(57)【要約】本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する方法、及びその作製された製剤を提供する。本開示はまた、作製されたＬＮＰ製剤に関連する治療的使用及び診断的使用を提供する。【選択図】図１
2022501367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を作製する方法であって、前記方法が、
ｉ）緩衝水溶液と有機溶液を混合し、それにより核酸を内包する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することと；
ｉｉ）前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を処理し、それにより前記脂質ナノ粒子組成物を形成することと、を含み、
前記有機溶液が、有機溶媒中に有機溶媒可溶性核酸及びイオン化脂質を含み、
前記有機溶媒可溶性核酸は疎水性有機カチオンを含む、前記方法。
【請求項２】
ｉａ）前記混合の前に、核酸の水溶性塩を有機溶媒可溶性核酸に変換し、それにより前記有機溶媒可溶性核酸を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉａａ）前記変換後に前記有機溶媒可溶性核酸を凍結乾燥することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｉｉａ）前記ＬＮＰ製剤を濾過することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記処理により前記ＬＮＰ製剤から有機溶媒を除去することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記濾過がタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＮＰを処理する前記工程が、前記ＬＮＰ製剤を包装することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＮＰ溶液を包装する前記工程が、以下：
ｉｉｂ）前記ＬＮＰ製剤に凍結保護剤を添加する工程；
ｉｉｃ）前記ＬＮＰ製剤を凍結乾燥し、それにより凍結乾燥されたＬＮＰ組成物を形成する工程；
ｉｉｄ）前記ＬＮＰ製剤または前記凍結乾燥されたＬＮＰ組成物を保存する工程；及び
ｉｉｅ）前記ＬＮＰ製剤または前記凍結乾燥されたＬＮＰ組成物に緩衝溶液を添加し、それにより前記ＬＮＰ組成物を形成する工程のうち１つ以上を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記混合が乱流混合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合が層流混合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合がマイクロ流体混合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合が自動化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合が自動化されていない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合が、５．０×１０４未満、１．０×１０４未満、５．０×１０３未満、または２．５×１０３未満のレイノルズ数を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合が約１０００未満、約５００未満、または約２５０未満のレイノルズ数を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記変換が、透析、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、疎水性イオン対逆相カラムの使用、イオン交換樹脂の使用、及びサイズ排除カラムの使用からなる群より選択される少なくとも１つを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機溶媒可溶性核酸が第三級アミン塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記有機溶媒可溶性核酸が、トリブチルアミン（ＴＢＡ）塩、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）塩からなる群より選択される少なくとも１つである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸の前記水溶性塩が、ナトリウム塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）塩からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝水溶液が、約４〜約６、約４．５〜約５．５、または約４．８〜約５．２の範囲のｐＨを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記有機溶液は、約７．０〜約９．０、約７．０〜約８．１、または約７．１〜約７．８、または約７．２〜約７．７、または約７．３〜約７．６、または約７．４〜約７．５の範囲のｐＨを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、前記方法が
水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質及び封入剤を含む有機溶液とを提供することと；
前記脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、前記脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の前記有機溶媒を含むように、前記水溶液と前記有機溶液を混合することにより、前記治療薬及び／または前記予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む前記脂質ナノ粒子製剤を形成することと；
前記混合後約７２時間未満に前記脂質ナノ粒子製剤を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項２３】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、前記方法が
水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質を含む有機溶液とを提供することと；
前記脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、前記脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の前記有機溶媒を含むように、前記水溶液と前記有機溶液を混合することにより、前記治療薬及び／または前記予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む前記脂質ナノ粒子製剤を形成することと；
前記混合後約７２時間未満に前記脂質ナノ粒子製剤を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項２４】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、前記方法が
約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質、封入剤、ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；
前記脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、前記脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも約１体積％の前記有機溶媒を含むように、前記緩衝水溶液と前記有機溶液を混合することにより、前記治療薬及び／または前記予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む前記脂質ナノ粒子製剤を形成することと；
前記混合後約７２時間未満に前記脂質ナノ粒子製剤を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項２５】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、前記方法が
約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；
前記脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、前記脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の前記有機溶媒を含むように、前記緩衝水溶液と前記有機溶液を混合することにより、前記治療薬及び／または前記予防薬を内包する前記脂質ナノ粒子を含む前記脂質ナノ粒子製剤を形成することと；
前記混合後約７２時間未満に前記脂質ナノ粒子製剤を前記患者に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記第１のｐＨ及び前記第２のｐＨが、約７．０〜約８．１、または約７．１〜約７．８、または約７．２〜約７．７、または約７．３〜約７．６、または約７．４〜約７．５の範囲内である、請求項１９または請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のｐＨ及び前記第２のｐＨが、約４．５〜約６．５、または約４．６〜約６．０、または約４．８〜約５．５の範囲内である、請求項２０または請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合後約７２時間未満、好ましくは前記混合後約６０時間未満、好ましくは前記混合後約４８時間未満、好ましくは前記混合後約３６時間未満、好ましくは前記混合後約２４時間未満、好ましくは前記混合後約２０時間未満、好ましくは前記混合後約１６時間未満、好ましくは前記混合後約１２時間未満、好ましくは前記混合後約８時間未満に前記投与が実施される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合後約１２０分未満、好ましくは前記混合後約１００分未満、好ましくは前記混合後約９０分未満、好ましくは前記混合後約８０分未満、好ましくは前記混合後約７０分未満、好ましくは前記混合後約６０分未満、好ましくは前記混合後約５０分未満、好ましくは前記混合後約４０分未満、好ましくは前記混合後約３０分未満、好ましくは前記混合後約２０分未満、好ましくは前記混合後約１５分未満、好ましくは前記混合後約１０分未満に前記投与が実施される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記混合から前記投与までの間、前記脂質ナノ粒子製剤を処理しない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合から前記投与までの間にｐＨ調整を含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合から前記投与までの間、前記脂質ナノ粒子製剤を濾過しない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
混合兼投与装置の第１の投入口に前記有機溶液を送ることをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
混合兼投与装置の第２の投入口に前記緩衝水溶液を送ることをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
混合兼投与装置のミキサー部分で前記混合を実施する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
混合兼投与装置の出口から前記脂質ナノ粒子製剤を投与する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記提供、前記形成、前記混合、及び前記投与すべてが、単一の混合兼投与装置を使用して実施される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記混合兼投与装置が２連式シリンジを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記混合兼投与装置が、Ｋシリンジ及びＬシリンジからなる群より選択される少なくとも１つを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記混合兼投与装置がミキサー部分にスタティックミキサーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記スタティックミキサーが、らせん型スタティックミキサーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝水溶液のｐＨ及び前記脂質ナノ粒子製剤のｐＨが、ほぼ同じである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記脂質ナノ粒子製剤が、前記脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して約１体積％〜約５０体積％の前記有機溶媒、好ましくは前記脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して約２体積％〜約４５体積％、好ましくは約３体積％〜約４０体積％、好ましくは約４体積％〜約３５体積％、好ましくは約５体積％〜約３３体積％の前記有機溶媒を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記有機溶媒がアルコールである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記有機溶媒がエタノールである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機溶媒が、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の有機溶媒がアルコールであり、前記第２の有機溶媒がアルコールである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の有機溶媒がエタノールであり、前記第２の有機溶媒がベンジルアルコールである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の有機溶媒と前記第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比が、約１００：１〜約１：１、または約５０：１〜約１：１、または約２０：１〜約１：１、または約１０：１〜約１：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記有機溶液が湿潤剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記湿潤剤が有機溶媒である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記湿潤剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記湿潤剤と前記有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比が、約１０００：１〜約１：１、または約５００：１〜約５：１、または約１００：１〜約１０：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記緩衝水溶液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、及びｔｒｉｓ緩衝液からなる群より選択される少なくとも１種である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記緩衝水溶液が張性剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記張性剤が糖である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記糖がスクロースである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記有機溶液が封入剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記封入剤が式（ＥＡ−Ｉ）：
【化１】
2022501367.tif 000118
［式中、Ｒ２０１及びＲ２０２はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ１０１）２からなる群より独立して選択され、各Ｒ１０１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ２０３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より選択され；
Ｒ２０４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１〜Ｃ２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ２〜Ｃ２０アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１〜Ｃ２０アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ２〜Ｃ２０アルケニル）からなる群より選択され；
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される］の化合物、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記封入剤が式（ＥＡ−ＩＩ）：
【化２】
2022501367.tif 000119
［式中、Ｘ１０１は、結合、ＮＨ、またはＯであり；
Ｒ１０１及びＲ１０２はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ１０３及びＲ１０４はそれぞれ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より独立して選択され；
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される］の化合物、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記封入剤が式（ＥＡ−ＩＩＩ）：
【化３】
2022501367.tif 000120
［式中、Ｒ１０５及びＲ１０６はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ１０７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より選択され；
Ｒ１０８は、Ｈ及びＣ（Ｏ）ＮＲ１０９Ｒ１１０からなる群より選択され；
Ｒ１０９及びＲ１１０はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される］の化合物、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記封入剤が、
【化４】
2022501367.tif 000121
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記封入剤が、
【化５】
2022501367.tif 000122
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記封入剤が、
【化６】
2022501367.tif 000123
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記封入剤が、
【化７】
2022501367.tif 000124
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記封入剤が、
【化８】
2022501367.tif 000125
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記封入剤が、
【化９】
2022501367.tif 000126
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記封入剤が、
【化１０】
2022501367.tif 000127
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記封入剤が、
【化１１】
2022501367.tif 000128
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記封入剤が、エチルラウロイルアルギネートまたはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記治療薬及び／または前記予防薬が、ワクチンまたは免疫応答を誘発することができる化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記治療薬及び／または前記予防薬が核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記リボ核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ワクチンが、がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ワクチンが個別化がんワクチンであり、前記がん抗原が対象特異的がん抗原である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ワクチンが、免疫チェックポイント調節物質をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記個別化がんワクチンが、少なくとも２つのがん抗原エピトームをコードするオープンリーディングフレームを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ｍＲＮＡが２〜１００個のがん抗原をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｍＲＮＡが１０〜１００個のがん抗原をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ｍＲＮＡが１０〜１０００個のがん抗原をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｍＲＮＡが１つ以上の再発性多型をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記再発性多型が、ｐ５３における再発性体細胞がん突然変異を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ｍＲＮＡが、ステムループ、連鎖停止ヌクレオシド、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、及び５’キャップ構造からなる群より選択される少なくとも１つのモチーフを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸がゲノム編集技術に適している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ゲノム編集技術が、規則的に間隔を空けて配置された短い回文の反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸が、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びＤＮＡ修復鋳型からなる群より選択されるゲノム編集技術に適した少なくとも１つの核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ｍＲＮＡが少なくとも３０ヌクレオチド長である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｍＲＮＡが少なくとも３００ヌクレオチド長である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物と前記核酸とのｗｔ／ｗｔ比が、約５：１〜約６０：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物と前記核酸とのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１〜約５０：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＬＮＰが、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、封入剤、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、封入剤、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記有機溶液が、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、
約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化脂質；
約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質；
約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質；及び
約０．０１〜１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、
約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化脂質；
約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質；
約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質；及び
約０．０１〜２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、
約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化脂質；
約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質；
約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質；及び
約０．０１〜２．０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−Ｉ）：
【化１２】
2022501367.tif 000129
［式中、Ｒ３は−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは、端点を含む、１から１００までの整数であり；
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンが、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で独立して置換され；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：
【化１３】
2022501367.tif 000130
または
【化１４】
2022501367.tif 000131
のものであり；
Ｌ２の各事例は、独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位が、任意選択で、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換され；
Ｒ２の各事例は、独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで独立して置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり；
ｐは１または２である］の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−Ｉ−ＯＨ）：
【化１５】
2022501367.tif 000132
の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化１６】
2022501367.tif 000133
［式中、Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは、１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ５の１つ以上のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である］の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＩ−ＯＨ）：
【化１７】
2022501367.tif 000134
［式中、ｒは、１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ５の１つ以上のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である］の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
ｒが４０〜５０の整数である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
ｒが４５である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
Ｒ５がＣ１７アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化１８】
2022501367.tif 000135
の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化１９】
2022501367.tif 000136
の化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＩＩ）：
【化２０】
2022501367.tif 000137
［式中、ｓは１〜１００の整数である］の化合物またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＰＥＧ脂質が、以下の式：
【化２１】
2022501367.tif 000138
の化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＰＥＧ脂質が、式（ＰＬ−ＩＶ）：
【化２２】
2022501367.tif 000139
［式中、Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルであり；
ｒは、端点を含む、０から１００までの整数であり、
いくつかの実施形態では、ｒは０であり、
いくつかの実施形態では、Ｒ６はＣ１６アルキルであり、
いくつかの実施形態では、Ｒ６はＣ１８アルキルである］の化合物またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＰＥＧ脂質が、
【化２３】
2022501367.tif 000140
である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＰＥＧ脂質が、
【化２４】
2022501367.tif 000141
である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、及びそれらの誘導体からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記リン脂質が、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの誘導体からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記リン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記イオン化脂質がイオン化アミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−１）：
【化２５】
2022501367.tif 000142
［式中、Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ＊ＯＲ’’からなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子とともに、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、水素、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、
各ｎは１、２、３、４、及び５から独立して選択され；
各Ｒ５は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、その中のＭ’’は、結合、Ｃ１−１３アルキル、またはＣ２−１３アルケニルであり；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環、及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒは、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’は、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’’は、Ｃ３−１５アルキル及びＣ３−１５アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｒ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され；Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合に、（ｉ）ｎが１、２、３、４、または５のとき、Ｑは−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２のとき、Ｑは５員、６員、または７員のヘテロシクロアルキルではない］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＡ）：
【化２６】
2022501367.tif 000143
［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のＱは、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＢ）：
【化２７】
2022501367.tif 000144
の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、すべての変数が本明細書で定義されている通りであり、いくつかの実施形態では、ｍは５、６、７、８、及び９から選択され；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のＱは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩ）：
【化２８】
2022501367.tif 000145
［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のｎは、２、３、または４であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩａ）：
【化２９】
2022501367.tif 000146
［式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩｂ）：
【化３０】
2022501367.tif 000147
［式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩｃ）または（ＩＬ−ＩＩｅ）：
【化３１】
2022501367.tif 000148
または
【化３２】
2022501367.tif 000149
［式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩｆ）：
【化３３】
2022501367.tif 000150
［式中、Ｍは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ’’は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ２−６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択され、ｎは２、３、及び４から選択される］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩｄ）：
【化３４】
2022501367.tif 000151
［式中、ｎは２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ２〜Ｒ６は本明細書に記載されている通りであり；いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択することができる］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩｇ）：
【化３５】
2022501367.tif 000152
［式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される］の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記イオン化脂質が、
【化３６】
2022501367.tif 000153
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記イオン化脂質が、
【化３７】
2022501367.tif 000154
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記イオン化脂質が、
【化３８】
2022501367.tif 000155
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記イオン化脂質が、
【化３９】
2022501367.tif 000156
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記イオン化脂質が、
【化４０】
2022501367.tif 000157
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩＩ）：
【化４１】
2022501367.tif 000158
［式中、Ｗは、
【化４２】
2022501367.tif 000159
または
【化４３】
2022501367.tif 000160
であり、
環Ａは、
【化４４】
2022501367.tif 000161
または
【化４５】
2022501367.tif 000162
であり；
ｔは１または２であり；
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して、ＣＨまたはＮから選択され；
ＺはＣＨ２であるか、存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）それぞれが単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）と（２）はいずれも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ’’ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ＊ＯＲ’’からなる群より独立して選択され；
ＲＸ１及びＲＸ２はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１−３アルキルであり；
各Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群より独立して選択され；
Ｍ＊はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群より独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−５アルキルからなる群より独立して選択され；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群より独立して選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｒ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｒは、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群より独立して選択され；
各Ｒ’は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’’は、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ３−１２アルケニル、及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群より独立して選択され；
ｎは、１〜６の整数であり；
環Ａが
【化４６】
2022501367.tif 000163
である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうち少なくとも１つが−ＣＨ２−ではなく；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つが−Ｒ’’ＭＲ’である］の化合物、またはその塩もしくは異性体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記イオン化脂質が、式（ＩＬ−ＩＩＩａ１）〜（ＩＬ−ＩＩＩａ８）：
【化４７】
2022501367.tif 000164
【化４８】
2022501367.tif 000165
【化４９】
2022501367.tif 000166
【化５０】
2022501367.tif 000167
【化５１】
2022501367.tif 000168
【化５２】
2022501367.tif 000169
【化５３】
2022501367.tif 000170
または
【化５４】
2022501367.tif 000171
のいずれかの化合物である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記イオン化脂質が、
【化５５】
2022501367.tif 000172
またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記イオン化脂質が、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群より選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、約１．１：１〜約３０：１のＮ：Ｐ比を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、約２：１〜約２０：１のＮ：Ｐ比を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、約２：１〜約１０：１または約２：１〜約５：１のＮ：Ｐ比を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均ＬＮＰ径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、約０．０１〜約０．２５の多分散指数を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＬＮＰ製剤及び／または前記ＬＮＰ組成物が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の封入効率を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径が、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＬＮＰ製剤の封入効率が、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の封入効率よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００以上、または約１００００倍以上高い、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ＬＮＰ製剤の前記核酸発現（例えば、前記ｍＲＮＡ発現）が、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＬＮＰ製剤の前記核酸発現（例えば、前記ｍＲＮＡ発現）が、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００以上、または約１００００倍以上高い、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法に従って、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項１４８】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって調製される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
【請求項１４９】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって調製される、疾患または障害を治療または予防するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
【請求項１５０】
先行請求項のいずれか１項に記載の緩衝水溶液及び／または有機溶液。
【請求項１５１】
疾患または障害を治療または予防するための医薬品（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物）の製造における、先行請求項のいずれか１項に記載の緩衝水溶液及び／または有機溶液の使用。
【請求項１５２】
先行請求項のいずれか１項に記載の緩衝水溶液及び先行請求項のいずれか１項に記載の有機溶液を含むキット。
【請求項１５３】
先行請求項のいずれか１項に記載の混合兼投与装置をさらに含む、請求項１５２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年９月２０日出願の米国仮出願第６２／７３３，９７４号に対する優先権、及びその利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１９年９月２０日に作成されたファイル名「ＭＲＮＡ−０４８＿００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、サイズ１ＫＢの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
開示の分野
本開示は、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する新規の方法、その作製された製剤、ならびに関連する治療的使用及び／または診断的使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物学的活性物質の効果的な標的化送達は、継続中の医療課題である。特に、細胞への核酸の送達は、このような種の相対的不安定性かつ低細胞透過性によって困難になる。したがって、核酸などの治療薬及び予防薬の細胞への送達を容易にするための方法及び組成物を開発する必要性がある。
【０００５】
脂質含有ナノ粒子または脂質ナノ粒子、リポソーム、及びリポプレックスは、細胞及び／または細胞内区画への小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物学的活性物質の輸送媒体として、有効性が実証されている。様々な当該脂質含有ナノ粒子が実証されているが、安全性、有効性、及び特異性の改善は未だ不十分である。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を作製する方法であって、（ｉ）緩衝水溶液と有機溶液を混合し、それにより核酸を内包する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を処理し、それにより脂質ナノ粒子組成物を形成することとを含み、当該有機溶液が、有機溶媒中に有機溶媒可溶性核酸及びイオン化脂質を含み、有機溶媒可溶性核酸は疎水性有機カチオンを含む方法を提供する。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質及び封入剤を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質、封入剤、ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも約１体積％の有機溶媒を含むように、緩衝水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法を提供する。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、緩衝水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法に従って、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される、疾患または障害を治療または予防するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される緩衝水溶液及び本明細書に開示される有機溶液を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、疾患または障害を治療または予防するための医薬品（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物）の製造における、本明細書に開示される緩衝水溶液及び／または有機溶液の使用を提供する。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される緩衝水溶液及び本明細書に開示される有機溶液を含むキットを提供する。
特に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本開示が属する分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等である方法及び材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で述べる刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００１５】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）と有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）の脂質ナノ粒子製剤化プロセスの違いを示す模式図である。
【図２】有機性供給源ｍＲＮＡで形成した脂質ナノ粒子のクライオ画像である。
【図３】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）と有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。四角形はＡＦＭを表し、円はＯＦＭを表す。
【図４】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、ＡＦＭナノ沈殿混合、及び有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）ナノ沈殿混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。
【図５】実験用Ｔ混合プロセスの設定を示す模式図である。
【図６】有機性供給源ｍＲＮＡで形成した脂質ナノ粒子のクライオ画像である。
【図７】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）９６ウェル混合、ならびに個別及びプールでの有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）９６ウェル混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。四角形はＯＦＭ９６ウェル複製Ａを表し、濃色三角形はＯＦＭ９６ウェル複製Ｂを表し、淡色三角形はＯＦＭ９６ウェル複製Ｃを表し、円はプールしたＯＦＭ９６ウェルを表し、菱形はＡＦＭ９６ウェルを表す。
【図８】９６ウェル混合及びマイクロ流体混合によって形成されたＯＦＭ及びＡＦＭ脂質ナノ粒子の平均脂質ナノ粒子径及び封入効率を比較するグラフである。
【図９】ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から６時間後のマウスにおけるルシフェラーゼ発現レベル（全身フラックス）を比較するグラフである。
【図１０】ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から２４時間後のマウスにおけるルシフェラーゼ発現レベル（全身フラックス）を比較するグラフである。
【図１１】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図１１Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図１１Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図１１Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から６時間後のマウスの全身ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）生物発光画像である。
【図１２】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図１２Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図１２Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図１２Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から６時間後のマウスの肺（１）、肝臓（２、丸で囲む）、及び脾臓（３）の組織分布のｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。
【図１３】Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏマウスの肝臓（図１３Ａ）、肺（図１３Ｂ）、及び脾臓（図１３Ｃ）組織におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較するグラフである。
【図１４】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図１４Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇ（図１４Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図１４Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図１４Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与から２４時間後のマウスの全身ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）生物発光画像である。
【図１５】ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内背側投与から６時間後のマウスにおけるルシフェラーゼ発現レベル（全身フラックス）を比較するグラフである。
【図１６】ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内背側投与から２４時間後のマウスにおけるルシフェラーゼ発現レベル（全身フラックス）を比較するグラフである。
【図１７】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図１７Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（図１７Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図１７Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図１７Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から６時間後のマウスの全身ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）生物発光画像である。
【図１８】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏマウスの注射部位（図１８Ａ）、肝臓（図１８Ｂ）、肺（図１８Ｃ）、及び脾臓（図１８Ｄ）組織におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較するグラフである。
【図１９】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図１９Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図１９Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図１９Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から６時間後のマウスの肺（１）、肝臓（２）、脾臓（３）、及び注射部位（４、丸で囲む）の組織分布のｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。
【図２０】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図２０Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（図２０Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図２０Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図２０Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から２４時間後のマウスの全身ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）生物発光画像である。
【図２１】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（１）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（２）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（３）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（４）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から２４時間後のｅｘ  ｖｉｖｏマウスの注射部位（図２１Ａ）、肝臓（図２１Ｂ）、肺（図２１Ｃ）、及び脾臓（図２１Ｄ）組織におけるルシフェラーゼ発現レベルを比較するグラフである。
【図２２】Ａ〜Ｄは、ＰＢＳ（図２２Ａ）；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ（図２２Ｂ）；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（図２２Ｃ）及び９６ウェルプレートハイスループット混合（図２２Ｄ）を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から２４時間後のマウスの肺（１）、肝臓（２）、脾臓（３）、及び注射部位（４、丸で囲む）の組織分布のｅｘ  ｖｉｖｏ生物発光画像である。
