【手続補正書】
【提出日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化された抗体またはその抗原結合断片を設計するための方法であって、該安定化された抗体またはその抗原結合断片は、候補抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来の安定化されたＶＨドメインおよび安定化されたＶＬドメインを含み、ここで該方法は、
（ａ）免疫グロブリンスーパーファミリーポリペプチドに属するアミノ酸配列のキュレーションされた参照組を提供する工程；
（ｂ）該参照組のアミノ酸配列を整列して、整列された組を生成する工程；
（ｃ）該整列された組における２以上のアミノ酸位置の間の共変動を計算して、共変動データセットを作成する工程；
（ｄ）該候補抗体ＶＨドメインまたは該候補抗体ＶＬドメインにおいて共変動しないアミノ酸を同定する工程であって、ここで、該共変動しないアミノ酸は、該共変動データセットにおいて１以上の共変動を満足しない、工程；および
（ｅ）該候補抗体ＶＨドメインまたは候補抗体ＶＬドメインにおける該共変動しないアミノ酸のうちの１以上を、該整列された組において対応するアミノ酸位置で見出された、該共変動データセットにおける共変動を満足するアミノ酸で置換することにより、改良された生物物理学的特性を有する安定化された抗体およびその抗原結合断片を作製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物物理学的特性が、熱安定性、ｐＨ折り畳み解除プロフィール、グリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学機能、およびそれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定化された抗体またはその抗原結合断片は、ドメイン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、二特異的抗体、ｓｃＦｖ分子、ｓｃＦｖ含有抗体、ドメイン欠失抗体、およびこれらの抗体断片のいずれかの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）における前記共変動データセットにおける前記アミノ酸は、ジスルフィド結合、塩架橋、リガンド結合ポケットまたは表面の一部分、ファンデルワールス相互作用のネットワーク、水素結合相互作用のネットワーク、電荷−電荷相互作用のネットワーク、およびこれらの構造的特徴のうちの２つ以上の組合せよりなる群から選択される構造的特徴の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）における前記整列された組の各アミノ酸配列は、該整列された組における他の配列と９５％未満の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列のキュレーションされた参照組の構築は、
（ａ）Ｉｇ折畳みの三次元構造の組を収集する工程であって、ここで、該構造は、Ｖ−クラス折畳み、Ｉ−クラス折畳み、Ｃ１−クラス折畳み、Ｃ２−クラス折畳みおよびこれらのＩｇ折畳みクラスの組み合わせよりなるＩｇ折畳みクラスの群より選択されるＩｇ折畳みを含む、工程；
（ｂ）破壊、１００％配列同一性、異常な長さ、または誤って折畳まれたトポロジーの提示を有する配列を含むＩｇ折畳み構造を捨てることにより、該Ｉｇ折畳み構造の組をフィルタリングする工程；
（ｃ）構造整列を構築する工程であって、ここで、該フィルタリングされたＩｇ折畳み構造の組は、互いに重ねられる、工程；
（ｄ）該構造整列から配列整列を得る工程であって、ここで、１つの構造の配列からのアミノ酸は、該ポリペプチド骨格のα−炭素環の最も短い距離に基づいて、第２の構造の配列からのアミノ酸に適合する、工程；
（ｅ）該Ｉｇ折畳みクラスのうちの１つについての構造ベースの配列整列に基づいて隠れたマルコブモデル（ＨＭＭ）を構築する工程；
（ｆ）該Ｉｇ折畳みクラスに特異的なＨＭＭのうちの１以上を用いて蛋白質配列データベースを検索する工程であって、ここで、該蛋白質配列データベースにおける該ＨＭＭに適合する配列が収集される、工程；および
（ｇ）蛋白質ドメインの注釈されたデータベースを用いて（ｆ）において収集された該蛋白質配列の該Ｉｇ折畳みクラスの整列を確認する工程であって、ここで、（ｆ）において見出される候補Ｉｇ折畳み蛋白質配列は、該蛋白質ドメインの注釈されたデータベースにおけるＩｇ折畳みクラスに対するそれらの割り当てが統計学的に有意な場合にのみ保持される、工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記整列がさらに、
（ａａ）（ｂ）において得られた前記配列整列から冗長なまたは高度に類似するアミノ酸配列を除去する工程；および
（ｂｂ）ＨＭＭプロフィールにおいて適合状態にない該整列における列を除去する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｃ）の計算が、（ｉ）区別されるアミノ酸タイプとしてのギャップの同定；（ｉｉ）重み付け関数、ここで、該重み付け関数は、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ多様性重み付け関数ではない；（ｉｉｉ）共変動対についてのフィルタリング関数、ここで、該関数は、配列平均同一性（ＳＡＩ）を使用しない；（ｉｖ）事象カットオフ、ここで、共変動対は、最少数の回数観察されたのでない限り報告されず、そしてここで該事象カットオフは、約２以上の事象である；ならびに（ｖ）これらの特徴のうちの２以上の組み合わせよりなる群から選択される１以上の特徴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｃ）の計算が、χ２解析を用いた変動の統計学的有意性の計算を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記χ２の値が、事象ベースのカウントの式を用いて計算される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記事象ベースのカウントの式が、
【数１】
2009531028.tif 000001
であり、ここで、
ｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）は、前記整列した配列の組における、各々、位置ｉおよびｊにおける注目するいずれかの２つのアミノ酸タイプのアミノ酸頻度であり；
ｃ（ｉ，ｊ）は、ｐ（ｉ）およびｐ（ｊ）が同一配列内で観察される回数であり；および
ｃ（ｔ）は、該整列における合計配列の数であり；そして
ここで、アミノ酸頻度は、あるアミノ酸タイプが整列中の特定の位置で観察される回数を、該整列中の配列の合計数で割ったものであると定義される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｃ）の計算が、以下の式：
【化３−１】
2009531028.tif 000002
を用いて行われる相関係数（φ）の計算を含み、ここで、
ａｉｂｊは、各々、位置ｉおよび位置ｊにおいてタイプａまたはｂのアミノ酸が同一配列で見出される回数であり；
【化３−２】
2009531028.tif 000003
は双方のアミノ酸タイプが同一配列に存在しない回数であり；
【化３−３】
2009531028.tif 000004
は、アミノ酸ｂが不存在でありながらもアミノ酸ａが存在することが見出される回数であり；および
【化３−４】
2009531028.tif 000005
は、アミノ酸ｂが存在しながらもアミノ酸ａが存在しない回数であり、そしてここで、該相関係数（φ）は、該共変動の統計学的強さを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記共変動の計算は、統計学的有意性の閾値レベルを満足する共変動についてのみ共変動スコアの作成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記共変動スコアは、閾値χ２値またはφ値を超えるかまたは下回る共変動についてのみ作成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補配列のアミノ酸位置に、約＋０．２５〜約＋１．０のφ相関係数を有する正の共変動については正の特定の共変動スコアが割り当てられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記候補配列のアミノ酸位置に、約−０．２５〜約−１．０のφ相関係数を有する負の共変動については負の特定の共変動スコアが割り当てられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
（ａａ）鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインおよび前記候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインの構造モデルを提供する工程；
（ｂｂ）鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の、安定性に重要である蛋白質−蛋白質界面アミノ酸を同定する工程；
（ｃｃ）該（ｂｂ）の界面アミノ酸と共変動する骨格アミノ酸を同定する工程；
（ｄｄ）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の１以上の界面アミノ酸または骨格アミノ酸を、（ｂｂ）および（ｃｃ）で同定された対応する界面アミノ酸または骨格アミノ酸で置換する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記鋳型抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、Ｉｇスーパーファミリー折畳みを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛋白質−蛋白質界面アミノ酸は、候補のＶＨドメインまたはＶＬドメインのＶＨ／ＶＬ界面に位置する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（１）前記候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインの１以上のアミノ酸位置についてコンセンサスベースのスコアを計算する工程；
（２）該コンセンサスベースのスコアを、前記共変動データセット中のデータと合わせる工程；および
