(57)【要約】  本発明の目的は、同時に又は別々にペプチド及び／又は疎水性活性化合物のカプセル化のために設計された、ヒアルロン酸誘導体に基づくナノカプセル・イン・ナノカプセルタイプのマルチコンパートメントシステムであって、界面活性剤、乳化剤、及び／又は安定剤がシステム安定性のために必要ではなく、前記システムが、攻撃的な外部環境並びに生じる分解及び不活性化に対する、影響を受けやすい親水性物質の保護を可能にし、様々な親水性の活性物質を同時に投与することを可能にする担体として機能するシステムである。本発明の目的は、水中油中水型ダブルエマルションの形態のマルチコンパートメントナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムを製造する方法も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性化合物及び親油性化合物の同時送達のための、水中油中水型ダブルエマルションの形態のナノカプセル・イン・ナノカプセルタイプのマルチコンパートメントシステムであって、
ａ）オレイン酸、パルミチン酸イソプロピル、脂肪酸、天然抽出物及びコーン油、亜麻仁油、大豆油、アルガンオイルなどの油、又はこれらの混合物を含む群から選択される油を含む、有益にはオレイン酸を含む、親油性化合物の輸送のための液体油コアと、
ｂ）親水性化合物の輸送のための、油コアに埋め込まれた水性コアを有する1以上のカプセルと、
ｃ）キトサン、オリゴキトサン、デキストラン、カラギーナン、アミロース、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルラン及びグリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸の誘導体を含む群から選択される疎水化修飾多糖からなる、有益にはヒアルロン酸の誘導体からなる、油コアを有する前記カプセルと水コアを有する内部カプセルの両方のための安定化シェルと、
ｄ）水溶液中で安定な、１μｍ未満の直径を有する外側カプセルと、
ｅ）活性物質と、
を含む、システム。
【請求項２】
疎水化修飾多糖中の疎水性側鎖置換の程度が０．１〜４０％の範囲である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
油コアを有する前記カプセル及び水コアを有する前記カプセル（内部カプセル）のための前記安定化シェルが、以下の式：
【化１】
2022500488.tif 000015
（ここで、ｘは１〜３０の範囲の整数であり、それが、前記疎水性側鎖中の炭素原子の総数を規定し、数の比ｍ／（ｍ＋ｎ）は０．００１〜０．４の範囲である）
を有する疎水化修飾ヒアルロン酸ナトリウム、Ｈｙ−Ｃｘからなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記輸送される親油性化合物が、蛍光染料、脂溶性ビタミン、又は疎水性薬物であり得る、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記輸送される親水性化合物が、蛍光染料、水溶性ビタミン、タンパク質、又は親水性薬物；好都合にはインスリンであり得る、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
インスリンが、カプセル懸濁液の１ｍｌあたり０．００５〜２０．０００のインスリン単位の濃度である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
請求項１に定義される水中油中水型ダブルエマルションの形態のナノカプセル・イン・ナノカプセルタイプのマルチコンパートメントシステムを製造する方法であって、
ａ）第１工程の間に、油中水（Ｗ／Ｏ）型の逆エマルションが、上記式により記述されるヒアルロン酸ドデシル誘導体Ｈｙ−Ｃｘの水溶液を、混合物体積の約０．１〜９９．９％を構成する非毒性の油と、超音波（音波処理）又は機械的刺激にさらすこと、好都合には混合又は振盪により、水相と油相の体積比を１：１０〜１：１００００の範囲、好都合にはおよそ１：１００として混合することにより製造され、
ｂ）第２工程の間に、前記連続的な油相に懸濁している水滴が、ヒアルロネートコーティングを、Ｗ／Ｏ相エマルションと水相の体積比を１：１０〜１：１００００の範囲、好都合にはおよそ１：１００として受け取り、
ｃ）結果として、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）ダブルエマルションシステムが、超音波（音波処理）又は機械的刺激へさらすこと、好都合には混合又は振盪により製造され、
ここで、適用される前記水相が、キトサン、オリゴキトサン、デキストラン、カラギーナン、アミロース、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルラン及びグリコサミノグリカン、及び特にヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸の誘導体を含む群から選択される疎水化修飾多糖；好都合にはヒアルロン酸の誘導体の、２〜１２の範囲のｐＨ、０．１〜３０ｇ／Ｌの濃度、及び０．００１〜３ｍｏｌ／ｄｍ３の範囲のイオン強度を有する水溶液に基づいており、
前記油相が、オレイン酸、パルミチン酸イソプロピル、脂肪酸、天然の油、とりわけ亜麻仁油、大豆油、アルガンオイル、又はこれらの混合物を含む群から選択される油を含み、有益にはオレイン酸を含み、
注目すべきことに、前記プロセスが、小粒子界面活性剤を全く使用せずに実施される、
方法。
【請求項８】
パルス状音波処理が、衝撃持続期間を、２つの連続する衝撃の間の間隔の継続期間の半分として実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カプセル化された親油性化合物が前記油コアに含まれ、前記カプセル化された親水性化合物が前記ナノカプセルの前記水コアに含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記多糖中のイオン性基の含量が２０ｍｏｌ％以上である場合に好都合であり、それが６０ｍｏｌ％を超える場合に（一量体あたりで計算）好都合である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１及び第２工程の間、音波処理が、１５〜６０分間、１８℃〜４０℃の温度で、好都合には６０分間継続されて逆エマルションが得られ、２５〜３０℃で３０分間継続されてダブルエマルションが得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記親油性化合物が、蛍光染料、脂溶性ビタミン、又は疎水性薬物であり得て、前記親水性化合物が、蛍光染料、水溶性ビタミン、タンパク質又は親水性薬物、好都合にはインスリンであり得る、親油性化合物及び親水性化合物の輸送のための、請求項１に記載のマルチコンパートメントシステムの適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、親油性化合物及び親水性化合物のカプセル化のためのナノカプセル・イン・ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ−ｉｎ−ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）タイプのマルチコンパートメントシステム並びにヒアルロン酸の疎水化誘導体により安定化され追加の乳化剤を使用することを全く必要としない水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）ダブルエマルションに基づく関連する製造方法であり、前記システムは、タンパク質を含む影響を受けやすい親水性物質の攻撃的な外部環境に対する保護を確保する必要性に関連する問題も解決し、様々な親水性の活性物質の同時投与を可能にする担体である。
【背景技術】
【０００２】
