【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年9月28日(2010.9.28)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
以前の定方向進化法は最適以下（suboptimal）である
突然変異導入は過去多くの機会において、しかし本発明の目的にとって不適切である方法によって、実施されてきた。例えば、過去に記載された非確率論的方法は（しばしば単に単独の子孫分子からなる）非常に小さな子孫分子セットのみの産生において役に立った。説明のために、各断片が別々の祖先（又は親）分子に由来するような、制限酵素により産生された適合性の粘着末端を用いて2つのポリヌクレオチド断片を連結することによりキメラ遺伝子が作製された。別の例は、ある単一の部位突然変異導入ポリヌクレオチドをコードする、単一の子孫ポリヌクレオチドを産生するために、親ポリヌクレオチドにおける単一コドン部位の突然変異導入（すなわち、コドン置換、付加または欠失を達成するための）であってもよい。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
特定の態様において、本発明は設計により選抜される全体の集合順序を有するキメラ核酸分子のライブラリーを非確率論的に作製する方法であり、以下の段階を含む方法を提供する：
（a）利用可能な相互に適合性のライゲーション可能末端を有する複数の特定の合成核酸構築ブロックを設計により産生する段階；および
（b）設計された全体の集合順序が達成されるようにこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階。それによって、祖先鋳型セット、例えば遺伝子（例えばエステラーゼ遺伝子ファミリー）または（たとえば抗生物質をコードする）遺伝子経路がシャッフリングされて子孫ポリヌクレオチド分子のかなり大きなライブラリー（例えば10100）および対応するコードされたポリペプチドが産生されうり、かつそれによって、子孫ポリヌクレオチドライブラリーの発現スクリーニングが、商業応用に役立つ特定の酵素活性等の所望の特性を有する所望の種を同定するための手段を提供する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
設計により選抜された全体の集合順序を有するキメラ核酸分子の一またはそれ以上の群からなる、規定された数の群からなるライブラリーを非確率論的に産生する方法であり、以下の段階を含む方法もまた含まれる：
（a）利用可能な相互に適合性のライゲーション可能末端を有する特定の核酸構築ブロックセットを各群についての設計により産生する段階；および
（b）設計された全体の集合順序が達成されるように、該群によりこれらの核酸構築ブロックを集合させる段階。それによって、祖先鋳型セット、例えば遺伝子（例えばエステラーゼ遺伝子ファミリー）または（たとえば抗生物質をコードする）遺伝子経路がシャッフリングされて子孫ポリヌクレオチド分子のかなり大きなライブラリー（例えば10100）および対応するコードされたポリペプチドが産生されうり、かつそれによって、子孫ポリヌクレオチドライブラリーの発現スクリーニングが商業応用に役立つ特定の酵素活性等の所望の特性を有する所望の種を同定するための手段を提供する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６８】
特に目立つ差異は本SLR法はシャッフリングされるポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しないことである。対照的に、以前の方法、特に以前の確率的シャッフリング法は、シャッフリングされるポリヌクレオチド間の、とくに結合部位間における、高レベルの相同性の存在を必要とする。したがってこれらの以前の方法は、本来の祖先分子の再作製を有利にし、多数の新規子孫キメラの作製、特に全長子孫の作製には最適以下である。一方本発明は、10100以上の異なるキメラからなる子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率的に作製するために使用することができる。おそらくSLRは101000を上回る（上限の見こみはなく）の異なる子孫キメラからなるライブラリーを作製するために使用することさえできる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６９】
したがって、ある局面において、本発明は、非確率的で、設計により選択された全集合の順序を有する最終的なキメラ核酸分子のセットを作製する方法を提供し、この方法は、設計により利用可能な互いに適合性のライゲーションされうる（mutually compatible ligatable）末端を有する多数の特定の核酸構築ブロックを作製する段階及び、設計された全集合の順序が達成されるように、これらの核酸構築ブロックを集合させる段階からなる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２７０】
