【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年5月6日(2010.5.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  以下の段階を含む、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法：
（a）核酸リンカーに付着したインビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；および
（b）符号化用分子を核酸リンカーに結合させることで、該タンパク質を符号化する段階。
【請求項２】  タンパク質がRNAタンパク質融合分子に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項３】  符号化用分子が以下の要素を含む、請求項1または2記載の方法：
（a）固有のアドレス指定用要素；
（b）リンカーに特異的な整列要素；および
（c）該アドレス指定用要素と、該リンカーに特異的な整列要素との間に位置する連結要素。
【請求項４】  符号化用分子が核酸または核酸類似体を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】  連結要素がポリエチレングリコールユニットを含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】  ポリエチレングリコールユニットがヘキサエチレンオキシドである、請求項5記載の方法。
【請求項７】  核酸リンカーとリンカーに特異的な整列要素とのハイブリッド形成を介して、タンパク質を符号化用分子に結合させる、請求項3記載の方法。
【請求項８】  以下の段階を含む、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法：
（a）インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；および
（b）アドレス指定用要素を含む核酸リンカーを該タンパク質に結合させることで、タンパク質を符号化する段階。
【請求項９】  タンパク質がRNAタンパク質融合分子に由来する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】  以下の段階を含む、インビトロ翻訳タンパク質を符号化する方法：
（a）インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；および
（b）アドレス指定用要素が核酸リンカーから分枝しており、該核酸リンカーをタンパク質に結合させることで、該タンパク質を符号化する段階。
【請求項１１】  タンパク質がRNAタンパク質融合分子に由来する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】  連結要素を介して、アドレス指定用要素を核酸リンカーに結合させる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】  連結要素がポリエチレングリコールユニットを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】  ポリエチレングリコールユニットがヘキサエチレンオキシドである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】  段階（b）で形成された符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む、請求項1、8、または10記載の方法。
【請求項１６】  符号化タンパク質が符号化タンパク質混合物から選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】  固相支持体がガラスまたはシリカを基材とするチップまたはビーズである、請求項15記載の方法。
【請求項１８】  捕捉用プローブを固相支持体に付着させる、請求項15記載の方法。
【請求項１９】  捕捉用プローブが核酸または核酸類似体を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】  符号化候補タンパク質を、捕捉用プローブとハイブリッド形成させることで固相支持体上に固定する、請求項18記載の方法。
【請求項２１】  タンパク質がレポータータグで標識される、請求項1、8、または10記載の方法。
【請求項２２】  レポータータグがフルオロフォアである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】  アフィニティータグを符号化用分子に付着させ、アフィニティータグを用いて符号化タンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項1、8、または10記載の方法。
【請求項２４】  アフィニティータグがビオチンである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】  符号化用分子を架橋成分で機能化し、かつ該符号化用分子とタンパク質とを架橋する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２６】  核酸リンカーを架橋成分で機能化し、かつ該核酸リンカーとタンパク質とを架橋させる段階をさらに含む、請求項8または10記載の方法。
【請求項２７】  固相支持体を架橋成分で機能化し、かつ符号化タンパク質と固相支持体とを架橋させる段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２８】  架橋成分が、ソラレン、アジド化合物、および硫黄含有分子からなる群より選択される、請求項25、26、または27記載の方法。