疎水性化合物及び親水性化合物を同時に適用する必要性は、多くの場合、活性物質の組合せの相乗的作用に（Ｃｈｏｕ  ＴＣ（２００６）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５８：６２１−６８１；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＧＲ，Ｌｅｈａｒ  Ｊ，Ｋｅｉｔｈ  ＣＴ（２００７）Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｗｈｅｎ  ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｉｓ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｄａｙ  １２：３４−４２．）、又は治療薬と診断プロセスを支援する物質の同時で共局在化された（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ）送達の可能性（セラノスティクス）に（Ｌｉｕ  Ｇ，Ｄｅｎｇ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｆ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｐｅｅｒｃ  Ｄ，Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ＭＲＩ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ  ａｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１８，６，１９９５−２００３）関連している。これは、特に、医薬品、ビタミン、ホルモン、及び磁気共鳴画像法における造影剤などの投与と関連している。薬物投与の場合、それは、癌などの複雑な疾病の治療において（Ｂｌａｎｃｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｊｕｌ；２２（７）：１３１０−１３１９．）、又は微生物及び真菌における薬剤耐性と戦う際に（Ｌｅｖｙ  ＳＢ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｂ（２００４）Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｃａｕｓｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：２  Ｓ１２２−１２９；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＪＢ，Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ  Ｂ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢ，Ｓｏｒｇｅｒ  ＰＫ（２００６）Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｑｕｅｓｔ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：４５８−４６６）特に重要である。
【０００３】
様々な親水性の適用される活性物質は、通常、薬物動態の点で異なり、それは、そのような物質の混合物が同時投与される場合ですら、体内の相乗効果に悪影響を及ぼす。問題は、両方の（又は多くの）物質を同時に１つの位置に送達する（共局在）１つのサブマイクロメートルサイズの担体中でのそのような物質の投与により解決され得る。そのような担体は、水中油中水型ダブルエマルションのシステムに基づいており、構造上、それらは、本発明のように、油コアを有するカプセルに埋め込まれた水コアを有するカプセルとして記述することができる。
【０００４】
親水性化合物の場合、物質を外部環境から分離することにより達成される保護効果も、後者が物質を破壊し得るため（例えば、低ｐＨの胃液、体の免疫応答を担当するリンパ球）重要である。これは、タンパク質及びペプチドの経口送達に特に関連する（Ａｂｄｕｌ  Ｍｕｈｅｅｍ，Ｆａｉｙａｚ  Ｓｈａｋｅｅｌ，Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ａｓａｄｕｌｌａｈ，Ｊａｈａｎｇｉｒ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ  Ａｎｗａｒ，Ｎｅｈａ  Ｍａｌｌｉｃｋ，Ｇａｕｒａｖ  Ｋｕｍａｒ  Ｊａｉｎ，Ｍｕｓａｒｒａｔ  ＨｕｓａｉｎＷａｒｓｉ，Ｆａｒｈａｎ  Ｊａｌｅｅｓ  Ａｈｍａｄ，Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１６，２４，４１３−４２８）。
【０００５】
生物活性のある物質のバイオアベイラビリティは、それらの吸収の速度及び範囲により決まる［ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｄｅ  ｏｆ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｉｔｌｅ  ２１，ｖｏｌｕｍｅ  ５，ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｓｕｂｃｈａｐｔｅｒ  Ｄ，ｐａｒｔ  ３２０．Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ］。薬物の生物学的アベイラビリティが低いことは、医薬品が血中で最小有効濃度を達成できず、その結果望ましい治療効果を生み出すのが困難であることを意味する。物質が、要求される位置に到達できず、且つ／又はそこに蓄積できないと、投与量を増やすことが必要であり、その結果望まれない副作用が生じ、より高い療法のコストをもたらし得る。上記の因子のため、新たに合成された物質９つのうち、規制機関に認可されるのは１つである［Ｂｌａｎｃｏ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３，９４１−９５１］。
【０００６】
バイオアベイラビリティの改善のために適用される方法には、プロドラッグの製造、ポリマー担体による固体分散体、物質粒子の微粉化、又は界面活性剤の添加がある［Ｂａｇｈｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０１６，１０５，２５２７−２５４４］。ここ数年、とりわけ難水溶性物質に関連してマイクロ担体及びナノ担体も非常に注目されてきた［Ｃｈｅｎ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２０１０，７−８  ３５４−３６０］。ナノ化は、治療物質の溶解度増加及び薬物動態改善をもたらす。それは、物質取込みの有害副作用の低減にも貢献する。総合的に研究された担体には、ナノエマルション、ミセル、リポソーム、自己乳化型システム、固体脂質ナノ粒子、及びポリマー−薬物コンジュゲートがある［Ｊａｉｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２０１５，４１，８７５−８８７］。
【０００７】
研究により、ナノ担体の使用が、薬物動態パラメーターの改善及び影響を受けやすい物質の分解に対するより良好な保護をもたらすだけでなく、活性物質の循環の期間を延ばし、標的化送達を確保することも示された。薬物送達系に焦点をあてた研究の進歩から生じて、現在市販されている選択肢には、真菌感染症、Ａ型肝炎、及び多発性硬化症の治療に使用されるナノ粒子製剤がある［Ｚｈａｎｇ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８，８３，７６１−７６９］。ナノ製剤に基づく最初の薬物は、カポジ肉腫の治療のために設計され、１９９５年にＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎに認可されたリポソーマル型のドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）であった［Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２，１６０，１１７−１３４］。１０年後に、別の製剤、すなわちナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）に認可が得られた。この場合、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬの使用を無くすことにより、従来のパクリタキセル製剤に伴う有害な副作用を減少させることが可能であった。
【０００８】
疎水性又は親油性物質の担体システムは、主に、これらの物質の医薬的及び生物学的アベイラビリティを改善することを意図している。親水性化合物の場合、物質を外部環境から分離することにより達成される保護効果は、後者が物質を破壊し得るので（例えば、低ｐＨの胃液、体の免疫応答を担当するリンパ球）重要である。これは、タンパク質及びペプチドの経口送達に特に関連する［Ｍｕｈｅｅｍ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍ．Ｊ．２０１６，２４，４１３−４２８］。
【０００９】
インスリンは、１型糖尿病の治療に必要な、膵ランゲルハンス島のβ細胞により合成される主なタンパク質ホルモンである。その有病率を考えると、糖尿病は、世界的に、最も広くみられる非感染性疾患の１つである［Ｓｈａｈ  Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１６，６，１−９］。インスリンは、最も一般的には皮下注射されるが、それは、多くの場合、血糖コントロール不良、不快感、及び生活様式の悪化と関連する［Ｏｗｅｎｓ  Ｄ．Ｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００２，１，５２９−５４０］。経口インスリン送達は、最も快適で優先的なホルモン投与の方法であろう。さらに、ホルモンの経口送達は肝門脈循環へのその吸収を促進して、インスリンを肝臓に供給する生理学的経路を模倣し、インスリンを末梢循環に送達する皮下注射と関連する全身性高インスリン血症を減少させ、おそらくは、低血糖のリスクを最小限にし、代謝制御を改善するであろう［Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｌ．ａｎｄ  Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｙ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，３，５６８−５８４］。