構築ブロックをあらかじめ決定された順序で結合させることができるなら、集合されるべき核酸構築ブロックの互いに適合性のライゲーションされうる末端は、この型の集合された順序のために「利用可能」であると考えられる。したがって、ある局面において、核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は、ライゲーション可能末端の設計により特定され、複数の集合段階が使用されるならば、その後核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は集合段階の連続的な順序によっても特定される。図4のパネルCは、5個の核酸構築ブロックに関する設計された（非確率的な）全集合の順序を達成するための2つの連続した段階からなる例示的集合方法を図示している。本発明の好ましい態様においては、アニーリングされた構築部分はリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ）等の酵素で処理され、構築部分の共有結合を達成する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２７６】
核酸構築ブロック設計および集合されるべき核酸構築ブロックの互いに適合性のライゲーションされうる末端の設計過程は、図6および図7に図示される。示されたように、祖先鋳型セットのアラインメントはいくつかの天然の境界点を明らかにし、これらの鋳型により共有される境界点の同定は、子孫キメラ分子の作製のために作製され使用されるべき構築ブロックを非確率的に決定することに役立つ。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０４１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０４１２】
したがって、提供されたある使用法において役立つ末端選択マーカーは、産生された一本鎖のオリゴヌクレオチドを変性することでライゲーション適合性の末端を生成するために、酵素が特定部位でポリヌクレオチドを開裂させる（ニックを含む）のを可能にする酵素認識部位である。生成したポリヌクレオチド末端のライゲーション反応は、同じ酵素（例えば、ワクシニアウイルストポイソメラーゼIの場合）によって完成させることができるし、また別法では異なる酵素を利用して完成させることもできる。本発明の一局面によると、何らかの役立つ末端選択マーカーが、似ていようと（例えば、二つのワクシニアウイルストポイソメラーゼIの認識部位）、似ていまいと（例えば、クラスII制限酵素の認識部位とワクシニアウイルスのトポイソメラーゼIの認識部位）いずれにせよ、ポリヌクレオチドを選択するために組み合わせて用いることができる。それぞれの選択可能なポリヌクレオチドはこのように、一つまたはそれ以上の末端選択マーカーを持っていてもよく、そして末端選択マーカーと似ていてもよいし、またにていなくてもよい。特定の局面において複数の末端選択マーカーはポリヌクレオチドの一方の末端に位置していてもよいし、また互いに重複する配列を持っていてもよい。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０４４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０４４９】
実施例8
固相遺伝子ファミリー再集合（solid phase gene family reassembly）プロトコール
例えば、特定の遺伝子の遺伝子ライブラリー、遺伝子ファミリーのライブラリー、および関連性のない遺伝子のライブラリーを産生するためにDNA分子を再集合/シャッフリングすることが目的でありうる。全長分子の合成は、固体支持体上で実施される。本発明者らが使用する固体支持体は、ストレプトアビジンでコートされた常磁性ビーズである。原理は、ビオチンおよびストレプトアビジン間の強い相互作用、ならびに核酸構築ブロック（例えばssDNA構築ブロック）のアニーリングから産生されたDNA断片を段階的にまたは同時にライゲーションする能力に基づく。固体支持体の使用は、連続した様式での核酸構築ブロックの再集合を容易にし、それゆえ、ライゲーション再集合により産生されるべき核酸分子長全体に渡る、独特な結合だけでなく重複結合又は反復した結合の使用を可能にする。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０４５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０４５０】