（３）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを安定化すると予測されるアミノ酸置換を選択する工程であって、ここで、該選択は、コンセンサスベースのスコアおよび共変動データの組み合わせに基づく、工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記コンセンサスベースのスコアの計算が、
（ｉ）前記免疫グロブリンスーパーファミリーに属するポリペプチド配列のキュレーションされた参照組を提供する工程；
（ｉｉ）該参照組の配列を整列して整列された組を生成する工程；および
（ｉｉｉ）該候補抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメイン中の各アミノ酸位置について試験アミノ酸頻度を計算する工程であって、ここで、該頻度は、該アミノ酸位置における該アミノ酸が、該整列された組における対応する位置に存在する回数を合計し、そして該合計された値を該参照組中の配列の合計数によって割ることにより計算される、工程
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
さらなる工程：
（ａ）コンセンサス配列を計算する工程であって、該配列中の各位置における前記アミノ酸が、前記整列された組中の該位置での最も一般的なアミノ酸に対応する、工程；
（ｂ）該コンセンサスポリペプチド配列中の各アミノ酸位置について該コンセンサスアミノ酸頻度を計算する工程であって、ここで、該配列は、該アミノ酸位置における該アミノ酸が、該整列された組の対応する位置において存在する回数を合計し、そして該合計された値を該参照組中の配列の合計数によって割ることにより計算される、工程；および
（ｃ）前記試験アミノ酸頻度を該コンセンサスアミノ酸頻度によって割って、コンセンサススコアを得る工程；
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法によって設計された、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
安定化されたｓｃＦｖ分子を含む、請求項２３に記載の抗体またはその断片。
【請求項２５】
前記安定化されたｓｃＦｖ分子が、配列番号４または配列番号６８を含む候補ｓｃＦｖ分子由来のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の抗体またはその断片。
【請求項２６】
請求項２３に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドをコードする、宿主細胞。
【請求項２８】
配列番号４のＶＨドメインおよびＶＬドメイン由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む安定化されたｓｃＦｖ分子であって；ここで、
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸置換；
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸置換；
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸置換；
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９および位置５０におけるアミノ酸置換；
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸置換；
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸置換；
ｉ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸置換；
ｊ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６および５５ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換； 
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６、５５および１０１、ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｏ）これらの置換のうちの２以上の組み合わせ；
よりなる群から選択される少なくとも１つの安定化変異を除き、該ｓｃＦｖ  ＶＨドメインは、配列番号４の該ＶＨドメインのうちの３つの相補性決定領域を含み、そして該ｓｃＦｖ  ＶＬドメインは、配列番号４の該ＶＬドメインのうちの３つのＣＤＲを含み、
ここで、該ｓｃＦｖ分子は、リンフォトキシン−β受容体（ＬＴβＲ）に特異的に結合し、そして該安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性は、配列番号４のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖ分子の熱安定性よりも高い、ｓｃＦｖ分子。
【請求項２９】
前記ｓｃＦｖ  ＶＨドメインが、Ｋａｂａｔ位置４４にシステインを含み、そして前記該ｓｃＦｖ  ＶＬドメインが、Ｋａｂａｔ位置１００にシステインを含み、そして該ＶＨドメインにおける該システインと該ＶＬドメインにおける該システインとがジスルフィド結合を形成する、請求項２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３０】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む安定化されたｓｃＦｖ分子であって；ここで、少なくとも２つの安定化変異を除いて、該ｓｃＦｖ  ＶＨドメインは、配列番号４のＶＨドメインのうちの３つのＣＤＲを含み、そして該ｓｃＦｖ  ＶＬドメインは、配列番号４のＶＬドメインのうちの３つのＣＤＲを含み、ここで、該変異は、該ｓｃＦｖ  ＶＨドメインのＫａｂａｔ位置４４におけるシステインおよび該ｓｃＦｖ  ＶＬドメインのＫａｂａｔ位置１００におけるシステインを含み、ここで、該ＶＨドメインにおける該システインと該ＶＬドメインにおける該システインとがジスルフィド結合を形成し、ここで、該ｓｃＦｖ分子はＬＴβＲに特異的に結合し、そしてここで、該安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性は、該安定化変異を有さない対応する従来のｓｃＦｖ分子の熱安定性よりも高い、ｓｃＦｖ分子。
【請求項３１】
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸置換；
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸置換；
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸置換；
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９および５０におけるアミノ酸置換；
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸置換；
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸置換；
ｉ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸置換；
ｊ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６および５５ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６、５５および１０１、ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸置換；
ｏ）これらの置換のうちの２以上の組み合わせ；
よりなる群から選択される少なくとも１つのさらなる安定化変異をさらに含む、請求項３０に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの安定化変異が、以下：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるグルタミン酸（Ｅ）への置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるグルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）への置換；
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるイソロイシン（Ｉ）への置換；
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるロイシン（Ｌ）への置換；
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるチロシン（Ｙ）またはセリン（Ｓ）への置換；
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９のチロシン（Ｙ）またはセリン（Ｓ）への置換およびＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアラニン（Ａ）への置換；
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアスパラギン酸（Ｄ）への置換；
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるイソロイシン（Ｉ）またはグリシン（Ｇ）への置換；
ｉ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）への置換；
ｊ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるグリシン（Ｇ）への置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるイソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）への置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるグルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）への置換およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるロイシン（Ｌ）への置換およびアミノ酸置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるイソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）への置換、ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるグリシン（Ｇ）への置換、およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるロイシン（Ｌ）への置換；
