(57)【要約】  本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富むオイル、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）に富む微生物オイル、特に脂質の総質量に対して６０％超のＰＵＦＡを含有するオイルの抽出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オイルを含むオイル産生生物のバイオマスから、ＰＵＦＡに富むオイルを抽出する方法であって、
当該方法が、
（ａ）前記オイル産生生物のバイオマスの細胞を溶解する工程と、
（ｂ）溶解されたバイオマスからオイルを機械的に分離し、粗製オイルを回収する工程と
を含み、
前記細胞を溶解する工程（ａ）が、下記２つのパート：
（ａ１）第１の温度で実行される第１のパート、次いで
（ａ２）前記第１の温度よりも低い第２の温度で溶解を実行し続ける第２のパートを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記オイル産生生物のバイオマスが、ＰＵＦＡ産生微生物のバイオマスであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマスが、前記微生物の懸濁液であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オイル産生生物によって産生されるオイルが５０％超のＰＵＦＡを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、Ｃ２２：５ｎ６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４ｎ６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５ｎ３）およびそれらの混合物から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶解工程（ａ）が、機械的溶解であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶解工程（ａ）が、酵素的溶解であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ２）の溶解終了時の温度が、前記第１のパート（ａ１）の温度よりも少なくとも１０℃低いことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のパート（ａ２）の温度が、４０℃以下であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶解されたバイオマスからのオイルの機械的分離（ｂ）が、遠心プレートセパレータによる連続分離であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）において得られた粗製オイルを精製する工程（ｃ）を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）において得られた粗製オイルまたは前記工程（ｃ）において得られた精製されたオイルを希釈する工程（ｄ）を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られたオイルを含むことを特徴とする、医薬組成物、化粧品組成物または食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富むオイル、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）に富む微生物オイル、特に脂質の総質量に対して６０％超のＰＵＦＡを含有するオイルの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、高ＰＵＦＡ含有量の濃縮オイルに対する要求、すなわち同等量のＰＵＦＡのために必要な単位用量の数を減らすことを可能とする濃縮オイルカプセルなどの濃縮製品の供給に対する要求がある。高ＰＵＦＡ含有量（例えば５５％超のＤＨＡ）のオイルを得るために、エタノールなどの溶媒の使用を伴ってトリグリセリドをエチルエステルに変換する方法によってオイルが濃縮される。エチルエステルは人工的な化学形態であり、自然界には存在しない。エチルエステルの形態での脂肪酸のバイオアベイラビリティは、トリグリセリドの形態での脂肪酸のバイオアベイラビリティよりはるかに低い（Ｇｈａｓｅｍｉｆａｒｄら、２０１４）。また、上記の方法は粗製オイルに含まれるビタミンおよび抗酸化物質を除去してしまう。その結果、濃縮オイルは酸化に対しより弱いものとなる。
【０００３】
したがって、天然にＰＵＦＡに富み、その組成が産生生物の脂溶性物質にできる限り近く、処理中に生成される不純物が最小であるオイルを得ることは有利である。しかしながら、ＰＵＦＡに富むオイルの抽出は、バイオマスから抽出される脂肪酸の量を制限する高ＰＵＦＡ含有量に伴う特定の困難に直面する。
【０００４】
現在用いられている抽出方法は、ナトリウム（ＷＯ２０１１／１５３２４６）、溶媒（ＵＳ２０１４／３５０２２２）の添加、および／または数時間の高温（ＷＯ２０１５／０９５６９４）を伴い、得られるオイルおよびその副産物（脱脂バイオマス）の品質を損ない得る。実際、温度は、シス脂肪酸からトランス脂肪酸の形成を誘起する要因である。しかしながら、規制により、食用オイルに含まれるトランス脂肪酸の最大含有量は１％未満とされている。ＰＵＦＡ産生微生物の脂肪酸は、天然ではシス構造であるため、トランス脂肪酸の形成はオイルの品質を低下させる。温度はまた、毒性化合物である２−ＭＣＰＤ、３−ＭＣＰＤおよびグリシドールの形成を引き起こす可能性があり、これら化合物の含有量は規制されている（グリシドール）か、または規制の過程にある（２−および３−ＭＣＰＤ）。オイルの品質を最適化し、可能な限り少なくすることが、特に乳児食品におけるオイルの使用のために重要である。
【０００５】
抽出中に、ナトリウムを、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムの形態で添加することは、公知の方法である（ＷＯ２０１１／１５３２４６）。残念なことに、ナトリウムは脱脂バイオマス中に見つかる。このことは、特に動物飼料にとって、タンパク質にも富むバイオマスの利点を損なわせる。また、ナトリウムの添加および７０°Ｃ以下の温度を伴う方法の効率には、６０％超のＰＵＦＡを含むバイオマスからの抽出収率の点で限界がある。
【０００６】
本発明は、高ＰＵＦＡ含有脂質を抽出するための新規な方法によって上述した要求を満たし、オイルの品質を維持しつつ、オイルの抽出収率、特にオイルが含まれるバイオマスからのＰＵＦＡの抽出を改善する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、オイルを含むオイル産生生物のバイオマスから、ＰＵＦＡに富むオイルを抽出する新規な方法であって、
当該方法が、
（ａ）前記オイル産生生物のバイオマスの細胞を溶解する工程と、
（ｂ）溶解されたバイオマスからオイルを機械的に分離し、粗製オイルを回収する工程と
を含み、
前記細胞を溶解する工程（ａ）が、下記２つのパート：
（ａ１）第１の温度で実行される第１のパート、次いで
（ａ２）前記第１の温度よりも低い第２の温度で溶解を実行し続ける第２のパート
を含むことを特徴とする、方法に関する。
【０００８】
