(57)【要約】感染症の診断のための組成物および方法が提供される。抗体アイソタイプ、サブタイプ、およびグリコシル化のパターンは、感染剤および感染に対する患者応答を特定し得るシグネチャパターンを提供する。治療的介入から便宜を受ける可能性が高い患者は、応答性の確率が低い患者から判別され得る。療法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体による病原体に対する免疫応答を特徴付ける方法であって、
前記個体から少なくとも１つの抗体含有試料を収集することと、
前記個体由来の前記少なくとも１つの抗体含有試料を診断病原体と接触させることと、
前記診断病原体を、検出可能な部分に作用可能に連結されている１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬と接触させることと、
結合したアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬の存在について前記診断病原体を分析して、病原体特異的抗体の存在および種類を決定することであって、前記存在および種類が、病原体感染および免疫応答を示す、決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記診断病原体が、フルオロフォアを発現するように遺伝子修飾された無傷の病原体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フルオロフォアが、蛍光タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、およびこれらの類似体からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記診断病原体が、生病原体または固定病原体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記診断病原体が、臨床分離株または環境分離株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記診断病原体が、細胞株または細胞培養物由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記診断病原体が、さらに、病原体間で高度に保存されるタンパク質および他のエピトープの発現を排除するように遺伝子修飾される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記エピトープが、細胞表面タンパク質上に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面タンパク質が、鞭毛タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記鞭毛タンパク質が、ボレリアのｆｌｉＨタンパク質およびｆｌｉＩタンパク質のうちの一方または両方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体が、細胞病原体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記病原体が、細菌、真菌、および原虫から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が、スピロヘータである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記スピロヘータが、ボレリア属である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
感染性病原体が、ダニ媒介性病原体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ダニ媒介性病原体が、ボレリア・ブルグドルフェリである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アイソタイプ特異的試薬が、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇ特異的グリコシル化部位（例えば、ＩｇＡ１−Ｇ２Ｓ１またはＩｇＧ４−Ｇ０Ｆ）のうちの１つを認識する抗体である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
２つ以上の一意的に標識されたアイソタイプ／サブタイプ／グリコシル化特異的試薬のカクテルを、前記試料と接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
分析が、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、配列バーコード化抗体の配列決定またはＰＣＲ、および高次元／多パラメータ顕微鏡法から選択される方法によって実行される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記病原体が、ワクチン株であり、前記病原体特異的抗体の存在および種類が、ワクチン免疫化に対する応答を示す、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記分析に従って、任意選択で、病原体特異的ＩｇＥ抗体が存在する、抗ヒスタミン剤、抗ＩｇＥ剤、または肥満細胞安定化剤のうちの１つ以上で前記個体を治療することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体含有試料が、血液試料である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
複数の時点でａ）〜ｄ）を繰り返すことによって、前記個体による前記病原体に対する前記免疫応答を一定期間監視することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第１の時点で前記個体から第１の抗体含有試料が収集され、後の第２の時点で前記個体から第２の抗体含有試料が収集され、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、前記病原体による前記感染が悪化していることを示し、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、前記病原体による感染が改善していることを示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原体による前記感染を治療するための療法の有効性を監視することをさらに含み、前記第１の抗体含有試料が、患者が前記療法を受ける前に前記個体から収集され、前記第２の抗体含有試料が、前記患者が前記療法を受けた後に前記個体から収集され、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、前記病原体による前記感染が悪化しているかまたは前記療法に対して応答しないことを示し、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、前記病原体による感染が改善していることを示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法において使用するための診断用病原体。
【請求項２８】
ライム病の個体を診断および治療する方法であって、
前記個体から少なくとも１つの抗体含有試料を収集することと、
前記個体由来の前記少なくとも１つの抗体含有試料を、複数のボレリア・ブルグドルフェリ病原体抗原を示す診断ベイトと接触させることと、
前記診断ベイトを、検出可能な部分に作用可能に連結されている１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬と接触させることと、
結合したアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬の存在について前記診断ベイトを分析して、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在および種類を決定することであって、前記存在および種類が、ボレリア・ブルグドルフェリ感染症、および前記ボレリア・ブルグドルフェリ病原体に対する免疫応答を示す、決定することと、
前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在が検出される場合に、前記ライム病の個体を診断することと、
前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在が検出された場合に、ライム病について前記個体を治療することであって、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出された場合に、抗ヒスタミン剤、抗ＩｇＥ剤または肥満細胞安定化剤のうちの１つ以上が前記個体に投与される、治療することと
を含む、方法。
【請求項２９】
前記抗ヒスタミン剤が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択されるヒスタミン受容体を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ヒスタミン剤が、シメチジン、ラニチジン、ベナドリル、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、ドキセピン、チオペラミド、およびクロベンプロピットからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出される場合、前記個体における肥満細胞を枯渇させることまたは安定化させることをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記肥満細胞が、抗ｃ−キット療法を投与することによって枯渇される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗ＣＤ４７療法を投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出される場合、前記個体におけるＩｇＥ産生Ｂ細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
抗ＩｇＥ療法が、ＩｇＥ遮断、または有益なエフェクター機能を有する異なるアイソタイプへのＩｇＥ特異的抗体の結合を含む、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記アイソタイプが、ＩｇＧである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３からなる群から選択される１つ以上のサイトカインのサイトカイン遮断によってＩｇＥ応答を減衰させることをさらに含む、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記診断ベイトが、診断用ボレリア・ブルグドルフェリ病原体である、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記診断用ボレリア・ブルグドルフェリ病原体が、フルオロフォアを発現するように遺伝子修飾される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記フルオロフォアが、蛍光タンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、およびこれらの類似体から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記診断用ボレリア・ブルグドルフェリ病原体が、ボレリア・ブルグドルフェリ臨床分離株または環境分離株である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記診断用ボレリア・ブルグドルフェリ病原体が、ボレリア・ブルグドルフェリ細胞株またはボレリア・ブルグドルフェリ細胞培養物由来である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
診断病原体が、さらに、病原体間で高度に保存されるタンパク質および他のエピトープの発現を排除するように遺伝子修飾される、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記エピトープが、細胞表面タンパク質上に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞表面タンパク質が、ボレリアのｆｌｉＨタンパク質またはｆｌｉＩタンパク質、またはこれらの組み合わせである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
診断病原体が、生病原体または固定病原体である、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記診断ベイトが、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体タンパク質またはペプチドエピトープを含む抗体アレイである、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記アイソタイプ特異的試薬が、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇ特異的グリコシル化部位（例えば、ＩｇＡ１−Ｇ２Ｓ１またはＩｇＧ４−Ｇ０Ｆ）のうちの１つを認識する抗体である、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
分析が、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、配列バーコード化抗体の配列決定またはＰＣＲ、および高次元／多パラメータ顕微鏡法から選択される方法によって実行される、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
複数の時点で繰り返すことによって、前記個体による前記ボレリア・ブルグドルフェリ病原体に対する前記免疫応答を一定期間監視することをさらに含む、請求項２８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
第１の時点で前記個体から第１の抗体含有試料が収集され、後の第２の時点で前記個体から第２の抗体含有試料が収集され、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、ライム病が悪化していることを示し、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、前記ライム病が改善していることを示す、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ライム病を治療するための療法の有効性を監視することをさらに含み、前記第１の抗体含有試料が、患者が前記療法を受ける前に前記個体から収集され、前記第２の抗体含有試料が、前記患者が前記療法を受けた後に前記個体から収集され、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、前記ライム病が悪化しているかまたは前記療法に対して応答しないことを示し、前記第１の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、前記第２の抗体含有試料中の前記１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、前記ライム病が改善していることを示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ライム病の個体を前記治療することが、抗生物質を投与することをさらに含む、請求項２８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項２８〜４７および４９〜５４のいずれか一項に記載の方法で使用するためのボレリア・ブルグドルフェリ診断病原体。
【請求項５６】
請求項５５に記載のボレリア・ブルグドルフェリ診断病原体と、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体を検出するための１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬とを含む、キット。
【請求項５７】
前記アイソタイプ特異的試薬が、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのＩｇＥ特異的試薬を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
抗ヒスタミン剤または抗ＩｇＥ治療剤をさらに含む、請求項５６または５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記抗ヒスタミン剤が、シメチジン、ラニチジン、ベナドリル、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、ドキセピン、チオペラミド、およびクロベンプロピットからなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
病原体感染症の臨床的検出は、感染した個体からの生体試料中の病原体の直接的検出または病原体特異的抗体の間接的検出のいずれかを必要とする。直接的な病原体試験で検出することが困難な感染症、例えば、病原体が非常に少ない数で存在するか、または試料組織に対しては困難である場合、病原体特異的抗体の検出は、診断試験のためのより信頼性が高い方法である。
【０００２】
病原体特異的抗体の検出のための従来の診断は、しばしば、病原体溶解物または特定の病原体タンパク質／ペプチドのいずれかを利用して病原体特異的抗体に結合し、それらを下流検出のために病原体または病原体タンパク質に複合体化する酵素結合免疫吸着アッセイまたはウェスタンブロットに依存する。しかしながら、これらの戦略には大きな制限がある。病原体溶解物の使用は、全クラスの病原体によって共有される高度に保存された内部タンパク質に対する抗体との非特異的相互作用を導入する。一方、１つの特定のタンパク質またはペプチドのみを使用することは、１つの特定の亜種に特異的な検出を行うことができて、その結果、多くの感染が見逃される。さらに、従来の免疫吸着アッセイは、病原体の表面上にあるように、それらの天然の立体構造にないタンパク質またはタンパク質のペプチドを示す。
【０００３】
さらに、病原体特異的抗体についての従来の間接試験は、典型的には、バルクＩｇＧ、またはＩｇＭおよびＩｇＧのみを測定し、他の主要アイソタイプ、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧを見逃す可能性があり、これらは、さらに複数のアロタイプを含有するサブクラスにさらにサブセットされ得る。例えば、アイソタイプＩｇＡは、アロタイプＩｇＡ２ｍ３を含有するサブタイプＩｇＡ２も含有する。異なるアロタイプおよびサブクラスは、免疫系によって異なる下流エフェクター機能を誘発し得る。
【０００４】
ライム病は、非常に少ない数で存在し得、組織から直接試料を採取することが困難なボレリア・ブルグドルフェリ細菌によって引き起こされる。したがって、ライム病は、感染者による抗体産生に基づく間接試験を必要とする。しかしながら、この目的のための現在の診断には欠点がある。ライム病に感染した後、現在の方法で検査を受けている人の半数超が、感染後最初の数週間の最も重要な早期治療期間中に検査結果が陰性になる（Ｂｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）を参照されたい）。
【０００５】
ボレリア感染を検出するための現在の診断方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または間接蛍光抗体のいずれかを必要とする２層プロトコルであり、その後（反応性の場合）免疫グロブリンＭおよび免疫グロブリンＧについてウェスタン免疫ブロットが続く。これらのアッセイは、重要な結合エピトープを維持することができず、細胞内タンパク質のディスプレイを通じて非特異性を不必要に導入する細菌溶解物を使用する。ウェスタン免疫ブロット成分は、早期感染における主観的解釈および低感度をさらに導入する。
【０００６】
非常に少ない数で存在するかまたは試料組織が困難である病原体の検出のための改善された方法については、臨床的に非常に関心が高い。これらの疾患をより深く理解し、標的治療薬の設計を可能にするためには、高感度かつ高精度の診断を開発および改善することが重要である。本発明は、これに対処する。
【０００７】
刊行物
