(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を反応させるステップと、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製するステップと、脂質バッチを処理してＣＰＰ修飾リポソームを得るステップと、リポソーム凍結乾燥物を経口剤形に組み込むステップと、を含む、経口剤形の製造方法に関する。本発明はさらに、経口剤形、並びに治療法で使用される経口剤形に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ  少なくとも１つのＣＰＰを少なくとも１つの第１の脂質と反応させて、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを得るステップと、
ｂ  前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製して、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るステップと、
ｃ  少なくとも
ｃ１  規定量の前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートと、
ｃ２  規定量の少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と
を含む脂質バッチを調製するステップと、
ｄ  前記脂質バッチを処理して、２ｍＶ超１０ｍＶ未満のゼータ電位を有するＣＰＰ修飾リポソームを得るステップと、
ｅ  前記ＣＰＰ修飾リポソームを凍結乾燥して、リポソーム凍結乾燥物を得るステップと、
ｆ  前記リポソーム凍結乾燥物を経口剤形に組み込むステップと、
を含む経口剤形の製造方法であって、
前記精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物中の非共役の第１の脂質の量は、前記組成物中の前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満である、経口剤形の製造方法。
【請求項２】
前記ＣＰＰが、直鎖又は環化ポリアルギニン、直鎖又は環化ペネトラチン、直鎖又は環化ＴＡＴ（転写トランス活性化因子）ペプチド、直鎖又は環化ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、直鎖又は環化ｐＶＥＣ、直鎖又は環化トランスポータン及び直鎖又は環化ＭＰＧ、それらの二量体、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の脂質が、ステロイド（コレステロール及びその誘導体を含む）、脂肪酸、リン脂質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＰＰ修飾リポソーム中の前記ＣＰＰの量が、前記リポソーム中の前記第１及び第２の脂質の累積量に対して、４モル％以下、好ましくは２．５モル％以下である、請求項１〜３の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製して、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るステップが、
ｂ１  前記非共役の第１の脂質から前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを分離するステップと、
ｂ２  前記非共役のＣＰＰ及び／又は１つ以上のＣＰＰを担持するコンジュゲートから、任意選択的に、前記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを分離するステップと、
を含む、請求項１〜４の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質バッチを処理して、ＣＰＰ修飾リポソームを得るステップが、高圧均質化、押出、エタノール注入及び／又は二重非対称遠心分離（ＤＡＣ）を含む、請求項１〜５の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＰＰが環状ペプチドである、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＰＰ修飾リポソームが、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＺ平均直径を有する、請求項１〜７の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＰＰ修飾リポソームを凍結乾燥して、リポソーム凍結乾燥物を得るステップが、
ｅ１  前記ＣＰＰ修飾リポソームと少なくとも１つの凍結保護剤との混合物を調製するステップ
を含む、請求項１〜８の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結保護剤が、脂質１ｇあたり０．０１〜２ｇの比率で前記混合物中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１の脂質に対して共役された少なくとも１つのＣＰＰと、
少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と、
少なくとも１つの医薬活性成分と、
を有するＣＰＰ修飾リポソームを含む経口剤形であって、
前記ＣＰＰ修飾リポソームは、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＺ平均直径、及び好ましくは＞２ｍＶ〜＜１０ｍＶの範囲の正のゼータ電位を有する、経口剤形。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得られる、請求項１１に記載の経口剤形。
【請求項１３】
前記ＣＰＰ修飾リポソーム中の非共役の第１の脂質の量が、前記ＣＰＰ修飾リポソーム中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満、好ましくは３モル％未満である、請求項１１又は１２に記載の経口剤形。
【請求項１４】
前記ＣＰＰ修飾リポソーム中のＣＰＰの量が、前記リポソーム中の第１及び第２の脂質の累積量に対して４モル％以下、好ましくは２．５モル％以下である、請求項１１〜１３の少なくとも１項に記載の経口剤形。
【請求項１５】
錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末、液剤、顆粒剤、ペレット、薄膜、発泡性製剤、ペースト、トローチ剤、チューインガム、ゲル、噴霧剤又はその組み合わせから選択され、及び／又は
治療法で使用される、前記請求項１１〜１４の少なくとも１項に記載の経口剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口剤形の製造方法、経口剤形及び該経口剤形の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口剤形は、当技術分野で周知である。経口剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、懸濁剤、発泡性製剤、ペレット、チューインガム、トローチ剤、顆粒剤、薄膜、噴霧剤及び粉末が挙げられる。医薬剤形の経口摂取は、非常に便利であり、治療アドヒアランスを改善する。
【０００３】
欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）及びその他の規制によれば、経口剤形は、一定の投与単位の均一性を有する必要がある。「一組の経口剤形内の各単位は、表示量の周囲の狭い範囲内の活性物質含有量を有さなければならない」（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．９．４０）ことが要求されている。「活性物質含有量」とは、該物質が必要な量で投与単位に存在し、化学的に変化せず、例えば、分解され、誘導体化され、又は他の分子と共有結合を形成することがないことを意味している。投与単位の均一性を達成するために、経口剤形の製造方法では、最終剤形中の活性物質の量及び化学的完全性に影響を及ぼし得る全ての要因を考慮に入れなければならない。経口剤形の製造方法の全体的な複雑さが増すにつれて、最終製品中の活性物質の均一性を確保することがより困難になる。化学反応を含む経口剤形の製造方法では、反応性賦形剤の存在又は反応性官能基を持つ活性物質の使用により、この複雑さが増大するため、製造業者が最終製品の均一性を保証し、化学的副反応を抑制することはより困難となる。
【０００４】
経口剤形は、活性医薬成分（ＡＰＩ）を含み得る。最も認知度が高く、商業的に成功しているＡＰＩとして、抗体及び酵素などのペプチド及びタンパク質が挙げられる。これらのＡＰＩは、ペプチド鎖を形成する複数のアミノ酸で構成されている。多くのアミノ酸は、側鎖に反応性官能基を有している。例えば、システインはチオール基を、リジンはアミノ基を側鎖にそれぞれ有している。他のアミノ酸は、側鎖にさらに反応性官能基を有している。ペプチド及びタンパク質ＡＰＩの側鎖反応基に多様性があるため、複数の副反応が発生する可能性がある。これらの種類のＡＰＩを用いた経口剤形の製造は、剤形中の変化していないＡＰＩの量を減少させ、かつ製品の均一性に影響を与える望ましくない副反応を起こしやすいため、特に困難である。望ましくない副反応が発生したペプチド及びタンパク質は、対象体内で致命的なアレルギー反応を引き起こし得る免疫原性産物を形成する可能性がある。
【０００５】
一方、ペプチド及びタンパク質は、経口バイオアベイラビリティを確保するために複雑な剤形を必要とする。これは、ポリペプチド及びタンパク質などの分子サイズが大きいペプチドに特に当てはまる。複雑な剤形は複雑な製造方法を必要とするため、望ましくない副反応を排除し、かつ投与まで安定性を確保することが困難となる。同じ特性、すなわち反応基及び低い固有バイオアベイラビリティを有する他のＡＰＩも同様である。複雑な方法では、関連する副反応が起こらないように中間段階を制御することは困難である。したがって、何らかの副反応や他の望ましくないプロセスが生じない中間体を使用する方法があることが好ましい。本発明の１つの目的は、従来技術の方法の上記の課題を克服する経口剤形の製造方法を提供することである。更なる目的は、優れた均一性を有する剤形を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、経口剤形の製造方法を含み、該方法は、
