(57)【要約】本開示は、迅速かつ簡単に高純度免疫グロブリン（Ｉｇ）又は抗体を得るプロセスに関する。これらのポリクローナル抗体は卵黄から得られ、卵黄はポリクローナル抗体の取得の代替手段であり、ポリクローナル抗体の産生にとって再生可能で収益性の高い供給源である。本明細書に記載のプロセスは、低コストで、生体適合性があり、選択的な沈殿剤を限外濾過工程と組み合わせて使用することができるいくつかの工程を包む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄から抗体を精製するプロセスであって、
水溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）を得るために前記卵黄を遠心分離する工程と;
前記水溶性タンパク質画分を少なくとも１回の沈殿剤による沈殿工程にかける工程と；
前記精製された抗体を得るために、少なくとも１回の沈殿工程を経た前記水溶性タンパク質画分を限外濾過し、前記沈殿剤を除去する工程を含む、プロセス。
【請求項２】
前記卵黄を凍結させ、解凍する前工程を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記水溶性タンパク質画分を少なくとも１回の沈殿剤による沈殿工程にかける工程が、沈殿剤による第１沈殿工程と第２沈殿工程とを含む、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記沈殿剤が、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、又はそれらの混合物から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールの分子量が、１０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間、好ましくは６０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間、さらにより好ましくは６０００ｇ／ｍｏｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの濃度が、５〜４０％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間、好ましくは８〜３０％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間、さらにより好ましくは８．５〜１５％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記第１沈殿工程が、８．５％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）のポリエチレングリコール濃度で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記第２沈殿工程が、１２％（ｗｔポリマー／Ｖ第１沈殿工程後に再懸濁されたＩｇＹ）のポリエチレングリコール濃度で実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記水溶性タンパク質画分を限外濾過する工程が、７０〜１５０ｋＤａの間、好ましくは１００〜１５０ｋＤａの間、さらにより好ましくは１５０ｋＤａの細孔を有するフィルタで実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
卵を１〜１２週間、好ましくは２〜５週間、さらにより好ましくは３週間保存する前工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記工程が２〜６℃の間の温度で実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記卵黄をその卵白から分離する工程を含み、前記卵黄嚢膜の表面からアルブミンが除去されてから、前記膜が穿刺される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
