(57)【要約】本発明は、高い見かけの親和性で内在性ＲＡＧＥリガンドを結合することができる、増加された安定性および延長された半減期を有する可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本発明は、安定な可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を作製および使用する方法も提供する。これらの可溶性ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、内在性ＲＡＧＥリガンドを結合するそれらの能力に基づく治療薬として有用であり、商業目的の製造可能性を満たし得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、
（ａ）第１のドメインと、ここで、前記第１のドメインは配列番号７４の配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域の断片を含む第２のドメインと；
を含み、
前記第１のドメインのカルボキシ末端は、ペプチド連結によって前記第２のドメインのアミノ末端に結合されている、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１０（ＡＤＡＭ１０）による切断に対して抵抗性である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号５の配列を有するポリペプチドと比較して、ＡＤＡＭ１０、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびトリプシンの少なくとも１つによる切断に対して少なくとも１５％高い抵抗性を示す、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号５の配列を含むポリペプチドと比較して、ヒト血清中での分解に対して少なくとも１５％高い抵抗性を示し、パーセント抵抗性が、同一の時間および同一の条件下で処理された対照ペプチドと比較した、所定の期間のヒト血清中でのインキュベーション後に完全長のまま残存するペプチドの割合の差に等しい、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号５の配列を有するポリペプチドと比較して、少なくとも５℃の増加した熱安定性を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが終末糖化産物（ＡＧＥ）を特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＨＭＧＢ１（アンフォテリン）を特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ４（メタスタシン）、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ７（ソリアシン）、Ｓ１００Ａ８／９、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｐ、リポ多糖（ＬＰＳ）、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１）、ホスファチジルセリン、Ｃ３ａ、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｇ、Ｓ１００Ｚ、カルボニル化タンパク質、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＣＡＰＺＡ１、ＣＡＰＺＡ２、ＤＤＯＳＴ、ＬＧＡＬＳ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＰＲＫＣＳＨ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００ＰおよびＳＡＡ１からなる群の少なくとも１つを特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドがアミロイドβを特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号７４の配列を有するポリペプチドの二量体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記第１のドメインが、グリカンに連結された少なくとも１つのアスパラギン残基を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記第１のドメインが、配列番号７４のアミノ酸残基３または５９の１またはそれより多くにおいてアミノ酸置換を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸置換が、アミノ酸残基３におけるグルタミン酸またはグルタミンでの置換である、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸置換が、アミノ酸残基５９におけるアラニン、グルタミン酸またはグルタミンでの置換である、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記第１のドメインが、配列番号７４のアミノ酸残基６０におけるアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記第１のドメインが、配列番号７４に記載された配列を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記アミノ酸置換がセリンでの置換である、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｆｃ断片がヒトＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｆｃ断片が、ＥＵ付番に従って付番されたアミノ酸残基２５２、２５４または２５６の１またはそれより多くにおいて、１またはそれを超えるアミノ酸置換を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アミノ酸残基２５２におけるチロシンでの置換である、請求項２０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アミノ酸残基２５４におけるスレオニンでの置換である、請求項２０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アミノ酸残基２５６におけるグルタミンまたはグルタミン酸での置換である、請求項２０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ１である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ２である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ４である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチド連結が、可溶性ＲＡＧＥスプライスバリアントに由来するペプチドステムを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチド連結が免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、ＩｇＧ１のヒンジ領域のものである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、配列番号１１に記載されている配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、ＩｇＧ２の下部ヒンジ領域のものである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、配列番号９または配列番号１０に記載されている配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、ＩｇＧ４のヒンジ領域のものである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
免疫グロブリンヒンジ領域の前記少なくとも一部が、配列番号８に記載されている配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号５の配列を有するポリペプチドと比較して、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）リガンドへのより高い見かけの結合親和性を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
ポリペプチド−リガンド相互作用の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）が２０ナノモル濃度（ｎＭ）またはそれ未満である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチド−リガンド相互作用がポリペプチド−Ｓ１００Ａ１２相互作用である、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチド−リガンド相互作用がポリペプチド−Ｓ１００Ａ９相互作用である、請求項３６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
前記単離されたポリペプチドをコードする核酸プラスミドで規定された条件下でトランスフェクトされたＣＨＯ−３Ｅ７細胞が、他の点では同一の所定の条件を使用して、前記ポリペプチド配列番号５をコードする他の点では同等の核酸プラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ−３Ｅ７細胞によって発現される配列番号５に記載の配列を有するポリペプチドの量より多い量の前記単離されたポリペプチドを発現する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
前記より多い量が少なくとも５％である、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
前記核酸プラスミドが、核酸ベクターｐＴＴ５を含む、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
免疫グロブリンのＦｃ領域に結合されたＲＡＧＥポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、前記ＲＡＧＥポリペプチドのカルボキシ末端がペプチド連結によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端に結合されており、前記ＲＡＧＥポリペプチドが配列番号２の配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが配列番号５３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。
【請求項４８】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドは、
（ａ）第１のドメインと、ここで、前記第１のドメインは配列番号７４の配列と少なくとも９７％同一の配列を有する；
（ｂ）第２のドメインと、ここで、前記第２のドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域の断片を含む；
を含み、
前記第１のドメインのカルボキシ末端は、ペプチド連結によって前記第２のドメインのアミノ末端に結合されている、単離された核酸分子。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが転写または翻訳制御配列に動作可能に連結されている、請求項４７または４８に記載の核酸分子。
【請求項５０】
請求項４７または４８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５１】
請求項４７または４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドを含む、ＲＡＧＥ媒介性障害を処置するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年９月１４日に出願された米国仮出願第６２／７３１，６６３号の優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、サイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【０００３】