ａ  少なくとも１つのＣＰＰ（細胞膜透過ペプチド）を少なくとも１つの第１の脂質と反応させて、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを得るステップと、
ｂ  ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製して、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るステップと、
ｃ  少なくとも
ｃ１  規定量のＣＰＰ−脂質コンジュゲートと、
ｃ２  規定量の少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と
を含む脂質バッチを調製するステップと、
ｄ  脂質バッチを処理して、２ｍＶ超１０ｍＶ未満のゼータ電位を有するＣＰＰ修飾リポソームを得るステップと、
ｅ  ＣＰＰ修飾リポソームを凍結乾燥して、リポソーム凍結乾燥物を得るステップと、
ｆ  リポソーム凍結乾燥物を経口剤形に組み込むステップと、
を含み、
精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物中の非共役の第１の脂質の量は、組成物中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満である。
【０００７】
本発明者らは、該方法により、製造中及び製造後の副反応に対して特に耐性があり、均一性に優れ、再現性の高い製品を提供する経口剤形の製造が可能であることを見出した。驚くべきことに、該方法で得られる経口剤形は、優れた製品均一性を有する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、経口剤形、特に本発明の方法によって得られる経口剤形を含み、該経口剤形は、
第１の脂質に対して共役された少なくとも１つのＣＰＰと、
少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と、
少なくとも１つの医薬活性成分（ＡＰＩ）と、を有するＣＰＰ修飾リポソームを含み、
該ＣＰＰ修飾リポソームは、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＺ平均直径、及び好ましくは＞２ｍＶ〜＜１０ｍＶの範囲の正のゼータ電位を有する。
【０００９】
これらの剤形は、特にペプチド及びタンパク質を活性物質として使用する場合に、優れた均一性を有することが見出された。ＡＰＩ含有量の均一性とは別に、均一性は、リポソームのゼータ電位及びサイズにおいてバッチ間で変動が小さいことによっても確認される。
【００１０】
本発明によれば、「ペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸を一体に連結する少なくとも１つのペプチド結合を有する。「ポリペプチド」は少なくとも８個のアミノ酸を有する。「タンパク質」は少なくとも３０個のアミノ酸を有する。本発明は、ＡＰＩとしての「ポリペプチド」及び「タンパク質」に特に有用である。
【００１１】
「リポソーム」という用語は、脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞を指す。リポソームは、水溶液の一部を親油性二重層膜内にカプセル化するという独自の特性により、ＡＰＩの送達に使用できる。親油性化合物は、脂質二重層に溶解することができ、このようにして、リポソームは、親油性化合物及び親水性化合物の両方を担持することができる。分子を作用部位に送達するために、脂質二重層は、細胞膜などの他の二重層と融合して、リポソームの内容物を送達することができる。
【００１２】
ゼータ電位は、当技術分野で周知の方法によって決定できる。ゼータ電位は、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液を使用して、リポソームを脂質濃度０．９５ｍｇ／ｍｌに希釈した後に決定できる。マルバーンＴＭ（マルバーンインスツルメンツ社、ウスターシャー州、英国）のゼータサイザーナノＺＳの自動モードの初期設定は、測定数＝３、実行時間＝１０ｓ、実行数＝１０、平衡時間＝６０ｓ、屈折率溶媒が１．３３０、屈折率ポリスチレン製キュベット１．５９０、粘度＝０．８８７２ｍＰａ・ｓ、温度＝２５℃、誘電率＝７８．５Ｆ／ｍ、後方散乱モード（１７３°）、自動電圧選択、スモルコフスキー方程式とするように選択できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で使用されるＣＰＰは、ペネトラチン、ＴＡＴ（転写トランス活性化因子）、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、ポリアルギニン（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２を含む）、ｐＶＥＣ、トランスポータン、ＭＰＧ及びそれらの組み合わせから選択されてよい。本発明で使用されるＣＰＰは、環化されていてもよく、又は直鎖であってもよく、二量体化されていても、二量体化されていなくてもよい。ＣＰＰは、以下の配列からなってもよく、又は以下の配列を含んでもよい。ペネトラチンは、配列番号１を含んでよく、ＴＡＴは、配列番号２を含んでよく、ＭＡＰは、配列番号３を含んでよく、Ｒ９は、配列番号４を含んでよく、ｐＶＥＣは、配列番号５を含んでよく、トランスポータンは、配列番号６を含んでよく、及び／又はＭＰＧは、配列番号７を含んでよい。上記のＣＰＰは、上記の配列の機能的誘導体を含む。機能的誘導体は、上記の配列、もしくはそれと少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるか、又はそれを含むＣＰＰを含む。任意選択に、機能的誘導体は、追加のアミノ酸を含んでよい。
【００１４】
一実施形態では、本発明で使用されるＣＰＰは、正に帯電及び／又は環化されている。環化ＣＰＰは、本発明の概念内で有利な直鎖ＣＰＰよりも反応性が低く、より安定であるという利点を有する。環状ペプチドは、直鎖ＣＰＰよりも酵素切断に対してより安定であるため、腸溶性コーティングなしで胃の通過に耐えることもできる場合がある。本明細書で使用される場合、「環化」という用語は、１つの環系のみを有するペプチドに関連するものとして解釈されるべきではなく、すなわち、本発明は、単環ペプチドに限定されない。したがって、本発明は、２つ以上の環系が互いに共有結合を形成するシクロペプチドを含む。さらに、シクロペプチドはまた、環系の一部ではないアミノ酸を含んでよく、すなわち、本発明は、分岐シクロペプチドを含む。シクロペプチドは、好ましくは単環ペプチドであり、より好ましくは非分岐単環ペプチドである。さらに、ＣＰＰは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又はそれらの混合物から構成されてよく、直鎖ＣＰＰの場合、Ｄ−アミノ酸が好ましい。
【００１５】
一実施形態では、ＣＰＰは、それぞれ約９．５及び１１の等電点を有するリジン及び／又はアルギニン部位の大部分を含む。それらの追加のアミノ基又はグアニジン基のため、これらの２個のアミノ酸は、中性、ひいては弱塩基性の条件下でも正に帯電する。したがって、大部分が上記２個の特定のアミノ酸の部位からなるＣＰＰは、中性及び弱塩基性の条件下でも正に帯電する。本明細書において、「大部分」という用語は、ＣＰＰ分子を形成するアミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％がリジン及び／又はアルギニン部位であることを意味する。これにより、ＣＰＰが中性及び弱塩基性の条件下で正に帯電すること、つまり７を超える等電点を有することが保証される。したがって、本発明の特定の実施形態では、ＣＰＰは、７．０を超え、好ましくは７．５を超え、より好ましくは８．０を超え、特に好ましくは８．５を超える等電点を有する。この文脈では、ＣＰＰの等電点は、ＣＰＰを形成するアミノ酸の等電点の算術平均である。
【００１６】
本発明の特定の実施形態では、ＣＰＰは、２〜１９個、好ましくは３〜１６個、より好ましくは４〜１４個、特に好ましくは６〜１２個のアルギニン部位、並びにチロシン、スレオニン、セリン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン及びシステインからなる群から選択される１つ以上の部位を含む。例えば、ＣＰＰは、環系に９個のアルギニン部位及び１つのシステイン部位を含んでよく、そして環状システインＲ９誘導体（例えば、配列番号８、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣ）と呼ばれる。別の好ましい例は、環系に９個のアルギニン部位及び１つのリジン部位を含むシクロペプチドであり、これは、環状Ｒ９Ｋ誘導体（配列番号９、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫ）と呼ばれる。
【００１７】
本発明のＣＰＰは、二量体化ＣＰＰを含み、ホモ二量体及びヘテロ二量体は、本開示の範囲内にある。ＣＰＰの二量体化は、当技術分野で知られている任意の手段によって達成できる。特定の実施形態では、ＣＰＰは、トリペプチドＫＡＫを介して二量体化される。
【００１８】
シクロペプチドを形成するアミノ酸は、タンパク質性アミノ酸に限定されない。本明細書において、アミノ酸は、当技術分野で知られている任意のアミノ酸から選択でき、そしてそれぞれのＤ−エナンチオマー、Ｌ−エナンチオマー又はそれらの任意の混合物を含んでよい。
【００１９】
ＣＰＰは、リポソーム中の脂質の総量、すなわち第１の脂質と第２の脂質の総量に対して、少なくとも０．０５モル％、少なくとも０．１モル％又は少なくとも０．２モル％の量でＣＰＰ修飾リポソーム中に存在してよい。最小量のＣＰＰは、膜の浸透を向上させるために必要であると考えられる。しかしながら、ＣＰＰの最大量を超えると、望ましくない副反応が発生する可能性があり、そして含有量の均一性、均質性及びリポソームの安定性が低下する。したがって、最大量は、リポソーム中の脂質、すなわち第１の脂質と第２の脂質の総量に対して４モル％、２．５モル％又は１．５モル％に制限されてよい。