本発明による方法は、動物、特に海洋生物であるか、油糧種子植物であるか、または微生物であるかを問わず、高ＰＵＦＡ含有量のオイルを産生する任意の種類の生物について実施可能である。
【０００９】
本発明による方法は、高ＰＵＦＡ含有量の微生物オイルを抽出するために特に適している。本発明による方法は、オイル抽出のために溶媒の添加を伴わない。
【００１０】
本発明はまた、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるか、または本発明による方法によって抽出されたオイルを他のオイルと混合して含む、希釈されたオイルであるかを問わず、本発明による方法によって得られたＰＵＦＡに富むオイルに関する。
【００１１】
本発明はまた、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるか、または希釈されたオイルであるかを問わず、本発明による方法によって得られたオイルを含む医薬組成物、化粧品組成物、または食品組成物に関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明による方法によって得られた、粗製オイル、精製されたオイル、または希釈されたオイルの、ヒトまたは動物の消費用の食品、特に新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦による摂取用の食品のための、使用に関する。
【００１３】
本発明はまた、本発明による方法によって得られた、粗製オイル、精製されたオイル、または希釈されたオイルを含む組成物、特に栄養補助組成物、または食品に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＰＵＦＡは、特に食品添加物としての用途、または機能性食品、特に乳児用ミルク、妊婦もしくは授乳婦用の機能性食品を調製する用途において、当業者によく知られている。特に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ３）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸、Ｃ２２：５ｎ６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４ｎ６）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５ｎ３）を挙げることができる。考慮される産生生物に応じて、オイルはＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＲＡ、またはいくつかのＰＵＦＡの混合物を含む。
【００１５】
ＡＲＡ産生生物はよく知られている。特に、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ属の糸状菌が挙げられる。ＥＰＡ産生生物もよく知られている。特に、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａが挙げられる。ＤＨＡ産生生物もよく知られている。特に、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の原生生物が挙げられる。植物もまた良好なＰＵＦＡ産生体であり、特に種子段階では：亜麻仁（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ  Ｌ．）オイルは５０％を超えるα−リノレン酸（ＡＬＡ）を含みうる；菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）もまたよく知られたＡＬＡ産生体である。植物は、（Ｃ１８超の）長鎖脂肪酸を産生しない。しかしながら、最近、遺伝子組み換えのＣａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ植物が、ＤＨＡ（Ｍａｎｓｏｕｒら、２０１４）またはＥＰＡ（Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら、２０１４）を産生するように改変されている。油糧種子植物の種子は、典型的には２０％（ダイズ）から７０％（脱水ココナッツ）の間の脂質を含有する（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、１９９６）。
【００１６】
本発明による方法は、オイル産生微生物からＰＵＦＡに富むオイルを抽出するのに特に適している。これらの微生物は、特に糸状菌および原生生物から選択される。
【００１７】
このようなオイルを得ることを可能とする微生物の株は工業株であり、すなわち、本発明によれば、株は、脂肪含有量が乾燥物の少なくとも４５％、優先的には少なくとも約５０％を占め、少なくとも５０ｇ／Ｌ、優先的には少なくとも７０ｇ／Ｌ、より優先的には少なくとも１００ｇ／Ｌの細胞密度での増殖能力を有する。
【００１８】
当業者は、主に、スラウストキトリド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、渦鞭毛藻（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、珪藻（ｄｉａｔｏｍｓ）、ユースティグマトフィセアエ（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）に含まれるＰＵＦＡ産生微生物の工業株、特に、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のＤＨＡ産生微生物の工業株に精通している。
【００１９】
特に、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  Ｍ６４２４５，  Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  ＦＪ８２１５０１，  Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  ＣＣＡＰ  １１０４／３  （ＷＯ２０１６０３０６３１），  Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  ＣＣＡＰ  １１０４／５またはＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ  ＣＣＡＰ  １１０４／４，  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＡＢ０２２１０７；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＨＭ０４２９０９；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＪＮ９８６８４２；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＳＬ１１０１  