(57)【要約】  本発明は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される組換えアデノウイルス核酸、アデノウイルスヌクレオチド配列が、コートタンパク質の１つ又は２つ以上をもはや産生することができないように変異している組換えアデノウイルス核酸、そのようなアデノウイルス物質で満たされた細胞小胞、そのようなアデノウイルス材料を備えている細胞、及びその方法と使用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする前記遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする前記遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸。
【請求項２】
前記変異が、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス核酸。
【請求項３】
前記組換えアデノウイルス核酸が、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である、請求項１又は２に記載の組換えアデノウイルス核酸。
【請求項４】
異種遺伝子が挿入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
【請求項６】
タンパク質Ｖをコードする前記遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
【請求項７】
異種遺伝子を更に含む、請求項６に記載の細胞小胞。
【請求項８】
前記初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸を更に含む、請求項６に記載の細胞小胞。
【請求項９】
細胞小胞であって、
前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Ｖをコードする前記遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする前記遺伝子が異種プロモーター及び前記異種遺伝子の制御下にて配置される、核酸分子、
又は
前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Ｖをコードする前記遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする前記遺伝子が異種プロモーター及び前記異種遺伝子を含む核酸分子の制御下にて配置される、核酸分子、
を含む、請求項７に記載の細胞小胞。
【請求項１０】
アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、及び
前記初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び／又は
異種遺伝子
を含む、細胞小胞。
【請求項１１】
前記アデノウイルス核酸が、主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１２】
前記主要カプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、ヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されている、請求項１１に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１３】
後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下にて配置される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１４】
好ましくは、配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立するためにｌｏｘＰ部位によりアデノウイルスパッケージング（ｐｓｉ）に隣接することによって、前記アデノウイルス核酸を変異させてアデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージングできないようにする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１５】
異種プロモーターが初期アデノウイルスプロモーターである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１６】
前記プロモーターが、タンパク質ＩＸの中間プロモーターである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１７】
前記プロモーターが、非アデノウイルス由来の異種プロモーター、好ましくはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又はサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１８】
タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩが、異種分子、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質と融合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項１９】
前記異種分子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、ＳＮＡＰタグ、ビオチン化配列を含む群から選択される、請求項１８に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項２０】
前記異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９−ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドを含む群から選択される生体分子をコードする、請求項４〜１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項２１】
繊維タンパク質に融合したＲＧＤ配列を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
【請求項２２】
タンパク質Ｖをコードする前記遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする前記遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
【請求項２３】
好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１〜４又は１１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
【請求項２４】
製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
請求項１〜４又は１１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
を含む、請求項２３に記載の細胞の製造方法。
【請求項２５】
請求項１〜４又は１１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２６】
疾患の治療に使用するための、請求項５〜２２のいずれか一項に記載の細胞小胞。
【請求項２７】
前記疾患が癌である、請求項２６に記載の使用のための細胞小胞。
【請求項２８】
前記疾患が、遺伝障害、特に、脳、肝臓、又は胃腸管の遺伝障害である、請求項２６に記載の使用のための細胞小胞。
【請求項２９】
前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又は関節炎である、請求項２６に記載の使用のための細胞小胞。
【請求項３０】
前記疾患が感染性疾患である、請求項２６に記載の使用のための細胞小胞。
【請求項３１】
請求項５〜２２のいずれか一項に記載の細胞小胞、又は請求項２５に記載の組換えアデノウイルス粒子、及び医薬担体又は小胞、を含む、治療用組成物。
【請求項３２】
組織又は細胞培養物及びオルガノイドのインビトロでのラベリング用の染料としての、請求項５〜２２のいずれか一項に記載の細胞小胞の使用。
【請求項３３】
細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
請求項１〜４又は１１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、製造方法。
【請求項３４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞、又は請求項３１に記載の治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患、特に遺伝障害、癌又は加齢疾患の治療方法。
【請求項３５】
アデノウイルス核酸の検出のための診断方法であって、
請求項２５に記載の組換えアデノウイルス粒子又は請求項５〜２２のいずれか一項に記載の細胞小胞を、それを必要とする対象へ投与すること、
前記対象からの体液を採取すること、
細胞小胞中の前記アデノウイルス核酸を定量化すること
を含む、方法。
【請求項３６】
細胞外小胞を調製するための方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて細胞内に配置される、組換えアデノウイルス核酸を導入することと、
前記初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入することと、
任意選択に、前記組換えアデノウイルス核酸を含む前記細胞を細胞ストレスに供することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、方法。
【請求項３７】
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーター、好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
【請求項３８】
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置され、前記異種プロモーターは、初期アデノウイルスプロモーター又はタンパク質ＩＸの中間プロモーターである、組換えアデノウイルス核酸。
【請求項３９】
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置される組換えアデノウイルス核酸、アデノウイルスヌクレオチド配列が、コートタンパク質の１つ又は２つ以上をもはや産生することができないように変異している組換えアデノウイルス核酸、そのようなアデノウイルス物質で満たされた細胞小胞、そのようなアデノウイルス材料を備えている細胞、及びその方法と使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、遺伝子物質が細胞内部に導入され、遺伝子物質が、欠損遺伝子を置換することができるか、又はサイトカイン又は治療抗体などの治療分子の発現のためコードする、治療方法である。
【０００３】
これらの遺伝子は、ウイルスベクターなどの好適なビヒクルを使用して細胞に送達される。ウイルスベクターは、細胞にＤＮＡを挿入及び複製することによって細胞を感染させる自然な能力を有する。
【０００４】
アデノウイルスは、多くの場合、ウイルスベクターとして使用される。アデノウイルスは、気道及び結膜炎の感染に関連する、十分に特徴付けられた非エンベロープウイルスである。（Ｃｈｕ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１０，５２９９−５３１２）。
【０００５】
アデノウイルスは特に好適なウイルスベクターであるが、その理由は、複製細胞及び静止細胞の両方を感染させることができ、多量のＤＮＡ（最大３０ｋｂｐ）の宿主になり得、また宿主細胞のゲノムに組み込むことができないためである。更に、広範な分子学的知識が利用可能であり、ウイルスを高力価に効率的に精製することができる。
【０００６】
様々なサブタイプのアデノウイルスが存在し、その２型及び５型は、送達ビヒクルの目的のために、最も一般的に使用される。
【０００７】
完全に成熟したヒトアデノウイルス５型ウイルス粒子は、約１１０ナノメートルであり、正二十面体として成形され、カプシドによって囲まれた二本鎖ＤＮＡを含むコアを含有する。
【０００８】
カプシドを形成する主要なタンパク質は、ヘキサン、ペントン及び繊維タンパク質であるが、カプシドは、タンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸを更に含む。これにおいて、繊維タンパク質は、コクサッキー−Ａｄ受容体（ＣＡＲ）などの宿主細胞受容体への結合を促進する。更に、タンパク質ＩＸは、ウイルス粒子の安定性において役割を果たすことが見出された。（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１７，４，４３−６３）。
【０００９】
ウイルスのコアは、３６ｋｂのサイズの二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムと、タンパク質ＩＶａ２、Ｖ、ＶＩＩ、末端タンパク質、ｍｕ、及びアデノウイルスプロテアーゼで構成される。
【００１０】
ゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製に関与する初期遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４、中間遺伝子ｐＩＸ及びＩＶａ２、並びにカプシドタンパク質をコードする後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５、並びにコアタンパク質Ｖ及びＶＩＩからなる。
【００１１】
ゲノムに対する特異的な修飾又は欠失を各々が含む、異なる世代のウイルスベクターの安全性を改善するために、ウイルスがそれ自体を複製する能力、又は免疫応答を誘発する能力を変化させるよう開発されてきた。
【００１２】
アデノウイルスの第１世代は、Ｅ１領域の欠失を含み、ウイルス複製を欠損させる。しかしながら、このようなアデノウイルスベクターの使用は、依然、高い細胞毒性に関連する強力な免疫応答をもたらす。
【００１３】
したがって、Ｅ１領域から離れて、Ｅ２及び／又はＥ４遺伝子に特異的変異又は欠失を作製した、ウイルスベクターの第２世代を開発した。免疫応答は顕著に低下したが、細胞毒性の副作用は依然として観察された。
【００１４】
したがって、複製に必要な酵素又はタンパク質をコードしている全ての遺伝子が除去された、第３世代又はガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターが開発された。しかしながら、このようなウイルスは、好適なヘルパーウイルスの存在を必要とするため、精製の問題を引き起こす。（Ｊｏｕｎａｉｄｉ，Ｙ，Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．（２００７）；７（３）；２８５−３０１．
【００１５】
癌の治療法では、癌細胞を選択的に標的化する際に、条件付き複製アデノウイルス（ＣＲＡｄｓ）などの細胞溶解ウイルスが強力なツールとなっている。この効果は、異なる方法で達成することができる。
【００１６】
最初に、Ｅ１ａ遺伝子（ＡｄΔ２４）における２４塩基対の欠失又はＥ１ｂ−５５ｋＤａ遺伝子（ＡｄΔ１５２０）の欠失などの特定の突然変異を、ウイルスＤＮＡに導入することができ、これは、健常な細胞におけるＣＲＡｄの複製の阻害につながるが、癌細胞では、この突然変異は、細胞の欠損によって補償され、ウイルスの複製をもたらし、その結果、癌細胞の溶解を引き起こす。