「捕捉オリゴヌクレオチド」は、ビーズへの結合のために5'末端においてビオチン化されている。「捕捉オリゴ」は、（ビオチン化されていない）相補的な配列にアニーリングされる。二重鎖捕捉断片は、固体支持体からの集合された分子の放出を可能にする、2つの制限酵素部位を5'末端に含む。ライゲーション再集合は20塩基〜100塩基のアニーリングされたオリゴヌクレオチドの段階的ライゲーションにより実施される。集合の最初の断片は、捕捉ビオチン化断片の3'末端と適合性の5'末端を含む。相補的な末端を含む二重鎖断片の連続ライゲーションは全長分子の産生を可能にする。中間合成（half way synthesis）（中間点）分子は、固体支持体から放出される。両末端から産生された分子間の最終ライゲーション段階は、全長再集合DNAの産生をもたらす。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  エキソヌクレアーゼ活性
酵素エキソヌクレアーゼIII活性を示す。これはポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、再結合、および/または連結するために使用されうる代表的な酵素である。星印は、酵素がポリヌクレオチド基質の3'方向から5'方向に向かって作用することを示している。
【図２】  ポリメラーゼに基づく増幅による核酸構築ブロックの産生
ポリメラーゼに基づく増幅反応（例えばPCR）を用いて2つの突出をもつ二重鎖核酸構築ブロックを産生する方法を図示する。示されるように、最初のプライマーセット、F2およびR1を用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Aと同一な平滑末端産物（反応1、産物1と標記）を産生するために使用される。第二のプライマーセット、F1およびR2を用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Bと同一な平滑末端産物（反応2、産物2と標記）を産生するために使用される。これらの2つの産物はその後混合され、融解およびアニーリングされ、2つの突出を有する潜在的に有用な二重鎖核酸構築ブロックを産生する。図1の例では3'突出を有する産物（産物C）が、例えばエキソヌクレアーゼIII等の3'作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の3産物のヌクレアーゼに基づく破壊により選抜される。示されているように、利用可能なプライマーが重複しうり、かつ更に利用可能なプライマーが異なる長さでありうることを図示するために、代替のプライマーが括弧内に示されている。
【図３】  独特な（unique）突出および独特な結合
各サイズの独特な突出の数（例えば1、2または3等のヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出の使用によりもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示している。例えば単ヌクレオチドからなる4つの独特な3'突出、及び単ヌクレオチドからなる4つの独特な5'突出がある。しかし、全8個の独特な単ヌクレオチド3'突出および単ヌクレオチド5'突出を用いて作製されうる独特な結合の総数は4である。
【図４】  構築ブロックを順次結合することにより達成される独特の全体集合順序
全体で「n」個の核酸構築ブロックを集合させるためには「n-1」回の結合が必要とされる事実を図示している。しかし用途に利用可能な独特な結合の数は「n-1」値より小さいことが時々ある。これら及び他の状況下では、厳密な非確率論的全体集合順序は、一連の段階の集合過程を実施することによってもなお達成されうる。本例においては2回の連続した段階が5個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序を達成するために使用される。この図示では、5個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序は5'-(#1-#2-#3-#4-#5)-3'であり、式中、#1が構築ブロック番号1を表す（以下同じ）。
【図５】  2ヌクレオチド3'突出を用いて利用可能な独特な結合
さらに、各サイズの独特な突出の数（ここでは、例えば2ヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出の使用からもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示する。例えば、示されているような全32個に対しては、2ヌクレオチドからなる16個の独特な3'突出および2ヌクレオチドからなる別の16個の独特な5'突出がある。しかし、全32個の独特な2ヌクレオチド3'突出および2ヌクレオチド5'突出を用いて作製されうる、独特かつ自己結合しない結合の総数は12個である。いくつかの明らかな独特な結合は「一卵性双生児」（同じ影付けでマークされている）であり、それらはこの図示では視覚的に明らかである。さらに他の突出は、この図において示されおよび標識付けられているように回文構造性様式で自己結合できるヌクレオチド配列を含んでいる。それゆえ、それらは全体集合順序に対して高い厳密性を与えない。
【図６】  合成ライゲーション再集合によるキメラ組み合わせの網羅的なセットの産生