終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）のウシ型およびヒト型の両方をコードする遺伝子が１９９２年に報告された。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、２２アミノ酸残基の突出したシグナル配列、約３２１残基のＮ末端エキソドメイン、１９残基の膜貫通ドメインおよび４１残基の細胞内ドメインに（Ｎ末端からＣ末端へ）組織化された４０４アミノ酸残基からなった。エキソドメインは、可変ドメインと２つの定常領域を含む、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有することが示された。シグナル配列は、残基１〜２２であると考えられ、その後ろに残基２３〜１１６における可変ドメイン、その後ろに約６〜８残基の非常に短い介在配列が続き、残基１２４〜２２１におけるＣ１ドメインに至る。Ｃ１ドメインとＣ２ドメインは、より長い約１８残基のリンカーによって隔てられている。Ｃ２は残基２３９〜３０４にまたがり、その後に約３８残基の非常に柔軟なステムが続き、細胞の表面上での受容体の大幅な移動範囲を可能にする。膜貫通ドメインは約１９残基であり、タンパク質のＣ末端細胞内部分は残基２６４〜４０４にまたがり、Ｓ３９１にセリンリン酸化部位を有する。
【０００４】
複数のＲＡＧＥ受容体が相互作用してクラスターを形成し得、終末糖化産物（ＡＧＥ）などの特定のリガンドの結合を補助し、細胞内シグナル伝達を引き起こし得る。細胞に結合したＲＡＧＥへのＲＡＧＥリガンドの結合は、一連の下流シグナル伝達事象を引き起こすことができる。特定のシグナル伝達プロファイルは、リガンド相互作用の性質、ＲＡＧＥ密度およびその他の要因に応じて異なり得る。シグナル伝達は、プロテインキナーゼＣ−ゼータ（ＰＫＣζ）によるアミノ酸残基Ｓ３９１におけるＲＡＧＥのリン酸化を伴い得る。
【０００５】
タンパク質、脂質および核酸の非酵素的糖化および酸化は、古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＲＡＧＥリガンドである終末糖化産物（ＡＧＥ）を生成する。
【０００６】
ＡＧＥに加えて、ＲＡＧＥは、アミロイドβ、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ７（ソリアシン）、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２、ＨＭＧＢ１（アンフォテリン）、リポ多糖（ＬＰＳ）、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１）、ホスファチジルセリン、Ｃ３ａ、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｇ、Ｓ１００Ｚ、カルボニル化タンパク質、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＣＡＰＺＡ１、ＣＡＰＺＡ２、ＤＤＯＳＴ、ＬＧＡＬＳ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＰＲＫＣＳＨ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５  Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００ＰおよびＳＡＡ１を含む複数のリガンドを結合する。
【０００７】
ＲＡＧＥの活性化を引き起こすＡＧＥの蓄積は、糖尿病およびその微小血管の合併症、大血管の合併症ならびにその他の合併症を含むさまざまな疾患および障害に関係している。ＡＧＥおよびその他のＲＡＧＥリガンドは、神経変性疾患、糖尿病性合併症、複数の臓器における虚血再灌流障害、腎疾患などを含む多くの他の疾患の他、加齢にも関係している。細胞外リガンド結合ドメインを含むが、内在性タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く可溶性形態のＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥおよびｅｓＲＡＧＥ）は、ＲＡＧＥリガンドを結合させるために有用であり得、それにより、ＲＡＧＥ活性化および下流のシグナル伝達カスケードを妨げる。したがって、ＲＡＧＥリガンドへの増強された結合親和性および治療用途に適した延長された半減期を有する薬物様の可溶性ＲＡＧＥ分子が必要とされている。
商業規模での治療用タンパク質の生産には、タンパク質の機能を損なうことなく効率的に発現および精製することができるタンパク質が必要である。製造可能性は、タンパク質の費用対効果が高い生産を可能にするために、十分に効率的な様式で、ならびに十分な安定性および構造的完全性でタンパク質を発現および精製する能力として記述することができる。商業目的の場合、製造可能性は、各治療用タンパク質の候補に対して決定しなければならない。タンパク質の発現および精製過程はタンパク質に対して最適化することができるが、製造可能性はタンパク質の固有の特性に依存し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、効率的な生産が可能な改善された製造可能性特性ならびにインビボでの増強されたリガンド結合特性および増強された安定性を有するＲＡＧＥに基づく生物学的に活性な治療用タンパク質を提供する。
【０００９】
ＲＡＧＥ融合物を含む組成物およびその使用方法が、本明細書に開示されている。したがって、本開示の一実施形態は、第１のドメインおよび第２のドメインを含む単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号７４の配列と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインのカルボキシ末端は、ペプチド連結によって第２のドメインのアミノ末端に結合されている。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１０（ＡＤＡＭ  １０）による切断に対して抵抗性である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５に記載されている配列を含むポリペプチドと比較して、ＡＤＡＭ１０、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびトリプシンの少なくとも１つによる切断に対して少なくとも１５％高い抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、パーセント抵抗性は、同一の時間および同一の条件下で処理された対照ポリペプチドと比較した、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ９およびトリプシンの少なくとも１つとの所定の期間のインキュベーション後に完全長のまま残存するポリペプチドの割合の差に等しい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ヒト血清中での分解に対して抵抗性である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５に記載されている配列を含むポリペプチドと比較して、ヒト血清中での分解に対して少なくとも１５％高い抵抗性を示す。いくつかの実施形態において、パーセント抵抗性は、同一の時間および同一の条件下で処理された対照ポリペプチドと比較した、所定の期間のヒト血清中でのインキュベーション後に完全長のまま残存するポリペプチドの割合の差に等しい。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、熱変性に対して改善された抵抗性を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５に記載された配列を含むポリペプチドと比較して、少なくとも５℃のより高い熱変性の開始（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態において、熱変性の開始（Ｔａｇｇ）の変化は、同一の温度勾配および同一の条件下で処理された対照ポリペプチドと比較した、所定の温度勾配で分析されたポリペプチドがコンパクトな折り畳まれた単量体状態から折り畳まれていない状態に遷移する温度に等しい。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、終末糖化産物（ＡＧＥ）、ＣＭＬ−ＨＳＡ（カルボキシメチル化されたヒト血清アルブミン）、ＨＭＧＢ１（アンフォテリン）、アミロイドβ、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ４（メタスタシン）、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ７（ソリアシン）、Ｓ１００Ａ８／９、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｐ、リポ多糖（ＬＰＳ）、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１）、ホスファチジルセリン、Ｃ３ａ、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｇ、Ｓ１００Ｚ、カルボニル化タンパク質、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＣＡＰＺＡ１、ＣＡＰＺＡ２、ＤＤＯＳＴ、ＬＧＡＬＳ３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＰＲＫＣＳＨ、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００ＰおよびＳＡＡ１の少なくとも１つを特異的に結合する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチド二量体を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１のドメインは、グリカンに連結された少なくとも１つのアスパラギン残基を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、アミノ酸残基３または５９の１またはそれより多くにおけるアミノ酸置換であり、ここで、前記アミノ酸残基３または５９は、前記第１のドメインの位置３または５９のアミノ酸に対応する。好ましい実施形態において、ドメインの３位のアミノ酸は、グルタミン酸またはグルタミンで置換されている。別の好ましい実施形態において、第１のドメインの５９位のアミノ酸は、アラニン、グルタミン酸またはグルタミンで置換されている。一実施形態において、第１のドメインの６０位のアミノ酸残基はセリンで置換されている。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号７４に記載されている配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドの重鎖は、ヒトＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドの免疫グロブリンＦｃは、ＥＵ付番に従って付番された、アミノ酸残基２５２、２５４または２５６の１またはそれより多くにおいて、１またはそれを超えるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基２５２は、チロシンで置換されている。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基２５４は、スレオニンで置換されている。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基２５６は、グルタミンまたはグルタミン酸で置換されている。
【００１８】
本開示のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃ領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含むペプチド連結を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチド連結は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態において、ペプチド連結は、配列番号１１、配列番号１０または配列番号８に記載されている配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４  ＣＨ２−ＣＨ３免疫グロブリンドメインのカルボキシ末端のリジンは欠失されており、配列番号５４および配列番号５５に記載されている配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５の配列を含むポリペプチドと比較して、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）リガンドに対してより高い見かけの結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドとそのリガンドとの間の相互作用の見かけの平衡解離定数（Ｋｄ）は、２０ナノモル濃度（ｎＭ）またはそれ未満であり得る。
【００２１】
例示的な実施形態は、他の点では同一の規定された条件下においてＣＨＯ−３Ｅ７細胞がいずれかのポリペプチドをコードする核酸プラスミドでトランスフェクトされる場合に、配列番号５に記載されている配列を含むポリペプチドより多い量をＣＨＯ−３Ｅ７細胞中で発現されるポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、より多い量は少なくとも５％である。別の好ましい実施形態において、核酸プラスミドは、核酸ベクターｐＴＴ５を含む。
【００２２】