【００１７】
あるいは、Ｅ１遺伝子を癌特異的プロモーターの下に配置して、Ｅ１領域の制御された転写を可能にし、癌細胞のみにおいてウイルス粒子の選択的複製をもたらすことができる。（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ，Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０，１８（２），２４３−２５０）
【００１８】
更に、癌細胞腫瘍溶解ウイルス粒子の溶解が放出され、これは続いて隣接（非感染）癌細胞を感染させることができる。この現象は、ビスタンダー効果として知られており、改善された治療効果に寄与する。（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１７，４，４３−６３）
【００１９】
しかしながら、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの使用は、依然として主要な欠点に関連する。例えば、大きなサイズ、細胞に対する「粘着性」、血液を介して移動できないこと、抗体による中和、及び細胞、例えば赤血球又は肝臓のマクロファージにおける結合／取り込みに起因して、特に転移した腫瘍への効率的な送達は、課題のままである。
【００２０】
細胞外小胞（ＥＶ）は、典型的には、細胞から排出される約５０〜１０００ｎｍのサイズの範囲の脂質二重層で作製された細胞器官である。それらは、原形質膜の外向きの出芽（アポトーシス性ブレブなど）を通して、又はエンドソーム膜の内向きの出芽を通じて形成され得、次に、原形質膜と融合した際に小胞を放出する多官能性ユニット（エクソソーム）をもたらす。ＥＶは、典型的には、ドナー細胞に応じて異なる種類のカーゴを含有する。このようなカーゴは、細胞からの廃棄物として処理されてもよく、それに応じてＥＶによって廃棄され得、あるいは、細胞内の伝達に使用され得る、すなわち、１つの細胞から他の細胞へのカーゴの送達によって使用され得る。（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ，Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６４  （３），６７６−７０５；Ｍａａｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１５，２００，８７−９６）
【００２１】
更に、腫瘍由来のＥＶは、腫瘍の進行及び転移において、隣接する細胞及びそれらの局所的な微小環境との活性した伝達を通して、重要な役割を果たしたことが示された。腫瘍ＥＶは、いくつかの経路、とりわけ、ＣＤ８＋Ｔ細胞を介した腫瘍の標的化の阻害又はＮＫ細胞の抑制を介して免疫系ホメオスタシスに影響を及ぼし、それによって腫瘍のための保護的微生物環境を生成すると考えられている。加えて、ＥＶは、酸素供給を改善し、腫瘍細胞の循環への放出及び他の部位へのその拡散を促進するために、血管の動員を促進するように思われる。（Ｂｅｃｋｅｒ，Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１６，３０，８３６−８４８）。
【００２２】
加えて、ＥＶは、その表面タンパク質組成物に応じて組織特異的であり得る。例えば、特定の細胞型への接着のために、腫瘍分泌型ＥＶアカウント上に発現された特異的インテグリンがある。（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５，５２７（７５７８）：３２９−３３５Ｃｏｓｔａ−Ｓｉｌｖａ，Ｂ，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５，１７（６）：８１６〜８２６）。
【００２３】
生体内容物をレシピエント細胞及びそれらの標的特異性に伝達する自然の能力のために、治療用ビヒクルとしてＥＶを利用する関心が近年現れている。実際に、治療用ビヒクルとしてのＥＶの使用は、多数の利益を提供している。生体系内で自然に発生することにより、それらは組織内により深く浸透し、それによって送達効率を改善することができる。それらは更に、血液脳バリアを通過させることができ、したがって脳内に存在する標的の送達ビヒクルとして使用することができる。
【００２４】
更に、ＥＶは免疫系から隠すことができ、それによってシステムからのＥＶの除去を低減し、また、ＥＶは免疫原性応答を誘導しない。
【００２５】
しかしながら、ＥＶを効率的に装填し、大型ＤＮＡ構築物をパッケージ化するための信頼性が高く再現可能な方法は未だ確立されていない。一般に、エレクトロポレーション又は超音波処理を使用して、小さい核酸（例えば、短いヘアピンＲＮＡ）をＥＶに導入する。これらの方法は非効率的であり、研究は、そのような戦略がＥＶの内部の真のパッケージングにつながることはなく、単に外部での凝集につながることが報告されている。（Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１３年１１月２８日；１７２（１）：２２９−２３８）。
【００２６】
したがって、アデノウイルスベクターと比較して、改善された送達特性及び低減された毒性を示すが、同様のパッキング効率及び大きなＤＮＡ断片を装填する能力のあるビヒクルは依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００２７】
本発明者らは、驚くべきことに、アデノウイルスを細胞に感染させるとき、アデノウイルスコア断片を装填した細胞小胞、すなわち、ウイルスコアタンパク質と組み合わせたウイルスゲノムからなる、「アデノソーム」という名の新しい粒子を有する細胞を得ることができることを見出した。アデノソームは、細胞小胞の有利な特性をアデノウイルスのものと組み合わせる。
【００２８】
したがって、本発明は、初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸を提供する。好ましい実施形態では、変異は、Ｅ１ｂ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ａ領域におけるΔ５５ｋ変異である。更に好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。組換えアデノウイルスにおいて、核酸本発明による、初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されることが更に好ましい。一実施形態では、異種遺伝子は、組換えアデノウイルス核酸に挿入され得る。更なる態様では、本発明は、初期遺伝子における変異を含む、かかる組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞を提供し、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、本発明による異種プロモーターの制御下にて配置される。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。一実施形態では、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸は、異種プロモーターの制御下にて配置されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子と、元のプロモーター、すなわち、後期アデノウイルスプロモーターの制御下でＶ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子の両方を含む。あるいは、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸は、異種プロモーターの制御下にて配置されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子のみを含み、元のプロモーター、すなわち、後期アデノウイルスプロモーターの制御下でＶ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子を含まない。好ましい実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、もはや主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を産生できなくなるような方法で変異される。別の好ましい実施形態では、主要カプシドタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸のヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失され、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下にて配置される。別の実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されるアデノウイルス核酸の１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下に配置される。別の好ましい実施形態では、初期遺伝子における変��を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、アデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージングできないような方法で変異され、それは好ましくは、当該配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立するために、ｌｏｘＰ部位にアデノウイルスパッケージング配列（ｐｓｉ）を隣接させることによる。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞を提供する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。好ましい一実施形態では、当該核酸は、初期のアデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まない。特に好ましい実施形態では、当該核酸は、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない。組換えアデノウイルス核酸において、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されることが更に好ましい。一実施形態では、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置されている組換えアデノウイルス核酸を含む当該細胞小胞は、異種遺伝子又は初期遺伝子における変異を含む第２のアデノウイルス核酸を更に含み、好ましくは、変異は、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異であり、及び／又は組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。当該組換えアデノウイルス核酸は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下にて配置され、初期遺伝子における変異を含む当該第２のアデノウイルス核酸が同じ核酸分子上に存在し得る、又は２つの別々の核酸分子上に存在し得る。好ましい実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、もはや主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を産生できなくなるような方法で変異される。別の好ましい実施形態では、主要カプシドタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸のヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失され、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下にて配置される。別の実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されるアデノウイルス核酸の１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、発現調節因子、好ましくはドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下に配置される。別の好ましい実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、アデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージ��グできないような方法で変異され、それは好ましくは、当該配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立するために、ｌｏｘＰ部位にアデノウイルスパッケージング（ｐｓｉ）を隣接させることによる。当該組換えアデノウイルス核酸は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーター及び異種遺伝子を含む核酸分子の制御下にて配置され、当該異種遺伝子は、同じ核酸分子上に存在し得る、又は２つの別々の核酸分子上に存在し得る。
【００３０】
更なる態様では、本発明は、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞を提供し、それにおいてタンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下にて配置され、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは異種分子と融合される、具体的には、治療用タンパク質、イメージング用タンパク質（ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又は精製を可能にするタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。好ましい実施形態では、当該核酸は、初期のアデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まない。特に好ましい実施形態では、当該核酸は、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない。組換えアデノウイルス核酸において、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されることが更に好ましい。タンパクＶ及び／又はＶＩＩは、異種分子、好ましくは異種タンパク質に直接融合することができ、あるいは、リンカー配列が、タンパクＶ／タンパク質ＶＩＩと異種分子との間に存在し得る。２つのタンパク質及び／又はペプチド配列の融合に好適なリンカーは、当技術分野において周知である。
【００３１】
