(57)【要約】  本発明は、凍結乾燥中に均一で秀麗な（ｅｌｅｇａｎｔ）ケーキを形成する上にＤＮＡプラスミドの安定性を維持する新規な凍結乾燥した薬剤学的組成物を提供する。新規な凍結乾燥剤形はまた、薬剤学的に許容される溶液においてＤＮＡプラスミドの均一な再構成を可能にすることで、活性成分の完全な回復を可能にし、力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）の部分的損失を最小化し、活性成分を正確で一貫した方式で投与可能にする。凍結乾燥した薬剤学的組成物の製造方法及び様々な疾病の治療のための組成物の投与方法が、本願にさらに提供される。
2022500354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物において、凍結乾燥前に次を含む液体（ｌｉｑｕｉｄ）組成物を凍結乾燥させることによって得られる凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）はＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％超過及び１．１％未満（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ。
【請求項２】
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項２に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４】
第１プラスミドがｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項４に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項６に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８】
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項９】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１０】
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１１】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項１０に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１２】
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１３】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項１２に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１５】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、請求項１４に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１７】
前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成された、請求項１６に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１８】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成された、請求項１７に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１９】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル形成された、請求項１８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２０】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２１】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項２０に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２２】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項２１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２３】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項２２に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２４】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２５】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％はスーパーコイル状態を維持する、請求項２４に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２６】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも８０％は、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前１０週間４０℃で貯蔵されたものである、 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２７】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中にスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９０％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、 請求項１〜２6のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２８】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中にスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、請求項２７に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２９】
前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３０】
前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、請求項２９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３１】
前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、請求項３０に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３２】
前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で第１プラスミドを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３３】
前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３４】
前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、請求項３３に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３５】
前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、請求項３４に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３６】
前記液体組成物は、１０ｍＭの濃度でリン酸カリウムを含む、請求項１〜35のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３７】
前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む、請求項１〜36のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３８】
前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムバッファーを含む、請求項３７に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３９】
前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でマンニトールを含む、請求項１〜請求項３８のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４０】
前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）の濃度でマンニトールを含む、請求項３９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４１】
前記液体組成物は、０．７５％〜１．１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む、請求項１〜40のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４２】
前記液体組成物は、０．９％〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む、請求項４１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４３】
前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度でスクロースを含む、請求項４２に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４４】
前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、請求項１〜43のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４５】
前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、請求項４４に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４６】
前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、請求項４５に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４７】
前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）の濃度でＮａＣｌを含む、請求項４６に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４８】
プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物であって、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる、凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選択され、
ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；
ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；
ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ、
前記液体組成物中の少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡはスーパーコイル形成され、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後２５℃で７日間貯蔵後にスーパーコイル状態に残っている。
【請求項４９】
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５０】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項４９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５１】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５２】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項５１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５３】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５４】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項５３に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５５】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５６】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項５５に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５７】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５８】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項５７に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５９】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６０】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項５９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６１】
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、請求項４８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６２】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、請求項６１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６３】
水（ｗａｔｅｒ）中に請求項１〜６２のいずれか一項の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
【請求項６４】
前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００２以下である、請求項６３に記載の再構成された組成物。
【請求項６５】
前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００１であるか、或いは０．００１未満である、請求項６４に記載の再構成された組成物。
【請求項６６】
前記光吸収は、再構成された日に測定されたものである、請求項６４又は６５に記載の再構成された組成物。
【請求項６７】
前記光吸収は、凍結乾燥した薬剤学的組成物の貯蔵後１０週間測定されたものである、請求項６４又は６５に記載の再構成された組成物。
【請求項６８】
単位容量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）内のプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物であって、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる、凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選択され、
ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；
ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；
ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ、
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、バイアル（ｖｉａｌ）内にあり、前記バイアルは全体中に２．５ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有する。
【請求項６９】
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７０】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項６９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７１】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７２】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項７１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７３】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７４】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項７３に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７５】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７６】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項７５に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７７】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７８】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項７７に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７９】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８０】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、請求項７９に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８１】
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、請求項６８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８２】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、請求項８１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８３】
水（ｗａｔｅｒ）中に請求項６８〜８２のいずれか一項の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
【請求項８４】
次の段階を含むプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物の製造方法：
次を含む液体組成物を製造する段階：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％以上及び１．１％以下（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ；
前記液体組成物を凍結乾燥させることによって、凍結乾燥した薬剤学的組成物を製造する段階。
【請求項８５】
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ又はｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６又はｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
前記凍結乾燥の段階は次を含む、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）前記液体組成物をローディングする段階；
（ｉｉ）凍結段階；
（ｉｉｉ）第１乾燥段階；及び
（ｉｖ）第２乾燥段階。
【請求項９１】
前記ローディング段階は、５℃で行われる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記凍結段階は、−５０℃〜−２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記凍結段階は、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１乾燥段階は、−２０℃で行われる、請求項84〜93のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２乾燥段階は、−２０℃〜２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、請求項８４〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された、請求項８４〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成された、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成された、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル形成された、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項８４〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９７％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９８％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項８４〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも８０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前の１０週間４０℃で貯蔵されたものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、請求項84〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、請求項８４〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、請求項８４〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記液体組成物は、１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含む、請求項８４〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む、請求項８４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトールを含む、請求項８４〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトールを含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記液体組成物は、０．７５％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む、請求項８４〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記液体組成物は、０．９％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロースを含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、請求項84〜123のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
次の段階を含む、疾病を治療する方法：
疾病にかかった患者に再構成された薬物の有効量を投与する段階であって、前記再構成された薬物は、請求項１〜４９又は請求項６８〜６９のいずれか一項の前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を再構成することによって生成される段階。
【請求項１２９】
さらに次の段階を含む、請求項１２８に記載の方法：
水（ｗａｔｅｒ）中に請求項１〜６２又は請求項６８〜８２のいずれか一項の前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させる段階であって、これによって前記再構成された薬物を生成する段階。
【請求項１３０】
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００３以下である、請求項１２８又は１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００２以下である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００１であるか、或いは又は０．００１未満である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記疾病は、神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、虚血性疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋肉萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び心臓病（ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる、請求項１２８〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記疾病は、虚血性四肢疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＤＰＮ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）からなる群から選ばれる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記投与する段階は、前記再構成された薬物の筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を含む、請求項１２８〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥中に均一で秀麗な（ｅｌｅｇａｎｔ）ケーキを形成しながらＤＮＡプラスミドの安定性を維持する新規な凍結乾燥した薬剤学的組成物に関する。
【０００２】
関連出願に対する交差参照
本出願は、２０１８年７月１９日に出願された米国仮出願第６２／７００，６５５号に対して優先権を主張し、それはその全文が本願に参照によって組み込まれる。
【０００３】
配列目録
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて提出された配列目録を含み、その全文が本願に参照によって組み込まれる。２０１９年７月１６日に作成された、ＡＳＣＩＩ写本の名は４０３１９ＵＳ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇであり、サイズは１２５，９７９バイトである。
【背景技術】
【０００４】
ウイルス又はウイルス様粒子（いわゆる“ネイキッド（ｎａｋｅｄ）”ＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ））にパッケージ化（ｐａｃｋａｇｅｄ）されていない核酸コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ伝達を伴う遺伝子療法（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）が様々な疾病の治療に有効であり得るという実質的な臨床的証拠がある。例えば、ヒトＨＧＦタンパク質の２個の異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ）（すなわち、“ＶＭ２０２”とも呼ばれるｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７）を発現させるＤＮＡプラスミドコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の直接的な筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、神経病症性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ）の治療に効果的であることが立証された。II相臨床試験において、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）患者のふくらはぎの筋肉にＶＭ２０２を注射すると疼痛が有意に減少したことが見られ、これは、２週間隔で２日治療すれば、３ヶ月の間に生活の質が向上する程度の症状緩和を提供するに十分であった。Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２（５）：４６５−４７８（２０１５）。前記同じＤＮＡプラスミドコンストラクトはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）患者を治療するのに有効であることが示された。Ｉ相臨床試験において、ＡＬＳ患者のほぼ半分近くがＶＭ２０２投与後に安定となったり又は改善された状態を維持し、これは、１ヶ月、２ヶ月及び３ヶ月にそれぞれ４７％、５０％及び２４％の対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）が、ＡＬＳ患者の身体的機能を示すＡＬＳＦＲＳ−Ｒ（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ−ｒｅｖｉｓｅｄ）点数の減少を経験しないか又は点数の向上を経験したことが示されたが、これは、過去の対照群から観察されたそれよりも良い結果である。Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｓｕｆｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｒｏｎｔｏｅｍｐｏｒａｌ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  １８：２６９−２７８（２０１７）。
【０００５】
しかしながら、直接注射のための２個のアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物（脊髄腔内注射（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）用ヌシネルセン（ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ）、及び静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）用エテプリルセン（ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ））の最近の承認にもかかわらず、実際にヒト遺伝子療法に対して承認されたネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は殆どなかった。したがって、実験室使用のためのネイキッド核酸の剤形化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）に対する数十年の経験、及びｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法接近のための核酸の剤形化に対するより最近の経験にもかかわらず、直接的な治療的伝達のための薬剤学的製品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）としてＤＮＡを剤形化する研究は殆ど行われていない。特に、様々な保管（ｓｔｏｒａｇｅ）条件下で核酸活性成分の安定性、又は投与のための剤形の均一な再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を許容するために要求される賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）、又は汚染物質負荷（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ  ｌｏａｄ）を減少させる方法などに対する研究は殆どない。このような属性は、より良い及びより再現性のあるＤＮＡベース薬物の治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）及び安定性に重要である上に、薬物の生産及び分配を拡大する経済的妥当性（ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）にも重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、改善された安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、安全性（ｓａｆｅｔｙ）及び経済的妥当性を提供するネイキッドＤＮＡベース薬物の薬剤学的製品の剤形化が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様によれば、本発明は、凍結乾燥中にＤＮＡコンストラクト（例えば、プラスミド）の安定性を維持する新規な凍結乾燥した薬剤学的組成物を提供する。具体的に、前記剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、凍結乾燥中に、比較的より安定したスーパーコイル状の形態（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ  ｆｏｒｍ）から比較的安定しない開環状（ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｌａｒ）及び線形の形態へのＤＮＡコンストラクトの立体構造的変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）を減少させる。前記新規な凍結乾燥した剤形はまた、製薬学的に許容される溶液においてＤＮＡコンストラクトの均一な再構成を可能にすることによって、活性成分の完全な回復を可能にし、力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）の部分損失を最小化し、正確で一貫した方式で活性成分の投与を可能にする。また、前記新規な凍結乾燥した剤形は、凍結乾燥後に均一で秀麗な（ｅｌｅｇａｎｔ）ケーキ外見（ｃａｋｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）を生成することによって、ＤＮＡベース薬物の品質を視覚的に検査可能にする。
【０００８】
一部の具現例において、前記新規な凍結乾燥した剤形は、プラスミドＤＮＡを含むものであり、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体（ｌｉｑｕｉｄ）組成物を凍結乾燥させることによって得られる：ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）のＤＮＡ；ｂ．７．０〜９．０の範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；ｄ．０．５％超過及び１．１％（ｗ／ｖ）未満濃度のスクロース；及びｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ。前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものでよい。
【０００９】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物はさらに第２プラスミド（ｓｅｃｏｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄ）のＤＮＡを含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１０】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１１】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１２】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１３】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１４】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００１５】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる。
【００１６】
一部の具現例において、前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）ものである。一部の具現例において、前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９２．５％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル形成されたものである。
【００１７】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９２．５％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル状態を維持する。
【００１８】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９２．５％は、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル状態を維持する。
【００１９】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも８０％はスーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前の１０週間４０℃で貯蔵される。
【００２０】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９０％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９２．５％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。
【００２１】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で第１プラスミドＤＮＡを含む。
【００２２】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第２プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第２プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第２プラスミドＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で第２プラスミドＤＮＡを含む。
【００２３】
一部の具現例において、前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、１０ｍＭの濃度でリン酸カリウムを含む。
【００２４】
一部の具現例において、前記液体組成物は、７．０〜８．５範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムバッファーを含む。
【００２５】
一部の具現例において、前記液体組成物は、１．５％〜３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でマンニトールを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でマンニトールを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）の濃度でマンニトールを含む。
【００２６】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．７５％〜１．１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．９％〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度でスクロースを含む。
【００２７】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）の濃度でＮａＣｌを含む。
【００２８】
