(57)【要約】本発明は、デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、調整されたナノ粒子組成物を製造する方法、それにより得られる組成物、及びこのような組成物の使用に関する。調整された組成物は、改良されたパラメーター、例えば、より低いバッチ間変化及び改良された安定性を有し、磁気イメージング剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
調整されたナノ粒子組成物を製造する方法であって、
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、限外ろ過された組成物を用意するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の限外ろ過された組成物中に存在するデキストラン−Ｔ１０の量を決定するステップと、
ｉｉｉ）デキストラン−Ｔ１０をステップｉ）の限外ろ過された組成物に添加して、鉄のｗｔ．％に対して少なくとも１４０ｗｔ．％で最大１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、調整された組成物を得るステップと、
ｉｖ）任意選択で、調整された組成物をろ過するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｉ）の限外ろ過された組成物又はステップｉｉｉ）の調整された組成物が１．５〜２．５ｗｔ．％の鉄を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｉｉ）がステップｉ）の限外ろ過された組成物の鉄の量を決定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｉｉｉ）がクエン酸塩のような等張化剤を、限外ろ過された組成物又は調整された組成物に、好ましくは鉄のｗｔ．％に対して７〜１２ｗｔ．％の量で、添加することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｉ）の限外ろ過された組成物が薬学的に許容できる賦形剤を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉｉｉ）がデキストラン−Ｔ１を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して少なくとも１４０ｗｔ．％で最大１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１を含むように、添加することを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
調整された組成物が、重量で実質的に等しい量のデキストラン−Ｔ１０及びデキストラン−Ｔ１を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｉ）において、限外ろ過された組成物が、
ｉ．ａ）デキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液を用意するステップと、
ｉ．ｂ）水酸化アンモニウムのような塩基をステップｉ．ａ）の溶液に添加するステップと、
ｉ．ｃ）ステップｉ．ｂ）の溶液を６０℃超に加熱して、デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含むナノ粒子組成物を得るステップと、
ｉ．ｄ）限外ろ過を使用してステップｉ．ｃ）のナノ粒子組成物を精製して限外ろ過された組成物を得るステップと
を含む方法により提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｉ）の限外ろ過された組成物のろ液が５００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは５０μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満の導電率を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
調整された組成物を凍結乾燥するステップを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と、
ｉｉｉ）任意選択でクエン酸塩のような等張化剤と
を含む組成物であって、鉄のｗｔ．％に対して少なくとも１４０ｗｔ．％で最大１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、組成物。
【請求項１２】
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と、
ｉｉｉ）任意選択でクエン酸塩のような等張化剤と
を含む組成物であって、
鉄のｗｔ．％に対して少なくとも１４０ｗｔ．％で最大１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含み、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、組成物。
【請求項１３】
デキストラン−Ｔ１０の濃度が最大で±１０％の分散を有する、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ナノ粒子のモード平均径が少なくとも６ヶ月安定である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物であって、医薬が好ましくはインビボ診断用であり、より好ましくはＭＲＩ造影剤用である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、調整されたナノ粒子組成物を製造する方法、それにより得られる組成物、及びこのような組成物の使用に関する。調整された組成物は改良されたパラメーター、例えば、より低いバッチ間変化及び改良された安定性を有し、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤として有用である。
【０００２】
［背景技術］
デキストランで被覆された酸化鉄ナノ粒子はＭＲＩ造影剤として有用である。一例は医薬品フェルモクストラン−１０であり、そのブランド名Ｓｉｎｅｒｅｍ及びＣｏｍｂｉｄｅｘでも知られている。この医薬品は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で細網内皮系のマーカーとして使用されるＵＳＰＩＯ（超小型超常磁性酸化鉄粒子、ＵＳＰＩＯＮＰといわれることもある）の種類の造影剤である。この医薬品は、ナノサイズの酸化鉄粒子を含んでおり、悪性腫瘍の患者のリンパ節転移の診断用が意図されている。ＭＲＩと組み合わせて使用したとき、これらの粒子は身体の正常なリンパ節を転移性のリンパ節、即ち悪性腫瘍転移により浸潤されたリンパ節と区別するのに役立つ。極めて小さいリンパ節（直径２ｍｍまで）でもこの技術を用いて検出することができる。この種類の医薬品は一般に凍結乾燥物として提供されており、この凍結乾燥物は水、例えば０．９％塩化ナトリウム溶液若しくは注射用水で再構成した後酸化鉄ナノ粒子のコロイド状溶液となり、又はこの種類の医薬品は液体製剤として提供される。これらの医薬品は０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈後非経口用及び点滴としての投与が意図されている。
【０００３】
デキストランで被覆された酸化鉄粒子、それらの使用、及びそれらの調製は当技術分野で公知である（欧州特許第０７１３６０２号；米国特許第５２６２１７６号；  Ｃｏｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２００６．０９．０１３  ；  Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ｄｏｉ：１０．１００２／ｎｂｍ．８８１  ；  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊｃｂｆｍ．２００９．１９２  ；  Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｃｒ０６８４４５ｅ）。例えば、フェルモクストラン−１０が第三相臨床試験で臨床的に開発されている（Ｓｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ００３３００１０１１３０）。
【０００４】
Ｊｕｎｇ及びＪａｃｏｂｓは（１９９５，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  １３，  Ｎｏ．  ５，  ｐｐ．  ６６１−６７４）、フェルモクストラン−１０粒子内部の実際の酸化鉄コアが不定比のマグネタイトからなり、Ｘ線回折ラインブロードニングにより測定して５．８〜６．２ｎｍの平均直径を有すると報告している。粒子の流体力学直径は約２１ｎｍ（数加重）である。より厚いデキストランコーティングは粒子の血漿タンパク質との相互作用を低下させ、したがって、オプソニン化を低下させると考えられている。
【０００５】
Ｊｕｎｇは（１９９５，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  １３，  Ｎｏ．  ５，  ｐｐ．  ６７５−６９１）更に、デキストランと酸化鉄粒子との間には共有結合性相互作用が起こらず、デキストランのより厚い層がオプソニン化を更に低下させるであろうと報告している。フェルモクストラン−１０に対する層厚は８〜１２ｎｍと報告されており、コア当たりおよそ３０の吸着したデキストラン分子に相当する。デキストラン結合は、ループ（非吸着内部セグメント）、トレイン（吸着した内部セグメント）、及びテール（非吸着末端セグメント）を有する可逆的なポリマー−表面相互作用を含む表面に対するポリマー吸着の古典的なＪｅｎｃｋｅｌ及びＲｕｍｂａｃｈモデルに従うことが見出されている。
【０００６】
Ａｎｚａｉらは（１９９４，  ＡＪＮＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ  １５：８７−９４）、フェルモクストラン−１０ナノ粒子が、デキストランコーティングが粒子のサイズを増大するという事実にも拘らず、被覆されてない酸化鉄ＵＳＰＩＯより長い血漿半減期（＞２００分）を有すると記載している。これは、マクロファージによる粒子の認識が粒子のサイズだけでなく、表面の特性にも依存するからである。酸化鉄はそれ自体が溶液中で負又は正に帯電して、その表面の回りの水分子の固定化を引き起こし得る。この結果、粒子のサイズは循環中徐々に増大する。デキストランは酸化鉄粒子に対する無電荷のコーティングであり、血管区画内で粒子のサイズを効果的に安定化する。したがって、デキストランで被覆された粒子は肝臓及び脾臓の単核性食細胞系により容易に捕捉されない。フェルモクストラン−１０のような粒子は生分解性であり、通常の異化経路を介して身体から排泄される。
【０００７】
デキストランは様々な長さの鎖から構成された複雑な分岐グルカン（結合したグルコース分子からなる多糖）である。デキストランには、一般にｋＤａ単位の平均分子量に対応するＴ−数が割り当てられることが多い。例えば、デキストラン−Ｔ１は約１０００Ｄａの平均分子量を有し、デキストラン−Ｔ１０は約１００００Ｄａ即ち１０ｋＤａの平均分子量を有する。フェルモクストラン−１０への用途において、デキストランは鉄塩の沈殿ステップにおいて酸化鉄コアのサイズを制御し、プロセス中及び医薬品内で粒子を安定化するのを補助するのに充分な分子量を有していなければならない。他のポリマー又は巨大分子（国際公開第９７／２５０７３号のデンプン、コンドロイチン、又はグルコサミノグリカン、国際公開第９６／０９８４０号のヘパリン）の使用が文献に記載されているが、重要な利点は報告されていない。
【０００８】
Ｕｎｔｅｒｗｅｇｅｒらは（ｄｏｉ：  １０．２１４７／ＩＪＮ．Ｓ１３８１０８）、デキストラン−Ｔ４０（約４０ｋＤａの平均分子量を有する）で被覆された酸化鉄ナノ粒子が約８０ｎｍの狭いサイズ分布によって特徴付けられることを報告している。粒子生産中デキストラン−Ｔ４０の使用によってより弱い免疫原特性を有する粒子が得られる。
【０００９】