【００２０】
本発明によれば、ＣＰＰを少なくとも１つの第１の脂質に共役させてＣＰＰ−脂質コンジュゲートを得る。第１の脂質は、ステロイド（コレステロール及びその誘導体を含む）、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミン、少なくとも８個の炭素原子の炭素鎖長を有する炭化水素、リン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、糖脂質、エーテル脂質、カロテノイド、グリセリド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてよい。共役は、共有結合の形成を含んでよい。炭化水素は、好ましくは、マレイミド活性エステル、アミンアルコール、ハロゲン化物、チオール、ケトン又はアルデヒド、三重及び／又は二重炭素結合などの、化学結合のための少なくとも１つの活性化基を含む。
【００２１】
一実施形態では、脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール及び／又は炭化水素は、８〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２０個の炭素原子又は１６〜２０個の炭素原子の炭素鎖長を有してよい。脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール及び／又は炭化水素は、飽和又は不飽和であってよい。飽和化合物は、不飽和化合物より化学的に安定であるという利点を有する。
【００２２】
一実施形態では、リン脂質は、合成、半合成又は天然のリン脂質、又はそれらの組み合わせであってよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシット、ホスファチジルセリン、セファライン、ホスファチジルグリセロール、リゾリン脂質、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい第１の脂質は、Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥ［（２Ｒ）−３−（（（（４，４６−ジオキソ−４６−（２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシ）−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５、２８，３１，３４，３７，４０，４３−トリデカオキサ−３−アザヘキサテトラコンチル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート（ＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル）］、Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥ［（２Ｒ）−３−（（（（４６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，４４−ジオキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−３，４３−ジアザヘキサテトラコンチル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］（ナトリウム塩）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ナトリウム塩）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）（ナトリウム塩）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）及びそれらの組み合わせから選択されてよい。
【００２３】
一実施形態では、第１の脂質は活性化される。第１の脂質の活性化は、ＣＰＰ−脂質コンジュゲート形成中にＣＰＰと第１の脂質との反応を促進することができる。活性化された第１の脂質は、活性化基を含む脂質が挙げられる。活性化基は、活性化基のない脂質よりＣＰＰに対してより大きな反応性を有する基であってよい。適切な活性化基としては、活性化された重合性基（分子量が１０００ｇ／ｍｏｌを超える）及び小分子活性化基（分子量が１０００ｇ／ｍｏｌまで）が挙げられる。
【００２４】
活性化された重合性基としては、マレイミド基（Ｍａｌ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、テトラフルオロフェノール（Ｔｆｐ）及びパラ−ニトロフェノールエステルなどの活性エステルから選択される１つ以上の基に共有結合的に連結しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミン、アルコール、ケトン、アルデヒド、チオール、ハロゲン化合物、三重及び二重炭素結合、並びにそれらの組み合わせを含み得る。したがって、活性化基は、重合性部分と、互いに共有結合的に結合している反応基とを含んでよく、これにより重合性部分は、反応基を脂質に連結する。例示的な活性化された重合性基としては、ＳＭ（ＰＥＧ）２４（ＰＥＧ化、長鎖ＳＭＣＣ架橋剤）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）−リンカー、６−マレイミドヘキサン酸リンカー及びそれらの組み合わせが挙げられる。重合性部分の長さは、サイズ及びＰＤＩなどのリポソームの特性に影響を与える可能性がある。したがって、活性化された重合性基の好ましいＰＥＧ重合性部分は、８〜５０個の個々のＰＥＧ単位の長さを有してよい。
【００２５】
好ましい活性化された第１の脂質としては、Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥ［（２Ｒ）−３−（（（（４，４６−ジオキソ−４６−（２，３，５，６−テトラフルオロフェノキシ）−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５、２８，３１，３４，３７，４０，４３−トリデカオキサ−３−アザヘキサテトラコンチル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート（ＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル）］、Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥ［（２Ｒ）−３−（（（（４６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，４４−ジオキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０−ドデカオキサ−３，４３−ジアザヘキサテトラコンチル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）プロパン−１，２−ジイルジステアレート］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロ−ヘキサン−カルボキサミド］（ナトリウム塩）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール−アミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロ−ヘキサン−カルボキサミド］（ナトリウム塩）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
第２の脂質は、ステロイド（コレステロール及びその誘導体を含む）、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミン、少なくとも８個の炭素原子の炭素鎖長を有する炭化水素、スフィンゴ脂質、セラミド、糖脂質、エーテル脂質、カロテノイド、グリセリド、リン脂質及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてよい。
【００２７】
一実施形態では、脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール及び／又は炭化水素は、８〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個の炭素原子又は１６〜２０個の炭素原子の炭素鎖長を有してよい。脂肪酸、脂肪アミン、脂肪アルコール及び／又は炭化水素は、飽和又は不飽和であってよい。飽和化合物は、不飽和化合物より化学的に安定であるという利点を有する。
【００２８】
一実施形態では、リン脂質は、合成、半合成又は天然のリン脂質、又はそれらの組み合わせであってよい。好ましいリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシット、ホスファチジルセリン、セファライン、ホスファチジルグリセロール、リゾリン脂質、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２９】
第２の脂質は、第１の脂質と同じであってもよいし、異なってもよい。好ましい実施形態では、第２の脂質は第１の脂質と異なっている。その違いには、第２の脂質の少なくとも１つ又は全てが活性化基を有していないこと、つまり第２の脂質が非活性化され得ることが含まれてもよい。これは、そうでない場合に方法を実行する間に起こり得るあらゆる副反応を抑制し、本発明の１つの目的を達成するために役立つ。
【００３０】
第２の脂質の好ましい組み合わせとしては、（第２の脂質の総量に対して）少なくとも５０モル％、少なくとも６０モル％又は少なくとも７０モル％の少なくとも１つのリン脂質を含む。これらの脂質の量は、第２の脂質の総量に対して最大９９モル％、又は９７モル％又は９５モル％に制限されてよい。代替的又は追加的に、第２の脂質は、第２の脂質の総量に対して１モル％〜２０モル％又は４モル％〜１２モル％の範囲であり得る、コレステロールなどのステロイドの量を含んでよい。
【００３１】
本発明のＣＰＰ−脂質コンジュゲートは、以下の一般的な構造を有してよい。
【００３２】
ＦＬ−ＡＧ−ＣＰＰ（式Ｉ）
【００３３】
