(57)【要約】  本発明は、ヒトまたは動物における加齢性老視、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）および／または糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）による失明の処置に関する。加齢性老視は、現在老眼鏡で処置されている４０〜５０歳より高齢の任意の個人の適応の喪失である。ＡＭＤは、西欧諸国で＞６５歳の人の不可逆的な視力喪失の最も一般的な原因である。現時点では、ＡＭＤの乾燥型の利用可能な処置はない。ＡＭＤの乾燥型は、最終糖化産物（ＡＧＥ）およびフルオロフォアの網膜（下）蓄積である視力を脅かすドルーゼン（Druesen）によって特徴付けられる。ＤＲおよびＤＭＥは、西欧諸国で＜６５歳の人の不可逆的な視力喪失の最も一般的な原因である。加齢性老視、ＡＭＤ、ＤＲおよびＤＭＥの現在の治療は期待外れであり、視力障害、萎縮または失明への進展を妨げない。本発明は、具体的には、フルクトサミン−３−キナーゼおよびその補因子（単数または複数）の投与に関する。これは、ＡＧＥおよびフルオロフォアの脱糖化および不活性化をもたらす。
2022500429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物において加齢性黄斑変性症、糖尿病網膜症および／または糖尿病黄斑浮腫を処置するための使用のための、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含む組成物。
【請求項２】
硝子体内注射によって投与される、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
マグネシウムイオンをさらに含む、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
アデノシン三リン酸再生系をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
ヒトまたは動物において加齢性黄斑変性症、糖尿病網膜症および／または糖尿病黄斑浮腫を処置するための使用のための、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸再生系を含む組成物。
【請求項６】
硝子体内注射によって投与される、請求項５に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
マグネシウムイオンをさらに含む、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記フルクトサミン−３−キナーゼが、組換えフルクトサミン−３−キナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記組換えフルクトサミン−３−キナーゼが、Pichia pastorisにおける組換え産生によって得られる、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
Pichia pastorisにおける組換え産生によって得られる前記組換えフルクトサミン−３−キナーゼが、配列番号１または配列番号２によって与えられるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
加齢性黄斑変性症、糖尿病網膜症および／または糖尿病黄斑浮腫の前記処置が、網膜（下）最終糖化産物およびフルオロフォアの脱糖化を伴う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物の１つの目当たり５μｌに等しい総量が投与されるとき、または、前記組成物の１つの目当たり５μｌよりも多い総量が投与されるとき、０．１ｍｏｌ／Ｌのチオスルファートおよび５Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼが、前記組成物に加えられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
ヒトにおける加齢性老視を処置するための使用のための、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸を含む組成物。
【請求項１４】
硝子体内注射によってまたは外部適用として投与される、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
マグネシウムイオンをさらに含む、請求項１３または１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
加齢性老視の前記処置が、毛様体最終糖化産物およびフルオロフォアの脱糖化を伴う、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトまたは動物における加齢性老視、黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）および糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）などの最終糖化産物（ＡＧＥ）関連眼疾患による視力障害または失明の処置に関する。ＡＧＥの蓄積により毛様体および水晶体の弾性が著しく減少するときに、加齢性老視は４０〜５０歳前後の人に発症する。その結果、適応（accommodation）およびすぐ近くを読む能力は徐々に減少する。加齢性老視の現在の唯一の解決策は、老眼鏡である。ＡＭＤは、西欧諸国で＞６５歳の人の不可逆的な視力喪失の最も一般的な原因である。現時点では、ＡＭＤの乾燥型に対して利用可能な処置はない。ＡＭＤの乾燥型は、最終糖化産物およびフルオロフォアの網膜（下）蓄積である、視力を脅かすドルーゼン（Druesen）によって特徴付けられる。他方、ＤＲおよびＤＭＥは、西欧諸国で＜６５歳の人の不可逆的な視力喪失の最も一般的な原因である。ＤＲおよびＤＭＥの実際の処置の選択肢は、局所および全身ステロイド、抗炎症剤、レーザー光凝固、毛様体扁平部硝子体切除、および／または抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体からなるが、多くの患者は不十分な応答を示す。ＤＲおよびＤＭＥは、高血糖によるブルッフ膜および網膜におけるＡＧＥの蓄積によって特徴付けられる。本発明は、特に、フルクトサミン−３−キナーゼおよびその補因子（単数または複数）の投与に関する。これは、ＡＧＥおよびフルオロフォアの脱糖化および不活性化をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
老視は、誰もが４０〜５０歳で直面する老化状態であり、近方視力が減少する。水晶体は、毛様体によって合成された水晶体毛様小体（lenszonule）の複雑な３次元システムによって所定の位置に保持される。適応中、毛様体の収縮は水晶体毛様小体の弛緩を引き起こし、水晶体嚢および外側皮質水晶体層の弾性により、水晶体の増大した曲率および屈折力の増加をもたらす。加齢とともに、ＡＧＥは硝子体のコラーゲン物質と密接に関連する毛様体、水晶体、および水晶体毛様小体において蓄積し、適応力が減少する（１）。現在、加齢性老視の唯一の処置は、老眼鏡をかけることである。
【０００３】
ＡＭＤは、先進国における高齢者の視力喪失の主な原因である（２）；７５歳を超えた４人に１人がＡＭＤを発症する。後期ＡＭＤは、乾燥型（９０％）および湿潤型または新生血管型（１０％）の２つの形態に分類され得る。現在、処置は新生血管型に対してのみ利用可能である。この処置は、抗血管新生剤の硝子体内注射からなり、根底にある変性プロセスに有益な効果があるという証拠はない（３）。湿潤ＡＭＤの目が処置され、乾燥ＡＭＤに戻される最良の状況下でさえ、乾燥ＡＭＤは経時的に視力喪失に進行する傾向にあるであろう。乾燥ＡＭＤは、光受容体細胞の喪失に関連しており、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の損傷がしばしば先行する。
【０００４】
糖尿病は、２０２５年までに約３億人に発症すると予測されている。ＤＲおよびＤＭＥは、長期にわたる１型および２型糖尿病のすべての患者の約２５％に発症する合併症である。英国のProspective Diabetes Study and the Diabetes Control and Complications Trialにより、慢性高血糖とＤＲおよびＤＭＥの進行との間の関係性が確認された（１、４）。糖尿病では、網膜微小血管系は、様々な高血糖に反応して次第に機能不全になる。ＡＧＥおよび／または後期アマドリ（Amadori）産物は、糖尿病患者の網膜血管および神経膠細胞に局在している。ＤＭＥ、ＤＲ、およびＡＭＤの重要な病態生理学的プロセスの１つは、ＡＧＥの形成であるようであり、これは、血液−網膜障壁の破壊、および局所炎症性サイトカイン（プロスタグランジン、Ｉｌ−６、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦ−Ｂ）、ＮＦｋＢ遺伝子転写およびＶＥＧＦの上方調節につながる（５）。ＶＥＧＦの上方調節は、ＡＭＤ、ＤＲ、およびＤＭＥにおいて浮腫および出血を伴う血管新生を引き起こす。しかしながら、合併症の処置および分子標的としてのＶＥＧＦに焦点を当てた実際の処置の選択肢は、問題の根本、すなわちＡＧＥの処置を標的とはしていない。