本開示の一実施形態は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合されたＲＡＧＥポリペプチドを含む単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥポリペプチドのカルボキシ末端は、ペプチド連結によって免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、ペプチド連結は、新規ステムおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本開示のいくつかの実施形態は、免疫グロブリンのＦｃ領域の重鎖断片に結合されたＲＡＧＥポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第１のドメインの配列は、配列番号７４に記載されている配列と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態において、第２のアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１のアミノ酸配列のカルボキシ末端は、ペプチド連結によって第２のアミノ酸配列のアミノ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、転写または翻訳制御配列に動作可能に連結されている。
【００２５】
さらなる実施形態は、免疫グロブリンのＦｃ領域の重鎖断片に結合されたＲＡＧＥポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含むベクターを含む。本開示のいくつかの実施形態は、免疫グロブリンのＦｃ領域の重鎖断片に結合されたＲＡＧＥポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００２６】
本開示の一実施形態は、組成物が第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を含む、ＲＡＧＥ媒介性障害を処置するための治療用組成物を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号７４に記載されている配列と少なくとも９７％同一である。いくつかの実施形態において、第２のアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＦｃ領域の重鎖断片を含む。いくつかの実施形態において、第１のアミノ酸配列のカルボキシ末端は、ペプチド連結によって第２のアミノ酸配列のアミノ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列を連結するペプチド連結は、可溶性スプライスバリアントに由来するステムとサイレント抗体ヒンジ領域とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明のこれらのおよびその他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付の図面に関連してさらによく理解されるであろう。
【００２８】
【図１】図１は、二量体化されたｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の概略図である。ＲＡＧＥポリペプチドは、Ｖ、Ｃ１、Ｃ２およびステムドメインを含む。ＦｃポリペプチドはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。２つのポリペプチド間のリンカーはヒンジとして特定される。
【００２９】
【図２−１】図２は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃１（図２Ａ）；構築物＃９（図２Ｂ）；構築物＃１０（図２Ｃ）；構築物＃１１（図２Ｄ）；構築物＃１２（図２Ｅ）；構築物＃１３（図２Ｆ）；構築物＃１４（図２Ｇ）；構築物＃１５（図２Ｈ）；構築物＃１６（図２Ｉ）；構築物＃１７（図２Ｊ）；構築物＃１８（図２Ｋ）；および構築物＃１９（図２Ｌ）。
【図２−２】図２は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃１（図２Ａ）；構築物＃９（図２Ｂ）；構築物＃１０（図２Ｃ）；構築物＃１１（図２Ｄ）；構築物＃１２（図２Ｅ）；構築物＃１３（図２Ｆ）；構築物＃１４（図２Ｇ）；構築物＃１５（図２Ｈ）；構築物＃１６（図２Ｉ）；構築物＃１７（図２Ｊ）；構築物＃１８（図２Ｋ）；および構築物＃１９（図２Ｌ）。
【図２−３】図２は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃１（図２Ａ）；構築物＃９（図２Ｂ）；構築物＃１０（図２Ｃ）；構築物＃１１（図２Ｄ）；構築物＃１２（図２Ｅ）；構築物＃１３（図２Ｆ）；構築物＃１４（図２Ｇ）；構築物＃１５（図２Ｈ）；構築物＃１６（図２Ｉ）；構築物＃１７（図２Ｊ）；構築物＃１８（図２Ｋ）；および構築物＃１９（図２Ｌ）。
【００３０】
【図３−１】図３は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃２０（図３Ａ）；構築物＃２１（図３Ｂ）；構築物＃２２（図３Ｃ）；構築物＃２３（図３Ｄ）；構築物＃２４（図３Ｅ）；構築物＃２５（図３Ｆ）；構築物＃２６（図３Ｇ）；構築物＃２７（図３Ｈ）；構築物＃２８（図３Ｉ）；および構築物＃２９（図３Ｊ）。
【図３−２】図３は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃２０（図３Ａ）；構築物＃２１（図３Ｂ）；構築物＃２２（図３Ｃ）；構築物＃２３（図３Ｄ）；構築物＃２４（図３Ｅ）；構築物＃２５（図３Ｆ）；構築物＃２６（図３Ｇ）；構築物＃２７（図３Ｈ）；構築物＃２８（図３Ｉ）；および構築物＃２９（図３Ｊ）。
【図３−３】図３は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃２０（図３Ａ）；構築物＃２１（図３Ｂ）；構築物＃２２（図３Ｃ）；構築物＃２３（図３Ｄ）；構築物＃２４（図３Ｅ）；構築物＃２５（図３Ｆ）；構築物＃２６（図３Ｇ）；構築物＃２７（図３Ｈ）；構築物＃２８（図３Ｉ）；および構築物＃２９（図３Ｊ）。
【００３１】
【図４−１】図４は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃３０（図４Ａ）；構築物＃３１（図４Ｂ）；構築物＃３２（図４Ｃ）；構築物＃３３（図４Ｄ）；構築物＃３４（図４Ｅ）；構築物＃３５（図４Ｆ）；構築物＃３６（図４Ｇ）；構築物＃１６ΔＫ（図４Ｈ）；構築物＃１２ΔＫ（図４Ｉ）。
【図４−２】図４は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃３０（図４Ａ）；構築物＃３１（図４Ｂ）；構築物＃３２（図４Ｃ）；構築物＃３３（図４Ｄ）；構築物＃３４（図４Ｅ）；構築物＃３５（図４Ｆ）；構築物＃３６（図４Ｇ）；構築物＃１６ΔＫ（図４Ｈ）；構築物＃１２ΔＫ（図４Ｉ）。
【図４−３】図４は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の発現を示す：構築物＃３０（図４Ａ）；構築物＃３１（図４Ｂ）；構築物＃３２（図４Ｃ）；構築物＃３３（図４Ｄ）；構築物＃３４（図４Ｅ）；構築物＃３５（図４Ｆ）；構築物＃３６（図４Ｇ）；構築物＃１６ΔＫ（図４Ｈ）；構築物＃１２ΔＫ（図４Ｉ）。
【００３２】
【図５−１】図５は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の増大された発現を示す：構築物＃１（図５Ａ）；構築物＃９（図５Ｂ）；構築物＃１０（図５Ｃ）；構築物＃１１（図５Ｄ）；構築物＃１２（図５Ｅ）；構築物＃６（図５Ｆ）。
【図５−２】図５は、ウエスタンブロットによって評価されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の増大された発現を示す：構築物＃１（図５Ａ）；構築物＃９（図５Ｂ）；構築物＃１０（図５Ｃ）；構築物＃１１（図５Ｄ）；構築物＃１２（図５Ｅ）；構築物＃６（図５Ｆ）。
【００３３】
【図６−１】図６は、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイによって生成された濃度応答曲線を示す。ＣＭＬ−ＨＳＡ（図６Ａ）；ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）；Ｓ１００Ａ９（図６Ｃ）；Ｓ１００Ａ１２（図６Ｄ）。
【図６−２】図６は、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイによって生成された濃度応答曲線を示す。ＣＭＬ−ＨＳＡ（図６Ａ）；ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）；Ｓ１００Ａ９（図６Ｃ）；Ｓ１００Ａ１２（図６Ｄ）。
【図６−３】図６は、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイによって生成された濃度応答曲線を示す。ＣＭＬ−ＨＳＡ（図６Ａ）；ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）；Ｓ１００Ａ９（図６Ｃ）；Ｓ１００Ａ１２（図６Ｄ）。
【図６−４】図６は、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイによって生成された濃度応答曲線を示す。ＣＭＬ−ＨＳＡ（図６Ａ）；ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）；Ｓ１００Ａ９（図６Ｃ）；Ｓ１００Ａ１２（図６Ｄ）。
【００３４】
【図７−１】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−２】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−３】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−４】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−５】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−６】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【図７−７】図７は、緩衝液のみとともに０時間および２４時間インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す（図７Ａ）。；０時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｂ）；１５時間および２４時間のＭＭＰ９（図７Ｃ）；０時間および２時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｄ）；１５時間および２４時間のＡＤＡＭ１０（図７Ｅ）；０時間および２時間のトリプシン（図７Ｆ）；１５時間および２４時間のトリプシン（図７Ｇ）。
【００３５】
【図８−１】図８は、プロテアーゼの不存在下（図８Ａ）；またはＭＭＰ９（図８Ｂ）；ＡＤＡＭ１０（図８Ｃ）；もしくはトリプシン（図８Ｄ）の存在下でインキュベートされた融合タンパク質に対する経時的タンパク質分解データを示す。
【図８−２】図８は、プロテアーゼの不存在下（図８Ａ）；またはＭＭＰ９（図８Ｂ）；ＡＤＡＭ１０（図８Ｃ）；もしくはトリプシン（図８Ｄ）の存在下でインキュベートされた融合タンパク質に対する経時的タンパク質分解データを示す。
【図８−３】図８は、プロテアーゼの不存在下（図８Ａ）；またはＭＭＰ９（図８Ｂ）；ＡＤＡＭ１０（図８Ｃ）；もしくはトリプシン（図８Ｄ）の存在下でインキュベートされた融合タンパク質に対する経時的タンパク質分解データを示す。
【図８−４】図８は、プロテアーゼの不存在下（図８Ａ）；またはＭＭＰ９（図８Ｂ）；ＡＤＡＭ１０（図８Ｃ）；もしくはトリプシン（図８Ｄ）の存在下でインキュベートされた融合タンパク質に対する経時的タンパク質分解データを示す。
【００３６】
【図９−１】図９は、ヒト血清とともに０時間（図９Ａ）；１７時間（図９Ｂ）；４９時間（図９Ｃ）；および１３８時間（図９Ｄ）インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図９−２】図９は、ヒト血清とともに０時間（図９Ａ）；１７時間（図９Ｂ）；４９時間（図９Ｃ）；および１３８時間（図９Ｄ）インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図９−３】図９は、ヒト血清とともに０時間（図９Ａ）；１７時間（図９Ｂ）；４９時間（図９Ｃ）；および１３８時間（図９Ｄ）インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図９−４】図９は、ヒト血清とともに０時間（図９Ａ）；１７時間（図９Ｂ）；４９時間（図９Ｃ）；および１３８時間（図９Ｄ）インキュベートされたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００３７】
【図１０】図１０は、ヒト血清中で１３８時間にわたってインキュベートされた融合タンパク質に対する経時的タンパク質分解データを示している。
【００３８】
