【事件の表示】
　特許第３３９３５２８号「分析用ポリヌクレオチド配列」の請求項１ないし４、７ないし１５、１７、１９、２０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３９３５２８号に係る特許を維持する。
【理　由】
〔１〕手続の経緯：
　本件特許第3393528号は、特願平1-505144号の特許出願（優先日1988年5月3日、GB）に係り、平成15年1月31日に特許権の設定がなされた後、請求項１乃至４，７乃至１５、１７及び１９乃至２０に係る発明の特許に対してキャノン株式会社から特許異議の申立てがなされた。当審においてなされた平成16年2月10日付取消理由通知に対して平成16年8月20日付で意見書が提出された。その後、平成17年7月12日付でファクシミリによる審尋がなされ、回答書と共に新たな訂正明細書案が提出されたので、平成17年8月15日付で再度取消理由が通知され、その指定期間内である平成17年9月6日付で意見書と共に明細書の訂正請求がなされたものである。                  
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮を目的として、
(1)請求項１、１０及び１４の「複数の」とあるのを「少なくとも72の」に、同「不透過性支持体」とあるのを「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」に、そして
(2)請求項１５の「オリゴヌクレオチド」とあるのを「少なくとも72のオリゴヌクレオチド」に、同「不透過性支持体」とあるのを「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」に、
それぞれ訂正しようとするものである。
　当該訂正は、特許明細書の特許請求の範囲において、「複数の」という数値範囲を「少なくとも72の」に限定し、かつ単なる「不透過性支持体」を「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」に限定するものであって、「72」については特許明細書第9頁第17欄18行に、そして「滑らかな不透過性表面」については同第7頁第14欄33行に具体的に記載されている事項である。
　そうなので、上記訂正事項はいずれも明細書に記載された事項の範囲内における特許請求の範囲の減縮にあたるものであり、またいずれも特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
　したがって、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成6年法律第116号）附則第6条第1項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第120条の4第3項において準用する平成5年改正特許法第126条第1項ただし書、第2項、及び第3項の規定に適合するので、当該訂正は認められるものである。
　
〔３〕特許異議申立について：
１．本件発明について：
　本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、上記異議申立がなされた本件の請求項１〜４、７〜１５、１７及び１９〜２０に係る発明は、訂正明細書の請求項１〜４、７〜１５、１７及び１９〜２０の記載により特定されており、そのうちの請求項１には下記のように記載されている（以下、「本件発明」ともいう。）。
　
「【請求項１】　特定の長さの少なくとも72のオリゴヌクレオチドのアレイをその表面に結合してなる滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体を用いることにより、ポリヌクレオチド配列を分析する方法であって、異なるオリゴヌクレオチドがアレイにおいて支持体の表面上の間隔をおいた区域にて共有結合しており、該方法は、
ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、
ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そして
オリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に対応する上記表面上の標識の位置を観察すること
からなる上記方法。」　
　
２．異議申立の理由の概要：
　特許異議申立人キャノン株式会社は、(1)本件訂正前の請求項１〜４，９〜１５および１７に係る発明は、いずれも実質的に下記甲第２号証に記載された発明であるから、特許法第29条第1項第3号に該当するものであり、(2)同請求項１〜４，７〜１５，１７及び１９〜２０に係る発明は下記甲第１〜８号証の記載から当業者が容易に想到できた発明であるから、訂正前の請求項１〜４、７〜１５、１７及び１９〜２０に係る発明の特許は特許法第29条第2項の規定に違反してなされたものであるので、これら請求項に係る発明の特許は同法第113条第1項第2号の規定により取り消されるべきである旨と共に、(3)訂正前の請求項１〜３及び１０〜１２の記載は特許法第36条第4項及び第5項に規定する要件を満たしていないから、これら請求項に係る特許は同法第113条第1項第4号により取り消されるべきである旨を主張している。
　
　　　　　　　　　　 記                            
　
甲第１号証：欧州特許出願公開第235726A2号公報
甲第２号証：特開昭61-23957号公報
甲第３号証：特開昭61-227591号公報
甲第４号証：特開昭59-141599号公報
甲第５号証：特公昭63-12260号公報
甲第６号証：国際公開第88／01302号パンフレット
甲第７号証：特表昭60-502155号公報
甲第８号証：特開昭62-282599号公報
　
３．当合議体の判断：
（１）特許法第29条第1項第3号違反の主張について：異議申立理由(1)について
　
  甲第２号証第11頁左上欄9行〜右上欄10行には、異なるオリゴヌクレオチドプローブを（スライド）ガラス表面の異なる位置に結合させて、これにDNAまたはRNA試料と標識した核酸配列とを前もって決定した厳格さのハイブリダイズ条件で競合させた後、スライド表面に残った標識をレドックス反応を利用して光学的に観察することにより、試料中の核酸配列の分析を行うことが記載されている。
　確かに当該手法は、「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」であるスライドガラスを支持体として用いて試料ポリヌクレオチドの配列を分析する手法であり、試料ポリヌクレオチドが当該ガラス表面の異なる位置に存在する異なるプローブとハイブリダイズしたか否かを、ガラス表面上の標識の位置を観察する手法である点で本件発明と軌を一にするものではあるとはいえる。
　しかしながら、甲第２号証には、ガラス表面の異なる位置に結合させるプローブの数について、単に「異なるプローブ」と記載されるのみであり、例えば「72」以上等の「多数」種類の場合にも適用される手法であることは記載されていない。
　ところで、甲第２号証で「DNAまたはRNA試料」として具体的に例示されたポリヌクレオチドは、dsDNAを変性後機械的もしくは酵素的に切断して調製された「平均長500〜10,000nt」という極めて長いフラグメントの混合物であることからみて、同時に「多数」のプローブに対するハイブリダイズの有無を観察することが想定されていたとは考えにくい。しかも、具体的に例示されたアッセイ法はいわゆる競合法であるから、固定プローブの種類ごとに適切な競合条件を設定する煩雑さが予想されるにもかかわらず、具体的な実験例の記載がなく各工程の具体的な実験条件も全く示されていない。そうしてみると、ここでいう「異なるオリゴヌクレオチド配列」の数としては極めて少ない数、せいぜい数個程度であるとする方が自然である。
　そうなので、甲第２号証には本件発明が記載されているとも、記載されているに等しいともいうことはできない。
　同様に、甲第２号証には、本件請求項２〜４，９〜１５および１７に係る発明のいずれも実質的に記載されていない。
　したがって、本件請求項１〜４，９〜１５および１７に係る発明の特許が特許法第29条第1項第3号の規定に違反してなされたものであるとする異議申立人の主張は採用しない。
　
（２）特許法第29条第2項違反の主張について：異議申立の理由(2)について
　
　甲第１号証には、いくつかの異なるタイプの未標識のプローブを支持体に固定し、標識された核酸試験サンプルを、当該プローブとハイブリダイズさせ、試験サンプルとハイブリダイズしたプローブに対応する支持体表面上の標識の位置を観察することで、試験サンプルの核酸配列を解析することが記載されている。