本発明の一部の具現例は、プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物に関し、該薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる：ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及びｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ。少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡはスーパーコイル形成され、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後に２５℃で３日〜７日間貯蔵後、スーパーコイル状に残っている。前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００２９】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３０】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３１】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３２】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３３】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３４】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３５】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる。
【００３６】
本発明の一部態様によれば、本発明は、水（ｗａｔｅｒ）中に前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される再構成された組成物に関する。
【００３７】
一部の具現例において、前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収（ｌｉｇｈｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、吸光度）は、０．００２以下である。一部の具現例において、前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００１であるか或いは０．００１未満である。一部の具現例において、前記光吸収は、再構成された日に測定されたものである。一部の具現例において、前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、凍結乾燥した薬剤学的組成物の貯蔵後１０週間測定したものである。
【００３８】
本発明の一部の態様によれば、本発明は、単位容量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）内のプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物に関し、該薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる：ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及びｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ。前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、バイアル（ｖｉａｌ）内にあり、前記バイアルは、全体中に２．５ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有する。前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００３９】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４０】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４１】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４２】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４３】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４４】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる。
【００４５】
一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる。
【００４６】
本発明の一部の態様によれば、本発明は、凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される再構成された組成物に関する。
【００４７】
本発明の一部の態様によれば、本発明は、次の段階を含むプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物の製造方法に関する：次を含む液体組成物を製造する段階：ａ．第１プラスミドのＤＮＡ；ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；ｄ．０．５％以上及び１．１％以下（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及びｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ；及び前記液体組成物を凍結乾燥させることによって、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を製造する段階。前記第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものでよい。
【００４８】
一部の具現例において、前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである。一部の具現例において、前記第１プラスミドはｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである。
【００４９】
一部の具現例において、前記凍結乾燥の段階は次を含む：（ｉ）前記液体組成物をローディングする段階；（ｉｉ）凍結段階；（ｉｉｉ）第１乾燥段階；及び（ｉｖ）第２乾燥段階。
【００５０】
一部の具現例において、前記ローディング段階は、５℃で行われる。
【００５１】
一部の具現例において、前記凍結段階は、−５０℃〜−２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる。
【００５２】
一部の具現例において、前記第１乾燥段階は、−２０℃で行われる。
【００５３】
一部の具現例において、前記第２乾燥段階は、−２０℃〜２０℃範囲内で温度が上昇する間に行われる。
【００５４】
一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９２．５％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成されたものである。一部の具現例において、前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成されたものである。
【００５５】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９２．５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９７％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９８％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。
【００５６】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９２．５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する。
【００５７】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも８０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前の１０週間４０℃で貯蔵されたものである。
【００５８】
一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９０％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９２．５％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。一部の具現例において、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイルＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイルＤＮＡを含む。
【００５９】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のプラスミドを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の第１プラスミドを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の第１プラスミドを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドを含む。
【００６０】
一部の具現例において、前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、１０ｍＭ濃度のリン酸カリウムを含む。
【００６１】
一部の具現例において、前記液体組成物は、７．０〜８．５範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含む。
【００６２】
一部の具現例において、前記液体組成物は、１．５％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトールを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトールを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトールを含む。
【００６３】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．７５％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．９％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロースを含む。
【００６４】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内のＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内のＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内のＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌを含む。
【００６５】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、疾病を治療する方法に関し、次の段階を含む：疾病にかかった患者に再構成された薬物の有効量を投与する段階であって、前記再構成された薬物は、本発明の前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を再構成することによって生成される段階。
【００６６】
一部の具現例において、前記方法はさらに、水（ｗａｔｅｒ）中に前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させる段階であって、これによって前記再構成された薬物を生成する段階を含む。
【００６７】
一部の具現例において、前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収（ｌｉｇｈｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、吸光度）は、０．００３以下である。一部の具現例において、前記光吸収は、０．００２以下である。一部の具現例において、前記光吸収は０．００１であるか、或いは０．００１未満である。
【００６８】
一部の具現例において、前記疾病は、神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、虚血性疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋肉萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び心臓病（ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる。一部の具現例において、前記疾病は、虚血性四肢疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＤＰＮ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）からなる群から選ばれる。
【００６９】
一部の具現例において、前記投与する段階は、前記再構成された薬物の筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＶＭ２０２の毛細管電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）からの例示的な結果を提供する。前記結果は２つのピークを示す−一方はスーパーコイル状の形態（ｓｕｐｅｒｃｏｌｉｅｄ  ｆｏｒｍ）で、他方は開環状の形態（ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｌｅ  ｆｏｒｍ）である−。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、アニーリング段階の有無に関係なく１回目の小規模凍結乾燥サイクルから様々な剤形の液体状態に対するサブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）ＤＳＣ分析結果を提供する。具体的に、図２ＡはＫＰ８Ｍ２ＳＮに対する結果を提供し、図２ＢはＫＰ８ＭＳ３Ｎに対する結果を提供し、図２ＣはＫＰ８ＭＴ３Ｎに対する結果を提供し、そして図２Ｄは対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する結果を提供する。ガラス転移温度（ｇｌａｓｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｇ’）、共融溶融温度（ｅｕｔｅｃｔｉｃ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｅ）、及び失透温度（ｄｅｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｄ）がグラフに表示されている。
【図３】図３は、ＫＰ８Ｍ２ＳＮ、ＫＰ８ＭＳ３Ｎ、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ及び対照群の１回目の凍結乾燥サイクル中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時変化を提供する。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、凍結乾燥前（図４Ａ）、凍結乾燥後（図４Ｂ）、及び再構成後（図４Ｃ）の１回目の小規模凍結乾燥サイクルから、様々な剤形を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５】図５は、凍結乾燥前又は再構成後の１回目の小規模凍結乾燥サイクルから、ＶＭ２０２剤形の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、アニーリング段階の有無に関係なく２回目の小規模凍結乾燥サイクルから様々な剤形の液体状態に対するサブアンビエントＤＳＣ分析結果を提供する。具体的に、図６Ａは４ＭＳＮに対する結果を提供し、図６Ｂは３ＭＳＮに対する結果を提供し、図６Ｃは２ＭＳＮに対する結果を提供し、そして図６Ｄは対照群に対する結果を提供する。
【図７】図７は、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の一番目のセットの２回目の凍結乾燥サイクル中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時変化を提供する。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、凍結乾燥前（図８Ａ）、凍結乾燥後（図８Ｂ）、及び再構成後（図８Ｃ）の２回目の小規模凍結乾燥サイクルから、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の一番目のセットを含有するバイアルの写真を提供する。
【図９】図９は、凍結乾燥前又は再構成後の２回目の小規模凍結乾燥サイクルから、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の一番目のセットの毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図１０】図１０は、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ、及び対照群の二番目のセットの２回目の凍結乾燥サイクルの二番目中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時変化を提供する。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、凍結乾燥前（図１１Ａ）及び凍結乾燥後（図１１Ｂ）の２回目の小規模凍結乾燥サイクルの二番目から４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ、及び対照群の二番目のセットを含有するバイアルの写真を提供する。図１１Ｃ〜図１１Ｆは、再構成後の４ＭＳＮ（図１１Ｃ）、３ＭＳＮ（図１１Ｄ）、２ＭＳＮ（図１１Ｅ）、及び対照群（図１１Ｆ）の二番目のセットを含むバイアルの写真を示す。
【図１２】図１２は、凍結乾燥前又は再構成後の２回目の小規模凍結乾燥サイクルの二番目から４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の二番目のセットの毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図１３】図１３は、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの凍結乾燥サイクル中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時変化を提供する。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、凍結乾燥前（図１４Ａ）及び凍結乾燥後（図１４Ｂ）の２ＭＳＮ又は２Ｍ１ＳＮを含有するバイアルの写真を提供する。図１４Ｃ〜図１４Ｄは、再構成後の２ＭＳＮ（図１４Ｃ）及び２Ｍ１ＳＮ（図１４Ｄ）を含有するバイアルの写真を示す。
【図１５】図１５は、凍結乾燥前又は再構成後の２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂは、Ｔ＝０において再構成後に２５℃で３日間（図１６Ａ）又は７日間（図１６Ｂ）貯蔵した後の４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群を含有するバイアルの写真を提供する。
【図１７】図１７Ａ及び図１７Ｂは、２５℃で３日間（図１７Ａ）又は７日間（図１７Ｂ）貯蔵した後の４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｃは、２５℃（図１８Ａ）で、４０℃（図１８Ｂ）で又は５℃（図１８Ｃ）で１０週間貯蔵された前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後の４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群を含有するバイアルの写真を提供する。
【図１９】図１９は、４０℃で１０週間貯蔵した後、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、前記剤形が５℃（図２０Ａ）、２５℃（図２０Ｂ）又は４０℃（図２０Ｃ）で貯蔵される時、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群に対する毛細管電気泳動（ＣＥ）結果に基づいて測定されたスーパーコイルＤＮＡ百分率の経時変化を提供する。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、前記剤形が５℃（図２１Ａ）、２５℃（図２１Ｂ）又は４０℃（図２１Ｃ）で貯蔵される時、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群に対する毛細管電気泳動（ＣＥ）結果に基づいて測定された開環状ＤＮＡ百分率の経時変化を提供する
【図２２】図２２Ａ及び図２２Ｂは、再構成後に３日間２５℃で貯蔵された２ＭＳＮ（図２２Ａ）又は２Ｍ１ＳＮ（図２２Ｂ）を含有するバイアルの写真を提供する。図２２Ｃ〜図２２Ｄは、再構成後に７日間２５℃に貯蔵された２ＭＳＮ（図２２Ｃ）又は２Ｍ１ＳＮ（図２２Ｄ）を含有するバイアルの写真を提供する。
【図２３】図２３Ａ及び図２３Ｂは、３日間（図２３Ａ）又は７日間（図２３Ｂ）２５℃で貯蔵した後、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、２５℃（図２４Ａ）、４０℃（図２４Ｂ）、又は５℃（図２４Ｃ）で１０週間貯蔵された前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、２ＭＳＮ又は２Ｍ１ＳＮを含有するバイアルの写真を提供する。
【図２５】図２５は、４０℃で１０週間貯蔵した後、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｃは、前記剤形が５℃（図２６Ａ）、２５℃（図２６Ｂ）又は４０℃（図２６Ｃ）で貯蔵される時、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮに対する毛細管電気泳動（ＣＥ）結果に基づいて測定されたスーパーコイルＤＮＡ百分率の経時変化を提供する
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、前記剤形が５℃（図２７Ａ）、２５℃（図２７Ｂ）又は４０℃（図２７Ｃ）で貯蔵される時、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮに対する毛細管電気泳動（ＣＥ）結果に基づいて測定された開環状ＤＮＡ百分率の経時変化を提供する。
【図２８】図２８は、実施例２で用いられる凍結乾燥サイクル中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時変化を提供する。
【図２９】図２９は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ１を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３０】図３０は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ２を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３１】図３１は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ３を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３２】図３２は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ４を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３３】図３３は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ５を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３４】図３４は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例２のＦ６を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３５】図３５は、実施例２のＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４及びＦ５の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する。
【図３６】図３６は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ１を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３７】図３７は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ２を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３８】図３８は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ３を含有するバイアルの写真を提供する。
【図３９】図３９は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ４を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４０】図４０は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ５を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４１】図４１は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ６を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４２】図４２は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ７を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４３】図４３は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ８を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４４】図４４は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例３のＦ９を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４５】図４５は、実施例３のＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する（表４０）。
【図４６】図４６は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ１を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４７】図４７は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ２を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４８】図４８は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ３を含有するバイアルの写真を提供する。
【図４９】図４９は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ４を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５０】図５０は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ５を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５１】図５１は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ６を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５２】図５２は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ７を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５３】図５３は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ８を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５４】図５４は、白色背景（左側）又は黒色背景（右側）にわたって、前記凍結乾燥した剤形の再構成前又は後に、実施例４のＦ９を含有するバイアルの写真を提供する。
【図５５】図５５は、実施例４のＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９の毛細管電気泳動（ＣＥ）からの結果を提供する（表４４）。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
これらの図面は、単に例示の目的で本発明の様々な実施例を示す。当業者には、次の議論から、本願に述べられた構造及び方法の代案的な実施例が本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく利用可能であることが容易に認識できよう。
【００７２】
１．定義
【００７３】
特に断りのない限り、本願に使われる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で使われるように、次の用語は、下記の意味を有する。
【００７４】
本願に使われる用語“液体組成物（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”は、プラスミドＤＮＡ及び少なくとも一つの薬剤学的に許容される賦形剤を含み、本願に記載のとおり、凍結乾燥した薬剤学的組成物を生成するために凍結乾燥できる液体形態の組成物を意味する。
【００７５】
本願に使われる用語“凍結乾燥した組成物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”又は“凍結乾燥した薬剤学的組成物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”は、凍結乾燥によって製造される乾燥形態の任意の組成物又は薬剤学的組成物を意味する。“凍結乾燥させる（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）”又は“凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）”は、真空下に凍結された状態で脱水後に行われる任意の凍結工程を広範囲に意味するもので、当業者に理解される意味を有する。凍結乾燥した組成物は、注射のために再構成可能である。
【００７６】
本願に使われる用語“再構成された（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）”又は“再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”は、保存及び貯蔵のために以前に変更された物質の元来形態への復元、例えば再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）、すなわち、以前に凍結乾燥して貯蔵されたＤＮＡプラスミド剤形の液体状態への復元を意味する。本発明の凍結乾燥した組成物は、薬剤学的投与に適した安定な溶液を生成する任意の水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で再構成可能である。このような水溶液は、滅菌水（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｗａｔｅｒ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、Ｔｒｉｓバッファー及び生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）を含むが、これに制限されない。
【００７７】
本願に使われる用語“分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）”又は“生物学的に純粋な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）”は、その本来の状態で発見されるように、物質に正常に伴われる成分が実質的にない物質を意味する。したがって、本願に用いられる分離されたプラスミドＤＮＡは、バクテリアタンパク質、脂質又は細胞壁成分のようなｉｎ  ｓｉｔｕ環境でプラスミドＤＮＡと正常に関連した成分が実質的にない。
【００７８】
本願に使われる用語“ＶＭ２０２”は、ｐＣＫベクター（配列番号５）及びｐＣＫベクターにクローニングされたＨＧＦ−Ｘ７（配列番号１３）を含む、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７とも呼ばれるプラスミドＤＮＡを意味する。ＶＭ２０２は、２００２年３月１２日に寄託番号ＫＣＣＭ−１０３６１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にブダペスト条約に基づいて寄託された。
【００７９】
本願に使われる用語“ＨＧＦの異型体（ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＨＧＦ）”は、動物から自然に発生するＨＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記用語は、任意の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）野生型ＨＧＦポリペプチドと少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、自然に発生するＨＧＦ対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）又は欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ）と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明における使用に好適なＨＧＦの異型体は、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＨＧＦ，ｆｌＨＧＦ）（同義語としてｆＨＧＦ）、欠失された変異体ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ＨＧＦ，ｄＨＧＦ）、ＮＫ１、ＮＫ２及びＮＫ４からなる群から選ばれる２個以上の異型体を含む。本発明のより好ましい具現例によれば、本願に記載の方法に用いられるＨＧＦの異型体は、ｆｌＨＧＦ（配列番号１）及びｄＨＧＦ（配列番号２）を含む。
【００８０】
用語“ヒトｆｌＨＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｆｌＨＧＦ）”、“ｆｌＨＧＦ”及び“ｆＨＧＦ”は、ヒトＨＧＦタンパク質のアミノ酸１−７２８で構成されたタンパク質を意味するために本願において互いに同じ意味で使われる。ｆｌＨＧＦの配列は、配列番号１に提供される。
【００８１】
用語“ヒトｄＨＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｄＨＧＦ）”及び“ｄＨＧＦ”は、ヒトＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって生成されたＨＧＦタンパク質の欠失された変異体を意味するために本願において互いに同じ意味で使われる。具体的に、“ヒトｄＨＧＦ”又は“ｄＨＧＦ”は、全長ＨＧＦ配列から、アルファ鎖（ｃｈａｉｎ）の最初のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）において５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳ）が欠失されたヒトＨＧＦタンパク質を意味する。ヒトｄＨＧＦは、７２３個アミノ酸長である。ヒトｄＨＧＦのアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。
【００８２】
本願に使われる用語“ＩＧＦ−１の異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ＩＧＦ−１）”、“ヒトＩＧＦ−１異型体（ｈｕｍａｎ  ＩＧＦ−１ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“ＩＧＦ−１異型体（ＩＧＦ−１ｉｓｏｆｏｒｍ）”は、自然に発生するヒトｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ポリペプチドのいずれか一つのアミノ酸配列、又はその対立遺伝子変異体、スプライス変異体、又は欠失変異体と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。自然に発生するｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ポリペプチドは、クラスＩ、Ｅｃ（配列番号２５）；クラスＩＩ、Ｅａ（配列番号２７）；クラスＩ、Ｅｂ（配列番号２９）；及びクラスＩ、Ｅａ異型体（配列番号２３）を含む。
【００８３】
用語“異型体＃１（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃１）”、“クラスＩ、Ｅｃ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，Ｅｃ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅｃ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅｃ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅｃ（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅｃ）”は、配列番号２５のポリペプチドを指すために、本願において互いに同じ意味で使われる。
【００８４】
用語“異型体＃２（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃２）”、“クラスＩＩ、Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ  ＩＩ，Ｅａ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩＩ、ＩＧＦ−１Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ  ＩＩ，ＩＧＦ−１Ｅａ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩＩ、ＩＧＦ−１Ｅａ（Ｃｌａｓｓ  ＩＩ，ＩＧＦ−１Ｅａ）”は、配列番号２７のポリペプチドを指すために、本願において互いに同じ意味で使われる。
【００８５】
用語“異型体＃３（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃３）”、“クラスＩ、Ｅｂ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，Ｅｂ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅｂ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅｂ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅｂ（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅｂ）”は、配列番号２９のポリペプチドを意味するために本願において互いに同じ意味で使われる。
【００８６】
用語“異型体＃４（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃４）”、“クラスＩ、Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，Ｅａ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”、“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅａ異型体（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅａ  ｉｓｏｆｏｒｍ）”又は“クラスＩ、ＩＧＦ−１Ｅａ（Ｃｌａｓｓ  Ｉ，ＩＧＦ−１Ｅａ）”は、配列番号２３のポリペプチドを意味するために本願において互いに同じ意味で使われる。
【００８７】
本願に使われる用語“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”は、（ａ）疾病の症状を抑制すること；（ｂ）疾病の症状を緩和させること；及び（ｃ）疾病の症状を除去すること、のうち少なくとも一つを意味する。一部の具現例において、本発明の組成物は、神経病症、虚血性疾患、筋肉萎縮症又は心臓病に関連した症状を治療できる。
【００８８】
本願に使われる用語“治療的有効容量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）”又は“有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）”は、投与されて好ましい効果を生成する容量（ｄｏｓｅ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）を意味する。本方法の脈絡において、治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）は、疾病の症状を治療するのに効果的な量である。正確な容量又は量は、治療の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者にとって確認できよう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）  Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ参照）。
【００８９】
本願に使われる用語“十分な量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｏｕｎｔ）”は、所望の効果を生成するのに十分な量を意味する。
