(57)【要約】本発明は、特別の性能を持つプロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアントに関する。前記のプロテアーゼバリアントのスクリーニング方法は、（１）プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程；（２）前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下で、プロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程；および（３）必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程を含み、ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである。本発明のプロテアーゼバリアントは、タンパク質の工業生産に有利である。
2022502070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程；
（２）前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下でプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程；および
（３）必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程を含み、
ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである、
プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法。
【請求項２】
ランダム突然変異誘発キットで前記の変異ライブラリーを生成することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）において、例えばＴＥＶプロテアーゼテンプレート（例えば配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖ  ＴＥＶプロテアーゼ）のような適切なプロテアーゼテンプレートをテンプレートとして、ランダム変異を行い、前記のライブラリーを構築し、
好ましくは、プロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、最初のプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で最初のプロテアーゼの酵素切断活性を保持し；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼの酵素切断活性を保持する、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントが、プロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１（例えばＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１）を含む融合タンパク質として提示され；プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントが、ファージの表面に提示されることが好ましく；ここで、ＴＥＶｐがＴＥＶプロテアーゼであり、ｓＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼの切断配列であり、Ｙ１が標的タンパク質であり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
宿主内で、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントのＮ末端に、直接的、またはリンカーを介して間接的に部分Ａを付加することを含み、
ここで、好ましくは、前記の部分Ａが、親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記のプロテアーゼに適した生体外条件下で、部位Ａに特異的な部位Ｂを固定化した固体支持体とともに、部分Ａを付加したファージライブラリーを一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液と支持体とを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返し、
ここで、好ましくは、前記の部分Ｂが部分Ａに特異的に結合するという条件で、部分Ｂが、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼが、Ａｖｉ−プロテアーゼ−プロテアーゼ切断部位−Ｙ１−ＰＩＩＩ、好ましくはｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１構築物を介してＡｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰＩＩＩとして、ファージＰＩＩＩタンパク質の末端に提示され、ここで、Ａｖｉタグが１５個のアミノ酸残基ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥからなる短いペプチドタグであり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択され；
好ましくは、前記の酵素切断活性が、前記のプロテアーゼおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質、好ましくはＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１に対して測定されるものであり；
好ましくは、前記のスクリーニングが、宿主内で前記のプロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーをビオチン化することを含み；
好ましくは、前記のスクリーニングが、ビオチン化されたファージライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズで処理し、磁気ビーズによって捕捉されたファージを中／高濃度の尿素中で一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液から磁気ビーズを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返し；
好ましくは、前記のライブラリーが、コロニーＰＣＲによって検証され、好ましくは、前記のコロニーＰＣＲに使用されるプライマーが、
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３’
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣ−３’
であり；
好ましくは、ライブラリーの容量は１×１０９以上、好ましくは２×１０９であり；好ましくは、全体の変異頻度は１．５〜７個／ｋｂの中／低程度である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｙ１がヒトまたはブタのＡＣＴＨまたはＧＬＰ−１であり、好ましくは、前記の宿主が大腸菌である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記の生体外変性条件が中／高程度の変性条件であり、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の条件である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記のプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントの切断配列はＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈから選択され、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列は、配列番号７および８から選択され；好ましくは、前記のプロテアーゼバリアントまたはＴＥＶプロテアーゼバリアントは、中／高程度の変性条件下、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、最初のプロテアーゼ（例えばＳ２１９Ｖプロテアーゼ）の生体外酵素切断活性を保持し；好ましくは、前記の酵素切断活性は、前記のプロテアーゼバリアントおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものであり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列は配列番号７および８から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法によって得られるプロテアーゼバリアント。
【請求項１１】
前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）またはヒスチジン（Ｈ）への変異、
配列番号１に示される配列の第１３８位に対応する位置でのイソロイシン（Ｉ）からリジン（Ｋ）への変異、
配列番号１に示される配列の第２８位に対応する位置でのヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）への変異、
配列番号１に示される配列の第１９６位に対応する位置でのグルタミン酸（Ｑ）からヒスチジン（Ｈ）への変異、
配列番号１に示される配列の第１３５位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への変異、および
配列番号１に示される配列の第１８７位に対応する位置でのメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への変異からなる群から選択される１つまたは複数の変異を含み；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１３８位に対応する位置でのイソロイシン（Ｉ）からリジン（Ｋ）への変異；
配列番号１に示される配列の第２８位に対応する位置でのヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）への変異、配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１９６位に対応する位置でのグルタミン酸（Ｑ）からヒスチジン（Ｈ）への変異；ならびに
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からヒスチジン（Ｈ）への変異、配列番号１に示される配列の第１３５位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１８７位に対応する位置でのメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への変異からなる群から選択される変異の組合せを含み；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、配列番号１に示される配列の第２１９位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からバリン（Ｖ）への変異を含み；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有すること、および／または前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、中／高程度の変性条件下で、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、高い酵素切断活性を有し、好ましくはＳ２１９Ｖバリアントの生体外酵素切断活性を保持することという条件下で、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、上記の変異以外の１つまたは複数の変異をさらにを含む、
請求項１０に記載のプロテアーゼバリアント。
【請求項１２】
前記の相同体が、配列番号４、５または６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
好ましくは、前記の相同体が、配列番号４、５または６と比較して、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、最も好ましくは少なくとも４個のアミノ酸部位の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記の相同体が、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、および／または前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、中／高程度の変性条件下で、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、より好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、Ｓ２１９Ｖバリアントの生体外酵素切断活性を保持する、
請求項１０または１１に記載のプロテアーゼバリアント。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のプロテアーゼバリアントを含む融合タンパク質であって、
好ましくは、前記の融合タンパク質は、プロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１、好ましくはＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１の構造を含み、ここで、Ｙ１は、標的ポリペプチドであり；ＴＥＶｐは、請求項１０〜１２のいずれかに記載のＴＥＶプロテアーゼバリアントであり；ｓＴＥＶは、ＴＥＶプロテアーゼの切断配列であるＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓであり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記の切断配列は配列番号７および８から選択され；好ましくは、前記の標的ポリペプチドは、ＡＣＴＨ、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ、ＣＣＬ５、ＳＤＦ−１α、ＩＧＦ−１、Ｌｅｐｔｉｎ、ＢＮＰ、Ｅｘ−４からなる群から選択され、好ましくはＡＣＴＨであり、好ましくはヒトＡＣＴＨであり、より好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のヒトＡＣＴＨであり；好ましくは、プロテアーゼバリアント（例えばＴＥＶｐ）はプロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアントおよびプロテアーゼバリアント切断配列（例えばＴＥＶｐおよびｓＴＥＶ）は直接接続され、または１つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され；好ましくは、プロテアーゼバリアント（例えばＴＥＶｐ）はプロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）およびＹ１は直接接続され、または１つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され、好ましくは、プロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）およびＹ１は直接接続され；好ましくは、前記の融合タンパク質は、タグをさらに含み、好ましくは、前記のタグは、精製タグであり；好ましくは、前記のタグは、Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＮｕｓＡタグ、ＳＵＭＯタグ、Ａｖｉタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、またはＳｔｒｅｐ  ＩＩタグからなる群から選択され；好ましくは、前記のタグは、融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にあり、或いはＴＥＶｐのＮ末端にタグはない、