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるイソロイシン（Ｉ）またはロイシン（Ｌ）への置換、ＶＨのＫａｂａｔ位置５５位におけるグリシン（Ｇ）への置換、ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアスパラギン酸（Ｄ）への置換、およびＶＬのＫａｂａｔ位置４６におるロイシン（Ｌ）への置換；
ｏ）これらの置換のうちの２以上の組み合わせ；
よりなる群から選択されるアミノ酸置換である、請求項３１に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３３】
ＶＨのＫａｂａｔ位置１６および５５、ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６にアミノ酸置換を含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３４】
ＶＨのＫａｂａｔ位置１６、５５および１０１、ならびにＶＬのＫａｂａｔ位置４６にアミノ酸置換を含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３５】
Ｔ５０として測定した前記安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性が、前記少なくとも１つの安定化変異を有さない対応する従来のｓｃＦｖ分子の熱安定性よりも少なくとも１０℃高い、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３６】
Ｔ５０として測定した前記安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性が、熱挑戦アッセイによって測定した場合に６７℃よりも高い、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３７】
配列番号６８のＶＨおよびＶＬドメイン由来のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む安定化されたｓｃＦｖ分子であって；ここで、
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸置換；
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸置換；
ｄ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸置換；
ｅ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸置換；
ｆ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸置換；
ｇ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸置換；
ｈ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸置換；
ｉ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸置換；
ｊ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６および４９におけるアミノ酸置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６、３２および４９におけるアミノ酸置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６および７２におけるアミノ酸置換；
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６、３２および７２におけるアミノ酸置換；
ｏ）これらの置換のうちの２以上の組み合わせ；
よりなる群から選択される少なくとも１つの安定化変異を除き、該ｓｃＦｖ  ＶＨドメインは、配列番号６８の該ＶＨドメインのうちの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、そして該ｓｃＦｖ  ＶＬドメインは、配列番号６８の該ＶＬドメインのうちの３つのＣＤＲを含み、
ここで、該ｓｃＦｖ分子は、ＣＤ２３に特異的に結合し、そして該安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性は、配列番号６８の熱安定性よりも高い、ｓｃＦｖ分子。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの安定化変異は、
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるグルタミン（Ｑ）への置換；
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるセリン（Ｓ）への置換；
ｃ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるリジン（Ｋ）への置換；
ｄ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）への置換；
ｅ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）への置換；
ｆ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるセリン（Ｓ）またはチロシン（Ｙ）への置換；
ｇ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）への置換；
ｈ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるイソロイシン（Ｉ）への置換；
ｉ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるセリン（Ｓ）への置換；
ｊ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）への置換；
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるグルタミン（Ｑ）への置換およびＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）への置換；
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるグルタミン（Ｑ）への置換、ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるセリン（Ｓ）への置換、およびＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）への置換；
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるグルタミン（Ｑ）への置換およびＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換；
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるグルタミン（Ｑ）への置換、ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるセリン（Ｓ）への置換、およびＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換；ならびに
ｏ）これらの置換のうちの２以上の組み合わせ；
よりなる群から選択されるアミノ酸置換である、請求項３７に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項３９】
少なくとも１つの安定化変異を除いて、前記ｓｃＦｖ  ＶＨは配列番号６８のＶＨと同一であり、前記ｓｃＦｖのＶＬは配列番号６８のＶＬと同一である、請求項３７に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４０】
ＶＨのＫａｂａｔ位置６、３２、４９および７２にアミノ酸置換を含む、請求項３７に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４１】
熱挑戦アッセイによってＴ５０として測定した前記安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性が、前記少なくとも１つの安定化変異を有さない対応する従来のｓｃＦｖ分子の熱安定性よりも少なくとも１℃高い、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４２】
Ｔ５０として測定した前記安定化されたｓｃＦｖ分子の熱安定性が、熱挑戦アッセイによって測定した場合に４３℃よりも高い、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖ分子は、前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインとの間に安定化された界面を有し、そして前記少なくとも１つの安定化変異は、直接的に該界面内のアミノ酸位置にある、請求項２８〜３２および３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４４】
前記ｓｃＦｖ  ＶＨドメインと前記ｓｃＦｖ  ＶＬドメインとの間に位置するｓｃＦｖリンカーをさらに含む、請求項２８〜３４および３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４５】
前記ｓｃＦｖリンカーが、配列番号２１または配列番号２０を含む、請求項４４に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４６】
前記熱安定性が、示差走査型熱量測定（ＤＳＣ）、二色性（ＣＤ）分光測定、蛍光発光分光測定、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定、または熱挑戦アッセイによって測定される、請求項２８〜３２および３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項４７】
