(57)【要約】  様々ながん細胞の表面上で発現される抗原であるエプシン−１（ＥＰＮ１）に特異的な抗体が、本明細書に記載される。ＥＰＮ１発現腫瘍細胞によって特徴付けられる様々な種類のがんを治療する、寛解する、および診断するための方法も開示される。【選択図】図７
2022501062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含む、タンパク質、エプシン１に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
Ａ）ＶＨＣが、配列番号２に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性を共有するアミノ酸を含み、
Ｂ）ＶＬＣが、配列番号４に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％相同性を共有するアミノ酸を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列：
配列番号９に対応するＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号１０に対応するＣＤＲ−Ｈ２、
配列番号１１に対応するＣＤＲ−Ｈ３、
配列番号１２に対応するＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号１３に対応するＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号１４に対応するＣＤＲ−Ｌ３、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体、または抗原結合断片が、エプシン−１（ＥＰＮ１）に結合する、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合断片とＥＰＮ１との間のＫＤが５０ｎＭ以下である、請求項３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
前記ＫＤが、１ｎＭ以下である、請求項４に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体または断片が、細胞表面上で発現される抗原に結合した後に、前記細胞により内部移行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗原結合断片が、単離された可変重（ＶＨ）単一ドメインモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗原結合断片が、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ−Ｆｃ断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合断片が、免疫グロブリンＦｃ領域に由来するＣＨ３ドメインの野生型アミノ酸配列の少なくとも１つの修飾を含むＣＨ３足場を含む、請求項７または８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
前記単離された抗原結合断片が、半減期が増加されていてもよい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、または任意の断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体または断片が、モノクローナルである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体または抗原結合断片が、ヒトまたはヒト化である、請求項１１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合断片が、二重特異性である、請求項１２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗体または抗原結合断片と、エフェクター分子とを含む、単離された免疫複合体。
【請求項１５】
前記エフェクター分子が、薬物である、請求項１４に記載の単離された免疫複合体。
【請求項１６】
前記エフェクター分子が、毒素である、請求項１４に記載の単離された免疫複合体。
【請求項１７】
前記エフェクター分子が、放射性薬物である、請求項１４に記載の単離された免疫複合体。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体中に、治療有効量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合断片、または単離された免疫複合体を含む、組成物。
【請求項１９】
前記抗体または抗原結合断片が標識される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２０】
前記標識が、蛍光標識、酵素標識、または放射性標識である、請求項１８に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２１】
少なくとも１つの種類のがんに罹患している対象を治療する方法であって、前記がんの細胞がＥＰＮ１を発現する、前記がんに罹患している前記対象を選択することと、前記対象に治療有効量の請求項１８に記載の組成物を投与し、それによって前記対象の前記がんを治療することと、を含む、上記方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの種類のがんに罹患している対象を選択することを含む、腫瘍増殖または転移を阻害する方法であって、前記がんの細胞がＥＰＮ１を発現する、前記がんに罹患している前記対象を選択することと、前記対象に治療有効量の請求項１８に記載の組成物を投与し、それによって腫瘍増殖または転移を阻害することとを含む、上記方法。
【請求項２３】
前記がんの種類が、肺がん、黒色腫または肝細胞がんである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のＶＨをコードする単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項１に記載のＶＬをコードする単離された核酸分子。
【請求項２６】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項２３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項２４に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項２９に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２７および２８のうちの少なくとも１つに記載の単離された核酸分子を含む、単離された発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸分子または発現ベクターで形質転換した単離された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、がんの治療または検出のための抗体ベースの治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト適応免疫系は、細胞（Ｔ細胞）プロセスと体液（Ｂ細胞）プロセスとの両方を通じて応答する。体液応答は、抗原に結合することができる表面結合免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現するＢ細胞の選択およびクローン増幅をもたらす。体細胞超変異およびクラススイッチングのプロセスは、クローン増幅と一致して行われる。これらのプロセスと共に、標的抗原に対して親和性が成熟し、かつ４つの一般クラス（Ｍ、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＥ）のうちの１つに属する定常ドメインを含有する分泌抗体がもたらされる。抗体の各クラス（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＥ）は、細胞免疫系と異なる方法で相互作用する。標的抗原に対して親和性成熟した抗体の特徴としては、次のものを挙げることができる：１）ヌクレオチド、およびそれに続くアミノ酸が、生殖細胞系遺伝子に関連して変化する、２）標的抗原に対する高い結合親和性、３）他のタンパク質と比較した標的抗原に対する結合選択性。
【０００３】
がん患者は、腫瘍細胞抗原に対する免疫応答を開始できることが十分に理解される。これらの抗原は、変異したタンパク質をもたらす腫瘍内の遺伝的変化、またはそうでなければ正常なタンパク質の免疫系に対する異常な提示のいずれかから生じる可能性がある。異常な提示は、新生児タンパク質の異所性発現、細胞表面への細胞内タンパク質の誤った局在化、または細胞の溶解を含むが、これらに限定されないプロセスを通じて起こる場合がある。タンパク質のグリコシル化の変化につながる酵素の異常な発現はまた、体液性免疫系によって認識される非自己抗原の生成をもたらす可能性がある。
【０００４】
がんに関連するものを含む疾患関連タンパク質に選択的に結合する抗体は、治療有効性につながる方法でそれらの標的タンパク質の機能を調節することに成功していることが証明されている。ヒト免疫系が、変異した、または別途異常なタンパク質に対する抗体応答を開始する能力は、患者の免疫応答が、重要な腫瘍ドライバーを認識し、その機能を調節することができる抗体を含む場合があることを示唆している。
【０００５】
膜輸送は、広範囲の細胞プロセスの調節に寄与する。細胞表面受容体の内部移行は、増殖因子受容体媒介性シグナル伝達の適切な調節のための重要な機構である。クラスリン被覆小胞を介した内部移行は、細胞表面からのがん関連受容体の内部移行のための１つの経路を表す。クラスリン被覆小胞へのその後の内部移行のために、これらの受容体をクラスリン被覆ピット（ＣＣＰ）にロードすることは、経路における最初のステップの１つである。受容体のＣＣＰへのロードは、エプシン−１（ＥＰＮ１）等のアダプター分子との相互作用によって部分的に指示される。
【０００６】
ＥＰＮ１は、細胞膜に局在する約６０．３ｋＤａタンパク質である。これは、ＰＩ（４，５）Ｐ２−、ユビキチン−、およびクラスリン／ＡＰ−２相互作用ドメインを含有する。ＥＰＮ１の内在的発現の発現をノックダウンすること、ＥＰＮ１の変異型を過剰発現すること、またはそのカーゴ分子とのＥＰＮ１の相互作用を遮断するように設計された薬剤で細胞を処理することは、既知のＣＣＰ依存性カーゴの内部移行を阻害することができる。かかるカーゴの例は、ＶＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ３である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、それぞれＶＨおよびＶＬフレームワークならびに配列番号４および８と相関する相補領域を有するＥＰＮ１特異的抗体、またはその断片、ならびに配列番号９〜１４にそれぞれ対応する１つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ  ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ  ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を有するＥＰＮ１特異的抗体を含む、タンパク質、エプシン１（ＥＰＮ１）に特異的な抗体を提供する。
【０００８】
