(57)【要約】  本発明は、インビトロまたはインビボで実施されるそれぞれのドリマニルアルコール源のアセチル化による、アセチルトランスフェラーゼ触媒を用いたドリマニルアセテート化合物の新規な生成方法を提供する。本発明はまた、異なる微生物および植物源からの対応するアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の同定に関する。本発明はまた、前記新たに同定された酵素に由来する酵素変異体の提供に関する。本発明の更なる態様は、そのような酵素および変異体、組換えベクター、ならびにそのようなアセチルトランスフェラーゼおよび変異体の産生に適し、かつドリマニルアセテート化合物の新規な生成方法を実施するのに適した組換え宿主細胞の対応するコーディング配列の提供に関する。本発明の別の態様は、本発明に従って得られるそのようなドリマニルアセテートの、匂い物質、フレーバーもしくはフレグランスまたは昆虫／害虫防除成分の製造のための中間体としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドリマニルアセテート化合物を生体触媒的に生成する方法であって、
（１）アセチル基供与体の存在下で、ドリマニルアルコールを、前記アセチル基供与体からのアセチル基を前記ドリマニルアルコールに移動させることができる酵素クラスＥＣ２．３．１のアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、ドリマニルアセテートを得るステップと、
（２）任意に、ステップ（１）の反応生成物からドリマニルアセテート化合物を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ドリマニルアセテート化合物が、アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテート、およびビシクロファルネシルアセテートからなる群から選択され、それぞれが立体異性体的に純粋な形態で、またはその少なくとも２つの立体異性体の混合物、または前記群のうちの少なくとも２つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ドリマニルアルコールが、アルビカノール、ドリメノール、およびビシクロファルネソールからなる群から選択され、それぞれが立体異性的に純粋な形態で、またはその少なくとも２つの立体異性体の混合物、または前記群のうちの少なくとも２つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記アセチル基供与体がアセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記アセチルトランスフェラーゼが、
ａ）配列番号９、１７、１１８、１２４、１４４、２３、２１、１１、１９、１３、１５、２５、１２１、１４３、１２７、１３０、１３３または１３６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
ｂ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号９、１７、１１８、１２４、１４４、２３、２１、１１、１９、１３、１５、２５、１２１、１４３、１２７、１３０、１３３または１３６の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも４０％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ステップ１）に先立って、前記ドリマニルアルコール化合物の生体触媒的形成、特に、非環状セスキテルペン前駆体、例えばファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からの酵素的合成をさらに含む、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ドリマニルアルコールの前記酵素的合成が、前記非環状セスキテルペン前駆体を１つ以上の酵素的ステップで少なくとも１種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する１つ以上のポリペプチドによって触媒される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のドリマニルアルコールを、ＦＰＰから単一のステップまたは２つ以上の酵素的ステップで生成する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種のドリマニルアルコールが、
ａ）前記ドリマニルアルコールを形成するドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド；または
ｂ）少なくとも１種のドリマニルリン酸中間体を形成するドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと、前記少なくとも１種のドリマニルリン酸中間体を少なくとも１種のドリマニルアルコールに変換するホスファターゼ活性を有するポリペプチドとの組み合わせ
によって触媒される、ＦＰＰの酵素的変換によって生成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、アルビカノールシンターゼ活性、ドリメノールシンターゼ活性、ビシクロファルネソールシンターゼ活性またはそのような活性の任意の組み合わせから選択され、かつ
ｂ）前記ポリペプチドの組み合わせが、ドリマニル二リン酸シンターゼ活性、特にアルビカニル二リン酸シンターゼ活性およびホスファターゼを含む、
請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ドリマリンセスキテルペンシンターゼが、
ａ）アルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはアルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号５と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド；
ｂ）ドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号７と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド
から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
インビボでは宿主細胞培養中で、またはインビトロでは液体反応媒体中で実施され、それぞれ少なくとも１種のドリマニルアセテートの生成を助長する条件下にある、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ａ）請求項５に定義されている少なくとも１種のアセチルトランスフェラーゼと、任意に
ｂ）非環状セスキテルペン前駆体ＦＰＰを、請求項７から１１までのいずれか１項において定義されている少なくとも１種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する少なくとも１つのポリペプチドと、任意に
ｃ）メバロン酸経路に関与する酵素から選択される少なくとも１種の酵素と
を機能的に発現することができる、組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物中で実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記非ヒト宿主細胞または宿主生物が、原核生物もしくは真核生物の微生物、またはそれらに由来する細胞から選択され、特に、ここで、前記非ヒト宿主細胞または宿主生物は、細菌、真菌および植物の細胞または植物から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（３）として、ステップ（１）またはステップ（２）の前記ドリマニルアセテートを処理して、化学合成または生体触媒合成またはその両方の組み合わせを使用して誘導体を得ることをさらに含む、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、特に、非ヒト宿主生物または宿主細胞を、
ａ）アセチル基供与体からのアセチル基をドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
ｂ）非環状セスキテルペン前駆体からドリマニルアルコールを生成することができるドリマニルアルコールシンターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
ｃ）前記非環状セスキテルペン前駆体を生成するための生合成経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと
で形質転換することを含む、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
匂い物質、フレーバーもしくはフレグランス成分または昆虫／害虫防除成分を調製するための、請求項１から１５までのいずれか１項において定義されるアセチルトランスフェラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロまたはインビボで実施されるそれぞれのドリマニルアルコール源のアセチル化による、アセチルトランスフェラーゼ触媒を用いたドリマニルアセテート化合物の新規な生成方法を提供する。本発明はまた、異なる微生物および植物源からの対応するアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の同定に関する。本発明はまた、前記新たに同定された酵素に由来する酵素変異体の提供に関する。本発明の更なる態様は、そのような酵素および変異体、組換えベクター、ならびにそのようなアセチルトランスフェラーゼおよび変異体の産生に適し、かつドリマニルアセテート化合物の新規な生成方法を実施するのに適した組換え宿主細胞の対応するコーディング配列の提供に関する。本発明の別の態様は、本発明に従って得られるそのようなドリマニルアセテートの、匂い物質、フレーバーもしくはフレグランスまたは昆虫／害虫防除成分の製造のための中間体としての使用に関する。
【０００２】
背景技術
テルペン類は、ほとんどの生物（微生物、動物、植物）に見出される。これらの化合物は、イソプレン単位と呼ばれる５つの炭素単位で構成されており、それらの構造中に存在するイソプレン単位の数によって分類され、当該単位は環状構造要素を含む場合がある。したがって、モノテルペン類、セスキテルペン類およびジテルペン類は、それぞれ１０個、１５個および２０個の炭素原子を含むテルペン類である。例えば、セスキテルペン類は、植物界に広く見出される。セスキテルペン分子の多くは、それらがフレーバーおよびフレグランス特性ならびに化粧品、薬用、抗菌効果を有することで知られている。数多くのセスキテルペン炭化水素およびセスキテルペノイド類が同定されている。化学合成アプローチが開発されてきたが、それでも複雑であり、必ずしも費用対効果が高いとは限らない。
【０００３】
テルペン類の生合成による産生には、テルペンシンターゼと呼ばれる酵素が関与している。植物界には数多くのセスキテルペンシンターゼが存在し、すべて同じ基質（ファルネシル二リン酸、ＦＰＰ）を使用するが、生成物プロファイルが異なる。セスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子およびｃＤＮＡがクローニングされ、対応する組換え酵素の特性が明らかにされている。
【０００４】
セスキテルペン類の主な供給源、例えば、ドリマニルアルコール類、特にアルビカノールまたはドリメノールのようなドリマン構造を有する化合物の多くは、セスキテルペンを天然に含有する植物または微生物である。しかしながら、これらの天然源中のセスキテルペン類の含有量は低い場合がある。たとえ入手可能であったとしても、そのようなドリマニルアルコール類は、主にそれらが周囲温度で固体であるという事実に照らして、それらの更なる処理中に取り扱うことが困難である。取り扱いが容易な誘導体を提供することは、改善されたアプローチであり、ドリマニルアルコール類の更なる処理を簡素化するであろう。
【０００５】
Akita, H. et alは、Tetrahedron: Asymmetry 11 (2000). 1375-1388に、リパーゼ触媒を用いた（＋）アルビカニルアセテートの不斉合成を記載している。この先行技術のアプローチは、エナンチオマー的に純粋なアルビカニルアセテートを得るために、少なくとも８つの化学合成ステップと、リパーゼによって触媒される２つの逐次反応とを必要とする。さらに、アセチル化反応はジイソプロピルエーテルおよびイソプロペニルアセテートの存在下に３３℃で行われており、生合成経路に必要とされる生理学的条件とは相容れない条件であった。そのうえ、生理学的条件下では、我々の知る限りでは、リパーゼは必要とされるエステル交換反応を触媒することができない。リパーゼによるエステル形成は可能であるが、この活性は、存在する水の含有量に強く依存する。したがって、本発明のインビボ設定などの水性環境では、リパーゼはアセチル化よりもエステル結合の加水分解を触媒する(Jaeger K. et al; FEMS Microbiology Reviews, 1994, 15:1 pp29−63)。
【０００６】
ドリマニルアセテート化合物を生成する新規な方法、特に、例えば、糖基質の代謝によってドリマニルアルコール前駆体を提供する宿主細胞ベースのプロセスのように、水性環境でのドリマニルアセテートの完全な生化学合成に実施され得る方法を提供する必要性が依然として残っている。
【０００７】
概要
上記の課題は、アセチルトランスフェラーゼ活性を示し、かつアルビカノールまたはドリメノールのようなそれぞれのドリマンアルコール前駆体から、アセチル化を介してアセチル基供与体としてアセチル−ＣｏＡを使用して、アルビカニルアセテートまたはドリメノールアセテートのようなドリマニルアセテートを産生する、新しいクラスの酵素を提供することによって解決され得る。物理化学的特性のために、特にそれらは周囲温度で液体であることから、ドリマニルアルコール類のアセチル化誘導体は、より適切な材料として役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】（＋）−アルビカノール、（−）−ドリメノールおよびビシクロファルネソールの構造、ならびに図１のｃのドリマン構造よりも特異的なドリマン部分の構造を示す。
【図１ｂ】非環状セスキテルペン前駆体ＦＰＰおよびアルビカノールを介したアルビカニルアセテートの細胞生物学的産生を説明する反応スキームを示す。
【図１ｃ】より一般的な「ドリマン構造」であって、Ｃ＝Ｃ−二重結合の潜在的な位置を表示したものを示す。
【図２】（Ａ／Ｂ）アセチルトランスフェラーゼＣｒＤＡＴ（Ａ）またはアセチルトランスフェラーゼＦｇａＡＴ（Ｂ）のいずれかとアルビカノールシンターゼＸＰ＿００７３６９６３１．１を共発現する改変されたS. cerevisiae株ＹＳＴ０６９を用いて産生されたアルビカニルアセテートのＧＣ−ＦＩＤ分析を示し、（Ａ）からのアセチルトランスフェラーゼＣｒＤＡＴによって産生されたアルビカニルアセテートのＭＳスペクトルを（Ｃ）に示し、このＭＳスペクトルは、アルビカノニルアセテート標準物質からのＭＳスペクトルと同一であることを示す。
【図３】（例２に記載したように）アルビカノールに対して活性であることが見出された９つのアセチルトランスフェラーゼ（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６およびＣｆＡＣＴ１−８）によって産生されたアルビカニルアセテートの相対量を示す。
【図４】（例２に記載したように）アルビカノールに対しても活性であることが見出された９つのアセチルトランスフェラーゼ（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６およびＣｆＡＣＴ１−８）によって産生されたドリメニルアセテートの相対量を示す。
【図５】ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６およびＤｆＡＴＣ１３の各アセチルトランスフェラーゼを発現するS. cerevisiae細胞によって産生されたアルビカニルアセテートの相対量を示す。
【図６】ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８、ＸＰ＿００１２５８０７９．１、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６およびＤｆＡＴＣ１３の各アセチルトランスフェラーゼを発現するS. cerevisiae細胞によって産生されたドリメニルアセテートの相対量を示す。
【図７】図７のＡは、アセチルトランスフェラーゼＣｒＤＡＴによって産生されたドリメニルアセテートのＭＳスペクトルを示し、図７のＢは、このＭＳスペクトルがドリメニルアセテート標準物質からのＭＳスペクトルと同一であることを示す。
【図８】図８のＡは、アセチルトランスフェラーゼＣｒＤＡＴによって産生されたビシクロファルネシルアセテートのＭＳスペクトルを示し、図８のＢは、このＭＳスペクトルがビシクロファルネシルアセテート標準物質からのＭＳスペクトルと同一であることを示す。
【図９】ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８、ＢＡＵ６１５５１．１、ＰｓＳａｌＡＴ、ＸＰ＿００１２１７２５０．１、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６、ＰＹＩ０４５５５．１およびＤｆＡＣＴ１３の各アセチルトランスフェラーゼを発現するS. cerevisiae細胞によって産生されたビシクロファルネシルアセテートの相対量を示す。
【０００９】
使用した略語
ｂｐ  塩基対
ｋｂ  キロベース
ＣｏＡ  コエンザイムＡ
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ＤＴＴ  ジチオスレイトール
ＦＰＰ  ファルネシル二リン酸
ＧＣ  ガスクロマトグラフ
ＭＳ  質量分析計／質量分析
ＭＶＡ  メバロン酸
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ  リボ核酸
ｍＲＮＡ  メッセンジャーリボ核酸
ｍｉＲＮＡ  マイクロＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ  低分子干渉ＲＮＡ
ｒＲＮＡ  リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ  転写ＲＮＡ
【００１０】
定義
別段の記載がない限り、以下の技術用語の定義が適用されるものとする：
本発明の目的のための「アセチルトランスフェラーゼ」または「アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」または「アセチル基を移動させることができるポリペプチド」は、より一般的にはアシルトランスフェラーゼＥＣ２．３．１のクラスの酵素を指し、特にアセチル−ＣｏＡ：アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼＥＣ２．３．１．８４を指す。それは、アセチル基供与体としてアセチル−ＣｏＡを用いて、アルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールから選択される少なくとも１種のドリマニルアルコールをアセチル化する能力を示す。ドリマニルアセテートは、その立体異性体のいずれかの形態で、またはその混合物として生成され得る。アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテートまたはビシクロファルネシルアセテートは、対応するアルコール前駆体が単一のアセチル基受容体として存在する場合には、唯一の生成物であり得、または２種以上のドリメニルアルコール類の混合物が提供され、アセチルトランスフェラーゼが基質特異的でない場合には、２種以上のドリメニルアセテートの混合物の一部であり得る。選択性が増加した場合、アセチルトランスフェラーゼは、優勢に単一のドリマニルアセテートを形成し得る。本明細書に記載されるようなアセチルトランスフェラーゼは、基質としての異なるドリマニルアルコール類に対して同一または異なる優先性または特異性を示し得る。例えば、第１のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にアルビカノールをアセチル化し得、第２のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にドリメノールをアセチル化し得、第３のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にビシクロファルネソールをアセチル化し得る。そのような場合、そのようなドリマニルアルコール類の混合物が基質として使用される場合には、それぞれの主生成物として、アルビカノールアセテート、ドリメノールアセテートまたはビシクロファルネシルアセテートが形成されるであろう。基質特異性の場合、アセチルトランスフェラーゼは、たとえそのようなドリマニルアルコール類の混合物が基質として使用される場合であっても、単一のドリマニルアセテートを選択的に形成し得る。特にアセチル化は、ドリマニルアルコール基質のそれぞれの立体化学的配置を保持した状態で実施される。
【００１１】
「アセチル基供与体」とは、酵素的にアセチル基を供与体から官能性ヒドロキシル基を有する分子のような受容体分子に移動させるための供給源として作用する化学的実体または分子を指し、この化学的実体または分子はまた、前記アセチル基と反応して対応する酢酸エステルを形成し得る。特定のアセチル基供与体は、アセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）である。
【００１２】
「ドリマンセスキテルペン」または「ドリマン」という用語は、図１ａに描写されているようなドリマン様炭素骨格構造を有する環状テルペン、またはより具体的には図１ｃのより一般的な構造に関し、ここで、任意に存在するＣ＝Ｃ二重結合の潜在的な位置は点線で示されている。
【００１３】
「ドリマニルアルコール」という用語は、「ドリマンセスキテルペン」または「ドリマン」のヒドロキシル化誘導体に関する。その例としては、任意の立体異性体の形態のアルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールが挙げられる。
【００１４】
「ドリマニルアセテート」という用語は、そのようなドリマニルアルコールのアセチルエステル誘導体、例えばアルビカニルアセテート、ドリメニルアセテート、およびビシクロファルネシルアセテートに関する。
【００１５】
本出願の目的のための「アルビカノール」とは、特に（＋）−アルビカノール（ＣＡＳ：５４６３２−０４−１）に関する。
【００１６】
本出願の目的のための「ドリメノール」とは、特に（−）−ドリメノール（ＣＡＳ：４６８−６８−８）に関する。
【００１７】
本出願の目的のための「ビシクロファルネソール」とは、特に（＋）−ビシクロファルネソールまたは［（４ａＳ，８ａＳ）−２，５，５，８ａ−テトラメチル−３，４，４ａ，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−１−ナフタレニル］メタノール（ＩＵＰＡＣ名）に関する。
【００１８】
「ファルネシル二リン酸」とは、（２Ｅ，６Ｅ）−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，６，１０−トリエン−１−ピロリン酸（ＦＰＰ）を指す。
【００１９】
本出願の目的のための「Ａｍｂｒｏｘ」とは、ＩＵＰＡＣ名：（−）−（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（ＣＡＳ：６７９０−５８−５）に関する。
【００２０】
「テルペンシンターゼ」または「セスキテルペンシンターゼ」または「ドリマンセスキテルペンシンターゼ」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２１】
「二官能性テルペンシンターゼ」または「二官能性テルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド」という用語は、２０１８年５月３１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４号明細書にさらに定義されているポリペプチドに関する。
【００２２】
「アルビカニル二リン酸シンターゼ」または「アルビカニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド」または「アルビカニル二リン酸シンターゼタンパク質」または「アルビカニル二リン酸を産生する能力を有する」という用語は、アルビカニル二リン酸の合成を、その立体異性体またはそれらの混合物のいずれかの形態で、非環状テルペンピロリン酸、特にファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から出発して触媒することができるポリペプチドに関する。アルビカニル二リン酸は、唯一の生成物であってもよいし、セスキテルペン類の混合物の一部であってもよい。前記混合物は、アルビカニル一リン酸および／またはアルビカノールを含んでいてもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、２０１８年５月２９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８８９０２に記載されている。
【００２３】
「アルビカニル二リン酸シンターゼ活性」は、国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８８９０２号明細書に記載されているように、「標準的な条件」の下で決定される。
【００２４】
「アルビカノールシンターゼ」または「アルビカノールシンターゼ活性を有するポリペプチド」または「アルビカノールシンターゼタンパク質」という用語は、アルビカノールの合成を、その立体異性体またはそれらの混合物のいずれかの形態で、非環状テルペンピロリン酸、特にファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から出発して触媒することができるポリペプチドに関する。アルビカノールは、唯一の生成物であってもよいし、２種以上のセスキテルペン類の混合物の一部であってもよい。
【００２５】
「ドリメノールシンターゼ」または「ドリメノールシンターゼ活性を有するポリペプチド」または「ドリメノールシンターゼタンパク質」という用語は、ドリメノールの合成を、その立体異性体またはそれらの混合物のいずれかの形態で、非環状テルペンピロリン酸、特にファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から出発して触媒することができるポリペプチドに関する。ドリメノールは、唯一の生成物であってもよいし、２種以上のセスキテルペン類の混合物の一部であってもよい。
【００２６】
「アルビカノールシンターゼ活性」およびドリメノールシンターゼ活性は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４４号明細書、国際公開第２０１５／１６９８７１号または国際公開第２０１５／１７６９５９号に記載されているように決定される。
【００２７】
本発明で使用される「ホスファターゼ」酵素は、水の消費下でオルトリン酸エステルをそれぞれのアルコールとオルトリン酸とに変換する能力を有する。ここで包含されるのは、酸性ホスファターゼ（酸性反応が最適なＥＣ３．１．３．２）およびアルカリ性ホスファターゼ（アルカリ性反応が最適なＥＣ３．１．３．１）である。
【００２８】
