(57)【要約】特定のヒトＴＮＦＲ２エピトープに結合する抗ＴＮＦＲ２抗体、上記抗ＴＮＦＲ２抗体を含む治療用組成物、並びに、がんの治療においてこのような抗体を使用する方法、およびがんの治療においてこのような組成物を使用する方法、が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項２】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の６０〜７７番内、６５〜７７番内、７０〜７７番内、７５〜７７番内、５５〜７５番内、５５〜７０番内、５５〜６５番内、または５５〜６０番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項３】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７０〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項４】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番内、１２０〜１４３番内、または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５】
ＴＮＦＲ２キメラ３（配列番号１１または１２）に結合し、ＴＮＦＲ２キメラ０（配列番号５または６）と結合しない、単離抗体。
【請求項６】
１×１０−５Ｍ未満（例えば、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満）のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ３（配列番号１１または１２）と結合する、請求項５に記載の単離抗体。
【請求項７】
野生型ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）と比較した場合にヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の４８番残基および６８番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基において置換を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性が低減された、単離抗体。
【請求項８】
前記置換が非保存的置換である、請求項７に記載の単離抗体。
【請求項９】
酵母表面ディスプレイによる評価で、変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性が少なくとも約５０％低減された、請求項７または請求項８に記載の単離抗体。
【請求項１０】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、単離抗体。
【請求項１１】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項１２】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜４４番内、２３〜３６番内、２３〜３０番内、２３〜２５番内、２５〜４４番内、３０〜４４番内、３５〜４４番内、または４０〜４４番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項１３】
野生型ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）と比較した場合にヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の３７、４４、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、７２、７４、７６、７８、および８７番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基において置換を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性が低減された、単離抗体。
【請求項１４】
前記置換が非保存的置換である、請求項１３に記載の単離抗体。
【請求項１５】
酵母表面ディスプレイによる評価で、変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性が少なくとも約５０％低減された、請求項１３または請求項１４に記載の単離抗体。
【請求項１６】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の９７〜１１８番、１２０〜１４３番、または１６１〜２００番アミノ酸残基と結合しない、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１７】
ＴＮＦＲ２キメラ７（配列番号１９または２０）と結合し、ＴＮＦＲ２キメラ４（配列番号１３または１４）と結合しない（例えば、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ４と結合しない）、単離抗体。
【請求項１８】
１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ７（配列番号１９または２０）と結合する、請求項１７に記載の単離抗体。
【請求項１９】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体。
【請求項２０】
ＴＮＦＲ２キメラ１（配列番号７または８）と結合し、ＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）と結合しない（例えば、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）と結合しない）、単離抗体。
【請求項２１】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、単離抗体。
【請求項２２】
非改変型の同一抗体との比較でそのエフェクター機能を増強させるように改変された、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２３】
非改変型の同一抗体との比較でエフェクター機能を増強させる１または複数のアミノ酸置換を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２４】
非改変型の同一抗体との比較でそのエフェクター機能を増強させるように改変された、ヒトＴＮＦＲ２に結合する単離抗体。
【請求項２５】
非改変型の同一抗体との比較でエフェクター機能を増強させる１または複数のアミノ酸置換を含む、請求項２４の単離抗体。
【請求項２６】
非改変型の同一抗体との比較で抗腫瘍活性が増加した、請求項２４または請求項２５に記載の単離抗体。
【請求項２７】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２８】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を少なくとも約５０％阻害する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項２９】
ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７番内または１１９〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３０】
（１）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、（２）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸残基と結合せず、（３）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を阻害しない、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３１】
ＴＮＦＲ２活性に対しアゴニストとして作用する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３２】
ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対しアゴニストとして作用するその能力とは無関係に、腫瘍成長を阻害する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３３】
ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦ−αの結合を阻害するその能力とは無関係に、腫瘍成長を阻害する、請求項３２に記載の単離抗体。
【請求項３４】
ヒトＴＮＦＲ２上の不連続エピトープと結合する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項３５】
ヒトＴＮＦＲ２と結合し、（ａ）配列番号１７０および配列番号１７１にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号７１および配列番号７２にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号７４および配列番号８６にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号１４８および配列番号１４９にそれぞれ記載のアミノ酸配列、または（ｅ）配列番号１２６および配列番号１２７にそれぞれ記載のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、単離抗体。
【請求項３６】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、
（ａ）配列番号１５２、１５３、および１５４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１５５、１５６、および１５７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｂ）配列番号１５８、１５９、および１６０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６１、１６２、および１６３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｃ）配列番号１６４、１６５、および１６６をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６７、１６８、および１６９をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｄ）配列番号４７、４８、および４９をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５０、５１、および５２をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｅ）配列番号５３、５４、および５５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５６、５７、および５８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｆ）配列番号５９、６０、および６１をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６２、６３、および６４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｇ）配列番号６５、６６、および６７をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６８、６９、および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；
（ｈ）配列番号１３０、１３１、および１３２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１３３、１３４、および１３５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列；または
（ｉ）配列番号１０８、１０９、および１１０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１１１、１１２、および１１３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、
を含む、単離抗体。
【請求項３７】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離抗体であって、前記重鎖可変領域が、配列番号１７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体。
【請求項３８】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離抗体であって、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７１、７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１７１、７２、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体。
【請求項３９】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離抗体であって、前記重鎖可変領域が、配列番号１７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７１、７２、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号１７１、７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、および１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体。
【請求項４０】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、（ａ）配列番号１７０および配列番号１７１にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；（ｂ）配列番号７１および配列番号７２にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；（ｃ）配列番号７４および配列番号８６にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；（ｄ）配列番号１４８および配列番号１４９にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；または（ｅ）配列番号１２６および配列番号１２７にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、単離抗体。
【請求項４１】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、
（ａ）配列番号１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｃ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｅ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離抗体。
【請求項４２】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、（ａ）配列番号１５０および配列番号１５１にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；（ｂ）配列番号１２８および配列番号１２９にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；（ｃ）配列番号１０６および配列番号１０７にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して；または（ｄ）配列番号１０１および配列番号１０２にそれぞれ記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する重鎖配列および軽鎖配列を含む、単離抗体。
【請求項４３】
ヒトＴＮＦＲ２に結合し、
（ａ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ｄ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、単離抗体。
【請求項４４】
アゴニスト抗体である、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項４５】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、またはそのバリアントからなる群から選択される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項４６】
バリアントＦｃ領域を含む、請求項４５に記載の単離抗体。
【請求項４７】
前記バリアントＦｃ領域が、対応する非バリアントＦｃ領域を用いた場合に確認された結合性との比較において、Ｆｃγ受容体への結合性を増大させている、請求項４６に記載の単離抗体。
【請求項４８】
前記Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩＩｂ受容体である、請求項４７に記載の単離抗体。
【請求項４９】
前記バリアントＦｃ領域が、対応する野生型Ｆｃ領域との比較において、抗体クラスタリングを増大させている、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５０】
対応する野生型Ｆｃ領域を用いた抗体との比較で、アゴニスト活性の増加を示す、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５１】
Ｔ細胞を共刺激する、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５２】
前記バリアントＦｃ領域がバリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域である、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５３】
前記バリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域が、
（ａ）Ｓ２６７Ｅ、
（ｂ）Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、
（ｃ）Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、
（ｄ）Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、
（ｅ）Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、および
（ｆ）Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、
からなる群から選択される１または複数の置換を含む、請求項５２に記載の単離抗体。
【請求項５４】
ＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化する、請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５５】
Ｔ細胞の増殖を促進する、請求項３５〜５４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５６】
Ｔ細胞を共刺激する、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５７】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進する、請求項３５〜５６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５８】
制御性Ｔ細胞の存在量を減少させる、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５９】
長期間の抗がん作用を誘導する、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項６０】
抗がん性メモリーＴ細胞の発生を誘導する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項６１】
一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、またはドメイン抗体である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項６２】
ヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６３】
配列番号１０４に基づいた番号付けで、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、Ｑ２９位、Ｍ３０位、およびＫ４７位のうちの１または複数に結合する、単離抗体。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか一項に記載の抗体と同じ、ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する、単離抗体。
【請求項６５】
ヒトＴＮＦＲ２への結合において、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の抗体と競合する、単離抗体。
【請求項６６】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合領域と、第二の異なる抗原結合領域と、を含む二重特異性抗体。
【請求項６７】
薬剤に連結された、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の抗体を含む、免疫複合体。
【請求項６８】
請求項１〜６５に記載の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項６９】
請求項６８に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項７０】
請求項６９に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
【請求項７１】
請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体と、担体と、を含む組成物。
【請求項７２】
請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体と、取扱説明書と、を含むキット。
【請求項７３】
抗ＴＮＦＲ２抗体を作製する方法であって、請求項７０に記載の細胞において前記抗体を発現させ、前記細胞から前記抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、方法。
【請求項７４】
対象におけるＴ細胞増殖を増加させる方法であって、前記対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の有効量を投与することで、Ｔ細胞増殖の増加を達成することを含む、方法。
【請求項７５】
エフェクターＴ細胞を共刺激する方法であって、対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の有効量を投与することで、エフェクターＴ細胞の共刺激を達成することを含む、方法。
【請求項７６】
対象において制御性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させる方法であって、前記対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の有効量を投与することで、制御性Ｔ細胞の数の減少または枯渇を達成することを含む、方法。
【請求項７７】
がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項７８】
がんの治療のための医薬の製造のための請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の使用。
【請求項７９】
がんの治療で使用される、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体。
【請求項８０】
前記がんが非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、および大腸がんからなる群から選択される、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項８１】
１または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項８２】
前記１または複数の追加の治療薬が免疫調節薬、細胞傷害性薬物、標的治療薬、およびがんワクチンからなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する抗体の抗腫瘍活性を増強する方法であって、抗体のエフェクター機能を増強させるように抗体を改変することを含む、方法。
【請求項８４】
前記改変が非改変型の同一抗体と比較してエフェクター機能を増強させる１または複数のアミノ酸置換を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
抗腫瘍活性の増大が、ヒトＴＮＦＲ２のエピトープに抗体が結合することとは無関係である、請求項８３または請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体が、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用するその能力とは無関係に腫瘍成長を阻害する、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体が、ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦ−αの結合を阻害するその能力とは無関係に腫瘍成長を阻害する、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、方法。
【請求項８９】
がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用であって、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、使用。
【請求項９０】
エフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、がんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体。
【請求項９１】
がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、方法。
【請求項９２】
がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用であって、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、使用。
【請求項９３】
エフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、がんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体。
【請求項９４】
がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有する、方法。
【請求項９５】
がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用であって、前記抗体がエフェクター機能を有する、使用。
【請求項９６】
エフェクター機能を有する、がんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体。
【請求項９７】
前記がんが非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、および大腸がんからなる群から選択される、請求項７７〜９６のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項９８】
１または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項７７〜９７のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体。
【請求項９９】
抗ＴＮＦＲ２抗体が長期間の抗がん作用を誘導する、請求項７７〜９８のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体。
【請求項１００】
抗ＴＮＦＲ２抗体が抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導する、請求項７７〜９９のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体。
【請求項１０１】
自己免疫疾患を治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１０２】
自己免疫疾患の治療用の医薬の製造のための請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の使用。
【請求項１０３】
自己免疫疾患の治療で使用される、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体。
【請求項１０４】
前記自己免疫疾患が移植片対宿主病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、大腸炎、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、天疱瘡、表皮水疱症、および１型糖尿病からなる群から選択される、請求項１０１〜１０３のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１０５】
１または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１０６】
細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減する方法であって、前記対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の有効量を投与することで、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減することを含む、方法。
【請求項１０７】
細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減するための医薬の製造のための、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の使用。
【請求項１０８】
細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減する際に使用される、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体。
【請求項１０９】
前記移植片が同種移植片である、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１１０】
移植片拒絶反応が細胞同種移植片、組織同種移植片、または臓器同種移植片のレシピエントにおける反応である、請求項１０６〜１０９のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１１１】
１または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１０６〜１１０のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１１２】
細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片対宿主病を治療、予防、または低減する方法であって、前記対象に請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の有効量を投与することで、移植片対宿主病を治療、予防、または低減することを含む、方法。
【請求項１１３】
移植片対宿主病を治療、予防、または低減するための医薬の製造のための請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体の使用。
【請求項１１４】
移植片対宿主病を治療、予防、または低減する際に使用される、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体。
【請求項１１５】
１または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載の方法、使用、または抗体、二重特異性抗体、もしくは免疫複合体。
【請求項１１６】
試料中のＴＮＦＲ２の存在を検出する方法であって、抗体とＴＮＦＲ２との間での複合体の形成を可能にする条件下で、前記試料を請求項１〜６５のいずれか一項に記載の抗体と接触させ、前記複合体を検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３２，８４６号；２０１８年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／７６０，７７７号；および２０１９年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８１２，８５９号に基づく優先権および利益を主張するものである。上記出願の内容は参照により本明細書に援用されたものとする。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究で、疾患と闘う身体それ自体の能力を免疫応答の調節を通して増強することが、従来の治療プラットフォームの代替および／または補足として魅力的であることが示された。例えば、種々の疾患（例えば、がんまたは感染症）の標的化および治療のための、Ｔリンパ球に対する活性の増強が、治療上有益であることが、研究により示されている。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のＴリンパ球活性抑制能の阻害は、疾患に対する免疫応答を増大させるための１つの強力な機構である。
【０００３】
ＴＮＦＲＳＦ１ＢおよびＣＤ１２０ｂとしても知られている腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）は、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などのタンパク質を包含する、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激性メンバーである。ＴＮＦＲ２は、Ｔ細胞上に発現される細胞表面受容体であり、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞の活性化を増強し、制御性Ｔ細胞を介した抑制を減少させることが示されている。ＴＲＡＦ２／３およびＮＦ−κＢシグナル伝達の制御を通じて、ＴＮＦＲ２は、細胞の生存および増殖を促進する遺伝子の転写を媒介することができる。ＴＮＦＲ２は、がん細胞上、腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞上、およびエフェクターＴ細胞上に発現され得る。がんなどの疾患を標的とするための戦略の改善が今も求められていることを考慮すると、免疫応答、特にＴ細胞応答、の増強、制御性Ｔ細胞活性を調節する新規の薬剤および方法から得られる恩恵は非常に望ましいものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）上の特定のエピトープに特異的に結合し、且つ、治療上望ましい特性を有する、組換え型モノクローナル抗体（例えば、ヒト抗体）などの、単離抗体が提供される。これを受けて、本明細書に記載の抗体は、腫瘍成長の阻害、がんの治療、自己免疫疾患の治療、移植片対宿主病の治療、および移植片生着の促進、並びに／または移植片拒絶反応の低減などのために使用することができる。
【０００５】
１つの実施形態において、本明細書では、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、５５〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない（例えば、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の６０〜７７番内、６５〜７７番内、７０〜７７番内、７５〜７７番内、５５〜７５番内、５５〜７０番内、５５〜６５番内、または５５〜６０番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない）、抗体（例えば、単離モノクローナル抗体）が提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番内、１２０〜１４３番内、および／または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない。
【０００６】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の４８番アミノ酸残基または６８番アミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少（例えば、少なくとも５０％の結合性減少、少なくとも６０％の結合性減少、少なくとも７０％の結合性減少、少なくとも８０％の結合性減少、または少なくとも９０％の結合性減少）を示す、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、３７、３９、４２、４９、５１、５６、６５、６６、６９、８６、８９、および９１番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少を示さない（例えば、２０％以下の結合性減少または１０％以下の結合性減少しか示さない）。他の実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の９７〜１１８番、１２０〜１４３番、および／または１６１〜２００番アミノ酸残基と結合しない。他の実施形態において、変異型ＴＮＦＲ２に対する抗体の結合性減少は、酵母表面ディスプレイにより評価される。
【０００７】
別の実施形態において、ＴＮＦＲ２キメラ３（配列番号１１または１２）に結合し、ＴＮＦＲ２キメラ０（配列番号５または６）と結合しない、単離抗体が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０と結合しない。
【０００８】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない（例えば、２３〜４４、２３〜３６、２３〜３０、２３〜２５、２５〜４４、３０〜４４、３５〜４４、または４０〜４４番内の１または複数のアミノ酸と結合しない）、単離抗体が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の９７〜１１８番、１２０〜１４３番、および／または１６１〜２００番アミノ酸残基と結合しない。
【０００９】
別の実施形態において、野生型ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）と比較した場合に、（ｉ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の３７、４４、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、７２、７４、７６、７８、および８７番残基、または（ｉｉ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５および７２番残基、からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少（例えば、少なくとも５０％の結合性減少、少なくとも６０％の結合性減少、少なくとも７０％の結合性減少、少なくとも８０％の結合性減少、または少なくとも９０％の結合性減少）を示す、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、３９、４１、８０、１１２、および１１３番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少を示さない（例えば、２０％以下の結合性減少または１０％以下の結合性減少しか示さない）。他の実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の９７〜１１８番、１２０〜１４３番、および／または１６１〜２００番アミノ酸残基と結合しない。他の実施形態において、変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する上記抗体の結合性は、酵母表面ディスプレイにより評価された場合に、少なくとも約５０％低減されている。他の実施形態において、変異型ＴＮＦＲ２に対する抗体の結合性減少は、酵母表面ディスプレイにより評価される。
【００１０】
別の実施形態において、ＴＮＦＲ２キメラ７（配列番号１９または２０）と結合し（例えば、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ７と結合し）、ＴＮＦＲ２キメラ４（配列番号１３または１４）と結合しない（例えば、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ４と結合しない）、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１１】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１２】
別の実施形態において、ＴＮＦＲ２キメラ１（配列番号７または８）と結合し、ＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）と結合しない（例えば、１×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）と結合しない）、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１３】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１４】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（例えば、本明細書に記載のものなど）に結合する単離抗体であって、エフェクター機能を増強するアミノ酸置換を導入することなどによって、非改変型の同一抗体との比較でエフェクター機能を増強させるように改変された、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、非改変型の同一抗体との比較で抗腫瘍活性が増加されている。他の実施形態において、上記抗体は、以下のうちの１つを示す：（ａ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない；（ｂ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を少なくとも約５０％阻害する、（ｃ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７番内または１１９〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、あるいは、（ｄ）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８以内の１または複数のアミノ酸残基とは結合せず、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を阻害しない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体はＴＮＦＲ２活性に対しアゴニストとして作用する。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対しアゴニストとして作用するその能力とは無関係に、且つ／または、ＴＮＦＲ２に対するＴＮＦ−αの結合を阻害するその能力とは無関係に、腫瘍成長を阻害する。
【００１６】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２と結合し、（ａ）配列番号７１および配列番号７２にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号７４および配列番号８６にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１７０および配列番号１７１にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号１４８および配列番号１４９にそれぞれ記載のアミノ酸配列、または（ｅ）配列番号１２６および配列番号１２７にそれぞれ記載のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１７】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、以下を含む、単離抗体が本明細書で提供される：（ａ）配列番号４７、４８、および４９をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５０、５１、および５２をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｂ）配列番号５３、５４、および５５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５６、５７、および５８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｃ）配列番号５９、６０、および６１をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６２、６３、および６４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｄ）配列番号６５、６６、および６７をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６８、６９、および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｅ）配列番号１５２、１５３、および１５４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１５５、１５６、および１５７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｆ）配列番号１５８、１５９、および１６０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６１、１６２、および１６３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｇ）配列番号１６４、１６５、および１６６をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６７、１６８、および１６９をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、（ｈ）配列番号１３０、１３１、および１３２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１３３、１３４、および１３５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、または、（ｉ）配列番号１０８、１０９、および１１０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１１１、１１２、および１１３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体である。
【００１８】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離抗体であって、前記重鎖可変領域が、配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、且つ／あるいは、前記軽鎖可変領域が、配列番号７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、１４９、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいは、配列番号７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、１４９、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００１９】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、それぞれ配列番号７１および７２に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。
【００２０】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、それぞれ配列番号７４および８６に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。
【００２１】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、それぞれ配列番号１７０および１７１に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。
【００２２】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、それぞれ配列番号１４８および１４９に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。
【００２３】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、それぞれ配列番号１２６および１２７に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。
【００２４】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、それぞれ配列番号１０１および１０２に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００２５】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、それぞれ配列番号１５０および１５１に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００２６】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、それぞれ配列番号１２８および１２９に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００２７】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、それぞれ配列番号１０６および１０７に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む、単離抗体が本明細書で提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、アゴニスト抗体である。例えば、上記抗体は、ＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化し、Ｔ細胞増殖（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）を促進し、且つ／あるいは、Ｔ細胞を共刺激する。他の実施形態において、上記抗体は、制御性Ｔ細胞の存在量（例えば、Ｔ細胞区画の制御性Ｔ細胞の存在量）を減少させる。他の実施形態において、上記抗体は、抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導することなどにより、長期間の抗がん作用を誘導する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアントである。他の実施形態において、上記抗体はバリアントＦｃ領域を含む。他の実施形態において、上記バリアントＦｃ領域は、対応する非バリアントＦｃ領域を用いた場合に確認される結合性と比較して、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ受容体）への結合性を増加させる。他の実施形態において、上記バリアントＦｃ領域は、対応する非バリアントＦｃ領域と比較して、抗体クラスタリングを増大させる。他の実施形態において、上記抗体はＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を共刺激する。他の実施形態において、上記バリアントＦｃ領域はバリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。他の実施形態において、上記バリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、以下からなる群から選択される１または複数の置換を含む：（ａ）Ｓ２６７Ｅ、（ｂ）Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、（ｃ）Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、（ｄ）Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、（ｅ）Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ、および（ｆ）Ｅ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＴＮＦＲ２上の不連続エピトープと結合する。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体である。他の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、可変領域または重鎖および軽鎖）を含む、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または免疫複合体である。他の実施形態において、上記抗体は、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、またはドメイン抗体からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の以下の位置（配列番号（ＳＥＱ  ＮＯ）１０４に基づいた番号付け）のうちの１または複数に結合する：Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と同じ、ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する抗体が、本明細書で提供される。他の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２への結合において本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と競合する抗体が、本明細書で提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＡＢＶ３、ＡＢＶ４、ＡＢＶ７、ＡＢＶ１２、ＡＢＶ１３、ＡＢＶ１４、ＡＢＶ１５、ＡＢＶ１８、および／またはＡＢＶ１９と名付けられたハイブリドーマにより産生される抗体である。いくつかの実施形態において、上記ハイブリドーマ抗体は、ヒト型化されたものである。他の実施形態において、上記抗体は、ＡＢＶ３、ＡＢＶ４、ＡＢＶ７、ＡＢＶ１２、ＡＢＶ１３、ＡＢＶ１４、ＡＢＶ１５、ＡＢＶ１８、またはＡＢＶ１９と名付けられたハイブリドーマにより産生される抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。