ＪＮ９８６８４２；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＤＱ３２３１５７；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＤＱ３５６６５９；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＤＱ３６７０４９；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／２；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／３；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／４；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／５；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／６；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／１；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ０５２５５５；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ０７３３０８；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ＰＲＡ２７６  ＤＱ８３６６２８；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ１０  ＦＪ８２１４７７；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＹ  ２０１２  ＰＫＵ  Ｍｎ５  ＪＸ８４７３６１；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＹ２０１２  ＪＸ８４７３７０；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｎ１−２７；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＤ１１６；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ２０９  ＡＢ２９０５７４；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ２１７  ＡＢ２９０５７２；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ  ２１８  ＡＢ２９０５７３；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  １８Ｗ−１３ａ；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ  Ｒａｇｈｕｋｕｍａｒ  １６；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ  ＳＥＫ３５３；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＴＲＢＣ  １４３；  Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｒａｇｈｕｋｕｍａｒ  ２９；  Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ；  Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｉｓ；  Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ３４７；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ  ＳＥＫ３５１；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓａｒｋａｒｉａｎｕｍ  ＳＥＫ３６４；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｆ３−１；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｈ１−１４；  Ｐａｒｉｅｔｉｃｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１０２９８４；  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ  ＤＱ３２３１５９；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ  ＤＱ３５６６６１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＯＵＣ１６６  ＨＭ０４２９０７；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＦＢ１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＦＢ３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＦＢ５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ２０８８８  ＤＱ３６７０５０；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＧＳ２  ＫＣ２９７１３７；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＫＡ１０  ＪＱ２４８００９；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２０１１１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２０８８８  （ＷＯ１９９１００７４９８）；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２０８８９；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２６１８５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＲ２．１．２；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＣＡＡＡ  ０３２；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＣＡＡＡ  ０９３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＣＡＣＤ  １５２；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＣＡＲＡ  ０２１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＣＨＡＯ  １１３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＲＡＢＱ  １３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＵＲＡＲＭ  ８０２；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／３  （ＷＯ２０１７０１２９３１）；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／４；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＪＵ−５１２；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＨ１０５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＫ１７−３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＲ−５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＰＪ１０．