列が、配列番号１、そこに含まれているまたはそれから誘導される配列に記載されているタンパク質を含んでいる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】　治療目的で、ＮＳ５Ｂと会合した酵素活性を阻害する化合物を選択することができる酵素試験を準備するための、請求項２又は３に記載の組成物の使用。」
　
２．異議申立理由の概要：
　一方、特許異議申立人は、下記(1)乃至(3)の点を主張している。
(1)　訂正前の請求項１乃至６に係る発明は、下記甲第２乃至５号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、当該各請求項に係る発明の特許は特許法第29条第2項の規定に違反してなされたものであること。
(2)　訂正前の請求項１乃至３中の「プライマー又はペプチド補因子を添加せずに行うことができる」の記載について、「プライマー又はペプチド補因子を添加して行う態様が排除されているか否かが不明確なため、各請求項に係る発明が不明確であるから、本願は特許法第36条第4項又は第5項及び第6項に規定する要件を満たしていないこと。
(3)　訂正前の請求項１乃至３中の「ペプチド補因子」に関する記載は、国際出願当初の明細書等に記載した事項の範囲内にない事項であるから、特許法第113条第1項第5号に該当すること。
　
　　　　　　　　 記                            
甲第２号証：特開平6-303980号公報
甲第３号証：J.Virol.,68(1994)p.8147-8157
甲第４号証：J.Virol.,63(1989)p.216-225  
甲第５号証：J.Virol.,68(1994)p.5811-5818　　
　
３．当審の判断：
（３−１）(1)の点について
  甲第２号証に記載される図2-13〜図2-16のC型肝炎ウイルス（以下、HCVという。）のゲノムの塩基配列には、NS5B（配列番号１）に対応する配列が含まれており、甲第３号証にはNS5Bのゲノム上の位置が示されると共に、RNAポリメラーゼをコードすると推定されていることが記載されている。しかしながら、いずれの文献にも当該NS5Bを実際に発現させてRNAポリメラーゼ活性を確認したことの記載はない。
　一方、甲第４及び５号証に記載されているのは、ポリオウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼに関する実験結果及び考察であってHCVのそれではない。
　確かに、HCVも正鎖（＋）RNAウイルスである点ではポリオウイルスと共通しているが、前者がフラビウイルス（Flavi）科に属するものであるのに対して、後者はピコナウイルス（Picorna）科に属しており、両者は少なくとも「科」という「種」「属」よりも上位のレベルでの差異、すなわち「ウイルス粒子としての物理化学的性状」の明らかな差異があると解される。
　そのようなとき、「科」のレベルで異なったとしても、同じ「正鎖（＋）RNAウイルス」でありさえすれば、確実にRNA合成機構が共通する、といえるような合理的な根拠が示されていない以上、ポリオウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ自体に、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性（TUTasa活性、TATase活性）が存在する旨の知見が得られたとしても、直ちにHCVのRNA依存性RNAポリメラーゼに適用できるものではない。
　しかも、甲５号証においては、ポリオウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ（3Dpol）のTATase活性について、付加されるA残基の機能として、poli（A）tailを形成することによるRNA鎖の保護と翻訳の促進、及び（＋）鎖RNA合成の開始における役割（図7）と考察している図7には、（−）鎖3’末端に付加されたpoli（A）が（＋）鎖の合成の開始に寄与した後、ウリジニリル化されたVPg蛋白質と反応することで、5’末端に「VPg蛋白質」が付着した新生（＋）鎖RNAが合成されるモデルが図示されている（第5816頁右欄36−63行）。
　甲４号証において、ポリオウイルスポリメラーゼで観察されたプライマー非存在下でのTUTase様活性は、テンプレートとしてポリオウイルス自身のRNA又はグロビンmRNAという「polyA　tail構造」を有するものを使用した場合のものであり、その際に2倍長のRNA分子が合成されるメカニズムも、当該「polyA　tail構造」を前提として説明されている。
　このように、ポリオウイルスのRNAポリメラーゼに末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が存在するといっても、その機能を発揮するためにはゲノム構造上の5'末端の「VPg蛋白質」及び／又は3'末端の「polyA　tail構造」の存在が必須と考えられていたと解される。
　一方、甲２及び３号証に記載されるHCVのゲノム構造及びポリヌクレオチド配列情報は、HCVゲノムにこのような5'末端の「VPg蛋白質」、3'末端の「polyA　tail構造」のいずれについてもその存在を示唆するものではなく、本件優先権主張日当時、HCVのゲノムRNAの構造として、そのような構造が知られていたともいえない。むしろ、乙1号証の表2（170−173頁）によれば、本件優先日当時の当業者には、少なくともRNAの3'末端の構造に関して、poli（A）tailとは別の構造を有していると認識されていたことが窺える。
　そうなので、HCVがポリオウイルスと同じ「正鎖（＋）RNAウイルス」であるからといって、HCVのRNA依存性RNAポリメラーゼに対して、ポリオウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼと同様な末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を期待することにならないことは明らかである。すなわち、そもそも甲第２及び３号証の記載と甲第４及び５号証の記載とを組み合わせようとすることには無理がある。
  そして、本件発明は、従来推定の域を出なかったHCVゲノム配列中のNS5B（配列番号１）が、実際にRNA依存性RNAポリメラーゼをコードすることを確認したに留まらず、当該RNAポリメラーゼが、イン・ビトロで宿主及びウイルス由来のタンパク質のない精製した状態であっても、プライマーの非存在下で末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を示すという予想外の性質をはじめて確認したことに基づく発明であるということができる。
　そうであるから、本件発明は、甲第２乃至５号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとはいえず、請求項１の方法を引用する請求項２乃至４に係る発明も同様である。　
　したがって、この点についての異議申立人の主張は採用しない。
　
（３−２）(2)及び(3)の点について：
　異議申立人の主張(2)及び(3)については、前記訂正によりいずれも解消された。
　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のイン・ビトロでの再生法
【発明の詳細な説明】
　　　
説明
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分子生物学およびウイルス学に関する。更に具体的には、本発明の目的は、ＨＣＶによって産生されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）および末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＮＴアーゼ）活性、ＨＣＶ　ＲｄＲｐおよびＴＮＴアーゼの発現法、治療目的でこれらの酵素活性を阻害し、従ってＨＣＶウイルスの複製を妨害する化合物を同定するための、ＨＣＶによってコードされるＲｄＲｐおよびＴＮＴアーゼ活性をイン・ビトロで試験する方法である。