この式では、ＦＬは第１の脂質を表し、ＡＧは任意選択な活性化基を表し、ＣＰＰは細胞膜透過ペプチドを表す。ハイフンは共有結合を表す。換言すれば、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートは、ＣＰＰに共有結合的に付着している第１の脂質を含み、この共有結合は、活性化基を介して、又は活性化基もしくは他の中間基を介さず直接に、任意選択に達成することができる。
【００３４】
好ましいＣＰＰ−脂質コンジュゲートは、１０００〜１００００ｇ／モル、好ましくは１２００〜５０００ｇ／モル又は１５００〜３５００ｇ／モルの範囲の分子量を有する。ＣＰＰ修飾リポソーム中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの相対重量は、ＣＰＰ修飾リポソームの総重量に対して１〜２５ｗｔ％の範囲にあってよい。好ましい下限には、２ｗｔ％、３ｗｔ％及び５ｗｔ％が含まれる。好ましい上限には、２０ｗｔ％、１５ｗｔ％及び１０ｗｔ％が含まれる。
【００３５】
少なくとも１つのＣＰＰを少なくとも１つの第１の脂質と反応させて、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを得るステップは、反応容器内で少なくとも１つのＣＰＰと少なくとも１つの第１の脂質との混合物を調製することを含んでよい。混合物は、液体媒体を含んでよい。
【００３６】
反応混合物は、第１の脂質よりもモル過剰のＣＰＰを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＣＰＰのモル比は、反応混合物中の第１の脂質のモル比を、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍又は少なくとも２．５倍上回る。第１の脂質よりも過剰なＣＰＰを使用すると、反応後の反応混合物中の未反応の第１の脂質の量が減少する。これには特定の利点がある。１つの利点は、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製して精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るための次のステップに要する労力が、より少ないということである。それは、ＣＰＰとＣＰＰ−脂質コンジュゲートとの物理化学的差異が、第１の脂質とＣＰＰ−脂質コンジュゲートとの物理化学的差異より大きいためである。したがって、未反応の第１の脂質をＣＰＰ−脂質コンジュゲートから分離することより、未反応のＣＰＰをＣＰＰ−脂質コンジュゲートから分離する方が簡単である。さらに、特に第１の脂質が第１の脂質とＣＰＰとの反応をさらに促進するために少なくとも１つの活性化基を有する場合、未反応の第１の脂質は、アミノ酸と反応する傾向がある。生成物中に適切な量の未反応の第１の脂質があると、ＡＰＩが第１の脂質と望ましくない反応を起こすリスクが高まる。これは特にペプチド及びタンパク質ＡＰＩに当てはまる。
【００３７】
別個の反応、すなわちリポソームが形成される前にＣＰＰと第１の脂質を反応させることで、所定量のＣＰＰを正確に含む、より均一な経口剤形が得られることが見出された。また、該方法はＣＰＰ及び第１の脂質の使用量が少ないため、経済的に効率的である。従来技術では、ＣＰＰ修飾リポソームは、ＣＰＰをリポソームと反応させることによって製造され、すなわち、ＣＰＰと脂質との反応は、リポソームが製造された後に実行される。本発明においては、まずＣＰＰ−脂質コンジュゲートが製造され、次に、予め製造されたＣＰＰ−脂質コンジュゲートを含むリポソームが形成される。こうすることで、リポソーム中に存在するＣＰＰ−脂質コンジュゲートの量は、目的に応じて正確に調整できる。上述したように、リポソーム中のＣＰＰ（及びＣＰＰ−脂質コンジュゲート）の量は、ＡＰＩの膜透過、特にペプチド及びタンパク質に対する好ましい効果を最大にする一方、ＣＰＰの最大量を超えているためにリポソームの安定性と均一性がリスクにさらされないように、バランスを取る必要がある。リポソームが形成される前に別個の反応でＣＰＰと第１の脂質を反応させることにより、それぞれのリポソームに許容される最大量を超えるリスクを冒すことなく、より大量のＣＰＰをリポソームで使用できることが見出された。したがって、この特定の一連の方法ステップは、リポソームの均一性及び安定性に悪影響を与えるリスクを冒すことなく、経口バイオアベイラビリティに対するＣＰＰの好ましい効果を向上させる。特に、冷凍乾燥／凍結乾燥中のリポソームの安定性は、本発明のリポソームに関して非常に高い。
【００３８】
好ましくは、少なくとも１つのＣＰＰを少なくとも１つの第１の脂質と反応させて、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを得るステップは、第１の液体媒体中にＣＰＰ及び第１の脂質の溶液を形成することを含む。適切な第１の液体媒体としては、芳香族及び脂肪族アルコール、ハロゲン化又は非ハロゲン化アルカン、カルボン酸エステル及びアミド、並びにそれらの組み合わせから選択される有機溶媒などの有機溶媒が挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るために、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製するステップを含む。このステップは、本発明の１つの目的を達成するため、すなわち経口剤形の均一性を向上させ、副反応、特に脂質とＡＰＩとの反応を回避するために重要である。前述したように、経口剤形の均一性は、ＡＰＩが製造及び保管中に化学的に変化しないことを含む。該方法は、ＣＰＰを第１の脂質と反応させるステップを含む。したがって、第１の脂質は、ペプチドに対して特定の反応性を有する。ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを形成後に精製すると、望ましくない副反応を減らすことができることが見出された。精製後、ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物中の非共役の第１の脂質の量は、組成物中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満であることが好ましい。好ましい実施形態では、上記組成物中の非共役の第１の脂質の量は、３モル％未満、１モル％未満又はさらに０．５モル％未満である。非共役の第１の脂質の量を減らし、これによって反応性の第１の脂質の量を本質的に減らすことにより、望ましくない副反応の量が減る。好ましい実施形態では、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物だけでなく、経口剤形で使用できる最終ＣＰＰ修飾リポソームも、これらの制限された量の非共役の第１の脂質を有する。
【００４０】
ＣＰＰ−脂質コンジュゲートの精製は、例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は当業者に周知の他の適切な方法によって行うことができる。一般的には、非共役の第１の脂質及びＣＰＰ共役の第１の脂質という２つの物質は非常に類似した物理化学的な特性を有するため、非共役の第１の脂質をＣＰＰ共役の第１の脂質から分離するためには、コンジュゲートを非常に注意深く精製する必要がある。ＣＰＰ−脂質コンジュゲートの精製中に、未反応のＣＰＰも除去する必要があり、それはＣＰＰと脂質との物理化学的な相違のため、容易に実現することができる。
【００４１】
好ましい実施形態では、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを精製して、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を得るステップは、
ｂ１  非共役の第１の脂質からＣＰＰ−脂質コンジュゲートを分離するステップと、
ｂ２  非共役のＣＰＰ及び／又は１つ以上のＣＰＰを担持するコンジュゲートから、任意選択的に、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートを分離するステップと、
を含む。
【００４２】
ステップｂ１及びｂ２は、別個のステップで実行する必要がなく、ＨＰＬＣなどの適切な方法で共に実行できる。
【００４３】
本発明の方法は、
少なくとも
ｃ１  規定量の上記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートと、
ｃ２  規定量の少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と
を含む脂質バッチを調製するステップを含む。
【００４４】
精製後、精製ＣＰＰ−脂質コンジュゲート組成物を使用して、第２の脂質とともに脂質バッチを製造する。第２の脂質は依然として共役していない可能性がある。本発明の利点は、規定量のＣＰＰ−脂質コンジュゲートを使用して脂質バッチを製造できることである。従来技術では、ＣＰＰ−脂質コンジュゲートはリポソーム調製後に形成されるため、最終生成物中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの正確な量は、不確定のままである。好ましい実施形態では、非ＣＰＰ共役の第２の脂質のＣＰＰ−脂質コンジュゲートに対する重量比は、少なくとも７対１、より好ましくは少なくとも１５対１、最も好ましくは少なくとも２０対１である。規定量のＣＰＰ−脂質コンジュゲートを脂質バッチ中で使用する利点は、この方法では、剤形の望ましくない副作用のリスクを増やす可能性のある過剰なＣＰＰの追加によるリスクを冒すことなく、最大有用量に非常に近い量のＣＰＰを使用できることである。上記の比を選択することにより、本発明の方法において更なる処理のための安定なリポソームを得ることが示されている。
【００４５】
特定の実施形態では、脂質バッチを調製するステップは、第２の液体媒体中で、ＣＰＰ−脂質コンジュゲート及び非ＣＰＰ共役の第２の脂質の混合物（例えば、溶液）を形成することを含む。好ましい第２の液体媒体は、芳香族及び脂肪族アルコール、ハロゲン化又は非ハロゲン化アルカン、カルボン酸エステル及びアミド、並びにそれらの組み合わせから選択される。第１及び第２の液体媒体は、同じであってもよいし、異なってもよい。
【００４６】