４；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ  ２１０；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ  ３４５；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＥＫ  ３４６；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＲ２１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｔ���Ｏ０１；  Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  ＳＥＫ３５４；  Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２９７５，  Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２９７９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＢＵＲＡＢＧ１６２  ＤＱ１００２９５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＣＧ９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＬＹ２０１２  ＪＸ８４７３７８；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１０９３  ＡＢ１８３６６４；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＮＩＯＳ１  ＡＹ７０５７６９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＃３２  ＤＱ３２３１６１；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＃３２  ＤＱ３５６６６３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＲＴ４９  ＤＱ３２３１６７；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＲＴ４９  ＤＱ３５６６６９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  ＲＴ４９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  Ｔｈｅｌ２  ＤＱ３２３１６２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ  ｓｐ．  Ｔｈｅｌ２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ  ＤＱ３５６６６２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ  ＤＱ３５６６６６；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｇａｅｒｔｎｅｒｉｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｋｉｎｎｅｉ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｋｉｎｎｅｉ  ＤＱ３２３１６５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｏｔｉｖｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  １３Ａ４．１；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２６１８５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ１３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ１４；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ４；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ６；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ７；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ８；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＬ９；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＰ３．２．２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＰ３．３．３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｃａｕｄｉｖｏｒｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＨＮ−１；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＪＮ−１０；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＫ１；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＫ１��；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＫ５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＫ８；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＫ８ａ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＫ１７−３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬ１；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬ２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬ２ａ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＯＮＣ−Ｔ１８；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＰＪＡ１０．