　知られているように、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）の主要な病因物質である。ＨＣＶは、輸血後のＮＡＮＢウイルス性肝炎の少なくとも９０％および突発性ＮＡＮＢ肝炎の５０％を引き起こすものと推定されている。血液供与者の選択、および輸血に用いられる血液の免疫学的特性決定には大きな進歩が見られたが、輸血を受けるヒトの中には未だ多数のＨＣＶ感染（世界中で毎年百万人以上の感染）が見られる。ＨＣＶ感染者の約５０％が、５〜４０年の期間以内に肝硬変を発症する。更に、最近の臨床研究によれば、慢性ＨＣＶ感染症と肝細胞癌の発症との間に相関があることが示唆されている。
　ＨＣＶは、約９．４ｋｂのＲＮＡ陽性ゲノムを含むエンベロープのあるウイルスである。このウイルスはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の一員であり、他の構成部員はフラビウイルスおよびペスチウイルスである。ＨＣＶのＲＮＡゲノムは、最近になり遺伝子地図が作成された。世界の他の部分で単離されたＨＣＶゲノムからの配列を比較したところ、これらの配列は極端に，異種性であることがあることが判った。ＨＣＶゲノムの大半は、９０３０〜９０９９個のヌクレオチドの間で変化することができるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）によって占められている。このＯＲＦは単一のウイルス性ポリタンパク質をコードし、その長さは３０１０〜３０３３個のアミノ酸の間で変化することができる。ウイルスの感染サイクルの間に、ポリタンパク質は、ウイルスの複製に必要な個々の遺伝子生成物にタンパク質分解的に加工される。ＨＣＶ構造タンパク質をコードする遺伝子は、ＯＲＦの５′−末端に位置し、非構造タンパク質をコードする領域はＯＲＦの残りの部分を占める。
　構造タンパク質は、Ｃ（コア、２１ｋＤａ）、Ｅ１（エンベロープ、ｇｐ３７）、およびＥ２（ＮＳ１、ｇｐ６１）からなる。Ｃは、２１ｋＤａの非グリコシル化タンパク質であり、ウイルス性のヌクレオカプシドを形成していると思われる。タンパク質Ｅ１は約３７ｋＤａの糖タンパク質であり、外側ウイルスエンベロープの構造タンパク質であると考えられる。６１ｋＤａのもう一つの膜糖タンパク質であるＥ２は、ウイルスの外側エンベロープにおける第二の構造タンパク質であると思われる。
　非構造領域は、２４ｋＤａの疎水性タンパク質であるＮＳ２（ｐ２４）から始まり、その機能は知られていない。ポリタンパク質のＮＳ２に続く６８ｋＤａのタンパク質であるＮＳ３は、最初の２００アミノ末端アミノ酸におけるセリンプロテアーゼドメイン、およびカルボキシ末端におけるＲＮＡ−依存性ＡＴＰアーゼドメインの２種類の機能的ドメインを有することが予言されている。ＮＳ４に相当する遺伝子領域は、それぞれ６および２６ｋＤａの２種類の疎水性タンパク質ＮＳ４Ａ（ｐ６）およびＮＳ４Ｂ（ｐ２６）をコードするが、これらのタンパク質の機能は未だ解明されていない。ＮＳ５に相当する遺伝子も、それぞれ５６および６５ｋＤａの２種類のタンパク質ＮＳ５Ａ（ｐ５６）およびＮＳ５Ｂ（ｐ６５）をコードする。
　様々な分子生物学的検討は、宿主細胞の小胞体と会合したプロテアーゼであるシグナルペプチダーゼが非構造領域における、すなわちＣ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２およびＥ２／ＮＳ２の部位でのタンパク質分解性加工に関与していることを示している。ＨＣＶのウイルス的にコードされたプロテアーゼ活性は、ＮＳ２とＮＳ３斗野開裂に関与しているものと思われる。このプロテアーゼ活性は、セリンプロテアーゼドメインを含むＮＳ２の部分とＮＳ３の部分とを両方共含んでなる領域に含まれるが、同一の触媒機構は用いない。ＮＳ３に含まれるれりプロテアーゼはＳ３とＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＡとＮＳ４Ｂ、ＮＳ４ＢとＮＳ５Ａ、およびＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂとの間の結合の開裂に関与している。
　他の（＋）−鎖ＲＮＡウイルスと同様に、ＨＣＶの複製は最初に相補性の（−）−ＲＮＡ鎖が合成され、これが次に後代の（＋）−鎖ＲＮＡ分子産生の鋳型として働くことによって進行すると考えられている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）は、これらの両段階に関与しているものと仮定されてきた。総てのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに含まれるアミノ酸配列は、ＮＳ５領域にあると認めることができる。これにより、ＮＳ５領域はウイルス複製機構の成分を含んでいることが示唆される。ウイルスによりコードされるポリメラーゼは、抗ウイルス化合物によって阻害するための重要な標的であると従来から考えられてきた。しかしながら、具体的なＨＣＶの場合には、そのような物質の研究は、ウイルス感染の適当なモデル系（例えば、培養における細胞の感染、または入手しやすい動物モデル）、および機能的なＲｄＲｐ酵素試験法のいずれもが欠けていたため極めて困難であった。
　意外なことには、この重大な制限は、本発明による方法を採用することによって解消することができ、これがまた下記の説明から明らかになる他の利益も付与することを見出だした。
　本発明の目的は、ＨＣＶ　ＮＳ５Ｂタンパク質に含まれる配列を使用する、ＨＣＶＫＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性をイン・ビトロで再生する方法である。ＮＳ５Ｂタンパク質のもう一つの特性である末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性も、この方法を用いて再生することができる。この方法は、ＮＳ５Ｂの配列を含むタンパク質は、真核または原核性の異種系のいずれでも発現することができること、すなわち明らかに均一になるまで精製したまたは過剰に生成する生体の抽出物に含まれるＮＳ５Ｂの配列を含む組換えタンパク質は、鋳型依存性（ＲｄＲｐ）または鋳型とは独立して（ＴＮＴアーゼ）外来ＲＮＡ分子の３′末端へのリボヌクレオチドの付加を触媒することができることを利用している。
　本発明は、新規な組成物であって、配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１またはそれに含まれているまたはそれから誘導される配列であるタンパク質を含んでなることを特徴とするものにも敷衍される。この配列は、総てのＲＮＡウイルスが高度の変異性を示すように、様々なＨＣＶ単離物で変化し得ることが理解されている。この新規な組成物はＨＣＶウイルスに必要なＲｄＲｐ活性を有し、そのゲノムを複製する。
　本発明の目的は、ＲｄＲｐのインヒビターおよびＴＮＴアーゼのインヒビターなどのＮＳ５Ｂと会合した酵素活性を阻害する化合物を治療目的で同定することができる酵素試験法を作成するためのこの組成物の使用である。
　この点までは、本発明の一般的説明は行なった。下記の例により、具体的態様を更に詳細に説明し、その目的、特徴、利点および操作の方法を一層明確に理解してもらうことにする。
　図１は、バキュロウイルス発現ベクターへのＨＣＶｃＤＮＡの転移に用いるプラスミド構築物を示す。
　図２は、それぞれＨＣＶ　ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＤ−ＲＮＡ基質のイン・ビトロでの合成に用いるプラスミド［ｐＴ７−７（ＤＣｏＨ）］およびＥ．ｃｏｌｉ細胞におけるＨＣＶ　ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現に用いるプラスミド［ｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）］を示している。
　図３は、Ｄ−ＲＮＡの（＋）および（−）鎖の略図を示す。転写体は、ＤＣｏＨ　ｍＲＮＡのコード領域を含んでいる。ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドａ、ｂおよびｃをデザインして、新規に合成したアンチセンスＲＮＡでアニールし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮアーゼＨで開裂させた。略図の株に、それぞれオリゴヌクレオチドａ、ｂおよびｃとのＲＮＡ（−）ハイブリッドのＲＮアーゼ消化によって生成される予想ＲＮＡ断片の大きさを示している。