Ｂｅｎａｃｈ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６．Ａｎ  ＩｇＥ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ  ｆｕｒ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２６３（１−２），ｐｐ．１２７−１３２．
【０００８】
Ｂｌｕｔｈ，Ｍ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００７．ＩｇＥ  Ａｎｔｉ−Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ｐ１８，ｐ３１，ｐ３４，ｐ４１，ｐ４５，ｐ６０）ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ８＋ＣＤ６０＋Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５（４），ｐｐ．３７６−３８２．
【０００９】
Ｂｒａｎｄａ，Ｊ．Ａｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｒｅ  ａｔ  Ｈａｎｄ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ＶＩＥＷＰＯＩＮＴＳ・ＣＩＤ，２０１８，ｐ．１１３３．
【００１０】
Ｉｒａｎｉ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６７（２），ｐｐ．１７１−１８２．
【００１１】
Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２０１７．ＩｇＥ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  α−Ｇａｌ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｙｍｅ  ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，１２（９），ｐ．ｅ０１８５７２３．
【発明の概要】
【００１２】
個体における感染に対する抗体応答の分析および感染性病原体の同定のための組成物および方法が提供される。本方法は、感染した個体における複数の病原体特異的抗体アイソタイプの同時分析を可能にする。本方法では、複数の病原体タンパク質／エピトープ（例えば、診断試験病原体または抗原アレイ）を示す診断ベイトを、血液試料およびその誘導体を含むが、これらに限定されない、個体由来の試料を含有する抗体と接触させる。診断ベイトは、結合していない抗体を含まずに洗浄され、１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的標識試薬で染色され、これらの試薬は、検出可能な部分、例えば、金属、比色法、フルオロフォア等に作用可能に結合される。したがって、標識された診断ベイトは、病原体特異的抗体のレベル、および抗体のアイソタイプ分布について分析される。本方法は、感染した個体由来の複数の病原体特異的抗体アイソタイプの同時分析を可能にする。病原体特異的抗体の同定および病原体に対する免疫応答の性質は、個体のための治療の適切な選択を可能にする。
【００１３】
一態様では、個体による病原体に対する免疫応答を特徴付ける方法が提供され、本方法は、ａ）個体から少なくとも１つの抗体含有試料を収集することと、ｂ）個体からの前記少なくとも１つの抗体含有試料を、複数の病原体タンパク質を示す診断ベイトと接触させることと、ｃ）診断ベイトを、試薬が検出可能な部分に作用可能に結合される、１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬と接触させることと、ｄ）結合したアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬の存在について診断ベイトを分析して、病原体特異的抗体の存在および種類を決定することとを含み、存在および種類が、病原体感染および免疫応答を示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、方法は、複数の時点でステップａ）〜ｄ）を繰り返すことによって、個体による病原体への免疫応答を一定期間監視することを含む。例えば、第１の抗体含有試料は、第１の時点で個体から収集され得、第２の抗体含有試料は、後の第２の時点で個体から収集され得、第１の試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出は、病原体による感染が悪化していることを示し、第１の試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの低下の検出は、病原体による感染が改善していることを示す。シリアルサンプリングは、経時的に病原体に対する免疫応答の違いを検出するために使用され得、これは、感染を示す変化を明らかにする。シリアルサンプリングは、個体における病原体レベルが最初に検出することが困難な非常に低いレベルにある場合に特に有用であり得、シリアルサンプリングは、試料が単一の時点でのみ収集される場合よりも、感染した個体を感染していない個体から区別することを容易にする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、方法は、病原体による感染を治療するための療法の有効性を監視することをさらに含み、第１の抗体含有試料が、患者が療法を受ける前に個体から収集され、第２の抗体含有試料が、患者が療法を受けた後に個体から収集され、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、病原体による感染が悪化しているかまたは療法に対して応答しないことを示し、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの減少の検出が、病原体による感染が改善していることを示す。
【００１６】
いくつかの実施形態では、診断ベイトは、診断病原体、例えば、無傷の病原体である。診断病原体は、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリなどのスピロヘータ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・フラバスなどの真菌病原体、トキソプラズマ・ゴンディ、熱帯熱マラリア原虫などの原生動物などを含む、細菌、真菌、および原虫などの細胞病原体であってもよい。診断病原体は、例えば、臨床分離株もしくは環境分離株であってもよく、または細胞株もしくは細胞培養株に由来してもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、診断病原体は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、およびＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ｍＹＦＰ、シトリン、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、セルリアン、ＥＢＦＰなどを含むそれらの類似体を含むが、これらに限定されないフルオロフォアを発現するように遺伝子修飾される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、診断病原体は、病原体間で高度に保存されているタンパク質および他のエピトープの発現を排除するためにさらに遺伝子修飾され、それによって、診断病原体への非特異的結合を低減する。いくつかの実施形態では、保存されたエピトープは、細胞表面タンパク質上に存在する。いくつかの実施形態では、エピトープは、病原体のクラス、例えば、鞭毛細菌間、スピロシャート間などで高度に保存されている細胞表面タンパク質の存在である。いくつかの実施形態では、高度に保存されたタンパク質は、ボレリアのｆｌｉＨタンパク質および／またはｆｌｉＩタンパク質を含むが、これらに限定されないフラゲラである。いくつかの実施形態では、診断病原体は、患者試料中の抗体に結合し、アイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬で標識した後、不活性化される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、診断ベイトは、病原体タンパク質またはペプチドエピトープを含む抗原アレイである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、標識された診断ベイト（例えば、検出可能な部分を含むアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬に結合した病原体タンパク質またはペプチドエピトープを含む病原体または抗原アレイ）は、複数のパラメータの同時分析を可能にする方法によって分析され、これらのパラメータは、診断病原体に結合した開存抗体、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥなどのアイソタイプ分布、診断病原体に結合した抗体のグリコシル化分布、抗体結合の全体レベルなどを含み得る。いくつかの実施形態では、分析は、フローサイトメトリーによって実行される。いくつかの実施形態では、分析は、マスサイトメトリーまたは顕微鏡法によって実行される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、産生される抗体の異なるサブタイプ間の比を同時に測定および比較する結果は、適切な治療レジメン、例えば、感染性病原体を治療するために適切な抗生物質の選択のために、感染性病原体を同定するために利用される。感染のステージはまた、アイソタイプ分布によって推測されてもよく、ＩｇＭクラス抗体と比較したＩｇＧサブクラス抗体の増加は、より進行した感染を示し、この段階は、適切な治療レジメンの選択のために利用されてもよく、例えば、追加の薬剤、抗炎症療法などが、より慢性的な感染状態に必要とされてもよい。感染剤および患者による免疫応答の評価は、改善されたケアを可能にし、応答性に従って分類される患者は、適切な薬剤で治療することができる。一実施形態では、本方法は、分析に基づいて対象の治療経過を決定することをさらに含む。
【００２２】
患者は、症状の初期提示時に分類され得、適切な療法を維持するために疾患の経過にわたる状態をさらに監視され得、または疾患進行の任意の適切なステージで分類され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、個体を治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、病原体特異的ＩｇＥの存在は、治療介入における区別を可能にし、病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出される場合、抗ＩｇＥ療法、肥満細胞安定剤、および抗ヒスタミン剤のうちの１つ以上が個体に投与される。いくつかの実施形態では、抗ヒスタミン剤は、Ｈ２拮抗薬である。
【００２３】
一実施形態では、本方法は、１つ以上のコンピュータに実装される。
【００２４】
一実施形態では、対象は、ヒト対象である。
【００２５】
一実施形態では、ワクチンに対する個体の免疫応答は、感染性病原体に対する保護応答を試験するように決定される。かかる実施形態では、ワクチン免疫原は、感染性病原体に対応する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ライム病の個体を診断する方法が提供され、本方法は、ａ）個体から少なくとも１つの抗体含有試料を収集することと、ｂ）個体からの前記少なくとも１つの抗体含有試料を、複数のボレリア・ブルグドルフェリ病原体抗原を示す診断ベイトと接触させることと、ｃ）診断ベイトを、検出可能な部分に作用可能に結合される１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬と接触させることと、ｄ）結合したアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬の存在について診断ベイトを分析して、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在および種類を決定することであって、存在および種類は、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体に対するボレリア・ブルグドルフェリ感染および免疫応答を示す、決定することと、ｅ）、１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在が検出された場合に、ライム病の個体を診断することとを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体の存在が検出される場合、ライム病について個体を治療することをさらに含む。ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的ＩｇＥの存在を同定することは、治療介入における区別を可能にする。いくつかの実施形態では、抗ＩｇＥ療法、肥満細胞安定剤、および抗ヒスタミン剤のうちの１つ以上が、病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出される場合に、個体に投与される。抗ヒスタミン剤は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される１つ以上のヒスタミン受容体を阻害し得る。いくつかの実施形態では、抗ヒスタミン剤は、Ｈ２アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、本方法は、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的ＩｇＥ抗体の存在が検出される場合、個体における肥満細胞を枯渇させることをさらに含む。肥満細胞は、例えば、抗ｃ−キット療法を単独で、または抗ＣＤ４７療法と組み合わせて投与することによって、枯渇され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体の存在が検出される場合、個体におけるＩｇＥ産生Ｂ細胞を枯渇させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＩｇＥ療法は、ＩｇＥ遮断、またはＩｇＥ特異的抗体の有益なエフェクター機能を有する異なるアイソタイプへの結合を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数の時点でステップａ）〜ｄ）を繰り返すことによって、個体によるボレリア・ブルグドルフェリ病原体に対する免疫応答を一定期間監視することをさらに含む。例えば、第１の抗体含有試料は、第１の時点で個体から収集され得、第２の抗体含有試料は、後の第２の時点で個体から収集され得、第１の試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体による感染が悪化していることを示し、第１の試料中の１つ以上のボレリアブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体による感染が改善されていることを示す。いくつかの実施形態では、本方法は、ライム病を治療するための療法の有効性を監視することをさらに含み、第１の抗体含有試料は、患者が療法を受ける前に個体から収集され、第２の抗体含有試料は、患者が療法を受けた後に個体から収集され、第１の抗体含有試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの増加の検出が、ライム病が悪化しているかまたは治療に対して応答しないことを示し、第１の抗体含有試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体のレベルの低下の検出が、ライム病が改善していることを示す。
【００２９】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するために、ボレリア・ブルグドルフェリ診断病原体が提供される。
【００３０】
別の実施形態では、ボレリア・ブルグドルフェリ診断病原体、およびボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体を検出するための１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのＩｇＥ特異的試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、抗ヒスタミン剤、肥満細胞安定剤、または抗ＩｇＥ治療剤のうちの１つ以上をさらに含む。
【００３１】
本発明は、添付の図面と併せて読む場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な実施によれば、図面の様々な特徴は、縮尺通りでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】診断用免疫吸着アッセイの概略図を示す。ＧＦＰ（Ｂｂ−ＧＦＰ）を発現するように遺伝子修飾されたボレリア・ブルグドルフェリを、感染宿主または未感染宿主由来の血清とともにインキュベートする。次いで、これらのＢｂ特異的抗体を、蛍光標識アイソタイプ特異的二次抗体のパネルでプローブする。次いで、細菌死滅（ＧＦＰの損失）、凝集体形成のサイズ、およびスピロヘータへの様々な抗体結合のレベルについてフローサイトメトリーによって、これらのＢｂを評価する。
【図２Ａ】ボレリア特異的免疫応答、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかの代表的な分析を表し、炎症ピーク時の足首腫脹を示す。
【図２Ｂ】ボレリア特異的免疫応答、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかの代表的な分析を表し、ボレリア特異的抗体の力価を示す。
【図２Ｃ】ボレリア特異的免疫応答、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかの代表的な分析を表し、抗体力価対足首腫脹のグラフを示す。
【図２Ｄ】ボレリア特異的免疫応答、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかの代表的な分析を表し、ＩｇＧ２ａの結合のための血清源の比較を示す。
【図２Ｅ】ボレリア特異的免疫応答、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかの代表的な分析を表し、ＩｇＥの結合のための血清源の比較を示す。
【図３Ａ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染後２週間にわたる抗体力価の変化を示す。
【図３Ｂ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染２週間後のＩｇＧ１分析を示す。
【図３Ｃ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染２週間後のＩｇＧ２ａ分析を示す。
【図３Ｄ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染２週間後のＩｇＭ分析を示す。
【図３Ｅ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染２週間後のＩｇＥ分析を示す。
【図３Ｆ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、感染２週間後にＦＡＣＳ分析により評価したときに、血清が細菌凝集を誘発したことを示す。
【図３Ｇ】感染に対する抗体応答の時間経過分析を表し、Ｂｂ−ＧＦＰのサイズのＦＡＣＳ分析を示す。
【図４Ａ】Ｂｂ感染に対するＩｇＥ抗体応答が、Ｃ３Ｈマウスでは感染後７日間検出可能であるが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは検出不可能であることを表す。１０５個または１０６個のＢｂ−ＧＦＰに感染したＣ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの結果を示す。感染７日後に血清を収集した。図１に記載されるように、診断用免疫アッセイを実行した。
【図４Ｂ】Ｂｂ感染に対するＩｇＥ抗体応答が、Ｃ３Ｈマウスでは感染後７日間検出可能であるが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは検出不可能であることを表す。感染１週間後に結合したＩｇＥの割合を示す。ＩｇＥはＣ３Ｈマウスで検出されたが、この時点ではＣ５７Ｂｌ／６マウスでは検出されなかった。