【００９０】
本願に使われる用語“縮退性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”は、参照核酸配列から翻訳されたものと同じアミノ酸配列を提供するように翻訳され得る核酸配列を意味する。
【００９１】
２．他の解釈規則（Ｏｔｈｅｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）
【００９２】
本願に引用された範囲は、引用された終末点を含めて範囲内の全ての値に対して略称（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ）されたものと理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０からなる群から任意の数字（ｎｕｍｂｅｒ）、数字の組合せ、又は下位範囲を含むものと理解される。
【００９３】
特に指示されない限り、一つ以上の立体中心を有する化合物に対する言及は、それぞれの立体異性質体、及びこれらの立体異性質体の全ての組合せを意図する。
【００９４】
３．凍結乾燥した薬剤学的組成物
【００９５】
一番目の態様において、凍結乾燥した薬剤学的組成物が提示される。前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、プラスミドＤＮＡを含み、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる：
【００９６】
ａ．第１プラスミドのプラスミドＤＮＡ；
【００９７】
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
【００９８】
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
【００９９】
ｄ．０．５％超過及び１．１％未満（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
【０１００】
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ。
【０１０１】
前記第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものでよい。
【０１０２】
３．１．プラスミドＤＮＡ
【０１０３】
前記液体組成物は、薬剤学的組成物の活性成分であるプラスミドＤＮＡを含む。前記プラスミドＤＮＡは、遺伝子療法のための遺伝物質を含むことができる。具体的に、前記プラスミドＤＮＡは、欠陥遺伝子又は転写体の機能を矯正できるか、ポリペプチド、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コーディング又は非コーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物質（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードできる。遺伝子療法に用いられる当業界に公知の任意のプラスミドＤＮＡを含有する剤形は、本発明の範囲内に属する。
【０１０４】
前記液体組成物は、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の以後の再構成が、前記再構成された薬物の治療的適用に効果的な濃度を提供可能にする濃度でプラスミドＤＮＡを含むことができる。前記プラスミドＤＮＡの濃度は、伝達される組成物の量、治療される疾病、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の年齢及び体重、伝達方法、及び投与経路などをはじめとする様々な要因によって調整可能である。
【０１０５】
具体的に、前記液体組成物は、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１〜３ｍｇ／ｍｌ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌ、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でプラスミドＤＮＡを含むことができる。
【０１０６】
前記プラスミドＤＮＡは、３，０００〜１５，０００個の塩基対、３，０００〜１０，０００個の塩基対、３，０００〜９，０００個の塩基対、３，０００〜８，０００個の塩基対、３，０００〜７，０００個の塩基対、３，０００〜６，０００個の塩基対、３，０００〜５，０００個の塩基対、４，０００〜８，０００個の塩基対、４，０００〜７，５００個の塩基対、４，０００〜６，０００個の塩基対、６，０００〜９，０００個の塩基対、又は７，０００〜８，０００個の塩基対の長さのポリヌクレオチドでよい。前記プラスミドＤＮＡは、本願に提供された範囲内に属する長さのポリヌクレオチドであってもよい。
【０１０７】
３．１．１．ベクター
【０１０８】
本発明の方法に用いられたプラスミドＤＮＡは、典型的に発現した配列に作動可能に連結された一つ以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を有するベクターを含む。前記調節配列は、タンパク質（例えば、ＨＧＦ又はＩＧＦ−１の一つ以上の異型体）の発現を調節する。
【０１０９】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現コンストラクトにおいてプロモーターに作動可能に連結されたものが好ましい。用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”は、核酸発現制御配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（プロモーター、信号配列、又は多数の転写因子結合部位のような）と二番目の核酸配列間の機能的連結を意味し、ここで、発現制御配列は、転写及び／又は二番目の配列に相応する核酸の翻訳に影響を及ぼす。
【０１１０】
典型的な具現例において、ポリヌクレオチドに連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドの転写を制御するために、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物細胞で作動可能であり、哺乳動物細胞のゲノム又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ７．５Ｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ベータ−アクチンプロモーター（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ヒトＩＬ−２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子プロモーター（ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子プロモーターを含むが、これに制限されない。より好ましくは、本発明に有用なプロモーターは、ヒトＣＭＶ（ｈｕｍａｎ  ＣＭＶ，ｈＣＭＶ）又はＥＦ１アルファプロモーターのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙ）遺伝子、最も好ましくはｈＣＭＶ  ＩＥ遺伝子由来プロモーター／エンハンサー、及びＡＴＧ開始コドンの直前に配列にわたったエクソン１及びエクソン２の全配列を含む５’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）から由来したプロモーターである。
【０１１１】
本発明に用いられた発現カセットは、ポリアデニル化配列を含むことができ、例えば、ウシ成長ホルモン終結子（ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（ＳＶ４０−  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１  ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンポリＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ  ＴＫポリＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ  Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５  Ｂｉｏｌ．５：２１０４−２１１３（１９８５））又はポリオマウイルスポリＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これに制限されない。
【０１１２】
現在、好ましい具現例において、前記ベクターは、ｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸ１、ｐＴｘ又はｐＣＹである。特に好ましい具現例において、前記ベクターはｐＣＫであり、その細部事項は、ＷＯ２０００／０４０７３７及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７２：２３０・２３５（２０００）から見出すことができ、これら両方ともその全文が本願に参照によって組み込まれる。ｐＣＫ（Ｔｏｐ１０−ｐＣＫ）で形質転換された大腸菌は、２００３年３月２１日付ブダペスト条約に基づいて韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０４７６）。ｐＣＫ−ＶＥＧＦ１６５で形質転換された大腸菌（すなわち、ＶＥＧＦコーディング配列を有するｐＣＫベクター−Ｔｏｐ１０−ｐＣＫ／ＶＥＧＦ１６５’）は、１９９９年１２月２７日付ブダペスト条約に基づいて韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０１７９）。
【０１１３】
前記ｐＣＫベクターは、遺伝子、例えばＨＧＦ遺伝子又はＩＧＦ−１遺伝子の発現がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター下で調節されるように構成され、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２：２３０（２０００）；ＷＯ２０００／０４０７３７に細部事項が開示されており、これら両者ともその全文が参照によって組み込まれている。ｐＣＫベクターは人体に対する臨床試験に用いられ、その安全性及び効能（ｅｆｆｉｃａｃｙ）が確認された（Ｈｅｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８：７８８（２０１１））。
【０１１４】
他の好ましい具現例において、前記ベクターは、ｐＣＫから由来したプラスミドベクターであるｐＴｘ（配列番号１５）である。ｐＴｘは、ｐＣＫの２個の順次的連続の突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって生成された。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）とｐＣＫのＣｏｌＥ１間の不要な配列を除去するために、一番目の欠失突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）キャンペーンが行われた。具体的に、一番目のプライマー対（配列番号１７及び１８）を用いて欠失突然変異誘発ＰＣＲ（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＰＣＲ）を行った。カナマイシン耐性とＣｏｌＥ１間の２２８個塩基対の欠失は、プラスミドをシーケンシングすることによって確認された。その後、ＨＣＭＶイントロン配列の大きさを最適化するために、二番目のプライマー対（配列番号１９及び２０）を用いて二番目の欠失突然変異誘発キャンペーンが行われた。ＩＥ１エクソン１とエクソン２との間のＨＣＭＶイントロン配列（４２１塩基対）が欠失され、この欠失をシーケンシングから確認した。
【０１１５】
３．１．２．ヒトＨＧＦをコードするプラスミドＤＮＡ
【０１１６】
一部の具現例において、前記プラスミドＤＮＡは、ヒトＨＧＦ又はその変異体をコードする。
【０１１７】
肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）は、散乱因子（ｓｃａｔｔｅｒｆａｃｔｏｒ）又はヘパトポエチン−Ａ（ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ−Ａ）とも知られたヘパリン結合糖タンパク質である。ヒトＨＧＦをコードする内因性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ）は、染色体７ｑ２１．１に位置し、１８個のエクソン及び１７個のイントロンを含む（Ｓｅｋｉ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０２：２１３−２１９（１９９１））。ＨＧＦ遺伝子から約６ｋｂの転写体が転写され、その後、７２８個のアミノ酸で構成されたポリペプチドＨＧＦ前駆体（ｆｌＨＧＦ）が合成される。同時に、７２３個のアミノ酸で構成されたｄＨＧＦ前駆体のポリペプチドはまた、ＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシングによって合成される。生物学的に不活性である前駆体は、血清においてタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって活性形態の二硫化結合ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）に転換され得る。ヘテロダイマーにおいて、高分子量（ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を有するアルファ鎖（ｃｈａｉｎ）は、４個のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）及びプラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）の前活性されたペプチド領域（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のようなＮ末端ヘアピンループ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｌｏｏｐ）を形成する。約８０個のアミノ酸で構成された三重二硫化結合されたループ構造のクリングルドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用において重要な役割を果たすことができる。低分子量（ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）ベータ鎖は、不活性セリンプロテアーゼ様ドメイン（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）を形成する。７２３個のアミノ酸で構成されたｄＨＧＦは、アルファ鎖の最初のクリングルドメインにおいて５個のアミノ酸、すなわち、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳの欠失があるポリペプチドである。
【０１１８】
ＨＧＦは、次を含む様々な生物学的機能を有する：例えば、１）上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）を管状構造（ｔｕｂｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に誘導する機能；２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）から血管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を刺激する機能；３）その抗アポトーシス活性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）によって肝及び腎臓を再生する機能；４）腎臓、卵巣及び睾丸の器官形成（ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）；５）骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を調節する機能；６）赤血球造血前駆体細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）の成長及び分化を刺激する機能；及び７）ニューロンの軸索発芽（ａｘｏｎ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）（Ｓｔｅｌｌａ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３１：１３５７−１３６２（１９９９））。これらの様々な機能に基づいて、ＨＧＦ又はＨＧＦをコードする遺伝子又はその変異体が治療剤として開発可能である。
【０１１９】
実際に、ヒトＨＧＦの一つ以上の異型体をコードするプラスミドは、米国特許番号第７，８１２，１４６号、第８，３３８，３８５号及び第８，３８９，４９２号、及び米国公開番号第２０１４０２９６１４２号及び第２０１６０２５０２９１号に記載の通り、様々な疾患を治療するために開発され使用されており、本明細書においてその全体が参照によって組み込まれる。前記プラスミドは、本発明開示内容の様々な具現例において使用可能である。
【０１２０】
具体的に、前記プラスミドは、それぞれの異型体コーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによってＨＧＦの２個以上の異型体を発現させることができる。一部の具現例において、前記コンストラクトは、例えば、（１）発現調節配列−（２）最初の異型体のコーディング配列−（３）ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−（４）二番目の異型体のコーディング配列−（５）転写終結配列の順に２個のコーディング配列間のＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳから翻訳し始まるようにし、単一のコンストラクトから関心のある２個の遺伝子の発現を許容する。さらに他の具現例において、それぞれのＨＧＦの単一異型体を暗号化する複数のコンストラクトは、投与される対象においてＨＧＦの一つ以上の異型体の発現を誘導するために共に用いられる。
【０１２１】
本発明の方法の好ましい具現例は、選択的スプライシング部位を含むことによって、２つ以上の異なる類型のＨＧＦの異型体、すなわち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを同時に発現するコンストラクトを使用する。選択的スプライシングによってＨＧＦの２個の異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）をコードするコンストラクトは、ＨＧＦの１個の異型体（ｆｌＨＧＦ又はｄＨＧＦのいずれか一方）をコードするコンストラクトに比べて遥かに高い（殆ど２５０倍さらに高い）発現効率を有するということは、本願に参照によって含まれた米国特許第７，８１２，１４６号から既に立証された。典型的な具現例において、前記コンストラクトは、（ｉ）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１−４を含む第１配列（配列番号３）又は第１配列の縮退性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；（ｉｉ）ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む第２配列（配列番号６）又は第２配列の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）；及び（ｉｉｉ）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５−１８を含む第３配列（配列番号４）又は第３配列の縮退性配列を含む。コンストラクトから、エクソン４とエクソン５間の選択的スプライシングによってＨＧＦの２個の異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）が生成され得る。
【０１２２】
一部の具現例において、前記コンストラクトは、全配列のイントロン４を含む。一部の具現例において、前記コンストラクトは、イントロン４の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。好ましい具現例において、前記コンストラクトは、配列番号７〜配列番号１４からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。配列番号７のヌクレオチド配列は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦをコードする７１１３ｂｐポリヌクレオチドに相応し、イントロン４の全配列を含む。配列番号８〜１４のヌクレオチド配列は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦをコードするポリヌクレオチドに相応し、様々なイントロン４の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。
【０１２３】
ヒトＨＧＦのエクソン１−１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４に相応するｃＤＮＡ又はその断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む様々な核酸コンストラクトは、“ＨＧＦ−Ｘ”と命名され、米国特許第７，８１２，１４６号に記載の通りに固有番号が付く。出願人によってテストされたＨＧＦ−Ｘは、ＨＧＦ−Ｘ１（配列番号７）、ＨＧＦ−Ｘ２（配列番号８）、ＨＧＦ−Ｘ３（配列番号９）、ＨＧＦ−Ｘ４（配列番号１０）、ＨＧＦ−Ｘ５（配列番号１１）、ＨＧＦ−Ｘ６（配列番号１２）、ＨＧＦ−Ｘ７（配列番号１３）、及びＨＧＦ−Ｘ８（配列番号１４）を含むが、これに制限されない。
【０１２４】
ＨＧＦの２個の異型体（すなわち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）は、それぞれのコンストラクトからエクソン４とエクソン５間の選択的スプライシングによって生成できるということが既に立証された。また、様々なＨＧＦコンストラクトのうち、ＨＧＦ−Ｘ７は、米国特許第７，８１２，１４６号に開示の通りにＨＧＦの２個の異型体（すなわち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）の最高レベルの発現を示しており、その全体内容が本願に参照によって含まれる。したがって、ＨＧＦ−Ｘ７を含む核酸コンストラクトは、本発明の方法の好ましい具現例で使用可能である。
【０１２５】
特に好ましい具現例において、ＨＧＦ−Ｘ７発現配列を含有するｐＣＫプラスミドは、本発明の方法において核酸コンストラクトとして用いられる。具体的に、ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７（“ＶＭ２０２”ともいう。）を使用することができる。ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７は、ｐＣＫベクター（配列番号５）及びｐＣＫベクターにクローニングされたＨＧＦ−Ｘ７（配列番号１３）を含むコンストラクトである。ｐＣＫ−ＨＧＦ−Ｘ７は、２００２年３月１２日付に寄託番号ＫＣＣＭ−１０３６１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にブダペスト条約に基づいて寄託された。
【０１２６】
本願に記載の方法に用いられたＨＧＦ異型体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、野生型ヒトＨＧＦ異型体の配列と実質的に同じアミノ酸配列及びヌクレオチド配列をさらに含むことができる。前記実質的な同一性は、野生型ヒトＨＧＦ異型体のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が最大限に配列と整列されて少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。比較のための配列整列方法は、当業界に広く公知されている。具体的に、ＮＢＣｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）ウェブサイトのＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）に開示され、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと連結されて用いられる整列アルゴリズム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を、百分率同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定するために用いることができる。
【０１２７】
３．１．３．  ＩＧＦ−１をコードするプラスミドＤＮＡ
【０１２８】
一部の具現例において、前記プラスミドＤＮＡは、ヒトＩＧＦ−１又はその変異体をコードする。
【０１２９】
インスリン様成長因子１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １，ＩＧＦ−１）は、幼い時期に成長に重要な役割を担い、成人において同化効果（ａｎａｂｏｌｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を有するインスリンと分子構造が類似なホルモンである。ヒトＩＧＦ−１遺伝子はほとんど９０ｋｂのゲノムＤＮＡに亘っている６個のエクソン（エクソン１、２、３、４、５及び６（６−１及び６−２））を含有する。エクソン１及び２は、相互排他的リーダ（ｌｅａｄｅｒ）エクソンであり、それぞれ可変的に用いられる多数のプロモーター部位を有する。また、ＩＧＦ−１遺伝子は、多数の転写体変異体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ）を生成するために個別にスプライシングされ得る。それぞれの転写体変異体は、可変信号伝達ペプチドリーダ配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する異なるｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１タンパク質（“ＩＧＦ−１異型体”）をコードする。しかし、全ての転写体異型体は、加工後に同じ受容体を使用する同じ成熟した７０−アミノ酸ＩＧＦ−１ペプチドを発生させる。
【０１３０】
前記ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ペプチドは、そのリーダ（ｌｅａｄｅｒ）、又は信号、配列及びそのカルボキシ（Ｃ）末端において異なる。エクソン１又はエクソン２の挿入は相互排他的であり、このいずれか一方は、ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ペプチドのリーダ配列として機能し；他方のリーダエクソンは、他の５’−ＵＴＲを生成する。前記ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ポリペプチドは、転写後にタンパク質分解性切断を経てリーダ及びＥ−ペプチドカルボキシ末端を除去して、成熟した７０−アミノ酸ＩＧＦ−１を生成する。
【０１３１】
エクソン１を含有する転写体は、クラス１転写体（例えば、クラスＩ、Ｅｃ；クラスＩ、Ｅｂ；及びクラスＩ、Ｅａ）と呼ばれるが、エクソン２を含有する転写体は、クラス２転写体（例えば、クラスＩＩ、Ｅａ）と呼ばれる。ほぼ全てのｐｒｅ−ｐｒｏペプチドは、エクソン１又は２を含むことから誘導された残り信号配列を有するエクソン３から由来した信号伝達ペプチド（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に２７個アミノ酸を含む。２２個アミノ酸のより短い信号伝達ペプチドを生成するエクソン３内において少数の転写体は、異なる転写開始サイトを用いる。エクソン３及び４は変わらず、成熟したＩＧＦ−１ペプチドのＢ、Ｃ、Ａ及びＤドメインをコードする；エクソン４は、成熟したＩＧＦ−１ペプチドの３分の２をコードする。前記ヒトＥｂペプチドは、単にエクソン４及び５で構成されるのに対し、Ｅｃは、エクソン４、５、及び６を含有する。
【０１３２】
選択的スプライシング及び相互排他的転写開始は、異なるｐｒｅ−ｐｒｏ−ＩＧＦ−１ポリペプチド（すなわち、ＩＧＦ−１異型体）の生成を招く。具体的に、少なくともエクソン１、３／４、５及び６の断片を含むクラスＩ、Ｅｃ  ＩＧＦ−１異型体（配列番号２５）は、配列番号２６の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン２、３／４及び６の断片を含むクラスＩＩ、Ｅａ  ＩＧＦ−１異型体（配列番号２７）は、配列番号２８の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４及び５の断片を含むクラスＩ、Ｅｂ  ＩＧＦ−１異型体（配列番号２９）は、配列番号３０の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４及び６の断片を含むクラスＩ、Ｅａ  ＩＧＦ−１異型体（配列番号２３）は、配列番号２４の配列を含む転写体から生成される。
【０１３３】
様々な転写体から由来した成熟したＩＧＦ−１タンパク質は異ならないが、様々な転写体異型体は、異なる調節役割を有することが提案された。前記変異体形態は、異なる安定性、結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ）及び異型体に対する主要調節役割を示す活性を有する。エクソン１を有するクラスＩ異型体は、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）／傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）であり、エクソン２を有するクラスＩＩ異型体は、内分泌（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）の形態で分泌されると仮定されたが、異型体の生物学的重要性は不明である。これは、クラスＩＩ転写体が、効率的な分泌と関連した典型的な信号ペプチドモチーフを含むのに対し、クラスＩ転写体は、分泌を妨害できるより長い信号伝達ペプチドを有するという発見に基づく。
【０１３４】
ヒトＩＧＦ−１の一つ以上の異型体をコードするプラスミドは、米国出願第１６／５１３，５６０号及び／又は第１６／５１３，５６４号に記載の通り、神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）を治療するために開発され試験され、これはその全文が本願に参照によって含まれる。前記プラスミドは、本発明開示内容の様々な具現例で使用可能である。
【０１３５】
具体的に、一部の具現例において、前記プラスミドは、ＩＧＦ−１異型体のうち一つのコーディング配列を含有する。例えば、前記ＤＮＡコンストラクトは、クラスＩ、Ｅａ（配列番号２４）；クラスＩ、Ｅｂ（配列番号３０）；クラスＩ、Ｅｃ（配列番号２６）；又はクラスＩＩ、Ｅａ（配列番号２８）をコードする配列を含むことができる。
【０１３６】
一部の具現例において、前記ＤＮＡコンストラクトは、それぞれの異型体コーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによって、一つ以上のＩＧＦ−１異型体を発現できるＤＮＡコンストラクトである二重発現コンストラクトである。一部の具現例において、前記コンストラクトは、例えば、（１）発現調節配列−（２）最初の異型体のコーディング配列−（３）ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−（４）二番目の異型体のコーディング配列−（５）転写終結配列の順に２個のコーディング配列間のＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳ配列から翻訳し始まるようにし、単一転写体から２個のタンパク質生成物の発現を許容する。さらに他の具現例において、それぞれＩＧＦ−１の単一異型体をコードする複数のコンストラクトは、投与される対象においてＩＧＦ−１の一つ以上の異型体の発現を誘導するために共に用いられる。
【０１３７】
好ましい具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、２個以上のＩＧＦ−１異型体、例えば、（ｉ）クラスＩ、Ｅｃ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃１）及びクラスＩＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃２）；（ｉｉ）クラスＩ、Ｅｃ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃１）及びクラスＩ、Ｅｂ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃３）；（ｉｉｉ）クラスＩ、Ｅｃ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃１）及びクラスＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃４）；（ｉｖ）クラスＩＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃２）及びクラスＩ、Ｅｂ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃３）；（ｖ）クラスＩＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃２）及びクラスＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃４）；（ｖｉ）クラスＩ、Ｅｂ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃３）及びクラスＩ、Ｅａ異型体（Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＃４）を選択的スプライシング部位を含むことによって同時に発現させることができる。
【０１３８】
例えば、ＤＮＡコンストラクトは、（ｉ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のエクソン１、３及び４を含む第１配列（配列番号３１）又は第１配列の縮退性配列；（ｉｉ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のイントロン４を含む第２配列（配列番号３２）又は第２配列の断片；（ｉｉｉ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のエクソン５及び６−１を含む第３配列（配列番号３３）又は第３配列の縮退性配列；（ｉｖ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のイントロン５を含む第４配列（配列番号３４）又は第２配列の断片；及び（ｖ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のエクソン６−２を含む第５配列（配列番号３５）又は第５配列の縮退性配列を含むことができる。イントロン４及び５は選択的にスプライシングされてよく、その結果、ＩＧＦ−１の２個の異型体（例えば、クラスＩ、Ｅｃ、及びクラスＩ、Ｅａ）が生成される。
【０１３９】
一部の具現例において、ＤＮＡコンストラクトは、一つ以上のＩＧＦ−１異型体を発現させるその能力と関連してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。好ましい具現例において、クラスＩ、Ｅｃ及びクラスＩ、Ｅａ  ＩＧＦ−１異型体を全て発現できるＤＮＡコンストラクトが選択される。
【０１４０】
（ｉ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のエクソン１−６及び（ｉｉ）ヒトＩＧＦ−１遺伝子のイントロン４及び５、又はイントロン４及び５の様々な断片に相応するｃＤＮＡを含む様々なＤＮＡコンストラクトは、固有番号によって“ＩＧＦ−１Ｘ”と命名される。出願人によって試験されたＩＧＦ−１Ｘコンストラクトは、ＩＧＦ−１Ｘ１、ＩＧＦ−１Ｘ２、ＩＧＦ−１Ｘ３、ＩＧＦ−１Ｘ４、ＩＧＦ−１Ｘ５、ＩＧＦ−１Ｘ６、ＩＧＦ−１Ｘ７、ＩＧＦ−１Ｘ８、ＩＧＦ−１Ｘ９及びＩＧＦ−１Ｘ１０を含むが、これに制限されない。試験されたコンストラクトのうち、ＩＧＦ−１Ｘ６及びＩＧＦ−１Ｘ１０は、クラスＩ、Ｅｃ及びクラスＩ、Ｅａ  ＩＧＦ−１異型体を全て発現させることが確認された。
【０１４１】
好ましい具現例において、ＩＧＦ−１Ｘ６（配列番号２１）又はＩＧＦ−１Ｘ１０（配列番号２２）が用いられる。ＩＧＦ−１Ｘ６（配列番号２１）及びｐＣＫベクターにクローニングされたＩＧＦ−１Ｘ１０（配列番号２２）はそれぞれ、ｐＣＫ−ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＩＧＦ−１Ｘ１０と命名される。ｐＣＫ−ＩＧＦ−１Ｘ６で形質転換された大腸菌細胞（“ＤＨ５α＿ｐＣＫ−ＩＧＦ１Ｘ６”）は、ブダペスト条約に基づいて韓国生物資源センター（Ｋｏｒｅａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＫＣＴＣ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）大韓民国、５６２１２、チョルラプク−ト、チョンウブ−シ、イブシンギル１８１）に寄託番号ＫＣＴＣ１３５３９ＢＰとして２０１８年５月３０日付に寄託された。ｐＣＫ−ＩＧＦ−１Ｘ１０で形質転換された大腸菌細胞（“ＤＨ５α＿ｐＣＫ−ＩＧＦ１Ｘ１０”）は、ブダペスト条約に基づいて韓国生物資源センター（Ｋｏｒｅａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＫＣＴＣ、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）大韓民国、５６２１２、チョルラプク−ト、チョンウブ−シ、イブシンギル１８１）に寄託番号ＫＣＴＣ１３５４０ＢＰとして２０１８年５月３０日付に寄託された。
【０１４２】
一部の具現例において、ｐＴｘプラスミドは、ＩＧＦ−１Ｘ６（すなわち、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６）又はＩＧＦ−１Ｘ１０（すなわち、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０）を含有する。例えば、５’でＣｌａＩエンザイム及び３’でＳａｌ１エンザイムで分解されたｐＴｘにおいてＩＧＦ−１Ｘ１０をライゲーションして（ｌｉｇａｔｉｎｇ）生成されたｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０（配列番号１６）を用いることができる。
【０１４３】
一部の具現例において、ｐＴｘプラスミドは、ＩＧＦ−１Ｅｃ又はＩＧＦ−１Ｅａを含有する。例えば、ｐＴｘにおいてＩＧＦ−１Ｅｃ（配列番号２６）をライゲーションすることによってｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃが生成され、ｐＴｘにおいてＩＧＦ−１Ｅａ（配列番号２４）をライゲーションすることによってｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａが生成される。プラスミドはそれぞれ、ＩＧＦ−１Ｅｃ異型体（配列番号２５）又はＩＧＦ−１Ｅａ異型体（配列番号２３）を発現させる。
【０１４４】
本願に記載されたＩＧＦ−１異型体をコードするＩＧＦ−１異型体又はプラスミドは、野生型ヒトＩＧＦ−１異型体から変形を含むことができる。変形された配列が最大限に野生型ヒトＩＧＦ−１異型体配列と整列されるとき、変形された配列は、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むことができる。比較のための配列整列方法は、当業界に広く公知されている。具体的に、ＮＢＣｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）ウェブサイトのＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）に開示され、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと連結されて用いられる整列アルゴリズム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を百分率同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定するために用いることができる。
【０１４５】
３．１．４  ＳＤＦ−１αをコードするプラスミドＤＮＡ
【０１４６】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  １２，ＣＸＣＬ１２）とも知られた、ストロマ細胞由来因子１（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １，ＳＤＦ−１）は、ヒトにおいて染色体１０番のＣＸＣＬ１２遺伝子によってコードされるケモカインタンパク質である。これは、多くの組織及び細胞類型において非常に多く（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）発現する。ストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）及び１β（ＳＤＦ−１β）は、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）ファミリーに属する小さいサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であり、これらの構成員は、白血球を活性化させ、しばしば脂質多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ＴＮＦ又はＩＬ１のような前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）刺激によって誘導される。ＳＤＦ−１は、同じ遺伝子の選択的スプライシングによってＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２ａ及びＳＤＦ−１β／ＣＸＣＬ１２ｂの２個の形態で生産される。
【０１４７】
ヒトＳＤＦ−１の一つ以上の異型体をコードするプラスミドは、その全文が本願に参照によって含まれた米国出願第１５／５１４，２４４号に記載された通り、末梢血管疾病を治療するために開発され試験された。具体的に、ＳＤＦ−１αをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＨＧＦをコードするポリヌクレオチドと共に投与されるとき、血管内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）移動及び血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を効果的に促進させた。