寄託物
　それぞれ、受理番号ＮＣＩＭＢ４０７２７、４０７２８、４０７２９および４０７３０号で、ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテド（ＭＣＩＭＢ）、アバディーン、スコットランド、英国に１９９５年５月９日に登録した、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２の転写のためのｃＤＮＡおよびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を含むプラスミドｐＢａｃ５Ｂ、ｐＢａｃ２５、ｐＴ７．７ＤＣｏＨおよびｐＴ７．７ＮＳ５Ｂを用いて形質転換したＣ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１バクテリア。
例１
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａクローン９（Ｓｆ９）の培養細胞でのＨＣＶ　ＲｄＲｐ／ＴＮＴアーゼの発現の方法
　昆虫の培養細胞での異種遺伝子の発現のための系、例えばバキュロウイルスベクターで感染したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａクローン９（Ｓｆ９）細胞は、当該技術分野で知られている（Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、ヒト遺伝子生成物の発現のためのバキュロウイルス系（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４，ｐｐ．５６４−５７２）。異種遺伝子は、通常はＢｏｍｂｉｘ　ｍｏｒｉ核ポリヘドロシスウイルスのＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルスの強力なポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれている。同種組換えによるバキュロウイルスにおける所望な部位における異種ＤＮＡの導入法も、当該技術分野で知られている（Ｄ．Ｒ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，（１９９２）バキュロウイルス発現ベクター−実験室便覧（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク）。
　プラスミドベクターｐＢａｃ５ＢおよびｐＢａｃ２５はｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体の誘導体であり、バキュロウイルス発現ベクターにおけるＮＳ４Ｂおよび他の非構造ＨＣＶタンパク質をコードする遺伝子の転写の目的で構築された。これらのプラスミドは図１に模式的に示され、その構築は例８に詳記されている。ＨＣＶ−ＢＫ単離物のゲノムに相当するｃＤＮＡの選択された断片（ＨＣＶ−ＢＫ；Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，Ａ．，Ｍｏｒｉ，Ｃ．，Ｆｕｋｅ，Ｉ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｊ．，Ｏｎｉｓｈｉ，Ｅ．，Ａｎｄｏｈ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｉ．およびＯｋａｙａｍａ，Ｈ．，（１９９１）ヒトキャリヤーから単離したＣ型肝炎ウイルスゲノムの構造および組織（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５−１１１３）を、核ポリヘドロシスウイルスの強力なホリヘドリンプロモーター下でクローニングし、バキュロウイルスベクター中で同種組換えができる配列によってフランクした。
　ｐＢａｃ５Ｂを構築するため、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２４２０〜３０１０をコードするｃＤＮＡ領域を含み、ＮＳ５Ｂタンパク質（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に相当するＰＣＲ生成物をｐＢｌｕｅ　ＢａｃＩＩＩのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でクローニングした。ＰＣＲセンスオリゴヌクレオチドは翻訳開始シグナルを含み、元のＨＣＶ終止コドンは、翻訳終止の働きを行なう。
　ｐＢａｃ２５はｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体であり、ＨＣＶ−ＢＫポリタンパク質のアミノ酸８１０〜３０１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）をコードするｃＤＮＡ領域がＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間でクローニングされたものである。
　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａクローニング９（Ｓｆ９）細胞およびバキュロウイルス組換えキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。細胞を皿上でまたは１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含む完全Ｇｒａｃｅ昆虫培地（Ｇｉｂｃｏ）中で２７℃の懸濁液で成育させた。バキュロウイルスのトランスフェクション、組換えおよび選択は、製造業者が推奨する方法で行なった。組換えバキュロウイルスクローンＢａｃ２５およびＢａｃ５Ｂは、所望なＨＣＶｃＤＮＡを含むものを単離した。
　タンパク質の発現のため、Ｓｆ９細胞を、細胞当たり約５個のウイルス流しの割合で２×１０６個の細胞／ｍｌの密度で組換えバキュロウイルスＢａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染させた。感染から４８〜７２時間後、Ｓｆ９細胞をペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、Ｓｉｇｍａ）および４ｍｇ／ｍｌロイペプチンを含む緩衝液Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃｌ　ｐＨ８，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に慎重に再懸濁した（７．５×１０７個／ｍｌ）。総ての下記の段階は、氷上で行なった。３０分間膨潤させた後、きっちりと取り付けた乳棒を用いてダウンスホモゲナイザー中で２０往復させることによって細胞を破壊した。グリセロール、並びに洗剤Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ４０）および３−［（３−クロラミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）および０．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるまで加え、細胞抽出物を氷上で時折攪拌を行ないながら更に１時間インキュベーションした。核を１０００×ｇで１０分間遠心分離することによってペレット化し、上清を集めた。ペレットを、上記濃度のグリセロールおよび洗剤を含む緩衝液Ａ（７．５×１０７個の核当たり０．５ｍｌ）にダウンスホモゲナイザー中で２０往復させることによって再懸濁させた後、氷上で１時間インキュベーションした。核を再ペレット化した後、両上清を合わせて、８０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。生成する粗製細胞質抽出物を用いて、直接ＲｄＲｐ活性を測定し、またはスクロースグラディエント上で更に精製した（例５を参照されたい）。
　Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスＢａｃ２５またはＢａｃ５Ｂで感染させることにより、予想したＨＣＶタンパク質を発現する。実際に、Ｓｆ９細胞をＢａｃ２５で感染させた後、性格に加工したＨＣＶ　ＮＳ２（２４ｋＤａ）、ＮＳ３（６８ｋＤａ）、ＮＳ４Ｂ（２６ｋＤａ）、ＮＳ４Ａ（６ｋＤａ）、ＮＳ５Ａ（５６ｋＤａ）およびＮＳ５Ｂ（６５ｋＤａ）タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および免疫染色によって細胞溶解物中に検出することができる。Ｓｆ９細胞をＢａｃ５Ｂで感染させた後には、真のＮＳ５Ｂ（６５ｋＤａ）に大きさの点で相当する１個のＨＣＶでコードされたタンパク質だけが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に免疫染色またはクーマシーブルー染色を行なうことによって検出される。
例２
合成ＲＮＡ鋳型／基質上の組換えＨＣＶＲｄＲｐの試験法
　ＲｄＲｐ試験法は、新規なＲＮＡ生成物に取り込まれた標識したヌクレオチドの検出に基づいている。ＲｄＲｐ活性を測定するためのイン・ビトロ試験法は、Ｓｆ９粗製細胞質抽出物または精製したタンパク質画分１〜５μｌを含む総容量４０μｌ中で行なった。Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染したＳｆ９細胞の未分画または精製細胞質抽出物を、ＨＣＶＲｄＲｐの供給源として用いることができる。ＨＣＶには関係しないタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス構築物に感染した細胞から得たＳｆ９細胞抽出物を、ネガティブ・コントロールとして用いることができる。下記の補足物を反応混合物に加えた（最終濃度）：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃｌ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，２５ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１核種を５〜１０μＣｉ［３２Ｐ］ＮＴＰ（特に断らない限り、ＧＴＰ、３０００Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ、を用いた）、それぞれ０．５ｍＭのＮＴＰ（すなわち、特に断らない限り、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰ）、２０Ｕ　ＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｇＲＮＡ−基質（約４ピコモル；最終濃度１００ｎＭ）、２μｇのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）。反応物を室温で２時間インキュベーションし、等容量の２×Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（ＰＫ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃｌ　ｐＨ７．５、１％ｗ／ｖＳＤＳ）を加えて反応を停止し、３７℃でＰＫ５０μｇで半時間処理した。ＲＮＡ生成物をＰＣＡ抽出し、エタノールで沈澱し、７Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分析した。
　本発明者らが通常試験（Ｄ−ＲＮＡ）に用いたＲＮＡ基質は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２に記載の配列を有し、典型的には下記のように線形化したプラスミドｐＴ７−７（ＤＣｏＨ）をＴ７ポリメラーゼでイン・ビトロでの転写によって得た。
　プラスミドｐＴ７−７（ＤＣｏＨ）（図２）をＤＣｏＨコード配列の末端に含まれるユニークＢｇｌＩＩ制限部位で線形化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造業者によって記載された手続きにより転写した。転写は、ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５Ｕ／１０μｌを加えて停止した。混合物を更に１５分間インキュベーションし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＡ）で抽出した。取り込まれないヌクレオチドは、１ｍｌ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０紡糸カラム（ｓｐｕｎ　ｃｏｌｕｍｎ）を介するゲル濾過によって除去した。ＰＣＡによる抽出およびエタノール沈澱の後、ＲＮＡを乾燥し、水に再溶解し、その濃度を２６０ｎｍでの光学密度によって決定した。
　下記の実験から明らかになるように、Ｄ−ＲＮＡ以外の他のＲＮＡ分子を本発明のＲｄＲｐ分析に用いることができる。
　前記のＨＣＶＲｄＲｐ試験により、放射能標識した反応生成物の特徴的パターンが得られ、基質ＲＮＡと同時移行する一つの標識生成物は、ネガティブ・コントロールを含む総ての反応物に見られた。このＲＮＡ種は、銀染色によって可視化することもでき、従って投入基質ＲＮＡに双頭すると考えられ、バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の細胞質抽出物に含まれる末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性によって標識されるものと思われる。ＨＣＶに関係しないタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス構築物に感染した細胞ではなく、Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染したＳｆ９細胞の細胞質抽出物を用いて行なった反応では、基質ＲＮＡより速やかに移動する追加のバンドが観察された。この後者の反応生成物は、オートラジオグラフィだけによって検出することができ、銀染色によっては検出することができないので、高い特異活性に表しきされていることが判った。この新規な生成物は、ＲＮＡを加えない対照反応からは見られなかったので、外部から加えたＲＮＡ鋳型から誘導されることが判った。興味深いことには、基質ＲＮＡより速やかに移動する標識した種の形成は、ＨＣＶ３′−未翻訳領域を含んでいるまたはいないに関わらず、様々な鋳型ＲＮＡ分子で一貫して見られた。肝臓に特異的な転写補助因子ＤＣｏＨの３９９個のヌクレオチドｍＲＮＡ（Ｄ−ＲＮＡ）は、本発明者らのＲｄＲｐにおいて効率的に受容される基質であることが判った。
　Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染した細胞抽出物による反応で生成した新規な種の性質を画定するため、下記の一連の実験を行なった。（ｉ）反応混合物をＲＮＡアーゼまたはＮｕｃｌｅａｓｅ　Ｐ１で処理した。これにより、放射性バンドは完全に消失するので、標識生成物はいずれもＲＮＡ分子であると結論した。（ｉｉ）４種のヌクレオチド三リン酸のいずれかを反応混合物から除くと、投入ＲＮＡだけが標識されたことから、一層速やかに移動する種は重合反応の生成物であることが示唆された。（ｉｉｉ）試験からＭｇ２＋イオンを除くと、反応が完全にブロックされ、新規なＲＮＡの合成も、投入ＲＮＡの標識も見られなかった。（ｉｖ）試験を放射能標識した投入ＲＮＡと未標識ヌクレオチドとで行なうと、標識生成物は標準的条件下で得られたものと識別できなかった。この結果から、新規なＲＮＡ生成物は、最初の投入ＲＮＡ分子から生成すると結論した。
　まとめると、これらのデーターは、Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染したＳｆ９細胞の抽出物は新たなＲＮＡ合成を触媒する新規なマグネシウムに依存する酵素活性を含んでいることを示している。この活性は、加えたＲＮＡの存在によって変化するが、加えたプライマーまたは投入したＲＮＡ分子の供給元とは無関係であることが示された。更に、Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染したＳｆ９細胞の抽出物によって生成した生成物は同一であると思われるので、記載した実験は、観察され他ＲｄＲｐ活性はＨＣＶＮＳ５Ｂタンパク質によってコードされることを示している。
例３
ＨＣＶ　ＲｄＲｐ　ＲＮＡ生成物の特性決定の方法