【請求項２９】  タンパク質の求核性アミノ酸側鎖を位置特異的に架橋する求電子試薬で、符号化用分子の5'末端を機能化し、かつ、該符号化用分子とタンパク質とを架橋する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】  以下の段階を含む、タンパク質と化合物間の相互作用を検出する方法：
（a）固相支持体上に固定化した、符号化インビトロ翻訳タンパク質を提供する段階；
（b）タンパク質と化合物との間の相互作用を可能とする条件下で、タンパク質を候補化合物に接触させる段階；および
（c）タンパク質と化合物との間の相互作用を示す指標として、化合物の存在について固相支持体を分析する段階。
【請求項３１】  化合物が核酸、タンパク質、治療用物質、および酵素からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】  核酸リンカーに付着し、かつ符号化用分子に結合した、インビトロ翻訳タンパク質。
【請求項３３】  符号化核酸リンカー分子に付着した、インビトロ翻訳タンパク質。
【請求項３４】  分枝状符号化核酸リンカー分子に付着した、インビトロ翻訳タンパク質。
【請求項３５】  捕捉用プローブを有する固相支持体に付着した、請求項32、33、または34記載のタンパク質。
【請求項３６】  ハイブリッド形成を介して符号化タンパク質が捕捉用プローブに付着した、請求項32、33、または34記載のタンパク質。
【請求項３７】  共有結合を介して符号化タンパク質が捕捉用プローブに付着した、請求項32、33、または34記載のタンパク質。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
一つの薬剤候補を発見するためには、数千種類の化合物をスクリーニングする必要がある。したがって、多数の化合物を迅速かつ効率よくスクリーニング可能であることが重要である。多数の化合物をスクリーニングする一つの方法では、タンパク質等の候補結合パートナーを固相支持体に固定する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
発明の概要
本発明の特徴は、個々のインビトロ翻訳タンパク質、またはインビトロ翻訳タンパク質群に、固有の極めて小さな符号化用分子のタグを付ける、または「符号化する」方法であり、続けて、符号化分子を固相支持体上または微粒子上で選別する関連した方法である。本発明はまた、本発明で符号化して選別したタンパク質を用いて、所望の結合パートナー（例えばタンパク質または他の化合物）を同定する方法を特徴とする。本発明により、部分的または完全にランダムなアミノ酸配列の大規模プールから所望の性質を有するタンパク質を単離しやすくなる。本発明により、タンパク質または化合物をスクリーニングする方法に対する自動化アプローチの採用も容易になる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
一つの態様において本方法は、符号化タンパク質を固相支持体上に固定化する段階をさらに含む。別の態様においては、候補タンパク質はRNAタンパク質融合分子に由来する。さらに別の態様においては、符号化用分子は核酸または核酸類似体から作られる。この符号化用分子は、好ましくは固有のアドレス指定用要素、リンカーに特異的な整列要素、およびアドレス指定用要素とリンカーに特異的な整列要素とをつなぐ連結要素を含む。さらに、符号化用分子の連結要素には、ポリエチレングリコールのユニット（好ましくはヘキサエチレンオキシド）を含めることができる。さらに別の態様においては、符号化用分子のリンカー特異的整列要素と、候補タンパク質の核酸リンカーまたは候補タンパク質そのものとの間にハイブリッドを形成させることで、候補タンパク質と符号化用分子とを付着させる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
さらなる態様においては、符号化用分子および固相支持体を、架橋成分で機能化する。架橋成分は、好ましくはソラレン、アジド化合物、または硫黄含有分子である。一つの態様においては、符号化用分子の5'末端を、対象タンパク質の求核性アミノ酸側鎖を位置選択的に架橋する求電子試薬で機能化する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
本発明の第5の局面は、核酸リンカーに付着し、符号化用分子に結合したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
本発明の第6の局面は、符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の第7の局面は、分枝状符号化核酸リンカー分子に付着したインビトロ翻訳タンパク質を特徴とする。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
「符号化用分子（encoding molecule）」とは、タンパク質またはペプチドに付着可能で、タンパク質集団に含まれるタンパク質を認識しやすくする固有のタグを意味する。符号化用分子は、核酸、核酸類似体、または非ヌクレオシドで構成されうるが、翻訳されて対象タンパク質そのものを生じるRNAは含まない。「符号化（encoded）」とは、符号化用分子を付着させることを意味する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
