【事件の表示】
　特願２０１５−５４５８３８「ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム修飾および制御」拒絶査定不服審判事件〔平成２６年　６月１２日国際公開、ＷＯ２０１４／０８９２９０、平成２８年　２月　１日国内公表、特表２０１６−５０２８４０、請求項の数（２１）〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　原査定を取り消す。
　本願の発明は、特許すべきものとする。
【理　由】
第１　手続の経緯
　この出願は、平成２５年１２月５日（パリ条約による優先権主張　２０１２年１２月６日　米国、２０１３年１月３０日　米国、２０１３年２月５日　米国、２０１３年３月１５日　米国）を国際出願日とする特許出願（以下「本願」という。）であって、その手続の経緯は以下のとおりである。
　平成２９年　８月　９日付け：拒絶理由通知書
　平成３０年　１月２２日　　：意見書、手続補正書の提出
　平成３０年　５月２１日付け：拒絶査定
　平成３０年　９月２８日　　：審判請求書の提出
　平成３０年１１月１４日　　：審判請求書を対象とする手続補正書の提出
第２　原査定の概要
　平成３０年５月２１日付け拒絶査定の概要は次のとおりである。
　本願請求項１〜２１に係る発明は、以下の引用文献１及び２に記載された発明に基づいて、その発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者（以下「当業者」という。）が容易に発明することができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
引用文献等一覧
１：Science Express, 03 Jan 2013, p.1-7及び
　　Supplementary materials(doi: 10.1126/science.1231143)
２：Genome Research, Jul 2012, Vol.22, p.1327-1333
第３　本願発明
１　本願発明
（１）本願発明１及び１１について
　本願請求項１〜２１に係る発明（以下、それぞれ「本願発明１」〜「本願発明２１」という。）は、平成３０年１月２２日付けの手続補正で補正された特許請求の範囲の請求項１〜２１に記載された事項により特定される発明であって、そのうちの本願発明１及び１１は以下のとおりの発明である。
「【請求項１】
　２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを含む組成物であって、各々のＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムが、（ｉ）１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である、および（ｉｉ）二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡ、を含み、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムの標的部位が二本鎖配列の対向する鎖にあり、各々の標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置し、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが共に、二本鎖配列の対向する鎖を独立に切断することにより、二本鎖の切断を導入できるものである、組成物。」
「【請求項１１】
　真核細胞において二本鎖配列を修飾するための方法（人間を手術、治療または診断する方法を除く）であって、該方法は、
　ａ）真核細胞に、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムまたは該システムをコードする核酸、および任意にドナーポリヌクレオチド、ここで、各々のＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムが：
　（ｉ）１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である；および
　（ｉｉ）二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡ、ここで、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムの標的部位が二本鎖配列の対向する鎖にあり、各々の標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する；
を導入すること、および
ｂ）２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが共に、二本鎖配列の対向する鎖を独立に切断することにより、二本鎖の切断を導入し、ＤＮＡ修復過程による二本鎖の切断の修復が、二本鎖配列の修飾を導入するように、真核細胞を培養すること、
を含む方法。」
（２）本願発明２〜１０及び１２〜２１の概略
　本願発明２〜４は本願発明１を単に減縮した発明であり、本願発明５〜８は本願発明１の組成物をコードする複数の核酸に係るものであり、本願発明９及び１０は本願発明５〜８の複数の核酸を含むベクターに係るものである。また、本願発明１２〜２１は本願発明１１を単に減縮した発明である。
２　本願発明１〜２１の進歩性に関する審査の基準日について
　前記１（１）に示したとおり、本願発明１及び１１は、何れも「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステム」を「２つ」用いることを発明特定事項とするものである。
　そして、前記第１のとおり、本願は、米国における２０１２年１２月６日（以下「第１優先日」という。）、２０１３年１月３０日（以下「第２優先日」という。）、２０１３年２月５日（以下「第３優先日」という。）及び２０１３年３月１５日の出願に基づいて優先権主張をしている。
　ここで、第３優先日の優先権主張出願（６１／７６１，０４６）の出願書類には、「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステム」を「２つ」用いることについての記載があるものの、第１優先日及び第２優先日の優先権主張出願（６１／７３４，２５６及び６１／７５８，６２４）の出願書類には、当該事項についての記載がなく、かつ、第１優先日又は第２優先日当時の技術常識を考慮しても、当該事項が、明示がなくとも自明な事項であったとまではいえない。そうすると、「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステム」を「２つ」用いることについては、第３優先日の優先権主張出願の出願書類において初めて記載されたものといえるから、これを発明特定事項とする本願発明１及び１１の進歩性についての審査の基準日は第３優先日である。