【０１４８】
ＳＤＦ−１の一つ以上の異型体をコードするプラスミドを、本開示内容の様々な具現例において用いることができる。一部の具現例において、米国出願第１５／５１４，２４４号に開示された一つ以上のＳＤＦ−１をコードするプラスミドが用いられる。一部の具現例において、ＳＤＦ−１αのコーディング配列を含むプラスミドが用いられる。一部の具現例において、ＳＤＦ−１βのコーディング配列を含むプラスミドが用いられる。一部の具現例において、ＳＤＦ−１α及びＳＤＦ−１βの両方をコードするプラスミドが用いられる。特定具現例において、配列番号３６の配列を含むプラスミドが用いられる。
【０１４９】
３．２．バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ）
【０１５０】
液体組成物は、薬剤学的組成物のｐＨを維持するためにバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）をさらに含む。前記バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）は、当業界に公知のバッファー化合物、例えば、ＴＡＰＳ、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＰＯＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩（Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）又はＭＥＳを含むことができる。前記バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）は、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸カリウム（ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホウ酸（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）又はジエチルバルビツール酸（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含有できる。前記バッファーは、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ又はＴＲＩＳ／ＥＤＴＡバッファーであり得る。前記バッファーは、他のリン酸塩バッファーであってもよい。リン酸塩バッファー（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｓ）は、一塩基性二水素リン酸塩（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と二塩基性一水素リン酸塩（ｄｉｂａｓｉｃ  ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を含むことができる。
【０１５１】
具体的に、前記バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）は、リン酸カリウムバッファーでよい。前記リン酸カリウムバッファーは、５ｍＭ〜１５ｍＭ、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭ、９ｍＭ〜１１ｍＭ、又は１０ｍＭの濃度でリン酸カリウムを含むことができる。
【０１５２】
前記液体組成物に含まれたバッファーは、ｐＨ７〜ｐＨ９でよい。一部の具現例において、前記ｐＨは７．０〜８．５又は８．０である。一部の具現例において、前記ｐＨは７．０〜８．０である。
【０１５３】
一部の具現例において、前記液体組成物はｐＨ７〜ｐＨ９の７．５ｍＭ〜１２ｍＭリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０の７．５ｍＭ〜１２ｍＭのリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５の９ｍＭ〜１１ｍＭのリン酸カリウムバッファーを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、ｐＨ８．０で１０ｍＭリン酸カリウムバッファーを含む。
【０１５４】
３．３．炭水化物（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）
【０１５５】
凍結乾燥した薬剤学的組成物においてプラスミドＤＮＡの安定性は、安定化量（ｓｔａｂｉｌｚｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）の炭水化物を含む水溶液（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、凍結乾燥前にプラスミドＤＮＡを剤形化することによって増大させることができる。前記炭水化物は、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）又はスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）でよい。
【０１５６】
前記炭水化物は、約０．０５％〜約３０％、約０．１％〜約１５％、約０．２％〜約１５％、約０．２％〜約１０％、約０．５％〜約１０％、約１％〜約５％、約１％〜約３％、約０．７５％及び１．１％、約０．９％及び１．１％、約１．０％又は約１．１％の炭水化物の最終濃度を有するように液体組成物に添加できる。
【０１５７】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％超過及び１５％未満、０．２％超過及び１０％未満、０．３％超過及び７．５％未満、０．５％超過及び５％未満、０．５％超過及び３％未満、０．５％超過及び２％未満、０．５％超過及び１．１％未満、０．７５％超過及び１．１％未満、０．９％超過及び１．１％未満、又は１．０％の少なくとも一つの炭水化物の最終濃度を有する。
【０１５８】
具体的に、前記液体組成物は、約０．０５％〜約３０％、約０．１％〜約１５％、約０．２％〜約１５％、約０．２％〜約１０％、約０．５％〜約１０％、約１％〜約５％、約１％〜約３％、約０．７５％〜約１．１％、約０．９％〜約１．１％、又は約１．０％のスクロースの最終濃度を有することができる。
【０１５９】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％超過及び１５％未満、０．２％超過及び１０％未満、０．３％超過及び７．５％未満、０．５％超過及び５％未満、０．５％超過及び３％未満、０．５％超過及び２％未満、０．５％超過及び１．１％未満、０．７５％超過及び１．１％未満、０．９％超過及び１．１％未満、又は１．０％のスクロースの最終濃度を有する。
【０１６０】
一部の具現例において、前記液体組成物は、５％未満、４％未満、３％未満のマンニトールの最終濃度を有する。一部の具現例において、前記液体組成物は、０％〜１０％、１％〜９％、２％〜７．５％、２％〜３％、２％〜５％、２％〜４％、０％〜３％、０％〜２％、１％〜２％、１．５％〜３％、又は２％のマンニトールの最終濃度を有する。
【０１６１】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０％超過及び１０％未満、０％超過及び７．５％未満、０％超過及び５％未満、０％超過及び４％未満、０％超過及び３％未満又は０％超過及び２．５％未満、又は１％超過及び２．５％未満のマンニトールの最終濃度を有する。
【０１６２】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．５％超過及び１．１％未満のスクロースの最終濃度を有し、０％超過及び３％未満のマンニトールの最終濃度を有する。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．７％〜１．１％のスクロースの最終濃度を有し、１．５％〜３％又は２％のマンニトールの最終濃度を有する。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．９％〜１．１％のスクロースの最終濃度及び１．５％〜３％又は２％のマンニトールの最終濃度を有する。一部の具現例において、前記液体組成物は、１．０％のスクロースの最終濃度及び１．５％〜３％、２％〜３％、又は２％のマンニトールの最終濃度を有する。
【０１６３】
一部の具現例において、他の炭水化物が前記組成物に用いられる。炭水化物は、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、ペントース（ｐｅｎｔｏｓｅ）、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）、イドース（ｉｄｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、ヘプトース（ｈｅｐｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、メチルａ−グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ  ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、イソアスコルビン酸（ｉｓｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ラクトン（ｌａｃｔｏｎｅ）、ソルボース（Ｓｏｒｂｏｓｅ）、グルカル酸（ｇｌｕｃａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、エリトロース（ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ）、トレオース（ｔｈｒｅｏｓｅ）、アロース（ａｌｌｏｓｅ）、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、グロース（ｇｕｌｏｓｅ）、エリトルロース（ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ）、リブロース（ｒｉｂｕｌｏｓｅ）、キシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マンヌロン酸（ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトサミン（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アラビナン（ａｒａｂｉｎａｎｓ）、フルクタン（ｆｒｕｃｔａｎｓ）、フカン（ｆｕｃａｎｓ）、ガラクタン（ｇａｌａｃｔａｎｓ）、ガラクツロナン（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎｓ）、グルカン（ｇｌｕｃａｎｓ）、マンナン（ｍａｎｎａｎｓ）、キシラン（ｘｙｌａｎｓ）、レバン（ｌｅｖａｎ）、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、ガラクトカロロース（ｇａｌａｃｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎｓ）、ペクチン酸（ｐｅｃｔｉｃ  ａｃｉｄｓ）、アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、グリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）、アミロペクチン（ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン（ｃｈｉｔｉｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、ケラチン（ｋｅｒａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、デルマタン（ｄｅｒｍａｔａｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｍ  ｇｕｍ）、又は澱粉（ｓｔａｒｃｈ）のような単糖類、オリゴ糖又は多糖類でよい。
【０１６４】
３．４．塩（Ｓａｌｔ）
【０１６５】
前記液体組成物は、塩をさらに含有する。前記塩は、ＮａＣｌ又はＫＣｌでよい。
【０１６６】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％超過及び０．９％未満、０．２５％超過及び０．７５％未満、０．４％超過及び０．６％未満、０．４％超過及び０．５％の濃度、又は０．４５％の濃度で塩を含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．９％、０．１％〜０．６％、０．２５％〜０．７５％、０．４％〜０．６％、０．４％〜０．５％の濃度又は０．４５％の濃度で塩を含む。
【０１６７】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％超過及び０．９％未満、０．２５％超過及び０．７５％未満、０．４％超過及び０．６％未満、０．４％超過及び０．５％の濃度又は０．４５％の濃度でＮａＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．９％、０．１％〜０．６％、０．２５％〜０．７５％、０．４％〜０．６％、０．４％〜０．５％の濃度又は０．４５％の濃度でＮａＣｌを含む。
【０１６８】
一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％超過及び０．９％未満、０．２５％超過及び０．７５％未満、０．４％超過及び０．６％未満、０．４％超過及び０．５％の濃度又は０．４５％の濃度でＫＣｌを含む。一部の具現例において、前記液体組成物は、０．１％〜０．９％、０．２５％〜０．７５％、０．４％〜０．６％、０．４％〜０．５％の濃度又は０．４５％の濃度でＫＣｌを含む。
【０１６９】
一部の具現例において、他の塩（ｓａｌｔ）が前記組成物に用いられる。塩（ｓａｌｔ）は、１価陽イオン性ハライド塩（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｈａｌｉｄｅ  ｓａｌｔ）（例えば、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、臭化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、塩化リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ヨウ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）、臭化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、臭化リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、フッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、フッ化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、フッ化リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）及び／又はヨウ化リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ））、２価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）又は３価（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ）塩（例えば、塩化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、硫酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、三塩化クロム（ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、硫酸クロム（ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、塩化鉄（ＩＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化イットリウム（ＩＩＩ）（Ｙｔｔｒｉｕｍ（ＩＩＩ）  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、塩化第１鉄（ｆｅｒｒｏｕｓ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、塩化第２鉄（ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、又はこれらの組合せでよい。
【０１７０】
４．凍結乾燥条件
【０１７１】
本発明の凍結乾燥した組成物は、本願に記載の液体組成物を凍結乾燥させることによって生成される。前記液体組成物は、当業界に公知の標準凍結乾燥条件又はその変形下に凍結乾燥できる。
【０１７２】
本発明の液体組成物を凍結乾燥させる方法は、（ａ）液体組成物の入っている容器を約５℃〜約−５０℃の開始温度でローディングする段階；（ｂ）ＤＮＡ剤形を零下の温度（例えば、−１０℃〜−５０℃）に冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）させる段階；及び（ｃ）ＤＮＡ剤形を実質的に乾燥させる段階、を含むことができる。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥条件、例えば、温度及び持続時間は、凍結乾燥パラメータに影響を及ぼす因子、例えば、使用された凍結乾燥機械の類型、使用されたＤＮＡの量、及び使用された容器の大きさを考慮して当業者によって調整可能である。
【０１７３】
一部の具現例において、（ｂ）冷却（ｃｏｏｌｉｎｇ）及び（ｃ）乾燥の段階は、温度を変化させながら行われる。例えば、−５０℃から−４０℃に、−５０℃から−３０℃に、−５０℃から−２０℃に、−５０℃から−１０℃に、又は−５０℃で０℃に温度を上げながら凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）段階を行うことができる。一部の具現例において、凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）段階は、−４０℃から−５０℃に、−３０℃から−５０℃に、−２０℃から−５０℃に、−１０℃から−５０℃に、０℃から−５０℃に、又は５℃から−５０℃に温度を減少させながら行うことができる。一部の具現例において、凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）段階は、温度を減少させてから温度を上昇させながら行われる。
【０１７４】
一部の無定形生成物（マンニトール又はグリシンのような）は、初めて凍結する時に不完全な結晶化を有する準安定性（ｍｅｔａｓｔａｂｌｅ）ガラスを形成する。このような製品は、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）と呼ぶ熱処理工程（ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ）から利得を得ることができる。アニーリング中に、製品温度はより完全な結晶化を得るために循環される（ｃｙｃｌｅｄ）（例えば、数時間では−４０℃から−２０℃に、その後に再び−４０℃；−５０℃から−２０℃に２時間維持し、その後に真空を導入；又は、−５０℃から−２０℃に、その後に再び−５０℃）。アニーリングは、より大きい結晶成長とこれに相応するより短い乾燥時間の更なる利点を有する。非晶相（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）に捕獲された水（ｗａｔｅｒ）は、２次乾燥中にさらに除去されてよい。
【０１７５】
一部の具現例において、乾燥段階は、（ｉ）１次乾燥、及び（ｉｉ）２次乾燥の２段階で行われる。
【０１７６】
一部の具現例において、１次乾燥は、温度を維持しながら又は温度を下げたり上げながら行う。一部の具現例において、温度を−５０℃、−４０℃、−３０℃、−２０℃、−１０℃又は０℃に維持しながら１次乾燥が行われる。一部の具現例において、２次乾燥は、温度を維持しながら又は温度を下げたり上げながら行う。一部の具現例において、２次乾燥は、−５０℃から２０℃に、−４０℃から２０℃に、−３０℃から２０℃に、−２０℃から２０℃に、−１０℃から２０℃に、−５０℃から１０℃に、−４０℃から１０℃に、−３０℃から１０℃に、−２０℃から１０℃に、−１０℃から１０℃に温度を上昇させながら行うことができる。
【０１７７】
凍結乾燥工程中に相分離（ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）が起こり得る。例えば、純粋な結晶相（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｐｈａｓｅ）は、飽和非晶相（ａｍｏｒｐｈｕｓ  ｐｈａｓｅ）と分離され得る。結晶相（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｐｈａｓｅ）は、氷又は任意の他の結晶化賦形剤を含むことができる。したがって、１次乾燥中に、純粋な氷相は、他の結晶相及び任意の飽和した非晶相を残して除去され得る。ケーキ構造及びＤＮＡ安定性を維持しながら該結合しない水を効果的に除去するために１次乾燥条件が調整されてもよい。１次乾燥（昇華）は、製品の臨界崩壊温度よりも安全なように低い、より涼しい温度で行われるのろい工程である。昇華は、固体から気体に相変化工程を推進するために熱エネルギーを必要とする。製品を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）する時、伝導（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ）、対流（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）及び輻射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の３つの熱伝達（ｈｅａｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）方法を全て考慮しなければならない。
【０１７８】
各液体組成物は、固有の臨界温度（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有する。崩壊を避けるために、１次乾燥中に組成物をこの臨界温度未満の温度に安全に維持しなければならない。温度は、氷境界面における蒸気圧に依存し、結局、この蒸気圧は組成物への熱伝達速度（棚温度を調整して制御される。）及びシステム真空レベル設定点に依存する。１次乾燥の間に、システム圧力と棚温度は、適切な製品温度を算出するように組み合わせられて設定及び制御される。温度及び圧力パラメータが設定されると、その後、全ての氷結晶が昇華されるのに十分な時間の間に１次乾燥が続く。
【０１７９】
１次乾燥の間に昇華される遊離した（ｆｒｅｅ）氷の他にも、生成物に結合した相当量の水分子が残っている。これは、２次乾燥の間に除去（脱着）される水である。全ての遊離した氷が１次乾燥で除去されたので、これからは溶けるか崩壊する心配なく製品温度はだいぶ増加し得る。２次乾燥は、実際に１次段階の間に始まるが、昇温（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（典型的には、２０℃〜５０℃範囲）では、脱着（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）がはるかに速く進行される。２次乾燥速度は製品温度に依存する。システム真空は、１次乾燥の間に用いられたのと同じレベルに持続でき；低い真空レベルは２次乾燥時間を向上させない。
【０１８０】
生成物が長期間貯蔵のために許容可能な水分含有量を有するまで２次乾燥が続く。適用によって、完全乾燥した製品の水分含有量は、典型的に、０．５％〜３％である。大部分の場合、製品が乾燥しているほど貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ  ｌｉｆｅ）がより長いだろう。しかし、特定複合生物学的製品は、実際に最適の貯蔵結果を得るには乾燥しすぎることがあるため、２次乾燥工程は適切に制御される必要がある。
【０１８１】
２次乾燥段階は、−５０℃から２０℃に、−４０℃から２０℃に、−３０℃から２０℃に、−２０℃から２０℃に、−１０℃から２０℃に、−５０℃から１０℃に、−４０℃から１０℃に、−３０℃から１０℃に、−２０℃から１０℃に、−１０℃から１０℃に温度を上げながら行うことができる。
【０１８２】
５．単位容量で凍結乾燥した組成物
【０１８３】
本発明のさらに他の態様は、単位容量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）で凍結乾燥した薬剤学的組成物である。一部の具現例において、単位容量形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）は、バイアル（ｖｉａｌ）、アンプル（ａｍｐｕｌｅ）、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、又は事前充填型注射器（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）である。一部の具現例において、単位容量は、約５０μｇ〜１ｇのプラスミドＤＮＡ、１００μｇ〜１ｇのプラスミドＤＮＡ、１００μｇ〜１００ｍｇのプラスミドＤＮＡ、１ｍｇ〜１００ｍｇのプラスミドＤＮＡ、１０ｍｇ〜１００ｍｇのプラスミドＤＮＡ、又は１０ｍｇ〜５０ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有する。単位容量は、約１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ又は１ｇのプラスミドＤＮＡを含むことができる。前記単位容量形態は、０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１６ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ又は２００ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有できる。
【０１８４】
典型的な具現例において、単位容量形態は、再構成後に投与に適した凍結乾燥した薬剤学的組成物の５０ｍｇ、１０ｍｇ、７．５ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、１００μｇ又は５０μｇを含有するバイアルである。前記投与は、上述したあらかじめ決定された量の薬剤学的組成物をそれぞれ含有する予備ローディングされた注射器（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅｓ）、自動注入器（ａｕｔｏ−ｉｎｊｅｃｔｏｒｓ）、及び自動注射ペン（ａｕｔｏ−ｉｎｊｅｃｔ  ｐｅｎｓ）を用いた、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、血内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）又は筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）投与を含む。
【０１８５】
容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内の単位容量は、様々な要因、例えば、活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（例えば、プラスミドＤＮＡ）、治療する疾病、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）、経路（ｒｏｕｔｅ）及び投与方法に基づいて決定することができる。単位容量は、臨床試験を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ研究に基づいて決定することができる。
【０１８６】
容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内の単位容量は、様々な温度（例えば、室温〜約−１８０℃、好ましくは約２〜８℃〜約−８０℃、より好ましくは約−２０℃〜約−８０℃、最も好ましくは約−２０℃））で長期間密封及び貯蔵することができる。
【０１８７】
容器に貯蔵された凍結乾燥したＤＮＡ組成物は、好ましくは約２〜２０℃〜約−８０℃の範囲内で、少なくとも１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月又は１年の期間中に有意の活性（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ａｃｉｔｉｖｔｙ）を失わずに好適に安定である。保管時間は、数ヶ月、１年、５年、１０年、１５年又は最大２０年でよい。好ましくは、前記製造（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、少なくとも約３年間安定である。
【０１８８】
６．凍結乾燥した組成物の特徴
【０１８９】
本発明は、薬剤学的製品として、一つ以上の所望の特性を有する凍結乾燥した薬剤学的組成物を提供する。前記特性は、様々な貯蔵条件で活性成分の安定性及び力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）、ケーキ形成（ｃａｋｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、投与のための剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の均一な再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、少ない汚染などを含むことができる。本願に提供された様々な特性は、好ましい凍結乾燥した組成物を選択したり、凍結乾燥した組成物の理想的な貯蔵条件を決定するために用いることができる。
【０１９０】
前記凍結乾燥した組成物において、プラスミドＤＮＡの安定性は、当業界に公知の方法に基づいて決定することができる。特に、安定性は、プラスミドＤＮＡの立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、例えば、それらが比較的安定したスーパーコイル状（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）の形態で存在するか、又は比較的安定しない開環状（ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｌｅ）及び線形（ｌｉｎｅａｒ）の形態で存在するかによって決定できる。プラスミドＤＮＡの立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、プラスミドＤＮＡを含有するサンプルの毛細管電気泳動によって決定できる。開環状及び線形の形態に比較して、スーパーコイルＤＮＡ含有量は様々な条件で測定され得る。例えば、スーパーコイルＤＮＡ含有量は、凍結乾燥前、中、又は後に、又は凍結乾燥した組成物の再構成前、中又は後に決定され得る。スーパーコイルＤＮＡ含有量は、安定した凍結乾燥した組成物を選択するとともに、理想的な貯蔵条件を決定するために、また異なる温度で貯蔵する前、中、又は後に決定され得る。
【０１９１】
プラスミドＤＮＡの安定性を決定するさらに他の方法は、ＤＮＡ濃度に基づく。当業界に公知のＤＮＡ濃度を測定する様々な方法を採択することができる。例えば、ＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍの吸光度（ｌｉｇｈｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、光吸収）に基づいて測定することができる。前記方法は、サンプルにおいてＤＮＡ濃度をよりよく定量化するために汚染物質の測定をさらに伴ってよい。
【０１９２】
ケーキ外見（ｃａｋｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）は、凍結乾燥した製品のさらに他の重要な特性であり得る。均一（ｕｎｉｆｏｒｍ）で秀麗（ｅｌｅｇａｎｔ）なケーキ外見が通常好ましい。非理想的なケーキ外見は、例えば、視覚的検査に基づいて製品品質を決定することを困難にさせるか、容器内の全体量の活性成分を回復することを困難にさせることによって、製品品質に影響を与えることがある。また、ケーキの部分的又は完全なメルトバック（ｍｅｌｔｂａｃｋ）は、活性成分の不安定性及び分解を招くことがある。メルトバック（ｍｅｌｔｂａｃｋ）は、ケーキ崩壊の一形態であり、固体状態から液体状態への変化によって発生する。すなわち、バイアルにおいて不完全な昇華（固体状態から蒸気状態への変化）がある。このような変化は、薬物物質（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の物理的形態及び水分ポケット（ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｃｋｅｔ）の変化を伴うことがある。
【０１９３】
ケーキ外見は、写真撮影を伴い得る視覚的検査によって決定することができる。過去の先例に基づいて視覚的検査を行うことができる。製品品質を判断する前に視覚的検査のための強力な性能検証プログラム（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）が重要である。性能検証プログラム（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）は、過去の経験又は公開された情報に基づき得る。特定の医薬品に対する視覚的検査指針は、例えば、米国食品医薬局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって出版された“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｓ：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｓ（７／９３）”検査指針から提供された情報に基づいて特定医薬品によって開発できる。
【０１９４】
医薬品の品質に影響を与え得る凍結乾燥した生成物のさらに他の特性は、凍結乾燥した生成物を溶解させて得た再構成された薬物の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）である。再構成された薬物の濁度は、凍結乾燥した組成物において活性成分の回復と関連し得る。一般に、完全な溶解、すなわち再構成された薬物の低い濁度が好ましい。不完全な溶解は、薬剤学的組成物の活性成分の浪費、及び再構成された薬物を投与するための注射器の詰まりを招くことがある。
【０１９５】
再構成された薬物の濁度は、視覚的検査によって又は特定の波長、例えば４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで吸光度を測定することによって測定できる。吸光度（ｌｉｇｈｔ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ、光吸収）は、当業界で利用可能な装置、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＴｈｅｒｍｏＭＡＸ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅを用いて測定できる。
【０１９６】
再構成時間は、医薬品の品質と関連し得るさらに他の因子である。一般に、短い再構成時間が好ましい。患者に投与する間に、インラインフィルター（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｆｉｌｔｅｒｓ）を使用することが一般であるため、薬物が完全に溶解しないと、使用者段階で増加した再構成時間が力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）の部分的な喪失を招くことがある。凍結乾燥した生成物の再構成に必要な時間は、例えば、再構成後に様々な時点で再構成された薬物の濁度を測定することによって決定できる。例えば、濁度は、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、１時間、２時間又はそれ以降に測定できる。
【０１９７】
凍結乾燥後の残留水分も重要であり得る。凍結乾燥した組成物において残留水分を測定するために当業界に公知の様々な方法を採択することができる。例えば、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒ  Ｃ２０（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を水分含有量分析に用いることができる。凍結乾燥した組成物において水分ポケットは、より大きい不安定性と増加した生成物分解を招くことがある。したがって、少ない水分含有量が好ましいだろう。
【０１９８】
７．凍結乾燥した組成物を用いた疾病治療の方法
【０１９９】
凍結乾燥した組成物を用いて疾病を治療する方法は、本発明の範囲内にある。
【０２００】
７．１．凍結乾燥した組成物の再構成
【０２０１】
スワーリング方法（ｓｗｉｒｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）、機械的オービタル撹拌器（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）を用いる方法、又はバイアルを停止状態に維持する方法のような様々な再構成方法を用いることができる。
【０２０２】
投与のための再構成された薬物の最終濃度は、伝達される剤形の量、対象の年齢及び体重、伝達方法及び経路及び伝達される抗原の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を含む多くの要因によって調整することができる。
【０２０３】
本発明の凍結乾燥した組成物は、許容可能な溶液、例えば、水、ＴＥ、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓバッファー又は生理食塩水で約１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ又は０．０５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で再構成することができる。
【０２０４】
７．２．再構成された薬物の投与
【０２０５】
本発明の再構成された薬物は、様々な疾病を治療するために哺乳動物対象（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与できる。本発明の再構成された凍結乾燥した組成物は、様々な伝達方法によって、例えば、経口（ｏｒａｌｌｙ）又は非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、心内膜内（ｉｎｔｒａｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ）、心筋内（ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ）、心腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ）、心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、血内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ）、腎臓内（ｉｎｔｒａｒｅｎａｌ）、肝内（ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ）、脾臓内（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ）、リンパ管内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、睾丸内（ｉｎｔｒａｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ）、卵巣内（ｉｎｔｒａｏｖａｒｉａｎ）、子宮内（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ）、胸骨（ｓｔｅｒｎａｌ）、気管内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）、胸腔内（ｉｎｔｒａｐｌｕｅｒａｌ）、胸内（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ）、硬膜内（ｉｎｔｒａｄｕｒａｌ）、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、骨髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ）、壁内（ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ）、絨毛膜内（ｉｎｔｒａｓｃｏｒｉｏｎｉｃ）及び動脈内注射（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又は注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、又は直腸（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ）又は眼球内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）を通じた局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）投与によって投与できる。特定の具現例において、伝達方法は、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、心筋内（ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ）、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ）又は腎臓内（ｉｎｔｒａｒｅｎａｌ）である。
【０２０６】
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは液体薬剤学的組成物の注射によって投与される。現在、好ましい具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは筋肉内注射によって投与される。典型的に、ポリヌクレオチドコンストラクトは、影響を受ける部位の近くに筋肉内注射によって投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、対象の四肢（ｌｉｍｂｓ）、心臓、又は他の身体部位の筋肉に投与される。
【０２０７】