「アドレス指定用要素（addressing element）」とは、任意の集団内における他のそのような要素とは配列を十分異にすることで固有の特性（unique identity）を符号化用分子に付与する符号化用分子の一部分を意味する。アドレス指定用要素の長さは、好ましくは4〜40ヌクレオチド単位である。さらにアドレス指定用要素は、核酸または核酸類似体を含む場合がある。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
「選別する」とは、系統だったかたちで位置を定めることを意味し、または同定もしくは分離することを意味する。符号化タンパク質を、固相支持体上に選別することができる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
「捕捉用プローブ」とは、集団内の固有の符号化用分子のアドレス指定用要素に依存してハイブリッドを形成するデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の配列を意味する。捕捉用プローブには、核酸または核酸類似体を含めることができる。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
「機能化する（functionalize）」とは、官能基または官能性成分の付着を可能とするように化学的な修飾を施すことを意味する。例えば符号化用分子を、タンパク質またはペプチドの求核性アミノ酸側鎖を位置特異的に架橋する求電子試薬で機能化することができる。別の例では、固相支持体の符号化用分子または捕捉用プローブを、ソラレン、アジド化合物、または硫黄含有ヌクレオシドなどの架橋成分で機能化することができる。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
本発明には利点がいくつかある。例えば本発明により、事前に作製した、核酸または核酸類似体などの一連の汎用性の高い（ユニバーサルな；universal）符号化用分子を使用することが可能となる。これらの符号化用分子は、対応するユニバーサルなマイクロアレイまたは一連の微粒子とともに使用して、新しいタンパク質ディスプレイシステムを構築することができる。事前に作製した符号化用分子のシステムには柔軟性、モジュール形成性、拡張性、および、優れた経済性がある。本発明の別の利点は、酵素反応を介した取り込みまたは重合化には適していないが、いくつかの点で従来のDNAまたはRNAより優れた核酸類似体の使用を選択できることである。本発明のさらなる利点は、リアルタイムにおけるタンパク質のモニターに使用可能な蛍光成分でタンパク質を標識可能なことである。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
本発明のさらに別の利点は、符号化して選別した産物が、最終的にタンパク質をコードするRNAを含まないことである。これはいくつかの点で重要である。特に、化学的に安定であり、かつヌクレアーゼに対して耐性をもつDNAは、その扱いが単純である。さらにタンパク質のRNAの長さは、タンパク質のサイズに直接関連し、大きなタンパク質ほどRNAのメッセージは長くなる。このような長いRNA領域は時に、予測困難な安定な2次構造をとる傾向があり、このような2次構造が、ハイブリダイゼーション段階ならびにタンパク質の折りたたみおよび機能と干渉する場合がある。したがって、タンパク質をコードするRNAの非存在下において、タンパク質を符号化して選別する方法が開発されれば、この分野における大きな進歩となる。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
本明細書は、インビトロ翻訳タンパク質の符号化方法および選別方法を開示する。本発明の各方法を実行する手法を、特定の実施例を用いて詳細に説明する。実施例は本発明を説明することを目的として提供するものであって、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
RNAタンパク質融合分子は、好ましくは候補タンパク質のコード配列に機能的に連結された翻訳開始配列および開始コドン、ならびに、当該候補タンパク質のコード配列の3‘末端にペプチドアクセプターを含む、RNA分子を含む。DNA配列またはRNA分解酵素に耐性の核酸類似体の配列は、メッセージの末端とペプチドアクセプターとの間に含まれる。必要に応じ、例えば特定の源に由来する、または任意のタイプのRNA配列の群または集合体は、同じ一般的な方法によって一つの反応混合物中でともに翻訳することができる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
必要に応じ、RNAタンパク質融合体をレポーター基、例えば蛍光レポーター基で標識する。DNAリンカーを組み立てる際に、例えばロバーツおよびショステックの論文（前掲）に記載された一般的な手順を改変して、DNAリンカーの一つまたは複数のヌクレオチドを蛍光性dT（Glen Research、バージニア州、スターリング）と置換することで、蛍光レポーター基をピューロマイシン含有DNAリンカーに組み入れることができる。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
次に個々の残りのタンパク質を、以下の手順で符号化する。符号化段階では、個々のタンパク質がそれぞれ固有の符号化用分子をもつように符号化することができる。この方法では、各符号化タンパク質を、選別過程で唯一の捕捉用プローブに対応するように設計することにより、固相支持体上における各タンパク質の正確な「アドレス」を識別することができる。または、複数のタンパク質をプールして、一つまたは複数の符号化用分子で符号化することができる。この方法では、同じ符号化用要素に、一つまたは複数の異なるタンパク質を符号化することができる。また符号化タンパク質を選別する際に、一つ以上の符号化タンパク質を特定の捕捉用プローブに結合させることができる。したがって、固相支持体上の各「アドレス」には、それぞれ同じ符号化用分子を有するタンパク質の混合物を含むことができる。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