「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、本明細書に記載されるようなテルペンシンターゼの能力であって、ａ）アルビカニル二リン酸および／またはアルビカノール、以下：アルビカニル二リン酸、および／またはアルビカニル一リン酸および／またはアルビカノールおよび／または１種以上の他のテルペン類、特にアルビカニル二リン酸を含む化合物の混合物の形成を触媒すること、またはｂ）ドリマニルアルコールもしくは２種以上のドリマニルアルコールと任意に１種以上の他のテルペン類との混合物の形成を触媒することを指す。
【００２９】
「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、本明細書に記載されるようなアセチルトランスフェラーゼの能力であって、ドリマニルアセテートまたは２種以上のドリマニルアセテートと任意に１種以上の他のアセチル化化合物との混合物の形成を触媒することを指す。
【００３０】
「テルペン類の混合物」または「セスキテルペン類の混合物」という用語は、アルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールのうちの少なくとも１種を含み、かつ１種以上の追加のテルペン類および／または１種以上の追加のセスキテルペン類を含んでいてもよいテルペン類またはセスキテルペン類の混合物を指す。
【００３１】
「イソプレノイド経路」または「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路」としても知られている「メバロン酸経路」は、真核生物、古細菌、および一部の細菌に存在する必須の代謝経路である。メバロン酸経路はアセチル−ＣｏＡから始まり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と呼ばれる２つの５炭素ビルディングブロックを産生する。鍵となる酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼである。メバロン酸経路を酵素活性と組み合わせて、特にＦＰＰシンターゼのような、テルペン前駆体ＧＰＰ、ＦＰＰまたはＧＧＰＰを産生することにより、テルペン類の組換え細胞産生が可能になる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」または「形質転換細胞」という用語は、少なくとも１つの核酸分子、例えば、所望のタンパク質または核酸配列をコードする組換え遺伝子を含むように改変された細胞（または生物）を指し、この組換え遺伝子は、転写時に、本明細書に記載されるような生体触媒法または他の組換え法を実施するために必要とされる本発明の少なくとも１種の機能的ポリペプチドを産出する。特に、そのような宿主細胞または形質転換細胞は、対応するドリマニルアルコールから少なくとも１種のドリマニルアセテートを調製するのに有用なアセチルトランスフェラーゼを提供する。それらはまた、アルビカニル二リン酸および／またはアルビカニル一リン酸および／またはアルビカノール、またはアルビカニル二リン酸および／またはアルビカニル一リン酸および／またはアルビカノールを含有するテルペン類の対応する混合物を産生するのに有用なアルビカニル二リン酸シンターゼタンパク質のような他の酵素を提供し得る。それらはまた、少なくとも１種のドリマニルアルコールを調製するのに有用なテルペンシンターゼを提供し得る。宿主細胞は、特に細菌細胞、真菌細胞、または植物細胞もしくは植物である。宿主細胞は、宿主細胞の核ゲノムまたはオルガネラゲノムに組み込まれた組換え遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、宿主は、組換え遺伝子を染色体外に含んでいてもよい。
【００３３】
「生物」という用語は、非ヒト多細胞もしくは単細胞生物、例えば植物、または微生物を指す。特に微生物は、細菌、酵母、藻類、または真菌類である。
【００３４】
「植物」という用語は、植物原形質体、植物組織、再生植物、もしくは植物の一部を生じさせる植物細胞組織培養物を含む植物細胞、または根、茎、葉、花、花粉、卵巣、胚、果実などの植物器官を含めるために互換的に使用される。本明細書の一実施形態の方法を実行するために、任意の植物を使用することができる。
【００３５】
特定の生物または細胞は、それがＦＰＰを天然に産生する場合、またはそれがＦＰＰを天然に産生しないが、本明細書に記載されているように核酸でＦＰＰを産生するように形質転換されている場合、「ＦＰＰを産生することができる」ことを意味する。天然に存在する生物または細胞よりも多量のＦＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞もまた、「ＦＰＰを産生することができる生物または細胞」に包含される。
【００３６】
特定の生物または細胞は、それがドリマニルアセテートを天然に産生する場合、またはそれがドリマニルアセテートを天然に産生しないが、本明細書に記載されているように核酸でドリマニルアセテートを産生するように形質転換されている場合、「ドリマニルアセテートを産生することができる」ことを意味する。天然に存在する生物または細胞よりも多量のドリマニルアセテートを産生するように形質転換された生物または細胞もまた、「ドリマニルアセテートを産生することができる生物または細胞」に包含される。
【００３７】
特定の生物または細胞は、それがドリマニルアルコールを天然に産生する場合、またはそれがドリマニルアルコールを天然に産生しないが、ドリマニル二リン酸を産生するように形質転換されており、任意にさらに核酸で形質転換されてドリマニル二リン酸をドリマニルアルコールに変換する酵素活性を産生する場合、「ドリマニルアルコールを生成することができる」ことを意味する。天然に存在する生物または細胞よりも多量のドリマニルアルコールを生成するように形質転換された生物または細胞も、「ドリマニルアルコールを生成することができる生物または細胞」に包含される。
【００３８】
本明細書の説明および添付の特許請求の範囲において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」は互換性があり、限定することを意図していない。
【００３９】
様々な実施形態の説明が「含む(comprising)」という用語を使用する場合、当業者であれば、いくつかの特定の例において、実施形態が「本質的に〜からなる」または「〜からなる」という言語を使用して代替的に記載され得ることを理解するであろうことをさらに理解されたい。
【００４０】
本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その天然状態で付随する他の異種化合物を含まない状態を指し、そのため、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象は、所定のサンプルの質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％もしくは２０重量％、または少なくとも５０重量％もしくは７５重量％を含む。一実施形態では、これらの用語は、所定のサンプルの質量の少なくとも９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％または１００％重量％を含む本発明の化合物を指す。本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質を指すときの核酸またはタンパク質の「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語はまた、例えば、原核生物または真核生物の環境において、例えば、細菌もしくは真菌の細胞、または哺乳類の生物、特に人体のような環境において天然に存在するものとは異なる精製または濃度の状態を指す。（１）他の関連する構造物もしくは化合物からの精製、または（２）前記原核生物もしくは真核生物の環境において通常は付随しない構造物もしくは化合物との関連付けを含む、天然に存在するものよりも高い精製または濃度の任意の程度は、「単離された」の意味の範囲内である。本明細書に記載される核酸もしくはタンパク質または核酸もしくはタンパク質のクラスは、当業者に知られている様々な方法およびプロセスに従って、単離されていてもよいし、そうでなければ、自然界に通常は付随しない構造物または化合物と関連付けされていてもよい。
【００４１】
「約」という用語は、記載された値の±２５％、特に±１５％、±１０％、より具体的には±５％、±２％または±１％の潜在的な変動を示す。
【００４２】
「実質的に」という用語は、約８０〜１００％の範囲の値、例えば、８５〜９９．９％、特に９０〜９９．９％、より具体的には９５〜９９．９％、または９８〜９９．９％、特に９９〜９９．９％などの範囲の値を記載する。
【００４３】
「優勢に」とは、例えば、５１〜１００％の範囲、特に７５〜９９．９９％、より具体的には８５〜９９．５％、例えば９５〜９９％の範囲のように、５０％を超える範囲の割合を指す。
【００４４】
本発明の文脈における「主生成物」は、単一の化合物または少なくとも２種の化合物、例えば２種、３種、４種、５種以上、特に２種もしくは３種の化合物の群を示し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載されるような反応によって「優勢に」調製され、かつ前記反応によって形成された生成物の構成成分の総量を基準として優勢な割合で前記反応中に含まれる。前記割合は、モル比、重量比、または好ましくはクロマトグラフィー分析に基づいて、反応生成物の対応するクロマトグラムから計算された面積比であってもよい。
【００４５】
本発明の文脈における「副生成物」は、単一の化合物または少なくとも２種の化合物、例えば２種、３種、４種、５種以上、特に２種もしくは３種の化合物の群を示し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載されるような反応によって「優勢に」調製されない。
【００４６】
酵素反応は可逆性を有するため、本発明は、別段の記載がない限り、本明細書に記載される酵素反応または生体触媒反応の両方向の反応に関する。
【００４７】
本明細書に記載されるポリペプチドの「機能的変異体」には、以下に定義されているポリペプチドの「機能的等価物」が含まれる。
【００４８】
「立体異性体」という用語には、特に立体配座異性体が含まれる。
【００４９】
一般に、本発明によれば、本明細書に記載される化合物のすべての「立体異性体の形態」、例えば、構造異性体、特に立体異性体およびそれらの混合物、例えば、光学異性体、またはＥ−異性体およびＺ−異性体などの幾何異性体、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。複数の不斉中心が１分子中に存在する場合、本発明は、これらの不斉中心の異なる立体配座のすべての組み合わせ、例えば、エナンチオマー対を包含する。
【００５０】
「立体選択性」は、化合物の特定の立体異性体を立体異性体的に純粋な形態で生成する能力、または複数の立体異性体から本明細書に記載されるような酵素触媒法で特定の立体異性体を特異的に変換する能力を記載する。より具体的には、これは、本発明の生成物が特定の立体異性体に関して濃縮されていたり、抽出物が特定の立体異性体に関して希釈されていたりすることを意味する。これは、次の式に従って計算された純度％ｅｅパラメーターを介して定量化され得る：
％ｅｅ＝［ＸＡ−ＸＢ］／［ＸＡ＋ＸＢ］＊１００
式中、ＸＡおよびＸＢは、立体異性体ＡおよびＢのモル比（モル分率）を表す。
【００５１】
「選択的に変換する」または「選択性を高める」という用語は、一般に、不飽和炭化水素の特定の立体異性体の形態、例えばＥ形態のようなものが、対応する他の立体異性体の形態、例えばＺ形態のようなものよりも（モルベースで比較して）高い割合または量で、前記反応の全過程中（すなわち、反応の開始と終了の間）、前記反応の特定の時点で、または前記反応の「間隔」中のいずれかで変換されることを意味する。特に、前記選択性は、基質の初期量の１〜９９％、２〜９５％、３〜９０％、５〜８５％、１０〜８０％、１５〜７５％、２０〜７０％、２５〜６５％、３０〜６０％、または４０〜５０％の変換率に対応する「間隔」中に観察され得る。前記のより高い割合または量は、例えば、以下の観点から表現され得る：
−  反応の全過程またはその前記間隔中に観察された異性体のより高い最大収率；
−  基質の変換値の定義された％度での異性体のより高い相対量；および／または
−  より高い変換値の％度での異性体の同一の相対量
であって、それぞれが参照方法と比較して観察されることが好ましく、前記参照方法は、既知の化学的または生化学的手段と他の点では同一の条件下で実施される。
【００５２】
一般に、本発明に従って、本明細書に記載される化合物のすべての「異性体の形態」、例えば、構造異性体、特に立体異性体およびそれらの混合物、例えば、光学異性体、またはＥ−異性体およびＺ−異性体などの幾何異性体、ならびにそれらの組み合わせなども含まれる。複数の不斉中心が分子中に存在する場合、本発明は、これらの不斉中心の異なる立体配座のすべての組み合わせ、例えば、エナンチオマー対、または立体異性体の形態の任意の混合物などを含む。
【００５３】
本発明による反応の「収率」および／または「変換率」は、例えば、反応が行われる４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、３６または４８時間の定義された期間にわたって決定される。特に、反応は、正確に定義された条件、例えば、本明細書で定義されるような「標準的な条件」で行われる。
【００５４】
異なる収率パラメーター（「収率」またはＹＰ／Ｓ；「比産性収率」；または「空時収率（ＳＴＹ）」）は、当該技術分野で周知であり、文献に記載されているように決定される。
【００５５】
「収率」および「ＹＰ／Ｓ」（それぞれ、産生された生成物の質量／消費された材料の質量で表される）は、本明細書では同義語として使用される。
【００５６】
比産性収率は、バイオマス１ｇあたり１時間および発酵ブロス１Ｌあたりで産生される生成物の量を記載する。ＷＣＷと記載される湿潤細胞重量の量は、生化学反応における生物学的に活性な微生物の量を記載する。この値は、１時間あたりのＷＣＷ１ｇあたりの生成物のｇ数（すなわち、ｇ／ｇＷＣＷ−１ｈ−１）として与えられる。あるいは、バイオマスの量は、ＤＣＷとして記載される乾燥細胞重量の量として表すこともできる。さらに、バイオマス濃度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度を測定し、実験的に決定された相関係数を使用して対応する湿潤細胞重量または乾燥細胞重量をそれぞれ推定することによって、より簡単に決定することができる。
【００５７】
「発酵産生」または「発酵」という用語は、インキュベーションに添加された少なくとも１つの炭素源を利用して、細胞培養において化合物を生成する微生物の能力（前記微生物に含まれるか、または前記微生物によって引き起こされる酵素活性によって支援される）を指す。
【００５８】
「発酵ブロス」という用語は、発酵プロセスに基づいており、かつ処理されていないか、または、例えば、本明細書に記載されているように処理された液体、特に水性または水性／有機溶液を意味すると理解される。
【００５９】
「酵素的に触媒される」または「生体触媒による」方法とは、前記方法が、本明細書で定義されているように、酵素変異体を含む酵素の触媒作用下で実施されることを意味する。したがって、この方法は、単離された（精製された、濃縮された）もしくは粗製の形態の前記酵素の存在下で、または細胞系、特に、前記酵素を活性形態で含有し、かつ本明細書に開示されているような変換反応を触媒する能力を有する天然または組換え微生物細胞の存在下のいずれかで実施され得る。
【００６０】
本開示が、異なる優先性の程度の特徴、パラメーターおよびその範囲（一般的な、明示的に好ましくない特徴、パラメーターおよび範囲を含む）に言及する場合、別段の記載がない限り、そのような特徴、パラメーターおよび範囲の２つ以上の組み合わせが、それらのそれぞれの優先性の程度にかかわらず、本明細書の開示によって包含される。
【００６１】
詳細な説明
ａ．本発明の特定の実施形態
１．少なくとも１種の、特に１種、２種または３種、特に１種または２種のドリマニルアセテート化合物を生体触媒的に生成する方法であって、
（１）アセチル基供与体の存在下で、立体異性的に純粋な形態または立体異性体の混合物の形態における少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアルコールを、特に、前記アセチル基供与体からのアセチル基を少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１種の、特に１つのポリペプチドと接触させて、主生成物として少なくとも１種のドリマニルアセテート、特に主生成物として１種のドリマニルアセテートを得るステップと、
（２）任意に、ステップ（１）の反応生成物から少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアセテート化合物を単離するステップと
を含む、方法。
複数のドリマニルアセテートが形成される場合、混合物をさらに分離し、個々のアセテートを精製してもよい。
【００６２】
２．前記ドリマニルアセテート化合物が、アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテート、およびビシクロファルネシルアセテートからなる群から選択され、それぞれが立体異性体的に純粋な形態で、またはその少なくとも２つの立体異性体の混合物、または前記アセテートの群のうちの少なくとも２つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、実施形態１の方法。特定の実施形態では、単に１種のドリマニルアルコールが基質として使用され、単に１種のドリマニルアセテートが、立体異性体的に純粋な形態で、またはその少なくとも２種の立体異性体の混合物として、特に立体異性体的に純粋な形態で、生成物として得られる。
【００６３】
３．前記ドリマニルアルコールが、アルビカノール、特に（＋）−アルビカノール、ドリメノール、特に（−）−ドリメノール、およびビシクロファルネソール、特に（＋）−ビシクロファルネソールからなる群から選択され、それぞれが立体異性的に純粋な形態で、またはその少なくとも２つの立体異性体の混合物、または前記アルコールの群のうちの少なくとも２つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、実施形態１または２の方法。特定の実施形態では、単に１種のドリマニルアルコール、特に立体異性体的に純粋な形態のものが基質として使用される。
【００６４】
４．前記アセチル基供与体がアセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）である、前記先行する実施形態のいずれか１つの方法。前記供与体は、外因的に反応混合物に添加されてもよく、例えば、単離された、濃縮された、もしくは精製された酵素を適用するインビトロプロセスにおいて添加されてもよく、またはより具体的には内因的に存在してもよく、例えば、代謝物としてアセチル−ＣｏＡを産生し、かつ意図されたアセチル化もしくは前記アセチル化を１つのステップとして包含するより複雑な多段階のプロセスを実施するために必要とされるポリペプチドまたはポリペプチド類を発現する宿主細胞系を適用するインビボプロセスにおいて存在してもよい。
【００６５】
５．前記アセチルトランスフェラーゼが、
ａ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１４３および１４４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
ｂ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１４３および１４４の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００６６】
本発明の特定のアセチルトランスフェラーゼが、アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテート、およびビシクロファルネシルアセテートからなる群から選択される１種以上のドリメニルアセテート化合物を生成する能力は、以下のリストによって示される：
【表１】
2022502008.tif 000002
【００６７】
６．ステップ１）に先立って、前記少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアルコール化合物を生体触媒的に形成することをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００６８】
７．前記ドリマニルアルコール化合物が反応混合物中に内因的に存在してもよく、例えば、代謝物として前記ドリマニルアセテート化合物を生成し、かつ意図されたドリマニルアルコール合成または前記ドリマニルアルコール合成を１つのステップとして包含するより複雑な多段階のプロセスを実施するために必要とされるポリペプチドまたはポリペプチド類を発現する宿主細胞系を適用するインビボプロセスにおいて存在してもよく、それによって前記ドリマニルアルコールは、非環状セスキテルペン前駆体から酵素的に合成される、実施形態６の方法。
【００６９】
あるいは、前記ドリマニルアルコール化合物は、化学的または酵素的に生成され、かつ反応混合物に外因的に添加され、例えば、以下に定義されているように、その形成に必要とされる単離された、濃縮された、または精製されたシンターゼ酵素を適用するインビトロプロセスにおいて添加される。
【００７０】
８．前記非環状セスキテルペン前駆体がファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）である、実施形態７の方法。
【００７１】
９．ドリマニルアルコールの前記酵素的合成が、前記非環状セスキテルペン前駆体を、１つ以上の酵素的ステップにおいて、特に主生成物として少なくとも１種のドリマニルアルコール、特に１種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する１つ以上のポリペプチドによって触媒される、実施形態７または８の方法。
【００７２】
１０．前記少なくとも１種のドリマニルアルコールが、１つまたはそれ以上、特に２つの酵素的ステップでＦＰＰから産生される、実施形態６から９のうちのいずれか１つの方法。
【００７３】
１１．前記少なくとも１種のドリマニルアルコールが、
ａ）前記ドリマニルアルコールを形成するドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド（１段階生合成）；または
ｂ）少なくとも１種のドリマニルリン酸中間体を形成するドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと、前記少なくとも１種のドリマニルリン酸（一リン酸および／または二リン酸）中間体を少なくとも１種のドリマニルアルコールに変換するホスファターゼ活性を有するポリペプチドとの組み合わせ（２段階生合成）
によって触媒される、ＦＰＰの酵素的変換によって生成される、実施形態１０の方法。
【００７４】
１２．
ａ）前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、アルビカノールシンターゼ活性、ドリメノールシンターゼ活性、ビシクロファルネソールシンターゼ活性またはそのような活性の任意の組み合わせから選択され、特に、前記活性のうちの１つを優先的に示し、より具体的には、前記活性のうちの１つを特異的に示し、かつ
ｂ）前記ポリペプチドの組み合わせが、ドリマニル二リン酸シンターゼ活性、特にアルビカニル二リン酸シンターゼ活性およびホスファターゼ酵素、例えば細菌性アルカリホスファターゼを含む、
実施形態１１の方法。
【００７５】
１３．
ａ）前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４号明細書（２０１８年５月３１日付出願）に記載されるようなドリマンシンターゼならびに国際公開第２０１５／１６９８７１号および国際公開第２０１５／１７６９５９号に記載されるようなドリメノールシンターゼから選択され、
ｂ）前記ドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、モノリン酸のようなアルビカニルリン酸誘導体、より具体的には基質としてのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からアルビカニル二リン酸誘導体を産生する能力を含む、２０１８年５月２９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８８９０２号明細書に記載されるようなアルビカニル二リン酸シンターゼである。
実施形態１２の方法。
【００７６】
国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８８９０２号明細書（２０１８年５月２９日付出願）に記載されるようなアルビカニル二リン酸シンターゼは、
Dryopteris fragransのＤｆＨＡＤ、ＤｆＨＡＤ−９（Ｖ２７４Ａ）、ＤｆＨＡＤ−Ｈｉｓ＿ＧＳＴ、およびＤｆＨＡＤ−８（Ｋ５３２Ｒ）
ならびにそれらと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、それらに由来するポリペプチド
である。
【００７７】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４号明細書（２０１８年５月３１日付出願）に記載されるようなドリマンシンターゼ（すなわち、アルビカノールシンターゼまたはドリメノールシンターゼ）は、
【表２】
2022502008.tif 000003
およびそれらと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、それらに由来するポリペプチド
である。
【００７８】
国際公開第２０１５／１６９８７１号に記載されるようなドリメノールシンターゼは、
【表３】
2022502008.tif 000004
およびそれらと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、それらに由来するポリペプチド
である。
【００７９】
国際公開第２０１５／１７６９５９号に記載されるようなドリメノールシンターゼは、
Valeriana amurensisのＶａＴＰＳ３
およびそれと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、それに由来するポリペプチド
である。
【００８０】
上記シンターゼ酵素のそれぞれのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の配列番号は、本明細書の末尾に列挙されている。これらのポリペプチドおよび核酸ならびにこれらの配列のうちの少なくとも１つと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、それらに由来するポリペプチドおよび核酸も本開示の一部である。
【００８１】
１４．前記ドリマンセスキテルペンシンターゼが、
ａ）国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４号明細書に記載されるような、（二官能性）アルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはアルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号５と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド；