【００３４】
別の態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸が、本明細書で提供される。また、上記核酸を含む発現ベクターおよび上記発現ベクターで形質転換された細胞（例えば、宿主細胞）が提供される。
【００３５】
別の態様において、本明細書に記載の抗体、および担体（例えば、薬剤的に許容できる担体）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が、本明細書で提供される。また、本明細書に記載の抗体、および取扱説明書を含むキットが提供される。
【００３６】
別の態様において、対象において、Ｔ細胞増殖を増大させる、エフェクターＴ細胞を共刺激する、且つ／あるいは、制御性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させる方法であって、前記対象に本明細書に記載の抗体の有効量を投与することで、Ｔ細胞増殖の増大、エフェクターＴ細胞の共刺激、および／または制御性Ｔ細胞の数の減少もしくは枯渇を達成することを含む、方法が、本明細書で提供される。
【００３７】
別の態様において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、または、がんを患う対象の治療で使用される本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体、が提供される。
【００３８】
別の態様において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がんの治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、またはがんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体であって、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、上記の使用または抗体が提供される。
【００３９】
別の態様において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、またはがんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体であって、前記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、上記の使用または抗体が提供される。
【００４０】
別の態様において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、前記抗体がエフェクター機能を有する、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がんを患う対象の治療のための医薬の製造のための抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、またはがんを患う対象の治療で使用される抗ＴＮＦＲ２抗体であって、前記抗体がエフェクター機能を有する、上記の使用または抗体が提供される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、治療対象となるがんは、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、または大腸がんである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記のがんを治療する方法では、１または複数の追加の治療薬（例えば、免疫調節薬、細胞傷害性薬物、標的治療薬、がんワクチン）が投与される。他の実施形態において、本明細書に記載の方法、使用、または抗体は、長期間の抗がん作用を誘導する。他の実施形態において、本明細書に記載の方法、使用、または抗体は、抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導する。
【００４３】
別の態様において、自己免疫性の疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、自己免疫性の疾患または障害を患う対象の治療のための医薬の製造のための本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、または、自己免疫性の疾患または障害を患う対象の治療で使用される本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体、が提供される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、治療対象となる自己免疫性の疾患または障害は、移植片対宿主病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、大腸炎、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、天疱瘡、表皮水疱症、または１型糖尿病である。他の実施形態において、自己免疫性の疾患または障害を治療する方法では、１または複数の追加の治療薬が投与される。
【００４５】
別の態様において、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減する方法であって、前記対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量（例えば、治療有効量）を投与することで、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、もしくはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進する、もしくは移植片拒絶反応を低減するための医薬の製造のための本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、または、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、もしくはそれを受けることとなる対象において移植片生着を促進する、もしくは移植片拒絶反応を低減する際に使用される本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体、が提供される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、上記移植片は、同種移植片（例えば、細胞同種移植片、組織同種移植片、または臓器同種移植片）である。他の実施形態において、上記移植片拒絶反応は、細胞同種移植片、組織同種移植片、または臓器同種移植片を投与されたことがある、またはそれを投与されることとなるレシピエントにおける移植片拒絶反応である。他の実施形態において、移植片生着を促進する、または移植片拒絶反応を低減する方法では、１または複数の追加の治療薬が投与される。
【００４７】
別の態様において、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において移植片対宿主病を治療、予防、または低減する方法であって、前記対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量（例えば、治療有効量）を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、もしくはそれを受けることとなる対象において移植片対宿主病を治療、予防、もしくは低減するための医薬の製造のための本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の使用、または、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、もしくはそれを受けることとなる対象において移植片対宿主病を治療、予防、もしくは低減する際に使用される本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体、が提供される。他の実施形態において、移植片対宿主病を治療、予防、または低減する方法では、１または複数の追加の治療薬が投与される。
【００４８】
また、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）を検出する方法であって、抗体とＴＮＦＲ２タンパク質との間での複合体の形成を可能にする条件下で試料（例えば、生物試料）を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させ、複合体の形成を検出することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、試料（例えば、生物試料）中のＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）を検出するための本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の使用であって、上記抗体とＴＮＦＲ２タンパク質との間での複合体の形成を可能にする条件下で上記試料を上記抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させ、複合体の形成を検出することを含む、使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ヒトＴＮＦＲ２アミノ酸配列およびマウスＴＮＦＲ２アミノ酸配列の配列比較である。
【図２】図２Ａは、表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の、ＴＮＦＲ２を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する、細胞結合性（ｏｎ−ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を示すグラフである。図２Ｂは、表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の野生型ＣＨＯ細胞に対する結合性を示すグラフである。
【図３】図３は、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイを用いた、ＨｉｓタグマウスＴＮＦＲ２に対する表示の抗体の結合親和性（一価ＫＤ（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＫＤ））を示すグラフである。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡで評価された場合の、表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦの結合を遮断する能力を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、エピトープマッピングに使用された、マウスＴＮＦＲ２およびヒトＴＮＦＲ２の各キメラ受容体の構造を模式的にまとめたものである。図５Ｂは、表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の各キメラへの結合性を模式的に示している（濃い網掛け：結合あり；網掛けなし：結合なし）。
【図６】図６は、マウスＴＮＦ（リボンモデル）に結合したマウスＴＮＦＲ２（空間充填モデル）の相同性モデルである。変異によりＭ３結合が有意に破壊されたアミノ酸位置がマッピングされている（−、黒色；＋、濃い灰色）。
【図７−１】図７Ａは、ＣＴ２６マウスモデルにおける腫瘍成長に対する表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果を示すグラフである。図７Ｂは、無作為割り付け後１８日目の腫瘍サイズを表すヒストグラムを示している。
【図７−２】図７Ｃは、腫瘍サイズに基づいたヒトエンドポイント（ｈｕｍａｎ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）を達成するまでの時間により求められた、動物の生存率を示す生存曲線である。図７Ｄは、治癒歴があるマウスをＣＴ２６腫瘍細胞に再暴露した場合の、生存率を示す生存曲線である。
【図８−１】図８Ａは、エフェクター機能に影響する変異を与えた場合または与えない場合の、ＣＴ２６マウスモデルにおける腫瘍成長に対する１ｍｇまたは０．３ｍｇのＭ３６の効果を示すグラフである。
【図８−２】図８Ｂは、無作為割り付け後１８日目の腫瘍サイズを表すヒストグラムを示している。図８Ｃは、エフェクター機能に影響する変異を与えた場合または与えない場合の、ＣＴ２６マウスモデルにおける腫瘍成長に対する０．３ｍｇのＭ３の効果を示すグラフである。
【図８−３】図８Ｄは、無作為割り付け後１８日目の腫瘍サイズを表すヒストグラムを示している。ＣＴ２６細胞（５×１０５個）を６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（７匹マウス／群）に皮下接種した。
【図８−４】図８Ｅ〜８Ｊは、エフェクター機能に影響する変異を与えた場合または与えない場合の、ＣＴ２６（図８Ｅ−８Ｇ）マウスモデルまたはＷｅｈｉ１６４（図８Ｈ−８Ｊ）マウスモデルにおける腫瘍成長に対する、３×０．３ｍｇのＹ９の効果を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、ＣＴ２６マウスモデルにおける腫瘍成長に対する表示の抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果を示すグラフである。図９Ｂは、無作為割り付け後１８日目の腫瘍サイズを表すヒストグラムを示している。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｉは、ＥＭＴ６マウスモデルにおける腫瘍成長に対する１ｍｇ（図１０Ａ〜１０Ｆ）または０．３ｍｇ（図１０Ｇ〜１０Ｉ）の表示の抗体の効果を示すグラフである。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、  ＰＤ−１抑制耐性（ＭＢＴ−２）腫瘍モデルおよびＰＤ−１抑制感受性（Ｓａ１／Ｎ）腫瘍モデルに対する抗体Ｙ９および抗ＰＤ−１抗体の抗腫瘍反応を示すグラフである。
【図１２】図１２は、種々の同系モデル（ＷＥＨＩ１６４、Ｓａ１／Ｎ、ＭＢＴ２、ＣＴ２６、およびＥＭＴ６）における抗体Ｙ９単独、抗ＰＤ−１抗体単独、およびＹ９および抗ＰＤ−１抗体の組み合わせの抗腫瘍活性に関する一連のグラフである。
【図１３】図１３は、健常マウスの体重に対する抗体Ｙ９および抗ＣＴＬＡ４抗体の効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、健常マウスの脾臓重量に対する抗体Ｙ９および抗ＣＴＬＡ４抗体の効果を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、健常マウスにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ値（ＡＬＴ；図１５Ａ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ値（ＡＳＴ；図１５Ｂ）に対する抗体Ｙ９および抗ＣＴＬＡ４抗体の効果を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、皮膚−流入領域リンパ節から単離された末梢血リンパ球および樹状細胞の免疫細胞表現型に対する抗体Ｙ９および抗ＣＴＬＡ４抗体の効果である。図１６Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する表示の治療の効果を示すグラフである。図１６Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する表示の治療の効果を示すグラフである。図１６Ｃは、フローサイトメトリーにおけるゲーティングの方針を説明している一連のドットプロットである。図１６Ｄは、樹状細胞によるＴ細胞の活性化において重要な共刺激分子であるＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現に対する表示の治療の効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける、野生型マウス、ＦｃＧＲ２Ｂノックアウトマウス、およびＦｃ共通γノックアウトマウスにおける抗体Ｙ９の抗腫瘍活性に関する一連のグラフである。
【図１８】図１８は、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける、抗体アイソタイプおよびバリアントＦｃ領域が異なる抗体Ｙ９の抗腫瘍活性に関する一連のグラフ。
【図１９】図１９は、増殖、ＣＤ２５＋細胞の割合、ＧｒｎＢ＋細胞の割合、およびＰＤ−１＋細胞の割合を含む、ＣＤ８＋Ｔ細胞の種々の側面に対する、抗体Ｙ９の効果を示す一連のグラフである。
【図２０】図２０は、マウスＴＮＦ（リボンモデル）に結合したマウスＴＮＦＲ２（空間充填モデル）の相同性モデル。変異によりＹ９結合が有意に破壊されたアミノ酸位置がマッピングされている（−、黒色）。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＣＴ２６大腸がん細胞による同系腫瘍モデルにおける、ＰＢＳ  抗ＴＮＦＲ２抗体（１ｍｇ、０．３ｍｇ、および０．１ｍｇ）の単回投与の抗腫瘍反応を示す一連のグラフである。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＥＭＴ６乳がん細胞による同系腫瘍モデルにおける、ＰＢＳまたは抗ＴＮＦＲ２抗体（１ｍｇ、０．３ｍｇ、および０．１ｍｇ）の単回投与の抗腫瘍反応を示す一連のグラフである。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｄは、  Ｗｅｈｉ６４線維肉腫細胞による同系腫瘍モデルにおける、ＰＢＳまたは抗ＴＮＦＲ２抗体（１ｍｇ、０．３ｍｇ、および０．１ｍｇ）の単回投与の抗腫瘍反応を示す一連のグラフである。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｄは、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫細胞による同系腫瘍モデルにおける、ＰＢＳまたは抗ＴＮＦＲ２抗体（１ｍｇ、０．３ｍｇ、および０．１ｍｇ）の単回投与の抗腫瘍反応を示す一連のグラフである。
【図２５】図２５は、未処置同齢対照と比較した場合の、Ｗｅｈｉ６４線維肉腫細胞による同系腫瘍モデルにおける、抗ＴＮＦＲ２抗体（１ｍｇ、０．３ｍｇ、および０．１ｍｇ）の単回投与の持続的腫瘍反応を示すグラフである。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、ＥＭＴ−６同系モデルの腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節における、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＴＬＡ４の発現に対する、抗体Ｙ９およびＹ９  ＤＡＮＡの効果を示すグラフである。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｃは、ＥＭＴ−６同系モデルの腫瘍における、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＧＩＴＲの発現（図２７Ａ）、ＧＡＲＰの発現（図２７Ｂ）、およびＰＤ−１の発現（図２７Ｃ）に対する、抗体Ｙ９およびＹ９  ＤＡＮＡの効果を示すグラフである。
【図２７−２】同上。
【図２８−１】図２８〜２８Ｄは、ＣＴ２６同系モデルの腫瘍、ＭＣ３８同系モデルの腫瘍、およびＷＥＨＩ−１６４同系モデルの腫瘍における、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞（図２８Ａ）、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（図２８Ｂ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図２８Ｃ）における、ＴＮＦＲ２の発現に対する、抗体Ｙ９およびＹ９  ＤＡＮＡの効果を示すグラフである。
【図２８−２】同上。
【図２９】図２９は、ＥＬＩＳＡで測定された、キメラ０（斜線）、キメラ３（白色）、マウスＴＮＦＲ２（縞模様）、およびヒトＴＮＦＲ２（黒色）に対する、ハイブリドーマ抗体（ＡＢＶ３、ＡＢＶ４、ＡＢＶ７、ＡＢＶ１２、ＡＢＶ１３、ＡＢＶ１４、ＡＢＶ１５、ＡＢＶ１８、およびＡＢＶ１９）の結合性を示すグラフである。
【図３０−１】図３０Ａ〜３０Ｄは、ヒト型化ＡＢＶ２抗体の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の配列比較である。
【図３０−２】同上。
【図３０−３】同上。
【図３０−４】同上。
【図３１】図３１は、ＮＦ−κＢレポーター活性に対するＡＢＶ２キメラ（ＡＢＶ２ｃ）抗体の用量依存効果を示すグラフである。
【図３２】図３２Ａは、卵巣がん腹水の培養物中のＣＤ４＋細胞中の制御性Ｔ細胞の割合に対するＡＢＶ２ｃの効果を示すグラフである。図３２Ｂは、図３２Ａのフローサイトメトリー解析におけるゲーティング方針である。
【図３３】図３３Ａは、カルボキシフルオセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ＪＪＮ３（形質細胞性骨髄腫）標的細胞と一緒に培養された、健常ドナーから単離されたＮＫ細胞を用いた、ヒト細胞のＡＤＣＣ活性に対するＡＢＶ２ｃの効果を示すグラフ。標的細胞が死滅するにつれて、１細胞当たりのＣＦＳＥ蛍光は減少し、これはフローサイトメトリーで検出することができる。図３３Ｂは、図３３Ａのフローサイトメトリー解析におけるゲーティング方針である。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、インビトロにおける、キメラ抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃによる、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する、増殖、活性化マーカーの誘導、およびサイトカインの誘導である。ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞またはナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５μｇ／ｍＬのプレート結合型ＣＤ３、１μｇ／ｍＬの可溶性ＣＤ２８、および各種濃度のプレート結合型のアイソタイプ対照、抗ＴＮＦＲ２  ｍＡｂ（ＡＢＶ２ｃ）、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ（ウレルマブ）、または抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ（ＴＲＸ５１８）で、４日間刺激した。図３４Ａおよび図３４Ｂは、３個体からのデータを示しており、抗ＴＮＦＲＳＦ抗体の非存在下で刺激された試料に対して正規化されたものである。アスタリスクはアイソタイプとＡＢＶ２ｃとの間の統計的有意性を示している。
【図３５】図３５は、異種間ＧｖＨＤモデルにおける生存率に対するキメラ抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃの効果である。
【図３６】図３６Ａは、フローサイトメトリーで評価された、キメラ抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃの結合に対する、ヒトＴＮＦＲ２のＣＲＤ１領域内の各種変異の影響を示すグラフ。ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性がフローサイトメトリーで評価された。結合曲線は４パラメータの用量反応を用いて当てはめを行った。図３６Ｂは、ＡＢＶ２ｃにおいてヒトＴＮＦＲ２に対する抗体結合性が得られなかった変異（Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７；リーダー配列を含まないヒトＴＮＦＲ２に基づいた番号付け）が黒色でハイライトされている構造モデル（ヒトＴＮＦＲ２は白色、ＴＮＦは灰色）。
【図３７−１】図３７Ａは、フローサイトメトリーで評価された、マウス抗ＴＮＦＲ２抗体Ｙ９の結合に対する、マウスＴＮＦＲ２のＣＲＤ１領域内の各種変異の影響を示すグラフである。マウスＴＮＦＲ２に対する結合性がフローサイトメトリーで評価された。結合曲線は４パラメータの用量反応を用いて当てはめを行った。図３７Ｂおよび図３７Ｃは、フローサイトメトリーで評価された、マウス抗ＴＮＦＲ２抗体Ｙ９の結合に対する、マウスＴＮＦＲ２のＣＲＤ１領域内の追加の変異（Ｙ２５Ｔ、Ｋ２８Ｅ、およびＭ３１Ａ）の影響を示すグラフである。結合曲線は４パラメータの用量反応を用いて当てはめを行った。図３７Ｄは、Ｒ２７およびＮ４７が黒色にハイライトされている（ヒトＴＮＦＲ２は白色、ＴＮＦは灰色）相同性モデルである。図３７Ｅは、マウスＴＮＦＲ２に対するＹ９抗体結合性の減少をもたらした５つ全ての変異（Ｙ２５、Ｒ２７、Ｋ２８、Ｍ３１、およびＮ４７）が黒色にハイライトされている（ヒトＴＮＦＲ２は白色、ＴＮＦは灰色）相同性モデルである。
【図３７−２】同上。
【図３７−３】同上。
【図３８】図３８は、ヒト型化マウスの患者由来異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）モデルにおけるキメラ抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃの抗腫瘍活性を示すグラフ。腫瘍成長動態が平均値および平均値の標準誤差（Ｎ＝９動物／アーム）と共に示されている。７２日目の試験終了時に、ＡＮＯＶＡおよびテューキーのＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）法を用いて統計的有意性を評価し、多重比較補正を行った。
【図３９−１】図３９Ａ〜３９は、フローサイトメトリーによって評価された、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（図３９Ａ）、生細胞総数に反映されるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（図３９Ｂ）、およびＰＤ−１陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（図３９Ｃ）に対する、抗体ＡＢＶ２ｃ、ＡＢＶ２．１３、およびＡＢＶ２．７の効果を示すグラフである。データは、１ドナーから得られたものであり、２個体のドナーを代表するものが示されている。
【図３９−２】同上。
【図４０】図４０Ａおよび４０Ｂは、フローサイトメトリーで評価された、細胞内ＩＦＮ−γについて陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（図４０Ａ）および細胞内ＩＬ−２について陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（図４０Ｂ）に対する抗体ＡＢＶ２ｃ、ＡＢＶ２．１３、およびＡＢＶ２．７の効果を示すグラフ。データは、１ドナーから得られたものであり、２個体のドナーを代表するものである。
【図４１−１】図４１Ａ〜４１Gは、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームで評価された、刺激を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されたＴｈ−１関連サイトカイン（図４１Ａ：ＩＬ−２、図４１Ｂ：ＩＦＮ−γ、図４１Ｃ：ＴＮＦ、図４１Ｄ：ＧＭ−ＣＳＦ）およびＴｈ２関連サイトカイン（図４１Ｅ：ＩＬ−４、図４１Ｆ：ＩＬ−５、図４１Ｇ：ＩＬ−１３）の量に対する、抗体ＡＢＶ２ｃ、ＡＢＶ２．１３、およびＡＢＶ２．７の効果を示すグラフ。データは、１ドナーから得られたものであり、２個体のドナーを代表するものである。
【図４１−２】同上。
【図４１−３】同上。
【図４１−４】同上。
【図４２】ヒトＴＮＦＲ２レポーター細胞株におけるＮＦ−κＢレポーター活性に対する抗体ＡＢＶ２ｃ、ＡＢＶ２．１３、ＡＢＶ２．１５、およびＡＢＶ２．７の効果を示すグラフである。
【図４３−１】図４３Ａ〜４３Ｅは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖(ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ)（図４３Ａおよび図４３Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ)（図４３Ｃ）、ＰＤ−１陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（図４３Ｄ）、およびＮＦ−κＢ活性（図４３Ｅ）に対する、抗体ＡＢＶ２．１、ＡＢＶ２．１５、および比較対象としての従来抗体Ａ〜Ｃの効果を示すグラフである。
【図４３−２】同上。
【図４３−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
Ｉ．概要
ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）上の特定のエピトープに特異的に結合する、単離抗体、特に組換え型モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体が、本明細書で提供される。また、上記抗体、免疫複合体、および多特異性分子を作製する方法、並びに、上記抗体を含む医薬組成物を作製する方法、並びに、上記抗体を用いて腫瘍成長を阻害する方法、上記抗体を用いてがんを治療する方法、上記抗体を用いて自己免疫疾患を治療する方法、上記抗体を用いて移植片対宿主病を治療する方法、および、上記抗体を用いて移植片生着を促進する、且つ／あるいは移植片拒絶反応を低減する方法が、本明細書で提供される。
【００５１】
ＩＩ．定義
本明細書の理解をより容易にするために、まず特定用語の定義を行う。追加の定義の記載は、発明を実施するための形態の全体を通じて行われる。
【００５２】
「腫瘍壊死因子受容体２」、「ＴＮＦＲ２」、「ＣＤ１２０ｂ」、「ｐ７５」、「ｐ７５ＴＮＦＲ」、「ｐ８０  ＴＮＦ−α受容体」、「ＴＢＰＩＩ」、「ＴＮＦＢＲ」、「ＴＮＦＲ１Ｂ」、「ＴＮＦ−Ｒ７５」、および「ＴＮＦＲ８０」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、全てのファミリーメンバー、変異型、対立遺伝子、断片、およびタンパク質種を含み、下記のアミノ酸配列（ヒトおよびマウス）を有するタンパク質を指す。ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインは４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ１〜ＣＲＤ４）を含み、これらの配列は表１にまとめられている。表１の各ＣＲＤ領域の番号付けは、リーダー配列を含むヒトＴＮＦＲ２およびマウスＴＮＦＲ２（すなわち、配列番号１および３）に基づくものである。マウスＴＮＦＲ２アミノ酸配列およびヒトＴＮＦＲ２アミノ酸配列の配列比較を図１に示す。
【００５３】
ヒトＴＮＦＲ２（ＮＰ＿００１０５７）（リーダー配列は下線部）：
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＦＡＬＰＶＧＬＩＶＧＶＴＡＬＧＬＬＩＩＧＶＶＮＣＶＩＭＴＱＶＫＫＫＰＬＣＬＱＲＥＡＫＶＰＨＬＰＡＤＫＡＲＧＴＱＧＰＥＱＱＨＬＬＩＴＡＰＳＳＳＳＳＳＬＥＳＳＡＳＡＬＤＲＲＡＰＴＲＮＱＰＱＡＰＧＶＥＡＳＧＡＧＥＡＲＡＳＴＧＳＳＤＳＳＰＧＧＨＧＴＱＶＮＶＴＣＩＶＮＶＣＳＳＳＤＨＳＳＱＣＳＳＱＡＳＳＴＭＧＤＴＤＳＳＰＳＥＳＰＫＤＥＱＶＰＦＳＫＥＥＣＡＦＲＳＱＬＥＴＰＥＴＬＬＧＳＴＥＥＫＰＬＰＬＧＶＰＤＡＧＭＫＰＳ（配列番号１）
【００５４】
マウスＴＮＦＲ２（ＮＰ＿０３５７４０）（リーダー配列は下線部）：
ＭＡＰＡＡＬＷＶＡＬＶＦＥＬＱＬＷＡＴＧＨＴＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＩＳＬＰＩＧＬＩＶＧＶＴＳＬＧＬＬＭＬＧＬＶＮＣＩＩＬＶＱＲＫＫＫＰＳＣＬＱＲＤＡＫＶＰＨＶＰＤＥＫＳＱＤＡＶＧＬＥＱＱＨＬＬＴＴＡＰＳＳＳＳＳＳＬＥＳＳＡＳＡＧＤＲＲＡＰＰＧＧＨＰＱＡＲＶＭＡＥＡＱＧＦＱＥＡＲＡＳＳＲＩＳＤＳＳＨＧＳＨＧＴＨＶＮＶＴＣＩＶＮＶＣＳＳＳＤＨＳＳＱＣＳＳＱＡＳＡＴＶＧＤＰＤＡＫＰＳＡＳＰＫＤＥＱＶＰＦＳＱＥＥＣＰＳＱＳＰＣＥＴＴＥＴＬＱＳＨＥＫＰＬＰＬＧＶＰＤＭＧＭＫＰＳＱＡＧＷＦＤＱＩＡＶＫＶＡ（配列番号３）
【００５５】
【表１】
2022502076.tif 000002
【００５６】
ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲ１と共に、ＴＮＦαの活性を媒介する。ＴＮＦＲｌは５５ｋＤの膜結合型タンパク質であり、一方ＴＮＦＲ２は７５ｋＤの膜結合型タンパク質である。ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦαのＴＮＦＲ１への結合を制御することが可能であることから、ＮＦ−κＢの作用を惹起するのに必要なＴＮＦαのレベルを制御している可能性がある。ＴＮＦＲ２はまた、メタロプロテアーゼによる切断を受け（または選択的スプライシングを受け）、ＴＮＦαに対する親和性を維持している可溶性受容体を生じることが可能である。
【００５７】
「ＴＮＦＲ２キメラ」とは、本明細書で使用される場合、細胞外ドメイン内のある特定の領域が対応するマウスＴＮＦＲ２配列と置き換えられたヒトＴＮＦＲ２タンパク質を指す。例示的なＴＮＦＲ２キメラの模式図を図５Ａに示し、置き換えられたドメインに関する詳細を表２に示す。
【００５８】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で同義的に使用されている場合、抗体全体と、任意のその抗原結合性断片（抗原結合性部分）または一本鎖コグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）と、を包含する。「抗体」は、１つの重（Ｈ）鎖および１つの軽（Ｌ）鎖を少なくとも含む。例えば、天然起源のＩｇＧにおいては、これらの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって相互接続されており、２つの重鎖・軽鎖対が存在し、これら２つもジスルフィド結合によって相互接続されている。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略）および重鎖定常領域から構成される。この重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という３つのドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略）および軽鎖定常領域から構成される。この軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインから構成される。これらＶＨおよびＶＬの各領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域と、それらの間に散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）または連結（Ｊ）領域（重鎖および軽鎖それぞれでＪＨまたはＪＬ）と称されるより保存性が高い領域と、にさらに細分できる。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順番で並んだ、３つのＣＤＲと、３つのＦＲおよびＪドメインと、から構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、Ｊ。重鎖および軽鎖の各可変領域は抗原と結合する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織への結合を媒介する場合もあれば、種々の免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）を包含する宿主因子への結合を媒介する場合もあれば、あるいは古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）などの液性因子への結合を媒介する場合もある。完全長抗体の断片は抗体の抗原結合性機能を果たすことが可能であることが示されている。抗体の抗原結合性部分または断片と表される結合性断片の例としては、以下が挙げられる：（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームである、ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、頁５４４〜５４６）；（ｖｉｉ）ＶＨドメインもしくはＶＬドメインからなるｄＡｂ；並びに、（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｉｘ）所望により合成リンカーで連結されていてもよい２以上の単離ＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子にコードされているが、組換え法を用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価の分子を形成している単一タンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーにより、連結できる（このような免疫グロブリン断片の一本鎖コグネイトは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。このような一本鎖抗体も、用語「抗体」に包含されることが意図される。当業者に公知の従来技術を用いて抗体断片が得られ、これらの断片は、インタクトな抗体がスクリーニングされるのと概して同様に、有効性についてスクリーニングされる。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術によって作製することもできるし、あるいは、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的な切断によって作製することもできる。特に記載がない限り、本明細書に記載の抗体におけるアミノ酸位置（例えば、Ｆｃ領域内のアミノ酸残基）の番号付け、および関心領域（例えば、ＣＤＲ）の同定は、カバット方式（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２）を用いている。
【００５９】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一の抗体の集団（すなわち、当該集団を構成している個々の抗体が、少量存在していてもよい起こり得る天然起源の変異を除いて同一である）から得られた抗体を指す。このような免疫グロブリンの抗原結合性断片（ｓｃＦｖを含む）も、本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」に包含される。モノクローナル抗体は高い特異性を有し、単一の抗原性部位を対象とする。さらに、様々な決定基（エピトープ）を対象とする様々な抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基を対象とする。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、トランスジェニック動物、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）などの、当該分野で認知されている任意の技術および本明細書に記載の技術を用いて作製することもできるし、あるいは、例えば、米国特許第７，３８８，０８８号および米国特許出願第０９／８５６，９０７号（ＰＣＴ国際公開第００／３１２４６号）に記載の技術を用いたファージ抗体ライブラリーを用いて作製することもできる。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト型化抗体を包含し、天然に生じたものでも、組み換えによって作製されたものでもよい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子にコードされる、抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体）をいう。
【００６１】
用語「組換え抗体」とは、組み換え手段によって作製、発現、生成、または単離された抗体を指し、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）に関してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはそれから作製されたハイブリドーマ、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから、単離された抗体、（ｃ）ファージディスプレイを用いて組み換え型のコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離された抗体、並びに、（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のスプライシングにより他のＤＮＡ配列にすることを含む任意の他の手段で作製、発現、生成、または単離された抗体などである。このような組み換え抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有していてもよい。しかし、ある実施形態では、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発を受け得るため、当該組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来および関連していながら、生体内のヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しない場合がある配列である。
【００６２】
「キメラ免疫グロブリン」または「キメラ抗体」という用語は、第一の種に由来する可変領域および第二の種に由来する定常領域を有する免疫グロブリンまたは抗体を指す。キメラ免疫グロブリンは、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子断片から、遺伝子操作などにより、構築することができる。
【００６３】
用語「ヒト型化抗体」とは、少なくとも１つのヒト型化抗体鎖（すなわち、少なくとも１つのヒト型化軽鎖またはヒト型化重鎖）を含む抗体を指す。用語「ヒト型化抗体鎖」（すなわち、「ヒト型化免疫グロブリン軽鎖」）とは、実質的にヒト抗体由来の可変フレームワーク領域と、実質的に非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、２つのＣＤＲ、または３つのＣＤＲ）と、を含む可変領域を有する、抗体鎖（すなわち、それぞれ軽鎖または重鎖）を指す。いくつかの実施形態において、ヒト型化抗体鎖は、定常領域（例えば、軽鎖の場合では、１つの定常領域またはその一部、重鎖の場合では３つの定常領域が好ましい）をさらに含む。
【００６４】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がＫａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２を参照）などに記載されたヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来である、可変領域を有する抗体を包含することが意図される。さらに、この抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来である。ヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発により誘導される変異、またはインビボにおける体細胞突然変異により誘導される変異）を含んでいてもよい。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を包含することは意図されない。
【００６５】
上記ヒト抗体は、少なくとも１または複数のアミノ酸が、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列にコードされていない活性増強アミノ酸残基で置換されているものとすることができる。典型的には、上記ヒト抗体は、最大２０個の位置が、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置換されているものとすることができる。特定の実施形態では、これらの置換は、以下で詳細に記載されるような、ＣＤＲ領域内の置換である。
【００６６】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する、人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法で作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９巻：頁３１５〜３２１（１９９０年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻、頁１５４７〜１５５３（１９９２年）を参照されたい。
【００６７】
「単離された」とは、本明細書で使用される場合、抗体が異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないことを指すことが意図されている。加えて、単離抗体は、通常、他の細胞性物質および／または化学物質も実質的に含まない。
【００６８】
「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用、またはそれから生じた生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）など）、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の発現減少が挙げられる。このようなエフェクター機能は通常、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせるためにＦｃ領域を必要とする。
【００６９】
「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃ」とは、抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。すなわち、Ｆｃ領域は、第１定常領域免疫グロブリン領域（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除いた抗体の定常領域からなる。
【００７０】
「抗原」は、抗体が結合する実体（例えば、タンパク質性の実体またはペプチド）であり、例えばＴＮＦＲ２である。
【００７１】
用語「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、および「選択的に結合する」とは、抗体が特定の抗原またはエピトープに対してかなりの親和性を示し、且つ、通常は、他の抗原およびエピトープと有意な交差反応性を示さないことを意味する。「かなりの」または好ましい結合性は、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、もしくは１０−１０ＭのＫＤでの結合、またはより良好な結合を包含する。抗体抗原相互作用のＫＤ（親和定数）は、抗体分子および抗原分子の５０％が結合して一緒になる抗体の濃度を表す。すなわち、好適な固定の抗原濃度において、親和性がより高い（すなわち、より強い）抗体の５０％は、親和性がより低い抗体と同パーセントの結合性を達成するのに必要であろう抗体濃度よりも低い抗体濃度で、抗原分子と結合することとなる。すなわち、ＫＤ値が低いほど親和性がより高い（より強い）ことを表す。本明細書で使用される場合、「より良好な」親和性とは、比較対象よりも、親和性がより強く、数値が低いものであり、１０−７ＭのＫＤは、１０−６ＭのＫＤよりも、数値がより低く、すなわち、親和性がより良好であることを表す。１０−７Ｍよりも良好な、好ましくは１０−８Ｍよりも良好な親和性（すなわち、ＫＤ値がより小さい、すなわちより強い親和性）が通常は好まれる。本明細書に記載される値の中間の値も企図され、好ましい結合親和性は一連の親和性として表すことができ、例えば、本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体において好ましい結合親和性は１０−７〜１０−１２Ｍであり、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍである。「有意な交差反応性を示さない」、または「生理学的に適切な親和性で結合しない」抗体は、非特異的な抗原（例えば、ＴＮＦＲ２以外のタンパク質）またはエピトープに顕著に結合することのない抗体である。例えば、１つの実施形態において、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する抗体は、ＴＮＦＲ２以外のタンパク質などよりも、ＴＮＦＲ２に対して、少なくとも２桁、好ましくは３桁以上または４桁以上良好な、結合親和性（すなわち、２桁以上、３桁以上、または４桁以上小さなＫＤ値を示す結合性）を示すこととなる。特異的または選択的な結合は、このような結合を測定するための当該技術分野において承認されている任意の手段に基づいて測定することができ、例えば、本明細書に記載されるような、スキャチャード解析、ビアコア解析、バイオレイヤー干渉法、および／または競合的結合アッセイが挙げられる。
【００７２】
用語「ＫＤ」とは、本明細書で使用される場合、ｋｄのｋａに対する比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、特定の抗体抗原相互作用の解離平衡定数または抗原に対する抗体の親和性を指すことが意図される。抗体のＫＤ値は当該技術分野において確立された方法を用いて求めることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、パール・フォートバイオ社（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）製Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６  Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙシステムによるバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒｙ）、または組み換えＴＮＦＲ２を分析物として用い当該抗体をリガンドとして用いたＢＩＡＣＯＲＥ３０００装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定された場合に、およそ１０−７Ｍ未満（およそ１０−８Ｍ未満、およそ１０−９Ｍ未満、またはおよそ１０−１０Ｍ未満、またはそれ以下など）の親和性（ＫＤ）で抗原と結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）または近縁の抗原に結合する場合のその親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性で所定の抗原に結合する。ＫＤを求めるための他の方法としては、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を介したＴＮＦＲ２を発現する生細胞に対する平衡結合、またはＫｉｎＥｘＡ（登録商標）技術を用いた溶液中の平衡結合が挙げられる。ＫＤ値は、本明細書で使用される場合、一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）ＫＤを指す。
【００７３】
用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体抗原相互作用の結合速度を指すことが意図され、一方、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。
【００７４】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する、抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸（通常は直鎖状エピトープ）からも形成できるし、あるいはタンパク質の三次フォールディング（通常は立体構造エピトープ）によって並置された非連続アミノ酸からも形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、必ずしもそうとは限らないが、変性溶媒に曝されても保持され、一方、三次フォールディングで形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理されると失われる。所与の抗体がどのエピトープに結合するかを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当該技術分野において周知であり、例えば、免疫ブロットアッセイおよび免疫沈降アッセイが挙げられ、重複ペプチドまたは連続ペプチドが所与の抗体との反応性について試験される。エピトープの空間的立体構造を決定する方法としては、当該技術分野における技術、例えば、Ｘ線結晶解析、２次元核磁気共鳴、およびＨＤＸ−ＭＳが挙げられる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ（編）（１９９６年）を参照されたい）。用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識における分子的決定基の同定過程を指す。
【００７５】
２つ以上の抗体を指して、用語「同一エピトープに結合する」とは、所与の方法で決定された場合に、それらの抗体が同一のアミノ酸残基セグメントに結合することを意味する。抗体が本明細書に記載の抗体と「同じＴＮＦＲ２上のエピトープ」に結合していることを判定するための技術として、例えば、エピトープマッピング法が挙げられ、エピトープの原子レベルの分解能が実現される抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析、および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）などがある。他の方法では、抗原断片または抗原の変異型への上記抗体の結合性がモニターされ、抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合性の減少は、エピトープ成分であることを示しているとしばしば見なされる。加えて、エピトープマッピング用の計算的コンビナトリアル法を用いることもできる。これらの方法は、目的抗体の、コンビナトリアルなファージディスプレイ用ペプチドライブラリーから特定の短ペプチドをアフィニティー単離する能力に基づいている。同じＶＨおよびＶＬまたは同じＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を有する抗体は、同じエピトープに結合すると予想される。
【００７６】