次に、例えば図2Aおよび図2Bに示した、入力RNAに対してモル比が約1：1の固有の符号化用分子を各ウェルに添加する。個々の固有のタンパク質は、異なる固有の符号化用分子の受け手となり、かつ固有の符号化用分子の特性は既知であることから、タンパク質の特性を決定することができる。図2Aに示すように、固有の符号化用分子はそれぞれ3種類の非常に重要な要素を含む：「リンカーに特異的な整列要素」は、核酸または核酸類似体からなり、ペプチドアクセプターとインビトロ翻訳タンパク質間に位置するDNAリンカーに結合するか、またはタンパク質部分に直接に結合し；「アドレス指定用要素」は、核酸または核酸類似体からなり、固相支持体上の特定の位置、または特定の微粒子に結合し；「連結要素」は、リンカーに特異的な整列要素と固有の符号化用要素を連結する。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
単純な固有の符号化用分子は、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）（Tetrahedron Letters 22： 1859、1981）に記載の従来の自動固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば図2Bに示す例示的な符号化用分子の合成は、A単量体で、当該ヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスビーズ（controlled-pore glass）またはポリスチレン）から始まる。さらに単量体を段階的に結合させて、所望の符号化用配列を構築する。特異的な符号化用配列の設計上の規則は米国特許第5,863,722号に記載されている。符号化用配列を組み立てた後に、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して、柔軟性のある連結要素を得る。次に、リンカーに特異的な整列要素を添加する。融合体をロバーツおよびショステック（前掲）に記載の標準的な30P DNAリンカーとともに調製する場合は、15量体のポリT整列要素を付加する。他のDNAリンカーを融合体（すなわち30P以外）の調製に使用する場合は、整列要素はDNAリンカー配列の一部の領域の逆相補でなければならない。最後に、必要に応じソラレンホスホラミダイト（Glen Research）、または同等のホスホラミダイト部分を5'末端に付加して第1架橋成分として機能させる。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
単純な固有の符号化用分子に手を加えることで、容易に広範な符号化用分子を得ることができる。例えば上述したように、固有の符号化用分子は、通常はリンカーに特異的な整列要素において、固有の符号化種をインビトロ翻訳タンパク質と恒久的に架橋するために使用する第1架橋成分、例えばソラレンにより機能化することができる。アドレス指定用要素についても、第2架橋成分、例えば4-チオTにより機能化して、固相支持体と固有の符号化用分子との間に共有結合を形成させることができる。またアドレス指定用要素を、符号化タンパク質を単離および濃縮する際に使用するアフィニティータグ、例えばビオチンでさらに標識することができる。アフィニティータグを3'の支持体（Glen Research）として組み入れ、符号化用分子の残りの部分を上述の手順で構築する。一つの特定の態様においては、唯一の符号化用分子の連結要素はポリエチレングリコールユニット、例えばヘキサエチレンオキシドを含む。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
固有の符号化用分子を、当技術分野で周知の例えば図1Cに示した標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、符号化用分子のリンカーに特異的な整列要素とタンパク質融合体のDNAリンカー間の相互作用を介してタンパク質とハイブリッドを形成させる。次に固有の符号化用分子を、タンパク質のDNAリンカー、またはタンパク質そのもののいずれかに対し、紫外線（通常350 nm）を照射して共有結合で架橋する。符号化用分子をタンパク質のDNAリンカーに共有結合で架橋させる場合は、例えばガスパッロ（Gasparro）らの方法（Nucleic Acids Research、 22：2845〜2852、1994）にしたがって、ソラレンなどの架橋剤を使用することができる。または符号化用分子をタンパク質に共有結合で直接架橋させる場合は、例えばベイレイ（Bayley）の方法（「生化学および分子生物学における光生成試薬（Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology）」、エルゼビア、ニューヨーク、1983）にしたがって、アジド化合物などの架橋剤を使用することができる。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
次に、固有の符号化用分子に架橋させたタンパク質を含む溶液を混合し、例えばビオチン化したタンパク質を、標準的な方法でストレプトアビジンカラムに添加して、標準的なアフィニティー分離法で単離する。符号化用分子に付着するアフィニティータグを用いた他の標準的なアフィニティー分離法を使用することができる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