ｂ）国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６４３４４号明細書に記載されるような、（二官能性）ドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号７と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド
から選択される、実施形態１３の方法。
【００８２】
１５．インビボでは宿主細胞培養中で、またはインビトロでは宿主細胞溶解物もしくは少なくとも１種のドリマニルアセテートを産生するのに必要とされる濃縮もしくは単離されたポリペプチドを含む液体反応媒体中で実施され、それぞれ少なくとも１種のドリマニルアセテートの生成を助長する条件下にある、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００８３】
特に反応は、アセチル基供与体として内因的に形成されたまたは外因的に添加されたアセチル−ＣｏＡの存在下で行われる。特に反応は、内因的に形成されたまたは外因的に添加されたＦＰＰの存在下で行われる。特に内因的に形成されたＦＰＰは、ＦＰＰに生体変換可能な少なくとも１つの炭素源、例えば糖基質のような炭素源の代謝の結果である。ＦＰＰおよびアセチル−ＣｏＡが内因的に形成された細胞内インビボ法が特に着目される。
【００８４】
これらの宿主細胞または生物の中には、ＦＰＰを天然に産生しないものもある。本明細書に記載されるような実施形態の方法を行うのに好適には、非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰを天然に産生しない生物または細胞は、前記前駆体を生成するように遺伝子改変される。生物または細胞は、例えば、上記の実施形態のいずれかに従って記載された核酸による修飾前に、または同時に、そのように形質転換され得る。非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰを産生するように生物を形質転換する方法は、当該技術分野で既に知られている。例えば、メバロン酸経路の酵素活性を導入することは、生物にＦＰＰを産生させるのに適した戦略である。
【００８５】
１６．
ａ）実施形態５に定義されている少なくとも１種のアセチルトランスフェラーゼ；任意に
ｂ）非環状セスキテルペン前駆体ＦＰＰを、実施形態９から１４のうちのいずれか１つに定義されている少なくとも１種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する少なくとも１つのポリペプチド；および任意に
ｃ）上記で定義されているメバロン酸経路に関与する酵素から選択される少なくとも１種の酵素
を機能的に発現することができる、組換え非ヒト宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物中で実施される、実施形態１５の方法。
【００８６】
特定の実施形態では、酵素ａ）およびｂ）、または酵素ａ）、ｂ）およびｃ）は、本発明のインビボ法において適用されるような細胞系によって機能的に発現される。
【００８７】
１７．前記非ヒト宿主細胞または宿主生物が、原核生物もしくは真核生物の微生物、またはそれらに由来する細胞から選択される、実施形態１６の方法。
【００８８】
１８．前記非ヒト宿主細胞または宿主生物が、細菌、真菌および植物の細胞または植物から選択される、実施形態１７の方法。
【００８９】
１９．前記真菌細胞が、酵母細胞であって、特に、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属またはヤロウイア(Yarrowia)属から、特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（出芽酵母）種、ピキア・パストリ（Pichia pastori）（ピキア酵母）種またはヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）（アルカン資化酵母）種から選択された酵母細胞である、実施形態１８の方法。
【００９０】
２０．前記細菌細胞が、ロドコッカス（Rhodococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、またはエシェリヒア（Escherichia）属、特に大腸菌から選択される、実施形態１８の方法。
【００９１】
２１．ステップ（３）として、ステップ（１）またはステップ（２）の少なくとも１種のドリマニルアセテートを処理して、化学合成または生体触媒合成またはその両方の組み合わせを使用して誘導体を得ることをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００９２】
２２．誘導体が、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシド、エステルおよび／または多環式化合物である、実施形態２１の方法。
【００９３】
２３．ドリマニルアセテートが、アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテートまたはビシクロファルネシルアセテート、特にアルビカニルアセテートまたはドリメニルアセテートを、主たるドリマニルアルコール生成物として、または特に単一のドリマニルアルコール生成物として含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００９４】
２４．前記方法が、特に、非ヒト宿主生物または宿主細胞を、
ａ）アセチル基供与体からのアセチル基をドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
ｂ）非環状セスキテルペン前駆体からドリマニルアルコールを生成することができるドリマニルアルコールシンターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
ｃ）前記非環状セスキテルペン前駆体を生成するための生合成経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと
で形質転換することを含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
【００９５】
特定の実施形態では、非ヒト宿主生物または宿主細胞は、ａ）およびｂ）、またはａ）、ｂ）およびｃ）で形質転換され、より具体的には、安定的にゲノムに組み込まれた前記核酸を含む。前記核酸ａ）、ｂ）および／またはｃ）は、同一もしくは２種以上の異なるベクター上に位置していてもよい。
【００９６】
２５．アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、ドリマニルアセテートを産生するためにアセチル基供与体からのアセチル基をドリマニルアルコールに移動させることができるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１４３および１４４から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【００９７】
２６．単離された核酸分子であって、
ａ）実施形態５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３２、１３４および１３５から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上１００％未満の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）の配列のうちの１つに相補的な配列を含むヌクレオチド配列を含むか、または
ｄ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、
単離された核酸分子。
【００９８】
２７．実施形態２６の少なくとも１つの核酸分子を含む発現構築物。
【００９９】
２８．実施形態２５の少なくとも１つの核酸分子または実施形態２６の少なくとも１つの発現構築物を含むベクター。
【０１００】
２９．ベクターが、原核生物、ウイルスまたは真核生物のベクターである、実施形態２８のベクター。
【０１０１】
３０．ベクターが発現ベクターである、実施形態２８または２９のベクター。
【０１０２】
３１．ベクターがプラスミドベクターである、実施形態２８〜３０のいずれか１つのベクター。
【０１０３】
３２．組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物であって、
ａ）実施形態２６の少なくとも１つの単離された核酸分子であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているもの、または
ｂ）実施形態２７の少なくとも１つの発現構築物であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているもの、または
ｃ）実施形態２８から３１のうちのいずれか１つの少なくとも１つのベクター
を含む、組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物。
【０１０４】
特定の実施形態では、非ヒト宿主生物または宿主細胞は、ａ）およびｂ）、またはａ）、ｂ）およびｃ）で形質転換され、より具体的には、安定的にゲノムに組み込まれた前記核酸を含む。
【０１０５】
３３．原核生物または真核生物の微生物、またはそれらに由来する細胞から選択される、実施形態３２の宿主細胞または宿主生物。
【０１０６】
３４．細菌、真菌および植物の細胞または植物から選択される、実施形態３３の宿主細胞または宿主生物。
【０１０７】
３５．前記真菌細胞が酵母細胞である、実施形態３４の宿主細胞または宿主生物。
【０１０８】
３６．前記細菌細胞が、エシェリヒア属、特に大腸菌種から選択され、前記酵母細胞が、サッカロマイセス属、ピキア属、またはヤロウイア属から、特に、サッカロマイセス・セレビシエ種、ピキア・パストリス種、またはヤロウイア・リポリティカ種から選択される、実施形態３５の宿主細胞または宿主生物。
【０１０９】
３７．実施形態２５記載の少なくとも１種の触媒活性ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）実施形態３２から３４のうちのいずれか１つの非ヒト宿主生物または宿主細胞を培養して、実施形態２５記載の少なくとも１つのポリペプチドを発現または過剰発現させるステップと、
ｂ）任意に、ステップａ）で培養された非ヒト宿主細胞または生物からポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
【０１１０】
３８．ステップａ）に先立って、特に、非ヒト宿主生物または細胞を、それが請求項２５記載のポリペプチドを発現または過剰発現するように、請求項２６記載の少なくとも１つの核酸、または請求項２７記載の少なくとも１つの構築物、または請求項２８から３１のうちのいずれか１つのうちの少なくとも１つのベクターで形質転換することを提供するステップをさらに含む、実施形態３７の方法。
【０１１１】
３９．アセチルトランスフェラーゼ活性を含み、少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアセテートを産生するためにアセチル基供与体からのアセチル基を少なくとも１種の、特に１種のドリマニルアルコールに移動させることができる変異体ポリペプチドを調製する方法であって、当該方法は、
ａ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３３、１３６、１４３および１４４から選択されるポリペプチドをコードする核酸分子を選択するステップと、
ｂ）選択された核酸分子を改変して、少なくとも１つの変異体核酸分子を得るステップと、
ｃ）宿主細胞または単細胞宿主生物を変異体核酸配列で形質転換して、変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現させるステップと、
ｄ）発現産物を、アセチルトランスフェラーゼ活性を含む少なくとも１つの変異体についてスクリーニングするステップと、
ｅ）任意に、ポリペプチドが所望の変異体活性を有しない場合、所望の変異体活性を有するポリペプチドが得られるまで、プロセスステップａ）〜ｄ）を繰り返すステップと、
ｆ）任意に、ステップｄ）で所望の変異体活性を有するポリペプチドが同定された場合、ステップｃ）で得られた対応する変異体核酸を単離するステップと
を含む、方法。
【０１１２】
４０．匂い物質、フレーバーもしくはフレグランス成分または昆虫／害虫防除成分を調製するための、例えば、ボディケア、ホームケア、またはフレグランス組成物から選択される組成物の調製における使用のための、先行する実施形態のいずれか１つに定義されているアセチルトランスフェラーゼの使用。
【０１１３】
ｂ．本発明に従って適用可能なポリペプチド
この文脈では、以下の定義が適用される：
「ポリペプチド」または「ペプチド」という一般用語は、互換的に使用することができ、約１０〜約１，０００を超える残基までを含む、ペプチドで連結された連続アミノ酸残基の天然もしくは合成の直鎖または配列を指す。３０残基までを有する短鎖ポリペプチドは、「オリゴペプチド」とも称される。
【０１１４】
「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチドを含む高分子構造を指す。そのポリペプチド（類）のアミノ酸配列は、タンパク質の「一次構造」を表す。アミノ酸配列はまた、ポリペプチド鎖内に形成されたα−ヘリカル構造およびβ−シート構造などの特殊な構造要素の形成によって、タンパク質の「二次構造」を決定する。そのような二次構造要素の複数の配置は、タンパク質の「三次構造」または空間的配置を規定する。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、前記鎖は空間的に配置され、タンパク質の「四次構造」を形成する。タンパク質の正しい空間的配置または「フォールディング」は、タンパク質の機能の必須条件である。変性またはアンフォールディングは、タンパク質の機能を破壊する。そのような破壊が可逆的である場合、タンパク質の機能はリフォールディングによって回復され得る。
【０１１５】
本明細書で言及される典型的なタンパク質の機能は、「酵素機能」であり、すなわち、タンパク質は、基質、例えば化合物上で生体触媒として作用し、前記基質の産物への変換を触媒する。酵素は、高度または低度の基質特異性および／または産物特異性を示し得る。
【０１１６】
したがって、特定の「活性」を有するものとして本明細書で言及される「ポリペプチド」とは、例えば特定の酵素活性のように、指標活性を示す正しく折り畳まれたタンパク質を暗示的に指す。
【０１１７】
したがって、別段の指示がない限り、「ポリペプチド」という用語はまた、「タンパク質」および「酵素」という用語を包含する。
【０１１８】
同様に、「ポリペプチド断片」という用語は、「タンパク質断片」および「酵素断片」という用語を包含する。
【０１１９】
「単離されたポリペプチド」という用語は、当該技術分野で知られている任意の方法または方法の組み合わせによって自然環境から除去されたアミノ酸配列を指し、組換え法、生化学的法および合成法を含む。
【０１２０】
「標的ペプチド」とは、タンパク質またはポリペプチドを細胞内小器官、すなわちミトコンドリアもしくはプラスチド、または細胞外空間（分泌シグナルペプチド）に標的化するアミノ酸配列を指す。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端、例えばＮ末端をコードする核酸配列に融合され得るか、または天然の標的化ポリペプチドの代わりに使用され得る。
【０１２１】
本発明はまた、本明細書に具体的に記載されるポリペプチドの「機能的等価物」（「アナログ」または「機能的変異」とも称される）に関する。
【０１２２】
例えば、「機能的等価物」とは、酵素活性の決定に使用される試験において、本明細書に具体的に記載されるポリペプチドの酵素活性より少なくとも１〜１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％高いまたは低い酵素活性を示し、前記比較の基礎として役立つポリペプチドを指す。
【０１２３】
「機能的等価物」はまた、本発明によれば、本明細書に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に記載されたアミノ酸とは異なるアミノ酸を有するが、それにもかかわらず、例えば酵素活性のような上述の生物学的活性のうちの１つを有する特定の変異体を対象とする。したがって、「機能的等価物」は、１以上、例えば１〜２０、特に１〜１５または５〜１０のアミノ酸の付加、置換、特に保存的置換（すなわち、その結果、当該アミノ酸は、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸で置き換えられる）、欠失および／または逆転によって得られる変異体を含み、この場合、記載された変化は、本発明による特性のプロファイルを有する変異体をもたらすことを条件として、いかなる配列位置でも起こり得るものである。機能的等価性は、活性パターンが、変異体と未変化ポリペプチドとの間で定性的に一致する場合、すなわち、例えば、同じアゴニストまたはアンタゴニストまたは基質との相互作用が、しかしながら異なる速度で観察される場合（すなわち、ＥＣ５０またはＩＣ５０値または当該技術分野において適切な他の任意のパラメーターによって表される場合）にも、特に提供される。適切な（保存的）アミノ酸置換の例を以下の表に示す。
【０１２４】
【表４】
2022502008.tif 000005
【０１２５】
上記の意味での「機能的等価物」はまた、本明細書に記載されるポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。
【０１２６】
「前駆体」は、その場合、所望の生物学的活性の有無にかかわらず、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【０１２７】
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のアミノ基の酸付加塩と同様に、カルボキシル基の塩を意味する。カルボキシル基の塩は、公知の方法で生成することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛の塩、ならびに有機塩基、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどのアミン類との塩を含む。酸付加塩、例えば、塩酸および硫酸などの無機酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩も本発明の対象となる。
【０１２８】
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸側基上またはそのＮ末端もしくはＣ末端で生成することができる。そのような誘導体は、例えば、アンモニアとの反応または第一級もしくは第二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって生成される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応により生成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。
【０１２９】
「機能的等価物」はまた、当然、天然に存在する多様体だけでなく、他の生物から得ることができるポリペプチドも含む。例えば、配列比較によって相同配列領域の範囲を確立することができ、本発明の具体的なパラメーターに基づいて等価なポリペプチドを決定することができる。
【０１３０】
「機能的等価物」はまた、本発明によるポリペプチドの個々のドメインもしくは配列モチーフ、またはＮ末端および／またはＣ末端で切断された形態のような「断片」を含み、これらは所望の生物学的機能を示していてもよいし、示していなくてもよい。好ましくは、そのような「断片」は、少なくとも定性的に所望の生物学的機能を保持する。
【０１３１】
「機能的等価物」はさらに融合タンパク質であって、当該融合タンパク質は、本明細書に記載されるポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物のうちの１つと、機能的にＮ末端またはＣ末端が会合した少なくとも１つの更なる、機能的に異なる異種配列とを有する（すなわち、融合タンパク質部分の実質的な相互機能障害を伴わない）。これらの異種配列の非限定的な例は、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【０１３２】
本発明に従ってまた含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示されたポリペプチドに対するホモログである。これらは、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムによって計算して、具体的に開示されたアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０または８５％、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％などの相同性（または同一性）を有する。本発明による相同ポリペプチドの相同性または同一性（パーセンテージで表される）とは、特に、本明細書に具体的に記載されるアミノ酸配列のうちの１つの全長に基づくアミノ酸残基の同一性（パーセンテージで表される）を意味する。
【０１３３】
パーセンテージで表される同一性データはまた、ＢＬＡＳＴアラインメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）を用いて、または以下に記載されるＣｌｕｓｔａｌ設定を適用することによって決定されてもよい。
【０１３４】
可能なタンパク質のグリコシル化の場合、本発明による「機能的等価物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化された形態で本明細書に記載されるようなポリペプチドだけでなく、グリコシル化パターンを変更することによって得ることができる改変された形態も含む。
【０１３５】
本発明によるポリペプチドの機能的等価物またはホモログは、突然変異誘発によって、例えば、点突然変異、タンパク質の延長もしくは短縮によって、または以下でより詳細に説明されるように生成され得る。
【０１３６】
本発明によるポリペプチドの機能的等価物またはホモログは、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、タンパク質多様体の多彩なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的ライゲーションによって作成され得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列からの潜在的なホモログのデータベースの作成には、非常に多くの方法を使用することができる。縮重した遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーで行うことができ、次いで合成遺伝子を適切な発現ベクターでライゲーションすることができる。縮重したゲノムの使用により、混合物中のすべての配列を供給することが可能になり、これらは潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードする。縮重したオリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者に知られている。
【０１３７】
先行技術では、点突然変異または短縮により作成されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が知られている。これらの技術は、本発明によるホモログのコンビナトリアル突然変異誘発によって産生された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適合させることができる。ハイスループット分析に基づく大規模な遺伝子バンクのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクター中での遺伝子バンクのクローニング、結果として得られたベクターデータベースを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。再帰的アンサンブル変異誘発法（ＲＥＭ）は、データベース内の機能的変異体の頻度を増加させる技術であり、ホモログを同定するために、スクリーニング検査と組み合わせて使用することができる。
【０１３８】
本明細書で提供される実施形態は、本明細書で開示されたポリペプチドのオルソログおよびパラログ、ならびにそのようなオルソログおよびパラログを同定し単離するための方法を提供する。「オルソログ」および「パラログ」という用語の定義は以下に与えられ、アミノ酸配列および核酸配列に適用される。
【０１３９】
ｃ．本発明に従って適用可能なコーディング核酸配列
この文脈では、以下の定義が適用される：
「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、ヌクレオチドの配列を意味する。核酸配列は、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり得、遺伝子のコーディング配列および非コーディング配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンス相補配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離および精製された天然に存在するＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、断片、プライマーおよび核酸プローブを含む。当業者は、ＲＮＡの核酸配列がＤＮＡ配列と同一であり、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が用いられているという違いを有する。「核酸配列」という用語はまた、ポリヌクレオチド分子もしくはオリゴヌクレオチド分子を別個の断片の形態で含むものとして、またはより大きな核酸の構成要素として理解されるべきである。
【０１４０】
「単離された核酸」または「単離された核酸配列」は、核酸または核酸配列が天然に存在する環境とは異なる環境にある核酸または核酸配列に関し、内因性物質を汚染していないものを実質的に含み得る。
【０１４１】
本明細書で核酸に適用される「天然に存在する」という用語は、自然界の生物の細胞内に見出され、実験室でヒトによって意図的に改変されていない核酸を指す。
【０１４２】
ポリヌクレオチドまたは核酸配列の「断片」とは、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの長さが、特に少なくとも１５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐおよび／または少なくとも６０ｂｐである連続したヌクレオチドを指す。特に、ポリヌクレオチドの断片は、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの少なくとも２５、より具体的には少なくとも５０、より具体的には少なくとも７５、より具体的には少なくとも１００、より具体的には少なくとも１５０、より具体的には少なくとも２００、より具体的には少なくとも３００、より具体的には少なくとも４００、より具体的には少なくとも５００、より具体的には少なくとも６００、より具体的には少なくとも７００、より具体的には少なくとも８００、より具体的には少なくとも９００、より具体的には少なくとも１０００の連続したヌクレオチドを含む。限定されることなく、本明細書のポリヌクレオチドの断片は、ＰＣＲプライマーとして、および／またはプローブとして、またはアンチセンス遺伝子サイレンシングもしくはＲＮＡｉのために使用され得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」または特定の条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一または相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図している。条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列が互いに結合したままであるような条件であってもよい。低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義が、以下に本明細書で提供される。適切なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示されているように、当業者が最小限の実験で選択することも可能である。さらに、ストリンジェンシーの条件は、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