【図５】Ｈ２ヒスタミン受容体拮抗薬であるシメチジンでの抗ヒスタミン剤治療が、足首腫脹およびＩｇＥ結合を低減することを示す。１０５個のＢｂ−ＧＦによる感染の２週間後、感染マウスに、その飲料水中に２ｍｇ／ｍＬのシメチジンを与えた。４９日目のＰＩ（右側）でピークの足首腫脹を測定し、感染６週間後に診断免疫アッセイを実行した。異なる条件にわたるＢｂに対するＩｇＥ結合レベルを左側に示す。
【図６Ａ】培養Ｂｂが感染動物由来の血清に曝露され、Ｂｂの殺菌抗体死滅と区別可能であるときに、抗体およびＢｂ免疫複合体が形成されることを示す。培養したＢｂ−ＧＦＰを、図１に示される未感染または感染動物由来の血清とともにインキュベートした。サイズと比較してＧＦＰの蛍光を調べることによって（フォワードスキャッターＦＳＣ）、単一スピロヘータ、クランプ、および抗体誘導Ｂｂ免疫複合体（「スーパークランプ」と表される）、ならびにどの細菌が依然としてＧＦＰを発現するかまたはもはや発現しないかを区別することが可能である。未感染であるか、または指示された時間にわたって感染しているマウス由来の１０μｌの血清の有無にかかわらず、ＢＳＫ−Ｈ培地中で６％ウサギ血清（Ｓｉｇｍａ）とともに一晩インキュベートした１０６／１００μｌのＢｂを示す。代表的な顕微鏡観察が、Ｂｂ−ＧＦＰ、ＩｇＥ、およびＩｇＭで示されている。
【図６Ｂ】培養Ｂｂが感染動物由来の血清に曝露され、Ｂｂの殺菌抗体死滅と区別可能であるときに、抗体およびＢｂ免疫複合体が形成されることを示す。培養したＢｂ−ＧＦＰを、図１に示される未感染または感染動物由来の血清とともにインキュベートした。サイズと比較してＧＦＰの蛍光を調べることによって（フォワードスキャッターＦＳＣ）、単一スピロヘータ、クランプ、および抗体誘導Ｂｂ免疫複合体（「スーパークランプ」と表される）、ならびにどの細菌が依然としてＧＦＰを発現するかまたはもはや発現しないかを区別することが可能である。死んだ細菌（ＧＦＰ陰性）のグラフを示す。
【図６Ｃ】培養Ｂｂが感染動物由来の血清に曝露され、Ｂｂの殺菌抗体死滅と区別可能であるときに、抗体およびＢｂ免疫複合体が形成されることを示す。培養したＢｂ−ＧＦＰを、図１に示される未感染または感染動物由来の血清とともにインキュベートした。サイズと比較してＧＦＰの蛍光を調べることによって（フォワードスキャッターＦＳＣ）、単一スピロヘータ、クランプ、および抗体誘導Ｂｂ免疫複合体（「スーパークランプ」と表される）、ならびにどの細菌が依然としてＧＦＰを発現するかまたはもはや発現しないかを区別することが可能である。超細菌凝集塊（Ｂｂ免疫複合体）を示す。
【図７Ａ】マラリア（プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（Ｐｂ−Ａ））感染赤血球と比較して、示されるタイプの未感染赤血球への抗体結合の分析を表す。
【図７Ｂ】マラリア（プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（Ｐｂ−Ａ））感染赤血球と比較して、示されるタイプの未感染赤血球への抗体結合の分析を表す。
【図７Ｃ】マラリア（プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（Ｐｂ−Ａ））感染赤血球と比較して、示されるタイプの未感染赤血球への抗体結合の分析を表す。
【図７Ｄ】マラリア（プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（Ｐｂ−Ａ））感染赤血球と比較して、示されるタイプの未感染赤血球への抗体結合の分析を表す。
【図８Ａ】アスペルギルス・フミガーツス感染マウス由来の血清により示されるタイプの抗体結合の分析を表す。
【図８Ｂ】アスペルギルス・フミガーツス感染マウス由来の血清により示されるタイプの抗体結合の分析を表す。
【図８Ｃ】アスペルギルス・フミガーツス感染マウス由来の血清により示されるタイプの抗体結合の分析を表す。
【図８Ｄ】アスペルギルス・フミガーツス感染マウス由来の血清により示されるタイプの抗体結合の分析を表す。
【図９】ＨＡタグ付けされた組換えボレリアタンパク質（ｐ６６、ｐ１６ｓ、およびＯｓｐＡ）を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定化し、次いでボレリア・ブルグドルフェリによる感染２８日後のマウス由来の血清とインキュベートし、次いで結合した抗体アイソタイプおよびサブタイプについてプローブした。ＩｇＥに対するＩｇＧ１が、各タンパク質タイプについて示されている。ＯｓｐＡは、ＩｇＥ結合および低ＩｇＧ１結合を示さず、一方、ｐ６６およびｐ１６ｓはともに、効率的なＩｇＧ１結合およびＩｇＥ結合を有し、二次抗体プロファイリングが、ビーズまたはチップタンパク質またはペプチドアレイ上でも行われ得ることを示した。
【図１０】Ｂｂ感染に対するＩｇＥ特異的抗体応答は、Ｃ３Ｈマウスでは感染７日後に検出可能であるが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは検出不可能である。Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを１０５Ｂｂ−ＧＦＰで腹腔内（ＩＰ）に感染させ、感染後の示された時点で血清を収集した。図１に示されるように診断用免疫アッセイを実行し、ＩｇＥおよびＩｇＧ２ａのレベルを示す。
【図１１】肥満細胞脱顆粒は、腫脹を悪化させる。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを１０５Ｂｂ−ＧＦＰで腹腔内（ＩＰ）に感染させ、感染経過にわたって脛骨関節腫脹を測定した。感染２４日後に、肥満細胞脱顆粒またはアイソタイプ対照抗体を誘発するｃＫＩＴに対する抗体を後眼窩でマウスに注射した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書の説明からより明らかになる。本教示は様々な実施形態と併せて説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、修正、および等価物を包含する。
【００３４】
本明細書で使用される単語のほとんどは、当業者によってそれらの単語に帰属する意味を有する。本明細書において具体的に定義される単語は、本教示全体の文脈において提供され、当業者によって典型的に理解される意味を有する。単語または語句の技術分野で理解される定義と本明細書で具体的に教示される単語または語句の定義との間に矛盾が生じる場合、本明細書が優先するものとする。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００３６】
本発明は、説明される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されるものではなく、それら自体は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。
【００３７】
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
病原体。本明細書で使用される場合、この用語は、宿主動物において複製され、それによって疾患を引き起こす感染性生物、例えば、細菌、真菌、原虫、ウイルスなどを指す。いくつかの実施形態では、病原体は、細胞病原体であり、すなわち、ウイルス、例えば、細菌、単細胞真菌、原生動物など以外である。
【００３９】
病原体種は、細菌、ウイルス、原生動物寄生虫、真菌種などであり得る。細菌としては、ボレリア属、ブルセラ属、トレポネマ属、マイコバクテリウム属、リステリア属、レジオネラ属、ヘリコバクター属、ストレプトコッカス属、ナイセリア属、クロストリジウム属、スタフィロコックス属、またはバシラス属が挙げられ、トレポネーマ・パリズム、結核菌、マイコバクテリウム・レプラエ、リステリア・モノサイトゲネス、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎レンサ球菌、髄膜炎菌、クロストリジウム・ノービ、ボツリヌス菌、スタフィロコッカス・アウレウス、炭疽菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
寄生虫病原体としては、トリコモナス、トキソプラズマ、ジアルディア、クリプトスポリジウム、プラスモジウム、リーシュマニア、トリパノソーマ、エンタモエバ、住血吸虫、フィラリア、アスカリア、ファシオラが挙げられ、腟トリコモナス、トキソプラズマ原虫、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム・パルバ、熱帯熱マラリア原虫、クルーズトリパノソーマ、赤痢アメーバ、ジアルディア・ランブリア、肝蛭などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
病原体は、ヒトにおいて、または非ヒト哺乳動物および鳥類、例えば、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、ペット、例えば、イヌ、ネコ、鳥、実験動物、例えば、マウス、ラット、げっ歯類、非ヒト霊長類などにおいて感染性であり得る。感染症は、局所的または全身的、例えば、皮膚、経口腔、消化管、聴覚などであり得る。
【００４２】
スピロヘータは、独特のディダーム（二重膜）細菌を含有するスピロヘータ門のメンバーであり、その大部分は、長い螺旋状のコイル状細胞を有する。スピロヘータは、その鞭毛の位置によって他の細菌性フィラと区別され、軸状フィラメントと呼ばれることもあり、周辺質空間における細菌内膜と外膜との間で長手方向に延在する。これらはねじれ運動を引き起こし、スピロヘータが動き回ることを可能にする。
【００４３】
スピロヘータ門内の多くの生物は、流行性疾患を引き起こす。この門の病原性メンバーには、ライム病を引き起こすレプトスピラ種、ボレリア・ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、およびＢ．アフゼリ、回帰熱を引き起こす回帰熱ボレリア、およびＢ．ヘムシー、梅毒およびイチゴ腫を引き起こす梅毒トレポネ−マ、腸管スピロヘータ症を引き起こすブラキスピラ・ピロシコリおよびブラキスピラ・アアルボルギが含まれる。
【００４４】
ダニ媒介性疾患。いくつかの実施形態では、本方法は、個々の試料を、ダニ媒介性寄生虫による感染の証拠について分析する。かかる疾患および寄生虫には、アナプラズマ症（ＨＧＡ）：アナプラズマファゴサイトフィラム細菌、ダニ媒介性回帰熱：ボレリア・ヘルムシー、Ｂ．ツリカタエ、またはＢ．ｐａｒｋｅｒｉｉ、コロラドダニ熱：コルチウイルス、ポワッサン脳炎：ポワッサンウイルス、バベシア症：バベシア寄生虫、ロッキー山熱：リケッチア・リケッチイ、エーリキア症（ＨＭＥ）：エーリキア・シャフェンシス、Ｅ．エウィンギー、またはＥ．ｍｕｒｉｓ  ｅａｕｃｌａｉｒｅｎｓｉｓが含まれる。かかる実施形態では、各診断病原体は、一意に標識され得、分析は、診断病原体のカクテル上で同時に実行され得る。
【００４５】
ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトは、スピロヘータ科のボレリア属に属するスピロヘータのグループである。スピロヘータは、保有宿主間で、マダニ科のダニによって媒介される。ヒトにおけるＢ．ブルグドルフェリの感染は、ライム病、またはライムボレリア症を引き起こす可能性があり、これは、北米およびヨーロッパで最も一般的なベクター媒介性疾患である。ボレリア属としては４０種超が記載されている。これらには、Ｂ．ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体内の２０種のボレリア種と、回帰熱に関連する２０種超のボレリア種が含まれる。ボレリア属は、原核生物間に特有である特定の遺伝的および表現型特徴を有する。ボレリア細胞は、０．２〜０．５μｍ×１０〜３０μｍの寸法を有する螺旋状であり、すべてのスピロヘータに共通の表現型特徴に基づいて、それらを他の真正細菌と容易に区別することを可能にする。ボレリアはまた、細胞コイルの波長、末端フックの有無、細胞極の形状、およびペリプラズム鞭毛の数を含む、形態学的形質に基づいて、トレポネ−マおよびレプトスピアなどの他の病原性スピロヘータから分化され得る。しかしながら、ボレリア属内の異なる種を表現型的に区別することはほぼ不可能である。したがって、異なるボレリア種および株の同定および分化は、それらの遺伝的特徴の分析または血清学に大きく依存する。
【００４６】
名前付きボレリア種のうちの５つは、ヒト患者において定期的に発見される。ヒトライム病のこれらの原因物質は、北米およびヨーロッパにおけるＢ．ブルグドルフェリ・センスストリクト、ヨーロッパおよびアジアにおけるＢ．ガリニ、Ｂ．ババリエンシス、Ｂ．アフゼリ、ならびにヨーロッパにおけるＢ．スピールマニイである。種内の種および株を正確に特徴付ける本明細書に提供されるものなどのタイピングシステムは、疫学的、臨床的、および進化学的研究にとって重要である。
【００４７】
ライム病。ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリによって引き起こされるダニ媒介性感染症である。初期症状としては、数週間〜数ヶ月後に神経学的、心臓的、または関節の異常が続く場合がある遊走性紅斑発疹が挙げられる。診断は主に初期ステージ疾患における臨床的なものであるが、本明細書に記載される方法による血清学的検査は、疾患の後半に生じる心臓、神経、およびリウマチ合併症を診断するために役立ち得る。治療は、ドキシサイクリンまたはセフトリアキソンなどの抗生物質で行われ、疾患の後期ステージにおける追加の薬剤を伴い得る。
【００４８】
ライム病は、世界中で主に４種のマダニ種：米国北東部および北中部におけるクロアシマダニ（シカダニ）、米国西部におけるＩ．パシフィカス、ヨーロッパにおけるＩ．リシヌス、アジアにおけるシュルツェマダニによって感染される。Ｂ．ブルグドルフェリは、ダニに咬まれた部位で皮膚に入る。３〜３２日後、生物は咬まれた周囲の皮膚内で局所的に移動し、リンパ管を介して広がって局所的リンパ節腫大を引き起こすか、または臓器または他の皮膚部位まで血液中を播種する。最初は、感染に対する有意な抗体応答（血清学的転換）の前に炎症反応（遊走性紅斑）が生じる。
【００４９】
ライム病には、初期ローカライズ、初期播種、および後期という３つのステージがある。初期ステージおよび後期ステージは、通常、無症候性間隔で分離される。ライム病の特徴であり、最良の臨床指標である遊走性紅斑（ＥＭ）は、疾患の最初の徴候である。これは、少なくとも７５％の患者で発生し、通常、ダニ咬傷の３〜３２日後に、四肢または胴体（特に太もも、お尻、または腋窩）の近位部分で、ダニ咬傷の部位において赤い斑点または丘疹として始まる。この領域は、多くの場合、雄牛の眼に似た中心と周囲との間の隙間を直径約５０ｃｍに拡大する。この中央部に黒ずんだ紅斑が生じる場合があり、これは触ると熱くなり、硬結する場合がある。治療なしでは、ＥＭは通常３〜４週間以内に治る。
【００５０】
初期に播種した疾患の症状は、細菌が体内に広がったときに、原発病変の出現の数日または数週間後に始まる。発症後間もなく、未治療の患者のほぼ半数が硬結中心なしで複数の、通常は小さな環状二次皮膚病変を発症する。これらの二次病変の生検試料の培養は陽性であり、感染の拡散を示す。患者はまた、数週間続く可能性がある不調、疲労、悪寒、発熱、頭痛、首の凝り、筋肉痛、および関節痛からなる筋骨格性インフルエンザ様症候群を発症する。症状は非特異的であることが多いため、ＥＭが存在しない場合、診断が外れることが多い。症状は特徴的に断続的で変化しているが、不調および疲労が数週間続く場合がある。線維筋痛の症状を発症する患者もいる。解消された皮膚病変は、後期疾患において、時には関節炎の再発性発作の前に、かすかに再発する場合がある。
【００５１】
神経学的異常は、ＥＭから数週間〜数ヶ月間以内（一般に関節炎が発生する前）に約１５％の患者で発症し、一般に数ヶ月間持続し、通常は完全に回復する。最も一般的なのは、単独で、または組み合わせて、リンパ球性髄膜炎または髄膜脳炎、頭蓋神経炎、および感覚神経または運動神経根障害である。心筋異常は、ＥＭから数週間以内に約８％の患者で生じる。これらには、心房ブロック（第１度、ウェンケバッハ、または第３度）の変動度、およびまれに胸痛を伴う筋膜炎、駆出率の減少、および心臓腫大が含まれる。
【００５２】
未治療のライム病では、初期感染から数ヶ月〜数年後に後期が始まる。関節炎は、（ＥＭによって規定される）疾患発症から数ヶ月以内、場合によっては最大２年以内に約６０％の患者で発症する。いくつかの大きな関節、特に膝における断続的な腫れと痛みとが、典型的には数年間再発する。患部の膝は通常、痛みがあるよりもはるかに腫れることが多く、しばしば熱をもち、まれに赤くなる。ベーカー嚢胞が形成され、破裂する場合がある。不整脈、疲労、および微熱は、関節炎発作前にあるまたはそれらに伴う場合がある。約１０％の患者では、膝関与は慢性的である。他の後期所見（発症から数年後に生じる）には、抗生物質感受性皮膚病変（慢性萎縮性肢端皮膚炎）および慢性ＣＮＳ異常、多発性神経障害または気分、記憶、および睡眠障害を伴う微妙な脳症のいずれかが含まれる。
【００５３】
治療代替物は、疾患のステージによって変化し得るが、典型的には、アモキシシリン、ドキシサイクリン、およびセフトリアキソンを含む。後期疾患では、抗生物質は細菌を根絶し、ほとんどの人の関節炎を緩和する。しかしながら、個体は、継続的な炎症のために感染が排除された後であっても持続性関節炎を有し得、抗炎症剤でさらに治療され得る。
【００５４】
ボレリア・ブルグドルフェリ特異的ＩｇＥ抗体が検出される個体には、抗ＩｇＥ療法、肥満細胞安定剤、または限定されないが、シメチジン、ラニチジン、ベナドリル、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、ドキセピン、チオペラミド、およびクロベンプロピットなどの抗ヒスタミン剤が投与され得る。治療はまた、ボレリア・ブルグドルフェリ特異的ＩｇＥ抗体のレベルの上昇を有する個体における肥満細胞の枯渇を含み得る。肥満細胞は、例えば、抗ｃ−キット療法を単独で、または抗ＣＤ４７療法と組み合わせて投与することによって、枯渇され得る。
【００５５】
「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を具体的に包含する。抗体は、感染した個体に存在する病原体特異的血清抗体を指してもよく、アイソタイプまたはグリコシル化特異的標識剤としての使用も見出され得る。
【００５６】
「天然抗体および免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、定期的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端部に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる（Ｃｌｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００５７】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基を添加することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた、既知である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」、およびそのすべての文法的変異形は、インタクト抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクト抗体の一部として定義され、その部分は、インタクト抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない。
【００５９】
「分離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、ならびに他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の７５重量％超、最も好ましくは８０重量％超、９０重量％もしくは９９重量％超、または（２）クマシーブルー、または好ましくは銀染色を使用して、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製される。分離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュ抗体を含む。しかしながら、通常、分離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６０】
肥満細胞安定化薬は、肥満細胞からのアレルギー媒介物の放出を阻害し、例えば、アレルギー反応を防止するために臨床的に使用される。肥満細胞は、アレルギー反応を誘発する物質に対する過敏反応、例えば、ヒスタミンなどの予め形成された化学調節物質の放出、ＰＧおよびＬＴなどの脂質調節物質の合成、サイトカインおよびケモカインの産生などのために、アレルギー疾患において役割を有する。肥満細胞安定剤は、望ましくない肥満細胞活性化を低減するために、従来の投薬量で使用され得る。