　下記の方法を用いて、新たに合成したＲＮＡ生成物の構造的特徴を解明した。本発明者らの標準的な電気泳動条件下（５％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）では、新規なＲＮＡ生成物の大きさは約２００ヌクレオチドであると思われた。これは、ＲＮＡ転写の内部開始または未成熟終止によると思われた。しかしながら、異なるＲＮＡ基質を用いてＲｄＲｐ試験法によって誘導された生成物は総てそれぞれの鋳型よりも著しく速やかに移動することが判ったので、これらの可能性は極めて疑わしいと思われた。電気泳動中の温度および分析ゲル中のアクリルアミドの濃度を増加させると、ＲｄＲｐ生成物の移動挙動は著しく異なったものとなる。従って、例えば１０％アクリルアミド、７Ｍ尿素を含むゲル系を用いて高温で分離を行なった場合には、ＲｄＲｐ生成物は、投入ＲＮＡの長さの少なくとも二倍に相当する位置では投入基質ＲＮＡよりも遅く移動した。同様な効果は、メチルヒドロキシ−水銀（ＣＨ３ＨｇＯＨ、１０ｍＭ）のようなＲＮＡ変性剤をＲｄＲｐ生成物に加えた後、低比率／低温ゲル上で電気泳動を行なったときにも見られた。これらの観察結果は、ＲｄＲｐ生成物が広汎な二次構造を有することを示唆している。
　本発明者らは、様々な特異性の各種のリボヌクレアーゼに対する生成物分子の感受性について検討した。生成物を、ＲＮアーゼＡで処理して完全に分解した。一方、これが、一本鎖の特異的ヌクレアーゼＲＮアーゼＴ１に対して驚くほど耐性を有することが判った。投入ＲＮＡは、６０ＵのＲＮアーゼＴ１と共に２２℃で１０分間インキュベーションした後には完全に分解し、同じゲルの銀染色を行なったところ、鋳型のみならずＳｆ９細胞の細胞質抽出物に通常検出することができる総ての他のＲＮＡもＲＮアーゼＴ１でインキュベーション中に完全に加水分解した。対照的に、ＲｄＲｐ生成物は変化しないままであり、ＲＮアーゼＴ１で長時間インキュベーションした後にもごく僅かしか影響を受けなかった。従って、ＲＮアーゼＴ１で２時間処理した後、標識した生成物分子はゲル中のその最初の位置に検出することはできなかった。代わりに、投入した鋳型ＲＮＡと同様な電気泳動の移動度を有する新たなバンドが出現した。同様な効果はＲＮアーゼＴ１消化を１時間行なったときにも見られたが、異なる温度、例えば２２℃ではＲｄＲｐ生成物はほとんど変化しないままであったが、３７℃では、これは最初の基質と同時移動する新規な生成物に転換した。
　これらの観察結果に対する説明は、投入ＲＮＡはＨＣＶ　ＲｄＲｐの鋳型として作用し、３′−ＯＨを用いて、アンチセンス鎖が共有的に結合しているセンス（鋳型）鎖からなる二重のＲＮＡ「ヘアピン」分子を生じるターン−または「コピー−バック」機構による相補性鎖の合成の下準備を行なう。このような構造により、ポリアクリルアミドゲル上のＲｄＲｐ生成物の異常な電気泳動の移動度、並びに一本鎖の特異的ヌクレアーゼに対する高い耐性が説明される。回転するループは塩基対であるべきではなく、従ってヌクレアーゼの影響を受けやすいものであるべきである。従って、ＲＮアーゼＴ１で処理すると、センスおよびアンチセンス鎖の共有結合が加水分解されて、二本鎖ＲＮＡ分子が生じる。変性けける電気泳動中に、２本の鎖は分離して、新たに合成されたアンチセンス鎖であって、長さが最初のＲＮＡ鋳型と同様なものだけが検出可能なままとなる。この機構は、特にこの種の生成物がイン・ビトロで幾つかの他のＲＮＡポリメラーゼによ生成するということを考慮すれば、可能性があると思われる。
　下記の実験は、ポリメラーゼ反応中に標識されＲＮアーゼＴ１処理によって明らかに放出されたＲＮＡ生成物が投入した鋳型に対してアンチセンス配向を示すことを示す目的で設計した。このため、本発明者らは、投入した鋳型ＲＮＡ分子の３個の分離した配列（図２）に相当するオリゴデオキシリボヌクレオチドである、Ｄ−ＲＮＡのヌクレオチド１７０〜１９５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）に相当するオリゴヌクレオチドａ、ヌクレオチド２８６〜３０９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）に相補性のオリゴヌクレオチドｂ、ヌクレオチド３３１〜３５４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）に相補性のオリゴヌクレオチドｃを合成した。これらを用いて、ポリメラーゼ反応の生成物とのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成させ、それらをＲＮアーゼＨ消化を受けられるようにした。最初に、完全なＲｄＲｐ生成物をハイブリダイゼーションに用いた。しかしながら、この構造は熱安定性が高すぎて、特異的なハイブリッドは全く形成されなかった。従って、ヘアピンＲＮＡをＲＮアーゼＴ１で前処理し、５分間沸騰して変性させた後、それぞれのオリゴヌクレオチドの存在下で室温まで放冷した。予想されたように、ハイブリッドのＲＮアーゼＨへの暴露により、特異的な開裂生成物が生じた。オリゴヌクレオチドａ方向への開裂により、長さが約１７０および２２０個のヌクレオチドの生成物を生じ、オリゴヌクレオチドｂは約２９０および１１０個のヌクレオチドの生成物を生じ、オリゴヌクレオチドｃは約３３０および６５個のヌクレオチドの断片を生じた。これらの断片は予想した大きさを有するので（図３を参照されたい）、結果はＨＣＶ　ＮＳ５Ｂによって媒介されたＲＮＡ合成は、ヘアピン様ＲＮＡ二重体を生成するコピー−バック機構によって進行することを示している。
例４
合成ＲＮＡ基質上での組換えＨＣＶ　ＴＮＴアーゼの試験法
　ＴＮＴアーゼ試験法は、ＲＮＡ基質の３′ヒドロキシル基に対する標識したヌクレオチドの鋳型とは独立した取り込みの検出に基づいている。この試験法のＲＮＡ基質（Ｄ−ＲＮＡ）は、典型的には例２に記載したように線形かしたプラスミドｐＴ７−７ＤＣＯＨのＴ７ポリメラーゼによるイン・ビトロ転写によって得た。しかしながら、Ｄ−ＲＮＡ以外の任意の他のＲＮＡ分子を用いて、本発明のＴＮＴアーゼ試験法を行うこともできる。
　ＴＮＴアーゼ活性を決定するためのイン・ビトロ試験法は、Ｓｆ９粗製細胞質抽出物または精製したタンパク質画分１〜５μｌを含む総容量が４０μｌで行った。Ｂａｃ２５またはＢａｃ５Ｂに感染したＳｆ９細胞の未分画または精製した細胞質抽出物をＨＣＶ　ＴＮＴアーゼの供給源として用いた。ＨＣＶに関係しないタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス構築物に感染した細胞から得たＳｆ９細胞抽出物を、ネガティブコントロールとして用いることができる。下記の補足物を反応混合物に加えた（最終濃度）：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃｌ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，２５ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１核種を５〜１０μＣｉ［３２Ｐ］ＮＴＰ（特に断らない限り、ＧＴＰ、３０００Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ、を用いた）、２０Ｕ　ＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μｇＲＮＡ−基質（約４ピコモル；最終濃度１００ｎＭ）、２μｇのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）。反応物を室温で２時間インキュベーションし、等容量の２×Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（ＰＫ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｃｌ　ｐＨ７．５、１％ｗ／ｖＳＤＳ）を加えて反応を停止し、３７℃でＰＫ５０μｇで半時間処理した。ＲＮＡ生成物をＰＣＡ抽出し、エタノールで沈澱し、７Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分析した。
例５
スクロースグラディエント沈降によるＨＣＶ　ＲｄＲｐ／ＴＮＴアーゼの精製法
