(57)【要約】  溶液からヘテロ二量体多重特異性抗体を精製するための方法が提供される。【選択図】図１
2022501357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性クロマトグラフィーによって混合物から多重特異性ＩｇＧ抗体を精製するための方法であって、前記方法が、
前記混合物から前記多重特異性ＩｇＧ抗体を、前記ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインに結合特異性を有する第１の親和性クロマトグラフィーカラム上に固定化すること、及び
１つ以上のポリオールを含む抗凝集組成物を含む溶出緩衝液を用いて前記第１の親和性クロマトグラフィーカラムから前記多重特異性抗体を溶出させて前記混合物から前記多重特異性抗体を精製すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上のポリオールが、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のポリオールが、約５％〜約２５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のポリオールが、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するグリセロールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グリセロールが、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のポリオールが、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するスクロースを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記スクロースが、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶出緩衝液が、約１０％ｗ／ｖのグリセロール及び約１０％ｗ／ｖのスクロースを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶出緩衝液が、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶出緩衝液が、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶出緩衝液が、約２５ｍＭの濃度のクエン酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶出緩衝液が、約３．２〜約４．２の範囲のｐＨを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶出緩衝液が、約３．４〜約３．８の範囲のｐＨを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶出緩衝液が、約３．６のｐＨを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出緩衝液が、約２５ｍＭのクエン酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、前記溶出緩衝液が、約３．６のｐＨを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記親和性クロマトグラフィーカラムが、前記ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶出緩衝液が、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される緩衝液を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出緩衝液が、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭの範囲の濃度の酢酸を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出緩衝液が、約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶出緩衝液が、約３．４〜約４．４の範囲のｐＨを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶出緩衝液が、約３．８〜約４．２の範囲のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶出緩衝液が、約４．０のｐＨを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶出緩衝液が、約５０ｍＭの酢酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、前記溶出緩衝液が、約４．０のｐＨを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性ＩｇＧ抗体の凝集を低減する方法であって、前記方法が、
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラム上、前記多重特異性ＩｇＧ抗体を固定化すること、及び
２５ｍＭのクエン酸、１０％ｗ／ｖのグリセロール、及び１０％ｗ／ｖのスクロースを含むｐＨ３．６の溶出緩衝液を用いて前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムから前記多重特異性ＩｇＧ抗体を溶出させること、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性ＩｇＧ抗体の凝集を低減する方法であって、前記方法が、
前記多重特異性ＩｇＧ抗体を、前記多重特異性ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合親和性を有するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラム上に固定化すること、及び
５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含むｐＨ４．０の溶出緩衝液を用いて前記親和性クロマトグラフィーカラムから前記多重特異性ＩｇＧ抗体を溶出させること、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記多重特異性ＩｇＧ抗体が、第１の結合単位及び第２の結合単位を含む、請求項１、請求項２５、及び請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の結合単位が、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の結合単位が、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の結合単位が、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含み、前記第２の結合単位が、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の結合単位が、腫瘍関連抗原に対する結合親和性を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の結合単位が、エフェクター細胞に結合親和性を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の結合単位が、前記Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合親和性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記多重特異性ＩｇＧ抗体が、二重特異性ＩｇＧ抗体である、請求項１、請求項２５、及び請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７３４，５６６号、ならびに２０１８年１０月８日出願の米国仮特許出願第６２／７４２，８２１号の出願日の優先権の利益を主張し、これらの出願の開示内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、溶液からヘテロ二量体多重特異性抗体を精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、新たなクラスの重要なタンパク質治療薬である。ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原を認識し、それらに結合するように設計され、この設計の目的は、多くの場合、免疫エフェクター細胞を再標的化してがん細胞を死滅させることである。現在のところ、治療薬として認可されたＢｓＡｂは、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって認可されたものが２つ、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されたものが１つ存在する。ヘテロ二量体多重特異性抗体の精製では、捕捉のために従来のプロテインＡクロマトグラフィーを使用することが問題になることが多く、この原因の一部は、未精製のＢｓＡｂ混合物中にＦｃ含有産物バリアントが存在することにある。さらに、多量体タンパク質（抗体など）は凝集する傾向がより強く、このことが不純物レベルを顕著に高める一因となっている。したがって、産物に特定的な不純物（凝集体または分解産物）及び処理に関連する不純物（培地成分、ＨＣＰ、ＤＮＡ、精製において使用されるクロマトグラフィー媒体、エンドトキシン、ウイルスなど）を効率的に除去し、十分な量の正確かつ完全な多重特異性抗体が得られる精製方法を開発する必要がある。抗体を精製するための方法は、当該技術分野でさまざまなものが知られてはいるものの、凝集体及び複合体（例えば、プロセス由来の修飾または製造条件の結果として形成され得るもの）から多重特異性抗体を分離及び精製することができる代替のクロマトグラフィープロセスに対するアンメットニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の態様は、親和性クロマトグラフィーによって混合物から多重特異性ＩｇＧ抗体を精製するための方法を含み、この方法は、当該多重特異性ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインに結合特異性を有する第１の親和性クロマトグラフィーカラムに対して、当該混合物から当該ＩｇＧ抗体を固定化すること、及び１つ以上のポリオールを含む抗凝集組成物を含む溶出緩衝液を用いて第１の親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて当該混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約２５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、グリセロールは、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するスクロースを含む。いくつかの実施形態では、スクロースは、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約１０％ｗ／ｖのグリセロール及び約１０％ｗ／ｖのスクロースを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭの濃度のクエン酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．２〜約４．２の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．４〜約３．８の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭのクエン酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、溶出緩衝液は、約３．６のｐＨを有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーカラムは、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭの範囲の濃度の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．４〜約４．４の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．８〜約４．２の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約４．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、溶出緩衝液は、約４．０のｐＨを有する。
【０００８】
本発明の態様は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性ＩｇＧ抗体の凝集を低減する方法を含み、この方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムに対して多重特異性ＩｇＧ抗体を固定化すること、ならびに２５ｍＭのクエン酸、１０％ｗ／ｖのグリセロール、及び１０％ｗ／ｖのスクロースを含むｐＨ３．６の溶出緩衝液を用いてプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性ＩｇＧ抗体を溶出させること、を含む。
【０００９】
本発明の態様は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性ＩｇＧ抗体の凝集を低減する方法を含み、この方法は、多重特異性ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合親和性を有するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムに対して多重特異性ＩｇＧ抗体を固定化すること、及び５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含むｐＨ４．０の溶出緩衝液を用いて親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性ＩｇＧ抗体を溶出させること、を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、多重特異性ＩｇＧ抗体は、第１の結合単位及び第２の結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合単位は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の結合単位は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合単位は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含み、第２の結合単位は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１の結合単位は、腫瘍関連抗原に結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、第２の結合単位は、エフェクター細胞に結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、第２の結合単位は、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性ＩｇＧ抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体である。
【００１２】
こうした態様及び別の態様については、実施例を含めて、本開示の残りの部分においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のいくつかの実施形態によるＢｓＡｂ分子を示す。
【図２】ＢｓＡｂの非限定的な例を示す。この示される実施形態は、ＣＤ３結合アームと、第１のＶＨドメイン及び第２のＶＨドメインを含むＴＡＡ結合アームと、を含む。この示される実施形態では、第１のＶＨドメイン及び第２のＶＨドメインは同一のものであり、両方がＴＡＡに結合親和性を有する。
【図３】図２に示されるＢｓＡｂの活性形態及び不活性形態を示す。活性形態は、ヘテロ二量体（パネルＡ）であり、不活性形態には、ＴＡＡホモ二量体、半Ａｂ、ＣＤ３ホモ二量体、余剰軽鎖（ＬＣ）、及び凝集体が含まれる。
【図４】時間の関数として吸光度単位（ＡＵ）を示すＳＥＣ分析のグラフを示す。このグラフは、ＢｓＡｂヘテロ二量体のサイズが、ＣＤ３結合アームのみを含むＣＤ３ホモ二量体（図３のパネルＢに示されるもの）と同様であることを示す。
【図５】ＢｓＡｂヘテロ二量体、ＣＤ３ホモ二量体、及びＴＡＡホモ二量体が、異なる等電点（ｐＩ）を有することを示すＩＥＦゲル分析を示す。
【図６】ｐＨ３．６でのプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイルを示す。この結果は、溶出ピークが総積分面積の９６％を占めることを示す。ロード条件、平衡化条件、及び溶出条件が記載される。
【図７】時間の関数として吸光度単位（ＡＵ）を示すＳＥＣ分析のグラフを示し、ｐＨ３．６でのプロテインＡからの溶出後にＢｓＡｂ凝集体が存在することを実証している。緩衝液条件及び流速条件が記載される。
【図８】高分子量画分はＢｓＡｂ産物に対応することを確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】添加剤がプロテインＡから溶出されたＢｓＡｂの凝集を低減し得ることを実証する一連のグラフを示す。検討した添加剤には、マンニトール、グリセロール、スクロース、及びトレハロースが含まれ、これらについての検討をさまざまな組み合わせで行った。
【図１０】パネルＡは、ＣＨ１ドメインを含む活性なＢｓＡｂ分子を示し、パネルＢは、不活性なＴＡＡホモ二量体を示す。