【００６１】
最も一般的に使用される肥満細胞安定剤は、ＩｇＥ依存性肥満細胞活性化を阻害するクロモグリセート二ナトリウムである。天然生成物マスト安定剤としては、例えば、ルテオリン、ジオスメチン、クエルセチン、フィセチン、カエンフェロール、ギンクゲチン、シリマリン、スコプレチン、スカポロン、アルテケイスケアノール、セリニジン、シナミ酸、エラギン酸、マグノロールおよびホノキオール、レスベラトロール、ポリダチン、クルクミン、マンゴスチン−α、−βおよび−γ、パルテノライド、セスキテルペンラクトン、モノテルペン、シノメニン、インドリン、エストスポンジン、テアニンなどが挙げられ、生物学的阻害剤としては、例えば、補体由来ペプチドＣ３ａ、およびそれに由来するＣ３ａ９ペプチドも挙げられる。他の抗アレルギーペプチド、例えば、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼの抗原刺激放出を阻害したＬＶＡ、ＬＳＹ、ＲＶＳ、ＥＴＩ、ＴＤＧ、ＲＶＶ、およびＧＦＷが同定されている。
【００６２】
合成および半合成肥満細胞安定化剤は、当該技術分野においても知られている。例えば、インダノンセスキテルペンが修飾されており、インダノン、プテロシンＺを含む。合成安定剤としては、例えば、化合物１３、Ｒ１１２、ＥＲ−２７３１７、Ｕ６３Ａ０５、ＷＨＩ−１３１、ヒポテマイシン、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ＣＰ９９９９４、Ｋ１、Ｒｏ  ２０−１７２４、ロリプラムおよびシグアゾダン、フラーレン、バキュオリン−１、ＣＭＴ−３、ＯＲ−１３８４、ＯＲ−１９５８、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ブロモエノールラクトン（ＢＥＬ）、セリバスタチン、アトルバスタチンおよびフルバスタチン、ニロチニブなどが挙げられる。
【００６３】
抗ヒスタミン剤という用語は、その通常の使用、すなわち、体内のヒスタミン受容体の活性に対抗する薬物のクラスが与えられ、これらは、それらが作用するヒスタミン受容体に従って下位分類される。抗ヒスタミン剤の２つの最大クラスは、Ｈ１−抗ヒスタミン剤およびＨ２−抗ヒスタミン剤である。Ｈ１−抗ヒスタミン剤は、肥満細胞、平滑筋、および体内の内皮ならびに脳の結節乳頭核中のヒスタミンＨ１受容体に結合することによって作用する。Ｈ２−抗ヒスタミン剤は、主に胃の上部消化管中のヒスタミンＨ２受容体に結合する。
【００６４】
Ｈ１−抗ヒスタミン剤の大部分は、受容体拮抗薬である。臨床的に、Ｈ１−抗ヒスタミン剤を使用して、アレルギー反応および肥満細胞関連障害を治療する。Ｈ１拮抗薬の例としては、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロモジフェンヒドラミン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、カルビノキサミン、セチリジン、クロロジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シクリジン、シプロヘプタジン、デスロラタジン（Ａｅｒｉｕｓ）、デクスブロンフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、エバスチン、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボカバスチン、レボセチリジン、ロラタジン、メクリジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、トリプロリジンなどが挙げられる。
【００６５】
インバースＨ１アゴニストとしては、例えば、レボセチリジン、デスロラタジン、ピリラミンなどが挙げられる。
【００６６】
Ｈ２−抗ヒスタミン剤としては、例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン、ロキサチジン、チオチジンなどが挙げられる。
【００６７】
特に反対に示されていない限り、本明細書に記載されるおよび特許請求の範囲に記載される「コンジュゲート」という用語は、１つ以上の抗体断片（複数可）の１つ以上の検出可能な部分への共有結合によって形成される異種分子として定義される。
【００６８】
「適切な条件」は、この用語が使用される文脈に依存する意味を有するものとする。すなわち、抗体と関連して使用される場合、この用語は、抗体がその対応する抗原に結合することを可能にする条件を意味するものとする。薬剤と細胞との接触に関連して使用される場合、この用語は、そうすることが可能な薬剤が細胞に入り、意図された機能を実行することを可能にする条件を意味する。一実施形態では、本明細書で使用される「好適な状態」という用語は、生理学的状態を意味する。
【００６９】
本教示の文脈における「対象」または「患者」は、概して、哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物は、炎症の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、雄または雌であり得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「検出可能な部分」、「検出剤」、および「検出可能な標識」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、蛍光剤、化学発光剤、発色団、生物発光タンパク質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、同位体標識、半導体ナノ粒子、染料、金属イオン、金属溶剤、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などを含む、検出可能な分子または物質を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲内で蛍光を示すことができる物質またはその一部を指す。本発明の実施において使用され得る標識の具体的な例としては、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｏｉｓ２）などの蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および誘導体（ＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ｄｓＲｅｄ、ｅｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰｓ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ／ＩｒｉｓＦＰ、およびＤｅｎｄｒａなどの蛍光タンパク質、限定されないが、ＳＹＢＲ緑色およびＳＹＢＲ金色などのＳＹＢＲ色素、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、およびＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５などのＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、およびＱｕａｓａｒ  ７０５などのＱｕａｓａｒ色素、Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７８４などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７などのシアニン色素、フルオレセイン、２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４−７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＦＩＴＣ、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ルミノール、および量子ドットなどを含む、蛍光色素、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ，Ｇ４１８ｒ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータグルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、および分��型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）などの酵素が挙げられる。酵素タグは、それらの同族基質とともに使用される。この用語にはまた、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステルなどの化学発光標識、ならびにホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、およびエアコリンなどのペルオキシオキサレートおよび生物発光タンパク質が含まれる。この用語にはまた、３Ｈ、２Ｈ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、３２Ｐ、１５Ｎ、１３Ｎ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、および８３Ｓｒなどの放射性および非放射性同位体も含む同位体標識が含まれる。この用語にはまた、既知の蛍光灯強度の色分けされた微粒子（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によって製造されたｘＭＡＰ技術による微粒子を参照されたい）、例えば、量子ドット色（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により製造されるＱｄｏｔナノ結晶）の異なる比率および組み合わせを含有する量子ドットナノ結晶を含有する微粒子、ガラスコーティングされた金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により製造されるＳＥＲＳナノタグを参照されたい）、バーコード材料（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により製造されるナノバーコードなどのサブミクロンサイズの縞状金属ロッドを参照されたい）、着色されたバーコードを有するコード化された微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ  により製造されるＣｅｌｌＣａｒｄ、デジタルホログラフィックコード画像を有するガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により製造されるマイクロビーズ、近赤外線（ＮＩＲ）プローブ、およびナノシェルが含まれる。
【００７１】
「分析する」ことには、試料中のマーカー（例えば、抗体アイソタイプの有無など）の測定によって試料と関連付けられた値のセットを決定することと、測定値を、同じ対象または他の対照対象（複数可）からの試料または試料のセットにおける測定値と比較することとが含まれ得る。本教示のマーカーは、当該技術分野で既知の様々な従来の方法のいずれかによって分析することができる。「分析する」ことには、例えば、対象が関心対象の病原体に感染しているか否か、感染の段階などを決定するために統計分析を実行することが含まれ得る。
【００７２】
本教示の文脈における「試料」は、対象から分離される任意の生体試料を指す。試料には、単一の細胞または複数の細胞、細胞の断片、体液のアリコート、全血、血小板、血清、血漿、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、内皮細胞、組織生検、滑液、リンパ液、腹水、ならびに間質性または細胞外流体を含み得るが、これらに限定されない。「試料」という用語はまた、歯肉溝滲出液、骨髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿、または任意の他の体液を含む、細胞間の空間中の流体を包含する。
【００７３】
「血液試料」は、血液細胞、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、血小板、血清および血漿を含む、全血またはその任意の画分を指し得る。試料は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引液、洗浄、スクラッピング、外科的切開、または介入、または当該技術分野において既知の他の手段を含むが、これらに限定されない、手段によって、対象から得ることができる。
【００７４】
「データセット」は、所望の条件下での試料（または試料の集団）の評価した結果として得られる数値のセットである。データセットの値は、例えば、試料から測定値を実験的に取得し、これらの測定値からデータセットを構築することによって、または代替的に、実験室などのサービスプロバイダから、またはデータセットが格納されているデータベースもしくはサーバからデータセットを取得することによって、得ることができる。同様に、「試料と関連付けられたデータセットを取得すること」という用語は、少なくとも１つの試料から決定されるデータのセットを取得することを包含する。データセットを取得することは、試料を取得すること、および試料を処理して、例えば、本明細書に記載の方法による測定を介して、データを実験的に決定することを包含する。この語句はまた、例えば、試料を処理してデータセットを実験的に決定した第三者から、一連のデータを受信することを包含する。加えて、この語句は、少なくとも１つのデータベースまたは少なくとも１つの刊行物、またはデータベースおよび刊行物の組み合わせからのデータをマイニングすることを包含する。
【００７５】
本教示の文脈における「測定すること」または「測定」は、臨床試料または対象由来試料中の物質、典型的には病原体特異的抗体の存在、不在、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）、または有効量（そのような物質の存在、不在、濃度レベルを含む）決定すること、および／または対照に基づいて対象の臨床パラメータの値または分類を評価することを指す。
【００７６】
分類は、試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデリング方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％以上である。分類はまた、取得されたデータセットと参照データセットとの間の比較が統計的に有意な差を生じるか否かを判定することによって行うことができる。そうである場合、データセットが取得された試料は、参照データセットクラスに属しないものとして分類される。逆に、そのような比較によって参照データセットと統計的に有意に異なる場合、データセットが得られた試料は、参照データセットクラスに属するものとして、すなわち、感染が存在するか否か、感染の段階などで、分類される。
【００７７】
予測能力は、特定の値、または値の範囲の品質メトリック、例えば、ＡＵＣまたは精度を提供するその能力に従って評価され得る。いくつかの実施形態では、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、またはそれ以上の精度で試料を分類する予測モデルである。代替の尺度として、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれ以上のＡＵＣ（曲線下の面積）を有する試料を分類する予測モデルを指し得る。
【００７８】
当該技術分野で既知であるように、予測モデルの相対感度および特異性は、選択性メトリックまたは感度メトリックのいずれかを有利にするように「調整される」ことができ、２つのメトリックは逆の関係を有する。上述のモデルにおける制限は、実行される試験の特定の要件に応じて、選択された感度または特異性レベルを提供するように調整され得る。感度および特異性の一方または両方は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれ以上であり得る。
【００７９】
文脈から別段明らかでない限り、本発明のすべての要素、ステップまたは特徴は、他の要素、ステップまたは特徴との任意の組み合わせで使用され得る。
【００８０】
分子および細胞生化学における一般的な方法は、分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｏｋ  ｅｔ    ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、ならびに細胞および組織培養：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）の標準的なデキストブックに見出され得る。本開示に言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商業ベンダーから入手可能である。
【００８１】
本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、または提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正および変更を行うことができることを理解されたい。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変化を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【００８２】
主題の方法は、診断または治療目的で使用される。本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、再発の予防、および既存の状態の治療の両方を指すために使用される。例えば、感染の結果である炎症性疾患の予防は、感染の早い段階で、すなわち、高感度方法で薬剤を投与することによって達成され得る。治療が患者の臨床症状を安定化または改善する進行中の疾患の治療は、特に関心対象である。
【００８３】
方法
感染に対する抗体応答の分析および個体における感染性病原体の同定のための方法が提供される。本方法は、複数の病原体特異的抗体アイソタイプの同時分析を可能にする。本方法において、複数の病原体抗原／エピトープ、または無傷の病原体を示す診断ベイトは、血液試料およびその誘導体を含むが、これらに限定されない、個体由来の試料を含有する抗体と接触させる。診断ベイトは、結合していない抗体を含まずに洗浄され、１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的標識試薬で染色され、これらの試薬は、検出可能な部分、例えば、金属、比色法、フルオロフォアなどに作用可能に結合される。したがって、標識された診断ベイトは、病原体特異的抗体のレベルおよび抗体のアイソタイプ分布について分析される。病原体特異的抗体の同定および病原体に対する免疫応答の性質は、個体のための療法の適切な選択を可能にする。
【００８４】
いくつかの実施形態では、診断ベイトは、無傷の生病原体（すなわち、診断病原体）である。診断病原体は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、およびＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ｍＹＦＰ、シトリン、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、セルリアン、ＥＢＦＰなどを含むその類似体を含むが、これらに限定されない、フルオロフォアを発現するように遺伝子修飾されてもよい。診断病原体は、感染性病原体と同じ種であってもよく、または密接に関連する種であってもよく、例えば、診断病原体は、ボレリア属の１つの種であってもよいが、密接に関連するボレリア属を検出するために使用されてもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、診断病原体は、病原体間で高度に保存されているタンパク質および他のエピトープの発現を排除するためにさらに遺伝子修飾され、それによって、診断病原体への非特異的結合を低減する。いくつかの実施形態では、エピトープは、細胞表面タンパク質上に存在する。いくつかの実施形態では、エピトープは、病原体のクラスにおいて高度に保存されている細胞表面タンパク質上に、例えば、鞭毛細菌間、スピロチート間などに存在する。いくつかの実施形態では、高度に保存されているタンパク質は、ボレリアのｆｌｉＨタンパク質および／またはｆｌｉＩタンパク質を含むが、これらに限定されない鞭毛タンパク質である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、診断病原体は、アイソタイプ特異的および／またはグリコシル化特異的標識試薬と接触する前に固定される。例えば、特定の実施形態では、細胞病原体は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等の１つ以上の架橋剤、またはエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート（ＥＧＳ）などの二官能性リンカーで固定されてもよく、またはメタノールもしくはエタノールなどのアルコールで脱水によって固定されてもよい。