Ｐａｕｌらは（ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｂｃ０３４１９４ｕ）、デキストラン−Ｔ１０で被覆された酸化鉄ナノ粒子が鉄１グラム当たり約０．７９グラムの結合デキストランのデキストラン−鉄含量を有すると報告しており、更に、デキストラン−Ｔ１０より短い鎖長のデキストラン（即ちデキストラン−Ｔ１及びデキストラン−Ｔ５）を使用すると、コロイド状の物質を得ることができなかったので、磁気的特性が劣った酸化鉄粒子になると報告している。この報告は、得られる粒子の特性を改良するためには製造中低減したデキストランの使用を推奨している。
【００１０】
Ｂｏｕｒｒｉｎｅｔは（プレゼンテーション“Ｃｏｎｇｒｅｓ  ｄｅ  ｌａ  ＳＦＴ”，  ２０−２１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８，  Ｐａｒｉｓ）、デキストラン−Ｔ１０コーティングを有し、各々鉄含量に対して１５０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０、１５０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１、及び９．５ｗｔ．％のクエン酸塩の追加の賦形剤を含む酸化鉄ナノ粒子の製剤を開示した。
【００１１】
デキストランで被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｄＵＳＰＩＯ）のより信頼性のある製造方法に対するニーズが継続して存在する。したがって、より信頼性の高い特徴を持つこのような粒子の組成物に対するニーズが継続している。
【００１２】
［発明の概要］
第１の態様において、本発明は、調整されたナノ粒子組成物を製造する方法であって、
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、限外ろ過された組成物を用意するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の限外ろ過された組成物中に存在するデキストラン−Ｔ１０の量を決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）の限外ろ過された組成物にデキストラン−Ｔ１０を添加して、鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、調整された組成物を得るステップと、
ｉｖ）任意選択で、調整された組成物をろ過するステップと
を含む、方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物又はステップｉｉｉ）の調整された組成物は１．５〜２．５ｗｔ．％の鉄を含む。好ましい実施形態において、ステップｉｉ）はステップｉ）の限外ろ過された組成物中の鉄の量を決定することを更に含む。好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）はクエン酸塩のような等張化剤を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に、好ましくは鉄のｗｔ．％に対して７〜１２ｗｔ．％の量で添加することを更に含む。好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物は薬学的に許容できる賦形剤を更に含む。好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物のろ液は５００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは５０μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。
【００１４】
好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）はデキストラン−Ｔ１を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に添加して、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して１４０−１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１を含むようにすることを更に含む。好ましい実施形態において、調整された組成物は重量で実質的に等しい量のデキストラン−Ｔ１０及びデキストラン−Ｔ１を含む。好ましい実施形態において、方法は調整された組成物を凍結乾燥するステップを更に含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、ステップｉ）において、限外ろ過された組成物は、
ｉ．ａ）デキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液を用意するステップと、
ｉ．ｂ）水酸化アンモニウムのような塩基をステップｉ．ａ）の溶液に添加するステップと、
ｉ．ｃ）ステップｉ．ｂ）の溶液を６０℃超に加熱してデキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含むナノ粒子組成物を得るステップと、
ｉ．ｄ）限外ろ過を用いてステップｉ．ｃ）のナノ粒子組成物を精製して限外ろ過された組成物を得るステップと
を含む方法により提供される。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と、
ｉｉｉ）任意選択で、クエン酸塩のような等張化剤と
を含む組成物であって、鉄のｗｔ．％に対して１４０−１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、組成物を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態において、この組成物は本発明の第１の態様に従う方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、デキストラン−Ｔ１０の濃度は最大で±１０％の分散を有する。好ましい実施形態において、ナノ粒子のモード平均径は少なくとも６ヶ月安定である。第３の態様において、本発明は医薬として使用するための組成物であって、医薬が好ましくはインビボ診断で、より好ましくはＭＲＩ造影剤として使用される、組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】デキストランにより安定化された酸化鉄コアの略図である。図は一定の縮尺で記載されてはいない。
【図２】本発明に従う方法を示すフローチャートである。太い破線の輪郭のステップは調整されたナノ粒子組成物を製造するステップである。
【図３】調整されたナノ粒子組成物の超遠心分離後のいろいろなデキストラン画分の分析を示すグラフである。デキストラン−Ｔ１は依然としてナノ粒子と実質的に結合していないことが明らかにされる一方、デキストラン−Ｔ１０の約７０％がナノ粒子と結合している。
【図４Ａ】調整されたナノ粒子組成物の異なるパラメーターに対するデキストラン−Ｔ１又はクエン酸塩の影響の分析を示す図である。Ａ）デキストラン−Ｔ１及びクエン酸塩の様々な濃度のｐＨに対する影響；明白な最適条件を決定することはできない。
【図４Ｂ】Ｂ）デキストラン−Ｔ１及びクエン酸塩の様々な濃度のモード径に対する影響；最適なゾーンは、デキストラン−Ｔ１が２０〜３０ｍｇ／ｇで、クエン酸塩が２．６ｍｇ／ｇより低いときに見出すことができる。
【図４Ｃ】Ｃ）デキストラン−Ｔ１及びクエン酸塩の様々な濃度のナノ粒子に結合したクエン酸塩レベルに対する影響；デキストラン−Ｔ１はこのパラメーターに対して顕著な影響がなく、約２．１ｍｇ／ｇ過剰のクエン酸塩はより顕著な影響がない。
【００１９】
［実施形態の説明］
本発明者は驚くべきことにデキストランで被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｄＵＳＰＩＯ）の新しい製造方法を見出した。この方法は重要な調整ステップを含んでいる。得られる調整されたナノ粒子は改良された特徴を有する。
【００２０】
方法
したがって、本発明は調整されたナノ粒子組成物を製造する方法であって、
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、限外ろ過された組成物を用意するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の限外ろ過された組成物中に存在するデキストラン−Ｔ１０の量を決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）の限外ろ過された組成物にデキストラン−Ｔ１０を添加して、鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、調整された組成物を得るステップと、
ｉｖ）任意選択で、調整された組成物をろ過するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２１】
このような方法は以後本発明に従う方法といわれる。
【００２２】
ｉ）未調整ナノ粒子の提供
ステップｉ）において、デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、限外ろ過された組成物が提供される。超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子は当技術分野で公知であり、例えばＭｏｒｕｐ  ＆  Ｈａｎｓｅｎ  （２００７）  “Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，  ｄｏｉ：  １０．１００２／９７８０４７００２２１８４．ｈｍｍ４０９  ，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ参照。限外ろ過された組成物は好ましくは未調整組成物であり、即ち言い換えると好ましくは上記のステップｉｉ、ｉｉｉ、及びｉｖに既に付されている組成物ではない。本明細書で使用されるとき、用語「未調整」とは、本発明に従う方法の生成物ではない組成物又はナノ粒子を指す。これらは当技術分野で公知であり、提供は任意の形態で、例えば粒子の新たな生産により、又は商業的供給業者から購入により、又はナノ粒子組成物の限外ろ過により限外ろ過された組成物を得ることができる。極めて適切な限外ろ過された組成物は上記のＳｉｎｅｒｅｍ又はフェルモクストラン−１０又はＣｏｍｂｉｄｅｘである。
【００２３】
ｄＵＳＰＩＯは超小型のナノ粒子であり、約２０ｎｍ未満のコア直径を有するナノ粒子である。好ましい超小型のナノ粒子は約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、より好ましくは約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、より好ましくは約１ｎｍ〜約８ｎｍ、更により好ましくは約２ｎｍ〜約８ｎｍ、最も好ましくは約４〜６ｎｍ又は約５〜７ｎｍ又は約４．３〜５．６ｎｍのコア直径を有する。好ましいコア直径は１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０ｎｍ以上、好ましくは３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、又は４．５ｎｍ以上である。好ましいコア直径は１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、又は１０．５ｎｍ以下、好ましくは５、５．２５、５．５、５．７５、又は６ｎｍ以下である。本明細書で使用されるとき、コア直径は、好ましくは、例えばＪｕｎｇ（１９９５）又はＪｕｎｇ及びＪａｃｏｂｓ（１９９５）に記載されているような動的光散乱（ＤＬＳ）、透過電子顕微鏡法、又はＸ線回折により決定される、ｄＵＳＰＩＯに含まれる酸化鉄の直径である。好ましくは、この文書で使用される直径は平均直径である。好ましいコア直径は体積加重平均直径である。好ましくは、本発明に従う方法で使用されるｄＵＳＰＩＯは実質的に同様な長さ、幅、及び高さを有しており、好ましくは３つの寸法のいずれも他の３つの寸法の１つ又は２つより１００、８０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％以上長くも短くもない。
【００２４】
