【手続補正書】
【提出日】平成22年4月23日(2010.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
【請求項２】
ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
【請求項３】
２−ブタノールを生産させるための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項４】
２−ブタノンを生産させるための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生産させる条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により生産される、２−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
【請求項６】
請求項４に記載の方法により生産される、２−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が２−ブタノールを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
２．ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞であって、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物の宿主細胞に対して異種であり、かつ該微生物の宿主細胞が
２−ブタノンを生産する、組換え微生物の宿主細胞。
３．ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
４．α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
５．アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセトインアミナーゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
６．３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールキナーゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
７．３−アミノ−２−ブタノールリン酸塩から２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである、上記１または２に記載の宿主細胞。
８．２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記１に記載の宿主細胞。
９．細胞が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、上記１または２に記載の宿主細胞。
１０．細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記８に記載の宿主細胞。
１１．アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記３に記載の宿主細胞。
１２．アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記４に記載の宿主細胞。
１３．アセトインアミナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記５に記載の宿主細胞。
１４．アミノブタノールキナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記６に記載の宿主細胞。
１５．アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記７に記載の宿主細胞。
１６．ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記８に記載の宿主細胞。
１７．２−ブタノールを生産させるための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、および
ｖｉ）２−ブタノンから２−ブタノールへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノールが生産される条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
１８．２−ブタノンを生産させるための方法であって、
１）ｉ）ピルビン酸からα−アセト乳酸へ、
ｉｉ）α−アセト乳酸からアセトインへ、
ｉｉｉ）アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへ、
ｉｖ）３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸へ、および
ｖ）３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへ、
からなる群から選択される生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ分子を含む組換え微生物の宿主細胞を提供し、ここで少なくとも１個のＤＮＡ分子が該微生物宿主細胞に対して異種であり、そして
２）（１）の宿主細胞を２−ブタノンが生産させる条件下の発酵培地内で発酵可能な炭素基質と接触させる、
ことを含む、上記方法。
１９．発酵可能な炭素基質が単糖、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される、上記１７または１８に記載の方法。
２０．ピルビン酸からα−アセト乳酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸シンターゼである、上記１７または１８に記載の方法。
２１．α−アセト乳酸からアセトインへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセト乳酸デカルボキシラーゼである、上記１７または１８に記載の方法。
２２．アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアセトインアミナーゼである、上記１７または１８に記載の方法。
２３．３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールリン酸への生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールキナーゼである、上記１７または１８に記載の方法。
２４．３−アミノ−２−ブタノールリン酸から２−ブタノンへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼである、上記１７または１８に記載の方法。
２５．２−ブタノンから２−ブタノールへの生成物変換に対して基質を触媒するポリペプチドがブタノール脱水素酵素である、上記１７に記載の方法。
２６．細胞が細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、上記１７または１８に記載の方法。
２７．細胞が、クロストリジウム属、ザイモモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、腸球菌属、ペディオコッカス属、アルカリゲネス属、クレブシエラ属、パエニバチルス属、アースロバクタ
ー属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ピキア属、カンジダ属、ハンセヌラ属およびサッカロミセス属からなる群から選択される属のメンバーである、上記２６に記載の方法。
２８．アセト乳酸シンターゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号４、配列番号７７、および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２０に記載の方法。
２９．アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号２、配列番号８１、および配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２１に記載の方法。
３０．アセトインアミナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２２に記載の方法。
３１．アミノブタノールキナーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２３に記載の方法。
３２．アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼが、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０のシリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１２６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２４に記載の方法。
３３．ブタノール脱水素酵素が、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法に基づき、配列番号１４、配列番号７２、配列番号７５、および配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記２５に記載の方法。
３４．上記１７に記載の方法により生産される、２−ブタノールを含有する発酵生産物培地。
３５．上記１８に記載の方法により生産される、２−ブタノンを含有する発酵生産物培地。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
実施例１
アセト乳酸シンターゼのクローニングおよび発現
この実施例の目的は、大腸菌内でアセト乳酸シンターゼ酵素をコードするｂｕｄＢ遺伝子のクローニングおよび発現を行うことであった。ＰＣＲを用い、ｂｕｄＢ遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２５９５５のゲノムＤＮＡから増幅した。
アセト乳酸シンターゼをコードするｂｕｄＢ配列を、プライマー対のＢ１（配列番号１５）およびＢ２（配列番号１６）を用いるＰＣＲにより、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ２５９５５）のゲノムＤＮＡから増幅した。他のＰＣＲ増幅試薬（例えばＫｏｄ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）；カタログ番号７１８０５−３））は製造業者のキットで供給されたものであり、それらを製造業者のプロトコルに準じて使用した。クレブシエラ・ニューモニエのゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；カタログ番号Ｄ−５０００Ａ）を用いて調製した。増幅をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ）のＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で行った。酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列は各々、配列番号３および配列番号４として示される。