(57)【要約】  タンパク質構造プローブを使用して、治療用抗体に結合してそれらの動的構造を変化させることより体液性免疫機能およびそれらの薬理活性に悪影響を及ぼす腫瘍誘発性または腫瘍産生性（ＴＩＰＳ）因子を同定することができる。そのようなタンパク質構造プローブおよびＴＩＰＳ因子を使用して、影響を受けた治療用抗体へのＴＩＰＳ因子の結合に対抗することができる阻害剤をスクリーニングおよび同定することができる。これらの阻害剤は、癌を治療するためのＴＩＰＳ因子感受性抗体（ＴＳＡ）の存在下で使用することができる。阻害剤は、単独で、または癌を治療するための化学療法と組み合わせて使用することができる。抗体がＴＳＡの場合でも、患者をスクリーニングして、ＴＩＰＳ因子の産生が少ないか、または全くない患者を抗体療法の候補として同定することができる。逆に、ＴＩＰＳ因子の産生が高い患者は、阻害剤療法の候補である。【選択図】図１
2022501444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を特徴づけるためのキットであって、前記キットが、
ａ．前記抗体の前記Ｆａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、
ｂ．前記抗体の前記Ｆｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと
を含み、
前記第１の蛍光体および前記第２の蛍光体が、前記抗体に結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する、
前記キット。
【請求項２】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体であって、前記抗体がＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されており、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着している、前記抗体。
【請求項３】
前記抗体が、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）に結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を特徴づけるためのキットであって、前記キットが、
第１の蛍光体で標識された抗体と、
第２の蛍光体で標識されたタンパク質またはアプタマーと
を含み、
前記タンパク質またはアプタマーが前記抗体に結合すると、前記第１および第２の蛍光体がＦＲＥＴに関与し、
前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着しており、前記タンパク質もしくはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合するか、または、前記第１の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着しており、前記タンパク質もしくはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合する、
前記キット。
【請求項５】
前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーおよび前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが存在しない場合に、ならびにそれらが存在する場合に、前記抗体が同種抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
１つ以上の腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、蛍光標識プロテインＬ（配列番号１）である、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、蛍光標識プロテインＡ（配列番号２）である、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、第１のアプタマーを含み、前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、第２のアプタマーを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、前記抗体が特異的に結合する同種抗原を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、ヒトＦＣＧＲ１Ａ（配列番号４）、ＦＣＧＲ２Ａ（配列番号５）、ＦＣＧＲ２Ｂ（配列番号６）、ＦＣＧＲ２Ｃ（配列番号７）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８）、ＦＣＧＲ３Ｂ（配列番号９）、ＦＣＧＲＴ（配列番号１０）、ＦＣＲＬ５（配列番号１１）、マウスＦＣＧＲ４（配列番号１２）、およびヒトＣ１ｑ（配列番号１３）からなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
前記第１または前記第２の蛍光体が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０クマリン（ＡＭＣＡ）、Ｃｙ２またはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３またはテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７からなる群から選択される、請求項１または４に記載のキット。
【請求項１３】
前記第１または前記第２の蛍光体に付着した前記アミノ酸残基が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０クマリン（ＡＭＣＡ）、Ｃｙ２またはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３またはテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ローダミンレッド、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７からなる群から選択される蛍光体を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を特徴づけるための方法であって、以下を含む方法：
三元複合体を形成させるために、第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーおよび第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーを、特徴づけられる前記抗体と接触させることであって、前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合し、前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合し、前記第１および第２の蛍光体がＦＲＥＴに関与する、前記接触させることと、
前記三元複合体の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を決定することと、
前記三元複合体または前記三元複合体の成分を腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させることと、
前記ＴＩＰＳ因子の存在下での前記三元複合体のＦＲＥＴを決定すること。
【請求項１５】
前記第１または第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが試薬抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体を特徴づけるための方法であって、以下を含む方法：
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む二重標識抗体のＦＲＥＴを決定することであって、前記二重標識抗体が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する第１および第２の蛍光体で標識されており、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着している、前記決定することと、
（ａ）前記二重標識抗体を（ｂ）腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させることと、
前記ＴＩＰＳ因子の存在下での前記二重標識抗体のＦＲＥＴを決定すること。
【請求項１７】
特徴づけられる前記抗体が、癌患者から得られた抗腫瘍抗体である、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項１８】
特徴づけられる前記抗体が、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、およびＹＰ２１９からなる群から選択される抗体である、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項１９】
特徴づけられる前記抗体が、
（ａ）Ｋａｂａｔに従って番号付けされた、ＹＰ２１９の相補性決定領域ＣＤＲＨ１としてＧＦＤＬＧＦＹＦＹＡＣ（配列番号１４）、ＣＤＲＨ２としてＣＩＹＴＡＧＳＧＳＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号１５）、ＣＤＲＨ３としてＡＲＳＴＡＮＴＲＳＴＹＹＬＮＬ（配列番号１６）、ＣＤＲＬ１としてＱＡＳＱＲＩＳＳＹＬＳ（配列番号１７）、ＣＤＲＬ２としてＧＡＳＴＬＡＳ（配列番号１８）、およびＣＤＲＬ３としてＱＳＹＡＹＦＤＳＮＮＷＨＡ（配列番号１９）を含む抗体、または
（ｂ）ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））に従って番号付けされた、相補性決定領域：ＣＤＲＨ１としてＧＹＴＦＴＳＹＮ（配列番号２０）、ＣＤＲＨ２としてＩＹＰＧＮＧＤＴ（配列番号２１）、ＣＤＲＨ３としてＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号２２）、ＣＤＲＬ１としてＳＳＳＶＳＹ（配列番号２３）、ＣＤＲＬ２としてＡＴＳ（配列番号２４）、およびＣＤＲＬ３としてＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号２５）を含む、抗ＣＤ２０治療用抗体
を含む、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＦａｂドメインおよびＦｃドメインを含むＴＩＰＳ感受性抗体に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
第１の複合体を形成させるために、前記ＴＩＰＳ感受性抗体を、（ａ）前記ＴＩＰＳ感受性抗体の前記Ｆａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、および（ｂ）前記ＴＩＰＳ感受性抗体の前記Ｆｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと接触させることと、
第２の複合体を形成させるために、前記第１の複合体を、（ｃ）前記ＴＩＰＳ因子と接触させることと、
前記第２の複合体の少なくとも一部を（ｄ）試験物質と接触させることと、
前記第１の複合体、前記試験物質の非存在下での前記第２の複合体、および前記試験物質の存在下での前記第２の複合体の、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定すること。
【請求項２１】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含むＴＩＰＳ感受性抗体に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
前記ＴＩＰＳ感受性抗体のＦＲＥＴを測定することであって、前記ＴＩＰＳ感受性抗体がＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されており、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着している、前記測定することと、
複合体を形成させるために、前記ＴＩＰＳ感受性抗体を前記ＴＩＰＳ因子と接触させることと、
前記複合体を試験物質と接触させることと、
前記試験物質の存在下および前記試験物質の非存在下での前記複合体のＦＲＥＴを測定すること。
【請求項２２】
ＦａｂおよびＦｃドメインと第１の蛍光体とを含むＴＩＰＳ感受性抗体に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：
第１の複合体を形成させるために、前記ＴＩＰＳ感受性抗体を、前記ＴＩＰＳ感受性抗体に結合するタンパク質またはアプタマーと接触させることであって、それにより、前記ＴＩＰＳ感受性抗体が、前記第１の蛍光体と共にＦＲＥＴに関与する第２の蛍光体で標識されることになり、ここで、（１）前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着しており、前記第２の蛍光体が前記タンパク質もしくは前記アプタマーに付着しており、前記タンパク質もしくは前記アプタマーが前記Ｆｃドメインに結合するか、または（２）前記第１の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着しており、前記第２の蛍光体が前記タンパク質もしくは前記アプタマーに付着しており、前記タンパク質または前記アプタマーが、前記Ｆａｂドメインに結合する、前記接触させることと、
第２の複合体を形成させるために、前記第１の複合体をＴＩＰＳ因子と接触させることと、
前記第２の複合体を試験物質と接触させることと、
前記第１の複合体、前記試験物質の非存在下での前記第２の複合体、および前記試験物質の存在下での前記第２の複合体の、ＦＲＥＴを測定すること。
【請求項２３】
抗体を特徴づけるための、または抗体に結合するタンパク質もしくはアプタマーの対を特徴づけるための方法であって、以下を含む方法：
前記抗体を、前記抗体のＦａｂまたはＦｃドメインにおいて前記抗体に特異的に結合する第１のタンパク質またはアプタマーと接触させることであって、前記第１のタンパク質またはアプタマーが、前記抗体を固体支持体に連結するために、前記固体支持体に付着している、前記接触させることと、
前記固体支持体に連結された前記抗体を、前記抗体のＦａｂまたはＦｃドメインにおいて前記抗体に特異的に結合する第２のタンパク質またはアプタマーと接触させることであって、前記第２のタンパク質またはアプタマーが、検出可能な標識で標識されており、前記第１のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合する場合、前記第２のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合し、前記第１のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合する場合、前記第２のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合する、前記接触させることと、
前記固体支持体に連結された前記検出可能な標識の量を決定することと、
腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の存在下で、前記固体支持体に連結された前記抗体を前記第２のタンパク質またはアプタマーと接触させることと、
前記ＴＩＰＳ因子の存在下で前記固体支持体に連結された前記検出可能な標識の量を決定すること。
【請求項２４】
前記第１または第２のタンパク質またはアプタマーが、Ｆｃ特異的抗体または抗体断片、ヒトＦＣＧＲ１Ａ（配列番号４）、ＦＣＧＲ２Ａ（配列番号５）、ＦＣＧＲ２Ｂ（配列番号６）、ＦＣＧＲ２Ｃ（配列番号７）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８）、ＦＣＧＲ３Ｂ（配列番号９）、ＦＣＧＲＴ（配列番号１０）、ＦＣＲＬ５（配列番号１１）、マウスＦＣＧＲ４（配列番号１２）、およびヒトＣ１ｑ（配列番号１３）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な標識が、蛍光標識、酵素標識、比色標識、および放射性核（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅａｒ）標識からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を特徴づけるためのキットであって、
ａ．前記抗体の前記Ｆａｂまたは前記Ｆｃドメインに特異的に結合する第１のタンパク質またはアプタマーであって、前記第１のタンパク質またはアプタマーが固体支持体に付着している、前記第１のタンパク質またはアプタマーと、
ｂ．前記抗体の前記Ｆａｂまたは前記Ｆｃドメインに特異的に結合する第２のタンパク質またはアプタマーであって、前記第２のタンパク質またはアプタマーが検出可能な作用物質で標識されており、前記第１のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合する場合、前記第２のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合し、前記第１のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆｃドメインに結合する場合、前記第２のタンパク質またはアプタマーが前記Ｆａｂドメインに結合する、前記第２のタンパク質またはアプタマーと
を含む、前記キット。
【請求項２７】
１つ以上の腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）に対する抗体の感受性を測定するためのタンパク質またはアプタマープローブの適切な対を同定するための方法であって、以下を含む方法：
前記抗体への結合についてタンパク質またはアプタマーの対を試験し、対の両方のメンバーが同時に前記抗体に結合できることを決定することと、
前記抗体が前記タンパク質またはアプタマーの対に同時に結合している間に、前記抗体の同種抗原への前記抗体の結合を試験することと、
前記タンパク質またはアプタマーの対の存在下および非存在下での、前記同種抗原への前記抗体の同等の結合を決定すること。
【請求項２９】
前記抗体を腫瘍誘発性または腫瘍産生性タンパク質因子と接触させることであって、前記抗体が、前記タンパク質またはアプタマーの対および同種抗原に同時に結合する、前記接触させることと、
前記抗体への前記タンパク質またはアプタマーの対の前記結合の変化を検出することにより、前記腫瘍誘発性または腫瘍産生性タンパク質因子の存在下での前記抗体の構造の変化を決定することと
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ａ．抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、
ｂ．前記抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと
を含む組成物であって、
前記第１の蛍光体および前記第２の蛍光体が、前記抗体に結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する、
前記組成物。
【請求項３１】