ｄＵＳＰＩＯは超常磁性の酸化鉄コアを含む。このコアは好ましくは結晶、例えば酸化鉄のナノ結晶のような酸化鉄粒子である。好ましい結晶は、逆スピネル構造を有する結晶である。適切な酸化鉄はＦｅ（ＩＩ）の酸化物、例えばＦｅＯ及びＦｅＯ２、Ｆｅ（ＩＩＩ）の酸化物、例えばα−Ｆｅ２Ｏ３（ヘマタイト）、β−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグへマイト）、及びε−Ｆｅ２Ｏ３、並びにＦｅ（ＩＩ）とＦｅ（ＩＩＩ）の混合酸化物、例えばＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）、Ｆｅ４Ｏ５、Ｆｅ５Ｏ６、Ｆｅ５Ｏ７、Ｆｅ２５Ｏ３２、及びＦｅ１３Ｏ１９である。好ましい酸化鉄はＦｅ（ＩＩＩ）の酸化物並びにＦｅ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）の混合酸化物である。より好ましい酸化鉄はＦｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ４Ｏ５、Ｆｅ５Ｏ６、及びＦｅ５Ｏ７である。更により好ましい酸化鉄はマグへマイト及びマグネタイトであり、マグネタイトは最も好ましい酸化鉄である。好ましいマグネタイトは不定比のマグネタイトである。
【００２５】
ｄＵＳＰＩＯは好ましくはデキストラン−Ｔ１０で被覆される。天然に存在するデキストランは、様々な長さの鎖状につながった複数のグルコース分子を含み、約３〜約２０００キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する複雑な分岐した多糖である。デキストランはまた合成起源であることもでき、この場合分岐はあまり優勢ではないか、又は更には実質的に不在又は完全に不在であることができる。当技術分野で公知のように、デキストランの平均分子量（Ｍｗ）はその名前に付加されたＴ−数で表されることが多く、ここで数はｋＤａ単位の平均分子量を示す。例えば、デキストラン−Ｔ１は１ｋＤａ（又は好ましくは８００〜１２００Ｄａ、より好ましくは８５０〜１１５０Ｄａ）のＭｗを有し、デキストラン−Ｔ５は５ｋＤａ（又は４５００〜５５００Ｄａ）のＭｗを有し、デキストラン−Ｔ１０は１０ｋＤａ（又は９０００〜１１０００Ｄａ）のＭｗを有する。本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は＋１８８〜＋１９８の比旋光度（＋／−）ｏを有し；本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は９０００〜１１０００ＤａのＭｗを有し；本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は最大で１１０ｐｐｍの窒素含有物質を含み；本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は最大で７の乾燥減量（１０５℃、５時間、重量％（ｗｔ．％））を有し；本発明で使用する好ましいデキストラン−Ｔ１０は０．３ｗｔ．％未満の硫酸塩灰分を含み；本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は１グラムの微生物汚染に対し１００より少ないコロニー形成単位を含み；本発明で使用するのに好ましいデキストラン−Ｔ１０は医薬品品質である（より好ましくは分子量に関するヨーロッパ薬局方仕様に準拠している）。これらのパラメーターを決定する方法は当技術分野で公知である。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「被覆された」とは、酸化鉄コアの外面と結合している材料の層をいう。コーティングは好ましくはコア表面を覆って実質的に均一に分布する。ｄＵＳＰＩＯに対するコーティングの厚さは好ましくは水溶液中の動的光散乱により、より好ましくはＪｕｎｇ（１９９５）又はＪｕｎｇ及びＪａｃｏｂｓ（１９９５）により記載されているように決定される。好ましいコーティングの厚さは約４〜３０ｎｍ、より好ましくは約５〜２５ｎｍ、更により好ましくは約６〜２０ｎｍ、最も好ましくはコア当たりおよそ３０の吸着したデキストラン分子に対応する約８〜１２ｎｍである。好ましいコーティングは少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９ｎｍ、好ましくは少なくとも約４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｍ、例えば７、８、９、又は１０ｎｍの厚さを有する。好ましいコーティングは最大で約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｍ、好ましくは約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｎｍ、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７ｎｍの厚さを有する。好ましくは、コアは平均で約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の吸着したデキストラン分子を有する。好ましくは、コーティング内のデキストラン結合は表面に対するポリマー吸着の古典的なＪｅｎｃｋｅｌ及びＲｕｍｂａｃｈモデルに従う。
【００２７】
ｄＵＳＰＩＯの全直径はコア直径とコーティング厚さの二倍との和である。好ましいｄＵＳＰＩＯは約９〜約８０ｎｍ、より好ましくは約１５〜約５０ｎｍ、更により好ましくは約１７〜約２５ｎｍ、最も好ましくは約１８〜約２２ｎｍ、例えば１９又は２０ｎｍの全直径を有する。好ましいｄＵＳＰＩＯは少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ｎｍ、好ましくは少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ｎｍ、より好ましくは少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｍ、例えば１９ｎｍ又は２０ｎｍ又は２１ｎｍの全直径を有する。好ましいｄＵＳＰＩＯは最大で２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５ｎｍ、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５ｎｍ、より好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１ｎｍ、例えば２９ｎｍ又は３０ｎｍ又は３１ｎｍの全直径を有する。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、限外ろ過された組成物は限外ろ過に付された組成物である。限外ろ過は当技術分野で巨大分子又はナノ粒子を精製及び／又は濃縮するのに日常的に使用される。これは、圧力のような力が半透膜を通して分離を引き起こす、ある種の膜ろ過である。懸濁している高分子量の固体及び溶質、一般にフィルターの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）より高い分子量の物質は保持液に保持される。溶媒及び低分子量溶質のような他の物質は膜を透過し、透過液ともいわれるろ液を形成する。一般にこれらはフィルターのＭＷＣＯより低い分子量の物質である。限外ろ過は好ましくは接線流ろ過（クロスフローろ過ともいわれる）又はデッドエンドろ過、より好ましくは接線流ろ過である。
【００２９】
本発明で使用される限外ろ過は好ましくは約３０〜４００ｋＤａ、より好ましくは約５０〜２５０ｋＤａ、更により好ましくは約５０〜２００ｋＤａ、最も好ましくは約８０〜１５０ｋＤａ、例えば１００ｋＤａのＭＷＣＯのフィルターを使用する。フィルターのＭＷＣＯは好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０ｋＤａ、より好ましくは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、又は１２０ｋＤａ、最も好ましくは少なくとも９０、１００、又は１１０ｋＤａである。フィルターのＭＷＣＯは好ましくは最大で１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｋＤａ、より好ましくは最大で１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、又は２５０ｋＤａ、最も好ましくは最大で１００、１１０、又は１２０ｋＤａである。
【００３０】
好ましい実施形態において、未調整組成物は本発明に従う方法の一部として製造される。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ステップｉ）において、限外ろ過された組成物が、
ｉ．ａ）デキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液を用意するステップと、
ｉ．ｂ）水酸化アンモニウムのような塩基をステップｉ．ａ）の溶液に添加するステップと、
ｉ．ｃ）ステップｉ．ｂ）の溶液を６０℃超に加熱してデキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含むナノ粒子組成物を得るステップと、
ｉ．ｄ）限外ろ過を用いてステップｉ．ｃ）のナノ粒子組成物を精製して限外ろ過された組成物を得るステップと
を含む方法によって提供される、本発明に従う方法を提供する。
【００３１】
ステップｉ．ａ）において最終的なナノ粒子の構成材料が提供される。ステップｉ．ａ）は好ましくは不活性雰囲気中、例えば窒素下、ヘリウム下、又はアルゴン下で行われる。溶液は約１〜１０℃、好ましくは約１〜８℃で貯蔵することができる。水は本発明で使用されるとき好ましくは超純水又は注射用水である。好ましくは、ステップｉ．ａ）の溶液の溶媒は少なくとも７０ｗｔ．％の水、より好ましくは少なくとも８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９ｗｔ．％の水を含む。極めて好ましい実施形態において、水はステップｉ．ａ）の溶液の唯一の溶媒である。
【００３２】
デキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液は好ましくはデキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の少なくとも１種を含む異なる溶液を混合することによって得られる。好ましくは、ＦｅＣｌ３溶液をデキストラン−Ｔ１０溶液に添加し、その後ＦｅＣｌ２水溶液を更に添加する。好ましくは、各々の溶液は、使用前に、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方を通してろ過する。好ましくは、２つ又はそれ以上の溶液を混合したら、得られた溶液を少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又は２１０分、好ましくは少なくとも１１０分撹拌する。この撹拌は好ましくは少なくともステップｉ．ａ）において行う。
【００３３】
これに関連して、好ましいデキストラン−Ｔ１０溶液は水及びデキストラン−Ｔ１０を含み、好ましくは水及びデキストラン−Ｔ１０からなり、好ましくは約５０〜６００グラム／リットルのデキストラン−Ｔ１０を含み；より好ましくは、溶液は約２００〜６００グラム／リットルのデキストラン−Ｔ１０を含み；更により好ましくは、溶液は約４００〜６００グラム／リットルのデキストラン−Ｔ１０を含み；尚更により好ましくは、溶液は約５００〜６００グラム／リットルのデキストラン−Ｔ１０を含み；最も好ましくは、溶液は約５５０〜５８０グラム／リットルのデキストラン−Ｔ１０を含む。好ましくは、溶液は、デキストラン−Ｔ１０を水に、好ましくは撹拌しながら添加することによって調製される。調製後、溶液は任意選択で、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方に通してろ過する。Ｌａｕｒｅｎｔらは、デキストラン−Ｔ１０の使用が形成される超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子のサイズに直接役立つことを示唆している。本発明の組成物に対して所望の１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０（鉄のｗｔ．％に対して）に達するには後の段階で過剰のデキストラン−Ｔ１０の除去が必要となる。
【００３４】