【図１１−１】図１１は、動的光散乱法によって測定された、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の熱変性曲線を示している。構築物＃１（図１１Ａ）；構築物＃１０（図１１Ｂ）；構築物＃１２（図１１Ｃ）；および構築物＃１６（図１１Ｄ）。
【００３９】
【図１１−２】図１１は、動的光散乱法によって測定された、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の熱変性曲線を示している。構築物＃１（図１１Ａ）；構築物＃１０（図１１Ｂ）；構築物＃１２（図１１Ｃ）；および構築物＃１６（図１１Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本開示は、カルボキシ末端におけるペプチド連結を介して免疫グロブリンＦｃと結合された細胞外ＲＡＧＥを含む融合タンパク質を記載する。本開示の融合タンパク質は、少なくとも１つのＲＡＧＥリガンド（例えば、終末糖化産物（ＡＧＥ）、ＨＭＧＢ１（アンフォテリン）、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２）に高い親和性で結合し、それによって内在性ＲＡＧＥによって媒介されるシグナル伝達を破壊する能力によって特徴づけられる。本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、他の可溶性ＲＡＧＥタンパク質と比較して、強化された安定性、延長された半減期および改善された製造可能性によってさらに特徴づけられる。
【００４１】
安定化されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、カルボキシ末端における１６アミノ酸の付加により、完全長ＲＡＧＥポリペプチドの細胞外ドメインとは異なるＲＡＧＥタンパク質によって特徴づけられる。ＲＡＧＥタンパク質のカルボキシ末端は、免疫グロブリンヒンジの少なくとも一部から構成されるペプチド連結を介して、ヒト免疫グロブリンＦｃのアミノ末端に結合されている。いくつかの実施形態において、短いペプチドリンカーが、ＲＡＧＥタンパク質と免疫グロブリンヒンジとの間に挿入され得る。
【００４２】
定義
特許請求の範囲および本明細書中で使用される用語は、別段の記載がなければ以下に記載されているように定義される。
【００４３】
「改善する」という用語は、疾患状態（例えば、ＲＡＧＥ媒介性疾患）の処置における任意の治療的に有益な結果を指す。
【００４４】
「単離された」という用語は、内在性物質からある程度精製されたタンパク質またはポリペプチド分子を指す。
【００４５】
本明細書で使用される「ＲＡＧＥ」という用語は、Ｎ末端Ｖ型免疫グロブリンドメインの全部または一部を欠如するアイソフォーム（Ｎ末端切断型）、膜貫通ドメインの全部または一部を欠如するアイソフォーム（Ｃ末端切断型）および野生型ＲＡＧＥと比較して１、２、３、４または４を超えるアミノ酸置換を含むアイソフォームを含むがこれらに限定されない、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）またはその任意の変形をコードするポリペプチド配列を指す。
【００４６】
本明細書で使用される「ｓＲＡＧＥ」という用語は、可溶性ＲＡＧＥまたは膜貫通ドメインを欠如するＲＡＧＥ（Ｃ末端切断型）を指す。本明細書で使用される場合、ｓＲＡＧＥは、膜貫通ドメインを除去するプロテアーゼ切断の結果として生成される可溶性ＲＡＧＥを指す。
【００４７】
本明細書で使用される「ｅｓＲＡＧＥ」（内在性可溶性ＲＡＧＥ）という用語は、以下の配列を含む修飾されたＣ末端を位置３３２〜３４７にもたらす選択的スプライシング部位によって生成される可溶性ＲＡＧＥを指す。ＥＧＦＤＫＶＲＥＡＥＤＳＰＱＨＭ（Ｖ１ステムのＣ末端部分）（配列番号５２）。本明細書で使用される場合、「ｅｓＲＡＧＥ」は、アミノ酸位置３３２〜３４７内の点突然変異を含む、１またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
２またはそれを超える核酸またはポリペプチド配列の文脈におけるパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用し、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている初期設定パラメータを使用して、最大の対応が得られるように比較および整列されたときに同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定されたパーセンテージを有する２またはそれを超える配列または部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在することができ、または比較されるべき２つの配列の全長にわたって存在することができる。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視による検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら参照）によって実施することができる。
【００４８】
【００４９】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」などの用語は、薬剤を投与すること、または効果を得るための手順を実行することを指す。効果は、疾患またはその症候を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、ならびに／または疾患および／もしくは疾患の症候の部分的なもしくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける任意の病的状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと；（ｃ）疾患の発症を遅らせること；（ｄ）病気の期間を減らすこと；（ｅ）疾患の任意の症候の重症度を緩和もしくは低減すること；または（ｆ）疾患の任意の合併症のリスクもしくは重症度を減少することを含む。
【００５０】
処置することは、病的状態の処置または改善または予防における成功の任意の兆候を指し得、軽減；寛解；症候を軽減させることもしくは疾患症状を患者にとってより許容できるものにすること；悪化もしくは衰えの速度を低下させること；または悪化の最終点の衰弱性の度合いをより低下させることなどの任意の客観的または主観的パラメータが含まれる。症候の処置または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づくことができる。したがって、「処置する」という用語は、病的状態に関連する症候または症状の発症を遅らせる、軽減する、または阻止もしくは阻害するための本発明の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症候または疾患の副作用の軽減、除去、予防、遅延された発生または加速された解消を指す。
【００５１】
本明細書で使用される「予防する」という用語は、１またはそれを超える疾患状態に特徴的な１つまたは複数の症候の発生を回避しまたは防ぐことを指す。
【００５２】
本明細書で使用される「予防」という用語は、１またはそれを超える疾患状態の症候を予防または改善するために与えられる治療を指す。
【００５３】
「併用」、「併用療法」および「併用製品」は、特定の実施形態において、第１の治療薬および本明細書で使用される化合物の患者への同時投与を指す。併用投与される場合、各成分は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で逐次に投与することができる。したがって、各成分は、別々に、但し、所望の治療効果を提供するために時間的に十分に近接して投与することができる。
【００５４】
「対象」という用語は、ヒトを含む哺乳動物などの任意の動物を指す。
【００５５】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。
【００５６】
「治療的有効量」という用語は、疾患の症候を改善するのに有効な量である。予防は治療と考えることができるので、治療的有効量は、「予防的有効量」であり得る。
【００５７】
「パーセント抵抗性の」という用語は、同一の時間および同一の条件下で処理された対照ペプチドと比較した、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ９およびトリプシンの少なくとも１つとの所定の期間のインキュベーション後に完全長のまま残存するペプチドの割合の差に等しいパーセント抵抗性を指す。
【００５８】
「増加した熱安定性」という用語は、同じ条件下において同じ温度勾配で処理された対照ポリペプチドと比較した、所定の期間、温度勾配でのインキュベーション後にポリペプチドが折り畳まれた状態を保つ最高の温度を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、Ｋｄ値が１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満である、受容体とそのリガンド間の親和性を指す。
【００６０】
本願において使用される略語には、以下のものが含まれる。終末糖化産物（ＡＧＥ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）、内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）。
【００６１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含むことに留意しなければならない。
【００６２】
ＲＡＧＥ融合タンパク質
本開示は、ＲＡＧＥ融合タンパク質ならびにこのような融合タンパク質を作製および使用する方法を提供する。
【００６３】
第１の態様では、単離されたポリペプチドが提供される。
【００６４】
単離されたポリペプチドの実施形態は、ＲＡＧＥエキソドメインに由来するアミノ末端、可溶性スプライスバリアント（ｅｓＲＡＧＥ）に由来するステムまたは（タンパク質分解性切断部位を含有する、ステムのＣ末端１３アミノ酸残基を欠如する）そのステム領域の短縮化された部分、サイレント抗体ヒンジ領域および抗体Ｆｃ領域という４つのモジュールを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ｅｓＲＡＧＥポリペプチドを含む。ｅｓＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号７４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【００６５】
典型的な実施形態において、単離されたポリペプチドは、第１のドメインと、ここで、前記第１のドメインは配列番号７４の配列と少なくとも９７％同一のアミノ酸配列を有し；免疫グロブリンのＦｃ領域の断片を含む第２のドメインと；を含み、前記第１のドメインのカルボキシ末端は、ペプチド連結によって前記第２のドメインのアミノ末端に結合されている。
【００６６】
配列番号１は（Ｎ末端リーダー配列を含む）ｅｓＲＡＧＥの配列を提供し、配列番号７４は（Ｎ末端リーダー配列を欠如する）成熟ｅｓＲＡＧＥの配列を提供する。ｅｓＲＡＧＥは、完全なＲＡＧＥの細胞外ドメインをもたらす選択的スプライシング部位によって生成されるＲＡＧＥの内在性可溶性形態であり、位置３３２（配列番号１）または位置３１０（配列番号７４）で始まる追加の１６アミノ酸によってカルボキシ末端において修飾されている。
【００６７】
様々な実施形態において、第１のドメインは、配列番号１と１、２、３、４、５、６、７または７を超えるアミノ酸が異なる配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号１の位置２５（配列番号７４の位置３）にアスパラギンの置換を有し、ここで、置換は、グルタミン酸またはグルタミンである。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号１の位置８１（配列番号７４の位置５９）にアラニンで置換されたアスパラギンを有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号１の位置８２（配列番号７４の位置６０）にセリンで置換されたグリシンを有する。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、配列番号１の位置３３２〜３４７（配列番号７４の位置３１０〜３２５）に対応するアミノ酸配列中に挿入、欠失または置換されたアミノ酸を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、完全長のＲＡＧＥポリペプチドを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｃ末端の１３アミノ酸残基を欠如する短縮されたステム領域を有するＲＡＧＥポリペプチドを含む。短縮されたステムＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号７４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、アミノ末端モジュールは、シグナル配列を含み得る。シグナル配列は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列の位置１〜２２のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、配列番号１に記載されている配列の１〜２２位におけるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。さらに他の実施形態において、アミノ末端モジュールは、ＲＡＧＥ融合タンパク質を発現するのに有用な任意のシグナル配列を含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示のＲＡＧＥポリペプチドを含むアミノ末端モジュールは、位置２５および８１（配列番号１）または位置３および５９（配列番号７４）のアスパラギン残基の少なくとも１つにおいてグリコシル化され得る。いくつかの実施形態において、いずれかの位置でのグリコシル化は、最適なリガンド結合のために必要とされ得る。いくつかの実施形態において、位置２５および８１（配列番号１）または位置３および５９（配列番号７４）の両方でのアスパラギン残基のグリコシル化は、リガンド結合を損ない得る。