【００８７】
他の実施形態では、診断ベイトは、病原体タンパク質またはペプチドを示す抗原アレイである。抗原アレイは、個体由来の試料を含有する抗体と接触させることができ、試料由来の病原体特異的抗体は、抗原アレイのタンパク質／ペプチド上に示されるエピトープに結合する。抗原アレイは、当該技術分野で周知の方法を使用して、固体支持体上に病原体タンパク質および／またはペプチドを固定化することによって生成され得る。固体支持体は、例えば、限定されないが、ガラススライド、プラスチック、金属、ゲル、膜、シリカ、ビーズ、またはナノ粒子を含んでもよい。かかる抗原アレイは、病原体プロテオーム、特に、病理学的炎症性免疫応答に寄与する目的の病原体タンパク質からの代表的な数のペプチドまたはタンパク質を示すように設計され得る。加えて、アレイは、対照として使用するために病原体に由来しないタンパク質を含み得る。抗原アレイを製造する方法の議論については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６５４：２７１−２２７およびＲｏｂｉｎｓｏｎ（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（１）：６７−７２を参照されたい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、標識された診断ベイトは、複数のパラメータの同時分析を可能にする方法によって分析され、これらのパラメータとしては、診断病原体に結合した特許抗体、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥなどのアイソタイプ分布、診断病原体に結合した抗体のグリコシル化分布、抗体結合の全体レベルなどが含まれ得る。
【００８９】
本明細書で提供する方法では、標識試薬のカクテルを使用してもよく、各カクテルは、抗体アイソタイプまたはグリコシル化パターンに特異的である。カクテルは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の異なる標識試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、標識試薬は、検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体であり、この抗体は、目的のアイソタイプまたはグリコシル化パターンに特異的に結合する。他の実施形態では、試薬は、例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．１２（２）：１３９９−４１０に記載されているアイソタイプに特異的な標識されたアプタマー、またはＡｐｔａｇｅｎから市販されているように、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａｐｔ８）（ＩＤ＃４４）である。
【００９０】
各標識試薬は、典型的には、異なる標識、例えば、フルオロフォア、金属などで標識される。蛍光標識のセットは、典型的には、ＦＡＣＳ、例えば、ＦＩＴＣ、ＢＶ６５０、ｅＶｏｌｖｅ  ６５５、ＢＶ６０５、Ｋ−Ｏｒａｎｇｅ、ｅＦ４５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ、ＦＩＴＣ／ＡＦ４８８、ＡＰＣ−ｅＦ７８０、ＡＦ７００およびＡＰＣなどの実質的に等価なフルオロフォアを使用して同定され得るように選択される。これらのラベルの任意の組み合わせが使用され得る。
【００９１】
あるいは、マスサイトメトリーが使用され得る。マスサイトメトリーは、多くの２つ以上の標識原子の同時検出に適しており、例えば、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、３２、４０、５０、またはさらには１００個の異なる標識原子を可能にする。使用され得る標識原子には、ＩＣＰ−ＭＳによって検出可能であり、かつ標識されていない試料に実質的に存在しない任意の種が含まれる。好ましい実施形態では、標識原子は、希土類金属（１５種類のランタノイド、加えてスカンジウムおよびイットリウム）などの遷移金属である。これらの１７種類の元素は、ＩＣＰ−ＭＳによって容易に区別することができる多くの異なる同位体を提供する。これらの元素の多種多様なものは、濃縮同位体の形態で入手可能であり、例えば、サマリウムは、６種類の安定な同位体を有し、ネオジムは、７種類の安定な同位体を有し、これらはすべて、濃縮形態で入手可能である。１５種類のランタノイド元素は、非冗長特異的質量を有する少なくとも３７種類の同位体を提供する。標識原子としての使用に好適な元素の例としては、ランサナム（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジウム（Ｐｒ）、ネオジウム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッタービウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、およびイットリウム（Ｙ）が挙げられる。希土類金属に加えて、他の金属原子、例えば、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）、ビスマス（Ｂｉ）などは、ＩＣＰ−ＭＳによる検出に好適である。
【００９２】
アイソタイプまたはグリコシル化パターンの分別検出を可能にするために、標識試薬は、ＩＣＰ−ＭＳによってそれらのシグナルを区別することができるように、異なる標識原子を担持する必要がある。例えば、１０種類の異なるアイソタイプが検出されている場合、１０種類の異なる抗体を使用することができ、それらの各々は、異なる抗体からのシグナルを区別することができるように、特異的な標識を有する。
【００９３】
他の分析方法は、ＤＮＡ配列バーコード化抗体のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。ＰＣＲは、ＤＮＡの特異的セグメントを指数関数的に増幅して、特定のＤＮＡ配列の多くのコピーを生成する技術である。代替的には、配列バーコード化抗体は、ＤＮＡバーコードの配列決定を通して分析され得る。配列決定は、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を決定するプロセスである。
【００９４】
抗体の比色標識または蛍光標識は、複数の異なる抗体を同時にまたは順番に検出することを容易にする高次元マルチパラメータ顕微鏡法によって検出することができる。これは、連続イメージングおよびクエンチングのためのＤＮＡ配列バーコード化抗体と組み合わされて、特定の試料中の任意の異なる２〜５０（または潜在的にはさらに多い）種類の抗体の同定を可能にする。
【００９５】
病原体に対する免疫応答パターンは、例えば、上記のように、任意の好都合なプロトコルを使用して、生体試料から生成され得る。読み出しは、測定値に関連付けられた平均値（ｍｅａｎ）、平均値（ａｖｅｒａｇｅ）、中央値、または分散値、または他の統計的もしくは数学的に導出された値であってもよい。マーカー読み出し情報は、対応する参照または対照パターンと直接比較することによってさらに洗練され得る。結合パターンは、複数の点で評価することができ、データマトリックスにおける任意の点で統計的に有意な変化があるか否か、変化が結合における増加または減少であるか否か、変化が１つ以上の生理学的状態に特異的であるか否かなどを判定する。同一の条件下で各マーカーについて得られた絶対値は、生体系に固有の変動性を示し、個体間に固有の変動性も反映する。
【００９６】
アッセイされる試料から病原体に対する免疫応答パターンを得た後、病原体に対する免疫応答パターンを参照または対照プロファイルと比較して、試料が得られた／由来した患者の感染の状態およびステージに関する予後予測をする。通常、影響を受けていない正常な供給源からの試料または試料のセットとの比較が行われる。加えて、参照または対照パターンは、感染していることが知られている患者の試料から得られるシグネチャパターンであり得、したがって、陽性参照または対照プロファイルであり得る。
【００９７】
患者の感染およびステージング状態は、臨床ベースの基準を使用して評価することができる。これらのステージおよびサブセットを示すサブセットを同定するために、統計的試験は、有意と見なされる試験プロファイルと対照プロファイルとの間のマーカーの発現、力価または濃度の変化の信頼水準を提供し、対照プロファイルは応答性または非応答性のためであり得る。生データは、最初は、各マーカーについての値を測定することによって分析することができ、通常、１マーカー当たり２つ、３つ、４つ、または５〜１０個の複製特徴で分析することができる。
【００９８】
プロファイルのパラメータ値のうちの１つ以上が所定の有意水準に対応する制限を超えている場合、試験データセットは対照データセットとは異なっていると見なされる。
【００９９】
有意性順序付けを提供するために、誤検出率（ＦＤＲ）を決定することができる。まず、一連の非類似性値のヌル分布が生成される。一実施形態では、観察されたプロファイルの値を置き換えて、偶然に得られる相関係数の分布のシーケンスを作成し、それによって、適切な相関係数のヌル分布のセットを作成する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ  ９８，５１１６−２１を参照されたい）。この分析アルゴリズムは、現在、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）として知られるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ用のソフトウェア「プラグイン」として利用可能である。ヌル分布のセットは、すべての利用可能なプロファイルについて各プロファイルの値を置き換えることと、すべてのプロファイルについてペアワイズ相関係数を計算することと、この置き換えについての相関係数の確率密度関数を計算することと、Ｎが多数、通常は３００であるＮ回の手順を繰り返すこととによって得られる。Ｎ分布を使用して、それらの値が所与の有意水準で実験的に観測された類似値の分布から得られる値（類似性の）を超える相関係数値のカウントの適切な尺度（平均、中央値など）を計算する。
【０１００】
ＦＤＲは、予想される偽有意相関の数（ランダム化されたデータのセットにおけるこの選択されたピアソン相関より大きい相関から推定される）の、経験的データにおけるこの選択されたピアソン相関より大きい相関の数（有意な相関）に対する比率である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間の相関に適用することができる。
【０１０１】
ＳＡＭの場合、Ｚスコアは、データセット内のばらつきの別の尺度を表し、標準偏差で除算された、Ｘの平均値を除算したＸの値に等しい。Ｚスコアは、単一のデータポイントが通常のデータ分布に対してどのように比較されるかを示す。Ｚスコアは、データポイントが平均を上回るか下回るか否かだけでなく、測定値がどれほど異常かを示す。標準偏差は、データセット内の各値とデータセット内の値の平均との間の平均距離である。
【０１０２】
前述の分布を使用して、信頼性の水準が有意性について選択される。これは、偶然に得られる結果を上回る相関係数の最小値を決定するために使用される。この方法を使用することで、正相関、負相関、またはその両方の閾値を得る。この閾値（複数可）を使用して、ユーザは、ペアワイズ相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値（複数可）を上回る値を除去することができる。さらに、所与の閾値について偽陽性率の推定値を得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、どれくらい多くの観測結果が閾値範囲外に該当するかを見つけることができる。この手順は、カウントのシーケンスを提供する。このシーケンスの平均および標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数およびその標準偏差を提供する。
【０１０３】
データは、監督されていない階層クラスタリングに供されて、プロファイル間の関係を明らかにすることができる。例えば、階層クラスタリングを実行することができ、ピアソン相関がクラスタリングメトリックとして用いられる。１つのアプローチは、患者疾患データセットを「監督学習」の問題における「学習試料」と見なすことである。ＣＡＲＴは、医学への応用における標準であり（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９９）Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、これは、あらゆる定性的特徴を定量的特徴に変換し、それらをホテルリングのＴ２統計のためのサンプル再利用方法によって評価される達成された有意性レベルによってソートし、ラッソ法を適切に適用することによって修正することができる。予測における問題は、予測を見失うことなく回帰の問題に変わり、実際には回帰の質を評価する際に分類のためのジーニ基準を適切に使用することによって変わる。
【０１０４】
使用され得る他の分析方法は、論理回帰を含む。論理回帰の１つの方法については、Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １２：４７５−５１２を参照されたい。論理回帰は、その分類子がバイナリツリーとして示され得る点で、ＣＡＲＴに類似する。各ノードには、ＣＡＲＴによって生成される単純な「ａｎｄ」ステートメントよりも一般的な機能に関するブールステートメントがあるという点で異なる。
【０１０５】
別のアプローチは、最短収縮重心法のアプローチである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：６５６７−７２）。この技術は、ｋ−平均法のようなものであるが、クラスタセンターを縮小することで、（ラッソにおけるように）機能を自動的に選択して、情報量が少ないものに注目するという利点がある。このアプローチは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ用のソフトウェア「プラグイン」であるＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ＰＡＭ）ソフトウェアとして利用でき、広く使用されている。さらに２組のアルゴリズムはランダムフォレストである（Ｂｒｅｉｍａｎ（２００１）Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５：５−３２  ａｎｄ  ＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ（２００１）Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。この２つの方法はすでに「委員会方法」である。したがって、それらは結果に「投票」する予測因子を伴う。これらの方法のいくつかは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで開発された「Ｒ」ソフトウェアに基づいており、これは、継続的に改善および更新されている統計フレームワークを提供する。
【０１０６】
他の統計分析アプローチとしては、主成分分析、再帰分割、予測アルゴリズム、ベイジアンネットワーク、およびニューラルネットワークが挙げられる。
【０１０７】
これらの統計ツールは、あらゆる血清学的データに適用可能である。容易に決定することができ、異なるステージの感染症を有する個体の検出および治療に対する応答性に関して非常に有益である一連のデータが提供される。病原体に対する免疫応答性のためのシグネチャーパターンのデータベースも提供される。かかるデータベースは、典型的には、特定の種類およびステージの免疫応答などを有する個体のシグネチャパターンを含み、かかるプロファイルは、上記の通りである。
【０１０８】
分析およびデータベースストレージは、ハードウェアまたはソフトウェア、またはこれらの組み合わせで実装され得る。本発明の一実施形態では、機械可読記憶媒体が提供され、この媒体は、機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含み、このデータは、前記データを使用するための命令でプログラムされた機械を使用するときに、本発明のデータセットおよびデータ比較のいずれかを示すことができる。かかるデータは、患者モニタリング、初期診断などの様々な目的で使用され得る。好ましくは、本発明は、プロセッサ、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリおよび／または記憶素子を含む）、少なくとも１つの入力デバイス、ならびに少なくとも１つの出力デバイスを含む、プログラマブルコンピュータ上で実行されるコンピュータプログラムに実装される。プログラムコードは、上述の機能を実行し、出力情報を生成するために入力データに適用される。出力情報は、既知の様式で１つ以上の出力デバイスに適用される。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または従来の設計のワークステーションであり得る。
【０１０９】
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するために、高レベルの手続き型またはオブジェクト指向プログラミング言語で実装されることが好ましい。しかしながら、必要に応じて、プログラムを組み立て言語または機械言語で実装することができる。いずれにしても、言語は、コンパイル言語または解釈言語であり得る。各かかるコンピュータプログラムは、記憶媒体またはデバイスが本明細書に記載の手順を実行するためにコンピュータによって読み取られるときにコンピュータを構成および動作させるために、汎用または特殊目的のプログラマブルコンピュータによって読み取ることができる記憶媒体またはデバイス（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスク）に記憶されることが好ましい。システムはまた、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として実装されると見なされ得、そのように構成された記憶媒体は、コンピュータに、本明細書に記載される機能を実行するために、特定の所定の方法で動作させる。
【０１１０】
入力手段および出力手段のための様々な構造フォーマットは、本発明のコンピュータベースのシステム内の情報を入力および出力するために使用され得る。出力のための１つのフォーマットは、信頼できるプロファイルに対して類似性の程度が異なる試験データセットを意味する。そのような提示により、当業者に類似性の順位付けが提供され、試験パターンに含まれる類似性の程度が特定される。
【０１１１】