　線形の０．３〜１．５Ｍのスクロースグラディエントを、洗剤を含む緩衝剤Ａで調製した（例１を参照されたい）。Ｂａｃ５ＢまたはＢａｃ２５（約８×１０７個の細胞に相当）に感染したＳｆ９細胞の抽出物２ｍｌまでを、１２ｍｌのグラディエントに装填した。遠心分離を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ４０ローターを用いて３９０００×ｇで２０時間行った。０．５ｍｌずつの画分を集め、活性を試験した。ウェスターンブロット法によって同定したＮＳ５Ｂタンパク質は、予想外の高沈降計数で密度勾配中を移動することが判った。ウイルスタンパク質およびリボソームは、同じグラディエント画分中で同時沈降することが判った。この特異な挙動により、グラディエントの最上部に止まっている細胞質タンパク質の主要量からウイルスタンパク質を分離することができた。ＲｄＲｐ活性試験から、ＲｄＲｐ活性はＮＳ５Ｂタンパク質と同時沈降することが明らかになった。末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性（ＴＮＴアーゼ）も、これらの画分に含まれていた。
例６
Ｓｆ９細胞からＨＣＶ　ＴＮＴアーゼ／ＲｄＲｐの精製法
　全細胞抽出物を、Ｂａｃ５Ｂ組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞１ｇから作成する。凍結した細胞を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＰＭＳＴを補足した５０％グリセロール（Ｎ緩衝液）を含む緩衝液１０ｍｌ中で氷上で解凍する。次に、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００およびＮａＣｌを、それぞれ２％および５００ｍＭの最終濃度まで加え、細胞の破壊を促進する。ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）およびＤＮアーゼＩ（１５μｇ／ｍｌ）を加えた後、混合物を室温で３０分間拡販する。次に、抽出物を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機中９０Ｔｉローターを用いて４０，０００ｒｐｍで４℃で３０分間超遠心によって透明しする。透明にした抽出物を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＬＧ緩衝液）を含む緩衝液で希釈し、ＮａＣｌ濃度を３００ｍＭに調整して、３００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液中で平衡にしたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ５ｍｌでバッチ毎にインキュベーションする。次に、マトリックスをカラムに投入し、２倍容量の同じ緩衝液で洗浄する。流出液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）およびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムの初流をＬＧ緩衝液で１：３に希釈して、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液で平衡にしたＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ６Ｂカラム（１０ｍｌ）に装填する。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ６Ｂを十分に洗浄し、結合タンパク質をＬＧ緩衝液中１００ｍＭ〜１Ｍ　ＮａＣｌの線形の１００ｍｌグラディエントで溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀−および免疫−染色によって判定されたＮＳ５Ｂを含む画分をプールしてＬＧ緩衝液で希釈し、ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭに調整する。希釈した画分を次に、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液で平衡にしたＭｏｎｏ　Ｑ−ＦＰＬＣカラム（１ｍｌ）に装填する。タンパク質を、ＬＧ緩衝液中５０ｍＭ〜１Ｍ　ＮａＣｌの線形グラディエント（２０ｍｌ）で溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀−および免疫−染色によって判定されたＮＳ５Ｂを含む画分をプールして、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液に対して透析する。広汎な透析の後、プールした画分を、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液で平衡にしたＰｏｙＵ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ６Ｂ（１０ｍｌ）に装填した。ＰｏｙＵ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ６Ｂを十分に洗浄し、結合したタンパク質を、ＬＧ緩衝液中１００ｍＭ〜１Ｍ　ＮａＣｌまでの線形の１００ｍｌのグラディエントで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀−および免疫−染色によって判定されたＮＳ５Ｂを含む画分をプールして、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含むＬＧ緩衝液に対して透析し、液体窒素中に保管した後、活性を試験した。
　精製したタンパク質ＮＳ５Ｂを含む画分を、両活性の存在について試験した。ＲｄＲｐおよびＴＮＴアーゼ活性は、同じ画分に見出だされた。これらの結果は、両活性であるＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよび末端リボヌクレオチドトランスフェラーゼは、ＨＣＶ　ＮＳ５Ｂタンパク質の関数であることを示している。
　本発明者らは、精製したＮＳ５Ｂを、非飽和基質濃度における４種類のリボヌクレオチド三リン酸のそれぞれを用いて、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性について試験した。これらの結果は、明らかに、ＵＴＰは好ましいＴＮＴアーゼ基質であり、投入ＲＮＡの供給源とは無関係にＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰであることを示した。
例７
ホモポリマー性ＲＮＡ鋳型上の組換えＨＣＶ　ＲｄＲｐの試験法
　これまで、本発明者らは、ＨＣＶ　ＮＳ５ＢがＲＮＡ−依存性のＲＮＡポリメラーゼ活性を有し、相補性ＲＮＡ鎖の合成が鋳型によって開始される反応であることを記載してきた。興味深いことには、ＲｄＲｐｋ供給源としてのＢａｃ５ＢまたはＢａｃ２５に感染したＳｆ９細胞の未分画細胞質抽出物を用いて、プライマーとして外部から加えたオリゴヌクレオチドを用いる相補性ＲＮＡ鎖の合成を観察することはできなかった。本発明者らは、未分画抽出物中に含まれることの確かな豊富なＡＴＰ依存性のＲＮＡ−ヘリカーゼによるも野とすることができると推論した。従って、本発明者らは、この問題を精製したＮＳ５Ｂを用いて解明しようとした。