請求項２８〜３２および３７〜４０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子および抗体またはその抗原結合断片を含む多価抗原結合分子であって、ここで、該安定化されたｓｃＦｖ分子は、該抗体またはその断片に遺伝子的に融合された、多価抗原結合分子。
【請求項４８】
前記抗体またはその断片が、ＣＤ２３に特異的に結合する、請求項４７に記載の多価抗原結合分子。
【請求項４９】
請求項２８〜３２および３７〜４０のいずれか１項に記載の安定化されたｓｃＦｖ分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５０】
請求項４７に記載の多価抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項４９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５２】
請求項５０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５３】
請求項５１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
請求項５２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５５】
安定化されたｓｃＦｖ分子を産生する方法であって、請求項５３に記載の宿主細胞を培地中で培養する工程および該安定化されたｓｃＦｖ分子を精製する工程を含む、方法。
【請求項５６】
多価抗原結合分子を産生する方法であって、請求項５４に記載の宿主細胞を培地中で培養する工程および該多価抗原結合分子を精製する工程を含む、方法。
【請求項５７】
大規模製造プロセスにおいて安定化されたｓｃＦｖ分子を製造する方法であって、請求項５３に記載の宿主細胞を大規模生産に適した条件で培養する工程、およびｓｃＦｖ分子の集団を収集する工程を含む、方法。
【請求項５８】
大規模製造プロセスにおいて安定化された多価抗原結合分子を製造する方法であって、請求項５４に記載の宿主細胞を大規模生産に適した条件で培養する工程、および多価抗原結合分子の集団を収集する工程を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
もう１つの態様において、本発明は安定化されたｓｃＦｖ分子に関し、ここに、該安定化されたｓｃＦｖ分子が、
ａ．ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間に存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有するｓｃＦｖリンカー、ここにＶＨおよびＶＬドメインはＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００；の間のジスルフィド結合によって連結されており；
ｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ここに分子は：
ａ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１３におけるアミノ酸の置換
ｂ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１６におけるアミノ酸の置換
ｃ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４６におけるアミノ酸の置換
ｄ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｅ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｆ）ＶＬのＫａｂａｔ位置４９および５０におけるアミノ酸の置換
ｇ）ＶＨのＫａｂａｔ位置１０１におけるアミノ酸の置換
ｈ）ＶＨのＫａｂａｔ位置２０におけるアミノ酸の置換
ｉ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４８におけるアミノ酸の置換
ｊ）ＶＬのＫａｂａｔ位置３におけるアミノ酸の置換
ｋ）ＶＨのＫａｂａｔ位置５５におけるアミノ酸の置換
ｌ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６７におけるアミノ酸の置換
ｍ）ＶＨのＫａｂａｔ位置６におけるアミノ酸の置換
ｎ）ＶＨのＫａｂａｔ位置３２におけるアミノ酸の置換
ｏ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４９におけるアミノ酸の置換
ｐ）ＶＨのＫａｂａｔ位置４３におけるアミノ酸の置換
ｑ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７２におけるアミノ酸の置換
ｒ）ＶＨのＫａｂａｔ位置７９におけるアミノ酸の置換
ｓ）ＶＬのＫａｂａｔ位置５０におけるアミノ酸の置換
ｔ）ＶＬのＫａｂａｔ位置７５におけるアミノ酸の置換
ｕ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８０におけるアミノ酸の置換
ｖ）ＶＬのＫａｂａｔ位置８３におけるアミノ酸の置換；
よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、または
ｉｉｉ）ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間の安定化された界面を備えたＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ここに、分子は界面内に直接的にアミノ酸位置において、および／またはＶＨおよびＶＬの間の相互作用の足場となるアミノ酸位置において少なくとも１つの置換を有し、ここに、該少なくとも１つのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、４７Ｈ、３７Ｈ、４５Ｈ、４６Ｈ、５１Ｈ、５９Ｈ、１０９Ｈ、１４Ｈ、２６Ｈ、２７Ｈ、４０Ｈ、６９Ｈ、１０３Ｈ、２９Ｈ、３８Ｈ、４４Ｈ、４９Ｈ、５５Ｈ、６３Ｈ、５４Ｈ、６８Ｈ、７２Ｈ、７４Ｈ、７９Ｈ、８２ｂＨ、８Ｈ、３２Ｈ、３９Ｈ、４１Ｈ、６２Ｈ、８５Ｈ、９１Ｈ、２４Ｈ、６０Ｈ、３７Ｌ、３６Ｌ、４４Ｌ、５９Ｌ、５７Ｌ、６４Ｌ、４６Ｌ、４８Ｌ、６３Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、３９Ｌ、４５Ｌ、４７Ｌ、５４Ｌ、５６Ｌ、７９Ｌ、８５Ｌ，９８Ｌ，５８Ｌ，７４Ｌ，７７Ｌ，８３Ｌ，８９Ｌおよび１０４Ｌよりなる群から選択され、およびここに、安定化されたｓｃＦｖ分子は、置換を欠如するｓｃＦｖ分子のそれよりも大きなＴ５０を有する；
を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
本明細書中で用いるように、用語「慣用的なｓｃＦｖ分子」とは、安定化されたｓｃＦｖ分子ではないｓｃＦｖ分子をいう。例えば、典型的な慣用的ｓｃＦｖ分子は、安定化突然変異を欠如し、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
例示的な分析分光測定方法は示差操走査型熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどの蛋白質または蛋白質ドメインの折畳み解除に伴う熱吸収に感受性である熱量計を使用する（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８参照）。蛋白質の熱安定性を決定するには、蛋白質の試料を熱量計に挿入し、ＦａｂまたはｓｃＦｖが折畳み解除されるまで温度を上昇させる。蛋白質が折畳み解除される温度は、総じての蛋白質安定性を予測する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７９】
【図１】図１Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。図１Ｂは、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図２】図２は、ＢＨＡ１０の精製された慣用的ＦａｂまたはｓｃＦｖ断片での示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の結果を示す。図２Ａは、ＢＨＡ１０の慣用的ＦａｂおよびｓｃＦｖ断片の折畳み解除を比較するＤＳＣ実験の結果を示す。図２Ｂは、１℃／分および２℃／分の走査速度での精製されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖのＤＳＣ走査の結果を示す。
【図３】図３Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む安定化されたＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体をコードするＤＮＡ配列（配列番号：９）を示す。図３Ｂは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド−安定化ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太文字のイタリック体で示す。
【図４】図４Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含む安定化されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１４）を示す。図４Ｂは、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）４  ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す。注釈は図４Ａと同一である。
【図５】図５Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーを含むＢＨＡ１０ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１６）を示す。図５Ｂは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５  ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ構築体のアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す。注釈は図５Ａと同一である。