更なる態様では、本発明は、アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む細胞小胞と、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子とを提供する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。好ましい実施形態では、細胞小胞は、タンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩを含む。好ましい実施形態では、変異は、Ｅ１ｂ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ａ領域におけるΔ５５ｋ変異である。更に好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。好ましい実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、もはや主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を産生できなくなるような方法で変異される。別の好ましい実施形態では、主要カプシドタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸のヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失され、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下にて配置される。別の実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置されるアデノウイルス核酸の１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、発現調節因子、好ましくはドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下に配置される。別の好ましい実施形態では、初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置されるアデノウイルス核酸は、アデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージングできないような方法で変異され、それは好ましくは、当該配列のＣｒｅリコンビナーゼに基づく欠失を確立するために、ｌｏｘＰ部位にアデノウイルスパッケージング（ｐｓｉ）を隣接させることによる。一実施形態では、異種遺伝子は、組換えアデノウイルス核酸に挿入され得る。組換えアデノウイルス核酸において、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下にて配置されることが更に好ましい。
【００３２】
更なる態様では、本発明は、アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む細胞小胞及び異種遺伝子を含む核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、タンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩの両方を含む。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【００３３】
更なる態様では、本発明は、アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む細胞小胞を提供し、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩが、異種分子、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質と融合する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。好ましい実施形態では、細胞小胞は、タンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩの両方を含み、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは異種分子と融合され、好ましくは、タンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩの両方が異種分子と融合される。タンパク質Ｖと融合した異種分子及びタンパク質ＶＩＩと融合した異種分子は、同一であっても異なっていてもよい。タンパクＶ及び／又はＶＩＩは、異種分子、好ましくは異種タンパク質に直接融合することができ、あるいは、リンカーが、タンパクＶ／タンパク質ＶＩＩと異種分子との間に存在し得る。２つのタンパク質及び／又はペプチド配列の融合に好適なリンカーは、当技術分野において周知である。細胞小胞は、更に、本発明による初期遺伝子における変異を含み、任意選択で、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下にて配置される組換えアデノウイルス核酸を含み得る。
【００３４】
更なる態様では、本発明は、核酸ベクター又はプラスミドなどの、本発明による組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子を提供する。一実施形態では、当該組換えアデノウイルス核酸は、初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸である。別の実施形態では、当該組換えアデノウイルス核酸は、組換えアデノウイルス核酸であり、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置され、好ましくは初期アデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスがカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まず、より好ましくは、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない。
【００３５】
更なる態様では、本発明は、組換えアデノウイルス核酸に関し、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、好ましくは、初期アデノウイルスプロモーター、タンパク質ＩＸの中間プロモーター、又は非アデノウイルス由来の異種プロモーター、例えばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又はサイトメガロウイルスプロモーターから選択される。
【００３６】
また、本発明の一部は、上に定義したような組換えアデノウイルス核酸であり、これにおいて、ウイルスの核酸は、主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異され、好ましくは主要カプシドタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の後期遺伝子がヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されているか、又は１つ又は２つ以上の後期遺伝子が、ドキシサイクリン誘導性又は制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムなどの発現調節因子の制御下に配置される。
【００３７】
あるいは、本発明は、組換えアデノウイルス核酸に関し、これにおいてアデノウイルスヌクレオチド配列は、主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異され、好ましくは主要カプシドタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の後期遺伝子がヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されているか、又は１つ又は２つ以上の後期遺伝子が、ドキシサイクリン誘導性又は制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムなどの発現調節因子の制御下に配置される。請求項８〜１０によるかような組換えアデノウイルス核酸において、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下に配置され、好ましくは、初期アデノウイルスプロモーター、タンパク質ＩＸの中間プロモーター、又は非アデノウイルス由来の異種プロモーター、例えばホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又はサイトメガロウイルスプロモーターから選択される。
【００３８】
本発明の組換えアデノウイルス核酸の別の実施形態では、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩは、異種分子、好ましくはタンパク質、特に治療若しくはイメージング用タンパク質又は精製を可能にするタンパク質、又は治療若しくはイメージング用タンパク質又は精製を可能にするタンパク質をコードする核酸分子と融合される。好ましい実施形態では、異種分子は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、二酸化鉄、ＳＮＡＰタグ、ビオチン化配列を含む群から選択される。
【００３９】
本発明の更なる好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、挿入された異種遺伝子を有し、好ましくは、異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９−ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドを含む群から選択される生体分子をコードする。
【００４０】
更なる好ましい実施形態では、本発明は、上記のような組換えアデノウイルス核酸を含み、初期遺伝子における変異、好ましくはＥ１ａ領域内のΔ２４変異、又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異を含む。また、繊維タンパク質に融合されたＲＧＤ配列を含む、本発明による組換えアデノウイルス核酸も好ましい。
【００４１】
また、本発明の一部は、本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による核酸分子を含む細胞であり、好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００４２】
本発明の更なる一部は、本発明による細胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
上記の組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入すること、
を含む、方法である。
【００４３】
本発明の更なる一部は、本発明による組換えアデノウイルス核酸を含む組換えアデノウイルス粒子である。
【００４４】
また、本発明に含まれるのは、細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解させた細胞に由来する細胞外小胞又は小胞、好ましくはＭＳＣ由来であり、当該細胞の原形質膜、より好ましくは細胞外小胞由来の構成要素を含み、本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による核酸分子を含む。また、本発明に含まれるのは、細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解させた細胞に由来する細胞外小胞又は小胞、好ましくはＭＳＣ由来であり、当該細胞の原形質膜、より好ましくは細胞外小胞由来の構成要素を含み、本発明による組換えアデノウイルス核酸を充填される。好ましくは、組換えアデノウイルス核酸を含む又はこれらを充填したかような細胞小胞は、疾患の治療に使用されるものであり、好ましくは、疾患が癌であるか、又は疾患が遺伝障害、特に、脳、肝臓、若しくは胃腸管の遺伝障害である、又は疾患が、加齢関連疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病又は関節炎から選択されるか、又は疾患が感染性疾患である。
【００４５】
更なる実施形態では、細胞小胞、好ましくは細胞外小胞、又は溶解させた細胞に由来する細胞外小胞又は小胞、好ましくはＭＳＣ由来である、当該細胞の原形質膜、より好ましくは細胞外小胞由来の構成要素を含み、組換えアデノウイルス核酸を含む又は充填されるものは、ウイルス核酸のモニタリングに使用される。
【００４６】
また、本発明は、治療組成物を含み、細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解させた細胞に由来する小胞、好ましくはＭＳＣ由来を含み、本発明による、当該細胞の原形質膜、より好ましくは細胞外小胞由来の構成要素、本発明による組換えアデノウイルス粒子又は本発明による核酸分子及び医薬担体又は小胞を含む。
【００４７】
本発明の更なる部分は、細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解させた細胞に由来する小胞、好ましくはＭＳＣ由来であり、当該細胞の原形質膜、より好ましくは本発明による細胞外小胞由来の構成要素を含む細胞小胞をインビトロで組織又は細胞培養及びオルガノイドのための染料として使用することである。
【００４８】
本発明は、本発明による細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入することと、
組換えアデノウイルス核酸を含むか、又はそれらで充填された細胞外小胞を採取すること、
を更に含む、製造方法である。
【００４９】
更なる態様では、本発明は、細胞外小胞を調製するための方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて細胞内に配置される、組換えアデノウイルス核酸を導入することと、
初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を細胞内に導入することと、
任意選択に、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞を細胞ストレスに供することと、
細胞外小胞を採取すること、
を含む、方法を提供する。
【００５０】
更に、本発明は、疾患、特に遺伝障害、癌又は加齢疾患の治療方法であって、
細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解した細胞由来の小胞、好ましくはＭＳＣ由来のもの、当該細胞の原形質膜、より好ましくは本発明による細胞外小胞由来の構成要素、又は本発明による治療組成物を、それを必要とする対象に投与すること、
を含む、方法に関する。
【００５１】
本発明は、アデノウイルス核酸の検出のための診断方法であって、
本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による組換えアデノウイルスで充填された細胞小胞を、それを必要とする対象に投与することと、
当該対象からの体液を採取することと、
細胞小胞中のアデノウイルス核酸を定量化すること、を含む、方法を含む。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】質量分析による、ＥＶ内部のアデノウイルスコアタンパク質Ｖ及びＶＩＩの検出。ＧＳ１８４神経膠芽腫細胞を野生型ＨＡｄＶ−５に感染させた。Ａ：イオジキサノール密度勾配における超遠心分離を使用して、ＥＶを単離し、これらをアデノウイルス粒子から分離した（自社開発方法）。Ｂ：ウエスタンブロットにより、ウイルス粒子（抗繊維染色）からのＥＶ（抗Ｒａｂ２７ｂ染色）の適切な分離を確認した。Ｃ：細胞、ウイルス、及びＥＶのタンパク質プロファイルを比較するために質量分析を実施した。予想されるように、ウイルスカプシド及びコアタンパク質の両方が、細胞及びウイルス中で検出された。しかしながら、ＥＶは、豊富に存在していたコアタンパク質（Ｖ及びＶＩＩ）を排他的に含有するように見えた。