前記抗体をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ＴＩＰＳ因子をさらに含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体が、ＹＰ２１９である、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗体が、リツキシマブである、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体が、ＲＴＸ−１６９（配列番号２６および２８）である、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、プロテインＬである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３８】
前記第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーが、プロテインＡである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３９】
前記プロテインＬが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標識されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第１のタンパク質またはアプタマーが、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−ＡＦ５５５標識プロテインＬ（ＰＬ５５５）である、請求項１に記載のキット。
【請求項４１】
前記タンパク質またはアプタマーが、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ５５５標識プロテインＬ（ＰＬ５５５）である、請求項４に記載のキット。
【請求項４２】
前記第１のタンパク質またはアプタマーが、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ５５５標識プロテインＬ（ＰＬ５５５）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４３】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を含む組成物であって、
前記抗体が、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されており、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインに特異的に結合するタンパク質もしくはアプタマーに付着しているか、または、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインに特異的に結合するタンパク質もしくはアプタマーに付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着している、
前記組成物。
【請求項４４】
二重標識抗体を特徴づけるための方法であって、以下を含む方法：
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む二重標識抗体のＦＲＥＴを決定することであって、前記二重標識抗体が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する第１および第２の蛍光体で標識されており、前記第１の蛍光体が前記Ｆａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆｃドメインに結合するタンパク質もしくはアプタマーに付着しているか、または、前記第１の蛍光体が前記Ｆｃドメインのアミノ酸残基に付着し、前記第２の蛍光体が前記Ｆａｂドメインに結合するタンパク質もしくはアプタマーに付着している、前記決定することと、
前記二重標識抗体を腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させることと、
前記ＴＩＰＳ因子の存在下での前記二重標識抗体のＦＲＥＴを決定すること。
【請求項４５】
第１の蛍光体標識プロテインＬと第２の蛍光体標識プロテインＡとを含む組成物であって、
プロテインＬおよびプロテインＡが抗体に結合すると、前記第１の蛍光体および前記第２の蛍光体が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する、
前記組成物。
【請求項４６】
前記抗体をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
抗体と、
前記抗体のＦａｂドメインにおいて前記抗体に結合する第１のタンパク質またはアプタマーと、
前記抗体のＦｃドメインにおいて前記抗体に結合する第２のタンパク質またはアプタマーと
を含む組成物であって、
前記第１のタンパク質もしくはアプタマーが固体支持体に付着しており、前記第２のタンパク質もしくはアプタマーが検出可能な標識で標識されているか、または前記第１のタンパク質もしくはアプタマーが検出可能な標識で標識されており、前記第２のタンパク質もしくはアプタマーが固体支持体に結合している、
前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、体液性免疫腫瘍学の分野に関する。特に、それは、癌の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害することまたは他の疾患を治療することにおける抗体の効力を改善するための方法、キット、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
人間の免疫システムは、２つの主要なタイプの適応免疫、すなわち細胞性免疫および体液性免疫で構成されている。細胞性免疫を媒介する免疫チェックポイント阻害剤の最近の発見（Ｈｏｄｉ  ＦＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：７１１−７２３，２０１０（非特許文献１））により、これらの経路を遮断できる作用物質の追求は、この腫瘍生存メカニズムを克服するためのアプローチに関する重要な知識を得てきている。いくつかの商業的に承認された治療用抗癌抗体は、体液性抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）免疫経路を介してそれらの抗腫瘍効果を示すことが報告されているが（ＤｉＬｉｌｌｏ  ＤＪ，Ｒａｖｅｔｅｃｈ  ＪＶ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：７０４−７１３，２０１５（非特許文献２））、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）を介して抑制できる潜在的な体液性免疫経路の理解および発見は、それらが免疫抑制を媒介できる自明ではないメカニズム（複数可）のためにあまり調べられていない。抗体媒介性体液性免疫応答は、抗体と細胞表面の抗原との会合が調整されることで細胞表面に特定の近接性で抗原エピトープ上に抗体を配置することによって制御される。この配置が最適な場合、細胞表面に結合した抗体はナチュラルキラー（ＮＫ）または骨髄性／単球細胞のＦｃ−γ受容体と会合してＡＤＣＣを開始する、ならびにＣ１ｑ補体開始タンパク質と会合して古典的な補体ＣＤＣ経路を介して抗体結合細胞の死滅を引き起こす可能性がある（Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５８：１５３５−１５４４，２００９（非特許文献３））。これらの効果は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブなどのいくつかの治療用抗体、およびいくつかの実験的抗体の開発中に観察されている（Ｚｈｏｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １３：９５４−９６６，２００８（非特許文献４）、Ｈｓｕ  ＹＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：−８，２０１０（非特許文献５）、Ｓｐｉｒｉｄｏｎ  ＣＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：１７２０−１７３０，２００２（非特許文献６）、Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：１８７２−１８８２，２０１８（非特許文献７））。同様に、体液性応答は、ワクチンおよび緩慢進行性疾患を有するものに応答して、調節不全におよび／または異常に増殖する細胞に対する患者自身の免疫応答内で起こり、抗増殖性（ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）および体液性免疫媒介性殺活性を伴う主にＩｇＭクラスの抗体を産生することが示されている（Ｓｔａｆｆ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：８５５−８６５（非特許文献８）、Ｂｒａｎｄｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：７９９５−８００５，２００３（非特許文献９））。
【０００３】
ＴＩＰＳ因子は、確立されたアッセイを使用して患者の血清で容易に検出できるため、予後および／または病期ならびに再発を確立する目的で、それらのレベルを都合良く監視できる。最近の発見は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５（本明細書ではＣＡ１２５と呼ぶ）などのＴＩＰＳ因子が、抗体に直接結合してＦｃ領域を混乱させ、それにより免疫細胞におけるＦｃ−ガンマ活性化受容体ＦＣＧＲ２ＡもしくはＦＣＧＲ３Ａおよび／またはＣ１ｑを含む補体媒介タンパク質との会合の有効性を低下させることにより、体液性免疫応答を抑制する可能性があることを示している。これらのデータのいくつかは、それらの薬理学的活性についての免疫エフェクターメカニズムに依存する抗癌抗体の臨床研究から得られたものである。血清ＣＡ１２５レベルは、報告された多くの症例で臨床転帰と相関することが見出されている。これらには、卵巣癌における実験的ファルレツズマブ抗体および中皮腫におけるアマツキシマブ抗体に関する報告が含まれる（Ｖｅｒｇｏｔｅ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４：２２７１−２２７８，２０１６（非特許文献１０）、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ＮＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：１−２２，２０１８（非特許文献１１））。いくつかの報告では、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の患者における血清ＣＡ１２５レベルと無増悪生存期間（ＰＦＳ）の短縮との相関関係も示されており、これにより、リツキシマブとＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン（ヒドロキシダウノマイシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、プレドニゾロン）で治療された濾胞性リンパ腫の患者は、ＣＡ１２５レベルが正常範囲内にある場合、５年間のＰＦＳで３１．４％の改善が見られた（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９６：５８−６４，２０１２（非特許文献１２））。さらに、ＣＡ１２５は、標準的な化学療法で治療された患者の予後因子であると報告されており、ＣＡ１２５レベルが正常範囲を超えている患者と比較して血清ＣＡ１２５レベルが正常範囲内にある場合に３年生存率が２６．３％改善した（Ｂａｉｒｅｙ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｍｅｍｉａ  Ｌｙｍｐｈ  ４４：１７３３−１７３８，２００３（非特許文献１３））。ＴＩＰＳ因子の役割、ＴＩＰＳ感受性抗体に対するそれらの効果、および癌患者の体液性免疫におけるそれらの負の効果に対抗するための手段を発見および分析するためのツールを開発するための当技術分野における継続的な必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｏｄｉ  ＦＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：７１１−７２３，２０１０
【非特許文献２】ＤｉＬｉｌｌｏ  ＤＪ，Ｒａｖｅｔｅｃｈ  ＪＶ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：７０４−７１３，２０１５
【非特許文献３】Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５８：１５３５−１５４４，２００９
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １３：９５４−９６６，２００８
【非特許文献５】Ｈｓｕ  ＹＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：−８，２０１０
【非特許文献６】Ｓｐｉｒｉｄｏｎ  ＣＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：１７２０−１７３０，２００２
【非特許文献７】Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：１８７２−１８８２，２０１８
【非特許文献８】Ｓｔａｆｆ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：８５５−８６５
【非特許文献９】Ｂｒａｎｄｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：７９９５−８００５，２００３
【非特許文献１０】Ｖｅｒｇｏｔｅ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４：２２７１−２２７８，２０１６
【非特許文献１１】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ＮＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：１−２２，２０１８
【非特許文献１２】Ｐｒｏｃｈａｚｋａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９６：５８−６４，２０１２
【非特許文献１３】Ｂａｉｒｅｙ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｍｅｍｉａ  Ｌｙｍｐｈ  ４４：１７３３−１７３８，２００３
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を特徴づけるためのキットである。このキットは、抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、を含む。第１の蛍光体および第２の蛍光体は、抗体に結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する。任意選択で、キットは抗体をさらに含む。
【０００６】
本発明の一態様では、ＦａｂおよびＦｃドメインを含む試験抗体を特徴づけるためのキットを提供する。キットは、試験抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、試験抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーと、を含む。第１の蛍光体および第２の蛍光体は、試験抗体に結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する。
【０００７】
本発明の別の態様では、ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を提供する。抗体は、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体はＦｃドメインのアミノ酸残基に付着している。
【０００８】
本発明の一態様では、抗体を特徴づけるためのキットが提供される。抗体はＦａｂドメインおよびＦｃドメインを含む。キットは、第１の蛍光体で標識された抗体と、第２の蛍光体で標識されたタンパク質またはアプタマーとを含む。タンパク質またはアプタマーが抗体に結合すると、第１および第２の蛍光体がＦＲＥＴに関与する。第１の蛍光体はＦａｂドメインのアミノ酸残基に付着しており、タンパク質もしくはアプタマーはＦｃドメインに結合するか、または、第１の蛍光体はＦｃドメインのアミノ酸残基に付着しており、タンパク質もしくはアプタマーはＦａｂドメインに結合する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、抗体と、第１および第２のタンパク質またはアプタマーとを含む組成物が提供される。抗体はＦａｂドメインおよびＦｃドメインを含む。抗体は、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体はＦｃ結合タンパク質またはアプタマーに付着している。
【００１０】
本発明の別の態様では、ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を含む組成物が提供される。抗体は、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂ結合タンパク質またはアプタマーに付着し、第２の蛍光体はＦｃドメインのアミノ酸に付着している。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、二重標識抗体を特徴づけるための方法が提供される。第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーおよび第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーを、特徴づけられる抗体と接触させて、三元複合体を形成させる。第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーはＦａｂドメインに結合し、第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーはＦｃドメインに結合する。第１および第２の蛍光体はＦＲＥＴに関与する。三元複合体の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が決定される。三元複合体を、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させる。ＴＩＰＳ因子の存在下での三元複合体のＦＲＥＴが決定される。ＴＩＰＳ因子は、既知または未知の場合がある。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、抗体を特徴づけるための方法を提供する。ＦａｂおよびＦｃドメインを含む二重標識抗体のＦＲＥＴが決定される。二重標識抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体はＦｃドメインのアミノ酸残基に付着している。二重標識抗体を、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させる。ＴＩＰＳ因子の存在下での二重標識抗体のＦＲＥＴが決定される。ＴＩＰＳ因子は、既知または未知の場合がある。
【００１３】
本発明の別の態様は、二重標識抗体を特徴づけるための方法である。ＦａｂおよびＦｃドメインを含む二重標識抗体のＦＲＥＴが決定される。二重標識抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂまたはＦｃドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体は他のドメインに結合するタンパク質またはアプタマーに付着している。二重標識抗体を、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）と接触させる。ＴＩＰＳ因子の存在下での二重標識抗体のＦＲＥＴが決定される。ＴＩＰＳ因子は、既知または未知の場合がある。
