(57)【要約】  本開示は、コスト効率の良いリジンの産生のためのコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株、このエンジニアリングされた株を作製するために使用されるツール及び方法、並びにエンジニアリングされた株を用いてリジンを産生する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＲＬ  Ｂ−６７５３５として寄託されたコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【請求項２】
ＮＲＲＬ  Ｂ−６７４３９として寄託された細菌のゲノムから本質的になる細菌ゲノムを有するが：
（ａ）ｃｇ１３８３開始コドンの前へのプロモーターの挿入；
（ｂ）天然のｐｈｏＵプロモーターの置換；
（ｃ）天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換；及び
（ｄ）天然のｃｇ０８００プロモーターの置換からなる群から選択される最大４つの構造変化を有するコリネバクテリウム。
【請求項３】
リジンを産生させるための請求項１又は請求項２のコリネバクテリウムの使用。
【請求項４】
リジンを産生する方法であって：
（ａ）請求項１又は請求項２に記載のコリネバクテリウムを培養すること；及び
（ｂ）前記コリネバクテリウムによって産生されたリジンを回収することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[1]  本開示で引用される各参考文献、特許、及び公開特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[2]  本出願には、２０１９年９月７日に作成された、本出願の配列表である「00820000060sequencelisting.txt,」という名称の１９５ｋｂのテキストファイルが参照により組み込まれる。
【０００３】
技術分野
[03]  本開示は、一般に、リジン産生に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】[04]図１Ａ及び図１Ｂは、米・国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）の参照番号ＷＰ＿０１１０１４７９１．１（配列番号７８）、ＷＰ＿０９６４５６６８７．１（配列番号７９）、及びＷＰ＿０２３６３５８７５．１（配列番号８０）によって同定された３つのコリネバクテリアリボヌクレアーゼＪ（ｒｎａＪ）タンパク質のアミノ酸配列との配列番号３の多重アラインメントである。ボックスは、配列番号３のアミノ酸４４８と整列する各配列におけるアミノ酸を明らかにする。図１Ａは、配列番号３のアミノ酸１〜５６０とのアラインメントである。
【図１Ｂ】[04]図１Ａ及び図１Ｂは、米・国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）の参照番号ＷＰ＿０１１０１４７９１．１（配列番号７８）、ＷＰ＿０９６４５６６８７．１（配列番号７９）、及びＷＰ＿０２３６３５８７５．１（配列番号８０）によって同定された３つのコリネバクテリアリボヌクレアーゼＪ（ｒｎａＪ）タンパク質のアミノ酸配列との配列番号３の多重アラインメントである。ボックスは、配列番号３のアミノ酸４４８と整列する各配列におけるアミノ酸を明らかにする。図１Ｂは、配列番号３のアミノ酸５６１〜７１８とのアラインメントである。
【図２】[05]図２は、ＮＣＢＩ参照番号ＷＰ＿０７５３４８１２８（配列番号８１）、ＡＧＴ０４８２８．１（配列番号８２）、及びＷＰ＿０６６５６４９７８．ｌ（配列番号８３）によって同定された３つのコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質のアミノ酸配列との配列番号６の多重アラインメントである。ボックスは、配列番号６のアミノ酸３１０と整列する各配列におけるアミノ酸を明らかにする。
【図３】[06]図３は、ＮＣＢＩ参照番号ＷＰ＿０１１８９７００１（配列番号８４）、ＷＰ＿０６６５６５１２４（配列番号８５）、及びＥＥＷ４９９７９（配列番号８６）によって同定された３つのコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質のアミノ酸配列との配列番号９の多重アラインメントである。ボックスは、配列番号９のアミノ酸６６と整列する各配列におけるアミノ酸を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
詳細な説明
[07]  本開示は、コスト効率の良いリジン産生のためのエンジニアリングされたコリネバクテリア（Corynebacteria）株、このエンジニアリングされた株を作製するために使用されるツール及び方法、並びにエンジニアリングされた株を使用してリジンを産生する方法を提供する。
【０００６】
構造変化
[08]  本開示は、リジン産生を改善するためにコリネバクテリア（Corynebacteria）にエンジニアリングすることができる以下の４つの構造変化を提供する：（ａ）ｃｇ１３８３開始コドンの前へのプロモーターの挿入、（ｂ）天然のｐｈｏＵプロモーターの置換、（ｃ）天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換、（ｄ）天然のｃｇ０８００プロモーターの置換。
【０００７】
ａ．ｃｇ１３８３開始コドンの前へのプロモーターの挿入
[09]  ｃｇ１３８３は、ＮＣｇ１１１７９としても知られており、ＡＢＣタイプのモリブデン輸送システムのＡＴＰａｓｅ成分をコードする（例えば、ＷＰ＿０１１０１４２１６．１）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｃｇ１３８３開始コドンの前に挿入される。挿入されるプロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであるか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター、又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、挿入されるプロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号及び国際公開第２０１７／００３７６号を参照されたい。
【０００８】
ｂ．天然のｐｈｏＵプロモーターの置換
[10]  ｐｈｏＵは、リン酸取り込みレギュレーター（例えば、ＢＡＢ９９９６４．１）をコードし、ｃｇｌ２５７１及びＮＣｇｌ２４８２としても知られている。いくつかの実施形態では、天然のｐｈｏＵプロモーターは、ｐｈｏＵ置換プロモーターで置換されている。ｐｈｏＵ置換プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ｐｈｏＵ置換プロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号及び国際公開第２０１７／００３７６号を参照されたい。
【０００９】
ｃ．天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換
[11]  ｃｇ３２１０は、ＮＣｇ１２８０２としても知られており、細胞エンベロープ関連転写調節因子（例えば、ＷＰ＿０１１２６６０２９．１）をコードする。いくつかの実施形態では、天然のｃｇ３２１０プロモーターは、ｃｇ３２１０置換プロモーターで置換されている。ｃｇ３２１０置換プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ｃｇ３２１０置換プロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号及び国際公開第２０１７／００３７６号を参照されたい。
【００１０】
ｄ．天然のｃｇ０８００プロモーターの置換
[12]  ｃｇ０８００は、ＮＣｇ１０６６８又はｐｒｐＲとしても知られており、ＭｅｒＲファミリーの転写調節をコードする（例えば、ＷＰ＿０１１０１３８２５．ｌ）。いくつかの実施形態では、天然のｃｇ０８００プロモーターは、ｃｇ０８００置換プロモーターで置換されている。ｃｇ０８００置換プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ｃｇ０８００置換プロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号及び国際公開第２０１７／００３７６号を参照されたい。
【００１１】
追加の構造変化
[13]  いくつかの実施形態では、上記の構造変化の１つ又は複数を含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、以下に記載の追加の構造変化（ｅ）〜（ｏ）の１つ又は複数を含み得る。
【００１２】
ｅ．改変されたコリネバクテリアリボヌクレアーゼＪタンパク質
[14]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、改変されたコリネバクテリアリボヌクレアーゼ（ｒｎａＪ）タンパク質を含み得る。改変されたコリネバクテリアｒｎａＪタンパク質はＧ４４８Ｓ置換を含む。そのようなタンパク質の一例が、配列番号３に示されている。本明細書で使用される「Ｇ４４８Ｓ置換を含むコリネバクテリアｒｎａＪタンパク質」は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）の株からのｒｎａＪタンパク質を意味し、このｒｎａＪタンパク質は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（登録商標）アラインメントツールを使用して配列番号３と比較した場合に、図１Ａ及び図Ｂに示されているように、配列番号３のアミノ酸４４８と整列する位置にグリシンの代わりにセリンを有する。Ｇ４４８Ｓ置換を含むように改変することができるコリネバクテリアｒｎａＪタンパク質には、限定されるものではないが、表１のＮＣＢＩ参照番号によって提供されるアミノ酸配列で同定されたタンパク質（命名方法に関係なく）が含まれる。
【００１３】
【表１】
2022500024.tif 000002
【００１４】
【表２】
2022500024.tif 000003
【００１５】
【表３】
2022500024.tif 000004
【００１６】
ｆ．改変されたコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質
[15]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、改変されたコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質を含み得る。改変されたコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質はＧ３１０Ｅ置換を含む。そのようなタンパク質の一例が配列番号６に示されている。本明細書で使用される「Ｇ３１０Ｅ置換を含むコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質」は、米・国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴ（登録商標）アラインメントツールを使用して配列番号６と比較すると、図２に例示されているように、配列番号６のアミノ酸３１０と整列する位置にグリシンの代わりにグルタミン酸を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）株由来のａｃｃＤＡタンパク質を意味する。Ｇ３１０Ｅ置換を含むように改変できるコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質には、限定されるものではないが、表２のＮＣＢＩ参照番号によって示されるアミノ酸配列で同定されるタンパク質（命名法に関係なく）が含まれる。