　また、前記１（２）に示したとおり、本願発明２〜１０及び１２〜２１も、本願発明１及び１１と同様に「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステム」を「２つ」用いることを発明特定事項とするものであるから、本願発明２〜１０及び１２〜２１の進歩性についての審査の基準日も第３優先日である。
　なお、以下において特に断りなく「本願優先日」という場合は、第３優先日である２０１３年２月５日を意味することとする。
第４　引用文献の記載事項
１　引用文献１
　原査定で引用された、本願優先日より前に頒布された刊行物である引用文献１は、「ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を用いた多重ゲノム工学」と題する学術論文であって、以下の事項が記載されている。なお、英文であるから当審による訳文を記載する。
（１−１）「原因となる遺伝的変異及び要素の機能解明には、正確なゲノム編集技術が必要である。原核生物由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（…）適応免疫システムは、ＲＮＡが誘導する部位特異的ＤＮＡ切断を促進することが示されている。我々は、２つの異なるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を設計し、短いＲＮＡにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ヒト細胞及びマウス細胞の内在性ゲノム遺伝子座で、正確な切断が生じるよう誘導され得ることを実証した。また、Ｃａｓ９は、最小限の変異原性で相同配列依存的修復を促進する、ニッキング酵素に変換され得る。最後に、哺乳動物ゲノム内の複数の部位を同時編集することを可能とするために、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、このことは、ＣＲＩＳＰＲ技術が、容易にプログラム可能で広い用途を有することを示している。」（要旨）
（１−２）「化膿レンサ球菌ＳＦ３７０のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ並びに２つの非コードＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ；ｔｒａｃｒＲＮＡ及び前駆ｃｒＲＮＡアレイを含む４つの遺伝子からなっており、前駆ｃｒＲＮＡ体アレイには、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって隔てられたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）が含まれている（図Ｓ１）（…）。…必須のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）であるＮＧＧの前に位置する、ヒトＥＭＸ１遺伝子座の３０塩基対（ｂｐ）の部位（プロトスペーサー）を標的とする初期スペーサーを設計した（図１Ｃ及び図Ｓ１）（…）。」（１頁左欄２段落〜右欄１段落）
（１−３）「…野生型ＳｐＣａｓ９は部位特異的ＤＳＢを媒介することができ、これはＮＨＥＪ又は相同配列依存的修復（ＨＤＲ）のいずれかを介して修復され得る。我々は、ヌクレアーゼをＤＮＡニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ。図４Ａ）に変換するために、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣＩドメインにおいて、アスパラギン酸のアラニン置換（Ｄ１０Ａ）を実施した（…）。なぜなら、ニックの入ったゲノムＤＮＡは、シームレスに、又は忠実度の高いＨＤＲを介して、典型的に修復されるからである。…次に、プロトスペーサーの近くに一対の制限部位を導入するために、相同性修復テンプレートを使用して、同じＥＭＸ１遺伝子座におけるＣａｓ９を介したＨＤＲを試験した（図４Ｃ）。ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９ｎは、同様のレベルでＥＭＸ１遺伝子座への修復テンプレートの統合を触媒し（図４Ｄ）、これはサンガーシーケンシングによりさらに検証された（図４Ｅ）。これらの結果は、標的ゲノムにおける挿入を容易にすることに関して、ＣＲＩＳＰＲの有用性を示している。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（シード配列から１２ｂｐ及びＰＡＭから２ｂｐ）の標的特異性（図３Ｂ）を考えると、ニッカーゼの使用によりオフターゲット変異が減少する可能性がある。」（２頁左欄３段落）
（１−４）「最後に、スペーサーが配列されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然の構造（図Ｓ１）は、多重ゲノム工学の可能性を示唆している。ＥＭＸ１を標的とするスペーサー、及びＰＶＡＬＢを標的とするスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを用いて、我々は、両方の遺伝子座で効率的な切断を検出した（図４Ｆ）。さらに、１１９ｂｐ離れたＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを用いて、ＤＳＢを同時に生成することにより、より大きなゲノム領域における標的の削除を試験したところ、１．６％の削除効率（１８２アンプリコンのうち３つ、図４Ｇ）を観察したので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが単一ゲノム内で多重編集を仲介できることが実証された。」（２頁左欄４段落）
（１−５）「
図１　化膿レンサ球菌ＳＦ３７０のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、標的ＤＮＡのＤＳＢを促進するように、哺乳動物細胞で再構成することができる。…（Ｃ）標的遺伝子座とＥＭＸ１を標的とするｃｒＲＮＡ 間の塩基対の模式図。赤い矢印は、推定切断部位を示す。…」（図１）
（１−６）「