卵黄を水で５〜２０倍、好ましくは水で６〜１０倍、さらにより好ましくは水で７倍希釈する前工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記卵黄を希釈する前工程が、４〜６の間のｐＨ、好ましくは５のｐＨで実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記卵黄を凍結させる工程が、−２０〜０℃の間の温度で実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記卵黄を凍結させる工程が、８〜２４時間の間で実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記卵黄の解凍が、１５〜２５℃の間の温度で実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記卵黄を解凍する工程が、２〜１０時間の間で実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
水溶性画分を得るために前記解凍した卵黄を遠心分離する工程が、２０００〜５０００ｇの間で、４〜２０℃の間の温度で４５〜９０分間、好ましくは４℃の間の温度で６０分間実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記抗体がＩｇＹである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロセスによって得られる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、迅速かつ簡単に高純度免疫グロブリン（Ｉｇ）又は抗体を得るプロセスに関する。これらのポリクローナル抗体は卵黄から得られ、卵黄はポリクローナル抗体の取得の代替手段であり、ポリクローナル抗体の産生にとって再生可能で収益性の高い供給源である。
【０００２】
本開示に記載のプロセスは、低コストで、生体適合性があり、選択的な沈殿剤を限外濾過工程と組み合わせて使用することができるいくつかの工程を包含する。現在業界で使用されて説明されている方法、すなわちクロマトグラフィープロセスを用いて哺乳動物の血清から得られる抗体（免疫グロブリンＧ、ＩｇＧ）と比較して高純度、高収率、低コストのＩｇＹ濃縮沈殿物が、このプロセスを実行することにより得られる。特に、本明細書に記載のプロセスを用いて、卵黄１個あたり約１００〜１２０ｍｇの抗体（Ｉｇ）を、９０〜９９％の間、大部分は９８％を超える純度で得ることが可能である。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリン（Ｉｇ）すなわち抗体は、脊椎動物の血漿又は細胞外液中に見ることができる糖タンパク質であり、免疫系の主要な体液性応答物質であり、ヒト血漿中に存在する全タンパク質の約２０％を構成する。抗体は、細菌及びウイルスなどの病原体、又は生体にとって異物であるタンパク質及び分子に反応して産生される。
【０００４】
特に、免疫グロブリンＹ（ＩｇＹ）は、哺乳動物の免疫グロブリンＧと機能的に同等であるトリ抗体の一種である。ＩｇＹは鳥類によって産生され、これらの抗体は卵黄の形成中に卵黄に濃縮される。
【０００５】
これらの抗体は、免疫診断又は臨床目的、すなわち動物及び／又はヒトへの受動免疫に使用することができる。受動免疫は、ウイルス又は細菌などの病原体によって引き起こされる感染症の治療の代替方法である。近年、抗生物質に対する細菌耐性の事例がいくつか出現しているため、細菌感染症の治療の代替方法を見つけることは、現代社会にとって非常に重要なことである。免疫グロブリンＹを用いた治療的保護は、いくつかの研究で成功裏に報告されており、ヘリコバクターピロリ菌のヒト胃粘膜への付着を阻害するＩｇＹの適用に関する２つの特許（韓国特許第２００２／００２３５２１号及び中国特許第１０３３６０４９１号）が確立されている。
【０００６】
受動免疫では、哺乳動物（ウサギ、ヤギ、マウス、ヒツジなど）の血清から得られる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に頼るのが一般的である。しかしながら、このプロセスは、包括的に動物の死につながる可能性のある採血工程の繰り返しを伴うため、一般に動物にとって不快なものである。
【０００７】
哺乳動物由来の抗体（ＩｇＧ）よりもＩｇＹを使用することのもう一つの利点は、鶏卵黄１個あたり１００ｍｇを超えるＩｇＹに相当する最大量の抗体を、より費用対効果の高い方法で得ることができることである。同量のＩｇＧを得るには、約２０ｍＬの哺乳動物の血液が必要であり、これは小動物（例えば、ウサギ）で１ヶ月に採取することができる最大量の半分に相当する。
【０００８】
鳥類がヒトから系統学的に離れているという事実は、これらの抗体の反応性に関連するさらなる利点をもたらし、ＩｇＹはＩｇＧとは異なりヒトの免疫反応の補体系の活性化に関与せず、リウマチ因子がＩｇＹのＦｃ領域を認識しないためリウマチ因子を認識することもないため、これが結果として非特異的反応及び哺乳動物の内在性ＩｇＧとの交差反応を最小限に抑え、したがって免疫診断検査での偽陽性及び免疫療法に用いたときの望ましくない反応を回避する。