【０１４４】
「組換え核酸配列」は、実験室的方法（例えば、分子クローニング）を使用して、ソースを上回る遺伝物質を一緒にして、天然には存在せず、他の方法では生物には見出されない核酸配列を作製または改変することにより生じる核酸配列である。
【０１４５】
「組換えＤＮＡ技術」とは、例えば、Laboratory Manuals edited by Weigel and Glazebrook, 2002, Cold Spring Harbor Lab Press; and Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような組換え核酸配列を調製するための分子生物学的手順を指す。
【０１４６】
「遺伝子」という用語は、適切な調節領域、例えばプロモーターに操作可能に連結されたＲＮＡ分子、例えば細胞内のｍＲＮＡに転写される領域を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのコーディング領域、イントロン、エクソンを含む５’リーダー配列、および／または例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列などの、複数の操作可能に連結された配列を含み得る。
【０１４７】
「ポリシストロニック」とは、核酸分子、特にｍＲＮＡを指し、同じ核酸分子内で２つ以上のポリペプチドを別々にコードすることができる。
【０１４８】
「キメラ遺伝子」とは、ある種において自然界で通常は見出されない任意の遺伝子、特に、自然界で互いに関連していない核酸配列の１つ以上の部分が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、転写領域の一部もしくは全部、または別の調節領域と自然界では関連していない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーターまたは転写調節配列が、１つ以上のコーディング配列またはアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補体、または逆方向反復配列（センスおよびアンチセンス、それによってＲＮＡ転写物は転写時に二本鎖ＲＮＡを形成する）に操作可能に連結された発現構築物を含むことが理解される。「キメラ遺伝子」という用語はまた、１つ以上のコーディング配列の一部を組み合わせて新たな遺伝子を産生することによって得られる遺伝子も含む。
【０１４９】
「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」または「３’末端」とも呼ばれる）とは、遺伝子のコーディング配列の下流に見出される核酸配列を指し、これは、例えば、転写終結部位および（すべてではないが、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡで）ポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＵＡＡＡまたはその多様体を含む。ｍＲＮＡ転写物は、転写終結後、ポリアデニル化シグナルの下流で切断されてもよく、翻訳部位、例えば細胞質へのｍＲＮＡの輸送に関与するポリ（Ａ）テールが付加されてもよい。
【０１５０】
「プライマー」という用語は、テンプレート核酸配列にハイブリダイズされた短い核酸配列を指し、テンプレートに相補的な核酸配列を重合させるために使用される。
【０１５１】
「選択可能なマーカー」という用語は、発現時に、選択可能なマーカーを含む細胞または細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に記載する。当業者であれば、異なる抗生物質、殺菌剤、栄養要求菌株または除草剤の選択可能なマーカーが、異なる標的種に適用可能であることを知るであろう。
【０１５２】
本発明はまた、本明細書で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
【０１５３】
特に、本発明はまた、上記のポリペプチドおよびそれらの機能的等価物（これらは、例えば人工ヌクレオチドアナログを使用して得ることができる）のうちの１つをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ）に関する。
【０１５４】
本発明は、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明によるコーディング核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸断片との両方に関する。
【０１５５】
本発明はまた、本明細書に具体的に開示された配列とある程度の「同一性」を有する核酸に関する。２つの核酸間の「同一性」とは、いずれの場合においても核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味する。
【０１５６】
２つのヌクレオチド配列間の「同一性」（ペプチド配列またはアミノ酸配列についても同様）は、これらの２つの配列のアラインメントが生成されたときの２つの配列において同一であるヌクレオチド残基（またはアミノ酸残基）の数の関数である。同一残基は、アラインメントの所定の位置にある２つの配列において同一である残基と定義される。本明細書で使用される配列同一性のパーセンテージは、２つの配列間で同一の残基の数を取り、それを最短配列における残基の総数で割って１００を掛けることによって、最適なアラインメントから計算される。最適なアラインメントは、同一性のパーセンテージが可能な限り最も高いアラインメントである。最適なアラインメントを得るために、アラインメントの１つ以上の位置で一方または両方の配列にギャップを導入してもよい。次いで、これらのギャップは、配列同一性のパーセンテージを計算するための非同一残基として考慮される。アミノ酸または核酸の配列同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアラインメントは、コンピュータープログラム、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上で利用可能な公的に入手可能なコンピュータープログラムを使用して、様々な方法で達成することができる。
【０１５７】
特に、米国国立生物工学情報センター（NCBI）のウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi）から入手可能である、デフォルトパラメーターに設定されたＢＬＡＳＴプログラム(Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999)は、タンパク質または核酸配列の最適なアラインメントを取得し、配列同一性のパーセンテージを計算するために使用することができる。
【０１５８】
別の例では、同一性は、以下の設定を伴うClustal Method（Higgins DG, Sharp PM. （1989））を用いて、Informax社（ＵＳＡ）のVector NTI Suite 7.1により計算することができる：
多重アラインメントパラメーター
ギャップオープニングペナルティ  １０
ギャップ伸長ペナルティ  １０
ギャップ分離ペナルティ範囲  ８
ギャップ分離ペナルティ  オフ
アラインメント遅延に対する％同一性  ４０
残基特異性ギャップ  オフ
親水性残基ギャップ  オフ
トランジション重み付け（Transition weighing）  ０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
ＦＡＳＴアルゴリズム  オン
Ｋタプルサイズ  １
ギャップペナルティ  ３
ウィンドウサイズ  ５
最良の対角線数  ５
【０１５９】
あるいは、同一性は、Chenna, et al. (2003)、ウェブページ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#、および以下の設定に従って決定してもよい：
ＤＮＡギャップオープンペナルティ  １５．０
ＤＮＡギャップ伸長ペナルティ  ６．６６
ＤＮＡマトリックス  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
タンパク質ギャップオープンペナルティ  １０．０
タンパク質伸長ペナルティ  ０．２
タンパク質マトリックス  Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ  −１
タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ  ４
【０１６０】
本明細書に記載されるすべての核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成、例えば二重らせんの個々の重なり合う相補的な核酸ビルディングブロックの断片縮合によって、公知の方法で生成することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897)によって、公知の方法で実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片およびライゲーション反応による合成オリゴヌクレオチドの蓄積およびギャップの充填、ならびに一般的なクローニング技術は、Sambrook et al. (1989)に記載されており、以下を参照されたい。
【０１６１】
本発明による核酸分子は、コーディング遺伝子領域の３’末端および／または５’末端からの非翻訳配列をさらに含み得る。
【０１６２】
本発明はさらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。
【０１６３】
本発明によるヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列の同定および／またはクローニングに使用され得るプローブおよびプライマーの生成を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、一般に、「ストリンジェントな」条件下で（本明細書の他の箇所で定義されているように）本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０または７５の連続したヌクレオチド上でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１６４】
「相同」配列には、オルソログまたはパラログ配列が含まれる。系統解析法、配列類似性およびハイブリダイゼーション法を含む、オルソログまたはパラログを同定する方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【０１６５】
「パラログ」は、類似の配列と類似の機能とを有する２つ以上の遺伝子を生じさせる遺伝子重複から生じる。パラログは、典型的には、一緒にクラスター化し、関連する植物種内での遺伝子重複によって形成される。ペアワイズＢｌａｓｔ解析を用いた類似遺伝子のグループ内で、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを用いた遺伝子ファミリーの系統解析中にパラログが見出される。パラログでは、関連する遺伝子内の配列に特徴があり、かつ遺伝子の類似の機能を有するコンセンサス配列が同定され得る。
【０１６６】
「オルソログ」またはオルソログ配列は、共通の祖先の子孫である種に見出されるため、互いに類似の配列である。例えば、共通の祖先を有する植物種には、類似の配列および機能を有する酵素が多く含まれていることが知られている。当業者であれば、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ある種の遺伝子ファミリーのポリジーン系図を構築することによって、オルソログ配列を同定し、オルソログの機能を予測することができる。相同配列間の類似機能を同定または確認する方法としては、宿主細胞または生物、例えば植物もしくは微生物において、関連するポリペプチドを過剰に発現させた場合と欠失させた場合（ノックアウト／ノックダウンにおいて）との転写物プロファイルを比較することによる方法がある。当業者であれば、類似した転写物プロファイルを有する遺伝子、共通して５０％を超える調節された転写物を有する遺伝子、または共通して７０％を超える調節された転写物を有する遺伝子、または共通して９０％を超える調節された転写物を有する遺伝子が、類似の機能を有することを理解するであろう。本明細書の配列のホモログ、パラログ、オルソログおよび任意の他の多様体は、テルペンシンターゼタンパク質を産生する宿主細胞、生物、例えば植物または微生物を作製することによって、同様の方法で機能することが期待される。
【０１６７】
「選択可能なマーカー」という用語は、発現時に、選択可能なマーカーを含む細胞または細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に記載する。当業者であれば、異なる抗生物質、殺菌剤、栄養要求菌株または除草剤の選択可能なマーカーが、異なる標的種に適用可能であることを知るであろう。
【０１６８】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え技術によって産生されている場合には、他の細胞物質または培地を実質的に含まないことができる、それが化学的に合成されている場合には、化学前駆体または他の化学物質を含まないことができる。
【０１６９】
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技術および本発明による提供される配列情報によって単離することができる。例えば、具体的に開示された完全配列のうちの１つまたはそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブおよび標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook, (1989)に記載されているように）を使用して、適切なｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離することができる。
【０１７０】
さらに、開示された配列の１つまたはそのセグメントを含む核酸分子を、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化することができ、ＤＮＡシークエンシングによって特徴付けることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して生成することができる。
【０１７１】
本発明による核酸配列またはその誘導体、これらの配列のホモログまたは一部を、例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを介して、他の細菌から通常のハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術によって単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で本発明による配列とハイブリダイズする。
【０１７２】
「ハイブリダイズ」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、標準的な条件下でほぼ相補的な配列に結合する能力を意味するが、これらの条件下では、非相補的なパートナー間で非特異的結合が起こらない。このために、配列は９０〜１００％相補的であり得る。互いに特異的に結合することができるという相補的な配列の特性は、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングにおいて、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用される。
【０１７３】
保存領域の短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに有利に使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのために、本発明による核酸のより長い断片または完全配列を使用することも可能である。これらの「標準的な条件」は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片、または完全配列）、またはハイブリダイゼーションに使用される核酸の種類（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に応じて異なる。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも約１０℃低い。
【０１７４】
例えば、特定の核酸に応じて、標準的な条件は、０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度の緩衝水溶液中で、またはさらに５０％ホルムアミドの存在下で４２〜５８℃の温度、例えば、５×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド中４２℃を意味する。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣであり、温度は約２０℃〜４５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣであり、温度は約３０℃〜５５℃、好ましくは約４５℃〜５５℃である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの記載された温度は、ホルムアミドの非存在下で約１００ヌクレオチドの長さおよび５０％のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について計算された融解温度の値の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al., 1989に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類またはＧ＋Ｃ含有量に応じて、当業者に知られている式を用いて計算することができる。当業者であれば、以下の教科書からハイブリダイゼーションに関する更なる情報を得ることができる：Ausubel et al. (eds), (1985), Brown (ed) (1991)。
【０１７５】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件下で行うことができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションまたは特定の条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一または相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図している。条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列が互いに結合したままであるような条件であってもよい。低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義が、以下に本明細書で提供される。
【０１７７】
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示されているように、当業者が最小限の実験で選択することも可能である。さらに、ストリンジェンシーの条件は、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、低ストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４０℃にて６時間前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の変更を加えた同じ溶液中で行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸塩、および５〜２０×１０６の３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で４０℃にて１８〜２０時間インキュベートし、次いで５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄液を新しい溶液に交換し、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾燥させ、オートラジオグラフィーのために露光する。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、中ストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５０℃にて７時間前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の変更を加えた同じ溶液中で行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸塩、および５〜２０×１０６の３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で５０℃にて３０時間インキュベートし、次いで５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄液を新しい溶液に交換し、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾燥させ、オートラジオグラフィーのために露光する。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、高ストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で６５℃にて８時間〜一晩中行う。１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、フィルターを６５℃にて４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で３７℃にて１時間行う。その後、０．１×ＳＳＣで５０℃にて４５分間洗浄する。
【０１８１】
当該技術分野で周知の低、中、および高ストリンジェンシーの他の条件（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられるような条件）を、上記の条件が不適切である場合に使用することができる（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられるような条件）。
【０１８２】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の検出キットは、ポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブ、ならびに当該プライマーおよび／またはプローブを用いてサンプル中のポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための関連プロトコルを含み得る。そのような検出キットは、植物、生物、微生物または細胞が改変されたかどうかを、すなわちポリペプチドをコードする配列で形質転換されたかどうかを判定するために使用することができる。
【０１８３】
本明細書の実施形態による多様体ＤＮＡ配列の機能を試験するために、目的の配列は、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に操作可能に連結され、前記レポーター遺伝子の発現は、例えば、微生物を用いて、またはプロトプラストを用いて、または安定的に形質転換された植物を用いて、一過性の発現アッセイにおいて試験される。
【０１８４】
本発明はまた、具体的に開示されたまたは誘導化可能な核酸配列の誘導体に関する。
【０１８５】
したがって、本発明による更なる核酸配列は、本明細書に具体的に開示された配列に由来することができ、それとは、１または複数（例えば１〜１０のような）のヌクレオチドの１以上、例えば１〜２０、特に１〜１５または５〜１０のアミノ酸の付加、置換、挿入または欠失だけ異なり、さらに所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをコードすることができる。
【０１８６】
本発明はまた、特殊な起源または宿主生物のコドン使用頻度に従って、いわゆるサイレント突然変異を含むか、または具体的に記載された配列と比較して改変された核酸配列を包含する。
【０１８７】
本発明の特定の実施形態によれば、多様体核酸を、特定の発現系にそのヌクレオチド配列を適合させるために調製することができる。例えば、細菌の発現系は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされている場合、ポリペプチドをより効率的に発現させることが知られている。遺伝暗号の縮退性のために、２つ以上のコドンが同じアミノ酸配列をコードする可能性があり、複数の核酸配列が同じタンパク質またはポリペプチドをコードする可能性があり、これらのＤＮＡ配列はすべて本明細書の実施形態によって包含される。適切な場合には、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現の増加のために最適化されてもよい。例えば、本明細書の実施形態の核酸は、発現を改善するために宿主に特定のコドンを用いて合成されてもよい。
【０１８８】
本発明はまた、本明細書に記載される配列の天然に存在する多様体、例えば、スプライシング多様体または対立遺伝子変異体を包含する。
【０１８９】
対立遺伝子変異体は、誘導されたアミノ酸のレベルで少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、特に好ましくは全配列範囲にわたって少なくとも９０％の相同性を有し得る（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについて上述した詳細を参照されたい）。有利には、相同性は、配列の部分領域にわたってより高いものであり得る。
【０１９０】
本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、その結果、対象となるアミノ酸は、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸で置き換えられる）によって得られる配列に関する。
【０１９１】