【００１７】
【表４】
2022500024.tif 000005
【００１８】
【表５】
2022500024.tif 000006
【００１９】
【表６】
2022500024.tif 000007
【００２０】
ｇ．改変されたコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質
[16]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、改変されたコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質を含み得る。改変されたコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質はＰ６６Ｓ置換を含む。このようなタンパク質の一例が配列番号９に示されている。本明細書で使用される「Ｐ６６Ｓ置換を含むコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質」は、米・国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴ（登録商標）アラインメントツールを使用して配列番号９と比較すると、図３に例示されているように、配列番号９のアミノ酸６６と整列する位置にプロリンの代わりにセリンを有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）株由来のｃｇ１１４４タンパク質を意味する。Ｐ６６Ｓ置換を含むように改変できるコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質には、限定されるものではないが、表３のＮＣＢＩ参照番号によって示されるアミノ酸配列で同定されるタンパク質（命名法に関係なく）が含まれる。
【００２１】
【表７】
2022500024.tif 000008
【００２２】
【表８】
2022500024.tif 000009
【００２３】
ｈ．ｃｇ２７６６開始コドンの前へのプロモーターの挿入
[17]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、ｃｇ２７６６開始コドンの前に挿入されたプロモーターを含み得る。挿入されるプロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、挿入されるプロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号及び国際公開第２０１７／００３７６号を参照されたい。
【００２４】
ｉ．天然のａｃｔＡプロモーターの置換
[18]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、天然のａｃｔＡプロモーターの代わりに置換ａｃｔＡプロモーターを含み得る。ａｃｔＡ置換プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ａｃｔＡ置換プロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である。
【００２５】
ｊ．天然のｏｐｃＡコード配列の置換
[19]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、天然のｏｐｃＡコード配列の代わりに、異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）種又は株のｏｐｃＡタンパク質のコード配列を含み得る。適切なｏｐｃＡタンパク質が、表４Ａ及び表４Ｂに一覧にされている。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（登録商標）アラインメントツールを使用すると、表４ＡのｏｐｃＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４のｏｐｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９４）と７５％未満同一であり、表４ＢのｏｐｃＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４のｏｐｃＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９４）と７５％超同一である。
【００２６】
[20]  いくつかの実施形態では、置換ｏｐｃＡコード配列は、ｚｗｆ及びｏｐｃＡの両方の発現を駆動するプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、置換ｏｐｃＡコード配列は、挿入されたｏｐｃＡプロモーターの制御下にある。挿入されるｏｐｃＡプロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、挿入されるｏｐｃＡプロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である。
【００２７】
【表９】
2022500024.tif 000010
【００２８】
【表１０】
2022500024.tif 000011
【００２９】
【表１１】
2022500024.tif 000012
【００３０】
【表１２】
2022500024.tif 000013
【００３１】
【表１３】
2022500024.tif 000014
【００３２】
【表１４】
2022500024.tif 000015
【００３３】
【表１５】
2022500024.tif 000016
【００３４】
ｋ．ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及び／又はｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーの挿入
［21］  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを含み得る。追加のコピーは、１つ又は複数のベクターを使用して提供することができる。実施例１は、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢのコピーを挿入するために使用できる２つの組み込みベクターについて説明する。
【００３５】
[22]  いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。
【００３６】
[23]  いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。
【００３７】
[24]  いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｋ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。
【００３８】
[25]  いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｄｄｈ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｄ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｄ及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ及びｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡ及びａｓｋの少なくとも１つの追加のコピーを含む。
【００３９】
[26]  他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｌｙｓＡの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｋの少なくとも１つの追加のアスクのコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ａｓｄの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｄｄｈの少なくとも１つの追加のコピーを含む。他の実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）は、ｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む。
【００４０】
[27]  エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）がｌｙｓＡの少なくとも１つの追加のコピーを含む上記のいずれの実施形態でも、ｌｙｓＡの追加コピーは、以下に説明されるコドンが最適化されたタイプのコピーである。
【００４１】
ｌ．ａｃｅＥの開始コドンの置換
[28]  いくつかの実施形態では、上記のコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株のいずれかのゲノムにおける天然のａｃｅＥ遺伝子の開始コドンが置換される。これらの実施形態のいくつかでは、開始コドンは、ＧＴＧ、ＣＴＧ、又はＴＴＧで置換される。いくつかの実施形態では、開始コドンは、ＴＴＧで置換される。
【００４２】
ｍ．天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターの置換
[29]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターの代わりにｐｙｃ置換プロモーターを含み得る。ｐｙｃ置換プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ｐｙｃ置換プロモーターは、プロモーターＰｃｇ１８６０（配列番号１１；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号を参照）である。
【００４３】
ｎ．ｚｗｆオープンリーディングフレームの前へのプロモーターの挿入
[30]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株はまた、ｚｗｆオープンリーディングフレームの前に挿入されたプロモーターを含み得る。挿入されるプロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、追加のプロモーターは、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である。
【００４４】
ｏ．コドン最適化ｌｙｓＡコード配列の挿入