  しかしながら、その際の支持体として、実施例で実際に用いられているのはニトロセルロース膜であり、スライドガラスなどの「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」に関しては具体的な例示もなされていない。
　また、支持体に固定された核酸プローブの数について、「いくつかの異なるタイプの」と表現されていることから「複数」の種類であるとは解されるものの、核酸プローブを透過性のニトロセルロース膜に吸着させて固定する以上、核酸含有液のスポットが膜内に浸透し拡散することは避けられないから、スポットサイズはある程度の大きさを有することになり、支持体表面に固定できる核酸プローブ数は極めて少ない数であるはずである。実際に、実施例において用いられた核酸プローブの数は２又は数種類であり、例えば「72」以上等の「多数」種類の場合にも適用できる旨の記載はない。
　一方、甲第２号証においても、「多数」の核酸プローブをガラス表面に結合することが教示されていない点は上述の如くである。甲第３〜８号証においては、ガラス表面など「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」表面にプローブ等の核酸を共有結合で固定することが記載もしくは示唆されている場合でも、結合させる核酸プローブが「複数」であることすら記載されておらず、しかも例示された「ガラス」の表面の性質に関し、核酸プローブ含有液を浸透しないという「（液体の）不透過性」という特性を積極的に利用することを教示する記載もない。
　そうしてみると、たとえ甲第１号証の核酸配列解析法において、複数の核酸プローブを支持体表面の異なる位置に固定する際に用いる支持体として、透過性のニトロセルロース膜に代えて、スライドガラスなど「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」を用いて共有結合させることを当業者が想定した場合でも、その際に「少なくとも72」という多数の核酸プローブを「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」に結合させようとすることまでは容易に想到できないものというべきである。
　そして、「少なくとも72」という多数のオリゴヌクレオチドを表面に結合したアレイにより、試料ポリヌクレオチドの配列分析を行う方法に関する本件発明は、アレイの支持体としてスライドガラスなど「滑らかな不透過性表面を有する不透過性支持体」を用い、支持体表面が「滑らかな不透過性表面」であることを利用してオリゴヌクレオチド含有液スポットの表面での拡散を減少させ、極めて小さなスポットサイズを達成したものであり、そのことではじめて「少なくとも72」という多数のオリゴヌクレオチドアレイに対する試料ポリヌクレオチド配列の分析が可能となったものである。
　したがって、本件発明は、甲第１号証及び甲第２〜８号証の記載事項を組み合わせても当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　請求項２〜４，７〜１５，１７及び１９〜２０に係る発明についても、同様の理由で甲第１〜８号証の記載事項からは当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　したがって、本件請求項１〜４，７〜１５，１７及び１９〜２０に係る発明の特許が特許法第29条第2項の規定に違反してなされたものであるとする異議申立人の主張は採用しない。
　
（３）特許法第36条第4項及び第5項違反の主張について：異議申立理由(3)について
　
（３−１）特許異議申立人は、下記の（イ）及び（ロ）の点を指摘し、訂正前の本願明細書の請求項１〜３及び請求項１０〜１２の記載は、特許法第36条第4項及び第5項に規定される要件を満たしていない旨を主張している。
（イ）訂正前の請求項１〜３及び請求項１０〜１２に記載された「特定の長さ」について、具体的にどのようにして特定された「長さ」を使用するのか、また具体的にどのような塩基長を用いるのかについて何ら記載がない点。
（ロ）同請求項３及び１２に記載された「アレイが特定の長さの一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対を含む」について、どのような長さのどのような種類のオリゴヌクレオチドの対を含むか不明である点。
　
（３−２）（イ）の点について：
　しかしながら、本件請求項１などに記載された、支持体表面に結合したオリゴヌクレオチドは、そもそも当該請求項中の記載からみて、試料のポリヌクレオチド配列を分析するために、標識された当該ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとの「ハイブリッド形成プローブ」として用いることが明らかであり、このような「ハイブリッド形成プローブ」の長さは、解析もしくは検出したい対象のポリヌクレオチド配列に対応して従来から適宜決定されていたものである。
  本件特許明細書においては、実施例１では10〜14mer、実施例２では12mer、実施例３及び４では19merのオリゴヌクレオチドがそれぞれ用いられており、実施例５では先駆物質をレイダウンさせるための自動化系のテストから導かれた結論として、12〜19merのオリゴヌクレオチドが適していることが記載されている。
　このように、典型的な例が記載される実施例においても、通常のプローブとして用いられないような極めて短い場合や、「『オリゴ』ヌクレオチド」とも呼べないような極めて長い場合は用いられていない。このことからも、請求項１などの「特定の長さ」としては、オリゴヌクレオチドプローブとして通常の範囲内の長さであると解することが自然である。
　そして、当業者であれば通常のプローブの長さを決定する場合と同様に、解析したい対象のポリヌクレオチド配列の特異性やアレイ全体の大きさなどを勘案し、適宜オリゴヌクレオチドの長さを決定するものであるといえるから、当業者にとって上記「特定の長さ」の用語は明瞭であり、かつ充分に明細書の記載にサポートされているものである。
　したがって、上記（イ）の点に関して、格別な本件明細書の記載不備はない。
　
（３−３）（ロ）の点について：
　また、請求項３における「特定の長さ」は、請求項３が間接的に請求項１を引用していることからも、上記（イ）に関して述べた通り、オリゴヌクレオチドプローブとして通常の範囲内の長さであることは明らかである。そして同請求項３の「オリゴヌクレオチド対」を含む「アレイ」に関し、請求項３を引用する請求項４では「研究される点変異の正常バージョンと変異バージョンを表す一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対」を含むものであることが記載される一方、請求項３が引用する請求項２では、「アレイ」中の「複数のオリゴヌクレオチド」が「複数のオリゴヌクレオチド配列の相補体を含む」ものであって、かつ「ポリヌクレオチド配列間の差異を研究するために適用される」ものであることが記載されている。
　特許明細書中においても、「3.　既知塩基配列の分析」（第4頁右欄30行〜第5頁左欄11行）の項で、プローブの最も有効な使用方法の１つとして、各種遺伝病の原因となるようなヒト遺伝子中の単独塩基変化の検出について詳細に述べられており、実施例４では遺伝疾患の診断法が具体的に記載されている。
　そうしてみると、請求項３における「一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対」の「オリゴヌクレオチド対」とは、「ポリヌクレオチド配列間の差異を研究するために適用される」「アレイ」において、「点変異を有するオリゴヌクレオチド配列とその正常配列とからなる対」のような場合を包含する、「対」となったオリゴヌクレオチドのセットを表現した用語であると解することができる。
　そうであるから、当該記載は請求項の記載のみから充分に明確な用語であり、発明の構成に欠くことができない事項の記載が不足しているとはいえず、かつ明細書の記載にも充分サポートされた記載である。
　請求項１２における同一用語の記載も同様である。
  したがって、上記（ロ）の点についても、異議申立人が主張するような記載不備はない。
　
（３−４）まとめ：
　以上述べたように、請求項１〜３及び請求項１０〜１２の記載に関する特許法第36条第4項及び第5項に規定される要件を満たしていない旨の特許異議申立人の主張も採用しない。
　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
分析用ポリヌクレオチド配列
【発明の詳細な説明】
　１．導入