次のステップとして、該方法は、脂質バッチを処理して、２ｍＶ超１０ｍＶ未満のゼータ電位を有するＣＰＰ修飾リポソームを得るステップを含む。一般的に、より高いゼータ電位は、リポソームの特性を向上させてＡＰＩの膜浸透を促進するのに役立つ。しかしながら、ゼータ電位が高すぎると、リポソームは、不安定となり、均質性が低下する。安定性を危険にさらすことなくゼータ電位を最大限界に近づけるように調整できることは、本発明の１つの利点である。リポソームに使用される脂質及びＣＰＰの正確な種類に応じて、ゼータ電位の正確な値は異なる。特定の実施形態では、ゼータ電位は、最大８ｍＶ又は最大６ｍＶである。本発明の方法は、リポソームの異なるバッチ間のゼータ電位の変動が非常に小さいという利点を有する。
【００４７】
好ましい実施形態では、脂質バッチを処理して、ＣＰＰ修飾リポソームを得るステップは、高圧均質化、押出、エタノール注入及び／又は二重非対称遠心分離（ＤＡＣ）を含む。これらのプロセスは、当技術分野で周知である。
【００４８】
一実施形態では、脂質バッチを処理して、ＣＰＰ修飾リポソームを得るステップは、
ｄ１  少なくとも１つの医薬活性成分をＣＰＰ修飾リポソームに組み込むステップ
を含む。
【００４９】
本発明は、タンパク質及び少なくとも８個のアミノ酸を有するポリペプチドなどのペプチドに特に有用である。本発明の方法によれば、より大きな分子であっても良好な取り込み効率を可能にする。この理論に拘束されることを望むものではないが、リポソームは、膜の組成及びそれらの製造方法に基づいて、良好な膜流動性を有する。膜流動性は、ＡＰＩの取り込み、凍結乾燥及び膜を通過するＡＰＩの送達に関連すると考えられている。したがって、膜流動性に悪影響を与える可能性のあるいかなる成分も回避する必要がある。このような成分としては、テトラエーテル脂質が挙げられる。リポソーム中のテトラエーテル脂質の量は、好ましくは、リポソーム中の脂質の総量に対して１モル％未満の量に制限される。この量は、０．１モル％未満ひいては０．０１モル％未満に制限されることが好ましい。
【００５０】
ＡＰＩが取り込まれるとき、リポソームが既にＣＰＰ修飾されていることは、本発明の重要な態様である。後の段階においてＣＰＰでリポソームを修飾する従来技術の方法では、温度の上昇が必要であるが、これはＡＰＩの安定性に悪影響を与える。また、活性化脂質は、従来技術の方法ではＡＰＩを共有結合的に修飾する可能性がある。したがって、本発明の方法はＡＰＩ分解を回避し、ペプチド及びタンパク質に非常に有用である。
【００５１】
本発明において有用なＡＰＩとしては、タンパク質及びペプチド、特にポリペプチドが挙げられる。好ましいＡＰＩは、１０００〜１５００００ｇ／モル、好ましくは１００００〜１０００００ｇ／モル又は３００００〜８００００ｇ／モルの範囲の分子量を有する。好ましいＡＰＩは、抗癌剤（例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニボルマブ）、免疫調節剤（例えば、アダリムマブ、エタナセプト、サイトカイン、インターフェロン、グラチラマー酢酸塩）、インスリン、ＧＬＰ−１類似体、ソマトスタチン及びその類似体、ｈＧｈ、オクトレオチドなどのホルモン、バンコマイシン及びダプトマイシンなどのグリコペプチド系抗生物質、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ  Ｂなどの肝炎治療用ペプチド薬、並びにグルカゴン、ロイプロリド、オクトレオチド、バソプレッシン、セツキシマブなどの細胞受容体に作用するペプチド及び抗体から選択されてよい。
【００５２】
適切なＡＰＩとしては、バンコマイシン、グラチラマー酢酸塩、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ  Ｂ、オクトレオチド、インスリン、リラグルチド、並びにエキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、タスポグルチド、セマグルチドなどのその他のＧＬＰ（グルカゴン様ペプチド）類似体及び抗体（例えば、エタネルセプト、ペグフィルグラスチム、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、エポエチンアルファ、トラスツズマブ、ラニビズマブ、ベータインターフェロン、オマリズマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー阻害剤、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン及びそれらの断片ポリペプチド、アポリポタンパク質−Ｅ、エリスロポエチン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、表皮成長因子、骨形成成長因子、骨刺激タンパク質、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラクシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、様々なウイルス、細菌又は毒素に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、シクロスポリン、リファンピシン、ロピナビル、リトナビル、テラバンシン、オリタバンシン、ダルババンシン、ビスホスホネート、イトラコナゾール、ダナゾール、パクリタキセル、ナプロキセン、カプサイシン、アルブテロール硫酸塩、テルブタリン硫酸塩、ジフェンヒドラミン塩酸塩、クロルフェニラミンマレイン酸塩、ロラチジン塩酸塩、フェキソフェナジン塩酸塩、フェニルブタゾン、ニフェジピン、カルバマゼピン、ベータメタゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、１７ベータ−エストラジオール、ケトコナゾール、メフェナム酸、ベクロメタゾン、アルプラゾラム、ミダゾラム、ミコナゾール、イブプロフェン、ケトプロフェン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、フェニトイン、テストステロン、フルニソリド、ジフルニサル、ブデソニド、フルチカゾン、グルカゴン様ペプチド、Ｃ−ペプチド、カルシトニン、黄体形成ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、ロイプロリド、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ−Ｉａ、サルグラモスチム、アルデスロイキン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−ｎ３アルファ−プロテイナーゼ阻害剤、エチドロネート、ナフ���レリン、絨毛性ゴナドトロピン、プロスタグランジンＥ２、エポプロステノール、アカルボース、メトホルミン、デスモプレシン、シクロデキストリン、抗生物質、抗真菌薬、ステロイド、抗癌剤、鎮痛剤、抗炎症薬、駆虫薬、抗不整脈薬、ペニシリン、抗凝固薬、抗鬱薬、抗糖尿病薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン剤、降圧薬、抗ムスカリン剤、抗酸菌症治療薬、抗腫瘍薬、ＣＮＳ活性剤、免疫抑制剤、抗甲状腺剤、抗ウイルス剤、抗不安鎮静薬、睡眠薬、神経抑制薬、収斂薬、ベータアドレナリン受容体遮断剤、血液製剤及び代替物、心臓変力薬、造影剤、副腎皮質ステロイド、鎮咳薬、去痰薬、粘液溶解薬、利尿薬、ドーパミン作動薬、抗パーキンソン病薬、止血薬、免疫薬、脂質調節薬、筋弛緩薬、副交感神経興奮薬、パラチロイドカルシトニン、プロスタグランジン、放射性医薬品、性ホルモン、抗アレルギー薬、興奮剤、食欲抑制薬、交感神経様作用薬、甲状腺剤、血管拡張薬、キサンチン、ヘパリン、治療用オリゴヌクレオチド、ソマトスタチン及びそれらの類似体などのホルモン、並びに薬理学的に許容される有機塩及び無機塩又はそれらの金属複合体からなる群から選択される薬学的に活性な薬剤が挙げられる。
【００５３】
本発明の方法は、ＣＰＰ修飾リポソームを凍結乾燥して、凍結乾燥物を得るステップを含む。好ましい凍結乾燥物は、含水量が制限され、その含水量は、好ましくは５ｗｔ％以下又は３ｗｔ％未満である。含水量は、カールフィッシャー滴定又は含水量分析装置などの自動システムによって決定できる。ＣＰＰ修飾リポソームの液剤と比較して、冷凍乾燥／凍結乾燥リポソームは、より優れた長期安定性を有している。本発明のリポソームの１つの重要な特性は、リポソームの均一性が凍結乾燥中に有意に変化しないことである。一方では、この特性は、上記のように本発明の方法によって影響を受ける。他方では、この特性を達成するために、凍結保護剤の選択、より具体的にはその量が重要である。
【００５４】
ＣＰＰ修飾リポソームを凍結乾燥して、リポソーム凍結乾燥物を得るステップは、
ｅ１  上記ＣＰＰ修飾リポソームと少なくとも１つの凍結保護剤との混合物を調製するステップ
を含んでよい。
【００５５】
混合物中の脂質の量に関連して、凍結保護剤は最適な量の範囲があることが示されている。好ましくは、凍結保護剤の量は、脂質１ｇあたり０．０１〜２ｇ、好ましくは脂質１ｇあたり０．０２〜１ｇ又は脂質１ｇあたり０．０３〜０．５ｇの範囲である。好ましい実施形態では、最小値は、脂質１ｇあたり少なくとも０．０３ｇである。最大値は、脂質１ｇあたり凍結保護剤が０．３、０．２又は０．１ｇである。この文脈において、「脂質」は、組成物中の共役又は非共役の第１及び第２の脂質の総量を指す。凍結保護剤の量が少ないと、リポソームが不安定になり、Ｚ平均値が低下し、それによって製品の均一性に影響を与えることが分かっている。凍結保護剤の量を増やしても、好ましい効果がさらに増加することはないため望ましくなく、また多くの凍結保護剤は糖尿病患者に適していないため、量を制限する必要がある。したがって、凍結保護剤の量は、脂質１ｇあたり０．５ｇを超えないことが好ましい。実施形態では、脂質の量に対する凍結保護剤の量に関するこれらの制限は、経口剤形及びリポソームにも同様に適用される。
【００５６】
凍結保護剤は、糖類、好ましくは単糖類又は二糖類から選択されてよく、糖及び糖アルコールを含む。凍結保護剤は、スクロース、マンニトール、グルコース、トレハロース、ラクトース、パラチノース及びそれらの組み合わせから選択されてよい。
【００５７】
好ましい実施形態では、ＣＰＰ修飾リポソームのゼータ電位及び／又はＺ平均値は、水中でのリポソーム凍結乾燥物の再調製後に有意に変化しない。特に、ゼータ電位の変化及び／又はそのＺ平均値は、凍結乾燥前のそれぞれの値と比較して、５％以下、好ましくは３％以下である。これは、本発明の方法によって得られるリポソームが特に安定であり、そして優れた膜流動性を有することを示している。