本発明はまた、配列多型による具体的に開示された核酸に由来する分子に関する。そのような遺伝的多型は、自然な対立遺伝子変異のために、異なる集団からの細胞または集団内に存在してもよい。対立遺伝子変異体は、機能的等価物を含み得る。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％のばらつきを生じさせる。前記多型は、本明細書に開示されたポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらし得る。対立遺伝子変異体はまた、機能的等価物を含み得る。
【０１９２】
さらに、誘導体はまた、本発明による核酸配列のホモログ、例えば、動物、植物、真菌または細菌のホモログ、短縮配列、コーディングおよび非コーディングＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであると理解されるべきである。例えば、ホモログは、ＤＮＡレベルで、本明細書に具体的に開示された配列で与えられる全ＤＮＡ領域にわたって、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１９３】
さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合体であると理解されるべきである。記載されたヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、反転および／または欠失によって改変することができるが、プロモーターの機能性または有効性は損なわれない。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を変更することによって高めることもできるし、異なる属の生物であっても、より有効なプロモーターと完全に交換することもできる。
【０１９４】
ｄ．機能性ポリペプチド変異体の生成
さらに、当業者であれば、機能的変異体を生成する方法、すなわち、本明細書に開示されているようなアミノ酸関連配列番号のいずれか１つと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または本明細書に開示されているようなヌクレオチド関連配列番号のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成する方法に精通している。
【０１９５】
使用される技術に応じて、当業者であれば、遺伝子あるいは非コーディング核酸領域（当該領域は、例えば発現を調節するために重要である）に、完全にランダムな、あるいはより指向性のある突然変異を導入し、その後、遺伝子ライブラリーを生成することができる。この目的のために必要とされる分子生物学の方法は当業者に知られており、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
【０１９６】
遺伝子を改変するための方法、ひいては遺伝子によってコードされるポリペプチドを改変するための方法は、当業者には長い間知られており、例えば、以下のようなものがある：
−  遺伝子の個々のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドが指示された方法で置換される部位特異的突然変異誘発(Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
−  遺伝子の任意の点で任意のアミノ酸のコドンを交換または追加することができる、飽和突然変異誘発(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
−  ヌクレオチド配列が変異性ＤＮＡポリメラーゼによって変異させられる、変異性ポリメラーゼ連鎖反応(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739)、
−  好ましい交換がポリメラーゼによって妨げられる、ＳｅＳａＭ法（配列飽和法）Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279、
−  例えばヌクレオチド配列の変異率の増加がＤＮＡ修復機構の欠陥のために起きる、突然変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、または
−  密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、その断片がポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用され、鎖の分離および再アニーリングの繰り返しによって全長のモザイク遺伝子が最終的に生成される、ＤＮＡシャッフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
【０１９７】
いわゆる定方向進化(とりわけ、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial polypeptides by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載される)を用いて、当業者であれば、指示された方法で、大規模に機能的変異体を生成することができる。このために、第１のステップでは、それぞれのポリペプチドの遺伝子ライブラリーが、例えば上記に示した方法を用いて、最初に作成される。この遺伝子ライブラリーは、適切な方法で、例えば、細菌またはファージディスプレイシステムによって発現される。
【０１９８】
所望の特性に概ね対応する特性を有する機能的変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子は、別の突然変異サイクルに供され得る。突然変異および選択またはスクリーニングのステップは、存在する機能的変異体が所望の特性を十分な程度で有するまで反復的に繰り返され得る。この反復手順を使用して、限定された数の突然変異、例えば１、２、３、４または５の突然変異を段階的に実施し、対象となる活性に及ぼすそれらの影響について評価し、選択することができる。次いで、選択された変異体は、同様の方法で更なる突然変異ステップに供され得る。このようにして、調査される個々の変異体の数を有意に減少させることができる。
【０１９９】
本発明による結果はまた、所望の改変された特性を有する更なるポリペプチドを標的化された方法で生成するために必要とされる、関連するポリペプチドの構造および配列に関して重要な情報を提供する。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち、標的突然変異を導入することによって特性を改変するのに適している可能性のある配列セグメントを規定することが可能である。
【０２００】
また、活性にほとんど影響を与えないと予想される突然変異が周辺でなされている可能性があるアミノ酸配列の位置に関しての情報を導き出すこともでき、こうした突然変異は、潜在的な「サイレント突然変異」と称され得る。
【０２０１】
ｅ．本発明のポリペプチドを発現させるための構築物
この文脈では、以下の定義が適用される：
「遺伝子の発現」は、「異種発現」および「過剰発現」を包含し、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む。過剰発現とは、遺伝子導入細胞または生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または酵素活性のレベルによって測定される遺伝子産物の産生が、非形質転換細胞または類似の遺伝的背景を持つ生物における産生レベルを上回ることを意味する。
【０２０２】
本明細書で使用される「発現ベクター」とは、宿主細胞への外来または外因性ＤＮＡの送達のために、分子生物学的方法および組換えＤＮＡ技術を用いて操作された核酸分子を意味する。発現ベクターは、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な転写に必要とされる配列を含む。コーディング領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードしてもよい。
【０２０３】
本明細書で使用される「発現ベクター」には、ウイルスベクター、バクテリオファージおよびプラスミドを含むがこれらに限定されない任意の線状または環状の組換えベクターを含む。当業者であれば、発現系に応じて適切なベクターを選択することができる。一実施形態では、発現ベクターは、転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、またはｍＲＮＡリボソーム結合部位などの、転写、翻訳、開始および終結を制御する少なくとも１つの「調節配列」に操作可能に連結された本明細書の実施形態の核酸を含み、任意に、少なくとも１つの選択マーカーを含む。ヌクレオチド配列は、調節配列が本明細書の実施形態の核酸に機能的に関連する場合、「操作可能に連結されている」。
【０２０４】
本明細書で使用される「発現系」は、所与の発現宿主のインビボまたはインビトロのいずれかにおいて、１つの発現、または２つ以上のポリペプチドの共発現に必要とされる核酸分子の任意の組み合わせを包含する。それぞれのコーディング配列は、例えば、多重クローニング部位を含むベクターなどの、単一の核酸分子またはベクター上に、もしくはポリシストロニック核酸上に位置してもよく、または２つ以上の物理的に異なるベクター上に分散されてもよい。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に記載されているように、天然に発現された核酸の組換え体を生成または検出するための任意の適切な増幅法の使用を指す。例えば、本発明は、天然に発現された本発明の（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）または組換え（例えば、ｃＤＮＡ）核酸をインビボ、エクスビボまたはインビトロで（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲによって）増幅するための方法および試薬（例えば、特異的変性オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。
【０２０６】
「調節配列」とは、本明細書の実施形態の核酸配列の発現レベルを決定する核酸配列であって、調節配列に操作可能に連結された核酸配列の転写速度を調節することができる核酸配列を指す。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーターエレメントなどを含む。
【０２０７】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」は、本発明に従って、転写される核酸に機能的に連結された場合に、前記核酸の転写を調節する核酸を意味するものとして理解される。「プロモーター」とは、特に、ＲＮＡポリメラーゼ、および転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位を含むがこれらに限定されない適切な転写に必要な他の因子の結合部位を提供することによって、コーディング配列の発現を制御する核酸配列を指す。プロモーターという用語の意味にはまた、「プロモーター調節配列」という用語も含まれる。プロモーター調節配列には、転写、ＲＮＡ処理、または関連するコーディング核酸配列の安定性に影響を与え得る上流および下流のエレメントが含まれ得る。プロモーターには、天然由来の配列と合成配列とが含まれる。コーディング核酸配列は、通常、転写開始部位から始まる転写の方向に対してプロモーターの下流側に位置する。
【０２０８】
この文脈では、「機能的」または「操作可能な」な連結は、例えば、核酸の１つと調節配列との連続配列を意味するものとして理解される。例えば、プロモーター活性を有する配列と、転写される核酸配列の配列と、任意に更なる調節エレメント、例えば核酸の転写を確実にする核酸配列と、例えばターミネーターが、調節エレメントの各々が核酸配列の転写時にその機能を果たすことができるように連結されている。これは、必ずしも化学的な意味での直接的な連結を必要としない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、より遠隔の位置からの標的配列、または他のＤＮＡ分子からの標的配列にもそれらの機能を発揮することができる。好ましい配列は、２つの配列が共有結合的に結合されるように、転写される核酸配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち、３’末端）に位置した配列である。プロモーター配列と組換え発現される核酸配列との距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対未満、または５０塩基対未満であってよい。
【０２０９】
プロモーターおよびターミネーターに加えて、他の調節エレメントの例としては、ターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点などを挙げることができる。適切な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【０２１０】
「構成的プロモーター」という用語は、それが操作可能に連結された核酸配列の継続的な転写を可能にする非調節プロモーターを指す。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結」という用語は、ポリヌクレオチドエレメントの機能的関係にある連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれたときに「操作可能に連結」されている。例えば、プロモーター、あるいはむしろ転写調節配列は、それがコーディング配列の転写に影響を与える場合には、コーディング配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していることを意味する。プロモーター配列に関連するヌクレオチド配列は、形質転換される植物に関して相同または異種起源であり得る。この配列はまた、全体的にまたは部分的に合成されたものであってもよい。起源にかかわらず、プロモーター配列に関連する核酸配列は、本明細書の一実施形態のポリペプチドに結合した後、それが連結されたプロモーターの特性に従って発現またはサイレンシングされる。関連する核酸は、生物全体で常時、あるいは特定の時間に、または特定の組織、細胞、もしくは細胞コンパートメントで発現または抑制されることが望ましいタンパク質をコードしてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、特に、それによって改変もしくは形質転換された宿主細胞または生物に望ましい表現型形質を与えるタンパク質をコードする。より具体的には、関連するヌクレオチド配列は、細胞または生物において、本明細書で定義されるような目的の生成物または複数の生成物の産生をもたらす。特に、ヌクレオチド配列は、本明細書で定義されるような酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２１２】
本明細書に記載されるようなヌクレオチド配列は、「発現カセット」の一部であってもよい。「発現カセット」および「発現構築物」という用語は同義的に使用される。（好ましくは組換え）発現構築物は、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、調節核酸配列の遺伝的制御下にある。
【０２１３】
本発明に従って適用されるプロセスにおいて、発現カセットは、「発現ベクター」、特に組換え発現ベクターの一部であってもよい。
【０２１４】
「発現ユニット」は、本発明に従って、本明細書に定義されるようなプロモーターを含み、かつ発現される核酸または遺伝子との機能的な連結後、発現を調節する、すなわち、前記核酸または前記遺伝子の転写および翻訳を調節する、発現活性を有する核酸を意味するものと理解される。したがって、これに関連して、「発現ユニット」は「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、他の調節エレメント、例えばエンハンサーも存在してよい。
【０２１５】
「発現カセット」または「発現構築物」は、本発明に従って、発現される核酸または発現される遺伝子に機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解される。したがって、発現カセットは、発現ユニットとは対照的に、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現される核酸配列も含む。
【０２１６】
「発現」または「過剰発現」という用語は、本発明の文脈では、対応するＤＮＡによってコードされた微生物における１つ以上のポリペプチドの細胞内活性の産生または増加を記載する。このために、例えば、遺伝子を生物に導入すること、既存の遺伝子を別の遺伝子で置き換えること、遺伝子のコピー数を増加させること、強力なプロモーターを使用すること、または高い活性を有する対応するポリペプチドをコードする遺伝子を使用することが可能であり、これらの手段は任意に組み合わせることができる。
【０２１７】
好ましくは、本発明によるそのような構築物は、それぞれのコード配列の５’上流にプロモーターおよび３’下流にターミネーター配列、ならびに任意に他の通常の調節エレメントを含み、いずれの場合においてもコード配列に操作可能に連結されている。
【０２１８】
本発明に従った核酸構築物は、特に、例えば本明細書に記載されるようなアミノ酸関連配列番号もしくはその逆相補体に由来するポリペプチドをコードする配列、またはその誘導体およびホモログを含み、有利には、遺伝子発現を制御するために、例えば遺伝子発現を増加させるために、１つ以上の調節シグナルと操作可能にもしくは機能的に連結されたものである。
【０２１９】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節が依然として実際の構造遺伝子の前に存在していてもよく、任意に、天然の調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増強されたように遺伝子的に改変されていてもよい。しかしながら、核酸構築物はまた、より単純な構築物、すなわち、コーディング配列の前に追加の調節シグナルが挿入されておらず、その調節を有する天然のプロモーターが除去されていないものであってもよい。その代わりに、天然の調節配列は、もはや調節が起こらず、遺伝子発現が増加するように突然変異される。
【０２２０】
好ましい核酸構築物はまた、有利には、プロモーターと機能的に連結している既述の「エンハンサー」配列のうちの１つ以上を含み、この配列は、核酸配列の増強された発現を可能にする。追加の有利な配列はまた、更なる調節エレメントまたはターミネーターなどのＤＮＡ配列の３’末端に挿入されてもよい。本発明による核酸の１つ以上のコピーが、構築物中に存在してもよい。構築物において、他のマーカー、例えば、栄養要求性または抗生物質耐性を補完する遺伝子もまた、構築物を選択するように任意に存在してもよい。
【０２２１】
適切な調節配列の例は、プロモーター、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ−ＰＲ、またはｌａｍｂｄａ−ＰＬプロモーターに存在し、これらはグラム陰性細菌において有利に用いられる。更なる有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母または真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。人工プロモーターもまた、調節のために使用され得る。
【０２２２】
宿主生物における発現のために、核酸構築物は、有利には、宿主中の遺伝子の最適な発現を可能にするプラスミドまたはファージなどのベクターに挿入される。ベクターはまた、プラスミドおよびファージに加えて、当業者に知られている他のすべてのベクター、すなわち、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミドおよび線状もしくは環状のＤＮＡまたは人工染色体を意味するものと理解される。これらのベクターは、宿主生物において自律的に複製され得るか、または染色体的に複製され得る。これらのベクターは、本発明の更なる発展形である。バイナリーベクターまたはｃｐｏ組込み型ベクターも適用可能である。
【０２２３】
適切なプラスミドは、例えば、大腸菌におけるｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス（Streptomyces）におけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、バチルス（Bacillus）におけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム（Corynebacterium）におけるｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、真菌類におけるｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、酵母における２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、または植物におけるｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１である。上述のプラスミドは、可能なプラスミドのほんの一部の選択肢である。更なるプラスミドは当業者に周知であり、例えば、書籍Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に見出すことができる。
【０２２４】
ベクターの更なる開発において、本発明による核酸構築物または本発明による核酸を含むベクターはまた、有利には、線状ＤＮＡの形態で微生物に導入され、異種または相同組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込まれ得る。この線状ＤＮＡは、プラスミドなどの線状化ベクターから、または本発明による核酸構築物もしくは核酸のみからなることができる。
【０２２５】
生物における異種遺伝子の最適な発現のためには、その生物において使用される特異的な「コドン使用頻度」に一致するように核酸配列を改変することが有利である。「コドン使用頻度」は、対象となる生物の他の既知の遺伝子のコンピューター評価によって容易に決定することができる。
【０２２６】
本発明による発現カセットは、適切なプロモーターを適切なコーディングヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルに融合させることによって生成される。この目的のために慣用の組換えおよびクローニング技術が記載され、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)およびAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている。
【０２２７】
適切な宿主生物における発現のために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば、「cloning vectors」(Pouwels P. H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。
【０２２８】
本明細書の実施形態の代替的な実施形態は、宿主細胞において「遺伝子発現を改変させる」方法を提供する。例えば、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物において、特定の状況（例えば、特定の温度または培養条件への曝露時）において、増強されるか、または過剰発現されるか、または誘発され得る。
【０２２９】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドの発現の改変はまた、改変された生物と対照または野生型生物とにおける異なる発現パターンである異所性発現をもたらし得る。発現の改変は、本明細書の実施形態のポリペプチドと外因性または内因性モジュレーターとの相互作用から、またはポリペプチドの化学修飾の結果として生じる。この用語はまた、検出レベル未満で改変されているか、または完全に抑制された活性である、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの改変された発現パターンを指す。
【０２３０】
一実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドまたは多様体ポリペプチドをコードする単離された、組換えまたは合成ポリヌクレオチドも本明細書で提供される。
【０２３１】
一実施形態では、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドが、単一の宿主において、特に異なるプロモーターの制御下で共発現される。別の実施形態では、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドが、単一の形質転換ベクター上に存在し得るか、または別々のベクターを使用し、両方のキメラ遺伝子を含む形質転換体を選択すると同時に共形質転換され得る。同様に、遺伝子をコードする１つまたはポリペプチドが、他のキメラ遺伝子と一緒に、単一の植物、細胞、微生物または生物において発現され得る。
【０２３２】
ｆ．本発明に適用される宿主
文脈に応じて、「宿主」という用語は、野生型宿主もしくは遺伝子的に改変された、組換え宿主、またはその両方を意味し得る。
【０２３３】
原則として、すべての原核生物または真核生物は、本発明による核酸または核酸構築物のための宿主または組換え宿主生物とみなすことができる。
【０２３４】
本発明によるベクターを使用して、組換え宿主を産生することができ、これは、例えば、本発明による少なくとも１つのベクターで形質転換され、本発明によるポリペプチドを産生するために使用することができる。有利には、上記の本発明による組換え構築物は、適切な宿主系に導入され、発現される。好ましくは、記載された核酸をそれぞれの発現系において発現させるために、当業者に知られている一般的なクローニング法およびトランスフェクション法、例えば、共沈法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、レトロウイルストランスフェクション法が使用される。適切な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０２３５】
有利には、宿主生物として、細菌、真菌または酵母などの微生物が使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性の細菌が使用され、好ましくは、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、リゾビウム科（Rhizobiaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）またはノカルディア科（Nocardiaceae）のファミリーの細菌、特に好ましくは、エシェリヒア属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ノカルディア属、バークホルデリア（Burkholderia）属、サルモネラ（Salmonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属またはロドコッカス属の細菌が使用される。大腸菌の属および種が非常に好ましい。さらに、他の有利な細菌は、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリアまたはγ−プロテオバクテリアからなる群に見出され得る。有利にはまた、サッカロマイセスまたはピキアのようなファミリーの酵母も適切な宿主である。
【０２３６】