　核酸配列の分子分析に主として次の３方法がある：制限フラグメントのゲル電気泳動、分子ハイブリッド形成および迅速ＤＮＡ塩基配列決定方法。これらの３方法は生物学において基礎研究と、医学および農業のような生物学の応用分野との両方において広範囲に用いられている。これらの方法が現在用いられている規模についての若干の示唆は、現在１年間に１００万より充分に大きい塩基対が蓄積されるＤＮＡ塩基配列の蓄積速度によって与えられる。しかし、これらの方法は強力ではあるけれども、限界を有している。制限フラグメントはハイブリッド形成方法は広範囲な領域を大ざっぱに分析するにすぎないが、迅速である。塩基配列分析法は究極的な分析を与えるが、緩慢であり、一度に短い範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）のみを分析するにすぎない。現在の方法よりも迅速な方法、および特に各分析において多量の塩基配列をカバーする方法が必要とされている。
　本発明は単一分析でフィンガープリントと、部分的または完全な塩基配列との両方を生じ、複合ＤＮＡおよびＲＮＡの集団にクローニングの必要なく直接用いることのできるような新しいアプローチを提供する。
　本発明は、特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、ポリヌクレオチドの決定されていない配列もしくは決定されていない配列の変異体を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下、ポリヌクレオチド中の相補体を有するオリゴヌクレオチドをそれを有しないオリゴヌクレオチドから区別しうる条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
　本発明はまた、特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで、各々のオリゴヌクレオチドは末端ヌクレオチドを介して支持体の表面に結合しており、異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
　本発明はまた、特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで各々のオリゴヌクレオチドはインサイチオで合成されており、共有結合を介して支持体の表面に結合しており、異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
　本発明はまた、正確な適合（マッチ）と不適切な適合（ミスマッチ）との間を区別するように選択された長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体もしくは特定部分のアレイをその表面に結合してなる支持体を用いることにより、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そしてオリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に関連する表面上の標識の位置を観察する、ことを含み、ここで異なるオリゴヌクレオチドはアレイの別々のセルを占有していることを特徴とする。
　本発明はまた、ポリヌクレオチドの決定されていない配列もしくは決定されていない配列の変異体を分析するための装置であって、異なる配列を有する異なるオリゴヌクレオチドのアレイをその表面に結合してなる支持体を含み、ここでオリゴヌクレオチドはアセイのセルを占有し表面に結合しており、アレイの１つのセルのオリゴヌクレオチドの定められた配列はアレイの他のセルのオリゴヌクレオチドの定められた配列とは異なっており、かつ、配置は、分析されるべきポリヌクレオチド配列のアレイへの供給がハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチド中の相捕体を有するオリゴヌクレオチドをそれを有しないオリゴヌクレオチドから区別しうるようなものであることを特徴とする装置を提供する。
　本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドは末端ヌクレオチドを介して支持体の表面に結合されており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
　本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドはインサイチオで合成されており、かつ共有結合を介して支持体の表面に結合されており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
　本発明はまた、あらかじめ決定されているポリヌクレオチド配列を分析するための装置であって、少なくとも２つの定められたセルに分画された表面を有する支持体を含み、各々のセルには既知の配列のオリゴヌクレオチドが結合されており、各々のセルのオリゴヌクレオチドは正確な適合と不適切な適合との間を区別するように選択された長さを有しており、ここで第１のセルのオリゴヌクレオチドの配列は別のセルのオリゴヌクレオチドの配列と異なることを特徴とする装置を提供する。
　本発明はまた、本発明の装置のために、支持体物質の別々のセル中に選択された長さのオリゴヌクレオチドのアレイを生成する方法を提供する。この方法は、
　ａ）支持体物質を別々のセル区域に分画し；
　ｂ）あるヌクレオチドをセル区域の第１のセットにカップリングさせ；
　ｃ）あるヌクレオチドをセル区域の第２のセットにカップリングさせ；
　ｄ）あるヌクレオチドをセル区域の第３のセットにカップリングさせ；そしてｅ）所望のアレイが生成するまで一連のカップリング工程を続ける；
の各工程を含み、カップリングは、各々の区域において、支持体の表面に対してまたは前工程においてその区域にカップリングされたヌクレオチドに対して実施されることを特徴とする。
　本発明は１態様において、支持体とその表面に取付けた、アレイの別々のセルを占有し、ハイブリッド形成反応に参加しうる特定長さの異なるオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体または特定の部分のアレイ（ａｒｒａｙ）から成るポリヌクレオチド塩基配列の分析装置を提供する。ポリヌクレオチド塩基配列の差異を調べるために、本発明は他の態様において支持体と、その表面に取付けた、アレイの別々のセルを占有するハイブリッド形成反応に参加しうる異なるオリゴヌクレオチドであって、ポリヌクレオチド塩基配列を含む特定長さのオリゴヌクレオチドの完全なセットの全体または特定部分のアレイとから成る装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）を提供する。
　他の態様において本発明はその表面に特定長さのオリゴヌクレオチドの完全セットの全体または特定部分のアレイを取付けた支持体を用いることによるポリヌクレオチド塩基配列の分析方法であって（異なるオリゴヌクレオチドがアレイの別々のセルを占有する）、ポリヌクレオチド塩基配列またはそのフラグメントを標識して標識物質を形成し、ハイブリッド形成条件下で標識物質をアレイに加え、オリゴヌクレオチドセットの特定要素と結合した、表面の標識の位置を観察することから成る方法を提供する。
　このように、本発明の考えは１種類の特定長さまたは数種類の特定長さのオリゴヌクレオチドの完全セットの全体または特定部分の組織化アレイ（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　ａｒｒａｙ）を提供することである。支持フィルムまたはガラスプレート上に展開されるアレイはハイブリッド形成反応の標識を形成する。ハイブリッド形成の特定条件とオリゴヌクレオチドの長さとはいずれにしても正確に適合したオリゴヌクレオチドと不適合オリゴヌクレオチドとを識別する有効な装置のために充分でなければならない。ハイブリッド形成反応では、特定長さ以上のポリヌクレオチド塩基配列またはフラグメントのオリゴマーを含み、その性質が特定の用途に依存する標識プローブによって、アレイが利用される。例えば、プローブはポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムＤＮＡから増幅される標識塩基配列、またはｍＲＮＡ集団、または例えば全ゲノムのような、複合塩基配列からのポリヌクレオチドの完全セットを含む。最終結果は分析塩基配列中に存在するオリゴヌクレオチドに一致する充てんセル（ｆｉｌｌｅｄ　ｃｅｌｌ）のセットと、分析塩基配列中に存在しない配列に一致する「エンプティ」座位のセットである。このパターンは被分析塩基配列のすべてを表すフィンガープリントを生ずる。さらに、オリゴヌクレオチド長さをオリゴヌクレオチドの殆んどまたはすべてをが１回のみ生ずるように選択するならば、被分析塩基配列の殆んどまたは全てを集合させることも可能である。