一部の具現例において、前記コンストラクトは皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は血内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）に注射される。一部の具現例において、前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、血管内伝達によって投与される。特定の具現例において、前記コンストラクトは逆行性静脈注射（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって注射される。
【０２０８】
本発明の再構成された凍結乾燥した組成物の典型的な一日服用量は、治療される状態、選択された投与経路、患者個人の年齢、性別、及び体重、及び患者症状の重症度を含む様々な関連因子に照らして決定すべきであり、単一容量又は分割容量で投与可能であることを理解すべきである。ポリヌクレオチドコンストラクトは治療的有効容量で投与される。
【０２０９】
本願に記載の方法の一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、１μｇ〜２００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、５ｍｇ〜１０ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ又は４ｍｇの総容量で投与される。
【０２１０】
典型的な具現例において、総容量は、複数の個別注射容量に分割される。一部の具現例において、総容量は、複数の同一注射容量に分割される。一部の具現例において、総容量は、均等でない注射容量に分割される。
【０２１１】
様々な分割された容量（ｄｉｖｉｄｅｄ  ｄｏｓｅ）の具現例において、総容量は、４、８、１６、２４又は３２個の異なる注射部位に投与される。
【０２１２】
一部の具現例において、注射容量は、０．１〜５ｍｇである。特定の具現例において、注射容量は、０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ又は０．５ｍｇである。
【０２１３】
総投与容量は、１回訪問又は２回以上の訪問で投与され得る。
【０２１４】
典型的な分割された容量の具現例において、全ての複数の注射容量は、互いに１時間以内に投与される。一部の具現例において、全ての複数の注射容量は、互いに１．５、２、２．５又は３時間内に投与される。
【０２１５】
本方法の様々な具現例において、単一の一元化した容量（（ｕｎｉｔａｒｙ  ｄｏｓｅ）で投与されたり、複数の注射容量に分割されて投与されたり、或いは総容量のポリヌクレオチドコンストラクトは対象に一回のみ投与される。
【０２１６】
一部の具現例において、１回、２回、３回又は４回訪問にわたって複数の注射部位への総容量のポリヌクレオチドコンストラクトの投与は、単一周期を含むことができる。特に、２回訪問にわたった３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ又は４ｍｇのポリヌクレオチドコンストラクトの複数の注射部位への投与は、単一周期を含むことができる。２回訪問は、３、５、７、１４、２１又は２８日間隔でよい。
【０２１７】
一部の具現例において、周期は反復されてよい。周期は、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上に反復可能である。
【０２１８】
一部の具現例において、周期は、以前周期後に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月又はそれ以上で反復可能である。
【０２１９】
一部の具現例において、後続周期で投与される総容量は、以前周期に投与された総容量と同一である。一部の具現例において、後続周期に投与される総容量は、以前周期に投与された総容量と異なる。
【０２２０】
現在、好ましい具体例において、核酸コンストラクトは、影響を受けた四肢（ｌｉｍｂｓ）当たり８ｍｇの容量で投与され、複数の筋肉内注射及び複数の訪問で同一に分割され、任意の単一訪問における複数の注射のそれぞれが別個の注射部位で行われる。特定の具現例において、核酸コンストラクトは、影響を受けた四肢（ｌｉｍｂｓ）当たり８ｍｇの容量で投与され、０日に四肢（ｌｉｍｂｓ）当たり４ｍｇの第１容量及び１４日に四肢（ｌｉｍｂｓ）当たり４ｍｇの第２容量で均等に分割され、ここで、第１及び第２容量はそれぞれ複数の注射容量で均等に分割される。
【０２２１】
実際に投与された量及び速度及び投与の時間経過は、治療される疾病の属性（ｎａｔｕｒｅ）及び重症度によって変わるだろう。典型的な具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、疾病の症状、例えば疼痛を減少させるのに効果的な量で投与される。一部の具現例において、前記量は、投与１週間以内に症状を減少させるのに効果的である。一部の具現例において、前記量は、投与後２週、３週又は４週内に症状を減少させるのに効果的である。
【０２２２】
プラスミドＤＮＡは、治療される状態によって同時に又は順次に、単独で又は他のプラスミドＤＮＡと共に組み合わせて投与可能である。
【０２２３】
一部の具現例において、再構成された組成物は、ヒトＨＧＦをコードするプラスミドＤＮＡを含む。再構成された薬物は、様々な疾病、例えば、プラスミドＤＮＡの投与によって以前に治療可能なものと立証された疾病を治療するために投与できる。プラスミドＤＮＡは、ヒトＨＧＦのような治療遺伝子をコードできる。この疾病は虚血性又は肝疾患、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，“ＣＡＤ”）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，“ＡＬＳ”）、末梢動脈疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，“糖尿病性潰瘍（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｕｌｃｅｒ）”）及び糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，“ＤＰＮ”）又は疾病、負傷、感染又はビタミン欠乏状態による神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）を含むが、これに制限されない。例えば、神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏、自己免疫疾患、遺伝的又は遺伝性障害、アミロイド症（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、毒素（ｔｏｘｉｎｓ）又は毒（ｐｏｉｓｏｎｓ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）又は傷害（ｉｎｊｕｒｙ）、腫瘍（ｔｕｍｏｒｓ）によって誘発され得るか或いは特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）であり得る。米国特許番号第７，８１２，１４６号；第７，８３８，５０５号；第７，７４５，１７４号；第８，３３８，３８５号；第８，３８９，４９２号及び米国出願番号第１２／５９，１３７号；第１４／３５５，７９２号；第１５／０３０，９９９号に記載の方法は、凍結乾燥した組成物を投与することによって疾病を治療するために採択することができる。本願に提供された参考文献は、その全文が本願に参照によって組み込まれる。
【０２２４】
一部の具現例において、再構成された組成物は、ヒトＩＧＦ−１をコードするプラスミドＤＮＡを含む。再構成された薬物は、様々な疾病、例えばヒトＩＧＦ−１をコードするプラスミドＤＮＡ又はヒトＩＧＦ−１タンパク質の投与によって治療可能なものと既に立証された疾病を治療するために投与できる。この疾病は、疾病、負傷、感染又はビタミン欠乏状態によって引き起こされる神経病症を含むが、これに制限されない。例えば、神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏、自己免疫疾患、遺伝的又は遺伝性障害、アミロイド症、尿毒症、毒素又は毒、外傷又は傷害、腫瘍によって誘発され得るか或いは特発性であり得る。一部の具現例において、ヒトＩＧＦ−１タンパク質をコードするプラスミド（ｐＴｘ−ＩＧＦ−１）は、疾病を治療するためにヒトＨＧＦをコードするさらに他のプラスミド（例えば、ＶＭ２０２）と共に投与される。米国出願番号第１６／５１３，５６０号及び／又は１第６／５１３，５６４号に記載の方法は、凍結乾燥した組成物を投与することによって疾病を治療するために採択できる。
【０２２５】
一部の具現例において、再構成された組成物は、ヒトＳＤＦ−１αをコードするプラスミドＤＮＡを含む。プラスミドは、疾病を治療するために単独で又は他のプラスミドＤＮＡと共に投与できる。一部の具現例において、ヒトＳＤＦ−１αをコードするプラスミド（例えば、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１α）は、疾病を治療するためにヒトＨＧＦをコードするさらに他のプラスミドＤＮＡ（例えば、ＶＭ２０２）と共に投与される。前記疾病は、末梢血管疾病（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖｅｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）のような血管疾患を含むが、これに制限されない。米国出願番号第１５／５１４，２４４号に記載の方法は、ヒトＳＤＦ−１αをコードするプラスミドを投与することによって疾病を治療するために採択できる。
【実施例】
【０２２６】
次の実施例は、当業者に本発明を製造し使用する方法に関する完全な開示（ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）及び説明を提供するために提供され、次の実施例は、本発明者らが彼らの発明と見なす範囲を制限するためのものではなく、また、次の実施例は、下記実験が、行われた全ての又は唯一の実験であることを示すためのものでもない。用いられた数字（例えば、量、温度など）と関連して正確性を保障するために努力したが、一部の実験誤り及び偏差を考慮に入れるべきである。特に指示されない限り、部分（ｐａｒｔｓ）は重量部（ｐａｒｔｓ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）で、分子量は重量平均分子量（ｗｅｉｇｈｔ  ａｖｅｒａｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）で、温度は摂氏温度で、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。標準略語は、例えば、ｂｐ、塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ（ｓ））；ｋｂ、キロベース（ｋｉｌｏｂａｓｅ（ｓ））；ｐｌ、ピコリットル（ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ（ｓ））；ｓ又はｓｅｃ、秒（ｓｅｃｏｎｄ（ｓ））；ｍｉｎ、分（ｍｉｎｕｔｅ（ｓ））；ｈ又はｈｒ、時間（ｈｏｕｒ（ｓ））；ａａ、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ｓ））；ｎｔ、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｓ））；などを用いることができる。
【０２２７】
特に指示されない限り、本発明の実施は、当業界の技術における通常のタンパク質化学（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、生化学（ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、組換えＤＮＡ技術（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）及び薬理学的（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）方法を用いるだろう。
【０２２８】
実施例１：ＶＭ２０２の凍結乾燥した組成物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（研究００１）
【０２２９】
１．１  ＶＭ２０２を含むテストされた薬剤学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）
【０２３０】
次表１に提供される通り、ＶＭ２０２を含有する様々な剤形（ｆｏｍｕｌａｔｉｏｎ）が製造された（ｐｒｅｐａｒｅｄ）。活性成分である、前記ＶＭ２０２プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）は、０．９％  ＮａＣｌ中に１．６ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２、又は０．９％  ＮａＣｌ中に１．３ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２を含有する冷凍貯蔵物（ｓｔｏｃｋ）から得られた。
【０２３１】
【表１】
2022500354.tif 000003
【０２３２】
＊対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、米国特許第８，３８９，４９２号に既に記述された剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）であり、その全文は本願に参照によって含まれる。
【０２３３】
＊＊ＫＰ８ＭＳ３Ｎ及び２ＭＳＮは、同一組成物の凍結乾燥した剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）である。
【０２３４】
該剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、市販されている物質及び装備、例えば、リン酸水素カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、カタログ番号ＰＯ２００）、リン酸二水素カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ）（ＥＭＤ、カタログ番号ＰＸ１５７０−１）、マンニトール（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号２５５３−０５）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号４０７４−０５）、塩化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１．０６４０４．５０００）及びトレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、カタログ番号Ｔ−１０４−０４）、透析カセット（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６６３８０（１０，０００ＭＷＣＯ））、ガラスバイアル（ｇｌａｓｓ  ｖｉａｌｓ）（３ｃｃ又は２０ｃｃガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ類型Ｉホウケイ酸塩（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ）、カタログ番号６８０００３１６又は６８０００３２１））、及びストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒｓ）（１３ｍｍ又は２０ｍｍ単一ベントリオストッパー（ｓｉｎｇｌｅ−ｖｅｎｔ  ｌｙｏ  ｓｔｏｐｐｅｒ）、Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、カタログ番号１９７０００３４又は１９７００３１１））を用いて製造された（ｐｒｅｐａｒｅｄ）。デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号１０１５１４）、水酸化リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ４５３３−１００Ｇ）及びリン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、カタログ番号０２６２−０１）のような賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）も用いられた。
【０２３５】
１．２  様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の小規模（ｓｍａｌｌ  ｓｃａｌｅ）テスト
【０２３６】
１．２．１  サンプル製造（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）
【０２３７】
様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を生成するために、０．９％  ＮａＣｌ中に１．６ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２が入っているバイアルを、−７０℃保管から取り出してアンビエント温度（ａｍｂｉｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、周辺温度）に解凍した。
【０２３８】
１回目の小規模テストのためのサンプル：その後、２〜８℃で２４時間、標的剤形緩衝液（ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２％マンニトール、１．０％スクロース、０．１％  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して１０，０００倍以上の体積交換（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）によって１０，０００  ＭＷＣＯ  Ｔｈｅｒｍｏ透析カセットを用いてＫＰ８Ｍ２ＳＮ（表１参照）を透析して製造した。透析後、ＫＰ８Ｍ２ＳＮの濃度は、剤形緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で０．５ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２に調整した。
【０２３９】
前記薬物物質（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を希釈してＫＰ８ＭＳ３Ｎ、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ及び対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を製造した。具体的に、１．７ｍＬのＶＭ２０２（すなわち、０．９％  ＮａＣｌ中ＶＭ２０２）を、次表２に提供された０．８５ｍＬの希釈緩衝液（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＫＰ８ＭＳ３Ｎ用緩衝液２番、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ用緩衝液３番、及び対照群用緩衝液８番）で希釈した。前記希釈後、０．４５％  ＮａＣｌを含有する剤形緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）と共にＫＰ８ＭＳ３Ｎ及びＫＰ８ＭＴ３Ｎに対してそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２を含有するようにそれぞれの剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を調整した。
【０２４０】
２回目の小規模テストのためのサンプル：０．８４ｍＬの前記薬物物質（すなわち、０．９％  ＮａＣｌ中ＶＭ２０２）を、次表２に提供された０．４２ｍＬの希釈緩衝液（４ＭＳＮ用緩衝液４番、３ＭＳＮ用緩衝液５番、及び２ＭＳＮ用緩衝液６番）で希釈して４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び２ＭＳＮを製造した。希釈後、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）以外の各剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、０．４５％  ＮａＣｌを含有するそれぞれの剤形緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２を含むように調整された。
【０２４１】
【表２】
2022500354.tif 000004
【０２４２】
安定性加速試験（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ）のためのサンプル製造：安定性加速試験のために別個の剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）セットをさらに製造した。前記別個のセットのために、薬物物質（すなわち、０．９％  ＮａＣｌ中ＶＭ２０２）を、前記表２に提供された希釈緩衝液で２：１の比率（４ＭＳＮ用緩衝液４番、３ＭＳＮ用緩衝液５番、２ＭＳＮ用緩衝液６番、２Ｍ１ＳＮ用緩衝液７番、及び対照群用緩衝液８番）で希釈して４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ、２Ｍ１ＳＮ及び対照群を製造した。希釈後、対照群以外の全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、０．４５％  ＮａＣｌを含有するそれぞれの剤形緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で０．５ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２を含有するように調整された。
【０２４３】
０．９％  ＮａＣｌ及び１．１％スクロース中０．５ｍｇ／ｍＬのデキストランを用いて代理剤形（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を製造した。
【０２４４】
サンプルの凍結乾燥：濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調整した後、剤形化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＶＭ２０２を無菌条件（ａｓｅｐｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で０．２μｍ  ＰＥＳフィルター（小規模及び安定性加速研究（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ））又はセルロースアセテート（ＣＡ）フィルター（追加の安定性加速研究（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ））を用いて滅菌濾過した。全てのサンプルは、無菌条件下の生物安全キャビネット（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ｃａｂｉｎｅｔ，ＢＳＣ）において、小規模凍結乾燥のためにはバイアル（ｖｉａｌ）当たり０．７５ｍＬの充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）で滅菌された３ｃｃバイアルに充填されたり、又は安定性加速研究のためにはバイアル当たり５ｍＬの充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）で滅菌された２０ｃｃバイアルに充填された。具体的に、安全キャビネット（ＮｕＡｉｒｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｃａｂｉｎｅｔ、クラスＩＩ類型Ａ／Ｂ３モデル番号ＮＵ−４２５−６００）下で真空濾過システム（ｖａｃｕｕｍ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，１Ｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｆｉｌｔｅｒ／Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｏｔｔｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，０．２μｍ  ＣＡメンブレイン、カタログ番号４３１−２０５；Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ、０．２μｍ  ＰＥＳメンブレイン、カタログ番号５６７−００２０）で注射器フィルター（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｃｒｏｄｉｓｃ  １３ｍｍ，０．２μｍ  ＰＥＳメンブレイン、カタログ番号４６０２）を用いて前記剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は充填（ｆｉｌｌｅｄ）された。
【０２４５】
充填後、前記バイアルを滅菌ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ）で部分的に栓し（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、表３に記述のサイクルを用いて凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）のために凍結乾燥器（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ）（ＶｉｒＴｉｓ、モデル番号２５  Ｌ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＳＱ  Ｓｕｐｅｒ  ＸＬ−７０）にローディング（ｌｏａｄ）した。小規模凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）のために乾燥工程（ｄｒｙｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）の間に、代理バイアル（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｖｉａｌ）はＶＭ２０２バイアルを完全に取り囲むように用いられ、これは、隣のバイアルから比較可能な（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）光照射熱転写（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が提供されるようにするためである。
【０２４６】
【表３】
2022500354.tif 000005
【０２４７】
凍結乾燥後、前記バイアルを６００ｍｔｏｒｒである部分真空下で完全に栓し（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、アルミニウムシール（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓｅａｌｓ）で圧着し（ｃｒｉｍｐｅｄ）、ラベルを付けた（ｌａｂｅｌｅｄ）。ラベルは、プロジェクト、日付、培養温度／ストレス条件、及び時点（ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）に関する情報を含む。ラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）後、サンプルをそれぞれの安定性条件に置いた。
【０２４８】
１．２．２  様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のテストのための分析（ａｓｓａｙ）
【０２４９】
前記凍結乾燥した剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を、その相対的な安定性を評価するために様々なストレス条件に露出させた。サンプルに熱ストレスを加えるために、全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を５℃、２５℃又は４０℃で最大で１０週間保管した。再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）後、安定性の評価のために、濾過された（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）注射用水（ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ＷＦＩ）で５．０ｍＬの目標体積（ｔａｒｇｅｔ  ｖｏｌｕｍｅ）を用いて生物安全キャビネットでサンプルを再構成し（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）、再栓し（ｒｅｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、再密封した（ｒｅｓｅａｌｅｄ）。再構成後、サンプルを３日間又は７日間２５℃で保管した。本実験でテストされた様々な条件は、次表４に要約されている。
【０２５０】
【表４】
2022500354.tif 000006
【０２５１】
異なる条件で様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の安定性を分析するために、次の分析を行った。
【０２５２】
（１）視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：黒い背景及び白い背景で視覚的検査を行った。デジタル写真を得た。
【０２５３】
（２）ＵＶ分光光度法（ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）：ｌｉｄ  ｆａｃｔｏｒが１０であるＩｍｐｌｅｎ  ＮａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでＵＶ分光光度法を行った。前記テストサンプルのプラスミドＤＮＡ濃度は、２３０、２６０、２８０及び３５０ｎｍで吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定することによって決定された。ＶｉｒｏＭｅｄのＵＶ／Ｖｉｓプロトコルを用いて濃度分析を行った。次の方程式を用いて計算を行った。
【０２５４】
濃度（μｇ／ｍＬ）＝［（Ｄ−Ｅ）／Ｃ］×（Ｂ／Ａ）
【０２５５】
回復（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）＝（低μｇ／ｍＬ）／（高μｇ／ｍＬ）×１００％
【０２５６】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ＝Ｄ／Ｆ
【０２５７】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ＝Ｄ／Ｇ
【０２５８】
ここで、
【０２５９】
Ａ＝希釈のために採取したサンプルの重さ。
【０２６０】
Ｂ＝希釈のためのサンプル及び緩衝液の総重量。
【０２６１】
Ｃ＝１ｃｍ経路長（ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ）キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）において０．００５％溶液の吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（０．０２）。
【０２６２】
Ｄ＝２６０ｎｍで最大光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）。
【０２６３】
Ｅ＝３５０ｎｍで測定された吸光度。
【０２６４】
Ｆ＝２８０ｎｍで測定された吸光度。
【０２６５】
Ｇ＝２３０ｎｍで測定された吸光度。
【０２６６】
受容基準（Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）：
【０２６７】
Ｄは、０．５ＯＤ~１．５ＯＤの単位範囲に属するべきである。
【０２６８】
回復は、９８％以上でなければならない。
【０２６９】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ＝１．８〜２．０の範囲に属するべきである。
【０２７０】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ＝１．１以上でなければならない。
【０２７１】
（３）毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）：Ｐ／ＡＣＥ（商標）  ＭＤＱ  ＵＶ検出器モジュールが装着されたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）  ＰＡ  ８００  ＣＥ機器は、プラスミドＤＮＡ構造分析（スーパーコイル形成された（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）ＤＮＡの純度）に用いられた。３２Ｋａｒａｔソフトウェア（バージョン７．０）を用いて結果を分析した。毛細管電気泳動分析前に、５０μｍ内径（部品番号４７７４４１）及び８μｍ絞りの開口窓（ａｐｅｒｔｕｒｅ  ｗｉｎｄｏｗ）を持つ４０ｃｍ毛細管でコーティングされたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎｅｕｔｒａｌは、２０ｐｓｉで１分間ＨＰＬＣ超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ｇｒａｄｅ  ｗａｔｅｒ）で稼働した（ｒｕｎｎｉｎｇ）後、２０ｐｓｉで１分間１００ｍＭリン酸（ｐＨ２．６）で洗ってコンディションされた（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。前記分離は、１４分間１７ｋＶの一定の電圧を適用して行った。０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のサンプル４０μＬは、分析のためにポリエチレンインサート（ｉｎｓｅｒｔ）に添加された。次のパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）が用いられた：
【０２７２】
・圧力／注入時間（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）：０．５ｐｓｉ／１１秒。
【０２７３】
・分離緩衝液／圧力：１００ｍＭリン酸（ｐＨ２．６０）、８５％／２０ｐｓｉ；６０秒。
【０２７４】
・洗浄緩衝液／圧力：ＨＰＬＣ超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ｇｒａｄｅ  ｗａｔｅｒ）／２０ｐｓｉ；６０秒。
【０２７５】
・検出器波長：２５４ｎｍ。
【０２７６】
・分離電圧：１７ＫＶ；０．１７分；１４分。
【０２７７】
ＶＭ２０２の例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）毛細管電気泳動結果が図１に提供される。
【０２７８】
（４）濁度（Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＴｈｅｒｍｏＭＡＸマイクロプレートリーダ（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでサンプル吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定することによって濁度を決定した。
【０２７９】
（５）サブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）ＤＳＣ分析：Ｉｎｔｅｒｃｏｏｌｅｒ  ＩＩがあるＰｙｒｉｓ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＳＣを用いて、概略１０μＬの各剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を−６０℃で凍結させた。５℃／分のランプ速度（ｒａｍｐ  ｒａｔｅ）で、前記サンプルを２５℃に温め、加温（ｗａｒｍｉｎｇ）過程中の熱流れ（ｈｅａｔ  ｆｌｏｗ）を記録した。また、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階を含むプログラムが行われた。前記アニーリング段階は、サンプルを５℃／分のランプ速度で−１５℃に加温することによって行った。
【０２８０】
（６）Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ水分分析：Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒ  Ｃ２０（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を、水分含有量（ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ）分析に用いた。ＡｑｕａＳｔａｒ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｖｅｎ  １％は、システム正確度を決定するために用いられた。分析のためにキャップを除去する前にサンプルバイアルを室温に置いた。サンプルを添加する前と後に、分析のために用いられた凍結乾燥した粉末の量を決定するために、秤量ボート（ｗｅｉｇｈ  ｂｏａｔ）の重さを測った。概略１０〜１６０ｍｇの物質が分析に用いられた。
【０２８１】
１．２．３  ＫＰ８Ｍ２ＳＮ、ＫＰ８ＭＳ３Ｎ及びＫＰ８ＭＴ３Ｎの分析（１回目の小規模テスト）
【０２８２】
サブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）ＤＳＣ分析：凍結乾燥工程（ｐｒｏｃｅｓｓ）前に、候補剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の特性を把握する（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ）ために、０．５ｍｇ／ｍＬに剤形化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＶＭ２０２、すなわち、ＫＰ８Ｍ２ＳＮ、ＫＰ８ＭＳ３Ｎ、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ及び対照群（表１）の１０μＬサンプルをサブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）時差走査熱量計（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ＤＳＣ）で分析した。分析された信号は、崩壊温度（Ｔｇ´，ｃｏｌｌａｐｓｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、失透温度（Ｔｄ，ｄｅｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、及び冷凍状態でＶＭ２０２を有する様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のアニーリングの利点を含む。図２Ａ〜図２Ｄは、ＶＭ２０２のアニーリング無し又はＶＭ２０２のアニーリング有り（右側）の、ＫＰ８Ｍ２ＳＮ（図２Ａ）、ＫＰ８ＭＳ３Ｎ（図２Ｂ）、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ（図２Ｃ）及び対照群（図２Ｄ）の１回目の小規模凍結乾燥のための液体状態のＤＳＣ結果を示す。前記ＫＰ８Ｍ２ＳＮのガラス転移（ｇｌａｓｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（Ｔｇ´）温度は、−４４℃で観察された。対照群は、共融溶融温度（Ｔｅ，ｅｕｔｅｃｔｉｃ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を〜−２１℃と示した。全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で失透温度（Ｔｄ）が観察され、アニーリング後に消えた。一部の添加剤（ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）がアニーリング後に消える失透信号を示したので、凍結乾燥サイクル１（表３）は、１回目の小規模の凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）の間にアニーリング段階を含むように設計された。
【０２８３】
凍結温度（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を−５０℃から−２０℃にランピング（ｒａｍｐｉｎｇ）し、２時間維持した後、その後に真空を導入したことが、アニーリング及びマンニトール結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）の誘導を可能にした。１次乾燥は、８０ｍＴｏｒｒチャンバー圧力（表３）で−２０℃棚（ｓｈｅｌｆ）温度（２４時間）で行われた。２０℃の棚温度で２次乾燥は、１次乾燥段階で昇華しなかった残余の水（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｗａｔｅｒ）を除去するように設計された。
【０２８４】
図３は、１回目の小規模テストの凍結乾燥工程中の温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ）グラフを示す。真空を加えた時、昇華による熱損失によって前記生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）温度が−３６℃未満に下がった。ピラニゲージ（ｐｉｒａｎｉ  ｇａｕｇｅ）値は、１次乾燥工程の完了が確認された１次乾燥段階中の約３０時間の間に静電容量圧力計（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｍａｎｏｍｅｔｅｒ）の読み取り値（ｒｅａｄｉｎｇ）と合算された。２次乾燥を開始し、サンプルをさらに１３時間乾燥させた。全体サイクルは４６時間持続し、１次乾燥が完了した直後に２次乾燥が始まった場合には、４３時間に減少させる可能性がある。
【０２８５】
１回目の小規模凍結乾燥サイクルを完了した後、全てのバイアルを６００ｔｏｒｒ真空圧力で栓した。前記凍結乾燥物（ｌｙｓｏｐｈｉｌａｔｅ）をチャンバーから取り出して分析した。ＫＰ８Ｍ２ＳＮの凍結乾燥ケーキ（ｌｙｓｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃａｋｅ）は、外見上秀麗であった（ｅｌｅｇａｎｔ）。他のケーキは、特に対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は崩壊徴候を示した。再構成されたサンプル（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）は透明（ｃｌｅａｒ）であり、前凍結乾燥（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）サンプルと比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった（図４Ａ〜図４Ｃ）。前記ケーキの水分含有量はそれぞれ、１．３７％（ＫＰ８Ｍ２ＳＮ）、２．４０％（ＫＰ８ＭＳ３Ｎ）、１．４４％（ＫＰ８ＭＴ３Ｎ）及び１．２５％（対照群）であった。