図２　ＳｐＣａｓ９は、哺乳動物細胞の複数の遺伝子座を標的とするように再プログラム可能である。…（Ｂ）前駆ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の概略図（上）は、前駆ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのダイレクトリピート（灰色）領域間でのハイブリダイゼーションを示す。キメラＲＮＡデザインの概略図（…）（下）。ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は赤で、２０ｂｐのスペーサー配列は青で示される。…」（図２）
（１−７）「
図４　相同組換え及び多重ゲノムエンジニアリングへのＣａｓ９の応用。（Ａ）ＲｕｖＣ　Ｉドメインの変異は、Ｃａｓ９をニッキング酵素（ＳｐＣａｓ９ｎ）に変換する。（Ｂ）ＥＭＸ１を標的とするキメラＲＮＡとＳｐＣａｓ９との共発現はインデルをもたらすものの、ＳｐＣａｓ９ｎはそうではない（Ｎ＝３）。（Ｃ）組換え戦略の概略図。修復テンプレートは、ＥＭＸ１遺伝子座に制限部位を挿入するように設計されている。修飾領域の増幅に使用されるプライマーは、赤矢印で示される。（Ｄ）制限断片長多型ゲル分析。矢印は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生成された断片を示す。（Ｅ）組換えの成功を示すクロマトグラムの例。（Ｆ）ＳｐＣａｓ９は、ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢを標的とする２つのスペーサーを含む１つのｃｒＲＮＡアレイを使用することにより、多重ゲノム修飾を促進できる。ｃｒＲＮＡアレイのデザインを示す概略図（上）。両スペーサーは、効率的なプロトスペーサー切断を仲介する（下）。（Ｇ）ＳｐＣａｓ９を使用して、正確なゲノム欠失を達成できる。ＥＭＸ１を標的とする２つのスペーサー（上）は、１１８ｂｐのゲノム欠失を媒介した（下）。」（図４）
（１−８）「（Ｄ）相同組換えを検出するための制限断片長多型分析
　ＨＥＫ２９３ＦＴ及びＮ２Ａ細胞はプラスミドＤＮＡでトランスフェクとされ、…インキュベートされた。標的ゲノム配列は、相同組換え（ＨＲ）テンプレートの相同アームの外側に位置するプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルにより分離され、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎキットにより抽出された。精製産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ（…）により消化され、…分析された。」（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｍａｔｅｒｉａｌｓの４頁２段落）
２　引用文献２
　原査定で引用された、本願優先日より前に頒布された刊行物である引用文献２は、「プログラム可能なＤＮＡニッキング酵素による精密ゲノム工学」と題する学術論文であって、以下の事項が記載されている。なお、英文であるから当審による訳文を記載する。
（２−１）「ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はゲノム工学の強力なツールであるものの、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復、すなわち、オンターゲット部位及びオフターゲット部位の両方においてランダムに発生する、不必要な小さな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす修復に依存せざるを得ないことによって制限を受けている。本論文では、ＤＳＢの代わりに、変異性のＮＨＥＪではなく、エラーのない相同組換え（ＨＲ）によって修復される一本鎖切断（ＳＳＢ）又はニックを生成する、プログラム可能なＤＮＡニック酵素（ニッカーゼ）を提示する。対応するヌクレアーゼとは異なり、ジンクフィンガーニッカーゼは、不必要なインデルの誘導をすることなく、オンターゲット部位でのみ部位特異的なゲノム修飾を可能にする。我々は、プログラム可能なニッカーゼが、研究、医学及びバイオテクノロジーにおいて、あらゆる細胞や生物での正確なゲノム工学を可能にする幅広い有用性があろうことを提案する。」（要旨）
（２−２）「ＺＦＮとＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを切断し、ゲノムに部位特異的なＤＳＢを生成する。ＤＳＢ…は危険な信号であり、適切に修復しない限り、多くの場合、細胞死と癌につながる。細胞には、競合する２つのＤＳＢ修復システム：ＨＲ及びＮＨＥＪ（…）が装備されている。相同ＤＮＡの存在下では、ＤＳＢはＨＲによって修復され得る。ＨＲ機構は、テンプレートとして相同ＤＮＡを使用する、エラーのないＤＳＢ修復システムである。対照的に、ＤＳＢの２つの末端は、相同ＤＮＡを使用することなくＮＨＥＪによって効率的に連結され得る。ＨＲとは異なり、ＮＨＥＪはエラーが発生しやすく、多くの場合、末端接合部位で小さな挿入及び欠失（インデル）を引き起こす。ヌクレアーゼに誘導された部位特異的ＤＳＢの、ＨＲ又はＮＨＥＪによる修復は標的ゲノムの修飾を引き起こす。
　基礎研究、バイオテクノロジー及び医学におけるこれらの酵素の広範な有用性にもかかわらず、プログラム可能なヌクレアーゼによるゲノム工学は、ＤＳＢが必然的に生じることと、エラーが発生しやすいＮＨＥＪへ依存していることにより、制限を受けている。その結果、プログラム可能なヌクレアーゼは、相同ドナーＤＮＡの存在下であっても、ランダムに生成された不要なインデルを標的部位に誘発することがよくある。なぜなら、高等真核生物の細胞及び生物において、ＮＨＥＪは、ＨＲを越えた、ＤＳＢ修復の主要な経路だからである（…）。より悪いことに、これらの酵素は、目的の標的部位と高度に相同な部位にオフターゲット変異を誘発し、オフターゲットＤＳＢを生成する（…）。また、ＮＨＥＪを介したオフターゲットＤＳＢの修復は、望ましくない染色体再構成を引き起こす可能性がある（…）。さらに、オフターゲットＤＳＢを過剰に誘導するヌクレアーゼは、細胞に対して毒性があり、遺伝子が編集された細胞の単離を、不可能ではないにしても、困難にする（…）。
　原理的には、（１）目的の標的部位でのみＤＳＢを誘発するか、（２）標的部位で、ＤＳＢを誘発しないものの、部位特異的変異は誘発する酵素を使用することにより、これらの制限を克服できるはずである。本論文では、部位特異的ＤＮＡニック酵素（ニッカーゼ）（これはＺＦＮのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを操作して構築されたものである）が、ゲノムにＳＳＢを誘発することができ、そして、高度に正確なＨＲを介したその修復によって、標的ゲノムの修飾が引き起こされることを実証する。重要なのは、ＳＳＢはエラーが発生しやすいＮＨＥＪによって修復されず、それ故に、オンターゲット部位及びオフターゲット部位の何れにおいてもインデルが発生しないことである。このように、ＳＳＢ誘導ジンクフィンガー（ＺＦ）ニッカーゼは、オフターゲット効果が全く又はほとんどない、非常に特異的な変異原として機能し得るのである。」（１３２７頁左欄２段落〜右欄２段落）