【００７２】
本開示のいくつかの実施形態において、ＲＡＧＥポリペプチドは二量体化し得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥポリペプチドは、ＲＡＧＥリガンドを結合すると二量体化し得る。いくつかの事例では、ＲＡＧＥポリペプチドのＶドメインは相互作用してホモ二量体を形成し得る。いくつかの事例では、二量体化はＣ１またはＣ２ドメインによって媒介され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥポリペプチドは、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンドメインの一部（例えば、その断片）を含むポリペプチドに連結され得る。いくつかの事例では、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンドメインの一部を含むポリペプチドは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域またはその一部を含み得る。いくつかの事例では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、公知のＩｇＧサブタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれにも由来し得る。
【００７４】
いくつかの事例では、ＲＡＧＥ融合タンパク質はヒトＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７に記載されている配列を含み得る。他の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、インビボで炎症誘発性であり得る。他の実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、インビボにおいて抑制され（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）得る（例えば、Ｆｃ受容体へのＦｃポリペプチドの生産的結合（すなわち、炎症反応をもたらす結合）を通じて本来形成される免疫複合体の形成を妨げるペプチド配列を含む）。いくつかの実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ領域中の特定のＡＡ配列の性質によって、Ｆｃ−ガンマ受容体の結合に関して抑制され得る。
【００７６】
ＲＡＧＥ融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、融合タンパク質の安定性を増大させ得る。例えば、融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、ＲＡＧＥ融合タンパク質の安定化に寄与し得、それにより、ＲＡＧＥ融合タンパク質の半減期を増加させ得る。いくつかの事例において、Ｆｃポリペプチドは血清半減期を大幅に増加させ得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は先行技術のＲＡＧＥ融合タンパク質のプロテアーゼ切断部位を欠いているので、本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、先行技術におけるＲＡＧＥ融合タンパク質よりも安定であり得る。例えば、ｅｓＲＡＧＥスプライスバリアント中の追加の１６アミノ酸を除去すると、１またはそれを超えるプロテアーゼ切断部位が除去され得る。いくつかの実施形態において、ＲＡＧＥ融合タンパク質は、ＲＡＧＥステムのＣ末端の１３アミノ酸を欠き、それにより、先行技術のプロテアーゼ切断部位を欠く。いくつかの実施形態において、本開示のＦｃポリペプチドは、先行技術よりも少ないプロテアーゼ切断部位を含み得る。他の実施形態において、ペプチド連結は、先行技術におけるよりも少ないプロテアーゼ切断部位を含み得る。
【００７８】
プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼ酵素によって認識および切断され、切断されたポリペプチドをもたらすアミノ酸配列である。プロテアーゼ酵素には、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１０（ＡＤＡＭ１０）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）およびトリプシンが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７９】
一実施形態において、本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボ血清半減期を増加させるように最適化されたＦｃポリペプチドを含む。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、融合タンパク質の半減期を増加させる変異（例えば、アミノ酸置換）を生成することによって最適化される。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、残基位置２５２、２５４および２５６（ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って付番されている）でのアミノ酸置換を含む変異を含む。好ましい実施形態において、２５２位の残基はチロシンで置換され、２５４位の残基はスレオニンで置換され、２５６位の残基はグルタミン酸（グルタメート）で置換されている。
【００８０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の血清半減期は、配列番号５に記載されている配列を含むポリペプチドと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％増加する。
【００８１】
本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、ペプチド連結（リンカー）をさらに含む。リンカーは、主に、ポリペプチドと第２の異種ポリペプチドとの間のスペーサーまたはその他の種類の融合として機能する。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。一実施形態において、リンカーは、立体障害のないアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン）の大部分から構成されている。さらなる実施形態において、リンカーは、配列番号８に例示されるように、ＩｇＧヒンジ領域または部分的ＩｇＧヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【００８２】
ＲＡＧＥ融合タンパク質の発現
本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、様々な発現−宿主系を使用して産生され得る。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；およびウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；および哺乳動物の系が含まれまるが、これらに限定されない。組換えタンパク質産生において有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞）、ＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＥＫ  ２９３、表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫおよびＪｕｒｋａｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物の発現は、増殖培地から回収され得る分泌されたまたは可溶性のポリペプチドの産生を可能にする。
【００８３】
本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質の組換え発現は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの構築を必要とし得る。プラスミドは、標準的な組換え技術を使用して、ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＴＴ５、ｐｃＤＮＡ３．１）中にサブクローニングすることによって生成され得、発現ベクターは、哺乳動物系における転写および翻訳のための調節シグナルを含む。
【００８４】
一実施形態において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドは、細胞が融合タンパク質を発現するように、トランスフェクションによってＣＨＯ細胞中に導入され得る。一実施形態において、融合タンパク質を発現する細胞は、融合タンパク質を安定して発現する細胞株を生成するために選択およびクローニングされ得る。例えば、組換え構築物を発現する細胞は、トランスフェクトされた細胞に抗生物質Ｇ４１８を適用することにより、プラスミドによってコードされるネオマイシン耐性について選択され得る。個々のクローンが選択され得、細胞上清のウエスタンブロット分析によって検出されるように高レベルの融合タンパク質を発現するクローンが拡大され得る。
【００８５】
本開示のＲＡＧＥ融合タンパク質は、当業者に公知のタンパク質精製技術に従って精製され得る。例えば、組換えタンパク質を培養物中に分泌する系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮され得る。一実施形態において、上清は、適切なアフィニティー精製マトリックスに直接適用され得る。例えば、適切なアフィニティー精製マトリックスは、支持体に結合された分子（例えばプロテインＡ、ＡＧＥ）を含み得る。一実施形態において、上清は、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスに適用され得る。別の実施形態において、上清は、陽イオン交換マトリックスに適用され得る。マトリックスには、アクリルアミド、アガロース、デキストランおよびセルロースが含まれ得るが、これらに限定されない。洗浄し、精製マトリックスから溶出した後、溶出された画分は濃縮され得る。いくつかの実施形態において、溶出物は、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーに供され得る。いくつかの実施形態において、溶出物は、最終精製のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供され得る。
【００８６】
薬学的組成物
ＲＡＧＥ媒介性疾患の処置のための方法も、本開示によって包含される。本開示の前記方法は、治療的有効量のｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を投与することを含む。本開示の融合タンパク質は、薬学的組成物中に調合することができる。これらの組成物は、１またはそれを超えるｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質に加えて、薬学的に許容され得る、賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含むことができる。このような材料は無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、静脈内、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。
【００８７】
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または苦痛の部位での注射用の薬学的組成物の場合、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容され得る水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸リンゲル注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤を含めることができる。