【０００５】
視覚サイクル中のＲＰＥ細胞の１つの機能は、視覚サイクルにおける光形質導入カスケード中のオールトランスレチナールからの１１−シスレチナールの再生である。ＲＰＥ細胞の別の機能は、ビスレチノイドフルオロフォアおよびＡＧＥの機能不全レチンアルデヒドで飽和した桿体および錐体の先端を貪食し、この「リポフスチン」物質をそれらの基底膜に沈着させることである。ビスレチノイドは、視覚サイクルの副産物として生成され、ＲＰＥ細胞の老化および網膜変性を駆動する炎症性ケモカインの発現を仲介する（６）。
【０００６】
タンパク質の糖化の過程において、グルコースおよびフルクトースなどの代謝的に重要な糖は、第一級アミン基（リジンのアミノ末端およびε−アミノ基）と反応して付加体を形成し、次いで当該付加体は再配列してさらに反応し、最終的にタンパク質間の架橋につながり得、これは、しばしばこれらのタンパク質を不活性化するか、または自然の細胞分解機構に耐性を持たせる。これらのＡＧＥが形成されるこのプロセスは、より一般的には「メイラード」反応としても知られ、これは実際には極めて複雑であり、まだ完全には理解されていない一連の反応である。メイラード反応は、網膜におけるリポフスチンの形成に主要な役割を果たすことが示されている（７）。
【０００７】
光受容体ディスクの更新のプロセスで、外側のセグメントの先端は日周的（diurnal manner）に脱落し、食細胞活性の短いバーストでＲＰＥ細胞によって除去される。黄斑の錐体外側セグメントも同様にＲＰＥ細胞によって除去されるが、プロセスは大幅に遅い。貪食された外側セグメントの先端は、広範なＲＰＥファゴリソソーム系で消化される。プロセスは生涯にわたって続く。次いで、可溶化された廃棄物は、ＲＰＥ細胞の基底陥入（basal infolding）を越えて脈絡毛細管に輸送される。よって、ＡＧＥおよびビスレチノイド複合体は光受容体のレベルで形成され、次いでＲＰＥ細胞によって消化され、最終的に年齢とともにドルーゼンおよびブルッフ膜に（８）、より具体的にはＡＭＤ、ＤＲおよびＤＭＥに蓄積する（９）。ＡＧＥは、網膜における明るい蛍光ドットとして初期の疾患で検出され得、進行とともに、ＡＧＥの蓄積は大きくなり、カルシウムヒドロキシアパタイトでカプセル化される（１０）。
【０００８】
ＡＧＥは、２つの主な供給源から発生する：体内の総ＡＧＥの約３０％に寄与する外因性のもの、および残りの７０％に寄与する内因性のもの。よって、ＡＧＥは、メイラード反応によって高濃度の血糖からゆっくりと形成され得るか、またはメチルグリオキサール、グリオキサール、または３−デオキシグルコサンなどのアルファ−ジカルボニルとの反応によってより速く形成され得る。後者は、水晶体および水晶体包被膜（lenscapsule）、毛様体、硝子体、網膜、角膜、および目の視神経においてＡＧＥの負担（burden）を生じさせる（１、５）。網膜およびブルッフ膜などの目の血管新生部分における高酸素濃度および環境酸化ストレスは、ＡＧＥの形成を加速する酸化プロセスに寄与し、それらをＡＧＥの蓄積に対して特に脆弱にする。ＤＲ、ＤＭＥ、およびＡＭＤでは、これらのＡＧＥおよびビスレチノイド複合体が基底膜に過剰に沈着すると、ＲＰＥが損傷し、炎症反応および変性反応が誘発され、網膜萎縮、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現、およびこれに続く新血管新生、またはその両方をもたらす。沈着物は、サイズが増加し得、ほとんどの患者で融合し得、または非常にまれに退行し得る、動的な構造である（１１）。乾燥ＡＭＤを予測する初期のバイオマーカーはなく、治療法または療法もない。外側の網膜はグルコースが豊富であるため、この組織ではＡＧＥ形成が高い。ペントシジンおよびカルボキシメチルリジンなどのＡＧＥの免疫局在性、およびＲＡＧＥは、初期のＡＭＤおよびＤＲおよびＤＭＥの網膜で既に示されている（５、１２）。さらに、ビスレチノイド複合体の光分解により、ＡＧＥ形成によってタンパク質を修飾することが知られているジカルボニルグリオキサールおよびメチルグリオキサールが生成される（１３）。
【０００９】
酵素フルクトサミン−３−キナーゼは、グルコースとタンパク質の第一級アミン基との最初の縮合産物の自然な細胞修復能の一部を構成することが長い間知られている（１４）。補基質としてのＡＴＰの要件は、それが機能するために細胞の状況（context）を必要とすることを意味し、これは潜在的な治療用途に関する調査を思い止まらせてきた。さらに重要なことに、最終糖化産物（ＡＧＥ）およびビスレチノイドに対する酵素の作用は未知である。
【００１０】
目の硝子体は、過去１０年間で既に広範に示されているように、網膜疾患の処置における治療剤を含有するための完璧な貯蔵所である。抗血管内皮増殖因子抗体（ラニビズマブ、ベバシズマブ）、血管内皮増殖因子デコイ受容体（アフリバーセプト）は、２００６年以降、末期ＡＭＤの出血、糖尿病網膜症、ＤＭＥ、網膜静脈閉塞症、病的近視の処置のために硝子体に定期的に注射されている（１５）。硝子体は、眼の水晶体と網膜との間に位置し、９８％超の水および２％のヒアルロン酸、ＩＩ型およびＩＸ型コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、およびオプチシンを含有する本質的に無細胞の粘弾性ゲルからなる（１６）。
【発明の概要】
【００１１】
しかしながら、フルクトサミン−３−キナーゼなどの脱糖化酵素およびその必要な補因子（単数または複数）を投与することが、最終糖化産物およびビスレチノイドフルオロフォアの崩壊をもたらすかどうかは完全に未知である。視覚サイクルの糖化副産物の脱糖化により、ドルーゼンを脅かす視力形成の悪循環が崩壊し、乾燥ＡＭＤ、ＤＲ、およびＤＭＥの処置が提供される。さらに、ＷＯ２０１９１４９６４８によって開示されている事柄を考慮すると、脱糖化酵素をフルクトサミン−３−キナーゼおよびその必要な補因子（単数または複数）として毛様体に投与することが加齢性老視における適応を回復するかどうかは完全に未知である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図の簡単な記載
【図１】図１は、本発明の態様による、硝子体内に脱糖化酵素を注射するためのシステムを示す。
【図２Ａ−２Ｂ】図２  処置された／未処置のヒト網膜におけるドルーゼンの組織学。ドルーゼン（Ｄ）を有するヒト網膜の５マイクロメートルの切片は、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたか（図２Ａ）、またはＦ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された（図２Ｂ）。生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたドルーゼ（Druese）（未処置のドルーゼ）は丸で囲まれており、これは依然として無傷であり、均一な好酸球物質を示す。Ｆ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたドルーゼ（処置されたドルーゼ）は丸で囲まれており、これはもはや無傷ではない。後者はまた、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたドルーゼよりも好酸球物質が少ないことを示す。使用された用量は、約４，１７μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌとの間のフルクトサミン−３−キナーゼ、２．５０ｍＭと４，１７ｍＭとの間のＡＴＰ、および１．００ｍＭと１．６７ｍＭとの間のＭｇＣｌ２の範囲であった。（Ｒ＝網膜、Ｃ＝脈絡膜、Ｓ＝強膜、Ｄ＝丸で囲まれたドルーゼ）
【図２Ｃ】ヒト網膜の生理食塩水処置およびＦＮ３Ｋ処置ドルーゼンのＲＧＢ強度値が計算された（図２Ｃ）。
【図２Ｄ】次いで、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された１０のドルーゼンの平均強度値が計算された（図２Ｄ）。
【００１３】