【００５８】
ＣＰＰ修飾リポソームと凍結保護剤の混合物は、溶媒中で調製されてよい。溶媒は、少なくとも５０ｗｔ％の水又は少なくとも７５ｗｔ％又は少なくとも９５重量％の水を含む溶媒などの水性溶媒であってよい。溶媒は、２〜１２、４〜１０又は５．５〜８．５のｐＨ値に緩衝されてよい。好ましい実施形態では、溶媒はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）である。
【００５９】
最後に、凍結乾燥は、当技術分野で知られているように、ＣＰＰ修飾リポソームと凍結保護剤の混合物の冷凍乾燥を含む。
【００６０】
リポソーム凍結乾燥物を組み込むステップは、以下に限定はされないが、錠剤、丸剤、カプセル剤、ペレット、液剤（懸濁剤を含む）、粉末、薄膜、発泡性製剤、ペースト、トローチ剤、チューインガム、ゲル、噴霧剤又は顆粒剤の調製を含むことができる。
【００６１】
本発明によれば、固体経口剤形は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、及び／又は少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤、及び／又は少なくとも１つのリパーゼ阻害剤をさらに含んでよい。これらの物質を剤形に組み込むことができる。上記の物質は、リポソームの内側ルーメン、リポソームの脂質二重層（例えば、共有結合又は非共有結合によって二重層の一部を形成する）又はリポソームの外側（例えば、剤形の他の一部）に存在してよい。好ましくは、上記少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤は、ソルビタンモノステアレート、トリパルミチン、パルミチン酸セチル、アルギン酸塩、オレイン酸エチル、Ｃ８トリグリセリド、Ｃ１０トリグリセリド、セルロース、二糖類、単糖類、オリゴ糖類、ステアリン酸マグネシウム、コーンスターチ、クエン酸塩、酒石酸、アミノ酸の酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに、上記少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、アプロチニン、ダイズトリプシン阻害剤、バシトラシン、リココール酸ナトリウム、ベスタチン、ロイペプチン、シスタチン、カモスタットメシル酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに、上記少なくとも１つのリパーゼ阻害剤は、好ましくは、オルリスタット、リプスタチン、キチン、キトサン、サポニン、フラボノイド配糖体、ポリフェノール、エベラクトンＡ及びＢ、エステラスチン、バリラクトン、パンクリシン、プロアントシアニジン、ビブララクトン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６２】
ＣＰＰ修飾リポソームは、非常に安定で均一であるという利点を有している。好ましくは、ＣＰＰ修飾リポソームは、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＺ平均直径を有する。Ｚ平均直径の用語及び決定は、当業者に周知である。この値は、ＩＳＯ  ２２４１２：２００８で定義されている。好ましい実施形態では、ＣＰＰ修飾リポソームは、７５ｎｍ又はより好ましくは１００ｎｍの最小Ｚ平均直径を有する。最大Ｚ平均直径は、２２５ｎｍに制限されてよい。ＣＰＰ修飾リポソームのＰＤＩは、０．５未満、０．４５未満、０．４未満又は０．３未満であってよい。
【００６３】
好ましい実施形態では、ＣＰＰ修飾リポソームのゼータ電位及び／又はＺ平均値は、水中でのリポソーム凍結乾燥物の再調製後に有意に変化しない。特に、ゼータ電位の変化及び／又はそのＺ平均値の変化は、凍結乾燥前のそれぞれの量と比較して、５％以下、好ましくは３％以下である。これは、本発明の方法によって得られるリポソームが特に安定であることを示している。
【００６４】
ＡＰＩはＣＰＰ修飾リポソームに埋め込まれてよい。ＡＰＩの親水性に応じて、ＡＰＩは主に、環境が水性であり得るリポソーム内又は環境がより親油性であるリポソームの二重層内に存在する。タンパク質及びポリペプチドの場合、ＡＰＩは主に、リポソーム内に存在し得る。リポソームでは、第２の脂質は、二重層の一部を形成する。
【００６５】
ＣＰＰは、リポソーム中の脂質の総量、すなわち第１の脂質と第２の脂質の総量に対して、少なくとも０．０５モル％、少なくとも０．１モル％又は少なくとも０．２モル％の量でＣＰＰ修飾リポソーム中に存在してよい。ＡＰＩの膜の浸透を向上させるためには、最小量のＣＰＰが必要であると考えられる。しかしながら、ＣＰＰの最大量を超えると、望ましくない副反応が発生する可能性があり、そして含有量の均一性及びリポソームの安定性が低下する。したがって、最大量は、リポソーム中の脂質、すなわち第１の脂質と第２の脂質の総量に対して４モル％、２．５モル％又は１．５モル％に制限されてよい。
【００６６】
経口剤形中のＣＰＰ修飾リポソームは、正のゼータ電位を有してよく、好ましくは、＞２ｍＶ〜＜１０ｍＶの範囲である。実施形態では、ゼータ電位は、最大８ｍＶ又は最大６ｍＶである。このゼータ電位を持つリポソームが安定であることが証明されており、それらのリポソームは、冷凍乾燥及びその後の再調製後でもゼータ電位を保持する。
【００６７】
好ましくは、ＣＰＰ修飾リポソーム中の非共役の第１の脂質の量は、上記リポソーム中のＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満である。好ましい実施形態では、上記リポソーム中の非共役の第１の脂質の量は、３モル％未満、１モル％未満又はさらに０．５モル％未満である。非共役の第１の脂質の量を減らし、これによって反応性の第１の脂質の量を本質的に減らすことにより、望ましくない副反応の量が減り、分解に対してリポソームをより安定にする。
【００６８】
本発明はまた、経口剤形に関し、該経口剤形は、本明細書に記載されるように、
−第１の脂質に対して共役された少なくとも１つのＣＰＰと、
−少なくとも１つの非ＣＰＰ共役の第２の脂質と、
−少なくとも１つの医薬活性成分（ＡＰＩ）と、
を有するＣＰＰ修飾リポソームを含み、
上記ＣＰＰ修飾リポソームは、５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲のＺ平均直径、及び好ましくは＞２ｍＶ〜＜１０ｍＶの範囲の正のゼータ電位を有する。該経口剤形は、本明細書に記載されるような方法によって得ることができる。
【００６９】
本発明は、経口剤形を含み、上記ＣＰＰ修飾リポソーム中の上記非共役の第１の脂質の量は、上記ＣＰＰ修飾リポソーム中の上記ＣＰＰ−脂質コンジュゲートの総モル量に対して５モル％未満、好ましくは３モル％未満である。
【００７０】
経口剤形は、その特定の種類に特に限定されない。固体経口剤形が好ましい。いくつかの実施形態では、経口剤形は、腸溶コーティングの形態などの腸溶性剤形であり、これにより経口摂取後の胃液からＡＰＩを保護することができる。剤形は、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、ペレット又はそれらの組み合わせであってよい。
【００７１】
本発明に係る治療方法は、それを必要とする対象に、有効量のＡＰＩを含む本発明の経口剤形を投与するステップを含む。対象はヒトであってよい。実施形態では、本発明の経口剤形は、治療法又は診断法で使用するための組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明に従って調製されたＣＰＰ修飾リポソームと、ＣＰＰをリポソームに直接結合することによって得られたＣＰＰ修飾リポソームとの比較を示す。
【図２】本発明に従って調製されたリポソームの同じバッチ間におけるゼータ電位の変動の少なさを示す。
【図３】本発明に従って調製されたリポソームの異なるバッチ間におけるゼータ電位の変動の少なさを示す。
【図４】リポソームの特性に関する異なるリポソーム調製法に対する温度の影響を示す。
【図５】凍結保護剤としてのスクロースの異なる量での凍結乾燥プロセス前後のＺ平均値の比較を示す。
【図６】凍結保護剤として異なる量のスクロースを使用する場合の凍結乾燥プロセスの前後のリポソーム特性（サイズ、ＰＤＩ）の比較を示す。
【図７】凍結乾燥プロセス前後のＣＰＰ−リポソームのゼータ電位の比較を示す。
【図８】凍結保護剤として異なる量のスクロースを使用する場合の凍結乾燥後のＣＰＰ−リポソームのＺ平均値及びＰＤＩを示す。
【図９】ＣＰＰの遡及的カップリングのために活性化された第１の脂質を含むリポソームの調製後の修飾ＡＰＩ（バンコマイシン）の同定を示す。
【図１０】ＡＰＩ（バンコマイシン）と活性化された第１の脂質のコンジュゲートの構造を示す。
【図１１】異なる緩衝液でのリポソームサイズの比較を示す。
【図１２】異なる緩衝液でのＰＣＩの比較を示す。
【図１３】異なる緩衝液でのゼータ電位の比較を示す。
【図１４】異なるＡＰＩを使用する場合のリポソームサイズの比較を示す。
【図１５】異なるＡＰＩを使用する場合のＰＣＩの比較を示す。
【図１６】異なるＡＰＩでのゼータ電位の比較を示す。
【図１７Ａ】活性化された脂質Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥを含むインスリンのリポソーム製剤の高分解能質量スペクトルを示す。
【図１７Ｂ】活性化された脂質Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥを含むインスリンのリポソーム製剤の高分解能質量スペクトルを示す。
【図１８Ａ】Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥの構造を示す。
【図１８Ｂ】Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥの構造を示す。
【実施例】
【００７３】
環状Ｒ９−ペプチド（Ｒ９Ｃ及びＲ９Ｋ）の合成