【図１１】プロテインＡプール及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１（ＣＨ１−ＸＬ）プールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。この分析は、ＴＡＡホモ二量体がＣＨ１−ＸＬ素通り画分に存在することを実証している。
【図１２】プロテインＡによるＢｓＡｂの捕捉及び溶出のプロファイル（パネルＡ）と、ＣＨ１−ＸＬによるＢｓＡｂの捕捉及び溶出のプロファイル（パネルＢ）と、を比較したものである。プロテインＡからの溶出は、ｐＨ３．３で実施し、ＣＨ１−ＸＬからの溶出は、ｐＨ４．６で実施した。
【図１３】ＣＨ１−ＸＬによるＢｓＡｂの捕捉及び溶出のプロファイルを示し、ここではｐＨ４で溶出を実施した。この結果は、ＢｓＡｂが効率的に溶出され、総積分ピーク面積の９３％に相当することを実証している。
【図１４】時間の関数として吸光度単位（ＡＵ）を示すＳＥＣ分析のグラフを示し、ＣＨ１−ＸＬから溶出されたＢｓＡｂが含む凝集体が最小限にとどまることを実証している。ＣＨ１−ＸＬプールのＨＭＷ含量は少なく（２．２％）、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）から産物が効率的に結合分離されていた。
【図１５】ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィー樹脂の滞留時間及び動的結合容量を示す表である。この結果は、４分としたときに動的結合容量（ＤＢＣ）がプラトー（９．３ｍｇ／ｍＬ）に達することを実証している。
【図１６】ＢｓＡｂの製造プロセスに伴うさまざまな上流単位工程及び下流単位工程を示す流れ図である。
【図１７】ＢｓＡｂ精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施の際には、別段の指定がない限り、分子生物学の従来の手法（組換え手法を含む）、微生物学の従来の手法、細胞生物学の従来の手法、生化学の従来の手法、及び免疫学の従来の手法が用いられることになるが、これらの手法は、当該技術分野の技能の範囲である。そのような手法は、文献において完全に説明されており、そうした文献は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７及び定期的な更新版）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）、ならびにＵｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（２０１７）などである。
【００１５】
値の範囲が与えられる場合、別に文脈上明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間に存在する、下限値の１０分の１の単位までの各介在値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または介在値と、が本発明に包含されることが理解されよう。こうしたより小さな範囲の上限値及び下限値は、そのより小さな範囲に独立して含まれ得るものであり、こうした上限値及び下限値もまた、本発明に包含され、記載範囲において具体的に除外される任意の限界値の対象にもなる。記載範囲が限界値の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限界値のどちらか一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１６】
別段の指定がない限り、本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【００１７】
以下に続く説明では、本発明の理解がより完全なものとなるように、多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、こうした具体的な詳細のうちの１つ以上が与えられなくとも本発明を実施し得ることが、当業者には明らかであろう。場合によっては、当業者によく知られており、知見が豊富に存在する特徴及び手順については、本発明の理解を妨げることを避けるために記載されていないこともある。
【００１８】
特許出願及び刊行物を含めて、本開示を通じて引用される参考文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１９】
Ｉ．定義
「含む」は、記載の要素が組成物／方法／キットにおいて必要であるが、特許請求の範囲に含まれる組成物／方法／キットを形成させるためには他にも要素が含められ得ることを意図する。
【００２０】
「から本質的になる」は、記載の組成物または方法の範囲を、本発明の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えない指定の材料またはステップに限定することを意図する。
【００２１】
「からなる」は、特許請求の範囲で指定されない任意の要素、ステップ、または成分は組成物、方法、またはキットに含めないことを意図する。
【００２２】
本明細書で使用される「結合単位」という用語は、結合標的に結合する少なくとも１つの可変ドメイン配列（ＶＨ）を含むポリペプチドを指し、このポリペプチドは、関連する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含むことも含まないこともある。いくつかの実施形態では、結合単位は、重鎖のみの抗体の単一のＶＨドメインを含む。他の実施形態では、結合単位は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。
【００２３】
「精製された」抗体（例えば、二重特異性抗体）は、当該抗体の純度が高められており、その結果、当該抗体が、その天然環境中にそれが存在する場合、及び／または実験室条件の下で最初にそれが合成及び／または増幅された時点と比較して純度が高い形態で存在することを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味しない。「精製すること」または「分離すること」という用語は、本明細書で互換的に使用され、所望の分子（多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）など）及び１つ以上の不純物を含む組成物または試料から所望の分子の純度を高めることを指す。典型的には、所望の分子の純度は、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全または部分的に）除去することによって高められる。
【００２４】
本発明の方法に従って精製され得る抗体には、多重特異性抗体が含まれる。多重特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。「多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」という用語は、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびにより高次の独立した特異的結合親和性（より高次のポリエピトープ特異性、ならびに四価の抗体及び抗体断片など）を含む。「多重特異性」抗体には、具体的には、異なる結合実体の組み合わせを含む抗体、ならびに同じ結合実体を複数含む抗体が含まれる。「多重特異性抗体」、「多重特異性重鎖のみの抗体」、「多重特異性重鎖抗体」、及び「多重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、複数の結合特異性を有する抗体をすべて包含する。非限定的な例では、本発明に従って精製される多重特異性抗体には、具体的には、ＣＤ３タンパク質（ヒトＣＤ３など）及びＢＣＭＡタンパク質（ヒトＢＣＭＡなど）に免疫特異的に結合する抗体が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される「凝集体」という用語は、タンパク質凝集体（例えば、ホモ二量体）を指す。凝集体は、精製すべき多重特異性抗体及び／またはそのサブユニットの多量体（二量体、四量体、またはより高次の凝集体など）を包含し、例えば、高分子量凝集体となり得る。
【００２６】
本明細書で使用される「抗凝集組成物」は、２つ以上のタンパク質（例えば、多重特異性抗体またはそのサブユニット）の望ましくない会合を低減する組成物を指す。いくつかの実施形態では、抗凝集組成物は、１つ以上のポリオールを含む。
【００２７】
「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を有する物質であり、「ポリオール」には、糖（還元糖及び非還元糖）、糖アルコール、ならびに糖酸が含まれる。ポリオールの例としては、限定されないが、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びソルビトールが挙げられる。
【００２８】
「ロード密度」は、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットルで示される）と接触させる組成物の量（例えば、グラムで示される）を指す。いくつかの例では、ロード密度は、ｇ／Ｌで表現される。
【００２９】
「試料」は、より大きい量の材料の小さな部分を指す。一般に、本明細書に記載の方法による試験は、試料に対して実施される。試料は、典型的には、得られる組換えポリペプチド調製物を含む「混合物」から得られ、例えば、培養組換えポリペプチド発現細胞株（本明細書では「産生細胞株」とも称される）または培養宿主細胞から得られる。試料は、混合物（例えば、限定されないが、収集細胞培養液を含むもの）から得られるものであるか、精製プロセスにおけるある特定のステップの時点のプロセス中プールから得られるものであるか、または最終精製産物から得られるものであり得る。試料は、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、ならびに所望の分子（多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）など）と混ざって見られる混入種、デブリ、及び同様のものも含み得る。
【００３０】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、目的組換えポリペプチドまたは産物を発現させるための遺伝子を含むのではなく、導入（例えば、トランスフェクションによる導入）すべきそのような遺伝子のための受容宿主として働く。
【００３１】
本明細書に記載の「産物」という用語は、本発明の方法によって精製すべき物質（例えば、ポリペプチド（例えば、多重特異性抗体））である。
【００３２】
「重鎖のみの抗体」及び「重鎖抗体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、広い意味では、通常の抗体の軽鎖を含まない抗体を指す。重鎖のみの抗体については、例えば、ＷＯ２０１８／１１９２１５に記載されており、当該文献の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、天然に生じる可能性のある変異が少量存在し得ることを除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向化されている。さらに、通常の（ポリクローナル）抗体調製物が、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向化された異なる抗体を含むものであることとは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向化されている。本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって調製することができ、さらには、組換えタンパク質産生法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によっても調製することができる。
【００３４】
本明細書で使用される「インタクトな抗体鎖」は、全長可変領域及び全長定常領域（Ｆｃ）を含むものである。インタクトな「従来の」抗体は、分泌されるＩｇＧのインタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）ならびに重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し、こうした「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ定常領域（天然の配列を有するＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントであるＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、及び細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。定常領域バリアントには、エフェクタープロファイルが変化したもの、Ｆｃ受容体への結合が変化したもの、及び同様のものが含まれる。
【００３５】
ＩｇＧクラスに由来する抗体及びさまざまな抗原結合タンパク質は、その重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、異なるサブクラスのものとされ得る。抗体のＩｇＧクラスは、さらに４つの「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に分類され得る。ＩｇＧクラスの抗体に対応するＦｃ定常ドメインは、γ（ガンマ）と称され得る。さまざまなクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。Ｉｇ形態には、ヒンジ修飾形態またはヒンジなしの形態が含まれる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３−４０９０、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６−７２５６、ＵＳ２００５／００４８５７２、ＵＳ２００４／０２２９３１０）。いずれの脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つのタイプ（κ及びλと呼ばれる）のうちの一方に割り当てられ得る。本発明の実施形態による方法は、任意のサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（そのバリアント配列（本明細書にさらに記載される）を含む））のＩｇＧ抗体を対象として使用され得る。
【００３６】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然の配列を有するＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。エフェクター機能の例としては、限定されないが、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が受容体（例えば、ＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩＡ受容体、ＦｃγＲＩＩＢ１受容体、ＦｃγＲＩＩＢ２受容体、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体、ＦｃγＲＩＩＩＢ受容体、及び低親和性ＦｃＲｎ受容体）と相互作用することを必要とし、当該技術分野で知られるさまざまなアッセイを使用して評価され得る。「非機能化（ｄｅａｄ）」Ｆｃまたは「抑制化（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）」Ｆｃは、活性（例えば、血清中半減期の長期化に関するもの）を保持するように変異しているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないＦｃである。
【００３７】
「天然の配列を有するＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然の配列を有するヒトＦｃ領域には、例えば、天然の配列を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）、天然の配列を有するヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然の配列を有するヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、ならびに天然の配列を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然起源のバリアントが含まれる。
【００３８】
「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換（複数可）によって、天然の配列を有するＦｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然の配列を有するＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然の配列を有するＦｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中のアミノ酸が約１〜約１０個置換されたもの、好ましくは、約１〜約５つ置換されたものである。本明細書のバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然の配列を有するＦｃ領域との相同性及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域との相同性が少なくとも約８０％となり、最も好ましくは、それとの相同性が少なくとも約９０％となり、より好ましくは、それとの相同性が少なくとも約９５％となる。
【００３９】