【図３Ａ】図３  処置された／未処置のヒト網膜におけるドルーゼンのＮＩＲ。  図３Ａ：Ｆ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された網膜内ドルーゼンの蛍光ＡＧＥ（四角）と比較した、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された網膜内ドルーゼンの蛍光ＡＧＥのホテリングＴ２プロット（円）（図３Ａ）。ヒト網膜の５ミクロンの切片のドルーゼンは生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２またはＦ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で６時間処置された。使用した用量は、約４，１７μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌとの間のフルクトサミン−３−キナーゼ、２．５０ｍＭと４，１７ｍＭとの間のＡＴＰ、および１．００ｍＭと１．６７ｍＭとの間のＭｇＣｌ２の範囲であった。近赤外（ＮＩＲ）スペクトルは、７本の４００μｍファイバーの固定化反射プローブ、ＩｎＧａＡｓ検出器、およびハロゲンランプを備えたＮＩＲ分光計（FCR-7UVIR400-2-BX反射プローブを備えたAvaSpecNIR256-2.5-HSC、Avantes）を使用してオフラインで記録した。Bruker Vertex 80v FTIR分光計は、ＦＴ−ＮＩＲ透過マイクロスペクトルを記録するためにBruker Hyperion 2000顕微鏡に結合された。顕微鏡の対物倍率は１５×、口径は２０×２０μｍに設定された。バックグラウンドは８００の同時追加で収集された。スペクトルは、１２０００〜４０００ｃｍ−１の範囲で１６ｃｍ−１の分解能で記録され、８００回の同時添加でも収集された。スペクトルデータ分析は、SIMCAソフトウェアバージョン１５．０（MKS Data Analytics Solutions）を使用して行われた。無関係な光散乱を最小限に抑え、分光シグナルを標準化するために、種々の前処理ステップが行われた。小さな構造上の違いを強調し、ベースライン効果を減らすために微分が行われ６、乗法スケーリング効果および加法ベースラインオフセット変動を排除するために標準的な正規変量正規化（normal variate normalization）が行われ６，７、最終的にSavitzky-Golayベースの平滑化（smoothing）手順が行われた。前処理後、スペクトルデータは、主成分分析（ＰＣＡ）などの教師なしパターン認識方法および部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）などの教師ありパターン認識方法によって分析された。  糖化がタンパク質の近赤外スペクトルにスペクトルシフトをもたらすため、タンパク質の脱糖化によるＮＩＲスペクトルの特定のピーク先鋭化およびスペクトル変動を観察することができる。
【図３Ｂ】図３Ｂ：生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（対照）またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたブルッフ膜における蛍光ＡＧＥのホテリングＴ２プロットおよびスペクトル変動。
【図３Ｃ】図３Ｃ：生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（対照）またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された網膜下ドルーゼンのホテリングＴ２プロットおよびスペクトル変動。
【図３Ｄ】図３Ｄは、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（対照）で処置またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたときのブルッフ膜（実線）および網膜下ドルーゼン（点線）のＡＧＥのすべての測定ＮＩＲスペクトルの平均スペクトルを示す。  図３の結果は、ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２処置が、網膜ドルーゼン（図３Ａ）、ブルッフ膜（図３Ｂ）、および網膜下ドルーゼン（図３Ｃ）の種々の組織学的レベルでＡＧＥのＮＩＲスペクトルを変化させることを示す。
【００１４】
【図４Ａ】図４：処置された／未処置のヒト網膜におけるドルーゼンの蛍光定量法：Ｆ３Ｋ＋Ｍｇ＋ＡＴＰで処置されたドルーゼン（下の灰色の線）と比較した、生理食塩水＋Ｍｇ＋ＡＴＰで処置されたドルーゼンのＵＶ蛍光分光法（上の黒い線）。ヒト網膜の５ミクロンの切片のドルーゼンは、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で６時間処置された。蛍光定量法は、４００ｎｍ〜６８０ｎｍの範囲のＵＶ蛍光分光法で行われた。特にＡＧＥ蛍光の範囲（５６０ｎｍから６８０ｎｍまで）で鋭い違いが検出された。  ヒト神経網膜は、死後１２時間以内に、角膜移植のために除去された死体の目から熟練した眼科医による解剖によって単離され、すぐに滅菌６ウェルプレートに移された。網膜は５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で５回注意深く洗浄された。続いて、メイラードタイプの蛍光測定（励起３７０ｎｍ、発光３９０〜７００ｎｍ）は、各網膜（３０の異なる測定位置）でベースライン時に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行われた。その後、２ミリリットルの最終ＦＮ３Ｋ溶液が各網膜ウェルに加えられ、ヒト網膜は３７℃で２４時間インキュベートされた。処置手順の後、すべてのウェルはＰＢＳで５回洗浄され、蛍光測定は再度行われた。  合計で、死体の目の５つの異なるヒト網膜の網膜内ＡＧＥは、in vitroでＵＶ蛍光分光法によって測定された。図４Ａは、ドナー１の目の網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。図４Ｂは、他の４つの死体の目（ドナー２の左目、ドナー３の左目、ドナー３の右目、ドナー１０の左目）における網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。  ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２による処置は、網膜内ＡＧＥの蛍光強度を低下させる。
【図４Ｂ１】図４Ｂは、他の４つの死体の目（ドナー２の左目、ドナー３の左目、ドナー３の右目、ドナー１０の左目）における網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。
【図４Ｂ２】図４Ｂは、他の４つの死体の目（ドナー２の左目、ドナー３の左目、ドナー３の右目、ドナー１０の左目）における網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。
【図４Ｂ３】図４Ｂは、他の４つの死体の目（ドナー２の左目、ドナー３の左目、ドナー３の右目、ドナー１０の左目）における網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。
【図４Ｂ４】図４Ｂは、他の４つの死体の目（ドナー２の左目、ドナー３の左目、ドナー３の右目、ドナー１０の左目）における網膜内ＡＧＥの蛍光定量法を示す。
【００１５】
【図５】図５  試験は老齢のＣ５７／Ｂｌ６マウス（＞９ヶ月齢）で行われる。  マウスはイソフルレン５％ガス吸入で麻酔され、首の脱臼（ヘルシンキ宣言による）によって犠牲死させ、両目は摘出され、硝子体内注射により直ちに処置された。各マウスのうち、一方の目はＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置され、反対側の目は生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された。目は３７℃で２４時間維持され、次いで組織切片の調製およびヘマトキシリン／エオシンでの染色のためにパラホルムアルデヒド２％において保存された。ドルーゼンは生理食塩水で処置された目に存在したが、ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された目にはドルーゼンは見つからなかった。図５は、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された目における、丸い網膜下ドルーゼ（太い矢印のマウス１）およびマウス２の厚い平らな網膜下ドルーゼ（太い矢印のマウス２）を示しているが、ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された同じ動物の目にはドルーゼンは存在しなかった。注目すべきことに、マウス１の生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された目における基底膜（三角形にある）は完全に破壊されているが、同じマウスのＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された目ではライン全体で完全である。ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された目において、ドルーゼンは存在せず、網膜色素上皮層は無傷である。図５の組織学は、ex vivoマウスモデルにおけるＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２の硝子体内注射によってドルーゼンが溶解することを示す。