ペプチドの合成は、０．８９ｍｍｏｌ／ｇの容量のクロロ−（２’−クロロ）トリチルポリスチレン樹脂において行った。ローディングは、樹脂１ｇあたり０．８ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ又はＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを使用して、３当量のＤＩＰＥＡを有するＤＣＭ中で２ｈ行った。過剰な２−クロロトリチル官能基は、１７：２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ混合物でＭｅＯＨをロードすることによってクエンチした。Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを過剰な７当量のｆｍｏｃ−アミノ酸、６．６当量のＨＢＴＵ及び４当量のＤＩＰＥＡとカップリングさせる９つの連続的なステップを行い、続いてＤＭＦ中の２０％ピペリジンでの処理によるＦｍｏｃ基の除去を行った。これらのステップの間に、ＤＭＦで樹脂を徹底的に洗浄した。７：２：１のＤＣＭ／トリフルオロエタノール／酢酸の混合物によって側鎖保護ペプチドを分裂させた。分裂液をロータリーエバポレーター上でトルエンと３回共蒸発させた。側鎖保護ペプチドを３ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＦに溶解した。４当量のＰｙＡＯＰ及びＤＩＰＥＡを用いて、ＲＴで一晩環化を行った。
【００７４】
水（３％ｖ／ｖ）によって反応を停止した後、溶液を開始体積の５０〜１００分の１に濃縮し、側鎖保護シクロペプチドを冷たいｔ−ブチルメチルエーテルに注ぐことにより沈殿させた。沈殿した保護シクロペプチドを乾燥させ、続いてＴＦＡ中に５％ジチオエタノールの混合物で脱保護した。ジエチルエーテルで沈殿させた後、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（登録商標）ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＲＰ−Ｃ１８ｅカラム（１００×３ｍｍ）を使用したＨＰＬＣでシクロペプチドを精製した。水と、０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルとを２ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離液として使用した。
【００７５】
ＣＰＰ−脂質−コンジュゲートの合成
５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＦに溶解したマレイミド−ＰＥＧ（１２）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に、３当量のＣＰＰ（環状Ｒ９−ペプチド）及び１０等量のＤＩＰＥＡを加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏの１：２混合物で希釈し、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（登録商標）ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＲＰ−Ｃ１８ｅカラム（１００×３ｍｍ）を使用してＨＰＬＣを介して精製した。水と、０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルとを２ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離液として使用した。
【００７６】
リポソームの調製
脂質混合物の調製
まず、各脂質（ＥＰＣ、コレステロール、マレイミド−ＰＥＧ（１２）−ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン、ＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル）をメタノール又はクロロホルムに溶解して原液（７〜１０ｍｇ／ｍｌ）を得た。ＣＰＰ−脂質コンジュゲートも、７ｍｇ／ｍｌの濃度でメタノールに溶解した。必要な量の各原液を各比率で混合し、有機溶媒を４０℃に加熱した窒素流で蒸発させた。
【００７７】
得られた脂質混合物を凍結乾燥機（ＡｄＶａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ  ＸＬ−７０、ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１ｈ乾燥させた。
【００７８】
二重非対称遠心分離
ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒＴＭ（ＤＡＣ１５０．１  ＣＭ４１、Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、ハム、ドイツ）を使用して二重非対称遠心分離によってリポソームを調製した。リポソームを調製する前に、２ｍｌの反応チューブ内の脂質混合物（総脂質質量１８ｍｇ）に２０ｍｇのガラスビーズ（Φ０．７５〜１ｍｍ）を加えた。リポソームは、特別なバイアルホルダーを使用し、二重非対称遠心分離機を用いて３００ｒｐｍで高速混合することによって調製した。異なる量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は薬液（薬物含有リポソーム調製用、バンコマイシンの場合２０ｍｇ／ｍｌ、インスリンの場合、１ｍｇ／ｍｌ）を（それぞれ５０μｌと１００μｌ）加えた後に、連続して２回（３０分間及び５分間）実行した。これに続いて、１５０μｌのＰＢＳを加えた後に、３回目は５分間実行した。
【００７９】
リポソームの特徴をゼータサイザー測定によって決定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５カラム）によりリポソームを精製し、リポソームの特性を再度測定した。
【００８０】
リポソーム調製後のＣＰＰの結合（カップリング）（比較）
１％のマレイミド−ＰＥＧ（１２）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ）又はＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むリポソームを調製した。必要な環状ＣＰＰ（ｃｙｃＲ９Ｃ又はｃｙｃＲ９Ｋ）をＰＢＳ（０．５〜２ｍｇ）に溶解させ、リポソーム懸濁液に加え、（室温〜５０°Ｃで）一晩インキュベートした。リポソームの特徴をゼータサイザー測定によって決定した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ５カラム）により遊離ＣＰＰを除去し、リポソームの特性を再度測定した。
【００８１】
ゼータサイザー測定
ＭａｌｖｅｒｎＴＭ（マルバーンインスツルメンツ社、ウスターシャー州、英国）のゼータサイザーＮａｎｏＺＳを使用して、全てのリポソーム製剤の粒子サイズ、ＰＤＩ及びゼータ電位を室温で測定した。自動モードを使用してｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液で脂質濃度０．０７６ｍｇ／ｍｌに希釈した後に、サイズ及びＰＤＩを測定した。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液で脂質濃度０．９５ｍｇ／ｍｌに希釈した後に、ゼータ電位を測定した。マルバーンＴＭ（マルバーンインスツルメンツ社、ウスターシャー州、英国）のゼータサイザーナノＺＳの自動モードの初期設定は、測定数＝３、実行時間＝１０ｓ、実行数＝１０、平衡時間＝６０ｓ、屈折率溶媒１．３３０、屈折率ポリスチレン製キュベット１．５９０、粘度＝０．８８７２ｍＰａ・ｓ、温度＝２５℃、誘電率＝７８．５Ｆ／ｍ、後方散乱モード（１７３°）、自動電圧選択、スモルコフスキー方程式であった。
【００８２】
冷凍乾燥
固体リポソーム調製物を得るために、リポソームをＶｉｒｔｉｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰｌｕｓＸＬ−７０凍結乾燥機で冷凍乾燥させた。一次乾燥を−２０℃で２日間行い、続いて二次乾燥を０℃で少なくとも６時間行った。異なる量のスクロースを凍結保護剤として使用した。手短に言えば、リポソームを上記のように調製し、必要な量のスクロースを加えた。リポソーム懸濁液を５０μｌのアリコートに分配し、冷凍乾燥させた。冷凍乾燥生成物の品質を評価するために、リポソームを５０μｌのＰＢＳで再水和し、サイズ、ｚ平均値及びＰＤＩを決定した。
【００８３】
図面の説明
コンジュゲートとリポソーム製造後カップリングのゼータ電位の比較（図１）
最も高いゼータ電位は、本発明の共役及び合成戦略によって達成できる。リポソーム調製後のＣＰＰカップリングでは、大過剰のＣＰＰを使用しても、同じ高いゼータ電位値は得られない。結果を図１に示している。リポソーム調製のための事前に合成された秤量済みコンジュゲートによる本発明の方法は、３．５ｍＶの範囲で非常に高いゼータ電位値を生じることが分かる。ゼータ電位のこのような高い値は、リポソーム調製後にコンジュゲートを合成する従来の調製技術を用いて、ＣＰＰの異なる量（ｅｑ＝第１の脂質に対する当量）では到達できなかった。特に、８当量のＲ９Ｃを使用すると、わずかに正のゼータ電位しか達成できなかった。
【００８４】
ゼータ電位のバッチ内変動（図２）
図２は、本発明に従って調製されたリポソームの同じバッチの試料間のゼータ電位の変動が非常に小さいことを示している。次の表に、基礎データを示す。
【００８５】
【表１】
2022502392.tif 000002
【００８６】
ゼータ電位のバッチ間変動（図３）
図３は、本発明に従って調製されたリポソームの異なるバッチ間のゼータ電位の変動が非常に小さいことを示している。
【００８７】
２つの異なるリポソーム製造プロセス（バッチ１及び２）のゼータ電位の比較が示されている。この図は、本発明の製造方法によるゼータ電位の高い再現性を強く強調している。
【００８８】
リポソームの製造は温度に依存しない（図４）
ＣＰＰリポソームと、リポソーム製造後にＣＰＰがカップリングされたリポソームとのゼータ電位を比較する。ゼータ電位が低いことから、不完全なカップリングが明確に示されている。したがって、このグラフは、製造中の温度に関係なく、本発明の方法による一定の高いゼータ電位を伴うリポソーム製造の高い再現性を示している。
【００８９】
凍結乾燥前後のＺ平均値（図５）