バリアントＦｃ配列は、ＥＵインデックスでの２３４位、２３５位、及び２３７位（ＣＨ２領域中）に３つのアミノ酸置換を含むことで、ＦｃγＲＩへの結合が低減されたものであり得る（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３を参照のこと）。ＥＵインデックスでの３３０位及び３３１位（補体Ｃ１ｑへの結合部位中）の２つのアミノ酸置換は、補体結合を低減する（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照のこと）。ＩｇＧ２の２３３〜２３６位の残基、及びＩｇＧ４の３２７位、３３０位、及び３３１位の残基がヒトＩｇＧ１のものへと置換変換されると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが大幅に低減される（例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４を参照のこと）。ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８５７）は、本明細書では配列番号４３として提供される。ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）は、本明細書では配列番号４４として提供される。抑制化ＩｇＧ１については、例えば、Ｂｏｅｓｃｈ，ＡＷ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５−２７に記載されており、当該文献の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４０】
他のＦｃバリアントもあり得、こうした他のＦｃバリアントには、限定されないが、ジスルフィド結合の形成が可能な領域が欠失したもの、または天然のＦｃのＮ末端に位置するある特定のアミノ酸残基が除去されたものもしくは天然のＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたもの、が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、結合化合物のＦｃ位置の１つ以上は、ジスルフィド結合を除去するための変異をヒンジ領域中に１つ以上含み得る。さらに別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域全体が除去され得る。さらに別の実施形態では、結合化合物は、Ｆｃバリアントを含み得る。
【００４１】
さらに、アミノ酸残基を置換（変異導入）するか、欠失させるか、または付加して補体結合またはＦｃ受容体結合に影響を与えることによってエフェクター機能が除去または実質的に低減されるようにＦｃバリアントが構築され得る。例えば、限定されないが、欠失は補体結合部位（Ｃ１ｑ結合部位など）に導入され得る。免疫グロブリンＦｃ断片のそのような配列誘導体を調製するための手法は、国際特許公開公報第ＷＯ９７／３４６３１号及び同第ＷＯ９６／３２４７８号に開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化、及び同様のものによって修飾され得る。
【００４２】
Ｆｃは、天然の糖鎖を有する形態であり得るか、天然の形態と比較して糖鎖が増加した形態もしくは天然の形態と比較して糖鎖が減少した形態であり得るか、または非グリコシル化形態もしくは脱グリコシル化形態であり得る。糖鎖の増加、減少、除去、または他の改変は、当該技術分野で一般に使用される方法（化学法、酵素法など）によって達成されるか、または遺伝子操作された産生細胞株においてＦｃを発現させることによって達成され得る。そのような細胞株には、グリコシル化酵素を天然に発現する微生物（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）が含まれ得る。さらに、微生物または細胞は、グリコシル化酵素を発現するように操作され得るか、またはグリコシル化酵素が発現できないようにされ得る（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１（２００６）、Ｋａｎｄａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３０：３００（２００７）、Ｋｉｔａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２７）：１７８７２（１９９４）、Ｕｊｉｔａ−Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（２３）：１３８４８（１９８９）、Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ，ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：８４（２００７）、及びＷＯ０７／０５５９１６を参照のこと）。シアリル化活性が変化するように操作された細胞の一例として、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１遺伝子がチャイニーズハムスター卵巣細胞及びｓｆ９細胞に操作導入されている。したがって、こうした操作された細胞が発現する抗体は、外来遺伝子産物によってシアリル化される。複数の天然分子と比較して糖残基の量が改変されたＦｃ分子を得るためのさらなる方法には、当該複数の分子をグリコシル化画分及び非グリコシル化画分へと分離するものが含まれ、この分離は、例えば、レクチン親和性クロマトグラフィーを使用して行われる（例えば、ＷＯ０７／１１７５０５を参照のこと）。特定のグリコシル化部分が存在すると、免疫グロブリンの機能が変化することが示されている。例えば、Ｆｃ分子から糖鎖を除去すると、補体第１成分Ｃ１のＣ１ｑ部分への結合親和性が激減し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が減少または消失することによって、インビボで不要な免疫応答が誘導されなくなる。追加の重要な修飾には、シアリル化及びフコシル化が含まれる：ＩｇＧ中にシアル酸が存在することは、抗炎症活性と関連しており（例えば、Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：７６０（２００６）を参照のこと）、一方で、ＩｇＧからフコースを除去すると、ＡＤＣＣ活性が増進する（例えば、Ｓｈｏｊ−Ｈｏｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０：７７７（２００６）を参照のこと）。
【００４３】
代替の実施形態では、本発明に従って精製される結合化合物は、エフェクター機能が増進したＦｃ配列を有し得、この増進は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡへのその結合能力の向上及びＡＤＣＣ活性の増加によって生じる。例えば、ＦｃのＡｓｎ−２９７に位置するＮ結合型糖鎖にフコースが付加されると、ＦｃとＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用が立体的に妨害され、糖鎖工学によってフコースが除去されるとＦｃγＲＩＩＩＡへの結合が増加し得、この増加は、野生型ＩｇＧ１対照と比較してＡＤＣＣ活性が５０倍超に上昇するという結果となる。ＩｇＧ１のＦｃ部分にアミノ酸変異を導入することによるタンパク質工学によって、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合の親和性が増加したバリアントが複数得られている。注目すべきことに、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａという三重アラニン変異は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合及びＡＤＣＣ機能を２倍に増加させる。Ｓ２３９Ｄ／１３３２Ｅ（２×）バリアント及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（３×）バリアントでは、インビトロ及びインビボでＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性が顕著に上昇し、ＡＤＣＣ能力が増強されている。酵母ディスプレイによって同定された他のＦｃバリアントでは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合が改善され、マウス異種移植モデルにおける腫瘍細胞死滅が増進していることも示された。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＪＢＣ  ２８９（６）：３５７１−９０を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【００４４】
「Ｆｃ領域含有抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は除去される可能性があり、この除去は、例えば、抗体の精製の間に行われるか、または抗体をコードする核酸の組換え操作によって行われる。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有する抗体またはＫ４４７を有さない抗体を含み得る。
【００４５】
２つ以上の抗体の可変ドメインを組換えで融合させることによって多価人工抗体を産生させるための方法は、さまざまなものが開発されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド上の第１の抗原結合ドメインとポリペプチド上の第２の抗原結合ドメインとが、ポリペプチドリンカーによって連結される。そのようなポリペプチドリンカーの例は、限定されないが、ＧＳリンカーであり、このＧＳリンカーは、４つのグリシン残基の後に１つのセリン残基が続くアミノ酸配列を有し、この配列は、ｎ回繰り返す（ｎは、１〜約１０の範囲の整数（２、３、４、５、６、７、８、または９など）である）。そのようなリンカーの例としては、限定されないが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）（ｎ＝２）が挙げられる。他の適切なリンカーを使用することもでき、こうしたリンカーは、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５；６５（１０）：１３５７−６９に記載されており、当該文献の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４６】
「二重特異性三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」という用語は、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、３つのポリペプチドサブユニットから本質的になるか、または３つのポリペプチドサブユニットからなる抗体様分子を指すために本明細書で使用され、これらのポリペプチドサブユニットのうちの２つは、１つのモノクローナル抗体の重鎖１つ及び軽鎖１つ、もしくはそのような抗体鎖の機能性抗原結合断片（抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含む）、を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインが存在せず、ＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメイン及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分と、第２の抗原のエピトープに結合するか、または第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメイン（そのような結合ドメインは、抗体重鎖もしくは抗体軽鎖の可変領域に由来するか、または抗体重鎖もしくは抗体軽鎖の可変領域との配列同一性を有する）と、を含む重鎖のみの抗体を含むか、当該抗体から本質的になるか、あるいは当該抗体からなる。そのような可変領域の部分は、ＶＨ遺伝子セグメント及び／またはＶＬ遺伝子セグメントによってコードされるか、Ｄ遺伝子セグメント及びＪＨ遺伝子セグメントによってコードされるか、またはＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成されたＶＨＤＪＨ遺伝子セグメント、ＶＬＤＪＨ遺伝子セグメント、ＶＨＪＬ遺伝子セグメント、またはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。
【００４７】
ＴＣＡ結合化合物は、「重鎖のみの抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」を利用するものであり、本明細書で使用される「重鎖のみの抗体」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」は、重鎖定常領域のＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４は含むが、ＣＨ１ドメインは含まない一本鎖抗体を意味する。一実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインが短縮された重鎖抗体もまた、本明細書に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン及び少なくとも１つのＣＨドメイン（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ４ドメイン）から構成されるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖のみの抗体は、二量体の形態であり得、この二量体形態では、２つの重鎖がジスルフィドによって結合されているか、またはその他の様式で互いに共有結合もしくは非共有結合で結合されており、ポリペプチド鎖の間での適切な対形成を促進するための非対称界面をＣＨドメインの１つ以上の間に任意選択で含み得る。本発明の実施形態に従って精製すべき重鎖抗体は、ＩｇＧクラスに属する。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１サブクラス、ＩｇＧ２サブクラス、ＩｇＧ３サブクラス、またはＩｇＧ４サブクラスのものであり、具体的には、ＩｇＧ１サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプのもの（そのバリアント（本明細書にさらに記載される）を含む）である。
【００４８】
「エピトープ」は、結合化合物の抗原結合領域の結合相手である抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原は、異なるエピトープをいくつかまたは多く有し、多くの異なる結合化合物（例えば、多くの異なる抗体）と反応する。この用語は、具体的には、直線状エピトープ及び立体構造エピトープを含む。
【００４９】
本明細書で使用される「価」という用語は、抗体分子または結合化合物中の特定の結合部位数を指す。
【００５０】
「多価」結合化合物は、２つ以上の結合部位を有する。したがって、「二価」、「三価」、及び「四価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位が存在することを指す。したがって、本発明による方法によって精製される二重特異性抗体は、少なくとも二価のものであり、三価、四価、またはそれ以外の価数の多価のものであり得る。多種態様な方法及びタンパク質配置が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体、及び同様のものの調製に使用される。
【００５１】
本明細書で使用される「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相及び活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を実行する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞など）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を有する。例えば、単球及びマクロファージは、ＦｃＲを発現しており、特定の標的細胞死滅及び免疫系の他の成分への抗原提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。
【００５２】
「ヒトエフェクター細胞」は、受容体（Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなど）を発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載のように、その天然源（例えば、血液またはＰＢＭＣ）から単離され得る。
【００５３】
「免疫細胞」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されないが、骨髄系起源またはリンパ系起源の細胞を含み、こうした細胞は、例えば、リンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む）など）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞（好中球、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球など）である。
【００５４】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然の配列を有するＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントであるＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））の下方制御などが挙げられる。
【００５５】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後にそうした標的細胞を溶解させる細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性の評価には、インビトロのＡＤＣＣアッセイ（米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のものなど）が実施され得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的分子のＡＤＣＣ活性をインビボで評価するすることができ、例えば、動物モデル（Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示のものなど）において評価することができる。