【００１４】
本発明の一態様では、ＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングするための方法を提供する。ＴＩＰＳ感受性抗体を、（ａ）ＴＩＰＳ感受性抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、（ｂ）ＴＩＰＳ感受性抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、および（ｃ）ＴＩＰＳ因子と接触させて、第１の複合体を形成させる。第１の複合体の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定する。ＴＩＰＳ感受性抗体を、（ａ）ＴＩＰＳ感受性抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、（ｂ）ＴＩＰＳ感受性抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、（ｃ）ＴＩＰＳ因子、および（ｄ）試験物質と接触させて、第２の複合体を形成させる。第２の複合体の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定する。
【００１５】
本発明の別の態様では、ＦａｂおよびＦｃドメインを含むＴＩＰＳ感受性抗体に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングするための方法を提供する。ＴＩＰＳ感受性抗体をＴＩＰＳ因子と接触させる。ＴＩＰＳ感受性抗体は、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体はＦｃドメインのアミノ酸残基に付着している。第１の複合体を形成させる。第１の複合体のＦＲＥＴを測定する。ＴＩＰＳ感受性抗体を、ＴＩＰＳ因子および試験物質と接触させて、第２の複合体を形成させる。第２の複合体のＦＲＥＴを測定する。
【００１６】
本発明の別の態様では、ＴＩＰＳ感受性抗体に対する腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の影響を軽減する能力について試験物質をスクリーニングするための方法が提供される。ＴＩＰＳ感受性抗体は、ＦＲＥＴに関与する第１および第２の蛍光体で標識されている。第１の蛍光体はＦａｂまたはＦｃドメインのアミノ酸残基に付着し、第２の蛍光体は他のドメインに結合しているタンパク質またはアプタマーに付着している。二重標識試験抗体を、ＴＩＰＳ因子と接触させて複合体を形成させる。ＴＩＰＳ感受性抗体は、ＦａｂドメインおよびＦｃドメインを含む。第１の複合体の抗体ＦＲＥＴを測定する。ＴＩＰＳ感受性抗体を、ＴＩＰＳ因子および試験物質と接触させて、第２の複合体を形成させる。第２の複合体のＦＲＥＴを測定する。
【００１７】
本発明のさらに１つの態様では、抗体を特徴づけるための、または抗体に結合するタンパク質またはアプタマーの対を特徴づけるための方法を提供する。抗体を、抗体のＦａｂドメインにおいて抗体に特異的に結合する第１のタンパク質またはアプタマーと接触させる。第１のタンパク質またはアプタマーは、抗体を固体支持体に連結するために、固体支持体に付着している。固体支持体に連結された抗体を、試験抗体のＦｃドメインにおいて試験抗体に特異的に結合する第２のタンパク質またはアプタマーと接触させる。第２のタンパク質またはアプタマーは検出可能な標識で標識されている。固体支持体に連結された検出可能な標識の量が決定される。固体支持体に連結された抗体を、腫瘍誘発性因子または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）の存在下で、試験抗体のＦｃドメインにおいて試験抗体に特異的に結合する第２のタンパク質またはアプタマーと接触させる。ＴＩＰＳ因子の存在下で固体支持体に連結された検出可能な標識の量が決定される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、ＦａｂおよびＦｃドメインを含む試験抗体を特徴づけるためのキットが提供される。キットには、試験抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１のタンパク質またはアプタマーが含まれている。第１のタンパク質またはアプタマーは、固体支持体に付着している。このキットには、試験抗体のＦｃドメインに特異的に結合する第２のタンパク質またはアプタマーも含まれている。第２のタンパク質またはアプタマーは検出可能な作用物質で標識されている。あるいは、第１のタンパク質またはアプタマーはＦｃドメインに結合し、第２のタンパク質またはアプタマーはＦｃドメインに結合する。
【００１９】
本発明の一態様では、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ因子）に対する抗体感受性のタンパク質またはアプタマープローブの適切な対を同定するための方法が提供される。タンパク質またはアプタマーの対は、抗体への結合について試験され、対の両方のメンバーが同時に結合できることを決定する。抗体に同時に結合するタンパク質またはアプタマーの対は、抗体の同種抗原への抗体の結合について試験される。対またはタンパク質またはアプタマーの存在下および非存在下での、抗体への同種抗原の同等の結合が決定される。
【００２０】
本発明の追加の態様では、抗体のＦａｂドメインに特異的に結合する第１の蛍光体標識タンパク質またはアプタマー、および抗体のＦｃドメインに特異的に結合して二重標識抗体を形成させる第２の蛍光体標識タンパク質またはアプタマーを含む、組成物が提供される。第１の蛍光体および第２の蛍光体は、抗体に結合すると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する。１つのタンパク質またはアプタマーはプロテインＡであり得、１つはプロテインＬであり得る。あるいは、１つはプロテインＡであり得、１つは抗体が結合する同種抗原であり得る。抗体は組成物中に存在し得る。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、抗体、抗体のＦａｂドメインにおいて抗体に結合する第１のタンパク質またはアプタマー、および試験抗体のＦｃドメインにおいて試験抗体に結合する第２のタンパク質またはアプタマーを含む組成物が提供される。第１のタンパク質またはアプタマーは、固体支持体に付着している。第２のタンパク質またはアプタマーは検出可能な標識で標識されている。あるいは、第１のタンパク質またはアプタマーは抗体にＦｃドメインにおいて結合しており、第２のタンパク質またはアプタマーは抗体のＦａｂドメインに結合する。
【００２２】
本明細書を読めば当業者に明らかとなる本発明のこれらおよび他の態様は、抗癌抗体の有効性ならびに抗癌治療の有効性を一般に改善するのに使用するための方法、組成物、およびキットを当業者に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】定常状態およびＴＩＰＳ因子の存在下での抗体の動的構造を監視するためのＦａｂ／Ｎ末端およびＦｃ／Ｃ末端ドメイン対プローブセットのおおよその位置の模式図。この図は、抗体結合タンパク質であるプロテインＬ（ＰＬ）、プロテインＡ（ＰＡ）、プロテインＧ（ＰＧ）；Ｆｃ受容体（ＦｃＲまたはＦｃＲｎ）；Ｃ１ｑ補体開始タンパク質（Ｃ１ｑ）；抗Ｆａｂ（αＦａｂ）および抗Ｆｃ（αＦｃ）アプタマー；抗Ｆａｂ（αＦａｂ）および抗Ｆｃ（αＦｃ）抗体および抗体断片；ならびに抗体特異的標的抗原（抗原）が結合するおおよその領域、または蛍光体がＦａｂおよび／もしくはＦｃ領域内のアミノ酸（ａａ）残基に直接コンジュゲートして、二重標識試験抗体を生成することができるおおよその領域、を示している。異なる色調は、蛍光体１および蛍光体２を表す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ．ＣＤ２０抗原またはリツキシマブ結合エピトープを含むペプチドに結合できるヒト齧歯類キメラ抗体であるリツキシマブを使用したＥＬＩＳＡによる相補的ＦａｂおよびＦｃ対の同定（Ｒｅｆｆ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５−４４５，１９９４）。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＣＤ２０ペプチド（図２Ａ）、プロテインＬ（図２Ｂ）、またはタンパク質もしくはペプチドなしでコーティングし、リツキシマブ、非結合対照ヒトＩｇＧ１、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とインキュベートし、ビオチン化プロテインＧ、ビオチン化ヒトＦＣＧＲ１Ａ、またはビオチン化ヒトＦＣＧＲ３Ａでプローブし、二次的にＳＴＲＰ−ＨＲＰでプローブする。結果は、試験抗体への二重結合に対しプローブが有し得る適合性の例を示している。
【図３】二重標識試験抗体およびプローブ選択に対するＴＩＰＳ因子の影響。ＥＬＩＳＡプレートをＣＤ２０ペプチド（左のバーセット）、プロテインＬ（中央のバーセット）またはＢＳＡ（右のバーセット）でコーティングし、ＣＡ１２５  ＴＩＰＳ因子とともにもしくはなしで、緩衝液（なし）、プロテインＧ−ビオチン、ＦＣＧＲ１Ａ−ビオチンまたはＦＣＧＲ３Ａ−ビオチンでプローブした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰで二次的にプローブした。示されるように、ＣＡ１２５  ＴＩＰＳ因子は、ＣＤ２０抗原およびプロテインＬ捕捉プレートの両方でＦｃドメインプローブＦＣＧＲ３Ａ−ビオチンの結合を抑制したが、プロテインＧ−ビオチンもＦＣＧＲ１Ａ−ビオチンも影響を受けず、後者の２つのセットが、ＦＣＧＲ３Ａがそうではないのに、ＴＩＰＳ因子の存在下で二重標識試験抗体の動的構造を監視するのに適切であることがいかに発見されたかの例を示し、提供する。
【図４】図４Ａ〜４Ｂ．共有結合的に連結した抗ＦａｂＡＦ４８８および抗ＦｃＡＦ５５５抗体でそれぞれ標識されたＦａｂおよびＦｃドメインへの相補的プローブを有する二重標識試験抗体に対するＴＩＰＳ因子の効果。簡単に説明すると、二重標識試験抗体をＴＩＰＳ因子または対照タンパク質とインキュベートし、相補的なＡＦ４８８蛍光体とＡＦ５５５蛍光体の間のエネルギー交換を介して抗体の動的構造への影響を試験し、ＦＲＥＴを介して捕捉する。図４Ａは、使用した二重標識試験抗体のフルオログラムを示す。図４Ｂは、ＴＩＰＳ因子および対照タンパク質の存在下で一緒に添加された、共有結合的に連結した二重標識試験抗体または共有結合的に連結した単一標識抗ＦａｂＡＦ４８８および抗ＦｃＡＦ４８８試験抗体に対する１０ｎｇ／ｍＬのＴＩＰＳ因子ＣＡ１２５または対照ＨＳＡタンパク質の効果を示す。Ｐ＜０．００３
【図５】図５Ａ〜５Ｃ．Ｎ末端でプロテインＬ−ＡＦ５５５（ＰＬ５５５）プローブに共有結合的に連結した二重標識試験抗体および同じ試験抗体のＣ末端に共有結合的に連結したプロテインＡ−ＡＦ４８８（ＰＡ４８８）プローブに対するＴＩＰＳ因子の影響。簡単に説明すると、二重標識試験抗体をＴＩＰＳ因子または対照タンパク質とインキュベートし、相補的なＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｓ  ＡＦ４８８とＡＦ５５５の間のエネルギー交換を介して抗体の動的構造への影響を試験し、ＦＲＥＴを介して捕捉する。図５Ａは、ＡＦ５５５標識プロテインＬのフルオログラム（左）、および非標識（左）またはＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ標識（右）プロテインＬ（ＰＬ）およびプロテインＡ（ＰＡ）タンパク質を含む変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図５Ｂは、それぞれ４８８および５５５ｎｍに蛍光対ピークを有するＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ分光光度法／蛍光光度法を介してＰＡ４８８およびＰＬ５５５に共有結合的に連結した精製二重標識試験抗体を示す。図５Ｃは、共有結合的に連結した二重標識試験抗体または共有結合的に連結したＰＬ５５５もしくはＰＡ４８８単一標識試験抗体のみ、またはＴＩＰＳ因子もしくは対照タンパク質の存在下で一緒に添加した場合、に対する１０ｎｇ／ｍＬのＴＩＰＳ因子ＣＡ１２５または対照ＨＳＡタンパク質の効果を示す。これらのデータは、ＴＩＰＳ因子の存在下では増強されたシグナルを放出するが、対照タンパク質でも、または試験プローブが単一標識フォーマットの場合でも放出しない、二重標識試験抗体の能力を示している。Ｐ＜０．００６
【図６】図６Ａ〜６Ｄ．ＦａｂドメインでのＡＦ５５５およびＡＦ４８８蛍光体標識Ｆｃドメイン結合プローブでアミノ酸残基を直接標識した二重標識試験抗体に対するＴＩＰＳ因子の影響。簡単に説明すると、二重標識試験抗体をＴＩＰＳ因子または対照タンパク質とインキュベートし、相補的蛍光体間のエネルギー交換を介して抗体の動的構造への影響を試験し、ＦＲＥＴを介して捕捉する。図６Ａは、ＮａＮ３で処理したＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯビオチン標識抗体はＳＴＲＰ−ＨＲＰに結合し、ＮａＮ３で処理したＲＴＸ−ＷＴ−ＤＢＣＯビオチンまたは未処理抗体はＳＴＲＰ−ＨＲＰによって結合しなかったことを示すＥＬＩＳＡである。ポリリジンビオチン標識ＲＴＸ−１６９（ＲＴＸ−１６９−Ｂｉｏ  ｆｕｌｌ）は、ＳＴＲＰ−ＨＲＰ結合の陽性対照として機能した。図６Ｂは、ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンが、結合していないＣＹＳ１６９が存在するＦａｂドメインで標識されたことを示している。簡単に説明すると、ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンをパパイン消化し、精製し、ＦａｂおよびＦｃドメインを未変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ウエスタンブロットによりＳＴＲＰ−ＨＲＰ−ビオチン結合を試験した。示されるように、ＳＴＲＰ−ＨＲＰは、ＤＢＣＯビオチンのＦａｂドメインへのＮａＮ３を介したクリックケミストリーコンジュゲートの成功を示す、Ｆａｂ断片にのみ結合した。全長ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンおよびＲＴＸ−１６９非標識抗体は、それぞれ陽性対照および陰性対照として機能した。膜の染色は、等量のＦａｂおよびＦｃフラグメントを示した（示さず）。ＭＷは分子量マーカーをｋＤａで表す。図６Ｃは、使用した二重標識ＲＴＸ−１６９試験抗体のフルオログラムを示しており、これにより、ＡＦ５５５はリツキシマブのＮ末端領域（配列番号２６および２７）内の変異ＣＹＳ  １６９残基にコンジュゲートし、ＰＡ４８８のＣ末端へのコンジュゲーションを介して二重標識される。図６Ｄは、試験タンパク質の存在下で一緒に添加した場合の、二重標識された試験抗体またはＡＦ５５５で単一標識された試験抗体およびＰＡ４８８で標識された別個の試験プローブに対する１０ｎｇ／ｍＬのＴＩＰＳ因子ＣＡ１２５または対照ＨＳＡタンパク質の効果を示し、これにより、ＴＩＰＳ因子は二重標識試験抗体の放出を刺激したが、対照は刺激しなかった。Ｐ＜０．００８
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明者らは、体液性媒介療法が利用可能である癌および他の疾患を治療するための改良された抗体の開発に有用な方法、試薬、および組成物を開発した。特定の理論または作用メカニズムに限定されることを望まないが、出願人は、特定の腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ）が抗体に結合し、それらが同種抗原に結合できなくなるまたは体液性免疫システムの他の要素と会合できなくなるようにそれらの構造を変化させると考えている。これらの破壊には、タンパク質−抗体ＦｃＲ−Ａｂ結合（ナチュラルキラー（ＮＫ）、マクロファージ、単球などの免疫エフェクター細胞における抗体−Ｆｃ受容体）および／またはＣ１ｑ−Ａｂ（古典的な抗体補体複合体）ならびにその後のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ（抗体標的抗原結合および／または代替補体媒介性殺傷）活性の抑制；ＳＩＧＬＥＣＳ（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）受容体を介したＡｂ−ＦｃＲ会合時のエフェクター細胞活性化の抑制；および代替補体経路認識タンパク質結合の抑制、を含み得る。
【００２５】
抗原またはＴＩＰＳ因子への抗体の結合を測定するために以下に教示および記載されるアッセイでは、任意の検出可能な標識を使用することができる。多くの場合、蛍光標識が便利である。また、酵素、比色、強力な結合対、および放射性核（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅａｒ）の標識または作用物質も有用である。検出可能な標識は、すぐに表示または検出できる場合がある。あるいは、検出を開発するために他の試薬の追加が必要になる場合がある。例えば、標識は、直接検出される産物を作製するために特定の基質を必要とする酵素であり得る。それにもかかわらず、ここで言及されるように、酵素自体は、特定の基質による処理によって容易に検出され得るので、検出可能な標識である。同様に、直接標識された結合パートナーが追加された場合にのみ実際に検出される強力な結合対のメンバーを使用することができる。ビオチン−ストレプトアビジンは、このような強力な結合対の多くの例のうちの１つにすぎない。
【００２６】
方法、組成物、およびキットのいくつかは、３つのカテゴリーに分類することができる。１つのカテゴリーでは、抗体、例えば、抗癌抗体は、２つの共有結合的に付着する蛍光体を使用して直接標識される。１つの蛍光体はＦａｂまたはＮ末端ドメインに付着し、もう１つはＦｃまたはＣ末端ドメインに付着する。２つの蛍光体はＦＲＥＴに関与する。第２のカテゴリーでは、抗体、例えば、抗癌抗体は、抗体に特異的に結合する２つのタンパク質またはアプタマーによって結合される。タンパク質またはアプタマーは、ＦＲＥＴに関与する一対の蛍光体で標識されている。第３のカテゴリーでは、１つのタンパク質またはアプタマーが使用され、抗体は、相補的な蛍光体に連結できる一次アミノ酸配列に操作された固有のアミノ酸を有することができる（図６を参照）。全てのカテゴリーで、タンパク質もしくはアプタマーに、または抗体に直接付着しているかどうかにかかわらず、２つの蛍光体間で発生するＦＲＥＴ発光の変化は、抗体分子の２つの部分の関係の変化を示す。このような変化は、抗癌抗体に対するＴＩＰＳ因子の効果を検出および／または測定するために使用することができる。同様に、同種抗原（標的抗原とも呼ばれる）に結合したときの抗体の変化を測定するために使用できる。発光の変化は、発光の強度の変化として決定できる。通常、変化は、抗体構造の変化を引き起こさない対照を使用して発生する量よりも多い場合に決定される。
【００２７】
ヒト抗体のＦｃドメインに結合するために使用できるタンパク質の例は、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒトＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＧＲＴ、ＦＣＲＬ５、マウスＦＣＧＲ４、およびヒトＣ１ｑである。抗体のＦａｂドメインに結合するために使用できるタンパク質はプロテインＬまたは抗体の自然抗原である。試験抗体のＦａｂまたはＦｃドメインに対して産生された抗体も、ドメイン特異的タンパク質プローブの例である。