【００８８】
本発明の薬学的に有用な融合タンパク質の投与は、好ましくは「治療的有効量」または「予防的有効量」であり（場合によっては、予防は治療と見なすことができるが）、これは、個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量、および投与の速度と時間経過は、処置されている疾患の性質および重症度に依存する。処置の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医およびその他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知のその他の要因を考慮に入れる。上記の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に記載されている。
【００８９】
組成物は、単独でまたは他の処置と組み合わせて、処置されるべき症状に応じて同時にまたは順次に投与することができる。
【００９０】
ＲＡＧＥ融合タンパク質の使用
本開示は、高い親和性でＲＡＧＥリガンドを結合し、それにより、ＲＡＧＥ活性化、したがってＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達を阻害または低減するための方法および薬学的組成物を提供する。一態様において、本開示は、ＲＡＧＥ媒介性障害を処置することを必要とする対象に治療的有効量の本開示の融合タンパク質を投与することにより、前記対象において、ＲＡＧＥ媒介性障害（例えば、炎症、腎症、動脈硬化症、網膜症および糖尿病に起因するその他の合併症）を処置するための方法および試薬を提供する。一実施形態において、本開示の融合タンパク質は、対象中の１またはそれを超えるＲＡＧＥリガンドを結合し、それにより、ＲＡＧＥ媒介性シグナル伝達カスケードを減少または阻害し得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、それにより、炎症反応を低減または阻害し得る。
【実施例】
【００９１】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、例示の目的でのみ提示されており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するために努力が為されたが、もちろん、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。
【００９２】
別段の記述がなければ、本発明の実施は、本分野の技術に属する、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の慣用の方法を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。
【００９３】
［実施例１］ＲＡＧＥ−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製。
ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を発現および精製するために、以下の方法を使用した。
【００９４】
以下の方法を使用して、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ−Ｆｃタンパク質を作製した。ＰＣＲオーバーラップ伸長によって、ＩｇＧ２ヒンジ（配列番号９）に由来するリンカー配列をコードするポリヌクレオチドを介して、ｅｓＲＡＧＥ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドをヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（配列番号１７に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸残基３５９〜５９０）をコードするポリヌクレオチドに融合させた。ＰＣＲのために使用されるプライマーは、Ｆｃポリペプチドの２５２位でメチオニンからチロシンへ、２５４位でセリンからスレオニンへ、２５６位でスレオニンからグルタミン酸（グルタメート）へのアミノ酸置換をもたらす変異を含有し、付番はＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質に対する配列番号４３である。二本鎖ＤＮＡ断片をｐＴＴ５ベクター中にサブクローニングした。
【００９５】
ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の一過性発現は以下のように行った。
【００９６】
無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖させたＣＨＯ−３Ｅ７細胞中で、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ−Ｆｃポリペプチドを一過性に発現させた。オービタルシェーカー（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、５％ＣＯ２、３７℃の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）中で細胞を維持した。トランスフェクションの１日前に、適切な密度で細胞をＣｏｒｎｉｎｇ三角フラスコ中に播種した。トランスフェクションの日に、ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡとトランスフェクション試薬を最適な比率で混合し、次いで、トランスフェクション用に予め播種された細胞を含有するフラスコ中に加えた。ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃポリペプチドをコードする組換えプラスミドＤＮＡを、浮遊ＣＨＯ−３Ｅ７細胞培養物中に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後６日目に収集した細胞培養上清を精製に使用した。
【００９７】
ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の精製は以下のように行った。
【００９８】
細胞培養ブロスを遠心分離し、Ｍｏｎｏｆｉｎｉｔｙ  Ａ  Ｒｅｓｉｎが予め充填されたアフィニティー精製カラム上に、得られた上清を適切な流速で添加した。洗浄し、適切な緩衝液で溶出した後、溶出された画分をプールし、緩衝液を最終調合用緩衝液に交換した。
【００９９】
精製されたタンパク質は、分子量および純度の測定のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析した。融合タンパク質のウエスタンブロットの結果が図２〜４に示されている。構築物＃１（図２Ａ）；構築物＃９（図２Ｂ）；構築物＃１０（図２Ｃ）；構築物＃１１（図２Ｄ）；構築物＃１２（図２Ｅ）；構築物＃１３（図２Ｆ）；構築物＃１４（図２Ｇ）；構築物＃１５（図２Ｈ）；構築物＃１６（図２Ｉ）；構築物＃１７（図２Ｊ）；構築物＃１８（図２Ｋ）；構築物＃１９（図２Ｌ）；構築物＃２０（図３Ａ）；構築物＃２１（図３Ｂ）；構築物＃２２（図３Ｃ）；構築物＃２３（図３Ｄ）；構築物＃２４（図３Ｅ）；構築物＃２５（図３Ｆ）；構築物＃２６（図３Ｇ）；構築物＃２７（図３Ｈ）；構築物＃２８（図３Ｉ）；構築物＃２９（図３Ｊ）；構築物＃３０（図４Ａ）；構築物＃３１（図４Ｂ）；構築物＃３２（図４Ｃ）；構築物＃３３（図４Ｄ）；構築物＃３４（図４Ｅ）；構築物＃３５（図４Ｆ）；構築物＃３６（図４Ｇ）；構築物＃１６ΔＫ（図４Ｈ）；構築物＃１２ΔＫ（図２４Ｉ）。
【０１００】
多数の融合タンパク質の発現を１Ｌ規模で行い、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。精製されたタンパク質は、分子量と純度の測定のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析した。融合タンパク質のウエスタンブロットの結果が図５に示されている。構築物＃１（図５Ａ）；構築物＃９（図５Ｂ）；構築物＃１０（図５Ｃ）；構築物＃１１（図５Ｄ）；構築物＃１２（図５Ｅ）；構築物＃６（図５Ｆ）
【０１０１】
図２Ａ〜２Ｌ、図３Ａ〜３Ｊ、図４Ａ〜４Ｉおよび図５Ａ〜５Ｆ中の各ブロットのレーンは、それぞれの内容物に従って以下のように符号が付されているＭ２、タンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００５２１）；Ｐ、ヒトＩｇＧ１、カッパ（陽性対照として）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ５１５４）；１、還元条件下（ＤＴＴあり）でのＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；２、非還元条件下（ＤＴＴなし）でのＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質。すべてのブロットに対して使用された一次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１６６）であった。
【０１０２】
精製されたタンパク質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用したブラッドフォードアッセイによって決定された。定量化された発現データが表９、１０および１１に示されている。
【０１０３】
［実施例２］ＥＬＩＳＡによるＲＡＧＥ融合タンパク質の結合親和性を評価する。
ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合特性を評価するために機能的ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＲＡＧＥリガンドＣＭＬ−ＨＳＡ、ＨＭＧＢ１、Ｓ１００Ａ９およびＳ１００Ａ１２に対するＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の見かけの結合親和性を、以下の融合タンパク質について測定した：構築物＃１（配列番号５）、構築物＃９（配列番号５３）、構築物＃１０（配列番号１２）、構築物＃１２（配列番号１５）および構築物＃１６（配列番号１６）。以前の実験は、ＥＬＩＳＡの基本的な機能、最適なコーティング濃度および体積、ＲＡＧＥ−Ｆｃ構築物のダイナミックレンジならびに最適化された抗体希釈およびＴＭＢ発色時間を決定するために実施された。
【０１０４】
ＲＡＧＥリガンドＣＭＬ−ＨＳＡ、ＨＭＧＢ１、Ｓ１００Ａ９およびＳ１００Ａ１２を、５０ナノモル濃度（ｎＭ）の濃度、ウェルあたり１００マイクロリットル（μＬ）で、コーティングされたプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））上に別々にコーティングした。ＲＡＧＥリガンドＣＭＬ−ＨＳＡは、１００ナノグラム（ｎｇ）、ウェルあたり１００μＬの濃度で、コーティングされたプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））上に別個にコーティングした。次に、プレートを４℃で一晩インキュベートして、タンパク質をプレートコーティングに結合させた。コーティング工程に続いて、１５０μＬの洗浄液（２．６７ｍＭ塩化カリウム、１．４７リン酸二水素カリウム、１３６．９ｍＭ塩化ナトリウム、８．１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを１回洗浄した。次にプレートを吸引し、可溶性ＲＡＧＥ構築物と相互作用していないタンパク質をブロックしながら、プレートウェルの満たされていない領域へのバックグランド結合を抑制するために、０．０３％アジ化ナトリウムを加えたＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％ＢＳＡ（１ｇ／Ｌ）の溶液１３０μＬで、４°Ｃで９０分間ブロッキングした。ブロッキング工程の後、洗浄溶液で２回洗浄した。次に、振とうしながら３７℃で１２０分間、ウェル上で、ｌｏｇ１０希釈にて各個別のリガンドとともにＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質をインキュベートした。ＲＡＧＥ−Ｆｃ結合工程の後、洗浄溶液で３回洗浄した。ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物のＣＭＬ−ＨＳＡ、ＨＭＧＢ１、Ｓ１００Ａ９およびＳ１００Ａ１２への結合は、ＩｇＧ  Ｆｃに対する抗原特異性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９９７５９）で検出した。ＤＢＰＳ中に１：５０００希釈された１００μＬの抗体をアッセイウェルに加え、振とうしながら３７℃で６０分間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した。次に、１００μＬのＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２９）を各ウェルに添加した。約１分後、５０μＬの１Ｍ塩酸の添加によって反応を停止させた。ウェル内容物の吸光度を、４５０ｎＭの波長で分光光度計で測定した。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図６Ａ〜Ｄ）は、本開示のＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質（構築物＃９、１０、１２、１６）が、先行技術におけるＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物（構築物＃１）より高い見かけの親和性で、ＲＡＧＥリガンドであるＣＭＬ−ＨＳＡ（図６Ａ）、ＨＭＧＢ１（図６Ｂ）、Ｓ１００Ａ９（図６Ｃ）およびＳ１００Ａ１２（図６Ｄ）に結合することを示している。見かけのＫｄ値が、各融合タンパク質−リガンド相互作用について計算され、表１、２、３および４に示されている。