「標的への結合において別の抗体と競合する」抗体とは、当該標的への他の抗体の結合を（部分的または完全に）阻害する抗体を指す。２つの抗体が標的への結合において互いに競合しているかどうか、すなわち、ある抗体が標的へのその他の抗体の結合を阻害するか否かとその程度は、公知の競合実験を用いて求めてもよい。ある実施形態では、抗体は、標的に対する別の抗体の結合と競合し、それを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「遮断抗体」となるか（すなわち、当該標的と最初にインキュベートされる寒冷抗体）に依存して異なる場合がある。競合アッセイは、例えば、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ；２００６年；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４２７７、またはＥｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅによる「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」の１１章、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、米国、１９９９年、に記載されている通りに実行することができる。競合する抗体同士は、重なり合うエピトープである同一エピトープに、または隣接し合うエピトープ（例えば、立体障害から明らかにされる）に、結合する。他の競合的結合アッセイとしては、以下が挙げられる：固相直接的または間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接的または間接的酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９巻：頁２４２（１９８３年）参照）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：頁３６１４（１９８６年）参照）；固相直接的標識アッセイ、固相直接的標識サンドイッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー出版局（１９８８）参照）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接的標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５巻（１号）：頁７（１９８８年）参照）；固相直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６巻：頁５４６（１９９０年））；および直接的標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２巻：頁７７（１９９０年））。
【００７７】
用語「核酸分子」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含することが意図される。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖のＤＮＡであることが好ましい。
【００７８】
用語「単離核酸分子」とは、本明細書で抗体または抗体断片（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸を指して使用される場合、核酸分子において、そのヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡ内で当該核酸と天然に隣接している場合がある、他のゲノムヌクレオチド配列、例えばＴＮＦＲ２以外の抗原と結合する抗体をコードする配列、を本質的に含まない、核酸分子を指すことが意図される。
【００７９】
用語「改変する」、または「改変」とは、本明細書で使用される場合、抗体もしくはその抗原結合性部分の、または組み換えＴＮＦＲ２タンパク質（例えば、エピトープマッピング用）上の、１または複数のアミノ酸を変化させることを指す。この変化は、１または複数の位置におけるアミノ酸の付加、置換、または欠失によってなすことができる。この変化は、ＰＣＲ変異誘発などの公知の技術を用いてなすことができる。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法を用いて同定された抗体またはその抗原結合性部分は、改変されることにより、当該抗体またはその抗原結合性部分のＴＮＦＲ２への結合親和性を変化させることができる。
【００８０】
抗体の配列における「保存的アミノ酸置換」とは、ヌクレオチド配列にコードされる抗体または当該アミノ酸配列を含有する抗体の、その抗原（例えば、ＴＮＦＲ２）に対する結合性を消失させない、ヌクレオチド配列の改変およびアミノ酸配列の改変を指す。保存的アミノ酸置換は、あるクラスのアミノ酸の同一クラスのアミノ酸による置換を包含し、ここで、クラスは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性、および、天然に存在する相同タンパク質において置換頻度が高いこと、によって定義され、置換頻度は、例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｔｒｉｘ）またはＢＬＯＳＵＭマトリックス（ＢＬＯＳＵＭ  ｍａｔｒｉｘ）によって決定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が包含される。例えば、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基への置換は、保存的置換である。すなわち、抗ＴＮＦＲ２抗体内の予測可欠アミノ酸残基は、同一クラスからの別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法が、当該技術分野において周知である。
【００８１】
用語「非保存的アミノ酸置換」とは、あるクラスのアミノ酸の別のクラスからのアミノ酸との置換を指し；例えば、クラスＩＩ残基であるＡｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎなどのクラスＩＩＩ残基との置換である。
【００８２】
あるいは、別の実施形態において、変異（保存的または非保存的な変異）を、抗ＴＮＦＲ２抗体コード配列の全てまたは一部に、飽和突然変異誘発などによってランダムに導入することができ、得られた改変型抗ＴＮＦＲ２抗体を結合活性についてスクリーニングにかけることができる。
【００８３】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、それに連結された別の核酸を運搬可能な核酸分子を指すことが意図される。１種のベクターとして「プラスミド」があり、プラスミドとは、その中に追加のＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターとしてウイルスベクターがあり、ウイルスベクターにおいては、ウイルスゲノムの中に追加のＤＮＡセグメントが連結されている場合がある。ある特定のベクターは導入された宿主細胞内で自律増殖が可能である（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入後に宿主細胞のゲノムに組み入れられることで、宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、ある特定のベクターは、作動可能なように連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。そのようなベクターは「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態の発現ベクターである場合が多い。用語「プラスミド」および「ベクター」は同義的に使用される場合がある。しかし、等価な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態も企図されている。
【００８４】
用語「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書で使用される場合、組み換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図される。このような用語が、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることは理解されたい。変異または環境の影響によってある特定の改変が続く世代において生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に包含される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「連結された」とは、２つ以上の分子の結び付きを指す。連結は共有結合性の連結とすることも非共有結合性の連結とすることもできる。連結は遺伝的な連結（すなわち、組換えによる融合）とすることもできる。このような連結は、化学的結合および組換えタンパク質生成などの、種々様々な当該分野で認知されている技術を用いて達成できる。
【００８６】
また、本明細書に記載の配列の「保存的配列改変」、すなわち、ヌクレオチド配列にコードされた抗体または当該アミノ酸配列を含有する抗体の、その抗原に対する結合性を消失させないアミノ酸配列改変、が提供される。このような保存的配列改変は、保存的なヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、並びに、保存的なヌクレオチドおよびアミノ酸の付加および欠失を包含する。例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、表１０の配列に改変を導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるもとを包含する。当該技術分野においては、類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐鎖側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。すなわち、抗ＴＮＦＲ２抗体内の予測可欠アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を消失させないヌクレオチド保存的置換およびアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３２巻：頁１１８０〜１１８７（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１２巻（１０号）：頁８７９〜８８４（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻：頁４１２〜４１７（１９９７年）を参照）。あるいは、別の実施形態において、変異を、抗ＴＮＦＲ２抗体コード配列の全てまたは一部に、飽和突然変異誘発などによってランダムに導入することができ、得られた改変型抗ＴＮＦＲ２抗体を結合活性についてスクリーニングにかけることができる。
【００８７】
核酸において、用語「実質的な相同性」とは、２本の核酸、またはその指定の配列同士が、最適なアラインメントと比較が行われた場合に、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って、少なくとも約８０％のヌクレオチドにおいて同一であることを表し、通常は少なくとも約９０％〜９５％のヌクレオチドにおいて同一であり、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のヌクレオチドにおいて同一である。あるいは、実質的な相同性は、選択的なハイブリダイゼーション条件下でセグメントが鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。
【００８８】
ポリペプチドにおいて、用語「実質的な相同性」とは、２つのポリペプチド、またはその指定の配列同士が、最適なアラインメントと比較が行われた場合に、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って、少なくとも約８０％のアミノ酸において同一であることを表し、通常は少なくとも約９０％〜９５％のアミノ酸において同一であり、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のアミノ酸において同一である。
【００８９】
２つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列が共有する同一である位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一である位置の数／位置の総数×１００）であり、これら２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮したものである。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例に記載されているような、数学アルゴリズムを用いて達成できる。
【００９０】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ギャップ重み付け４０、５０、６０、７０、または８０、長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を使用して、決定できる。２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：頁１１〜１７（１９８９年））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０残基重み付け表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用して、決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８巻）：頁４４４〜４５３（１９７０年））のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４、長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を使用して、決定できる。
【００９１】
本明細書に記載の核酸配列およびタンパク質配列を、さらに、公開データベースに対する検索を実行するための「問い合わせ配列」として使用することで、関連配列を特定することなどが可能となる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：頁４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムによりスコア＝１００、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２として実行することで、本明細書に記載の核酸分子と類似しているヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムによりスコア＝５０、ワードレングス＝３として実行することで、本明細書に記載のタンパク質分子と類似しているアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップの入ったアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻（１７号）：頁３３８９〜３４０２に記載の通りに利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００９２】
用語「阻害」とは、本明細書で使用される場合、生物活性におけるあらゆる統計的に有意な減少を指し、活性の部分遮断および完全遮断を包含する。例えば、「阻害」は、生物活性における、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の、統計的に有意な減少を指し得る。
【００９３】
「ＴＮＦＲ２へのＴＮＦＲ２リガンドの結合を阻害する」という表現は、本明細書で使用される場合、抗体（対照）非存在下におけるＴＮＦＲ２リガンド結合と比較して、ＴＮＦＲ２へのＴＮＦＲ２リガンド（例えば、ＴＮＦα）の結合を統計的に有意に減少させる抗体の能力を指す。言い換えれば、抗体の存在下では、対照（抗体なし）と比較した場合に、ＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２リガンドの量が統計的に有意に減少する。ＴＮＦＲ２に結合するＴＮＦＲ２リガンドの量は、本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体の存在下で、抗体非存在下（対照）における量と比較して、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約１００％、減少し得る。ＴＮＦＲ２リガンド結合の減少は、抗体存在下または非存在下（対照）におけるＴＮＦＲ２発現細胞への標識ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、放射標識ＴＮＦα）の結合レベルを測定する、当該技術分野において承認されている技術を用いて測定できる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、腫瘍の「成長を阻害する」という用語は、腫瘍の成長におけるあらゆる測定可能な減少を包含し、例えば、少なくとも約１０％の腫瘍の成長の阻害であり、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、または約１００％の腫瘍の成長の阻害である。
【００９５】
用語「治療する」、「治療すること」、および「治療」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の治療的または予防的な処置を指す。「治療」の各方法では、疾患もしくは障害または再発性の疾患もしくは障害を予防する、それを治癒する、それを遅延する、その重症度を低減する、またはその１または複数の症状を改善するための、あるいは、そのような治療の非存在下で予測される生存を超えて対象の生存を延長させるための、腫瘍もしくはがんを有する対象、またはそのような疾患もしくは障害に罹り易い対象への、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）の投与が行われる。
【００９６】
用語「がん」および「がん性」とは、制御されていない細胞成長を典型的な特徴とする、哺乳類における生理的条件を指すか、その記述である。がんの例としては、癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。このようながんのさらなる具体例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん、膵がん、グリア芽腫および神経線維腫症などの膠細胞腫瘍、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、メラノーマ、大腸がん、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎がん、腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、並びに各種頭頸部がんが挙げられる。
【００９７】
「長期間の抗がん作用」という表現は、本明細書で使用される場合、抗体による初回治療後に長期間（例えば、少なくとも６か月以上）のがん成長抑制を誘導する抗体の能力を指す。抗がん作用の持続は、例えば、腫瘍成長を測定することにより評価してもよいし、あるいは、元のがんに対するメモリーＴ細胞の存在に関して寛解期の対象の血液試料を定期的に検査することにより（例えば、元の生検標本に対する反応性に関して検査することにより）評価してもよい。
【００９８】
用語「有効量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効量」は、既に疾患に罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途において有効な量は、治療対象の障害の重症度および患者自身の免疫系の全身状態に依存することとなる。
【００９９】
用語「治療薬」は、疾患もしくは障害の症状の重症度を低減もしくは阻害する能力、または、疾患もしくは障害における無症状期間もしくは症状低減期間の頻度および／もしくは期間を増加する能力、または、疾患もしくは障害の苦痛による機能障害もしくは能力障害を阻害もしくは予防する能力、または、疾患もしくは障害の進行を阻害もしくは遅延する能力、または、疾患もしくは障害の発病を阻害もしくは遅延する能力、または、感染性の疾患もしくは障害における感染を阻害もしくは予防する能力、を有するあらゆる全ての化合物を包含することが意図される。治療薬の非限定例としては、有機小分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組み換え技術により操作された生物学的製剤、ＲＮＡｉ化合物、および市販の抗体が挙げられる。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「投与」とは、当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを用いた、治療薬を含む組成物の対象への物理的な導入を指す。本明細書に記載の抗体の例示的な投与経路としては、静脈内投与経路、腹腔内投与経路、筋肉内投与経路、皮下投与経路、脊髄投与経路、または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは点滴による投与経路が挙げられる。「非経口投与」という表現は、本明細書で使用される場合、経腸投与および局所投与を除いた、通常は注射による投与様式を意味し、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および点滴、並びにインビボエレクトロポレーション。あるいは、本明細書に記載の抗体は、局所投与経路、表皮投与経路、または粘膜投与経路などの非経口経路以外の経路を介して投与することができ、例えば、鼻腔内に、経口で、経膣で、経直腸で、舌下に、または局所的に投与することができる。投与は、例えば、１回、複数回、且つ／あるいは、１または複数の長期間に亘って、実施することもできる。
【０１０１】
用語「患者」は、予防的処置または治療的処置を受けているヒト対象および他の哺乳類対象を包含する。
【０１０２】
用語「対象」はあらゆる哺乳動物を包含する。例えば、本明細書において開示された方法および組成物は、がんを患う対象を治療するために使用できる。特定の実施形態では、上記対象はヒトである。
【０１０３】
用語「試料」とは、患者または対象から採取された組織、体液、または細胞（または上記のいずれかの画分）を指す。通常、組織または細胞が患者から摘出されることとなるが、インビボでの診断も企図される。固形腫瘍の場合、外科的に摘出された腫瘍から組織試料を入手し、従来技術による試験用に調製できる。リンパ腫および白血病の場合、リンパ球、白血球細胞、またはリンパ組織を入手し（例えば、血液から白血球細胞を入手し）、適宜調製できる。尿、涙、血清、血漿、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出物などを含む他の試料も、特定のがんの場合に有用であり得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値±１０％を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、関連付けられた列挙項目の１または複数のあらゆる全ての組み合わせを包含する。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という表現は、Ａ；Ｂ；Ｃ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；並びにＡ、Ｂ、およびＣを包含することが意図される。
【０１０６】
本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明示していない限り、複数形も含むことが意図されている。
【０１０７】
以下のサブセクションでは、本開示の種々の態様をさらに詳細に説明する。
【０１０８】
ＩＩＩ．抗ＴＮＦＲ２抗体
本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）およびその抗原結合性断片は、特定の機能的特徴または特性によって特徴付けることができる。例えば、上記抗体はヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインに結合する。抗ＴＮＦＲ２抗体はまた、長期間の抗がん作用や抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導する場合がある。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２の１または複数のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の一部または全てに結合する。ヒトＴＮＦＲ２  ＣＲＤおよびマウスＴＮＦＲ２  ＣＲＤに対応するアミノ酸残基を表１にまとめる。
【０１１０】
これを受けて、１つの態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７、６０〜７７、６５〜７７、７０〜７７、７５〜７７、５５〜７５、５５〜７０、５５〜６５、または５５〜６０番内の１または複数のアミノ酸と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７、７８〜１１８、１２０〜１４３、または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７、７８〜１１８、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜７７、７８〜１１８、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内のアミノ酸残基と結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害する（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を５０％超（例えば、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超）阻害する）。
【０１１１】
別の態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）などで評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番内の１または複数のアミノ酸と結合しない。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４、２３〜４４、２３〜３６、２３〜３０、２３〜２５、２５〜５４、３０〜５４、３５〜５４、または４０〜５４番内の１または複数のアミノ酸と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４、９７〜１１８、１２０〜１４３、または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４、９７〜１１８、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４、９７〜１１８、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内のアミノ酸残基と結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の５５〜９６番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、野生型ヒトＴＮＦＲ２と比較した場合にヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の３７、４４、５１、５２、５５、５８、５９、６１、６２、７２、７４、７６、７８、および８７番からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基において置換（例えば、非保存的置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性の減少を示す。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト活性を示す（例えば、少なくとも５０％のＴＮＦ−αの有効性において、（例えば、実施例１０に記載のように）制御性Ｔ細胞におけるＩＫＢａ分解を誘導する）。
【０１１２】
別の態様において、野生型ヒトＴＮＦＲ２と比較した場合にヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）のＧ３７Ｄ、Ｅ４４Ａ、Ｑ５１Ａ、Ｍ５２Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｓ５８Ａ、Ｐ５９Ａ、Ｑ６１Ａ、Ｈ６２Ａ、Ｄ７２Ａ、Ｖ７４Ａ、Ｄ７６Ａ、Ｓ７８Ａ、およびＷ８７Ａからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性の減少（例えば、少なくとも５０％の結合性減少、少なくとも８０％の結合性減少、または少なくとも９０％の結合性減少）を示す、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔ３９Ａ、Ｒ４１Ａ、Ｌ４２Ａ、Ｒ４３Ａ、Ｋ６４Ａ、Ｖ６５Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｔ７０Ａ、Ｓ７１Ａ、Ｅ７９Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｒ１１２Ａ、および／またはＥ１１３Ａからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対する結合性の減少を示さない（例えば、５０％超の結合性減少、４０％超の結合性減少、３０％超の結合性減少、２５％超の結合性減少、２０％超の結合性減少、１５％超の結合性減少、１０％超の結合性減少、または５％超の結合性減少を示さない）。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト活性を示す（例えば、少なくとも５０％のＴＮＦ−αの有効性において、（例えば、実施例１０に記載のように）制御性Ｔ細胞におけるＩＫＢａ分解を誘導する）。
【０１１３】
別の態様において、Ｇ３７、Ｅ４４、Ｑ５１、Ｍ５２、Ｓ５５、Ｓ５８、Ｐ５９、Ｑ６１、Ｈ６２、Ｄ７２、Ｖ７４、Ｄ７６、Ｓ７８、およびＷ８７からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基においてヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）に結合する、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、アミノ酸残基Ｓ５５およびＤ７２においてヒトＴＮＦＲ２に結合する。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、アミノ酸残基Ｔ３９、Ｒ４１、Ｄ８０、Ｒ１１２、および／またはＥ１１３においてはヒトＴＮＦＲ２に結合しない。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、アミノ酸残基Ｔ３９、Ｒ４１、Ｌ４２、Ｒ４３、Ｋ６４、Ｖ６５、Ｋ６９、Ｔ７０、Ｓ７１、Ｅ７９、Ｄ８０、Ｒ１１２、および／またはＥ１１３においてはヒトＴＮＦＲ２に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト活性を示す（例えば、少なくとも５０％のＴＮＦ−αの有効性において、（例えば、実施例１０に記載のように）制御性Ｔ細胞におけるＩＫＢａ分解を誘導する）。
【０１１４】
別の態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の４８番アミノ酸残基および／または６８番アミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少（例えば、少なくとも５０％の結合性減少、少なくとも６０％の結合性減少、少なくとも７０％の結合性減少、少なくとも８０％の結合性減少、または少なくとも９０％の結合性減少）を示す、単離抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）のアミノ酸残基４８および／またはアミノ酸残基６８に結合する、単離抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記抗体は、３７、３９、４２、４９、５１、５６、６５、６６、６９、８６、８９、および９１番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基に置換（例えば非保存的アミノ酸置換、例えばアラニン置換）を含む変異型ヒトＴＮＦＲ２に対しての、結合性減少を示さない（例えば、２０％以下の結合性減少または１０％以下の結合性減少しか示さない）。いくつかの実施形態において、上記抗体は、３７、３９、４２、４９、５１、５６、６５、６６、６９、８６、８９、および９１番残基からなる群から選択される１または複数のアミノ酸残基に結合しない。いくつかの実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の９７〜１１８、１２０〜１４３、および／または１６１〜２００番アミノ酸残基と結合しない。いくつかの実施形態において、変異型ＴＮＦＲ２に対する抗体の結合性減少は、酵母表面ディスプレイにより評価される。
【０１１５】
別の態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の、７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、２３〜７７または１１９〜２００番内の１または複数のアミノ酸と結合しない、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７、２３〜７５、２３〜７０、２３〜６５、２３〜６０、２３〜５５、２３〜５０、２３〜４５、２３〜３５、２３〜３０、２３〜２５、または１１９〜１２０番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号Ｘ）の２３〜７７、１１９〜１２０、１２０〜１４３、または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７、１１９〜１２０、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７、１１９〜１２０、１２０〜１４３、および１６１〜２００番内のアミノ酸に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害する（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を５０％超（例えば、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超）阻害する）。
【０１１６】
別の態様において、（１）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、（２）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号1）への結合を有意に阻害しない、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、（１）１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、（２）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８以内の１または複数のアミノ酸残基と結合せず（例えば、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８、７８〜１１５、７８〜１１０、７８〜１０５、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８５、７８〜８０、または２３〜７７番内の１または複数のアミノ酸に結合しない）、（３）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号1）への結合を有意に阻害しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、（１）１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、（２）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７または７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸に結合せず、（３）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号1）への結合を有意に阻害しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、（１）１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、（２）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７および７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸に結合せず、（３）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号1）への結合を有意に阻害しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、（２）１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、（２）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７および７８〜１１８番内のアミノ酸に結合せず、（３）ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号1）への結合を有意に阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。
【０１１７】
別の態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸残基と結合しない、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８、７８〜１１５、７８〜１１０、７８〜１０５、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８５、７８〜８０、または２３〜７７番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７または７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７および７８〜１１８番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜２５７番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７および７８〜１１８番内のアミノ酸に結合しない。
【０１１８】
別の態様において、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、２３〜７７番内の１または複数のアミノ酸に結合しない、抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜７７、２３〜７５、２３〜７０、２３〜６５、２３〜６０、２３〜５５、２３〜５０、２３〜４５、２３〜４０、２３〜３５、２３〜３０、または２３〜２５番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、（１）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、（２）１２０〜１４３番アミノ酸残基の全てまたは一部に結合し、（３）ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜１４３または１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜１４３および１６１〜２００番内の１または複数のアミノ酸に結合しない。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の７８〜１１８番アミノ酸残基の全てまたは一部と結合し、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の１２０〜１４３および１６１〜２００番内のアミノ酸に結合しない。
【０１１９】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）は、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含むより多くのうちの１つの（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）キメラ受容体へのその結合能によって特徴付けることもでき、当該細胞外ドメイン内の特定の領域は対応するマウスＴＮＦＲ２領域の部分と置き換えられている（すなわち、「ＴＮＦＲ２キメラ」）。表２には例示的なＴＮＦＲ２キメラがまとめられており、所望により抗体のＦｃ領域に融合させることもできる（例えば、結合アッセイで使用される場合；キメラ−Ｆｃ融合体の配列は表５に示す）。ＴＮＦＲ２キメラの模式図を図５Ａに示す。
【表２】
2022502076.tif 000003
【０１２０】
これを受けて、１つの態様において、ＴＮＦＲ２キメラ３（配列番号１１または１２）に結合し（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合し）、ＴＮＦＲ２キメラ０（配列番号５または６）と結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤでは結合しない）、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦＲ２キメラ０（配列番号５または６）への結合よりも、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも（ａｔｅ  ｌａｓｔ）２０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１０，０００倍）より良好な親和性で、ＴＮＦＲ２キメラ３（配列番号１１または１２）に結合する。
【０１２１】
キメラ３と結合し、キメラ０と結合しない、例示的なマウス抗ヒトＴＮＦＲ２抗体としては、ハイブリドーマＡＢＶ３、ＡＢＶ４、ＡＢＶ７、ＡＢＶ１２、ＡＢＶ１３、ＡＢＶ１４、ＡＢＶ１５、ＡＢＶ１８、およびＡＢＶ１９によって産生された抗体が挙げられる。
【０１２２】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ３によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ３によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ３によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２３】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ４によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ４によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ４によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２４】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ７によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ７によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ７によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２５】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１２によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１２によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１２によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２６】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１３によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１３によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１３によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２７】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１４によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１４によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１４によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２８】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１５によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１５によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１５によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１２９】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１８によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１８によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１８によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１３０】
１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１９によって産生された抗体である。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１９によって産生された抗体のＶＨＣＤＲ１〜３配列およびＶＬＣＤＲ１〜３配列を含む。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ハイブリドーマＡＢＶ１９によって産生された抗体のヒト型化形態またはキメラ形態である。
【０１３１】
１つの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、および／またはＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１５、および２３（または配列番号１２、１４、１５、および２４））に結合し（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合し）、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ６、および／またはＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１７、および２１（または配列番号６、８、１０、１８、および２２））に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合しない）。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１５、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１６、２０、および２４））に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１５、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１６、２０、および２４））に結合するが、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ６、およびＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１７、および２１（または配列番号６、８、１０、１８、および２２））に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害する（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を５０％超（例えば、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超）阻害する）。
【０１３２】
別の態様において、ＴＮＦＲ２キメラ７（配列番号１９または２０）に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、ＴＮＦＲ２キメラ４（配列番号１３または１４）に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤでは結合しない）、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦＲ２キメラ４（配列番号１３または１４）への結合よりも、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１０，０００倍）より良好な親和性で、ＴＮＦＲ２キメラ７（配列番号１９または２０）に結合する。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）などで評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）への結合の阻害が約５０％未満である）。１つの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、および／またはＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１５、１９、および２３（または配列番号１６、２０、および２４））に結合し（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合し）、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、および／またはＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１１、１３、１７、および２１（または配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、および２２））に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合しない）。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１５、１９、および２３（または配列番号１６、２０、および２４））に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ５、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１５、１９、および２３（または配列番号１６、２０、および２４））に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、およびＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１１、１３、１７、および２１（または配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、および２２））に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２に対するアゴニスト活性を示す（例えば、少なくとも５０％のＴＮＦ−αの有効性において、（例えば、実施例１０に記載のように）制御性Ｔ細胞におけるＩＫＢａ分解を誘導する）。
【０１３３】
別の態様において、ＴＮＦＲ２キメラ１（配列番号７または８）に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、ＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤでは結合しない）、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦＲ２キメラ２（配列番号９または１０）への結合よりも、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも（ａｔｅ  ｌａｓｔ）２０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１０，０００倍）より良好な親和性で、ＴＮＦＲ２キメラ１（配列番号７または８）に結合する。１つの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、および／またはＴＮＦＲ２キメラ５（それぞれ、配列番号５、７、および１５（または配列番号６、８、および１６））に結合し（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合し）、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、ＴＮＦＲ２キメラ８、および／またはＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号９、１１、１３、１７、１９、２１、および２３（または配列番号１０、１２、１４、１８、２０、２２、および２４））に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合しない）。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、およびＴＮＦＲ２キメラ５（それぞれ、配列番号５、７、および１５（または配列番号６、８、および１６））に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、およびＴＮＦＲ２キメラ５（それぞれ、配列番号５、７、および１５（または配列番号６、８、および１６））に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、ＴＮＦＲ２キメラ８、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号９、１１、１３、１７、１９、２１、および２３（または配列番号１０、１２、１４、１８、２０、２２、および２４））に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害する（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を���０％超（例えば、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超）阻害する）。
【０１３４】