ＥＰＮ１発現腫瘍細胞によって特徴付けられる様々な種類のがんを治療、寛解、または診断するための組成物および方法も、本発明によって提供される。前述の組成物および方法の実施形態は、天然に存在する抗ＥＰＮ１抗体、その断片、そのバリアントを含む。例えば、本発明の抗体の実施形態としては、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、本発明の抗体は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間の正しい折り畳みおよび安定化に必要な残基を保持するだけでなく、分子の低ｐＩおよび低毒性も保持するアミノ酸配列修飾を含むことができる。本発明に従う治療方法または診断方法で使用される抗体は、特定の実施形態では、治療薬、診断薬、または半減期および生物学的利用能増強分子を含むエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。
【０００９】
本発明による抗体は、様々な組換え発現系によって産生することができる。かかるシステムは、本発明に従う抗体のための適切なヌクレオチドコード配列で細胞を形質転換またはトランスフェクションすることによって、本発明に従う抗体を発現するために利用され得る宿主発現ベクター系を含む。様々な実施形態では、宿主発現細胞系は、本発明に従う抗体をコードする挿入配列の発現を調節するか、または所望に応じて抗体遺伝子産物を修飾および処理することができる。
【００１０】
上述のように、本発明の抗ＥＰＮ１抗体は、対象内のがん、例えば、肺がんまたは黒色腫などを予防、治療、または寛解するための組成物および方法に使用することができる。したがって、本発明の様々な実施形態では、治療有効量の抗体が、がん細胞の増殖、複製もしくは転移を阻害する、またはがんの徴候もしくは症状を阻害するのに十分な量で対象に投与される。これらの実施形態において、抗体は、対象への組成物の投与様式に好適な組成物へと製剤化される。
【００１１】
対象におけるがんの存在を診断または監視するために本発明の抗体を使用するための組成物および方法に関して、がんの検出は、ある特定の実施形態においてインビトロで、または他の実施形態においてインビボで実行することができる。本発明の一実施形態は、ＥＰＮ１陽性細胞を検出するためのキットとすることもできる。かかるキットは、典型的には、本発明による抗体組成物、キットがそのために設計される特定の用途のための緩衝液および試薬、ならびに教材を含有することになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】生存無傷がん細胞株のプールに結合したハイブリドーマ産生抗ＥＰＮ１抗体ＰＲ０４５−２Ｈ１１の検出を示す顕微鏡写真である。フルオロフォア標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体をＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｅｙ（登録商標）Ｓａイメージングシステムと組み合わせて使用して、ＰＲ０４５−２Ｈ１１産生抗体の結合の結合を検出した。
【図２】図１に示されるウェルのサブセットで観察される蛍光シグナルの定量分析を示す。黒色塗りつぶしバーは、潜在的なスクリーニングヒットを表し、斑点状のバーは、バックグラウンドシグナルを表し、白抜きのバーは、陽性対照ウェルを表す。
【図３】Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ機器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるフローサイトメトリーによる無傷Ａ５４９肺がん細胞株に結合するＩＭＭ２００５９について観察された濃度依存性結合曲線を示す。無傷細胞へのＩＭＭ２００５９の結合をフルオロフォア標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図４】Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ機器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるフローサイトメトリーによる無傷Ｈｕｈ７肝細胞がん細胞に結合するＩＭＭ２００５９について観察された濃度依存性結合曲線を示す。無傷細胞へのＩＭＭ２００５９の結合をフルオロフォア標識抗ヒト二次Ａｂで検出した。
【図５】ストリンジェントな（２００ｍＭおよび３００ｍＭのＮａＣｌ）洗浄条件下、および非洗浄条件下の両方での６５ｋＤａタンパク質のＩＭＭ２００５９による免疫沈降のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解能の走査画像を示す。
【図６】その相同体ＥＰＮ２に優るＥＰＮ１に対するＩＭＭ２００５９の選択性を示す定量的なドットブロット結果を示す。ＩＭＭ２００５９の結合を、組換えＥＰＮ１またはＥＰＮ２の濃度の増加に対するドットブロットによって分析した。
【図７】親ＨＥＫ２９３およびＣＲＩＳＰＲベースのノックアウトによって生成されたＨＥＫ２９３のＥＰＮ１−／−バリアントのフローサイトメトリー分析を示す。固定および透過処理した細胞を、ＩＭＭ２００５９または市販の抗ＥＰＮ１ｍＡｂのいずれかで染色した。フルオロフォア標識抗ヒト二次抗体で結合を検出した。
【図８】Ｈ４６０ヒト肺がん細胞株に対するＩＭＭ２００５９について観察された免疫蛍光染色パターンを示す顕微鏡写真である。フルオロフォア標識抗ヒト二次抗体で結合を検出した。
【図９】Ｈ４６０ヒト肺がん細胞株に対する抗ＥＰＮ１モノクローナル抗体について観察された免疫蛍光染色パターンを示す顕微鏡写真である。フルオロフォア標識抗マウス二次抗体で結合を検出した。
【図１０】ラットＥＰＮ１分子（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ：１ｅｄｕ）のエプシンＮ末端相同性（ＥＮＴＨ）ドメインのＰｙＭＯＬから生成された表現であり、これはアミノ酸配列レベルでヒトＥＰＮ１に対して１００％保存されている。濃い灰色のポンチ絵で描かれた残基は、ＩＭＭ２００５９への架橋として同定されたタンパク質分解由来ペプチドを構成している。薄い灰色のリボンで描かれた残基は、架橋ペプチドの外側である。球体の残基は、ＩＭＭ２００５９に直接架橋されたアミノ酸を表す。
【図１１】ラットＥＰＮ１分子（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ：１ｅｄｕ）のエプシンＮ末端相同性（ＥＮＴＨ）ドメインのＰｙＭＯＬから生成された表現であり、これはアミノ酸レベルでヒトＥＰＮ１に１００％保存されている。濃い灰色のポンチ絵で描かれた残基は、ＩＭＭ２００５９への架橋として同定されたタンパク質分解由来ペプチドを表す。薄い灰色のリボンで描かれた残基は、架橋ペプチドの外側である。球体の残基は、ヒトＥＰＮ１とヒトＥＰＮ２との間で異なるアミノ酸を表す。ＩＭＭ２００５９結合部位内のそれらの位置は、ＥＰＮ１対ＥＰＮ２に対する特異性の理論的根拠を提供する。
【図１２】ラットＥＰＮ１分子（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ：１ｅｄｕ）のエプシンＮ末端相同性（ＥＮＴＨ）ドメインのＰｙＭＯＬから生成された表現であり、これはアミノ酸レベルでヒトＥＰＮ１に１００％保存されている。濃い灰色のポンチ絵で描かれた残基は、ＩＭＭ２００５９への架橋として同定されたタンパク質分解由来のペプチドを構成している。薄い灰色で描かれたリボンの残基は、架橋ペプチドの外側である。球体の残基は、ヒトＥＰＮ１とヒトＥＰＮ３との間で異なるアミノ酸を表す。ＩＭＭ２００５９結合部位内のそれらの位置は、ＥＰＮ１対ＥＰＮ３に対する特異性の理論的根拠を提供する。
【図１３】ヒト、ラット、およびマウスＥＰＮ１アミノ酸配列の多重配列アラインメントである。ヒトＥＰＮ１におけるＥＮＴＨドメインの下線付き領域は、ＩＭＭ２００５９結合部位を構成するアミノ酸ペプチドに対応する。マウスおよびラットＥＰＮ１は、この領域内でヒトＥＰＮ１と１００％同一であり、マウスＥＰＮ１に対する交差反応性の理論的根拠を提供する。
【図１４】ヒトＥＰＮ１、ＥＰＮ２、およびＥＰＮ３アミノ酸配列の多重配列アラインメントである。ヒトＥＰＮ１は、ヒトＥＰＮ２およびＥＰＮ３とそれぞれ５６．７％および４９．６％同一である。
【図１５】ＩＭＭ２００５９がマウスＥＰＮ１抗原と交差反応することを示すフローサイトメトリー分析を示す。マウスＮＩＨ３Ｔ３およびヒトＭＦＥ２９６細胞株の細胞の表面および細胞内染色を行った。ＩＭＭ２００５９の細胞表面および細胞内結合が、両方の細胞株のプールにおいて観察された。マウスおよびヒトＥＰＮ１の両方と交差反応することが知られている市販の抗ＥＰＮ１抗体は、ＮＩＨ３Ｔ３およびＭＦＥ２９６細胞と同様に結合した。しかしながら、市販抗体は、細胞の両方のプールにおいて細胞表面でＥＰＮ１と相互作用することができなかった。
【図１６】細胞増殖アッセイの結果を示し、ＨＥＫ２９３のＥＰＮ１−／−バリアントが親ＨＥＫ２９３細胞よりもゆっくりと増殖することを示している。
【図１７】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて増殖したＢ１６Ｆ０黒色腫腫瘍モデルで観察された腫瘍増殖を示すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照（破線、黒丸）、抗ＣＴＬＡ４（点線、黒四角）、またはＩＭＭ２００５９（実線、黒三角）を有する腹腔内注射（ＩＰ）によって、動物のコホートを週１回１０ｍｇ／ｋｇで処置した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載の本発明は、配列番号４またはその一部、および配列番号８またはその一部に対応するアミノ酸配列を含有する抗体に関する組成物および方法を対象とする。実際には、本発明による抗体は、配列番号４に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列、もしくはその一部、配列番号８に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列、もしくはその一部、またはその両方を含んでもよい。
【００１４】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列間の類似性を指す。配列同一性は、典型的には、同一性（または類似性もしくは相同性）パーセントの観点から測定され、パーセンテージが高いほど、２つの配列の類似性はより高い。配列番号４または８に対応するアミノ酸配列を含有することに加えて、本発明による抗体は、上皮由来のがん細胞を含む様々ながん細胞の表面上で発現される抗原であるＥＰＮ１への特異的な結合もする。したがって、本明細書に記載される抗体を、ＥＰＮ１発現腫瘍細胞によって特徴付けられる様々な種類のがんを診断または治療する方法に有用な組成物に含むことができる。
【００１５】
構造に関して、本発明による「抗体」は、少なくとも抗原のエピトープに特異的に結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域から構成されるポリペプチドリガンドを指す。例えば、抗体は、重鎖および軽鎖から構成される免疫グロブリン分子であってもよく、その各々は可変領域を有し、それぞれ可変重鎖（「ＶＨ」）領域および可変軽鎖（「ＶＬ」）領域と称される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は共に、抗体のその抗原への特異的結合を担う可変断片「Ｆｖ」を形成する。
【００１６】