[31]  上記の構造変化のいずれかを含むコリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株は、ターミネーター配列を含む、プロモーターの制御下にあるコドン最適化ｌｙｓＡコード配列を含み得る。プロモーターは、エンジニアリングされているコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株の異なる遺伝子からのプロモーターであり得るか、又は異種プロモーター（即ち、別のコリネバクテリウム（Corynebacterium）種若しくは株のプロモーター又は人工的に構築されたプロモーター）であり得る。これらのプロモーターには、限定されるものではないが、Nesvera et al., 2012；Patek et al., 2003(a)；Patek et al., 2003(b)；Patek et al., 2013；Rytter et al., 2014；Shang et al., 2017；Yim et al., 2013；米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号；及び国際公開第２０１７／００３７６号に開示されているプロモーターが含まれる。ターミネーター配列には、限定されるものではないが、Pfeifer-Sancar et al., 2013に開示されているものが含まれる。
【００４５】
[32]  いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｐｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である。これらの実施形態のいくつかでは、コドン最適化配列は配列番号１６である。これらの実施形態のいくつかでは、ターミネーターは、ｓｏｄターミネーター（配列番号１７のヌクレオチド１４３６〜１５１６）である。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたコリネバクテリウム（Corynebacterium）のゲノムは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、ｓｏｄターミネーター（配列番号１７のヌクレオチド１４３６〜１５１６）を含む、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）の制御下にあるコドン最適化ｌｙｓＡ配列（配列番号１６）である。
【００４６】
核酸及びベクター
[33]  ベクターを使用して、上記の１つ又は複数の構造変化を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）をエンジニアリングすることができ、対応する天然のコリネバクテリウム（Corynebacterium）（即ち、構造変化を含むようにエンジニアリングされていないコリネバクテリウム（Corynebacterium））と比較してリジン産生が改善される。そのようなコリネバクテリア（Corynebacteria）には、限定されるものではないが、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４として寄託されたコリネバクテリウム（Corynebacterium）、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７４３９として寄託されたコリネバクテリウム（Corynebacterium）、並びに表１、表２、表３、表４Ａ、及び表４Ｂのコリネバクテリア種及び株が含まれる。ベクターをコリネバクテリア（Corynebacteria）に送達する方法は周知であり、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、及び感染が含まれる。
【００４７】
[34]  上記の改変をエンジニアリングするために使用することができる核酸は周知であり、例えば、米国特許第７，３６８，２７６号、米国特許第６，９２７，０４６号、米国特許出願公開第２０１７／０１５９０４５号、及び国際公開第２０１７／００３７６号、並びに以下の実施例に記載されている。上記の改変されたコリネバクテリアｒｎａＪ、ａｃｃＤＡ、及びｃｇ１１４４タンパク質をコードする核酸は、ベクターに含めることができ、このベクターでは、コード配列がコリネバクテリウム（Corynebacterium）での発現に適した調節配列に作動可能に連結されている。配列番号２、配列番号５、及び配列番号８はそれぞれ、配列番号３、配列番号６、及び配列番号９をコードするヌクレオチド配列の例であるが、改変されたコリネバクテリアタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を使用することができる。ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知であるコリネバクテリア（Corynebacteria）の様々な種又は株での発現のために最適化することができる。
【００４８】
[35]  調節配列は、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位及び転写と翻訳の終結を調節するための配列を含み、プロモーター又はオペレーターなどの他の要素を含み得る。ひとたび宿主コリネバクテリウム（Corynebacterium）に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立に複製又は機能し得るか、又はゲノム自体に組み込まれ得る。使用されるベクターは、特に限定されるものではなく、コリネバクテリウム（Corynebacterium）宿主において複製することができるのであれば、当技術分野で公知のあらゆるベクターであり得る。例えば、Lee, 2014; Knoppova et al., 2007；及びPatek & Nesvera, 2013を参照されたい。
【００４９】
[36]  ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。適切な抗生物質には、例えば、アミカシン、アンピシリン、オーグメンチン（アモキシシリン及びクラブロン酸（clavulonic acid））、セファゾリン、セフォキシチン、セフタジジム、セフチオフル、セファロチン、クロラムフェニコール、エンロフロキサシン、フロルフェニコール、ゲンタマイシン、イミペネム、カナマイシン、ペニシリン、サラフロキサシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、及びチルミコシンが含まれる。
【００５０】
コリネバクテリア（Corynebacteria）のエンジニアリングされた株
[37]  本開示は、上記の４つの改変、即ち、（ａ）ｃｇ１３８３開始コドンの前への置換プロモーターの挿入；（ｂ）天然のｐｈｏＵプロモーターの置換；（ｃ）天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換；及び（ｄ）天然のｃｇ０８００プロモーターの置換、並びに以下の改変のうちの少なくとも１つのうちの少なくとも１つを含むようにエンジニアリングされたコリネバクテリア（Corynebacteria）株を提供する：
（ｅ）Ｇ４４８Ｓ置換を含むリボヌクレアーゼＪタンパク質をコードするためのｒｎａＪコード配列の改変；
（ｆ）Ｇ３１０Ｅ置換を含むアセチルＣｏＡカルボキシラーゼカルボキシルトランスフェラーゼサブユニットα／βタンパク質をコードするための天然のａｃｃＤＡコード配列の改変；
（ｇ）Ｐ６６Ｓ置換を含むｃｇ１１４４タンパク質をコードするための天然のｃｇ１１４４コード配列の改変；
（ｈ）ｃｇ２７６６開始コドンの前へのプロモーターの挿入；
（ｉ）天然のａｃｔＡプロモーターの置換；
（ｊ１）異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）種又は株のｏｐｃＡタンパク質のコード配列による天然のｏｐｃＡコード配列の置換；
（ｊ２）挿入されたｏｐｃＡプロモーターの制御下にある異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）種又は株のｏｐｃＡタンパク質のコード配列による天然のｏｐｃＡコード配列の置換；
（ｋ）ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの追加コピーの挿入；
（ｌ）天然のａｃｅＥ遺伝子の開始コドンの置換；
（ｍ）天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターの置換；
（ｎ）ｚｗｆオープンリーディングフレームの前への追加のプロモーターの挿入；並びに
（ｏ）コドン最適化ｌｙｓＡコード配列の挿入。
【００５１】
[38]  エンジニアリングされたコリネバクテリア（Corynebacteria）の以下の非限定的な実施形態は上記の説明の範囲内である。
【００５２】
実施形態１．ブタペスト条約の規定の下で２０１７年１２月２２日にAgriculture Research Culture Collection (NRRL) International Depository Authority, 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604に、割り当てアクセッション番号ＮＲＲＬ  Ｂ−６７５３５として寄託されたコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００５３】
実施形態２．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７４３９として寄託された細菌のゲノムから本質的になるが、以下からなる群から選択される最大４つの構造変化を有する細菌ゲノムを有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）：
（ａ）ｃｇ１３８３開始コドンの前へのプロモーターの挿入；
（ｂ）天然のｐｈｏＵプロモーターの置換；
（ｃ）天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換；及び
（ｄ）天然のｃｇ０８００プロモーターの置換。
【００５４】
実施形態３．ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４として寄託された細菌のゲノムから本質的になるが、以下の構造変化を有する細菌ゲノムを有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）、
（ｉ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの構造変化：
（ａ）ｃｇ１３８３開始コドンの前へのプロモーターの挿入；
（ｂ）天然のｐｈｏＵプロモーターの置換；
（ｃ）天然のｃｇ３２１０プロモーターの置換；及び
（ｄ）天然のｃｇ０８００プロモーターの置換；並びに
（ｉｉ）以下からなる群から選択される少なくとも１つの追加の構造変化：
（ｅ）Ｇ４４８Ｓ置換を含むコリネバクテリアｒｎａＪタンパク質をコードするためのｒｎａＪコード配列の改変；
（ｆ）Ｇ３１０Ｅ置換を含むコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質をコードするための天然のａｃｃＤＡコード配列の改変；
（ｇ）Ｐ６６Ｓ置換を含むコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質をコードするための天然のｃｇ１１４４コード配列の改変；
（ｈ）ｃｇ２７６６開始コドンの前へのプロモーターの挿入；
（ｉ）天然のａｃｔＡプロモーターの置換；
（ｊ１）異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）のｏｐｃＡタンパク質の置換ｏｐｃＡコード配列による天然のｏｐｃＡコード配列の置換；