２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＴＲ１．４；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＴＲＲ２；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＡＴＣＣ２４４７３  （ＷＯ２０１７１３１１８８）；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＤＱ３２３１６３；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＤＱ３５６６６５；  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｅ；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ  ＳＥＫ  ２１４；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｐｒｏｆｕｎｄａ；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｐｒｏｆｕｎｄａ  ＢＵＴＲＢＧ  １１１；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｓｐ．；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２８２０７  （ＷＯ１９９８００３６７１）；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ  ＢＵＲＡＡＡ  １４１；  Ｕｌｋｅｎｉａ  ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２８２０８；ＰＴＡ−９６９５、ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７およびＰＴＡ−９６９８（ＵＳ２０１０−２３９５３３）の受託番号でＡＴＣＣに寄託されているスラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）が挙げられる。
【００２０】
ＥＰＡに富むオイルの生産については、特に、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  （Ｐｔ１）  Ｂｏｈｌｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  ８．６  ＣＣＭＰ２５６１  （ＷＯ２０１５００８１６０）；  Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｂｒｅｖｉｒｏｓｔｒｉｓ  （ＣＣＡＰ  １０５２／２１；  ＷＯ２０１３１３６０２５）；  Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ  （ＵＴＥＸ  ２０４７；  ＷＯ２００８００４９００）；  Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ  （ＵＳ９０７４１６０）；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ  （ＷＯ２０１６０５９２６２）；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｖｉｃｕｌａ；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ａｃｃｅｐｔａｔａ；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ  ＣＣＡＰ８４９／１；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ２１１／４６；  Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ  ＣＣＡＰ２１１／１７  （ＷＯ２０１１１５０４１）；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｉｅｎｅｓｉ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄｉｓ  ＣＣＡＰ２１１／３；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｓｌｅｒｉ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ  ＣＣＡＰ２１１／８Ｋ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｆｉｕｓｃａ  ｖａｒ．  ｖａｃｕｏｌａｔａ；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．；  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ；  Ｍｏｎｏｄｕｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓが挙げられる。
【００２１】
ＡＲＡに富むオイルの生産については、特に、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ  ＩＦＯ８５７０、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ  ＩＦ０８５７１、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ  ＩＦ０５９４１、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＩＦ０８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、およびＣＢＳ７５４．６８（ＷＯ２０１５／０９５６９６）が挙げられる。
【００２２】
本発明による方法は、ＰＵＦＡに富むオイルを含む生物からＰＵＦＡを抽出するのに特に適しており、とりわけ脂質の総質量に対して５０％を超える含有量でＰＵＦＡを含むオイルを含む生物からＰＵＦＡを抽出するのに適している。本発明による方法は、脂質の総質量に対して６０％を超えるＰＵＦＡ、有利には少なくとも６２％のＰＵＦＡ、より有利には少なくとも６５％のＰＵＦＡ、好ましくは６７％超、より優先的には少なくとも７０％、さらにより優先的には７５％のＰＵＦＡを含有するオイルを産生する微生物からＰＵＦＡを抽出する最良の方法である。
【００２３】
しかしながら、高ＰＵＦＡ含有量において顕著に見られる利点は、ＰＵＦＡに富むオイルの産生は低いが、脂質の総質量に対して４０％から５０％の、依然顕著な量のＰＵＦＡを含む微生物からＰＵＦＡを抽出する場合にもあてはまる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、抽出されるＰＵＦＡは、ＤＨＡまたはＤＨＡ＋ＤＰＡ混合物であり、使用される微生物は、ＤＨＡまたはＤＨＡ＋ＤＰＡに富むオイルを産生する微生物である。
【００２５】