本発明に従う抗体は、無傷免疫グロブリン、または免疫グロブリンのバリアント、または免疫グロブリンの一部であってもよい。天然に存在する免疫グロブリンは、その各々が定常領域および可変領域を含有し、かつジスルフィド結合によって相互連結される、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には、ラムダ（「λ」）およびカッパ（「κ」）と称される２種類がある。抗体分子の機能活性を決定する、アイソタイプとしても知られる５つの主な重鎖クラス：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥがある。その可変ドメインに加えて、重鎖はまた、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）も有する。Ａｂの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する場合がある。
【００１７】
軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」を含む。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。異なる軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存され、三次元空間におけるＣＤＲの位置決定およびアラインメントに役割を果たす。各鎖の３つのＣＤＲは通常、Ｎ末端から開始して順次付番されてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、しばしば特定のＣＤＲが配置される鎖によって識別される。したがって、重鎖ＣＤＲは、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３と称され、同様に、軽鎖ＣＤＲは、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３と称される。抗原結合断片である、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインはＦａｂ断片と称される。Ｆ（ａｂ）’２断片は、２つのＦａｂ断片を含有し、そして免疫グロブリン分子をそのヒンジ領域の下で切断することによって生成することができる。
【００１８】
本発明に従う抗体のＶＨおよびＶＬフレームワークならびに相補領域のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４および８と相関している。より具体的には、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（「ＩＭＧＴ」）番号付けシステムに基づいて、（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２（１９９９））、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３は、配列番号４の残基２６〜３３（配列番号９）、５１〜５８（配列番号１０）、および９７〜１１３（配列番号１１）に対応する。本発明による抗体の類似体Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号８の残基２７〜３２（配列番号１２）、５０〜５６（配列番号１３）、および８９〜９６（配列番号１４）に対応する。本発明による抗体は、前述のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含有するため、抗体のＣＤＲの組み合わせは、例えば、（Ｈ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ１）、（Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ２）、（Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３）、（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ２）、（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３）、（Ｈ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３）、または（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３）であってもよい。
【００１９】
本発明による抗体は、モノクローナル抗体であり、つまり抗体は、単一抗体またはその一部の遺伝子で切断された単一のクローナルＢリンパ球集団、クローナルハイブリドーマ細胞集団、または細胞のクローナル集団によって産生されることを意味する。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞と免疫リンパ球細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、当業者に既知の方法によって産生される。
【００２０】
本発明に従うモノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体も含まれる。より具体的には、本発明による「完全ヒト」抗体とも呼ばれる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリン由来のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲを含む抗体である。例えば、抗体のフレームワークおよびＣＤＲは、同一の起源ヒト重鎖もしくはヒト軽鎖アミノ酸配列、またはその両方に由来する。あるいは、フレームワーク領域は、１つのヒト抗体に由来してよく、また異なるヒト抗体由来のＣＤＲを含むように操作されてよい。
【００２１】
本発明による抗体は、免疫グロブリン断片であってもよい。本発明による抗体と見なされる免疫グロブリンバリアントの例としては、単一ドメイン抗体（ＶＨドメイン抗体など）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）が挙げられる。ＶＨ単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインからなる免疫グロブリン断片である。Ｆａｂ断片は、一価の抗原結合免疫グロブリン断片を含有し、これは、酵素パパインによる全抗体の消化によって産生することができ、無傷の軽鎖および１本の重鎖の一部を得ることができる。同様に、Ｆａｂ’断片は、一価の抗原結合免疫グロブリン断片も含有し、これは、酵素ペプシンによる全抗体の消化、続いて還元によって産生することができ、無傷の軽鎖および重鎖の一部を得ることができる。免疫グロブリン分子当たり２つのＦａｂ’断片を得る。（Ｆａｂ’）２断片は、２つのＦａｂ’断片の二量体であり、これは、その後の還元なしに酵素ペプシンで全抗体を処理することによって得ることができるため、Ｆａｂ’モノマーは、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持されたままである。Ｆｖ断片は、二本鎖として発現する軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片である。ｓｃＦｖ断片等の一本鎖（「ｓｃ」）抗体は、軽鎖のＶＬ領域、重鎖のＶＨ領域を含有する遺伝子操作された分子であり、遺伝的に融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結される。ｓｃＦＶ２抗体等の一本鎖抗体の二量体は、ｓｃＦＶの二量体であり、「ミニ抗体」としても知られる場合がある。ｄｓＦｖバリアントは、免疫グロブリンのＶＬ領域およびＶＨ領域も含有するが、鎖は、ジスルフィド結合を導入して鎖の会合を安定化させるように変異されている。
【００２２】
当業者であれば、抗体の保存的バリアントを産生することができることを理解するであろう。ｄｓＦｖ断片またはｓｃＦｖ断片などの抗体断片に用いられるかかる保存的バリアントは、ＶＨ領域とＶＬ領域との間の正しい折り畳みおよび安定化に必要な重要なアミノ酸残基を保持し、かつ分子の低ｐＩおよび低毒性を維持するために残基の電荷特性を保持するであろう。収率を増加させるために、アミノ酸置換（最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、または最大５個のアミノ酸置換など）を、ＶＨおよびＶＬ領域内で行うことができる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つのアミノ酸のグループ分けは、互いに保存的置換であると見なされるアミノ酸の例である：ｉ）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）、ｉｉ）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）、ｉｉｉ）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）、ｉｖ）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）、ｖ）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）、ならびにｖｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）。
【００２３】
本発明による抗体はまた、内在性抗体のバックグラウンドに対する生物学的製剤の検出を容易にするための「タグ付け」された免疫グロブリンＣＨ３ドメインも含んでもよい。より具体的には、タグ付きＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ由来のＣＨ３ドメインのＡＢ、ＥＦ、またはＣＤ構造ループのうちの１つ以上に組み込まれた異種抗体エピトープである。ＣＨ３タグは、ＩｇＧ１サブクラス抗体の構造的環境に組み込まれることが好ましく、本発明に従って、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む他のヒトＩｇＧサブクラスも利用可能である。「ＣＨ３足場」とも称されるエピトープタグ付きＣＨ３ドメインは、一般に免疫グロブリンＦｃ部分の形態で、重鎖定常領域を有する本発明の任意の抗体に組み込むことができる。ＣＨ３足場タグの例、およびそれらを抗体に組み込むための方法は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／３２７８０号に開示される。エピトープタグ付きＣＨ３足場を検出するために使用される抗体は、本明細書では一般に、「検出体抗体」と称される。
【００２４】
本発明に従う抗体の治療および診断有効性は、その標的抗原に対するその結合親和性と相関する。結合親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１−１０６，１９７９によって説明されたスキャッチャード法の修正によって計算され得る。あるいは、結合親和性は、その抗原からの抗体の解離速度によって測定され得る。結合親和性を測定するために、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、競合ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、およびフローサイトメトリーを含む、様々な他の方法を使用することもできる。
【００２５】