この例において設計された核酸構築ブロックの全ての可能な組み合わせを網羅的かつ体系的に産生する能力における本発明の力を見せている。特に大きな子孫キメラ分子セット（又はライブラリー）が産生されうる。本方法を網羅的かつ体系的に実施することが可能であるため、新規の境界点（demarcation point）を選抜することにより、かつ対応する新規に設計された核酸構築ブロックを用いて、その方法の適用を繰り返すことが可能であり、過去に試験されたおよび拒絶された分子種を再産生および再スクリーニングする負担は回避される。境界点の頻度を増加させるためにコドンゆらぎ（wobble）を有利に使用することが可能であることは理解される。言い換えると、コドン縮重のために、祖先コドンによりコードされるアミノ酸（すなわち現在変更されたコドン）を変更することなしに、ある特定の塩基がある核酸構築ブロックにしばしば置換されうる。図示されているように、境界点は8個の祖先鋳型のアラインメントに基づいて選抜される。それらの（順序付けられた結合形成に役立つ）突出を含む核酸構築ブロックがその後設計及び合成される。この例では、全144個の核酸構築ブロック（又は二重鎖オリゴ）を得るために、8個の祖先鋳型それぞれの配列に基づき18個の核酸構築ブロックが産生される。ライゲーション合成方法を実行することにより、818（又は1.8×1016超）のキメラ収量量からなる子孫分子のライブラリーが作製されると考えられる。
【図７】  オリゴからの合成遺伝子
本発明のある一つの態様によると、二重鎖核酸構築ブロックは複数の祖先核酸鋳型を整列化することにより設計される。好ましくはこれらの鋳型は、多少の類似性および多少のの異質性を含む。核酸は、その関連性が機能もしくは構造またはその両方に基づきうる、関連酵素等の関連タンパク質をコードしうる。3個のポリヌクレオチド祖先鋳型のアラインメントおよび全ての祖先分子により共有されている境界点（囲み表示）の選抜を示す。この特定の例においては、各祖先鋳型由来の核酸構築ブロックは約30ヌクレオチド長から50ヌクレオチド長となるように選抜された。
【図８】  合成ライゲーション遺伝子再集合のための核酸構築ブロック
図7の例からの核酸構築ブロックを示す。本明細書において核酸構築ブロックは、5'突出および3'突出の両方を含む適合性の突出を有する、一般的な漫画の形式で示されている。3個の祖先鋳型の各々に由来する全22個の核酸構築ブロックが存在する。したがってライゲーション合成方法により322（又は3.1×1010超）のキメラ収量からなる子孫分子のライブラリーが作製される。
【図９】  合成ライゲーション再集合によるイントロンの付加
核酸構築ブロック経由でイントロンがキメラ子孫分子内に導入されうることを、一般的な漫画の形式で示している。それらを動作可能にするために、イントロンはしばしば共通配列を両末端に有することが理解される。遺伝子スプライシングを可能にすることに加えて、他の核酸と類似した部位を提供することにより相同性組換えを可能にするという別の目的のためにイントロンがはたらきうることもまた理解される。この目的および潜在的な他の目的のためには、イントロンを導入するために巨大な核酸構築ブロックを産生することが時には望ましくてもよい。もし2つの一重鎖オリゴの直接化学合成により容易に産生されるよりもサイズが非常に大きいならば、図2に示されているように、そのような特殊化された核酸構築ブロックもまた2を超える一重鎖オリゴの直接化学合成により、またはポリメラーゼに基づく増幅反応を用いることにより産生されうる。
【図１０】  突出の全ヌクレオチドより少ない数を用いたライゲーション再集合
関係する突出において全てのヌクレオチドを使用しない様式で結合が起こりうるることを示している。「ギャップライゲーション」または「ギャップド（gapped）ライゲーション」と称されうるものを形成するリガーゼ酵素を用いた処理により結合が補強されるならば、結合は（例えば形質転換された宿主内で）特に存続する可能性が高い。示されているように、この種類の結合は不要なバックグラウンド産物の産生に寄与できるが、また設計されたライゲーション再集合により産生された子孫ライブラリーの多様性を有利に増加させるために使用されうることが理解される。
【図１１】  回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避
上述し、かつ図5に示されているように、ある突出は自己結合を受けることが可能であり、回文構造性結合を形成する。もしリガーゼ酵素を用いた処理により補強されるならば、結合は実質的に強化される。したがって、示されているようにこれらの突出における5'リン酸の欠失は、この種の回文構造性自己結合を阻止するために有利に使用されうることが理解される。したがって本発明により、ライゲーション再集合過程における回文構造性自己結合を阻止するために、例えばウシ小腸アルカリフォスファターゼ（CIAP）等の脱リン酸化酵素を用いた処理により、5'リン酸基を欠失する核酸構築ブロックが化学的に作製（または注文）されうる（また一方それらが除去されうる）。
【図１２】  経路操作