特に、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／２；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／３；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／４；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／５；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／６；  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ  ４０６２／１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／３；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／１；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／４；  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ  ４０８７／５；またはＰＴＡ−９６９５、ＰＴＡ−９６９６、ＰＴＡ−９６９７およびＰＴＡ−９６９８の受託番号でＡＴＣＣに寄託されているスラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）が挙げられる。本発明による方法は、特にＤＨＡに富むオイルを産生する微生物、特にＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ  ＣＣＡＰ４０６２／７およびＣＣＡＰ４０６２／８およびＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＣＡＰ４０８７／７を用いて実施されてもよい。
【００２６】
産生生物のバイオマスは、細胞溶解を許容する第１の処理を受けることができる。例えば、油糧種子植物の種子については、バイオマスは、殻から穀実を分離し、その後溶解を行う前に、まず粉砕し、そして粉砕したものを懸濁する公知の一連の処理を受けてもよい。
【００２７】
微生物の培養に由来する微生物のバイオマスについては、バイオマスは発酵マストから直接的に得ることができる。バイオマスは、特定の可用性成分を除去するために（特に、発酵培地を除去するために濾過し、水で洗浄することによって）洗浄し、そして溶解工程（ａ）のために再懸濁してもよい。微生物バイオマスはまた、保存され、溶解工程の前に再懸濁される、乾燥または凍結乾燥されたバイオマスでもありえる。溶解工程（ａ）の実施を容易にするための微生物オイルの上述した前処理は、当業者によく知られている。
【００２８】
細胞溶解工程（ａ）は、有利にはバイオマス懸濁液に対して行われる。この懸濁液は、好ましくは、５〜２０質量パーセント、一般的には８〜１０質量パーセントの乾燥物質含有量を有する。
【００２９】
細胞溶解は、酵素的溶解または機械的溶解によって行われる。溶解の第１のパートの温度は、好ましくは少なくとも５０℃であり、かつ、細胞溶解を促進しつつオイルの組成を劣化させる温度より低い温度、すなわち９５℃未満、さらには９０℃未満、好ましくは８０℃未満、さらにより優先的には７０℃未満の温度である。
【００３０】
使用可能な酵素は公知であり、特に、ＷＯ２０１５／０９５６８８、ＷＯ２０１１／１５３２４６、ＵＳ６７５００４８およびＷＯ２０１５／０９５６９４に記載の酵素、特に、ＮｏｖｏｚｙｍｅによってＡｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．４Ｌ、Ａｌｃａｌａｓｅ  ３．０Ｔ、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ３７０７１、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １０００Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ＦＭ  ２．４Ｌ、Ｐｒｏｔａｍｅｘ、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅの名称で市販されている酵素などのプロテアーゼまたはセルラーゼである。使用条件は供給業者によって推奨される条件であり、温度は最適な酵素活性のために推奨される温度であり、少なくとも５０度から最大で７０℃であり、好ましくは約６５℃である。有利には、酵素的溶解は酸素の乏しい雰囲気下で行われる。一般的に、酸素濃度は１質量パーセント未満である。
【００３１】
機械的溶解方法もまたよく知られており、特にボールミル、ミキサー−分散機、高圧ホモジナイザー、ピンミルまたはインパクトミル、超音波、パルス電解による方法が知られている。これらの機械的溶解方法を実施するための装置として（括弧内は製造業者の名前）、特に、ボールミルについて：Ｄｉｓｃｕｓ−１０００（Ｎｅｔｚｓｃｈ）；ＥＣＭ−ＡＰ６０（ＷＡＢ）；高圧ホモジナイザーについて：Ａｒｉｅｔｅ（ＧＥＡ）；ミキサー−分散機について：７００−Ｘ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）；ピンミルについて：Ｃｏｎｔｒａｐｌｅｘ（Ｈｏｓａｋａｗａ）；インパクトミルについて：Ｃｏｎｄｕｘ（Ｎｅｔｚｓｃｈ）が挙げられる。
【００３２】
溶解の第１のパート（ａ１）は、特に酵素的溶解または粉砕サイクルの時間に関して、細胞溶解の従来技術によって推奨されている通常の条件で実施される。
【００３３】
溶解継続工程（ａ２）は、溶解バイオマスを事前に抽出することなく、実施条件を変更することによって溶解を完了させる。実施条件の変更は温度の変更であって、塩、酸または塩基の追加のような、溶解バイオマスを部分的に含む懸濁媒体の実質的な変更は含まない。温度を下げる前またはそれと同時の懸濁媒体の実質的な変更は、本発明による先験的な「溶解継続」ではない。溶解後の懸濁媒体の上記実質的な変更は、ＵＳ２０１１／２９５０２８およびＵＳ２０１５／１７６０４２に記載されているが、高ＰＵＦＡ含有オイルの効率的な抽出を可能としない。
【００３４】
有利には、酵素的溶解は、（ａ１）および（ａ２）の２つのパートから実質的になり、これらは溶解の第２のパート（ａ２）に移るときの温度の低下によって実質的に区別される。
【００３５】
第２のパートにおける溶解温度は、第１のパートにおける溶解温度よりも少なくとも１０℃低い。好ましくは、第２のパートの溶解温度は、４０℃以下であり、有利には５℃〜４０℃であり、より有利には１０℃〜３５℃であり、さらには１５℃〜３０℃であり、好ましくは２０℃〜３０℃である。より低温での第２のパート（ａ２）の溶解、またはその終了時の溶解は、有利には、少なくとも３０分、最大で３０時間行われる。従来技術によれば、出発バイオマスが微生物であるか（ＷＯ２０１８０１１２７５）、油糧種子であるか（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、１９９６）にかかわらず、温度を４０℃超に維持すること、さらには溶解工程中または溶解工程後の抽出を改善するために温度を８０℃超に昇温させることが教示されている。驚くべきことに、本発明者らは、とりわけ高ＰＵＦＡ含有オイルに関しては、その逆（低温）がより良好な結果をもたらすことを見出した。工程（ａ２）の温度は、分離工程（ｂ）の前の溶解終了時は増加されない。
【００３６】