抗原に「特異的に結合する」抗体は、高い親和性で抗原に結合し、他の無関係の抗原に有意に結合しない抗体である。その抗原への抗体の高親和性結合は、抗原決定基としても知られる、抗原標的のエピトープへの抗体のＣＤＲのうちの１つ以上の結合相互作用によって媒介される。エピトープは、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、特異的免疫応答を誘発することができることを意味する。本発明に従う抗体によって特異的に結合するエピトープは、例えば、１つ以上の種類のがんの細胞によって発現されるタンパク質内に含有される場合がある。一般に、抗体は、その解離定数値（「ＫＤ」）が５０ｎＭ以下である場合、「高親和性結合」を示す。したがって、本発明に従う抗体は、本発明に従う抗体のエピトープを含有する抗体とエプシン１（「ＥＰＮ１」）との間のＫＤ、またはその一部が５０ｎＭ以下である場合、高親和性結合を示す。例えば、ＫＤ値が４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下である場合、本発明による抗体は、ＥＰＮ１への高親和性結合を示す。
【００２６】
本発明による抗体の高親和性結合は、例えば、ＥＰＮ１を発現する細胞へのその結合に関して説明することができる。より具体的には、本発明による抗体は、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の半最大有効濃度（ＥＣ５０）値を示す場合、ＥＰＮ１発現細胞への高親和性結合を示す。
【００２７】
本発明に従う抗体の治療的使用および診断的使用には、免疫複合体の使用が含まれ得る。本明細書に記載されるように、免疫複合体は、本発明に従う抗体に連結されたエフェクター分子を含むキメラ分子である。本明細書で言及されるように、エフェクター分子は、免疫複合体が標的とされる細胞に所望の効果を有することを意図する免疫複合体の部分であるか、またはエフェクター分子は、本発明に従う抗体の半減期または生物学的利用能を増加させるのに役立ち得る。エフェクター分子の一般的な例としては、治療剤（毒素および化学療法薬など）、診断剤（検出可能なマーカーなど）、ならびに半減期および生物学的利用能増強分子（脂質など）が挙げられる。
【００２８】
エフェクター分子は、共有結合手段および非共有結合手段を含む、当業者に既知の任意の数の手段を使用して、本発明による抗体に連結することができる。抗体にエフェクター分子を付着させるための手順は、エフェクターの化学構造によって異なる場合がある。ポリペプチドは、典型的には、抗体上の好適な官能基と反応してエフェクター分子の結合をもたらすのに利用可能な様々な官能基（カルボン酸（ＣＯＯＨ）基、遊離アミン（−ＮＨ２）、およびスルフヒドリル（ＳＨ）基など）を含有する。あるいは、本発明に従う抗体を誘導体化して、追加の反応性官能基を露出または付着させることができる。誘導体化は、いくつかの既知のリンカー分子のうちのいずれかの付着を含んでもよい。リンカーは、抗体をエフェクター分子に結合させるために使用される任意の分子とすることができる。例えば、リンカーは、抗体およびエフェクター分子の両方に共有結合を形成することができる。好適なリンカーは、当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。エフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えばシステインへのジスルフィド結合などを介して）構成アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基に結合されてもよい。組換え技術を使用して、リンカーペプチドを含む２つ以上のポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子にしてもよい。
【００２９】
本発明による抗体にコンジュゲートすることができる治療剤としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、組換えウイルス、または小分子薬物が挙げられるが、これらに限定されない。核酸治療用部分および診断用部分には、アンチセンス核酸、一本鎖または二本鎖ＤＮＡと共有結合架橋するための誘導体化オリゴヌクレオチド、ならびに三本鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３０】
治療剤は、本発明の特定の実施形態では、化学療法剤とすることもできる。本明細書で言及されるように、化学療法剤は、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する、放射性薬剤を含む任意の化学薬剤である。かかる疾患には、腫瘍、新生物、およびがん、ならびに過形成性増殖を特徴とする疾患が含まれる。例えば、本発明による免疫複合体は、少なくとも１つのタイプのがん、または他の過形成性障害を治療するためのレジメンの一部として対象に投与されてもよい。化学療法分子は、本発明に従う抗体に直接コンジュゲートされてもよく、またはそれは、薬物、核酸（アンチセンス核酸など）、または循環系への直接曝露から保護することができる別の治療部分などの治療組成物を含有するリポソームもしくはミセルなどの関連付けられたカプセル化システムに含まれてもよい。抗体に付着したリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、およびＣｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ  ２８：３４１−３６５，１９８５を参照されたい）。
【００３１】
上述のように、本発明による治療薬はまた毒素であってもよい。本発明による抗体に関連付けられてもよい毒素の例としては、アブリン、リシン、緑膿菌外毒素（「ＰＥ」、例えばＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０）、ジフテリア毒素（「ＤＴ」）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、ゲロニン、ブーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、およびそれらの修飾毒素が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、一般に、本発明の文脈における毒素は、細胞に対して毒性のある分子である。
【００３２】
いくつかの状況では、免疫複合体がその標的部位に到達したときに、エフェクター分子を抗体から遊離させることが望ましい。したがって、これらの状況において、免疫複合体は、標的部位の近傍で切断可能な結合を含むであろう。本発明に従う抗体からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、免疫複合体が標的細胞内もしくは標的部位の近傍のいずれかで受ける酵素活性または条件によって促進され得る。あるいは、その標的抗原に特異的に結合した後、本発明に従う抗体は、標的抗原を発現する細胞によって内部移行することができる。
【００３３】
治療免疫複合体を含む本発明に従う治療抗体は、対象の疾患を予防、治療、または寛解するための方法に使用することができる。より具体的には、本発明による治療用抗体は、がん、例えば、肺がんまたは黒色腫を予防、治療、または寛解するために使用することができる。疾患の「予防」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「治療」とは、腫瘍負荷の減少または転移の大きさの数の低下など、疾患または病的状態が発症し始めた後の徴候または症状を改善する治療介入を指す。「寛解」とは、がん等の疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。がんを予防、治療、または寛解するための方法は、抗体の抗原標的を発現するがんを有する対象を選択することを含む、腫瘍増殖または転移を阻害するために、有効量の本発明による抗体を含む組成物の対象への投与を必要としてもよい。投与された抗体は、腫瘍細胞と接触し、言い換えると、腫瘍細胞と直接的な物理的会合に配置され、そこでは抗体が、その標的に結合し、細胞傷害性療法を送達することができる。
【００３４】
「がん」とは、体内の異常細胞の制御されていない増殖を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。調節されていない細胞分裂および増殖は、隣接する組織を侵す悪性腫瘍の形成をもたらし、リンパ系または血流を介して身体の遠隔部分に転移する場合がある。「がん」または「がん組織」は、腫瘍を含む場合がある。本開示の方法によって治療することができるがんの例としては、肺がん（肺扁平上皮癌細胞など）、肝臓癌（肝細胞癌など）、および皮膚癌（黒色腫など）が挙げられるが、これらに限定されない。実際、本発明の方法は、例えば、肺、肝臓、皮膚、乳房、結腸直腸、胃食道がん、卵巣、前立腺、腎臓、膀胱、甲状腺、頭頸部扁平上皮がん、膵臓、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ホジキン病、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）から選択されるがんに由来する腫瘍の腫瘍サイズもしくは転移、またはその両方を減少させるために使用されてもよい。
【００３５】
本発明の様々な方法では、治療有効量の抗体は、がん細胞の増殖、複製もしくは転移を阻害する、またはがんの徴候もしくは症状を阻害するのに十分な量で対象に投与される。好適な対象は、腫瘍細胞が本発明に従う抗体の標的抗原を発現する、がんと診断された対象を含む場合がある。本発明に従う抗体の治療有効量は、がんの重症度、および患者の健康の一般的な状態に依存することになる。治療有効量の抗体は、症状（複数可）の主観的緩和、または臨床医もしくは他の適格な専門家によって指摘される客観的に識別可能な改善のいずれかを提供する抗体である。
【００３６】
それを必要とする対象に投与される本発明による抗体は、組成物に製剤化される。より具体的には、抗体は、全身投与、または腫瘍内投与などの局所投与のために製剤化することができる。例えば、本発明に従う抗体は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化されてもよい。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製することができる。投与の量およびタイミングは、所望の転帰を達成するために治療を行う臨床医の裁量に委ねられている。
【００３７】
本発明に従う抗体の投与はまた、化学療法剤等のなどの抗がん剤の投与、または腫瘍の外科的切除などの治療処置を伴うこともできる。任意の好適な抗がん剤を、本明細書に開示される抗体と組み合わせて投与することができる。例示的な抗がん剤としては、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、挿入抗生物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）、増殖因子抑制剤、細胞周期抑制剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤（ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｇｅｎｔ）、生物学的応答修飾物質、抗ホルモン薬（例えば、抗アンドロゲン薬）、および抗血管新生剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗がん治療には、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的とする他の抗体が含まれる。
【００３８】