【０２８６】
それぞれのサンプルにおいてＶＭ２０２の濃度は、１回目の小規模凍結乾燥サイクルからのサンプルを再構成した後に測定され、前記結果は、表５に要約されている。前記結果は、各サンプルが類似の濃度でＶＭ２０２を含有していることを示す。
【０２８７】
【表５】
2022500354.tif 000007
【０２８８】
毛細管電気泳動：再構成されたサンプルをＣＥで生成物純度に対してさらに調べた。ＣＥ後にクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）及びピーク面積（％）データは、図５及び表６に示す。ＣＥ分析結果は、凍結乾燥及び再構成後にＫＰ８Ｍ２ＳＮ、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ及び対照群においてスーパーコイルピーク面積（ｓｕｐｅｒ  ｃｏｉｌｅｄ  ｐｅａｋ  ａｒｅａ）の減少を示した。ＫＰ８ＭＳ３Ｎは、凍結乾燥及び再構成後に最高のスーパーコイルピーク面積を有している。
【０２８９】
【表６】
2022500354.tif 000008
【０２９０】
要するに、前記結果は、１．０％スクロース及び０．１％  ＮａＣｌを含有するＫＰ８Ｍ２ＳＮが、０．５％スクロース及び０．４５％  ＮａＣｌを含有するＫＰ８ＭＳ３Ｎに比べて、又は０．５％トレハロース及び０．４５％  ＮａＣｌを含有するＫＰ８ＭＴ３Ｎに比べてより良い凍結乾燥ケーキ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃａｋｅ）を生成するということを示す。前記結果はさらに、０．５％スクロース及び０．４５％  ＮａＣｌを含有するＫＰ８ＭＳ３ＮがＣＥで測定されるとき、最小量の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を有するということを示した。これは、スクロースを含有する剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（ＫＰ８Ｍ２ＳＮ及びＫＰ８ＭＳ３Ｎ）が、トレハロースを含有する剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（ＫＰ８ＭＴ３Ｎ）に比べてより良い特性（例えば、秀麗なケーキ（ｅｌｅｇａｎｔ  ｃａｋｅ）形成及び安定性）を有することを示唆する。
【０２９１】
１．２．４  ４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び２ＭＳＮの一番目のセット分析（２回目の小規模凍結乾燥サイクル）
【０２９２】
前記１回目の小規模凍結乾燥サイクルの結果に基づき、次の凍結乾燥サイクル（２回目の小規模テスト）は、スクロース（０．５％）及びＮａＣｌ（０．４５％）濃度は維持する上に、ＫＰ８ＭＳ３Ｎにおいてマンニトールの濃度は変更することによって、ケーキ外見（ｃａｋｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）を向上させることに重点をおいた。
【０２９３】
凍結乾燥工程前に、０．５ｍｇ／ｍＬに剤形化された（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＶＭ２０２、すなわち、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ、及び対照群（表１）の１０μＬサンプルを、候補剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の特性を把握する（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ）ために、サブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）ＤＳＣで分析した。図６Ａ〜図６Ｄは、２回目の小規模凍結乾燥テストからの液体状態の前記ＤＳＣ結果を示す。対照群（図６Ｄ）は、〜−２１℃の共融溶融温度（Ｔｅ）を示した。失透温度（Ｔｄ）は全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）から観察され（左側でアニーリング無しで）、アニーリング後に消えた（右側で）。失透信号の観察によって、凍結乾燥サイクル２（表３）は、２回目の小規模テストの凍結（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）の間にアニーリング段階を含むように設計された。
【０２９４】
前記凍結温度を−５０℃から−２０℃にランピング（ｒａｍｐｉｎｇ）し、２時間維持した後、その後に真空を導入したことが、アニーリング及びマンニトール結晶化の誘導を可能にした。１次乾燥は、５０ｍＴｏｒｒチャンバー圧力（表３）で−２０℃棚温度（２５時間）で行われた。２０℃の棚温度で２次乾燥は、１次乾燥段階中に昇華しなかった残余の水を除去するように設計された。
【０２９５】
図７は、２回目の小規模テストの凍結乾燥工程中に温度（左ｙ軸）及び圧力（右ｙ軸）の経時グラフを示す。真空を加えた時、昇華による熱損失によって前記生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）温度が−３７℃未満に下がった。ピラニゲージ値は、１次乾燥工程の完了が確認された１次乾燥段階中に約２３時間に静電容量圧力計の読み取り値と合算された。２次乾燥を開始し、前記サンプルをさらに１３時間乾燥させた。全体サイクルは４７時間持続され、１次乾燥が完了した直後に２次乾燥が始まった場合には、４２時間に減少させる可能性がある。
【０２９６】
前記サイクルが完了すると、サンプルを前記凍結乾燥器から取り出して分析した。視覚的検査によって、４ＭＳＮは、秀麗なケーキ（ｅｌｅｇａｎｔ  ｃａｋｅ）を示した。３ＭＳＮ及び２ＭＳＮは、収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）のある良好なケーキ（ｄｅｃｅｎｔ  ｃａｋｅ）を示したが、対照群は、凍結乾燥後にケーキ崩壊の徴候を示した。再構成後、前記サンプルは透明（ｃｌｅａｒ）で無色であり、前凍結乾燥サンプルと比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった（図８Ａ〜図８Ｃ）。ケーキの水分含有量は、２．５１％（４ＭＳＮ）、２．１５％（３ＭＳＮ）、２．０１％（２ＭＳＮ）及び１．１２％（対照群）であった。
【０２９７】
２回目の小規模凍結乾燥サイクルからのサンプルを再構成した後、各サンプルでＶＭ２０２の濃度を測定し、結果を表７に要約した。前記結果は、各サンプルが類似の濃度でＶＭ２０２を含有していることを示す。
【０２９８】
【表７】
2022500354.tif 000009
【０２９９】
毛細管電気泳動：前記再構成されたサンプルを、生成物純度に対してＣＥでさらに調べた。前記ＣＥからのクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）と表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）は、図９及び表８に詳細に示されている。４ＭＳＮ及び３ＭＳＮは、スーパーコイルピーク面積（ｓｕｐｅｒ  ｃｏｉｌｅｄ  ｐｅａｋ  ａｒｅａ）で最小の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示し、一方、２ＭＳＮ及び対照群は、凍結乾燥及び再構成後にスーパーコイルピークの減少を示した。
【０３００】
【表８】
2022500354.tif 000010
【０３０１】
これらの結果は、４ＭＳＮ（ｐＨ８．０で１０ｍＭリン酸カリウム、４％マンニトール、０．５％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌ）が、２回目の小規模凍結乾燥サイクルにおいてＣＥによる最上の（ｂｅｓｔ）凍結乾燥ケーキ及び最小量の分解を生産したということを示唆する。
【０３０２】
１．２．５  ４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び２ＭＳＮの二番目のセット分析（２回目の小規模凍結乾燥サイクル）
【０３０３】
チャンバー圧力５０ｍＴｏｒｒで−２０℃の１次乾燥棚温度、及びチャンバー圧力５０ｍＴｏｒｒで２０℃の２次乾燥棚温度（表３）に設計された２回目の小規模凍結乾燥サイクルによって、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群のさらに他のセットを製造した。図１０は、このサイクル中に得た温度及び圧力の経時グラフを示す。真空を加えた時、昇華による熱損失によって生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）温度が−３７℃未満に下がった。ピラニゲージ値は、１次乾燥中の約７５時間の間に静電容量圧力計の読み取り値と合算された。２次乾燥を開始し、サンプルをさらに１３時間乾燥させた。前記全体サイクルは８７時間持続した。
【０３０４】
前記サイクルが完了すると、サンプルを凍結乾燥器から取り出して分析した。視覚的検査によって４ＭＳＮは秀麗なケーキ（ｅｌｅｇａｎｔ  ｃａｋｅ）を示した。３ＭＳＮ及び２ＭＳＮはまた、収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）のある良好なケーキ（ｄｅｃｅｎｔ  ｃａｋｅ）を示し、一方、対照群は、凍結乾燥後にケーキ崩壊の徴候を示した。再構成時に、対照群以外の全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の一部のバイアルは、濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）を示し、一方、凍結乾燥前には全てのサンプルが透明（ｃｌｅａｒ）であった（図１１Ａ〜図１１Ｆ）。前記ケーキの水分含有量は、０．９７％（４ＭＳＮ）、０．９５％（３ＭＳＮ）、１．６９％（２ＭＳＮ）及び１．０６％（対照群）であった。
【０３０５】
濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）：濃度及び濁度結果は、表９に要約されている。全てのサンプルは、再構成後に類似の濃度値を示した。凍結乾燥前及び再構成後に全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に対して濁度が検出されなかった。
【０３０６】
【表９】
2022500354.tif 000011
【０３０７】
毛細管電気泳動：前記再構成されたサンプルは、生成物純度に対してＣＥでさらに調べた。ＣＥからのクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）及びピーク百分率は、図１２及び表１０に示している。４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び対照群は、凍結乾燥及び再構成後にスーパーコイルピーク面積の有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）減少を示した。２ＭＳＮは、凍結乾燥及び再構成後に前記スーパーコイルピーク面積で最小の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示した。
【０３０８】
【表１０】
2022500354.tif 000012
【０３０９】
前記結果は、２ＭＳＮ（ｐＨ８．０で１０ｍＭリン酸カリウム、２％マンニトール、０．５％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌ）が、２回目の小規模テストのためのこの別個の実験において、ＣＥによって最小量の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を生産した、ということを示唆する。
【０３１０】
この凍結乾燥サイクルで生産されたサンプルは、安定性加速研究（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ）のために１０週にわたって用いられた。
【０３１１】
１．２．６  ２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの分析
【０３１２】
２％マンニトール、０．５％スクロース及び０．４５％  ＮａＣｌを含有するＫＰ８ＭＳ３Ｎ及び２ＭＳＮが１回目及び特定２回目の小規模テストにおいてＣＥによって測定された最小量の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示したということを考慮して、マンニトール（２％）及びＮａＣｌ（０．４５％）濃度は同一濃度に維持する上にスクロース濃度を変化させることによって、前記ＫＰ８ＭＳ３Ｎ及び２ＭＳＮ剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）をさらに最適化した。具体的に、２％マンニトール、０．４５％  ＮａＣｌ及び１．０％スクロースを含有する２Ｍ１ＳＮ剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を製造し、２ＭＳＮと比較して分析した。
【０３１３】
２Ｍ１ＳＮ及び２ＭＳＮを、安定性加速研究に用いられたのと類似の凍結乾燥サイクルパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を用いて凍結乾燥させた。図１３は、このサイクルの温度及び圧力測定値を示す。真空を加えた時、昇華による熱損失によって、前記生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）温度が−４１℃未満に下がった。ピラニゲージ値は、１次乾燥中の約６０時間の間に静電容量圧力計の読み取り値と合算された。２次乾燥を開始し、前記サンプルをさらに１３時間乾燥させた。全体サイクルは７６時間持続し、１次乾燥が完了した直後に２次乾燥が始まった場合には、７０時間に減少させる可能性がある。
【０３１４】
凍結乾燥後、２Ｍ１ＳＮは、秀麗なケーキ（ｅｌｅｇａｎｔ  ｃａｋｅ）を示し、２ＭＳＮは小さな収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）のある良好なケーキ（ｄｅｃｅｎｔ  ｃａｋｅ）を示した（図１４）。再構成時に、２Ｍ１ＳＮは透明な（ｃｌｅａｒ）溶液を生産し、一方、２ＭＳＮは濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）を示した。凍結乾燥前には両剤形とも透明（ｃｌｅａｒ）であった。前記ケーキの水分含有量は、１．３１％（２ＭＳＮ）及び１．４４％（２Ｍ１ＳＮ）であった。
【０３１５】
濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）：剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を濃度及び濁度に対して評価し、その結果を表１１に要約した。全てのサンプルは再構成後に類似の濃度値を示した。前記追加の安定性加速研究のために、４５０ｎｍにおける濁度測定が、剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の差異をよりよく評価できるものと決定された。凍結乾燥前及び再構成後に、２Ｍ１ＳＮに対する濁度は検出されなかった。２ＭＳＮの再構成後、濁度において有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）増加が４５０ｎｍで観察された。
【０３１６】
【表１１】
2022500354.tif 000013
【０３１７】
毛細管電気泳動：再構成されたサンプルを、生成物純度に対してＣＥによってさらに調べた。ＣＥからのクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）と表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）が、図１５及び表１２に詳細に示されている。２ＭＳＮは、凍結乾燥及び再構成後に、スーパーコイルピーク面積の減少を示した。２Ｍ１ＳＮは、凍結乾燥及び再構成後に、スーパーコイルピーク面積において最小の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示した。
【０３１８】
【表１２】
2022500354.tif 000014
【０３１９】
この凍結乾燥周期で生成された前記サンプルは、追加の安定性加速研究のために１０週にわたって用いられた。
【０３２０】
１．３．  ４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の安定性加速研究
【０３２１】
凍結乾燥したＶＭ２０２剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の安定性を、冷蔵（５±３℃）、アンビエント（ａｍｂｉｅｎｔ、周辺）（２５±３℃）、及び加速化された（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）（４０±３℃）温度及びアンビエント（ａｍｂｉｅｎｔ、周辺）温度で３日間又は７日間ＶＭ２０２剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を再構成した異なる保管条件下で評価した。
【０３２２】
前記安定性加速研究からの凍結乾燥したサンプルを生物学的安全キャビネットにおいて５ｍＬの濾過水（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｗａｔｅｒ）で再構成し、再栓し（ｒｅ−ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、密封し（ｓｅａｌｅｄ）、３日間及び７日間２５℃でインキュベーションした。３日及び７日後、前記インキュベーションされた（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）サンプルを、前記インキュベーターから取り出して視覚的（ｖｉｓｕａｌ）分析、濃度分析及びＣＥ分析で分析した。
【０３２３】
視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：Ｔ＝０と比較するとき、再構成後３日（図１６Ａ）及び７日（図１６Ｂ）の間に２５℃で前記剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群の貯蔵後に視覚的に（ｖｉｓｕａｌ）外見の変化が観察されなかった。
【０３２４】
各時点において、サンプルを、ＶＭ２０２の濃度を決定するために、２６０ｎｍで吸光度を分析した。３日間及び７日間２５℃で保管した後、各剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の濃度は、Ｔ＝０で得た結果と類似であった（表１３）。全てのサンプルは、目標とした濃度値の５％以内であった。したがって、温度ストレスは、ＶＭ２０２濃度において大きな変化を誘発しなかった。
【０３２５】
【表１３】
2022500354.tif 000015
【０３２６】
毛細管電気泳動：温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）の間に生成物純度をモニターするためにＣＥ分析を用いた。貯蔵後、前記剤形のＣＥクロマトグラム（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）及び表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）が、図１７Ａ及び図１７Ｂ及び表１４に詳細に示されている。全ての剤形（すなわち、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群）は、２５℃で３日〜７日までの貯蔵後にスーパーコイルピーク面積の減少を示した。２ＭＳＮは、３日〜７日までスーパーコイルピーク面積の１．１％減少だけを有する最上の安定性を示した。
【０３２７】
【表１４】
2022500354.tif 000016
【０３２８】
前記凍結乾燥したＶＭ２０２剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を、５℃、２５℃、及び４０℃で１０週にわたって保管した（表４）。各時点において、サンプルを温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）から取り出して視覚的（ｖｉｓｕａｌｌｙ）に評価した。前記バイアルの写真を撮り、ケーキ形状に対してサンプルを評価した。全ての凍結乾燥したケーキは、完全に（ｉｎｔａｃｔ）維持され、温度条件に関係なく保管時にいかなる変化の徴候も見られなかった（対照群ケーキは持ち上げられて（ｌｉｆｔｅｄ）維持された。）。その後、前記サンプルを５ｍＬの濾過水（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｗａｔｅｒ）で再構成し、透明度（ｃｌａｒｉｔｙ）及び沈殿に対して評価した。４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び２ＭＳＮに対する大部分のサンプルは、Ｔ＝０と比較するとき、透明度において若干の差異を示した。１０週間５℃（図１８Ｃ）、２５℃（図１８Ａ）及び４０℃（図１８Ｂ）保管後の各剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の視覚的外見は、図１８Ａ〜図１８Ｃに示されている。
【０３２９】
温度ストレスの間に凍結乾燥したＶＭ２０２の安定性を評価するために、濃度、濁度、水分含有量及び毛細管電気泳動分析も行った。
【０３３０】
各時点において、サンプルを再構成し、バイアルでＶＭ２０２の濃度を決定するために、２６０ｎｍで吸光度を分析した。表１５は、１０週の温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）後、凍結乾燥したサンプルにおいて、ＶＭ２０２の濃度が、Ｔ＝０で得た結果と類似していることを示す。したがって、温度ストレスは、ＶＭ２０２濃度において大きな変化を誘発しなかった。
【０３３１】
【表１５】
2022500354.tif 000017
【０３３２】
濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）：各サンプルの濁度はまた、研究の各時点において評価された。前記結果は、表１６に詳細に示されている。再構成された剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び２ＭＳＮの濁度は、温度条件に関係なく１０週保管後に有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）変わらなかった。
【０３３３】
【表１６】
2022500354.tif 000018
【０３３４】
水分含有量分析はまた、各時点において行われた。表１７は、１０週の温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）後に水分含有量に対する結果を略述した（ｏｕｔｌｉｎｅ）ものである。５℃、２５℃及び４０℃で１０週間保管した後、温度による水分含有量の若干の減少が観察された。保管温度が高いほど水分含有量が低くなった。２ＭＳＮは、安定性加速研究において水分含有量が最も高かった。
【０３３５】
【表１７】
2022500354.tif 000019
【０３３６】
毛細管電気泳動：毛細管電気泳動分析は、生成物純度をモニターするために用いた。４０℃で１０週のインキュベーション後、ＣＥクロマトグラム及びピーク面積値をそれぞれ図１９及び表１８に示した。全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、再構成して４０℃で１０週間保管後、Ｔ＝０に比べて、開環ピーク面積（ｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｌｅ  ｐｅａｋ  ａｒｅａ）の相応する増加と共にスーパーコイルピーク面積（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ  ｐｅａｋ  ａｒｅａ）の有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）減少を示した。２ＭＳＮは最も高いスーパーコイルピーク面積を示したが、この値は、ゼロ（ｚｅｒｏ）時点に比べて、４０℃で１０週保管において有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）より低かった。３％及び４％マンニトールを含有する剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）において及び対照群剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）においてより高いレベルの開環ピーク面積が観察された。
【０３３７】
【表１８】
2022500354.tif 000020
【０３３８】
標準偏差によって加重され、偏差誤差棒を含み、様々な温度で１０週を越える、ＣＥスーパーコイルピーク純度の傾向が、図２０Ａ〜図２０Ｃ、５℃（図２０Ａ）、２５℃（図２０Ｂ）又は４０℃（図２０Ｃ）に詳細に示されている。昇温（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）でインキュベーションした後、純度の有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）差が観察された。図２０Ａ〜図２０Ｃに示すように、２％マンニトール及び０．４５％  ＮａＣｌを含有する２ＭＳＮは、４０℃保管後に最高レベルの純度を示した。
【０３３９】
異なる温度で保管後、ＣＥで検出された開環ピーク不純物の傾向も、図２１Ａ〜図２１Ｃに示した。５℃で開環ピーク面積の若干の増加が観察された。しかし、２５℃以上において、全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は相当な分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示した。４０℃インキュベーション後、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び対照群においてより高いレベルの開環ピーク不純物が観察された。これに比べて、２ＭＳＮは、全ての温度において実質的により少ない分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を示した。
【０３４０】
１．４．  ２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの安定性加速研究
【０３４１】
凍結乾燥したＶＭ２０２剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮの安定性はまた、アンビエント（ａｍｂｉｅｎｔ、周辺）温度（２５℃）で３日間又は７日間インキュベーションした後に評価された。サンプルを生物学的安全キャビネットにおいて５ｍＬの濾過水（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｗａｔｅｒ）で再構成し、再栓し、密封し、３日間及び７日間２５℃でインキュベーションした。３日及び７日後、インキュベーションされたサンプルをインキュベーターから取り出して視覚的（ｖｉｓｕａｌ）分析、濃度分析及びＣＥ分析によって分析した。
【０３４２】
視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：２時点ともにおいて視覚的検査が行われた（図２２Ａ〜図２２Ｄ）。再構成して２５℃で３日及び７日の保管後に２ＭＳＮにおいて濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）が観察された。２Ｍ１ＳＮは、２時点ともにおいて透明に（ｃｌｅａｒ）維持された。
【０３４３】
各時点において、ＶＭ２０２の濃度を決定するために、サンプルを２６０ｎｍで吸光度を分析した。両剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）においてＶＭ２０２濃度は、Ｔ＝０に及び再構成して３日間及び７日間２５℃でインキュベーションした後に、目標した通りであった（表１９）。したがって、温度ストレスは、ＶＭ２０２濃度において大きな変化を誘発しなかった。
【０３４４】
【表１９】
2022500354.tif 000021
【０３４５】
毛細管電気泳動：温度保管後、生成物純度に対してＣＥでサンプルをまた分析した。保管後、サンプルのＣＥクロマトグラム及びピーク面積結果は、図２３Ａ及び図２３Ｂ及び表２０に示されている。両剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、保管後に類似のスーパーコイルピーク面積を示した。２Ｍ１ＳＮは２ＭＳＮに比べて高いスーパーコイルピーク面積を示した。
【０３４６】
【表２０】
2022500354.tif 000022
【０３４７】
保管中の安定性：追加の安定性加速研究のために、凍結乾燥したＶＭ２０２剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を５℃、２５℃及び４０℃で１０週にわたって保管した（表４）。各時点において、サンプルを温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）から採取し、視覚的に評価した。前記バイアルの写真を撮り、サンプルは、ケーキ形状に対して評価した。サンプルを５ｍＬの濾過水（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｗａｔｅｒ）で再構成し、透明度（ｃｌａｒｉｔｙ）及び沈殿に対して評価した。全ての凍結乾燥したケーキは、完全に維持され、温度条件に関係なく保管時にいかなる変化の徴候も見られなかった。１０週にわたって保管した後、再構成された２ＭＳＮにおいて濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）が観察された。再構成した後、保管後の２Ｍ１ＳＮは透明であった。１０週間５℃、２５℃及び４０℃保管後の各剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の視覚的外見は、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されている。
【０３４８】
温度ストレスの間に、凍結乾燥したＶＭ２０２の安定性を評価するために、濃度、濁度、水分含有量、及び毛細管電気泳動分析を行った。
【０３４９】
各時点において、サンプルを再構成し、バイアルでＶＭ２０２の濃度を決定するために、２６０ｎｍにおける吸光度を分析した。表２１は、１０週の温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）後、凍結乾燥したサンプルにおいて、ＶＭ２０２の濃度がＴ＝０で得た結果と類似していることを示す。したがって、温度ストレスは、ＶＭ２０２濃度において大きな変化を誘発しなかった。
【０３５０】
【表２１】
2022500354.tif 000023
【０３５１】
各サンプルの濁度はまた、２個のに異なる波長に対してそれぞれの時点で評価された。作業者がサンプルから視覚的に濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）を発見したが、６５０ｎｍ波長で測定した時は、濁度において有意な差が観察されなかった。したがって、剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）間に濁度の差を評価するためには、４５０ｎｍが適切なものと決定された。この評価からの結果は、表２２に詳細に示されている。２ＭＳＮは、温度保管条件に関係なく４５０ｎｍで適当な吸光度を示した。２Ｍ１ＳＮは、全ての温度に対して４５０ｎｍで低い吸光度を示した。
【０３５２】
【表２２】
2022500354.tif 000024
【０３５３】
水分含有量分析はまた、各時点で行われた。表２３は、１０週の温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）後に水分含有量に対する結果を略述したものである。５℃、２５℃及び４０℃で１０週の保管後、若干増加した水分含有量（１．５６％）を示した５℃に保管された２Ｍ１ＳＮを除けば、全てのサンプルにおいて類似の水分含有量が観察された。
【０３５４】
【表２３】
2022500354.tif 000025
【０３５５】
毛細管電気泳動分析を、生成物純度をモニターするために用いた。４０℃で１０週のインキュベーション後、ＣＥクロマトグラム及びピーク面積値はそれぞれ、図２５及び表２４に示されている。両剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は４０℃で１０週間保管した後、再構成後のＴ＝０に比べて、開環ピーク面積の相応する増加と共に、スーパーコイルピーク面積の有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）減少を示した。２Ｍ１ＳＮは、最も高いスーパーコイルピーク面積を示したが、この値は、ゼロ（ｚｅｒｏ）時間に比べて、４０℃の１０週保管において有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）低かった。２ＭＳＮから、より高いレベルの開環ピーク面積が観察された。
【０３５６】
【表２４】
2022500354.tif 000026
【０３５７】
様々な温度で１０週にわたったＣＥスーパーコイルピーク純度傾向は、図２６Ａ〜図２６Ｃ、５℃（図２６Ａ）、２５℃（図２６Ｂ）又は４０℃（図２６Ｃ）に詳細に示されている。昇温（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）インキュベーション後、純度において有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）差が観察された。表２４に示すように、１％スクロース及び０．４５％  ＮａＣｌを含有する２Ｍ１ＳＮは、４０℃保管後に最も高いレベルの純度を示した。
【０３５８】
温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）中にＣＥによって検出された開環ピーク不純物の傾向は、図２７Ａ〜図２７Ｃ、５℃（図２７Ａ）、２５℃（図２７Ｂ）又は４０℃（図２７Ｃ）に示されている。このグラフは、増加した温度保管（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ）に相応する開環ピークの増加を示す。４０℃インキュベーション後、２ＭＳＮから、より高いレベルの開環ピーク不純物が観察された。２Ｍ１ＳＮは、全ての温度でより少ない開環ピークを示したが、２ＭＳＮと同じ傾向に従った。
【０３５９】
１．５．  テスト結果の要約
【０３６０】
凍結乾燥前に、プラスミドＤＮＡ（ＶＭ２０２）を含む全てのテストされた剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、変色又は可視的な微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）無しで透明に維持された。また、毛細管電気泳動（ＣＥ）結果は、全ての組成物の高い純度を一貫して示した。
【０３６１】
６個の他の剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（ＫＰ８Ｍ２ＳＮ、ＫＰ８ＭＳ３Ｎ（＝２ＭＳＮ）、ＫＰ８ＭＴ３Ｎ、４ＭＳＮ、３ＭＳＮ及び対照群）を用いてＶＭ２０２に対して１回目及び２回目の小規模凍結乾燥テストを行ったが、ここで、生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）は３ｃｃガラスバイアルに０．７５ｍＬで充填された。５ｍＬで２０ｃｃガラスバイアルに充填された２回目の小規模凍結乾燥の同一の４個の剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（４ＭＳＮ、３ＭＳＮ、２ＭＳＮ及び対照群）を用いてＶＭ２０２に対する安定性加速研究を行い、小規模凍結乾燥研究から得たデータから凍結乾燥パラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を決定した。また、２個の異なる剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）（２ＭＳＮ及び２Ｍ１ＳＮ）を、初期安定性加速研究のデータに基づく追加の安定性加速研究においてテストした。凍結乾燥サイクルは、サブアンビエント（ｓｕｂａｍｂｉｅｎｔ）ＤＳＣ分析後に得た結果から設計された。アニーリング後に失透温度が除去されたと決定されたので、アニーリング段階が凍結乾燥サイクルに含まれた。
【０３６２】
凍結乾燥後、０．９％  ＮａＣｌ及び１．１％スクロースを含む対照群以外の全ての組成物に対して秀麗な（ｅｌｅｇａｎｔ）又は良好な（ｄｅｃｅｎｔ）ケーキが観察された。前記対照群は、米国特許第８，３８９，４９２号に既に記述された剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）であり、その全文は本願に参照によって含まれる。
【０３６３】
しかし、凍結乾燥した組成物の再構成後に、２Ｍ１ＳＮ（ｐＨ８．０で１０ｍＭリン酸カリウム、２％マンニトール、１％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌ）以外の全てのテストされた組成物は、濁っている（ｈａｚｙ）ことが観察された。再構成後、再構成された組成物を２５℃で３日間及び７日間保管した後にも依然として濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）が維持された。再構成後に、及び再構成後３日間及び７日間２５℃で保管した後に、２Ｍ１ＳＮだけが透明に（ｃｌｅａｒ）維持され、本研究全般にわたって２Ｍ１ＳＮにおいてＶＭ２０２の濃度には変化がなかった。
【０３６４】
毛細管電気泳動は、ＶＭ２０２生成物純度を評価するのに効果的であった。凍結乾燥及び再構成後、全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）はスーパーコイルピーク面積において減少を示した。スーパーコイルピーク面積の減少は、２５℃及び４０℃で１０週保管後にも、全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）から観察された。しかし、２Ｍ１ＳＮは、１０週の安定性研究の間に、開環ピーク百分率の最小増加と相応する最高スーパーコイルピーク百分率を示した。
【０３６５】
２０ｃｃバイアルにおいて５ｍＬの充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）でｐＨ８．０、２％マンニトール、１％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌで１０ｍＭリン酸カリウムと共に０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に剤形化される（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）とき、凍結乾燥したＶＭ２０２が、凍結乾燥及び貯蔵後に秀麗な（ｅｌｅｇａｎｔ）ケーキ外見及び最高レベルの純度（スーパーコイルＤＮＡ）を維持するということを、前記結果は示唆する（表２５で２Ｍ１ＳＮ）。たとえより高い温度でＶＭ２０２に対する不安定性速度が増加するが、他のテストされた剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に比べて、この２Ｍ１ＳＮ剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）から、より少ない分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が観察された。
【０３６６】
【表２５】
2022500354.tif 000027
【０３６７】
実施例２：ＶＭ２０２の凍結乾燥した組成物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（研究００２）
【０３６８】
ｐＨ及び／又は増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）及び安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）の濃度において若干の変化を有する剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中のＶＭ２０２の品質の他に、凍結乾燥後の医薬品（ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ）剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中のＶＭ２０２の品質もテストするために、ＶＭ２０２を含有する様々な凍結乾燥した剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を生成し、分析した。
【０３６９】
２．１．実験設計
【０３７０】
材料：本研究で検査した活性薬剤成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ；ＡＰＩ）は、ＶＭ２０２である。本研究に用いられた材料は、次のように構成された：ＶＭ２０２を剤形化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）し分析するのに用いられた化学物質と材料は、次の通りである：
【０３７１】
【表２６】
2022500354.tif 000028
【０３７２】
剤形パラメータ（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）：本研究で、次のパラメータが固定された：
【０３７３】
（１）充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）：５ｍＬ
【０３７４】
（２）ＡＰＩ濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ
【０３７５】
（３）緩衝液濃度：１０ｍＭリン酸カリウム
【０３７６】
（４）スクロース濃度：１％
【０３７７】
この剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）において、次の剤形パラメータ（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を検査した：
【０３７８】
（１）ｐＨ：７．０、８．０、及び９．０
【０３７９】
（２）マンニトール濃度：１％及び２％
【０３８０】
（３）塩化ナトリウム濃度：０．４５％、０．６％、及び０．９％
【０３８１】
次表２７に列挙された剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、分析のために製造された：
【０３８２】
【表２７】
2022500354.tif 000029
【０３８３】