　アレイ「ルックアップ表」中に存在するオリゴヌクレオチドの数、長さおよび塩基配列も用途に依存する。アレイは被分析塩基配列に関する塩基配列情報存在しない場合に必要になるような、特定長さのあらゆる可能なオリゴヌクレオチドを含みうる。この場合に、使用オリゴヌクレオチドの好ましい長さは被分析塩基配列の長さに依存し、被分析塩基配列中の特定オリゴマーの１コピーにすぎないと思われるような長さである。このようなアレイは大きい。被分析塩基配列に関する情報が全く得られない場合には、アレイは選択された部合集合（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｓｕｂｓｅｔ）でありうる。公知の塩基配列の分析では、アレイのサイズは塩基配列の長さと同じオーダーであり、例えば突然変位遺伝子の分析のような多くの用途では、きわめて短い。これらの要素については下記で詳細に考察する。
　２．塩基配列プローブとしてのオリゴヌクレオチド
　オリゴヌクレオチドは相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと塩基対合した二本鎖（ｂａｓｅ　ｐａｉｒｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）を形成する。二本鎖の安定性はオリゴヌクレオチドの長さと塩基組成とに依存する。二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）安定性に対する塩基組成の効果は高濃度の４級アミンまたは３級アミンの存在によって非常に減ぜられる。しかし、ハイブリッドの熱安定性に対してオリゴヌクレオチド二本鎖中の不適合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の強力な効果が依存し、このことがオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成技術を突然変異分析のためおよびＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応による増幅の特異的塩基配列を選択するためのこおような強力な方法にしている。不適合の位置は不安定化度（ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｄｅｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）に影響を与える。二本鎖の中心に存在する不適合は末端不適合の１℃に比べてＴｍを１０℃低下させる。ここに述べる方法に密接に関係する。不適合の位置に依存するある範囲の識別力が存在する。例えば、ハイブリッド形成を二本鎖のＴｍ近くで実施して不適合二本鎖の形成率を減ずることによる、または非反復表現（ｕｎｉｑｕｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に必要である以上にオリゴヌクレオチドの長さを増大することによるような、識別改良方法が幾つか存在する。これの系統的実施方法を考察する。
　３．既知塩基配列の分析
　オリゴヌクレオチド　プローブの最も有効な使用方法の１つはヒト遺伝子中の単独塩基変化の検出である。最初の例は鎌状赤血球病を生ずるベータグロビン遺伝子における単独塩基変化であった。このアプローチを例えばＤＭＤ遺伝子およびＨＰＲＴ遺伝子のような、同じ表現型を生ずる多くの異なる突然変異が生ずる遺伝子にまで拡大して、例えばハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）およびのう胞性線維症のような疾患遺伝子座（ｄｉｓｅａｓｅ　ｌｏｃｕｓ）を含むことが結合分析によって判明している領域における突然変異のヒトゲノムの効果的な走査方法を発見することが必要とされている。如何なる既知の塩基配列も重複オリゴヌクレオチドのセットとして完全に表すことができる。セットのサイズＮはＳ＋１〜Ｎであり、Ｎは塩基配列の長さ、Ｓはオリゴマーの長さである。例えば１ｋｂの遺伝子は特定長さの約１０００オリゴヌクレオチドの重複セットに分けることができる。別々のセル内にこれらのオリゴヌクレオチドの各々によって構成されたアレイは例えばヒトゲノム中の単独コピー遺伝子（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙ　ｇｅｎｅ）または混合ＲＮＡ集団中のメッセンジャーＲＮＡのような、何らかの意味で相同塩基配列を検出するための多重ハイブリッド形成プローブとして用いられる。長さＳは、塩基配列内のオリゴマーが被分析配列中のどこかで表される確率がごく小さいように選択することができる。これは下記の統計を考察する項に述べる式から算出することができる。あまり完全ではない分析では、例えば一部重複または非重複セットで塩基配列を表すことによって、５までのファクターを用いてアレイのサイズを減ずることが可能である。完全重複セットを用いることの利点は、Ｓ連続オリゴヌクレオチド中の不適合が走査されるので、塩基配列差の正確な位置確認が可能になることである。
　４．未知塩基配列の分析
　あらゆる自由生活有機体（ｆｒｅｅ　ｌｉｖｉｎｇ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）のゲノムは１００万以上の塩基対であり、いずれのゲノムもまだ完全には解明されていない。制限座位マッピングは塩基配列のごく一部のみを明らかにするにすぎず、２ゲノムの比較に用いる場合に突然変異の小部分のみを検出できるにすぎない。関係する遺伝子に直接接近することのできない多くの生物学的問題に分子生物学の全エネルギーを集中するには、複合塩基配列のさらに効果的な分析方法が必要である。多くの場合に、核酸の完全な塩基配列を決定する必要はなく、重要な配列は２種類の核酸を区別するような配列である。３例を挙げると、野生型有機体と突然変異体含有有機体とでは異なるＤＮＡ塩基配列は問題遺伝子の単離方法を誘導しうる；同様に、癌細胞とその正常相対細胞との間の塩基配列差によって形質転換の原因を解明することができる；また、２細胞型の間で異なるＲＮＡ配列はこれらを区別する機能を与える。これらの問題は塩基配列差を確認する方法によって、分子分析で解説することができる。ここに述べるアプローチを用いると、このような差は２種類の核酸、例えば２遺伝子型のゲノムＤＮＡまたは２細胞型のｍＲＮＡ集団から全ての可能な塩基配列を表すオリゴヌクレオチドアレイにハイブリッド形成することによって示される。１塩基配列によって占められ他方の配列によって示されていないアレイ中の位置は２塩基配列の差を表す。これは関係する塩基配列のクローンの単離に用いられるプローブの合成に必要な塩基配列情報を与える。
　４．１塩基配列情報の組立て
　アレイへのハイブリッド形成の結果を調べることによって、塩基配列を再構成することができる。長い配列内からの長さＳのオリゴヌクレオチドは長さＳ−１にわたって他の２塩基配列と重複する。各陽性のオリゴヌクレオチドから出発して、左へ４オリゴヌクレオチドおよび１塩基置換体と重複しうる右方へ４オリゴヌクレオチドについてアレイを調べる。これらの４オリゴヌクレオチドの中の１個のみが右方へ陽性であることが判明した場合には、重複と右方への付加塩基とが未知塩基配列中のＳ塩基を決定する。このプロセスを両方向にくり返して、アレイ中の他のオリゴヌクレオチドとの独特の適合を求める。各独特適合が再構成配列に塩基を加える。
　４．２統計学
　長さＮの塩基配列は長さＳ塩基対の〜Ｎ重複塩基配列のセットに分解される。（二重鎖核酸では、Ｎ塩基対の配列の塩基配列複合度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）は、２本の鎖が異なる配列を有するので２Ｎであるが、本発明のためには、この２という係数は重要ではない）。長さＳのオリゴヌクレオチドでは、４Ｓ種類の配列組合せが存在する。複合度Ｎの被分析配列中に大ていのオリゴヌクレオチドが１回のみ表われることを保証するには、Ｓの大きさはどの位であるべきか？ランダム配列では、１つ以上のコピー中に存在するＳ−ｍｅｒの期待数はμ＞１〜４Ｓ（１−ｅ−λ（１＋λ））であり、λ＝（Ｎ−Ｓ＋１）／４Ｓである。
　実用的な理由から、単独塩基変化によってあらゆるＳ−ｍｅｒ（Ｓマー）に如何に多くの配列が関係するかを知ることも有用である。各位置は３塩基の１つによって置換されるので、単独塩基変化によって各Ｓ−ｍｅｒに関して３Ｓ配列が存在し、Ｎ塩基の配列中のＳ−ｍｅｒが１置換を可能にする配列中の他のＳｍｅｒと関係する確率は３Ｓ×Ｎ／４Ｓである。この場合に適合配列と不適合配列の相対シグナルは、完全適合を単独塩基だけ異なる適合から区別することにハイブリッド形成条件が如何に良好であるかにも依存する。（４ＳがＮより大きい、大きさのオーダーである場合には、１塩基変化によるいかなるオリゴヌクレオチドに比べてもごく小さい３Ｓ／１０であるにちがいない）。不適合配列からのハイブリッド収量が完全な二重鎖によって形成される収量の一部にすぎないことが示唆される。
　下記に関して、プローブ中に相補性を有するオリゴヌクレオチドを相補性を有さないオリゴヌクレオチドから区別させる条件が存在すると考える。