そのシグネチャパターンおよびデータベースは、それらの使用を容易にするために様々な媒体に提供され得る。「媒体」とは、本発明のシグネチャパターン情報を含む製品を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ可読媒体、例えば、コンピュータによって直接読み取りおよびアクセスすることができる任意の媒体に記録することができる。かかる媒体としては、限定されないが、磁気ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体、ならびに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリのハイブリッドが挙げられる。当業者は、現在知られているコンピュータ可読媒体のうちのいずれかが、本データベース情報の記録を含む製造物を作成するためにどのように使用され得るかを容易に理解することができる。「記録された」とは、当該技術分野で既知の任意のかかる方法を使用して、コンピュータ可読媒体に情報を記憶するためのプロセスを指す。記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の便利なデータ記憶構造を選択することができる。様々なデータプロセッサプログラムおよびフォーマットが、ストレージ、例えば、ワープロテキストファイル、データベースフォーマットなどに使用され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、病原体に対する免疫応答は、複数の時点で診断方法のステップを繰り返すことによって、個体において一定期間監視される。例えば、第１の時点で個体から第１の抗体含有試料を収集することができ、第２の時点（後で）で個体から第２の抗体含有試料を収集することができ、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出は、病原体による感染が悪化していることを示し、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの低下の検出は、病原体による感染が改善していることを示す。シリアルサンプリングは、経時的に病原体に対する免疫応答の違いを検出するために使用され得、これは、感染を示す変化を明らかにする。個体からの抗体レベルの連続サンプリングは、特に、個体における病原体レベルが最初に検出することが困難な非常に低いレベルにある場合に有用であり得、連続サンプリングは、試料が単一の時点でのみ収集される場合よりも、感染した個体を感染していない個体から区別することを容易にする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、連続サンプリングは、本明細書に記載の方法を使用して、患者の感染を治療するための療法の有効性を監視するために使用される。例えば、第１の抗体含有試料は、患者が療法を受ける前に個体から収集されてもよく、第２の抗体含有試料は、患者が療法を受けた後に個体から収集されてもよく、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの増加の検出は、病原体による感染が悪化しているかまたは療法に対して応答しないことを示し、第１の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルと比較して、第２の抗体含有試料中の１つ以上の病原体特異的抗体のレベルの低下の検出は、病原体による感染が改善されていることを示す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「抗生物質」は、一般的に使用される静菌性抗生物質および殺菌性抗生物質、通常は経口投与される抗生物質をすべて含む。抗生物質としては、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、およびトブラマイシンなどのアミノグリコシド、セファマンドール、セファゾリン、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロシン、セファピリン、およびセフラジンなどのセファロスポリン、エリスロマイシンおよびトロレアンドマイシンなどのマクロライド、ペニシリンＧ、アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェネチシリン、およびチカルシリンなどのペニシリン、バシトラシン、コリスチメタート、コリスチン、ポリミキシンＢなどのポリペプチド抗生物質、クロルトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリンなどのテトラサイクリン、ならびにクロラムフェニコール、クリンダマイシン、サイクロセリン、リンコマイシン、リファンピン、スペクチノマイシン、バンコマイシン、およびバイオマイシンなどの雑菌抗生物質が挙げられる。さらなる抗生物質については、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”１６ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９８０），ｐｐ．１１２１−１１７８に記載されている。
【０１１５】
本明細書で使用される免疫抑制または免疫抑制レジメンは、自己抗原または移植片に対する宿主免疫系の免疫応答を減少させるための薬剤による個体、例えば、移植片レシピエントの治療を指す。例示的な免疫抑制レジメンについては、本明細書においてより詳細に記載される。
【０１１６】
一次免疫抑制剤としては、カルシニューリン活性を阻害するために結合タンパク質と組み合わされ、例えば、タクロリムス、シクロスポリンＡなどを含む、カルシニューリン阻害剤が挙げられる。シクロスポリンおよびタクロリムスの両方のレベルを注意深く監視する必要がある。当初、１０〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲でレベルを維持することができるが、３ヶ月後には、腎毒性のリスクを低減するためにレベルをより低く（５〜１０ｎｇ／ｍＬ）維持することができる。アジュバント剤は、通常、カルシニューリン阻害剤と組み合わされ、ステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、およびシロリムスを含む。関心対象のプロトコルとしては、ミコフェノール酸モフェチルを有するカルシニューリン阻害剤が挙げられる。アジュバント剤の使用により、個々の薬剤の用量および毒性を低減させながら、臨床医が適切な免疫抑制を達成することが可能になる。
【０１１７】
様々な障害の治療のために製剤化された薬学的組成物中の活性成分は、上記の通りである。活性成分は、治療有効量、すなわち、それによって媒介される疾患または医学的状態を治療するために標的タンパク質またはポリペプチドの効果を実質的に調節するために十分な量で存在する。組成物はまた、送達および有効性を増強するための、例えば、活性成分の送達および安定性を増強するための様々な他の薬剤を含み得る。
【０１１８】
したがって、例えば、組成物はまた、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される非毒性担体または希釈剤も含み得る。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例には、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンク溶液がある。加えて、薬学的組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および洗剤などの生理学的状態に近づけるための追加の物質を含んでもよい。組成物はまた、抗酸化剤などの様々な安定化剤のうちのいずれかを含んでもよい。
【０１１９】
検出試薬、例えば、１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬が、キットの一部として提供されてもよい。したがって、本発明は、生体試料中の関心対象の病原体特異的抗体の存在を検出するためのキットをさらに提供する。キットは、例えば、診断病原体または抗原アレイを含み得る、関心対象の病原体特異的抗体を検出するための診断ベイトをさらに含み得る。これらのキットを使用する手順は、臨床検査室、実験室、医療従事者、または個人によって実行されてもよい。マーカーを検出するための本発明のキットは、遺伝子修飾病原体（複数可）および評価に有用な標識試薬を含む。このキットは、緩衝液、現像試薬、標識、反応表面、検出のための手段、対照試料、標準物、説明書、および解釈情報を含むが、これらに限定されない、手順において有用な追加の構成要素を任意選択的に提供してもよい。
【０１２０】
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するための説明書をさらに含む。これらの説明書は、様々な形態で対象キット中に存在してもよく、それらのうちの１つ以上は、キット中に存在してもよい。これらの命令が存在し得る１つの形態は、好適な媒体または基板、例えば、情報が印刷される１枚または複数枚の紙、キットのパッケージ内、添付文書内など上の印刷情報としてのものである。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、ＣＤ、ハードドライブ、ネットワークデータ記憶装置などである。存在し得るさらに別の手段は、削除されたサイトで情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキット中に存在し得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、キットは、ボレリア・ブルグドルフェリ診断病原体、およびボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的抗体を検出するための１つ以上のアイソタイプ特異的試薬またはグリコシル化特異的試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ボレリア・ブルグドルフェリ病原体特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのＩｇＥ特異的試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、抗ヒスタミン剤、肥満細胞安定剤、および抗ＩｇＥ治療剤のうちの１つ以上をさらに含む。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、発明と見なされるものについての範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度、濃度など）に対する精度を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差は許容されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または略大気圧である。
【０１２３】
実験
包括的な抗体アイソタイププロファイリングが、免疫病態の重要なバイオマーカーおよびインチベーターとしてＩｇＥを同定することが本明細書に示される。免疫グロブリンレベルおよび比率をプロファイリングすることにより、細菌の存在の指標を提供し、各患者における免疫応答の状態を評価し、これを使用して、臨床的意思決定を通知することができる。血清中のすべての抗体アイソタイプおよびそれらの相対量の包括的な分析方法が、以下の実施例に記載される。
【０１２４】
臨床的には、ＩｇＥは、好塩基球および肥満細胞上のそのＦｃ受容体に対して高い親和性で結合し、有意な局所ヒスタミン放出を引き起こし、これは、ＩｇＧ媒介性免疫応答を抑制しながら、ＩｇＥ媒介性免疫応答をさらに増幅するため、有意である。肥満細胞Ｆｃ受容体に結合したＩｇＥへの抗原結合時の好塩基球および肥満細胞脱顆粒は、ヒスタミンおよび他のアレルギー因子の放出をもたらし、広範な組織損傷を引き起こし、例えば、関節炎、不調、疲労、および認知障害を含む、ライム病において報告されている多くの徴候および症状において役割を果たすことができる。したがって、ＩｇＥの産生は、病因に影響を及ぼし得る。ＩｇＥの産生および２型免疫応答の重症度は、異なる株のマウス間で大きく異なり、ライム病患者によって報告される症状の多様性が個々の遺伝子構造と関係していることを示唆している。
【０１２５】
高分解能で個々の免疫応答を調査するために、すべての抗体アイソタイプの抗体の存在および相対量について包括的な血清学的試験を開発した。本方法は、フローサイトメトリーの能力および分解能と組み合わされた抗アイソタイプおよび抗サブタイプパネルを利用して、推定患者から生ＧＦＰ発現病原体細胞への病原体特異的抗体の結合を測定する。
【０１２６】
例えば、全ＧＦＰ標識細菌を血清試料とともにインキュベートし、細菌表面エピトープに結合するＢｂ特異的抗体を、フローサイトメトリによって分析される包括的な二次抗体パネルを使用して検出する。この方法は、結合したＢｂ特異的抗体のアイソタイプレパートリーのプロファイリングを可能にし、Ｂｂ感染について陽性をスコアリングするための閾値を決定する。この方法においては、抗体の基質が全細菌であり、保存された細胞内細菌エピトープを曝露する細菌溶解物ではないため、偽陽性の率が低くなる。加えて、フローサイトメトリの分解能は、非常に高い感度および再現性を提供する。この高感度では、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のサブタイプなどの古典的な感染指標は、感染の最初の週で検出可能であるが、現在使用されている方法では、信頼できる結果のための推奨は、感染の８週間後に試験することである。驚くべきことに、我々はまた、感染後より長い期間に分析された動物モデルおよび２層陽性患者からの試料の両方において、細菌病原体に対する予期しない応答であるＢｂに対するＩｇＥ抗体を発見した。
【０１２７】
ボレリア感染の場合、感受性マウス株（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）は、Ｂｂ誘発病理に耐性があるマウス株と比較して、それらのＩｇＥ応答の動態および大きさにおいて著しく異なる。また、肥満細胞がＢｂ感染Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腫脹関節に浸潤することも観察する。我々のデータは、ＩｇＥ誘発性肥満細胞脱顆粒がライム性関節炎において病理学的であることを示す。肥満細胞脱顆粒中のヒスタミン放出は多くの経路の主要な修飾因子であり、肥満細胞脱顆粒が関節の周囲の腫脹をどのように引き起こすかに直接関与する可能性があるため、我々は感染経過にわたって抗ヒスタミン剤治療の影響を試験した。感染後２週間からマウスの飲料水に投与されるヒスタミン２型受容体拮抗薬（Ｈ２遮断薬）での治療は足首膨張を防ぎ、一方、１型ヒスタミン受容体拮抗薬は効果を有しなかった。これらの所見は、標的細胞上の２型ヒスタミン受容体を介したヒスタミンの肥満細胞脱顆粒放出およびシグナル伝達が脛足根骨側浮腫腫れの原因であり、Ｂｂ感染に対する明確な関連性を有しないライム病に関連するいくつかの臨床症状を説明することができることを示す。
【０１２８】
診断で使用するためのＢｂを調製するための条件が、最適化される。細菌エピトープを維持し、実行間のバッチ効果を排除するために開発された固定および保存プロトコルが得られる。固定は、細菌を非感染性にするため、生物学的安全性の懸念を減少させる。例えば、高度に保存された細胞内タンパク質を曝露する外側膜を透過させることなく表面エピトープを最適に維持することができる様々な濃度、浸漬時間、および温度での、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド製剤から始まるアルデヒド系固定剤の反復がなされる。
【０１２９】
現在、指数増殖フェーズと定常増幅フェーズとの両方でＢｂを使用し、両方のフェーズと並行してすべての試料を試験する。所与のコホートからのすべての試料を、同じバッチの細菌培養物、同じ染色条件、および同日フローサイトメトリー分析に結び付けた後にともに比較する。これにより、コホート内のバッチ効果が防止されるが、あるコホートからの結果を別のコホートと比較するために、アッセイ中の細菌数および濃度を正規化し、血清との事前インキュベーションなしで二次抗体でインキュベートされた細菌と比較して、結合割合を比較する。
【０１３０】
Ｂｂは、特異性を増加させるためにさらに遺伝子修飾され得る。現在、Ｂｂベイトは、フローサイトメトリーによってそれらを陽性に同定することを容易にするために、ＧＦＰを発現するように遺伝子修飾される。Ｂｂは、所望に応じて高度に保存された表面タンパク質を排除するために、さらに遺伝子修飾され得る。あるいは、抗体が結合する最も高い免疫原性のエピトープが同定され、スクリーニングのための基質として抗原パネルを生成するために使用される。
【０１３１】
免疫グロブリン重鎖は、免疫系によって産生される５つの主要なアイソタイプの抗体の区別を可能にする。これらは、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり、これらはサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１）にさらに編成され得、これらの各々は、異なるエフェクター機能を誘発する複数のアイソタイプを含有する。バルクＩｇＧまたはＩｇＭを測定するライム診断は、他の主要なアイソタイプを探すことができないだけでなく、患者の免疫応答の詳細な理解に最適な抗体サブクラスの分解能も逃す。これらのアッセイは、主要な結合エピトープを変性させることができ、細胞内タンパク質の表示を通じて、結果を非特異的にし得る細菌溶解物を使用する。これらの欠点は、感度を低くし、早期感染の検出のために試験を不十分にする。したがって、ＣＤＣ推奨の２層試験を使用して血清陽性でもある遊走性紅斑（ＥＭ）発疹を有する病院で受信した患者の割合は、抗生物質療法が最も有効である場合に重要な早期ウインドウでは３０％未満である。ほとんどの場合、ドキシサイクリン、アモキシシリン、またはセフロキシムなどの抗生物質による治療は、ちょうどよいときに開始された場合、感染を解消するために十分である。したがって、すべての抗体アイソタイプを試験することによって、Ｂｂ感染の初期段階の血清陰性患者が真の陰性であるか否かを確認することが重要である。
【０１３２】
現在の診断方法によって同定されるＩｇＭおよびＩｇＧ抗Ｂｂ抗体は、Ｂｂに感染した患者を特定するための小さなウィンドウを提供する。ＩｇＥおよび他の抗体アイソタイプを含めることにより、２層検証されたライム患者と未感染の健康な対照との間の分離を改善することができた。この方法によるＩｇＧ１単独でさえ、ウェスタンブロットによる不定値およびフローサイトメトリーベースのアッセイによる明らかに陽性値を有した患者に見られるように、ウェスタンブロットよりも高い感度で実施されたＥＬＩＳＡの感度を示す。ＩｇＧの追加のサブタイプ、またはＩｇＥなどの他のアイソタイプが患者をさらに分離したか否かにかかわらず、追加のパラメータを追加することで、ＩｇＥ対ＩｇＧサブタイプ抗Ｂｂ抗体の比率は、健常な対照および患者を２つの異なる、明確なクラスターに階層化した。さらに、ＩｇＧまたはＩｇＭに対して陰性であるが、偽陰性を回避するための直接試験において陽性である患者においてＩｇＥを同定することによって、感染に対して非規範応答する患者を特定することができる。
【０１３３】
ＩｇＧおよびＩｇＭは、細菌感染に対する免疫応答を支配する古典的な抗体アイソタイプと見なされるが、ＩｇＡはまた、神経白血病に関与している。治療前および治療後の患者試料中のすべての抗Ｂｂ抗体アイソタイプおよびサブタイプのレベルを決定する。我々は、単独で、または他の抗体アイソタイプレベルと比較した場合のいずれかのＩｇＥまたはＩｇＡのレベルが、治療後に回復しない患者と比較して回復するクラスター患者であるか否かを追跡する。
【０１３４】
ライム病マウスまたは患者におけるアレルギー反応を排除することができるＩｇＥの上流へのアプローチもまた利用される。抗ヒスタミン剤の使用またはＩｇＥ遮断を超えて、肥満細胞のＩｇＥ結合およびヒスタミン放出のさらに上流の免疫調節戦略を通じて、より長期的な解決策が提供される。肥満細胞脱顆粒の上流に作用するアプローチは、マウスおよび／または患者におけるライム病に対するＩｇＥ媒介性応答を低減することができる。キリズマブは、膜発現ＩｇＥのＭ１プライムセグメントＣεｍＸを標的とするモノクローナル抗体である。この抗体は、Ｂ細胞上の膜結合ＩｇＥ抗原受容体を架橋し、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞アポトーシスを誘導し、遊離循環ＩｇＥレベルを低下させ、ＩｇＥの生成を阻害する。この抗ヒト抗体のインビボでの有効性を評価するために、臨床的に承認された抗体によって媒介されるＩｇＥ産生Ｂ細胞を枯渇しやすくするヒトＭ１′ドメインをマウスＩｇＥ遺伝子座に挿入する遺伝子修飾マウスモデルを使用する。これらのマウスは、Ｂｂに対する感受性を保証するためにＣ３Ｈに戻し交配され、病原体に感染され、キジルマブ抗体で処理される。ＣＤ４７遮断試薬の有無にかかわらず、キリズマブの併用療法を試験して、ＩｇＥ＋Ｂ細胞クリアランスおよび細菌クリアランスをさらに改善する。
【０１３５】
共培養システムを使用して、Ｂｂ感染時にＩｇＥアイソタイプスイッチを受けたＢ細胞におけるＩｇＥ＋Ｂ細胞枯渇の有効性を試験する。この同じモデルでは、ＩｇＥ＋Ｂ細胞を枯渇させ得る追加の薬物は、ＸｍＡｂ７１９５を、単独で、またはＣＤ４７遮断と組み合わせて試験する。ＸｍＡｂ７１９５は、最も包括的であり、ＩＩ型免疫応答において最も遠い上流で相互作用する。ＸｍＡｂ７１９５は、信頼性が高い二重機構で知られている。この機構は、血清中の遊離ＩｇＥを隔離して、Ｂ細胞上でＦｃγＲＩＩβおよびＩｇＥ受容体との複合体を形成し、ＩｇＥシグナル伝達を遮断する。これは、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞分化を阻害し、ＩｇＥ分泌形質細胞を減少させるとともに、ＩｇＥ陽性Ｂ細胞の形成を阻害し、遊離および総ＩｇＥを減少させる。この機構は、他のＢ細胞の抗原アイソタイプには影響しない。これらの薬物は、ＩｇＥおよび／またはＩｇＥ陽性Ｂ細胞を循環させることによって見られる応答を減少させ、ＩＩ型免疫応答を減少させることができる。より高い上流およびより包括的に妨げるほど、血清中の遊離ＩｇＥおよびＩｇＥ陽性Ｂ細胞はより少ない。これは、利用可能な現在の治療と比較して、ライム病の影響を減少させ、より長い時間をかけ得る。