【００１０】
インスリンの腸内吸収の主な障壁には、腸壁へのタンパク質の低い透過性並びに酸性の胃内環境中の変性及び腸内の酵素分解に対する高い感受性がある。今まで文献に発表された、消化管内のインスリンの吸収を改善するいくつかの戦略には、インスリンのナノスフィア又はナノ粒子、ミクロ粒子、及びリポソーム中へのカプセル化がある。これらの担体は、ペプチドを、消化管の上部でタンパク質分解性／変性プロセスに対して保護し、小腸の種々の部分での経粘膜タンパク質捕捉の増加を可能にする。しかし、担体の使用は、カプセル化の有効性の低さ及び活性物質の放出速度に関する制御の欠如のため、限定されている［Ｓｏｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４，９，２１２７−２１３６；Ｓａｊｅｅｓｈ  Ｓ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｍａ  Ｃ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｂ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００６，７６，２９８−３０５；Ｓａｒｍｅｎｔｏ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００７，８，３０５４−３０６０；Ｎｉｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０１２，８１，２６５−２７２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ポーランド特許第ＰＬ２２９２７６Ｂ号明細書は、修飾された多糖により安定化され、疎水性化合物を効果的にカプセル化できる、コアシェル構造を有する安定な水中油型（Ｏ／Ｗ）システムを開示している。
【００１２】
国際特許国際公開第２０１６／１７９２５１号パンフレットは、揮発性化学化合物、例えばシクロプロパンの誘導体をカプセル化できる安定なエマルションを提示している。水中油中水型ダブルエマルションは、乳化剤及びその安定性を確保する界面活性剤を含んでいる。
【００１３】
安定なダブルエマルションは、米国特許出願公開第２０１０／０２３３２２１号明細書に記載されている。それらは、油中水型エマルション及びダブルエマルションの安定化を確保する、様々なモル質量を有する、最低で２種の乳化剤を含む。
【００１４】
国際特許国際公開第２０１８／０７７９７７号パンフレットは、化粧品に使用される親水性化合物をカプセル化することが意図される、架橋脂肪酸を内層として含むダブルエマルションを提示している。エマルションは、最低で３か月安定である。
【００１５】
国際特許国際公開第２０１７／１９９００８号パンフレットは、乳化剤及び高温で架橋を受けるポリマーを含む内水相を含むダブルエマルションであって、その結果として水中油中ハイドロゲルシステムが得られる、ダブルエマルションを記載している。得られたシステムは、親水コロイド粒子中に組み込まれた活性物質（薬物及び細胞）を運ぶことができる。
【００１６】
安定なダブルエマルションは、米国特許出願公開第２０１０／０２３３２２１号明細書に記載されている。それらは、油中水型エマルション及びダブルエマルションの安定化を確保する、様々なモル質量を有する最低で２種の乳化剤を含む。
【００１７】
米国明細書米国特許出願公開２０１７０３６０８９４号明細書は、酸性の胃内環境を中和する作用物質並びに自己乳化型タンパク質含有システムを含むボーラス剤の製造を含む、経口型インスリンの製造を開示している。
【００１８】
特許明細書米国特許第６１９１１０５号明細書は、インスリンを含む油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションシステムを提示している。しかし、製剤の経口送達は、エマルションシステム内の相転移をもたらすことがあり、それは、ペプチドの時期尚早な放出及び消化管内でのその分解を起こし得る。
【００１９】
米国特許第６２７７４１３号明細書において明らかになった通り、ポリマー及び脂質含有ミクロスフィアの製剤中で、インスリンは内水相中にカプセル化されているが、そのようなカプセル化の有効性は非常に低い。
【００２０】
多糖インスリン担体の製造は、米国特許第０９８２８４４５号明細書に記載された。キトサンナノ粒子は、事前に、脂肪酸、修飾脂肪酸、及び／又はアミノ酸によるアミド化を受けたキトサンの架橋により製造される。インスリンは、他方で、担体に吸着している。
【００２１】
キトサンは、タンパク質カプセル化及び経口投与のためのＷ／Ｏ／Ｗシステムの製造にも使用されている。明細書ＣＮ１０６１３９１６２号明細書に開示されているナノ担体は、さらに、ポリガラクツロン酸（ＰＧＬＡ）及びポリマー界面活性剤Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１８８を含む。
【００２２】
特許明細書国際出願第２０１１０８６０９３号明細書は、自己マイクロ乳化型薬物送達系（ＳＭＥＤＤＳ）の使用による、インスリンを含むペプチドの経口送達のための組成物を開示している。担体システム内でのペプチドの不安定性を克服するために（酸性胃内環境中での分解又は不活性化に対する保護）、それは、被覆された軟質カプセル中に埋め込まれており、それは、残念なことに、経口投与後に遅延した活性を示す。さらに、胃内容排出の速度が人によって異なり、これが、製剤からのインスリン放出のタイミング及び腸による適切な吸収に影響する。そのような変化は、インスリン吸収の著しい差をもたらし、潜在的に血糖のコントロール不良につながる。問題には、担体薬物システムにおける可能性がある不適合性も含まれる。
【００２３】
関連する文献は、活性物質の経口送達を可能にするために、疎水性化合物及び親水性化合物の同時の効率よいカプセル化の能力を有する小粒子若しくは大粒子（ｓｍａｌｌ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）界面活性化合物又は他の安定剤の添加を必要としない、水中油中水型ダブルエマルションを製造し安定化する方法を提示していない。この問題は本発明において達成された。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の目的は、ナノカプセル・イン・ナノカプセル構造を有する水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルションシステムであって、小分子界面活性剤、乳化剤、及び／又は安定剤がシステム安定性のために必要とされないシステムである。前記システムは、影響を受けやすい親水性物質の攻撃的な外部環境に対する保護並びに生じる分解及び不活性化に対する保護を可能にし、様々な親水性の活性物質を同時に投与することを可能にし、特にタンパク質の送達を可能にする担体として機能する。
【００２５】
本発明の目的は、新規な水中油中水型エマルションシステム（ナノカプセル・イン・ナノカプセル）を提供することである。新たなシステムは、医薬剤形であり、抗腫瘍活性物質又はタンパク質を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の目的は、以下に列記される実施例及び図面に示される。
【００２７】
【図１】図１は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションをヒアルロン酸ドデシル誘導体の水−エタノール溶液（２：３の水：アルコール体積比）と混合することにより得られた、実施例Ｉに記載の逆エマルションを表す。矢印は、乳化の間に生み出された大きい泡を示す。
【図２】図２は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションをヒアルロン酸ドデシル誘導体の水−エタノール溶液（１：２の水：アルコール体積比）と混合することにより得られた、実施例ＩＩに記載の逆エマルションを製造するプロセスの間に生み出された泡を表す。
【図３】図３は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションをヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液と混合することにより得られた、製造された１日後（ａ）及び５日後（ｂ）の実施例ＩＩＩに記載の逆エマルションを表わす。
【図４】図４は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションをヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液と混合することにより得られた、実施例ＩＩＩに記載の逆エマルション中の分子サイズ分布を表す（乳化の日の構造）。
【図５】図５は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションをヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液と混合することにより得られた、実施例ＩＩＩに記載の逆エマルション中の分子サイズ分布を表す（乳化の５日後）。