【００２８】
抗癌抗体は、治療される患者から収集される抗体、別の患者から収集される抗体、または他の手段によって実験室で作製される抗体であり得る。患者の抗体は、使用前に様々な手段によって改変され得る。本発明の方法を使用して分析することができる特定の市販または実験的抗癌抗体には、リツキシマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、セツキシマブ、ＹＰ２１９、オクレリズマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、アレムツズマブ、ネシツムマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、サシツズマブゴビテカン（ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ  ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、ブレンツキシマブベドチンおよびトシツモマブが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
図３に示されるように、抗体に結合する望ましい一対のタンパク質またはアプタマーは、望ましくは、抗原の存在下で抗体に結合し、結合したままである。さらに、タンパク質またはアプタマーの望ましい対はまた、ＴＩＰＳ因子の存在下で抗体に結合し、かつ結合したままである。これは、当業者に知られている架橋剤の使用の有無にかかわらず達成することができる。
【００３０】
二重標識抗体または抗体に結合するタンパク質もしくはアプタマーの対が適切に同定されると、それらを使用して、ＴＩＰＳ因子の存在によって動的構造が変化する抗体を同定することができる。このような抗体は、ＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）と呼ばれる。これらの成分を配置すると、例えば天然もしくは合成、純粋な化合物もしくは混合物、または天然抽出物などを問わない、１つ以上の物質を試験して、ＴＩＰＳ因子によって誘発される抗体の変化を軽減、改善、または逆転させる物質を同定できる。試験物質は、例えば、市販されているコレクションまたはライブラリーに含まれている場合がある。
【００３１】
本発明の組成物は、方法を実施する過程で形成させることができる。それらは、例えば、事前に形成され得、パッケージ化され得、スクリーニングする物質ライブラリーを有する実体に提供され得る。同様に、ここで記載するアッセイおよび方法の構成要素は、一緒に容器にパッケージ化され、キットとして販売され得る。キットの構成要素は必須ではないが、一緒に混合することができる。それらは、例えば、別々の容器または分割された容器で提供することができる。本明細書に記載の抗体、抗体に結合するタンパク質またはアプタマーの対、標識抗体、ＴＩＰＳ因子、緩衝液、固体支持体、および標識の、任意の選択は、組成物またはキットとして形成され得る。
【００３２】
潜在的に多くのＴＩＰＳ因子のうちの１つに、例えばＣＡ１２５に、感受性のあるいくつかの抗体が知られているが、これらの因子および、動的構造が変化してこれらの効果に対する体液性免疫および薬理活性が抑制されるＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）を同定できる技術は依然として必要とされている。
【００３３】
抗体またはタンパク質の「動的構造」は、所与の時点での抗体の三次元構造として定義され、そのような時点は、別のタンパク質または作用物質との当該抗体の会合と一致し、この時点の前の当該抗体の構造は、抗体が別のタンパク質または作用物質と会合したことに応じて、この時点以降、別の構造に変化している。抗体に結合し、その動的構造に影響を与えるＴＩＰＳ因子（タンパク質または非タンパク質）の効果は、ハプテンが抗体のＣＤＲドメインに結合し、それらのＦｃドメインをアロステリックに変化させ、それによってＦｃ受容体とのその会合を低減させる場合が報告されている（Ｊａｎｄａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：２２，２０１６）。以前の研究では、（Ｆａｂ’）２ドメインの動的構造は、抗体がその抗原に結合したときに影響を受けることも示されている（Ｗｅｒｎｅｒ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６９：７９５−７９９，１９７２）。最近では、Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌが、いくつかのヒト化モノクローナルＩｇＧ１型抗体は類似のアミノ酸構造を持っているが、ＣＡ１２５などのＴＩＰＳ因子がそれらに結合する能力に大きな違いがあることを報告し、一次構造または二次構造のいずれかがＴＩＰＳ因子−抗体結合を決定する可能性があることを示唆している（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ  ８：５２０４５−５２０６０，２０１７）。腫瘍が宿主の免疫防御を回避するために様々な経路を利用するという証拠が増えていること、および抗体ベースのアプローチが様々な種類の癌に対して追求され続けているという事実に照らして、ここで説明するような、体液性免疫メカニズムおよび／または他の機能との関与に影響を与える可能性のある構造的な動的変化をもたらす可能性のあるＴＩＰＳ因子結合に感受性がある抗体を決定する方法を定義することが重要である。これらの方法は、次に、ＴＩＰＳ因子抑制効果に対する耐性および／または患者スクリーニングのための当該ＴＩＰＳ因子を同定する手段に基づいて、抗体ライブラリーからのリード抗体（ｌｅａｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の選択を可能にする。例えば、試験抗体が１つ以上のＴＩＰＳ因子によって影響を受けることが見出された場合、特定のＴＩＰＳ因子を発現する患者の治療を回避するために患者を事前にスクリーニングすることができる。完全な開発の前に、薬剤開発計画の一部として特定のＴＩＰＳ因子の存在について患者試料をスクリーニングするために、任意の前臨床段階の抗体を使用でき、これにより、ＴＳＡである可能性のある抗体の開発に必要な費用のかかる投資を回避する開発者の時間を節約する。
【００３４】
抗体の動的構造に影響を与え、その標的細胞表面の標的抗原に結合するとその下流の免疫エフェクター機能（複数可）および／または細胞内在化を抑制する可能性のある既知および未知のＴＩＰＳ因子の存在下で抗体の動的構造をスクリーニングするためのプローブ、キット、および方法を提供する。この方法は一致したまたは相補的プローブを構成するおよび使用するステップを含み、このプローブは所与の試験抗体のＮ末端またはＦａｂドメインおよびＣ末端またはＦｃドメインに同時に結合することができ、その天然の標的抗原に結合する抗体の能力に影響を及ぼさず、腫瘍膜に由来するＴＩＰＳ因子の存在下でおよび／または可溶性因子として、抗体単独と比較して当該プローブの空間距離の変化を決定できるようにフォーマットされ得る。プローブ（または「作用物質」）は、抗体のＮ末端およびＣ末端に結合することが知られているプロテインＬおよびプロテインＡまたはＧなどの標識された抗体結合タンパク質を含み得る。プローブには、試験抗体のＮ末端およびＣ末端に特異的に結合する標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および／またはアプタマーを含めることもできる。プローブはまた、Ｃ末端プローブ（Ｆｃ−ガンマ受容体またはＣ１ｑなどの天然のＦｃ結合タンパク質である場合もそうでない場合もある）と併用して使用した場合に、抗体の動的構造を単独で、またはＴＩＰＳ結合因子の存在下で定義できる、標識修飾された抗体特異的抗原を含むことができる。これらの因子は、試験抗体に対してコンジュゲートフォーマットまたは非コンジュゲートフォーマットで使用できる。最後に、プローブは、図６に示すように、可溶性または膜結合型ＴＩＰＳ因子の存在下で試験抗体の動的構造を監視することができるアクセプター−ドナープローブによる当該抗体の部位特異的標識をサポートするようにＮ末端およびＣ末端残基が修飾されている抗体であり得る。
【００３５】
図１にプローブとそのおおよその結合領域の概略例を提示する。コンジュゲートされた対の色素または蛍光体を含むプローブを使用して、試験抗体のＮ末端およびＣ末端の空間距離を測定することができる。これらのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析で使用でき、これにより、１つのプローブからの励起状態のフルオロフォア（ドナー）が、双極子−双極子相互作用を介して相補的プローブの隣接するフルオロフォア（アクセプター）にエネルギーを伝達し、オングストローム距離での試験抗体のＮ末端とＣ末端の分子的近接性を測定できるようにする。試験抗体単独と試験抗体＋ＴＩＰＳ因子の間のシグナルの増加または減少は、試験抗体の動的構造および機能の結合および摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を示唆している。
【００３６】
試験抗体のＮ末端とＣ末端との間の距離変化の関数として抗体の動的状態を測定するための１つの方法では、抗体は最初に、抗体に同時に結合することができ、試験抗体のその抗原への結合に影響を与えることも試験抗体へのその結合時にプローブがＴＩＰＳ因子によって置き換えられることもない、対のプローブ（検出可能な作用物質で標識されたまたは非標識の）とともにインキュベートされる。これは、ＥＬＩＳＡを含むサンドイッチフォーマットでプローブを測定できる任意の方法で実現できる。次に、そのような対のプローブを検出物質（蛍光体、酵素、放射性核種などであるがこれらに限定されない）で標識して、可溶性または膜結合型ＴＩＰＳを有する溶液中の抗体と比較して、溶液のみの中の当該試験抗体のＮ末端およびＣ末端距離を効果的に監視することができる。いくつかの態様では、プローブは、以下を含む抗体結合タンパク質またはその誘導体を含む：
（ａ）プロテインＬ（配列番号１）、Ｆａｂ特異的抗体または抗体断片、または試験抗体の特異的抗原を含むＮ末端（Ｆａｂドメイン）結合タンパク質または誘導体：
（ｂ）プロテインＡ（配列番号２）、プロテインＧ（配列番号３）、Ｆｃ特異的抗体または抗体断片を含むＣ末端（Ｆｃドメイン）結合タンパク質または誘導体：
（ｃ）免疫グロブリンＦｃ受容体（Ｆｃドメインを結合）であるヒトＦＣＧＲ１Ａ（配列番号４）、ＦＣＧＲ２Ａ（配列番号５）、ＦＣＧＲ２Ｂ（配列番号６）、ＦＣＧＲ２Ｃ（配列番号７）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８）、ＦＣＧＲ３Ｂ（配列番号９）、ＦＣＧＲＴ（配列番号ＮＯ：１０）、ＦＣＲＬ５（配列番号１１）、マウスＦＣＧＲ４（配列番号１２）、ヒトＣ１ｑ（配列番号１３）および／またはそれらの誘導体。
【００３７】
対のプローブは、抗体のＮ末端およびＣ末端に特異的かつ同時に結合することができ、その抗原に結合する試験抗体に影響を及ぼさないアプタマー対を含むことができ、そこで当該アプタマーがドナーおよびアクセプター検出物質（すなわち、フルオロフォア（蛍光体）、酵素、放射性核種など）で標識され、試験抗体に単独で、または潜在的に可溶性もしくは膜ＴＩＰＳ因子の存在下で、結合する場合、Ｎ末端およびＣ末端の近接性について試験される。結合し、相補的プローブの空間距離に「影響を与える」ＴＩＰＳ因子は、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および細胞内在化または試験抗体の抗原結合を含む薬理学的（ＰＬ）抑制を含む体液性応答（複数可）の抑制を課す潜在的因子として同定される。「影響を与える」という用語は、一般に、ＴＩＰＳ因子を有する抗体と比較して、試験抗体のみとインキュベートした場合の対のプローブのシグナルの８％以上の変化を指す。使用される抗体およびプローブに応じて、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％の変化を指す場合もある。
【００３８】
組成物および方法のいくつかの態様では、対のプローブに連結したドナーおよびアクセプター検出物質は、以下のＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）を含む：
2022501444.tif 000003
【００３９】
方法の他の態様では、ドナーおよびアクセプター検出物質は、蛍光体を含む：
2022501444.tif 000004
【００４０】
ＦａｂおよびＦｃドメインを含む抗体を試験するための対のプローブをスクリーニングする方法は、以下の能力についてプローブを試験することを含み得る。（１）試験抗体に結合する能力、およびその標的抗原に結合する当該抗体の能力に影響を及ぼさない能力、ならびに（２）既知の候補または未知のＴＩＰＳ因子の存在下で、両方のプローブが試験抗体に結合したままでいる能力。次に、これらの仕様を満たすプローブ対を、既知または未知のＴＩＰＳの存在下で抗体の動的構造を測定できる検出物質で標識することができる。
【００４１】
二重特異性（ＢＳＰ）抗体は、ＰＫ、ＰＤ、および／またはＰＬ活性を変化させる可能性のある可溶性もしくは膜結合型ＴＩＰＳ因子の影響を受ける可能性がある抗体についてスクリーニングでき、これには試験抗体の標的抗原（複数）の一方または両方に結合できないことも含まれる。ＢＳＰは、Ｎ末端およびＣ末端の対プローブでプローブして、可溶性もしくは膜結合型ＴＩＰＳ因子の存在下または非存在下で動的構造を試験することができる。ＢＳＰ試験抗体特異的抗原は、アクセプター／ドナー検出物質（すなわち、蛍光体、酵素、放射性核種など）で標識され得、動的構造は、可溶性または膜ＴＩＰＳの存在下または非存在下で抗原結合ＢＳＰに対して試験され得る。次に、「影響を受けた」ものを、結合ＴＩＰＳ因子の存在下で、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および薬理学的（ＰＬ）活性について試験することができる。
【００４２】
ＰＫ、ＰＤ、またはＰＬ活性を変化させる可能性のある可溶性または膜結合型ＴＩＰＳ因子の影響を受ける可能性のある抗体薬物複合体（ＡＤＣ）をスクリーニングする方法には、細胞内在化が含まれる。ＡＤＣは、Ｎ末端およびＣ末端プローブでプローブして、可溶性または膜結合型ＴＩＰＳの存在下または非存在下で動的構造を試験することができる。次に、「影響を受けた」ものを、結合しているＴＩＰＳ因子の存在下での細胞内在化を含む、ＰＫ、ＰＤ、およびＰＬ活性について試験することができる。
【００４３】
標識された対のプローブは、架橋剤の存在下で試験抗体に添加され得る。
【００４４】
プロテインＬは、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ５５５にコンジュゲートでき、ＡＦ４８８にコンジュゲートしたプロテインＡと組み合わせて使用できる。
【００４５】
操作されたリツキシマブ（配列番号２６および２７）は、そのＦａｂドメインに対になっていないシステインを有するように生成されて、ＡＦ５５５を含むがこれに限定されない蛍光体を直接コンジュゲートするために使用され得る。次に、操作された抗体を、ＡＦ４８８で標識されたプロテインＡにコンジュゲートさせ、ＴＩＰＳ因子の試験抗体への結合を監視するために使用することができる。
【００４６】
記述に含まれる態様に関連する様々な用語および用語法（「用語」）が、本書の明細書および特許請求の範囲全体で使用されている。そのような用語は、特に明記しない限り、当技術分野においてそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、提供された定義と一致する方法で解釈されるべきである。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単数形はまた、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。「プローブ」への言及は、当業者によって知られている任意の分析方法を介して２つのプローブ間の距離を測定することができる一対の相補的プローブの組み合わせを含み得る。同様に、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含み得る。
【００４８】
量、期間、分子距離などの定量化された値を指すときに使用される「約」という用語は、開示された方法を実行するために変動が適切であるため、指定された値から最大±８％の変動を包含することを意味する。特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される分子量、モル濃度、反応条件、分子距離などの試薬の量を表す全ての値は、全ての場合において「約」という用語によって定量化されると理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、以下の明細書および記載された特許請求の範囲に記載の数値は、本発明によって得られることが求められる組成物質の所望の特性および／または方法に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値は、報告された有効数字によって、および当業者に知られている通常の丸め方法によって少なくとも評価されるべきである。
【００４９】
使用される「抗体」（「Ａｂ」とも呼ばれる）という用語は、広い意味で意味され、免疫グロブリン（「Ｉｇ」とも呼ばれる）、またはポリクローナル抗体（ｐＡｂとも呼ばれる）、マウス、ラット、サル、ヒト、ヒト化およびキメラ化ｍＡｂを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂとも呼ばれる）、二重特異性抗体（ＢＳＰとも呼ばれる）、抗体薬物複合体（ＡＤＣとも呼ばれる）、抗体融合免疫毒素および抗体断片を含む抗体分子を含む。一般に、抗体は特定の抗原に結合するタンパク質またはポリペプチド鎖である。抗原は、特定の抗体によって特異的に認識される構造である。標準的な抗体は、ジスルフィド結合と水素結合の複合体を介して裏打ちされた２つの軽鎖と２つの重鎖で構成されるヘテロテトラマーグリコシル化タンパク質で構成されている。各重鎖には、可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）と、それに続くいくつかの定常ドメイン（Ｆｃドメインと呼ばれる）がある。各軽鎖には、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメインがあり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖ＶＬは重鎖の可変ドメインと整列する。任意の種の抗体軽鎖は、定常ドメイン内のアミノ酸配列、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）に基づいて、２つの異なるタイプのうちの１つに割り当てられる。本明細書に含まれる組成物の場合、軽鎖への言及はいずれかのサブタイプを含む。
【００５０】
免疫グロブリンは、Ｆｃドメインのタイプ、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに応じて、クラスまたはアイソタイプに分類され、これらは、重鎖定常ドメイン内に含まれる配列に依存する。ＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらにサブクラスで構成される。本明細書に含まれる組成物の場合、重鎖への言及は任意のサブタイプを含む。
