【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年8月5日(2010.8.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
組換えタンパク質、特に生物医学的製品（例えば、血液因子）の調製はますます重要となっている。組換え細胞の最適な増殖を可能にするために、通常、血清が培地に加えられる。血清の高い費用のために、および培養培地中の血清を介するウイルス病原体または分子病原体によって生じ得るコンタミネーションを防ぐために、多くの無血清培地が開発されてきたが、これらは、特に、ウシまたはヒト起源の添加物をなんら含んではならない。調製プロセスにおけるこのような培地の使用は、ウイルス病原体および分子病原体による調製産物のコンタミネーションの低い危険性を可能にするのみでなく、発現タンパク質のより簡単な精製をも可能にする。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
日本国特許第２６９６００１号は、宿主細胞の生産性を向上するための非イオン性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加による、ＣＨＯ細胞における第ＶＩＩＩ因子の調製のための無タンパク質培地の使用について記載する。これらの添加物の有効性を増すために、例えば、ブチレートおよびリチウムを添加することが、推奨されてきた。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
ＷＯ９６／２６２６６は、グルタミン含有タンパク質加水分解産物を含む培地での細胞の培養について記載し、その加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、全タンパク質重量の１５％未満であり、そしてその加水分解産物のペプチドは、４４ｋｄ未満の分子量を有する。合成最小培地は、細胞培養のための培養培地における基本培地として使用され、その基本培地には、タンパク質加水分解産物以外に、ウシ胎仔血清、ゲンタマイシンおよびメルカプトエタノールを含む他の添加物もまた、加えられる。血液因子の組換え調製に対するこの血清含有培地の使用は、述べられていない。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
このことは、培養条件の変化の結果としての、組換えクローンの不安定性または増殖の減少によって説明される。変化した醗酵条件のために−そして安定なオリジナルクローンの使用にもかかわらず−細胞の大部分が、減少した発現を有する細胞に、または非産生細胞に常に変化し、この細胞は、産生プロセスの間、産物産生細胞を過剰増殖し、その結果、最後には、大部分が非産生細胞または低発現の細胞からなる醗酵培養物が得られる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
この状況の結果は、醗酵培養物の最大の産生能力は連続的に減少し、そして最大の産物産生は、一定数の世代または細胞継代に限定されるということである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
本発明に従って、この課題は、細胞培養から得られ得る組換え細胞クローンを利用可能とすることによって解決され、ここで、細胞クローンは、血清含有培地においてオリジナル組換え細胞クローンを培養し、そして無血清無タンパク質培地にこの細胞を再び適用した後に得られる。本明細書中で、細胞はさらに、産生条件と同じ条件下で、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間培養される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
本発明の文脈において、用語、オリジナル細胞クローン（Ｕｒｓｐｒｕｎｇｓｚｅｌｌｋｌｏｎ）は、組換え細胞クローントランスフェクト体を意味し、これは、組換えヌクレオチド配列による宿主細胞の形質導入後に、研究室条件下で安定な様式で組換え産物を発現する。オリジナルクローンは、血清含有培地で増殖最適化のために培養される。生産性を上げるために、オリジナルクローンは、必要に応じて、選択試薬の存在下で、かつ選択マーカーおよび／または増殖マーカーに対する選択を伴って培養される。工業的産生のために、オリジナル細胞クローンは、高い細胞密度が達成されるまで、血清含有培養条件下で培養され、そして、このオリジナル細胞クローンは、産生期直前に、無血清および／または無タンパク質培地に適用される。本明細書中で、培養は、好ましくは、選択圧なしで実行される。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
これらの条件下では、無血清無タンパク質培地に再び適用されたこのような細胞培養物における、大部分（９５％を超える）の細胞が、産物非産生細胞に変化することがわかった。産物特異的抗体による免疫蛍光の方法によって、無血清無タンパク質培地における細胞の世代時間の関数として、培養での非産生細胞の数は増加し、産物産生細胞を過剰増殖させ、その結果、培養物の生産性が減るということが示され得る。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
無血清無タンパク質培地への再適用の後に得られる細胞培養物は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な産物を産生する細胞集団の細胞クローンについて、必要に応じて選択圧の存在しない状態で、試験される。これは、例えば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対してなされる、特異的に標識された抗原を用いる免疫蛍光によって、達成され得る。産物産生細胞として同定された細胞は、細胞培養物から単離され、そして、血清およびタンパク質を含まない条件（これは、好ましくは、産生条件と等しい）下で再び増殖される。細胞の単離は、本明細書中で、細胞の単離および産物産生細胞についての試験によってなされ得る。必要に応じて、安定な細胞を含む細胞培養物は、安定な組換えクローンについて再び試験され、次いで、このクローンは、細胞培養物から単離されクローンニングされる。次いで、血清およびタンパク質を含まない条件下で得られた安定な組換え細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下でさらに増殖される。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