【０１０６】
【表１】
2022500086.tif 000002
【０１０７】
【表２】
2022500086.tif 000003
【０１０８】
【表３】
2022500086.tif 000004
【０１０９】
【表４】
2022500086.tif 000005
【０１１０】
［実施例３］タンパク質分解に対する感受性の評価。
ＡＤＡＭ１０（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１０）およびＭＭＰ９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）は、完全長ＲＡＧＥを切断する酵素である。酵素は、生物学的に関連する酵素によるタンパク質分解切断に対するＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の脆弱性を評価するために使用された。さらに、トリプシンを非特異的酵素として使用して、各融合タンパク質の一般的なプロテアーゼ耐性を評価した。比較のために、本開示のｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、市販のＲＡＧＥ−Ｆｃ構築物と同一の精製されたバージョンと対比して試験した。
【０１１１】
既知のペプチド基質の切断を実証することによって、各酵素は、設定されたアッセイ条件下で機能することが確認された。簡単に説明すると、０．０６μＭのＡＤＡＭ１０または０．０１μＭのＭＭＰ９を５μＭの蛍光発生ペプチド基質［Ｍｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２］とともにインキュベートした。自動蛍光マイクロプレートリーダーを介して、３２０ｎｍでの励起および４０５ｎｍの発光での蛍光を速度論的に測定した。０．００２μＭのトリプシンを７６６μＭの発色基質［Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン４−ニトロアニリド塩酸塩］とともにインキュベートした。自動マイクロプレート分光光度計を介して、４０５ｎｍで吸光度を速度論的に測定した。すべての酵素がタンパク質分解活性を示した（データは示さず）。
【０１１２】
酵素が機能していることが確認されたら、３７℃でさまざまなＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質とともに最長２４時間インキュベートした。簡単に説明すると、０．０６μＭのＡＤＡＭ１０（比活性：１μｇのＡＤＡＭ１０は２０ｐｍｏｌ／分／μｇの基質を切断する；５０，０００μｇ＝１ユニット）、０．０１μＭのＭＭＰ９（比活性：１μｇのＭＭＰ９は１，３００ｐｍｏｌ／分／μｇの基質を切断する基質；７６９μｇ＝１ユニット）、または０．００２μＭのトリプシン（比活性：１μｇのトリプシンは２，５００ｐｍｏｌ／分／μｇの基質を切断する；４００μｇ＝１ユニット）を２．５μＭのＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。以下の時点：０、２、１５、２４時間で、陰イオン性界面活性剤１％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を加えることにより、酵素反応を停止させた。対照として、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を酵素なしでインキュベートして、実験の２４時間の時間経過にわたって安定していることを確認した。次に、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色を使用して、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。各試料は、還元（０．１Ｍ  ＤＴＴ）条件下で泳動した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒでゲルを画像化し、バンドはＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
【０１１３】
タンパク質分解安定性実験の結果が図７Ａ〜Ｇ、図８Ａ−Ｄおよび表５に示されている。結果は、構築物＃１（ＲＡＧＥポリペプチドのカルボキシ末端に追加の１６アミノ酸を含まない市販のＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号５）と比較して、構築物＃９（Ｃ末端の１３アミノ酸のＲＡＧＥステムを欠くＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物）および１０、１２、１６（ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物）がＭＭＰ９およびトリプシンによるタンパク質分解切断に対してより抵抗性があること、構築物＃１２および＃１６は、ＡＤＡＭ１０によるタンパク質分解切断に対してより抵抗性があることを示す。すべてのプロテアーゼ実験は、安定性の時間経過の間にＦｃポリペプチド中のジスルフィド結合を保存するために非還元条件下で実施した。還元された単量体生成物を観察するために、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で反応生成物を泳動させた（図７Ａ〜７Ｇ）。特定の時点でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の定量化データの例を表５に示す。データは、示された処理後に残存する完全長ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＬ）のパーセントとして表されている。完全長タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での蛍光画像強度によって定量化された。パーセンテージは、各条件に対するゼロ時でのバンド強度の関数として表される。図８は、融合タンパク質に対する経時的なタンパク質分解データを示している。示されているデータは、還元条件下で走行されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの蛍光バンドから定量化されている。パーセント変化は、示された時点で存在する完全長ＲＡＧＥ−Ｆｃ構築物のパーセントとして表される。表６は、試験された各構築物の配列番号を特定する。
【０１１４】
【表５】
2022500086.tif 000006
【０１１５】
【表６】
2022500086.tif 000007
【０１１６】
［実施例４］血清中での分解に対する感受性の評価。
正常なヒト血清中に見られる酵素による切断に対する脆弱性について、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を評価した。比較のために、本開示のｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、市販のＲＡＧＥ−Ｆｃ構築物と同一の精製されたバージョンと対比して試験した。
【０１１７】
蛍光発生ペプチド基質の切断を実証することにより、血清は、設定されたアッセイ条件下で活性な酵素を含有することが確認された。簡単に説明すると、１０μＭの蛍光発生ペプチド基質［Ｍｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２］とともに血清をインキュベートした。自動蛍光マイクロプレートリーダーを介して、３２０ｎｍでの励起および４０５ｎｍの発光での蛍光を速度論的に測定した。血清はタンパク質分解活性を示した（データは示されていない）。
【０１１８】
血清が活性な酵素を含有していることが確認されたら、３７℃でさまざまなＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質とともに最長１３８時間インキュベートした。簡単に説明すると、７５％（ｖ／ｖ）の血清を、２５％（ｖ／ｖ）のＰＢＳ中２μＭ  ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質とともにインキュベートした。以下の時点：０、１７、４９、１３８時間で、陰イオン性界面活性剤１％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を加えることにより、酵素反応を停止させた。対照として、血清中に内在性の可溶性ＲＡＧＥが検出されないことを確認するために、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質なしで血清を試験した。構築物の存在を検出するために、血清試料をウエスタンブロットで試験した。簡単に説明すると、還元条件下（０．１Ｍ  ＤＴＴ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で試料を泳動し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写し、転写が成功したことを確認するためにポンソーで染色した。次に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ＢＳＡで室温で１時間ブロックし、次いで、５％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７０１３１６）を含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１：５００に希釈された一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、１回の洗浄につき５分間、膜を５回洗浄し、次いで、５％ＢＳＡ（ＧｅｎＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ２１３１１０−０１）を含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１：５０００に希釈された二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、１回の洗浄につき５分間、膜を再度５回洗浄し、次いで、（ＥＣＬ）化学発光を使用して検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒでゲルを画像化し、バンドはＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。
【０１１９】
血清安定性実験の結果を図９Ａ〜Ｄ、図１０および表７に示す。結果は、構築物＃１および＃１０と比較して、構築物＃９、１２および１６が、血清中に見られる酵素によるタンパク質分解切断に対してより抵抗性があることを示している。すべての血清安定性実験は、安定性の時間経過の間にＦｃポリペプチド中のジスルフィド結合を保存するために非還元条件下で実施した。ウエスタンブロット上において見られるように還元された単量体生成物を観察するために、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で反応生成物を泳動させた（図９Ａ〜９Ｄ）。ウエスタンブロットの結果の定量化データを表７に示す。データは、示された時点後に残存する完全長ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＬ）のパーセントとして表されている。拡散係数ウエスタンブロット膜上での画像強度によって、完全長タンパク質を定量化した。パーセンテージは、各条件に対するゼロ時でのバンド強度の関数として表される。図８は、融合タンパク質に対する経時的なタンパク質分解データを示している。示されているデータは、還元条件下で実行されたウエスタンブロット膜の強度バンドから定量化されている。パーセント変化は、示された時点で存在する完全長ＲＡＧＥ−Ｆｃ構築物のパーセントとして表される。表４は、試験された各構築物の配列番号を特定する。
【０１２０】
【表７】
2022500086.tif 000008
【０１２１】
［実施例５］熱安定性および凝集の評価。