別の態様において、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、および／またはＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、および／またはＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１７、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１８、２０、および２４））に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合しない）、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）への結合を阻害しない。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、およびＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、およびＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、１×１０−７未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１７、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１８、２０、および２４））に結合しない。いくつかの実施形態において、上記抗体は、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ８に結合しない。本態様のいくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない（例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、実施例３に記載されるようなＥＬＩＳＡ）で評価された場合に、ＴＮＦ−αのヒトＴＮＦＲ２への結合の阻害が５０％未満である）。
【０１３５】
別の態様において、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、および／またはＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合するが（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫＤで結合するが）、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、および／またはＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１７、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１８、２０、および２４））に結合しない（例えば、１×１０−５Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、または１×１０−８Ｍ未満のＫＤで結合しない）、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。１つの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、および／またはＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２キメラ０、ＴＮＦＲ２キメラ１、ＴＮＦＲ２キメラ２、ＴＮＦＲ２キメラ５、およびＴＮＦＲ２キメラ８（それぞれ、配列番号５、７、９、１５、および２１（または配列番号６、８、１０、１６、および２２））に結合するが、１×１０−７Ｍ未満のＫＤで、ＴＮＦＲ２キメラ３、ＴＮＦＲ２キメラ４、ＴＮＦＲ２キメラ６、ＴＮＦＲ２キメラ７、およびＴＮＦＲ２キメラ９（それぞれ、配列番号１１、１３、１７、１９、および２３（または配列番号１２、１４、１８、２０、および２４））に結合しない。
【０１３６】
本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体は、特定の機能的特徴および構造的特徴（例えば、ＣＤＲ、可変領域、重鎖および軽鎖）によって特徴付けることもできる。
【０１３７】
これを受けて、１つの実施形態において、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２に結合し、（ａ）配列番号７１および配列番号７２にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号７４および配列番号８６にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１７０および配列番号１７１にそれぞれ記載のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号１４８および配列番号１４９にそれぞれ記載のアミノ酸配列、または（ｅ）配列番号１２６および配列番号１２７にそれぞれ記載のアミノ酸配列を含む重鎖・軽鎖可変領域対の重鎖・軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、上記のＣＤＲ配列はカバット（Ｋａｂａｔ）番号付けを用いて定義されている。他の実施形態において、上記のＣＤＲ配列はコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）番号付けを用いて定義されている。他の実施形態において、上記のＣＤＲ配列はＩＭＧＴ番号付けを用いて定義されている。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、配列番号４７、４８、および４９をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５０、５１、および５２をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、配列番号５３、５４、および５５をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号５６、５７、および５８をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、配列番号５９、６０、および６１をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６２、６３、および６４をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、配列番号６５、６６、および６７をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号６８、６９、および７０をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、配列番号１５２、１５３、および１５４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１５５、１５６、および１５７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、配列番号１５８、１５９、および１６０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６１、１６２、および１６３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、配列番号１６４、１６５、および１６６をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１６７、１６８、および１６９をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、配列番号１３０、１３１、および１３２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１３３、１３４、および１３５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、配列番号１３６、１３７、および１３８をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１３９、１４０、および１４１をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、配列番号１４２、１４３、および１４４をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１４５、１４６、および１４７をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、配列番号１０８、１０９、および１１０をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１１１、１１２、および１１３をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、配列番号１１４、１１５、および１１６をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１１７、１１８、および１１９をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、配列番号１２０、１２１、および１２２をそれぞれ含む重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、配列番号１２３、１２４、および１２５をそれぞれ含む軽鎖ＣＤＲ１配列、軽鎖ＣＤＲ２配列、および軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が本明細書で提供される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、上記重鎖ＣＤＲ配列、および定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアント）を含む。他の実施形態において、上記重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域が、定常ドメインに連結されることで、重鎖（例えば、完全長重鎖）を形成していてもよい。同様に、上記軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域が、定常領域に連結されることで、軽鎖（例えば、完全長軽鎖）を形成していてもよい。完全長重鎖（存在していなくてもよいし除去されていてもよい、Ｃ末端のリジン（Ｋ）を除くか、またはＣ末端のグリシンおよびリジン（ＧＫ）を除く）と、完全長軽鎖とが組み合わさることで、完全長抗体を形成する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は配列番号７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、１４９、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該軽鎖可変領域は配列番号７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、１４９、および１７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域の配列および／または当該軽鎖可変領域の配列は、上記の重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列（例えば、配列番号７１〜１００、１２６、１２７、１４８、１４９、１７０、および１７１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。他の実施形態において、上記の重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列（例えば、配列番号７１〜１００、１２６、１２７、１４８、１４９、１７０、および１７１）は、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、または１〜５個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０のうちのいずれかの重鎖可変領域配列、並びに定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアント）を含む。他の実施形態において、上記の配列番号７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、１２６、１４８、および１７０のうちのいずれかの重鎖可変領域配列は、定常ドメインに連結されることで、重鎖（例えば、完全長重鎖）を形成していてもよい。同様に、上記の配列番号７２、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２７、１４９、および１７１のうちのいずれかの軽鎖可変領域配列は、定常領域に連結されることで、軽鎖（例えば、完全長軽鎖）を形成していてもよい。完全長重鎖（存在していなくてもよいし除去されていてもよい、Ｃ末端のリジン（Ｋ）を除くか、またはＣ末端のグリシンおよびリジン（ＧＫ）を除く）と、完全長軽鎖とが組み合わさることで、完全長抗体を形成する。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、それぞれ配列番号７１および／または７２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。他の実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、それぞれ配列番号７４および／または８６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。他の実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、それぞれ配列番号１７０および／または１７１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。他の実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、それぞれ配列番号１４８および／または１４９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。他の実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、それぞれ配列番号１２６および／または１２７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む。他の実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、上記の重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列は、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、または１〜５個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列または重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体（例えば、組換え型のヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体）である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、上記抗ヒトＴＮＦＲ２抗体は、上記重鎖可変領域配列、および定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアント）を含むことで、重鎖（例えば、完全長重鎖）を形成していてもよい。同様に、上記軽鎖可変領域配列を含む軽鎖可変領域が、定常領域に連結されることで、軽鎖（例えば、完全長軽鎖）を形成していてもよい。完全長重鎖（存在していなくてもよいし除去されていてもよい、Ｃ末端のリジン（Ｋ）を除くか、またはＣ末端のグリシンおよびリジン（ＧＫ）を除く）と、完全長軽鎖とが組み合わさることで、完全長抗体を形成する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、それぞれ配列番号１０１および／または１０２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が、本明細書で提供される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、それぞれ配列番号１５０および／または１５１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が、本明細書で提供される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、それぞれ配列番号１２８および／または１２９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が、本明細書で提供される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、それぞれ配列番号１０６および／または１０７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、重鎖配列および軽鎖配列を含む抗ＴＮＦＲ２抗体が、本明細書で提供される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、上記の重鎖配列および／または軽鎖配列は、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、または１〜５個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）の細胞外ドメイン、または特定のヒトＴＮＦＲ２エピトープ（上記のエピトープなど）に、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒｙ）などで評価された場合に、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、または１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、結合する。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の不連続エピトープに結合する。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、ＴＮＦα）のＴＮＦＲ２への結合を阻害しない。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、ＴＮＦα）のＴＮＦＲ２への結合を部分的に阻害する。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、ＴＮＦα）のＴＮＦＲ２への結合を阻害する。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、ＴＮＦα）のＴＮＦＲ２への結合を、対照抗体（例えば、ＴＮＦＲ２に結合しない抗体）との比較において、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、阻害する。
【０１７１】
他の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、細胞におけるＴＮＦＲ２シグナル伝達経路を活性化する（すなわち、アゴニスト抗体）。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、例えば、ＮＦ−κＢレポーター細胞株（例えば、ヒトＴＮＦＲ２を発現するように操作されたＮＦ−κＢレポーター細胞株）で評価された場合に、ＮＦ−κＢ活性を増大させる。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、対照（例えば、アイソタイプ対照抗体、またはヒトＴＮＦＲ２を発現しないＮＦ−κＢレポーター細胞株）と比較した場合に、例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍、ＮＦ−κＢ活性を増大させる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、対照（例えば、抗体なし対照またはアイソタイプ抗体対照）と比較した場合に、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の割合を減少させる。いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画内の制御性Ｔ細胞の割合を、対照（例えば、抗体なし対照またはアイソタイプ抗体対照）と比較した場合に、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％減少させる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＮＫ細胞の存在下でＡＤＣＣを誘導する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔ細胞活性化を増強する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、フローサイトメトリーなどで評価された場合に、活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＰＤ１）の発現増加などに反映されて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増大する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、Ｔ細胞の増殖を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルなどにおいて評価された場合に、移植片拒絶反応を低減させる（移植片拒絶反応から保護する）。移植片拒絶反応の低減は、対照との比較などにより評価することができる（例えば、対照抗体またはビヒクルまたは非関連抗体による治療と比較した場合の生存率の改善）。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、腫瘍成長を、対照治療と比較した場合に、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上、阻害する。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する能力とは無関係に、腫瘍成長を阻害する。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を阻害する能力とは無関係に、腫瘍成長を阻害する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、長期間の抗がん作用を誘導する（例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体による処置後長期間、腫瘍成長を阻害および／または抑制する）。特定の実施形態では、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体は、対照（例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体で処置されていない対象）と比較した場合に、抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導する。
【０１８２】
また、がんを患う対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を投与することを含む、長期間の抗がん作用を誘導する方法が、本明細書で提供される。
【０１８３】
１つの実施形態において、長期間の抗がん作用が、ヒトがんのマウスモデル（例えば、トランスジェニックモデル、ヒト化モデル、並びに／またはキメラモデル、同種移植片モデル、および異種移植モデル）において測定され得る。腫瘍再発（または抑制）が、例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体による初回治療後に腫瘍退縮を示したマウスにおいて少なくとも６か月間モニターされ得る。他の実施形態においては、腫瘍再発（または抑制）が、少なくとも１年間以上または少なくとも２年間以上モニターされ得る。
【０１８４】
別の実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がメモリーＴ細胞になったかどうかを判定するため、各種用量の同一腫瘍細胞が、腫瘍退縮後の異なる時点で腫瘍退縮後マウスに再接種され、その後、当該レシピエントマウスにて腫瘍成長がモニターされ得る。野生型マウスには対照と同じ腫瘍が接種され得る。腫瘍退縮後マウスにおける腫瘍特異的メモリーＴ細胞の発生頻度を求めるため、インビトロ細胞毒性アッセイが、特定のがん細胞抗原を標的として用いて実施され得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、モノクローナル抗体であり、例えばモノクローナルヒト抗体である。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、またはキメラ抗体である。
【０１８７】
当該技術分野において公知の、本明細書に記載の方法に従って求められた場合に、上記の機能特性（例えば、生化学的活性、免疫化学的活性、細胞活性、生理学的活性、または他の生物活性など）のうちの１または複数を示す抗体は、当該抗体の非存在下（または、無関係な特異性を有する対照抗体が存在する場合など）で確認された活性と比較した場合の、特定の活性における統計的に有意な差異に関連していると、理解されることとなる。好ましくは、上記抗ＴＮＦＲ２抗体により誘導された測定パラメータにおける増加は、測定パラメータの少なくとも１０％の統計的に有意な増加効果を奏し、より好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％（すなわち、少なくとも２倍）、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の、統計的に有意な増加効果を奏する。逆に、抗ＴＮＦＲ２抗体により誘導された測定パラメータ（例えば、腫瘍体積、ＴＮＦαのＴＮＦＲ２への結合）における減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の、統計的に有意な減少効果を奏する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＨドメインが、定常ドメインに連結されることで、重鎖、例えば完全長の重鎖、が形成される。他の実施形態において、上記ＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそのバリアント（例えば、エフェクター機能が増強されたＦｃ領域を含むバリアント）の定常ドメインに連結される。同様に、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体のＶＬドメインが、定常ドメインに連結されることで、軽鎖、例えば完全長軽鎖、が形成される。
【０１８９】
本明細書で開示される抗体は、全ての公知の抗体形態および抗体に似た特性を有する他のタンパク質骨格を包含する。例えば、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、二重特異性抗体、免疫複合体、キメラ抗体、または、フィブロネクチンもしくはアンキリンリピートなどの抗体に似た特性を有するタンパク質骨格とすることができる。上記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ＡＦＦＩＢＯＤＹ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ、またはドメイン抗体とすることもできる。上記抗体には、任意のアイソタイプを持たせることもでき、例えば下記のアイソタイプのいずれかが挙げられる：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ。完全長の抗体が、ＶＨ配列およびＶＬ配列から、標準的な組換えＤＮＡ技術と、当該可変領域配列に作動可能なように連結されることとなる所望の定常領域配列をコードする核酸と、を用いて、作製され得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の以下の位置のうちの１または複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全ての位置）に結合する（配列番号１０４に基づく番号付け）：Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の以下の位置のうちの１または複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全ての位置）から成るヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する（配列番号１０４に基づく番号付け）：Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２のアミノ酸位置２４〜４７（配列番号１０４に基づく番号付け）に跨る、その間にある、且つ／またはそれと重なる、ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と同じ、ＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する。他の実施形態において、上記抗体は、ＴＮＦＲ２への結合において本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と競合する。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、非改変型の同一抗体と比較してエフェクター機能を増強するように改変されたものである。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、非改変型の同一抗体との比較で抗腫瘍活性の増加を示すものである。
【０１９３】
これを受けて、上記抗ＴＮＦＲ抗体の可変領域は、非天然起源のＦｃ領域に連結されていてもよく、例えば、１または複数の活性化性Ｆｃ受容体（ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩａ、またはＦｃγＩＩＩａ）への結合性が増強されたＦｃに連結されていてもよい。通常、本明細書に記載の可変領域は、親Ｆｃ配列（例えば、未改変Ｆｃポリペプチド）と比較した場合に、典型的には血中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および／または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などの、当該抗体の１または複数の機能特性を増強するように、１または複数の改変（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸挿入）を含むＦｃに連結されていてもよい。さらに、抗体は、当該抗体の１または複数の機能特性を変化させるように、化学修飾を受けていてもよいし（例えば、１または複数の化学部分を当該抗体に結合することが可能である）、あるいはその糖鎖付加を変化させるような改変を受けていてもよい。以下、これらの実施形態のそれぞれをさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けはカバット（Ｋａｂａｔ）のＥＵインデックスの番号付けである。
【０１９４】
抗体医薬のＦｃγ受容体結合はその抗腫瘍活性にとって重要であり得る（Ｃｌｙｎｅｓら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２０００年；６巻：頁４４３〜６）。マウスおよびヒトの両方が、活性化性のＦｃγ受容体（例えば、マウスではｍＦｃγＲＩ、ｍＦｃγＲＩＩＩ、またはｍＦｃγＲＩＶ、ヒトではｈＦｃγＲＩ、ｈＦｃγＲＩＩａ、ｈＦｃγＲＩＩｃ、ｍＦｃγＲＩＩＩａ、またはｍＦｃγＲＩＩＩｂ）と、抑制性のＦｃγ受容体（マウスではｍＦｃγＲＩＩｂ、ヒトではｈＦｃγＲＩＩｂ）とを有している（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８年；８巻：頁３４〜４７）。Ｆｃγ受容体結合は、１）活性化性Ｆｃγ受容体を介した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、オプソニン作用、または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などの抗体のエフェクター機能の寄与（Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２０１５年；２８巻：頁２８５〜９５）；または、２）Ｆｃγ受容体発現細胞種上の抗体のクラスタリングを介した受容体活性化作用の増強（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１５年；３６巻：頁３２５〜３６  を表し得る。これを受けて、いくつかの実施形態において、アゴニスト活性およびＴ細胞の共刺激を媒介する抗ＴＮＦＲ２抗体が、本明細書で提供される。受容体活性化作用の増強において、抑制性Ｆｃγ受容体であるＦｃγＲＩＩｂが、受容体活性化作用を促進するのに最も重要なものとして報告されている（例えば、Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２０１６年；２９巻：頁８２０−３１を参照）。
【０１９５】
各種抗体ＩｇＧアイソタイプは、特定のＦｃγ受容体との結合に関して、優先度が異なる（Ｂｒｕｈｎｓら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２年；１１９巻：頁５６４０〜９）。ヒトにおいて、ＩｇＧ１抗体は、活性化性Ｆｃγ受容体に対する親和性が高いことから、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰなどのエフェクター機能の媒介において、優先度の高いアイソタイプである。各種Ｆｃγ受容体への結合性プロファイルを変化させる、故に抗体の活性を調節することが可能な、抗体Ｆｃに対する各種変異が報告されている。Ｎ２９７Ａ変異（ＮＡ）、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ変異（ＤＡＮＡ）、またはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｇ変異（ＤＡＮＧ）は、全てのＦｃγ受容体への結合を低減または消失させるため（Ｌｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１７年；２９２巻：３９００〜８）、エフェクター機能または増強された受容体活性化作用の能力を低減させる。Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異（ＬＡＬＡ）は、全てのＦｃγ受容体に対する結合を低減または消失させる（Ａｒｄｕｉｎら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１５年；６３巻：頁４５６〜６３）。同様に、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合性が増強され、アゴニスト活性が増大した変異が報告されており（例えば、Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２０１６；２９：８２０〜３１を参照）、例えば、Ｓ２６７Ｅ変異（ＳＥ）、Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆ変異（ＳＥＬＦ）、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｖ９）、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｖ１０）、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｖ１１）、またはＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異（Ｖ１２）（Ｍｉｍｏｔｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２０１３年；２６巻：頁５８９〜９８）などである。
【０１９６】
これを受けて、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、バリアントＦｃ領域（例えば、バリアントＩｇＧ１Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記バリアントＦｃ領域は、当該Ｆｃ領域の対応する非バリアント型を用いた場合に確認される結合性と比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合性を増加させる（例えば、上記バリアントＦｃ領域がバリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域である場合、対応する非バリアント型は野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である）。いくつかの実施形態において、上記バリアントＦｃ領域（例えば、バリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域）は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体に対する結合性を増加させる。いくつかの実施形態において、上記バリアントＦｃ領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比較して、抗体クラスタリングを増大させる。いくつかの実施形態において、上記抗体は、バリアントＦｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域の対応する非バリアント型を有する抗体と比較して、アゴニスト活性の増大を示す。いくつかの実施形態において、上記抗体は、Ｔ細胞を共刺激する。いくつかの実施形態において、上記バリアントＦｃ領域は、バリアントＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、２６７Ｅ変異（ＳＥ）、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（ＳＥＬＦ）、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異、Ｅ２３３Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異、またはＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ変異を有する。エフェクター機能を変化させるためのＦｃ領域に対する他の例示的な改変を以下に記載する。
【０１９７】
親Ｆｃと比較した場合に、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増大を示す、（ｂ）抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増大を示す、（ｃ）補体仲介性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＤＣ）の増大を示す、（ｄ）Ｃ１ｑに対する親和性の増加を示す、且つ／または（ｅ）Ｆｃ受容体に対する親和性の増加を示す、Ｆｃバリアントを作製するための改変がＦｃ領域になされ得る。このようなＦｃ領域バリアントは、通常、Ｆｃ領域にアミノ酸改変を少なくとも１つは含むこととなる。アミノ酸改変を組み合わせることが特に望ましいと考えられている。例えば、バリアントＦｃ領域は、その中に２つ、３つ、４つ、５つなどの置換を含んでいてもよく、例えば、本明細書で特定された、特定のＦｃ領域の位置の置換を含んでいてもよい。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することで、抗体のエフェクター機能を変化させることにより、変化させられる。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性は変化しているが、親抗体の抗原結合性は保持しているように、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２番アミノ酸残基から選択される１または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。親和性の変化対象のエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方Ｗｉｎｔｅｒらによる、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号で詳細に説明されている。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、下記の位置における１または複数のアミノ酸を改変することで、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるように、且つ／または、Ｆｃγ受容体に対する親和性を増加させるように、改変され得る：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、または４３９。例示的な置換としては、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅが挙げられる。例示的な置換の組み合わせとしては、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられる。ＦｃｙＲおよび補体の相互作用を増強するための他の改変として、２９８Ａ置換、３３３Ａ置換、３３４Ａ置換、３２６Ａ置換、２４７Ｉ置換、３３９Ｄ置換、３３９Ｑ置換、２８０Ｈ置換、２９０Ｓ置換、２９８Ｄ置換、２９８Ｖ置換、２４３Ｌ置換、２９２Ｐ置換、３００Ｌ置換、３９６Ｌ置換、３０５Ｉ置換、および３９６Ｌ置換が挙げられるが、これらに限定はされない。これらおよび他の改変は、Ｓｔｒｏｈｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年；２０巻：頁６８５〜６９１に概説されている。
【０２００】
Ｆｃγ受容体への結合性を増加させるＦｃ改変としては、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２４、３２７、３２９、３３０、３３５、３３７、３３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９番のアミノ酸位置の任意の１または複数におけるアミノ酸改変が挙げられ、Ｆｃ領域内の残基の番号付けはカバット（Ｋａｂａｔ）（ＷＯ００／４２０７２）のＥＵインデックスの番号付けである。
【０２０１】
抑制性受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を増強するＦｃバリアントが使用される場合もある。このようなバリアントは、免疫調節活性をＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞（Ｂ細胞および単球などを含む）に関連付けられたＦｃ融合タンパク質を提供し得る。１つの実施形態において、上記Ｆｃバリアントは、１または複数の活性化性受容体と比較した場合で、ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性の選択的な増強を実現する。ＦｃｙＲｌｌｂに対する結合性を変化させるための改変としては、ＥＵインデックスに基づいて、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２番からなる群から選択される位置における１または複数の改変が挙げられる。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性を増強するための例示的な置換としては、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅが挙げられるが、これらに限定はされない。ＦｃｙＲｌｌｂに対する結合性を増強するための他のＦｃバリアントとしては、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆが挙げられる。
【０２０２】
Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合特性は、当該技術分野において公知の種々のインビトロアッセイ法（生化学ベースまたは免疫学ベースのアッセイ）によって求めることができ、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、またはカイネティクス法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ解析）、並びに、間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などの他の方法が挙げられるが、これらに限定はされない。これらおよび他の方法では、検査対象の１または複数の成分上の標識が利用されてもよく、且つ／あるいは、色素生産標識、蛍光標識、発光標識、または同位体標識を含むがこれらに限定はされない種々の検出法が採用されてもよい。結合親和性およびカイネティクスの詳細な説明については、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てている、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．（編）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、リッピンコット・レイブン社、フィラデルフィア（１９９９年）に見出すことができる。
【０２０３】
ある実施形態では、上記抗体はその生物学的半減期を延長するように改変されている。例えば、この改変は、米国特許第６，２７７，３７５号に記載の通りに、以下の残基のうちの１または複数を変異させて、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることによってなすことができる：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６番。特定の例示的な置換として以下のうちの１または複数が挙げられる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、および／またはＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延長させるため、上記抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載の通りに、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取得されたサルベージ受容体結合エピトープ（ｓａｌｖａｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内に変化を加えることができる。ＦｃＲｎへの結合性を増加させる、且つ／あるいは薬物速度論的特性を向上させる、他の例示的なバリアントとしては、２５９、３０８、４２８、および４３４位における置換が挙げられ、そのような置換としては、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎへのＦｃの結合性を増加させる他のバリアントとしては、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９巻（８号）：頁６２１３〜６２１６、Ｈｉｎｔｏｎら、２００６年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７６巻：頁３４６〜３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、２７６巻（９号）：頁６５９１〜６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ  Ａｃｑｕａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２年、１６９巻：頁５１７１〜５１８０、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、２００６年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８１巻：頁２３５１４〜２３５２４）が挙げられる。ＦｃＲｎとの結合性を調節するための他の改変は、Ｙｅｕｎｇら、２０１０年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８２巻：頁７６６３〜７６７１に記載されている。
【０２０４】
ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングがなされており、結合性が向上したバリアントが報告されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻：頁６５９１〜６６０４参照）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、および３３９位における特定の変異が、ＦｃγＲＩＩＩへの結合性を向上させることが示された。加えて、以下の組み合わせ変異がＦｃγＲＩＩＩ結合性およびＡＤＣＣ活性を向上させることが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓら、前掲論文）。ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合性が強く増強された他のＩｇＧ１バリアントも特定されており、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異およびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントが挙げられ、このバリアントは、カニクイザルにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の最も大きな増加、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合性の減少、および強力な細胞障害活性を示した（Ｌａｚａｒら、２００６年）。アレムツズマブ（ＣＤ５２特異的）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異的）、およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）などの抗体への上記三重変異の導入は、インビトロにおけるＡＤＣＣ活性を大きく増強させる結果となり、上記Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥバリアントはサルにおいてＢ細胞を枯渇させる能力の増強を示した（Ｌａｚａｒら、２００６年）。加えて、Ｂ細胞悪性腫瘍モデルおよび乳がんモデルのヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現する遺伝子導入マウスにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合性の増強と、それと同時にＡＤＣＣ活性の増強を示した、Ｌ２３５Ｖ変異、Ｆ２４３Ｌ変異、Ｒ２９２Ｐ変異、Ｙ３００Ｌ変異、およびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が特定された（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、２０１１年）。使用することができる他のＦｃ変異としては、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓが挙げられる。
【０２０５】
別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、改変されたものである。例えば、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体が作製され得る（すなわち、当該抗体はグリコシル化を含まない）。例えば、上記抗体の抗原に対する親和性を増加させるように、グリコシル化を変化させることができる。このような炭水化物の改変は、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させることで達成できる。例えば、可変領域フレームワークのグリコシル化部位を１または複数除去することで、当該部位におけるグリコシル化を排除する結果となる、１または複数のアミノ酸置換がなされ得る。このようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号でより詳細に説明されている。１つの実施形態では、Ｎ２９７に対しての定常領域グリコシル化が、当該Ｎ２９７残基を別の残基、（例えば、Ｎ２９７Ａ）に変異させ、且つ／あるいは、隣接アミノ酸（例えば、２９８番）を変異させ、Ｎ２９７に対するグリコシル化を低減することによって、防止され得る。
【０２０６】
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体、または二等分（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、グリコシル化の種類が変更された抗体が作製できる。このように変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増大することが示されている。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞で抗体を発現することにより、達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は、当該技術分野で報告されており、組み換え抗体を発現させてグリコシル化が変化した抗体を産生させるための宿主細胞として用いることができる。いくつかの実施形態において、非グリコシル化抗体のエフェクター機能を回復させる変異が、例えば、米国特許第８，８１５，２３７号に記載の通りに、なされ得る。例示的な変異としては、Ｅ２６９Ｄ、Ｄ２７０Ｅ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｈ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｉ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｙ、Ｌ３２８Ａ、およびＬ３２８Ｇが挙げられる。
【０２０７】
また、バリアントＦｃ領域は、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去される、または他のアミノ酸と置換される、配列変異を含んでいてもよい。このような除去により、抗体を産生させるために使用された宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応が回避され得る。システイン残基が除去された場合でも、一本鎖Ｆｃドメインは非共有結合的に結合した二量体Ｆｃドメインを形成できる。
【０２０８】
ＩＶ．抗ＴＮＦＲ２抗体と同じエピトープに結合する、または抗ＴＮＦＲ２抗体と競合する抗体
また、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と同じ、ＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する抗体が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体として、ＴＮＦＲ２への結合において競合する抗体が、本明細書で提供される。
【０２０９】
交差競合抗体は、標準的な結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と交差競合するその能力に基づいて、スクリーニングできる。
【０２１０】
抗体が本明細書に記載の抗体と「同じＴＮＦＲ２上のエピトープ」に結合していることを判定するための技術として、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、これにより、エピトープの原子レベルの分解能が実現される。他の方法では、抗原断片または抗原の変異型への上記抗体の結合性がモニターされ、抗原配列内のアミノ酸改変により結合性が減少した場合、エピトープ成分であることを示している。方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、または標的タンパク質のプロテアーゼ消化物から特異的な短ペプチド（未変性の三次元形態であっても変性型形態であってもよい）をアフィニティー分離する目的抗体の能力に基づくものであってもよい。上記ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用された抗体に対応するエピトープを定義するためのリードと見なされる。エピトープマッピング用に、立体構造的な不連続エピトープをマッピングすることが示された計算アルゴリズムも開発された。