（ｊ２）挿入されたｏｐｃＡプロモーターの制御下にある異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）のｏｐｃＡタンパク質の置換ｏｐｃＡコード配列による天然のｏｐｃＡコード配列の置換；
（ｋ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの追加コピーの挿入；
（ｌ）ａｃｅＥの天然の開始コドンのＧＴＧ、ＣＴＧ、又はＴＴＧでの置換；
（ｍ）プロモーターＰｃｇ１８６０（配列番号１１）による天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターの置換；
（ｎ）ｚｗｆオープンリーディングフレームの前へのプロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）の挿入；
（ｏ）コドン最適化ｌｙｓＡコード配列の挿入。
【００５５】
実施形態４．ｃｇ１３８３開始コドンの前のプロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である、実施形態２又は３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００５６】
実施形態５．天然のｐｈｏＵプロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）で置換されている、実施形態２〜４のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００５７】
実施形態６．天然のｃｇ３２１０プロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）で置換されている、実施形態２〜５のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００５８】
実施形態７．天然のｃｇ０８００プロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）で置換されている、実施形態２〜６のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００５９】
実施形態８．（ｅ）天然のｒｎａＪコード配列が、Ｇ４４８Ｓ置換を含むコリネバクテリアｒｎａＪタンパク質をコードするように改変されている、実施形態３〜７のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６０】
実施形態９．（ｅ）天然のｒｎａＪコード配列が、配列番号３のアミノ酸配列をコードするように改変されている、実施形態３〜８のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６１】
実施形態１０．（ｆ）天然のａｃｃＤＡコード配列が、Ｇ３１０Ｅ置換を含むコリネバクテリアａｃｃＤＡタンパク質をコードするように改変されている、実施形態３〜９のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６２】
実施形態１１．（ｆ）天然のａｃｃＤＡコード配列が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするように改変されている、実施形態３〜１０のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００６３】
実施形態１２．（ｇ）天然のｃｇ１１４４コード配列が、Ｐ６６Ｓ置換を含むコリネバクテリアｃｇ１１４４タンパク質をコードするように改変されている、実施形態３〜１１のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６４】
実施形態１３．（ｇ）天然のｃｇ１１４４コード配列が、配列番号９のアミノ酸配列をコードするように改変されている、実施形態３〜１２のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００６５】
実施形態１４．（ｈ）プロモーターが、ｃｇ２７６６開始コドンの前に挿入されている、実施形態３〜１３のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００６６】
実施形態１５．（ｈ）ｃｇ２７６６開始コドンの前に挿入されたプロモーターがプロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である、実施形態３〜１４のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６７】
実施形態１６．（ｉ）天然のａｃｔＡプロモーターが置換されている、実施形態３〜１５のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００６８】
実施形態１７．（ｉ）天然のａｃｔＡプロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）で置換されている、実施形態３〜１６のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００６９】
実施形態１８．（ｊ）天然のｏｐｃＡコード配列が、異なるコリネバクテリウム（Corynebacterium）のｏｐｃＡタンパク質の置換ｏｐｃＡコード配列で置換されている、実施形態３〜１７のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００７０】
実施形態１９．天然のｏｐｃＡコード配列が、コリネバクテリウム・ビタエルミニス（Corynebacterium vitaeruminis）DSM 20294、コリネバクテリウム・マトルショッティイ（Corynebacterium matruchotii）ATCC 33806、コリネバクテリウム・ファルセニイ（Corynebacterium falsenii）DSM 44353、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）YIM 70093、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Corynebacterium pyruviciproducens）ATCC BAA-1742、コリネバクテリウム・カゼイ（Corynebacterium casei）UCMA 3821、コリネバクテリウム・テルペノタビダム（Corynebacterium terpenotabidum）Y-11、及びＣ．フミレデュセンス（C. humireducens）NBRC 106098からなる群から選択されるコリネバクテリウム（Corynebacterium）のｏｐｃＡタンパク質の置換ｏｐｃＡコード配列で置換されている、実施形態３〜１８のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００７１】
実施形態２０．天然のｏｐｃＡコード配列が、Ｃ．フミレデュセンス(C. humireducens)ＮＢＲＣ  １０６０９８のｏｐｃＡタンパク質の置換ｏｐｃＡコード配列で置換されている、実施形態３〜１９のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００７２】
実施形態２１．置換ｏｐｃＡコード配列が、挿入されたｏｐｃＡプロモーターの制御下にある、実施形態３〜２０のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００７３】
実施形態２２．挿入されたｏｐｃＡプロモーターが、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）である、実施形態２１のコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００７４】
実施形態２３．（ｋ）細菌のゲノムが、ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを含む、実施形態３〜２２のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００７５】
実施形態２４．細菌のゲノムが、（ａ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加のコピーを含む、実施形態２３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００７６】
実施形態２４．細菌のゲノムが以下を含む、実施形態２３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌：
（ｂ）ａｓｋ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｃ）ｌｙｓＡ、ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｄ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｅ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；又は
（ｆ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー。
【００７７】
実施形態２５．細菌のゲノムが以下を含む、実施形態２３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌：
（ｇ）ａｓｄ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｈ）ａｓｋ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｉ）ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｊ）ａｓｋ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー；
（ｋ）ｌｙｓＡ、ｄｄｈ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｌ）ｌｙｓＡ、ａｓｄ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｍ）ｌｙｓＡ、ａｓｄ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー；
（ｎ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；又は
（ｏ）ｌｙｓＡ、ａｓｋ、及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー。
【００７８】
実施形態２６．細菌のゲノムが以下を含む、実施形態２３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌：
（ｐ）ｄｄｈ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｑ）ａｓｄ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｒ）ａｓｄ及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー；
（ｓ）ｌｙｓＡ及びｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー；