投与用組成物は、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解される抗体の溶液を含むことができる。一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなどの薬学的および生理的に許容される流体を含む注入可能な流体を含む。粉末、丸薬、錠剤、またはカプセル形態などの固体組成物に対し、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。前述の担体溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まず、かつ従来の周知の滅菌技法によって滅菌されていてもよい。組成物は、生理学的条件に近似するために必要に応じて、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤および緩衝剤、ならびに毒性調整剤など、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。これらの製剤中の抗体の濃度は、広く変化することができ、選択される特定の投与様式および対象のニーズに従って、主に流体体積、粘度、患者の体重等に基づいて選択されることになる。
【００３９】
本発明による抗体を投与するための選択肢としては、低速の点滴による投与、または静注もしくはボーラスによる投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与される前、本発明による抗体組成物は、凍結乾燥形態で提供されてもよく、投与前に滅菌溶液中で所望の濃度に再水和されてもよい。次いで、抗体溶液を、０．９％塩化ナトリウム（米国薬局方）を含有する輸液バッグに添加してもよく、場合によっては、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与してもよい。本発明による抗体組成物の投与の一例では、より高い負荷用量が投与され、その後、より低いレベルの維持用量で投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量は、約９０分の期間にわたって点滴されてもよく、続いて、以前の用量が十分に忍容された場合、４〜８週間の間３０分間にわたって２ｍｇ／ｋｇの週一回の維持用量が点滴されてもよい。
【００４０】
本発明に従う抗体組成物はまた、制御放出製剤であってよい。制御放出非経口製剤は、例えば、インプラントまたは油性注射剤として作製することができる。ミクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子を含む粒子系もまた、本発明による抗体組成物を送達するために使用されてもよい。本明細書で言及するマイクロカプセルは、中央コア成分として本発明に従う抗体を含有する。ミクロスフェアでは、本発明に従う抗体は、粒子全体に分散する。約１μｍ未満の粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは、一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルと称される。
【００４１】
上記に記載されるように、本発明による抗体は、がん等であるがこれらに限定されない病理学的状態の存在を診断または監視するためにも有用である場合がある。より具体的には、本発明に従う抗体の抗原標的の発現を検出するために本発明の方法が有用である。検出は、インビトロまたはインビボであってもよい。生検、剖検、および病理標本由来の組織を含むがこれらに限定されない、任意の組織試料が、インビトロ診断検出のために使用されてもよい。生物学的試料は、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。生物学的試料は、さらに、血液、血清、血漿、痰、脊髄液または尿等の体液を含む。
【００４２】
方法は、対象からの生検などの試料を、本発明に従う抗体と接触させ、かつ試料中に存在するその標的抗原との抗体の結合を検出することによって、対象ががんを有するかどうかを判定する。対照試料中の抗体の結合と比較して、試料中のその標的抗原への抗体の結合の増加は、対象を、本発明に従う抗体のＥＰＮ１抗原標的を発現するがん、例えば、肺の扁平上皮がんなどの肺がん、もしくは肝細胞がん、もしくは黒色腫、または上記に開示される、様々ながんを含む任意の他の種類のがん、を有するとして特定する。一般に、対照試料は、がんを有しない対象由来の試料である。
【００４３】
診断方法は、それらの感度および特異度において異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性となった罹患者のパーセンテージ（真陽性のパーセンテージ）である。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたものであり、偽陽性率は、検査で陽性となった者で疾患がない者の割合として定義される。特定の診断方法が状態の確定診断を提供しない場合もあるが、方法が診断を補助する肯定的徴候を提供する場合には十分である。「予後」は、肝臓がんまたは転移などの病理学的状態の発症の確率（例えば、重症度）である。
【００４４】
本発明の抗体は、診断薬として有用な免疫複合体を形成するために検出可能な標識と関連させることができる。本明細書で言及される検出可能な標識は、疾患の存在と相関する分子、例えば、本発明による抗体の抗原標的である腫瘍細胞抗原、の検出を容易にする目的で、本発明による抗体に直接または間接的にコンジュゲートされる化合物または組成物である。そのような目的に有用な検出可能な標識は、当該技術分野で周知であり、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、テクネチウム−９９ｍ（「９９ｍＴｃ）、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉなどの放射性同位体；蛍光団；化学発光剤；西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；ビオチニル基；ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなどの二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ；およびガドリニウムキレートなどの磁性剤が挙げられる。本発明に従う標識抗体は、「標識抗体」とも称される場合がある。本発明によるいくつかの抗体について、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサアームによって付着される。
【００４５】
本発明に従う抗体を使用するステップを含む診断方法は、特定の用途では、イムノアッセイであってもよい。イムノアッセイの詳細は、使用される特定の形式によって異なってもよいが、生体試料中の本発明に従う抗体の抗原標的の検出方法は、一般に、免疫学的に反応する条件下で、抗原と特異的に反応する抗体と生体試料を接触させて免疫複合体を形成するステップを含む。得られる免疫複合体の存在は、直接的または間接的に検出することができる。言い換えれば、本発明による抗体は、診断方法において一次抗体（１°Ａｂ）として機能することができ、本発明による抗体に特異的な標識抗体は、２°Ａｂとして機能する。免疫複合体の間接検出の場合、診断方法のための本発明に従う抗体の使用は、一次抗体（本発明に従う抗体）のその標的抗原への結合を検出するための、標識された二次抗体（２°Ａｂ）の使用も含む。二次抗体に好適な検出可能な標識には、本発明に従う直接標識された抗体のための上述の標識が含まれる。本発明による診断方法で使用される２°Ａｂはまた、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／３２７８０号に記載されるＣＨ３エピトープタグを含有する本発明による抗体と組み合わせて使用するための上で定義されるような「検出体抗体」であってもよい。
【００４６】
本発明による抗体はまた、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）にも使用できる。細胞集団のＦＡＣＳ解析では、複数の色チャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを、数ある中でもより高度な検出レベルで使用して、細胞を分離または分類する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。
【００４７】
上述のように、本発明に従う抗体の診断用途で使用される試薬は、血液試料または組織試料などの生体試料の本発明に従う抗体の抗原標的を検出するためのキットで提供されてもよい。かかるキットは対象におけるがん診断を確認するために使用することができる。例えば、本発明に従う抗体を含む診断キットを使用して、生検から得られた組織試料中の腫瘍細胞の組織学的検査を実行することができる。より特定の例では、キットは、肺生検を実施することによって得られる組織または細胞内の肺がん細胞を検出するために使用することができる本発明に従う抗体を含んでもよい。代替の特定の例では、キットは、肝生検における肝細胞がん細胞を検出するために使用することができる本発明に従う抗体を含んでもよい。加えて、代替の特定の例として、キットは、生検を実施することによって得られた組織または細胞における黒色腫を検出するために使用することができる本発明に従う抗体を含んでもよい。
【００４８】
本発明に従う抗体の抗原標的を検出するためのキットは、典型的には、本発明に従う抗体を、モノクローナル抗体、またはその断片、例えば、ｓｃＦｖ断片、ＶＨドメイン、もしくはＦａｂの形態で含む。抗体は、上記のように、蛍光標識、放射性標識、または酵素標識等の検出可能なマーカーによる標識がされない場合がある。キットはまた、一般に、本発明に従う抗体の使用手段を開示する教材も含む。教材は、記載されたもの、携帯型ハードドライブなどの電子形式であってもよく、教材はまた、ビデオファイルなどの視覚的なものであってもよい。教材はまた、説明書を提供する、ウェブサイトまたはモバイルデバイスもしくはコンピュータ「アプリ」などのアプリケーションソフトウェアプログラムへのリンクを参照してもよい。キットはまた、キットが設計される特定の用途を容易にするために追加の構成要素も含んでもよい。例えば、キットはまた、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体等の適切な二次標識等）も含有してもよい。診断目的のために本発明に従う抗体を使用する方法で日常的に使用される緩衝液および他の試薬も、本発明に従うキットに含めることができる。
【００４９】
本発明による抗体は、様々な組換え発現系によって産生することができる。言い換えれば、抗体は、培養液中の生細胞におけるそれらのアミノ酸配列をコードする核酸配列の発現によって産生することができる。本発明に従う「単離された」抗体は、細胞、タンパク質、および器官などの他の生物学的成分環境から実質的に分離または精製された抗体である。例えば、抗体は、それが、ｉ）Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるように、タンパク質の９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、または９９重量％を超えて、また代替的に９９重量％を超えて精製される場合に、ｉｉ）スピニングカップシーケンサを使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に精製される場合に、ｉｉｉ）クーマシーブルーまたはシルバー染色を使用して、還元条件下または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に、精製される場合に単離されてもよい。単離された抗体はまた、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内にインサイチュである本発明に従う抗体であってもよい。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