次に、符号化用タンパク質を含むアフィニティー分離した溶液を、例えば図1Dに示すように固相支持体に添加する。この固相支持体は好ましくは、例えばフルトン（Fulton）らの論文（Clinical Chemistry 43： 1749〜1756、1997）ならびに図3Aおよび図3Bに示されるような、符号化タンパク質と相互作用するように設計した捕捉用プローブを含むユニバーサルなチップまたはユニバーサルな符号化微粒子セットである。捕捉用プローブは好ましくは、符号化用分子の固有の符号化用要素に配列特異的に結合して、タンパク質を固相支持体に連結してタンパク質を選別する核酸または核酸類似体である。固相支持体上の各捕捉用プローブは、各配列が異なる符号化用分子タンパク質複合体と結合する種々のヌクレオチド配列を含むように設計する。第2架橋成分（上述）を介して、捕捉用プローブと符号化用分子とを架橋するために酸化反応で使用可能な分子、例えば4-チオTを含めることもできる。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
実施例2
符号化用DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
符号化過程をさらに単純化するために、インビトロ翻訳タンパク質を図4A〜図4Cに示すような符号化DNAリンカーの状態で固有の符号化用分子に直接連結させたRNA分子から作製することもできる。符号化DNAリンカーには、核酸または核酸類似体、および固相支持体上の特定の位置または特定の微粒子に結合する核酸または核酸類似体を含む「アドレス指定用要素」を含めることができる。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
単純な符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）の論文（前掲）に記載された、従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法で3'→5'方向に組み立てることができる。例えば、図5Bに示す例示的な符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を添加する。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化用配列を構築する。特定の符号化用配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。12個のA単量体を段階的に結合させて、DNAリンカーの構築を終了する。符号化DNAリンカー分子の全長は、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）で使用される30P DNAリンカーと同じであることが好ましい。合成が完了したら、符号化用分子を支持体から切り離し、通常の手順で水酸化アンモニウムを用いて脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気移動法で行う。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
必要に応じ、単純な符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで容易に広範な符号化DNAリンカー分子を得ることができる。アフィニティータグおよびフルオロフォアは、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域中にそれぞれ組み入れられ、図5Bに示す12個のA単量体のうち1個/2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な符号化DNAリンカーについて既に記載した通りに構築する。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
5'末端がリン酸化された符号化DNAリンカーを、例えば図4Aに示すようにT4 DNAリガーゼを用いてRNAに連結する。次に、連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1で示した方法で、また、図4Bに示したように分解する。このRNA分解過程を経てインビトロ翻訳タンパク質は符号化DNAリンカーに付着する。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、図4Cに示すように、ユニバーサルなチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で図1に示すように生じる。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
基本的に上述された手法を用いて、TNF-αを結合するポリペプチド、およびIL-13を結合するポリペプチドを、以下のようにインビトロで翻訳し、符号化して選別し、TNF-αおよびIL-13を結合することを示した。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
4組の連続した4ヌクレオチドブロックに基づく固有の配列を、符号化ポリペプチドの選別および固定の両方における捕捉点として働くように選択した。使用した捕捉（選別）用配列の一覧を以下に示す（5'→3'方向に記載）：
2003508761.tif 000001