【００１６】
【図６】図６：ＦＮ３Ｋ＋チオスルファート＋ヒアルロニダーゼのヒト死体の目への硝子体内注射によって処置されたドルーゼン。  ４つのヒト死体の目（角膜移植のために除去された廃棄物）は、硝子体内で５０μｌのＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置された。チオスルファート（０．１ｍｏｌ／Ｌ）およびヒアルロニダーゼ（５Ｕ／ｍｌ）は、ドルーゼンおよび硝子体のそれぞれの周りのヒドロキシアパタイトクラストの浸透を促進するために混合物に加えられた。ドルーゼン（丸で囲まれている）は、注射前および注射の３時間後に分光法（スペクトルドメインOptical Coherence Tomography Van Hopplynus、ハイデルベルク、ドイツ）によって測定された。ドルーゼンのサイズは、ヒトex vivoモデルにおけるＦＮ３Ｋ処置後に大幅に低下する。
【００１７】
【図７】図７：in vivoの硝子体内注射によるｏｂ／ｏｂマウスおよびｗｔマウスにおける網膜のＦＮ３Ｋ処置  ２６〜３０週齢のｏｂ／ｏｂマウスは、一方の目に５μｌのＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２を、他方の目に５μｌの生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２を硝子体内注射することによって処置された。２４時間後にマウスを犠牲死させ、目を収集し、組織学のためにパラホルムアルデヒド２％において保存した。生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの網膜は、大きな漏出血管（大きな矢印）および極めて厚いコラーゲン性内境界膜（三角形）を伴う糖尿病網膜症の兆候を示した。ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置されたｏｂ／ｏｂマウスの網膜は、ｗｔマウスと同等の網膜の正常化および正常な微小血管系（小さな矢印）を示した。
【００１８】
【図８】図８：in vitroでのヒト死体の目の毛様体におけるＡＧＥのＦＮ３Ｋ処置  毛様体はヒト死体の目（角膜移植のために除去された廃棄物）から解剖され、３ｍＬのＦＮ３Ｋ（４１．６μｇ／ｍＬ）＋ＡＴＰ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＭｇＣｌ２（１ｍｍｏｌ／Ｌ）でex vivoで３時間処置された。ベースライン蛍光定量法は、（０時間の点線）およびＦＮ３Ｋ処置の１時間後（破線）、２時間後（実線）および３時間後（縞と点のある線）に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行われた。QR400-7-VIS-BX Premium 400ミクロン反射プローブが使用された。ＦＮ３Ｋによる毛様体の処置は、４９０ｎｍの波長でＡＧＥの蛍光シグナルを低減する。
【００１９】
【図９Ａ】図９：ex vivoでのＦＮ３Ｋ点滴薬の外部適用によるヒト死体の目のＦＮ３Ｋ処置  ヒト死体の目（角膜移植のために除去された廃棄物）は、プレレベーション（prelevation）後２４時間以内に処置された。クロスオーバー実験では、常に同じドナーからの２つの目が使用された。  図９Ａは、無傷のヒト死体の目にＦＮ３Ｋ点滴薬を適用する技法を示す。６〜７滴のＦＮ３Ｋ（２５μｇ／ｍＬ）＋ＡＴＰ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）＋ＭｇＣｌ２（２ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液は、一方の目に１時間ごとに６時間適用され、生理食塩水は、同じドナーからの他方の目に１時間ごとに６時間適用された。蛍光定量法は、処置前のベースライン時および処置後に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行われた。QR400-7-VIS-BX Premium 400ミクロン反射プローブが使用された。
【図９Ｂ１】図９Ｂ：ＡＧＥの蛍光シグナルは、実験の開始（ｔ＝０時間）に目２よりも目１の方が低い。次いで、目１はＦＮ３Ｋ点滴薬で６時間処置され、他方、目２は生理食塩水点滴薬で処置される。しかしながら、６時間の処置（ｔ＝６時間）後に測定されたＡＧＥの蛍光シグナルは、ＦＮ３Ｋで処置された目でのみ低下する。クロスオーバー実験として実験を行うとき、次いで、目１は生理食塩水点滴薬でさらに６時間処置され、目２はＦＮ３Ｋ点滴薬で処置される。ＡＧＥの蛍光シグナルは再度測定される（ｔ＝１２時間）。ＡＧＥの蛍光シグナルは、目２では大幅に減少するが、目１ではそうならない。  図９は、ＦＮ３Ｋ点滴薬などの外部適用による無傷のヒトの目のＦＮ３Ｋ処置が、目におけるＡＧＥの蛍光シグナルを低下させることを示す。
【図９Ｂ２】図９Ｂ：ＡＧＥの蛍光シグナルは、実験の開始（ｔ＝０時間）に目２よりも目１の方が低い。次いで、目１はＦＮ３Ｋ点滴薬で６時間処置され、他方、目２は生理食塩水点滴薬で処置される。しかしながら、６時間の処置（ｔ＝６時間）後に測定されたＡＧＥの蛍光シグナルは、ＦＮ３Ｋで処置された目でのみ低下する。クロスオーバー実験として実験を行うとき、次いで、目１は生理食塩水点滴薬でさらに６時間処置され、目２はＦＮ３Ｋ点滴薬で処置される。ＡＧＥの蛍光シグナルは再度測定される（ｔ＝１２時間）。ＡＧＥの蛍光シグナルは、目２では大幅に減少するが、目１ではそうならない。
【図９Ｂ３】図９Ｂ：ＡＧＥの蛍光シグナルは、実験の開始（ｔ＝０時間）に目２よりも目１の方が低い。次いで、目１はＦＮ３Ｋ点滴薬で６時間処置され、他方、目２は生理食塩水点滴薬で処置される。しかしながら、６時間の処置（ｔ＝６時間）後に測定されたＡＧＥの蛍光シグナルは、ＦＮ３Ｋで処置された目でのみ低下する。クロスオーバー実験として実験を行うとき、次いで、目１は生理食塩水点滴薬でさらに６時間処置され、目２はＦＮ３Ｋ点滴薬で処置される。ＡＧＥの蛍光シグナルは再度測定される（ｔ＝１２時間）。ＡＧＥの蛍光シグナルは、目２では大幅に減少するが、目１ではそうならない。
【図９Ｂ４】図９Ｂ：ＡＧＥの蛍光シグナルは、実験の開始（ｔ＝０時間）に目２よりも目１の方が低い。次いで、目１はＦＮ３Ｋ点滴薬で６時間処置され、他方、目２は生理食塩水点滴薬で処置される。しかしながら、６時間の処置（ｔ＝６時間）後に測定されたＡＧＥの蛍光シグナルは、ＦＮ３Ｋで処置された目でのみ低下する。クロスオーバー実験として実験を行うとき、次いで、目１は生理食塩水点滴薬でさらに６時間処置され、目２はＦＮ３Ｋ点滴薬で処置される。ＡＧＥの蛍光シグナルは再度測定される（ｔ＝１２時間）。ＡＧＥの蛍光シグナルは、目２では大幅に減少するが、目１ではそうならない。
【００２０】
本発明の詳細な記載
本発明は、フルクトサミン−３−キナーゼおよびその補因子（単数または複数）の投与が、ＡＭＤにおいてより少ない／より少ない密度（less/less dens）のドルーゼンをもたらすという驚くべき知見に関する。換言すれば、後者の投与は、ＡＭＤを有する患者において光透過率を回復させ、よって視力を回復させる。
本発明はまた、フルクトサミン−３−キナーゼおよびその補因子（単数または複数）による処置が、網膜、ブルッフ膜、および網膜下におけるＡＧＥを低下させるという驚くべき知見に関する。換言すれば、ＦＮ３Ｋおよびアデノシン三リン酸を含む組成物は、ＡＭＤ、ＤＲ、およびＤＭＥなどのＡＧＥ依存性眼疾患を有する患者において光透過率を回復させ、よって視力を回復させる。
本発明はまた、フルクトサミン−３−キナーゼおよびその補因子（単数または複数）による処置が毛様体におけるＡＧＥを低下させるという知見に関する。換言すれば、ＦＮ３Ｋおよびその補因子を含む組成物は、加齢性老視を有する個人において適応を回復させ、よって近方視力を回復させる。
