【手続補正書】
【提出日】平成22年7月9日(2010.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団であって、前記細胞集団は基底細胞を含み、前記基底細胞の少なくとも５％は
１．原始内胚葉に似た形態を有し、
２．内皮細胞様の形を有し、
３．光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりに暗位相差像を示しかつ境界明瞭であり、および／または
４．図１９に例示されるとおり、光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有し、
さらに以下の特徴：
ｉ）前記細胞の少なくとも３０％はブラキウリのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）前記細胞の少なくとも３０％はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）前記細胞の少なくとも３０％はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
ｉｖ）前記細胞の少なくとも３０％はデスミンのタンパク質発現を示さない、
ｖ）前記細胞の少なくとも３０％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、前記マーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｖｉ）前記細胞の少なくとも３０％は実施例３の表ＩＩに列挙される遺伝子、たとえばバソヌクリン１（ＢＮＣ１）、ネフロネクチン（ＮＰＮＴ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、アネキシンＡ８（ＡＮＸＡ８）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、透明帯糖タンパク質４（ＺＰ４）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、ホメオボックスＢ７（ＨＯＸＢ７）、心臓および神経冠誘導体発現１（ＨＡＮＤ１）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ＩＬ６ＳＴ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＦＲＺＢ）、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（Ｆｌｋ−１）（ＫＤＲ）などのうち少なくとも１つまたはそれ以上の遺伝子発現を示す、
ｖｉｉ）前記細胞の少なくとも３０％は、未分化ｈＢＳ細胞に比べてダウンレギュレーションされたｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇの遺伝子発現を有する、
を有する、細胞集団。
【請求項２】
前記特徴ｉ），ｉｉ），ｉｉｉ），ｉｖ），ｖ），ｖｉ）および／またはｖｉｉ）は、前記細胞の少なくとも４０％または少なくとも５０％に対して有効である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記細胞集団は異種成分不含である、請求項１または２のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項４】
ＭＣＰ細胞を提供するための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項５】
心臓細胞型に影響する可能性のある薬物を研究するための、インビトロモデルにおける請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項６】
インビトロの心臓毒性試験のための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項７】
再生医療における、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項８】
たとえば心臓組織の変性などの組織変性によってもたらされる病状および／または疾患の予防および／または処置のための医薬製品を製造するための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項９】
たとえば壊死心筋、アポトーシス心筋、損傷した心筋、機能不全の心筋、または形態的に異常な心筋に関係する障害などの心臓障害の予防および／または処置のための医薬製品を製造するための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項１０】
たとえば虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫性心疾患、心臓弁膜疾患、先天性の心臓障害、心臓リズム異常、および／または心臓機能不全などの疾患の処置および／または予防のための医薬製品を製造するための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
【請求項１１】
心筋細胞様の細胞を得るための、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの１つまたはそれ以上の細胞の使用。
【請求項１２】
心臓細胞毒性に対して化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの細胞を前記化合物に露出させるステップと、前記化合物が前記細胞に対して毒性であるかどうかを定めるステップとを含む、方法。
【請求項１３】
心臓細胞機能を調節する能力に対して化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの細胞を前記化合物に露出させるステップと、前記化合物との接触によってもたらされる前記細胞のあらゆる表現型または代謝の変化を定めるステップと、前記変化を心臓細胞機能を調節する能力と相関させるステップとを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団を調製する方法であって、
ｉ）約１日から約１０日、たとえば約１日から約６日などの間、懸濁培養中の分化培地において未分化ｈＢＳ細胞の１つまたはそれ以上のコロニー切片またはコロニーを培養するステップと、
ｉｉ）こうして培養された前記細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップと、
ｉｉｉ）任意には、光学顕微鏡における形態的基準および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップと、
ｉｖ）任意には、こうして得られた前記基底細胞を単離するステップと、
ｖ）任意には、ステップｉｉ）−ｉｖ）を繰返すステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１−３のいずれかにおいて定義される細胞集団を調製する方法であって、
ｉ）ｈＢＳ細胞を分離および解離して懸濁液にし、細胞懸濁液をマルチウェル組織培養プレートに分配するステップと、
ｉｉ）前記細胞の強制凝集のために遠心力を加えるステップと、
ｉｉｉ）こうして増強された３Ｄクラスタ化細胞を、約１日から約２０日、たとえば約６日から約８日などの間、マイクロウェル形式の分化培地中で培養するステップと、
ｉｖ）任意には、こうして３Ｄ培養された前記細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップと、
ｖ）任意には、光学顕微鏡における形態的基準および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップと、
ｖｉ）任意には、こうして得られた前記基底細胞を単離するステップと、
ｖｉｉ）任意には、ステップｉｉｉ）−ｉｖ）を繰返すステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
ステップｉ）はｈＢＳ細胞の未分化コロニーの切片を用いて行なわれる、請求項１４−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップｉ）における前記懸濁培養は、たとえばＦＢＳまたはヒト血清などの血清中で行なわれ、血清の濃度は少なくとも２％、たとえば約２％から約３０％、約５％から約２５％または約２０％である、１４−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）は約１日から約６日、たとえば約１日から約４日、約１日から約３日、または約１日から約２日の期間にわたって行なわれる、請求項１４−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ステップｉｉ）は同じ培地または異なる培地において行なわれる、請求項１４−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記培地は、たとえばＦＢＳもしくはヒト血清などの血清を含有するか、または血清を含まない培地であり、血清が存在するとき、血清の濃度は少なくとも２％、たとえば約２％から約３０％、約５％から約２５％または約２０％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｉｉ）は、前記培養容器の表面上または細胞外基質成分上に直接前記細胞を蒔くことによって行なわれる、請求項１４−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ステップｉｉ）は約２日から約２０日、たとえば約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約６日、または約２日から約４日の期間にわたって行なわれる、請求項１４−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ステップｉｖ）は約２日から約２５日、たとえば約２日から約２０日、約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約５日、または約２日から約４日の期間にわたって行なわれる、請求項１４−２２のいずれかに記載の方法。