これに関連して、好ましいＦｅＣｌ３溶液は水及びＦｅＣｌ３を含み、又はそれらからなり、また任意選択でデキストラン−Ｔ１０も、好ましくはデキストラン−Ｔ１０溶液に関して上記したように含む。溶液は好ましくは約４〜１２０グラム／リットルのＦｅＣｌ３を含み；より好ましくは溶液は約２０−８０グラム／リットルのＦｅＣｌ３を含み；更により好ましくは溶液は約３０−６０グラム／リットルのＦｅＣｌ３を含み；最も好ましくは溶液は約４０〜４５グラム／リットルのＦｅＣｌ３、例えば約４２グラム／リットルのＦｅＣｌ３を含む。ＦｅＣｌ３溶液は好ましくは、ＦｅＣｌ３、例えばその粉末を上記のデキストラン−Ｔ１０溶液に添加し、好ましくは続いて少なくとも６０、９０、１２０、１５０、又は１８０分撹拌し、例えば１８０分撹拌することによって調製される。代わりの好ましい実施形態において、ＦｅＣｌ３はＦｅＣｌ３の水溶液として添加される。ＦｅＣｌ３の溶液へのいかなる添加も、又はＦｅＣｌ３溶液の別の溶液へのいかなる添加も、又はＦｅＣｌ３のいかなる貯蔵も好ましくは不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下で、好ましくは約１−６℃で行われる。好ましいＦｅＣｌ３は無水のＦｅＣｌ３である。好ましいＦｅＣｌ３はＦｅＣｌ３六水和物、より好ましくはＦｅＣｌ３六水和物Ｐｈ．  Ｅｕｒ．である。調製後、溶液を任意選択で、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方に通してろ過する。
【００３５】
これに関連して、好ましいＦｅＣｌ２溶液は水及びＦｅＣｌ２を含み、又はそれらからなり、また任意選択で、好ましくはデキストラン−Ｔ１０溶液に関して上記したようなデキストラン−Ｔ１０も含む。溶液は好ましくは約１０〜１２００グラム／リットルのＦｅＣｌ２を含み；より好ましくは溶液は約７０〜１２００グラム／リットルのＦｅＣｌ２を含み；更により好ましくは溶液は約４００〜１０００グラム／リットルのＦｅＣｌ２を含み；最も好ましくは溶液は約７００〜８００グラム／リットルのＦｅＣｌ２、例えば約７４０グラム／リットルのＦｅＣｌ２を含む。ＦｅＣｌ２溶液は好ましくは、ＦｅＣｌ２、例えばその粉末を水に添加し、好ましくは続いて少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、又は１２０分撹拌、例えば１１０分撹拌することによって調製される。ＦｅＣｌ２の溶液へのいかなる添加も、又はＦｅＣｌ２溶液の別の溶液へのいかなる添加も、又はＦｅＣｌ２のいかなる貯蔵も、好ましくは不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下、好ましくは約２〜８℃で行われる。好ましいＦｅＣｌ２は無水のＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ２二水和物、ＦｅＣｌ２四水和物、又はＦｅＣｌ２六水和物である。より好ましいＦｅＣｌ２はＦｅＣｌ２四水和物である。調製後、溶液は任意選択で、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方に通してろ過する。
【００３６】
これに関連して、デキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の好ましい水溶液を用意するには、最初に、上記のデキストラン−Ｔ１０溶液を、好ましくは約８００〜１４００グラムのデキストラン−Ｔ１０を用い、より好ましくは約１１００〜１２００グラム、例えば約１１４３グラムのデキストラン−Ｔ１０を用いることにより調製し、その後ＦｅＣｌ３、好ましくはＦｅＣｌ３六水和物を、好ましくは約４０〜１２０グラム、より好ましくは約７０〜１００グラム、例えば約８５グラム添加し、その後溶液を好ましくは少なくとも１８０分混合し、次いで不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下で１〜６℃になるまで冷却する。この溶液に、ＦｅＣｌ２溶液を、好ましくは撹拌しながら、不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下で添加する。このＦｅＣｌ２溶液は好ましくは、上記のように、約２０〜５０グラム、好ましくは約３０〜４０グラム、例えば約３５グラムのＦｅＣｌ２四水和物を用い、好ましくは少なくとも１１０分撹拌し、その後溶液を不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下で２〜８℃になるまで冷却することによって調製される。次いで２つの別々の溶液を好ましくは、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方に通してろ過し、その後デキストラン−Ｔ１０及びＦｅＣｌ３を含む溶液にＦｅＣｌ２溶液を添加し、こうしてデキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液を提供する。
【００３７】
ステップｉ）で提供されるデキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、及びＦｅＣｌ２の水溶液は好ましくは２０〜５０：１〜５：１の範囲のデキストラン−Ｔ１０：ＦｅＣｌ３：ＦｅＣｌ２の重量比を有し、より好ましくはその範囲は２０〜４０：２〜４：１、更により好ましくは３０〜３５：２〜３：１の範囲である。最も好ましくは約３２．８：２．４：１である。このような重量比の一例は１１４３：８４．７：３４．８である。
【００３８】
方法ステップで使用するために本明細書を通じて述べられており、得られる生成物の特徴として述べられていない化合物量は代表的なものであり、限定することを意図されていないと理解されたい。例えば量は、好ましくは全工程にわたって記載されている比を維持しながら増減することができる。
【００３９】
ステップｉ．ｂ）においてステップｉ．ａ）の溶液に塩基が添加される。好ましくは、塩基はその塩基の溶液として、より好ましくはその塩基の水溶液として添加される。適切な塩基は炭酸塩、重炭酸塩、水酸化物、及びアンモニア、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＮＨ３、及びＮＨ４ＯＨである。塩基は好ましくは約１０〜４０ｗｔ．％、より好ましくは約２０〜３５ｗｔ．％、更により好ましくは約２５〜３０ｗｔ．％の水溶液として使用される。アンモニアは好ましい塩基である。したがって、ステップｉ．ｂ）でアンモニア溶液、好ましくは約２５〜３０ｗｔ．％のＮＨ４ＯＨ水溶液をステップｉ．ａ）の溶液に添加するのが極めて好ましい。このようなアンモニア溶液が医薬品グレードであり、任意選択で当技術分野で強アンモニア溶液といわれるものであると更により好ましい。貯蔵するとき、このような溶液は好ましくは２〜８℃で貯蔵される。ステップｉ．ａ）での量が上記の通りであるとき、約１０〜１０００グラムより好ましくは約５０〜５００グラム、更により好ましくは約７５〜１５０グラム、最も好ましくは約９０〜１１５グラム、例えば約１０３グラムの塩基溶液を使用するのが好ましい。その他の場合、ここに記載されているのと同じ比が好ましい。
【００４０】
ステップｉ．ｃ）においてデキストラン−Ｔ１０、ＦｅＣｌ３、ＦｅＣｌ２、及び塩基を含む溶液は６０℃超に加熱され、好ましくは６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、又は１００℃超に加熱される。好ましくは、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、又は１２０℃を超えて加熱されない。好ましくは、溶液は約６０〜１００℃、より好ましくは約７０〜９０℃、最も好ましくは約７５〜８５℃、例えば約８０℃に加熱される。加熱は好ましくは撹拌しながら、好ましくは不活性雰囲気、例えばＮ２雰囲気下で行われる。上記の加熱により、デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｄＵＳＰＩＯ）を含むナノ粒子組成物が形成される。
【００４１】
ステップｉ．ｄ）においてステップｉ．ｃ）のナノ粒子組成物が限外ろ過を用いて精製されて限外ろ過された組成物を得る。このステップで、任意選択でステップｉ．ｃ）のナノ粒子組成物は濃縮もされ、又は任意選択で精製する代わりに濃縮される。好ましくは、限外ろ過に先立って、ナノ粒子組成物を、好ましくは限外ろ過と適合性のある溶媒、例えば水である希釈剤を用いて希釈する。希釈のための水は好ましくは、ナノ粒子組成物に添加される間ナノ粒子組成物とほぼ同じ温度である。希釈は好ましくは約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍、より好ましくは約３、４、５、６、又は７倍、最も好ましくは約４、５、又は６倍、例えば５倍である。したがって、好ましくは約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍容量の希釈剤を添加し、より好ましくは約２、３、４、５、６、又は７倍容量の希釈剤を添加し、更により好ましくは約３、４、又は５倍容量の希釈剤、例えば約４倍容量の希釈剤を添加する。限外ろ過に先立ってナノ粒子組成物は好ましくは、例えば約１〜６０℃、好ましくは約１０〜５０℃、より好ましくは約１５〜３５℃、最も好ましくは約２０〜３０℃、例えば約２５℃に冷却される。限外ろ過に先立って、好ましくは冷却後、ナノ粒子組成物を好ましくは、例えば０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルター、又は両方に通してろ過する。任意選択で、限外ろ過の前に、多数のバッチのナノ粒子組成物を組み合わせ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のバッチ、好ましくは例えば３、４、５、６、７、８、又は９のバッチ、より好ましくは５、６、又は７のバッチ、例えば６のバッチを組み合わせる。
【００４２】
限外ろ過は好ましくは約３０〜４００ｋＤａ、より好ましくは約５０〜２５０ｋＤａ、更により好ましくは約５０〜２００ｋＤａ、最も好ましくは約８０〜１５０ｋＤａ、例えば１００ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルターを使用する。好ましくは限外ろ過は一定流量の限外ろ過、例えば接線流限外ろ過である。好ましくは、ろ過は組成物の容量が約２０〜８０％、好ましくは約３０〜７０％、より好ましくは約３５〜４５％、例えば約４０％に低減するまで継続する。これは本明細書中で限外ろ過ステップといわれる。次いで、任意選択で、各限外ろ過ステップの後ろ液を廃棄する。
【００４３】
当業者には知られているように、限外ろ過はバッチ式及び連続式に実行することができる。バッチ式限外ろ過は一定容量を限外ろ過される生成物に添加することを含む。連続式の限外ろ過は一定期間中限外ろ過しながら追加の容量（例えば緩衝液又はその他の溶液）を生成物に添加することを含む。連続式限外ろ過において組成物の容量は好ましくは安定、又は実質的に安定に保たれる。両者の組合せを適用することができ、結果は同一の生成物になる。
【００４４】
任意選択で、限外ろ過ステップの後、追加の限外ろ過ステップが実行される。好ましくは、このような追加の限外ろ過ステップの前、ナノ粒子組成物を１、２、３、４、又は５倍容量の希釈剤、より好ましくは１、２、又は３倍容量の希釈剤、例えば２倍容量の希釈剤で希釈する。このような追加の限外ろ過ステップを実行するならば、組成物の容量が約５〜６０％、好ましくは約８〜３０％、より好ましくは約１０〜１５％、例えば約１２％に低下するまでろ過を続けたときが好ましい。
【００４５】
このような追加の限外ろ過ステップの後、任意選択の更なる追加の限外ろ過ステップを実行するのが好ましい。このような更なる追加の限外ろ過ステップの前に、ナノ粒子組成物を好ましくは約１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、又は５倍容量の希釈剤、より好ましくは約１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、３、３．２、又は３．４倍容量の希釈剤、例えば約２．６倍容量の希釈剤で希釈する。好ましくは、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のこのような更なる追加の限外ろ過ステップ、例えば３の更なる追加の限外ろ過ステップを実行する。実行される最終の限外ろ過ステップが限外ろ過されたナノ粒子組成物の容量を約３〜３０％、好ましくは約５〜１５％、最も好ましくは約５〜１０％、例えば約６．５％に低下させるときが非常に好ましい。
【００４６】