【図２３】ＰＢＳ；対照の水性供給源ｍＲＮＡ法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇ；ならびに有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合及び９６ウェルプレートハイスループット混合を用いて本開示の方法によって調製された脂質ナノ粒子製剤０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与から６時間後のサイトカイン誘導レベル（ＩＦＮ−アルファ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１）を比較するグラフである。円はＰＢＳを表し、四角形は水性供給源ｍＲＮＡのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（ＡＦＭ−Ｎａ）を表し、上向き三角形は有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（ＯＦＭ−Ｔ混合）を表し、逆三角形はＯＦＭ９６ウェルを表す。
【図２４】水性供給源ｍＲＮＡのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、ならびに有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）のＴ混合及び９６ウェル混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。円は水性供給源ｍＲＮＡのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（ＡＦＭ−Ｎａ）を表し、四角形は有機性供給源ｍＲＮＡのＴ混合（ＯＦＭ−Ｔ混合）を表し、三角形はＯＦＭ９６ウェルを表す。
【図２５】初期形成後、ＰＢＳ緩衝液での透析後、及び遠心フィルター装置を使用した濃縮後、凍結乾燥を行わないタンジェンシャルフローフィルトレーション法によって調製された、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）の有機可溶性ｍＲＮＡ塩を用いて撹拌プレートベンチトップバイアル混合によって調製された脂質ナノ粒子製剤の平均粒子径を比較するグラフである。
【図２６】初期形成後、ＰＢＳ緩衝液での透析後、及び遠心フィルター装置を使用した濃縮後、凍結乾燥を行わないタンジェンシャルフローフィルトレーション法によって調製された、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）の有機可溶性ｍＲＮＡ塩を用いて撹拌プレートベンチトップバイアル混合によって調製された脂質ナノ粒子製剤の多分散指数（ＰＤＩ）を比較するグラフである。
【図２７】凍結乾燥を行わないタンジェンシャルフローフィルトレーション法によって調製された、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）の有機可溶性ｍＲＮＡ塩を用いて撹拌プレートベンチトップバイアル混合によって調製された脂質ナノ粒子製剤の、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイで測定した封入効率（％ＥＥ）を比較するグラフである。
【図２８】２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ約５）または２０ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液／８％スクロース（ｐＨ約７．４）の水相と有機性供給源ｍＲＮＡストック及び脂質混合物を混合する、または水性供給源ｍＲＮＡストックを混合することによって調製された脂質ナノ粒子の封入効率（％ＥＥ）を比較するグラフである。
【図２９】６時間でのｉｎ  ｖｉｖｏベッドサイド脂質ナノ粒子製剤の発現レベルを比較するグラフである。
【図３０】２４時間でのｉｎ  ｖｉｖｏベッドサイド脂質ナノ粒子製剤の発現レベルを比較するグラフである。
【図３１】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、ならびにＡＦＭの９６ウェル混合及び有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）の９６ウェル混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。円は水性供給源ｍＲＮＡのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（ＡＦＭ−Ｎａ）を表し、四角形は９６ウェルのプールしたＡＦＭを表し、三角形は９６ウェルのプールしたＯＦＭを表す。
【図３２】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、ならびにＬシリンジ混合ＡＦＭ及び有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）のＬシリンジ混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。濃色円はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ−Ｎａ）を表し、淡色円はＬシリンジ混合ＡＦＭ（Ｌシリンジ−ＡＦＭ）を表し、四角形はＬシリンジ混合ＯＦＭ（Ｌシリンジ−ＯＦＭ）を表す。
【図３３】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、ならびにＫシリンジ混合ＡＦＭ及び有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）のＫシリンジ混合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。円はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ−Ｎａ）を表し、三角形はＫシリンジ混合ＡＦＭ（Ｋシリンジ−ＡＦＭ）を表し、菱形はＫシリンジ混合ＯＦＭ（Ｋシリンジ−ＯＦＭ）を表す。
【図３４】水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合、９６ウェル混合ＡＦＭ、Ｋシリンジ混合ＡＦＭ、及びＬシリンジ混合ＡＦＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を比較するグラフである。濃色円はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ水性供給源ｍＲＮＡを表し、四角形は９６ウェルのプールしたＡＦＭを表し、三角形はＫシリンジ混合ＡＦＭ（Ｋシリンジ−ＡＦＭ）を表し、淡色円はＬシリンジ混合ＡＦＭ（Ｌシリンジ−ＡＦＭ）を表す。
【図３５】６時間でのＣＤ−１マウスからのｈＥＰＯ発現を対数目盛で示すグラフであり、Ｎ：Ｐが５．８、４、及び３である同一の製剤に対する投与ｐＨの影響を示している。
【図３６】６時間でのＣＤ−１マウスからのｈＥＰＯ発現を線形目盛で示すグラフであり、Ｎ：Ｐが５．８、４、及び３である同一の製剤に対する投与ｐＨの影響を示している。
【図３７】２４時間でのＣＤ−１マウスからのｈＥＰＯ発現を対数目盛で示すグラフであり、Ｎ：Ｐが５．８、４、及び３である同一の製剤に対する投与ｐＨの影響を示している。
【図３８】２４時間でのＣＤ−１マウスからのｈＥＰＯ発現を線形目盛で示すグラフであり、Ｎ：Ｐが５．８、４、及び３である同一の製剤に対する投与ｐＨの影響を示している。
【図３９】Ａ〜Ｃは、製剤の投与ｐＨ及びＮ：Ｐ比を比較した、６時間でのＣＤ−１マウスからのサイトカイン応答を示すグラフである。
【図４０】実施例８で中性ｐＨのベッドサイド製剤化手順に使用される高ｐＫａカチオンの構造を示す。
【図４１】投与後６時間でのｈＥＰＯ発現を示すグラフであり、中性ｐＨ手法を使用して作製された製剤は従来の対照と同等であることを示している。群２はｐＨ５で製剤化及び投与し、群３は、群２の試料を投与前にｐＨ７．４に中和した。群４及び５はｐＨ７．４で作製し、投与した。
【図４２】投与後２４時間でのｈＥＰＯ発現を示すグラフであり、中性ｐＨ手法を使用して作製された製剤は従来の対照と同等であることを示している。群２はｐＨ５で製剤化及び投与し、群３は、群２の試料を投与前にｐＨ７．４に中和した。群４及び５はｐＨ７．４で作製し、投与した。
【図４３】Ａ〜Ｃは、製剤化プロセス及び高ｐＫａ脂質の添加を比較する、６時間でのＣＤ−１マウスからのサイトカイン応答を示すグラフである。
【図４４】中性ｐＨ製剤化プロセスを使用して試験した追加の高ｐＫａカチオンの構造を示すグラフである。
【図４５】投与後６時間でのｈＥＰＯ発現を示すグラフであり、ＥＡ−ＩＩＩ群の代替高ｐＫａカチオンを使用して作製された製剤は中性ｐＨのベッドサイドナノ沈殿手法と同等であることを示している。
【図４６】投与後２４時間でのｈＥＰＯ発現を示すグラフであり、ＥＡ−ＩＩＩ群の代替高ｐＫａカチオンを使用して作製された製剤は中性ｐＨのベッドサイドナノ沈殿手法と同等であることを示している。
【図４７】Ａ〜Ｂは、ＥＡ−ＩＩＩ群全体の高ｐＫａカチオンの効果とＥＡ−１及び従来のＬＮＰ対照の効果とを比較する、６時間でのＣＤ−１マウスからのサイトカイン応答を示すグラフである。
【図４８】投与及び試料採取の日程を示すグラフである。
【図４９】ベッドサイド群３〜６の投与２の大型粒子（０．８μｍ未満）の特性データを示すグラフである。
【図５０】ベッドサイド群３〜６の投与２の大型粒子（２μｍ未満）の特性データを示すグラフである。
【図５１】群１〜６のＩｇＧ（五量体）力価を示すグラフであり、酸性または中性ｐＨのベッドサイドナノ沈殿手順を用いて生成されたものを含む、試験した全製剤にわたる免疫応答を示している。
【図５２】群１〜６のＩｇＧ（ｇＢ）力価を示すグラフであり、酸性または中性ｐＨのベッドサイドナノ沈殿手順を用いて生成されたものを含む、試験した全製剤にわたる免疫応答を示している。
【図５３】投与及び試料採取の日程を示すグラフである。
【図５４】対照製剤及び中性条件または酸性条件を使用するベッドサイドナノ沈殿製剤について観察されたＣＡ−Ａ、ＣＡ−Ｂ、及びＣＡ−Ｃ再刺激に対するクラスＩ応答を示すグラフである。
【図５５】対照製剤及び中性条件または酸性条件を使用するベッドサイドナノ沈殿製剤について観察されたＣＡ−Ｄ及びＣＡ−Ｅ再刺激に対するクラスＩＩ応答を示すグラフである。
【図５６】投与６時間後の全身発光を示すグラフである。
【図５７】投与６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏ肝臓発光を示すグラフである。
【図５８】投与６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏ脾臓発光を示すグラフである。
【図５９】投与６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏ肺発光を示すグラフである。
【図６０】実施例１３に使用した高ｐＫａ脂質（ＥＡ−１３）の構造を示す。
【図６１】投与６時間後のｈＥＰＯ濃度を示すグラフである。
【図６２】投与２４時間後のｈＥＰＯ濃度を示すグラフである。
【図６３】投与６時間後のＩＰ−１０レベルを示すグラフである。
【図６４】投与６時間後のＭＣＰ−１レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、部分的に、本明細書に開示される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する方法が、ＬＮＰ製剤の物理的特性（例えば、ＬＮＰ安定性）、化学的特性（例えば、核酸安定性）、及び／または生物学的特性（例えば、有効性、細胞内送達、免疫原性）に影響を及ぼし得る、及び／または決定し得るという発見に基づく。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、作製された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の望ましくない特性変化を緩和する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、同等の方法（例えば、本明細書に開示される１つ以上の工程を含まない方法）によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、作製された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の望ましくない特性変化を緩和する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤またはそこに含まれるＬＮＰに対するストレスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ストレスは、ＬＮＰ製剤の作製時、精製時、包装時、貯蔵時、輸送時、及び／または使用時に誘発される。いくつかの実施形態では、ストレスは、熱、剪断、過度の撹拌、膜濃度極性（電荷状態の変化）、脱水、凍結ストレス、乾燥ストレス、凍結／解凍ストレス、及び／または噴霧ストレスである。いくつかの実施形態では、ストレスは、ＬＮＰ製剤の凍結または凍結乾燥時に誘発される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、不純物量及び／または肉眼不可視の粒子量の増加、またはＬＮＰ製剤中のＬＮＰの平均サイズの増加である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、作製されたＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下（例えば、ＬＮＰの平均サイズの増加）を緩和する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、本明細書に開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下の平均ＬＮＰ径を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の化学的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤中の核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））の完全性の低下である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の生物学的特性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性の低下である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、本明細書に開示される同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも高い有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００以上、または約１００００倍以上高い有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００以上、または約１００００倍以上高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
【００２９】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製方法及び投与方法
本発明は、ＬＮＰ形成プロセスにおける水相の導入前に、オリゴヌクレオチド及び脂質成分を有機相に事前混合することにより、従来の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）形成プロセスに使用される複雑な混合により生ずる制限のいくつかを改善する。これは、従来のＬＮＰ形成プロセスに適合する有機溶液に溶解できるように、イオン対形成により溶解度を変化させたｍＲＮＡを使用して達成される。リン酸骨格に会合するカチオンが疎水性有機分子であるｍＲＮＡ塩を作成すると、ｍＲＮＡの溶解度プロファイルが、高水溶性から、エタノール含有量の高い有機溶媒及び溶媒混合物に可溶性のものへと変換される。従来の手順とは対照的に、この方法では、ＬＮＰ形成時に水相と混合する前に、有機相でＬＮＰの疎水性脂質成分及びカチオン性脂質成分とオリゴヌクレオチドペイロードを直接溶解することが可能である。
【００３０】
通常の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）形成手順は、エタノールなどの有機溶媒に溶解された疎水性脂質成分と、得られる粒子に充填しようとするオリゴヌクレオチドを含有する緩衝水溶液との混合を制御する必要がある。混合の複雑さ、及びオリゴヌクレオチドを粒子コアに正常に封入するために必要とされる様々なイオン相互作用に起因して、粒子形成プロセス全体を通じて作用する多数の変数が存在し、これが、得られる粒子の品質、安定性、及び機能に影響を与える可能性がある。
【００３１】
本発明は、水相と混合する前に、有機溶媒相中でｍＲＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドを脂質成分と混和させることによって、ＬＮＰ形成プロセスを簡素化する。有機溶媒可溶性ｍＲＮＡ（ＯＳＳＭ）により、混合プロセス全体を通じて縮合カチオン性脂質が確実にｍＲＮＡと自由に接触できるようになり、混合時に、ｍＲＮＡを疎水性環境に分配したり、または疎水性成分で被覆したりする必要性をなくし、ＬＮＰコアに組み込むことが可能になる。これにより、高脱水状態である有機相からｍＲＮＡが出発するため、制御混合プロセスに付随する複雑さを緩和すること、高脱水状態のＬＮＰコアを生成すること、及びＬＮＰ表面周囲のパラメーターの組成柔軟性を提供することが期待される。この追加脱水性は、製剤内部の粒子安定性とｍＲＮＡの化学的安定性に有益な効果をもたらすものである一方、混合の負担軽減とバルク水相からのペイロードの移動の負担軽減は、製剤化プロセスを簡素化するものである。
【００３２】
混合の簡素化に加えて、水相の導入前の、ＬＮＰコアを構成する疎水性成分を含む有機相にオリゴヌクレオチドが滞留することは、オリゴペイロードを水相からＬＮＰコアに移動する必要性を省くことにより、ＬＮＰ表面の柔軟性向上を可能にすることが期待される。オリゴヌクレオチドが水相から供給される場合、高密度のＰＥＧ化脂質などの分子は、従来の形成技術に従うｍＲＮＡ交換の際に、立体障害が生じる可能性がある。ＯＳＳＭは、水相導入前に、予めｍＲＮＡをＬＮＰの疎水性成分に確実に近接させることで、特にＬＮＰ表面修飾成分に関してＬＮＰ組成物の柔軟性を高める。
【００３３】
本発明は、有機溶媒相に溶解されたｍＲＮＡを使用してＬＮＰの形成を可能にするプロセスに関する。最初の工程は、水溶性ナトリウム塩形態のｍＲＮＡを有機溶媒可溶性ｍＲＮＡ（ＯＳＳＭ）形態に変換することを含む。次の工程は、ＯＳＳＭを有機溶媒または溶媒混合物に溶解して、ｍＲＮＡが供給された有機溶液でＬＮＰを形成できるようにすることである。
【００３４】
ナトリウム塩のような水溶性形態のｍＲＮＡを水に溶解する。この溶液を、緩衝液の塩基性部分が有機化合物で構成されている有機溶解度が増加した緩衝溶液と混合する。次に、この溶液を緩衝液交換プロセスにより処理して、残留無機カチオンを溶液から除去し、ｍＲＮＡのリン酸骨格との相互作用に望ましい疎水性カチオンのみを残す。
【００３５】
このプロセスは、いくつかの方法で達成することができる。いくつかの実施形態では、疎水性カチオンへのカチオン交換を促進するために、タンジェンシャルフローフィルトレーションを使用してｍＲＮＡ溶液を緩衝液と交換することによりｍＲＮＡ溶液を処理する。緩衝液交換工程の後、ｍＲＮＡ溶液をさらにｄｄＨ２Ｏで交換して過剰な緩衝液を除去し、ｍＲＮＡは疎水性カチオン塩形態で溶液中に残すことができる。次に、この溶液をタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）により濃縮し、蒸発または凍結乾燥を介して脱水し、ＬＮＰプロセスに必要とされる有機相に溶解する材料を得ることができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、透析を使用して水溶性ｍＲＮＡを疎水性塩形態に変換する。この実施形態では、出発ｍＲＮＡ溶液を、塩基性成分が疎水性有機カチオンである緩衝液に溶解する。次に、追加緩衝液交換によりカチオン交換プロセスを促進するため、追加緩衝液でｍＲＮＡを透析する。さらに、ｍＲＮＡ含有溶液をｄｄＨ２Ｏで透析して、目的とする塩形態のｍＲＮＡを残しつつ過剰な緩衝液を除去することができる。水中透析後、蒸発または凍結乾燥を介してｍＲＮＡ溶液を脱水し、ＬＮＰプロセスに必要とされる有機相に溶解する材料を得ることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、疎水性イオン対逆相法を使用して、目的とする疎水性塩形態のｍＲＮＡを作成する。この手順では、疎水性イオン対の手法を使用して、ｍＲＮＡを逆相支持体に結合させることができる。さらに、有機溶媒と、カチオン部分が疎水性有機分子である水性緩衝液との組み合わせを用いて逆相カラムからｍＲＮＡを溶出してもよい。得られたｍＲＮＡ含有画分をさらに脱水して、目的とする疎水性カチオン形態のｍＲＮＡを得ることができる。この方法は、ｍＲＮＡの疎水性塩を生成するプロセスにおいて特に有用であり、ｍＲＮＡ及び他のオリゴヌクレオチド構築物の産生及び精製に一般的に使用される逆相精製技術に組み込むことができる。
【００３８】
別の実施形態では、イオン交換樹脂を使用して、ｍＲＮＡを水溶性カチオン塩形態から疎水性塩形態に変換することができる。この手順では、目的とする疎水性カチオンをイオン交換樹脂に充填し、ｍＲＮＡ溶液で処理して、目的とする疎水性塩形態のｍＲＮＡを得る。蒸発または凍結乾燥を介してｍＲＮＡ溶液を脱水し、ＬＮＰプロセスに必要とされる有機相に溶解する材料を得る。
【００３９】
別の実施形態では、疎水性カチオン含有緩衝液で事前に平衡化したサイズ排除カラムを使用して、疎水性カチオンをｍＲＮＡに添加することができる。蒸発または凍結乾燥を介してｍＲＮＡ溶液を脱水し、ＬＮＰプロセスに必要とされる有機相に溶解する材料を得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、適切な分子量の遠心分離装置を使用して、ｍＲＮＡのカチオンをより疎水性で有機可溶性のものに交換することができる。ｍＲＮＡの水溶性カチオン塩を含有するｍＲＮＡ溶液を、緩衝液の塩基性成分として望ましい疎水性カチオンを含有する緩衝液で希釈する。交換緩衝液工程で濃縮と希釈を繰り返した後、任意選択でｄｄＨ２Ｏと交換すると、目的とする疎水性塩形態のｍＲＮＡが得られる。蒸発または凍結乾燥を介してｍＲＮＡ溶液を脱水し、ＬＮＰプロセスに必要とされる有機相に溶解する材料を得る。
【００４１】
疎水性塩形態のｍＲＮＡを乾燥させた後、その材料を有機溶液に溶解でき、ＬＮＰの製剤化が可能になる。
いくつかの実施形態では、有機溶媒可溶性ｍＲＮＡ（ＯＳＳＭ）は、ｍＲＮＡなどの目的とする有機溶媒に直接溶解される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、最初に、疎水性ｍＲＮＡ塩の湿潤及び溶解を促進するためにＯＳＳＭをベンジルアルコールなどの少量の有機溶媒に溶解した後、エタノールなどのバルク相に使用される目的とする溶媒で希釈し、混合有機溶媒系を得る。
【００４３】
この溶液をカチオン性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ化脂質と混和し、ＬＮＰ作製に適した、ｍＲＮＡと脂質の有機溶液を生成することができる。
ｍＲＮＡと脂質の有機溶液を、ｐＨ５酢酸緩衝液などの水性緩衝液に沈殿させて、目的とするカチオン性脂質成分を確実にプロトン化し、ｍＲＮＡとのカチオン交換を促進し、最初の有機可溶性ｍＲＮＡ材料の生成に使用された疎水性カチオンを置換することができる。
【００４４】
マイクロ流体力学またはＴ混合手法を使用して、ｍＲＮＡと脂質の有機溶液を、ｐＨ５酢酸緩衝液などの水性緩衝液と混合すると、目的とするカチオン性脂質成分のプロトン化が保証され、ｍＲＮＡとのカチオン交換を促進し、最初の有機可溶性ｍＲＮＡ物質の生成に使用される疎水性カチオンを置換することができる。
【００４５】
本開示は、部分的に、脂質ナノ粒子の作製方法が、脂質ナノ粒子内部の特定の成分の分布に影響を及ぼし得ることと、この分布が脂質ナノ粒子の物理的特性（例えば、安定性）及び／または生物学的特性（例えば、有効性、細胞内送達、免疫原性）に影響を及ぼし得る、及び／または決定し得るという発見に基づく。
【００４６】
本開示では、成分の有利な分布を有する脂質ナノ粒子を含む組成物を生成する方法を記載する。
有利には、有機可溶性ｍＲＮＡ及び／または水溶性ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ  ＬＮＰのベッドサイド製剤化を可能にし得る。未製剤化状態で保存されたｍＲＮＡは、保存及び安定性の面で大幅な利点があると同時に、カチオンのｐＫａと製剤パラメーターを用いて、製剤化中の緩衝作用またはｐＨ調整の必要性を低減または排除することができる。
【００４７】
ＬＮＰ溶液の提供
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を作製する方法であって、（ｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、当該ＬＮＰが核酸及びイオン化脂質を含むＬＮＰ溶液を提供することと；（ｉｉ）ＬＮＰ溶液を処理し、それによりＬＮＰ製剤を形成することと、を含む方法を提供する。
【００４８】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を作製する方法であって、（ｉ）緩衝水溶液と有機溶液を混合し、それにより核酸を内包する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を形成することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を処理し、それにより脂質ナノ粒子組成物を形成することとを含み、当該有機溶液が、有機溶媒中に有機溶媒可溶性核酸及びイオン化脂質を含み、有機溶媒可溶性核酸は疎水性有機カチオンを含む方法を提供する。
【００４９】
本開示の方法に適した核酸を本明細書でさらに開示する。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
本開示の方法に適したイオン化脂質を本明細書でさらに開示する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。本開示の方法に適したリン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を本明細書でさらに開示する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を提供する工程は、緩衝水溶液及び有機溶液を混合することを含み、当該有機溶液が、有機溶媒中に有機溶媒可溶性核酸及びイオン化脂質を含み、有機溶媒可溶性核酸は疎水性有機カチオンを含む方法を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を提供する工程は、
ｉａ）混合する前に、核酸の水溶性塩を有機溶媒可溶性核酸に変換し、それにより有機溶媒−溶媒可溶性核酸を形成することを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を提供する工程は、
ｉａａ）変換後に有機溶媒可溶性核酸を凍結乾燥することを含む。
いくつかの実施形態では、変換は透析を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、変換は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、変換は疎水性イオン対逆相カラムの使用を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、変換はイオン交換樹脂の使用を含む。
いくつかの実施形態では、変換はサイズ排除カラムの使用を含む。
いくつかの実施形態では、有機溶媒可溶性核酸は、第三級アミン塩である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、有機溶媒可溶性核酸は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）塩である。
いくつかの実施形態では、有機溶媒可溶性核酸は、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）塩である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、有機溶媒可溶性核酸は、トリメチルアミン（ＴＥＡ）塩である。
いくつかの実施形態では、核酸の水溶性塩はナトリウム塩である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸の水溶性塩はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）塩である。
いくつかの実施形態では、有機溶媒はアルコールである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、有機溶媒はエタノールである。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とを含む。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒はアルコールであり、第２の有機溶媒はアルコールである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒はエタノールであり、第２の有機溶媒はベンジルアルコールである。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約１００：１〜約１：１の範囲内である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約５０：１〜約１：１の範囲内である。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１〜約１：１の範囲内である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約１：１の範囲内である。
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、約４〜約６の範囲のｐＨを有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、約４．５〜約５．５の範囲のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、約４．８〜約５．２の範囲のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、約４〜約６、約４．５〜約５．５、または約４．８〜約５．２の範囲のｐＨを有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、有機溶液は、約７．０〜約９．０、約７．０〜約８．１、または約７．１〜約７．８、または約７．２〜約７．７、または約７．３〜約７．６、または約７．４〜約７．５の範囲のｐＨを有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は酢酸緩衝液である。
いくつかの実施形態では、混合は乱流混合を含む。
いくつかの実施形態では、混合は層流混合を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、混合はマイクロ流体混合を含む。
いくつかの実施形態では、混合は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｒ（商標）によって実施される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、混合は乱流ではなく、５．０×１０４未満のレイノルズ数を有する。
いくつかの実施形態では、混合は乱流ではなく、１．０×１０４未満のレイノルズ数を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、混合は乱流ではなく、５．０×１０３未満のレイノルズ数を有する。
いくつかの実施形態では、混合は乱流ではなく、２．５×１０３未満のレイノルズ数を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、混合は、５．０×１０４未満、１．０×１０４未満、５．０×１０３未満、または２．５×１０３未満のレイノルズ数を有する。
いくつかの実施形態では、混合は、約１０００未満、約５００未満、または約２５０未満のレイノルズ数を有する。
【００７０】
ＬＮＰ溶液の処理
本明細書で使用される「処理」という用語は、ＬＮＰを精製、ｐＨ調整、緩衝液交換、及び／または濃縮するための１つ以上の工程を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を処理する工程は、
ｉｉａ）ＬＮＰ溶液を濾過することを含む。
いくつかの実施形態では、濾過により、ＬＮＰ溶液から有機溶媒（例えば、アルコールまたはエタノール）を除去する。いくつかの実施形態では、処理は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒（例えば、アルコールまたはエタノール）を除去すると、ＬＮＰ溶液は、中性ｐＨ、すなわちｐＨ６．５〜７．８、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．５、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．２の緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液）に変換される。いくつかの実施形態では、得られるＬＮＰ溶液は、好ましくは、保存前または使用前に、例えば濾過により（例えば、０．１〜０．５μｍフィルターに通して）滅菌される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を処理する工程は、ＬＮＰ溶液を包装することをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「包装」とは、最終状態での医薬品の保存、または最終的なパッケージに入れる前の製造過程のＬＮＰの保存を指す場合がある。保存様式及び／または包装様式として、滅菌バッグ中での冷蔵、バイアル中で冷蔵または冷凍された製剤、バイアル及びシリンジ中の凍結乾燥製剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を包装する工程は、以下の工程：
ｉｉｂ）ＬＮＰ溶液に凍結保護剤を添加すること；
ｉｉｃ）ＬＮＰ溶液を凍結乾燥し、それにより凍結乾燥されたＬＮＰ組成物を形成すること；
ｉｉｄ）ＬＮＰ溶液または凍結乾燥されたＬＮＰ組成物を保存すること；及び
ｉｉｅ）ＬＮＰ溶液または凍結乾燥されたＬＮＰ組成物に緩衝溶液を添加し、それによりＬＮＰ製剤を形成することのうち１つ以上を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、凍結乾燥前にＬＮＰ溶液に添加される。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、１種以上の凍結保護剤を含み、１種以上の凍結防止剤はそれぞれ独立して、ポリオール（例えば、ジオールまたはトリオール、例えばプロピレングリコール（すなわち、１，２−プロパンジオール）、１，３−プロパンジオール、グリセロール、（＋／−）−２−メチル−２，４−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、エチレングリコール、またはジエチレングリコール）、非界面活性剤スルホベタイン（例えば、ＮＤＳＢ−２０１（３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート）、オスモライト（例えば、Ｌ−プロリンまたはトリメチルアミンＮ−オキシド二水和物）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５５０（ｍＰＥＧ５５０）、ｍＰＥＧ６００、ｍＰＥＧ２０００、ｍＰＥＧ３３５０、ｍＰＥＧ４０００、ｍＰＥＧ５０００、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドンＫ１５）、ペンタエリトリトールプロポキシラート、またはポリプロピレングリコールＰ４００）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはエタノール）、糖（例えば、Ｄ−（＋）−スクロース、Ｄ−ソルビトール、トレハロース、Ｄ−（＋）−マルトース一水和物、ｍｅｓｏ−エリトリトール、キシリトール、ｍｙｏ−イノシトール、Ｄ−（＋）−ラフィノース五水和物、Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物、またはＤ−（＋）−グルコース一水和物）、もしくは塩（例えば、酢酸リチウム、塩化リチウム、ギ酸リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、塩化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの任意の水和物）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、凍結保護剤はスクロースを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、好適なガラス容器（例えば、１０ｍＬの円筒形ガラスバイアル）中で実施される。ガラス容器は、好ましくは、短時間での−４０℃未満から室温超への極端な温度変化に耐え、及び／または均一形状に切削されている。いくつかの実施形態では、凍結乾燥の工程は、ＬＮＰ溶液を約−４０℃超、好ましくは約−３０℃未満の温度で凍結し、それにより凍結されたＬＮＰ溶液を形成することと；凍結されたＬＮＰ溶液を乾燥させて、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物を形成することとを含む。凍結工程の結果、終了までの約６分にわたり、好ましくは毎分約１℃ずつ２０℃から−４０℃まで、直線的な温度低下になることが好ましい。いくつかの実施形態では、１２〜１５％のスクロースを使用することができ、乾燥工程は、約５０ｍＴｏｒｒ〜約１５０ｍＴｏｒｒの範囲の真空にて、好ましくは、最初に約−３５℃〜約−１５℃の範囲の低温で、次に室温〜約２５℃の範囲の高温で実施され、好ましくは、乾燥工程は３〜７日で完了する。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、約５０ｍＴｏｒｒ〜約１００ｍＴｏｒｒの範囲の真空にて、好ましくは、最初に約−１５℃〜約０℃の範囲の低温で、次に高温で実施される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥されたＬＮＰ組成物は、緩衝溶液を添加するまで、約−４０℃、約−３５℃、約−３０℃、約−２５℃、約−２０℃、約−１５℃、約−１０℃、約−５℃、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、または約２５℃の温度で保存される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥されたＬＮＰ組成物は、緩衝溶液を添加するまで、約−４０℃〜約０℃、約−３５℃〜約−５℃、約−３０℃〜約−１０℃、約−２５℃〜約−１５℃、約−２２℃〜約−１８℃、または約−２１℃〜約−１９℃の温度で保存される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥されたＬＮＰ組成物は、緩衝溶液を添加するまで、約−２０℃の温度で保存される。
ＬＮＰ製剤の投与
一態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質及び封入剤を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法に関する。
【００７９】
一態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）水性緩衝液中に治療薬及び／または予防薬を含む、約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法に関する。
【００８０】
一態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）約７．０〜約９．０の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質、封入剤、ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約７．０〜約９．０の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも約１体積％の有機溶媒を含むように、緩衝水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法に関する。
【００８１】
一態様では、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を患者に投与する方法であって、（ｉ）約４．５〜約７．０未満の範囲の第１のｐＨを有する緩衝水溶液と、有機溶媒中にイオン化脂質ならびに治療薬及び／または予防薬を含む有機溶液とを提供することと；（ｉｉ）脂質ナノ粒子製剤が、約４．５〜約７．０未満の範囲の第２のｐＨを有し、脂質ナノ粒子製剤の総量に対して少なくとも１体積％の有機溶媒を含むように、緩衝水溶液と有機溶液を混合することにより、治療薬及び／または予防薬を内包する脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を形成することと；（ｉｉｉ）混合後約７２時間未満に脂質ナノ粒子製剤を患者に投与することと、を含む方法に関する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、第１のｐＨ及び第２のｐＨは、約７．０〜約８．１、または約７．１〜約７．８、または約７．２〜約７．７、または約７．３〜約７．６、または約７．４〜約７．５の範囲内である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第１のｐＨ及び第２のｐＨは、約４．５〜約６．５、または約４．６〜約６．０、または約４．８〜約５．５の範囲内である。
いくつかの実施形態では、混合後約７２時間未満、好ましくは混合後約６０時間未満、好ましくは混合後約４８時間未満、好ましくは混合後約３６時間未満、好ましくは混合後約２４時間未満、好ましくは混合後約２０時間未満、好ましくは混合後約１６時間未満、好ましくは混合後約１２時間未満、好ましくは混合後約８時間未満に投与が実施される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、混合後約１２０分未満、好ましくは混合後約１００分未満、好ましくは混合後約９０分未満、好ましくは混合後約８０分未満、好ましくは混合後約７０分未満、好ましくは混合後約６０分未満、好ましくは混合後約５０分未満、好ましくは混合後約４０分未満、好ましくは混合後約３０分未満、好ましくは混合後約２０分未満、好ましくは混合後約１５分未満、好ましくは混合後約１０分未満に投与が実施される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、混合から投与までの間、脂質ナノ粒子製剤を処理しない。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、混合から投与までの間にｐＨ調整を含まない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、混合から投与までの間、脂質ナノ粒子製剤を濾過しない。
いくつかの実施形態では、この方法は、混合兼投与装置の第１の投入口に有機溶液を送ることをさらに含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、この方法は、混合兼投与装置の第２の投入口に緩衝水溶液を送ることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、混合兼投与装置のミキサー部分で混合を実施する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、混合兼投与装置の出口から脂質ナノ粒子製剤を投与する。
いくつかの実施形態では、提供、形成、混合、及び投与すべてが、単一の混合兼投与装置、好ましくは流体連通された混合兼投与装置を使用して実施される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、混合兼投与装置は２連式シリンジを含む。
いくつかの実施形態では、混合兼投与装置は、Ｋシリンジ及びＬシリンジからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、混合兼投与装置は、ミキサー部分にスタティックミキサーを含む。
いくつかの実施形態では、スタティックミキサーは、らせん型スタティックミキサーである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液のｐＨと脂質ナノ粒子製剤のｐＨは、ほぼ同じである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して約１体積％〜約５０体積％の有機溶媒、好ましくは脂質ナノ粒子製剤の総体積に対して約２体積％〜約４５体積％、好ましくは約３体積％〜約４０体積％、好ましくは約４体積％〜約３５体積％、好ましくは約５体積％〜約３３体積％の有機溶媒を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、有機溶媒はアルコールである。
いくつかの実施形態では、有機溶媒はエタノールである。
いくつかの実施形態では、有機溶媒は、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒はアルコールであり、第２の有機溶媒はアルコールである。
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒はエタノールであり、第２の有機溶媒はベンジルアルコールである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約１００：１〜約１：１、または約５０：１〜約１：１、または約２０：１〜約１：１、または約１０：１〜約１：１の範囲内である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、有機溶液は湿潤剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、湿潤剤とは、液体が固体表面及び／または液体表面などの表面との接触を維持する能力を増加、減少、または改善する薬剤を指す場合がある。
【００９６】
いくつかの実施形態では、湿潤剤は有機溶媒である。
いくつかの実施形態では、湿潤剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
いくつかの実施形態では、湿潤剤と有機溶媒とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０００：１〜約１：１、または約５００：１〜約５：１、または約１００：１〜約１０：１の範囲内である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、及びｔｒｉｓ緩衝液からなる群より選択される少なくとも１種である。いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、生理学的ｐＨを維持するのに適した任意の緩衝液であってよい。いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は、患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者への投与に適したｐＨを維持するのに適する任意の緩衝液であってよい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、緩衝水溶液は張性剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、張性剤は、２種の溶液の水電位によって定義される有効浸透圧勾配、または拡散の方向及び程度に影響を及ぼす、溶液中に溶解する溶質の相対濃度を増加、減少、または改善する薬剤を指す場合がある。
【００９９】
いくつかの実施形態では、張性剤は糖である。
いくつかの実施形態では、糖はスクロースである。
ＬＮＰ製剤
いくつかの態様では、本開示のＬＮＰ製剤は、本明細書に開示される方法によって調製される。
【０１００】
いくつかの態様では、本開示のＬＮＰ製剤は、複数のＬＮＰを含み、その場合、ＬＮＰは核酸及びイオン化脂質を含む。
本開示の方法に適した核酸を本明細書でさらに開示する。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
【０１０１】
本開示の方法に適したイオン化脂質を本明細書でさらに開示する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。本開示の方法に適したリン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を本明細書でさらに開示する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ製剤は、少なくとも１種の脂質ナノ粒子成分を含む。脂質ナノ粒子は、脂質成分と、治療薬及び／または予防薬、例えば核酸などの１種以上の追加成分とを含み得る。ＬＮＰは、１種以上の特異的用途または特異的標的に合わせて設計することができる。ＬＮＰの要素は、特定の用途または標的に基づいて、及び／または１種以上の要素の有効性、毒性、費用、使いやすさ、入手可能性、または他の特徴に基づいて選択することができる。同様に、例えば、要素の特定の組み合わせの有効性及び毒性に従って、特定の用途または標的に応じた特定のＬＮＰ製剤を選択することができる。ＬＮＰ製剤の有効性及び忍容性は、製剤の安定性による影響を受ける場合がある。
【０１０３】
ＬＮＰの脂質成分は、例えば、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）に従う脂質、リン脂質（不飽和脂質など、例えばＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。ＬＮＰの脂質成分は、例えば、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）に従う脂質、リン脂質（不飽和脂質など、例えばＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、及び構造脂質を含み得る。脂質成分の要素を特定の画分に提供することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分は、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）に従う脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分は、総ｍｏｌ％が１００％を超えないことを条件として、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％の、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）の化合物、約０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分は、約３５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％の、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）の化合物、約５ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％の構造脂質、及び約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、脂質成分は、約５０ｍｏｌ％の上記化合物、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。別の特定の実施形態では、脂質成分は、約４０ｍｏｌ％の上記化合物、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧであり得、及び／または構造脂質はコレステロールであり得る。
【０１０５】
脂質ナノ粒子は、１種以上の特異的用途または特異的標的に合わせて設計することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物の体内の特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群に、ＲＮＡなどの治療薬及び／または予防薬を送達するようにＬＮＰを設計することができる。特定の身体標的に対する選択性を高めるために、脂質ナノ粒子の物理化学的特性を変更してもよい。例えば、異なる器官の開窓部の大きさに基づいて粒子のサイズを調整することができる。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬はまた、目的とする１つまたは複数の送達標的に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、特定の適応症、病態、疾患、または障害に合わせて、及び／または特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群への送達（例えば、局所送達または特異的送達）に合わせて、治療薬及び／または予防薬を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、細胞内で翻訳されて、対象となるポリペプチドを生成できる、対象となるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。そのような組成物は、特定の器官に特異的に送達されるように設計することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物の肝臓に特異的に送達されるように組成物を設計することができる。
【０１０６】
ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、目的とする標的及び／または用途、または他の特性、ならびに治療薬及び／または予防薬の特性に応じて異なり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰに有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、及び他の特性に応じて異なり得る。ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬ならびに他の要素（例えば、脂質）の相対量もまた変化し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ中の脂質成分と核酸などの治療薬及び／または予防薬とのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１〜約６０：１、例えば５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、及び６０：１であり得る。いくつかの実施形態では、脂質成分と治療薬及び／または予防薬とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は約２０：１である。ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬の量は、例えば、吸収分光法（例えば、紫外可視分光法）を使用して測定することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは１種以上のＲＮＡを含み、１種以上のＲＮＡ、脂質、及びその量は、特異的Ｎ：Ｐ比を示すように選択することができる。組成物のＮ：Ｐ比とは、１種以上の脂質中の窒素原子とＲＮＡ中のリン酸基数とのモル比を指す。一般に、Ｎ：Ｐ比は低い方が好ましい。１種以上のＲＮＡ、脂質、及びその量は、Ｎ：Ｐ比が約２：１〜約３０：１、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１を示すように選択することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが含まれる製剤は、塩化物塩などの塩をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰが含まれる製剤は、二糖などの糖をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は糖をさらに含むが、塩化物塩などの塩は含まない。
【０１０９】
物理的特性
本開示のＬＮＰの物理的特性は、様々な方法によって特性決定することができる。いくつかの実施形態では、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用して、ＬＮＰの形態及び粒度分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定法）を使用すると、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法は粒経の決定にも利用することができる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの装置を使用して、粒経、多分散指数、及びゼータ電位など、ＬＮＰの複数の特性を測定することもできる。
【０１１０】
ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定すると、数十ｎｍ〜数百ｎｍの間であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約８０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１００ｎｍであり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１ｍｍ〜約５００ｍｍ、約５ｍｍ〜約２００ｍｍ、約１０ｍｍ〜約１００ｍｍ、約２０ｍｍ〜約８０ｍｍ、約２５ｍｍ〜約６０ｍｍ、約３０ｍｍ〜約５５ｍｍ、約３５ｍｍ〜約５０ｍｍ、または約３８ｍｍ〜約４２ｍｍの範囲である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ製剤と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下である。
【０１１３】
ＬＮＰは、比較的均一であり得る。多分散指数を使用して、ＬＮＰの均一性、例えば脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。一般に、多分散指数が小さいと（例えば、０．３未満）、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０〜約０．２５、例えば０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５などの多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０１１４】
ＬＮＰのゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。いくつかの実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表す場合がある。高電荷種は、体内の細胞、組織、及び他の要素と望ましくない相互作用をする可能性があるため、正負を問わず比較的低電荷を帯びた脂質ナノ粒子が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０１１５】
核酸などの治療薬及び／または予防薬の封入効率とは、提供される初期量に対して、調製後にＬＮＰに封入されるか、それ以外の方法で抱合される治療薬及び／または予防薬の量を表す。封入効率は高いことが望ましい（例えば、１００％に近似）。封入効率は、例えば、脂質ナノ粒子を１種以上の有機溶媒または界面活性剤で分解する前と後の、脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬及び／または予防薬の量を比較することにより測定することができる。アニオン交換樹脂を使用して、溶液中に遊離する治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。蛍光法を使用して、溶液中に遊離する治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、治療薬及び／または予防薬の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は少なくとも８０％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は少なくとも９０％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は少なくとも９５％であり得る。
【０１１６】
ＬＮＰは、任意選択で、１種以上のコーティングを含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル剤、フィルム剤、または錠剤に製剤化することができる。本明細書に記載の組成物を含むカプセル剤、フィルム剤、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度、または密度を有し得る。
【０１１７】
化学的特性