融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、または請求項１３に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、
好ましくは配列番号１４〜１６から選択される、
ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項１５に記載のポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクターであって、
好ましくは、前記の発現ベクターが真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターであり；好ましくは、ｐＲＳ３１４、ｐＹＥＳ２、バキュロウイルス−Ｓ２発現系およびｐｃＤＮＡ３．１からなる群から選択され、或いは、好ましくは、ｐＥＴ系発現ベクター、ｐＱＥ系発現ベクターおよびｐＢＡＤ系発現ベクターからなる群から選択される、
発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項１５に記載のポリヌクレオチド構築物、または請求項１６に記載の発現ベクターを含む細胞であって；
好ましくは、前記の真核細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、昆虫細胞発現系からなる群から選択され；好ましくは、前記の原核細胞が、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ２、Ｒｏｓｅｔｔａ２  ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、またはＯｒｉｇａｍｉ  ２からなる群から選択される、
細胞。
【請求項１８】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントを調製する方法であって、
（１）請求項１７に記載の細胞の培養に適した条件下で、培地中で前記の細胞を培養すること；
（２）培地を回収するか、または細胞を溶解して、ライセートを回収すること；
（３）精製して前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントを得ることを含む、
プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントの調製方法。
【請求項１９】
標的ポリペプチドの調製における、請求項１０〜１２のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントの使用であって、
ここで、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントおよび前記の標的ポリペプチドが、融合タンパク質として発現され、好ましくは、前記の融合タンパク質が請求項１３に記載の融合タンパク質である、
プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントの使用。
【請求項２０】
標的ポリペプチドを調製する方法であって、
（１）請求項１３に記載の融合タンパク質を適当な条件下で培地中で培養すること；
（２）融合タンパク質の封入体を得ること；
（３）約８Ｍの尿素または約６Ｍのグアニジン塩酸塩のような高変性条件下で、封入体を溶解すること；
（４）中／高程度変性条件下で、好ましくは３Ｍ〜５Ｍ尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍ尿素、より好ましくは４Ｍ尿素または１Ｍ〜２Ｍグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍグアニジン塩酸塩の条件下で、一定の温度、例えば２０〜４０℃、好ましくは２５℃で、例えば１０〜２４時間、例えば１２時間インキュベートすること；
（５）緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した後、プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼを沈殿させること；
（６）プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼの沈殿物を遠心分離で除去し、前記の標的ポリペプチドを得ること；
（７）前記の標的ポリペプチドを精製し、ここで、前記の精製が、塩析、限外濾過、有機溶媒沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーカラム、逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術によって実施されることを含む、
標的ポリペプチドの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１８年１０月１０日に出願された、発明の名称が「ＴＥＶプロテアーゼバリアント、その融合タンパク質、調製方法および使用」である、出願番号がＣＮ２０１８１１１７７１０５．９である中国特許出願と、２０１８年１２月１７日に出願された、発明の名称が「プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント」である、出願番号がＣＮ２０１８１１５４０３４４．６である中国特許出願との優先権を主張するものであり、それらの全体を参照により本出願の一部をなすものとして引用する。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は、タンパク質分野に関し、具体的に、プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法およびＴＥＶプロテアーゼバリアントに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＥＶプロテアーゼ（ＴＥＶ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）Ｎｌａプロテアーゼに由来する２７ｋＤａの活性ドメインであり、そのアミノ酸配列は配列番号１に示される。ＴＥＶプロテアーゼは、強い部位特異性を持ち、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）７アミノ酸配列を認識できる。最も一般的な配列は、グルタミンＧｌｎ（Ｐ１）とグリシンＧｌｙ（Ｐ１’）との間（即ち、Ｐ１とＰ１’との間）に制限部位を有するＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（またはＥＮＬＹＦＱＧ）である。ＴＥＶプロテアーゼの配列特異性は、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼなどのプロテアーゼの配列特異性よりもはるかに高い。
【０００４】
ＴＥＶプロテアーゼは、広い範囲のｐＨ（ｐＨ４〜８．５）および温度（４〜３４℃）に耐えられ、タンパク質の溶解性または安定性を増加させる一般的な添加剤（エチレングリコール、ＥＧＴＡ、洗剤および還元剤）に対してある程度の耐性がある。ＴＥＶプロテアーゼがエチレングリコール、ＥＧＴＡおよび一部の洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｅｎ−２０、およびＮＰ−４０）に対して感受性がないことを示す研究がある。１％のＣＨＡＰＳの存在下では、活性が低下し、低濃度の変性剤（２Ｍの尿素、１％のＳＤＳ）および還元剤（０．７Ｍのβ−メルカプトエタノール）の存在下でも、ほとんどの活性を維持することができる（Ｃ．Ｓｕｎら、２０１２）。
【０００５】
野生型ＴＥＶ酵素は、発現や溶解性などに一定の欠陥があるため、遺伝子工学技術によって改良された変異体に関する報告が多数ある。例えば、天然のＴＥＶプロテアーゼでは、自己切断が起こる。発現および精製のプロセスにおいて、ＴＥＶプロテアーゼは、他のＴＥＶプロテアーゼとの衝突によって、コンフォメーション変化を起こし続け、特定の部位で自己切断することで、完全なプロテアーゼは切断され、その活性が大幅に低下する。Ｌｕｃａｓｔらによって発見されたＳ２１９Ｎ変異体は、安定性が大幅に改善されたが、溶解度は高くなく、タンパク質の約９５％が封入体として沈殿物に存在する。Ｋａｐｕｓｔらは、遺伝子工学を用いて天然のＴＥＶプロテアーゼの遺伝子配列に点突然変異を行ったことで、安定性が高く、酵素活性がわずかに向上した変異体Ｓ２１９Ｖを得た。その安定性はＳ２１９Ｎの約１００倍高かった。さらに、ＴＥＶプロテアーゼの発現収率は高くなく、溶解度も非常に低い。ＴＥＶプロテアーゼの約５％のみは、細胞破砕液の上清中に存在し、収量は１２．５ｍｇ／Ｌであった。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇらは、ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）により、収量を５４ｍｇ／Ｌまで増加させることができる変異体ＴＥＶＳＨを発見した。その溶解度はＳ２１９Ｎよりもはるかに高いが、酵素活性の変化はほとんど見られなかった。Ｃａｂｒｉｔａ，Ｌ．Ｄ．らは、ＰｏＰＭｕＳｉＣソフトウェアによる設計を利用してＴＥＶプロテアーゼのシングルポイント変異体（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｎｔ）の安定性を解析し、野生型ＴＥＶプロテアーゼと比べ、溶解度と酵素活性がともに改善された５つの変異体をスクリーニングし、同時に、シングルポイント変異体と比べ、溶解度と酵素活性が大幅に改善された二重変異体（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）を得た。ＴＥＶプロテアーゼ自体の欠点を考慮して、研究者は改良された変異体を検討している。例えば、ＴＥＶ  Ｓｅｒ１３５Ｇｌｙ変異体は、ＷＴよりも安定であり、より高い温度（＞４０℃）に耐えることができる。また、ＴＥＶプロテアーゼの溶解度を大幅に増加させることができる変異（Ｔ１７Ｓ、Ｎ６８Ｄ、Ｎ１７７Ｖ）も存在する。
【０００６】
現在、ＴＥＶプロテアーゼのスクリーニング方法は、主に、酵素活性、溶解性、および収量などのＴＥＶプロテアーゼの特性を改善することに注目している。本発明のＴＥＶプロテアーゼのスクリーニング方法はまだ報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的に、ポリペプチド薬物の調製における本発明者らの発見に基づいており、即ち、従来のＴＥＶプロテアーゼは、発現過程で大量の融合タンパク質を切断（自己切断）してしまい、その結果、ポリペプチドが早期放出され、細胞内でプロテアーゼによって加水分解されやすくなるため、精製に不利であり、工業的な生産に適しないという問題があった。従来のＴＥＶプロテアーゼは、低濃度の変性剤（２Ｍ尿素、１％ＳＤＳ）でその活性をほとんど維持することができる（Ｃ．Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が、多くのタンパク質は２Ｍ尿素などの低濃度変性条件下では完全に溶解できないため、ＴＥＶプロテアーゼの使用が制限されている。これに関して、本発明者らは、この問題の解決に適するＴＥＶプロテアーゼバリアントを探すために、以下の新しいスクリーニング方法を提供した。
【０００８】
本発明は、以下の工程（１）〜（３）を含むプロテアーゼバリアントのスクリーニング方法を提供する。
（１）プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程；
（２）前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下でプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程；および
（３）必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程；
ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである。
【０００９】
一実施形態において、方法は、ランダム突然変異誘発キットで前記の変異ライブラリーを生成することをさらに含む。
【００１０】
一実施形態において、工程（１）では、例えばＴＥＶプロテアーゼテンプレート（例えば配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖ  ＴＥＶプロテアーゼ）のような適切なプロテアーゼテンプレートをテンプレートとして、ランダム変異を行い、前記のライブラリーを構築する。
【００１１】
一実施形態において、プロテアーゼバリアントは、宿主内または同様の条件下で、最初のプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で最初のプロテアーゼの酵素切断活性を保持する。
【００１２】
一実施形態において、ＴＥＶプロテアーゼバリアントは、宿主内または同様の条件下で、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼの酵素切断活性を保持する。
【００１３】
一実施形態において、プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントは、プロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１（例えばＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１）を含む融合タンパク質として提示され；プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントは、ファージの表面に提示されることが好ましく；ここで、ＴＥＶｐはＴＥＶプロテアーゼであり、ｓＴＥＶはＴＥＶプロテアーゼの切断配列であり、Ｙ１は標的タンパク質であり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列はＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択される。
【００１４】
一実施形態において、方法は、宿主内で前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントのＮ末端に、直接的、またはリンカーを介して間接的に部分Ａを付加することを含む。
【００１５】
一実施形態において、部分Ａは、親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである。
【００１６】
一実施形態において、方法は、前記のプロテアーゼに適した生体外条件下で、部位Ａに特異的な部位Ｂを固定化した固体支持体とともに、部分Ａを付加したファージライブラリーを一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液と支持体とを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返す。
【００１７】
一実施形態において、部分Ｂが部分Ａに特異的に結合するという条件で、部分Ｂは、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである。
【００１８】
