【手続補正書】
【提出日】平成22年5月21日(2010.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的な抗体を発現するＢ細胞を同定するための方法であって、
（ａ）宿主からＢ細胞を採取する工程と、
（ｂ）前記抗原に特異的なＢ細胞の比率を増加させるために、採取されたＢ細胞を富化し、それによって富化されたＢ細胞集団を形成する工程と、
（ｃ）前記の富化されたＢ細胞集団から１以上の細胞のサブ集団を培養する工程と、
（ｄ）前記の培養されたサブ集団が前記抗原に特異的な抗体を産生するかどうかを決定し、それによって１以上の抗原陽性のサブ集団を同定する工程と；および
（ｅ）個々のＢ細胞が、前記抗原に特異的な抗体を産生するかどうかを決定する工程であって、その方法は、
（ｉ）工程（ｄ）の１以上の前記の抗原陽性のサブ集団から、１以上の個々のＢ細胞を単離する工程と、
（ｉｉ）前記抗原が直接的にまたは間接的に付着した、マトリックスまたは固体の支持体を含む固定化された抗原を提供する工程と、
（ｉｉｉ）個々のＢ細胞を、前記の固定化された抗原と共にインキュベートする工程と、
（ｉｖ）前記の個々のＢ細胞より分泌された抗体が、前記の固定化された抗原に結合するかどうかを検出する工程と；および
（ｖ）前記の個々のＢ細胞より分泌された抗体と結合した前記の固定化された抗原がＢ細胞と空間的に近接していることにより、前記抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞を同定する工程と、を含む上記方法。
【請求項２】
前記の固定化された抗原が抗原を負荷したビーズを含み、工程（ｅ）（ｉｖ）は前記の固定化された抗原をフルオロフォアと連結した２次抗体と共にインキュベートする工程を含み、ここで前記２次抗体は、工程（ａ）の宿主の抗体と結合する抗免疫グロブリン抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
工程（ａ）が、脾臓、リンパ節、骨髄、および末梢血単核球から選択された少なくとも１つの源からＢ細胞を回収する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、前記の１つより多くの源から前記Ｂ細胞を貯蔵する工程を更に含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｅ）において抗原に特異的な抗体を作製すると決定された、前記の個々のＢ細胞由来の抗体鎖またはその断片をコードする核酸を、単離するかまたは配列を決定する工程と、前記核酸にコードされるポリペプチドを組換え細胞内で発現させる工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記組換え細胞は、酵母、細菌、昆虫、両生類、または哺乳類の細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記組換え細胞は二倍体酵母である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記二倍体酵母はピキアである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記宿主は哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主はモルモット、ウサギ、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類、ヒト、または齧歯類である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）は、固体マトリックスまたは支持体に、直接的または間接的に付着した抗原を用いて、抗原特異的なＢ細胞を親和性精製する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
固体マトリックスがカラムであるか、または固体マトリックスが磁気ビーズを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約１０，０００個以下の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約１０，０００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約５，０００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約２５０個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、フィーダー細胞を含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィーダー細胞はＥＬ４Ｂ細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、活性化されたＴ細胞馴化培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地は、約１％ないし約５％の活性化したウサギＴ細胞馴化細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）の前記サブ集団は少なくとも３日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）の前記サブ集団は約３日〜約５日間培養される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）の前記サブ集団は少なくとも１週間培養される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の培養された前記サブ集団が、結合パートナーへの抗原の結合のアゴニズムまたはアンタゴニズム、特定の標的細胞の型の増殖の誘導または抑制；標的細胞の溶解の誘導または抑制；または前記抗原に関与する生物学的経路の誘導または抑制、を示す抗体を作製するかどうかを決定する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）の培養された前記サブ集団により作製された抗体の、抗原結合親和性を決定する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
抗原特異的な抗体を発現するＢ細胞を同定するための、請求項１記載の工程を含む方法であって、
ここで工程（ｂ）は、固体マトリックスまたは支持体に直接的または間接的に付着した抗原を用いた抗原に特異的なＢ細胞の親和性精製により、前記抗原に特異的なＢ細胞の比率を増加させて採取されたＢ細胞を富化し、それによって富化されたＢ細胞集団を形成する工程と；および
検出工程（ｉｖ）は、前記の固定化された抗原を検出可能な標識と連結した２次抗体と共にインキュベートする工程であって、ここで前記２次抗体は宿主特異的な抗免疫グロブリン抗体であって、ここで前記２次抗体は工程（ａ）の宿主の抗体に結合する抗免疫グロブリン抗体であり、それによって前記の個々のＢ細胞により分泌された抗体が前記の固定化された抗原と結合するかどうかを検出する、ことを含む上記方法。
【請求項２７】
前記の固定化された抗原が抗原を負荷したビーズを含み、工程（ｅ）（ｉｖ）における検出可能な標識はフルオロフォアである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）が、脾臓、リンパ節、骨髄、および末梢血単核球から選択された少なくとも１つの源からＢ細胞を回収する工程を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
工程（ａ）が、前記の１つより多くの源から前記Ｂ細胞を貯蔵する工程を更に含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約１０，０００個以下の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約１０，０００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約５，０００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約１０００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約５００個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約５０〜約２５０個の抗原特異的な抗体分泌細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、少なくとも３日間培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、約３日〜約５日間培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｃ）の前記サブ集団は、少なくとも１週間培養される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｃ）の培養された前記サブ集団が、結合パートナーへの抗原の結合のアゴニズムまたはアンタゴニズム、特定の標的細胞の型の増殖の誘導または抑制；標的細胞の溶解の誘導または抑制、または前記抗原に関与する生物学的経路の誘導または抑制、を示す抗体を作製するかどうかを決定する工程を更に含む、請求項２６記載の方法。