（ｔ）ｌｙｓＡ及びｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー；
（ｕ）ｌｙｓＡ及びａｓｋの少なくとも１つの追加コピー。
【００７９】
実施形態２７．細菌のゲノムが以下を含む、実施形態２３のコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌：
（ｖ）ｌｙｓＡの少なくとも１つの追加コピー；
（ｗ）ａｓｋの少なくとも１つの追加のコピー；
（ｘ）ａｓｄの少なくとも１つの追加コピー；
（ｙ）ｄｄｈの少なくとも１つの追加コピー；又は
（ｚ）ｄａｐＢの少なくとも１つの追加コピー。
【００８０】
実施形態２８．ａｃｅＥの開始コドンが、ＴＴＧ、ＧＴＧ、又はＣＴＧで置換されている、実施形態３〜２７のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８１】
実施形態２９．ａｃｅＥの開始コドンがＴＴＧで置換されている、実施形態３〜２８のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８２】
実施形態３０．天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターが置換されている、実施形態３〜２９のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８３】
実施形態３１．天然のｐｙｃ遺伝子プロモーターがプロモーターＰｃｇ１８６０（配列番号１１）で置換されている、実施形態３〜３０のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８４】
実施形態３２．プロモーターが、ｚｗｆオープンリーディングフレームの前に挿入されている、実施形態３〜３１のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８５】
実施形態３３．プロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）が、ｚｗｆオープンリーディングフレームの前に挿入されている、実施形態３〜３２のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００８６】
実施形態３４．（ｏ）コドン最適化ｌｙｓＡコード配列を含む、実施形態３〜３３のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００８７】
実施形態３５．コドン最適化されたｌｙｓＡコード配列が、Ｐｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）の制御下にある、実施形態３４のコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００８８】
実施形態３６．コドン最適化ｌｙｓＡコード配列の異種ターミネーターを含む、実施形態３４又は３５のコリネバクテリウム（Corynebacterium）。
【００８９】
実施形態３７．配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、実施形態３４〜３６のいずれかのコリネバクテリウム（Corynebacterium）菌。
【００９０】
リジンの産生
[39]  コリネバクテリア（Corynebacteria）を使用してリジンを産生する方法は当技術分野で周知であり、本開示で提供されるエンジニアリングされたコリネバクテリア（Corynebacteria）は、これらの方法のいずれかで使用することができる。例えば、米国特許第８，０４８，６４９号、同第７，６３５，５７９号、同第７，５０４，２４２号、同第７，３００，７７７号、同第７，２６７，９６７号、同第７，１６０，７１１号、同第７，１４１，３８８号、同第７，１２２，３６９号、同第６，９２７，０４６号、同第６，８３０，９０３号、米国特許出願公開第２００２／００８６３７１号、同第２００４／００４３４５８号、同第２００９／０３２５２４４号、欧州特許第１２４６９２１号、及び同第１６１９２５２号を参照されたい。
【００９１】
[40]  当業者であれば、添付の特許請求の範囲内に含まれる上記の実施形態の多数の変形形態及び変更形態が存在することを理解されよう。
【実施例】
【００９２】
実施例１．Ｌ−リジン経路４遺伝子構築物の調製
実施例１Ａ．ｂｉｏＤ領域にリジン生合成遺伝子ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈを含む組み込みベクターの構築
[41]  ｐＢＫＭＳベクターは、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）で複製できないｐＢＲ３２２誘導体であり、スクロース対抗選択の強力な合成プロモーターの制御下の、カナマイシン耐性遺伝子マーカー及びバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のレバンスクラーゼｓａｃＢ遺伝子を含む。５．４ｋｂのａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｄａｐＢ−ｏｒｆ２’カセット（４Ｇｏ）を、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈプラスミド（米国特許第７，３６８，２７６号）からＰｍｅＩ及びＸｍａＩを用いて消化し、ＨｉｎｃＩＩ及びＸｍａＩを用いて線状化ｐＤＥｌｉａ１１（米国特許第６，９２７，０４６号）にライゲーションしてｐＤ１１−ＫＢＤＨを構築した。
【００９３】
[42]  ＳｐｅＩ部位を含む９．４ｋｂの相同領域を生成するために、プライマー１８４ｆ７（配列番号７０）及び１８４Ｆ８（配列番号７１）を使用してＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅し、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）（Clontech）によってｐＢＫＭＳベクターＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＢＫＭＳ  １８４  ３ｐをＳｐｅＩで消化し、プライマー１６１−ｌ８４ｆ５及び１６２−ｌ８４ｒ６を用いてＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡから同様に得た第２のＰＣＲ産物を、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）反応によって挿入してｐＢＫＭＳ１８４を作製した。５．４ｋｂの４ＧＯカセットを、プライマー２４４−４Ｇｏ  Ｆ２  Ｉｎｆ  ＳｐｅＩ（配列番号７２）及び２５３−４Ｇｏ  Ｒ３（配列番号７３）を用いてｐＤ１１−ＫＤＢＨから増幅し、ＳｐｅＩで消化し、ライゲーションによりｐＢＫ  ＭＳ  １８４  ＳｐｅＩ部位にクローニングした。
【００９４】
実施例１Ｂ．リジン生合成遺伝子ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ及び標的組み込みのためのＦａｒＩ相同領域を含むベクターの構築
[43]  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４由来株からの３’ＦａｒＩ相同性領域を、プライマーＦａｒＩ  ３Ｐ  ＩｎｆｕｓＦ（配列番号３０）及びＦａｒＩ  ３Ｐ  ＩｎｆｕｓＲ  ＡｖｒＩＩ（配列番号３１）を用いてＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ断片を、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）（Clontech）反応によってｐＢＫＭＳにクローニングし、ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐＢＫＭＳ  ＦａｒＩ  ３ｐを作製した。同様に、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４由来株からの５’ＦａｒＩ相同性領域を、プライマーＦａｒＩ  ５ｐ  ＩｎｆｕｓＦ（配列番号３２）及びＦａｒＩ  ５ｐ  ＩｎｆｕｓＲ（配列番号３３）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＢＫＭＳ  ＦａｒＩ  ３ｐのＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩ部位にクローニングしてｐＢＫＭＳ  ＦａｒＩを作製した。
【００９５】
[44]  ５．４ｋｂのａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｄａｐＢ−ｏｒｆ２’カセット（４Ｇｏ）を、ＰｍｅＩ及びＸｍａＩを用いてｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈプラスミド（米国特許第７３６８２７６号）から消化し、ＨｉｎｃＩＩ及びＸｍａＩを用いて線状化ｐＤＥｌｉａ１１（米国特許６，９２７，０４６号）にライゲーションした。得られたベクターｐＤ１１−ＫＢＤＨを、ＮｒｕＩ及びＳｗａＩで消化してｄｄｈ−ｄａｐＢ  ２．９ｋｂ断片を除去して、ｐＤ１１ＫＤを作製した。次いで、ｐＤ１１ＫＤをＳｍａＩを用いて消化し、プライマー６８５（配列番号７４）及び６８６（配列番号７５）を用いてｐＤ１１ＫＤＢＨから１．３６ｋｂのＰＣＲ断片を増幅し、これを、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）（Clontech）を用いて挿入してｐＤ１１ＫＤＨを作製した。次いで、プライマー６８７（配列番号７６）及び６９３（配列番号７７）を用いてｐＤ１１ＫＤＢＨから９８６ｂｐのｄａｐＢ断片を増幅し、これを、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）（Clontech）反応によってｐＤ１１ＫＤＨ  ＳｂｆＩ部位にクローニングした。得られたｐＤ１１ＫＢＤＨ  ＲプラスミドからＳｐｅＩでの制限によってＫＢＤＨ断片を切り出し、これを、ｐＢＫＭＳ  ＦａｒＩのＡｖｒＩＩ部位にクローニングしてｐＢＫＭＳＦａｒＩ４ＧＲＡを作製した。
【００９６】
実施例２．Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）の対立遺伝子置換
[45]  この実施例では、以下の実施例４での対立遺伝子置換に使用される方法について説明する。菌株を、ＯＤ  ６６０ｎｍが０．５に達するまで、培地Ｂ（表５）又はＢＨＩブロス（BD Biosciences）で３０℃で培養した。細胞を遠心分離によって４℃で回収し、氷冷した脱イオン水で２回洗浄し、氷冷した１０％グリセロールに再懸濁して、エレクトロコンピテントなＣ．グルタミカム（C. glutamicum）細胞を作製した。プラスミドと細胞を混合し、エレクトロポレーションで形質転換し、１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＢＨＩ寒天プレートにプレーティングし、プラスミドを組み込んだ形質転換体（カナマイシン耐性、スクロース感受性）が現れるまでインキュベートした。形質転換体を、追加の５％スクロース（最終濃度１０％スクロース）を添加した培地Ｂ（表５）で３０℃でさらに一晩培養し、培地Ｂにプレーティングして、２回目の組換え事象でプラスミドを切除した菌株を選択したため、スクロース耐性且つカナマイシン感受性であった。クローンをＰＣＲ及び配列決定によってさらにスクリーニングして、目的の変異の存在を検証した。