【図６】図６は、慣用的ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ（レーン１）および本発明の安定化されたＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ分子（レーン２ないし４）の発現レベルを比較するウェスタンブロット分析の結果を示す。各資料は還元（左側パネル）および非−還元（右パネル）条件下で電気詠動に付した。
【図７】図７Ａは、（太文字タイプで示された）（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含むＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド安定化ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１８）を示す。図７Ｂは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド＋（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−安定化ＢＨＡ１０ｓｃＦｖのアミノ酸配列（配列番号：１９）を示す。注釈は図７Ａと同一である。ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は太文字のイタリック体で示す。
【図８】図８は、熱挑戦アッセイの結果を示し、該アッセイでは、本発明の安定化されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖ分子の熱安定性を慣用的ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ分子のそれと比較した。ｓｃＦｖ分子の５０％がそれらの結合活性を保有する温度（Ｔ５０）は図面の脚注に示す。
【図９】図９は慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖおよびａＢＨＡ１０ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ｓｃＦｖで行った示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析の結果を示す。
【図１０】図１０は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ，ＢＨＡ１０（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ｓｃＦｖ  およびＢＨＡ１０ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ｓｃＦｖへの疎水性蛍光色素１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）の結合の結果を示す。
【図１１】図１１は、ＢＨＡ１０ＶＨおよびＶＬドメインの残基頻度分析の結果を示す。図１１Ａは、ＩｇＧ可変ドメイン配列の残基頻度分析に基づくスクリーニングのためのＢＨＡ１０ＶＨライブラリー位置をリストする。図１１Ｂは、ＩｇＧ可変ドメイン配列の残基頻度分析に基づくスクリーニングのためのＢＨＡ１０ＶＬライブラリー位置をリストする。
【図１２】図１２は、熱挑戦アッセイの結果を示し、該アッセイでは、熱安定性に対する安定化性ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ突然変異の効果、および安定化性突然変異の相加性を評価した。（ＧＳ３は（Ｇ４Ｓ）３を示し、ＧＳ４は（Ｇ４Ｓ）４を示し；ＳＳはジスルフィド結合を示す）
【図１３】図１３は、本発明の例示的な安定化されたＬＴβＲ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ２二特異的抗体（「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ハーキュレズ）」抗体）を示す。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体は、本発明の安定化されたＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ分子の１４Ａ２  ＩｇＧ抗体への融合によって形成される。ｓｃＦｖ分子は重鎖（Ｃ−ＨｅｒｃｕｌｅｓまたはＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）のＣ−末端またはＮ−末端へ、あるいは軽鎖のＮ−末端（ＮＬ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に融合させることができる。
【図１４】図１４は、慣用的および作製されたＢＨＡ１０ｓｃＦｖを、１４Ａ２重鎖のアミノ末端（図１４Ａ）またはカルボキシル末端（図１４Ｂ）へ融合させるのに用いる順次のＰＣＲ反応を模式的に示す。
【図１５】図１５Ａは、シグナルペプチド（下線を施す）を含むキメラ１４Ａ２軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号：２８）を示す。図１５Ｂは、キメラ１４Ａ２軽鎖のアミノ酸配列（配列番号：２９）を示す。
【図１６】図１６は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３０）を示す。
【図１７】図１７は、慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのアミノ酸配列（配列番号：３１）を示す。
【図１８】図１８は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３２）を示す。
【図１９】図１９は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【図２０】図２０は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３４）を示す。
【図２１】図２１は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３５）を示す。
【図２２】図２２は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：３６）を示す。
【図２３】図２３は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：３７）を示す。
【図２４】図２４は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４４）を示す。
【図２５】図２５は、慣用的なＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４５）を示す。
【図２６】図２６は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４６）を示す。
【図２７】図２７は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４７）を示す。
【図２８】図２８は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：４８）を示す。
【図２９】図２９は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：４９）を示す。
【図３０】図３０は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のＤＮＡ配列（配列番号：５０）を示す。
【図３１】図３１は、ＢＨＡ１０ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓの重鎖のアミノ酸配列（配列番号：５１）を示す。
【図３２】図３２は、ＣＨＯ細胞における一過的に発現されたＣ−およびＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のウェスタンブロット分析からの結果を示す。左側パネルは非−還元条件下で分析し、右側パネルは還元条件下で分析する。
【図３３】図３３は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＬＴβＲ受容体への結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。図３３Ａは、安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。図３３Ｂは、安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。「ｗｔ」は、慣用的なＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ＧＳ４」は安定化された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ｄｓ」は、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドリンカーを含む安定化されたｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。
【図３４】図３４は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２受容体への結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。図３４Ａは、安定化されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。図３４Ｂは、安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体での結果を示す。「ｗｔ」はＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ＧＳ４」は、安定化された（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４  ｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。「ｄｓ」は、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドリンカーを含む安定化されたｓｃＦｖを含む安定化されたＮＨ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。
【図３５】図３５は、プロテインＡクロマトグラフィーに従う安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のＳＥＣ分析の結果を示す。