一実施形態において、プロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼは、Ａｖｉ−プロテアーゼ−プロテアーゼ切断部位−Ｙ１−ＰＩＩＩ、好ましくはｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１構築物を介してＡｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰＩＩＩとして、ファージＰＩＩＩタンパク質の末端に提示され、ここで、Ａｖｉタグが１５個のアミノ酸残基ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥからなる短いペプチドタグであり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択される。
【００１９】
一実施形態において、酵素切断活性は、前記のプロテアーゼおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質、好ましくはＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１に対して測定されるものである。
【００２０】
一実施形態において、スクリーニングは、宿主内で前記のプロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーをビオチン化することを含む。
【００２１】
一実施形態において、スクリーニングは、ビオチン化されたファージライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズで処理し、磁気ビーズによって捕捉されたファージを中／高濃度の尿素中で一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液から磁気ビーズを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返す。
【００２２】
一実施形態において、前記のライブラリーは、コロニーＰＣＲによって検証される。一実施形態において、前記のコロニーＰＣＲに使用されるプライマーは次の通りである。
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３’
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣ−３’
【００２３】
一実施形態において、ライブラリーの容量は１×１０９以上、好ましくは２×１０９であり；好ましくは、全体の変異頻度は１．５〜７個／ｋｂの中／低程度である。
【００２４】
一実施形態において、Ｙ１はヒトまたはブタのＡＣＴＨまたはＧＬＰ−１である。一実施形態において、前記の宿主は大腸菌である。
【００２５】
一実施形態において、生体外変性条件は中／高程度の変性条件であり、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の条件である。
【００２６】
本発明は、本発明の方法によって得られるプロテアーゼバリアントを提供する。一実施形態において、前記のプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントの切断配列はＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈから選択され、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列は、配列番号７および８から選択され；好ましくは、前記のプロテアーゼバリアントまたはＴＥＶプロテアーゼバリアントは、中／高程度の変性条件下、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、最初のプロテアーゼ（例えばＳ２１９Ｖプロテアーゼ）の生体外酵素切断活性を保持し；好ましくは、前記の酵素切断活性は、前記のプロテアーゼバリアントおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものであり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択される。
【００２７】
一実施形態では、ＴＥＶプロテアーゼバリアントは、以下の変異からなる群から選択される１つまたは複数の変異を含んでも良い。
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）またはヒスチジン（Ｈ）への変異；
配列番号１に示される配列の第１３８位に対応する位置でのイソロイシン（Ｉ）からリジン（Ｋ）への変異；
配列番号１に示される配列の第２８位に対応する位置でのヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）への変異；
配列番号１に示される配列の第１９６位に対応する位置でのグルタミン酸（Ｑ）からヒスチジン（Ｈ）への変異；
配列番号１に示される配列の第１３５位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への変異；および
配列番号１に示される配列の第１８７位に対応する位置でのメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への変異。
【００２８】
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、以下の変異からなる群から選択される変異の組合せを含む。
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１３８位に対応する位置でのイソロイシン（Ｉ）からリジン（Ｋ）への変異；
配列番号１に示される配列の第２８位に対応する位置でのヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）への変異、配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１９６位に対応する位置でのグルタミン酸（Ｑ）からヒスチジン（Ｈ）への変異；ならびに
配列番号１に示される配列の第１１１位に対応する位置でのロイシン（Ｌ）からヒスチジン（Ｈ）への変異、配列番号１に示される配列の第１３５位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への変異、および配列番号１に示される配列の第１８７位に対応する位置でのメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への変異；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、配列番号１に示される配列の第２１９位に対応する位置でのセリン（Ｓ）からバリン（Ｖ）への変異を含み；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有すること、および／または前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、中／高程度の変性条件下で、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、高い酵素切断活性を有し、好ましくはＳ２１９Ｖバリアントの生体外酵素切断活性を保持することという条件下で、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、上記の変異以外の１つまたは複数の変異をさらにを含む。
【００２９】
一実施形態では、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）は、配列番号４、５または６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；好ましくは、配列番号４、５または６と比較して、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、最も好ましくは少なくとも４個のアミノ酸部位の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含み；好ましくは、前記の相同体は、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い切断活性を有し、および／または前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、中／高程度の変性条件下で、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、Ｓ２１９Ｖバリアントの生体外酵素切断活性を保持する。
【００３０】
本発明は、融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、本発明によるプロテアーゼバリアントを含み；好ましくは、前記の融合タンパク質は、プロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１、好ましくはＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１の構造を含み、ここで、Ｙ１は、標的ポリペプチドであり；ＴＥＶｐは、本発明によるＴＥＶプロテアーゼバリアントであり；ｓＴＥＶは、ＴＥＶプロテアーゼの切断配列であるＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記の切断配列が配列番号７および８から選択され；好ましくは、標的ポリペプチドは、ＡＣＴＨ、ＧＬＰ−１／ＧＬＰ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ、ＣＣＬ５、ＳＤＦ−１α、ＩＧＦ−１、Ｌｅｐｔｉｎ、ＢＮＰ、Ｅｘ−４からなる群から選択され、好ましくはＡＣＴＨであり、好ましくはヒトＡＣＴＨであり、より好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列のヒトＡＣＴＨであり；好ましくは、プロテアーゼバリアント（例えばＴＥＶｐ）がプロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアントおよびプロテアーゼバリアント切断配列（例えばＴＥＶｐおよびｓＴＥＶ）は、直接接続され、または１つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され；好ましくは、プロテアーゼバリアント（例えばＴＥＶｐ）がプロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）およびＹ１は、直接接続され、または１つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され、好ましくは、プロテアーゼバリアント切断配列（例えばｓＴＥＶ）およびＹ１は、直接接続され；好ましくは、前記の融合タンパク質は、タグをさらに含み、好ましくは、前記のタグは、精製タグであり；好ましくは、前記のタグは、Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＮｕｓＡタグ、ＳＵＭＯタグ、Ａｖｉタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、またはＳｔｒｅｐ  ＩＩタグからなる群から選択され；好ましくは、前記のタグは、融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にあり、或いはＴＥＶｐのＮ末端にタグはない。
【００３１】
本発明は、プロテアーゼバリアントまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。好ましくは、前記のポリヌクレオチド配列は配列番号１４〜１６から選択される。
【００３２】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。
【００３３】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド配列、または本発明のポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクターを提供し；好ましくは、前記の発現ベクターは、真核生物発現ベクター、または原核生物発現ベクターであり；好ましくは、ｐＲＳ３１４、ｐＹＥＳ２、バキュロウイルス−Ｓ２発現系およびｐｃＤＮＡ３．１からなる群から選択され、或いは好ましくは、ｐＥＴ系発現ベクター、ｐＱＥ系発現ベクターおよびｐＢＡＤ系発現ベクターからなる群から選択される。
【００３４】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド配列、本発明によるポリヌクレオチド構築物、または本発明による発現ベクターを含む細胞を提供し；好ましくは、真核細胞または原核細胞であり；好ましくは、前記の真核細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞発現系からなる群から選択され；好ましくは、前記の原核細胞は、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ２、Ｒｏｓｅｔｔａ２  ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、またはＯｒｉｇａｍｉ  ２からなる群から選択される。
【００３５】
本発明は、以下の（１）〜（３）を含む、本発明によるプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントの調製方法を提供する。
（１）本発明の細胞の培養に適した条件下で、培地中で前記の細胞を培養する。
（２）培地を回収するか、または細胞を溶解して、ライセートを回収する。
（３）精製して前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントを得る。
【００３６】
本発明は、標的ポリペプチドの調製における、本発明によるプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントの使用を提供し、ここで、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントおよび前記の標的ポリペプチドが、融合タンパク質として発現され；好ましくは、前記の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質である。
【００３７】
本発明は、以下の（１）〜（７）を含む標的ポリペプチドの調製方法を提供する。
（１）本発明の融合タンパク質を適当な条件下で培地中で培養する。
（２）融合タンパク質の封入体を得る。
（３）約８Ｍの尿素または約６Ｍのグアニジン塩酸塩のような高変性条件下で、封入体を溶解する。
（４）中／高程度変性条件下、好ましくは３Ｍ〜５Ｍ尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍ尿素、より好ましくは４Ｍ尿素または１Ｍ〜２Ｍグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍグアニジン塩酸塩の条件下で、一定の温度、例えば２０〜４０℃、好ましくは２５℃で、例えば１０〜２４時間、例えば１２時間インキュベートする。
（５）緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した後、プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼを沈殿させる。
（６）プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼの沈殿物を遠心分離で除去し、前記の標的ポリペプチドを得る。