【０００９】
ＩｇＹの精製については、ここ数十年の間に複数の著者によって報告されている。エタノール、アセトン、クロロホルム、ポリエチレングリコール、天然ガム、さらには塩類（例えば、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなど）などの種々の沈殿剤を用いる沈殿法が報告されている（Ｐｏｌｓｏｎ，ｖｏｎ  Ｗｅｃｈｍａｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｒｅｑｅｎｍｏｒｔｅｌ，１９８０；Ｈａｔｔａ，Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，１９９０；Ａｋｉｔａ  ａｎｄ  Ｎａｋａｉ，１９９３；Ｂｉｚｈａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｖｙｓｈｎｉａｕｓｋｉｓ，２０００；Ｈｏｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１０】
卵黄からのＩｇＹの精製に関する特許もある。米国特許第５，３６７，０５４号明細書には、卵黄脂質をカプリル酸で沈殿させる工程；イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフ；限外濾過プロセス；並びに塩類を用いたＩｇＹの沈殿を含む一連の方法を組み合わせ、種々のプロセスの組み合わせの最後に少なくとも９０％の純度のＩｇＹ画分を得る使用が記載されている。続いて、特許文献米国特許出願公開第２０１１／００１５３７４Ａ１号明細書では、ＩｇＹの精製は、卵黄を水で希釈し、イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて抗体をさらに精製した後、膜濾過プロセス及び付随的乾燥によって抗体を濃縮させることで行われ、プロセスの最後には純度４０％〜９８％の間のＩｇＹが得られることが報告されている。特許文献米国特許出願公開第２００６／２２３９８６Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１４／０７３７６６Ａ１号明細書には、塩類（例えば、硫酸アンモニウム）などの沈殿剤の使用について言及しているが、この場合、ガンカモ目の鳥類にのみ存在するマイナー抗体型であるＩｇＹデルタＦｃを選択的に沈殿させるためのものである。モノクローナル抗体を含むタンパク質の沈殿プロセスによる代替精製も種々の業界で注目されており、例えばＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社は、タンパク質沈殿にクエン酸ナトリウムを使用することを説明している発明（米国特許出願公開第２０１０／０２６１８８６Ａ１号明細書）を所有しており、Ａｍｇｅｎ社はポリエチレングリコールを用いたモノクローナル抗体の沈殿をクレームする特許（米国特許出願公開第２００８／０２１４７９５Ａ１号明細書）を有している。
【００１１】
既知の先行技術による解決策は、本開示によって解決されるべき技術的問題を示している。
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、いくつかの工程によって、特に選択的沈殿及び限外濾過工程によって、高純度卵黄からポリクローナル抗体を精製するプロセスに関する。
【００１３】
本明細書で言及される抗体（免疫グロブリンＹ）は、天然の、再生可能で安価な供給源、すなわち鳥の卵黄から得られる。家禽の卵、特に卵黄は、抗体を得るための代替手段であり、受動免疫に用いることができる。プロセス全体で使用される沈殿剤も、生体適合性があり、安価であると考えられる。
【００１４】
免疫グロブリンＹはタンパク質であり、より具体的には糖タンパク質であり、総分子量は約１８０ｋＤａであり、ジスルフィド架橋で結合しているそれぞれ６７〜７０ｋＤａの２本の同一ポリペプチド鎖からなり、これらの「重」（Ｈｃ）鎖のそれぞれがジスルフィド架橋を介して２５ｋＤａの「軽」鎖とも結合している。
【００１５】
本開示は、卵黄から抗体を精製するプロセスであって、
水溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）を得るために卵黄を遠心分離する工程と;
水溶性タンパク質画分を少なくとも１回の沈殿剤による沈殿工程にかける工程と；
精製された抗体を得るために、少なくとも１回の沈殿工程を経た水溶性タンパク質画分を限外濾過し、沈殿剤を除去する工程を含むプロセスに関する。
【００１６】