【図３６】図３６は、精製された安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図３６Ａは、ＮＨ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体での結果を示す。図３６Ｂは、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体での結果を示す。５ｕｇの試料を各レーンにおいて負荷した。
【図３７】図３７は、精製された安定化されたＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の分析的ＳＥＣ分析の結果を示す。パネルＡは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖでのＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＢは、分取用ＳＥＣに従うものを示す。パネルＣは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４  ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＤは、分取用ＳＥＣに従うものを示す。
【図３８】図３８は、精製された安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的抗体の分析的ＳＥＣ分析の結果を示す。パネルＡは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＢは分取用ＳＥＣに従うものを示す。パネルＣは、プロテインＡクロマトグラフィーに従うＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４  ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓのプロフィールを示し、パネルＤは分取用ＳＥＣに従うものを示す。
【図３９】図３９は、慣用的ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇ４Ｓ）４  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および慣用的ＢＨＡ１０ｓｃＦｖでのＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓで行った示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析の結果を示す。
【図４０】図４０は、本発明の安定化されたＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体の、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ  Ｉｇ受容体への二特異的結合活性を評価するＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｎ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＣｙｓおよびＣ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」Ｃｙｓは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィド結合を有するＮＨ−またはＣ−末端ｓｃＦｖを含むＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。Ｎ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＣｙｓおよびＮ−「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ」ＤＭは、ＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドおよび（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含むＮＨ−またはＣ−末端ｓｃＦｖを含むＨｅｒｃｕｌｅｓ抗体である。ＣＢＥ１１ペンタマーは、一特異的ＬＴβＲ結合活性を持つ対照抗体である。
【図４１−１】図４１は、腫瘍細胞成長に対する、安定化されたＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的および一特異的抗体の効果を示す。図４１Ａないし４１Ｄは、各々、ＷｉＤｒ腫瘍細胞、Ｍｅ１８０腫瘍細胞、ＭＤＡ２３１腫瘍細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞に対する効果を示す。
【図４１−２】図４１は、腫瘍細胞成長に対する、安定化されたＮ−およびＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ二特異的および一特異的抗体の効果を示す。図４１Ａないし４１Ｄは、各々、ＷｉＤｒ腫瘍細胞、Ｍｅ１８０腫瘍細胞、ＭＤＡ２３１腫瘍細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞に対する効果を示す。
【図４２】図４２は、安定化されたｓｃＦｖを含む安定化された２鎖キメラミニボディの模式的ダイアグラムを示す。例示的ミニボディは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各結合特異性を改変することができる。
【図４３】図４３は、アミノ末端に付着された本発明の安定化されたｓｃＦｖ断片を含む例示的な安定化二特異的２鎖ダイマー四価ミニボディ（安定化された二特異的Ｎ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）の模式的ダイアグラムを示す。例示的な安定化された二価四価ミニボディは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。他の立体配置も可能であり、例えば、該二特異的四価ミニボディは、各鎖部分が異なる特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することができる。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりは少ないｓｃＦｖを安定化させる。
【図４４】図４４は、二価ミニボディの双方のカルボキシル末端に付着された安定化されたｓｃＦｖ断片を含む例示的な安定化された二特異的２鎖ダイマー四価ミニボディ（安定化された二特異的Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）の模式的ダイアグラムを示す。例示的な安定化された二価四価ミニボディは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第一の鎖部分、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖを含む第二の鎖部分を含有する。他の立体配置も可能であり、例えば、二特異的２−鎖ダイマー四価ミニボディは、各鎖が異なる特異性を持つ２つの安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することができる。もう１つの具体例において、ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。
【図４５】図４５は、本発明の安定化されたｓｃＦｖを含む安定化された二特異的４鎖ダイマーダイアボディの模式的ダイアグラムを示す。他の立体配置も可能であり、例えば、安定化された二特異的２−鎖ダイマー四価ミニボディは、各アームが異なる特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ断片を含有するように構築することもできる。ＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。
【図４６】図４６は、ＣＨ３のカルボキシル末端に付着した安定化されたｓｃＦｖ、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された二特異的４鎖ダイマー四価ｓｃＦｖ抗体の模式的ダイアグラムを示す。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができる。別法として、安定化されたｓｃＦｖ断片を重鎖または軽鎖いずれかの部分のアミノ末端に付着させて、各々、ＮＨ−ｓｃＦｖ四価抗体またはＮＬ−ｓｃＦｖ四価抗体を形成することができる。
【図４７】図４７は、ＣＨ３のカルボキシル末端に付着された安定化されたｓｃＦｖ、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価Ｃ−ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＣ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）の模式的ダイアグラムを示す。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きは変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てより少ないｓｃＦｖを安定化させる。
【図４８】図４８は、ＶＨのアミノ末端に付着された安定化されたｓｃＦｖを含み、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＮＨ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）の模式的ダイアグラムを示す。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２抗原に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖが安定化される。
【図４９】図４９は、ＶＬのアミノ末端に付着された安定化されたｓｃＦｖを含み、およびペプチドを連結するヒンジを含む安定化された４−鎖四価ｓｃＦｖＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体（安定化されたＮＬ−ｓｃＦｖ四価ＣＨ２ドメイン欠失二特異的抗体）を含有する。二特異的抗体の各重鎖部分は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２に対する結合特異性を持つＦｖ領域、およびＬＴβＲ抗原に対する結合特異性を持つ安定化されたｓｃＦｖ領域を含有する。安定化されたｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬドメインの向きを変化させることができ、各抗原結合特異性を改変することができる。もう１つの具体例において、全てよりも少ないｓｃＦｖを安定化させる。