【００２１】
よって、本発明は、第１の場合において、ヒトまたは動物におけるＡＭＤ、ＤＲおよび／またはＤＭＥ、加齢性老視を処置するための使用のためのフルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸を含む組成物に関する。
本発明はさらに、上記のとおりの使用のための組成物に関し、当該組成物は、硝子体内注射によって投与される。
本発明はさらに、マグネシウムイオンおよび／またはアデノシン三リン酸再生系をさらに含む、上記のとおりの使用のための組成物に関する。
【００２２】
本発明はさらに、ヒトまたは動物におけるＡＭＤ、ＤＲおよび／またはＤＭＥを処置するための使用のための、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸再生系を含む組成物に関し、当該組成物は、硝子体内注射によって投与される。
本発明はさらに、マグネシウムイオンをさらに含む、上記のとおりの使用のための、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸再生系を含む組成物に関する。
【００２３】
「フルクトサミン−３−キナーゼ」という用語は、例えばBrenda酵素データベース（www.brenda-enzymes.org）において酵素２．７．１．１７１として分類されている酵素に関する。後者の酵素は、非酵素的に糖化されたタンパク質から炭水化物を除去するためのＡＴＰ依存系の一部であり、以下の反応を触媒する：ＡＴＰ＋［タンパク質］−Ｎ６−Ｄ−フルクトシル−Ｌ−リジン＝ＡＤＰ＋［タンパク質］−Ｎ６−（３−Ｏ−ホスホ−Ｄ−フルクトシル）−Ｌ−リジン。より具体的には、「フルクトサミン−３−キナーゼ」という用語は、非限定例として、アクセッション番号または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_071441を参照）を有するヒトフルクトサミン−３−キナーゼに関する。「フルクトサミンキナーゼ」という用語は、上記の酵素だけでなく、その機能的フラグメントおよびバリアントにも関することはさらに明らかであるはずである。「機能的フラグメントおよびバリアント」という用語は、天然に存在する酵素のフラグメントおよびバリアントに関する。実際、酵素の多くの用途では、タンパク質の一部が酵素効果を達成するのに十分であり得る。同じことがバリアント（すなわち、１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているが、機能性を保持するか、または改善された機能性を示すタンパク質）、特に酵素活性について最適化された酵素のバリアントにも当てはまる（これはまた、組換え酵素に関してさらに記載されている）。よって、「フラグメント」という用語は、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１を有するヒトフルクトサミン−３−キナーゼの３０９アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸を含み、前記酵素活性を保持する酵素を指す。かかるフラグメントは、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端のアミノ酸の総数の１０％以下の欠失を有するタンパク質であり得る。よって、「バリアント」という用語は、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１を有し、前記酵素活性を保持するヒトフルクトサミン−３−キナーゼの３０９アミノ酸配列と、少なくとも５０％の配列同一性を有する、好ましくは少なくとも５１〜７０％の配列同一性を有する、より好ましくは少なくとも７１〜９０％の配列同一性を有する、または最も好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００２４】
したがって、オルソログ、または、アミノ酸レベルで少なくとも５０％の同一性を有し、前記酵素活性を有する他の属および種の遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１を有するヒトフルクトサミン−３−キナーゼ以外）は、本発明の一部である。アミノ酸配列同一性のパーセンテージは、２つの配列のアラインメント、および同一のアミノ酸を有する位置の数を、短い方の配列のアミノ酸数で割ったもの×１００の識別によって決定される。後者の「バリアント」もまた、酵素活性を有するタンパク質の能力が保持されるように、保存的置換および／または修飾においてのみ、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１を有するタンパク質と異なる場合がある。「保存的置換」は、タンパク質化学の当業者がタンパク質の性質が実質的に変化しないことを期待するように、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものである。一般に、以下のアミノ酸の群は保存的な変化を表す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。（１３，１４）。
【００２５】
バリアントはまた（または代替的に）、例えば、酵素の上記で定義された酵素活性、２次構造およびヒドロパシー性質（hydropathic nature）に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって修飾された、本明細書に記載のタンパク質であり得る。
「アデノシン三リン酸」（ＡＴＰ）および「マグネシウムイオン」という用語は、後者の酵素のよく知られた補因子に関する。
「アデノシン三リン酸生成系」という用語は、ＡＤＰまたはＡＭＰからＡＴＰを再生するためのいくつかの酵素的および全細胞ベースの方法に関し、例えば、Woodyer R. D. et al. 2006に記載されている（１５，１６）。特に、後者の用語は、ＡＤＰからのＡＴＰの再生に一般的に使用される以下の４つの酵素を指す：１）ピルビン酸キナーゼによって触媒される結合反応におけるホスホエノールピルビン酸の使用、２）酢酸キナーゼと結合したアセチルリン酸、３）クレアチンキナーゼと結合したクレアチンリン酸、および４）ポリリン酸キナーゼと結合したポリリン酸。好ましくは、「ＡＴＰ生成系」という用語は、二次エネルギー源としてのホスホクレアチンおよびそのリン酸基をＡＤＰに移してＡＴＰを再生するためのクレアチンキナーゼの利用を指す。よって、後者のＡＴＰ生成系の利用は、さらに記載されるように、硝子体に注射された混合物中に存在するＡＴＰの濃度を制限する。
【００２６】
「ＡＭＤおよび／またはＤＲおよび／またはＤＭＥを処置する」という用語は、処置対象の視力の安定化および／または改善に関する。
「加齢性老視を処置する」という用語は、処置対象の近方視力の安定化および／または改善に関する。
「動物」という用語は、任意の動物に関し得る。
「硝子体内注射による投与」という用語は、目の硝子体への本発明の化合物の注射に関する。硝子体内注射技法は、制御された無菌条件下で使用される。注射の前に適切な麻酔が与えられる。動物の目の処置には、（例えば、イソフルレン５％の吸入麻酔による）全身麻酔が使用される。ヒトの処置には、局所麻酔点眼薬が使用され得る。３２ゲージの針は、より小さな動物（小さい齧歯類の動物など）の目における注射のために使用され得、３０ゲージの針は、ヒトの目およびウマおよびブタなどのより大きな動物の目における注射のために使用され得る。すべての種において、強膜は４５°〜９０°の角度で貫通される。例えば、マウスでは、強膜は角膜輪部から１〜１．５ミリメートルで貫通され得、ヒトでは、強膜は角膜輪部から３〜５ミリメートルで貫通され得る。針は、硝子体に到達するまで強膜および脈絡膜を通過する。針は水晶体にも網膜にも触れない。本発明の組成物は、そのまま送達され得、針は直ちに引き抜かれる。
【００２７】
よって、本発明は、換言すれば、それを必要とする対象における加齢性老視、ＡＭＤ、ＤＲおよび／またはＤＭＥを処置（または予防）する方法に関し、当該方法は、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸、または、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸生成系、または、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸およびアデノシン三リン酸生成系、または、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸およびマグネシウムイオン、または、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸およびアデノシン三リン酸生成系およびマグネシウムイオン、または、フルクトサミン−３−キナーゼおよびアデノシン三リン酸生成系およびマグネシウムイオンを含む化合物の治療有効量を（例えば、その注射によって）、前記対象の目に（例えばその硝子体に）投与することを含む。