２．２．  剤形調製（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）
【０３８４】
２．２．１．  小規模研究
【０３８５】
表２７の目標とした剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）ｐＨ値を達成するように、薬物物質（Ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ：ＤＳ）を希釈させるために必要な緩衝液ｐＨ値を決定する目的で小規模テストを行った。薬物物質を保存するために、ＤＳの代わりに、０．９％  ＮａＣｌプラセボ（ＤＳにおけると同じ剤形）で小規模研究希釈（ｓｍａｌｌ−ｓｃａｌｅ  ｓｔｕｄｙ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を行った。前記０．９％  ＮａＣｌプラセボは、ＤＳ剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）組成物をよりよく表すためにｐＨ調節無しで製造された。希釈緩衝液組成（水）（表２８）は、１．６ｍｇ／ｍＬから０．５ｍｇ／ｍＬまでのＤＳ希釈に基づいて計算された。剤形緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した後、全ての最終剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が表２７の目標としたｐＨ値又はその近くのｐＨ値を示したことが、小規模テストから見られた。しかし、剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）Ｆ３（９．０）のｐＨがリン酸塩の緩衝範囲を超えることによって、ｐＨの下方移動が観察された。これを最もよく補完するために、より高いｐＨ希釈剤緩衝液を選択した（９．５）。小規模テストにおいて、希釈直後にｐＨ９．２が、２４時間及び４８時間後にそれぞれｐＨ９．１及びｐＨ８．５に減少したことが見られた。
【０３８６】
本研究において目標としたｐＨ値を最もよく達成するために、凍結乾燥１日以内に剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を製造し、再構成後のｐＨ変化をモニターした。表２８に示す希釈緩衝液を剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の製造に用いた。
【０３８７】
【表２８】
2022500354.tif 000030
【０３８８】
２．２．２．  凍結乾燥
【０３８９】
コブラ（Ｃｏｂｒａ）から提供された０．９％  ＮａＣｌ中１．６ｍｇ／ｍＬのＶＭ２０２を、−７０℃保管から取り出して５℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）解凍させた。３５ｍＬのＤＳを２１ｍＬの希釈緩衝液（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（表２８）で１．０ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈した。希釈後、ｐＨ及びＡＰＩ濃度を測定した。プラセボ（ｐｌａｃｅｂｏ）を用いた小規模テストの結果にもかかわらず、ＶＭ２０２の存在下で剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は目標としたｐＨ値を生成しなかったので、４８ｍＬの希釈緩衝液で１．０ｍｇ／ｍｌ  ＤＳを希釈する間に（表２９）、スターティング希釈緩衝液（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）のｐＨは、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にさらに調整された。
【０３９０】
【表２９】
2022500354.tif 000031
【０３９１】
希釈後、剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を０．２μｍセルロースアセテートフィルターを用いて滅菌濾過し、ＢＳＣにおいて５ｍＬ充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）（２．５ｍｇ容量）で２０ｃｃガラス（ｇｌａｓｓ）である、発熱源が除去された（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）バイアルに充填した。充填後、バイアルを部分的に栓し（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）のために凍結乾燥器にローディングした。ＶＭ２０２  ＤＳを含有するバイアルを完全に取り囲むために空の（ｅｍｐｔｙ）バイアルを用いた。凍結乾燥後、バイアルを取り出す前に、６００Ｔｏｒｒの部分真空である凍結乾燥チャンバー内で、前記バイアルを完全に栓した。バイアルをクリンピングし（ｃｒｉｍｐｅｄ）、ラベルを付けた（ｌａｂｅｌｅｄ）後、−７０℃に置いた。各剤形の１個のバイアルを５℃に置いた。各剤形当たり１個のバイアルを５ｍＬの濾過されたＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成し、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）サンプルと共に分析した。
【０３９２】
２．２．３．  分析方法
【０３９３】
凍結乾燥した剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を、表３０に要約したように、異なる時点で分析した。
【０３９４】
【表３０】
2022500354.tif 000032
【０３９５】
視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：視覚的検査は、黒い背景及び白い背景に対して白色光源（１３Ｗ蛍光チューブ）下で行われた。全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のデジタル写真を得た。
【０３９６】
濃度測定（Ａ２６０）：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ８００によって経路長（ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）が１ｃｍである石英キュベット（ｑｕａｒｔｚ  ｃｕｖｅｔｔｅ）で分光光度法（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）分析を行った。テストサンプルのプラスミドＤＮＡ濃度は、２３０、２６０、２８０及び３５０ｎｍで吸光度を測定することによって決定された。ＨｅｌｉｘｍｉｔｈのＵＶ／Ｖｉｓプロトコルを用いて濃度分析を行った。次の方程式を用いて計算を行った。
【０３９７】
濃度（μｇ／ｍＬ）＝［（Ｄ−Ｅ）／Ｃ］×（Ｂ／Ａ）
【０３９８】
回復（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）＝（低μｇ／ｍＬ）／（高μｇ／ｍＬ）×１００％
【０３９９】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ＝Ｄ／Ｆ
【０４００】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ＝Ｄ／Ｇ
【０４０１】
ここで：
【０４０２】
Ａ＝希釈のために採取したサンプルの重さ
【０４０３】
Ｂ＝希釈に用いられたサンプル及び緩衝液の総重量
【０４０４】
Ｃ＝１ｃｍ経路長（ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）で０．００５％溶液の吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（０．０２）
【０４０５】
Ｄ＝２６０ｎｍで最大光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）
【０４０６】
Ｅ＝３５０ｎｍで測定された吸光度
【０４０７】
Ｆ＝２８０ｎｍで測定された吸光度
【０４０８】
Ｇ＝２３０ｎｍで測定された吸光度
【０４０９】
受容基準（Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）：
【０４１０】
Ｄは０．５ＯＤ〜１．５ＯＤ単位の範囲に属しなければならない。
【０４１１】
回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は９８％以上でなければならない。
【０４１２】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ＝１．８〜２．０の範囲にあるべきである。
【０４１３】
ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ＝１．１以上でなければならない。
【０４１４】
ｐＨ：補正勾配（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｌｏｐｅ）の９５％又はそれ以上を有する３つのｐＨ標準溶液（ｐＨ４、ｐＨ７、及びｐＨ１０）で補正された（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）ＳｙｍｐＨｏｎｙ（登録商標）  ｐＨ  Ｍｅｔｅｒ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＢ７０Ｐ）でｐＨ分析を行った。サンプルは、温度を調整せず、アンビエント（ａｍｂｉｅｎｔ、周辺）温度に平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）させて測定した。
【０４１５】
濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）測定（Ａ３５０、Ａ４５０、Ａ６５０）：濁度は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ８００を用いて３５０、４５０及び６５０ｎｍでサンプル吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定して決定された。Ａ６５０＞０．０１である剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、一般に、増加した濁度を示したと見なされる。
【０４１６】
毛細管区域電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）：分析前に、毛細管は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、及び再びＭｉｌｌｉ−Ｑ水をそれぞれ１０分間２０ｐｓｉずつ稼働（ｒｕｎｎｉｎｇ）してコンディションされた（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）（調子は総４０分持続した。）。０．５ｍｇ／ｍＬの濃度であるサンプル４０μＬを、分析のためにポリエチレンインサート（ｉｎｓｅｒｔ）にローディングした。
【０４１７】
機器：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰＡ８００＋ＣＥ（Ｓ／Ｎ３０６３３０９）
【０４１８】
毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：中性のコーティングされた毛細管（ｎｅｕｔｒａｌ  ｃｏａｔｅｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、５０μｍ  Ｉ．Ｄ、４０ｃｍ総長、３０ｃｍ有効長、８μｍ絞り（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／Ｎ４７７４４１、ロット番号Ｍ８１２１３４）
【０４１９】
データ分析：３２Ｋａｒａｔ（バージョン９．０）
【０４２０】
圧力／注入時間：０．５ｐｓｉ／１１秒
【０４２１】
分離緩衝液（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）／圧力：１００ｍＭリン酸（ｐＨ２．６０）、８５％／２０ｐｓｉ；６０秒
【０４２２】
洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）／圧力：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水／２０ｐｓｉ；６０秒
【０４２３】
測定（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）：２５４ｎｍでＵＶ
【０４２４】
分離電圧（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖｏｌｔａｇｅ）：１７ＫＶ；ランプ（ｒａｍｐ）０．１７分；１４分
【０４２５】
残余水分含有量（Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｅｎｔ）：Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒ  Ｃ２０（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を水分含有量分析に用いた。Ａｐｕｒａ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｖｅｎ  １％を用いてシステム正確度を決定した。分析のために、キャップを除去する前にサンプルバイアルを室温に置いた。各分析に概略１００ｍｇの物質が用いられた。
【０４２６】
２．３．  テスト結果の要約
【０４２７】
この部分（ｓｅｃｔｉｏｎ）は、様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で凍結乾燥したＶＭ２０２の品質（ｑｕａｌｉｔｙ）を要約する。
【０４２８】
２．３．１．  凍結乾燥サイクルプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）
【０４２９】
以前に設計されたリオサイクル（Ｌｙｏ  Ｃｙｃｌｅ、凍結乾燥サイクル）は、様々な剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）において２．５ｍｇ容量のＶＭ２０２を凍結乾燥させるために用いられた。凍結温度（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の−５０℃から−２０℃へのランピング（ｒａｍｐｉｎｇ）及び真空を引く（ｐｕｌｌ）前の２時間の維持は、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）が起こるようにした。前記アニーリング工程は、非晶質（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）賦形剤の結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）を助ける。真空が、与えられた時間内に設定点に到達しないと、プログラムを中断させることができる、この実験に用いられた凍結乾燥器の独特の特徴によって、１次乾燥が始まりながら真空が、最初には１００ｍＴｏｒｒに抜け、最終真空に調整される１次乾燥の開始段階が用いられた。１次乾燥は、５０ｍＴｏｒｒチャンバー圧力（表３１）で−２０℃（〜５３．４時間）の棚温度で行われた。２０℃の棚温度での２次乾燥は、１次乾燥段階中に昇華しなかった残余の水（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｗａｔｅｒ）を除去するように設計された。
【０４３０】
【表３１】
2022500354.tif 000033
【０４３１】
＊ソフトウェア制限によって１次乾燥時間が３２４０分から３２００分に変更された。
【０４３２】
２次乾燥に進行する前に、ピラニゲージ（Ｐｉｒａｎｉ  ｇａｕｇｅ）と静電容量圧力計（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｍａｎｏｍｅｔｅｒ）が併合された。
【０４３３】
図２８は、全体凍結乾燥サイクルのチャートを示す。真空を加えた時、昇華による熱損失によって前記生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）温度が約−４０℃に下がる。ピラニゲージ値は約４１時間に静電容量圧力計の読み取り値と合算され、これは、１次乾燥工程の完了を確認した。全体サイクルの６２時間後、２０℃で２次乾燥を開始し、サンプルをさらに１３時間乾燥させた。全体サイクルは、約７５時間持続した。
【０４３４】
ケーキの測定された水分含有量を表３２に示す。
【０４３５】
【表３２】
2022500354.tif 000034
【０４３６】
２．３．２．  凍結乾燥研究
【０４３７】
視覚的検査（Ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：凍結乾燥後、Ｆ１、Ｆ２及びＦ３は、若干の収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）だけを持つ良好なケーキ（ｄｅｃｅｎｔ  ｃａｋｅ）を示した。Ｆ５は、有意なケーキ収縮（ｃａｋｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）を示した。ケーキの総崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）は、Ｆ４（図３２）及びＦ６（図３４）から観察された。再構成された液体サンプルであるＦ１（図２９）、Ｆ２（図３０）、Ｆ３（図３１）、Ｆ４（図３２）及びＦ５（図３３）は透明（ｃｌｅａｒ）で、無色（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ）であり、可視的な微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ）がなく、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった。再構成後、Ｆ６は、濁っていた（ｈａｚｙ）。
【０４３８】
濃度（Ａ２６０）：全てのサンプルは、表３３に提供される通り、凍結乾燥前及び再構成後、その目標とした濃度にあった。
【０４３９】
【表３３】
2022500354.tif 000035
【０４４０】
ｐＨ及び再構成時間：剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）Ｆ３の緩衝限界によって、Ｆ３のｐＨは充填中に安定でなく、速く減少した。プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）サンプルを分析するとき、既に、サンプルはｐＨ９．０からｐＨ８．７に減少した。再構成後、ｐＨ値の更なる減少（Δ＝−０．４）が、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較して観察された。再構成後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、そのプレリオ対照群と比較して同じｐＨ値（Δ≦０．１）を示した。再構成された時間分析は、凍結乾燥したケーキが１分〜１．５分で溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）することを示した。ｐＨ及び再構成時間の結果は、表３４に詳細に示されている。
【０４４１】
【表３４】
2022500354.tif 000036
【０４４２】
濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）（Ａ３５０、Ａ４５０、Ａ６５０）：再構成後、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでＦ６に対する濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）の若干の増加が観察された。他の全ての剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、凍結乾燥前又は再構成後、次表３５に提供される通り、有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）濁度を示さなかった。
【０４４３】
【表３５】
2022500354.tif 000037
【０４４４】
注（ｎｏｔｅ）：サンプルの濁度値を得るために水の吸光度を引き、Ａ６５０≧０．０１は、濁っている（ｔｕｒｂｉｄ）ものと見なされた。
【０４４５】
毛細管区域電気泳動（ＣＺＥ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）：再構成されたサンプルを、ＣＺＥによって生成物純度に対してさらに調べた。濁度のためにＦ６を分析しなかった。ＣＺＥの電気泳動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓ）及び表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）が、それぞれ図３５及び表３６に詳細に示されている。再構成後、全ての剤形は、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）（９９．１％〜１００．０％）と比較して、スーパーコイルピークの相応する減少（９７．５％〜９９．０％）と共に、開環ピークの若干の増加を示した。Ｆ４及びＦ５は、他の剤形と比較して、０．４％以下の開環ピーク百分率の最小増加を示した。ケーキ外見が不良な（ｐｏｏｒ）剤形を除いて、現在剤形（Ｆ１）は、凍結乾燥前（１００％）及び凍結乾燥後（９８．６％）に最も高い純度を示した。
【０４４６】
【表３６】
2022500354.tif 000038
【０４４７】
結論：本研究の目的は、凍結乾燥後、ｐＨ８．０で２％マンニトール、１％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌと共に１０ｍＭリン酸カリウム中の０．５ｍｇ／ｍＬ  ＶＭ２０２である、薬物剤形（ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）において、ＶＭ２０２の品質を評価する上に、薬物剤形からｐＨ及び／又は増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）及び安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）の濃度に若干の変化を有する剤形におけるＶＭ２０２の品質を評価することであった。本研究で施行された分析方法には、毛細管区域電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＣＺＥ）、透明度（ｃｌａｒｉｔｙ）及びケーキ外見（ｃａｋｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）に対する視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）、濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）、濃度（Ａ２６０）、ｐＨ及び水分含有量分析（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）が含まれ、これらはいずれも、生成物のための効果的な安定性指示分析（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）であることを示した。
【０４４８】
本凍結乾燥した剤形研究において、ＶＭ２０２は、充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）５ｍＬでバイアル当たり２．５ｍｇで評価された。大規模でＶＭ２０２に対する希釈法（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって適切な剤形の製造手順を確立するために、０．９％  ＮａＣｌプラセボ（ｐｌａｃｅｂｏ）を用いて小規模ｐＨテストを行った。
【０４４９】
凍結乾燥前に、ＶＭ２０２の全ての剤形は変色無しで透明であり、可視的な（ｖｉｓｉｂｌｅ）微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）がなく、濃度は、目標とした（ｔａｒｇｅｔ）濃度にあった。凍結乾燥及び再構成後にさらに観察された減少と共に、ｐＨ９．０で１０ｍＭリン酸カリウム剤形のｐＨは充填（ｆｉｌｌ）中に安定でなく、速く減少した。最高百分率のスーパーコイルピークを示す薬物剤形と共に、凍結乾燥前の全ての剤形に対する毛細管区域電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）結果は、高い純度を示した。
【０４５０】
凍結乾燥後、薬物剤形に対して及びより高いｐＨ及びより低いｐＨで薬物剤形に対して、良好な（ｄｅｃｅｎｔ）ケーキが観察された。再構成後、最も高い濃度のＮａＣｌを有する剤形は濁り（ｈａｚｉｎｅｓｓ）を示したが、残りの剤形は透明で、無色で、可視的な微粒子がなく、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった。再構成後、スーパーコイルピークの相応する減少と共に、全ての剤形は開環ピークの若干の増加を示した。ケーキ外見が不良な（ｐｏｏｒ）剤形を除いて、薬物剤形は、凍結乾燥後、毛細管区域電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって最高の純度を示した。
【０４５１】
本研究から得た結果は、２０ｃｃバイアルにおいて５ｍＬの充填体積（ｆｉｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）でｐＨ８．０，２％マンニトール、１％スクロース、０．４５％  ＮａＣｌで１０ｍＭリン酸カリウムと共に０．５ｍｇ／ｍＬに凍結乾燥後、凍結乾燥したＶＭ２０２が良好な（ｄｅｃｅｎｔ）ケーキ外見及び最高レベルの純度（スーパーコイルＤＮＡ）を維持するということを示唆する。
【０４５２】
実施例３．ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０の凍結乾燥した組成物
【０４５３】
凍結乾燥後、剤形においてｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０の品質のために、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０を含有する様々な凍結乾燥した剤形を生成し分析した。次表３７に列挙された剤形が、分析のために製造された。
【０４５４】
【表３７】
2022500354.tif 000039
【０４５５】
３．１．テスト結果の要約
【０４５６】
視覚的検査（Ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：凍結乾燥後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９は、若干の収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）だけを持つ良好な（ｄｅｃｅｎｔ）ケーキを示した。Ｆ５は、有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）ケーキ収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）を示した。Ｆ３は、跳ねる（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）形態を示した。ケーキの総崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）は、Ｆ４及びＦ６で観察された。再構成された液体サンプルであるＦ１（図３６）、Ｆ２（図３７）、Ｆ３（図３８）、Ｆ４（図３９）、Ｆ５（図４０）、Ｆ６（図４１）、Ｆ７（図４２）、Ｆ８（図４３）及びＦ９（図４４）は透明で、無色で、可視的な微粒子がなく、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった。サンプルの濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）（透明度；Ｃｌａｒｉｔｙ）を決定するために、サンプルをＴｕｒｂｉｄｉｔｙ  ４０００ＮＴＵ補正スタンダード（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと比較した。“＜Ｉ透明度（Ｃｌａｒｉｔｙ）”を有する剤形は、濁っていないものと評価できる。
【０４５７】
濃度（Ａ２６０）：全てのサンプルは、凍結乾燥前及び再構成後、次表３８に提供される通り、その目標とした濃度（ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）にあった。
【０４５８】
【表３８】
2022500354.tif 000040
【０４５９】
ｐＨ及び再構成時間：Ｆ３のｐＨ値は、再構成後にｐＨ９．０からｐＨ７．６に減少した。再構成後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９剤形は、プレリオ対照群と比較して同じｐＨ値（Δ≦０．５）を示した。再構成された時間分析は、凍結乾燥したケーキが１分２０秒及び４分０５秒との間に溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）ことを示した。ｐＨ及び再構成時間の結果が、表３９に詳細に示されている。
【０４６０】
【表３９】
2022500354.tif 000041
【０４６１】
毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＣＥ）：再構成されたサンプルをＣＥで生成物純度に対してさらに調べた。ＣＥの電気泳動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓ）及び表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）が、それぞれ図４５及び表４０に詳細に示されている。再構成後、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）と比較してスーパーコイルピークの相応する減少と共に、Ｆ３を除く全ての剤形は、開環ピークの若干の増加（０．５〜３％）を示した。ケーキ外見が不良な（ｐｏｏｒ）剤形を除いて、現在剤形（Ｆ１）は、凍結乾燥後にスーパーコイルピークの最低減少を示した。
【０４６２】
【表４０】
2022500354.tif 000042
【０４６３】
実施例４．ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αの凍結乾燥した組成物
【０４６４】
４．１．実験設計
【０４６５】
凍結乾燥後、剤形においてｐＣＫ−ＳＤＦ−１αの品質のために、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αを含有する様々な凍結乾燥した剤形を生成し分析した。次表４１に列挙された剤形が分析のために製造された。
【０４６６】
【表４１】
2022500354.tif 000043
【０４６７】
４．２．  テスト結果の要約
【０４６８】
視覚的検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）：凍結乾燥後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９は、若干の収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）だけを持つ良好な（ｄｅｃｅｎｔ）ケーキを示した。Ｆ５は、有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）ケーキ収縮（ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）を示した。ケーキの総崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）は、Ｆ４及びＦ６から観察された。再構成された液体サンプルであるＦ１（図４６）、Ｆ２（図４７）、Ｆ３（図４８）、Ｆ４（図４９）、Ｆ５（図５０）、Ｆ６（図５１）、Ｆ７（図５２）、Ｆ８（図５３）及びＦ９（図５４）は透明で、無色で、可視的な微粒子がなく、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較可能（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）であった。サンプルの濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）（透明度；Ｃｌａｒｉｔｙ）を決定するために、サンプルをＴｕｒｂｉｄｉｔｙ  ４０００ＮＴＵ補正スタンダード（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと比較した。“＜Ｉ透明度（Ｃｌａｒｉｔｙ）”を有する剤形は、濁っていないものと評価できる。
【０４６９】
濃度（Ａ２６０）：全てのサンプルは、凍結乾燥前及び再構成後、次表４２に提供される通り、その目標とした濃度（ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）にあった。
【０４７０】
【表４２】
2022500354.tif 000044
【０４７１】
ｐＨ及び再構成時間：Ｆ３のｐＨ値は、再構成後、ｐＨ９．０からｐＨ７．９に減少した。再構成後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９剤形は、そのプレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）対照群と比較して同じｐＨ値（Δ≦０．５）を示した。再構成された時間分析は、凍結乾燥したケーキが１．５分〜４分の間に溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ）ことを示した。ｐＨ及び再構成時間の結果が、次表４３に詳細に示されている。
【０４７２】
【表４３】
2022500354.tif 000045
【０４７３】
毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）：再構成されたサンプルを、ＣＥで生成物純度に対してさらに調べた。ＣＥの電気泳動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓ）及び表で整理した結果（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ）が、それぞれ図５５及び表４４に詳細に示されている。再構成後、全ての剤形は、プレリオ（ｐｒｅ−ｌｙｏ）に比べて、スーパーコイルピークの相応する減少と共に、開環ピークの若干の増加（０．５−２％）を示した。ケーキ外見が不良な（ｐｏｏｒ）剤形を除けば、現在剤形（Ｆ１）は、凍結乾燥後にスーパーコイルピークの最低減少を示した。
【０４７４】
【表４４】
2022500354.tif 000046
【０４７５】
文献の援用（ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＢＹ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ）
【０４７６】
本出願に援用された全ての刊行物、特許、特許出願書及びその他の文書は、それぞれの個別刊行物、特許、特許出願書又はその他の文書が全ての目的において個別に参照によって含まれたことが表示されるのと同じ程度に、全ての目的においてその全文が参照によって本願に組み込まれる。
【０４７７】
均等物（ＥＱＵＩＶＡＬＥＮＴＳ）
【０４７８】
様々な特定の具現例が図示され説明されたが、前記明細書は制限的でない。本発明の思想（ｓｐｉｒｉｔ）及び範囲から逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されよう。本明細書を検討すれば、多くの変形が当業者にとって明白であろう。
【０４７９】
配列目録：
【０４８０】
【化１】
2022500354.tif 000047
【０４８１】
【化２】
2022500354.tif 000048
【０４８２】
【化３】
2022500354.tif 000049
【０４８３】
【化４】
2022500354.tif 000050
【０４８４】
【化５】
2022500354.tif 000051
【０４８５】
【化６】
2022500354.tif 000052
【０４８６】
【化７】
2022500354.tif 000053
【０４８７】
【化８】
2022500354.tif 000054
【０４８８】
【化９】
2022500354.tif 000055
【０４８９】
【化１０】
2022500354.tif 000056
【０４９０】
【化１１】
2022500354.tif 000057
【０４９１】
【化１２】
2022500354.tif 000058
【０４９２】
【化１３】
2022500354.tif 000059
【０４９３】
【化１４】
2022500354.tif 000060
【０４９４】
【化１５】
2022500354.tif 000061
【０４９５】
【化１６】
2022500354.tif 000062
【０４９６】
【化１７】
2022500354.tif 000063
【０４９７】
【化１８】
2022500354.tif 000064
【０４９８】
【化１９】
2022500354.tif 000065
【０４９９】
【化２０】
2022500354.tif 000066
【０５００】
【化２１】
2022500354.tif 000067
【０５０１】
【化２２】
2022500354.tif 000068
【０５０２】
【化２３】
2022500354.tif 000069
【０５０３】
【化２４】
2022500354.tif 000070
【０５０４】
【化２５】
2022500354.tif 000071
【０５０５】
【化２６】
2022500354.tif 000072
【図１】
2022500354.tif 000073
【図２】
2022500354.tif 000074
【図３】
2022500354.tif 000075
【図４】
2022500354.tif 000076
【図５】
2022500354.tif 000077
【図６】
2022500354.tif 000078
【図７】
2022500354.tif 000079
【図８】
2022500354.tif 000080
【図９】
2022500354.tif 000081
【図１０】
2022500354.tif 000082
【図１１】
2022500354.tif 000083
【図１２】
2022500354.tif 000084
【図１３】
2022500354.tif 000085
【図１４】
2022500354.tif 000086
【図１５】
2022500354.tif 000087
【図１６】
2022500354.tif 000088
【図１７】
2022500354.tif 000089
【図１８】
2022500354.tif 000090
【図１９】
2022500354.tif 000091
【図２０】
2022500354.tif 000092
【図２１】
2022500354.tif 000093
【図２２】
2022500354.tif 000094
【図２３】
2022500354.tif 000095
【図２４】
2022500354.tif 000096
【図２５】
2022500354.tif 000097
【図２６】
2022500354.tif 000098
【図２７】
2022500354.tif 000099
【図２８】
2022500354.tif 000100
【図２９】
2022500354.tif 000101
【図３０】
2022500354.tif 000102
【図３１】
2022500354.tif 000103
【図３２】
2022500354.tif 000104
【図３３】
2022500354.tif 000105
【図３４】
2022500354.tif 000106
【図３５】
2022500354.tif 000107
【図３６】
2022500354.tif 000108
【図３７】
2022500354.tif 000109
【図３８】
2022500354.tif 000110
【図３９】
2022500354.tif 000111
【図４０】
2022500354.tif 000112
【図４１】
2022500354.tif 000113
【図４２】
2022500354.tif 000114
【図４３】
2022500354.tif 000115
【図４４】
2022500354.tif 000116
【図４５】
2022500354.tif 000117
【図４６】
2022500354.tif 000118
【図４７】
2022500354.tif 000119
【図４８】
2022500354.tif 000120
【図４９】
2022500354.tif 000121
【図５０】
2022500354.tif 000122
【図５１】
2022500354.tif 000123
【図５２】
2022500354.tif 000124
【図５３】
2022500354.tif 000125
【図５４】
2022500354.tif 000126
【図５５】
2022500354.tif 000127
【配列表】
2022500354000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年7月8日(2021.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７８】
様々な特定の具現例が図示され説明されたが、前記明細書は制限的でない。本発明の思想（ｓｐｉｒｉｔ）及び範囲から逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されよう。本明細書を検討すれば、多くの変形が当業者にとって明白であろう。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物において、凍結乾燥前に次を含む液体（ｌｉｑｕｉｄ）組成物を凍結乾燥させることによって得られる凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）はＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％超過及び１．１％未満（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ。
＜２＞
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜２＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４＞
第１プラスミドがｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜４＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜６＞