【００９７】
【表１６】
2022500024.tif 000017
【００９８】
実施例３．ゲノムＤＮＡの抽出
[46]  ゲノムＤＮＡを抽出するために、選択した菌株を、培地Ｂ（表５）で３０℃で一晩増殖させた。５０００×ｇ（４℃）で１０分間の遠心分離によって培養物を沈殿させた。ペレットを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  グルコース、及び２０ｍｇ／ｍｌ  リゾチームを含む１０ｍｌの溶液に懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。１．３ｍｌの１０％ＳＤＳ、６７μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ  Ａ、及び１６７μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌストック）を添加した後、インキュベーションをさらに２時間延長した。ゲノムＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出と、２倍量の氷冷エタノール及び０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の添加による沈殿とによってさらに精製した。−８０℃で１時間インキュベートした後、１４，０００ｒｐｍ（４℃）での１時間の遠心分離によってＤＮＡペレットを分離し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、ヌクレアーゼを含まない水に溶解した。
【００９９】
実施例４．挿入断片のｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ由来ベクターへの組み込み及びＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株への形質転換
実施例４Ａ．組み込み及び対立遺伝子置換のためのプラスミドの構築
[47]  上流又は下流の相同組換え領域の生成に使用されるすべてのＤＮＡ断片、及びインサートを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４株から抽出された精製ゲノムＤＮＡから、若しくは実施例２に記載されているようにこの株に由来する配列を含むプラスミドから増幅するか、又は化学的に合成した（ＤＮＡ２．０）。酵母で選択するためのＵＲＡ３遺伝子を含むｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaffer et al., Gene 145: 69-73, 1994; Accession FJ437239）に由来するｐＺベクターを、Ｃ．グルタミカム（C. glutamicum）に変化を導入するためのベクターバックボーンとして使用した。相同性アーム及びインサートを、酵母における相同組換えによってベクターバックボーンに組み立てた（Ma et al., Gene (58): 201-16, 1987）。各ＤＮＡ断片には、隣接する部分との正確な構築を確実にするために、両側に５０ｂｐの重複が含まれていた。構築のために、線状化ベクターバックボーン、２つの相同性アーム、及び任意選択による挿入されたＤＮＡ断片を同時に、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＥＮ．ＰＫ（Entian & Kotter, Methods in Microbiology 36: 629-66, 2007）に形質転換し、ウラシルを含まない合成完全寒天培地（Sigma）にプレーティングした。構築されたプラスミドを、ZYMOPREP（商標）Ｉ酵母プラスミドミニプレップキット（Zymo Research）を使用して酵母から抽出し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン選択で大腸菌（E. coli）１０−ベータ細胞（New England Biolabs）で増殖させてから、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）に形質転換した。
【０１００】
実施例４Ｂ．ｒｎａＪＧ４４８Ｓ対立遺伝子を導入するための形質転換ベクターの構築
[48]  ２つの相同性アームを、実施例３に記載されているように、得られたＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲを使用して増幅した。
【０１０１】
[49]  約２．１ｋｂの下流相同性アーム（配列番号１のヌクレオチド２０２６〜４１０１）を、プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ１（配列番号３８）及びＳＮＰ＿０８４＿Ｐ２（配列番号３９）を使用して増幅した。プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐｌには、実施例４Ａに記載のｐＺバックボーンと重複する５０ヌクレオチドの５’伸長が含まれている。プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ２には、Ｇ４４８Ｓ置換を導入するために２５位にＧからＡへの置換が含まれている。同様に、約２．１ｋｂの上流相同性アーム（配列番号１のヌクレオチド１〜２０７５）を、プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ３（配列番号４０）及びＳＮＰ＿０８４＿Ｐ４（配列番号４１）を使用して増幅した。プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ３には、Ｇ４４８Ｓ置換を導入するために２０位にＣからＴへの置換が含まれている。ＳＮＰ＿０８４＿Ｐ４には、実施例４Ａに記載のｐＺと重複する５０塩基の５’伸長が含まれている。２つの相同性アームのアラインメントにより、プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ２及びＳＮＰ＿０８４＿Ｐ３によって明確にされた５０ｂｐの重複が生じている。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、Ｇ４４８Ｓ置換を有するｒｎａＪアミノ酸配列（配列番号３）をコードする改変ｒｎａＪコード配列（配列番号２）を有する。
【０１０２】
実施例４Ｃ．ａｃｃＤＡＧ３１０Ｅ対立遺伝子を導入するための形質転換ベクターの構築
[50]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０７０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号４のヌクレオチド２０３２〜４１０１）を、プライマーＳＮＰ＿０３３＿Ｐ１（配列番号４６）及びＳＮＰ＿０３３＿Ｐ２（配列番号４７）を使用して増幅した。プライマーＳＮＰ＿０３３＿Ｐｌには、実施例４Ａに記載のｐＺベクターバックボーンと重複する５０ヌクレオチドの５’伸長が含まれている。プライマーＳＮＰ＿０３３＿Ｐ２には、Ｇ３１０Ｅ変異を導入するために２０位にＧからＡへの置換が含まれている。同様に、約２．１ｋｂの上流相同性アーム（配列番号４のヌクレオチド１〜２０７１）を、プライマーＳＮＰ＿０８４＿Ｐ３（配列番号４８）及びＳＮＰ＿０８４＿Ｐ４（配列番号４９）を用いて増幅した。プライマーＳＮＰ＿０３３＿Ｐ３には、Ｇ３１０Ｅ変異を導入するために２１位にＣからＴへの置換が含まれている。ＳＮＰ＿０３３＿Ｐ４には、実施例４Ａに記載のｐＺバックボーンと重複する５０塩基の５’伸長が含まれている。２つの相同性アームのアラインメントにより、プライマーＳＮＰ＿０３３＿Ｐ２及びＳＮＰ＿０３３＿Ｐ３によって明確にされた４０ｂｐの重複が生じている。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、Ｇ３１０Ｅ置換を有するａｃｃＤＡアミノ酸配列（配列番号６）をコードする改変ａｃｃＤＡコード配列（配列番号５）を有する。
【０１０３】
実施例４Ｄ．ｃｇ１１４４Ｐ６６Ｓ対立遺伝子を導入するための形質転換ベクターの構築
[51]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０３７ｂｐの上流相同性アーム（配列番号７のヌクレオチド１〜２０３７）を、プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ１（配列番号５０）及びＳＮＰ＿３１６＿Ｐ２（配列番号５１）を用いて増幅した。プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ１には、実施例４Ａに記載のｐＺベクターバックボーンと重複する５０ヌクレオチドの５’伸長が含まれている。プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ２には、Ｐ６６Ｓ変異を導入するために２１位にＧからＡへの置換が含まれている。同様に、２０７０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号７のヌクレオチド１９９８〜４０６７）を、プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ３（配列番号５２）及びＳＮＰ＿３１６＿Ｐ４（配列番号５３）を用いて増幅した。プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ３には、Ｐ６６Ｓ変異を導入するために２０位にＣからＴへの置換が含まれている。ＳＮＰ＿３１６＿Ｐ４には、実施例４Ａに記載のｐＺバックボーンと重複する５０塩基の５’伸長が含まれている。２つの相同性アームのアラインメントにより、プライマーＳＮＰ＿３１６＿Ｐ２及びＳＮＰ＿３１６＿Ｐ３によって明確にされた４０ｂｐの重複が生じている。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、Ｐ６６Ｓ置換を有するｃｇ１１４４アミノ酸配列（配列番号９）をコードする改変ｃｇ１１４４コード配列（配列番号８）を有する。
【０１０４】
実施例４Ｅ．天然のｐｙｃプロモーターをプロモーターＰｃｇ１８６０で置換するための形質転換ベクターの構築
[52]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０４３ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１０のヌクレオチド１〜２０４３）をプライマーＰｃｇ１８６０＿ｐｙｃ＿Ｐ１（配列番号４２）及びＰｃｇ１８６０＿ｐｙｃ＿Ｐ２（配列番号４３）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１０のヌクレオチド２１６１〜４２１０）を、プライマーＰｃｇ１８６０＿ｐｙｃ＿Ｐ３（配列番号４４）及びＰｃｇ１８６０＿ｐｙｃ＿Ｐ４（配列番号４５）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ１８６０ヌクレオチド配列（配列番号１１）は、プライマーＰｃｇ１８６０＿ｐｙｃ＿Ｐ２及びＰｃｇ１８６０−ｐｙｃ＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、ｐｙｃプロモーター（配列番号１２）の代わりにプロモーターＰｃｇ１８６０（配列番号１１）を有する。