一実施形態では、前記プロセスは、卵黄を凍結させ、解凍する前工程を含み得る。
【００１７】
一実施形態では、水溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）を少なくとも１回の沈殿剤による沈殿工程にかける工程は、沈殿剤による第１沈殿工程と第２沈殿工程とを含み得る。
【００１８】
一実施形態では、沈殿剤は、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、又はそれらの混合物、好ましくは塩化ナトリウム、より好ましくはクエン酸ナトリウム、さらにより好ましくはポリエチレングリコールから選択され得、前記ポリエチレングリコールの分子量は、１０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間、好ましくは６０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間、さらにより好ましくは６０００ｇ／ｍｏｌである。
【００１９】
一実施形態では、最良の結果を得るために、ポリエチレングリコールの濃度は、５〜４０％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間、好ましくは８〜３０％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間、さらにより好ましくは８．５〜１５％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）の間である。
【００２０】
一実施形態では、第１沈殿工程は、８．５％（ｗｔポリマー／ＶＳＰＦ）のポリエチレングリコール濃度で実施され得る。
【００２１】
一実施形態では、第２沈殿工程は、１２％（ｗｔポリマー／Ｖ第１沈殿工程後に再懸濁されたＩｇＹ）のポリエチレングリコール濃度で実施され得る。
【００２２】
一実施形態では、水溶性タンパク質画分を限外濾過する工程は、７０〜１５０ｋＤａの間、好ましくは１００〜１５０ｋＤａの間、さらにより好ましくは１５０ｋＤａの細孔を有するフィルタで実施され得る。
【００２３】
一実施形態では、前記プロセスは、卵を１〜１２週間、好ましくは２〜５週間、さらにより好ましくは３週間保存する前工程を含み得、この工程は２〜６℃の間の温度で実施され得る。
【００２４】
一実施形態では、前記プロセスは、卵黄をその卵白から分離する工程を含み得、卵黄のみを得るように卵黄嚢膜の表面からアルブミンが除去されてから、前記膜が穿刺される。
【００２５】
一実施形態では、本プロセスは、卵黄を水で５〜２０倍、好ましくは水で６〜１０倍、最も好ましくは水で７倍希釈する前工程を含み得る。特に、この事前の卵黄希釈工程は、４〜６の間のｐＨ、好ましくは５のｐＨで実施される。
【００２６】
一実施形態では、卵黄を凍結させる工程は、−２０〜０℃の間の温度で８〜２４時間実施され得る。
【００２７】
一実施形態では、卵黄を解凍する工程は、１５〜２５℃の間の温度で２〜１０時間実施され得る。
【００２８】
一実施形態では、水溶性画分を得るために解凍した卵黄を遠心分離する工程は、２０００〜５０００ｇの間で、４〜２０℃の間の温度で４５〜９０分間、好ましくは４℃で６０分間実施され得る。
【００２９】
一実施形態では、抗体はＩｇＹである。
【００３０】
一実施形態では、卵黄は、好ましくは鶏卵黄（ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））である。
【００３１】
本開示はまた、抗体、特にＩｇＹに関するものであり、前記抗体は、本明細書に記載のプロセスによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本開示の理解を容易にするために、本明細書には図が添付されており、これらは好ましい実施形態を表しているが、本開示の目的を限定することを意図していない。
【図１】本開示で提示されるプロセスの主要工程の模式図である。
【図２】本開示の精製プロセスに関する好ましい工程及び条件の詳細な模式図である。