【００５６】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で分子が標的を溶解させる能力を指す。補体活性化経路は、結合相手である抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）に対して補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始される。補体活性化の評価には、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のもの）が実施され得る。
【００５７】
「治療」及び「治療すること」という用語ならびに同様のものは、一般に、所望の薬理的効果及び／または生理的効果を得ること意味するために本明細書で使用される。こうした効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に阻止するという点で予防的であり得、及び／または疾患及び／または疾患に起因し得る有害作用を部分的もしくは完全に治癒させるいう点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳類における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患に罹りやすくあり得るが、それを有するとはまだ診断されていない対象における疾患の発症阻止、（ｂ）疾患の抑制、すなわち、その発症の抑止、または（ｃ）疾患の軽減、すなわち、疾患の退縮誘起、を含む。治療剤は、疾患または損傷の発生の前、間、または後に投与され得る。進行中の疾患の治療は、特に目的となるものであり、こうした場合、治療は、患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減するものである。そのような治療は、患部組織における機能が完全に失われる前に実施されることが望ましい。対象の治療は、疾患の兆候段階の間、場合によっては、疾患の兆候段階の後に実施され得る。
【００５８】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、治療の評価がなされており、及び／または治療されている哺乳類を指すために本明細書で互換的に使用される。一実施形態では、哺乳類は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、がんを有する個体、及び／または自己免疫疾患を有する個体、ならびに同様のものを包含する。対象はヒトであり得るが、対象には、他の哺乳類、具体的には、ヒト疾患の実験モデルとして有用な哺乳類（例えば、マウス、ラットなど）も含まれる。
【００５９】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効にすることを可能にする形態を有しており、そうした製剤が投与されると想定される対象に許容不可能な毒性を与える追加成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌されたものである。「医薬的に許容可能な」医薬品添加物（媒体、添加剤）は、用いられる活性成分を有効用量で与えるために対象哺乳類に合理的に投与可能なものである。
【００６０】
「滅菌」製剤は、無菌であるか、またはすべての生存微生物及びその胞子を含まないか、もしくは本質的に含まない。「凍結」製剤は、０℃未満の温度にある製剤である。
【００６１】
「安定」製剤は、そこに含まれるタンパク質の物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を保存時に本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保存時にその物理的安定性及び化学的安定性ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。保存期間は、一般に、製剤の意図される有効期間に基づいて選択される。タンパク質安定性を測定するための分析手法は、当該技術分野ではさまざまなものが利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ．Ａ  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０）（１９９３）において概説されている。安定性は、選択される期間、選択される温度で測定され得る。安定性は、さまざまな異なる方法で定性的及び／または定量的に評価することができ、こうした方法には、凝集体形成を評価するもの（この評価は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用し、濁度を測定し、及び／または目視による検証を行うことによって行われる）、陽イオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷の多様性を評価することによるもの、アミノ末端またはカルボキシ末端の配列を分析するもの、質量分析を行うもの、還元した抗体とインタクトな抗体とをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で比較するもの、ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析を行うもの、抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価するものなどが含まれる。不安定性は、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異などのうちの任意の１つ以上を伴い得る。
【００６２】
ＩＩ．詳細な説明
多重特異性抗体の精製方法
ヘテロ二量体多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を含む）の精製では、捕捉のためにプロテインＡクロマトグラフィーを使用することが問題になることが多く、この原因は、未精製のＢｓＡｂ混合物中に望ましくないＦｃ含有産物バリアント（例えば、望ましくないホモ二量体種）が存在することにある。さらに、多量体タンパク質（抗体など）は凝集する傾向がより強く、このことが不純物レベルを顕著に高める一因となっている。したがって、ＢｓＡｂのための製造プロセスの設計では、代替の親和性捕捉方法が必要である。本明細書では、プロテインＡクロマトグラフィー単位工程の特性及び能力特徴、ならびに代替の捕捉方法について論じられている。
【００６３】
本発明の実施形態による方法は、親和性クロマトグラフィー手順を使用して混合物から多重特異性抗体を精製することを含み、この精製は、第１の親和性クロマトグラフィーカラムを混合物と接触させること、第１の親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、第１の親和性クロマトグラフィーカラムを、抗凝集組成物を含む溶出緩衝液と接触させること、及び第１の親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【００６４】
他の態様では、本発明は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性抗体の凝集を低減する方法を提供し、この方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを、多重特異性抗体を含む混合物と接触させること、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを、２５ｍＭのクエン酸、１０％ｗ／ｖのグリセロール、及び１０％ｗ／ｖのスクロースを含むｐＨ３．６の溶出緩衝液と接触させること、及びプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【００６５】
さらに他の態様では、本発明は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性抗体の凝集を低減する方法を提供し、この方法は、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムを、多重特異性抗体を含む混合物と接触させること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムを、５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含むｐＨ４．０の溶出緩衝液と接触させること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【００６６】
本発明の方法は、複数の結合単位を含む多重特異性抗体の精製に使用され得る。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、第１の結合単位及び第２の結合単位を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合単位は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の結合単位は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む第１の結合単位と、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む第２の結合単位と、を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、重鎖のみの抗体である。重鎖のみの抗体については、例えば、ＷＯ２０１８／１１９２１５に記載されており、当該文献の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ＢｓＡｂは、ＩｇＧタイプの抗体であり、エフェクター機能活性を低減または増進する改変Ｆｃ領域を有するように操作されたサブクラスを含めて、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に由来するものである。本発明の実施形態によるＢｓＡｂは、任意の種に由来し得る。一態様では、ＢｓＡｂは、大部分がヒト起源のものである。いくつかの実施形態では、ＢｓＡｂは、ＩｇＧ４サブタイプのものであり、ＣＤ３と組み合わせて腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向化される（ＣＤ３−ＴＡＡ）。図１及び図２には、本発明の実施形態によるＢｓＡｂの非限定的な例が示される。図３には、不活性種及び活性種が示される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）のいずれの第１の結合単位も腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞に比較的限定されたものである一方で、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞に特有のものである。ＴＳＡ及びＴＡＡは、典型的には、細胞内分子の一部が主要組織適合遺伝子複合体の一部として細胞表面上に提示されたものである。腫瘍関連抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、及びＢＣＭＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体のいずれの第２の結合単位も、エフェクター細胞に結合する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、第２の結合単位は、ＣＤ３に結合する。
【００６９】
「ＣＤ３」という用語は、ヒトＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体を指す。ＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体は、６つの特徴的なポリペプチド鎖から構成される。これらのポリペプチド鎖には、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）、及び１つのＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ２０９６３）が含まれ、これらのポリペプチド鎖は、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖と結び付いている。「ＣＤ３」という用語は、記載がない限り、細胞（Ｔ細胞を含む）が天然に発現するか、またはそうしたポリペプチドをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡがトランスフェクションされた細胞上に発現し得る任意のＣＤ３バリアント、ＣＤ３アイソフォーム、及びＣＤ３種相同体を含む。
【００７０】
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という用語は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、及びＴＮＦＲＳＦ１７としても知られる）を指し、この抗原は、分化した形質細胞に選択的に発現する瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである。本明細書で使用される「ヒトＢＣＭＡ」という用語は、ヒトＢＣＭＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（その供給源または調製様式は無関係である）を含む。したがって、「ヒトＢＣＭＡ」は、細胞が天然に発現するヒトＢＣＭＡ、及びヒトＢＣＭＡ遺伝子がトランスフェクションされた細胞上に発現するＢＣＭＡを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＢｓＡｂは、構造的には三量体であり、この三量体では、一方のアーム（例えば、ＣＤ３結合アーム）は、完全ヒト重鎖及び完全ヒト軽鎖の両方を含み、もう一方のアーム（例えば、ＴＡＡアーム）（ＵｎｉＲａｔ（商標）技術から得られるもの）は、ヒト重鎖（ＣＨドメイン（例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ＣＨ１ドメインを含まないもの）に直接的に融合した１つ以上のＶＨドメインを有するもの）からなる。このＢｓＡｂは特有の構造を有するため、ヘテロ二量体産物のみが、ヒト重鎖のＣＨ１ドメイン（ＣＤ３結合アームの一部）を含む。
【００７２】
本明細書で使用される「ＣＤ３８」という用語は、細胞外酵素活性を有する１回膜貫通型のＩＩ型膜貫通タンパク質（ＡＤＰ−リボシルサイクラーゼ／サイクリックＡＤＰ−リボースヒドロラーゼ１としても知られる）を指す。「ＣＤ３８」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物種のＣＤ３８タンパク質を含み、具体的には、ヒトＣＤ３８ならびに非ヒト哺乳類のＣＤ３８を含む。本明細書で使用される「ヒトＣＤ３８」という用語は、ヒトＣＤ３８（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２８９０７）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（その供給源または調製様式は無関係である）を含む。したがって、「ヒトＣＤ３８」は、細胞が天然に発現するヒトＣＤ３８、及びヒトＣＤ３８遺伝子がトランスフェクションされた細胞上に発現するＣＤ３８を含む。「抗ＣＤ３８重鎖のみの抗体」、「ＣＤ３８重鎖のみの抗体」、「抗ＣＤ３８重鎖抗体」、及び「ＣＤ３８重鎖抗体」という用語は、ヒトＣＤ３８を含めて、本明細書の上部に定義されるＣＤ３８に免疫特異的に結合する本明細書の上部に定義される重鎖のみの抗体を指すために本明細書で互換的に使用される。この定義は、限定されないが、ヒト抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含めて、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニック動物（トランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなど）によって産生される、本明細書の上部に定義されるヒト重鎖抗体を含む。
【００７３】
本明細書で使用される「ＣＤ１９」及び「分化抗原群１９」という用語は、形質細胞へと最終分化するまでのＢ細胞発生のすべての相で発現する分子を指す。「ＣＤ１９」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種のＣＤ１９タンパク質を含み、具体的には、ヒトＣＤ１９ならびに非ヒト動物のＣＤ１９を含む。本明細書で使用される「ヒトＣＤ１９」という用語は、ヒトＣＤ１９（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１５３９１）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（その供給源または調製様式は無関係である）を含む。したがって、「ヒトＣＤ１９」は、細胞が天然に発現するヒトＣＤ１９、及びヒトＣＤ１９遺伝子がトランスフェクションされた細胞上に発現するＣＤ１９を含む。「抗ＣＤ１９重鎖のみの抗体」、「ＣＤ１９重鎖のみの抗体」、「抗ＣＤ１９重鎖抗体」、及び「ＣＤ１９重鎖抗体」という用語は、ヒトＣＤ１９を含めて、本明細書の上部に定義されるＣＤ１９に免疫特異的に結合する本明細書の上部に定義される重鎖のみの抗体を指すために本明細書で互換的に使用される。この定義は、限定されないが、ヒト抗ＣＤ１９  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含めて、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニック動物（トランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなど）によって産生される、本明細書の上部に定義されるヒト重鎖抗体を含む。
【００７４】