【００５１】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、報告されているように配列の変動性に基づいて「抗原結合部位」とも呼ばれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって中断される「フレームワーク」領域で構成される（Ｗｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−２５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は６つのＣＤＲで構成され、３つは可変重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）内にあり、３つは可変軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）内にある（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．５ｔｈ  Ｅｄ．ＰＨＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。
【００５２】
抗原結合または抗体結合断片は、特定の抗原に対して結合親和性を示す可能性のある任意の構造である。一部の断片は、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する抗体の部分で構成されている。場合によっては、断片は、特定の抗原に結合することが知られている抗体の少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）または１つ以上のＣＤＲを含み得、これは別の抗原の可変領域と複合体を形成し得、一本鎖フォーマットのままにするか、標的抗原への結合を保持するペプチドとしてフォーマットされる。断片の例には、二重特異性、ダイアボディおよび一本鎖分子、ならびにＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｃ、および一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖またはＣＤＲ間のキメラ融合、および他のタンパク質、タンパク質足場、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、１つの重鎖および１つの軽鎖からなるダイマーなどが含まれるが、これらに限定されない。任意の抗体アイソタイプを使用して、抗体または抗原結合断片を生成することができる。さらに、断片は、フィブロネクチンおよびコラーゲンを含む接着型タンパク質に由来するタンパク質足場など、目的の所与の抗原に対する親和性を与える方向でポリペプチドセグメントを首尾よく組み込むことができるフレームワークからなる非抗体タンパク質を含み得る。抗原結合断片は、アプタマーなどの非タンパク質足場を含み得る。アプタマーは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸、または非古典的ヌクレオチドを有する核酸を含み得る。「その抗原結合断片」という句は、所与の抗原結合断片が、その句で言及される抗体結合断片の１つ以上の抗原結合セグメントを組み込むことを示すために使用され得る。抗体断片は、「プローブ」と呼ばれることもある。
【００５３】
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体、抗体断片、抗原結合断片、またはアプタマーが、他の抗原よりも高い親和性で抗原（抗体自体に含有される配列を含む）に結合することを指す。典型的には、特定の抗体、抗原結合断片またはアプタマーは、約９×１０−８Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで標的抗原に結合する。
【００５４】
「抗体誘導体」は、ペプチド化学（すなわち、アミド化など）、化学的コンジュゲーション、遺伝子融合、および／または通常は抗体に関連しない翻訳後部分（すなわち、グリコシル、アセチルおよび／またはホスホリル）などを介して、別の分子の共有結合によって修飾される、上記で定義される抗体を意味する。
【００５５】
「抗体の動的構造」という用語は、抗体に付着している２つのプローブ（すなわち、抗体結合タンパク質（プロテインＬ、Ａ、Ｇなど；アプタマー；天然の哺乳類結合タンパク質（すなわち、Ｆｃ受容体、Ｃ１ｑなど）；ＦａｂおよびＦｃ結合抗体；ハプテン；および／または抗体特異的抗原）のシグナルに影響を与える可能性のある任意の構造の変化を指す。
【００５６】
「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、真核生物または原核生物の細胞クローン、またはファージクローンを含む単一の細胞クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されず、組換え法も含み得る。
【００５７】
「Ｆａｂドメイン」は、当業者に知られている、抗体ヒンジジスルフィド領域のＮ末端の任意の抗体配列を指す。
【００５８】
「Ｆｃドメイン」は、当業者に知られている、抗体ヒンジジスルフィド領域のＣ末端にある任意の抗体配列を指す。
【００５９】
「抗原」は、抗体、抗体断片またはアプタマーが特異的に結合する実体である。これには、当該目的の抗体またはタンパク質への結合が含まれる。
【００６０】
「腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳまたはＴＩＰＳ因子）」という用語は、調節不全細胞によって直接産生されるか、または調節不全の悪性細胞によって正常細胞から誘導される任意のタンパク質または非タンパク質因子を指す。ＣＡ１２５タンパク質は、卵巣癌や中皮腫などの調節不全細胞によって産生され（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：１８７２−１８８２，２０１８）、正常な周囲の上皮細胞からのリンパ腫によって誘導されることが報告されている（Ｓａｎｕｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｉｔ  Ｄｉａｌ  Ｉｎｔ．２１：４９５−５００，２００１）。
【００６１】
「調節不全細胞」という用語は、通常の対応物とは異なる機能を果たす任意の細胞を指す。これには、病原体による形質転換細胞や腫瘍由来の悪性細胞が含まれる。
【００６２】
「ＴＩＰＳ阻害剤」という用語は、腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子および／または調節不全細胞からの因子が試験抗体に結合するのを阻止することができる任意のタンパク質または非タンパク質作用物質を指す。
【００６３】
「試験抗体」という用語は、２つのプローブが一方はＦａｂドメインに、他方はＦｃドメインに付着し、試験抗体がＴＩＰＳ因子によって結合され、その動的構造に影響を与えるかどうかを決定するためにスクリーニングされた抗体を指す。
【００６４】
「ＣＡ１２５」という用語は、ＭＵＣ１６遺伝子（ＨＧＮＣ：１５５８２、ＯＭＩＭ：６０６１５４）によって産生されるＴＩＰＳ遺伝子産物を指し、可溶性および膜結合型で見られる。抗体に結合し、結合した抗体の体液性免疫機能に影響を与えることが報告されている（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８：５２０４５−５２０６０，２０１７）。
【００６５】
「未知のＴＩＰＳ」という用語は、抗体、ＢＳＰ、またはＡＤＣに結合することが知られていない、またはスクリーニング時に組成が不明であるＴＩＰＳを指す。
【００６６】
「癌」、「悪性」、および「腫瘍」という用語は当技術分野でよく知られており、同様の起源の正常な細胞型とは異なる調節不全の細胞増殖および形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。悪性とは、病的状態および／または死亡を引き起こす可能性のある癌細胞を指す。使用される場合、「癌および腫瘍」には、前癌性および悪性のタイプが含まれる。
【００６７】
使用される場合、「可溶性」という用語は、細胞の細胞膜に付着していないタンパク質または非タンパク質作用物質を指す。例えば、可溶性の作用物質は、正常な、調節不全の、または癌性の細胞から、血清、全血、血漿、尿、または腫瘍の微小流体を含む生体液に放出、分泌、または輸出され得る。
【００６８】
試験抗体の結合物質（「プローブ」とも呼ばれる）に関する「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブに結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブ（蛍光体、酵素、放射性核種などであるがこれらに限定されない）の直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブの間接標識によるものを包含することを意図している。間接標識の例には、当該プローブに特異的な抗体またはアプタマーを含み得る二次蛍光標識プローブを介した一次プローブの検出が含まれる。一次または二次プローブは、放射性核種、発色団、フルオロフォア、または酵素を介して標識することができる。プローブまたは二次プローブは、抗体誘導体、抗体断片、標的特異的結合が可能なタンパク質足場、またはタンパク質リガンド（例えば、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンのリガンド）で標識されたアプタマーであり得る。
【００６９】
「検出物質」または「検出可能な作用物質」という用語は、タンパク質に、アプタマーを含むタンパク質結合物質に、連結することができる、ならびにこの分野で一般的に使用されるデバイスを介して検出することができる、任意の作用物質を指す。これらには、濃度測定、分光光度法、発光、顕微鏡法、ラジオグラフィー、シンチレーションなどであるが、これらに限定されない方法で検出できる蛍光体、酵素および酵素基質、放射性核種、重金属および比色色素および基質が含まれるが、これらに限定されない。検出可能なシグナルを発生させるために、追加の試薬が必要になる場合がある。検出物質は、アレクサフルオロＡＦ５５５で共有結合的に標識されたプロテインＬであり得る。
【００７０】
「相補的蛍光体」という用語は、２つの蛍光部分を指し、１つがある波長での励起時に第２の蛍光体物質に対するドナーとして機能することができ、第２の蛍光体剤はアクセプターとして機能し、２つの蛍光体物質の絶対距離に比例し当業者によってＦＲＥＴベースのアッセイで一般的に使用されている特定の波長シグナルおよび強度を放出する。これは、ドナーとアクセプターの蛍光体の任意の組み合わせを可能にする。
【００７１】
使用される特定のタンパク質または非タンパク質作用物質の「レベル」は、インビトロまたはインビボでのタンパク質および／または非タンパク質作用物質レベルの測定のための当技術分野で知られている任意の方法を使用して決定される作用物質の１つ以上のレベルを指す。このような方法には、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体またはゲル内沈降反応、吸収分光法、比色分析法、分光光度分析法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（単一または二重）、液相アッセイ、免疫電気泳動法、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フェルスター共鳴エネルギー移動、電気化学発光免疫測定法などが含まれる。ＴＩＰＳ因子（例えば、ＣＡ１２５）のレベルは、より詳細に説明されるように、プローブベースの技術を使用して決定され得る。
【００７２】
「二重標識試験抗体」という用語は、蛍光体がＦａｂドメインの残基に直接または間接的に付着し、そしてＦｃドメインの残基に相補的な蛍光体が付着しているものを指す。
【００７３】
「ＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）」という用語は、その動的構造が変化するＴＩＰＳ因子によって直接結合される任意の抗体、抗体断片、ＢＳＰまたはＡＤＣを指す。卵巣癌や中皮腫などの悪性細胞によって産生され（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ＮＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９：６２２−６３０，２０１８）、ならびに正常な周囲の上皮細胞からのリンパ腫によって誘発される（Ｓａｎｕｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｉｔ  Ｄｉａｌ  Ｉｎｔ．２１：４９５−５００，２００１）、ＣＡ１２５  ＴＩＰＳ因子は、特定の抗体に結合してその動的構造を変化させ、したがって、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、オプシン化、内在化などの生物学的活性および／またはＰＫプロファイルに影響を与える可能性があることが報告されている。
【００７４】
「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」という用語は、細胞に対して毒性活性を有する化学物質またはポリペプチドにコンジュゲートまたは融合された任意の抗体を指す。
【００７５】
「二重特異性抗体（ＢＳＰ）」という用語は、２つ以上の異なる抗原に結合することができる任意の抗体を指す。ＢＳＰは、限定されないが少なくとも２つの全長抗体、全長抗体および一本鎖抗体、または２つの一本鎖抗体を含むことができ、それにより、それぞれが異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。
【００７６】
「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、抗体が細胞表面の抗原に結合し、次に当該抗体のＦｃドメイン内の配列を介して免疫細胞に関与でき、その結果、免疫細胞が毒素を放出し、結合した細胞を殺傷し得るプロセスを指す。
【００７７】
「補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）」という用語は、抗体が細胞表面の抗原に結合し、次に当該抗体のＦｃドメイン内の配列を介してＣ１ｑタンパク質に関与でき、その結果、古典的補体カスケードが開始されて結合した細胞を殺傷し得るプロセスを指す。
【００７８】
「内在化」という用語は、抗体、抗体断片、またはＡＤＣが細胞の表面上の抗原に結合し、次に当業者に知られているメカニズムを介して内在化することができるプロセスを指す。
【００７９】
「薬物動態（ＰＫ）」という用語は、対象に投与されたときに抗体がその定常状態濃度を維持する時間を指す。
【００８０】
「薬力学的（ＰＤ）」という用語は、抗体ベースの薬物の生化学的および生理学的効果とその作用（複数可）メカニズムの研究を指し、対象に投与されたときのそれらの作用および効果とそれらの生化学的構造との相関を含む。
【００８１】
「薬理学的（ＰＬ）」という用語は、抗体がインビトロまたはインビボで疾患細胞を管理するまたは殺傷するのに及ぼす既知の効果を指す。
【００８２】
「試料」という用語は、対象から単離された類似の液体、細胞または組織、ならびに対象内に存在する液体、細胞または組織、の集合を指す。液体は、細胞およびオルガノイド培地、尿、唾液、洗浄液などを含む、対象または生物学的供給源と接触した液体溶液を含む生体液を含み得る。
【００８３】
使用される「対照試料」という用語は、例えば、特定の癌タイプに罹患していない健康な対象からの試料または試験抗体に結合しないことが知られているタンパク質を含む、生物学的または臨床的に関連する任意の対照試料を指す。
【００８４】
「対照レベル」という用語は、対象に由来する試料中の同じ作用物質のレベルと比較するために使用される、または非特異的な試験抗体へのタンパク質結合のベースラインである、タンパク質または非タンパク質作用物質の許容または所定のレベルを指す。
【００８５】
使用される場合、対照の抗体とＴＩＰＳ物質により結合している抗体のシグナル間の「差」は、一般に、当業者によって一般的に使用される統計的方法を使用して統計的に決定され得る任意の差であり、対照と比較して少なくとも８％以上の差である。使用される抗体およびプローブに応じて、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％の変化を指す場合もある。
【００８６】
「阻害する」または「の阻害」という用語は、統計的に測定可能な量だけ低減すること、または完全に防ぐことを意味する。
【００８７】
記載された方法に従って使用される抗体、抗体断片または抗体含有部分（すなわち、ＢＳＰ、ＡＤＣなど）に関連する「機能的」という用語は、抗体が抗原に結合できること、および／またはインビトロまたはインビボで標的細胞に結合して殺傷できることを示す。
【００８８】
「標的細胞」という用語は、特定の抗体または抗体含有部分に対する抗原を発現する細胞または細胞集団を指す。これらは、患者に直接由来することも、細胞株に由来することもあり得る。
【００８９】
「エフェクター細胞」という用語は、抗体に結合し、標的細胞に殺傷効果を誘発することができる任意の細胞を指す。これらには、ＮＫ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「薬学的に許容される」という用語は、薬理学的および毒物学的側面から患者に投与することが許容され、当業者に知られているアプローチを使用して製造される物質を指す。これらには、連邦政府または州政府の規制機関によって承認された、または米国薬局方またはその他の一般的に認められている動物およびヒトでの使用のための薬局方に記載されている薬剤が含まれる。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗癌剤を投与するのに用いられる薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはマトリックスビヒクルを指す。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分（複数可）の生物学的活性の有効性を妨げず、宿主に対して無毒であるマトリックスを指す。
【００９１】
「有効量」および「治療上有効」という用語は交換可能に使用され、患者において増強された臨床転帰をもたらすのに十分な量で医薬品を投与することに関連して使用される。有効量の薬剤は、「効果的なレジメン」において、本明細書に記載されている方法に従って投与される。「効果的なレジメン」という用語は、特定のＴＩＰＳプロファイルのために選択され得る特定の癌の患者の臨床転帰の向上を達成するのに適切な薬剤の量および投薬頻度の組み合わせを指す。増強された有効性は、患者が、当該親化合物よりも病的状態をよりよく克服することができる薬剤または効果的なレジメンの臨床転帰を増強することができる薬剤を投与された場合の改善された臨床転帰である。
【００９２】
「患者」および「対象」という用語は、治療薬治療を受けるヒトおよび獣医対象を含む他の非ヒト動物を指すために交換可能に使用される。「非ヒト動物または非ヒト」という用語には、全ての脊椎動物が含まれる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００９３】
「非ヒト」という用語は、ホモサピエンスを除く全ての脊椎動物を指す。
【００９４】
「治療薬」は、通常、望ましくない汚染物質を実質的に含まない。これは、薬剤が通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、妨害タンパク質および汚染物質が実質的にないことを意味する。
【００９５】
「スクリーニング」という用語は、例えば抗体への２つのプローブを使用して、試験抗体、抗体断片または抗体含有部分（すなわち、ＢＳＰ、ＡＤＣ、一本鎖抗体、抗体フラグメントなど）に結合することができるＴＩＰＳ因子の試験を指すことができ、プローブは単独の場合および患者または対象からの液体内の潜在的なＴＩＰＳまたは未確認のＴＩＰＳ因子と組み合わせた場合に、抗体、抗体断片、または抗体含有部分に結合した場合、２つの間の距離を監視できる。この用語は、多数の試験要素が分析されて、特定の特性を有する試験要素を決定する他の状況で使用され得る。同様に、特定の特性を有する患者の患者試料のアッセイを指すために使用することができる。
【００９６】