【図６】図６は、水及びオレイン酸を含むプレエマルションを、タングステン酸（ＶＩ）ナトリウムを含むヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液と混合することにより得られた、実施例ＩＶに記載の逆エマルション（Ｗ／Ｏ）の分子のクライオＴＥＭ顕微鏡写真を表す。
【図７】図７は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体を含む０．４体積％の逆エマルションを、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例Ｖに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す（乳化の日の構造）。
【図８】図８は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体を含む０．４体積％の逆エマルションを、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例Ｖに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す（乳化の７日後の構造）。
【図９】図９は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体を含む０．４体積％の逆エマルションを、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例ＶＩに記載のダブルエマルションシステムの共焦点顕微鏡画像−累積チャネル（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）（ａ）及びＦＩＴＣチャネル（ｂ）（５μｍスケール）における観察を表す。
【図１０】図１０は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体及び溶解されたタングステン酸（ＶＩ）ナトリウムを含む０．４体積％の逆エマルションを、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例ＶＩＩに記載のダブルエマルションの分子のクライオＴＥＭ顕微鏡写真を表す。
【図１１】図１１は、カルセインを内水相中に含む、実施例ＶＩＩＩに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す。
【図１２】図１２は、実施例ＶＩＩＩに記載のダブルエマルションシステムの共焦点顕微鏡画像−累積／集合（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ）チャネルにおける観察−カルセイン及びヒアルロネートの修飾に使用したローダミンのシグナルの重複（１０μｍスケール）を表す。
【図１３】図１３は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体を含む０．１体積％の逆エマルション（１：３０の水相−油相の体積比）を、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例ＩＸに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す。
【図１４】図１４は、ＦＩＴＣ標識ヒアルロン酸ドデシル誘導体を含む０．１体積％の逆エマルション（１：３０の水相−油相の体積比）を、ＲｈＢＩＴＣ標識ヒアルロネートの水溶液と混合することにより得られた、実施例ＩＸに記載のダブルエマルションの共焦点顕微鏡画像を表す。累積チャネル（ａ）、ＦＩＴＣチャネル（ｂ）及びＴＲＩＴＣチャネル（ｃ）における観察（１０μｍスケール）。
【図１５】図１５は、Ｗ／Ｏ／Ｗシステムが製造された１１週間後の、実施例Ｘに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す。
【図１６】図１６は、ダブルエマルションシステムが得られた日並びに７、１４、２１、２８、４３、５９及び７９日後に測定された、実施例Ｘに記載のＷ／Ｏ／Ｗシステムのゼータ電位及び標準偏差（ＳＤ）の一覧を表す。
【図１７】図１７は、実施例Ｘに記載のダブルエマルションシステムの共焦点顕微鏡画像−３週間後（上のパネル）、及び４週間後（下のパネル）の累積チャネルにおける観察（５μｍスケール）を表す。
【図１８】図１８は、カルセインを内水相に、ナイルレッドを油相に含む、実施例ＸＩに記載のダブルエマルション中の分子サイズ分布を表す。
【図１９】図１９は、カルセインを水相に、ナイルレッドを油相に含む、実施例ＸＩに記載のダブルエマルションシステムの共焦点顕微鏡により得られた画像−ＴＲＩＴＣチャネル（ａ、ナイルレッド）、ＦＩＴＣ（ｂ、カルセイン）及び累積チャネル（ｃ）における観察（５μｍスケール）を表す。
【図２０】図２０は、実施例１に記載の手順に従ってダブルエマルションが製造された日（ａ）、１週間後（ｂ）、及び２週間後（ｃ）の、実施例ＸＩＩに記載のダブルエマルションのナノカプセルサイズ分布を表す。
【図２１】図２１は、実施例１に記載の手順に従ってダブルエマルションが製造された１週間後の、実施例ＸＩＩに記載のエマルションの油相の表面への小さな流出及び希釈を示す写真を表す。
【図２２】図２２は、実施例１に記載の手順に従ってダブルエマルションが製造された２週間後の、実施例ＸＩＩに記載のエマルションの油相の表面への小さな流出及び希釈を示す写真を表す。
【図２３】図２３は、透過光モードにおける測定を使用した（ａ）、及びＴＲＩＴＣフィルターを使用した（ｂ）、実施例ＸＩＩに記載のカプセルの調製された日の共焦点顕微鏡画像−共焦点顕微鏡を使用して収集された画像を表す。
【図２４】図２４は、実施例ＸＩＩＩに記載のダブルエマルションが製造された日（ａ）、実施例２に記載の手順に従ってダブルエマルションが製造された１週間後（ｂ）、２週間後（ｃ）及び３週間後（ｄ）のナノカプセルサイズ分布を表す。
【図２５】図２５は、透過光モードにおける測定を使用した（ａ、ｃ）及びＴＲＩＴＣフィルターを使用した（ｂ、ｄ）、実施例ＸＩＩＩに記載のカプセルの、調製された日の共焦点顕微鏡画像−共焦点顕微鏡を使用して収集された画像を表す。
【図２６】図２６は、透過光モードにおける測定を使用した（ａ）及びＴＲＩＴＣフィルターを使用した（ｂ）、実施例ＸＩＩＩに記載のカプセルの製造の３週間後の共焦点顕微鏡画像−共焦点顕微鏡を使用して収集された画像を表す。
【図２７】図２７は、実施例３に記載の手順に従ってダブルエマルションが製造された日（ａ）及びその１週間後（ｂ）の、実施例ＸＩＶに記載のダブルエマルションのナノカプセルサイズ分布を表す。
【図２８】図２８は、透過光モードにおける測定を使用した（ａ）及びＴＲＩＴＣフィルターを使用した（ｂ）、実施例ＸＩＶに記載のカプセルの調製された日の共焦点顕微鏡画像−共焦点顕微鏡を使用して収集された画像を表す。
【図２９】図２９は、ダブルエマルションが製造された日（ａ）及びその１週間後（ｂ）の、実施例ＸＶに記載のダブルエマルションのナノカプセルサイズ分布を表す。
【図３０】図３０は、ダブルエマルションが製造された日（ａ）及びその１週間後（ｂ）の、実施例ＸＶＩに記載のダブルエマルションのナノカプセルサイズ分布を表す。
【図３１】図３１は、関連する対照群を参照した、第１群及び第２群（ａ）並びに第３群、第４群、及び第５群（ｂ）の、平均値として計算された実施例ＸＶＩＩに記載のグルコースレベル測定の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の目的は、親油性化合物（油相中）及び親水性化合物（内水相中）の同時送達のために設計された生体適合性水中油中水型ダブルエマルションシステムである。小粒子界面活性化合物（界面活性剤）を使用するのではなく、システムの安定性は、疎水化修飾ヒアルロン酸により確保されている。
【００２９】
油コアを有するカプセル及び水性コア（ａｑｕａｔｉｃ  ｃｏｒｅ）（内部カプセル）を有するカプセルの製造された安定化シェルは、以下の式：
【化１】
2022500488.tif 000002
（ここで、ｘは、１〜３０の範囲の整数であり、それは、疎水性側鎖中の炭素原子の総数を規定し、数の比ｍ／（ｍ＋ｎ）は０．００１〜０．４の範囲である）を有する疎水化修飾ヒアルロン酸ナトリウム、Ｈｙ−Ｃｘからなる。
【００３０】
ナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムは２段階のプロセスで製造される。第１段階の間、油中水型の逆エマルション（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）は、例えば、ヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液を、混合物体積の８０％〜９９．９％を構成する非毒性の油と混合することにより製造される。次の段階で、連続的な油相中に懸濁している水滴はヒアルロネートコーティングを受け取り、その結果として水中油中水型ダブルエマルションが製造される。第２段階は、コロイドシステムの安定性の達成を可能にするので必要である；第１段階の間に製造されたＷ／Ｏシステムが不安定である一方で、ダブルエマルションは最低で２か月安定性を示す。