【図５０】図５０は、野生型ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ（塗り潰ぶした丸印）−対−ＶＬ＿Ｓ４６Ｌ（図５０Ａ、塗り潰ぶしていない丸印）、ＶＨ＿Ｖ５５Ｇ（図５０Ｂ、塗り潰ぶしていない丸印）、およびＶＨ  Ｐ１０１Ｄ（塗り潰ぶしていない丸印）（図５０Ｃ）安定化性突然変異を含有するＢＨＡ１０  ｓｃＦｖのＴ５０曲線を示す。
【図５１】図５１は、野生型ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ（灰色の線）−対−ＶＬ  Ｓ４６Ｌ（黒色の線）（図５１Ａ）およびＶＨ  Ｖ５５Ｇ（黒色の線）（図５１Ｂ）安定化性突然変異を含有するＢＨＡ１０  ｓｃＦｖｂのＤＳＣ曲線を示す。
【図５２】図５２は、野生型ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ  ＢＨ１０  ｓｃＦｖ（灰色の線）−対−ＶＨ＿Ｐ１０１Ｄ安定化性突然変異を含有するＢＨ１０  ｓｃＦｖ（黒色の線）のＤＳＣ曲線を示す。
【図５３】図５３は、野生型（「ＷＴ（Ｇ４Ｓ）Ｘ３」）および安定化された突然変異体ｓｃＦｖのＤＳＤ−Ｐａｇｅ分析を示す。全ての突然変異体ｓｃＦｖは、Ｎ−末端ＶＨおよびＣ−末端ＶＬの間に式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４のペプチドを連結するｇｌｙ−ｓｅｒ（「（Ｇ４Ｓ）Ｘ４」）を含有する。各レーンにおけるｓｃＦｖの同一性を示す。レーン１２ないし１４は、ＶＨ４４およびＶＬ１００の間のジスルフィド結合を有するＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを含有する。（Ｇ４Ｓ）Ｘ４／ジスルフィド安定化ｓｃＦｖを「二重突然変異体」の代わりに「ＤＭ」という。最後の２つのレーンは、ジスルフィド連結ｓｃＦｖに対してやはり安定化された命名された突然変異を含む。
【図５４】図５４Ａは、野生型（「ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ」）ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ（ダッシュ線）、ＶＨ  Ｓ１６Ｅ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い灰色の線）、ＶＬ  Ｓ４６Ｌ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い黒色の線）、ＶＨ  Ｖ５５Ｇ突然変異体ｓｃＦｖ（濃い灰色の線）、およびＶＨ  Ｐ１０１Ｄ突然変異体ｓｃＦｖ（薄い黒色の線）のＤＳＣ曲線を示す。図５４Ｂは、ＰＢＳ中の（塗り潰ぶしていない丸印）、あるいは野生型（「ＶＨ−（ＧＳ）４−ＶＬ−６Ｈｉｓ」）ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ（塗り潰ぶした灰色の丸印）、ＶＨ  Ｓ１６Ｅ突然変異体ｓｃＦｖ（菱形）、ＶＬ  Ｓ４６Ｌ突然変異体ｓｃＦｖ（四角）、ＶＨ  Ｖ５５Ｇ突然変異体ｓｃＦｖ（倒立した三角形）、およびＶＨ  Ｐ１０１Ｄ突然変異体ｓｃＦｖ（三角形）の存在下における１０ｍＭ  ＡＮＳの温度依存性蛍光を示す。曲線を通る直線は２−状態折畳み解除モデルに対するフィットである。
【図５５】図５５は、野生型および突然変異体ｓｃＦｖの存在下における１５℃でのＡＮＳ蛍光を示す。各ｓｃＦｖによって誘導されたＡＮＳ蛍光を、ＤＳＣ（図５５Ａ）、および各ｓｃＦｖの折畳み解除転移によるＡＮＳ蛍光の温度−依存性増加（図５５Ｂ）によって決定された同一ｓｃＦｖのＶＨドメインのＴＭに対してプロットする。
【図５６】図５６は、６つの時点（Ｔ＝０、Ｔ＝１週、Ｔ＝２週、Ｔ＝１ヶ月、Ｔ＝２ヶ月およびＴ＝３ヶ月）および低温（２ないし８℃）における、高濃度の安定化されたＮ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８；ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｎ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ；図５６Ａ）、安定化されたＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６；ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ４４：ＶＬ１００／（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ；図５６Ｂ）、および野生型ＢＨＡ１０抗体（図５６Ｃ）のサイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す。ｘ−軸は時間（分）であって、ｙ−軸は２８０ｎｍにおけるｍＡＵ（吸光度単位）である。溶出プロフィールの有意な変化は経時的に観察されなかった。
【図５７】図５７は、２ないし８℃における貯蔵前、およびその３ヶ月後における、ＸＷＵ０２８およびＸＷＵ０３６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パネルＡ。試料は還元されていなかった（「ＮＲ」と命名する）。予測されたＭＷ、〜２００ｋＤａは二特異的試料で観察される。ＢＨＡ１０は〜１５０ｋＤａのその予測されたＭＷにおいて移動する。レーン１ないし４はＸＷＵ０２８試料である。レーン５ないし８はＸＷＵ０３６試料である。レーン９ないし１０はＢＨＡ１０  ＩｇＧ試料である。パネルＢ。試料はＤＴＴで還元した（還元されたについては「赤色」として示す）。重鎖の予測されるＭＷである〜７５ｋＤａ、および軽鎖の予測されるＭＷである〜２５ｋＤａが、還元条件下で二特異的試料で観察される。ＢＨＡ１０重鎖および軽鎖は、還元条件下で、各々、５０ｋＤａおよび２５ｋＤａのそれらの予測されるＭＷで移動する。レーン１、２、６および７はＸＷＵ０２８試料である。レーン３、４、８および９はＸＷＵ０３６試料である。レーン５および１０はＢＨＡ１０  ＩｇＧ試料である。
【図５８】図５８は、Ｔ＝０、Ｔ＝１ヶ月、およびＴ＝３ヶ月におけるＸＷＵ０２８（パネルＡ）およびＸＷＵ０３６（パネルＢ）の完全な質量分析を示す。ＣＨ２におけるＮ−結合炭水化物の種々のレベルのシリル化のため多数のピークが各蛋白質で観察される。二特異性の炭水化物分布は標準ＩｇＧ１蛋白質で典型的である。
【図５９】図５９は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２およびＬＴβＲ受容体に対する、Ｎ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０２８；図５６Ａ）またはＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０３６；図５６Ｂ）を含有する血清試料の二特異的結合を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図６０】図６０は、安定化された二特異的抗体（ＸＷＵ０２８（菱形）およびＸＷＵ０３６（塗り潰ぶしていない四角））、および一特異的抗体単独で（ｈＣＢＥ１１（塗り潰ぶした三角形）（ｈＢＨＡ１０（倒立した三角形））およびｃｈ１４Ａ２（菱形））および組合せて（塗り潰ぶしていない三角形）腫瘍異種移植片マウスモデルに対して投与された一特異的抗体の相対的イン・ビボ活性を評価する実験の結果を示す。投与は１３日に開始した。ｈＣＢＥ１１  ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；ｈＢＨＡ１０  ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；ｃｈ１４Ａ２  ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．０１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０２８  ｖ．ＶＣ．：Ｐ＜０．００１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０２８  ｖ．ｈＢＨＡ１０：Ｐ＜０．０５；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０２８  ｖ．ｃｈ１４Ａ２：Ｐ＜０．００５；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０３６  ｖ．ＶＣ：Ｐ＜０．００１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０３６  ｖ．ｈＢＨＡ１０：Ｐ＜０．０１；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ  ＸＷＵ０３６  ｖ．ｃｈ１４Ａ２：Ｐ＜０．０５；ｃｏｍｂｏ  ｖ．Ｖ．Ｃ．：Ｐ＜０．００１。
【図６１】図６１は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：５２）を示す。
【図６２】図６２は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖アミノ酸配列（配列番号：５３）を示す。
【図６３】図６３は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：５４）を示す。
【図６４】図６４は、Ｃ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  ＶＨ４４−ＶＬ１００／ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ二特異的抗体についての重鎖アミノ酸配列（配列番号：５５）を示す。
【図６５】図６５は、安定化されたＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖ  （ＸＷＵ０５４）を持つＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、および慣用的な（「ＷＴ」）ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つＣ−Ｈｅｒｃｕｌｅｓを含有する上清からのプロテインＡ溶出物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。