好ましくは、全部で少なくとも２、３、４、５、６、又はそれ以上の限外ろ過ステップが実行される。好ましくは、追加の限外ろ過ステップは、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上、好ましくは１０倍容量の最小合計の希釈剤又は洗浄流体容量が使用されるまで、或いはろ液の導電率が充分に低く、例えば５００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは５０μＳ／ｃｍ未満、更により好ましくは４０μＳ／ｃｍ未満、最も好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満になるまで行われる。好ましくは、追加の限外ろ過ステップは、最小合計の希釈剤又は洗浄流体容量が使用され、且つろ液の導電率が充分に低くなるまで行われる。希釈剤は適切な洗浄流体である。導電率は電気伝導率計を用いて、好ましくは室温で測定することができる。好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物のろ液が５００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは５０μＳ／ｃｍ未満、更により好ましくは４０μＳ／ｃｍ未満、最も好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満の導電率を有する、本発明に従う方法が提供される。
【００４７】
或いは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上、好ましくは少なくとも約１０容量、好ましくは最大で約２０容量、より好ましくは最大で約１５倍容量の洗浄流体が使用される単一の限外ろ過ステップが行われる。
【００４８】
限外ろ過後、ナノ粒子組成物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍容量の希釈剤、例えば水を用いて希釈することができる。ナノ粒子組成物を限外ろ過機から取り出した後、希釈剤を用いて限外ろ過機を濯ぐことが有用であり、これは次いでナノ粒子組成物に添加することができる；これによりナノ粒子の収量が改良される。好ましくは、ステップｉｉ）で使用するためのナノ粒子組成物は４倍の追加の容量の希釈剤を用いて希釈する。好ましくは、限外ろ過機を、約１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．４、２．６、２．８、又は３容量、例えば約１．２〜１．６容量、より好ましくは約１．４倍容量の希釈剤を用いて濯ぎ；この濯ぎの後その容量は好ましくは限外ろ過されたナノ粒子組成物に添加される。このような濯ぎ容量の添加後組成物を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分、例えば約５分撹拌するのが好ましい。
【００４９】
ｄＵＳＰＩＯ組成物に言及するのに有用なパラメーターはその鉄のｗｔ．％である。鉄含量は当技術分野で公知の技術、例えば誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、原子発光分析法（ＡＥＳ）、及び原子吸光分析法（ＡＡＳ）を用いて決定することができ；ＡＡＳ及びＩＣＰ−ＭＳが好ましい技術であり、ＡＡＳが最も好ましい。好ましい実施形態において、本発明は、ステップｉ）の限外ろ過された組成物又はステップｉｉｉ）の調整された組成物が約１．５〜２．５ｗｔ．％の鉄、好ましくは約１．６〜２．３ｗｔ．％の鉄、より好ましくは約１．７〜２．１ｗｔ．％の鉄、最も好ましくは約１．８〜２．０ｗｔ．％の鉄、例えば１．９ｗｔ．％の鉄を含む、本発明に従う方法を提供する。
【００５０】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物は薬学的に許容できる賦形剤を更に含むことができる。この賦形剤はステップｉｉ）で使用するために提供される限外ろ過された組成物中に存在することができ、又は限外ろ過の前に存在することができ、又はステップｉ）中に使用される溶媒又は希釈剤又は洗浄流体中に存在することができる。薬学的に許容できる賦形剤の例は本明細書中後に挙げる。ステップｉ）のために、好ましい薬学的に許容できる賦形剤は水、例えば注射用水、ｍｉｌｌｉＱ水、又はＳｕｐｅｒＱ水、より好ましくは注射用水である。本出願を通して、溶媒又は賦形剤としての水への言及は薬学的に許容できる水溶液、例えば０．９ｗｔ．％のＮａＣｌ水溶液、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液への言及も含むことが意図されている。
【００５１】
ｉｉ）未調整ナノ粒子の分析
ステップｉｉ）においてステップｉ）の限外ろ過された組成物中に存在するデキストラン−Ｔ１０の量が決定される。この決定の間限外ろ過された組成物を２〜８℃で保存するのが好ましい。この決定の前に、限外ろ過された組成物を少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分、例えば約５分撹拌するのが好ましい。デキストラン−Ｔ１０の決定は標準的なクロマトグラフィー技術、例えばＨＰＬＣ及びＧＰＣにより、例えば比色分析法を用いるＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって、又は好ましくは全有機炭素（ＴＯＣ）分析機、例えばＳｈｉｍａｄｚｕ  ＴＯＣ−Ｌ分析機を用いるＴＯＣの試験によって行うことができる。好ましい比色分析法はＪｕｎｇ（１９９５）により使用されたＤｕｂｏｉｓらのもの（１９５６，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８：３５０−３５６）であり、その場合フェノール及び硫酸のような試薬を使用して、デキストラン−Ｔ１０の総量に比例する定量化可能な量の色を生成させる。この検定法は、デキストラン−Ｔ１０が組成物中に存在する唯一の炭水化物であるときに行うのが好ましい。その理由は、比色分析法が合計の炭水化物含量を決定し、デキストラン−Ｔ１０に特異的ではないからである。
【００５２】
好ましい実施形態において、ステップｉｉ）は、ステップｉ）の限外ろ過された組成物中の鉄の量を決定することを更に含む。鉄含量は当技術分野で公知の技術、例えば誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、原子発光分析法（ＡＥＳ）、及び原子吸光分析法（ＡＡＳ）を用いて決定することができ；ＡＡＳが好ましい技術である。
【００５３】
好ましくは、決定されるデキストラン−Ｔ１０の量は組成物中の鉄のｗｔ．％に対するデキストラン−Ｔ１０のｗｔ．％として表される。好ましくは、組成物中の鉄の量は組成物中の鉄のｗｔ．％として表される。
【００５４】
ｉｉｉ）限外ろ過された組成物を調整する
ステップｉｉｉ）において、限外ろ過された組成物は、ステップｉ）の限外ろ過された組成物にデキストラン−Ｔ１０を添加することによって調整される。調整された組成物は鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む。ｄＵＳＰＩＯの調製は一般に限外ろ過を含み、その間デキストラン−Ｔ１０はｄＵＳＰＩＯからゆっくりと解離する。これは、デキストラン−Ｔ１０の酸化鉄コアとの結合が共有結合ではなく（Ｊｕｎｇ  １９９５）、平衡で存在しているからである。一時的に解離したデキストラン−Ｔ１０は限外ろ過中、ｄＵＳＰＩＯと再び結合することができる前に洗い流されることができる。結果として、限外ろ過はｄＵＳＰＩＯ中のデキストランの量を低下させる。使用するのに適切となるほど充分に純粋なｄＵＳＰＩＯを得るには徹底的な限外ろ過が必要とされ、これには一般に極めて再現性が高くなければならない良好な製造プロセスを使用する必要がある。限外ろ過中のデキストラン−Ｔ１０の損失は限外ろ過中制御又は軽減することができない。したがって、当技術分野で公知のｄＵＳＰＩＯは１５％を超える分散を有するデキストラン−Ｔ１０含量を有する。最大で１５％、好ましくは最大で１０％の分散が望ましい。
【００５５】
これに関連して、分散は好ましくは、ｄＵＳＰＩＯの複数の生産バッチ間の標準偏差の３倍を平均値で割った値と定義され、百分率として表され、より好ましくは最も近い正数の百分率に丸めた百分率として表される。この複数は好ましくはｄＵＳＰＩＯの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の生産バッチ、より好ましくは少なくとも３、４、５、又は６の生産バッチ、更により好ましくは少なくとも４、５、又は６、最も好ましくは少なくとも６の生産バッチを含む。ｄＵＳＰＩＯの組成は、その分散がある一定の百分率より低いときその百分率で規定されているといわれる。
【００５６】
本発明者は、驚くべきことに、限外ろ過後デキストラン−Ｔ１０の量を調整して、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含むようにすると、分散が最大で１５％、より好ましくは最大で１０％のデキストラン−Ｔ１０の信頼性のある量を維持しながら更にろ過又は操作することができる調整された組成物が得られることを見出した。好ましい実施形態において、本発明に従う方法により得られるｄＵＳＰＩＯは１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５％未満の分散を有する。デキストラン含量の決定は本明細書中他の部分に記載されている。より好ましい実施形態において、限外ろ過後のデキストラン−Ｔ１０の量の調整は、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１５８ｗｔ．％、より好ましくは１４０〜１５５ｗｔ．％、更により好ましくは１４５〜１５５ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含むようなものである。
【００５７】
当業者には明らかなように、含量範囲は調製方法中積極的に求められる範囲である。したがって、鉄のｗｔ．％に対して１４０−１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、調整された組成物は１４０ｗｔ．％より少ないデキストラン−Ｔ１０を含まず、１６０ｗｔ．％より多くのデキストラン−Ｔ１０を含まない。したがって、好ましい実施形態においてある範囲の特定の成分を含むと規定された組成物は、その成分を示されている範囲の下限として規定されているより少なく含まず、その成分を示されている範囲の上限として規定されているより多く含まない。極めて好ましい例として、鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、調整された組成物は鉄のｗｔ．％に対して少なくとも１４０ｗｔ．％、最大で１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、調整とは、好ましくは、決定された値と標的の値との間の実質的な差である量の添加をいう。したがって、デキストラン−Ｔ１０の調整は、好ましくは、調整された組成物が所望の総量のデキストランＴ−１０を含むことになるような量のデキストランＴ−１０を組成物に添加することである。非限定例として、ある組成物に対して、ステップｉｉ）におけるデキストラン−Ｔ１０の量が鉄のｗｔ．％に対して１２０ｗｔ．％であると判明し、１４０ｗｔ．％のデキストランを含む組成物の製造が意図されていれば、そのときの調整は２０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０の組成物への添加を必要とする。
【００５９】
ステップｉｉｉ）において、更なる物質を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に添加することができる。適切な更なる物質はデキストラン−Ｔ１０ではないデキストラン、等張化剤、希釈剤、及び本明細書中後に定義される薬学的に許容できる賦形剤である。したがって、好ましい実施形態において、ステップｉ）の限外ろ過された組成物が薬学的に許容できる賦形剤を更に含むか、又はステップｉｉｉ）の調整された組成物が薬学的に許容できる賦形剤を更に含み、薬学的に許容できる賦形剤が好ましくはデキストラン−Ｔ１０含量の調整の前又は後、より好ましくは調整後に添加される、本発明に従う方法が提供される。適切な薬学的賦形剤は当技術分野で公知であり、更なる好ましい賦形剤の例は、以下に記載されるような、アジュバント、バインダー、乾燥剤、固化防止剤、染料、希釈剤、及び等張化剤である。
【００６０】