動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、同じ緩衝溶液中でのＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の凝集温度（Ｔａｇｇ）を分析した。散乱された光の動的変動を定量化することにより、溶液中のナノ粒子とコロイドの並進拡散係数（Ｄｔ）に対する温度の影響を測定するために、ＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）ＮａｎｏＳｔａｒ（登録商標）機器を使用してＤＬＳを実行した。次に、流体力学的直径（ｄｈ）に関する拡散係数から、サイズとサイズ分布が計算される。結果が、図１１に示されている：構築物＃１（図１１Ａ）；構築物＃１０（図１１Ｂ）；構築物＃１２（図１１Ｃ）；構築物＃１６（図１１Ｄ）。融合タンパク質のＤＬＳプロファイルはＯｎｓｅｔモデルのフレームワークによって分析され、点は生データを示し、緑色の実線はこのモデルによるフィッティング曲線を示す。結果は、構築物＃１０および＃１２（ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合物）が構築物＃１と比較して向上した熱安定性を有することを示している。流体力学的半径（ｎｍ）とＴａｇｇ（℃）を含むこの分析の結果を表８に示す。
【０１２２】
【表８】
2022500086.tif 000009
【０１２３】
［実施例６］改善された製造可能性。
さらなる改変されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を構築して、タンパク質発現の改善および融合タンパク質の製造可能性に関して試験した。改善された製造可能性は、以下の１またはそれを超える態様で現れる：より高い発現、増加した安定性または改善された溶解度。溶解度は、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続くウエスタンブロットによって評価され得る。先行技術とは対照的に、本開示の改良された分子は、非還元条件下において見られる塗抹したように尾を引くバンドと比べて、還元条件下において見られる明瞭に区別できるタンパク質バンドによって示されるとおり、凝集する傾向の低下を示す（図２Ａ〜２Ｌ、図３Ａ〜３Ｊ、図４Ａ〜４Ｉおよび図５Ａ〜５Ｆ参照、レーン１（還元条件）のバンドをレーン２（非還元条件）のバンドと比較している）。
【０１２４】
例えば、ｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｅｓＲＡＧＥのＣ末端と融合タンパク質のＦｃポリペプチドのアミノ末端との間のリンカーとして、代替ヒトＩｇＧポリペプチドのヒンジ領域の少なくとも一部を使用して構築された。また、ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＲＡＧＥのＣ末端と融合タンパク質のＦｃポリペプチドのアミノ末端との間のリンカーとして代替ヒトＩｇＧポリペプチドのヒンジ領域の一部を用い、Ｃ末端の１３アミノ酸残基を欠く短縮されたステム領域を有するＲＡＧＥポリペプチドを使用して構築された。ｅｓＲＡＧＥポリペプチドおよび／または融合タンパク質のＦｃポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することにより、さらなる修飾された融合タンパク質を生成した。代替リンカーおよびアミノ酸置換を含む融合タンパク質は、公知の方法に従ってオーバーラップＰＣＲ突然変異誘発を使用して生成された。
【０１２５】
代替ＩｇＧヒンジ領域から得たリンカーを含むｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質およびアミノ酸置換を含むｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の試験を以下のように実施した。ＩｇＧ４ヒンジリンカーを含むｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３９）、Ｃ末端の１３アミノ酸残基を欠く短縮されたステム領域を有するＲＡＧＥポリペプチド（配列番号５４）、またはＩｇＧ２リンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４１）を、実施例１に記載されるように、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞中で発現させた。さらに、Ｆｃポリペプチド中にアミノ置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含むｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４４）も、実施例１に記載されているように、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞中で発現させた。トランスフェクション後、培養物を６日間増殖させた。６日目に、細胞培養上清を収集し、実施例１に記載されているように精製のために使用した。還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、および一次ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１６６）を使用したウエスタンブロットによって、精製されたタンパク質を分析した。タンパク質濃度は、タンパク質標準としてＢＳＡを使用するブラッドフォードアッセイによって決定した。表５および６は、各融合タンパク質の濃度、純度および精製されたタンパク質の総収量を示している。
【０１２６】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列（配列番号３９に記載のヌクレオチド配列）によってコードされるｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列（配列番号４１に記載のヌクレオチド配列）によってコードされる融合タンパク質とは、リンカーが由来するＩｇＧヒンジのみが相違する。さらに、配列番号１６に記載のアミノ酸配列（配列番号４３に記載のヌクレオチド配列）によってコードされるｅｓＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列（配列番号４１に記載のヌクレオチド配列）によってコードされる融合タンパク質とは、Ｆｃポリペプチドの位置２５２、２５４および２５６（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換のみが相違する。表９に示されている結果は、ＩｇＧ４ヒンジからのリンカーをＩｇＧ２ヒンジからのリンカーで置き換えることによって、融合タンパク質の純度および収量、したがって製造可能性が改善され得ることを実証する。同様に、表９に示されている結果は、融合タンパク質のＦｃポリペプチド中にアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（ＥＵ付番）を組み込むことにより、融合タンパク質の製造可能性が改善されることを実証する。
【０１２７】
【表９】
2022500086.tif 000010
【０１２８】
１Ｌの規模で発現され、Ｍｏｎｏｆｉｎｉｔｙ  Ａ  Ｒｅｓｉｎアフィニティー精製後、ＨｉＬｏａｄ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されたＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度、純度および精製されたタンパク質の総収量を示すデータ。表１０に示されている結果は、ＩｇＧ４ヒンジからのリンカーをＩｇＧ２ヒンジからのリンカーで置き換えることによって、大規模化された生産における融合タンパク質の純度および収量、したがって製造可能性が改善され得ることを実証する。同様に、表１０に示されている結果は、融合タンパク質のＦｃポリペプチド中にアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（ＥＵ付番）を組み込むことにより、融合タンパク質の製造可能性が改善されることを実証する。
【表１０】
2022500086.tif 000011
【０１２９】
さらなるＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の濃度、純度および精製されたタンパク質の総収量を示すデータが表１１に示されている。
【０１３０】
【表１１】
2022500086.tif 000012
【０１３１】
好ましい実施形態および様々な代替実施形態を参照しながら、本発明を具体的に示し、説明してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および細部の様々な変更をこれらの実施形態中に施すことが可能であることを理解するであろう。
【０１３２】
本明細書の本文内に引用されているすべての参考文献、発行された特許および特許出願は、あらゆる目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
非公式の配列表
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
2022500086.tif 000019
【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１１】
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【表１２−１２】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−１５】
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【表１２−１６】
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【表１２−１７】
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【表１２−１８】
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【表１２−１９】
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【表１２−２０】
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【表１２−２１】
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【表１２−２２】
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【表１２−２３】
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【表１２−２４】
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【表１２−２５】
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【表１２−２６】
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【表１２−２７】
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【表１２−２８】
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【表１２−２９】
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【表１２−３０】
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【表１２−３１】
2022500086.tif 000043
【表１２−３２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
2022500086.tif 000049
【図３−２】
2022500086.tif 000050
【図３−３】
2022500086.tif 000051
【図４−１】
2022500086.tif 000052
【図４−２】
2022500086.tif 000053
【図４−３】
2022500086.tif 000054
【図５−１】
2022500086.tif 000055
【図５−２】
2022500086.tif 000056
【図６−１】
2022500086.tif 000057
【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
2022500086.tif 000066
【図７−７】
2022500086.tif 000067
【図８−１】
2022500086.tif 000068
【図８−２】
2022500086.tif 000069
【図８−３】
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【図８−４】
2022500086.tif 000071
【図９−１】
2022500086.tif 000072
【図９−２】
2022500086.tif 000073
【図９−３】
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【図９−４】
2022500086.tif 000075
【図１０】
2022500086.tif 000076
【図１１−１】
2022500086.tif 000077
【図１１−２】
2022500086.tif 000078
【配列表】
2022500086000001.app
【国際調査報告】
2022500086.tif 000079
2022500086.tif 000080
2022500086.tif 000081