本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の化学的特性は、様々な方法によって特性決定することができる。いくつかの実施形態では、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、逆相液体クロマトグラフィー）を使用して、ｍＲＮＡの完全性を調べることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＬＮＰ完全性よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００以上、または約１００００倍以上高い。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％は、約１２か月以上、約１５か月以上、約１８か月以上、約２１か月以上、約２４か月以上、約２７か月以上、約３０か月以上、約３３か月以上、約３６か月以上、約４８か月以上、約６０か月以上、約７２か月以上、約８４か月以上、約９６か月以上、約１０８か月以上、約１２０か月以上である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ８０％よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、約１２か月以上、約１５か月以上、約１８か月以上、約２１か月以上、約２４か月以上、約２７か月以上、約３０か月以上、約３３か月以上、約３６か月以上、約４８か月以上、約６０か月以上、約７２か月以上、約８４か月以上、約９６か月以上、約１０８か月以上、約１２０か月以上である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２は、同等の方法によって作製されたＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤のＴ１／２よりも、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上長い。
【０１２４】
定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）を含む、任意選択で置換される直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。「Ｃ１−１４アルキル」という表記は、１〜１４個の炭素原子を含む、任意選択で置換される直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。特に指定のない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換アルキル基と置換アルキル基の両方を指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、任意選択で置換される直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。「Ｃ２−１４アルケニル」という表記は、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、任意選択で置換される直鎖状または分枝状の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１８アルケニルは、１個以上の二重結合を含み得る。２個の二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。特に指定のない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換アルキル基と置換アルケニル基の両方を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「炭素環」または「炭素環基」という用語は、炭素原子の環を１つ以上含む、任意選択で置換される単環式系または多環式系を意味する。環は、３員環、４員環、５員環、６員環、７員環、８員環、９員環、１０員環、１１員環、１２員環、１３員環、１４員環、１５員環、１６員環、１７員環、１８員環、１９員環、または２０員環であり得る。「Ｃ３−６炭素環」という表記は、３〜６個の炭素原子を有する単一の環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１個以上の炭素−炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、シクロアルキル基またはアリール基）であってもよい。炭素環の例として、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、及び１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、非芳香族炭素環を意味し、任意の二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に指定のない限り、本明細書に記載の炭素環とは、非置換炭素環基と置換炭素環基の両方、すなわち任意選択で置換される炭素環を指す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環基」という用語は、１つ以上の環を含み、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む、任意選択で置換される単環式系または多環式系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子であり得る。環は、３員環、４員環、５員環、６員環、７員環、８員環、９員環、１０員環、１１員環、１２員環、１３員環、または１４員環であり得る。複素環は、１個以上の二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基）であり得る。複素環の例として、イミダゾリル基、イミダゾリジニル基、オキサゾリル基、オキサゾリジニル基、チアゾリル基、チアゾリジニル基、ピラゾリジニル基、ピラゾリル基、イソオキサゾリジニル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリジニル基、イソチアゾリル基、モルホリニル基、ピロリル基、ピロリジニル基、フリル基、テトラヒドロフリル基、チオフェニル基、ピリジニル基、ピペリジニル基、キノリル基、及びイソキノリル基が挙げられる。本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族複素環を意味し、任意の二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に指定のない限り、本明細書に記載の複素環とは、非置換複素環基と置換複素環基の両方、すなわち任意選択で置換される複素環を指す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「生分解性基」とは、哺乳動物実体内での脂質の迅速な代謝を促進できる基である。生分解性基は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群より選択することができるが、これに限定されない。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意選択で置換される炭素環基である。アリール基の例として、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意選択で置換される複素環基である。ヘテロアリール基の例として、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基とヘテロアリール基はいずれも任意選択で置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群より選択することができる。本明細書の式において、Ｍ及びＭ’は、上記の生分解性基の一覧から独立して選択することができる。特に指定のない限り、本明細書に記載のアリール基またはヘテロアリール基とは、非置換基と置換基の両方、すなわち任意選択で置換されるアリール基またはヘテロアリール基を指す。
【０１３０】
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、特に指定のない限り、任意選択で置換されていてもよい。任意選択的な置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物基、臭化物基、フッ化物基、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいはＣ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、ここで、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ’’’’、ここで、各ＯＲは、同じでも異なっていてもよいアルコキシ基であり、Ｒ’’’’はアルキル基またはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、サルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群より選択できるが、これらに限定されない。前述のいずれにおいても、Ｒは、本明細書で定義されるアルキル基またはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義される１個、２個、３個、４個、５個、または６個の置換基でさらに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ１−６アルキル基が、本明細書に記載の１個、２個、３個、４個、５個、または６個の置換基でさらに置換されていてもよい。
【０１３１】
約、ほぼ：本明細書で使用される場合、「ほぼ」及び「約」という用語は、対象となる１つ以上の値に付加される場合、示される参照値とほぼ同じ値を指す。いくつかの実施形態では、「ほぼ」または「約」という用語は、特に指定のない限り、または文脈から明らかでない限り、指定された参照値の上下（大小）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の幅を指す（そのような数が許容値の１００％を超える場合を除く）。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分中の所与の化合物量に関する文脈で使用される場合、「約」は、列挙値の＋／−１０％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分が含まれるＬＮＰは、化合物を３０〜５０％含み得る。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、図示された構造の異性体及び同位体をすべて含むことを意図する。「同位体」とは、原子番号は同じだが、原子核内の中性子数が異なるため質量数が異なる原子を指す。いくつかの実施形態では、水素の同位体には、三重水素及び重水素が含まれる。さらに、通常の方法によって、本開示の化合物、塩、または錯体を溶媒または水分子と組み合わせて調製することで溶媒和物及び水和物を形成することができる。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の要素間の物理的結合を確立することを意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞をＬＮＰと接触させることは、哺乳動物細胞及びナノ粒子が物理的結合を共有するようにすることを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏの両方で細胞を外部要素と接触させる方法は、生物学分野で周知されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物の体内に配置されたＬＮＰと哺乳動物細胞との接触は、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）で実施することができ、多様な量の脂質ナノ粒子を伴い得る。さらに、複数の哺乳動物細胞をＬＮＰと接触させることができる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「同等の方法」という用語は、方法が比較される時点（例えば、本開示のＬＮＰ製剤の作製時点）で、同等のパラメーターまたは工程を有する方法を指す。いくつかの実施形態では、「同等の方法」とは、比較される方法の工程ｉ）、ｉａ）、ｉａａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、及びｉｉｅ）のうちの１つ以上を有する方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」とは、比較される方法の工程ｉ）、ｉａ）、ｉａａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、及びｉｉｅ）のうちの１つ以上を有さない方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」とは、比較される方法の工程ｉａ）及びｉｂ）のうちの１つ以上を有さない方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、核酸の水溶性塩を用いる方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、有機溶媒可溶性核酸を含まない有機溶液を用いる方法である。いくつかの実施形態では、「同等の方法」は、脂質ナノ粒子製剤を投与する前に脂質ナノ粒子を処理することを含む方法である。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「送達する」という用語は、要素を目的位置に提供することを意味する。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に投与することを伴い得る（例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、または皮下経路による）。哺乳動物または哺乳動物細胞へのＬＮＰの投与は、１つ以上の細胞を脂質ナノ粒子と接触させることを伴い得る。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「送達の増強」という用語は、対象となる標的組織への対照ナノ粒子（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）による治療薬及び／または予防薬の送達レベルと比較して、ナノ粒子により治療薬及び／または予防薬が、対象となる標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）により多く（例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍多く）送達されることを意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織内に生成されたタンパク質の量を上記組織の重量と比較すること、組織内の治療薬及び／または予防薬の量を上記組織の重量と比較すること、組織内に生成されたタンパク質の量を上記組織のタンパク質の総量と比較すること、または組織内の治療薬及び／または予防薬の量を上記組織内の治療薬及び／または予防薬の総量と比較することにより測定することができる。標的組織へのナノ粒子の送達の増強は、治療される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理物において決定してもよいと理解される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、標的外組織（哺乳動物の脾臓など）と比較して、ナノ粒子により治療薬及び／または予防薬が、対象となる標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）により多く（例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍多く）送達されることを意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織内に生成されたタンパク質の量を上記組織の重量と比較すること、組織内の治療薬及び／または予防薬の量を上記組織の重量と比較すること、組織内に生成されたタンパク質の量を上記組織のタンパク質の総量と比較すること、または組織内の治療薬及び／または予防薬の量を上記組織内の治療薬及び／または予防薬の総量と比較することにより測定することができる。いくつかの実施形態では、腎血管標的の場合、治療薬及び／または予防薬の全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、組織１ｇあたり１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多くの治療薬及び／または予防薬が腎臓に送達される場合、肝臓及び脾臓と比較して哺乳動物の腎臓に特異的に治療薬及び／または予防薬が提供される。標的組織へナノ粒子を特異的に送達する能力は、治療される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理物において決定してもよいと理解される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「封入効率」とは、ＬＮＰの調製に使用される治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。いくつかの実施形態では、組成物に最初に供給される合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰに封入される場合、封入効率は９７％と示すことができる。本明細書で使用される場合、「封入」とは、完全な、実質的な、もしくは部分的な封入、密閉、包囲、または内包を指す場合がある。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳、及び／またはポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の内部ではなく、人工環境内、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養液中、ペトリ皿中などで発生する事象を指す。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）の内部で発生する事象を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）の外部で発生する事象を指す。ｅｘ  ｖｉｖｏ事象は、天然（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）環境から最小限に変更された環境で行うことができる。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体、互変異性体、双性イオン、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。化合物は１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含む場合があるため、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（−）またはシス／トランス異性体）などの立体異性体として存在し得る。本開示は、立体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物、例えばラセミ体を含め、本明細書に記載の化合物のあらゆる異性体を包含する。化合物のエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物、ならびにそれらを、それらの成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分解する手段は周知である。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「脂質成分」は、１種以上の脂質を含む脂質ナノ粒子の成分である。いくつかの実施形態では、脂質成分は、１種以上のカチオン性／イオン化脂質、ＰＥＧ化脂質、構造脂質、またはリン脂質などの他の脂質を含み得る。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「リンカー」とは、２つの部分を連結する部分、例えば、キャップ種の２つのヌクレオシド間の連結部である。リンカーは、限定されないが、リン酸基（例えば、ホスフェート、ボラノホスフェート、チオホスフェート、セレノホスフェート、及びホスホネート）、アルキル基、アミダート、またはグリセロールを含む１つ以上の基を含み得る。いくつかの実施形態では、キャップ類似体の２つのヌクレオシドは、三リン酸基によって、または２つのホスフェート部分及びボラノホスフェート部分を含む鎖によって、それらの５’位で連結することができる。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法を含み得る。投与方法を選択して、身体の特定の領域または系に送達を標的化する（例えば、特異的に送達する）ことができる。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「修飾」とは、非天然を意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡであり得る。すなわち、ＲＮＡは、天然に存在しない１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。本明細書で「修飾」種を「改変」種と称する場合もある。種は、化学的、構造的、または機能的に修飾または改変することができる。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基種は、天然に存在しない１つ以上の置換を含み得る。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「Ｎ：Ｐ比」とは、例えば、脂質成分及びＲＮＡが含まれるＬＮＰ中の、脂質中の（生理学的ｐＨ範囲の）イオン化窒素原子とＲＮＡ中のリン酸基とのモル比である。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」とは、１種以上の脂質を含む組成物である。脂質ナノ粒子は、通常、マイクロメートル以下のオーダーのサイズであり、脂質二重層を含む場合がある。本明細書で使用される脂質ナノ粒子は、特に指定のない限り、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、直径が５００ｎｍ以下である脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」とは、人工的な補助なしに自然界に存在することを意味する。
本明細書で使用される場合、「患者」とは、治療を求めているかまたは必要としている可能性がある対象、治療を要する対象、治療を受けている対象、治療を受ける予定のある対象、または特定の疾患もしくは病態について熟練した専門家による治療を受診している対象を指す。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ化脂質」とは、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。
「薬学的に許容される」という語句は、そのような化合物、物質、組成物、及び／または剤形が、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、堅実な医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合うことを指して本明細書で使用される。
【０１５１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外であり、実質的に患者に無毒かつ非炎症性である特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁、複合体化、または溶解可能であるビヒクル）を指す。賦形剤は、例えば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、皮膚軟化剤、乳化剤、増量剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング、香味剤、香料、流動促進剤（流動賦活剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水を含み得る。例示的な賦形剤として、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）、ビタミンＣ、キシリトール、及び本明細書に開示される他の種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
組成物はまた、１種以上の化合物の塩を含み得る。塩は、薬学的に許容される塩であり得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、（例えば、遊離塩基を適切な有機酸と反応させることにより）既存の酸部分または塩基部分をその塩形態に変換することによって親化合物が改変されている、本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例として、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンのカチオン、例えば、限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来的な非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態または遊離塩基形態のこれらの化合物を化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中、またはその２種の混合物中（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒が好ましい）で反応させることにより調製することができる。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃ���ｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９（１９７７）に記載されており、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「リン脂質」は、リン酸部分と、不飽和脂肪酸鎖などの１つ以上の炭素鎖とを含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重または三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含み得る。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含んでいてもよい。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含まなくてもよい。特定のリン脂質は、膜との融合を促進することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負電荷リン脂質と相互作用することができる。リン脂質と膜との融合により、脂質含有組成物の１つ以上の要素が膜を通過でき、例えば、１つ以上の要素を細胞に送達することが可能になる。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、多分散指数とは、系の粒度分布の均一性を表す比である。値が小さいと（例えば、０．３未満）、狭い粒度分布を示す。
本明細書で使用される場合、両親媒性「ポリマー」とは、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位などのオリゴマー断片を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の両親媒性ポリマーは、ＰＳ２０であり得る。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」または「対象となるポリペプチド」という用語は、通常はペプチド結合によってアミノ酸残基が結合されたポリマーを指し、天然に生成され得る（例えば、単離または精製される）か、または合成的に生成され得るものである。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」は、リボ核酸を指し、天然または非天然であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾された及び／または天然に存在しない成分、例えば１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、連鎖停止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内でのｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳により、コードされたポリペプチドを生成することができる。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる非限定的な群より選択することができる。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「単一単位用量」とは、１回用量／同時／単一経路／単一接触点、すなわち単一の投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
本明細書で使用される場合、「分割用量」とは、単一単位用量または１日総用量を２回以上の用量に分割することである。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「１日総用量」とは、２４時間の期間に与えられる量または処方される量である。これを単一単位用量として投与することができる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示に従う組成物または製剤を、例えば、実験目的、診断目的、予防目的、及び／または治療目的で投与できる任意の生物を指す。典型的な対象として、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／または植物が挙げられる。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「Ｔｘ」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸の完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性を約Ｘに分解するまでの所要時間量を指す。例えば、「Ｔ８０％」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸の完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性を約８０％に分解するまでの所要時間量を指す。別の例として、「Ｔ１／２」とは、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の核酸の完全性（例えば、ｍＲＮＡ完全性）が、ＬＮＰ、ＬＮＰ溶液、凍結乾燥されたＬＮＰ組成物、またはＬＮＰ製剤の調製に使用される核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の初期完全性を約１／２に分解するまでの所要時間量を指す。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、対象となる任意の１つ以上の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは器官に存在し得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「標的組織」とは、治療薬及び／または予防薬の送達により、望ましい生物学的及び／または薬理学的効果が得られる、対象となる任意の１つ以上の組織型を指す。対象となる標的組織の例として、特異的な組織、器官、及びそれらの系または群が挙げられる。特定の用途では、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管内（例えば、冠状動脈内または大腿内）の血管内皮、または腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射による）であり得る。「標的外組織」とは、コードされたタンパク質の発現により、望ましい生物学的及び／または薬理学的効果が得られない、任意の１つ以上の組織型を指す。特定の用途では、標的外組織は肝臓及び脾臓を含み得る。
【０１６２】
「治療薬」または「予防薬」という用語は、対象に投与されたときに、治療効果、診断効果、及び／または予防効果を有する、及び／または望ましい生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。治療薬を「活性物質」または「活性剤」とも称する。そのような薬剤の例として、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、小分子薬、タンパク質、及び核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または病態を患っている、または患いやすい対象に投与すると、感染症、疾患、障害、及び／または病態を治療、症状改善、診断、予防、及び／または発症遅延させるのに十分である、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、組成物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」とは、細胞への種（例えば、ＲＮＡ）の導入を指す。トランスフェクションは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状または特徴を部分的または完全に緩和する、改善する、好転する、軽減する、その発症を遅延する、その進行を阻害する、その重症度を抑制する、及び／またはそれらの発生率を減少させることを指す。いくつかの実施形態では、がんを「治療する」は、腫瘍の生存、成長、及び／または拡散を阻害することを指す場合がある。治療は、疾患、障害、及び／または病態の徴候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または病態の初期徴候のみを示す対象に、疾患、障害、及び／または病態に付随する病変を発現するリスクを低減する目的で行われる場合がある。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「ゼータ電位」は、例えば、粒子組成物中の脂質の界面動電位である。
イオン化脂質
いくつかの態様では、本開示のイオン化脂質は、式（ＩＬ−１）：
【０１６７】
【化１】
2022501367.tif 000003
【０１６８】
の１種以上の化合物もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であってよく、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ＊ＯＲ’’からなる群より独立して選択されるか、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子とともに、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、水素、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、
各ｎは、１、２、３、４、及び５から独立して選択され；
各Ｒ５は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、その中のＭ’’は、結合、Ｃ１−１３アルキル、またはＣ２−１３アルケニルであり；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環、及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒは、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’は、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’’は、Ｃ３−１５アルキル及びＣ３−１５アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｒ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され；Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合に、（ｉ）ｎが１、２、３、４、または５のとき、Ｑは−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２のとき、Ｑは５員、６員、または７員のヘテロシクロアルキルではない。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ−ＩＡ）：
【０１７０】
【化２】
2022501367.tif 000004
【０１７１】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のＱは、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ−ＩＢ）：
【０１７３】
【化３】
2022501367.tif 000005
【０１７４】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、すべての変数は本明細書で定義されている通りである。いくつかの実施形態では、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のＱは、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒまたは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＬ−ＩＩ）：
【０１７６】
【化４】
2022501367.tif 000006
【０１７７】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、その中のｎは、２、３、または４であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ’’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩａ）：
【０１７９】
【化５】
2022501367.tif 000007
【０１８０】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩｂ）：
【０１８１】
【化６】
2022501367.tif 000008
【０１８２】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩｃ）または（ＩＬ−ＩＩｅ）：
【０１８３】
【化７】
2022501367.tif 000009
【０１８４】
または
【０１８５】
【化８】
2022501367.tif 000010
【０１８６】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書に記載されている通りである。
別の実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩｆ）：
【０１８７】
【化９】
2022501367.tif 000011
【０１８８】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ’’は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ２−６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
【０１８９】
さらなる実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩｄ）：
【０１９０】
【化１０】
2022501367.tif 000012
【０１９１】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ２〜Ｒ６は本明細書に記載されている通りである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択することができる。
【０１９２】
さらなる実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＩＬ−ＩＩｇ）：
【０１９３】
【化１１】
2022501367.tif 000013
【０１９４】
のものもしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｍ’’は、Ｃ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）またはＣ２−６アルケニル（例えば、Ｃ２−４アルケニル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、同第６２／２５２，３１６号、同第６２／２５３，４３３号、同第６２／２６６，４６０号、同第６２／３３３，５５７号、同第６２／３８２，７４０号、同第６２／３９３，９４０号、同第６２／４７１，９３７号、同第６２／４７１，９４９号、同第６２／４７５，１４０号、及び同第６２／４７５，１６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載される１つ以上の化合物である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、米国出願第６２／４７５，１６６号に記載される化合物１〜２８０から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０１９７】
【化１２】
2022501367.tif 000014
【０１９８】
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０１９９】
【化１３】
2022501367.tif 000015
【０２００】
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０２０１】
【化１４】
2022501367.tif 000016
【０２０２】
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０２０３】
【化１５】
2022501367.tif 000017
【０２０４】
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０２０５】
【化１６】
2022501367.tif 000018
【０２０６】
またはその塩である。
いくつかの態様では、本開示のイオン化脂質は、式（ＩＬ−ＩＩＩ）：
【０２０７】
【化１７】
2022501367.tif 000019
【０２０８】
の１種以上の化合物、またはその塩もしくは異性体であってよく、式中、
Ｗは、
【０２０９】
【化１８】
2022501367.tif 000020
【０２１０】
または
【０２１１】
【化１９】
2022501367.tif 000021
【０２１２】
であり、
環Ａは、
【０２１３】
【化２０】
2022501367.tif 000022
【０２１４】
または
【０２１５】
【化２１】
2022501367.tif 000023
【０２１６】
であり；
ｔは、１または２であり；
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して、ＣＨまたはＮから選択され；
ＺはＣＨ２であるか、存在せず、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）それぞれが単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）と（２）はいずれも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ’’ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、及び−Ｒ＊ＯＲ’’からなる群より独立して選択され；
ＲＸ１及びＲＸ２はそれぞれ独立して、ＨまたはＣ１−３アルキルであり；
各Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群より独立して選択され；
Ｍ＊はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２はそれぞれ、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群より独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−５アルキルからなる群より独立して選択され；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群より独立して選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｒ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より独立して選択され；
各Ｒは、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群より独立して選択され；
各Ｒ’は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ’’は、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ３−１２アルケニル、及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群より独立して選択され；
ｎは、１〜６の整数であり；
環Ａが
【０２１７】
【化２２】
2022501367.tif 000024
【０２１８】
である場合、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうち少なくとも１つが−ＣＨ２−ではなく；及び／または
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つが−Ｒ’’ＭＲ’である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＬ−ＩＩＩａ１）〜（ＩＬ−ＩＩＩａ８）：
【０２２０】
【化２３】
2022501367.tif 000025
【０２２１】
【化２４】
2022501367.tif 000026
【０２２２】
【化２５】
2022501367.tif 000027
【０２２３】
【化２６】
2022501367.tif 000028
【０２２４】
【化２７】
2022501367.tif 000029
【０２２５】
【化２８】
2022501367.tif 000030
【０２２６】
【化２９】
2022501367.tif 000031
【０２２７】
または
【０２２８】
【化３０】
2022501367.tif 000032
【０２２９】
のいずれかのものである。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、米国出願第６２／２７１，１４６号、同第６２／３３８，４７４号、同第６２／４１３，３４５号、及び同第６２／５１９，８２６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００号に記載される１つ以上の化合物である。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載される化合物１〜１５６から選択される。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載される化合物１〜１６、４２〜６６、６８〜７６、及び７８〜１５６から選択される。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、
【０２３２】
【化３１】
2022501367.tif 000033
【０２３３】
またはその塩である。
式（ＩＬ−１）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）に従う脂質の中央アミン部分が、生理学的ｐＨでプロトン化されていてもよい。したがって、脂質は生理学的ｐＨで正電荷または部分的正電荷を有する場合がある。そのような脂質を、カチオン性脂質またはイオン化（アミノ）脂質と称する場合がある。脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷と負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
【０２３４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例として、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ脂質、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質として、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群より選択される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例として、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【０２３９】
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４  Ａ２号に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４０】
一般に、本明細書に記載の様々な式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、２０１６年１２月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」に記載されるように合成することができ、これは参照によりその全体が組み込まれる。
【０２４１】
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質などの、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含み得る。そのような種は、ＰＥＧ化脂質と別称される場合もある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＧ脂質、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ脂質、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ脂質、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ  ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは以下の構造を有する：
【０２４３】
【化３２】
2022501367.tif 000034
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であってよく、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＥＧ鎖にヒドロキシル基を含めるように、本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれかを修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義されるように、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書で「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも称する）は、１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基を脂質に有するＰＥＧ化脂質である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質またはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＰＬ−Ｉ）：
【０２４６】
【化３３】
2022501367.tif 000035
【０２４７】
の化合物、またはその塩であり、式中：
Ｒ３は−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは、端点を含む、１から１００までの整数であり；
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンであり、任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンが、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で独立して置換され；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：
【０２４８】
【化３４】
2022501367.tif 000036
【０２４９】
または
【０２５０】
【化３５】
2022501367.tif 000037
【０２５１】
のものであり；
Ｌ２の各事例は、独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位が、任意選択で、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換され；
Ｒ２の各事例は、独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで独立して置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり；
ｐは１または２である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は、−ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ＯＨ）：
【０２５３】
【化３６】
2022501367.tif 000038
【０２５４】
のもの、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。いくつかの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【０２５５】
【化３７】
2022501367.tif 000039
【０２５６】
の化合物、またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは、端点を含む、１から１００までの整数であり；
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ５の１つ以上のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は、式（ＰＬ−ＩＩ−ＯＨ）：
【０２５８】
【化３８】
2022501367.tif 000040
【０２５９】
のもの、またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは４５である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は、
【０２６０】
【化３９】
2022501367.tif 000041
【０２６１】
またはその塩である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は、
【０２６２】
【化４０】
2022501367.tif 000042
【０２６３】
である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載される１つ以上のＰＥＧ脂質であり得る。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−ＩＶ）：
【０２６５】
【化４１】
2022501367.tif 000043
【０２６６】
の化合物、またはその塩であり、式中：
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルであり；
ｒは、端点を含む、０から１００までの整数である。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、ｒは０である。
いくつかの実施形態では、Ｒ６はＣ１６アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ６はＣ１８アルキルである。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＶ）の化合物は、
【０２６９】
【化４２】
2022501367.tif 000044
【０２７０】
である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＶ）の化合物は、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｃ２（例えば、ポリオキシエチレンセチルエーテル）である。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＶ）の化合物は、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ２（例えば、ポリオキシエチレンセチルエーテル）である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＶ）の化合物は、
【０２７２】
【化４３】
2022501367.tif 000045
【０２７３】
である。
いくつかの態様では、本明細書に記載の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
【０２７４】
構造脂質
本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロール、さらにステロール部分含有脂質を指す。
【０２７５】
理論に束縛されるものではないが、脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むと、粒子内での他の脂質の凝集を緩和するのに役立つ可能性がある。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群より選択することができる。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロールである。本明細書で定義されるように、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの亜集団である。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロイドである。いくつかの実施形態では、構造脂質はコレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質はコレステロールの類似体である。いくつかの実施形態では、構造脂質はアルファ−トコフェロールである。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、構造脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載される１つ以上の構造脂質であり得る。
封入剤
本開示のいくつかの実施形態では、封入剤は、式（ＥＡ−Ｉ）：
【０２７７】
【化４４】
2022501367.tif 000046
【０２７８】
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｒ２０１及びＲ２０２はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ１０１）２からなる群より独立して選択され、各Ｒ１０１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ２０３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より選択され；
Ｒ２０４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１〜Ｃ２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ２〜Ｃ２０アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１〜Ｃ２０アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ２〜Ｃ２０アルケニル）からなる群より選択され；
