【手続補正書】
【提出日】平成22年2月26日(2010.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
感染を、MCMVの105 (BALB/c)、5 x 105の(C57BL6, PTX3+/+およびPTX3-/-)プラーク形成単位(PFU)を腹腔内注射により開始した。採取した組織を、各々ホモジネートし、上清を-80℃で貯蔵し、その後ウイルス力価を標準プラークアッセイによりMEFに対して定量した。PTX3で感染したCHO細胞の培養上清の免疫親和性(Nature2002, 420:182)により内毒素不含条件下でPTX3を獲得し、そして感染を開始して7または14日間腹腔内投与(1または4 mg/kg)行った。ガンシクロビル(GCV)(Cymevene; from Recordati, Milan, Italy)を、感染6時間後に開始する、40 mg/kgにて週に3回腹腔内投与した。コントロールには希釈液のみを与えた。組織学について、パラフィン埋包組織の切片をパス染色法により染色した。A. fumigatusの株および培養条件は、記載されている(Blood 2003, 102:3807)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
DCサブセット作成
マウスDCを、CD11+DCを得るために7日間150 U/mL マウスrGM-CSF (Sigma)および75 U/mL rIL-4) (R&D システム)、またはpDCを得るために9日間(Blood 2003, 102:3807)200 ng/mL FLT3-L(Immunex Corporation, Seattle, WA)の存在下で、Iscoveの修飾培地(Blood 2003, 102:3807)中で培養した骨髄細胞から得た。Blood 2003, 102:3807に記載したように最終成熟を行い、CD11+DCを、CD11c高発現に対して識別し、CD8α+ DCおよびCD11b+ DCを明らかに含んでいた。pDCをCD11c低 Ly6G+ CD8α+/-細胞として定義した。脾臓DCを、CD11c MicroBeadsおよびMidiMacs (Miltenyi Biotec)を用いて磁性活性化分別により精製した。写真を、AxioVision Software Rel. 3.1 (Carl Zeiss S.p.A., Milano, Italy)を用いる高解像度顕微鏡カラーカメラAxioCamにより撮影した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
結果
PTX3はインビトロでのCMV感染を阻害する
PTX3がインビトロでのCMV感染に影響するかどうかを試験するために、i) HCMVまたはMCMVへの結合に対するPTX3の能力、ii)許容状態のMEF細胞中への増殖感染に対するPTX3へのウイルス暴露の効果、およびiii) その後のウイルス感染に対するPTX3によるMEF細胞処置の効果を評価した。PTX3は、用量依存様式においてHMCVおよびMCMV両方に結合し、該結合は非標識PTX3の存在下に有意に低下した(図1A)。PTX3のHCMVへの結合は、150 (後期)、65および52(初期)または28(特異的)kDa抗原に対するヒト抗体の存在において阻害しなかった、知見はPTX3およびヒト特異的抗体によって認識された多様なウイルス分子を示唆している。PTX3への暴露は、非感染細胞におけるMCMV gB 転写物の低いレベルにより72時間後に評価したように、用量依存様式において、ウイルス感染を強く阻害した(図1A)。抑制効果は急速であり、既に不活性化を暴露30-45分間後得た。興味深いことに、PTX3の最高濃度を用いる細胞の前処置は該感染を阻害した。残余PTX3を特異的抗体により中和した実験は、細胞またはウイルスのいずれかに対して遊離PTX3の潜在的なキャリー・オーバー効果を排除したので、これらの知見は、PTX3がウイルス伝染力および感染に対する細胞の許容性に影響することを示唆している。PTX3が他のエンベロープウイルスを同じように結合するかどうかを評価するために、H3N2 ヒトインフルエンザウイルスを結合し、インビトロの伝染性を阻害するPTX3の能力を評価した。図1Bは、使用したPTX3の最高濃度で観察された完全に低下した細胞変性効果により決定したとおり、PTX3が濃度および特異的様式においてウイルスを強力に結合し、インビトロでのその伝染性を強く阻害することを示している。また、PTX3は、細胞の前処置によりわずかに感染を遅らせ、この知見により感染に対する細胞寛容性に対するPTX3の可能な効果を確認される。細胞の両方の型において、PTX3は、細胞単層および／または細胞形態学のコンフルエンシーに対して可視的効果を示さず、PTX3が非毒性であることが確認された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
IL-12p70/IFN-γ-依存経路に依存するPTX3の効力