【図３】ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びクマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）によって得られたゲルの複製を示す図であり、本開示に記載のプロセスを実施した後に得られた結果を描写している。位置１〜３は還元条件下（ジチオスレイトール、ＤＴＴの存在下）で作られたゲルに対応し、位置４〜７は非還元条件下（ＤＴＴの非存在下）で作られたゲルに対応する。位置１及び７は分子量標準に対応しており、最初のものは「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏｒａｄ）に、最後のものは「Ｆｕｌｌ−Ｒａｎｇｅ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ）に対応する。位置２及び４は精製ＩｇＹ標準（ＨｅｎＢｉｏｔｅｃｈ）に対応し、位置３及び５は、本開示に記載のポリマーの１つ、特に６０００ｇ／ｍｏｌの分子量のポリエチレングリコールでの選択的沈殿プロセスを用いて精製されたＩｇＹに対応する。位置６は、可溶性タンパク質画分に対応する。それぞれのゲルウェルに入れたタンパク質の量は均一であった。
【図４】本開示に記載のポリマーの１つ、特に分子量６０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールでＩｇＹ沈殿プロセスを実施した後の様々な卵黄について得られた結果を示すクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの複製を示す図である。ゲルは、還元条件下（ＤＴＴの存在下）で作られたものであった。位置１は、分子量標準である「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏｒａｄ）に対応する。位置２〜４は８週齢の卵黄を用いた精製ＩｇＹに対応し、位置５〜８は５週齢の卵黄を用いた精製ＩｇＹに対応し、位置９及び１０は３週齢の卵黄を用いた精製ＩｇＹに対応する。それぞれのゲルウェルに入れたタンパク質の量は均一であった。
【図５】本開示に記載のポリマーの１つ、特に分子量６０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールでＩｇＹ沈殿プロセスを実施した後の様々な卵バッチの評価を示す図である。Ｓｈｏｄｅｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＫＷ−８０２．５分子排除カラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）（２５ｃｍ×２ｍｍ内径、２５μｍ）、及びＨＰＬＣ  Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ  ＨＰＬＣ（ＶＷＲ、日立）を用いた高速液体クロマトグラフィーによって決定された、様々なＩｇＹサンプルのクロマトグラム及び純度評価。卵１、２、及び３は、それぞれ採取後３、５、及び８週間に相当する。純度は、クロマトグラムのピーク面積から、対照１を標準ＩｇＹとして使用して算出されたものである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、卵黄から抗体、すなわち免疫グロブリンＹ（ＩｇＹ）を得て、精製するプロセスを記載している。本明細書で言及する抗体は、哺乳動物に存在する免疫グロブリンＧと機能的に同等である。
【００３４】
図１及び２は、鶏卵黄からＩｇＹを精製する本明細書に開示のプロセスの好ましい実施形態を示しており、前記プロセスは、以下を含むいくつかの工程を含み得る：
卵黄をその卵白から分離する工程。この工程は、卵黄嚢膜の表面から全アルブミン部分（卵白とも呼ばれる）を除去してから、膜を穿刺して卵黄を抽出するように実施され得る；
得られた卵黄を蒸留水で、特に卵黄の初期体積の６〜１０倍に希釈し、付随的に混合液をホモジナイズし、そのｐＨを、特に４〜８の間、好ましくはｐＨ＝５の値に調整する工程；
得られた混合液を８〜２４時間にわたって低温（０〜−２０℃）にさらすことができ、そうして脂質画分の除去を最適化することができる；
混合液の解凍プロセスを、室温、特に１５〜２５℃の間の温度で２〜１０時間実施することができる；
解凍した混合液を、２０００〜５０００ｇの間の回転速度で、４〜２０℃の間の温度で４５〜９０分間の遠心分離にかけることができる；
遠心分離後、２つの画分、すなわち不溶性固体画分（脂質）と透明な水性画分が得られ、後者は卵黄の可溶性タンパク質からなる；
この可溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）を、小さな懸濁固体粒子を除去するために濾過することができる；
次いで、ポリエチレングリコールなどのポリマー、及び／又はクエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの塩類を含むが、これらに限定されない適切な沈殿剤、好ましくは塩化ナトリウム、最も好ましくはクエン酸ナトリウム、さらにより好ましくはポリエチレングリコールで、ＳＰＦを選択的に沈殿させる；