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、Ｒ２０１及びＲ２０２はそれぞれ、Ｈ及びＣＨ３からなる群より独立して選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０１及びＲ２０２はそれぞれ、（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２及び（Ｃ＝ＮＨ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択される。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、Ｒ２０３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ８〜Ｃ１８アルキル、及びＣ１２〜Ｃ１６アルキルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２０４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１〜Ｃ２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ２〜Ｃ２０アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１〜Ｃ２０アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ２〜Ｃ２０アルケニル）；Ｃ８〜Ｃ１８アルキル、Ｃ８〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ８〜Ｃ１８アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ８〜Ｃ１８アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ８〜Ｃ１８アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ８〜Ｃ１８アルケニル）；ならびにＣ１２〜Ｃ１６アルキル、Ｃ１２〜Ｃ１６アルケニル、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１２〜Ｃ１６アルキル）、Ｃ（Ｏ）（ＯＣ１２〜Ｃ１６アルケニル）、Ｃ（Ｏ）（ＮＨＣ１２〜Ｃ１６アルキル）、及びＣ（Ｏ）（ＮＨＣ１２〜Ｃ１６アルケニル）からなる群より選択さる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択され；ｎ１は、１、２、３、４、５、及び６から選択され；ｎ１は、２、３、及び４から選択される。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、ｎ１は３である。
本開示のいくつかの実施形態では、封入剤は、式（ＥＡ−ＩＩ）：
【０２８３】
【化４５】
2022501367.tif 000047
【０２８４】
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｘ１０１は、結合、ＮＨ、またはＯであり；
Ｒ１０１及びＲ１０２はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ１０３及びＲ１０４はそれぞれ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より独立して選択され；
ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１は結合である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１はＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１０１はＯである。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１０１及びＲ１０２はそれぞれ、Ｈ及びＣＨ３からなる群より独立して選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１０３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ８〜Ｃ１８アルキル、及びＣ１２〜Ｃ１６アルキルからなる群より選択される。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１０４は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ８〜Ｃ１８アルキル、及びＣ１２〜Ｃ１６アルキルからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択されるか；ｎ１は、１、２、３、４、５、及び６から選択されるか；またはｎ１は、２、３、及び４から選択される。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ｎ１は３である。
例示的な封入剤として、エチルラウロイルアルギネート、エチルミリストイルアルギネート、エチルパルミトイルアルギネート、エチルオレインアルギネート、エチルカプリンアルギネート、及びエチルカプリルアルギネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、封入剤はエチルラウロイルアルギネート、
【０２９０】
【化４６】
2022501367.tif 000048
【０２９１】
またはその塩もしくは異性体である。
ある特定の実施形態では、封入剤は、
【０２９２】
【化４７】
2022501367.tif 000049
【０２９３】
【化４８】
2022501367.tif 000050
【０２９４】
【化４９】
2022501367.tif 000051
【０２９５】
【化５０】
2022501367.tif 000052
【０２９６】
【化５１】
2022501367.tif 000053
【０２９７】
【化５２】
2022501367.tif 000054
【０２９８】
【化５３】
2022501367.tif 000055
【０２９９】
【化５４】
2022501367.tif 000056
【０３００】
及び
【０３０１】
【化５５】
2022501367.tif 000057
【０３０２】
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、またはその塩もしくは異性体、例えば、遊離塩基、ＴＦＡ塩、及び／またはＨＣｌ塩などである。
本開示のいくつかの実施形態では、封入剤は、式（ＥＡ−ＩＩＩ）：
【０３０３】
【化５６】
2022501367.tif 000058
【０３０４】
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、
Ｒ１０５及びＲ１０６はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
Ｒ１０７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル及びＣ２〜Ｃ２０アルケニルからなる群より選択され；
Ｒ１０８は、Ｈ及びＣ（Ｏ）ＮＲ１０９Ｒ１１０からなる群より選択され；
Ｒ１０９及びＲ１１０はそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、及びＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群より独立して選択され；
ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１０５及びＲ１０６はそれぞれ、Ｈ及びＣＨ３からなる群より独立して選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１０７は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ８〜Ｃ１８アルキル、及びＣ１２〜Ｃ１６アルキルからなる群より選択される。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、ｎ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ２は、１、２、３、４、５、及び６から選択される。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、ｎ２は、２、３、及び４から選択される。
いくつかの実施形態では、ｎ２は３である。
例示的な封入剤として、ＥＡ−１１、ＥＡ−１２、ＥＡ−１３、及びＥＡ−１４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、封入剤は、
【０３０９】
【化５７】
2022501367.tif 000059
【０３１０】
【化５８】
2022501367.tif 000060
【０３１１】
【化５９】
2022501367.tif 000061
【０３１２】
【化６０】
2022501367.tif 000062
【０３１３】
【化６１】
2022501367.tif 000063
【０３１４】
【化６２】
2022501367.tif 000064
【０３１５】
【化６３】
2022501367.tif 000065
【０３１６】
及び
【０３１７】
【化６４】
2022501367.tif 000066
【０３１８】
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、またはその塩もしくは異性体、例えば、遊離塩基、ＴＦＡ塩、及び／またはＨＣｌ塩などである。
リン脂質
リン脂質は集合して１つ以上の脂質二重層を形成することができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と１つ以上の脂肪酸部分とを含む。
【０３１９】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群より選択することができる。
【０３２０】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファリノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群より選択することができる。
【０３２１】
特定のリン脂質は、膜との融合を促進することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負電荷リン脂質と相互作用することができる。リン脂質と膜との融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過でき、例えば、１つ以上の要素を標的組織に送達することが可能になる。
【０３２２】
非天然リン脂質種もまた企図され、これには分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換をもつ天然種が含まれる。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合に置換されているアルケニル基）で官能化することも、アルキンと架橋することもできる。適切な反応条件下で、アルキン基をアジドに曝露すると銅触媒による付加環化反応を施すことができる。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過または細胞認識を容易にする、あるいはナノ粒子組成物を標的部分または画像化部分（例えば、色素）などの有用な成分と複合体化する際に有用であり得る。
【０３２３】
リン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質には、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も含まれる。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体または変異体である。いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、式（ＰＬ−Ｉ）：
【０３２５】
【化６５】
2022501367.tif 000067
【０３２６】
の化合物、またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか；あるいは任意選択で２つのＲ１が介在原子と一緒に結合して、任意選択で置換される単環式カルボシクリルまたは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか；あるいは任意選択で３つのＲ１が介在原子と一緒に結合して、任意選択で置換される二環式カルボシクリルまたは任意選択で置換される二環式ヘテロシクリルを形成し；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：
【０３２７】
【化６６】
2022501367.tif 000068
【０３２８】
または
【０３２９】
【化６７】
2022501367.tif 000069
【０３３０】
のものであり；
Ｌ２の各事例は、独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位が、任意選択で−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置換され；
Ｒ２の各事例は、独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり；任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で独立して置換され；
ＲＮの各事例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり；
ｐは１または２であり；
ただし、化合物が式：
【０３３１】
【化６８】
2022501367.tif 000070
【０３３２】
でない場合、
Ｒ２の各事例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、リン脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載される１つ以上のリン脂質であり得る。
ｉ）リン脂質頭部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば、修飾コリン基）を含む。いくつかの実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾された第四級アミンを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つはメチルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つは水素またはメチルではない。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、以下の式：
【０３３４】
【化６９】
2022501367.tif 000071
【０３３５】
【化７０】
2022501367.tif 000072
【０３３６】
【化７１】
2022501367.tif 000073
【０３３７】
【化７２】
2022501367.tif 000074
【０３３８】
【化７３】
2022501367.tif 000075
【０３３９】
のうちの１つ、またはその塩であり、式中、
各ｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各ｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各ｖは、独立して、１、２、または３である。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ａ）：
【０３４１】
【化７４】
2022501367.tif 000076
【０３４２】
のもの、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ｂ）：
【０３４３】
【化７５】
2022501367.tif 000077
【０３４４】
のもの、またはその塩である。
ｉｉ）リン脂質尾部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、修飾尾部を含む。いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、修飾尾部を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。本明細書に記載されるように、「修飾尾部」は、より短いか、より長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状基もしくはヘテロ原子基で置換された脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であり得る。いくつかの実施形態では、（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ａ）のもの、またはその塩であり、式中、Ｒ２の各事例である、Ｒ２の少なくとも１つの事例は、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキルであり、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で独立して置換される。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ｃ）：
【０３４６】
【化７６】
2022501367.tif 000078
【０３４７】
のもの、またはその塩であり、式中：
各ｘは、独立して、端点を含む、０〜３０の整数であり；
Ｇの各事例は、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−からなる群より独立して選択される。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）修飾ホスホコリン部分を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に有用であるか、有用な可能性があるリン脂質は、ｎが、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、以下の式：
【０３４９】
【化７７】
2022501367.tif 000079
【０３５０】
、
【０３５１】
【化７８】
2022501367.tif 000080
【０３５２】
のうちの１つ、またはその塩である。
代替脂質
いくつかの実施形態では、本開示のリン脂質の代わりに代替脂質が使用される。そのような代替脂質の非限定的な例として、以下：
【０３５３】
【化７９】
2022501367.tif 000081
【０３５４】
【化８０】
2022501367.tif 000082
【０３５５】
【化８１】
2022501367.tif 000083
【０３５６】
【化８２】
2022501367.tif 000084
【０３５７】
【化８３】
2022501367.tif 000085
【０３５８】
【化８４】
2022501367.tif 000086
【０３５９】
及び
【０３６０】
【化８５】
2022501367.tif 000087
【０３６１】
が挙げられる。
アジュバント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の脂質を含むＬＮＰは、１種以上のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４をさらに含み得る。
【０３６２】
治療薬
脂質ナノ粒子は、核酸などの１種以上の治療薬及び／または予防薬を含み得る。本開示は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を哺乳動物細胞または器官に送達し、対象となるポリペプチドを哺乳動物細胞内に産生し、それを必要とする哺乳動物の疾患または障害を治療する方法を特徴とし、これには、核酸などの治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを哺乳動物に投与すること、及び／または哺乳動物細胞と接触させることを含む。
【０３６３】
治療薬及び／または予防薬は、生物学的活性物質を含み、「活性剤」とも称される。治療薬及び／または予防薬は、細胞または器官に送達されると、細胞、器官、または他の身体組織もしくは系に望ましい変化をもたらす物質であり得る。そのような種は、１種以上の疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、特定の疾患、障害、または病態の治療に有用な小分子薬物である。脂質ナノ粒子に有用な薬物の例として、抗悪性腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、及びストレプトゾトシン）、抗腫瘍剤（例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、シトシンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、及びメトトレキサートなどのヌクレオシド類似体、ならびにプリン類似体及びピリミジン類似体）、抗感染剤、局所麻酔薬（例えば、ジブカイン及びクロルプロマジン）、ベータアドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、及びラベタロール）、抗高血圧剤（例えば、クロニジン及びヒドララジン）、抗うつ薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、及びドキセピン）、抗けいれん薬（例、フェニトイン）、抗ヒスタミン薬（例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、及びプロメタジン）、抗生物質／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、及びセフォキシチン）、抗真菌剤（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、及びアムホテリシンＢ）、抗寄生虫剤、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節薬、神経伝達物質拮抗薬、抗緑内障剤、ビタミン、麻酔剤、及び造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、細胞毒素、放射性イオン、化学療法薬、ワクチン、免疫応答を誘発する化合物、及び／または別の治療薬及び／または予防薬である。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞に有害であり得る任意の薬剤が含まれる。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えばマイタンシノール、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、及びそれらの類似体または相同体が挙げられるが、これらに限定されない。放射性イオンとしては、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、及びプラセオジムが挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンとしては、インフルエンザ、麻疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、疫病、肝炎、及び結核などの感染性疾患に関連する１つ以上の病態に対する免疫を与えることができる化合物及び調製物が挙げられ、感染性疾患由来の抗原及び／またはエピトープをコードするｍＲＮＡを含む場合がある。ワクチンはまた、がん細胞に対する免疫応答を誘導する化合物及び調製物を含み、腫瘍細胞由来の抗原、エピトープ、及び／またはネオエピトープをコードするｍＲＮＡを含む場合がある。免疫応答を誘発する化合物は、ワクチン、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、及び他の種を含み得るが、これらに限定されない。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はタンパク質である。本開示のナノ粒子に有用な治療用タンパク質として、ゲンタマイシン、アミカシン、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、因子ＶＩＲ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体、インターフェロン、ヘパリン、Ｂ型肝炎表面抗原、腸チフスワクチン、及びコレラワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ワクチン、及び／または免疫応答を誘発することができる化合物は、式（ＩＬ−Ｉ）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）に従う化合物（例えば、化合物３、１８、２０、２６、または２９）を含む組成物を介して筋肉内投与される。他の治療薬及び／または予防薬として、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名称ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、及びマイタンシノイド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６６】
ポリヌクレオチド及び核酸
いくつかの実施形態では、治療薬は、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸）である。「ポリヌクレオチド」という用語は、最も広義では、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれている、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を含む。本開示に従って使用される例示的なポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸（ＲＮＡ）、それらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどのうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はＲＮＡである。本明細書に記載の組成物及び方法に有用なＲＮＡは、限定されないが、短鎖、アンタゴミル、アンチセンス、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる非限定的な群より選択することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、天然または非天然のポリペプチド、またはそれ以外の修飾ポリペプチドを含む、対象となる任意のポリペプチドをコードし得る。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、どのサイズのものでもよく、任意の二次構造または活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞に発現すると治療効果を有し得る。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、対象となる遺伝子の発現を選択的にノックダウンまたは下方制御できる場合がある。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰを、それを必要とする対象に投与する際、特定の疾患、障害、または病態に関連する遺伝子をサイレンシングするように、ｓｉＲＮＡを選択することができる。ｓｉＲＮＡは、対象となる遺伝子またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に相補的である配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、免疫調節性ｓｉＲＮＡであり得る。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ｓｈＲＮＡまたはそれをコードするベクターもしくはプラスミドである。適切な構築物が核に送達されると、標的細胞内でｓｈＲＮＡが産生され得る。ｓｈＲＮＡに関連する構築物及び機構は、関連技術分野において周知されている。
【０３７０】
本開示に有用な核酸及びポリヌクレオチドには、典型的に、対象となるポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域（例えば、５’−ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域（例えば、３’−ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’キャップ領域、及び３’安定領域が含まれる。いくつかの実施形態では、核酸またはポリヌクレオチドは、ポリＡ領域またはコザック配列をさらに含む（例えば、５’−ＵＴＲ内）。場合によって、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドから切断できる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造、ヌクレオチド末端鎖、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。核酸の領域のいずれか１つは、１つ以上の代替成分（例えば、代替ヌクレオシド）を含み得る。いくつかの実施形態では、３’安定領域は、Ｌ−ヌクレオシド、逆チミジン、もしくは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの代替ヌクレオシドを含んでもよく、及び／またはコード領域、５；−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、またはキャップ領域は、５−置換ウリジン（例えば、５−メトキシウリジン）、１−置換シュードウリジン（例えば、１−メチル−シュードウリジン）、及び／または５−置換シチジン（例えば、５−メチル−シチジン）などの代替ヌクレオシドを含んでもよい。
【０３７１】
一般に、ポリヌクレオチドの最短長は、ジペプチドをコードするのに十分なポリヌクレオチド配列長であり得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、トリトリペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、テトラペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、ペンタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、ヘキサペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、ヘプタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、オクタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、ノナペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列長は、デカペプチドをコードするのに十分である。
【０３７２】
代替ポリヌクレオチド配列によってコードできるジペプチドの例として、カルノシン及びアンセリンが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、ポリヌクレオチドは３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、３５ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、長さは少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５０００ヌクレオチドであるか、または５０００ヌクレオチドを超える。
【０３７３】
核酸及びポリヌクレオチドは、標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）のいずれかを含む、１つ以上の天然成分を含み得る。いくつかの実施形態では、（ａ）５’−ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｃ）３’−ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡ尾部、及び（上記のａ、ｂ、ｃ、またはｄ）の任意の組み合わせを含むヌクレオチドのすべて、または実質的にすべてが、天然に存在する標準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）を含む。
【０３７４】
核酸及びポリヌクレオチドは、本明細書に記載の１つ以上の代替成分を含んでもよく、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の安定性の増加及び／または実質的な誘導の欠損を含め、有用な特性を与える。いくつかの実施形態では、代替のポリヌクレオチドまたは核酸は、対応する未改変のポリヌクレオチドまたは核酸と比較して、ポリヌクレオチドまたは核酸が導入される細胞において分解の減少を示す。これらの代替種は、タンパク質産生の効率、ポリヌクレオチドの細胞内保持、及び／または接触した細胞の生存率を増強することに加え、免疫原性を低減することができる。
【０３７５】
ポリヌクレオチド及び核酸は天然であっても非天然であってもよい。ポリヌクレオチド及び核酸は、１つ以上の修飾型（例えば、改変型または代替）の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ＬＮＰに有用な核酸及びポリヌクレオチドは、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間結合（例えば、リン酸基、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル骨格との結合）などに対して任意の有用な修飾または改変を含み得る。いくつかの実施形態では、改変（例えば、１つ以上の改変）は、核酸塩基、糖、及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本開示に従う改変は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、リボフラノシル環の２’−ＯＨの２’−Ｈへの置換）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドへの改変であり得る。さらなる改変が本明細書に記載される。
【０３７６】
ポリヌクレオチド及び核酸は、分子の全長に沿って均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上またはすべての種類のヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくはすべて）は、ポリヌクレオチドまたは核酸において、またはその所与の所定の配列領域において均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。場合によっては、ポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）において、すべてのヌクレオチドＸが改変され、その場合、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｕ＋Ｃの組み合わせのいずれか１つであり得る。
【０３７７】
異なる糖改変及び／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチドの様々な位置に存在し得る。ヌクレオチド類似体または他の改変（複数可）は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下されないようなポリヌクレオチドの任意の位置（複数可）に位置し得ることが当業者に理解されよう。改変はまた、５’末端または３’末端の改変であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’末端に改変を含む。ポリヌクレオチドは、（全体的なヌクレオチド含量に対して、または１種類以上のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣのいずれか１つ以上に対して）約１％〜約１００％またはその間の任意の率（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）の代替ヌクレオチドを含有し得る。標準ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣ）の存在によって、任意の残余の比率を占めることが理解されよう。
【０３７８】
ポリヌクレオチドは、最小でゼロ及び最大で１００％の代替ヌクレオチド、またはその間の任意の比率、例えば、少なくとも５％の代替ヌクレオチド、少なくとも１０％の代替ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の代替ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、代替ピリミジン、例えば、代替ウラシルまたはシトシンを含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、代替ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置換される。代替ウラシルは、単一の固有な構造を有する化合物で置換することができるか、または異なる構造（例えば、２、３、４、またはそれ以上の固有な構造）を有する複数の化合物で置換することができる。場合によっては、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、代替シトシン（例えば、５−置換シトシン）で置換される。代替シトシンは、単一の固有な構造を有する化合物で置換することができるか、または異なる構造（例えば、２、３、４、またはそれ以上の固有な構造）を有する複数の化合物で置換することができる。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、及び／または３）タンパク質翻訳の終結または低減が挙げられる。
【０３８０】
核酸は、任意選択で他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター）を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチド（すなわち、代替ｍＲＮＡ分子）を有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）分子、式、組成物、またはそれに関連する方法は、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００２／０９８４４３、ＷＯ２００３／０５１４０１、ＷＯ２００８／０５２７７０、ＷＯ２００９１２７２３０、ＷＯ２００６１２２８２８、ＷＯ２００８／０８３９４９、ＷＯ２０１００８８９２７、ＷＯ２０１０／０３７５３９、ＷＯ２００４／００４７４３、ＷＯ２００５／０１６３７６、ＷＯ２００６／０２４５１８、ＷＯ２００７／０９５９７６、ＷＯ２００８／０１４９７９、ＷＯ２００８／０７７５９２、ＷＯ２００９／０３０４８１、ＷＯ２００９／０９５２２６、ＷＯ２０１１０６９５８６、ＷＯ２０１１０２６６４１、ＷＯ２０１１／１４４３５８、ＷＯ２０１２０１９７８０、ＷＯ２０１２０１３３２６、ＷＯ２０１２０８９３３８、ＷＯ２０１２１１３５１３、ＷＯ２０１２１１６８１１、ＷＯ２０１２１１６８１０、ＷＯ２０１３１１３５０２、ＷＯ２０１３１１３５０１、ＷＯ２０１３１１３７３６、ＷＯ２０１３１４３６９８、ＷＯ２０１３１４３６９９、ＷＯ２０１３１４３７００、ＷＯ２０１３／１２０６２６、ＷＯ２０１３１２０６２７、ＷＯ２０１３１２０６２８、ＷＯ２０１３１２０６２９、ＷＯ２０１３１７４４０９、ＷＯ２０１４１２７９１７、ＷＯ２０１５／０２４６６９、ＷＯ２０１５／０２４６６８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６５、ＷＯ２０１５／０２４６６６、ＷＯ２０１５／０２４６６４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０６２７３８、ＷＯ２０１５１０１４１６に記載される特徴を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０３８２】
核酸塩基代替物
代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、代替核酸塩基を含み得る。核酸の核酸塩基は、プリンもしくはピリミジンまたはその誘導体などの有機塩基である。核酸塩基は、標準塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、及びシトシン）であり得る。これらの核酸塩基は、増強された特性、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性などの安定性の増加を有するポリヌクレオチド分子を提供するように、改変または完全に置換され得る。非標準塩基または修飾塩基は、例えば、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／またはチオ置換；１つ以上の縮合環または開環；酸化；及び／または還元を含むがこれらに限定されない１つ以上の置換または修飾を含み得る。
【０３８３】
代替ヌクレオチド塩基対形成は、標準アデニン−チミン、アデニン−ウラシル、またはグアニン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド間及び／または非標準塩基もしくは代替塩基を含む代替ヌクレオチド間に形成された塩基対を包含し、その場合、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置が、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的な非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。そのような非標準塩基対形成の一例は、代替ヌクレオチドのイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替ウラシルである。代替ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウラシル、６−アザ−ウラシル、２−チオ−５−アザ−ウラシル、２−チオ−ウラシル（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウラシル（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウラシル、５−ハロ−ウラシル（例えば、５−ヨード−ウラシルまたは５−ブロモ−ウラシル）、３−メチル−ウラシル（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウラシル、１−プロピニル−シュードウラシル、５−タウリノメチル−ウラシル（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウラシル（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチル−ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウラシル、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウラシル、２−メトキシ−４−チオ−ウラシル、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−���リジン（ｍ５Ｕｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウラシル、デオキシチミジン、５−（２−カルボメトキシビニル）−ウラシル、５−（カルバモイルヒドロキシメチル）−ウラシル、５−カルバモイルメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチル−２−チオ−ウラシル、５−シアノメチル−ウラシル、５−メトキシ−２−チオ−ウラシル、及び５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替シトシンである。代替シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、５−アザ−シトシン、６−アザ−シトシン、シュードイソシチジン、３−メチル−シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シトシン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シトシン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シトシン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シトシン（例えば、５−ヨード−シトシン）、５−ヒドロキシメチル−シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シトシン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シトシン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シトシン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シトシン、２−メトキシ−５−メチル−シトシン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−（３−アジドプロピル）−シトシン、及び５−（２−アジドエチル）−シトシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替アデニンである。代替アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとしては、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデニン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデニン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデニン、８−アジド−アデニン、Ｎ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデニン、２，８−ジメチル−アデニン、Ｎ６−ホルミル−アデニン、及びＮ６−ヒドロキシメチル−アデニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替グアニンである。代替グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドとして、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、非修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアニン、６−チオ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアニン、７−メチル−グアニン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアニン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアニン、１−メチル−グアニン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアニン、７−メチル−８−オキソ−グアニン、１−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、１−チオ−グアニン、及びＯ−６−メチル−グアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８８】
ヌクレオチドの代替核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体またはピリミジン類似体であり得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンの代替であり得る。別の実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然誘導体及び合成誘導体も含み得るが、これには、限定されないが、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンが含まれる。ヌクレオチドが、略語Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵを用いて示される場合、各文字は、代表的な塩基及び／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニンまたはアデニン類似体、例えば、７−デアザアデニンを含む。
【０３８９】
糖での改変
ヌクレオシドは、核酸塩基と組み合わせた糖分子（例えば、ペントース、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、またはそれらのデオキシ誘導体などの５炭素糖または６炭素糖）を含み、一方、ヌクレオチドは、ヌクレオシド及びリン酸基または代替基（例えば、ボラノホスフェート、チオホスフェート、セレノホスフェート、ホスホネート、アルキル基、アミダート、及びグリセロール）を含有するヌクレオシドである。ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、標準種、例えば、標準核酸塩基、糖、及びヌクレオチドの場合はホスフェート基を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得るか、または１つ以上の代替成分を含む代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖に改変が存在し得る。いくつかの実施形態では、代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、構造：
【０３９０】
【化８６】
2022501367.tif 000088
【０３９１】
【化８７】
2022501367.tif 000089
【０３９２】
【化８８】
2022501367.tif 000090
【０３９３】
または
【０３９４】
【化８９】
2022501367.tif 000091
【０３９５】
を含む。
式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩのそれぞれにおいて、
ｍ及びｎのそれぞれは、独立して、０〜５の整数であり、
ＵとＵ’のそれぞれは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕは０〜２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロ、または任意選択で置換されるアルキルであり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１’’、Ｒ２’’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、存在する場合、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルコキシ、任意選択で置換されるアルケニルオキシ、任意選択で置換されるアルキニルオキシ、任意選択で置換されるアミノアルコキシ、任意選択で置換されるアルコキシアルコキシ、任意選択で置換されるヒドロキシアルコキシ、任意選択で置換されるアミノ、アジド、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるアミノアルケニル、任意選択で置換されるアミノアルキニルであるか、あるいは存在せず、Ｒ３とＲ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、Ｒ２’’、またはＲ５の１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ３との組み合わせ、Ｒ１’’とＲ３との組み合わせ、Ｒ２’とＲ３との組み合わせ、Ｒ２’’とＲ３との組み合わせ、Ｒ５とＲ３との組み合わせ）は一緒に結合して、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を形成することができ；Ｒ５とＲ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、またはＲ２’’の１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ５との組み合わせ、Ｒ１’’とＲ５との組み合わせ、Ｒ２’とＲ５との組み合わせ、Ｒ２’’とＲ５との組み合わせ）は一緒に結合して、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を形成することができ；Ｒ４とＲ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３、またはＲ５の１つ以上との組み合わせは一緒に結合して、任意選択で置換されたアルキレンまたは任意選択で置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、任意選択で置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を形成することができ；ｍ’及びｍ’’のそれぞれは、独立して、０〜３（例えば、０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）の整数であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３のそれぞれは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意選択で置換されるアルキレン、または任意選択で置換されるヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるアリールであるか、あるいは存在せず；
各Ｙ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるアルコキシ、任意選択で置換されるアルケニルオキシ、任意選択で置換されるアルキニルオキシ、任意選択で置換されるチオアルコキシ、任意選択で置換されるアルコキシアルコキシ、または任意選択で置換されるアミノであり；
各Ｙ５は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択で置換されるアルキレン（例えば、メチレン）、または任意選択で置換されるヘテロアルキレンであり；
Ｂは、修飾または非修飾の核酸塩基である。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、２’−ヒドロキシ基（ＯＨ）を、いくつかの異なる置換基で修飾または置換することができる。２’位における例示的な置換として、Ｈ、アジド、ハロ（例えば、フルオロ）、任意選択で置換されるＣ１−６アルキル（例えば、メチル）；任意選択で置換されるＣ１−６アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）；任意選択で置換されるＣ６−１０アリールオキシ；任意選択で置換されるＣ３−８シクロアルキル；任意選択で置換されるＣ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、任意選択で置換されるＣ１−１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここで、Ｒは、Ｈまたは任意選択で置換されるアルキルであり、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数である）；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（ここで、２’−ヒドロキシが、Ｃ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’−炭素に結合され、例示的な架橋には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が含まれた）；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９７】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的、非限定的な代替ヌクレオチドとして、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノ（ホスホロアミダート骨格も有する）などの、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員環または７員環を形成する）；多環式形態（例えば、トリシクロ及び「アンロック」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、その場合、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されたグリコール単位で置換される）、トレオース核酸（ＴＮＡ、その場合、リボースは、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’−＞２’）で置換される）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ、その場合、２−アミノ−エチル−グリシン結合が、リボース及びホスホジエステル骨格を置換する）が挙げられる。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、糖基は、リボース中の対応する炭素と反対の立体化学配置を保有する１つ以上の炭素を含有する。したがって、ポリヌクレオチド分子は、糖として、例えば、アラビノースまたはＬ−リボースを含有するヌクレオチドを含み得る。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドを含み、その場合、糖は、Ｌ−リボース、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−フルオロ−リボース、アラビノース、ヘキシトール、ＬＮＡ、またはＰＮＡである。
【０４００】
ヌクレオシド間結合での改変
代替ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）が改変され得る。本明細書では、ポリヌクレオチド骨格という文脈において、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を異なる置換基で置換することによって改変することができる。
【０４０１】
代替ヌクレオチドは、本明細書に記載の別のヌクレオシド間結合による、非改変ホスフェート部分の全体的な置換を含み得る。代替リン酸基の例として、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリール、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定はされない。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄で置換されている。ホスフェートリンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホネート）による結合酸素の置換によって改変することができる。
【０４０２】
代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、ボラン部分（ＢＨ３）、硫黄（チオ）、メチル、エチル、及び／またはメトキシによる非架橋酸素の１つ以上の置換を含み得る。非限定的な例として、同じ位置（例えば、アルファ（α）位、ベータ（β）位、またはガンマ（γ）位）にある２つの非架橋酸素が、硫黄（チオ）及びメトキシで置換され得る。
【０４０３】
ホスフェート部分のα位における酸素原子の１つ以上の置換（例えば、α−チオリン酸）は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡ及びＤＮＡに安定性（例えば、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する安定性など）を付与するために行われる。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加しており、後に細胞環境において半減期が長くなる。
【０４０４】
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本開示に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合を本明細書に記載する。
配列内リボソーム進入部位