凍結保護剤としての脂質１ｍｇあたり０．３９ｍｇのスクロースで冷凍乾燥したＣＰＰ−リポソームのＺ平均値を比較する。冷凍乾燥プロセスの前後でＺ平均値が一定であることから、凍結乾燥の成功が実証されている。
【００９０】
凍結乾燥前後のサイズ及びＰＤＩ（図６）
凍結保護剤としての脂質１ｍｇあたり０．３９ｍｇのスクロースで冷凍乾燥したＣＰＰ−リポソームのサイズ及びＰＤＩを比較する。冷凍乾燥プロセスの前後でサイズ及びＰＤＩが一定であることから、凍結乾燥の成功が実証されている。
【００９１】
凍結乾燥前後のゼータ電位（図７）
凍結保護剤としての脂質１ｍｇあたり０．３９ｍｇのスクロースで冷凍乾燥したＣＰＰ−リポソームのゼータ電位を比較する。冷凍乾燥前後のゼータ電位が一定であることから、凍結乾燥の成功が実証されている。
【００９２】
凍結保護剤として様々な量のスクロースで冷凍乾燥したＣＰＰ−リポソームのＺ平均値及びＰＤＩ（図８）
凍結保護剤として様々な量のスクロース（脂質１ｍｇあたり０．００３９ｍｇ〜０．３９ｍｇスクロース）で冷凍乾燥したＣＰＰ−リポソームのＺ平均値及びＰＤＩを比較する。少量のスクロース（脂質１ｍｇあたり０．００７８及び０．００３９ｍｇのスクロース）で冷凍乾燥した製剤のリポソームＺ平均値及びＰＤＩが大幅に増加したことから、凍結乾燥の限界が実証されている。
【００９３】
活性化された第１の脂質を含むリポソームの調製後の修飾ＡＰＩ（バンコマイシン）の同定（図９）
ＣＰＰ−リポソームを含むＡＰＩの調製後と、ＣＰＰの遡及的カップリングのための活性化された第１の脂質（ＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステル）を含むリポソームを含むＡＰＩの調製後とのＡＰＩ（バンコマイシン）の質量スペクトルを比較する。
【００９４】
３／１／１のＭｅＯＨ／ＡＣＮ／水＋０．１％ギ酸でリポソームを溶解した。高分解能質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳＱＴｏｆ質量分析計に直接注入して記録した。
【００９５】
Ａ）ＣＰＰ−リポソームを含むＡＰＩの質量スペクトルである。番号が付けられたピークは、次のように対応している。１は、リポソーム調製前に合成ならびに精製されたＴｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥ及びＲ９Ｋ−ペプチドのＣＰＰ−脂質コンジュゲートの［Ｍ＋３Ｈ］３＋ピークに対応しており、２は、バンコマイシンのイオン化で発生するバンコマイシンの断片であるデスバンコサミン−バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋ピークに対応しており、３は、バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋及び［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークに対応している。
【００９６】
Ｂ）ＣＰＰの遡及的カップリングのための活性化された第１の脂質を含むリポソームを含むＡＰＩの質量スペクトルである。番号が付けられたピークは、次のように対応している。１は、３の電荷を荷電しているＴｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥ及びバンコマイシンのコンジュゲートに対応するピークに対応している。これは、ｍ／ｚ９６６．５７でのこのシグナルの断片化によって確認され、主にバンコマイシンに対応するドーターシグナルが生成された（図９Ｄ）。２は、バンコマイシンのイオン化で発生するバンコマイシンの断片であるデスバンコサミン−バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋ピークに対応しており、３は、バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋ピークに対応している。
【００９７】
Ｃ）ｍ／ｚ９６６．５７でのシグナルの衝突誘起分解（ＣＩＤ）後の質量スペクトル（ドーターシグナル）であり、Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥ及びバンコマイシンのコンジュゲートに対応している。ＰＥＧ（１３）−ジステアロイルホス−ファチジルエタノールアミン−テトラフルオロフェニルエステルとバンコマイシンの非断片化コンジュゲートの親ピーク（番号２が付けられている）に加えて、ＣＩＤ断片は、主にバンコマイシンに対応するシグナルであり、１は、バンコマイシンの［Ｍ＋２Ｈ］２＋ピークに対応しており、３は、デスバンコサミン−バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋ピークに対応しており、そして４は、バンコマイシンの［Ｍ＋Ｈ］＋ピークに対応している。
【００９８】
活性化された第１の脂質による修飾ＡＰＩの構造（図１０）
活性化された第１の脂質を含むリポソームの調製後に同定されたＴｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥとバンコマイシンのコンジュゲートの構造（図９に記載されているようにＭＳ分析によって検出された）である。この図は、リポソーム調製の前に遊離の活性化された第１の脂質を除去することによって、このようなＡＰＩ修飾を回避することができる、本発明で主張される調製方法の高い利点を示している。
【００９９】
緩衝液とＡＰＩの変化に対するリポソームの堅牢性（図１１〜１６）
本発明のリポソームは、均一性に優れている。これは、異なる緩衝液又は活性成分を使用しても、重要なリポソームの特性が変化しないことを含む。
【０１００】
上記のように調製されたリポソームを異なる緩衝液に懸濁し、それらのサイズ、ＰＤＩ及びゼータ電位を測定した。図１１、１２及び１３からは、ｐＨが５．４から７．２に大幅に変化したにもかかわらず、これらのリポソームパラメータが本質的に変化していないことが確認される。
【０１０１】
別の実験では、異なる活性剤、すなわちオクトレオチドとバンコマイシンを使用してリポソームを作成した。どちらの場合も、２０ｍｇ／ｍｌのＡＰＩを使用した。図１４、１５及び１６は、重要なリポソームパラメータであるサイズ、ＰＤＩ及びゼータ電位がほとんど影響を受けていないことを示している。
【０１０２】
データから、本発明のリポソームが非常に堅牢であり、様々な異なる組成物及び環境にわたって本質的に一定のリポソーム特性を可能にすることが確認される。
【０１０３】
インスリン含有リポソームの質量スペクトル（図１７Ａ〜１８Ｂ）
図１７Ａ及びＢは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＧＳ−２−ＸＳ  ＱＴｏｆで取得された、後続のリポソーム表面修飾のための準備中の活性化された脂質を含むインスリンのリポソーム製剤の高分解能質量スペクトルを示している。
【０１０４】
図１７Ａは、Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥを含むリポソーム製剤に関する。ｍ／ｚ１９３６．４２０に、インスリンとそのナトリウム付加物のｚ＝３ピーク、ｍ／ｚ１８０３．３２９に、共有結合的に修飾されたインスリン（Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥとの反応による）及び対応するナトリウム付加物のｚ＝４シグナルが見られる。図１８Ａは、Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥの構造を示している。Ｔｆｐ−ＰＥＧ１３−ＤＳＰＥは、テトラフルオロフェニル部位の置換によってアミノ官能基と反応することができる。
【０１０５】
図１７ＢはＭａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥを含むリポソーム製剤を示している。ｍ／ｚ１９３６．４２０に、インスリンとそのナトリウム付加物ｚ＝３ピーク、ｍ／ｚ１８２７．５６９に、共有結合的に修飾されたインスリンのｚ＝４シグナル（Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥとの反応による）が見られる。図１８Ｂは、Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥの構造を示している。Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＤＳＰＥは、マレイミド官能基でのマイケル付加によりチオール官能基と反応することができる。
【０１０６】
図１７Ａ及び１７Ｂは、リポソーム調製の前に遊離の活性化された第１の脂質を除去することによって、ＡＰＩ修飾を回避することができる本発明の調製方法の高い利点を示している。
【図１】
2022502392.tif 000003
【図２】
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【図３】
2022502392.tif 000005
【図４】
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【図５】
2022502392.tif 000007
【図６】
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【図７】
2022502392.tif 000009
【図８】
2022502392.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2022502392.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2022502392.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2022502392.tif 000017
【図１６】
2022502392.tif 000018
【図１７Ａ】
2022502392.tif 000019
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
2022502392000001.app
【国際調査報告】
2022502392.tif 000023
2022502392.tif 000024
2022502392.tif 000025