【００５０】
本発明に従う抗体の適切なヌクレオチドコード配列で細胞を形質転換またはトランスフェクションすることによって、様々な宿主発現ベクターシステムを利用して本発明に従う抗体を発現させてもよい。宿主発現細胞の例としては、これらに限定するものではないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクター内に含有される抗体コード配列でトランスフェクトされ得るＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ等の細菌；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａ等の酵母；抗体コード配列を含有するバキュロビン１（ｂａｃｕｌｏｖｉｎ１）等の組換えウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含有するカリフラワーモザイクウイルス（「ＣａＭＶ」）、またはタバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）などの組換えウイルス発現ベクターに感染した植物細胞系；ならびに、メタロチオネインプロモーターもしくは伸長因子Ｉアルファプロモーター、または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（アデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）などの哺乳動物細胞系のゲノム由来のプロモーターを含む組換え発現構築物を保有する、ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、３Ｔ３、ＮＳＯ細胞などの、しかしこれらに限定するものではない哺乳動物細胞系が挙げられる。例えば、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）などの哺乳動物細胞、またはＥｘｐｉ２９３などのその誘導体は、重鎖および軽鎖断片をそれぞれ発現するためにマウスおよびラット伸長因子１アルファプロモーターを組み込む二重プロモーターベクターと併せて、本発明に従う抗体のための有効な発現系であり、発現される抗体分子の意図する使用に応じて、有利に選択することができる。
【００５１】
抗体の薬学的組成物の生成のために本発明に従う大量の抗体が産生される場合、高レベルの容易に精製される融合タンパク質生成物の発現を目的とするベクターが望ましい場合がある。かかるベクターとしては：抗体コード配列が、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃ  Ｚコード領域を有するフレーム内でベクターに個別にライゲーションされ得る、ｐＵＲ２７８ベクター（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐｌＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、およびＶａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；本発明の抗体をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）と融合させるｐＧＥＸベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従う抗体およびポリペプチドタグのＧＳＴ融合タンパク質は可溶性であり、かつマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。対照的に、ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物（本発明に従う抗体）をＧＳＴ部分から放出することができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００５２】
本発明に従う抗体をコードする挿入配列（複数可）の発現を調節するか、または所望に応じて遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主発現細胞系も選択されてもよい。例えば、タンパク質生成物の切断等のグリコシル化およびプロセシングを含む修飾は、タンパク質の機能にとって重要である場合がある。実際、異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。この目的のために、本発明による一次転写物の適切なプロセシング、ならびに遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための適切な細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。
【００５３】
本発明に従う抗体を産生するために使用されるベクターは、その特定の抗体の少なくとも一部をコードする核酸分子を含む。例えば、かかる核酸配列は、配列番号３に対応するＤＮＡ配列、またはその一部を含むことができる。したがって、プロモーターなどの第１の核酸配列と機能的な関係に配置される第２の核酸配列と作動可能に連結される、本発明に従う抗体の少なくとも一部をコードする第１の核酸は、本発明に従う核酸である。連結されたプロモーター配列がコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、作動可能な連結が存在する。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、連続しており、同じリーディングフレーム内で、２つ以上のタンパク質コード領域を結合してもよい。
【００５４】
本発明によるＤＮＡ配列を含む核酸が、細胞、他の染色体および染色体外ＤＮＡならびにＲＮＡ、タンパク質および器官などの環境中の他の生物学的成分から実質的に分離または精製される場合、それは、本発明に従う「単離された核酸」であると見なされる場合がある。例えば、標準的な精製方法によって精製された核酸は、単離された核酸である。
【００５５】
本発明に従う核酸はまた、本発明に従う抗体をコードするヌクレオチドの縮重バリアントも含む。より具体的には、「縮重バリアント」とは、本発明に従う抗体をコードするが、遺伝コードの結果として縮重しているポリヌクレオチドを指す。コードされた抗体のアミノ酸配列が本発明に従う抗体の抗原標的に特異的に結合する限り、本発明によれば、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、ＥＰＮ１に結合する抗体ＩＭＭ２００５９の単離および特徴付けを説明する。
【００５７】
実施例１．無傷ヒトがん細胞の表面に結合する抗体を産生するヒトハイブリドーマの単離。図１は、頭頸部がん患者のリンパ節から単離されたヒトＢ細胞とＢ５−６Ｔ融合パートナー細胞株との融合から生成された、ＰＲ０４５−２Ｈ１１ハイブリドーマ細胞によって産生されたＡｂの検出を示す。ヒトＢ細胞とＢ５−６Ｔ細胞との融合を、本質的に米国特許第８，９９９，７０７号（「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）に記載されるように電気融合によって実行した。融合後、ハイブリドーマをプレーティングし、そして約２週間増殖させた。次いで、ＩｇＧ陽性ハイブリドーマ由来の条件培地を収集し、そしてがん細胞株の表面に結合する抗体の能力についてスクリーニングした。ＰＲ０４５−２Ｈ１１で産生されたＡｂの生存無傷がん細胞株のプールへの結合を、９６ウェルプレート用に構成されたＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）Ｓａイメージングシステムと組み合わせてフルオロフォア標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次Ａｂを使用して検出した。スクリーニングの前に、がん細胞を同じ比率で混合し、プールを９６ウェルプレートに等分し、２４〜４８時間付着させた。ハイブリドーマ上清を、アジ化ナトリウムを含有する培地内で０．１％の最終濃度となるように希釈した。スクリーニングアッセイにおける活性を評価するために、３つの異なる陽性対照を使用した：１）抗バシジン、抗ＥＧＦＲ、および抗ＥＲＢＢ２（ＢＣＨ）の等比率の混合物を、各１００ｎｇ／ｍＬの濃度から開始して、１：５の段階希釈で、３点でプレーティングした、２）各抗体の１００ｎｇ／ｍＬまたは２０ｎｇ／ｍＬのいずれかを含有する抗ＣＥＡおよび抗インテグリンｍＡｂの混合物の２点タイトレーション、ならびに３）単一濃度の抗ＣＤ２９ｍＡｂ（５００ｎｇ／ｍＬ）。二次抗体のみを単独で陰性対照として使用した。対照の組み合わせは、細胞株プールおよびＬＩ−ＣＯＲ機器の検出範囲の両方にわたって絶対シグナル強度の範囲を提供した。ＰＲ０４５−２Ｈ１１の検出シグナルは、ベースライン陽性対照と比較して１７７％のシグナル増加を示した。ベースライン陽性対照と比較して少なくとも１５％のシグナル増加を示したハイブリドーマを含有する全てのウェルを図２に示す。
【００５８】
実施例２．ＰＲ０４５−２Ｈ１１ハイブリドーマは、ＩＧＨＶ３／ＩＧＫ可変ドメインを有するＩｇＧを産生する。ＰＲ０４５−２Ｈ１１産生Ａｂの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＰＲ０４５−２Ｈ１１ハイブリドーマ細胞から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得られ、また得られた抗体ｃＤＮＡを配列決定反応に供する。配列番号１は、ＰＲ０４５−２Ｈ１１で産生されるＡｂのＶＨに対応し、配列番号５は、ＶＬに対応する。ここで使用されるＰＣＲ戦略は、可変ドメインのフレームワーク１の５’の大部分に対応する領域を増幅するように設計されなかった。Ｉｇ重鎖Ｖ（「ＩＧＨＶ」）および免疫グロブリンカッパ遺伝子座（「ＩＧＫＬ」）遺伝子の割り当てを、既知の生殖系列遺伝子配列との相同性に基づいて予測し、かつＶＨおよびＶＬ配列の正確な５’末端の代替物として使用した。
【００５９】
ＶＨおよびＶＬドメインのコード領域は、生殖系列配列とはそれぞれ１５ヌクレオチドおよび１４ヌクレオチドが異なる体細胞超突然変異の特徴を有する。ＰＲ０４５−２Ｈ１１ＶＨ（配列番号３）の全長発現断片を、ＩＧＨＶ３−４８＊０２のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して生成した。ＰＲ０４５−２Ｈ１１ＶＬ（配列番号７）に対する全長発現断片を、ＩＧＫＶ３−１１＊０１のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して生成した。デュアルプロモーターＩｇＧ１発現ベクターへのギブソンスタイルクローニングを容易にするために、配列番号３および配列番号７ドメインに対応する断片を追加の５’および３’伸長で合成した。ＶＨおよびＶＬ断片によってコードされる対応するタンパク質配列は、それぞれ、配列番号４および配列番号８に定義される。同様に、ＰＲ０４５−２Ｈ１１のＶＨ（配列番号４）およびＶＬ（配列番号８）をコードするＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１の２つのベクター発現系へとクローニングした。両方のベクター系によってコードされる重鎖および軽鎖の全長アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１５および配列番号１６に対応する。