【図２−１】アデノウイルス感染細胞からのＥＶは、ウイルスＤＮＡを含有するように見え、感染性であるように見える。ＧＳ７５６細胞を条件付き複製アデノウイルス（Ａｄ．５．ｄ２４．ＲＧＤ．ＧＦＰ）に感染させ、７２時間後、上清を、イオジキサノール密度勾配遠心分離に供して、ウイルス粒子（下部領域）からＥＶ（上部領域）を分離した。異なる断片を異なるアッセイに付した：Ａ．ＥＶ−Ｑｕａｎｔアッセイは、上部分画中のＥＶを示す、Ｂ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ（ウイルス繊維遺伝子の配列を標的とする）は、底部でのウイルスＤＮＡの存在を示す（予想されるように）が、頂部もであった。
【図２−２】Ｃ．Ａ５４９細胞における感染性アッセイは、細胞を感染させるＥＶの能力を示した。
【図３−１】ｐＶ．ＧＦＰアデノウイルスで細胞を注入した後のＥＶにおけるＧＦＰに融合したｐＶの検出。Ａ：自社開発のＥＶ−Ｑｕａｎｔアッセイを使用して、赤色蛍光粒子のみが検出され得る（ＥＶ膜と標識された）だけでなく、緑色蛍光粒子も可視化されている。結果として、３種類の粒子が検出された：緑色のみの粒子＝ウイルス粒子、赤色のみの粒子＝空のＥＶ、赤色＋緑色粒子＝ｐＶ．ＧＦＰ（アデノソーム）を充填したＥＶである。Ｂ：ＧＳ１８４細胞の感染から６４時間後に、相当量のアデノソームが上清で検出された。Ｃ：異なる細胞型（ＧＳ５６２、ＨＥＲ９１１、Ａ５４９）については、アデノソームの分泌が生じる。培養培地の種類は、アデノソーム分泌に影響を及ぼし得る。例えば、血清不含有ＤＭＥＭ中で培養されたＨＥＲ９１１細胞のＥＶの収率を増加させる。
【図３−２】Ｄ：細胞の上清中のアデノソーム濃度は経時的に増加する。
【図４】癌細胞に感染した後、アデノソームのレベルはアデノウイルスの感染性レベルと相関する。これは、バイオマーカーのプラットフォームとしてのアデノソームの機会を開いている。Ａ：ｐＶ．ＧＦＰアデノウイルスを用いて４つの異なる初代神経膠芽腫培養物を感染させた後、上清でのＥＶＱｕａｎｔアッセイによりアデノソームのレベルを決定した（感染から６日後）。細胞生存率を、ＡＴＰベースの細胞生存率アッセイで測定した。Ｂ：アデノソームの濃度及び細胞生存率のプールされた線形回帰分析。両方のグラフは、アデノソーム濃度と細胞生存率との間の強い負の相関を示す。
【図５】神経膠芽腫神経球上のアデノソーム及びウイルス粒子の組織浸透を比較する図である。イオジキサノール密度勾配処置を用いて、ＨＡｄＶ−５Δ２４．ＲＧＤ．ＧＦＰに感染したＨＥＲ９１１細胞から、アデノソーム及びウイルス粒子を単離した。アデノソーム及びウイルス粒子を、ＧＳ神経球に等しい感染性ユニットで適用した。６日間の共焦点顕微鏡を行って、球体のＧＦＰ発現を分析した。神経球の異なる深さにおけるＧＦＰ陽性細胞の平均数が示される（条件毎に５つの球）。
【図６】ｐＶ．ｐＶＩＩのヘテロガス発現は、ＥＶへのＤＮＡの組み込みを向上させる。ＨＥＲ９１１細胞を、プラスミドＤＮＡ：ｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰ（空プラスミド）又はｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ−ｐＶＩＩ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰ−ｐＶ（ＥＶ装填プラスミド）でトランスフェクトした。１日後、細胞をアデノウイルス（野生型ＨＡｄＶ−５）に感染させ、３日間のＥＶを、イオジキサノール密度勾配処置（分画４〜７におけるＥＶ）によって単離した。Ｂ：Ｑ−ＰＣＲを使用して、ＥＶにおけるＤＮＡの組み込みを定量化した。このことは、ｐＶ／ｐＶＩＩの異種発現が、ウイルスゲノムＤＮＡの組み込みを更にブーストしたことを明らかに示した（上図）。更に、ｐＵＣ５７ＤＮＡも、ｐＶ／ｐＶＩＩ発現＋ウイルス感染（下図）の文脈において、ＥＶに増加したレベルで組み込まれた。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
細胞がアデノウイルスに感染している場合、細胞は、生物学的物質の送達ビヒクルとして使用され得るアデノウイルス物質を含む細胞外小胞を分泌することが見出された（Ａｋｓｅｌａ，Ｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｉａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ｄｏｕｒａｄｏ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２０１７，６  （ｓｕｐｐ  １），ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｍａｙ  ｈａｖｅ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ；Ｇａｒｏｆａｌｏ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２０１７，６  （ｓｕｐｐ  １），Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｇａｒｏｆａｌｏ，Ｍ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１８，２８３，２２３−２３４．）
【００５４】
本発明者らは、今や、驚くべきことに、細胞小胞、例えば、「アデノソーム」と呼ばれる細胞外小胞は、例えば、標的細胞への生物学的カーゴの送達において、大きな治療値の固有の特性を有することを見出した。細胞外小胞は、典型的には、限定されたパッキングの能力を呈するため、驚くべきことである。これらのアデノソームを詳細に評価するとき、アデノソームは、ウイルスコアタンパク質Ｖ及びＶＩＩに結合したウイルスＤＮＡでパッケージ化されたのに対し、ヘキサン、ペントン及び繊維タンパク質などのカプシドタンパク質が存在しないことが観察された。したがって、本発明者らは、タンパク質Ｖ及びＶＩＩが、細胞外小胞に適合するように、ウイルスＤＮＡの緊密なパッキングにおいて重要な役割を果たすことを認識した。実際、図６Ｂに示されるように、ｐＶ及びｐＶＩＩをコードする遺伝子を含む核酸は、アデノウイルスＤＮＡの細胞外小胞（上側の図）への組み込みを増加させることができる。
【００５５】
細胞小胞に効率的にパッキングされる可能性のあるアデノウイルスが大きな治療値であることが更に想定された。したがって、本発明は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸に関する。本発明による組換えアデノウイルス核酸は、タンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子の一方又は両方を有するアデノウイルス核酸であってもよく、すなわち、完全な長さのアデノウイルス核酸であってもよく、又はそれらの２つのタンパク質のうちの１つをコードする遺伝子のみであってもよい。更に、天然に生じるアデノウイルスに対する更なる突然変異及び／又は欠失を含んでもよい。
【００５６】
したがって、本発明は、いくつかの態様を包含する。一態様では、本発明は、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩの増強又は早期発現によって、細胞小胞中のそのゲノムの分泌を増加させた新規のタイプの細胞溶解アデノウイルスに関し、拡散及び殺傷が改善された癌殺傷アデノウイルスを提供する。この新規のタイプのアデノウイルスは、初期遺伝子における変異を有するアデノウイルスであってもよく、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩをコードしている遺伝子は、元のｐＶ及び／又はｐＶＩＩが無傷のままであるか、又は非作用的若しくは欠失した元のｐＶ及び／又はｐＶＩＩを残したままで、異種プロモーターの制御下にて配置される。あるいは、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩは、異種プロモーターの制御下に配置され、細胞溶解アデノウイルスは、別々に提供されるが、組み合わせて提供される。このようなアデノウイルスは、細胞内で早期にｐＶ及び／又はｐＶＩＩの発現を有し、アデノウイルス核酸の細胞小胞へのパッケージングを促進する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩを使用することに関し、アデノウイルス若しくは異種ＤＮＡ若しくは異種タンパク質若しくはペプチド、又は任意選択的に、細胞小胞への異種タンパク質又はペプチド配列の高いレベルでの装填で、これらの組み合わせを、これらのタンパク質又はペプチドをｐＶ及び／又はｐＶＩＩに融合させることによって、細胞小胞に装填し、多数の疾患の治療薬として細胞小胞を提供することに関する。細胞小胞は、例えば、細胞内に２つの別個の組換え核酸分子を導入すると排出される。１つの核酸分子は、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩをコードする遺伝子を含み、治療用タンパク質の配列と任意選択に融合されており、当該遺伝子は異種プロモーターの制御下にて配置される。他の核酸分子は、初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を有するアデノウイルス核酸を含む。細胞に導入されると、産生細胞は、アデノウイルス核酸及び／又は異種遺伝子を含む細胞小胞を排出する。あるいは、治療用タンパク質の配列と任意選択的に融合する、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩをコードする遺伝子、及び初期遺伝子及び／又は異種遺伝子における変異を有するアデノウイルス核酸の両方を含む単一の核酸分子で作製される。理論に束縛されるものではないが、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩは、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩをコードする遺伝子を含む核酸から細胞内で発現され、遺伝子は異種プロモーターの下に配置され、細胞小胞内への核酸分子のパッケージングを促進すると考えられる。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「細胞小胞」は、内部空間を包囲する膜を有する細胞由来の小胞を指す。例えば、本明細書で以下に記載される本発明による方法を使用して、及び本明細書の実施例で製造及び／又は得られる。
【００５９】
本明細書で使用される細胞小胞の１つの好ましい例は、細胞外小胞である。細胞外小胞（ＥＶ）は、典型的には、細胞から排出される約５０〜１０００ｎｍのサイズの範囲の脂質二重層で作製された細胞器官である。それらは、原形質膜の外向きの出芽（アポトーシス性ブレブなど）を通して、又はエンドソーム膜の内向きの出芽を通じて形成され、次に、原形質膜と融合した際に小胞を放出する多官能性ユニット（エクソソーム）をもたらす。細胞外小胞は、適切な培地中で適切な産生細胞を培養すること、本発明による組換えアデノウイルス核酸及び任意選択で異種遺伝子を細胞に導入し、細胞外小胞を採取することによって調製することができる。
【００６０】
あるいは、装填された細胞小胞はまた、Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎらに２０１７年（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ（ｃはセディーユ付き）  ＦＤＣ，Ｌｕｋ  Ｆ，Ｋｏｒｅｖａａｒ  ＳＳ，Ｂｏｕｚｉｄ  Ｒ，Ｐａｚ  ＡＨ，Ｌｏｐｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｃ，Ｂａａｎ  ＣＣ，Ｍｅｒｉｎｏ  Ａ，Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ  ＭＪ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１７  Ｓｅｐ  ２１；７（１）：１２１００）、及び国際公開第２０１７／２０４６３９号に記載されているような、「細胞及び小胞再形成の破壊」プロトコルによって産生することもできる。それにより、ｐＶ及び／又はｐＶＩＩ、並びに、例えば異種ＤＮＡ又は細胞溶解アデノウイルスは、間葉系幹細胞（間葉間質細胞、ＭＳＣとも呼ばれる）などの産生細胞で発現され、続いて後続的な細胞破壊（例えば、浸透圧ショックによる）、細胞核の除去、分画（例えば、針を通過させる）、及び小胞の再形成を行う。このような細胞小胞は、脂質及びタンパク質を含む産生細胞の原形質膜からの成分を含み、７０〜１７０ｎｍの平均粒径を有する。このような細胞小胞を調製するために使用されるＭＳＣは、脂肪組織、好ましくはヒト脂肪組織から導出される。本発明によるこのような細胞小胞は、例えば、Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎらによって２０１７年に記載されている方法によって調製される。それにより、本発明による組換えアデノウイルス核酸及び任意選択で異種遺伝子は、細胞破壊の前に細胞に導入される。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明による細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくは溶解したＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、本発明による細胞小胞は、細胞外小胞である。
【００６２】
異種プロモーターは、天然に生じる状況において、その特定の場所に位置しておらず、かつ／又はそれが配置されるタンパク質の発現を駆動する任意の種類のプロモーターであってもよい。それは、アデノウイルス及び／又は宿主細胞において機能性である、サイトメガロウイルス又は任意の他の構成的プロモーターなどの異種生物のプロモーターであってもよく、それにおいてアデノウイルス核酸が発現される。細胞中のタンパク質Ｖ及びＶＩＩの一方又は両方の発現は、ＤＮＡ並びに細胞小胞中の治療用タンパク質部分と融合したｐＶ及び／又はｐＶＩＩのパッケージングを可能にする。
【００６３】
あるいは、それは、中間プロモーターｐＩＸなどのアデノウイルスプロモーター、又は初期アデノウイルスプロモーターのいずれかであってもよい。初期プロモーターは、いわゆる初期遺伝子、すなわち、ウイルス感染後に発現される第１の遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。初期プロモーターの制御下にて遺伝子を配置することにより、ウイルスの複製中、これらの遺伝子は最初に転写される。したがって、初期プロモーターの制御下でタンパク質Ｖ及びＶＩＩをコードする遺伝子を配置する場合、ウイルスＤＮＡの効率的なパッキングを達成することができる。
【００６４】
しかしながら、細胞がこのようなアデノウイルス粒子に感染している場合、アデノソームの調製に冗長なカプシド（又はコート）タンパク質が依然として産生される。したがって、別の代替実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、もはや主要カプシドタンパク質のうちの１つ又は２つ以上を産生できなくなるような方法で変異される。有利にも、かかるアデノウイルス核酸は、免疫応答を誘発しないアデノウイルス材料の産生を可能にする。
【００６５】