あるいは、植物または植物細胞全体は、天然または組換え宿主として機能し得る。非限定的な例としては、それらに由来する以下の植物または細胞：ニコチアナ（Nicotiana）属、特にニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）およびニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）（タバコ）；ならびにシロイヌナズナ（Arabidopsis）属、特にシロイヌナズナ・タリアナ（Arabidopsis thaliana）を挙げることができる。
【０２３７】
宿主生物に応じて、本発明による方法で使用される生物は、当業者によって知られている方法で増殖または培養される。培養は、バッチ式、セミバッチ式または連続式とすることができる。栄養素は、発酵の開始時に存在してもよいし、後で半連続的もしくは連続的に供給してもよい。これについても、以下で詳しく説明される。
【０２３８】
ｇ．本発明によるポリペプチドの組換え産生
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはその機能的、生物学的に活性な断片を組換え産生するための方法であって、ポリペプチド産生微生物を培養し、任意に、遺伝子発現を有する少なくとも１種の誘導物質を適用することによってポリペプチドの発現を誘導し、発現されたポリペプチドを培養物から単離する方法に関する。ポリペプチドはまた、所望される場合、工業的規模でこのようにして生成することもできる。
【０２３９】
本発明により産生された微生物は、バッチ法で連続的もしくは非連続的に培養してもよいし、またはフェッドバッチ法で培養してもよいし、フェッドバッチ法を繰り返して培養してもよい。既知の培養法の概要は、以下の教科書に見出すことができる：Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))。
【０２４０】
使用される培養培地は、それぞれの菌株の要件を適切に満たすものでなければならない。様々な微生物用培地の説明は、米国細菌学会(ワシントンD.C.、米国、1981)のマニュアル「一般細菌学の方法マニュアル（Manual of Methods for General Bacteriology）」に記載されている。
【０２４１】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含む。
【０２４２】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。非常に良好な炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類はまた、複合化合物、例えば糖蜜、または糖精製の他の副生成物を介して媒体に添加してもよい。また、異なる炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール、および有機酸、例えば酢酸または乳酸である。
【０２４３】
窒素源は、通常、有機もしくは無機の窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例には、アンモニアガスもしくはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどが含まれる。窒素源は、単独で使用してもよいし、混合物として使用してもよい。
【０２４４】
媒体中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
【０２４５】
硫黄源としては、無機硫黄含有化合物、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物、ならびに有機硫黄含有化合物、例えばメルカプタンおよびチオールを使用することができる。
【０２４６】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０２４７】
金属イオンを溶液中に保持するために、キレート剤を媒体に添加してもよい。特に適切なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール類、例えばカテコールもしくはプロトカテキン酸、または有機酸、例えばクエン酸を含む。
【０２４８】
本発明に従って使用される発酵培地は、通常、他の成長因子、例えばビタミン類または成長促進剤を含有し、これには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが含まれる。成長因子および塩類は、しばしば、複合培地、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの成分に由来する。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は、それぞれの実験に強く依存し、それぞれの特定のケースごとに個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に見出すことができる。増殖培地はまた、Standard 1(Merck)またはＢＨＩ(脳心臓注入、DIFCO)などの商業的供給業者から得ることができる。
【０２４９】
すべての培地成分は、加熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または滅菌濾過によって滅菌される。これらの成分は、一緒に滅菌してもよいし、必要に応じて別々に滅菌してもよい。すべての培地成分は培養の開始時に存在してもよいし、連続的にまたはバッチ式に添加してもよい。
【０２５０】
培養物の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、実験中は変化させたり、一定に保つようにしたりしてもよい。培地のｐＨは、５〜８．５、好ましくは７．０前後の範囲とすることが望ましい。増殖のためのｐＨは、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を添加することによって増殖中に制御することができる。発泡を制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を培地に添加してもよい。好気性条件を維持するために、酸素または酸素含有ガスの混合物、例えば周囲空気を培養物に通す。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃の範囲である。最大限の所望の生成物が形成されるまで、培養を続ける。この目標は、通常、１０時間〜１６０時間以内に達成される。
【０２５１】
次いで、発酵ブロスをさらに処理する。必要に応じて、バイオマスは、分離技術、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション、またはこれらの方法の組み合わせによって、発酵ブロスから完全にもしくは部分的に除去することができ、または完全に発酵ブロス中に残すこともできる。
【０２５２】
ポリペプチドが培養培地中で分泌されない場合、細胞を溶解し、公知のタンパク質単離法によって溶解物から産物を得ることもできる。細胞は、任意に、高周波超音波、高圧、例えばフレンチプレス、浸透圧溶解、界面活性剤、溶菌酵素または有機溶媒の作用、ホモジナイザーにより、または前述の方法のいくつかの組み合わせによって破砕することができる。
【０２５３】
ポリペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーなどのモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー技術、ならびに限外濾過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動などの他の通常の技術を用いて精製することができる。適切な方法は、例えば、Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical processes], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０２５４】
組換えタンパク質を単離するためには、定義されたヌクレオチド配列によってｃＤＮＡを伸長し、したがって、例えば精製を容易にする改変されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。このタイプの適切な修飾は、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られている修飾のようなアンカー、または抗体の抗原として認識され得るエピトープとして機能する、いわゆる「タグ」である（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載されている）。これらのアンカーは、固体支持体、例えば、クロマトグラフィーカラムにおける充填物として使用され得るか、またはマイクロタイタープレートもしくは他のいくつかの担体上で使用され得るポリマーマトリックスへのタンパク質の結合に役立ち得る。
【０２５５】
同時に、これらのアンカーはまた、タンパク質の認識のために使用され得る。タンパク質の認識のために、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する蛍光色素、酵素マーカー、または放射性マーカーなどの通常のマーカーを、単独でまたはタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用することも可能である。
【０２５６】
ｈ．ポリペプチド固定化
本発明による酵素またはポリペプチドは、本明細書に記載される方法において、遊離または固定化された形態で使用することができる。固定化された酵素は、不活性担体に固定化された酵素である。適切な担体材料およびその上に固定化された酵素は、欧州特許出願公開第１１４９８４９号明細書、欧州特許出願公開第１０６９１８３号明細書および独国特許出願ＤＥ−ＯＳ１００１９３７７３号明細書およびそこに引用された参考文献から知られている。これに関して、これらの文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切な担体材料としては、例えば、粘土、粘土鉱物、例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体材料、合成ポリマー、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリオレフィン類、例えばポリウレタン、ポリエチレンおよびポリプロピレンが挙げられる。担持された酵素を作製するために、担体材料は、通常、微細に分割された粒状形態で用いられ、多孔質状形態が好ましい。担体材料の粒径は、通常５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（粒度分布曲線）である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを使用する場合には、遊離形態または固定化形態を選択することができる。担体材料は、例えば、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。細胞と同様に酵素もまた、グルタルアルデヒドと直接架橋され得る（ＣＬＥＡへの架橋）。対応する他の固定化技術が、例えば、J. Lalonde and A. Margolin 「Immobilization of Enzymes」、K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。本発明による方法を行うためのバイオ形質転換およびバイオリアクターに関する更なる情報も、例えば、Rehm et al. (Ed.) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheimに与えられる。
【０２５７】
ｉ．本発明の生体触媒による製造方法の反応条件
本発明の反応は、インビボまたはインビトロ条件下で実施することができる。
【０２５８】
本発明の方法または上記で定義されるような多段階法の個々のステップの間に存在する少なくとも１つのポリペプチド／酵素は、天然にまたは組換えにより酵素または酵素類を産生する生細胞中に、採取細胞中に、すなわちインビボ条件下で、または死細胞中に、透過性細胞中に、粗細胞抽出物中に、精製抽出物中に、または本質的に純粋なまたは完全に純粋な形態で、すなわちインビトロ条件下で存在し得る。少なくとも１つの酵素が、溶液中に存在してもよいし、担体上に固定化された酵素として存在してもよい。１つまたは複数の酵素が、同時に可溶性および／または固定化された形態で存在してもよい。
【０２５９】
本発明による方法は、当業者に知られている一般的な反応器で、異なる範囲の規模、例えば、実験室規模（数ミリリットルから数十リットルの反応量）から工業的規模（数リットルから数千立方メートルの反応量）までの規模で実施することができる。ポリペプチドが、多少なりとも精製された細胞抽出物の形態で、または精製された形態で、生存していない、任意に透過処理された細胞によってカプセル化された形態で使用される場合、化学反応器を使用することができる。化学反応器は、通常、少なくとも１つの酵素の量、少なくとも１つの基質の量、ｐＨ、温度、および反応媒体の循環を制御することを可能にする。少なくとも１つのポリペプチド／酵素が生細胞中に存在する場合、プロセスは発酵となる。この場合、生体触媒による製造は、バイオリアクター（発酵槽）で行われ、ここでは、生細胞に適した生存条件に必要なパラメーター（例えば、栄養素、温度、通気、酸素または他のガスの有無、抗生物質などを伴う培養培地）が制御され得る。当業者であれば、例えば、化学的もしくはバイオテクノロジー的手法を実験室規模から工業的規模に拡大するための手順、またはプロセスパラメーターを最適化するための手順と共に、化学反応器またはバイオリアクターに精通しており、これらはまた、文献に広く記載されている（バイオテクノロジー的手法については、例えば、Crueger und Crueger, Biotechnologie − Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 2. Ed., R. Oldenbourg Verlag, Muenchen, Wien, 1984を参照されたい）。
【０２６０】
少なくとも１つの酵素を含む細胞は、物理的または機械的手段、例えば超音波または高周波パルス、フレンチプレス、または化学的手段、例えば低張培地、培地中に存在する溶菌酵素および界面活性剤、またはそのような方法の組み合わせによって透過処理することができる。界面活性剤の例は、ジギトニン、ｎ−ドデシルマルトシド、オクチルグリコシド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、デオキシコール酸塩、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０（エチルフェノールポリ（エチレングリコルエーテル））などである。
【０２６１】
生細胞の代わりに、必要とされる生体触媒を含む非生存細胞のバイオマスを本発明の生体内変換反応に適用してもよい。
【０２６２】
少なくとも１つの酵素が固定化されている場合、上記のように不活性担体に結合される。
【０２６３】
変換反応は、バッチ式、セミバッチ式、または連続的に行うことができる。反応物（および任意に栄養素）は、反応の開始時に供給してもよいし、後で半連続的または連続的に供給してもよい。
【０２６４】
本発明の反応は、特定の反応タイプに応じて、水性、水性有機または非水性反応媒体中で実施することができる。
【０２６５】
水性または水性有機媒体は、ｐＨを５〜１１、例えば６〜１０の範囲の値に調整するために、適切な緩衝液を含んでもよい。
【０２６６】
水性−有機媒体中には、水と混和性、部分的に混和性または非混和性の有機溶媒を適用することができる。適切な有機溶媒の非限定的な例を以下に列挙する。更なる例は、一価または多価の、芳香族または脂肪族アルコール、特にグリセロールのような多価脂肪族アルコールである。
【０２６７】
非水性媒体は、実質的に水を含んでいなくてもよく、すなわち、約１重量％または約０．５重量％未満の水を含むであろう。
【０２６８】
生体触媒法はまた、有機非水性媒体中で実施されてもよい。適切な有機溶媒としては、例えば５〜８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、例えばペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンまたはシクロオクタン；芳香族炭水化物、例えばベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンまたはジクロロベンゼン、脂肪族非環式およびエーテル類、例えばジエチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル；またはそれらの混合物を挙げることができる。
【０２６９】
反応物／基質の濃度は、適用される特定の酵素に依存し得る最適な反応条件に適合させることができる。例えば、初期の基質濃度は、０．１〜０．５Ｍ、例えば１０〜１００ｍＭなどの範囲であり得る。
【０２７０】
反応温度は、適用される特定の酵素に依存し得る最適な反応条件に適合させることができる。例えば、反応は、０〜７０℃、例えば２０〜５０℃または２５〜４０℃の範囲の温度で実施することができる。反応温度の例は、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃および約６０℃である。
【０２７１】
プロセスは、基質とその後の産物との間の平衡が達成されるまで進行してもよいが、早めに停止してもよい。通常のプロセス時間は、１分〜２５時間、特に１０分〜６時間の範囲であり、例えば１時間〜４時間、特に１．５時間〜３．５時間の範囲である。これらのパラメーターは、適切なプロセス条件の非限定的な例である。
【０２７２】
宿主がトランスジェニック植物である場合、最適な増殖条件、例えば最適な光、水、栄養条件などを提供することができる。
【０２７３】
ドリマニルアセテート化合物の調製を実施するための特定の反応条件は、以下のとおりである。２０〜３５℃およびｐＨ４〜７でインキュベートされた水性環境において、アセチルトランスフェラーゼ酵素は、精製されたポリペプチドとして、または全細胞系に存在し得る。基質濃度は１０〜１００ｍＭの間で変動し得る。
【０２７４】
ｋ．生成物の単離
本発明の方法は、任意に立体異性体的または鏡像異性体的に実質的に純粋な形態で、最終生成物または中間生成物を回収するステップをさらに含み得る。「回収する」という用語には、培養物または反応媒体から化合物を抽出、採取、単離または精製することが含まれる。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変化、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の従来の単離法または精製法に従って実施することができる。
【０２７５】
単離された生成物の同定および純度は、公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、分光法（ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲなど）、着色法、ＴＬＣ、ＮＩＲＳ、酵素または微生物アッセイによって決定することができる（例えば、Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32;およびSchmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.を参照されたい）。
【０２７６】
本明細書に記載される方法のいずれかで生成された環状テルペン化合物は、炭化水素、エステル、アミド、グリコシド、エーテル、エポキシド、アルデヒド、ケトン、アルコール、ジオール、アセタールまたはケタールなどの誘導体に変換されることができるが、これらに限定されない。テルペン化合物誘導体は、酸化、還元、アルキル化、アシル化および／または転位などの化学的方法によって得ることができるが、これらに限定されない。あるいは、テルペン化合物誘導体は、テルペン化合物をオキシドレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、トランスフェラーゼなどの酵素と接触させることによって、生化学的方法を用いて得ることができるが、これらに限定されない。生化学的変換は、単離された酵素、溶解細胞からの酵素を使用してインビトロで、または全細胞を使用してインビボで実施することができる。
【０２７７】
ｌ．ドリメニルアセテートの発酵産生
本発明はまた、ドリマニルアセテートを発酵産生するための方法に関する。
【０２７８】
本発明に従って使用されるような発酵は、例えば、撹拌発酵槽、気泡塔およびループ反応器で実施することができる。撹拌器の種類および幾何学的設計を含む、可能な方法の種類の包括的な概要は、「Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1」に見出すことができる。本発明のプロセスにおいて、利用可能な典型的な多様体は、例えば、当業者に知られているか、または例えば「Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering」に説明されている以下の変異体、例えば、バイオマスのリサイクルの有無にかかわらず、バッチ式、フェッドバッチ式、フェッドバッチ式の繰り返し、または連続発酵により培養されたものである。産生株に応じて、良好な収率（ＹＰ／Ｓ）を得るために、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素または適切なガス混合物によるスパージングを行ってもよい。
【０２７９】
使用される培養培地は、特定の菌株の要件を適切に満たすものでなければならない。様々な微生物用培地の説明は、米国細菌学会(ワシントンD.C.、米国、1981)のマニュアル「一般細菌学の方法マニュアル（Manual of Methods for General Bacteriology）」に記載されている。
【０２８０】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含む。
【０２８１】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。非常に良好な炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類はまた、複合化合物、例えば糖蜜、または糖精製の他の副生成物を介して媒体に添加してもよい。また、様々な炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール、および有機酸、例えば酢酸または乳酸である。
【０２８２】
窒素源は、通常、有機もしくは無機の窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例には、アンモニアガスもしくはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどが含まれる。窒素源は、単独で使用してもよいし、混合物として使用してもよい。
【０２８３】
媒体中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
【０２８４】
硫黄源としては、無機硫黄含有化合物、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物だけでなく、有機硫黄含有化合物、例えばメルカプタンおよびチオールを使用することができる。
【０２８５】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０２８６】
金属イオンを溶液中に保持するために、キレート剤を媒体に添加してもよい。特に適切なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール類、例えばカテコールもしくはプロトカテキン酸、または有機酸、例えばクエン酸を含む。
【０２８７】
本発明に従って使用される発酵培地は、他の成長因子、例えばビタミン類または成長促進剤を含有し、これには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが含まれる。成長因子および塩類は、しばしば、複合培地、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの成分に由来する。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は、特定の実験に強く依存し、それぞれの特定のケースごとに個別に決定されなければならない。培地の最適化に関する情報は、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(1997)に見出すことができる。増殖培地はまた、Standard 1(Merck)またはＢＨＩ(脳心臓注入、DIFCO)などの商業的供給業者から得ることができる。
【０２８８】
すべての培地成分は、加熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または滅菌濾過によって滅菌される。これらの成分は、一緒に滅菌してもよいし、必要に応じて別々に滅菌してもよい。すべての培地成分は培養の開始時に存在してもよいし、任意に連続的にまたはバッチ式に添加してもよい。
【０２８９】
培養物の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、実験中は変化させたり、一定に保つようにしたりしてもよい。培地のｐＨは、５〜８．５、好ましくは７．０前後の範囲とすることが望ましい。増殖のためのｐＨは、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を添加することによって増殖中に制御することができる。発泡を制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を培地に添加してもよい。好気性条件を維持するために、酸素または酸素含有ガスの混合物、例えば周囲空気を培養物に通す。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃の範囲である。最大限の所望の生成物が形成されるまで、培養を続ける。これは、通常、１時間〜１６０時間以内に達成される。
【０２９０】
本発明の方法は、前記ドリマニルアセテートを回収するステップをさらに含み得る。
【０２９１】
「回収する」という用語には、培養培地から化合物を抽出、採取、単離または精製することが含まれる。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変化、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の従来の単離法または精製法に従って実施することができる。
【０２９２】
意図した分離の前に、ブロスのバイオマスを除去することができる。バイオマスを除去するためのプロセス、例えば、濾過、沈降および浮遊は、当業者に知られている。その結果、バイオマスは、例えば、遠心器、分離器、デカンター、フィルター、または浮遊選別器を用いて除去することができる。有価生成物を最大限に回収するために、例えば、透析濾過の形態で、バイオマスの洗浄がしばしば推奨される。方法の選択は、発酵槽ブロス中のバイオマス含有量およびバイオマスの特性、ならびにバイオマスと有価生成物との相互作用にも依存する。
【０２９３】
一実施形態では、発酵ブロスは、滅菌または低温殺菌することができる。更なる実施形態では、発酵ブロスは濃縮される。要件に応じて、この濃縮はバッチ式または連続的に行うことができる。圧力と温度の範囲は、まず生成物の損傷が起こらないように選択することが望ましく、次に装置とエネルギーの使用を最小限に抑える必要がある。特に多段蒸発のための圧力と温度レベルの熟練した選択により、エネルギーの節約が可能になる。