（７）前記の標的ポリペプチドを精製し；好ましいは、前記の精製は、塩析、限外濾過、有機溶媒沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーカラム、逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術によって実施される。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法を通じて、発明者らは、新規のＴＥＶプロテアーゼバリアント４Ｄ、１２Ｄおよび３２Ｃを得た。これは、本発明の方法を使用することによって、宿主内でＴＥＶプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でＴＥＶプロテアーゼ酵素切断活性を有するＴＥＶプロテアーゼバリアントを得ることができる。さらに、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列ＥＸＸＹＸＱＨを使用してスクリーニングを行うと、ＥＮＬＹＦＱ↓Ｈを効率的に切断するＴＥＶプロテアーゼ変異体も得られる。このような変異体は、Ｎ末端がヒスチジンで始まる多くのポリペプチドの場合、望ましいものである。
１．本発明のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、天然のＮ末端を有する様々なポリペプチドまたはタンパク質を産生するために広く使用される。
２．本発明のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、スクリーニングにより得られるが、直接得られた変異体は、要件を満たすことができないか、または部分的に要件を満たす。一連の変異点の組み合わせにより、さらに改善された独特の特性を備える改良型突然変異体を得ることが可能である。例えば、Ｌ１１１Ｆと他の変異点との組み合わせは、生体内活性がないかまたは極めて低いが、中程度の生体外変性条件下ではより高い活性を有することを特徴とする。
３．本発明の方法は、標的タンパク質を発現させるために、ＤＮＡ組換え技術および原核生物発現系を採用しており、幅広い適用性を有する。
４．ブタ下垂体からＡＣＴＨを抽出する方法と比較して、本発明の方法を使用してヒトまたはブタ由来のＡＣＴＨを調製する場合の製造コストは、従来のブタの脳からの抽出による製造技術の製造コストよりも数百倍も低くすることができる。この方法は、生産サイクルを大幅に短縮し、生産時間およびコストを節約し、ブタの下垂体を得るために大量のブタの屠殺に依存する必要がなくなり、ブタ由来のＡＣＴＨの使用による免疫原性アレルギー反応のリスクを回避し、薬の安全性を大幅に向上させることができる。また、本発明の方法で調製されたＡＣＴＨは、人体から分泌されるＡＣＴＨと全く同じものであるため、アミノ酸配列の精度および製品の純度が極めて高く、優れた生物活性を持ち、薬効を向上させ、副作用の発生を抑えることができる。本方法は、有機合成法に比べて、ヒト由来の全長ＡＣＴＨの調製の難易度およびコストを大幅に低減し、操作が簡単で、高価な触媒や高圧装置を必要とせず、収率が高く、大量生産に適している。つまり、本方法は、製造プロセスが明確で簡単であり、再現性が良く、大規模生産の実現が容易であり、環境汚染を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、異なる濃度の尿素でのＴＥＶＰ変異体１２Ｄの消化効率のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクマシーブリリアントブルー染色画像である。矢印は標的タンパク質を示す。
【図２】図２は、異なる濃度の尿素でのＴＥＶＰ変異体４Ｄの消化効率のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクマシーブリリアントブルー染色画像である。矢印は標的タンパク質を示す。
【図３】図３は、異なる濃度の尿素でのＴＥＶＰ変異体３２Ｃの消化効率のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクマシーブリリアントブルー染色画像である。矢印は標的タンパク質を示す。
【図４】図４Ａは、異なる濃度の尿素でのＴＥＶＰ変異体４Ｄの消化効率のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクマシーブリリアントブルー染色画像である。図４Ｂは、電気泳動バンドのグレー値の比較である。
【図５】図５は、ＴＥＶＰ変異体４Ｄ、１２Ｄおよび３２Ｃの生体内および生体外の酵素切断活性とＳ２１９Ｖとの比較である。矢印は標的タンパク質を示す。
【図６】図６は、ＴＥＶＰ変異体４Ｄ、１２Ｄ、３２ＣおよびＳ２１９Ｖの融合タンパク質の０．５Ｍ尿素での溶解度試験である。
【図７】図７は、プラスミドｐＥＴ−２８ｂ−ＰＤ１−Ａｖｉの模式図である。
【図８】図８は、プラスミドｐＥＴ−２８ｂ−ＡＣＴＨの模式図である。
【図９】図９は、プラスミドＡｖｉ−ＴＥＶ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨの遺伝子構造図である。
【図１０】図１０は、質量分析計で測定した、精製されたＡＣＴＨの分子量を示すスペクトルである。
【図１１】図１１は、生体外で測定したＡＣＴＨ活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明の目的、技術構成および利点をより明確にするために、本発明の実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明の実施形態はそれに限定されない。
【００４１】
本明細書では、「宿主」という用語は、タンパク質を発現するのに適した任意の真核細胞または原核細胞を指す。一実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【００４２】
本明細書では、「生体外変性条件」という用語は、ＴＥＶプロテアーゼを含む融合タンパク質を溶解させ、酵素切断活性を有する条件を指し、例えば、３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の条件である。
【００４３】
本明細書では、ＴＥＶプロテアーゼは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）に由来するＮｌａプロテアーゼにおける２７ｋＤａの活性ドメインである。本明細書では、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖ  ＴＥＶプロテアーゼを、出発ＴＥＶプロテアーゼとして使用する。しかしながら、当業者は、様々な他のＴＥＶプロテアーゼが、本発明の方法における出発ＴＥＶプロテアーゼとして使用されることを理解すべきである。ＴＥＶプロテアーゼは優れた部位特異性を持ち、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）の７アミノ酸配列を認識することができ、最も一般的な配列がＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（またはＥＮＬＹＦＱＧ）であり、その制限部位がグルタミンＧｌｎ（Ｐ１）とグリシンＧｌｙ（Ｐ１’）との間（即ち、Ｐ１とＰ１’との間）にあり、その配列特異性が、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼなどのプロテアーゼの配列特異性よりもはるかに高い。
【００４４】
本明細書では、「ＴＥＶプロテアーゼバリアント」とは、スクリーニングで使用される出発ＴＥＶプロテアーゼと比較してアミノ酸残基の差異を有するＴＥＶプロテアーゼを指し、ここで、バリアントは、ＴＥＶプロテアーゼが特定の配列および／または構造を有することを意味しない。
【００４５】
本明細書では、「ＴＥＶプロテアーゼ酵素切断活性」とは、ＴＥＶプロテアーゼが、ＴＥＶプロテアーゼおよびその切断部位を含む融合タンパク質を自己切断する酵素切断活性を指す。一実施形態において、本発明のＴＥＶプロテアーゼ酵素切断活性は、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ／Ｈ）を含む融合タンパク質に対する切断活性である。
【００４６】
本明細書において、ファージ提示技術を使用して融合タンパク質を提示する。ファージ提示技術は、外来タンパク質またはポリペプチドのＤＮＡ配列をファージコートタンパク質の構造遺伝子の適切な位置に挿入して、コートタンパク質の発現とともに外来遺伝子がコートタンパク質を発現しながら、ファージの再構築によって外来タンパク質をファージの表面に提示するバイオテクノロジーである。当業者は、本発明の方法を実施するために、他のＴＥＶプロテアーゼランダム変異ライブラリーを選択できることを理解すべきである。
【００４７】
ファージ提示系は、一本鎖糸状ファージ提示系、λファージ提示系、およびＴ４ファージ提示系であって良い。一本鎖糸状ファージ提示系の場合、ＰＩＩＩ提示系およびＰＶＩＩＩ提示系であって良い。λファージ提示系の場合、ＰＶ提示系およびＤタンパク質提示系であって良い。好ましくは、一実施形態では、ファージ提示系は、ＰＩＩＩ提示系である。
【００４８】
本明細書では、「部分Ａ」および「部分Ｂ」とは、例えば、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーから選択される一対の結合パートナーを指し、ただし、「部分Ａ」と「部分Ｂ」は特異的に結合する。
【００４９】
一実施形態において、部分Ｂを含む固体支持体は、部分Ａを含む融合タンパク質の捕捉に用いられる。一実施形態において、タグがビオチン部分である場合、固体支持体は、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズまたは樹脂であってもよく、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジンセファロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）、ストレプトアビジンハイパーリンク樹脂、ＭａｇｎａＢｉｎｄストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢｉｏＭａｇストレプトアビジン、ＰｒｏＭａｇストレプトアビジン、シリカストレプトアビジン（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、高性能ストレプトアビジンセファロース（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ストレプトアビジンポリスチレンミクロスフェア（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−  Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ストレプトアビジンコーティングポリスチレン粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）、またはビオチン標識分子を捕捉するために当業者が一般的に使用される他のストレプトアビジンコーティングビーズまたは樹脂である。
【００５０】
一実施形態において、ＴＥＶプロテアーゼは、Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰＩＩＩとして、をファージＰＩＩＩタンパク質の末端（Ｎ末端）に提示され、ここで、Ａｖｉタグは、１５個のアミノ酸残基ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥからなる短いペプチドタグである。宿主での発現において、Ａｖｉタグを介してＡｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰＩＩＩをビオチン化する。
【００５１】
本明細書では、「エンテロキナーゼ」は、哺乳動物の十二指腸に存在するヘテロ二量体セリンプロテアーゼである。エンテロキナーゼの制限部位は、ＤＤＤＤＫなど知られており、エンテロキナーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も、当業者であれば、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ５０１３８．１、ＡＡＢ４００２６．１などが利用可能である。
【００５２】
ＴＥＶプロテアーゼ
ＴＥＶプロテアーゼは、融合タンパク質を効率的に切断するためによく用いられるが、切断は両方が可溶性である場合に限られている。現在、ほとんどのポリペプチド薬は、溶解性が悪く、通常、封入体として発現しており、ＴＥＶプロテアーゼの切断条件と一致しない。封入体は、高濃度の尿素またはグアニジン塩酸塩で溶解させる必要があるが、このような条件での切断が極めて困難である。従来のＴＥＶプロテアーゼは、基質と同条件下で、効率的な切断活性と、同時溶解とを両立させることが困難であった。
【００５３】
封入体は、精製に有利で、簡単な処理で比較的純粋な目的タンパク質を得ることができる。しかし、封入体タンパク質は、高濃度の尿素またはグアニジン塩酸塩で溶解する必要がある。このような条件下では、野生型ＴＥＶプロテアーゼは、不活性または極めて低活性であり、融合タンパク質を効率的に切断することができない。現在、改良されたＴＥＶプロテアーゼに関する報告は多数あるが、切断に最適な条件は、いずれも生理的条件または非変性条件であり、通常、低濃度の変性剤（尿素またはグアニジン塩酸塩）に対してある程度の耐性を有しているが、ほとんどの封入体タンパク質は低濃度変性条件下で不溶性である。したがって、従来のＴＥＶプロテアーゼは、上記の場合には適していない。
【００５４】
本発明者らは、ＴＥＶプロテアーゼとポリペプチドを融合させてポリペプチド医薬品を調製するための理想的な製造条件が以下の通りであることを見出した。（１）該融合タンパク質は、封入体として発現し、精製に有利である。（２）該融合タンパク質は、細胞内で自己切断しない。そうでなければ、精製に不利である。（３）該融合タンパク質は、高濃度の変性剤に溶解された後、中／高程度の濃度の変性剤を含む酵素切断反応系に希釈されると、ＴＥＶプロテアーゼが活性を回復し、効率的に自己切断してポリペプチドを放出する。（４）大容量のＴＥＶプロテアーゼライブラリーからスクリーニングして進化させたＴＥＶプロテアーゼバリアントは、その制限部位のＰ１’位置に幅広いアミノ酸スペクトルを有するため、天然のＮ末端を有する様々なポリペプチドまたはタンパク質の生産に広く利用することができる。
【００５５】
通常調製される自己切断性を有する融合タンパク質の構造は、ＵＳ２０１００３５３００Ａ１に提供されている。融合タンパク質の調製において、Ｈｉｓタグは、発現させる標的タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ）と密接に連結する必要がある。これは、融合タンパク質を細胞内で発現させると、従来の野生型ＴＥＶｐまたは変異型ＴＥＶｐが細胞内で一定の酵素切断活性を有し、自己切断が発生するためである。切断後のＥＧＦＰは、それに密接に接続されたＨｉｓタグを介して回収することができる。このＨｉｓタグがなければ、細胞内での自己切断が早すぎるため、タンパク質を回収することが難しくなり、ＥＧＦＰを効率的に生産することができない。しかし、これはまた、特定のニーズに応じて、ＥＧＦＰのＨｉｓタグをさらに除去する必要がある場合は、明らかに時間と手間がかかるという問題をもたらす。
【００５６】
本発明において、融合タンパク質における標的タンパク質は、例えばＨｉｓのようなタグを含まなくてもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨの構造を含み、ここで、ＡｖｉはＡｖｉタグタンパク質であり、ｓＴＥＶはＴＥＶプロテアーゼ制限部位である。ＴＥＶｐバリアント（例えば１２Ｄバリアント）は、細胞内酵素活性が極めて低いため、発現した融合タンパク質はほとんど細胞内で溶解することはない。封入体を回収し、８Ｍ尿素で溶解し、環境を４Ｍ尿素に調整すると、１２Ｄは、酵素の活性を発揮し、ｓＴＥＶとして認識部位を切断する。切断した後、単純な希釈で尿素またはグアニジン塩酸塩の最終濃度を０．５Ｍに低下させる。ＴＥＶプロテアーゼは、溶解性が低いため、沈殿しやすいが、生物学的活性を有する放出されたポリペプチドは緩衝液に溶解しやすいことが多いため、遠心分離によって、高度に精製されたペプチドを得ることができる。これにより、追加のプロテアーゼ除去工程の必要性が巧みに排除され、後の精製プロセスが大幅に簡素化される。
【００５７】