本発明に従う安定な組換え細胞クローンは、好ましくは、組換え哺乳動物細胞に由来する。本明細書中では、組換え哺乳動物細胞は、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む任意の細胞であり得る。この規定は、全ての連続的増殖細胞（接着性のものも非接着性のものも両方とも）を含有する。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞を使用することが、特に好ましい。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖因子および他の生物医学的関連産物であり得る。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
マスター細胞バンクを発展させるために、３０世代が必要とされる。１０００Ｌ規模で平均バッチ培養を実行するためには、少なくとも４０世代が要求される。従って、最初、個々のクローンから、約８〜１０世代を用いて、「マスター細胞バンク（ＭＣＢ）」、「ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）」を調製し、次いで、これらの条件下で２０〜２５世代までを用いて、産生規模（産生バイオマス）で細胞培養物を調製することが可能である。なぜなら、今日まで利用可能な細胞クローンは、血清または無タンパク質培地での数世代の増殖後不安定になり、ａ）産物産生細胞による均一な細胞培養、およびｂ）長期間にわたる安定な産物生産性、を得るには無力となるからである。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
予期しなかったが、本発明による細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下で、血清含有培地で培養されたオリジナル細胞クローンと比較してさえも、増加した生産性を示すことが示された。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
別の局面によると、本発明は、血清およびタンパク質を含まない条件下で、少なくとも９０％の、好ましくは９５％より多くの、そして特により有利には９８％より多くの、安定な組換え細胞を含む細胞培養物を利用可能とし、この安定な組換え細胞は、少なくとも４０世代の間、特に少なくとも５０世代の間、安定であり、かつ組換え産物を発現する。本発明の文脈において、細胞培養物は、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）、ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ−Ａｒｂｅｒｉｔｓｚｅｌｌ−ｂａｎｋ）または工業的産生バイオリアクターにおける産生バイオマスを意味する。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
本発明に従う細胞培養物は、本明細書中で、個々のクローン（すなわちシード細胞）からＭＣＢ、ＷＣＢまたはバイオマスまでの、血清およびタンパク質を含まない条件下でのバイオリアクターにおける産生規模で、好ましくは選択および／またはマーカー遺伝子に対する選択圧なしでの、単離された安定な細胞クローンの増殖によって、得られ得る。特に、本発明に従って安定な組換えクローンから得られた細胞培養物中の組換え細胞は、血清およびタンパク質を含まない条件下で、少なくとも４０世代の間安定であることが示された。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
ほとんどタンパク質を含まない培養および産生条件下で、本発明に従って利用可能となった細胞培養物（これは、血清およびタンパク質非依存性安定細胞クローンから調製される）は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に有利には少なくとも９８％の安定な組換え細胞を含む。本明細書中で、用語「安定な組換え細胞」は、詳細には、安定な細胞クローンに由来する組換え哺乳動物細胞を意味する。本明細書中で、組換えＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＢＨＫ細胞を使用することが好まれ、これらの細胞は、血液因子、好ましくは、組換えｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子およびｖＷＦ、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
本発明に従う細胞培養物は、懸濁培養物として、安定な組換え細胞を含み得る。この細胞はまた、支持体、特に微細支持体に固定され得、ここでは、多孔性の微細支持体が特に好ましい。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）またはＣｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）のような多孔性支持体は、特に適切であることがわかった。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
別の局面によると、本発明は、本発明に従って利用可能となった安定な細胞クローンを使用して、血清およびタンパク質を含まない条件下で、組換え産物を工業的に生産するための方法を示す。本明細書中の方法は、細胞培養物の調製のための、上記の型の単離された安定な組換え細胞クローンの調製工程を含む。本明細書中で、単離された安定な細胞クローンの増殖は、安定な個々の細胞クローンから細胞培養物まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で起こる。特に、安定な細胞クローンの継代培養はまた、タンパク質を含まない条件下で、特にプロテアーゼ（例えば、トリプシンなど）の添加なしに、起こる。結果として、組換え産物の産生において利用される細胞培養物の調製中のいかなるときでも、ヒトまたは動物起源の血清およびタンパク質を含む添加物の細胞培養物への添加によって、ある環境下で起こり得るコンタミネーションが起きない、ということが保証される。従って、開始クローンから始まり、そしてワーキング細胞バンクの調製、バイオマスの産生、そして引き続い起こる、血清およびタンパク質を含まない条件下での組換えタンパク質の産生を介する調製を可能とする方法が、初めて記載される。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