【０２９４】
以下の例は、例示的なものに過ぎず、本明細書に記載される特許請求の範囲および実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２９５】
本明細書で提供される開示を検討した後に、当業者に直ちに明らかになるであろう多数の可能な変形もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２９６】
実験部
材料：
別段の記載がない限り、本明細書で用いられるすべての化学的および生化学的な材料ならびに微生物または細胞は市販品である。
【０２９７】
別段の定めがない限り、組換えタンパク質は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているような標準的な方法でクローン化され、発現される。
【０２９８】
ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）
ＤＢ−５ＭＳ  ＵＩカラム（膜厚１０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）（Agilent Technologies Inc（カリフォルニア州サンタ・クララ）製）のカスタムカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｔｕｖｏ  ９０００シリーズＧＣシステム。ＧＣは、１：１検出器スプリッターチップ（Ｇ４５８８−６０５０２，Agilent Technologies Inc（カリフォルニア州サンタ・クララ））によって２つの検出器に結合した。１つ目の検出器はＡｇｉｌｅｎｔ  ５９７７Ｂシリーズ質量分析計で、２つ目の検出器は標準的なＩｎｔｕｖｏ  ９０００水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）である。キャリアガスとして、ヘリウムを２．５ｍｌ／分の一定流量で使用した。インジェクションは、インジェクター温度を２４０℃に設定したスプリット（１：１００）モードで行った。オーブン温度は、１５０℃（０．１分保持）から２４０℃に４０℃／分で、次いで３２５℃に１８０℃／分でプログラムし、０．５分保持した。
【０２９９】
例１
ドリマンセスキテルペンをドリマニルアセチル化セスキテルペンに変換するためのアセチルトランスフェラーゼ候補の選択
アセチルトランスフェラーゼは、８，０００を超える既知の代表例を有する遺伝的に多様な酵素のクラスを構成している（ＰＦＡＭデータベース：ＰＦ０２４５８トランスフェラーゼファミリー）。アセチルトランスフェラーゼが基質として受容する分子のレパートリーは膨大であるが、セスキテルペンアルコールを基質として受容することは報告されていない。ドリマン型セスキテルペンアルコールをアセチル化できるアセチルトランスフェラーゼを同定するために、植物、真菌、細菌由来の既知のアセチルトランスフェラーゼ数千種のうち５４種（第１表）を、以下の根拠に基づいて選択した。
【０３００】
植物アセチルトランスフェラーゼＢＡＨＤファミリーから知られている５つのクレードのうち２つの、クレード３および５は、アシル供与体としてアセチル−ＣｏＡを用いたアルカロイド類およびテルペノイド類のアセチル化について同定されたメンバーを有する(Curr Opin Plant Biol. 2006, 9(3):331-40)。さらに、クレード３および５からのアセチルトランスフェラーゼが使用する基質のいくつかは、バルキーで、多環式であり、かつアシル受容体として立体障害されたアルコール基を有する(BMC Genomics 2011, 12:236; Curr Opin Plant Biol. 2006, 9:331-40; Elife. 2017 Mar 14;6: e23001; Planta. 2015, 242:709-19)。これに基づいて、植物のＢＡＨＤファミリークレード３および５から２１の候補が選択され、これらの候補には、多環式ジテルペンパクリタキセル（タキソール）の生合成に関与する同定されたアセチルトランスフェラーゼ（Proc Natl Acad Sci U S A．2000, 18; 97(2): 583-587）および二環式のラブダンジテルペンフォルスコリン（Elife 2017, 14; 6: e23001）の生合成に関与するコレウス・フォルスコリ（Plectranthus barbatus）からの２つのアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０３０１】
植物候補と同様に、７つの真菌アセチルトランスフェラーゼを、アシル供与体としてアセチル−ＣｏＡを受容する能力と、それらの基質の構造的特徴：立体障害されたアルコール基を有するバルキーな多環式化合物に基づいて選択した(FEMS Microbiol Lett. 2005, 251:193-201; Chembiochem. 2009, 10:2325-8; Biotechnol Equip. 2014, 28(5):818-826; Nat Chem. 2010, 2:858-64)。これらの中から、アリール酸エステル化ドリマン型セスキテルペンラクトンの生合成に関与するタンパク質ＡｓｔＧ（アルペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０２３０９１０８３．１）、アステロリド（Sci Rep. 2016, 6:32865）を選択した。
【０３０２】
さらに、ＰＳＩ  Ｂｌａｓｔ検索（Trends Biochem Sci. 2002, 27:161-4）を用いて、ＡｓｔＧとの配列類似性に基づいて、ＮＣＢＩタンパク質データベースから２１の真菌アセチルトランスフェラーゼを検索した（標準パラメーター、２回の反復）。結果は、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  Ｔｒｅｅ  Ｖｉｅｗ機能を使用して系統樹上に可視化して、ＡｓｔＧと５００ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ由来の配列間の相同性を示した。候補は、系統樹の単一枝に由来するクエリ配列との相同性によって選択した。
【０３０３】
最後に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼは、無差別酵素であることが知られており、クロラムフェニコールよりも大きいバルキーな基質を収容することができる(Protein Sci. 2012, 21(4): 520−530)。このように、クラス１からクラス３までの５つの細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをＮＣＢＩタンパク質データベースから推定クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼとして選択するか、または文献から選択した(Biochem J. 1990, 272:505-10)。
【表５−１】
2022502008.tif 000006
【表５−２】
2022502008.tif 000007
【０３０４】
例２
アルビカノールシンターゼおよび異なるアセチルトランスフェラーゼ候補を共発現するSaccharomyces cerevisiaeにおけるアルビカニルアセテートのインビボ生成
酵素候補をそれぞれ、アルビカノールからアルビカニルアセテートへのインビボ生物変換についてスクリーニングした。スクリーニングのために、アセチルトランスフェラーゼ候補をそれぞれ、内因性ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）のレベルが増加した、操作されたSaccharomyces cerevisiae株におけるディコミタス・スクアレン（Dichomitus squalens）由来のアルビカノールシンターゼＸＰ＿００７３６９６３１．１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００７３６９６３１．１）をコードする遺伝子と共発現させた。
【０３０５】
S. cerevisiaeにおける内因性ＦＰＰプールのレベルを増加させるために、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼをコードするＥＲＧ１０からＦＰＰシンターゼをコードするＥＲＧ２０まで、メバロン酸経路に関与するすべての酵母内因性遺伝子の余分なコピーを、Paddon et al., Nature, 2013, 496:528-532に記載されているのと同様に、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でS. cerevisiae株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ(Euroscarf,フランクフルト、ドイツ)のゲノムに組み込んだ。簡単に言えば、３つのカセットを、それぞれＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３遺伝子座に組み込んだ。ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ２０および切断型ＨＭＧ１(Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 109:E111-8に記載されているようなｔＨＭＧ１)ならびに同じくＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ１９およびＥＲＧ１３を含む第１のカセットは、ＬＥＵ２の上流セクションおよび下流セクションに対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。遺伝子ＩＤＩ１およびｔＨＭＧ１がＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にあり、遺伝子ＥＲＧ１３がＧＡＬ７プロモーター領域の制御下にある第２のカセットでは、このカセットは、ＴＲＰ１の上流セクションおよび下流セクションに対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。遺伝子ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１２、ｔＨＭＧ１およびＥＲＧ８を有し、これらすべてＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある第３のカセットは、ＵＲＡ３の上流および下流セクションに対応する２つの１００ヌクレオチド領域に隣接していた。３つのカセットのすべての遺伝子には、それ自身のターミネーター領域の２００ヌクレオチドが含まれていたいた。また、Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:8597-8601に記載されるように、それ自身のプロモーターの突然変異型の制御下にあるＧＡＬ４の余分なコピーを、ＥＲＧ９プロモーター領域の上流に組み込んだ。さらに、プロモーター交換によってＥＲＧ９の発現を改変させた。ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ１遺伝子は、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを有するＨＩＳ３遺伝子を含むカセットを用いて欠失させた。得られた株を、株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ(Euroscarf,フランクフルト、ドイツ)と交配させ、Solis-Escalante et al, FEMS Yeast Res, 2015, 15:2に従って胞子形成のために誘導されたＹＳＴ０４５と呼ばれる二倍体株を得た。胞子分離は、２μＬのザイモリアーゼ（１０００ＵｍＬ−１、Zymo research,カリフォルニア州アーバイン）を含む２００μＬの０．５Ｍソルビトールに子嚢を再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートすることによって達成された。次いで、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含む培地上にプレーティングし、１つの発芽胞子を単離し、ＹＳＴ０６９と呼んだ。
【０３０６】
ＸＰ＿００７３６９６３１．１および評価されたアセチルトランスフェラーゼをＹＳＴ０６９で発現させるために、Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47に以前記載されていたように、酵母内因性相同組換えを用いてプラスミドをインビボで構築した。このプラスミドは、S. cerevisiaeの共形質転換に用いた４つのＤＮＡ断片から構成されている。断片は、以下のとおりであった：
ａ）ＢｓｍＢＩを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドｐＦ１６７（配列番号１）。ｐＦ１６７は、以前は酵母でのインビボアセンブリによって構築されており、ｐＦ１６７は、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを有する酵母マーカーＬＥＵ２、大腸菌マーカーＡｍｐＲ、２μ酵母複製起点、大腸菌ｐＵＣ複製起点ならびに相同組換えのための５’−ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）および５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）を含む；
ｂ）５’−ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）、酵母遺伝子ＰＧＫ１のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたセスキテルペンシンターゼＸＰ＿００７３６９６３１．１  ＤＮＡ配列コドン（配列番号４）によって構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた。酵母由来の双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター領域をＰＣＲオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6)；
ｃ）評価されるアセチルトランスフェラーゼＤＮＡコーディング配列（S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン）の１つである酵母ＧＡＬ１０プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する６０ｂｐと、酵母ＣＹＣ１ターミネーター領域の６０ｂｐとから構成される断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた；ならびに
ｄ）酵母遺伝子ＣＹＣ１のターミネーター領域と、配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）とから構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）により得られた。
【０３０７】
ＹＳＴ０６９を、インビボでのプラスミドアセンブリに必要とされる断片を用いて形質転換した。酵母の形質転換は、Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350:87−96に記載されているように、酢酸リチウムプロトコルを用いて実施した。形質転換混合物を、アミノ酸を含まない６．７ｇ／Ｌ酵母培養用ニトロゲンベース（BD Difco、ニュージャージー州、米国）、ロイシンを含まない１．６ｇ／Ｌドロップアウトサプリメント（Sigma Aldrich、ミズーリ州、米国）、２０ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含むＳｍＬｅｕ−培地上にプレーティングした。プレートを３０℃で３〜４日間インキュベートした。個々のコロニーを、Westfall et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:E111-118に記載されているように２５０μＬの培地と、有機オーバーレイとして５０μＬのアジピン酸ジイソデシルエステル（abcr GmbH、ドイツ）を含むディープウェルプレート中でアルビカノールおよびアルビカニルアセテートを産生するために使用した。ディープウェルプレートをプレートインキュベーターで３０℃にて３日間インキュベートした。酵母細胞によって産生されるアルビカノールおよびアルビカニルアセテートを抽出するために、ディープウェルプレートの各ウェルを、内部標準物質を含む酢酸エチル７００μＬで抽出した。アルビカノールおよびアルビカニルアセテートの生成は、ＧＣ−ＭＳ分析を用いて同定し、上記の内部標準物質を用いてＧＣ−ＦＩＤにより定量化した。
【０３０８】
これらの実験条件下で、アルビカノールシンターゼとアセチルトランスフェラーゼとの９つの組み合わせにおいて、アルビカニルアセテートが検出された（第２表）。驚くべきことに、２つの最も活性の高いアセチルトランスフェラーゼ（ＣｒＤＡＴおよびＦｇａＡＴ）は、最適化されていないスクリーニング条件で１５０ｍｇ／Ｌ以上のアルビカニルアセテートの力価を産生した。ＧＣ−ＦＩＤクロマトグラムを図２に示す。さらに、図２から、酵母由来のアルビカニルアセテートのＭＳスペクトルは、基準となるアルビカニルアセテートのＭＳスペクトルと同一であることがわかる。
【０３０９】
興味深いことに、我々のスクリーニングで最も活性の高いアセチルトランスフェラーゼであるＣｒＤＡＴは、植物ＢＡＨＤファミリーのクレード３のメンバーであり、植物アルカロイドの生合成に関与しているが、同じファミリーおよびクレードからの他の試験されたアセチルトランスフェラーゼであるＰｓＳａｌＡＴおよびＲｓＶＩＳＹは、植物アルカロイド生合成に関与しているが（それぞれテバインおよびビノリン）、アルビカノールが基質として提示された場合には活性ではなかった。さらに、同じくアルカロイドの生合成に関与するアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）由来のＦｇａＡＴ（フミガラクビンＢに対して活性）は、我々のスクリーニングでは相当量のアルビカニルアセテートを産生していたが、推定フミガラクビンＢ  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＧＡＯ８１６６６．１は、驚くべきことに、ＦｇａＡＴよりも一桁少ないアルビカニルアセテートを産生していた。
【０３１０】
注目に値するのは、アセチルトランスフェラーゼＡｓｔＧも、ＡｓｔＧとの類似性に基づいて選択されたタンパク質（ＧＡＯ８１６６６．１を除く、上記参照）のいずれも、ＡｓｔＧが、修飾されたドリマン型セスキテルペンアステロリドの生合成に関与しているという事実にもかかわらず、ドリマニルアセチル化セスキテルペンアルビカニルアセテートを産生しなかったことである。
【０３１１】
ジテルペン生合成において唯一の同定されたアセチルトランスフェラーゼは、パクリタキセル（タキソール）およびフォルスコリンの産生に関与するものである。C. forskohliiから試験された８つのアセチルトランスフェラーゼのうち、ＣｆＡＣＴ１−６とＣｆＡＣＴ１−８のみがアルビカノールをアセチル化することができた。ＴｃＴＡＴおよびＴｃＤＢＡＴ遺伝子は、タキソールの生合成において構造的に類似した中間体をアセチル化することができるが（それぞれタキサ−４（２０），１１（１２）−ジエン−５ａ−イルアセテートおよびバッカチンＩＩＩ）、ＴｃＴＡＴのみがアルビカニルアセテートを産生した。
【０３１２】
アシル受容体としてアルビカノールを使用することができるアセチルトランスフェラーゼを同定するために、現在文書化されている複雑さに加えて、５つの試験された基質汎用性の高いクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのうち、アルビカノールをアルビカニルアセテートに変換することができたのは１つだけであった。
【０３１３】
【表６】
2022502008.tif 000008
【０３１４】
例３
ドリメノールシンターゼと選択されたアセチルトランスフェラーゼ候補とを共発現するSaccharomyces cerevisiaeにおけるドリメニルアセテートのインビボ産生
Saccharomyces cerevisiaeにおけるドリメニルアセテートの生成のために、例２に示すように、アルビカノールをアルビカニルアセテートに変換することができる９種類の選択されたアセチルトランスフェラーゼ（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８）を使用して、ドリメノールからドリメニルアセテートへの変換を評価した。
【０３１５】
ドリメニルアセテートは、内因性ＦＰＰのレベルが増加した、操作されたS. cerevisiae株ＹＳＴ０６９（例２参照）において、選択されたアセチルトランスフェラーゼ酵素候補の各々を、アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus）由来のドリメノールシンターゼＸＰ＿００６４６１１２６（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００６４６１１２６）をコードする遺伝子と共発現させることによってインビボで産生した。
【０３１６】
ＸＰ＿００６４６１１２６および選択されたアセチルトランスフェラーゼ（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６およびＣｆＡＣＴ１−８）をＹＳＴ０６９で発現させるために、Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47に以前記載されていたように、酵母内因性相同組換えを用いてプラスミドをインビボで構築した。このプラスミドは、S. cerevisiaeの共形質転換に用いた４つのＤＮＡ断片から構成されている。断片は、以下のとおりであった：
ａ）ＢｓｍＢＩを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドｐＦ１６７（配列番号１）。ｐＦ１６７は、以前は酵母でのインビボアセンブリによって構築されており、ｐＦ１６７は、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを有する酵母マーカーＬＥＵ２、大腸菌マーカーＡｍｐＲ、２μ酵母複製起点、大腸菌ｐＵＣ複製起点ならびに相同組換えのための５’−ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）および５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）を含む；
ｂ）５’−ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）、酵母遺伝子ＰＧＫ１のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたセスキテルペンシンターゼＸＰ＿００６４６１１２６  ＤＮＡ配列コドン（配列番号６）によって構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた。酵母由来の双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター領域をＰＣＲオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6)；
ｃ）評価されるアセチルトランスフェラーゼＤＮＡコーディング配列（S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン）の１つである酵母ＧＡＬ１０プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する６０ｂｐと、酵母ＣＹＣ１ターミネーター領域の６０ｂｐとから構成される断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた；ならびに
ｄ）酵母遺伝子ＣＹＣ１のターミネーター領域と、配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）とから構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）により得られた。
【０３１７】
酵母の形質転換、スクリーニング条件、およびドリメノールおよびドリメニルアセテートの定量化は、アルビカノールおよびアルビカニルアセテートの生成について例２に記載したように実施した。
【０３１８】
（例２からの）アルビカニルアセテートおよびドリメニルアセテートの相対量をそれぞれ図３および図４に示す。試験した９つの酵素候補から、７つの酵素（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６およびＣｆＡＣＴ１−８）がドリメニルアセテートを産生した。アルビカノールおよびドリメノールの構造的類似性が高いために、類似した相対変換率が見出されることが期待された。
【０３１９】
予期せぬことに、ドリメノールの対応するアセテートへの変換が著しく変化していることが判明した。特に、最も高い相対量のアルビカニルアセテートを産生することが判明したＣｒＤＡＴは、ドリメニルアセテートの生成量が最も少ない物質の１つであることが判明した。対照的に、ＦｇａＡＴおよびＣｆＡＣＴ１−８は、最も高い相対量のｏｆｄアセテートを産生することがわかったが、アルビカノールに対しては活性が低かった。これらの驚くべき知見は、非生理学的基質を受容する適切なアセチルトランスフェラーゼ酵素の候補を同定することの難しさを示している。
【０３２０】
例４
ドリメノールおよびアルビカノール対して活性を有するアセチルトランスフェラーゼに基づきドリマンセスキテルペンをアセチル化ドリマニルセスキテルペンに変換するためのアセチルトランスフェラーゼ候補の選択
ａ）実験１
ドリマン型セスキテルペンアルコールをアセチル化することができるアセチルトランスフェラーゼをさらに同定するために、アルビカノールおよびドリメノールに対して活性を有するアセチルトランスフェラーゼＣｒＤＡＴおよびＦｇａＡＴ（例２および３に示す）のアミノ酸配列を用いて、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌａｓｔ検索を行い、類似したタンパク質配列のホモログを見つけ出した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌａｓｔ検索は、デフォルトのパラメーターを使用して実行した(Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999)。
【０３２１】
ＣｒＤＡＴに対する植物アセチルトランスフェラーゼＸＰ＿００８３４０１６５．２ホモログおよびＦｇａＡＴに対する４つの真菌アセチルトランスフェラーゼホモログ（ＫＥＹ８０３９１、ＰＹＩ０４５５５．１、ＸＰ＿００１２７６７３４．１、ＸＰ＿０２４７０９０５５．１）をＢｌａｓｔ検索で検索した。それらを表３に列挙する。
【０３２２】
【表７】
2022502008.tif 000009
【０３２３】
ｂ）実験２
さらに、追加のアセチルトランスフェラーゼ候補を、苔類エゾムチゴケ（Bazzania trilobata）およびシダ植物ニオイシダ（Dryopteris fragrans）のトランスクリプトームから検索した。苔類Bazzaniaは、ドリマンセスキテルペンを含むテルペノイド類を豊富に含んでおり、さらに、Bazzania属の苔類からの天然物としてアルビカニルアセテートおよびアルビカニルカフェートが報告されている(Asakawa et al, Phytochemistry, Volume 30, Issue 9, 1991, Pages 3037-3040)。同様に、Dryopteris属では、アルビカニルアセテートを含むいくつかの異なる天然物が報告されている(Hideyuki Ito et al. Chem. Pharm. Bull. 48(8) 1190-1195 (2000); Froissard D et al. Nat Prod Commun. 2014 Jan;9(1):137-40.)。