（２−３）「ジンクフィンガーニッカーゼによるゲノム編集
　次に、これらのニッカーゼが、ＨＲを介して、内在性の染色体部位で標的ゲノム修飾を誘導できるかどうかを試験した。ニッカーゼプラスミド及び相同染色体領域に存在しないＸｂａＩ部位を含む相同ドナーＤＮＡで、ヒトＫ５６２細胞をトランスフェクトした（図３Ａ）。この染色体領域のＰＣＲアンプリコンはＸｂａＩによって部分的に消化され、ニッカーゼによるゲノム編集効率が１％〜３％であることを示した（図３Ｂ）。…
　また、ＰＣＲ産物のクローニングと配列決定により、ゲノム編集頻度を測定した。Ｌ＿ＫＫ／Ｒ＿ＥＬヌクレアーゼは、ランダムに生成されたインデル（１７クローン／合計５２クローン、３３％）及び相同性に基づくＸｂａＩ部位の取り込み（１３／５２、２５％）の両方を誘導することがわかった（図３Ｃ；補足図１）。対照的に、Ｌ＿ＫＫ／Ｒ＿ｅｌニッカーゼはインデルを全く誘導しなかった（０／１４９クローン）ものの、９％（＝１３／１４９）の頻度でＨＲを介した修飾を誘導した。これらの結果は、ＺＦＮよりも効率的ではないものの、ＺＦニッカーゼが哺乳動物細胞で真正なゲノム修飾を誘発し、また、ニッカーゼによるゲノム編集が不要なインデルを伴わないことを示しており、ニッカーゼのヌクレアーゼに対する重要な利点を立証するしている。」（１３２８頁右欄２〜３段落）
（２−４）「２対のニッカーゼはＤＳＢを生成する。
　ニッカーゼがゲノム標的部位でＳＳＢを誘導することを確認するために、ヒト培養細胞に２つのニッカーゼを導入した。２つのＳＳＢが互いに近接して発生する場合、反対側の鎖に１つのＳＳＢを生成する２つのニッカーゼは、ＤＳＢを誘発するであろう。この合成ＤＳＢは、ＮＨＥＪによって効率的に修復されるであろう。このアイデアをテストするために、Ｋ５６２細胞に、２つのニッカーゼ：Ｌ＿ＫＫ／Ｒ＿ｅｌ及びＬ＿ｅｌ／Ｒ＿ＫＫをコードするプラスミドをトランスフェクトした。…ミスマッチ感受性Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）を使用して、エラーが発生しやすいＮＨＥＪによって誘導されたインデルを検出した（図４　…）。２つのニッカーゼをコードするプラスミドで同時トランスフェクトされた細胞からのＰＣＲアンプリコンは、予想される位置で部分的に切断され、ＣＣＲ５部位にインデルが存在することが示された。ＤＮＡ配列分析により、スペーサー領域でのインデルの誘導が確認された（図４Ｂ）。…対照的に、各ニッカーゼ単独（Ｌ＿ＫＫ／Ｒ＿ｅｌ及びＬ＿ｅｌ／Ｒ＿ＫＫ）は変異を誘発しなかった（アッセイ感度は〜１％）。…」（１３２８頁右欄最終段落〜１３２９頁左欄１段落）
（２−５）「ニッカーゼ誘導ＳＳＢはインデルを生じさせない
　また、ハイスループットＤＮＡシーケンスを実行し、ＺＦニッカーゼが、オンターゲット部位及びオフターゲット部位において、ＮＨＥＪを介したインデルを誘導しなかったことを確認した。ＺＦＮ−２２４又はＬ＿ＫＫ／Ｒ＿ｅｌニッカーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトされたＫ５６２細胞から単離されたゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＣＲ５オンターゲット部位、及び最近の研究（…）で明らかにされたいくつかのオフターゲット部位でのインデルの頻度を測定した。予想通り、ＺＦＮ−２２４はこれらの部位で最大２０％の頻度でインデルを誘導した（図５；補足表１）。対照的に、ニッカーゼを発現している細胞は、空ベクターのコントロールを含む細胞と比較して、ＣＣＲ５サイトを含むこれらの部位で、インデル形成の証拠を何ら示さなかった。恐らく、ニッカーゼによって誘導されたＳＳＢは、痕跡を残さない、内在性の塩基除去修復（ＢＥＲ）システムによって忠実に修復された（…）。まとめると、ＺＦニッカーゼは、ＺＦＮとは異なり、ＤＮＡ切断を修復するにあたって、エラーを起こしやすいＮＨＥＪを誘発しないことを、Ｔ７Ｅ１アッセイ及びディープシーケンス解析の何れもが示している。」（１３２９頁左欄２段落〜右欄１段落）
（２−６）「プログラム可能なニッカーゼには、ヌクレアーゼよりも多くの利点がある。第一に、ニッカーゼによって生成されたオフターゲットＳＳＢは、非常に正確な塩基除去修復によって効率的かつ忠実に封じられ、オフターゲット部位に痕跡は残らない。対照的に、ヌクレアーゼにより生成されたオフターゲットＤＳＢは、エラーが発生しやすいＮＨＥＪによって修復され、望ましくないインデルが発生する。さらに、ＳＳＢは自然に発生し、ＤＳＢよりもはるかに頻繁にゲノムに存在し、細胞死や癌を引き起こすことが多いＤＳＢよりもはるかに害が少ない。全てではないにしても多くのヌクレアーゼは細胞傷害性であり、遺伝子が編集された細胞のクローン集団の単離を困難にする。ＳＳＢを生成するニッカーゼは、細胞へのストレスが少ないと思われる。加えて、ヌクレアーゼは、相同ドナーＤＮＡが存在する場合でも、標的部位に不要なインデルを誘導する。我々のディープシーケンス分析は、ニッカーゼが標的部位にインデルを誘導しないことを示している。…」（１３３０頁左欄２段落）
（２−７）「結論として、我々は、ＳＳＢを生成するプログラム可能なニッカーゼが標的ゲノムの修飾に使用できることを実証した。ＺＦニッカーゼは、対応するヌクレアーゼとは異なり、標的部位に不要なインデルを誘導することなく効率的なゲノム編集を可能にした。さらに、ニッカーゼを介したオフターゲット変異は、ハイスループットシーケンスでも検出できなかったため、ゲノム編集における前例のない精度が実証された。プログラム可能なニッカーゼは、任意の細胞または生物での標的変異誘発を可能にする、精密ゲノム工学のための新しいツールであることを提案する。」（１３３１頁左欄最終段落〜右欄１段落）
（２−８）「
図４　２対のＺＦニッカーゼはゲノムにＤＳＢを生成する。（Ａ）Ｔ７Ｅ１アッセイで検出されたヌクレアーゼまたはニッカーゼにより誘導されたインデル。ニッカーゼ又はヌクレアーゼをコードするプラスミド（４μｇ／モノマー）でトランスフェクトされた細胞からのゲノムＤＮＡを用いて増幅したＰＣＲ産物を、Ｔ７Ｅ１により消化し、アガロースゲル電気泳動で分析した。（矢印）結果として生じるＤＮＡバンドの予想される位置。（ゲル写真の上の黒い三角形）トランスフェクトされたプラスミドの増加（４、８及び１０μｇ／各モノマー）。（Ｂ）ＣＣＲ５の野生型及び変異体クローンのＤＮＡ配列。２つのハーフサイトは太字で示される。マイクロホモロジーには下線が引かれ、挿入された塩基は斜体で示される。ダッシュは削除された塩基を示す。発生番号が括弧内に示されている。Ｘ１及びＸ５は各クローンの番号である。（ＷＴ）は野生型を意味する。」（図４）