　最初に、本発明者らは、精製したＮＳ５Ｂポリメラーゼがホモポリマー性ＲＮＡ鋳型上でプライマーに依存するやり方でＲＮＡを合成することができるかどうかを画定しようとし、このような鋳型は分子内ヘアピンを形成することができないものであり、従って本発明者らは、相補性ＲＮＡ鎖の合成は厳密にプライマー依存性であると予想した。従って、本発明者らは、ポリ（Ａ）鋳型に依存するＵＭＰ組み込みを測定し、ポリメラーゼ反応のプライマーとしてオリゴ（ｒＵ）１２およびオリゴ（ｄＴ）１２〜１８の両方を評価した。放射性ＵＭＰの取り込みは、下記のようにして測定した。標準的反応（１０〜１００μｌ）は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＤＴＴ，２５ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２０Ｕ　ＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μＣｉ［３２Ｐ］ＵＴＰ（４００Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、または１μＣｉ［３Ｈ］ＵＴＰ（５５Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１０μＭ　ＵＴＰ、および１０μｇ／ｍｌポリ（Ａ）またはポリ（Ａ）／オリゴ（ｄＴ）１２〜１８を含む緩衝液で行った。オリゴ（Ｕ）１２（１μｇ／ｍｌ）を、プライマーに加えた。ポリＡおよびポリＡ／オリゴｄｔ１２〜１８は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。オリゴ（Ｕ）１２はＧｅｎｓｅｔから得た。最終的なＮＳ５Ｂ酵素濃度は１０〜１００ｎＭであった。これらの条件下で、反応は３時間まで直線的に進行した。２２℃で２時間インキュベーションした後、試料をＤＥ８１フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）に置くことによって反応を停止し、フィルターを１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で十分に洗浄し、水で濯ぎ、風乾して、最後にフィルターに結合した放射能をシンチレーションβ−カウンターで測定した。あるいは、イン・ビトロで合成した放射性生成物を０．２Ｍピロリン酸ナトリウム中キャリヤーｔＲＮＡ１００μｇを有する１０トリクロロ酢酸で沈澱し、０．４５μｍＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃフィルター上に集め、真空乾燥して、シンチレーション流体中でカウントした。
　幾らかの［３２Ｐ］ＵＭＰまたは［３Ｈ］ＵＭＰの取り込みはプライマーの不在でも検出可能であり、本発明者らの精製したＮＳ５Ｂと会合した末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性によるものと思われるが、２０％までの生成物の取り込みは、オリゴ（ｒＵ）１２が反応混合物にプライマーとして含まれるときにのみ観察された。意外なことには、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８も、低効率ではあるが、ポリ（Ａ）−依存性のポリ（Ｕ）合成のプライマーとして機能することができた。
　ＮＳ５ＢのＲｄＲｐ活性を測定するのに好適な他の鋳型／プライマーとしては、放射性ＧＴＰの存在下でのポリ（Ｃ）／オリゴ（Ｇ）またはポリ（Ｃ）／オリゴ（ｄＧ）、放射性ＣＴＰの存在下でのポリ（Ｇ）／オリゴ（Ｃ）またはポリ（Ｇ）／オリゴ（ｄＣ）、放射性ＡＴＰの存在下でのポリ（Ｕ）／オリゴ（Ａ）またはポリ（Ｕ）／オリゴ（ｄＡ）、放射性ＣＴＰの存在下でのポリ（Ｉ）／オリゴ（Ｃ）またはポリ（Ｉ）／オリゴ（ｄＣ）が挙げられる。
例８
Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＨＣＶ　ＲｄＲｐ／ＴＮＴアーゼの発現法
　図２および例８に記載のプラスミドｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）を構築して、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に記載の配列を有するＨＣＶタンパク質断片をＥ．ｃｏｌｉで発現させた。このようなタンパク質断片は、上記のようにＮＳ５ＢのＲｄＲｐおよびＴＮＴアーゼを含んでいる。ＮＳ５ＢをコードするＨＣＶ　ｃＤＮＡの断片を、分子生物学の実施について知られており、例８に詳記されている方法を用いて、バクテリオファージＴ７φ１０プロモーターの下流およびファージＴ７遺伝子１０タンパク質の最初のＡＴＧコドンと共にフレームにクローニングした。ｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）プラスミドも、プラスミドｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞の選択のマーカーとして用いることができるｂ−ラクタマーゼ酵素の遺伝子を含んでいる。
　次に、プラスミドｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）を、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターにクローニングした遺伝子の高水準発現に通常用いられるＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ５３）株に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉのこの株において、Ｔ７遺伝子ポリメラーゼはバクテリオファージ１　ＤＥ５３上に担持され、ＢＬ２１細胞の染色体に組み込まれる（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ，クローニングした遺伝子の直接的で、選択的な高水準発現に対するバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｔｏ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ，（１９８６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９，ｐ．１１３−１３０）。興味深い遺伝子からの発現は、以前に記載された（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ，１９８６）手続きによる成長培地にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘発される。従って、ＲｄＲｐを含む組換えＮＳ５Ｂタンパク質断片は、宿主細胞の封入体に産生される。組換えＮＳ５Ｂタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ５３）抽出物の粒状画分から精製し、当該技術分野で知られている手続きによって再折り畳みをすることができる（Ｄ．Ｒ．Ｔｈａｔｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ａ．Ｈｉｃｈｃｏｋ，バイオテクノロジーにおけるタンパク質の折り畳み（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｌｄｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）、「タンパク質折り畳みの機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｌｄｉｎｇ）」Ｒ．Ｈ．Ｐａｉｎ編、ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ，ｐ．２２９−２５５）。あるいは、組換えＮＳ５Ｂタンパク質は、細菌の成長培地の温度を２０℃以下に低下させることによって可溶性タンパク質として産生することができた。従って、可溶性タンパク質は、実質的に例５に記載のＥ．ｃｏｌｉの溶解生成物から精製することができた。
例９
図におけるプラスミドの詳細な構築
　ＨＣＶ−ＢＫ単離物のゲノム（ＨＣＶＢＫ）に相当するｃＤＮＡの選択された断片を、核ポリヘドロシスウイルスの強力なポリヘドリンプロモーター下でクローニングし、バキュロウイルスベクター中で同種組換えができる配列によってフランクした。
　ｐＢａｃ５Ｂは、ヌクレオチド７５９０〜９３６６を含んでなるＨＣＶ−ＢＫ配列を含み、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１記載されたＮＳ５Ｂタンパク質をコードする。このプラスミドを得るために、ｃＤＮＡ断片を、それぞれ配列５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）、および５′−ＡＡＴＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）を有する合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成した。次に、ＰＣＲ生成物をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、５′末端でＢａｍＨＩで消化した後、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターのＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ部位の間でクローニングした。次いで、興味深いｃＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同一部位に再連結した。