【０１３６】
実施例１
診断病原体を用いる免疫吸着アッセイ
病原体特異的抗体の最適な検出のために、無傷の遺伝子修飾された病原体を使用するための方法を開発した。本方法は、複数の抗体アイソタイプ、サブタイプ、およびグリコシル化状態の同時検出のために、蛍光、比色、または金属検出アッセイと結合された免疫吸着アッセイを利用する。複数の抗体アイソタイプ／サブタイプ／グリコシル化モチーフを並行して検査することによって、これらの異なる抗体形態の比率が決定され、病原体に対する免疫応答の高分解能指示とともに、疾患状態の詳細なサブグループ化を可能にする。
【０１３７】
病原体を蛍光に遺伝子修飾することは、死んだ病原体およびデブリから区別することができる生きた無傷の病原体を迅速に同定することを可能にする。病原体全体を維持し、表面タンパク質のみを病原体特異的抗体に曝露することはまた、特異性を損なう高度に保存された細胞内タンパク質の曝露を排除する。
【０１３８】
病原体表面上で発現されることから高度に保存されたエピトープを排除するための病原体のさらなる遺伝子修飾は、最大の抗体エピトープ認識のためにタンパク質をそれらの天然確認において維持しながら、病原体特異的抗体の免疫吸着検出のための最大特異性の複合体を生成する。これらの修飾病原体は、高度に保護された抗体の生成のためのワクチン接種株としても有用である。
【０１３９】
ボレリア・ブルグドルフェリ菌によって引き起こされるライム病は、正確に検出することが困難であることで知られている疾患の一例である。現在の診断試験は、特異性の欠如、感受性の欠如、または他の試験が陰性となるように、ある特定の株のみに対する感受性の欠如のいずれかを被る。本明細書に提供されるアッセイは、ボレリア感染の初期段階であっても、高い特異性および感度診断を提供することが示される。さらに、異なる抗体アイソタイプ、サブタイプ、およびグリコシル化状態を同時に解決することは、患者をライム病内の異なるサブグループに階層化することを可能にし、これは、治療オプションの決定のための重要な情報を提供する。
【０１４０】
このアッセイは、小さな血液の液滴からの感染の最初の週内に、生きたマウスにおける感染を検出することが示される。このアッセイにより、免疫応答の状態について有益である異なる種類の抗体間の重要な比率も同定された。細菌感染は概して保護性ＩｇＧ応答の誘導につながるが、我々は、実験室マウス株Ｃ３Ｈにおけるボレリア感染はまた、寄生虫またはアレルゲンに対する応答のより典型的なＩｇＥ応答の誘導につながることを見出した。撮像結果を伴う診断情報および他の観察結果を組み合わせることで、異なる感染状態が異なる免疫応答をどのように引き起こすかについての理解の進歩がもたらされる。
【０１４１】
結果
図１に、診断用免疫吸着アッセイの概略図が示されている。懸濁液中に遊離した無傷のボレリア・ブルグドルフェリ病原体は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように遺伝子修飾される。病原体は、感染した宿主または感染していない宿主由来の血漿とともにインキュベートされる。複数回の洗浄後、これらの病原体は、暴露された表面タンパク質に結合された任意の病原体特異的抗体とともに、抗体アイソタイプ、サブタイプ、およびアロタイプに特異的に結合する二次蛍光標識抗体のパネルでプローブされる。この同じ戦略は、検出に使用され得る他の分子、例えば、マスサイトメトリーのための金属にコンジュゲートされた抗体に適用される。炭水化物モチーフに特異的な抗体も、パネルに含めることができる。
【０１４２】
ボレリア特異的免疫応答の代表的な分析、およびそれらが感染状態によってどのように影響されるかが、図２Ａ〜２Ｅに示されている。複数のアイソタイプおよびサブタイプをプロファイリングすることは、感染に対する応答のより大きな分解能を可能にする。Ｃ３Ｈマウスをボレリア・ブルグドルフェリ−ＧＦＰで感染させ、６７日間の感染経過にわたって足首腫脹を測定した。４８日目に足首腫脹のピークが観察され、６７日目のエンドポイントで抗体レベルを測定した。図２Ａは、群別の足首幅（ｍｍ）を示し、ＣＨＯ培地に注入されたボレリアに感染した群において最も高い程度の腫脹および関節レベルの炎症があった。この状態はまた、より大きな凝集物へのボレリアの凝集を誘発する。
【０１４３】
図２Ｂは、感染後６７日目における抗体アイソタイプレベルを示し、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥアイソタイプが示されている。マウスＩｇＧ２ａは、ヒトＩｇＧ１と同等であり、ＩｇＧサブタイプのうちのいずれかの最も高い活性化／抑制率を有する。ＩｇＥアイソタイプは、典型的には寄生虫感染およびアレルギー応答と関連付けられるために、驚くべきことに見出された。
【０１４４】
本明細書に開示された方法によってボレリア特異的抗体のパネルを測定することは、従来の方法と比較して、免疫応答の状態の改善された分解能を可能にする。これは重要であり、図２Ｃに示されるように、ＣＨＯ培地および感染後６７日目のアジュバント条件を有するＣＨＯ培地の両方のＩｇＥ／ＩｇＧ２ａの抗体比が、感染後４８日目の足首腫脹測定ピークと相関する。図２Ｄは、感染後６７日目でマウスＩｇＧ２ａ抗体レベルの代表的なＦＡＣＳプロットを示し、図２Ｅは、この時点でのマウスＩｇＥを示す。
【０１４５】
図３Ａ〜３Ｇは、感染から１週間後に検出可能であり、感染から２週間後にさらに増加する、感染に対する抗体応答の時間経過分析を提供し、感染の早期検出のための感受性アプローチを示す。Ｃ３Ｈマウスをボレリア・ブルグドルフェリ−ＧＦＰに感染させ、血漿を毎週分離した。１０μｌの血漿を１×１０６個のＢｂ−ＧＦＰとともに一晩インキュベートした。洗浄後、血漿由来の病原体特異的抗体に結合したＢｂ−ＧＦＰを、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥに特異的な二次マウス抗体のパネルとともにインキュベートした。
【０１４６】
図３Ａは、感染していないマウスと比較して、感染後１週間および２週間のマウス抗体レベルを示す。図３Ｂ〜３Ｅは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥの各々について、感染後２週目でのマウスＩｇＧ２ａ抗体レベルの代表的なＦＡＣＳプロットである。第１の列は、未感染マウス由来の血漿である。第２の列には感染されたマウスの血漿が含まれている。第３の列には、血漿または二次抗体が含まれずに、Ｂｂ−ＧＦＰのみが含有されている。第４の列には、Ｂｂ−ＧＦＰおよびすべての二次抗体が含有されるが、血漿は含有されていない。この最後の条件はノイズの尺度であり、一方で、第１の未感染血漿の条件は、結合抗体の％の各抗体についてゲートを設定するために使用される。図３Ｆは、未感染マウスと比較して、感染後２週間のＦＡＣＳ分析によって評価されるマウス血清誘導細菌凝集を測定したものである。図３Ｇは、Ｂｂ−ＧＦＰのサイズの代表的なＦＡＣＳ分析である。
【０１４７】
実施例２
ボレリア−ＧＦＰ診断病原体を用いた免疫吸着アッセイ
ボレリア感染に対する免疫応答状態の診断アプローチは、ヒトにおける早期感染および後期感染を検出するために適合され、診断の特異性を１００％近くまで体系的に増加させるために適合される。
【０１４８】
ヒト抗体アイソタイプ、サブタイプ、およびアロタイプに特異的な二次パネルを健康な個体で試験して、ボレリア−ＧＦＰへの結合のバックグラウンドレベルを決定する。免疫吸着アッセイで使用されるボレリアは、特異性を増加させるためにさらに遺伝子修飾される。フラゲラは、異なる細菌種間で高度に保存される。フラゲラ変異体を、感染の経過にわたって連続した時点からの患者血漿試料中のＢｂ−ＧＦＰと比較して、ボレリアナイーブ対照と比較して分析する。Ｂｂ−ＧＦＰ上に曝露された表面タンパク質を、他の細菌種とのそれらの保存レベルについて検査し、特異性のさらなる増加のために保存の順序によって体系的に変異させる。臨床分離株を収集し、ＧＦＰを遺伝子導入する。フラゲラおよび必要に応じての他の遺伝子は、遺伝子修飾されて、この検出アプローチが地理的にボレリアの１つの形態に限定されないことを確実にするが、すべてのライム病を引き起こす株を検出することができる。
【０１４９】
アッセイの感度は、細菌との血漿インキュベーション時間、フローサイトメトリーによる二次抗体濃度および電圧を変化させるか、または抗体コンジュゲートおよび検出方法を変更することによって最適化される。
【０１５０】
ヒト患者試料は、ボレリア感染に対する免疫応答の状態によって規定される特定のサブグループにライム病症状をサブセットするための診断アプローチを利用するために、治療履歴とともに収集される。
【０１５１】
患者の血漿試料は、健常な対照から収集され、抗生物質治療で症状が緩和されたものと持続的な症状を有するものとで分離された現在の血清学的アプローチを使用して、ボレリア抗体に対して陽性である個体からの試料と比較される。抗体サブタイプ比率を検査して、治療に応答した患者または応答しなかった患者を区別するための指標を特定する。
【０１５２】
患者の血漿試料は、赤血球移行片（ボレリアによる早期感染）を提示した時点で収集され、診断戦略は、８週間にわたって毎週現在の血清診断と比較される。治療への応答について、患者を追跡する。試料は、現在の血清学的アプローチの前に明らかである我々の診断戦略を通じて、感染症の指標について分析される。ＩｇＥは、初期の週にＩｇＭおよびバルクＩｇＧのみをプローブする現在の血清学で陰性を試験した患者で検査される。
【０１５３】
免疫状態の検出のための診断戦略は、他の病原体への応答に拡大される。真菌感染症アスペルギルスは、肺損傷が存在する場合に非常に深刻な問題を引き起こす可能性があるが、アスペルギルスによる感染症を特定するには、呼吸器から抽出して培養する必要がある。異なる蛍光分子を含有し、異なる形態の遺伝子修飾アスペルギルスの試料を、活動性感染の患者の患者血清およびヒト二次抗体パネルで試験して、アスペルギルス感染に対する抗体応答を特徴付け、診断戦略が真菌感染に適用可能であるか否かを評価する。
【０１５４】
細胞内寄生虫のトキソプラズマ・ゴンディによる感染は非常に一般的であるが、厳格に試験がなされているところである。トキソプラズマ・ゴンディは遺伝子修飾に非常に適しており、多くの遺伝子変異体が既に利用可能であるため、診断戦略は、文書化されたトキソプラズマ曝露および活動性トキソプラズマ感染を有する個体と比較して、トキソプラズマナイーブ健常対照において試験される。
【０１５５】
病原体に対する免疫応答の状態における高分解能分析は、それらが異なる抗体重鎖およびグリコシル化モチーフによってトリガーされるエフェクター機能と相関するため、異なる症状のより良好な機械的理解を可能にする。高度に保存された表面曝露タンパク質を排除するためにインタクトな生物を遺伝子修飾することは、病原体タンパク質をそれらの天然確認に保持するが、所与の病原体に高度に特異的な表面タンパク質のみを保持することによって、抗体検出に対する強化された特異性を可能にする。
【０１５６】
感染中に現在見過ごされている異なる抗体サブクラスを同時に評価する能力は、疾患の検出および治療を改善し得る。この免疫吸着診断戦略においてベイトとして使用される高度に特異的なモデル病原体に結合される抗体型間の比率は、カスタマイズ可能な特異性を有する高感度アプローチを可能にし得る。
【０１５７】
材料および方法
ボレリアの遺伝子組換え。Ｍｏｒｉａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４（６）：ｅ１００００９０に記載されているように実行される。簡潔に述べると、ＧＦＰ発現プラスミドｐＴＭ６１の構築のために、ｐＣＥ３２０（ｇｆｐ）−ＰｆｌａＢからのターミネーター配列（Ｔ１ｘ４）、ｒｂｓ，Ｂ．ブルグドルフェリｆｌａＢプロモーターおよびＧＦＰコード配列を、隣接ＳａｃＩ部位およびＫｐｎＩ部位でＰＣＲ増幅し、プライマーＢ６９６（５´−ｃｃｇｇａｇｃｔｃａｔｇａｔａａｇｃｔｇｔｃａａａｃａｔｇａｇ−３´）およびＢ６９７（５´−ｃｃｇｇｔａｃｃｔｃａｇａｔｃｔａｔｔｔｇｔａｔａｇｔｔｃａｔｃ−３´）を使用して、ベクターＰｓｔＩ部位に近接する挿入ＳａｃＩ部位を用いてｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｎａｄａ，Ｂｌｕｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）にクローニングしてプラスミドｐＴＭ４１を作製した。この挿入物は、複製起点およびコピー数が大腸菌中の蛍光タンパク質の発現および毒性に影響を及ぼすことがあるため、ｐＢＳＶ２シャトルベクター（ｐＢＳＶ２Ｇ）のゲンタマイシン耐性バージョンにクローニングすることができなかった。したがって、修飾シャトルベクター、ｐＴＭ４９を構築し、ｐＢＳＶ２ＧのｃｏｌＥＩ  ｏｒｉを、酵素ＭｌｕＩおよびＳｎａＢＩでの制限消化によって除去し、ｐＵＣ  ｏｒｉを含有するｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯからのＭｌｕＩ／ＳｎａＢＩ断片で置き換えた。ｐＴＭ４１からの（Ｔ１ｘ４）−ＰｆｌａＢ−ｇｆｐカセットを、ｐＴＭ４９のＳａｃＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングして、ｐＴＭ６１を生成した。
【０１５８】
すべての株を、自社で調製したＢＳＫ−ＩＩ培地中で成長させた。エレクトロコンピテント感染性Ｂ．ブルグドルフェリ株Ｂ３１  ５Ａ４  ＮＰ１および非感染性株Ｂ３１−Ａ（両方ともＢ３１由来）を、前述のように調製した。液体めっき形質転換を、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの存在下で５０μｇのｐＴＭ６１で実施した。ゲンタマイシン耐性Ｂ．ブルグドルフェリクローンを、１）記載されるようにプライマーＢ３４８およびＢ３４９で実施されるコロニースクリーニングＰＣＲによるａａｃＣ１配列の存在、ならびに２）従来のエピ蛍光顕微鏡によるＧＦＰ発現についてスクリーニングした。蛍光株中の非組み込み形態のｐＴＭ６１プラスミドの存在を、小規模で調製した全ゲノムＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によって確認した。天然プラスミド内容物についてのＰＣＲスクリーニングを実施し、１つの蛍光伝染性Ｂ．ブルグドルフェリクローン（ＧＣＢ７２６）が、ｃｐ９ベースのｐＴＭ６１構築物によって置換されたｃｐ９を除くすべての内因性プラスミドを含有していることが示された。非感染性株ＧＣＢ７０５を、非感染性Ｂ．ブルグドルフェリの実験に使用した。天然プラスミド内容物についてのＰＣＲスクリーニングは、ＧＣＢ７０５がＢ３１−Ａ親と同じプラスミドを含有することを示した。プラスミドｌｐ２５、ｌｐ２８−１およびｌｐ３６は、感染性に不可欠であることが知られている。
【０１５９】
鞭毛の欠失。欠失は、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ｍＢｉｏ  ６（３）：ｅ００５７９−１５に記載されるように実施される。Ｂ．ブルグドルフェリＢ３１誘導体５Ａ１８ＮＰ１は、ｆｌｉＨおよびｆｌｉＩ変異体の生成に使用される感染性の、中程度に形質転換可能なクローンである。５Ａ１８ＮＰ１は、プラスミドｌｐ２８−４およびｌｐ５６が欠損し、推定制限修飾酵素をコードするｂｂｅ０２が破壊された遺伝子操作されたクローンである。ＦｌｉＨ変異体は、Ｈｉｍａｒ１ベースの自殺ベクターｐＧＫＴ−ＳＴＭ５またはｐＧＫＴ−ＳＴＭ１０を使用して、ランダムな、シグネチャータグ付きトランスポゾン変異誘発によって得られる。Ｂ．ブルグドルフェリ株を、６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウサギ血清および適切な抗生物質を補充したＢａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ  ＩＩ（ＢＳＫＩＩ）培地中、または３％のＣＯ２中３４℃で半固体寒天プレート上で成長させる。５Ａ１８ＮＰ１は、２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地中で培養され、トランスポゾン変異体は、カナマイシンおよび４０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの両方の存在下で培養される。加えて、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）は、補体トランスポゾン変異培養物に含まれる。各クローンのプラスミド内容物は、ルミネックスベースの手順を使用して決定することができる。
【０１６０】
相補的シャトルベクターは、構成的発現構築物ｐｆｌａＢ：：ｆｌｉＨ、ｐｆｌａＢ：：ｆｌｉＩ、およびｐｆｌａＢ：：ｆｌｉＨＩをシャトルベクターｐＫＦＳＳ１に挿入することによって構築される。簡潔に述べると、ｆｌａＢプロモーター（ＰｆｌａＢ）、遺伝子ｆｌｉＨおよびｆｌｉＩ、ならびに連続ｆｌｉＨＩ遺伝子クラスターは、操作された制限部位を有するプライマーを使用してＰＣＲによって増幅され、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）にクローニングされる。ＰｆｌａＢは、まず、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ部位でｐＫＦＳＳ１にサブクローニングされ、次いで、ｆｌｉＨ、ｆｌｉＩ、およびｆｌｉＨＩ遺伝子は、ＫｐｎＩ部位およびＰｓｔＩ部位でｆｌａＢプロモーターの３’末端に融合され、相補性プラスミドがもたらされる。結果として生じる構築物は、ＰＣＲ、制限パターン、およびＰＣＲ産生物の配列決定によって確認される。ＦｌｉＨ変異体およびｆｌｉＩ変異体は、相補的シャトルベクターで形質転換することによってトランス相補する。Ｂ．ブルグドルフェリの電気穿孔は、前述のように行われる。形質転換体は、ＰＣＲおよび配列決定によって確認される。
【０１６１】
ｆｌｉＨおよびｆｌｉＩ変異体、補体クローン、ならびに親株の形態学的、運動性、および泳ぐ能力は、暗視野顕微鏡検査下で１％メチルセルロースの存在および非存在下でＢＳＫＩＩ培地で判定される。
【０１６２】
診断分析のための染色血清。抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入される。ＰＥ抗マウスＩｇＥ、クローンＲＭＥ−１、カタログ番号４０６９０８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７抗マウスＩｇＭ、クローンＲＭＭ−１、カタログ番号４０６５２６、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＩｇＧ２ａ、クローンＲＭＧ２ａ−６２、カタログ番号４０７１１４、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＩｇＧ１、クローンＲＭＧ１−１、カタログ番号４０６６２０である。
【０１６３】
採血によって血液試料を調製する。４℃で５分間４００ＲＣＦでソフトスピンする。血漿をクリーンチューブ内に移動させる。４℃で１０分間１０，０００ＲＣＦでハードスピンする。毎週同じスキームを使用して、１０μＬの血漿をウェルプレート内に移動させる。可能であれば重複させる。Ｂｂを振り動かして、清浄なリザーバー内に注ぐ。マルチチャネルピペットを使用して、Ｖ字底プレート内の右端２つのカラム内に１５０μＬをピペットで移す。４℃で１０分間１５００ＲＣＦ／ｇでスピンする。
【０１６４】
染色を５０μｌの抗体溶液／試料で行い、５０μｌ／ｗｅｌｌの血清試料を２ｍｌのＰＢＳに入れて希釈する。暗がりの中で氷上で１８分間に染色する。ＰＢＳ１５０μｌを加え、４℃で６分間１５００ＲＣＦ／ｇでスピンする。上清をピペットで取り、ＰＢＳ２００μｌで２回洗浄し、４℃で６分間１５００ＲＣＦ／ｇでスピンする。
【０１６５】
フローサイトメトリーの場合、暗がりの中で室温で１０分間４％のＰＦＡ中に試料を固定する。直ちに分析する場合は、ＰＦＡで実行し、細胞を２４時間以上維持する場合は、２００μｌのＰＢＳで洗浄する。
【０１６６】
実施例３
ボレリア特異的ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥ媒介病理学の介入から治療的に便宜を得るライム病症例のサブセットを示す。