したがって、好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）が更なるデキストラン、例えばデキストラン−Ｔ１を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に添加することを更に含む、本発明に従う方法が提供される。この更なるデキストランはデキストラン−Ｔ１０ではなく；適切な更なるデキストランはデキストラン−Ｔ１、デキストラン−Ｔ５、デキストラン−Ｔ２０、及びデキストラン−Ｔ４０であり、デキストラン−Ｔ１は一般にデキストランに対する可能な免疫反応を低減するのに役立つことができるので、デキストラン−Ｔ１が最も好ましい更なるデキストランである。更なるデキストランは、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して１０〜３００ｗｔ．％、好ましくは５０〜２５０ｗｔ．％、より好ましくは１００〜２００ｗｔ．％、更により好ましくは１４０〜１６０ｗｔ．％、最も好ましくは１４５〜１５５ｗｔ．％、例えば１５０ｗｔ．％の更なるデキストランを含むように添加することができる。好ましくは、更なるデキストランは調整の後又は調整中に、最も好ましくは調整中に添加され、言い換えると、更なるデキストランは好ましくは調整のために使用されるデキストラン−Ｔ１０と同時に添加される。したがって、好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）が更なるデキストラン、例えばデキストラン−Ｔ１を、限外ろ過された組成物又は調整された組成物に、好ましくは調整された組成物に、調整された組成物が鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％の更なるデキストラン、例えばデキストラン−Ｔ１を含むことになるように添加することを更に含む、本発明に従う方法が提供される。本発明者は、本発明に従う組成物内に重量で実質的に等しい量のデキストラン−Ｔ１及びデキストラン−Ｔ１０を有するのが有利であることを見出した。好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）でデキストラン−Ｔ１を、調整された組成物が重量で実質的に等しい量のデキストラン−Ｔ１及びデキストラン−Ｔ１０を含むことになるように調整された組成物に添加する。したがって、本発明は、調整された組成物が重量で実質的に等しい量のデキストラン−Ｔ１０及びデキストラン−Ｔ１を含む、本発明に従う方法を提供する。結合したデキストランと遊離のデキストランの両方を考慮して、合計のデキストラン含量に言及していることを理解されたい。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態において、ステップｉｉｉ）がクエン酸塩のような等張化剤を限外ろ過された組成物又は調整された組成物に、好ましくは鉄のｗｔ．％に対して７〜１２ｗｔ．％の量で添加することを更に含む、本発明に従う方法が提供される。より好ましくは、等張化剤は約７．５〜１１．５ｗｔ．％、８〜１１ｗｔ．％、８．５〜１０．５ｗｔ．％、又は９〜１０ｗｔ．％、更により好ましくは８．５〜１０．５ｗｔ．％又は９〜１０ｗｔ．％、最も好ましくは９〜１０ｗｔ．％、例えば９．５ｗｔ．％で存在する。本発明において、等張化剤は組成物の適用部位で浸透圧衝撃を抑制することにより局所の刺激を低減する。等張化剤は当技術分野で公知である。適切な等張化剤はヘキソース、例えばデキストロース、アミノ酸、例えばグリセリン、糖アルコール、例えばマンニトール、ハロゲン化アルカリ塩、例えば塩化カリウム及び塩化ナトリウム、及び弱い有機酸塩、例えばクエン酸塩及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩である。弱い有機酸塩は得られるｄＵＳＰＩＯの安定性を増大し、ゼータ電位に対して良好な効果を有するので好ましく；このため、クエン酸塩が特に好ましい。適切なクエン酸塩はクエン酸三ナトリウム塩二水和物、クエン酸二ナトリウム塩、及びクエン酸ナトリウム塩であり、最も好ましいクエン酸塩はクエン酸三ナトリウム塩二水和物である。
【００６２】
本発明の幾つかの実施形態において、本発明に従う方法は調整された組成物を凍結乾燥するステップを更に含む。凍結乾燥は当技術分野で公知である。この凍結乾燥はステップｉｖ）においてそのろ過の前又は後の調整された組成物に対して行うことができる。得られる凍結乾燥物は調整された組成物の貯蔵に適した形態である。凍結乾燥のために、調整された組成物は好ましくはバイアルで瞬間凍結する。好ましくは、凍結乾燥中凍結乾燥機内、又は凍結乾燥したバイアルのヘッドスペース内、又は両方で真空を破るために窒素を使用する。本発明に従う方法が凍結乾燥ステップを含むとき、凍結乾燥ステップの前にデキストラン−Ｔ１及びクエン酸塩のような等張化剤の両方を上記の調整された組成物に添加するのが好ましい。驚くべきことにこの組合せは凍結乾燥結果を改良することが判明した。
【００６３】
ｉｖ）調整された組成物をろ過する
ステップｉｖはろ過ステップであり、ｄＵＳＰＩＯ組成物から凝集体を一掃するのに有用である。これに関連して好ましいろ過は０．０５〜０．５μｍフィルター、好ましくは０．１〜０．３μｍフィルター、例えば０．２μｍフィルターを通すろ過である。上で説明したように、ろ過はｄＵＳＰＩＯ中の酸化鉄コアからデキストランを分離することができ、組成物の正確な含量を変更させ得る。本発明に従う方法で製造される調整された組成物は、調整が以前のろ過ステップが起こした影響を中和するので、このような変化に対してより頑強である。こうして、ろ過された調整された組成物はより確かな含量であり、したがって、調整されてないろ過された組成物より信頼性が高い。本発明は、調整された組成物をろ過後凍結乾燥するステップを更に含む本発明に従う方法を提供する。
【００６４】
組成物
別の態様において、本発明は、
ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と、
ｉｉｉ）任意選択でクエン酸塩のような等張化剤と
を含む組成物であって、鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％のデキストラン−Ｔ１０を含む、組成物を提供する。このような組成物は本明細書中で本発明に従う組成物という。好ましくは組成物は薬学的組成物である。鉄のｗｔ．％に対して１４０〜１６０ｗｔ．％含まれるデキストラン−Ｔ１０はデキストラン−Ｔ１０の総計、即ちｉ）のｄＵＳＰＩＯ並びにｉｉ）の遊離のデキストラン−Ｔ１０をカバーする両方のデキストラン−Ｔ１０である。好ましくは、本発明に従う組成物は本発明に従う方法により得ることができ、より好ましくは本発明に従う方法により直接得られる。したがって、上記欄に記載された組成物は本発明のこの態様内である。
【００６５】
好ましい実施形態において、組成物は更に本明細書中他で定義される薬学的に許容できる賦形剤を含む。これに関連して、デキストラン−Ｔ１のような更なるデキストランが好ましく、クエン酸塩のような等張化剤も好ましい。
【００６６】
この態様内の好ましい実施形態において、デキストラン−Ｔ１０の濃度が最大で±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、又はそれ以下、好ましくは最大で±１０％、より好ましくは最大で±９％の分散を有する、本発明に従う組成物が提供される。これに関連して、分散は好ましくは本発明に従う組成物の複数の生産バッチ間の標準偏差の３倍として規定され、より好ましくは最も近い正数の百分率に丸められる。この複数は好ましくは本発明に従う組成物の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の生産バッチ、より好ましくは少なくとも４、５、又は６の生産バッチ、最も好ましくは少なくとも６の生産バッチを含む。本発明に従う組成物はその分散がある一定の百分率より低いときその百分率で規定されるといわれる。したがって、好ましい実施形態はデキストラン−Ｔ１０に対して１０％で規定された本発明に従う組成物を提供する。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明は、好ましくは各々の組成物が異なる生産バッチに由来し、デキストラン−Ｔ１０の濃度が組成物間で最大で±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、又はそれ以下、好ましくは最大で±１０％の分散を有する、本発明に従う複数の組成物を提供する。この複数は好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の本発明に従う組成物、より好ましくは少なくとも３、更により好ましくは少なくとも４、５、又は６の組成物、最も好ましくは少なくとも６の組成物を含む。この複数は好ましくは最大で１０００００の組成物を含む。好ましくは、複数からの少なくとも２つの組成物が異なる生産バッチに由来する。好ましくは、各々の組成物は、例えば賦形剤に関して実質的に同じ含量を有する。より好ましくは、各々の組成物は生産方法をもう一度繰り返したときに起こる正確な成分含量の変動の外で実質的に同じであり、例えば各々の組成物はデキストラン−Ｔ１０のような構成成分に対して起こる分散の外で同じである。好ましい実施形態において、複数はデキストラン−Ｔ１０に対して１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、又は１０％で、最も好ましくは１０％で規定される。
【００６８】
本発明に従う組成物は高い安定性を有する。この安定性を評価する有用なパラメーターは本発明に従う組成物に含まれるナノ粒子のモード平均径である。ナノ粒子が凝集すると、モード平均径は増大する。ナノ粒子が溶解したり若しくは解離したり又はその他分解したりすると、モード平均径は低下する。安定なモード平均径はナノ粒子の安定な集団、したがって、本発明に従う安定な組成物を反映する。この態様の実施形態において、ナノ粒子のモード平均径が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月、又はそれ以上安定である、本発明に従う組成物が提供される。好ましくは、モード平均径は少なくとも４、５、６ヶ月、又はそれ以上、最も好ましくは少なくとも６ヶ月以上安定である。好ましい実施形態において、安定性はほぼ室温、例えば２０〜３０℃、例えば２５℃である。
【００６９】
これに関連して、安定な平均のモード径は、同じ組成物に対して測定された値から、異なる時点で６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、又はそれ以上、好ましくは６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれ以上、より好ましくは６％を超えて外れない平均のモード径である。
【００７０】
本発明に従う組成物は好ましくは凍結乾燥物である。他の実施形態において、本発明に従う組成物は再構成された凍結乾燥物である。適切な再構成流体は、好ましくは薬学的に許容できる塩、例えば０．９ｗｔ．％塩化ナトリウムを含む注射用水である。再構成された本発明に従う組成物は好ましくは約１．５〜２．５ｗｔ．％の鉄、好ましくは約１．６〜２．３ｗｔ．％の鉄、より好ましくは約１．７〜２．１ｗｔ．％の鉄、最も好ましくは約１．８〜２．０ｗｔ．％の鉄、例えば１．９ｗｔ．％の鉄を含む。
【００７１】
好ましい実施形態において、組成物は両方が別々の容器に入った凍結乾燥物及び注射用水として提供される。このような凍結乾燥物に適した容器はガラスバイアル、例えば透明なガラスバイアル、例えば透明なＩ型ガラスバイアルであり、好ましくはゴム栓、例えばブロモブチル又はクロロブチルゴム栓で密閉され、好ましくは例えばアルミニウムのクリンプオンシールで密封される。
【００７２】
以下が、本発明に従う組成物の好ましい実施形態である。
【００７３】
１．ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と、
を含む本発明に従う組成物であって、約１９ｍｇ／ｇの鉄及び約２８．５ｍｇ／ｇのデキストラン−Ｔ１０を含む、組成物。
【００７４】
１’．更なる鉄もデキストラン−Ｔ１０も含まない、実施形態１の組成物。
【００７５】
２．約２８．５ｍｇ／ｇのデキストラン−Ｔ１を更に含む、実施形態１又は１’の組成物。
【００７６】
３．約２．４５ｍｇ／ｇのクエン酸ナトリウムを更に含む、実施形態１〜２のいずれかの組成物。
【００７７】
４．残りが実質的に水、例えば注射用水からなる、実施形態１〜３のいずれかの組成物。
【００７８】
５．残りが実質的に０．９ｗｔ．％のＮａＣｌ水溶液からなる、実施形態１〜３のいずれかの組成物。
【００７９】
６．実質的に更なる物質も成分も含まない、実施形態１〜５のいずれか１つの組成物。