　４．３アレイフォーマット、構成とサイズ
　異なる複合度の塩基配列を分析するために必要なアレイの規模について考えるために、アレイを方形マトリックスと見なすことが便利である。一定長さのすべての配列を４塩基を表す４列を引き、次に同様に４縦列を引くことによって構成されるマトリックス中に１回のみ表すことができる。これは４×４マトリックスを形成し、１６方形の各々１６ダブレットの１つを表す。次に、大きさが１／４である以外は同じ４マトリックスを各オリジナルマトリックス中に描いた。これによって全体で２５６テトラヌクレオチド配列を含む、１６×１６マトリックスが形成される。このプロセスをくり返すと、特定の深さＳ、セル数が４Ｓに等しいマトリックスが得られる。上述したように、Ｓの選択は、これが塩基配列複合度を決定するので、非常に重要である。下記で検討するように、Ｓは、複合ゲノムのために充分に大きくなければならない構成マトリックスのサイズをも決定する。最後に、オリゴヌクレオチドの長さはハイブリッド形成条件と、ハイブリッド形成プローブとしてのそれらの識別力とを決定する。
　この表は数個のゲノムの第１分析を実施するために必要なアレイの予想規模を示す。例は通常の方法によって塩基配列を決定された（コスミドスケール）、または現在塩基配列決定中（大腸菌スケール）であるゲノムであるか、または問題の大きさがかなり検討されている（ヒトスケール）ゲノムであるために、選択した。表はマトリックスアプローチの予想スケールが通常のアプローチのごく一部であることも示す。これは用いられるＸ線フィルムの面積に容易に認められる。分析に要する時間がゲル方法に要する時間のごく一部であることも明らかである。「ゲノム」縦列はマトリックスのセルの約５％を満たすランダム配列の長さを示す。これは下記で考察する塩基配列決定法の第一段階の最適条件であるように選択した。このサイズでは、正シグナルの割合の大きいことが各オリゴマーの１回発生を示し、これは２ゲノムを比較して配列差を知るために必要な条件である。
　５．不完全塩基配列の精製
　複合配列の再構成は、配列中でくり返されるオリゴマーが発生する個所において再構成配列が中断されるという結果を生ずる。例えばヒトＤＮＡに分散され、タンデム反復する、ＤＮＡの構造組織の一部をなす長い反復構造の成分として反復が存在する。しかし、マトリックスに用いるオリゴヌクレオチドの長さが非反復表現の全体を与えるために必要であるよりも短い場合には、偶発的に反復が生ずる。このような反復は単離されやすい。すなわち、反復オリゴマーを囲む配列は互いに関係していない。これらの反復によって生ずるギャップは配列を長いオリゴマーに伸長することによって解消される。あやるゆ可能なオリゴマーのアレイ表現を用いた、第１分析によって反復することが判明した塩基配列は、原則として、各端部での伸長によって再合成することができる。各反復オリゴマーに対して、新しいマトリックス中に４×４＝１６オリゴマーが存在する。ハイブリッド形成分析は、配列が完成するまで、くり返される。実際には、ハイブリッド形成における陽性シグナルの結果が不明瞭であるので、第１分析において明確な陰性結果を与えなかったすべての配列の伸長による第１結果の精製（ｒｅｆｉｎｅ　ｍｅｎｔ）を利用することが好ましい。このアプローチの利点は配列の伸長によって、短いオリゴマーの末端に近い不適合を伸長オリゴマーの中央近くに持ってきて、二重鎖形成の識別力を高めることである。
　５．１．バクテリオファージλＤＮＡの塩基配列の仮説的分析
　ラムダファージＤＮＡは４８，５０２塩基対長さである。これの塩基配列は完全に決定されているので、これの一重鎖を分析のコンピューターシミュレーションにテストケースとして処理した。表は、この複合度の配列に用いるオリゴマーの適当なサイズが１０ｍｅｒであることを示す。１０ｍｅｒのマトリックスでは、サイズは１０２４ライン平方であった。コンピューターでのラムダ１０ｍｅｒの「ハイブリッド形成」後に、４６，３７７セルが陽性であり、１９５７が二重発生を示し、７５が三重発生を示し、３セルが四重発生を示した。これらの４６，３７７陽性セルはマトリックスのそれらの位置から推定して、既知の配列を表した。各々を３’末端において４×１塩基、５’末端において４×１塩基伸長させて、１６×４６，３３７＝７４２，０３２セルを得た。この伸長セットは二重発生を１６１に減じ、さらに１６倍の伸長はこの数を１０に減じ、再度の実験は完全に重複した結果を示した。完全に重複した配列の同じ最終結果は４１６マトリックスから出発して得られるが、このマトリックスはすべての１０−ｍｅｒを表すために必要なマトリックスよりも４０００倍大きく、この上に表された配列の大部分は冗長であった。
　５．２マトリックスのレイダウン
　ここに述べた方法は、例を上述したように、４塩基の先駆物質を所定パターンでレイダウンすることによって、アレイのセル中にオリゴヌクレオチドを合成することによってマトリックスが製造されることを可能にする。先駆物質を供給する自動装置はまだ開発されていないが、明白に可能性が存在する。この目的にペンプロッターその他のコンピューター制御プリンティング装置を用いることも困難でない筈である。複合ゲノムは非常に多数のセルを必要とするので、アレイのピクセルサイズが小さければ小さいほど良い。しかし、これらを如何に小さく製造するかについては限界がある。１００ミクロンはかなり満足できる上限であるが、組織および拡散のために、紙ではおそらく達せられない。例えばガラスのような滑らかな不透過性表面では、例えばレーザータイプセッター（ｌａｓｅｒ　ｔｙｐｅｓｅｔｔｅｒ）を用いて溶媒抵抗性グリッドを形成し、暴露部分にオリゴヌクレオチドを構成することによって約１０ミクロンまでの分析が達切される。本発明のオリゴヌクレオチド合成方法の適用を可能にする魅力的な可能性の１つは、ガラスプレートの表面上の顕微鏡パッチとしての微孔質ガラスを焼結することである。プリンティングメカニズムが緩慢である場合には、非常に多数のラインまたはドッドとレイダウンには長時間を要する。しかし、低コストジェットプリンターは約１０，０００スポット／秒の速度でプリントすることができる。このような速度では、約３時間に１０８スポットをプリントすることができる。
　５．３オリゴヌクレオチドの合成
　幾つかのオリゴヌクレオチド合成方法が存在する。現在用いられている大ていの方法は制御孔度ガラス（ＣＰＧ）の固体支持体にヌクレオチドを結合させる方法であり、ガラス面での合成に用いるため適している。それらをその上で合成したマトリックスにまだ結合した状態のハイブリッド形成プローブとしてのオリゴヌクレオチドの直接使用については、我々の知るところでは、開示されていないが、合成後に結合させた固体サポート上のハイブリッド形成プローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用は報告されている。ＰＣＴ出願第ＷＯ８５／０１０５１号はＣＰＧカラムに結合したオリゴヌクレオチドの合成方法を述べている。我々が実施した実験では、ファージラムダの左手ＣＯＳ座位に相補的な１３ｍｅｒを合成するためにアプライドバイオシステムズオリゴヌクレオチド合成器のサポートとしてＣＰＧを用いた。カップリング工程は理論的収量にすべて密接した。全合成と脱保護との工程を通して第１塩基は支持体媒質に共有結合によって安定に結合した。
　６．プローブ、ハイブリッド形成および検出
　微孔質ガラス上に合成されるオリゴヌクレオチドの収量は約３０μｍｏｌ／ｇである。この物質の１ミクロン厚さ×１０ミクロン平方のパッチは、ヒトＤＮＡ約２ｇの等価である、〜３×１０−１２μｍｏｌを維持した。それ故、ハイブリッド形成反応はプローブ中のオリゴヌクレオチドよりも非常に大きく過剰な結合オリゴヌクレオチドによって実施される。そのため、収量は反応のすべての段階において濃度に比例するので、プローブ塩基配列の単独発生と多量発生とを含むハイブリッド形成を区別できる系の設計が可能であるべきである。
　被分析ポリヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである。プローブを製造するには、ポリヌクレオチドを分解してフラグメントを形成する。ポリヌクレオチドをできるだけランダムな方法で分解して、支持体上の特定の長さを中心とした平均的長さのオリゴヌクレオチドおよび塩基配列決定用ゲルでの電気泳動によって選択される正確な長さＳのオリゴマーを形成することが好ましい。プローブを次に標識する。例えば、長さＳのオリゴヌクレオチドを末端標識することができる。３２Ｐで標識する場合には、全ヒトＤＮＡからの個々のＳ−ｍｅｒの放射能収量（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｙｉｅｌｄ）は１０４ｄｐｍ／総ＤＮＡｍｇ以上になりうる。検出のためには、このごく一部が１０〜１００ミクロン平方のパッチに必要である。これはハイブリッド形成条件を二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）のＴｍに近いように選択することを可能にする、これはハイブリッドの収量および形成速度を減ずるがが、識別力を高める。結合オリゴヌクレオチドが過剰に存在するので、平衡近くで作用する場合にもシグナルが問題になる必要はない。