腫瘍誘発性および／または腫瘍産生性因子（ＴＩＰＳ）の存在下で抗体の動的構造を監視するためのプローブ、キット、および方法の構成
プローブの組成、キット、および方法は、試験抗体に結合しその動的構造に影響を与える可能性のあるＴＩＰＳ因子に対する感受性抗体［本明細書では、ＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）と呼ぶ］を同定するために、ならびに、抗体の動的構造に影響を与える可能性のある腫瘍誘発性または腫瘍産生性因子（ここではＴＩＰＳと呼ばれる）を同定するために、ならびにＴＳＡおよび／または抗体に結合することができる既知または未知のＴＩＰＳ因子を検出するためのプローブおよびキットの使用方法で、使用することができる。この方法は、一方がＦａｂドメインに結合し、他方がＦｃドメインに結合する２つのプローブの結合を含み得る。Ｆａｂ結合プローブは、抗体のＮ末端配列に特異的なアプタマー、プロテインＬ、Ｆａｂ特異的抗体、試験抗体の特異的抗原、またはＦａｂドメインの天然もしくは非天然の残基（複数可）に特異的にコンジュゲートできる小さな化学物質である。Ｆｃ結合プローブは、Ｃ末端配列に特異的なアプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ特異的抗体、天然の哺乳類Ｆｃ結合タンパク質（すなわち、Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑなど）、またはＦｃドメインの天然または非天然残基（複数可）に特異的にコンジュゲートできる小さな化学物質もしくはリンカーであってよい。例を図１に模式的に示し、実験的なものを図４〜６に示す。キットは、ＴＳＡがＴＩＰＳ因子の影響を受けたときに、Ｎ末端プローブとＣ末端プローブの間の距離の変化を検出できる当該プローブで構成され得る。距離はオングストロームで測定することができ、当業者によって使用される検出標識を備えたプローブのシグナルを測定することができる任意の機器によって検出することができる。
【００９７】
ＴＳＡを同定する方法では、候補ＴＩＰＳ因子または未知のＴＩＰＳ因子の存在下で、ＦａｂおよびＦｃドメインプローブの相補的なセットに試験抗体を添加し、シグナルを二重標識試験抗体とプローブのみと比較して、候補ＴＩＰＳ因子がプローブを近づけたり遠ざけたりすることにより抗体の動的構造を変化させ、それによってプローブ間で生成されるシグナルが変化し得るかどうかを決定する。相補的プローブとは、シグナルを検出するために組み合わせて使用できるプローブを指す。例えば、Ｆａｂドメインプローブは、特定の光波長に曝されたときにエネルギーを放出する蛍光体で標識され得、これは、次に、蛍光体を含むＦａｂプローブによる放出を刺激することができる蛍光体を含むＦｃドメインプローブのシグナルを刺激する。これらのシグナル（波長、酵素活性、温度など）は、シグナルの蛍光、比色、サーモグラフィー、発光、または視覚的な変化を検出できる任意の機械またはデバイスで捕捉できる。試験抗体がＴＩＰＳ因子に結合し、抗体構造が変化すると、２つの相補的プローブ間の波長が変化し、抗体がＴＳＡであることをシグナル通知する。少なくとも８％の変化は、ＴＳＡ  ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を混乱させる可能性があるため、通常、動的構造に対する有意義な効果であると見なされる。使用する抗体およびプローブに応じて、有意義な効果は、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％の変化として定義され得る。
【００９８】
ＴＩＰＳ因子およびＴＳＡ評価では、既知または未知のＴＩＰＳ因子結合およびその後のＴＳＡ活性について試験される試料は、組換え的、合成的に産生され、または天然源に由来する精製タンパク質または非タンパク質因子であり得る。天然源には、全血、血清、血漿、胸水、腹水、外科的切除または生検からの腫瘍組織、組織学的調製物などが含まれる。あるいは、タンパク質画分を、調節不全または悪性細胞の可溶性または膜区画から単離し、試験抗体に対するＴＩＰＳ因子結合およびＴＳＡ効果について分析することができる。例えば、ＴＩＰＳ因子に試験抗体結合およびＴＳＡ活性があるかどうかを決定するステップでは、試験抗体をＮ末端およびＣ末端の相補的蛍光プローブで標識し、ＦＲＥＴを使用してそのシグナルを決定し、抗体が単独の場合または既知もしくは未知のＴＩＰＳ因子と混合後のシグナルを比較する。一般に、抗体は、二重標識試験抗体として検出可能なシグナルを生成できる特定の相補的色素または蛍光体で直接標識されるか、相補的なＮ末端およびＣ末端プローブによって結合される。標識の種類の例には、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識が含まれる。多くのそのような標識は当業者に容易に知られている。例えば、適切な標識には、放射性標識、蛍光標識［Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）または５５５（ＡＦ５５５）など］、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、または酵素が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、記載されている標識には、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナントリジン色素、ローダミン色素、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素などが含まれる。二重標識試験抗体からのシグナルの検出は、ＴＩＰＳ因子がＴＳＡ活性を有することを示し、これは通常、条件間の８％以上のシグナル変化によって示される。使用する抗体およびプローブに応じて、シグナル変化は少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％である可能性がある。
【００９９】
生物学的試料中のＴＳＡ活性を伴うＴＩＰＳ因子のレベルは、１つ以上の標準に関して決定できる（ただし、必ずしもそうする必要はない）。標準は、歴史的にまたは同時に決定することができる。標準は、例えば、異なる対象からの癌性ではないことが知られている生体試料であり得る。標準は、ＴＳＡ活性に耐性があることが知られている無関係な抗体と接触した分析中の患者試料でもある。
【０１００】
試験抗体にＴＳＡ効果をもたらすことができるＴＩＰＳ因子の使用は、特定のＴＩＰＳ因子に結合する可能性のある阻害剤をスクリーニングするようにフォーマットすることもできる。ＴＳＡは、二重標識試験抗体を生成するために標識でき、またはＦａｂ（Ｎ末端）およびＦｃ（Ｃ末端）ドメインへの相補的なプローブセットで標識することができ、化合物のライブラリーの存在下でＴＩＰＳタンパク質を標識ＴＳＡに添加し、ＴＳＡへのＴＩＰＳ結合の阻害についてスクリーニングする。二重標識試験抗体を使用して、既知のＴＳＡの存在下で化合物ライブラリーをスクリーニングすることができ、阻害性化合物は、抗体を試験するための当該ＴＳＡのシグナルを遮断することができる。ライブラリーは小さな化学物質で構成されている。ライブラリーは、抗体および抗体断片を含むペプチドおよび／またはタンパク質からなり得る。ライブラリーはまた、ヒトまたは非ヒト由来の血清タンパク質、土壌試料または植物抽出物などの天然物を含み得る。ＦＲＥＴまたは他のアッセイを介してＴＳＡに結合するＴＩＰＳ因子の能力を遮断することが見出された化合物は、ＴＩＰＳ因子阻害剤と呼ばれる。
【０１０１】
ＴＩＰＳ因子阻害剤のスクリーニングでは、ＦＲＥＴに関与する検出可能な標識の１つが、ＦａｂまたはＦｃドメインにおいて、抗体の一部であるアミノ酸残基に付着しており、ＦＲＥＴに関与する検出可能な標識の１つは、ＦａｂまたはＦｃドメインに結合するプローブに付着している、ハイブリッドフォーマットが使用され得る。通常、２つの検出可能な標識のうちの１つはＦａｂドメインに付着し、もう１つはＦｃドメインに付着している。２つの標識のＦＲＥＴを試験する場合、それらが抗体のドメインにどのように付着または結合しているかに関係なく、ＴＩＰＳ因子の存在下および非存在下で試験できる。ＴＩＰＳ因子は抗体に結合し、ＦＲＥＴを変化させる可能性がある。潜在的なＴＩＰＳ因子阻害剤が、ＴＩＰＳ因子に結合した二重標識抗体と接触すると、ＦＲＥＴを再度測定できる。この測定は、潜在的なＴＩＰＳ因子阻害剤の存在下および非存在下で行うことができる。同様に、測定は、潜在的なＴＩＰＳ因子阻害剤と接触したＴＩＰＳ因子に結合した二重標識抗体、およびＴＩＰＳ因子阻害剤と接触していないＴＩＰＳ因子に結合した二重標識抗体で行うことができる。
【０１０２】
癌の対象は、ＴＩＰＳ因子阻害剤で治療することができる。例えば、患者は、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、または中皮腫などのメソテリン発現癌（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）を患っている可能性がある。いくつかの抗メソテリン抗体がＴＩＰＳ因子に結合することが報告されており、ＴＩＰＳ因子阻害剤が望ましい存在となっている。
【０１０３】
ＴＩＰＳ因子を発現するメソテリン発現癌の患者は、ＴＩＰＳ因子阻害剤で治療することができる。抗メソテリン治療薬は、ＴＩＰＳ阻害剤とともに対象に投与される。ＴＩＰＳ因子はＣＡ１２５である可能性がある。抗メソテリン治療薬は対象が正常範囲を超えるベースラインＣＡ１２５レベルを有する場合に対象に投与することができる。ＴＩＰＳ因子阻害剤は単独で投与することができる。ＴＩＰＳ因子阻害剤は化学療法と組み合わせて投与することができる。化学療法は、シスプラチン、カルボプラチンおよび／またはペメトレキセド、または対象が治療される時点での標準治療と見なされる他の化学療法剤であり得る。ＣＡ１２５発現レベルは、当技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。
【０１０４】
抗メソテリン治療薬は、メソテリン、好ましくは中皮腫、肺腺癌、または結腸直腸細胞に発現されるメソテリンに特異的に結合する抗体であり得る。あるいは、そのような抗体、誘導体、および変異体の抗原結合断片を治療に使用することができる。メソテリンに特異的に結合する例示的な抗体は、以下からなる群から選択される抗体であり得る：
（ａ）Ｋａｂａｔに従って番号付けされた、ＹＰ２１９抗体ＣＤＲ：ＣＤＲＨ１として配列番号１４（ＧＦＤＬＧＦＹＦＹＡＣ）、ＣＤＲＨ２として配列番号１５（ＣＩＹＴＡＧＳＧＳＴＹＹＡＳＷＡＫＧ）、ＣＤＲＨ３として配列番号１６（ＡＲＳＴＡＮＴＲＳＴＹＹＬＮＬ）、ＣＤＲＬ１として配列番号１７（ＱＡＳＱＲＩＳＳＹＬＳ）、ＣＤＲＬ２として配列番号１８（ＧＡＳＴＬＡＳ）およびＣＤＲＬ３として配列番号１９（ＱＳＹＡＹＦＤＳＮＮＷＨＡ）を含む抗体、
（ｂ）ＹＰ２１８と同じエピトープに結合する抗体（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：９９２８，２０１５）。
【０１０５】
メソテリンに特異的に結合する抗体は、配列番号１７、１８および１９のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域および／または配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域を含み得る。抗メソテリン治療薬はＹＰ２１９であり得る。メソテリンに特異的に結合する他の有用な抗体は、配列番号１７、１８および１９、または配列番号１４、１５および１６に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する成熟軽鎖および重鎖可変領域を含む。他の有用な抗メソテリン抗体またはその誘導体は、例えばイムノアッセイによって決定されるように、ＹＰ２１９のメソテリンへの結合を競合的に阻害することができる。抗メソテリン抗体の誘導体もまた、本方法の実施において使用され得る。そのような誘導体を作製するための典型的な修飾には、例えば、グリコシル化、脱グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結、細胞毒性小分子などが含まれる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１０６】
本発明の方法は、外科手術（例えば、減量手術）、放射線、標的療法、化学療法、免疫療法、増殖因子阻害剤の使用、または抗血管新生因子などの他の治療手段と組み合わせることができる。抗メソテリン治療薬は、ＴＩＰＳ因子阻害剤とともに、手術、化学療法、または放射線療法治療を受けている患者に同時に投与することができる。あるいは、患者は、抗メソテリン治療薬およびＴＩＰＳ因子阻害剤の投与の前または後に、手術、化学療法、または放射線療法を受けることができ、抗メソテリン治療薬の投与の前または後の、少なくとも１時間から最大数ヶ月まで、例えば、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、または３ヶ月まで受けることができる。抗メソテリン治療薬およびＴＩＰＳ因子阻害剤に加えて、治療有効量のプラチナベースの化学療法および／または葉酸代謝拮抗剤の投与を対象に与えることができる。例えば、治療有効量の抗メソテリン抗体、ＴＩＰＳ因子阻害剤、白金ベースの化学療法、および／または葉酸代謝拮抗剤の投与を投与することができる。白金ベースの化学療法は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、リポプラチン、またはそれらの組み合わせであり得る。白金ベースの化学療法は、当技術分野で知られている他の白金ベースの化学療法であり得る。葉酸代謝拮抗剤はペメトレキセドである。プラチナベースの化学療法は、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、対象に投与することができる。葉酸代謝拮抗剤は、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、対象に投与することができる。葉酸代謝拮抗剤とプラチナベースの化学療法の両方が治療レジメンの一部として対象に投与される場合、抗メソテリン治療薬、ＴＩＰＳ因子阻害剤、プラチナベースの化学療法、および葉酸代謝拮抗剤は、任意の順序または同時に連続して投与することができる。
【０１０７】
対象は、抗メソテリン抗体とＴＩＰＳ因子阻害剤を投与する前にメソテリン発現癌の治療のために、腫瘍の一次外科的切除、一次プラチナベース療法、一次葉酸代謝拮抗剤ベース療法、および／または一次プラチナおよび葉酸代謝拮抗剤ベース療法を受けた可能性がある。
【０１０８】
治療薬（抗メソテリン治療薬、葉酸代謝拮抗剤、および／または白金ベースの化学療法およびＴＩＰＳ因子阻害剤を含む）の投与は、当技術分野で知られている任意の手段によって行うことができる。
【０１０９】
抗体のＣＤ２０抗原への結合を指示することができるＣＤＲ配列を含む治療用抗体を使用することができる：ＩＭＧＴに従って番号を付けされた、ＣＤＲＨ１としての配列番号２０（ＧＹＴＦＴＳＹＮ）、ＣＤＲＨ２としての配列番号２１（ＩＹＰＧＮＧＤＴ）、ＣＤＲＨ３としての配列番号２２（ＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ）を、ＣＤＲＬ１としての配列番号２３（ＳＳＳＶＳＹ）、ＣＤＲＬ２としての配列番号２４（ＡＴＳ）、およびＣＤＲＬ３としての配列番号２５（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ）。例えば、これらに限定されないが、患者は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または濾胞性リンパ腫などのＣＤ２０発現癌を患っている可能性がある。以前の報告では、抗ＣＤ２０抗体はＴＩＰＳ因子に結合しているため、ＴＩＰＳ因子阻害剤が望ましい存在であることが示されている。
【０１１０】
ＴＩＰＳ因子を発現するＣＤ２０発現癌の患者は、ＴＩＰＳ因子阻害剤で治療することができる。抗ＣＤ２０治療薬は、ＴＩＰＳ因子阻害剤とともに対象に投与され得る。ＴＩＰＳ因子はＣＡ１２５である可能性がある。抗ＣＤ２０治療薬は対象が正常範囲を超えるベースラインＣＡ１２５レベルを有する場合に対象に投与することができる。この方法は、ＴＩＰＳ因子阻害剤を単独で投与することを含み得る。あるいは、ＴＩＰＳ因子阻害剤を化学療法と組み合わせて投与することもできる。化学療法は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン（ヒドロキシダウノマイシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびプレドニゾロン）またはその他の化学療法剤および／または対象が治療される時点での標準治療と見なされる医療処置の組み合わせであり得る。ＣＡ１２５発現レベルは、当技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。
【０１１１】
必要に応じて、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む治療薬（抗メソテリンまたは抗ＣＤ２０治療薬、葉酸代謝拮抗剤、プラチナベース、および／またはＣＨＯＰ化学療法またはＴＩＰＳ因子阻害剤を含む）を投与するために、様々な送達システムを使用することができる。薬剤は、例えば、注入またはボーラス注射によって、全身的または局所的アプローチを介して、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得る。
【０１１２】
治療薬は、注射器、カテーテル、坐剤、または任意の移植可能なマトリックスまたはデバイスを介した注射によって投与することができる。
【０１１３】
治療薬および薬学的組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液などの任意の許容可能な剤形で経口投与することができる。
【０１１４】
治療薬の好ましい投与方法には、効果的な治療に適した最終濃度での静脈内注射および腹腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
他の薬物と組み合わせたＴＩＰＳ因子阻害剤は、治療的または予防的に有効な量の治療薬（複数可）および１つ以上の薬学的に許容されるまたは適合性のある成分を含む薬学的組成物として投与することができる。
【０１１６】
癌の治療または予防に有効な治療薬の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイを任意選択で使用して、ＴＩＰＳ因子阻害剤に必要な最適な投与量範囲を同定するのを助けることができる。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから得られたＴＩＰＳ因子阻害剤の用量反応曲線から推定することができる。
【０１１７】
例えば、薬剤の毒性および治療効果は、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）値を決定するための標準的な薬学的手順によって、細胞培養または実験動物で決定することができる。毒性効果と治療の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤が毒性の副作用を示す場合、影響を受けた組織の部位に薬剤を標的とする送達システムを使用して、非メソテリン発現細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減することができる。
【０１１８】
投薬および投薬スケジュールは、対象の必要性に依存し得る活性薬物濃度に応じて変化し得る。
【０１１９】
ＴＩＰＳ因子およびＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）を同定するためのキットの構成