本明細書で使用される「ＣＤ２２」及び「分化抗原群２２」という用語は、ＳＩＧＬＥＣレクチンファミリーに属する分子を指し、この分子は、成熟Ｂ細胞の表面上見られ、さらには、程度は低くなるが、いくつかの未熟Ｂ細胞上にも見られる。「ＣＤ２２」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種のＣＤ２２タンパク質を含み、具体的には、ヒトＣＤ２２ならびに非ヒト哺乳類のＣＤ２２を含む。本明細書で使用される「ヒトＣＤ２２」という用語は、ヒトＣＤ２２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２０２７３）の任意のバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（その供給源または調製様式は無関係である）を含む。したがって、「ヒトＣＤ２２」は、細胞が天然に発現するヒトＣＤ２２、及びヒトＣＤ２２遺伝子がトランスフェクションされた細胞上に発現するＣＤ２２を含む。「抗ＣＤ２２重鎖のみの抗体」、「ＣＤ２２重鎖のみの抗体」、「抗ＣＤ２２重鎖抗体」、及び「ＣＤ２２重鎖抗体」という用語は、ヒトＣＤ２２を含めて、本明細書の上部に定義される含むＣＤ２２に免疫特異的に結合する本明細書の上部に定義される重鎖のみの抗体を指すために本明細書で互換的に使用される。この定義は、限定されないが、ヒト抗ＣＤ２２  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含めて、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニック動物（トランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなど）によって産生される、本明細書の上部に定義されるヒト重鎖抗体を含む。
【００７５】
本発明の実施形態による方法を使用して精製され得る他の二重特異性抗体の例としては、限定されないが、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）、エミシズマブ（第ＩＸａ因子×第ＩＸ因子、Ｒｏｃｈｅ，Ｃｈｕｇａｉ）、ＡＢＴ−９８１（ＩＬ−１アルファ×ＩＬ−１ベータ、ＡｂｂＶｉｅ）、ＡＦＭ１３（ＣＤ３０×ＣＤ１６ａ、Ａｆｆｉｍｅｄ）、イスチラツマブ（ＩＧＦ−１Ｒ×ＨＥＲ３、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＳＡＲ１５６５９７（ＩＬ−４×ＩＬ−１３ｓ、Ｓａｎｏｆｉ）、ＭＰ０２５０（ＶＥＧＦ×ＨＧＦ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）、ＭＣＬＡ−１２８（ＨＥＲ３×ＨＥＲ３、Ｍｅｒｕｓ）、ＭＣＬＡ−１１７（ＣＬＥＣ１２Ａ×ＣＤ３、Ｍｅｒｕｓ）、ＡＬＸ−０７６１（ＩＬ−１７Ａ×ＩＬ−１７Ｆ、Ａｂｌｙｎｘ）、ＡＭＧ５７０（ＢＡＦＦ×ＩＣＯＳＬ、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ２１１（ＣＥＡ×ＣＤ３、Ａｍｇｅｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＡＭＧ３３０（ＣＤ３３×ＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ４２０（ＢＣＭＡ×ＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＢＴ−１６５（ＤＬＬ×ＶＥＧＦ、ＡｂｂＶｉｅ）、ＡＦＭ１１（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ａｆｆｉｍｅｄ）、ＭＥＤＩ４２７６（ＨＥＲ２×ＨＥＲ２、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＪＮＪ−６１１７８１０４（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｇｅｎｍａｂ（標的非開示））、ＪＮＪ−６１１８６３７２（ＥＧＦＲ×ｃＭＥＴ、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｇｅｎｍａｂ）、ＭＤＧ００６（ＣＤ１２３×ＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＧＤ００７（ｇｐＡ３３×ＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ドゥボルツキシズマブ（ＭＤＧ０１１）（ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＭＤＧ００９（Ｂ７−Ｈ３×ＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＤＧ０１０（ＣＤ３２Ｂ×ＣＤ７９Ｂ、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＲＥＧＮ１９７９（ＣＤ２０×ＣＤ３、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＲＧ７３８６（ＦＡＰ×ＤＲＳ、Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７８２８（ＣＤ２０×ＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ７８０２（ＣＥＡ×ＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７９９２（ＦＧＦＲ１×ＫＬＢ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＸｍＡｂ１４０４５（ＣＤ１２３×ＣＤ３、Ｘｅｎｃｏｒ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＪＮＪ−６３７０９１７８（ＣＤ１２３×ＣＤ３、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。
【００７６】
混合物
本発明の態様は、多重特異性抗体及び１つ以上の混入物を含む混合物から、親和性クロマトグラフィー手順を使用して多重特異性抗体を精製するための方法を含む。混合物は、一般に、多重特異性抗体の組換え産生から得られるものであり、例えば、培養組換えポリペプチド発現細胞株または培養宿主細胞から得られるものである。試料または混合物は、例えば、限定されないが、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）から得られるものであるか、精製プロセスにおけるある特定のステップの時点のプロセス中プールから得られるものであるか、または最終精製産物から得られるものであり得る。試料は、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、ならびに所望の分子（多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）など）と混ざって見られる混入種、デブリ、及び同様のものも含み得る。
【００７７】
ポリペプチドの組換え産生については、ポリペプチドをコードする核酸は単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能ベクターに挿入される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、ポリペプチドが抗体の場合は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによるもの）を使用して容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素には、一般に、限定されないが、下記のもののうちの１つ以上が含まれる：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列（例えば、米国特許第５，５３４，６１５号に記載のもの（当該文献は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる））。
【００７８】
本明細書のベクターでのＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌（グラム陰性生物またはグラム陽性生物など）が含まれ、こうした真正細菌は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びＳｈｉｇｅｌｌａなど）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなど）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主の１つはＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）など）も適している。こうした例は例示であり、限定ではない。
【００７９】
有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、限定されないが、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓細胞（２９３細胞または浮遊培養において増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【００８０】
宿主細胞は、ポリペプチドを産生させるための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地において培養される。
【００８１】
本発明のポリペプチドの産生に使用される宿主細胞は、さまざまな培地において培養され得る。宿主細胞の培養には市販の培地（ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）など）が適している。さらにＨａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許３０，９８５に記載の培地はいずれも、宿主細胞の培地として使用され得る。こうした培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が添加され得る。任意の他の必要サプリメントもまた、当業者に知られると想定される適切な濃度で含められ得る。培養条件（温度、ｐＨ、及び同様のものなど）は、発現用に選択される宿主細胞で以前に使用されたことのあるものであり、当業者には明らかであろう。
【００８２】
組換え手法を使用する場合、ポリペプチドは、細胞内に産生されるか、ペリプラズム間隙中に産生されるか、または培地に直接的に分泌され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１のステップとして、微粒子状デブリ（宿主細胞または溶解細胞のいずれか）（例えば、均質化に由来して生じる）が除去され、この除去は、例えば、遠心分離または限外ろ過によって行われる。ポリペプチドが培地に分泌される場合、そのような発現系から得られる上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニット）を使用して最初に濃縮される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体混合物は、親和性クロマトグラフィーを含む精製の前に界面活性剤処理に供される。次に、多重特異性抗体混合物は、本明細書に記載の精製ステップの１つ以上に供される。
【００８４】
親和性クロマトグラフィー
本明細書に記載の精製プロセスの設計において、いくつかのＢｓＡｂは低ｐＨに曝露されると凝集する傾向を有することが発見された。それ故に、そのような場合、プロテインＡクロマトグラフィーを使用するにあたって低ｐＨでの溶出を行うことが特に問題となり、このことが、プロテインＡの適切な代替物として働き得る親和性樹脂を検討するきっかけとなった。本明細書に記載のようにプロテインＡ溶出緩衝液に添加剤を含めることで観察凝集レベルは低下したものの、望ましくないホモ二量体種（例えば、ＴＡＡホモ二量体種）が一緒に精製されてしまうことが依然として観察された。さらに、酸に対してＢｓＡｂが不安定であることから、低ｐＨでのウイルス不活化単位工程を使用することが不可能である。それ故に、本発明の実施形態による方法は、さまざまな型の親和性樹脂（限定されないが、プロテインＡ親和性樹脂を含む）を用いるクロマトグラフィー単位工程を含む。ある特定の実施形態では、プロテインＡ溶出緩衝液に対して本明細書に記載の抗凝集組成物が添加されることで、溶出液中の望ましくないホモ二量体凝集体が低減される。
【００８５】
本発明の他の態様は、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合し、プロセス不純物としての重鎖ホモ二量体と比較してヘテロ二量体多重特異性抗体産物に選択的に結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を利用する親和性クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー単位工程を含む。ある特定の実施形態では、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂である。いくつかの実施形態では、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１−ＸＬ親和性樹脂である。
【００８６】
親和性クロマトグラフィーの樹脂または材料は、親和性に基づいて抗体をクロマトグラフィー担体上に保持することを可能にする。親和性クロマトグラフィーの例としては、限定されないが、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー、またはプロテインＬクロマトグラフィーが挙げられる。親和性クロマトグラフィー材料の例としては、限定されないが、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−ｒ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＦｃＸＬ、及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１−ＸＬが挙げられる。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィー材料は、カラムの形態で提供される。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、「結合溶出モード」（あるいは「結合溶出プロセス」とも称される）で実施される。「結合溶出モード」は、試料中の産物（多重特異性抗体など）を親和性クロマトグラフィー材料に結合させた後、親和性クロマトグラフィー材料から溶出させる産物分離手法を指す。いくつかの実施形態では、溶出はステップ溶出であり、この場合、溶出プロセスの間に移動相の組成がステップワイズで変更され、この変更は１回または数回行われる。ある特定の実施形態では、溶出はグラジエント溶出であり、この場合、溶出プロセスの間に移動相の組成が連続的に変更される。
【００８７】
ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィー樹脂の一般特性は、この樹脂がＩｇ重鎖ＣＨ１特異的ナノボディリガンドを含み、４つのサブクラスのＩｇＧ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）をすべて認識し、６５μｍのサイズを有するアガロース上にリガンドが固定化されており、ＩｇＧの結合容量が２０ｍｇ／ｍＬ未満であり、５〜２００ｃｍ／時間の流速条件の下で使用可能であり、衛生化のための塩基（２５〜５０ｍＭのＮａＯＨ）に対して安定であり、市販されていることである。ＢｓＡｂの精製目的では、ＣＨ１−ＸＬ樹脂は、ＣＨ１ドメインを含む二重特異性ヘテロ二量体には結合するが、重鎖ホモ二量体種（例えば、ＴＡＡホモ二量体）には結合しない。図１０に示されるように、活性種のみがＣＨ１ドメインを含む。さらに、ＣＨ１−ＸＬ樹脂は、あまりストリンジェントでない酸性溶出条件（ｐＨ４）の下で使用可能である。こうして溶出条件が緩和されることが、溶出プールにおける抗体凝集の低減に寄与する。
【００８８】
「ロード」は、クロマトグラフィー材料上に組成物をロードすることを指す。ロード用緩衝液は、クロマトグラフィー材料（本明細書に記載のクロマトグラフィー材料のいずれか１つなど）上への組成物（例えば、多重特異性抗体及び不純物を含む組成物、または抗体アーム及び不純物を含む組成物）のロードに使用される緩衝液である。クロマトグラフィー材料は、精製すべき組成物のロード前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。クロマトグラフィー材料上への組成物のロード後には、洗浄緩衝液が使用され得る。溶出緩衝液を使用することで、目的ポリペプチドが固相から溶出される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体組成物は、親和性クロマトグラフィー材料（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー材料、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィー材料）上にロードされ、このロードの際の多重特異性抗体のロード密度は、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、約１８ｍｇ／ｍＬ、または約１９ｍｇ／ｍＬである。ＣＨ１−ＸＬ樹脂の動的結合容量（ＤＢＣ）を調べた。この結果は、図１５に示される。この結果は、４分としたときに動的結合容量がプラトーに達し、その際の動的結合容量値が９．３ｍｇ／ｍＬであったことを実証している。その後、ＨＣＣＦを使用してパイロットスケールでの実験を行ったところ、ロード密度を最大で１９ｍｇ／ｍＬ（約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、または約１８ｍｇ／ｍＬなど）まで上げることができる可能性があることが実証された。したがって、対象方法の実施形態のいくつかでは、ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィーステップは、約９〜約１９ｍｇ／ｍＬの範囲のロード密度（約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、または約１８ｍｇ／ｍＬなど）で行われる。