ポリヌクレオチドは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る。ＩＲＥＳは、単独のリボソーム結合部位として作用することも、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用することもできる。２つ以上の機能性リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる（例えば、多シストロン性ｍＲＮＡ）。ポリヌクレオチドがＩＲＥＳを備えている場合、さらに任意選択で第２の翻訳可能領域が提供される。本開示に従って使用され得るＩＲＥＳ配列の例として、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０５】
５’−キャップ構造
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は５’−キャップ構造を含み得る。ポリヌクレオチドの５’−キャップ構造は、核外輸送とポリヌクレオチド安定性の向上に関与し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合して、ＣＢＰとポリＡ結合タンパク質との会合により、細胞内のポリヌクレオチド安定性及び翻訳能力を担い、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング時の５’近位イントロン除去の除去を補助する。
【０４０６】
内因性ポリヌクレオチド分子は、５’末端にキャッピングされ、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を形成することができる。さらに、この５’−グアニル酸キャップをメチル化して、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を形成することができる。ポリヌクレオチドの５’末端側の末端及び／または末端前にある転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で２’−Ｏ−メチル化することができる。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’−キャップ除去により、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子を標的化して分解することができる。
【０４０７】
ポリヌクレオチドに対する改変は、非加水分解性キャップ構造を生成して、キャップ除去を防止し、それによりポリヌクレオチド半減期を増加させることができる。キャップ構造の加水分解には、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、代替ヌクレオチドはキャッピング反応中に使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））製のワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従って、α−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用すると、５’−ｐｐｐ−５’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成することができる。α−メチル−ホスホネート及びセレノリン酸ヌクレオチドなどの追加の代替グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
【０４０８】
追加の改変として、糖の２’−ヒドロキシ基に対する、ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述）が挙げられるが、これに限定されない。複数の異なった５’−キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドの５’−キャップを生成することができる。
【０４０９】
５’−キャップ構造として、国際特許公開第ＷＯ２００８１２７６８８号、同第ＷＯ２００８０１６４７３号、及び同第ＷＯ２０１１０１５３４７号に記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１０】
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能性キャップ類似体とも称するキャップ類似体は、キャップ機能を保持しながら、その化学構造が天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’−キャップとは異なるものである。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成され、ポリヌクレオチドに連結され得る。
【０４１１】
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基によって連結された２つのグアノシンを含有することができ、その場合、１つのグアノシンは、Ｎ７−メチル基に加え３’−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これらは同義で３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと称される場合がある）。他方の非改変グアノシンの３’−Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結されることになる。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアノシンは、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０４１２】
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと類似しているが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０４１３】
キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体であってもよい。非限定的な例として、米国特許第８，５１９，１１０号（そのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体などのジヌクレオチドキャップ類似体は、様々なリン酸位置で、ボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
【０４１４】
あるいは、キャップ類似体は、当技術分野において公知である、及び／または本明細書に記載されるＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体であってもよい。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体の非限定的な例として、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載される様々なキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照；このキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の事例では、本開示のポリヌクレオチドに有用なキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０４１５】
キャップ類似体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応においてポリヌクレオチドの同時キャッピングが可能であるが、転写物の最大２０％がキャッピングされないままである。これは、内因性の細胞転写機構によって産生されるポリヌクレオチドの内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差に加え、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０４１６】
代替ポリヌクレオチドは、より真正な５’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて、転写後にキャッピングすることもできる。本明細書で使用される場合、「より真正な」という語句は、特徴が内因性または野生型の特徴と構造的または機能的に酷似しているか、または近似していることを指す。すなわち、「より真正な」特徴とは、先行技術の合成的特徴または類似体と比較して、内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能、及び／または構造をより良好に表すか、あるいは１つ以上の点で、対応する内因性、野生型、天然、または生理学的な特徴よりも性能が優れている。本開示のポリヌクレオチドに有用なより真正な５’−キャップ構造の非限定的な例は、中でも特に、当技術分野において公知の合成５’−キャップ構造（または野生型、天然、または生理学的な５’−キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の延長、５’−エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下、及び／または５’−キャップ除去の減少を有するものである。いくつかの実施形態では、組換え型ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え型２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素により、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドとの間に標準５’−５’−三リン酸結合を形成することができ、その場合、キャップのグアノシンは、Ｎ７−メチル化を含み、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含む。そのような構造をキャップ１構造と称する。このキャップは、例えば、当技術分野において公知である他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力、細胞安定性、及び細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。他の例示的なキャップ構造として、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）、及びｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が挙げられる。
【０４１７】
代替ポリヌクレオチドは、転写後にキャッピングできるため、また、この方法がより効率的であるため、代替ポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャッピングすることができる。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でキャップ類似体をポリヌクレオチドに連結する場合の約８０％とは対照的である。
【０４１８】
５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。５’末端キャップは、グアノシン類似体を含み得る。有用なグアノシン類似体として、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが挙げられる。
【０４１９】
場合によって、ポリヌクレオチドは、修飾５’−キャップを含有する。５’−キャップにおける修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を高め、ポリヌクレオチドの半減期を延長させることができ、ポリヌクレオチド翻訳効率を増加させることができる。修飾５’−キャップは、限定されないが、以下の修飾の１つ以上、すなわちキャッピングされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位及び／または３’位における修飾、メチレン部分（ＣＨ２）による糖環酸素の置換（これにより炭素環が生成される）、キャップ構造の三リン酸架橋部分における修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分における修飾を含み得る。
【０４２０】
５’−ＵＴＲ
隣接領域として５’−ＵＴＲをポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に設定することができる。５’−ＵＴＲは、ポリヌクレオチドに存在するコード領域に対して相同的であっても異種であってもよい。複数の５’−ＵＴＲが隣接領域に含まれていてもよく、これらは同じ配列でも異なる配列でもよい。隣接領域の任意の部分（全くない場合を含む）が、コドン最適化されていてもよく、独立して、コドン最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的または化学的改変を含有し得る。
【０４２１】
米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号の表２１、ならびに米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号の表２１及び表２２（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の開始部位及び終止部位の一覧が示されている。表２１において、各５’−ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５〜５’−ＵＴＲ６８５１１）は、その天然または野生型（相同性）転写物に対するその開始部位及び終止部位によって同定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースで使用される識別番号）。
【０４２２】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上の特性を改変するために、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコード領域と異種である５’−ＵＴＲを操作することができる。さらに、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は細胞、組織、または生物に投与でき、またタンパク質レベル、局在化、及び／または半減期などの結果を測定して、異種５’−ＵＴＲが代替ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）に対して与え得る有益な効果を評価することができる。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが末端に付加されるかまたは除去された５’−ＵＴＲの変異体を利用することができる。５’−ＵＴＲはまた、コドン最適化されてもよく、または本明細書に記載の任意の方法で改変されてもよい。
【０４２３】
５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、及び翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメントを含み得る。「翻訳エンハンサーエレメント」という用語は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。５’−ＵＴＲに少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−ＵＴＲにキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥが、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳を受けるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置してもよい。
【０４２４】
一態様では、ＴＥＥはＵＴＲの保存的エレメントであり、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳などのポリヌクレオチドの翻訳活性を促進することができる。このような配列の保存は、以前にＰａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，１−１０）によってヒトを含む１４種にわたって示されている。
【０４２５】
１つの非限定的な例では、公知のＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’−リーダーに位置し得る（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４。このＴＥＥは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４２６】
別の非限定的な例では、ＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号及び同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開第ＷＯ２００９／０７５８８６号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、及び同第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、米国特許第６，３１０，１９７号及び同第６，８４９，４０５号に開示され、それぞれのＴＥＥ配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２７】
さらに別の非限定的な例では、ＴＥＥは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、またはＩＲＥＳエレメント、例えば、限定されないが、米国特許第７，４６８，２７５号、米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７／０２５００８号及び同第ＷＯ２００１／０５５３６９号に記載されるもの（それぞれのＩＲＥＳ配列は参照により本明細書に組み込まれる）であってよい。ＩＲＥＳエレメントは、限定されないが、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ１０２：６２７３−６２７８，２００５）によって、ならびに米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号、及び国際特許公開第ＷＯ２００７／０２５００８号（それぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）を含み得る。
【０４２８】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」は、本明細書に例示される、及び／または当技術分野において開示される特定のＴＥＥの１つ以上（例えば、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９０／２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００９／００９３０４９号、同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開第ＷＯ２００９／０７５８８６号、同第ＷＯ２００７／０２５００８号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、同第ＷＯ２００１／０５５３７１号、同第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、ならびに欧州特許第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照）またはそれらの変異体、相同体、もしくは機能的誘導体を含むポリヌクレオチドである。特定のＴＥＥの１つまたは複数のコピーが、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に存在してもよい。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおいてＴＥＥを１つ以上の配列セグメントに構成することができる。配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの１つ以上を保有することができ、各ＴＥＥは１つ以上のコピーに存在する。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに複数の配列セグメントが存在する場合、それらは相同的であっても異種であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの同一もしくは異なる種類、特定のＴＥＥそれぞれの同一もしくは異なる数のコピー、及び／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一または異なる構成を保有し得る。
【０４２９】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、国際特許公開第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、同第ＷＯ２００９／０７５８８６号、同第ＷＯ２００７／０２５００８号、同第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、ならびに米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号、及び同第２０１３／０１７７５８１号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。ＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置し得る。
【０４３０】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、同第ＷＯ２００９／０７５８８６号、及び同第ＷＯ２００７／０２５００８号、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＴＥＥと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。
【０４３１】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回以上反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。このようなパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０４３２】
場合によって、５’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーを含み得る。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドのスペーサー及び／または当技術分野において公知である他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、５’−ＵＴＲは、５’−ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含み得る。
【０４３３】
他の事例では、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーは、限定されないが、ｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などの、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当技術分野において公知である他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０４３４】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、同第ＷＯ２００９／０７５８８６号、及び同第ＷＯ２００７／０２５００８号、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％超含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開第ＷＯ１９９９／０２４５９５号、同第ＷＯ２０１２／００９６４４号、同第ＷＯ２００９／０７５８８６号、及び同第ＷＯ２００７／０２５００８号、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
【０４３５】
場合によって、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，２００５）開示されるＴＥＥ配列、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１及び補足表２に開示されるＴＥＥ配列（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％超を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，２００４）及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，２００５）開示されるＴＥＥ配列、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１及び補足表２に開示されるＴＥＥ配列（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
【０４３６】
場合によって、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、限定されないが、米国特許第７，４６８，２７５号及び国際特許公開第ＷＯ２００１／０５５３６９号に記載されるもの（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）などのＩＲＥＳ配列である。
【０４３７】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７／０２５００８号及び同第ＷＯ２０１２／００９６４４号に記載される方法（それぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）によって同定することができる。
【０４３８】
場合によって、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１／０５５３７１号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される転写制御エレメントであり得る。転写制御エレメントは、限定されないが、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１／０５５３７１号に記載される方法（それぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）など、当技術分野において公知の方法によって同定することができる。
【０４３９】
さらに他の事例では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、ならびに国際公開第ＷＯ２００１／０５５３７１号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分である。
【０４４０】
本明細書に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’−ＵＴＲは、限定されないが、ベクター系またはポリヌクレオチドベクターなどのモノシストロン性配列に組み込むことができる。非限定的な例として、ベクター系及びポリヌクレオチドベクターは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号、及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２００７／０２５００８号及び同第ＷＯ２００１／０５５３７１号（それぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含み得る。
【０４４１】
本明細書に記載のＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに位置し得る。３’−ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’−ＵＴＲに位置するＴＥＥ、及び／または５’−ＵＴＲへの組み込みについて記載したＴＥＥと同じであり得る、及び／または異なり得る。
【０４４２】
場合によって、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回以上反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。このようなパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０４４３】
ある事例では、３’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーを含み得る。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドのスペーサー及び／または当技術分野において公知である他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、３’−ＵＴＲは、３’−ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含み得る。
【０４４４】
他の場合では、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサーは、限定されないが、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などの、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当技術分野において公知である他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０４４５】
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲ及び／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みにより、ステムループ領域の形状を変化させることができ、これは、翻訳を増加及び／または減少させることができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  １２（１０）：１０１４−２０を参照のこと。
【０４４６】
センサー配列及びｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
センサー配列として、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。センサー配列の非限定的な例は、米国公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４４７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、センサー配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。
【０４４８】
ｍｉＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドに結合し、ポリリボヌクレオチドの安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含むことができ、その場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補性部位は、ｍｉＲＮＡの１位と向かい合うアデノシン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含むことができ、その場合、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補性部位は、ｍｉＲＮＡの１位と向かい合うアデノシン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照のこと。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施して、細胞内または組織内のｍｉＲＮＡの有無を判定することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、またはｍｉｃｒｏＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５で教示されているものなどの任意の公知のｍｉｃｒｏＲＮＡに対応することができ、それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４４９】
本明細書で使用される場合、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡの全部またはある領域に対して、ｍｉＲＮＡと相互作用、会合、または結合するのに十分な相補性を有するポリリボヌクレオチド内部、例えば、ＤＮＡ内部またはＲＮＡ転写物内部の配列（５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む）を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０４５０】
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、相補性の程度が、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在型制御、例えば、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在型の翻訳抑制または分解を促進するのに十分であるものを指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、相補性の程度が、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在型分解、例えば、ｍｉＲＮＡをガイドとするＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在型のｍＲＮＡの切断を促進するのに十分であるものを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長のうち１、２、３、または４ヌクレオチド未満の部分に相補的であり得る。目的とする制御がｍＲＮＡ分解である場合、全相補性または完全相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの全長または大部分にわたる全相補性または完全相補性）が好ましい。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分相補性または完全相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分相補性または完全相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全相補性は有するが、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドに置換、末端付加、及び／または短縮を有する。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらに他の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するｍｉｃｒｏＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位でも、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込んだｍＲＮＡを分解する、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。
【０４５３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣの対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解する、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドに不安定性を誘導するように不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの転写を抑制するように不完全な相補性を有する。
【０４５４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のミスマッチ（複数可）を有する。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドに対して相補性である、それぞれ少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
【０４５６】
ｍｉＲＮＡが有効であるという条件で、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を操作して、本開示のポリリボヌクレオチドに組み込むことにより、ポリリボヌクレオチドを標的化して分解または翻訳を低減することができる。これにより、ポリリボヌクレオチドの送達時のオフターゲット効果を低減することができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が操作によりポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに組み込まれている場合、本開示のポリリボヌクレオチドが組織または細胞に送達されることを意図しなくても、最終的にそこに送達されれば、組織または細胞に豊富であるｍｉＲＮＡが、対象となる遺伝子の発現を阻害することができる。
【０４５７】
逆に、天然に存在するポリリボヌクレオチド配列からｍｉＲＮＡ結合部位を除去することで、特定の組織においてタンパク質発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、特定のｍｉＲＮＡに対する結合部位をポリリボヌクレオチドから除去して、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、細胞毒性または細胞保護的ｍＲＮＡ治療薬を、特定の細胞、例えば、限定されないが、正常細胞及び／またはがん細胞に誘導するために、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、細胞毒性または細胞保護的ｍＲＮＡ治療薬を、特定の細胞、例えば、限定されないが、正常細胞及び／またはがん細胞に誘導するために、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０４５９】
複数の組織における発現の制御は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の導入及び／または除去によって行うことができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか挿入するかの判断は、疾患におけるｍｉＲＮＡの発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、及びそれらの発現パターンの同定、ならびに生物学上の役割が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３及びその中のすべての参考文献；それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６０】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載される非限定的な例（それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を含め、任意の公知の配列に対応することができる。
【０４６１】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、さらにそれによりタンパク質発現を制御することが知られている組織の例として、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６２】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて差次的に発現されることが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染、炎症に対する免疫応答、ならびに遺伝子療法及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの局面を制御する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は、免疫細胞に排他的に発現し、特に骨髄樹状細胞に豊富である。ｍｉＲ−１４２結合部位をポリリボヌクレオチドの３’−ＵＴＲに付加することにより、ポリヌクレオチドに対する免疫応答を遮断でき、組織及び細胞へのより安定した遺伝子導入を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞において外因性ポリリボヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞毒性除去を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５−５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４−４１５２、それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６３】
抗原介在性免疫応答は、外来抗原が生物に侵入した際、抗原提示細胞によって処理されて抗原提示細胞の表面に発現することによって生じる免疫応答を指す場合がある。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞毒性除去を誘導することができる。
【０４６４】
ｍｉＲ−１４２結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドの５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに導入することにより、ｍｉＲ−１４２を介在した分解によって、抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制でき、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後の抗原介在性免疫応答を妨げることができる。したがって、ポリリボヌクレオチドは、細胞毒性除去を誘発せずに、標的組織または細胞において安定して発現される。
【０４６５】
いくつかの実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞に発現することが知られているｍｉＲＮＡ結合部位を操作して本開示のポリリボヌクレオチドに組み込むことで、ｍｉＲＮＡ介在性ＲＮＡ分解により抗原提示細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を抑制し、抗原介在性免疫応答を抑制することができる。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞においては、ポリリボヌクレオチドの発現が維持される。いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を妨げるために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去すること、ならびにｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉＲ−１４６）結合部位を操作して本開示のポリリボヌクレオチドの５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに組み込むことができる。
【０４６６】
ＡＰＣ及びマクロファージにおける選択的な分解及び抑制をさらに促進するために、本開示のポリリボヌクレオチドは、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに負の調節エレメントを単独でまたはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位と組み合わせてさらに含み得る。非限定的な例として、さらなる負の調節エレメントは、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）である。
【０４６７】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、免疫細胞において、新規ｍｉＲＮＡをマイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析によって同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４６８】
肝臓に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、肝臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４６９】
肺に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、肺におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７０】
心臓に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、心臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７１】
神経系に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。神経系に濃縮されるｍｉＲＮＡには、ニューロンに特異的に発現するもの、限定されないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２、ならびにグリア細胞に特異的に発現するもの、限定されないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７がさらに含まれる。任意のＣＮＳ肺特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、神経系におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７２】
膵臓に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が挙げられるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、膵臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７３】
腎臓に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、腎臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７４】
筋肉に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、筋肉におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は単独で操作することも、さらに本開示のポリリボヌクレオチドの免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作することもできる。
【０４７５】
ｍｉＲＮＡはまた、限定されないが内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの異なる種類の細胞に差次的に発現する。
内皮細胞に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。ディープシーケンシング分析により、多くの新規ｍｉＲＮＡが内皮細胞に確認されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、内皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０４７６】
上皮細胞に発現することが公知であるｍｉＲＮＡとして、呼吸器線毛上皮細胞に特異的な、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２、及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、肺上皮細胞に特異的な、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、腎臓上皮細胞に特異的な、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞に特異的なｍｉＲ−７６２が挙げられるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入するか、本開示のポリリボヌクレオチドから除去して、上皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０４７７】
加えて、ｍｉＲＮＡの大集団は胚性幹細胞に濃縮され、幹細胞の自己複製、ならびに神経細胞、心臓細胞、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞、及び筋細胞などの、様々な細胞系譜の発生及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ，ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１，ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。ディープシーケンシングにより、多数の予測される新規ｍｉＲＮＡがヒト胚性幹細胞に確認されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５、それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドの３’−ＵＴＲに含めるかまたはそこから除去して、胚性幹細胞の発生及び／または分化を調節する、変性病態（例えば、変性疾患）における幹細胞の老化を阻害する、または疾患病態（例えば、がん幹細胞）における幹細胞の老化及びアポトーシスを刺激することができる。
【０４７９】
様々ながん細胞／組織及び他の疾患におけるｍｉＲＮＡの差次的な発現をプロファイリングするために、多くのｍｉＲＮＡ発現試験が実施されている。ある特定のがん細胞に異常に過剰発現するｍｉＲＮＡもあれば、低発現するものもある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓癌及び膵臓疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息及び炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；大腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；癌陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に差次的に発現する。
【０４８０】
非限定的な例として、ある特定のがん細胞及び／または腫瘍細胞に過剰発現するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリリボヌクレオチドの３’−ＵＴＲから除去することで、がん細胞において過剰発現ｍｉＲＮＡによって抑制された発現を修復し、それにより対応する生物学的機能、例えば、転写刺激及び／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、及び細胞死を改善することができる。ｍｉＲＮＡ発現が上方制御されていない正常細胞及び組織は影響されないままとなる。
【０４８１】
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的過程を制御することができる（例えば、ｍｉＲ−１３２）（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本開示のポリリボヌクレオチドにおいて、そのような過程に関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することで、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程に合わせてポリリボヌクレオチドの発現を調整することができる。この文脈において、本開示のポリリボヌクレオチドは栄養要求性ポリリボヌクレオチドと定義される。
【０４８２】
ステムループ
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、限定されないが、ヒストンステムループなどのステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列、例えば、限定されないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９に記載されるもの（参照により本明細書に組み込まれる）などであってよい。ヒストンステムループはコード領域に対して３’側（例えば、コード領域の３’末端）に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは本明細書に記載のポリヌクレオチドの３’末端に位置し得る。場合によって、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、複数のステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループ配列の例は、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０１９７８０号及び同第ＷＯ２０１５０２６６７号に記載されており、これらのステムループ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。場合によっては、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号１）を含む。ほかには、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号２）を含む。
【０４８３】
ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’−ＵＴＲ）内に位置し得る。
【０４８４】
場合によって、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、限定されないがｍＲＮＡなどは、３’−安定化領域（例えば、少なくとも１つの連鎖停止ヌクレオシドを含む３’−安定化領域）の付加によって安定化することができる。理論に束縛されるものではないが、少なくとも１つの連鎖停止ヌクレオシドの付加は、ポリヌクレオチドの分解を遅延させることができ、それによりポリヌクレオチドの半減期を延長することができる。
【０４８５】
他の場合には、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、限定されないがｍＲＮＡなどは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’領域に対する改変によって安定化することができる（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号を参照）。
【０４８６】
さらに他の場合には、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、限定されないがｍＲＮＡなどを、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、及び当技術分野において公知である、及び／または本明細書に記載される他の代替ヌクレオシドでの、終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化することができる。
【０４８７】
場合によっては、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、ポリＡ領域、及び／または５’−キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリＡ領域の前及び／または後に位置し得る。ヒストンステムループ及びポリＡ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載の連鎖停止ヌクレオシドを含み得る。
【０４８８】
他の事例では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ及び５’−キャップ構造を含み得る。５’−キャップ構造は、限定されないが、本明細書に記載されるもの及び／または当技術分野において公知のものを含み得る。
【０４８９】
場合によって、保存ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例として、ステムループ領域は、ｍｉＲ−１２２シード配列を含み得る。
【０４９０】
ある特定の事例では、保存ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み、ＴＥＥ配列も含み得る。
場合によって、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みにより、ステムループ領域の形状を変化させることができ、これは、翻訳を増加及び／または減少させることができる。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３´ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照）。
【０４９１】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１２０４９７号、同第ＷＯ２０１３／１２０６２９号、同第ＷＯ２０１３／１２０５００号、同第ＷＯ２０１３／１２０６２７号、同第ＷＯ２０１３／１２０４９８号、同第ＷＯ２０１３／１２０６２６号、同第ＷＯ２０１３／１２０４９９号、及び同第ＷＯ２０１３／１２０６２８号に記載されており、それぞれの配列は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の場合には、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１２０４９９号及び同第ＷＯ２０１３／１２０６２８号に記載されるポリヌクレオチド配列（いずれの配列も参照により本明細書に組み込まれる）など、病原体抗原またはその断片をコードし得る。他の場合には、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１２０４９７号及び同第ＷＯ２０１３／１２０６２９号に記載されるポリヌクレオチド配列（いずれの配列も参照により本明細書に組み込まれる）など、治療用タンパク質をコードし得る。場合によって、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１２０５００号及び同第ＷＯ２０１３／１２０６２７号に記載されるポリヌクレオチド配列（いずれの配列も参照により本明細書に組み込まれる）など、腫瘍抗原またはその断片をコードし得る。他の場合では、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１２０４９８号及び同第ＷＯ２０１３／１２０６２６号に記載されるポリヌクレオチド配列（それぞれの配列は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）など、アレルゲン性抗原または自己免疫自己抗原をコードし得る。
【０４９２】
ポリＡ領域
ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、全体または大部分がアデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体で構成され得る。ポリＡ配列は、核酸の３’非翻訳領域に隣接して位置する尾部であり得る。
【０４９３】
ＲＮＡプロセシング時、アデノシンヌクレオチドの長鎖（ポリＡ領域）は、通常、分子の安定性を高めるためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加される。転写の直後、転写物の３’末端が切断されて、３’−ヒドロキシが解放される。次に、ポリＡポリメラーゼにより、アデノシンヌクレオチドの鎖がＲＮＡに付加される。ポリアデニル化と呼ばれるこの過程により、長さが１００〜２５０残基であるポリＡ領域が付加される。
【０４９４】
一意なポリＡ領域の長さは、本開示の代替ポリヌクレオチドに特定の利点を与えることができる。
一般に、本開示のポリＡ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、長さは少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは少なくとも３０００ヌクレオチドである。