【００２８】
「治療有効量」という用語は、約４，１７μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌとの間のフルクトサミン−３−キナーゼ、２．５０ｍＭと４，１７ｍＭとの間のＡＴＰ、および１．００ｍＭと１．６７ｍＭとの間のＭｇＣｌ２の範囲の治療用量から取られた５μｌ（単一のマウスの目に投与／注射用）から５０μｌ（単一のウシの目に投与／注射用）の範囲の量に関する。後者の治療用量は、２５μｇ／ｍｌのフルクトサミン−３−キナーゼの溶液を５ｍＭ ＡＴＰ／２ｍＭ ＭｇＣｌ２の新しい溶液と１：１、１：２、１：３または１：５で混合することによって得ることができる。
動物の目（マウスではない）およびヒトの目において＞５μｌの量が（硝子体内に）投与されるとき、０．１ｍｏｌ／Ｌのチオスルファートおよび５Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼが混合物に加えられる。
【００２９】
投与の１つの方法である「硝子体内に」前記治療有効量を「注射する」ことに加えて、点滴薬またはゲルを介するなどの外部適用、および脈絡膜上注射または網膜下注射または目の他のあらゆる場所へのインプラントなどの他の内部適用など（これらに限定されない）の他の投与手段も想定されることは明らかである。ゆえに、例えば、本発明は、したがって、加齢性老視を処置するための使用のためのフルクトサミン−３−キナーゼおよびＡＴＰを含む（およびマグネシウムイオンをさらに含み得る）組成物に関し、当該組成物は、硝子体内注射によってまたは外部適用として投与される。
【００３０】
本発明はさらに、前記フルクトサミン−３−キナーゼが組換えフルクトサミン−３−キナーゼである上記の組成物に関する。「組換え」という用語は、細菌または酵母細胞などの生細胞内のフルクトサミン−３−キナーゼをコードする組換えＤＮＡの発現の結果として得られるフルクトサミン−３−キナーゼを指す。実務家はさらに、Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, 4th ed. , Cold Spring Harbor press, Plainsview, New York (2012) および Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)に向けられる。
【００３１】
より具体的には、本発明は、Pichia pastorisにおける組換え産生によって得られる組換えフルクトサミン−３−キナーゼに関し、さらにより具体的には、Pichia pastorisにおける組換え産生によって得られる前記組換えフルクトサミン−３−キナーゼは、配列番号１または配列番号２によって与えられるアミノ酸配列を有する。配列番号１は、Ｎ末端の切断可能なＨＩＳタグ、および、Ｈｉｓ６タグとタンパク質コード配列との間にカスパーゼ３で切断可能なＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ）リンカーを有し、これにより、当該タグのきれいな除去を可能にするコンストラクトである。配列番号２は、配列番号１の切断されたバージョンである。
【００３２】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列（およびそれらをコードする核酸配列、それぞれ配列番号３および配列番号４）は以下の通りである：
【化１】
2022500429.tif 000003
【００３３】
【化２】
2022500429.tif 000004
【００３４】
【化３】
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【００３５】
【化４】
2022500429.tif 000006
【００３６】
本発明は、さらに実際、Pichia pastorisにおける組換え産生によって得られ、配列番号１および２によって与えられるアミノ酸配列を有する組換えフルクトサミン−３−キナーゼが、ＡＭＤを処置するための好ましい酵素であるという知見に関する。実際、後者の酵素は、以下のように好ましい：１）Pichiaにおけるそれらの産生が、例えば大腸菌における産生と比較して酵素のより高い収率をもたらしたこと、２）ＳＤＳページで分析したときに酵素がより高い純度を有したこと、および３）硝子体内注射中に眼の炎症を引き起こすことが知られているエンドトキシンの存在が回避され得ること。
以下の例は、本発明をよりよく説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。
【００３７】
例
例１：フルクトサミン−３−キナーゼの組換え産生
ヒトフルクトサミン−３−キナーゼをコードする遺伝子（アクセッション番号または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）参照配列番号：ＮＰ＿０７１４４１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_071441を参照）、Pichia pastoris発現についてコドン最適化（配列番号１）、を有する）を、Claes, K. et al. （“Modular Integrated Secretory System Engineering in Pichia Pastoris To Enhance G-Protein Coupled Receptor Expression,” ACS Synthetic Biology 5, no. 10 (October 21, 2016): 1070−75）にしたがって、ｐＫａｉ６１ P. Pastoris発現ベクターにクローニングした。コードされた遺伝子は、カスパーゼ３切断部位（ＤＥＶＤ）とともにフレーム内にＮ末端Ｈｉｓ６タグ（ＭＨＨＨＨＨＨ）を含み、発現はメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある。プラスミドは、細菌および酵母細胞の選択のためのゼオシン耐性マーカーを含む。ベクターは、P. Pastoris（ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０株）に形質転換する前にＡＯＸ１プロモーターで線形化され、ゲノムへの安定した組み込みのために内因性ＡＯＸ１遺伝子座での相同組換えを促進した。
【００３８】
安定した組み込み体（integrant）は、１％グリセロールを加えたＢＭＹ緩衝複合培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌ ＹＮＢ（アミノ酸なし））において２８℃で振とうしながら増殖させた。４８時間の増殖後、１％メタノールを加えたＢＭＹ培地に移すことにより組換え発現を誘導した。４８時間の発現後、培養物を遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを液体窒素で急速冷凍し、−２０℃で保存した。
ペレットを解凍し、タンパク質抽出のために洗浄緩衝液に再懸濁した。Pichia pastoris細胞を０．５ｍｍガラスまたはシリカ／ジルコニウム（silicia/zirkonium）ビーズを使用して機械的に破壊した。清澄化した上清を、Ｈｉｓ６タグ付きフルクトサミン−３−キナーゼのＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過により精製した。ＦＮ３Ｋ試料緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）で溶出したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓ６タグおよびヒトＦＮ３Ｋ（ThermoFisher）に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより組換えヒトフルクトサミン−３−キナーゼとして同定した。酵素活性は、１デオキシ１モルホリノＤフルクトース基質（R&D Systems）を用いたキナーゼ活性アッセイで確認した。フルクトサミン−３−キナーゼのアリコートを液体窒素で瞬間冷凍し、−２０℃で保存した。
【００３９】
例２：ドルーゼンを有するヒトの目の５ミクロンの切片の処置。