【００３１】
時間が経過しても安定であるＷ／Ｏ／Ｗエマルションを得るために、多糖高分子の親水性フラグメントと疎水性フラグメントの間のバランスを維持することが必要である。多糖鎖中の疎水性基の置換度が０．１％〜４０％の範囲である場合に有益である。実施された研究は、ドデシル側鎖により修飾されたヒアルロン酸により安定化されたシステムにより最良の性質が示されることを示した。多糖鎖中の最も効果的な置換度は５％以下である。これは、疎水性鎖が過度に含まれるとポリマーの水への溶解度が減少し得るからである。
【００３２】
システムの良好な安定性を達成するために、イオン性基、例えばカルボキシル基を含む多糖を使用することも重要である。多糖中のイオン性基の含量が２０ｍｏｌ％を超える場合（一量体あたりで計算）好都合であり、含量が４０ｍｏｌ％を超える場合、より効果的であり、それが６０ｍｏｌ％を超える場合、最も効果的である。
【００３３】
Ｗ／Ｏ逆エマルションとＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルションの両方を得るために、音波処理（又は動的混合（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ））を適用することが必要である。音波処理が、１５〜６０分間、１８℃より高く４０℃以下の温度で継続される場合に好都合である。音波処理が６０分間継続して逆エマルションが得られ、３０分継続してダブルエマルションが得られ、且つプロセスが２５〜３０℃の範囲の温度で実施されると最も効果的である。
【００３４】
安定なダブルエマルションは、０．１〜２０ｇ／Ｌの濃度及び０．００１〜１．０ｍｏｌ／ｄｍ３のイオン強度を有する疎水化修飾イオン性多糖の水溶液を使用して製造される。塩化ナトリウムの０．１５ｍｏｌ／ｄｍ３溶液に溶解されたヒアルロン酸の２ｇ／Ｌ溶液を適用することが好都合である。
【００３５】
得られたナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムは、疎水性化合物（油相へ）及び親水性化合物（内水相へ）の同時カプセル化を可能にするので、広範囲の目的に使用できる。画像化調査のために蛍光染料をカプセル化することが可能である。親水性染料及び疎水性染料の同時適用は、カプセル形状の画像化を可能にする。ヒアルロン酸の蛍光標識された誘導体を使用することも可能である。様々なスペクトル特性を有する染料を適用することが好都合である。異なるレーザーにより励起され、共焦点蛍光顕微鏡法において様々な発光のチャネルにおける放射を発する染料を使用することがより効果的である。ローダミンイソチオシアネート又はフルオレセインイソチオシアネートにより修飾されたヒアルロン酸を使用することが最も効果的である。
【００３６】
本発明の目的は、親水性化合物及び親油性化合物の同時送達のための、水中油中水型ダブルエマルションの形態のナノカプセル・イン・ナノカプセルタイプのマルチコンパートメントシステムであって：
ａ）オレイン酸、パルミチン酸イソプロピル、脂肪酸、天然抽出物（ｎａｔｕｒａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）及びコーン油、亜麻仁油、大豆油、アルガンオイルなどの油、又はこれらの混合物を含む群から選択される油；有益にはオレイン酸を含む、親油性化合物の輸送のための液体油コア；
ｂ）油コアに埋め込まれた、親水性化合物の輸送のための、水性コアを有するカプセル又は多くのカプセル；
ｃ）キトサン、オリゴキトサン、デキストラン、カラギーナン、アミロース、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルラン及びグリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸の誘導体を含む群から選択される疎水化修飾多糖；有益にはヒアルロン酸の誘導体からなる、油コアを有するカプセルと水コアを有する内部カプセルの両方のための安定化シェル；
ｄ）水溶液中で安定な、１μｍ未満の直径を有する外側カプセル；
ｅ）活性物質
を含むマルチコンパートメントシステムである。
【００３７】
疎水化修飾多糖中の疎水性側鎖置換の程度が０．１〜４０％の範囲であるシステム。
【００３８】
油コアを有するカプセル及び水コアを有するカプセル（内部カプセル）のための安定化シェルが、以下の式：
【化２】
2022500488.tif 000003
（ここで、ｘは、１〜３０の範囲の整数であり、それは、疎水性側鎖中の炭素原子の総数を規定し、数の比ｍ／（ｍ＋ｎ）は０．００１〜０．４の範囲である）を有する疎水化修飾ヒアルロン酸ナトリウム、Ｈｙ−Ｃｘからなるシステム。
【００３９】
輸送される親油性化合物が、蛍光染料、脂溶性ビタミン、又は疎水性薬物であり得るシステム。
【００４０】
輸送される親水性化合物が、蛍光染料、水溶性ビタミン、タンパク質、又は親水性薬物；好都合にはインスリンであり得るシステム。
【００４１】
インスリンが、カプセル懸濁液の１ｍｌあたり０．００５〜２０．０００のインスリン単位の濃度であるシステム。
【００４２】
請求項１に定義された水中油中水型ダブルエマルションの形態のナノカプセル・イン・ナノカプセルタイプのマルチコンパートメントシステムを製造する方法であって：
ａ）第１工程の間に、油中水型（Ｗ／Ｏ）型の逆エマルションが、上記式により記述されるヒアルロン酸ドデシル誘導体Ｈｙ−Ｃｘの水溶液を、混合物体積の約０．１〜９９．９％を構成する非毒性の油と、超音波（音波処理）又は機械的刺激へさらすことにより、好都合には混合又は振盪により、水相と油相の体積比を１：１０〜１：１００００の範囲；好都合にはおよそ１：１００として混合することにより製造され；
ｂ）第２工程の間に、連続的な油相中に懸濁している水滴が、ヒアルロネートコーティングを、Ｗ／Ｏ相エマルションと水相の体積比を１：１０〜１：１００００の範囲；好都合にはおよそ１：１００として受け取り、
ｃ）結果として、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）ダブルエマルションシステムが、超音波（音波処理）又は機械的刺激へさらすこと、好都合には混合又は振盪により製造され、
ここで、適用される水相が、キトサン、オリゴキトサン、デキストラン、カラギーナン、アミロース、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、プルラン及びグリコサミノグリカン、及び特にヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸の誘導体を含む群から選択される疎水化修飾多糖；好都合にはヒアルロン酸の誘導体の、２〜１２の範囲のｐＨ、０．１〜３０ｇ／Ｌの濃度、及び０．００１〜３ｍｏｌ／ｄｍ３の範囲のイオン強度を有する水溶液に基づいており、
油相が、オレイン酸、パルミチン酸イソプロピル、脂肪酸、天然の油、とりわけ亜麻仁油、大豆油、アルガンオイル、又はそれらの混合物を含む群から選択される油；有益にはオレイン酸を含み、
注目すべきことに、プロセスが小粒子界面活性剤を全く使用せずに実施される、
製造方法。
【００４３】
パルス音波処理が、衝撃持続期間を、２つの連続する衝撃の間の間隔の持続期間の半分として実施される方法。
【００４４】
カプセル化された親油性化合物が油コア中に含まれ、カプセル化された親水性化合物がナノカプセルの水コア中に含まれる方法。
【００４５】
多糖中のイオン性基の含量が２０ｍｏｌ％以上である場合に好都合であり、それが６０ｍｏｌ％（一量体あたりで計算）を超える場合に好都合である方法。
【００４６】
第１及び第２工程の間、音波処理が、１５〜６０分間、１８℃〜４０℃の温度で、好都合には６０分間継続されて逆エマルションが得られ、２５〜３０℃の温度で３０分間継続されてダブルエマルションが得られる方法。
【００４７】
親油性化合物が、蛍光染料、脂溶性ビタミン、又は疎水性薬物であり得て、親水性化合物が、蛍光染料、水溶性ビタミン、タンパク質、又は親水性薬物；好都合にはインスリンであり得る、親油性化合物及び親水性化合物の輸送のための、上記で定義されたマルチコンパートメントシステムの適用。
【００４８】
前記発明の利点は、二重ナノカプセルの別なコンパートメント中で親水性化合物及び親油性化合物を同時に送達することができる生体適合性で安定なナノ製剤を得る可能性を含む。これは、分解、担体からの時期尚早な放出、及び系、例えば血液循環からの過度に迅速な消失に対して、カプセル化された化合物を保護する。これは、調製の簡潔さ及び低い金銭的コストも特徴とする前記システムの用途の範囲を著しく改善する。さらに、担体システムの使用により、ペプチド及び他の活性物質の経口投与並びにそれらのバイオアベイラビリティの改善が可能である。
【００４９】
本発明は、以下の非限定的な例により説明される。
【実施例】
【００５０】
実施例Ｉ
油中水型の逆エマルションを製造する方法
逆エマルション（Ｗ−Ｏ型）を製造するために、ヒアルロン酸ドデシル誘導体の水−エタノール溶液を適用した。揮発性有機溶媒の存在は、（逆エマルションを製造するために）ポリマー鎖が伸びたコンフォメーションを達成するのを可能にすることになっていた。溶媒は、その後に、蒸発されることになっていた。
【００５１】