【０２１１】
エピトープまたはエピトープを含む領域は、ＴＮＦＲ２にまたがる一連の重複ペプチドへの結合性についてスクリーニングを行うことでも、特定できる。あるいは、エピトープが同じであり、そのため本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と特性が似ている抗体のセレクションを導くために、Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻：頁８９９の方法が用いられてもよい。ファージディスプレイを用いて、まず、抗ＴＮＦＲ２抗体の重鎖を（例えば、ヒト）軽鎖のレパートリーとペアリングすることで、ＴＮＦＲ２と結合する抗体がセレクションされ、次いで、新たな軽鎖を（例えば、ヒト）重鎖のレパートリーとペアリングすることで、エピトープまたはエピトープ領域が本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と同じである、（例えば、ヒト）ＴＮＦＲ２と結合する抗体がセレクションされる。あるいは、本明細書に記載の抗体のバリアントは、本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列の変異誘発によって得ることができる。
【０２１２】
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：頁１０８１によって報告されたアラニンスキャニング変異誘発、または他のいくつかの、ＴＮＦＲ２におけるアミノ酸残基の点変異誘発形態を用いて、抗ＴＮＦＲ２抗体に対する機能的エピトープが決定されてもよい。
【０２１３】
特定の抗体による、エピトープまたはエピトープ領域（「エピトープ領域」は当該エピトープを含む領域または当該エピトープと重複する領域である）との結合は、当該抗体のＴＮＦＲ２断片を含むペプチドへの結合性を評価することにより、求められてもよい。ＴＮＦＲ２配列を含む一連の重複ペプチドが、合成され、例えば、直接ＥＬＩＳＡにおいて、競合ＥＬＩＳＡ（ペプチドがマイクロタイタープレートのウェルに結合されたＴＮＦＲ２への抗体の結合を妨げる能力について評価される）において、またはチップ上で、結合性に基づいてスクリーニングされ得る。このようなペプチドスクリーニング法は、いくつかの不連続な機能的エピトープ、すなわち、ＴＮＦＲ２ポリペプチド鎖の一次配列上で連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープ、を検出可能でなくてもよい。
【０２１４】
エピトープは、ＨＤＸ−ＭＳおよびタンパク質の高速光化学酸化（Ｆａｓｔ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＦＰＯＰ）などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法で特定されてもよい。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、Ｗｅｉら（２０１４年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１９巻：頁９５におけるさらなる説明の通りに実行されてもよく、その方法は参照によって本明細書に明確に援用されたものとする。ＦＰＯＰは、例えば、ＨａｍｂｌｅｙおよびＧｒｏｓｓ（２００５年）、Ｊ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、１６巻：頁２０５７に記載の通りに実行されてもよく、その方法は参照によって本明細書に明確に援用されたものとする。
【０２１５】
抗ＴＮＦＲ２抗体によるエピトープ結合は構造に基づいた方法で求められてもよく、例えば、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリング、および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などであり、ＮＭＲ分光法としては、遊離状態の場合および目的抗体と結合して複合体となっている場合のＴＮＦＲ２における不安定なアミド水素の水素重水素交換率のＮＭＲ測定が挙げられる（Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎら（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：頁１１３３５；Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎら（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２巻：頁６８８４）。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の以下の位置のうちの１または複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全ての位置）に結合する（配列番号１０４に基づく番号付け）：Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７。例えば、１つの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２９位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位およびＱ２６位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位およびＱ２９位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位およびＱ２９位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２９位およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２９位およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＭ３０位およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、およびＱ２９位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２９位、およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２９位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｍ３０位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位、Ｑ２９位、およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位、Ｑ２９位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２９位、Ｍ３０位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、Ｑ２９位、およびＭ３０位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、Ｑ２９位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＱ２６位、Ｑ２９位、Ｍ３０位、およびＫ４７位に結合する。別の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上のＹ２４位、Ｑ２６位、Ｑ２９位、Ｍ３０位、およびＫ４７位に結合する。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２上の以下の位置のうちの１または複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全ての位置）から成るヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する（配列番号１０４に基づく番号付け）：Ｙ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、ヒトＴＮＦＲ２のアミノ酸位置２４〜４７（配列番号１０４に基づく番号付け）に跨る、その間にある、且つ／またはそれと重なる、ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープに結合する。
【０２１８】
Ｖ．核酸分子
また、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子が本明細書で提供される。上記核酸は、ホールセル中に存在する核酸であってもよいし、細胞溶解液中に存在する核酸であってもよいし、あるいは、部分的に精製された形態の核酸であっても実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。本明細書に記載の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、イントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。特定の実施形態では、上記核酸はｃＤＮＡ分子である。本明細書に記載の核酸は、標準的な分子生物学的手法を用いて得ることができる。抗体をハイブリドーマ（例えば、以下でさらに説明されるようにヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから作製されたハイブリドーマ）に発現させる場合、当該ハイブリドーマによって産生される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡクローニング法で得ることができる。抗体を免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ法を用いて）得る場合、当該抗体をコードする核酸は当該ライブラリーから回収することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＦＮＲ２抗体のいずれかの、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、または重鎖配列および／もしくは軽鎖配列、をコードする核酸分子が、本明細書で提供される。本明細書に記載のヌクレオチド配列（例えば、核酸分子）を含む宿主細胞が本明細書で包含される。
【０２２０】
ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を得た後、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子に変換するように、Ｆａｂ断片遺伝子に変換するように、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、標準的な組換えＤＮＡ法でさらなる操作を与えることができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に、作動可能なように連結される。用語「作動可能なように連結された」とは、この文脈で使用された場合、上記２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、上記２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味することが意図されている。
【０２２１】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１〜３２４２を参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【０２２２】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能なように連結することにより、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１〜３２４２を参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域とすることができる。
【０２２３】
また、核酸分子の翻訳後に得られるアミノ酸配列を変化させない保存的置換を有する核酸分子が、本明細書で提供される。
【０２２４】
ＶＩ．抗体をスクリーニングする方法および抗体を産生させる方法
本明細書において提供される抗ＴＮＦＲ２抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）は、通常、標準的な組み換えＤＮＡ法によって作製される。加えて、モノクローナル抗体は、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換もしくは癌化、または、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いた酵母ディスプレイ法もしくはファージディスプレイ法などの、種々の公知の手法を用いて、産生させることができる。特定の実施形態において、上記抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０２２５】
１つの実施形態において、抗ヒトＴＮＦＲ２モノクローナル抗体を作製するための方法が、本明細書で提供される。モノクローナル抗体は、周知の手法を用いて容易に作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所、１９８８年を参照；参照によって本明細書に援用されたものとする）。典型的には、この手法は、好適な動物を、担体タンパク質（例えば、ＫＬＨ、ウシ血清アルブミン）に結合された選択されたポリペプチド（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたは目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープを含むポリペプチド）で免疫することを含む。
【０２２６】
上記の免疫用組成物は抗体産生細胞を刺激するために有効な方法で投与される。マウスおよびラットなどのげっ歯類が好ましいが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用も可能である。ラットの使用はある特定の利点を与える場合もあるが（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年、頁６０〜６１；参照によって本明細書に援用されたものとする）、マウスが好ましく、最も頻繁に使用され、一般的に安定な融合体が高い割合で得られることから、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好ましい。免疫後、抗体作製用プロトコルで使用されるＢリンパ球（Ｂ細胞）のセレクションが行われる。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃腺、またはリンパ節から得られたものであってもよいし、あるいは末梢血試料から得られたものであってもよい。通常、動物の一団が免疫され、抗体価が最も高い動物の脾臓が摘出され、注射器で脾臓をホモジナイズすることにより脾臓内リンパ球が得られる。次いで、免疫動物由来の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を産生するＢリンパ球は、不死骨髄腫細胞の細胞、通常は免疫された動物と同じ種のうちの１つ、と融合される。ハイブリドーマ作製用融合法で使用するのに好適な骨髄腫細胞株は、抗体産生型ではなく、融合効率が高く、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持するある特定の選択培地中で増殖できなくする酵素欠乏を有することが好ましい。例示的な骨髄腫細胞としては、例えば、マウスの場合では、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが挙げられ；ラットの場合では、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０、または上記マウス細胞株のうちの１つが挙げられ；ヒト細胞融合体に関してはＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６が有用である。
【０２２７】
ハイブリドーマ産生
抗体産生型の脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを作製する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する１または複数の作用因子（化学的または電気的な作用因子）の存在下で、体細胞と骨髄腫細胞とを４：１の比率で混合することを含むが、この比率は約２０：１から約１：１までそれぞれ変動させてもよい。センダイウイルスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなど）を用いた融合法が当該技術分野において公知である。電気誘導型の融合法の使用も適している。
【０２２８】
生存している融合後のハイブリッドが、組織培養培地中でのヌクレオチドの新規合成を阻止する薬剤を通常は含有する選択培地中での培養により、親の未融合細胞から区別される。例示的な薬剤はアミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、上記培地にはヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが添加される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、上記培地にはヒポキサンチンが添加される。ＨＡＴ培地が使用される場合、ヌクレオチドサルベージ経路を作動可能な細胞のみがＨＡＴ培地中で生存可能となる。骨髄腫細胞はサルベージ経路の重要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、を欠損しているため、生存することができない。選択培地中で生存できる細胞のみが、骨髄腫およびＢ細胞から形成されるハイブリッドとなる。この培養過程により、ハイブリドーマ集団が得られ、そこから特定のハイブリドーマのセレクションが行われる。通常、ハイブリドーマのセレクションは、マイクロタイタープレート内で単一クローン希釈により細胞を培養した後、個々のクローン含有上清（約２〜３週間後）を所望の抗ヒトＴＮＦＲ２反応性について検査することによって、行われる。例示的なアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ、バイオレイヤー干渉法などが挙げられる。
【０２２９】
セレクション後のハイブリドーマは、段階希釈され、個々の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体産生細胞株クローンが作製され、その後、これらのクローンは無期限に増殖してモノクローナル抗体を供給できる。これらの細胞株は、２種類の基本的な方法におけるモノクローナル抗体産生に使用されてもよい。上記ハイブリドーマの試料が、元の融合体のための体細胞および骨髄腫細胞を得るために使用された種類の組織適合性動物に、注射（多くの場合、腹膜腔への注射）され得る。注射後の動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発達させる。そして、この動物の体液（血清または腹水など）を利用することで、モノクローナル抗体を高濃度で得ることができる。個々の細胞株はインビトロで培養することもでき、その場合、モノクローナル抗体は培地中に自然に分泌され、その培地からモノクローナル抗体を高濃度で容易に得ることができる。いずれの手段で産生されたモノクローナル抗体も、通常、例えば、濾過法、遠心分離法、および種々のクロマトグラフ法（ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーなど）を用いた、さらなる精製を受けることとなるが、これらの精製法は全て当業者に周知である。これらの精製法はそれぞれ、所望の抗体を混合物の他の成分から分離するための分画を含む。抗体作製に特に適した分析法としては、例えば、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧ−セファロースクロマトグラフィーが挙げられる。
【０２３０】
抗ＴＮＦＲ２抗体のハイスループットスクリーニング
また、ヒトＴＮＦＲ２エピトープ（本明細書に記載のエピトープなど）へ結合する分子を求める、ライブラリーのハイスループットスクリーニング法が本明細書で提供され、例えば、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびｃＤＮＡディスプレイが提供される。
【０２３１】
１つの実施形態において、ファージミドライブラリーを用いた抗ヒトＴＮＦＲ２抗体をスクリーニングするための方法が、本明細書で提供される。例示的なファージディスプレイプロトコルは、例えば、米国特許第７，８４６，８９２号、同第８，８４６，８６７号、国際公開第１９９７／００２３４２号、および同第２００７／１３２９１号に見出すことができ、これらは参照により本明細書に援用されたものとする。現在では、組み換え技術により、一連の抗体をコードする組み換え遺伝子から所望の特異性を有する抗体を作製することが可能である。特定の組み換え法は、免疫動物（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたは目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープを含むペプチドで免疫された動物）の脾臓から単離されたＲＮＡから作製されたコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を含む。そのような方法の場合、免疫動物の脾臓から単離されたＲＮＡからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが作製され、抗原を発現する細胞および対照細胞を用いたパニングにより適切な抗体を発現するファージミドがセレクションされる。従来のハイブリドーマ技術に優るこのアプローチの利点は、およそ１０４倍の多くの抗体を１回で産生およびスクリーニングできることであり、Ｈ鎖およびＬ鎖の組み合わせにより新たな特異性が生み出され、これが適切な抗体が作製される割合をさらに増加させる点である。
【０２３２】
細菌内に多様な抗体分子からなる大きなレパートリーを作製するための１つの方法は、バクテリオファージλをベクターとして利用する（Ｈｕｓｅら、１９８９年；参照によって本明細書に援用されたものとする）。上記λベクターを用いた抗体の産生は、重鎖集団および軽鎖集団の各ＤＮＡ配列を別々の開始ベクターにクローニングすることを含む。その後、これらのベクターが無作為に組み合わされることで、抗体断片を形成するための重鎖および軽鎖の共発現を指示する単一ベクターが形成される。上記の重鎖ＤＮＡ配列および軽鎖ＤＮＡ配列は、選択された抗原（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインまたは目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープを含むペプチド）で免疫された動物由来の脾臓細胞（またはそのハイブリドーマ）から単離されたｍＲＮＡの、増幅によって得られ、ＰＣＲまたは関連の増幅法によって得られることが好ましい。重鎖配列および軽鎖配列は、通常、プライマーを用いて増幅されるが、これらのプライマーは増幅されたＤＮＡセグメントの両端に制限酵素認識部位を組み入れることで、重鎖セグメントおよび軽鎖セグメントの開始ベクターへのクローニングを促進する。
【０２３３】
完全または部分的な合成抗体結合部位、またはパラトープ、の大きなライブラリーを作製およびスクリーニングするための別の方法は、Ｍ１３、ｆｌ、またはｆｄなどの繊維状ファージに由来するディスプレイベクターを利用する。「ファージミド」と称される、これらの繊維状ファージディスプレイベクターは、多様且つ新規の免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリーをもたらす。この技術は、繊維状ファージコートタンパク質膜アンカードメインを、遺伝子産物および繊維状ファージ複製の組み立て段階中の遺伝子を結び付けるための手段として用い、コンビナトリアルライブラリーからの抗体のクローニングおよび発現に用いられている。一般的な意味では、上記方法は、単一のベクター系を用いて抗体遺伝子レパートリーから予め選択されたリガンド結合特異性のクローニングおよびスクリーニングを同時に行うための系を実現する。予め選択されたリガンド結合能を求めてライブラリーの単離されたメンバーをスクリーニングすることで、発現された抗体分子の結合能を、当該メンバーをコードする遺伝子を当該ライブラリーから単離するための好都合な手段と関連付けることが可能となる。
【０２３４】
繊維状ファージをベースとしたコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のシャフリングにより、ライブラリーのクローニングされた重鎖遺伝子の相補性決定領域の１もしくは複数を変化させることにより、または、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応によりライブラリーにランダム変異を組み入れることにより、増加させることができる。ファージミドライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法は、米国特許第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号に記載されており、これらは各々参照によって本明細書に援用されたものとする。
【０２３５】
別の実施形態において、酵母ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９７年；１５巻：頁５５３）およびバクテリアディスプレイなどの、細胞ベースのディスプレイ技術を用いた、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体をスクリーニングするための方法が、本明細書で提供される。ランダム化された超可変領域を含有する、ポリペプチド、例えば一本鎖ポリペプチド、抗体、または抗体断片、を発現する細菌細胞または酵母細胞のライブラリーを作製およびスクリーニングするための確立された手順は、例えば、米国特許第７，７４９，５０１号、米国特許出願公開第２０１３／００８５０７２号、ｄｅ  Ｂｒｕｉｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９年；１７巻：頁３９７に見出すことができ；その各々の教示は参照によって本明細書に援用されたものとする。
【０２３６】
別の実施形態において、指定の超可変領域内に変異を含有する一本鎖ポリペプチド、抗体、または抗原結合性断片をコードするランダム化ポリヌクレオチドライブラリーのインビトロ翻訳を用いる、ヌクレオチドディスプレイ技術を用いて抗ヒトＴＮＦＲ２抗体をスクリーニングするための方法（例えば、国際公開第２００６／０７２７７３号、米国特許第７，０７４，５５７号を参照）が、本明細書で提供される。抗体は、ｍＲＮＡの代わりにｃＤＮＡが使用されることを除いてｍＲＮＡディスプレイに類似している技術である、ｃＤＮＡディスプレイを用いて作製することもできる。ｃＤＮＡディスプレイ技術は、例えば、Ｕｅｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１２年；８０５巻：頁１１３〜１３５に記載されている）。
【０２３７】
上記のインビトロディスプレイ技術は、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の親和性を改善するためにも用いることができる。例えば、特定の抗ＴＮＦＲ２抗体の超可変領域内の特定部位に目的の変異を有する一本鎖ポリペプチド、抗体、およびその抗原結合性断片のライブラリーを用いることができる。次いで、これらの変異型の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドを、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ｃＤＮＡディスプレイで用いることで、目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープに特異的に結合するポリペプチドのスクリーニングを行うことができる。
【０２３８】
ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることで、目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープに結合する抗ＴＮＦＲ２抗体を同定することもできる。抗体ライブラリーまたは抗体断片ライブラリーなどのコンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、当該技術分野において承認されている遺伝子発現技術を用いた、真核生物または原核細胞における抗体またはその抗原結合性断片のランダム化超可変領域をコードするポリヌクレオチドの発現などによって、得ることができる。得られる抗体の不均一混合物が、標準的な技術を用いて上記細胞から単離され、表面に固定されたＴＮＦＲ２由来ペプチドへの結合能についてスクリーニングされ得る。適切な緩衝液を用いて非結合抗体が洗い流され、結合したままの抗体がＥＬＩＳＡベースの検出プロトコルを用いて検出され得る。ＴＮＦＲ２ペプチドに特異的に結合する抗体断片の配列は当該技術分野において公知の技術で決定することができ、例えば、エドマン分解、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および二次元ゲル電気泳動が特に挙げられる（例えば、国際公開第２００４／０６２５５３号参照）。
【０２３９】
組換えＤＮＡ技術、宿主細胞トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）、およびトランスジェニック動物を用いた抗ＴＮＦＲ２抗体の産生
また、例えば、当該技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：頁１２０２）を用いて、宿主細胞トランスフェクトーマで抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を産生させる方法が、本明細書で提供される。例えば、抗体、またはその抗体断片の発現のため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするするＤＮＡを、標準的な分子生物学的手法（例えば、目的抗体を発現するハイブリドーマ（上記のハイブリドーマなど）を用いたＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって得て、このＤＮＡを、各遺伝子が転写調節配列および翻訳調節配列に作動可能なように連結されるように、発現ベクターに挿入できる。これに関連して、用語「作動可能なように連結された」とは、ベクター内の転写調節配列および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳の調節というそれらの意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされていることを意味する。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現用宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができ、あるいは、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上およびベクター上の相補的な制限酵素認識部位同士のライゲーション、または制限酵素認識部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を用いて、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターに挿入し、ＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントに作動可能なように連結させ、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントに作動可能なように連結させることで、任意の抗体アイソタイプの完全長の抗体遺伝子を作製することができる。
【０２４０】
重鎖および重鎖を発現させる場合、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。原核生物宿主細胞または真核生物性宿主細胞のいずれにおいても本明細書に記載の抗体を発現させることは可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳類宿主細胞、における抗体の発現が最も好ましく、というのも、このような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞よりも、適切にフォールディングされた免疫学的活性を有する抗体を構築および分泌させやすいためである。本明細書に記載の組み換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：頁４２１６〜４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９巻：頁６０１〜６２１などに記載のＤＨＦＲ選択マーカーとの使用を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入したら、上記宿主細胞における上記抗体の発現を可能にするのに十分な期間、または、より好ましくは、上記宿主細胞を増殖させた培地中への上記抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、上記宿主細胞を培養することによって、上記抗体が産生される。標準的なタンパク質精製法を用いて、抗体を上記培地から回収することができる。
【０２４１】
さらに別の実施形態においては、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを用いて、ヒトＴＮＦＲ２上の特定のエピトープに対するヒトモノクローナル抗体を作製させることができる（例えば、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに属する、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらに属する、米国特許第５，５４５，８０７号；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに属する、国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号、および同第９９／４５９６２号、；並びに、Ｋｏｒｍａｎらに属する、国際公開第０１／１４４２４号、を参照）。
【０２４２】
別の実施形態において、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなどの、導入遺伝子上および導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｏｍｏｓｏｍｅ）上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを用いて、ヒトＴＮＦＲ２上の特定のエピトープに対するヒト抗体を産生させることができる（例えば、Ｉｓｈｉｄａらに属する国際公開第０２／４３４７８号を参照）。
【０２４３】
またさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当該技術分野において利用可能であり、特定のヒトＴＮＦＲ２エピトープを認識する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を発現させるために使用することができる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（アブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．））と称される別のトランスジェニック系を使用することができ；このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに属する、米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載されている。別の好適なトランスジェニック動物系は、ＨｕＭＡｂマウス（メダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ））であり、これは、ヒトの重鎖（μおよびγ）およびヒトκ軽鎖の非再編成免疫グロブリン配列を、内在性のμ鎖遺伝子座およびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共にコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻（６４７４号）：頁８５６〜８５９を参照）。さらに別の好適なトランスジェニック動物系はＫＭマウスであり、国際公開０２／４３４７８号に詳述されている。
【０２４４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソミック動物系が当該技術分野においては利用可能であり、抗ＴＮＦＲ２抗体を産生させるために使用することができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体（ｔｒａｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）の両方を保有するマウスが使用できる。さらに、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を保有する雌ウシが当該技術分野において報告されており、抗ＴＮＦＲ２抗体を産生させるために使用することができる。
【０２４５】
さらに別の実施形態において、このような抗体を産生するトランスジェニック植物および／または培養植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、およびアヒル雑草など）を用いて、抗体を作製することができる。誘導性プロモーターなどを用いてこのような抗体を産生させるために、例えば、抗体を発現するトランスジェニックタバコ葉を使用することができる。また、このような抗体およびその抗原結合部分を発現させるために、トランスジェニックトウモロコシを使用することができる。また、タバコ種およびジャガイモ塊茎などを用いて、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体部分を含むトランスジェニック植物種から、抗体を大量に産生できる。
【０２４６】
上記の実施形態において、動物を免疫するために使用された抗原は、例えば、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインとしてもよい。ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを抗原として使用した場合、作製された抗体を、ヒトＴＮＦＲ２上の特定のエピトープ（例えば、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸、５５〜９６番アミノ酸、７８〜９６番アミノ酸、および１２０〜２５７番アミノ酸）と選択的に結合する能力についてさらにスクリーニングする。スクリーニングは、例えば、目的のヒトＴＮＦＲ２エピトープを含むペプチドへの結合を評価するためのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、または本明細書に記載のＴＮＦＲ２キメラを用いる結合アッセイを用いて実施できる。次いで、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体のエピトープまたはＴＮＦＲ２キメラへの結合特徴を共有する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体がセレクションされる。
【０２４７】
別の実施形態において、動物を免疫するために使用された抗原、またはライブラリー（例えば、ファージミドライブラリー、酵母表面ディスプレイライブラリー）をスクリーニングするために使用された標的は、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体によって認識されるヒトＴＮＦＲ２エピトープを含むペプチドである。本明細書に記載の抗体によって認識されるヒトＴＮＦＲ２の例示的なエピトープとしては、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号１）の２３〜５４番アミノ酸、５５〜９６番アミノ酸、７８〜９６番アミノ酸、および１２０〜２５７番アミノ酸が挙げられる。これらの配列を含むペプチドを、上記の技術を用いて、動物を免疫するために、またはライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。この方法を用いて作製された抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を、例えば、実施例５に記載の方法を用いて、ＴＮＦＲ２キメラに対する結合性についてスクリーニングすることもできるし、あるいは、免疫原として使用されたペプチドに対する選択的結合性についてスクリーニングすることもできる。
【０２４８】
ヒト型化且つ／またはキメラＴＮＦＲ２抗体の産生
本明細書に記載のものなどの、マウスモノクローナル抗体の配列に基づいて、キメラ且つ／またはヒト型化抗体を作製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得て、標準的な分子生物学的技術を用いて非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。
【０２４９】
例えば、キメラ抗体およびその抗原結合性断片は、２種以上の異なる種（例えば、マウスおよびヒト）由来の部分を含む。キメラ抗体を作製するために、当該技術分野において公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに属する米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる。この方法において、非ヒト抗体を、ヒト臨床応用においてより好適なものとなるように改変できる（例えば、ヒト対象においてがんを治療または予防するための方法）。
【０２５０】
あるいは、ヒト型化抗体は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるように改変されたタンパク質配列を有する、ヒト以外の種由来の抗体である。本開示のモノクローナル抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト型化」形態（例えば、ハイブリドーマＡＢＶ３、ＡＢＶ４、ＡＢＶ７、ＡＢＶ１２、ＡＢＶ１３、ＡＢＶ１４、ＡＢＶ１５、ＡＢＶ１８、および／またはＡＢＶ１９によって産生された抗体のヒト型化形態）を包含する。ヒト型化またはＣＤＲ移植ｍＡｂはヒト用の治療薬として特に有用であるが、これは、これらのｍＡｂが、マウス抗体ほど急速には血流からクリアランスされず、有害な免疫反応を通常は引き起こさないためである。
【０２５１】
ヒト型化抗体を作製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、ヒト型化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って実施できる（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：頁５２２〜５２５（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：頁３２３〜３２７（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：頁１５３４〜１５３６（１９８８年））。さらに、本明細書に記載のヒト型化ＴＮＦＲ２抗体は、当該技術分野において公知の種々の技術を用いて作製することができ、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；並びに米国特許第４，８１６，５６７号；同第６，３３１，４１５号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号を参照；各々参照によって本明細書に援用されたものとする）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば、欧州特許５９２，１０６号および同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５号）：頁４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６号）：頁８０５〜８１４；およびＲｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１巻：頁９６９〜９７３を参照；各々参照によって本明細書に援用されたものとする）、鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照；参照によって本明細書に援用されたものとする）、並びに、米国特許第６，４０７，２１３号、同第５，７６６，８８６号、国際公開第９３１７１０５号、Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９巻：頁１１１９〜２５（２００２年）、Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１３巻（５号）：頁３５３〜６０（２０００年）、Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０巻（３号）：頁２６７〜７９（２０００年）、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻（１６号）：頁１０６７８〜８４（１９９７年）、Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（１０号）：頁８９５〜９０４（１９９６年）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５巻（２３号補遺号）：頁５９７３〜５９７７（１９９５年）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５巻（８号）：頁１７１７〜２２（１９９５年）、Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ、Ｇｅｎｅ、１５０巻（２号）：頁４０９〜１０（１９９４年）、およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５巻（３号）：頁９５９〜７３（１９９４年）（各々参照によって本明細書に援用されたものとする）などで開示された技術。しばしば、ＦＷ領域内のフレームワーク（ＦＷ）残基は、抗原結合性を変化、好ましくは改善させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されることとなる。これらのＦＷ置換は、当該技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なＦＷ残基を特定するためのＣＤＲとＦＷ残基の相互作用のモデル化、および特定の位置における異常なＦＷ残基を特定するための配列比較によって、特定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：頁３２３を参照；全体が参照によって本明細書に援用されたものとする）
【０２５２】
いくつかの実施形態において、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト型化形態は、ヒト抗体（レシピエント抗体）において、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、所望の特異性、親和性、および結合能を有するマウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類などのヒト以外の種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基に置換されたものである。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基も、対応する非ヒト残基に置換される（いわゆる「復帰変異」）。加えて、抗体配列内の選択された位置のアミノ酸を変化させるために、ファージディスプレイライブラリーを用いることができる。ヒト型化抗体の特性はヒトフレームワークの選択によっても影響を受ける。さらに、例えば親和性またはエフェクター機能などの抗体特性をさらに改善するために、レシピエント抗体またはドナー抗体には存在しない残基を含むように、ヒト型化且つ／またはキメラ抗体を改変できる。
【０２５３】
このようなヒト型化キメラ抗体において、実質的にインタクトとは言えないヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応する配列に置換されている。実際には、ヒト型化抗体は通常、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＷ残基がげっ歯類抗体内の相似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。抗ＴＮＦＲ２抗体のヒト型化は、ベニヤリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５号）：頁４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６号）：頁８０５〜８１４（１９９４年）；およびＲｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１巻：頁９６９〜９７３（１９９４年））、または鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）（これらの内容はその全体が参照によって本明細書に援用されたものとする）によっても達成できる。
【０２５４】
ヒト型化抗体の作製で使用するために、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインを選択することで、抗原性が低減されることとなる。いわゆる「ベストフィット」法に従って、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対して、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も密接に関連したヒト配列が、抗原結合性、適切な構造形成、および／または目的のヒト型化ｍＡｂの安定性にとって決定的となり得る特定の残基の存在について、スクリーニングされる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：頁２２９６（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：頁９０１（１９８７年）（内容の全体が参照によって本明細書に援用されたものとする）。次いで、得られたＦＷ配列で所望の基準に合うものが、ヒト型化抗体用のヒトドナーＦＷ領域として使用される。
【０２５５】
別の方法では、特定の軽鎖亜群または重鎖亜群のヒト抗体全てのコンセンサス配列由来の特定のＦＷが使用される。同じＦＷを、いくつかの異なるヒト型化抗ＴＮＦＲ２抗体に用いてもよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：頁４２８５（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：頁２６２３（１９９３年）（内容の全体が参照によって本明細書に援用されたものとする）。
【０２５６】
ヒトＴＮＦＲ２に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持したまま、抗ＴＮＦＲ２抗体をヒト型化できる。本発明の１つの態様によれば、親配列およびヒト型化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的なヒト型化産物の解析法によって、ヒト型化抗体が作製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。セレクション後の免疫グロブリン配列候補の可能な三次元立体構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することで、免疫グロブリン配列候補の機能における残基の考えられる役割の解析、すなわち、ＴＮＦＲ２と結合する免疫グロブリン候補の能力に影響する残基の解析が可能となる。このようにして、レシピエント配列およびインポート配列（ｉｍｐｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からＦＷ残基のセレクションおよび組み合わせを行って、所望の抗体特性、例えばＴＮＦＲ２に対する親和性、を達成できる。通常、ＣＤＲ残基が、抗原結合性への影響に、直接的且つ最も実質的に関与する。
【０２５７】
本明細書で開示されたものを含む任意の技術を用いて作製されたＴＮＦＲ２と結合するモノクローナル抗体（またはその一部）の結合特異性は、免疫沈降法によって求めることもできるし、あるいは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、バイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイ）、および／またはスキャチャード解析などのインビトロ結合アッセイによって求めることもできる。
【０２５８】
ある実施形態では、上記の方法のいずれかを用いて作製された抗ＴＮＦＲ２抗体は、本明細書に記載の技術などの当該分野で認知されている技術を用いて、所望の結合特異性および／または親和性を達成するように、さらに変化または最適化してもよい。
【０２５９】
ＶＩＩ．多特異的抗体
本明細書において提供される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）は、本明細書に記載されているようなＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）上の特定のエピトープに対する結合親和性と、少なくとも１つの他の結合特異性と、を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、非ＴＮＦＲ２結合特異性は、がん抗原に対する結合特異性である。多特異的抗体は、完全長抗体として作製することも、あるいは抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２抗体）としても作製することもできる。
【０２６０】
多特異的抗体を作製するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、国際公開第０５１１７９７３号および国際公開第０６０９１２０９号を参照）。例えば、完全長多特異的抗体の作製は、２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現をベースとして行うことができ、ここで、これら２つの鎖は異なる特異性を有する。また、多特異的抗体断片を組換え細胞培養物から作製および直接単離するための様々な技術が報告されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて多特異的抗体を作製することができる。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により多特異的抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。