前記第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜６＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜８＞
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜９＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１０＞
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１１＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜１０＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１２＞
第１プラスミドがｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１３＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜１２＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１４＞
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、＜１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１５＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６、及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、＜１４＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１６＞
前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）、＜１＞〜＜１５＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１７＞
前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成された、＜１６＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１８＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成された、＜１７＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜１９＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル形成された、＜１８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２０＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、＜１＞〜＜１９＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２１＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル状態を維持する、＜２０＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２２＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル状態を維持する、＜２１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２３＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル状態を維持する、＜２２＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２４＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、＜１＞〜＜２３＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２５＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９５％はスーパーコイル状態を維持する、＜２４＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２６＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも８０％は、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前１０週間４０℃で貯蔵されたものである、  ＜１＞〜＜２５＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２７＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中にスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９０％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、  ＜１＞〜＜２６＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２８＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中にスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、＜２７＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜２９＞
前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、＜１＞〜＜２８＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３０＞
前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、＜２９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３１＞
前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、＜３０＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３２＞
前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で第１プラスミドを含む、＜１＞〜＜３１＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３３＞
前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、＜１＞〜＜３２＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３４＞
前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、＜３３＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３５＞
前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、＜３４＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３６＞
前記液体組成物は、１０ｍＭの濃度でリン酸カリウムを含む、＜１＞〜＜３５＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３７＞
前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む、＜１＞〜＜３６＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３８＞
前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムバッファーを含む、＜３７＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜３９＞
前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でマンニトールを含む、＜１＞〜＜３８＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４０＞
前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）の濃度でマンニトールを含む、＜３９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４１＞
前記液体組成物は、０．７５％〜１．１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む、＜１＞〜＜４０＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４２＞
前記液体組成物は、０．９％〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む、＜４１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４３＞
前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度でスクロースを含む、＜４２＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４４＞
前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、＜１＞〜＜４３＞のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４５＞
前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、＜４４＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４６＞
前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、＜４５＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４７＞
前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）の濃度でＮａＣｌを含む、＜４６＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜４８＞
プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物であって、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる、凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選択され、
ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；
ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；
ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ、
前記液体組成物中の少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡはスーパーコイル形成され、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後２５℃で７日間貯蔵後にスーパーコイル状態に残っている。
＜４９＞
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５０＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜４９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５１＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５２＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜５１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５３＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５４＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜５３＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５５＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５６＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜５５＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５７＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５８＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜５７＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜５９＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜６０＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜５９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜６１＞
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、＜４８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜６２＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、＜６１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜６３＞
水（ｗａｔｅｒ）中に＜１＞〜＜６２＞のいずれか一項の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
＜６４＞
前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００２以下である、＜６３＞に記載の再構成された組成物。
＜６５＞
前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００１であるか、或いは０．００１未満である、＜６４＞に記載の再構成された組成物。
＜６６＞
前記光吸収は、再構成された日に測定されたものである、＜６４＞又は＜６５＞に記載の再構成された組成物。
＜６７＞
前記光吸収は、凍結乾燥した薬剤学的組成物の貯蔵後１０週間測定されたものである、＜６４＞又は＜６５＞に記載の再構成された組成物。
＜６８＞
単位容量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）内のプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物であって、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる、凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選択され、
ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；
ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；
ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ、
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、バイアル（ｖｉａｌ）内にあり、前記バイアルは全体中に２．５ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有する。
＜６９＞
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７０＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜６９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７１＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７２＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜７１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７３＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃである、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７４＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜７３＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７５＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７６＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜７５＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７７＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６である、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７８＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜７７＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜７９＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜８０＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれる、＜７９＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜８１＞
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、＜６８＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜８２＞
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ  ＩＧＦ−１Ｘ６及びｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０からなる群から選ばれる、＜８１＞に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
＜８３＞
水（ｗａｔｅｒ）中に＜６８＞〜＜８２＞のいずれか一項の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
＜８４＞
次の段階を含むプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物の製造方法：
次を含む液体組成物を製造する段階：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％以上及び１．１％以下（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ；
前記液体組成物を凍結乾燥させることによって、凍結乾燥した薬剤学的組成物を製造する段階。
＜８５＞
前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２である、＜８４＞に記載の方法。
＜８６＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７である、＜８４＞に記載の方法。
＜８７＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ又はｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａである、＜８４＞に記載の方法。
＜８８＞
前記第１プラスミドは、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６又はｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０である、＜８４＞に記載の方法。
＜８９＞
前記第１プラスミドは、ｐＣＫ−ＳＤＦ−１αである、＜８４＞に記載の方法。
＜９０＞
前記凍結乾燥の段階は次を含む、＜８４＞〜＜８９＞のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）前記液体組成物をローディングする段階；
（ｉｉ）凍結段階；
（ｉｉｉ）第１乾燥段階；及び
（ｉｖ）第２乾燥段階。
＜９１＞
前記ローディング段階は、５℃で行われる、＜９０＞に記載の方法。
＜９２＞
前記凍結段階は、−５０℃〜−２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、＜８４＞〜＜９１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９３＞
前記凍結段階は、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階を含む、＜９２＞に記載の方法。
＜９４＞
前記第１乾燥段階は、−２０℃で行われる、＜８４＞〜＜９３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９５＞
前記第２乾燥段階は、−２０℃〜２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、＜８４＞〜＜９４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９６＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された、＜８４＞〜＜９５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９７＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９５％は、スーパーコイル形成された、＜９６＞に記載の方法。
＜９８＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９７％は、スーパーコイル形成された、＜９６＞に記載の方法。
＜９９＞
前記液体組成物中のプラスミドＤＮＡの少なくとも９８％は、スーパーコイル形成された、＜９８＞に記載の方法。
＜１００＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜８４＞〜＜９９＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０１＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜１００＞に記載の方法。
＜１０２＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９７％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜１００＞に記載の方法。
＜１０３＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも９８％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜１０２＞に記載の方法。
＜１０４＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜８４＞〜＜１０３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０５＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３日〜７日間２５℃で貯蔵後に、少なくとも９５％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持する、＜１０４＞に記載の方法。
＜１０６＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、少なくとも８０％のプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前の１０週間４０℃で貯蔵されたものである、＜１０５＞に記載の方法。
＜１０７＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、＜８４＞〜＜１０６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０８＞
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、前記液体組成物中のスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９５％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、＜１０７＞に記載の方法。
＜１０９＞
前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、＜８４＞〜＜１０７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１０＞
前記液体組成物は、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、＜１０９＞に記載の方法。
＜１１１＞
前記液体組成物は、０．４〜０．６ｍｇ／ｍｌ濃度範囲の第１プラスミドを含む、＜１１０＞に記載の方法。
＜１１２＞
前記液体組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドを含む、＜１１１＞に記載の方法。
＜１１３＞
前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、＜８４＞〜＜１１２＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１４＞
前記液体組成物は、７．５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、＜１１３＞に記載の方法。
＜１１５＞
前記液体組成物は、９ｍＭ〜１１ｍＭの濃度範囲のリン酸カリウムを含む、＜１１４＞に記載の方法。
＜１１６＞
前記液体組成物は、１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含む、＜８４＞〜＜１１３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１７＞
前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む、＜８４＞〜＜１１６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１８＞
前記液体組成物は、ｐＨ８．０のリン酸カリウムを含む、＜１１７＞に記載の方法。
＜１１９＞
前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトールを含む、＜８４＞〜＜１１８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２０＞
前記液体組成物は、２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトールを含む、＜１１９＞に記載の方法。
＜１２１＞
前記液体組成物は、０．７５％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む、＜８４＞〜＜１２０＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２２＞
前記液体組成物は、０．９％以上、１．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度のスクロースを含む、＜１２１＞に記載の方法。
＜１２３＞
前記液体組成物は、１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロースを含む、＜１２２＞に記載の方法。
＜１２４＞
前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、＜８４＞〜＜１２３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２５＞
前記液体組成物は、０．１％〜０．６％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、＜１２４＞に記載の方法。
＜１２６＞
前記液体組成物は、０．４％〜０．５％（ｗ／ｖ）濃度範囲内のＮａＣｌを含む、＜１２５＞に記載の方法。
＜１２７＞
前記液体組成物は、０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌを含む、＜１２６＞に記載の方法。
＜１２８＞
次の段階を含む、疾病を治療する方法：
疾病にかかった患者に再構成された薬物の有効量を投与する段階であって、前記再構成された薬物は、＜１＞〜＜４９＞又は＜６８＞〜＜６９＞のいずれか一項の前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を再構成することによって生成される段階。
＜１２９＞
さらに次の段階を含む、＜１２８＞に記載の方法：
水（ｗａｔｅｒ）中に＜１＞〜＜６２＞又は＜６８＞〜＜８２＞のいずれか一項の前記凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させる段階であって、これによって前記再構成された薬物を生成する段階。
＜１３０＞
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００３以下である、＜１２８又は１２９＞に記載の方法。
＜１３１＞
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００２以下である、＜１３０＞に記載の方法。
＜１３２＞
前記再構成された薬物の４５０ｎｍ（Ａ４５０）における光吸収は、０．００１であるか、或いは又は０．００１未満である、＜１３１＞に記載の方法。
＜１３３＞
前記疾病は、神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、虚血性疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋肉萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び心臓病（ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる、＜１２８＞〜＜１３２＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１３４＞
前記疾病は、虚血性四肢疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＤＰＮ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）からなる群から選ばれる、＜１３３＞に記載の方法。
＜１３５＞
前記投与する段階は、前記再構成された薬物の筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を含む、＜１２８＞〜＜１３４＞のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物において、凍結乾燥前に次を含む液体（ｌｉｑｕｉｄ）組成物を凍結乾燥させることによって得られる凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）はＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％超過及び１．１％未満（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ。
【請求項２】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０、及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれ、前記第２プラスミドは前記第１プラスミドとは異なる、請求項１に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記液体組成物中の前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル形成された（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）、請求項１又は請求項２に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成後３〜７日間２５℃で保管後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも９０％は、スーパーコイル状態を維持する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物の再構成３０分後に、前記プラスミドＤＮＡの少なくとも８０％は、スーパーコイル状態を維持し、前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、再構成前１０週間４０℃で貯蔵されたものである、 請求項１〜５のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、液体組成物中にスーパーコイル形成されたＤＮＡ総量の少なくとも９０％量のスーパーコイル形成されたＤＮＡを含む、 請求項１〜６のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記液体組成物は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で第１プラスミドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記液体組成物は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度範囲でリン酸カリウムを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記液体組成物は、７．０〜８．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記液体組成物は、２％〜３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でマンニトールを含む、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１２】
前記液体組成物は、０．７５％〜１．１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でスクロースを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１３】
前記液体組成物は、０．１％〜０．７５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲でＮａＣｌを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項１４】
水（ｗａｔｅｒ）中に請求項１〜１３のいずれか一項の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
【請求項１５】
前記再構成された組成物の４５０ｎｍにおける光吸収は、０．００２以下である、請求項１４に記載の再構成された組成物。
【請求項１６】
前記光吸収は、再構成された日に測定されたものである、請求項１５に記載の再構成された組成物。
【請求項１７】
前記光吸収は、凍結乾燥した薬剤学的組成物の貯蔵後１０週間測定されたものである、請求項１５に記載の再構成された組成物。
【請求項１８】
単位容量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）内のプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物であって、前記薬剤学的組成物は、凍結乾燥前に次を含む液体組成物を凍結乾燥させることによって得られる、凍結乾燥した薬剤学的組成物：
ａ．０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の第１プラスミドのＤＮＡ；前記第１プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選択され、
ｂ．ｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー；
ｃ．２％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトール；
ｄ．１．０％（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．４５％（ｗ／ｖ）濃度のＮａＣｌ、
前記凍結乾燥した薬剤学的組成物は、バイアル（ｖｉａｌ）内にあり、前記バイアルは全体中に２．５ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有する。
【請求項１９】
第２プラスミドのＤＮＡをさらに含み、前記第２プラスミドは、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれ、前記第２プラスミドは前記第１プラスミドとは異なる、請求項１８に記載の凍結乾燥した薬剤学的組成物。
【請求項２０】
水（ｗａｔｅｒ）中に請求項１８又は請求項１９の凍結乾燥した薬剤学的組成物を溶解させることによって製造される、再構成された組成物。
【請求項２１】
次の段階を含むプラスミドＤＮＡを含む凍結乾燥した薬剤学的組成物の製造方法：
次を含む液体組成物を製造する段階：
ａ．第１プラスミド（ｆｉｒｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ）は、ＶＭ２０２、ｐＴｘ−ＨＧＦ−Ｘ７、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅｃ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｅａ、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ６、ｐＴｘ−ＩＧＦ−１Ｘ１０及びｐＣＫ−ＳＤＦ−１αからなる群から選ばれるものである、第１プラスミドのＤＮＡ；
ｂ．７．０〜９．０範囲のｐＨを有するリン酸カリウムバッファー；
ｃ．０％〜３％（ｗ／ｖ）濃度範囲のマンニトール；
ｄ．０．５％以上及び１．１％以下（ｗ／ｖ）濃度のスクロース；及び
ｅ．０．１％〜０．９％（ｗ／ｖ）濃度範囲のＮａＣｌ；
前記液体組成物を凍結乾燥させることによって、凍結乾燥した薬剤学的組成物を製造する段階。
【請求項２２】
前記凍結乾燥の段階は次を含む、請求項２１に記載の方法：
（ｉ）前記液体組成物をローディングする段階；
（ｉｉ）凍結段階；
（ｉｉｉ）第１乾燥段階；及び
（ｉｖ）第２乾燥段階。
【請求項２３】
前記ローディング段階は、５℃で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記凍結段階は、−５０℃〜−２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結段階は、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１乾燥段階は、−２０℃で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２乾燥段階は、−２０℃〜２０℃の範囲内で温度が上昇する間に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、虚血性疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋肉萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、血管疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び心臓病（ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選ばれる疾患を処置するための、請求項２０に記載の再構成された組成物を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２９】
前記疾患は、虚血性四肢疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＤＰＮ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、末梢血管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＡＤ）からなる群から選ばれる、請求項２８に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３０】
前記再構成された薬物は筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって対象に投与される、請求項２８に記載の薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
2022500354.tif 000128
2022500354.tif 000129
2022500354.tif 000130
2022500354.tif 000131
2022500354.tif 000132