溶解バイオマスからのオイルの機械的分離（ｂ）もまた、重力分離として当業者によく知られており、特にＷＯ０１／５３５１２に記載の遠心分離がよく知られている。連続分離、特に遠心プレートセパレータを用いることも可能である。そのようなセパレータは、ＷＯ２０１０／０９６００２に記載されているように、固体残渣と水を含む複合培地から連続的にオイルを抽出することが知られており、特にＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ社、Ｆｌｏｔｔｗｅｇ社またはＧＥＡ  Ｗｅｓｔｆａｌｉａ社によって市販されている。この連続的分離工程は、本発明によるオイルを得るための工程において好適である。
【００３７】
産生生物のＰＵＦＡ含有量に応じて、本発明による方法によって得られる粗製オイルは、抽出される脂質の総質量に対して６０％を超える非常に高い含有量のＰＵＦＡ、特にＤＨＡを含んでもよく、有利には少なくとも６２％のＰＵＦＡ、さらに有利には少なくとも６５％のＰＵＦＡ、好ましくは６７％超のＰＵＦＡ、より優先的には少なくとも７０％のＰＵＦＡ、さらにより優先的には７５％のＰＵＦＡを抽出される脂質の総質量に対して含んでもよい。
【００３８】
本発明による方法によって得られるオイルは、実質的にトリグリセリドの形態である。トリグリセリドは、有利には脂質の総質量の少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％、さらにより有利には少なくとも９３％を占める。トリグリセリドの含有量は、例えば、薄層クロマトグラフィーによって分析される（Ｊｏｕｅｔら、２００３）。
【００３９】
一般的に、本発明による方法を用いたバイオマスからのオイルの抽出は、ＰＵＦＡ、特にＤＨＡおよびＤＰＡの含有量のわずかな上昇をもたらし、低分子量飽和脂肪酸に比べてこれらＰＵＦＡの抽出を促進する。しかしながら、この濃縮はバイオマスに含まれるオイルの固有特性、特にトリグリセリド含有量を実質的に変更するものではない。いずれにせよ、本発明によるオイルは、例えばエステルの形態でのＰＵＦＡの添加、濃縮、および／またはパルチミン酸などの飽和脂肪酸の除去によるその脂肪酸含有量の実質的な変更を経ていないオイルである。
【００４０】
得られるオイルは、一般的に粗製オイル（ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ）と呼ばれるオイルであり、そのままでも使用でき、または、特に、悪臭を抑制することで保存を容易にするため、もしくは消費者がより受け入れ易いように色を変化させるために精製することもできる。精製工程、特に、脱ガム、遊離脂肪酸の中性化、脱色、および脱臭は当業者によく知られている。これらの工程は（完全にまたは部分的に）、リン脂質、色素、揮発性物質および遊離脂肪酸を除去する。実際に、これらの方法は、粗製オイルと比較して、得られる精製されたオイル中の飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸またはトリグリセリドの相対含有量を実質的に変化させない。
【００４１】
したがって、本発明はまた、精製工程（ｃ）を含む、既に説明したＰＵＦＡに富むオイルを抽出するための方法に関する。
【００４２】
従来技術のいくつかの方法は、特に飽和脂肪酸を除去するために、粗製オイルまたは精製されたオイルに対して実施されるいわゆる「脱ろう」工程を有し、ＰＵＦＡ含有量を増加させる効果がある（ＷＯ０２／１０３２２）。本発明によって抽出されたオイルは、粗製オイルでも精製されたオイルでも、先験的に「脱ろう」の利用を必要としない。しかしながら、当業者は、最終製品に商業的利点を見出す場合には、そのような「脱ろう」工程を追加することを選択してもよい。
【００４３】
使用するＰＵＦＡに富むオイル産生微生物、特にＤＨＡ産生微生物によっては、本発明による方法によって得られるオイルは、オイル１ｋｇあたり１０ｍｇ超、さらには３０ｍｇ／ｋｇ超、優先的には４０ｍｇ／ｋｇ超、さらにより優先的には６０ｍｇ／ｋｇ超、さらには少なくとも６５ｍｇ／ｋｇの天然カロテノイドを含有してもよい。含まれるカロテノイドは、主にアスタキサンチンおよびベータカロテンである。オイルは、２０ｍｇ／ｋｇ超、さらには３０ｍｇ／ｋｇ超、より優先的には４０ｍｇ／ｋｇ超のアスタキサンチンを含有する。カンタキサンチンも含有されるが、少量である。ルテインおよびゼアキサンチンなどの他のカロテノイドが含まれてもよいが、使用される方法の検出限界で含まれる。「天然カロテノイド」との用語は、カロテノイドが添加されておらず、すなわちオイルが得られるバイオマスと同じバイオマスから得られ、オイルの抽出と同時にこのバイオマスから抽出されるものを意味する。天然カロテノイドは、従属栄養の発酵条件下にある株から、特に刺激を与えることなく、産生される。天然カロテノイドは、それゆえ本発明による方法を通じて存在し、脂肪酸、とりわけＤＨＡを酸化から保護する。精製工程は色素を除去することがあるため、精製されたオイルは、カロテノイドを含んでいるとしても、より少ないカロテノイドを含んでいてよい。
【００４４】
粗製オイルまたは精製されたオイルは、さらなる使用のために希釈されてもよい。
【００４５】
したがって、本発明はまた、機械的分離工程（ｂ）において得られた粗製オイルまたは精製工程（ｃ）において得られた精製されたオイルを希釈する工程（ｄ）をさらに含む、既に説明したＰＵＦＡに富むオイルを抽出するための方法に関する。
【００４６】
本発明による方法によって得られるＰＵＦＡに富むオイルを希釈するために使用されるオイルは、一般的にまた好ましくは、ヒトおよび動物用の消費に適したベジタブルオイルである。特に、ヒマワリオイル、ナタネオイル、ダイズオイル、クルミオイル、ゴマオイル、ヘンプオイル、ヘーゼルナッツオイル、アルガンオイル、オリーブオイル、アマニオイル、または食品用途に適した他のオイルが挙げられる。添加されるオイルは、他のＰＵＦＡ、特にＤＨＡ、ＡＲＡおよび／またはＥＰＡを含むオイル、特に微生物起源の他のオイルまたは魚油であってもよい。
【００４７】
本発明はまた、粗製オイルであるか、精製されたオイルであるか、希釈されたオイルであるかにかかわらず、本発明による方法によって得られたＰＵＦＡに富むオイルを含む組成物に関する。
【００４８】
本発明による組成物は、一つまたはそれ以上の賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、食品、医薬組成物、化粧品組成物および工業用組成物を含む前記組成物に、当該組成物の保存および使用のための所望の特性を付与するために本発明において用いられる一つの成分または複数の成分の混合物である。賦形剤は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の合併症をもたらすことなくヒトおよび動物の組織に接触させて使用され、薬局方によってその特性が知られている医薬組成物に添加される場合には、「薬学的に許容可能な」賦形剤と表現される。有機ベースまたは無機ベース、有機酸または無機酸、ｐＨバッファ、安定剤、酸化防止剤、付着剤、剥離剤、コーティング剤、外相成分、制御された剥離成分、界面活性剤、保湿剤、充填剤、軟化剤、またはそれらの組み合わせなどの種々の賦形剤を用いてもよい。
【００４９】
目的に応じて、本発明による組成物は、特に医薬組成物、化粧品組成物、栄養補助組成物または食品である。
【００５０】
食品は、ヒト用および動物用の双方を意図し、固体組成物、ペースト状組成物、液状組成物を含む。特に、一般食品、牛乳、飲料、治療用飲料および栄養飲料を含む液体製品、機能性食品、サプリメント、栄養補助食品、未熟児用調合ミルクを含む新生児用調合ミルク、妊婦または授乳婦用食品、成人用食品、高齢者用食品および動物用飼料を挙げることができる。
【００５１】