【０２６１】
特定の実施形態では、多特異的抗体は、ＴＮＦＲ２上のエピトープおよび別の標的分子に結合する多特異性分子が得られるように、誘導体化された、または別の機能分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体に対するリガンド）に連結された、ＴＮＦＲ２上の目的のエピトープに結合する第一抗体（またはその結合性部分）を含む。３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子が得られるように、抗体を誘導体化してもよいし、あるいは２つ以上の他の機能分子に連結してもよい。多特異性分子を作製するため、本明細書で開示される抗体を、多特異性分子が結果として生じるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性ミメティックなどの１または複数の他の結合性分子に、（例えば、化学的共役、遺伝子的融合、非共有結合的会合、または別の様式で）機能的に連結することができる。
【０２６２】
これを受けて、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）上の特定のエピトープに対する第一結合特異性を少なくとも１つ含み、且つ、第二の非ＴＮＦＲ２標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、多特異性分子が企図される。特定の実施形態では、上記の第二標的エピトープはＦｃ受容体であり、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。従って、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、またはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞（ＰＭＮ））と、ＴＮＦＲ２を発現する標的細胞との両方に結合可能な多特異性分子も提供される。これらの多特異性分子は、ＴＮＦＲ２発現細胞をエフェクター細胞に標的化し、ＴＮＦＲ２発現細胞のファゴサイトーシス、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などの、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性を惹起する。
【０２６３】
１つの実施形態において、上記多特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含み、抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖが挙げられる。上記抗体は、軽鎖または重鎖の二量体であってもよいし、あるいは、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているようなＦｖまたは一本鎖構築体などの任意のその最小断片であってもよい。
【０２６４】
上記多特異性分子は、当該技術分野において公知の方法を用いて、構成要素である結合特異性を、例えば、ＦｃＲに対する結合特異性とＴＮＦＲ２に対する結合特異性とを、複合することにより作製できる。例えば、多特異性分子の各結合特異性を別々に生成した後、互いに複合することができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤を用いて、共有結合性の複合を行うことができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、および４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。好ましい複合化剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともピアス・ケミカル社（ロックフォード、イリノイ州）から入手できる。
【０２６５】
結合特異性が抗体である場合、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域同士のスルフヒドリル結合を介して複合体化できる。特定の好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、複合前に、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１個のスルフヒドリル残基、を含むように改変される。
【０２６６】
あるいは、両方の結合特異性を同一のベクターにコードさせ、同一の宿主細胞において発現および構築することができる。この方法は、多特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。多特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子とすることもできるし、あるいは、２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子とすることもできる。多特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含んでいてもよい。多特異性分子を作製するための方法は、米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；および同第５，４８２，８５８号などに記載されている。
【０２６７】
多特異性分子のその特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、またはウエスタンブロットアッセイなどにより確認できる。これらの各アッセイでは、通常、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することにより、目的のタンパク質−抗体複合体の存在が検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、当該抗体−ＦｃＲ複合体を認識し特異的に結合する酵素連結型の抗体または抗体断片を用いて検出できる。あるいは、上記複合体は、種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出できる。例えば、上記抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に使用できる。放射性同位元素は、α  γ−βカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用するなどの手段により検出することもできるし、あるいは、オートラジオグラフィーで検出することもできる。
【０２６８】
ＶＩＩＩ．免疫複合体
本明細書において提供される免疫複合体は、本明細書に記載の抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）を別の治療薬に複合体することにより形成できる。好適な薬剤としては、例えば、細胞傷害性薬物（例えば、化学療法剤）、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、および／または放射性同位元素（すなわち、放射性物質複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））が挙げられる。
【０２６９】
使用できる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンジン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。細胞毒または細胞傷害性薬物のさらなる例としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｓｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２７０】
放射性物質と複合体化された抗ＴＮＦＲ２抗体の作製に、種々の放射性核種が利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２７１】
免疫複合体を用いて所与の生物学的反応を改変することもでき、薬剤部分は従来の化学治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチド（例えば、リンホカイン、腫瘍壊死因子、ＩＦＮγ、増殖因子）であり得る。
【０２７２】
免疫複合体は、３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸塩（トリレン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジベンゼンなど）などの種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製できる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化するための例示的なキレート化剤である（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照）。
【０２７３】
このような治療的部分を抗体に複合体化するための技術は周知であり、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）の、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、頁２４３〜５６（アラン・Ｒ・リス社（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、１９８５年）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）の、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、頁６２３〜５３（マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、１９８７年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）の、Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、頁４７５〜５０６（１９８５年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）の、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、頁３０３〜１６（アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８５年）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻：頁１１９〜５８（１９８２年）を参照されたい。
【０２７４】
ＩＸ．アッセイ
抗体（例えば、本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体のＣＤＲ配列を有する抗体）を作製した後、これらの抗体は、当該技術分野において公知の種々のアッセイを用いて、本明細書に記載の特性などの種々の特性（例えば、ＴＮＦＲ２への結合性）についての、スクリーニングまたは検査にかけられ得る。
【０２７５】
１つの実施形態において、上記抗体は、例えば、精製ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２の精製細胞外ドメインまたはヒトＴＮＦＲ２内の目的エピトープを含むペプチド）および／またはＴＮＦＲ２発現細胞を用いて、ＴＮＦＲ２への結合性について、スクリーニングまたは検査される（例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、またはバイオレイヤー干渉法で）。いくつかの実施形態において、上記抗体は、実施例５に記載のように、ＴＮＦＲ２キメラパネルを用いることで、ＴＮＦＲ２上の特定のエピトープと結合する能力について、スクリーニングされ得る。他の方法では、ヒトＴＮＦＲ２の抗原断片または変異型への上記抗体の結合性がモニターされ、抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合性の減少は、エピトープ成分であることを示しているとしばしば見なされる。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、上記抗体は、ウェスタンブロッティングによって、ＴＮＦＲ２への結合性についてスクリーニングまたは検査される。簡潔に説明すると、ＴＮＦＲ２を発現する細胞から得られた細胞抽出物（例えば、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン）が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられ得る。電気泳動後、分離された抗原が、ニトロセルロース膜に転写され、血清でブロッキングされ、モノクローナル抗体でプロービングされることで、検査が行われ得る。ＩｇＧ結合が、抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出され、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）、セントルイス、ミズーリ州）で発色され得る。
【０２７７】
別の実施形態において、上記抗体は、リガンド（例えば、ＴＮＦα）への結合後に露出されるエピトープに結合する能力（すなわち、ＴＮＦＲ２リガンドのＴＮＦＲへの結合を阻害しない）についてのスクリーニングにかけられる。このような抗体は、例えば、当該抗ＴＮＦＲ２抗体の非存在下（対照）または存在下で、ＴＮＦＲ２発現細胞を標識ＴＮＦＲ２リガンド（例えば、放射性標識またはビオチン化ＴＮＦα）と接触させることにより、特定できる。上記抗体がＴＮＦαのＴＮＦＲ２への結合を阻害しない場合、上記抗体の非存在下における量と比較して、回収される標識量に統計的に有意な減少が確認されることはない。あるいは、上記抗体がＴＮＦαのＴＮＦＲ２への結合を阻害する場合、上記抗体の非存在下における量と比較して、回収される標識量に統計的に有意な減少が確認されることとなる。
【０２７８】
各種抗ＴＮＦＲ２抗体の結合親和性、交差反応性、および結合カイネティクスを分析するための方法としては、当該技術分野において公知の標準的なアッセイ、例えば、実施例に記載される、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００  ＳＰＲ装置（ビアコア社（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）、ウプサラ、スウェーデン）を用いたＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析、またはバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイ）、が挙げられる。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、例えば実施例３に記載されているように、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、およびバイオレイヤー干渉法などの、当該技術分野において承認されている方法を用いて、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を阻害する能力についてのスクリーニングまたは検査にかけられる。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、アゴニスト活性についてのスクリーニングまたは検査にかけられる。アゴニスト活性は、レポーターアッセイ（例えば、ＮＦ−κＢレポーターアッセイ）を用いて検査できる。いくつかの実施形態において、例えば実施例２３に記載されているように、上記抗体はレポーター細胞株と接触させられ、レポーター活性がフローサイトメトリーで求められる。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト活性は、例えば実施例１５、実施例２４、および実施例２６に記載れているように、初代単離Ｔ細胞の増殖、および／または初代単離Ｔ細胞における活性化マーカー発現の誘導を評価することにより、求められる。
【０２８１】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＡＤＣＣを誘導する能力についてのスクリーニングまたは検査にもかけられ得る。簡潔に説明すると、エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）が、目的の抗体（例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体）および／または対照抗体（例えば、アイソタイプ対照）の存在下または非存在下で、標的細胞と一緒に培養される。次いで、標的細胞の死滅が、例えば、実施例２５に記載されているように、フローサイトメトリーなどを用いた、検出可能な標識（例えば、標的細胞が蛍光標識されている場合は蛍光）の定量化に基づいて評価される。
【０２８２】
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイまたはトリチウム標識チミジン取り込みアッセイ、またはフローサイトメトリーといった当該分野で認知されている技術を用いて、腫瘍細胞などの細胞の増殖または生存を阻害する能力についての、抗体の検査（インビボまたはインビトロ）も行われ得る。
【０２８３】
Ｘ．組成物
別の態様において、薬剤的に許容できる担体と一緒に製剤化された、本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体（例えば、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書で提供される。医薬組成物は、当該技術分野において公知の標準方法を用いて、所望の純度を有する有効成分（例えば、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体）を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより、調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、２０００年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）。好ましい医薬組成物は、無菌組成物、注射に適した組成物、および、静脈内注射などによる、所望の投与経路による注射に適した無菌組成物である。
【０２８４】
本明細書で使用される場合、「薬剤的に許容できる担体」は、生理的に適合性の、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌材、抗真菌剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、吸収遅延剤などを包含する。上記担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄内投与、または経上皮投与（例えば、注射または点滴による投与）に好適な担体であることが好ましい。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体は、酸の作用、および当該化合物を不活性化する恐れがある他の自然条件から当該化合物を保護するための物質でコーティングしてもよい。
【０２８５】
組成物は、単独で投与することもできるし、あるいは、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、上記併用療法には、本明細書において提供される組成物を、少なくとも１または複数の追加の治療薬、例えば、がんの治療に使用される他の化合物、薬（ｄｒｕｇ）、および／または剤（ａｇｅｎｔ）（例えば、抗がん剤）と共に含ませることができる。また、抗ＴＮＦＲ２抗体の特定の組み合わせは、個別に投与されても順次に投与されてもよく、追加の治療薬を伴っても伴わなくてもよい。
【０２８６】
組成物は当該技術分野において公知の種々の方法によって投与できる。当業者には理解されることであるが、投与経路および／または投与様式は所望の結果に応じて異なるものとなる。上記抗体は急速な放出から抗体を保護する担体と調製することができ、徐放性製剤などであり、留置用剤、経皮貼布、およびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができ、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などである。このような製剤を調製するための多くの方法が特許取得済みであるか当業者に周知である。
【０２８７】
組成物をある特定の投与経路で投与するために、成分（例えば、抗体）を、その不活性化を抑制するための物質でコーティングすること、または、当該組成物を上記物質と同時に投与すること、が必要となる場合がある。例えば、上記組成物は、適切な担体（例えば、リポソーム）、または希釈剤に含ませて、対象に投与されてもよい。許容できる希釈剤としては、食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦ乳剤および従来のリポソームが挙げられる。
【０２８８】
許容できる担体としては、無菌の水溶液または分散液、および無菌注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌散剤が挙げられる。薬剤的に活性な物質へのこのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が上記抗体と不適合性でない限り、本明細書において提供される組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分を上記組成物に組み入れることもできる。
【０２８９】
治療用組成物は、通常、製条件および保存条件の下で無菌且つ安定でなければならない。上記組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤濃度に好適な他の規則構造として製剤化できる。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物、を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合で必要な粒径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合で、上記組成物中に等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいこととなる。上記組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチン、を含むことにより、当該注射用組成物の長期の吸収が可能となる。
【０２９０】
無菌注射剤は、必要量の上記モノクローナル抗体を、適切な溶媒中で、必要に応じて上記成分の１種または組み合わせと混合した後、滅菌精密濾過を行うことで、調製できる。通常、分散液は、上記抗体を、基礎となる分散媒および上記に挙げたものの中から必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に混合することによって、調製される。無菌注射液の調製のための無菌散剤の場合、好ましい調製法として、真空乾燥法および凍結乾燥法があり、これらにより、予め滅菌濾過したその溶液から、任意の追加の所望成分を加えた有効成分の粉末が得られる。
【０２９１】
投与計画は最適な所望の反応（例えば、治療反応）が得られるように調整される。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよいし、いくつかの分割量を長期に亘って投与してもよいし、あるいは、投与量を治療状況の必要に応じて比例的に減少または増加させてもよい。例えば、ヒト抗体を、皮下注射で週に１回または２回投与してもよいし、あるいは、皮下注射で月に１回または２回投与してもよい。
【０２９２】
投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口用組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、治療対象に対し単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し；各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の抗体を、必要な医薬担体と共に含有する。本明細書において提供される単位剤形の規格は、（ａ）抗体の独特な特徴および達成すべき特定の治療効果、並びに、（ｂ）個人における感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の治療のためにこのような抗体を配合することの当該技術分野における固有の制限、によって決定され、且つこれらに直接依存する。
【０２９３】
薬剤的に許容できる抗酸化剤の例としては以下が挙げられる：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および、（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤。
【０２９４】
治療用組成物の場合、製剤は、経口投与、経鼻投与、局所投与（頬側投与および舌下投与を含む）、直腸内投与、および非経口投与に好適な製剤が挙げられる。非経口投与は抗体を含む治療用組成物の最も一般的な投与経路である。上記製剤は、好都合には、単位剤形で提供されてもよく、また、薬学分野において公知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を調製するために担体物質と組み合わせることができる抗体の量は、治療対象、および特定の投与様式に応じて異なるものとなる。この抗体量は、通常、治療効果を生むのに十分な量である。通常、１００％中、この量は、約０．００１質量％〜約９０質量％の抗体の範囲を取り、好ましくは約０．００５質量％〜約７０質量％であり、最も好ましくは約０．０１質量％〜約３０質量％である。
【０２９５】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、本明細書で使用される場合、経腸投与および局所投与を除いた、通常は注射による投与様式を意味し、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、上皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および点滴。
【０２９６】
本明細書において提供される医薬組成物中に使用されてもよい好適な水性担体および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、並びに注射用有機酸エステル（オレイン酸エチルなど）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合で必要な粒径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０２９７】
これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有させてもよい。当該技術分野において周知の補助剤の具体例としては、例えば、無機補助剤（アルミニウム塩など、例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム）、有機補助剤（例えば、スクアレン）、油性補助剤、ビロソーム（例えば、インフルエンザウイルス由来の膜結合型ヘマグルチニン（ｈｅａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）およびノイラミニダーゼを含有するビロソーム）が挙げられる。
【０２９８】
微生物の存在の防止は、滅菌法と、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸（ｐｈｅｎｏｌ  ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）など）を含ませることの両方によって、確保することができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を上記組成物に含ませることが望ましい場合もある。加えて、ステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの１または複数の吸収遅延剤を含ませることによって、注射用剤形の長期に亘る吸収を実現してもよい。
【０２９９】
組成物は、医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、単独で投与することもできるし、あるいは、例えば０．００１〜９０％（０．００５〜７０％がより好ましく、０．０１〜３０％などである）の有効成分を、薬剤的に許容できる担体と組み合わせて含有する医薬組成物として投与することもできる。
【０３００】
選択された投与経路に関わらず、本明細書において提供される組成物は、好適な水和物形態で使用でき、それらは当業者に公知の従来法によって薬剤的に許容できる剤形に製剤化できる。
【０３０１】
本明細書において提供される医薬組成物中の抗体の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式において、当該患者に対し毒性とならないように、所望の治療反応を達成するのに有効な有効成分の量が得られるように、変更してもよい。選択された投与量レベルは、種々の薬物動態学的要因に依存することとなり、例えば、使用された特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、使用されている特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用された特定の組成物と組み合わせて使用された他の薬剤、化合物および／または物質、治療対象の患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および既往歴、並びに医学分野で周知の同様の要因が挙げられる。当業者である医師または獣医師であれば、必要とされる組成物の有効量を容易に求め、処方することができる。例えば、医師または獣医師であれば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。通常、本明細書において提供される組成物の好適な一日量は、治療効果を生むのに有効な最低投与量である抗体量となる。このような有効量は、上記の要因に通常は依存することとなる。投与は静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与であることが好ましく、標的部位の近位に投与されることが好ましい。必要であれば、治療用組成物の有効一日量が、１日に亘って適切な間隔をおいて個別に投与される、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の分割量として、所望により単位剤形で、投与されてもよい。抗体を単独で投与することは可能であるが、製剤（組成物）として抗体を投与することが好ましい。
【０３０２】
投与量および投与頻度は、使用される投与経路および特定の抗体、治療対象の疾患の性質および重症度、並びに対象のサイズおよび全身状態などの要因に応じて、変化し得る。適切な投与量は、関連技術分野（例えば用量漸増試験を伴う場合がある臨床試験）で公知の方法により求めることができる。
【０３０３】
治療用組成物は当該技術分野において公知の医療機器で投与することができ、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、同第４，５９６，５５６号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、および同第４，４７５，１９６号で開示された医療機器などである。
【０３０４】
化合物のがんを阻害する能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価できる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のアッセイによってインビトロにおいてそのような阻害を阻害する化合物の能力を調べることにより、評価できる。治療有効量の治療化合物は、対象において、腫瘍サイズを減少させることができ、あるいは、症状を改善することができる。当業者であれば、このような量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて求めることができる。
【０３０５】
ＴＮＦＲ２依存性シグナル伝達と関連した疾患の治療のための医薬の製造における、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体およびそれを含む組成物の使用が提供される。また、がんの治療のための（または、がんの治療のための医薬の製造で使用されることとなる）、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、上記がんは固形腫瘍である。例示的ながんとしては、肺がん、腎がん、乳がん、卵巣がん、肝細胞癌、腎細胞癌、肺癌、子宮頸がん、前立腺がん、メラノーマ、頭頸部がん、リンパ腫、および大腸がんが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体および組成物は、自己免疫性の疾患または障害を治療するために使用される（または、自己免疫疾患の治療のための医薬の製造で使用されることとなる）。例示的な自己免疫性の疾患および障害としては、移植片対宿主病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、大腸炎、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、天疱瘡、表皮水疱症、および１型糖尿病が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体および組成物は、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象において、移植片生着を促進するために、または移植片拒絶反応を低減するために、使用される（または、移植片生着を促進するための、または移植片拒絶反応を低減するための、医薬の製造で使用されることとなる）。また、他の実施形態において、移植片対宿主病を治療、予防、または低減するための（または、移植片対宿主病を治療、予防、または低減するための医薬の製造で使用されることとなる）、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体および組成物が提供される。
【０３０８】
加えて、企図される組成物は、追加の治療薬（例えば追加の抗がん剤）をさらに含んでいてもよいし、あるいは、追加の治療薬（例えば追加の抗がん剤）を用いた併用療法における医薬としての用途に調製されてもよい。「抗がん剤」は、腫瘍、がん、悪性腫瘍などを治療するために使用される薬物である。薬物療法（例えば、本明細書で開示される抗体組成物を用いた薬物療法）は、他の治療なしで施行される場合もあれば、他の治療と組み合わせて施行される場合もある。
【０３０９】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体または組成物の「治療有効量」は、病気の症状の重症度の低減、病気の症状を呈さない期間の頻度および持続時間の増加、または罹患による機能障害もしくは能力障害の予防をもたらすものであることが好ましい。がん関連では、治療有効量は、生存率の増加、および／またはがんと関連した身体症状のさらなる増悪の予防をもたらすものであることが好ましい。治療有効量は、がんの発病を予防または遅延するものであってもよく、例えば、当該疾患の初期兆候または予備兆候がある場合に望まれるものであってもよい。
【０３１０】
ＸＩ．キット
また、所望により単一のバイアルまたは容器内に含まれた、本明細書で開示される抗ＴＮＦＲ２抗体、多特異性分子、または免疫複合体を含むキットが提供され、例えば、がんなどの疾患の治療または診断で使用する際の説明書が含まれる。上記キットは、キットの内容物の用途を表記する標識を含んでいてもよい。標識という用語は、上記キットに添付もしくは同梱された、または他の方法で上記キットに付随した、任意の書面、宣伝資料、または記録資料を包含する。このようなキットは、単回投与用バイアルまたは単回投与用充填済み注射器などに含まれた、単位剤形の上記抗体、多特異性分子、または免疫複合体を含んでいてもよい。
【０３１１】
ＸＩＩ．抗体の使用法
本明細書で開示される抗体および組成物は、幅広い治療用途および診断用途に使用することができ、例えば、がんを治療するために（腫瘍学的用途）、自己免疫性の疾患もしくは障害を治療するために、移植レシピエントにおいて移植片生着を促進する、且つ／あるいは移植片拒絶反応を低減するために、移植片対宿主病を治療、予防、もしくは低減するために、または感染症を治療するために、使用することができる。
【０３１２】
これを受けて、１つの実施形態において、増殖性障害（例えば、がん）を治療する方法であって、対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を上記障害を治療するのに有効な量（例えば、治療有効量）で投与することを含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記障害はがんである。例示的ながんとしては、肺がん、腎がん、乳がん、卵巣がん、肝細胞癌、腎細胞癌、肺癌、子宮頸がん、前立腺がん、メラノーマ、頭頸部がん、リンパ腫、および大腸がんなどの、固形腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。上記抗ＴＮＦＲ２抗体のがんの進行を減弱する（例えば、１または複数の腫瘍の体積の減少に反映される）効力をモニターするために、治療中に対象の検査が行われ得る。
【０３１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＴＮＦＲ２抗体療法を開始する前の腫瘍の体積と比較した場合に、腫瘍の体積を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約１００％、減少させることが可能である。
【０３１４】
別の実施形態において、腫瘍の成長または腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を腫瘍の成長または腫瘍細胞の増殖を阻害する有効量（例えば、治療有効量）で投与することを含む、方法が本明細書で提供される。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、長期間の抗がん作用を誘導する。他の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗がん性のメモリーＴ細胞の発生を誘導する。
【０３１６】
別の実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２上のエピトープ（例えば、本明細書に記載のヒトＴＮＦＲ２エピトープ）に結合する抗体の抗腫瘍活性を増強する方法であって、エフェクター機能を増大させることが知られているＦｃ領域における１または複数のアミノ酸置換を誘導するなどによって、非改変型の同一抗体と比較した場合に、上記抗体のエフェクター機能を増大させるように上記抗体を改変することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、抗腫瘍活性の増大は、ヒトＴＮＦＲ２のエピトープに抗体が結合することとは無関係である。他の実施形態において、腫瘍成長の阻害は、ＴＮＦＲ２シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する上記抗体の能力とは無関係である。他の実施形態において、腫瘍成長の阻害は、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を阻害する上記抗体の能力とは無関係である。
【０３１７】
別の実施形態において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、上記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲ２への結合を有意に阻害しない、方法が、本明細書で提供される。
【０３１８】
別の実施形態において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、上記抗体がエフェクター機能を有し、ＴＮＦＲ２受容体シグナル伝達に対しアゴニストとして作用する、方法が、本明細書で提供される。
【０３１９】
別の実施形態において、がんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に抗ＴＮＦＲ２抗体の治療有効量を投与することを含み、上記抗体がエフェクター機能を有する、方法が、本明細書で提供される。
【０３２０】
本明細書に記載の方法において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体は、腫瘍またはがんを有する対象を治療するために、単独で投与することもできるし、あるいは、上記抗体と連動して、または上記抗体と相乗的に作用する１または複数の治療薬（例えば、抗がん剤）または標準的ながん治療と一緒に投与することもできる。例えば、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、免疫チェックポイント遮断薬と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と組み合わせて使用するのに好適な免疫チェックポイント遮断薬としては、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、または抗ＴＩＭ３抗体が挙げられる。
【０３２１】
チェックポイント阻害剤であるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は、がん治療においてかなり有望である（Ｂｒａｈｍｅｒら、ＮＥＪＭ、２０１２年；３６６巻：頁２４５５〜６５；Ｔｏｐａｌｉａｎら、ＮＥＪＭ、２０１２年；３６６巻：頁２４４３〜５４）。残念なことに、これらの活性は、長期的に多くの進行がなされた、転移性膀胱がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、メラノーマ、および頭頸部がんなどの適応症において、一部の患者に限定されたものにとどまっている（Ｓｗａｉｋａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１５年；６７巻：頁４〜１７；Ｇｒｉｇｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１６年；４巻：頁４８）。ＣＴＬＡ４阻害剤のイピリムマブなどの、化学療法または他の免疫療法との併用は、効力を改善はするが、ＰＤ−１阻害剤単独と比較した場合に、しばしば、多くの毒性における顕著な増加を代償とすることが示された（Ｗｅｂｅｒ、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、２０１６年；２１巻：頁１２３０〜４０；Ｐａｚ−Ａｒｅｓら、ＮＥＪＭ、２０１８年、印刷前出版版（ｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）、ＰＭＩＤ：３０２８０６３５）。実施例１２に示されるように、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と組み合わせたＴＮＦＲ２アゴニスト抗体（Ｙ９）は、抗腫瘍活性を有意に改善し、抗ＣＴＬＡ４抗体治療の慢性投与時に確認された毒性は確認されなかった（実施例１３参照）。このことは、アゴニストのＴＮＦＲ２ｍＡｂとＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤の組み合わせが、イピリムマブなどのＣＴＬＡ４阻害剤とＰＤ−１阻害剤の治療指数よりも、有意に大きな治療指数を有することを示唆している。
【０３２２】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体および組み合わせ抗体療法は、治療中の適応症（例えば、がん）に対するその特定の有用性のために選択された他の周知の治療法と組み合わせて用いてもよい。
【０３２３】
例えば、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、追加の治療と組み合わせて（例えば、同時または個別に組み合わせて）用いることができ、例えば、照射、外科手術、化学療法（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５−ｆｕ、またはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘコンボ）を用いる化学療法）、１または複数のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）、１または複数のＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ−２’（ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９、またはＦ００１２８７）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ−２６３（小分子）、ＧＸ−１５−０７０（オバトクラクス）、またはＭＣＬ−１（骨髄性白血病細胞分化タンパク質−１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、低分子ｓｍａｃ模倣薬、合成ｓｍａｃペプチド（Ｆｕｌｄａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００２年；８巻：頁８０８〜１５を参照）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）、またはＡＥＧ−３５１５６（ＧＥＭ−６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤、抗ＣＤ２０  抗体（例えば、リツキシマブ）、血管新生抑制剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的とする血管新生阻害剤（例えば、アバスチン）、合成トリテルペノイド（Ｈｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年；６５巻：頁４７９９〜８０８を参照）、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ抑制タンパク質）修飾薬（例えば、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ）の天然リガンドおよび合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシンおよびテムシロリムスなど）、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｌｄｏｍｉｄｅ）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、遺伝毒性薬、標的治療薬、および／またはがんワクチンなどと組み合わせて用いることができる。
【０３２４】
また、上記抗ＴＮＦＲ２抗体はがん治療に有用な抗体医薬と組み合わせて用いてもよく、例えば、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、リンホサイド（Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ）（登録商標）（エピラツズマブ（ｅｐｒｔｕｚｕｍａｂ））、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）、並びに、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、およびＮＧＦＲなどのＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバー分子（リガンドまたは受容体）を標的とする抗体と組み合わせて用いてもよい。
【０３２５】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と組み合わせたがんの治療に有用な細胞傷害性薬物としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および当該技術分野において承認されている他の抗増殖剤が挙げられる。例示的なアルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼンが挙げられ、例えば、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（商標））ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミドなどである。例示的な代謝拮抗剤としては、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が挙げられ、例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンなどである。本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と組み合わせて使用するための他の好適な抗増殖剤としては、例えば、タキサン、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（商標）として市販）、ドセタキセル、ディスコデルモリド（ＤＤＭ）、ジクチオスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシドＡ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２，１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン（ＥＰＯ−９０６）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモリド）、ＴＺＴ−１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ−６５１（タシドチン塩酸塩）、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Ｅ−７３８９）、ヘミアステリン（ＨＴＩ−２８６）、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン（Ｃｙｒｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイド免疫複合体（ＤＭ−１）、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２（イスピネシブ）、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４，１６−ジデメチル−（＋）−ジスコデルモリド、およびクリプトチロン１が挙げられ、それに加えて、当該技術分野において公知の他の微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎｅ）安定化剤も挙げられる。
【０３２６】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体による治療と併用して、またはそれに先立って、異常な増殖性を有する細胞を静止状態にすることが望ましい場合では、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックス（商標）などのホルモン類およびステロイド類（合成類似化合物を含む）も、患者に投与することができる。本明細書に記載の方法または組成物を使用する場合、アンチミメティック（ａｎｔｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）などの、臨床環境において腫瘍成長または転移の調節で使用される他の薬剤も、必要に応じて投与することができる。
【０３２７】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、当該技術分野において承認されているワクチン接種プロトコル（例えば、がんワクチン）と組み合わせてもよい。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験戦略が考案された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．、２０００年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：頁６０〜６２；Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．、２０００年、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：頁３００〜３０２；Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．、２０００年、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：頁４１４〜４２８；Ｆｏｏｎ，Ｋ．、２０００年、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：頁７３０〜７３８、を参照；また、ＤｅＶｉｔａら（編）、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第５版のＲｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．およびＳｚｎｏｌ，Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６１章、頁３０２３〜３０４３も参照）。いくつかの実施形態においては、自家腫瘍細胞または同種腫瘍細胞を用いてワクチンが作製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう変換されている場合に、最も有効であることが示された。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種において抗原提示の強力な活性化因子となることが示された（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３年）、米国科学アカデミー紀要、９０巻：頁３５３９−４３）。
【０３２８】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、自己免疫性の疾患および障害の治療にも有用である。これを受けて、１つの実施形態において、自己免疫性の疾患および障害を治療する方法であって、対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を上記自己免疫性の疾患および障害を治療するのに有効な量（例えば、治療有効量）で投与することを含む、方法が本明細書で提供される。本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体での治療における、例示的な自己免疫性の疾患および障害としては、例えば、移植片対宿主病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、大腸炎、乾癬、自己免疫性ブドウ膜炎、天疱瘡、表皮水疱症、および１型糖尿病が挙げられる。上記抗ＴＮＦＲ２抗体の自己免疫疾患の症状または病態を減弱する効力をモニターするために、対象の検査が治療中に行われ得る。治療の効力は、投与前および投与後の上記抗体および／または併用療法の効果を比較することでモニターすることができる。
