【手続補正書】
【提出日】平成22年8月18日(2010.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
実施例１３
多様な糖アルコール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
８つの滅菌済み５０ｍｌスクリューキャップ付き遠心管（カタログ番号２１００８−１７８、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約１０のＯＤ６００の２００μｌのＺＷ６５８株グリセロールストックを、９２ｇ／Ｌグルコース、８２ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１０ｍＭのソルビトール、アラビトール、アドニトール（リビトールとも呼ばれる）、もしくはガラクチトールか；または５０ｍＭのアラビトール、アドニトール、もしくはガラクチトールのいずれか一方を含有する２５ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。コントロールには、糖アルコールを添加しなかった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、０〜４０時間の間で定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、およびエタノールについて、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。増殖およびグルコース資化の結果を、それぞれ図２０Ａおよび２０Ｂに示す。キシロース資化およびエタノール産生の結果を、それぞれ図２１Ａおよび２１Ｂに示す。ソルビトールまたはガラクチトールを伴う培養物は、コントロールよりかなり迅速かつ良好に増殖した。アドニトールを伴う培養物もまた、より良好に増殖した。４０時間後、ソルビトールまたはガラクチトールを補充した培養物のＯＤ６００は、７〜８であった；アドニトールを補充した培養物のＯＤ６００は約５であった；一方、他の培養物のＯＤ６００は１未満であった。培地中にソルビトールまたはガラクチトールまたはアドニトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。ソルビトール、ガラクチトール、またはアドニトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。
本実施例は、ガラクチトールが、細胞増殖の改善、キシロース資化、キシリトールの減少、およびエタノール産生の増加に対し、高濃度糖類における同濃度のソルビトールと同程度に有効であることを示す。アドニトールは、ソルビトールほど有効ではなかった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
実施例１４
多様な糖アルコール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
６つの滅菌済み５０ｍｌスクリューキャップ付き遠心管（カタログ番号２１００８−１７８、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約１０のＯＤ６００の２００μｌのＺＷ６５８株グリセロールストックを、９２ｇ／Ｌグルコース、８２ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１０ｍＭのＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルビトール、Ｄ−スレイトール、ミオ−イノシトール、またはキシリトールを含有する２５ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。コントロールには、糖アルコールを添加しなかった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、０〜４８時間の間で定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、およびエタノールについて、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。増殖およびグルコース資化の結果を、それぞれ図２２Ａおよび２２Ｂに示す。キシロース資化およびエタノール産生の結果を、それぞれ図２３Ａおよび２３Ｂに示す。Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールを伴う培養物は、コントロールより迅速かつ良好に増殖した。４８時間後、Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールで補充した培養物のＯＤ６００はそれぞれ６．２および５．２であった；一方、他の培養物のＯＤ６００は１未満であった。培地中にＤ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。Ｄ−ソルビトールの方がＬ−ソルビトールより有効であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）キシロースをエタノールに変換することが可能な組み換えザイモモナス細胞を提供すること；
（ｂ）（ｉ）キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖組成物、ならびに（ｉｉ）ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、およびリビトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖アルコールを含む適切な培地を提供すること；ならびに
（ｃ）（ａ）と（ｂ）とを接触させることによって、ザイモモナス細胞にエタノールを
産生させること、
を含む、エタノール産生を改善するための方法。
２．キシロースをエタノールに変換する組み換えザイモモナスの性能を、（ｂ）の糖アルコールの存在によって改善する、上記１に記載の方法。
３．より多い量のキシロースが混合糖組成物においてエタノールに変換される、上記２に記載の方法。
４．上記１の（ｂ）に記載の糖アルコールの非存在下よりキシリトールの産生が少ない、上記２に記載の方法。
５．上記１（ｂ）の糖アルコールが、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２ｍＭ〜約１００ｍＭ、および約５ｍＭ〜約２０ｍＭからなる群から選択される量で培地中に存在する、上記１に記載の方法。
６．組み換えザイモモナス細胞が、以下の株、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、Ｚ．モビリス８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−６、ＺＭ４（ｐＺＢ５）またはＺ．モビリスＣＰ４：ｐＺＢ５のいずれか１つ由来の細胞である、上記１に記載の方法。
７．キシロース資化性Ｚ．モビリス株ＺＷ６５８。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キシロースをエタノールに変換することが可能な組み換えザイモモナス細胞を提供すること；
（ｂ）（ｉ）キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖組成物、ならびに（ii）ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、およびリビトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖アルコールを含む適切な培地を提供すること；ならびに
（ｃ）（ａ）と（ｂ）とを接触させることによって、ザイモモナス細胞にエタノールを産生させること、
を含む、エタノール産生を改善するための方法。
【請求項２】
キシロース資化性Ｚ．モビリス株ＺＷ６５８。