【００９０】
溶出
本明細書で使用される溶出は、クロマトグラフィー材料からの産物（例えば、多重特異性抗体）の脱離または解離を指す。溶出緩衝液は、クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体の溶出に使用される緩衝液である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及び同様のものを含み得る。ある特定の実施形態では、プロテインＡを含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度（約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、または約４５ｍＭなど）のクエン酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中のクエン酸の濃度の範囲は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭの濃度のクエン酸を含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約５ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度（約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭなど）の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の酢酸の濃度の範囲は、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む。
【００９１】
多重特異性抗体の凝集には溶出緩衝液のｐＨが影響することが明らかとなった。したがって、一実施形態では、プロテインＡを含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約３．２〜約４．２の範囲のｐＨ（３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、または４．２など）を有する。ある特定の実施形態では、プロテインＡを含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約３．４〜約３．８の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約３．４〜約４．４の範囲のｐＨ（３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、または４．４など）を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、３．８〜約４．２の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムからの多重特異性抗体の溶出に使用される溶出緩衝液は、約４．０のｐＨを有する。
【００９２】
抗凝集組成物
プロテインＡ樹脂を用いてＢｓＡｂを精製する場合、プロテインＡ樹脂からの溶出を低ｐＨで行うと高分子量凝集体が生じることが、最初の試験から明らかとなった。溶出緩衝液に添加剤を添加することによって、ＢｓＡｂ凝集体の量が低減されることが発見された。したがって、ある特定の好ましい実施形態では、抗凝集組成物を溶出緩衝液に添加してから、多重特異性抗体の溶出が行われる。いくつかの実施形態では、抗凝集組成物は、１つ以上のポリオールを含む。ポリオールの例としては、限定されないが、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びソルビトールが挙げられる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、１つ以上のポリオールを含む抗凝集組成物を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のポリオールは、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約２５％ｗ／ｖの範囲の濃度（５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、または２０％ｗ／ｖなど）を有する。他の実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するグリセロールを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約１０％ｗ／ｖの濃度のグリセロールを含む。他の実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するスクロースを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約１０％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約１０％ｗ／ｖのグリセロール及び約１０％ｗ／ｖのスクロースを含む。本発明の実施形態による方法は、本明細書に記載の添加剤を任意の組み合わせで含む溶出緩衝液を本明細書に記載の任意のｐＨで使用するプロテインＡクロマトグラフィーを含む。本発明の実施形態による別の方法は、本明細書に記載の添加剤を任意の組み合わせで含む溶出緩衝液を本明細書に記載の任意のｐＨで使用して、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を利用する親和性クロマトグラフィーを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を利用する親和性クロマトグラフィーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を利用するものである。いくつかの実施形態では、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１−ＸＬである。
【００９３】
下流の精製プロセス
ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーから得られる溶出液は、１つ以上の追加の精製ステップに供される。例えば、ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーステップから得られる溶出液は、その後に例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー手順及び／または陽イオン交換クロマトグラフィー手順に供される。
【００９４】
陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、自体の表面上または中を通過する水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中の陰イオンと交換させるための遊離陰イオンを有する正荷電固相である。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態のいくつかでは、陰イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。一実施形態では、陰イオン交換材料は、樹脂である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、一級アミン、二級アミン、三級アミン、もしくは四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジジエチルアミノエチル官能基を含み得る。陰イオン交換材料の例は当該技術分野で知られており、そうした陰イオン交換材料には、限定されないが、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＰＩ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＱＳＦＦ）、Ａｃｃｅｌｌ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ａｍｉｎｅ（ＱＭＡ）樹脂、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（登録商標）、及びＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が含まれる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、「結合溶出」モードで実施される。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムの形態で提供される。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、膜を含む。
【００９５】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、自体の表面上または中を通過する水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中の陽イオンと交換させるための遊離陰イオンを有する負荷電固相である。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態のいくつかでは、陽イオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換材料は、樹脂である。陽イオン交換材料は、カルボン酸官能基またはスルホン酸官能基を含み得、こうした官能基は、限定されないが、スルホン酸、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトリン酸などである。上記のものの実施形態のいくつかでは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。上記のものの実施形態のいくつかでは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー膜である。陽イオン交換材料の例は、当該技術分野で知られており、そうした陽イオン交換材料には、限定されないが、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ、Ｓ０３  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（例えば、ＣＩＭ（登録商標）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）、及びＣＩＭａｃ（登録商標）Ｓ０３など）、Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ２０、ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＳＰＳＦＦ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ（ＳＰＸＬ）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  Ｓｅ  Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  Ｓ０３、またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯが含まれる。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、「結合溶出」モードで実施される。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで実施される。上記のものの実施形態のいくつかでは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、カラムに充填されたものである。上記のものの実施形態のいくつかでは、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、膜を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーから得られる溶出液は、混合モードクロマトグラフィーに供される。
【００９７】
混合モードクロマトグラフィーは、混合モード媒体を利用するクロマトグラフィーであり、こうした混合モード媒体は、限定されないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（商標）などである。そのような媒体は、混合モードクロマトグラフィーリガンドを含む。ある特定の実施形態では、そのようなリガンドは、結合物質と相互作用する少なくとも２つの異なる部位（これらの部位は、異なるものの、協同的に働く）を提供する能力を有するリガンドを指す。こうした部位の１つは、リガンドと目的物質との間に誘引型の電荷間相互作用を生じさせる。その他の部位は、典型的には、電子受容体−電子供与体相互作用及び／または疎水性相互作用及び／または親水性相互作用を生じさせる。電子供与体−電子受容体相互作用には、水素結合、π−π、陽イオン−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子などの相互作用が含まれる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、混合モード（ＭＭ）クロマトグラフィー媒体は、有機担体または無機担体（基礎マトリックスと呼ばれることもある）と直接的にカップリングするか、またはスペーサーを介してカップリングした混合モードリガンドから構成される。担体は、粒子（本質的に球状の粒子など）、モノリス、フィルター、膜、表面、キャピラリーなどの形態であり得る。ある特定の実施形態では、担体は、天然ポリマーから調製されるものであり、こうした天然ポリマーは、架橋糖質物質（アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン、アルギン酸など）などである。高い吸着容量を得るためには、担体は多孔性であり得、その結果、リガンドが外表面ならびに孔表面にカップリングする。そのような天然ポリマー担体は、標準的な方法（逆懸濁ゲル化法（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４）など）に従って調製され得る。あるいは、担体は、合成ポリマーから調製されるものであり得、こうした合成ポリマーは、架橋合成ポリマー（例えば、スチレンまたはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなど）などである。そのような合成ポリマーは、標準的な方法に従って調製されるものであり得、こうした方法については、例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照のこと。多孔性の天然ポリマー担体または合成ポリマー担体は、商業的な供給元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）など）からも入手可能である。
【００９９】
ある特定の実施形態では、混合モード樹脂は、負荷電部分及び疎水性部分を含む。一実施形態では、負荷電部分は、陽イオン交換のための陰イオン性カルボン酸基または陰イオン性スルホ基である。そのような担体の例としては、限定されないが、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（登録商標）は、従来の陰イオン交換体と比較して異なる選択性を樹脂に与える多モード機能性を有する強力な陰イオン交換体である。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（登録商標）リガンド（Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン）は、イオン性相互作用、水素結合、及び疎水性相互作用を含めて、複数モードのタンパク質相互作用化学を示す。樹脂が多モード機能性を有することで、抗体二量体及び抗体凝集体、漏出プロテインＡ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、抗体／ＨＣＰ複合体、プロセス残留物、ならびにウイルスを除去する能力が樹脂に備わるようになる。多重特異性抗体は直接的にカラムを通過する一方で、混入物は吸着されるように設計された工程パラメーターを用いる生産スケールでの洗練ステップを行う状況では、樹脂は、フロースルーモードで使用され得る。
【０１００】
ある特定の実施形態では、精製された多重特異性結合化合物は、ウイルスろ過ステップに供される。ウイルスろ過は、全精製プロセスの中でウイルス低減に特化したステップである。このステップは、通常、クロマトグラフィー洗練ステップの後に実施される。ウイルス低減は、適切なフィルターを使用することで達成でき、こうしたフィルターには、限定されないが、Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｈａｒｍａから供給されるＰｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ（商標）、Ｐｌａｎｏｖａ  ５０Ｎ、もしくはＢｉｏＥｘ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから供給されるＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓから供給されるＶｉｒｏＳａｒｔ  ＣＰＶ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓフィルター、ＣＵＮＯから供給されるＺｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター、またはＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから供給されるＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ２０（商標）フィルターもしくはＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターが含まれる。所望のろ過性能を得る上で適したフィルターを選択することは、当業者には明らかであろう。