【００８０】
７．ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と
を含む本発明に従う組成物であって、約２１０．４ｍｇの鉄及び約３１５．５ｍｇのデキストラン−Ｔ１０を含み、好ましくは更なる鉄もデキストラン−Ｔ１０も含まない、組成物。
【００８１】
８．約３１５．５ｍｇのデキストラン−Ｔ１を更に含む、実施形態７の組成物。
【００８２】
９．約２７．２ｍｇのクエン酸ナトリウムを更に含む、実施形態７又は８の組成物。
【００８３】
１０．実質的に更なる物質も成分も含まない、実施形態７〜９のいずれか１つの組成物。
【００８４】
１１．バイアル、例えばガラスバイアルにパッケージ化された、実施形態７〜１０のいずれか１つの組成物。
【００８５】
１２．バイアルが不活性雰囲気、例えば窒素雰囲気を含む、実施形態１１の組成物。
【００８６】
１３．分離している、注射用水のような水の容器と組み合わせられた、実施形態７〜１２のいずれか１つの組成物。
【００８７】
１４．分離している、０．９ｗｔ．％のＮａＣｌ水溶液の容器と組み合わせられた、実施形態７〜１２のいずれか１つの組成物。
【００８８】
１ａ．ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と
を含む本発明に従う組成物であって、約１７〜２１ｍｇ／ｇの鉄及び約２６〜３１ｍｇ／ｇのデキストラン−Ｔ１０を含み、好ましくは更なる鉄もデキストラン−Ｔ１０も含まない、組成物。
【００８９】
２ａ．約２６〜３１ｍｇ／ｇのデキストラン−Ｔ１を更に含む、実施形態１ａの組成物。
【００９０】
３ａ．約２．２〜２．７ｍｇ／ｇのクエン酸ナトリウムを更に含む、実施形態１ａ又は２ａの組成物。
【００９１】
４ａ．残りが実質的に水、例えば注射用水からなる、実施形態１ａ〜３ａのいずれかの組成物。
【００９２】
５ａ．残りが実質的に薬学的に許容できる塩溶液、例えば０．９ｗｔ．％のＮａＣｌ水溶液からなる、実施形態１ａ〜３ａのいずれかの組成物。
【００９３】
６ａ．実質的に更なる物質も成分も含まない、実施形態１ａ〜５ａのいずれか１つの組成物。
【００９４】
７ａ．ｉ）デキストラン−Ｔ１０で被覆された超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子と、
ｉｉ）遊離のデキストラン−Ｔ１０と
を含む本発明に従う組成物であって、約１９０〜２３０ｍｇの鉄及び約２８５〜３４５ｍｇのデキストラン−Ｔ１０を含み、好ましくは更なる鉄もデキストラン−Ｔ１０も含まない、組成物。
【００９５】
８ａ．約２８５〜３４５ｍｇのデキストラン−Ｔ１を更に含む、実施形態７ａの組成物。
【００９６】
９ａ．約２５〜３０ｍｇのクエン酸ナトリウムを更に含む、実施形態７ａ又は８ａの組成物。
【００９７】
１０ａ．実質的に更なる物質も成分も含まない、実施形態７ａ〜９ａのいずれか１つの組成物。
【００９８】
１１ａ．バイアル、例えばガラスバイアルにパッケージ化された、実施形態７ａ〜１０ａ、又は１５ａ、又は１６ａのいずれか１つの組成物。
【００９９】
１２ａ．バイアルが不活性雰囲気、例えば窒素雰囲気を含む、実施形態１１ａの組成物。
【０１００】
１３ａ．分離している、注射用水のような水の容器と組み合わせられた、実施形態７ａ〜１２ａのいずれか１つの組成物。
【０１０１】
１４ａ．分離している、薬学的に許容できる塩溶液、例えば０．９ｗｔ．％のＮａＣｌ水溶液の容器と組み合わせられた、実施形態７ａ〜１２ａのいずれか１つの組成物。
【０１０２】
１５ａ．単一の組成物として、実施形態７ａ〜１０ａのいずれか１つの更なる組成物と組み合わせられた、実施形態７ａ〜１０ａのいずれか１つの組成物。
【０１０３】
１６ａ．ある一定容量の組成物が組成物から除去されている、実施形態７ａ〜１０ａのいずれか１つの組成物。
【０１０４】
１７ａ．単一の組成物として、実施形態１ａ〜６ａのいずれか１つの更なる組成物と組み合わせられた、実施形態１ａ〜６ａのいずれか１つの組成物。
【０１０５】
１８ａ．ある一定容量の組成物が組成物から除去されている、実施形態１ａ〜６ａのいずれか１つの組成物。
【０１０６】
使用
本発明に従う組成物は有用なＭＲＩ造影剤である。したがって、本発明は、医薬として使用される本発明に従う組成物であって、医薬が好ましくはインビボ診断用であり、より好ましくはＭＲＩ造影剤として使用される、組成物を提供する。これは本明細書中本発明に従って使用される組成物といわれる。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明に従って使用される組成物は鉄補充療法において、例えば貧血を処置するのに使用される。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明に従って使用される組成物は多発性硬化症の診断に使用される。本発明に従って使用される組成物は脳において活動性病変の同定を可能にし、活動性病変を古い非活動性病変から識別する。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明に従って使用される組成物はアテローム性動脈硬化症の診断に使用される。本発明に従って使用される組成物は動脈内の活性なアテローム性プラークの同定を可能にし、破裂しがちなプラークの決定を可能にする。したがって、本発明に従って使用される組成物は血栓塞栓性合併症を予防するのに役立つことができる。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明に従って使用される組成物は血管造影に使用される。
【０１１１】
ＭＲＩ造影剤は好ましくは細網内皮系、肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、アテローム性動脈硬化症、及び活動性病変の可視化、より好ましくはリンパ節の可視化、更により好ましくは肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、アテローム性動脈硬化症、及び活動性病変の可視化、最も好ましくはリンパ節の可視化用である。
【０１１２】
特定の実施形態において、インビボ診断はがんの診断、より好ましくは前立腺、膀胱、乳房、又は婦人科がんのような固形がんからなる群から選択されるがんの診断用である。好ましいタイプの診断はＭＲＩにおけるリンパ節の病期分類又は特徴付けである。例えば、リンパ節は腫瘍又は非腫瘍であることを決定することができる。
【０１１３】
本発明に従って使用される組成物は好ましくは粉末、例えば凍結乾燥物、又は濃縮物、又は非経口投与、例えば点滴、好ましくはゆっくりした点滴用の溶液である。投与は好ましくは体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５ｍｇの鉄、より好ましくは体重１ｋｇ当たり少なくとも１．５、２、２．５、３、又は３．５ｍｇの鉄の薬量である。投与は好ましくは体重１ｋｇ当たり最大で１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、又は５．５ｍｇの鉄、より好ましくは体重１ｋｇ当たり最大で３、３．５、又は４ｍｇの鉄の薬量である。好ましい薬量は体重１ｋｇ当たり１〜４ｍｇの鉄、より好ましくは体重１ｋｇ当たり２〜３ｍｇの鉄、例えば体重１ｋｇ当たり２．６ｍｇの鉄である。
【０１１４】
粉末又は濃縮物の再構成後、デキストランにより、好ましくはクエン酸ナトリウムのような等張化剤によっても安定化された超常磁性の酸化鉄ナノ粒子の溶液が得られる。再構成は好ましくは、好ましくは０．９ｗｔ．％の塩化ナトリウムのような薬学的に許容できる塩を含む適切な薬学的希釈流体、例えば注射用水による。活性物質は、プロトンの緩和イメージングにおいてコントラストの特性をもたらすナノメートルサイズの酸化鉄コアからなり、これらのコアの適切な分散及び安定化を確実にする安定化剤（デキストラン−Ｔ１０、好ましくはデキストラン−Ｔ１、及び好ましくはクエン酸ナトリウムのような等張化剤も）から更になる。
【０１１５】
本発明に従って使用される組成物はＭｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＲＩ）に有用であり、細網内皮系（肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄）に特異的な公知の造影剤群、特に粒子直径が５０ｎｍ未満である酸化鉄の超小型粒子（ＵＳＰＩＯ）として公知の亜群に属する。本発明に従って使用される組成物は、リンパ節に対するその特異的且つ優先的な標的化を与える小さいサイズ（２０〜５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ未満、より好ましくは２５〜３５ｎｍ、例えば約３０ｎｍの平均直径、好ましくはレーザー光散乱平均直径）のナノ粒子を含む。
【０１１６】
医薬の製剤化、投与の方法、及び薬学的に許容できる賦形剤の使用は当技術分野で公知であって、慣用であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。
【０１１７】
一般的定義
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形はその非限定的な意味で使用されていて、その単語に続く事項が含まれるが、具体的に述べられていない事項が排除されないことを意味する。また、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によるある要素への言及は、その要素を１つであって１つだけであることを文脈が明らかに要求していない限り、その要素が１つより多く存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【０１１８】
数値と関連して使用されるとき単語「約」又は「およそ」（例えば約１０）は好ましくはその値が与えられた値より１％多いか又は少ない値であってもよいことを意味する。
【０１１９】
本発明においてある物質のパラメーターが考察されるときは、他に規定されない限り、そのパラメーターが生理的条件下で決定され、測定され、又は現れることが仮定されている。生理的条件は当業者に公知であり、水性溶媒系、大気圧、６〜８のｐＨ−値、室温から約３７℃までの範囲の温度（約２０℃〜約４０℃）、及び適切な濃度の緩衝塩又はその他の成分を含む。電荷は平衡と関連していることが多いと理解される。電荷を担う又は帯びるといわれる部分は、このような電荷を帯びない又は担わないよりも頻繁にこのような電荷を帯びる又は担う状態にあることが見出される部分である。したがって、当業者には理解されるように、本開示において帯電すると示されている原子は特定の条件下で帯電しないことができ、中性の部分は特定の条件下で帯電することができる。
【０１２０】
本発明において、評価されるパラメーターの低下又は増大はそのパラメーターに対応する値の少なくとも５％の変化を意味する。より好ましくは、値の低下又は増大は少なくとも１０％、更により好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は１００％の変化を意味する。この後者の場合は、パラメーターに関連する検出可能な値がもうない場合であることができる。
【０１２１】
本明細書に記載されているある物質の医薬としての使用は医薬の製造における前記物質の使用と解釈することもできる。同様に、ある物質が処置に、又は医薬として使用されるときは、このような処置のための医薬の製造に使用することもできる。本明細書に記載されている使用のための生成物は本明細書に記載されている処置又は診断の方法に使用するのに適している。
【０１２２】
以上、幾つかの代表的な実施形態を参照して本発明を記載して来た。幾つかの部分又は要素の変更及び代わりの実施が可能であり、添付の特許請求の範囲に定義される保護範囲内に含まれる。文献及び特許文書の引用は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
［実施例］
実施例１−調整されたｄＵＳＰＩＯの製造
限外ろ過されたｄＵＳＰＩＯの提供（図２の最初の７つの形状）
以降の製造プロセスの記載は臨床バッチサイズ（１４３ｇ鉄）に対する。
【０１２４】
ステップ１：デキストラン−鉄溶液の調製。精製水（１９５０±４０ｇ）をＡとラベル付けした５Ｌ容器に添加する。精製水を混合しながら、容器にデキストラン−Ｔ１０（１１４３ｇ）を添加する。塩化第二鉄（８４．７±１．７ｇ）をデキストラン溶液に添加し、溶液を最低３時間混合する。デキストラン−鉄溶液を０．２μフィルター及び０．４５μｍプレフィルターに通して容器「Ｂ」に移し、次いで蠕動ポンプを用いて反応器に移す。デキストラン−鉄溶液を窒素下反応器内で撹拌しながら、温度が１〜６℃に達するまで冷却する。