【０３２９】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、自己免疫疾患を患う対象を治療するために、単独で、または、当該抗体と連動して、もしくは当該抗体と相乗的に作用する１または複数の治療薬と、投与することができる。例えば、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン）、カルシニュリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）；ＥＶＩＤＨ阻害剤（例えば、アザチオプリン、レフルノミド、ミコフェノール酸）；生物学的製剤（例えば、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ）；およびモノクローナル抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ）と組み合わせて使用することができる。
【０３３０】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、移植（例えば、細胞移植、組織移植、または臓器移植）関連でも有用である。これを受けて、いくつかの実施形態において、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象（例えば、ヒト移植片レシピエント）において、移植片生着を促進する、および／または移植片拒絶反応を低減する方法であって、前記対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２の有効量（例えば、治療有効量）を投与することで、移植片生着を促進する、および/または移植片拒絶反応を低減することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記移植片は当該レシピエントに対して自己、同種、または異種の移植片である。他の実施形態において、上記抗ＴＮＦＲ２抗体（または併用療法）は、移植片生着を促進するため、および／または移植片拒絶反応を低減するために、移植前に、移植と同時に、および／または移植後に投与され得る。
【０３３１】
いくつかの実施形態において、上記移植片拒絶反応は、細胞同種移植片レシピエント、組織同種移植片レシピエント、または臓器同種移植片レシピエントにおける移植片拒絶反応である。他の実施形態において、上記移植片レシピエントは、造血細胞もしくは骨髄の移植のレシピエント、膵島細胞の同種移植のレシピエント、または心臓移植、腎臓−膵臓移植、腎移植、肝臓移植、肺移植、および膵臓移植からなる群から選択される固形臓器移植のレシピエントである。移植片のさらなる例としては、血管組織、眼、角膜、水晶体、皮膚、骨髄、筋肉、結合組織、胃腸組織、神経組織、骨、幹細胞、軟骨、肝細胞、または造血細胞などの、同種移植された細胞、組織、または臓器が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３３２】
いくつかの実施形態において、上記の移植片生着を促進する、および／または移植片拒絶反応を低減する方法は、対照レシピエントで確認された移植片生着と比較して、上記レシピエントにおける移植片生着を、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、増加させる。対照レシピエントは、例えば、移植後治療を受けない移植片レシピエントとしてもよいし、あるいは、移植後に単独療法を受ける移植片レシピエントとしてもよい。ある実施形態において、移植片生着を促進する方法は、長期間の移植片生着（例えば、移植後、少なくとも約６か月、少なくとも１年間、少なくとも５年間、少なくとも約１０年間、またはそれ以上  を促進する。
【０３３３】
移植片対宿主病（例えば、細胞移植、組織移植、もしくは臓器移植を受けたことがある、またはそれを受けることとなる対象における移植片対宿主病）を治療、予防、または低減する方法であって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２の有効量（例えば、治療有効量）を投与することで、移植片対宿主病を治療、予防、または低減することを含む、方法が、本明細書で提供される。上記抗ＴＮＦＲ２抗体（または併用療法）は、移植片対宿主病を治療、予防、または低減するために、移植前に、移植と同時に、および／または移植後に投与され得る。
【０３３４】
本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、移植片生着を促進する、且つ／または、移植片拒絶反応を低減する、または、移植片対宿主病を治療する、予防する、もしくは減弱するために、単独で、または、当該抗体と連動して、もしくは当該抗体と相乗的に作用する１または複数の治療薬と、投与することができる。例えば、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、免疫調節剤または免疫抑制剤と組み合わせて用いることができ、例えば、アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、ブレディニン、ブレキナル、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎａｍｉｄｅ）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、６−メルカプトプリン、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症剤、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、ムロモナブ−ＣＤ３、ＯＫＴ３、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、抗胸腺細胞グロブリン、およびＩＶＩｇと組み合わせて用いることができる。
【０３３５】
本明細書に記載の併用療法では、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体は、上記の１または複数の追加の薬剤の前、後、またはそれと同時に投与され得る。
【０３３６】
また、細胞においてＴＮＦαのＴＮＦＲ２への結合を遮断する方法であって、上記細胞を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量と接触させることを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０３３７】
別の実施形態において、細胞においてＴＮＦＲ２を介したシグナル伝達を活性化する方法であって、上記細胞を本明細書に記載の抗体の有効量と接触させることを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０３３８】
いくつかの実施形態において、細胞または対象においてＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化する方法であって、上記細胞を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量と接触させることで、または、上記対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量を投与することで、ＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化することを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、インビトロで（例えば、培養液中で）またはインビボで（すなわち、対象において）Ｔ細胞の増殖（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方）を促進する（例えば、増加させる）方法であって、細胞（例えば、Ｔ細胞）を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させることで、または、上記対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量を投与することで、Ｔ細胞の増殖を促進することを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、インビトロで（例えば、培養液中で）またはインビボで（すなわち、対象において）Ｔ細胞を共刺激する方法であって、細胞（例えば、Ｔ細胞）を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させることで、または、対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量を投与することで、Ｔ細胞を共刺激することを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、制御性Ｔ細胞の存在量（例えば、Ｔ細胞区画中の制御性Ｔ細胞の存在量）を減少させる方法であって、細胞（例えば、Ｔ細胞）を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させることで、または、対象に本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体の有効量を投与することで、制御性Ｔ細胞の存在量を減少させることを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記の制御性Ｔ細胞の存在量の減少は、ＡＤＣＣを伴う。いくつかの実施形態において、上記の制御性Ｔ細胞の存在量の減少は、増殖の阻害もしくは低減、または細胞死の誘導を伴う。
【０３４２】
また、試料中のＴＮＦＲ２の存在を検出する方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記方法は、抗体とＴＮＦＲ２タンパク質との間での複合体の形成を可能にする条件下で上記試料を本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体と接触させ、複合体の形成を検出することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を用いて、細胞培養液中または細胞集団中の細胞の表面上のＴＮＦＲ２タンパク質の存在または発現レベルが検出され得る。別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を用いて、生物試料（例えば、生検）中のＴＮＦＲ２タンパク質の量が検出され得る。さらに別の実施形態において、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体をインビトロアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ）で用いて、ＴＮＦＲ２タンパク質が検出され得る。また、本明細書に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体を用いて蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が行われ得る。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【０３４３】
下記の実施例により本発明のさらなる例示がなされるが、下記の実施例はさらなる限定とは見なされるべきではない。本願を通じて引用された配列表、図面、並びに全ての参考文献、特許、および特許出願公開の内容は、参照により本明細書に明確に援用されたものとする。
【実施例】
【０３４４】
特に記載がない限り、下記の実施例で言及される市販の試薬は製造業者の説明書に従って使用された。特に記載がない限り、本発明は、当該技術分野において承認されている組換えＤＮＡ技術の方法を用いており、例えば、本明細書上記の方法および下記の教本に記載の方法などである：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲論文；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（グリーン・パブリッシング・アソシエーツ社およびワイリー・インターサイエンス社、ニューヨーク、１９８９年）；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（アカデミック・プレス社：ニューヨーク、１９９０年）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・プレス社：コールドスプリングハーバー、１９８８年）；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （ＩＲＬプレス社：オックスフォード、１９８４年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８７年；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１年。
【０３４５】
実施例１．抗マウスＴＮＦＲ２抗体のマウスＴＮＦＲ２への結合性
本実施例は、細胞上に発現したマウスＴＮＦＲ２への抗マウスＴＮＦＲ２抗体の結合性について記載する。
【０３４６】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をマウスＴＮＦＲ２プラスミドで一過性にトランスフェクトし、培養下で維持した。ＣＨＯ細胞上のマウスＴＮＦＲ２発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで測定し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用いた細胞ソーティングにより、マウスＴＮＦＲ２の発現が９０％超であるＣＨＯ細胞のセレクションを行った。各抗体の３倍連続希釈系列を、２μＭから開始して、ＦＡＣＳ緩衝液中、９６ウェルプレート内で、５０μＬとなるように作製した。ＣＨＯ細胞を７０μｍストレーナーに通し、ＦＡＣＳ緩衝液に２×１０６個／ｍＬの濃度に再懸濁した。１００，０００個の細胞を各ウェルに添加したところ、マウスＴＮＦＲ２抗体の開始濃度は１μＭであった。抗体および細胞を、穏やかに撹拌しながら、室温で２時間、共インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で合計３回洗浄を行った後、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を各ウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら４℃で４５分間インキュベートした。３回以上洗浄を行った後、細胞をヨウ化プロピジウム／ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで抗マウスＴＮＦＲ２抗体の結合性をＡｌｅｘａ６４７のＭＦＩとして求めた。
【０３４７】
図２Ａおよび図２Ｂは、抗マウスＴＮＦＲ２抗体のＴＮＦＲ２過剰発現ＣＨＯ細胞（図２Ａ）および野生型ＣＨＯ細胞（図２Ｂ）に対する細胞上結合性（ｏｎ−ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の非線型回帰曲線を示している。試験された抗体は全て、ＴＮＦＲ２過剰発現ＣＨＯ細胞に強く結合し、野生型ＣＨＯ細胞への非特異的結合は無視できるものであった。
【０３４８】
実施例２．抗ＴＮＦＲ２抗体の結合親和性
本実施例では、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイ（バイオレイヤー干渉法）を用いて抗マウスＴＮＦＲ２抗体の結合親和性（一価ＫＤ）を求めた。
【０３４９】
簡潔に説明すると、ＩｇＧ  Ｆｃ捕捉用センサーチップを室温で１０分間ＰＢＳ中で水和した。カイネティクスアッセイを９６ウェルプレート内で行い、各工程に以下の時間を用いて実行した：ａ）ベースライン：ＰＢＳ中で３０秒間、ｂ）デュープリケートで２５μｇ／ｍＬの抗マウスＴＮＦＲ２抗体を添加、１８０秒間、ｃ）ＰＢＳ中で解離、６０秒間、ｄ）７５μｇ／ｍＬのＨｉｓタグマウスＴＮＦＲ２を結合、１８０秒間、およびｅ）ＰＢＳ中で解離、１８０秒間。
【０３５０】
図３に示すように、８種全ての被験抗体がマウスＴＮＦＲ２に対し特異的な結合を示した。具体的には、抗体Ｙ６、Ｙ９、およびＹ１０は約１ｎＭの一価ＫＤを示し；Ｒ２−Ｈ５−Ｌ１０は約５ｎＭの一価ＫＤを有し；Ｙ７、Ｍ３、およびＭ７は約２０ｎＭの一価ＫＤを有し；Ｍ３６は約１２２ｎＭの一価ＫＤを有していた。
【０３５１】
実施例３．抗ＴＮＦＲ２抗体のリガンド遮断
本実施例では、ＴＮＦのＴＮＦＲ２への結合を遮断する抗マウスＴＮＦＲ２抗体の能力をＥＬＩＳＡで調べた。
【０３５２】
９６ウェルプレートを５０μＬの２μｇ／ｍＬ  ＨｉｓタグマウスＴＮＦＲ２タンパク質で４℃で一晩コーティングした。次に、各ウェルを、ピアス社製無タンパク質ブロッキング緩衝液で１時間ブロッキングして非特異的な抗体結合を防止し、５００ｎＭから開始した２倍連続希釈系列の抗マウスＴＮＦＲ２抗体と２時間インキュベートした。組み換えマウスＴＮＦαを１時間インキュベートし、ビオチン化抗マウスＴＮＦαと、続くストレプトアビジンＨＲＰ抗体との４０分間のインキュベーションにより検出した。発光を、マウスＴＮＦαに結合されたペルオキシダーゼの活性の結果として求め、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各インキュベーションの間に０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０含有ＰＢＳを用いて３回の洗浄を行った。特に指示しない限りアッセイは室温で実行し、タンパク質の希釈は０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０含有ＰＢＳで行った。
【０３５３】
図４は、全ての被験濃度の全ての抗体の、正規化された４５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を示している。抗体Ｍ３およびＲ２−Ｈ５−Ｌ１０はＴＮＦＲ２への結合においてＴＮＦαと競合しなかったが、Ｙ７およびＭ３６は部分的に、そしてＹ６、Ｙ９、Ｙ１０、およびＭ３は完全に、ＴＮＦαのＴＮＦＲ２への結合を遮断した。
【０３５４】
実施例４．抗ＴＮＦＲ２抗体のエピトープ結合
【０３５５】
本実施例では、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイを用いた、市販抗体である３２．４（バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））および５４．７（バイオ×セル社（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ））と比較した、新たに作製された抗マウスＴＮＦＲ２抗体のエピトープ結合について記載する。
【０３５６】
簡潔に説明すると、ストレプトアビジン捕捉用センサーチップを室温で１０分間ＰＢＳ中で水和した。カイネティクスアッセイを９６ウェルプレート内で行い、各工程に以下の時間を用いて実行した：ａ）ベースライン：ＰＢＳ中で３６０秒間、ｂ）デュープリケートで３０μｇ／ｍＬのビオチン化済みの３２．４抗体または５４．７抗体を添加、１２０秒間、ｃ）ＰＢＳ中で解離、１０秒間、ｄ）１５０μｇ／ｍＬのＨｉｓタグマウスＴＮＦＲ２を結合、１８０秒間、ｅ）ＰＢＳ中で解離、５秒間、および、ｆ）５０μｇ／ｍＬの各抗マウスＴＮＦＲ２抗体を結合、１８０秒間。
【０３５７】
結果を表３にまとめる。抗体Ｙ６、Ｙ７、Ｙ１０、Ｍ７、およびＭ３６は抗体３２．４と同じｂｉｎにグループ化され、抗体Ｙ９およびＭ３は５４．７と同じｂｉｎにグループ化された。興味深いことに、抗体Ｈ５Ｌ１０は３２．４のｂｉｎとも５４．７のｂｉｎとも重ならず、このことは、抗体Ｈ５Ｌ１０が上記２つの市販抗体が認識するｂｉｎとは異なる新たなｂｉｎを認識することを示唆している。
【表３−１】
2022502076.tif 000004
【表３−２】
2022502076.tif 000005
【０３５８】
実施例５．キメラ受容体構築体を用いたエピトープマッピング
本実施例では、抗マウスＴＮＦＲ２抗体が標的とするエピトープをより具体的に定義するためのマウス／ヒトキメラＴＮＦＲ２構築物の使用について記載する。
【０３５９】
簡潔に説明すると、マウスＴＮＦＲ２およびヒトＴＮＦＲ２のキメラ受容体のＦｃ融合体をＡＴＵＭ（ニューアーク、カリフォルニア州）に合成させ（図５Ａ）、各タンパク質をＥｘｐｉ２９３一過性導入法を用いて生成した後、プロテインＡ精製にかけた。抗ＨｉｓバイオセンサーチップをＰＢＳ中で室温で１０分間水和した。カイネティクスアッセイを９６ウェルプレート内で行い、各工程に以下の時間を用いて実行した：ａ）ベースライン：ＰＢＳ中で６０秒間、ｂ）５０μｇ／ｍＬの各キメラタンパク質（０〜９）、マウスＴＮＦＲ２、およびヒトＴＮＦＲ２を添加、１８０秒間、ｃ）ＰＢＳ中で解離、６０秒間、ｄ）２５０ｎＭの各抗マウスＴＮＦＲ２抗体を結合、１８０秒間、およびｅ）ＰＢＳ中で解離、１８０秒間。
【０３６０】
図５Ｂに示すように、全ての抗体が、マウスＴＦＮＲ２に結合したが、ヒトＴＮＦＲ２には結合しなかった。各キメラ構築体への結合のパターンに基づいて、各抗体が標的とする特定のエピトープ領域がより詳細に定義された。
【０３６１】
実施例６．抗体Ｍ３のエピトープマッピング
本実施例では、酵母表面ディスプレイを用いた抗体Ｍ３の微細エピトープマッピングについて記載する。
【０３６２】
マウスＴＮＦＲ２をコードする核酸配列（２３−２５８）にカルボキシ末端ＦＬＡＧエピトープタグを融合することにより、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したマウスＴＮＦＲ２を合成した。酵母ディスプレイ用ベクターｐＭＹＤ１２００（Ｘｕら、ＭＡｂｓ、２０１３年；５巻：頁２３７〜５４）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＫａｓＩで消化し、ＷＩＺＡＲＤ  ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（プロメガ社）を用いるゲル精製にかけた。Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（ザイモリサーチ社）を用いてケミカルコンピテントＥＢＹＺ細胞（Ｘｕら、前掲論文）を作製し、５００ｎｇのインサートおよび２μｇの消化ベクターで形質転換し、トリプトファン欠乏ＣＭグルコースプレート上に播種した（テクノバ社（Ｔｅｋｎｏｖａ））。単一コロニーを選択し、ＳＤＣＡＡ培地（ブドウ糖：２０ｍｇ／ｍｌ、カザミノ酸：１０ｍｇ／ｍｌ、酵母ニトロゲンベース：３．４ｍｇ／ｍｌ、硫酸アンモニウム：１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４：５．４ｍｇ／ｍｌ、およびＮａＨ２ＰＯ４：７．４ｍｇ／ｍｌ）に移し、３０℃で２４時間振盪（２２５ｒｐｍ）した。次に、細胞をペレット状にし、ＳＤＧＡＡ培地（ガラクトース：２０ｍｇ／ｍｌ、カザミノ酸：１０ｍｇ／ｍｌ、酵母ニトロゲンベース：３．４ｍｇ／ｍｌ、硫酸アンモニウム：１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４：５．４ｍｇ／ｍｌ、およびＮａＨ２ＰＯ４：７．４ｍｇ／ｍｌ）で再懸濁し、振盪させながら２０℃でさらに４８時間増殖させ、酵母細胞表面上のＴＮＦＲ２の発現を誘導した。
【０３６３】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、Ｍ３  ＩｇＧを標識した。酵母ディスプレイ用ＴＮＦＲ２点変異体（０．５×１０６個の細胞）を、連続希釈系列のＭ３／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（０．０１〜４００ｎＭ）または１μＭの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（セル・シグナリング・テクノロジー社）と、１時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄用緩衝液（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＦＡＣＳ−ＣＡＮＴＯサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて蛍光を測定した。各ＴＮＦＲ２点変異体のディスプレイレベルに対するＭ３の結合性を正規化するため、Ｍ３／抗ＦＬＡＧの平均蛍光強度（ＭＦＩ）比を算出し、Ｍ３濃度の関数としてプロットした。ＰＲＩＳＭソフトウェア（グラフパッド社）を用いた１サイト双曲線当てはめにより、非線形回帰を適合させた。
【０３６４】
ドメインレベルマッピングにより、マウスＴＮＦＲ２のＣＲＤ１領域およびＣＲＤ２領域に対するＭ３抗体のエピトープが同定された（実施例５）。微細エピトープマッピング戦略を用いて、アミノ酸分解能（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）により上記エピトープをさらに定義した（Ｌｅｖｙら、ＪＭＢ、２００７年；３６５巻：頁１９６〜２１０）。それぞれ表面露出位置に１アミノ酸置換を含む合計２８種のＴＮＦＲ２変異体が、酵母の表面上に提示された。各位置のＭ３結合性への寄与を評価するため、各位置でアラニンまたはアスパラギン酸への置換を行った（表４）。
【表４−１】
2022502076.tif 000006
【表４−２】
2022502076.tif 000007
【０３６５】
２８種全ての変異体および野生型配列について、Ｍ３（４００ｎＭ）に対する結合等温式を求めた（表４）。Ｍ３に有意な混乱が生じた位置（−および＋）をマウスＴＮＦＲ２の相同性モデル上にマッピングした（図６）。ドメインマッピングの結果と一致して、Ｍ３結合性にとって重要な位置は、ＣＲＤ１のＢ２モジュール内およびＣＲＤ２のＡ１モジュール内に位置していた。また、Ｍ３エピトープはＴＮＦα結合面の反対側に位置しており、Ｍ３がリガンド結合を有意に阻害しないという結果と合致している。
【０３６６】
実施例７．同系腫瘍モデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体中和の治療効果
本実施例は、同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果を示す。
【０３６７】
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを管理条件下の無菌環境に収容した。１００μＬのＰＢＳ中５×１０５個の細胞を側腹部に皮下注射することにより、大腸ＣＴ２６腫瘍を樹立した（７匹のマウス／群）。表示の抗体は全て、８０〜９０ｍｍ３の平均サイズを有する腫瘍を担持するマウスの腹腔内に注射された。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、長さに幅の二乗を掛けた積の半分として体積を評価した。抗マウスＴＮＦＲ２抗体を表示の時間に総体積２００〜３００μＬで腹腔内注射した。抗体３２．４および５４．７は０日目、２日目、および４日目に３００μｇで投与した。抗体Ｍ３およびＭ３６は０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目に１０００μｇで投与した。抗体Ｍ７は０日目、２日目、および４日目に１０００μｇで投与した。腫瘍が完全に退縮したマウス（治癒マウス）に対し、リチャレンジ実験を実施した。腫瘍を最後に検出できた日の少なくとも６０日後、２．５×１０５個のＣＴ２６細胞をマウスの対側側腹部に再移植した。
【０３６８】
図７に示すように、マウスＴＮＦＲ２に対する市販モノクローナル抗体（すなわち、クローン＃３２．４およびクローン＃５４．７）は、マウス大腸がんＣＴ２６モデルにおいて腫瘍成長を有意に低減した（図７Ａおよび図７Ｂ）。同モデルおよび治癒後の数匹の動物において、新たに作製した抗マウスＴＮＦＲ２抗体Ｍ３およびＭ３６は、腫瘍成長を有意に低減し、Ｍ７は低減の程度がより少ないものであった。Ｍ３やＭ３６処置で予め治癒されたマウスの対側側腹部にＣＴ２６細胞をリチャレンジし、長期間の治療的保護を評価した。Ｍ３やＭ３６処置で治癒された動物（図７Ａ〜７Ｃ）は、同一癌化細胞株ＣＴ２６によるリチャレンジに対し抵抗性であった（図７Ｄ）。これらの結果をまとめると、新たに作製された抗マウスＴＮＦＲ２抗体は、腫瘍成長を強力に低減し、長期間の生体内保護を確立することが示唆される。
【０３６９】
実施例８．Ｆｃ媒介性エフェクター機能は同系腫瘍モデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体の治療効果を増強する
本実施例は、同系腫瘍モデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効力に対する、Ｆｃエフェクター機能の影響を示す。
【０３７０】
ＣＴ２６腫瘍をマウスで樹立し、実施例７に記載の通りに抗体Ｍ３およびＭ３６（Ｆｃ変異型の野生型）を当該マウスに投与した。Ｆｃ変異体は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を消失させる、２つの１アミノ酸置換Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを有している。ＣＴ２６細胞（５×１０５個）を６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（７匹マウス／群）に皮下接種した。表示の抗体は全て、８０〜９０ｍｍ３の平均サイズを有する腫瘍を担持するマウスの腹腔内に注射された。抗体Ｍ３６（野生型またはＦｃ変異型）を２つの異なる投与計画で試験した：（ｉ）０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目に１０００μｇ、または（ｉｉ）０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目に３００μｇ。抗体Ｍ３は０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目に３００μｇで投与した。図８Ａ〜８Ｄに示すように、ＣＴ２６マウスモデルにおいて抗マウスＴＮＦＲ２抗体の最大の抗がん剤効力を達成するために、Ｆｃ媒介性エフェクター機能が必要とされた。
【０３７１】
さらに、同様の結果がＹ９を用いて得られた。ＣＴ２６腫瘍およびＷｅｈｉ１６４腫瘍を実施例７に記載の通りにマウスに樹立し、Ｙ９またはＦｃ変異型（Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ）Ｙ９を、６０〜９０ｍｍ３の平均サイズを有する腫瘍を担持するマウスに、週１回、０．３ｍｇの投与量で３回、腹腔内注射した（ｎ＝１５匹／群）。図８Ｅ〜８Ｊに示すように、Ｙ９の抗腫瘍効果はＦｃ変異によってかなりの抑制を受けた。
【０３７２】
抗体Ｙ９、Ｍ３、およびＭ３６は、マウスＴＮＦＲ２上の別々のエピトープを標的とする。さらに、Ｍ３は非リガンド競合体であり、Ｍ３６は部分リガンド競合体である。重要なこととして、標的とされたエピトープおよびリガンド競合特性とは非依存的に、最大抗がん剤効力が達成された。
【０３７３】
実施例９．同系腫瘍モデルにおける別々のエピトープを標的とする抗マウスＴＮＦＲ２抗体の治療効果
本実施例は、マウスＴＮＦＲ２上の別々のエピトープを標的とするいくつかの候補抗マウスＴＮＦＲ２抗体の治療効果を明らかにする。
【０３７４】
実施例７に記載の通りにＣＴ２６腫瘍をマウスに樹立し、表示の抗体を０日目に１ｍｇ投与した。全ての被験抗体は飽和投与量で同等の効力があったが（図示せず）、準最適投与量では、抗体Ｙ９およびＭ３がインビボで最も良好な抗腫瘍効果を示し（図９Ａおよび図９Ｂ）、Ｙ９の方が優れていた。
【０３７５】
別の実験で、実施例７に記載の通りにＥＭＴ６腫瘍をマウスに樹立し、表示の抗体を１ｍｇ（図１０Ａ〜１０Ｆ）または０．３ｍｇ（図１０Ｇ〜１０Ｉ）の単回投与で投与した。抗体Ｙ９およびＭ３がインビボで最も良好な抗腫瘍効果を示し、再びＹ９の方が優れており、投与量レベルが低いほど特に優れていた。
【０３７６】
実施例１０．マウス乳がんモデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体中和の治療効果
本実施例は、マウス乳がんモデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果を示す。
【０３７７】
実施例８に記載の通りに乳房ＥＭＴ６腫瘍をマウスに樹立する。ＴＮＦＲ２抗体は、８０〜９０ｍｍ３の平均サイズを有する腫瘍を担持するマウスに腹腔内注射する。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、長さに幅の二乗を掛けた積の半分として体積を評価する。抗マウスＴＮＦＲ２抗体を表示の時間に総体積２００〜３００μＬで腹腔内注射する。抗体３２．４および５４．７は０日目、２日目、および４日目に３００μｇで投与する。抗体Ｍ３およびＭ３６は０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目に１０００μｇで投与する。抗体Ｍ７は０日目、２日目、および４日目に１０００μｇで投与する。これらの抗体は腫瘍成長を有意に低減する。
【０３７８】
実施例１１．ＰＤ−１抑制感受性およびＰＤ−１抑制抵抗性の同系マウスモデルにおける抗体Ｙ９の治療効果
本実施例では、ＰＤ−１抑制治療に対し感受性または抵抗性である同系マウスモデルにおいて、抗体Ｙ９および抗ＰＤ−１抗体の効力を比較した。
【０３７９】
抗ＰＤ−１抗体に対し抗体Ｙ９の活性を評価するため、ハムスターＦｃをＤ２６５Ａ置換およびＮ２９７Ａ置換を有するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃと置換することにより、ハムスター抗マウスＰＤ−１抗体のマウスバージョン（Ｊ４３クローン；Ａｇａｔａら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６年；８巻：頁７６５〜７２）を作製した。両抗体をＰＤ−１抑制感受性（ＳａＩ／Ｎ）およびＰＤ−１抑制抵抗性（ＭＢＴ−２）の同系マウスモデルで試験した。６〜８週齢の雌マウスを管理条件下の無菌環境に収容した。２００μＬのＰＢＳ中の１×１０６個のＭＢＴ−２（Ｃ３Ｈ膀胱）細胞または５×１０６個のＳａＩ／Ｎ（ＮＣＩ  １／ＪＣＲ線維肉腫）細胞の右側腹部への皮下注射により、腫瘍を樹立した（１０〜１５匹のマウス／群）。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、体積は式π／６×（長さ×幅×幅）に従って算出した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の平均サイズに達したら、３００μｇの抗体を、表示の通りに週１回を３週間、総体積２００μＬで腹腔内注射した。Ｓａ１／Ｎ（ＰＤ−１抑制感受性）モデルおよびＭＢＴ−２（ＰＤ−１抑制抵抗性）モデルの両方で、抗ＴＮＦＲ２（Ｙ９）処置単独は、全ての処置動物で完全な腫瘍退縮をもたらした。しかし、ＭＢＴ−２膀胱モデルの抗ＰＤ−１ｍＡｂでの処置は、限定的な活性しか示さなかった（図１１）。
【０３８０】
実施例１２．同系マウスモデルにおける抗体Ｙ９および抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による併用療法の治療効果
本実施例は、種々の同系マウスモデルにおける抗体Ｙ９および抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による併用療法について記載する。
【０３８１】
マウス代替抗ＴＮＦＲ２抗体（Ｙ９）による治療が抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療と相乗作用を示すかどうかを評価するために、実施例１１に記載の通りにＪ４３のマウスバージョンを作製した。また、ヒトＦｃをＤ２６５Ａ置換およびＮ２９７Ａ置換を有するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃと置換することによりＰＤ−Ｌ１抗体のマウスバージョン、ＭＰＤＬ３２８０ａ（Ｐｏｗｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年；５１５巻：頁５５８〜６２）を作製した。抗体の組み合わせを、同系マウスモデルにおける活性について試験した。６〜８週齢の雌マウスを管理条件下の無菌環境に収容した。２００μＬのＰＢＳ中の３×１０５個のＣＴ２６細胞（Ｂａｌｂ／Ｃ結腸）細胞、ＥＭＴ６（Ｂａｌｂ／Ｃ乳房）細胞、もしくはＷｅｈｉ１６４（Ｂａｌｂ／Ｃ線維肉腫）細胞、１×１０６個のＭＢＴ−２（Ｃ３Ｈ膀胱）細胞、または５×１０６個のＳａＩ／Ｎ（ＮＣＩ  １／ＪＣＲ線維肉腫）細胞の右側腹部への皮下注射により、腫瘍を樹立した（７〜１５匹のマウス／群）。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、体積は式π／６×（長さ×幅×幅）に従って算出した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の平均サイズに達したら、３００μｇの抗体を、表示の通りに週１回を３週間、総体積２００μＬで腹腔内注射した。ＷＥＨＩ１６４モデル、ＳａＩ／Ｎモデル、およびＭＢＴ２モデルでは、抗ＴＮＦＲ２（Ｙ９）治療単独により長期間の生存が示されたが、一方、ＣＴ２６モデルおよびＥＭＴ６モデルでは、抗ＴＮＦＲ２（Ｙ９）治療および抗ＰＤ−１治療の組み合わせが最大の長期生存率を示した（図１２）。単独およびＹ９と組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１治療の場合も同様の結果が得られた（データ未記載）。
【０３８２】
実施例１３．抗体Ｙ９の安全性プロファイルと抗ＣＴＬＡ４抗体の安全性プロファイルの比較
本実施例は、抗ＣＴＬＡ４抗体と比較した、抗体Ｙ９の種々の安全性／毒性パラメータについて記載する。
【０３８３】
抗体Ｙ９の毒性プロファイルを抗ＣＴＬＡ４抗体と比較するために、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを有するマウス抗マウスＣＴＬＡ−４抗体の組み換え型９Ｄ９クローン（Ｑｕｅｚａｄａら、２００６年）を作製した（抗体Ｙ９と同じアイソタイプ）。上記抗体を用いた長期暴露試験を２０匹の６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスにおいて実施した。マウスを管理条件下の無菌環境に収容した。計８週間、マウスに１ｍｇの抗体（ＰＢＳ、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗ＴＮＦＲ２（Ｙ９）、または抗ＣＴＬＡ４、ｎ＝５／群）を週１回、総体積２００μｌで腹腔内注射した。マウス体重を週２回測定し、試験を通してマウスの身体的健康を追跡した。治療スケジュール後、全ての群から伏在静脈血を週１回採取し、治療前採血を１回行ってベースライン用対照として利用した。最後の（第８）週の治療の４８時間後に全てのマウスを屠殺し、脾臓を摘出して秤量し、血液を心穿刺により採取した。図１３に示すように、治療の最初の６週間はグループ間で重量に差は検出されなかったが、７回目の抗体投与の後、抗ＣＴＬＡ４群は急速な体重減少を起こし、他の全ての群には体重変化は起こらなかった。抗ＣＴＬＡ４抗体で治療されたマウスにおいて脾腫大が確認され、このことは、Ｙ９群または対照群と比較した場合の抗ＣＴＬＡ４群における脾臓重量の有意な増加に反映されている（図１４）。
【０３８４】
血液中の肝臓酵素レベルを、Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｄｘ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アイデックス社（ＩＤＥＸＸ）、ウェストブルック、メイン州）を用いて評価した。簡潔に説明すると、血液試料を心穿刺で採取し、リチウムヘパリン全血セパレーター（アイデックス社、製品番号９８−１４３２３−００）に移した。ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の血中レベルを、ＮＳＡＩＤ  ６  ＣＬＩＰ（アイデックス社、製品番号９８−１１００７−０１）を用いて分析した。血中ＡＬＴ（図１５Ａ）および血中ＡＳＴ（図１５Ｂ）の有意な増加が抗ＣＴＬＡ４群で確認されたが、全ての群が正常範囲内であった。
【０３８５】
免疫細胞表現型に対する治療の影響をプロファイリングするため、最後の治療から４８時間後の皮膚−流入領域リンパ節から得られた末梢血リンパ球および樹状細胞をフローサイトメトリーで分析した（図１６Ａ〜１６Ｄ）。フローサイトメトリー用に血液を調製するため、赤血球を、ＡＣＫ溶解用緩衝液（ロンザ社）を用いて溶解し、フローサイトメトリー用緩衝液（１％ＦＣＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。樹状細胞（ＤＣ）分析では、Ｓｐｌｅｅｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク社）を製造業者の取扱説明書に従って使用して皮膚−流入領域リンパ節を消化した。単一細胞懸濁液を、まず、ＰＢＳ中のＦｃ−ＢｌｏｃｋおよびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色試薬で、４℃で１０分間染色した。次に、細胞を細胞外マーカーについて４℃で３０分間染色した。ＣＤ４制御性Ｔ細胞を同定するため、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（バイオレジェンド社）を製造業者の取扱説明書に従って使用して細胞を固定および透過処理し、Ｋｉ−６７、Ｆｏｘｐ３、およびＣＴＬＡ−４について細胞内染色を行った。Ｇ０期を除く細胞周期の全ての期で発現されるＫｉ−６７の発現を、Ｔ細胞増殖の評価に用いた。抗ＣＴＬＡ−４抗体で治療されたマウスでは、アイソタイプ対照と比較して、増殖中のＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の頻度がかなり増加した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。対照的に、Ｙ９で治療されたマウスはＴ細胞増殖の増加を示さず、このことは、抗ＣＴＬＡ−４抗体と異なり、Ｙ９が末梢性Ｔ細胞の自発的な活性化および増殖を引き起こさないことを示している。これと一致して、Ｙ９は樹状細胞によるＴ細胞の活性化において重要な共刺激分子であるＣＤ８６（Ｂ７．２）発現を増加させなかったが、一方、抗ＣＴＬＡ−４抗体は発現増加を示した（図１６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、抗ＴＮＦＲ２抗体Ｙ９の投与が、健常マウスにおいて自発的な免疫細胞の活性化に繋がることはないことを示している。
【０３８６】
実施例１４．種々の遺伝子操作マウスモデルにおける、種々の抗体アイソタイプバリアント間の抗体Ｙ９の治療効果の比較
実施例８に記載されたように、マウス代替抗ＴＮＦＲ２抗体Ｙ９のＦｃγ受容体結合はそのインビボ活性において重要である。Ｆｃγ受容体結合は、１）活性化性Ｆｃγ受容体であるｍＦｃγＲＩ、ｍＦｃγＲＩＩＩ、またはｍＦｃγＲＩＶを介した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などの抗体のエフェクター機能の寄与；または、２）Ｆｃγ受容体発現細胞種上の抗体のクラスタリングを介した受容体活性化作用の増強（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１５年；３６巻：頁３２５〜３６）を表し得る。後者に関して、受容体活性化作用の促進には、抑制性Ｆｃγ受容体ｍＦｃγＲＩＩが最も重要と考えられている（例えば、Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２０１６年；２９巻：頁８２０〜３１を参照）。
【０３８７】
Ｙ９の効力にとってどのＦｃγ受容体が最も重要であるかを評価するため、Ｆｃγ受容体に関して野生型の同系マウスモデル（「ＷＴ」、Ｂａｌｂ／Ｃ）、ｍＦｃγＲＩＩを欠損している同系マウスモデル（「ＦｃＧＲ２Ｂノックアウト」；Ｆｃｇｒ２ｂ−Ｍｏｄｅｌ５７９、タコニック社（Ｔａｃｏｎｉｃ））、または共通Ｆｃ−γ鎖を欠損している同系マウスモデル（「Ｆｃ共通γノックアウト」；Ｆｃｅｒ１ｇ−Ｍｏｄｅｌ５８４、タコニック社）を用いた。Ｆｃ共通γノックアウトマウスは、ｍＦｃγＲＩ、ｍＦｃγＲＩＩＩ、またはｍＦｃγＲＩＶの発現が欠失している。６〜８週齢の雌マウスを管理条件下の無菌環境に収容した。２００μＬのＰＢＳ中３×１０５個のＣＴ２６（結腸）細胞を右側腹部に皮下注射することにより、腫瘍を樹立した（１０匹のマウス／群）。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、体積は式π／６×（長さ×幅×幅）に従って算出した。腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の平均サイズに達したら、３００μｇのＹ９抗体または対照としてのＰＢＳを、表示の通りに週１回を３週間、総体積２００μＬで腹腔内注射した。図１７に示すように、Ｙ９活性は、ＦｃＧＲ２ＢノックアウトマウスおよびＦｃ共通γノックアウトマウスの両方において減少した。このデータは、Ｆｃγ受容体によるクラスタリングによるアゴニスト活性の増強と、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰの両方が、Ｙ９のインビボ活性に寄与している可能性があることを示唆している。
【０３８８】
どの抗体アイソタイプがＦｃγ受容体の結合を介して最も高い活性を示すかを評価するため、異なるＦｃアイソタイプおよび変異型アイソタイプを用いてＹ９のバリアントを作製した：１）ｍＦｃγＲＩ、ｍＦｃγＲＩＩＩ、およびｍＦｃγＲＩＶに対し高い親和性を有するマウスＩｇＧ２ａ；２）ｍＦｃγＲＩＩおよびｍＦｃγＲＩＩＩに対し中間の親和性を有するマウスＩｇＧ１；いずれのｍＦｃγＲとも結合しない、Ｄ２６５Ａ変異およびＮ２９７Ａ変異（ＤＡＮＡ）を有するマウスＩｇＧ２ａ；並びに、ｍＦｃγＲＩＩに対する親和性の増強を示す、Ｓ２６７Ｅ変異およびＬ３２８Ｆ変異（ＳＥＬＦ）を有するマウスＩｇＧ２ａ。これらの種々のバリアントの活性をＣＴ２６（結腸）同系マウスモデルにおいて比較した。６〜８週齢の雌マウスを管理条件下の無菌環境に収容した。ＣＴ２６モデルの作製およびＹ９バリアントの投与条件は上記の通りとした。図１８に示すように、ＳＥＬＦバリアントが最も高い活性を有し、ｍＩｇＧ１アイソタイプがそれに続き、その次にｍＩｇＧ２ａアイソタイプであった。ＤＡＮＡバリアントは効力を失っていた。このデータは、クラスタリングによるアゴニスト活性の増強が、Ｆｃγ受容体を介した活性に対する主要な寄与因子であることを示唆している。
【０３８９】
実施例１５．インビトロにおける、抗体Ｙ９の共刺激活性、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および機能性に対する影響
本実施例では、Ｙ９を介したＣＤ８＋Ｔ細胞の架橋結合の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の共刺激活性、増殖、および機能性に対する直接的な影響について記載する。
【０３９０】
マウスＣＤ８  Ｔ細胞を漸増濃度のＹ９の存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によりインビトロ刺激した。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳに添加された漸増量の機能グレード抗ＣＤ３（クローン１７Ａ２；サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）およびＹ９と、４℃で一晩インキュベートした。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓および皮膚−流入領域リンパ節から、全ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ネガティブセレクション（ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｍｏｕｓｅ；ミルテニーバイオテク社）により、精製した。次に、ＣＤ８  Ｔ細胞を５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（インビトロジェン社）で標識した。細胞を加える前に、抗体を９６ウェルプレートから吸引し、ウェルを１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで室温で１０分間ブロッキングし、その後再度吸引した。４×１０４個のＣＤ８＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８（クローン３７．５１）と共に各ウェルに加え、３７℃で７２時間インキュベートした。次に、細胞を活性化マーカー染色および細胞内グランザイムＢ染色にかけ、フローサイトメトリー分析を行った。図１９に示すように、Ｙ９は、インビトロにおいて、共刺激活性を示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および機能性を増大させた。示されたデータでは、１．６７μｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＣＤ３、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８、および漸増濃度のＹ９が使用された。増殖の定義は、細胞の少なくとも１回の分裂の実行が、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ平均蛍光強度の２倍希釈で示されることとした。
【０３９１】
実施例１６．抗体Ｙ９のエピトープマッピング
本実施例では、酵母表面ディスプレイを用いた抗体Ｙ９の微細エピトープマッピングについて記載する。
【０３９２】
ドメインレベルマッピングにより、マウスＴＮＦＲ２のＣＲＤ１領域に対するＹ９抗体のエピトープが同定された（実施例５）。実施例６に記載の通りの微細エピトープマッピング戦略を用いて、アミノ酸分解能（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）により上記エピトープをさらに定義した（Ｌｅｖｙら、ＪＭＢ、２００７年；３６５巻：頁１９６〜２１０）。それぞれ表面露出位置に１アミノ酸置換を含む合計１５種のＴＮＦＲ２変異体が、酵母の表面上に提示された。各位置のＹ９結合性への寄与を評価するため、各位置でアラニンまたはアスパラギン酸への置換を行った（表５）。
【表５−１】
2022502076.tif 000008
【表５−２】
2022502076.tif 000009
【０３９３】
１５種全ての変異体および野生型配列について、Ｙ９（４００ｎＭ）に対する結合等温式を求めた（表５）。Ｙ９結合に有意な混乱が生じた位置（−）をマウスＴＮＦＲ２の相同性モデル上にマッピングした（図２０）。Ｒ４９の受容体／リガンド界面に対する近接は、Ｙ９がＴＮＦＲ２への結合においてリガンドと競合し得るという知見と合致する。
【０３９４】
実施例１７．同系腫瘍モデルにおける抗マウスＴＮＦＲ２抗体の単回投与の抗腫瘍効果
本実施例では、複数の同系腫瘍モデルにおいて抗ＴＮＦＲ２抗体の単回投与の抗腫瘍反応を明らかにする。６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを管理条件下の無菌環境に収容した。２００μＬのＰＢＳ中３×１０５個のＣＴ２６（結腸）細胞、ＥＭＴ６（乳房）細胞、Ｗｅｈｉ６４（線維肉腫）細胞、またはＡ２０（Ｂ細胞リンパ腫）細胞を右側腹部に皮下注射することにより、腫瘍を樹立した（６〜７匹のマウス／群）。ノギスを用いて腫瘍成長をモニターし、体積は式π／６×（長さ×幅×幅）に従って算出した。腫瘍が５０〜７０ｍｍ３の平均サイズに達したら、Ｙ９抗体を、総体積２００μＬの単回投与（０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、または１ｍｇ）として腹腔内注射した。４種全てのモデルにおいて１回のみの抗体投与で有意な抗腫瘍活性が見られた（表６、図２１Ａ〜２１Ｄ、図２２Ａ〜２２Ｄ、および図２３Ａ〜２３Ｄ、および図２４Ａ−２４Ｄ）。
【表６】
2022502076.tif 000010
【０３９５】
１１匹のＷｅｈｉ６４完全レスポンダーにリチャレンジを行って、長期の抗腫瘍反応が誘導されるかを調べた。初回接種後２１４日目、ＣＲマウスおよび同齢対照マウス（５）を、２００μＬのＰＢＳ中の３×１０５個のＷｅｈｉ６４細胞を、初回接種の反対の左側腹部に皮下注射することにより、リチャレンジした。上記の通りに腫瘍サイズをモニターした。０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、または１ｍｇのＹ９のいずれかを最初に投与されていたマウスは腫瘍成長を示さず、一方、同齢対照は全て腫瘍成長を示した（図２５）。
【０３９６】
本実施例は、抗ＴＮＦＲ２抗体の単回投与が複数の同系腫瘍モデルで抗腫瘍効果を示し、その効果が腫瘍除去後も保持される場合があることを示している。
【０３９７】
実施例１８．表面ＣＴＬＡ４発現に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の効果
本実施例は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４発現に対する抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果について記載する。
【０３９８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３×１０５匹のＥＭＴ−６細胞を皮下注射した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスをＰＢＳ、または３００μｇのＹ９もしくはＹ９−ＤＡＮＡ（すなわち、Ｄ２６５Ａ置換およびＮ２９７Ａ置換を有するＦｃ領域を含むＹ９）で処置した。３６時間後に腫瘍を回収し、Ｔｕｍｏｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｍｏｕｓｅ（ミルテニーバイオテク社）を製造業者の取扱説明書に従って使用して消化し、Ｔ細胞系マーカーおよびＣＴＬＡ−４（クローンＵＣ１０−４Ｂ９、バイオレジェンド社）の染色を行った。図２６Ａおよび図２６Ｂに示すように、Ｙ９処置（および、程度はより小さいが、Ｙ９  ＤＡＮＡ処置）は、腫瘍内のＣＤ４＋通常Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＣＴＬＡ４の細胞表面発現を有意に減少させたが、腫瘍流入領域リンパ節では変化は確認されなかった。
【０３９９】
実施例１９．腫瘍におけるＧＩＴＲ発現、ＧＡＲＰ発現、およびＰＤ−１発現に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の効果
本実施例では、腫瘍におけるＧＩＴＲ発現、ＧＡＲＰ発現、およびＰＤ−１発現に対する抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果について記載する。
【０４００】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３×１０５匹のＥＭＴ−６細胞を皮下注射した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスをＰＢＳ、または３００μｇのＹ９もしくはＹ９−ＤＡＮＡで処置した。３６時間後に腫瘍を回収し、Ｔｕｍｏｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｍｏｕｓｅ（ミルテニーバイオテク社）を製造業者の取扱説明書に従って使用して消化し、Ｔ細胞系マーカー、ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ−１、バイオレジェンド社）、ＧＡＲＰ（クローンＦ０１１−５、バイオレジェンド社）、ＬＡＰ（ＴＷ７−１６Ｂ４、バイオレジェンド社）、およびＰＤ−１（ＲＭＰ１−３０、バイオレジェンド社）の染色を行った。Ｙ９処置を用いた場合、および、程度はより小さいが、Ｙ９  ＤＡＮＡを用いた場合に、ＧＩＴＲの細胞表面発現に有意な減少が起こった（図２７Ａ）。Ｙ９は、潜在型ＴＧＦ−βに対するドッキングステーションとして働くＧＡＲＰ、およびＴＧＦ−βと関連しているＬＡＰ（潜在関連ペプチド）の発現に、協調された減少を引き起こしたが、Ｙ９  ＤＡＮＡは引きこさなかった（図２７Ｂ）。ＧＩＴＲと同様に、Ｙ９は、ＰＤ−１＋エフェクターＴ細胞の頻度の減少を引き起こし、さらに、ＣＤ８  Ｔ細胞上の細胞当たりの発現（ｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（蛍光強度の中央値として示される）に顕著な減少を引き起こした（図２７Ｃ）。
【０４０１】
実施例２０．ＴＮＦＲ２発現に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の効果
本実施例は、腫瘍におけるＴＮＦＲ２発現に対する抗マウスＴＮＦＲ２抗体の効果について記載する。