主要カプシドタンパク質を産生できない組換えアデノウイルス核酸を得るいくつかの方法が存在する。例えば、核酸は、主要コートタンパク質をコードする後期遺伝子の１つ又は２つ以上の、好ましくは全てが、完全に又は部分的に欠失されるように変異されてもよい。これらの主要コートタンパク質をコードする遺伝子を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルスゲノムをウイルスビリンに組み込むことを排除し、ＥＶへの組み込みを促進することによって、産生の経済性を鑑みた、より効率的なシステムを提供する。更に、アデノウイルスのゲノムから冗長遺伝子を除去することで、異種遺伝子の実装のためのより高い能力が残る。
【００６６】
別の実施形態では、後期遺伝子の転写は、テトラサイクリン制御転写活性化を介して可逆的にオン又はオフにされる。テトラサイクリンが存在しない場合、ＴｅｔオペレーターへのＴｅｔリプレッサーの結合は、後期遺伝子の発現を遮断する。このような抑制は、テトラサイクリン、又はドキシサイクリンなどの特定の誘導体の存在下で逆転される。したがって、本発明はまた、組換えアデノウイルス核酸に関し、後期遺伝子のうちの１つ又は２つ以上が、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン誘導可能又は制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下にて配置される。
【００６７】
このようなアデノウイルス核酸の利点は、後期遺伝子の発現が、例えば細胞培養において依然として利用され得ることであり、アデノウイルスが効率的に複製されることが可能であり、その一方で、例えば、本発明による方法で使用される場合、後期遺伝子の発現をオフにすることができることである。
【００６８】
本発明の更なる一部は、アデノウイルス核酸が、アデノウイルスカプシドにパッケージ化することがもはや可能でないような方法で変異される、本発明による組換えアデノウイルス核酸である。これは、好ましくは、アデノウイルスパッケージング配列（ｐｓｉ）をｌｏｘＰ部位に隣接させることによって達成される。これにより、Ｃｒｅリコンビナーゼに基づくｐｓｉ配列の欠失が生じる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換えは、当技術分野において周知であり、ガットレスアデノウイルス構築物の産生に頻繁に適用される。したがって、当業者は、これを達成する方法を知っている。パッケージング遺伝子のＣｒｅリコンビナーゼベースの欠失をもたらす任意の方法を使用することができる。好適な例は、Ｐａｒｋｓらによって記載されている（Ｐａｒｋｓ  ＲＪ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ａｎｔｏｎ  Ｍ，Ｓａｎｋａｒ  Ｕ，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ  ＭＡ，Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ．Ａ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６  Ｎｏｖ  ２６；９３（２４）：１３５６５−７０）。
【００６９】
好ましい実施形態では、ウイルス核酸は、上記の変異の組み合わせを含む。したがって、一実施形態における本発明は、好ましくは、組換えアデノウイルス核酸に関し、コアタンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はコアタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種、好ましくは初期アデノウイルスプロモーター、中間タンパク質ＩＸプロモーター、又は異種生物、特にサイトメガロウイルスからのプロモーターの下に配置されて、アデノソームの効率的な形成を確実にし、アデノウイルス核酸は、１つ又は２つ以上の主要コートタンパク質、好ましくはアデノウイルス核酸をもはや産生することができないように変異し、主要カプシドタンパク質をコードする後期遺伝子の１つ又は２つ以上が部分的又は完全に削除されているか、１つ又は２つ以上の後期遺伝子は、発現調節因子、好ましくはドキシサイクリン誘導性又は制御可能な遺伝子発現のためのＴｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆシステムの制御下に配置される。
【００７０】
導入パラグラフで論じたように、アデノウイルスベクターは、（大型のサイズの）異種遺伝子を細胞に送達する強力なベクターとして作用する、証明されたトラック記録を有する。この送達は、宿主ゲノムへのウイルス及び異種配列の組み込みなしに生じるが、これは更なる安全をもたらす。
【００７１】
更に、アデノウイルスベクターは効率的なワクチンベクターであり、これは、保護的な免疫応答を誘導することに関して、ポキサウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡワクチン、及びα−ウイルスベクターなどの共通するワクチンベクターを放出することが示された。したがって、本発明はまた、対象において保護的な免疫応答を誘導する能力を有する異種遺伝子のワクチンベクターとしてのアデノウイルスベクターにも関する。
【００７２】
異種遺伝子をアデノウイルスＤＮＡに挿入することは、当技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。例えば、これは、より新しい世代の遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）を使用すること、及び／又は古典的な組換えＤＮＡ技術を使用することによって、達成することができる。当業者は、これを行う方法を知っているであろう。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「異種遺伝子」は、アデノウイルス核酸とは異種である任意の遺伝子を指す。原則として、有用であると考えられる任意の異種遺伝子を挿入することができ、例えば、治療効果を有する分子をコードする遺伝子、保護的な抗体力価を誘導する遺伝子、又は報告（イメージング）目的に使用できる分子をコードする遺伝子などが挙げられる。好ましい実施形態では、異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−１２、チェックポイント阻害剤、好ましくは、ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９−ｇｕｉｄｅＲＮＡ、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドを含む群から選択される生体分子をコードする。
【００７４】
注目に値する治療用遺伝子の１つの群は、プロドラッグ活性化遺伝子群（自殺遺伝子とも呼ばれる）である。（非毒性）プロドラッグの（毒性）薬物への変換を触媒する酵素のためのこのような遺伝子コードがある。
【００７５】
一実施形態では、挿入される異種遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする遺伝子である。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の転写により、ガンシクロビルなどの癌細胞を殺傷する能力を有する物質で、細胞の治療に対する感受性を上げる。
【００７６】
チミジンキナーゼは、ガンシクロビルのリン酸化に関与し、ＤＮＡ複製を遮断し、それによって分裂細胞を選択的に殺傷することによって、リン酸化すると細胞毒性になるヌクレオチド類似体が関与する。加えて、リン酸化ガンシクロビルの細胞毒性効果は、ごく近接して、トランスフェクトされていない細胞に、更に拡散されたことが見出された。したがって、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子転写及びガンシクロビルの投与は、固形腫瘍の治療に特に好適である。（Ｓａｎｄｍａｉｒ，Ａ−Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，７（３），４１３−４２１）。
【００７７】
更に、本発明によるアデノウイルス核酸、及び溶解させた細胞好ましくはＭＳＣに由来し、該当の材料を含む又は充填させた当該細胞の原形質膜より好ましくは細胞外小胞のプラズマ膜由来の構成要素を含む細胞小胞、好ましくは細胞外小胞は、遺伝障害の治療に特に好適である。これらの遺伝障害は、遺伝的なもの又は獲得したもののいずれかであり得るが、いずれの場合にも、疾患はゲノム中の異常によって引き起こされる。異常に応じて、機能性遺伝子は、欠損遺伝子を修正又は阻害のいずれかに導入することができる。
【００７８】
したがって、本発明はまた、遺伝障害において治療的に活性である、ないしは別様で有益である、異種遺伝子が挿入される組換えアデノウイルス核酸にも関する。
【００７９】
具体的には、本発明はアデノウイルス核酸に関し、それにおいて、異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ又はリガンド、例えば、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−１２、チェックポイント阻害剤、好ましくはＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１を標的化するもの、免疫細胞を刺激するためのアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは抗腫瘍免疫応答、特に、４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０を標的化するもの、組換え二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、好ましくはＢｉＴＥｓ，ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＳ、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、欠損遺伝子を修正するＤＮＡをコードするものを含む群から選択される生体分子をコードする。
【００８０】
例に示されるように、タンパク質Ｖ及びＶＩＩは、細胞外小胞における更なる核酸分子の組み込みを促進する。したがって、異種遺伝子をアデノウイルス核酸に挿入する代替として、異種遺伝子は、タンパク質Ｖ及び／若しくはタンパク質ＶＩＩ、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩ、又はタンパク質Ｖ及び／若しくはタンパク質ＶＩＩ、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子と組み合わされるが別個に提供され得る。この実施形態では、異種遺伝子は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置され、初期のアデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まない、本発明による組変え核酸と組み合わせることができる。例えば、異種遺伝子は、異種プロモーターの制御下にて配置されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない本発明による組換え核酸と組み合わせることができる。
【００８１】
したがって、本発明はまた、組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子を含む細胞小胞を提供し、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーター及び異種遺伝子の制御下にて配置される。好ましい一実施形態では、当該核酸は、初期のアデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まない。特に好ましい実施形態では、当該核酸は、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない。当該異種遺伝子は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子と同じ核酸分子上に、例えばベクター又はプラスミドに存在し得、又は異種遺伝子は、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子を含む核酸分子とは異なる核酸分子上に存在してもよい。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【００８２】
本発明はまた、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む細胞小胞及び異種遺伝子を含む核酸分子に関する。任意選択で、当該タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩは、異種分子、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質と融合する。これは、本明細書において以下に更に詳細に記載される。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【００８３】
原則として、細胞小胞は、治療効果を有する分子をコードする遺伝子、保護的な抗体力価を誘導する遺伝子、又は報告（イメージング）目的のために使用することができる分子をコードする遺伝子など、本明細書で上に詳述されているように、有用であると考えられる任意の異種遺伝子を含むことができる。
【００８４】
治療用生体分子をレシピエント細胞に送達する別の方法は、ウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを異種タンパク質、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、精製を可能にするタンパク質、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、又は抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドに融合させることによるものである。
【００８５】
タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩのイメージング用タンパク質への融合により、対象における融合タンパク質を含むアデノウイルス又は細胞小胞のモニタリングが可能になる。基本的に、タンパク質Ｖ又はタンパク質ＶＩＩに結合され得る任意のイメージング用タンパク質が好適であり得る。好適なイメージング用分子（ｉｍａｇｉｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の例としては、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、例えば、酸化鉄、ＳＮＡＰタグ、又はビオチン化配列が挙げられる。当該タンパク質を結合させることは、タンパク質Ｖ又はタンパク質ＶＩＩのためのウイルス遺伝子を、対象とするタンパク質をコードする核酸と融合させることによって行うことができる。また、アダプタータグに融合したタンパク質Ｖ又はタンパク質ＶＩＩにタンパク質を結合するために、ストレプトアビジン−ビオチン系などのアダプターシステムを使用することもできる。
【００８６】
イメージング用タンパク質に関して、上記のようにｐＶ／ｐＶＩＩに融合されたとき、又はアデノウイルスベクター核酸から単一のタンパク質として発現されるか、例えばＣＭＶプロモーター又は組織／細胞特異的プロモーターによって駆動されるとき、あるいは、同じ小胞に含有されるがアデノウイルス配列とは別個の場合であっても、それらの蛍光又は磁気に起因して生物学的システムにおいて検出され得、したがって、疾患の検出若しくは診断、又は粒子の分布の監視に好適である。したがって、このような標識アデノウイルス核酸はまた、染料又は標識分子としての使用にも好適である。具体的には、これらは、エックスビボ又はインビトロのシステム、例えば細胞及び組織培養物で使用することができる。有望な用途の１つは、本発明の細胞小胞を、組織又は細胞培養物及びオルガノイド、すなわち組織培養器官様系をラベリング用の染料として使用することである。細胞特異的化合物を局在化し、可能な薬物標的を特定するために、特定の細胞型で蛍光色を発現するために適用されてもよい。