【０１０５】
実施例４Ｆ．ａｃｅＥａｔｇ＞ｔｔｇ対立遺伝子を導入するための形質転換ベクターの構築
[53]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０７２ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１３のヌクレオチド１〜２０７２）を、プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ１（配列番号５４）及びＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ２（配列番号５５）を用いて増幅した。プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ１には、実施例４Ａに記載のｐＺベクターバックボーンと重複する５０ヌクレオチドの５’伸長が含まれている。プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ２には、Ａ変異を導入するために２２位にＴからＡへの置換が含まれている。同様に、２０７３ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１３のヌクレオチド２０２９〜４１０１）を、プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ３（配列番号５６）及びＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ４（配列番号５７）を用いて増幅した。プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ３には、Ｔ変異を導入するために２３位にＡからＴへの置換が含まれている。ＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ４には、実施例４に記載のｐＺバックボーンと重複する５０塩基の５’伸長が含まれている。２つの相同性アームのアラインメントにより、プライマーＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ２及びＳＮＰ＿ａｃｅＥ＿Ｐ３によって明確にされた４４ｂｐの重複が生じている。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、ａｃｅＥオープンリーディングフレーム（配列番号１４）にＴＴＧ開始コドンを有する。
【０１０６】
実施例４Ｇ．コドン最適化ｌｙｓＡコード配列の挿入
[54]  配列番号１６のコドン最適化ｌｙｓＡ断片を含むカセットを、配列番号１５のヌクレオチド２０４８と２０４９の間に挿入し、実施例４Ａに記載のｐＺベクターに合成的に組み立てた（ＤＮＡ２．０）。最終的なプラスミドには、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡＣＯ−ｓｏｄＴ（配列番号１７）に隣接する２つの約２ｋｂの相同性アーム（ヌクレオチド１〜２０４８、及び配列番号１５のヌクレオチド２０４９〜４０９９）が含まれる。ｌｙｓＡＣＯ含有プラスミドを、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、プロモーターＰｃｇ０００７＿３９の制御下のコドン最適化ｌｙｓＡコード配列の追加コピーを有する。
【０１０７】
実施例４Ｈ．ｚｗｆコード配列の上流へのプロモーターの挿入
[55]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０５０ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１９のヌクレオチド１〜２０５０）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ＿Ｐ１（配列番号３４）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ＿Ｐ２（配列番号３５）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１９のヌクレオチド２０５２〜４１０１）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ＿Ｐ３（配列番号３６）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ＿Ｐ４（配列番号３７）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｐｙｃ＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、配列番号１９のヌクレオチド２０５１がプロモーターＰｃｇ０００７＿３９（配列番号２０）によって置換されている。得られた菌株は、ｚｗｆＯＲＦ（配列番号２１）の上流にプロモーターＰｃｇ０００７＿３９を有する。
【０１０８】
実施例４Ｉ．Ｃ．フミレデュセンス（C. humireducens）ＮＢＲＣ１０６０９８のｏｐｃＡコード配列による天然のｏｐｃＡコード配列の置換
[56]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４由来株ＢＳ２ＣＺゲノムＤＮＡ（実施例３）からＰＣＲによって増幅した。２０３９ｂｐの上流相同性アーム（配列番号２２のヌクレオチド１〜２０３９）を、プライマーｏｐｃＡ＿Ｐ１（配列番号５８）及びｏｐｃＡ＿Ｐ２（配列番号５９）を用いて増幅した。同様に、２０８３ｂｐの下流相同性アーム（配列番号２２のヌクレオチド３０００〜５０８２）を、プライマーｏｐｃＡ＿Ｐ３（配列番号６０）及びｏｐｃＡ＿Ｐ４（配列番号６１）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列（配列番号２０）及びＣ．フミレデュセンス（C. humireducens）ｏｐｃＡ（配列番号２３）からなる遺伝子カセットは、プライマーｏｐｃＡ＿Ｐ２とｏｐｃＡ＿Ｐ３の５’伸長の配列重複を有する。次いで、２つの相同性アーム及び遺伝子カセットを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、配列番号２２のヌクレオチド２０４０〜２９９９がＰｃｇ０００７＿３９−ｏｐｃＡ（配列番号２４）によって置換されている。
【０１０９】
実施例４Ｊ．ｃｇ２７６６開始コドンの前にプロモーターＰｃｇ０００７＿３９を挿入するための形質転換ベクターの構築
[57]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号２６のヌクレオチド２０５１〜４１００）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ１（配列番号６２）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ２（配列番号６３）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの上流相同性アーム（配列番号２６のヌクレオチド１〜２０５０）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ３（配列番号６４）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ４（配列番号６５）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列（配列番号２０）は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、ｃｇ２７６６（配列番号２７）の前に挿入されたプロモーターＰｃｇ０００７＿３９を有する。
【０１１０】
実施例４Ｋ．ａｃｔＡプロモーターをプロモーターＰｃｇ０００７＿３９で置換するための形質転換ベクターの構築
[58]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡ（実施例３）からＰＣＲによって増幅した。
【０１１１】
[59]  ２０２１ｂｐの下流相同性アーム（配列番号２８のヌクレオチド２２６３〜４２８３）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ１（配列番号６６）及びＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ２（配列番号６７）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの上流相同性アーム（配列番号２８のヌクレオチド１〜２０５０）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ３（配列番号６８）及びＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ４（配列番号６９）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列（配列番号２０）は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ａｃｔＡ＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、配列番号２８のヌクレオチド２０５１〜２２６２の代わりに、ａｃｔＡ（配列番号２９）の前に挿入されたプロモーターＰｃｇ０００７＿３９を有する。
【０１１２】
実施例４Ｌ．ｃｇ１３８３開始コドンの前にプロモーターＰｃｇ０００７＿３９を挿入するための形質転換ベクターの構築
[60]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０４３ｂｐの上流相同性アーム（配列番号９８のヌクレオチド１〜２０４３）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ１（配列番号９９）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ２（配列番号１００）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号９８のヌクレオチド２０４４〜４０９３）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ３（配列番号１０１）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ４（配列番号１０２）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１３８３＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、ｃｇ１３８３開始コドン（配列番号１０３）の前に挿入されたＰｃｇ０００７＿３９プロモーターを有する。
【０１１３】
実施例４Ｍ．天然のｐｈｏＵプロモーターをプロモーターＰｃｇ０００７＿３９で置換するための形質転換ベクターの構築