急性MCMV感染におけるPTX3の保護効果におけるIFN-α、IL-12p70およびIFN-γ産生生の相対的役割を直接評価するために、IFN-γ、IL-12 p40およびIFN-αβR欠損マウスにおけるPTX3の相対的な効力を評価した。既に報告されているように(J. Exp. Med. 2003, 197:885)、IFN-γまたはIFN-αβRの欠損は、対応するWTマウスと比べて肺中のウイルス負荷の1以上のlog増加から明らかなように、感染に対する感受性を大きく増加させた。対照的に、IL-12 p40の欠損により、ウイルス負荷を有意に増加しなかった(3.4 x103から4.2 x103に、WT 対 IL-12 p40-/-マウス)(図5A)。PTX3は、IFN-αβ-/-において1以上のlogのウイルス負荷を阻害し、効果は、WTマウスにおいて見られる効果よりも優れていた。これに対して、抑制活性は、対応するWTコントロールマウスと比べてIFN-γ-/-またはIL-12p40-/-において有意に低下した(PTX3処置後に、IFN-γ-/- では6.3 log10から6log10に vs BALB/c WTにおいて4.8 log10から3.4log10に、およびIL-12p40-/-において3.6 log10から3.4 log10に vs C57BL6 WTにおいて 3.4 log10から2.9 log10に)(図5A)。PTX3により処理したIFN-αβR-/-マウスにおいて、IL-12およびIFN-γの両方を高レベルで産生し、知見は、PTX3の保護効果におけるIL-12p70/IFNγの中心的な優れた役割を確認するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
PTX3はMCMVのTLR9/MyD88独立性検出を活性化する
効果的な抗MCMV免疫性監視は、機能的TLRシグナルを必要とし、特にTLR9/MyD88シグナル伝達経路は、迅速なMCMVクリアランスについて決定的な役割を持つが、TLR2、TLR3およびTLR4は有意な役割を持つとは思われていなかった(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:3516)。急性感染におけるPTX3の効果においてTLRの役割を評価するために、TLR シグナル伝達経路欠損マウスを、MCMVにより攻撃し、肺におけるウイルス複製に供した。公開データに従って(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:3516)、TLR9-/-、特にMyD88-/-マウスは、C57BL6マウスよりもMCMVに対してより感受性が高かったが、一方で、TLR2およびTLR4欠損マウスはマウス耐性に有意に影響しなかった(図5B)。TLR9-/-およびMyD88-/-マウスにおいてPTX3が依然有効あっただけでなく、C57BL6マウスに比べ、特にMyD88-/-マウスにおいて(PTX3処置後にWTにおいて3.4 log10から2.9 log10に vs MyD88-/-マウスにおいて4.8 log10から3.2 log10、およびTLR9-/-マウスにおいて3.9 log10から3 log10に)、その効力は明らかに増加した。驚くべきことに、PTX3は、TLR2-/-およびTLR4-/-マウスにおいて完全に無効であり、この知見はPTX3による抗ウイルス免疫応答の活性化においてこれらのTLRが関与している可能性を示唆するものであった。またここで、他の文献により既に明らかであるとおり(J. Immunol. 2005, 175:6723)この産生レベルは低いが、PTX3の効力は、MyD88-/-およびTLR9-/-マウス由来の脾細胞の上清において有意に増加するIL-12およびIFN-γのレベルと直接相関し、TLR2-/- およびTLR4 -/- マウスにおいて低下した(図5)。この知見は、公開されたデータと一致して、血清中では大幅に欠失するが、遅れてはいあるが、顕著に高レベルのIFN-γの有意な高レベルがMyD88-/-および TLR9-/-マウスにおいて産生され得ることを示す(J Immunol. 2005, 175:6723)。それ故に、MyD88アダプターがTLR3を除く他の全てのTLRのシグナル伝達にも必要とされるので(Annu. Rev. Immunol. 2003, 21:335)、TLR9以外のTLR経路は、MCMV検出およびその後のPTX3により誘導された応答に関与する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
【図５】図5：PTX3活性はIL-12/IFN-γ-依存性およびTLR9/MyD88非依存性である。(A) MCMV 感染およびPTX3 処置に対する、BALB/c、IFN-γ-/-、C57BL6、IL-12p40-/-およびIFN-γ-/-マウスの感染およびウイルス負荷。動物を、MCMVの105(BALB/c、IFN-γ-/-)、5 x 105 (C57BL6、IL-12p40-/-およびIFN-αβ-/-) PFUを用いて腹腔内感染させた。ウイルス力価を、感染7日後に取り出した肺組織に対する標準プラークアッセイによりMEF細胞で定量した。PTX3 (1mg/kg/腹腔内)を投与して、感染を開始し、一日に一回一週間投与した。コントロールは希釈液のみ受容した。ウイルス力価はlog10として表す。バーは標準偏差を示す。*P ＜ 0.05、MCMV処理マウス vs MCMV 非処理マウス。結果は4つの独立試験を表す。(B) PTX3により処理したC57BL6、TLR2-/-、TLR4-/-、TLR9-/-およびMyD88-/-マウスにおけるMCMV複製。マウスを、上記のように処理したMCMVおよびPTX3の5 x 105(C57BL6、TLR2-/-、TLR4-/-、TLR9-/-、MyD88-/-) PFUを腹腔内に接種した。肺MCMV力価を、プラークアッセイにより感染1週間後に決定した。コントロールは希釈液のみ受容した。ウイルスの力価をlog10として表した。バーは標準偏差を示す。*P＜0.05、MCMV処理マウス vs MCMV 非処理マウス。結果は4つの独立試験を表す。