第５　対比・判断
１　本願発明１について
（１）引用発明１ａ
　ゲノム編集に関する学術論文である引用文献１の要約部分である摘記事項（１−１）には、Ｃａｓ９が、最小限の変異原性で相同配列依存的修復（以下「ＨＤＲ」という。）を促進する、ニッキング酵素に変換され得ることが記載されている。
　そして、この点について、摘記事項（１−３）には、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣＩドメインにおけるアスパラギン酸のアラニン置換（Ｄ１０Ａ）により、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎを調製したこと、及び相同性修復テンプレートを使用して、ＥＭＸ１遺伝子座におけるＣａｓ９を介したＨＤＲを試験したところ（図４Ｃ）、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎは、ＥＭＸ１遺伝子座への修復テンプレートの統合を触媒したこと（図４Ｄ）が記載されている。また、その具体的な実験データとして、摘記事項（１−７）には、図４Ａに、キメラＲＮＡと、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎとを用いたことが記載されていると認められ、そして、図４Ｂの説明部分に、キメラＲＮＡがＥＭＸ１を標的とするものであることが記載されており、また、図４Ｃに、ＨＲテンプレートがＥＭＸ１遺伝子座にＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を挿入するように設計されていることが記載されていると認められ、さらに、図４Ｄ及びその説明部分に、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎとＨＲテンプレートとの存在下、ＨＤＲが起きたことが、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって生成された断片を確認している制限断片長多型分析により示されたことが記載されていると認められる。また、摘記事項（１−８）には、上記制限断片長多型分析がＨＥＫ２９３ＦＴ細胞等を用いて行われたことが記載されている。さらに、摘記事項（１−８）に、ＨＲテンプレートが相同組換えテンプレートを意味することが記載されていることからみて、引用文献１において、「相同性修復テンプレート」、「ＨＲテンプレート」及び「相同組換えテンプレート」は同義であると認められる。
　そうすると、引用文献１には、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ、ＥＭＸ１遺伝子座を標的とするキメラＲＮＡ、及びＥＭＸ１遺伝子座に制限部位を挿入するように設計された相同性修復テンプレートにより、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のＥＭＸ１遺伝子座において、ＨＤＲを起こしたことが記載されていると認められる。
　加えて、摘記事項（１−２）には、ＥＭＸ１遺伝子座の標的部位が、ＰＡＭであるＮＧＧの前に位置する、ＥＭＸ１遺伝子座の部位であることが記載されており、摘記事項（１−５）には、図１Ｃとして、ＥＭＸ１遺伝子座の標的部位がＰＡＭの直前に位置することが記載されていると認められる。
　以上からみて、引用文献１には、以下の発明（以下「引用発明１ａ」という。）が記載されていると認められる。
「（ｉ）ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ、（ｉｉ）ＥＭＸ１遺伝子座のＰＡＭの直前に位置する部位を標的とするキメラＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）ＥＭＸ１遺伝子座に制限部位を挿入するように設計されている相同性修復テンプレート、を含む組成物。」
（２）対比
　引用発明１ａの「キメラＲＮＡ」は、「ＥＭＸ１遺伝子座のＰＡＭの直前に位置する部位を標的とする」ものであって、前記（１）に示したとおり、相同性修復テンプレートの存在下、ＥＭＸ１遺伝子座の標的部位に、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎを介したＨＤＲを起こすことができるものであり、その構造は、摘記事項（１−６）の図２Ｂ下からみて、５’末端から順に、標的部位に相補的な領域（青色）、ステムループ構造を形成する領域、及びｔｒａｃｒＲＮＡに由来する領域（赤色）を含むものである。そして、このような構造を有するＲＮＡに関する本願優先日当時の技術常識（要すれば、「Science, Aug 2012, Vol.337, p.816-821, Supplementary Materials」の「キメラＲＮＡ」、「Science, published online 3 Jan 2013, Vol.339, p.823-826」の「ガイドＲＮＡ」、「eLife, 29 Jan 2013, 2:e00471, DOI:10.7554/eLife.00471」の「ｓｇＲＮＡ」に関する記載を参照。）も併せ考慮すれば、引用発明１ａの「キメラＲＮＡ」は、本願発明１の「二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡ」であって、「標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置」するものに相当すると認められる。
　また、引用発明１ａの「ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ」は、前記（１）に示したとおり、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａアミノ酸置換により調製されたものであるところ、摘記事項（１−２）からみて、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するものであるから、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎはＩＩ型に由来するものであるといえる。そうすると、引用発明１ａの「ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ」は、本願発明１の「１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」であって、「ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である」ものに相当すると認められる。