【０４０２】
ＣＴ２６同系腫瘍モデル、ＭＣ３８同系腫瘍モデル、およびＷＥＨＩ−１６４同系腫瘍モデルのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３×１０５個の細胞を皮下注射した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスをＰＢＳ、または３００μｇのＹ９もしくはＹ９−ＤＡＮＡで処置した。３６時間後（ＣＴ２６）または２４時間後（ＭＣ３８およびＷＥＨＩ−１６４）に腫瘍を回収し、Ｔｕｍｏｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｍｏｕｓｅ（ミルテニーバイオテク社）を製造業者の取扱説明書に従って使用して消化し、Ｔ細胞系マーカーおよびＴＮＦＲ２（クローンＴＲ７５−８９、バイオレジェンド社）の染色を行った。図２８Ａ〜２８Ｃに示すように、Ｙ９処置を用いた場合、および、程度はより小さいが、Ｙ９  ＤＡＮＡを用いた場合に、ＴＮＦＲ２の細胞表面発現に有意な減少が確認された。
【０４０３】
実施例２１．抗ヒトＴＮＦＲ２抗体およびキメラの結合
アブベリス社（Ａｂｖｅｒｉｓ）（カントン、マサチューセッツ州）にてマウスの免疫を実施した。簡潔に説明すると、ヒトＴＮＦＲ２−Ｈｉｓをフロイント完全アジュバントで乳化し、４匹のＤｉｖｅｒｓｉｍＡｂマウスを１００μｇで免疫した。フロイント不完全アジュバント中の１００μｇのＴＮＦＲ２−Ｈｉｓの追加抗原注射を、１４日目、２８日目、４２日目、および５６日目に与えた。最後の免疫の後、ＥＬＩＳＡでＴＮＦＲ２反応性について抗体価の試験を行った。抗体産生Ｂ細胞と骨髄腫細胞との融合を６０日目に行い、９６ウェルプレート上に播種した。融合体を１０〜１４日間培養した後、ヒトＴＮＦＲ２−Ｈｉｓ、ヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃ、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、および無関係なＦｃ融合タンパク質に対するスクリーニングにかけた。次に、ＴＮＦＲ２タンパク質全てについて陽性であり、且つ無関係Ｆｃタンパク質については陽性ではなかったハイブリドーマを、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を用いてサブクローニングした。サブクローニングされたハイブリドーマクローンを再度、ＥＬＩＳＡでＴＮＦＲ２反応性について試験し、陽性クローンを抗体産生用に増殖させた。プロテインＧを用いて抗体を培地から精製した。ハイブリドーマの配列決定はジェンスクロプト社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）で実施した。簡潔に説明すると、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＲＡＣＥを用いて抗体配列を増幅し、シークエンシング用ベクターにクローニングし、シークエンシングした。
【表７−１】
2022502076.tif 000011
【表７−２】
2022502076.tif 000012
【０４０４】
ヒトＴＮＦＲ２に対するハイブリドーマ抗体を、ＥＬＩＳＡで、キメラ０、キメラ３、マウスＴＮＦＲ２、およびヒトＴＮＦＲ２に対する結合性について特徴付けした。簡潔に説明すると、黒色３８４ウェルマイクロプレート（グライナー・バイオワン社（Ｇｒｅｎｉｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ））を、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したキメラ０、キメラ３、マウスＴＮＦＲ２−Ｈｉｓ、およびヒトＴＮＦＲ２−Ｈｉｓで、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ／１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした後、ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で洗浄した。次いで、プレートをハイブリドーマ抗体含有培地と１時間インキュベートし、再度洗浄した後、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））を添加し１時間置いた。洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（サーモサイエンティフィック社）を各ウェルに添加し、ＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（バイオテック社）を用いて発光を検出した。図２９に示すように、キメラ３およびヒトＴＮＦＲ２に結合し、キメラ０およびマウスＴＮＦＲ２に結合しない、いくつかのマウス抗体が同定された。本実施例では、Ｙ９エピトープのヒトコグネイトに対応するヒトＴＮＦＲ２の領域に結合する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の産生が示された。
【０４０５】
実施例２２．抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のヒト型化
本実施例は、マウス抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２のヒト型化の、実施例２１に記載の方法を用いた作製について記載する。ＡＢＶ２のＶＨ配列およびＶＬ配列をヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域と融合することにより、ＡＢＶ２（ＡＢＶ２ｃ）のキメラ型を作製した。
【０４０６】
マウス親ＡＢＶ２のＶＨ配列およびＶＬ配列、並びにキメラＡＢＶ２ｃの完全長の配列を表８および表９に示す。
【表８−１】
2022502076.tif 000013
【表８−２】
2022502076.tif 000014
【０４０７】
ＡＢＶ２のヒト型化において、シュレディンガー社（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）製Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウェアを用いて、マウス抗体の可変配列をインプットとして用いて相同性モデルを作製した。改良型Ｃｈｏｔｈｉａ命名法を用いて、ＣＤＲとフレームワーク境界を定義した。限定はされないが、全体的な同一性、類似性、ＣＤＲステム形状などの種々の配列パラメーターおよび構造パラメーターに基づいて、蛋白質構造データバンクから様々なヒト型化用鋳型を選択した。加えて、マウス親抗体配列に対し最も高い同一性を有するヒト生殖細胞系列遺伝子配列を入手し、フレームワークのセレクションに利用した。スコアが最も高いヒト抗体鋳型を選び、正準構造ｖｅｒｎｉｅｒゾーンの一部である残基を除いたフレームワーク置換を行い、界面は未変化とした（マウス親）。
【０４０８】
フレームワーク置換の後、ヒト型化相同性モデルを、ＧＲＯＭＯＳ力場を用いてエネルギー最小化し、総エネルギーが非常に高い残基をさらに調べた。立体衝突を示した非保存残基を対応する親マウス配列に変異により戻すか、あるいは、抗体データベースから得られたヒト抗体配列間の残基分布統計に基づいて置換を行った。これらの残基変化の後、モデルに再度エネルギー最小化を行い、許容可能なエネルギースコアを有するフレームワークを試験用に選んだ。上記方法を用いて作製されたＡＢＶ２のヒト型化された重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を下記に示す。ヒト型化配列のアラインメントを図３０Ａ〜３０Ｄに示す。
【０４０９】
ヒト型化重鎖可変領域
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃１（ＨＤ１）（配列番号７３）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＲＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＮＦＱＧＲＦＡＦＴＶＤＴＥＡＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＫＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃２（ＨＤ３）（配列番号７４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃３（ＨＤ４）（配列番号７５）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＡＳＭＲＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＮＴＡＦＬＱＭＮＳＬＫＳＤＤＴＡＭＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃４（ＨＤ５）（配列番号７６）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＫＦＱＧＲＦＴＦＴＬＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃５（ＨＤ６）（配列番号７７）
ＥＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＡＦＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＭＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＮＥＮＦＫＧＱＦＴＦＳＬＤＴＳＳＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃６（ＨＤ８）（配列番号７８）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＮＥＮＦＫＧＲＦＴＦＳＶＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃７（ＨＤ９）（配列番号７９）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＮＥＫＦＫＳＫＦＴＦＴＬＤＴＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃８（ＨＤ１３）（配列番号８０）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＫＦＱＧＲＦＴＦＴＬＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃９（ＨＤ１５）（配列番号８１）
ＥＩＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃１０（ＧＢＭ０１）（配列番号８２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃１１（ＧＢＭ０２）（配列番号８３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃１２（ＧＢＭ０４）（配列番号８４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０４１０】
ヒト化軽鎖可変領域
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１（ＨＤ１）（配列番号８５）
ＥＩＶＬＭＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＦＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＡＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃２（ＨＤ３）（配列番号８６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃３（ＨＤ４）（配列番号８７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＳＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＦＱＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＩＲＶＥＡＥＤＡＧＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃４（ＨＤ５）（配列番号８８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃５（ＨＤ６）（配列番号８９）
ＤＩＶＬＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃６（ＨＤ８）（配列番号９０）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃７（ＨＤ９）（配列番号９１）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃８（ＨＤ１０）（配列番号９２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＦＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃９（ＨＤ１３）（配列番号９３）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＦＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１０（ＨＤ１４）（配列番号９４）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１１（ＨＤ１５）（配列番号９５）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＦＱＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１２（ＨＤ１７）（配列番号９６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１３（ＨＤ２５）（配列番号９７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＡＧＱＳＦＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１４（ＧＢＭ０１）（配列番号９８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１５（ＧＢＭ０２）（配列番号９９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃１６（ＧＢＭ０３）（配列番号１００）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０４１１】
実施例２３．
ＮＦ−κＢレポーター細胞株アッセイにおける抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のインビトロ試験
本実施例は、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト活性を評価するための、ヒトＴＮＦＲ２レポーター細胞株の作製について記載する。シグナル伝達アッセイにおいてヒト抗ＴＮＦＲ２抗体のアゴニスト活性を試験するため、ヒトＴＮＦＲ２レポーター細胞株を作製した。簡潔に説明すると、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を用いて、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃ２ｐ  ＨＥＫ２９３細胞株（プロメガ社）を、完全長ヒトＴＮＦＲ２遺伝子（オリジーン社（Ｏｒｉｇｅｎｅ））でトランスフェクトし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に回収した。トランスフェクションの２日後、培地をジェネティシン（登録商標）（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有する培地と置き換えた。ジェネティシン含有培地中で１４日間培養した後、ヒトＴＮＦＲ２の安定発現をフローサイトメトリーで確認した。ＴＮＦＲ２誘導性のＮＦ−κＢシグナル伝達を測定するため、ヒトＴＮＦＲ２レポーター細胞およびベクター対照細胞（１×１０４個）を、ＡＢＶ２ｃ（０．１４〜１００ｎＭ）と３７℃で５時間インキュベートした。次に、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬を添加し、発光をＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（バイオテック社）で測定した。抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃとのインキュベーション後、ＮＦ−κＢシグナル伝達において用量依存的な増加が確認された（図３１）。
【０４１２】
実施例２４．インビトロにおける卵巣がん腹水中の制御性Ｔ細胞に対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の効果
卵巣がん患者由来の制御性Ｔ細胞は、高レベルのＴＮＦＲ２を有し、免疫抑制性が高いことが報告されている。他にも、抗ＴＮＦＲ２抗体による処理は、腹水中制御性Ｔ細胞の生存率を減少させることが示されている（Ｔｏｒｒｅｙら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ、２０１７年；１０巻：ｅａａｆ８６０８）。本実施例は、卵巣がん腹水中の制御性Ｔ細胞に対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の効果について記載する。
【０４１３】
卵巣がん腹水を得て、全腹水を、表示濃度の抗ＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃと一緒に４８時間培養した。フローサイトメトリーを用いて、処理後のＣＤ４＋Ｔ細胞区画内の制御性Ｔ細胞の相対的存在量を求めた（図３２Ａおよび図３２Ｂ）。図３２Ａに示すように、ＡＢＶ２ｃはＣＤ４区画内の制御性Ｔ細胞系マーカーＦｏｘｐ３を発現する細胞の割合を減少させたが、このことは、ＡＢＶ２ｃが制御性Ｔ細胞を選択的に阻害するが、エフェクターＣＤ４Ｔ細胞は阻害しないことを示唆している。
【０４１４】
実施例２５．インビトロにおけるＡＤＣＣに対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の効果
本実施例は、インビトロアッセイを用いた、ＡＤＣＣに対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃの効果について記載する。
【０４１５】
実施例８および実施例１４に示されているように、同系マウス腫瘍モデルにおけるマウス代替抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍活性には、Ｆｃγ受容体結合が必要である。ＮＫ細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の重要なエフェクターである。ＡＢＶ２ｃがヒト細胞のＡＤＣＣを媒介するかどうかを調べるために、ＮＫ細胞（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ステムセル社（ＳｔｅｍＣｅｌｌ））を健常ドナーから得られた末梢血から単離し、高レベルのＴＮＦＲ２を発現するカルボキシフルオセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ＪＪＮ３（形質細胞性骨髄腫）標的細胞と一緒に、エフェクター（ＮＫ細胞）：標的細胞の比が５：１となるように、５μｇ／ｍＬの濃度のＡＢＶ２ｃの存在下または非存在下で４時間培養した。標的細胞が死滅するにつれ、細胞膜は透過性となり、細胞内タンパク質は漏出し、１細胞当たりのＣＦＳＥ蛍光の低下が生じ、これはフローサイトメトリーで定量化できる。図３３Ａおよび図３３Ｂに示すように、ＮＫ細胞の存在下では、ＡＢＶ２ｃは、複数のドナーにわたって、標的細胞単独＋アイソタイプ対照抗体、または標的細胞＋ＮＫ細胞＋アイソタイプ対照抗体と比較して、死細胞の数を増加させ、このことは、ＡＢＶ２ｃがヒト標的細胞のＡＤＣＣを媒介することを示唆している。
【０４１６】
実施例２６：ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の共刺激活性、増殖、および機能性に対するヒト抗ＴＮＦＲ２抗体の効果
Ｔ細胞機能の様々な側面に対するヒト抗ＴＮＦＲ２抗体の効果を以下の通りに調べた。
【０４１７】
簡潔に説明すると、９６ウェル平底プレート（コーニング社）を、漸増量の機能グレード抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、バイオレジェンド社）およびヒト抗ＴＮＦＲ２抗体でコーティングした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配（ＧＥヘルスケア社）により、５０ｍＬ  ＳｅｐＭａｔｅ−５０チューブ（ステムセルテクノロジーズ社）内で単核細胞を単離した。全ＣＤ８  Ｔ細胞またはナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４  Ｔ細胞を、ネガティブセレクション（ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ｈｕｍａｎ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）またはナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｎａiｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ）、ミルテニー社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））で精製し、５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）で標識した。２〜５×１０４個の細胞（通常、ＣＤ８  Ｔ細胞は８５％超の純度、ＣＤ４  Ｔ細胞は９０％超）を、１０％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ギブコ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ社）、５０μＭ  β−ＭＥ（Ｇ−バイオサイエンシーズ社（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ギブコ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））中、１μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、バイオレジェンド社）と共に、各ウェルに加え、３７℃で、表示の通りに７２時間または９６時間、インキュベートした。最後の５時間、ゴルジ阻害剤（ｇｏｌｇｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ブレフェルジンＡ（バイオレジェンド社）をＣＤ８＋Ｔ細胞培養物に添加した。その後、細胞の活性化マーカーおよび細胞内サイトカインを染色し、フローサイトメトリー分析にかけた。まず、細胞を以下のバイオレジェンド社製抗体とインキュベートし染色を行った：ＣＤ４（ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＳＫ１またはＨＩＴ８ａ）、ＣＤ２５（ＢＣ９６）、ＰＤ−１（ＥＨ１２．２Ｈ７）。まず、単一細胞懸濁液を、ＰＢＳ中、Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤバイオサイエンス社）およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  Ｇｈｏｓｔ  Ｄｙｅ  Ｒｅｄ７１０  （トンボ・バイオサイエンシーズ社（Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））と４℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞の細胞外マーカーを、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中、４℃で３０分間染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトゾルタンパク質を染色する場合、バイオレジェンド社製Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を透過処理した。試料をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）にかけ、ＦｌｏｗＪｏ解析用ソフトウェア（ツリー・スター社（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ））バージョン１０．５．３を用いてデータを解析した。データの解析は、２元配置分散分析とダネットの多重比較事後検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を用いて行った。データを平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）としてプロットした。アイソタイプとの統計的有意差が示されている（＊ｐ＜０．０��、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【０４１８】
図３４Ａ〜３４Ｃに示すように、ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体ＡＢＶ２ｃは、インビトロにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させ、これらの細胞上に活性化マーカーを誘導した。さらに、ＡＢＶ２ｃは、抗ＧＩＴＲ抗体（ＴＲＸ５１８）または抗４−１ＢＢ抗体（ウレルマブ）よりも大きな、増殖および活性化マーカー誘導をもたらした。
【０４１９】
実施例２７：移植片対宿主病モデルにおけるヒト抗ＴＮＦＲ２抗体の効果
ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体の疾患から保護する能力を、下記の通りに異種ＧｖＨＤモデルを用いて調べた。
【０４２０】
簡潔に説明すると、３〜６週齢の雌ＮＳＧ−ＳＧＭ３（ＮＯＤ  Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（ＣＭＶ−ＩＬ−３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚ）マウスに、１０７個の健常ドナー由来ＰＢＭＣを、静脈内投与し、体重減少および身体状態の変化のモニタリングを毎日実施した。２０％超の初期体重減少または身体状態の重篤な悪化が見られた場合、動物を安楽死させた。１４日目、２３日目、および３０日目に、マウスに、３００μｇの抗ＴＮＦＲ２（ＡＢＶ２ｃ）、抗４−１ＢＢ（ウトミルマブ）、またはアイソタイプ対照抗体を腹腔内処置した。対照群と治療群との間でログランク検定を用いた比較を行った。ＰＢＳとの統計的有意差が示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図３５に示すように、ＡＢＶ２ｃは異種ＧｖＨＤモデルにおいて生存率を増加させた。保護効果はアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体（ウトミルマブ）のそれよりも大きかった。
【０４２１】
実施例２８：ヒト抗ＴＮＦＲ２抗体およびマウス抗ＴＮＦＲ２抗体の高解像度エピトープマッピング
Ｙ９およびＡＢＶ２ｃによって認識されるＴＮＦＲ２上のエピトープの高解像度マッピングを、下記の通りに実施した。
【０４２２】
ヒトＴＮＦＲ２およびマウスＴＮＦＲ２両方のＣＲＤ１領域の表面残基を変異走査にかけた。マウスＴＮＦＲ２の相同性モデルに基づいて、ＣＲＤ１内の表面露出部位を、アラニンまたはアスパラギン酸に変異させた。ヒトＴＮＦＲ２の場合、より多くの破壊的アミノ酸置換を導入した（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４年）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ｔｏ  Ｈｅｌｐ  Ｅｘｐｌａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８５巻（４１５４号）、頁８６２〜８６４）。野生型ヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（２４〜２５７）、野生型マウスＴＮＦＲ２のＥＣＤ（２３〜２５８）、および全ての対応する点変異体を、Ｃ末端のＦＬＡＧエピトープタグに融合し、酵母表面ディスプレイを用いて発現させた。抗マウスＴＮＦＲ２抗体のＹ９または抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のＡＢＶ２ｃで染色した酵母（１×１０６個の細胞）に対して、フローサイトメトリー分析を実施した。抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ・アルドリッチ社）を用いて、細胞表面発現の正規化を行った。ＰＲＩＳＭ（グラフパッド社）において、抗体結合／ＦＬＡＧ検出の平均蛍光強度（ＭＦＩ）比を抗体濃度の関数としてプロットした。
【０４２３】
ＡＢＶ２ｃおよびＹ９の結合性にとって重要な位置がいくつか確認された（それぞれ図３６Ａおよび図３７Ａ）。ＡＢＶ２ｃの場合、これらの位置は、リーダー配列を含まないヒトＴＮＦＲ２（配列番号１０４）のＹ２４、Ｑ２６、Ｑ２９、Ｍ３０、およびＫ４７に該当する。Ｙ９の場合、これらの位置は、リーダー配列を含まないマウスＴＮＦＲ２（配列番号１０７）のＹ２５、Ｒ２７、Ｋ２８、Ｍ３１、およびＮ４７に該当する。ヒトＴＮＦＲ２／ＴＮＦ複合体（ＰＤＢ：３ＡＬＱ）の結晶構造およびマウスＴＮＦＲ２／ＴＮＦ複合体の相同性モデルを用いて、両方の抗体エピトープの、ＴＮＦ結合性に関する可視化を行った（それぞれ、ＡＢＶ２ｃは図３６Ｂ；Ｙ９は図３７Ｄおよび図３７Ｅ）。注目すべきことに、ＡＢＶ２ｃおよびＹ９は共に、ヒト（Ｙ２４、Ｑ２６、およびＭ３０）およびマウス（Ｙ２５、Ｒ２７、およびＭ３１）において、構造的に等価な位置と相互作用する。ＡＢＶ２ｃおよびＹ９の両エピトープとヒト／マウスＴＮＦ結合界面とが近位であることは、これらの抗体が、立体上の遮蔽により、ＴＮＦと競合する可能性があることを示唆している。別の可能性として、これらの抗体は受容体に立体構造変化を誘導することで、ＴＮＦ結合を妨げるということもあり得る。
【０４２４】
実施例２９：ヒト型化マウスの患者由来異種移植モデルにおける抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍活性
腫瘍モデルにおける抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の活性を調べるため、３週齢のＮＳＧ−ＳＧＭ３雌マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に１４０ｃＧｙの照射を行った後、同日に２×１０４個の混合ドナー由来ヒト臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞（オールセルズ社（ＡｌｌＣｅｌｌｓ））を静脈内注射した。１２週間の安静による造血幹細胞生着およびヒト免疫系との再構築の後、抗ヒトＣＤ４５用および抗マウスＣＤ４５用のフロー抗体（ｆｌｏｗ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた染色により末梢血をヒト免疫細胞生着についてスクリーニングした。全ＣＤ４５＋細胞の２５％以上がヒト由来であった場合に、マウスをヒト型化と見なした。ヒト型化マウスに、５×１０６細胞の患者由来異種移植片細胞株ＬＧ１３０６（ジャクソン・ラボラトリーズ社）を皮下注射した。平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ３になったら、マウスを３つの治療群に均等に分配し、０．３ｍｇの、ヒトアイソタイプＩｇＧ１（バイオ×セル社）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１  ＩｇＧ１）単独、またはニボルマブ＋ＡＢＶ２ｃ（ＩｇＧ１）の組み合わせを、７日毎に合計５回、腹腔内注射した。腫瘍体積は２〜３日毎に測定した。
【０４２５】
図３８に示すように、アイソタイプ対照群とニボルマブ＋ＡＢＶ２ｃ群との間、およびニボルマブ群とニボルマブ＋ＡＢＶ２ｃ群との間に、腫瘍体積における統計的有意差（ＡＮＯＶＡ、テューキーのＨＳＤ法）が確認された。
【０４２６】
実施例３０：抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の親和性成熟
ＡＢＶ２  ＶＨ＿ｈｕｍ＃２（ＨＤ３）（配列番号７４）およびＡＢＶ２  ＶＬ＿ｈｕｍ＃２（ＨＤ３）（配列番号８６）に対して親和性成熟を実施した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方のアミノ酸配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用に最適化し、合成し、Ｆａｂファージミドにクローニングした。市販Ｆａｂファージミドの例としては、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣ３Ｃ、およびｐＡＤＬ−２３ｃがある。変異原性プライマー（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、下記の位置（コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）を用いて番号付け）のランダム化を行った：重鎖ＣＤＲ１（２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）、重鎖ＣＤＲ２（５０位、５１位、５２Ａ位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、および５８位）、重鎖ＣＤＲ３（９５、９６、９７、９８、１０１、および１０２）、軽鎖ＣＤＲ１（２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３１、３２、３３、および３４）、軽鎖ＣＤＲ２（５０、５１、５２、５３、５４、５５、および５６）、および軽鎖ＣＤＲ３（８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、および９７）。各プライマーには、重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つのＣＤＲ内の４つの位置に、縮重コドンであるＮＮＳまたはＶＮＳを含ませた。プライマーを組み合わせて、ＰＣＲベースの変異誘発を用いて第１世代変異Ｆａｂライブラリーを作製した。ヒトＴＮＦＲ２−Ｈｉｓに対するパニングを２回行った後、濃縮されたファージ感染細菌クローンをプールし、ＤＮＡを単離した。２回目のＰＣＲ変異誘発を実施して、第２世代変異Ｆａｂライブラリーを作製し、さらに２回の抗原に対するパニングを行った。プレートから、最終出力ファージより得られた個々の感染大腸菌クローンをセレクションし、９６ウェルの培養液中で増殖させた。可溶性Ｆａｂタンパク質を含有するペリプラズム抽出液のＴＮＦＲ２−Ｈｉｓ結合性についてＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。Ｆａｂの親和性を評価するため、競合ＥＬＩＳＡを同時に行った。Ｆａｂ抽出物を可溶性の競合的ＴＮＦＲ２−Ｈｉｓ（５ｎＭ）の存在下または非存在下で１時間インキュベートした後、ＴＮＦＲ２をコーティングしたウェル上でインキュベートした。競合物質の存在下でＥＬＩＳＡシグナルが減少したクローンを、より大きな親和性（５ｎＭ未満）を有していると見なし、さらなる分析用に選択した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域をクローニングし、ヒトＩｇＧ１抗体としてＥｘｐｉ２９３細胞において発現させた。これらの親和性成熟抗体（ＡＢＶ２．７、ＡＢＶ２．１３、およびＡＢＶ２．１５）の完全長配列、可変領域配列、およびＣＤＲ配列を表１０に示す。
【０４２７】
ＡＢＶ２．７ＶＨ（配列番号１２６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２．７ＶＬ（配列番号１２７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＬＴＡＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＲＨＶＮＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２．１３ＶＨ（配列番号１４８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＨＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２．１３ＶＬ（配列番号１４９）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＴＶＤＳＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＧＮＲＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＢＶ２．１５ＶＨ（配列番号１７０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＦＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＨＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＳＮＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＢＶ２．１５ＶＬ（配列番号１７１）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＥＳＬＴＡＳＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＲＨＶＮＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０４２８】
実施例３１：ヒトＴＮＦＲ２に対する親和性成熟抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の結合親和性
実施例３０で作製された親和性成熟抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のヒトＴＮＦＲ２に対する結合親和性を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で測定した。簡潔に説明すると、下記の条件下で、抗ヒトＦｃ捕捉（ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ）（ＡＨＣ）バイオセンサー（フォートバイオ社（ＦｏｒｔｅＢｉｏ））を用いて、ＢＬＩカイネティクスアッセイを実施した：（ａ）抗体（４μｇ／ｍＬ）の添加、６０秒、（ｂ）ベースライン、６０秒、（ｄ）ヒトＴＮＦＲ２−Ｈｉｓ（４ｍｇ／ｍｌ）との結合、３００秒、および（ｅ）解離、３００秒。表９に記載されているように、親和性成熟抗体の結合親和性は、親抗体（配列番号７４の重鎖可変領域配列および配列番号８６の軽鎖可変領域配列を有するＡＢＶ２．１）のそれよりも実質的に高くなり、ＡＢＶ２．１５はヒトＴＮＦＲ２に対し最も強い親和性を示した（ＫＤ＝０．１５８ｎＭ）。
【表９−１】
2022502076.tif 000015
【表９−２】
2022502076.tif 000016
【０４２９】
実施例３２：親和性成熟抗ヒトＴＮＦＲ２抗体によるＴ細胞共刺激
実施例３０で作製された親和性成熟抗ヒトＴＮＦＲ２抗体を用いて、Ｔ細胞共刺激の様々な側面を調べた。
【０４３０】
増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、およびＰＤ１の発現上昇
３人の健常ドナーから得られたヒトナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４  Ｔ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（ｈｕｍａｎ  Ｎａiｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ）（ミルテニー社）を用いたネガティブセレクションにより濃縮し、５ｍＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識した。９６ウェル平底プレート（コースター社）を、５ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、バイオレジェンド社）および漸増量の抗ＴＮＦＲ２で、３７℃で２時間コーティングした。次いで、プレートを完全ＲＰＭＩで洗浄し、室温で１０分を超えて室温でブロッキングし、４×１０４個の細胞を１ｍｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８（バイオレジェンド社）と一緒に加えた。細胞を４日間刺激した後、フローサイトメトリー分析にかけた。ＣＤ４＋生Ｔ細胞の、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、および急性活性化マーカーＰＤ−１の発現上昇についての評価を行った。
【０４３１】
図３９Ａ〜３９Ｃに示すように、３種の被験抗体の中で親和性が最も低いことにもかかわらず、ＡＢＶ２．１３は、ＡＢＶ２ｃと比較して同様の、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、およびＰＤ−１発現上昇を促進する能力を示した。
【０４３２】
サイトカイン産生細胞
健常ドナーから得られたナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、上記の通りに抗ＣＤ３／２８と、漸増量のプレート結合型ＩｇＧ１アイソタイプ、キメラＡＢＶ２ｃ、並びにヒト型化バリアントのＡＢＶ２．１３およびＡＢＶ２．７とで刺激した。最後の５時間の刺激の間、ブレフェルジンＡを培養液に添加し、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋細胞およびＩＬ−２産生ＣＤ４＋細胞の割合をフローサイトメトリーで評価した。
【０４３３】
図４０Ａおよび図４０Ｂに示すように、ＡＢＶ２．１３は、ＡＢＶ２ｃおよびＡＢＶ２．７と同程度に、ＩＦＮ−γ産生細胞およびＩＬ−２産生細胞の数を増加させた。
【０４３４】
サイトカイン産生
上記の（図３９Ａ〜３９Ｃの）インビトロにおける単離ヒトナイーブＣＤ４  Ｔ細胞の刺激後、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム（サーモフィッシャー・インビトロジェン社：Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １８−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ  １Ｃ、１８分析物）を用いて、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３）についての評価を行った。
【０４３５】
図４１Ａ〜４１Ｇに示すように、サイトカイン産生は、ＡＢＶ２ｃと比較して、ＡＢＶ２．１３で処理されたＣＤ４＋Ｔ細胞において最も多かった。ＩＬ−２誘導を除いて、ＡＢＶ２．７は、被験抗体の中で親和性が最も高かったのにもかかわらず、サイトカイン産生刺激は最少量となった。
【０４３６】
ＮＦ−κＢ活性の刺激
リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャー社）を用いた完全長マウスＴＮＦＲ２遺伝子（オリジーン社）またはベクター対照で安定にトランスフェクトしたＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃ２ｐ  ＨＥＫ２９３細胞（プロメガ社）を用いて、ヒトＴＮＦＲ２レポーター細胞株を作製した。細胞はジェネティシン（０．２ｍｇ／ｍＬ）含有ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で維持した。９６ウェル黒色壁組織培養プレートを漸増濃度の抗ＴＮＦＲ２  ｍＡｂで３７℃で２時間コーティングした後、洗浄し、完全培地でブロッキングした。４×１０４個のＴＮＦＲ２発現細胞または対照ＨＥＫ２９３細胞を各ウェルに加えて５０ｍＬの体積とし、３７°で５時間培養した後、５０ｍＬのＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を各ウェルに添加した。発光をＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（バイオテック社）で測定した。
【０４３７】
図４２に示すように、全ての抗体がＮＦ−κＢ活性の刺激において比較的に同様のＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）を示した：ＡＢＶｃ（ＥＣ５０＝８．６μｇ／ｍｌ）、ＡＢＶ２．７（ＥＣ５０＝１０．８μｇ／ｍｌ）、ＡＢＶ２．１３（ＥＣ５０＝４．１μｇ／ｍｌ）、およびＡＢＶ２．１５（ＥＣ５０＝９．３μｇ／ｍｌ）。しかし、ＡＢＶ２．１５は最も高いレベルのＮＦ−κＢ活性を誘導した。
【０４３８】
実施例３３：比較対象である従来抗体よりも優れた、ＡＢＶ２抗体によるＴ細胞共刺激
Ｔ細胞共刺激の様々な側面を、低親和性の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体（ＡＢＶ２．１、別名ＡＶＢ２ヒト＿Ｄｓｎ３）、親和性成熟型（ＡＢＶ２．１５）、および比較対象である従来の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体Ａ〜Ｃの間で比較した。
【０４３９】
実施例３２に記載の通りに、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、ＰＤ−１発現上昇、およびＮＦ−κＢ活性刺激について評価した。最高被験濃度において、ＡＢＶ２．１およびＡＢＶ２．１５の両方が、５０％以上のＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激により分裂させ、それと比較して、比較対象Ａは３０％であり、比較対象Ｂは２４％であり、比較対象Ｃは３２％であり、アイソタイプ対照抗体は１５％であった（図４３Ａ）。アイソタイプ対照（１．５倍）と比較した場合の、２０μｇ／ｍｌのＡＢＶ２．１（４．５倍）およびＡＢＶ２．１５（４．８倍）によって誘導された細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）における平均変化倍率は、２元配置分散分析により有意である（ｐ＜０．０５）ことが確認された。対照的に、比較対象Ａ（２．６倍）、比較対象Ｂ（２．０倍）、および比較対象Ｃ（３．３倍）の場合の平均変化倍率は、アイソタイプ対照と比較した場合に有意ではなかった（図４３Ｂ）。
【０４４０】
アイソタイプ対照（０．９６倍）と比較した場合の、２０μｇ／ｍｌのＡＢＶ２．１（１．８倍）およびＡＢＶ２．１５（２．０倍）によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞拡大（ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）における平均変化倍率は、２元配置分散分析により有意である（ｐ＜０．０５）ことが確認された。対照的に、比較対象Ａ（１．２倍）、比較対象Ｂ（１．２倍）、および比較対象Ｃ（１．５倍）の場合の平均変化倍率は、アイソタイプ対照と比較した場合に有意ではなかった（図４３Ｃ）。
【０４４１】
アイソタイプ対照（１．３倍）と比較した場合の、２０μｇ／ｍｌのＡＢＶ２．１（３．４倍）およびＡＢＶ２．１５（３．６倍）によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現上昇における平均変化倍率は、２元配置分散分析により有意である（ｐ＜０．０５）ことが確認された。対照的に、比較対象Ａ（２．２倍）、比較対象Ｂ（１．８倍）、および比較対象Ｃ（２．６倍）の場合の平均変化倍率は、アイソタイプ対照と比較した場合に有意ではなかった（図４３Ｄ）。
【０４４２】
ＡＢＶ２．１およびＡＢＶ２．１５は、それぞれ１．６μｇ／ｍｌおよび５．３μｇ／ｍｌのＥＣ５０でＮＦ−κＢ活性を誘導し、比較対象Ａ（ＥＣ５０＝９．７μｇ／ｍｌ）、比較対象Ｂ（ＥＣ５０＝１６．６μｇ／ｍｌ）、および比較対象Ｃ（ＥＣ５０＝４４μｇ／ｍｌ）よりも活性が高いことが分かった（図４３Ｅ）。
【０４４３】
総じて、ＡＢＶ２．１およびその親和性成熟型ＡＢＶ２．１５は、比較対象の従来抗体Ａ〜Ｃよりも優れている。
【表１０−１】
2022502076.tif 000017
【表１０−２】
2022502076.tif 000018
【表１０−３】
2022502076.tif 000019
【表１０−４】
2022502076.tif 000020
【表１０−５】
2022502076.tif 000021
【表１０−６】
2022502076.tif 000022
【表１０−７】
2022502076.tif 000023
【表１０−８】
2022502076.tif 000024
【表１０−９】
2022502076.tif 000025
【表１０−１０】
2022502076.tif 000026
【表１０−１１】
2022502076.tif 000027
【表１０−１２】
2022502076.tif 000028
【表１０−１３】
2022502076.tif 000029
【表１０−１４】
2022502076.tif 000030
【表１０−１５】
2022502076.tif 000031
【表１０−１６】
2022502076.tif 000032
【表１０−１７】
2022502076.tif 000033
【表１０−１８】
2022502076.tif 000034
【表１０−１９】
2022502076.tif 000035
【表１０−２０】
2022502076.tif 000036
【表１０−２１】
2022502076.tif 000037
【表１０−２２】
2022502076.tif 000038
【表１０−２３】
2022502076.tif 000039
【表１０−２４】
2022502076.tif 000040
【表１０−２５】
2022502076.tif 000041
【表１０−２６】
2022502076.tif 000042
【表１０−２７】
2022502076.tif 000043
【表１０−２８】
2022502076.tif 000044
【表１０−２９】
2022502076.tif 000045
【表１０−３０】
2022502076.tif 000046
【表１０−３１】
2022502076.tif 000047
【表１０−３２】
2022502076.tif 000048
【表１０−３３】
2022502076.tif 000049
【表１０−３４】
2022502076.tif 000050
【表１０−３５】
2022502076.tif 000051
【表１０−３６】
2022502076.tif 000052
【０４４４】
均等論
当業者であれば、本明細書で開示された特定の実施形態の多くの均等物を認識し、あるいは、通例の実験法のみを用いてそれを確認することができる。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2022502076.tif 000053
【図２】
2022502076.tif 000054
【図３】
2022502076.tif 000055
【図４】
2022502076.tif 000056
【図５】
2022502076.tif 000057
【図６】
2022502076.tif 000058
【図７−１】
2022502076.tif 000059
【図７−２】
2022502076.tif 000060
【図８−１】
2022502076.tif 000061
【図８−２】
2022502076.tif 000062
【図８−３】
2022502076.tif 000063
【図８−４】
2022502076.tif 000064
【図９】
2022502076.tif 000065
【図１０−１】
2022502076.tif 000066
【図１０−２】
2022502076.tif 000067
【図１０−３】
2022502076.tif 000068
【図１０−４】
2022502076.tif 000069
【図１１】
2022502076.tif 000070
【図１２】
2022502076.tif 000071
【図１３】
2022502076.tif 000072
【図１４】
2022502076.tif 000073
【図１５】
2022502076.tif 000074
【図１６】
2022502076.tif 000075
【図１７】
2022502076.tif 000076
【図１８】
2022502076.tif 000077
【図１９】
2022502076.tif 000078
【図２０】
2022502076.tif 000079
【図２１】
2022502076.tif 000080
【図２２】
2022502076.tif 000081
【図２３】
2022502076.tif 000082
【図２４】
2022502076.tif 000083
【図２５】
2022502076.tif 000084
【図２６】
2022502076.tif 000085
【図２７−１】
2022502076.tif 000086
【図２７−２】
2022502076.tif 000087
【図２８−１】
2022502076.tif 000088
【図２８−２】
2022502076.tif 000089
【図２９】
2022502076.tif 000090
【図３０−１】
2022502076.tif 000091
【図３０−２】
2022502076.tif 000092
【図３０−３】
2022502076.tif 000093
【図３０−４】
2022502076.tif 000094
【図３１】
2022502076.tif 000095
【図３２】
2022502076.tif 000096
【図３３】
2022502076.tif 000097
【図３４】
2022502076.tif 000098
【図３５】
2022502076.tif 000099
【図３６】
2022502076.tif 000100
【図３７−１】
2022502076.tif 000101
【図３７−２】
2022502076.tif 000102
【図３７−３】
2022502076.tif 000103
【図３８】
2022502076.tif 000104
【図３９−１】
2022502076.tif 000105
【図３９−２】
2022502076.tif 000106
【図４０】
2022502076.tif 000107
【図４１−１】
2022502076.tif 000108
【図４１−２】
2022502076.tif 000109
【図４１−３】
2022502076.tif 000110
【図４１−４】
2022502076.tif 000111
【図４２】
2022502076.tif 000112
【図４３−１】
2022502076.tif 000113
【図４３−２】
2022502076.tif 000114
【図４３−３】
2022502076.tif 000115
【配列表】
2022502076000001.app
【国際調査報告】
2022502076.tif 000116
2022502076.tif 000117
2022502076.tif 000118
2022502076.tif 000119
2022502076.tif 000120
2022502076.tif 000121