　ハイブリッド形成条件は、フィルターへのハイブリッド形成に用いる標準方法に適することが知られている条件に合わせて選択することができるが、最適条件を確立することが重要である。特に、温度は±０．５℃より良好に、密接に制御することが必要である。特に、オリゴヌクレオチドの選択された長さが小さい場合に、ハイブリッド形成速度および／またはハイブリッド形成度の僅かな差を分析が識別しうることが必要である。装置は種々なオリゴヌクレオチドの間の塩基組成の差に対してプログラムされることが必要である。アレイの構成では、これを同じ塩基組成を有するサブマトリックス（ｓｕｂ−ｍａｔｒｉｃｅｓ）に分割することが好ましい。これは塩基組成によって僅かに異なるＴｍを明確にすることを容易にする。
　特に３２Ｐによるオートラジオグラフィーは画像分解（ｉｍａｇｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を生じ、分析を決定する限定要素になる；ハロゲン駆動銀フィルムの限界は約２５ミクロンである。直接検出系が明らかに好ましいと考えられる。蛍光プローブも考られ、標的オリゴヌクレオチドが高濃度であるならば、蛍光の低感度も問題にならない。
　我々はデジタルスキャナーによる走査ラジオグラブィー画像もかなり経験している。我々の現在の設計は２５ミクロンまでの分析を可能にするが、ハイブリッド形成反応の質と、１つ以上の塩基配列の存在から１つの配列の不存在をどのように良好に識別するかとに依存して、分析範囲は現在の適用よりも低い範囲にまで容易に伸長される。ぼう大なプレートを測定する装置が約１μの精度を有する。走査速度は数分間内に数百万セルのマトリックスが走査されるような速度である。データ分析のソフトウェアは直接的であるが、大きなデータセットは迅速なコンピュータを必要とする。
　下記の実験は請求項の実行可能性を実証する。市販の顕微鏡スライド〔ＢＤＨスーパープレミウム（ＢＤＨ　Ｓｕｐｅｒ　Ｐｒｅｍｉｕｍ）７６×２６×１ｍｍ〕を支持体として用いた。これらは芳香族ヘテロ環塩基の脱保護に用いられる条件、すなわち３０％ＮＨ３、５５℃、１０時間に耐えることのできる長い脂肪族リンカーによって誘導体化した（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）。次のオリゴヌクレオチドの出発点として役立つヒドロキシル基を有するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を２段階で合成する。スライドを最初に、触媒としてヒューニッヒの塩基（Ｈｕｎｉｇ’ｓ　ｂａｓｅ）数滴を含むキシレン中の３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランの２５％溶液で最初に処理する。反応は乾燥管を備えたステイニングジャー（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｊａｒ）中で、９０℃において２０時間実施する。スライドをＭｅＯＨ，Ｅｔ２Ｏで洗浄し、風乾させる。ストレート（ｎｅａｔ）のヘキサエチレングリコールと痕跡量の濃硫酸を加え、混合物を８０℃に２０時間維持する。スライドをＭｅＯＨ，Ｅｔ２Ｏで洗浄し、風乾させ、使用するまで−２０℃において乾燥維持する。この調製法は英国特許第８８２２２２８，６号（１９８８年９月２１日出願）に述べられている。オリゴヌクレオチド合成サイクルは次のように実施する：
　カップリング溶液を各工程に対して、無水アセトニトリル中０．５Ｍテトラゾール６量（ｖｏｌ．）と必要なベーターシアノエチルホスホーラミジトの０．２Ｍ溶液５量とを混合することによって新たに製造する。カップリング時間は３分間である。ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ中Ｉ２の０．１Ｍ溶液による酸化は安定なホスホトリエステル結合を生ずる。ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸による５’末端の脱トリチル化はオリゴヌクレオチド鎖のさらに伸長を可能にする。スライド上の反応性部位に対して用いたホスホーラミジトの過剰量はカップリングを完成させるために充分に大きいので、キャッピング段階は存在しなかった。合成が完成した後に、オリゴヌクレオチドを３０％ＮＨ３中、５５℃において１０時間脱保護する。カップリング段階に用いた化学薬品は感湿性であるので、この重要な段階は次のように密閉容器内の無水条件下で実施しなければならない。合成すべきパッチの形を、上述のように誘導体化した顕微鏡スライドと、同じサイズおよび厚さのテフロン片との間にサンドイッチしたシリコーンゴムシート（７６×２６×０．５ｍｍ）から切断した。これに、カップリング溶液の注射器による注入、抽出およびアルゴンによる空隙のフラッシュを可能にするプラスチック・チューブの小片を取付けた。全組立て体をホールドバックペーパークリップ（ｆｏｌｄ−ｂａｃｋ　ｐａｐｅｒ　ｃｌｉｐ）によって一緒に維持した。カップリング後に、セットアップを分解し、スライドをスティニングジャー中に浸せきすることによって、次の化学反応（ヨウ素による酸化：ＴＣＡ処理による脱トリチル化）に通した。
例１
　第１例として、カップリング溶液レベルを工程１０〜１４に徐々減ずることによって、スライド上にオリゴーｄＴ１０−オリゴーｄＴ１４の配列を合成した。このようにして、スライドの上部に１０ｍｅｒを合成し、底部に１４ｍｅｒを合成し、この間に１１、１２、１３ｍｅｒを合成した。ハイブリッド形成プローブとしてポリヌクレオチドキナーゼ反応によって、１５０万ｃ．ｐ．ｍ．の総活性まで３２Ｐによって５’末端において標識した１０ｐｍｏｌオリゴーｄＡ１２を用いた。ハイブリッド形成は顕微鏡スライドに適合するように製造し、ＴＥ中１ＭＮａＣｌ１．２ｍｌ、０．１％ＳＤＳを充てんしたパースペックス（プレキシ−ガラス）容器内で２０℃において５分間実施した。オリゴヌクレオチドを含まない同じ溶液中で短時間すすいだ後に、放射線モニター（ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒ）によって２０００ＣＰＳ以上を検出することができた。オートラジオグラフは全てのカウントがオリゴヌクレオチド合成部分から生じたこと、すなわちガラスまたはリンカーのみによって誘導体化した領域への非特異的結合が存在しないことを示した。０．１Ｍ　ＮａＣｌ中に一部溶解した後に、標的への示差結合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｂｉｎｄ）が検出可能である、すなわち長いオリゴーｄＴへよりも短いオリゴーｄＴへの結合が少ない。スランドを洗浄溶液中で徐々に加熱することによって、Ｔｍ（５０％溶離した場合の転移の中点値）３３°であることが測定された。３９℃でのインキュベーション後に検出可能なカウントは存在しなかった。ハイブリッド形成とは溶触はシグナルを弱めることなく８回くり返した。結果は再現可能である。入力カウントの少なくとも５％が各サイクルにおいてスライドに取り込まれたことが考えられる。
例２
　適合または不適合オリゴヌクレオチドを区別できるかどうかを知るために、２配列３’ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＧＧＡ（ＣｏｓＬ）と３’ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＴＣＴ　ＧＧＡを合成した、これらは７位置の１塩基によって異なる。第７塩基以外の全ての塩基を長方形パッチに加えた。第７塩基では、長方形の半分を代わりに露出し、２ストリップにおいて２種類の塩基を加えた。ｃｏｓＲプローブオリゴヌクレオチド（５’ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＴ）（３２Ｐにより１１０万ｃ．ｐ．ｍ．まで標識したキナーゼ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ，ＴＥ，０．１％ＳＤＳ）のハイブリッド形成を３０℃において５時間実施した。スライドの前面はすすぎ洗い後に１００ｃ．ｐ．ｓ．を示した。オートラジオグラフィーは完全に相補的オリゴヌクレオチドを含むスライド部分にのみアニーリングが生ずることを示した。不適合配列を含むパッチではシグナルが検出されなかった。
例３