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、従来のホスホラミダイト化学法で、グレンリサーチ社（Glen Research）から入手した試薬を用いて、自動化DNA合成装置（PE BioSystems Expedite 8909）で調製した。合成は、3'末端のアミンが最終脱保護段階まで露出状態とならないように直交的に保護されたアミノ基を有する固相支持体から開始させた。添加する先頭の4個の単量体はヘキサエチレンオキシドのユニット（HEO）とし、それに続けて標準的なA、G、C、およびTの各単量体を添加した。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離して水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥し、エタノールで沈殿させ、トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中、アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLC法で精製した。HPLC法から適切な分画を回収し、真空遠心して蒸発乾固した後、水で共蒸発させた。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
次に固有の符号化DNAリンカーを5'末端のdA11トラクトを用いて合成し、4ヌクレオチドブロック群からなる固有の16量体、dC2、および3'末端のピューロマイシンと続けて合成した。これは図5Bの符号化用分子と同様である。符号化用配列は以下の通りであり、上述の捕捉用プローブ配列と接合して作用するように設計した（5'→3'の方向に記載）：
2003508761.tif 000002
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
基本的に上述されたとおり自動化DNA合成装置を用いて、従来のホスホラミダイト化学法で符号化DNAリンカーを調製した。すべての試薬はグレンリサーチ社（Glen Research）から入手した。保護されたピューロマイシン成分をもつ固相支持体から合成を開始させた。オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離し、水酸化アンモニウムで脱保護処理を行い、濃縮して乾燥させた後に、エタノールで沈殿させた。純度と完全性は陰イオン交換HPLC法で確認した。
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６６】
FnTNFのRNA構築物およびFnIL13のRNA構築物を、5'末端がリン酸化された固有の符号化用配列に酵素を用いて連結した。FnTNF RNAはTAG_LN-8に連結させ、FnIL13はTAG_LN-16に連結させて、RNA-DNAリンカーピューロマイシンキメラ分子：それぞれFnTNF_LN-8およびFnIL13_LN-16を得た。連結は1ナノモルスケールで、等モル量のRNAと5'端がリン酸化された符号化DNAピューロマイシンリンカーとを対象に、100ユニットのT4 DNAリガーゼ（Promega）を用いて、1ナノモルの共通DNAスプリント（splint）
2003508761.tif 000003
の存在下で行った。16℃で12〜18時間インキュベートし、連結産物を変性PAGE（6% TBE-尿素）で分離した。連結産物をUVシャドウイング法で可視化し、ゲルから切り出して溶出し、破砕および浸漬した後に沈殿させてH2Oに再懸濁した。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
精製後の連結産物のインビトロ翻訳を以下の手順で行った：H2O中、83μLの連結RNA（120pmol）に15μLのマスターミックス（Ambion、メチオニン非含有）、2μLの35S-メチオニン（15μM）および200μLのウサギ網状赤血球溶解物（Ambion）を添加して総量を300μLとした。この反応混合物を30分間30℃でインキュベートした後に、100μLの2M KClおよび20μLの1M MgCl2を添加した。さらに60分間室温でインキュベートした後に47μLの0.5M EDTAを添加した。
【誤訳訂正３８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
選別したポリペプチドが機能することを、標識したTNF-αタンパク質に結合させて明らかにした。組換え型のヒトTNF-α（500μg、PeproTech）を、230μLの1×PBSに溶解し、700mLの攪拌済みの1×PBSでマイクロダイアライザー（Microdialyzer）ユニット（3,500MWCO、Pierce）を用いて4℃で18時間かけて透析した。透析したTNF-αタンパク質を、EZ-LinkのNHS-LC-LCビオチン化試薬（20μg、Pierce）を用いて0℃で2時間かけて処理し、再び700mLの攪拌済みの1×PBSを用いて4℃で18時間かけてマイクロダイアライザーユニット（3,500MWCO、Pierce）で透析した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。
【誤訳訂正３９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
選別したポリペプチドが機能することは、標識したIL-13タンパク質に結合することから証明された。組換え型のヒトIL-13（500μg、PeproTcch）を上述の方法でビオチン化した。結果として得られた接合体をMALDI-TOF質量分析計で分析し、それが一つのビオチン部分によりほぼ完全に機能化されていることを確認した。ビオチン化したIL-13タンパク質の結合後に、Cy3で標識した抗ビオチンモノクローナル抗体による検出を上述の方法で行った。
【誤訳訂正４０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
実施例3
分枝状符号化DNAリンカーを用いたインビトロ翻訳タンパク質の符号化および選別