　ｐＢａｃ２５は、ヌクレオチド２７５９〜９４１６を含んでなるＨＣＶ−ＢＫｃＤＮＡ領域を含み、ＨＣＶ−ＢＫポリタンパク質のアミノ酸８１０〜３０１０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）をコードする。この構築物は、下記のようにして得た。最初に、ヌクレオチド２７５９〜３５７８を含んでなるＨＣＶ−ＢＫ配列を含む８２０ｂｐ　ｃＤＮＡ断片をｐＣＤ（３８−９．４）からＮｃｏＩで消化することによって得て（Ｔｏｍｅｉ　Ｌ．，Ｆａｉｌｌａ，Ｃ．，Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ，Ｅ．，Ｄｅ　Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｒ．ａｎｄ　Ｌａ　Ｍｏｎｉｃａ，Ｎ．（１９９３）、ＮＳ３はＣ型肝炎ウイルスポリタンパク質の加工に必要なセリンプロテアーゼである（ＮＳ３　ｉｓ　ａ　Ｓｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｒｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，４０１７−４０２６），ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ部位においてクローニングし、ｐＢａｃＮＣＯと呼ばれるプラスミドを生じた。ヌクレオチド１９５９〜９４１６を含んでなるＨＣＶ−ＢＫ配列を含むｃＤＮＡ断片はｐＣＤ（３８−９．４）からＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化することによって得て、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターの同じ部位にクローニングして、ｐＢｌｓＮＸと呼ばれるプラスミドを得た。ヌクレオチド３３０４〜９４１６を含んでなるＨＣＶ−ＢＫ配列を含むｃＤＮＡ断片は、ＳａｃＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによってｐＢｌｓＮＸから得て、ｐＢｌｓＮＸプラスミドの同じ部位にクローニングし、プラスミドｐＢａｃ２５を得た。
　ｐＴ７−７（ＤＣｏＨ）は、肝細胞核因子１ａａのラット二量体化補助因子の全コード領域（３１６個のヌクレオチド）を含む（ＤＣｏＨ；Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．Ｂ．，Ｋｈａｖａｒｉ，Ｐ．Ａ．，Ｃｏｎｌｅｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｇｒａｖｅｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｐ．，Ａｄｍｏｎ，Ａ．およびＣｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．（１９９１），哺乳動物のホメオドメインタンパク質の二量体化を制御する補助因子の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｆａｃｔｏｒ　ｔｈａｔ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４，１７６２−１７６７；Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ受付番号：Ｍ８３７４０）。ラットＤＣｏＨのコード配列に相当するｃＤＮＡ断片を、それぞれ配列ＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）およびＡＧＧＣＡＧＧＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）を有する合成オリゴヌクレオチドＤｐｒ１およびＤｐｒ２を用いるＰＣＲによって増幅した。このようにして得られたｃＤＮＡ断片を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴ７−７のＳｍａＩ制限部位にクローニングした。ｐＴ７−７発現ベクターは、β−ラクタマーゼ遺伝子および複製のＣｏｌ　Ｅ１起源の他に、Ｔ７遺伝子１０タンパク質に対するＴ７ポリメラーゼプロモーターφ１０および翻訳開始部位を含むｐＢＲ３２２の誘導体である（Ｔａｂｏｒ　Ｓ．およびＲｉｃｈｅｒｄｓｏｎ　Ｃ．Ｃ．（１９８５），特異的遺伝子の制御された独占的発現のためのバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系（Ａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ７　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２，１０７４−１０７８）。
　ｐＴ７−７（ＮＳ５Ｂ）は、ヌクレオチド７５９０からヌクレオチド９３６６までのＨＣＶ配列を含み、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に記載のＮＳ５Ｂタンパク質をコードする。
　このプラスミドを得るため、ｃＤＮＡ断片を、それぞれ配列５′−ＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）および５′−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＧＣＣ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）を有する合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成した。次に、ＰＣＲ生成物をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理した後、これをＥｃｏＲＩで線形化して、クレノウＤＮＡポリメラーゼでその両端を平滑化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴ７−７に連結した。あるいは、ｃＤＮＡ断片を、それぞれ配列５′−ＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）および５′−ＡＡＴＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ−３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）を有する合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成した。次に、ＰＣＲ生成物をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理した後、これをＮｄｅＩで線形化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼでその両端を平滑化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴ７−７に連結した。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．プライマ
ーを
しない、
精製された
　２．請求項
１に
　３．配列が、配列番号１、そこに含まれているまたはそれから誘導される配列に記載されているタンパク質を含んでいる、請求項
１
　４．治療目的で、ＮＳ５Ｂと会合した酵素活性を阻害する化合物を選択することができる酵素試験を準備するための、請求
項２又は３