ヒアルロン酸ドデシル誘導体（４．５％からの疎水性側鎖置換の程度）の溶液を、生理食塩水中に調製した（濃度およそ７．５ｇ／Ｌ）。次いで、中性の溶液をエタノール化して（ｅｔｈａｎｏｌｉｚｅｄ）、２：３の体積比の混合物が得られた。
【００５２】
同時にプレエマルションを、オレイン酸を、塩化ナトリウムの水溶液（ｃ＝０．１５ｍｏｌ／ｄｍ３）と、１００：１の体積比で混合することにより調製した。システムを、１０分間ボルテックスタイプのシェーカーでの振盪に付し、３０分間超音波洗浄機中で（パルスモード、１秒超音波、２秒間隔）室温で音波処理に付した。音波処理の結果として、乳白色のエマルションが生じた。
【００５３】
ヒアルロン酸ドデシル誘導体の水−エタノール溶液を、徐々に、プレエマルションに５分間滴加した。エタノールを蒸発させるために、混合物全体を、蓋がないボトル中で、パルスモードで３０分間音波処理に付した。
【００５４】
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定したサイズ分布は、システムが多くの分子分画（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を含んでいたことを示す。システムの安定性を示すゼータ電位（ζ）を測定することは不可能であった（非常に不安定な測定）。さらに、ボトルは、直径が１ｍｍを超える、目に見える球状の泡を含んでいた（図１）。
【００５５】
実施例ＩＩ
水−エタノール溶液中の水相の含量を減少させた後に油中水型の逆エマルションを製造する方法
プレエマルションを、実施例Ｉに記載の通り調製した。ヒアルロン酸ドデシル誘導体の水−エタノール溶液を徐々に加えたが、１：２の水相とエタノール相の体積比を適用した。
【００５６】
エタノールを蒸発させるために、システムを、より高温で（約３４℃）音波処理に付した。
【００５７】
最初、白色の懸濁液は油中に見えなかった。システムをＤＬＳ測定に使用されるキュベット中に導入した後、懸濁液は、直径が１ｍｍを超える泡に変わった（図２）。
【００５８】
ＤＬＳ装置でサイズを測定した後、２つの大きい水滴がキュベット中に観察された。ゼータ電位は測定できなかった。
【００５９】
実施例Ｉ及びＩＩに表された結果に基づいて、エタノールがエマルションの製造に悪影響を与えたと結論付けた。次の段階で、アルコールをシステムから除去した。
【００６０】
実施例ＩＩＩ
システムからエタノールを除去した後に油中水型の逆エマルションを製造する方法
油中水型の逆エマルションを、ヒアルロン酸ドデシル誘導体の生理食塩水（ｃＮａＣｌ＝０．１５ｍｏｌ／ｄｍ３）中の溶液（ｃ＝４．７ｇ／Ｌ）を、オレイン酸と、１：１００の体積比で混合することにより調製した。システムを、実施例Ｉに記載の通り振盪及び音波処理に付したが、音波処理プロセスは１時間続いた。
【００６１】
乳白色エマルションが得られて、その安定性を、乳化の日及び５日後に測定した。ＤＬＳ試験は、初期システムの高い安定性を示した（ζ＝−３３±２１．７ｍＶ）。分子サイズは狭い分布を特徴とした。５日後に、分子サイズを記述する分布はより小さい分子の方にシフトした。さらに、別の小さい極大が観察できた。５日後に、試料の濁度が著しく減少した（図３、図４、図５）。目視観察とＤＬＳデータを組み合わせると、５日後に、分子の含量の減少（ａ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）があったと結論付けることができ、それは、得られたシステムが安定な要素と不安定な要素を両方含んでいたことを示唆する。適応性の観点から、この状況は、材料の喪失及び制御できない組成のシステムの製造につながるので不利益を呈する。上記のため、次の段階では、逆エマルションシステムを、ダブルエマルションの製造につながるその後の工程に直接付した。
【００６２】
実施例ＩＶ
低温観測（ｃｒｙｏｓｃｏｐｉｃ）透過型電子顕微鏡による逆エマルション画像化
逆エマルションを、実施例ＩＩＩに記載の手順に従って調製したが、画像化調査の間にコントラストを増大させるために内水相はタングステン酸（ＶＩ）ナトリウムを含んでいた。２日後に、エマルションを、低温観測装置が追加された透過型電子顕微鏡技法を使用して調査した。得られた画像の分析により、およそ２５０ｎｍの直径を有する球状分子の存在が確認される（図６）。
【００６３】
実施例Ｖ
ダブルエマルションを製造する方法
逆エマルションを実施例ＩＩＩと同様に調製したが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヒアルロン酸のドデシル誘導体を２ｇ／Ｌの濃度で適用し、音波処理を３０分間続けた。
【００６４】
混合物の０．４体積％を構成する逆エマルションを、生理食塩水中１ｇ／Ｌの濃度のローダミンイソチオシアネート（ＲｈＢＩＴＣ）標識ヒアルロン酸のドデシル誘導体と混合することにより、ダブルエマルションが得られた。システムを、実施例Ｉに記載のパラメーターに従って、ボルテックスタイプのシェーカーで１０分間振盪に付し、室温で３０分間音波処理に付した。ＤＬＳ試験における分子サイズ分布の分析により、５００〜６００ｎｍの直径を有する分子があることが示される一方で、ゼータ電位測定により、得られたシステムの安定性が確認される（ζ＝−４４．６±３．３３ｍＶ）。７日間の観察の後、分子サイズにもゼータ電位の値にも（ζ＝−４４．６±３．０８ｍＶ）著しい変化は示されなかった（図７、図８）。
【００６５】
実施例ＶＩ
共焦点顕微鏡法によるダブルエマルション画像化
標識された多糖を適用して、実施例Ｖで得られた構造を、共焦点顕微鏡法を使用して可視化した。スペクトル特性のために、両染料を、様々な波長のレーザー（４８８ｎｍ及び５６１ｎｍ）により励起させることができ、発光は他の顕微鏡チャネルで観察できる。ＦＩＴＣがＲｈＢに対応するレーザーにより励起されず（逆も同様である）；ＲｈＢシグナルがＦＩＴＣチャネルにおいて観察されず、ＦＩＴＣシグナルがローダミン発光に対応するチャネルで特定されないことが示された。
【００６６】
ＦＩＴＣを含む誘導体を第１のＷ−Ｏ型エマルションに適用し、ＲｈＢＩＴＣを含む誘導体を第２段階で適用してダブルエマルションを製造することにより、得られた構造を可視化し、それらのモルホロジーを確認することが可能であった。
【００６７】
共焦点顕微鏡（１００×レンズ、４８８ｎｍ及び５６１ｎｍレーザー）から得られた画像により、「層状」シースの存在が確認された−全てのチャネル及びＦＩＴＣに独特なチャネルからのシグナルの観察（図９）。
【００６８】
実施例ＶＩＩ
低温観測透過型電子顕微鏡によるダブルエマルション画像化
ダブルエマルションを、実施例Ｖに記載の手順に従って調製したが、画像化調査の間のコントラストを増大させるために内水相はタングステン酸（ＶＩ）ナトリウムを含んでいた。２日後、透過型電子顕微鏡技法及び低温観測装置を使用して試料を調査した。得られた画像の分析により、およそ６００ｎｍの直径を有する球状分子の存在が確認された（図１０）。
【００６９】
実施例ＶＩＩＩ
内水相中の親水性染料のカプセル化
ダブルエマルションを、実施例Ｖに記載の通り調製したが、生理食塩水中４．５ｇ／Ｌの濃度のヒアルロン酸ドデシル誘導体の水溶液を、カルセイン溶液と（ｃｋａｌｃ＝２ｇ／Ｌ）、３：１の体積比で混合して逆エマルションを調製した。ＤＬＳ測定の結果に基づく分子サイズの分析により、得られた製剤が安定であり（ζ＝−３２．５±６．５８ｍＶ）、およそ６００ｎｍの流体力学的直径を有する分子を含んでいたことが確認された（図１１）。知見は、コロイドシステムの物理化学的性質においてカプセル化された物質の影響が全くないことを示した。
【００７０】
共焦点顕微鏡画像（全てのチャネルにおける観察）により、ナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムが得られ、両チャネルにおける目に見えるシグナル及び観察された分子内での重複により示されることが確認された（図１２）。
【００７１】
Ｐｒｚｙｋｌａｄ  ＩＸ
ダブルエマルション組成の最適化
得られるシステムのサイズ及び組成を最適化するために、逆エマルション中の水相と油相の体積比に変化を導入し、水相と油相の体積比を３０：１として実施例ＶＩＩＩに記載の通り製造した。ダブルエマルションは、逆エマルションと、１ｇ／Ｌの濃度のローダミンイソチオシアネート標識ヒアルロン酸のドデシル誘導体を混合することにより得られた。混合物中の逆エマルションの含量は０．１体積％であった。音波処理を実施例Ｖに記載の通り実施した。
【００７２】
得られたシステムは、ゼータ電位の値により測定された高い安定性（ζ＝−３１．０±２．３２ｍＶ）と共に、分子サイズの狭い分布（図１３）を特徴とした。
【００７３】
共焦点顕微鏡（１００×レンズ、４８８ｎｍ及び５６１ｎｍレーザー）による観察により、ナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムが形成されたことが確認された（図１４）。
【００７４】
実施例Ｘ
ダブルエマルションの長期安定性
ヒアルロン酸ドデシル誘導体を使用して製造した水中油中水型ダブルエマルションの安定性を、１１週間にわたり試験した。システムのパラメーターを、動的光散乱技法及び共焦点顕微鏡法を使用して、明示された時点で調査した。カプセルを実施例ＩＸに記載の通り製造した。
【００７５】