封入体の形成は精製に有利である。１）遠心分離によって高濃度で比較的純粋なタンパク質を容易に得ることができる。２）封入体は、プロテアーゼの加水分解からタンパク質を保護する。また、毒性タンパク質は不活性な封入体として発現し、宿主細菌の増殖に影響を与えない。例えば、本発明の方法に係るＴＥＶ−ＡＣＴＨ融合タンパク質は、封入体として発現しているため、精製工程が大幅に簡素化され、より高い濃度と純度に達することができ、さらに、プロテアーゼの加水分解を受けないため、安定した高収量が得られやすい。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法
本発明において、大容量のＴＥＶランダム変異ファージライブラリーが構築され、その重要な遺伝子構造はＡｖｉ−ＴＥＶ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰIIIであり、即ち、プロテアーゼがこのような形でファージＰIIIタンパク質の末端に提示される。ここで、Ａｖｉ  ｔａｇは、１５個のアミノ酸残基からなる短いペプチドタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）であり、生体内または生体外においてビオチンリガーゼによってリジン残基（Ｋ）で１つのビオチンに結合されることで、タンパク質のビオチン化を達成し、さらに、ビオチン化されたタンパク質は、ストレプトアビジンに特異的に結合することができる。これらの２つの反応に基づいて、本発明のＴＥＶファージは、生体内でビオチン化され、ビオチン化されたファージライブラリーは、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化することができる。理想的な条件下では、細胞内で発現したときに酵素切断活性を有するＴＥＶバリアントは、発現過程で自己切断され、その結果、最終的に組み立てられたファージＰＩＩＩタンパク質の末端にＡｖｉ  ｔａｇなしで、ポリペプチドＹ１のみを有し、磁気ビーズによって捕捉されない。また、細胞内で発現したときに酵素切断活性を有しないＴＥＶバリアントは、発現過程で自己切断が起こらず、最終的に組み立てられたファージＰＩＩＩタンパク質の末端はＡｖｉ−ＴＥＶ−ｓＴＥＶ−Ｙ１であり、Ｎ末端のＡｖｉ  ｔａｇはビオチン化されており、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉することができる。磁気ビーズに捕捉されたファージは、中／高濃度の尿素中でインキュベートされる。このような条件下で酵素切断を受けたファージは、自己切断により磁気ビーズから脱落し、溶液に入る。この溶液を回収することで、最初の標的ファージが得られる。これを増殖した後に、次回のスクリーニングに供する。数回のスクリーニングの後、生体内で酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下で酵素切断活性を有するＴＥＶプロテアーゼバリアントがエンリッチ化される。遺伝子配列解析により、発現ベクターにクローニングした後に１つずつ確認できるエンリッチ化された配列を得る。それにより、本発明のＴＥＶバリアントをスクリーニングする。
【００５９】
酵素切断活性または効率の測定
酵素切断活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果に基いて算出することができる。具体的には、ＴＥＶプロテアーゼバリアントの封入体を１０倍希釈した後、１０％のβ−メルカプトエタノールを含む５×ＳＤＳローディング緩衝液を添加し、１００℃で５分間煮沸し、ローディングしてゲルで電気泳動を行う。終了後、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色液に入れて３０分間染色した後、クマシーブリリアントブルー脱色液に入れ、背景が無色になるまで約２０分間加熱して脱色する。次に、ゲルをゲルイメージングシステムに設置して撮影する。取得した画像をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで処理し、バンドのグレー値を定量する。生体内酵素切断活性＝１−融合タンパク質バンドのグレー値／（融合タンパク質バンドのグレー値＋Ａｖｉ−ＴＥＶバンドのグレー値＊融合タンパク質の分子量／Ａｖｉ−ＴＥＶの分子量）。
【００６０】
本明細書において、電気泳動バンドのグレー値をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで解析する方法は、現在の一般的な方法である。
【００６１】
本明細書において、生体外酵素切断効率の算出方法は以下の通りである。
生体外酵素切断効率＝１−酵素切断後の融合タンパク質バンドのグレー値／酵素切断前の融合タンパク質バンドのグレー値
【００６２】
本明細書において、８Ｍ以上の尿素または６Ｍ以上のグアニジン塩酸塩を高濃度の変性剤とし、４Ｍ尿素を中程度の濃度の変性剤とする。中／高程度の濃度の変性条件とは、４Ｍ尿素または１．５Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴを指し、反応温度は４℃〜３７℃、好ましくは２５℃である。
【００６３】
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。
【００６４】
実施例
実施例１：ＴＥＶプロテアーゼバリアントの取得
１．  大容量ＴＥＶプロテアーゼランダム変異ライブラリーの構築
１．１  実験材料
大腸菌ＴＧ１：ｓｕｐＥ  ｈｓｄ  Δ５ｔｈｉΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ  ｌａｃＺΔＭ１５］（Ｂｉｏ−ｖｉｅｗｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）。ファージミドベクターｐＨＥＮ１（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＣＣ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒから購入、カタログ番号Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ７８６６２３）。ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ社から購入した。プラスミド抽出キットおよびアガロースゲルＤＮＡ回収キットは、Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｅｎ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）社から購入した。ランダム変異誘発キット（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。プライマーの合成および遺伝子配列の決定は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで行った。
【００６５】
１．２  ＴＥＶＰランダム変異ライブラリーの構築
１．２．１  ランダムミューテーションＰＣＲによるＴＥＶＰ  ＤＮＡ断片の調製
ＴＥＶＰ  Ｓ２１９Ｖ遺伝子の大範囲のランダム変異は、ｐＱＥ３０−ＴＥＶ（Ｓ２１９Ｖ）（この２７ｋＤａのＴＥＶ  ＮＩａプロテアーゼバリアント遺伝子は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成され、ｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨ１とＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングされた）をテンプレートとして使用したランダム変異誘発キット（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）で行った。ＰＣＲプライマーは、以下の通りである。
ＴＥＶ−Ｆ：５−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣ−３
ＴＥＶ−Ｒ：５−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣ−３
【００６６】
具体的に、各工程はキットのプロトコールに従って操作し、ＰＣＲサイクル数およびテンプレート量を正確に制御し、ＰＣＲ条件は中程度の変異条件に設定された。５０μｌ反応系は、次のように調製した。ＰＣＲチューブに、４１．５μｌのｄｄＨ２Ｏ、５μｌの１０×Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ反応緩衝液、１μｌの４０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（各最終濃度は２００μＭ）、０．５μｌのプライマー混合物（各プライマーは２５０ｎｇ／μｌ）、１μｌのＭｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）、１μｌのＴＥＶＰテンプレート（テンプレート量１０ｎｇ）を順次に添加した。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で３分間の前変性；９５℃で３０秒；６０℃で３０秒；７２℃で５０秒；合計３２サイクル；７２℃で１０分間の最終伸長とした。ＰＣＲ終了後、５μｌの産物を採取して、キットにおける１．１−ｋｂのゲル標準を分子量標準として、１％アガロースゲル電気泳動を行った。染色後、標的バンドの明るさを標準と比較し、ＰＣＲの収量を算出し、これをテンプレート量で割って増幅率を求めた。これを基づいて、ＰＣＲ工程でのｄ値を算出した（計算式：２ｄ＝ＰＣＲ収量／初期テンプレート量）。本発明のＴＥＶＰランダムミューテーションＰＣＲの最終的なｄ値は７．５であり、対応する変異頻度は約９変異／ｋｂ（説明書参照）であり、これは期待通りである。ＰＣＲ産物をフェノールクロロホルムで抽出・精製した後、Ｘｈｏ１とＢａｍＨ１でダブルダイジェストし、アガロースゲルＤＮＡ回収キットで消化産物を回収し、−２０℃で保存した。
【００６７】
１．２．２  線形化されたベクターの調製
ファージミドベクターｐＨＥＮ１（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＣＣ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒから購入、カタログ番号Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ７８６６２３）を線形化する前に、修飾を行った。まず、Ａｖｉタグ配列であるＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥをシグナルペプチドの下流に挿入し、得られた融合タンパク質をビオチン化してから、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化した。ｐＥＴ２８ｂ−ＰＤ１−Ａｖｉ（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成した。遺伝子構造はＮｃｏ１−ＰＤ１遺伝子−Ｎｏｔ１−ＢａｍＨＩ−ＧＧＧＳリンカー−ａｖｉタグ−Ｘｈｏ１である。ＰＤ１遺伝子のＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号は、ＮＭ＿００５０１８である。プラスミドマップを図７に示す。）を、ＡｖｉタグのＰＣＲ増幅用テンプレートとして使用し、ＰＣＲプライマーは次のとおりである。
Ａｖｉ−Ｆ：５−ＡＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３
Ａｖｉ−Ｒ：５−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧ−３
【００６８】
生成物をフェノールクロロホルムで精製し、Ｎｃｏ１とＸｈｏ１でダブルダイジェストし、ゲルを回収した後、同様に酵素で消化したｐＨＥＮ１ベクターにライゲーションしてｐＨＥＮ１−Ａｖｉを得た。次に、ｓＴＥＶ（ヌクレオチド配列：ＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣ、アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＳ）とヒトＡＣＴＨ遺伝子を含むタンデム配列をＡｖｉタグの後ろ（クローニングサイトＸｈｏ１＋Ｎｏｔ１）に挿入した。ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨタンデム配列のＰＣＲ増幅用テンプレートは、ｐＥＴ２８ｂ−ＡＣＴＨ（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成した。プラスミドマップを図８に示す。アミノ酸配列は、配列番号２に示す。ヌクレオチド配列は、配列番号１３に示す。）であり、ＰＣＲプライマーは次のとおりである。
ＡＣＴＨ−Ｆ：ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣ−３
ＡＣＴＨ−Ｒ：５−ＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣ−３
【００６９】
プライマーの上流にＢａｍＨ１部位を追加導入し、フェノールクロロホルムでＰＣＲ産物を精製し、Ｎｏｔ１とＸｈｏ１でダブルダイジェストした後、同様に酵素で消化したｐＨＥＮ１−Ａｖｉベクターにライゲーションして、ｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨを得た。ベクターの線形化：ｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨをＸｈｏ１とＢａｍＨ１でダブルダイジェストし、消化産物における大きな断片をゲルで回収し、−２０℃で保存した。
【００７０】
１．２．３  ライゲーションおよびライゲーション生成物の回収
消化して回収したベクター（ｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨ）を、インサートフラグメント（ランダムに変異したＴＥＶＰ遺伝子）と１：３、１：５、１：１０でライゲーションした。具体的に、まず、ベクターｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨを調製（１．２．２  線形化されたベクターの調製を参照）し、次に、インサートフラグメントを調製（１．２．１  ランダムミューテーションＰＣＲによるＴＥＶＰ  ＤＮＡ断片の調製を参照）し、両方をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でライゲーションして、ｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨを得た。ライゲーションシステムはキットのプロトコールに従った。２０μｌ反応系を例にとると、ＰＣＲチューブに、１５０ｎｇの線形化されたベクター、対応する量のインサートフラグメント（ベクターに対するモル比は１：３または１：５または１：１０）、２μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを順次に添加し、最後にｄｄＨ２Ｏで容量を２０μｌになるように容量を調整した。形質転換によって生成されたクローンの数を計算することにより、最適なライゲーション比は１：５であると判定された。プラスミドマップを図９に示す。最適なライゲーション比は１：５であると判定された。異なる濃度のライゲーション生成物を用いて形質転換を行い、最適な形質転換生成物量を０．２μｇ（１０μｌ）と判定した。ライゲーション生成物をフェノール−クロロホルム抽出で精製し、タンパク質および塩イオンを除去して、ｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００７１】
１．２．４  電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