【０４９５】
場合によっては、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子において、ポリＡ領域は８０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長であり得る。
他の事例では、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子において、ポリＡ領域は２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、または１６０ヌクレオチド長であり得る。
【０４９６】
場合によって、ポリＡ領域は、代替ポリヌクレオチド全体の長さに比例して設計される。この設計は、代替ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、代替ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）の特定のフィーチャーもしくは領域の長さに基づくか、または代替ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づくものであり得る。代替ポリヌクレオチドの任意のフィーチャー（例えば、ポリＡ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）と比較して、ポリＡ領域は、追加のフィーチャーよりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くてもよい。ポリＡ領域はまた、それが属する代替ポリヌクレオチドの一部として設計することができる。これに関して、ポリＡ領域は、構築物の全長または構築物の全長からポリＡ領域を除いた部分の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
【０４９７】
ある特定の場合には、ポリＡ結合タンパク質に合わせたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の操作結合部位及び／または複合体を使用して、発現を増強することができる。操作結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の局所微小環境のリガンドに対する結合部位として動作できるセンサー配列であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）及びその類似体の結合親和性を改変するために、少なくとも１つの操作結合部位を含み得る。少なくとも１つの操作結合部位を組み込むと、ＰＡＢＰ及びその類似体の結合親和性を増加させることができる。
【０４９８】
加えて、ポリＡ領域の３’末端に代替ヌクレオチドを使用して、複数の異なったポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）と連結することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を実施でき、トランスフェクションから１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び７日後にＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をアッセイすることができる。非限定的な例として、トランスフェクション実験を使用して、少なくとも１つの操作結合部位の付加の結果生じる、ＰＡＢＰまたはその類似体に対する結合親和性の影響を評価することができる。
【０４９９】
ある特定の場合には、ポリＡ領域を使用して、翻訳開始を調節することができる。理論に束縛されるものではないが、ポリＡ領域はＰＡＢＰを動員し、それにより翻訳開始複合体と相互作用できるため、タンパク質合成に不可欠であり得る。
【０５００】
場合によって、本開示においてポリＡ領域はまた、３’−５’−エキソヌクレアーゼ消化から保護するために使用することができる。
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）はポリＡ−Ｇ四重鎖を含み得る。Ｇ四重鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアノシンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。本実施形態では、Ｇ四重鎖は、ポリＡ領域の末端に組み込まれる。得られるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、様々な時点で、安定性、タンパク質産生、及び半減期を含む他のパラメーターについてアッセイすることができる。ポリＡ−Ｇ四重鎖は、１２０ヌクレオチドのポリＡ領域のみを用いたときに見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
【０５０１】
場合によって、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ領域を含んでもよく、３’−安定化領域の付加によって安定化されてもよい。ポリＡ領域をもつポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造をさらに含み得る。
【０５０２】
他の場合には、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）はポリＡ−Ｇ四重鎖を含み得る。ポリＡ−Ｇ四重鎖をもつポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造をさらに含み得る。
【０５０３】
場合によって、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇ四重鎖を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の安定化に使用できる３’安定化領域は、限定されないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号（そのポリＡ領域及びポリＡ−Ｇ四重鎖は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものであり得る。他の場合には、本開示に使用できる３’安定化領域として、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、またはＯ−メチルヌクレオシドなどの連鎖停止ヌクレオシドが挙げられる。
【０５０４】
他の場合には、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇ四重鎖を含むポリヌクレオチド、限定されないがｍＲＮＡなどは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’領域に対する改変によって安定化することができる（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号を参照）。
【０５０５】
さらに他の事例では、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇ四重鎖を含むポリヌクレオチド、限定されないがｍＲＮＡなどは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、及び当技術分野において公知である、及び／または本明細書に記載される他の代替ヌクレオシドでの、終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化することができる。
【０５０６】
連鎖停止ヌクレオシド
核酸は、連鎖停止ヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、連鎖停止ヌクレオシドは、糖基の２’位及び／または３’位の脱酸素化ヌクレオシドを含み得る。そのような種には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、及び２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、及び２’，３’−ジデオキシチミンを含み得る。
【０５０７】
ゲノム編集技術
いくつかの実施形態では、核酸はゲノム編集技術に適している。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術は、規則的に間隔を空けて配置された短い回文の反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【０５０８】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びＤＮＡ修復鋳型からなる群より選択されるゲノム編集技術に適した少なくとも１つの核酸である。
【０５０９】
ワクチン
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ほぼすべてのがんタンパク質または対象となるその断片を産生するように身体の細胞機構を安全に誘導することができるＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））のリボ核酸（ＲＮＡ）がんワクチンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは修飾ＲＮＡである。本開示のＲＮＡワクチンを使用すると、例えば、挿入変異誘発のリスクを冒さずに、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含む、がんに対するバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。
【０５１０】
ＲＮＡワクチンは、がんの有病率、または未対応の医療ニーズの程度もしくは水準に応じて様々な状況で利用することができる。ＲＮＡワクチンを利用して、様々な段階または程度の転移のがんを治療及び／または予防することができる。ＲＮＡワクチンは、がんワクチンを含む代替の抗がん療法よりもはるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであるＲＮＡワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質立体構造を生じるように良好に設計されていると考えられる。ｅｘ  ｖｉｖｏで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、ＲＮＡワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
【０５１１】
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのがん抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、がんに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、がんワクチンを提供する。他の実施形態は、がんに対する免疫応答を誘導することができる２つ以上の抗原またはそのエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
【０５１２】
いくつかの態様において、本発明は、がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ及び免疫チェックポイント調節物質をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡのワクチンである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節物質は、抑制性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抑制性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３からなる群より選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。抑制性チェックポイントポリペプチドは、いくつかの実施形態において抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１抗体である。任意選択で、ワクチンは脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡのワクチンを対象に投与する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は３〜１０週間後に投与される。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は４週間後に投与される。
【０５１３】
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの個別化がんワクチンであり、少なくとも２つのがん抗原が、患者特異的がん抗原及び脂質ナノ粒子担体である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
【０５１４】
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの個別化がんワクチンであり、少なくとも２つのがん抗原が患者の抗原を代表する。いくつかの実施形態では、患者の抗原は、患者のエクソソームで同定される抗原である。いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、複数のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。
【０５１５】
各ｍＲＮＡは、いくつかの実施形態では、５〜１０個のがん抗原または単一のがん抗原をコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２〜１００個のがん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１０〜１００、２０〜１００、５０〜１００、１００〜２００、３００〜４００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、９００〜１，０００、または１，０００〜１０，０００のがん抗原をコードする。
【０５１６】
いくつかの実施形態では、
ａ）各がん抗原をコードするｍＲＮＡには、切断感受性部位が挿入されている；
ｂ）各がん抗原をコードするｍＲＮＡは、リンカーなしで互いに直接連結されている；
ｃ）各がん抗原をコードするｍＲＮＡは、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されている；
ｄ）各がん抗原は２５〜３５アミノ酸を含み、中心に位置するＳＮＰ変異を含む；
ｅ）がん抗原の少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；
ｆ）がん抗原の少なくとも３０％は、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；
ｇ）がん抗原の少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測される結合親和性を有する；
ｈ）ｍＲＮＡは、２０個のがん抗原をコードする；
ｉ）がん抗原の５０％は、クラスＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有し、がん抗原の５０％は、クラスＩＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有する；及び／または
ｊ）がん抗原をコードするｍＲＮＡは、偽エピトープが最小限になるようにがん抗原を命令するよう配置されている。
【０５１７】
いくつかの実施形態では、各がん抗原は３１個のアミノ酸を含み、中心に位置するＳＮＰ変異があり、そのＳＮＰ変異の両側に１５個の隣接アミノ酸が配されている。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、がん抗原が対象特異的がん抗原である個別化がんワクチンである。いくつかの実施形態では、対象特異的がん抗原は、対象の腫瘍試料のエクソーム、または対象の腫瘍試料のトランスクリプトームを表す場合がある。いくつかの実施形態では、対象特異的がん抗原は、対象のエクソソームを表す場合がある。
【０５１８】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、１つ以上の通常のがん抗原をさらにコードする。いくつかの実施形態では、通常のがん抗原は非変異型抗原である。いくつかの実施形態では、通常のがん抗原は変異型抗原である。
【０５１９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１つ以上の通常のがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、複数のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、各がん抗原は、１０〜５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、各がん抗原は、１５〜２０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、がん抗原は、２０〜５０、２５〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１，０００、または１，０００〜１０，０００アミノ酸長である。
【０５２０】
いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのがんポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップ、及び少なくとも１つの化学修飾を有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子に封入して製剤化されているがんワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
【０５２１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、Ｎ１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチルウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンから選択される。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤に対する免疫応答を改善するために、化学修飾されたヌクレオチドの導入度が最適化されている。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン性のカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される。
【０５２３】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ワクチン（製剤）の免疫原性を増強するための免疫増強剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト）を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームのウラシルのうち１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾はウラシルの５位にある。いくつかの実施形態では、化学修飾はＮ１−メチルシュードウリジンである。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣリプログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、ワクチンに含まれるか、またはワクチンと同時投与される。ＡＰＣリプログラミング分子は、ＣＩＩＴＡ、シャペロンタンパク質（ＣＬＩＰ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＭなど）、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）、ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６〜１３７などのＣＩＩＴＡ断片、またはＣＩＩＴＡに対して８０％の配列同一性を有するタンパク質であり得る。
【０５２５】
他の態様では、フレームシフト突然変異及び組換えからなる群より選択される突然変異を含む少なくとも２つのがん抗原を対象の試料から特定し、その少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することにより、対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。
【０５２６】
いくつかの実施形態では、がん抗原は、対象のエクソソームから特定される。いくつかの実施形態では、２〜１００個の抗原が対象のエクソソームから特定される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、この２〜１００個の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。その抗原は単一のｍＲＮＡによってコードされても、または複数のｍＲＮＡによってコードされてもよい。
【０５２７】
いくつかの実施形態では、抗原はがん抗原である。がん抗原は、点突然変異、フレームシフト突然変異、及び組換えから選択される突然変異を有し得る。この方法はさらに、エクソーム解析によってがん抗原が対象特異的であることを確認することを含み得る。
【０５２８】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、トランスクリプトーム解析によってがん抗原が対象特異的であることを確認することを含み得る。
いくつかの実施形態では、方法はまた、ｍＲＮＡワクチンの投与から少なくとも１か月後に、少なくとも２つのがん抗原を対象の試料から特定してがん抗原の第２のセットを産生し、対象に対するがん抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することを含む。
【０５２９】
いくつかの実施形態では、対象の試料は腫瘍試料である。
他の態様では、本発明は、少なくとも２つのがん抗原を対象の試料から特定してがん抗原の第１のセットを産生し、対象に対するがん抗原の第１のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与し、ｍＲＮＡワクチンの投与から少なくとも１か月後に、少なくとも２つのがん抗原を対象の試料から特定してがん抗原の第２のセットを産生し、対象に対するがん抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与することにより、対象における免疫応答を誘発する方法を含む。
【０５３０】
いくつかの実施形態では、抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、がん抗原の第１のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの６か月〜１年後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、抗原の第２のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、がん抗原の第１のセットをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの１〜２年後に対象に投与される。
【０５３１】
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが、がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。いくつかの実施形態では、複数のｍＲＮＡが、抗原をコードする。いくつかの実施形態では、がん抗原の第２のセットは、２〜１００個の抗原を含む。いくつかの実施形態では、がん抗原は、点突然変異、フレームシフト突然変異、及び組換えから選択される突然変異を有する。
【０５３２】
他の態様では、本発明は、少なくとも２つのがん抗原を対象の試料から特定し、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを対象に投与し、がん治療薬を対象に投与することにより、対象における免疫応答を誘発する方法を含む。いくつかの実施形態では、がん治療薬は標的療法である。標的療法は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤であり得る。
【０５３３】
いくつかの実施形態では、がん治療薬はＴ細胞治療薬である。Ｔ細胞治療薬は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体などのチェックポイント阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブである。いくつかの実施形態におけるＴ細胞治療薬は、ＯＸ４０Ｌである。いくつかの実施形態では、がん治療薬は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
【０５３４】
いくつかの実施形態では、がん治療薬は、１つ以上の通常のがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含むワクチンである。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをがん治療薬と同時に対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを、がん治療薬の投与前に対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを、がん治療薬の投与後に対象に投与する。
【０５３５】
本発明の他の態様では、がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを脂質ナノ粒子製剤と混合してｍＲＮＡがんワクチンを作製すること、及び混合から２４時間以内にｍＲＮＡがんワクチンを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチンは、混合から１２時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチンは、混合から１時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチンは、２〜１００個のがん抗原または１０〜１００個のがん抗原をコードする。
【０５３６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、がん抗原が対象特異的がん抗原である個別化がんワクチンである。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、複数のｍＲＮＡが、がん抗原をコードする。各ｍＲＮＡは、いくつかの実施形態では、５〜１０個のがん抗原または単一のがん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、各がん抗原は、１０〜５０アミノ酸長または１５〜２０アミノ酸長である。
【０５３７】
本明細書では、抗原特異的免疫応答を対象に誘導する方法であって、抗原特異的免疫応答を生じさせるのに有効な量でがんワクチンを対象に投与することを含む方法に使用される医薬品の製造におけるがんワクチンの使用をさらに提供する。
【０５３８】
他の態様では、対象から単離されたエクソソームから少なくとも２つのがん抗原を特定し、その特定した抗原に基づいて、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを作製し、ｍＲＮＡワクチンを対象に投与することにより、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、当該ｍＲＮＡワクチンが、対象において腫瘍特異的免疫応答を誘導し、それにより対象におけるがんを治療する方法を提供する。他の態様では、本発明は、対象から単離されたエクソソームから少なくとも２つのがん抗原を特定し、その特定した抗原に基づいて、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンを作製することを含む方法に従って作製可能なＲＮＡワクチンである。
【０５３９】
本発明の態様では、がん抗原に対する免疫応答を対象に誘発する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与し、それにより抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することを含み、予防有効用量の従来型抗がんワクチンをワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価がワクチン接種後に増加する。「抗抗原ポリペプチド抗体」とは、抗原ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
【０５４０】
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでがんの進行を予防する治療有効用量である。いくつかの実施形態では、治療有効用量とは、ワクチンの添付文書に列挙された用量である。本明細書で使用される場合、従来型ワクチンとは、本発明のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンとして、生存微生物ワクチン、死滅微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、従来型ワクチンは、例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）といった国家医薬品規制機関による規制認可を取得している、及び／または各機関に登録されているワクチンである。
【０５４１】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇ〜１０ｌｏｇ増加する。
【０５４２】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇ増加する。
【０５４３】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に２ｌｏｇ増加する。
【０５４４】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に３ｌｏｇ増加する。
【０５４５】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に５ｌｏｇ増加する。
【０５４６】
いくつかの実施形態では、予防有効用量の従来型抗がんワクチンでワクチン接種された対象における抗抗原ポリペプチド抗体価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体価は、ワクチン接種後に１０ｌｏｇ増加する。
【０５４７】
本発明の他の態様では、がん抗原に対する免疫応答を対象に誘発する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与し、それにより抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することを含み、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して２倍〜１００倍の投与量レベルの従来型抗がん抗原ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５４８】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して２倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５４９】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して３倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５０】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して４倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５１】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して５倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して１０倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５２】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して５０倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５３】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して１００倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５４】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して１０倍〜１０００倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５５】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して１００倍〜１０００倍の投与量レベルの従来型ワクチンをワクチン接種された対象における免疫応答と同等である。
【０５５６】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における抗体価を決定することにより評価される。
他の態様では、本発明は、少なくとも１つのがん抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンを対象に投与し、それにより抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を対象に誘導することにより、対象における免疫応答を誘発する方法を含み、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型抗がん抗原ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、２日〜１０週早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、ＲＮＡワクチンと比較して２倍〜１００倍の投与量レベルで予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導されるものである。
【０５５７】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、２日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、３日早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、１週間早く誘導される。
【０５５８】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、２週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、３週間早く誘導される。
【０５５９】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、５週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答が、予防有効用量の従来型ワクチンをワクチン接種された対象に誘導される免疫応答と比較して、１０週間早く誘導される。
【０５６０】
第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するがんＲＮＡワクチンを対象に投与することにより、対象においてがんに対する免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、かつアジュバントがワクチンと合剤にされていないか、または共投与されない。
【０５６１】
さらに他の態様では、本発明は、１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー状がん抗原をコードするｍＲＮＡを生成する方法を含み、当該方法は、
（ａ）コンカテマー状がん抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチドと、５’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドとを固体支持体にコンジュゲートされたポリヌクレオチドに結合すること；
（ｂ）好適な条件下（ここでの好適な条件はＤＮＡリガーゼを含む）で第２のポリヌクレオチドの３’末端を第１のポリヌクレオチドの５’末端にライゲーションし、それにより第１のライゲーション産物を生成すること；
（ｃ）好適な条件下（ここでの好適な条件はＲＮＡリガーゼを含む）で３’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端を第１のライゲーション産物の３’末端にライゲーションし、それにより第２のライゲーション産物を生成すること；
（ｄ）固体支持体から第２のライゲーション産物を切り離し、それにより１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー状がん抗原をコードするｍＲＮＡを生成することによるものである。提供される組成物または方法のいずれか１つに関するいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の再発性多型をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上の再発性多型が、ｐ５３における再発性体細胞がん突然変異を含む。いくつかのそのような実施形態では、ｐ５３における１つ以上の再発性体細胞がん突然変異は、
（１）コドンに隣接する標準的な５’スプライス部位での変異ｐ．Ｔ１２５；
（２）コドンに隣接する標準的な５’スプライス部位での変異ｐ．３３１；
（３）コドンに隣接する標準的な３’スプライス部位での変異ｐ．１２６；
（４）潜在性選択的イントロン５’スプライス部位を誘導する、コドンに隣接する標準的な５’スプライス部位での変異ｐ．２２４からなる群より選択される。
【０５６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、新生抗原ペプチド（１）〜（４）のうち１つ以上をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡを含むがん治療ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記変異のいずれを含むかに基づいて、ペプチド（１）〜（４）の１つ以上を含むかまたはコードするワクチンの選択的投与を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記変異のいずれを含むか、及び対象の正常ＨＬＡ型が、変異により生じる新生抗原に結合すると予測される対応するＨＬＡアレルを含むかという２重基準に基づいて、ワクチンの選択的投与を提供する。
【０５６３】
本発明の他の態様では、対象から試料を単離し、試料から得た患者のトランスクリプトーム及び／または患者のエクソームの解析により一連のネオエピトープを特定して患者特異的ミュータノームを作製し、ＭＨＣ結合強度、ＭＨＣ結合多様性、予測される免疫原性の程度、低自己反応性、及び／またはＴ細胞反応性に基づいて、ワクチンに合わせた一連のネオエピトープをミュータノームから選択し、一連のネオエピトープをコードするｍＲＮＡワクチンを調製し、対象から試料を単離してから２か月以内にｍＲＮＡワクチンを対象に投与することにより、個別化ｍＲＮＡがんワクチンで対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、対象から試料を単離してから１か月以内に対象に投与される。
【０５６４】
他の態様では、本発明は、ａ．患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析により患者特異的ミュータノームを特定すること、ｂ．患者のＲＮＡ−ｓｅｑにおける遺伝子または転写物レベルの発現の評価；変異体検出の信頼スコア；ＲＮＡ−ｓｅｑアレル特異的発現；保存的アミノ酸置換対非保存的アミノ酸置換；点突然変異の位置（ＴＣＲ会合の増加に関する中間スコア）；点突然変異の位置（差次的ＨＬＡ結合に関するアンカースコア）；自己性：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性が１００％未満；８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒに対するＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−ＢのＩＣ５０；１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒに対するＨＬＡ−ＤＲＢ１のＩＣ５０；無差別スコア（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）；８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒに対するＨＬＡ−ＣのＩＣ５０；１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒに対するＨＬＡ−ＤＲＢ３−５のＩＣ５０；１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒに対するＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１のＩＣ５０；１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒに対するＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１のＩＣ５０；クラスＩとクラスＩＩの比率；患者のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＤＲＢ１アロタイプの多様性範囲；点突然変異と複合体エピトープ（フレームシフトなど）の比率；及び／または偽エピトープＨＬＡ結合スコアのうち、少なくとも３つに基づいたネオエピトープに関する加重値を用いて、ミュータノームから１５〜５００のネオエピトープのサブセットを選択すること、ｃ．最高加重値に基づいて個別化ｍＲＮＡがんワクチンに使用される一連のネオエピトープ（ここで、一連のネオエピトープは、１５〜４０個のネオエピトープを含む）をサブセットから選択することにより、一連のネオエピトープをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡがんワクチンに使用される一連のネオエピトープを特定する方法を含む。
【０５６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは化学修飾される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは修飾されていない。
態様によっては、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含む、対象にワクチン接種するための組成物及び方法を提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、かつアジュバントがワクチンと合剤にされていないか、または共投与されない。
【０５６６】
他の態様では、本発明は、対象にワクチン接種するための組成物及び方法であり、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、投与量１０ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの核酸ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投与量は、用量あたり１〜５ｕｇ、５〜１０ｕｇ、１０〜１５ｕｇ、１５〜２０ｕｇ、１０〜２５ｕｇ、２０〜２５ｕｇ、２０〜５０ｕｇ、３０〜５０ｕｇ、４０〜５０ｕｇ、４０〜６０ｕｇ、６０〜８０ｕｇ、６０〜１００ｕｇ、５０〜１００ｕｇ、８０〜１２０ｕｇ、４０〜１２０ｕｇ、４０〜１５０ｕｇ、５０〜１５０ｕｇ、５０〜２００ｕｇ、８０〜２００ｕｇ、１００〜２００ｕｇ、１２０〜２５０ｕｇ、１５０〜２５０ｕｇ、１８０〜２８０ｕｇ、２００〜３００ｕｇ、５０〜３００ｕｇ、８０〜３００ｕｇ、１００〜３００ｕｇ、４０〜３００ｕｇ、５０〜３５０ｕｇ、１００〜３５０ｕｇ、２００〜３５０ｕｇ、３００〜３５０ｕｇ、３２０〜４００ｕｇ、４０〜３８０ｕｇ、４０〜１００ｕｇ、１００〜４００ｕｇ、２００〜４００ｕｇ、または３００〜４００ｕｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量の核酸ワクチンが２１日目に対象に投与される。
【０５６７】
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量２５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量１００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量７５マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量１５０マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量４００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに、投与量２００マイクログラムのＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾され、いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾されない。
【０５６８】
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントがワクチンに含まれていない。いくつかの実施形態では、安定化要素はヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列と比較してＧＣ含量が増加している核酸配列である。
【０５６９】
本発明の態様は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主にｉｎ  ｖｉｖｏ投与される製剤中に存在し、ヒト対象に許容される比率で、第１の抗原に対する抗体保有率の基準を上回る抗体価を与える核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる抗体価は、中和抗体価である。いくつかの実施形態では、中和抗体価はタンパク質ワクチンよりも大きい。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる中和抗体価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生じる中和抗体価は、１，０００〜１０，０００、１，２００〜１０，０００、１，４００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜４，０００、１，８００〜１０，０００、２０００〜１０，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、３，０００〜５，０００、３，０００〜４，０００、または２，０００〜２，５００である。中和価は通常、プラーク数の５０％減を達成するために必要とされる最大血清希釈率で表される。
【０５７０】
好ましい態様では、本発明のワクチン（例えば、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種された対象の血液または血清中に、予防的及び／または治療的に有効なレベル、濃度、及び／または力価の抗原特異的抗体を生じさせる。本明細書の定義によれば、抗体価という用語は、対象、例えばヒト対象で産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態では、抗体価は、持続的に陽性結果を示す（段階希釈での）最大希釈率の逆数で表される。例示的な実施形態では、抗体価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体価は、中和アッセイ、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様では、抗体価の測定値は、１：４０、１：１００などの比で表される。
【０５７１】
本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、１：４０超、１：１００超、１：４００超、１：１０００超、１：２０００超、１：３０００超、１：４０００超、１：５００超、１：６０００超、１：７５００超、１：１００００超の抗体価を生じさせる。例示的な実施形態では、抗体価は、ワクチン接種の１０日後まで、ワクチン接種の２０日後まで、ワクチン接種の３０日後まで、ワクチン接種の４０日後まで、またはワクチン接種の５０日後以降までに生じるか、または達成される。例示的な実施形態では、力価は、単回用量のワクチンを対象に投与後に生じるかまたは達成される。いくつかの実施形態では、力価は複数回投与後、例えば第１回投与と第２回投与（例えば、ブースター投与）の後に生じるかまたは達成される。
【０５７２】
本発明の例示的な態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌ単位で測定されるか、またはＩＵ／Ｌ単位（リットルあたりの国際単位）またはｍｌＵ／ｍｌ（ｍｌあたりのミリ国際単位）で測定される。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞０．１μｇ／ｍｌ、＞０．２μｇ／ｍｌ、＞０．３５μｇ／ｍｌ、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞１μｇ／ｍｌ、＞２μｇ／ｍｌ、＞５μｇ／ｍｌ、または＞１０μｇ／ｍｌを生じさせる。本発明の例示的な実施形態では、有効なワクチンは、＞１０ｍｌＵ／ｍｌ、＞２０ｍｌＵ／ｍｌ、＞５０ｍｌＵ／ｍｌ、＞１００ｍｌＵ／ｍｌ、＞２００ｍｌＵ／ｍｌ、＞５００ｍｌＵ／ｍｌ、または＞１０００ｍｌＵ／ｍｌを生じさせる。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、ワクチン接種の１０日後まで、ワクチン接種の２０日後まで、ワクチン接種の３０日後まで、ワクチン接種の４０日後まで、またはワクチン接種の５０日後以降までに生じるか、または達成される。例示的な実施形態では、レベルまたは濃度は、単回用量のワクチンを対象に投与後に生じるかまたは達成される。いくつかの実施形態では、レベルまたは濃度は複数回投与後、例えば第１回投与と第２回投与（例えば、ブースター投与）の後に生じるかまたは達成される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示的な実施形態では、抗体レベルまたは抗体濃度は、中和アッセイ、例えばマイクロ中和アッセイによって決定または測定される。また、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ＲＮＡポリヌクレオチドが、宿主にｉｎ  ｖｉｖｏ投与される製剤中に存在しており、安定化要素を有するかまたはアジュバントと合剤にされた、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体価よりも長く持続する高い抗体価を誘発する核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与の１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫刺激性核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドはプロタミンである。
【０５７３】
態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは任意選択でヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、オープンリーディングフレームは少なくとも第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードし、宿主における抗原発現のレベルが、安定化要素を有するかまたはアジュバントと合剤にされた第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって生じる抗原発現のレベルを有意に上回るように宿主にｉｎ  ｖｉｖｏ投与するために、ＲＮＡポリヌクレオチドが製剤中に存在する核酸ワクチンを提供する。
【０５７４】
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは任意選択でヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、オープンリーディングフレームは少なくとも第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードし、同等の抗体価を生じさせるために、非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの投与量で存在する。
【０５７５】
本発明の態様はまた、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは任意選択でヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームであって、少なくとも第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド１０ｕｇ〜４００ｕｇと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ヒト対象に送達するように製剤化された使用単位ワクチンも提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンはカチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
【０５７６】
本発明の態様は、個体または個体集団において腫瘍に対する抗原記憶を構築、維持、または修復する方法を提供し、これには、上記個体または集団に、抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、当該核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾を含むかまたは任意選択でヌクレオチド修飾を含まず、２つ以上のコドン最適化されたオープンリーディングフレームを含み、上記オープンリーディングフレームが一連の標準抗原ポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意選択で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与、及び皮下投与からなる群より選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与工程は、対象の筋肉組織を組成物の注射に適したデバイスと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、投与工程は、エレクトロポレーションと組み合わせて、組成物の注射に適したデバイスと対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
【０５７７】
本発明の態様は、対象にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、有効量の第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、単回投与量２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む。
【０５７８】
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、オープンリーディングフレームは少なくとも第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードし、同等の抗体価を生じさせるために、非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの投与量で存在する。
【０５７９】
他の態様は、ヌクレオチド修飾を含まない（非修飾）オープンリーディングフレームを有する、ＬＮＰ製剤化されたＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、オープンリーディングフレームは第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードし、同等の抗体価を生じさせるために、ＬＮＰで製剤化されていない非修飾ｍＲＮＡワクチンの少なくとも１０分の１のＲＮＡポリヌクレオチドしか必要としないワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは２５〜１００マイクログラムの投与量で存在する。
【０５８０】
他の態様では、本発明は、有効量の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む、６０歳以上の高齢者対象を治療する方法を包含する。
【０５８１】
他の態様では、本発明は、有効量の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種をすることを含む、１７歳以下の若年対象を治療する方法を包含する。
【０５８２】
他の態様では、本発明は、有効量の抗原ポリペプチドまたはコンカテマー状ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与して、対象にワクチン接種することを含む、成人対象を治療する方法を包含する。
【０５８３】
いくつかの態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含み、ワクチン投与量が治療投与量の合計であり、抗原をコードする個々の各核酸の投与量が治療量以下投与量である混合ワクチンで対象にワクチン接種する方法を含む。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが２５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが１００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが７５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが１５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、合計投与量は、対象に投与される核酸ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドが４００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、抗原をコードする個々の各核酸の治療量以下投与量とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾され、いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは化学修飾されない。
【０５８４】
他の成分
ＬＮＰは、前述の項に記載したものに加えて、１つ以上の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）及び／またはステロールなどの１つ以上の疎水性小分子を含み得る。
【０５８５】
脂質ナノ粒子はまた、１つ以上の透過性増強剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の成分を含み得る。透過性増強剤分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってよく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含み得る。
【０５８６】
