【手続補正書】
【提出日】平成22年3月31日(2010.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ローラーボトル培養装置は典型的には、培養時間の温度を制御するための手段だけでなく、（例えば、ローラーボトルに細胞を最初に播種する間、または、後続の移し変えを行う間に）培養株を無菌で操作するための手段をも更に備えている。細胞の採取は、酵素処理、例えば、トリプシン(trypsin)、トリプシンーＥＤＴＡ、ディスパーゼ(dispase)およびコラゲナーゼ(collagenase)を使用する酵素処理、または、他の複数種類の酵素を使用する酵素処理、または、複数種類の酵素と他の成分との組合せを使用する酵素処理、または、他の成分を用いない複数種類の酵素の組合せを使用する酵素処理によって達成することができる。他の市販の製品を利用してもよい。それらの製品は、トリプル（TrypLE）（商標）・エクスプレス（ギブコ社(Gibco, Inc.)）を包含するが、それらに限定されない。細胞は、手動操作（例えば、バッチ遠心分離(batch centrifugation)）によって採取されることが可能であり、または、採取は自動化することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
現在のところ、採取するのに利用できる細胞の量を最大化する方法は、分娩後取り出し細胞（とりわけ、胎盤由来細胞または臍帯由来細胞）に適用することが好ましい。本発明で好ましいタイプの細胞は、特許出願日２００４年６月２５日の米国特許出願第10/877,446号（胎盤由来細胞）および特許出願日２００４年６月２５日の同第10/877,012号（臍帯由来細胞）の明細書に記述されている。これらの米国特許出願明細書は、参照されることによって、その全てが本明細書に組み入れられる。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７、ＰＴＡ−６０６８、ＰＴＡ−６０７４、ＰＴＡ−６０７５またはＰＴＡ−６０７９として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the American Type Culture Collection：米国微生物系統保存機関)から入手することのできるタイプの細胞も好ましい。それらの細胞の各々に関する特性表示および記述もまた、参照されることによって、本明細書に組み入れられる。例えば臍帯由来細胞を培養するための最大化または最適化された方法に向けられる本方法にとりわけ好ましいのは、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６０６７およびＰＴＡ−６０６８である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
使用するのに好ましいローラーボトルは、典型的には、細胞が当該ローラーボトルの内面に付着するのを助ける作用物質、例えば、ゼラチン、細胞外マトリックスの分子（例えば、ゼラチン、ラミニン(laminin)、ビトロネクチン(vitronectin)、フィブロネクチン(fibronectin)、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびVI型コラーゲン）等で被覆されるということを強調することができる。例示される諸具体例の多くに対してはゼラチンのコーティングを使用したが、他のコーティングは適切であるように思える。また、当業者は、市販の被覆済みローラーボトル(coated bottles)が本出願書類に教示される方法に十分に適合するということを、よく理解するであろう。そのような市販の被覆済みローラーボトルの一例は、（コーニング社(Corning)（登録商標）からカタログ番号３９０７として入手可能な）セルバインド(CellBIND)（登録商標）で被覆されたローラーボトルである。セルバインド（登録商標）被覆のローラーボトルの使用、および、ゼラチン被覆済みローラーボトルとの比較は、以下の実施例４に例示される。本出願書類において提供される諸方法に従って細胞の付着および成長を行うために様々な被覆用作用物質が容認可能であることが見出だされるものと予見される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
ボトル：複数個の８５０ｃｍ２ボトル（例えば、コーニング社(Corning)（登録商標）カタログ番号４３０８５１）を使用した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
採取：培地を各々のローラーボトルから吸引によって除去し、次いで、付着細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを吸引によって除去し、次いで、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０ｍＬを添加して、当該ローラーボトルの表面から細胞が引き離されるのを助けた。ローラーボトルを、ローラー装置に戻し、次いで、０．７５ｒｐｍで５分間培養した。培養の後、各々のボトルに培地４０ｍＬを加えた。細胞を含有する培地を、次いで、５０ｍＬ円錐管(conical tube)に移し換え、次いで、３００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離の後、当該培地を吸引によって除去し、次いで、各々の細胞ペレットを、培地１０ｍＬの中に再懸濁（re-suspended）させた。細胞を、ベックマン・コールター・セデックス(Beckman Coulter Cedex）（登録商標）計器を用いて計数した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ボトル：ボトルは、８５０ｃｍ２培養ボトル（例えば、コーニング社（登録商標）カタログ番号430851）を使用した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