電気穿孔法によりライゲーション生成物を宿主細菌ＴＧ１にトランスフェクトした。電気形質転換用コンピテント細胞の調製方法は、分子クローニング実験ガイド（第３版）に従った。１０μｌのライゲーション生成物を２００μｌの電気形質転換用コンピテント細胞と穏やかに混合して、氷浴に２分間入れ、０．２ｃｍの孔隙を備えた予冷した電気形質転換キュベットに移して電気形質転換を行った。電気形質転換装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ）のパラメーターは、２．５ＫＶ、２５μＦ、２００Ωであった。電撃した後、直ちに１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、吸い出した後、１ｍｌのＳＯＣ培地で電撃キュベットを２回濯いだ。３ｍｌの細菌液を合わせ、３７℃、２００ｒｐｍで４５〜６０分間振とうした。１０−２、１０−３、および１０−４の勾配で細菌液を希釈し、各勾配で１００μｌの菌体を採取して、ＳＯＣ（２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む）の小プレートに広げ、残量を５０００×ｇで５分間遠心分離し、菌体を回収した。再懸濁した後に、ＳＯＣ（２５μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む）の正方形の大きなプレート（２５×２５ｃｍ）に広げた。倒立したプレートを３７℃で１２〜１６時間インキュベートした後、小プレートでカウントを行った。そして、２ＹＴ培地で大プレート上のコロニーをすすぎ、塗布ロッドで軽く掻き取り、最終濃度が５０％になるようにグリセロールを加えた後、チューブに分注し、−８０℃で凍結保存した。ライブラリー容量の計算方法：容量プレート上のクローン数＊希釈倍率＊希釈前の細菌液の総体積。ライブラリー容量が１×１０９以上になるまで、電気形質転換を数回繰り返した。
【００７２】
１．２．５  配列の決定および解析
一部の元の細菌クローンをランダムに選択し、コロニーＰＣＲによって組換えプラスミドを検証した。ＰＣＲ検証プライマーは次の通りである。
フォワードプライマー：５−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３
リバースプライマー：５−ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣ−３
ＰＣＲ陽性の組換えプラスミドを配列決定を委託（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）し、構築されたライブラリーのランダム性、ライブラリー容量、および存在度を評価した。
【００７３】
１．２．６  ライブラリーの容量および多様性の評価
ベクターとインサートフラグメントとのモル比は１：５であり、１０μｌのライゲーション生成物を利用して電気形質転換を行った。形質転換効率は９×１０８ｃｆｕ／μｇＤＮＡである。複数回の形質転換を組み合わせた容量は２．０２×１０９で、スクリーニングのニーズを満たした。ペプチドライブラリーから２０個のクローンをランダムに選び、配列を決定した。結果（表１）は、全体的な変異頻度が中／低程度（１．５〜７個／ｋｂ）であることを示す。実際の値と理論値の間には一定の偏差がある。考えられる理由の１つは、同義突然変異がカウントされていないことであり、もう１つは、サンプル数が少ないことである。配列決定用サンプルの数が増えるにつれて、このような偏差は減少していく。上記の結果は、構築されたＴＥＶＰランダムファージライブラリーが、基本的なフレームワーク、ライブラリー容量、および多様性の観点から、設計要件を満たしたことを示す。
【００７４】
表１  ランダムに選択されたクローンにおけるアミノ酸変異の分布
【表１】
2022502070.tif 000003
【００７５】
２．  ＴＥＶＰランダム変異ファージライブラリーからの標的クローンのスクリーニング
２．１  実験材料
ＨＲＰ−Ｍ１３抗体はＢｅｉｊｉｎｇ  Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートおよびＥＬＩＳＡ試薬はＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社から購入し、ストレプトアビジン磁気ビーズはＮＥＢから購入し、Ｄ−ビオチン、ＩＰＴＧなどの試薬はＳａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社から購入した。
【００７６】
２．２  ファージライブラリーの培養
少なくとも１つのライブラリー容量の細菌を採取し、２ｘＹＴ−ＣＧ（２ｘＹＴ＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２％グルコース）を含む２Ｌ三角フラスコに、初期ＯＤ６００値＝約０．１になるように加え、ＯＤ６００が約０．５になるまで３７℃、２００ｒｐｍで振とうした。ヘルパーファージＭ１３０Ｋ０７（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏ−ｖｉｅｗｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）を加えて感染（ＭＯＩ＝２０）させ、１００ｒｐｍでゆっくり回転させながら３７℃で１時間インキュベーションを続けた。その後、遠心分離（２０００×ｇで２０分間）により細菌を回収し、上清を可能な限り除去して廃棄した。１Ｌの２ｘＹＴ−ＣＫ（２ｘＹＴ＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン＋２００μｍＤ−ビオチン）で菌体を再懸濁し、２５０ｒｐｍ、２５℃で一晩インキュベートした。翌日、パッケージされたファージを回収して精製した。細胞培養物を７５０ｍｌの遠心分離ボトルに移し、氷中でわずかに冷却した。次に、大型ベンチトップ遠心分離機によって４５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清が濁った場合は、別の清潔なボトルに移し、このステップを繰り返した。上層の８０％の上清（細胞ペレットを攪拌しないように）を別の新しい７５０ｍｌ遠心分離ボトルに移し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０％［ｗ／ｖ］のＰＥＧ−８０００、２．５ＭのＮａＣｌ）を加え、混合した後、氷中に少なくとも２時間放置し、４５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。すべての上清を注意深く取り除き、１０ｍｌのＰＢＳを加えた。ピペットで沈殿物を再溶解させ、２ｍｌのＥＰチューブに移した。１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して、残った菌体や破片を取り除いた。ピペットで上清を新しいＥＰチューブに注意深く移し、そこに１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加え、氷上に１時間置いてファージを再び沈殿させた後、１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、ファージ沈殿物を回収した。すべての上清を注意深く取り除き、廃棄した。さらに、ファージ沈殿物を適量のＰＢＳで再溶解し、完全に溶解した後、１５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、残った不溶性不純物を除去した。上清を新しいＥＰチューブに分注し、５０％のグリセリンを加え、−８０℃で長期間保存した。
【００７７】
２．３ライブラリー力価の決定
Ｃａｒｏｌ  Ｍ  Ｙ  Ｌｅｅらの方法（Ｍ  Ｙ  Ｌｅｅ，Ｃａｒｏｌ  ＆  Ｉｏｒｎｏ，Ｎｉｃｃｏｌб  ＆  Ｓｉｅｒｒｏ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃ  ＆  Ｃｈｒｉｓｔ，Ｄａｎｉｅｌ．（２００７）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２．３００１−８．１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００７．４４８．）に参照して、ファージライブラリーを２×ＹＴで勾配希釈した。１０−９、１０−１０、および１０−１１の希釈液について、それぞれ１０μｌを採取し、対数増殖期まで培養した新鮮なＴＧ１細菌液２００μｌに加え、均一に混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、２×ＹＴ−ＣＧを含むプレートにすべて広げた。プレートを３０℃のインキュベーター内で一晩インキュベートし、翌日、単一コロニーの数をカウントし、力価を算出した。
【００７８】
２．４  ライブラリのパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
本発明のＴＥＶＰバリアントをパンニングする原理は以下の通りである。Ａｖｉタグは、１５アミノ酸残基（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）で構成される短いペプチドタグであり、生体内および生体外の両方でもビオチンリガーゼによってリジン残基にビオチンをライゲーションすることにより、タンパク質のビオチン化を実現する。ビオチン化タンパク質は、特にストレプトアビジンによって結合される。これらの２つの反応に基づいて、本発明のＴＥＶｐファージは、生体内でビオチン化することができ、ビオチン化ファージライブラリーは、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化することができる。理想的な条件下では、細胞内で酵素切断活性を持つＴＥＶＰバリアントは、発現プロセスにおいて自己切断され、その結果、最終的に組み立てられたファージＰＩＩＩタンパク質は、末端にＡＣＴＨのみを有し、Ａｖｉタグを有しないため、磁気ビーズで捕捉することができない。一方、細胞内で発現させた場合、酵素切断活性を有しないＴＥＶＰバリアントは、発現プロセスにおいて自己切断をすることがなく、その結果、最終的に組み立てられたファージＰＩＩＩタンパク質は、末端がＡｖｉ−ＴＥＶＰ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨであり、Ｎ末端のＡｖｉタグがビオチン化されているため、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉することができる。磁気ビーズによって捕捉されたファージは、中／高濃度の尿素中でインキュベートされる。生理学的条件下で不溶性であるＴＥＶＰバリアントは、この条件下で溶解してその活性を回復し、酵素切断ができる。この条件下で消化されたファージは、自己切断により磁気ビーズから脱落し、溶液に入る。溶液を回収して、最初の標的ファージを取得し、増幅した後、次のスクリーニングを行うことができる。数回のスクリーニングの後、弱い生体内酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で酵素切断活性を有するＴＥＶプロテアーゼバリアントがエンリッチ化される。遺伝子配列解析により、発現ベクターにクローニングした後に１つずつ確認できるエンリッチ化された配列を得る。各回のパンニング結果を以下の表２に示します。
【００７９】
表２．  各回のパンニングのデータ
【表２】
2022502070.tif 000004
【００８０】
ファージパンニングの具体的なプロセスは次の通りである。
（１）ファージの固定化：清潔な２ｍｌのＥＰチューブで、１００倍のライブラリー容量のファージをＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ＰＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０）に希釈し、適量のストレプトアビジン磁気ビーズを添加して混合し、４℃で回転させ、２０分間インキュベートした。磁石で磁気ビーズを沈殿させた後、ＴＢＳＴで５回洗浄して未結合のファージを除去した。
【００８１】
（２）酵素切断のスクリーニング：３Ｍ尿素を含むＴＢＳ緩衝液を磁気ビーズに添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。磁石で磁気ビーズを沈殿させ、上清を可能な限り回収した。
【００８２】
（３）ファージの増幅：ＯＤ６００＝０．５のＴＧ１宿主細菌５０ｍｌに、溶出したファージを加え、３７℃で１時間ゆっくり振とうした。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％のグルコースを添加し、さらに２時間インキュベートした。ヘルパーファージ（Ｍ１３０Ｋ０７（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏ−ｖｉｅｗｓｈｉｎｅ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入））を添加して感染（ＭＯＩ＝２０）させ、ゆっくりと回転させながら３７℃で１時間インキュベーションした。次に、遠心分離により細菌を回収し、上清を可能な限り取り除いた。１００ｍｌの２ｘＹＴ−ＣＫ（２ｘＹＴ＋１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン＋２００μＭのＤ−ビオチン）で菌体を再懸濁し、２５℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、パッケージされたファージを回収して精製した。培養物を清潔な５０ｍｌ遠心管に移し、１３，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上層の８０％の上清を新しい遠心管に移し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加え、４℃で１時間以上沈殿させた。その後、再び遠心分離して沈殿物を回収し、適量のＰＢＳを加えてファージ沈殿物を再懸濁し、さらに遠心分離して細菌の破片などの不純物を除去した。上清を回収し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加し、氷上で１時間静置した後、再び遠心分離して沈殿物を回収し、適量のＰＢＳに溶解した。次に、１３，０００ｇで１０分間遠心分離して不溶性不純物を除去し、上清を別の新しいＥＰチューブに移し、増幅後の溶出液とした。
【００８３】
（４）力価測定のために１μｌの精製ファージを採取し、残りは次のパンニングまたは保存のために使用した。
【００８４】
（５）シーケンシングによるスクリーニング配列のエンリッチ化の分析：３回のパンニング後、最終回で溶出したファージを使用して宿主細菌を感染させ、２ｘＹＴ−ＣＧプレートにプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、シングルクローンコロニーを選択し、コロニーＰＣＲを行ってライブラリー配列に属するかどうかを確認し、陽性クローンを配列決定解析に供した。配列決定の結果を解析し、変異部位の頻度を統計することにより、最終的に最良の７つの変異体が候補クローンとして選定した。
【００８５】
３．  候補クローンの特性評価
上記の７つの候補配列を消化（Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１）し、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｈｕｎａｎ  Ｙｏｕｂｉｏ社から購入）にトランスフェクトして発現させた。発現条件：ＬＢ培地、３７℃でＯＤ６００＝約０．６になるまで培養した。誘導条件：３７℃で２５０ｒｐｍで振とうし、２ｍＭ  ＩＰＴＧ、４時間誘導した。細菌処理：遠心分離で細菌を回収し、細菌を再懸濁し、超音波によって破壊し、遠心分離で封入体の沈殿物を回収し、封入体を洗浄し、最後に、８Ｍ尿素（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）で封入体を溶解した。
【００８６】