ポリマーはＬＮＰに含有されてもよく、及び／またはＬＮＰを封入または部分的に封入するために使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であってもよい。ポリマーは、限定されないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などの塩化ポリビニル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロースなどの誘導体セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸ポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ならびにそのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、炭酸トリメチレン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールを含み得る。
【０５８７】
表面改質剤は、限定されないが、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステップロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、及びＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）を含み得る。表面改質剤は、ナノ粒子内部及び／またはＬＮＰの表面に配置することができる（例えば、被覆、吸着、共有結合、またはその他の処理による）。
【０５８８】
ＬＮＰはまた、１つ以上の官能化脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露されると、付加環化反応を受ける可能性があるアルキン基で官能化されてもよい。特に、この方法で、膜透過、細胞認識、または画像化を容易にするのに有用な１つ以上の基を用いて脂質二重層を官能化することができる。ＬＮＰの表面に１つ以上の有用な抗体をコンジュゲートすることもできる。標的細胞送達、画像化、及び膜透過に有用な官能基及びコンジュゲートは、当技術分野において周知である。
【０５８９】
このような成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物に有用な任意の物質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１種以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分を含んでもよく、例えばこれは、限定されないが、１種以上の溶媒、分散媒体、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、増量剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、防腐剤、及び他の種などである。また、ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味剤、及び着香剤などの賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は当技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照）。
【０５９０】
希釈剤の例は、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類果肉、寒天、ベントナイト、セルロース及び木製品、海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせから選択することができる。
【０５９１】
表面活性剤及び／または乳化剤は、限定されないが、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０５９２】
結合剤は、デンプン（例えば、コーンスターチ及びデンプンペースト）；糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然ガム及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、トチャカ抽出物、パンワーガム、ガティガム、イサポールハスクの粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、及びカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；ならびにそれらの組み合わせ、または任意の他の好適な結合剤であり得る。
【０５９３】
防腐剤の例は、限定されないが、抗酸化剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／または他の防腐剤を含み得る。抗酸化剤の例として、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌性防腐剤の例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌性防腐剤の例として、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アルコール防腐剤の例として、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性防腐剤の例として、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤として、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロオキシム、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９４】
緩衝剤の例として、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリン、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群より選択することができる。
【０５９５】
油の例として、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ種子油、ボリジ油、カデ油、カモミール油、カノーラ油、キャラウェイ油、カルナウバ油、ヒマシ油、シナモン油、カカオバター油、ココナッツ油、タラ肝油、コーヒー、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、マツヨイグサ油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンディン油、ラベンダー油、レモン油、アオモジ油、マカデミアナッツ油、ゼニアオイ科植物油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、菜種油、米ぬか油、ローズマリー油、ベニバナ油、サンダルウッド油、サザンカ油、セイバリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバ油、クルミ油、及び小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９６】
医薬組成物
脂質ナノ粒子を含む製剤は全体的または部分的に、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１種以上の異なる治療薬及び／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載のものなどの１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または補助成分をさらに含み得る。医薬組成物及び薬剤の製剤化及び製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６に提供されている。任意の従来の賦形剤または補助成分が、本開示の製剤中のＬＮＰの１種以上の成分と適合し得ない場合を除いて、従来の賦形剤または補助成分を任意の医薬組成物に使用することができる。賦形剤または補助成分は、ＬＮＰの成分との組み合わせが、望ましくない生物学的効果またはその他の有害な効果を生じさせる可能性がある場合、製剤のＬＮＰの成分と適合し得ない。
【０５９７】
いくつかの実施形態では、１種以上の賦形剤または補助成分が、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または総体積の５０％超を占める場合がある。いくつかの実施形態では、１種以上の賦形剤または補助成分が、医薬組成物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を占める場合がある。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用及び獣医学的使用が承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は医薬品等級である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たす。
【０５９８】
本開示に従う医薬組成物中の１種以上の脂質ナノ粒子、１種以上の薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、治療される対象の同一性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて決定されることになる。一例として、医薬組成物は、０．１％〜１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１種以上の脂質ナノ粒子を含み得る。別の例として、医薬組成物は、０．１％〜１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、または１２．５％ｗ／ｖ）の１種以上の両親媒性ポリマーを含み得る。
【０５９９】
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子及び／または医薬組成物は、保存及び／または出荷に備え冷蔵または冷凍される（例えば、４℃以下の温度、例えば、約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃の温度（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃）などで保存される）。例えば、１種以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、保存及び／または出荷に備えて、例えば、約−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、または−８０℃で冷蔵される溶液または固体（例えば、凍結乾燥による）である。ある特定の実施形態では、本開示はまた、脂質ナノ粒子及び／またはその医薬組成物を４℃以下の温度、例えば、約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃の温度（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃）などで保存することにより、脂質ナノ粒子の安定性を増加させる方法に関する。
【０６００】
脂質ナノ粒子及び／または１種以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、任意の患者または対象に投与することができ、そのような患者または対象には、１種以上の特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群、例えば腎臓系などに治療薬及び／または予防薬を送達することにより与えられる治療効果から利益を得ることができるものを含む。脂質ナノ粒子及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物について本明細書に示す記載は、主にヒトへの投与に適した組成物に関するものであるが、そのような組成物は概ね、任意の他の哺乳動物への投与に適していることを当業者は理解されるであろう。様々な動物への投与に適した組成物を提供するための、ヒトへの投与に適した組成物の修飾は十分に理解されており、当業者の獣医薬理学者は、必要だとしても単なる通常の実験を用いてそのような修飾を設計及び／または実行することができる。組成物の投与を企図される対象として、ヒト、他の霊長類、ならびにウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／またはラットなどの商業に関連する哺乳動物を含む他の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０１】
１種以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学の分野で公知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法には、活性成分を賦形剤及び／または１種以上の他の補助成分と混和された状態にした後、望ましい場合または必要な場合には、目的とする単回投与単位または複数回投与単位に製品を分割、成形、及び／または包装することを含む。
【０６０２】
本開示に従う医薬組成物は、単一の単位用量として及び／または複数の単回単位用量として、バルクで調製、包装、及び／または販売することができる。本明細書で使用される場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の個別量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量、及び／またはそのような投与量の利便な画分、例えば、そのような投与量の半分または３分の１に等しい。
【０６０３】
医薬組成物は、様々な経路及び投与方法に適した様々な形態で調製することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体剤形（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル）、注射液形態、固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤）、局所及び／または経皮投与用の剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及びパッチ）、懸濁液、粉末、及び他の形態に調製することができる。
【０６０４】
経口投与用及び非経口投与用の液体剤形として、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及び／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤を含み得る。不活性希釈剤以外に、経口組成物は、追加の治療薬及び／または予防薬、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁剤などの追加薬剤、甘味剤、香味剤、及び／または着香剤などを含んでもよい。非経口投与の特定の実施形態では、組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）などの可溶化剤、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせと混合される。
【０６０５】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用の水性懸濁液または油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口に許容される希釈剤及び／または溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／または乳濁液であり得る。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。従来から滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を使用してもよい。オレイン酸などの脂肪酸も注射液の調製に使用することができる。
【０６０６】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することにより、及び／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解もしくは分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【０６０７】
活性成分の効果を延長するために、多くの場合、皮下注射または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶性材料または非晶質材料の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。薬物の吸収速度はその溶解速度に応じて異なり、これはさらに、結晶サイズ及び結晶形態に応じて異なり得る。あるいは、非経口投与される剤形の吸収遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーとの比率、及び使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することにより調製される。
【０６０８】
直腸投与または膣投与用の組成物は、典型的には、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶融し、活性成分を放出するような、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤と組成物を混合することによって調製できる坐剤である。
【０６０９】
経口投与用の固体剤形として、カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルム剤、散剤、及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形において、少なくとも１種の不活性で薬学的に許容される賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、及び／または増量剤もしくは希釈剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシア）、軟釈剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土、ケイ酸塩）、及び滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにそれらの混合物と活性成分が混合される。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含み得る。
【０６１０】
同様の種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルの増量剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤といった固体剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤分野において周知である他のコーティング剤などのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。固体剤形は任意選択で乳白剤を含んでもよく、活性成分（複数可）のみを、または優先的に腸管の特定の部分に、任意選択で遅延して放出する組成物のものであり得る。使用できる包埋組成物の例として、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルの増量剤として使用することができる。
【０６１１】
組成物の局所投与及び／または経皮投与のための剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及び／またはパッチを含み得る。一般的に、活性成分は滅菌条件下で、必要とされ得る場合には、薬学的に許容される賦形剤及び／または任意の必要な防腐剤及び／または緩衝剤と混和される。加えて、本開示は経皮パッチの使用を企図しており、これは、多くの場合、化合物の体内への送達に制御をもたらすという付加的な利点を有する。そのような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解及び／または分散させることにより調製することができる。代わりにまたは加えて、速度制御膜を設けること、及び／またはポリマーマトリックス及び／またはゲルに化合物を分散させることにより速度を制御することができる。
【０６１２】
本明細書に記載の皮内医薬組成物を送達する際に使用するのに適した装置として、短針装置が挙げられ、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号；同第５，１９０，５２１号；同第５，３２８，４８３号；同第５，５２７，２８８号；同第４，２７０，５３７号；同第５，０１５，２３５号；同第５，１４１，４９６号；及び同第５，４１７，６６２号に記載のものである。皮内組成物は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３４８５０に記載されているもの及びその機能的同等物など、皮膚への針の有効貫通長を制限する装置によって投与することができる。液体ジェット式注射器を介して、及び／または角質層を貫通して真皮に到達する噴流を生成する針を介して液体組成物を真皮に送達するジェット式注射装置が好適である。ジェット式注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；同第５，５９９，３０２号；同第５，３３４，１４４号；同第５，９９３，４１２号；同第５，６４９，９１２号；同第５，５６９，１８９号；同第５，７０４，９１１号；同第５，３８３，８５１号；同第５，８９３，３９７号；同第５，４６６，２２０号；同第５，３３９，１６３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，５０３，６２７号；同第５，０６４，４１３号；同第５，５２０，６３９号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第４，９４０，４６０号：ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９７／３７７０５及びＷＯ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを使用して散剤形態のワクチンを皮膚の外層から真皮まで高速で送る発射式の粉末／粒子送達装置が好適である。代わりにまたは加えて、皮内投与の従来的なマントー法に従来のシリンジを使用することができる。
【０６１３】
局所投与に適した製剤として、液体及び／または半液体調製物、例えば、塗布剤、ローション、水中油型及び／または油中水型エマルジョン、例えばクリーム、軟膏、及び／またはペーストなど、及び／または溶液及び／または懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度程度の高さであってよいが、局所投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含み得る。局所投与用の製剤は、本明細書に記載の追加成分のうち１種以上をさらに含み得る。
【０６１４】
医薬組成物は、頬腔を経由した肺投与に適する製剤として調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、活性成分を含有する乾燥粒子を含み得る。利便上、そのような組成物は、粉末が分散するように噴射剤の流れを誘導できる乾燥粉末リザーバーを備える装置を使用する、及び／または密封容器内で低沸点噴射剤に溶解及び／または懸濁された活性成分を含む装置などの自動噴射式の溶媒／粉末分配容器を使用する投与用の乾燥粉末形態である。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含んでもよく、利便上、単位剤形で提供される。
【０６１５】
低沸点噴射剤は一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、組成物の５０％〜９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を噴射剤が占めてよく、組成物の０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）を活性成分が占めてよい。噴射剤はさらに、液体非イオン性及び／または固体アニオン性界面活性剤及び／または固体希釈剤（活性成分を含んでいる粒子と同じオーダーの粒径を有し得る）などの追加成分を含み得る。
【０６１６】
肺送達用に製剤化された医薬組成物は、溶液及び／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供することができる。そのような製剤は、活性成分が含まれる、任意選択で滅菌された水性及び／または希釈アルコール溶液及び／または懸濁液として調製、包装、及び／または販売することができ、利便上、任意の噴霧装置及び／または微粒化装置を使用して投与することができる。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、及び／またはヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を含むがこれらに限定されない１種以上の追加成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲内である平均直径を有し得る。
【０６１７】
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分が含まれた、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、鼻から吸入して摂取する方法、すなわち、鼻付近で保持した粉末容器から鼻道を通して急速吸入することによって投与される。
【０６１８】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、最小約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）〜最大１００％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含んでよく、本明細書に記載の１種以上の追加成分を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に適する製剤として調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して製造された錠剤及び／またはロゼンジの形態であってよく、例えば、活性成分は０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）であり、残部は経口溶解性及び／または分解性組成物、ならびに任意選択で本明細書に記載の１種以上の追加成分を含み得る。あるいは、頬側投与に適した製剤は、活性成分が含まれた散剤及び／またはエアロゾル化及び／または微粒化された溶液及び／または懸濁液を含み得る。そのような粉末化、エアロゾル化、及び／またはエアロゾル化製剤は、分散すると、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲内である平均粒子及び／または液滴径を有することができ、本明細書に記載の任意の追加成分のうち１つ以上をさらに含み得る。
【０６１９】
医薬組成物は、眼内投与に適する製剤として調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分の溶液及び／または懸濁液を含む点眼薬の形態であり得る。そのような液滴は、緩衝剤、塩、及び／または本明細書に記載の任意の追加成分のうちの１種以上をさらに含み得る。有用な他の眼内投与可能な製剤として、微結晶形態及び／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが挙げられる。点耳薬及び／または点眼薬は、本開示の範囲内であると企図される。
【０６２０】
細胞内でポリペプチドを生成する方法
本開示は、哺乳動物細胞において、対象となるポリペプチドを生成する方法を提供する。ポリペプチドを生成する方法は、対象となるポリペプチドをコードするｍＲＮＡが含まれるＬＮＰを含む本開示の製剤と細胞を接触させることを含む。細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、ｍＲＮＡが細胞内に取り込まれて翻訳され、対象となるポリペプチドが生成され得る。
【０６２１】
一般に、哺乳動物細胞を、対象となるポリペプチドをコードするｍＲＮＡが含まれるＬＮＰと接触させる工程は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、培養物中、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。細胞と接触せる脂質ナノ粒子の量、及び／またはその中のｍＲＮＡの量は、接触させる細胞または組織の種類、投与手段、脂質ナノ粒子とその中のｍＲＮＡの物理化学的特性（例えば、サイズ、電荷、及び化学組成など）、及びその他の要因に応じて異なり得る。一般に、脂質ナノ粒子が有効量であれば、細胞内での効率的なポリペプチド生成が可能になる。効率の測定基準には、ポリペプチドの翻訳（ポリペプチドの発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解の程度、及び免疫応答の指標が含まれる場合がある。
【０６２２】
ｍＲＮＡが含まれるＬＮＰを細胞と接触させる工程は、トランスフェクションを伴うか、または引き起こす可能性がある。ＬＮＰの脂質成分に含まれるリン脂質は、例えば、細胞膜または細胞内膜と相互作用及び／または融合することによって、トランスフェクションを促進する、及び／またはトランスフェクション効率を高めることができる。トランスフェクションにより、細胞内でのｍＲＮＡの翻訳を可能にし得る。
【０６２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、治療的に使用することができる。例えば、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、治療用ポリペプチドをコードし（例えば、翻訳可能領域内）、接触時及び／または細胞への侵入時（例えば、トランスフェクション）に治療用ポリペプチドを生成することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、対象の免疫を改善または増加させ得るポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、顆粒球コロニー刺激因子またはトラスツズマブをコードし得る。
【０６２４】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子と接触する細胞には実質的に存在し得ない、１つ以上のポリペプチドを置換できる組換えポリペプチドをコードし得る。１つ以上の実質的に存在しないポリペプチドは、コード遺伝子またはその制御経路の遺伝子突然変異による欠失であり得る。あるいは、ｍＲＮＡの翻訳によって生成される組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗することができる。拮抗性組換えポリペプチドは、突然変異によって引き起こされる活性変化または局在化など、内因性タンパク質の活性によって引き起こされる有害な影響を抑制するために望ましい場合がある。別の代替法では、ｍＲＮＡの翻訳によって生成される組換えポリペプチドは、細胞内、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される生物学的部分の活性に直接的または間接的に拮抗することができる。拮抗される生物学的部分は、限定されないが、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、及び小分子毒素を含み得る。ｍＲＮＡの翻訳によって生成される組換えポリペプチドは、核などの特定の区画内など、細胞内部に局在化するように操作すること、または細胞から分泌するもしくは細胞の原形質膜に移行するように操作することができる。
【０６２５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡが含まれるＬＮＰと細胞を接触させると、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を低下させることができる。翻訳可能領域を含む第１の量の第１の外因性ｍＲＮＡが含まれる第１の脂質ナノ粒子と細胞を接触させ、第１の外因性ｍＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答のレベルを決定することができる。引き続き、第２の量の第１の外因性ｍＲＮＡ（第２の量とは、第１の量と比較して少ない量の第１の外因性ｍＲＮＡである）が含まれる第２の組成物と細胞を接触させてもよい。あるいは、第２の組成物は、第１の量の、第１の外因性ｍＲＮＡとは異なる第２の外因性ｍＲＮＡを含み得る。細胞を第１及び第２の組成物と接触させる工程は、１回以上繰り返してもよい。加えて、任意選択で、細胞におけるポリペプチド生成（例えば、翻訳）の効率を決定することができ、標的タンパク質の生成効率が達成されるまで、細胞を第１及び／または第２の組成物と繰り返し再接触させてもよい。
【０６２６】
治療薬を細胞及び器官に送達する方法
本開示は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を哺乳動物の細胞または器官に送達する方法を提供する。細胞への治療薬及び／または予防薬の送達は、核酸などの治療薬及び／または予防薬が含まれるＬＮＰを含む本開示の製剤を対象に投与することを含み、その場合、組成物の投与は細胞を組成物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質、細胞毒性剤、放射性イオン、化学療法剤、または核酸（例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、細胞または器官に送達され得る。治療薬及び／または予防薬がｍＲＮＡである場合、細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、翻訳可能なｍＲＮＡが細胞内で翻訳され、対象となるポリペプチドが生成され得る。しかしながら、実質的に翻訳不可能なｍＲＮＡも細胞に送達される場合がある。実質的に翻訳不可能なｍＲＮＡは、ワクチンとして有用な場合があり、及び／または細胞の翻訳構成要素を隔離して、細胞内の他の種の発現を低下させることができる。
【０６２７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、特定の型またはクラスの細胞（例えば、特定の器官またはその系の細胞）を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、対象となる治療薬及び／または予防薬が含まれるＬＮＰを、哺乳動物の肝臓、腎臓、脾臓、大腿骨、または肺に特異的に送達することができる。特定のクラスの細胞、器官、またはその系もしくは群への特異的の送達とは、治療薬及び／または予防薬が含まれる脂質ナノ粒子が、例えば、哺乳動物へのＬＮＰの投与時に、他の送達先と比較して、対象となる送達先（例えば、組織）に送達される比率が高いことを意味する。いくつかの実施形態では、特異的送達により、別の送達先（例えば、脾臓）と比較して、標的の送達先（例えば、肝臓など、対象となる組織）の組織１ｇあたりの治療薬及び／または予防薬の量に２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍を超える増加をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、対象となる組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、大腿骨、血管内（例えば、冠状動脈内または大腿内）または腎臓の血管内皮、及び腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射による）からなる群より選択される。
【０６２８】
標的化送達または特異的送達の別の例として、タンパク質結合パートナー（例えば、抗体もしくはその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチド）または細胞表面にある受容体をコードするｍＲＮＡを、ＬＮＰに含めることができる。加えてまたは代わりに、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成及び細胞外局在化を指示するｍＲＮＡを使用してもよい。あるいは、ＬＮＰの他の治療薬及び／または予防薬または要素（例えば、脂質またはリガンド）は、ＬＮＰが受容体を含む標的細胞集団とより容易に相互作用できるように、特定の受容体（例えば、低密度リポタンパク質受容体）に対する親和性に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、限定されないが、特異的結合対のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及びその断片、ヒト化抗体及びその断片、ならびにそれらの多価型；ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディなどの単一特異性抗体または二重特異性抗体を含む多価結合試薬；ならびにアプタマー、受容体、及び融合タンパク質を含み得る。
【０６２９】
いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞標的特異性の調整を可能にし得る表面結合抗体であり得る。これは、目的とする標的部位の対象となるエピトープに対して特異性の高い抗体を生成できるため、特に有用である。いくつかの実施形態では、１つの細胞の表面に複数の抗体が発現し、各抗体が、目的とする標的に対して異なる特異性を有することができる。このような手法は、標的化相互作用の親和力と特異性を高めることができる。
【０６３０】
リガンドは、例えば、細胞の目的とする局在化または機能に基づいて、生物学分野の当業者が選択することができる。いくつかの実施形態では、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体リガンドは、細胞表面上のエストロゲン受容体数の増加したエストロゲン依存性乳癌細胞に細胞を標的化することができる。リガンド／受容体相互作用の他の非限定的な例として、ＣＣＲ１（例えば、関節リウマチ及び／または多発性硬化症における炎症を起こした関節組織または脳の治療のため）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織を標的とする）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織を標的とする）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚を標的とする）、ＣＸＣＲ４（例えば、全身に拡張された遊走）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症及び炎症性障害の治療のため、骨髄）、Ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７（例えば、腸粘膜を標的とする）、及びＶＬＡ−４ＮＣＡＭ−１（例えば、内皮を標的とする）が挙げられる。一般に、標的化（例えば、がん転移）に関与する任意の受容体を利用して、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することができる。
【０６３１】
標的細胞は、限定されないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜内層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞を含み得る。
【０６３２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは肝細胞を標的とし得る。アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）などのアポリポタンパク質は、体内の中性またはほぼ中性の脂質を含有する脂質ナノ粒子と会合することが示されており、肝細胞の表面に見られる低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）などの受容体と会合することが知られている。したがって、対象に投与される中性またはほぼ中性の電荷を有する脂質成分が含まれるＬＮＰは、対象の体内でａｐｏＥを獲得し、その後、ＬＤＬＲを含む肝細胞に標的を絞って治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）を送達することができる。
【０６３３】
疾患及び障害を治療する方法
脂質ナノ粒子は、疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。特に、そのような組成物は、タンパク質またはポリペプチドの活性の欠損または異常を特徴とする疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、欠損または異常のあるポリペプチドをコードするｍＲＮＡが含まれるＬＮＰを含む本開示の製剤を、細胞に投与または送達することができる。それに続くｍＲＮＡの翻訳により、ポリペプチドを生成することにより、ポリペプチドが引き起こす活性の欠損または異常を原因とする問題を低減または解消することができる。翻訳は迅速に生じ得るため、この方法及び組成物は、敗血症、脳卒中、及び心筋梗塞などの急性の疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬はまた、所与の種の転写速度を変化させることができ、それにより遺伝子発現に影響を与えることができる。
【０６３４】
組成物を投与され得る、機能不全または異常なタンパク質またはポリペプチド活性を特徴とする疾患、障害、及び／または病態として、希少疾患、感染性疾患（ワクチン及び治療薬の両方）、がん及び増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管及び腎血管疾患、ならびに代謝性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。複数の疾患、障害、及び／または病態が、タンパク質活性の欠損（または適切なタンパク質機能が発生しない程度の実質的な減少）を特徴とする場合がある。そのようなタンパク質は存在しないか、本質的に機能しない可能性がある。機能不全タンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス突然変異型変異体であり、これは、嚢胞性線維症の原因となるＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質変異体を生成する。本開示は、式（Ｉ）に従う脂質、リン脂質（任意選択で不飽和）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含む脂質成分及びＲＮＡが含まれるＬＮＰを投与することにより、対象における当該疾患、障害、及び／または病態を治療するための方法を提供する。その場合、ＲＮＡは、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、それ以外の方法で抑制するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり得る。
【０６３５】
本開示は、核酸などの１種以上の治療薬及び／または予防薬が含まれる脂質ナノ粒子、ならびにそれが含まれる医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。治療薬及び予防薬という用語は、本開示の特徴及び実施形態に関して本明細書で同義に使用することができる。治療用組成物、またはその画像化組成物、診断組成物、もしくは予防組成物は、疾患、障害、及び／または病態を予防、治療、診断、または画像化する、及び／またはその他の任意の目的に有効な任意の合理的な量及び任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。所与の対象に投与される具体的な量は、対象の種、年齢、及び全身の状態；投与の目的；特定の組成物；投与様式などに応じて異なり得る。本開示に従う組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位形態で製剤化することができる。ただし、本開示の組成物の合計の１日用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効量、予防有効量、またはそれ以外の適切な用量レベル（例えば、画像化の場合）は、様々な要因に依存することになり、これには、治療される障害がある場合にはその重篤度及び特性；使用される１種以上の治療薬及び／または予防薬；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び使用される具体的な医薬組成物の排出速度；治療の継続期間；使用される具体的な医薬組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知されている同様の要因が含まれる。
【０６３６】
核酸などの１種以上の治療薬及び／または予防薬が含まれるＬＮＰは、任意の経路で投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の脂質ナノ粒子が含まれる予防組成物、診断組成物、または画像化組成物を含む組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮または皮内、真皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、腸、硝子体内、腫瘍内、舌下、鼻腔内を含む、様々な経路のうちの１つによって；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって；経口スプレー及び／または散剤、点鼻スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを介して投与される。いくつかの実施形態では、静脈内に、筋肉内に、皮内に、動脈内に、腫瘍内に、皮下に、または吸入により組成物を投与することができる。しかしながら、本開示は、薬物送達科学に見込まれる進歩を考慮した、任意の適切な経路による本明細書に記載の組成物の送達または投与を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子の性質（例えば、血流および胃腸管などの様々な身体環境におけるその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に忍容であるかどうか）などを含む様々な要因に応じて異なることになる。
【０６３７】
ある特定の実施形態では、本開示に従う組成物は、所与の用量で、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するのに十分な投与量レベルで投与することができ、その場合、用量１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）は、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇの治療薬及び／または予防薬を規定する。いくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）の用量のＬＮＰを投与することができる。いくつかの実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／または予防薬の用量を投与することができる。ある特定の実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。いくつかの実施形態では、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。目的のレベルのｍＲＮＡ発現及び／または治療的効果、診断的効果、予防的効果、または画像化効果を得るために、同じかまたは異なる量の用量を１日１回以上投与することができる。例えば、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに目的の投与量を送達してもよい。ある特定の実施形態では、目的の投与量を複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、外科的処置の前または後に、あるいは急性の疾患、障害、または病態の場合に、単回用量を投与することができる。
【０６３８】
核酸などの１種以上の治療薬及び／または予防薬が含まれる脂質ナノ粒子は、１種以上の他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と併用することができる。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与される、及び／または一緒に送達されるように製剤化されなければならないことを意味することを意図しないが、このような送達方法は本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、１種以上の異なる治療薬及び／または予防薬が含まれる１つ以上の脂質ナノ粒子を組み合わせて投与することができる。１種以上の他の望ましい治療処置または医療処置と同時に、その前に、またはその後に組成物を投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／または日程で投与されることになる。いくつかの実施形態では、本開示は、組成物、またはその画像化、診断、もしくは予防組成物を、それらのバイオアベイラビリティを向上させる薬剤、それらの代謝を低減及び／または調節する薬剤、それらの排泄を阻害する薬剤、及び／または体内でのそれらの分布を調節する薬剤と組み合わせて送達することを包含する。
【０６３９】
さらに、組み合わせに利用される治療用、予防用、診断用、または画像化用の活性剤は、単一の組成物として一緒に投与することも、または異なる組成物として個別に投与することもできるものと理解されよう。一般に、組み合わせに利用される薬剤は、それらが個別に利用されるときのレベルを超えないレベルで用いられることが予測される。いくつかの実施形態では、組み合わせに利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも少なくてよい。
【０６４０】
併用レジメンに用いる療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、望ましい治療薬及び／または手順の適合性、ならびに達成しようとする望ましい治療効果を考慮することになる。また、用いられる療法は、同じ障害に対して望ましい効果を達成できる（例えば、がん治療に有用な組成物を化学療法剤と同時に投与できる）か、あるいは異なる効果を達成することができる（例えば、注入に伴う反応などの有害作用の制御）と理解される。
【０６４１】
ＬＮＰは、組成物の有効性及び／または治療域を増加させる薬剤と併用することができる。そのような薬剤は、例えば、抗炎症化合物、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、スタチン、エストラジオール、ＢＴＫ阻害剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）、または抗ヒスタミンであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、デキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬と併用することができる。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象を治療する方法、または対象（例えば、哺乳動物）に治療薬及び／または予防薬を送達する方法は、ＬＮＰを投与する前に１種以上の薬剤で対象を前処置することを含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、有用量（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、または任意の他の有用量）のデキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬で前処置することができる。前処置は、脂質ナノ粒子の投与の２４時間以内（例えば、２４時間前、２０時間前、１６時間前、１２時間前、８時間前、４時間前、２時間前、１時間前、５０分前、４０分前、３０分前、２０分前、または１０分前）に行うことができ、１回、２回、またはそれ以上、例えば、投与量を漸増して行うことができる。
【０６４２】
当業者は、本明細書に記載の本開示に従う具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識しているか、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されることを意図されず、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
【０６４３】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する記載がない限り、または文脈から特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上の構成要素間に「または」を含む請求項または記載は、それに反する記載のない限り、または文脈から特に明らかでない限り、１つ、２つ以上、またはすべての群要素が所与の生成物またはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれ以外の方法で関連する場合に満たされるとみなされる。本開示は、群のちょうど１つの構成要素が、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれ以外の方法で関連する実施形態を含む。本開示は、群の２つ以上またはすべての構成要素が、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれ以外の方法で関連する実施形態を含む。
【０６４４】
また留意点として、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意図され、追加の要素または工程の包含を許容するが、それを必要とするわけではない。したがって、「を含む」という用語が本明細書で使用される場合、「から本質的になる」及び「からなる」という用語も包含され、開示される。本明細書全体を通じて、組成物が特定の成分を有する、包含する、または含むと記載される場合、組成物はまた、列挙される成分から本質的になるか、またはそれからなることが企図される。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセス工程を有する、包含する、または含むと記載される場合、プロセスはまた、列挙されるプロセス工程から本質的になるか、またはそれからなる。さらに、本発明が動作可能なままである限り、工程の順序または特定の動作を行う順序は重要でないことが理解されるべきである。さらに、２つ以上の工程または動作を同時に実施することができる。
【０６４５】
範囲が示される場合、両端の値が含まれる。さらに、特に記載のない限り、または文脈及び当業者の知見から特に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈から特に明示されない限り、本開示の様々な実施形態で指定された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を当該範囲の下限の単位の１０分の１までと想定できるものと理解されるべきである。
【０６４６】
加えて、先行技術の範囲内である本開示のいずれかの特定の実施形態が、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外される場合もあると理解されるべきである。このような実施形態は、当業者に公知であるとみなされるため、本明細書に除外が明示されていない場合であっても、除外され得る。
【０６４７】
すべての引用資料、例えば、本明細書で引用される参照文献、刊行物、特許出願、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用に際して明示的に記載されていない場合であっても、参照により本出願に組み込まれる。引用資料と本出願の記載内容に矛盾が生じる場合、本出願の記載内容が優先されるものとする。
【０６４８】
開示内容を説明してきたが、以下の実施例を限定ではなく例示として提供する。
【実施例】
【０６４９】
実施例１：有機可溶性ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡを有機溶媒に溶解すると、多様なナノ粒子送達プラットフォーム及び手法による製剤化を可能にできることを見出した。有機可溶性ｍＲＮＡは、ナノ沈殿時の混合要件を簡素化し得る（図１）。混合の簡素化は、ベッドサイド用途を企図したハイスループット製剤化の手法及び手段を可能にするにあたり有望であることが示されている。ｍＲＮＡの中間体塩は、有機相を介したナノ粒子へのｍＲＮＡの組み込みを可能にする。標準的なＬＮＰ製剤化技術は、粒子形成時に水性流からのｍＲＮＡの抽出をプロセス中に利用しており、粒子形成前及び粒子形成中の制御が制限される。
【０６５０】
水溶性ｍＲＮＡからカチオン性脂質−ｍＲＮＡ塩を直接形成することは、困難である。水性ｍＲＮＡとカチオン性脂質を混合すると、通常は界面析出が生じ、沈殿物は水溶性でなくなるが、通常、有機溶媒にも溶解しない。急速沈殿法は、カチオン交換が非効率的になる可能性があり、生成物は、親水性（例えばナトリウム）と疎水性（例えばカチオン性脂質）両方の対イオンを含むｍＲＮＡ塩になる。そのため、水溶性と有機溶解性の範囲をまたぐ中間体ｍＲＮＡ塩形態を用いた進行について調べた。中間体塩形態（例えば、ＴＢＡ−ｍＲＮＡ、トリブチルアミン塩形態）は逆相イオン対クロマトグラフィー技術により抽出し、オリゴヌクレオチドを精製することができる。この手法は、ｍＲＮＡの沈殿を回避すると同時に、有機溶解性を十分に達成できる疎水性をｍＲＮＡに与えることが想定される。
【０６５１】
有機可溶性ｍＲＮＡへの変換処理には、熱サイクルによるｍＲＮＡの前処理が含まれる場合がある。初期水溶性形態のｍＲＮＡ溶液約１ｍｇ／ｍＬを６５℃に加熱し、５分間、目標温度に保持した後、水／氷浴で急冷する。
【０６５２】
中間体塩を得る簡易な緩衝液交換は、必要なｍＲＮＡの規模に応じて様々な方法で達成することができる。例えば、ｍＲＮＡ（１〜１０ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭ酢酸トリブチルアンモニウム（ＴＢＡＡ、約ｐＨ６．５）で希釈し、適切なＭＷＣＯ透析チューブまたはカセットに収容してもよい。緩衝液によりｍＲＮＡを広範に透析し、親水性カチオンをＴＢＡ分子に置換することができる。例えば、緩衝液を２４時間で約３回交換する、１０透析濾過容量の１０ｍＭ  ＴＢＡＡ（約ｐＨ６．５）による透析を実施し、透析バッグ／カセットの内容物を凍結乾燥して白色粉末にすることができる。大規模の場合、基本的な処理、緩衝液、及び概念は同じままで、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を実施することができる。
【０６５３】
中間体カチオンが粒子中に残存することは望ましくない。中間体カチオン及びカチオン性脂質の化学的特性は、製剤化中の除去効率を規定する可能性がある。有機溶媒へのｍＲＮＡの溶解性に必要とされる疎水性を確定するために、代替の中間体カチオンをスクリーニングしてもよい。これは、低疎水性の中間体カチオンを有する有機溶媒可溶性ｍＲＮＡ塩を生成できる最小疎水性の対イオンを集中的に検出でき、ナノ粒子形成時の抽出及びカチオン性脂質とのイオン交換を促進する。カチオン間のｌｏｇＤ値の大きな変化と、有機液滴を崩壊させる大きな比表面積との組み合わせは、交換を効率化させることができる。可能性のある中間体塩であると特定された好適なカチオンの例として、トリブチルアミン（ＴＢＡ、ｃＬｏｇＰ＝４．７、ｃＬｏｇＤ５．０＝１．６）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ、ｃＬｏｇＰ＝３．２、ｃＬｏｇＤ５．０＝０．１）、トリエチルアミン（ＴＥＡ、ｃＬｏｇＰ＝１．７、ｃＬｏｇＤ５．０＝−１．５）、ジイソプロパノールアミン（ｃＬｏｇＰ＝−１．１、ｃＬｏｇＤ５．０＝−４．１）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５４】
（ＴＢＡＡ）ストック溶液の調製
最初に、ストック濃度の酢酸トリブチルアンモニウム（ＴＢＡＡ）をトリブチルアミンと酢酸から調製した。簡潔には、トリブチルアミンを水で１００ｍＭに調製し、室温で１時間撹拌させた。氷酢酸（初期化学量論１：１）を添加し、ｐＨをモニターした。追加の氷酢酸を添加して、ｐＨを６．３〜６．６の間に調整した。ＴＢＡＡストックを完全に混合し、ドラフトチャンバー内で一晩撹拌させる。次に、この溶液を４℃に冷却する。
【０６５５】
ＴＢＡ：ｍＲＮＡ塩の調製のための透析方法
ストックの１００ｍＭ  ＴＢＡＡ溶液を最初に水で１０ｍＭに希釈し、約４℃に冷却した。この手順は体積１５ｍＬの調製に特化したものであるが、必要なｍＲＮＡ塩の量に基づいて調整することができる。特定量のｍＲＮＡを５０ｍＬコニカルチューブに加えた。ヌクレオシド一リン酸の平均分子量３４４ｇ／ｍｏｌに基づいて、ｍＲＮＡのモル数を算出した。最初は、ＴＢＡ：ｍＲＮＡ比を１：１〜３：１に維持した。適当量のＴＢＡＡストックをｍＲＮＡに加え、体積を１５ｍＬに調整した。この溶液を透析カセット（２０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）に加えるまで氷上に静置した。冷ＴＢＡＡ（１０ｍＭ、２Ｌ）によりｍＲＮＡ：ＴＢＡ溶液を２時間透析した。透析媒体を新しいＴＢＡＡ（１０ｍＭ、２Ｌ）に交換した。さらに２時間後、ｍＲＮＡ：ＴＢＡ溶液を透析カセットから取り出し、５０ｍＬコニカルチューブ中で液体窒素により瞬間冷凍した。この材料を凍結乾燥させ、薄片状の白色粉末を得た。