任意で飽和突然変異導入等の他の定方向進化法を用いて、ライゲーション再集合を用いる新規遺伝子経路を作製する方法を提供することが本発明の目標である。この目標を達成するためにとられうる好ましいアプローチを図示している。天然の微生物遺伝子経路は、時に部分的に連結されているに過ぎない天然の真核生物（例えば植物）遺伝子経路よりも、しばしば連結されていることが理解される。ある特定の態様では、本発明はライゲーション再集合過程により産生された子孫遺伝子経路に、（プロモーターを含む）制御遺伝子配列が核酸構築ブロックの形で導入されうることを提供する。それゆえ、本来連結されていない遺伝子および遺伝子経路ならびに元来連結されている微生物遺伝子経路が、植物および他の真核生物における実施可能性を獲得するためにそのように変換されうる。
【図１３】  回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避
新規遺伝子経路の産生に加えて、本発明で開示された定方向進化法（飽和突然変異導入および合成ライゲーション再集合を含む）を用いて改良型子孫分子を達成するため、本発明の別の目標は、天然および人工の両方の遺伝子経路を、突然変異導入および選抜に供することであることが図示されている。本発明で提供されているようにある特定の態様においては、微生物および植物の両経路を定方向進化により改良することができ、かつ示されているように、定方向進化過程を、経路に連結される前の遺伝子および遺伝子経路自身の両方に対して実施することができる。
【図１４】  微生物経路の真核生物経路への変換
ある特定の態様においては、本発明は、微生物経路が植物および他の真核生物種で機能する制御配列の導入によりそれらの種において実施可能な経路に変換されうることを提供する。好ましい制御配列はプロモーター、オペレーターおよびアクチベーター結合部位を含む。示されているようにそのような利用可能な制御配列の導入を達成する好ましい方法は、核酸構築ブロックの形式であり、特にライゲーション再集合過程における結合の使用を介する。これらの結合はA、B、C、DおよびFの文字でマークされている。
【図１５】  対応する推定ポリヌクレオチドを（インビボまたはインビトロ）合成することおよび推定ポリヌクレオチドを定方向進化に供すること、および続いて発現されたポリペプチドを発現スクリーニングすることによるポリペプチドの進化
本発明はライゲーション再集合および部位飽和性突然変異導入がヌクレオチド置換ならびにヌクレオチド欠失およびヌクレオチド付加ならびにそれらの組み合わせを導入するために各々役立つことを提供する。さらに合成ライゲーション再集合は、ヌクレオチドカセットの順序を非確率論的な事前決定された様式で再配列するために、単一の鋳型ならびに複数の開始鋳型において実施されうる。その上、複数の開始鋳型をライゲーション再集合に供する場合、（例えば各結合に関与する）各鋳型から同じ数の核酸構築ブロックが産生される必要はない。それゆえ例えば3個の鋳型が使用されるならば、その後各鋳型に対応する異なる数の核酸構築ブロックが産生されうる。
【図１６】  インシリコトリアージ（triage）
潜在的産物の分類および「構造機能」予測による分類の順位付けを図示しており、その段階は本明細書において「トリアージ」および、コンピュータの支援を用いて実施されるならば、具体的に「インシリコトリアージ」と称されるものの局面である。
【図１７】  固相ライゲーション再集合
【図１８】  ポリヌクレオチド再集合
定方向進化の例が示されている。n個の異なるウイルス株がこの図示で使用されているが、技術は、異なる株、種または遺伝子ファミリーが、他の相同な核酸と比較して1つ又は複数のヌクレオチドが変化された相同な核酸を有する任意の核酸、ならびに任意の単一の核酸にも適用可能である。本明細書に記載されているように、異なる変異核酸は実験的に、好ましくは非確率論的に産生され、スクリーニングまたは選抜されて所望の特性を示すそれらの変異体が同定される。さらなる改良を獲得するために定方向進化法およびスクリーニングは1回又は複数回反復されうる。パネルBは、連続した回の定方向進化が次第に増大された特性を産生することができ、かつ個々の有益な変異の組み合わせが、個々の有益な変異により達成される改良と比較して増大された改良をもたらしうることを示している。
【図１９Ａから図１９Ｃ】  ヒトおよび霊長類種由来の2つのCMV由来ヌクレオチド配列のアラインメント
ヒトおよび霊長類種の2つのCMV由来ヌクレオチド配列のアラインメントが示されている。このアラインメントは非確率論的ポリヌクレオチド再集合を実施するために役立つ。2配列により共有されるヌクレオチド配列は、再集合点の好ましいがこれに限定されない例を図示するために、赤字で示されている。
【図２０】  ヒト、ネコ、げっ歯類種由来のIFN-γヌクレオチド配列のアラインメント
ヒト、ネコ、げっ歯類種由来のIFN-γヌクレオチド配列のアラインメントが示されている。このアラインメントは非確率論的ポリヌクレオチド再集合を実施するために役立つ。再集合点の好ましいがこれに限定されない例を図示するために、2配列により共有されるヌクレオチド配列は青字で、かつ3配列により共有されるヌクレオチド配列は赤字で示されている。