インビトロ翻訳タンパク質を符号化するさらに別の方法を図8A〜図8Cに示す。このアプローチでは、インビトロ翻訳の対象となる所望のタンパク質をコードするRNAを、分枝状符号化DNAリンカーの形状の固有の符号化用分子に連結させる。このDNAリンカーは図9A〜図9Bに示す核酸または核酸類似体を含む。核酸または核酸類似体を含むアドレス指定用要素がDNAリンカーから分枝し、そこにリンカー要素が連結する。
【誤訳訂正４１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７８】
単純な分枝状符号化DNAリンカー分子を、例えばボーケージ（Beaucage）およびカルサース（Caruthers）による前掲の論文に記載の従来の自動化固相支持体結合ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド化学法によって3'→5'の方向に組み立てることができる。例えば図9Bに示す例示的な分枝状符号化DNAリンカー分子の合成は、ペプチドアクセプター（例えばピューロマイシン）で、当該ヌクレオシドの2’-ヒドロキシル基において機能化された固相支持体（例えば多孔性球状ガラスまたはポリスチレン）から始まる（Glen Research）。次に2個のC単量体を付加した後に、18個のA単量体を付加する。次に、差次的に保護された非対称の分枝状単量体（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）を付加してDMT保護基を除去する。次に9個のA単量体を付加する。次に分枝状の単量体上にあるLev保護基を除去し、4個のヘキサエチレンオキシド単量体ユニット（Glen Research）を添加して柔軟性のある連結要素を得る。次に適切な単量体を段階的に添加して所望の符号化配列を構築する。特定の符号化配列の設計上の規則は、米国特許第5,863,722号に開示されている。完成時に分枝状符号化DNAリンカー分子は2か所の5'末端を含む。合成が終了したら、通常の方法で水酸化アンモニウムを用いて符号化用分子を支持体から切り離して脱保護処理を行う。最終的な精製は、標準的なクロマトグラフィー法または電気泳動法で行う。
【誤訳訂正４２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
上述の単純な分枝状符号化DNAリンカー分子に、アフィニティータグ（例えばビオチン）および/またはフルオロフォア（例えばフルオレセイン）を用いて手を加えることで、容易に広範な分枝状符号化DNAリンカー分子を得ることができる。好ましくは、アフィニティータグおよびフルオロフォアはそれぞれ、核酸塩基を機能化したT単量体（Glen Research）として符号化用分子のポリA領域に組み入れられ、27個のA単量体のうち1個または2個を置換する。符号化用分子の残りの部分は、単純な場合について既に述べたように構築される。RNAおよび分枝状DNAリンカーを、例えばT4 DNAリガーゼを用いて連結させる。次に連結産物を、ロバーツおよびショステックの方法（前掲）、およびショステックらの方法（前掲）でインビトロで翻訳し、RNAタンパク質融合分子を形成させ、次にこの分子のRNA部分を実施例1に記述した方法で、または図8Bに示すように分解する。このRNAの分解段階で、インビトロ翻訳タンパク質が分枝状符号化DNAリンカーに付着する。
【誤訳訂正４３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８０】
符号化したインビトロ翻訳タンパク質は、ユニバーサルなチップまたはビーズセットと図8Cに示すようにハイブリッドを形成させることができる。ハイブリッド形成は、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素と、固相支持体の捕捉用プローブとの間で、実施例1に示すように形成される
【誤訳訂正４４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
他の態様は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着するRNA分子が、インビトロで翻訳されてRNAタンパク質融合分子を形成する。次に融合分子のRNA部分をRNaseで分解する。融合分子の残りの部分は、DNAリンカーに付着したタンパク質からなる。
【図１Ｂ】  図1Aで説明したRNAの分解後に残る融合分子のタンパク質部分を示す略図である。
【図１Ｃ】  符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、符号化タンパク質の作製にかかわる後続の手順を表し、（i）DNAリンカーと「固有の符号化用分子」とのハイブリッドを形成させる段階、（ii）符号化用分子とDNAリンカー分子との共有結合による架橋を誘導する段階、（iii）全符号化タンパク質を一つの溶液中に混合する段階、および（iv）アフィニティーを利用した分離で符号化タンパク質を単離した後に、タンパク質産物を濃縮する段階を含む。以上の段階で得られる最終的な産物は、符号化インビトロ翻訳タンパク質の混合物である。
【図１Ｄ】  符号化して選別したインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与するさらなる例示的段階を示す略図である。この別の段階は、（i）図1Cで形成された分子が固有の符号化用分子を介してユニバーサルなチップまたはビーズとのハイブリッドを形成する段階、および（ii）チップまたはビーズと唯一の符号化用要素との間に共有結合による架橋を誘導する段階を含む。この段階はまた、符号化タンパク質を固相支持体の捕捉用プローブに特異的に結合させること、および符号化タンパク質と、符号化タンパク質に対応しない捕捉用プローブとの間には結合がないことを示している。