継代：継代培地を、各々のローラーボトルから吸引によって除去し、次いで、付着細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ１０ｍＬを添加した。ボトルをローラー装置に戻し、次いで、０．７５ｒｐｍで５分間培養した。培養の後、各々のボトルに培地４０ｍＬを加えた。細胞を含有する培地を、次いで、５０ｍＬ円錐管に移し換え、次いで、３００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離の後、当該培地を吸引によって除去し、次いで、各々の細胞ペレットを、培地１０ｍＬの中に再懸濁させた。細胞を、ベックマン・コールター・セデックス（登録商標）計器を用いて計数した。細胞を、ガス処理済みローラーボトルの中に約２５００細胞／ｃｍ２で播種した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
ボトル：８５０ｃｍ２培養ボトル（例えば、コーニング社（登録商標）カタログ番号430851）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
細胞の採取：培地を各々のボトルから吸引によって除去し、次いで、付着細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを吸引によって除去し、次いで、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０ｍＬを添加した。それらのボトルを、ローラー装置で０．７５ｒｐｍで５分間培養した。培養の後、それらボトルに培地４０ｍＬを加えた。細胞を含有する培地を、次いで、５０ｍＬ円錐管に移し換え、次いで、３００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離の後、それらの培地を吸引によって除去し、次いで、各々の細胞ペレットを培地１０ｍＬの中に再懸濁させた。細胞を、ベックマン・コールター・セデックス（登録商標）計器を用いて計数した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリー分析を、ファックスキャリバー(FACScalibur)（商標）（ベクトン・ディキンソン・サンノゼ社(Becton Dickinson San Jose)、カリフォルニア州）計器を用いて行った。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
全ＲＮＡの分離：ＲＮＡを、製造者の仕様書（RNeasy（登録商標）・ミニ・キット；キアゲン社(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア(Valencia)）に従い、RNeasy（登録商標）・ミニ・キットを用いて分離した。ＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理済み水５０μＬで溶出し、次いで、−８０℃で貯蔵した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
逆転写：タクマン(TaqMan)（商標）逆転写試薬（アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティー(Foster City)）と共にランダム・ヘキサマー(random hexamers)を使用して、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、および、９５℃で１０分間、ＲＮＡの逆転写を行った。諸試料を、−２０℃で貯蔵した。リアルタイムＰＣＲを使用して、「シグネチャー遺伝子(signature genes)」と称される遺伝子（酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニンおよびレティキュロン(reticulon)）を更に詳細に調べた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ボトル：コーニング（登録商標）８５０ｃｍ２ボトル（カタログ番号430851）、セルバインド（登録商標）・コーニング（登録商標）８５０ｃｍ２ボトル（カタログ番号3907）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ゼラチンコーティング：２％ゼラチン溶液２０ｍＬを、複数個のコーニング（登録商標）８５０ｃｍ２ボトル（カタログ番号430851）に入れ、次いで、ローラー装置に２０分間置いた。当該ゼラチン溶液を吸引によって除去し、次いで、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）２０ｍＬで洗浄した。複数個のセルバインド（登録商標）・コーニング（登録商標）８５０ｃｍ２ボトルは被覆されない。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
継代：継代培地を、各々のローラーボトルから吸引によって除去し、次いで、付着細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０ｍＬで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ１０ｍＬを添加した。ボトルをローラー装置に戻し、次いで、０．７５ｒｐｍで５分間培養した。培養の後、それらのボトルに培地４０ｍＬを加えた。細胞を含有する培地を、次いで、５０ｍＬ円錐管に移し換え、次いで、３００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離の後、当該培地を吸引によって除去し、次いで、各々の細胞ペレットを、培地１０ｍＬの中に再懸濁させた。細胞を、ベックマン・コールター・セデックス（登録商標）計器を用いて計数した。細胞を、ガス処理済みローラーボトルの中に２５００細胞／ｃｍ２で播種した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
結果：
【表１１】
2009519728.tif 000001