　以上からみて、本願発明１と引用発明１ａとの一致点及び相違点は、次のとおりと認められる。
【一致点】
「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを含む組成物であって、ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムが、（ｉ）１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である、および（ｉｉ）二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡであって、その標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する、組成物。」
【相違点１ａ】
　本願発明１は、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを含むこと、それらの標的部位が二本鎖配列の対向する鎖にあること、及びそれらのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが共に、二本鎖配列の対向する鎖を独立に切断することにより、二本鎖の切断を導入できるものであることが特定されているのに対し、引用発明１ａは、１つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを含むにとどまり、二本鎖の切断を導入できるものではない点。
（３）判断
ア　引用文献１のその余の記載について
　引用文献１の摘記事項（１−１）には、前記（１）に示した事項に加え、哺乳動物ゲノム内の複数の部位を同時編集することを可能とするために、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができることが記載されている。
　この点について、摘記事項（１−４）には、ＥＭＸ１を標的とするスペーサー、及びＰＶＡＬＢを標的とするスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを用いて、両方の遺伝子座で切断を検出したこと（図４Ｆ）、及び１１９ｂｐ離れたＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを用いて、ＤＳＢを同時に生成することにより、より大きなゲノム領域における標的の削除を観察したこと（図４Ｇ）が記載されている。そして、その具体的な実験データとして、摘記事項（１−７）には、図４Ｆ及びその説明部分に、ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢを標的とする２つのスペーサーを含む１つのｃｒＲＮＡアレイを使用することにより、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９が多重ゲノム修飾を促進したことが記載され、また、図４Ｇ及びその説明部分に、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９、ＥＭＸ１を標的とする２つのスペーサーを用いて、１１８ｂｐのゲノムの欠失を媒介したことが記載されていると認められる。そうすると、引用文献１には、２つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを用いて、異なるあるいは同じ標的遺伝子座の２か所に同時に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成させることが具体的に記載されているとはいえるものの、これはあくまでヌクレアーゼＳｐＣａｓ９を用いるものである。
　一方、引用文献１には、ＲＮＡ誘導ニッカーゼシステムは、ＨＤＲによりシームレスかつ高い忠実度で修復されるニック（一本鎖切断）を導入するものとして記載されているに過ぎず（摘記事項（１−３））、それを２つ用いることは記載されておらず、ましてや、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを用いて、二本鎖配列の対向する鎖に存在する標的部位を独立に切断することによりＤＳＢを生成させることまでが記載あるいは示唆されているとはいえない。
イ　引用文献２の記載について
　ゲノム編集に関する学術論文である引用文献２には、要約部分である摘記事項（２−１）及び導入部分である摘記事項（２−２）の記載からみて、ゲノム編集に用いるＺＦＮやＴＡＬＥＮが、ゲノムの標的部位及びオフターゲット部位においてＤＳＢを生成し、当該ＤＳＢがＮＨＥＪによって修復されることにより不要な小さな挿入又は欠失（インデル）を引き起こすことの問題点が記載されているとともに、ＺＦＮのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを操作して構築した部位特異的ＤＮＡニック酵素（以下「ＺＦニッカーゼ」という。）を用いてゲノムに一本鎖切断（以下「ＳＳＢ」という。）を生成することにより、この問題点を解決できることが記載されているといえる。そして、このＺＦニッカーゼ及びそれが生成するＳＳＢに関し、より具体的には、摘記事項（２−２）に、ＳＳＢはＮＨＥＪによっては修復されず、それ故に、オンターゲット部位及びオフターゲット部位の何れにおいてもインデルが発生しないことが、また、摘記事項（２−３）に、ＺＦニッカーゼによってＳＳＢを誘導することにより、不要なインデルを伴わずに、ＨＲを介した標的ゲノム修飾を誘発し得ることが、さらに、摘記事項（２−５）に、ＺＦＮとは異なり、ＺＦニッカーゼはＤＮＡ切断を修復するにあたってＮＨＥＪを誘発しないことが記載されている。また、このＺＦニッカーゼのＺＦＮに対する他の利点として、摘記事項（２−６）には、ＺＦニッカーゼによって生成されたオフターゲットＳＳＢは、非常に正確な塩基除去修復によって効率的かつ忠実に封じられること、及びＳＳＢを生成するニッカーゼは、ＤＳＢを生成するヌクレアーゼよりも、細胞へのストレスが少ないと思われることが記載されている。さらに、引用文献２の結論部分に該当する摘記事項（２−７）には、ＺＦニッカーゼが、標的部位に不要なインデルを誘導することなく効率的なゲノム編集を可能にすること、ＺＦニッカーゼを介したオフターゲット変異はハイスループットシーケンスでも検出できず、ゲノム編集における前例のない精度が実証されたこと、及びプログラム可能なＺＦニッカーゼは精密ゲノム工学のための新しいツールであることが記載されている。