ここでさらに提供されるのは、抗体をスクリーニングして、潜在的な試験抗体結合ＴＩＰＳ因子の存在下および非存在下でそれらの動的構造を決定するために相補的プローブを作製し、ＴＩＰＳ因子阻害剤を同定するためのスクリーニングのためのキットである。キットには、本書に記載されているような、蛍光体で標識された標識蛍光プロテインＬ（配列番号１）、およびプロテインＬに結合した蛍光体によって刺激できる相補的な蛍光体で標識されているプロテインＡ（配列番号２）またはプロテインＧ（配列番号３）、使用しないときにプロテインＬ、プロテインＡおよび／またはプロテインＧを収容するための容器、およびＴＩＰＳ因子が二重標識試験抗体の動的構造に影響を与える可能性があるかどうかを決定するために対のプローブを使用するための説明書を含み得る。キットは、プロテインＬプローブとプロテインＡプローブをコンジュゲートして、二重標識試験抗体を効果的に生成する方法についての説明書を含み得る。説明書は、蛍光読み取り機器によって決定されるシグナルのベースラインレベル、および少なくとも８％変化するシグナルが、試験抗体に影響を与えるＴＩＰＳを示し、当該抗体がＴＩＰＳ感受性抗体（ＴＳＡ）であることを明示し得る。説明書は、５０％のベースラインシグナル変化が試験抗体に影響を与えるＴＩＰＳ因子を示していると明示し得る。あるいは、説明書は、プローブを３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットに追加して、複数のＴＩＰＳ因子を同時にスクリーニングできることを明示し得、ＴＩＰＳ因子は、生体液、原発性もしくは培養腫瘍細胞、または単離されたタンパク質もしくは非タンパク質作用物質に由来し得る。マイクロタイタープレートはまた、ペプチド、タンパク質、核酸、天然産物、および／または小さな化学物質（ここでは化合物と呼ばれる）のライブラリーを含み得、それにより、プローブは、ＴＩＰＳ因子の存在下でＴＳＡに添加され、当該ライブラリーを含む３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートに添加されてＴＳＡの動的構造に対するＴＩＰＳ因子の影響を遮断できる化合物を同定する。８％以上低減または増強されたシグナルは、ＴＩＰＳ因子阻害剤活性を有する化合物を示す。１つ以上の追加の容器は、アッセイ（複数可）で使用され得る試薬または緩衝液などの要素を封入し得る。このようなキットはまた、または代わりに、ＴＩＰＳ因子抗体結合の直接的または間接的検出に適したレポーターグループを含む検出試薬を含むことができる。
【０１２０】
相補的なアプタマーベースのプローブを作製するためのキットを使用して、試験抗体をスクリーニングして、ＴＩＰＳ因子の存在下および非存在下でのそれらの動的構造を決定し、ＴＩＰＳ因子阻害剤をスクリーニングすることができる。キットには、抗体のＦａｂドメインに結合でき、抗原に結合するその能力を破壊しない標識蛍光アプタマーが含まれている。蛍光体は、この文書内に記載されている蛍光体のリストにあるのものなど、任意の蛍光体、およびＦａｂアプタマーに結合した蛍光体によって刺激され得る相補的蛍光体で標識された抗体Ｆｃドメインに特異的に結合できる第２のアプタマーであり得、使用しないときにＦａｂおよびＦｃ結合アプタマーを収容するための容器、およびＴＩＰＳ因子が二重標識試験抗体の動的構造に影響を与える可能性があるかどうかを決定するために対のプローブを使用するための説明書。説明書は、アプタマーを化学的にコンジュゲートして効果的な二重標識試験抗体を作成する方法に関する方法を含み得る。説明書は、蛍光読み取り機器によって決定されるシグナルのベースラインレベル、および少なくとも８％変化するシグナルが、試験抗体に影響を与えるＴＩＰＳ因子を示し、当該抗体がＴＳＡであることを明示し得る。指示は、５０％のベースラインシグナル変化が試験抗体に影響を与えるＴＩＰＳ因子を示していると明示し得る。あるいは、説明書は、プローブを３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットに追加して、複数のＴＩＰＳ因子を同時にスクリーニングできることを明示し得、ＴＩＰＳ因子は、生体液、原発性もしくは培養腫瘍細胞、または単離されたタンパク質もしくは非タンパク質作用物質に由来し得る。ＴＩＰＳ因子は、既知または未知の場合がある。マイクロタイタープレートはまた、ペプチド、タンパク質、核酸、天然物、および／または小さな化学物質（ここでは化合物と呼ばれる）のライブラリーを含み得、それにより、プローブは、ＴＩＰＳ因子の存在下でＴＳＡに添加され、当該ライブラリーを含む３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートに添加されてＴＳＡ動的構造に対するＴＩＰＳ因子の影響を遮断することができる化合物を同定し、８％以上低減または増強されたシグナルがＴＩＰＳ因子阻害剤として示される。１つ以上の追加の容器は、アッセイ（複数可）で使用される試薬または緩衝液などの要素を封入することができる。このようなキットはまた、または代わりに、ＴＩＰＳ因子抗体結合の直接的または間接的検出に適したレポーターグループを含む検出試薬を含むことができる。
【０１２１】
キットは、試験抗体のＦａｂドメインに結合でき、抗原に結合する能力を破壊しない標識蛍光抗体を含み得る。蛍光体は、この文書内に記載されている蛍光体のリストから任意選択で、選択することができる。キットはまた、Ｆａｂ結合抗体に結合した蛍光体によって刺激され得る相補的蛍光体で標識された抗体Ｆｃドメインに特異的に結合することができる二次抗体、使用しないときにＦａｂおよびＦｃ結合抗体を収容するための容器、およびＴＩＰＳ因子が二重標識試験抗体の動的構造に影響を与える可能性があるかどうかを決定するために対のプローブを使用するための説明書を含み得る。説明書は、抗Ｆａｂ抗体と抗Ｆｃ抗体を化学的にコンジュゲートさせて抗体を試験し、効果的な二重標識試験抗体プローブを生成するための最適な方法を含み得る。説明書は、蛍光読み取り機器によって決定されるシグナルのベースラインレベル、および少なくとも８％変化するシグナルが、試験抗体がＴＳＡに影響された抗体であることを示すことを明示し得る。指示は、５０％のベースラインシグナル変化がＴＳＡ抗体を示すことを明示し得る。あるいは、説明書は、プローブを３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットに追加して、複数のＴＩＰＳ因子を同時にスクリーニングできることを明示し得、ＴＩＰＳ因子は、生体液、原発性もしくは培養腫瘍細胞、または単離されたタンパク質もしくは非タンパク質作用物質に由来し得る。それは、既知または未知の場合がある。マイクロタイタープレートはまた、ペプチド、タンパク質、核酸、天然物、および／または小さな化学物質（ここでは化合物または作用物質と呼ばれる）のライブラリーを含み得、それにより、プローブは、ＴＩＰＳ因子の存在下で、二重標識試験ＴＳＡ抗体に添加され、当該ライブラリーを含む３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートに添加されて、ＴＳＡ動的構造に対するＴＩＰＳ因子の影響を遮断できる化合物を同定し、８％以上低減または増強されたシグナルがＴＩＰＳ因子阻害剤として示される。１つ以上の追加の容器は、アッセイ（複数可）で使用される試薬または緩衝液などの要素を封入することができる。このようなキットはまた、または代わりに、ＴＩＰＳ因子抗体結合の直接的または間接的検出に適したレポーターグループを含む検出試薬を含むことができる。
【０１２２】
キットは、標識がその抗原に結合する試験抗体の能力を破壊しないように試験抗体によって特異的に結合され、この文書に記載されているような蛍光体で標識される標識蛍光抗原および、抗原に結合した蛍光体によって刺激され得る相補的蛍光体で標識された抗体Ｆｃドメインに結合する第２のプローブ、使用しないときに抗原およびＦｃプローブを収容するための容器、ならびに対のプローブを使用してＴＩＰＳ因子が二重標識試験抗体の動的構造に影響を与える可能性があるかどうかを決定するために対のプローブを使用するための説明書を含み得る。Ｆｃプローブは、ヒトＦＣＧＲ１Ａ（配列番号４）、ＦＣＧＲ２Ａ（配列番号５）、ＦＣＧＲ２Ｂ（配列番号６）、ＦＣＧＲ２Ｃ（配列番号７）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８）、ＦＣＧＲ３Ｂ（配列番号９）、ＦＣＧＲＴ（配列番号１０）、ＦＣＲＬ５（配列番号１１）、マウスＦＣＧＲ４（配列番号１２）、ヒトＣ１ｑ（配列番号１３）および／もしくはそれらの誘導体、Ｆｃドメイン特異的アプタマーまたはＦｃ特異的抗体または抗体断片、プロテインＡまたはＧを含むがこれらに限定されない、いくつかの既知のＦｃ結合タンパク質に由来し得る。説明書は、プローブを試験抗体に化学的にコンジュゲートして効果的な二重標識試験抗体を作製するための最適な手段を特定し得る。説明書は、蛍光読み取り機器によって決定されるシグナルのベースラインレベル、および少なくとも８％変化するシグナルが、ＴＳＡに影響を与えるＴＩＰＳ因子を示すことを明示し得る。指示は、５０％のベースラインシグナル変化が試験抗体に影響を与えるＴＩＰＳ因子を示していると明示し得る。あるいは、説明書は、プローブを３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットに追加して、複数のＴＩＰＳ因子を同時にスクリーニングできることを明示し得、ＴＩＰＳ因子は、生体液、原発性もしくは培養腫瘍細胞、または単離されたタンパク質もしくは非タンパク質作用物質に由来し得る。マイクロタイタープレートはまた、ペプチド、タンパク質、および／または小さな化学作用物質（ここでは化合物と呼ばれる）のライブラリーを含み得、それにより、プローブは、ＴＩＰＳ因子の存在下で二重標識試験ＴＳＡに添加され、当該ライブラリーを含む３８４または９６ウェルマイクロタイタープレートに添加されて、ＴＳＡ動的構造に対するＴＩＰＳ因子効果を遮断でき、化合物を同定し、８％以上低減または増強され、試験抗体への抗原結合に影響を及ぼさないシグナルがＴＩＰＳ因子阻害剤として示される。１つ以上の追加の容器は、アッセイ（複数可）で使用される試薬または緩衝液などの要素を封入することができる。このようなキットはまた、または代わりに、ＴＩＰＳ因子抗体結合の直接的または間接的検出に適したレポーターグループを含む検出試薬を含むことができる。
【０１２３】
キットはまた、例えば、蛍光体標識プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ特異的抗体もしくは抗体断片、またはＦｃ結合タンパク質と組み合わせて蛍光体標識抗原を使用する、ＦａｂおよびＦｃプローブの混合物を含み得る。別の例は、蛍光体標識プロテインＬを、蛍光体標識Ｆｃ特異的抗体もしくは抗体断片、またはコンジュゲートまたは非コンジュゲート形態のＦｃ結合タンパク質と組み合わせて使用することである。さらに別の例は、相補的な蛍光体標識されたＦａｂまたはＦｃ結合タンパク質と組み合わせた蛍光体標識されたアプタマーであり得る。
【０１２４】
キットはまた、ＥＬＩＳＡフォーマットで使用して試験抗体を捕捉できる非標識相補的Ｆａｂプローブ（プロテインＬ、アプタマー、抗原など）と、試験抗体Ｆｃドメイン（プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ受容体など）に結合できる第２のビオチンまたは他の検出体対応標識および非標識プローブを含み得る。このフォーマットは、ＴＩＰＳ因子の一次スクリーニングに使用され、Ｆｃ結合プローブに影響があるかどうかを以下により決定する：（１）ＥＬＩＳＡプレートをＦａｂプローブでコーティングすることと、（２）ＴＩＰＳとともにもしくはＴＩＰＳなしで試験抗体とＦｃ−ビオチンプローブを添加し、ＴＩＰＳ因子の存在下または非存在下での結合を測定する。ＴＩＰＳ因子で処理されたウェルと対照ウェルとの間にＦｃプローブ結合の違いが観察されない場合、当該プローブは対形成に適している。最後に、キットには、試験抗体を標識するビオチン化剤を含むことができ、以下により非標識ＦａｂおよびＦｃプローブの存在下で試験抗体が抗原に結合する能力を決定する：（１）試験抗体の抗原でウェルをコーティングすること、（２）ＦａｂおよびＦｃプローブをビオチン化試験抗体に添加し、二次ストレプトアビジン−ＨＲＰを介した抗原結合についてスクリーニングすること。試験抗体のみの場合と比較して、ＦａｂプローブとＦｃプローブの存在下での抗原結合に違いがない場合、プローブはＴＩＰＳ因子に対して試験し、試験抗体がＴＳＡであるかどうかを決定するための対として十分である。
【０１２５】
キットには通常、本明細書で説明する方法で使用するための標識または説明書も含まれている。標識または説明書は、キットの製造、輸送、販売、または使用中の任意の時点でキットに添付されている、またはキットに付属している書面または記録された資料を指す。これは、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知である場合があり、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映している。標識または説明書には、広告チラシやパンフレット、包装材料、説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピューターディスク、ならびに医薬品キットに直接刻印された書き込みも含まれる。
【０１２６】
上記の開示は、本発明を一般的に説明している。本明細書中に開示される全ての参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができるが、これらの実施例は、例示のみを目的として本明細書に提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２７】
実施例１ -- 二重標識試験抗体へのＴＩＰＳ因子結合およびそれらの動的構造への影響を監視するための相補的結合対の開発
図１は、抗体構造の概略図と、Ｆａｂ／Ｎ末端およびＦｃ／Ｃ末端に特異的なプローブが結合し、抗体の動的構造を測定するために対で使用できるかどうかを試験できるおおよその領域を示している。これらのタンパク質の多くは抗体に結合することが示されているが、２つを同時に使用して、ハイスループットで機能ベースのアッセイで抗体の動的構造を監視する能力は不明である。特に、二重標識試験抗体に結合したままで、化学的コンジュゲートとスクリーニングを使用してＴＩＰＳ因子によって置き換えられない可能性のあるプローブを同定して組み合わせる方法を教示し、そのような処理が試験抗体のその抗原への結合に影響を与えないようにする。
【０１２８】
図２は、標的抗原への抗体の結合に影響を与えることなく同時に結合することにより、二重標識された試験抗体と組み合わせて使用されるプローブ対の能力の例を提示する。示されているように、一部のプローブは同時使用に適合性があるが（すなわち、プロテインＬとプロテインＧまたはプロテインＡ、抗原とＦＣＧＲ１Ａ）、他のプローブは適合性がなく（つまり、プロテインＬとＣ１ｑ、試験抗体の抗原とＦＣＧＲ２ＡまたはＦＣＧＲ３Ａ）、抗体の動的構造を測定するための適合性のあるプローブの定義された対を備えたキットの重要性を強調している。
【０１２９】
ＴＩＰＳ因子の存在下または非存在下で当該試験抗体への適合性のあるＦａｂおよびＦｃ結合対を試験するために、捕捉体としてＦａｂプローブおよび検出体としてＦｃプローブを使用してＥＬＩＳＡフォーマットに適用した。２つのプローブがＴＩＰＳ因子の存在下で試験抗体に結合できる場合は、追加の試験を実行して、プローブに結合した試験抗体が依然としてその標的抗原に結合できることを確認した。抗体、抗体断片、Ｆｃ結合タンパク質ＦＣＲ１Ａ、ＦＣＲ２Ａ、ＦＣＲ３Ａ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、プロテインＬ、プロテインＡ、およびプロテインＧからなるＦａｂおよびＦｃプローブの試験は、粉末ミルクとＰＢＳ緩衝液ｐＨ５．５を使用して行われた、ＦｃＲｎに対するプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）と洗浄を除いて、前述のとおり緩衝液を使用してＥＬＩＳＡフォーマットで実行された（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８：５２０４５−５２０６０，２０１７）。簡単に説明すると、９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬの各捕捉プローブ、試験抗体または抗体特異的抗原で、０．０５Ｍ炭酸緩衝液中４℃で一晩コーティングした。翌日、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で濯ぎ、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで１時間ブロックした後、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＣＡ１２５とともにもしくはＣＡ１２５なしで、試験抗体（リツキシマブとペルツズマブをそれぞれ陽性対照と陰性対照として使用された）、［ＴＩＰＳ因子ＣＡ１２５はリツキシマブに結合するがペルツズマブには結合しないことが報告されている（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：１８７２−１８８２，２０１８）］およびビオチン化Ｆｃプローブを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＲＴＰ−ＨＲＰ）で室温で１時間プローブした。次に、ウェルを３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１５分間添加した。０．１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、９６ウェルＶａｒｉｏｓｃａｎプレートリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）で読み取った。図２に示すように、ＦａｂおよびＦｃ抗体の同時結合は一貫して堅牢であり、両方のプローブと組み合わせた場合、試験抗体も抗原に結合できたため、プロテインＬ捕捉体とＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、およびプロテインＧプローブの使用は適合性があった。これは、ＥＬＩＳＡプレートを標的抗原（リツキシマブのＣＤ２０ペプチドおよびペルツズマブのＨＥＲ２抗原）でコーティングし、ＦａｂおよびＦｃ非標識タンパク質の存在下でビオチン化リツキシマブまたはペルツズマブを添加することによって実証された。プロテインＬとＣ１ｑの対は適合性がなかった。次に、ＣＡ１２５の存在下もしくは非存在下で、プロテインＬを捕捉体として使用し、ビオチン化ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、またはプロテインＡまたはＧを検出体として使用して、対プローブ結合を混乱させるＣＡ１２５の能力を試験した。図３に示すように、ＣＡ１２５はＦＣＧＲ３Ａの結合を減少させたが、ＦＣＧＲ１Ａ、プロテインＡ（図示せず）、またはプロテインＧのリツキシマブへの結合は��少させなかった。ＣＡ１２５はペルツズマブに結合しないため、期待どおりにペルツズマブに影響は見られなかった（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８：５２０４５−５２０６０，２０１７、Ｇｕｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１５４９−１５５８，２０１６）。これらのデータは、検出のために試験抗体に同時に結合できる相補的プローブを見つけることが必要であるが、リツキシマブなどのＴＩＰＳ因子感受性抗体（ＴＳＡ）の同定に役立つには十分ではないことを示している。試験抗体がＴＩＰＳ因子と相互作用すると、プローブの動作が変化し、自明ではなくなる可能性があり、これらのプローブは、ＴＳＡならびにＴＩＰＳ因子を同定するため、およびＴＩＰＳ因子阻害剤をスクリーニングするためのスクリーニングツールとしての効果が低くなる。より安定した対（すなわち、プロテインＬとプロテインＧ、プロテインＬとプロテインＡ、試験抗体抗原とＦＣＧＲ１Ａ、または相補的抗体および／もしくはアプタマーＦａｂとＦｃ結合プローブを含む他のプローブ）は、ＴＩＰＳ因子の存在下で実施例２に記載および教示されている抗体の動態を研究するのに最も役立つ可能性がある。