　ハイブリッド形成挙動に対する不適合または短い塩基配列の影響をさらに調べるために、１つ（ａ）は２４オリゴヌクレオチドのアレイ、他方（ｂ）は７２オリゴヌクレオチドのアレイの２アレイを構成した。
　これらのアレイを第１表（ａ）と（ｂ）に示すようにセットした。これらのアレイのレイダウンに用いたマスク（ｍａｓｋ）は以前の実験に用いたものとは異なるものであった。シリコーンゴムチューブ（外径１ｍｍ）の長さをプレートな顕微鏡スライドの表面にＵ字形にシリコーンゴムセメントで付着させた。これらのマスクを誘導体化顕微鏡スライドに対してクランプし、生じた空隙中にカップリング溶液を注射器によって注入した。このようにして、空隙内のスライド部分のみがホスホーラミジト溶液と接触した。不適合塩基の位置を例外として、第１表に挙げたアレイはスライド幅の大部分をカバーするマスクを用いてレイダウンさせた。次のカップリング反応において誘導体化スライドを３ｍｍ上下させることによってこのマスクをオフセット（ｏｆｆ−ｓｅｔ）させると、３’未満と５’未満において切り取られたオリゴヌクレオチドが生成した。
　不適合を導入するために、第１マスクの幅１／２（アレイ（ａ）のために）または１／３（アレイ（ｂ）のために）をカバーしたマスクを用いた。６位置と７位置の塩基は２本または３本の細長いストリップによってレイダウンした。これはスライドの各１／２（アレイ（ａ））または各１／３（アレイ（ｂ））に１塩基のみ異なるオリゴヌクレオチドの合成を生じた。他の位置では、配列は最も長い配列から末端配列のないことによって異なった。
　アレイ（ｂ）では、第１表（ｂ）に示した配列の間に配列の２縦列が存在し、この場合にはスライドがシリコーンゴムシールによってストリップ状に遮へいされたので、全ての位置において第６塩基と第７塩基とが欠損した。従って、９０の異なる位置においてスライド上に表された７２種類の塩基配列が存在した。
１９ｍｅｒ　５’ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　Ｃを用いてハイブリッド形成した（２００万ｃｐｍ，ＴＥ中０．１Ｍ　ＮａＣｌ１．２ｍｌ、０．１％ＳＤＳ，２０°）。
　洗浄と溶離後にオートラジオグラフィーを行った。スライドは各溶離工程において５分間洗浄液中に保持し、それから暴露させた（４５分間、強化）。溶離温度はそれぞれ２３、３６、４２、４７、５５および６０℃であった。
　表に示したように、オリゴヌクレオチドは異なる融解挙動を示した。短いオリゴヌクレオチドは長いオリゴヌクレオチドよりも前に融解し、５５℃では、完全適合１９ｍｅｒのみが安定であり、他のすべてのオリゴヌクレオチドは溶離した。従って、この方法は末端の１塩基欠損のみによって異なる１８ｍｅｒと１９ｍｅｒとを識別することができる。オリゴヌクレオチド末端と内部部位における不適合はすべて、完全な二重鎖が残留する条件下で融解した。
　従って、不適合配列または長さにおいて１塩基程度異なるオリゴヌクレオチドを排除する非常に激しいハイブリッド形成条件を用いることができる。固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を用いた方法で不適合の効果にこれほど敏感である方法は他に存在しない。
例４
　遺伝疾患の診断への本発明の適用をテストするために、野生型とβ−グロビン遺伝子の鎌状赤血球突然変異とに対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を有するアレイ（ａ）と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてβ−グロビン遺伝子から増幅した１１０塩基対フラグメントとをハイブリッド形成した。正常個体の血液からの全ＤＮＡ（１μｇ）を適当なプライマーオリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲによって増幅した。生成した１１０塩基対フラグメントをアガロースゲルを通しての電気泳動によって精製した。溶離後に、小サンプル（約１０ピコグラムｐｇ）を第２ＰＣＲ反応においてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（５０マイクロキュリー）を用いて標識した。このＰＣＲは上流で開始するオリゴヌクレオチドのみを含有した。延長時間９分間による６０サイクルの増幅後にゲル濾過によって先駆物質から生成物を除去した。放射性生成物のゲル電気泳動は１１０塩基フラグメントに長さが相当する主要バンドを示した。この生成物（１００，０００ｃ．ｐ．ｍ．０．９Ｍ　ＮａＣｌ中、ＴＥ，０．１％ＳＤＳ）の１／４をアレイ（ａ）にハイブリッド形成した。３０°での２時間後に、１５０００ｃ．ｐ．ｍ．が吸収された。ハイブリッドの融解挙動は例３の１９ｍｅｒに述べた融解挙動に従い、この融解挙動はオリゴヌクレオチドの融解挙動と同じであることが判明した。すなわち、不適合がハイブリッドの融点をかなり低下させ、完全適合二重鎖が残留するが不適合二重鎖は完全に融解するような条件が容易に発見された。
　従って、本発明を用いてＤＮＡの長いフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを分析することができる、この例は突然変異の核酸配列を調べるために本発明を如何に利用するかを示す。特に、遺伝疾患の診断にどのように利用するかを示す。
例５
　先駆物質をレイダウンさせるための自動化系をテストするために、上記のやり方で加えた１２塩基の中の１１塩基を用いてｃｏｓＬオリゴヌクレオチドを合成した。しかし、第７塩基を加えるために、スライドをペンプロッター含有アルゴン充てん室に移した。プロッターのペンを、ペンと同じ形状およびサイズを有するが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブをも有し、これを通して化学薬品がプロッターの床に配置されたガラススライドの表面に放出される「ナイロン製」の要素と取り替えた。マイクロコンピューターを用いてプロッターと、化学薬品を放出する注射器ポンプとを制御した。注射器からの放出チューブを有するペンはスライド上の位置に移動し、ペンが降下し、ポンプが始動してカップリング溶液をレイダウンさせる。ペンに連続的にＧ、ＴおよびＡホスホーラミジト溶液を充てんし、１２スポットのアレイを３種類のオリゴヌクレオチド配列を有する、４個ずつの３グループとしてレイダウンさせた。例２に述べたようにｃｏｓＬにハイブリッド形成し、オートラジオグラフィーした後に、シグナルはｄＧを加えた完全適合オリゴヌクレオチドの４スポット上でのみ見られた。
　結論として、次のことを実証した。
　１．平たいガラスプレート上で良好な収量においてオリゴヌクレオチドを合成することができる。
　２．サンプル上の小スポットにおいて高密度で、多重配列を簡単な手動方法またはコンピューター制御装置を用いて自動的に合成することができる。
　３．プレート上でのオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成を非常に簡単な方法で実施することができる。ハイブリッド形成は効果的であり、ハイブリッドは短時間のオートラジオグラフィー暴露によって検出することができる。
　４．ハイブリッド形成は特異的である。オリゴヌクレオチドが存在しないプレート部分ではシグナルが検出されない。不適合塩基の効果を調べ、１２ｍｅｒ〜１９ｍｅｒの長さの範囲内のオリゴヌクレオチドのいずれかの位置での単独不適合塩基がハイブリッドの安定性を充分に低下させ、シグナルは非常に低いレベルに低下するが、完全適合ハイブリッドへの有意なハイブリッド形成は保有される。
　５．オリゴヌクレオチドはガラスに安定に結合し、プレートはハイブリッド形成に反復して用いることができる。
　本発明はこのように、ヌクレオチド配列の新規な分析方法を提供し、広範囲な用途を見出すと思われる。可能な用途の幾つかを下記に挙げる：
フィンガー　プリントまたはマッピングツールとしてのオリゴヌクレオチドの小アレイ
　遺伝疾患を含めた既知突然変異の分析。
　上記例４は本発明を如何に用いて突然変異を分析するかを示す。遺伝病の検出を含めてこのような方法には多くの用途がある。
ゲノム　フィンガープリンティング
　検出可能な疾患を生ずる突然変異と同様に、この方法を用いてＤＮＡのいずれかの区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）における点変異を検出することができる。制限フラグメント長さ多型性（ＲＦＬＰ）を生ずる塩基差を含む多くの領域に関する塩基配列が現在入手可能である。このような多型性を示すオリゴヌクレオチドのアレイは２つの対立制限部位を表すオリゴヌクレオチド対から製造することができる。ＲＦＬＰを含む配列の増幅および次のプレートへのハイブリッド形成は、試験ゲノム中にどのような対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）が存在するかを示すことができる。単独分析で分析することのできるオリゴヌクレオチド数は非常に大きい。選択した対立遺伝子から製造した５０対は個体に特有のフィンガープリントを与えるために充分である。