【００６０】
実施例３．ＰＲ０４５−２Ｈ１１Ａｂの組換え形態であるＩＭＭ２００５９は、腫瘍細胞株の表面に結合する。ＰＲ０４５−２Ｈ１１ＡｂＶＨおよびＶＬドメインを含有する全長ＩｇＧ１抗体を、標準条件を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびヒト胚腎臓（ＨＥＫ）などの哺乳動物細胞株、またはこれらの細胞株の誘導物への一過性トランスフェクションによって組み換え発現させた。ＩＭＭ２００５９と称される組み換え抗体を、アフィニティクロマトグラフィによって条件培地から精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、フローサイトメトリーによって活性について分析した。ＩＭＭ２００５９は、元のＰＲ０４５−２Ｈ１１ハイブリドーマ産生抗体と一致する結合活性を示した。ＩＭＭ２００５９は、ヒトがん細胞、不死化正常ヒト細胞株、およびマウス腫瘍株のパネルに含まれる細胞の表面に様々な程度で結合する（表１）。図３および４に示されるように、ＩＭＭ２００５９は、フローサイトメトリーによって分析すると、それぞれ、Ａ５４９肺腺がんおよびＨｕｈ７肝細胞がん細胞株の表面への飽和結合を示す。ＩＭＭ２００５９は、それぞれ０．９および１．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＡ５４９およびＨｕｈ７に結合する。これらの値は６〜９ｎＭのＥＣ５０値に対応する。
【表１−１】
2022501062.tif 000003
【表１−２】
2022501062.tif 000004
【００６１】
実施例４．ＩＭＭ２００５９はＥＰＮ１に結合する。ＩＭＭ２００５９が結合する標的抗原を同定するために実施された免疫沈降実験は、約６５ｋＤａタンパク質のバンドを一貫して同定した（図５）。免疫沈降バンドの質量分析は、タンパク質をＥＰＮ１として同定した。ＩＭＭ２００５９がＥＰＮ１に結合する能力は、一連のインビトロアッセイにおいて確認された。図６に示すように、ＩＭＭ２００５９は、その相同体ＥＰＮ２と比較して、用量依存的な様態で組換えＥＰＮ１に選択的に結合する。
【００６２】
次いで、ＩＭＭ２００５９を、ＣＤＩヒトプロテオーム（ＨｕＰｒｏｔ）マイクロアレイベースのハイ−スペック（Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｃ）抗体交差反応性アッセイを使用してスクリーニングした。アッセイでは、ヒトプロテオームの約８０％に対応するタンパク質をネイティブ形式でマイクロアレイ上にスポット（ｓｐｏｔ）し、そしてＩＭＭ２００５９の特異性をプローブするために使用した。より具体的には、ＩＭＭ２００５９（１μｇ／ｍＬ）をネイティブＣＤＩ  ＨｕＰｒｏｔアレイに対して、ＥＰＮ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ、カタログ番号ＴＰ３０７０９９）を追加の対照としてアレイに追加して、４℃で一晩インキュベートした。スライドを洗浄し、ＩＭＭ２００５９結合を、Ａｌｅｘａ−６４７コンジュゲート抗Ｈ＋Ｌ二次抗体で検出した。二次的に結合した非特異的ヒットを任意の分析から除外した。標的タンパク質への選択的結合を、全体的なシグナル強度、各スライド上の複製物への結合の再現性を決定するためのＺスコア、および可能な標的に対する選択性の差を決定するためのＳスコアを組み合わせて分析した。最上位ヒットと２位ヒットとの間のＳスコア＞３は、上位ヒットに対する特異性を示すものと見なされる。
【００６３】
表２に示す通り、ＩＭＭ２００５９は、アレイ上の上位６つのヒットのうちの２つとして、アレイ上に通常見られるＥＰＮ１と、ＥＰＮ１の追加された対照スポットとの両方に結合した。シグナル強度は、これらの６つのタンパク質のそれぞれについての最大閾値を超え、代替タンパク質とのいくつかの交差反応性の可能性を示唆している。ＩＭＭ２００５９は、ハイ−スペックアッセイにおけるＥＰＮ３と比較して、ＥＰＮ１に対する選択性を示した。ＥＰＮ３はタンパク質アレイ上に存在するが、選択的結合を示さなかった。
【表２】
2022501062.tif 000005
【００６４】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＰＮ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲに基づく破壊は、ＩＭＭ２００５９がそれらの細胞に結合する能力を取り消す。固定および透過性親細胞およびＥＰＮ１−／−細胞のフローサイトメトリーに基づく分析を、ＩＭＭ２００５９および市販の抗ＥＰＮ１抗体を用いて実施した。両方の抗体は、ＥＰＮ１−／−クローンで失われた親ＨＥＫ２９３細胞への同等レベルの結合を示す（図７）。市販の抗ＥＰＮ１ｍＡｂおよびＩＭＭ２００５９の両方によるＥＰＮ１−／−クローンへの残留結合は、クローンが実際にはＥＰＮ１発現細胞を含む混合集団であるか、または２つの抗体が、同様の程度で、非ＥＰＮ１標的タンパク質と交差反応するかのいずれかであることを示唆する。
【００６５】
ＩＭＭ２００５９および市販のマウス抗ｈｕＥＰＮ１を一次抗体として使用して、Ｈ４６０ヒト肺がん細胞株におけるＥＰＮ１の局在を視覚化した。ＥＰＮ１の既知の膜局在化と一致して、結合した一次抗体を検出するために適切な種特異性を有するフルオロフォア二次抗体を使用して免疫蛍光によって可視化されたときに両方の抗体は、膜染色を示した（図７および図８）。
【００６６】
組換えＥＰＮ１との相互作用の強度を、標準的なランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４）中の２５℃でのＢＩＡｃｏｒｅ２０００の表面プラズモン共鳴によってさらに定義した。プロテインＡ表面を、１５０ｍＭのリン酸により結合サイクル間で再生した。ＩＭＭ２００５９、またはアイソタイプ対照をＣＭ５／プロテインＡセンサ表面上に捕捉させて結合および対照表面を生成し、ＩＭＭ２００５９を約２００および４５０ＲＵで捕捉させ、アイソタイプ対照を約６００ＲＵの密度で捕捉させた。組換えＥＰＮ１の３つの表面の各々への結合を、最高濃度として３３．３ｎＭから開始して３倍希釈系列を使用して、３回（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）試験した。ＥＰＮ１の結合は、高密度（４５０ＲＵ）および低密度（２００ＲＵ）の両方のＩＭＭ２００５９表面に観察された。これらの条件下では、試験したいずれの濃度でもアイソタイプ対照表面への結合は観察されなかった。４５０ＲＵのＩＭＭ２００５９表面に対して測定した結合から得られた二重減算データを１：１結合モデルに適合させた。表３に概説されるように、ＩＭＭ２００５９は、平均ＫＤが９５０＋／−１０ｐＭでＥＰＮ１への再現可能な結合を示した。
【表３】
2022501062.tif 000006
【００６７】
ドットブロット結合データと一致して、ＳＰＲ分析は、ＩＭＭ２００５９が、ＥＰＮ２と比較してＥＰＮ１に選択的に結合することを示した。ＩＭＭ２００５９を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡをランニング緩衝液として使用して、ＣＭ５／プロテインＡセンサチップ上で４つの異なる表面密度（５００、１０００、２６００、および２８００ＲＵ）で捕捉した。ＥＰＮ１（Ｏｒｉｇｅｎｅカタログ番号ＴＰ３０７０９９）またはＥＰＮ２（Ｏｒｉｇｅｎｅカタログ番号ＴＰ３１０８９９）をランニング緩衝液で２００ｎＭおよび２０ｎＭの両方に希釈し、２５℃で固定化されたＩＭＭ２００５９に結合する能力について分析した。これらのすべての条件下では、ＩＭＭ２００５９はＥＰＮ１に強く結合したが（表３）、ＥＰＮ２へのいかなる結合も示さなかった。しかしながら、表４に詳述されるように、ＥＰＮ１への結合について観察されたオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、ＩＭＭ２００５９表面密度に依存し、５００ＲＵ表面上のオフレートは、２８００ＲＵ密度表面上で測定されたオフレートよりも２．４倍速い。これらのデータは、ＥＰＮ１が、溶液中またはチップ表面への結合の際のいずれかで多量体化され得る可能性を示唆し、これは、結合相互作用へのアビディティ効果を誘発し、かつ相互作用のみかけのＫＤを変化させることを可能とする。
【表４】
2022501062.tif 000007
【００６８】
ＥＰＮ１のＩＭＭ２００５９への結合は、抗体が、標準的なランニング緩衝液中で、約５０ＲＵの密度でＣ１／プロテインＡセンサチップの表面上に捕捉されたときに評価された。Ｃ１チップのカルボキシメチル化されたマトリックスのない表面と、低密度のＩＭＭ２００５９の組み合わせは、積極的な結合を制限すると予測される。ランニング緩衝液中の最大２００ｎＭのＥＰＮ１の３倍希釈系列を２５℃で表面上に通過させ、そして同等のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）でＩＭＭ２００５９表面に結合することが示された（表５）。しかしながら、観察されたオフレートは、これらの条件下でおよそ一桁速く、測定された固有結合親和性のおよそ１０倍の減少につながる。
【表５】
2022501062.tif 000008
【００６９】
実施例５．ＩＭＭ２００５９は、ＥＰＮ１の高度に保存された領域内の残基に結合する。架橋実験を実施して、高分解能で、ＩＭＭ２００５９によって結合されるＥＰＮ１上のエピトープを決定した。ＧＳＴ−ＥＰＮ１融合タンパク質（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，カタログ番号Ｈ０００２９９２４−Ｐ０１、配列番号１７）は、架橋実験に対して標的抗原として機能した。ＩＭＭ２００５９／ＥＰＮ１タンパク質複合体が形成され、重水素化架橋剤と共にインキュベートされ、トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ−Ｎ、エラスターゼ、およびサーモリシンと共に多酵素切断に供された。架橋ペプチドの濃縮後、試料を高分解能質量分析法（ｎＬＣ−ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＭＳ）によって解析し、生成されたデータをＸＱｕｅｓｔおよびＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを使用して解析した。
【００７０】
ｎＬＣ−ｏｒｂｉｔｒａｐＭＳ／ＭＳ分析は、ＥＰＮ１とＩＭＭ２００５９との間の８つの架橋ペプチドを検出した（表６）。相互作用は、ＥＰＮ１のエプシンＮ末端相同性（「ＥＮＴＨ」）ドメインの２つの領域にマッピングされ、配列番号１８のアミノ酸位置１０１、１１１、１２４、１３５、および１４１で架橋が同定されている。ＥＮＴＨドメイン内のそれらの架橋の物理的位置を、ラットＥＰＮ１のＥＮＴＨドメイン（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ：１ＥＤＵ）の結晶構造の上にモデル化した。ヒトＥＰＮ１は、ラットとマウスとの両方のＥＰＮ１と、ＥＮＴＨドメイン全体で１００％同一であり、全体として９６％を超えて同一である（図１３）。図１０に示すように、ＥＰＮ１への架橋として同定された残基は、互いに物理的に近接したＥＮＴＨドメインの単一の面上に位置する。
【００７１】