【０３２４】
Bazzania trilobata（ＮＣＢＩアクセッション番号ＥＲ３６４４１５）のトランスクリプトームを、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Qiagen）を用いてアセンブルした結果、平均長さ１，２２５塩基対で合計２２０８３コンティグが得られた。ＣｒＤＡＴアミノ酸配列を用いて、Bazzania trilobataのトランスクリプトームの相同配列を検索した。この検索のために、デフォルトのパラメーターでｔＢｌａｓｔｎアルゴリズム（Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410）を使用した。Ｅ値が０．００１を超える転写物を考慮した。ＣｒＤＡＴに対して２０％という低いアミノ酸配列相同性を有する植物アセチルトランスフェラーゼＢＡＨＤファミリーに属する１０個の転写物を選択した。
【０３２５】
D. fragransからの植物材料を中国北部から収集した。D. fragransの生葉（サンプルＩＤ  ＰＮＬＩ２０１４１０７４）をトランスクリプトーム解析のために用いた。D. fragransのトータルＲＮＡを、QIAGEN社のＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４９０４）を用いて抽出した。トータルＲＮＡサンプルＰＮＬＩ２０１４１０７４を、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＵｌｔｒａＴＭ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（NEB、米国）およびＴｒｕＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ（Illumina、米国）を用いて処理し、次いでＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑシーケンサー上でシークエンシングした。２×３５０ｂｐのペアエンドリード２，０８８万個を生成した。このリードをＴｒｉｎｉｔｙ(http://trinityrnaseq.sf.net/)ソフトウェアを用いてアセンブルし、１３７３ｂｐのＮ５０を有する８５７５３コンティグを得た。コンティグをＥＭＢＯＳＳソフトウェア(http://emboss.sourceforge.net/)を用いて解析し、タンパク質配列を得た。アセチルトランスフェラーゼＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６（上記のようにBazzania trilobata（ＮＣＢＩアクセッション番号ＥＲＲ３６４４１５）トランスクリプトームから得られたもの）のアミノ酸配列（配列番号１４４）を用いて、D. fragransトランスクリプトームの相同配列を検索した。この検索のために、標準パラメーターを用いてｔＢｌａｓｔｎアルゴリズムを用いた(Altschul et al 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410)。このアプローチにより、植物アセチルトランスフェラーゼＢＡＨＤファミリーに属する２０個の転写物が提供された。
【０３２６】
例５
アルビカノール、ドリメノールまたはビシクロファルネソールのいずれかを産生するための酵素を、選択されたアセチルトランスフェラーゼ候補と共に共発現させることよる、Saccharomyces cerevisiaeにおけるドリマニルアセテートのインビボ産生
アルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールをそれらの対応するアセテート誘導体に変換するためのアセチルトランスフェラーゼの拡張スクリーニングを実施した。例１の表１および例４に記載される計８９のアセチルトランスフェラーゼを、操作されたSaccharomyces cerevisiae細胞においてインビボでスクリーニングした。例２および例３に記載されるような予備的な数のアセチルトランスフェラーゼについて産生されたスクリーニングデータは繰り返さなかった。したがって、例２および例３で試験されなかったアルビカノール、ドリメノールまたはビシクロファルネソールのいずれかを産生するSaccharomyces cerevisiae細胞とのアセチルトランスフェラーゼの新しい組み合わせのみをスクリーニングした。
【０３２７】
操作されたS. cerevisiae株ＹＳＴ０６９を、例２および例３に記載されているように、アルビカニルアセテートおよびドリメニルアセテートの生成スクリーニングのために使用した。
【０３２８】
ビシクロファルネシルアセテートは、操作されたS. cerevisiae株ＹＳＴ０６９において、選択されたアセチルトランスフェラーゼ酵素候補の各々を、アステロリド生合成からのビシクロファルネソールの産生を担う酵素ＡｓｔＣ（配列番号１３８）、ＡｓｔＩ（配列番号１４０）およびＡｓｔＫ（配列番号１４２）と一緒に共発現させることによってインビボで産生した（Yasutomo Shinohara et al. Sci Rep. 2016, 6: 32865）。
【０３２９】
ＡｓｔＣおよびＡｓｔＩの同時発現のために、ＡｓｔＣをコードする遺伝子（配列番号１３８）とＡｓｔＩをコードする遺伝子（配列番号１４０）のS. cerevisiae型用に最適化されたコドンならびに双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを含む発現カセットを構築し、ＹＳＴ０６９のゲノムに組み込んだ結果、ＹＳＴ２１６と呼ばれる新しい株が得られた。ＡｓｔＣおよびＡｓｔＩのコドン最適化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）により得られた。酵母由来の双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター領域をＰＣＲオーバーラップ拡張によりこれらの遺伝子に付加した（Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6）。
【０３３０】
ＡｓｔＫおよび評価されたアセチルトランスフェラーゼをＹＳＴ２１６で発現させるために、Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47に以前記載されていたように、酵母内因性相同組換えを用いてプラスミドをインビボで構築した。プラスミドは、S. cerevisiaeの共形質転換に用いた４つのＤＮＡ断片から構成されている。断片は、以下のとおりであった：
ａ）ＢｓｍＢＩを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドｐＦ１６７（配列番号１）；
ｂ）５’−ＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２）、酵母遺伝子ＰＧＫ１のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたＡｓｔＫ  ＤＮＡ配列コドン（配列番号１４１）によって構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた。酵母由来の双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター領域をＰＣＲオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6)；
ｃ）評価されるアセチルトランスフェラーゼＤＮＡコーディング配列（S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン）の１つである酵母ＧＡＬ１０プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する６０ｂｐと、酵母ＣＹＣ１ターミネーター領域の６０ｂｐとから構成される断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）によって得られた；ならびに
ｄ）酵母遺伝子ＣＹＣ１のターミネーター領域と、配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴ−３’（配列番号３）とから構成された断片であって、この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM、カリフォルニア州メンローパーク９４０２５）により得られた。
【０３３１】
ＹＳＴ２１６を、インビボでのプラスミドアセンブリに必要とされる断片で形質転換した。酵母の形質転換は、例２に記載したように実施した。スクリーニング条件およびビシクロファルネソールおよびビシクロファルネシルアセテートの定量化は、スクリーニング手順において有機オーバーレイとして２５μＬの鉱油（2705-01、VWR International, LLC.）を使用したことを除き、例２に記載したものと同一であった。
【０３３２】
結果：
アルビカノールに対して活性を有する前述の９つの酵素（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＬｉＡＡＴ−４、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８）（例２参照）に加えて、これらの条件下で、Bazzania trilobata（配列番号１２４または１４４）由来のアセチルトランスフェラーゼＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６、およびDryopteris fragrans（配列番号１１８）由来のＤｆＡＴＣ１３を使用した場合、アルビカニルアセテートが検出された。しかしながら、それらの活性はＣｒＤＡＴおよびＦｇａＡＴに比べて低かった。アルビカニルアセテートの相対量を図５に示す。
【０３３３】
ドリメノールをドリメニルアセテートに変換し得る７つの酵素候補（ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＯＡＨ９４４１５．１、ＴｃＴＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６およびＣｆＡＣＴ１−８）（例３参照）の他に、３つの追加のアセチルトランスフェラーゼ、Aspergillus fischeri由来のＸＰ＿００１２５８０７９．１（配列番号１２７）、Bazzania trilobata由来のＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６（配列番号１２４または１４４）およびDryopteris fragrans由来のＤｆＡＴＣ１３（配列番号１１８）が、拡大スクリーニングにおいて、ドリメノールからドリメニルアセテートを産生することが見出された。得られたドリメニルアセテートの相対量を図６に示す。図７に示すように、酵母由来のドリメニルアセテートのＭＳスペクトルは、基準となるドリメニルアセテートのＭＳスペクトルと同一であることがわかる。興味深いことに、これらの実験条件下では、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６およびＤｆＡＴＣ１３は、試験したすべてのアセチルトランスフェラーゼの中で最も高い活性を示した。
【０３３４】
ビシクロファルネシルアセテートを、試験した８９のアセチルトランスフェラーゼを用いて、ＡｓｔＣ、ＡｓｔＩおよびＡｓｔＫの１３の組み合わせについて検出した。図８は、酵母由来のビシクロファルネシルアセテートのＭＳスペクトルが、基準となるビシクロファルネシルアセテートのＭＳスペクトルと同一であることを示している。ビシクロファルネシルアセテートの相対量を図９に示す。Aspergillus fumigatus由来のアセチルトランスフェラーゼＦｇａＡＴおよびBazzania trilobata由来のＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６は、ビシクロファルネソールを用いて最も高いアセチル化活性を示した。ビシクロファルネソールに対して活性を有する、これらの１３の発見されたアセチルトランスフェラーゼ、すなわち、上記例２に記載のＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８、およびＢＡＵ６１５５１．１（配列番号１３３）、ＰｓＳａｌＡＴ（配列番号１３６）、ＸＰ＿００１２１７２５０．１（配列番号１３０）、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６（配列番号１２４または１４４）、ＰＹＩ０４５５５．１（配列番号１２１または１４３）、ＤｆＡＣＴ１３（配列番号１１８）のうち、９つの、すなわち、ＣｒＤＡＴ、ＦｇａＡＴ、ＴｃＴＡＴ、ＣｒＭＡＴ、ＧＡＯ８１６６６．１、ＣｆＡＣＴ１−６、ＣｆＡＣＴ１−８、ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６、ＤｆＡＣＴ１３は、アルビカノールおよびドリメノールに対しても活性を有することが判明した。アリール酸エステル化されたドリマン型セスキテルペンラクトンであるアステロリド(Sci Rep. 2016, 6:32865)の生合成に関与するアセチルトランスフェラーゼＡｓｔＧが、試験した任意のドリマン型セスキテルペンアルコールに対して活性を有していなかったことは注目する価値がある。このことは、アルビカノール、ドリメノール、またはビシクロファルネソールをアシル受容体として使用することができるアセチルトランスフェラーゼを同定することの予測不可能性と複雑さを改めて示している。
【０３３５】
相互参照された文書の内容は、参照により組み込まれる。
【０３３６】
【表８−１】
2022502008.tif 000010
【表８−２】
2022502008.tif 000011
【表８−３】
2022502008.tif 000012
【０３３７】
配列表リスト
配列番号１
プラスミドｐＦ１６７
【化１−１】
2022502008.tif 000013
【化１−２】
2022502008.tif 000014
【化１−３】
2022502008.tif 000015
【０３３８】
配列番号２
相同組換え用配列
【化２】
2022502008.tif 000016
【０３３９】
配列番号３
相同組換え用配列
【化３】
2022502008.tif 000017
【０３４０】
配列番号４
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＸＰ＿００７３６９６３１．１ＤＮＡ配列コドン
【化４−１】
2022502008.tif 000018
【化４−２】
2022502008.tif 000019
【０３４１】
配列番号５
ディコミタス・スクアレン（Dichomitus squalens）アルビカノールシンターゼのＸＰ＿００７３６９６３１．１アミノ酸配列
【化５】
2022502008.tif 000020
【０３４２】
配列番号６
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＸＰ＿００６４６１１２６アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus）ドリメノールシンターゼＤＮＡ配列コドン
【化６−１】
2022502008.tif 000021
【化６−２】
2022502008.tif 000022
【０３４３】
配列番号７
アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus）ドリメノールシンターゼのＸＰ＿００６４６１１２６タンパク質配列
【化７】
2022502008.tif 000023
【０３４４】
配列番号８
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＣｒＤＡＴＤＮＡ配列コドン
【化８−１】
2022502008.tif 000024
【化８−２】
2022502008.tif 000025
【０３４５】
配列番号９
ＣｒＤＡＴタンパク質配列
【化９】
2022502008.tif 000026
【０３４６】
配列番号１０
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＴｃＴＡＴＤＮＡ配列コドン
【化１０−１】
2022502008.tif 000027
【化１０−２】
2022502008.tif 000028
【０３４７】
配列番号１１
ＴｃＴＡＴタンパク質配列
【化１１】
2022502008.tif 000029
【０３４８】
配列番号１２
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＣｒＭＡＴＤＮＡ配列コドン
【化１２】
2022502008.tif 000030
【０３４９】
配列番号１３
ＣｒＭＡＴタンパク質配列
【化１３】
2022502008.tif 000031
【０３５０】
配列番号１４
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＬｉＡＡＴ−４ＤＮＡ配列コドン
【化１４】
2022502008.tif 000032
【０３５１】
配列番号１５
ＬｉＡＡＴ−４タンパク質配列
【化１５−１】
2022502008.tif 000033
【化１５−２】
2022502008.tif 000034
【０３５２】
配列番号１６
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＦｇａＡＴＤＮＡ配列コドン
【化１６】
2022502008.tif 000035
【０３５３】
配列番号１７
ＦｇａＡＴタンパク質配列
【化１７】
2022502008.tif 000036
【０３５４】
配列番号１８
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＧＡＯ８１６６６．１ＤＮＡ配列コドン
【化１８】
2022502008.tif 000037
【０３５５】
配列番号１９
ＧＡＯ８１６６６．１タンパク質配列
【化１９】
2022502008.tif 000038
【０３５６】
配列番号２０
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＣｆＡＣＴ１−６ＤＮＡ配列コドン
【化２０】
2022502008.tif 000039
【０３５７】
配列番号２１
ＣｆＡＣＴ１−６タンパク質配列
【化２１】
2022502008.tif 000040
【０３５８】
配列番号２２
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＣｆＡＣＴ１−８ＤＮＡ配列コドン
【化２２−１】
2022502008.tif 000041
【化２２−２】
2022502008.tif 000042
【０３５９】
配列番号２３
ＣｆＡＣＴ１−８タンパク質配列
【化２３】
2022502008.tif 000043
任意にＣ末端の「Ｔ」が欠けていてもよい。
【０３６０】
配列番号２４
S. cerevisiae におけるその発現に最適化されたＯＡＨ９４４１５．１ＤＮＡ配列コドン
【化２４−１】
2022502008.tif 000044
【化２４−２】
2022502008.tif 000045
【０３６１】
配列番号２５
ＯＡＨ９４４１５．１タンパク質配列
【化２５】
2022502008.tif 000046
【０３６２】
配列番号１１６
ＤｆＡＣＴ１３天然ヌクレオチド配列
【化２６】
2022502008.tif 000047
【０３６３】
配列番号１１７
S. cerevisiae におけるその発現に最適化されたＤｆＡＣＴ１３ヌクレオチド配列コドン
【化２７】
2022502008.tif 000048
【０３６４】
配列番号１１８
ＤｆＡＣＴ１３タンパク質配列
【化２８】
2022502008.tif 000049
【０３６５】
配列番号１１９
ＰＹＩ０４５５５．１天然ヌクレオチド配列
【化２９−１】
2022502008.tif 000050
【化２９−２】
2022502008.tif 000051
【０３６６】
配列番号１２０
配列番号１４３のＣ末端拡張型タンパク質多様体をコードする、S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＰＹＩ０４５５５．１ヌクレオチド配列コドン
【化３０−１】
2022502008.tif 000052
【化３０−２】
2022502008.tif 000053
【０３６７】
配列番号１２１
配列番号１４３のＰＹＩ０４５５５．１タンパク質配列Ｃ末端拡張型タンパク質多様体
【化３１】
2022502008.tif 000054
【０３６８】
配列番号１２２
ＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６天然ヌクレオチド配列
【化３２−１】
2022502008.tif 000055
【化３２−２】
2022502008.tif 000056
【０３６９】
配列番号１２３
配列番号１４４のＣ末端拡張型タンパク質多様体をコードする、S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６ヌクレオチド配列コドン
【化３３】
2022502008.tif 000057
【０３７０】
配列番号１２４
配列番号１４４のＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６タンパク質配列Ｃ末端拡張型タンパク質多様体
【化３４】
2022502008.tif 000058
【０３７１】
配列番号１２５
ＸＰ＿００１２５８０７９．１天然ヌクレオチド配列
【化３５−１】
2022502008.tif 000059
【化３５−２】
2022502008.tif 000060
【０３７２】
配列番号１２６
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＸＰ＿００１２５８０７９．１ヌクレオチド配列コドン
【化３６】
2022502008.tif 000061
【０３７３】
配列番号１２７
ＸＰ＿００１２５８０７９．１タンパク質配列
【化３７−１】
2022502008.tif 000062
【化３７−２】
2022502008.tif 000063
【０３７４】
配列番号１２８
ＸＰ＿００１２１７２５０．１天然ヌクレオチド配列
【化３８】
2022502008.tif 000064
【０３７５】
配列番号１２９
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＸＰ＿００１２１７２５０．１ヌクレオチド配列コドン
【化３９−１】
2022502008.tif 000065
【化３９−２】
2022502008.tif 000066
【０３７６】
配列番号１３０
ＸＰ＿００１２１７２５０．１タンパク質配列
【化４０】
2022502008.tif 000067
【０３７７】
配列番号１３１
ＢＡＵ６１５５１．１天然ヌクレオチド配列
【化４１−１】
2022502008.tif 000068
【化４１−２】
2022502008.tif 000069
【０３７８】
配列番号１３２
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＢＡＵ６１５５１．１ヌクレオチド配列コドン
【化４２−１】
2022502008.tif 000070
【化４２−２】
2022502008.tif 000071
【０３７９】
配列番号１３３
ＢＡＵ６１５５１．１タンパク質配列
【化４３】
2022502008.tif 000072
【０３８０】
配列番号１３４
ＰｓＳａｌＡＴ天然ヌクレオチド配列
【化４４−１】
2022502008.tif 000073
【化４４−２】
2022502008.tif 000074
【０３８１】
配列番号１３５
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＰｓＳａｌＡＴヌクレオチド配列コドン
【化４５】
2022502008.tif 000075
【０３８２】
配列番号１３６
ＰｓＳａｌＡＴタンパク質配列
【化４６−１】
2022502008.tif 000076
【化４６−２】
2022502008.tif 000077
【０３８３】
配列番号１３７
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＡｓｔＣヌクレオチド配列コドン
【化４７】
2022502008.tif 000078
【０３８４】
配列番号１３８
ＡｓｔＣ  タンパク質配列
【化４８−１】
2022502008.tif 000079
【化４８−２】
2022502008.tif 000080
【０３８５】
配列番号１３９
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＡｓｔＩヌクレオチド配列コドン
【化４９】
2022502008.tif 000081
【０３８６】
配列番号１４０
ＡｓｔＩタンパク質配列
【化５０】
2022502008.tif 000082
【０３８７】
配列番号１４１
S. cerevisiaeにおけるその発現に最適化されたＡｓｔＫヌクレオチド配列コドン
【化５１】
2022502008.tif 000083
【０３８８】
配列番号１４２
ＡｓｔＫタンパク質配列
【化５２】
2022502008.tif 000084
【０３８９】
配列番号１４３
Ｃ末端が拡張されていないＰＹＩ０４５５５．１タンパク質配列
【化５３】
2022502008.tif 000085
【０３９０】
配列番号１４４
Ｃ末端が拡張されていないＥＲＲ３６４４１５−１＿ｃｏｎｔｉｇ＿８５４６タンパク質配列
【化５４】
2022502008.tif 000086
【０３９１】
本発明において適用可能な更なる配列を以下に列挙する。「以前の」配列番号は、それぞれの特許文献で使用されているものを指す。
【表９】
2022502008.tif 000087
【表１０】
2022502008.tif 000088
【表１１】
2022502008.tif 000089
【表１２】
2022502008.tif 000090
【図１ａ】
2022502008.tif 000091
【図１ｂ】
2022502008.tif 000092
【図１ｃ】
2022502008.tif 000093
【図２−１】
2022502008.tif 000094
【図２−２】
2022502008.tif 000095
【図２−３】
2022502008.tif 000096
【図２−４】
2022502008.tif 000097
【図３】
2022502008.tif 000098
【図４】
2022502008.tif 000099
【図５】
2022502008.tif 000100
【図６】
2022502008.tif 000101
【図７−１】
2022502008.tif 000102
【図７−２】
2022502008.tif 000103
【図８−１】
2022502008.tif 000104
【図８−２】
2022502008.tif 000105
【図９】
2022502008.tif 000106
【配列表】
2022502008000001.app
【国際調査報告】
2022502008.tif 000107
2022502008.tif 000108
2022502008.tif 000109