結合分析
　最後のパラグラフに述べた方法を系図（ｐｅｄｉｇｒｅｅ）に適用すると、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が指摘される。アレイ中の各スポット対はゲル電気泳動とプロッティングを用いたＲＦＬＰ分析のトラックに認められるような情報を与え、これは現在ルーチンに結合研究に用いられている。オリゴヌクレオチドの対立遺伝子対のアレイへのハイブリッド形成によって、単独分析において多くの対立遺伝子対を分析することが可能になり、これはＤＮＡ多型性と例えば疾患遺伝子のような表現型マーカーとの間の結合の検出に用いられる方法を非常に簡単化する。
　上記例は我々が開発し、実験によって実証した方法を用いて実施することができる。
配列読み取りツールとしてのオリゴヌクレオチドの大きなアレイ
　オリゴヌクレオチドが小パッチ内の正確に定めた位置に２方法の１つによって、すなわちペンプロッターのペンから先駆物質を放出することによってまたはシリコーンゴムで部分を遮へいすることによって合成できることを示した。各位置に異なる配列を有する大きなアレイの合成にペンプロッターを用いる方法は明白である。幾つかの用途に対して、アレイは予め定められ、限定されたセットでありうるが、他の用途に対しては、アレイは定められた長さの各配列から構成される。後者に対して遮へい方法は交差ラインを形成するマスク中に先駆物質をレイダウンすることによって用いられる。これを実施する多くの方法があるが、１例のみを説明のために用いる：
　１．最初の４塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔを方形プレート上の４本の幅広ストリップ中に配置する。
　２．第２セットを第１ストリップと等しい幅であり、第１ストリップと直交する４本のストリップ中にレイダウンする。アレイをすべてで１６個のジヌクレオチドから構成する。
　３．第３層と第４層を第１ストリップの幅の１／４である４ストリップの４セット中にレイダウンする。４本の狭いストリップの各セットは幅広ストリップの１本の内を通る。この場合にアレイはすべてで２５６個のテトラヌクレオチドから構成される。
　４．各回に先行２層の幅の１／４であるストリップによって２層をレイダウンすることによって、プロセスをくり返す。加えた各層はオリゴヌクレオチドの長さを１塩基だけ伸長し、異なるオリゴヌクレオチド配列の数を４の倍数ずつ増やす。
　このようなアレイのサイズはストリップの幅によって定まる。配置した最も狭いストリップは１ｍｍであるが、これが下限でないことは明らかである。
　塩基配列の一部が予め定められたものであり、一部があらゆる可能な配列から構成されたものであるアレイには有用な用途が存在する。例えば、ｍＲＮＡ集団の特性化
　高級真核生物中の大ていのｍＲＮＡは３’末端近くに配列ＡＡＵＡＡＡを有している。ｍＲＮＡ分析に用いられるアレイはプレート全体でこの配列を有すると考えられる。ｍＲＮＡ集団を分析するには、これをＮｍＡＡＴＡＡＡＮｎ型のすべての配列から成るアレイとハイブリッド形成させる。例えば哺乳動物細胞のような入手源に存在すると考えられる数千のｍＲＮＡの大部分に対する非反復オリゴヌクレオチド表現を与えるために充分であるｍ＋ｎ＝８に対して、アレイは２５６要素平方である。上記遮へい方法を用いて２５６×２５６要素をＡＡＴＡＡＡ上に配置する。約１ｍｍのストリップでは、アレイは約２５６ｍｍ平方であると考えられる。
　この分析はｍＲＮＡ集団の複合度を測定し、異なる細胞型からの集団の比較の根拠として用いられる。このアプローチの利点はハイブリッド形成パターンの差が集団において異なるすべてのｍＲＮＡを単離させるために用いられるオリゴヌクレオチドの配列を形成することである。
塩基配列決定
　特定長さのあらゆる可能なオリゴヌクレオチドから成るアレイを用いて、この概念を未知塩基配列の決定にまで拡大することは、我々が現在までに合成したよりも大きなアレイを必要とする。しかし、スポットのサイズをスケールダウンさせ、数を我々が開発した小アレイでテストしてきた方法の拡大によって必要とされる数にスケールアップすることが可能である。我々の経験によると、この方法はゲルに基づく方法よりも操作が非常に簡単である。
　上記アレイ（ｂ）の３縦列の間に２縦列が存在し、左方からの塩基６と７は各ラインにおいて欠損した。これらの配列はすべて２０°または３０°で融解した。（ａ，ｔ）不適合塩基（．）欠損塩基。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．特定の長さの
少なくとも７２
滑らかな不透過性表面を有する
　ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを標識し、
　ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをハイブリダイゼーション条件下でアレイに供給し、そして
　オリゴヌクレオチドのセットの特定の構成員に対応する上記表面上の標識の位置を観察すること
からなる上記方法。
　２．アレイが、複数のポリヌクレオチド配列の相補体を含む特定の長さの複数のオリゴヌクレオチドである、ポリヌクレオチド配列間の差異を研究するために適用される、請求項１記載の方法。
　３．アレイが特定の長さの一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対を含む、請求項２記載の方法。
　４．アレイが、研究される点変異の正常バージョンと変異バージョンを表す一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対を含む、請求項３記載の方法。
　５．ポリヌクレオチドがランダムに分解されて特定の長さのオリゴマーの混合物を形成し、該混合物はその後標識されてアレイに供給される標識物質を形成する、請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
　６．オリゴマーが３２Ｐまたは蛍光標識で標識される、請求項５記載の方法。
　７．オリゴヌクレオチドの特定の長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
　８．各オリゴヌクレオチドが末端のヌクレオチドを通して共有結合により支持体に結合している、請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
　９．各区域のオリゴヌクレオチドが規定された配列を有する、請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
　１０．
滑らかな不透過性表面を有する
少なくとも７２
　１１．アレイが、ポリヌクレオチド配列の相補体を含む特定の長さの複数のオリゴヌクレオチドである、ポリヌクレオチド配列間の差異を研究するための請求項１０記載の装置。
　１２．アレイが特定の長さの一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対を含む、請求項１１記載の装置。
　１３．アレイが、研究される点変異の正常バージョンと変異バージョンを表す一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対を含む、請求項１２記載の装置。
　１４．ポリヌクレオチドの配列を決定するための装置であって、規定された配列を有する異なる
少なくとも７２
滑らかな不透過性表面を有する
　１５．少なくとも２つの規定された区域のアレイに分離された
滑らかな不透過性表面を有する
少なくとも７２の
　１６．その表面に微孔質ガラスのパッチを結合した不透過性ガラス支持体を有するポリヌクレオチド分析装置であって、ガラスパッチは少なくとも２つの規定された区域のアレイを形成し、各区域は公知配列のオリゴヌクレオチドを共有結合して有し、そして第１の区域のオリゴヌクレオチドの配列は他方の区域のオリゴヌクレオチドの配列とは異なる、請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法に使用するためのポリヌクレオチド分析装置。
　１７．不透過性支持体がガラスである、請求項１０ないし１５のいずれか１項記載の装置。
　１８．アレイの区域が溶媒抵抗性グリッドにより分離される、請求項１０ないし１７のいずれか１項記載の装置。
　１９．オリゴヌクレオチドの長さが８から２０ヌクレオチドである、請求項１０ないし１８のいずれか１項記載の装置。
　２０．オリゴヌクレオチドが末端のヌクレオチドを通して共有結合により支持体に結合している、請求項１０ないし１９のいずれか１項記載の装置。