種間のＥＰＮ１に見られる同一性とは対照的に、ヒトＥＰＮ１は、ヒトＥＰＮ２およびＥＰＮ３とそれぞれ５６．７％および４９．６％のみ同一である（図１４）。図１１および１２に示されるように、いくつかのアミノ酸の違いは、ＩＭＭ２００５９への結合として同定されたインターフェースにマッピングされる。これらの違いは、ＥＰＮ２またはＥＰＮ３のいずれかと比較して、ＥＰＮ１に対するＩＭＭ２００５９の選択性の理論的根拠を提供する。
【表６】
2022501062.tif 000009
【００７２】
ＩＭＭ２００５９結合部位内のマウスとヒトＥＰＮ１との間のアミノ酸同一性は、ＩＭＭ２００５９がマウスＥＰＮ１に結合できることを予測する。この予測は、マウスがん細胞株に対して観察されるフローサイトメトリーに基づく結合と一致する（表１）。図１５は、ヒト細胞株ＭＦＥ２９６およびマウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３の両方でのＥＰＮ１の表面プールが、全細胞ＥＰＮ１の一部を表していることを示している。細胞を生存細胞として染色して表面ＥＰＮ１を同定するか、または透過させて表面プールと細胞内プールとの両方を同定する。ＩＭＭ２００５９および市販の抗ＥＰＮ１モノクローナル抗体（クローンＣ−１１）は、類似の染色パターンを示した。
【００７３】
実施例６．ＥＰＮ１活性の喪失は、細胞増殖を阻害する。ＥＰＮ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲベースのノックアウトを保有する複数のクローンを、細胞増殖アッセイにおいて分析した。図１６に示されるように、全てのクローンは、親ＨＥＫ２９３細胞と比較して、統計的に有意な細胞増殖速度の低下を示した。これは、潜在的に抗体ベースのアプローチによるＥＰＮ１機能の破壊が、がん細胞の増殖を遅らせる可能性があるという仮説を支持する。
【００７４】
実施例７．ＩＭＭ２００５９は、黒色腫の同系モデルにおける腫瘍増殖を遅らせる。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける同系腫瘍として増殖したＢ１６Ｆ０黒色腫モデルを使用して、腫瘍増殖に対するＩＭＭ２００５９の影響を評価した。確立されたＢ１６Ｆ１０腫瘍を保有するマウス（ｎ≧８／コホート）を、週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＭＭ２００５９の腹腔内注射により処置し、平均腫瘍体積をキャリパー測定により計算した。図１７に示すように、ＩＭＭ２００５９処置した腫瘍の増殖は、ビヒクル処置した腫瘍の増殖と比較して著しく減速した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の増殖を適度に阻害することが知られている臨床的に関連する免疫腫瘍チェックポイントであるＣＴＬＡ４を標的とする抗体を、この実験において陽性対照として使用した。
【００７５】
配列表
配列番号１−ＶＨＰＲ０４５−２Ｈ１１ヌクレオチド配列
ＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣ
配列番号２−ＶＨＰＲ０４５−２Ｈ１１アミノ酸配列
ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号３−ＶＨＰＲ０４５−２Ｈ１１発現断片ヌクレオチド配列
ＡＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ
配列番号４−ＶＨＰＲ０４５−２Ｈ１１発現断片アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬ
配列番号５−ＶＬＰＲ０４５−２Ｈ１１ヌクレオチド配列
ＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴ
配列番号６−ＶＬＰＲ０４５−２Ｈ１１アミノ酸配列
ＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ
配列番号７−ＶＬＰＲ０４５−２Ｈ１１発現断片ヌクレオチド配列
ＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧ
配列番号８−ＶＬＰＲ０４５−２Ｈ１１発現断片アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
配列番号９−Ｈ−ＣＤＲ１
ＳＩＨＳＬＮ
配列番号１０−Ｈ−ＣＤＲ２
ＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１１−Ｈ−ＣＤＲ３
ＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬ
配列番号１２−Ｌ−ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡ
配列番号１３−Ｌ−ＣＤＲ２
ＤＡＳＩＲＡＴ
配列番号１４−Ｌ−ＣＤＲ３
ＱＱＲＹＮＷＬＴ
配列番号１５−ＩＭＭ２００５９重鎖アミノ酸
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１６−ＩＭＭ２００５９軽鎖アミノ酸
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１７−ＧＳＴ−ＥＰＮ１
ＭＥＳＰＩＬＧＹＷＫＩＫＧＬＶＱＰＴＲＬＬＬＥＹＬＥＥＫＹＥＥＨＬＹＥＲＤＥＧＤＫＷＲＮＫＫＦＥＬＧＬＥＦＰＮＬＰＹＹＩＤＧＤＶＫＬＴＱＳＭＡＩＩＲＹＩＡＤＫＨＮＭＬＧＧＣＰＫＥＲＡＥＩＳＭＬＥＧＡＶＬＤＩＲＹＧＶＳＲＩＡＹＳＫＤＦＥＴＬＫＶＤＦＬＳＫＬＰＥＭＬＫＭＦＥＤＲＬＣＨＫＴＹＬＮＧＤＨＶＴＨＰＤＦＭＬＹＤＡＬＤＶＶＬＹＭＤＰＭＣＬＤＡＦＰＫＬＶＣＦＫＫＲＩＥＡＩＰＱＩＤＫＹＬＫＳＳＫＹＩＡＷＰＬＱＧＷＱＡＴＦＧＧＧＤＨＰＰＫＳＤＬＥＶＬＦＱＧＰＬＥＴＳＬＹＫＫＡＧＴＭＳＴＳＳＬＲＲＱＭＫＮＩＶＨＮＹＳＥＡＥＩＫＶＲＥＡＴＳＮＤＰＷＧＰＳＳＳＬＭＳＥＩＡＤＬＴＹＮＶＶＡＦＳＥＩＭＳＭＩＷＫＲＬＮＤＨＧＫＮＷＲＨＶＹＫＡＭＴＬＭＥＹＬＩＫＴＧＳＥＲＶＳＱＱＣＫＥＮＭＹＡＶＱＴＬＫＤＦＱＹＶＤＲＤＧＫＤＱＧＶＮＶＲＥＫＡＫＱＬＶＡＬＬＲＤＥＤＲＬＲＥＥＲＡＨＡＬＫＴＫＥＫＬＡＱＴＡＴＡＳＳＡＡＶＧＳＧＰＰＰＥＡＥＱＡＷＰＱＳＳＧＥＥＥＬＱＬＱＬＡＬＡＭＳＫＥＥＡＤＱＥＥＲＩＲＲＧＤＤＬＲＬＱＭＡＩＥＥＳＫＲＥＴＧＧＫＥＥＳＳＬＭＤＬＡＤＶＦＴＡＰＡＰＡＰＴＴＤＰＷＧＧＰＡＰＭＡＡＡＶＰＴＡＡＰＴＳＤＰＷＧＧＰＰＶＰＰＡＡＤＰＷＧＧＰＡＰＴＰＡＳＧＤＰＷＲＰＡＡＰＡＧＰＳＶＤＰＷＧＧＴＰＡＰＡＡＧＥＧＰＴＰＤＰＷＧＳＳＤＧＧＶＰＶＳＧＰＳＡＳＤＰＷＴＰＡＰＡＦＳＤＰＷＧＧＳＰＡＫＰＳＴＮＧＴＴＡＧＧＦＤＴＥＰＤＥＦＳＤＦＤＲＬＲＴＡＬＰＴＳＧＳＳＡＧＥＬＥＬＬＡＧＥＶＰＡＲＳＰＧＡＦＤＭＳＧＶＲＧＳＬＡＥＡＶＧＳＰＰＰＡＡＴＰＴＰＴＰＰＴＲＫＴＰＥＳＦＬＧＰＮＡＡＬＶＤＬＤＳＬＶＳＲＰＧＰＴＰＰＧＡＫＡＳＮＰＦＬＰＧＧＧＰＡＴＧＰＳＶＴＮＰＦＱＰＡＰＰＡＴＬＴＬＮＱＬＲＬＳＰＶＰＰＶＰＧＡＰＰＴＹＩＳＰＬＧＧＧＰＧＬＰＰＭＭＰＰＧＰＰＡＰＮＴＮＰＦＬＬ
配列番号１８−ＥＰＮ１
ＭＳＴＳＳＬＲＲＱＭＫＮＩＶＨＮＹＳＥＡＥＩＫＶＲＥＡＴＳＮＤＰＷＧＰＳＳＳＬＭＳＥＩＡＤＬＴＹＮＶＶＡＦＳＥＩＭＳＭＩＷＫＲＬＮＤＨＧＫＮＷＲＨＶＹＫＡＭＴＬＭＥＹＬＩＫＴＧＳＥＲＶＳＱＱＣＫＥＮＭＹＡＶＱＴＬＫＤＦＱＹＶＤＲＤＧＫＤＱＧＶＮＶＲＥＫＡＫＱＬＶＡＬＬＲＤＥＤＲＬＲＥＥＲＡＨＡＬＫＴＫＥＫＬＡＱＴＡＴＡＳＳＡＡＶＧＳＧＰＰＰＥＡＥＱＡＷＰＱＳＳＧＥＥＥＬＱＬＱＬＡＬＡＭＳＫＥＥＡＤＱＥＥＲＩＲＲＧＤＤＬＲＬＱＭＡＩＥＥＳＫＲＥＴＧＧＫＥＥＳＳＬＭＤＬＡＤＶＦＴＡＰＡＰＡＰＴＴＤＰＷＧＧＰＡＰＭＡＡＡＶＰＴＡＡＰＴＳＤＰＷＧＧＰＰＶＰＰＡＡＤＰＷＧＧＰＡＰＴＰＡＳＧＤＰＷＲＰＡＡＰＡＧＰＳＶＤＰＷＧＧＴＰＡＰＡＡＧＥＧＰＴＰＤＰＷＧＳＳＤＧＧＶＰＶＳＧＰＳＡＳＤＰＷＴＰＡＰＡＦＳＤＰＷＧＧＳＰＡＫＰＳＴＮＧＴＴＡＧＧＦＤＴＥＰＤＥＦＳＤＦＤＲＬＲＴＡＬＰＴＳＧＳＳＡＧＥＬＥＬＬＡＧＥＶＰＡＲＳＰＧＡＦＤＭＳＧＶＲＧＳＬＡＥＡＶＧＳＰＰＰＡＡＴＰＴＰＴＰＰＴＲＫＴＰＥＳＦＬＧＰＮＡＡＬＶＤＬＤＳＬＶＳＲＰＧＰＴＰＰＧＡＫＡＳＮＰＦＬＰＧＧＧＰＡＴＧＰＳＶＴＮＰＦＱＰＡＰＰＡＴＬＴＬＮＱＬＲＬＳＰＶＰＰＶＰＧＡＰＰＴＹＩＳＰＬＧＧＧＰＧＬＰＰＭＭＰＰＧＰＰＡＰＮＴＮＰＦＬＬ
配列番号１９−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸４４−７２）
ＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲ
配列番号２０−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸９２−１０２）
ＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫ
配列番号２１−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸４４−６７）
ＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ
配列番号２２−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸５５−６１）
ＡＴＧＩＰＡＲ
配列番号２３−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸２０−３８）
ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲ
配列番号２４−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸１９−２４）
ＡＴＬＳＣＲ
配列番号２５−ＩＭＭ２００５９（アミノ酸３０−３６）
ＳＩＨＳＬＮＷ
配列番号２６−ＥＰＮ１（アミノ酸９８−１０７）
ＥＮＭＹＡＶＱＴＬＫ
配列番号２７−ＥＰＮ１（アミノ酸１０８−１１４）
ＤＦＱＹＶＤＲ
配列番号２８−ＥＰＮ１（アミノ酸１０８−１１７）
ＤＦＱＹＶＤＲＤＧＫ
配列番号２９−ＥＰＮ１（アミノ酸１１５−１２６）
ＤＧＫＤＱＧＶＮＶＲＥＫ
配列番号３０−ＥＰＮ１（アミノ酸１１８−１２６）
ＤＱＧＶＮＶＲＥＫ
配列番号３１−ＥＰＮ１（アミノ酸１２７−１３９）
ＡＫＱＬＶＡＬＬＲＤＥＤＲ
配列番号３２−ＥＰＮ１（アミノ酸１３５−１５４）
ＲＤＥＤＲＬＲＥＥＲＡＨＡＬＫＴＫＥＫＬ
【図１】
2022501062.tif 000010
【図２】
2022501062.tif 000011
【図３】
2022501062.tif 000012
【図４】
2022501062.tif 000013
【図５】
2022501062.tif 000014
【図６】
2022501062.tif 000015
【図７】
2022501062.tif 000016
【図８】
2022501062.tif 000017
【図９】
2022501062.tif 000018
【図１０】
2022501062.tif 000019
【図１１】
2022501062.tif 000020
【図１２】
2022501062.tif 000021
【図１３】
2022501062.tif 000022
【図１４】
2022501062.tif 000023
【図１５】
2022501062.tif 000024
【図１６】
2022501062.tif 000025
【図１７】
2022501062.tif 000026
【配列表】
2022501062000001.app
【国際調査報告】
2022501062.tif 000027
2022501062.tif 000028
2022501062.tif 000029