実施例１および２に記載されるように、フローサイトメトリーによってインタクトＢｂ上のすべての抗体サブタイプを検出することを可能にする包括的な抗アイソタイプパネルを使用する診断試験を開発した。全細菌を、Ｂｂ特異的抗体を含有する血清とともにインキュベートし、次いで細菌表面エピトープに結合させる。洗浄後、フローサイトメトリーによって分析される包括的な二次抗体パネルを使用して、結合したＢｂ特異的抗体のアイソタイプレパートリーをプロファイルし、Ｂｂ感染について陽性をスコアリングするための閾値を決定する（図１）。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のサブタイプなどの感染の古典的指標は、感染の４日目に早ければ、我々の診断方法で検出可能である。
【０１６７】
驚くべきことに、我々は、動物モデル、および感染後のより長い期間で分析されたＣＤＣ陽性患者からの試料の両方において、細菌病原体に対する予期しない応答である、Ｂｂに対するＩｇＥ抗体を発見した（表１）。Ｂｂ特異的ＩｇＥ抗体は、ライム病患者において以前に散発的に記録されているが、これにもかかわらず、現在の診断戦略ではＩｇＥを検査しない。現在の診断では、他のアイソタイプを除外するためにＢｂ特異的ＩｇＥ抗体を産生する個体は、Ｌｙｍｅに対して完全に陰性として分類され得る。
【０１６８】
肥満細胞はＩｇＥに結合し、有意な局所ヒスタミン放出を引き起こし、ＩｇＧ媒介性免疫応答を抑制しながら、ＩｇＥ媒介性免疫応答をさらに増幅する。肥満細胞ＩｇＥ受容体への抗原結合時の肥満細胞脱顆粒は、ヒスタミンおよび他のアレルギー因子放出をもたらし、広範な組織損傷を引き起こし、関節炎、不調、疲労、および認知障害を含む、ライム病において報告されている多くの徴候および症状において役割を果たし得る。したがって、Ｂｂに応答するＩｇＥの産生は、病因に影響を及ぼし、より包括的な試験の必要性を肯定する。
【０１６９】
現在の試験は、抗Ｂｂ  ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体のみを同定し、我々は、遺伝子感受性および免疫偏向のためにＩｇＧよりも多くのＩｇＥ抗体をＢｂに対して産生する個体が、現在の方法で陰性を試験することを提案する。したがって、それらは試験結果に基づいて治療が禁忌であるために、および１型応答ではなく２型応答をするために、治療を受けることも感染を解消することもできない。したがって、新しい包括的診断の開発が不可欠である。さらに、ＢｂへのＩｇＥの産生は、関節の腫脹、疲労、不調、認知障害など、Ｂｂ感染に対する明確な関連性を有しないライム病に関連するいくつかの臨床症状を説明し得る。
【０１７０】
現在、我々は患者の血清をスクリーニングして、Ｂｂ感染後のＩｇＥ産生の普及度を決定し、以下の質問について調査する。１）Ｂｂ感染に関連するライム病症状の２型ＩｇＥ媒介性免疫応答が原因であるか、および特定の細胞型または分子（例えば、ヒスタミン）によって媒介される病態であるか？および２）患者の血清中の抗Ｂｂ  ＩｇＥ抗体の検出が、診断の改善および治療的介入の通知に利用され得るか？
【０１７１】
重要なことに、ＩｇＥの産生および２型免疫応答の重症度は、異なる株のマウス間で大きく異なり、様々なライム病患者によって報告される症状の多様性は、この病気に罹患する各個体の遺伝子構成と関係していることを示唆する。アレルギー傾向は、長い間、家族に遺伝することが観察されてきた。仮説が正しければ、なぜライム病の症状の臨床的提示は患者間で大きく異なるのか、およびなぜ一部の患者は抗生物質治療後もこれらの症状に苦しみ続けるのかをよりよく理解することができるかもしれない。特定の対立遺伝子およびアレルギー障害の現在のゲノムワイド関連解析は、ライム病症状が解消したか、または解消しなかったＢｂ感染患者を分類する方法についての手がかりを与えることができる。
【０１７２】
【表１】
2022502656.tif 000002
【０１７３】
２０１７年に収集されたニューヨーク州ロングアイランドの患者および地方特有の健康な対照のライム病バイオバンクによって試料が提供された。患者６４０、６６３および６７３は、２つの時点で血液を採取され、連続的な結果がそれぞれ１および２として示されている。これら３名の患者を来院間にドキシサイクリンで治療した。他の患者は１回のみ採血を行った。患者６１１および６７４は、ＩｇＭおよびＩｇＧの両方について不定ＷＢ後の２層法を使用してライムについて陰性と診断されたが、他の確認された陰性よりも検出可能なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを有する。感染した患者は全員、Ｂｂに対するＩｇＥ抗体を作ることが見出されたが、絶対値は個体間でかなり異なる。Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  ＥＬＩＳＡは、Ｂ３１  Ｂｂの全細胞溶解物を使用し、一方、Ｃ−６ペプチドＥＬＩＳＡは、ＢｂからのＣ−６成分のみを使用する。ＮＥＧ＝陰性、ＰＯＳ＝陽性、ＩＴ＝不定である。
【０１７４】
実施例４
Ｂｂ感染のクリアランスおよび免疫反応に基づく病理学の緩和を目的とした免疫調節戦略。
我々の診断戦略は、有意なレベルのＢｂ特異的ＩｇＥを誘導する感染状態を特定した（図３および４）。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞、好塩基球、好酸球およびヒスタミン放出の動員とともに、２型免疫応答の特徴である。これは細菌病原体に対する予期しない応答であり、我々はＢｂ病原体との関連性に興味を持った。Ｂｂに対する２型免疫応答および標準的な抗生物質療法との組み合わせにおける治療免疫調節の意味を調査する。ライム病が治療することが困難であり、多くの罹患率を引き起こす限り、疾患を改善する可能性がある抗アレルギー化合物が同定される。
【０１７５】
インビボでのＩｇＥ対他の免疫グロブリンアイソタイプ抗体の生成は、複数の因子を伴い、まず、抗原活性化Ｂ細胞に結合し、免疫グロブリンクラスのＩｇＥへの切り替えを誘発するサイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１３を分泌する「ヘルパー」Ｔ細胞の活性化から始まる。抗原によるさらなる活性化は、ＩｇＥを分泌する血漿Ｂ細胞の形成をもたらす。分泌型ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球に結合し、ＩｇＥのＦｃ部分（ＦｃεＲＩ）に対する高親和性受容体を有する細胞であり、追加の受容体結合型ＩｇＥ抗体間で長期にわたる架橋を形成する。アレルゲン、ＩｇＥ、およびＦｃεＲＩ＋細胞間の相互作用は、これらの細胞を脱顆粒させ、ヒスタミンおよび他の分子を放出する。これらのアレルギー反応の炎症、腫脹および疼痛の大部分は、脱顆粒産生物に由来する。この経路は、考慮すべき様々な標的を提供し、各ステップは、効果的な治療的介入について検査することができる。多くの患者は、アレルギー型免疫応答から生じる可能性がある症状からの緩和を求め、多くの抗ヒスタミン剤が手頃な価格で広く入手可能であり、それらを治療計画に組み込むことを比較的容易にして、Ｂｂ感染における抗ヒスタミン剤治療の可能性を調査する。
【０１７６】
ヒスタミンは、４つの独自の受容体を有し、多くの生理学の非免疫学的側面に影響を及ぼす。マウスをＢｂに感染させ、診断免疫アッセイによってＩｇＥ産生を確認し、それらの関節の腫脹が解消されるか否かを確認するために様々な抗ヒスタミン剤でそれらを治療することによって、ライム病症状におけるヒスタミンの役割の性質を解明している。異なるヒスタミン受容体アンタゴニスト（Ｈ１：ジフェンヒドラミン、ロラタジン、Ｈ２：シメチジン、ラニチジン、Ｈ１および２：ドキセピン、Ｈ３：チオペラミド、クロベンプロピット）を使用することによって、どのヒスタミン関連病理が阻害され得るかを判定する。
【０１７７】
抗ヒスタミン剤のみが不十分である場合、肥満細胞脱顆粒に対して上流に作用し、マウスおよび／または患者におけるライム病に対するＩｇＥ媒介応答を低減するアプローチが使用される。肥満細胞は、このアプローチがアレルギーのいずれかを排除することができるか否かを判断するために、マウスモデル中で枯渇する。インビボ枯渇のために肥満細胞を除去する免疫療法的組み合わせは、単独の、または抗ＣＤ４７と組み合わせた、抗ｃキット抗体である。
【０１７８】
加えて、抗ＩｇＥ抗体の有効性が試験され、これは、ａ）ＩｇＥの組織レベルを低下させ、ｂ）ＩｇＥおよび肥満細胞の両方を排除し、ｃ）ＩｇＥ＋メモリＢ細胞を排除し得る。これらの研究は、Ｂｂに対する２型免疫応答の役割を明らかにし、ＩｇＥおよびヒスタミンがライム病の病因および症状提示に及ぼす影響を調べる。
【０１７９】
実施例５
免疫プロファイリングプラットフォームは、ライム病患者サブセットを、それらの免疫応答の種類およびそれらの臨床プレゼンテーションの特徴によって迅速に層別化する。
実施例１および２に記載されるように、我々は、血清中のすべてのＢｂ特異的抗体、それらのアイソタイプ、およびそれらの相対量の包括的な分析のための方法を開発した。本方法は、図１〜４に示されるように、フローサイトメトリーの力および分解能を利用して、血清中に見出されるＢｂ特異的抗体の、生きたＧＦＰを発現する個々のＢｂ細菌への結合を測定する。さらに、この技術は、生きた細菌に対する免疫応答の影響を測定し、Ｂｂ−免疫複合体および殺菌抗体のレベルの定量化を可能にする。この技術を使用して、我々は、現在の診断方法によって試験されておらず、したがって、ＩｇＭまたはＩｇＧ応答のみに焦点を当てた現在の診断において偽陰性に寄与し得る、Ｂｂに対する予期しない抗体応答を特定した。
【０１８０】
この方法を、個々の患者の血清中の様々なアイソタイプの抗Ｂｂ抗体の分布の体系的な特徴付けに適用し、次いで、各患者の臨床症状を、それらの体液性免疫応答の特定のパターンと相関させる。この目的のために、ヒト患者試料および治療履歴を収集し、診断アプローチを利用して、ライム病症状の広範な傘下にある患者を特定のサブグループに分類する。
【０１８１】
血清試料は、健全な対照から収集され、現在の血清学的アプローチを使用して、Ｂｂ抗体に対して陽性であった個体からの試料と比較される。確認された患者は、抗生物質治療で症状が解消された患者および持続的な症状の患者によってさらに分類される。抗体サブタイプ比率を検査して、治療に応答した患者または応答していない患者を区別するための指標を特定する。さらに、患者の血清試料は、早期感染における我々の診断戦略の性能を評価するために、特徴的な遊走性紅斑発疹を伴って提示時に収集される。我々の診断は、８週間にわたって毎週現在の血清診断と比較される。患者は、治療に対する応答についても追跡される。我々の新しい方法の感度を既存の診断と比較するために、試料は、従来の血清学的アプローチを使用して、感染の初期に現れる感染指標についてそれらが現れる前に分析される。ＩｇＥは、感染の初期の週に現在の血清学で陰性を試験する患者において特異的に検査される。
【０１８２】
実施例６
マラリア感染後の免疫プロファイリング
感染赤血球対非感染赤血球に結合するときに抗体を検出するこの免疫プロファイリング法の能力を試験するために、プラスモディウム・ベルゲイＡＮＫＡ（Ｐｂ−Ａ）モデルにおいて実験的脳性マラリア（ＥＣＭ）を発症するマウスからの血清を使用した。このＥＣＭのマウスモデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの６０〜１００％が、感染の脳相（６〜１０日目）中にヒトＣＭの臨床的特徴に類似する症状を発症する。ＥＣＭを発症しないマウスは代わりに、重度の貧血および高寄生虫血症を発症するのは、感染後１５日目以降であり、これもまた致死的である。１０６匹のＰｂ−Ａ寄生虫で感染したＣ５７ＢＬ／６マウスを、感染後３日目にＰＢＳまたは抗体のいずれかで処理し、それらのマウス由来の血清抗体を、６匹の感染マウスを試験した１日目からの感染赤血球への結合対未感染赤血球への結合について評価した。２０ｕｌの血清を５ｕｌの全血とともにインキュベートし、細胞を３０分間または一晩インキュベートし、次いで抗体型に対する二次抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各抗体型の未感染赤血球への結合は最小限であり、各抗体型のＧＦＰ陽性であった感染赤血球への結合が示されている。データを図７Ａ〜７Ｄに示す。
【０１８３】
実施例６
アスペルギルス感染後の免疫プロファイリング
アスペルギルスフミガーツスでの感染後３日目のマウス由来の血清を、アスペルギルスフミガーツスの円錐体とともに一晩または１時間インキュベートし、次いで、マウスＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧ２ａに対する抗体で染色した。ＩｇＧ２ａ対ＩｇＭでは、感染グループと非感染グループとの間であまり分離が示されなかったが、ＩｇＥ対ＩｇＧ２ａでは分離が示された。ＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１ではより良好な分離が見られ、陽性試料と陰性試料とを明確に区別するグループ間の最良の分離はＩｇＥ対ＩｇＧ１であった。データを図８Ａ〜８Ｄに示す。
【０１８４】
参考文献
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【０１８９】
Ｔｈａｎｇａｍ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｈｕｎｔ  ｆｏｒ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１８７３（２０１８）．
【０１９０】
Ｈａｔｚｉａｇｅｌａｋｉ，Ｅ．，Ａｄａｍａｋｉ，Ｍ．，Ｔｓｉｌｉｏｎｉ，Ｉ．，Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｉｓ，Ｇ．＆Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ，Ｔ．Ｃ．Ｍｙａｌｇｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ／Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｆａｔｉｇｕｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒ  Ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ｆｏｃａｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ？Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３６７，１５５−１６７（２０１８）．
【０１９１】
Ｊａｉｓｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤ４７  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａｖｏｉｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  １３８，２７１−８５（２００９）．
【０１９２】
Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤ４７  ｉｓ  ａｎ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３８，２８６−９９（２００９）．
【０１９３】
Ｌａｇａｓｓｅ，Ｅ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．ｂｃｌ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１０４７−５２（１９９４）．
【０１９４】
Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＣＤ４７−ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰａ）ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，６６６２−７（２０１２）．
【０１９５】
Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＩＲＰα  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，８８−９１（２０１３）．
【０１９６】
Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｒｅｍｏｖａｌ：ａ  ｎｅｗ  ｏｂｓｔａｃｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２，５８−６７（２０１２）．
【０１９７】
Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＣＤ４７  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｅｌｌ  １４２，６９９−７１３（２０１０）．
【０１９８】
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【０１９９】
Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‘Ｄｏ  ｎｏｔ  Ｅａｔ  Ｍｅ’Ｓｉｇｎａｌ，ＣＤ４７，Ｉｓ  Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｔａｒｇｅｔ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ００６
【０２００】
Ｓｉｋｉｃ，Ｂ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−Ｈｕｍａｎ，Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−Ｃｌａｓｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４７  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．ＪＣＯ１８０２０１８（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．１８．０２０１８
【０２０１】
Ｋｅｎｅｄｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｌｅｎｈａｒｔ，Ｔ．Ｒ．＆Ａｋｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｏｕｔｅｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６，１−１９（２０１２）．
【０２０２】
相互参照
本出願は、２０１８年１０月１日に出願された米国仮出願第６２／７３９，６２６号、２０１９年６月１７日に出願された米国仮出願第６２／８６２，３９７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2022502656.tif 000003
【図２Ａ】
2022502656.tif 000004
【図２Ｂ】
2022502656.tif 000005
【図２Ｃ】
2022502656.tif 000006
【図２Ｄ】
2022502656.tif 000007
【図２Ｅ】
2022502656.tif 000008
【図３Ａ】
2022502656.tif 000009
【図３Ｂ】
2022502656.tif 000010
【図３Ｃ】
2022502656.tif 000011
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2022502656.tif 000013
【図３Ｆ】
2022502656.tif 000014
【図３Ｇ】
2022502656.tif 000015
【図４Ａ】
2022502656.tif 000016
【図４Ｂ】
2022502656.tif 000017
【図５】
2022502656.tif 000018
【図６Ａ】
2022502656.tif 000019
【図６Ｂ】
2022502656.tif 000020
【図６Ｃ】
2022502656.tif 000021
【図７Ａ】
2022502656.tif 000022
【図７Ｂ】
2022502656.tif 000023
【図７Ｃ】
2022502656.tif 000024
【図７Ｄ】
2022502656.tif 000025
【図８Ａ】
2022502656.tif 000026
【図８Ｂ】
2022502656.tif 000027
【図８Ｃ】
2022502656.tif 000028
【図８Ｄ】
2022502656.tif 000029
【図９】
2022502656.tif 000030
【図１０】
2022502656.tif 000031
【図１１】
2022502656.tif 000032
【国際調査報告】
2022502656.tif 000033
2022502656.tif 000034