封入体タンパク質の希釈および消化試験：尿素の最終濃度を３Ｍまたは４Ｍになるように、ＴＥＶＰ消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で各候補クローンの封入体タンパク質を希釈した後、２５℃で一晩消化した。翌日、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行い、消化を確認した。タンパク質電気泳動バンドをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで処理し、バンドのグレー値を算出した。
【００８７】
消化条件の最適化：上記の消化試験で得られた陽性クローンは、異なる条件下で消化効率をさらに試験する必要がある。このような条件としては、異なる尿素濃度、異なる温度、異なるグアニジン塩酸塩濃度、反応溶液中のＤＴＴおよびＥＤＴＡ濃度が挙げられる。
【００８８】
本発明は、上記のスクリーニングを通して、最終的に、生体内酵素切断活性が弱いが生体外活性が正常である３つの変異体を得た。試験結果を図１、２、３、４Ａ−Ｂに示す。
【００８９】
具体的なプロセスは、以下の通りである。８Ｍ尿素緩衝液に溶解した各ＴＥＶプロテアーゼバリアント−ＡＣＴＨ融合タンパク質を、１：１０の比率で希釈液に添加した。希釈液は、異なる濃度の尿素を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴであった。尿素の最終濃度が４Ｍの場合、希釈液は、３．５６Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴであった。各サンプルを均一に混合した後、直ちに２本のＥＰチューブに均等に分注し、そのうちの１本に５×ＳＤＳローディング緩衝液を添加し、１００℃で５分間煮沸し、０時間の酵素切断サンプルとした。もう１本は、２５℃で１６時間自己切断した後、５×ＳＤＳローディング緩衝液を添加し、１００℃で５分間煮沸し、１６時間の酵素切断サンプルとした。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲルで電気泳動を実行し、各バリアントの０時間、１６時間の酵素切断サンプルを検出した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、脱色し、写真を撮った。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで画像を処理して、電気泳動バンドのグレー値を算出した。計算方法は以下の通りである。
【００９０】
生体内酵素切断活性＝１−酵素切断前の融合タンパク質バンドのグレー値／（酵素切断前の融合タンパク質バンドのグレー値＋Ａｖｉ−ＴＥＶＰバンドのグレー値×融合タンパク質分子量／Ａｖｉ−ＴＥＶＰ分子量）。
【００９１】
生体外酵素切断効率＝１−酵素切断後の融合タンパク質バンドのグレー値／酵素切断前の融合タンパク質バンドのグレー値。
【００９２】
表３に示すように、４Ｄ、１２Ｄ、および３２Ｃプロテアーゼバリアントの生体内酵素切断活性は、有意に低下し、４Ｍ尿素での生体外切断効率は、いずれも３０％以上であった。本発明におけるＡＣＴＨポリペプチドの調製に用いたＴＥＶプロテアーゼバリアントは、表３に示すいずれかである。本発明でスクリーニングされたＴＥＶプロテアーゼバリアントは、他の組換えポリペプチドおよびタンパク質の調製に使用することができる。
【００９３】
表３は、複数のプロテアーゼバリアントとＡＣＴＨとの融合タンパク質の収量（計算方法：融合タンパク質サンプルとＢＳＡ標準品と共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲルで電気泳動を実行した後、クマシーブリリアントブルー染色溶液で染色し、脱色溶液で背景を取り除き、写真を撮影する。写真におけるＢＳＡ標準品バンドのグレー値をサンプルのグレー値と比較してサンプルの濃度を推定し、融合タンパク質の濃度と収量を算出する。）、生体内活性、および４Ｍ尿素に対する生体外耐性（対照としてＳ２１９Ｖを使用）を示し、タンパク質バンドのグレー値に基づいて比較する。データは、３つの異なるバッチで発現されたＴＥＶＰバリアントの融合タンパク質の収量、および生体内酵素切断と生体外酵素切断の比率の統計結果である。
【表３】
2022502070.tif 000005
【００９４】
注：ここで、融合タンパク質の収量は、酵素切断されていない融合タンパク質を指す。生体内で酵素切断された融合タンパク質は、役に立たないためカウントされない。Ｓ２１９Ｖは、野生型ＴＥＶＰの第２１９位のアミノ酸がセリン（Ｓ）からバリン（Ｖ）に変異している。
４Ｄ：Ｓ２１９Ｖの第１１１位のアミノ酸はロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異し、第１３８位のアミノ酸はイソロイシン（Ｉ）からリジン（Ｋ）に変異している。
１２Ｄ：Ｓ２１９Ｖの第２８位のアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）に変異し、第１１１位のアミノ酸はロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変異し、第１９６位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｑ）からヒスチジン（Ｈ）に変異している。
３２Ｃ：Ｓ２１９Ｖの第１１１位のアミノ酸はロイシン（Ｌ）からヒスチジン（Ｈ）に変異し、第１３５位のアミノ酸はセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）に変異し、第１８７位のアミノ酸はメチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）に変異している。
【００９５】
図１は、ＴＥＶｐ変異体１２Ｄが４Ｍ尿素溶液で最も高い酵素切断効率を有することを示す。図２は、ＴＥＶｐ変異体４Ｄが４Ｍ尿素で最も高い酵素切断効率を有することを示す。図３は、ＴＥＶｐ変異体３２Ｃが４Ｍ尿素で最も高い酵素切断効率を有することを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＴＥＶｐバリアント４Ｄが４Ｍ尿素、２５℃の条件下で最も高い酵素切断効率を有することを示す。尿素濃度が４Ｍを超えると、各変異体の酵素切断効率が徐々に低下する。
【００９６】
図５は、本発明でスクリーニングされたＴＥＶｐ変異体４Ｄ、１２Ｄおよび３２Ｃの生体内酵素切断活性がＳ２１９Ｖ対照のそれよりも大幅に低く（０時間バンドの比較に基づく）、生体外酵素切断活性がＳ２１９Ｖと同等またはそれ以下であることを示す。
【００９７】
図６は、０．５Ｍ尿素における各ＴＥＶｐ変異体の融合タンパク質の溶解度がいずれも低いことを示す（希釈された上清には少量のタンパク質のみがあり、ほとんどのタンパク質は希釈された沈殿物にあった）。これは、ＴＥＶＰ変異体融合タンパク質が０．５Ｍ尿素に希釈された後に、沈殿物として存在した。
【００９８】
本発明におけるＡＣＴＨポリペプチドの調製に使用されたＴＥＶプロテアーゼバリアントは、表１に示すいずれかである。本発明でスクリーニングされたＴＥＶプロテアーゼバリアントは、他の組換えポリペプチドおよびタンパク質の調製に使用することができる。
【００９９】
実施例２：ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質によるＡＣＴＨポリペプチドの調製
１．ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質発現ベクターの構築
実施例１において、融合タンパク質の酵素切断によって放出されたＡＣＴＨのカルボキシル末端は、実際の生産において除去される必要があるＨｉｓタグを有する。したがって、ＰＣＲによってＡＣＴＨ遺伝子の下流に終止コドンを導入する必要がある。具体的には、実施例１の工程３で最も効果があったＴＥＶプロテアーゼバリアント１２Ｄを含むプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによりベクターのオープンリーディングフレームにおけるＡｖｉ−ＴＥＶＰ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨ領域を増幅した（ＴＥＶＰバリアント１２Ｄの配列は配列番号５であり、ＡＣＴＨ遺伝子の配列は配列番号１３である。）。増幅は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡハイフィデリティポリメラーゼ（東洋紡）を使用して行った。増幅プログラムは、９５℃で２分間の前変性、９８℃で１０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で１分間１２秒間の伸長、３０サイクル増幅である。遺伝子の下流に終止コドンを導入した。プライマーは次のとおりである。
ＴＥＶ−ＡＣＴＨ−Ｆ：５−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３
ＴＥＶ−ＡＣＴＨ−Ｒ：５−ＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣ−３
【０１００】
ここで、下線部分は、それぞれ制限部位Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１である。ＰＣＲ生成物およびベクターｐＥＴ−２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、３７℃、Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１で３時間消化した後、断片をゲルで回収し、次に、２０℃、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで２時間ライゲーションした。ＤＨ５αコンピテント細胞にライゲーション生成物を形質転換した後、形質転換した生成物をカナマイシン耐性（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢプレートに塗布し、単一のコロニーが出現するまで培養した。単一のコロニーを選び、プラスミドを抽出し、酵素切断の検証を行った。組換えプラスミドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに委託して配列決定を行い、プラスミドｐＥＴ−２８ｂ−Ａｖｉ−ＴＥＶＰ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨ（ここで、ｓＴＥＶ配列はＴＥＶＰ−ＡＣＴＨプラスミドにある）を得た。
【０１０１】
２．  ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質の誘導性発現、精製、酵素切断および検証
構築された発現ベクターを形質転換した。具体的には、５０ｎｇのプラスミドｐＥＴ−２８ｂ−ＴＥＶＰ−ｓＴＥＶ−ＡＣＴＨを、対応する化学コンピテント細胞Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）に加え、氷浴に３０分間入れ、４２℃で４５秒間加熱ショックを与え、氷浴に２分間入れた。抗生物質を含まない１ｍｌのＬＢ培地を添加し、３７℃で１時間培養した。１００μｌの細菌溶液を採取して、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）＋クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに塗布し、単一のコロニーが出現するまで３７℃でインキュベートした。
【０１０２】
ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質の誘導性発現：単一コロニーを採取し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地でＯＤ６００＝０．５〜０．８になるまで培養した。体積比１：５０で培養物をＬＢ液体培地に接種し、３７℃で激しく振とうしながらＯＤ６００＝０．５〜０．８まで培養し、最終濃度２ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間誘導した。発現過程において、ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質は、不溶性の封入体として存在した。発酵が完了した後、菌体を回収し、超音波で破砕し、洗浄緩衝液（組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で数回洗浄し、ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質の粗抽出物を得た。変性剤であるグアニジン塩酸塩または尿素を含む緩衝液（組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、８Ｍ尿素または６Ｍ  ＧｕＨＣｌ）を添加し、ＴＥＶＰ−ＡＣＴＨ融合タンパク質を溶解し、変性溶液を調製した。
【０１０３】
ＴＥＶＰ消化緩衝液（３．５５６Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で融合タンパク質変性溶液を１０倍希釈し、尿素の最終濃度を４Ｍにし、２５℃で一晩自己切断した。酵素切断生成物を８倍希釈（希釈液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）した後、ＴＥＶプロテアーゼおよび未切断の融合タンパク質は、溶解性が低いため、沈殿（図６を参照）したが、ＡＣＴＨポリペプチドは、溶液に溶解された。したがって、１３０００ｇ、低温、高速、４℃で３０分間遠心分離した後、上清を回収し、ＡＣＴＨ原液を得た。
【０１０４】
３．  ＡＣＴＨの精製および保存
０．２２μｍメンブレンフィルターでＡＣＴＨ原液をろ過して不純物を除去し、１ｋの限外ろ過遠心管理（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濃縮しながら脱塩し、５０％の硫酸アンモニウムで沈殿させた。ＡＣＴＨは、溶液の上層に懸濁物を形成し、これを注意深く回収してＰＢＳで溶解し、限外濾過によって濃縮および脱塩を行い、高純度のヒトまたはブタ由来の組換えＡＣＴＨの溶液を得て、次に凍結乾燥して保存した。
【０１０５】
４．  ＡＣＴＨの構造同定
精製されたＡＣＴＨの分子量を質量分析計で測定した結果、測定された分子量は理論値と一致した。その結果を図１０に示す。
【０１０６】
５．  ＡＣＴＨの活性測定
２週齢の健康なＳＤラットを１％ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、無菌状態で副腎を摘出し、皮膜と髄質を取り除き、ハンクス平衡塩溶液に入れた。１ｍｍ３の大きさにカットした後、Ｉ型コラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含む消化液に移し、５分間隔で振とうしながら１時間消化した。ピペットを使用して数回ピペッティングすることにより細胞を機械的に分離して懸濁液を形成した。次に、これをセルシーブ（ｃｅｌｌ  ｓｉｅｖｅ）で濾過して５０ｍｌの遠心管に入れ、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、沈殿した細胞をハンクス溶液で２回洗浄し、最後に、２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で再懸濁して、濃度を２×１０５個／ｍｌに調整し、９０ｍｍシャーレに接種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でインキュベートした。倒立型位相差顕微鏡で副腎細胞の成長過程および形態変化を観察した。４８時間の培養後、顕微鏡下で、副腎細胞は、付着して成長すること、細胞体積が増加していること、細胞体が円形または多角形になること、細胞体が大きいこと、細胞質が透明であること、細胞質中に規則的な大きさの粒子が多数存在していることが観察された。このようにして、ラット副腎皮質細胞を得た。
【０１０７】