　以上をまとめると、引用文献２には、ＺＦニッカーゼが、ＺＦＮと同様に、ゲノムの標的部位及びオフターゲット部位においてＤＮＡの切断を生成し得るものの、ＺＦＮが生成するＤＳＢとは異なり、ＳＳＢを生成するため、ＮＨＥＪによる修復とそれによる不要なインデルが起こらないこと、及びＺＦニッカーゼによってＳＳＢを生成することにより、ＨＲを介した標的ゲノム修飾を誘発し得ること記載されているといえ、また、それらにより、ゲノム編集においてＺＦＮやＴＡＬＥＮを用いてＤＳＢを生成させた際に生じる問題点を解決できることが記載されているといえる。
　ここで、摘記事項（２−４）及び（２−８）からみて、引用文献２には、２対のＺＦニッカーゼにより、一方の鎖と他方の鎖に、近接して１つずつＳＳＢを生成させることにより、ＤＳＢを生成させる実験が記載されている。しかし、この実験は、摘記事項（２−４）冒頭において、ＺＦニッカーゼがゲノム標的部位でＳＳＢを誘導することを確認することを目的とすることが記載されており、また、摘記事項（２−４）及び（２−８）からみて、この実験における２対のＺＦニッカーゼにより生成したＤＳＢはＮＨＥＪにより修復される、すなわち、摘記事項（２−１）及び（２−２）からみて、ここで生成されるＤＳＢは引用文献２において不要なインデルが発生しやすいものとして問題視されているＮＨＥＪの修復経路により修復されることが記載されていることから、この実験は、２対のＺＦニッカーゼによりＤＳＢを生成すること自体や、ＤＳＢを生成することでゲノム編集を行うことを目的とするものではなく、上記した摘記事項（２−４）冒頭の記載のとおり、ＺＦニッカーゼがゲノム標的部位でＳＳＢを誘導することを確認することを目的とするものであるといえる。そうすると、摘記事項（２−４）及び（２−８）の記載を考慮しても、引用文献２に、ゲノム編集において、２対のＺＦニッカーゼによるＤＳＢを生成させることが記載されてはいるとはいえない。
　以上のとおりであるから、引用文献２には、ゲノム編集において、２対のＺＦニッカーゼを使用してＤＳＢを生成させることまでが記載又は示唆されているとはいえない。
ウ　相違点１ａについての判断
　引用発明１ａは、ゲノム編集に用いるためのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを含む組成物に係る発明であって、前記（１）に示したとおり、摘記事項（１−１）に、ニッキング酵素について、最小限の変異原性でＨＤＲを促進するものであることが記載されていることからみて、引用発明１ａは、ゲノム編集において、最小限の変異原性でＨＤＲを促進するための組成物であるといえる。
　そして、前記アで検討したとおり、引用文献１には、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを用いて、二本鎖配列の対向する鎖に存在する標的部位を独立に切断することによりＤＳＢを生成させることは記載も示唆もされていない。また、引用文献２には、前記イで検討したとおり、ゲノム編集において、ＺＦニッカーゼを使用してＤＳＢを生成させることは記載も示唆もされておらず、むしろ、ＺＦニッカーゼを使用して、ＤＳＢではなくＳＳＢを生成することにより、ＮＨＥＪによる修復とそれによる不要なインデルを回避することができるとともに、ＳＳＢを生成することによりＨＲを介したゲノム編集を行うことができることが記載されているといえる。
　そうすると、引用文献２の記載に接した当業者が、ゲノム編集において最小限の変異原性でＨＤＲを促進するための組成物である引用発明１ａを、ＮＨＥＪによる修復とそれによる不要なインデルが起こり得るＤＳＢを形成することに用いるよう動機付けられることはないといえる。
　したがって、本願発明１と引用発明１ａとの相違点１ａは、引用発明１ａに、引用文献２に記載された技術的事項を組み合わせても、当業者が容易になし得たものとはいえない。
（４）小括
　以上からみて、本願発明１は、当業者であっても、引用発明１ａ並びに引用文献１及び２に記載された技術的事項に基づいて容易に発明できたものとはいえない。
２　本願発明２〜１０について
　本願発明２〜４は本願発明１を単に減縮した発明であって、いずれも本願発明１と同一の構成を備えるものであるから、本願発明１と同一の理由により、当業者であっても、引用発明１ａ並びに引用文献１及び２に記載された技術的事項に基づいて容易に発明できたものとはいえない。
　本願発明５〜８は本願発明１の組成物をコードする複数の核酸に係るものであって、また、本願発明９及び１０は本願発明５〜８の複数の核酸を含むベクターに係るものであって、いずれも本願発明１の構成に対応する構成を備えるものであるから、本願発明１と同様の理由により、当業者であっても、引用発明１ａ並びに引用文献１及び２に記載された技術的事項に基づいて容易に発明できたものとはいえない。
３　本願発明１１について
（１）引用発明１ｂ
　引用文献１に前記１（１）に示したとおりの事項が記載されていることから、引用文献１には、以下の発明（以下「引用文献１ｂ」という。）が記載されていると認められる。
「ａ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に、
（ｉ）ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ、（ｉｉ）ＥＭＸ１遺伝子座のＰＡＭの直前に位置する部位を標的とするキメラＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）ＥＭＸ１遺伝子座に制限部位を挿入するように設計されている相同性修復テンプレート
を導入し、
ｂ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のＥＭＸ１遺伝子座において、相同配列依存的修復（ＨＤＲ）を起こす方法。」
（２）対比
　前記１（２）で検討したとおり、引用発明１ｂのキメラＲＮＡは、本願発明１１の「二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡ」であって、「標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置」するものに相当すると認められ、また、引用発明１ｂの「ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ」は、本願発明１１の「１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」であって、「ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である」ものに相当すると認められる。