[61]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。１９３５ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１０４のヌクレオチド１〜１９３５）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ１（配列番号１０５）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ２（配列番号１０６）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１０４のヌクレオチド１９９５〜４０４４）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ３（配列番号１０７）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ４（配列番号１０８）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｐｈｏＵ＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られる。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換する。得られた菌株は、配列番号１０４のヌクレオチド１９３６〜１９９４を置換するＰｃｇ０００７＿３９プロモーターをｐｈｏＵ開始コドン（配列番号１０９）の前に有する。
【０１１４】
実施例４Ｎ．天然のｃｇ３２１０プロモーターをプロモーターＰｃｇ０００７＿３９で置換するための形質転換ベクターの構築
[62]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。１９３５ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１１０のヌクレオチド１〜２０３０）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０＿Ｐ１（配列番号１１１）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０＿Ｐ２（配列番号１１２）を用いて増幅した。同様に、２０４７ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１１０のヌクレオチド２０９０〜４１３６）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０＿Ｐ３（配列番号１１３）及びＰｃｇ０００７＿３９−３２１０＿Ｐ４（配列番号１１４）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換する。得られた菌株は、ｃｇ３２１０開始コドン（配列番号１１５）の前に挿入された、配列番号１１０のヌクレオチド２０３１〜２０８９を置換するＰｃｇ０００７＿３９を有する。
【０１１５】
実施例４Ｏ．天然のｃｇ０８００プロモーターをプロモーターＰｃｇ０００７＿３９で置換するための形質転換ベクターの構築
[63]  ２つの相同性アームを、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。２０４３ｂｐの上流相同性アーム（配列番号１１６のヌクレオチド１〜２０４３）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０８００＿Ｐ３（配列番号１１７）及びＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０８００＿Ｐ４（配列番号１１８）を用いて増幅した。同様に、２０５０ｂｐの下流相同性アーム（配列番号１１６のヌクレオチド２１８４〜４２３３）を、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０８００＿Ｐ１（配列番号１１９）及びＰｃｇ０００７＿３９−０８００＿Ｐ２（配列番号１２０）を用いて増幅した。９３ｂｐのＰｃｇ０００７＿３９ヌクレオチド配列は、プライマーＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０８００＿Ｐ２とＰｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０８００＿Ｐ３との５’伸長の重複によって得られた。次いで、２つの相同性アームを、実施例４Ａに記載されているようにｐＺに組み立て、実施例２に記載されているようにＣ．グルタミカム（C. glutamicum）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４及びその派生株に形質転換した。得られた菌株は、ｃｇ０８００開始コドン（配列番号１２１）の前に挿入された、配列番号１１６のヌクレオチド２０４４〜２１８３を置換するＰｃｇ０００７＿３９プロモーターを有する。
【０１１６】
実施例５．マイクロタイタープレートでのリジン産生のための改変されたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株の評価
実施例５Ａ．改変されたＣ．グルタミカム（C. glutamicum）株によるリジン産生
[64]  前の実施例に記載の改変された菌株のそれぞれ、及び異なる改変を組み合わせて得られた菌株を、マイクロタイタープレートでの３段階発酵によってリジン産生について評価した。細胞を培地Ｃで増殖させた（表５）。４８時間後、１０％接種物を培地Ｄに移した（表５）。細胞培養物の１０パーセントを１９時間後に培地Ｅに移し（表５）、さらに２４時間又は９６時間増殖させた。培養条件は、３２℃、１０００ｒｐｍ（Infors HT）であった。
【０１１７】
[65]  産生されたリジンの量を、結合リジンオキシダーゼアッセイを用いて決定した。培養上清をリジンオキシダーゼ反応溶液（２５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、８２４ｍｇ／ｍｌ  フェノール、７６ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノアンチピレン（Sigma）、０．０３ｍｇ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（Sigma）、０．０１５単位／ｍｌ  リジンオキシダーゼ（Sigma））に加えた。サンプルを２５℃で４０分間インキュベートし、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。マイクロタイタープレート内のデキストロースの量を、結合グルコースオキシダーゼアッセイによって決定した。培養上清をグルコースオキシダーゼ反応溶液（２７５ｍＭ  マレイン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ５．５、７３０ｍｇ／ｍｌ  フェノール、６８０ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノアンチピレン（Sigma）、０．０２７ｍｇ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（Sigma）、５６ｍｇ／Ｌ  グルコースオキシダーゼ（Sigma））に加えた。サンプルを２５℃で４０分間インキュベートし、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１１８】
[66]  各組換え株及びその直接の親株によって産生されるリジンの量（ｍＭ）を表６に示す。表７Ａは、ゲノム改変の一覧であり、表７Ｂは、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１４７４として寄託された細菌の天然のゲノムに対する、試験した菌株に存在する改変を明らかにする。
【０１１９】
【表１７】
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【０１２０】
【表１８】
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【０１２１】
【表１９】
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【０１２２】
【表２０】
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【０１２３】
【表２１】
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【０１２４】
【表２２】
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【０１２５】
【表２３】
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【０１２６】
【表２４】
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【０１２７】
【表２５】
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【０１２８】
【表２６】
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【０１２９】
【表２７】
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【０１３０】
【表２８】
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【０１３１】
【表２９】
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【０１３２】
【表３０】
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【０１３３】
【表３１】
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【０１３４】
【表３２】
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【０１３５】
【表３３】
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【０１３６】
【表３４】
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【０１３７】
【表３５】
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【０１３８】
【表３６】
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【０１３９】
【表３７】
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【０１４０】
【表３８】
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【０１４１】
【表３９】
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【０１４２】
【表４０】
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【０１４３】
【表４１】
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【０１４４】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2022500024.tif 000048
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