【図６６】図６６は、ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つ精製されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６６Ａ）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つ精製されたＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６６Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図６７】図６７は、ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６７Ａ）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（図６７Ｂ）の、初期プロテインＡ精製工程に続いての分析的ＳＥＣ溶出プロフィールを示す。
【図６８】図６８は、ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５４）、およびＶＨ４４：ＶＬ１００／ＶＨ  Ｓ１６Ｅ  ＋  ＶＬ  Ｓ４６Ｌ  ＢＨＡ１０  ｓｃＦｖを持つＣ−末端Ｈｅｒｃｕｌｅｓ（ＸＷＵ０５５）の活性のイン・ビトロ腫瘍細胞増殖アッセイの結果を示す。ＭＤＡ２３１（図６８Ａ）およびＷｉＤｒ細胞（図６８Ｂ）は共に抗体が投与された。Ｈｅｒｃｕｌｅｓ抗体双方についての活性を、単独で、または組合せて投与された、安定化されたＸＷＵ０３６二特異的抗体、および一特異的抗体（ｈＢＨＡ１０およびｃｈ１４Ａ２）と比較した。
【図６９】図６９Ａは、残存する１８のＢＩＩＢヒト（化）抗体で用いるのと同一の条件下で取られたＢＩＩＢ７  ＩｇＧ１のＤＳＣ折畳み解除曲線を示す（実線）。ＤＳＣ曲線内で明らかな個々のＦａｂ、ＣＨ２およびＣＨ３転移を標識し、点線でスケッチする。図６９Ｂは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４様式双方でのＢＩＩＢ７抗体のＤＳＣ折畳み解除曲線を示す。
【図７０】図７０は、４つのヒト（化）ＩｇＧ１抗体、ＢＩＩＢ１６、ＢＩＩＢ６、ＢＩＩＢ４およびＢＩＩＢ１の熱的折畳み解除曲線を示す。全ての４つのＩｇＧ１構築体についてのＣＨ２およびＣＨ３ドメインの折畳み解除転移は同一であり、他方、Ｆａｂ折畳み解除転移は高度に可変である。
【図７１】図７１は、１８２のヒト抗体可変ドメイン参照配列および個々のサブクラスコンセンサス配列についてのコンセンサススコアリング結果を示す。Ａ。哺乳動物ＶＨデータベースに対する残基頻度分析によって誘導されたＶＨサブクラス配列スコア。Ｂ。ＮＣＢＩから選択された参照ＶＨ配列からのスコアの分布。ＶＨ配列スコアはサブクラスに従ってクラスター化される。Ｃ。哺乳動物Ｖκデータベースに対する残基頻度分析によって誘導されたＶκサブクラスコンセンサス配列スコア。Ｄ。ＮＣＢＩから選択された参照Ｖκ配列からのスコアの分布。Ｖκ配列スコアはサブクラスに従ってクラスター化される。
【図７２】図７２は、ＤＳＣによって測定された、対応するＦａｂ  ＴＭを持つ１８のＢＩＩＢ抗体についての配列スコアを比較する二次元プロットを示す。図７２Ａは、Ｆａｂ  ＴＭに対してプロットされたＢＩＩＢ１−１８  ＶＨスコアを示す。各点の同一性は表２０において見出すことができる。ＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６のＶＨはそれらのＣＤＲにおいて異常な挿入／欠失を含有する。ＢＩＩＢ１５およびＢＩＩＢ１６についての結果は四角として表示する。ＢＩＩＢ１８のＴＭは（ＢＩＩＢ１７からの最低の測定されたＴＭにマッチさせるため）５７．２℃として人工的に表示する。というのは、それ自身のＴＭは発現の欠如のため測定不能だったからである。ＢＩＩＢ１８のＴＭは、その極端に低い配列スコアおよび発現するその無能力に基づいてかなり低いようである。ＢＩＩＢ１８についてのＦａｂ結果を三角形として表示する。残りのＢＩＩＢ抗体ＶＨ結果は丸印として表示する。図７２Ｂは、Ｆａｂ  ＴＭに対してプロットされたＢＩＩＢ１−１８  Ｖκスコアを示す。記号は、スコアがＶκについての物である以外はプロット（Ａ）について記載したのと同一である。
【図７３】図７３は、Ｉｇ折畳みのＶ−クラス、Ｃ−クラス、およびＩ−クラスについての代表的な構造を示す。
【図７４】図７４は、ＳＣＯＰから得られたＶ−、Ｉ−、Ｃ１−、およびＣ２−クラスＩｇ−折畳み配列の長さのヒストグラムを示す。
【図７５】図７５は、Ｃ−クラスデータ組内のあらゆる残基組合せについて計算されたｆ−値相関係数のヒストグラムを示す。
【図７６】図７６は、共変動解析が基礎とされる整列プラットフォームの一部を含むＮＡＰＭＡＰビジュアルツールの出力を示す。プラットフォームは、Ｖ領域内の各位置（残基位置＃）についてのギャップ（残基タイプ）を含めたアミノ酸のすべてを含有する行を表示する。
【図７７】図７７は、ＮＡＰＭＡＰ鋳型へのＩｇ−折畳み共変動統計学のオーバーレイを示す。注目する配列は、関連アミノ酸を通っての曲がった線として示される。共変動は、関連共変動アミノ酸残基の間の真っ直ぐな棒線として示される。
【図７８】図７８は、実施例７に記載されたような、Ｋａｂａｔ位置３６におけるＴｙｒ（残基位置＃４８）およびＫａｂａｔ位置４６における突然変異Ｓｅｒ→Ｌｅｕ（残基位置＃６７）の間の共変動を強調するＢＨＡ１０  ＶＬの共変動解析からの詳細を示す。
【図７９】図７９は、Ｋａｂａｔ位置６７におけるＶａｌ（残基位置＃１００）、Ｋａｂａｔ位置７０におけるＴｈｒ（残基位置＃１０４）およびＫａｂａｔ位置８０における突然変異Ｍｅｔ→Ｌｅｕ（残基位置＃１１６）の間のコンフリクトする共変動を強調するＢＨＡ１０  ＶＨの共変動解析からの詳細を示す。
【図８０】図８０（配列番号：６３）は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。
【図８１】図８１（配列番号：６４）は、慣用的なｓｃＦｖを含む重鎖Ｃ−末端四価ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８抗体のアミノ酸配列を示す。
【図８２】図８２Ａ（配列番号：６５）は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖の一本鎖ＤＮＡ配列を示す。シグナルペプチド配列を下線を施して示す。図８２Ｂ（配列番号：６６）は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図８３】図８３Ａ（配列番号：６７）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖの一本鎖ＤＮＡ配列を示す。シグナルペプチド配列を下線を施して示す。図８３Ｂ（配列番号：６８）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。
【図８４】図８４Ａ（配列番号：６９）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖの一本鎖ＤＮＡ配列を示す。図８４Ｂ（配列番号：７０）は、慣用的なＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。
【図８５】図８５は、慣用的なｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖ（塗り潰ぶされた丸印）−対−慣用的ｐ５Ｅ８（ＶＬ／ＶＨ）ｓｃＦｖ（塗り潰ぶしてない丸印）のＴ５０曲線を示す。
【図８６】図８６は、単独で（ｈＶＨＡ１０（倒立した塗り潰ぶした三角形）およびｃｈ１４Ａ２（塗り潰ぶした菱形））、および組み合わせて（塗り潰ぶしていない倒立三角形）ヒト乳癌の腫瘍異種移植片マウスモデル（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対して投与される安定化された二特異的「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ−ＩＩ」抗体（ＸＷＵ０３６（塗り潰ぶした丸印））および一特異的抗体の相対的イン・ビボ活性を評価する実験の結果を示す。
【図８７】図８７は、界面維持で重要な共変動ネットワークに関与するＶＨ残基（図８７Ａ）、およびＶＨ／ＶＬ界面との直接的接触を行うことに関与し、ＶＨドメインの表面に直接的にマッピングされる界面残基（図８７Ｂ）を示す。矢印は、ＶＨ／ＶＬ相互作用を安定化させるのに、およびＶＨ／ＶＬ安定性で重要であることを共変動解析が知らせる現実の界面の外側の残基位置を示す。ＶＨおよびＶＬの間の界面において直接的接触を行う超可変ＣＤＲ３残基の位置をボックス内に囲う。
【図８８】図８８は、界面維持に重要な共変動ネットワークに関与するＶＬ残基（図８８Ａ参照）、およびＶＨ／ＶＬ界面との直接的接触を行うのに関与し、およびＶＬの表面に直接的にマッピングされる界面残基（図８８Ｂ）を示す。矢印は、共変動解析が、ＶＨ／ＶＬ相互作用を安定化するのに、およびＶＨ／ＶＬ安定性のために重要であることを知らせる現実の界面の外側の残基位置を示す。ＶＨおよびＶＬの間の界面において直接的接触を行う超可変ＣＤＲ３残基の位置をボックス内に囲う。
【図８９】図８９は、本発明の具体例を実施するのに適した例示的な環境を示す。
【図９０】図９０は、ポリペプチドの安定性の尺度として用いることができる配列雇用変動スコアを決定するために本発明の具体例がそれに続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。
【図９１】図９１は、コンセンサススコアを決定し、それを用いて、候補蛋白質の安定性を予測するために本発明の具体例が続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。
【図９２】図９２は、候補蛋白質の安定性の尺度として平均コンセンサススコアを決定し、それを用いるために本発明の具体例が続くことができる工程の例示的配列のフローチャートである。
【図９３】図９３は、ポリペプチドの代替残基を用いて、該ポリペプチドの改良された配列を決定するために本発明の具体例を続けることができる工程の例示的なシリーズの負ローチャートである。
【図９４】図９４Ａおよび９４Ｂは、Ｓ４６Ｌ（ＶＬ）安定化性突然変異（配列番号：１３７）およびＶ５５Ｇ（ＶＨ）安定化性突然変異（配列番号：１３８）を含有する安定化されたＢＨＡ１０  ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。安定化性突然変異はボックスに入れた残基によって示される。リーダー配列、ｇｌｙ／ｓｅｒ連結ペプチドおよびＣＨ１ドメインは、各々、下線を施した、太文字の、およびイタリック体の残基によって示される。