【０１０１】
本発明のある特定の実施形態では、限外ろ過（ＵＦ）ステップ及び／または透析ろ過（ＤＦ）ステップを用いて抗体試料がさらに精製及び濃縮される。これは、典型的には、本明細書に記載の精製ステップのうちの１つ以上の後に実施される。限外ろ過については、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．Ｚｅｍａｎ  ａｎｄ  Ａ  Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）、及びＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６；ＩＳＢＮ番号８７７６２−４５６−９）に詳述されている。好ましいろ過プロセスは、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」と題するＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，１９９５／９６）の１７７〜２０２ページに記載のタンジェンシャルフローフィルトレーションである。限外ろ過は、一般に、平均サイズが（例えば）５０ｋＤａ以下のタンパク質が通過可能な孔径を有するフィルターを使用するろ過を意味すると考えられる。そのような小孔径を有するフィルターを用いることによって、試料緩衝液がフィルターを通過して浸透することで試料の体積は減少し得る一方で、抗体はフィルターを通過せずに保持される。
【０１０２】
透析ろ過は、限外ろ過膜を使用することで、塩、糖、及び非水性溶媒を除去及び交換し、結合種からの遊離分離を行い、低分子量物質を除去し、及び／またはイオン環境及び／またはｐＨ環境の迅速変更を誘導する方法である。限外ろ過されている溶液に対して限外ろ過速度とほぼ等しい速度で溶媒を添加することによって最も効率的に微小溶質が除去される。これによって、体積を一定に保ちながら溶液から微小種が洗浄除去され、保持される抗体が効率的に精製される。本発明のある特定の実施形態では、本発明との関連で使用されるさまざまな緩衝液の交換（任意選択で、さらなるクロマトグラフィーまたは他の精製ステップの前に行われる）、ならびに多重特異性結合物質からの不純物の除去、のために透析ろ過ステップが用いられる。
【０１０３】
図１６には、本発明の実施形態に従うＢｓＡｂの生産に使用され得る製造プロセスの流れ図が示される。この流れ図は、代表的な上流単位工程及び下流単位工程を示す。図１７には、精製プロセスの各段階に見られるＢｓＡｂ種の分析が示される。この結果は、ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィーステップを行うことでＴＡＡホモ二量体種が除去されたことを実証している。本発明の実施形態による製造プロセスの全収率は、約７０％〜約９０％の範囲のもの（約７５％、約８０％、または約８５％など）であった。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の精製方法から得られる多重特異性抗体産物の全収率は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％である。
【０１０４】
医薬組成物
本発明の別の態様は医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、本発明の方法によって精製された１つ以上の多重特異性抗体が適切な医薬的に許容可能な担体と混合されたものを含む。本明細書で使用される医薬的に許容可能な担体の例としては、限定されないが、補助剤、固体担体、水、緩衝液、もしくは治療成分を保持するために当該技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０５】
本発明に従って精製された多重特異性抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するタンパク質を任意選択の医薬的に許容可能な担体、医薬品添加物、または安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ  Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液などの形態で保存用として調製される。許容可能な担体、医薬品添加物、または安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに無毒なものであり、こうしたものには、緩衝液（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖、二糖、及び他の糖質（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【０１０６】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは、滅菌され、かつ実質的に等張性であり、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）条件の下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための用量）で提供され得る。製剤は、選択される投与形態に依存する。本明細書に記載の方法に従って精製された多重特異性抗体は、静脈内注射もしくは静脈内注射によって投与されるか、または皮下に投与され得る。注射投与については、本明細書に記載の方法に従って精製された多重特異性抗体は、注射部位で生じる不快感を低減するために、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液において製剤化され得る。溶液は、上で論じた担体、医薬品添加物、または安定化剤を含み得る。あるいは、多重特異性抗体は、使用前に適切な媒体（例えば、滅菌された発熱物質非含有水）を用いて構成するための凍結乾燥形態であり得る。
【０１０７】
製造物品
本明細書に記載の方法によって精製された多重特異性抗体、及び／または本明細書に記載の方法によって精製されたポリペプチドを含む製剤は、製造物品中に含められ得る。本発明の方法に従って精製された１つ以上の多重特異性抗体を含む製造物品または「キット」は、本明細書に記載の疾患及び障害の治療に有用である。一実施形態では、キットは、本明細書に記載のように精製された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗ＣＤ３抗体）を含む容器を含む。キットは、容器上または容器付属のラベルまたは添付文書をさらに含み得る。「添付文書」という用語は、治療医薬品の商用パッケージに慣習的に含められ、そのような治療医薬品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌、及び／または警告についての情報を含む説明物を指すために使用される。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどが含まれる。容器は、さまざまな材料（ガラスまたはプラスチックなど）から形成され得る。容器は、本明細書に記載の多重特異性抗体の１つ以上または状態の治療に有効なその製剤（例えば、２つ以上の多重特異性抗体の合剤）を含み得、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内輸液バッグであるか、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、選択される状態（がんまたは免疫障害など）の治療に組成物が使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製造物品は、医薬的に許容可能な緩衝液（注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液など）を含む第２の容器をさらに含み得る。製造物品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めて、商用及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１０８】
キットは、１つ以上の多重特異性抗体、及び存在する場合は、その合剤の投与についての指示物をさらに含み得る。例えば、第１の多重特異性抗体を含む第１の医薬組成物と、第２の多重特異性抗体を含む第２の医薬組成物と、をキットが含む場合、第１の医薬組成物及び第２の医薬組成物を、それらを必要とする患者に対して、同時、連続的、または別々に投与することについての指示を、キットはさらに含み得る。キットが２つ以上の組成物を含む場合、それら別々の組成物を入れるための容器（分割ボトルまたは分割ホイルパケットなど）をキットは含み得るが、それら別々の組成物は、単一の非分割容器中に含められることもあり得る。キットは、別々の成分の投与またはその合剤の投与についての指示を含み得る。
【０１０９】
使用方法
ある特定の態様では、本発明は、親和性クロマトグラフィー手順を使用して混合物から多重特異性抗体を精製するための方法を提供し、この方法は、第１の親和性クロマトグラフィーカラムを混合物と接触させること、第１の親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、第１の親和性クロマトグラフィーカラムを、抗凝集組成物を含む溶出緩衝液と接触させること、及び第１の親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、抗凝集組成物は、１つ以上のポリオールを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、マンニトール、グリセロール、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約２５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するグリセロールを含む。ある特定の実施形態では、グリセロールは、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する。他の実施形態では、１つ以上のポリオールは、約５％〜約１５％ｗ／ｖの範囲の濃度を有するスクロースを含む。いくつかの実施形態では、スクロースは、約１０％ｗ／ｖの濃度を有する。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約１０％ｗ／ｖのグリセロール及び約１０％ｗ／ｖのスクロースを含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸を含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭの濃度のクエン酸を含む。こうした実施形態のうちのある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約３．２〜約４．２の範囲のｐＨを有する。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約３．４〜約３．８の範囲のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約３．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約２５ｍＭのクエン酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、溶出緩衝液は、約３．６のｐＨを有する。
【０１１２】
他の実施形態では、親和性クロマトグラフィーでは、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂が利用される。こうした実施形態のうちのある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、クエン酸、アセテート、酢酸、４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、クエン酸−リン酸、コハク酸、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭの範囲の濃度の酢酸を含む。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭの濃度の酢酸を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約３．４〜約４．４の範囲のｐＨを有する。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液は、約３．８〜約４．２の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約４．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸、約１０％のグリセロール、及び約１０％のスクロースを含み、溶出緩衝液は、約４．０のｐＨを有する。
【０１１３】
他の態様では、本発明は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性抗体の凝集を低減する方法を提供し、この方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを、多重特異性抗体を含む混合物と接触させること、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムを、２５ｍＭのクエン酸、１０％ｗ／ｖのグリセロール、及び１０％ｗ／ｖのスクロースを含むｐＨ３．６の溶出緩衝液と接触させること、及びプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【０１１４】
さらに他の態様では、本発明は、親和性クロマトグラフィー手順から得られる溶出プールにおける多重特異性抗体の凝集を低減する方法を提供し、この方法は、ＩｇＧ抗体のＣＨ１ドメインに結合するドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムを、多重特異性抗体を含む混合物と接触させること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラム上で多重特異性抗体を固定化すること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムを、５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含むｐＨ４．０の溶出緩衝液と接触させること、ドメイン特異的クロマトグラフィー樹脂を含む親和性クロマトグラフィーカラムから多重特異性抗体を溶出させて混合物から多重特異性抗体を精製すること、を含む。
【０１１５】
すべての態様において、多重特異性抗体は、第１の結合単位及び第２の結合単位を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの結合単位のうちの一方は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合単位及び第２の結合単位は両方共、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、これらの結合単位の一方は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、第１の結合単位及び第２の結合単位は両方共、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、第１の結合単位は、重鎖のみの抗体の重鎖可変領域を含み、第２の結合単位は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、第１の結合単位は、腫瘍関連抗原に結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、第２の結合単位は、エフェクター細胞に結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、第２の結合単位は、Ｔ細胞上のＣＤ３タンパク質に結合親和性を有する。
【０１１７】
本発明の態様のすべてにおいて、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり得る。
【０１１８】
本明細書に開示のように精製された多重特異性抗体、または当該多重特異性抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物は、次に、そのような多重特異性抗体及び組成物について知られるさまざまな診断用途、治療用途、または他の用途に使用される。例えば、多重特異性抗体は、治療的に有効な量の多重特異性抗体を哺乳類に投与することによって哺乳類における障害を治療するために使用され得る。
【０１１９】
本発明は、この時点で完全に説明されており、本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、さまざまな変更または改変を実施可能であることが当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：抗ＣＤ３−ＢＣＭＡ二重特異性抗体の精製
ＢｓＡｂ  ＣＤ３−ＢＣＭＡは、図２に示されており、下記のように精製した。ＢｓＡｂ  ＣＤ３−ＢＣＭＡは二重特異性抗体であり、構造的には三量体である。この三量体では、一方のアーム（例えば、ＣＤ３結合アーム）は、完全ヒト重鎖及び完全ヒトκ軽鎖の両方を含み、もう一方のアーム（例えば、ＢＣＭＡアーム）（ＵｎｉＲａｔ（商標）技術から得られたもの）は、ヒト重鎖（ＣＨドメイン（例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ＣＨ１ドメインを含まないもの）に直接的に融合した１つ以上のＶＨドメインを有するもの）からなる。ＢｓＡｂ  ＣＤ３−ＢＣＭＡを構成する可変ドメイン配列は、以下の表１に示される。具体的には、ＢｓＡｂ  ＣＤ３−ＢＣＭＡは、２つの重鎖（ＨＣ−１及びＨＣ−２）ならびに１つのカッパ軽鎖（κＬＣ）を有する完全ヒトＩｇＧ４二重特異性モノクローナル抗体であり、酸に対して不安定である。重鎖の正しい対形成は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を介して達成される。ＣＤ３アームは、ＨＣ−１及びκＬＣを含み、Ｔ細胞受容体ＣＤ３と結合する。ＴＡＡアーム、すなわちＢＣＭＡアームは、ＨＣ−２のみを含み、ＢＣＭＡを認識する２つの同一のＶＨドメインからなる。ＴＡＡアームは、結合親和性を向上させるために二価であり（１ｎＭ未満）、ＵｎｉＲａｔ（商標）技術から得られたものである。このＢｓＡｂは特有の構造を有するため、ヘテロ二量体産物のみが、ヒト重鎖のＣＨ１ドメイン（ＣＤ３結合アームの一部）を含む。