【０１３０】
図３に示すように、リツキシマブなどのＴＳＡに結合できるＣＡ１２５などのＴＩＰＳ因子は、動的構造と抗体の体液性機能の変化につながる可能性がある。これらのアッセイは、ＴＩＰＳ因子およびＴＩＰＳ因子阻害剤が二重標識試験抗体に及ぼす可能性のある機能的影響を監視するのに役立つ。全てのビオチン化プローブは、製造元（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ）の説明に従って、スルホタグコンジュゲーションを使用して作成された。全ての反応は少なくとも３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行われ、平均値はスチューデントのＴ検定を使用して分析された。
【０１３１】
実施例２ -- ＴＩＰＳ因子の存在下または非存在下での二重標識試験抗体の抗体動的構造を測定するための相補的プローブの決定
実施例１に示されるように、プローブを試験抗体のＮ末端／ＦａｂドメインおよびＣ末端／Ｆｃドメインに結合させ、次いで、結合および試験抗体の動的構造を変更させるＴＩＰＳ因子の影響を測定することが可能であり、その結果、ＦＣＧＲ２ＡやＦＣＧＲ３Ａなどの低親和性Ｆｃ受容体の結合が減少するが、高親和性結合タンパク質（すなわち、プロテインＬ、プロテインＧ、ＦＣＧＲ１Ａ）、抗体、および／またはアプタマーの結合は減少しない。後者のグループのプローブは、試験抗体へのＴＩＰＳ因子結合の存在下で試験抗体への結合を保持でき、定常状態でＴＩＰＳ因子の存在下でのそのＮ末端とＣ末端の距離を測定することによって試験抗体の動的構造を監視でき、ＴＩＰＳ因子が結合して試験抗体の動的構造を変化させるかどうかを決定するためのできる追加のフォーマットで役立つ。距離がＴＩＰＳ因子によって変更された場合、抗体はそのＴＩＰＳ因子によって結合されていると決定され、ＦＣＧＲ２Ａ（図示せず）およびＦＣＧＲ３Ａ結合の減少に関するリツキシマブおよびＣＡ１２５の場合と同様に、その動的構造が変更される可能性がある。
【０１３２】
本明細書で説明するように、ハイスループットシステムでＴＩＰＳ因子結合に対する抗体の動的構造を試験する機能は、ＴＩＰＳ因子の影響を受けやすい抗体（ＴＩＰＳ感受性抗体、ＴＳＡ）を同定するユニークな機会を提供し、治療用抗体プログラムの開発中に以下を可能にする：（１）影響を受けたＴＳＡで治療される当該ＴＩＰＳ因子を発現する患者の回避、（２）ＴＩＰＳ因子（複数可）結合に対するＴＳＡの感受性を克服できる化合物をスクリーニングするための対形成したプローブシステムの使用、および／または（３）ＴＩＰＳ因子の存在下または非存在下でＮ末端ドメインとＣ末端ドメイン間の定常状態の距離を監視して難治性ＴＳＡを操作する、またはＴＩＰＳ因子阻害剤を開発することができる、相補的なプローブを備えた二重標識試験抗体の使用。上記のような二重標識試験抗体を標識する任意の方法を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して監視できる相補的蛍光体とともに使用でき、ＦＲＥＴシグナルの増加は、ＴＩＰＳ因子により試験抗体のＮ末端とＣ末端が近接することを示し、ＦＲＥＴシグナルの減少は、ＴＩＰＳ因子によりそれらをより遠位になることを示し、いずれの場合も、試験抗体の動的構造と機能への影響を示している。
【０１３３】
図４に示すように、二重標識試験抗体は、試験抗体のＦａｂドメインとＦｃドメインを特異的に認識できる蛍光標識抗体プローブの結合によって形成された。抗Ｆａｂ抗体はＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ４８８で標識され、抗Ｆｃ抗体はＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ５５５で標識された。１００ｍＭのＮａＨＰＯ４、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＨ２ＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３中の２．５ｍＭのジスクシンイミジルスベレートを使用して、プローブを同時に試験抗体に架橋し、続いて１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５でクエンチした。試料を、ヒト化試験抗体に結合するが非ヒト結合抗体プローブにはコンジュゲートしないプロテインＡカラムで脱塩および精製した。試験抗体を、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が推奨するように、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（商標）分光光度法／蛍光光度法を介して濃度と二重標識について分析した。図４Ａに示されるように、二重標識されたＡＦ４８８およびＡＦ５５５試験抗体が生成され、図４Ｂに示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイで使用された。簡単に説明すると、Ｆａｂ４８８−Ｆｃ５５５二重標識または個別標識試験抗体を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＩＰＳ因子  ＣＡ１２５、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のみの緩衝液と、黒色の９６ウェル不透明なマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）でインキュベートし、Ｖａｒｉｏｓｃａｎ蛍光プレートリーダーを使用してＦＲＥＴで３連で定量した。試料を１０分〜３時間インキュベートし、遅延時間０．０５ミリ秒、積分時間０．４ミリ秒の４７０ｎｍ励起を使用して、ＦＲＥＴ活性を試験し、前述の方法（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  Ｓ，ｅｔ．ａｌ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ９：ｅ１０２５７２，２０１４）に従って、５７０ｎｍの発光波長で読み取った。示されているように、ＨＳＡは緩衝液のみのプローブと同様の値を示したが、ＣＡ１２５で処理された二重標識試験抗体は５７０ｎｍの発光シグナルが３５％増加し、Ｎ末端とＣ末端が接近することでＦＲＥＴシグナルが増加したことを示している。これらの値は、実験の時点間で類似しており、最小限の３つのデータポイントを表している。Ｆａｂ５５５を含む単一標識試験抗体とＦｃ４８８を含む単一標識試験抗体を添加しても、ＣＡ１２５を添加した場合、ＦＲＥＴシグナルは増強されず、緩衝液のみのベースラインシグナルは二重標識抗体よりも全体的にはるかに低く、５７０ｎｍで１．８５０対４．８８０であって、抗体の動的構造に対するＴＩＰＳ因子の影響を検出するために、２つの蛍光色素が近接して同じ分子上にある必要があることを示している。
【０１３４】
図５は、Ｆａｂ軽鎖を特異的に認識するＡＦ５５５標識プロテインＬ（ＰＬ５５５と呼ばれる）と試験抗体のＦｃドメインを認識するＡＦ４８８標識プロテインＡ（ＰＡ４８８と呼ばれる）の結合によって形成される二重標識試験抗体の使用を示している。ＰＡ４８８タンパク質の生成は以前に報告されている（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）。ＡＦ４８８の対でのＦＲＥＴの二次プローブとしての使用を含むあらゆるユーティリティのためのＡＦ５５５標識プロテインＬの開発の試みを同定した以前の発見はない。ここでは、ＦＲＥＴ適用のためのＰＬ５５５の生成と有益性について説明する。ＰＬ５５５を生成するために、１．９ｍＭの組換えプロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３中の７５０μＭスクシンイミジルエステル標識ＡＦ５５５とともに１時間インキュベートした。７ｋＤａ分子量カットオフ（７−ＭＷＣＯ）Ｚｅｂａカラム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して反応を脱塩し、Ｉ−Ｂｒｉｇｈｔ  ＣＬ１０００イメージャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ分光光度法／蛍光光度法でのイメージングによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動／ＵＶ可視化によりプロテインＬ−ＡＦ５５５標識を確認した。図５Ａに示すように、５５５ｎｍ（左図）の正しい蛍光スペクトルと３６ｋＤａ（右図）の分子量を持つＡＦ５５５−プロテインＬ標識プローブが生成された。次に、２：１モル体積の試験抗体とＰＬ５５５およびＰＡ４８８を一緒に（二重標識の場合）またはそれぞれ単独で（単一標識の場合）、上記のように２．５ｍＭのＤＳＳの存在下でインキュベートした。試験抗体は、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の１００ｋＤａ分子量カットオフ（１００−ＭＷＣＯ）透析チューブを使用して、サイズ排除によって４°Ｃで７２時間精製された。次に、抗体を上記のように濃度および二重標識について分析した。抗原結合の試験は、二重標識された試験抗体が依然として抗原結合を保持していることを示した（示さず）。図５Ｂは、二重標識された試験抗体が生成され、次に上記の方法を使用する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイで使用されたことを示す。結果を図５Ｃに示す。簡単に説明すると、ＰＬ５５５−ＰＡ４８８二重標識試験抗体を１０ｎｇ／ｍＬのＴＩＰＳ因子ＣＡ１２５、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のみの緩衝液とインキュベートし、９６ウェルＶａｒｉｏｓｃａｎ蛍光プレートリーダーを使用してＦＲＥＴで定量した。試料を１０分から３時間インキュベートし、励起波長４７０ｎｍ、遅延時間０．０５ミリ秒、積分時間０．４ミリ秒を使用して、ＦＲＥＴ活性を試験し、発光波長５７０ｎｍで読み取った。示されているように、ＨＳＡは緩衝液のみのプローブと同様の値を示したが、ＣＡ１２５で処理された試験プローブは５７０ｎｍの発光シグナルが１８％増加し、ＣＡ１２５の存在下でＦＲＥＴシグナルが増加したことを示している。これらの値は、実験の時点間で類似しており、最小限の３つのデータポイントを表している。ＰＬ５５５で標識された単一標識試験抗体とＰＡ４８８で標識された単一標識試験抗体��添加は、ＣＡ１２５を添加した場合、ＦＲＥＴシグナルをもたらさず、ベースラインが全体的にはるかに低く５７０ｎｍで４．７０に対して０．６５５であり、ＴＩＰＳ因子の結合および試験抗体の動的構造への影響を検出するために、同じ分子上で２つの相補的な蛍光体が近接している必要があることを示している。
【０１３５】
図６に示すように、二重標識された試験抗体は、試験抗体内の固有の残基への直接的コンジュゲートによって形成された。抗ＣＤ２０抗体リツキシマブはＣＡ１２５に結合し、その体液性免疫機能（複数可）を抑制することが示されている（Ｋｌｉｎｅ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：１８７２−１８８２，２０１８）。最近のマッピングでは、ＣＡ１２５の結合がＦａｂ領域に局在化している。Ｆａｂドメイン領域の標準的なＰＣＲベースのランダム突然変異誘発を使用して、重鎖（Ｓ１６９Ｃ）の残基１６９に不対システイン（ＣＹＳ）を含むバリアントリツキシマブを操作した。ランダム化されたフラグメントを真核生物の発現ベクターにクローニングし、哺乳類の宿主細胞に一過性にトランスフェクトし、培養上清を使用して機能的にスクリーニングし、ＣＡ１２５とそのＣＤ２０抗原に結合できると推定されるリツキシマブ変異体を同定した。ＣＤ２０およびＣＡ１２５結合を保持する数百のクローンのスクリーニングおよび配列決定後、Ｓ１６９Ｃ変異体（配列番号２６および２７）を含む１つのクローンを同定した。このクローンはＲＴＸ−１６９と呼ばれる。２９３細胞の大規模な一過性トランスフェクションとプロテインＡカラム精製による抗体産生のスケールアップ後、前述の方法（Ｂａｎｋｓ  ＤＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９７：７６４−７７９，２００８）に従って直接システイン標識用のＲＴＸ−１６９を調製した。まず、１ｍｇ／ｍＬのリツキシマブ野生型（ＲＴＸ−ＷＴ）およびＲＴＸ−１６９を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０中の１．５ｍＭのＬ−システイン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）とともに４°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、７−ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａカラムを使用して反応物を脱塩し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅを介してタンパク質含有量を定量した。次に、各抗体を、製造元の指示（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、Ｅｌｌｍａｎアッセイを介して脱システイン化について試験した。分析により、処理および未処理ＲＴＸ−１６９ｍＡｂのエルマン試薬標識が１２％向上することがわかったが、処理および未処理のＲＴＸ−ＷＴの間に違いは見られず、ＲＴＸ−１６９内に遊離システイン１６９が存在することが示唆された。次に、ＲＴＸ−ＷＴとＲＴＸ−１６９の両方を、前述のように（Ｌｉ，ＸＹ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２８：８５６−８６１，２０１２）、２０：１のモル比のＮａＮ３：抗体で室温で一晩処理し、等モル濃度のＮａＮ３処理および未処理抗体を、２００μＭのジベンジルシクロオクチン−ＰＥＧ４−ビオチン（ＤＢＣＯ−ビオチン）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と室温で１時間インキュベートして、当業者に知られているプロセスであるクリックケミストリーを介した抗体−ビオチンコンジュゲートを形成させた。上記のように７−ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａカラムを使用して試料を脱塩し、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを介してビオチン標識について試験した。ＥＬＩＳＡのために、三連のウェルに、０．２ｍｇ／ｍＬのＮａＮ３で処置したまたは未処理の、０．０５Ｍ炭酸緩衝液中のＤＢＣＯビオチン曝露ＲＴＸ−ＷＴまたはＲＴＸ−１６９を、４℃で一晩プレーティングし��。ウェルを０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢ緩衝液）で洗浄し、ＰＢ緩衝液中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＲＴＰ−ＨＲＰ）の１：３０００希釈液で、室温で１時間プローブした。次に、ウェルをＰＢ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に５分間曝露し、０．１ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、Ｖａｒｉｏｓｃａｎ  ９６ウェルプレートリーダーを使用して４５０ｎｍのＯＤで読み取った。図６Ａに示すように、ＲＴＸ−１６９は、ＮａＮ３未処理ＲＴＸ−１６９またはＮａＮ３−ＲＴＸ−ＷＴ処理抗体のいずれよりもビオチン標識が有意に増強されていて（Ｐ＜０．０００００９）、これは、ＲＴＸ−１６９内の残基１６９の遊離システインが原因である可能性がある。Ｎ末端Ｆａｂドメインでの標識を確認するために、ＲＴＸ−１６９をパパインで消化し、製造元（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の推奨に従ってプロテインＬおよびプロテインＡアガロースビーズを介して単離したＦａｂおよびＦｃフラグメントを使用した。全長ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチン標識および非標識ＲＴＸ−１６９とＤＢＣＯ−ビオチン標識ＲＴＸ−１６９ＦａｂおよびＦｃ断片を、４〜１２％の非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、エレクトロブロッティングし、ＳＴＲＰ−ＨＲＰを使用してビオチンの存在についてウエスタンブロットでプローブした。図６Ｂに示すように、ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンの全長とＦａｂ断片は両方ともＳＲＴＰ−ＨＲＰに結合したが、未処理のＲＴＸ−１６９とＤＢＣＯ−ビオチンで標識されたＲＴＸ−１６９のＦｃ断片は結合せず、ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンＦａｂドメイン内のビオチン特異的標識を確認した。次に、ＲＴＸ−１６９のＤＢＣＯ−ビオチンタグを使用して、ＲＴＸ−１６９にＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ＡＦ５５５の標識を付けた。ＲＴＸ−１６９−ＤＢＣＯ−ビオチンを、アビジン標識ＡＦ５５５およびＰＡ４８８と２：１の比率で、上記のようにＤＳＳの存在下で１時間インキュベートした。抗体は、１００−ＭＷＣＯ透析膜を使用した透析によって精製され、ＲＴＸ−１６９−ＡＦ５５５−ＰＡ４８８二重標識抗体で予想される高分子量種を示す変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された（図示せず）。試験抗体は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ分光光度法／蛍光光度法によってさらに分析され、ＡＦ４８８およびＡＦ５５５蛍光体で二重標識されていることが確認された（図６Ｃ）。二重標識抗体の抗原結合は、ＥＬＩＳＡを介して確認された（示さず）。次に、緩衝液、ＨＳＡまたはＣＡ１２５の存在下で上記と同様のパラメーターを使用して試験抗体をＦＲＥＴで使用し、１０分〜３時間定量した。図６Ｄに示すように、ＲＴＸ−１６９−ＡＦ５５５−ＰＡ４８８抗体は、ＨＳＡまたは緩衝液のみとは対照的に、ＣＡ１２５とインキュベートしたときに陽性のＦＲＥＴシグナルを示し、リツキシマブなどのＴＳＡに結合するＴＩＰＳ因子を検出するこのフォーマットの有用性を確認した。
【０１３６】
試薬の組成ならびにＴＳＡおよびＴＩＰ因子を明らかにするためのそれらの使用方法の教示により、抗Ｆａｂもしくは抗Ｆｃ抗体、プロテインＡ、ＧまたはＬ結合タンパク質、Ｆａｂおよび／もしくはＦｃ結合アプタマー、ならびにＦａｂおよび／もしくはＦｃドメイン内の単一アミノ酸の変化などであるがこれらに限定されないプローブの特異的結合を使用して二重標識試験抗体を形成する有益性を可能にする。上記のような相補的蛍光体対または他の検出物質の任意の組み合わせを使用するそのような二重標識試験抗体の形成は、試験抗体に結合できる潜在的なＴＩＰＳ因子の同定、ＴＳＡ影響抗体の同定、および新規治療剤としてのＴＩＰＳ因子阻害剤の化学物質およびタンパク質ライブラリーのスクリーニング、ならびに患者選択のためのＴＩＰＳ発現プロファイルの使用のためのそれらの使用に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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