得られた最終沈殿物は、部分的に精製されたＩｇＹ、特に９０％を超える純度のＩｇＹに相当し、適切な量の緩衝水溶液に再懸濁することができる；
使用した沈殿剤（単数又は複数）の除去を可能にすると同時に、９８〜１００％の間の純度のＩｇＹを得ることができる最終的な限外濾過工程を適用する工程。
【００３５】
一実施形態では、この方法の最後に大量のＩｇＹを得るために、免疫鶏から卵を収穫した後、収穫後２〜４週間、好ましくは３週間（図４）、２〜６℃の温度で卵を保存することができ、卵黄の総量は約１５ｍＬである。本プロセスを開始する前に卵を数週間保存することの利点は、卵黄とアルブミンとのより効率的な分離に関連している。
【００３６】
このように、今回開示しているプロセスでは、卵黄から高純度のＩｇＹ沈殿物を得ることが可能であり、一般的に使用されるクロマトグラフィー手順で精製された同じ抗体と同じ純度を示す（図３）。提案したプロセスでは、高価なクロマトグラフィー法を使用する必要がなく、使用される沈殿剤は生体適合性があって安価であり、精製抗体の純度をさらに高めることができる限外濾過工程により除去される。
【００３７】
このように、本明細書に記載のプロセスでは、９０％を超える、好ましくは９８％を超える純度でＩｇＹを精製することができ、不純物成分は卵黄中に存在する他のタンパク質である。プロセス全体の収率は６０％〜９０％の間、好ましくは８５％を超え、卵黄１個あたり約１００〜１２０ｍｇのＩｇＹを得ることが可能である。
【００３８】
本開示に記載のプロセスは、いくつかの工程（図１及び２）、すなわち、卵黄の分離と、付随的な水での希釈と、ｐＨ調整、それに続く脂質固体画分を沈殿させるための混合液の凍結及び解凍とを含み、脂質固体画分は遠心分離工程によって除去され、それによって可溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）が得られ、可溶性タンパク質画分はその後選択的ＩｇＹ沈殿工程にかけられる。
【００３９】
一実施形態では、今回開示しているプロセスから得られた沈殿物は、主に９０％を超える純度の所望の抗体からなり、適切な緩衝塩の水溶液、例えばリン酸塩−生理食塩緩衝水溶液など、特に１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸カリウム、２．７ｍＭのＫＣｌに、ｐＨ７．４で再懸濁される。
【００４０】
一実施形態では、さらに良好な結果を得るために、限外濾過工程を適用することで最終的な精製及び濃縮工程を適用することができ、沈殿剤を除去すると同時に、９８〜１００％の純度のＩｇＹを得ることができる。
【００４１】
一実施形態では、卵黄を卵白から分離する工程は、卵黄嚢膜の表面から全アルブミン部分（すなわち卵白）を除去してから、膜を穿刺して卵黄だけを得るように注意して実施する必要がある。
【００４２】
一実施形態では、卵黄嚢膜を穿刺した後、その中に含まれる液体を、その体積の記録を可能にする目盛り付きガラス容器（例えば、目盛り付きビーカー）に注ぐ。その後、得られた卵黄を、蒸留水で、その初期体積の６〜１０倍の間、好ましくはその体積の７倍に希釈することができる。得られた卵黄を６〜１０倍の間に希釈することの利点は、脂質画分の除去効率に関連しており、６倍未満の希釈では遠心分離後に濁った溶液が生じることが分かっており、１０倍を超える希釈ではその後の精製工程でのＩｇＹの収率及び純度が低下した通りである。
【００４３】
一実施形態では、その後、混合液を室温、特に１５〜２５℃の間の温度で約５分間ホモジナイズし、１Ｍ  ＨＣｌ溶液でそのｐＨを４〜８の間に含まれる値、好ましくは５に調整することができる。ｐＨを４〜８に調整する理由は、この範囲外ではＩｇＹの安定性が得られないことによるものである。
【００４４】
一実施形態では、得られたホモジネートを、０〜−２０℃の温度で、８〜２４時間、好ましくは１２時間、凍結プロセスにかけることができる。混合液の解凍プロセスを、室温、特に１５〜２５℃の間の温度で２〜１０時間、混合液が均一に解凍されるまで実施することができる。混合液を凍結させ、解凍することの利点は以下の通りである：凍結プロセスにより顆粒の凝集が大きくなるため、解凍及びその後の遠心分離後に脂質画分を効果的に除去することができる。
【００４５】
一実施形態では、その後、均一に解凍された混合液を遠心分離プロセスに、２０００〜５０００ｇの間に含まれる回転速度で、４〜２０℃の温度で４５〜９０分間、より好ましくは４６９６ｇ、４℃で６０分間かけることができる。遠心分離工程の後、２つの画分が得られる：（ｉ）卵黄の不溶性（脂質）部分を構成する、廃棄される黄色がかった固体画分；及び（ｉｉ）卵黄の可溶性タンパク質画分（ＳＰＦ）に相当する水溶性の卵黄タンパク質からなる透明な水性画分。この画分を濾紙で濾過して、まだ懸濁している小さな固体及び不溶性粒子を除去することができる。