【０１２５】
ステップ２：塩化第一鉄溶液の調製。精製水（４６．８±０．９ｇ）をＣとラベル付けした２５０ｍＬ容器に添加する。精製水を撹拌しながら３４．８ｇ±０．７ｇの塩化第一鉄四水和物を添加する。撹拌を最低１１０分続ける。溶液を必要になるまで窒素下２〜８℃で保存する。
【０１２６】
ステップ３：強アンモニア溶液の調製。強アンモニア溶液（１０３．２±２．０ｇ）をドラフト内で秤量してＤとラベル付けした２５０ｍＬ容器に入れ、２〜８℃に冷却する。
【０１２７】
ステップ４：８０℃±５℃に加熱。反応器含有物を窒素下で撹拌しながら塩化第一鉄溶液をポンプで０．２μフィルターに通して反応器に送る。次いで水酸化アンモニウム溶液を反応器に添加する。反応器を加熱し、含有物が８０℃±５℃に達するまで撹拌する。
【０１２８】
ステップ５：精製水による希釈。次いで撹拌し続けながら８６６０±１５０ｍＬの８０℃±５℃精製水を反応器に添加する。反応器の温度を２５℃±５℃に冷却する。溶液を０．２μｍフィルター（及び０．４５μｍプレフィルター）に通してろ過して容器Ｆに入れる。
【０１２９】
ステップ６：限外ろ過。６つの超常磁性酸化鉄バッチを０．２μフィルター（及び０．４５μｍプレフィルター）に通してろ過して、１００，０００ダルトンのカットオフカートリッジ膜を備えた限外ろ過装置のタンクに直接入れる。一定流量の限外ろ過法を精製に使用する。保持される容量が２５．５Ｌになるまで溶液を限外ろ過機に通して処理する。全限外ろ過ステップ中流出液を捨てる。酸化鉄溶液を再び限外ろ過機に通して、容量を２５．５Ｌに保ちながら５１Ｌの注射用水で溶液を洗浄することにより処理する（連続限外ろ過）。溶液を限外ろ過機に通して保持される容量が９Ｌになるまで処理する。酸化鉄溶液を再び限外ろ過機に通して、容量を９Ｌに保ちながら２４Ｌの注射用水で溶液を洗浄することにより処理する。最低２以上の限外ろ過サイクルを行う。流出液の導電率を試験する。２５μＳ未満であれば、限外ろ過を２．１６±０．１Ｌの容量になるまで継続し、限外ろ過が完了する。導電率が２５μＳを超えていれば、１回又は２回の追加の限外ろ過サイクルを行い、各サイクルの後導電率を試験する。限外ろ過を完了するには両方の条件が満たさなければならない：
−  第１に、最低１０のダイアフィルトレーションの容量の注射用水を使用しなければならない、
−  第２に、２５μＳ未満の導電率が達成されなければならない。
【０１３０】
溶液を限外ろ過機タンクから取り出し、０．２μｍフィルター（０．４５μｍプレフィルター付き）に通してろ過して１０Ｌの容器に入れる。注射用水（１４４０±４０ｍＬ）を限外ろ過機タンクに添加して濯ぎ、その後１０Ｌの容器に添加する。
【０１３１】
限外ろ過されたｄＵＳＰＩＯの分析（図２の形状８）
ステップ７  限外ろ過された溶液を最低５分間撹拌した後、鉄含量及び総デキストラン含量のためのＴＯＣ（全有機炭素）の決定のために原子吸光分析を用いて総鉄濃度及びデキストラン含量を分析する。溶液は、結果が得られるまで２℃〜８℃で保存する。
【０１３２】
ｄＵＳＰＩＯの調整及び更なる処理（図２の形状９、１０、１１の一部）
ステップ８：デキストラン−Ｔ１０、デキストラン−Ｔ１及びクエン酸ナトリウム二水和物溶液の調製。注射用水中のデキストラン−Ｔ１０、デキストラン−Ｔ１及びクエン酸ナトリウム二水和物溶液の量は、ステップ７からの鉄濃度及びデキストラン−Ｔ１０濃度に基づいて、最終の製剤中で鉄の濃度が１８〜２０ｍｇ／ｇ、デキストランの合計濃度が５３〜６１ｍｇ／ｇ、デキストラン−Ｔ１０とデキストラン−Ｔ１の比が１／１ｇ／ｇ、クエン酸塩含量が１．５〜２．１ｍｇ／ｇとなるように計算される。注射用水を１０Ｌ容器に添加する。注射用水を撹拌し、デキストラン−Ｔ１０、デキストラン−Ｔ１、及びクエン酸ナトリウム二水和物を添加する（ゆっくりした添加で良好な結果が得られた）。溶液を最低１５分撹拌する。
【０１３３】
ステップ９：デキストラン−Ｔ１０、デキストラン−Ｔ１及びクエン酸ナトリウム二水和物溶液の添加。ステップ７の溶液を混合し、ステップ８の溶液を０．２μｍフィルター及び０．４５μｍプレフィルターに通して連続的に混合しながら添加することにより最終製剤を調製する。
【０１３４】
ステップ１０：ろ過。溶液を０．２μフィルターに通してろ過して貯蔵及び輸送のための１０Ｌの容器に入れる。このステップは必要であれば（例えばフィルターの機能停止の場合）繰り返すことができる。
【０１３５】
表１は、上のステップ１〜６に従って調製された３つの異なるバッチの調整の実施例を示す。
【０１３６】
【表１】
2022500495.tif 000002
【０１３７】
実施例２−調整されたｄＵＳＰＩＯと未調整のｄＵＳＰＩＯの比較
実施例１の調整された組成物は、製造中デキストラン−Ｔ１０の調整をしているので最適化された製剤である。この調整は最終生成物のデキストランの濃度のより良好な再現性（±１０％）を確実にすることを可能にし、モード平均径の安定性を増大させる。製剤がその他の点では等価であることを示すために、調整された（実施例１の全プロトコル）と未調整の（実施例１のステップ１〜６）組成物の比較研究を行った。両方の組成物は１．８ｍｇ／ｇのクエン酸イオン及び２８．５ｍｇのデキストラン−Ｔ１を含んでおり、凍結乾燥物として安定化され、４℃及び２５℃で６ヶ月間貯蔵された。ゼータ電位はＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。モード平均径はレーザー光散乱を用いて測定した（適したモデルはＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ  ９０、及びＭａｌｖｅｒｎ  ４７００である）。
【０１３８】
【表２】
2022500495.tif 000003
【０１３９】
両方の組成物について、４及び２５℃の、ｐＨは時間と共に変化せず、ゼータ電位は水又は塩溶液の両方で非常に類似している。未調整組成物の場合、モード平均径は４℃で７％より大きく、２５℃では３５％より大きく変化したが、両方の条件下で調整された組成物は約５％の変動でとどまった。
【０１４０】
未調整及び調整されたバッチをそれらの総デキストラン含量についても分析した。調整された組成物は分散±９％において±１０％で規定することができた。未調整組成物は±１７％の分散を有していた。
【０１４１】
【表３】
2022500495.tif 000004
【０１４２】
実施例３−ｄＵＳＰＩＯの分析
遊離及び結合デキストラン画分の分析
実施例１で調製された組成物のデキストラン画分を、組成物を平衡させた後、限外ろ過された組成物について上記したように３０ｋＤａのＭＷＣＯで単一ステップの超遠心分離の後に決定した。デキストランはゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いて確認した。結果を図３に示す。デキストラン−Ｔ１は実質的にナノ粒子と結合していないままであることが明らかにされ、一方約７０％のデキストラン−Ｔ１０がナノ粒子と結合する。デキストラン−Ｔ１は溶媒中で遊離の状態のままであり、デキストラン−Ｔ１０／酸化鉄相互作用を変化させない。データはまた、デキストラン−Ｔ１０の粒子に結合した割合が、組成物が平衡であるときデキストラン−Ｔ１０の総量の７０％を示すことを裏付けている。
【０１４３】
最適な賦形剤濃度の決定
Ｄｏｅｌｈｅｒｔ’ｓ  ｍａｔｒｉｘ（例えばＳａｕｔｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２００１，  ９１，  ９００−９０６参照）に従う分析に使用するために表４に示されているいろいろな製剤を調製した。各製剤は凍結乾燥物として安定化されており、０．９％ＮａＣｌで再構成後分析した。各製剤を室温及び５５℃で１２ヶ月間貯蔵した。以下のパラメーターを分析した：ｐＨ、レーザー散乱による粒子のサイズ、ゼータ電位、及び結合したクエン酸塩。結合したクエン酸塩はＨＰＬＣ技術、又はＬＣＭＳにより、再構成後上清で評価することができる。結果はＮｅｍｒｏｄ  ３．０ソフトウェアを用いて分析する。
【０１４４】
因子（クエン酸塩における濃度及びデキストラン−Ｔ１における濃度）をそれぞれＸ１及びＸ２によりシンボル化する。Ｘ１及びＸ２に関して測定されるＹ応答（パラメーター）をモデル化する関数は、
Ｙ＝ｂｏ＋ｂ１Ｘ１＋ｂ２Ｘ２＋ｂ１１Ｘ１２＋ｂ２２Ｘ２２＋ｂ１２Ｘ１Ｘ２
である。
【０１４５】
【表４】
2022500495.tif 000005
【０１４６】
ｐＨ
実施したいずれの実験でも、２５℃でｐＨの変動は全く観察されない。このパラメーターはこの研究では適切でない。ｐＨの応答（５５℃）は次の多項式：
ｐＨ＝７．３８＋０．２６Ｘ１−０．２３Ｘ２−０．０８Ｘ１２＋０．０３Ｘ２２＋０．２２Ｘ１Ｘ２
でモデル化される。
【０１４７】
式は、主要な効果が、クエン酸塩（濃度が増大するとｐＨが上昇する）、デキストラン−Ｔ１（濃度が増大すると低下する）及び両方の因子の相互作用に関係していることを示している。応答曲線（図４Ａ）は、特徴的な最適条件を示すことなく、これらの結果を図に示している。高温で、クエン酸塩は緩衝剤として働き、デキストランの存在に関連するｐＨの低下の制限を可能にしている。この現象は貯蔵の通常の条件では見られない。
【０１４８】
モード径
平均のモード径の応答（２５℃）は次の多項式：
直径＝３４．１−８．３Ｘ１−３０．５Ｘ２＋７．０Ｘ１２＋２９．２Ｘ２２＋２０．１Ｘ１Ｘ２
でモデル化される。
【０１４９】
式は、デキストランが重要な効果を有することを示している。クエン酸塩とデキストラン−Ｔ１の間に少し相互作用がある。応答曲線（図４Ｂ）は明らかに、２０〜３０ｍｇ／ｇのデキストラン−Ｔ１含量及び２．６ｍｇ／ｇ未満のクエン酸塩含量に最適なゾーンを示している。
【０１５０】
平均のモード径の応答（５５℃）は次の多項式：
直径＝３７．９−１３．８Ｘ１−５７．８Ｘ２＋１２．１Ｘ１２＋５５．２Ｘ２２＋３０．５Ｘ１Ｘ２
でモデル化される。
【０１５１】
効果は２５℃より顕著であるが、その性質は変わらない。
【０１５２】
ゼータ電位
ζ電位の応答は次の多項式：
ζ＝−４２．５−６．１Ｘ１−３．３Ｘ２＋１１．７Ｘ１２−０．５Ｘ２２＋３．１Ｘ１Ｘ２
でモデル化される。
【０１５３】
式は、クエン酸塩が重要な効果を有することを示している。最適条件（最大負荷）は１．４〜２．３ｍｇ／ｇに含まれる範囲内にあり、２．３ｍｇ／ｇ（鉄に対して１２．１２ｗｔ．％）を超える濃度は更なる効果をもたない。
【０１５４】
結合したクエン酸塩
結合したクエン酸塩の応答は次の多項式：
結合したクエン酸塩＝１．０９＋０．２５Ｘ１−０．０１Ｘ２−０．１５Ｘ１２−０．０４Ｘ２２−０．０３Ｘ１Ｘ２
でモデル化される。
【０１５５】
予想通り、式は、クエン酸塩のみがこのパラメーターに対して効果を有する。応答曲線（図４Ｃ）もまた、粒子表面に対するクエン酸塩の飽和現象を示している。最適な応答は０〜１．１ｍｇ／ｇであり、１．４ｍｇ／ｇに等しい総クエン酸塩濃度で得られる。２．１〜２．２ｍｇ／ｇより多く過剰の総クエン酸塩はそれ以上の有意な効果をもたない。これらの結果はゼータ電位に対して得られたものと一致している。
【０１５６】
結論
研究は、クエン酸塩が粒子電荷に寄与し、１．４ｍｇ／ｇを超える濃度で有益であり；デキストラン−Ｔ１が凍結乾燥の間凍結保護剤として作用し、２０ｍｇ／ｇ以上の濃度で最も効率的であることを示した。
【０１５７】
実施例４−ｄＵＳＰＩＯの凍結乾燥
３つの異なる組成物の熱的特性を、電気伝導特性を検査することにより氷マトリックスの変化をモニターする標準的な技術を用いて分析した。デキストラン−Ｔ１とクエン酸塩の両方を含む組成物は個々の添加剤の相加効果に基づいて期待できたよりも凍結乾燥に対して耐性であることが分かった。これは、よりゆっくりした、より緩やかな凍結乾燥ということになり、粒子の凝集を低減する。
【０１５８】
【表５】
2022500495.tif 000006
【０１５９】
参考文献
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【図１】
2022500495.tif 000007
【図２】
2022500495.tif 000008
【図３】
2022500495.tif 000009
【図４Ａ】
2022500495.tif 000010
【図４Ｂ】
2022500495.tif 000011
【図４Ｃ】
2022500495.tif 000012
【国際調査報告】
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2022500495.tif 000014