　そして、引用発明１ｂの「ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞」は、本願発明１１の「真核細胞」に相当し、また、引用発明１ｂの「ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のＥＭＸ１遺伝子座において、相同配列依存的修復（ＨＤＲ）を起こす」ことは、引用発明１ｂにおいて、ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎが、標的部位であるＥＭＸ１遺伝子座における標的部位にニックを生成することにより、相同配列依存的修復（ＨＤＲ）が起こることであるから、本願発明１１の「真核細胞において二本鎖配列を修飾する」ことに相当するとともに、本願発明１１の「ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、二本鎖配列の鎖を切断することにより、鎖の切断を導入し、ＤＮＡ修復過程による鎖の切断の修復が、二本鎖配列の修飾を導入するように、真核細胞を培養すること」に相当すると認められる。
　また、引用文献１ｂが、人間を手術、治療又は診断する方法でないことは明らかである。
　以上からみて、本願発明１１と引用発明１ｂとの一致点及び相違点は、次のとおりと認められる。
【一致点】
「真核細胞において二本鎖配列を修飾するための方法（人間を手術、治療または診断する方法を除く）であって、該方法は、
　ａ）真核細胞に、ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムまたは該システムをコードする核酸、および任意にドナーポリヌクレオチド、ここで、ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムが：
　（ｉ）１つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、二本鎖配列の一本鎖を切断するように修飾されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ここで、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、ＩＩ型のクラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムタンパク質に由来し、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣａｓ９タンパク質である；および
　（ｉｉ）二本鎖配列の一本鎖中の標的部位と相補性を有する第一の領域およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用する第二の領域を含むガイドＲＮＡであって、その標的部位がプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する；
を導入すること、並びに
　ｂ）ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、二本鎖配列の鎖を切断することにより、鎖の切断を導入し、ＤＮＡ修復過程による鎖の切断の修復が、二本鎖配列の修飾を導入するように、真核細胞を培養すること、
を含む方法。」
【相違点１ｂ】
　本願発明１１は、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを導入すること、それらの標的部位が二本鎖配列の対向する鎖にあること、及びそれらのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが共に、二本鎖配列の対向する鎖を独立に切断することにより、二本鎖の切断を導入することが特定されているのに対し、引用発明１ｂは、１つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを導入するにとどまり、二本鎖の切断を導入するものではない点。
（３）判断
　引用発明１ｂは、ＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを用いたゲノム編集の方法に係る発明であって、前記１（１）に示したとおり、摘記事項（１−１）に、ニッキング酵素について、最小限の変異原性でＨＤＲを促進するものであることが記載されていることからみて、引用発明１ｂは、ゲノム編集において、最小限の変異原性でＨＤＲを促進するための方法であるといえる。
　ここで、前記１（３）アで検討したとおり、引用文献１には、２つのＲＮＡ誘導型ニッカーゼシステムを用いて、二本鎖配列の対向する鎖に存在する標的部位を独立に切断することによりＤＳＢを生成させることは記載も示唆もされていない。
　また、前記１（３）イで検討したとおり、引用文献２には、ゲノム編集において、ＺＦニッカーゼを使用してＤＳＢを生成させることは記載も示唆もされておらず、むしろ、ＺＦニッカーゼを使用して、ＤＳＢではなくＳＳＢを生成することにより、ＮＨＥＪによる修復とそれによる不要なインデルを回避することができるとともに、ＳＳＢを生成することによりＨＲを介したゲノム編集を行うことができることが記載されているといえる。
　そうすると、引用文献２の記載に接した当業者が、ゲノム編集において最小限の変異原性でＨＤＲを促進するための方法である引用発明１ｂを、ＮＨＥＪによる修復とそれによる不要なインデルが起こり得るＤＳＢを形成することに用いるよう動機付けられることはないといえる。
　したがって、本願発明１１と引用発明１ｂとの相違点１ｂは、引用発明１ｂに、引用文献２に記載された技術的事項を組み合わせても、当業者が容易になし得たものとはいえない。
（４）小括
　以上からみて、本願発明１１は、当業者であっても、引用発明１ｂ並びに引用文献１及び２に記載された技術的事項に基づいて容易に発明できたものとはいえない。
４　本願発明１２〜２１について
　本願発明１２〜２１は本願発明１１を単に減縮した発明であって、いずれも本願発明１１と同一の構成を備えるものであるから、本願発明１１と同一の理由により、当業者であっても、引用発明１ｂ並びに引用文献１及び２に記載された技術的事項に基づいて容易に発明できたものとはいえない。
第６　むすび
　以上のとおり、本願発明１〜２１は、当業者が、引用文献１及び２に記載された発明に基づいて容易に発明をすることができたものではない。
　したがって、原査定の拒絶理由によっては、本願を拒絶することはできない。
　また、他に本願を拒絶すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり審決する。