【００４６】
一実施形態では、本開示に記載のプロセスの次の工程は、上記で調製したＳＰＦからＩｇＹを選択的に沈殿させて、９０％を超える、好ましくは９５〜９８％の間の純度の部分的に精製されたＩｇＹ沈殿物を得ることを含み得る（図３）。この工程では種々の沈殿剤が使用され、これには、ポリエチレングリコールポリマー、及び／又は硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの塩類がとりわけ含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４７】
一実施形態では、１つ又は２つの連続した沈殿工程を、５〜４０％（ｗｔ沈殿剤／ＶＳＰＦ）、好ましくは３０％（ｗｔ沈殿剤／ＶＳＰＦ）、さらにより好ましくは８．５％（ｗｔ沈殿剤／ＶＳＰＦ）の範囲の選択した沈殿剤の濃度で実施することができる。
【００４８】
一実施形態では、選択した沈殿剤と共に溶液をホモジナイズした後、混合液を遠心分離プロセスに、２０００〜５０００ｇの間に含まれる回転速度で、４〜２０℃の温度で４５〜９０分間、好ましくは４６９６ｇ、４℃で６０分間かける。
【００４９】
一実施形態では、塩類を沈殿剤として使用する場合、８５％を超える純度を得るために１つの沈殿工程のみで十分であり得、その場合、沈殿剤として３０％（ｍ／Ｖ）を超える塩濃度を選択することができる。
【００５０】
一実施形態では、好ましくは、９５％を超えるより良好な純度を得るために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を沈殿剤として使用することができ、ここでＰＥＧの分子量は、１０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間に含まれ得、好ましくは６０００〜１００００ｇ／ｍｏｌの間、好ましくは６０００ｇ／ｍｏｌであり得る。
【００５１】
一実施形態では、２つの連続したＰＥＧ沈殿工程を実施することができる。第１工程におけるＰＥＧ濃度は８〜１０％（ｍ／Ｖ）の間に含まれ得、好ましくは８．５％（ｍ／Ｖ）であり得る。第１沈殿物を得た後、それを、ある量の適切な緩衝液水溶液に、例えば、限定されないが、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液などに再懸濁し、第２ＰＥＧ沈殿を実施する。この２回目の沈殿工程では、ＰＥＧ濃度は１０〜１５％（ｍ／Ｖ）の間に含まれる必要があり、好ましくは１２％（ｍ／Ｖ）である。最終的に得られた沈殿物は部分的に精製されたＩｇＹであり、その純度は９０％を超え、好ましくはその純度は９５〜９８％の間である。このＰＥＧ沈殿工程の実行に使用されるＳＰＦ１０ｍＬごとに、約１０ｍｇのＩｇＹを得ることが可能である。
【００５２】
一実施形態では、本プロセスは、限外濾過工程をさらに含み得る。上記で得られたＩｇＹ沈殿物を、適切な量の最適な緩衝液、特に１０ｍＭリン酸緩衝液にｐＨ７．４で再懸濁する。次に、７０〜１５０ｋＤａ、好ましくは１００〜１５０ｋＤａ、さらにより好ましくは１５０ｋＤａの細孔フィルタを用いて限外濾過工程を実施することにより、使用した沈殿剤（ＰＥＧ）の残存量及び依然として存在するいくつかの低分子量タンパク質が溶液から除去され、その結果、純度９８〜１００％の最終ＩｇＹ濃縮物が得られる。
【００５３】
この精製プロセスの最後に、得られたＩｇＹの量及びその純度を、この目的で一般的に使用される従来の分析方法、例えば、限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び分子排除カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）などによって決定することができる。
【００５４】
本開示では、本発明の特定の実施形態のみを表し、説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって定義される保護の範囲から逸脱することなく、各状況の要件に応じて、変更を導入し、技術的特徴を同等のものに置き換える方法を理解するであろう。提示した実施形態は、互いに組み合わせ可能である。以下の特許請求の範囲は、実施形態をさらに定義するものである。
【００５５】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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