ドルーゼンを有するヒト網膜の５マイクロメートルの切片（Ｄ）を、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置するか、またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置する。使用した用量は、約４，１７μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌとの間のフルクトサミン−３−キナーゼ、２．５０ｍＭと４，１７ｍＭとの間のＡＴＰ、および１．００ｍＭと１．６７ｍＭとの間のＭｇＣｌ２の範囲であった。ドルーゼンを、好酸球物質の完全性および存在について光学顕微鏡で評価する（図２ＡおよびＢ）。
【００４０】
染色した組織切片を、Olympus dotSlide Digital Virtual Microscopy Systemによってスキャンし、OlyVIAビューアプログラム（オリンパス株式会社、東京、日本）を使用して処理した。その後の画像分析には、ＮＩＨのウェブサイト（http://rsb.info.nih.gov/ij）からダウンロードしたフリーウェアImageJ v1.8.0を使用した。赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、および青（Ｂ）の強度値をRGB Measureプラグインを使用して計算した。図２Ｃは、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（未処置）で処置またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置したときのドルーゼンの組織切片のＲＧＢカラーヒストグラムの強度値を示す。図２Ｄは、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（未処置）で処置した１０のドルーゼンおよびＦＮ３Ｋで処置した１０のドルーゼンのすべての強度値の平均値を示す。近赤外（ＮＩＲ）スペクトルは、７本の４００μｍファイバーの固定化反射プローブ、ＩｎＧａＡｓ検出器、およびハロゲンランプを備えたＮＩＲ分光計（FCR-7UVIR400-2-BX反射プローブを備えたAvaSpecNIR256-2.5-HSC、Avantes）を使用してオフラインで記録した。糖化がタンパク質の近赤外スペクトルにスペクトルシフトをもたらすため、タンパク質の脱糖化によるＮＩＲスペクトルの特定のピーク先鋭化およびスペクトル変動を観察することができる（図３）。図３Ａは、ＦＮ３Ｋ＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰで処置したヒト網膜の網膜内ＡＧＥ（四角）と比較した、生理食塩水＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰで処置したヒト網膜の網膜内ＡＧＥ（円）のホテリングＴ２プロットを示す。
【００４１】
図３Ｂは、ＦＮ３Ｋ＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰで処置したブルッフ膜のＡＧＥと比較した、生理食塩水＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰ（対照）で処置したブルッフ膜のＡＧＥのＮＩＲスペクトルおよびホテリングプロットを示す。図３Ｃは、ＦＮ３Ｋ＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰで処置した網膜下ドルーゼンのＡＧＥと比較した、生理食塩水＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰ（対照）で処置した網膜下ドルーゼンのＡＧＥのＮＩＲスペクトルおよびホテリングプロットを示す。
図３Ｄは、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（対照）で処置またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置したときのブルッフ膜（実線）および網膜下ドルーゼン（点線）のＡＧＥの測定したＮＩＲスペクトルの平均スペクトルを示す。
【００４２】
ドルーゼンの蛍光定量法を、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（円）またはＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（四角）で処置したヒト網膜網膜の５ミクロンの切片で行う。蛍光定量法を、４００ｎｍ〜６８０ｎｍの範囲のＵＶ蛍光分光法で行う。違いは特にＡＧＥ蛍光の範囲（５６０ｎｍから６８０ｎｍまで）で検出される（図４）。蛍光定量法は、ヒト死体の目の５つの異なる網膜で行う。図４は、網膜内ドルーゼンのＡＧＥの測定を示す。図４Ａは、目１の未加工のＡＧＥ蛍光分光曲線を示す。図４Ｂは、曲線を滑らかにした後の他の４つのヒト網膜のＡＧＥ蛍光分光結果を示す。
【００４３】
次いで、後者の４つのヒト網膜の平均蛍光強度を計算して比較する（表１）。
【表１】
2022500429.tif 000007
【００４４】
例３：老化したＣ５７／Ｂｌ６マウスの目の処置。in vivo実験。
試験を、典型的なＡＭＤ病変をドルーゼンとして示す老齢のＣ５７／Ｂｌ６マウスで行う。硝子体内注射による一方の目のＦＮ３Ｋ処置に続いて、近赤外（ＮＩＲ）および蛍光分光法を使用してマウスの網膜を研究する。
典型的なドルーゼンの有無を評価するために組織切片を行う（図５）。生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２の硝子体内注射で目を処置したとき、ドルーゼンは存在したが、ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で目（同じ動物の反対側の目）を処置したときは存在しなかった。
【００４５】
２３ヶ月齢のマウスを吸入麻酔（イソフルレン５％）で外科手術中に麻酔する。同じ動物の両目に（一方に５マイクロリットルのフルクトサミン−３キナーゼ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（例２の実験と同じ調製物）を、一方に５マイクロリットルの生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２を）注射する。２４時間および１週間後、マウスを犠牲死させ、両目を眼球除去する。近赤外（ＮＩＲ）スペクトルは、７本の４００μｍファイバーの固定化反射プローブ、ＩｎＧａＡｓ検出器、およびハロゲンランプを備えたＮＩＲ分光計（FCR-7UVIR400-2-BX反射プローブを備えたAvaSpecNIR256-2.5-HSC、Avantes）を使用してオフラインで記録した。糖化がタンパク質の近赤外スペクトルにスペクトルシフトをもたらすため、タンパク質の脱糖化によるＮＩＲスペクトルの特定のピーク先鋭化およびスペクトル変動を観察することができる。これは我々がフルクトサミン−３−キナーゼで処置した目と未処置の目を区別することを可能にする。非侵襲的ＮＩＲモニタリングの使用は、我々が非破壊的な方法で処置を評価することを可能にする。
【００４６】
例４．硝子体内注射によるヒト死体の目のドルーゼンの処置。
ヒト死体の目（角膜移植のために除去された）を氷上で輸送し、プレレベーション後２４時間以内に光干渉断層撮影によってドルーゼンの存在について評価した。ドルーゼンが存在するとき、ドルーゼンをＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２＋０．１ｍｏｌ／Ｌチオスルファート＋５Ｕ／ｍｌヒアルロニダーゼを目に硝子体内注射することによって処置した。大きな網膜下ドルーゼンの周りのカルシウムヒドロキシアパタイトの最適な浸透のために、硝子体内注射の前にチオスルファートを混合物に加えた。硝子体の最適な浸透のためにヒアルロニダーゼを混合物に加えた。目を３７℃で２時間維持し、ドルーゼンを再び光干渉断層撮影によって記録した（図６）。ドルーゼンが存在した４つの死体の目では、ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２の硝子体内注射が明らかなサイズの低下を引き起こす。
【００４７】
例５．in vitroでのＡＧＥ修飾ブタ網膜のＦＮ３Ｋ処置。
ブタ網膜をプレレベーション後２４時間以内に解剖した。ブタ網膜におけるＡＧＥのＵＶ蛍光分光法を、ベースライン時と、ヒト網膜で最も一般的な２つのＡＧＥ（メチルグリオキサール（methyglyxoal）（ＭＧ）、グリコールアルデヒド（ＧＡ））で２４時間処置した後に行った。次いで、ブタ網膜をＰＢＳで洗浄し、生理食塩水＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰまたはＦＮ３Ｋ＋ＭｇＣｌ２＋ＡＴＰで２４時間処置し、ＵＶ蛍光分光法を繰り返した。