【０１２１】
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【０１２２】
図３に示されるさまざまな種のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析は、ＢｓＡｂヘテロ二量体がＨＣ／ＬＣホモ二量体種（例えば、ＣＤ３ホモ二量体種）と同様のサイズを有することを実証している。ＳＥＣパラメーターは下記の通りである：流速０．２５ｍｌ／分でのＴＳＫｇｅｌ  １０×３００ｍｍによるＭＳＳプールのＵＨＰＬＣ  ＳＥＣ分析；移動相：０．１Ｍのクエン酸、０．２Ｍのアルギニン、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．２）。こうした結果は図４に示される。さらに、こうした種の等電点（ｐＩ）の分析から、ヘテロ二量体及びホモ二量体が異なるｐＩを有することが明らかになっている。こうした結果は図５に示される。レーン１は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）のｐＩ標準である。レーン２は、ＣＤ３ホモ二量体（ノブ−ノブ）（ｐＩ＝８）である。レーン３は、ＣＤ３／ＢＣＭＡ二重特異性ＩｇＧ（ｐＩ＝７．４〜７．６）である。レーン４は、ＢＣＭＡホモ二量体（ホール−ホール）（ｐＩ＝６．２）である。ロード量は、５μｇ／レーンとした。ＩＥＦパラメーターは下記の通りである：ｐＨ３〜１０  ＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）；Ｓｅｒｖａ  ＩＥＦマーカー３〜１０ミックス；ＩＥＦ  Ｇｅｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ２００Ｖ、１８ｍＡ、２．０Ｗで１時間；２００Ｖ、１８ｍＡ、３．５Ｗで１時間；５００Ｖ、１８ｍＡ、９．０Ｗで３０分。
【０１２３】
プロテインＡ樹脂でのＢｓＡｂの精製は、図６に示されるように効率的なものであることが最初の試験から明らかとなり、この精製結果は、溶出ピークが総積分面積の９０％を占めることが示す。プロテインＡクロマトグラフィーのパラメーターは下記の通りである：カラム：１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ  ＨｉＴｒａｐ（登録商標），ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ロード：５０ｍＬ  Ｔｅｎｅｏ−ＢｓＡｂ  ＨＣＣＦ；平衡化／洗浄緩衝液：５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）；溶出緩衝液：２５ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．６）；中和緩衝液：１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）。
【０１２４】
最初の試験からは、プロテインＡ樹脂でＢｓＡｂを精製すると、望ましくない高分子量（ＨＭＷ）凝集体が得られることも明らかとなった（図７）。ｐＨ３．６での溶出後に凝集産物がかなりの量で存在することがＳＥＣ分析によって示された。ＳＥＣパラメーターは下記の通りである。カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｉ  １０／３０  ＧＬ；緩衝液：０．１Ｍのクエン酸、０．２Ｍのアルギニン、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．２）；流速：０．５ｍｌ／分；試料：ＴｅｎｅｏＢｓＡｂ  Ｐｒｏｔ  Ａ溶出液プール；注入：１００μｌ、１．４ｍｇ／ｍＬ；画分体積：１ｍＬ。
【０１２５】
ＨＭＷ画分はＢｓＡｂ産物を含むことがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された（図８）。レーンＡ２〜Ａ５：凝集体；レーンＡ６：単量体。ＳＤＳ−ＰＡＧＥパラメーターは下記の通りである：４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル；ＭＥＳ電気泳動用緩衝液；ロード：５μｇ／レーン；Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ染色済み；マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；クマシーによるゲル染色。
【０１２６】
したがって、添加剤を検討することで、ＢｓＡｂ凝集体の量が減少することによってプロテインＡ精製が改善され得るかどうかを決定した。この目的のために、さまざまなポリオールを、異なる量でプロテインＡ溶出緩衝液に添加した。ポリオールの型、ポリオールのパーセント、及び溶出緩衝液のｐＨという３つの因子を、実験計画（ＤＯＥ）マトリックスにおいて試験した。ポリオールの型としては、マンニトール、グリセロール、スクロース、及びトレハロースを検討した。パーセントについては、０％〜３０％の範囲のもの（５％、１０％、１５％、２０％、または２５％など）を試験した。溶出緩衝液のｐＨは、３．４、３．５、または３．６とした。試験したさまざまな組み合わせの結果は図９に示される。本発明の実施形態による方法は、上記の添加剤を任意の組み合わせで含む溶出緩衝液を、上記のいずれのｐＨで使用するプロテインＡクロマトグラフィーも含む。
【０１２７】
こうした試験の結果から、プロテインＡ溶出緩衝液に添加剤を加えるとＢｓＡｂ産物の凝集が低減され得ることが実証された。１０％のグリセロール及び１０％のスクロースを溶出緩衝液に含めると観観凝集レベルが最低となった。この溶出緩衝液組成が、試験した組成の中で最適なものであった。したがって、好ましい一実施形態では、ＢｓＡｂを精製するための方法は、プロテインＡクロマトグラフィーステップを含み、プロテインＡ溶出緩衝液は、１０％のグリセロール及び１０％のスクロースを含む。
【０１２８】
上記の添加剤をプロテインＡ溶出緩衝液に添加することで観察凝集レベルは低下したものの、望ましくないホモ二量体種（例えば、ＴＡＡホモ二量体種）が一緒に精製されてしまうことが依然として観察された。さらに、酸に対してＢｓＡｂが不安定であることから、低ｐＨでのウイルス不活化単位工程を使用することが不可能である。
【０１２９】
したがって、プロテインＡに代わるものとして使用し得るクロマトグラフィー樹脂を探索する上で以下の２つの基準を指針とした：（ａ）穏やかな（低酸性）条件の下で産物を溶出させる能力を有すること、及び（ｂ）プロセス不純物としての重鎖ホモ二量体と比較して、ヘテロ二量体産物に対する選択性を有すること。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１−ＸＬは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されており、ヒトＩｇＧの重鎖上のＣＨ１ドメインに特異的に結合する親和性樹脂であり、この親和性樹脂は、１３ｋＤａのラマ重鎖抗体断片によって得られた頑強かつ高品質な親和性マトリックスの利点を有するものである。
【０１３０】
ＣＨ１−ＸＬ樹脂の一般特性は、この樹脂がＩｇ重鎖ＣＨ１特異的ナノボディリガンドを含み、４つのサブクラスのＩｇＧ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）をすべて認識し、６５μｍのサイズを有するアガロース上にリガンドが固定化されており、ＩｇＧの結合容量が２０ｍｇ／ｍＬ未満であり、５〜２００ｃｍ／時間の流速条件の下で使用可能であり、衛生化のための塩基（２５〜５０ｍＭのＮａＯＨ）に対して安定であり、市販されていることである。ＢｓＡｂの精製目的では、ＣＨ１−ＸＬ樹脂は、ＣＨ１ドメインを含む二重特異性ヘテロ二量体には結合するが、重鎖ホモ二量体種（例えば、ＴＡＡホモ二量体）には結合しない。図１０に示されるように、活性種のみがＣＨ１ドメインを含む。さらに、ＣＨ１−ＸＬ樹脂は、あまり厳しくない酸性溶出条件（ｐＨ４）の下で使用可能である。
【０１３１】
ＣＨ１−ＸＬ樹脂を検討したところ、重鎖ホモ二量体はＣＨ１−ＸＬ素通り画分に存在することが実証され、このことは、予想通り、このホモ二量体がこの樹脂に結合しないことを示している（図１１）。図１１に示される通り、レーン１は、分子量標準（５μｌ）である。レーン２は、二重特異性ＩｇＧプロテインＡプール（２μｇ）である。レーン３は、二重特異性ＩｇＧ  ＣＨ１素通り画分（２μｇ）である。レーン４は、ＣＨ１塩洗浄画分（２μｇ）である。レーン５は、ＣＨ１  ＮａＯＨストリッピング画分（２μｇ）である。レーン６は、ＣＨ１プール（２μｇ）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥパラメーターは下記の通りである：タンパク質ロード：２μｇ／レーン；ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル；ＭＥＳ電気泳動用緩衝液；ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染料（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）；ＰａｇｅＲｕｌｅｒ染色済みタンパク質ラダー；電気泳動条件：３５分、２００Ｖ、１２０ｍＡ、２５ワット。
【０１３２】
図１２には、捕捉媒体からの溶出が生じるｐＨの比較が示される。図１２では、最初の捕捉ステップとして（プロテインＡの代わりに）ＣＨ１−ＸＬ樹脂を使用すると、プロテインＡでの捕捉では溶出ｐＨが３．３であることと比較して、溶出ｐＨをｐＨ４．６に高めることが可能であることが実証されている。こうして溶出条件が緩和されることが、溶出プールにおける抗体凝集の低減に寄与する。図１２のパネルＡに示されるパラメーターは下記の通りである：カラム：１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ロード：１０ｍＬのＨＣＣＦ；平衡化／洗浄緩衝液：５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、５０ｍＭの酢酸（ｐＨ３．０）；ストリッピング緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ；溶出：直線勾配１０ＣＶ−１００％Ｂ。図１２のパネルＢに示されるパラメーターは下記の通りである：カラム：１ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１−ＸＬ（商標）；ロード：１０ｍＬのＨＣＣＦ；平衡化／洗浄緩衝液：５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのアセテート（ｐＨ３．０）；ストリッピング緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ；溶出：直線勾配１０ＣＶ−１００％Ｂ。
【０１３３】
ＣＨ１−ＸＬ樹脂からのＢｓＡｂの溶出は、５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含むｐＨ４．０の溶出緩衝液を使用したときに最適となった。こうした条件の下でＢｓＡｂは効率的に溶出され、２ＣＶプール体積中に存在するものの積分ピーク面積の９３％を占めた。図１３。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）パラメーターは下記の通りである：カラム：９ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ；ロード：５０ｍＬのＢｓＡｂ含有培養液；平衡化／洗浄緩衝液＃１：５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）；平衡化／洗浄緩衝液＃２：５０ｍＭのトリス、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）；溶出緩衝液：５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、１０％のスクロース（ｐＨ４．０）；中和緩衝液：１Ｍのトリス（ｐＨ９．０）。
【０１３４】
ＣＨ１−ＸＬプールをさらに分析したところ、ＢｓＡｂ凝集体の含量が最小であることが明らかとなった（ＨＭＷの含量は２．２％であり、ＨＣＣＦ中からのＢｓＡｂ産物の結合が効率的に生じていた）。図１４。図１４に示されるパラメーターは下記の通りである：ＴＳＫｇｅｌ  １０×３００ｍｍ；流速：０．７５ｍｌ／分；移動相：０１Ｍのクエン酸；０．２Ｍのアルギニン、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．２）。したがって、好ましい一実施形態では、ＢｓＡｂを精製するための方法は、ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィーステップを含み、ＣＨ１−ＸＬ溶出緩衝液は、５０ｍＭの酢酸、１０％のグリセロール、及び１０％のスクロースを含み、４．０のｐＨを有する。
【０１３５】
ＣＨ１−ＸＬ樹脂の動的結合容量を検討した。この結果は図１５に示される。図１５に示されるパラメーターは下記の通りである：１ｍＬのＣＨ１−ＸＬカラム（０．７×２．５ｃｍ）；ロード：精製ＢｓＡｂ（５ｍｇ／ｍｌ）；滞留時間：１分、２分、４分、８分；溶出前の１０％破過；タンパク質濃度：プールの２８０ｎｍによるもの。この結果は、４分としたときに動的結合容量がプラトーに達し、その際の動的結合容量値が９．３ｍｇ／ｍＬであったことを実証している。その後、ＨＣＣＦを使用してパイロットスケールでの実験を行ったところ、ロード密度を最大で１９ｍｇ／ｍＬ（約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、または約１８ｍｇ／ｍＬなど）まで上げることができる可能性があることが実証された。したがって、対象方法の実施形態のいくつかでは、ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィーステップは、約９〜約１９ｍｇ／ｍＬの範囲のロード密度（約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、または約１８ｍｇ／ｍＬなど）で行われる。
【０１３６】
図１６には、本発明の実施形態に従うＢｓＡｂの生産に使用され得る製造プロセスの流れ図が示される。この流れ図は、代表的な上流単位工程及び下流単位工程を示す。図１７には、精製プロセスの各段階に見られるＢｓＡｂ種の分析が示される。レーン１：分子量標準；レーン２：ＨＣＣＦ５μｌ；レーン３：ＣＨ１素通り画分５μｌ；レーン４：ＣＨ１−ＸＬ１プール２μｇ；レーン５：精製ステップ２−プール２μｇ；レーン６：精製ステップ３−プール２μｇ；レーン７：分子量標準；レーン８：ＣＨ１プール２μｇ（還元）；レーン９：精製ステップ２（還元）−プール２μｇ；レーン１０：精製ステップ３（還元）−プール２μｇ。パラメーターは下記の通りである：ＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル；ＭＥＳ電気泳動用緩衝液；ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染料（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）；Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ染色済みタンパク質ラダー；タンパク質ロード：２μｇ／レーン；電気泳動条件：３５分、２００Ｖ、１２０ｍＡ、２５ワット。この結果は、ＣＨ１−ＸＬクロマトグラフィーステップを行うことでＴＡＡホモ二量体種が除去されたことを実証している。本発明の実施形態による製造プロセスの全収率は、約７０％〜約９０％の範囲のもの（約７５％、約８０％、または約８５％など）であった。
【０１３７】
実施例２：重鎖のみの結合単位を含む二重特異性抗体の精製
重鎖のみの抗体の重鎖可変領域をそれぞれが含む第１の結合単位及び第２の結合単位を含む二重特異性抗体が、本明細書に記載の方法に従って、当該抗体を含む混合物から精製される。当該二重特異性抗体を含む混合物は、第１の親和性クロマトグラフィー材料と接触され、それによって当該抗体が固定化される。当該抗体は、本明細書に記載のポリオールを含む抗凝集組成物を含む溶出緩衝液を用いて溶出され、それによって溶出プールにおける当該二重特異性抗体の凝集が低減される。
【０１３８】
実施例３：重鎖／軽鎖結合単位を含む二重特異性抗体の精製
抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域をそれぞれが含む第１の結合単位及び第２の結合単位を含む二重特異性抗体が、第１の親和性クロマトグラフィーカラムと接触され、それによって当該抗体が固定化される。当該抗体は、本明細書に記載のポリオールを含む抗凝集組成物を含む溶出緩衝液を用いて溶出され、それによって溶出プールにおける当該二重特異性抗体の凝集が低減される。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に明示及び説明されているが、そのような実施形態は例として提供されるものにすぎないことが当業者には明らかであろう。この時点で、当業者なら本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置き換えを想到するであろう。本発明を実施する上では、本明細書に記載の本発明の実施形態に対するさまざまな代替形態を利用できることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、それによって、この特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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