【００８７】
イメージング装置は、ラベルの検出に好適な任意のイメージング装置であってもよい。例えば、蛍光を検出するために、蛍光顕微鏡、蛍光活性化細胞選別、又は紫外線を利用することができる。発光は、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼなどの発光シグナルを誘導する標識を検出するために使用することができる。磁気ナノ粒子又はタンパク質を検出するために、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、又はマンガンペルオキシダーゼなどの好適な染色を用いてもよい。標識はまた、関連するＤＮＡと共にｐＶ及び／又はｐＶＩＩをプルダウンするために使用され得るタグであってもよい。このプルダウンは、例えば、細胞溶解アデノウイルスの複製のためのバイオマーカーを提供するために使用することができる。
【００８８】
したがって、本発明の別の態様は、アデノウイルス核酸の検出のための診断方法であって、
本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による組換えアデノウイルス核酸で充填された細胞小胞を、それを必要とする対象に投与することと、
当該対象から体液の試料を採取することと、
細胞小胞中のアデノウイルス核酸を定量化すること
を含む、方法に関する。
【００８９】
タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩの治療用タンパク質への融合は、治療用タンパク質を含む細胞小胞の産生を可能にする。このような細胞小胞は、以下に更に詳述するように、感染症、癌、加齢関連疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、又は関節炎、並びに脳、肝臓、心臓及び胃腸管の特定の遺伝障害における遺伝障害などの様々な疾患の治療に使用することができる。任意の治療用タンパク質を、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩに融合させることができる。例は、抗腫瘍免疫応答を刺激するプロテインキナーゼ及びペプチドを阻害するペプチドである。好ましい実施形態では、当該治療用タンパク質は、腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドである。腫瘍抗原ペプチドに融合したタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む細胞小胞は、癌の治療に特に有用である。腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特異的なタンパク質である腫瘍抗原タンパク質の分解によって生成される。腫瘍抗原ペプチドは、抗原として提示される細胞の表面に輸送されるＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）に結合する。腫瘍は、腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドを、腫瘍患者において腫瘍特異的ＣＴＬを強化するために、いわゆる癌ワクチンとして使用することによって、治療することができる。好ましい実施形態では、細胞小胞は、治療用タンパク質、好ましくは腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドに融合されたタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩと、組換えアデノウイルス核酸と、を含み、本発明による初期遺伝子における変異を含み、好ましくは、変異は、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異であり、より好ましくは、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列の初期遺伝子における変異を含む、組換えアデノウイルス核酸に関する。このような変異は、アデノウイルス粒子の場合と同様に、ウイルス複製を欠損させる場合があり、Ｅ１領域、Ｅ１領域とＥ２領域の両方、Ｅ１及びＥ４、Ｅ１とＥ２とＥ４、又は全ての初期遺伝子が欠失される。あるいは、初期遺伝子における特異的突然変異は、Ｅ１ａ遺伝子におけるΔ２４変異など、既知であり、これは、癌細胞のみにおいてウイルスの特異的複製を引き起こす。加えて、特定の突然変異はまた、脳又は前立腺などのこの特定の器官に特異的なウイルスを付与する、組織特異的プロモーターの導入も含み得る。したがって、本発明によるアデノウイルス粒子及びこのような変異を担持することは、癌治療における使用に特に好適である。
【００９１】
好ましくは、本発明は、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５変異、及び当該核酸を含むアデノウイルス粒子を含む、組換えアデノウイルス核酸に関する。
【００９２】
更に好ましい実施形態では、本発明は、組換えアデノウイルス核酸に関し、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスベクター、特に細胞溶解アデノウイルスベクターのアデノウイルス核酸である。
【００９３】
更なる実施形態では、本発明は、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）などのインテグリン認識モチーフを有する組換えアデノウイルス核酸を含むウイルス粒子に関し、これは、ウイルスをインテグリンファミリーの特定のメンバーへ結合することを可能にし、それは（哺乳類の）細胞へのウイルスの侵入受容体として機能する。好ましくは、ＲＧＤ配列は、繊維タンパク質に融合される。
【００９４】
更に、本発明は、本発明による任意の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞に関する。一実施形態では、本発明はまた、本発明による組換えアデノウイルス核酸で充填された細胞小胞に関する。
【００９５】
好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【００９６】
更に好ましいのは、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞であり、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される細胞小胞を提供する。このようなＥＶは、好ましくは、異種遺伝子、あるいは初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸を更に含む。したがって、本発明はまた、
組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーター及び異種遺伝子の制御下にて配置される、核酸分子、又は、
組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が異種プロモーター及び異種遺伝子を含む核酸分子の制御下にて配置される、核酸分子、
含む、細胞小胞を含む。
【００９７】
本発明はまた、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ、好ましくはタンパク質Ｖ及びタンパク質ＶＩＩ、及び
初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び／又は
異種遺伝子、を含む、細胞小胞にも関する。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸の初期遺伝子における変異は、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異、及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異である。更に好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。一実施形態では、初期遺伝子における変異を含む当該組換えアデノウイルス核酸を含む当該核酸分子は、異種遺伝子を更に含む。別の実施形態では、当該異種遺伝子は、組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子とは異なる核酸分子上に存在する。
【００９８】
原則として、細胞小胞は、治療効果を有する分子をコードする遺伝子、保護的な抗体力価を誘導する遺伝子、又は報告（イメージング）目的のために使用することができる分子をコードする遺伝子など、本明細書で上に詳述されているように、有用であると考えられる任意の異種遺伝子を含むことができる。
【００９９】
本発明によるこれらの細胞小胞（アデノソーム）は、標準的アデノウイルスベクターと比較して治療送達ビヒクルとして使用するためのいくつかの利点を構成する。それらの脂質二重層コーティングにより、組織内深くへの、又は血液−脳関門の上への、長距離にわたるウイルスＤＮＡの送達は、大部分が改善される。このような効果は、細胞小胞が中和抗体からの遮蔽を可能にし、したがって、システム内でより長い循環時間を可能にするという事実によって達成される。
【０１００】
更に、細胞小胞は非免疫原性であり、したがって、共通のウイルスベクターと比較してより低い毒性を示す。
【０１０１】
したがって、本発明の細胞小胞は、様々な疾患の予防及び治療に好適である。例としては、感染症、癌、加齢関連疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、又は関節炎、並びに脳、肝臓、心臓、及び胃腸管の特定の遺伝障害における遺伝障害が挙げられる。
【０１０２】
好ましくは、本発明の細胞小胞は、癌、遺伝障害、感染症、又は加齢性疾患の治療又は予防に使用される。
【０１０３】
したがって、本発明はまた、疾患、特に遺伝障害、癌、感染症又は加齢疾患の治療方法であって、
本発明による細胞小胞の、それを必要とする対象への投与、
を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【０１０４】
癌の治療において、細胞小胞は、好ましくは、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターを含む。一実施形態では、細胞小胞は、初期遺伝子における変異を含み、かつ条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターである、本発明による組換えアデノウイルス核酸を含み、それにおいて、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置される。代替の実施形態では、細胞小胞は、
タンパク質Ｖ及び／若しくはタンパク質ＶＩＩ、又はタンパク質Ｖをコードする遺伝子、及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置され、
条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターである、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸、を含む。両方の代替例では、組換えアデノウイルス核酸の初期遺伝子における変異は、好ましくは、Ｅ１ａ領域におけるΔ２４変異、及び／又はＥ１ｂ領域におけるΔ５５ｋ変異である。
【０１０５】
癌の治療に更に特に好適であるのは、タンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩが、治療用タンパク質、好ましくは腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドに融合される、本発明による細胞小胞である。このような細胞小胞は、本発明による初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を更に含んでもよく、任意選択に、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置される。
【０１０６】
感染症、加齢関連疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、又は関節炎、並びに脳、肝臓、心臓、及び胃腸管の特定の遺伝障害における遺伝子障害の治療、あるいは癌の治療において、本発明による細胞小胞は、好ましくは異種遺伝子を含む。
【０１０７】
一実施形態では、異種遺伝子は、本発明による組換えアデノウイルス核酸に挿入され、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置される。この組換えアデノウイルス核酸は、
初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーター、好ましくは、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスのベクターの制御下に配置される、アデノウイルス核酸、又は、
アデノウイルス核酸であって、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置され、初期アデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスがカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まず、好ましくは、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない、アデノウイルス核酸、いずれかであり得る。
【０１０８】
別の実施形態では、異種遺伝子は、アデノウイルス核酸を含む核酸分子以外の核酸分子上に存在し、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置される。
【０１０９】
更に別の実施形態では、細胞小胞は、アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩ及び異種遺伝子を含み、好ましくは細胞小胞は、アデノウイルスタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩと、異種遺伝子を含む核酸分子とを含む。
【０１１０】
本発明は、本発明による細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入することと、
組換えアデノウイルス核酸を含むか、又はそれらで充填された細胞外小胞を採取すること、
含む、方法に更に関する。
【０１１１】
この方法は、ＥＶの治療目的に応じて、広範囲の細胞株を使用して実施することができる。好適な細胞株としては、ヒト胚性網膜（ＨＥＲ）９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ５４９（肺上皮癌）、及び初代ヒト神経膠芽腫細胞が挙げられる。
【０１１２】
細胞は、当技術分野において既知の任意の好適な方法に従って培養することができ、当業者はこれをどのように行うか知っているであろう。
【０１１３】
細胞は、増殖に好適な任意の培地を使用して培養することができる。細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＮＳ（神経球、無血清）培地中で培養した場合に、特に良好な結果が得られている。
【０１１４】