【表２】
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【００４８】
地元の畜殺場から６つのブタの目を得、処置するまで４℃で保管した。神経網膜は、死後１２時間以内に熟練した眼科医による解剖によって単離され、滅菌６ウェルプレート（Thermo scientific、ロスキレ、デンマーク）に移され、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ、米国）において４℃で保管された。ＲＰＭＩ培地を除去し、５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で網膜を５回注意深く洗浄することにより、４８時間以内に実験を開始した。続いて、メイラードタイプの蛍光測定（励起３７０ｎｍ、発光３９０〜７００ｎｍ）を、各網膜（３０の異なる測定位置）でベースライン時に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行った。ＡＧＥ修飾を、４ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌメチルグリオキサール（Ｈ２Ｏ中のメチルグリオキサール溶液〜４０％、Sigma-Aldrich）を有する２つの網膜ウェル、および４ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌグリコールアルデヒドダイマー（結晶形、Sigma-Aldrich）（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）を有する２つの網膜ウェルの３７℃で２４時間のインキュベーションによって行った。インキュベーション後、活性剤を各ウェルで５ｍＬのＰＢＳで注意深く洗い流し（１０回）、蛍光測定を再度行った。最後に、ＡＴＰ依存性ＦＮ３Ｋ（Fitzgerald Industries International、アクトン、マサチューセッツ、米国）を使用してin vitro脱糖化を開始した。ＰＢＳに０．００１６ｇ／ＬのＡＴＰ依存性ＦＮ３Ｋを含む溶液を、ＰＢＳ中５ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰおよび２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２（Sigma-Aldrich）の混合物に加えた（１：１）。２ミリリットルの最終ＦＮ３Ｋ溶液を、メチルグリオキサールでインキュベートした１つの網膜ウェルおよびグリコールアルデヒドでインキュベートした１つの網膜ウェルに加え、３７℃で２４時間インキュベートした。残りのウェルはＰＢＳで対照処置した。処置手順の後、すべてのウェルをＰＢＳで５回洗浄し、蛍光測定を行った。
ＦＮ３Ｋ処置は、in vitroでブタ網膜の網膜内ＡＧＥの蛍光を減少させた。
【００４９】
例６．ｏｂ／ｏｂマウスおよびｗｔマウスの目の処置。in vivo実験。
試験は、典型的な糖尿病病変を示す老齢のｏｂ／ｏｂマウスで行う。硝子体内注射による一方の目のＦＮ３Ｋ処置に続いて、近赤外（ＮＩＲ）および蛍光分光法を使用してマウス網膜を研究する。
組織切片を、大きな漏出血管の増加および内境界膜のコラーゲン線維の厚さなど、ＤＲおよびＤＭＥの典型的な病変を評価するために行う。図７は、大きな漏出血管（大きな矢印）および極めて厚いコラーゲン性内境界膜（三角形）を有する、生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置したｏｂ／ｏｂマウスの糖尿病網膜症の兆候を示す。ＦＮ３Ｋ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２で処置したｏｂ／ｏｂマウスの網膜は、ｗｔマウスと同等の網膜の正常化および正常な微小血管系（小さな矢印）を示した。
【００５０】
３０〜３６週齢のマウスを、外科手術中に吸入麻酔（イソフルレン５％）で麻酔する。同じ動物の両目に（一方に５マイクロリットルのフルクトサミン−３キナーゼ＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２（例２の実験と同じ調製物）を、一方に５マイクロリットルの生理食塩水＋ＡＴＰ＋ＭｇＣｌ２を）注射する。２４時間後、マウスを犠牲死させ、両目を眼球除去する。近赤外（ＮＩＲ）スペクトルは、７本の４００μｍファイバーの固定化反射プローブ、ＩｎＧａＡｓ検出器、およびハロゲンランプを備えたＮＩＲ分光計（FCR-7UVIR400-2-BX反射プローブを備えたAvaSpecNIR256-2.5-HSC、Avantes）を使用してオフラインで記録した。糖化がタンパク質の近赤外スペクトルにスペクトルシフトをもたらすため、タンパク質の脱糖化によるＮＩＲスペクトルの特定のピーク先鋭化およびスペクトル変動を観察することができる。これは我々がフルクトサミン−３−キナーゼで処置した目と未処置の目を区別することを可能にする。非侵襲的ＮＩＲモニタリングの使用は、我々が非破壊的な方法で処置を評価することを可能にする。
【００５１】
例７．in vitroでのヒト死体の目の毛様体におけるＡＧＥのＦＮ３Ｋ処置
毛様体をヒト死体の目（角膜移植のために除去された廃棄物）から解剖し、３ｍＬのＦＮ３Ｋ（４１．６μｇ／ｍＬ）＋ＡＴＰ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＭｇＣｌ２（１ｍｍｏｌ／Ｌ）でex vivoで３時間処置した。蛍光定量法（図８）は、ＦＮ３Ｋ処置の１時間、２時間、および３時間後に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行った。QR400-7-VIS-BX Premium 400ミクロン反射プローブを使用した。
【００５２】
例８  ex vivoでのＦＮ３Ｋ点滴薬の外部適用によるヒト死体の目の処置
ヒト死体の目（角膜移植のために除去された廃棄物）は、プレレベーション（prelevation）後２４時間以内に処置した。クロスオーバー実験では、常に同じドナーからの２つの目を使用する。
ＦＮ３Ｋ点滴薬または生理食塩水点滴薬を無傷のヒト死体の目に適用する技法は、以下からなる：ＦＮ３Ｋ（２５μｇ／ｍＬ）＋ＡＴＰ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）＋ＭｇＣｌ２（２ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液の６〜７の点滴薬を、一方の目に１時間ごとに６時間適用し、生理食塩水点滴薬を、同じドナーからの他方の目に１時間ごとに６時間適用した。蛍光定量法は、処置前のベースライン時および処置の６時間後に、ミニチュア分光計システム（Flame-S-VIS-NIR、Ocean Optics、ラルゴ、フロリダ）を使用して固定距離および９０°の角度で行った。QR400-7-VIS-BX Premium 400ミクロン反射プローブを使用した。まず、一方の目をＦＮ３Ｋ点滴薬で処置し、同じドナーの他方の目を生理食塩水点滴薬で処置する。クロスオーバー実験では、次いで処置を切り替え、ＦＮ３Ｋで処置した目をさらに生理食塩水点滴薬で処置し、最初にＦＮ３Ｋで処置した目をさらに生理食塩水点滴薬で６時間処置する。蛍光定量法は、ベースライン時（実験開始、ｔ＝０時間）、最初の処置の６時間後、および他の処置の６時間後に行う。
【００５３】
参考文献
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ１】
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【図４Ｂ２】
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【図４Ｂ３】
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【図４Ｂ４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ１】
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【図９Ｂ２】
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【図９Ｂ３】
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【図９Ｂ４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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