得られたシステムは単峰性分子サイズ分布を特徴とし（図１５）、ゼータ電位の値（ζ＝−３７．２±１．４ｍＶ）により測定して高い安定性を有した（図１６）。システムの安定性を評価する試験の間、サイズ分布の極大はより大きい分子の方にわずかにシフトした。システム中のゼータ電位の測定値により定義した安定性は１１週間の観察の後に低下しなかった。共焦点顕微鏡によるシステムの観察により、「ナノカプセル・イン・ナノカプセル」システムが形成されたことが確認された（両蛍光チャネルからのシグナルの重複）（図１７）。
【００７６】
実施例ＸＩ
溶解した蛍光染料を含むダブルエマルションの調製及び可視化
逆エマルションを、実施例ＩＸに記載の通り、オレイン酸を、ヒアルロン酸ドデシル誘導体の生理食塩水中の溶液と、ナイルレッド染料が油相に溶解し（ｃ＝０．８５ｇ／Ｌ）、カルセインが水相に溶解している状態で（ｃ＝０．１７ｇ／Ｌ）混合することにより製造した。ダブルエマルションを、実施例ＩＸに記載の通り製造した。
【００７７】
得られた分子は、実施例Ｘで形成された分子に類似の流体力学的直径を特徴とした（図１８）。サイズ分布は、目に見える比率の、直径がおよそ７００ｎｍである分子を含んでいた。
【００７８】
共焦点顕微鏡を使用して実施した可視化は、ナノカプセル・イン・ナノカプセルシステムが形成されたことを示した（両蛍光チャネルからのシグナルの重複）（図１９）。
【００７９】
実施例ＸＩＩ
１）インスリン溶液の調製
２１．６６ｍｇのインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌの０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解させた（４μｌ  ３Ｍ  ＨＣｌ、ｐＨおよそ１．９の添加）、すなわちおよそ６００ＵＩ／ｍｌ（３．５６ｍｇ＝１００ＵＩ）＊。
【００８０】
プロセスにより透明なインスリン溶液が生じ、それは４℃の温度で保存すると透明な形態を保った（２週間の観察）。
【００８１】
その後に、インスリン溶液を、染料、すなわちニュートラルレッド（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝１ｇ／ｌ）の添加により調製した（１８０μｌインスリン溶液＋２０μｌ染料溶液）。
【００８２】
インスリン溶液に加えた染料の悪影響は全く観察されなかった。
【００８３】
２）カプセルの調製
ａ）エマルション１：
本発明において上述された手順に従って、エマルション１が、以下の処方に従って得られた：３．６ｍｌのオレイン酸を１００μｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝４．６ｇ／ｌ）及び２０μｌの染料を有するインスリン溶液と共に乳化した；プロセスを、ボルテックスタイプのシェーカー（１０分）及び超音波（パルスモード、３０分）を使用して実施した。
【００８４】
ｂ）エマルション２：
エマルション２を、６ｍｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝１ｇ／ｌ）及び１２μｌのエマルション１から製造した。混合物を、ボルテックスシェーカー（１０分）及び超音波（３０分、パルスモード）を使用して乳化した。
【００８５】
乳白色のエマルションが得られた。
【００８６】
１ｍｌのカプセルは０．０１μｌのインスリン溶液を含んでおり、すなわちカプセルの１ｍｌあたり０．００６１単位のインスリンであった。
【００８７】
３）特性：
得られたＷ／Ｏ／Ｗエマルションは、１８０ｎｍまでの流体力学的直径を有する懸濁した分子からなっていた。それは、高い値のゼータ電位により示される通り非常に安定であった。カプセルを４℃の温度で保存した。１週間後、表面への油相の小さい流出が、エマルションの希釈と共に観察された。動的光散乱（ＤＬＳ）技法を使用して実施した測定は、わずかに減少したモジュール値（ｍｏｄｕｌａｒ  ｖａｌｕｅ）のゼータ電位及び分子サイズの減少を示した。結果を、表１及び図２０〜２３に表す。
【００８８】
【表１】
2022500488.tif 000004
【００８９】
実施例ＸＩＩＩ
１）インスリン溶液の調製
実施例１のインスリン溶液を４９．７３ｍｇのインスリンのさらなる溶液により濃縮し（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）、透明な溶液を得るために６μｌの塩酸（Ｃ＝３ｍｏｌ／ｄｍ３）の添加により酸性化させ、次いでそれをボルテックスシェーカーでの５分間の振盪に付した。
【００９０】
得られたインスリンは、８１．３４ｍｇ／ｍｌ（２２８４．７５ＵＩ）の濃度を有した。
【００９１】
エマルション１の第１の成分を、３０μｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝１５ｇ／ｌ）を、８０μｌのインスリン溶液及び１０μｌの染料（ニュートラルレッド、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝３．５ｍｇ／ｍｌ）と混合することにより調製した。
【００９２】
エマルション１：
１２０μｌのエマルション１の第１の成分と３．６ｍｌのオレイン酸の混合物を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードでの３０分間の音波処理に付した。
【００９３】
エマルション２：
２０μｌのエマルション１と２ｍｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌのＣ＝５ｍｇ／ｍｌ）の混合物を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードで３０分間の音波処理に付した。得られた乳状で粘性があり非常に濃いエマルションは、１ｍｌあたり０．４９単位のインスリンを含んでいた。
【００９４】
特性：
得られたカプセルは、高い値のゼータ電位により反映される良好な安定性を特徴としていた。カプセル化された染料もこれらの高い値に影響した。カプセルを４℃で保存した。１及び２週間後、エマルションはその安定性を保っていた。１週間後（及びその後）流体力学的直径の測定、高い分散指数（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）、及び共焦点顕微鏡法により、凝集体及びより大きい構造が形成されることが示され、試料中の単分散性の証拠はない。
【００９５】
測定の目的で、カプセルを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で希釈した（１００倍）。結果を表２及び図２４〜２６に示す。
【００９６】
【表２】
2022500488.tif 000005
【００９７】
実施例ＸＩＶ
エマルション１：実施例２に記載の手順に従って調製
エマルション２：
１０μｌのエマルション１及び２ｍｌのＨｙＣ１２（Ｃ＝２．５ｍｇ／ｍｌ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードで３０分間の音波処理に付した。
【００９８】
得られた乳状で粘性のあるエマルションは、１ｍｌあたり０．２４５単位のインスリンを含んでいた。
【００９９】
特性：
得られたカプセルは、高い値のゼータ電位により示される良好な安定性を特徴としていた。カプセル化された染料もこれらの高い値に影響した。カプセルを４℃の温度で保存した。
【０１００】
１週間後、エマルションはその安定性を保っていた。低いＰＤＩ値は、試料の単分散性及び凝集の傾向がないことを反映する。
【０１０１】
測定の目的で、カプセルを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で希釈した（１００倍）。結果を表３及び図２７〜２８に示す。
【０１０２】
【表３】
2022500488.tif 000006
【０１０３】
実施例ＸＶ
インスリン溶液の調製：実施例２に記載の手順に従う
エマルション１の第１の成分を、６０μｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝７．５ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌのインスリン溶液及び１０μｌの染料（ニュートラルレッド０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝３．５ｍｇ／ｍｌ）と混合することにより調製した。
【０１０４】
エマルション１：
１２０μｌのエマルション１の第１の成分と３．６ｍｌのオレイン酸の混合物を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードでの３０分間の音波処理に付した。
【０１０５】
エマルション２：
１０μｌのエマルション１と２ｍｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝２．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードでの３０分間の音波処理に付した。得られた乳状で粘性のある非常に濃いエマルションは、１ｍｌあたり０．１５４単位のインスリンを含んでいた。
【０１０６】
特性：
得られたカプセルは、高い値のゼータ電位により反映される良好な安定性を特徴としていた。カプセル化された染料もこれらの高い値に影響した。カプセルを４℃の温度で保存した。