【０６５６】
ＴＢＡ：ｍＲＮＡ塩の調製のためのタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）方法
１００ｍＭ  ＴＢＡＡ溶液を最初に水で１０ｍＭに希釈し、約４℃に冷却した。この手順は２００ｍｇのｍＲＮＡをＴＢＡ塩に変換することに特化したものであったが、適宜これを調整することができる。ＴＢＡ：ｍＲＮＡの初期比を１：１にするために、ＴＢＡＡ（１０ｍＭ、１０４ｍＬ）を添加し、水で総量を２００ｍＬにした。この溶液を氷上に静置し、５〜１０分間、５透析濾過容量のＴＢＡＡ（１０ｍＭ）により循環させ、低温ＴＦＦ（３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜）を通過させた。その後、５透析濾過容量は廃棄側に送られ、保持されたｍＲＮＡ：ＴＢＡ溶液は回収される（約２００ｍＬ）。この溶液を適当数の５０ｍＬコニカルチューブに分配し、液体窒素で瞬間冷凍する。この材料を凍結乾燥させ、薄片状の白色粉末を得る。
【０６５７】
ベンジルアルコール及びエタノールへのｍＲＮＡ−ＴＢＡの溶解
ｍＲＮＡ−トリブチルアミン（ＴＢＡ）塩の初期ストック溶液を、ベンジルアルコール中１０ｍｇ／ｍＬ（６．５ｍｇ／ｍＬの遊離ｍＲＮＡ）に調製した。それぞれのｍＲＮＡ−ＴＢＡ塩にベンジルアルコールを添加した後、この溶液を室温で１５〜６０分間ボルテックスシェーカーに置いた。ベンジルアルコールへの溶解後、さらにエタノールによる希釈を実施することができる。エタノール／ベンジルアルコールストック溶液中のｍＲＮＡ含有量は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して決定した。
【０６５８】
実施例２：有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の調製
ナノ粒子組成物の特性決定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、ナノ粒子組成物の粒子径、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を決定することができる。粒子径の決定は１倍ＰＢＳ中で、ゼータ電位の決定は１５ｍＭ  ＰＢＳ中で行った。
【０６５９】
紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物中の治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１倍ＰＢＳで希釈した配合物１００μＬを、メタノール及びクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物９００μＬに添加する。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ  ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で２３０ｎｍ〜３３０ｎｍについて記録する。ナノ粒子組成物中の治療薬及び／または予防薬の濃度は、組成物に使用される治療薬及び／または予防薬の吸光係数、及び例えば、波長２６０ｎｍでの吸光度と、例えば、波長３３０ｎｍでのベースライン値との差に基づいて算出することができる。
【０６６０】
ＲＮＡが含まれるナノ粒子組成物の場合、ＱＵＡＮＴ−ＩＴＴＭ  ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ナノ粒子組成物によるＲＮＡの封入を評価することができる。ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で、約５μｇ／ｍＬの濃度に試料を希釈する。希釈試料５０μＬをポリスチレン９６ウェルプレートに移し、ＴＥ緩衝液５０μＬまたは２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液５０μＬのいずれかをウェルに添加する。プレートを３７℃の温度で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、この溶液１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、例えば約４８０ｎｍの励起波長、及び例えば約５２０ｎｍの発光波長で測定することができる。各試料の蛍光値から試薬ブランクの蛍光値を差し引き、インタクトな試料（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００無添加）の蛍光強度を、破壊された試料（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により起こる）の蛍光値で除算することにより、遊離ＲＮＡの比率を決定する。
【０６６１】
有機性供給源ｍＲＮＡの一般的な手順
細胞への治療薬及び／または予防薬の送達に使用するための安全かつ有効なナノ粒子組成物を調べるために、一連の配合物を調製し、これを試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分中の特定の構成要素及びその比率を最適化する。ナノ粒子は、マイクロ流体力学またはＴ混合など、２種の流体流の混合プロセスを用いて作製することができる。流体の一方は、治療薬及び／または予防薬（すなわちｍＲＮＡ）ならびに脂質成分（すなわち、イオン化／カチオン性脂質、構造脂質、リン脂質／ヘルパー脂質、ＰＥＧ脂質）を含有する有機性のもの、もう一方は脂質ナノ粒子の形成を促進する緩衝水溶液である。
【０６６２】
エタノール中で有機可溶性ｍＲＮＡ（本明細書に記載の通り調製）を標準的な脂質混合物と共溶解すると、機能性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を生成することができる。脂質組成物及びｍＲＮＡの有機性供給源溶液は、エタノール中約５０ｍＭの濃度の、本明細書に記載の式のいずれかに従う脂質、リン脂質（ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能）、ＰＥＧ脂質（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール、別名ＰＥＧ−ＤＭＧ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能、または本明細書に記載の式のうち１つに従うＰＥＧ脂質）、及び構造脂質（コレステロールなど、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）を、約０．０５〜０．５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｍＲＮＡと混合することにより調製することができる。溶液は、例えば、−２０℃で冷蔵して保存する必要がある。目的とするモル比が得られるように脂質を混合し、水及び／またはエタノールで希釈して、最終脂質濃度を約５．５ｍＭ〜約２５ｍＭにする。
【０６６３】
治療薬及び／または予防薬（すなわち、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）と脂質成分とが含まれるナノ粒子組成物は、有機性供給源溶液と水溶液（すなわち、酢酸緩衝液５〜１０ｍＭ、ｐＨ約５．０）を約１：１〜約５０：１の体積比で混合することにより調製する。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体系システムを使用して、約１０ｍｌ／分〜約１８ｍｌ／分の流速で有機溶液を水溶液に急速注入すると、水とエタノールの比が約１：１〜約４：１の懸濁液を生成することができる。
【０６６４】
ナノ粒子組成物を透析により処理すると、エタノールを除去し、緩衝液交換を行うことができる。配合物は、分子量カットオフが１０ｋＤであるＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、一次産物の２００倍の体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４により２回透析してもよい。最初の透析を室温で３時間実施し、その後、配合物を４℃で一晩透析してもよい。得られたナノ粒子懸濁液は、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通してガラスバイアルに濾過し、圧着封止により密閉することができる。通常、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が得られる。
【０６６５】
上記の一般的な方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘発する。Ｔ混合及び直接注入、ならびに回転ディスクまたは高スループット混合による撹拌を含むがこれらに限定されない代替プロセスを使用して、同様のナノ沈殿を達成することができる。エタノール供給源中の有機可溶性ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ  ＬＮＰのプロセス効率、再現性、及び拡張性を改善させる可能性を有する。概ね、標準的な脂質混合物を含む有機性（すなわちエタノール）供給源ｍＲＮＡの可能性は高く、それには混合の簡素化、付着物の低減、及び組成の柔軟性が挙げられる。混合の簡素化に関しては、粒子形成時に水相からｍＲＮＡを抽出する必要がない。そのため、従来の界面活性剤と混合エネルギー技術によるサイズ制御を向上させることができる。予測される付着物の低減は、粒子形成時の水／エタノール界面でのｍＲＮＡ沈殿の防止に関するものである。組成の柔軟性に関しては、製剤化プロセス時のｍＲＮＡ分画の排除により、特にＰＥＧ脂質などの油／水界面種に対して、賦形剤の柔軟性が増加するはずである。これらの方法はさらに、ＬＮＰ表面修飾安定剤の後挿入への依存度を低減する可能性と、代替有機溶媒及び溶媒比の柔軟性を有する。
【０６６６】
【化９０】
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【０６６７】
【化９１】
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【０６６８】
【化９２】
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【０６６９】
【化９３】
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【０６７０】
中間体塩形態を通過するｍＲＮＡの活性を評価するために、疎水性ルシフェラーゼｍＲＮＡ有機性供給源を使用して、ナノ沈殿により、標準的な脂質組成物からＬＮＰを生成した。撹拌バイアルまたはＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体混合装置での単純混合を使用して、製剤を作製することができる。標準的なＬＮＰ脂質混合物を含むエタノール供給源ＴＢＡ−ｍＲＮＡは、様々な組み合わせにわたり、高封入効率と極めて均一なサイズを示す機能性粒子を形成した（表１）。ナノ沈殿粒子のクライオ画像は、比較的粗雑な混合手法を使用している場合でも、明瞭な多層構造を備えた、明確で極めて均一な粒子構造を示している（図２）。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合プロセスを従来の水性供給源ｍＲＮＡまたは有機エタノール供給源ＴＢＡ−ｍＲＮＡと比較すると、同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が観察された（図３及び図４）。
【０６７１】
【表１】
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【０６７２】
有機性ｍＲＮＡ供給源のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）混合手順
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、マイクロ流体力学混合チャンバー（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標））を使用して、緩衝水溶液（酢酸緩衝液６．２５ｍＭ、ｐＨ５．０）と、有機性供給源ｍＲＮＡ（約０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬ）、カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、及びＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧ）（４８：４０．５：１０：１．５モル比）を含有するエタノール溶液とを３：１の体積比で混合して形成することができる。得られたＬＮＰ含有溶液は、４℃で４０００ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）により透析し、１８時間かけて２回交換することができる。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量アッセイ、及び動的光散乱（ＤＬＳ）法による粒子径測定を使用して、回収したナノ粒子の利用可能なｍＲＮＡについて試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００ｋＤＡ  ＭＷＣＯ、４℃）を使用して粒子を濃縮した。濃縮後、試料を濾過した（０．２μｍ）。
【０６７３】
有機性供給源ｍＲＮＡ手順のＴ混合手順
カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ脂質をモル比５０：３８．５：１０：１．５で含有する脂質ストックをベンジルアルコール／エタノールに溶解したｍＲＮＡと混合した。脂質を含有する有機性供給源ｍＲＮＡをシリンジに充填し、ＰＥＥＫ  Ｔ接合部を使用して酢酸ナトリウムと体積比３：１で混合した。５ｍｇスケールの最初のＴ混合バッチは、ＴｅｃｈＤｅｖ装置を使用して正常に実行された。Ｔ混合生成物（ＴＭＰ）をインライン希釈し、目的とする最終ｐＨに調整し、ｍＲＮＡを充填した脂質ナノ粒子を濃縮し、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより残留エタノールを除去した。
【０６７４】
大規模なＬＮＰバッチを評価し、封入効率の改善による付着物の低減を検証するためにＴ混合プロセスを開発した。Ｔ混合プロセスの簡潔な模式図及び概要を図５に示している。簡潔には、本明細書に記載の通り調製した有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）Ｌｕｃ−ＴＢＡ  ｍＲＮＡ、イオン化脂質１（５０ｍｏｌ％）、ＤＳＰＣリン脂質（１０ｍｏｌ％）、コレステロール構造脂質（３８．５ｍｏｌ％）、及びＰＥＧ−ＤＭＧ  ＰＥＧ脂質（１．５ｍｏｌ％）を成分に含めた。プロセスのパラメーターには、６０ｍＬ／分のｍＲＮＡ流、２０ｍＬ／分の脂質流、ｐＨ調整前の３０分間の保持、及び５重量％、０．１ｍＬ／ｓのｐＨ調整を含めた。粒子をより迅速に固体化させるとともに、混合中に有機相を脱水するために、水：エタノール比及び有機溶媒を含むさらなる変更を設定に加えることができる。最終的な脂質ナノ粒子製剤について、一貫した望ましい粒径測定値及び封入効率値（ＥＥ％、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ）が得られ（表２）、追加のアッセイで算出した封入値との優れた相関が認められた。低温電子顕微鏡（クライオＥＭ）では、ほぼ均一な粒子形態が観察された（図６）。
【０６７５】
【表２】
2022501367.tif 000097
【０６７６】
有機性供給源ｍＲＮＡの９６ウェルプレート混合手順
有機可溶性ｍＲＮＡにより、ストリンジェントな混合環境の必要性が低下する。迅速な平行混合及び精製により、製剤スクリーニングの幅が大幅に増加する可能性がある。別の有機可溶性ｍＲＮＡを供給源とした粒子製剤には、粒子の生成にハイスループット混合を用いた。この方法では、同じ組成を有する個々の製剤を調製した。有機可溶性ｍＲＮＡをエタノール相に溶解し、９６ウェル形式で単純混合することにより粒子を生成した。各粒子組成は同一であり、５０μｇのｍＲＮＡを含有した。形成後、粒子製剤をまとめてプールし、ＰＢＳにより透析することができる。
【０６７７】
このプロセスのＬＮＰは、８００ｒｐｍでの回転ディスク撹拌を使用する９６ウェルプレートミキサー（ＶＰ７１０Ｅ３）の撹拌ウェル内で形成した。簡潔には、０．４１２ｍＬの緩衝液（酢酸緩衝液６．２５ｍＭ、ｐＨ５．０）を各ウェルに加え、回転ディスク手法を使用して撹拌した。ｍＲＮＡ−ＴＢＡ塩（０．３６４ｍｇ／ｍＬ）と、カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、及びＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧ）（モル比５０：３８．５：１０：１．５）とを含有するエタノール溶液（０．１３７ｍＬ）を手動ピペットで撹拌水溶液に添加してＬＮＰを形成した。複製ウェル（Ｎ＝２０）を合一し、得られたＬＮＰ含有溶液を４０００ｍＬのＰＢＳ緩衝液により４℃で透析し、１８時間かけて２回交換した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量アッセイ及びＤＬＳによる粒子径測定を使用して、回収したナノ粒子の利用可能なｍＲＮＡについて試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００ｋＤＡ  ＭＷＣＯ、４℃）を使用して粒子を濃縮した。濃縮後、試料を濾過した（０．２μｍ）。最終的な脂質ナノ粒子製剤について、一貫した望ましい粒径測定値及び封入効率値（ＥＥ％、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ）が得られた（表３）さらに、９６ウェルプレートＬＮＰ製剤粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、個別ウェルとプールしたウェルのいずれにおいても、バイアル撹拌及びＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ製剤と同等である（図７）。加えて、有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）が平行混合粒子形成に最適であることが実証された（図８）。有機相のｍＲＮＡは、水相のｍＲＮＡよりも低エネルギー混合に適している。高エネルギー混合（すなわち、ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｅ，Ｇｉｌｓｏｎ）は、ｍＲＮＡ相に基づく粒子の違いを示さない。さらに、Ｌａｕｒｄａｎを利用した蛍光アッセイでは、水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合試料製剤と比較して、ハイスループット９６ウェルプレート混合及びＴ混合の有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）試料製剤の表面破壊が少ないことが示された。蛍光測定は、従来のＡＦＭ粒子と比較してＯＦＭ粒子に極性表面が少ないことを示唆している。
【０６７８】
【表３】
2022501367.tif 000098
【０６７９】
実施例３：有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）製剤化ＬＮＰ投与後のマウスにおけるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現
ｉｎ  ｖｉｖｏ製剤試験
様々なナノ粒子組成物が治療薬及び／または予防薬を標的細胞にいかに効果的に送達するかをモニターするために、特定の治療薬及び／または予防薬（例えば、修飾されたまたは天然に存在する、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）が含まれている異なるナノ粒子組成物を調製し、齧歯類集団に投与する。本明細書で提供されるような製剤を内包するナノ粒子組成物を含む単回用量をマウスに静脈内、筋肉内、動脈内、または腫瘍内投与する。場合によっては、用量をマウスに吸入させてもよい。用量規模は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。その場合、１０ｍｇ／ｋｇとは、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇの治療薬及び／または予防薬をナノ粒子組成物中に含む用量を表す。ＰＢＳを含む対照組成物を使用することもできる。
【０６８０】
ナノ粒子組成物をマウスに投与した際の、特定の製剤及びその用量の用量送達プロファイル、用量反応、及び毒性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、生物発光イメージング、またはその他の方法によって測定することができる。ｍＲＮＡが含まれるナノ粒子組成物について、タンパク質発現の時間経過を評価することもできる。評価のために齧歯類から採取される試料には、血液、血清、及び組織（例えば、筋肉内注射部位の筋肉組織及び内部組織）を含み得る。試料採取には、動物の犠牲死を伴う場合がある。
【０６８１】
ｍＲＮＡが含まれるナノ粒子組成物は、治療薬及び／または予防薬の送達に対する様々な製剤の有効性及び有用性の評価に有用である。ｍＲＮＡが含まれる組成物の投与によって誘導されるタンパク質発現レベルが高いほど、ｍＲＮＡ翻訳及び／またはナノ粒子組成物のｍＲＮＡ送達効率が高いことを表すと考えられる。非ＲＮＡ成分は翻訳機構自体に影響を与えるとは考えられないため、タンパク質発現レベルが高いほど、他のナノ粒子組成物またはその不在と比較して、所与のナノ粒子組成物による治療薬及び／または予防薬の送達効率が高いことを表すと見込まれる。
【０６８２】
本明細書に記載のナノ粒子組成物の有効性を、生物発光試験を用いて評価した。この試験では、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与または静脈内（ｉ．ｖ）投与したマウスにおいて、有機性供給源ＬＮＰ製剤化ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｍＲＮＡの発現を評価した。本試験では、標準的な水性供給源ＬＮＰ製剤と比較した、マウスにおける生体内分布の発現及び類似性を試験した。製剤は、イオン化脂質１と、有機可溶性ｍＲＮＡトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩を使用する本明細書に記載の方法によって生成された様々な有機可溶性ｍＲＮＡ供給源溶液とを含んでいた。ＬＮＰ製剤の２つの有機可溶性ｍＲＮＡ供給源粒子調製方法（Ｔ混合有機性供給源ｍＲＮＡ及び９６ウェルプレート混合有機性供給源ｍＲＮＡ）を、従来の水性ｍＲＮＡ  ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）ＬＮＰ製剤と比較した。筋肉内（ｉ．ｍ．）は０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の投与量、及び静脈内（ｉ．ｖ．）は０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の投与量で製剤をマウス（雌ＣＤ−１系統、６週齢、２０〜２２ｇ、ｎ＝１０）に筋肉内または静脈内投与した。投与の６時間後（ｎ＝５）及び２４時間後（ｎ＝５）に、全身ならびに肝臓、肺、脾臓、及び筋肉内投与された注射部位のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＶＩＳイメージングによりルシフェラーゼの発現を評価した。６時間（ｎ＝５）及び２４時間（ｎ＝５）で採血し、サイトカイン分析を行った。標準的な水性供給源ＬＮＰ製剤とＰＢＳ対照とを比較して評価した。
【０６８３】
標準的な水性ｍＲＮＡ供給源のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）による混合手順（比較対照）
比較対照プロセスは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）マイクロ流体混合を使用して生成された標準的な水性ｍＲＮＡ製剤であった。これは、標準的な水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）条件を用いた標準的なＬＮＰプロセスであった。水相にはｍＲＮＡが含まれており、これを酢酸緩衝液（ｐＨ５、６．２５ｍＭ）で緩衝した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）を使用して粒子を形成し、ＰＢＳに透析した。
【０６８４】
比較対照プロセスのための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、マイクロ流体力学混合チャンバー（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標））を使用して、ｍＲＮＡ（０．１２１ｍｇ／ｍＬ）の緩衝水溶液（酢酸緩衝液６．２５ｍＭ、ｐＨ５．０）と、カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、及びＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧ）（モル比４８：４０．５：１０：１．５）を含有するエタノール溶液とを３：１の体積比で混和して形成することができる。得られたＬＮＰ含有溶液を４℃で４０００ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）により透析し、１８時間かけて２回交換した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量アッセイ、及び動的光散乱（ＤＬＳ）法による粒子径測定を使用して、回収したナノ粒子の利用可能なｍＲＮＡについて試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００ｋＤＡ  ＭＷＣＯ、４℃）を使用して粒子を濃縮した。濃縮後、試料を濾過した（０．２μｍ）。
【０６８５】
有機性供給源ｍＲＮＡ手順のＴ混合手順
カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ脂質をモル比５０：３８．５：１０：１．５で含有する脂質ストックをベンジルアルコール／エタノールに溶解したｍＲＮＡと混合した。脂質を含有する有機性供給源ｍＲＮＡをシリンジに充填し、ＰＥＥＫ  Ｔ接合部を使用して酢酸ナトリウムと体積比３：１で混合した。５ｍｇスケールの最初のＴ混合バッチは、ＴｅｃｈＤｅｖ装置を使用して正常に実行された。Ｔ混合生成物（ＴＭＰ）をインライン希釈し、目的とする最終ｐＨに調整し、ｍＲＮＡを充填した脂質ナノ粒子を濃縮し、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより残留エタノールを除去した。
【０６８６】
有機性供給源ｍＲＮＡの９６ウェルプレート混合手順
第２の有機可溶性ｍＲＮＡを供給源とした粒子製剤には、粒子の生成にハイスループット混合を用いた。この方法では、同じ組成を有する２０の個々の製剤を調製した。有機可溶性ｍＲＮＡをエタノール相に溶解し、９６ウェル形式で単純混合することにより粒子を生成した。各粒子組成は同一であり、５０μｇのｍＲＮＡを含有した。形成後、粒子製剤をまとめてプールし、ＰＢＳにより透析した。
【０６８７】
このプロセスのＬＮＰは、８００ｒｐｍでの回転ディスク撹拌を使用する９６ウェルプレートミキサー（ＶＰ７１０Ｅ３）の撹拌ウェル内で形成した。簡潔には、０．４１２ｍＬの緩衝液（酢酸緩衝液６．２５ｍＭ、ｐＨ５．０）を各ウェルに加え、回転ディスク手法を使用して撹拌した。ｍＲＮＡ−ＴＢＡ塩（０．３６４ｍｇ／ｍＬ）と、カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、及びＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧ）（モル比４８：４０．５：１０：１．５）とを含有するエタノール溶液（０．１３７ｍＬ）を手動ピペットで撹拌水溶液に添加してＬＮＰを形成した。複製ウェル（Ｎ＝２０）を合一し、得られたＬＮＰ含有溶液を４０００ｍＬのＰＢＳ緩衝液により４℃で透析し、１８時間かけて２回交換した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量アッセイ及びＤＬＳによる粒子径測定を使用して、回収したナノ粒子の利用可能なｍＲＮＡについて試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与前に、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００ｋＤＡ  ＭＷＣＯ、４℃）を使用して粒子を濃縮した。濃縮後、試料を濾過した（０．２μｍ）。
【０６８８】
サイズ及びＰＤＩ値は、９６ウェルプレート混合及びプールにより調製されたものでも、全群で一貫性が見られた。さらに、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して測定したところ、全群で良好な封入が観察された。本試験に用いた製剤の特性を表４に要約する。
【０６８９】
【表４】
2022501367.tif 000099
【０６９０】
静脈内投与及び筋肉内投与された実験製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで良好に発現した。Ｔ混合製剤は、従来の水性供給源ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤と同等であった。９６ウェルプレート混合製剤は約１０分の１であったが、実施された混合の簡易性を考慮すると有望であった（図９、図１０、図１１Ａ〜１１Ｄ、図１２Ａ〜１２Ｄ、図１３Ａ〜１３Ｃ、図１４Ａ〜１４Ｄ、図１５、図１６、図１７Ａ〜１７Ｄ、図１８Ａ〜１８Ｄ、図１９Ａ〜１９Ｄ、図２０Ａ〜２０Ｄ、図２１Ａ〜２１Ｄ、及び図２２Ａ〜２２Ｄ）。
【０６９１】
筋肉内投与された有機性供給源製剤化ＬＮＰはすべて、全身イメージングにおいてルシフェラーゼ発現を示し、６時間目に最大発現ピークに達し、２４時間でシグナルが低下した（約１〜１．５ｌｏｇ）。Ｔ混合有機性供給源ｍＲＮＡトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩製剤は、標準的な水性供給源比較対照製剤と同等の発現が得られたが、９６ウェルプレート混合有機性供給源ｍＲＮＡトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩製剤は、全身イメージングでわずかに低い発現を示した（＜０．５ｌｏｇ）。試験した製剤はすべて、標準的な水性供給源の比較対照製剤と同等かまたはそれより低い、注射部位、肝臓、肺、及び脾臓の発現を示した。試験した製剤すべてにおいて、画像化された全組織において６時間目に発現がピークに達し、２４時間でシグナルの低下を示した。筋肉内処置したマウスにおけるタンパク質発現が、水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）と有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）（Ｔ混合）との間で同等であったことに加え、ＡＦＭ−ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ粒子製剤とＯＦＭ−Ｔ混合粒子製剤に同等のサイトカイン誘導も見られた（図２３）。タンパク質発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（初代マウス肝細胞における試験）とｉｎ  ｖｉｖｏデータとの間で良好な相関関係を保持していた（図２４）。水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）試料と有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）（Ｔ混合）試料は、各濃度で同様の発現を示している。有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）（９６ウェル）試料は、タンパク質発現に約８分の１の減少を示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の全体的な傾向はｉｎ  ｖｉｖｏデータと十分に一致している。
【０６９２】
実施例４：エタノールに交換され、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）により可溶化された、凍結乾燥しない様々な有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）塩からの脂質ナノ粒子の調製
新しい有機可溶性ｍＲＮＡプロセスを評価するために、凍結乾燥不要なタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）プロセスを開発した。カチオン交換による変換をタンジェンシャルフローフィルトレーションによって実施した後、タンジェンシャルフローフィルトレーションによりエタノールに交換した。このプロセスは、凍結乾燥した乾燥粉末を溶解する際のエタノール溶液中の任意のベンジルアルコールを不要にするために設計された。加えて、この設計のプロセスにより、水溶性から有機可溶性ｍＲＮＡへの転換時間を短縮することが可能である（数日に対して数時間）。さらに、これらのプロセスにより、凍結乾燥／再構成手順を使用する可溶性ｍＲＮＡの生成を困難にすることが実証されている低疎水性カチオン（すなわち、トリメチルアミン）を利用しやすくなる。タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を使用して調製された、様々な有機性ｍＲＮＡ塩［トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、及びトリブチルアミン（ＴＢＡ）］の比較を行った。水相として酢酸緩衝液（６．２５ｍＭ、ｐＨ５）を使用した。脂質混合物としてイオン化脂質１／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ（モル比５０：１０：３８．５：１．５）を使用した。単純な撹拌プレートベンチトップのバイアル混合（約１０００ｒｐｍ）により脂質ナノ粒子を調製し、濾過せずに１倍ＰＢＳにより透析した。粒子の形成、透析、及び濃縮後に動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。
【０６９３】
トリブチルアミン（ＴＢＡ）塩、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）塩、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）塩への変換
それぞれトリブチルアミン、トリプロピルアミン、またはトリエチルアミンと酢酸をモル比１：１（すなわち、それぞれ最終濃度１００ｍＭ）で混合し、脱イオン水を加えて体積を調整することにより、１００ｍＭ酢酸トリブチルアンモニウム（ＴＢＡＡ）、酢酸トリプロピルアンモニウム（ＴＰＡＡ）、または酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）の水溶液を調製した。完全に溶解すると、溶液のｐＨは約６．０〜６．５になると予想された。次に、ストックを脱イオン水で１０ｍＭの作用濃度に希釈した。前処理したｍＲＮＡをタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）装置の容器に加え、１０ｍＭのＴＢＡＡ、ＴＰＡＡ、またはＴＥＡＡで約５倍に希釈した。冷却ＴＦＦシステムで約１０分間再循環させながら、ｍＲＮＡをＴＢＡＡ、ＴＰＡＡ、またはＴＥＡとインキュベートした。次に、ｍＲＮＡを追加１０透析濾過容量の１０ｍＭ  ＴＢＡＡでさらに洗浄した。ｍＲＮＡ−ＴＢＡ、ｍＲＮＡ−ＴＰＡ、またはｍＲＮＡ−ＴＥＡを２０透析濾過容量で洗浄することにより無水エタノールに交換した後、エタノール中のｍＲＮＡ−ＴＢＡ、ｍＲＮＡ−ＴＰＡ、またはｍＲＮＡ−ＴＥＡを回収した（概ね、約０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度）。
【０６９４】
有機性供給源ｍＲＮＡのバイアル混合手順
有機相には、カチオン性脂質（イオン化脂質１）、構造脂質としてのコレステロール、リン脂質としてのヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、及びＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧ）（モル比５０：３８．５：１０：１．５）と、エタノール中の有機可溶性ｍＲＮＡ塩（ＴＥＡ、ＴＰＡ、またはＴＢＡ塩形態のｍＲＮＡ０．３７ｍｇ／ｍＬ）が含まれた。水相には６．２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０が含まれた。ナノ沈殿によりＬＮＰを形成した。磁気撹拌棒を用いて１０００ｒｐｍで撹拌しながら、体積比３：１（水性対有機性）で、水性緩衝液を入れたバイアルに有機相を添加した。得られたＬＮＰ含有溶液を４℃で４０００ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）により透析し、１８時間かけて２回交換した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量アッセイを使用して、回収したナノ粒子の利用可能なｍＲＮＡについて試験し、ＤＬＳにより粒子径測定を実施した。遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００ｋＤａ  ＭＷＣＯ、４℃）を使用して粒子を濃縮した。
【０６９５】
バイアル混合では、サイズは比較的均一で約１００ｎｍのままである（図２５及び図２６）。さらに、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して決定した封入効率（％ＥＥ）は、すべての塩形態で高いままであり（図２７）、％ＥＥの傾向は、Ｒｉｂｏ＊アッセイでの測定を維持したが、絶対値の低下を示した。
【０６９６】
実施例５：有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）による生理学的ｐＨ製剤及び水溶液の柔軟性
生理学的ｐＨ付近での脂質ナノ粒子製剤の挙動を調べるために、水相としてＴｒｉｓ／スクロース（ｐＨ約７．３）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ８％スクロース（ｐＨ約７．４）、またはグルコース（５％ｗ／ｖ、ｐＨ約４．５）のいずれかを使用した粒子形成について、ｍＲＮＡ−ＴＢＡ、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／イオン化脂質１脂質混合物の有機性（ＯＦＭ）供給源ストックと水性（ＡＦＭ）供給源ストックとを比較する試験を実施した（表５）。形成直後にＤＬＳで評価した粒子径はすべて１５０ｎｍを超えており、多分散性が良好である。このような単純な混合手法により、適度な封入効率、サイズ、及び多分散性が達成された。グルコース中で良好なＥＥ％が維持される理由は、ｐＨの低さによると思われる（図２８）。加えて、粒子を１倍ＰＢＳにより透析し、透析後にＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用してｍＲＮＡ封入を再評価した。
【０６９７】
【表５】
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【０６９８】
実施例６：ベッドサイド製剤化脂質ナノ粒子のパイロットｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ベッドサイド製剤としての用途可能性について、簡素化されたベンチトップナノ沈殿法（Ｋシリンジ混合）を使用して調製されたＬＮＰの筋肉内投与後のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を評価した。本試験には、有機可溶性ｍＲＮＡまたは標準的な水溶性ｍＲＮＡのいずれかを含有するイオン化脂質１製剤を含めた。加えて、一部の製剤では、初期ｐＨ調整を必要とせずに封入を促進するエチルラウロイルアルギネート（ＥＡ−１）を使用した。本試験では、開示製剤と標準的なイオン化脂質１  ＬＮＰ製剤の発現プロファイルを比較した。ベッドサイド用途であるため、このような製剤は残留溶媒を含有しており、低ｐＨ（約５）で注入した。設計された試験には、２μｇ用量（約０．１ｍｐｋ）で筋肉内（ＩＭ）処置された雌Ｃｄ−１マウス（群あたりｎ＝８）を加えた。標準的な製剤には、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５）を含め、測定値は、注射部位の臨床観察、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡ（３時間、６時間、２４時間）、及びサイトカインレベル（６時間）であった。シリンジ型での容量混合であるため、水性：有機性比４：１で粒子を形成した。有機性供給源ｍＲＮＡ（ＯＦＭ）には、水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）とは対照的に、凍結乾燥されたｈＥＰＯ  ＴＢＡ及びＤＭＳＯが含まれた。ＥＡ−１ＤＭＳＯはＮ：Ｐ＝２で組み込まれた。ベッドサイド混合群はすべて、投与の約２４時間前に調製した。対照製剤（１）は、標準的な前精製手順（すなわち、投与前のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ混合及び透析）を使用して処理した。ベッドサイド製剤は、混合後にそれ以上の処理または精製をせずに投与した。ベッドサイド製剤はすべて、ｉｎ  ｖｉｖｏで良好な性能を示し、ｈＥＰＯ発現はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ対照と同等である（図２９及び図３０を参照）。
【０６９９】
【表６】
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【０７００】
群２及び群３の凍結乾燥ＴＢＡ塩、及び群３及び群５のＥＡ−１を溶解するために、少量のＤＭＳＯが必要であった。今後の研究では、このＤＭＳＯを回避することもできる。ＤＭＳＯストック中１００ｍｇ／ｍＬのＥＡ−１；ＤＭＳＯストック中４．２ｍｇ／ｍＬのｈＥＰＯ  ＴＢＡを前提とし、動物体重０．０２ｋｇにｍＲＮＡ２μｇ用量を基準として値を算出した。群２〜５は、投与前に約１．７５倍に希釈した。群２〜５は、投与濃度で約１１％のエタノールを含有する。群２及び４は、６．２５ｍＭ酢酸塩８％スクロース、ｐＨ５で希釈した。群３及び５は、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ８％スクロース、ｐＨ７．４で希釈した。
【０７０１】
要約すると、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒで混合した対照粒子と比較して、ポイントオブケア（「ベッドサイド」）で製剤化したＬＮＰすべてにおいて良好なｈＥＰＯ発現を示した。インライン静的混合を備えたデュアルシリンジ装置は、良好な粒子特性（サイズ、％ＥＥ、及びＰＤＩ）を有するＬＮＰを生成した。有機性及び水性のｍＲＮＡ供給原料はいずれもｉｎ  ｖｉｖｏで奏功した。粒子及びｍＲＮＡの物理的安定性は、５℃で２４時間にわたり良好である。エチルラウロイルアルギネート（ＥＬＡ）の添加により、有機性及び水性のｍＲＮＡの生理学的ｐＨ条件下での製剤化が可能であった。さらに、残留有機溶媒レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現に悪影響を及ぼさなかった。
【０７０２】
加えて、ＬＮＰ製剤及び生物学的性能に混合が及ぼす影響を検討し、脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ性能に対する混合厳密性の影響がｉｎ  ｖｉｖｏ試験と一致することを確認した。設計された試験には、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ（５０：１０：３８．５：１．５）、Ｎ：Ｐ５．８が含まれる標準的な製剤を含めた。ＯＦＭはＥｔＯＨ中のｈＥＰＯ  ＴＥＡ塩であり、ＡＦＭは未処理のｈＥＰＯであった。有機溶媒はエタノールであり、水溶液は６．２５ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５であり、シリンジ型の容量混合により、水性：有機性比４：１で粒子を形成した。処理には、１倍ＰＢＳでの透析、遠心濾過による濃縮、及び０．２μｍフィルター処理が含まれていた。混合手段はすべて、サイズが良好で％ＥＥが高い（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）粒子を生成し、ＡＦＭ粒子は、ＯＦＭと比較して直径がわずかに小さくなる傾向がある。ｈＥＰＯの発現は、初代マウス肝細胞で試験し、３つの混合技術すべてについて、ＡＦＭはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＯＦＭより優れていた。Ｋシリンジ及びＬシリンジの混合でのＡＦＭの発現は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ対照の発現と同等であり、これらの装置は今後の研究にとって理想的となる（図３１、図３２、図３３、及び図３４）。
【０７０３】
【表７】
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【０７０４】
実施例７：ｐＨ５対ｐＨ７．４での種々のＮ：Ｐによる投与
４種の固有なベッドサイドＡＦＭ製剤は、ＡＦＭを使用して、ｐＨ５で水性：有機性４：１で静的混合するナノ沈殿により生成した。各ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ製剤を、ｐＨ５の酸性ナノ沈殿時、及びＰＢＳによる１倍ｐＨ７．４への中和後に投与した。対照製剤も中性ｐＨで投与した。表８は、ナノ沈殿中のエタノール相の脂質濃度、ＰＥＧ２ＫＤＭＧ比率、Ｎ：Ｐ比、及び水相のｐＨを示している。脂質ストック濃度が高いほど、産出ｍＲＮＡ濃度が高くなり、ベッドサイド環境で獲得可能な用量が増加する。群２及び群３の例示的な組成は、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５であった。群４及び群５の比は、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３９．５：０．５であった。群２〜９ではナノ沈殿後の精製は実施しなかった。性能への影響を決定するために、製剤６〜９に対するＮ：Ｐ比を調整した。製剤は２０時間５℃に保持し、投与前に特性決定した。粒子の特性を表８に詳述する。
【０７０５】
用量調製希釈剤は、目的とするｐＨで動物あたり２μｇのｍＲＮＡ用量になるように注射前の試料を希釈する際に使用される緩衝液に相当する。
【０７０６】
【表８】
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【０７０７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、動物あたり２μｇでＩＭ投与した雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）を使用して実施した。６時間でサイトカインを分析し、６時間と２４時間でｈＥＰＯレベルを測定した（図３５〜３８）。ＰＢＳでｐＨ７．４に中和した製剤は、全試験群にわたり、ｐＨ５で投与した製剤よりも多くのｈＥＰＯを発現した。この傾向は、６時間と２４時間いずれの時点でも維持された。サイトカインの減少は、ＩＰ１０を除き中和製剤でも観察された。群１０は１倍ＰＢＳである。製剤の投与ｐＨ及びＮ：Ｐ比を比較する、６時間でのＣＤ−１マウスからのサイトカイン応答を図３９Ａ〜３９Ｃに示す。
【０７０８】
実施例８：中性ｐＨ製剤の比較
実施例７で観察された投与ｐＨの影響では、水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）を用いた中性ｐＨ投与が与える利点が顕著であった。酸性製剤の手順には、使用場所またベッドサイドでの使用を複雑にする追加の中和工程が必要になる。ｐＫａ値がｐＨ７．４を超えるカチオンは、ナノ沈殿時に酸性化する必要がなく、投与前の中和が不要になる。中性ｐＨ製剤に使用されるＥＡ−５及びＥＡ−１３カチオンを図４０に示す。
【０７０９】
ＬＮＰは、実施例７に記載の条件下、ベッドサイド静的混合手法（群２〜５）を使用して生成した。製剤の詳細を、０時間時点及び２０時間５℃に保持した後の特性データとともに表９に記載する。雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）に２μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを投与し、６時間でサイトカインを、６時間と２４時間でｈＥＰＯを読み取った。ＬＮＰ対照を従来のナノ沈殿手順を使用して作製した。群４及び群５には、Ｎ：Ｐ５．８の従来のカチオン性脂質に加えて、ＥＡ−５またはＥＡ−１３のいずれかをリン酸に対して２電荷当量で添加した。
【０７１０】
【表９】
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【０７１１】
表１０の投与前に製剤を２０時間５℃に保持した。群２及び群３は同じｐＨ５のナノ沈殿物から生成し、群３は分離してＰＢＳでｐＨ７．４に中和した。投与前に再度、製剤を特性決定した。中性ｐＨの製剤希釈剤と一致するｔｒｉｓスクロース溶液も対照として投与した。
【０７１２】
【表１０】
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【０７１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、動物あたり２μｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをＩＭ投与した雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）を使用して実施した。６時間でサイトカインを分析し、６時間（図４１）と２４時間（図４２）でｈＥＰＯレベルを測定した。群３の製剤は投与前にｐＨ７．４に中和し、対して群４及び群６はｐＨ７．４で作製し、投与した。製剤化プロセス及び高ｐＫａ脂質の添加を比較する、６時間でのＣＤ−１マウスからのサイトカイン応答を図４３Ａ〜４３Ｃに示す。
【０７１４】
高ｐＫａ脂質の存在下、ｐＨ７．４で作製された製剤を含め、中性ｐＨで投与した製剤では発現が高いままであった。
実施例９：ＥＡ−ＩＩＩ群の直接ｐＨ製剤スクリーニング
追加の高ｐＫａ脂質（図４４）をスクリーニングして、水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）、中性ｐＨ、及びｍＲＮＡのベッドサイド製剤化を可能にするように設計された静的混合ベッドサイド製剤化手順に適した特性を決定した。実施例８に概説する中性ｐＨ製剤化条件を用いて、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを製剤化した。製剤モル比は、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５、またはイオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３９．５：０．５であり、ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧのレベルに応じて、ｍＲＮＡリン酸投入量に対して２電荷当量の高ｐＫａカチオン（図４４）を添加した。
【０７１５】
【表１１】
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【０７１６】
【表１２】
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【０７１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、動物あたり２ｕｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをＩＭ投与した雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）を使用して実施した。６時間（図４５）と２４時間（図４６）でｈＥＰＯの発現レベルを測定し、６時間でサイトカインを分析した（図４７Ａ〜４７Ｂ）。群９は１倍ＰＢＳ対照である。
【０７１８】
実施例１０：試験２８６９：ＣＭＶ例
中性ｐＨベッドサイドＡＦＭナノ沈殿技術を適用して、ワクチン用途におけるその有効性を検証した。五量体タンパク質複合体（５ｍＲＮＡ）とｇＢタンパク質（１ｍＲＮＡ）の両方をコードする６つの個別のｍＲＮＡで構成されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを使用した。
【０７１９】
全製剤は、同じ適切なカチオン性脂質を使用したが、製剤プロセスが異なっていた。群１及び群２は従来法で作製されたＬＮＰであり、従来のナノ沈殿法で製造され、業界標準に従って投与前に精製された。群３〜６は、静的混合ベッドサイドナノ沈殿プロセスを使用して作製し、投与前に精製しなかった。群３及び群４は、中和せずにｐＨ５で直接投与した。群５及び群６は、高ｐＫａ封入脂質として２電荷当量のＥＡ−１を添加することにより、中性ｐＨベッドサイド手順を使用して構築した。
【０７２０】
群３〜６の製剤モル比は、イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５、またはイオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧが５０：１０：３９．５：０．５であり、ＰＥＧ２Ｋ−ＤＭＧのレベルに応じて、群５及び群６に対して２電荷当量の高ｐＫａカチオンＥＡ−１を添加した。
【０７２１】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）に、２．５ｕｇ／用量のＣＭＶ  ｍＲＮＡをＩＭ投与した。用量は１日目と２２日目に投与した（図４８）。ＣＭＶ五量体とｇＢのＥＬＩＳＡを、２１日目と３６日目に実施した。ベッドサイド用量はすべて、投与の前日に新たに調製し、２４時間５℃に保持した。五量体及びｇＢの力価を測定するために、プライムの３週間後（２１日目）及びブーストの２週間後（３６日目）にマウスから採血した。
【０７２２】
【表１３】
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【０７２３】
【表１４】
2022501367.tif 000109
【０７２４】
投与２は、投与１と同様の方法で調製した。
【０７２５】
【表１５】
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【０７２６】
【表１６】
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【０７２７】
０時間及び２４時間で投与２について大規模な粒子数の測定を行った。０．８μｍ超の粒子を図４９、２μｍ超の粒子を図５０に示している。
五量体（図５１）及びｇＢタンパク質（図５２）のＥＬＩＳＡ力価は、酸性または中性のベッドサイドナノ沈殿プロセスで調製されたものを含め、全製剤にわたって免疫応答を示した。
【０７２８】
実施例１１：個別化ワクチン接種のためのベッドサイドナノ沈殿
ベッドサイド水性供給源ｍＲＮＡ（ＡＦＭ）ナノ沈殿は、患者固有のがんなどの個別化治療または他のワクチンに付随する時間及び費用を削減することができる。ベッドサイドナノ沈殿プロセスを使用して生成した製剤の生物学的性能を検証するために、公知のマウスエピトープ構築物を製剤化し、構築物特異的免疫応答について試験した。
【０７２９】
静的混合手法で作製した３つのベッドサイドナノ沈殿製剤を、同じｍＲＮＡ構築物を含有する標準製剤、及びｍＲＮＡを全く含まない空の脂質ナノ粒子製剤と比較した。酸性（ｐＨ５）と中性（ｐＨ７．４）両方のベッドサイド製剤を試験した。製剤には以下の組成を含んでいた。イオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧは、Ｎ：Ｐ５．８、及びＰＥＧレベルに応じて脂質モル比が５０：１０：３８．５：１．５または５０：１０：３９．５：０．５であり、中性ｐＨ製剤のｍＲＮＡリン酸に対して２電荷当量でＥＡ−１を添加した。脂質混合物に添加する前に、ＥＡ−１をＤＭＳＯに溶解した。投与時の最終ＤＭＳＯ濃度は０．１体積％未満であった。
【０７３０】
【表１７】
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【０７３１】
雌Ｂｌ／６マウスに、５ｕｇ／用量（２．５ｕｇ／４等分／用量に分割）を２回（１日目、８日目）ＩＭ投与した（図５３）。それぞれの希釈液を表１に示す。３つのクラスＩがん抗原（ＣＡ−Ａ、ＣＡ−Ｂ、及びＣＡ−Ｃ）（図５４）及び２つのクラスＩＩがん抗原（ＣＡ−Ｄ及びＣＡ−Ｅ）（図５５）について、各投与の６時間後にＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析によりサイトカインを読み取った。
【０７３２】
【表１８】
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【０７３３】
【表１９】
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【０７３４】
実施例１２：ベッドサイドナノ沈殿による、低量ＰＥＧ及びＰＥＧ非含有のＬＮＰ
ベッドサイドナノ沈殿手順に必要とされる安定時間域の短さにより、製剤でのＰＥＧのような立体安定剤の必要性が減少するかどうかを決定するために、ＰＥＧ含有量の低い、またはＰＥＧを投入しない脂質ナノ粒子を製剤化した。
【０７３５】
酸性（ｐＨ５条件）下、静的混合手法で作製したベッドサイドナノ沈殿製剤を標準製剤と比較した。製剤は酸性（ｐＨ５）希釈剤で投与するか、投与前にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で中和した。製剤には以下の組成、すなわちイオン化脂質１：ＤＳＰＣ：コレステロール：（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ置換）をＮ：Ｐ５．８、及び脂質モル比５０：１０：３９．５：０．５で含有した。３つのＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ代替物、Ｂｒｉｊ  Ｃ２、Ｂｒｉｊ  Ｏ２、及びセチルアルコールをスクリーニングした。投与前に最終エタノール濃度を約８体積％に希釈した。各群の製剤の内容と用量希釈液を、粒子特性データとともに表に示す。
【０７３６】
【表２０】
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【０７３７】
雌ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）に０．５ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼｍＲＮＡをＩＶ投与し、６時間で、全身（図５６）、及びｅｘ  ｖｉｖｏの肝臓（図５７）、脾臓（図５８）、及び肺（図５９）を読み取った。ＰＢＳを対照群として投与した。
【０７３８】
実施例１３：ＥＡ−１３によるベッドサイドナノ沈殿Ｎ対Ｐ比のスクリーニング
ベッドサイドナノ沈殿製剤を、静的混合手法、及び封入を促進するための高ｐＫａ脂質としてＥＡ−１３を用いて作製した。製剤をナノ沈殿させ、中性ｐＨで投与した。ＥＡ−１３は、ｍＲＮＡリン酸に対して２電荷当量で各製剤に添加した。実施例１３の製剤に使用されるＥＡ−１３脂質を図６０に示す。
【０７３９】
雌Ｃｄ−１マウスに、２ｕｇのｈＥＰＯ  ｍＲＮＡをＩＭ投与し、ｈＥＰＯを６時間（図６１）及び２４時間（図６２）で、ＩＰ１０（図６３）及びＭＣＰ−１（図６４）のサイトカインを６時間で読み取った。
【０７４０】
【表２１】
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【０７４１】
【表２２】
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【０７４２】
等価物
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を添付の上記説明に記載している。本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料も本開示の実施または試験に使用することができるが、ここでは好ましい方法及び材料が記載されている。本開示の他の特長、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象物を包含する。特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に引用される特許及び刊行物はすべて、参照により組み込まれる。
【０７４３】
前述の説明は、例示の目的でのみ提示されており、開示された厳密な形態に本発明を限定することを意図するものではなく、本明細書に添付された特許請求の範囲により限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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