精製されたＡＣＴＨを、ｅｘ  ｖｉｖｏでラット副腎皮質細胞とインキュベートした。具体的には、副腎細胞の各グループに、異なる濃度（０．１μＵ、０．２μＵ、２μＵ、２０μＵ、２００μＵ、１Ｕ＝１０μｇタンパク質）のＡＣＴＨ（細胞とＡＣＴＨとの体積比は４００：１）をそれぞれ添加した。３７℃で２４時間培養した後、培地を採取して遠心分離し、細胞破片を除去した後、酵素結合免疫吸着測定法（酵素結合免疫吸着測定法について、Ｈｅ  Ｓｈａｎｇｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＰＣＮＡ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｄｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２１．８（２００６）：６２５−６２６を参照）によりコルチコステロン濃度を測定した。その結果、ＡＣＴＨの濃度が増加するにつれて、コルチコステロンの濃度も徐々に増加することが分かった。ＡＣＴＨは、細胞を刺激してステロイドホルモンを分泌させるため、生成されたコルチコステロンの濃度を測定することでＡＣＴＨの活性を定量することができる（ＥＬＩＳＡ法）。結果は、精製後の複数バッチのＡＣＴＨが高い生物活性と活性安定性を有することを示した。その結果を図１１に示す。
【０１０８】
上記は、本発明の好ましい実施形態のみを示したものであり、いかなる形態でも本発明を限定するものではない。したがって、本発明の技術的本質に基づいて、本発明の技術構成の内容から逸脱することなく上記の実施形態になされた任意の単純な改変、同等な変更および修正は、依然として本発明の技術構成の範囲内にある。
【０１０９】
配列番号１（野生型ＴＥＶＰ）
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMSKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号２（ヒトＡＣＴＨアミノ酸配列）
SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF
配列番号３：ＴＥＶＰ（２１９Ｖ）ヌクレオチド配列
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号４（４Ｄ  ＴＥＶＰ）
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICFVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGKFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号５（１２Ｄ  ＴＥＶＰ）
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGLTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICFVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAHQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号６（３２Ｃ  ＴＥＶＰ）
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICHVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSGDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFIELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号７
ENLYFQS
配列番号８
ENLYFQH
配列番号９
EXXYXQ(G/S)
配列番号１０（Ｓ２１９Ｖ）
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号１１
EXXYXQS
配列番号１２：ｓＴＥＶ（実施例で使用されたＴＥＶｐ制限部位のヌクレオチド配列）
GAAAATCTGTATTTTCAGAGC
配列番号１３：ＡＣＴＨ  ＤＮＡヌクレオチド配列
AGCTATAGCATGGAACATTTTCGTTGGGGTAAACCGGTTGGTAAAAAACGTCGTCCGGTTAAAGTTTATCCGAATGGTGCAGAAGATGAATCGGCAGAAGCATTTCCGCTGGAATTT
配列番号１４：ＴＥＶ（４Ｄ）
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTTTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCCTCATCTGATGGCAAATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号１５：ＴＥＶ（１２Ｄ）
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCTCACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTTTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCATCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号１６：ＴＥＶ（３２Ｃ）
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCATGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCAGGTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACTAGCGTGCCGAAAAACTTCATTGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCCACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
【図１】
2022502070.tif 000006
【図２】
2022502070.tif 000007
【図３】
2022502070.tif 000008
【図４Ａ】
2022502070.tif 000009
【図４Ｂ】
2022502070.tif 000010
【図５】
2022502070.tif 000011
【図６】
2022502070.tif 000012
【図７】
2022502070.tif 000013
【図８】
2022502070.tif 000014
【図９】
2022502070.tif 000015
【図１０】
2022502070.tif 000016
【図１１】
2022502070.tif 000017
【配列表】
2022502070000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月13日(2021.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程；
（２）前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下でプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程；および
（３）必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程を含み、
ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである、
プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法。
【請求項２】
ランダム突然変異誘発キットで前記の変異ライブラリーを生成することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）において、例えばＴＥＶプロテアーゼテンプレート（例えば配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖ  ＴＥＶプロテアーゼ）のような適切なプロテアーゼテンプレートをテンプレートとして、ランダム変異を行い、前記のライブラリーを構築し、
好ましくは、プロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、最初のプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で最初のプロテアーゼの酵素切断活性を保持し；
好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖプロテアーゼの酵素切断活性を保持する、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントが、プロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１（例えばＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１）を含む融合タンパク質として提示され；プロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントが、ファージの表面に提示されることが好ましく；ここで、ＴＥＶｐがＴＥＶプロテアーゼであり、ｓＴＥＶがＴＥＶプロテアーゼの切断配列であり、Ｙ１が標的タンパク質であり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
宿主内で、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはＴＥＶプロテアーゼバリアントのＮ末端に、直接的、またはリンカーを介して間接的に部分Ａを付加することを含み、
ここで、好ましくは、前記の部分Ａが、親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記のプロテアーゼに適した生体外条件下で、部位Ａに特異的な部位Ｂを固定化した固体支持体とともに、部分Ａを付加したファージライブラリーを一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液と支持体とを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返し、
ここで、好ましくは、前記の部分Ｂが部分Ａに特異的に結合するという条件で、部分Ｂが、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの１つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼが、Ａｖｉ−プロテアーゼ−プロテアーゼ切断部位−Ｙ１−ＰＩＩＩ、好ましくはｐＨＥＮ１−Ａｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１構築物を介してＡｖｉ−ＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１−ＰＩＩＩとして、ファージＰＩＩＩタンパク質の末端に提示され、ここで、Ａｖｉタグが１５個のアミノ酸残基ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥからなる短いペプチドタグであり；好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列が配列番号７および８から選択され；
好ましくは、前記の酵素切断活性が、前記のプロテアーゼおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質、好ましくはＴＥＶｐ−ｓＴＥＶ−Ｙ１に対して測定されるものであり；
好ましくは、前記のスクリーニングが、宿主内で前記のプロテアーゼ、好ましくはＴＥＶプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーをビオチン化することを含み；
好ましくは、前記のスクリーニングが、ビオチン化されたファージライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズで処理し、磁気ビーズによって捕捉されたファージを中／高濃度の尿素中で一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液から磁気ビーズを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを１回以上繰り返し；
好ましくは、前記のライブラリーが、コロニーＰＣＲによって検証され、好ましくは、前記のコロニーＰＣＲに使用されるプライマーが、
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣ−３’
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣ−３’
であり；
好ましくは、ライブラリーの容量は１×１０９以上、好ましくは２×１０９であり；好ましくは、全体の変異頻度は１．５〜７個／ｋｂの中／低程度である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｙ１がヒトまたはブタのＡＣＴＨまたはＧＬＰ−１であり、好ましくは、前記の宿主が大腸菌である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記の生体外変性条件が中／高程度の変性条件であり、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の条件である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記のプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＳ２１９Ｖバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントの切断配列はＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈから選択され、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列は、配列番号７および８から選択され；好ましくは、前記のプロテアーゼバリアントまたはＴＥＶプロテアーゼバリアントは、中／高程度の変性条件下、好ましくは３Ｍ〜５Ｍの尿素、好ましくは３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素、より好ましくは４Ｍの尿素または１Ｍ〜２Ｍのグアニジン塩酸塩、好ましくは１．５Ｍのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、最初のプロテアーゼ（例えばＳ２１９Ｖプロテアーゼ）の生体外酵素切断活性を保持し；好ましくは、前記の酵素切断活性は、前記のプロテアーゼバリアントおよびその切断配列（例えばプロテアーゼ−プロテアーゼ切断配列−Ｙ１）を含む融合タンパク質、好ましくは前記のＴＥＶプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものであり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列がＥＸＸＹＸＱＧ／Ｓ／Ｈであり、ここで、Ｘが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のＴＥＶプロテアーゼの切断配列は配列番号７および８から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法によって得られるプロテアーゼバリアント。
【国際調査報告】
2022502070.tif 000018
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