細胞の増殖を更に支援するために、いくつかの添加剤を増殖培地に添加することができる。
【０１１５】
最適な能力のために、細胞の培養は、好ましくは３７℃でインキュベーター内で行われる。
【０１１６】
細胞への組換えアデノウイルス核酸の導入は、いくつかの方法で達成することができる。
【０１１７】
一実施形態では、本発明による組換えアデノウイルス核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。組み込みは、当技術分野において既知の任意の好適な方法、好ましくはレンチウイルストランスダクション又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを介して達成することができる。有利な実施形態では、組換えアデノウイルス核酸の一部のみが細胞のゲノムに組み込まれ、核酸の残部は、他の手段、例えばプラスミドを介して、又は細胞のウイルス感染を介して細胞に送達される。好ましい実施形態では、ｐＶ及びｐＶＩＩをコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれる。このように、重要なタンパク質ｐＶ及びｐＶＩＩは、産生細胞によって高度に発現され、細胞中に存在する（アデノウイルス）核酸の効率的なパッキングを可能にする。
【０１１８】
あるいは、トランスフェクションを通してアデノウイルス核酸を細胞に導入することも可能である。
【０１１９】
更に、本発明による組換えアデノウイルス核酸を含む細胞は、好ましくは低（低酸素；ｈｙｐｏｘｉｃ）酸素雰囲気下、又は正常（正常酸素；ｎｏｒｍｏｘｉｃ）酸素雰囲気下に維持される。細胞増殖は、３７℃又は３７℃で、一時的な冷間又は一時的な熱ショックで好ましくは発生する。
【０１２０】
したがって、本発明はまた、本発明による組換えアデノウイルス核酸、好ましくはＨＥＲ９１１、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む細胞を提供する。これらの細胞は、アデノウイルス粒子又は組換えアデノウイルス核酸を含む細胞外小胞を産生するために、産生細胞として使用することができる。好ましくは、アデノウイルス核酸の導入後、細胞は、アデノウイルス核酸の導入後に、非限定量の時間、例えば、アデノウイルス核酸の導入後の数週間の間、アデノウイルス粒子又は組換えアデノウイルス核酸を含む細胞外小胞を連続的に生成する。
【０１２１】
したがって、本発明はまた、このような産生細胞を作製する方法であって、
培地中で好適な細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞へ導入すること、
を含む、方法に関する。
【０１２２】
したがって、産生細胞は、組換えアデノウイルス核酸を含み、タンパク質Ｖをコードする遺伝子及び／又はタンパク質ＶＩＩをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置される。組換え核酸は、プラスミドとして存在してもよく、又は細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。
【０１２３】
本発明に更に含まれるのは、細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で好適な細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞へ導入することと、
アデノウイルス核酸を含む、細胞外小胞を採取すること、を含む、方法である。この方法の一部は、細胞外小胞が、標識タンパク質Ｖ又はタンパク質ＶＩＩの蛍光ベースの検出など、アデノウイルス核酸を含有するか否かを確認するアッセイであってもよい。換言すれば、このような試験は、正常なＥＶ又は本発明のアデノソームが産生される場合を定義する。
【０１２４】
細胞外小胞は、好ましくは初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸、並びにタンパク質Ｖ及び／又はタンパク質ＶＩＩを含む。
【０１２５】
任意選択的に本方法では、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞は、細胞ストレスに供される。このような工程により、細胞ストレス応答が誘発される。原則として、「細胞ストレス」は、細胞の任意の望ましくない環境条件を指す。細胞ストレスの例としては、細胞の感染、例えば、ウイルス感染、好ましくはアデノウイルスによるウイルス感染、細胞の照射、毒素への細胞の曝露、化学療法薬、例えば遺伝毒性薬物及びプロテアソーム阻害剤、例えばメルファラン、ボルテゾミブ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、及びドキソルビシン、細胞の温度差への曝露、細胞の低酸素状態への曝露、細胞の浸透性ショックへの曝露、及び細胞の酸化ストレスへの曝露が挙げられる。好ましい実施形態では、かかる細胞ストレスは、細胞のウイルス感染であり、好ましくは、条件付き複製アデノウイルス及び／又は複製欠損アデノウイルスベクターなどの、野生型又は組換えアデノウイルスによる細胞のウイルス感染である。
【０１２６】
アデノウイルス核酸を細胞に導入した後、アデノウイルス核酸を含有するＥＶを回収する。典型的には、アデノウイルス核酸を含有するＥＶは、細胞又は細胞培養培地から単離又は抽出することによって、感染後少なくとも４８時間後に回収される。
【０１２７】
一実施形態では、ＥＶは、懸濁液の遠心分離によって上清から単離される。遠心力は、懸濁粒子をチューブの底部にもたらし、ペレットが形成される。良好な結果のために、上清を、６０〜１２０分間、好ましくは７０分間、高速で、好ましくは約１００．０００×ｇ遠心分離する。
【０１２８】
任意選択で、上清を最初に遠心分離して、ＥＶを含む上清から細胞などのより大きな粒子を除去する。加えて、上清を好適なフィルターで濾過して、細胞残屑などのより大きな粒子を除去してもよい。
【０１２９】
ペレットの分離後、ペレットは好ましくは好適な溶媒中に懸濁され、懸濁液は任意選択で再び遠心分離される。ペレットを再び単離し、タンパク質などの汚染物質を含有し得る溶媒を除去することができる。ペレットを懸濁させ、可能な汚染物質を溶解する可能性を有する任意の好適な溶媒を使用することができる。特定の良好な結果は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を用いて得られた。
【０１３０】
次いで、ペレットを好適な溶媒、好ましくはＰＢＳ中に再懸濁し、イオジキサノール勾配に装填する。遠心分離後、アデノウイルス材料を含有するＥＶを含む画分を単離した。
【０１３１】
本発明はまた、本発明のアデノウイルス粒子又は本発明による細胞小胞と、薬学的に許容される担体又はビヒクルとを含む治療組成物も含む。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【０１３２】
本発明は、遺伝障害の治療のための方法であって、
本発明による治療組成物、細胞小胞又はアデノウイルス粒子を、それを必要とする対象へ投与すること、を含む、方法に更に関する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはＭＳＣに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
【０１３３】
本発明は、本発明によるアデノウイルスで細胞を感染させることにより、エクスビボでＥＶを生成することができる方法を提供する。次いで、ＥＶを対象に投与することができる。本発明の別の目的では、対象は、本明細書に記載されるようにアデノウイルスを直接提供する。次いで、これらのウイルスは、次いで対象における標的細胞を感染させ、細胞外小胞が形成され、身体を通じて更に分布する。
【０１３４】
投与様式は様々であり得る。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸内、非経口、筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、腫瘍内、吸入、送気、局所、皮膚、経皮、動脈内、硬膜内、又は頭蓋内が挙げられる。
【０１３５】
特定の実施形態では、本発明の治療組成物、アデノウイルス、又は細胞小胞は、注射などの侵襲的経路によって投与され得る。本発明の更なる実施形態では、本発明の治療組成物、アデノウイルス又は細胞小胞は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、頭蓋内、動脈内、腫瘍内、又は吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路による投与（例えば、経口；例えば、ピル、カプセル又は錠剤、局所、直腸）はまた、本発明の範囲内である。
【０１３６】
適切な投与量の決定は、臨床医によって、例えば、処置に影響を及ぼすために当技術分野において既知であるか、又は疑われるパラメータ又は要因を使用して行われる。一般に、用量は、最適な用量より幾分少ない量で開始され、その後、所望の又は最適な効果が任意の負の副作用に対して達成されるまで、少しずつ増加する。重要な診断尺度としては、例えば炎症の症状又は産生された炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
【０１３７】
本発明による治療組成物、細胞小胞、又はアデノウイルス粒子は、液体又は固体剤形であってもよい。液体剤形が使用される場合、液体剤形は、スプレー、ミスト、懸濁液、溶液、エマルション、又はエアロゾルを含んでもよい。固体剤形は、カプセル、錠剤、顆粒、粉末、及びゲルを含む。
【０１３８】
本明細書に開示される治療組成物、アデノウイルス粒子、及び細胞小胞は、連続注入によって、又は投与量、例えば、毎日、週に１〜７回、隔週、毎月、隔月、４ヶ月ごと、四分の１年ごと、半年ごとなどに提供されてもよい。週１回の投与量は、一般に、体重で、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ以上である（例えば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１５１−１４４；Ｗｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，２０１７，４，６３を参照されたい）。用量はまた、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌ以上又は約１０８〜１０１２個のウイルス粒子などの、対象の血清中のアデノソーム又はアデノウイルス粒子の所定の標的濃度を達成するために提供されてもよい。他の実施形態では、本発明のアデノソーム又はアデノウイルス粒子は、例えば、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００又は２５００ｍｇ／対象で、１週間に１回、２週間に１回、「４週間に１回」、毎月、隔月、又は３カ月ごとに、経口又は静脈内で投与される。
【０１３９】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、単独で、又は追加の治療薬と組み合わせて細胞、組織、又は対象に投与される場合、１つ又は２つ以上の疾患の症状の測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明のアデノウイルス又は細胞外ビヒクルの量を指す。有効量は、更に、症状の少なくとも部分的改善、例えば、腫瘍の収縮、肝臓における酵素産生の回復、頭蓋内プラーク蓄積の減少、及び記憶力の改善、梗塞後の心臓機能の改善をもたらすのに十分なアデノウイルス粒子又はアデノソームの量を更に指す。単独で投与される活性成分として個体に適用される場合、有効量は、その成分のみを指す。組み合わせとして適用される場合、有効量は、併用して投与されるか、連続的に又は同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせ量を指す。有効量の治療薬は、診断尺度又はパラメータを少なくとも１０％；通常、少なくとも２０％；好ましくは、少なくとも約３０％；より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％改善することになる。有効量はまた、主観的尺度が疾患重症度を評価するために使用される場合に、主観的尺度の改善をもたらすことができる。
【０１４０】
本発明による治療組成物、アデノウイルス粒子、又はアデノソームは、単剤療法として、又は併用療法として送達され得る。例えば、アデノソーム又はアデノウイルス粒子は、化学療法薬、放射線療法、免疫チェックポイント阻害剤、標的化された小分子（例えば、キナーゼ阻害剤又はプロテアソーム阻害剤）などの一般的な抗癌剤と組み合わせて投与され得る。
【０１４１】
本発明はまた、疾患を検出するためのキットに関する。キットは、標識アデノウイルス核酸を含むアデノウイルス粒子及び／又は標識アデノウイルス核酸を含むアデノソームを含む。あるいは、キットは、本発明による治療組成物、アデノウイルス粒子、又はアデノソーム、及びウイルスに特異的な標識抗体、又はウイルスによって生成され得る異種化合物を含む。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：質量分析によるＥＶ内のアデノウイルスコアタンパク質の検出
ＧＳ１８４細胞（神経手術のＥｒａｓｍｕｓ  ＭＣ、Ｄｅｐｔ．から入手した初代神経膠芽腫細胞）を、野生型ＨＡｄＶ−５での感染前に２４時間、１０個のＴ１７５フラスコに播種した。細胞を、ＮＳ培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋線維芽細胞増殖因子＋内皮増殖因子＋ヘパリン＋Ｂ２７＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）中の細胞外マトリックス（ｄＰＢＳ、Ｃｕｌｔｒｅｘ、Ｓａｎｂｉｏ中のＥＣＭ  １：１００）のコーティング上で単層として培養した。細胞を、細胞当たり５個の感染性粒子のＭＯＩを有する野生型ヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄＶ−５）に感染させた。培地を、２時間後にＮＳ培地へと新鮮にした。上清及び細胞を、感染後４０時間で収集した。Ｄｅ  Ｖｒｉｊ、２０１３，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８（９）１４４３−５８に記載のように、イオジキサノール系密度勾配（１９２，０００ｇで４時間超遠心分離）を使用して、細胞培養上清からＥＶを単離した。イオジキサノール勾配は、最下層（２ｍＬ）として４０％のイオジキサノール、中間層（６ｍＬ）として２５％のイオジキサノール、及び上層（２ｍＬ）として５％のイオジキサノールの３つの層からなる（図１ａ）。ＥＶは、上画分と中間画分との間の相間領域で濃縮することが以前示されている（Ｄｅ  Ｖｒｉｊ、２０１３，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）、８（９）：１４４３−５８）。アデノウイルス粒子は、底部（４０％のイオジキサノール）画分に濃縮することが知られている。イオジキサノール画分をアデノウイルス繊維タンパク質及びＲａｂ２７ａタンパク質に対する抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに供し、それはＥＶのエクソソーム型に特異的である（Ｄｅ  Ｖｒｉｊ、２０１３，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）、８（９）：１４４３−５８に記載されているプロトコル）（図１ｂ）。