粗製オイルであるか精製されたオイルであるかを問わず、本発明による方法によって得られるＰＵＦＡに富むオイル、または当該オイルを含むバイオマスは、そのまま直接使用することもでき、または、当業者にとって公知の用途に従って、オイル、スプレッド、他の脂質成分、飲料、ダイズ系ソース、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム）、ベーカリー製品、例えば（カプセルまたはタブレット形態の）栄養サプリメントの形態の栄養製品、ビタミンサプリメント、食品サプリメント、エネルギードリンクなどの飲料のために希釈される粉末、または乳児用製剤のためのミルク粉末、完成品または半製品の粉末状食品等の添加物として添加することもできる。
【００５２】
ペットフードもまた当業者に知られている。ペットフードは、特に、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギなどの家畜用のもの、または魚介類や養殖魚のための養魚用のものが意図される。
【００５３】
ＰＵＦＡに富むオイルを含む医薬組成物もまた当業者に知られており、オイルは単独で、または他の医療用製品と組み合わせて使用される。
【００５４】
本発明による方法によって得られるＰＵＦＡに富む粗製オイルまたは精製されたオイル、または当該オイルを含むバイオマスは、単回投与組成物の形態、特に経口投与に適したタブレット、カプセル、粉末、顆粒の形態で配合されてもよい。
【００５５】
本発明はまた、本発明による方法によって得られるＰＵＦＡに富む粗製オイル、精製されたオイル、または希釈されたオイルの、ヒトまたは動物消費用の食品、特に、新生児、小児、または妊婦もしくは授乳婦用の食品のための使用に関する。
【００５６】
このような使用は当業者によく知られており、特に、ＷＯ２０１０／１０７４１５およびＤＳＭ社のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍ．ｃｏｍ／ｍａｒｋｅｔｓ／ｆｏｏｄａｎｄｂｅｖｅｒａｇｅｓ／ｅｎ＿ＵＳ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ−ｌｉｐｉｄｓ／ｌｉｆｅ−ｄｈａ．ｈｔｍｌ）に記載されている。
【実施例】
【００５７】
実施例１：高ＤＨＡ含有株の発酵培養
培養は、専用の自動操作、およびコンピュータステーションによる監視を備えた１〜５Ｌの有用な容積を持つ発酵槽（バイオリアクター）中で行った。培養は、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉの２株を用い、２つの異なる培養プロトコルで行った。系は、塩基（実施例ｂ１およびｂ２についてはＮＨ４ＯＨ、実施例ａについてはＮａＯＨ）の添加によりｐＨ５に調整し、窒素供給を行いながら（実施例ｂ１およびｂ２について）、培養の全期間にわたってｐＨ調整を行った。培養温度は、３０℃、その後２２℃、最終的に培養の終了時に１８℃とした。
【００５８】
ＣＣＡＰ４０６２／７株を、実施例ａおよびｂ１について使用し、ＦＣＣＢ１８９７株を、実施例ｂ２について使用した。
【００５９】
培地の組成を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2022500049.tif 000002
【００６１】
グルコースの添加は、炭素：窒素：リン（ＣＮＰ）のモル比率が５３３：１１：１である強化溶液の形態で行われ（実施例ａ）、またはグルコースのみを含む溶液で行った（実施例ｂ１およびｂ２）。
【００６２】
培養モニタリング：
総バイオマス濃度は、乾燥質量を測定することによってモニターした（測定前に、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆフィルタで濾過し、その後１０５℃で、最小で２４時間オーブン乾燥させた）。脂肪酸分析は、バイオマスについては、ＩＳＯ１２９６６−２規格に準拠した方法に従って、またオイルについては、欧州薬局方９．０（２．４．２９．）に従って行った。
【００６３】
ａ、ｂ１およびｂ２条件下で得られたバイオマスの脂肪酸プロファイルを、総脂肪酸量に対するパーセンテージとして、表２に示す。ＳＦＡ：飽和脂肪酸。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
実施例２：高ＤＨＡ含有株の工業条件での培養
１０ｍ３（実施例ｄ）または１８０ｍ３（実施例ｅ）のタンクなどの工業用サイズの発酵槽中で、培地ｂ、および炭素：窒素：リン（ＣＮＰ）のモル比率が５３３：０．４：１である強化溶液の形態でのグルコース添加により、同様の条件で増殖させたとき、高ＤＨＡ含有Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ株は、同様の脂肪酸組成を有するバイオマスを生産する。
【００６６】
実施例ｄおよびｅのバイオマスの脂肪酸プロファイルを、総脂肪酸量に対するパーセンテージとして、表３に示す。
【００６７】
【表３】
2022500049.tif 000004
【００６８】
実施例３：高ＤＨＡ含有株のバイオマスからのオイル抽出：異なる方法での収率の比較
実施例２の条件下で生産され、６０％超のＤＨＡを含有する、同一のバイオマスからオイルを抽出した（表４）。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
抽出は、特に、化学的溶解（ＷＯ２０１５／０９５６８８Ａ１）または酵素的溶解および硫酸ナトリウムの添加（ＷＯ２０１１／１５３２４６）またはｐＨの変化（ＷＯ２０１５／０９５６９４）を含む、当業者に公知の様々な方法に従って実施した。バイオマス中の存在量と関連付けた脂質抽出収率を表５に示す。試験１、２および３は、従来技術の教示に従って実施した。試験４は、本発明に従って実施した。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
実施例４：高ＤＨＡ含有株のバイオマスからのオイル抽出
以下の手順に従って、実施例２で生産されたバイオマスからオイルを抽出した：
（ａ）６５℃の温度で４時間の、酵素的手段（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製のＡｌｃａｌａｓｅ  ２．５ＬまたはＡｌｃａｌａｓｅ  ２．４ＬまたはＮｏｖｏｚｙｍ  ３７０７１）による細胞溶解、
（ｂ）５から４０℃に温度を下げながら、３０分から３０時間、引き続き溶解、
（ｃ）遠心プレートセパレータによるオイルの機械的分離。
【００７３】
抽出収率は、バイオマスから抽出された脂質の６０％である。
【００７４】
【表６】
2022500049.tif 000007
【００７５】
参考文献
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・WO 1994/008467; WO 1997/037032; WO 2001/054510; WO 02/10322; WO 03/049832; WO 2010/107415; WO2011/153246; WO 2012/035262; WO 2013/136025; WO 2013/136028; WO 2014/146098; WO 2015/004402; WO 2015/004403; WO2015/095688; WO2015/095694; WO 2015/150716; WO 2016/030631
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