【０１０７】
１週間後エマルションはその安定性を保っていた。流体力学的直径の得られた分布により、最初に凝集体があり、それが１週間後に分解したことが示される。
【０１０８】
測定の目的で、カプセルを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で希釈した（１００倍）。結果を表４及び図２９に示す。
【０１０９】
【表４】
2022500488.tif 000007
【０１１０】
実施例ＸＶＩ
１）インスリン溶液の調製
実施例４で得られたインスリン溶液を、９４ｍｇのインスリンの添加により濃縮し、透明な溶液を得るために４μｌの３Ｍ塩酸により酸性化させ、それを、その後に、ボルテックスシェーカーでの５分間の振盪に付した。
【０１１１】
得られたインスリン溶液は、２００ｍｇ／ｍｌ（５６１７．９８ＵＩ）の濃度を有した。
【０１１２】
エマルション１の第１の成分を、２０μｌのＨｙＣ１２溶液（Ｃ＝７．５ｍｇ／ｍｌ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を１００μｌのインスリン溶液と混合することにより調製した。
【０１１３】
エマルション１：
１２０μｌのエマルション１の第１の成分と３．６ｍｌのオレイン酸の混合物を、ボルテックスシェーカーでの１０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードでの３０分間の音波処理に付した。
【０１１４】
エマルション２：
１０μｌのエマルション１と１ｍｌのＨｙＣ１２溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中Ｃ＝１．５ｍｇ／ｍｌ）の混合物を、ボルテックスシェーカーでの２０分間の振盪に付し、次いで、パルスモードで３５分間の音波処理に付した。
【０１１５】
得られた乳状で粘性のある非常に濃いエマルションは１ｍｌあたり１．５単位のインスリンを含んでいた。
【０１１６】
特性：
得られたカプセルは、高い値のゼータ電位により示される良好な安定性を特徴とした。カプセルを４℃の温度で保存した。１週間後、エマルションはその安定性を保っていた。流体力学的直径サイズの分布は狭い。
【０１１７】
測定の目的で、カプセルを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で希釈した（１００倍）。結果を表５及び図３０に示す。
【０１１８】
【表５】
2022500488.tif 000008
*3.56mg = 100 UI [(c) 2011, “Drug Discovery and Evaluation: Methods in Clinical Pharmacology”, Editors: Vogel, H.Gerhard, Maas, Jochen, Gebauer, Alexander] 
【０１１９】
実施例ＸＶＩＩ
１型糖尿病を誘発する
体重１８０〜２００ｇの範囲である１群の３０匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラットに、チオペンタール（５０ｍｇ／体質量ｋｇ）により麻酔をかけた。；その後に、リン酸緩衝液に溶解させたストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を、６０ｍｇ／体質量ｋｇの割合で尾静脈により注射した。注射した溶液の最終体積は、１ｍｌ／体質量ｋｇであった。血糖を、ストレプトゾトシン注射の３日後に測定した。動物のそれぞれは、４５０ｍｇ％を超える血糖値を有することが分かり、それは、膵臓中のインスリン産生β細胞が損傷を受けた事実を反映していた。この時間の間、動物は、飼料及び水へのアクセスが制限されなかった。
【０１２０】
カプセル化されたインスリン活性の評価
耐糖能試験の１２時間前、ラットを、６匹の動物の５群に分け（合計で３０匹の動物）、飼料を利用できないようにした。動物は、引き続き水へのアクセスを制限されなかった。実験を、以下の群で実施した：
１．対照群：体質量の１ｋｇあたり２ｇのグルコース、胃管により投与。
２．インスリン群：１キログラムあたり７．５単位及び体質量のｋｇあたり２ｇのグルコース、胃管により同時に投与。
３．対照群：体質量の１ｋｇあたり０．５ｇのグルコース、胃管により投与。
４．インスリン群：胃管により体質量の１ｋｇあたり０．５ｇのグルコースの投与の２０分前に送達される１キログラムあたり１１．２５単位。
５．インスリン群：１キログラムあたり１１．２５単位及び体質量のｋｇあたり０．５ｇのグルコース、胃管により同時に投与。
【０１２１】
インスリンを、実施例５に記載の手順に従って得られたＷ／Ｏ／Ｗシステム中のカプセル化された形態で投与した。
【０１２２】
各群において、グルコースレベルを、以下の時点：０；１５；３０；４５；６０；７５；９０；１０５；１２０（並びに第１群及び２群で１３５）で、尾静脈から採取した血液試料中で測定した。グルコース測定を、Ｂｉｏｎｉｍｅ  Ｒｉｇｈｔｅｓｔ（登録商標）ＧＭ１００血糖測定器を使用して実施した。
【０１２３】
グルコースレベル測定の結果を、表６〜１０及び図１２に、関連する対照群を参照して第１群及び第２群における平均値（図３１ａ）並びに第３群、第４群、及び第５群における平均値（図３１ｂ）を表すグラフの形態で示す。
【０１２４】
【表６】
2022500488.tif 000009
【０１２５】
【表７】
2022500488.tif 000010
【０１２６】
【表８】
2022500488.tif 000011
【０１２７】
【表９】
2022500488.tif 000012
【０１２８】
【表１０】
2022500488.tif 000013
【０１２９】
測定に基づき、グルコース曲線下の表面積（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）を計算した。平均値を各群で計算し、関連する対照群と比較し、パーセント比率を、対照群との関連で、すなわち対照群１に対して第２群、並びに対照群３に対して第４群及び第５群で計算した（表１１）。
【０１３０】
【表１１】
2022500488.tif 000014
【０１３１】
最終結論：
１．知見は、ストレプトゾトシン誘発１型糖尿病を有する動物において、グルコース曲線におけるカプセル化されたインスリンにより生み出された正の効果を示す。
２．観察された効果は、グルコース投与量がより低い場合により明らかであり、製剤中のインスリンの単位数を増加させる必要性を示唆している。
３．より有益な効果は、グルコース投与の２０分前のカプセル化されたインスリンの投与により生じる。
【図１】
2022500488.tif 000016
【図２】
2022500488.tif 000017
【図３（ａ）】
2022500488.tif 000018
【図３（ｂ）】
2022500488.tif 000019
【図４】
2022500488.tif 000020
【図５】
2022500488.tif 000021
【図６】
2022500488.tif 000022
【図７】
2022500488.tif 000023
【図８】
2022500488.tif 000024
【図９（ａ）】
2022500488.tif 000025
【図９（ｂ）】
2022500488.tif 000026
【図１０】
2022500488.tif 000027
【図１１】
2022500488.tif 000028
【図１２】
2022500488.tif 000029
【図１３】
2022500488.tif 000030
【図１４（ａ）】
2022500488.tif 000031
【図１４（ｂ）】
2022500488.tif 000032
【図１４（ｃ）】
2022500488.tif 000033
【図１５】
2022500488.tif 000034
【図１６】
2022500488.tif 000035
【図１７】
2022500488.tif 000036
【図１８】
2022500488.tif 000037
【図１９（ａ）】
2022500488.tif 000038
【図１９（ｂ）】
2022500488.tif 000039
【図１９（ｃ）】
2022500488.tif 000040
【図２０】
2022500488.tif 000041
【図２１】
2022500488.tif 000042
【図２２】
2022500488.tif 000043
【図２３（ａ）】
2022500488.tif 000044
【図２３（ｂ）】
2022500488.tif 000045
【図２４】
2022500488.tif 000046
【図２５】
2022500488.tif 000047
【図２６】
2022500488.tif 000048
【図２７】
2022500488.tif 000049
【図２８】
2022500488.tif 000050
【図２９】
2022500488.tif 000051
【図３０】
2022500488.tif 000052
【図３１】
2022500488.tif 000053
【国際調査報告】
2022500488.tif 000054
2022500488.tif 000055
2022500488.tif 000056
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