Ｄｅ  Ｖｒｉｊ、２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１３７（７）：１６３０−４２に記載のプロトコルを使用して、細胞ペレット及び精製ＥＶ及びウイルス調製物を質量分析して、タンパク質内容物の深部情報を得た（図１ｃ）。簡単に述べると、試料を５０ｍＭアンモニウム炭酸塩中の５０μｌの溶解緩衝液（ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）界面活性剤（１ｍｇ  ｍＬ−１；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ）に溶解した。各試料に２ｍＬの０．５Ｍジチオスレイトールを添加し、続いて６０℃で３０分間インキュベートすることによって、還元及びアルキル化を実施した。室温まで冷却した後、１０ｍｌの０．３Ｍヨードアセトアミドを加え、続いて暗所で３０分間インキュベートした。続いて、３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で１：１０希釈）中の１００ｎｇ  ｍＬ−１ゴールドのトリプトリプトリプシン１．５ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各試料に添加し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。トリプシンを不活性化するために、３ｍＬの２５％トリフルオリン酸を添加し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、試料を１０，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離し、上清をＬＣ／ＭＳ認定バイアル（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に移した。各試料について、ナノ液体クロ���トグラフィー（ナノＬＣ）システム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  Ｎａｎｏ−ＬＣシステム、Ｄｉｏｎｅｘ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で総量の画分（１０％）を測定して、相対濃度を決定した。これらの測定値に基づいて、各個々の試料の注入量を調整して、等量の消化試料のＭＳ分析を可能にすることができる。ＭＳ分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳプラットフォーム（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結させたナノＬＣシステムを用いて行った。ＭＳスペクトルを生データファイルから抽出し、Ｅｘｔｒａｃｔ−ＭＳＮ（ＸＣａｌｉｂｕｒ（バージョン２．０．７）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）を使用したＭａｓｃｏｔ一般フォーマット（ＭＧＦ）ファイルに変換した。データファイルを、Ｈｏｍｏサピエンス及びウイルスタンパク質に対して選択されたＵｎｉＰｒｏｔ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに対し、Ｍａｓｃｏｔ（バージョン２．３；Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）で検索した。図１ｃに示されるように、ウイルスカプシド及びコアタンパク質の両方が、細胞及びウイルス中で検出された。しかしながら、ＥＶは、豊富に存在していたコアタンパク質（Ｖ及びＶＩＩ）を排他的に含有するように見えた。
【０１４３】
実施例２：ＥＶにおけるＰＣＲにより細胞溶解アデノウイルスＤＮＡが検出され、ＥＶは細胞を感染させることができる。
条件付き複製アデノウイルス（ＣＲＡｄ）Ａｄ．５．ｄ２４．ＲＧＤ．ＧＦＰ（ＭＯＩ＝細胞当たり１感染性粒子）で感染させる前に、２つのＴ１７５フラスコにＧＳ７５６細胞を２４時間播種した。（ゲノム構築を含むウイルスの詳細は、Ｂａｌｖｅｒｓ，２０１４，Ｖｉｒｕｓｅｓ、６（８），３０８０〜３０９６に提供されている。）７２時間後、上清をＥＶ単離のために回収した。低速遠心分離を行い、細胞及び細胞残屑を除去し（１５０×ｇ５分＋３０００×ｇ２０分）を、続いて１００．０００ｘｇで７０分間超遠心分離して、ＥＶ及びウイルス粒子をペレット化した。ペレットを、イオジキサノール密度勾配遠心分離に供し、上記のようにイオジキサノール画分を単離した。
【０１４４】
各分画内のＥＶの量を決定するために、ＥＶ−Ｑｕａｎｔ分析用に試料を調製した。このため、試料を、ＥＶの膜を標識する赤色蛍光色素（最終濃度０．３３ｎｇ／μｌのＲｈｏｄａｍｉｎｅ）でインキュベートした。次に、（ＴＥＭＥＤビス−アクリルアミド及びＡＰＳビス−アクリルアミド（１：１）をガラスの底を有する９６ウェルプレートに添加し、続いて共焦点顕微鏡（Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘシステム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して画像を取得することで）ＥＶをインキュベートした。小胞の膜標識は、赤色のドットとして可視化することができる。オペレーティングシステムから得られたデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌテンプレートで変換し、ＥＶカウント数及びＥＶの濃度を提供した。グラフは、頂部画分におけるＥＶを示すＧｒａｐｈｐａｄプリズム６．０を使用して作製した（図２ａ）。
【０１４５】
ＥＶにおけるウイルス性ゲノムの存在を検出するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。ウイルスＤＮＡの検出のために、ウイルス繊維タンパク質（ＨＡｄＶ５＿ｆｉｂｅｒ＿ＦｏｒＰｒｉｍ１、配列：
ＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣ）、ＨＡｄＶ５＿ｆｉｂｅｒ＿ＲｅｖＰｒｉｍ１、配列：
ＡＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＡＴＣＧＧＴＧＧＴ）の配列に結合するプライマーが使用された。ｑＰＣＲは、標準的なＰＣＲ増幅設定を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法により実施した。アデノウイルスログ（１０）コピー数は、完全な長さのアデノウイルスＤＮＡ（直鎖化ウイルスゲノム）の連続希釈に由来する標準曲線を生成することによって決定された。Ｃｔ値を、生成された標準曲線に基づいてＬｏｇ（１０）コピー数に変換し、全ての試料をＤｕｐｌｏで測定した。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズム６．０を使用してプロットし、（予想されるように）底部にウイルスＤＮＡが存在することを示したが、頂部もであった（図２ｂ）。
【０１４６】
全てのイオジキサノール画分について、これらの画分をＡ５４９肺癌細胞に曝露することによって、感染性を評価した。感染から７２時間後に、蛍光顕微鏡検査を行って、ＧＦＰ陽性細胞の割合によって測定して、感染性を決定した。ＮｕｃＢｌｕｅ（商標）染色（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより、全細胞数の計数を促進した。細胞計数はＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＦＩＪＩ）を使用して行い、ＥＶが細胞に感染する能力を示した（図２ｃ）。
【０１４７】
実施例３：ＥＶ−Ｑｕａｎｔは、ｐＶ．ＧＦＰウイルスで細胞を感染させた後のＥＶにおけるｐＶ．ＧＦＰの組み込みを示す。
細胞（ＧＳ１８４、ＧＳ５６２、Ａ５４９、及びＨＥＲ９１１）を、ｐＶタンパク質に結合した緑色蛍光タンパク質（ｐＶ．ＧＦＰ）で感染させる前に、４８ウェルプレート上に２４時間播種した。細胞を、ウェル当たり１００μＬ培地（ＧＳ１８４及びＧＳ５６２用のＮＳ培地、及びＨＥＲ９１１／Ａ５４９）中の細胞当たり５０ウイルス粒子のＭＯＩに感染した。（血清培地：ダルベッコ改変イーグル培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）。培地は、各細胞株について、２時間後に、ＮＳ培地、ＤＭＥＭのみ、及び血清培地に対して新鮮にした。（血清培地は、１００，０００ｘｇで１６時間、超遠心分離によってウシＥＶから事前に除去した。全ての細胞株の各培地条件に三つ組を使用した。感染後６４時間で上清を回収し、５００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去した。ＥＶ−Ｑｕａｎｔ分析を、全ての上清１４３μＬに対して行った。ＧＦＰがｐＶタンパク質に融合している場合、ウイルス粒子は、ＥＶ−Ｑｕａｎｔアッセイにおいて緑色のドットとして現れることが予想された。加えて、試料を赤色蛍光色素でインキュベートし、これはＥＶの膜を標識した。
【０１４８】
したがって、アデノソームは、赤色及び緑色のドットの組み合わせとして可視化することができる（ソフトウェアによって黄色のドットとして疑似着色される）。結果として、３種類の粒子を、ＥＶ−Ｑｕａｎｔアッセイを用いて定量した：赤色のみ（空のＥＶ）、緑色のみ（ウイルス）、赤色＋緑色（黄色）（アデノソーム）（図３ａ）。ＧＳ１８４細胞の感染から６４時間後に、相当量のアデノソームが上清で検出された。（図３ｂ）。更に、異なる細胞型（ＧＳ５６２、ＨＥＲ９１１、Ａ５４９）に対してアデノソーム分泌が生じ、培養培地の種類は、アデノソーム分泌に影響を及ぼし得ること、例えば、血清なしでＤＭＥＭ中で培養されたＨＥＲ９１１細胞のためのＥＶの収率が増加した（図３ｃ）ことが見出された。最後に、細胞の上清のアデノソーム濃度が経時的に増加することが実証された（図３ｄ）。
【０１４９】
実施例４：アデノソームのバイオマーカー電位：細胞溶解ウイルス感染性とアデノソームレベルを相関させる
４つの異なるＧＳ培養物をｐＶ−ＧＦＰアデノウイルスに感染させ、細胞の感染がアデノソームの分泌と相関するかどうかを評価した（図４）。感染から６日後に、アデノソームレベルをＥＶ−Ｑｕａｎｔにより決定し、細胞生存率を、発光ＡＴＰ系細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。ルミネセンスを照度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００Ｔｅｃａｎ  Ｒｅａｄｅｒ）で測定した。線形回帰分析及び統計試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。
【０１５０】
癌細胞に感染した後、アデノソーム濃度は、アデノソーム濃度と細胞生存率との間の強い負の相関により明らかなように、アデノウイルスの感染性レベルと相関することが見出された（図４ａ及び４ｂ）。これは、バイオマーカーのプラットフォームとしてのアデノソームの機会を開いている。
【０１５１】
実施例５：Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ上のＡｄ５．ｄ２４．ＲＧＤ．ＧＦＰからのアデノソーム及びウイルス画分の感染
ＨＥＲ９１１細胞（血清と共にＤＭＥＭ培地中で増殖させた６つのＴ１７５フラスコ）をＣＲＡｄ  Ａｄ５．ｄ２４．ＲＧＤ．ＧＦＰに感染させた。培地を、２時間後にＤＭＥＭ血清不含有培地で新鮮なものにした。４８時間後、標準的なイオジキサノール系処置（上述のように）を使用して、ウイルス粒子からアデノソームを分離した。勾配の上部分画（４ｍＬ）及び底部分画（４ｍＬ）を収集した。分画、及び１分画当たり６ｍＬのＰＢＳを加えた分画を、Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤ遠心フィルターに通し、粒子を濃縮し、２００μＬの最終体積を得た。試料を神経球に添加する前に、単層のＧＳ細胞で感染性粒子力価を決定した。神経球は、ＧＳ９４０一次腫瘍細胞（ウェル当たり１つの球）から確立され、７日齢の場合、アデノソーム及びウイルス粒子を有する同等の感染性力価で感染した。共焦点顕微鏡検査を、感染後６日目に行って、神経球内のＧＦＰ発現について分析した。ＧＦＰの発現の深さは、アデノソーム及びウイルス粒子と同様に出現した（図５）。
【０１５２】
実施例６：ｐＶ．ｐＶＩＩのヘテロガス発現は、ＥＶへのＤＮＡの組み込みを向上させる
ＨＥＲ９１１細胞を、血清培地中４つのＴ７５フラスコに播種した。１日後、細胞をマキシプレップしたＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした（８５０μｌ培地＋３４μｌのＦｕＧＥＮＥ＋１７μｇのＤＮＡを１０ｍｌの培地に添加したＦｕＧＥＮＥ６プロトコル）：ｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰの２つのフラスコ、及びｐＵＣ５７．ＣＭＶ．Ｃｒｉｍｓｏｎ−ｐＶＩＩ＿ＣＭＶ．ｅＧＦＰ−ｐＶの２つのフラスコ（図６ａ参照）。ＤＮＡプラスミドの合成後、配列決定を質の管理として行った。ｐＶ及びｐＶＩＩの配列は、野生型ＨＡｄＶ−５ゲノム配列から誘導された。蛍光タグ配列（ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎ）とｐＶ／ｐＶＩＩ  との間に、配列が、可撓性リンカー（ａａｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｇｃ）をコードするフレームに導入された。トランスフェクションの１日後、ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎ（赤外線）の両方の蛍光が、顕微鏡検査（Ｎｉｋｏｎ  Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ顕微鏡）によって、全ての場合において約７０％のトランスフェクション効率で観察された。目的のため、ｅＧＦＰ及びＣｒｉｍｓｏｎは、細胞全体にわたって均質に（予想どおり）観察されたが、ｅＧＦＰ−ｐＶ及びＣｒｉｍｓｏｎ−ｐＶＩＩシグナルはドットとして現れた。全てのフラスコ中の細胞は、細胞生存率におけるストレス／損失のいかなる兆候も示さず、また、ｐＶ／ｐＶＩＩタンパク質の毒性も示さなかった。トランスフェクションの１日後に、細胞を野生型ＨＡｄＶ−５（ＭＯＩ＝細胞当たり５個の感染性ユニット）で２時間感染させた後、培地をＤＭＥＭのみの培地に置き換えた。感染の１日後に、感染の最初の兆候が明らかとなったが、これは、注目すべきことに、Ｃｒｉｍｓｏｎ−ｐＶＩＩ＿．ｅＧＦＰ−ｐＶ含有細胞を有するフラスコにのみ見られる。Ｃｒｉｍｓｏｎ＿ｅＧＦＰ含有細胞を有するフラスコでは、感染性は２日後に明らかとなり、これはＨＡｄＶ−５感染に対して標準的である。感染から３日後に、４つのフラスコからの上清を採取し、標準的なイオジキサノール系処置（上述のように）を使用して、ＥＶを単離した。（ＥＶは、分画４〜７であった）。ｑＰＣＲ（上述のとおり）を行って、ＥＶ中のＤＮＡの装填を分析した。このことは、ｐＶ／ｐＶＩＩの異種発現が、ウイルスゲノムＤＮＡの組み込みを更にブーストしたことを明らかに示した（図６ｂ、上図）。更に、ｐＵＣ５７ＤＮＡの組み込みの増加も観察され、これは、ｐＵＣ５７プラスミドの存在のみならず、追加因子も必要とされ、この場合、アデノウイルス感染に関連していた（図６ｂ、下図）。細胞溶解アデノウイルス内のパッケージングモジュールとしてｐＶ／ｐＶＩＩを使用することの重要性について、タンパク質モジュールの発現は、ウイルス収率に悪影響を及ぼさず、ウイルスの収率はわずかに増加した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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