【図２Ａ】  一般的な意味では図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化するために使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。この分子は、第1架橋成分を含むリンカー特異的な整列要素に、連結要素を介して付着したアドレス指定用要素を含む。
【図２Ｂ】  図1A〜1Dに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、アフィニティータグがビオチンであり、第2架橋成分が硫黄含有ヌクレオシドであり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示し、第1架橋成分はソラレンである。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してリンカー特異的な整列要素に連結される。
【図３Ａ】  固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なビーズを示す略図である。捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子を結合するように設計されている。
【図３Ｂ】  固相支持体の一例として、タンパク質ディスプレイシステムを作製するために本発明で使用可能なチップを示す略図である。チップの指定位置における捕捉用プローブの配列は、実施例2Bの符号化用分子に結合するように設計されている。
【図４Ａ】  符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる一つの例示的段階を示す略図である。この段階では、RNA分子と、符号化DNAリンカーを連結させる。このリンカーは、符号化タンパク質を固相支持体に結合させる際に使用される符合を有する。
【図４Ｂ】  符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる他の例示的段階を示す略図である。この段階は、RNAタンパク質融合分子を形成させるために符号化DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着したRNA分子の翻訳と、それに続くRNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解とを示す。融合分子の残りの部分は、符号化DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。
【図４Ｃ】  符号化DNAリンカーを用いて符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産にかかわる最終的な例示的段階を示す略図である。この段階は、図4Bで形成された分子が、符号化DNAリンカーを介して一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成することを示す。
【図５Ａ】  図4A〜4Cに示すタンパク質を符号化する際に使用する例示的な符号化用分子を示す略図であり、一般的にはアドレス指定用要素およびペプチドアクセプター、例えばピューロマイシンを含むDNAリンカーを含む。
【図５Ｂ】  図4A〜4Cに示すように、本発明でタンパク質を符号化する際に使用する符号化用分子の一例を示す略図であり、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。
【図６Ａ】  本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージ（phsophorimage）である。
【図６Ｂ】  本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図７Ａ】  本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイのホスホイメージである。
【図７Ｂ】  本発明の方法で得られた例示的なマイクロアレイの蛍光スキャン画像である。
【図８Ａ】  分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する一つの例示的段階を示す略図である。この段階は、RNA分子の分枝状DNAリンカーとの連結を示す。
【図８Ｂ】  分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する他の例示的段階を示す略図である。この段階は、分枝状DNAリンカーを介してペプチドアクセプターに付着させてRNAタンパク質融合分子を作製するRNA分子の翻訳、およびそれに続く、RNA分解酵素による融合分子のRNA部分の分解を含む。融合分子の残りの部分は、分枝状DNAリンカーに付着したタンパク質を含む。この段階の産物は、RNA分解後に残る融合分子のタンパク質部分である。
【図８Ｃ】  分枝状符号化DNAリンカーを用いて、符号化して選別するインビトロ翻訳タンパク質の生産に関与する最終的な例示的段階を示す略図である。この段階では、図8Bで形成された分子が、分枝状DNAリンカーのアドレス指定用要素を介して、一般的なチップまたはビーズセットとハイブリッドを形成する。
【図９Ａ】  一般的には図8A〜8Cに示したタンパク質の符号化に使用する例示的な符号化用分子を示す略図である。
【図９Ｂ】  本発明で使用し、図8A〜8Cに示した符号化用分子の一例を示す略図である。Xはこの分子の分枝点を示し、囲み中のヌクレオチド配列はアドレス指定用要素を示す。アドレス指定用要素は、ヘキサエチレンオキシドの連結要素を介してDNAリンカーに付着する。