本発明に従う細胞培養物（これは、９０％を超える、好ましくは９５％を超える、そして特に有利には９８％を超える、安定な産物産生細胞を含む）を用いる組換え産物の調製は、懸濁培養物としてまたは細胞を支持体に固定させて実行され得る。本明細書中で、このプロセスは、バッチ形式もしくは連続形式で、または無血清無タンパク質培地による灌流技術によって、実行され得る。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
次いで、発現する組換えタンパク質は、細胞培養物上清から得られ、次いで、公知の技術水準の方法で精製され、そしてさらに処理される。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
さらなる局面では、本発明は、以下の工程を包含する安定な組換え細胞クローンを得るための方法を利用可能にする；
−オリジナル組換えクローンを、血清含有培地で、好ましくは選択圧なく、細胞培養物まで増殖させる工程、
−好ましくは産生条件と等しい条件である血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞を培養する工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞培養物を、産物産生細胞について試験する工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で、安定な組換え細胞クローンをクローニングする工程で、ここでは、このクローニングは、通常公知な技術（例えば、希釈による細胞の単離および個々のクローンを増殖）によって行われ得る、工程、
−血清およびタンパク質を含まない条件下で単離された細胞クローンを増殖させる工程、および
−必要に応じて、細胞培養物を、産物再生細胞について試験する工程。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
（実施例２：安定な組換えＣＨＯクローンのクローニング）  実施例１による、ｒｖＷＦ  ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物（これは、無血清無タンパク質培地で６０世代の間培養された（図１Ｃ））から、希釈液を調製し、そして、各場合に、０．１細胞／ウェルをマイクロタイタープレートに播種した。この細胞を、血清もタンパク質添加物も含まないＤＭＥＭ／ＨＡＭ１２培地で、かつ選択圧もなく、約３週間培養し、そして標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、この細胞を試験した。ポジティブと同定された細胞クローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。このシードセルバンクから、無血清無タンパク質培地で、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を調製し、そして個々のアンプルを冷凍し、そしてワーキング細胞バンクの後の調製のために貯蔵した。個々のアンプルから開始して、ワーキング細胞バンクを、無血清無タンパク質培地で調製した。この細胞を、多孔性超微細支持体上に固定し、そして数世代の間、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養し続けた。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、異なる時期に、無血清無タンパク質培地で、生産性について、この細胞を試験した。ワーキング細胞バンクの段階で、および無血清無タンパク質培地において１０世代後ならびに６０世代後に、細胞の安定性の評価を行った。ワーキング細胞バンクの段階（図２Ａ）、および１０世代後（図２Ｂ）ならびに６０世代後（図２Ｃ）に、約１００％の細胞がｒｖＷＦを発現するポジティブな安定組換えクローンであると同定された。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
（実施例３：組換え細胞クローンの細胞特異的生産性）  組換え細胞を培養する間の規定された段階から、規定された細胞数を取り出し、そして２４時間の間新鮮な培地によって培養した。ｒｖＷＦ：Ｒｉｓｔｏ−ＣｏＦ［リストセチン補助因子］活性を、細胞培養上清において決定した。表１は、本発明による安定な組換え細胞クローンにおける細胞特異的生産性は、無血清無タンパク質培地において、６０世代後でさえも、安定であったこと、そしてこの生産性は、血清含有培地で培養されたオリジナルクローンと比較して、向上したことを示す。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
【表１】
2003506077.tif 000001
（実施例４：タンパク質および血清を含まない最小培地でのｒＦＶＩＩＩ  ＣＨＯ細胞の培養）  ｒＦＶＩＩＩ  ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌タンク内で培養し、そして灌流させた。ここでは、無血清無タンパク質培地を使用した。本明細書中で、この細胞を、多孔性超超微細支持体（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定し、そして少なくとも６週間培養した。灌流速度は、４容積変化／日で、ｐＨは６．９〜７．２で、Ｏ２濃度は約２０〜５０％で、そして温度は３７℃であった。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】図面の簡単な説明
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、血清含有培地から無血清無タンパク質培地へ再び適用した時点（Ａ）、無血清無タンパク質培地において１０世代後（Ｂ）、および無血清無タンパク質培地において６０世代後（Ｃ）、のオリジナルクローンのワーキング細胞バンクの顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な組換え細胞クローンから始めた細胞培養の、ワーキング細胞バンク段階（Ａ）、１０世代後（Ｂ）、および６０世代後（Ｃ）の顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、１０Ｌの灌流バイオリアクター中でｒＦＶＩＩＩ  ＣＨＯ細胞クローンを培養した結果を示す。  ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１〜５／日）。  ｂ）灌流リアクター内の容積測定による生産性（単位第ＶＩＩＩ因子／ｌ／日）。